(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
初期ＲＮＡ含有組成物から標的ＲＮＡ枯渇化組成物を調製する方法であって、前記方法は、以下：
ａ）１つ以上のグループのプローブ分子と前記初期ＲＮＡ含有組成物を接触させ、そして前記標的ＲＮＡおよび前記プローブ分子の間で二本鎖ハイブリッドを生成するステップであって、ここで、あるグループのプローブ分子が、以下：
ｉ）前記グループが、３５ｎｔ以下の長さを有する２つ以上の異なるプローブ分子を含む；
ｉｉ）前記グループにおいて含まれる前記プローブ分子が、標的ＲＮＡの標的領域に対して相補的である；
ｉｉｉ）前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、２つ以上の前記異なるプローブ分子が、形成される前記二本鎖ハイブリッドにおいて互いに離れた間隔が２０ｎｔ以下で互いに隣接して位置し、前記グループの前記２つ以上のプローブ分子は形成される前記二本鎖ハイブリッドにおいて互いに連続している、
との特徴を有するステップ；
ｂ）前記二本鎖ハイブリッドに結合する結合剤を使用することによって前記二本鎖ハイブリッドを捕捉し、それによって、ハイブリッド／結合剤複合体を形成するステップであって、ここで前記結合剤は、形成される前記ハイブリッドに特異的に結合することができる、抗ハイブリッド抗体またはその断片である、ステップ；
ｃ）前記組成物から前記ハイブリッド／結合剤複合体を分離し、それによって、標的ＲＮＡ枯渇化組成物を提供するステップ、
を含む、方法。
【請求項２】
前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、グループのすべてのプローブ分子が、形成された前記二本鎖ハイブリッドにおいて互いに連続している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プローブ分子が、１０ｎｔ〜３５ｎｔの範囲にある長さを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
プローブセットが、特異的な標的ＲＮＡの枯渇のために使用され、プローブセットが、２つ以上のグループのプローブ分子を含み、前記プローブセットにおいて含まれるプローブ分子のそれぞれのグループが、前記標的ＲＮＡにおける異なる標的領域を標的にする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
特異的な標的ＲＮＡにおいて、前記標的領域が、５００ｎｔ以下の距離内に位置する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
プローブセットにおいて含まれる前記プローブ分子の少なくとも８５％が、それらのグループメンバーに対して連続している、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
以下：
ｉ）前記標的領域が、前記標的ＲＮＡの完全長に相当する；
ｉｉ）前記標的領域が、前記標的ＲＮＡにおいて保存される領域である；
ｉｉｉ）前記標的領域が、異なる種において保存される領域である；
ｉｖ）前記標的領域が、前記標的ＲＮＡにおいて保存され、そして少なくとも種ヒト、マウス、およびラットにおいて保存される領域である；
ｖ）グループの前記プローブ分子がハイブリダイズする前記標的領域が、５０ｎｔ〜５００ｎｔから選択されるサイズを有する；
ｖｉ）プローブセットが、特異的な標的ＲＮＡの枯渇のために使用され、プローブセットが、２つ以上のグループのプローブ分子を含み、それぞれのグループのプローブ分子が、前記標的ＲＮＡにおける異なる標的領域を標的にし、前記標的領域が、前記標的ＲＮＡの全長にわたって分布する；ならびに／または
ｖｉｉ）標的ＲＮＡ枯渇効率が、少なくとも９５％である、
との特徴のうち１つ以上を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
複数の標的ＲＮＡが、前記初期ＲＮＡ含有組成物から枯渇される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
以下：
ｉ）少なくとも１つのタイプのｒＲＮＡが、標的ＲＮＡとして枯渇される；ならびに／または
ｉｉ）２８Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、５Ｓ  ｒＲＮＡ、ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡ、およびミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡから選択される少なくとも１つのタイプのｒＲＮＡが、枯渇される；ならびに／または
ｉｉｉ）複数のグループのプローブ分子および／もしくはプローブセットが、前記初期ＲＮＡ含有組成物から、２８Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、５Ｓ  ｒＲＮＡ、ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡ、およびミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡのうちの３つ以上を枯渇させるために使用される、
との特徴のうち１つ以上を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
以下：
ａａ）２８Ｓ  ｒＲＮＡが標的ＲＮＡとして枯渇される場合、２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットであって、以下：
ｉ）前記２８Ｓプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、３０ｎｔ以下である；
ｉｉ）前記２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれる、少なくとも７５％のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している；および／または
ｉｉｉ）前記２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットが、前記２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットについて表１において示されるプローブ分子のグループの少なくとも１つを含む
との特徴のうち、１つ以上を有する２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットが、使用される、ならびに／または
ｂｂ）１８Ｓ  ｒＲＮＡが標的ＲＮＡとして枯渇される場合、１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットであって、以下：
ｉ）前記１８Ｓプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、３０ｎｔ以下である；および／または
ｉｉ）前記１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれる、少なくとも７５％のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している；および／または
ｉｉｉ）前記１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットが、前記１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットについて表１において示されるプローブ分子のグループの少なくとも１つを含む；
との特徴のうち、１つ以上を有する１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットが、使用される；ならびに／または
ｃｃ）５．８Ｓ  ｒＲＮＡが標的ＲＮＡとして枯渇される場合、少なくとも１つのグループのプローブ分子であって、以下：
ｉ）前記プローブ分子が、３０ｎｔ以下の長さを有する；および／または
ｉｉ）前記５．８Ｓ  ｒＲＮＡグループが、５．８Ｓ  ｒＲＮＡについて表１において示される１つ以上のプローブ分子を含む
との特徴のうち、１つ以上を有する少なくとも１つのグループのプローブ分子が、使用される；ならびに／または
ｄｄ）５Ｓ  ｒＲＮＡが標的ＲＮＡとして枯渇される場合、少なくとも１つのグループのプローブ分子であって、以下：
ｉ）前記プローブ分子が、３０ｎｔ以下の長さを有する；および／または
ｉｉ）前記５Ｓ  ｒＲＮＡグループが、５Ｓ  ｒＲＮＡについて表１において示される１つ以上のプローブ分子を含む；
との特徴のうち、１つ以上を有する少なくとも１つのグループのプローブ分子が、使用される、ならびに／または
ｅｅ）ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡが標的ＲＮＡとして枯渇される場合、プローブセットであって、以下：
ｉ）前記１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、３０ｎｔ以下である；および／または
ｉｉ）前記１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれる、少なくとも７５％のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している；
との特徴のうち、１つ以上を有するプローブセットが、使用される、ならびに／または
ｆｆ）ミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡが標的ＲＮＡとして枯渇される場合、プローブセットであって、以下：
ｉ）前記１６ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、３０ｎｔ以下である；および／または
ｉｉ）前記１６ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれる、少なくとも７５％のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している；
との特徴のうち、１つ以上を有するプローブセットが、使用される、ならびに／または
ｇｇ）ａａ）において定められる２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットおよびｂｂ）において定められる１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットが、標的ＲＮＡとして２８Ｓ  ｒＲＮＡおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡが枯渇された標的ＲＮＡ枯渇化組成物を提供するために使用され、ｃｃ）において定められる５．８Ｓ  ｒＲＮＡグループ、ｄｄ）において定められる５Ｓ  ｒＲＮＡグループ、ｅｅ）において定められる１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセット、およびｆｆ）において定められる１６ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットが、標的ＲＮＡとして５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、５Ｓ  ｒＲＮＡ、ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡ、およびミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡをさらに枯渇させるために使用される、
との特徴のうち１つ以上を有する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
以下：
ｉ）大量のタンパク質コードｍＲＮＡが、標的ＲＮＡとして枯渇される、
ｉｉ）グロビンＲＮＡが標的ＲＮＡとして枯渇される；
ｉｉｉ）前記抗ハイブリッド結合剤が、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに対して特異的な抗ハイブリッド抗体である；
ｉｖ）使用される前記抗ハイブリッド結合剤が、固体支持体に対して固定されるもしくは前記抗ハイブリッド結合剤が、溶液において遊離しており、そして固体支持体に対して固定された第２の結合剤が、前記抗ハイブリッド結合剤に結合し、したがって形成された前記ハイブリッド／結合剤複合体を捕捉するために使用される；
ｖ）ステップａ）およびｂ）が同時に実行される、ならびに／または
ｖｉ）修飾されたＤＮＡ分子が、プローブ分子として使用され、二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが形成される、
との特徴のうち１つ以上を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ａ）１つ以上のグループのプローブ分子と全ＲＮＡを接触させ、そして前記標的ｒＲＮＡおよび前記プローブ分子の間で二本鎖ハイブリッドを生成するステップであって、前記グループにおいて含まれる前記プローブ分子が、標的ＲＮＡの標的領域に対して相補的であり、前記標的ＲＮＡが、ｒＲＮＡである、ステップ；
ｂ）前記二本鎖ハイブリッドに結合する抗ハイブリッド抗体を使用することによって前記二本鎖ハイブリッドを捕捉し、それによって、ハイブリッド／結合剤複合体を形成するステップ；
ｃ）前記組成物から前記ハイブリッド／結合剤複合体を分離し、それによって、標的ｒＲＮＡ枯渇化組成物を提供するステップ
を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ｄ）非結合プローブ分子を除去するステップを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ｅ）前記標的ＲＮＡ枯渇化組成物において含まれるＲＮＡを配列決定するステップを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
配列決定するステップが、次世代配列決定によって実行される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＮＡを配列決定するステップが、
ｉ）超並列配列決定に適した配列決定ライブラリーを調製するステップ；
ｉｉ）前記配列決定ライブラリーにおいて含まれる前記分子を並列に配列決定するステップ
を含む、請求項１５に記載の方法：
【請求項１７】
サンプルにおいて含まれる関心のあるＲＮＡ分子を配列決定するための方法であって、前記方法は、以下：
ａａａ）ＲＮＡ含有組成物を得るステップ；
ｂｂｂ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法を使用して、前記ＲＮＡ含有組成物から望まれない標的ＲＮＡを枯渇させ、それによって、標的ＲＮＡ枯渇化組成物を提供するステップ；
ｃｃｃ）非結合プローブ分子を除去するステップ；
ｄｄｄ）前記標的ＲＮＡ枯渇化組成物において含まれるＲＮＡ分子を配列決定するステップ、
を含む、方法。
【請求項１８】
ｉ）ステップｃｃｃ）において、前記標的ＲＮＡ枯渇化組成物が、精製されるおよび／もしくはＤＮアーゼ消化が実行される；ならびに／または
ｉｉ）配列決定するステップが、超並列配列決定に適した配列決定ライブラリーを調製するステップおよび前記配列決定ライブラリーにおいて含まれる前記分子を並列に配列決定するステップ
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＲＮＡ含有組成物から標的ＲＮＡを枯渇させるのに適したキットであって、前記キットは、以下：
ａ）標的ＲＮＡを枯渇させるための１つ以上のグループのプローブ分子であって、あるグループのプローブ分子は、以下：
ｉ）前記グループが、３５ｎｔ以下の長さを有する２つ以上の異なるプローブ分子を含む；
ｉｉ）前記グループにおいて含まれる前記プローブ分子が、標的ＲＮＡの標的領域に対して相補的である；
ｉｉｉ）前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、２つ以上の前記異なるプローブ分子が、形成される二本鎖ハイブリッドにおいて互いに離れた間隔が２０ｎｔ以下で互いに隣接して位置し、グループの２つ以上のプローブ分子は形成される前記二本鎖ハイブリッドにおいて互いに連続している、
との特徴を有する、１つ以上のグループのプローブ分子；および
ｂ）前記プローブ分子および標的ＲＮＡの間で形成される前記二本鎖ハイブリッドに結合するのに適した結合剤であって、形成される前記ハイブリッドに特異的に結合することができる、抗ハイブリッド抗体またはその断片である、結合剤
を含む、キット。
【請求項２０】
以下：
ｉ）前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、グループの前記異なるプローブ分子のうちの２つ以上が、形成された前記二本鎖ハイブリッドにおいて互いに連続している；
ｉｉ）前記キットにおいて含まれるプローブ分子が、１０ｎｔ〜３５ｎｔの範囲にある長さを有する；
ｉｉｉ）前記キットが、特異的な標的ＲＮＡを枯渇させるためのプローブセットを含み、プローブセットが、２つ以上のグループのプローブ分子を含み、前記プローブセットにおいて含まれるプローブ分子のそれぞれのグループが、標的ＲＮＡにおける異なる標的領域を標的にする；
ｉｖ）前記キットが、特異的な標的ＲＮＡを枯渇するためのプローブセットを含み、前記標的領域が５００ｎｔ以下の距離内に位置する；
ｖ）前記キットが、２つ以上のグループのプローブ分子を含むプローブセットを含み、前記プローブセットにおいて含まれるプローブ分子のそれぞれのグループが、標的ＲＮＡにおける異なる標的領域を標的にし、前記プローブセットにおいて含まれる前記プローブ分子の少なくとも少なくとも８５％が、それらのグループメンバーに対して連続している；
ｖｉ）前記標的領域が、前記標的ＲＮＡの完全長に相当する；
ｖｉｉ）前記標的領域が、前記標的ＲＮＡにおいて保存される領域である；
ｖｉｉｉ）前記標的領域が、異なる種において保存される領域である；
ｉｘ）前記標的領域が、前記標的ＲＮＡにおいて保存され、そして少なくとも種ヒト、マウス、およびラットにおいて保存される領域である；
ｘ）グループの前記プローブ分子がハイブリダイズする前記標的領域が、５０ｎｔ〜５００ｎｔから選択されるサイズを有する；
ｘｉ）前記キットが、特異的な標的ＲＮＡを枯渇させるためのプローブセットを含み、プローブセットが、２つ以上のグループのプローブ分子を含み、それぞれのグループのプローブ分子が、前記標的ＲＮＡにおける異なる標的領域を標的にし、前記標的領域が、前記標的ＲＮＡの全長にわたって分布する、
ｘｉｉ）前記キットにおいて含まれる前記プローブ分子が、修飾されたＤＮＡ分子である；
ｘｉｉｉ）前記抗ハイブリッド結合剤が、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに対して特異的な抗ハイブリッド抗体である；
ｘｉｖ）あるグループのプローブ分子が、２〜１０のプローブ分子を含む；ならびに／または
ｘｖ）前記キットが、複数の標的ＲＮＡを枯渇させるために１つ以上のグループのプローブ分子および／もしくはプローブセットを含む、
との特徴のうち１つ以上を有する、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
ｉ）標的ＲＮＡとして少なくとも１つのタイプのｒＲＮＡを枯渇させる；ならびに／または
ｉｉ）２８Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、５Ｓ  ｒＲＮＡ、ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡ、およびミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡから選択される、少なくとも１つのタイプのｒＲＮＡを枯渇させる；ならびに／または
ｉｉｉ）２８Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、５Ｓ  ｒＲＮＡ、ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡ、およびミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡのうち、３つ以上を枯渇させる
ための、１つ以上のグループのプローブ分子ならびに／または１つ以上のプローブセットを含む、請求項１９または２０に記載のキット。
【請求項２２】
ａａ）２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットであって、以下：
ｉ）前記２８Ｓプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、３０ｎｔ以下である；
ｉｉ）前記２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれる、少なくとも７５％のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している；および／または
ｉｉｉ）前記２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットが、前記２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットについて表１において示されるプローブ分子のグループの少なくとも１つを含む
との特徴のうち、１つ以上を有する２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセット、ならびに／または
ｂｂ）１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットであって、以下：
ｉ）前記１８Ｓプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、３０ｎｔ以下である；および／または
ｉｉ）前記１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれる、少なくとも７５％のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している；および／または
ｉｉｉ）前記１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットが、前記１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットについて表１において示されるプローブ分子のグループの少なくとも１つを含む；
との特徴のうち、１つ以上を有する１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセット、ならびに／または
ｃｃ）５．８Ｓ  ｒＲＮＡを枯渇させるための少なくとも１つのグループのプローブ分子であって、以下：
ｉ）前記プローブ分子が、３０ｎｔ以下の長さを有する；および／または
ｉｉ）前記プローブ分子の少なくとも２つが、連続したプローブ分子である；および／または
ｉｉｉ）前記５．８Ｓ  ｒＲＮＡグループが、５．８Ｓ  ｒＲＮＡについて表１において示される１つ以上のプローブ分子を含む；
との特徴のうち、１つ以上を有する少なくとも１つのグループのプローブ分子、ならびに／または
ｄｄ）５Ｓ  ｒＲＮＡを枯渇させるための少なくとも１つのグループのプローブ分子であって、以下：
ｉ）前記プローブ分子が３０ｎｔ以下の長さを有する；および／または
ｉｉ）前記５Ｓ  ｒＲＮＡグループが、５Ｓ  ｒＲＮＡについて表１において示される１つ以上のプローブ分子を含む；
との特徴のうち、１つ以上を有する少なくとも１つのグループのプローブ分子、ならびに／または
ｅｅ）ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットであって、以下：
ｉ）前記１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、３０ｎｔ以下である；および／または
ｉｉ）前記１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれる、少なくとも７５％のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している；
との特徴のうち、１つ以上を有する、ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡプローブセット、ならびに／または
ｆｆ）ミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットであって、以下：
ｉ）前記１６ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、３０ｎｔ以下である；および／または
ｉｉ）前記１６ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれる、少なくとも７５％のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している；
との特徴のうち、１つ以上を有する、ミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡプローブセット、ならびに／または
ｇｇ）ａａ）において定められる２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットおよびｂｂ）において定められる１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットならびにさらに、ｃｃ）において定められる５．８Ｓ  ｒＲＮＡグループ、ｄｄ）において定められる５Ｓ  ｒＲＮＡグループ、ｅｅ）において定められる１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセット、およびｆｆ）において定められる１６ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットを含む、
を含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２３】
大量のタンパク質コードｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、および色素体ｒＲＮＡから選択される標的ＲＮＡを枯渇させるための１つ以上のグループもしくはプローブ分子および／または１つ以上のプローブセットを含む、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４】
前記大量のタンパク質コードｍＲＮＡが、グロビンＲＮＡである、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記抗ハイブリッド結合剤が、抗ハイブリッド抗体である、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６】
前記抗ハイブリッド結合剤が、固体支持体上に固定される、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２７】
前記抗ハイブリッド結合剤が、固体支持体上に固定されず、そして前記キットが、前記抗ハイブリッド結合剤に結合することができる第２の結合剤を含み、前記第２の結合剤が、固体支持体上に固定される、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２８】
前記キットが、ハイブリダイゼーション溶液を含む、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
あるグループのプローブ分子が、２〜１０のプローブ分子を含む、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、初期ＲＮＡ含有組成物から標的ＲＮＡ枯渇化組成物を調製するための方法を提供する。本明細書において開示される方法は、単離された全ＲＮＡからの、ｒＲＮＡなどのような望まれない標的ＲＮＡの効率的な枯渇を可能にする。方法は、次世代配列決定の適用、特にトランスクリプトーム配列決定のためのＲＮＡを調製するのに特に適している。さらに、本発明による方法を実行するのに適したキットが、提供される。
