(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粘度及び幾何学的流体焦点調節を組み合わせるように構成される粒子分析システムを使用して粒子を撮像する方法であって、前記粒子が血液サンプル内に含まれ、前記方法は、
前記粒子分析器のフローセルの流路に沿ってシース液を注入する工程であって、前記シース液が、前記血液サンプルの粘度よりも大きい粘度を有する、工程と、
前記血液サンプルをサンプル流体注入管からある流速で前記フローセル内を流れる前記シース液中に注入し、前記サンプル流体注入管に隣接して第１厚さを有するサンプル流体流をもたらす工程であって、前記フローセルの流路が、前記サンプル流体流の厚さが前記第１厚さから画像取込部位に近接する第２厚さまで減少するように、流路サイズが減少する、工程と、
前記フローセルの画像取込部位において前記サンプルの第１の複数の粒子を撮像する工程と、を含み、
前記流路サイズの減少が、近位厚さを有する近位流路部、及び、前記近位厚さ未満の遠位厚さを有する遠位流路部によって画定され、前記近位厚さの前記遠位厚さに対する比は、１０〜２００の範囲内にあり、
前記サンプル流体注入管の下流端が、前記近位流路部より遠位に位置し、
前記シースと血液サンプルとの間の粘度差を、前記流路サイズの減少及び前記サンプルの流速と組み合わせると、細胞が前記サンプル流体注入管から前記画像取込部位まで進むとき、前記シース液中の粘性剤が前記細胞の生存率を保持し、前記細胞が前記サンプル流体流から前記流れるシース液中に広がるとき、前記細胞の構造及び内容物を無傷のままにしながらも、前記血液サンプル中の細胞を前記サンプル流体注入管から前記画像取込部位まで４秒以下で進めるのに有効である、方法。
【請求項２】
前記サンプル流体注入管が、前記サンプル流体注入管の流路断面積対前記フローセルの流路断面積の比、前記サンプル流体注入管の流路断面積対前記フローセルの外径の比、又は、前記サンプル流体注入管の流路断面積対前記サンプル流体流の流路断面積の比に基づく内部容積を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記シース液がシース液流速で前記流路に沿って注入され、前記シース液の流速及び前記フローセルの流路断面積がシース液速度に対応し、前記血液サンプルの流速及び前記サンプル流体注入管の出口の流路断面積がサンプル速度に対応し、前記シース液速度と前記サンプル速度との間に速度差がある、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記粘度差及び速度差、並びに、前記流路サイズの減少が、前記画像取込部位における前記血液サンプル中の細胞の流体焦点調節に有効である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記流路サイズの減少が、前記サンプル流体流を第１厚さ及び第２厚さに二分する横断面に対して概ね対称である、前記流路に沿って半径方向内向きに角度付いた流路の対向壁によって画定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記流路サイズの減少における対称性が、前記血液サンプル中の赤血球撮像方向の誤整列を約２０％未満に制限するのに有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記血液サンプルが球状粒子を含み、前記サンプル流体と前記シース液との間の粘度差が、球状粒子の細胞内オルガネラを、前記フローセルの前記画像取込部位における焦点面内に整列させるのに有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプル流体注入管が、第１流路断面積を有する近位部と、第２流路断面積を有する遠位部と、を含み、前記近位部の流路断面積が前記遠位部の流路断面積の１．５倍を超える、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
シース液の流速のサンプル流体の流速に対する比が約２００である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記シース液が約３５μＬ／ｓの流速を有し、前記サンプル流体が約０．５μＬ／ｓの流速を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプル流体が、前記画像取込部位において約２０〜２００ｍｍ／秒の速度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプル流体流の第２厚さが、約２μｍ〜約１０μｍの範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプル流体流の第２厚さが、約２μｍ〜約４μｍの範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプル流体流の第１厚さ対前記サンプル流体流の第２厚さの比が、約２０：１〜約７０：１の範囲内の値を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
血液サンプル中の粒子の撮像のために、粘度及び幾何学的流体焦点調節を組み合わせて実行する粒子分析システムであって、
シース液の流れを送るように構成される流路を有するフローセルであって、前記シース液が前記血液サンプルの粘度よりも大きい粘度を有する、フローセルと、
前記流路と流体連通しており、前記サンプルを前記フローセル内を流れるシース液内に注入し、サンプル流体注入管に隣接して第１厚さを有するサンプル流体流をもたらすように構成される、サンプル流体注入システムであって、前記フローセルの流路が、前記サンプル流体流の厚さが前記第１厚さから画像取込部位に近接する第２厚さまで減少するように、流路サイズが減少し、前記流路サイズの減少が、近位厚さを有する近位流路部、及び、遠位厚さを有する遠位流路部によって画定され、前記近位厚さの前記遠位厚さに対する比は、１０〜２００の範囲内にあり、前記サンプル流体注入管の下流端が、前記近位流路部より遠位に位置する、サンプル流体注入システムと、
前記サンプル流体の複数の粒子を前記フローセルの前記画像取込部位において撮像するための、前記画像取込部位と整列する画像取込装置と、
前記サンプル流体注入システム及び前記画像取込装置と連結されるプロセッサであって、前記シースと血液サンプルとの間の粘度差を、前記流路サイズの減少及びサンプル流体流の流速と組み合わせると、細胞が前記サンプル流体注入管から前記画像取込部位まで進むとき、前記シース液中の粘性剤が前記細胞の生存率を保持し、前記細胞が前記サンプル流体流から前記流れるシース液中に広がるとき、前記細胞の構造及び内容物を無傷のままにしながらも、前記血液サンプル中の細胞を前記サンプル流体注入管から前記画像取込部位まで４秒以下で進めるのに有効であるように、前記サンプル流体を前記流れるシース液中にサンプル流速での注入を開始するように構成される、プロセッサと、を備える、システム。
【請求項１６】
前記サンプル流体注入管が、前記サンプル流体注入管の流路断面積対前記フローセルの流路断面積の比、前記サンプル流体注入管の流路断面積対前記フローセルの外径の比、又は、前記サンプル流体注入管の流路断面積対前記サンプル流体流の流路断面積の比に基づく内部容積を含む、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記流路サイズの減少が、前記サンプル流体流を第１厚さ及び第２厚さに二分する横断面に対して概ね対称である、前記流路に沿って半径方向内向きに角度付いた流路の対向壁によって画定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記流路サイズの減少における対称性が、前記血液サンプル中の赤血球撮像方向の誤整列を約２０％未満に制限するのに有効である、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１９】
前記サンプル流体注入管が、第１流路断面積を有する近位部と、第２流路断面積を有する遠位部と、を含み、前記近位部の流路断面積が前記遠位部の流路断面積の１．５倍を超える、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２０】
前記サンプル流体が、約１〜４秒の範囲内である前記フローセルの通過時間を有する、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２１】
前記フローセルが、シース液源から、前記画像取込部位での流路に沿った前記シース液の第２の流れ方向に直角である第１の流れ方向の流路内へ、前記シース液を受け取るように構成される、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２２】
前記フローセルが、前記画像取込装置に対する自動焦点標的を備える、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２３】
前記フローセルに対して固定位置を有する自動焦点標的を更に備える、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２４】
前記シース液と前記血液サンプルとの間の粘度差は、前記流路サイズの減少及び前記サンプル流体流の流速と組み合わせると、前記血液サンプル中の細胞を前記サンプル流体注入管から前記画像取込部位まで１秒〜４秒で進めるのに有効である、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２５】
前記画像取込装置は、高分解能撮像装置又はデジタル画像取込装置を含む、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２６】
前記画像取込装置は、１μｍ以下の分解能を有する、請求項１５に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年３月１５日出願の米国特許仮出願第６１／７９９，１５２号の仮出願であって、これに対する優先権を主張するものであり、その内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。本出願は、全て２０１４年３月１７日出願の米国特許出願第１４／２１５，８３４号、同第１４／２１６，５３３号、同第１４／２１６，３３９号、同第１４／２１６，８１１号、及び同第１４／２１７，０３４号、並びに国際出願第（自動焦点、シース液、ダイナミックレンジ、対比剤、血液学）にも関する。これらの出願のそれぞれの内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本開示は、サンプル中の血球などの粒子を識別し、定量化するための全体的又は部分的に自動化された装置を用いる、粒子の分析、例えば流体サンプル中の粒子の撮像のための機器、システム、組成物、及び方法の分野に関する。本開示はまた、被験体のサンプル中粒子の分析に有用な粒子及び／又は細胞内オルガネラ配列液（ＰＩＯＡＬ）、その液の調製方法、並びにその液を用いて粒子を検出し、分析する方法にも関する。画像ベースの体液サンプル分析を実施するのに有用な組成物、システム、装置及び方法も開示される。また、本開示の組成物、システム、装置、及び方法は、赤血球、網赤血球、有核赤血球、血小板などの体液中粒子を検出し、計数し、かつ特性決定をするのに、並びに、画像及び形態系白血球分画、分類、下位分類、特性決定及び／又は分析のためにも、有用である。
【０００３】
血球分析は、患者の健康状態の概要を示すために、最も一般的に行われる医学的検査のうちの１つである。血液サンプルは、患者の体から採取され、凝固を防ぐために抗凝固剤を含む試験管中に保管される場合がある。全血サンプルは通常、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）及び血小板（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅｓ）などの、主に３つの種別の血球を含む。各種別は、その種類のサブクラスに更に分けられる。例えば、主に５つのタイプ、つまりサブクラスの白血球（ＷＢＣ）は、異なる形状と機能を有する。白血球は、好中球、リンパ球、単球、好酸球、及び好塩基球を含み得る。赤血球のタイプにもサブクラスがある。サンプル中の粒子の出現は、病態、細胞成熟度、及びその他の要因によって異なり得る。赤血球のサブクラスは、網赤血球及び有核赤血球を含み得る。
【０００４】
ＲＢＣ、ＷＢＣ、又は血小板の濃度を推定する血球算定は、用手で、又は自動分析器を用いて実施できる。血球算定を用手で行う場合、１滴の血液を薄層塗抹標本として顕微鏡用スライドにのせる。従来は、顕微鏡用スライド上の血液を乾燥させ、染色した塗抹標本の用手検査を使用して、５種類の白血球の数又は相対量を決定している。組織学的な色素及び染料を用いて、細胞又は細胞構造を染色している。例えば、ライト染色は、光学顕微鏡下での検査のための血液塗抹標本の染色に用いられている組織学的染料である。自動分析器を用いて全血球算定（ＣＢＣ）が得られるが、ある種の機器は、粒子、つまり細胞が細い管に沿ってセンサ領域を通過する際のインピーダンス又は動的光散乱に基づいて、血液サンプル中の異なる粒子、つまり細胞の数を計数する。自動ＣＢＣは、別々に数えられ得るＲＢＣ、ＷＢＣ及び血小板（ＰＬＴ）を含む異なる種類の細胞の違いを識別する、機器又は方法を利用する場合がある。例えば、最小粒径又は容積を必要とする計算手法は、大きい細胞のみを計数するのに使用され得る。血液中の異常細胞などの特定の細胞は、計数されず、つまり正しく同定されない場合がある。互いに付着している小さい細胞は、大きい細胞と誤って数えられる恐れがある。計数エラーが疑われると、細胞を検証し、同定するために、機器による結果を人力で見直す必要があり得る。
【０００５】
自動血球算定手法は、フローサイトメトリーを伴う場合がある。フローサイトメトリーは、狭い流路を設け、個々の血球の通過を検知して計数することを伴う。フローサイトメトリー法は、流体中に浮遊した粒子、例えば、血液サンプル中の細胞を検出し、その粒子を粒子の種類、寸法、及び容積分布について分析して、血液サンプル中の各粒子の種類の濃度、つまり粒子容積を推定するために使用されている。流体中に浮遊した粒子を分析するのに好適な方法の例として、沈降、顕微鏡的特性決定、インピーダンスをベースとする計算、及び動的光散乱が挙げられる。これらの手段は、検査誤差を生じやすい。一方、粒子の種類及び濃度の正確な特性決定は、医療診断などの用途において重要である場合がある。
【０００６】
撮像をベースとする計算手法では、表示画面を通過し得る調製したサンプルのピクセルデータ像は、デジタルカメラに連結された顕微鏡の対物レンズを用いて取り込まれる。ピクセル画像データをデータ処理手法を用いて解析でき、またモニタに表示することもできる。
【０００７】
フローセルを有する自動診断システムの態様は、米国特許第６，８２５，９２６号（Ｔｕｒｎｅｒら）、並びに米国特許第６，１８４，９７８号、同第６，４２４，４１５号、及び同第６，５９０，６４６号（全てＫａｓｄａｎら）に開示されており、ここに、本明細書に完全に記載されているものとして参照することにより組み込まれる。
【０００８】
動的光散乱又はインピーダンスを用いる自動システムは、全血球算定（ＣＢＣ）：総白血球数（ＷＢＣ）、赤血球の総細胞容積（ＲＢＣ分布）、ヘモグロビンＨＧＢ（血中ヘモグロビン量）；平均赤血球容積（ＭＣＶ）（赤血球の平均容積）；ＭＰＶ（平均ＰＬＴ容積）；ヘマトクリット（ＨＣＴ）；ＭＣＨ（ＨＧＢ／ＲＢＣ）（赤血球当たりの平均ヘモグロビン量）；及びＭＣＨＣ（ＨＧＢ／ＨＣＴ）（細胞中ヘモグロビン平均濃度）を得るのに用いられている。自動化又は部分的自動化プロセスは、白血球の５種類の分画及び血液サンプル分析を容易にするために用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６，８２５，９２６号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１８４，９７８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，４２４，４１５号明細書
【特許文献４】米国特許第６，５９０，６４６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
かかる現在既知の粒子分析システム及び方法は、関連する医療用診断法と同様に、医師、臨床医、及び患者にとって本当に役立ち得るものの、更なる改善が望ましい。本発明の実施形態は、これら未解決のニーズの少なくとも一部に対する答えを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の実施形態は、粒子を含む調製サンプルを解析する機器、システム、組成物、及び方法に関する。いくつかの態様では、システムは、視覚的分析器であってよい分析器を含む。いくつかの態様では、機器は、視覚的分析器及びプロセッサを備える。一態様では、本開示は自動粒子撮像システムに関し、ここで対象粒子を含有する液体サンプルは、覗き窓を有するフローセルを通過させられ、この覗き窓を通して高分解能撮像装置が画像を取り込む。いくつかの態様では、高分解能撮像装置は、デジタルカメラなどのカメラを備える。一態様では、高分解能撮像装置は、対物レンズを備える。
【００１２】
フローセルは、調製サンプルなどのサンプル流体源、並びに、粒子及び／又は細胞内オルガネラ配列液（ＰＩＯＡＬ）源に連結される。システムは、流れるサンプル中の粒子の焦点画像を取り込むことができる。いくつかの実施形態では、粒子の分類及び下位分類のための自動ハイスループット処理において、画像を利用できる。例示の視覚的分析器は、画像の自動分析を容易にするプロセッサを備えてよい。いくつかの場合では、視覚的分析器を本開示の方法で用いて、自動化画像ＷＢＣ分画、又は他の血液サンプル粒子分析プロトコルを提供できる。いくつかの場合では、本開示の方法は、被験体が健康であるか、又は、疾患、状態、異常及び／若しくは感染を有しているかの見立てを判定、診断、予後診断、予測、及び／又は支持するため、並びに、被験体が治療に反応するか、又は反応しないかをモニタリングするための、形態異常の自動同定に関する。
【００１３】
一態様では、本発明の実施形態は、粘度及び幾何学的流体焦点調節（hydrofocusing）を組み合わせるように構成される粒子分析システムを用いる、粒子撮像方法を包含する。粒子は、血液サンプルの第１及び第２サンプル流体内に含まれ得る。例示の方法は、粒子分析器のフローセルの流路に沿ってシース液を流す工程を含んでよく、このシース液は、血液サンプルの粘度とは異なる粘度を有してよい。いくつかの場合では、シース液は、サンプル流体粘度と粘度差分異なるシース液粘度を有し、この粘度差は、所定の粘度差範囲内の値を有する。また、方法は、サンプル流体注入管からフローセル内の流れるシース液中に第１サンプル流体を注入し、注入管に近接して第１厚さを有するサンプル流体流を提供する工程も含んでよい。フローセルの流路は、サンプル流体流の厚さが、初期厚さから画像取込部位に近接する第２厚さまで減少するように、流路サイズが減少してよい。方法は更に、フローセルの画像取込部位において第１サンプル流体の第１の複数の粒子を撮像する工程と、流れるシース液中への第１サンプル流体の注入を終了し、流れるシース液中に第２サンプル流体を注入することによってサンプル流体過渡物を引き起こす工程と、を含んでよい。その上、方法は、フローセルの画像取込部位において第２サンプル流体の第２の複数の粒子を撮像する工程を含んでよい。第２の複数の粒子の撮像は、サンプル流体過渡物の実質的に後、かつ、第１の複数の粒子の撮像の４秒以内に行われてよい。いくつかの場合では、流路サイズの減少は、近位厚さを有する近位流路部、及び、近位厚さ未満の遠位厚さを有する遠位流路部によって画定される。サンプル流体注入管の下流端は、近位流路部より遠位に位置してよい。シース液と血液サンプルとの間の粘度差を、流路サイズの減少と組み合わせると、シース液中の粘性剤が第１及び第２サンプル流体中の細胞の生存率を保持し、細胞がサンプル流体流から流れるシース液中に広がるとき、細胞の構造及び内容物を無傷のままにしながらも、画像取込部位において第１及び第２サンプル流体を流体的に焦点調節するのに有効であり得る。
