(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）基材の先端に付着した被験者からの口腔上皮細胞サンプルを提供する工程と、
（Ｂ）基材に付着した口腔細胞を４５秒間以下で溶解可能な第一溶解溶液中で、前記の上皮細胞が付着した基材の先端を、４５秒間以下撹拌させる工程と、
（Ｃ）前記の第一溶解溶液中での基材の先端の撹拌工程（Ｂ）の完了と同時に、前記第一溶解溶液から前記基材を除去する工程と、
（Ｄ）前記第一溶解溶液から前記基材を除去する工程（Ｃ）の後に、前記第一溶解溶液を４５℃±３℃の温度で４５±１５分間インキュベーションして第一ゲノムＤＮＡサンプルを提供する工程と
を含む、一塩基多型検出用ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）サンプルの調製方法であって、
（Ｅ）第一溶解溶液から前記基材を除去する工程（Ｃ）の後に、前記基材に付着した口腔細胞を溶解可能な第二溶解溶液中で、前記基材を撹拌させる工程と、
（Ｆ）前記第二溶解溶液から前記基材を除去する工程と、
（Ｇ）前記第二溶解溶液から前記基材を除去する工程（Ｆ）の後に、前記第二溶解溶液を４５℃±３℃の温度で４５±１５分間インキュベーションして第二ゲノムＤＮＡサンプルを提供する工程と
により一塩基多型検出用の第二ＤＮＡサンプルを調製することをさらに含む、前記方法。
【請求項２】
前記第一溶解溶液から前記基材を除去する工程（Ｃ）の後、前記基材を凍結する工程（Ｉ）と、
前記基材を撹拌させる工程（Ｅ）の前に、前記基材を解凍する工程（Ｊ）と
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
基材の先端を撹拌させる工程（Ｅ）が、前記第二溶解溶液中に前記基材の先端を浸漬させる工程と前記基材の先端を前記溶解溶液に浸漬させたままで前記基材を回転させる工程とを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
溶解溶液の温度が、基材の先端を撹拌させる工程（Ｅ）の間、１５℃〜３０℃で維持される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
溶解溶液の温度が、基材の先端を撹拌させる工程（Ｅ）の間、１８℃〜２５℃で維持される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
基材の先端が、第二溶解溶液中で４５秒間以下撹拌（Ｅ）される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
第二溶解溶液が、体積１００μＬ〜２００μＬを有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（Ｋ）第一ｇＤＮＡ溶液、第二ｇＤＮＡ溶液、又は第一ｇＤＮＡ溶液及び第二ｇＤＮＡ溶液の各々における、温度４５℃±３℃での４５±１５分のインキュベーション工程（Ｄ）、（Ｇ）、又は（Ｄ）及び（Ｇ）の各々の後に、第一溶解溶液、第二溶解溶液、又は第一溶解溶液及び第二溶解溶液の両方から、ゲノムＤＮＡを単離する工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
第一ｇＤＮＡ溶液、第二ｇＤＮＡ溶液、又は第一ｇＤＮＡ溶液及び第二ｇＤＮＡ溶液の各々が、それぞれ体積１０μＬ〜２００μＬを有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（Ｌ）第一ｇＤＮＡ溶液のサンプル、第二ｇＤＮＡ溶液のサンプル、又は第一ｇＤＮＡ溶液のサンプル及び第二ｇＤＮＡ溶液のサンプルのリアルタイムＰＣＲ分析により、被験者のＤＮＡのアレルの存在を検出する工程
をさらに含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
リアルタイムＰＣＲ分析に使用される、第一ｇＤＮＡ溶液のサンプル、第二ｇＤＮＡ溶液のサンプル、又は第一ｇＤＮＡ溶液のサンプル及び第二ｇＤＮＡ溶液のサンプルの各々が、それぞれ体積２μＬ以下を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
リアルタイムＰＣＲ分析が、
（１）二本鎖核酸を変性させる工程と、
（２）フォワードプライマー、リバースプライマー、及び各々の前記ｇＤＮＡ溶液からのゲノムＤＮＡの検出プローブをアニーリングする工程と、
（３）アニーリングされたフォワードプライマー及びアニーリングされたリバースプライマーから第二鎖ＤＮＡを合成する工程と
