(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸が接合されたエキセナチド類似体を有効成分として含み、
前記エキセナチド類似体は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるエキセナチドのＣ末端の７〜９個のアミノ酸が欠失し、
前記アミノ酸が欠失したエキセナチドのＣ末端にリシンリンカーを通じて前記脂肪酸が接合されたものである糖尿病改善、予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項２】
前記脂肪酸は、吉草酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、及びアラキジン酸で構成された群から選択される脂肪酸であることを特徴とする請求項１に記載の糖尿病改善、予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項３】
脂肪酸が接合されたエキセナチド類似体を有効成分として含み、
前記エキセナチド類似体は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるエキセナチドのＣ末端の７〜９個のアミノ酸が欠失し、
前記アミノ酸が欠失したエキセナチドのＣ末端にリシンリンカーを通じて前記脂肪酸が接合されたものである肥満改善、予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項４】
前記脂肪酸は、吉草酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、及びアラキジン酸で構成された群から選択される脂肪酸であることを特徴とする請求項３に記載の肥満改善、予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項５】
脂肪酸が接合されたエキセナチド類似体を有効成分として含み、
前記エキセナチド類似体は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるエキセナチドのＣ末端の７〜９個のアミノ酸が欠失し、
前記アミノ酸が欠失したエキセナチドのＣ末端にリシンリンカーを通じて前記脂肪酸が接合されたものである食欲抑制用薬剤学的組成物。
【請求項６】
前記脂肪酸は、吉草酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、及びアラキジン酸で構成された群から選択される脂肪酸であることを特徴とする請求項５に記載の食欲抑制用薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１４年３月２１日付で大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１４−００３３７１２号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参考として組み込まれる。
【０００２】
本発明は、新規なエキセナチド類似体及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
エキセナチド（Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）は、米国南西部に生息するアメリカドクトカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）の唾液腺から分離されたＧＬＰ−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−１）の機能的類似体（ａｎａｌｏｇ）であって、２型糖尿病治療剤として使われている。学術名‘Ｅｘｅｎｄｉｎ−４’であるエキセナチドは、３９個のアミノ酸で構成された生理活性ペプチドであって、ヒト生体内に存在するが、ＧＬＰ−１と５３％アミノ酸が類似し、ＤＰＰ−４（Ｄｉｐｅｔｉｄｙｌ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４）のような分解酵素に安定して、ＧＬＰ−１に比べて体内半減期が比較的長い。
【０００４】
エキセナチドは、１日２回、朝と夕方の食事以前に投与する。エキセナチドは、腎臓に排泄されるので、深刻な腎臓機能の損傷や末期腎疾患を有した患者への使用は推薦されない。エキセナチドの排泄は、肝機能に依存的ではないので、肝に代謝される薬物と相互作用を有さない。一方、エキセナチドは、胃腸管運動性（ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ）に影響を与えるために、吸収と関連して、他の薬物と相互作用を起こしうる。
【０００５】
また、エキセナチドペプチドの合成過程で過量の試薬と材料とのコスト高になるという短所がある。また、反応段階数が多く、各段階別に中間体を遊離しなければならず、また、異性体が生じる可能性があって、精製することも容易ではない。
【０００６】
前述したように、エキセナチドの短い半減期によって、１日２回投与、高い製造コストのような既存のエキセナチドの短所が改善されなければならない問題点を有している。したがって、エキセナチドの安定性と効能とを改善しながら、製造コストを減らす方法についての研究は、医薬産業分野で非常に重要な技術であると言える。
【０００７】
本明細書の全般に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、ＧＬＰ−１の機能的アナログであって、糖尿病治療剤として使われるエキセナチドの効能と安定性、製造方法を改善するために努力した。その結果、従来のエキセナチドと同じ効能を有しながら、ペプチド分解酵素に高い安定性を示す短い脂肪酸エキセナチド類似体を開発することによって、本発明を完成した。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、エキセナチド類似体を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、糖尿病改善、予防または治療用薬剤学的組成物を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、肥満改善、予防または治療用薬剤学的組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、食欲抑制薬剤学的組成物を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一態様によれば、本発明は、エキセナチドのアミノ酸配列のＣ末端の１〜１５個のアミノ酸が欠失され、脂肪酸が接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）されたエキセナチド類似体を提供する。
【００１５】
本発明者らは、ＧＬＰ−１の機能的アナログであって、糖尿病治療剤として使われるエキセナチドの効能と安定性、製造方法を改善するために努力した。その結果、従来のエキセナチドと同じ効能を有しながら、ペプチド分解酵素に高い安定性を示す短い脂肪酸エキセナチドを開発した。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明は、エキセナチド類似体、糖尿病改善または肥満の予防、または治療用薬剤学的組成物、及び食欲抑制用薬剤学的組成物を提供する。
（ｂ）本発明は、従来のエキセナチド及び抗糖尿病剤であるリラグルチドと比較して、ほぼ同じレベルの抗糖尿病効果を示す。
（ｃ）本発明は、従来のエキセナチドの製造コストを節減することができる短い長さのエキセナチドを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４類似体にＮＥＰ２４．１１処理２４時間後の残存ペプチドの比率を示す。
【図２ａ】ＧＬＰ−１受容体に対する活性及びＥｘ−４構造との関連性を比較分析したＣＤスペクトルを示す。
【図２ｂ】ＧＬＰ−１受容体に対する活性及びＥｘ−４構造との関連性を比較分析したＣＤスペクトルを示す。
【図３ａ】ｅｘ４（１−３０）−脂肪酸コンジュゲートにＮＥＰ２４．１１処理２４時間後の残存ペプチドの比率を示す。
【図３ｂ】ｅｘ４（１−３０）−脂肪酸コンジュゲートにＮＥＰ２４．１１処理２４時間後の残存ペプチドの比率を示す。
【図３ｃ】ｅｘ４（１−３０）−脂肪酸コンジュゲートにＮＥＰ２４．１１処理２４時間後の残存ペプチドの比率を示す。
【図４】ｅｘ４（１−３２）−脂肪酸コンジュゲートにＮＥＰ２４．１１処理２４時間後の残存ペプチドの比率を示す。
【図５】ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートのインスリン分泌程度を示す。
【図６】脂肪細胞に対するｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートの脂肪分解（ｌｙｐｏｌｙｓｉｓ）程度を示す。
【図７ａ】ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲート４種のインビボ糖負荷効能を確認した結果を示す。
【図７ｂ】ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲート４種のインビボ糖負荷効能を確認した結果を示す。
【図８ａ】ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲート４種の２４時間インビボ抗糖尿病効能を確認した結果を示す。
【図８ｂ】ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲート４種の２４時間インビボ抗糖尿病効能を確認した結果を示す。
【図９ａ】ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲート４種の２４時間濃度依存的抗糖尿病効能を確認した結果を示す。
【図９ｂ】ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲート４種の２４時間濃度依存的抗糖尿病効能を確認した結果を示す。
【図１０ａ】リラグルチド及びｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートの効能比較実験であって、血糖測定１日目の結果を示す。
【図１０ｂ】リラグルチド及びｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートの効能比較実験であって、血糖測定１日目の結果を示す。
【図１１ａ】リラグルチド及びｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートの効能比較実験であって、血糖測定８日目の結果を示す。
【図１１ｂ】リラグルチド及びｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートの効能比較実験であって、血糖測定８日目の結果を示す。
【図１２ａ】リラグルチド及びｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートの効能比較実験であって、血糖測定１５日目の結果を示す。
【図１２ｂ】リラグルチド及びｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートの効能比較実験であって、血糖測定１５日目の結果を示す。
【図１３ａ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の皮下投与による血糖降下効能を示す。
