(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(e)配列番号21と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有し、トランスポータータンパク質として機能するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(g)配列番号25と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有し、転写調節因子として機能するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(o)配列番号41と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有し、ポリケチドシンターゼとして機能するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット
を含む組換え微生物であって、前記の発現カセットの少なくとも1つが組換え発現カセットであり、該組換え微生物がペシロマイセス属(Paecilomyces)の真菌である、組換え微生物。
【請求項２】
さらに、
(a)配列番号13と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(b)配列番号15若しくは89と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号89と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(c)配列番号17と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(d)配列番号19及び/若しくは105と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号105と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(f)配列番号23及び/若しくは121と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号121と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(h)配列番号27と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(i)配列番号29及び/若しくは141と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号29と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(j)配列番号31と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(k)配列番号33及び/若しくは158と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号158と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(l)配列番号35及び/若しくは169と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号169と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(m)配列番号37及び/若しくは180と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(n)配列番号39と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(o)配列番号196と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット
を含む組換え微生物であって、前記の発現カセットの少なくとも1つが組換え発現カセットであり、該組換え微生物がペシロマイセス属(Paecilomyces)の真菌である、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
(a)配列番号7と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(b)配列番号9と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(c)配列番号43と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(d)配列番号45と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット
も含む、請求項１又は２に記載の組換え微生物。
【請求項４】
(a)配列番号3と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(b)配列番号5と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(c)配列番号47と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット
も含む、請求項１、２又は請求項３に記載の組換え微生物。
【請求項５】
(e)配列番号20と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされ、トランスポータータンパク質として機能するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(g)配列番号24と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされ、転写調節因子として機能するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(o)配列番号40と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされ、ポリケチドシンターゼとして機能するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット
を含む組換え微生物であって、前記の発現カセットの少なくとも1つが組換え発現カセットであり、該組換え微生物がペシロマイセス属(Paecilomyces)の真菌である、組換え微生物。
【請求項６】
さらに、
(a)配列番号12と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(b)配列番号14と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(c)配列番号16と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(d)配列番号18と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(f)配列番号22と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(h)配列番号26と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(i)配列番号28と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(j)配列番号30と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(k)配列番号32と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(l)配列番号34と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(m)配列番号36と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(n)配列番号38と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット
を含む組換え微生物であって、前記の発現カセットの少なくとも1つが組換え発現カセットであり、該組換え微生物がペシロマイセス属(Paecilomyces)の真菌である、請求項５に記載の組換え微生物。
【請求項７】
(a)配列番号6と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(b)配列番号8と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(c)配列番号42と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(d)配列番号44と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット
も含む、請求項５又は６に記載の組換え微生物。
【請求項８】
(a)配列番号2と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(b)配列番号4と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(c)配列番号46と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット
も含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え微生物である、請求項５〜８のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
(f)配列番号1に示される核酸配列と少なくとも95％同一であり、かつ、配列番号21、25、若しくは41に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列;
(g)配列番号1のヌクレオチド1001〜ヌクレオチド57525の配列によって示される核酸配列と少なくとも95％同一であり、かつ、配列番号21、25、若しくは41に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列;
(h)配列番号1のヌクレオチド12423〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列と少なくとも95％同一であり、かつ、配列番号25、若しくは41に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列;
(i)配列番号1のヌクレオチド7505〜ヌクレオチド55295の配列によって示される核酸配列と少なくとも95％同一であり、かつ、配列番号21、若しくは41に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列;
(j)配列番号1のヌクレオチド18123〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列と少なくとも95％同一であり、かつ、配列番号21、若しくは41に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列; 及び
(k)ポリヌクレオチドが、前記によって記載されるポリヌクレオチドの少なくとも1つに高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを可能にする核酸配列、
ここで前記配列番号21に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドはトランスポータータンパク質として機能し、
前記配列番号25に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドは転写調節因子として機能し、及び/又は
前記配列番号41に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドはポリケチドシンターゼとして機能する、
からなる群より選択される核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項１１】
さらに、
(a)配列番号1に示される核酸配列と少なくとも95％同一である核酸配列;
(b)配列番号1のヌクレオチド1001〜ヌクレオチド57525の配列によって示される核酸配列と少なくとも95％同一である核酸配列;
(c)配列番号1のヌクレオチド12423〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列と少なくとも95％同一である核酸配列;
(d)配列番号1のヌクレオチド7505〜ヌクレオチド55295の配列によって示される核酸配列と少なくとも95％同一である核酸配列;
(e)配列番号1のヌクレオチド18123〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列と少なくとも95％同一である核酸配列;
(f)配列番号1に示される核酸配列と少なくとも95％同一であり、かつ、配列番号3、5、7、9、13、15、17、19、23、27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、89、105、121、142、158、169、180、若しくは196に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列;
(g)配列番号1のヌクレオチド1001〜ヌクレオチド57525の配列によって示される核酸配列と少なくとも95％同一であり、かつ、配列番号3、5、7、9、13、15、17、19、23、27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、89、105、121、142、158、169、180、若しくは196に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列;
(h)配列番号1のヌクレオチド12423〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列と少なくとも95％同一であり、かつ、配列番号13、15、19、27、29、35、37、89、105、142、169、180、若しくは196に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列;
(i)配列番号1のヌクレオチド7505〜ヌクレオチド55295の配列によって示される核酸配列と少なくとも95％同一であり、かつ、配列番号7、9、19、27、29、31、33、35、37、105、142、158、169、180、196に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列;
(j)配列番号1のヌクレオチド18123〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列と少なくとも95％同一であり、かつ、配列番号17、19、27、29、33、35、37、105、142、158、169、180、196に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列; 及び
(k)ポリヌクレオチドが、(a)〜(j)によって記載されるポリヌクレオチドの少なくとも1つに高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを可能にする核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項１０に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号13、15、19、25、27、29、35、37、41、89、105、142、169及び196に示される配列の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての発現カセットを含み、かつ、配列番号13、15、19、25、27、29、35、37、41、89、105、142、169及び196に示される配列の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのさらなる発現カセットを含む、請求項１０又は１１に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号13、15、19、25、27、29、35、37、41、89、105、142、169及び196に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのそれぞれ1つについての発現カセットを含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１５】
請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１４に記載のベクターを含む、ペシロマイセス属(Paecilomyces)の真菌である組換え微生物。
【請求項１６】
前記組換え微生物が、ペシロマイセス・ディバリカタス(Paecilomyces divaricatus)である、請求項１〜８及び１５のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１７】
請求項１〜９、１５及び１６のいずれか一項に記載の組換え微生物を生産する方法であって、該方法が、
(a)請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１４に記載のベクターで微生物を形質転換するステップ; 並びに
(b)請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１４に記載のベクターを含む微生物を選択するステップ
を含み、該微生物がペシロマイセス属(Paecilomyces)の真菌である、方法。
【請求項１８】
コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの生産、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産のための組換え微生物を生産する方法であって、該方法が、
(a)請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１４に記載のベクターで微生物を形質転換するステップ; 並びに
(b)請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１４に記載のベクターを含み、かつ、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンを生産するか、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンを生産する微生物を選択するステップ
を含み、該微生物がペシロマイセス属(Paecilomyces)の真菌である、方法。
【請求項１９】
コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの生産、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産のための方法であって、
(a)請求項１〜９、１５及び１６のいずれか一項に記載の組換え微生物を、前記組換え微生物によるコルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの生産を可能にするか、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産を可能にする条件下で培養するステップ; 並びに
(b)生産されたコルネキシスチン若しくは生産されたヒドロキシコルネキシスチンを得るか、又は生産されたコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンを得るステップを含む、方法。
【請求項２０】
コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチン、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンが、培養ブロスから得られる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
コルネキシスチン又はヒドロキシコルネキシスチンの少なくとも1つが、その二塩基酸として、又はその農学的に許容可能な塩の形態で得られる、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンを生産することができるか、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンを生産することができる微生物を同定する方法であって、該方法が、
(a)微生物の又は組換え微生物のゲノムDNA又はcDNAを提供するステップ;
(b)請求項１０又は１１に記載の核酸配列を有する少なくとも1つのポリヌクレオチドの存在についてゲノムDNA又はcDNAを試験するステップ
を含み、該微生物がペシロマイセス属(Paecilomyces)の真菌である、方法。
【請求項２３】
請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの少なくとも1つ、又は請求項１４に記載のベクターの少なくとも1つの、請求項１〜９、１５及び１６のいずれか一項に記載の組換え微生物を生産するための使用。
【請求項２４】
請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの少なくとも1つ、又は請求項１４に記載のベクターの少なくとも1つの、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法における、又は請求項２２に記載の方法における使用。
【請求項２５】
請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの少なくとも1つ、又は請求項１４に記載のベクターの少なくとも1つ、又は請求項１〜９、１５及び１６のいずれか一項に記載の組換え微生物の少なくとも1つの、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの製造のための、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、番号US61/728256、EP12193405.3、EP13182735.4を有する出願の優先権を主張し、それら全てはその全体において参照により組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、天然産物の生産の分野、特に、コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産の分野に関する。それは、コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び組換え微生物を提供する。また、そのようなポリヌクレオチド及びそれにコードされるポリペプチド、並びにそのようなポリヌクレオチド及びポリペプチドを含むベクター及び組換え微生物を用いた、天然産物の生産方法、特に、コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンは、ペシロマイセス・バリオッティ(Paecilomyces variotii)SANK21086として以前知られていた真菌ペシロマイセス・ディバリカタス(Paecilomyces divaricatus)に由来する天然産物である。コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの両方は、トウモロコシ植物に有害である固有の性質を有する極めて強力な除草剤である。この性質のため、両分子は、研究的興味を引き付けている。Sankyo社は、除草剤用途のための生物学的抽出物のスクリーニングの際に、コルネキシスチンを発見した(JP2256602)。コルネキシスチンは、除草剤としての優れた活性及びトウモロコシ植物に対する相対的不活性を示した。Sankyo社の特徴付けは、この真菌天然産物が、ノナドリド(nonadride)ファミリーのメンバーであることを示し、このノナドリドファミリーは、中心の9員環、融合された無水マレイン酸及びペンダントアルキル鎖を含む興味深いそれらの構造的特徴について知られる天然産物の群である。コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンは、ジアステレオマーとしてのみ化学合成によって合成されている(Org. Biomol. Chem., 2008, 6, 4012-4025)。9員の炭素環構造は、一般に天然では稀であり、それらの合成及び合成に関与する遺伝子は依然として知られておらず、記述されていない。
当初はペシロマイセス・バリオッティSANK21086として同定されたペシロマイセス属種の培養物からのコルネキシスチンの単離は、Sankyo社の研究グループによって早くも1989年に公表された(JP2256602)。DOW Elancoグループによるその後の研究は、同様にペシロマイセス・バリオッティSANK21086において生産されたヒドロキシコルネキシスチンの同定を記述した(US00542478)。しかし、発酵条件下での生産株SANK21086の収率は、商業的生産目的のためには低すぎると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】JP2256602
【特許文献２】US00542478
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Org. Biomol. Chem., 2008, 6, 4012-4025
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の根底にある技術的課題は、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの生産のための、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産のためのさらなる手段及び方法の提供とみなすことができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本技術的課題は、特許請求の範囲及び本明細書下記に特徴付けられる実施形態によって解決される。
【０００８】
本発明は、配列番号1に示される核酸配列と少なくとも80％同一であるか、若しくは配列番号1のヌクレオチド1001〜ヌクレオチド57525の配列によって示される核酸配列と少なくとも80％同一であるか、若しくは配列番号1のヌクレオチド12423〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列と少なくとも80％同一であるか、若しくは配列番号1のヌクレオチド7505〜ヌクレオチド55295の配列によって示される核酸配列と少なくとも80％同一であるか、若しくは配列番号1のヌクレオチド18123〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列と少なくとも80％同一である核酸配列を含むか、又は配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44若しくは46に示される核酸配列と少なくとも80％同一である核酸配列を含むか、又は配列番号3、5、7、9、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、89、105、121、142、158、169、180、196に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むか、又は配列番号3、5、7、9、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、89、105、121、142、158、169、180、若しくは196に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む核酸配列を含むか、又は配列番号1に示される核酸配列と少なくとも70％同一であり、かつ、配列番号3、5、7、9、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、89、105、121、142、158、169、180、若しくは196に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列を含むか、又は配列番号1のヌクレオチド1001〜ヌクレオチド57525の配列によって示される核酸配列と少なくとも80％同一であり、かつ、配列番号3、5、7、9、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、89、105、121、142、158、169、180、若しくは196に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列を含むか、又は配列番号1のヌクレオチド12423〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列と少なくとも70％同一であり、かつ、配列番号13、15、19、25、27、29、35、37、41、89、105、142、169、180、若しくは196に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列を含むか、又は配列番号1のヌクレオチド7505〜ヌクレオチド55295の配列によって示される核酸配列と少なくとも70％同一であり、かつ、配列番号7、9、19、21、27、29、31、33、35、37若しくは41に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列を含むか、又は配列番号1のヌクレオチド18123〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列と少なくとも70％同一であり、かつ、配列番号17、19、21、27、29、33、35、37若しくは41に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同��であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列を含む、組換えポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、これらのポリヌクレオチドが、上に記載されるポリヌクレオチドの少なくとも1つに高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを可能にする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明のさらなる実施形態は、配列番号13、15、19、25、27、29、35、37、41、89、105、142、169及び196に示される配列の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての発現カセットを含み、かつ、配列番号13、15、19、25、27、29、35、37、41、89、105、142、169、180及び196に示される配列の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのさらなる発現カセットを含む、上に記載される組換えポリヌクレオチドである。さらなる実施形態は、配列番号13、15、19、25、27、29、35、37、41、89、105、142、169、180及び196に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのそれぞれ1つについての発現カセットを含む、上に記載される組換えポリヌクレオチドである。これまでに記載されたポリヌクレオチドの全ては、ベクター又は組換え微生物に含まれても、含まれなくてもよい。したがって、これらのベクター及び組換え微生物はまた、本発明の部分である。組換え微生物は、細菌、真菌又は酵母であってよい。好ましくは、組換え微生物はペシロマイセス・ディバリカタスである。また本発明の部分は、上に記載される組換え微生物を生産する方法であって、以下のステップ: (a)本発明のポリヌクレオチドで微生物を形質転換するステップ、及び(b)本発明のポリヌクレオチドを含む微生物を選択するステップを含む、方法である。本発明のさらなる方法は、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの生産、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産のための組換え微生物を生産する方法であって、以下のステップ: (a)上に記載されるポリヌクレオチド又はベクターの少なくとも1つで微生物を形質転換するステップ、(b)これらのポリヌクレオチドの少なくとも1つ、又はベクターの少なくとも1つを含む微生物を選択し、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンを生産するか、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンを生産する組換え微生物を選択するステップを含む、方法である。また本発明の部分は、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの生産のための、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産のための方法であって、以下のステップ: (a)上に記載される組換え微生物の少なくとも1つを、前記組換え微生物によるコルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの生産を可能にするか、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産を可能にする条件下で培養するステップ、並びに(b)生産されたコルネキシスチン若しくは生産されたヒドロキシコルネキシスチンの全て若しくは一部を得るか、又は生産されたコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの全て若しくは一部を得るステップを含む、方法である。���ましくは、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチン、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンは、組換え微生物を培養するために使用された培養ブロスから得られる。実施形態のさらなる群において、コルネキシスチン又はヒドロキシコルネキシスチンの少なくとも1つは、その二塩基酸として、又はその農学的に許容可能な塩の形態で得られる。本発明によって提供される組換えポリヌクレオチドは、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンを生産することができるか、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンを生産することができる微生物を同定する方法において使用し得る。したがって、本発明のさらなる部分は、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンを生産することができるか、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンを生産することができる微生物を同定する方法であって、以下のステップ: (a)微生物の又は組換え微生物のゲノムDNA又はcDNAを提供するステップ、並びに(b)配列番号1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44若しくは46に示される核酸配列の少なくとも1つと少なくとも80％同一であるか、又は配列番号3、5、7、9、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、89、105、121、142、158、169、180若しくは196に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする、核酸配列を有する少なくとも1つのポリヌクレオチドの存在についてゲノムDNA又はcDNAを試験するステップを含む、方法である。本発明の他の部分は、上に記載される組換えポリヌクレオチドのいずれか1つ若しくは上に記載されるベクターの、組換え微生物を生産するための使用、又は上に記載される方法の少なくとも1つにおける使用である。本発明のさらなる部分は、上に記載される組換えポリヌクレオチドの少なくとも1つ、又は上に記載されるベクターの少なくとも1つ、又は上に記載される組換え微生物の少なくとも1つの、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの製造のための、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの製造のための使用である。また本発明の部分は、配列番号13、15、19、25、27、29、35、37、41、89、105、142、169、180及び196に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドの活性を上方調節することによって、ペシロマイセス・ディバリカタス又はビソクラミス・ベルコサ(Byssochlamys verrucosa)においてコルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチン、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産を増大させる方法である。好ましくは、配列番号13、15、25、35、41、89、169及び196の少なくとも1つに示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも2つのポリペプチドは上方調節される。より好ましくは、配列番号13又は25に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドの活性は上方調節される。
【０００９】
本発明のさらなる部分は、配列番号15又は89に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドの活性を上方調節することによって、ペシロマイセス・ディバリカタス又はビソクラミス・ベルコサにおいてヒドロキシコルネキシスチンの生産を増大させる方法を含む。本発明のさらなる部分は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットを含み、ここで、該プロモーターは、配列番号236に示される核酸配列と同一であるか、又は配列番号236に示される核酸配列と少なくとも80％同一であるか、又はプロモーターが、配列番号236に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドに高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを可能にするか、又は配列番号236に示される核酸配列と少なくとも60％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号238に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、又は配列番号236に示される核酸配列と少なくとも60％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号237に示される核酸配列と少なくとも90％同一である核酸配列を含む。本発明のさらなる実施形態は、配列番号238に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするか、又は配列番号237に示される核酸配列と少なくとも80％同一であるか、又はポリヌクレオチドが、配列番号237に示される核酸配列を有するポリヌクレオチドに高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを可能にする、核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む組換え発現カセットである。また本発明に含まれるのは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットであって、該プロモーターが、以下の基準の1つ以上を満たす核酸配列を有する、組換え発現カセットである: (a)配列番号217、218、219、220、221若しくは222に示される核酸配列の少なくとも1つと同一であるか、又は(b)配列番号217、218、219、220、221若しくは222に示される核酸配列と少なくとも80％同一であるか、又は(c)配列番号217、218、219、220、221若しくは222のいずれか1つに示される核酸配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズするか、(d)配列番号217、218、219、220、221若しくは222に示される核酸配列と少なくとも60％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号15、17、19、21、23、33、35、37、39、43、若しくは45に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、又は(e)配列番号217、218、219、220、221若しくは222に示される核酸配列と少なくとも60％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビ��クラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号14、16、18、20、22、32、34、36、38、42、若しくは44に示される核酸配列と少なくとも90％同一であるポリヌクレオチドを含むか、又は(f)(a)〜(e)の少なくとも1つの逆相補鎖である。
【００１０】
本発明はまた、上に記載される核酸配列を有し、かつ、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、又は47に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットを含む。
【００１１】