【背景技術】
【０００２】
トランスクリプトミクス（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ）は、調査中の特定のゲノムから転写されるＲＮＡを特徴付ける研究の分野である。ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＡＧＥ）、ｃａｐ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＣＡＧＥ）、およびｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇなどのようないくつかの方法が、転写されたＲＮＡを分析するために開発されてきた。さらなるアプローチは、トランスクリプトームの配列決定である。従来より、配列決定は、サンガー配列決定によって行われてきた。
【０００３】
ここ数年間にわたって、配列決定のためのサンガー法の使用から、いわゆる「次世代配列決定」（ＮＧＳ）技術への根本的な転換があった。ここで、ピロシーケンス、合成による配列決定、またはライゲーションによる配列決定などのような、様々なＮＧＳ技術および方法が、存在する。しかしながら、ほとんどのＮＧＳプラットフォームは、一般的な技術的特徴、すなわち、フローセルにおいてまたは油−水エマルションの生成によって空間的に分離された、クローン増幅されたＤＮＡ分子または単一ＤＮＡ分子の超並列配列決定を共有する。ＮＧＳにおいて、配列決定は、ポリメラーゼ媒介性ヌクレオチド伸長の繰り返しのサイクルまたはあるフォーマットでは、オリゴヌクレオチドライゲーションの反復サイクルによって実行される。超並列プロセスとして、ＮＧＳは、プラットフォームに依存して、単一の機器での試行（ｒｕｎ）において、何百ものメガベース〜ギガベースのヌクレオチド配列アウトプットを生成する。多量の配列データの低費用の産生は、従来の方法に対する主要な利点である。そのため、ＮＧＳ技術は、遺伝子研究において主な推進力になった。いくつかのＮＧＳ技術プラットフォームは、広範囲の使用を見出し、たとえば、以下のＮＧＳプラットフォームを含む：Ｒｏｃｈｅ／４５４、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｏｌｅｘａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＯＬｉＤ（商標）システム、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）半導体配列分析機器、ＰａｃＢｉｏ（登録商標）リアルタイム配列決定、およびＨｅｌｉｃｏｓ（商標）  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＳＭＳ）。ＮＧＳ技術、ＮＧＳプラットフォーム、およびＮＧＳ技術についての一般的な適用／分野は、たとえばＶｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇら（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５５：４  ６４１−６５８、２００９）およびＭｅｔｚｋｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １  １  、Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１０、ｐａｇｅｓ  ３１−４６）において概説される。配列決定がＮＧＳ技術において超並列方式で実行されるという特徴に加えて、ＮＧＳ技術プラットフォームは、それらが、超並列配列決定に適している配列決定ライブラリーの調製を必要とするという共通点を有する。そのような配列決定ライブラリーの例は、断片ライブラリー、メイトペアライブラリー（ｍａｔｅ−ｐａｉｒｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ）、またはバーコード化断片ライブラリー（ｂａｒｃｏｄｅｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｉｂｒａｒｙ）を含む。ほとんどのプラットフォームは、機器での「試行」前の小さな変更を伴うが、一般的なライブラリー調製手順に従う。この手順は、ｃＤＮＡから得られてもよいＤＮＡの断片化（たとえば超音波処理、ハイドロ剪断（ｈｙｄｒｏ−ｓｈｅａｒｉｎｇ）、超音波、噴霧化などのような機械的な剪断または酵素的断片化によって）、その後に続くＤＮＡ修復および末端研磨（ｅｎｄ  ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）（平滑末端またはＡオーバーハング）ならびに最終的に、多くの場合、プラットフォーム特異的アダプターライゲーションを含む。そのような配列決定ライブラリーの調製および設計はまた、Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ、２００９およびＭｅｔｚｋｅｒ、２０１０においても記載される。
【０００４】
これらの新しいハイスループット次世代配列決定技術は、診断法、癌、幹細胞研究、メタゲノミクス、集団遺伝学、および医学を含むが、これらに限定されない多くの研究分野において、高速で多目的な結果を導いた。今日のＮＧＳ研究は、複雑なサンプルおよび限られた出発物質から高品質の配列決定データを得る能力に、ますます依存している。ＮＧＳはまた、トランスクリプトーム配列決定にも使用されてきた。トランスクリプトーム配列決定はまた、「ＲＮＡ−ｓｅｑ」とも呼ばれ、たとえば、生物学的サンプルにおける転写物のマッピングおよび定量化にも使用される。この技術は、癌のような疾患の研究において速やかに採用された。深いカバー度および塩基レベルの分解能により、次世代配列決定は、遺伝子の対立遺伝子および異なってスプライスされた転写物；非コードＲＮＡ；転写後突然変異または編集；ならびに遺伝子融合を含む、遺伝子の発現差異についての情報を提供する。トランスクリプトーム配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）は、上記に記載されるように、様々なプラットフォームにより行うことができる。次世代配列決定を実行するのに必要である配列決定ライブラリーの生成は、プラットフォームごとに異なり得るが、一方では、それぞれの技術内で共通性がある。トランスクリプトーム配列決定についてのある主な問題は、干渉ＲＮＡ分子の存在である。たとえば、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は、全ＲＮＡにおいて最も大量にある分子であり、多くの場合、全ＲＮＡの９０％以上がｒＲＮＡである。しかしながら、リボソームＲＮＡは、トランスクリプトームに関する情報をほとんど提供しない。ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）などのような適用において、配列決定の試行から得られる情報の量を最大限にすることに大きな関心がある。大量のｒＲＮＡがライブラリー構築に関与する場合、大部分の配列決定パワーは、これらの遍在性の分子を配列決定するために使用され、それによって、残りのトランスクリプトームを調査するために利用可能なパワーを減らしてしまうであろう。それによって、有益な配列決定資源が浪費される。さらに、リボソームＲＮＡの存在は、関心のあるＲＮＡ種の検出を困難にし得る低ＳＮ比をもたらし得る。そのため、ｒＲＮＡおよび／または他の望まれないＲＮＡの除去は、下流の配列決定の価値を増加させる。ｒＲＮＡまたは他の望まれないＲＮＡ種を欠く配列決定ライブラリーを提供するために、いくつかのアプローチが、先行技術において開発された。
【０００５】
ポリＡ濃縮に基づくある一般的なアプローチによれば、ポリＡ＋ＲＮＡが、全ＲＮＡから得られる。ポリＡ  ＲＮＡは、一般的な方法を使用して、たとえば、ポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチドにより官能性をもたせ、したがってポリＡ  ＲＮＡを捕捉することができる磁気ビーズを使用することによって単離することができる。ポリＡ  ＲＮＡからの配列決定ライブラリーの調製は、ｒＲＮＡなどのようなポリＡテイルを持たないＲＮＡ種が全ＲＮＡから回収されず、したがって、配列決定反応に持ち越されないという利点を持つ。したがって、ポリＡ  ＲＮＡを使用して生成された配列決定ライブラリーから得られたほとんどの配列は、ポリＡテイルを持つ、タンパク質をコードするｍＲＮＡに相当する。しかしながら、配列決定ライブラリーを調製するために精製されたポリＡ  ＲＮＡを使用することはまた、不利でもある。ポリＡテイルを持たず、したがってポリＡ濃縮の間に失われるが、それにもかかわらず、トランスクリプトーム配列決定において関心がある、いくつかのＲＮＡタイプがある。たとえば、ポリＡ濃縮は、トランスクリプトームの重要な構成成分である、ポリアデニル化されていないｍＲＮＡ配列の損失をもたらす。ヒストンをコードするものなどのような、ある真核生物ｍＲＮＡもまた、ポリ−Ａテイルを持たず、他のものは、オリゴｄＴによる効率的な捕捉には短すぎるポリＡテイルを持つ。さらに、それらがポリアデニル化されていないので、この方法は、原核生物ｍＲＮＡに対して使用することができない。さらに不利なのは、ポリＡ濃縮がインプット材料として高品質のインタクトな全ＲＮＡを必要とするということである。ポリＡテイルを持つ断片のみが捕捉されるので、ポリＡ濃縮は、分解されたＲＮＡサンプルに適していない。
【０００６】
ポリＡ濃縮に関連するこれらの不利のために、代替方法が開発された。ポリＡ濃縮に基づくアプローチとは対照的に、これらの方法は、関心のあるＲＮＡを濃縮することを目指すのではなく、たとえばｒＲＮＡなどのような、続くトランスクリプトーム分析にとって関心のないＲＮＡタイプを枯渇させ、したがって除去することを目指す。ポリＡ濃縮とは対照的に、ｒＲＮＡ枯渇に基づく方法は、アデニル化されていないＲＮＡ、非コードＲＮＡ、および調節ＲＮＡについての情報を保護し、トランスクリプトームの複雑さについての我々の理解を増加させる、ＲＮＡ調節、新生転写、ＲＮＡ編集、および他の現象の調査を可能にする。ここで、また、ＮＧＳのための全ＲＮＡ調製物を調製するために、様々なアプローチが、望まれない標的ＲＮＡを枯渇させるために開発された。あるアプローチによれば、リボソームＲＮＡなどのような望まれない標的ＲＮＡは、完全長の標的ＲＮＡに対してハイブリダイズする長いプローブによって枯渇される。市販で入手可能な製品は、ＲｉｂｏＺｅｒｏ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）であり、これは、初期ＲＮＡ組成物中に存在するｒＲＮＡにハイブリダイズするプローブとして、ｒＲＮＡの長いビオチン化転写物を使用する。結果として生じるハイブリッドは、ストレプトアビジンビーズにより除去される。それによって、ｒＲＮＡ枯渇化組成物が、得られる。使用されるプローブは、ＲＮＡプローブであり、したがって、取扱いにとって不都合なことには、−７０〜−８０℃で保存されなければならない。それぞれの技術は、国際公開第２０１１／０１９９９３号において記載される。前記方法は、それが、分解されたＲＮＡの場合でさえ、リボソームＲＮＡを効率的に除去するという利点を持つ。しかしながら、前記方法は、異なる生物で多様な効率を有する。さらに、断片化されたｒＲＮＡの場合でもｒＲＮＡを効率的に除去するのに必要な長いプローブは、非標的ＲＮＡとクロスハイブリダイズし、それによって、情報価値のあるＲＮＡの非特異的枯渇をもたらし得るという欠点を有する。したがって、この方法は、特異性に関して不利である。他の市販で入手可能なｒＲＮＡ枯渇方法／キットは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＲｉｂｏＭｉｎｕｓ技術である。ここで、ビオチン化ロックド核酸プローブが、使用され、望まれない標的ＲＮＡに対してハイブリダイズし、タグ付きハイブリッドは、ストレプトアビジンビーズの使用によって結合され、除去される。このアプローチは、ＲｉｂｏＺｅｒｏ法よりも短いプローブを使用し、したがって、その方法よりもかなり効率的ではない、特に、断片化されたＲＮＡの場合に、ｒＲＮＡを枯渇させるのに効率的ではない（実施例もまた参照されたい）。さらに、また、この先行技術は、情報価値のあるＲＮＡが、ｒＲＮＡプローブおよびたとえばｍＲＮＡ配列の間の非特異的相互作用のために、ｒＲＮＡ枯渇の間に非特異的に枯渇されるという危険性をもたらす。したがって、特異性が改善され、さらに、断片化の場合でも望まれない標的ＲＮＡを効率的に枯渇させる標的ＲＮＡ枯渇方法についての必要性がある。
【０００７】
望まれない標的ＲＮＡを枯渇させることによってまたは望ましいＲＮＡタイプを濃縮することによって、ＲＮＡ組成物を調製した後、ＮＧＳ配列決定のために得られたＲＮＡを調製するための典型的なプロトコールは、たとえばランダムヘキサマープライミング逆転写を介しての第１鎖ｃＤＮＡの生成ならびにＲＮアーゼＨおよびＤＮＡポリメラーゼによる第２鎖ｃＤＮＡの続く生成を伴うであろう。たとえば、ｃＤＮＡは、断片化され、ＮＧＳアダプターに対してライゲーションされてもよい。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および低分子干渉ＲＮＡなどのような小型ＲＮＡについては、小型ＲＮＡ濃縮方法を介しての優先的な単離、電気泳動法ゲル上でのサイズ選択、またはこれらのアプローチの組み合わせが共通して使用される。ＲＮＡリガーゼは、ＲＮＡに対してアダプター配列を連結するために使用することができ、このステップに、多くの場合、ＮＧＳ処理前のＰＣＲ増幅ステップが後続する。配列決定後に、得られたリードは、参照ゲノムに対してアライメントし、知られている転写物配列と比較し、または新たにアセンブルし、ゲノム規模の転写マップを構築することができる。
【０００８】
全ＲＮＡからｒＲＮＡなどのような望まれないＲＮＡ分子を枯渇させるさらなる方法は、国際公開第０１／３２６７２号において記載される。ＲＮＡは、たとえばｒＲＮＡなどのような望まれない標的配列と複合体を形成することができるベイト分子と接触させ、それによって、初期組成物から除去することができるベイト：標的複合体を形成する。得られたｒＲＮＡ枯渇化組成物は、信号成分によりマークすることができる、ｍＲＮＡライブラリーを調製するために使用することができる、またはアレイハイブリダイゼーション技術を利用する発現研究において使用することができる。複数の他の方法の中でも、ベイト：標的複合体を除去するためのいくつかの方法が開示され、ハイブリッド捕捉に基づく方法もまた、開示される。
【０００９】
本発明の目的は、先行技術の方法の少なくとも１つの欠点を回避する、全ＲＮＡからｒＲＮＡなどのような望まれない標的ＲＮＡを枯渇させるのに適した方法を提供することである。特に、効率的で特異的であり、かつ様々な種に起源を持つサンプルおよび分解されたサンプルを含む様々なサンプルから望まれない標的ＲＮＡを枯渇させるために使用することもできる、次世代配列決定の適用のために、特にトランスクリプトーム配列決定のために、全ＲＮＡを調製するための方法を提供することを目的とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０１９９９３号
【特許文献２】国際公開第０１／３２６７２号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００９）５５：４  ６４１〜６５８
【非特許文献２】Ｍｅｔｚｋｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０年１月）１１巻、３１〜４６頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ハイブリッド捕捉と組み合わせて、枯渇されることになっている標的ＲＮＡに対してハイブリダイズする特異的に設計されたプローブ分子を使用することが、ＲＮＡ含有組成物から望まれない標的ＲＮＡを除去し、したがって枯渇させるための、有意に改善された方法を提供するという発見に基づく。方法は、全ＲＮＡからｒＲＮＡを特異的にかつ効率的に枯渇させるために使用し、それによって、トランスクリプトーム配列決定などのようなＮＧＳの適用において使用することができるｒＲＮＡ枯渇化ＲＮＡを提供することができる。
【００１３】
第１の態様によれば、初期ＲＮＡ含有組成物から標的ＲＮＡ枯渇化組成物を調製するための方法が提供され、この方法は、以下：
ａ）１つ以上のグループのプローブ分子と初期ＲＮＡ含有組成物を接触させ、そして標的ＲＮＡおよびプローブ分子の間で二本鎖ハイブリッドを生成するステップであって、あるグループのプローブ分子が、以下：
ｉ）グループが、１００ｎｔ以下の長さを有する２つ以上の異なるプローブ分子を含む；
ｉｉ）前記グループにおいて含まれるプローブ分子が、標的ＲＮＡ中に存在する標的領域に対して相補的である；
ｉｉｉ）前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、２つ以上の異なるプローブ分子が、形成される二本鎖ハイブリッドにおいて互いに隣接して位置する；
との特徴を有する、ステップ；
ｂ）二本鎖ハイブリッドに結合する結合剤を使用することによって二本鎖ハイブリッドを捕捉し、それによって、ハイブリッド／結合剤複合体を形成するステップ；
ｃ）組成物からハイブリッド／結合剤複合体を分離し、それによって、標的ＲＮＡ枯渇化組成物を提供するステップ
を含む。
【００１４】
本発明は、枯渇のために、たとえば様々なｒＲＮＡ種などのような望まれない標的ＲＮＡに対してハイブリダイズし、したがってマークする、特異的に設計されたグループのプローブ分子を使用する。それぞれのグループのプローブ分子は、本明細書において、標的領域とも呼ばれる、標的ＲＮＡにおける特異的な領域を標的にし、前記標的領域に対してハイブリダイズする２つ以上の異なる短いプローブ分子を含む。それらの標的領域に対してハイブリダイズする場合、１つのグループの短いプローブ分子は、形成される二本鎖ハイブリッドにおいて互いに隣接して位置する、したがって、すぐ近くに位置する。形成された二本鎖ハイブリッドは、標的領域をまたがり、したがってカバーする。１つのグループの短いプローブ分子を含む、形成された二本鎖ハイブリッドに、次いで、抗ハイブリッド結合剤が結合し、それによって、ハイブリッド／結合剤複合体が形成される。前記複合体は、残りの組成物から容易に分離し、それによって、望まれない標的ＲＮＡを除去し、したがって標的ＲＮＡ枯渇化組成物を提供することができる。実施例によって示されるように、ハイブリッド捕捉技術と組み合わせた、特異的に設計されたプローブ分子の使用は、先行技術の標的ＲＮＡ枯渇方法と比較して、標的ＲＮＡ除去の特異性および効率を有意に改善する。標的ＲＮＡ内の特異的な標的領域に対してハイブリダイズする複数の短いプローブ分子を含む１つ以上のグループの使用の重要な利点は、より長いプローブ分子と比較して、短いプローブ分子において許容されるミスマッチがより少ないので、特異性における、結果として生じる増加となる。これは、プローブレベルで、非標的ＲＮＡに対する非特異的結合を低下させる。短いプローブ長を使用するさらなる利点は、それがバイオインフォマティクス設計において可能にする容易さである。プローブ分子が短いほど、よりオーバーラップしない可能性のある組み合わせのプローブを設計することができる。これは、非標的配列と最小限のクロスハイブリダイゼーションを有するまたはさらにクロスハイブリダイゼーションを全く有さないプローブ分子を提供することを可能にする。特異性は、実行されるハイブリッド捕捉ステップにより第２のレベルでさらに増加する。抗ハイブリッド抗体などのような抗ハイブリッド結合剤は、前記ハイブリッドがミスマッチを全く含有しないまたはわずかなミスマッチのみを含有する場合しか、二本鎖ハイブリッドのみを認識しない。これは、プローブ分子がその標的ＲＮＡに対して結合する場合に通常生じる完全なマッチの捕捉に好都合である。さらに、３５ｎｔ以下または好ましくは３０ｎｔ以下の長さを有する特に短いプローブ分子が本発明による方法において使用される場合、これは、特異性をさらに改善する。３５ｎｔ以下の長さを有する単一のプローブ分子が非標的ＲＮＡに対して非特異的にハイブリダイズする場合に形成されると思われる短い二本鎖ハイブリッドは、通常、抗ハイブリッド結合剤によってあまり認識されない。したがって、非標的ＲＮＡに対して非特異的に結合するそれぞれの単一のプローブ分子は、特に抗ハイブリッド抗体の場合において、抗ハイブリッド結合剤の効率的な結合を可能にするのに十分な長さの二本鎖ハイブリッドを提供しない。さらに、捕捉、したがって枯渇効率は、あるグループのプローブ分子が標的に対してハイブリダイズする場合のように、抗ハイブリッド抗体などのような１つを超える抗ハイブリッド結合剤が、枯渇されることになっているハイブリッドに対して結合することができる場合、増加する。上記の理由で、大部分の非特異的な結合イベントは、抗ハイブリッド結合剤によって捕捉されないであろう、したがって、非特異的に結合した非標的ＲＮＡは、ＲＮＡ含有組成物から枯渇されない。しかしながら、グループのすべてのプローブ分子がそれらの標的領域に対してハイブリダイズする場合、著しくより長い二本鎖ハイブリッドが形成される。ミスマッチを含有しない、形成された長い二本鎖ハイブリッドは、抗ハイブリッド結合剤によって十分に認識され、それによって、効率的な捕捉および除去を確実にする。したがって、それらの標的領域に対してハイブリダイズする場合、そのグループの短いプローブ分子は、本質的に、長いプローブ分子の特徴を模倣し、これは、抗ハイブリッド結合剤による捕捉を改善する。特異性の増加に関するこの有益な効果は、特に、抗ハイブリッド抗体を使用する場合に達成され、抗ハイブリッド抗体は、そのため、好ましい。
【００１５】
本発明による方法の素晴らしい効率および優れた特異性は、ハイブリッド捕捉と組み合わせて複数の隣接した短いプローブ分子を使用することが、標的ＲＮＡ除去の特異性を有意に増加させ、これにより、先行技術の方法と比較して、関心のあるＲＮＡが、非特異的に枯渇されることがより少ないことがもたらされるということを特に示す実施例によって示される（特に図６および７を参照されたい）。さらに、方法は、断片化されたＲＮＡの場合でさえ、９９％を超える枯渇率に達することによって非常に効率的となる。したがって、本明細書において教示されるように、２つ以上の隣接した短いプローブ分子を含む、１つ以上のグループのプローブ分子を使用する場合、標的ＲＮＡ結合の効率は、より長いプローブに比べて損なわれない。しかしながら、特異性は、より少ない非特異的な結合イベントおよび抗ハイブリッド結合剤による、正確に形成された二本鎖ハイブリッドの捕捉から結果として生じる付加的なレベルの特異性のために、有意に改善され、抗ハイブリッド結合剤は、そのため、好ましくは、抗ハイブリッド抗体となる。標的ＲＮＡ枯渇化組成物は、したがって、ポリＡ  ｍＲＮＡ、アデニル化されていないｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、および調節ＲＮＡを含むＲＮＡ種の多様性を好都合に保持する。ＳＮ比は、改善され、低存在量のＲＮＡを検出することができる。複数の望まれない標的ＲＮＡは、本発明による方法を使用して同時に枯渇させることができる。したがって、本発明によって提供される方法は、既存の標的ＲＮＡ枯渇方法に対して有意な改善をもたらす。標的ＲＮＡ枯渇化組成物は、マイクロアレイ分析、ライブラリー構築物、逆転写、増幅、トランスクリプトームプロファイリング、発現分析、および重要なことには配列決定の適用を含むが、これらに限定されない多くの下流の適用において使用することができる。
【００１６】
第２の態様によれば、サンプルにおいて含まれる関心のあるＲＮＡ分子を配列決定するための方法が提供され、この方法は、以下：
ａ）好ましくはサンプルから全ＲＮＡを単離することによって、ＲＮＡ含有組成物を得るステップ；
ｂ）第１の態様による方法を使用して、好ましくは全ＲＮＡであるＲＮＡ含有組成物から望まれない標的ＲＮＡを枯渇させ、それによって、標的ＲＮＡ枯渇化組成物を提供するステップ；
ｃ）任意選択で、非結合プローブ分子を除去するステップ；
ｄ）標的ＲＮＡ枯渇化組成物において含まれるＲＮＡ分子を配列決定するステップ
を含む。
【００１７】
上記に説明されるように、第１の態様による方法は、ヒト、マウス、およびラットを含む様々な種由来のｍＲＮＡおよび非コードＲＮＡの回収を確実にしながら、全ＲＮＡから、様々なタイプのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）などのような望まれない標的ＲＮＡを有効に除去する。有用なデータの割合を改善し、偏りを減少させ、かつ非コードＲＮＡ種を保護することによって、方法は、次世代配列決定（ＮＧＳ）の適用にとりわけ適している高品質なＲＮＡを提供する。一般的な配列決定の適用、特に、トランスクリプトーム配列決定などのようなＮＧＳの適用において前記枯渇方法を統合することによって、ＲＮＡ分子を配列決定するための改善された方法が提供される。
【００１８】
第３の態様によれば、ＲＮＡ含有組成物から標的ＲＮＡを枯渇させるのに適したキットが提供され、このキットは、以下：
ａ）標的ＲＮＡを枯渇させるための１つ以上のグループのプローブ分子であって、あるグループのプローブ分子が、以下：
ｉ）グループが、１００ｎｔ以下の長さを有する２つ以上の異なるプローブ分子を含む；
ｉｉ）前記グループにおいて含まれるプローブ分子が、標的ＲＮＡの標的領域に対して相補的である；
ｉｉｉ）前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、２つ以上の異なるプローブ分子が、形成される二本鎖ハイブリッドにおいて互いに隣接して位置する；
との特徴を有する、１つ以上のグループのプローブ分子：ならびに
ｂ）プローブ分子および標的ＲＮＡの間で形成される二本鎖ハイブリッドに結合するのに適した結合剤
を含む。
【００１９】
それぞれのキットは、本発明の第１の態様による方法を実行するために使用することができる。キットにおいて使用される、グループのプローブ分子は、大型（１８Ｓ、２８Ｓ）、小型（５Ｓ、５．８Ｓ）、およびミトコンドリア（１２Ｓ、１６Ｓ）ｒＲＮＡなどのような複数の望まれない標的ＲＮＡに対して特異的にハイブリダイズするように設計することができる。複数の短いオリゴヌクレオチドは、分解された標的ＲＮＡまたは突然変異の存在下においてでさえ、標的ＲＮＡがサンプルから完全に除去されるであろうということを確実にするために、標的ＲＮＡごとに使用される。それらの短い長さのために、プローブは、非標的ＲＮＡ分子に対する交差反応性が最小限にされることを確実にするために注意深く設計することができる。さらなる利点は、上記に記載した。このキットにおけるプローブは、ヒト、マウス、およびラットなどのような様々な種から標的ＲＮＡを除去することができるように設計することができる。実施例によって示されるように、本発明によるキットは、全ＲＮＡから＞９９．９％の標的ＲＮＡ分子を除去することができる。したがって、キットは、次世代配列決定の適用のために、様々なタイプのｒＲＮＡなどのような望まれない標的ＲＮＡの高度に選択的で効率的な除去のために使用することができる。
【００２０】
本出願の他の目的、特徴、利点、および態様は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から当業者らに対して明らかになるであろう。しかしながら、以下の説明、添付の特許請求の範囲、および特定の実施例が、本出願の好ましい実施形態を示しながらも、例説のみのために与えられることを理解されたい。開示される本発明の精神および範囲内の様々な変更および修飾は、以下のものを読むことから当業者らに対して直ちに明らかになるであろう。
【００２１】
発明の詳細な説明
第１の態様によれば、初期ＲＮＡ含有組成物から標的ＲＮＡ枯渇化組成物を調製するための方法が提供され、この方法は、以下：
ａ）１つ以上のグループのプローブ分子と初期ＲＮＡ含有組成物を接触させ、そして標的ＲＮＡおよびプローブ分子の間で二本鎖ハイブリッドを生成するステップであって、あるグループのプローブ分子が、以下：
ｉ）グループが、１００ｎｔ以下の長さを有する２つ以上の異なるプローブ分子を含む；
ｉｉ）前記グループにおいて含まれるプローブ分子が、標的ＲＮＡの標的領域に対して相補的である；
ｉｉｉ）前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、２つ以上の異なるプローブ分子が、形成される二本鎖ハイブリッドにおいて互いに隣接して位置する；