【図１３ｂ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の皮下投与による血糖降下効能を示す。
【図１４ａ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の皮下投与によるグルコース耐性を示す。
【図１４ｂ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の皮下投与によるグルコース耐性を示す。
【図１５ａ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の皮下投与による長時間血糖降下効能を示す。
【図１５ｂ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の皮下投与による長時間血糖降下効能を示す。
【図１６ａ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の皮下投与のグルコース耐性をエキセナチド及びリラグルチドと比較して示す。
【図１６ｂ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の皮下投与のグルコース耐性をエキセナチド及びリラグルチドと比較して示す。
【図１７ａ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の皮下投与による血糖降下効能をエキセナチド及びリラグルチドと比較して示す。
【図１７ｂ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の皮下投与による血糖降下効能をエキセナチド及びリラグルチドと比較して示す。
【図１８ａ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の経口投与によるグルコース耐性をエキセナチド及びリラグルチドと比較して示す。
【図１８ｂ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の経口投与によるグルコース耐性をエキセナチド及びリラグルチドと比較して示す。
【図１９ａ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の経口投与による血糖降下効能を示す。
【図１９ｂ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の経口投与による血糖降下効能を示す。
【図２０ａ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の経口投与による血糖降下効能をメトホルミン（Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）及びシタグリプチン（Ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ）と比較して示す。
【図２０ｂ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の経口投与による血糖降下効能をメトホルミン（Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）及びシタグリプチン（Ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ）と比較して示す。
【図２１ａ】糖尿病モデルマウスを用いてＬＭＷＣ−Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の経口投与によるグルコース耐性をメトホルミンと比較して示す。
【図２１ｂ】糖尿病モデルマウスを用いてＬＭＷＣ−Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の経口投与によるグルコース耐性をメトホルミンと比較して示す。
【図２２ａ】糖尿病モデルマウスを用いてＬＭＷＣ−Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の経口投与によるグルコース耐性をメトホルミン及びシタグリプチンと比較して示す。
【図２２ｂ】糖尿病モデルマウスを用いてＬＭＷＣ−Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の経口投与によるグルコース耐性をメトホルミン及びシタグリプチンと比較して示す。
【図２３ａ】糖尿病モデルマウスを用いてＬＭＷＣ−Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）またはＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）及びＬＭＷＣを混合して経口投与による血糖降下効能をメトホルミンと比較して示す。
【図２３ｂ】糖尿病モデルマウスを用いてＬＭＷＣ−Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）またはＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）及びＬＭＷＣを混合して経口投与による血糖降下効能をメトホルミンと比較して示す。
【図２４ａ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）及びＬＭＷＣ（１００μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、または５００μｇ／ｋｇ）の混合経口投与による血糖降下効能を示す。
【図２４ｂ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）及びＬＭＷＣ（１００μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、または５００μｇ／ｋｇ）の混合経口投与による血糖降下効能を示す。
【図２５ａ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）及びＬＭＷＣ（１００μｇ／ｋｇまたは５０μｇ／ｋｇ）の混合経口投与による血糖降下効能を示す。
【図２５ｂ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）及びＬＭＷＣ（１００μｇ／ｋｇまたは５０μｇ／ｋｇ）の混合経口投与による血糖降下効能を示す。
【図２６ａ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）単一投与（１００μｇ／ｋｇ）、及びＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）（２５、５０または１００μｇ／ｋｇ）及びＬＭＷＣ（５０μｇ／ｋｇまたは１００μｇ／ｋｇ）の混合経口投与によるグルコース耐性を示す。
【図２６ｂ】糖尿病モデルマウスを用いてＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）単一投与（１００μｇ／ｋｇ）、及びＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）（２５、５０または１００μｇ／ｋｇ）及びＬＭＷＣ（５０μｇ／ｋｇまたは１００μｇ／ｋｇ）の混合経口投与によるグルコース耐性を示す。
【図２７ａ】糖尿病モデルマウスを用いてエキセナチド及びＬＭＷＣをそれぞれ４０、１００または４００μｇ／ｋｇずつ混合して経口投与による血糖降下効能を示す。
【図２７ｂ】糖尿病モデルマウスを用いてエキセナチド及びＬＭＷＣをそれぞれ４０、１００または４００μｇ／ｋｇずつ混合して経口投与による血糖降下効能を示す。
【図２８ａ】糖尿病モデルマウスを用いてエキセナチド（１００μｇ／ｋｇ）及びＬＭＷＣ（５０または１００μｇ／ｋｇ）を混合経口投与による血糖降下効能を示す。
【図２８ｂ】糖尿病モデルマウスを用いてエキセナチド（１００μｇ／ｋｇ）及びＬＭＷＣ（５０または１００μｇ／ｋｇ）を混合経口投与による血糖降下効能を示す。
【図２９ａ】糖尿病モデルマウスを用いてエキセナチド単一投与（１００μｇ／ｋｇ）、及びエキセナチド（１００μｇ／ｋｇ）及びＬＭＷＣ（５０μｇ／ｋｇ）を混合経口投与による血糖降下効能を示す。
【図２９ｂ】糖尿病モデルマウスを用いてエキセナチド単一投与（１００μｇ／ｋｇ）、及びエキセナチド（１００μｇ／ｋｇ）及びＬＭＷＣ（５０μｇ／ｋｇ）を混合経口投与による血糖降下効能を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
前記エキセナチドは、ＧＬＰ−１受容体亢進剤であって、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）によって迅速に分解されるＧＬＰ−１を模倣した類似体（ＧＬＰ−１  ｍｅｔｒｉｃｓ）であって、ＤＰＰ−ＩＶによって迅速に分解されずに、糖−依存的インスリン分泌を促進し、グルカゴン分泌、胃排出及び食欲を抑制し、β細胞保護効果を示すＧＬＰ−１の効果を示す薬物である。
【００１９】
本発明のエキセナチド類似体で、脂肪酸は、アミノ酸が欠失したエキセナチドの多様な位置に接合されうる。本発明の一具現例によれば、脂肪酸は、アミノ酸が欠失したエキセナチドのＬｙｓ残基、Ｎ末端またはＣ末端に接合されている。例えば、脂肪酸は、アミノ酸が欠失したエキセナチドの中間配列（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）でＬｙｓ残基に接合され、アミノ酸が欠失したエキセナチドのＮ末端またはＣ末端に接合されうる。
【００２０】
より具体的に、脂肪酸は、アミノ酸が欠失したエキセナチドのＣ末端に接合されている。
【００２１】
アミノ酸が欠失したエキセナチドに脂肪酸が接合されることは、直接的な接合及びリンカーの間接結合をいずれも含む。脂肪酸にあるカルボキシル基のような作用基とアミノ酸が欠失したエキセナチドの作用基（例えば、−ＮＨ２）とが反応して、共有結合を形成することによって、欠失したエキセナチド−脂肪酸コンジュゲートを形成しうる。間接結合方式によれば、当業者にリンカーとして通用される化合物が仲介して、欠失したエキセナチド−脂肪酸コンジュゲートを形成する。
【００２２】
本発明で用いられるリンカーは、当業者にリンカーとして用いられる如何なる化合物も可能であり、欠失したエキセナチドにある作用基の種類によって、適したリンカーを選択することができる。例えば、リンカーは、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセテート（Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（ｍ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）、Ｎ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル（Ｎ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙｓｕｃｃｉｎａｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）、及びＬｙｓを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