また本発明の部分は、(I)前記微生物において遺伝子発現を提供することができ、かつ、配列番号25、127、128、129、130、若しくは131と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、プロモーターを含む少なくとも1つの発現カセット、並びに(ii)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む1つ以上の発現カセットを含む、組換え微生物における協調した遺伝子発現のための系であり、ここで、該プロモーターは、以下の基準の1つ以上を満たす核酸配列を含む: (a)配列番号217、218、219、220、221若しくは222に示される核酸配列の少なくとも1つと同一であるか、又は(b)配列番号217、218、219、220、221若しくは222に示される核酸配列と少なくとも80％同一であるか、又は(c)配列番号217、218、219、220、221若しくは222のいずれか1つに示される核酸配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるか、又は(d)配列番号217、218、219、220、221若しくは222に示される核酸配列と少なくとも60％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号15、17、19、21、23、33、35、37、39、43、若しくは45に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、又は(e)配列番号217、218、219、220、221若しくは222に示される核酸配列と少なくとも60％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号14、16、18、20、22、32、34、36、38、42、若しくは44に示される核酸配列と少なくとも90％同一であるポリヌクレオチドを含むか、又は(f)(a)〜(e)の少なくとも1つの逆相補鎖である。好ましくは、協調した遺伝子発現のための系は、配列番号25と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、前記組換え微生物において構成的若しくは誘導性発現を提供するプロモーターを含む。好ましくは、協調した遺伝子発現のための系は、ペシロマイセス・ディバリカタス又はビソクラミス・ベルコサにおいて使用される。本発明の他の部分は、プロモーター、そのようなプロモーターを含む発現カセットの少なくとも1つ、及び/若しくは上に記載される協調した遺伝子発現の系の少なくとも1つ、又は本明細書に記載されるそれらの変形を含む、ベクター及び組換え微生物を含む。本発明のさらなる部分は、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの生産のための方法、並びに上に記載されるベクター、発現カセット及び/若しくは協調した遺伝子発現のための系を含む、並びに/又は上に記載されるベクター、発現カセット及び/若しくは協調した遺伝子発現のための系を含む組換え微生物を含む、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの生産を増大させる方法を含む。
本発明はまた、以下に関する。
[項目１]
(a)配列番号13と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(b)配列番号15若しくは89と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号89と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(c)配列番号17と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(d)配列番号19及び/若しくは105と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号105と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(e)配列番号21と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(f)配列番号23及び/若しくは121と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号121と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(g)配列番号25と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(h)配列番号27と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(i)配列番号29及び/若しくは141と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号29と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(j)配列番号31と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(k)配列番号33及び/若しくは158と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号158と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(l)配列番号35及び/若しくは169と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有する、好ましくは配列番号169と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(m)配列番号37及び/若しくは180と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(n)配列番号39と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(o)配列番号41及び/若しくは196と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット
を含む組換え微生物であって、(a)〜(o)の発現カセットの少なくとも1つが組換え発現カセットである、組換え微生物。
[項目２]
(a)配列番号7と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(b)配列番号9と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(c)配列番号43と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(d)配列番号45と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット
も含む、項目１に記載の組換え微生物。
[項目３]
(a)配列番号3と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(b)配列番号5と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(c)配列番号47と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット
も含む、項目１又は項目２に記載の組換え微生物。
[項目４]
(a)配列番号12と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(b)配列番号14と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(c)配列番号16と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(d)配列番号18と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(e)配列番号20と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(f)配列番号22と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(g)配列番号24と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(h)配列番号26と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(i)配列番号28と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(j)配列番号30と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(k)配列番号32と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(l)配列番号34と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(m)配列番号36と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(n)配列番号38と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(o)配列番号40と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット
を含む組換え微生物であって、(a)〜(o)の発現カセットの少なくとも1つが組換え発現カセットである、組換え微生物。
[項目５]
(a)配列番号6と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(b)配列番号8と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(c)配列番号42と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(d)配列番号44と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット
も含む、項目４に記載の組換え微生物。
[項目６]
(a)配列番号2と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(b)配列番号4と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(c)配列番号46と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット
も含む、項目４又は項目５に記載の組換え微生物。
[項目７]
項目１、２又は３のいずれか一項に記載の組換え微生物である、項目４、５又は６に記載の組換え微生物。
[項目８]
(a)配列番号1に示される核酸配列と少なくとも80％同一である核酸配列;
(b)配列番号1のヌクレオチド1001〜ヌクレオチド57525の配列によって示される核酸配列と少なくとも80％同一である核酸配列;
(c)配列番号1のヌクレオチド12423〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列と少なくとも80％同一である核酸配列;
(d)配列番号1のヌクレオチド7505〜ヌクレオチド55295の配列によって示される核酸配列と少なくとも80％同一である核酸配列;
(e)配列番号1のヌクレオチド18123〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列と少なくとも80％同一である核酸配列;
(f)配列番号2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44若しくは46に示される核酸配列と少なくとも80％同一である核酸配列;
(g)配列番号3、5、7、9、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、89、105、121、142、158、169、180、若しくは196に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列;
(h)配列番号3、5、7、9、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、89、105、121、142、158、169、180、若しくは196に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む核酸配列;
(i)配列番号1に示される核酸配列と少なくとも70％同一であり、かつ、配列番号3、5、7、9、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、89、105、121、142、158、169、180、若しくは196に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列;
(j)配列番号1のヌクレオチド1001〜ヌクレオチド57525の配列によって示される核酸配列と少なくとも70％同一であり、かつ、配列番号3、5、7、9、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、89、105、121、142、158、169、180、若しくは196に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列;
(k)配列番号1のヌクレオチド12423〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列と少なくとも70％同一であり、かつ、配列番号13、15、19、25、27、29、35、37、41、89、105、142、169、180、若しくは196に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列;
(l)配列番号1のヌクレオチド7505〜ヌクレオチド55295の配列によって示される核酸配列と少なくとも70％同一であり、かつ、配列番号7、9、19、21、27、29、31、33、35、37、41、105、142、158、169、180、196に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列;
(m)配列番号1のヌクレオチド18123〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列と少なくとも70％同一であり、かつ、配列番号17、19、21、27、29、33、35、37、41、105、142、158、169、180、196に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列; 及び
(n)ポリヌクレオチドが、(a)〜(m)によって記載されるポリヌクレオチドの少なくとも1つに高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを可能にする核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド。
[項目９]
配列番号13、15、19、25、27、29、35、37、41、89、105、142、169及び196に示される配列の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての発現カセットを含み、かつ、配列番号13、15、19、25、27、29、35、37、41、89、105、142、169及び196に示される配列の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのさらなる発現カセットを含む、項目８に記載の組換えポリヌクレオチド。
[項目１０]
配列番号13、15、19、25、27、29、35、37、41、89、105、142、169及び196に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのそれぞれ1つについての発現カセットを含む、項目８又は９に記載の組換えポリヌクレオチド。
[項目１１]
項目８、９又は１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[項目１２]
項目８、９若しくは１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は項目１１に記載のベクターを含む組換え微生物。
[項目１３]
前記組換え微生物が、細菌、真菌又は酵母である、項目１２に記載の組換え微生物。
[項目１４]
前記組換え微生物が、ペシロマイセス・ディバリカタス(Paecilomyces divaricatus)である、項目１〜６、１２又は１３のいずれか一項に記載の組換え微生物。
[項目１５]
項目１〜７、１２、１３又は１４のいずれか一項に記載の組換え微生物を生産する方法であって、
(a)項目８、９若しくは１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は項目１１に記載のベクターで微生物を形質転換するステップ; 並びに
(b)項目８、９若しくは１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は項目１１に記載のベクターを含む微生物を選択するステップ
を含む、方法。
[項目１６]
コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの生産、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産のための組換え微生物を生産する方法であって、  (a)項目８、９若しくは１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は項目１１に記載のベクターで微生物を形質転換するステップ; 並びに
(b)項目８、９若しくは１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は項目１１に記載のベクターを含み、かつ、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンを生産するか、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンを生産する微生物を選択するステップ
を含む、方法。
[項目１７]
コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの生産、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産のための方法であって、
(a)項目１〜７、１２、１３又は１４のいずれか一項に記載の組換え微生物を、前記組換え微生物によるコルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの生産を可能にするか、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産を可能にする条件下で培養するステップ; 並びに
(b)生産されたコルネキシスチン若しくは生産されたヒドロキシコルネキシスチンを得るか、又は生産されたコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンを得るステップを含む、方法。
[項目１８]
コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチン、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンが、培養ブロスから得られる、項目１７に記載の方法。
[項目１９]
コルネキシスチン又はヒドロキシコルネキシスチンの少なくとも1つが、その二塩基酸として、又はその農学的に許容可能な塩の形態で得られる、項目１６、１７又は１８のいずれか一項に記載の方法。
[項目２０]
コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンを生産することができるか、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンを生産することができる微生物を同定する方法であって、
(a)微生物の又は組換え微生物のゲノムDNA又はcDNAを提供するステップ;
(b)項目８に記載の核酸配列を有する少なくとも1つのポリヌクレオチドの存在についてゲノムDNA又はcDNAを試験するステップ
を含む、方法。
[項目２１]
項目８、９若しくは１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの少なくとも1つ、又は項目１１に記載のベクターの少なくとも1つの、項目１〜７、１２、１３又は１４のいずれか一項に記載の組換え微生物を生産するための使用。
[項目２２]
項目８、９若しくは１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの少なくとも1つ、又は項目１１に記載のベクターの少なくとも1つの、項目１５〜１９のいずれか一項に記載の方法における、又は項目２０に記載の方法における使用。
[項目２３]
項目８、９若しくは１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの少なくとも1つ、又は項目１１に記載のベクターの少なくとも1つ、又は項目１〜７、１２、１３若しくは１４のいずれか一項に記載の組換え微生物の少なくとも1つの、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの製造のための、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの製造のための使用。
[項目２４]
配列番号13、15、19、25、27、29、35、37、41、89、105、142、169、180及び196に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドの活性を上方調節することによって、ペシロマイセス・ディバリカタス又はビソクラミス・ベルコサ(Byssochlamys verrucosa)においてコルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチン、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産を増大させる方法。
[項目２５]
配列番号13、15、25、35、41、89、169及び196の少なくとも1つに示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも2つのポリペプチドの活性が上方調節される、項目２４に記載の方法。
[項目２６]
配列番号13又は25に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドの活性が上方調節される、項目２４又は２５に記載の方法。
[項目２７]
配列番号15に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるか、又は配列番号89によって示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一である、アミノ酸配列を有するポリペプチドの活性を上方調節することによって、ペシロマイセス・ディバリカタス又はビソクラミス・ベルコサにおいてヒドロキシコルネキシスチンの生産を増大させる方法。
[項目２８]
配列番号15に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるか、又は配列番号89によって示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一である、アミノ酸配列を有するポリペプチドの活性を下方調節することによって、ペシロマイセス・ディバリカタス又はビソクラミス・ベルコサにおいてコルネキシスチンの生産を増大させる方法。
[項目２９]
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットであって、該プロモーターが、
(a)配列番号236に示される核酸配列と少なくとも80％同一であるか、又は
(b)プロモーターが、配列番号236に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドに高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを可能にするか、又は
(c)配列番号236に示される核酸配列と少なくとも60％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号238に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、又は  (d)配列番号236に示される核酸配列と少なくとも60％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号237に示される核酸配列と少なくとも90％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む、
核酸配列を含む、組換え発現カセット。
[項目３０]
(a)配列番号238に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするか、又は
(b)配列番号237に示される核酸配列と少なくとも80％同一であるか、又は
(c)ポリヌクレオチドが、配列番号237に示される核酸配列を有するポリヌクレオチドに高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを可能にする
核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む組換え発現カセット。
[項目３１]
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットであって、該プロモーターが、
(a)配列番号217、218、219、220、221若しくは222に示される核酸配列の少なくとも1つと同一であるか、又は
(b)配列番号217、218、219、220、221若しくは222に示される核酸配列と少なくとも80％同一であるか、又は
(c)ポリヌクレオチドが、配列番号217、218、219、220、221若しくは222のいずれか1つに示される核酸配列を有するポリヌクレオチドに高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを可能にするか、又は
(d)配列番号217、218、219、220、221若しくは222に示される核酸配列と少なくとも60％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号15、17、19、21、23、33、35、37、39、43、若しくは45に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％同一である核酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、又は
(e)配列番号217、218、219、220、221若しくは222に示される核酸配列と少なくとも60％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号14、16、18、20、22、32、34、36、38、42、若しくは44に示される核酸配列と少なくとも90％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドを含むか、又は
(f)(a)〜(e)の少なくとも1つの逆相補鎖である
核酸配列を有する、組換え発現カセット。
[項目３２]
(I)項目２９又は３１に記載される核酸配列を含むプロモーター、
(II)配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、又は47に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド
を含む組換え発現カセットであって、(I)のプロモーターが、(II)の組換えポリヌクレオチドに作動可能に連結される、組換え発現カセット。
[項目３３]
組換え微生物における協調した遺伝子発現のための系であって、
(I)前記微生物において遺伝子発現を提供することができ、かつ、配列番号25、127、128、129、130、若しくは131と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、プロモーターを含む少なくとも1つの発現カセット、及び
(II)項目３１に記載の1つ以上の発現カセット
を含む、系。
[項目３４]
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号25と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、前記組換え微生物において構成的又は誘導性発現を提供するプロモーターに作動可能に連結される、項目３３に記載の系。
[項目３５]
組換え微生物がペシロマイセス・ディバリカタス又はビソクラミス・ベルコサである、項目３３又は３４に記載の系。
[項目３６]
項目２９〜３２のいずれか一項に記載の組換え発現カセットを含むベクター。
[項目３７]
項目２９〜３２のいずれか一項に記載の発現カセット、又は項目３３〜３５のいずれか一項に記載の協調した遺伝子発現のための系、又は項目３６に記載のベクターを含む組換え微生物。
[項目３８]
前記組換え微生物が細菌、真菌又は酵母である、項目３７に記載の組換え微生物。
[項目３９]
前記組換え微生物がペシロマイセス・ディバリカタスである、項目３７又は３８に記載の組換え微生物。
[項目４０]
コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの生産、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産のための方法であって、
(a)項目３７〜３９のいずれか一項に記載の組換え微生物を、前記組換え微生物によるコルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの生産を可能にするか、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産を可能にする条件下で培養するステップ; 並びに
(b)生産されたコルネキシスチン若しくは生産されたヒドロキシコルネキシスチンを得るか、又は生産されたコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンを得るステップを含む、方法。
[項目４１]
ペシロマイセス・ディバリカタス又はビソクラミスにおけるコルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチン、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産を増大させる方法であって、
(a)ペシロマイセス・ディバリカタス又はビソクラミスの細胞を提供するステップ、
(b)項目２９、３１若しくは３２のいずれか一項に記載の発現カセット、又は項目３３〜３５のいずれか一項に記載の協調した遺伝子発現のための系、又は項目３６に記載のベクターで、前記細胞を形質転換するステップ、
(c)項目２９、３１若しくは３２のいずれか一項に記載の少なくとも1つの発現カセット、又は項目３３〜３５のいずれか一項に記載の協調した遺伝子発現のための系を含む、形質転換されたペシロマイセス・ディバリカタス又はビソクラミスの細胞を同定するステップ、
(d)ステップ(c)の形質転換されたペシロマイセス・ディバリカタス又はビソクラミスの細胞を、前記形質転換されたペシロマイセス・ディバリカタス又はビソクラミスの細胞によるコルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの生産を可能にするか、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産を可能にする条件下で培養するステップ
を含む、方法。
[項目４２]
コルネキシスチン又はヒドロキシコルネキシスチンの少なくとも1つが、その二塩基酸として、又はその農学的に許容可能な塩の形態で得られる、項目４０又は４１に記載の方法。
[項目４３]
項目２９、３１若しくは３２のいずれか一項に記載の少なくとも1つの組換え発現カセット、又は項目３３〜３５のいずれか一項に記載の協調した遺伝子発現のための系、又は項目３６に記載のベクター、又は項目３７〜３９のいずれか一項に記載の組換え微生物の、項目４０〜４２のいずれか一項に記載の方法における使用。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1は、コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン遺伝子クラスターの概略図を示す。矢印は、表２にも記載されている、遺伝子1_9399、2_9300、3_9399から遺伝子23_9399までのコード領域の順序及び方向を表す。遺伝子クラスターの全長は、約58525塩基対である。
【図２ａ】図2aは、図1に記載されたものとオープンリーディングフレームについて同じ記号を使用した、コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン遺伝子クラスターの変異体の概略図を示す。この変異体は、図1に描写されたクラスターと同じ58525塩基対の長さを有するが、遺伝子5_9399の存在は選択的である。描写されたクラスターの長さは、固定された長さを表すと理解されるべきでない。描写されたクラスターの長さは、異なる(異種の)プロモーター若しくはターミネーターが、描写されたオープンリーディングフレームに作動可能に連結されている場合、並びに/又はイントロン配列が、交換、改変若しくは欠失されている場合、異なり得る。描写されたクラスターはまた、異なる順序の描写されたオープンリーディングフレームを有するクラスター変異体、又は1つ以上のオープンリーディングフレームの方向が変化しているクラスター変異体を表すことが意図される。描写されたオープンリーディングフレームは、配列番号1にコードされる各ポリペプチドと少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドの変異体、特に、表2〜24に記載される配列変異体を表すことが意図される。
【図２ｂ】図2bは、図1に記載されたものとオープンリーディングフレームについて同じ記号を使用した、コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン遺伝子クラスターの変異体の概略図を示す。この変異体は、48269塩基対の長さを有し、遺伝子1_9399、2_9399及び23_9399の欠失を有する。遺伝子5_9399及び6_9399の存在は選択的である。描写されたクラスターはまた、図2aに描写されたクラスター変異体について記載された理由に起因して、全配列長において、又は含まれるオープンリーディングフレームの順序若しくは方向において異なるクラスター変異体を表す。
【図３ａ】図3aは、図1に記載されたものとオープンリーディングフレームについて同じ記号を使用した、コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン遺伝子クラスターの変異体の概略図を示す。この変異体は、42338塩基対の長さを有し、遺伝子1_9399、2_9399、3_9399、4_9399、5_9399、21_9399、22_9399及び23_9399の欠失を有する。遺伝子6_9399及び12_9399の存在は選択的である。描写されたクラスターはまた、図2aに描写されたクラスター変異体について記載された理由に起因して、全配列長において、又は含まれるオープンリーディングフレームの順序若しくは方向において異なるクラスター変異体を表す。
【図３ｂ】図3bは、図1に記載されたものとオープンリーディングフレームについて同じ記号を使用した、コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン遺伝子クラスターの変異体の概略図を示す。変異体は、33634塩基対の長さを有し、遺伝子1_9399、2_9399、3_9399、4_9399、5_9399、6_9399、7_9399、21_9399、22_ 9399及び23_9399の欠失を有する。遺伝子12_9399の存在は選択的である。描写されたクラスターはまた、図2aに描写されたクラスター変異体について記載された理由に起因して、全配列長において、又は含まれるオープンリーディングフレームの順序若しくは方向において異なるクラスター変異体を表す。
【図４ａ】図4aは、遺伝子1_9399(配列番号3)及びその変異体(配列番号3、59、60、61、62及び63)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、標準的一文字アミノ酸コードにしたがって表される。異なる配列の名称は、その下にこれらの配列が配列表に記載されている、配列番号を含む。
【図４ｂ】図4bは、遺伝子1_9399(配列番号3)及びその変異体(配列番号3、59、60、61、62及び63)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、標準的一文字アミノ酸コードにしたがって表される。異なる配列の名称は、その下にこれらの配列が配列表に記載されている、配列番号を含む。
【図４ｃ】図4cは、遺伝子1_9399(配列番号3)及びその変異体(配列番号3、59、60、61、62及び63)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、標準的一文字アミノ酸コードにしたがって表される。異なる配列の名称は、その下にこれらの配列が配列表に記載されている、配列番号を含む。
【図４ｄ】図4dは、遺伝子1_9399(配列番号3)及びその変異体(配列番号3、59、60、61、62及び63)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、標準的一文字アミノ酸コードにしたがって表される。異なる配列の名称は、その下にこれらの配列が配列表に記載されている、配列番号を含む。
【図５ａ】図5aは、遺伝子2_9399(配列番号5)及びその変異体(配列番号5、64、65、66、67及び68)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図５ｂ】図5bは、遺伝子2_9399(配列番号5)及びその変異体(配列番号5、64、65、66、67及び68)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図６】図6は、遺伝子3_9399(配列番号7)及びその変異体(配列番号7、69、70、71、72及び73)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントを表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図７ａ】図7aは、遺伝子4_9399(配列番号9)及びその変異体(配列番号9、74、75、76、77及び78)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図７ｂ】図7bは、遺伝子4_9399(配列番号9)及びその変異体(配列番号9、74、75、76、77及び78)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図８ａ】図8aは、遺伝子6_9399(配列番号13)及びその変異体(配列番号13、79、80、81、82及び83)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図８ｂ】図8bは、遺伝子6_9399(配列番号13)及びその変異体(配列番号13、79、80、81、82及び83)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図８ｃ】図8cは、遺伝子6_9399(配列番号13)及びその変異体(配列番号13、79、80、81、82及び83)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図９ａ】図9aは、遺伝子7_9399(配列番号15)及びその変異体(配列番号15、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93及び94)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図９ｂ】図9bは、遺伝子7_9399(配列番号15)及びその変異体(配列番号15、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93及び94)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図９ｃ】図9cは、遺伝子7_9399(配列番号15)及びその変異体(配列番号15、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93及び94)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図９ｄ】図9dは、遺伝子7_9399(配列番号15)及びその変異体(配列番号15、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93及び94)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１０ａ】図10aは、遺伝子8_9399(配列番号17)及びその変異体(配列番号17、95、96、97、98及び99)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１０ｂ】図10bは、遺伝子8_9399(配列番号17)及びその変異体(配列番号17、95、96、97、98及び99)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１１ａ】図11aは、遺伝子9_9399(配列番号19)及びその変異体(配列番号19、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109及び110)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１１ｂ】図11bは、遺伝子9_9399(配列番号19)及びその変異体(配列番号19、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109及び110)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１２ａ】図12aは、遺伝子10_9399(配列番号21)及びその変異体(配列番号21、111、112、113、114及び115)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１２ｂ】図12bは、遺伝子10_9399(配列番号21)及びその変異体(配列番号21、111、112、113、114及び115)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１３ａ】図13aは、遺伝子11_9399(配列番号23)及びその変異体(配列番号23、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125及び126)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１３ｂ】図13bは、遺伝子11_9399(配列番号23)及びその変異体(配列番号23、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125及び126)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１３ｃ】図13cは、遺伝子11_9399(配列番号23)及びその変異体(配列番号23、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125及び126)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１３ｄ】図13dは、遺伝子11_9399(配列番号23)及びその変異体(配列番号23、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125及び126)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１３ｅ】図13eは、遺伝子11_9399(配列番号23)及びその変異体(配列番号23、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125及び126)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１４ａ】図14aは、遺伝子12_9399(配列番号25)及びその変異体(配列番号25、127、128、129、130及び131)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。矢印は、アライメントされたポリペプチドのZn2C6ジンクフィンガーDNA結合ドメインの部分を形成し、亜鉛イオンの錯体形成及びDNA結合ドメインの正確なフォールディングに必要である、保存されたシステインを示す。