との特徴を有する、ステップ；
ｂ）二本鎖ハイブリッドに結合する結合剤を使用することによって二本鎖ハイブリッドを捕捉し、それによって、ハイブリッド／結合剤複合体を形成するステップ；
ｃ）組成物からハイブリッド／結合剤複合体を分離し、それによって、標的ＲＮＡ枯渇化組成物を提供するステップ
を含む。
【００２２】
本発明は、初期ＲＮＡ含有組成物から標的ＲＮＡ枯渇化組成物を調製するための方法を提供する。重要な利点は、発明の概要において上記に記載した。個々の方法のステップおよび好ましい実施形態を続いて記載する。
【００２３】
一実施形態によれば、初期ＲＮＡ含有組成物が、全ＲＮＡである。全ＲＮＡは、任意の一般に使用されるＲＮＡ精製方法を使用して、様々なサンプルから単離することができる。適した方法は、先行技術においてよく知られており、したがって詳細な説明をここで必要としない。適した方法は、フェノール／クロロホルムに基づく方法を使用するＲＮＡの単離、カオトロピック剤、アルコール、および特にケイ素含有固相（たとえばシリカ、ガラス繊維、炭化ケイ素）などのような固相を使用するＲＮＡの単離、アルコール沈殿、他の有機溶媒、ポリマー、または陽イオン洗剤による沈殿、およびその他同種のものを含むが、これらに限定されない。本発明による方法は、低量および大量のＲＮＡインプット材料で、好適な枯渇性能を示す。実施例によって示されるように、１０ナノグラムほどの少ない量の全ＲＮＡをインプット材料として使用することができる。初期ＲＮＡ含有組成物として使用することができる全ＲＮＡの適した範囲は、０．００５μｇ〜１５μｇ、０．０１μｇ〜１０μｇ、０．０２５μｇ〜７．５μｇ、および０．５μｇ〜５μｇを含むが、これらに限定されない。この広範な範囲は、本明細書でのように、ＮＧＳの適用に関して有利であり、低量のＲＮＡインプット材料のみが、配列決定ライブラリーの調製に入手可能であることが多い。
【００２４】
一実施形態によれば、ＤＮＡ枯渇化溶解物が、初期ＲＮＡ含有組成物として使用される。ＤＮＡは、たとえば、ＤＮアーゼ消化を実行することによってまたは溶解物からＤＮＡを選択的に単離し、したがって除去することによって、溶解物から除去されてもよい。ＤＮＡに選択的に結合し、したがってＤＮＡを除去するための適した方法は、たとえば、参照によって本明細書において組み込まれる欧州特許第０８８０５３７号明細書および国際公開第９５／２１８４９号において記載される。たとえば、エタノールまたはイソプロパノールなどのような短鎖アルコールの非存在下において、カオトロピック塩などのようなカオトロピック剤を使用してサンプルを溶解する場合、特にケイ素含有固相が使用される場合、ＤＮＡに対して選択的な結合条件を確立することができる。所望の場合、結合したＤＮＡは、さらに使用する、たとえばさらに処理する、たとえば配列決定することができ、したがって、たとえば任意選択で洗浄され、核酸結合固相から溶出され、それによって、ＲＮＡが実質的にないＤＮＡ画分を提供してもよい。しかしながら、ＤＮＡに関心のない場合、ＲＮＡのみに関心がある場合、結合したＤＮＡはまた、単純に廃棄されてもよい。さらに、ＲＮＡ含有溶解物は、たとえば細胞残渣および他の混入物を除去するためにきれいにされてもよい。
【００２５】
しかしながら、初期ＲＮＡ含有組成物として精製された全ＲＮＡを使用することが好ましい。
【００２６】
ステップａ）
ステップａ）において、初期ＲＮＡ含有組成物、たとえば全ＲＮＡを、１つ以上のグループのプローブ分子と接触させる。したがって、１つのグループのプローブ分子が使用されてもよいまたは２つ以上のグループのプローブ分子が使用されてもよい。あるグループのプローブ分子は、２つ以上の異なるプローブ分子を含む。グループにおいて含まれるプローブ分子の特異的な設計は、それが本発明により達成される優れた特異性に寄与するので、本発明の重要な特徴となる。
【００２７】
使用されるプローブ分子は、１００ｎｔ以下の長さを有する。達成される特異性に関して、長いプローブ分子に対する短いプローブの使用の利点は、発明の概要において上記に説明した。プローブ分子は、７５ｎｔ以下、７０ｎｔ以下、６５ｎｔ以下、６０ｎｔ以下、５５ｎｔ以下、５０ｎｔ以下、４５ｎｔ以下、４０ｎｔ以下、３５ｎｔ以下、３０ｎｔ以下、または２５ｎｔ以下から選択される長さを有していてもよい。一実施形態によれば、前記プローブ分子の最小の長さは、これが枯渇性能を増加させるので、少なくとも１０ｎｔ、好ましくは少なくとも１５ｎｔ、より好ましくは少なくとも２０ｎｔである。たとえば１０ｎｔ〜１５ｎｔの長さを有する非常に短いプローブ分子を使用する場合、ハイブリダイゼーションの間の前記プローブ分子の濃度は、標的ＲＮＡに対するプローブ分子の効率的な結合を確実にするために増加させなければならない。一実施形態によれば、プローブ分子が、１０ｎｔ〜６５ｎｔ、好ましくは１５ｎｔ〜５５ｎｔ、より好ましくは２０ｎｔ〜４５ｎｔ、より好ましくは２０ｎｔ〜３５ｎｔ、最も好ましくは２５ｎｔ〜３０ｎｔの範囲にある長さを有する。それによって、より小さなプローブ長（これは、非特異的な結合の危険性を低下させる、また、さらなる手順において干渉がより少ない）および枯渇性能の間の好適な組み合わせが、達成される。３５ｎｔ以下、好ましくは３０ｎｔ以下、より好ましくは２５ｎｔ以下の長さを有するプローブ分子の使用は、単一の短いプローブ分子および非標的ＲＮＡの間で形成されると思われる短い二本鎖ハイブリッドに対する抗ハイブリッド結合剤の結合が、特に形成されたハイブリッドがミスマッチをさらに含む場合、低下するので、特異性がハイブリッド捕捉レベルでさらに増加するという利点を有する。これは、特に、抗ハイブリッド結合剤が抗ハイブリッド抗体である場合である。しかしながら、短いプローブ分子がそれらの標的領域に対してハイブリダイズし、したがって、それらの隣接したグループメンバーと一緒にハイブリダイズする場合、十分な長さを有する二本鎖ハイブリッドが形成されて、抗ハイブリッド結合剤による効率的な捕捉、したがって枯渇を可能にする。さらに、通常、ミスマッチは、グループのプローブ分子がそれらの標的領域に対してハイブリダイズする場合、形成される二本鎖ハイブリッド中に全く存在しない。１５ｎｔ〜４０ｎｔ、２０ｎｔ〜３５ｎｔ、２２ｎｔ〜３３ｎｔ、好ましくは２５ｎｔ〜３０ｎｔのプローブ長は、二本鎖ハイブリッドに結合させるために抗ハイブリッド抗体を使用する場合、特に適している。およそ２５ｎｔの長さを有するプローブ分子が最も好ましい。
【００２８】
グループにおいて含まれるプローブ分子は、たとえば特異的なｒＲＮＡなどのような、特異的な標的ＲＮＡの標的領域に対して相補的である。プローブ分子は、標的ＲＮＡの配列に対して相補的となるように設計され、したがって、それらの標的ＲＮＡに対して配列特異的な結合をすることができる。グループにおいて含まれるそれぞれのプローブ分子は、標的領域の異なる部分に対して特異的に配列にハイブリダイズする。プローブ分子および標的領域の間の配列特異的な対合を確実にし、かつ非標的ＲＮＡに対するプローブ分子の非特異的なハイブリダイゼーションを回避するために、プローブ分子が、標的ＲＮＡに対して１００％相補的である、したがって、標的ＲＮＡの標的領域の部分に対して１００％相補的である配列を有することが好ましい。したがって、グループのプローブ分子がそれらの標的領域に対してハイブリダイズする場合、二本鎖ハイブリッドが形成され、これは、標的ＲＮＡにおける突然変異のまれなイベントにおけるものを除いて、いかなるミスマッチをも含有しない。
【００２９】
前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、２つ以上の異なるプローブ分子は、形成される二本鎖ハイブリッドにおいて互いに隣接して位置する。隣接したプローブ分子は、前記ハイブリッドにおいて互いに２０ｎｔ、１５ｎｔ、１０ｎｔ、７ｎｔ、５ｎｔ、４ｎｔ、３ｎｔ、２ｎｔ、または１ｎｔ以下離れて間隔を置く。グループのすべてのプローブ分子がそれらの標的領域に対してハイブリダイズする場合、生成された二本鎖ハイブリッドは、本質的に、標的領域をまたがり、したがってカバーする。ヌクレオチドギャップが、個々の隣接したプローブ分子の間に存在する場合、それらは、プローブ分子の長さよりも小さい。形成された二本鎖ハイブリッドにおけるプローブ分子が近いほど、枯渇性能はよくなる。好ましくは、隣接したプローブ分子は、前記ハイブリッドにおいて互いに３ｎｔ、２ｎｔ、または１ｎｔ以下離れて間隔を置く。隣接した短いプローブ分子が、形成された二本鎖ハイブリッドにおいて互いに非常にすぐ近くにある場合、二本鎖ハイブリッドは、特異的なグループ効果によってさらに安定化される。好ましくは、グループの２つ以上の、より好ましくはすべてのプローブ分子は、形成された二本鎖ハイブリッドにおいて互いに連続しており、したがって、あるプローブ分子の第１のヌクレオチドは、直接後続し、したがって、先のプローブ分子の末端のヌクレオチドの隣にあるなどである。標的ＲＮＡの標的領域に対してハイブリダイズする場合、ヌクレオチドギャップは、そのような連続した環境において隣接したプローブ分子の間に存在しない。そのような連続した短いプローブ分子は、より長いプローブ分子に非常によく似ている、しかしながら、ホスホジエステル結合は、隣接したプローブ分子の連続したヌクレオチドの間に存在せず、これはニックとも呼ばれる。そのような連続した設計は、達成可能な特異性および枯渇性能に関してかなりの利点を有する。上記に説明されるように、短いプローブ分子は、それらの融解温度が効率的な結合には低すぎるので、ミスマッチにより非標的ＲＮＡに対して結合する可能性が低い。したがって、非標的ＲＮＡに対して非特異的にアニールする単一のプローブは、たとえばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用して、容易に除去することができる。さらに、非標的ＲＮＡに対してハイブリダイズする場合でさえ、それらは、ミスマッチが存在する場合、抗ハイブリッド結合剤によってそれほど十分に認識されず、さらに、それらの短い長さのためにそれほど十分に認識されない。これは、特に、抗ハイブリッド結合剤として抗ハイブリッド抗体を使用する場合である。これは、非特異的な結合イベントの捕捉、したがって枯渇を低下させる。それによって、特異性は、有意に改善される。しかしながら、それらの標的領域に対してハイブリダイズした場合、短いプローブ分子は、グループ効果によって安定化される。１つのグループのプローブ分子は、互いに隣接して位置し、したがって、形成された二本鎖ハイブリッドにおいてすぐ近くにある。これは、ハイブリッドを安定化する。特に、形成されるハイブリッドにおける連続した短いプローブ分子のアニーリングは、連続したプローブ分子の末端のヌクレオチド塩基の間のスタッキング相互作用によって安定化される。たとえば、ニックによってもたらされる安定性についての推定される自由エネルギーは、少なくとも−１．４ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、また、−２．４ｋｃａｌ／ｍｏｌと同じくらい大きくなり得る。したがって、連続したプローブ分子は、個々の単一のプローブ分子またはさらに隣接した間隔を置いたプローブ分子と比較して、標的領域から引き離すのが非常により困難となる。したがって、プローブ分子の融解温度は、連続したプローブ分子がそれらの標的領域に対してグループとしてハイブリダイズする場合、個々の単一のプローブ分子の融解温度と比較して、増加する。これは、ハイブリダイゼーション特異性をさらに増加させ、短いプローブ分子を使用する場合でさえ、さらにいっそうストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用することを可能にする。したがって、連続したプローブ分子の使用は、標的ＲＮＡと共に形成される二本鎖ハイブリッドが、グループのそれぞれのプローブ分子の末端のヌクレオチド塩基の間のスタッキング相互作用によって強く安定化されるという特定の利点を有する。理論に束縛されることを望むものではないが、本明細書において記載されるような連続した短いプローブ分子（たとえば３５ｎｔ以下の長さを有する）の使用が、標的ＲＮＡの弛緩を支持し、それによって、二本鎖ハイブリッドの形成および好ましくは抗ハイブリッド抗体である抗ハイブリッド結合剤の結合を支持することもまた、考えられる。さらに、連続したプローブ分子によって形成される長い二本鎖ハイブリッドは、特に、抗ハイブリッド結合剤によって十分に認識され、これは特異性および効率をさらに増加させる。たとえば、抗ハイブリッド抗体を使用する場合、より多くの抗ハイブリッド抗体が、形成されたハイブリッドに対して結合することができ、これは、さらには、捕捉効率を増加させる。好ましくは、１つのグループ内の少なくとも２つのプローブ分子、好ましくは、グループの少なくとも３つの、好ましくはすべてのプローブ分子が、連続している。
【００３０】
グループのプローブ分子によって標的にされる標的領域は、完全長標的ＲＮＡに相当していてもよい。これは、たとえば、５Ｓ  ＲＮＡまたは５．８Ｓ  ＲＮＡでの場合でのように、標的ＲＮＡがやや短い場合、実行可能である。たとえば３００ｎｔ以下または２００ｎｔ以下の長さを有するそのような短い標的ＲＮＡでは、実施例によって示されるように、標的ＲＮＡ当たり既に１つのグループのプローブ分子で十分である。しかしながら、所望の場合、１つを超えるグループのプローブ分子もまた、短い標的ＲＮＡの枯渇のために使用することができる。一実施形態によれば、標的領域が、より大きな標的ＲＮＡにおいて含まれる、より小さな領域である。好ましくは、標的領域は、標的ＲＮＡにおける保存領域に相当する。たとえば、様々なｒＲＮＡタイプが、様々な種の間で高度に保存されている領域を含むことが知られている。それぞれ保存された標的領域は、好ましくは、特異的なグループのプローブ分子によって標的にされる。好ましくは、標的領域は、様々な種において保存され、少なくとも２つの異なる種、好ましくは少なくとも２つの異なる真核生物種において高度の相同性を示す領域であり、好ましくは、少なくとも２つの真核生物種の間で少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の相同性を示す。好ましくは、標的領域は、少なくともヒト、マウス、およびラットにおいてそれぞれ保存されている。ヒトに加えて、ラットおよびマウス、他の哺乳動物、またはさらに他の真核生物もまた、高度の相同性が真核生物において、特に哺乳動物の間で存在するので、特にｒＲＮＡを標的ＲＮＡとする場合に、同じプローブ分子によって標的にすることができる。好ましくは、プローブ分子は、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、およびウサギから選択される様々な種由来の標的ＲＮＡを標的にし、したがってハイブリダイズする、好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、およびウサギのすべての種の標的ＲＮＡ、特にｒＲＮＡに対してハイブリダイズする。代替の設計は、たとえば、細菌の様々な種、植物の様々な種、または他の分類グループを標的にすることができる。非標的ＲＮＡに対するハイブリダイゼーションが最小限にされるまたは生じないようにプローブ分子が設計される。
【００３１】
あるグループのプローブ分子がハイブリダイズする標的領域は、５０ｎｔ〜５００ｎｔ、５０ｎｔ〜３５０、５０ｎｔ〜２５０ｎｔ、７５ｎｔ〜２２５ｎｔ、１００ｎｔ〜２００ｎｔ、１００ｎｔ〜１７５ｎｔから選択される範囲にあるサイズを有していてもよく、好ましくは、１００ｎｔ〜１５０ｎｔの範囲にある。標的領域のサイズはまた、好ましくは様々な種の間でも標的ＲＮＡにおいて保存されるが、非特異的枯渇を最小限にするためには非標的ＲＮＡにおいて存在しない標的領域を選ぶことが好ましいので、標的ＲＮＡの全長およびその配列に依存する。あるグループのプローブ分子が、それらの標的領域に対してハイブリダイズする場合、形成された二本鎖ハイブリッドは、標的領域のサイズに相当するサイズを有し、好ましくは、５０ｎｔ〜５００ｎｔ、５０ｎｔ〜３５０、５０ｎｔ〜２５０ｎｔ、７５ｎｔ〜２２５ｎｔ、１００ｎｔ〜２００ｎｔ、１００ｎｔ〜１７５ｎｔから選択される範囲にあり、好ましくは、１００ｎｔ〜１５０ｎｔの範囲にある。そのようなハイブリッド長はまた、抗ハイブリッド抗体によっても十分に認識される。
【００３２】
一実施形態によれば、あるグループのプローブ分子が、２〜１５、３〜１０、２〜８、２〜７、２〜６、３〜６、または４〜６の異なるプローブ分子を含む。使用されるプローブ分子の数もまた、それらの長さに依存し、グループの隣接したプローブ分子が標的領域に対してハイブリダイズする場合、好ましくはおよそ７５ｎｔ〜２２５ｎｔ、好ましくは１００ｎｔ〜１５０ｎｔの範囲にある、上記に指定される５０ｎｔ〜５００ｎｔの所望のサイズを好ましくは有する二本鎖ハイブリッドを得ることを可能にするべきである。より短いプローブ分子を使用する場合、より多くのプローブ分子、たとえば６〜１５、好ましくは１０〜１５が、所望の長さおよび安定したハイブリッドを達成するために、グループにおいて好ましくは含まれる。上記に記載されるように、標的ＲＮＡを枯渇させるための本発明の方法において使用される隣接したプローブ分子の少なくとも一部分が、連続した設計を有することが好ましい。好ましくは、１つのグループ内の少なくとも２つのプローブ分子、好ましくは、グループの少なくとも３つ、好ましくはすべてのプローブ分子が、連続した設計を有する。好ましくは、特異的な標的ＲＮＡを標的にするために使用されるプローブ分子の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくはすべてのグループが、２つ以上の連続したプローブ分子を含む。好ましくは、グループ内のすべてのプローブ分子が、連続している。
【００３３】
プローブ分子は、１０％〜９５％のＧＣ含量を有していてもよい。好ましくは、使用されるプローブ分子の大部分、好ましくは、プローブ分子の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％が、３０％〜７０％、より好ましくは４０％〜６０％のＧＣ含量を有する。それぞれのＧＣ含量を有することは、アニーリング温度が増加するという利点を有し、これは、また、ハイブリダイゼーション反応の特異性をも増加させる。
【００３４】
特に、次世代配列決定の適用では、望まれない標的ＲＮＡの効率的な枯渇が、必須である、さもないと、たとえばｒＲＮＡなどのような、過剰な量の望まれない標的ＲＮＡが配列決定され、それによって、配列決定能力を浪費してしまう危険性がある。たとえば、ｒＲＮＡが大部分のＲＮＡ（およそ９０％）を構成することを考慮すると、たとえそれぞれのｒＲＮＡのわずか５％が捕捉されないとしても、これは、続く配列決定反応の効率をひどく低下させると思われる。そのため、完全に、望まれない標的ＲＮＡを効率的に除去することは重要である。これは、より長い標的ＲＮＡ分子の場合には、標的ＲＮＡが断片化され得るまたは断片化されるようになり得るので、困難な作業となる。ここで、たとえば真核生物のｒＲＮＡタイプでの場合でのように、個々の標的ＲＮＡのサイズがかなり異なり得るということに注意することもまた重要である。５Ｓ  ｒＲＮＡは、１５０ｎｔ未満のサイズを有するが、２８Ｓ  ＲＮＡは、４．５００ｎｔを超えるサイズを有する。そのため、そのより長いサイズのために、２８Ｓ  ＲＮＡが完全に枯渇されないという危険性はより高い。たとえ標的ＲＮＡが断片化されたとしても、標的ＲＮＡ、特に、少なくとも２５０ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも４００ｎｔ、または少なくとも５００ｎｔのサイズを有するより長い標的ＲＮＡが効率的に除去されることを確実にするために、プローブセットを使用することが好ましい。プローブセットは、２つ以上のグループまたはプローブ分子を含み、プローブセットにおいて含まれるそれぞれのグループのプローブ分子は、特異的な標的ＲＮＡにおける異なる標的領域を標的にする。好ましくは、標的領域は、５００ｎｔ以下、４５０ｎｔ以下、４００ｎｔ以下、３５０ｎｔ以下、３００ｎｔ以下、２５０ｎｔ以下、２００ｎｔ以下、または１５０ｎｔ以下の距離内で標的ＲＮＡ中に存在する。断片化されたＲＮＡの場合でさえ、標的ＲＮＡ断片が、少なくとも１つの標的領域を含み、したがって、効率的に捕捉され、したがって、初期ＲＮＡ組成物から除去されることができる見込みが増加するので、異なる標的領域の間の距離が小さいほど、標的ＲＮＡ除去は、効率的となる。さらに、より多くのプローブ分子の使用は、抗ハイブリッド結合剤のための、より多くの結合部位をもたらし、したがって、断片化の場合でも、標的ＲＮＡを効率的に捕捉する機会を増加させる。そのため、プローブ分子の複数のグループを含むプローブセットを使用することが好ましく、プローブセットにおいて含まれるそれぞれのグループのプローブ分子は、同じ標的ＲＮＡ内の異なる標的領域を標的にし、異なる標的領域は、標的ＲＮＡの全長にわたって分布する。したがって、一実施形態によれば、プローブセットが、特異的な標的ＲＮＡの枯渇のために使用され、プローブセットが、２つ以上のグループのプローブ分子を含み、それぞれのグループのプローブ分子が、標的ＲＮＡにおける異なる標的領域を標的にし、標的領域が、前記標的ＲＮＡの全長にわたって分布する。均等な分布が好ましい。上記に記載されるように、連続したプローブ分子設計は、これにより性能が改善されるので、好ましい。プローブセットにおいて、好ましくは、特異的な標的ＲＮＡを標的にするために使用されるプローブ分子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、より好ましくはすべてのグループが、２つ以上の連続したプローブ分子を含む。好ましくは、プローブ分子のそれぞれのグループ内のすべてのプローブ分子が、グループメンバーに対して連続している。しかしながら、プローブセットの個々のグループにおいて含まれるすべてのグループのプローブ分子についておよび／またはすべてのプローブ分子について、連続したプローブ分子を設計することは可能でなくてもよい。しかしながら、そのうえ、前記プローブセットにおいて連続したプローブ分子を優勢に使用することは好ましい。一実施形態によれば、プローブセットにおいて含まれるすべてのプローブ分子のうち、少なくとも５０％、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、または少なくとも９８％が、それらのグループメンバーに対して連続している。
【００３５】
本明細書において記載されるように、１つ以上のグループのプローブ分子は、標的ＲＮＡを標的にし、したがって、ＲＮＡ含有組成物から標的ＲＮＡを除去するために使用される。しかしながら、上記に記載した１つ以上のグループのプローブ分子に加えて、単一のプローブ分子を使用することもまた、本発明の範囲内にある。これらの単一のプローブ分子は、したがって、グループの構成をとらない。たとえば、標的ＲＮＡの配列が、たとえば上記に記載されるように均等な分布を達成するために、標的にすることをしかしながら目的とする特異的な標的領域に対する、複数の隣接した短いプローブ分子、したがって、あるグループのプローブ分子を特異的に設計することを可能にしない場合、これは、あり得るかもしれない。そのようなさらなる単一のプローブ分子が加えて使用される場合、それらが、１００ｎｔ未満、好ましくは５０ｎｔ未満の長さを有することが好ましい。最も好ましくは、それらは、１つ以上のグループのプローブ分子において含まれるプローブ分子とほぼ同じ長さ（＋／−５ｎｔ、好ましくはまさにその同じ長さ）を有する。
【００３６】
実施例によって示されるように、本発明による方法は、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の標的ＲＮＡ枯渇効率を達成する。少なくとも９９．５％およびさらに９９．９％の効率を、本明細書において記載される戦略およびプローブの設計を使用することによって達成することができる。実施例によって示されるように、この素晴らしい枯渇効率は、断片化されたＲＮＡでなお達成される。
【００３７】
プローブ分子は、ポリヌクレオチドプローブである。適したプローブサイズは、上記に記載した。さらに、使用される抗ハイブリッド結合剤によって特異的に認識される配列特異的な二本鎖ハイブリッドが形成される限り、ＲＮＡおよびＤＮＡのヌクレオチドを含むまたは修飾ヌクレオチドおよび／もしくはヌクレオチドのアナログを含むプローブ分子を使用することができる。好ましくは、プローブ分子は、ＤＮＡポリヌクレオチドであり、したがって、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが形成される。好ましくは、使用されるプローブ分子は、化学的に合成されたＤＮＡ分子である。プローブ分子は、任意選択で、修飾されてもよい。たとえば、一本鎖ＤＮＡプローブ分子は、プローブ分子が配列決定ライブラリーに持ち越されず、したがって、配列決定反応において存在しないことを確実にするために、修飾することができる。たとえば、プローブ分子は、ライブラリー構築の間にアダプターライゲーションを予防するために、修飾され得る、たとえばブロックされ得るまたは非結合プローブ分子を分解するもしくは溶液から分離するのを可能にする、ビオチンタグなどのようなタグを組み込むことができる。それぞれの修飾の例は、Ｏ−メチル基またはジデオキシヌクレオチドの存在を含むが、これらに限定されない。一実施形態によれば、しかしながら、プローブ分子が、たとえばビオチンなどのようなアフィニティータグにより修飾されない。ハイブリッド／結合剤複合体が分離された後に、過剰な非結合プローブを除去するために、たとえばＤＮアーゼを使用する酵素的消化が使用されてもよい。
【００３８】
ハイブリダイゼーションについては、プローブ分子は、プローブ分子当たり５０ｎＭ〜１０μＭ、好ましくは５０ｎＭ〜５００ｎＭから選択される濃度で使用されてもよい。適した濃度はまた、当業者によって決定することもできる。実施例において示されるように、プローブ分子当たり１００ｎＭの濃度は、少なくとも２０ｎｔの長さを有するプローブ分子について十分に機能する。より小さなプローブについては、より高い濃度が好ましい。
【００３９】
プローブ分子および標的ＲＮＡの間の二本鎖ハイブリッドの特異的な形成を支持するために、ハイブリダイゼーション溶液が、好ましくは、ステップａ）において追加される。好ましくは、ハイブリダイゼーションバッファーが、使用される。適したハイブリダイゼーションバッファーは、先行技術においてよく知られており、したがって、いかなる具体的な記載をもここで必要としない。本質的に任意の緩衝化されたわずかに酸性〜わずかにアルカリ性の溶液（たとえば６〜９のｐＨ値を有する）を使用することができる、ただし、塩濃度が特異的なハイブリダイゼーションに適していることを条件とする。たとえば、２×ＳＣＣを最終ハイブリダイゼーション溶液として使用することができる。
【００４０】
さらに、それらの標的ＲＮＡに対するプローブ分子の効率的なハイブリダイゼーションを確実にするために、初期ＲＮＡ含有組成物を変性させることが好ましい。そのような変性ステップは、たとえば、ＲＮＡにおける二次構造を除去し、それによって、プローブ分子が、続いて、それらの標的領域に対してハイブリダイズすることができることを確実にする。変性は、プローブ分子および／またはハイブリダイゼーション溶液が初期ＲＮＡ組成物に対して追加される前にまたはその後に、行われてもよい。一実施形態によれば、ＲＮＡ含有組成物、ハイブリダイゼーション溶液、およびプローブ分子を含む混合物を、たとえば少なくとも３分間、好ましくは少なくとも５分間、少なくとも６５℃、好ましくは少なくとも７０℃の温度で、変性のために加熱することができる。記載される変性温度での、好ましくは７５℃以下でのまたは最も好ましくはおよそ７０℃での１０分間以下、７分間以下、好ましくはおよそ５分間の短いインキュベーション時間は、ＲＮＡを変性させるのに既に十分である。したがって、より長いインキュベーション時間は、必要でないが、所望の場合、もちろん使用されてもよい。さらに、抗ハイブリッド結合剤もまたＲＮＡ変性ステップの間に存在してもよく、上記に記載される変性条件、特に７５℃以下、最も好ましくはおよそ７０℃の温度および７分間以下、好ましくはおよそ５分間の短いインキュベーション時間を使用する場合、機能的なままであることが分かった。ＲＮＡ変性およびハイブリダイゼーションの間に適宜、存在する抗ハイブリッド結合剤を直接含むことは、それが取扱いステップを省くので、特に好都合である。この実施形態において、ステップａ）およびｂ）が、同時に実行される。ＲＮＡの分解が最小限にされるような変性条件が、選ばれるものとする。さらに、ＲＮアーゼ阻害剤は、ＲＮアーゼによる、含まれるＲＮＡの分解を最小限にするためにハイブリダイゼーションの間に存在してもよい。ＲＮアーゼ阻害剤は、たとえば、ハイブリダイゼーションバッファーの中に組み込まれてもよい。