具体的に、アミノ酸が欠失したエキセナチドは、そのＣ末端にリンカーが追加的に結合され、前記脂肪酸は、前記Ｃ末端に結合されたリンカーに接合されている。例えば、アミノ酸が欠失したエキセナチドのＣ末端にリンカーとしてＬｙｓが結合され、このＬｙｓに脂肪酸が接合されうる。この場合、前記追加的なＬｙｓの−ＮＨ２作用基と脂肪酸のカルボキシル基とが反応して、コンジュゲートを形成しうる。
【００２４】
本発明の一具現例によれば、本発明で、エキセナチドは、（ｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むエキセナチド、または（ｉｉ）前記エキセナチドと類似した活性を示しながら、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と配列相同性が少なくとも８０％、具体的に、９０％、より具体的に、９５％を示すエキセナチド類似体を含む。より具体的に、本発明で、エキセナチドは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むエキセナチド、さらに具体的に、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で構成されたエキセナチドである。
【００２５】
本発明のエキセナチド類似体で適した脂肪酸は、当業者に公知の多様な飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸を含む。
【００２６】
具体的に、本発明に適した脂肪酸は、Ｃ３〜Ｃ３６の炭素数を有する脂肪酸である。例えば、本発明に適した脂肪酸は、プロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、酪酸（ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）、吉草酸（ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）、カプロン酸（ｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、エナント酸（ｅｎａｎｔｈｉｃ  ａｃｉｄ）、カプリル酸（ｃａｐｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ペラルゴン酸（ｐｅｌａｒｇｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、カプリン酸（ｃａｐｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ウンデシル酸（ｕｎｄｅｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ラウリン酸（ｌａｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）、トリデシル酸（ｔｒｉｄｅｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ミリスチン酸（ｍｙｒｉｓｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ペンタデシル酸（ｐｅｎｔａｄｅｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ  ａｃｉｄ）、マルガリン酸（ｍａｒｇａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ステアリン酸（ｓｔｅａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ノナデシル酸（ｎｏｎａｄｅｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、アラキジン酸（ａｒａｃｈｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）、ヘンイコシル酸（ｈｅｎｅｉｃｏｓｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ベヘン酸（ｂｅｈｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、トリコシル酸（ｔｒｉｃｏｓｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、リグノセリン酸（ｌｉｇｎｏｃｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ペンタコシル酸（ｐｅｎｔａｃｏｓｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、セロチン酸（ｃｅｒｏｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ヘプタコシル酸（ｈｅｐｔａｃｏｓｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、モンタン酸（ｍｏｎｔａｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ノナコシル酸（ｎｏｎａｃｏｓｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、メリシン酸（ｍｅｌｉｓｓｉｃ  ａｃｉｄ）、ヘナトリアコンチル酸（ｈｅｎａｔｒｉａｃｏｎｔｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ラクセロン酸（ｌａｃｃｅｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、フィリン酸（ｐｓｙｌｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ゲダ酸（ｇhｅｄｄｉｃ  ａｃｉｄ）、セロプラスチン酸（ｃｅｒｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｃｉｄ）、及びヘキサトリアコンチル酸（ｈｅｘａｔｒｉａｃｏｎｔｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）で構成された群から選択される脂肪酸である。
【００２７】
より具体的に、本発明に適した脂肪酸は、Ｃ６〜Ｃ１６の炭素数を有する脂肪酸であり、さらに具体的には、吉草酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、またはパルミチン酸であり、最も具体的には、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、またはパルミチン酸であり、最も具体的には、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、またはパルミチン酸である。
【００２８】
例えば、Ｃ末端のアミノ酸残基９個が欠失したエキセナチドのＣ末端に、吉草酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、またはパルミチン酸が接合された本発明のエキセナチド類似体として製造可能である。また、Ｃ末端のアミノ酸残基７個が欠失したエキセナチドのＣ末端に、吉草酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、またはパルミチン酸が接合された本発明のエキセナチド類似体として製造可能である。
【００２９】
本発明の一具現例によれば、本発明のエキセナチド類似体は、Ｃ末端のアミノ酸残基９個が欠失したエキセナチドのＣ末端に、吉草酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、またはパルミチン酸が接合されたもの、より具体的に、吉草酸、カプリル酸、またはカプリン酸が結合されたものである。この場合、脂肪酸は、Ｃ末端にアミノ基を有するリンカー（例えば、Ｌｙｓリンカー）を通じて結合されうる。
【００３０】
本発明の一具現例によれば、本発明のエキセナチド類似体は、Ｃ末端のアミノ酸残基７個が欠失したエキセナチドのＣ末端に、吉草酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、またはパルミチン酸が接合されたもの、より具体的に、吉草酸、カプリル酸、またはカプリン酸が結合されたものである。この場合、脂肪酸は、Ｃ末端にアミノ基を有するリンカー（例えば、Ｌｙｓリンカー）を通じて結合されうる。
【００３１】
本発明の一具現例によれば、本発明のエキセナチド類似体は、Ｃ末端の１〜１０個（より具体的に、４〜１０個、最も具体的に、７〜９個）のアミノ酸が欠失したものである。
【００３２】
本発明の一具現例によれば、本発明のエキセナチド類似体は、接合されたキトサンをさらに含む。キトサンは、欠失したエキセナチドの多様な位置に接合されうる。欠失したエキセナチドにキトサンが接合されることは、直接的な接合及びリンカーの間接結合をいずれも含む。
【００３３】
本発明のエキセナチド類似体は、従来のエキセナチドとほぼ同じ安定性及び効能を有する。
【００３４】
本発明の一具現例によれば、前記エキセナチド類似体は、ペプチド分解酵素であるＮＥＰ２４．１１に対して、従来のエキセナチドとほぼ同じレベルの安定性を示す。
【００３５】
本発明の他の具現例によれば、前記エキセナチド類似体は、糖尿病モデルマウスで従来のエキセナチドとほぼ同じレベルの糖耐性を示す。
【００３６】
本発明のさらに他の具現例によれば、前記エキセナチド類似体は、糖尿病モデルマウスで従来のエキセナチドよりも優れた血糖降下効果を示す。
【００３７】
本発明のこのような効果は、抗糖尿病剤であるリラグルチド（ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）と比較して、血糖降下において、より優れ、持続的な効果を示す。
【００３８】
本発明の他の態様によれば、本発明は、本発明のエキセナチド類似体を有効成分として含む糖尿病改善、予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００３９】
本発明の他の態様によれば、本発明は、本発明のエキセナチド類似体を有効成分として含む薬剤学的組成物を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む糖尿病改善、予防または治療方法を提供する。
【００４０】
本発明のエキセナチド類似体を有効成分として含む薬剤学的組成物は、糖尿病を改善、予防または治療することができる。
【００４１】
本明細書で使われる用語“糖尿病”は、葡萄糖−不寛容（ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ）をもたらすインスリンの相対的または絶対的不足によって特徴づけられる慢性疾患を意味する。用語“糖尿病”は、あらゆる種類の糖尿病を含み、例えば、第１型糖尿病、第２型糖尿病及び遺伝性糖尿病を含む。第１型糖尿病は、インスリン依存性糖尿病であって、β細胞の破壊によって主に招かれる。第２型糖尿病は、インスリン非依存性糖尿病であって、食事後、不十分なインスリン分泌によって招かれるか、またはインスリン耐性によって招かれる。
【００４２】
本発明の一具現例によれば、前記組成物は、第２型糖尿病の改善、予防または治療に適用される。
【００４３】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、本発明のエキセナチド類似体を有効成分として含む肥満改善、予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００４４】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、本発明のエキセナチド類似体を有効成分として含む薬剤学的組成物を対象に投与する段階を含む肥満改善、予防または治療方法を提供する。