【００１４】
いくつかの方法では、注入管は、注入管の流路断面積対フローセルの流路断面積の比、注入管の流路断面積対フローセルの外径の比、又は、注入管の流路断面積対サンプル流の流路断面積の比に基づく内部容積を含んでよい。いくつかの場合では、流路サイズの減少は、サンプル流体流を第１及び第２厚さに二分する横断面に対して概ね対称である、流路に沿って半径方向内向きに角度付いた流路の対向壁によって画定されてよい。いくつかの場合では、流路サイズの減少における対称性は、血液サンプル中の赤血球撮像方向の誤整列を約２０％未満に制限するのに有効である。いくつかの場合では、血液サンプルは球状粒子を含み、サンプル流体とシース液との間の粘度差は、球状粒子の細胞内オルガネラを、フローセルの画像取込部位における焦点面内に整列させるのに有効である。いくつかの場合では、サンプル流体注入管の遠位部は、画像取込部位から軸方向分離距離において配置され、この軸方向分離距離は、約１６ｍｍ〜約２６ｍｍの範囲内の値を有する。いくつかの場合では、注入管は、約３０μＬ未満の内部容積を有する。
【００１５】
いくつかの方法では、注入管は、第１流路断面積を有する近位部と、第２流路断面積を有する遠位部と、を有し、近位部の流路断面積は、遠位部の流路断面積の１．５倍を超える。いくつかの方法では、注入管は、近位部と遠位部との間に配置される中央部を有し、中央部は第３流路断面積を有し、第３流路断面積は、第１及び第２流路断面積より大きい。
【００１６】
いくつかの方法では、サンプル流体注入管の遠位部は、高さ及び幅を有する出口を備え、高さは幅未満であってよい。いくつかの場合では、高さは約１５０μｍであり、幅は約１３５０μｍである。いくつかの場合では、高さは約５０μｍ〜約２５０μｍの範囲内の値を有し、幅は約５００μｍ〜約３０００μｍの範囲内の値を有する。
【００１７】
いくつかの方法では、シース液の流速のサンプル流体の流速に対する比は約７０である。いくつかの場合では、シース液の流速のサンプル流体の流速に対する比は約２００である。いくつかの場合では、シース液は約３５μＬ／ｓの流速を有し、サンプル流体は約０．５μＬ／ｓの流速を有する。いくつかの場合では、サンプル流体は、画像取込部位において約２０〜２００ｍｍ／秒の速度を有する。いくつかの場合では、シース液速度及び流体サンプル速度は、注入管の管出口付近の流路位置において異なっていてよく、シース液速度及び流体サンプル速度は、画像取込部位において同じであってよい。いくつかの場合では、サンプル流体流の第１厚さは、例えばサンプル流体が注入管を出る場所において、約１５０μｍである。いくつかの場合では、サンプル流体流の第２厚さは、例えばサンプル流体流が画像取込部位を通って流れる場所において、約２μｍ〜約１０μｍの範囲内である。いくつかの場合では、サンプル流体流の第２厚さは、約２μｍ〜約４μｍの範囲内である。いくつかの場合では、サンプル流体流の第１厚さ対サンプル流体流の第２厚さの比は、約２０：１〜約７０：１の範囲内の値を有する。いくつかの場合では、サンプル流体流の第１厚さ対サンプル流体流の第２厚さの比は、約５：１〜約２００：１の範囲内の値を有する。いくつかの場合では、近位流路部の近位厚さ対遠位流路部の遠位厚さの比は、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１、１００：１、１０５：１、１１０：１、１１５：１、１２５：１、１３０：１、１４０：１、１５０：１、１６０：１、１７０：１、１８０：１、１９０：１、及び２００：１からなる群から選択される幾何学的薄化値を有する。いくつかの場合では、フローセルは、最小圧縮比である約５０：１、及び最大圧縮比である約１２５：１を有する。
【００１８】
いくつかの方法では、フローセルは、フローセル内を流れるサンプル流体及びシース液が重力に逆らって流れるように、配置される。いくつかの場合では、フローセルは、フローセル内を流れるサンプル流体及びシース液が重力に従って流れるように、配置される。また、例示の方法は、流れるサンプル流体から気泡を除く工程も含んでよい。いくつかの場合では、第１サンプル流体は、サンプル流体注入管から流れるシース液中に第１サンプル流体を注入した後、約１〜３秒以内で安定化状態に達する。いくつかの場合では、第１サンプル流体は、サンプル流体注入管から流れるシース液中に第１サンプル流体を注入した後、１秒未満で安定化状態に達する。いくつかの場合では、第１サンプル流体は、サンプル流体注入管から流れるシース液中に第１サンプル流体を注入してから、約１．８秒以内で安定化状態に達する。いくつかの場合では、サンプル流体は、約１〜４秒の範囲内であるフローセルの通過時間を有する。いくつかの場合では、サンプル流体は、約２〜４秒の範囲内であるフローセルの通過時間を有する。いくつかの場合では、画像取込部位は、約１５０μｍ×１５０μｍ〜４００μｍ×４００μｍの視野を有する。いくつかの場合では、第１サンプル流体は、約５０〜約１５０μＬの範囲内の体積を有する。いくつかの場合では、注入管の近位部は、サンプル入口取り付け具のサンプル口に連結される。
【００１９】
別の態様では、本発明の実施形態は、血液サンプル中の粒子を撮像するために粘度及び幾何学的流体焦点調節の組み合わせを実施する、粒子分析システムを包含する。粒子は、第１及び第２サンプル流体内に含まれ得る。例示のシステムは、シース液の流れを送るように構成される、流路を有するフローセルを備えてよい。シース液は、血液サンプルの粘度とは異なる粘度を有してよい。いくつかの場合では、シース液粘度は血液サンプル粘度を超える。いくつかの場合では、シース液は、サンプル流体粘度と粘度差分異なるシース液粘度を有し、この粘度差は、所定の粘度差範囲内の値を有する。また、システムは、流路と流体連通するサンプル流体注入システムも備えてよい。サンプル流体注入システムは、フローセル内の流れるシース液中にサンプル流体を注入し、注入管に近接して第１厚さを有するサンプル流体流を提供するように構成され得る。フローセルの流路は、サンプル流体流の厚さが、初期厚さから画像取込部位に近接する第２厚さまで減少するように、流路サイズが減少してよい。更に、システムは、第１サンプル流体の第１の複数の粒子をフローセルの画像取込部位において撮像するために、画像取込部位と整列する画像取込装置を備えてよい。その上、システムは、サンプル流体注入システム及び画像取込装置と連結するプロセッサを備えてよい。プロセッサは、サンプル流体過渡物が引き起こされるように、流れるシース液中への第１サンプル流体の注入を終了して流れるシース液中に第２サンプル流体を注入し、フローセルの画像取込部位における第２サンプル流体の第２の複数の粒子を、サンプル流体過渡物の後、かつ、第１の複数の粒子の撮像の４秒以内に撮像するように構成されてよい。例示のシステムでは、シース液と血液サンプルとの間の粘度差を、流路サイズの減少と組み合わせると、シース液中の粘性剤が第１及び第２サンプル流体中の細胞の生存率を保持し、細胞がサンプル流体流から流れるシース液中に広がるとき、細胞の構造及び内容物を無傷のままにしながらも、フローセルの画像取込部位において第１及び第２サンプル流体を流体的に焦点調節するのに有効である。
【００２０】
いくつかのシステムでは、注入管は、注入管の流路断面積対フローセルの流路断面積の比、注入管の流路断面積対フローセルの外径の比、又は、注入管の流路断面積対サンプル流の流路断面積の比を基にした内部容積を含む。いくつかの場合では、流路サイズの減少は、サンプル流体流を第１及び第２厚さに二分する横断面に対して概ね対称である、流路に沿って半径方向内向きに角度付いた流路の対向壁によって画定される。いくつかの場合では、流路サイズの減少における対称性は、血液サンプル中の赤血球撮像方向の誤整列を約２０％未満に制限するのに有効である。いくつかの場合では、サンプル流体注入管の遠位部は、画像取込部位から軸方向分離距離において配置され、この軸方向分離距離は、約１６ｍｍ〜約２６ｍｍの範囲内の値を有する。いくつかの場合では、注入管は、第１流路断面積を有する近位部と、第２流路断面積を有する遠位部と、を含み、近位部の流路断面積は、遠位部の流路断面積の１．５倍を超える。いくつかの場合では、サンプル流体は、約１〜４秒の範囲内であるフローセルの通過時間を有する。いくつかの場合では、サンプル流体は、約２〜４秒の範囲内であるフローセルの通過時間を有する。いくつかの場合では、フローセルは、シース液源から、撮像部位での流路に沿ったシース液の第２の流れ方向に直角である第１の流れ方向の流路内へ、シース液を受け取るように構成される。いくつかの場合では、フローセルは、画像取込装置に対する自動焦点標的を備える。
【００２１】
上記したもの及び本発明の実施形態の多くの他の特徴及び付随する利点は、下記の実施形態への参照により、付随の図と共に考慮されると、明らかとなりより理解されるだろう。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
粘度及び幾何学的流体焦点調節を組み合わせるように構成される粒子分析システムを使用して粒子を撮像する方法であって、前記粒子が血液サンプル内に含まれ、
前記粒子分析器のフローセルの流路に沿ってシース液を注入する工程であって、前記シース液が、前記血液サンプルの粘度とは異なる粘度を有する工程と、
前記血液サンプルをサンプル流体注入管からある流速で前記フローセル内を流れる前記シース液中に注入し、前記注入管に隣接して第１厚さを有するサンプル流体流をもたらす工程であって、前記フローセルの流路が、前記サンプル流体流の厚さが前記初期厚さから画像取込部位に近接する第２厚さまで減少するように、流路サイズが減少する、工程と、
前記フローセルの画像取込部位において前記サンプルの第１の複数の粒子を撮像する工程と、を含み、
前記流路サイズの減少が、近位厚さを有する近位流路部、及び、前記近位厚さ未満の遠位厚さを有する遠位流路部によって画定され、
前記サンプル流体注入管の下流端が、前記近位流路部より遠位に位置し、
前記シースと血液サンプルとの間の粘度差を、前記流路サイズ及び前記サンプルの流速の減少と組み合わせると、細胞が前記サンプル流体注入管から前記画像取込部位まで進むとき、前記シース液中の粘性剤が前記細胞の生存率を保持し、前記細胞が前記サンプル流体流から前記流れるシース液中に広がるとき、前記細胞の構造及び内容物を無傷のままにしながらも、前記サンプル中の細胞を前記サンプル流体注入管から前記画像取込部位まで４秒以下で進めるのに有効な、方法。
（項目２）
前記注入管が、前記注入管の流路断面積対前記フローセルの流路断面積の比、前記注入管の流路断面積対前記フローセルの外径の比、又は、前記注入管の流路断面積対前記サンプル流の流路断面積の比に基づく内部容積を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記シース液がシース液流速で前記流路に沿って注入され、前記シース液の流速及び前記フローセルの流路断面積がシース液速度に対応し、前記サンプルの流速及び前記注入管の出口の流路断面積がサンプル速度に対応し、前記シース液速度と前記サンプル速度との間に速度差がある、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記粘度差及び速度差、並びに、前記流路サイズの減少が、前記画像取込部位における前記サンプル中の細胞の流体焦点調節に有効である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記流路サイズの減少が、前記サンプル流体流を第１厚さ及び第２厚さに二分する横断面に対して概ね対称である、前記流路に沿って半径方向内向きに角度付いた流路の対向壁によって画定される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記流路サイズの減少における対称性が、前記血液サンプル中の赤血球撮像方向の誤整列を約２０％未満に制限するのに有効である、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記血液サンプルが球状粒子を含み、前記サンプル流体と前記シース液との間の粘度差が、球状粒子の細胞内オルガネラを、前記フローセルの前記画像取込部位における焦点面内に整列させるのに有効である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記注入管が、第１流路断面積を有する近位部と、第２流路断面積を有する遠位部と、を含み、前記近位部の流路断面積が前記遠位部の流路断面積の１．５倍を超える、項目１に記載の方法。
（項目９）
シース液の流速のサンプル流体の流速に対する比が約２００である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記シース液が約３５μＬ／ｓの流速を有し、前記サンプル流体が約０．５μＬ／ｓの流速を有する、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記サンプル流体が、前記画像取込部位において約２０〜２００ｍｍ／秒の速度を有する、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記サンプル流体流の第２厚さが、約２μｍ〜約１０μｍの範囲内である、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記サンプル流体流の第２厚さが、約２μｍ〜約４μｍの範囲内である、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記サンプル流体流の第１厚さ対前記サンプル流体流の第２厚さの比が、約２０：１〜約７０：１の範囲内の値を有する、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記近位流路部の近位厚さ対前記遠位流路部の遠位厚さの比が、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１、１００：１、１０５：１、１１０：１、１１５：１、１２５：１、１３０：１、１４０：１、１５０：１、１６０：１、１７０：１、１８０：１、１９０：１、及び２００：１からなる群から選択される幾何学的薄化値を有する、項目１に記載の方法。
（項目１６）
血液サンプル中の粒子の撮像のために、粘度及び幾何学的流体焦点調節を組み合わせて実行する粒子分析システムであって、
シース液の流れを送るように構成される流路を有するフローセルであって、前記シース液が前記血液サンプルの粘度と異なる粘度を有する、フローセルと、
前記流路と流体連通しており、前記サンプルを前記フローセル内の前記流れるシース液内に注入し、前記注入管に隣接して第１厚さを有するサンプル流体流をもたらすように構成される、サンプル流体注入システムであって、前記フローセルの流路が、前記サンプル流体流の厚さが前記初期厚さから画像取込部位に近接する第２厚さまで減少するように、流路サイズが減少する、サンプル流体注入システムと、
前記サンプル流体の複数の粒子を前記フローセルの前記画像取込部位において撮像するための、前記画像取込部位と整列する画像取込装置と、
前記サンプル流体注入システム及び前記画像取込装置と連結されるプロセッサであって、前記シースと血液サンプルとの間の粘度差を、前記流路サイズ及びサンプルの流速の減少と組み合わせると、細胞が前記サンプル流体注入管から前記画像取込部位まで進むとき、前記シース液中の粘性剤が前記細胞の生存率を保持し、前記細胞が前記サンプル流体流から前記流れるシース液中に広がるとき、前記細胞の構造及び内容物を無傷のままにしながらも、前記サンプル中の細胞を前記サンプル流体注入管から前記画像取込部位まで４秒以下で進めるのに有効であるように、前記サンプル流体を前記流れるシース液中に前記サンプル流速での注入を開始するように構成される、プロセッサと、を備える、システム。
（項目１７）
前記注入管が、前記注入管の流路断面積対前記フローセルの流路断面積の比、前記注入管の流路断面積対前記フローセルの外径の比、又は、前記注入管の流路断面積対前記サンプル流の流路断面積の比に基づく内部容積を含む、項目１６に記載のシステム。
（項目１８）
前記流路サイズの減少が、前記サンプル流体流を第１厚さ及び第２厚さに二分する横断面に対して概ね対称である、前記流路に沿って半径方向内向きに角度付いた流路の対向壁によって画定される、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記流路サイズの減少における対称性が、前記血液サンプル中の赤血球撮像方向の誤整列を約２０％未満に制限するのに有効である、項目１６に記載のシステム。
（項目２０）
前記注入管が、第１流路断面積を有する近位部と、第２流路断面積を有する遠位部と、を含み、前記近位部の流路断面積が前記遠位部の流路断面積の１．５倍を超える、項目１６に記載のシステム。
（項目２１）
前記サンプル流体が、約１〜４秒の範囲内である前記フローセルの通過時間を有する、項目１６に記載のシステム。
（項目２２）
前記フローセルが、シース液源から、前記撮像部位での流路に沿った前記シース液の第２の流れ方向に直角である第１の流れ方向の流路内へ、前記シース液を受け取るように構成される、項目１６に記載のシステム。
（項目２３）
前記フローセルが、前記画像取込装置に対する自動焦点標的を備える、項目１６に記載のシステム。
（項目２４）
前記フローセルに対して固定位置を有する自動焦点標的を更に備える、項目１６に記載のシステム。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】部分的に断面であり正確な縮尺ではない、デジタル画像処理を利用するサンプル画像解析用の例示のフローセル、自動焦点システム、及び高分解能撮像装置の操作態様を示す模式図である。
【図２】例示の実施形態によるフローセルの斜視図である。
【図３】図２に示されるフローセルの線３−３に沿う長手方向正中断面図である。
【図３Ａ】本発明の実施形態によるフローセルの更なる断面図を提供する。
【図３Ｂ】本発明の実施形態によるフローセルの更なる断面図を提供する。
【図４】本発明の実施形態による分析器システムの態様を示す。
【図４Ａ】本発明の実施形態によるフローセルの態様を示す。
【図４Ｂ−１】本発明の実施形態によるフローセルの態様を示す。
【図４Ｂ−２】本発明の実施形態によるフローセルの態様を示す。
【図４Ａ−１】本発明の実施形態による、それぞれカニューレ出口及び画像取込部位における、フローセル内のシース液（例えばＰＩＯＡＬ）の包み及びサンプル流体流の寸法の断面図を示す。
【図４Ａ−２】本発明の実施形態による、それぞれカニューレ出口及び画像取込部位における、フローセル内のシース液（例えばＰＩＯＡＬ）の包み及びサンプル流体流の寸法の断面図を示す。
【図４Ｃ】本発明の実施形態によるカニューレ構造の態様を示す。
