(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
0006404220.tif 000063
（式中、
【表１】
0006404220.tif 000064
）
により表される、化合物。
【請求項２】
下記化学反応式により、請求項１に記載の化合物Ｉａを調製する方法。
【化２】
0006404220.tif 000065
【請求項３】
下記化学反応式により、請求項１に記載の化合物Ｉｂを調製する方法。
【化３】
0006404220.tif 000066
【請求項４】
下記化学反応式により、請求項１に記載の化合物Ｉｃを調製する方法。
【化４】
0006404220.tif 000067
【請求項５】
下記化学反応式により、請求項１に記載の化合物Ｉｄを調製する方法。
【化５】
0006404220.tif 000068
【請求項６】
下記化学反応式により、請求項１に記載の化合物Ｉｅを調製する方法。
【化６】
0006404220.tif 000069
【請求項７】
下記化学反応式により、請求項１に記載の化合物Ｉｆを調製する方法。
【化７】
0006404220.tif 000070
【請求項８】
下記化学反応式により、請求項１に記載の化合物Ｉｇを調製する方法。
【化８】
0006404220.tif 000071
【請求項９】
下記化学反応式により、請求項１に記載の化合物Ｉｈを調製する方法。
【化９】
0006404220.tif 000072
【請求項１０】
請求項１に記載の化合物及び任意に薬剤的に許容できる賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
前記医薬組成物が、嚥下可能な錠剤、頬側錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、注射液、塗り広げできるペースト、ゲル、軟膏、又はソープの形態で使用できる、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記医薬組成物が種々の医薬剤形であり、前記医薬剤形が、乳化可能なリポソーム、ミクロスフィア、及びナノスフィアから選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ヒトの肺癌、乳癌、肝臓癌、直腸癌、結腸癌、前立腺癌、胃癌、食道癌、喉頭癌、白血病、リンパ腫、メラノーマ、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、皮膚癌、気管支癌、細気管支癌、尿道癌、腎臓癌、口腔癌、膣癌、胆管癌、膵臓癌、膀胱癌、脳癌、神経腫、及び鼻咽頭癌の予防及び治療における使用のための、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２の阻害における使用のための、又は
ヒストンデアセチラーゼの阻害における使用のための、又は、
腫瘍、炎症、心血管疾患、及び免疫不全と関連した因子であるＮＦ−κＢの阻害における使用のための、又は、
腫瘍、炎症、心血管疾患、及び免疫不全に関連する、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ａｋｔ、サイクリンＤ１、β−カテニン、ＥＲ−α、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２、Ｄｖｌ−１、Ｄｖｌ−２、Ｄｖｌ−３、Ｂｃｌ−２、ＨＤＡＣ３及びＨＤＡＣ４からなる群から選択される因子のタンパク質レベルの低下における使用のための、又は、
Ｂａｘ、ｐ５３、ｐ２１、Ｅ−カドヘリン、カスパーゼ３、及びチトクロムＣのタンパク質レベルの増加における使用のための、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
放射線療法と相乗作用する、又は、放射線療法、化学療法、外科治療、温熱療法、及び集学的治療と協同した腫瘍治療における使用のための、化学療法剤と一緒になった、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記腫瘍が、ヒトの肺癌、乳癌、肝臓癌、直腸癌、結腸癌、前立腺癌、胃癌、食道癌、喉頭癌、白血病、リンパ腫、メラノーマ、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、皮膚癌、気管支癌、細気管支癌、尿道癌、腎臓癌、口腔癌、膣癌、胆管癌、膵臓癌、膀胱癌、脳癌、神経腫、及び鼻咽頭癌からなる群から選択される、請求項１４〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
炎症、心血管疾患、及び免疫不全の予防及び治療における使用のための、又は、上述の疾患の臨床診断蛍光標識における使用のための、又は生活用品の蛍光標識の化合物の組合せにおける使用のための、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療技術、特に、テアニン誘導体とカルボン酸クマリン誘導体との縮合生成物である式（Ｉ）により表される化合物、両方とも前記縮合生成物の中間体である式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）により表される化合物、これらの化合物を調製する方法、前記化合物を含む医薬組成物、並びに腫瘍、炎症、心血管疾患、免疫不全疾患、及び同種のものの予防及び治療のための医薬品を調製する際のその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの肺癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、リンパ腫、メラノーマ、及び同種のものなどの悪性腫瘍の異常な増殖、浸潤、及び転移は、毎年数万人の患者の死亡の重大な理由である。悪性腫瘍の発生率も特定のレベルのままであり、悪性腫瘍は、ヒトの健康をひどく脅かす主要な疾患になった。化学療法及び放射線療法の臨床的な毒性作用及び副作用により、前記疾患の効果的な予防及び治療のためのこれらの療法の利用は制限されてきた。テアニン（グルタミルエチルアミンとしても知られる）は、茶の質を示す特徴的なアミノ酸である。テアニンには、食品成分としての毒性作用及び副作用が全くないので、その量が制限されずに食品添加物として食品産業において広く使用されている。試験によると、テアニンが腫瘍中の抗癌医薬品の濃度を高め、ヒトの卵巣癌を相乗的に治療し得ることが示された（Ｓａｄｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｌｅｔｔ  １２３：１５９−６７，２００１）。発明者らの以前の実験は、テアニンが肝臓癌及び肺癌を阻害する効果を有することを証明した（Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５９：２１１−２１７，２００９；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００２，６６  （４）：７１１−６）。本発明において、テアニン誘導体とカルボン酸クマリン誘導体との新規な縮合生成物及び前記縮合生成物の中間体は、化学的方法によりテアニンから形成され、前記化合物の抗腫瘍活性は抗癌医薬品及びテアニンの活性を上回る。
【０００３】
ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２阻害剤及びＳＡＨＡ（スベロイルアニリドヒドロキサム酸）、バルプロ酸、酪酸ナトリウム、及び同種のものなどのヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤は、米国において血液腫瘍及び固形腫瘍のＩ相又はＩＩ相臨床試験にかけられ、ＥＺＨ２及びＨＤＡＣは、乳癌、肺癌、前立腺癌、白血病、膵臓癌、子宮頸癌、腸の癌、肝臓癌、及び他の悪性腫瘍を含む種々のヒトの癌において過剰発現しており、抗癌医薬品の標的としてのＥＺＨ２及びＨＤＡＣに関する数多くの研究が米国で実施され、これらのＥＺＨ２阻害剤及びＨＤＡＣ阻害剤は、種々の腫瘍の治療に広く使用されており、実用の見込みが良好な潜在的な新規抗癌医薬品と考えられている（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，１０：３５５−６２，２０１０；Ｄｅｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２５：１８３−１８９，２００８；Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２：１５０−１５７，２００５；Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｉｇｌｅｓｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｏｎｃｏｌ．  １０：３９５−８，２００８）。
【０００４】
核タンパク因子ＮＦ−κＢは、種々の腫瘍、炎症、心血管疾患、免疫不全、及び他の疾患を促進するタンパク因子であると考えられており、疾患の予防及び治療の重要な標的になりつつある（Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｎｕｔｒ  ５０：９１−１０５，２０１２）。
【０００５】
ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、及びＥＲ−αなどの高レベルの受容体、並びに腫瘍のシグナル伝達に関連しているＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ａｋｔ、サイクリンＤ１、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２、Ｄｖｌ−１、Ｄｖｌ−２、Ｄｖｌ−３、β−カテニン、及びＢｃｌ−２などのタンパク因子の異常な過剰発現が、種々の腫瘍の発生及び進行に関連している一方で、腫瘍抑制因子タンパク質ｐ５３、ｐ２１、Ｅ−カドヘリン、カスパーゼ３、Ｂａｘ、及びチトクロムＣのレベル増加は、種々の癌細胞の増殖、浸潤、及び（又は）転移の阻害を示す（Ｃｅｎｇｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ９：３４１−８，２００７；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７７：７９４−８０３，２００９；Ｐｒａｓａｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．７３：１１２−７，２００７）。そのため、これらの癌関連因子は、癌の予防及び治療の潜在的な重要な標的となり、これらのタンパク因子の発現レベル及び活性に効果的に影響を与えることができる化合物は、癌の予防及び治療において広い実用の見込みを有する。
【０００６】
テアニン誘導体とカルボン酸クマリン誘導体との縮合生成物である式（Ｉ）により表される化合物、並びに式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）により表されるその中間体は、全て本発明により与えられるが、上述のタンパク因子のレベル及び活性に著しく影響を与えることができ、そのため、腫瘍、炎症、心血管疾患、免疫不全疾患、及び他の疾患の予防及び治療のための阻害剤の調製において広い見込みを有する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の一目的は、式（Ｉ）により表される化合物並びに式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）により表されるその中間体を提供することである：
【０００８】
【化１】
0006404220.tif 000002
式中、
【０００９】
【表１】
0006404220.tif 000003
【００１０】
【化２】
0006404220.tif 000004
式中、
【００１１】
【表２】
0006404220.tif 000005
【００１２】
【化３】
0006404220.tif 000006
式中、
【００１３】
【表３】
0006404220.tif 000007
【００１４】
本発明の別な目的は、本発明の化合物を調製する方法を提供することである：
１）以下に下記の化合物Ｉａ〜Ｉｂ及びＩＩａ〜ＩＩｂを調製する方法
【００１５】
【表１】
0006404220.tif 000008
；
２）以下に記載の化合物Ｉｃ〜Ｉｈ及びＩＩＩｃ〜ＩＩＩｈを調製する方法
【００１６】
【表５】
0006404220.tif 000009
３）先に記載の化合物Ｉｉを調製する方法：化合物Ｉｉは、化合物Ｉｆを還元条件下で還元することにより容易に得ることができる。
【００１７】
本発明の別な目的は、少なくとも１種の本発明の化合物及び任意に薬剤的に許容できる賦形剤を含む、本発明の化合物を含む医薬組成物を提供することである。
【００１８】
本発明の別な目的は、本発明の化合物、又は式（ＩＩＩａ）により表される化合物、又は本発明の化合物若しくは式（ＩＩＩａ）により表される化合物を含む医薬組成物の、医薬品の調製、とりわけ、ヒトの肝臓癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、リンパ腫、メラノーマ、及び他の腫瘍の予防及び治療のための医薬品の調製における使用を提供することである。したがって、本発明は、ヒトの肝臓癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、リンパ腫、メラノーマ、及び他の腫瘍の予防及び治療の方法であって、治療すべき患者に、治療上有効な量の少なくとも１種の本発明の化合物、又は式（ＩＩＩａ）により表される化合物、又は本発明の化合物若しくは式（ＩＩＩａ）により表される化合物を含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する：
【００１９】
【化４】
0006404220.tif 000010
【００２０】
本発明は、ヒトの肝臓癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、リンパ腫、メラノーマ、及び他の腫瘍の予防及び治療のための本発明の化合物、又は式（ＩＩＩａ）により表される化合物、又は本発明の化合物若しくは式（ＩＩＩａ）により表される化合物を含む医薬組成物にさらに関する。
【００２１】