【００４５】
本発明のエキセナチド類似体を有効成分として含む薬剤学的組成物は、肥満を改善、予防または治療することができる。本明細書で使われる用語“肥満”は、健康に異常をもたらす程度に脂肪組織が体内に過剰に蓄積された状態を意味する。
【００４６】
本発明の他の態様によれば、本発明は、本発明のエキセナチド類似体を有効成分として含む食欲抑制用薬剤学的組成物を提供する。
【００４７】
本発明の他の態様によれば、本発明は、本発明のエキセナチド類似体を有効成分として含む薬剤学的組成物を対象に投与する段階を含む食欲抑制方法を提供する。
【００４８】
本明細書で使われる用語“食欲抑制”は、食べ物を摂取しようとする欲求が抑制されることを意味する。
【００４９】
本発明の薬剤学的組成物は、非経口投与方式で人体に主に投与されるが、おもしろいことに、下記の実施例から立証されたように、本発明のエキセナチド類似体は、それ自体として経口投与されて治療効能を発揮することができる。本発明の一具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物は、経口投与用組成物である。
【００５０】
本発明の一具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物は、キトサンをさらに含み、前記キトサンは、薬剤学的組成物に混合（ｍｉｘ）されており、エキセナチド類似体に共有結合されていないものである。
【００５１】
インスリンにキトサンを共有結合させて、インスリンの経口投与を可能にした先行技術がある（参照：大韓民国特許第０７６６８２０号）。しかし、この先行技術によれば、キトサンをインスリンに共有結合させなければならないが、このような共有結合過程は、医薬品の生産において、品質管理的な側面で大きな問題を引き起こせる。また、この先行技術には、エキセナチドについての言及はない。
【００５２】
下記の実施例から立証されたように、本発明のエキセナチド類似体を含む組成物にキトサンを単純に混合した場合に、エキセナチド類似体の経口投与による効能発揮がよくなされる。このようなエキセナチド類似体の経口投与の結果は、非常に面白い結果である。
【００５３】
本明細書で、用語‘有効成分として含む’とは、下記のエキセナチド誘導体の効能または活性を果たすのに十分な量を含むことを意味する。本発明の組成物に含まれた量的上限は、当業者が適切な範囲内で選択して実施することができる。
【００５４】
本発明の組成物が、薬剤学的組成物として製造される場合、本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含む。本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微小結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、体内吸収促進剤などをさらに含みうる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。
【００５５】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口投与することができる。
【００５６】
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方されうる。本発明の薬剤学的組成物の一般的な投与量は、成人基準に０．００１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【００５７】
本発明の薬剤学的組成物は、当業者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造可能である。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤、または乳液の形態であるか、エクストラクト剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、またはカプセル剤の形態でもあり、分散剤または安定化剤をさらに含みうる。
【００５８】
本発明の他の態様によれば、本発明は、（ａ）エキセナチドまたはその類似体、及び（ｂ）キトサンを含む経口投与用糖尿病または肥満改善、予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００５９】
本発明の薬剤学的組成物は、経口投与を可能にする組成物である。
【００６０】
本発明の薬剤学的組成物で、エキセナチド類似体は、当業者に公知の多様な類似体を含む。本発明の一具現例によれば、前記エキセナチド類似体は、前述した本発明のエキセナチド類似体である。
【００６１】
本発明の一具現例によれば、前記キトサンは、エキセナチドまたはその類似体に接合されているか、または薬剤学的組成物に混合されているものである。
【００６２】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。
【実施例】
【００６３】
用語
本明細書で、用語‘エキセナチド’は、米国南西部に生息するアメリカドクトカゲの唾液腺から分離されたＧＬＰ−１の機能的アナログ（ａｎａｌｏｇ）である。学術名Ｅｘｅｎｄｉｎ−４であるエキセナチドは、３９個のアミノ酸で構成された生理活性ペプチドであって、ヒト生体内に存在するＧＬＰ−１と５３％アミノ酸類似性を有する。下記の実施例で、Ｅｘ４に表現されたものは、エキセナチドを意味する。
【００６４】
本明細書で、用語‘Ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４類似体’は、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４のＣ末端の配列を異ならせた形態を意味する。詳しい内容は、実施例２に記載する。
【００６５】
本明細書で、用語‘Ｅｘ４（１−３０）Ｋ−脂肪酸’は、エキセナチドの配列１番から３０番までは同一であり、Ｃ末端に脂肪酸が側鎖に結合されたＫ（ｌｙｓｉｎｅ）を接合した形態である。
【００６６】
本明細書で特別な表示がない限り、アミノ酸及び保護基の指定に使われる略語は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの生化学用語委員会（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）で勧奨する用語に基づく（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１：１７２６−１７３２（１９７２））。
【００６７】
本明細書で使った保護基の略語は、次の通りである：
Ｔｈｒ：トレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）
Ｇｌｕ：グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）
Ｓｅｒ：セリン（Ｓｅｒｉｎｅ）
Ａｒｇ：アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）
Ｐｒｏ：プロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ）
Ｌｅｕ：ロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）
Ｈｉｓ：ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）
Ａｌａ：アラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）
Ｇｌｙ：グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）
Ｐｈｅ：フェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）
Ａｓｐ：アスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ）
Ｌｙｓ：リシン（Ｌｙsｉｎｅ）
Ｇｌｎ：グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）
Ｍｅｔ：メチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）
Ａｌａ：アラニン
Ｖａｌ：バリン（Ｖａｌｉｎｅ）
Ｉｌｅ：イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）
Ｔｒｐ：トリプトファン（Ｔｒｉｐｔｏｐｈａｎ）
Ａｓｎ：アスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）
Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）
ｔＢｕ：ｔ−ブチル（ｔ−ｂｕｔｙｌ）
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシオキシカルボニル（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）
Ｔｒｔ：トリフェニルメチル（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｙｌ）
ｄｄｅ：１−（４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，６−ｄｉｏｘｏｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｉｄｅｎｅ）ｅｔｈｙｌ
【００６８】
本明細書の全般に亘って、特定物質の濃度を示すために使われる“％”は、別途の言及がない場合、固体／固体は、（重量／重量）％、固体／液体は、（重量／体積）％、そして、液体／液体は、（体積／体積）％である。
【００６９】
実施例１：Ｅｘ４（１−３２）Ｋ−Ｃａｐの製造方法
本発明のＥｘ４（１−３２）Ｋ−Ｃａｐは、下記化学式１のエキセナチドのＮ末端から３２番に位置するセリンの配列にリシン−脂肪酸（Ｌｙｓｉｎｅ−ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ）を追加した３３個のアミノ酸を有するペプチドで構成される。
〔化学式１〕
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ
【００７０】