【００４１】
ステップａ）において、配列特異的な二本鎖ハイブリッドが、標的ＲＮＡおよびプローブ分子の間で生成される。したがって、１つの二本鎖ハイブリッドが、使用されるグループのプローブ分子ごとに形成される。上記に記載されるように、前記二本鎖ハイブリッドは、隣接したプローブ分子の間に小さなギャップを含んでいてもよい。しかしながら、適宜、ヌクレオチドギャップがハイブリダイズしたプローブ分子の間に存在しない連続したプローブ設計は、上記の理由で好ましい。対応して設計されたグループのプローブ分子、したがってプローブセットを使用して、標的ＲＮＡ内のいくつかの標的領域が標的にされる場合、より長い標的ＲＮＡが、いくつかのそれぞれの二本鎖ハイブリッドによって枯渇のためにマークされてもよい、ハイブリダイゼーションは、プローブ分子の１つ以上のグループのプローブ分子が、対応する相補的なＲＮＡに対してアニールして、二本鎖ハイブリッドを形成することを可能にする条件下で行われる。使用される特定のプローブ分子およびハイブリダイゼーションバッファーに適したハイブリダイゼーション条件が、用いられる。たとえば、プローブ分子およびＲＮＡ含有組成物は、適したハイブリダイゼーション時間、好ましくは、少なくとも約５〜約１２０分間、約１０〜約１００分間、約１５〜約８０分間、約２０分間〜約６０分間、約２５分間〜約４０分間および列挙される範囲内の任意の数、したがって、プローブ分子がそれらの標的ＲＮＡに対してアニールするのを可能にするのに十分な時間、インキュベートすることができる。ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約４０℃、好ましくは少なくとも約４５℃、より好ましくは少なくとも約５０℃のハイブリダイゼーション温度を含むことができる。適したハイブリダイゼーション温度はまた、使用されるプローブ分子の長さおよび使用されるハイブリダイゼーション溶液に依存する。適したハイブリダイゼーション溶液は上記に記載した、また、当業者が決定できる。適したハイブリダイゼーション温度−２０〜３５ｎｔの範囲にある長さを有するプローブ分子に特に適している−は、４５℃〜６５℃、好ましくは５０℃〜約６０℃、および列挙される範囲内の任意の数を含むが、これらに限定されない範囲から選択されてもよい。所定の標的ＲＮＡおよび所定のプローブ分子について、当業者は、慣用的な実験によって、所望のハイブリダイゼーション条件およびハイブリダイゼーション時間を容易に決定することができる。当業者は、さらに、ハイブリダイゼーションの時間および温度を、互いに最適化することができることを理解するであろう。限定されることなく、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、洗剤もしくは有機溶媒（たとえばＤＭＳＯ、ホルムアミドなど）を追加することによって、温度を減少させるもしくは増加させるまたは塩濃度／イオン強度を減少させるもしくは増加させることによってコントロールされてもよい。
【００４２】
ステップｂ）
ステップｂ）において、生成された二本鎖核酸ハイブリッドは、形成された二本鎖核酸ハイブリッドに対して結合し、多くの形成されたハイブリッドにそれぞれ結合する分子によって捕捉される。そのような分子は、本明細書において抗ハイブリッド結合剤と呼ばれる。それによって、ハイブリッド／結合剤複合体が形成され、そのような複合体は、少なくとも１つの抗ハイブリッド結合剤が結合する、少なくとも１つの二本鎖ハイブリッドを含んでいてもよい。本明細書において記載されるように、２つ以上の抗ハイブリッド結合剤分子もまた、１つの二本鎖ハイブリッドに対して結合してもよい。ステップａ）およびｂ）は、同時に実行されてもよい（実施例もまた参照されたい）または別々に実行されてもよい。
【００４３】
二本鎖核酸ハイブリッドに対して特異的な結合剤は、抗体、抗体断片、およびＲＮアーゼＨなどのようなタンパク質を含むが、これらに限定されない。一態様において、形成された二本鎖ハイブリッドに結合する抗体が、抗ハイブリッド結合剤として使用され、それぞれの抗体はまた、抗ハイブリッド抗体としても知られている。抗ハイブリッド抗体の使用は、より高い特異性のために、たとえばＲＮアーゼＨを使用することにまさって好ましい。抗ハイブリッド抗体は、ミスマッチを含むハイブリッドに対して十分に結合せず、さらに、抗ハイブリッド抗体による捕捉は、上記に説明されるように単一のプローブ分子から形成されるハイブリッドの場合に、効率的ではない。ＲＮアーゼＨは、ミスマッチしたハイブリッド中に含有されるＲＮＡを消化してもよい。そのため、抗ハイブリッド抗体と組み合わせた、特に上記に記載されるように連続したプローブ設計を使用する場合の、３５ｎｔ以下の長さを有するプローブ分子の組み合わせは、高い枯渇効率を達成しながらの、特異性の増加に関して特に有利であり、そのため、本発明との関連において好ましい。したがって、本発明に従って形成された二本鎖ハイブリッドは、二本鎖ハイブリッドに対して特異的な抗体または抗体断片を使用して捕捉することができる。続いて、本発明者らは、抗ハイブリッド抗体に言及することによって、適した好ましい実施形態について記載する。しかしながら、前記説明は、Ｆａｂ断片などのような抗ハイブリッド抗体断片または形成されたハイブリッドに特異的に結合することができる他の適した抗ハイブリッド結合剤に等しく適用される。
【００４４】
抗ハイブリッド抗体は、二本鎖ハイブリッド、好ましくはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに対して特異的である。ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに対する高い特異性は、二本鎖ＲＮＡに結合しないことを確実にするのに有益である。ポリクローナルまたはモノクローナル抗ハイブリッド抗体を使用することができることが当業者らによって理解されるであろう。一態様において、捕捉ステップの間に高ストリンジェンシーのインキュベーション温度を支持するモノクローナル抗体が、使用される。
【００４５】
本発明の一態様において、ハイブリドーマ細胞株に由来するモノクローナル抗ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド抗体が、使用される。そのようなハイブリドーマ細胞株は、米国特許第４，８６５，９８０号明細書、米国特許第４，７３２，８４７号明細書、および米国特許第４，７４３，５３５号明細書において記載される。ハイブリッド特異的モノクローナル抗体はまた、当技術分野において標準的な技術を使用して調製されてもよい。ハイブリッド特異的モノクローナル抗体は、標的核酸の捕捉および検出の両方のために使用されてもよい。形成されるハイブリッドに特異的に結合するのに適した他の結合剤もまた、ハイブリッドを捕捉するための結合剤として使用することができる。
【００４６】
形成されたハイブリッドは、抗ハイブリッド結合剤による二本鎖ハイブリッドへの結合、したがって捕捉を可能にするのに十分な時間、抗ハイブリッド結合剤と共にインキュベートされる。それによって、二本鎖ハイブリッド／結合剤複合体が、形成される。抗ハイブリッド結合剤は、溶液中に遊離して存在してもよいまたは固体支持体上に固定されてもよい。一態様において、支持体上に固定された、抗ハイブリッド抗体などのような抗ハイブリッド結合剤が、使用される。固定は、当技術分野における標準的な技術を使用して達成されてもよい。支持体は、１つ以上のウェルが抗ハイブリッド結合剤により官能性をもたせられる、好ましくは抗ハイブリッド抗体により官能性をもたせられるマイクロタイタープレートを含む反応容器、粒子、磁性粒子、カラム、プレート、膜、ろ紙、およびディップスティックまたは分離技術において使用することができる任意の他の固体支持体を含むが、これらに限定されない。任意の支持体を、それが液相の分離を可能にする限り、使用することができる。直径が約０．１μｍ〜２０μｍ、０．２５μｍ〜１５μｍ、０．５μｍ〜１０μｍ、および０．７５μｍ〜５μｍの粒子などのような、小さくて、大きな表面積を有する粒子が、好ましい。たとえば超常磁性、常磁性、強磁性、または強磁性の特性を有する、抗ハイブリッド結合剤のための固体支持体として磁性粒子を使用する場合、結合したハイブリッド／結合剤複合体を有するそれぞれの磁性粒子は、磁場の助けによって、たとえば永久磁石を使用することによって、容易に分離することができる。粒子はまた、ろ過によって分離することもできる。
【００４７】
抗ハイブリッド抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよい。一態様において、抗体が、モノクローナルである。一態様において、抗体が、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）リンカーによって支持体にカップリングされる。一態様において、支持体が、ポリスチレンビーズなどのようなポリマー粒子によってもたらされる。一態様において、好ましくは抗体である結合剤にカップリングされた粒子が、粒子希釈バッファーにおいて希釈される。粒子希釈バッファーは、ビーズ上でのタンパク質の変性を最小限にするのに役立つ。適した粒子希釈バッファーは、先行技術において知られている。
【００４８】
上記に記載され、実施例において示されるように、抗ハイブリッド結合剤はまた、溶液において遊離していてもよい。形成されたハイブリッド／結合剤複合体は、次いで、ステップｃ）に関連して記載されるように、複合体の分離を単純化するために、第２の結合剤によって捕捉されてもよい。第２の結合剤は、分離技術において使用するのに適した固体支持体に対して固定され、また、ステップａ）および／またはステップｂ）の間に存在してもよい。本質的に、実施形態に関連して上記に記載された固体支持体を含む任意の固体支持体を、使用することができ、抗ハイブリッド結合剤は、固体支持体上に直接固定される。さらに、ハイブリッド／結合剤複合体、たとえば、複合体において含まれる抗ハイブリッド結合剤に、枯渇のために複合体を本質的にマークするために、溶液において遊離しているさらなる結合剤が結合し、次いで、さらなる結合剤に結合し、それによって、また、ハイブリッド／結合剤複合体に間接的に結合し、それぞれ、ハイブリッド／結合剤複合体を捕捉する第２の結合剤を使用することもまた、本発明の範囲内にある。
【００４９】
一態様において、インキュベーションステップが、抗ハイブリッド抗体が形成された二本鎖ハイブリッドに対して結合するのを可能にするように実行される。インキュベーションは、室温または高温で実行されてもよい。形成されたハイブリッドの結合、したがって捕捉が、標的ＲＮＡに対するプローブ分子のハイブリダイゼーションと同時に行われる場合、上記に記載されるように、高温が使用される。インキュベーション時間は、約５〜約１２０分間、約１０〜約１００分間、１５〜約８０分間、２０〜約６０分間、または約２５〜約５０分間および捕捉を可能にするのに十分な、列挙される範囲内の任意の数の範囲にわたることができる。さらに、上記に記載されるように、ハイブリダイゼーションおよび捕捉はまた、同時に実行されてもよく、これは、調製時間を低下させる。組成物は、撹拌することができ、好ましくは撹拌し、たとえば、前記インキュベーションの間に振盪させる。インキュベーション時間、温度、および／または振盪条件は、所望されるように、代替の捕捉動態を達成するために、変動させることができることが、当業者らによって理解されるであろう。
【００５０】
一実施形態によれば、方法は、好ましくは、精製全ＲＮＡを、少なくとも７０℃で、少なくとも３分間、好ましくは少なくとも５分間であるが、好ましくは１０分間未満、適したハイブリダイゼーション溶液、たとえば２×ＳＳＣバッファーにおいて、プローブ分子の存在下において、好ましくは、さらに、抗ハイブリッド結合剤の存在下において、変性させるステップを含む。結果として生じる混合物は、好ましくは混合物を撹拌しながら、３０分間、５０℃でインキュベートされる。この実施形態において、ハイブリダイゼーションおよび捕捉（ステップａ）およびｂ））が、同時に行われ、これは、処理時間を考慮すると、有利である。抗ハイブリッド結合剤が、固体支持体上に固定されない場合、変性させたハイブリダイゼーション混合物を、抗ハイブリッド結合剤に結合し、したがって捕捉することができ、したがって、形成されたハイブリッド／結合剤複合体を捕捉することができる、固定された第２の結合剤を含む固相と接触させ、結果として生じる混合物は、上記に記載されるように、インキュベートされる。固定されたハイブリッド／結合剤複合体が結合する固体支持体は、残りのサンプルから分離することができる。たとえば、磁性粒子などのような粒子が、固体支持体として使用される場合、粒子、したがって、結合した複合体は、ステップｃ）において、磁石を使用することによってまたはろ過によって、容易に除去し、それによって、望まれない標的ＲＮＡが枯渇されたＲＮＡ組成物を提供することができる。固体支持体としてカラムを使用する場合、複合体は、カラム中に保持され、一方望まれない標的ＲＮＡが枯渇された組成物は、フロースルーとして収集することができる。
【００５１】
ステップｃ）
二本鎖ハイブリッドの結合、したがって捕捉後に、捕捉されたハイブリッドは、組成物の残りから分離され、それによって、標的ＲＮＡ枯渇化組成物を提供する。それぞれ、形成されたハイブリッド／結合剤複合体の抗ハイブリッド結合剤が固体支持体上に固定される場合、分離は、特に容易である。適した固体支持体は、上記に記載され、また、当業者に入手可能でもあり、そのうえ、残りのサンプルから固体支持体を分離するのを可能にする、適した分離手順となる。上記に記載されるように、抗ハイブリッド抗体は、たとえば、固相にカップリングされてもよく、次いで、標的ＲＮＡ枯渇化組成物を提供するために、固体支持体に対して結合したハイブリッド／結合剤複合体を、残りのサンプルから分離してもよい。たとえば、抗ハイブリッド抗体は、磁性粒子にカップリングされてもよく、これは、磁石を使用することによって、ろ過によって、分離することができる。この実施形態は、それが確立された手動またはロボットシステムと適合性であるので、好ましい。磁場を使用することによって磁性粒子を処理するために、ハイブリッド／結合剤複合体が結合する磁性粒子を処理するために本発明に関連して使用することができる様々なシステムが、先行技術において存在する。一実施形態によれば、磁性粒子が、反応容器の底または側面に収集され、残りの液体サンプルが、反応容器から除去され、ハイブリッド／結合剤複合体が結合した、収集された磁性粒子を残す。標的ＲＮＡ枯渇化組成物に相当する残りのサンプルの取り出しは、たとえばデカンテーションまたは吸引によって行うことができる。そのようなシステムは、先行技術においてよく知られており、したがって、ここで詳細な説明を必要としない。磁性粒子の処理で知られている代替のシステムにおいて、カバーまたは外被によって通常カバーされる磁石は、磁性粒子を収集するために反応容器の中に沈められている（ｐｌｕｎｇｅ）。次いで、結合したハイブリッド／結合剤複合体を持つ磁性粒子は、除去し、標的ＲＮＡ枯渇化組成物を残すことができる。それぞれのシステムが先行技術においてよく知られており、また市販で入手可能でもあるので（たとえばＱＩＡＳＹＭＰＨＯＮＹ（登録商標）；ＱＩＡＧＥＮ）、それらはここでいかなる詳細な説明をも必要としない。磁性粒子の処理で知られているさらに代替のシステムにおいて、磁性粒子を含むサンプルは、ピペットチップの中に吸引することができ、磁性粒子は、たとえばピペットチップの側面に磁石を適用することによって、ピペットチップ中に収集することができる。次いで、標的ＲＮＡ枯渇化組成物に相当する残りのサンプルは、ピペットチップから放出させることができるが、結合したハイブリッド／結合剤複合体を持つ、収集された磁性粒子は、磁石により、ピペットチップ中に残る。そのようなシステムもまた、先行技術においてよく知られており、また、市販で入手可能であり（たとえばＢｉｏＲｏｂｏｔ  ＥＺ１、ＱＩＡＧＥＮ）、したがって、ここでいかなる詳細な説明をも必要としない。しかしながら、磁性粒子はまた、任意の他の粒子のように、ろ過などのような他の手段によって分離されてもよい。ろ過はまた、自動化されたシステム（たとえばＱＩＡｃｕｂｅ、���ＩＡＧＥＮ）を使用して実行することもできる。
【００５２】
抗ハイブリッド結合剤が固体支持体に対して固定されない場合に適している他の実施形態によれば、ハイブリッド／結合剤複合体に対して結合する第２の結合剤により官能性をもたせた固体支持体が、使用される。詳細および適した固体支持体は、上記に記載される。たとえば、第２の結合剤は、抗ハイブリッド結合剤に結合し、それによって、残りの組成物からハイブリッド／結合剤複合体を分離することを可能にしてもよい。たとえば、第２の結合剤は、プロテインＧまたはプロテインＡであってもよく、これらは、抗ハイブリッド抗体が抗ハイブリッド結合剤として使用される場合、適している。固体支持体に対して固定された前記第２の結合剤はまた、ステップａ）および／またはｂ）の間に既に存在してもよく、これは、処理時間を考慮すると、有利である。分離を達成するための他の構成もまた、可能であり、当業者の通常の技術の範囲内に十分にある。
【００５３】
残りの組成物からハイブリッド／結合剤複合体を分離することによって、望まれない標的ＲＮＡは、残るＲＮＡ組成物から効率的に除去される。それによって、たとえば増幅に基づく方法、マイクロアレイ分析、発現分析のための、および／またはＮＧＳの適用のためのさらなる使用のために準備ができた標的ＲＮＡ枯渇化組成物が、得られる。たとえば、標的ＲＮＡが枯渇されたＲＮＡ組成物は、配列決定ライブラリーの構築のために使用することができる。
【００５４】
標的ＲＮＡ
標的ＲＮＡは、初期ＲＮＡ組成物中に存在する任意の望まれないＲＮＡであってもよい。標的ＲＮＡは、プローブ分子の配列特異的な設計を可能にするために、任意の配列を、それが関心のある残るＲＮＡ集団からその配列によって識別が可能な限り、含んでいてもよい。標的ＲＮＡは、配列、機能、またはその組み合わせによってを含む、任意の基準で選ばれてもよい。本明細書において示されるように、複数の標的ＲＮＡは、本発明の方法を使用して、初期ＲＮＡ含有組成物から同時に枯渇させることができる。
【００５５】
一実施形態によれば、枯渇されることになっている標的ＲＮＡが、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、および大量のタンパク質ｍＲＮＡから選択される。好ましくは、１つ以上のタイプのｒＲＮＡは、標的ＲＮＡ、それぞれ標的ＲＮＡとして枯渇される。
【００５６】
真核生物のサンプルを処理する場合、枯渇されることになっているｒＲＮＡは、好ましくは、真核生物ｒＲＮＡであり、２８Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、５Ｓ  ｒＲＮＡ、ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡ、およびミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡから好ましくは選択される。好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つの前述のｒＲＮＡタイプが、枯渇され、好ましくは、標的ｒＲＮＡの中で、１８Ｓ  ｒＲＮＡおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡが、枯渇される。一実施形態によれば、前述のｒＲＮＡタイプがすべて、標的にされ、したがって枯渇される。前記標的ｒＲＮＡは、それぞれの標的ｒＲＮＡタイプに対して特異的な、１つのグループのプローブ分子またはプローブセットを使用することによって枯渇されてもよい。上記に記載されるように、たとえば１８Ｓ  ｒＲＮＡおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡなどのようなより長い標的ＲＮＡについて、前記標的ＲＮＡを標的にし、したがって枯渇させるために２つ以上のグループのプローブ分子を適宜含むプローブセットを使用することが好ましい。好ましくは、特異的なｒＲＮＡを枯渇させるために使用されるグループのプローブ分子またはプローブセットは、様々な真核生物のサンプルから、好ましくは、少なくともヒト、マウス、およびラットサンプル、好ましくは、さらに他の哺乳動物サンプルから、対応するｒＲＮＡを枯渇させるのに適している。ｒＲＮＡがこれらの種の間で高度に保存されているので、種起源に関係なく対応する標的ｒＲＮＡを特異的に枯渇させることを可能にする１つのグループのプローブ分子またはプローブセットの２つ以上のグループのプローブ分子についてプローブ分子を設計することが可能である。
【００５７】
さらに、２８Ｓ  ｒＲＮＡおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡに加えて、１２Ｓおよび１６Ｓ真核生物ミトコンドリアｒＲＮＡ分子などのような他の非コードｒＲＮＡ種を標的にし、したがって枯渇させることもまた、好ましい。したがって、一実施形態によれば、１２Ｓおよび１６Ｓ真核生物ミトコンドリアｒＲＮＡ分子を標的にし、したがって枯渇させる、１つ以上のグループのプローブ分子またはプローブセットが、使用される。さらに、色素体ｒＲＮＡ、たとえば葉緑体ｒＲＮＡは、たとえば、植物サンプル由来の全ＲＮＡを処理する場合に、標的ＲＮＡとして枯渇されてもよい。
【００５８】
一実施形態によれば、２３Ｓ、１６Ｓ、および５Ｓ原核生物ｒＲＮＡから選択される標的ＲＮＡが、枯渇される。これは、原核生物サンプルを処理する場合、特に適している。好ましくは、すべてのこれらのｒＲＮＡタイプは、それぞれのｒＲＮＡタイプに対して特異的な、１つ以上のグループのプローブ分子またはプローブセットを使用して枯渇される。
【００５９】
さらに、上記に記載されるように、本発明による方法はまた、大量のタンパク質コードｍＲＮＡ種を特異的に枯渇させるために使用されてもよい。処理されたサンプルに依存して、サンプルにおいて含まれるｍＲＮＡは、ある大量のｍＲＮＡタイプに優勢に相当してもよい。たとえば、たとえば血液サンプルのトランスクリプトームの配列を分析することが意図される場合、サンプルにおいて含まれるほとんどのｍＲＮＡは、グロビンｍＲＮＡに相当するであろう。しかしながら、多くの適用について、含まれるグロビンｍＲＮＡの配列は、関心のあるものではなく、グロビンｍＲＮＡもまた、たとえタンパク質コードｍＲＮＡであっても、この適用について望まれない標的ＲＮＡを代表する。そのような望まれない大量のｍＲＮＡ配列を除去するために、グループのプローブ分子または枯渇されることになっている大量のｍＲＮＡの長さに依存して、標的ＲＮＡとしてそれぞれの大量のｍＲＮＡを特異的に標的にするプローブセットを使用することが好ましい。それによって、たとえばグロビンｍＲＮＡ、たとえば、血液サンプルの場合にはアルブミンｍＲＮＡなどのようなそれぞれの大量のｍＲＮＡを、サンプルから容易に枯渇させることができ、したがって、続く配列決定反応の負担にならない。ここで、大量のタンパク質ｍＲＮＡ配列、特異的なサンプルタイプ、たとえば、血液サンプルの場合にはアルブミンｍＲＮＡの除去のために設計されるグループのプローブ分子または特異的なプローブセットを使用者に提供することもまた、本発明の範囲内にある。そのようなグループのプローブ分子またはプローブセットは、初期ＲＮＡ含有組成物から様々なタイプのｒＲＮＡを枯渇させるために、上記に記載されるグループのプローブ分子および／またはプローブセットに加えて使用することができる。
【００６０】
上記に記載されるように、２つ以上の異なるタイプの標的ＲＮＡを初期ＲＮＡ含有組成物から枯渇させることを想定する場合、枯渇されることになっているそれぞれの個々の標的ＲＮＡについて、１つのグループのプローブ分子または特に、より長い標的ＲＮＡの場合には、１つのプローブセットを使用することが好ましい。したがって、一実施形態によれば、複数のグループのプローブ分子および／またはプローブセットが使用され、これらのそれぞれが、初期ＲＮＡ含有サンプルから様々なタイプの標的ＲＮＡを除去することを目指す。上記に記載されるように、プローブセットは、２つ以上のグループのプローブ分子を含み、それぞれのグループにおいて含まれるプローブ分子は、特異的な標的ＲＮＡ内の特異的な標的領域を標的にし、したがってハイブリダイズする。好ましくは、複数のグループのプローブ分子および／またはプローブセットは、初期ＲＮＡ含有組成物から、２８Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、５Ｓ  ｒＲＮＡ、ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡ、およびミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡのうちの３種以上、好ましくは４種以上、最も好ましくはすべてを枯渇させるために使用される。さらに、所望の場合、単一のプローブ分子が、使用されてもよく、たとえば、枯渇されることになっている特異的な標的ｒＲＮＡに対するプローブセットの中に組み込むことができる。
【００６１】
本発明による方法において使用することができ、かつ２８Ｓ  ｒＲＮＡおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡを枯渇させるのに適しているプローブセットならびに５．８Ｓ  ｒＲＮＡおよび５Ｓ  ｒＲＮＡを枯渇させるのに適したグループのプローブ分子もまた、実施例において記載され、特に表１を参照されたい。
【００６２】
少なくとも２８Ｓ  ｒＲＮＡが標的ＲＮＡとして枯渇される一実施形態によれば、２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットが使用され、２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも４つ、少なくとも６つ、少なくとも８つ、少なくとも１０、最も好ましくはすべてのグループが、２つ以上の連続したプローブ分子を含む。この実施形態において、それぞれの連続したグループ内に含まれる少なくとも２つのプローブ分子が、連続している。さらに、少なくとも３つのグループの２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて、好ましくは、少なくとも６つのグループにおいて、すべての含まれるプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続していることが好ましい。一実施形態によれば、２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットのグループにおいて含まれるすべてのプローブ分子の少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が、それらのグループメンバーに対して連続している。２８Ｓ  ｒＲＮＡセットにおいて含まれるプローブ分子が、５０ｎｔ以下、好ましくは３５ｎｔ以下、より好ましくは３０ｎｔ以下の長さを有することが好ましく、最も好ましくは、２０ｎｔ〜２５ｎｔの範囲内にある。好ましくは、２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットは、２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットについて表１において示されるプローブ分子のグループの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも４つ、少なくとも６つ、より好ましくは少なくとも８つ、少なくとも１０、最も好ましくはすべてを含む。
【００６３】