【図４Ｄ】本発明の実施形態によるカニューレ構造の態様を示す。
【図４Ｅ】本発明の実施形態によるカニューレ構造の態様を示す。
【図４Ｆ】本発明の実施形態によるカニューレ構造の態様を示す。
【図４Ｇ】本発明の実施形態によるカニューレ構造の態様を示す。
【図４Ｃ−１】本発明の実施形態によるカニューレ構造の態様を示す。
【図４Ｄ−１】本発明の実施形態によるカニューレ構造の態様を示す。
【図４Ｈ】本発明の実施形態によるフローセルの態様を示す。
【図４Ｉ】本発明の実施形態による、重力に対するフローセル中の流体の流れの態様を示す。
【図４Ｊ】本発明の実施形態による、重力に対するフローセル中の流体の流れの態様を示す。
【図４Ｋ】本発明の実施形態による、画像取込部位におけるフローセル内のシース液及びサンプルの流れの態様を示す。
【図４Ｌ】本発明の実施形態による、画像取込部位におけるフローセル内のシース液及びサンプルの流れの態様を示す。
【図４Ｌ−１】本発明の実施形態によるフローセル中の流体の流速の態様を示す。
【図４Ｍ】本発明の実施形態による細胞内整列及び撮像の態様を示す。
【図４Ｎ】本発明の実施形態による細胞内整列及び撮像の態様を示す。
【図４Ｏ】本発明の実施形態による、粒子及び／又は細胞内粒子の整列及び撮像に対するＰＩＯＡＬの効果の態様を示す。このＰＩＯＡＬを使用して得られた像と非ＰＩＯＡＬシース液を使用して得られた像との比較により、ＰＩＯＡＬ使用の結果、分葉、細胞質、及び／又は顆粒などの細胞内容物に対してより焦点が合うことがわかる。
【図４Ｒ】本発明の実施形態によるフローセル構成及びシース液組成物を使用して得られる、特定の粒子の整列結果を示す。
【図４Ｐ】ＰＩＯＡＬを使用して得られた像対標準シース液を使用して得られた像の比較を示す。ＰＩＯＡＬ使用の結果、ＲＢＣの整列が改善することがわかる。
【図４Ｑ】ＰＩＯＡＬを使用して得られた像対標準シース液を使用して得られた像の比較を示す。ＰＩＯＡＬ使用の結果、ＲＢＣの整列が改善することがわかる。
【図５】本発明の実施形態による粒子撮像方法の態様を示す。
【図６】本発明の実施形態による粒子撮像方法の態様を示す。
【図７】本発明の実施形態による流れひずみ速度の態様を示す。
【図８】本発明の実施形態による流れひずみ速度の態様を示す。
【図９Ａ】本発明の実施形態による自動焦点標的の態様を示す。
【図９Ｂ】本発明の実施形態による自動焦点標的の態様を示す。
【図１０】本発明の実施形態による自動焦点標的の態様を示す。
【図１１】本発明の実施形態による自動焦点標的の態様を示す。
【図１２Ａ】本発明の実施形態による自動焦点標的の態様を示す。
【図１２Ｂ】本発明の実施形態による自動焦点標的の態様を示す。
【図１３Ａ】本発明の実施形態によるフローセル温度センサの態様を示す。
【図１３Ｂ】本発明の実施形態によるフローセル温度センサの態様を示す。
【図１３Ｃ】本発明の実施形態によるフローセル温度センサの態様を示す。
【図１３Ｄ】本発明の実施形態によるフローセル気泡除去技術の態様を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本開示は、粒子を含むサンプルを解析する機器、システム、組成物、及び方法に関する。一実施形態では、本発明は、例えば視覚的分析器であってよい分析器を備える、自動粒子撮像システムに関する。いくつかの実施形態では、視覚的分析器は更に、画像の自動分析を容易にするプロセッサを備えてよい。
【００２４】
本開示によると、視覚的分析器を備えるシステムは、液体中に懸濁された粒子を含むサンプルの画像を得るために提供される。このシステムは、例えば、赤血球、網赤血球、有核赤血球、血小板、及び白血球の検出及び定量化、例えば白血球分画、分類、下位分類、及び分析などの、体液中粒子の特性決定に有用であり得る。他の流体の血球の特性決定など、別の類似用途も想到される。
【００２５】
血液サンプル中の血球識別は、この主題が特に適する例示の用途である。サンプルは、自動化法によって調製され、リボン状サンプル流が視野を横切って流れる間に周期的に撮像される、薄いリボン状サンプル流として高分解能撮像装置に呈示される。粒子（例えば血球）の画像は、ピクセル画像データをプログラム化した処理技術を、自動のみで、又は、人の手を限定的に用いて使用して、互いに識別され、分類され、下位分類され、かつ、計数され、細胞、つまり粒子を同定及び計数できる。異常な、又は、重要な特徴を持つ粒子の場合に保存され、かつ利用可能にし得る細胞画像に加えて、出力データは、記録されたサンプル画像中に識別される、それぞれ特定の分類及び／又は下位分類の細胞、つまり粒子の出現数を含む。
【００２６】
各画像中に見つかった異なる粒子数を更に処理でき、例えば、それを利用して、サンプル全体においてそれぞれ識別された分類及び／又は下位分類の細胞の、正確かつ統計的に有意な比率を蓄積できる。視覚的識別に使用するサンプルは希釈されてよいが、特に多くの画像を処理した後、各分類及び／又は下位分類の細胞の割合は希釈サンプル中で表される。
【００２７】
本明細書に開示される機器及び方法は、視覚的相違点に基づくサンプル中細胞の識別及び定量化に有用である。サンプルは、生体サンプル、例えば、血液、血清、骨髄、洗浄液、滲出液（effusions）、滲出液（exudates）、脳脊髄液、胸膜液、腹膜液、及び羊水を非限定的に含む、白血球を含む体液サンプルであってよい。いくつかの実施形態では、サンプルは、細胞懸濁液を得るのに処理されている、固体組織サンプル、例えば生検サンプルであってよい。サンプルは、糞便サンプルの処理によって得られる懸濁液であってもよい。サンプルは、細胞培養サンプルなどの粒子を含む、実験室又は生産ラインサンプルであってもよい。用語、サンプルは、患者若しくは実験室、又はその任意の画分、部分、若しくはアリコートから得られるサンプルを指すのに使用されてよい。サンプルを希釈し、部分に分け、又はいくつかの工程で染色してもよい。
【００２８】
一態様では、本開示のシステム、組成物及び方法は、意外にも流れの中で高品質の細胞画像を提供する。一態様では、視覚的分析器を本開示の方法で用いて、自動化画像ＷＢＣ分画を提供できる。特定の実施形態では、本開示の方法は、被験体が健康であるか、又は、疾患、状態、異常及び／若しくは感染を有しているか、及び／又は、被験体が治療に反応するか、若しくは反応しないかの見立てを判定、診断、予後診断、予測、及び／又は支持するための、形態特性及び／又は形態異常などの視覚的相違点の自動同定に関する。いくつかの実施形態では、システムは更に粒子計数器を備えてよい。用途として、分類及び／又は下位分類、並びに、血液サンプルなどの流体サンプル中の細胞の計数が挙げられる。更なる種類の粒子及び／又は別の流体サンプル中の粒子を計数する別の類似用途も想到される。本発明のシステム、組成物、及び方法は、リアルタイム分類及び下位分類、並びに任意の好適な自動粒子認識アルゴリズムを用いる画像の確認に使用できる。各サンプルについて取り込まれた画像を、後日確認するように保存できる。
【００２９】
別の態様では、本発明の機器、組成物、及び方法は、現在の自動分析器を使用したときの人による見直し率と比較して、人による見直し率を低下させる、意外にもより正確な画像ベースの細胞分類及び下位分類、並びにフラグ付けを提供する。このシステム、組成物、及び方法は、人による見直し率を低下させ、機器上での人による見直しを可能にする。加えて、本開示のシステム、組成物、及び方法は、人による見直しを必要とする、自動分析中のフラグ付きサンプルの割合も低下させる。
【００３０】
本開示は更に、視覚的分析器などの分析器を備える全血球算定（ＣＢＣ）計数器を組み合わせ、ＣＢＣ、並びに、画像ベースの拡大白血球分画及び画像ベースの拡大血小板算定を得ることによって、血小板を計数するための有効検出範囲を広げるシステム、方法及び組成物に関する。
【００３１】
それにより、いくつかの実施形態では、本開示は、粒子、例えば血球を含有するサンプルの分析機器及び方法を提供する。本開示によると、視覚的分析器は、液体中に懸濁された粒子を含むサンプルの画像を得るために提供される。いくつかの実施形態では、視覚的分析器は、フローセルと、自動焦点構成部品と、を備え、対象粒子を含有する液体サンプルは、覗き窓を有するフローセルを通過させられ、この覗き窓を通して対物レンズに連結されたカメラが粒子のデジタル画像を取り込む。フローセルは、サンプル流体、例えば希釈及び／若しくは処理された血液サンプル、又は本明細書に記載されるその他体液サンプルの源、並びに、透明シース液、つまり粒子及び／又は細胞内オルガネラ配列液（ＰＩＯＡＬ）源に連結される。
【００３２】
一実施形態では、機器は、少なくとも１つの検出範囲を有する粒子計数器、並びに分析器及びプロセッサも備えてよい。分析器及びプロセッサは、粒子計数器に関連する計数、分類、及び下位分類の誤りを補正するための追加情報を提供し、更に、サンプル中の正確な粒子数、又は異なる分類及び／若しくは下位分類の粒子の濃度を判定するように構成される。
【００３３】
本開示は、画像ベースのサンプル分析の実施において、粒子及び／又は細胞内オルガネラを整列するのに有用な方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、例えば、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、網赤血球、有核ＲＢＣ、芽球、前骨髄球、骨髄球、若しくは後骨髄球を含む、ＷＢＣ、ＲＢＣ、及び／又は血小板などの細胞種を同定して計数し、ＷＢＣ数及び形態、赤血球（ＲＢＣ）数及び形態、並びに血小板（ＰＬＴ）数及び形態に関する画像ベースの情報を提供できる、全血球算定（ＣＢＣ）及び画像ベースの拡大白血球（ＷＢＣ）分画の実施能を有する計数及び撮像を組み合わせたシステムにおける方法及び組成物に関する。
【００３４】
別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される粒子の画像ベースの分析に使用できるＰＩＯＡＬに関する。血液サンプル中の細胞分類及び／又は下位分類数は、分析できる種類のサンプルの非限定例として、本開示において使用される。いくつかの実施形態では、サンプル中に存在する細胞は、細菌細胞又は真菌細胞、並びに白血球、赤血球及び／又は血小板を含んでもよい。いくつかの実施形態では、組織又は吸引液から得られた粒子懸濁液を分析してよい。
【００３５】
血液サンプル中の血球識別は、この主題が特に適する例示の用途である。サンプルは、自動化法によって調製され、サンプルが視野を横切って流れる間に周期的に撮像される、薄いリボン状サンプル流として高分解能撮像装置に呈示される。粒子（例えば血球）の画像は、ピクセル画像データをプログラム化した処理技術を、自動のみで、又は、人の手を限定的に用いて使用して、互いに識別され、分類され、下位分類され、及び／又は、計数され、細胞、つまり粒子を同定及び計数できる。異常な、又は、重要な特徴を持つ場合に保存され、かつ利用可能にし得る細胞画像に加えて、出力データは、記録されたサンプル画像中に識別される、それぞれ特定の分類及び／又は下位分類の細胞、つまり粒子の出現数を含む。各画像中に見つかった異なる粒子数を更に処理でき、例えば、それを利用して、サンプル全体においてそれぞれ識別された分類及び／又は下位分類の細胞の、正確かつ統計的に有意な比較比率、又はその機能を蓄積できる。視覚的識別に使用するサンプルは高度に希釈されてもよいが、特に多くの画像を処理した後、各分類及び／又は下位分類の細胞の割合は希釈サンプルにおける分布中で表される。
【００３６】
いくつかの態様では、サンプルは、自動的に呈示され、撮像され、分析される。血液サンプルの場合では、サンプルを、好適な希釈剤又は生理食塩水溶液で実質的に希釈してよく、これにより、未希釈又は希釈度が低いサンプルにおいて、一部の細胞の像が別の細胞で隠され得る程度を低くする。細胞を、一部の細胞の外観の対比を向上する剤で処理してよく、例えば、透過剤を用いて細胞膜を透過性にし、組織染色を用いて顆粒及び核などの特徴に付着させ、その特徴を明らかにする。いくつかの実施形態では、網赤血球、有核赤血球、及び血小板を含む粒子の計数及び特性決定のため、並びに、白血球分画、特性決定、及び分析のために、サンプルのアリコートを染色することが望ましい場合がある。別の実施形態では、赤血球を含有するサンプルは、フローセルへの導入及び撮像の前に希釈されてよい。
【００３７】
サンプル希釈、透過、及び組織染色用のサンプル調製装置及び方法の詳細は、１つ以上のプログラム可能な制御装置によって操作される精密ポンプ及び弁を用いて通常は実施され、本開示の中心ではない。プログラム可能な制御に関してＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｍｏｔｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許第７，３１９，９０７号などの特許中に、例を見出すことができる。同様に、相対寸法及び色などの性状により、特定の細胞分類及び／又は下位分類を識別する手法は、白血球に関して米国特許第５，４３６，９７８号中に見出すことができる。これらの特許の開示は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００３８】
細胞などの粒子を分類及び／又は下位分類する能力、速度、及び効率を改善するために、データ処理システムによる自動分析のために、血球の明瞭な高品質画像を提供することが有利である。本開示によると、調製サンプル流は、フローセルの対向壁間に安定な位置を有する、薄いリボン上に配置される。サンプル流の位置とその薄いリボン状への平坦化は、サンプル流体と粘度が異なるフローセル内に導入され、対称的な流路を通って流れる、ＰＩＯＡＬの層間の流れによって達成できる。
【００３９】
ＰＩＯＡＬは好適な粘度及び密度を有し、サンプルのフローセルへの導入点における流速は、サンプル流体が薄いリボン状に平坦化するようなものである。リボン状サンプル流はＰＩＯＡＬと共に運ばれ、対物レンズ及び光源がリボン状サンプル流を観察可能にするように配置される、観察ポートの前を通過する。サンプル流体は、ＰＩＯＡＬの流路が対称的に狭まった点で、導入、例えば注入される。その結果、サンプル流体流が平坦化され、薄いリボン上に伸ばされる。本開示のＰＩＯＡＬは、本開示の任意の視覚的分析器と共にシース液として使用できる。一実施形態では、ＰＩＯＡＬをフローセルの末端部に導入し、サンプル流体に沿って放出口の向けて運んでよい。
【００４０】
観察ゾーンにおけるリボン状サンプル流の寸法は、ＰＩＯＡＬ流路の幾何学的薄化、並びにサンプル流体及びＰＩＯＡＬの異なる線速度の影響を受け、その結果、リボン状サンプル流が薄化し、引き延ばされる。サンプル対ＰＩＯＡＬの初期線速度差は、０．５：１〜５：１の範囲内であってよい。ＰＩＯＡＬ流路断面は、深さを、約１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１、１００：１、１０５：１、１１０：１、１１５：１、１２５：１、１３０：１、１４０：１、１５０：１、１６０：１、１７０：１、１８０：１、１９０：１、又は２００：１の倍率で小さくすることによって薄化してよい。一実施形態では、幾何学的薄化は４０：１である。一実施形態では、幾何学的薄化は３０：１である。考慮される要素は、フローセルの通過時間、サンプルスループットの所望の速度、粒径に相当するリボン状サンプル流厚さの達成、粒子及びオルガネラの整列の獲得、焦点が合った粒子内容物の達成、圧力の調整、流量、及び操作限界内の粘度、リボン状サンプル流厚さの最適化、所望の線速度の獲得、製造性の考慮、並びに、所望のサンプル及びＰＩＯＡＬ量である。
【００４１】
カニューレの長さ及び容積、並びに断面の平坦化は、サンプル流が不安定な時間を少なくすることによって、スループットを改善するように選択できる。いくつかの実施形態では、流れが不安定な時間は、約３、２．７５、２．５、２．２５、２、１．７５、１．５  １．２５未満、又は約１秒未満であってよい。カニューレ容積が小さいと、サンプル運転間のカニューレ洗浄に必要な時間と希釈剤量を削減することもできる。いくつかの実施形態では、フローセルの通過時間は、１、２、３、若しくは４秒、又はこれら任意の２つの時間の間の任意の範囲である。いくつかの実施形態では、通過時間は、４、３又は２秒未満であってよい。
【００４２】
サンプル流体及びＰＩＯＡＬの粘度及び流速、並びに、フローセルの外形は、ＰＩＯＡＬ流がサンプル流を、信頼できる場所で観察ゾーンを一貫して通過する平坦なリボン状に平坦化して引き延ばすように、定められる。サンプル流体流は、約２〜３μｍの流体の流れ厚さに圧縮されてよい。いくつかの血液細胞種は、流れ厚さより大きい直径を有する。流れ方向と平行方向の剪断力は、高分解能撮像装置の焦点面において、撮像条件下の粒子投影像の拡大を引き起こし、並びに／又は、粒子内構造、例えば細胞内構造、オルガネラ又は分葉を、流れ方向と実質的に平行に配置、再配置、及び／若しくはより良く配置させる。高分解能撮像装置の視野深さは、最大７μｍ、例えば１〜４μｍである。
【００４３】
リボン状サンプル流が共に運ばれるＰＩＯＡＬの流路断面積は、そこを通して対物レンズが向けられる、観察ポートの前の観察ゾーン全体で一定である。対物レンズは、高分解能撮像装置又はデジタル画像取込装置の、目的の構成部品であってよい。リボン状サンプル流は、フローセル中の既知かつ再現可能な位置において、例えば、フローセルの２つの壁部からの既知かつ再現可能な距離において、観察ゾーンを通過する経路を進み、下流に放出される。
【００４４】
リボン状サンプル流が観察ポートの前の観察ゾーンを通過して運ばれ、それによって、サンプル中に含まれる粒子／細胞よりデータが発生するとき、分析器の検出部によってサンプル中粒子の光学情報が検出される。この分析器を使用することにより、サンプル中に含まれる細胞及び／又は粒子の取り込み、処理、分類及び下位分類、並びに計数が可能になる。ＰＩＯＡＬ液は、粘度調整剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、抗菌剤、イオン強度調整剤、界面活性剤、及び／又はキレート剤を添加することによって調製できる。本開示における分析器の例示の機能性構成要素及び／又は特徴部として、例えば、画像解析からのデータ取得及び／若しくは処理能、サンプル染色処理、画像処理、並びに／又は、粒子画像同定、計数、及び／若しくは分類及び下位分類を挙げてよい。
【００４５】
一実施形態では、本開示は、好適な量の粘性剤をＰＩＯＡＬに添加すると、フローセル中の粒子／細胞整列が顕著に改善され、焦点が合った細胞、つまり細胞構成成分の割合が高くなり、流れ中の細胞及び／又は粒子のより高品質な画像が得られるという、驚くべきかつ思いもよらない発見を基にしている。粘性剤の添加により、ＲＢＣなどの細胞に対する剪断力が増して、流れ方向に実質的に平行な面での細胞の整列を改善し、その結果、撮像を最適化する。また、これによって、流れ方向に実質的に平行な細胞内構造、オルガネラ又は分葉などの粒子内構造の配置、再配置、及び／又はより良い配置ももたらし、その結果、撮像を最適化する。粘性剤は更に、通常は流れより直径が小さい細胞であるがこれには限定されない、細胞の誤整列を低下させる。
【００４６】
流れより直径が小さい細胞、例えば赤血球の整列は、例えば、ＰＩＯＡＬの粘度を上げる、又は、流速率を上げることによって得ることができる。この結果、流れ方向及び焦点面ＦＰ（例えば、図４Ｋに示される）に平行に、ＲＢＣが整列する。いくつかの実施形態では、ＲＢＣ誤整列の低下及び／又はＲＢＣ整列の増加は、ＰＩＯＡＬの粘度を上げることによって達成される。
【００４７】