本発明の別な目的は、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２阻害剤の調製における、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤の調製における、腫瘍、炎症、心血管疾患、免疫不全、及び他の疾患の促進に関連する因子であるＮＦ−κＢの阻害剤の調製における、腫瘍、炎症、心血管疾患、免疫不全、及び他の疾患と関連するＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＲ−α、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ａｋｔ、サイクリンＤ１、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２、Ｄｖｌ−１、Ｄｖｌ−２、Ｄｖｌ−３、β−カテニン、及びＢｃｌ−２を含む因子の阻害剤の調製における、並びに、Ｂａｘ、ｐ５３、ｐ２１、Ｅ−カドヘリン、カスパーゼ３、及び細胞質／ミトコンドリアチトクロムＣの比率を増加させる活性化因子の調製における、本発明の化合物、又は式（ＩＩＩａ）により表される化合物、又は本発明の化合物若しくは式（ＩＩＩａ）により表される化合物を含む医薬組成物の使用を提供することである。したがって、本発明は、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２を阻害する方法、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を阻害する方法、腫瘍、炎症、心血管疾患、免疫不全、及び他の疾患の促進と関連した因子であるＮＦ−κＢを阻害する方法、腫瘍、炎症、心血管疾患、免疫不全、及び他の疾患と関連しているＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＲ−α、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ａｋｔ、サイクリンＤ１、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２、Ｄｖｌ−１、Ｄｖｌ−２、Ｄｖｌ−３、β−カテニン、及びＢｃｌ−２を含む因子を阻害する方法、並びに、Ｂａｘ、ｐ５３、ｐ２１、Ｅ−カドヘリン、カスパーゼ３、及び細胞質／ミトコンドリアチトクロムＣの比率を増加させる方法を提供する。
【００２２】
本発明は、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２を阻害するための、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を阻害するための、腫瘍、炎症、心血管疾患、免疫不全、及び他の疾患の促進と関連した因子であるＮＦ−κＢを阻害するための、腫瘍、炎症、心血管疾患、免疫不全、及び他の疾患と関連しているＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＲ−α、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ａｋｔ、サイクリンＤ１、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２、Ｄｖｌ−１、Ｄｖｌ−２、Ｄｖｌ−３、β−カテニン、及びＢｃｌ−２を含む因子を阻害するための、並びにＢａｘ、ｐ５３、ｐ２１、Ｅ−カドヘリン、カスパーゼ３、及び細胞質／ミトコンドリアチトクロムＣの比率を増加させるための本発明の化合物にさらに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、実施形態１〜７で得られた化合物Ｉａ〜Ｉｈのインビボ及びインビトロで検出された蛍光画像を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の一目的は、式（Ｉ）により表される化合物並びに式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）により表されるその中間体を提供することである：
【００２５】
【化５】
0006404220.tif 000011
式中、
【００２６】
【表６】
0006404220.tif 000012
【００２７】
【化６】
0006404220.tif 000013
式中、
【００２８】
【表７】
0006404220.tif 000014
【００２９】
【化７】
0006404220.tif 000015
式中、
【００３０】
【表８】
0006404220.tif 000016
【００３１】
具体的には、化合物Ｉａの名称は、ＴＭＣと呼ばれるメチル５−エチルアミノ−５−オキソ−２−（２−オキソ−２Ｈ−ベンゾピラン−３−カルボキサミド）ペンタノエートであり、化合物Ｉａは、以下に示される化学構造式を有する：
【００３２】
【化８】
0006404220.tif 000017
化合物Ｉａは、白色粉末状固体であり、１５４℃の融点又はそれより高温で分解する。
【００３３】
中間体テアニンメチルエステルＩＩａは、以下の構造式により示される：
【００３４】
【化９】
0006404220.tif 000018
【００３５】
化合物Ｉｂの名称は、ＴＥＣと呼ばれるエチル５−エチルアミノ−５−オキソ−２−（２−オキソ−２Ｈ−ベンゾピラン−３−カルボキサミド）ペンタノエートであり、化合物Ｉｂは以下に示される化学構造式を有する：
【００３６】
【化１０】
0006404220.tif 000019
化合物Ｉｂは、白色粉末状固体であり、１８０℃の融点又はそれより高温で分解する。
【００３７】
中間体テアニンエチルエステルＩＩｂは以下の構造式により示される：
【００３８】
【化１１】
0006404220.tif 000020
【００３９】
化合物Ｉｃの名称は、ＴＣｌＣと呼ばれる（Ｒ）−２−（６−Ｃｌ−２−オキソ−２Ｈ−ベンゾピラン−３−カルボキサミド）−５−エチルアミノ−５−オキソ−ペンタン酸エチルエステルであり、化合物Ｉｃは以下に示される化学構造式を有する：
【００４０】
【化１２】
0006404220.tif 000021
化合物は、薄黄色の粉末状固体であり、２４２℃の融点又はそれより高温で分解する。
【００４１】
中間体６−クロロクマリン−３−カルボン酸は、以下の式により示される：
【００４２】
【化１３】
0006404220.tif 000022
【００４３】
化合物Ｉｄの名称は、ＴＢｒＣと呼ばれる（Ｒ）−２−（６−Ｂｒ−２−オキソ−２Ｈ−ベンゾピラン−３−カルボキサミド）−５−エチルアミノ−５−オキソ−ペンタン酸エチルエステルであり、化合物Ｉｄは以下に示される化学構造式を有する：
【００４４】
【化１４】
0006404220.tif 000023
化合物は、薄黄色の粉末状固体であり、２１１℃の融点又はそれより高温で分解する。
【００４５】
中間体６−ブロモクマリン−３−カルボン酸ＩＩＩｄは、以下の式により示される：
【００４６】
【化１５】
0006404220.tif 000024
【００４７】
化合物Ｉｅの名称は、ＴＦＣとも呼ばれる（Ｒ）−２−（６−Ｆ−２−オキソ−２Ｈ−ベンゾピラン−３−カルボキサミド）−５−エチルアミノ−５−オキソ−ペンタン酸エチルエステルであり、化合物Ｉｅは、以下の式により示される化学構造式を有する：
【００４８】
【化１６】
0006404220.tif 000025
化合物は、薄黄色の粉末状固体であり、６５℃の融点及びそれ以上で分解する。
【００４９】
中間体６−フルオロクマリン−３−カルボン酸ＩＩＩｅは以下に示される：
【００５０】
【化１７】
0006404220.tif 000026
【００５１】
化合物Ｉｆの名称は、ＴＮＣと呼ばれる（Ｒ）−２−（６−ニトロ−２−オキソ−２Ｈ−ベンゾピラン−３−カルボキサミド）−５−エチルアミノ−５−オキソ−ペンタン酸エチルエステルであり、化合物Ｉｆは、以下に示される化学構造式を有する：
【００５２】
【化１８】
0006404220.tif 000027
化合物は、薄黄色の粉末状固体であり、３００℃の融点又はそれより高温で分解する。
【００５３】
中間体６−ニトロクマリン−３−カルボン酸ＩＩＩｆは、以下に示される：
【００５４】
【化１９】
0006404220.tif 000028
【００５５】
化合物Ｉｇの名称は、ＤＴＣｌＣと呼ばれる（Ｒ）−２−（６，８−ジクロロ−２−オキソ−２Ｈ−ベンゾピラン−３−カルボキサミド）−５−エチルアミノ−５−オキソ−ペンタン酸エチルエステルであり、化合物Ｉｇは以下に示される化学構造式を有する：
【００５６】
【化２０】
0006404220.tif 000029
【００５７】
化合物Ｉｈの名称は、ＤＴＢｒＣと呼ばれる（Ｒ）−２−（６，８−ジブロモ−２−オキソ−２Ｈ−ベンゾピラン−３−カルボキサミド）−５−エチルアミノ−５−オキソ−ペンタン酸エチルエステルであり、化合物Ｉｈは以下に示される化学構造式を有する：
【００５８】
【化２１】
0006404220.tif 000030
化合物ＩｇとＩｈはどちらも薄黄色の粉末状固体であり、それぞれ１３６℃及び１２１℃の融点又はそれより高温で分解する。
【００５９】
中間体６，８−ジクロロ−クマリン−３−カルボン酸ＩＩＩｇは以下の式により示される：
【００６０】
【化２２】
0006404220.tif 000031
【００６１】
中間体６，８−ジブロモ−クマリン−３−カルボン酸ＩＩＩｈは、以下の式により示される：
【００６２】
【化２３】
0006404220.tif 000032
【００６３】
化合物Ｉｉの名称は、（Ｒ）−２−（６−アミノ−２−オキソ−２Ｈ−ベンゾピラン−３−カルボキサミド）−５−エチルアミノ−５−オキソ−ペンタン酸エチルエステルであり、化合物Ｉｉは以下に示される化学構造式を有する：
【００６４】
【化２４】
0006404220.tif 000033
【００６５】
本発明の別な目的は、本発明の化合物を調製する方法を提供することである：
１）以下に記載の化合物Ｉａ〜Ｉｂ及びＩＩａ〜ＩＩｂを調製する方法
【００６６】
【表２】
0006404220.tif 000034
；
２）以下に記載の化合物Ｉｃ〜Ｉｈ及びＩＩＩｃ〜ＩＩＩｈを調製する方法
【００６７】
【表１０】
0006404220.tif 000035
３）化合物Ｉｉを調製する方法：化合物Ｉｉは、還元条件下で化合物Ｉｆを還元することにより容易に得ることができる。
【００６８】
本発明は、本発明の化合物を含む医薬組成物をさらに提供する。本発明は、少なくとも１種の本発明の化合物及び任意に薬剤的に許容できる賦形剤を含むそのような医薬組成物を提供する。
【００６９】
本明細書では、特記されない限り、用語「プロドラッグ」は、生物学的条件下で（インビトロ又はインビボ）加水分解され、酸化され、又は他の反応を受けて、本発明の化合物を提供できる誘導体を意味する。プロドラッグは、生物学的条件下での反応により活性形態に変換されるか、又はその未反応の形態で活性を有する。一般に、プロドラッグは、１  Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  （１９９５）  １７２−１７８，９４９−９８２  （Ｍａｎｆｒｅｄ  Ｅ．  Ｗｏｌｆｆ  ｅｄ．，５ｔｈ  ｅｄ）に記載される方法など、公知の方法により調製できる。
【００７０】
プロドラッグは、以下の方法による化学修飾により調製できる：本発明の化合物のプロドラッグは、以下に示される通り、単糖類、例えばグルコース、又はビタミンＣ、プロパンジオール、並びに他の炭水化物及びアルコール化合物を、クマリン誘導体の７−ヒドロキシル基又はテアニン誘導体のアミノ基、アルキル基、及びカルボニル基に結合し、そのような修飾により形成されたグルコシド結合、エステル結合、アミド結合、及び同種のものはインビボで加水分解され、そのためプロドラッグは、本発明の活性な化合物に変換されて、生物活性を発揮できる。
【００７１】
【表１１】
0006404220.tif 000036
【００７２】
同様に、ヒドロキシル基又は類似の基を、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（Ｉｆ）、（Ｉｇ）、（Ｉｈ）、及び（Ｉｉ）により表される本発明の化合物に導入することができる。
【００７３】
さらに、上述の７−ヒドロキシル基及びヒドロキシル基が導入され得るどのような他の部位（例えば、５−ヒドロキシル基又はテアニンの直鎖上の可能性のある部位）も、単糖類、例えばグルコース、又はビタミンＣ、プロパンジオール、又は他の炭水化物及びアルコール化合物により修飾でき、本発明の化合物のプロドラッグを与える他の可能性のある修飾成分及びそのような修飾により形成されたグリコシド結合、エステル結合、アミド結合、及び同種のものは、インビボで加水分解され得るので、プロドラッグは、本発明の活性な化合物又は本体（又は基礎）が本発明の化合物である化合物に変換されて、生物活性を発揮できる。
【００７４】
【表１２】
0006404220.tif 000037
【００７５】
特定の量の活性成分を含む種々の医薬組成物を調製する方法は公知であるか、又は本発明の開示により当業者に明らかである。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｍａｒｔｉｎ，ＥＷ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９ｔｈ  ｅｄ．  （１９９５）に記載される通り、医薬組成物を調製する方法は、適切な医薬賦形剤、担体、希釈剤、及び同種のものなどを組み込む工程を含む。
【００７６】
本発明の医薬調合物を調製する公知の方法は、従来の混合、溶解、又は凍結乾燥方法を含む。本発明の化合物は、医薬組成物に製造され、経口又は非経口投与（静脈内、筋肉内、局所、又は皮下の方法により、鼻腔内及び他の部分への噴霧、錠剤のペースティング（ｐａｓｔｉｎｇ）、及び同種のもの）などの選択された投与様式に好適な種々の方法で患者に投与することができる。
【００７７】
そのため、薬剤的に許容できる担体（不活性な希釈剤又は同化でき食べられる担体など）と組み合わされた本発明の化合物は、経口投与など、全身投与できる。それらは、硬質又は軟質ゼラチンカプセルに封入することも、圧縮して錠剤にすることもできる。経口投与には、活性化合物は、１種以上の賦形剤と組み合わせることができ、嚥下可能な錠剤、頬側錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェファ、及び同種のものの形態で使用できる。そのような組成物又は調合物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含んでいるはずである。組成物又は調合物中の比率は、所与の単位剤形の重量の約１％から約９９％の範囲で変わり得る。そのような治療上有用な組成物において、活性化合物の量は、効果的な投与量を得るのに充分でなくてはならない。
【００７８】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤、及び同種のものは、トラガカント、アラビアゴム、コーンスターチ、若しくはゼラチンなどの結合剤；リン酸水素カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸、及び同種のものなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；スクロース、フルクトース、ラクトース、若しくはアスパルテームなどの甘味剤；又はペパーミント、ウィンターグリーン油、若しくはチェリーフレーバーなどの着香剤を含み得る。単位剤形がカプセルである場合、上記の材料に加え、植物油又はポリエチレングリコールなどの液体担体も含まれてよい。種々の他の材料も、コーティング又は固体単位剤形を他の方法で変えることのできる他の物理的形態として存在してよい。例えば、錠剤、丸剤、又はカプセル剤は、ゼラチン、ワックス、シェラック、又は糖、及び同種のものなどにより被覆できる。シロップ剤又はエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてのスクロース又はフルクトース、保存剤としてのメチルパラベン又はプロピルパラベン、染料、及び着香剤（チェリーフレーバー又はオレンジフレーバーなど）を含み得る。もちろん、単位剤形を調製するためのどの材料も、薬剤的に許容でき、使用量で基本的に非毒性でなければならない。さらに、活性化合物を混合して、徐放調合物及び徐放性装置にできる。
【００７９】