少なくとも１８Ｓ  ｒＲＮＡが標的ＲＮＡとして枯渇される一実施形態によれば、１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットが使用され、１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、少なくとも４つ、最も好ましくはすべてのグループが、２つ以上の連続したプローブ分子を含む。この実施形態において、それぞれの連続したグループ内に含まれる少なくとも２つのプローブ分子が、連続している。さらに、少なくとも２つのグループの１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて、好ましくは、少なくとも３つのグループにおいて、すべての含まれるプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続していることが好ましい。好ましくは、１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットのグループにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が、それらのグループメンバーに対して連続している。１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子が、５０ｎｔ以下、好ましくは３５ｎｔ以下、より好ましくは３０ｎｔ以下の長さを有することが好ましく、最も好ましくは、２０ｎｔ〜２５ｎｔの範囲内にある。好ましくは、１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットは、１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットについて表１において示されるプローブ分子のグループの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、少なくとも４つ、最も好ましくはすべてを含む。
【００６４】
少なくとも５．８Ｓ  ｒＲＮＡが標的ＲＮＡとして枯渇される一実施形態によれば、少なくとも１つのグループのプローブ分子が使用される。好ましくは、プローブ分子の前記グループは、２つ以上の連続したプローブ分子を含み、好ましくは、５．８Ｓ  ｒＲＮＡグループにおいて含まれるプローブ分子はすべて、連続している。５．８Ｓ  ｒＲＮＡグループにおいて含まれるプローブ分子が、５０ｎｔ以下、好ましくは３５ｎｔ以下、より好ましくは３０ｎｔ以下の長さを有することが好ましく、最も好ましくは、２０ｎｔ〜２５ｎｔの範囲内にある。５．８Ｓを標的にし、したがって枯渇させるのに特に適したプローブ分子の５．８Ｓ  ｒＲＮＡグループは、表１において示される。
【００６５】
少なくとも５Ｓ  ｒＲＮＡが標的ＲＮＡとして枯渇される一実施形態によれば、少なくとも１つのグループのプローブ分子が使用される。好ましくは、プローブ分子の前記グループは、２つ以上の連続したプローブ分子を含み、好ましくは、５Ｓ  ＲＮＡグループにおいて含まれるプローブ分子はすべて、連続している。５．８Ｓ  ｒＲＮＡグループにおいて含まれるプローブ分子が、５０ｎｔ以下、好ましくは３５ｎｔ以下、より好ましくは３０ｎｔ以下の長さを有することが好ましく、最も好ましくは、２０ｎｔ〜２５ｎｔの範囲内にある。好ましくは５Ｓ  ｒＲＮＡを枯渇させるために、１つ以上の、好ましくすべての、５Ｓについて表１において示されるプローブ分子を含むプローブ分子のグループが、使用される。
【００６６】
少なくとも真核生物ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡが標的ＲＮＡとして枯渇される一実施形態によれば、１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子が、５０ｎｔ以下、好ましくは３５ｎｔ以下、より好ましくは３０ｎｔ以下の長さを有するプローブセットが使用される。好ましくは、１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくはすべてのグループが、２つ以上の連続したプローブ分子を含む。一実施形態によれば、１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が、それらのグループメンバーに対して連続している。この実施形態において、それぞれの連続したグループ内に含まれる少なくとも２つのプローブ分子が、連続している。さらに、１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットの少なくとも２つのグループにおいて、すべての含まれるプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続していることが好ましい。
【００６７】
少なくとも真核生物ミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡが標的ＲＮＡとして枯渇される一実施形態によれば、１６ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子が、５０ｎｔ以下、好ましくは３５ｎｔ以下、より好ましくは３０ｎｔ以下の長さを有するプローブセットが使用される。好ましくは、１６ＳミトコンドリアのｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくはすべてのグループが、２つ以上の連続したプローブ分子を含む。一実施形態によれば、１６ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が、それらのグループメンバーに対して連続している。
【００６８】
好ましい実施形態によれば、上記に記載される２８ｓ  ｒＲＮＡプローブセットおよび１８ｓ  ｒＲＮＡプローブセットが、標的ＲＮＡとして２８ｓ  ｒＲＮＡおよび１８ｓ  ｒＲＮＡが枯渇された標的ＲＮＡ枯渇化組成物を提供するために、本発明による方法において使用される。好ましくは、上記に記載される５．８ｓ  ｒＲＮＡグループ、上記に記載される５ｓ  ｒＲＮＡグループ、上記に記載される１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセット、および上記に記載される１６ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットもまた、標的ＲＮＡとして５．８ｓ  ｒＲＮＡ、５ｓ  ｒＲＮＡ、ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡ、およびミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡをさらに枯渇させるために使用される。それによって、たとえば次世代配列決定の適用における続く分析を妨害し得る最も一般的なｒＲＮＡ種が枯渇された標的ＲＮＡ枯渇化組成物が得られる。
【００６９】
核酸は、全ＲＮＡなどのような初期ＲＮＡ含有組成物を提供するために、先行技術において知られている方法に従って、関心のあるサンプルから単離することができる。したがって、全ＲＮＡは、初期ＲＮＡ含有組成物を提供するために、サンプルから単離されてもよい。用語「サンプル」は、広い意味において本明細書において使用され、ＲＮＡを含有する様々な供給源および組成物を含むことが意図される。サンプルは、生物学的サンプルであってもよい。例示的なサンプルは、細胞サンプル、環境上のサンプル、身体から得られるサンプル、特に体液サンプル、およびヒト、動物、または植物組織サンプルを含むが、これらに限定されない。特定の例は、全血、血液製剤（ｂｌｏｏｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）、血漿、血清、赤血球、白血球、バフィーコート、尿、痰、唾液、精液、リンパ液、羊水、脳脊髄液、腹水、胸水、嚢胞由来の流体、滑液、硝子体液、眼房水、滑液包液（ｂｕｒｓａ  ｆｌｕｉｄ）、洗眼水、眼吸引液、肺洗浄液、骨髄穿刺液、肺吸引液、生検サンプル、スワブサンプル、肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉、膵臓、細胞培養物由来のサンプルを含むが、これらに限定されない、ヒトもしくは植物を含む動物組織、ならびに溶解物、抽出物、または上記に記載されるサンプルから得られた材料および画分またはサンプル上にもしくはその中に存在し得る任意の細胞および微生物およびウイルス、ならびにその他同種のものを含むが、これらに限定されない。ＲＮＡを含有する臨床上の環境または法医学的環境から得られた材料もまた、用語「サンプル」について意図される意味の範囲内にある。好ましくは、サンプルは、真核生物または原核生物に、好ましくはヒト、動物、植物、細菌、または真菌に由来する生物学的サンプルである。好ましくは、サンプルは、たとえば血液、バフィーコート、血漿、および血清などのような血液製剤、尿、液（ｌｉｑｕｏｒ）、痰、糞便、ＣＳＦおよび精子、上皮スワブ、生検材料、骨髄サンプル、ならびに組織サンプル、好ましくは、肺、腎臓、または肝臓などのような器官組織サンプルなどのような、細胞、組織、腫瘍細胞、細菌、ウイルス、ならびに体液からなる群から選択される。用語「サンプル」はまた、保存された、固定された、および／または安定化されたサンプルなどのような処理されたサンプルをも含む。そのようなサンプルの非限定的な例は、保存された細胞含有サンプル、たとえば、たとえばグルタルアルデヒドまたはＰＡＸｇｅｎｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｓｙｓｔｅｍなどのような、架橋または非架橋固定液により処理されたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥサンプル）または他のサンプルを含む。たとえば、腫瘍由来の生検サンプルは、ＲＮＡ完全性を損ない得、特に、含まれるＲＮＡを分解し得るＦＦＰＥによって外科手技の後に慣用的に保存される。開示される方法は、実施例によって示されるように、断片化された望まれない標的ＲＮＡを除去するために好都合に使用されてもよい。したがって、初期ＲＮＡサンプルは、修飾されたまたは分解されたＲＮＡからなってもよいまたはそれを含んでいてもよい。修飾または分解は、たとえば保存剤（複数可）による処理によるものであり得る。
【００７０】
本明細書において使用される場合、用語「核酸（複数可）」は、典型的に、サブユニットの間のホスホジエステル連結によってであるが、いくつかの場合においてホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびその他同種のものによって、共有結合で結ばれたリボヌクレオシドおよび／またはデオキシリボヌクレオシドを含むポリマーを特に指す。ＤＮＡは、すべてのタイプのＤＮＡ、たとえばゲノムＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびたとえば腫瘍由来のＤＮＡまたは胎児のＤＮＡなどのような遊離循環ＤＮＡを含むが、これらに限定されない。好ましくは、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである。ＲＮＡは、限定されないが、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ（長い非コードＲＮＡ）、ｌｉｎｃＲＮＡ（長い遺伝子間非コードＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）を含むが、これらに限定されない）を含み、また、たとえば腫瘍由来のＲＮＡなどのような遊離循環ＲＮＡをも含む。
【００７１】
ステップｄ）
任意選択のステップｄ）において、非結合プローブ分子は、除去されてもよい。たとえば、標的ＲＮＡ枯渇化組成物は、さらに精製されてもよい。それぞれの精製ステップは、たとえば、短い非結合プローブ分子、バッファー構成成分、およびその他同種のものを除去するためにならびに／またはＲＮＡを濃縮するために有用になり得る。それぞれの精製方法についての例は、抽出、固相抽出、ポリケイ酸に基づく精製、シリカカラムまたは磁性シリカビーズを使用する単離、磁性粒子に基づく精製、フェノールクロロホルム抽出、陰イオン交換クロマトグラフィー（陰イオン交換表面を使用）、ゲル電気泳動、沈殿、たとえばアルコール沈殿、およびその組み合わせを含むが、これらに限定されない。さらに、当業者によって知られている任意の他の核酸を単離する技術を使用することができる。一実施形態によれば、標的ＲＮＡ枯渇化組成物が、少なくとも１つのカオトロピック剤および少なくとも１つのアルコールの存在下において固相に対してＲＮＡを結合させることによってさらに精製される。好ましくは、ＲＮＡは、ケイ素を含む固相、好ましくはポリケイ酸ガラス繊維に対して結合させることによって単離される。適した方法およびキットはまた、ＲＮｅａｓｙシステム、特にＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔおよび他のＲＮＡ調製キットなどのように、市販で入手可能でもある。ここで、さらに、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙシステム、ＥＺ１機器、ＱＩＡｃｕｂｅ（ＱＩＡＧＥＮ）、またはＭａｇＮＡｐｕｒｅシステム（Ｒｏｃｈｅ）上で試行するものなどのような自動化されたプロトコールが利用可能である。非結合プローブ分子はまた、他の適した手段によって、たとえばＤＮアーゼ消化によってまたはタグ付きプローブ分子が使用される場合、親和性除去によって、除去されてもよい。さらに、記載されるように、プローブ分子は、それらが配列決定ライブラリーにおいて示されるのを予防するために修飾することができる。
【００７２】
ステップｅ）
標的ＲＮＡ枯渇化組成物が続く配列決定反応のために調製される場合、本発明による方法は、好ましくは、
ｅ）標的ＲＮＡ枯渇化組成物において含まれるＲＮＡを配列決定するステップを含む。
【００７３】
一実施形態によれば、配列決定が、次世代配列決定によって実行される。ここで、様々な方法が実行可能である。逆転写酵素を使用するＲＮＡのｃＤＮＡへの変換は、転写物の適切な特徴付けおよび定量化の両方に干渉し得る偏りおよび人工産物を招くことが示されたので、単一分子直接的ＲＮＡ配列決定技術が開発されている。一実施形態によれば、標的ＲＮＡ枯渇化組成物において含まれるＲＮＡ分子が、直接的な配列決定方法を使用して、たとえばＯｚｓｏｌａｋら、２００９（Ｄｉｒｅｃｔ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ  ４６１、ｐａｇｅ  ８１４  ｔｏ  ８１９）において記載されるように、直接、配列決定される。この方法は、ｃＤＮＡへのＲＮＡ変換もライゲーションおよび増幅などのような他の可能性として偏らせるサンプル操作も伴うことなく、超並列方式で直接、ＲＮＡ分子を配列決定することが可能である。
【００７４】
一実施形態によれば、ＲＮＡを配列決定するステップが、
ｉ）超並列配列決定に適した配列決定ライブラリーを調製するステップ、
ｉｉ）配列決定ライブラリーにおいて含まれる分子を並列に配列決定するステップを含む。
【００７５】
そのような配列決定ライブラリーは、複数の二本鎖分子を含んでいてもよく、好ましくは、超並列配列決定に適しており、したがって、次世代配列決定に適している。それぞれの配列決定ライブラリーの調製はまた、トランスクリプトーム配列決定において現在の標準である。配列決定ライブラリー中に存在する複数の二本鎖核酸分子は、直鎖または環状であってもよい、好ましくは、配列決定ライブラリーにおいて含まれる核酸分子は、直鎖である。次世代配列決定に適した配列決定ライブラリーは、先行技術において知られている方法を使用して調製することができる。好ましくは、配列決定ライブラリーにおける二本鎖分子は、ＤＮＡ分子である。この目的のために、ＲＮＡは、ｃＤＮＡに逆転写されてもよい。通常、次世代配列決定に適した配列決定ライブラリーを調製するための方法は、ＤＮＡ断片を得るステップ、任意選択で、その後に続くＤＮＡ修復および末端研磨ならびに最終的に、多くの場合、ＮＧＳプラットフォーム特異的アダプターライゲーションを含む。一実施形態によれば、得られたｃＤＮＡは、たとえば、続く配列決定に適したＤＮＡ断片を提供するために、超音波処理、ハイドロ剪断、超音波、噴霧化、または酵素的断片化などのような剪断によって断片化することができる。しかしながら、好ましくは、所望の長さへの断片化は、ＲＮＡレベルで、したがってｃＤＮＡ合成前に行われてもよい。たとえば、望まれない標的ＲＮＡ枯渇化組成物において含まれるＲＮＡは、ＲＮＡのマグネシウム触媒による加水分解によって断片化されてもよい。断片の長さは、配列決定のために続いて使用される次世代配列決定プラットフォームの配列決定能力に基づいて選ぶことができる。通常、得られた断片は、１５００ｂｐ以下、１０００ｂｐ以下、７５０ｂｐ以下、６００ｂｐ以下、好ましくは５００ｂｐ以下の長さを、これが最も流通している次世代配列決定プラットフォームの配列決定能力に相当するので、有する。好ましくは、得られた断片は、１００〜１０００ｂｐ、１２５〜８００ｂｐ、１５０〜７００ｂｐ、１７５〜６００ｂｐ、および２００〜５００ｂｐの範囲にある長さを有する。それぞれの断片サイズは、トランスクリプトーム配列決定に特に適しており、それぞれの短い断片は、一般的な次世代配列決定プラットフォームを使用して効率的に配列決定することができる。しかしながら、さらに、より長い断片は、たとえば、より長い配列リードを可能にする次世代配列決定方法を使用する場合またはペアエンド配列決定もしくはメイトペア配列決定のために、たとえば、転写物の構造および選択的スプライスアイソフォームを分析するために、使用することができる。さらに、もちろん、より小さな断片サイズ（たとえば１０または１５ｂｐから開始）もまた、配列決定ライブラリーを調製するための出発物質および関心のある配列に依存して、適していてもよい。たとえば、小型ＲＮＡ（２００ｎｔ以下、１００ｎｔ以下、５０ｎｔ以下、またはさらに、ｍｉＲＮＡについての場合のように２５ｎｔ以下のサイズを有する）を含むまたはそれからなるＲＮＡから得られたｃＤＮＡを処理する場合、ライブラリーは、それぞれのより短い断片を含んでいてもよい。
【００７６】
断片化されたＤＮＡは、先行技術において知られている方法を使用して、その後、修復し、末端研磨し、それによって、たとえば平滑末端またはＡオーバーハングなどのようなヌクレオチドオーバーハングを提供することができる。
【００７７】
さらに、好ましくは、アダプターは、ＤＮＡ断片の５’および／または３’末端で、好ましくは得られた断片の両端で、ライゲーションされる。アダプターの特異的な設計は、使用される次世代配列決定プラットフォームに依存し、本発明の目的のために、次世代配列決定のための配列決定ライブラリーを調製するために使用される本質的に任意のアダプターを使用することができる。アダプター配列は、たとえば、続くライブラリー増幅および／または配列決定プライマーアニーリングを可能にすることが知られている配列組成物を提供する。アダプターとして、配列が知られている二本鎖または部分的二本鎖核酸を使用することができる。アダプターは、平滑末端を有していてもよく、３’または５’オーバーハングを有する付着末端が、Ｙ状のアダプターまたはステムループ状のアダプターによって提供されてもよい。Ｙ状のアダプターは、たとえば米国特許第７，７４１，４６３号明細書において記載され、ステムループ状のアダプターは、たとえば米国特許出願公開第２００９／０２９８０７５号明細書において記載され、アダプターの特異的な設計に関して参照によって本明細書に組み込まれる。好ましくは、アダプターは、少なくとも７、好ましくは少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５塩基の長さを有する。アダプターの長さは、好ましくは、１０〜１００塩基、好ましくは１５〜７５塩基、より好ましくは２０〜６０塩基の範囲にある。同じまたは異なるアダプターを、断片の３’および５’末端で使用することができる。たとえばＹ状のまたはステムループ状のアダプターなどのような、両方の末端について同じタイプのアダプターを使用することは、アダプター誤対合によりライブラリー調製の間に失われる断片がないという利点を有し、これは、低量のＤＮＡを扱う場合に利点となる。
【００７８】
したがって、好ましくは、調製された配列決定ライブラリーは、それらの３’および５’末端でアダプター配列に対してライゲーションされた、ランダムに断片化された二本鎖ＤＮＡ分子を含むまたはそれからなる。アダプターは、知られている配列を提供し、したがって、増幅および／または配列決定プライマーに対して知られている鋳型を提供する。任意選択で、アダプターはまた、個々のインデックスを提供し、それによって、配列決定前に、２つ以上の配列決定ライブラリーの続くプールを可能にする。この実施形態は、さらに詳細に下記に記載される。配列決定ライブラリーは、酵素的操作を使用して、インビトロにおいて生成されてもよいが、好ましくは、生細胞のＤＮＡにより許容される形質転換（ＤＮＡ  ｐｅｒｍｉｔｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ならびに続くクローン細胞選択、培養、およびＤＮＡ単離を必要としない。配列決定ライブラリーを調製するための適した方法はまた、Ｍｅｔｚｋｅｒ、２０１１、Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ、２００９および国際公開第１２／００３３７４号においても記載される。
【００７９】
単一のＮＧＳの試行は、通常、一度にいくつかの配列決定ライブラリーを配列決定するための十分なリードを生成する。そのため、プール戦略およびインデックスアプローチは、サンプル当たりの費用を低下させるための実用的な手段である。それぞれの多重化戦略もまた、本発明の教示に関連して使用することができる。多重化を可能にする特徴は、様々な段階において組み込むことができる。一実施形態によれば、配列決定ライブラリーが、ライブラリーの標識および区別のための特異的な配列モチーフを含有するアダプター（「バーコード化」または「インデックス」アダプター）を使用することによって生成される。それぞれの配列決定ライブラリーは、ライブラリー特異的な配列を提供する、個々の、したがってライブラリー特異的なアダプターとともに提供される。好ましくは、それぞれのアダプターは、インデックス領域に加えて、すべてのライブラリーで使用することができるＰＣＲプライマーおよび／または配列決定プライマーに対して知られている鋳型を提供する一般的な汎用領域を含む。配列決定ライブラリーが得られた後、それらは、プールし、単一の試行で配列決定することができる。それぞれのインデックスアダプターを有する配列決定ライブラリーのＤＮＡ断片の提供は、したがって、配列決定された断片をインデックスアダプターのライブラリー特異的な配列に基づいて識別することができるので、続いて、同じ配列決定の試行において、いくつかの配列決定ライブラリーを配列決定することを可能にする。配列決定の後、それぞれのライブラリーに属する個々の配列は、次いで得られた配列において見つけられるライブラリー特異的なインデックスを介してソートすることができる。それぞれのインデックスアプローチは、先行技術において知られており、インデックスアダプターはまた、市販で入手可能でもあり、たとえば、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームにおいて使用するのに適しているＴｒｕＳｅｑ（登録商標）ＤＮＡサンプルプレップキットにおいて提供される。
【００８０】
上記に議論されるように、配列決定は、好ましくは、次世代配列決定プラットフォームで実行される。すべてのＮＧＳプラットフォームは、一般的な技術的特徴、すなわち、例えば、フローセルにおいてまたは油水エマルションの生成によって空間的に分離された、クローン増幅されたまたは単一のＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子の超並列配列決定を共有する。ＮＧＳにおいて、配列決定は、ポリメラーゼ媒介性ヌクレオチド伸長の繰り返しのサイクルまたはある一般的なフォーマットでは、オリゴヌクレオチドライゲーションの反復サイクルによって実行される。本発明による方法を使用して配列決定ライブラリーを得た後、単一分子のクローン分離および続く増幅は、エマルションＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ  ４５４のピロシーケンス、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔの半導体配列決定、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのライゲーションによるＳＯＬｉＤ配列決定、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの合成による配列決定）、フローセル上でのブリッジ増幅（たとえばＳｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｗｉｌｄｆｉｒｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による等温増幅  、またはローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ）によって生成されたロロニー（ｒｏｌｏｎｙ）／ナノボール（ｎａｎｏｂａｌｌ）のように、インビトロ鋳型調製反応によって実行される。Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、ＳＭＲＴ技術（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはナノポア配列決定（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ）のような配列決定技術は、事前のクローンの増幅を伴うことなく、単一分子の直接的な配列決定を可能にする。使用することができる適したＮＧＳ方法およびプラットフォームはまた、本発明の背景技術においても記載し、そしてそれは、それぞれの開示にゆだねられる。配列決定は、本発明の教示に従って得られた標的ＲＮＡ枯渇化組成物から調製された配列決定ライブラリーを使用してそれぞれのプラットフォームのいずれかで実行することができる。
【００８１】
得られた配列情報は、標的領域の配列を提供するためにアライメントすることができる。ここで、先行技術において知られている方法を使用することができる。適した方法は、たとえばＭｅｔｚｋｅｒ、２０１０において概説され、参照トランスクリプトームに対するリードのアライメントを含むが、これらに限定されない。
【００８２】
第２の態様によれば、サンプルにおいて含まれる関心のあるＲＮＡ分子を配列決定するための方法が提供され、この方法は、以下：
ａ）好ましくはサンプルから全ＲＮＡを単離することによって、ＲＮＡ含有組成物を得るステップ；
ｂ）第１の態様による方法を使用して、好ましくは全ＲＮＡであるＲＮＡ含有組成物から望まれない標的ＲＮＡを枯渇させ、それによって、標的ＲＮＡ枯渇化組成物を提供するステップ；
ｃ）任意選択で、たとえば標的ＲＮＡ枯渇化組成物を精製することによって、非結合プローブ分子を除去するステップ；
ｄ）標的ＲＮＡ枯渇化組成物において含まれるＲＮＡ分子を配列決定するステップ、を含む。
【００８３】
個々のステップならびにＲＮＡ含有組成物由来の様々なタイプの望まれない標的ＲＮＡを枯渇させるために使用することができる１つ以上のグループのプローブ分子および／またはプローブセットに関する詳細は、第１の態様による方法に関連して上記に既に記載した、また、それは、上記の開示にゆだねられる。好ましくは、精製された全ＲＮＡは、ステップａ）において得られる。続いておよび特許請求の範囲において記載されるキットは、１つ以上のタイプの望まれない標的ＲＮＡを除去するために、ステップｂ）において使用されてもよい。一実施形態によれば、配列決定が、超並列配列決定に適した配列決定ライブラリーを調製するステップおよび配列決定ライブラリーにおいて含まれる分子を並列に配列決定するステップを含む。詳細は、第１の態様による方法に関連して上記に記載しており、また、それは、それぞれの開示にゆだねられる。一実施形態によれば、配列決定が、次世代配列決定プラットフォームで実行され、好ましくは、次世代配列決定プラットフォームは、ブリッジ増幅配列決定プラットフォームまたはエマルション増幅配列決定プラットフォームから選択される。詳細は、第１の態様による方法に関連して上記に記載しており、また、それは、それぞれの開示にゆだねられる。
【００８４】
第３の態様によれば、ＲＮＡ含有組成物から標的ＲＮＡを枯渇させるためのキットが提供され、このキットは、以下：
ａ）標的ＲＮＡを枯渇させるための１つ以上のグループのプローブ分子であって、あるグループのプローブ分子が、以下：
ｉ）グループが、１００ｎｔ以下の長さを有する２つ以上の異なるプローブ分子を含む；
ｉｉ）前記グループにおいて含まれるプローブ分子が、標的ＲＮＡの標的領域に対して相補的である；
ｉｉｉ）前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、２つ以上の異なるプローブ分子が、形成される二本鎖ハイブリッドにおいて互いに隣接して位置する；