リボン状サンプル流厚さは、サンプル流体及びＰＩＯＡＬの相対粘度及び流速の影響を受け得る。例えば精密容積型ポンプを備えるサンプル源及び／又はＰＩＯＡＬ源は、リボン状サンプル流の寸法を最適化する、すなわち、少なくとも高分解能撮像装置又はデジタル画像取込装置の視野の幅を有する薄いリボンにするために、制御可能な流速でサンプル及び／又はＰＩＯＡＬを供給するように構成されてよい。
【００４８】
リボン状サンプル流が共に運ばれるＰＩＯＡＬの流路断面積は、そこを通して高分解能撮像装置が向けられる、観察ポートの前の観察ゾーン全体で一定である。リボン状サンプル流は、フローセルの前方及び後方壁部のいずれかからの既知かつ再現可能な距離において、観察ゾーンを通過する経路を進み、下流に放出される。
【００４９】
用語、高分解能撮像装置は、形態的特徴及び／又は変化を区別するのに十分な視覚的相違点を有する、粒子画像の取得が可能な装置を含んでよい。例示の高分解能撮像装置として、例えば０．４〜０．５μｍを含む、例えば０．４６μｍなど、１μｍ以下の分解能を有する装置を挙げてよい。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本発明の任意の組成物及び／又は方法で得られた画像はデジタル画像であってよい。いくつかの実施形態では、得られた画像は顕微鏡像であってよい。特定の実施形態では、画像は手動で得られてよい。別の実施形態では、画像取得方法のうち少なくとも一部は自動化される。いくつかの実施形態では、画像は、フローセルと、任意に自動焦点機能を備える高分解能撮像装置又はデジタル画像取込装置と、を備える、視覚的分析器を用いて得られてよい。
【００５１】
一実施形態では、画像は、細胞の細胞質、細胞核及び／又は核成分に関する情報を提供する。一実施形態では、画像は、細胞の顆粒状成分及び／又は別の形態的特徴部に関する情報を提供する。一実施形態では、画像は、細胞の細胞質、核及び／又は顆粒状成分に関する情報を提供する。顆粒状及び／又は核画像及び／又は特徴部は、独立して、又は互いに組み合わせての両方において、細胞分類及び下位分類の決定要因である。
【００５２】
本発明の方法の一態様では、粒子対比剤組成物と接触され、及び／又は撮像される細胞は、有核赤血球である。更に別の態様では、本発明の方法は、ａ）赤血球の一部を撮像する工程と、ｂ）撮像した赤血球の形態を判定する工程と、を含む、画像ベースの赤血球分類及び下位分類を実施する方法に関する。本明細書で使用するとき、赤血球（ＲＢＣ）として、例えば、正常又は異常赤血球、網赤血球、有核赤血球、及び／又はマラリアに感染した細胞を挙げてよい。いくつかの実施形態では、撮像は、粒子計数器と、視覚的分析器と、プロセッサと、を備える機器などの、本開示の機器を用いて実施される。
【００５３】
本明細書で使用するとき、例示の全血球算定（ＣＢＣ）は、典型的には医師又はその他医療専門家によって依頼される、患者の血液サンプル中の粒子及び／又は細胞についての情報を提供する試験パネルを含んでよい。血流中を循環する例示の細胞は、一般に、例えば、白血球（例えばｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）、赤血球（例えばｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）、及び血小板（例えばｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅｓ）を含むがこれらに限定されない、３つの種類に分類されてよい。
【００５４】
本明細書で使用するとき、異常に高い又は低い計数値は、疾患、障害、及び／又は状態の存在を示す場合がある。このように、ＣＢＣは、患者の全般的な健康状態の概要を提供できるため、医療において一般的に実施される血液検査の１つである。したがって、ＣＢＣは、年次健康診断において定期的に実施される。
【００５５】
本明細書で使用するとき、典型的には採血者が被験体から血液サンプルを採取し、血液は通常、凝固を停止するために、典型的には抗凝固剤（例えばＥＤＴＡ、時にはクエン酸塩）を含む試験管内に採取される。その後サンプルは実験室に運ばれる。時には、自動計数器による即時処理のため、毛細管ピペットを用いて指を穿刺してサンプルを採取する。一実施形態では、粒子がシース液、つまりＰＩＯＡＬに包まれている間に、粒子画像を取得する。特定の実施形態では、血液サンプルを、患者の血液のサンプルで作製したスライドにおいて、顕微鏡下（血液塗抹標本、つまり末梢塗抹標本）で観察してよい。特定の実施形態では、全血球算定は自動分析器で実施される。
【００５６】
本明細書で使用するとき、一般に血液分析器は、ごく少量の検体を細い管を通って吸引できる。センサは、管を通過する細胞の計数及び／又は数を検出でき、細胞の種類を同定できる。例示のセンサは、光（例えば可視光、ＵＶ、又はＩＲ）及び／又は電気インピーダンスの検出器を含んでよい。例示の検出パラメータとして、寸法、容積、及び／又は細胞の特徴を挙げてよい。特定の実施形態では、センサは、約２００ｎｍ〜約１００００ｎｍの範囲の波長スペクトルの可視光及び非可視光を検出できる。特定の実施形態では、センサは、約３８０ｎｍ〜約７６０ｎｍの波長を検出できる。
【００５７】
本明細書で使用するとき、血球算定のデータ／パラメータとして、例えば、全赤血球；ヘモグロビン−血中ヘモグロビン量；ヘマトクリット、つまりヘマトクリット値（ＰＣＶ）；平均赤血球容積（ＭＣＶ）−赤血球の平均容積（この値が予測される正常範囲を上回る、又は下回るかによって、貧血症が小球性又は大球性に分類される。ＭＣＶに影響する別の状態として、サラセミア、網赤血球増加症、及びアルコール依存症が挙げられる）；平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）−赤血球当たりの平均ヘモグロビン量（ピコグラム）；平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）−細胞中の平均ヘモグロビン濃度；赤血球容積粒度分布幅（ＲＤＷ）−ＲＢＣ集団の細胞容積のばらつき；全白血球；好中性顆粒球（細菌感染を示す場合があり、典型的には急性ウイルス感染で上昇する）を挙げてよい。核が分葉して見えることから、好中球は、時には「ｓｅｇ」と称される。成熟度が低い好中球の核は分葉していないが、バンド、つまり細長い形状を有している。成熟度が低い好中球−骨髄から血流に放出されたばかりのもの−は、「ｂａｎｄ」として知られる。また、血球算定の他のデータ／パラメータとして、例えば、リンパ球（例えば、腺熱などの一部のウイルス感染、及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）で増加し、ＨＩＶ管線によって減少する）；単球（細菌感染、結核、マラリア、ロッキー山発疹熱、単球性白血病、慢性潰瘍性大腸炎、及び限局性腸炎で増加する場合がある）；好酸性顆粒球（例えば、寄生虫感染、ぜんそく、又はアレルギー反応において増加）；塩基好性顆粒球（例えば、白血病又はリンパ腫などの骨髄関連状態で増加）も挙げてよい。
【００５８】
本明細書で使用するとき、血球算定のデータ／パラメータとして、例えば、血小板数、血中の寸法及び寸法範囲についての情報を含む血小板に関するデータ；平均血小板容積（ＭＰＶ）−血小板の平均寸法の測定値も挙げてよい。
【００５９】
本発明の方法の別の態様では、粒子対比剤組成物と接触され、及び／又は撮像される細胞は、マラリアに感染した細胞、異変型リンパ球などの異常細胞である。本発明のいくつかの態様では、細胞は、状態、疾患、感染及び／又は症候群を同定、予測、診断、予後診断、又は診断を支持するために利用できる、異常細胞である。
【００６０】
本発明の方法の別の態様では、細胞は血小板である。
【００６１】
特に明示的に指示のない限り、本開示で言及される「粒子（particle）」又は「粒子（particles）」は、流体中に分散される任意の分離した、つまり有形の物体を包含すると理解される。本明細書で使用するとき、「粒子」は、体液中の全ての測定可能かつ検出可能な（例えば、画像及び／又はその他測定可能パラメータにより）構成成分を含んでよい。粒子は、任意の物質、任意の形状、及び任意の寸法である。特定の実施形態では、粒子は細胞を含んでよい。粒子の例として、血球、胎児細胞、上皮細胞、幹細胞、腫瘍細胞、若しくは細菌、寄生体などの細胞、又は前記の任意のものの断片、若しくは体液中の別の断片が挙げられるが、これらに限定されない。血球は、体液中に潜在的に存在する任意の正常又は異常、成熟又は未熟細胞を含む任意の血球、例えば、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、血小板（ＰＬＴ）及びその他細胞であってよい。この種類には、未熟又は異常細胞を含んでもよい。未熟ＷＢＣとして、後骨髄球、骨髄球、前骨髄球、及び芽球を挙げてよい。成熟ＲＢＣに加えて、ＲＢＣの種類には有核ＲＢＣ（ＮＲＢＣ）及び網赤血球を含んでよい。ＰＬＴとして、「巨大」ＰＬＴ及びＰＬＴ凝集物を挙げてよい。血球及び有形成分は、本開示の別の場所で更に説明する。
【００６２】
例示の粒子として、例えば、球状及び非球状粒子を含む、生体流体サンプル中の有形成分を挙げてよい。特定の実施形態では、粒子は非球状成分を含んでよい。非球状成分の投影像は、高分解能撮像装置の焦点面において最大化できる。特定の実施形態では、非球状粒子は、高分解能撮像装置の焦点面に整列する（流れ方向と実質的に平行な面に整列する）。いくつかの実施形態では、血小板、網赤血球、有核ＲＢＣ、並びにＷＢＣ、例えば好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、及び未熟ＷＢＣ、例えば芽球、前骨髄球、骨髄球、又は後骨髄球は、粒子として計数され、分析される。
【００６３】
本明細書で使用するとき、検出可能かつ測定可能な粒子パラメータとして、例えば、寸法、形状、対称性、外形及び／又はその他特性の視覚的及び／又は非画像ベースの指標を挙げてよい。
【００６４】
サンプルは、例えば、体液サンプル、血液、血清、脳脊髄液、胸膜液、腹膜液、唾液、精液、涙液、汗、乳汁、羊水、洗浄液、骨髄吸引液、滲出液（effusions）、滲出液（exudates）、又は被験体から得られるその他サンプル（例えば、細胞懸濁液を得るために処理されている生検サンプル、又は、粒子を含む実験室若しくは生産ラインサンプル）などの、単離され及び／又は調製された生体サンプルであってよい。いくつかの実施形態では、サンプルは、細胞懸濁液を得るのに処理されている、固体組織サンプル、例えば生検サンプルであってよい。サンプルは、糞便サンプルの処理によって得られる懸濁液であってもよい。サンプルは、細胞培養サンプルなどの粒子を含む、実験室、化学的、工業的又は生産ラインサンプルであってもよい。用語、サンプルは、患者若しくは実験室、又はその任意の画分、部分、若しくはアリコートから得られるサンプルを指すのに使用されてよい。サンプルを希釈し、部分に分け、又はいくつかの工程で対比剤で処理してもよい。
【００６５】
本明細書に開示される方法は、哺乳類、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えばサル）、ウマ、ウシ又はその他家畜、イヌ、ネコ、又はその他ペットとして飼われる哺乳類、ラット、マウス、又はその他実験動物；鳥類、例えばニワトリ；爬虫類、例えばワニ；魚類、例えばサケ及びその他養殖種；並びに両生類などの広範な範囲の生物のサンプルに適用できる。
【００６６】
サンプルは、任意の従来の方法、例えば、排泄、採取、回収、吸引、又は生検によって得ることができる。サンプルは、健康であると考えられる被験体から、例えば、定期健康診断の一部として採取されたサンプルであってよい。サンプルは、ある障害を有する、障害のリスクがある、又は障害を有する疑いがある被験体からのものであってもよい。障害は、疾患、遺伝的異常、感染、外傷、又は未知の要因の結果であってよい。あるいは、又は加えて、この方法は、障害の一連の治療中に被験体をモニタリングするのに有用であってよい。ある処置及び／又は治療に応答しない兆候がある場合、医師は別の剤又は補助的剤を選択できる。被験体の状態及び特定の障害によって、ある場合は、サンプルを毎日、毎週、毎月、又は毎年１回（又は２回、３回など）採取してもよい。
【００６７】
粒子は、サンプルによって変化し得る。粒子は、生体細胞、例えば、血球、胎児細胞、幹細胞、腫瘍細胞又はそれらの断片であってよい。いくつかの実施形態では、粒子は、感染因子、例えば、ウイルス又は細菌であってよい。
【００６８】
本開示で言及される「血球」は、体液中に潜在的に存在する任意の正常又は異常、成熟又は未熟細胞、例えば、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、血小板（ＰＬＴ）及びその他細胞を包含すると理解される。一般に、正常ＲＢＣ、ＰＬＴ、及びＷＢＣは、それぞれ６〜８μｍ、２〜３μｍ、及び８〜１５μｍの範囲の粒径を有する。正常ＲＢＣ、ＰＬＴ及びＷＢＣは、正常患者の全血サンプル中に、それぞれ３．９〜５．７×１０１２個／Ｌ、１．４〜４．５×１０１１個／Ｌ、３．５〜１１×１０９個／Ｌであるおおよその細胞濃度範囲で存在する。Ｂａｒｂａｒａ  Ｊ．Ｂａｉｎ，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２００７，３４〜３６を参照のこと。
【００６９】
言及される「有形成分」は、生体流体サンプル中に存在する非流体成分を包含すると理解される。有形成分として、例えば、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）及び血小板（ＰＬＴ）、ＷＢＣ凝集物、単球、好中球、好酸球、好塩基球などの成熟リンパ球及び未熟白血球を含む白血球のサブクラスなど、科学的分類又は生理学的機能に基づく血球の種別が挙げられる。本明細書で使用する「有形成分」は、微生物、細菌、真菌、寄生体、又はこれらの断片若しくは別の細胞断片などの粒子も含む。主なＷＢＣの種類として、好中球、リンパ球、単球、好酸球、及び好塩基球が挙げられるが、これらに限定されない。この種類には、未熟又は異常細胞を含んでもよい。例えば、未熟ＷＢＣとして、後骨髄球、骨髄球、前骨髄球を挙げてよい。成熟ＲＢＣに加えて、ＲＢＣの種類には有核ＲＢＣ（ＮＲＢＣ）及び網赤血球を含んでよい。ＰＬＴとして、通常のＰＬＴ及びその寸法が通常のＷＢＣに近い「巨大」ＰＬＴを挙げてよい。本開示において言及される粒子の分類及び／又は下位分類の「種類（member）」又は「種類（members）」は、粒子の分類又は下位分類内の個々の粒子を包含すると理解される。
【００７０】
特に明示的に指示のない限り、本開示において言及される粒子の「分類」は、寸法、形状、外見、又は色などの測定、検出、又は派生した少なくとも１つの検出基準を用いて検出された粒子群を包含すると理解される。いくつかの実施形態では、本開示の機器によって計数された粒子の少なくとも１つの分類及び／又は下位分類の種類は、同種の有形成分である。
【００７１】
かかる粒子は、「チャネル」内で検出されてよい。本開示において言及される「チャネル」は、シグナル源に連結される検出器を備える粒子計数器の一部を包含すると理解され、程度の差はあるものの、少なくとも１つのチャネル検出基準を満たす粒子によって変化する出力値を提供する。例えば、チャネル検出基準は、粒子の寸法又は容積に基づいてよい。いくつかの実施形態では、粒子計数器中のチャネル数は１つである。いくつかの別の実施形態では、粒子計数器中のチャネル数は２つ以上である。
【００７２】
粒子計数器の１つのチャネルで検出された粒子の１つの分類及び／又は下位分類は、異なる種別及びサブクラスの粒子、及び、２つ以上のサブクラスにグループ分けした粒子の種類を含んでよい。本開示において言及される粒子の「分類」は、寸法、形状、外見、又は色などの測定、検出、又は派生した基準に対応する粒子群を包含すると理解される。いくつかの実施形態では、本開示の機器によって計数された粒子の少なくとも１つの分類及び／又は下位分類の種類は、同種の有形成分である。
【００７３】
本明細書で使用するとき、用語、高分解能撮像装置は、形態的特徴及び／又は変化を区別するのに十分な視覚的相違点を有する、粒子画像の取得が可能な装置を含んでよい。例示の高分解能撮像装置として、例えば０．４〜０．５μｍを含む、例えば０．４６μｍなど、１μｍ以下の分解能を有する装置を挙げてよい。
【００７４】
本明細書で使用するとき、粒子対比剤組成物は、被験体サンプル中の粒子を解析するための視覚的分析器中で、粒子及び／又は細胞内オルガネラ配列液（ＰＩＯＡＬ）と組み合わせて使用するのに適していてよい。例示のＰＩＯＡＬは、例えば、被験体サンプル中の異なる種類の粒子の自動化認識法において有用である。
【００７５】
別の態様では、画像を得るとき、細胞はＰＩＯＡＬに包まれていてよい。好適な例示の細胞内オルガネラ配列液を本明細書に記載する。
【００７６】
本明細書で使用するとき、「整列」は、球状及び／又は非球状粒子の整列を一部特徴とし得る。例えば、非球状粒子などの粒子は、流れ方向と実質的に平行な面に整列されてよい。特定の実施形態では、非球状粒子の整列は、粒子の向きにより、高分解能撮像装置の焦点面における撮像条件下での非球状粒子の投影像が拡大することを特徴とする。球状粒子などの粒子により、焦点が合った粒子及び細胞の粒子内内容物の量を増やすことができ、粒子分類及び下位分類において視覚的相違点をもたらすのに有効である。球状粒子などの粒子の粒子内構造は、流れ方向と実質的に平行に配置、再配置、及び／又はより良く配置され得る。例えば、細胞内構造、オルガネラ、又は分葉についても、流れ方向と実質的に平行に配置、再配置、及び／又はより良く配置され得る。
【００７７】
本開示において言及される粒子の「種別」は、科学的分類に基づいた粒子の集団を包含すると理解される。例えば、全血サンプル中には、ＲＢＣ、ＷＢＣ、及びＰＬＴを含む３つの主な種別の血球が存在する。
【００７８】
本開示において言及される粒子の「種類（member）」又は「種類（members）」は、粒子の１つの分類又は下位分類内の粒子を包含すると理解される。例えば、血球の各分類は更に、下位分類、つまり種類に分けることができる。主なＷＢＣの種類として、好中球、リンパ球、単球、好酸球、及び好塩基球が挙げられるが、これらに限定されない。この種類には、未熟又は異常細胞を含んでもよい。例えば、未熟ＷＢＣとして、後骨髄球、骨髄球、及び前骨髄球を挙げてよい。成熟ＲＢＣに加えて、ＲＢＣの種類には有核ＲＢＣ（ＮＲＢＣ）及び網赤血球を含んでよい。ＰＬＴとして、通常のＰＬＴ及びその寸法が通常のＷＢＣに近い「巨大」ＰＬＴを挙げてよい。
【００７９】
言及される「未熟細胞」は、特定の発生段階、例えば、骨髄内、又は骨髄から放出直後であるが、成熟細胞へ完全に発達する前の細胞を包含すると理解される。
【００８０】
言及される「異常細胞」は、不規則な形態的特徴を有する細胞、又は、特定の疾患若しくは状態に関連する細胞、又は場合によっては、特定の疾患若しくは状態に関連し得る不規則なものを包含すると理解される。特定の疾患の例として、赤血球増多症、多血症、貧血症、赤芽球減少症、白血球増多症、白血球減少症、リンパ球増加症、リンパ球減少症、顆粒球増加症、顆粒球減少症又は無顆粒球、好中球増加症、好中球減少症、好酸球増加症、好酸球減少症、好塩基球増加症、好塩基球減少症、血小板増多症、血小板減少症、及び汎血球減少症が挙げられるが、これらに限定されない。ある細胞の種別は、血流中で増加又は減少する場合がある。いくつかの状態では、通常の白血球より非常に大きい異常細胞が、血液サンプル中に少量存在する。寸法、形状、色、及び／又は細胞内構造の変化は、特定の疾患又は状態と関連し得る。