【図１４ｂ】図14bは、遺伝子12_9399(配列番号25)及びその変異体(配列番号25、127、128、129、130及び131)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１５ａ】図15aは、遺伝子13_9399(配列番号27)及びその変異体(配列番号27、132、133、134、135及び136)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１５ｂ】図15bは、遺伝子13_9399(配列番号27)及びその変異体(配列番号27、132、133、134、135及び136)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１６ａ】図16aは、遺伝子14_9399(配列番号29)及びその変異体(配列番号29、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146及び147)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１６ｂ】図16bは、遺伝子14_9399(配列番号29)及びその変異体(配列番号29、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146及び147)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１６ｃ】図16cは、遺伝子14_9399(配列番号29)及びその変異体(配列番号29、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146及び147)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１６ｄ】図16dは、遺伝子14_9399(配列番号29)及びその変異体(配列番号29、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146及び147)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１７ａ】図17aは、遺伝子15_9399(配列番号31)及びその変異体(配列番号31、148、149、150、151及び152)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１７ｂ】図17bは、遺伝子15_9399(配列番号31)及びその変異体(配列番号31、148、149、150、151及び152)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１８ａ】図18aは、遺伝子16_9399(配列番号33)及びその変異体(配列番号33、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162及び163)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１８ｂ】図18bは、遺伝子16_9399(配列番号33)及びその変異体(配列番号33、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162及び163)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１８ｃ】図18cは、遺伝子16_9399(配列番号33)及びその変異体(配列番号33、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162及び163)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１８ｄ】図18dは、遺伝子16_9399(配列番号33)及びその変異体(配列番号33、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162及び163)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１９ａ】図19aは、遺伝子17_9399(配列番号35)及びその変異体(配列番号35、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173及び174)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図１９ｂ】図19bは、遺伝子17_9399(配列番号35)及びその変異体(配列番号35、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173及び174)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２０ａ】図20aは、遺伝子18_9399(配列番号37)及びその変異体(配列番号37、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184及び185)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２０ｂ】図20bは、遺伝子18_9399(配列番号37)及びその変異体(配列番号37、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184及び185)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２０ｃ】図20cは、遺伝子18_9399(配列番号37)及びその変異体(配列番号37、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184及び185)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２０ｄ】図20dは、遺伝子18_9399(配列番号37)及びその変異体(配列番号37、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184及び185)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２１】図21は、遺伝子19_9399(配列番号39)及びその変異体(配列番号39、186、187、188、189及び190)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントを表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２２ａ】図22aは、遺伝子20_9399(配列番号41)及びその変異体(配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200及び201)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２２ｂ】図22bは、遺伝子20_9399(配列番号41)及びその変異体(配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200及び201)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２２ｃ】図22cは、遺伝子20_9399(配列番号41)及びその変異体(配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200及び201)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２２ｄ】図22dは、遺伝子20_9399(配列番号41)及びその変異体(配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200及び201)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２２ｅ】図22eは、遺伝子20_9399(配列番号41)及びその変異体(配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200及び201)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２２ｆ】図22fは、遺伝子20_9399(配列番号41)及びその変異体(配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200及び201)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２２ｇ】図22gは、遺伝子20_9399(配列番号41)及びその変異体(配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200及び201)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２２ｈ】図22hは、遺伝子20_9399(配列番号41)及びその変異体(配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200及び201)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２２ｉ】図22iは、遺伝子20_9399(配列番号41)及びその変異体(配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200及び201)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２２ｊ】図22jは、遺伝子20_9399(配列番号41)及びその変異体(配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200及び201)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２２ｋ】図22kは、遺伝子20_9399(配列番号41)及びその変異体(配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200及び201)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２２ｌ】図22lは、遺伝子20_9399(配列番号41)及びその変異体(配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200及び201)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２２ｍ】図22mは、遺伝子20_9399(配列番号41)及びその変異体(配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200及び201)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２２ｎ】図22nは、遺伝子20_9399(配列番号41)及びその変異体(配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200及び201)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２２ｏ】図22oは、遺伝子20_9399(配列番号41)及びその変異体(配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200及び201)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２２ｐ】図22pは、遺伝子20_9399(配列番号41)及びその変異体(配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200及び201)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２２ｑ】図22qは、遺伝子20_9399(配列番号41)及びその変異体(配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200及び201)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２２ｒ】図22rは、遺伝子20_9399(配列番号41)及びその変異体(配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200及び201)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２３】図23は、遺伝子21_9399(配列番号43)及びその変異体(配列番号43、202、203、204、205及び206)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントを表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２４】図24は、遺伝子22_9399(配列番号45)及びその変異体(配列番号45、207、208、209、210及び211)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントを表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２５ａ】図25aは、遺伝子23_9399(配列番号47)及びその変異体(配列番号47、212、213、214、215及び216)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２５ｂ】図25bは、遺伝子23_9399(配列番号47)及びその変異体(配列番号47、212、213、214、215及び216)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列アライメントの連続した部分を表す図である。アミノ酸は、図4(図4a〜4d)について記載されているように表され、名付けられている。
【図２６】図26は、実施例16に記載されるコルネキシスチン生産のタイムコースを描写する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
一般的定義
用語「コルネキシスチン」は、式(I)の化合物を意味する。
【化１】
0006420248.tif 000002
【００１４】
用語「コルネキシスチンの二塩基酸」は、式(II)の化合物及びこの化合物の塩、特に、式(II)の化合物の農学的に許容可能な塩を意味する。
【化２】
0006420248.tif 000003
【００１５】
用語「ヒドロキシコルネキシスチン」は、式(III)の化合物を意味する。
【化３】
0006420248.tif 000004
【００１６】
用語「ヒドロキシコルネキシスチンの二塩基酸」は、式(IV)の化合物及びこの化合物の塩、特に、式(IV)の化合物の農学的に許容可能な塩を意味する。
【化４】
0006420248.tif 000005
【００１７】
本明細書に記載される式I〜IVの化合物は、幾何異性体、例えばE/Z異性体を形成することができる。それらはまた、いくつかのキラル中心を有し、結果として、エナンチオマー又はジアステレオマーとして存在し得る。式II及びIVの化合物は、塩を形成することができる。したがって、用語「コルネキシスチン」、「コルネキシスチンの二塩基酸」、「ヒドロキシコルネキシスチン」及び「ヒドロキシコルネキシスチンの二塩基酸」はまた、広い意味では、異性体及びその混合物、並びに純粋なエナンチオマー及びジアステレオマー及びそれらの混合物、並びに式I〜IVの化合物の塩、好ましくは式I〜IVの化合物の農学的に許容可能な塩、より好ましくは式II及びIVの化合物の農学的に許容可能な塩を包含する。
【００１８】
用語「コルネキシスチン」、「コルネキシスチンの二塩基酸」、「ヒドロキシコルネキシスチン」及び「ヒドロキシコルネキシスチンの二塩基酸」の厳格な解釈において、これらの用語は、それぞれ式I〜IVに記載される化合物及びそれらの農学的に許容可能な塩を意味する。
【００１９】
用語「農学的に許容可能な塩」は、そのカチオン及びアニオンが、それぞれ、コルネキシスチンの二塩基酸、ヒドロキシコルネキシスチンの二塩基酸の除草活性に悪影響を有さない、好ましくは、コルネキシスチンの二塩基酸及びヒドロキシコルネキシスチンの二塩基酸の除草活性に悪影響を有さない、それらのカチオンの塩及びそれらの酸の酸付加塩を一般に意味するために本明細書で用いられる。
【００２０】
好ましいカチオンは、アルカリ金属の、好ましくはリチウム、ナトリウム及びカリウムのイオン、アルカリ土類金属の、好ましくはカルシウム及びマグネシウムのイオン、並びに遷移金属の、好ましくはマンガン、銅、亜鉛及び鉄のイオン、さらにアンモニウム、及び1〜4個の水素原子がC1〜C4-アルキル、ヒドロキシ-C1〜C4-アルキル、C1〜C4-アルコキシ-C1〜C4-アルキル、ヒドロキシ-C1〜C4-アルコキシ-C1〜C4-アルキル、フェニル若しくはベンジルによって置換されている置換アンモニウム、好ましくはアンモニウム、メチルアンモニウム、イソプロピルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、ジイソプロピルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、ヘプチルアンモニウム、ドデシルアンモニウム、テトラデシルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、2ヒドロキシエチル-アンモニウム(オラミン塩)、2-(2-ヒドロキシエト-1-オキシ)エト-1-イルアンモニウム(ジグリコールアミン塩)、ジ(2-ヒドロキシエト-1-イル)-アンモニウム(ジオラミン塩)、トリス(2-ヒドロキシエチル)アンモニウム(トロラミン塩)、トリス(2-ヒドロキシプロピル)アンモニウム、ベンジルトリメチルアンモニウム、ベンジルトリエチルアンモニウム、N,N,N-トリメチルエタノールアンモニウム(コリン塩)、さらにホスホニウムイオン、スルホニウムイオン、好ましくはトリ(C1〜C4-アルキル)スルホニウム、例えばトリメチルスルホニウム、及びスルホキソニウムイオン、好ましくはトリ(C1〜C4-アルキル)スルホキソニウム、並びに最後に多塩基性アミンの塩、例えばN,N-ビス-(3-アミノプロピル)メチルアミン及びジエチレントリアミンである。
【００２１】
有用な酸付加塩のアニオンは、主に、塩化物、臭化物、フッ化物、ヨウ化物、硫酸水素塩、硫酸メチル塩、硫酸塩、リン酸二水素塩、リン酸水素塩、硝酸塩、重炭酸塩、炭酸塩、ヘキサフルオロケイ酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、安息香酸塩、及びまた、C1〜C4-アルカン酸のアニオンであり、好ましくはギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩及び酪酸塩である。
【００２２】
用語「約」は、およそ、ほぼ、その前後、又はその辺りを意味するために本明細書で用いられる。用語「約」を数値範囲と組み合わせて用いる場合、それは記載の数値の上及び下に境界を拡張することによりその範囲を改変する。一般に、用語「約」は、記述された値の上及び下に数値を、20％、好ましくは15％、より好ましくは10％、最も好ましくは5％上又は下(高い又は低い)の差異で改変するために、本明細書で用いられる。
【００２３】
用語「ゲノム」又は「ゲノムDNA」は、宿主生物の遺伝性の遺伝情報を指す。前記ゲノムDNAは、核のDNA(染色体DNA)、染色体外DNA、及びオルガネラDNA(例えば、ミトコンドリアの)を含む、細胞又は生物の全遺伝的物質を含む。好ましくは、用語ゲノムまたはゲノムDNAは、核の染色体DNAを指す。
【００２４】
用語「染色体DNA」又は「染色体DNA配列」は、細胞周期状態とは独立した細胞核のゲノムDNAとして理解されるべきである。したがって、染色体DNAは、染色体又は染色分体に構造化されていてもよく、これらは凝縮されていてもよいし、又は非コイル状であってもよい。染色体DNA中への挿入を、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)分析、サザンブロット分析、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)、in situ PCR及び次世代シークエンシング(NGS)などの当技術分野で公知の種々の方法により実証及び分析することができる。
【００２５】
用語「プロモーター」は、mRNAを生成するために構造遺伝子の転写を指示するポリヌクレオチドを指す。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの近位の、遺伝子の5'領域に位置する。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写速度は、誘導物質に応答して増加する。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターである場合、転写速度は、誘導物質によって調節されない。
【００２６】
用語「エンハンサー」は、ポリヌクレオチドを指す。エンハンサーは、転写の開始部位に対するエンハンサーの距離又は方向にかかわらず、特定の遺伝子がmRNAに転写される効率を増加させることができる。通常、エンハンサーは、プロモーター、5'-非翻訳配列の近くに又はイントロン中に位置する。
【００２７】
ポリヌクレオチドは、別の種に由来する場合、又は同じ種に由来する場合には、その元の形態から改変されている場合、生物又は第二のポリヌクレオチドに対して「異種である」。例えば、異種コード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、プロモーターが由来した種とは異なる種に由来するコード配列、又は同じ種に由来する場合には、そのプロモーターと天然では関係がないコード配列(例えば、遺伝子操作されたコード配列又は異なる生態型若しくは種類に由来する対立遺伝子)を指す。
【００２８】
「導入遺伝子」、「トランスジェニック」又は「組換え」は、ヒトによって操作されたポリヌクレオチド又はヒトによって操作されたポリヌクレオチドのコピー若しくは相補鎖を指す。例えば、第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含むトランスジェニック発現カセットは、その発現カセットを含む単離された核酸のヒトによる操作(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989)又はCurrent Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc. (1994-1998)に記載される方法による)の結果として第二のポリヌクレオチドに対して異種であるプロモーターを含み得る。別の例では、組換え発現カセットは、ポリヌクレオチドが天然ではほとんど見られないように組み合わされたポリヌクレオチドを含み得る。例えば、ヒトによって操作された制限部位又はプラスミドベクター配列は、プロモーターに隣接し得るか、又は第二のポリヌクレオチドからプロモーターを分離し得る。当業者は、ポリヌクレオチドが多くの方法で操作され得ること及び上記の例に限定されないことを認識する。
【００２９】
用語「組換え」が、生物又は細胞、例えば微生物を特定するために用いられる場合、それは、生物又は細胞が、通常は後に特定される少なくとも1つの「導入遺伝子」、「トランスジェニック」又は「組換え」ポリヌクレオチドを含むことを表すために用いられる。
【００３０】
個体生物に対して「外因性である」ポリヌクレオチドは、性的交配以外の任意の手段によって生物に導入されるポリヌクレオチドである。
【００３１】
用語「作動可能な連結」又は「作動可能に連結された」は、遺伝的制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー又はターミネーターが、それに作動可能に連結されたポリヌクレオチド、例えばポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関してその機能を発揮することができる配置を意味することが一般に理解される。この関連において、機能は、例えば、核酸配列の発現、すなわち転写及び/又は翻訳の制御を意味し得る。この関連において、制御は、例えば、発現、すなわち転写及び適切な場合には翻訳を開始し、増加させ、支配し又は抑制することを包含する。次に、制御することは、例えば、組織及び/又は時間特異的であってよい。それはまた、例えば特定の化学物質、ストレス、病原体などにより、誘導性であってもよい。好ましくは、作動可能な連結は、例えば、核酸配列が発現される場合に調節エレメントのそれぞれがその機能を実行することができるような、プロモーターの、発現される核酸配列の、及び適切な場合にはさらなる調節エレメント、例えばターミネーターの、連続する配置を意味することが理解される。作動可能な連結は、化学的な意味における直接結合を必ずしも必要としない。遺伝的制御配列、例えばエンハンサー配列はまた、作動可能に連結されているポリヌクレオチドからある距離をおいた位置から標的配列にその機能を発揮することができる。好ましい配置は、2つの配列が互いに共有結合されるように、発現される核酸配列が、プロモーターとして作用する配列の後に位置する配置である。発現カセットにおけるプロモーターとアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとの距離は、好ましくは200塩基対未満、特に好ましくは100塩基対未満、極めて特に好ましくは50塩基対未満である。当業者は、そのような発現カセットを得るための様々な方法に精通している。しかし、発現カセットはまた、例えば相同組換えの手段によって又は他のランダム挿入によって、発現される核酸配列が、内在性遺伝的制御エレメント、例えば内在性プロモーターの制御下にもたらされるように構築されてもよい。そのようなコンストラクトは、本発明の目的のための発現カセットであると同様に理解される。
【００３２】
用語「発現カセット」は、発現されるアミノ酸配列をコードする核酸配列が、その発現(すなわち転写及び/若しくは翻訳)を可能にする又は調節する少なくとも1つの遺伝的制御エレメントに作動可能に連結されるコンストラクトを意味する。発現は、例えば安定的又は一過的、構成的又は誘導性であってよい。
【００３３】
用語「発現する」、「発現すること」、「発現された」及び「発現」は、コードされるこのタンパク質の生じる酵素活性、又はそれが指す経路若しくは反応が、この遺伝子/経路が発現される生物においてこの経路若しくは反応を通じた代謝フラックスを可能にするレベルでの、遺伝子産物(例えば、本出願に定義及び記載される経路又は反応の遺伝子の生合成酵素)の発現を指す。発現は、開始生物として使用される微生物の遺伝的変更によって行うことができる。いくつかの実施形態において、微生物は、開始微生物によって生産されるレベル又は変更されていない同等の微生物におけるレベルと比べて、増加したレベルで遺伝子産物を発現するように遺伝的に変更(例えば、遺伝子操作)することができる。遺伝的変更は、以下に限定されないが、特定の遺伝子の発現に関係がある調節配列又は部位を変更又は改変すること(例えば、強力なプロモーター、誘導性プロモーター若しくは複数のプロモーターを付加することによって、又は発現が構成的であるように調節配列を除去することによって)、特定の遺伝子の染色体位置を改変すること、特定の遺伝子に隣接する核酸配列、例えばリボソーム結合部位又は転写ターミネーターを変更すること、特定の遺伝子のコピー数を増加させること、特定の遺伝子の転写及び/又は特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質(例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーターなど)を改変すること、あるいは当技術分野のルーチンを使用して特定の遺伝子の発現を脱調節する任意の他の従来の手段(限定されないが、例えばリプレッサータンパク質の発現をブロックするためのアンチセンス核酸分子の使用を含む)を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態において、微生物は、変更されていない微生物における遺伝子産物の発現のレベルと比べて、増加した又は低下したレベルで遺伝子産物を発現するように物理的又は環境的に変更され得る。例えば、微生物は、転写及び/又は翻訳が増大するか又は増加するように、特定の遺伝子の転写及び/又は特定の遺伝子産物の翻訳を増加させることが知られているか、又は増加させることが推測される物質で処理され得る、あるいはその存在下で培養され得る。代替的に、微生物は、転写及び/又は翻訳が増大するか又は増加するように、特定の遺伝子の転写及び/又は特定の遺伝子産物の翻訳を増加させるために選択された温度で培養され得る。
【００３５】
用語「脱調節する」、「脱調節された」及び「脱調節」は、微生物における少なくとも1つの遺伝子の変更又は改変を指し、ここで、変更又は改変は、変更又は改変のない場合の生産と比べて、微生物における所与の化合物の生産の効率の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、変更又は改変される遺伝子は、微生物における生合成酵素のレベル又は活性が変更又は改変されるように、あるいは、輸送特異性又は効率が変更又は改変されるように、生合成経路における酵素又は輸送タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、生合成経路における酵素、すなわち生合成経路において特異的活性をもたらすポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子は、変更されていない又は野生型の遺伝子の存在下でのレベルと比べて、酵素のレベル又は活性が増大する又は増加するように、変更又は改変される。
【００３６】
脱調節はまた、例えば、フィードバック抵抗性であるか、又はより高い若しくはより低い特異的活性を有する酵素を生じさせるように、1つ以上の遺伝子のコード領域を変更することを含む。また、脱調節は、酵素又は輸送タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節する転写因子(例えば、アクチベーター、リプレッサー)をコードする遺伝子の遺伝的変更をさらに包含する。用語「脱調節する」、「脱調節された」及び「脱調節」は、存在する脱調節の種類に関してさらに特定され得る。
【００３７】
変更されていない又は野生型の遺伝子の存在下でのレベルと比べて、酵素のレベル又は活性が増大する又は増加するように、特定の活性が変更又は改変される場合、用語「上方調節された」が用いられる。変更されていない又は野生型の遺伝子の存在下でのレベルと比べて、酵素のレベル又は活性が低下する又は減少するように、特定の活性が変更又は改変される場合、用語「下方調節された」が用いられる。
【００３８】
用語「脱調節された」は、微生物の操作前に、又は操作されていない同等の微生物において発現したレベルより低い又は高いレベルでの遺伝子産物の発現を含む。一実施形態において、微生物は、微生物の操作前に、又は操作されていない同等の微生物において発現したレベルより低い又は高いレベルで遺伝子産物のレベルを発現するように遺伝子操作(例えば、遺伝子改変)することができる。遺伝子操作は、以下に限定されないが、特定の遺伝子の発現に関連する調節配列又は部位を変更又は改変すること(例えば、強力なプロモーター、誘導性プロモーター若しくは複数のプロモーターを除去することによって)、特定の遺伝子の染色体位置を改変すること、特定の遺伝子に隣接する核酸配列、例えばリボソーム結合部位又は転写ターミネーターを変更すること、特定の遺伝子のコピー数を減少させること、特定の遺伝子の転写及び/又は特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質(例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーターなど)を改変すること、あるいは当技術分野のルーチンを使用して特定の遺伝子の発現を脱調節する任意の他の従来の手段(限定されないが、アンチセンス核酸分子の使用、又は標的タンパク質の発現をノックアウト若しくはブロックする他の方法を含む)を含み得る。
【００３９】
用語「脱調節された遺伝子活性」はまた、例えば組換え遺伝子、例えば異種遺伝子を1つ以上のコピーにおいて微生物に、好ましくは遺伝子操作の手段によって導入することによって、遺伝子活性が微生物に導入されることを意味し、この場合、各遺伝子活性は、以前には観察されていなかったものである。
【００４０】
語句「脱調節された経路又は反応」は、少なくとも1つの生合成酵素のレベル又は活性が変更又は改変されるように、生合成経路又は反応における酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子が変更又は改変されている生合成経路又は反応を指す。語句「脱調節された経路」は、2つ以上の遺伝子が変更又は改変されており、それによって、対応する遺伝子産物/酵素のレベル及び/又は活性を変更する、生合成経路を含む。いくつかの場合において、微生物において経路を「脱調節する」(例えば、所与の生合成経路において2つ以上の遺伝子を同時に脱調節する)能力は、2つ以上の酵素(例えば、2つ又は3つの生合成酵素)が、「クラスター」又は「遺伝子クラスター」と称される遺伝物質の連続した部分において互いに隣接して存在する遺伝子によってコードされる、微生物の特定の現象から生じる。他の場合において、経路を脱調節するために、いくつかの遺伝子は、一連の連続的改変ステップにおいて脱調節されなければならない。
【００４１】
本発明による脱調節された遺伝子を発現させるために、ポリペプチドをコードするDNA配列は、発現ベクターにおいて転写発現を制御する調節配列に作動可能に連結され、次いで、いずれかの微生物に導入されなければならない。プロモーター及びエンハンサーなどの転写調節配列に加えて、発現ベクターは、翻訳調節配列、及び発現ベクターを保有する細胞の選択に適したマーカー遺伝子を含み得る。
【００４２】
用語「過剰発現する」、「過剰発現すること」、「過剰発現された」及び「過剰発現」は、遺伝子産物の発現、特に、開始微生物の遺伝的変更の前に存在したレベルより大きなレベルにおける遺伝子産物の発現の増大を指す。いくつかの実施形態において、微生物は、開始微生物によって生産されるレベルと比べて、増加したレベルにおいて遺伝子産物を発現するように遺伝的に変更(例えば、遺伝子操作)することができる。遺伝的変更は、以下に限定されないが、特定の遺伝子の発現に関係がある調節配列又は部位を変更又は改変すること(例えば、強力なプロモーター、誘導性プロモーター若しくは複数のプロモーターを付加することによって、又は発現が構成的であるように調節配列を除去することによって)、特定の遺伝子の染色体位置を改変すること、特定の遺伝子に隣接する核酸配列、例えばリボソーム結合部位又は転写ターミネーターを変更すること、特定の遺伝子のコピー数を増加させること、特定の遺伝子の転写及び/又は特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質(例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーターなど)を改変すること、あるいは当技術分野のルーチンを使用して特定の遺伝子の発現を脱調節する任意の他の従来の手段(限定されないが、例えばリプレッサータンパク質の発現をブロックするためのアンチセンス核酸分子の使用を含む)を含む。遺伝子産物を過剰発現するための別の方法は、その寿命を増加させるために遺伝子産物の安定性を増大させることである。
【００４３】
用語「ドメイン」は、進化的に関連のあるタンパク質の配列のアライメントに沿って特定の位置において保存されたアミノ酸のセットを指す。他の位置にあるアミノ酸はホモログの間で変化してもよいが、特定の位置において高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性又は機能において必須である可能性が高いアミノ酸を示す。タンパク質ホモログのファミリーのアライメントされた配列において、それらの高度な保存によって同定されると、それらは、問題となる任意のポリペプチドが以前に同定されたポリペプチドファミリーに属するかどうかを決定するための識別子として使用できる。
【００４４】
用語「モチーフ」又は「コンセンサス配列」又は「シグネチャー」は、進化的に関連のあるタンパク質の配列中の短い保存された領域を指す。モチーフは、ドメインの高い頻度で高度に保存された部分であるが、ドメインの部分のみを含んでもよく、又は保存されたドメインの外側に位置してもよい(モチーフのアミノ酸の全てが、既定のドメインの外側に収まる場合)。
【００４５】
専門的なデータベースがドメインの同定のために存在する、例えば、SMART(Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244)、InterPro(Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318)、Prosite(Bucher and Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004))又はPfam(Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002) & The Pfam protein families database: R.D. Finn, J. Mistry, J. Tate, P. Coggill, A. Heger, J.E. Pollington, O.L. Gavin, P. Gunesekaran, G. Ceric, K. Forslund, L. Holm, E.L. Sonnhammer, S.R. Eddy, A. Bateman Nucleic Acids Research (2010) Database Issue 38:D211-222)。タンパク質配列のin silico分析のためのツールのセットが、ExPASyプロテオミクスサーバー(Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003))において利用可能である。ドメイン又はモチーフはまた、配列アライメントなどの日常の技術を使用して同定してもよい。
【００４６】
比較のための配列アライメント方法は当技術分野において周知であり、このような方法は、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及びTFASTAを含む。GAPは、Needleman及びWunschのアルゴリズム((1970) J Mol Biol 48: 443-453)を使用し、一致数を最大にし、ギャップ数を最小にする、包括的な(すなわち、完全配列に及ぶ)2つの配列のアライメントを見出す。BLASTアルゴリズム(Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10)は、配列同一性パーセントを計算し、2つの配列の間の類似性の統計分析を実施する。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Centre for Biotechnology Information (NCBI)を介して公けに利用可能である。ホモログは、例えば、デフォルトペアワイズアライメントのパラメーター及びパーセンテージでのスコア付け方法を用いたClustalW多重配列アライメントアルゴリズム(バージョン1.83)を使用して容易に同定し得る。類似性及び同一性の包括的パーセンテージはまた、MatGATソフトウェアパッケージ(Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10;4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.)において利用可能な方法の1つを使用して決定してもよい。わずかな手作業の編集は、保存モチーフ間のアライメントを最適化するために行ってよく、このことは当業者には明らかである。さらに、ホモログの同定のために全長配列を使用する代わりに、特定のドメインを使用してもよい。配列同一性の値は、全核酸若しくはアミノ酸配列にわたって、又は選択されたドメイン若しくは保存モチーフ(複数可)にわたって、デフォルトパラメーターを用いた上述のプログラムを使用して決定してよい。局所的アライメントに関しては、Smith-Watermanのアルゴリズムが特に有用である(Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1);195-7)。
【００４７】
典型的には、これは、任意の配列データベース、例えば公けに利用可能なNCBIデータベースに対してクエリー配列をBLASTすることを含む、第一のBLASTを含む。BLASTN又はTBLASTX(標準デフォルト値を用いた)は、ヌクレオチド配列から開始する場合に一般に使用され、BLASTP又はTBLASTN(標準デフォルト値を用いた)は、タンパク質配列から開始する場合に一般に使用される。BLAST結果は、場合によりフィルターをかけてもよい。次いで、フィルターをかけた結果又はフィルターをかけていない結果のいずれかの全長配列は、クエリー配列が由来する生物に由来する配列に対してBLASTバックされる(第二のBLAST)。次いで、第一及び第二のBLASTの結果は比較される。第一のBLASTからの高位のヒットが、クエリー配列が由来するものと同じ種に由来する場合に、パラログが同定され、次いで、BLASTバックが、理想的には、最も高いヒットの中でクエリー配列をもたらす; 第一のBLASTにおける高位のヒットが、クエリー配列が由来するものと同じ種に由来しない場合に、オルソログが同定され、好ましくは、BLASTバックの際に、最も高いヒットの中にあるクエリー配列をもたらす。
【００４８】
高位のヒットは低いE値を有するものである。E値が低いほど、スコアはより有意となる(又は言い換えると、ヒットが偶然に見出された可能性が低くなる)。E値の計算は、当技術分野で周知である。E値に加えて、比較はまた、同一性パーセンテージによってスコア付けされる。同一性パーセンテージは、特定の長さにわたって2つの比較される核酸(又はポリペプチド)配列間で同一であるヌクレオチド(又はアミノ酸)の数を指す。大きなファミリーの場合、ClustalWと、続く近隣結合系統樹を用いて、関連遺伝子のクラスタリングを可視化するのを助け、オルソログ及びパラログを同定してもよい。
【００４９】
2つの核酸配列間の「配列同一性」という用語は、以下のパラメーター:
ギャップウェイト: 12  長さウェイト: 4
平均マッチ: 2.912  平均ミスマッチ:-2.003
を設定するプログラムアルゴリズムGAP(Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA)を用いたアライメントによって計算される、各場合における全配列長にわたる核酸配列の同一性パーセントを意味すると理解される。
【００５０】
2つのアミノ酸配列間の「配列同一性」という用語は、以下のパラメーター:
ギャップウェイト: 8  長さウェイト: 2
平均マッチ: 2.912  平均ミスマッチ:-2.003
を設定するプログラムアルゴリズムGAP(Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA)を用いたアライメントによって計算される、各場合における全配列長にわたる核酸配列の同一性パーセントを意味すると理解される。
【００５１】
用語「ハイブリダイゼーション」は、本明細書で定義される場合、実質的に相同な相補的ヌクレオチド配列が互いにアニールするプロセスである。ハイブリダイゼーションプロセスは完全に溶液中で生じることができ、すなわち、両方の相補的核酸は溶液中にある。ハイブリダイゼーションプロセスはまた、相補的核酸の一方が、マトリックス、例えば磁気ビーズ、セファロースビーズ又は任意の他の樹脂に固定されて生じることができる。ハイブリダイゼーションプロセスは、相補的核酸の一方が、固体支持体、例えばニトロセルロース若しくはナイロンメンブレンに固定されて、又は例えばフォトリソグラフィーによって、例えばシリカのガラス支持体に固定されてさらに生じることができる(後者は、核酸アレイ若しくはマイクロアレイとして又は核酸チップとして知られている)。ハイブリダイゼーションを生じさせるために、核酸分子は、一般に、二本鎖を2本の一本鎖に溶解させるため及び/又は一本鎖核酸からヘアピン若しくは他の二次構造を除去するために熱的又は化学的に変性される。