本発明のＥｘ４（１−３２）Ｋ−Ｃａｐを製造するために、トリチルレジン（ｔｒｉｔｙｌ  ｒｅｓｉｎ）にＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｄｄｅ）及びＤＭＦ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）をローディングして、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−トリチルレジンを製造した。前記Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−トリチルレジンに２０％ピペリジンが含まれたＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ；ＤＭＦ）及びＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ及びＨＯＢｔ（ｈｙｄｒｏｘｙ−ｂｅｎｚｏ  ｔｒｉａｚｏｌｅ）が含まれたＤＭＦを添加して、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ｄｄｅ）−トリチルレジンを製造した。次に、前記Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ｄｄｅ）−トリチルレジンに２０％ピペリジンが含まれたＤＭＦを添加し、引き続きＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨからＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨまで総３１回循環して、アミノ酸のカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を実施／並行して実施して、化学式２のペプチドを製造した。
〔化学式２〕
Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（ｄｄｅ）−トリチルレジン
【００７１】
前記化学式２のペプチドに２％ＮＨ２ＮＨ２・Ｈ２Ｏを含むＤＭＦを添加し、ｄｄｅを除去して、化学式３のペプチドを製造した。
〔化学式３〕
Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−トリチルレジン
【００７２】
前記化学式３のペプチドにカプリン酸、及びＨＯＢｔ及びＤＩＣを含むＤＭＦを添加して、カップリングさせて、化学式４のペプチドを製造した。
〔化学式４〕
Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（カプリン酸）−トリチルレジン
【００７３】
前記化学式４のペプチドに保護基切断後、精製して、化学式５のペプチドを製造した。
〔化学式５〕
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（カプリン酸）−ＯＨ（ＴＦＡ形態）
【００７４】
前記化学式５のペプチドを塩交換［ＴＦＡ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）ｔｏ  ＡｃＯＨ］して、下記化学式６のＥｘ４（１−３２）Ｋ−Ｃａｐを製造した。
〔化学式６〕
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（カプリン酸）−ＯＨ（ＡｃＯＨ形態）
【００７５】
実施例２：Ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４類似体の製造及び効果分析
Ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４類似体の製造及びＮＥＰ２４．１１に対する安定性試験
Ｅｘｅｎｄｉｎ−４のＣ末端は、ＧＬＰ−１にはない９−ＡＡ  Ｃ末端配列（ｎｉｎｅ−ＡＡ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）があって、ＮＥＰ２４．１１のような中性エンドペプチダーゼ（ｎｅｕｔｒａｌ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）に分解がよくできない（参照；Ｄｏｙｌｅ  ＭＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １１４，Ｉｓｓｕｅｓ  ２−３，１５  Ｊｕｌｙ  ２００３，Ｐａｇｅｓ  １５３−１５８）。
【００７６】
ペプチド分解酵素であるＮＥＰ２４．１１に対する安定性試験のために、既存のＥｘｅｎｄｉｎ−４のＣ末端の配列を異ならせて、さまざまなｓｈｏｒｔ−Ｅｘｅｎｄｉｎ−４類似体を次の方法で製造した：
（ａ）Ｅｘ４（１−２９）の製造方法
Ｅｘ４（１−２９）を製造するために、トリチルレジンにＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、ＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）及びＤＭＦをローディングして、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−トリチルレジンを製造した。前記Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−トリチルレジンに２０％ピペリジンが含まれたＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ及びＨＯＢｔが含まれたＤＭＦを添加して、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−トリチルレジンを製造した。次に、前記Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−トリチルレジンに２０％ピペリジンが含まれたＤＭＦを添加し、引き続きＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨからＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨまで総２９回循環して、アミノ酸のカップリングを実施／並行して実施して、Ｅｘ４（１−２９）を製造した。
Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−トリチルレジン
【００７７】
（ｂ）Ｅｘ４（１−３０）の製造方法
Ｅｘ４（１−３０）を製造するために、トリチルレジンにＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、ＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）及びＤＭＦをローディングして、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−トリチルレジンを製造した。前記Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−トリチルレジンに２０％ピペリジンが含まれたＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ及びＨＯＢｔが含まれたＤＭＦを添加して、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−トリチルレジンを製造した。次に、前記Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−トリチルレジンに２０％ピペリジンが含まれたＤＭＦを添加し、引き続きＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨからＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨまで総３０回循環して、アミノ酸のカップリングを実施／並行して実施して、Ｅｘ４（１−３０）を製造した。
Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−トリチルレジン
【００７８】
（ｃ）Ｅｘ４（１−３１）の製造方法
Ｅｘ４（１−３１）を製造するために、トリチルレジンにＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、ＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）及びＤＭＦをローディングして、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−トリチルレジンを製造した。前記Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−トリチルレジンに２０％ピペリジンが含まれたＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ及びＨＯＢｔが含まれたＤＭＦを添加して、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−トリチルレジンを製造した。次に、前記Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−トリチルレジンに２０％ピペリジンが含まれたＤＭＦを添加し、引き続きＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨからＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨまで総３１回循環して、アミノ酸のカップリングを実施／並行して実施して、Ｅｘ４（１−３１）を製造した。
Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−トリチルレジン
【００７９】
（ｄ）Ｅｘ４（１−３２）の製造方法
Ｅｘ４（１−３２）を製造するために、トリチルレジンにＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、ＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）及びＤＭＦをローディングして、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−トリチルレジンを製造した。前記Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−トリチルレジンに２０％ピペリジンが含まれたＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ及びＨＯＢｔが含まれたＤＭＦを添加して、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−トリチルレジンを製造した。次に、前記Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−トリチルレジンに２０％ピペリジンが含まれたＤＭＦを添加し、引き続きＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨからＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨまで総３２回循環して、アミノ酸のカップリングを実施／並行して実施して、Ｅｘ４（１−３２）を製造した。
Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−トリチルレジン
【００８０】
（ｅ）Ｅｘ４（１−３３）の製造方法