【００８１】
本開示において言及される粒子の「計数」、つまり「粒子数」は、粒子計数器の１つのチャネルで得られる粒子の数を包含すると理解される。本開示において言及される粒子の種別又は種類の「濃度」は、単位量当たり（例えば、１リットル当たり）又は既知の量のサンプル当たりの粒子の数を意味すると理解される。例えば、粒子計数器は、粒子の分類に対する計数又は濃度又はその他計数を基にした関数を提供でき、一方、視覚的分析器は、粒子の各分類又は下位分類に対する計数、濃度、比率、又はその他濃度を基にしたパラメータを提供できる。
【００８２】
本開示において言及される「比率」は、粒子の２つの分類／下位分類、種別、又は種類の任意の量的及び／又は比較比率を包含すると理解される。かかる比率の例として、粒子の濃度比、重量比、及び／又は数量比が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、比率は、１つの分類、種別、又は種類の計数の、別のかかる分類、種別、又は種類の計数に対する分数と関係がある。いくつかの実施形態では、重みつき計数、又は、重みつき及び／若しくは比較比率を用いる定量も実施されてよい。
【００８３】
血液学−粒子分析システム
ここで図面を確認すると、図１は、サンプル流３２中の微細粒子をデジタル画像処理を利用して撮像するよう構成される、高分解能撮像装置２４の観察ゾーン２３を通ってサンプル流体を運ぶための、例示のフローセル２２を、模式的に示す。フローセル２２は、粒子対比剤組成物との接触などの処理と、加熱を受け得るサンプル流体源２５と連結される。フローセル２２は、サンプル流体の粘度を超える粘度を有する澄明グリセロール溶液などの、１つ以上の粒子及び／又は細胞内オルガネラ配列液（ＰＩＯＡＬ）源２７にも連結される。
【００８４】
サンプル流体を、サンプル供給管２９の遠位端２８にある平坦な開口部を通して、ＰＩＯＡＬ流が実質的に確立されており、その結果、リボン状のサンプル流の上部及び下部（又は反対側）に安定かつ対称的なＰＩＯＡＬの層流が得られる点において、フローセル２２の内部に注入する。サンプル及びＰＩＯＡＬ流は、実質的に狭まっている流路に沿って、注入されたサンプル流体と共にＰＩＯＡＬを動かす精密定量ポンプによって供給され得る。ＰＩＯＡＬは、流路が狭まるゾーン２１において、サンプル流体を包み、圧縮する。したがって、ゾーン２１における流路厚さの減少は、サンプル流３２の形状に着目するのに寄与し得る。サンプル流体リボン３２は、ＰＩＯＡＬに包まれ、ＰＩＯＡＬに沿って狭窄ゾーン２１の下流に運ばれ、例えば、ＣＣＤ  ４８を用いて画像を収集する高分解能撮像装置２４の観察ゾーン２３の前面、ないしは別の方法で通過する。プロセッサ１８は、ＣＣＤ  ４８からピクセルデータを入力値として受信できる。サンプル流体リボンは、ＰＩＯＡＬと共に放出口３３まで流れる。
【００８５】
ここに示されるように、狭窄ゾーン２１は、遠位厚さＤＴが近位厚さＰＴ未満であるように、近位厚さＰＴを有する近位流路部２１ａ、及び遠位厚さＤＴを有する遠位流路部２１ｂを有してよい。したがってサンプル流体は、近位部２１ａの遠位、かつ遠位部２１ｂの近位である場所で、サンプル管２９の遠位端２８を通って注入され得る。したがって、ＰＩＯＡＬ流がゾーン２１によって圧縮されると、サンプル流体はＰＩＯＡＬの包みに入ることができ、このときサンプル流体注入管は遠位出口を有し、ここを通ってサンプル流体が流れているシース液中に注入され、この遠位出口はフローセルの流路サイズの縮小部によって囲まれる。
【００８６】
対物レンズ４６を有するデジタル高分解能撮像装置２４は、リボン状のサンプル流３２を横切る光軸に沿って方向付けられる。光センサアレイ上に焦点を合わせたデジタル画像を解像し、収集するため、対物レンズ４６とフローセル３３との間の相対距離を、モータ駆動部５４の操作によって可変させる。
【００８７】
いくつかの実施形態によると、システムを操作して、サンプル流体リボン３２の流体焦点調節が可能である。用語、流体焦点調節（ｈｙｄｒｏｆｏｃｕｓ又はｈｙｄｒｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）は、シース液とサンプル流体との間の粘度差、フローセルの幾何学的狭窄移行ゾーン、及び、シース液とサンプル流体との間の速度差によって影響される焦点効果を指すことができる。流体力学的流れが、サンプル流体流とシース液流との間の速度差から生じ、流れるリボン厚さ及び形状に影響する。
【００８８】
フローセル
フローセル２２の実施形態を、図２及び３に更に示す。ここに示されるように、フローセル２２は、サンプル源２５に、更にＰＩＯＡＬ材料源２７にも連結できる。サンプル流体は、カニューレ２９を介して、例えば、カニューレ２９の遠位出口３１を通ってフローセル２２内に注入される。典型的には、ＰＩＯＡＬシース液は、フローセル中の曲線状のチャネル部４１を通って、源２７から観察ゾーン２３に向かって運ばれるため、層流状態ではない。しかしながら、フローセル２２は、サンプル流体が流れるシース液内に導入される遠位出口３１を通過する際に、ＰＩＯＡＬシース液が層状である、若しくは層状になる、又は均一な速度プロファイルを呈するように構成されてよい。サンプル流体及びＰＩＯＡＬは、概ね矢印Ａで示す方向でフローセル２２に沿って流れ、その後、放出口３３を介してフローセル２２から出ることができる。フローセル２２は、流れ方向Ａにおいて対称的に狭まる（例えば、移行ゾーン２１にて）、内部流路２０を画定する。流路の対称性によって、サンプル流のしっかりとした中心にある流れがもたらされる。フローセル２２は、ＰＩＯＡＬに包まれたサンプル流れ３２を方向付け、フローセル中の観察ゾーン２３、すなわち、観察ポート５７の背面を通過するように構成される。覗き窓５７に関連するのは、自動焦点パターン４４である。フローセル２２は、顕微鏡の対物レンズ（図示せず）に対応する、つまり受容するように構成される、円形又は凹型台座５８も有する。
【００８９】
いくつかの実施形態によると、自動焦点パターン４４は、フローセル２２に対して固定され、リボン状サンプル流３２の面から変位距離で配置される位置を有してよい。ここに示される実施形態では、自動焦点パターン（標的４４）は、高分解能撮像装置（図示せず）によって覗き窓５７から収集される画像として観察できる位置で、フローセル２２に直接適用される。フローセル２２は、一体成形の材料から構成されてよい。あるいは、フローセル２２は、第１の、つまり上部、つまり層２２ａ、及び第２の、つまり下部、つまり層２２ｂから構成されてよい。ここに示されるように、ガラス、つまり透明窓ガラス６０を、第１部分２２ａに取り付け、つまり第１部分と一体化させる。ガラス６０は、フローセル内の少なくとも一部のサンプル流路を画定できる。光源４２からの光は、自動焦点パターン４４の開口部、つまり経路を通過して伝わり、流れ３２内を流れるサンプル粒子を照射できる。
【００９０】
いくつかの場合では、ガラス６０の厚さは、約１５０μｍ〜約１７０μｍの範囲内の値を有してよい。上で述べたように、ガラス６０は、流路、つまりシース（例えばＰＩＯＡＬ）チャネルの一部を画定、つまり形成してよい。薄いガラス６０を使用することによって、顕微鏡の対物レンズをサンプル流体リボンの極めて近くに配置することができ、そのため、流路に沿って流れる粒子の高倍率画像を得ることができる。
【００９１】
図３Ａは、撮像軸３５５と遠位移行ゾーン部３１６との距離が約８．２４ｍｍである、フローセルの実施形態の態様を示す。遠位移行ゾーン部３１６とカニューレ出口３３１との間の距離は、約１２．５４ｍｍである。カニューレ出口３３１とシース液入口３０１との間の距離は、約１２．７ｍｍである。カニューレ出口３３１と近位移行ゾーン部３１８との間の距離は、約０．７３ｍｍである。図３Ｂは、図３Ａの実施形態と比較して、カニューレ出口が移行ゾーンに対してより遠位の位置に移動しているフローセルの実施形態の態様を示す。ここに示されるように、カニューレ遠位端はフローセルの狭窄移行ゾーン内に送られており、撮像軸３５５と遠位移行ゾーン部３１６との間の距離は、約１６ｍｍ〜約２６ｍｍの範囲内である。いくつかの場合では、撮像軸３５５と遠位移行ゾーン部３１６との距離は、約２１ｍｍである。
【００９２】
図１を再度参照すると、フローセルの内部形状（例えば、移行ゾーン２１での）、並びに、ＰＩＯＡＬ及びサンプルの流速は、サンプルがリボン状流３２を形成するように調節され得る。この流れは、リボン状サンプル流に包まれる粒子と同じ程度の薄さであってよく、又は粒子より薄くてもよい。例えば白血球は、１０μｍ程度の直径を有する場合がある。１０μｍ未満の厚さを有するリボン状サンプル流を提供することによって、リボン状サンプル流がシース液、つまりＰＩＯＡＬによって引き延ばされると、細胞が方向付けられ得る。意外にも、リボン状サンプル流と異なる粘度、例えばより高い粘度のＰＩＯＡＬ層内を狭窄流路に沿ってリボン状サンプル流が引き延ばされると、有利には、流れ方向と実質的に平行な面に非球状粒子が整列し、細胞に力を加える傾向があり、細胞の内部構造の焦点が合った内容物を増加する。高分解能撮像装置２４の光軸は、リボン状サンプル流の面に対して実質的に垂直（直角）である。撮像点におけるリボン状サンプル流の線速度は、例えば２０〜２００ｍｍ／秒であってよい。いくつかの実施形態では、リボン状サンプル流の線速度は、例えば５０〜１５０ｍｍ／秒であってよい。
【００９３】
リボン状サンプル流厚さは、サンプル流体及びＰＩＯＡＬの相対粘度及び流速の影響を受け得る。例えば精密容積型ポンプを備えるサンプル源２５及び／又はＰＩＯＡＬ源２７は、リボン状サンプル流３２の寸法を最適化する、すなわち、少なくとも高分解能撮像装置２４の視野の幅を有する薄いリボンにするために、制御可能な流速でサンプル及び／又はＰＩＯＡＬを供給するように構成されてよい。
【００９４】
一実施形態では、ＰＩＯＡＬ源２７は、所定の粘度でＰＩＯＡＬを供給するように構成される。この粘度は、サンプルの粘度と異なっていてよく、サンプルの粘度より高くてよい。ＰＩＯＡＬの粘度及び密度、サンプル材料の粘度、ＰＩＯＡＬの流速、及びサンプル材料の流速を調整して、自動焦点パターンからの変位距離、かつ、所定の寸法特性、例えば有利なリボン状サンプル流厚さに、リボン状サンプル流を維持する。
【００９５】
実施形態では、ＰＩＯＡＬは、サンプルより高い線速度、及びサンプルより高い粘度を有することによって、サンプルを平坦なリボンに引き延ばす。ＰＩＯＡＬの粘度は最大１０センチポアズであってよい。
【００９６】
更に図２及び３を参照すると、フローセルの内部流路は、リボン状サンプル流をＰＩＯＡＬ内に注入する点から下流で狭まっており、例えば最大７μｍのリボン状サンプル流厚さをもたらし、及び／又は、内部流路は、５００〜３，０００μｍのリボン状サンプル流幅をもたらす。例示の実施形態では、図１に示されるように、フローセルの内部流路は、サンプル流をＰＩＯＡＬ内に注入する点の上流で狭窄移行ゾーンを開始する。
【００９７】
別の実施形態では、内部流路が狭まって、厚さ２〜４μｍのリボン状サンプル流厚さをもたらし、及び／又は、内部流路は、幅２０００μｍのリボン状サンプル流をもたらす。これらの寸法は、血液学的に特に有用である。この場合の流れの厚さは、一部の粒子、例えば弛緩状態の赤血球の直径より小さい。それにより、これらの粒子を、撮像軸に対して広いほうの径を向けるように再配置し始めることができ、特徴の識別を明らかにするのに役立つ。
【００９８】
リボン状サンプル流の線速度は、光センサアレイの撮像露出時間において、デジタル画像のモーションブラーを防ぐのに十分な程度に制限されてよい。光源は、任意に、閃光して、短時間で大きな入射光の振幅を与えるストロボライトであってよい。自動焦点パターン４４及び画像が同じ視野にある限り、光源は、リボン状サンプル流及び自動焦点パターンを同時に照射するように構成される。しかしながら、別の実施形態では、撮像用と自動焦点用の視野は異なっていてよく、例えば、別々に照射及び／又は撮像されてよい。
【００９９】
主題の開発には、方法並びに機器の態様を有する。視覚的分析器の焦点合わせの方法は、デジタル高分解能撮像装置又はデジタル画像取込装置であってよい高分解能撮像装置２４が、フローセル２２に対して固定される自動焦点パターン４４に焦点を合わせる工程を含み、ここで自動焦点パターン４４は、リボン状サンプル流３２から変位距離５２の位置に配置される。デジタル高分解能撮像装置２４は、リボン状のサンプル流３２を横切る光軸を有する対物レンズを有する。対物レンズとフローセル２２との間の相対距離は、モータ駆動部５４の操作によって可変であり、一方、高分解能撮像装置と最適焦点位置との間の光軸に沿った距離は既知である。デジタル高分解能撮像装置は、光センサアレイ上のデジタル画像を解像し、収集するように構成される。モータ駆動部を操作し、自動焦点プロセスにおいて自動焦点パターンに焦点を合わせる。続いて、変位距離全体でモータ駆動部を操作することによって、リボン状サンプル流に高分解能撮像装置の焦点を合わせる。
【０１００】
この方法は更に、リボン状サンプル流をリボン状に形成する工程を含んでよい。リボン形状は、高分解能撮像装置の光軸がリボン状サンプル流に対して実質的に直角、すなわち、リボン状流の面に対して垂直であるように呈示される。
【０１０１】
図４は、血液サンプル中の粒子を撮像するシステム４００の態様を示す。ここに示されるように、システム４００は、サンプル流体注入システム４１０と、フローセル４２０と、画像取込装置４３０と、プロセッサ４４０と、を備える。フローセル４２０は、シース液の流れを、任意にサンプル流体と組み合わせて送る流路４２２を提供する。いくつかの実施形態によると、サンプル流体注入システム４１０は、カニューレ、つまり管４１２を備えてよく、又はカニューレと連結されてよい。サンプル流体注入システム４１０は、流路４２２と流体連通してよく（例えば、サンプル流体入口４０２を介して）、システムを操作して、サンプル流体流４２８をもたらすために、サンプル流体４２４をカニューレ４１２の遠位出口４１３を通ってフローセル４２０内の流れるシース液４２６内に注入してよい。例えば、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、サンプル流体注入システム４１０によってサンプル流体４２４を流れるシース液４２６内に注入させるように構成される、コンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を備えてよく、又はその記憶媒体と連動してよい。ここに示されるように、シース液４２６は、シース液注入システム４５０によって（例えば、シース液入口４０１を介して）フローセル４２０内に導入されてよい。例えば、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、シース液注入システム４５０によってシース液４２６をフローセル４２０内に注入させるように構成される、コンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を備えてよく、又はその記憶媒体と連動してよい。
【０１０２】
サンプル流体流４２８は、注入管４１２に近接して第１厚さＴ１を有する。フローセルの流路４２２は、サンプル流体流４２８の厚さが、初期厚さＴ１から画像取込部位４３２に近接する第２厚さＴ２まで減少するように、流路サイズが減少する。画像取込部位４３２と整列する画像取込装置４３０を備え、第１サンプル流体の第１の複数の粒子をフローセル４２０の画像取込部位４３２において撮像する。
【０１０３】
プロセッサ４４０は、サンプル流体注入システム４１０、画像取込装置４３０、及び任意にシース液注入システム４５０と連結する。プロセッサ４４０は、サンプル流体過渡物が引き起こされるように、流れるシース液４２６中への第１サンプル流体の注入を終了し、流れるシース液４２６中に第２サンプル流体を注入し始めるように構成される。例えば、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、サンプル流体過渡物が引き起こされるように、サンプル流体注入システム４１０によって第２サンプル流体を流れるシース液４２６内に注入させるように構成される、コンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を備えてよく、又はその記憶媒体と連動してよい。
【０１０４】
更に、プロセッサ４４０は、サンプル流体過渡物の後、かつ、第１の複数の粒子の撮像の４秒以内に、フローセル４２０の画像取込部位４３２における第２サンプル流体の第２の複数の粒子の画像を取り込み始めるように構成される。例えば、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、画像取込装置４３０によって、サンプル流体過渡物の後、かつ、第１の複数の粒子の撮像の４秒以内に、フローセル４２０の画像取込部位４３２における第２サンプル流体の第２の複数の粒子の画像を取り込み始めさせるように構成される、コンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を備えてよく、又はその記憶媒体と連動してよい。
【０１０５】
図４Ａに示すフローセルの実施形態に示されるように、流路サイズの減少（例えば、移行ゾーン４１９ａにおける）は、流路４２２ａの対向壁４２１ａ、４２３ａによって画定されてよい。対向壁４２１ａ、４２３ａを、サンプル流体流４２８ａを二分する横断面４５１ａに対して概ね対称である、流路４２２ａに沿って半径方向内向きに角度付けてよい。面４５１ａは、サンプル流４２８ａが、カニューレ、つまりサンプル注入管４１２ａの遠位部４２７ａを出る位置である、サンプル流が第１厚さＴ１を有する場所で、サンプル流４２８ａを二分してよい。同様に、面４５１ａは、サンプル流４２８ａが画像取込部位４３２ａを通過する場所である、サンプル流が第２厚さＴ２を有する場所で、サンプル流４２８ａを二分してよい。いくつかの実施形態によると、第１厚さＴ１は約１５０μｍの値を有し、第２厚さＴ２は約２μｍの値を有する。かかる場合では、サンプルリボン流の圧縮比は７５：１である。いくつかの実施形態によると、第１厚さＴ１は約５０μｍ〜約２５０μｍの範囲内の値を有し、第２厚さＴ２は約２μｍ〜約１０μｍの範囲内の値を有する。サンプル流体がフローセルを通過して流れると、加速し、引き延ばされる間に、リボンは薄化する。フローセルの２つの特徴が、サンプル流体リボンの薄化に寄与し得る。第１には、シース液のつつみとサンプル流体リボンとの間の速度差を操作して、リボンの厚さを減らし得る。第２には、移行ゾーンのテーパ形状を操作して、リボンの厚さを減らし得る。
【０１０６】
図４Ａ（並びに図４及び４Ｂ−１）に示されるように、移行ゾーン４１９ａは、近位部（４１５ａ）及び遠位部（４１６ａ）での角度推移によって画定され得る。また、移行ゾーン４１９ａが代わりに、図１、３、３Ａ、３Ｂ、及び４Ｂ−２に示されるような滑らかな、つまり曲線状の推移と同様に、近位部（４１５ａ）及び遠位（４１６ａ）での滑らかな、つまり曲線状の推移を呈することができることも理解される。
【０１０７】
典型的には、第１厚さＴ１はサンプル粒子の寸法よりもかなり大きく、そのため粒子は、サンプルリボン流内に完全に含まれる。しかしながら、第２厚さＴ２は特定のサンプル粒子の寸法より小さい場合があり、そのためこれらの粒子は、サンプル流体を出て、その周囲のシース液に広がり得る。図４Ａに示されるように、サンプルリボン流は、カニューレを出て、画像取込部位に向かって運ばれるときと概ね同一面に沿って流れ得る。
【０１０８】