【００５２】
用語「ストリンジェンシー」は、その下でハイブリダイゼーションが起こる条件を指す。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、塩濃度、イオン強度及びハイブリダイゼーションバッファー組成などの条件によって影響を受ける。一般に、低ストリンジェンシー条件は、規定のイオン強度及びpHにおいて特定の配列に対する熱融点(Tm)より約30℃低いように選択される。中ストリンジェンシー条件は、温度がTmより20℃低い場合であり、高ストリンジェンシー条件は、温度がTmより10℃低い場合である。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、典型的には、標的核酸配列に対して高い配列類似性を有するハイブリダイズする配列を単離するために使用される。しかし、核酸は、遺伝コードの縮重のため、配列において相違し、依然として実質的に同一のポリペプチドをコードし得る。したがって、中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、そのような核酸分子を同定するために時々必要とされ得る。
【００５３】
Tmは、規定のイオン強度及びpH下で、標的配列の50％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。Tmは、溶液条件及び塩基組成及びプローブ長に依存する。例えば、より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。最大ハイブリダイゼーション速度は、Tmより約16℃から最大32℃低い場合に得られる。ハイブリダイゼーション溶液中の一価カチオンの存在は、2本の核酸鎖の間の静電反発力を低減し、それによってハイブリッド形成を促進する; この効果は、最大0.4Mまでのナトリウム濃度について見られる(より高い濃度については、この効果は無視され得る)。ホルムアミドは、各ホルムアミドパーセントについて0.6〜0.7℃、DNA-DNA及びDNA-RNA二重鎖の融点を低減し、50％ホルムアミドの添加は、ハイブリダイゼーションを30〜45℃において実施することを可能にするが、ハイブリダイゼーション速度は低下する。塩基対ミスマッチはハイブリダイゼーション速度及び二重鎖の熱安定性を低減する。平均して及び長いプローブについて、Tmは塩基ミスマッチ1％あたり約1℃低下する。Tmは、ハイブリッドの種類に応じて、以下の方程式を用いて計算し得る:
【００５４】
(1) DNA-DNAハイブリッド(Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984):
Tm= 81.5℃ + 16.6xlog10[Na+]a + 0.41x％[G/Cb] - 500x[Lc]-1 - 0.61x％ホルムアミド
【００５５】
(2) DNA-RNA又はRNA-RNAハイブリッド:
Tm= 79.8℃+ 18.5 (log10[Na+]a) + 0.58 (％G/Cb) + 11.8 (％G/Cb)2 - 820/Lc
【００５６】
(3) オリゴ-DNA又はオリゴ-RNAdハイブリッド:
<20ヌクレオチドについて: Tm= 2 (ln)
20〜35ヌクレオチドについて: Tm= 22 + 1.46 (ln)
【００５７】
a又は他の一価カチオンについて、0.01〜0.4M範囲においてのみ正確である。
b30％〜75％範囲における％GCについてのみ正確である。
cL = 塩基対における二重鎖の長さ。
dオリゴ、オリゴヌクレオチド; ln = プライマーの有効長 = 2×(G/Cの数)+(A/Tの数)。
【００５８】
非特異的結合は、いくつかの公知技術、例えばタンパク質含有溶液によるメンブレンのブロッキング、ハイブリダイゼーションバッファーへの異種RNA、DNA及びSDSの添加、並びにRnaseによる処理、のいずれか1つを用いて制御し得る。非相同プローブについて、一連のハイブリダイゼーションは、(i)アニーリング温度を徐々に低下させること(例えば68℃から42℃へ)、又は(ii)ホルムアミド濃度を徐々に低下させること(例えば50％から0％へ)の1つを変えることによって実施し得る。当業者は、ハイブリダイゼーション中に変更してよく、かつ、ストリンジェンシー条件を維持若しくは変化させる様々なパラメーターを認識している。
【００５９】
ハイブリダイゼーション条件に加えて、ハイブリダイゼーションの特異性はまた、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の作用に依存する。非特異的ハイブリダイゼーションから生じるバックグラウンドを除去するために、サンプルは、希釈塩溶液で洗浄される。そのような洗浄の重要な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度及び温度を含む: 塩濃度が低いほどそして洗浄温度が高いほど、洗浄のストリンジェンシーは高くなる。洗浄条件は、典型的には、ハイブリダイゼーションストリンジェンシー以下で実施される。陽性ハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも2倍であるシグナルを与える。一般に、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ又は遺伝子増幅検出法に適したストリンジェント条件は、上に記載されるとおりである。より高い又は低いストリンジェント条件を選択してもよい。当業者は、洗浄中に変更してよく、かつ、ストリンジェンシー条件を維持若しくは変化させる様々なパラメーターを認識している。
【００６０】
例えば、50ヌクレオチドより長いDNAハイブリッドについての典型的な高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、1×SSC中65℃での、又は1×SSC及び50％ホルムアミド中42℃でのハイブリダイゼーションと、続く0.3×SSC中65℃での洗浄を包含する。50ヌクレオチドより長いDNAハイブリッドについての中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は、4×SSC中50℃での、又は6×SSC及び50％ホルムアミド中40℃でのハイブリダイゼーションと、続く2×SSC中50℃での洗浄を包含する。ハイブリッドの長さは、ハイブリダイズする核酸について想定される長さである。公知の配列の核酸がハイブリダイズされる場合、ハイブリッドの長さは、配列をアライメントして、本明細書に記載される保存された領域を同定することによって決定してよい。1×SSCは、0.15M NaCl及び15mMクエン酸ナトリウムであり、ハイブリダイゼーション溶液及び洗浄溶液は、5×デンハルト試薬、0.5〜1.0％SDS、100μg/mlの変性して断片化したサケ精子DNA、0.5％ピロリン酸ナトリウムをさらに含んでもよい。
【００６１】
ストリンジェンシーのレベルを定義する目的で、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rdEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York又はCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 and yearly updates)への参照がなされ得る。
【００６２】
タンパク質の「ホモログ」は、問題になっている非改変タンパク質に対してアミノ酸置換、欠失及び/若しくは挿入を有し、かつ、それらが由来する非改変タンパク質と類似した生物学的及び機能的活性を有するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素を包含する。
【００６３】
欠失は、タンパク質からの1つ以上のアミノ酸の除去を指す。
【００６４】
挿入は、タンパク質におけるあらかじめ定められた部位に導入される1つ以上のアミノ酸残基を指す。挿入は、N末端及び/若しくはC末端融合、並びに単一若しくは複数アミノ酸の配列内挿入を含み得る。一般に、アミノ酸配列内の挿入は、N末端又はC末端融合より小さく、約1〜10残基のものである。N又はC末端融合タンパク質若しくはペプチドの例としては、酵母2-ハイブリッドシステムにおいて使用される転写アクチベーターの結合ドメイン若しくは活性化ドメイン、ファージコートタンパク質、(ヒスチジン)-6-タグ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ-タグ、プロテインA、マルトース結合タンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、タグ?100エピトープ、c-mycエピトープ、FLAG(登録商標)-エピトープ、lacZ、CMP(カルモジュリン結合ペプチド)、HAエピトープ、プロテインCエピトープ及びVSVエピトープが挙げられる。
【００６５】
置換は、タンパク質のアミノ酸を、類似の特性(例えば、類似の疎水性、親水性、抗原性、αヘリックス構造若しくはβシート構造を形成又は破壊する傾向)を有する他のアミノ酸と置き換えることを指す。アミノ酸置換は、典型的には単一残基であるが、ポリペプチドにある機能的制約に応じてクラスター化されてもよく、1〜10個のアミノ酸に及んでもよい。挿入は、通常、約1〜10個のアミノ酸残基のものである。アミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換である。保存的置換表は、当技術分野で周知である(例えば、Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company (Eds)及び以下の表1を参照)。
【００６６】
【表１】
0006420248.tif 000006
【００６７】
本明細書における「内在性」遺伝子への言及は、天然の形態にある(すなわち、いずれのヒトの介在もない)生物に見出される、問題になっている遺伝子に対して言及するだけでなく、後に微生物に(再)導入される単離された形態にある、その同じ遺伝子(又は実質的に相同な核酸/遺伝子)(導入遺伝子)に対しても言及する。例えば、そのような導入遺伝子を含有するトランスジェニック微生物は、導入遺伝子発現の実質的な低減及び/又は内在性遺伝子の発現の実質的な低減に直面し得る。単離された遺伝子は、生物から単離されてもよく、又は例えば化学合成によって、ヒトが作り出したものであってもよい。
【００６８】
用語「オルソログ」及び「パラログ」は、遺伝子の祖先の関係を記述するために用いられる進化的概念を包含する。パラログは、祖先遺伝子の重複を通して生じた同じ種内の遺伝子であり、オルソログは、種分化を通じて生じた異なる生物に由来する遺伝子であり、また、共通の祖先遺伝子に由来する。
【００６９】
用語「スプライス変異体」は、本明細書で用いられる場合、選択されたイントロン及び/若しくはエキソンが切り出され、置き換えられ、移動させられ若しくは付加された、又はイントロンが短縮若しくは伸長された核酸配列の変異体を包含する。そのような変異体は、タンパク質の生物学的活性が実質的に保持されている変異体である; これは、タンパク質の機能的セグメントを選択的に保持することによって達成し得る。そのようなスプライス変異体は、天然に見出し得るか、又はヒトが作り出したものであり得る。そのようなスプライス変異体を予測し単離する方法は、当技術分野で周知である(例えば、Foissac and Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25を参照)。
【００７０】
用語「ベクター」は、好ましくは、ファージ、プラスミド、フォスミド、ウイルスベクター、及び人工染色体、例えば細菌若しくは酵母の人工染色体を包含する。さらに、その用語はまた、ゲノムDNAへの標的化コンストラクトのランダムな又は部位特異的な組み込みを可能にする標的化コンストラクトに関する。そのような標的コンストラクトは、好ましくは、以下に詳細に記載されるように相同組換え又は異種組換えのいずれかについて十分な長さのDNAを含む。本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、好ましくは、組換え微生物における増殖及び/又は選択のための選択可能マーカーをさらに含む。ベクターは、当技術分野で周知の様々な技術によって組換え微生物に組み込んでよい。組換え微生物に導入された場合、ベクターは、細胞質に存在し得るか、又はゲノムに組み込まれ得る。後者の場合、ベクターは、相同組換え又は異種挿入を可能にする核酸配列をさらに含み得ることが理解される。ベクターは、従来の形質転換又はトランスフェクション技術を介して原核又は真核細胞に導入することができる。用語「形質転換」及び「トランスフェクション」、コンジュゲーション並びに形質導入は、この関連で用いられる場合、組換え微生物に外来核酸(例えばDNA)を導入するための先行技術の方法、例えばリン酸カルシウム、塩化ルビジウム若しくは塩化カルシウム共沈殿、DEAE-デキストラン-媒介トランスフェクション、リポフェクション、ナチュラルコンピテンス(natural competence)、炭素系クラスター、化学的に媒介される導入、エレクトロポレーション又は粒子ボンバードメント、の複数を含むことが意図される。微生物の多くの種についての方法が文献において、例えば、Turgeon (2010) Molecular and cell biology methods for fungi, p3-9において、Koushki, MM et al., (2011), AFRICAN JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY  Vol.10 (41): p7939-7948において、Coyle et al. (2010) Appl Environ Microbiol 76:3898-3903において、Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 13. Eds Ausubel F.M. et al. Wiley & Sons, U.K. において、及びGenome Analysis: A Laboratory Manual, Cloning Systems. Volume 3. Edited by Birren B, Green ED, Klapholz S, Myers RM, Riethman H, Roskams J. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1999:297-565において容易に利用可能である。
【００７１】
好ましい実施形態の詳細な説明
第一の態様において、本発明は、コルネキシスチン及び/又はヒドロキシコルネキシスチン合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。本明細書で用いられる場合、コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン合成は、コルネキシスチン及び/又はヒドロキシコルネキシスチンの生合成の全てのステップを包含する。したがって、コルネキシスチン及び/又はヒドロキシコルネキシスチンの合成に関与するポリペプチドは、基質をコルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンに変換し得るか、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン生合成において生じる前駆体のいずれかを生産し得る。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、生物、好ましくは、本明細書の他の箇所で特定される組換え微生物において発現すると、コルネキシスチン及び/若しくはヒドロキシコルネキシスチン又はそれらの前駆体の量を増加させることができる。そのような増加は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドの発現を欠く対照生物と比較した場合、統計的に有意である。好ましくは、対照生物は、同じ種であり、さらにより好ましくは、組換え微生物を構築するために使用された同じ株に属する。増加が有意であるかどうかは、例えばスチューデントのt検定などの当技術分野で周知の統計学的検定によって決定できる。より好ましくは、増加は、前記対照と比較した、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％又は少なくとも30％のコルネキシスチン及び/又はヒドロキシコルネキシスチンの量の増加である。コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンを同定し、それらの量を測定するための好適なアッセイは、当業者によって知られており、例えば、US4897104、US4990178、US5424278に、及び添付の実施例に記載される。
【００７２】
本発明によって提供される1つの核酸配列は、コルネキシスチン及び/又はヒドロキシコルネキシスチン合成に関与するポリペプチドについての発現カセットを含む、配列番号1によって記載される遺伝子クラスターである。遺伝子クラスターの概略図は図1に提供される。 
【００７３】
【表２】
0006420248.tif 000007
【００７４】
表2は、ポリペプチド(タンパク質)をコードする配列番号1の配列、各ORF名、ポリペプチドをコードする配列の開始及び終了点である配列番号1におけるヌクレオチドの番号、コードされるポリペプチドの推定機能、並びに配列表におけるポリヌクレオチド及びアミノ酸配列の各配列番号のリストを提供する。
【００７５】
提供されるポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチドは、それらの天然のゲノム環境から単離され、単離後に改変され、又は純粋な配列情報から人工的に生産され得る。本発明のポリヌクレオチドの天然供給源は、コルネキシスチン又はヒドロキシコルネキシスチンを生産する真菌並びに関連種である。そのような真菌は、例えば、ペシロマイセス属(genus Paecilomyces)、ビソクラミス属(genus Byssochlamys)、サーモアスカス属(genus Thermoascus)及びモナスカス属(genus Monascus)、例えば、種、ビソクラミス・ベルコサ、ビソクラミス・ニベア(Byssochlamys nivea)、ペシロマイセス・ディバリカタス、ペシロマイセス・バリオッティ、サーモアスカス・クルスタセウス(Thermoascus crustaceus)、サーモアスカス・サーモフィラス(Thermoascus thermophilus)及びサーモアスカス・オーランティアカス(Thermoascus aurantiacus)、からなる群において見出すことができる。特に興味があるのは、種: ペシロマイセス・ディバリカタス及びビソクラミス・ベルコサの真菌である。これらの種の菌株は、例えばCBS真菌生物多様性センター(CBS Fungal Biodiversity Centre)に、オーストラリアにおいて単離されたビソクラミス・ベルコサCBS 605.74、米国において単離されたペシロマイセス・ディバリカタスCBS 284.48、及びメキシコにおいて単離されたペシロマイセス・ディバリカタスCBS 110429として寄託される。ペシロマイセス・バリオッティの最も好ましい菌株は、日本国通商産業省の受託番号FERM BP-1351の下で寄託され、そしてアメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)にアクセッション番号ATTC 74268の下で寄託されており、両者は、カナダにおいて集められたシカの糞から単離されたペシロマイセス・バリオッティ・バイニエル(Paecilomyces variotii Bainier)SANK 21086に由来する。
【００７６】
好適な生物の選択についてのさらなる情報は、例えば、Mutsuo Nakajima et al.; CORNEXISTIN: A NEW FUNGAL METABOLITE WITH HERBICIDAL ACTIVITY; THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS, VOL.44 NO. 10, 1991: page 1065-1072において、US4897104、US4990178、US5424278において、及びR.A. Samson et al. "Polyphasic taxonomy of the heat resistant ascomycete genus Byssochlamys and its Paecilomyces anamorphs" Persoonia 22, 2009: pages 14-27において見出すことができる。
【００７７】
上に記載される天然供給源から単離されたポリヌクレオチドの配列情報は、配列番号1に含まれる遺伝子、プロモーター及びターミネーター配列の相同なポリヌクレオチド及び対立遺伝子変異体若しくはスプライス変異体、並びに配列番号1の相同なポリヌクレオチド及び対立遺伝子変異体を単離するために使用することができる。開示されたポリヌクレオチドのさらなる変異体は、コードされたポリヌクレオチドの発現を微生物の好ましい種若しくは培養条件に適合させるために、例えば、ポリペプチドをコードする核酸配列のコドン使用を微生物の好ましい種のコドン使用に適合させることによって、あるいは発現カセットのプロモーター領域及び/若しくはターミネーター領域又は両方を交換することによって、構築することができる。
【００７８】
本発明のポリヌクレオチドのさらなる変異体は、ポリヌクレオチドから1つ以上のポリヌクレオチドを付加、欠失させることによって、例えば、発現カセット間のスペーサー領域を短くすることによって、イントロンを取り除くことによって、あるいはポリペプチドコード領域の1つ以上のコドン、又はポリヌクレオチドの完全な機能的エレメント、例えば完全なプロモーター、ターミネーター若しくはポリペプチドコード領域若しくは完全な発現カセットを取り除くことによって、作製することができる。あるいは、又はそれに加えて、例えば、保存されたアミノ酸置換を導入することによって、あるいはコードされたポリペプチドを大きく若しくは短くするため又はポリペプチド融合体を作製するために、1つ以上のコドンを付加若しくは欠失させることによって、コードされたポリペプチド配列の変異体を作製することができる。好ましいポリペプチド融合体は、発現をモニターするためのポリペプチド(例えば、緑、黄、青若しくは赤色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼなど)、又は検出可能マーカーとして若しくは精製目的のための補助手段として機能し得るいわゆる「タグ」を含む。様々な目的のためのタグが当技術分野において周知であり、FLAG-タグ、6-ヒスチジン-タグ、MYC-タグなどを含む。
【００７９】
変異体核酸配列は、コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン合成に関与するポリペプチドを依然としてコードする。したがって、配列長における変異体によってコードされるポリペプチドは、前記生物学的活性をもたらす本発明のポリペプチドのドメインを含んでよく、又はそれからなってよい。
【００８０】
配列同一性及び配列長における変異体はまた、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前述の特異的核酸配列にハイブリダイズすることができる核酸配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００８１】
あるいは、ポリヌクレオチド変異体は、PCRに基づく技術、例えば、混合オリゴヌクレオチドプライマーに基づくDNAの増幅によって、すなわち、本発明のポリペプチドの保存された領域に対する縮重プライマーを用いて、得ることができる。本発明のポリペプチドの保存された領域は、ポリヌクレオチドの核酸配列又は本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の配列比較によって同定し得る。PCRプライマーとして好適なオリゴヌクレオチド及び好適なPCR条件は、添付の実施例に記載されている。鋳型として、細菌、真菌、植物又は動物由来のDNA又はcDNAは使用してよい。
【００８２】
したがって、本明細書及び配列表に開示されるポリヌクレオチド及びアミノ酸配列情報は、本明細書に開示される核酸配列及びアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む、配列同一性及び配列長における変異体を同定又は作製するために使用することができるか、あるいは本明細書に開示される各核酸配列又はアミノ酸配列の配列長の少なくとも 80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％を有する核酸配列又はアミノ酸配列を含む配列変異体を同定又は作製するために使用することができる。上記の配列同一性又は配列長における変異体は、例えば、各変異体に対して最も高い配列同一性を有する、配列番号1〜47、又は配列番号59〜223、又は配列番号236、237若しくは238の配列によって記載される配列に対して、11個未満、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個のアミノ酸又はヌクレオチドにおいてのみ異なってよい。差異は、アミノ酸配列の場合には好ましくは保存的アミノ酸置換、アミノ酸挿入又はアミノ酸のN若しくはC末端付加に起因し、核酸配列の場合には、サイレント突然変異又はコドン最適化に好ましくは起因する。
【００８３】
上記の配列同一性における変異体は、好ましくは、配列番号3、5、7、9、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、89、105、121、142、158、169、180、196の少なくとも1つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドによって示される活性のかなりの程度、好ましくは、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％又は少なくとも90％を保持するポリペプチドをコードする。活性は、添付の実施例に記載されるように、あるいは、同じ活性を有する又は同じ活性を有するポリペプチドをコードするペシロマイセス・ディバリカタスにおけるポリヌクレオチドを、配列同一性又は配列長における各変異体と置換し、組換えペシロマイセス・ディバリカタス細胞を、コルネキシスチン、ヒドロキシコルネキシスチン又は両方の生産を可能にする条件下で培養し、そしてコルネキシスチン、ヒドロキシコルネキシスチン又は両方の量を、同じ条件下で培養された非組換えペシロマイセス・ディバリカタスによって生産されたコルネキシスチン、ヒドロキシコルネキシスチン又は両方の量と比較することによって、試験し得る。好ましくはコルネキシスチンの量は、コルネキシスチン生合成に関与するポリペプチドについて比較され、一方、ヒドロキシコルネキシスチンの量は、ヒドロキシコルネキシスチン生合成に関与するポリペプチドについて比較される。コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン生合成に関与するポリペプチドの活性は、生産されたコルネキシスチンの量、又は好ましくは生産されたコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの総量を比較することによって測定される。
【００８４】
したがって、本発明は、
配列番号1に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列を含むか、又は配列番号1に示される核酸配列の配列長の少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％を有する、組換えポリヌクレオチド、並びに、
配列番号1のヌクレオチド1001〜ヌクレオチド57525の配列によって示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列を含むか、又は配列番号1のヌクレオチド1001〜ヌクレオチド57525の配列によって示される核酸配列の配列長の少なくとも 80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％を有する、ポリヌクレオチド、並びに
配列番号1のヌクレオチド12423〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列を含むか、又は配列番号1のヌクレオチド12423〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列の配列長の少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％を有する、ポリヌクレオチド、並びに
配列番号1のヌクレオチド7505〜ヌクレオチド55295の配列によって示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列を含むか、又は配列番号1のヌクレオチド7505〜ヌクレオチド55295の配列によって示される核酸配列の配列長の少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％を有する、ポリヌクレオチド、並びに
配列番号1のヌクレオチド18123〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列を含むか、又は配列番号1のヌクレオチド18123〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列の配列長の少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％を有する、ポリヌクレオチド
を包含する。
【００８５】
本発明によって提供されるさらなる組換えポリヌクレオチドは、
配列番号2に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチド、
配列番号4に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド、
配列番号6に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド、
配列番号8に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド、
配列番号12に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド、
配列番号14に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド、
配列番号16に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド、
配列番号18に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド、
配列番号20に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド、
配列番号22に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド、
配列番号24に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド、
配列番号26に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド、
配列番号28に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド、
配列番号30に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド、
配列番号32に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド、
配列番号34に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド、
配列番号36に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド、
配列番号38に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド、
配列番号40に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド、
配列番号42に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド、
配列番号44に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド、並びに
配列番号46に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド
である。
【００８６】
本発明によって提供される他の組換えポリヌクレオチドは、配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【００８７】
配列番号3と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号3のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号3、59、60、61、62及び63によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００８８】
配列番号3、59、60、61、62、63によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号3、59、60、61、62及び/若しくは63と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【００８９】
表3は、配列番号3、59、60、61、62及び63のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【００９０】
【表３】
0006420248.tif 000008
【００９１】
本発明によって提供されるさらなる組換えポリヌクレオチドは、配列番号5に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【００９２】
配列番号5と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号5のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号5、64、65、66、67及び68によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００９３】
配列番号5、64、65、66、67、68によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号5、64、65、66、67及び/若しくは68と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【００９４】
表4は、配列番号5、64、65、66、67及び68のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【００９５】
【表４】
0006420248.tif 000009
【００９６】
本発明によって提供される追加的組換えポリヌクレオチドは、配列番号7に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【００９７】
配列番号7と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号7のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号7、69、70、71、72及び73によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００９８】
配列番号7、69、70、71、72、73によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号7、69、70、71、72及び/若しくは73と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【００９９】
表5は、配列番号5、64、65、66、67及び68のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【０１００】
【表５】
0006420248.tif 000010
【０１０１】
本発明によって提供されるさらなる組換えポリヌクレオチドは、配列番号9に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【０１０２】
配列番号9と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号9のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号9、74、75、76、77及び78によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１０３】
配列番号9、74、75、76、77、78によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号9、74、75、76、77及び/若しくは78と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【０１０４】
表6は、配列番号9、74、75、76、77及び78のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【０１０５】
【表６】
0006420248.tif 000011
【０１０６】
本発明によって提供される他の組換えポリヌクレオチドは、配列番号13に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【０１０７】
配列番号13と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号13のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号13、79、80、81、82及び83によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１０８】
配列番号13、79、80、81、82、83によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号13、79、80、81、82及び/若しくは83と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【０１０９】
表7は、配列番号13、79、80、81、82及び83のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【０１１０】
【表７】
0006420248.tif 000012
【０１１１】
本発明によって提供される追加的組換えポリヌクレオチドは、配列番号15に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【０１１２】
配列番号15と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号15のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号15、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93及び94によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１１３】
配列番号15、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号15、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93及び/若しくは94、好ましくは15若しくは89と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【０１１４】
表8は、配列番号15、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93及び94のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【０１１５】
【表８】
0006420248.tif 000013
【０１１６】
本発明によって提供されるさらなる組換えポリヌクレオチドは、配列番号17に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【０１１７】
配列番号17と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号17のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号17、95、96、97、98及び99によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１１８】
配列番号17、95、96、97、98、99によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号17、95、96、97、98及び/若しくは99と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【０１１９】
表9は、配列番号17、95、96、97、98及び99のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【０１２０】
【表９】
0006420248.tif 000014
【０１２１】
本発明によって提供されるさらなる組換えポリヌクレオチドは、配列番号19に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【０１２２】
配列番号19と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号19のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号19、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109及び110によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１２３】
配列番号19、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号19、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109及び/若しくは110、好ましくは105、106、107、108、109及び/若しくは110、より好ましくは105と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【０１２４】
表10は、配列番号19、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【０１２５】
【表１０】
0006420248.tif 000015
【０１２６】
本発明によって提供される他の組換えポリヌクレオチドは、配列番号21に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【０１２７】
配列番号21と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号21のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号21、111、112、113、114及び115によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１２８】