Ｅｘ４（１−３３）を製造するために、トリチルレジンにＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、ＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）及びＤＭＦをローディングして、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−トリチルレジンを製造した。前記Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−トリチルレジンに２０％ピペリジンが含まれたＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びＨＯＢｔが含まれたＤＭＦを添加して、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−トリチルレジンを製造した。次に、前記Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−トリチルレジンに２０％ピペリジンが含まれたＤＭＦを添加し、引き続きＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨからＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨまで総３３回循環して、アミノ酸のカップリングを実施／並行して実施して、Ｅｘ４（１−３３）を製造した。
【００８１】
Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−トリチルレジン
【００８２】
Ｅｘｅｎｄｉｎ−４のＣ末端の配列が異なるＥｘｅｎｄｉｎ−４に対するＮＥＰ２４．１１に対する安定性試験を実施した。製造したペプチドは、組替えられたｈｕｍａｎ  ＮＥＰ２４．１１と０、４、１２、２４、４８、９６時間３７℃で反応させた後、ＨＰＬＣを通じてペプチドの濃度を分析した。その結果、Ｅｘ４（１−３５）、Ｅｘ４（１−３３）、Ｅｘ４（１−３２）、及びＥｘ４（１−３１）類似体は、ＮＥＰ２４．１１に対する長い半減期を示すが、Ｅｘ４（１−２９）及びＥｘ４（１−３０）類似体は、短い半減期を示すことを確認した。Ｅｘｅｎｄｉｎ−４の３１番目以後のアミノ酸配列が、ＮＥＰ２４．１１に対する抵抗性に重要な役割を果たすことが分かる（表１及び図１）。
【００８３】
【表１】
0006438563.tif 000002
【００８４】
Ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４類似体のＧＬＰ−１受容体に対する活性及びＣＤスペクトル
Ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４類似体のＧＬＰ−１受容体に対する活性とＥｘ−４構造との関連性を比較分析するために、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）分析及びＣＤスペクトルの実験を実施した。
【００８５】
本研究で使ったルシフェラーゼ分析システム（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ）は、薬物（ｌｉｇａｎｄ）が細胞の受容体に結合して細胞内でどれほど活性を示すかを確認することができる分析方法である。線維芽細胞株であるｃｖ−１（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を９６ウェル細胞培養プレートに２４時間培養後、アデノウイルスに挿入されたＧＬＰ−１受容体とＣＲＥ（ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）ルシフェラーゼをそれぞれ５０ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、２５ＭＯＩのウイルスを培養した９６ウェル細胞培養プレートに処理後、３時間培養後、ＦＢＳがない培地に取り替え後、１６時間培養した。培養後、それぞれのＳｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４類似体を処理して、６時間培養後、活性化されたＧＬＰ−１受容体によってレポーター遺伝子であるルシフェラーゼの発現程度をルミノメーター（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を使って定量した。
【００８６】
その結果、Ｅｘ４（１−３０）、Ｅｘ４（１−３１）、Ｅｘ４（１−３２）、Ｅｘ４（１−３３）、及びＥｘ４（１−３５）類似体のＧＬＰ−１受容体に対する活性が、陽性対照群であるＥｘ４と類似している態様を示すことを確認した。しかし、Ｅｘ４（１−２９）の場合、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４に比べて１０倍程度の活性が差があることを確認した（表２及び図２ａないし図２ｂ）。
【００８７】
【表２】
0006438563.tif 000003
【００８８】
実施例２：Ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートの製造及び効果分析
Ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートの製造及び活性及び安定性の比較試験
Ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４の安定性を改善するために、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４のＣ末端にさまざまな脂肪酸を接合させて、ｓｈｏｒｔ  Ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートを製造した後、ＮＥＰ２４．１１に対する安定性試験とＧＬＰ−１受容体に対する活性を比較した。実験方法は、前記実施例１と同一である。その結果、Ｅｘ４（１−３０）Ｋ−Ｃａｐ及びＥｘ４（１−３０）Ｋ−Ｐａｌ類似体が、ＧＬＰ−１受容体に対する活性に優れた（表３及び表４、図３ａないし図３ｃ、及び図４）。
【００８９】
【表３】
0006438563.tif 000004
【００９０】
【表４】
0006438563.tif 000005
【００９１】
膵臓β細胞に対するｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートのインスリン分泌評価
ラット（ｒａｔ）から抽出された膵臓β細胞であるＩＮＳ−１に対する製作したアナログのインスリン分泌程度を調べた。１１．１ｍＭグルコースが含まれたＫＲＨ緩衝液にＥｘｅｎｄｉｎ−４とそれぞれのアナログのそれぞれ１０ｎＭ及び１００ｎＭで処理して、１２時間後の分泌されたインスリン濃度をＥＬＩＳＡを用いて定量した。その結果、あらゆるｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートが、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４に比べて増加したインスリン分泌程度を確認することができ、特に、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）が、最も高いインスリン分泌程度を示すことが分かった（図５）。
【００９２】
脂肪細胞に対するｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートの脂肪分解（ｌｉｐｏｌｙｓｉｓ）程度評価
脂肪先駆細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）である３Ｔ３−Ｌ１を脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）に分化誘導後、ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートの脂肪分解程度を測定した。２４ウェル細胞培養プレートに３Ｔ３−Ｌ１（３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を２４時間培養後、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、ＩＢＭＸ（３−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）が含まれた培地に置き換えて、４８時間培養する。次いで、１０％ＦＢＳとインスリンとが含まれた培地に置き換えた後、２〜３日ごとに同じ組成の培地に置き換えて、１４日まで培養して脂肪細胞への分化を誘導した。分化された脂肪細胞に、それぞれのｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートを処理した後、細胞外に排出されるグリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）から誘導される過酸化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ、Ｈ２Ｏ２）の量を定量した。
【００９３】
その結果、あらゆるアナログが、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４に比べて脂肪細胞の脂肪分解程度を促進することを確認することができた（図６）。
【００９４】
糖尿病モデルマウスを用いたｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートの糖負荷試験
雄ｄｂ／ｄｂマウス（６〜１２週齢）を１８時間絶食させた後、４種のｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートのＥｘ４（１−３０）Ｋ−Ｐａｌ、Ｅｘ４（１−３０）Ｋ−Ｃａｐ、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ−Ｐａｌ、及びＥｘ４（１−３２）Ｋ−Ｃａｐをそれぞれ２０ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で皮下投与し、３０分経過後、腹腔に葡萄糖（１．５ｇ／ｋｇ）を投入する。０分、１５分、３０分、６０分、及び１２０分経過後、マウスのしっぽの先端から血液を採取して血糖測定器（Ａｃｃｕ−ｃｈｅｃｋ，Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で血糖を測定して、糖負荷能を確認した。その結果、４種いずれも陽性対照群であるエキセナチドと沸騰するようにグルコースに対して有意な耐性を有することを確認した（図７ａ及び図７ｂ）。
【００９５】
糖尿病モデルマウスを用いたｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートの抗糖尿病効果試験（ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｔｅｓｔ）
雄ｄｂ／ｄｂマウス（６〜１２週齢）に、４種のエキセナチド誘導体Ｅｘ４（１−３０）Ｋ−Ｐａｌ、Ｅｘ４（１−３０）Ｋ−Ｃａｐ、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ−Ｐａｌ、及びＥｘ４（１−３２）Ｋ−Ｃａｐをそれぞれ２０ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で皮下投与後、０、１、２、４、６、８、１２、１９、及び２４時間目のマウスのしっぽの先端から血液を採取して血糖測定器で血糖を測定した。その結果、４種いずれも、陽性対照群であるエキセナチドと沸騰するように有意な血糖降下効能を示し、特に、Ｅｘ４（１−３０）Ｋ−Ｃａｐ及びＥｘ４（１−３２）Ｋ−Ｃａｐは、既Ｅｘ４（１−３０）Ｋ−Ｐａｌ及びＥｘ４（１−３２）Ｋ−Ｐａｌよりもさらに優れた血糖降下効能を示すことを確認した（図８ａ及び図８ｂ）。
【００９６】
糖尿病モデルマウスを用いたｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートの濃度依存的効能の比較実験