フローセルは更に、遠位カニューレ部４２７ａと画像取込部位４３２ａとの間に分離距離４３０ａをもたらし得る。いくつかの実施形態によると、サンプル流体注入管４１２ａの遠位部４２７ａを、画像取込部位４３２ａから軸方向分離距離４３０ａにおいて配置でき、この軸方向分離距離４３２ａは、約２１ｍｍの値を有する。いくつかの場合では、軸方向分離距離４３０ａは、約１６ｍｍ〜約２６ｍｍの範囲内の値を有する。
【０１０９】
カニューレ出口と画像取込部位との間の軸方向分離距離４３０ａは、流体が出口から画像取込部位まで運ばれる際の、サンプル流体の遷移時間に影響を与え得る。例えば、比較的短い軸方向分離距離４３０ａによって、より短い遷移時間をもたらすことができ、比較的長い軸方向分離距離４３０ａによって、より長い遷移時間をもたらすことができる。
【０１１０】
流路移行ゾーン４１９ａに対する、つまり流路移行ゾーン４１９ａの近位部４１５ａに対する、カニューレ遠位部４２７ａの出口の位置も、流体が出口から画像取込部位まで運ばれる際の、サンプル流体の遷移時間に影響（inference）し得る。例えば、シース液は、近位部４１５ａにおいて比較的低い速度を、近位部４１５ａと遠位部４１６ａとの間の位置で比較的高い速度を有し得る。そのため、遠位部４２７ａのカニューレ出口が近位部４１５ａに位置する場合、移動距離がより長いためだけではなく、カニューレ遠位口を出た後のサンプル流体の初期速度がより低い（より低いシース液速度による）ために、サンプル流体が画像取込部位に到達するまでにより長い時間がかかるであろう。言い換えれば、サンプル流体が、フローセルのより厚い部分（例えば、近位部４１５ａ付近）により長く存在するほど、サンプルが画像取込部位に到達するまでにより長く時間がかかる。逆に、遠位部４２７ａのカニューレ出口が近位部４１５ａより遠位（例えば、図４Ａに示されるように、近位部４１５ａと遠位部４１６ａとの間の中央位置）に位置する場合、移動距離がより短いためだけではなく、カニューレ遠位口を出た後のサンプル流体の初期速度がより高い（より高いシース液速度による）ために、サンプル流体が画像取込部位に到達するまでにより短い時間がかかるであろう。本明細書の別の場所で記載するように、ゾーン４１９ａの断面積が小さくなるために、シース液は移行ゾーン４１９ａを通過すると加速される。
【０１１１】
いくつかの実施形態によると、より短い遷移時間によって、画像取込部位での画像収集のために、より多くの時間を利用できる。例えば、カニューレ遠位先端部から撮像区域までの遷移時間が短くなると、特定の時間においてより多くのサンプルの処理が可能であり、関連して、特定の時間（例えば、１分当たりの画像数）においてより多くの画像を得ることが可能である。
【０１１２】
カニューレ遠位部の出口４２７ａを画像取込部位４３２ａにより近く配置することによる利点があるものの、出口と取込部位との間に一定の距離を維持することも望ましい。例えば、図３に示されるように、撮像装置の光学対物レンズ、つまり前部レンズを、フローセル２２の台座５８に位置付けることができる。カニューレの出口３１が台座５８に近すぎる場合、サンプル流体がシース液中に注入された後、画像取込部位において所望の撮像特性を提供するために、十分に安定化されない場合がある。同様に、テーパ状領域が、画像取込装置の対物レンズを収容する台座５８の配置に干渉しないように、観察ゾーン２３からある距離でテーパ状移行領域２１を保持することが望ましい場合がある。
【０１１３】
続けて図４Ａを参照すると、サンプル流体注入管４１２ａの下流端４２７ａを、流路移行ゾーン４１９ａの近位部４１５ａより遠位に配置することができる。関連して、サンプル流体注入管４１２ａの下流端４２７ａを、流路移行ゾーン４１９ａの遠位部４１６ａより近位に配置することができる。そのため、いくつかの実施形態によると、サンプル流体は、注入カニューレ４１２ａから、移行ゾーン４１９ａ内の位置でフローセル内に注入され得る。
【０１１４】
いくつかの実施形態によると、流路サイズの（例えば、流路移行ゾーン４１９ａでの）減少における対称性を操作して、血液サンプル中の粒子の誤整列を制限する。例えば、かかる対称性は、血液サンプル中の赤血球撮像方向の誤整列を約２０％未満に制限するのに有効であり得る。
【０１１５】
いくつかの実施形態によると、本明細書に開示される方法は、血球算定分析中のフラグ付け率を、サンプルの３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％又は５％未満に操作可能である。
【０１１６】
いくつかの実施形態によると、画像取込部位４３２ａは、約１５０μｍ×１５０μｍ〜４００μｍ×４００μｍの視野４３３ａを有する。いくつかの場合では、画像取込部位４３２ａは、約２７５μｍ×２７５μｍの視野４３３ａを有する。いくつかの場合では、視野は、長さ×幅を単位として定義されてよい。表面積で表される場合、２７５μｍ×２７５μｍの視野は、７５，６２５μｍ２の面積を有する。いくつかの実施形態によると、視野は、撮像装置の対物レンズ及びその倍率によって決定され得る。いくつかの場合では、視野は、収集光学素子（例えば、対物レンズ、チューブレンズ、及びカメラ）によって撮像される視野の範囲（面積）に一致してよい。いくつかの場合では、視野は、画像取込部位の透明領域の観察ポートより非常に小さい。
【０１１７】
図４Ａ−１及び４Ａ−２は、サンプル流がカニューレ出口から画像取込部位まで運ばれる際の、流体焦点調節のサンプル流に対する影響を示す。図４Ａ−１に示されるように、サンプル流は、約１５０μｍである高さＨ（Ｓ）と、約１３５０μｍである幅Ｗ（Ｓ）と、を有し得る。更に、ＰＩＯＡＬシース流は、約６０００μｍである高さＨ（Ｐ）と、約４０００μｍである幅Ｗ（Ｐ）と、を有し得る。流体焦点調節の後では、図４Ａ−２に示されるように、サンプル流は、約２μｍである高さＨ（Ｓ）と、約１３５０μｍである幅Ｗ（Ｓ）と、を有し得る。更に、ＰＩＯＡＬシース流は、約１５０μｍである高さＨ（Ｐ）と、約４０００μｍである幅Ｗ（Ｐ）と、を有し得る。一実施形態では、カニューレ出口におけるＰＩＯＡＬシース流の断面積は、画像取込部位付近の断面積より４０倍大きい。
【０１１８】
いくつかの実施形態によると、画像取込部位でフローセルチャネルの断面を決定することが有用である場合がある。これは、図４Ａ−２に示されるような、ＰＩＯＡＬシース流の約１５０μｍである高さＨ（Ｐ）と、約４０００μｍである幅Ｗ（Ｐ）に一致し得る。また、画像取込部位において、フローセルを流れるサンプル流体及びシース液を組み合わせた体積流量を決定することが有用である場合もある。断面積及び流速が既知であるとき、画像取込部位において、サンプル流体及びシース液を組み合わせた速度を決定することが可能である。
【０１１９】
いくつかの実施形態によると、フローセルを通るサンプル流体及びシース液の流れは、平行板特性モデルにより近似できる。関連して、サンプル流体流の中央部（例えば、図４Ａ−２に示される）の流速は、サンプル流体及びシース液流を組み合わせた平均流速の約１．５倍であり得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態によると、カニューレ出口でのサンプル流の断面積（例えば、図４Ａ−１のＷ（Ｓ）×Ｈ（Ｓ））は、撮像部位でのサンプル流の断面積（例えば、図４Ａ−２のＷ（Ｓ）×Ｈ（Ｓ））より４０倍大きい。撮像区域におけるシース液の体積流量は、約４５μＬ／秒であり得る。撮像区域におけるサンプル流体の体積流量は、約０．２３２μＬ／秒であり得る。いくつかの場合では、撮像部位におけるシース流及びサンプル流の組み合わせた断面積は、６００，０００μｍ２である。いくつかの場合では、撮像部位における平均流れ速度は、７５ｍｍ／秒である。
【０１２１】
流速、つまり速度は、鮮明で焦点の合った細胞画像が得られる速度として決定され得る。例示の流速及び速度は、撮像部位において、特定のサンプル流れリボン形状又は特徴の達成が観測された、２種類のサンプルの流速を基にして発見された。例えば、約７５ｍｍ／秒の流速（つまり、２０〜２００ｍｍ／秒の範囲内）において、細胞は、連続画像において細胞の重なりがあるほどにはゆっくりと流れず、細胞は、ゴースト効果が得られる（ブラー画像）ほどには早く流れない。関連して、極端に高い流速を避けることによって、試薬及びサンプルをより節約することができる。いくつかの実施形態によると、体積流量（ポンプ速度）又はカニューレの形状のいずれかを変更することによって、最適な、つまり所望の線速度を達成することができる。
【０１２２】
画像取込ゾーンを通るサンプル流の流速は、フローセル機能に対する画像取込装置の性能にも関係し得る。例えば、サンプル流が早く流れすぎる場合、サンプルに含まれる粒子鮮明な画像を得ることが難しい場合がある（例えば、画像取込装置のシャッター速度が遅すぎて、ブラー画像が得られる場合）。同様に、サンプル流が遅く流れすぎる場合、画像取込装置は、同じ粒子の連続画像を得る場合がある（例えば、２枚の画像取り込み中、取り込みフレーム内に同じ粒子が留まる）。いくつかの実施形態では、フレーム取り込み間で最低限の流れがあるように、サンプルリボンの速度を画像取込速度に対して調節でき（例えば、様々なフローセル操作パラメータのうち任意のものを調節することにより）、そのため高い割合のサンプルが撮像される。
【０１２３】
いくつかの実施形態によると、粒子分析システム及び関連する構成部品は、シース液及び流体サンプルがフローセルを通って流れるとき、シース液が、４５μＬ／ｓのシース液体積流量で流れ、流体サンプルが０．２３２μＬ／ｓ（又は０．２〜０．３５μＬ／ｓの範囲内）の流体サンプル体積流量で流れることができるように、構成されてよい。いくつかの場合では、シース液の流速のサンプル流体の流速に対する比は約２００である。いくつかの場合では、シース液の流速のサンプル流体の流速に対する比は、約７０〜２００の範囲内の値を有する。いくつかの場合では、シース液の流速のサンプル流体の流速に対する比は約１９３である。いくつかの場合では、シース液の流速のサンプル流体の流速に対する比は約７０である。場合によっては、フローセル内を流れるシース液量の流体サンプル量に対する比は、２５：１〜２５０：１の範囲内であってよい。
【０１２４】
いくつかの実施形態によると、システム及び関連する構成部品は、シース液及び流体サンプルがフローセル４２０を通って流れるとき、シース液が、撮像区域の前に７５ｍｍ／秒のシース液速度で流れ、流体サンプルが、撮像区域の前に１３０ｍｍ／秒の流体サンプル速度で流れることができるように、構成されてよい。場合によっては、フローセル内を流れるシース液量の流体サンプル量に対する比は、１００：１〜２００：１の範囲内であってよい。
【０１２５】
場合によっては、フローセルは、最小圧縮比である約５０：１、及び最大圧縮比である約１２５：１を有してよい。いくつかの場合では、最小圧縮比は約３０：１又は２０：１であってよい。この圧縮比は、図４Ａ−１を図４Ａ−２と比較するとき、流れ厚さＨ（Ｓ）：Ｈ（Ｓ）の比率を指す。この圧縮比は、幾何学的圧縮（例えば、図４Ａ−１を図４Ａ−２と比較するとき、シース液厚さＨ（Ｐ）：Ｈ（Ｐ）の比率、一般に、図４Ａに示される、フローセルの狭窄テーパ状移行ゾーン４１９ａの寸法に相当し得る）と、流体力学的圧縮（例えば、速度の違いにも相当する）の組み合わせによって影響され得る。いくつかの実施形態によると、幾何学的圧縮比は約４０：１である。
【０１２６】
移行ゾーンに一致する流路サイズの減少は、近位厚さ、つまり高さを有する近位流路部、及び、近位厚さ、つまり高さ未満の遠位厚さ、つまり高さを有する遠位流路部によって画定され得る。例えば、図４Ｂ−１及び４Ｂ−２の部分図に示されるように、流路の移行ゾーン４１９ｂは、近位部４１５ｂと遠位部４１６ｂとの間の長さＬを有してよく、このとき近位部４１５ｂは近位高さ４１７ｂを有し、遠位部４１６ｂは遠位高さ４１８ｂを有する。図４Ｂ−２に示され、かつ、本明細書の別の場所で記載されるように、移行ゾーンの形状、つまり外形は、曲線状、つまり滑らかであってよく、例えば、Ｓ字曲線、Ｓ字状曲線、又は、正接曲線の形状で提供されてよい。いくつかの実施形態によると、近位高さ４１７ｂは約６０００μｍの値を有する。いくつかの場合では、近位高さ４１７ｂは、約３０００μｍ〜約８０００μｍの範囲内の値を有する。いくつかの実施形態によると、遠位高さ４１８ｂは約１５０μｍの値を有する。いくつかの場合では、遠位高さ４１８ｂは、約５０μｍ〜約４００μｍの範囲内の値を有する。
【０１２７】
移行ゾーン４１９ａの形状は、第１流路境界４０３ｂと二分する横断面４５１ｂとの間の第１角度α１、及び第２流路境界４０４ｂと二分する横断面４５１ｂとの間の第２角度α２を与え得る。いくつかの場合では、角度α１は約４５度であり、角度α２は約４５度である。いくつかの場合では、角度α１は、約１０度〜約６０度の範囲内の値を有する。いくつかの場合では、角度α２は、約１０度〜約６０度の範囲内の値を有する。いくつかの実施形態によると、角度α１及びα２は同じ値を有する。角度α１及びα２は、近位部４１５ｂから遠位部４１６ｂまで運ばれるとき、層流を維持し、つまりサンプル流体の乱流を最小限にするように選択されてよく、これによって横断面４５１ｂに沿ったサンプル内の粒子の整列を強化できる。図４Ａを参照して上で記載してように、移行ゾーンの遠位及び近位境界、つまり遠位及び近位部は、角度付きに代わって、曲線状、つまり滑らかであってよい。
【０１２８】
図４Ｃは、カニューレが長さＬを有する、本発明の実施形態による例示のカニューレ、つまりサンプル供給管４００ｃの特徴部を示す。図４Ｄは、カニューレ４００ｄの長手方向断面を示す。ここに示されるように、カニューレ４００ｄは、遠位平坦部４１０ｄと、中央テーパ形状部４２０ｄと、近位管状部４３０ｄと、を含む。図４Ｃ−１に示されるように、例示のカニューレ、つまりサンプル供給管４００ｃ−１は、遠位部４１０ｃ−１及び近位部４３０ｃ−１を有し得る。いくつかの場合では、遠位部４１０ｃ−１は、約１．３５９ｍｍの長さと約１．４３ｍｍの幅と、を有する。いくつかの場合では、遠位端の出口は、約１．３５９ｍｍの出口幅Ｗ（Ｅ）を有する。いくつかの実施形態によると、カニューレは、図４Ｃ及び４Ｄに示されるものと異なる内部流路形状を有してよい。例えば、図４Ｄ−１に示されるように、カニューレ４００ｄ−１は、拡張した流路断面積を有するテーパ状中央部を含まない。図４Ｄ−１に示されるように、カニューレ４００ｄ−１は、遠位部４１０ｄ−１と、先細り内径を有する中央テーパ形状部４２０ｄ−１と、近位部４３０ｄ−１と、を有する。中央部４２０ｄ−１の先細り内径に対応して、４１０ｄ−１の内部断面積は、４３０ｄ−１の内部断面積より小さい。
【０１２９】
図４Ｅは、遠位平坦部４１０ｅの横断面図を示す。ここに示されるように、遠位部４１０ｅは、サンプル流が通って流れる内部幅Ｗ（Ｉ）と、内部高さＨ（Ｉ）と、を有する。更に、遠位部４１０ｅは、外部幅Ｗ（Ｏ）と、外部高さＨ（Ｏ）と、を有する。図４Ｄ及び４Ｅを組み合わせて示されるように、サンプル流体注入管の遠位部４１０ｅは、高さＨ（Ｉ）及び幅Ｗ（Ｉ）を有する出口Ｐを有し、高さＨ（Ｉ）は幅Ｗ（Ｉ）より小さい。いくつかの実施形態によると、遠位部４１０ｅの出口Ｐの高さＨ（Ｉ）（つまり、遠位部４１０ｄの内部高さ）は、約１５０μｍの値を有してよい。いくつかの場合では、高さＨ（Ｉ）は、約５０μｍ〜約２５０μｍの範囲内の値を有してよい。いくつかの実施形態によると、遠位部４１０ｅの出口Ｐの高さＷ（Ｉ）（つまり、遠位部４１０ｄの内部幅）は、約１３５０μｍの値を有してよい。いくつかの場合では、幅は約１１９４μｍである。いくつかの場合では、幅Ｗ（Ｉ）は、約５００μｍ〜約３０００μｍの範囲内の値を有してよい。いくつかの場合では、遠位平坦部４１０ｄは、クランプ力を管、つまり導管に加えることによって製造され得る。
【０１３０】
図４Ｆは、中央テーパ形状部４２０ｆの横断面図を示す。ここに示されるように、中央テーパ形状部４２０ｆは、サンプル流が通って流れる内径Ｄ（Ｉ）を有する。更に、中央テーパ形状部４２０ｆは外径Ｄ（Ｏ）を有する。図４Ｇは、近位部４３０ｇの横断面図を示す。ここに示されるように、近位部４３０ｇは、サンプル流が通って流れる内径Ｄ（Ｉ）を有する。更に、遠位部４３０ｇは外径Ｄ（Ｏ）を有する。
【０１３１】
図４Ｄに示されるように、注入管、つまりカニューレ４００ｄは、第１流路断面積（例えば、図４Ｇに示されるπ×（Ｄ／２）２）を有する近位部４３０ｄと、第１流路断面積より小さい第２流路断面積（例えば、図４Ｅに示されるＷ（Ｉ）×Ｈ（Ｉ））を有する遠位部４１０ｄと、近位部４３０ｄと遠位部４１０ｄとの間に配置される第３部分４２０ｄと、を有してよい。第３部分４２０ｄは、第１及び第２流路断面積より大きい第３流路断面積（例えば、図４Ｆに示されるπ×（Ｄ／２）２）を有してよい。場合によっては、近位部４３０ｇの外径Ｄ（Ｏ）は約１０６７μｍであり、近位部４３０ｇの内径Ｄ（Ｉ）は約８１３μｍである。
【０１３２】
いくつかの実施形態によると、注入管の近位部は、サンプル入口取り付け具のサンプル口に連結されてよい。例えば、図４Ｈに示されるように、カニューレ４００ｈの近位部４０５ｈは、サンプル入口取り付け具４２０ｈの出口において、サンプル口４１０ｈに直接連結されてよい。
【０１３３】
血液サンプル中の粒子撮像用システムのフローセルは、重力の方向に対して任意の所望の角度、つまり方向に向けてよい。例えば、フローセルは、フローセル内を流れる流体（例えば、任意にサンプル流体と組み合わせたシース液）が、重力に逆らって上向きに運べるように、上向きに向けられてよい。同様に、フローセルは、フローセル内を流れる流体（例えば、任意にサンプル流体と組み合わせたシース液）が、重力と従って下向きに運べるように、下向きに向けられてよい。図４Ｉは、フローセル４２０ｉ内を流れるサンプル流体４２４ｉ及びシース液４２６ｉが、重力Ｇに逆らって流れるように、上向きに向けられたフローセル４２０ｉを示す。図４Ｊは、フローセル４２０ｊ内を流れるサンプル流体４２４ｊ及びシース液４２６ｊが、重力Ｇに逆らって流れず、むしろ重力Ｇに従って流れる、下向きに向けられたフローセル４２０ｊを示す。
【０１３４】
図４Ｋに示されるように、フローセル４２０ｋの画像取込部位４３２ｋを通って流れるサンプル流リボンＲは、約２μｍである厚さＴを有してよい。いくつかの場合では、サンプル流リボンの厚さＴは、最大約３μｍであってよい。典型的には、サンプル流厚さより小さい細胞、つまり粒子は、リボン内に含まれる。例示の赤血球（ＲＢＣ）は、両凹ディスクとして呈示され得、約６．２μｍ〜約８．２μｍの直径Ｄを有してよい。更に、例示の赤血球は、約２μｍ〜約２．５μｍの最大厚さＴ１と、約０．８μｍ〜約１μｍの最小厚さＴ２と、を有してよい。いくつかの場合では、赤血球は最大約３μｍの厚さを有してよい。例示のヒト血小板は寸法が可変であってよく、これも約２μｍの厚さ、つまり直径を有してよい。ここでは正確な縮尺で示されていないが、フローセルは、画像取込部位において、約１５０μｍの値を有する流路厚さＦを画定し得る。いくつかの場合では、流路厚さＦは、５０μｍ〜４００μｍの値を有する。この流路厚さＦは、図４Ｂ−１及び４Ｂ−２に示される遠位部４６１ｂの遠位高さ４１８ｂにも一致し得る。
【０１３５】
図４Ｋに示されるように、サンプル流体流の厚さＴの粒子（赤血球）の厚さに対する比は、約１：１である。いくつかの実施形態によると、画像取込部位におけるサンプル流体流の厚さＴの、粒子の１つの寸法に対する比は、０．２５〜２５の範囲内である。いくつかの場合では、厚さＴは、０．５μｍ〜５μｍの範囲内の値を有してよい。
【０１３６】