配列番号21、111、112、113、114、115によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号21、111、112、113、114及び/若しくは115と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【０１２９】
表11は、配列番号21、111、112、113、114及び115のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【０１３０】
【表１１】
0006420248.tif 000016
【０１３１】
本発明によって提供されるさらなる組換えポリヌクレオチドは、配列番号23に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【０１３２】
配列番号23と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号23のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号23、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125及び126によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１３３】
配列番号23、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号23、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125及び/若しくは126、好ましくは121、122、123、124、125及び/若しくは126、より好ましくは121と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【０１３４】
表12は、配列番号23、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125及び126のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【０１３５】
【表１２】
0006420248.tif 000017
【０１３６】
本発明によって提供される追加的組換えポリヌクレオチドは、配列番号25に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【０１３７】
配列番号25と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号25のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号25、127、128、129、130及び131によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１３８】
配列番号25、127、128、129、130、131によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号25、127、128、129、130及び/若しくは131と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。配列番号25の変異体は、好ましくは、図14aに描写される6個の保存されたシステインを含む。それらは、2個の亜鉛イオンの錯体形成及びZn2C6ジンクフィンガーDNA結合領域の正確なフォールディングに必要である。N末端から数えて2番目と3番目のシステインの間に存在する塩基性アミノ酸は、好ましくは保存されている。非保存的突然変異が、しばしば、このDNA結合ドメインのDNA結合能を無効にするからである。3番目と4番目のシステインの間の領域は可変サブ領域を表し、この可変サブ領域における保存的突然変異は、通常、ほとんど影響を示さない。この領域は、4番目のシステインの前にプロリンを含む。このプロリンは、正確なフォールディングに必要な、アミノ酸鎖の回転を支持すると考えられている。しかし、このプロリンは、絶対的に必要ではなく、多くの場合、特にさらなるプロリンがこの領域に導入されている場合、例えば、ロイシン、グルタミン、又はアルギニンと置き換えることができる。
【０１３９】
表13は、配列番号25、127、128、129、130及び131のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【０１４０】
【表１３】
0006420248.tif 000018
【０１４１】
本発明によって提供されるさらなる組換えポリヌクレオチドは、配列番号27に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【０１４２】
配列番号27と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号27のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号27、132、133、134、135及び136によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１４３】
配列番号27、132、133、134、135、136によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号27、132、133、134、135及び/若しくは136と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【０１４４】
表14は、配列番号27、132、133、134、135及び136のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【０１４５】
【表１４】
0006420248.tif 000019
【０１４６】
本発明によって提供されるさらなる組換えポリヌクレオチドは、配列番号29に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【０１４７】
配列番号29と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号29のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号29、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、及び147によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１４８】
配列番号29、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146及び147によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号29、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146及び/若しくは147、好ましくは29、137、138、139、140及び/若しくは141、より好ましくは29と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【０１４９】
表15は、配列番号29、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146及び147のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【０１５０】
【表１５】
0006420248.tif 000020
【０１５１】
本発明によって提供される追加的組換えポリヌクレオチドは、配列番号31に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【０１５２】
配列番号31と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号31のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号31、148、149、150、151及び152によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１５３】
配列番号31、148、149、150、151、152によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号31、148、149、150、151及び/若しくは152と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【０１５４】
表16は、配列番号31、148、149、150、151及び152のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【０１５５】
【表１６】
0006420248.tif 000021
【０１５６】
本発明によって提供されるさらなる組換えポリヌクレオチドは、配列番号33に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【０１５７】
配列番号33と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号33のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号33、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162及び163によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１５８】
配列番号33、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号33、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、好ましくは158、159、160、161、162、163、より好ましくは158と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【０１５９】
表17は、配列番号33、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162及び163のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【０１６０】
【表１７】
0006420248.tif 000022
【０１６１】
本発明によって提供される他の組換えポリヌクレオチドは、配列番号35に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【０１６２】
配列番号35と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号35のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号35、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173及び174によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１６３】
配列番号35、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173及び174によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号35、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、好ましくは169、170、171、172、173、174、より好ましくは169と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【０１６４】
表18は、配列番号35、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173及び174のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【０１６５】
【表１８】
0006420248.tif 000023
【０１６６】
本発明によって提供されるさらなる組換えポリヌクレオチドは、配列番号37に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【０１６７】
配列番号37と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号37のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号37、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184及び185によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１６８】
配列番号37、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184及び185によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号37、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、好ましくは37若しくは180と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【０１６９】
表19は、配列番号37、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184及び185のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【０１７０】
【表１９】
0006420248.tif 000024
【０１７１】
本発明によって提供される他の組換えポリヌクレオチドは、配列番号39に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【０１７２】
配列番号39と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号39のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号39、186、187、188、189及び190によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１７３】
配列番号39、186、187、188、189、190によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号39、186、187、188、189及び/若しくは190と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【０１７４】
表20は、配列番号39、186、187、188、189及び190のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【０１７５】
【表２０】
0006420248.tif 000025
【０１７６】
本発明によって提供されるさらなる組換えポリヌクレオチドは、配列番号41に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【０１７７】
配列番号41と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号41のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200又は201によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１７８】
配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、好ましくは41若しくは196と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【０１７９】
表21は、配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200及び201のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【０１８０】
【表２１】
0006420248.tif 000026
【０１８１】
本発明によって提供されるさらなる組換えポリヌクレオチドは、配列番号43に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【０１８２】
配列番号43と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号43のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号43、202、203、204、205又は206によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１８３】
配列番号43、202、203、204、205、206によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号43、202、203、204、205及び/若しくは206と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【０１８４】
表22は、配列番号43、202、203、204、205及び206のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【０１８５】
【表２２】
0006420248.tif 000027
【０１８６】
本発明によって提供される追加的組換えポリヌクレオチドは、配列番号45に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【０１８７】
配列番号45と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号45のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号45、207、208、209、210又は211によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１８８】
配列番号45、207、208、209、210、211によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号45、207、208、209、210及び/若しくは211と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【０１８９】
表23は、配列番号45、207、208、209、210及び211のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【０１９０】
【表２３】
0006420248.tif 000028
【０１９１】
本発明によって提供されるさらなる組換えポリヌクレオチドは、配列番号47に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドである。
【０１９２】
配列番号47と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号47のポリペプチドの変異体は、例えば、他を除外しないが、配列番号47、212、213、214、215又は216によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１９３】
配列番号47、212、213、214、215、216によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号47、212、213、214、215及び/若しくは216と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態であり、好ましくは、本明細書に記載される発現カセット、組換え生物、方法及びプロセスに使用される。
【０１９４】
表24は、配列番号47、212、213、214、215及び216のペアワイズ配列アライメントの％配列同一性を示す。ペアワイズ配列アライメントに使用したパラメーターは、EMBOSSソフトウェアスイートのNeedleman-Wunschアルゴリズム、#ギャップ方法: ギャップなし、#ギャップオープン: 10、ギャップ伸長: 0.5、マトリックス: EBLOSUM62である。
【０１９５】
【表２４】
0006420248.tif 000029
【０１９６】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号3、5、7、9、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、及び47によって記載されるポリペプチドの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21個若しくは全て、又は配列同一性におけるそれらの変異体、特に配列番号89、105、142、158、169、180及び196によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つ又はそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含むポリヌクレオチドである。
【０１９７】
本発明の追加的実施形態は、配列番号7、9、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、及び45によって記載されるポリペプチドの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18個若しくは全て、又は配列同一性におけるそれらの変異体、特に配列番号89、105、121、142、158、169、180及び196によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つ又はそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含むポリヌクレオチドである。
【０１９８】
本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、及び41によって記載されるポリペプチドの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14個若しくは全て、又は配列同一性におけるそれらの変異体、特に配列番号89、105、121、142、158、169、180及び196によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つ又はそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む。
【０１９９】
本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号13、15、19、25、27、29、35、37及び41によって記載されるポリペプチドの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8個若しくは全て、又は配列同一性におけるそれらの変異体、特に配列番号89、105、142、169、180及び196によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つ又はそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む。
【０２００】
本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号13、15、37及び41によって記載されるポリペプチドの少なくとも1、2、3個若しくは全て、又は配列同一性におけるそれらの変異体、特に配列番号89、180及び196によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つ又はそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む。
【０２０１】
本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号17、21及び33によって記載されるポリペプチドの少なくとも1、2個若しくは全て、又は配列同一性におけるそれらの変異体、特に配列番号158によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つ又はそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む。
【０２０２】
本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号13及び15によって記載されるポリペプチドの少なくとも1つ若しくは両方、又は配列同一性におけるそれらの変異体、特に配列番号89によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つ又はそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む。
【０２０３】
本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号19及び27によって記載されるポリペプチドの少なくとも1つ若しくは両方、又は配列同一性におけるそれらの変異体、特に配列番号105によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つ又はそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む。
【０２０４】
本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号29及び37によって記載されるポリペプチドの少なくとも1つ若しくは両方、又は配列同一性におけるそれらの変異体、特に配列番号142、180によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つ又はそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む。
【０２０５】
本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号35及び41によって記載されるポリペプチドの少なくとも1つ若しくは両方、又は配列同一性におけるそれらの変異体、特に配列番号169及び196によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つ又はそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む。
【０２０６】
本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号13によって記載されるポリペプチド又は配列同一性におけるその変異体についての少なくとも1つ又はそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む。
【０２０７】
本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号15によって記載されるポリペプチド又は配列同一性におけるその変異体、特に配列番号89によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つ又はそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む。
【０２０８】
本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号25によって記載されるポリペプチド又は配列同一性におけるその変異体についての少なくとも1つ又はそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む。
【０２０９】
本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号41によって記載されるポリペプチド又は配列同一性におけるその変異体、特に配列番号196によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つ又はそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む。
【０２１０】
上に記載されるポリヌクレオチドの例は、配列番号13、15、19、25、27、29、35、37、41、89、105、142、169、180又は196に示されるアミノ酸配列と少なくと80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む核酸配列を含むポリヌクレオチドである。
【０２１１】
そのようなポリヌクレオチドのさらなる例は、配列番号13、15、19、25、27、29、35、37、41、89、105、142、169、180及び196に示される配列の群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての発現カセットを含み、かつ、配列番号13、15、19、25、27、29、35、37、41、89、105、142、169、180及び196に示される配列の群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのさらなる発現カセットを含む、ポリヌクレオチドである。
【０２１２】
そのようなポリヌクレオチドの別の例は、配列番号13、15、19、25、27、29、35、37、41、89、105、142、169、180及び196に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのそれぞれ1つについての発現カセットを含むポリヌクレオチドである。
【０２１３】
上に記載されるポリヌクレオチドのさらなる例は、配列番号21、25、33、及び158に示される配列の群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む核酸配列を含むポリヌクレオチドである。
【０２１４】
他の例は、配列番号21、25、33、及び158に示される配列の群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含み、かつ、配列番号21、25、33、及び158に示される配列の群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、ポリヌクレオチドである。
【０２１５】
追加的な例は、配列番号21に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含み、かつ、配列番号33又は158に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセットを含む、ポリヌクレオチドである。
【０２１６】
これらの例は、これらのポリヌクレオチドの設計の原則を説明することだけを意味し、限定するものと解釈されるべきではない。
【０２１７】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号1に示される核酸配列と少なくとも70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含み、かつ、配列番号3、5、7、9、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、及び47によって記載されるポリペプチドの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21個若しくは全て、又は配列同一性におけるそれらの変異体についての少なくとも1つの発現カセットを含む、ポリヌクレオチドであり、好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号1に示される核酸配列と少なくとも70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含み、かつ、配列番号3、5、7、9、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、及び47によって記載されるポリペプチド、又は少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するそれらの変異体のそれぞれ1つについての少なくとも1つの発現カセットを含む。本発明のさらなる実施形態は、配列番号1に示される核酸配列と少なくとも70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含み、かつ、配列番号7、9、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、及び45によって記載されるポリペプチドの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18個若しくは全て、又は配列同一性におけるそれらの変異体についての少なくとも1つの発現カセットを含む、ポリヌクレオチドであり、好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号1に示される核酸配列と少なくとも70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含み、かつ、配列番号7、9、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、及び45によって記載されるポリペプチド、又は少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するそれらの変異体のそれぞれ1つについての少なくとも1つの発現カセットを含む。
【０２１８】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号1のヌクレオチド1001〜ヌクレオチド57525の配列によって示される核酸配列と少なくとも70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含み、かつ、配列番号3、5、7、9、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、若しくは47に示されるアミノ酸配列を有する少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22個若しくは全てのポリペプチド、又は配列同一性及び配列長におけるそれらの変異体についての少なくとも1つの発現カセットを含む、ポリヌクレオチドであり、好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド1001〜ヌクレオチド57525の配列によって示される核酸配列と少なくとも70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含み、かつ、配列番号3、5、7、9、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、若しくは47によって記載されるポリペプチド、又は少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するそれらの変異体のそれぞれ1つについての少なくとも1つの発現カセットを含む。 
【０２１９】
本発明の別の実施形態は、配列番号1のヌクレオチド12423〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列と少なくとも70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含み、かつ、配列番号13、15、19、25、27、29、35、37及び41に示されるアミノ酸配列を有する少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8個若しくは全てのポリペプチド、又は配列同一性及び配列長におけるそれらの変異体についての少なくとも1つの発現カセットを含む、ポリヌクレオチドであり、好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド12423〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列と少なくとも70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である核酸配列を含み、かつ、配列番号13、15、19、25、27、29、35、37及び41によって記載されるポリペプチド、又は少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するそれらの変異体のそれぞれ1つについての少なくとも1つの発現カセットを含む。
【０２２０】
これらのポリヌクレオチドの好ましい実施形態は、図1、2a、2b、3a及び3bに描写されたポリヌクレオチドである。
【０２２１】
本発明のさらなる実施形態は、上に記載されるいずれかのポリヌクレオチドの特徴の組み合わせを有するポリヌクレオチド、並びにポリヌクレオチドが、これらのポリヌクレオチドのいずれか1つに高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを可能にする核酸配列を有するポリヌクレオチド、好ましくは、配列番号1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44若しくは46に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドである。
【０２２２】
本発明の前述のポリヌクレオチドのいずれかへ言及することによって本発明はまた、先に言及された特異的配列又はその変異体の相補鎖又は逆相補鎖へ言及すると理解される。ポリヌクレオチドは、cDNA及びゲノムDNAを含めたDNA、又はRNAポリヌクレオチドを包含する。
【０２２３】
しかし、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドに由来し、本発明のポリヌクレオチドの転写又は翻訳を妨げることができる、ポリヌクレオチド変異体に関する。そのような変異体ポリヌクレオチドとしては、アンチセンス核酸、リボザイム、siRNA分子、モルフォリノ核酸(ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴ)、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、阻害性オリゴヌクレオチド、又はマイクロRNA分子があり、これらの全ては、相補的又は実質的に相補的な配列の存在によって本発明のポリヌクレオチドを特異的に認識する。これらの技術は当業者に周知である。前述の種類の好適な変異体ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの構造に基づいて容易に設計することができる。
【０２２４】
さらに、化学的に修飾されたポリヌクレオチド、例えば天然に生じる修飾されたポリヌクレオチド、例えばグリコシル化若しくはメチル化ポリヌクレオチド、又は人工的に修飾されたもの、例えばビオチン化ポリヌクレオチドも含まれる。
【０２２５】
本発明の別の実施形態は、上に記載されるポリヌクレオチドのいずれか1つを含むベクターである。
【０２２６】
好ましくは、本明細書に言及されるベクターは、クローニングベクター又は形質転換ベクターとして好適であり、すなわち、微生物系において複製可能であるか又はポリヌクレオチドを微生物のゲノムに組み込むことができる。また好ましくは、本発明のベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、各微生物においてポリヌクレオチドの転写及び翻訳を可能にする発現カセットを含む。発現カセットは、本発明の少なくとも1つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター及びターミネーターを含む。ポリペプチドの少なくとも1つをコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、各微生物のコドン使用に適合される。特定の微生物について使用するのに適したプロモーター、ターミネーター及びコドン使用についての情報は、当業者に知られている。酵母又は真菌種に適したプロモーターは、ADC1、AOX1r、GAL1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH trpC、GAL10、cbh1、hfb2 amyBである。さらなる例は、Microbiology and Molcular Biology Reviews 70, Pages: 583-ff 2006又はBlumhoff, M et al. “Six novel constitutive promoters for metabolic engineering of Aspergillus niger” (2013) APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY  Vol. 97 Issue: 1 Pages: 259-267から得ることができる。
【０２２７】
発現カセットは、構成的又は誘導性プロモーターを含んでもよい。例えば、酵母、特に出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)に適したプロモーターは、例えば、Gal1、Gal10、Cup1、Pho5、及びMet25プロモーター、trpC、gpdA、tub2及びTef1プロモーター、又はPGI1p、ADH1p、TDH2p、HXT7p、PGK1p、TEF2p、PYK1p、ENO2p、PDC1p、FBA1p、GPDp、GPM1p、TPI1p、TEF1pプロモーターであり、Sun et al. “Cloning and characterization of a panel of constitutive promotors for applications in pathway engineering in Saccharomyces cerevisiae” (2012); Biotechnology and Bioengineering, Vol. 109, No. 8に開示されている。さらなるプロモーター及びターミネーター、並びにクローニング戦略は、例えば、Shao et al. (2009) Nucleic Acids Research, Vol. 37, No. 2 e16 (10 pages)に記載されている。本発明の一実施形態において、発現カセットは、配列番号1に含まれるか、又はペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムから得ることができる、プロモーターを含む。
【０２２８】
ペシロマイセス・ディバリカタスのゲノムから得ることができるプロモーターの一例は、配列番号236の核酸配列に記載されるプロモーターである。
【０２２９】
したがって、本発明の一実施形態は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットであり、ここで、該プロモーターの核酸配列は、
(a)配列番号236に示される核酸配列と同一であるか、又は
(b)配列番号236に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるか、又は
(c)プロモーターが、配列番号236に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドに高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを可能にするか、又は
(d)配列番号236に示される核酸配列と少なくとも60％、75％若しくは80％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号238に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％、95％、若しくは100％同一であるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、又は