活性化合物は、注入又は注射により静脈内に又は腹腔内に投与できる。活性化合物又はその塩の水溶液を調製でき、任意に非毒性の界面活性剤と混合できる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、グリセロール三酢酸エステル、及びこれらの混合物中の分散剤並びに油中の分散剤も調製できる。通常の貯蔵及び使用条件下で、これらの調合物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。
【００８０】
注射又は注入に好適な医薬剤形は、活性成分（任意にリポソームに包まれている）を含む滅菌された水溶液若しくは分散剤又は滅菌された粉末を含み得るが、それらは滅菌された注射用又は注入用の溶液又は分散剤の即時調合物に好適である。どのような場合でも、最終剤形は、滅菌され、液体で、加工及び貯蔵条件下で安定でなければならない。液体担体は、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロパンジオール、液体ポリエチレングリコール、及び同種のものなど）、植物油、非毒性のグリセリド、及びこれらの好適な混合物などの溶媒でも液体分散媒体でもよい。例えば、リポソームの形成、分散剤の存在下での要求される粒径の維持、又は界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持できる。種々の抗菌剤及び抗真菌剤（パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、及び同種のものなど）を使用して、微生物を防ぐことができる。多くの場合で、糖、緩衝剤、又は塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。注射用組成物の遅延した吸収は、吸収遅延剤（モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど）の組成物の使用により達成できる。
【００８１】
滅菌注射液は、適切な溶媒中の要求される量の活性化合物を、先に列記された種々の成分と組み合わせ、次いで、濾過及び滅菌を実施することにより調製できる。滅菌注射液から滅菌散剤を調製する場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技法であり、それにより、活性成分の粉末及び先の滅菌濾過された溶液中で必要とされた他の成分の粉末ができるだろう。
【００８２】
有用な固体担体には、粉砕した固体がある（滑石、粘土、微結晶性セルロース、二酸化ケイ素、酸化アルミニウム、及び同種のものなど）。有用な液体担体には、水、エタノール、エチレングリコール、又は水−エタノール／エチレングリコール混合物があり、本発明の化合物を、非毒性の界面活性剤の介助の下で、効果的な含量で液体担体に溶解又は分散させることができる。補助剤（香料など）及び追加の抗微生物剤を、所与の用途のための性質を最適にするために加えることができる。
【００８３】
増粘剤（合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩及びエステル、脂肪族アルコール、修飾されたセルロース、又は修飾された無機物質など）を液体担体と共に使用して、使用者の皮膚に直接塗布できる、塗り広げできるペースト、ゲル、軟膏、ソープ、及び同種のものなどを形成できる。
【００８４】
治療のための化合物の要求される量は、選択された具体的な塩のみでなく、適用様式、治療すべき疾患の性質、並びに患者の年齢及び状態にも依存し、そして、現場の医師又は臨床医の決定に依存する。
【００８５】
上述の調合物は単位剤形で存在し得るが、それは投薬単位を含む物理的に分散した単位であり、ヒトの体及び他の哺乳動物への送達に好適である。単位剤形は、カプセル剤又は錠剤でも、複数のカプセル剤又は錠剤でもよい。関与する具体的な治療によって、活性成分の投薬単位の量は、約１ｍｇから約２０００ｍｇ又はそれ以上の範囲で変更又は調整できる。
【００８６】
さらに、本発明は、ポリマー性ミセル、ナノエマルション、サブミクロエマルション（ｓｕｂｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓ）、マイクロカプセル、ミクロスフィア、リポソーム、ニオソーム（非イオン性界面活性剤ベシクルとしても知られる）、及び同種のものを含む微粒子分散システムを利用して調製される医薬品など、乳化可能なリポソーム、ミクロスフィア、及びナノスフィアなどの種々の新しい医薬剤形の適用をさらに含む。
【００８７】
本発明は、本発明の化合物、又は式（ＩＩＩａ）により表される化合物、又は本発明の化合物若しくは式（ＩＩＩａ）により表される化合物を含む医薬組成物の、医薬品、とりわけ、ヒトの肝臓癌、乳癌、膵臓癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、リンパ腫、メラノーマ、及び他の腫瘍の予防及び治療のための医薬品の調製における使用をさらに提供する。したがって、本発明は、ヒトの肝臓癌、乳癌、膵臓癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、リンパ腫、メラノーマ、及び他の腫瘍の予防及び治療の方法であって、治療すべき患者に、治療上有効な量の少なくとも１種の本発明の化合物、又は式（ＩＩＩａ）により表される化合物、又は本発明の化合物若しくは式（ＩＩＩａ）により表される化合物を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００８８】
本発明は、ヒトの肝臓癌、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、リンパ腫、メラノーマ、及び他の腫瘍の予防及び治療のための、本発明の化合物、又は式（ＩＩＩａ）により表される化合物、又は本発明の化合物若しくは式（ＩＩＩａ）により表される化合物を含む組成物にさらに関する。
【００８９】
本発明の別な目的は、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２阻害剤の調製における、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤の調製における、腫瘍、炎症、心血管疾患、免疫不全、及び他の疾患の促進と関連した因子であるＮＦ−κＢの阻害剤の調製における、腫瘍、炎症、心血管疾患、免疫不全、及び他の疾患と関連しているＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＲ−α、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ａｋｔ、サイクリンＤ１、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２、Ｄｖｌ−１、Ｄｖｌ−２、Ｄｖｌ−３、β−カテニン、及びＢｃｌ−２／Ｂａｘを含む因子の阻害剤の調製における、ｐ５３、ｐ２１、Ｅ−カドヘリン、カスパーゼ３、及び細胞質／ミトコンドリアチトクロムＣの比率を増加させる活性化因子の調製における、本発明の化合物、又は式（ＩＩＩａ）により表される化合物、又は本発明の化合物若しくは式（ＩＩＩａ）により表される化合物を含む医薬組成物の使用を提供することである。したがって、本発明は、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２を阻害する方法、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を阻害する方法、腫瘍、炎症、心血管疾患、免疫不全、及び他の疾患の促進と関連した因子であるＮＦ−κＢを阻害する方法、腫瘍、炎症、心血管疾患、免疫不全、及び他の疾患と関連しているＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＲ−α、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ａｋｔ、サイクリンＤ１、β−カテニン、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２、Ｄｖｌ−１、Ｄｖｌ−２、Ｄｖｌ−３、及びＢｃｌ−２を含む因子を阻害する方法、並びにＢａｘ、ｐ５３、ｐ２１、Ｅ−カドヘリン、カスパーゼ３、及び細胞質／ミトコンドリアチトクロムＣの比率を増加させる方法を提供する。
【００９０】
本発明は、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２を阻害するための、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を阻害するための、腫瘍、炎症、心血管疾患、免疫不全、及び他の疾患の促進と関連した因子であるＮＦ−κＢを阻害するための、腫瘍、炎症、心血管疾患、免疫不全、及び他の疾患と関連しているＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＲ−α、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ａｋｔ、サイクリンＤ１、β−カテニン、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２、Ｄｖｌ−１、Ｄｖｌ−２、Ｄｖｌ−３、及びＢｃｌ−２／Ｂａｘを含む因子を阻害するための、並びにｐ５３、ｐ２１、Ｅ−カドヘリン、カスパーゼ３、及び細胞質／ミトコンドリアチトクロムＣの比率を増加させるための本発明の化合物にさらに関する。
【００９１】
本発明の化合物は、腫瘍の治療のための放射線療法、化学療法、手術、温熱療法、及び同種のものと組み合わせることができ、腫瘍の治療のための放射線療法、化学療法、手術、温熱療法、及び同種のものと協同する医薬品の調製に使用できる。
【００９２】
本発明の化合物は腫瘍細胞を効果的に殺傷でき、腫瘍の治療において、放射線療法及び化学療法医薬品の効果を増大することができ、腫瘍の阻害における化合物の効果は、抗癌医薬品及びテアニンの効果を上回る；さらに、毒性作用及び副作用は大きく低下しており、化合物は明らかな毒性作用及び副作用を全く有さない。
【００９３】
腫瘍には、肺癌、乳癌、肝臓癌、直腸癌、結腸癌、前立腺癌、胃癌、食道癌、脳腫瘍及び神経原性腫瘍、喉頭癌、白血病、リンパ腫、メラノーマ、子宮癌、網膜腫瘍、卵巣癌、皮膚癌、気管支癌、細気管支癌、尿道癌、腎臓癌、口腔癌、膣癌、胆管癌、膵臓癌、膀胱癌、鼻咽頭癌、及び他の様々な腫瘍がある。
【００９４】
本発明により提供される化合物は、化学療法の効果と放射線療法との相乗作用を一体化でき、より広い用途、より良い治療効果、より小さい毒性作用及び副作用、より広い適応症、並びにより大きい潜在的な適用価値（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）及び市場利益（ｍａｒｋｅｔ  ｂｅｎｅｆｉｔｓ）を有する新規な抗腫瘍医薬品である。
【００９５】
本発明により得られた化合物及びその中間体は、筋肉内、皮下、静脈内、及び腹腔内注射、又は経口投与により使用でき、種々のヒトの癌細胞、動物の癌細胞、及び動物におけるヒトの癌異種移植片の治療の効果は、テアニン及びいくつかの臨床用抗癌医薬品、例えばビンクリスチン、ダウノルビシン、シクロホスファミド、エンドスター、及び同種のものより良好である。
【００９６】
本発明により得られた化合物及びその中間体の蛍光特性は、以下の方法により応用できる。蛍光特性の応用について：１）蛍光標識として：暗所での全ての標識及び装飾、照明識別子、装飾、玩具、小道具、日用品の特定の蛍光サイン、省エネルギーランプ、ネオンランプ、衣類、帽子、靴、手袋、及びリュックサックなどの黒い衣類（ｄａｒｋ  ｃｌｏｔｈｅｓ）、位置のロゴ（ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｌｏｇｏｓ）及び器具の安全状態、及び同種のもののために。２）周囲ｐＨ値、Ｏ2、ＣＯ2、Ｎａ、Ｃａ、ＮＯ3、酸化還元状態、及び同種のものが変化する場合に色の変化を伴う、環境変化及び食品の質の指示薬など環境状態の変化の指示薬として（Ｃａ2+が化合物の蛍光プローブ溶液に加えられる場合、プローブの蛍光強度が約４５０ｎｍで鋭く増加し；クマリンタイプのアニオン性蛍光プローブが使用される場合、そのようなプローブは選択的に水溶液中のＨＳＯ3-及び同種のものを特定できるなど）。化合物は、例えば、医療衛生の側面において、分子プローブとして試験研究及び応用に利用でき、本発明の化合物が細胞又は医薬品又は成分を標識するために使用される場合、化合物は、細胞中又は体内でのその位置、インビボでの細胞の移動位置、並びにタンパク質、酵素、受容体、及び同種のものなどの結合標的を表示でき、それにより、診断予測及び評価の効果を実現させる。
【００９７】
以下の実施形態において、本発明がさらに説明される。以下の実施形態が、本発明の範囲を限定するよりも、本発明を説明するためにのみ利用されることを理解されたい。
【００９８】
以下の実施形態で使用される化学原材料は、市販されているか、当分野に周知である方法により合成される。
（適用に関連する温度は、摂氏温度を指す）。
【実施例】
【００９９】
実施形態１：化合物Ｉａ及びその中間体ＩＩａの調製
反応の全般的な工程は以下の通りである：
【０１００】
【表１３】
0006404220.tif 000038
【０１０１】
工程１：テアニンメチルエステルＩＩａの調製
テアニンを、８７ｇ／Ｌの比率でメタノールに溶解させ（すなわち、８７ｇのテアニンを１リットルのメタノールに溶解させた）、次いで、塩化スルホニルを、ゆっくりと５５ｍｌの体積比で前記系に加え、混合物を室温で１時間撹拌し、生じた混合物を減圧下で濃縮すると、テアニンメチルエステルＩＩａを与えた。
【０１０２】
工程２：ＴＭＣ  Ｉａの調製
２０ｇのテアニンメチルエステルを、２Ｌの無水ジクロロメタンに溶解させ、２７ｇの３−カルボン酸クマリンを加え、次いで、０．２１ＬのＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）及び７６ｇのＥＤＣＩをそれぞれ加えた。生じた混合物を室温で１時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮して溶媒を除去し、残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、生成物であるＴＭＣ  Ｉａを回収した。生成物は、薄黄色の粉末状固体であり、１８０℃の融点又はそれより高温で分解し、化合物の構造特性は以下の通りであった：
1H NMR (500 MHz, CDCl3)δ1.15 (t, 3H, J = 7.2 Hz), 2.10-2.17 (m, 1H), 2.28-2.31 (m, 2H), 2.34-2.41 (m, 1H), 3.27-3.33 (m, 2H), 3.78 (s, 3H), 4.78-4.83 (m, 1H), 6.07 (br s, 1H), 7.38-7.43 (m, 2H), 7.67-7.71 (m, 2H), 8.88 (s, 1H), 9.35 (br d, 1H, J = 7.6 Hz); 13C NMR (125 MHz, CDCl3)δ14.81, 28.72, 32.57, 34.47, 52.29, 52.63, 116.75, 117.93, 118.47, 125.39, 129.89, 134.40, 148.81, 154.57, 161.17, 161.74, 171.22, 171.75; ESI-MS m/z 361 [M+1].