本明細書の別の場所で、並びに同時係属の米国特許出願第＿＿＿＿号で記載されるように、サンプルリボンＲの流体とシース液との間の粘度差を操作して、サンプル流中の粒子、例えば赤血球を、流れ方向に沿って整列する、つまり向けることができる。そのように整列されると、図４Ｋに示されるように、血球の主表面がカメラに向かって面するため、撮像装置、つまりカメラが、円形に見えるような赤血球の画像を得ることができる。このように、赤血球は、流れに対して低い抵抗力を示して整列する。そのため、シース液及びサンプル流体の相対粘度特性は、カメラに向かって面する赤血球の高い割合、つまり数に貢献できることから、粒子分析システムの評価能を改善する。
【０１３７】
いくつかの実施形態によると、シース液の粘度特性を操作して、血液サンプル中の粒子の誤整列を制限する。例えば、粘度差は、血液サンプル中の赤血球撮像方向の誤整列を約１０％未満に制限するのに有効であり得る。つまり、サンプル中の１００個の赤血球のうち、９０個以上の赤血球を、その主表面が撮像装置に向けて面するように整列できる。対称的な狭窄移行ゾーンは、２０％の値を提供できる。例えば図４Ｒを参照して本明細書の別の場所で記載するように、対称的な狭窄フローセル移行ゾーン及び粘稠なシース液を伴う分析器構成により得られた整列結果と、粘稠なシース液を用いずに対称的な狭窄フローセル移行ゾーンを伴う分析器構成により得られた整列結果を比較することができる。粘稠なシース液の使用により、誤整列した細胞の割合を低下できる。いくつかの実施形態によると、シース液は、水と類似する（すなわち、ｎ＝１．３３３０）屈折率を有する。いくつかの場合では、シース液の含水量は約８９％である。粘度差の結果として得られる整列効果に加えて、整列効果は、両側のテーパ状移行ゾーンの結果としても得られる。いくつかの場合では、両側の（すなわち対称的な）テーパ状移行ゾーンは、非対称的テーパ状移行ゾーンのデザインと比較して、粒子の整列において２倍有効である。
【０１３８】
赤血球の効率的な整列は、診断の改善に寄与できる。いくつかの場合では、撮像された赤血球の形状を用いて、サンプルを得る患者が特定の生理学的状態、つまり疾患を有するかどうかを判定できる。例えば、鎌状血球症の患者は、異常形状（すなわち、鎌状）を有する血球を呈する。そのため、整列した赤血球の高品質画像を得ることによって、確実に正確な診断を行うことが可能である。赤血球のその他の形状変化、例えば、赤血球が自転車のタイヤ状の外観を示すことによる辺縁領域が薄く、中央領域が大きくて平らな赤血球を、即時整列法を用いて効率的に撮像できる。同様に、赤血球がトラックのタイヤ状の外観を示すことによる中央部が小さく、辺縁領域が厚い赤血球を、診断目的で撮像できる。本明細書に開示される改善された撮像技術は、別の赤血球特性、例えばヘモグロビン含量、鉄含量などの評価にも有用である。
【０１３９】
任意の特定の理論に制限されるものではないが、シース液の粘度とサンプル流体の粘度との粘度差が大きいと、放物線形状が変わると考えられ、このときこの形状は、概して放物線状であり、加速度が増す流れの中央部に対応する中央隆起部を有し、この中央隆起部により、サンプル粒子又は粒子内オルガネラの整列がもたらされる。いくつかの実施形態によると、シースとサンプルリボンとの間の速度差、及び粘度差により剪断力が生じ、オルガネラ、つまり細胞内粒子の整列を高める。シース液の放物線形状の例示の態様は、同時係属の米国特許出願第＿＿＿＿＿＿＿＿号に記載されており、その内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
白血球は、典型的には赤血球及び血小板より大きい。例えば、例示の好中球及び好酸球は、約１０μｍ〜約１２μｍの直径を有し得る。例示の好塩基球は、約１２μｍ〜約１５μｍの直径を有し得る。例示のリンパ球（小）は、約７μｍ〜約８μｍの直径を有し得、例示のリンパ球（大）は、約１２μｍ〜約１５μｍの直径を有し得る。例示の単球は、約１２μｍ〜約２０μｍの直径を有し得る。シース液と流体サンプルリボンがフローセルを通過する際に、これらの間の相互作用を伴う粒子分析システムの構成を操作して、図４Ｌに示されるように、白血球が画像取込部位４３２ｌを通って運ばれる際に圧縮できる。そのため、例えば、白血球（ＷＢＣ）の中央部を、サンプル流体リボンＲ内に位置付けでき、白血球の辺縁部を、シース液内に位置付けできる。そのため、白血球がリボンによってフローセル内を運ばれるとき、白血球の側部はシース液内に延在できる。図４Ｋについて上述したサンプル流リボンＲの厚さＴ及び流路の厚さＦに対する数値又は範囲は、図４Ｌにも同様に適用できる。
【０１４１】
いくつかの実施形態によると、シース液とサンプル流体との間の粘度差を操作して、白血球などの細胞内に存在するオルガネラ又はその他細胞内特徴部を整列できる。任意の特定の理論に制限されるものではないが、シース液とサンプル流体との間の粘度差に付随する剪断力は、細胞内特徴部を整列するために、白血球に対して作用し得ると考えられる。いくつかの場合では、シース液とサンプル流体との間の速度差に付随する剪断力は、かかる整列に寄与し得る。これらの整列効果は、粒子とサンプル流体リボンとの間の寸法差によって、同様に影響され得る。例えば、粒子の一部がサンプル流体リボンから出て周囲のシース液内に延在するとき、粘度差に付随する剪断力は、細胞内特徴部の整列にはっきりと影響し得る。
【０１４２】
図４Ｋ及び４Ｌを参照すると、場合によっては、細胞、つまり粒子の一部は、薄いサンプル流体リボンＲから出て周囲のシース液内に延在し得る。同時係属の米国特許出願第＿＿＿＿号に記載されるように、シース液は、シース液による、細胞、つまり粒子の破壊、つまり溶解を阻害する、つまり防ぐ、細胞保護剤を含有してよい。例えば、シース液は、細胞がシース液の化学的環境に曝されるとき、細胞壁の構造的一体性を維持する細胞保護剤を含有してよい。同様に、細胞保護剤を操作して、細胞が、フローセル形状、並びに、サンプル流体とシース液との間の速度及び／又は粘度差により引き起こされる任意の剪断力を経験するとき、細胞壁の構造的一体性を維持してもよい。関連して、保護剤（protectorants）は、細胞、つまり粒子を、サンプル流体とシース液との間の速度差から生じる力から保護できる。このように、細胞は、画像取込部位に到達する際、その生存率を保持している。
【０１４３】
剪断力は、サンプル流体リボンとシース液のつつみとの間の境界面で顕著であり得る。いくつかの実施形態によると、フローセル流路内の流れは、放物線流形状を特徴とし得る。図４Ｌ−１は、放物線流形状の例示の態様、４００ｌ−１ａ及び４００ｌ−１ｂを示す。上の図内の放物線形状４００ｌ−１ａは、本発明の実施形態の特定のフローセル内の流れで見出される典型的な速度プロファイルである（例えば、シース液流れ内に包まれるサンプル流体の流れ間の粘度差がわずかであるか、差がない場合）。示されるように、最高線速度は流体流の中央部で観測され、より低い線速度はフローセル壁部付近で観測される。形状４００ｌ−１ａは、シース液とサンプル流体との間の粘度差がわずかな流体流においても観測できる。シース流と流体流との間の粘度差が大きい場合では、形状４００ｌ−１ｂに見られるような中央隆起部が観測され、ここに、増幅された線速度を有する局部的中央領域がある。いくつかの実施形態によると、寸法が十分に大きい粒子は、かかる粒子が単一の流体相（すなわち、シース液のつつみ内、あるいは、サンプル流体リボン内のいずれか）に完全に含まれる場合であっても、ある程度の剪断力を受ける。
【０１４４】
場合によっては、シース液の速度はサンプル流体の速度と異なっていてよい。例えば、シース液は８０ｍｍ／秒で進んでよく、サンプル流体は６０ｍｍ／秒で進んでよい。そのため、場合によっては、サンプル流体は、周囲をつつむシース液速度より低いサンプル流体速度で、遠位カニューレ口を出る。そのため、シース液を操作して、カニューレの流路に沿ってサンプル流体を引っ張れることによって、サンプル流体を加速し、サンプル流体リボンの厚さを減少させる。サンプル流体リボンは、全体体積及び質量を維持するため、より早く運ばれると、より薄くなる。いくつかの実施形態によると、シース液及びサンプル流体の両方は、画像取込部位において約２０〜２００ｍｍ／秒の速度を有する。
【０１４５】
典型的には、サンプル流体がカニューレ出口から画像取込部位まで進むにつれて、サンプル流体の速度が増す。場合によっては、画像取込部位におけるサンプル流体の速度は、カニューレ遠位部でカニューレ口を出るときのサンプル流体の速度の４０倍である。いくつかの実施形態によると、サンプルリボンの断面積の減少は、速度の増加に対して直線性を有する。いくつかの実施形態によると、カニューレ出口におけるシース速度がサンプルリボン速度より高い場合、撮像区域における最終サンプルリボン速度も増加するであろう。
【０１４６】
シース液を操作して、サンプル流体リボン及びサンプル流体リボン内の粒子に有意な剪断力を印加できる。一部の力は流れ方向と並行であり、粒子は、流れ方向に直角の力にも遭遇し得る。多くの場合、シース液及びサンプル流体が画像取込部位、つまり取込ゾーンに近づくと、シース液及びサンプル流体は、同じ速度で、又はほぼ同じ速度で進む。そのため、画像取込部位を通過する際のシース液とサンプル流体との間の境界、つまり境界面は、遠位カニューレ出口又はテーパ状移行ゾーンにおける境界、つまり境界面と比較して、低い剪断力を呈し得る。例えば、テーパ状移行ゾーンにおいて、シース液のつつみとサンプル流体リボンとの間の境界、つまり境界面は、移行状態であり得、最初は遅く、厚いサンプルリボンが早く、薄くなり始め、サンプル流体の粒子は整列し始めている。言い換えれば、剪断力は、テーパ状移行ゾーンにおいて顕著であり得、画像取込部位に向けて消散し得る。画像取込部位における剪断力は、放物線形状で表すことができ、テーパ状移行ゾーンにおける剪断力よりもずっと低くなり得る。そのため、細胞、つまり粒子は、移行ゾーンを通過するとより高い剪断力と、画像取込部位を通過するとより低い剪断力を経験できる。いくつかの実施形態によると、シース液とサンプル流体との間の粘度差により赤血球を整列させ、これによって焦点を合わせることができる。いくつかの実施形態によると、シース液とサンプル流体との間の粘度差により白血球オルガネラを整列させ、これによって焦点を合わせることができる。関連して、流れの幾何学的狭窄、及び、シース液とサンプル流体との間の速度差によって得られる、整列して焦点が合った細胞及びオルガネラ成分について、改善された撮像結果を得ることができる。
【０１４７】
図４Ｍは、分葉４１０ｍなどの内部オルガネラを有する例示の好中球４００ｍ（白血球の１種）を示す。サンプル流体とシース液との間の粘度差によって、図４Ｎによって示されるように、内部オルガネラを細胞内で整列できる。そのため、オルガネラが互いに重なることなく、画像取込装置４３０ｍによって細胞内オルガネラを効率的に撮像できる。つまり、図４Ｍに示されるような互いに重なる分葉の代わりに、画像取込装置の撮像軸、つまり光軸から見るとき、図４Ｎに示されるように、分葉が整列し、並んで位置している。そのため、取り込み画像において、分葉をより効率的に可視化できる。内部オルガネラの整列は、サンプル流体とシース液との間の粘度差の、驚くべきかつ思いもよらない結果である。
【０１４８】
任意の様々な血液学的、つまり血液粒子分析法は、フローセルを通って流れるサンプル流体の画像を用いて行うことができる。多くの場合、画像解析は、特定の細胞、つまり粒子パラメータを特定する、つまり測定する工程と、特定の細胞、つまり粒子の特徴部を検出する、つまり評価する工程と、を含み得る。例えば、画像解析は、細胞寸法、つまり粒径、細胞核特徴部、細胞質特徴部、細胞内オルガネラ特徴部などを評価する工程を含み得る。関連して、分析法は、白血球（ＷＢＣ）分画などの特定の計数、つまり分類法、又は診断検査を包含し得る。いくつかの場合では、フローセルを用いて得られた画像は、５区分のＷＢＣ分画検査を支援し得る。いくつかの場合では、フローセルを用いて得られた画像は、９区分のＷＢＣ分画検査を支援し得る。関連して、図４を参照すると、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、システム４００によって、画像取込装置によって得られた画像に基づく異なる種類の細胞を区別させるように構成される、コンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を備えてよく、又はその記憶媒体と連動してよい。例えば、診断、つまり検査手法を用いて、様々な細胞（例えば、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、後骨髄球、骨髄球、前骨髄球、及び芽球）を区別できる。
【０１４９】
図４Ｏは、ＰＩＯＡＬを使用して得られた像対非ＰＩＯＡＬシース液を使用して得られた像の比較を示す。ＰＩＯＡＬ使用の結果、分葉、細胞質、及び／又は顆粒などの細胞内容物に対してより焦点が合った。この例では、粘性剤（約３０％グリセロール）を含むＰＩＯＡＬを用いて、サンプルを処理した。ｐＨは、ｐＨ約６．８〜７．２に調整し、サンプル混合液を（０．９％塩化ナトリウム）によって等張にした。ここで示される結果は、画像解析器で用いた例示のＰＩＯＡＬの、細胞及び細胞内オルガネラの整列に対する有効性を実証する。
【０１５０】
図４Ｐ及び４Ｑは、標準シース液（図Ｐ、上の図及び下の図）を用いて得られた画像対例示のＰＩＯＡＬ液（図４Ｑ、上の図及び下の図）を用いて得られた画像の比較を示す。ここに示されるように、ＰＩＯＡＬ使用の結果、ＲＢＣの整列が改善した。機器焦点合わせプロトコルを（図１に示される例示の標的４４に対して）用いてサンプルを分析し、視覚的分析器によって標的に焦点を合わせた。次に、焦点合わせシステムを変位距離５２だけずらすと、その結果、リボン状サンプル流中の粒子に焦点が合った。サンプル希釈剤を用いて血液サンプルを予め希釈した。カニューレを通って、フローセルの流路に沿ってサンプルを流すことによって、ＰＩＯＡＬ又は標準シース（対照）の２つの層間に、リボン状サンプル流（例えば、厚さ２マイクロメートル）を生じさせた。続いて、視覚的分析器は、分析に使用されるリボン状サンプル流中の粒子の焦点画像を生じる（例えば、１秒当たり約６０フレームで）。血液サンプルは、被験体から得られ、血液分析器による分析用に処理される。サンプルが標準シース液又はＰＩＯＡＬを用いて処理される間、フローセル中のＲＢＣの画像が取り込まれる。撮像データに基づく整列されたＲＢＣ数における相対的割合は、有意な改善を実証する（例えば、４Ｐ及び４Ｑ）。この結果により、本明細書に記載される焦点合わせ器／プロトコルを用いる、リボン状サンプル流中に流れている間のＲＢＣ整列割合の増加において、ＰＩＯＡＬが有効であったことが実証された。
【０１５１】
ＰＩＯＡＬの実施例の結果、対称的フローセル及び非対称的フローセルにおいて、濃度を上げたグリセロール（ｇｌｙ）の使用に基づいて、整列が改善することも観察された。
【０１５２】
図４Ｒのグラフは、対称的対非対称的フローセルによる、ＰＩＯＡＬ中０％〜３０％グリセロールを用いて得られた非整列細胞の割合を示す。ＰＩＯＡＬ中３０％グリセロール及び対称的フローセルを使用した結果、誤整列した細胞の割合をわずか８％に減少する。ＰＩＯＡＬ中にグリセロールを含まずに非対称的セルを用いると、誤整列した細胞の割合が８７％に上昇することに留意されたい。そのため、このグラフは、グリセロール割合及びフローセル形状の、粒子（例えばＲＢＣ）整列に対する影響を実証する。対称的又は非対称的フローセル形状のいずれかを用いて、グリセロールを追加すると、誤整列したＲＢＣ細胞の割合が減少する。非整列ＲＢＣ％は、非対称的セルにおいて８７％から１５％に、対称的セルにおいて４６％から８％に減少した。したがって、このグラフは、対称的な狭窄フローセル移行ゾーン及び粘稠なシース液を伴う分析器構成により得られた誤整列結果（８％）と、粘稠なシース液を用いずに対称的な狭窄フローセル移行ゾーンを伴う分析器構成により得られた誤整列結果（４６％）との間の比較を提供する。
【０１５３】
これらの結果は、特定のＰＩＯＡＬ組成物は、画像ベースの粒子／細胞分析の実施に用いられるとき、細胞を整列し、細胞内構造を再配置する思いもよらない特性を有するという、驚くべきかつ思いもよらない発見の証拠をもたらす。
【０１５４】
例として、いくつかの例示のＰＩＯＡＬ処方及びその使用方法を開発した。以下は、所望の特性を有するＰＩＯＡＬ処方のいくつかの見本である。ＰＩＯＡＬは、希釈剤と、少なくとも１つの粘度調整剤と、を含む。
【０１５５】
例示のＰＩＯＡＬ処方Ａとして、３００ｍＬのグリセロールと、９．８４ｇの硫酸ナトリウム、４．０７ｇの塩化ナトリウム、０．１１ｇのプロカインＨＣｌ、０．６８ｇのリン酸一カリウム、０．７１ｇのリン酸二ナトリウム、及び１．８６ｇのＥＤＴＡ二ナトリウムを含む希釈剤を、１Ｌまでの適量（最終量に十分な、つまり最終量をもたらす量）有する３０％（ｖ／ｖ）グリセロール溶液が挙げられる。水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．２に調整しながら、初めに混合した後、脱イオン水を１Ｌまで適量加えた。
【０１５６】
例示のＰＩＯＡＬ処方Ｂとして、６５ｍＬのグリセロールと、９．８４ｇの硫酸ナトリウム、４．０７ｇの塩化ナトリウム、０．１１ｇのプロカインＨＣｌ、０．６８ｇのリン酸一カリウム、０．７１ｇのリン酸二ナトリウム、及び１．８６ｇのＥＤＴＡ二ナトリウムを含む好適な例示の希釈剤を、１Ｌまでの適量有する６．５％（ｖ／ｖ）グリセロール溶液が挙げられる。水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．２に調整しながら、初めに混合した後、脱イオン水を１Ｌまで適量加えた。
【０１５７】
例示のＰＩＯＡＬ処方Ｃとして、５０ｍＬのグリセロールを有する緩衝液中１％  ＰＶＰ（ｗ／ｖ）、１０ｇのＰＶＰ（ＭＷ：３６０，０００）、Ｓｉｇｍａ  ＰＢＳ粉末１袋をｐＨ  ７．４（０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水；０．１３８Ｍ塩化ナトリウム；０．００２７Ｍ塩化カリウム）で有し、脱イオン水を１Ｌまでの適量有する、５％グリセロール（ｖ／ｖ）溶液が挙げられる。
【０１５８】
例示のＰＩＯＡＬ処方Ｄとして、１６ｇのＰＶＰ（ＭＷ：３６０，０００）及びＳｉｇｍａ  ＰＢＳ粉末１袋をｐＨ  ７．４（０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水；０．１３８Ｍ  塩化ナトリウム；０．００２７Ｍ塩化カリウム）で、並びに脱イオン水を１Ｌまでの適量有する、１．６％  ＰＶＰ（ｗ／ｖ）溶液が挙げられる。
【０１５９】
スループット
図５は、フローセル中の１つ以上のサンプル流体注入に対応する、タイムライン５００を示す。ここに示されるように、第１サンプル流体のフローセル内への注入を、工程５１０に示されるように開始できる。その後、工程５１５に示されるように、第１サンプル流体の粒子をフローセル内で撮像できる。いくつかの実施形態によると、第１サンプル流体は、約５μＬ〜約１５０μＬの範囲内の体積を有してよい。いくつかの場合では、流量は、撮像区域において０．２３２μＬ／秒（つまり、０．２μＬ／秒〜０．３５μＬ／秒の範囲内）である。工程５２０に示されるように、第１サンプル流体の注入を終了でき、工程５３０に示されるように、第２サンプル流体のフローセル内への注入を開始できる。第１サンプル流体注入の終了及び第２サンプル流体注入の開始の結果、工程５３５に示されるように、サンプル流体過渡物が引き起こされ得る。続いて、工程４４５に示されるように、フローセル中のサンプル流体過渡物を消散できる。工程５５０に示されるように、第２サンプル流体の粒子をフローセル内で撮像できる。工程５６０に示されるように、第２サンプル流体の注入を終了できる。場合によっては、約１８℃〜約４０℃の範囲内の温度で、注入及び流す手順を実施する。