２種の濃度で製造された４種のｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートを製造した。雄ｄｂ／ｄｂマウス（６〜１２週齢）に、Ｅｘ４（１−３０）Ｋ−Ｐａｌ、Ｅｘ４（１−３０）Ｋ−Ｃａｐ、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ−Ｐａｌ、及びＥｘ４（１−３２）Ｋ−Ｃａｐを１ｎｍｏｌ／ｋｇ及び５ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で、それぞれ糖尿病モデルマウスに皮下投与した後、０、１、２、４、６、８、１２、１９、２４時間後、マウスのしっぽの先端から血液を採取して血糖測定器で血糖を測定した。その結果、４種いずれも、陽性対照群であるエキセナチドと沸騰するように濃度依存的な血糖降下効能を示した（図９ａ及び図９ｂ）。
【００９７】
糖尿病モデルマウスを用いたｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４−脂肪酸コンジュゲートの効能比較実験
雄ｄｂ／ｄｂマウス（６〜１２週齢）に、リラグルチド２００μｇ／ｋｇ、Ｅｘ４（１−３０）Ｋ−Ｃａｐ  １００μｇ／ｋｇ、及びＥｘ４（１−３２）Ｋ−Ｃａｐ  １００μｇ／ｋｇを皮下投与し、１、８、１５日経過後、血糖降下効果を観察するために、投与後、０、１、２、４、６、８、１２、１９、２４時間目のマウスのしっぽの先端から血液を採取して血糖測定器で血糖を測定した。その結果いずれも、Ｅｘ４（１−３０）Ｋ−Ｃａｐ及びＥｘ４（１−３２）Ｋ−Ｃａｐ（Ｃ）が、リラグルチドと類似しているか、より良い効果（ＡＵＣ比較）を示し、２４時間での血糖値も、リラグルチドに比べてさらに低いか、同じであることを確認した。この実験を通じて、Ｅｘ４（１−３０）Ｋ−Ｃａｐ及びＥｘ４（１−３２）Ｋ−Ｃａｐが、リラグルチドと類似した効能持続時間を有しうる可能性を確認した（図１０ａないし図１２ｂ）。
【００９８】
実施例３：Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の特性分析
糖尿病モデルマウスを用いたＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）（皮下）糖負荷試験
雄ｄｂ／ｄｂマウス（６〜１２週齢）を１８時間絶食させた後、Ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎａｔｉｄｅ−脂肪酸コンジュゲートのＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）をそれぞれ０．００５ｎｍｏｌ／ｋｇ、０．０１ｎｍｏｌ／ｋｇ、０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ、１ｎｍｏｌ／ｋｇ、及び５ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で、それぞれ絶食した糖尿病モデルマウスに投与（皮下）した後、３０分経過後、腹腔に葡萄糖（１．５ｇ／ｋｇ）を投入する。０、２０、４０、６０、９０、１２０、１８０分経過後、マウスのしっぽの先端から血液を採取して血糖測定器で血糖を測定した。その結果、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の濃度依存的な血糖降下効能を確認した（図１３ａ及び図１３ｂ）。
【００９９】
陽性対照群であるエキセナチドと比較するために、絶食させたマウスに、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）とエキセナチドをそれぞれ０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で投与（皮下）した後、３０分経過した後、腹腔に葡萄糖（１．５ｇ／ｋｇ）を投入する。０、２０、４０、７５、１２０、１８０分経過後、マウスのしっぽの先端から血液を採取して血糖測定器で血糖を測定して、糖負荷能を確認した。その結果、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の濃度依存的な血糖降下効能及びエキセナチドと沸騰するようにグルコースに対して有意な耐性を有することを確認した（図１４ａ及び図１４ｂ）。
【０１００】
糖尿病モデルマウスを用いたＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）（皮下）抗糖尿病効果試験
ｄｂ／ｄｂマウス（６〜１２週齢）に、Ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎａｔｉｄｅ−脂肪酸コンジュゲートのＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）を０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ、１ｎｍｏｌ／ｋｇ、５ｎｍｏｌ／ｋｇ、及び２０ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で、そして、陽性対照群であるエキセナチドと比較するために、エキセナチドをそれぞれ１ｎｍｏｌ／ｋｇ及び５ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で投与（皮下）した後、０、１、２、４、７、９、１２、１６、２４、３８、４３、４８時間目のマウスのしっぽの先端から血液を採取して血糖降下効能を確認した。その結果、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の濃度依存的な血糖降下効能を確認し、１ｎｍｏｌ／ｋｇ及び５ｎｍｏｌ／ｋｇの同一容量投与時に、陽性対照群であるエキセナチドは、２４時間に初期血糖に回復されるが、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）は、４８時間血糖降下持続効果を示して、さらに優れた血糖降下効能を示すことを確認した（図１５ａ及び図１５ｂ）。
【０１０１】
糖尿病モデルマウスを用いたＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）（皮下）効能比較実験
エキセナチド類似体及びリラグルチドと血糖降下効能を比較するために、１８時間絶食させたｄｂ／ｄｂマウスに陽性対照群であるＳｈｏｒｔ  ｅｘｅｎａｔｉｄｅ−脂肪酸コンジュゲートＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）とエキセナチド、リラグルチドをそれぞれ２０ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で皮下投与した後、グルコースを腹腔注射して、０、２０、４０、６０、９０、１２０、１８０分経過後の薬物の糖負荷能を確認した。その結果、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）が、陽性対照群であるエキセナチド及びリラグルチドと沸騰するようにグルコースに対して有意な耐性を有することを確認した（図１６ａ及び図１６ｂ）。
【０１０２】
陽性対照群であるエキセナチド及びリラグルチドと比較するために、Ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎａｔｉｄｅ−脂肪酸コンジュゲートＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）をそれぞれ４ｎｍｏｌ／ｋｇ及び２０ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で、そして、エキセナチド及びリラグルチドをそれぞれ２０ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で糖尿病モデルマウスに皮下投与した後、０、１、２、４、６、８、１２、１９、２４、２８、３３、４３、４８時間経過した後、血糖降下効能を確認した。その結果、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）が、陽性対照群であるエキセナチド及びリラグルチドよりもさらに優れた血糖降下効能を示すことを確認した（図１７ａ及び図１７ｂ）。
【０１０３】
糖尿病モデルマウスを用いたＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）（経口）効能比較実験
１８時間絶食させたｏｂ／ｏｂマウス（６〜１２週齢）に、Ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎａｔｉｄｅ−脂肪酸コンジュゲートのＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）をそれぞれ１．９ｍｇ／ｋｇ（５００ｎｍｏｌ／ｋｇ）の濃度で投与（経口）した後、グルコースを腹腔注射して、０、２０、４０、６０、９０、１２０、１８０分経過した後、薬物の糖負荷能を確認した。その結果、経口投与時に、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）が、陽性対照群であるリラグルチドよりもさらに優れているようにグルコースに対して有意な耐性を有することを確認した（図１８ａ及び図１８ｂ）。
【０１０４】
糖尿病モデルマウスを用いたＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）（経口）糖負荷試験
１８時間絶食させたｏｂ／ｏｂマウス（６〜１２週齢）に、Ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎａｔｉｄｅ−脂肪酸コンジュゲートのＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）をそれぞれ０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び５ｍｇ／ｋｇの濃度で投与（経口）した後、グルコースを腹腔注射して、０、２０、４０、６０、９０、１２０、１８０分経過後、薬物の糖負荷能を確認した。その結果、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の濃度依存的な血糖降下効能を確認した（図１９ａ及び図１９ｂ）。
【０１０５】
糖尿病モデルマウスを用いたＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）（経口）効能比較実験２
陽性対照群であるメトホルミン及びシタグリプチンと比較するために、１８時間絶食させたｄｂ／ｄｂマウスに、Ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎａｔｉｄｅ−脂肪酸コンジュゲートＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）を４ｍｇ／ｋｇの濃度で、そして、メトホルミン３００ｍｇ／ｋｇ及びシタグリプチン３ｍｇ／ｋｇの濃度で、それぞれ絶食した糖尿病モデルマウスに経口投与した後、グルコースを腹腔注射して、０、２０、４０、６０、９０、１２０、１８０分経過後、薬物の糖負荷能を確認した。その結果、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）が、メトホルミン及びシタグリプチンと沸騰するようにグルコースに対して有意な耐性を有することを確認した（図２０ａ及び図２０ｂ）。