【０１０３】
実施形態２：化合物Ｉｂ及びその中間体ＩＩｂの調製
反応の全般的な工程は以下の通りである：
【０１０４】
【表１４】
0006404220.tif 000039
【０１０５】
工程１：テアニンエチルエステルＩＩｂの調製
テアニンを、８７ｇ／Ｌの比率でエタノールに溶解させ（すなわち、８７ｇのテアニンを１リットルのメタノールに溶解させた）、次いで、塩化スルホニルを、ゆっくりと、５５ｍｌの体積比で前記系に加え、混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、生じた混合物を減圧下で濃縮すると、テアニンエチルエステルＩＩｂを得た。
【０１０６】
工程２：ＴＥＣ  Ｉｂの調製
２０ｇのテアニンエチルエステルを、２Ｌの無水ジクロロメタンに溶解させ、２７ｇの３−カルボン酸クマリンを加え、次いで、０．２１ＬのＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）及び７６ｇのＥＤＣＩをそれぞれ加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮して溶媒を除去し、残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、生成物であるＴＥＣ  Ｉｂを回収した。生成物は薄黄色の粉末状固体であり、１８０℃の融点又はそれより高温で分解し、化合物の構造特性は以下の通りであった：
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.11 (t, 3H, J = 7.2 Hz), 1.28 (t, 3H, J = 7.1 Hz), 2.17-2.28 (m, 3H), 2.31-2.40 (m, 1H), 3.23-3.28 (m, 2H), 4.10-4.13 (m, 1H), 4.18-4.22 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 5.61 (br s, 1H), 6.90 (dt, 1H, J = 7.5, 0.8 Hz), 6.97 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 7.28 (dd, 1H, J = 7.7, 1.6 Hz), 7.34 (dt, 1H, J = 8.5, 1.6 Hz), 8.39 (s, 1H), 12.96 (br s, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 14.2, 14.8, 29, 32, 34, 61, 70, 117, 118.5, 118.9, 131, 132, 160, 167, 170, 171; ESI-MS m/z 375 [M+1].
【０１０７】
実施形態３：化合物Ｉｃ及びその中間体ＩＩＩｃの調製
反応の全般的な工程は以下の通りである：
【０１０８】
【表３】
0006404220.tif 000040
【０１０９】
工程１：６−クロロ−クマリン−３−カルボン酸ＩＩＩｃの調製
（１）２００ｇの５−クロロサリチルアルデヒド、２００ｍＬのマロン酸ジエチル、６００ｍＬの無水エタノール、１０ｍＬのピペリジン（１０．３ｇ）、及び１ｍｌの氷酢酸を順次加えた；（２）前記混合物を、水浴中で、無水状態で２時間８０℃で撹拌し還流し、冷却した；（３）約６００ｍＬの冷水（０℃）を加え、結晶の沈澱の後で混合物を濾過し、フィルターケーキを、氷水（０℃）で冷却した１００ｍＬの５０％エタノールで２回洗浄すると、６−クロロクマリン−３−カルボキシレートを得た；（４）１２４ｇのエチル６−クロロクマリン−３−カルボキシレート及び１００ｇの水酸化ナトリウムをそれぞれ加え、５００ｍＬの無水エタノール及び５００ｍＬの水を加え、混合物を、水浴中で、８０℃で約２時間加熱し還流した；並びに（５）混合物を、反応後に、直ちに０℃の氷浴に入れ、系から固体を沈殿させるために、濃塩酸を加えて系のｐＨ値を２〜３にし、混合物を氷浴により冷却し、次いで濾過し、フィルターケーキを少量の氷水で洗浄し、乾燥させた粗生成物を水による再結晶により精製すると、６−クロロクマリン−３−カルボン酸ＩＩＩｃを得た。
【０１１０】
工程２：テアニンエチルエステルＩＩｂの調製
テアニンを、８７ｇ／Ｌの比率でエタノールに溶解させ（すなわち、８７ｇのテアニンを１リットルのメタノールに溶解させた）、次いで、塩化スルホニルを、５５ｍｌの体積比で前記系にゆっくりと加え、混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、生じた混合物を減圧下で濃縮すると、テアニンエチルエステルＩＩｂを得た。
【０１１１】
工程３：ＴＣｌＣ  Ｉｃの調製
２０ｇのテアニンエチルエステルを２Ｌの無水ジクロロメタンに溶解させ、２７ｇの６−クロロ−クマリン−３−カルボン酸を加え、０．２１ＬのＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）及び７６ｇのＥＤＣＩをそれぞれ加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮して溶媒を除去し、残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、生成物であるＴＣｌＣ  Ｉｃを回収した。生成物は薄黄色の粉末状固体であり、２４２℃の融点又はそれより高温で分解し、化合物の構造特性は以下の通りであった：
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ: 1.12 (t, J = 7.25 Hz, 3H, CH3), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH3), 2.15-2.40 (m, 4H, CH2), 3.26 (m, 2H, NH-CH2), 4.14 (m, 1H, NH-CH), 4.21 (q, J = 7.1 Hz, 2H, O-CH2), 5.47 (br, 1H, NH), 6.91 (d, J = 8.6 Hz, 1H, クマリン-8H), 7.25-7.28 (m, 2H, クマリン-5H,7H), 8.33 (s, クマリン-4H), 12.93 (s, 1H, NH). 13C-NMR δ: 14.1 (CH3), 14.8 (CH3), 29.1 (CH2), 32.0 (CH2), 34.4 (CH2), 61.6 (CH), 70.0 (CH2), 118.7 (C), 119.3 (CH), 123.4 (C), 130.9 (CH), 132.7 (CH), 159.6 (C), 166.3 (C), 170.7 (C), 171.2 (C). ESI-MS (m/z): 407.1 [M-H]-.
【０１１２】
実施形態４：化合物Ｉｄ及びその中間体ＩＩＩｄの調製
反応の全般的な工程は以下の通りである：
【０１１３】
【表４】
0006404220.tif 000041
【０１１４】
工程１：６−ブロモ−クマリン−３−カルボン酸ＩＩＩｄの調製
（１）２００ｇの５−ブロモサリチルアルデヒド、２００ｍＬのマロン酸ジエチル、６００ｍＬの無水エタノール、１０ｍＬのピペリジン（１０．３ｇ）、及び１ｍｌの氷酢酸を順次加えた；（２）混合物を、水浴中、無水状態で、８０℃で２時間撹拌し還流し、冷却した；（３）約６００ｍＬの冷水（０℃）を加え、結晶の沈澱後に混合物を濾過し、フィルターケーキを、氷水（０℃）により冷却した１００ｍＬの５０％エタノールで２回洗浄すると、６−ブロモクマリン−３−カルボキシレートを得た；（４）１２４ｇのエチル６−ブロモクマリン−３−カルボキシレート及び１００ｇの水酸化ナトリウムをそれぞれ加え、次いで、５００ｍＬの無水エタノール及び５００ｍＬの水を加え、生じた混合物を、水浴中で、８０℃で約２時間加熱し還流した；並びに（５）混合物を、反応後に、直ちに０℃の氷浴に入れ、系から固体を沈殿させるために、濃塩酸を加えて系のｐＨ値を２〜３にし、混合物を氷浴により冷却し、次いで濾過し、フィルターケーキを少量の氷水で洗浄し、乾燥させた粗生成物を水による再結晶により精製すると、６−ブロモクマリン−３−カルボン酸ＩＩＩｄを得た。
【０１１５】
工程２：テアニンエチルエステルＩＩｂの調製
テアニンを、８７ｇ／Ｌの比率でエタノールに溶解させ（すなわち、８７ｇのテアニンを１リットルのメタノールに溶解させた）、次いで、塩化スルホニルを、ゆっくりと、５５ｍｌの体積比で前記系に加え、混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、生じた混合物を減圧下で濃縮すると、テアニンエチルエステルＩＩｂを得た。
【０１１６】
工程３：ＴＢｒＣ  Ｉｄの調製
２０ｇのテアニンエチルエステルを、２Ｌの無水ジクロロメタンに溶解させ、２７ｇの６−ブロモ−クマリン−３−カルボン酸を加え、次いで、０．２１ＬのＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）及び７６ｇのＥＤＣＩをそれぞれ加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮して溶媒を除去し、残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、生成物を回収すると、ＴＢｒＣ  Ｉｄを得た。生成物は、薄黄色の粉末状固体であり、２１１℃の融点又はそれより高温で分解し、化合物の構造特性は以下の通りであった：
1H-NMR δ: 1.12 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH3), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH3), 2.17-2.38 (m, 4H, CH2), 3.26 (m, 2H, NH-CH2), 4.15 (t, J = 5.4 Hz, 1H, NH-CH), 4.21 (q, J = 7.1 Hz, 2H, O- CH2), 5.50 (br, 1H, NH), 6.87 (d, J = 8.5 Hz, 1H, クマリン-8H), 7.39-7.42 (m, 2H, クマリン-5H,7H), 8.32 (s, クマリン-4H), 12.95 (s, 1H, NH). 13C-NMR δ: 14.2 (CH3), 14.8 (CH3), 29.1 (CH2), 32.0 (CH2), 34.4 (CH2), 61.6 (CH), 70.0 (CH2), 110.3 (C), 119.2 (CH), 119.9 (C), 133.9 (CH), 139.7 (CH), 160.1 (C), 166.2 (C), 170.7 (C), 171.2 (C). ESI-MS (m/z): 451.0 [M-H]-.
【０１１７】
実施形態５：化合物Ｉｅ及びその中間体ＩＩＩｅの調製
反応の全般的な工程は以下の通りである：
【０１１８】
【表１７】
0006404220.tif 000042
【０１１９】
工程１：６−フルオロ−クマリン−３−カルボン酸ＩＩＩｅの調製
（１）２００ｇの５−フルオロサリチルアルデヒド、２００ｍＬのマロン酸ジエチル、６００ｍＬの無水エタノール、１０ｍＬのピペリジン（１０．３ｇ）、及び１ｍｌの氷酢酸を順次加えた；（２）混合物を、水浴中、無水状態で、８０℃で２時間撹拌し還流し、冷却した；（３）約６００ｍＬの冷水（０℃）を加え、結晶の沈澱後に混合物を濾過し、氷水（０℃）により冷却した１００ｍＬの５０％エタノールで２回洗浄すると、６−フルオロクマリン−３−カルボキシレートを得た；（４）１２４ｇのエチル６−フルオロクマリン−３−カルボキシレート及び１００ｇの水酸化ナトリウムをそれぞれ加え、次いで、５００ｍＬの無水エタノール及び５００ｍＬの水を加え、生じた混合物を、水浴中で、８０℃で約２時間加熱し還流した；並びに（５）混合物を、反応後に、直ちに０℃の氷浴に入れ、系から固体を沈殿させるために、濃塩酸を加えて系のｐＨ値を２〜３にし、系を氷浴により冷却し、次いで濾過し、少量の氷水で洗浄し、乾燥させた粗生成物を水による再結晶により精製すると、６−フルオロクマリン−３−カルボン酸ＩＩＩｅを得た。
【０１２０】
工程２：テアニンエチルエステルＩＩｂの調製
テアニンを、８７ｇ／Ｌの比率でエタノールに溶解させ（すなわち、８７ｇのテアニンを１リットルのメタノールに溶解させた）、次いで、塩化スルホニルを、ゆっくりと、５５ｍｌの体積比で前記系に加え、混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、生じた混合物を減圧下で濃縮すると、テアニンエチルエステルＩＩｂを得た。
【０１２１】
工程３：ＴＦＣ  Ｉｅの調製
２０ｇのテアニンエチルエステルを２Ｌの無水ジクロロメタンに溶解させ、２７ｇの６−フルオロ−クマリン−３−カルボン酸を加え、次いで、０．２１ＬのＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）及び７６ｇのＥＤＣＩをそれぞれ加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮して溶媒を除去し、残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、生成物を回収するとＴＦＣ  Ｉｅを得た。生成物は、薄黄色の粉末状固体であり、３００℃の融点又はそれより高温で分解し、化合物の構造特性は以下の通りであった：
m.p.: 109-111℃. 1H-NMR δ: 1.12 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH3), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH3), 2.17-2.38 (m, 4H, CH2), 3.26 (m, 2H, NH-CH2), 4.15 (t, J = 5.4 Hz, 1H, NH-CH), 4.21 (q, J = 7.1 Hz, 2H, O- CH2), 5.50 (br, 1H, NH), 6.87 (d, J = 8.5 Hz, 1H, クマリン-8H), 7.39-7.42 (m, 2H, クマリン-5H,7H), 8.32 (s, クマリン-4H), 12.95 (s, 1H, NH). 13C-NMR δ: 14.2 (CH3), 14.8 (CH3), 29.1 (CH2), 32.0 (CH2), 34.4 (CH2), 61.6 (CH), 70.0 (CH2), 110.3 (C), 119.2 (CH), 119.9 (C), 133.9 (CH), 139.7 (CH), 160.1 (C), 166.2 (C), 170.7 (C), 171.2 (C). ESI-MS (m/z): 451.0 [M-H]-.