との特徴を有する、１つ以上のグループのプローブ分子、ならびに
ｂ）プローブ分子および標的ＲＮＡの間で形成される二本鎖ハイブリッドに結合するのに適した結合剤、を含む。
【００８５】
プローブ設計、プローブセットの使用、枯渇されることになっている様々な標的ＲＮＡ、抗ハイブリッド結合剤、ならびにその適した好ましい実施形態に関する詳細は、第１の態様による方法に関連して詳細に上記に記載しており、また、特許請求の範囲においても記載される。それは、それぞれの開示にゆだねられる。適したグループのプローブ分子およびプローブセットはまた、実施例においても記載される。一実施形態によれば、キットが、２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットを含み、２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも４つ、少なくとも６つ、少なくとも８つ、少なくとも１０、最も好ましくはすべてのグループが、２つ以上の連続したプローブ分子を含む。この実施形態において、それぞれの連続したグループ内に含まれる少なくとも２つのプローブ分子が、連続している。さらに、少なくとも３つのグループの２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて、好ましくは、少なくとも６つのグループにおいて、すべての含まれるプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続していることが好ましい。一実施形態によれば、２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットのグループにおいて含まれるすべてのプローブ分子の少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が、それらのグループメンバーに対して連続している。２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子が、５０ｎｔ以下、好ましくは３５ｎｔ以下、より好ましくは３０ｎｔ以下の長さを有することが好ましく、最も好ましくは、２０ｎｔ〜２５ｎｔの範囲内にある。好ましくは、２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットは、２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットについて表１において示されるプローブ分子のグループの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも４つ、少なくとも６つ、より好ましくは少なくとも８つ、少なくとも１０、最も好ましくはすべてを含む。一実施形態によれば、キットが、好ましくは、上記に記載される２８Ｓプローブセットに加えて、１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットを含み、１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、少なくとも４つ、最も好ましくはすべてのグループが、２つ以上の連続したプローブ分子を含む。この実施形態において、それぞれの連続したグループ内に含まれる少なくとも２つのプローブ分子が、連続している。さらに、少なくとも２つのグループの１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて、好ましくは、少なくとも３つのグループにおいて、すべての含まれるプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続していることが好ましい。好ましくは、１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットのグループにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が、それらのグループメンバーに対して連続している。１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子が、５０ｎｔ以下、好ましくは３５ｎｔ以下、より好ましくは３０ｎｔ以下の長さを有することが好ましく、最も好ましくは、２０ｎｔ〜２５ｎｔの範囲内にある。好ましくは、１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットは、１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットについて表１において示されるプローブ分子のグループの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、少なくとも４つ、最も好ましくはすべてを含む。さらに、キットは、方法に関連して上記に記載される５．８ｓ  ｒＲＮＡグループ、方法に関連して上記に記載される５ｓ  ｒＲＮＡグループ、方法に関連して上記に記載される１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセット、および／または方法に関連して上記に記載される１６ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットを含んでいてもよい。それぞれのキットを使用することによって、続く分析を妨害し得る最も一般的なｒＲＮＡ種が枯渇された標的ＲＮＡ枯渇化組成物を得ることができる。一実施形態によれば、キットにおいて含まれるプローブ分子が、３５ｎｔ以下、好ましくは３０ｎｔ以下の長さを有する一本鎖ＤＮＡ分子である。好ましくは、キットにおいて含まれる抗ハイブリッド結合剤は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに対して特異的な抗ハイブリッド抗体である。
【００８６】
実施例によって示されるように、本明細書において記載される特異的なプローブ設計と組み合わせてハイブリッド捕捉技術を使用することは、先行技術の方法よりも、標的ＲＮＡのより完全な枯渇および分解に対するより好適な保護ならびに先行技術の方法よりも、非特異的枯渇に対するより好適な保護を達成することを可能にする。上記に記載されるように、特異性は、特異性が２つのレベル、すなわち、グループ環境において含まれる短いプローブの特異性および抗ハイブリッド結合剤による捕捉で獲得され、有意なマッチ配列を有するそれらのプローブのみが抗ハイブリッド結合剤によって基質として認識されるので、本発明による方法により、より高度となる。そのため、大部分の非特異的結合イベントは、本発明による方法を使用して捕捉されないであろう。本発明の技術は、自動化することができ、そのため、高スループットの適用に十分に適している。重要な利点は、すべてのタイプのリボソームＲＮＡなどのような、９９．５％、さらに９９．９％を超える望まれない標的ＲＮＡの非常に効率的な除去、他のＲＮＡタイプの偏りがない保持、ヒト、マウス、およびラットを含む様々な種由来のｒＲＮＡなどのような標的ＲＮＡの有効な枯渇、低存在量のＲＮＡの高感度の検出についての改善されたＳＮ比である。
【００８７】
本出願は、２０１２年９月１８日に提出された先行出願米国特許出願公開第６１／７０２，５９４号および２０１２年９月１８日に提出されたＥＰ  １２  ００６  ５３４．７号の優先権を主張し、これらの全開示が、参照によって本明細書において組み込まれる。
【００８８】
本発明は、本明細書において開示される例示的な方法および材料によって限定されず、本明細書において記載されるものに類似するまたは等価である任意の方法および材料が、本発明の実施形態の実施または試験において使用することができる。数値の範囲は、範囲を特定する数を含む。本明細書において提供される見出しは、本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではなく、これらは、全体として本明細書への参照によって理解することができる。
【００８９】
本明細書において使用される場合、用語「溶液」は、特に、液体組成物、好ましくは水性組成物を指す。それは、たった１つの相の均質な混合物であってもよいが、溶液がたとえば沈殿物などのような固体の構成成分を含むこともまた、本発明の範囲内にある。
【００９０】
ヌクレオチドｎｔに関連して本明細書において示されるサイズ、それぞれのサイズ範囲は、鎖の長さを指し、したがって、一本鎖および二本鎖分子の長さを記載するために使用される。二本鎖分子において、前記ヌクレオチドは、対合される。したがって、二本鎖分子が１００ｎｔの鎖の長さを有するとして本明細書において記載される場合、前記二本鎖分子は１００ｂｐを含む。
【００９１】
一実施形態によれば、方法の場合、あるステップを含むとしてまたは組成物、溶液および／もしくはバッファーの場合、ある成分を含むとして本明細書において記載される事項が、それぞれのステップまたは成分からなる事項を指す。本明細書において記載される好ましい実施形態を選択し、組み合わせることは好ましく、好ましい実施形態のそれぞれの組み合わせから生じる特定の事項もまた、本開示に属する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
初期ＲＮＡ含有組成物から標的ＲＮＡ枯渇化組成物を調製する方法であって、前記方法は、以下：
ａ）１つ以上のグループのプローブ分子と前記初期ＲＮＡ含有組成物を接触させ、そして前記標的ＲＮＡおよび前記プローブ分子の間で二本鎖ハイブリッドを生成するステップであって、ここで、あるグループのプローブ分子が、以下：
ｉ）前記グループが、１００ｎｔ以下の長さを有する２つ以上の異なるプローブ分子を含む；
ｉｉ）前記グループにおいて含まれる前記プローブ分子が、標的ＲＮＡの標的領域に対して相補的である；
ｉｉｉ）前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、２つ以上の前記異なるプローブ分子が、形成される前記二本鎖ハイブリッドにおいて互いに隣接して位置する、
との特徴を有するステップ；
ｂ）前記二本鎖ハイブリッドに結合する結合剤を使用することによって前記二本鎖ハイブリッドを捕捉し、それによって、ハイブリッド／結合剤複合体を形成するステップ；
ｃ）前記組成物から前記ハイブリッド／結合剤複合体を分離し、それによって、標的ＲＮＡ枯渇化組成物を提供するステップ、
を含む、方法。
（項目２）
前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、グループの２つ以上のプローブ分子が、形成された前記二本鎖ハイブリッドにおいて互いに連続しているまたはグループのすべてのプローブ分子が、形成された前記二本鎖ハイブリッドにおいて互いに連続している、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記プローブ分子が、３５ｎｔ以下、３０ｎｔ以下、または２５ｎｔ以下から選択される長さを有し、好ましくは、１０ｎｔ〜３５ｎｔまたは１５ｎｔ〜３０ｎｔの範囲にある長さを有する、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
プローブセットが、特異的な標的ＲＮＡの枯渇のために使用され、プローブセットが、２つ以上のグループのプローブ分子を含み、前記プローブセットにおいて含まれるプローブ分子のそれぞれのグループが、前記標的ＲＮＡにおける異なる標的領域を標的にする、項目１〜３の一項以上に記載の方法。
（項目５）
特異的な標的ＲＮＡにおいて、前記標的領域が、５００ｎｔ以下、４５０ｎｔ以下、４００ｎｔ以下、３５０ｎｔ以下、３００ｎｔ以下、２５０ｎｔ以下、２００ｎｔ以下、または１５０ｎｔ以下の距離内に位置する、項目４に記載の方法。
（項目６）
プローブセットにおいて含まれる前記プローブ分子の少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、それらのグループメンバーに対して連続している、項目４または５に記載の方法。
（項目７）
以下：
ｉ）前記標的領域が、前記標的ＲＮＡの完全長に実質的に相当する；
ｉｉ）前記標的領域が、前記標的ＲＮＡにおいて保存される領域である；
ｉｉｉ）前記標的領域が、異なる種において保存される領域である；
ｉｖ）前記標的領域が、前記標的ＲＮＡにおいて保存され、そして少なくとも種ヒト、マウス、およびラットにおいて保存される領域である；
ｖ）グループの前記プローブ分子がハイブリダイズする前記標的領域が、５０ｎｔ〜５００ｎｔ、５０ｎｔ〜３５０、５０ｎｔ〜２５０ｎｔ、７５ｎｔ〜２２５ｎｔ、１００ｎｔ〜２００ｎｔ、および１００ｎｔ〜１７５ｎｔから選択されるサイズを有する；
ｖｉ）プローブセットが、特異的な標的ＲＮＡの枯渇のために使用され、プローブセットが、２つ以上のグループのプローブ分子を含み、それぞれのグループのプローブ分子が、前記標的ＲＮＡにおける異なる標的領域を標的にし、前記標的領域が、前記標的ＲＮＡの全長にわたって分布する；ならびに／または
ｖｉｉ）標的ＲＮＡ枯渇効率が、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．５％、そして最も好ましくは少なくとも９９．９％である、
との特徴のうち１つ以上を有する、項目１〜６の一項以上に記載の方法。
（項目８）
複数の標的ＲＮＡが、前記初期ＲＮＡ含有組成物から枯渇される、項目１〜７の一項以上に記載の方法。
（項目９）
以下：
ｉ）少なくとも１つのタイプのｒＲＮＡが、標的ＲＮＡとして枯渇される；ならびに／または
ｉｉ）２８Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、５Ｓ  ｒＲＮＡ、ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡ、およびミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡから選択される少なくとも１つのタイプのｒＲＮＡが、枯渇され、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ、そして最も好ましくはすべての前記ｒＲＮＡタイプが枯渇される；ならびに／または
ｉｉｉ）複数のグループのプローブ分子および／もしくはプローブセットが、前記初期ＲＮＡ含有組成物から、２８Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、５Ｓ  ｒＲＮＡ、ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡ、およびミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡのうちの３つ以上、好ましくは４つ以上、最も好ましくはすべてを枯渇させるために使用される、
との特徴のうち１つ以上を有する、項目１〜８の一項以上に記載の方法。
（項目１０）
以下：
ａａ）２８Ｓ  ｒＲＮＡが標的ＲＮＡとして枯渇される場合、２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットであって、以下：
ｉ）前記２８Ｓプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、５０ｎｔ以下、好ましくは３５ｎｔ以下、またはより好ましくは３０ｎｔ以下である；
ｉｉ）前記２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも４つ、少なくとも６つ、最も好ましくはすべてのグループが、２つ以上の連続したプローブ分子を含む；
ｉｉｉ）前記２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれる、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、もしくは最も好ましくは少なくとも９５％のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している；および／または
ｉｖ）前記２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットが、前記２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットについて表１において示されるプローブ分子のグループの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも４つ、少なくとも６つ、より好ましくは少なくとも８つ、少なくとも１０を含み、そして最も好ましくはすべてを含む
との特徴のうち、１つ以上、好ましくはすべてを有する２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットが、使用される、ならびに／または
ｂｂ）１８Ｓ  ｒＲＮＡが標的ＲＮＡとして枯渇される場合、１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットであって、以下：
ｉ）前記１８Ｓプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、５０ｎｔ以下、好ましくは３５ｎｔ以下、またはより好ましくは３０ｎｔ以下である；および／または
ｉｉ）前記１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、少なくとも４つ、そして最も好ましくはすべてのグループが、２つ以上の連続したプローブ分子を含む；
ｉｉｉ）前記１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれる、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している；および／または
ｉｖ）前記１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットが、前記１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットについて表１において示されるプローブ分子のグループの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、少なくとも４つ、そして最も好ましくはすべてを含む；
との特徴のうち、１つ以上、好ましくはすべてを有する１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットが、使用される；ならびに／または
ｃｃ）５．８Ｓ  ｒＲＮＡが標的ＲＮＡとして枯渇される場合、少なくとも１つのグループのプローブ分子であって、以下：
ｉ）前記プローブ分子が、５０ｎｔ以下、好ましくは３５ｎｔ以下、より好ましくは３０ｎｔ以下の長さを有する；および／または
ｉｉ）前記グループにおいて含まれる前記プローブ分子の少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくはすべてが、連続したプローブ分子である；および／または
ｉｉｉ）前記５．８Ｓ  ｒＲＮＡグループが、５．８Ｓ  ｒＲＮＡについて表１において示される１つ以上のプローブ分子を含む
との特徴のうち、１つ以上、好ましくはすべてを有する少なくとも１つのグループのプローブ分子が、使用される；ならびに／または
ｄｄ）５Ｓ  ｒＲＮＡが標的ＲＮＡとして枯渇される場合、少なくとも１つのグループのプローブ分子であって、以下：
ｉ）前記プローブ分子が、５０ｎｔ以下、好ましくは３５ｎｔ以下、より好ましくは３０ｎｔ以下の長さを有する；および／または
ｉｉ）前記グループにおいて含まれる前記プローブ分子の少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくはすべてが、連続したプローブ分子である；および／または
ｉｉｉ）前記５Ｓ  ｒＲＮＡグループが、５Ｓ  ｒＲＮＡについて表１において示される１つ以上のプローブ分子を含む；
との特徴のうち、１つ以上、好ましくはすべてを有する少なくとも１つのグループのプローブ分子が、使用される、ならびに／または
ｅｅ）ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡが標的ＲＮＡとして枯渇される場合、プローブセットであって、以下：
ｉ）前記１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、５０ｎｔ以下、好ましくは３５ｎｔ以下、またはより好ましくは３０ｎｔ以下である；および／または
ｉｉ）前記１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくはすべてのグループが、２つ以上の連続したプローブ分子を含む；および／または
ｉｉｉ）前記１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれる、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している；
との特徴のうち、１つ以上、好ましくはすべてを有するプローブセットが、使用される、ならびに／または
ｆｆ）ミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡが標的ＲＮＡとして枯渇される場合、プローブセットであって、以下：
ｉ）前記１６ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、５０ｎｔ以下、好ましくは３５ｎｔ以下、より好ましくは３０ｎｔ以下である；および／または
ｉｉ）前記１６ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくはすべてのグループが、２つ以上の連続したプローブ分子を含む；および／または
ｉｉｉ）前記１６ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれる、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している；
との特徴のうち、１つ以上、好ましくはすべてを有するプローブセットが、使用される、ならびに／または
ｇｇ）ａａ）において定められる２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットおよびｂｂ）において定められる１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットが、標的ＲＮＡとして２８Ｓ  ｒＲＮＡおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡが枯渇された標的ＲＮＡ枯渇化組成物を提供するために使用され、任意選択で、ｃｃ）において定められる５．８Ｓ  ｒＲＮＡグループ、ｄｄ）において定められる５Ｓ  ｒＲＮＡグループ、ｅｅ）において定められる１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセット、およびｆｆ）において定められる１６ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットが、標的ＲＮＡとして５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、５Ｓ  ｒＲＮＡ、ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡ、およびミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡをさらに枯渇させるために使用される、
との特徴のうち１つ以上を有する、項目８または９に記載の方法。
（項目１１）
以下：
ｉ）大量のタンパク質コードｍＲＮＡが、標的ＲＮＡとして枯渇され、前記大量のタンパク質コードｍＲＮＡが、好ましくはグロビンＲＮＡである；
ｉｉ）前記抗ハイブリッド結合剤が、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに対して特異的な抗ハイブリッド抗体である；
ｉｉｉ）使用される前記抗ハイブリッド結合剤が、固体支持体に対して固定されるもしくは前記抗ハイブリッド結合剤が、溶液において遊離しており、そして固体支持体に対して固定された第２の結合剤が、前記抗ハイブリッド結合剤に結合し、したがって形成された前記ハイブリッド／結合剤複合体を捕捉するために使用される；
ｉｖ）ステップａ）およびｂ）が同時に実行される、ならびに／または
ｖ）任意選択で修飾されたＤＮＡ分子が、プローブ分子として使用され、二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが形成される、
との特徴のうち１つ以上を有する、項目１〜１０の一項以上に記載の方法。
（項目１２）
ａ）１つ以上のグループのプローブ分子と全ＲＮＡを接触させ、そして前記標的ｒＲＮＡおよび前記プローブ分子の間で二本鎖ハイブリッドを生成するステップであって、あるグループのプローブ分子が、以下：
ｉ）前記グループが、３５ｎｔ以下の長さを有する２つ以上の異なるプローブ分子を含む；
ｉｉ）前記グループにおいて含まれる前記プローブ分子が、標的ＲＮＡの標的領域に対して相補的であり、前記標的ＲＮＡが、ｒＲＮＡである；
ｉｉｉ）前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、前記異なるプローブ分子のうちの２つ以上、好ましくはすべてが、形成された前記二本鎖ハイブリッドにおいて互いに連続して位置する；
との特徴を有する、ステップ；
ｂ）前記二本鎖ハイブリッドに結合する抗ハイブリッド抗体を使用することによって前記二本鎖ハイブリッドを捕捉し、それによって、ハイブリッド／結合剤複合体を形成するステップ；
ｃ）前記組成物から前記ハイブリッド／結合剤複合体を分離し、それによって、標的ｒＲＮＡ枯渇化組成物を提供するステップ
を含む、項目１〜１１の一項以上に記載の方法。
（項目１３）
ｄ）任意選択で、好ましくは前記標的ＲＮＡ枯渇化組成物を精製することによって、非結合プローブ分子を除去するステップ；および
ｅ）前記標的ＲＮＡ枯渇化組成物において含まれるＲＮＡを配列決定するステップを含む、項目１〜１２の一項以上に記載の方法。
（項目１４）
配列決定するステップが、次世代配列決定によって実行される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ＲＮＡを配列決定するステップが、
ｉ）超並列配列決定に適した配列決定ライブラリーを調製するステップ；
ｉｉ）前記配列決定ライブラリーにおいて含まれる前記分子を並列に配列決定するステップ
を含む、項目１４に記載の方法：
（項目１６）
サンプルにおいて含まれる関心のあるＲＮＡ分子を配列決定するための方法であって、前記方法は、以下：
ａ）好ましくは前記サンプルから全ＲＮＡを単離することによって、ＲＮＡ含有組成物を得るステップ；
ｂ）項目１〜１２の一項以上に記載の方法を使用して、好ましくは全ＲＮＡである前記ＲＮＡ含有組成物から望まれない標的ＲＮＡを枯渇させ、それによって、標的ＲＮＡ枯渇化組成物を提供するステップ；
ｃ）任意選択で、非結合プローブ分子を除去するステップ；
ｄ）前記標的ＲＮＡ枯渇化組成物において含まれるＲＮＡ分子を配列決定するステップ、
を含む、方法。
（項目１７）
ｉ）ステップｃ）において、前記標的ＲＮＡ枯渇化組成物が、精製されるおよび／もしくはＤＮアーゼ消化が実行される；ならびに／または
ｉｉ）配列決定するステップが、超並列配列決定に適した配列決定ライブラリーを調製するステップおよび前記配列決定ライブラリーにおいて含まれる前記分子を並列に配列決定するステップ
を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
ＲＮＡ含有組成物から標的ＲＮＡを枯渇させるのに適したキットであって、前記キットは、以下：
ａ）標的ＲＮＡを枯渇させるための１つ以上のグループのプローブ分子であって、あるグループのプローブ分子は、以下：
ｉ）前記グループが、１００ｎｔ以下の長さを有する２つ以上の異なるプローブ分子を含む；
ｉｉ）前記グループにおいて含まれる前記プローブ分子が、標的ＲＮＡの標的領域に対して相補的である；
ｉｉｉ）前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、２つ以上の前記異なるプローブ分子が、形成される二本鎖ハイブリッドにおいて互いに隣接して位置する、
との特徴を有する、１つ以上のグループのプローブ分子；および
ｂ）前記プローブ分子および標的ＲＮＡの間で形成される前記二本鎖ハイブリッドに結合するのに適した結合剤