(e)配列番号236に示される核酸配列と少なくとも60％、75％若しくは80％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号237に示される核酸配列と少なくとも90％、95％、若しくは100％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【０２３０】
好ましくは、作動可能に連結された、そのような組換え発現カセットのポリペプチドコード化ポリヌクレオチドは、以下をコードする。
(a)配列番号3、59、60、61、62及び/若しくは63と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号3、59、60、61、62若しくは63によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに/又は
(b)配列番号5、64、65、66、67及び/若しくは68と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号5、64、65、66、67若しくは68によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(c)配列番号7、69、70、71、72及び/若しくは73と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号7、69、70、71、72若しくは73によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(d)配列番号9、74、75、76、77及び/若しくは78と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号9、74、75、76、77若しくは78によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(e)配列番号13、79、80、81、82及び/若しくは83と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号13、79、80、81、82若しくは83によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(f)配列番号15、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93及び/若しくは94と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号15及び/若しくは89と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、より好ましくは配列番号15、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93若しくは94によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(g)配列番号17、95、96、97、98及び/若しくは99と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号17、95、96、97、98若しくは99によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(h)配列番号19、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109及び/若しくは110と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号105、106、107、108、109及び/若しくは110と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、より好ましくは配列番号105と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、さらにより好ましくは配列番号19、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109若しくは110によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(i)配列番号21、111、112、113、114及び/若しくは115と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号21、111、112、113、114若しくは115によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(j)配列番号23、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125及び/若しくは126、好ましくは121、122、123、124、125及び/若しくは126と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、より好ましくは配列番号121と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、さらにより好ましくは配列番号23、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125若しくは126によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(k)配列番号25、127、128、129、130及び/若しくは131と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号25、127、128、129、130若しくは131によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(l)配列番号27、132、133、134、135及び/若しくは136と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号27、132、133、134、135若しくは136によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(m)配列番号29、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146及び/若しくは147と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号29、137、138、139、140及び/若しくは141と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、より好ましくは配列番号29と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、さらにより好ましくは配列番号29、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146若しくは147によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(n)配列番号31、148、149、150、151及び/若しくは152と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号31、148、149、150、151、若しくは152によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(o)配列番号33、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号158、159、160、161、162、163と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、より好ましくは配列番号158と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、さらにより好ましくは配列番号33、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162若しくは163によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(p)配列番号35、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173及び/若しくは174と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号169、170、171、172、173及び/若しくは174と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、より好ましくは配列番号169と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、さらにより好ましくは配列番号35、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173若しくは174によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(q)配列番号37、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184及び/若しくは185と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号37及び/若しくは180と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、より好ましくは配列番号37、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184若しくは185によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(r)配列番号39、186、187、188、189及び/若しくは190と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号39、186、187、188、189若しくは190によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(s)配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200及び/若しくは201と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号41及び/若しくは196と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、より好ましくは配列番号41、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200若しくは201によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(t)配列番号43、202、203、204、205及び/若しくは206と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号43、202、203、204、205若しくは206によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに
(u)配列番号45、207、208、209、210及び/若しくは211と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号45、207、208、209、210若しくは211によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
(v)配列番号47、212、213、214、215及び/若しくは216と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号47、212、213、214、215若しくは216によって示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【０２３１】
本発明のさらなる実施形態は、
(a)配列番号238に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするか、又は
(b)配列番号237に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるか、又は
(c)ポリヌクレオチドが、配列番号237に示されるポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを可能にする
核酸配列を含む、ポリヌクレオチドを含む組換え発現カセットである。
【０２３２】
配列番号1の遺伝子の開始ヌクレオチドの上流に位置する配列が、真菌において、特にペシロマイセス属及びペシロマイセス・ディバリカタス種の真菌において、プロモーター機能を提供できることは、当業者には明らかである。
【０２３３】
配列番号1の遺伝子の終了点ヌクレオチドの下流に位置する配列が、真菌において、特にペシロマイセス属及びペシロマイセス・ディバリカタス種の真菌において、ターミネーター機能を提供できることもまた、当業者には明らかである。
【０２３４】
したがって、本発明のさらなる実施形態は、ペシロマイセス・ディバリカタスにおいてプロモーター機能を有する配列番号1の各遺伝子の開始ヌクレオチドの上流の約2000、1750、1500、1250、1000、750、500、300若しくは250ヌクレオチドの配列番号1のフラグメント、並びにペシロマイセス・ディバリカタスにおいてターミネーター機能を有する配列番号1の各遺伝子の終了点ヌクレオチドの下流の約500、300、若しくは250ヌクレオチドの配列番号1のフラグメント、並びにこれらのフラグメントの少なくとも1つを含む組換え発現カセット、ベクター及び組換え微生物である。
【０２３５】
したがって、本発明の一実施形態は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットを含み、ここで、該プロモーターは、
(a)配列番号217、218、219、220、221若しくは222に示される核酸配列の少なくとも1つと同一であるか、又は
(b)配列番号217、218、219、220、221若しくは222に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるか、又は
(c)配列番号217、218、219、220、221若しくは222のいずれか1つに示される核酸配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズするか、又は
(d)配列番号217、218、219、220、221若しくは222に示される核酸配列と少なくとも60％、75％若しくは80％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号15、17、19、21、23、33、35、37、39、43、45、89、105、121、158若しくは180に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％、95％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、又は
(e)配列番号217、218、219、220、221若しくは222に示される核酸配列と少なくとも60％、75％若しくは80％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号14、16、18、20、22、32、34、36、38、42、若しくは44に示される核酸配列と少なくとも90％、95％、若しくは100％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドを含むか、又は
(f)(a)〜(e)の少なくとも1つの逆相補鎖である
核酸配列を含む。
【０２３６】
これらの組換え発現カセットの好ましい変異体は、
(a)配列番号217に示される核酸配列若しくはその逆相補鎖の少なくとも1つと同一であるか、又は
(b)配列番号217に示される核酸配列若しくはその逆相補鎖と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるか、又は
(c)配列番号217若しくはその逆相補鎖のいずれか1つに示される核酸配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズするか、又は
(d)配列番号217に示される核酸配列若しくはその逆相補鎖と少なくとも60％、75％若しくは80％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号15、17及び/若しくは89に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％、95％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、又は
(e)配列番号217に示される核酸配列若しくはその逆相補鎖と少なくとも60％、75％若しくは80％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号14若しくは16に示される核酸配列と少なくとも90％、95％、若しくは100％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、
核酸配列を有するプロモーターを含む発現カセットを包含する。
【０２３７】
組換え発現カセットの他の変異体は、
(a)配列番号218に示される核酸配列の少なくとも1つと同一であるか、又は
(b)配列番号218に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるか、又は
(c)配列番号218のいずれか1つに示される核酸配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズするか、又は
(d)配列番号218に示される核酸配列と少なくとも60％、75％若しくは80％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号19及び/若しくは105に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％、95％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、又は
(e)配列番号217、218、219、220、221若しくは222に示される核酸配列と少なくとも60％、75％若しくは80％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号18に示される核酸配列と少なくとも90％、95％、若しくは100％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、
核酸配列を有するプロモーターを含む発現カセットを包含する。
【０２３８】
組換え発現カセットのさらなる変異体は、
(a)配列番号219に示される核酸配列若しくはその逆相補鎖の少なくとも1つと同一であるか、又は 
(b)配列番号219に示される核酸配列若しくはその逆相補鎖と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるか、又は
(c)配列番号219若しくはその逆相補鎖のいずれか1つに示される核酸配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズするか、又は
(d)配列番号219に示される核酸配列若しくはその逆相補鎖と少なくとも60％、75％若しくは80％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号21、23若しくは121に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％、95％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、又は
(e)配列番号219に示される核酸配列若しくはその逆相補鎖と少なくとも60％、75％若しくは80％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号20若しくは22に示される核酸配列と少なくとも90％、95％、若しくは100％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、
核酸配列を有するプロモーターを含む発現カセットを包含する。
【０２３９】
組換え発現カセットの追加的変異体は、
(a)配列番号220に示される核酸配列若しくはその逆相補鎖の少なくとも1つと同一であるか、又は
(b)配列番号220に示される核酸配列若しくはその逆相補鎖と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるか、又は
(c)配列番号220若しくはその逆相補鎖のいずれか1つに示される核酸配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズするか、又は
(d)配列番号220に示される核酸配列若しくはその逆相補鎖と少なくとも60％、75％若しくは80％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号33、35、158若しくは169に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％、95％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、又は
(e)配列番号220に示される核酸配列若しくはその逆相補鎖と少なくとも60％、75％若しくは80％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号32若しくは34に示される核酸配列と少なくとも90％、95％、若しくは100％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、
核酸配列を有するプロモーターを含む発現カセットを包含する。
【０２４０】
組換え発現カセットの他の変異体は、
(a)配列番号221に示される核酸配列若しくはその逆相補鎖の少なくとも1つと同一であるか、又は
(b)配列番号221に示される核酸配列若しくはその逆相補鎖と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるか、又は
(c)配列番号221若しくはその逆相補鎖のいずれか1つに示される核酸配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズするか、又は
(d)配列番号221に示される核酸配列若しくはその逆相補鎖と少なくとも60％、75％若しくは80％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号37、39若しくは180に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％、95％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、又は
(e)配列番号221に示される核酸配列若しくはその逆相補鎖と少なくとも60％、75％若しくは80％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号36若しくは38に示される核酸配列と少なくとも90％、95％、若しくは100％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、
核酸配列を有するプロモーターを含む発現カセットを包含する。
【０２４１】
組換え発現カセットのさらなる変異体は、
(a)配列番号222に示される核酸配列若しくはその逆相補鎖の少なくとも1つと同一であるか、又は
(b)配列番号222に示される核酸配列若しくはその逆相補鎖と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるか、又は
(c)配列番号222若しくはその逆相補鎖のいずれか1つに示される核酸配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズするか、又は
(d)配列番号222に示される核酸配列若しくはその逆相補鎖と少なくとも60％、75％若しくは80％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号43若しくは45に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％、95％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、又は
(e)配列番号222に示される核酸配列若しくはその逆相補鎖と少なくとも60％、75％若しくは80％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号42若しくは44に示される核酸配列と少なくとも90％、95％、若しくは100％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、
核酸配列を有するプロモーターを含む発現カセットを包含する。
【０２４２】
配列番号217、218、219、220、221若しくは222の少なくとも1つに示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるか、又は配列番号217、219、220、221若しくは222に示される少なくとも1つの核酸配列の逆相補鎖と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である、核酸配列、又は上に記載されるペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムから得ることができるそれらの変異体を含むプロモーターを含む発現カセットは、これらのプロモーターからの転写を活性化する転写因子を提供する発現カセットと組み合わせることができる。そのような転写因子は、好ましくは、配列番号25、127、128、129、130、又は131と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号25と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０２４３】
したがって、本発明はまた、組換え微生物における協調した遺伝子のための系であって、
(I)前記微生物において遺伝子発現を提供することができ、かつ、配列番号25、127、128、129、130、若しくは131と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、プロモーターを含む少なくとも1つの発現カセット、及び
(II)配列番号217、218、219、220、221若しくは222の少なくとも1つに示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるか、又は配列番号217、219、220、221若しくは222に示される少なくとも1つの核酸配列の逆相補鎖と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である、核酸配列、又はペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムから得ることができるそれらの変異体を有するプロモーターを含む1つ以上の発現カセット
を含む、系を含む。
【０２４４】
前記組換え微生物において遺伝子発現を提供することができるプロモーターは、目的の組換え微生物において、構成的、又は成長段階特異的、組織特異的若しくは誘導性発現を提供するプロモーターであり得る。構成的、成長段階特異的、組織特異的又は誘導性発現を提供するプロモーターは、当技術分野において容易に利用可能である。当業者は、所与の微生物に適したプロモーターを選択することができる。例は、Microbiology and Molecular Biology Reviews 70、Pages: 583-ff 2006から得ることができる。真菌及び酵母における発現についての他の好適な例は、上に提供されている。
【０２４５】
微生物は、好ましくは真菌生物、例えば真菌若しくは酵母細胞、例えば、他を除外しないが、ペニシリウム属(Penicillium)、アスペルギルス属(Aspergillus)、ペシロマイセス属(Paecilomyces)、ビソクラミス属(Byssochlamys)、サッカロミセス属(Saccaromyces)、ピキア属(Pichia)、ヤロウィア属(Yarrowia)のものである。好ましくは、組換え微生物は、ペシロマイセス属又はビソクラミス属のもの、例えば、ペシロマイセス・ディバリカタス又はビソクラミス・ベルコサ種のものである。
【０２４６】
本明細書に提供される発現カセットは、発現ベクターと組み合わせて使用することができる。様々な微生物についての複数の好適な発現ベクターは、当技術分野において公知である。これらのベクターは、例えば、大腸菌(E. coli)において、pLG338、pACYC184、pBRシリーズ、例えばpBR322、pUCシリーズ、例えばpUC18又はpUC19、M113mpシリーズ、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λ-gt11又はpBdCl、ストレプトマイセス属(Streptomyces)においてplJ101、plJ364、plJ702又はplJ361、バチルス属(Bacillus)においてpUB110、pC194又はpBD214である。酵母である出芽酵母(S. cerevisiae)における発現のためのベクターの例は、pYep Sec1(Baldari  1987, Embo J. 6:229-234)、pMFa(Kurjan 1982, Cell 30:933-943)、pJRY88(Schultz 1987, Gene 54:113-123)及びpYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, CA)を含む。さらなる好適な酵母ベクターは、例えば、pAG-1、YEp6、YEp13又はpEMBLYe23である。他の真菌、例えば糸状真菌における使用に適したベクター及びベクターの構築方法は、van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991)"Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi"において、Applied Molecular Genetics of fungi, J.F.Peberdy et al., Ed., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridgeにおいて、又はMore Gene Manipulations in Fungi (J.W. Bennett & L.L. Lasure, Ed., pp. 396-428: Academic Press: San Diego)において、詳細に記載されているものを含む。
【０２４７】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生産のための方法であって、
(a)前記ポリペプチドの生産を可能にする条件下で本発明の組換え微生物を培養するステップ、及び
(b)ステップ(a)の組換え微生物からポリペプチドを得るステップ
を含む、方法に関する。
【０２４８】
本発明のポリヌクレオチドの発現を可能にする好適な条件は、組換え微生物、及びポリヌクレオチドの発現を制御するために使用される発現制御配列に依存する。これらの条件及びそれらを選択する方法は、当業者に周知である。発現されるポリペプチドは、例えば、全ての従来の精製技術、例えばアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)及び沈殿技術、例えば抗体沈殿によって得てよい。方法は、ポリペプチドの本質的に純粋な調製物を生じさせることが好ましいが、必ずしもその必要はなくてよいことが理解される。前述の方法に使用される組換え微生物に応じて、それにより生産されるポリペプチドは、翻訳後修飾されても、又は他の方法で処理されてもよいことが理解される。
【０２４９】
本発明の実施形態の別の群は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、又は本発明の前述の方法によって得ることができるポリペプチドである。
【０２５０】
本発明のポリヌクレオチド及びベクターは、遺伝子又はポリヌクレオチドのそれらの天然のセットに加えて、上に記載されるポリヌクレオチドの少なくとも1つを含む、微生物におけるコルネキシスチン及び/又はヒドロキシコルネキシスチンの生産に特に適している。したがって、本発明のさらなる実施形態は、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも1つを含む組換え微生物である。この追加的ポリヌクレオチドは、ベクターに含まれてよく、又は微生物のゲノムに組み込まれてもよい。
【０２５１】
そのような微生物は、例えば、コルネキシスチン及び/又はヒドロキシコルネキシスチンを生産する方法において使用することができる。
【０２５２】
本発明の一実施形態において、組換え微生物は、図1、2a、2b、3a及び3bによって記載される遺伝子クラスターの少なくとも1つで微生物を形質転換することによって生産される。好ましくは、遺伝子クラスターの発現カセットは、各微生物において機能的であるプロモーター及びターミネーター配列を含む。好ましくはまた、遺伝子クラスターの配列をコードするポリヌクレオチドは、各微生物についてコドン最適化される。遺伝子クラスターは、1つの単一エレメントとして形質転換される必要はなく、いくつかの要素において形質転換されてもよく、このいくつかの要素はゲノム中の異なる場所に組み込んでも又は組み込まなくてもよい。通常、遺伝子クラスターの全ての要素は、遺伝子クラスターの要素が微生物のゲノム中の異なる場所に組み込まれる場合に発現カセットのいずれもが破壊されないように、完全な発現カセットを含む。
【０２５３】
好ましくは、前記組換え微生物は細菌、放線菌、酵母、真菌、例えば子嚢菌、不完全菌類、又は担子菌であり、好ましくは組換え微生物は、細菌細胞、真菌細胞又は酵母細胞である。
【０２５４】
本発明の組換え微生物として使用される好ましい細菌は、大腸菌(Escherichia coli)及び枯草菌(Bacilus subtilis)からなる群より選択される。
【０２５５】
好ましい真菌は、ペシロマイセス属、ビソクラミス属、サーモアスカス属、モナスカス属、アスペルギルス属及びペニシリウム属からなる群より選択される。特に好ましいのは、種: ペシロマイセス・ディバリカタス、ペシロマイセス・バリオッティ、ビソクラミス・ニベア、ビソクラミス・ベルコサ、サーモアスカス・オーランティアカス、ペニシリウム・クリソゲヌム(Penicillium chrysogenum)、アスペルギルス・ジャポニクス(Aspergillus japonicus)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)及びアスペルギルス・オリザ(Aspergillus oryzae)の真菌である。
【０２５６】
好ましい真菌株は、ビソクラミス・ベルコサCBS 605.74、ペシロマイセス・ディバリカタスCBS 284.48、ペシロマイセス・ディバリカタスCBS 110429、ペシロマイセス・バリオッティ・バイニエルSANK 21086、サーモアスカス・クルスタセウスCBS 117.66、サーモアスカス・サーモフィラスCBS 624.74、アスペルギルス・ニデュランスATCC 11414又はアスペルギルス・フミガーツスATCC 46645、アスペルギルス・ニガーATCC 10864及びペニシリウム・クリソゲヌムATCC 11500、アスペルギルス・オリザATCC 1015、アスペルギルス・オリザATCC 42149である。
【０２５７】
好ましい酵母は、サッカロミセス属、アシュビア属、シゾサッカロミセス属、カンジダ属及びピキア属からなる群より選択される。一実施形態において、酵母は出芽酵母である。
【０２５８】
1つのさらなる実施形態において、組換え微生物は、好ましくはペシロマイセス・ディバリカタスCBS 284.48、ペシロマイセス・ディバリカタスCBS 110429、ペシロマイセス・バリオッティ・バイニエルSANK 21086の菌株の群から選択される、ペシロマイセス・ディバリカタス種の組換え微生物である。
【０２５９】
別の実施形態において、組換え微生物は、真菌又は酵母であるが、ペシロマイセス・ディバリカタス種の組換え微生物ではなく、好ましくはペニシリウム属、アスペルギルス属又はサッカロミセス属に属する、より好ましくは種: ペニシリウム・クリソゲヌム、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・フミガーツス及びアスペルギルス・オリザ、又は出芽酵母に属する組換え微生物である。
【０２６０】
したがって、本発明は、 
(a)配列番号12と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(b)配列番号14と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(c)配列番号16と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(d)配列番号18と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(e)配列番号20と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(f)配列番号22と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(g)配列番号24と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(h)配列番号26と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(i)配列番号28と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(j)配列番号30と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(k)配列番号32と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(l)配列番号34と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(m)配列番号36と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(n)配列番号38と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(o)配列番号40と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット
を含む組換え微生物を含み、
ここで、(a)〜(o)の発現カセットの少なくとも1つは、組換え発現カセットであり、好ましくは、(b)〜(o)の発現カセットの少なくとも1つ、例えば他を除外しないが、(g)の発現カセットは、構成的プロモーターを含み、さらにより好ましくは、(a)〜(o)の発現カセットの少なくとも1つは、
(i)配列番号236に示される核酸配列と同一であるか、又は
(ii)配列番号236に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるか、又は
(iii)プロモーターが、配列番号236に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドに高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを可能にするか、又は
(iv)配列番号236に示される核酸配列と少なくとも60％、75％若しくは80％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号238に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％、95％、若しくは100％同一であるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、又は
(v)配列番号236に示される核酸配列と少なくとも60％、75％若しくは80％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号237に示される核酸配列と少なくとも90％、95％、若しくは100％同一であるポリヌクレオチドを含む、
核酸配列を含むプロモーターを含む。
【０２６１】
好ましくは、組換え微生物はまた、
(a)配列番号6と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(b)配列番号8と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(c)配列番号42と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(d)配列番号44と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット
を含む。
【０２６２】
本発明のさらなる実施形態において、組換え微生物はまた、
(1)配列番号2と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(2)配列番号4と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(3)配列番号46と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット
を含む。
【０２６３】
本発明のいくつかの実施形態において、組換え微生物は、
(a)配列番号14と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての下方調節された発現カセットを含まないか、又はそれを有し、あるいは
(b)配列番号24と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての下方調節された発現カセットを含まないか、又はそれを有し、あるいは
(c)配列番号14と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての下方調節された発現カセットを含まないか、又はそれを有し、かつ、配列番号24と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチドについての下方調節された発現カセットを含まないか、又はそれを有する。
【０２６４】
本発明はまた、
(a)配列番号13と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(b)配列番号15若しくは89と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号89と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(c)配列番号17と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(d)配列番号19及び/若しくは105と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号105と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(e)配列番号21と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(f)配列番号23及び/若しくは121と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号121と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(g)配列番号25と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(h)配列番号27と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び 