【０１２２】
実施形態６：化合物Ｉｆ及びその中間体ＩＩＩｆの調製
反応の全般的な工程は以下の通りである：
【０１２３】
【表１８】
0006404220.tif 000043
【０１２４】
具体的な工程１：６−ニトロ−クマリン−３−カルボン酸ＩＩＩｆの調製
５０ｇのクマリン−３−酸を２４０ｍＬの濃硫酸に溶解させ、−１０℃に冷却し、濃硝酸と濃硫酸の混合酸溶液（８０ｍＬ、濃硝酸と濃硫酸の体積比は１：３である）を加え、混合物を０℃で１時間撹拌し、次いで、温度を室温まで上げ、混合物をさらに１時間反応させた。反応溶液を５０００ｍＬの氷水に注ぎ、静置して結晶化させ、結晶を濾過し、氷水で洗浄し、乾燥させると、６−ニトロクマリン−３−カルボン酸ＩＩＩｆを得たが、薄黄色非晶質固体であった。
【０１２５】
工程２：テアニンエチルエステルＩＩｂの調製
テアニンを、８７ｇ／Ｌの比率でエタノールに溶解させ（すなわち、８７ｇのテアニンを１リットルのメタノールに溶解させる）、次いで、塩化スルホニルを、ゆっくりと５５ｍｌの体積比で前記系に加え、混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、生じた混合物を減圧下で濃縮すると、テアニンエチルエステルＩＩｂを得た。
【０１２６】
工程３：ＴＮＣ  Ｉｆの調製
２０ｇのテアニンエチルエステルを２Ｌの無水ジクロロメタンに溶解させ、２７ｇの６−ニトロ−クマリン−３−カルボン酸を加え、次いで、０．２１ＬのＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）及び７６ｇのＥＤＣＩをそれぞれ加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、減圧下で濃縮して溶媒を除去し、残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、生成物を回収するとＴＮＣ  Ｉｆを得た。生成物は、薄黄色の粉末状固体であり、１６５℃の融点又はそれより高温で分解し、化合物の構造特性は以下の通りであった：
m.p.: 109-111℃. 1H-NMR δ: 1.12 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH3), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH3), 2.17-2.38 (m, 4H, CH2), 3.26 (m, 2H, NH-CH2), 4.15 (t, J = 5.4 Hz, 1H, NH-CH), 4.21 (q, J = 7.1 Hz, 2H, O- CH2), 5.50 (br, 1H, NH), 6.87 (d, J = 8.5 Hz, 1H, クマリン-8H), 7.39-7.42 (m, 2H, クマリン-5H,7H), 8.32 (s, クマリン-4H), 12.95 (s, 1H, NH). 13C-NMR δ: 14.2 (CH3), 14.8 (CH3), 29.1 (CH2), 32.0 (CH2), 34.4 (CH2), 61.6 (CH), 70.0 (CH2), 110.3 (C), 119.2 (CH), 119.9 (C), 133.9 (CH), 139.7 (CH), 160.1 (C), 166.2 (C), 170.7 (C), 171.2 (C). ESI-MS (m/z): 451.0 [M-H]-.
【０１２７】
実施形態７：化合物Ｉｇ及びＩｈ並びにその中間体ＩＩＩｇ及びＩＩＩｈの調製
反応の全般的な工程は以下の通りである：
【０１２８】
【表５】
0006404220.tif 000044
Ｘ＝Ｃｌ且つＩＩＩｇ＝ＤＣｌＣである場合、最終生成物はＩｇである；Ｘ＝Ｂｒ且つＩＩＩｈ＝ＤＢｒＣである場合、最終生成物はＩｈである。
【０１２９】
工程１：６，８−ジクロロ−クマリン−３−カルボン酸ＩＩＩｇ及び６，８−ジブロモ−クマリン−３−カルボン酸ＩＩＩｈの調製
（１）２００ｇの３，５−ジクロロサリチルアルデヒド又は３，５−ジブロモサリチルアルデヒド、２００ｍＬのマロン酸ジエチル、６００ｍＬの無水エタノール、１０ｍＬのピペリジン（１０．３ｇ）、及び１ｍｌの氷酢酸を順次加えた；（２）混合物を、水浴中で、無水状態で、８０℃で２時間撹拌し還流し、冷却した；（３）約６００ｍＬの冷水（０℃）を加え、沈殿の結晶の後、混合物を濾過し、結晶を、氷水（０℃）で冷却した１００ｍＬの５０％エタノールで２回洗浄すると、６，８−ジクロロクマリン−３−カルボキシレート又は６，８−ジブロモクマリン−３−カルボキシレートを得た；（４）１２４ｇの６，８−ジクロロクマリン−３−カルボキシレート又は６，８−ジブロモクマリン−３−カルボキシレート、及び１００ｇの水酸化ナトリウムをそれぞれ加え、次いで、５００ｍＬの無水エタノール及び５００ｍＬの水を加え、混合物を、水浴中で８０℃で約２時間加熱し還流した；並びに（５）生じた混合物を、反応の後に、直ちに０℃の氷浴に入れ、系から固体を沈殿させるために、濃塩酸を加えて系のｐＨ値を２〜３にし、系を氷浴により冷却し、次いで濾過し、少量の氷水により洗浄し、乾燥させた粗生成物を水による再結晶により精製すると、６，８−ジクロロクマリン−３−カルボン酸又は６，８−ジブロモクマリン−３−カルボン酸を得た。
【０１３０】
工程２：テアニンエチルエステルＩＩｂの調製
テアニンを、８７ｇ／Ｌの比率でエタノールに溶解させ（すなわち、８７ｇのテアニンを１リットルのメタノールに溶解させた）、次いで、塩化スルホニルを、体積比５５ｍｌで前記系にゆっくりと加え、混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、生じた混合物を減圧下で濃縮するとテアニンエチルエステルを得た。
【０１３１】
工程３：ＤＴＣｌＣ  Ｉｇ及びＤＴＢｒＣ  Ｉｈの調製
２０ｇのテアニンエチルエステルを２Ｌの無水ジクロロメタンに溶解させ、２７ｇの６，８−ジクロロ−クマリン−３−カルボン酸又は６，８−ジブロモクマリン−３−カルボン酸を加え、次いで、０．２１ＬのＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）及び７６ｇのＥＤＣＩをそれぞれ加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去し、残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、生成物を回収すると、ＤＴＣｌＣ  Ｉｇ又はＤＴＢｒＣ  Ｉｈを得た。生成物は、薄黄色の粉末状固体であり、１３６℃又は１２１℃の融点又はそれより高温で分解し、２つの化合物の構造特性は以下の通りであった：(I) DTClC: 1H-NMR δ: 1.11 (t, J = 7.2 Hz, 3H, NHCH2CH3), 1.28 (t, J = 7.1 Hz, 3H, OCH2CH3), 2.19-2.40 (m, 4H, CH2CH2), 3.20-3.29 (m, 2H, NHCH2CH3), 4.18-4.25 (m, 3H),6.20 (br s, 1H, NH), 7.19 (d, J = 2.4 Hz, 1H, クマリン-5H), 7.39 (d, J = 2.4 Hz, 1H, クマリン-7H), 8.35 (s, クマリン-4H), 14.02 (br s, 1H, NH); 12.95 (s, 1H, NH). 13C-NMR δ: 13.92 (CH3), 14.52 (CH3), 28.90 (CH2), 31.45 (CH2), 34.16 (CH2), 61.49 (CH), 69.08 (CH2), 119.15 (C), 122.43 (CH), 122.65 (C), 129.31 (CH), 132.31 (CH), 156.07 (C), 165.68 (C), 170.14 (C), 171.04 (C). ESI-MS (m/z): 441.0 [M-H]-.
(II) DTBrC: 1H-NMR δ: 1.12 (t, J = 7.3 Hz, 3H, NHCH2CH3), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3H, OCH2CH3), 2.17-2.28 (m, 4H, CH2CH2), 3.22-3.29 (m, 2H, NHCH2CH3), 4.18-4.26 (m, 3H),5.75 (br s, 1H, NH), 7.38 (d, J = 2.3 Hz, 1H, クマリン-5H), 7.71 (d, J = 2.3 Hz, 1H, クマリン-7H), 8.32 (s, クマリン-4H), 14.12 (br s, 1H, NH); 12.95 (s, 1H, NH). 13C-NMR (100MHz, CDCl3) δ: 14.07 (CH3), 14.71 (CH3), 28.99 (CH2), 31.65 (CH2), 34.34 (CH2), 61.66 (CH), 69.16 (CH2), 109.80 (C), 112.09 (CH), 119.82 (C), 133.14 (CH), 137.96 (CH), 157.48 (C), 165.63 (C), 170.20 (C), 171.04 (C). ESI-MS (m/z): 528.5 [M-H]-.