を含む、キット。
（項目１９）
以下：
ｉ）前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、グループの前記異なるプローブ分子のうちの２つ以上、好ましくはすべてが、形成された前記二本鎖ハイブリッドにおいて互いに連続している；
ｉｉ）前記キットにおいて含まれるプローブ分子が、３５ｎｔ以下、３０ｎｔ以下、もしくは２５ｎｔ以下から選択される長さを有し、１０ｎｔ〜３５ｎｔもしくは１５ｎｔ〜３０ｎｔの範囲にあるプローブ長を好ましくは有する；
ｉｉｉ）前記キットが、特異的な標的ＲＮＡを枯渇させるためのプローブセットを含み、プローブセットが、２つ以上のグループのプローブ分子を含み、前記プローブセットにおいて含まれるプローブ分子のそれぞれのグループが、標的ＲＮＡにおける異なる標的領域を標的にし、任意選択で、特異的な標的ＲＮＡにおいて、前記標的領域が、５００ｎｔ以下、４５０ｎｔ以下、４００ｎｔ以下、３５０ｎｔ以下、３００ｎｔ以下、２５０ｎｔ以下、２００ｎｔ以下、または１５０ｎｔ以下の距離内に位置する；
ｉｖ）前記キットが、２つ以上のグループのプローブ分子を含むプローブセットを含み、前記プローブセットにおいて含まれるプローブ分子のそれぞれのグループが、標的ＲＮＡにおける異なる標的領域を標的にし、前記プローブセットにおいて含まれる前記プローブ分子の少なくとも少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、それらのグループメンバーに対して連続している；
ｖ）前記標的領域が、前記標的ＲＮＡの完全長に実質的に相当する；
ｖｉ）前記標的領域が、前記標的ＲＮＡにおいて保存される領域である；
ｖｉｉ）前記標的領域が、異なる種において保存される領域である；
ｖｉｉｉ）前記標的領域が、前記標的ＲＮＡにおいて保存され、そして少なくとも種ヒト、マウス、およびラットにおいて保存される領域である；
ｉｘ）グループの前記プローブ分子がハイブリダイズする前記標的領域が、５０ｎｔ〜５００ｎｔ、５０ｎｔ〜３５０、５０ｎｔ〜２５０ｎｔ、７５ｎｔ〜２２５ｎｔ、１００ｎｔ〜２００ｎｔ、および１００ｎｔ〜１７５ｎｔから選択されるサイズを有する；
ｘ）前記キットが、特異的な標的ＲＮＡを枯渇させるためのプローブセットを含み、プローブセットが、２つ以上のグループのプローブ分子を含み、それぞれのグループのプローブ分子が、前記標的ＲＮＡにおける異なる標的領域を標的にし、前記標的領域が、前記標的ＲＮＡの全長にわたって分布する、
ｘｉ）前記キットにおいて含まれる前記プローブ分子が、任意選択で修飾されたＤＮＡ分子である；
ｘｉｉ）前記抗ハイブリッド結合剤が、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに対して特異的な抗ハイブリッド抗体である；
ｘｉｉｉ）あるグループのプローブ分子が、２〜１０、３〜８、もしくは４〜６のプローブ分子を含む；ならびに／または
ｘｉｖ）前記キットが、複数の標的ＲＮＡを枯渇させるために１つ以上のグループのプローブ分子および／もしくはプローブセットを含む、
との特徴のうち１つ以上を有する、項目１８に記載のキット。
（項目２０）
ｉ）標的ＲＮＡとして少なくとも１つのタイプのｒＲＮＡを枯渇させる；ならびに／または
ｉｉ）２８Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、５Ｓ  ｒＲＮＡ、ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡ、およびミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡから選択される、少なくとも１つのタイプのｒＲＮＡを枯渇させる、好ましくは、前記ｒＲＮＡタイプのうち、少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ、最も好ましくはすべてを枯渇させる；ならびに／または
ｉｉｉ）２８Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、５Ｓ  ｒＲＮＡ、ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡ、およびミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡのうち、３つ以上、好ましくは４つ以上、最も好ましくはすべてを枯渇させる
ための、１つ以上のグループのプローブ分子ならびに／または１つ以上のプローブセットを含む、項目１８または１９に記載のキット。
（項目２１）
ａａ）２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットであって、以下：
ｉ）前記２８Ｓプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、５０ｎｔ以下、好ましくは３５ｎｔ以下、またはより好ましくは３０ｎｔ以下である；
ｉｉ）前記２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも４つ、少なくとも６つ、最も好ましくはすべてのグループが、２つ以上の連続したプローブ分子を含む；
ｉｉｉ）前記２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれる、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、もしくは最も好ましくは少なくとも９５％のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している；および／または
ｉｖ）前記２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットが、前記２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットについて表１において示されるプローブ分子のグループの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも４つ、少なくとも６つ、より好ましくは少なくとも８つ、少なくとも１０を含み、そして最も好ましくはすべてを含む
との特徴のうち、１つ以上、好ましくはすべてを有する２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセット、ならびに／または
ｂｂ）１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットであって、以下：
ｉ）前記１８Ｓプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、５０ｎｔ以下、好ましくは３５ｎｔ以下、またはより好ましくは３０ｎｔ以下である；および／または
ｉｉ）前記１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、少なくとも４つ、そして最も好ましくはすべてのグループが、２つ以上の連続したプローブ分子を含む；
ｉｉｉ）前記１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれる、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している；および／または
ｉｖ）前記１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットが、前記１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットについて表１において示されるプローブ分子のグループの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、少なくとも４つ、そして最も好ましくはすべてを含む；
との特徴のうち、１つ以上、好ましくはすべてを有する１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセット、ならびに／または
ｃｃ）５．８Ｓ  ｒＲＮＡを枯渇させるための少なくとも１つのグループのプローブ分子であって、以下：
ｉ）前記プローブ分子が、５０ｎｔ以下、好ましくは３５ｎｔ以下、より好ましくは３０ｎｔ以下の長さを有する；および／または
ｉｉ）前記プローブ分子の少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくはすべてが、連続したプローブ分子である；および／または
ｉｉｉ）前記５．８Ｓ  ｒＲＮＡグループが、５．８Ｓ  ｒＲＮＡについて表１において示される１つ以上のプローブ分子を含む；
との特徴のうち、１つ以上、好ましくはすべてを有する少なくとも１つのグループのプローブ分子、ならびに／または
ｄｄ）５Ｓ  ｒＲＮＡを枯渇させるための少なくとも１つのグループのプローブ分子であって、以下：
ｉ）前記プローブ分子が、５０ｎｔ以下、好ましくは３５ｎｔ以下、より好ましくは３０ｎｔ以下の長さを有する；および／または
ｉｉ）前記プローブ分子の少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくはすべてが、連続したプローブ分子である；および／または
ｉｉｉ）前記５Ｓ  ｒＲＮＡグループが、５Ｓ  ｒＲＮＡについて表１において示される１つ以上のプローブ分子を含む；
との特徴のうち、１つ以上、好ましくはすべてを有する少なくとも１つのグループのプローブ分子、ならびに／または
ｅｅ）ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットであって、以下：
ｉ）前記１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、５０ｎｔ以下、好ましくは３５ｎｔ以下、またはより好ましくは３０ｎｔ以下である；および／または
ｉｉ）前記１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくはすべてのグループが、２つ以上の連続したプローブ分子を含む；および／または
ｉｉｉ）前記１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれる、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している；
との特徴のうち、１つ以上、好ましくはすべてを有する、ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡプローブセット、ならびに／または
ｆｆ）ミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットであって、以下：
ｉ）前記１６ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、５０ｎｔ以下、好ましくは３５ｎｔ以下、またはより好ましくは３０ｎｔ以下である；および／または
ｉｉ）前記１６ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくはすべてのグループが、２つ以上の連続したプローブ分子を含む；および／または
ｉｉｉ）前記１６ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれる、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している；
との特徴のうち、１つ以上、好ましくはすべてを有する、ミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡプローブセット、ならびに／または
ｇｇ）ａａ）において定められる２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットおよびｂｂ）において定められる１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットならびに任意選択でさらに、ｃｃ）において定められる５．８Ｓ  ｒＲＮＡグループ、ｄｄ）において定められる５Ｓ  ｒＲＮＡグループ、ｅｅ）において定められる１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセット、およびｆｆ）において定められる１６ＳミトコンドリアｒＲＮＡプローブセットを含む、
を含む、項目１８〜２０の一項以上に記載のキット。
（項目２２）
大量のタンパク質コードｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、および色素体ｒＲＮＡから選択される標的ＲＮＡを枯渇させるための１つ以上のグループもしくはプローブ分子および／または１つ以上のプローブセットを含む、項目１８〜２１の一項以上に記載のキット。
（項目２３）
前記大量のタンパク質コードｍＲＮＡが、グロビンＲＮＡである、項目２２に記載のキット。
（項目２４）
前記抗ハイブリッド結合剤が、抗ハイブリッド抗体、好ましくはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに対して特異的な抗ハイブリッド抗体である、項目１８〜２３の一項以上に記載のキット。
（項目２５）
前記抗ハイブリッド結合剤が、固体支持体上に固定される、項目１８〜２４の一項以上、特に項目２４に記載のキット。
（項目２６）
前記抗ハイブリッド結合剤が、固体支持体上に固定されず、そして前記キットが、前記抗ハイブリッド結合剤に結合することができる第２の結合剤を含み、前記第２の結合剤が、固体支持体上に固定される、項目１８〜２５の一項以上に記載のキット。
（項目２７）
前記キットが、ハイブリダイゼーション溶液を含む、項目１８〜２６の一項以上に記載のキット。
（項目２８）
あるグループのプローブ分子が、２〜１０、３〜８、または４〜６のプローブ分子を含む、項目１８〜２７の一項以上に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、次世代配列決定の適用のための標的ＲＮＡ枯渇化ＲＮＡ組成物を調製するための、ハイブリッド捕捉と組み合わせた短いプローブのグループの使用に基づく本発明による方法、および長いタグ付きプローブ分子を使用する直接的な捕捉方法を使用する先行技術の方法の間の差異を示す図である。左手側に、本発明による方法を示す。右手側の方法は、先行技術に相当する。  ステップＡにおいて、プローブ分子は、標的ＲＮＡにハイブリダイズする。図１、左側に示される本発明による方法において、２つのグループのプローブ分子を含むプローブセットが使用される。それぞれのグループは、同じ標的ＲＮＡ内の異なる標的領域を標的にする。それぞれのグループは、３つの短い連続した一本鎖ＤＮＡプローブ分子を含む。それらの標的領域に対してハイブリダイズした場合、より長い二本鎖ハイブリッドが、グループにおいて含まれる連続したプローブ分子の配列特異的なアニーリングにより形成される。グループにおいて含まれるすべてのプローブ分子が連続している、示される実施形態において、二本鎖ハイブリッドが形成され、ヌクレオチドギャップは、個々のグループのプローブ分子の間に存在しない。しかしながら、ホスホジエステル結合は、隣接したプローブ分子の連続したヌクレオチドの間に存在しない。それぞれのニックを図１に示す。連続した設計は、上記に説明したように、連続したプローブ分子の間のスタッキング効果により、形成された二本鎖ハイブリッドを安定化する。非標的ＲＮＡに対してミスマッチ（Ｘによって示す）により非特異的に結合した単一のプローブ分子もまた示す。しかしながら、短いプローブ分子が使用されるので、短い分子のアニーリング温度が、通常、ミスマッチの場合に、安定したハイブリッドを生成するのに低すぎるので、非標的ＲＮＡに対する単一のプローブ分子の非特異的な結合イベントは、安定したハイブリッドをもたらさない。したがって、非特異的に結合した短いプローブ分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用することによって除去することができる。ビオチンによってタグ付けされる、より長いプローブを使用する先行技術の方法において（右手側）、ミスマッチがより長いプローブ長により、より許容されるので、より多くの安定したハイブリッドが非標的ＲＮＡにより形成される。したがって、既にプローブハイブリダイゼーションのレベルで、本発明による方法は、短いプローブ分子が使用されるので、先行技術方法と比較して、有意により特異的である。  ステップＢにおいて、本発明による方法は、プローブ分子および標的ＲＮＡの間で形成される二本鎖ハイブリッドを捕捉するために、抗ハイブリッド結合剤、ここでは抗ハイブリッド抗体（Ｙによって示す）を使用する。抗ハイブリッド抗体が結合するエピトープのおよそのサイズは、通常、およそ２０ｎｔの範囲にある。一般に、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが長いほど、抗ハイブリッド抗体の結合効率はより良好となり、したがって、標的ＲＮＡの捕捉、したがって枯渇がより効率的となる。さらに、抗ハイブリッド抗体は、ミスマッチを許容しないまたはわずかなミスマッチしか許容しない。形成される二本鎖ハイブリッドがより完全なほど、��ハイブリッド抗体の結合効率はより良好となる。標的ＲＮＡおよびグループのプローブ分子の間で形成されるより長い完全なハイブリッドは、万一、単一のプローブが非標的ＲＮＡに対してミスマッチによりハイブリダイズしても、形成される短いハイブリッドよりもよく認識される。したがって、特異性は、実行されるハイブリッド捕捉ステップによりさらに増加する。先行技術の方法は、そのような中間の選択ステップを含まず、したがって、先行技術において、特異性は、プローブからのみ生じる。さらに、プローブ分子のグループが、標的ＲＮＡ内の特異的な標的領域を標的にするために使用され、前記標的領域が、好ましくは１００ｎｔ〜２５０ｎｔの長さを有するので、より多くの抗ハイブリッド抗体が、好ましくは１００ｎｔ〜２５０ｎｔの対応する長さを有する、結果として生じる二本鎖ハイブリッドに結合することができる。これは、除去効率を増加させる。  ステップＣにおいて、形成されたハイブリッド／結合剤複合体は、標的ＲＮＡを除去するために分離される。図１において示される本発明の実施形態において、プロテインＧにより官能性をもたせたビーズ（Ｇ−Ｂ）が使用され、これは、抗ハイブリッド抗体に結合し、したがって、形成されたハイブリッド／結合剤複合体に結合し、したがって捕捉する。しかしながら、非標的ＲＮＡに対する単一のプローブ分子の非特異的な結合により形成され得、したがって、上記に説明される理由で抗ハイブリッド抗体が結合しない二本鎖ハイブリッドは、捕捉されず、したがって、ステップＣにおいて残りのサンプルから分離されない。そのため、本発明による方法により、非特異的に形成された二本鎖ハイブリッドは、ステップＣにおいて除去されず、したがって、枯渇されない。したがって、本発明により得られた結果として生じる標的ＲＮＡ枯渇化組成物は、望ましいＲＮＡタイプの多様性を保持する、たとえば、望まれない標的ＲＮＡとしてｒＲＮＡを枯渇させる場合、とりわけ、ポリＡ  ｍＲＮＡ、アデニル化されていないｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、および調節ＲＮＡを保存する。さらに、先行技術において使用されるアフィニティータグアプローチと異なり、ハイブリダイズしたプローブのみが、抗ハイブリッド抗体によって認識され、したがって、本発明によって捕捉されるであろう。これは、非常に高度な枯渇効率および速い反応時間を導く。しかしながら、ストレプトアビジンにより官能性をもたせたビーズ（Ｓ−Ｂ）が使用される先行技術の方法において、非特異的に生成されたハイブリッドもまた、それらもまた、分離のために使用されるアフィニティータグ、ここではビオチンによりマークされるので、枯渇される。本発明による方法の素晴らしい効率および優れた特異性はまた、続く実施例においても示される。そこに示されるように、たとえ、本発明の方法が、たとえばｒＲＮＡなどのような標的ＲＮＡを除去することに非常に効率的であっても、かなり少ない望ましいＲＮＡしか非特異的に枯渇されず、それによって、他の偏りがないＲＮＡ種を保持する。
【図２−１】図２は、２５ｎｔ（青線）または５０ｎｔ（赤線）の長さを有するプローブ分子を使用して本発明による方法によって得られた１８Ｓ枯渇化ＲＮＡ組成物で得られたＡｇｉｌｅｎｔ（登録商標）データを示す図である（実施例ＩＩを参照されたい）。ａ）１８Ｓおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡの両方のピークを示すコントロールＲＮＡ（枯渇なし）；ｂ）２５０μｌ  １％  ｈｃ（ハイブリッド捕捉）ビーズにより得られた結果。Ｃ）５００μｌ  １％  ｈｃビーズにより得られた結果。
【図２−２】図２は、２５ｎｔ（青線）または５０ｎｔ（赤線）の長さを有するプローブ分子を使用して本発明による方法によって得られた１８Ｓ枯渇化ＲＮＡ組成物で得られたＡｇｉｌｅｎｔ（登録商標）データを示す図である（実施例ＩＩを参照されたい）。ａ）１８Ｓおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡの両方のピークを示すコントロールＲＮＡ（枯渇なし）；ｂ）２５０μｌ  １％  ｈｃ（ハイブリッド捕捉）ビーズにより得られた結果。Ｃ）５００μｌ  １％  ｈｃビーズにより得られた結果。
【図３】図３は、本発明による方法を使用する、１８Ｓ  ＲＮＡ枯渇のＲＴ−ＰＣＲ結果を示す図である。１８Ｓ  ｒＲＮＡは、形成されたハイブリッド／結合剤複合体の除去を改善する、増加性のビーズ量により有意に枯渇される。もとの１８Ｓ  ｒＲＮＡの０．５％未満しか、１８Ｓ  ｒＲＮＡ枯渇化サンプル中に残らなかった（実施例ＩＩを参照されたい）。
【図４】図４は、ハイブリッド捕捉手順によって影響されず、方法の特異性を実証する、２８Ｓ  ｒＲＮＡについての対応するＰＣＲ結果を示す図である（実施例ＩＩを参照されたい）。
【図５】図５は、２つの配列決定試行の結果を示す図である（実施例ＶＩＩを参照されたい）。第１の配列決定試行において、Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）、ＲｉｂｏＭｉｎｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ａ）抗体が磁気ビーズに対して共有結合される実施形態（本発明Ａ）ならびにｂ）遊離抗ハイブリッド抗体およびプロテインＧビーズを捕捉のために使用した実施形態（本発明Ｂ）を使用する本発明による方法、ならびにポリＡ濃縮を比較し、図５ａ）は、得られたバイオタイプ分布を示す。分かるように、本発明による方法は、先行技術のｒＲＮＡ枯渇方法と比較して、タンパク質をコードするｍＲＮＡを最も良く保存する。さらに、導入される偏りはより少なく、ＲＮＡサンプルの天然の多様性が保存される。図５ｂ）は、第２の配列決定試行からの結果を示す。ここで、ＲｉｂｏＭｉｎｕｓは、第１の配列決定試行の結果が性能が低かったことを示したので、再試験しなかった。代替的に、２つの異なるＲｉｂｏ−Ｚｅｒｏキットを試験し（Ｒｉｂｏ−ＺｅｒｏおよびＲｉｂｏ−Ｚｅｒｏ  Ｇｏｌｄ）、本発明による方法の実施形態と比較した。ここで、遊離抗ハイブリッド抗体およびプロテインＧにより官能性をもたせたビーズを捕捉のために使用し、一実施形態において、磁石を分離のために使用し、他の実施形態において、スピンフィルターを使用した。さらに、ポリＡ濃縮は、コントロールとして果たした。
【図６Ａ】図６は、枯渇方法の特異性を決定するために、ポリＡ濃縮方法から結果として生じるものと比較した、それぞれの枯渇方法（本発明、２つの先行技術の方法）の配列決定の後に、タンパク質をコードする遺伝子上にマップしたリードの数を示す図である（実施例ＶＩＩＩを参照されたい）。薄い灰色のドットは、ポリＡに基づく濃縮において失われる、ポリＡテイルを有しないｍＲＮＡ種（たとえばヒストン）由来のリードを示す。結果は、先行技術のｒＲＮＡ枯渇方法と比較して、１に近い有意により高度なＲ２値（０．８６）が先行技術の方法（０．３１および０．２７）と比較して達成されたので、本発明による方法が、もとのサンプルにおいて存在するｍＲＮＡのプロファイルを保存することを実証する。
【図６Ｂ】図６は、枯渇方法の特異性を決定するために、ポリＡ濃縮方法から結果として生じるものと比較した、それぞれの枯渇方法（本発明、２つの先行技術の方法）の配列決定の後に、タンパク質をコードする遺伝子上にマップしたリードの数を示す図である（実施例ＶＩＩＩを参照されたい）。薄い灰色のドットは、ポリＡに基づく濃縮において失われる、ポリＡテイルを有しないｍＲＮＡ種（たとえばヒストン）由来のリードを示す。結果は、先行技術のｒＲＮＡ枯渇方法と比較して、１に近い有意により高度なＲ２値（０．８６）が先行技術の方法（０．３１および０．２７）と比較して達成されたので、本発明による方法が、もとのサンプルにおいて存在するｍＲＮＡのプロファイルを保存することを実証する。
【図６Ｃ】図６は、枯渇方法の特異性を決定するために、ポリＡ濃縮方法から結果として生じるものと比較した、それぞれの枯渇方法（本発明、２つの先行技術の方法）の配列決定の後に、タンパク質をコードする遺伝子上にマップしたリードの数を示す図である（実施例ＶＩＩＩを参照されたい）。薄い灰色のドットは、ポリＡに基づく濃縮において失われる、ポリＡテイルを有しないｍＲＮＡ種（たとえばヒストン）由来のリードを示す。結果は、先行技術のｒＲＮＡ枯渇方法と比較して、１に近い有意により高度なＲ２値（０．８６）が先行技術の方法（０．３１および０．２７）と比較して達成されたので、本発明による方法が、もとのサンプルにおいて存在するｍＲＮＡのプロファイルを保存することを実証する。
【図７】図７は、タンパク質をコードする遺伝子のより好適なレプリゼンテーションについてのｒＲＮＡ枯渇の特異性を示す図である（実施例ＶＩＩＩを参照されたい）。本発明による方法（右のカラムを参照されたい）または先行技術の枯渇方法（ＲＺ＝ＲｉｂｏＺｅｒｏ、左のカラムを参照されたい；ＲＭ＝ＲｉｂｏＭｉｎｕｓ、中央のカラムを参照されたい）を使用するｒＲＮＡの枯渇後にサンプルにおいて存在するタンパク質をコードする遺伝子の数を、ポリＡ濃縮と比較した。両方とも、枯渇された遺伝子の数および枯渇の大きさは、本発明で有意により低い。
【図８】図８は、本発明による方法が、枯渇性能を保存しながら、１０ナノグラムほどのわずかな量で存在する全ＲＮＡから標的ＲＮＡを枯渇させることを可能にすることを示す図である（実施例Ｘを参照されたい）。等価な性能は、枯渇対ポジティブコントロールのデルタＣｔによって測定された本発明による方法により見られる。枯渇されるべきでないＲＮＡ（ここではベータアクチン）は、低濃度においてさえ保持される。
【図９】図９は、１２／１３ｎｔの長さを有するプローブ分子により得られた結果を示す図である（実施例ＸＩを参照されたい）。図９は、互いに隣接するプローブ分子を配置する場合、特に、より多くのプローブ分子が使用される場合、枯渇結果が改善されることを実証する。結果は、隣接の増加について先に説明した有益性を確認し、より多くのプローブの使用もまたより有益であることを示す。
【図１０】図１０は、様々なレベルの連続性での、ｂ−アクチンに対する特異性を示す図である（実施例ＸＩＩを参照されたい）。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
実施例
Ｉ．材料および方法
１．  ５Ｓ、５．８Ｓ、１８Ｓ、２８Ｓに対するＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブ
プローブは、ヒト、マウス、およびラットリボソームＲＮＡについての参照配列を採用し、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／）においてそれらをアライメントすることによって設計した。結果として生じるファイルを、３つの種の間で１００％相同性な領域について分析し、プローブを適宜設計した。ヒト、マウス、およびラットを主な設計基準として使用するが、これらのプローブは、種々様々の他の種におけるｒＲＮＡに対して相同性が高く、最も高度な相同性は他の哺乳動物の間で生じるが、有意な相同性はまた、すべての真核生物においても見つけられる。したがって、グループのプローブ分子およびプローブセットは、ここで実証されるよりもより多くの種について同時に設計することができる。植物、細菌、および他の生物はすべて、等しく有効であろう、設計された特異的なプローブセットを有することができる。プローブはまた、枯渇が関心のある、任意の特異的な核酸配列、たとえばグロビンＲＮＡ（たとえば全血調製物において）について設計することもできる。ミトコンドリアおよび色素体ｒＲＮＡは、同じ手段で枯渇させることができる。