【０１６０】
典型的には、サンプルが注入され、注入が終了するとき、シース液の流れはフローセル内で流れ続ける。そのため、いくつかの実施形態によると、サンプル流体が流れるシース内に断続的に注入されている間、シース液の連続流が維持される。シース液の連続流は、サンプル流体がフローセルに沿って流れる際の、サンプル流体のリボン状の維持に寄与できる。
【０１６１】
いくつかの実施形態によると、工程５５０に付随する画像取込は、工程５１５に付随する画像取込の４秒以内に実施できる。いくつかの実施形態によると、第１サンプル流体の注入と第２サンプル流体の注入との間（例えば、工程５１０と５３０との間）の時間は約３０秒である。関連して、いくつかの実施形態によると、第１サンプル流体と第２サンプル流体の撮像開始間（例えば、工程５１５の開始と工程５５０の開始との間）の時間は約３０秒である。このように、１時間当たり１２０本のサンプル流体を処理できる。いくつかの場合では、画像取込装置を、１秒当たり１８０フレーム（ＦＰＳ）のフレーム速度で操作することによって、高頻度、つまり高速で、複数のユニークな連続画像、つまりフレームを得る。ここに示されるように、撮像工程（例えば、５１５又は５５０）の時間は１５秒であってよく、そのため、サンプル流体当たり２，７００枚の画像が得られる。
【０１６２】
場合によっては、第１サンプル流体は、サンプル流体注入管から流れるシース液中に第１サンプル流体を注入した（例えば工程５１０）後、約１〜３秒以内で安定化状態に達する。場合によっては、第１サンプル流体は、サンプル流体注入管から流れるシース液中に第１サンプル流体を注入した（例えば工程５１０）後、１秒未満で安定化状態に達する。フローセル内へのサンプルの注入は、２工程プロセスであってよい。この実施形態によると、第１工程は、全ての希釈剤をカニューレの外に追い出す高速注入であり、初期注入後、サンプルの流速は著しく低下する。遷移時間は、撮像流条件下（低い方のサンプル流速）における、サンプル（例えば細胞）がカニューレ出口から撮像区域まで進むのにかかる時間として定義してよい。いくつかの場合では、サンプル流体がカニューレ出口から撮像区域まで進むのに約４秒かかってよい。場合によっては、第１サンプル流体は、サンプル流体注入管から流れるシース液中に第１サンプル流体を注入（例えば工程５１０）してから、約１．８秒以内で安定化状態に達する。場合によっては、サンプル流体は、約２〜４秒の範囲内であるフローセルの通過時間（例えば、カニューレ出口から画像取込部位まで）を有する。いくつかの場合では、サンプル流体は、約１〜４秒の範囲内であるフローセルの通過時間を有する。
【０１６３】
いくつかの実施形態によると、流れが安定化するのに、つまり、カニューレの遠位出口から撮像区域まで進むのに、約２〜約５秒かかる。いくつかの場合では、画像取込時間は約２０秒であってよい。
【０１６４】
本発明の実施形態による血液学的システムは、約１５０μＬの量を有する血液サンプルを処理できる。吸引される血液量は約１２０〜１５０μＬであり得る。いくつかの場合では、サンプル管中で使用できる最小血液量は、自動サンプリングモードで約５００μＬ、手動サンプリングモードで約２５０μＬである。図４Ｄに示されるカニューレ、つまり注入管４００ｄは、約１３μＬの内部容積を有する。いくつかの実施形態によると、カニューレ、つまり注入管は、約３０μＬ未満の内部容積を有する。血液サンプル量は、画像収集を開始する前にカニューレを洗い流すのに有効であり、そのため、サンプル流が安定ではない時間の延長を防ぐことができる。例えば、約１３μＬの内部容積を有するカニューレを使用すると、約２〜３秒の間の不安定なサンプル流に対応することができる。いくつかの実施形態によると、カニューレ内部容積は、サンプル流の安定性に影響しない場合がある。いくつかの実施形態によると、カニューレ内部容積は、初期高速サンプル注入が、カニューレ内の全ての希釈剤を置き替えるのに不十分である場合、サンプルリボン自体中の細胞濃度の安定性に影響する場合がある。関連して、少量の希釈剤を用いて、サンプル間に短時間でカニューレを洗浄できる。このように、持ち越しが少ない、高品質画像の取り込みを容易にする安定なサンプル流の達成と同時に、ハイスループットの達成が可能である。いくつかの実施形態によると、内部容積が大きいカニューレは、ライン及びカニューレ中の全ての希釈剤を追い出すために、サンプルの大量初期高速注入を要する場合がある。本発明の実施形態は、より低い内部カニューレ容積の実施形態を包含し、利用可能なサンプル量が少ない場合、及びより短時間でより少量の注入が達成できる場合である、血液学的用途に好適である。
【０１６５】
いくつかの実施形態によると、血液学的システムは、血液サンプルの高速画像取り込みのため、過渡物及び一連のサンプルの二次汚染を制限するように構成できる。
【０１６６】
方法
図６は、本発明の実施形態による、血液サンプル中の粒子を撮像する例示の方法６００の態様を示す。ここに示されるように、血液サンプル６１０は粒子を含み、第１サンプル流体６１２などの粒子を含む１つ以上のサンプル流体、及び、粒子を含む第２サンプル流体６１４に分けることができる。この方法は、工程６２０に示されるように、フローセルの流路に沿ってシース液を流す工程を含んでよい。更に、この方法は、工程６３０に示されるように、サンプル流体注入管からフローセル内の流れるシース液中に第１サンプル流体６１２を注入し、注入管に近接して第１厚さを有するサンプル流体流を提供する工程を含んでよい。フローセルの流路は、サンプル流体流の厚さが、初期厚さから画像取込部位に近接する第２厚さまで減少するように、流路サイズが減少してよい。方法６００は更に、工程６４０に示されるように、第１サンプル流体の第１の複数の粒子をフローセルの画像取込部位において撮像する工程を含んでよい。
【０１６７】
方法６００は、サンプル流体過渡物を引き起こす工程も含んでよい。例えば、サンプル流体過渡物は、工程６５０に示されるように、流れるシース液中への第１サンプル流体の注入を終了し、流れるシース液中への第２サンプル流体を注入することによって、引き起こされてよい。更に、方法６００は、工程６６０に示されるように、第２サンプル流体の第２の複数の粒子をフローセルの画像取込部位において撮像する工程を含んでよい。いくつかの実施形態によると、第２の複数の粒子の撮像は、サンプル流体過渡物の実質的に後、かつ、第１の複数の粒子の撮像の４秒以内に行われてよい。
【０１６８】
剪断ひずみ速度
図７及び８は、本発明の実施形態による、フローセル中の特定の流れ条件における剪断ひずみ速度値の態様を示す。これらの図のそれぞれにおいて、３０％グリセロールシース液を使用する。いくつかの場合では、粘度は、２．４５×１０−３の値を有してよい。剪断応力値は、粘度値にひずみ速度値を乗じて得られる積に等しくてよい。図７について、サンプルは０．３μＬ／秒の流速を有してよく、シース液は２１μＬ／秒の流速を有してよい。図８について、サンプルは１μＬ／秒の流速を有してよく、シース液は７０μＬ／秒の流速を有してよい。これらの図のそれぞれにおいて、流れは、中心部（Ｃ）に向かってより低いひずみ値を、周辺部（Ｐ）に向かってより高いひずみ値を呈することが見て取れる。いくつかの実施形態では、かかるひずみ値は、非対称的フローセル構成に対応できる。
【０１６９】
図７に示されるように、いくつかの実施形態によると、流れの中心部（Ｃ）に向かうより低いひずみ速度は、約５００（１／ｓ）以下の値を有してよく、流れの周辺部（Ｐ）に向かうより高いひずみ速度は、約３０００（１／ｓ）以上の値を有してよい。図８に示されるように、いくつかの実施形態によると、流れの中心部（Ｃ）に向かうより低いひずみ速度は、約１０００（１／ｓ）以下の値を有してよく、流れの周辺部（Ｐ）に向かうより高いひずみ速度は、約９０００（１／ｓ）以上の値を有してよい。
【０１７０】
そのため、より低いサンプル及びシース液の速度（例えば図７）は、より低いひずみ速度に対応し、より高いサンプル及びシース液の速度（例えば図８）は、より高いひずみ速度に対応することがわかる。本発明の実施形態が、様々な粘度値、様々なひずみ速度値、及び／又は様々な剪断応力値に対応するサンプル及び／又はシース液の使用を包含することが理解される。
【０１７１】
自動焦点標的
再度図１を参照すると、粒子撮像システムは、フローセル２２に対して固定される自動焦点パターン、つまり標的４４を備えることができる。自動焦点標的４４を用いて、フローセルを通って流れる血液粒子の焦点画像を得ることができる。
【０１７２】
図９Ａは、本発明の実施形態による例示の自動焦点標的９００を示す。ここに示されるように、標的９００は、不透明な環状バンド９１０と、透明な中央部、つまり開口部９２０と、を含む。操作中、撮像装置はバンド９１０に焦点を合わせ、開口部を通して画像を取り込む。本明細書の別の場所及び同時係属の米国特許出願第＿＿＿＿号で記載されるように、画像取込プロセスは、バンド９１０にまず焦点を合わせる工程（つまり、自動焦点合わせ）と、その後、開口部９２０を通して画像を得る前に、画像取込装置とサンプル流体流との間の距離を調節する工程と、を含んでよい。それにより、バンド９１０は、画像取込装置の自動焦点システムが検出でき、その上に焦点を合わせられ、標的の特定の部分（例えば、縁部又は区分）を画像中に含むことができる、標的を呈示できる。いくつかの場合では、標的は、中央開口部を有するクロムディスクとして提供されてよい。例示の標的は、フローセルに接着、つまり固定される、約０．５ｍｍの直径を有する中央ピンホールを有して提供されてよい。図９Ｂに示されるように、中央ピンホール、つまり開口部９２０の寸法は、取り込まれた画像９４０内で不透明な環状バンド９１０の４つの縁部９３０のみが見えるように選択されてよい。そのため、環状バンド９１０は、細胞画像の取り込みに干渉しない（例えば、光は開口部９２０を通過してサンプル粒子を照射でき、視野は環状バンドによって実質的に妨げられない）。このように、バンド９１０は、画像の角部のみに写る。
【０１７３】
図１０、本発明の実施形態による例示の自動焦点標的１０００を示す。標的１０００は、バンド、つまり辺縁部１０１０と、中央開口部１０２０と、を含む。図１１、本発明の実施形態による別の例示の自動焦点標的１１００を示す。標的１１００は、バンド、つまり辺縁部１１１０と、中央開口部１１２０と、を含む。いくつかの実施形態によると、自動焦点標的１１００は、上部及び底部に黒色の５０ピクセルを有する画像をもたらす。いくつかの場合では、自動焦点標的１１００は、約６５．３μｍのフローセル焦点オフセット（ＦＣＦＯ）をもたらす。ＦＣＦＯの態様は、同時係属の米国特許出願第＿＿＿＿＿号に更に記載されており、その内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１７４】
図１２Ａは、本発明の実施形態による例示の自動焦点標的１２００を示す。標的１２００は、郵便受けデザインで提供され、第１の、つまり上側辺縁部１２１０と、第２の、つまり下側辺縁部１２２０と、を含む。標的１２００は更に、第１の辺縁部と第２の辺縁部との間に開口部、つまり透明経路１２３０を含む。いくつかの実施形態によると、標的は約４ｍｍの直径を有し、郵便受けの高さは２６５μｍである。いくつかの場合では、上側辺縁部及び下側辺縁部は、半円として呈示されてよく、酸化クロムなどの析出金属又はいくつかのその他不透明材料で製造できる。
【０１７５】
図１２Ｂは、自動焦点標的１２００の中央部の近接図を示す。ここに示されるように、第１辺縁部１２１０は、中央がゼロの値である負／正の数字目盛りを含む。第２辺縁部１２２０は同様の目盛りを含む。いくつかの場合では、目盛りの刻みは１００μｍである。いくつかの実施形態によると、目盛りを用いてフローセルの配置を容易にでき、撮像装置、つまりカメラの視野を、サンプル流の中心に置くことができる。ここに示されるように、サンプル流１２４０は、第１辺縁部及び第２辺縁部の目盛りに直角の方向で流れる。焦点合わせプロトコルの一部として、画像取込装置を操作し、辺縁部１２１０、１２２０に存在する数字、又は別の文字、又は撮像可能な対象物に焦点を合わせることができる。
【０１７６】
本発明の実施形態は、粒子分析システムの使用に付随する熱ドリフトに対処する（そうでない場合は、かかる熱の影響により撮像装置を用いて得られる画像の質を損なう場合がある）手法を包含する。図１３Ａは、熱センサ１３７０、反射体１３８０、及び自動焦点標的１３４４を有するフローセル１３２０の部分側面図を示す。粒子分析システムの操作中、熱の影響が、サンプル流を撮像装置の焦点外にゆっくりとドリフトさせる場合がある。例えば、熱の影響は、ランプ由来の放射熱によるフローセルの熱膨張に起因する場合がある。更に、熱の影響は、伝導熱及び放射熱によるフローセル及び光学ベンチアセンブリ（ＯＢＡ）組立体の熱膨張に起因する場合がある。いくつかの実施形態では、ＯＢＡの特定の構成部品が膨張し、焦点合わせのエラーをもたらす場合がある。例えば、かかる部品は、カメラ２４を共に保持する金属プレート、フローセルを保持する、若しくはフローセルに連結される金属プレート、又は、フローセル及びカメラ２４の両方を共に保持する金属プレートを含む場合がある。図１３Ｂは、熱センサ１３７０及び自動焦点標的１３４４を有するフローセル１３２０の部分斜視図を示す。更に、図１３Ｃは、熱センサ１３７０、反射体１３８０、及び自動焦点標的１３４４を有するフローセル１３２０の別の斜視図を示す。
【０１７７】
反射体１３８０を操作して、フローセル１３２０によって吸収される熱量を低下させる、又は制限することができる。例えば、反射体１３８０は、図１３Ａに示されるフラッシュランプ１３４２によって放射される熱を遮ることができる。そのため、反射体１３８０は、ランプの熱の影響を最小限にすることができる。反射体１３４２は、ランプによって発生するグレア及び光散乱を低下させることもでき、これによって、改善された画質をもたらす。熱センサ１３７０は、流体流チャネル付近、かつ、画像取込部位に近接して配置され、正確な温度読み取り値が得られるようにする。温度センサからの情報を用いて、サンプル流体リボン流での画像取込装置の焦点合わせができる。
【０１７８】
図１３Ｄに示されるように、フローセル１３００ｄは、気泡１３０２ｄが開放、つまり除去され得るポート、つまり脱気孔１３０１ｄを有する、流路１３２２ｄを含んでよい。ここに示されるように、真空が加えられる管１３０３ｄは、流れから気泡１３０２ｄを除去するため、ポート１３０１ｄと接触させてよい。かかる気泡除去機構は、フローセル内の流れる流体から気泡を除去するのに好適であり、この機構を操作して、気泡又は微小気泡がフローセル内部に留まる、つまり詰まるのを防ぐことができる。
【０１７９】
本明細書に記載される計算、つまり演算はそれぞれ、ハードウェア、ソフトウェア、及び／又はファームウェアを有するコンピュータ又はその他プロセッサを用いて実行されてよい。様々な方法工程はモジュールによって実行されてよく、モジュールは、本明細書に記載される方法工程を実行するために配置される、任意の広範なデジタル及び／又はアナログデータ処理ハードウェア及び／又はソフトウェアを備えてよい。データ処理ハードウェアを任意に備えるモジュールは、これらに伴って適当な機械プログラミングコードを有することによって、これらの工程のうち１つ以上を実行するのに適しており、２つ以上の工程（又は２つ以上の工程の部分）に対するモジュールは、任意の広範な統合処理及び／又は分散処理アーキテクチャにおいて、単一のプロセッサボードに組み込まれている、又は、異なるプロセッサボードに分かれている。これらの方法及びシステムは、多くの場合、上記方法工程を実行するための命令を伴う、コンピュータ読み取り可能なコードを組み込む有形媒体を利用するだろう。好適な有形媒体は、メモリ（揮発性メモリ及び／又は不揮発性メモリを含む）、記憶媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、テープなどへの磁気記録、ＣＤ、ＣＤ−Ｒ／Ｗ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤなどといった光学式メモリ、又は任意のその他デジタル若しくはアナログ記憶媒体）などを含んでよい。
【０１８０】
本開示で論じた全ての特許、特許公開、特許出願、雑誌論文、書籍、技術文献などは、それらの全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８１】
図面中に示し、上記で説明したものと異なる構成要素の配置、並びに、示されていない、すなわち説明されていない構成要素及び工程は可能である。同様に、一部の特徴及びサブコンビネーションは有用なものであり、他の特徴及びサブコンビネーションに関係なく使用できる。本発明の実施形態は、限定目的ではなく例示目的で説明しており、本発明の読者には、別の実施形態が明らかになるであろう。特定の場合では、方法工程又は操作が異なる順序で実施、つまり実行されてよく、あるいは、操作を追加、削除、又は変更してもよい。本発明の特定の態様では、ある要素若しくは構造を提供するため、又は、ある機能を実行するために、単一の構成要素を複数の構成要素と置き換えてよく、複数の構成要素を単一の構成要素と置き換えてよいことが理解され得る。かかる置換が本発明の特定の実施形態の実行に有効でない場合を除き、かかる置換は本発明の範囲内であると見なされる。したがって、本発明は、上記の、又は図に示した実施形態に限定されず、以下の特許請求の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態及び変更がなされてよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図４Ａ】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ−１】
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【図４Ｂ−２】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｃ−１】
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【図４Ｄ−１】
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【図４Ｄ−４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図４Ｌ−１】
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【図４Ｍ】
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【図４Ｎ】
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【図４Ｏ】
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【図４Ｐ】
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【図４Ｑ】
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【図４Ｒ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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