【０１３２】
実施形態８：実施形態１〜７で得られた化合物及びその中間体並びに式（ＩＩＩａ）により表される化合物の種々のヒトの癌細胞に対する不活性化効果
【０１３３】
実施形態１〜７で得られた化合物及びその中間体、陽性対照抗癌薬、及び同種のものの、インビトロで培養された種々のヒトの癌細胞に対する不活性化効果を、文献の方法の通りに決定し（ＺｈａｎｇＹ，ｅｔａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２００９，５９（３）：１９１−２００）、結果を表１に示した。
【０１３４】
１．細胞系及び細胞培養：ヒト肺癌細胞Ａ５４９及びＨ４６０、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト胃癌細胞ＢＧＣ−８２３、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ−３、ヒト慢性白血病細胞Ｋ５６２、ヒトリンパ腫細胞Ｕ９３７、ヒト肝臓癌細胞ＳＭＭＣ７７２１及びＨｅｐＧ２、ヒト結腸癌細胞ＨＴ２９、ヒト膵臓癌細胞ＰＡＮＣ−１及びＢｘＰＣ３、ヒト子宮頸癌Ｈｅｌａ細胞系、ヒト脳腫瘍細胞Ｄａｏｙ、ヒト神経腫細胞Ｄ５４及び強い薬剤耐性を有するヒト口腔類表皮癌細胞ＫＢＶ２００系、マウスメラノーマ細胞Ｂ１６、並びに高転移性Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞系を、米国のアメリカンタイプカルチャーコレクションから購入した。これらの細胞を、ＤＭＥＭ及びＲＰＭＩ−１６４０培養液で別々に培養した。
【０１３５】
２．機器及び装置：
二酸化炭素インキュベーター：３１１１、米国のＴｈｅｒｍｏ  Ｃｏｍｐａｎｙ；及び倒立蛍光顕微鏡：ＴＥ２０００−Ｕ、日本のＮｉｋｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ。倒立顕微鏡：ＣＫＸ３１、日本のＯｌｙｍｐｕｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ；卓上高速冷却遠心機：５８１０Ｒ、ドイツのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｏｍｐａｎｙ；マイクロピペット：ドイツのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｏｍｐａｎｙ；細胞培養プラスチックプレート（９６−ウェル）：ＢＤ  ｃｏｍｐａｎｙ；マイクロプレートリーダー：ＳＹＮＥＲＧＹ  ＨＴ多機能マイクロプレートリーダー、米国のＢＩＯ−ＴＥＫ  Ｃｏｍｐａｎｙ；製氷機：ＸＢ  ７０、ＧＲＡＮＴ  Ｃｏｍｐａｎｙ；及び生体用のインビボＸ線及び蛍光画像化装置：Ｋｏｄａｋ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ２０００：米国のＣａｒｅｓｔｒｅａｍ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ。
【０１３６】
実施形態１〜７で得られた化合物及びその中間体並びに式（ＩＩＩａ）により表される化合物の、癌細胞のインビトロの増殖に対する阻害効果を試験するためにＭＴＴ法を採用し、トリパンブルー染色法を確認のために利用した。手順は以下の通りであった：
【０１３７】
１．主な試薬、細胞系及び、機器：
癌細胞系及び機器は、上記１及び２に記載した。
ＲＰＭＩ１６４０及びＤＭＥＭ培養液：Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ；
不活性化ウシ胎児血清：Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ；
トリプシン：Ａｍｅｒｓｃｏ  Ｃｏｍｐａｎｙ；０．４％トリパンブルー：Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｍｐａｎｙ；
メチルチアゾリルテトラゾリウム（ＭＴＴ）：Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｍｐａｎｙ；
【０１３８】
２．実験手順：
（１）０．２５％トリプシンを使用して、対数増殖期にある癌細胞を消化し、単細胞懸濁液を調製し、細胞の濃度を５×１０4／ｍＬに調整し、調整した懸濁液を、ウェルあたり１００μｌで９６ウェルの培養プレートに接種した；
【０１３９】
（２）培養プレートを、飽和湿度及び５％のＣＯ2の３７℃のインキュベーターに移し、２４時間培養した；実施形態１〜７で得られた化合物及びその中間体並びに式（ＩＩＩａ）により表される化合物又は陽性対照抗癌薬を、１〜１０００μＭ／Ｌの濃度で加えて、最終濃度を０．１〜１５００μＭ／Ｌにした。対照ウェル（２００μｌの細胞懸濁液を加えるのみ）及び薬物不含ブランク対照ウェル（０．０１％ＤＭＳＯの溶媒を含む）を設定し、各群には８ウェルが含まれ、プレートを、飽和湿度及び５％のＣＯ2の３７℃のインキュベーターに配置して培養した；
【０１４０】
（３）９６ウェルプレートを、投薬後４８時間及び７２時間で取出し、元の培地を吸引により注意深く取り除き、１００μｌの血清不含ＤＭＥＭ培地及び１０μｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）溶液を各ウェルに加えた。プレートをさらに４時間連続して培養し、次いで培養を停止した；
【０１４１】
（４）ウェル中の上清を、吸引により注意深く取り除き、各ウェルに１５０μｌのＤＭＳＯを加え、室温で１０〜１５分間振とうして、結晶を完全に溶解させた。
【０１４２】
（５）比色定量分析：波長を５７０ｎｍに選択し、各ウェルの吸光度（Ａ値）をマイクロプレートリーダーで決定し、結果を記録した；実験を３回繰り返した；
【０１４３】
（６）実験結果を、以下の式により計算した：相対生存率＝（各実験群のＡ値／細胞対照群のＡ値）×１００％
【０１４４】
半数効果濃度（ＩＣ５０、すわわち、阻害率が５０％である薬物濃度、半数阻害濃度としても知られる）の計算：
【０１４５】
検出された成分のＩＣ５０を、回帰方程式を利用して計算した。
【０１４６】
３．実験結果（表１参照）
【０１４７】
【表２０】
0006404220.tif 000045
【０１４８】
【表２１】
0006404220.tif 000046
【０１４９】
備考：＊、溶媒対照群と比べてｐ＜０．０５；ＭＴＴによる細胞の増殖を試験する方法に関して、上記実験方法を参照されたい。上記結果を、トリパンブルー染色法により確認し、トリパンブルー染色法の結果は、化合物の同じ効果を示した。§は、５０％の癌細胞が、それぞれ列記された化合物による処理の７２時間後に生存した薬物濃度（ＩＣ５０）を指す。
【０１５０】
Ａ５４９：ヒト肺癌細胞；ＮＣＩ−Ｈ４６０：Ｈ４６０ヒト肺癌細胞；ＭＢ２３１：ＭＤＡ−ＭＢ２３１（エストロゲン受容体陰性の高転移性ヒト乳癌細胞）；ＭＣＦ−７：エストロゲン受容体陽性のヒト乳癌細胞；Ｓ−７７２１：ＳＭＭＣ７７２１（ヒト肝臓癌細胞）；ＰＡＮＣ−１：ヒト膵臓癌細胞；Ｈｅｌａ：ヒト子宮頸癌細胞；ＬＬＣ：Ｌｅｗｉｓ肺癌（高転移性マウス肺癌）細胞；ＢＧＣ−８２３：ヒト胃癌細胞；ＰＣ−３：ヒト前立腺癌細胞；Ｕ９３７：ヒト組織球性リンパ腫細胞；ヒト肝臓癌細胞；ＨＴ２９：ヒト結腸癌細胞；Ｂ１６：メラノーマ細胞；Ｋ５６２：ヒト白血病細胞；ＢｘＰｃ３：ヒト膵臓癌細胞；ＨｅｐＧ２：ヒト肝臓癌細胞；Ｃａｓｋｉ：ヒト子宮頸癌細胞；Ｄａｏｙ：ヒト脳腫瘍細胞；Ｄ５４：神経腫細胞；及びＫＢＶ２００：薬剤耐性の強いヒト口腔類表皮癌細胞。
【０１５１】
実施形態９：ヌードマウスにおける種々のヒトの癌異種移植片の増殖及びマウスの肺癌の転移の阻害における、実施形態１〜７で得られた化合物及びその中間体の実験
動物における種々のヒトの癌異種移植片のインビボ増殖に対する実施形態１〜７で得られた化合物及びその中間体の阻害効果を、文献の方法により決定し（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｎ．  Ｎａｕｍｏｖ，ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＥＧＦＲ）  Ｂｌｏｃｋａｄｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ＥＧＦＲ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９，１５：３４８４−３４９４；Ｙａｎｇ  Ｚｈｅｎｚｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，）、結果を表２に示す。
【０１５２】
１．実験動物、細胞系、主な試薬、及び機器：
ＳＰＦグレードの動物実験室で飼育され、動物許可番号（ａｎｉｍａｌ  ｌｉｃｅｎｓｅ  ｎｕｍｂｅｒ）ＳＣＸＫ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）２００９−０００４の付いた、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｈｕａｆｕｋａｎｇ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから購入した、４〜５週齢で１８〜２２ｇの雌のＳＰＦ−レベルＢＡＬＢ／ｃヌードマウス及びＣ５７／ＢＬ６Ｊブラックマウス；及びＩＶＣ（個別換気ケージ）：Ｓｕｚｈｏｕ  Ｓｕｈａｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．；及びヒト肺癌細胞Ａ５４９、エストロゲン受容体陰性ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ２３１、エストロゲン受容体陽性ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７、ヒト肝臓癌細胞ＳＭＭＣ７７２１、ヒト膵臓癌細胞ＰＡＮＣ−１、ヒト子宮頸癌細胞Ｈｅｌａ、高転移性Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞系、並びに他の機器は上述の通りであった。ＲＰＭＩ１６４０及びＤＭＥＭ培養液：Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ；不活性化ウシ胎児血清：Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、−２０℃で保存；トリプシン：Ａｍｅｒｓｃｏ  Ｃｏｍｐａｎｙ；及び０．４％トリパンブルー：Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｍｐａｎｙ；
【０１５３】
２．実験手順：
（１）細胞培養及び移植された腫瘍を有する動物モデルの確立：ヒト癌細胞株を、ＤＭＥＭ培養液又は１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培養液中で、３７℃及び５％のＣＯ2の条件下で、別々に培養した。対数増殖期にある細胞を回収し、２×１０7／ｍｌの濃度の単細胞懸濁液を調製し、０．１ｍｌの懸濁液を、ウルトラクリーンワークベンチ中で、各ヌードマウスの腿の裏側に、別々に皮下接種し、注射点のそれぞれを毎日観察して、発赤、腫脹、潰瘍化の有無を確認した。２〜５週後、明らかな発疹が注射部分に現れ、直径約１０〜１５ｍｍの皮下結節が全てのヌードマウスに現れ、移植腫瘍モデルを確立した；マウスのＬｅｗｉｓ肺癌転移モデルの確立について、濃度６×１０6／ｍｌの単細胞懸濁液を調製し、０．１ｍｌの細胞懸濁液を、Ｃ５７／ＢＬ６Ｊブラックマウスの尾静脈に静脈注射し、群分け後第２日から薬物を投与したが、ヌードマウスの薬物の投与量及び方法は以下に記載する。
【０１５４】
（２）マウスの群分け及び薬物送達：皮下異種移植片モデルヌードマウスを、接種の２〜５週間後に、各群７匹のマウスで無作為に３群に分けた；陰性対照群（０．０５％ＤＭＤＯの溶媒）、１日１回の０．２ｍｌ／マウスの腹腔内注射；薬物及び成分を腹腔内注射した（６０〜９０ｍｇ／ｋｇ）：陽性対照群、抗癌薬シスプラチン（１．５ｍｇ／ｋｇ／日）、シクロホスファミド（６０ｍｇ／ｋｇ／２日）、及びエンドスター（８ｍｇ／ｋｇ）、並びに実施形態１〜７で得られた化合物及びその中間体の群、１日１回、投薬を３〜５週間実施した。
【０１５５】
インビボ腫瘍のＥＺＨ２及びＨＤＡＣの酵素活性に対する薬物の効果の検出のために、腫瘍を、投薬の６時間後に別々に摘出し、総タンパク及び核タンパク質を別々に抽出して、酵素の活性を検出及び分析した。マウスを、ＤＭＳＯ溶媒（０．０５％）の陰性対照、２５ｍｇ／ｋｇ／マウスのＳＡＨＡ（スベロイルアニリドヒドロキサム酸）の陽性対照、又は実施形態１〜７で得られた化合物及びその中間体により処置した後、腫瘍を取りだし、総タンパク及び核タンパク質を総タンパク溶解物及び核タンパク質溶解物により抽出して（総タンパク溶解物、核タンパク質溶解物、及びＰＭＳＦは、Ｂｅｙｏｔｉｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入した）、１ｍｇの腫瘍組織を１ｍｌの溶解物に加え、１０μｌのＰＭＳＦを加え、均一な混合のために繰り返し解離し、次いで、試料を１５分間氷上に置き、１．５ｍＬのＥＰパイプに移し、１４０００ｒ／分及び４℃で１０分間遠心分離し、上清のタンパク抽出物を滅菌ＥＰパイプに移して、酵素活性を検出した。
【０１５６】
（３）ヌードマウスにおける腫瘍の増殖の観察：ヌードマウスの活動（餌の摂取、糞尿の特徴、精神状態、及び同種のもの）並びに移植された腫瘍の腫瘍増殖時間及び増殖状況を毎日観察し、体重及び腫瘍の大きさを２〜３日ごとに測定した。各腫瘍の長径ａ及び短径ｂ（ｍｍ）をノギスにより測定し、Ｖ＝π１／２・ａｂ２（ｍｍ3）で体積を計算した；
【０１５７】
（４）動物の屠殺：処置実験後に、マウスに麻酔をかけ、写真撮影した；ヌードマウスの首を折って屠殺し、腫瘍組織を滅菌条件下で剥ぎ取り、腫瘍の重量を量った；種々の器官及び組織の病理及び毒性に対する薬物の効果を検出した。
【０１５８】
（５）実験群の移植された腫瘍の重量を、ブランク対照群の腫瘍（又は肺転移）の重量と比較して、腫瘍阻害率を計算した、すなわち、腫瘍阻害率（％）＝（１−実験群の平均腫瘍重量／対照群の平均腫瘍重量）×１００％。