【０１０６】
実施例４：ＬＭＷＣ−Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）Ｃの効果分析
糖尿病モデルマウスを用いたＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）のＬＭＷＣコンジュゲート（経口）糖負荷試験
Ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎａｔｉｄｅ−脂肪酸コンジュゲートＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）にＬＭＷＣをコンジュゲーションさせたＬＭＷＣ−Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）Ｃを製造した。ＬＭＷＣは、エキセナチド類似体のＣ末端の活性に影響を与えない薬物伝達体である。ＬＭＷＣ−Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）Ｃをそれぞれ０．０７８ｍｇ／ｋｇ（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、０．３８８ｍｇ／ｋｇ（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、及び１．９４７ｍｇ／ｋｇ（５００ｎｍｏｌ／ｋｇ）の容量で投与し、糖負荷後、０、２０、４０、６０、９０、１２０、１８０分経った後、マウスのしっぽの先端から血液を採取して糖負荷能を確認した。その結果、ＬＭＷＣ−Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）Ｃが、１．９４７ｍｇ／ｋｇ（５００ｎｍｏｌ／ｋｇ）の容量で経口投与時に、陽性対照群であるメトホルミンと沸騰するようにグルコースに対して有意な耐性を有することを確認した（図２１ａ及び図２１ｂ）。
【０１０７】
糖尿病モデルマウスを用いたＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）のＬＭＷＣコンジュゲート（経口）効能比較実験
陽性対照群であるメトホルミン及びシタグリプチンと比較するために、１８時間絶食させたＳｈｏｒｔ  ｅｘｅｎａｔｉｄｅ−脂肪酸コンジュゲートＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）にＬＭＷＣをコンジュゲーションさせたＬＭＷＣ−Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）Ｃを４ｍｇ／ｋｇの濃度で、そして、メトホルミン３００ｍｇ／ｋｇ及びシタグリプチン３ｍｇ／ｋｇの濃度で、それぞれ絶食した糖尿病モデルマウスに投与（経口）し、６０分経過後、グルコースを腹腔注射した後、０、２０、４０、６０、９０、１２０、１８０分経った後、マウスのしっぽの先端から血液を採取して糖負荷能を確認した。その結果、ＬＭＷＣ−Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）Ｃが、陽性対照群であるメトホルミンと沸騰するように、シタグリプチンよりもさらに優れているようにグルコースに対して有意な耐性を有することを確認した（図２２ａ及び図２２ｂ）。
【０１０８】
糖尿病モデルマウスを用いたＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）のＬＭＷＣ混合投与（経口）糖負荷試験
Ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎａｔｉｄｅ−脂肪酸コンジュゲートＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）にＬＭＷＣを混合した溶液を１８時間絶食させたｄｂ／ｄｂマウスに、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）とＬＭＷＣのそれぞれ同一な４０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、及び４００μｇ／ｋｇの容量で混ぜて経口投与し、６０分経過後、グルコースを腹腔注射して、０、２０、４０、６０、９０、１２０、１８０分経った後、薬物の糖負荷試験を実施した。その結果、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）にＬＭＷＣを混合投与時に、濃度依存的な血糖降下効能を確認した（図２３ａ及び図２３ｂ）。
【０１０９】
糖尿病モデルマウスを用いたＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）のＬＭＷＣ混合投与（経口）効能比較実験
Ｓｈｏｒｔ  ｅｘｅｎａｔｉｄｅ−脂肪酸コンジュゲートＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）の投与（経口）にＬＭＷＣを混合した容量による効果を確認するために、１８時間絶食させたｄｂ／ｄｂマウスに、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）１００μｇ／ｋｇの容量にＬＭＷＣをそれぞれ１００μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、及び５００μｇ／ｋｇの容量で混ぜて経口投与し、６０分経過後、グルコースを腹腔注射して、０、２０、４０、６０、１００、１２０、１８０分経過後、薬物の糖負荷試験を実施した。その結果、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）にＬＭＷＣを混合投与時に、１００〜５００μｇ／ｋｇの容量では、１００μｇ／ｋｇの低い容量で血糖降下効能を確認した（図２４ａ及び図２４ｂ）。
【０１１０】
１８時間絶食させたｄｂ／ｄｂマウスに、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）１００μｇ／ｋｇの容量にＬＭＷＣをそれぞれ１００μｇ／ｋｇ及び５０μｇ／ｋｇの容量で混ぜて経口投与し、６０分経過後、グルコースを腹腔注射して、０、２０、４０、６０、１００、１２０、１８０分後、糖負荷試験を実施した。その結果、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）にＬＭＷＣを混合投与時に、ＬＭＷＣ１００μｇ／ｋｇよりもＬＭＷＣ５０μｇ／ｋｇの容量で付加的な血糖降下効能を確認した（図２５ａ及び図２５ｂ）。
【０１１１】
Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）１００μｇ／ｋｇの容量単一投与とＬＭＷＣ混合物の経口投与とを比較するために、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）１００μｇ／ｋｇ投与及びＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）２５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、及び１００μｇ／ｋｇとＬＭＷＣをそれぞれ２５μｇ／ｋｇ及び５０μｇ／ｋｇの容量で混合して絶食した糖尿病モデルマウスに経口投与した後、６０分経過した後、グルコースを腹腔注射して、０、２０、４０、６０、９０、１２０、１８０分後、薬物の糖負荷試験を実施した。その結果、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）１００μｇ／ｋｇにＬＭＷＣ５０μｇ／ｋｇ混合物の経口投与が、Ｅｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）１００μｇ／ｋｇ単一投与よりもさらに優れているようにグルコースに対する有意な耐性を有することを確認し、絶食した糖尿病ラットにＥｘ４（１−３２）Ｋ（Ｃａｐ）投与（経口）時に、付加的な血糖降下効能のために、ＬＭＷＣ混合容量を少なくとも５０μｇ／ｋｇ必要とした（図２６ａ及び図２６ｂ）。
【０１１２】
糖尿病モデルマウスを用いたエキセナチドのＬＭＷＣ混合投与（経口）糖負荷試験
エキセナチドとＬＭＷＣのそれぞれ同一な４０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、及び４００μｇ／ｋｇの容量で混ぜた溶液を経口投与し、６０分経過した後、グルコースを腹腔注射して、０、２０、４０、６０、９０、１２０、１８０分後の薬物の糖負荷試験を実施した。その結果、エキセナチドにＬＭＷＣを混合投与時に、濃度依存的な血糖降下効能を確認した（図２７ａ及び図２７ｂ）。
【０１１３】
糖尿病モデルマウスを用いたエキセナチドのＬＭＷＣ混合投与（経口）効能比較実験
エキセナチド１００μｇ／ｋｇの容量にＬＭＷＣをそれぞれ１００μｇ／ｋｇ及び５０μｇ／ｋｇの容量で混ぜた溶液を１８時間絶食した糖尿病モデルマウスに経口投与し、６０分経過した後、グルコースを腹腔注射して、０、２０、４０、９０、１２０、１８０分後の薬物の糖負荷試験を実施した。その結果、エキセナチドにＬＭＷＣを混合投与時に、ＬＭＷＣ１００μｇ／ｋｇよりもＬＭＷＣ５０μｇ／ｋｇの容量で付加的な血糖降下効能を確認した（図２８ａ及び図２８ｂ）。
【０１１４】
エキセナチド１００μｇ／ｋｇの容量単一投与とＬＭＷＣ混合経口投与とを比較するために、エキセナチド１００μｇ／ｋｇ投与及びエキセナチド１００μｇ／ｋｇとＬＭＷＣを５０μｇ／ｋｇの容量で混ぜた溶液を１８時間絶食した糖尿病モデルマウスに投与（経口）し、６０分経過後、グルコースを腹腔注射して、０、２０、４０、６０、９０、１２０、１８０分後の薬物の糖負荷試験を実施した。その結果、エキセナチド１００μｇ／ｋｇにＬＭＷＣ５０μｇ／ｋｇ混合投与（経口）が、エキセナチド１００μｇ／ｋｇ単一投与よりもさらに優れているようにグルコースに対する有意な耐性を有することを確認した（図２９ａ及び図２９ｂ）。
【０１１５】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したので、当業者にとって、このような具体的な技術は、単に望ましい具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２５ａ】
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【図２５ｂ】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２７ａ】
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【図２７ｂ】
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【図２８ａ】
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【図２８ｂ】
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【図２９ａ】
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【図２９ｂ】
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【配列表】
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