【００９４】
プローブ設計についての第１の考慮は、連続した（「スタックした」）プローブ分子を含むグループを提供することであった。あるグループのプローブ分子によって標的にされる標的領域は、合計およそ１００〜１５０ｎｔのサイズを有した。より長いｒＲＮＡ（１８Ｓ、２８Ｓ）について、それぞれのグループが、標的ＲＮＡ内の様々な標的領域を標的にする、複数のグループのプローブ分子を含んだプローブセットを調製した。標的領域は、断片化されたおよびインタクトなｒＲＮＡの効率的な除去を可能にするために、標的リボソームＲＮＡが可能な限り均等にカバーされるように間隔を置いた。プローブ設計についての第２の考慮は、ＧＣ（４０〜６０％が好ましい）についてであった。１０ｎｔ〜５０ｎｔの長さを有するプローブを、実施例において設計し、試験した。２５ｎｔの長さが、より小さなプローブ長（特異性を増加させ、その後、より少ない干渉を確実にするため）および枯渇性能（より長いプローブはわずかにより効率的である）の間の妥協点として好ましかった。この組み合わせは、特に、本明細書において記載される連続したプローブ設計が使用される場合、高度な特異性を確実にしながら、非常に高度な枯渇性能を確実にする。これは、特に、本明細書において記載される理由で、抗ハイブリッド抗体を使用する場合、達成される。
【００９５】
使用した２５塩基長を表１に示す。標的ＲＮＡにおける標的領域を標的にするグループのプローブ分子を示す。プローブ名は、標的ＲＮＡ（たとえば５Ｓ  ｒＲＮＡ）、種（ＨＭＲ＝ヒト、マウス、ラット）、標的ｒＲＮＡ上のヌクレオチド位置（たとえば２）、およびプローブ長（２５）の情報を提供する。分かるように、短いＲＮＡ（５Ｓ  ＲＮＡおよび５．８Ｓ  ＲＮＡ）を枯渇させるために、１つのグループのプローブ分子を標的ＲＮＡごとに使用した。５Ｓ  ＲＮＡを標的にするためにグループにおいて含まれる４つのプローブ分子はすべて連続している。５．８Ｓ  ＲＮＡを標的にするグループにおいて含まれる第１および第２ならびに第３および第４のプローブ分子は連続しているが、３ｎｔのギャップが第２および第３のプローブ分子を隔てている。１８Ｓ  ＲＮＡを標的にするために、５つのグループのプローブ分子からなるプローブセットを使用し、それぞれのグループは６つのプローブ分子を含む。すべてのグループのプローブ分子は、第１のグループを除いて連続したが、１ｎｔのギャップが、第２のプローブ分子から第１のプローブ分子を隔てている。したがって、１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブセットにおいて含まれる９５％を超えるプローブ分子は、それらのグループメンバーに対して連続した。長い２８Ｓ  ｒＲＮＡを枯渇させるために、１３のグループのプローブ分子を含むプローブセットを使用した。分かるように、グループＩＩＩを除いて、グループのすべてのプローブ分子が連続している、グループのプローブ分子を使用した。グループＩＩＩにおいて、隣接したプローブ分子を使用した。しかしながら、標的領域に対してハイブリダイズし、それによって二本鎖ハイブリッドを形成する場合、２０ｎｔ以下のギャップが、プローブ分子の間に存在した。
【００９６】
【表１−１】
0006324962.tif 000002
【００９７】
【表１−２】
0006324962.tif 000003
【００９８】
【表１−３】
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【００９９】
２．抗ハイブリッド抗体および磁気ビーズ
抗ハイブリッド抗体により官能性をもたせた磁気ビーズ（ｈｃビーズ）として、カルボキシル化ビーズにカップリングされた抗ハイブリッド抗体の１％固体溶液を使用した。代替的に、抗ハイブリッド抗体を溶液において遊離して使用し、次いで、抗体に対する親和性を有する結合剤、実施例において、ＢｉｏＭａｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇビーズなどのような、プロテインＧにより官能性をもたせた磁気ビーズによって捕捉した。
【０１００】
３．ハイブリダイゼーションバッファー
２０×ＳＳＣをハイブリダイゼーションのために追加した。１０μｌ  ２０×ＳＳＣを１００μｌ組成物に対して追加し、それによって、２×ＳＳＣハイブリダイゼーション溶液にした。ハイブリダイゼーション溶液は、ＲＮアーゼ阻害剤、ここでは抗ＲＮアーゼ抗体を含んだ。
【０１０１】
４．プロトコール
マニュアルのプロトコールは、特に指定のない限り、精製全ＲＮＡサンプルから出発して、以下のように実行した。
【０１０２】
【表１−４】
0006324962.tif 000005
【０１０３】
捕捉のために「遊離」抗ハイブリッド抗体およびプロテインＧにカップリングされたビーズを使用する場合、プロテインＧビーズは、ｈｃビーズについて記載されるように調製し、抗ハイブリッド抗体は、ステップ２においてハイブリダイゼーション混合物に対して追加する。上記に議論されるように、短いＲＮＡの変性は、抗ハイブリッド抗体の機能を損ねない。
【０１０４】
標的ＲＮＡ枯渇化サンプルは、直ちに、アッセイすることができるもしくはさらに処理することができる（たとえばＲＴ−ｑＰＣＲ、配列決定ライブラリーの調製によって）、またはそれは、たとえば過剰なプローブ、バッファー構成成分などを除去するためにアッセイ前に精製することができる。シリカカラム、ゲル電気泳動、エタノール沈殿、およびその他同種のものを含む複数の精製および濃縮方法が、可能である。
【０１０５】
ＩＩ．標的プローブおよびハイブリッド捕捉による１８Ｓ  ｒＲＮＡの除去
この実施例は、原理の証拠を実証するために実行した。それは、本発明による方法が標的にされたリボソームＲＮＡの非常に効率的で特異的な除去を可能にすることを示す。ヒト、マウス、およびラット１８ＳリボソームＲＮＡ配列から設計したＤＮＡプローブ分子を使用した。６×５０塩基長（赤線）または１２×２５塩基長（青線）を、標的ＲＮＡとして１８Ｓ  ＲＮＡを標的にするために使用し、プローブは、それぞれ１００ｎｔの３つのグループで配置し、１８Ｓ配列にわたって均等に分布した。グループのプローブ分子を全ＲＮＡと接触させ、１８Ｓ標的ＲＮＡに対するプローブ分子のハイブリダイゼーションを可能にした。それらの表面上に抗ハイブリッド抗体を持つ様々な量の磁性粒子（ｈｃビーズ）を、形成されたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを捕捉するために使用した。形成されたハイブリッド／結合剤複合体が結合した磁性粒子を、磁場を適用することによって収集し、残りのサンプルから分離し、１８Ｓ  ｒＲＮＡ枯渇化ＲＮＡ組成物がもたらされ、これを次いで分析した。
【０１０６】
図２は、異なるプロトコールによって調製した１８Ｓ枯渇化ＲＮＡ組成物により得られたＡｇｉｌｅｎｔ（登録商標）データを示す。図ａ）は、コントロールＲＮＡ（枯渇なし）の結果を示し、したがって、１８Ｓおよび２８ＳリボソームＲＮＡの両方のピークを有する。図ｂ）は、２５０μｌ  １％  ｈｃビーズにより得られた結果を示す。小さな１８Ｓピークは、２５塩基長プローブ分子を含むグループでのみ識別可能である（青線）。図ｃ）は、５００μｌ  １％  ｈｃビーズにより得られた結果を示す。１８Ｓピークは、両方のプローブミックスにおいてなくなっている。重要なことには、２８Ｓピークのサイズは、本発明による方法によって影響されず、これは、隣接したプローブ分子のグループを使用する本発明のハイブリッド捕捉手順の特異性を実証する。図３は、枯渇についてのＰＣＲ調査結果を示す。１８Ｓおよび２８ＳリボソームＲＮＡの相対的な枯渇を、ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ−ＱサイクラーでＱｕａｎｔｉＦａｓｔ試薬（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を使用して、ＲＴ−ＰＣＲにより調査した。それは、１８Ｓ  ｒＲＮＡが、ビーズ量の増加と共により有意に枯渇されることを示す。使用した試験環境の最善の場合で、７．８８のデルタＣｔが観察され、２００×よりも大きな枯渇を示し、これは、もとの１８Ｓ  ｒＲＮＡの０．５％未満しかサンプル中に残らなかったことを意味する。したがって、たとえ、わずか３つのグループのプローブ分子しか含まないプローブセットを１８Ｓ  ＲＮＡを標的にするために使用したとしても、本発明による方法は、非常に効率的である。続く実施例によって示されるように、プローブセットにおいて含まれるプローブ分子のグループの数を増加させることは、枯渇効率をさらに増加させることを可能にする。図４は、２８Ｓ  ｒＲＮＡがハイブリッド捕捉手順によって影響されないことを示し、本発明による方法の特異性を実証する。
【０１０７】
本明細書において記載されるように、２５塩基長など３５ｎｔ以下または３０ｎｔ以下の長さを有する、より短いプローブを使用することは、特異性が改善されるので、より長いプローブ長を使用することにまさって、さらに、５０ｎｔの長さを有するプローブを使用することにまさって有利である。クロスハイブリダイゼーションにより非標的ＲＮＡを捕捉する危険性は、プローブ長と共に増加する。本明細書において記載されるより短い連続したプローブの使用は、個々の短いプローブのものが抗ハイブリッド抗体による効率的な認識には短すぎるので、有利である。たとえば、２つの短いプローブが同じ場所にクロスハイブリダイズすることは全くありそうにない。
【０１０８】
ＩＩＩ．５μｇの全ＲＮＡからの１８Ｓ、２８Ｓ、５Ｓ、および５．８Ｓ  ｒＲＮＡの除去
この実施例において、本発明による方法を先行技術の方法（ＲｉｂｏＭｉｎｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））と比較した。全ＲＮＡを出発物質として使用し、５Ｓ、５．８Ｓ、１８Ｓ、および２８Ｓ  ｒＲＮＡを両方の方法を使用して同時に枯渇させた。２つの方法によって得た標的ｒＲＮＡ枯渇化ＲＮＡ組成物を、ｑＰＣＲによって分析し、同じ方法に従って処理したポジティブコントロールと比較して定量化した。
【０１０９】
表２は、本発明の方法またはＲＮＡ枯渇方法ＲｉｂｏＭｉｎｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による精製の後に残るそれぞれのリボソームＲＮＡ種の除去％を示す。本発明による方法は、特により大きなリボソームＲＮＡについて、効率に関して先行技術の方法ＲｉｂｏＭｉｎｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）より優れている。
【０１１０】
【表２】
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【０１１１】
さらに、ハイブリダイゼーション条件を最適化し、２８Ｓ  ｒＲＮＡに対するプローブセットにおいてより多くのグループのプローブ分子を使用することによって、改善された結果が得られ、枯渇効率は、さらに、２８Ｓ  ｒＲＮＡに関して９９．９７％以上であった（下記を参照されたい）。
【０１１２】
ＩＶ．分解されたＲＮＡからのｒＲＮＡの除去
標的ＲＮＡの一般的な例として分解されたｒＲＮＡを除去するための本発明による方法の効率を試験するために、ＲＮＡを３０分間にわたって８０℃で分解した。ｒＲＮＡは、本発明による方法を使用して、０分、１０分、２０分、および３０分でそれぞれのＲＮＡ含有組成物から枯渇させた。表３は、それぞれの時点についてコントロールに対して正規化した、ｒＲＮＡ枯渇化ＲＮＡのＰＣＲ分析によって得られた結果を示す。インキュベーション時間が長いほど、減少しているＲＮＡの完全性についての数値（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｎｕｍｂｅｒ）（ＲＩＮ）から導き出すことができるようにＲＮＡ分解が高度になる。高度に分解されたＲＮＡサンプル（ＲＩＮ  ３．７）の場合でさえ、９７％を上回る枯渇効率が長い２８Ｓ  ＲＮＡに対してでさえ達成された。これは、本発明による方法がまた、分解され、したがって断片化されたＲＮＡの場合にも、非常に効率的であることを実証する。
【０１１３】
【表３】
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【０１１４】
Ｖ．ハイブリッド捕捉によるｒＲＮＡ枯渇の自動化
標的ＲＮＡ枯渇の後に、クリーンアップステップをライブラリー構築前に実行することができる。それによって、非結合プローブ分子を除去することができる。ＱＩＡｃｕｂｅで容易に自動化することができる方法であるＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅは、この目的のために使用することができる。さらに、本発明のハイブリッド捕捉方法もまた、自動化に非常に適しており、２つの温度でのインキュベーション（一方は好ましくは振盪させながら）および捕捉された複合体の分離を必要とするだけである。これらのステップもまた、自動化することができる。一実施形態によれば、ハイブリダイゼーション混合物が、調製されてもよく、ＲＮＡ組成物を、７０℃でオフラインで変性させることができる。次いで、それぞれ調製されたサンプルは、ＱＩＡｃｕｂｅ上のヒーター／振盪機に移動され、ここで、ビーズが追加され、ハイブリダイゼーションおよび捕捉が行われる。次いで、反応物を中央のＱＩＡｃｕｂｅ位置のスピンカラムへ移し、これにより、ビーズをろ過し、それによってハイブリッド／結合剤複合体を除去する。除去されるｒＲＮＡを有するフィルタースピンを廃棄し、ｒＲＮＡ枯渇化ＲＮＡ組成物を含むフロースルーを、ＱＩＡｃｕｂｅでＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｅｌｕｔｅプロセスによって直接処理する。ＱＩＡｃｕｂｅで処理した後に得られたＣｔ値を、様々なフィルター材料で分析した。ＱＩＡｃｕｂｅ機で処理されたサンプルはすべて、手作業で処理されたサンプルと性能において等価であり、磁気ビーズは、磁場を使用することによって除去し、関連するポジティブコントロールよりも１０〜１２サイクル好適であった（９９．９％よりも大きな枯渇と等しい）。ベータアクチンは、特異性コントロールとして果たした。
【０１１５】
ＶＩ．本発明による方法を使用する５μｇの全ＲＮＡからの１８Ｓ、２８Ｓ、５Ｓ、５．８Ｓ、１２Ｓ  ｍｔ、および１６Ｓ  ｍｔ  ｒＲＮＡの除去
枯渇を上記に記載されるように実行したが、１２Ｓミトコンドリア（ｍｔ）ｒＲＮＡおよび１６Ｓミトコンドリア（ｍｔ）ｒＲＮＡを枯渇させるためのプローブもまた含んだ。表４は、本明細書において記載される方法を使用して標的ＲＮＡとして同時に枯渇させたリボソームＲＮＡのそれぞれについて、本発明により達成されたデルタＣｔ値および対応する除去％を示す。５Ｓ、５．８Ｓ、１８Ｓ、および２８Ｓを枯渇させるために、材料において記載されるようなグループおよびプローブセット（表１を参照されたい）を使用し、さらに、対応して設計されたプローブセットを、１２Ｓおよび１６ＳミトコンドリアｒＲＮＡを枯渇させるために使用した。測定はｑＰＣＲによって実行した。
【０１１６】
【表４】
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【０１１７】
また分かるように、本発明による方法は、すべての標的ＲＮＡの非常に効率的な枯渇を可能にする。
【０１１８】
ＶＩＩ．本発明による方法または先行技術のｒＲＮＡ枯渇方法を使用する５μｇの全ＲＮＡからの１８Ｓ、２８Ｓ、５Ｓ、および５．８Ｓ  ｒＲＮＡの除去
ｒＲＮＡを、様々な先行技術の方法および本発明の方法を使用して全ＲＮＡサンプルから枯渇させた。全ＲＮＡを出発物質として使用し、５Ｓ、５．８Ｓ、１８Ｓ、および２８Ｓ  ｒＲＮＡをすべての方法により枯渇させた。さらに、１２Ｓおよび１６ＳミトコンドリアｒＲＮＡは、本発明によるプローブ設計を使用して枯渇させた。先行技術の方法として、ポリＡ濃縮、Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、およびＲｉｂｏ−Ｍｉｎｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、メーカーの指示に従って使用した。ミトコンドリアｒＲＮＡもまた、第２の実験において使用したＲｉｂｏ−Ｚｅｒｏ  Ｇｏｌｄキットを使用して枯渇させる。
【０１１９】
本発明による方法は、抗ハイブリッド抗体が磁気ビーズに対して共有結合される実施形態（本発明Ａ）ならびに遊離抗ハイブリッド抗体およびプロテインＧビーズを捕捉のために使用した実施形態（本発明Ｂ）を使用して、第１の配列決定の試行において実行した。枯渇後に、ＲＮＡの残りをＭｉＳｅｑでのＮＧＳ試行によって分析し、タンパク質コードＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｔ−ｒＲＮＡ、ｓｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および他に分類した（図５ａ−第１の配列決定からの結果を参照されたい）。ＲＮＡ決定は、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子データベースおよびＢｏｗｔｉｅ  ２マッピングを使用して行った。第２の配列決定試行において、ＲｉｂｏＭｉｎｕｓは、第１の配列決定試行の結果について性能が低かったことを示したので、再試験しなかった。その代わりに、２つの異なるＲｉｂｏ−Ｚｅｒｏキットを試験し（Ｒｉｂｏ−ＺｅｒｏおよびＲｉｂｏ−Ｚｅｒｏ  Ｇｏｌｄ）、本発明による方法の実施形態と比較した。ここで、遊離抗ハイブリッド抗体およびプロテインＧにより官能性をもたせたビーズを捕捉のために使用し、一実施形態において、磁石を分離のために使用し、他の実施形態において、スピンフィルターを使用した。配列決定およびＲＮＡ分類は、ｓｎＲＮＡをさらなるカテゴリーとして、記載されるように行った（図５ｂ−第２の配列決定からの結果を参照されたい）。
【０１２０】
図５ａ）によって示されるように、ｒＲＮＡ含有量は、本発明により２％以下となり、ポリＡ濃縮およびＲｉｂｏ−Ｚｅｒｏもまた、ｒＲＮＡの良好な除去を示す。対照的に、ｒＲＮＡ含有量は、先行技術の方法ＲｉｂｏＭｉｎｕｓにより２８％となる。さらに、ミトコンドリアｒＲＮＡは、ＲｉｂｏＭｉｎｕｓおよびＲｉｂｏ−Ｚｅｒｏによりなお存在するが、それは、本発明による方法を使用する場合、枯渇される。さらに、一般的なトランスクリプトーム分析においてそれほど関心のないものでもあるｓｃＲＮＡ（７ＳＬ、Ａｌｕ）は、Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏにより強く濃縮され、それによって、ＲＮＡタイプの自然分布を歪める。さらに、分かるように、ポリＡ  ＲＮＡの濃縮の代わりとなるｒＲＮＡの枯渇に基づく方法（本発明、ＲｉｂｏＺｅｒｏ、ＲｉｂｏＭｉｎｕｓ）は、ポリＡ濃縮よりも、関心のあるより多くの非コードＲＮＡ種（ポリＡテイルを含まない）を保存する。結果は、図５ｂ）によって示される第２の配列決定試行において確認した。本発明による方法は、関心のある複数のＲＮＡタイプの自然分布を最も良く保存するが、望まれない標的ＲＮＡを効率的に枯渇させる。そのため、本発明は、改善された枯渇方法を提供することによって有意に貢献する。
【０１２１】
ＶＩＩＩ．得られた枯渇ライブラリーにおける偏りの分析
上記に議論されるように、ハイブリダイゼーションによる枯渇が実行される場合、望ましいＲＮＡの非特異的枯渇は、危険である。本発明による方法および先行技術の枯渇方法の相対的な性能を測定するために、３つの枯渇方法すべてからのタンパク質をコードするリードを、ポリ（Ａ）ライブラリーと比較した。枯渇の後に、サンプルをライブラリーにし、およそ１００万リード／サンプルの深さ（ｄｅｐｔｈ）までＩｌｌｕｍｎｉａプラットフォームで配列決定した。タンパク質コード遺伝子に対応するリードを、サンプルにおいてｍＲＮＡの通常のレプリゼンテーション（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を示すと思われるポリＡ濃縮サンプルからなるライブラリーと比較した。結果はすべて、ＭｉＳｅｑ実験からのものであった。遺伝子数を正規化し、散布図、それぞれのライブラリー対ポリ（Ａ）としてプロットした。高度な一致は、タンパク質をコードする遺伝子のレプリゼンテーションが、ポリＡライブラリーにおいて見られるものから外れていないことを示す。
【０１２２】
図６から分かるように、本発明による方法（図６ａ）は、ＲｉｂｏＭｉｎｕｓ（図６ｂ）およびＲｉｂｏ−Ｚｅｒｏ（図６ｃ）と比較して、ポリＡ  ｍＲＮＡの自然のレプリゼンテーションを最も良く保存した。ライトグレーでマークする遺伝子は、アデニル化されていないｍＲＮＡであるヒストンである。それらは、枯渇ライブラリーにおいて濃縮されることが期待される。結果は、先行技術のｒＲＮＡ枯渇方法と比較して、１に近い有意により高度なＲ２値（０．８６）が先行技術の方法（０．３１および０．２７）と比較して達成されたので、本発明による方法が、もとのサンプルにおいて存在するｍＲＮＡのプロファイルを保存することを実証する。ｒＲＮＡ枯渇方法による、情報価値のあるＲＮＡの非特異的な枯渇は、ｒＲＮＡプローブおよび他のｍＲＮＡ配列の間の相互作用のために危険である。図７から分かるように、枯渇された遺伝子の数およびそれらが枯渇される倍数は、本発明による方法よりも、２つの先行技術方法において、有意に高度である。観察された最大の枯渇倍数は、１０であり、先行技術の方法は、５０までの枯渇倍数を示した。したがって、本発明による方法は、先行技術の方法と比較して、有意により少ない枯渇されたｍＲＮＡおよび枯渇の最大のレベルの減少を示す。そのため、本発明による方法は、非特異的なハイブリダイゼーション、したがって、タンパク質をコードする転写物の望まれない枯渇が、それほど生じないので、有意に改善された特異性を示す。これは、非特異的ハイブリダイゼーションが先行技術の方法よりも本発明で非常に低いことを示す。
【０１２３】
すべてを考慮して、図６および７は、先行技術の枯渇方法が、特に非標的ＲＮＡの非特異的な除去によって、サンプルにおける、タンパク質をコードする遺伝子（ポリＡ）ＲＮＡのレプリゼンテーションを歪め得ることを示す。対照的に、本発明による方法は、ポリＡ濃縮とより優れた一致を示し、他のＲＮＡ種およびタンパク質をコードする遺伝子の天然のレプリゼンテーションを保存する。
【０１２４】
ＩＸ．様々な長さおよび濃度を有するプローブセットを使用する５Ｓ  ｒＲＮＡおよびβ−アクチンｍＲＮＡの枯渇
ＲＮＡサンプルは、ハイブリッド捕捉抗体およびスタックした短いｒＲＮＡプローブのセットを使用してｒＲＮＡを枯渇させた。プローブは、プローブ当たり１０、１５、２０、または２５ヌクレオチドの長さを有し、１００ｎｍ、１μＭ、または１０μＭの濃度で使用した。以下のグループを使用した：４×２５塩基長、５×２０塩基長、７×１５塩基長、および１０×１０塩基長。ｒＲＮＡ枯渇後に、サンプルは、５Ｓ  ＲＮＡ（表５）およびβ−アクチンｍＲＮＡ（表６）のリアルタイムＰＣＲ検出によって分析した。二連のアッセイから導き出した平均Ｃｔ値および標準偏差を、下記の表に示す。
【０１２５】
【表５】
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【０１２６】
ポジティブコントロールについての結果は、１００ｎＭおよび１μＭ試験環境について１５．５５＋／−０．１１であり、１０μＭ試験環境について１５．１６＋／−０．１４であり、これは別々に実行した。表５は、捕捉するために使用した抗ハイブリッド抗体が、既に１００ｎＭで２０および２５塩基長の場合に５Ｓ  ｒＲＮＡを効率的に枯渇させることを示す。さらなる実験は、５０ｎＭのより低い濃度もまた、機能することを示した。１５塩基長は、プローブ濃度を１μＭまで増加させる場合に働くが、１０塩基長は、１０μＭのプローブ濃度で適している。この実施例は、様々な長さのプローブ分子が適していることを実証する。
【０１２７】
【表６−１】
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【０１２８】
ポジティブコントロールについての結果は、１００ｎＭおよび１μＭ試験環境について２４．１０＋／−０．４３であり、１０μＭ試験環境について２２．１０＋／−０．８２であり、これは別々に実行した。
【０１２９】
β−アクチンｍＲＮＡは、サンプルからｒＲＮＡと一緒に同時に枯渇されなかった。したがって、本発明の方法は、ｍＲＮＡの同時の枯渇を伴うことなく、ｒＲＮＡの枯渇に対して特異的である。
【０１３０】
Ｘ．低濃度のスタックした短いプローブはｒＲＮＡの特異的な枯渇に十分である
１８Ｓおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡは、本発明による方法を使用して、様々な濃度（１μｇ、０．２５μｇ、０．１μｇ、０．０２５μｇ、および０．０１μｇ）で全ＲＮＡから枯渇させた。枯渇後に、サンプルは、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、２８Ｓ  ｒＲＮＡ、およびβ−アクチンｍＲＮＡについてリアルタイムＰＣＲによって分析する。ΔＣｔ値は、サンプル対ポジティブコントロールの比を使用して計算する。
【０１３１】
図８によって示されるように、ｒＲＮＡは、非常に低い量の全ＲＮＡインプット材料（１０ｎｇ）を使用する場合でさえ、効率的かつ特異的に枯渇させることができる。
【０１３２】
ＸＩ．ｒＲＮＡ枯渇効率はプローブの連続性および数と共に増加する
ｒＲＮＡ枯渇に対するプローブ数およびプローブ連続性の効果を分析するために、標的ｒＲＮＡ内の３００ｂｐまたは６００ｂｐに対して互いに隣接してまたは隣接しないでアニールする短い１２／１３塩基長プローブを設計した。ｒＲＮＡ枯渇は、抗ハイブリッド抗体を使用して実行し、枯渇化サンプルは、１８Ｓ  ｒＲＮＡの検出のために定量的リアルタイムＰＣＲによって分析した。２つの隣接および４つの隣接の間の差異は、単一のまたはペアで隣接する２５塩基長と似ている。８つの隣接は、四つ組の２５塩基長に似ている。図８は、定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。したがって、デルタＣｔ値に頼るよりも、どれだけ残されたかを正確に定量化することができた。実験は、隣接したプローブを使用することによって達成することができる高度な連続性が、ハイブリッド捕捉戦略を使用するｒＲＮＡ枯渇に対して有益であることを示す。さらに、隣接した結合プローブの数を増加させることもまた、ｒＲＮＡ枯渇のための効率を増加させる。
【０１３３】
ＸＩＩ．抗ハイブリッド抗体および短いプローブを使用するｒＲＮＡ枯渇効率
以下の実験は、抗ハイブリッド抗体が特異的であり、完全にマッチした配列でさえその短い領域を認識しないであろうということを示す。
【０１３４】
下記の表は、１８Ｓに対して特異的なプローブの様々なミックスの枯渇効率（太字）および抗体が２０〜２５ｎｔサイズの領域を認識する必要性を示す。この実験において使用したプローブは、１２または１３塩基長とした。ミックス１およびミックス２は、同じ数のプローブを使用し、ミックス２は、連続したプローブ設計を有した。ミックス２のみがｒＲＮＡの除去に効率的である。これは、１２〜１３ｎｔが連続した様式でハイブリダイズしない場合、抗体による認識に不十分であるが、２つの連続したプローブのハイブリダイゼーションによって得られた２５ｎｔは十分であることを示す。１２〜１３ｎｔのマッチは、２５塩基長のマッチよりも偶然生じる可能性がかなり高い。１３塩基長のマッチは、ビオチン標識プローブを使用する場合、オフターゲットＲＮＡをプルダウンする（ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ）のに十分になり得るが、抗ハイブリッド抗体を使用する場合、十分ではない。
【０１３５】
【表６−２】
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【０１３６】
図１０は、サンプルを上記の表において示されるミックスにより処理した場合のベータアクチンに対する効果を示す。条件の間に差異はなく、ｒＲＮＡ除去の効率の増加と共に、非標的ＲＮＡに対する効果はないことを示す。これもまた、達成される特異性を実証する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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