【０１５９】
３．実験結果（表２参照）
【０１６０】
【表２２】
0006404220.tif 000047
【０１６１】
備考：＊ｐ＜０．０５；関連する試験方法について、上記の実験方法パートを参照されたい；§阻害率％は、ＤＭＳＯ溶媒対照群の腫瘍の重量と比較した投薬群の腫瘍の重量の平均阻害率（％）である；及び＃は、マウスのＬｅｗｉｓ肺癌の腫瘍肺転移阻害率％である。
【０１６２】
Ａ５４９：ヒト肺癌細胞；ＭＢ２３１：ＭＤＡ−ＭＢ２３１（エストロゲン受容体陰性の高転移性ヒト乳癌細胞）；ＭＣＦ−７：エストロゲン受容体陽性のヒト乳癌細胞；Ｓ−７７２１：ＳＭＭＣ７７２１（ヒト肝臓癌細胞）；ＰＡＮＣ−１：ヒト膵臓癌細胞；Ｈｅｌａ：ヒト子宮頸癌細胞；ＬＬＣ：Ｌｅｗｉｓ肺癌（高転移性マウス肺癌）細胞；ＴＭＣ：ＴＭＣ群；ＴＥＣ：ＴＥＣ群；ＴＣＬＣ：ＴＣＬＣ群；ＴＢｒＣ：ＴＢｒＣ群；ＴＦＣ：ＴＦＣ群；ＴＮＣ：ＴＮＣ群；ＤＴＣＬＣ；ＤＴＣＬＣ群；ＤＴＢｒＣ：ＤＴＢｒＣ群；ＴＥ：ＴＥ群；ＴＭ：ＴＭ群：Ａ：シスプラチン群；Ｂ：ＣＴＸ群；ＥＳ：エンドスター群；及び対照：溶媒対照（ＤＭＳＯ）。
【０１６３】
動物の病理及び毒物学の分析結果は、実験期間の間、正常なマウス及びヒト癌異種移植片を有するヌードマウスを、６０ｍｇ／ｋｇの投与量で全て合成成分により処置すると、毒性作用及び副作用が全く検出されず、体重減少が全く観察されず、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、消化管、性腺、脳、及び骨格筋に毒性が全く見られなかったことを示した。シスプラチン及びシクロホスファミドの陽性対照薬物群において、マウスは、投薬の２週間後に、体重減少、食欲不振、異常な腫脹、及び緩慢な動作、並びに他の現象により示される毒性反応を有した。シスプラチン、シクロホスファミド、及びエンドスターの陽性対照群においても、マウスは、体重減少、食欲不振、緩慢な動作、及び同種のものの毒性現象を有した。
【０１６４】
急性毒性実験結果は、２５００ｍｇ／ｋｇの投与量で本発明の合成成分の経口投与から、マウスの死亡が全く見られないことを示した。
【０１６５】
【表２３】
0006404220.tif 000048
【０１６６】
備考：＊ｐ＜０．０５；関連する試験方法について、上記の実験方法パートを参照されたい；§阻害率％は、ＤＭＳＯ溶媒対照群の腫瘍の重量と比較した投薬群の腫瘍の重量の平均阻害率（％）である；及び＃は、マウスのＬｅｗｉｓ肺癌の腫瘍肺転移阻害率％である。
【０１６７】
Ａ５４９：ヒト肺癌細胞；ＭＢ２３１：ＭＤＡ−ＭＢ２３１（エストロゲン受容体陰性の高転移性ヒト乳癌細胞）；ＭＣＦ−７：エストロゲン受容体陽性のヒト乳癌細胞；Ｓ−７７２１：ＳＭＭＣ７７２１（ヒト肝臓癌細胞）；ＰＡＮＣ−１：ヒト膵臓癌細胞；Ｈｅｌａ：ヒト子宮頸癌細胞；ＬＬＣ：Ｌｅｗｉｓ肺癌（高転移性マウス肺癌）細胞；ＴＭＣ：ＴＭＣ群；ＴＥＣ：ＴＥＣ群；ＴＣＬＣ：ＴＣＬＣ群；ＴＢｒＣ：ＴＢｒＣ群；ＴＦＣ：ＴＦＣ群；ＴＮＣ：ＴＮＣ群；ＤＴＣＬＣ；ＤＴＣＬＣ群；ＤＴＢｒＣ：ＤＴＢｒＣ群；ＴＥ：ＴＥ群；ＴＭ：ＴＭ群：Ａ：シスプラチン群；Ｂ：ＣＴＸ群；ＥＳ：エンドスター群；及び対照：溶媒対照（ＤＭＳＯ）。
【０１６８】
動物の病理及び毒物学の分析結果は、実験期間の間、正常なマウス及びヒト癌異種移植片を有するヌードマウスを、９０ｍｇ／ｋｇの投与量で全て合成成分により処置すると、毒性作用及び副作用が全く検出されず、体重（ｅｉｇｈｔ）減少が全く観察されず、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、消化管、性腺、脳、及び骨格筋に毒性が全く見られなかったことを示した。シスプラチン及びシクロホスファミドの陽性対照薬物群において、マウスは、投薬の２週間後に観察された、体重減少、食欲不振、及び異常な腫脹、及び緩慢な動作、並びに他の現象により示される毒性反応を有した。シスプラチン、シクロホスファミド、及びエンドスターの陽性対照群においても、マウスは、体重減少、食欲不振、緩慢な動作、及び同種のものの毒性現象を有した。
【０１６９】
急性毒性実験結果は、２５００ｍｇ／ｋｇの投与量で本発明の合成成分の経口投与から、死亡が全く見られないことを示した。
【０１７０】
実施形態１０：実施例１〜７で得られた化合物の蛍光画像化
実施例１〜７で得られた化合物の蛍光画像及び波長範囲を、文献の方法により決定し（Ｃｈｅｎ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，２−（３−｛１−Ｃａｒｂｏｘｙ−５−［（６−［１８Ｆ］ｆｌｕｏｒｏ−ｐｙｒｉｄｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｎｙｌ）−ａｍｉｎｏ］−ｐｅｎｔｙｌ｝−ｕｒｅｉｄｏ）−ｐｅｎｔａｎｅｄｉｏｉｃ  ａｃｉｄ，［１８Ｆ］ＤＣＦＰｙＬ，ａ  ＰＳＭＡ−ｂａｓｅｄ  ＰＥＴ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１１，１７（２４）：７６４５−５３．）、結果を表３及び図１に示した。
【０１７１】
１．実験動物、細胞系、主な試薬、及び機器：詳細は実施形態９を参照されたい。
【０１７２】
２．実験手順：インビトロ蛍光画像化及び検出に関して：実施形態１〜７で得られた化合物Ｉａ〜Ｉｈを、１．５ｍｌプラスチック遠心管中で、濃度６０ｍｇ／０．２ｍｌの溶液に調製し、蛍光シグナル及び画像を、それぞれ、以下の励起及び発光波長条件で、多機能マイクロプレートリーダー及び動物インビボ画像化装置で検出及び記録し、得られた結果を表３及び図１に示す（小さい試験管の写真）；インビボの蛍光画像の検出に関して：実験動物の（飲料水は通常通り与えながら）絶食処置の１６時間後、実施形態１〜７で得られた化合物Ｉａ〜Ｉｈの溶液を、６０ｍｇ／ｋｇ体重／０．２ｍｌの濃度で調製し、動物に腹腔内投与し、蛍光画像を、以下の励起及び発光波長条件下で、動物インビボ画像化装置で検出及び記録し、得られた結果を図１に示した（動物インビボ画像化写真）；実験の励起波長範囲は３６０ｎｍ〜５９０ｎｍであった；検出波長範囲は４１０ｎｍ〜７００ｎｍであった。
【０１７３】
３．実験結果（表３参照）
【０１７４】
【表２４】
0006404220.tif 000049
【０１７５】
備考：実験検出条件：実施形態１〜７で得られた化合物Ｉａ〜Ｉｈのインビボ及びインビトロで検出可能な蛍光画像及び波長範囲。
（１）投与濃度：６０ｍｇ／ｋｇ体重／０．２ｍｌ；及び（２）励起波長範囲：３６０ｎｍ〜５９０ｎｍ；及び検出可能な波長範囲：４１０ｎｍ〜６９０ｎｍ。
【０１７６】
実施形態１１：実施形態１〜７で得られた化合物Ｉａ〜Ｉｈの、動物におけるＥＺＨ２酵素の活性に対する阻害効果
【０１７７】
１．実験動物、細胞系、機器、及び主な試薬：
実験動物：ヌードマウス；細胞系及び機器に関しては、詳細は実施形態９の動物実験パートを参照されたい。
【０１７８】
ＥＺＨ２  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入。
【０１７９】
実施形態１〜７で得られた化合物のＥＺＨ２の酵素活性に対する阻害効果を検出し、実験方法は、操作のためのキットの説明書に厳密に従い、工程は以下の通りであった：
【０１８０】
２．実験手順：
（１）１５０μｌのＴＢＳＴ緩衝液を、マイクロプレートの各反応ウェルに加え、室温で１５分間インキュベートし、緩衝液を除いた；
【０１８１】
（２）Ｓ−アデノシルメチオニン及びＥＺＨ２酵素使用溶液を、説明書に従って調製し、操作を氷浴上に保った；
【０１８２】
（３）ブランク対照生成物、基質対照生成物、陽性対照生成物、及び阻害剤対照生成物を、説明書に示された比率で調製した；
【０１８３】
（４）調製した種々の対照生成物及び試験すべき試料（各群で、ＥＺＨ２酵素を腫瘍タンパク質抽出物に替えた）を、それぞれ反応ウェルに５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させ、各試料で、２つの平行なウェルを設定したが、各群において腫瘍タンパク質抽出物を得る方法は、実施形態９の実験手順に記載された通りであった；プレートの洗浄及びブロッキング：２００μｌのＴＢＳＴ緩衝液を、プレートの洗浄のために各反応ウェルに加え、３回繰り返した；１００μｌのブロッキング緩衝液を、各反応ウェルにさらに加え、ブロッキングのために振とうベッド（ｓｈａｋｉｎｇ  ｂｅｄ）上で１０分間振とうし、液体を除いた；
【０１８４】
（５）希釈した一次抗体使用溶液を、１００μｌ／ウェルで反応ウェルに加え、振とうベッドで１時間反応させた；
【０１８５】
（６）プレートを洗浄してブロックした：操作は、操作（４）と同じであった；
【０１８６】
（７）希釈したＨＲＰ標識二次抗体使用溶液を、１００μｌ／ウェルで反応ウェルに加え、振とうベッドで３０分間反応させた；
【０１８７】
（８）プレートを洗浄してブロックした：操作は、操作（４）と同じであった；
【０１８８】
（９）等しい体積のＨＲＰ化学ルミネセンス基質ＡとＢを氷浴上で均一に混合し、１００μｌ／ウェルで反応ウェルに加えた；且つ
【０１８９】
（１０）蛍光値を、直ちに、マイクロプレートリーダーで読み取った。
【０１９０】
３．実験結果（表４参照）
【０１９１】
【表２５】
0006404220.tif 000050
【０１９２】
【表２６】
0006404220.tif 000051
【０１９３】
備考：＊ｐ＜０．０５；関連する試験方法に関して、上記実験方法パートを参照されたい。Ｈ３及びＨ４アセチル化レベル（％）は、ウェスタンブロッティングによるＬＬＣ（高転移性Ｌｅｗｉｓマウス肺癌）の分析により得た：前記方法は、以下の実施形態１２〜１３の関連するパートの内容に詳細に記載される通りであった。
【０１９４】
実施形態１２：実施形態１〜７で得られた化合物Ｉａ〜Ｉｈのヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＤＡＣ）の活性に対する阻害効果
【０１９５】
１．実験動物、細胞系、機器、及び主な試薬：
実験動物：ヌードマウス；細胞系及び機器に関して、詳細は実施形態９の動物実験パートを参照されたい。
ＥｐｉＱｕｉｋ  ＨＤＡＣ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ／Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  （Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）：Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ；
ＥｐｉＱｕｉｋ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ；
【０１９６】
２．実験手順：
【０１９７】
（１）薬物処置の後、腫瘍核抽出物を、ＥｐｉＱｕｉｋ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔの説明書の操作要件に厳密に従って調製した（実施形態９の実験手順を参照されたい）；各試料で、２つの平行なウェルを設定した；
【０１９８】
（２）５０μｌの希釈試料溶液を、各反応ウェルに加え、プレートを、プレートシールフィルムで密封し、室温で３０分間反応させた；
【０１９９】
（３）プレートシールフィルムを注意深く剥がし、液体を除き、乾燥させ、１５０μｌの洗浄液を各ウェルに加え、３０秒静置し、次いで液体を除き、２回繰り返し、乾燥させた；
【０２００】
（４）２μｌのＨＤＡＣ酵素又は腫瘍組織核抽出物を、それぞれ、２８μｌの希釈した試料溶液と均一に混合し、ウェルに加え、プレートをプレートシールフィルムで密封し、３７℃で６０分間反応させた；
【０２０１】
（５）プレートを３回洗浄したが、操作は（３）と同じであった；希釈した抗体捕捉使用溶液を、５０μｌ／ウェルで各反応ウェルに加え、振とうベッド上で、室温で６０分間反応させた；
【０２０２】
（６）プレートを４回洗浄したが、操作は（３）と同じであった；
【０２０３】
（７）希釈した抗体検出使用溶液を、５０μｌ／ウェルで各反応ウェルに加え、室温で３０分間反応させた；
【０２０４】
（８）プレートを５回洗浄したが、操作は（３）と同じであった；
発色剤を、１００μｌ／ウェルで加え、暗所発色（ｄａｒｋ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）を２〜１０分実施した；
【０２０５】
（９）５０μｌの停止溶液を、標準生成物のあるウェルの色が中程度の強度で青になったとき、反応を停止するために各ウェルに加えると、色は、添加後直ちに青から黄色に変わった；
【０２０６】
（１０）各ウェルの吸光度（ＯＤ値）を、４５０ｎｍの波長で順次測定した；測定は、停止溶液の添加後１５分以内に実施しなければならない；且つ
【０２０７】
（１２）酵素活性阻害率を、以下の式により計算した：
阻害率％＝［１−（陽性対照のＯＤ−試料のＯＤ）／（陽性対照のＯＤ−ブランク対照のＯＤ）］１００％
【０２０８】
３．実験結果（表４参照）
【０２０９】
実施形態１３：種々の腫瘍の増殖、浸潤、及び転移、心血管疾患、免疫不全、炎症、及び同種のものに密接に関連していたタンパク因子のレベルの調節における実施形態１〜７で得られた化合物Ｉａ〜Ｉｈの効果に関する実験
【０２１０】
ウェスタンブロッティング法を適用して、以下の腫瘍に関連したタンパク因子のレベルの調節における、実施形態１〜７で得られた化合物Ｉａ〜Ｉｈの効果を検出し、手順は以下の通りであった：
【０２１１】
１．主な試薬及び機器：
抗体：ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ａｋｔ、ＮＦ−κＢ、サイクリンＤ１、ＥＲ−α、Ｄｖｌ−１、Ｄｖｌ−２、Ｄｖｌ−３、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ２、β−カテニン、Ｂｃｌ−２、Ｂａｘ、ｐ５３、ｐ２１、Ｅ−カドヘリン、及びカスパーゼ３タンパク質の一次抗体、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ及びＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入；並びに、Ｈ３アセチル化、Ｈ４アセチル化、及びＨＤＡＣ（ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、及び同種のもの）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｋｉｔｓ、米国のＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入。
ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ培養液及び不活性化ウシ胎児血清：Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入；トリプシン：Ａｍｅｒｓｃｏ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入；タンパク質分子マーカー及び０．４％トリパンブルー：米国のＳｉｇｍａ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入；ＰＶＤＦフィルム：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入；
【０２１２】
総タンパク溶解物、核タンパク質溶解物、及びＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）溶液：Ｂｅｙｏｔｉｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入；二次抗体：西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ロバ抗ヤギ抗体、カラープレステインドタンパク質分子量マーカー、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓルミネセンスキット、定着パウダー（ｆｉｘｉｎｇ  ｐｏｗｄｅｒ）及び発色パウダー（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｐｏｗｄｅｒ）：Ｂｅｙｏｔｉｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入；医療用Ｘ線フィルム：Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入。
【０２１３】
二酸化炭素インキュベーター：３１１１、米国のＴｈｅｒｍｏ  Ｃｏｍｐａｎｙ；倒立顕微鏡：ＣＫＸ３１、日本のＯｌｙｍｐｕｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ；卓上高速冷却遠心機：５８１０Ｒ、ドイツのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｏｍｐａｎｙ；マイクロピペット：ドイツのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｏｍｐａｎｙ；細胞培養プラスチックプレート（６ウェル）：Ｎｕｎｃｌｏｎ  ｃｏｍｐａｎｙ；小型垂直式電気泳動槽：米国のＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｃｏｍｐａｎｙ；小型ウェット式電気転写槽：米国のＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｃｏｍｐａｎｙ；脱色振とうベッド（ｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ  ｓｈａｋｉｎｇ  ｂｅｄ）：ＴＳ−１型、Ｊｉａｎｇｓｕ  Ｈａｉｍｅｎ  Ｋｙｌｉｎ−Ｂｅｌｌ  Ｌａｂ  Ｉｎｓｔｒｕｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．；製氷機：ＸＢ  ７０、ＧＲＡＮＴ  Ｃｏｍｐａｎｙ；ＯＭＥＧＡ１０ゲル画像化分析器：米国のμｌＴＲＡ  ＬＵＭ  Ｃｏｍｐａｎｙ；密封装置：ＳＦ−Ｂ、Ｗｅｎｚｈｏｕ  Ｘｉｎｇｙｅ  Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．；タンパク分析ライトボックス：Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｊｉｎｇｋｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
【０２１４】
２．実験手順：
（１）細胞処理：対数増殖期にある細胞を、６ウェルプレートに接種し、検出された実施形態１〜７で得られた化合物Ｉａ〜Ｉｈ及び陽性対照薬物シクロホスファミド、及び同種のものを、細胞の密度が約７０％〜８０％になったときに、それぞれ細胞に加え、最終濃度をそれぞれ１〜１５００μＭ／Ｌにし、薬物でなく溶媒（０．０１％ＤＭＳＯ）を含む等しい体積の細胞培養液を有する対照群を設定し、連続的に４８時間培養し、次いで細胞を回収した；
【０２１５】
（２）細胞タンパク質の抽出：冷ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、総タンパク又は核タンパク質溶解物で溶解させ、１０μｌのＰＭＳＦを１ｍＬの溶解物に加え、均一な混合のために繰り返し解離し、氷上に１５分間置いた；試料を１．５ｍＬのＥＰパイプに移し、１４０００ｒ／分及び４℃で１０分間遠心分離し、上清を滅菌ＥＰパイプに移し、−８０℃で保存した；且つ
【０２１６】
（３）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）：等しい体積のタンパク質溶解物試料を使用して、タンパク質を分離し、膜転写、及びブロッキング、適切な一次抗体及び二次抗体で順次処理し、膜を洗浄し、次いで、ＥＣＬキットにより発色し、ブロットタンパク質のバンドを、Ｘ線フィルムの感光により検出した；Ｇｅｌ−Ｐｒｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒを、灰色度（ｇｒａｙ  ｄｅｇｒｅｅ）の定量的な分析に利用し、種々の濃度の対照群及び薬物処置群の光学濃度値を、それぞれ内部標準と比較し、得られた比率をそれぞれ対照群と比較し、タンパク質発現レベルを半定量化した。
【０２１７】
３．実験結果（表５及び表６参照）
【０２１８】
【表２７】
0006404220.tif 000052
【０２１９】
【表２８】
0006404220.tif 000053
【０２２０】
【表２９】
0006404220.tif 000054
【０２２１】
備考：ｐ＜０．０５；関連する試験方法について、上記実験方法パートを参照されたい。
【０２２２】
表中の関連するタンパク因子は、全て、ヒト肝臓癌細胞、Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞、及び他の癌細胞系、並びにこれら腫瘍組織のタンパク質溶解物由来のものであり、実施形態１〜７で得られた化合物Ｉａ〜Ｉｈ又は陽性対照抗癌薬又はＤＭＳＯ溶媒により処置し、結果をウェスタンブロッティングによる検出及び分析により与えた。
【０２２３】
【表３０】
0006404220.tif 000055
【０２２４】
【表３１】
0006404220.tif 000056
【０２２５】
【表３２】
0006404220.tif 000057
【０２２６】
備考：＊ｐ＜０．０５；関連する試験方法について、上記実験方法パートを参照されたい。
＃：関連する腫瘍抑制因子タンパク質ｐ５３、細胞周期阻害タンパク質ｐ２１、細胞アポトーシスヒドロラーゼカスパーゼ−３、細胞質／ミトコンドリアチトクロムＣの比率、及び細胞接着タンパク質Ｅ−カドヘリンの結果は全て、実施形態１〜７で得られた化合物Ｉａ〜Ｉｈ又は陽性対照抗癌薬又はＤＭＳＯ溶媒で処置された肝臓癌細胞、Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞、及び他の癌細胞系、並びにこれら腫瘍組織のタンパク質溶解物のウェスタンブロッティングによる検出及び分析結果であった。
【０２２７】
実施形態１４：核タンパク因子ＮＦ−κＢ（ｐ６５）−ＤＮＡ結合活性（ＥＭＳＡ）に対する実施形態１〜７で得られた化合物Ｉａ〜Ｉｈの阻害効果のインビトロ実験
【０２２８】
１．主な試薬及び機器：
化学ルミネセンスＥＭＳＡキット：米国のＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ；
ビオチン標識ＥＭＳＡプローブＮＦ−κＢ：米国のＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ；
タンパク質分子マーカー及び０．４％トリパンブルー：米国のＳｉｇｍａ  Ｃｏｍｐａｎｙ；ＰＶＤＦフィルム：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ；
核タンパク質溶解物及びＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）溶液：Ｂｅｙｏｔｉｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；
カラープレステインドタンパク質分子量マーカー、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓルミネセンスキット、定着パウダー及び発色パウダー：Ｂｅｙｏｔｉｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ。医療用Ｘ線フィルム：Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ。
【０２２９】
２．実験手順：
癌細胞を、１〜５００μＭ／Ｌの実施形態１〜７で得られた化合物Ｉａ〜Ｉｈ及び０．１〜１０００μＭ／Ｌのビンクリスチン及びＤＭＳＯ（０．０１％）で４８時間処置して、細胞核タンパク質抽出物を得たが、この方法は、実施形態６の実験パートに詳細に記載された通りであった。ＮＦ−κＢ（ｐ６５）−ＤＮＡ結合活性に対する阻害効果のインビトロ実験を、米国のＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｍｐａｎｙの化学ルミネセンスＥＭＳＡキットにより適用し、実験方法は、キットの説明書に従って厳密に操作し、具体的な手順は以下の通りであった：
【０２３０】
（１）ＥＭＳＡゲルの調製
ＥＭＳＡゲルの調製は以下の表に示した。薬物により処置した細胞を、核タンパク質抽出溶液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより提供）により抽出して、核タンパク質抽出物を得て、１０μｇ／パイプの核タンパク質抽出物を、以下の表に示される試料反応及び電気泳動検出及び分析にそれぞれ使用した。
【０２３１】
【表３３】
0006404220.tif 000058
【０２３２】
（２）プレ電気泳動：ゲルを、０．５×ＴＢＥ電気泳動緩衝液で充填された電気泳動タンク中で固定し、１０Ｖ／ｃｍで９０分間電気泳動にかけた。プローブ結合反応は以下の通りであった：
【０２３３】
【表３４】
0006404220.tif 000059
【０２３４】
【表３５】
0006404220.tif 000060
【０２３５】
成分を、上記表に従って順次ＥＰパイプに加え、均一に混合し、室温で１５分間静置して、起こる可能性のある非特異的なプローブとタンパク質の結合を除いた。１μｌのビオチン標識プローブＮＦ−κＢをそれぞれ加え、室温で２０分間静置した。
【０２３６】
（３）電気泳動：新しい０．５×ＴＢＥ電気泳動緩衝液に交換、１０Ｖ／ｃｍで１．５時間電気泳動にかけ、ゲルの温度が確実に３０℃以下であるようにした。
【０２３７】
（４）膜転写：ＥＭＳＡゲル上の核タンパク因子と結合プローブを、ナイロン膜に転写するプロセスは、氷浴中３８０ｍＡで４０分間電気的に転写した。
【０２３８】
（５）紫外線架橋：ナイロン膜を、２５４ｎｍ紫外線ランプの下に置き、１５分間照射した。
【０２３９】
（６）化学ルミネセンスによるビオチン標識プローブの検出：架橋したナイロン膜を、ブロッキング溶液によりブロックし、処理された膜を、キットの要件に従って、Ｘ線露光、発色、及び定着に付し、結果を分析した。
【０２４０】
３．実験結果
【０２４１】
【表３６】
0006404220.tif 000061
【０２４２】
【表３７】
0006404220.tif 000062
【０２４３】
§インビボ腫瘍組織核タンパク質溶解物を検出に使用した場合、腹腔内注射用の実施形態１〜７で得られた化合物及びシクロホスファミドの量は、それぞれ６０ｍｇ／ｋｇ及び２５ｍｇ／ｋｇであった。
【０２４４】
追加の注釈：本発明の出願及び結果に関連する研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  ８６３プログラム“Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｒｋｅｒｓ（２０１２ＡＡ０２０２０６）”及びＳｈａｎｄｏｎｇ  Ｐｒｏｖｉｎｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｐｌａｎ  Ｐｒｏｊｅｃｔ“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｔｅｒ  ｃａｔｅｃｈｉｎｓ（ＥＧＣＧ）ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ａｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  ｎｅｗ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｄｒｕｇｓ（２００９ＧＧ１０００２０８７）”、並びにＮａｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  ｏｆ  Ｓｈａｎｄｏｎｇ  Ｐｒｏｖｉｎｃｅ（ＺＲ２０１２ＨＭ０１６）により資金援助された。
【図１】
0006404220.tif 000073