(i)配列番号29及び/若しくは141と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号29と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(j)配列番号31と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(k)配列番号33及び/若しくは158と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号158と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(l)配列番号35及び/若しくは169と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号169と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(m)配列番号37及び/若しくは180と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(n)配列番号39と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(o)配列番号41及び/若しくは196と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット
を含む組換え微生物を含み、
ここで、(a)〜(o)の発現カセットの少なくとも1つは、組換え発現カセットであり、好ましくは、(b)〜(o)の発現カセットの少なくとも1つ、例えば他を除外しないが、(g)の発現カセットは構成的プロモーターを含み、さらにより好ましくは、(a)〜(o)の発現カセットの少なくとも1つは、
(i)配列番号236に示される核酸配列と同一であるか、又は
(ii)配列番号236に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるか、又は
(iii)プロモーターが、配列番号236に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドに高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを可能にするか、又は
(iv)配列番号236に示される核酸配列と少なくとも60％、75％若しくは80％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号238に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％、95％、若しくは100％同一であるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、又は
(v)配列番号236に示される核酸配列と少なくとも60％、75％若しくは80％同一であり、かつ、野生型ペシロマイセス・ディバリカタス若しくはビソクラミス・ベルコサのゲノムの発現カセットから得ることができ、ここで、該発現カセットは、配列番号237に示される核酸配列と少なくとも90％、95％、若しくは100％同一であるポリヌクレオチドを含む、
核酸配列を含むプロモーターを含む。
【０２６５】
好ましくは、組換え微生物はまた、
(a)配列番号7と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(b)配列番号9と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(c)配列番号43と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(d)配列番号45と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット
を含む。
【０２６６】
本発明のさらなる実施形態において、組換え微生物はまた、
(a)配列番号3と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(b)配列番号5と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット、及び
(c)配列番号47と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての少なくとも1つの発現カセット
を含む。
【０２６７】
コードされるポリペプチドの例は、他を除外しないが、表3〜24に挙げられたアミノ酸配列によって表されるポリペプチドである。
【０２６８】
本発明のいくつかの実施形態において、組換え微生物は、
(a)配列番号15若しくは89と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての下方調節された発現カセットを含まないか、又はそれを有し、あるいは
(b)配列番号25と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての下方調節された発現カセットを含まないか、又はそれを有し、あるいは
(c)配列番号15若しくは89と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての下方調節された発現カセットを含まないか、又はそれを有し、かつ、配列番号25と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドについての下方調節された発現カセットを含まないか、又はそれを有する。
【０２６９】
本発明の別の部分は、組換え微生物を生産する方法であって、以下のステップ: (a)本発明のポリヌクレオチド若しくはそのようなポリヌクレオチドを含むベクターで微生物を形質転換するステップ、及び(b)前記ポリヌクレオチド若しくは前記ベクターを含む微生物を選択するステップを含む、方法である。
【０２７０】
本発明さらなる部分は、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの生産、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産のための組換え微生物を生産する方法であって、以下のステップ: (a)本発明のポリヌクレオチド若しくはそのようなポリヌクレオチドを含むベクターで微生物を形質転換するステップ、(b)ポリヌクレオチド若しくはベクターを含む微生物を選択するステップ、(c)コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンを生産する、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンを生産するステップ(b)の組換え微生物を選択するステップを含む、方法である。
【０２７１】
組換え微生物は、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの生産、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産を可能にする条件下で組換え微生物を培養し、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの存在について、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの存在について、組換え微生物若しくは培養培地を分析すること、又は組換え微生物及び培養培地を分析することによって、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの生産、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産について試験することができる。
【０２７２】
特に、組換え微生物を生産するために使用される好ましいポリヌクレオチドは、次のものである。
【０２７３】
配列番号1に示される核酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列を含むか、又は配列番号1に示される核酸配列の配列長の少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％を有する、組換えポリヌクレオチド。
【０２７４】
配列番号1のヌクレオチド12423〜ヌクレオチド52300の配列によって示される核酸配列と少なくとも70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％同一である核酸配列を含み、かつ、配列番号13、15、19、25、27、29、35、37及び41に示されるアミノ酸配列を有する少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8個、若しくは全てのポリペプチド、又は少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、若しくは99％の配列同一性を有するそれらの変異体、特に配列番号89、105、169、180及び196によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つの発現カセットを含む、組換えポリヌクレオチド。
【０２７５】
配列番号13、15、19、25、27、29、35、37及び41によって記載されるポリペプチドの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8個若しくは全て、又は少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、若しくは99％の配列同一性を有するそれらの変異体、特に配列番号89、105、142、169、180及び196によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つ若しくはそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【０２７６】
配列番号17、21及び33によって記載されるポリペプチドの少なくとも1、2個若しくは全て、又は少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、若しくは99％の配列同一性を有するそれらの変異体、特に配列番号158によって記載されるポリペプチドについての少なくとも1つ若しくはそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【０２７７】
配列番号21によって記載されるポリペプチド、又は少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、若しくは99％の配列同一性を有するその変異体についての少なくとも1つの発現カセットを含むか、あるいは配列番号33によって記載されるポリペプチド、又は少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、若しくは99％の配列同一性を有するその変異体、特に配列番号158によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つの発現カセットを含むか、あるいは配列番号21によって記載されるポリペプチド、又は少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、若しくは99％の配列同一性を有するその変異体についての少なくとも1つの発現カセットを含み、かつ、配列番号33によって記載されるポリペプチド、又は少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、若しくは99％の配列同一性を有するその変異体、特に配列番号158によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つの発現カセットを含む、核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【０２７８】
配列番号13及び15によって記載されるポリペプチドの少なくとも1つ若しくは両方、又は少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、若しくは99％の配列同一性を有するそれらの変異体、特に配列番号89によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つ若しくはそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【０２７９】
配列番号19及び27によって記載されるポリペプチドの少なくとも1つ若しくは両方、又は少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、若しくは99％の配列同一性を有するそれらの変異体、特に配列番号105によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つ若しくはそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【０２８０】
配列番号29及び37によって記載されるポリペプチドの少なくとも1つ若しくは両方、又は少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、若しくは99％の配列同一性を有するそれらの変異体、特に配列番号142及び180によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つ若しくはそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【０２８１】
配列番号35及び41によって記載されるポリペプチドの少なくとも1つ若しくは両方、又は少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、若しくは99％の配列同一性及び配列長を有するそれらの変異体、特に配列番号169及び196によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つ若しくはそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【０２８２】
配列番号13によって記載されるポリペプチド、又は少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、若しくは99％の配列同一性を有するその変異体についての少なくとも1つ若しくはそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【０２８３】
配列番号15によって記載されるポリペプチド、又は少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、若しくは99％の配列同一性及び配列長を有するその変異体、特に配列番号89によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つ若しくはそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【０２８４】
配列番号25によって記載されるポリペプチド、又は少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、若しくは99％の配列同一性を有するその変異体についての少なくとも1つ若しくはそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【０２８５】
配列番号41によって記載されるポリペプチド、又は少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、若しくは99％の配列同一性及び配列長を有するその変異体、特に配列番号196によって記載されるポリペプチド、についての少なくとも1つ若しくはそれ以上の発現カセットを含む核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【０２８６】
コルネキシスチン又はヒドロキシコルネキシスチンの存在について試験する方法は、当技術分野で公知である。そのような方法の例は、US4897104、US4990178及びUS5424278に開示されている。
【０２８７】
本発明はまた、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンの生産のための方法、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産のための方法であって、以下のステップ: (a)少なくとも1つの本発明のポリヌクレオチドを含む組換え微生物を、前記微生物によるコルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチン、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産を可能にする条件下で培養するステップ、並びに(b)生産されたコルネキシスチン若しくは生産されたヒドロキシコルネキシスチンを得るか、又は生産されたコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンを得るステップを含む、方法を提供する。好ましくは、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチン、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンは、培養ブロスから得られる。
【０２８８】
生産されたコルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチン、又は生産されたコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンは、直接得ることができ、又はそれらの二塩基酸形態へ変換し、塩として、好ましくは農学的に許容可能な塩として得ることができる。
【０２８９】
したがって、本発明はまた、コルネキシスチンの遊離二塩基酸又はコルネキシスチンの農学的に許容可能な塩の生産のための方法であって、以下のステップ: (a)コルネキシスチンの生産を可能にする条件下で少なくとも1つの本発明のポリヌクレオチドを含む組換え微生物を培養するステップ、及び(b)生産されたコルネキシスチンを得て、コルネキシスチンの二塩基酸を生産するか、又はコルネキシスチンの二塩基酸の農学的に許容可能な塩を生産するステップを含む、方法を包含する。
【０２９０】
あるいは、コルネキシスチンの遊離二塩基酸又はコルネキシスチンの農学的に許容可能な塩の生産のための方法は、以下のステップ: (a)コルネキシスチンの生産を可能にする条件下で少なくとも1つの本発明のポリヌクレオチドを含む組換え微生物を培養するステップ、(b)コルネキシスチンの二塩基酸を生産するか、又はコルネキシスチンの二塩基酸の農学的に許容可能な塩を生産するステップ、並びに(c)コルネキシスチンの二塩基酸を得るか、又はコルネキシスチンの二塩基酸の農学的に許容可能な塩を得るステップを含む。
【０２９１】
本発明のさらなる実施形態は、ヒドロキシコルネキシスチンの遊離二塩基酸又はヒドロキシコルネキシスチンの農学的に許容可能な塩の生産のための方法であって、以下のステップ: (a)ヒドロキシコルネキシスチンの生産を可能にする条件下で少なくとも1つの本発明のポリヌクレオチドを含む組換え微生物を培養するステップ、及び(b)生産されたヒドロキシコルネキシスチンを得て、ヒドロキシコルネキシスチンの二塩基酸を生産するか、又はヒドロキシコルネキシスチンの二塩基酸の農学的に許容可能な塩を生産するステップを含む、方法である。
【０２９２】
あるいは、ヒドロキシコルネキシスチンの遊離二塩基酸又はヒドロキシコルネキシスチンの農学的に許容可能な塩の生産のための方法は、以下のステップ: (a) ヒドロキシコルネキシスチンの生産を可能にする条件下で少なくとも1つの本発明のポリヌクレオチドを含む組換え微生物を培養するステップ、(b)ヒドロキシコルネキシスチンの二塩基酸を生産するか、又はヒドロキシコルネキシスチンの二塩基酸の農学的に許容可能な塩を生産するステップ、並びに(c)ヒドロキシコルネキシスチンの二塩基酸を得るか、又はヒドロキシコルネキシスチンの二塩基酸の農学的に許容可能な塩を得るステップを含む。
【０２９３】
コルネキシスチンの二塩基酸及びコルネキシスチンの農学的に許容可能な塩を生産する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、US4897104及びUS4990178に開示され、これらはその全体において参照により本明細書に含まれる。
【０２９４】
用語「培養すること」は、本明細書で用いられる場合、細胞がコルネキシスチン及び/又はヒドロキシコルネキシスチンを生産することを可能にする培養条件下で組換え微生物を維持し、増殖させることを指す。これは、少なくとも1つの核酸配列によってコードされるポリペプチド(複数可)が生物学的に活性な形態で組換え微生物中に存在するように、本発明のポリヌクレオチドが組換え微生物において発現されることを意味する。組換え微生物を培養するために適した培養条件は、以下の添付の実施例により詳細に記載され、当技術分野で公知である。好ましくは、培養条件は、組換え微生物の各種の好ましい培養条件に適合される。特に、本発明の組換え微生物は、培養培地のための炭素源として、例えば、グルコース、スクロース、蜂蜜、デキストリン、デンプン、グリセロール、糖蜜、動物若しくは植物油などを用いて培養することができる。好ましくは、組換え微生物が、配列番号1によってコードされるポリペプチド(複数可)を発現するために配列番号1に含まれるプロモーター配列を使用し、異種プロモーター、好ましくは構成的プロモーターの制御下での配列番号25のポリペプチド又はその変異体の発現についての発現カセットを含まない場合に、ジャガイモのフレークは増殖培地に添加される。さらに、大豆粉、小麦胚芽、コーンスティープリカー(corn steep liquor)、綿実廃棄物、肉抽出物、ポリペプトン、麦芽抽出物、酵母抽出物、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素などは、窒素源のために使用できる。ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸(リン酸水素二カリウムなど)、硫酸(硫酸マグネシウムなど)及び必要に応じて他のイオンを生成し得る無機塩の添加も効果的である。さらに、様々なビタミン類、例えばチアミン(チアミン塩酸塩など)、アミノ酸、例えばグルタミン(グルタミン酸ナトリウムなど)、アスパラギン(DL-アスパラギンなど)、微量栄養素、例えばヌクレオチドなど、及び選択薬物、例えば抗生物質などはまた、必要に応じて添加することができる。さらに、微生物の増殖を補助し、コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン又はそれらの前駆体の生産を促進するために、有機物及び無機物を適切に添加できる。培養培地のpHは、例えば、約pH4.5〜pH8である。培養は、好気条件下の固体培養法、振とう培養法、通気撹拌培養法、又はディープエアロビック(deep aerobic)培養法などの方法を用いて行うことができるが、ディープエアロビック培養法が最も好適である。培養に適した温度は、15℃〜40℃であるが、多くの場合、増殖は20℃〜30℃の範囲で生じる。しかし、ペシロマイセス属及びビソクラミス属は、はるかにより高い温度で増殖することができる中温性、耐熱性及び好熱性の種を含む。
【０２９５】
コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン又はその前駆体の生産は、培養培地及び培養条件、又は使用される宿主に応じて異なるが、いずれの培養法を用いても、コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの蓄積は、一般に5〜20日で最大に達する。培養物中のコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン又はその前駆体の量が最高レベルに達するときに培養は停止され、標的物質は培養物から単離され、培養物質からコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン又はそれらの前駆体を単離するために精製される。
【０２９６】
コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産を可能にするそのような条件の例は、US4897104、US4990178及びUS5424278に開示され、これらは全体において参照により本明細書に含まれる。
【０２９７】
用語「得ること」は、本明細書中で用いられる場合、組換え微生物及び培養培地を含む細胞培養物の提供、並びにコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン又はそれらの前駆体を、好ましくは遊離形態で含むそれらの精製された又は部分的に精製された調製物の提供を包含する。精製技術についてのさらなる詳細は、以下の本明細書中の他の箇所に見出すことができる。これらの状況において一般に使用される抽出及び精製の通常の方法、例えば溶媒抽出などの単離方法、イオン交換樹脂、吸着若しくは分配クロマトグラフィー、ゲルろ過、透析、沈殿、結晶化などを含む方法は、個別に又は適切な組み合わせにおいて使用できる。特に、コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンは、コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンを単離するための公知の方法を用いて、コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンを含有する培地又は溶解物から単離することができる。好ましくは、Furuta 1982, Agricultural and Biological Chemistry (1982), 46(7), 1921-2に開示される単離方法は、本発明の方法において想定される。
【０２９８】
コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン、それらの二塩基形態又はそれらの農学的に許容可能な塩を得ることを可能にする方法の例は、US4897104、US4990178及びUS5424278に開示され、これらは全体において参照により本明細書に含まれる。
【０２９９】
本発明のさらなる方法は、配列番号13、15、19、25、27、29、35、37、41、89、105、142、169、180及び196に示されるアミノ酸配列と少なくと80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドの活性を上方調節することによって、ペシロマイセス・ディバリカタス又はビソクラミス・ベルコサにおいて、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチン、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産を増大させる方法を含む。
【０３００】
本発明のさらなる方法は、配列番号21、25、33又は158に示されるアミノ酸配列と少なくと80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドの活性を上方調節することによって、好ましくは配列番号21、25又は158に示されるアミノ酸配列と少なくと80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドの活性を上方調節することによって、ペシロマイセス・ディバリカタス又はビソクラミス・ベルコサにおいて、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチン、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産を増大させる方法を含む。
【０３０１】
本発明の一実施形態において、上方調節された活性は、配列番号13、15、25、35、41、89、169及び196に示されるアミノ酸配列と少なくと80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドの活性である。
【０３０２】
さらなる方法は、配列番号15又は89に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドの活性を上方調節することによって、ペシロマイセス・ディバリカタス又はビソクラミス・ベルコサにおいてヒドロキシコルネキシスチンの生産を増大させる方法である。
【０３０３】
本発明の別の方法は、配列番号15又は89に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドの活性を下方調節することによって、ペシロマイセス・ディバリカタス又はビソクラミス・ベルコサにおいてコルネキシスチンの生産を増大させる方法である。
【０３０４】
本発明によって提供されるポリヌクレオチドはまた、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンを生産することができる、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンを生産することができる、微生物を同定することを可能にする。
【０３０５】
したがって、本発明は、コルネキシスチン若しくはヒドロキシコルネキシスチンを生産することができる、又はコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンを生産することができる微生物を同定する方法であって、(a)微生物の若しくは組換え微生物のゲノムDNA若しくはcDNAを提供するステップ、及び(b)少なくとも1つの本発明のポリヌクレオチドの存在についてゲノムDNA若しくはcDNAを試験するステップを含む、方法を包含する。
【０３０６】
最後に、本発明に包含されるのは、本明細書に開示される方法のいずれかにおける、概して、コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産のための、本発明のポリヌクレオチド、ベクター又は組換え微生物の使用である。
【０３０７】
本明細書に引用される全ての参考文献は、それらの全開示内容及び本明細書に具体的に言及される開示内容に関して、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０３０８】
コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン遺伝子クラスターを単離及びクローニングするために、酵母である出芽酵母における、形質転換に関連した組換え(transformation-associated recombination: TAR)クローニングを用いる。この方法は、ゲノムDNAと、目的の領域に相同な各標的化配列(以下においてフック(hook)として記載される)を含有する直鎖化されたTARクローニングベクターとの間のin vivo組換えに基づく。本方法は、Larionov et al. 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 491-496及びKouprina and Larionov 2008 (Kouprina and Larionov 2008, Nature Protocols 3: 371-377)などの文献に記載されている。クラスターのクローニングは、Kouprina and Larionov 2008以下(Kouprina and Larionov 2008, Nature Protocols 3: 371-377)によって記載されるように行う。
【０３０９】
[実施例1］
ペシロマイセス・ディバリカタスSANK 21086のゲノムDNAの配列決定
真菌株SANK 21086の染色体DNAを、プロトコールにしたがってQiagen社からのDNAeasyキットを用いて単離した。DNAをDNAシークエンシングにかけ、得られた配列をまとめて、コンティグ配列に対して順序付けた。コンティグ配列を、イントロン及びエキソン同定によってORF及び生じるタンパク質について分析した。アノテーションを行い、ORFに名前を付けた。コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンについての遺伝子クラスターを、ゲノム解析、及びDNAがコードする各タンパク質の、含まれる酵素活性の機能的特徴付けによって、同定する。
【０３１０】
[実施例2］
TARクローニングベクターp9399の構築
プラスミドを、アメリカンタイプカルチャーコレクションATCC番号MBA-212を介して入手可能であり、酵母選択可能マーカー(HIS3)及び酵母セントロメア配列(CEN6)を含有する酵母-大腸菌シャトルベクターpVC-604に基づいて作製する。プラスミドpVC-604を、コルネキシスチン/ヒドロキシコルネキシスチンクラスターの5'隣接領域と相同な300bp配列を表す第一のフック(配列番号56)を組み込むために、BamHIで消化する。配列番号56を有するDNAフラグメントをPCR増幅し、精製し、pVC-604の対応するBamHI部位にライゲーションする。同じやり方で、コルネキシスチン/ヒドロキシコルネキシスチンクラスターの3'隣接領域の300bpを含有する第二のフック(配列番号57)をPCR増幅し、プラスミドp9399を作製するために、EcoRI制限部位にライゲーションする。このプラスミドを、DNA Maxiキット(Qiagen)を用いて大量に単離し、5μgのプラスミド-DNAを、SmaIによって直鎖化し、ゲル抽出によって精製する。直鎖化したプラスミドを、次いで、TARクローニング実験に用いる。
【０３１１】
[実施例3］
ゲノムDNAの調製
TARクローニング実験のためのペシロマイセス・ディバリカタスSANK 21086のゲノムDNAを、供給業者のプロトコールにしたがってZR真菌/細菌DNA MiniPrep(Zymo Research)を用いて単離する。
【０３１２】
[実施例4］
コンピテント酵母スフェロプラストの調製
TARクローニング実験の1日前に、50mlのYEPD培地(2％グルコース、1％バクト酵母抽出物、2％バクトペプトン、80mg/l アデニンヘミ硫酸塩)にアメリカンタイプカルチャーコレクションATCC番号: MYA-3666を介して入手可能な酵母株VL6-48を植菌し、3.0〜5.0のOD660が達成されるまで30℃にて一晩インキュベートする。酵母細胞を1000g及び5℃にて5分間の遠心分離によって回収し、30mlの滅菌水で洗浄し、20mlの1M ソルビトールに再懸濁する。1000g及び5℃にて5分間の遠心分離後、細胞ペレットを20mlのSPE溶液(1M ソルビトール、0.01M Na2HPO4、0.01M Na2EDTA、pH7.5)に再懸濁する。続いて、20μlのザイモリアーゼ溶液(25％(w/v)グリセロール中の10mg/ml ザイモリアーゼ20T)及び40μlのMEを添加し、ゆっくり振とうしながら20分間30℃でインキュベートする。スフェロプラストを5℃、570gで10分間遠心分離し、ペレットを50mlの1M ソルビトールに再懸濁する。洗浄ステップを繰り返した後、最終ペレットを2mlのSTC溶液(1M ソルビトール、0.01M Tris-HCl、0.01M CaCl2、pH7.5)に穏やかに溶解させる。
【０３１３】
[実施例5］
TARベクターp9399を伴うゲノムDNAによるスフェロプラストの形質転換 
200μlのスフェロプラスト懸濁液を、2〜3μgのゲノムDNA及び1μgの直鎖化p9399ベクターと混合し、室温にて10分間インキュベートする。800μlのPEG8000溶液(20％PEG8000、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl、pH7.5)を添加し、サンプルを室温にて10分間インキュベートする。5℃にて300〜500gでの5分間の遠心分離後、スフェロプラストを800μlのSOS溶液(1M ソルビトール、6.5mM CaCl2、0.25％酵母抽出物、0.5％ペプトン)に再懸濁し、振とうせずに30℃にて40分間インキュベートする。スフェロプラストを、7mlの融解したSORB-TOP-His選択培地(1M ソルビトール、2％ D-グルコース、0.17％酵母窒素ベース、0.5％(NH4)2SO4及び3％バクト寒天、以下の補給物質を含有する: 0.006％アデニン硫酸塩、0.006％ウラシル、0.005％ L-アルギニンHCl、0.008％ L-アスパラギン酸、0.01％ L-グルタミン酸、0.005％ L-イソロイシン、0.01％ L-ロイシン、0.012％ L-リジン.HCl、0.002％ L-メチオニン、0.005％ L-フェニルアラニン、0.0375％L-セリン、0.01％ L-トレオニン、0.005％ L-トリプトファン、0.005％ L-チロシン及び0.015％ L-バリン)を含有するチューブに移し、穏やかに混合し、選択培地を有するSORB-Hisプレートに素早く注ぎ入れる。プレートを、形質転換体が見えるようになるまで、30℃にて5〜7日間インキュベートする。
【０３１４】
[実施例6］
遺伝子-陽性プールの同定
300個の一次形質転換体を、つまようじによって、SD-Hisプレート(SORB-TOP-Hisに記載されたように補給された、2％ D-グルコース、0.17％酵母窒素ベース、0.5％(NH4)2SO4、2％バクト寒天)に移し、30個のコロニーを各マスタープレートにプレーティングし、2〜3日間30℃にてインキュベートする。各マスタープレートのレプリカプレートを実施し、マスタープレートを遺伝子-陽性プールの検出に用いる。各マスタープレートからの酵母細胞を5mlの水で洗浄し、細胞を、5℃にて1000gで5分間の遠心分離によってペレット化する。細胞ペレットを1mlの1M ソルビトール溶液に再懸濁し、室温にて2000gで30秒間遠心分離し、0.5mlのME含有SPE溶液(1/1000希釈)に再び再懸濁する。20μlのザイモリアーゼ溶液を添加した後、各サンプルを30℃にて2時間インキュベートする。スフェロプラストを室温にて2000gで5分間の遠心分離によって回収し、0.5mlのEDTAに再懸濁する。スフェロプラストの溶解を、1μlのジエチルピロカーボネートを添加し、15分間70℃にてインキュベートすることによって誘導する。50μlの5M KAc溶液の添加後、チューブを氷上で30分間インキュベートする。沈殿物を、室温にて最大速度(16,000g)で15分間の遠心分離によってペレット化し、上清を新たなチューブに移す。DNAを室温にてエタノールによって抽出し、室温にて最大速度(16,000g)で5分間の遠心分離によってペレット化する。ペレットを0.4mlの水に再懸濁する。0.5mlのイソプロパノール中での洗浄後、最終ペレットを0.3mlの水に溶解させる。
【０３１５】
遺伝子-陽性プールを同定するために、1μlのDNA溶液を、2つの診断用プライマー対P1f: 5'-GGAATAAGCAGGAATGGTTC-3'(配列番号48)、P1r: 5'-CGCATCCATTCTGGAGAAAC-3'(配列番号49)、P2f: 5'-CGCTGGATCTCGGCGTTATC-3'(配列番号50)、P2r: 5'-GCTGAGCTATCTTCTCCGACAAC-3')(配列番号51)を用いた50μlのPCRに使用する。PCRをTaqポリメラーゼの製造業者のプロトコールにしたがって行う。両プライマー対を用いると、遺伝子-陽性プールは、それぞれ、502bp及び558bpのアンプリコンを示す。
【０３１６】
[実施例7］
プールにおける個々の遺伝子-陽性クローンの同定及び分析
陽性プールを有するレプリカプレートからの各形質転換体を、80mlの水、20μlのザイモリアーゼ溶液及び1μlのMEの100μlの混合物に添加し、30℃にて1時間インキュベートする。10μlの2％SDS溶液を添加した後、70℃にてさらに15分間インキュベートし、10μlの5M KAc溶液を添加し、サンプルを15分間氷上に置く。遠心分離後、上清を新しいチューブに移し、等量のイソプロパノールを添加する。サンプルを沈殿させ、最終ペレットを30μlの水に溶解させる。1μlのDNA溶液を上述の診断用プライマー対を用いた50μl PCRに使用する。PCRをTaqポリメラーゼの製造業者のプロトコールにしたがって行う。正しいサイズのPCRアンプリコンを生成した酵母組換え体を、2mlのSD-His培地中で30℃及び225rpmで一晩増殖させる。DNAをChargeSwitch(Invitrogen)核酸精製技術を用いて単離し、大腸菌エレクトロコンピテント細胞に形質転換し、クローニングしたDNAを増幅させる(Kim et al. 2010 Biopolymers 93: 833-844)。
【０３１７】
配列番号1によって記載される遺伝子クラスターを含有するクローンを、上に記載されるように同定し、プラスミドp9399_Co1をもたらし、p9399_Co1を含有する菌株からのDNAを、次に形質転換のために調製する。
【０３１８】
[実施例8］
p9399_Co1及びnat1耐性マーカーの共形質転換
ペシロマイセス・ディバリカタスSANK 21086を、クローニングされたコルネキシスチン/ヒドロキシコルネキシスチンクラスタープラスミドpPtrpC-Pcnat1(配列番号58)で共形質転換する。プラスミドは、陽性のペシロマイセス・ディバリカタス形質転換体を選択するための、コドン最適化したnat1耐性マーカー遺伝子を含有する。共形質転換を、WO12116935に記載されるプロトコールにしたがって行うことができる。加えて、真菌の分生子も形質転換することができる。nat1耐性マーカー遺伝子、及びコルネキシスチン/ヒドロキシコルネキシスチン生合成の酵素をコードする遺伝子クラスターを含有する組換えプラスミドp9399_Co1を有するクローンを、ゲノムDNAを単離し、プライマー
配列番号52(5'-CGACGGCCAGTGAATTGTAATAC-3')及び
配列番号53(5'-GGAGGTAACCCACCTTTCTG-3')又は
配列番号54(5'-GAGCCACCTTTCCCAGAATG-3')及び
配列番号55(5'-GCTCCTATGTTGTGTGGAATTG-3')
を用いるPCRを行うことによって同定する。
【０３１９】
陽性クローンは、それぞれ、711bp及び703bpのバンドを示す。
【０３２０】
[実施例9］
SANK 21086 p9399_Co1を用いたコルネキシスチン/ヒドロキシコルネキシスチンの生産
形質転換体SANK 21086 p9399_Co1を、以下の培地: 5％ジャガイモフレーク、5％グリセロール、0.4％尿素、pH6を含有するバッフルの無いエルレンマイヤー振とうフラスコ中で、及び振幅4cmのロータリーシェーカーにおいて220rpmで増殖させる。26℃にて336時間のインキュベーション後、培養物を遠心分離(10000g、20分)によって回収する。コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンをブロスから単離する。
【０３２１】
・4000rpmで10分間培養物を遠心分離する
・10mLの上清を50mLのファルコンチューブに移し、2M H2SO4でpH2.5に酸性化する
・酸性化した上清を取り、10mLの酢酸エチルを添加し、50mLのファルコンチューブに移す
・ファルコンチューブをパラフィルムで密封し、箱の中に水平に置く
・ファルコンチューブを有する箱を220rpmで20分間振とうさせる
・4000rpmで10分間遠心分離する
・300μLの酢酸エチル抽出物(上の有機相)を真空遠心分離によって蒸発させる
・300μLのアセトニトリルを添加する
・ペレットを溶解させるために室温で1200rpmで10分間振とうする
・0.22μm滅菌フィルターでろ過する
・HPLCバイアルに移し、以下に記載されるように逆相HPLCによって分析する
【０３２２】
コルネキシスチン濃度を以下に記載されるようにHPLC分析によって決定する:
【０３２３】
【表２５】
0006420248.tif 000030
【０３２４】
[実施例10］
異種プロモーターを用いたコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産のための過剰発現カセットのクローニング
コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生合成をコードする遺伝子を、異種プロモーター、例えばA.ニデュランス(A. nidulans)のPtrpcプロモーター(配列番号223)を用いて発現させる。プロモーター遺伝子ターミネーター融合体を、当業者に公知のいくつかの技術によって得ることができる。技術は、プロモーター3'側及び遺伝子5'側についてのオーバーラッピングプライマー、並びにプロモーター5'プライマー及び遺伝子-ターミネーター3'プライマーを用いるPCR融合である。PCR融合を行う方法は、Nucl. Acids Res. (1989) 17: 4895に見出すことができる。プロモーター-遺伝子ターミネーター-融合体を得るための別の方法は、公知の方法(Czar et al. Trends in Biotechnology, 2009, 27, 63-72及びその中の参考文献)によるDNA合成であり得る。
【０３２５】
プロモーター遺伝子ターミネーター融合体を含有するフラグメントを、Biobrick法、Golden Gate法、SLIC法、CEPC法(Li et al. Nature Methods 2007, 4:251-256, Quan et al. PLOS ONE 4: e6441, Engler et al. PLOS ONE, 2008, 3 e3647, Engler et al. PLOS ONE, 2009 4 e5553)などのいくつかの方法によって組み合わせることができる。
【０３２６】
プロモーターPtrpC(配列番号223)及びオープンリーディングフレーム1_9399(配列番号2)、ORF2_9399(配列番号4)、ORF3_9399(配列番号6)、ORF4_9399(配列番号8)、ORF5_9399(配列番号10)、ORF6_9399(配列番号12)、ORF7_9399(配列番号14)、ORF8_9399(配列番号16)、ORF9_9399(配列番号18)、ORF10_9399(配列番号20)、ORF11_9399(配列番号22)、ORF12_9399(配列番号24)、ORF13_9399(配列番号26)、ORF14_9399(配列番号28)、ORF15_9399(配列番号30)、ORF16_9399(配列番号32)、ORF17_9399(配列番号34)、ORF18_9399(配列番号36)、ORF19_9399(配列番号38)、ORF20_9399(配列番号40)、ORF21_9399(配列番号42)、ORF22_9399(配列番号44)、ORF23_9399(配列番号46)をコードする遺伝子を含有する全てのカセットを上に記載される方法によって構築し、一緒に又は2つ以上の部分で、ベクターpPtrpC-Pcnat1(配列番号58)又はベクターpHOFF6(配列番号235)にクローニングする。
【０３２７】
全てのプロモーター-ORFターミネーターカセットを含有するフラグメントを、SwaI消化を用いてベクターから単離することができ、好適な真菌株の形質転換に使用する。
【０３２８】
[実施例11］
ペシロマイセス・ディバリカタスへのコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンクラスターDNAの形質転換
250μlの胞子懸濁液を、100mlのCCM培地(15g/L マルトデキストリン、0.5g/L NaCl、0.5g/L K2HPO4、0.5g/L MgSO4 x 7H2O、10mg/L FeSO4 x 7H2O、5g/L トリプチックソイブロス(Tryptic-Soy-Broth)、1g/L 酵母抽出物、1g/L 肉抽出物、pH6.9〜7.1)を含有する、1つのバッフルを有する500mlフラスコ(1つの形質転換実験について2個のフラスコ)に植菌し、27℃及び120rpmで3日間インキュベートする。菌糸体をろ過によって回収し、20mlのPP緩衝液(0.9M NaCl)を添加することによって洗浄する。乾燥した菌糸体を滅菌フラスコに移し、30mlの3％グルカネックス(Glucanex)溶液を添加する。インキュベーションを27℃及び100rpmで2時間行い、形成されたプロトプラストの顕微鏡的操作が続く。フリット(frit)(孔径1)を用いたプロトプラストのろ過を行う。
【０３２９】
プロトプラスト懸濁液の遠心分離を4℃及び2500rpmで5分間行う。
【０３３０】
上清を捨て、プロトプラストペレットを10mlのPP緩衝液に溶解させる。
【０３３１】
プロトプラスト懸濁液を滅菌チューブ中で4℃及び2500rpmで5分間遠心分離する。
【０３３２】
ペレットを5mlのTP1緩衝液(0.9M NaCl、50mM CaCl2)に溶解させる。
【０３３３】
プロトプラスト力価をAbbe-Zeissのカウンティングセルチャンバー(counting cell chamber)を用いて決定し、力価を1 x 108プロトプラスト/ml TP1緩衝液に調整する。10μgの直鎖DNA1及び2を、50μlのプロトプラスト懸濁液と混合する。12.5μlのTP2緩衝液(25％ PEG6000、50mM CaCl2、10mM Tris、pH7.5)を添加し、氷上で20分間インキュベートする。500μlのTP2緩衝液を添加し、穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートする。1mlのTP1緩衝液を添加する。2 x 780μlの形質転換アプローチを4mlのトップアガーI(CCM + 20％スクロース + 0.8％寒天)と混合し、CCMSプレートに注ぐ。プレートを一晩27℃にてインキュベートする。再生コントロール(regeneration control)の期待がある全てのプレートに11mlのトップアガーII(0.8M NaCl、0.8％寒天 + ノールセオスリシン50μg/ml)を重層し、26℃にて>6日インキュベートする。ノールセオスリシンに耐性があるクローンを単離し、精製し、振とうフラスコ実験におけるコルネキシスチン生産について分析する。
【０３３４】
あるいは、1M ソルビトールに懸濁した80μLの分生子(およそ2〜5*109/mL)を、形質転換される10μgのDNAと混合する。氷上5分のインキュベーション後、混合物を0.2cmキュベットに移す。エレクトロポレーションを2.5kV、400Ω及び25μFで行う。サンプルを1mLのCCMS(CCM + 20％スクロース)にすぐに再懸濁し、26℃及び100rpmで一晩再生させる。翌日、胞子を100μg/mL ノールセオスリシン又は200μg/mLハイグロマイシンを含有するCCMS(+ 2％寒天)にプレーティングし、26℃にて最大6日間インキュベートする。耐性クローンを単離し、精製し、振とうフラスコ実験におけるコルネキシスチン生産について分析する。
【０３３５】
[実施例12］
コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンクラスターDNAでの、アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・オリザの形質転換
アスペルギルス・オリザ株、例えばATCC 1015又はアスペルギルス・オリザATCC 42149、あるいは別の菌株を、CD-Met(40μg/ml L-メチオニンを含有する)寒天培養培地中で30℃にて1週間培養する。分生子(>108)をペトリ皿から回収し、500mlフラスコ中の100mlのYPD液体培養培地に植菌する。20時間(30℃、180rpm)培養した後、マリモ(aegagropila)様のバイオマスを得る。このバイオマスを3G-1ガラスフィルター上に集め、0.8M NaClで洗浄し、次いで、完全に脱水させ、TF溶液I(プロトプラスト化溶液)に懸濁し、30℃、60rpmにて2時間振とうさせる。物質を30分毎に顕微鏡で調べ、プロトプラストの存在を確認する。続いて、培養液をろ過し、プロトプラストを遠心分離(2000rpm、5分)によって回収し、次いで、TF溶液IIで洗浄する。洗浄後、0.8volのTF溶液II及び0.2volのTF溶液IIIを添加し、混合し、プロトプラスト懸濁液を得る。
【０３３６】
導入のためのベクターp9399_Co1及びptrpC nat1のプラスミドDNA(10μgの各ベクターDNA)を200μlのこの液体懸濁液に添加し、30分間氷上に置き、TF溶液III(1mL)を添加し、次いで、穏やかに混合する。続いて、混合物を室温にて15分間置き、プラスミドDNAを前述のプロトプラストに導入する。TF溶液II(8mL)を添加し、混合物を遠心分離し(2,000rpmで5分)、1〜2mlの残存プロトプラストを回収する。回収したプロトプラスト液を再生培養培地(下層)に滴下させ、再生培養培地(上層)を注ぎ入れ、ペトリ皿を回転させることによって混合した後、混合物を30℃にて4〜5日間培養する。出現したクローンを再生培養培地(下層)において単離し、形質転換体(アスペルギルス・オリザATCC 1015及びアスペルギルス・オリザATCC 42149)を続く精製によって得る。
【０３３７】
上述のTF溶液I(プロトプラスト化溶液)は下に示される組成を用いて調製する。
【０３３８】
0006420248.tif 000031
【０３３９】
上述の組成を調製し(pH5.6)、次いで、ろ過滅菌に供する。上述のTF溶液IIは下に示される組成を用いて調製する。
【０３４０】
0006420248.tif 000032
【０３４１】
上述の組成を調製し、次いで、オートクレーブ滅菌に供する。上述のTF溶液IIIは下に示される組成を用いて調製する。
【０３４２】
0006420248.tif 000033
【０３４３】
上述の組成を調製し、次いで、ろ過滅菌に供する。
【０３４４】
上述の培養培地を下に示される組成を用いて調製する。
【０３４５】
0006420248.tif 000034
【０３４６】
上述の組成を調製し(pH5.6)、次いで、オートクレーブ滅菌に供する。
【０３４７】
[実施例13］
コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンクラスターDNAでの、ペニシリウム・クリソゲヌムATCC 11500、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・ニデュランス及びアスペルギルス・フミガーツスの形質転換
プロトプラストを、Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. I I2 (1983) 284-2X9に記載されるように、A.ニデュランス(ATCC 11414、ATCC 10864、若しくは別の菌株)又はA.フミガーツス(ATCC 46645、若しくは別の菌株)の5つのセロファン培養物から調製する。ナイロンフィルタークロス(Gallenkamp, GMX-500-V)及び焼結ガラス(多孔性I)を通したろ過後、プロトプラストを5分間1000 x gで遠心分離し、次いで、0.6M KClで二回及び0.6M KCl、50mM CaClで一回洗浄する。プロトプラストを0.2mlの0.6M KCl、50mM CaClに再懸濁し(0.5〜5 x l08 ml)、次いで、50-4アリコートをスクリューキャップチューブ(Sarstedt)に分注する。次いでDNA(1pg)を添加し、12.5μLのTP2緩衝液(25％PEG 6000(BDH)、50mM CaCl、10mM Tris'HCl、pH7.5)が続く。氷上20分間のインキュベーション後、0.5mlの上記PEG溶液を添加し、混合物を5分間室温に置く。1mlの0.6M KCl、50mM CaCl2を添加し、アリコートをKCl(0.6M)及び寒天(2％ w/v)を含有する融解した最小培地に添加し、次いで、これを最小寒天プレート上に注ぐ。必要な場合、形質転換混合物を0.6M KCI、50mM CaClに希釈する。再生の効率を、KCl及びノールセオスリシンを含有する完全培地中の最終形質転換混合物の10-3希釈のアリコートをプレーティングすることによって評価する。再生対照を除く全てのプレートに11mlのトップアガーII(0.8M NaCl、0.8％寒天+ ノールセオスリシン50μg/ml)を重層し、27℃にて>6日間インキュベートする。
【０３４８】
抗生物質上で増殖できるクローンを単離し、ノールセオスリシンを含有する寒天プレート上で繰り返しインキュベーションすることによって精製し、コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン生産実験に使用する。
【０３４９】
[実施例14］
DNAでの形質転換後の真菌株の増殖
DNAでの形質転換後の真菌株の増殖、微生物の培地及び培養:
プラスミドp9399_Co1からのコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン遺伝子クラスターの遺伝子で首尾よく形質転換されるアスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・フミガーツス、アスペルギルス・ニガーATCC 10864、及びペニシリウム・クリソゲヌムATCC 11500株を、YG(0.5％酵母抽出物、2％グルコース)、完全培地、又は炭素源としての1％(w/v)グルコース及び窒素源としての5mMのグルタミン酸ナトリウム及びトリプトファンを有するアスペルギルス最小培地中(Biophys Acta 113:51-56)で、適切なインキュベーション温度(ペニシリウム・クリソゲヌムについて26℃、A.ニガー及びA.ジャポニクスについて30℃、A.フミガーツス及びA.ニデュランスについて37℃)で培養する。
【０３５０】
B. あるいは、菌株をグルコース一水和物80g/l、脱脂小麦胚芽ミール10g/l、脱脂大豆ミール16g/l、L-グルタミン酸3g/l、NaCl 1.25g/l、CaCO3 1.5g/l、シリコン油KM-72 0.03g/lを含有する培地上で増殖させる。あるいは、菌株を、30g/l マンニトール、10g/l グルコース、10g/l コハク酸、1g/l KH2PO4、0.3g/l MgSO4*7H2Oを含有し、NH4OHでpHを5.6に調整した培地中で増殖させる。固体培地は1.5％バクト寒天又は最小寒天プレートの場合にはDifco寒天を含有した。必要な場合、p-アミノ安息香酸(0.11mM)、ノールセオスリシン(50μg/ml)を添加する。 
【０３５１】
抗生物質に耐性があるクローンを、160〜250rpmにて5cmの動力行程で250mlのバッフルがある振とうフラスコ中で増殖させる。25mlの培地に新たに増殖させた菌糸体を植菌し、適切なインキュベーション温度(ペニシリウムについて26℃、A.ニガーについて30℃、A.フミガーツス及びA.ニデュランスについて37℃)にて7日間インキュベートする。
【０３５２】
細胞及びブロスを回収し、Furuta, Takaki; Koike, Masami; Abe, Matazo, Agricultural and Biological Chemistry (1982), 46, 1921-22に記載されるように抽出する。
【０３５３】
[実施例15］
形質転換した真菌株によって生産されるコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンは、適切なHPLC法によって分析できる
コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンを以下のHPLC法によって分析する: 2μlサンプルサイズの注入体積を、40℃の温度にてROD-HLPCカラム、50x4.6mm(Merck KGa Darmstadt Germany)に注入する。溶出のために、以下の溶媒を使用する: アセトニトリル+0.1％TFA; 水+0.1％TFA。流速を1.8ml/分に設定し、溶出する化合物の検出を電気化学的検出によって行う。HPLCのキャリブレーションのために、コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの標準を用いる。あるいは、以下の方法を用いることができる: カラム: Eclipse XDB C18(150*4.6mm)、40℃にて、1.00mL/分の流速、10.0μlの注入体積。検出をUV210nmにて行った。最大圧力を300barに設定した。溶出液Aは0.1％H3PO4を有するH2Oであり、溶出液Bは以下の勾配を有するアセトニトリルであった:
【０３５４】
0006420248.tif 000035
【０３５５】
[実施例16］
RNA-Seqを介した生合成クラスターの同定
2mLのペシロマイセス・ディバリカタス分生子懸濁液(およそ109胞子/mL)を、バッフルの無い500mL エルレンマイヤーフラスコに充填された100mLの前培養培地(20g/L グルコース一水和物、20g/L ポリペプトン、10g/L 麦芽抽出物、10g/L 酵母抽出物、1g/L K2HPO4、0.5g/L MgSO4 x 7H2O、0.001％シリコン油AR1000、pH7.0)中で増殖させる。フラスコを26℃及び220rpmにて3日間インキュベートする。
【０３５６】
24x2mLの前培養物を用いて、バッフルの無い500mL エルレンマイヤーフラスコに充填された24x100mLの前培養培地を植菌する。24x2mLの前培養物を用いて、バッフルの無い500mL エルレンマイヤーフラスコに充填された24x100mLの生産培地(50g/L ジャガイモフレーク、50g/L グリセロール、4g/L 尿素、pH6.0)を植菌する。全てのフラスコを26℃及び220rpmにて最大13日間インキュベートする。
【０３５７】
2日目から毎日、前培養培地中で増殖させた菌糸体を有する2つのフラスコ及び生産培地中で増殖させた菌糸体を有する2つのフラスコを回収し、上清を抽出し、HPLCによってコルネキシスチン生産について分析する(図26、実施例9及び15を参照)。
【０３５８】
3日間前培養培地中で増殖させた菌糸体、並びに2、3及び6日間生産培地中で増殖させた菌糸体から、それぞれRNAを単離する。RNA単離及びDNase消化を、QiagenのRNeasy Plantキットを用いて行う。RNAサンプルを、RNA-Seqを介したトランスクリプトーム解析のために用いる。
【０３５９】
結果を比較表としてもたらし、スライディングウィンドウ解析(sliding window analysis)によってトランスクリプトーム全体について調べる(表26)。各遺伝子について、+/-5個の遺伝子にわたって平均化した平均倍数変化を決定する(前培養物における3日目と比較した生産培地における6日目のRPKM値)。カットオフを5の倍数変化に設定する。最大の倍数変化を有する領域は、コルネキシスチンの生合成に必要な遺伝子を含有する。
【０３６０】
【表２６】
0006420248.tif 000036
【０３６１】
このクラスター内の遺伝子がどのように誘導されるかを、同様に分析し、クラスター内の多くの遺伝子が、前培養物における3日目と比較して生産培地において6日目に有意に誘導されることを示す(表27)。
【０３６２】
【表２７】
0006420248.tif 000037
【０３６３】
[実施例17］
クラスター9399におけるポリケチドシンターゼの欠失 
正しいクラスターの同定を確認するために、クラスター9399内のポリケチドシンターゼをスプリット-マーカーシステム(split-marker system)を用いて欠失させる。
【０３６４】
スプリットマーカーフラグメントを、フラグメント1についてプライマーKO_PKS_1 fw及びKO_PKS_1 rv(配列番号225+226)並びにフラグメント2についてプライマーKO_PKS_2 fw及びKO_PKS_2 rv(配列番号227+228)を用いて、プラスミドpKO-PKS(配列番号224)からPCRによって増幅させる。
【０３６５】
ペシロマイセス・ディバリカタスを、2つのスプリットマーカーノックアウトフラグメントで等モル比で形質転換する(実施例11を参照)。
【０３６６】
ゲノムDNAを、ノールセオスリシン耐性クローンから単離する(実施例3を参照)。いくつかのPCRを行い、適切に欠失したポリケチドシンターゼコード領域を有するクローンを同定する。プライマーである上流5'隣接fw及びclonNAT rv(配列番号229+230)を用いて、ポリケチドシンターゼコード領域の上流のスプリットマーカーフラグメントの正しい組換えを確かめる。プライマーであるclonNAT fw及び下流3'隣接rv(配列番号231+232)を用いて、ポリケチドシンターゼコード領域の下流のスプリットマーカーフラグメントの正しい組換えを確かめる。プライマーPKS fw及びPKS rv(配列番号233+234)を用いて、コルネキシスチン生合成クラスター内のポリケチドシンターゼの欠失を確かめる。野生型株及びヘテロカリオン欠失株のみがこのPCRでシグナルを示す。
【０３６７】
ホモカリオン欠失株を得るために、一ラウンドの単一胞子単離を行う。
【０３６８】
野生型株及び3個のポリケチドシンターゼ欠失クローンを、振とうフラスコ実験によってコルネキシスチン生産について調べる:
【０３６９】
2mLのペシロマイセス・ディバリカタス分生子懸濁液(およそ109胞子/mL、野生型由来又は欠失クローン由来のいずれか)を、バッフルの無い500mLエルレンマイヤーフラスコに充填された100mLの前培養培地(20g/L グルコース一水和物、20g/L ポリペプトン、10g/L 麦芽抽出物、10g/L 酵母抽出物、1g/L K2HPO4、0.5g/L MgSO4 x 7H2O、0.001％シリコン油AR1000、pH7.0)中で増殖させる。フラスコを26℃及び220rpmにて3日間インキュベートする。
【０３７０】
2mLの前培養物を用いて、バッフルの無い500mL エルレンマイヤーフラスコに充填された100mLの生産培地(50g/L ジャガイモフレーク、50g/L グリセロール、4g/L 尿素、pH6.0)を植菌する。全てのフラスコを26℃及び220rpmにて11日間インキュベートする。菌糸体を回収し、上清を抽出し、HPLCによってコルネキシスチン生産について分析する(実施例9及び15を参照)。
【０３７１】
【表２８】
0006420248.tif 000038
【０３７２】
[実施例18］
コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産のためのクラスター9399における転写調節因子の過剰発現
コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン生産を増加させるため、クラスター9399に存在する転写調節因子(配列番号24+25)を、ペシロマイセス・ディバリカタス由来の強力なHSP9プロモーター(配列番号236)を用いて過剰発現させる。
【０３７３】
この手段のため、過剰発現プラスミドpHOFF6 Phsp9-TF1(配列番号239)を、CPEC(環状ポリメラーゼ伸長クローニング)を用いて構築する。
【０３７４】
ペシロマイセス・ディバリカタスを、環状過剰発現コンストラクトpHOFF6 Phsp9-TF1(配列番号239)で形質転換する(実施例11を参照)。
【０３７５】
ゲノムDNAをハイグロマイシン耐性クローンから単離する(実施例3を参照)。PCRを、プライマーPhsp9 fw及びTF rv(配列番号240+241)を用いて行い、過剰発現コンストラクトが組み込まれたクローンを同定する。
【０３７６】
野生型株及び5個の転写因子過剰発現クローンを、振とうフラスコ実験によってコルネキシスチン生産について調べる:
【０３７７】
2mLのペシロマイセス・ディバリカタス分生子懸濁液(およそ109胞子/mL、野生型由来又は過剰発現クローン由来のいずれか)を、バッフルの無い500mL エルレンマイヤーフラスコに充填された100mLの前培養培地(20g/L グルコース一水和物、20g/L ポリペプトン、10g/L 麦芽抽出物、10g/L 酵母抽出物、1g/L K2HPO4、0.5g/L MgSO4 x 7H2O、0.001％シリコン油AR1000、pH7.0)中で増殖させる。フラスコを26℃及び220rpmにて3日間インキュベートする。
【０３７８】
2mLの前培養物を用いて、バッフルの無い500mL エルレンマイヤーフラスコに充填された100mLの生産培地(50g/L ジャガイモフレーク、50g/L グリセロール、4g/L 尿素、pH6.0)を植菌する。全てのフラスコを26℃及び220rpmにて13日間インキュベートする。菌糸体を回収し、上清を抽出し、HPLCによってコルネキシスチン生産について分析する(実施例9及び15を参照)。結果は、クローン毎の2つの独立した振とうフラスコの平均力価を示す。
【０３７９】
【表２９】
0006420248.tif 000039
【０３８０】
[実施例19］
実施例18からの形質転換体を用いたジャガイモを含まない培地におけるコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産
(a)ジャガイモ成分から独立してコルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンを生産するために、クラスター9399に存在する転写調節因子(配列番号24+25)を、ペシロマイセス・ディバリカタス由来の強力なHSP9プロモーター(配列番号236)を用いて過剰発現させる。
【０３８１】
この手段のため、過剰発現プラスミドpHOFF6 Phsp9-TF1(配列番号239)を、CPEC(環状ポリメラーゼ伸長クローニング)を用いて構築する。 
【０３８２】
ペシロマイセス・ディバリカタスを、環状過剰発現コンストラクトpHOFF6 Phsp9-TF1(配列番号239)で形質転換する(実施例11を参照)。 
【０３８３】
ゲノムDNAをハイグロマイシン耐性クローンから単離する(実施例3を参照)。PCRを、プライマーPhsp9 fw及びTF rv(配列番号240+241)を用いて行い、過剰発現コンストラクトが組み込まれたクローンを同定する。
【０３８４】
野生型株及び5個の転写因子過剰発現クローンを、振とうフラスコ実験によってコルネキシスチン生産について調べる:
【０３８５】
2mLのペシロマイセス・ディバリカタス分生子懸濁液(およそ109胞子/mL、野生型由来又は過剰発現クローン由来のいずれか)を、バッフルの無い500mL エルレンマイヤーフラスコに充填された100mLの前培養培地(20g/L グルコース一水和物、20g/L ポリペプトン、10g/L 麦芽抽出物、10g/L 酵母抽出物、1g/L K2HPO4、0.5g/L MgSO4 x 7H2O、0.001％シリコン油AR1000、pH7.0)中で増殖させる。フラスコを26℃及び220rpmにて3日間インキュベートする。
【０３８６】
2mLの前培養物を用いて、バッフルの無い500mL エルレンマイヤーフラスコに充填された100mLの改変した前培養培地(20g/L グリセロール、10g/L 麦芽抽出物、10g/L 酵母抽出物、3.6g/L ACES、0.5g/L MgSO4 x 7H2O、0.001％シリコン油AR1000、pH6.0)を植菌する。全てのフラスコを26℃及び220rpmにて13日間インキュベートする。菌糸体を回収し、上清を抽出し、HPLCによってコルネキシスチン生産について分析する(実施例9及び15を参照)。結果は、クローン毎の2つの独立した振とうフラスコの平均力価を示す。
【０３８７】
【表３０】
0006420248.tif 000040
【０３８８】
(b)あるいは、野生型株及び5個の転写因子過剰発現クローンを、改変した振とうフラスコ実験によってコルネキシスチン生産について調べる:
【０３８９】
2mLのペシロマイセス・ディバリカタス分生子懸濁液(およそ109胞子/mL、野生型由来又は過剰発現クローン由来のいずれか)を、バッフルの無い500mL エルレンマイヤーフラスコに充填された100mLの前培養培地(20g/L グルコース一水和物、20g/L ポリペプトン、10g/L 麦芽抽出物、10g/L 酵母抽出物、1g/L K2HPO4、0.5g/L MgSO4 x 7H2O、0.001％シリコン油AR1000、pH7.0)中で増殖させる。フラスコを26℃及び220rpmにて3日間インキュベートする。
【０３９０】
2mLの前培養物を用いて、バッフルの無い500mL エルレンマイヤーフラスコに充填された100mLの改変した前培養培地(50g/L グリセロール、4g/L 尿素、10g/L 麦芽抽出物、10g/L 酵母抽出物、3.6g/L ACES、0.5g/L MgSO4x 7H2O、0.001％シリコン油AR1000、pH6.0)を植菌する。全てのフラスコを26℃及び220rpmにて13日間インキュベートする。
【０３９１】
7日後、10mLの50％ w/v グリセロールを各フラスコに添加し、インキュベーションを13日目まで継続する。菌糸体を回収し、上清を抽出し、HPLCによってコルネキシスチン生産について分析する(実施例9及び15を参照)。結果は、クローン毎の2つの独立した振とうフラスコの平均力価を示す。
【０３９２】
【表３１】
0006420248.tif 000041
【０３９３】
[実施例20］
コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産のためのクラスター9399におけるのトランスポータータンパク質10の過剰発現
コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン生産を増加させるため、クラスター9399に存在するトランスポータータンパク質10(配列番号20+21)を、A.ニデュランスの異種構成的プロモーターtrpC(配列番号223)を用いて過剰発現させる。
【０３９４】
この手段のため、過剰発現プラスミドpHOFF6-トランスポーター10(配列番号242)をIn-Fusionクローニングを用いて構築する。
【０３９５】
ペシロマイセス・ディバリカタスを、環状過剰発現コンストラクトpHOFF6-トランスポーター10(配列番号242)で形質転換する(実施例11を参照)。
【０３９６】
ゲノムDNAをハイグロマイシン耐性クローンから単離する(実施例3を参照)。PCRを、プライマーであるトランスポーター10 fw及びTtrpC rv(配列番号243+244)を用いて行い、過剰発現コンストラクトが組み込まれたクローンを同定する。
【０３９７】
野生型株及び1個のトランスポーター過剰発現クローンを、振とうフラスコ実験によってコルネキシスチン生産について調べる:
【０３９８】
2mLのペシロマイセス・ディバリカタス分生子懸濁液(およそ109胞子/mL、野生型由来又は過剰発現クローン由来のいずれか)を、バッフルの無い500mL エルレンマイヤーフラスコに充填された100mLの前培養培地(20g/L グルコース一水和物、20g/L ポリペプトン、10g/L 麦芽抽出物、10g/L 酵母抽出物、1g/L K2HPO4、0.5g/L MgSO4 x 7H2O、0.001％シリコン油AR1000、pH7.0)中で増殖させる。フラスコを26℃及び220rpmにて3日間インキュベートする。
【０３９９】
2mLの前培養物を用いて、バッフルの無い500mL エルレンマイヤーフラスコに充填された100mLの生産培地(50g/L ジャガイモフレーク、50g/L グリセロール、4g/L 尿素、pH6.0)を植菌する。全てのフラスコを26℃及び220rpmにて13日間インキュベートする。菌糸体を回収し、上清を抽出し、HPLCによってコルネキシスチン生産について分析する(実施例9及び15を参照)。結果は、クローン毎の2つの独立した振とうフラスコの平均力価を示す。
【０４００】
0006420248.tif 000042
【０４０１】
[実施例21］
コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産のためのクラスター9399におけるのポリケチドシンターゼの過剰発現
コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン生産を増加させるため、クラスター9399に存在するポリケチドシンターゼ(配列番号40+41)を、ペシロマイセス・ディバリカタス由来の強力なHSP9プロモーター(配列番号236)を用いて過剰発現させる。
【０４０２】
この手段のため、過剰発現プラスミドpHOFF6 Phsp9-ポリケチドシンターゼ(配列番号247)をIn-Fusionクローニングを用いて構築する。
【０４０３】
ペシロマイセス・ディバリカタスを、環状過剰発現コンストラクトpHOFF6 Phsp9-ポリケチドシンターゼ(配列番号245)で形質転換する(実施例11を参照)。
【０４０４】
ゲノムDNAをハイグロマイシン耐性クローンから単離する(実施例3を参照)。PCRを、プライマーPhsp9 fw及びPKS rv(配列番号240+246)を用いて行い、過剰発現コンストラクトが組み込まれたクローンを同定する。
【０４０５】
野生型株及び1個のポリケチドシンターゼ過剰発現クローンを、振とうフラスコ実験によってコルネキシスチン生産について調べる:
【０４０６】
2mLのペシロマイセス・ディバリカタス分生子懸濁液(およそ109胞子/mL、野生型由来又は過剰発現クローン由来のいずれか)を、バッフルの無い500mL エルレンマイヤーフラスコに充填された100mLの前培養培地(20g/L グルコース一水和物、20g/L ポリペプトン、10g/L 麦芽抽出物、10g/L 酵母抽出物、1g/L K2HPO4、0.5g/L MgSO4 x 7H2O、0.001％シリコン油AR1000、pH7.0)中で増殖させる。フラスコを26℃及び220rpmにて3日間インキュベートする。
【０４０７】
2mLの前培養物を用いて、バッフルの無い500mL エルレンマイヤーフラスコに充填された100mLの生産培地(50g/L ジャガイモフレーク、50g/L グリセロール、4g/L 尿素、pH6.0)を植菌する。全てのフラスコを26℃及び220rpmにて13日間インキュベートする。菌糸体を回収し、上清を抽出し、HPLCによってコルネキシスチン生産について分析する(実施例9及び15を参照)。結果は、クローン毎の2つの独立した振とうフラスコの平均力価を示す。
【０４０８】
0006420248.tif 000043
【０４０９】
[実施例22］
コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産のためのクラスター9399のフラグメントD上の遺伝子の過剰発現
コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン生産を増加させるため、クラスター9399のクラスターフラグメントD(配列番号247)上の遺伝子を、このフラグメントの第二のコピーを挿入することによって過剰発現させる。
【０４１０】
この手段のため、プラスミドpフラグメントD(配列番号248)を、出芽酵母における、形質転換に関連した組換えを用いて構築する。
【０４１１】
ペシロマイセス・ディバリカタスを、環状過剰発現コンストラクトpフラグメントD(配列番号248)で形質転換する(実施例11を参照)。
【０４１２】
ゲノムDNAをノールセオスリシン耐性クローンから単離する(実施例3を参照)。PCRを、プライマーAmpR fw及び5'フラグメントD rv(配列番号249+250)並びにプライマー3'フラグメントD fw及びPtrpC pcnat1 rv(配列番号251+252)を用いて行い、フラグメントDが5'及び3'末端の両方において組み込まれたクローンを同定する。
【０４１３】
フラグメントDは、転写調節因子、グルコノラクトナーゼ、クエン酸シンターゼ及びジオキシゲナーゼ(配列番号24〜31)をコードする遺伝子を含有する。
【０４１４】
野生型株及び2個のフラグメントD過剰発現クローンを、振とうフラスコ実験によってコルネキシスチン生産について調べる:
【０４１５】
2mLのペシロマイセス・ディバリカタス分生子懸濁液(およそ109胞子/mL、野生型由来又は過剰発現クローン由来のいずれか)を、バッフルの無い500mL エルレンマイヤーフラスコに充填された100mLの前培養培地(20g/L グルコース一水和物、20g/L ポリペプトン、10g/L 麦芽抽出物、10g/L 酵母抽出物、1g/L K2HPO4、0.5g/L MgSO4 x 7H2O、0.001％シリコン油AR1000、pH7.0)中で増殖させる。フラスコを26℃及び220rpmにて3日間インキュベートする。
【０４１６】
2mLの前培養物を用いて、バッフルの無い500mL エルレンマイヤーフラスコに充填された100mLの生産培地(50g/L ジャガイモフレーク、50g/L グリセロール、4g/L 尿素、pH6.0)を植菌する。全てのフラスコを26℃及び220rpmにて13日間インキュベートする。菌糸体を回収し、上清を抽出し、HPLCによってコルネキシスチン生産について分析する(実施例9及び15を参照)。結果は、クローン毎の2つの独立した振とうフラスコの平均力価を示す。
【０４１７】
0006420248.tif 000044
【０４１８】
[実施例23］
コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチンの生産のためのクラスター9399のフラグメントF上の遺伝子の過剰発現
コルネキシスチン及びヒドロキシコルネキシスチン生産を増加させるため、クラスター9399のクラスターフラグメントF(配列番号253)上の遺伝子を、このフラグメントの第二のコピーを挿入することによって過剰発現させる。
【０４１９】
この手段のため、プラスミドpフラグメントF(配列番号2254)を、出芽酵母における、形質転換に関連した組換えを用いて構築する。
【０４２０】
ペシロマイセス・ディバリカタスを、環状過剰発現コンストラクトpフラグメントF(配列番号254)で形質転換する(実施例11を参照)。
【０４２１】
ゲノムDNAをノールセオスリシン耐性クローンから単離する(実施例3を参照)。PCRを、プライマーAmpR fw及び5'フラグメントF rv(配列番号249+255)並びにプライマー3'フラグメントF fw及びPtrpC pcnat1 rv(配列番号256+252)を用いて行い、フラグメントFが5'及び3'末端の両方において組み込まれたクローンを同定する。
【０４２２】
フラグメントFは、ポリケチドシンターゼ、あるタンパク質及び別のタンパク質(配列番号40〜45)をコードする遺伝子を含有する。
【０４２３】
野生型株及び1個のフラグメントF過剰発現クローンを、振とうフラスコ実験によってコルネキシスチン生産について調べる:
【０４２４】
2mLのペシロマイセス・ディバリカタス分生子懸濁液(およそ109胞子/mL、野生型由来又は過剰発現クローン由来のいずれか)を、バッフルの無い500mL エルレンマイヤーフラスコに充填された100mLの前培養培地(20g/L グルコース一水和物、20g/L ポリペプトン、10g/L 麦芽抽出物、10g/L 酵母抽出物、1g/L K2HPO4、0.5g/L MgSO4 x 7H2O、0.001％シリコン油AR1000、pH7.0)中で増殖させる。フラスコを26℃及び220rpmにて3日間インキュベートする。
【０４２５】
2mLの前培養物を用いて、バッフルの無い500mLエルレンマイヤーフラスコに充填された100mLの生産培地(50g/Lジャガイモフレーク、50g/Lグリセロール、4g/L尿素、pH6.0)を植菌する。全てのフラスコを26℃及び220rpmにて13日間インキュベートする。菌糸体を回収し、上清を抽出し、HPLCによってコルネキシスチン生産について分析する(実施例9及び15を参照)。結果は、クローン毎の2つの独立した振とうフラスコの平均力価を示す。
【０４２６】
0006420248.tif 000045
【図１】
0006420248.tif 000046
【図２ａ】
0006420248.tif 000047
【図２ｂ】
0006420248.tif 000048
【図３ａ】
0006420248.tif 000049
【図３ｂ】
0006420248.tif 000050
【図４ａ】
0006420248.tif 000051
【図４ｂ】
0006420248.tif 000052
【図４ｃ】
0006420248.tif 000053
【図４ｄ】
0006420248.tif 000054
【図５ａ】
0006420248.tif 000055
【図５ｂ】
0006420248.tif 000056
【図６】
0006420248.tif 000057
【図７ａ】
0006420248.tif 000058
【図７ｂ】
0006420248.tif 000059
【図８ａ】
0006420248.tif 000060
【図８ｂ】
0006420248.tif 000061
【図８ｃ】
0006420248.tif 000062
【図９ａ】
0006420248.tif 000063
【図９ｂ】
0006420248.tif 000064
【図９ｃ】
0006420248.tif 000065
【図９ｄ】
0006420248.tif 000066
【図１０ａ】
0006420248.tif 000067
【図１０ｂ】
0006420248.tif 000068
【図１１ａ】
0006420248.tif 000069
【図１１ｂ】
0006420248.tif 000070
【図１２ａ】
0006420248.tif 000071
【図１２ｂ】
0006420248.tif 000072
【図１３ａ】
0006420248.tif 000073
【図１３ｂ】
0006420248.tif 000074
【図１３ｃ】
0006420248.tif 000075
【図１３ｄ】
0006420248.tif 000076
【図１３ｅ】
0006420248.tif 000077
【図１４ａ】
0006420248.tif 000078
【図１４ｂ】
0006420248.tif 000079
【図１５ａ】
0006420248.tif 000080
【図１５ｂ】
0006420248.tif 000081
【図１６ａ】
0006420248.tif 000082
【図１６ｂ】
0006420248.tif 000083
【図１６ｃ】
0006420248.tif 000084
【図１６ｄ】
0006420248.tif 000085
【図１７ａ】
0006420248.tif 000086
【図１７ｂ】
0006420248.tif 000087
【図１８ａ】
0006420248.tif 000088
【図１８ｂ】
0006420248.tif 000089
【図１８ｃ】
0006420248.tif 000090
【図１８ｄ】
0006420248.tif 000091
【図１９ａ】
0006420248.tif 000092
【図１９ｂ】
0006420248.tif 000093
【図２０ａ】
0006420248.tif 000094
【図２０ｂ】
0006420248.tif 000095
【図２０ｃ】
0006420248.tif 000096
【図２０ｄ】
0006420248.tif 000097
【図２１】
0006420248.tif 000098
【図２２ａ】
0006420248.tif 000099
【図２２ｂ】
0006420248.tif 000100
【図２２ｃ】
0006420248.tif 000101
【図２２ｄ】
0006420248.tif 000102
【図２２ｅ】
0006420248.tif 000103
【図２２ｆ】
0006420248.tif 000104
【図２２ｇ】
0006420248.tif 000105
【図２２ｈ】
0006420248.tif 000106
【図２２ｉ】
0006420248.tif 000107
【図２２ｊ】
0006420248.tif 000108
【図２２ｋ】
0006420248.tif 000109
【図２２ｌ】
0006420248.tif 000110
【図２２ｍ】
0006420248.tif 000111
【図２２ｎ】
0006420248.tif 000112
【図２２ｏ】
0006420248.tif 000113
【図２２ｐ】
0006420248.tif 000114
【図２２ｑ】
0006420248.tif 000115
【図２２ｒ】
0006420248.tif 000116
【図２３】
0006420248.tif 000117
【図２４】
0006420248.tif 000118
【図２５ａ】
0006420248.tif 000119
【図２５ｂ】
0006420248.tif 000120
【図２６】
0006420248.tif 000121
【配列表】
0006420248000001.app