を含むステップの４０サイクルを実施することを含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
二本鎖核酸を変性させる工程（１）が、９５℃３秒間のインキュベーションを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
基材の先端に付着した被験者からの口腔上皮細胞サンプルを提供する工程（Ａ）が、前記基材を被験者の口腔粘膜に接触させる工程を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
基材が、先端が綿である綿棒又はレーヨンである綿棒である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
基材の先端を撹拌させる工程（Ｂ）が、前記第一溶解溶液中に前記基材の先端を浸漬させる工程と前記基材の先端を前記溶解溶液に浸漬させたままで前記基材を回転させる工程とを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
溶解溶液の温度が、基材の先端を撹拌させる工程（Ｂ）の間、１５℃〜３０℃で維持される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
溶解溶液の温度が、基材の先端を撹拌させる工程（Ｂ）の間、１８℃〜２５℃で維持される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
基材の先端が、第一溶解溶液中で３０秒間以下撹拌（Ｂ）される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
第一溶解溶液が、体積１００μＬ〜２００μＬを有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【出願の技術分野】
【０００１】
本出願は、一般的に疾患関連の遺伝子アレルの単離及び検出方法に関する。特に、この出願は、アベリノ角膜ジストロフィーに関連するアレルの改良された検出方法に関する。
【０００２】
《関連出願に関する相互参照》
本出願は、米国仮出願第６１／８５２，３５７号（２０１３年３月１５日出願）及び米国仮出願第６１／８５２，３５８号（２０１３年３月１５日出願）の優先権を主張する。前記出願の両方は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
《技術分野》
リアルタイムＰＣＲは、実質的に同一の配列を有する核酸配列間の相違を検出するために使用されることができる。示差的に標識された蛍光核酸プローブ、例えば、一方は野生型配列に結合しそして一方は変異体配列に結合するものの使用により、ヒトのゲノムにおける単一ヌクレオチドの変化を迅速かつ確実に検出することができる。この解決力は、一塩基多型（ＳＮＰ）、すなわち、タンパク質のコード配列及び／又は非コード配列内に見出される単一の塩基変化がヒト疾患と相関している医学的診断に適用されている。
【０００４】
しかし、リアルタイムＰＣＲ分析は、高品質のサンプルの収集及び単離に大きく依存する。質の悪いサンプル収集及び／又は単離は、より長いアッセイ条件及びリアルタイムＰＣＲ試薬のより多い使用を必要とし、その両方がコスト増加及び生産性の低下につながる。また、リアルタイムＰＣＲの一塩基多型検出アッセイの失敗は、追加サンプルを収集する必要性をもたらす可能性があり、それは時間と資源においてさらに大きな損失を引き起こす。
【０００５】
従って、アッセイの全体的な成功率を向上させる、改良されたサンプル収集及び単離をもたらす方法は、アッセイに必要な試薬を削減し、そして後になってからの追加のサンプル収集の必要性を減少し、非常に望ましい。また、サンプル材料のより少ない量でリアルタイムＰＣＲ ＳＮＰ検出アッセイを実施するための方法もまた、高品質サンプルの収集及び単離に伴う課題を減少させる。
【０００６】
角膜ジストロフィーは、最初に患者の角膜の中央に視力障害を呈する、常染色体優性遺伝性疾患であることがある。視力障害は角膜の周辺部に向かって広がり、年齢が上がるにつれて、患者の視力を悪化させる。アベリノ角膜ジストロフィー（果粒状角膜ジストロフィー２型としても知られている）、果粒状角膜ジストロフィー（１型）、ティール−ベンケ角膜ジストロフィー（Thiel-Behnke corneal dystrophy）、格子状角膜ジストロフィー（Lattice corneal dystrophy）、及びレイス・バックラー角膜ジストロフィー（Reis-bucklers corneal dystrophy）を含む、複数の種類の角膜ジストロフィーの特徴付けがされている。角膜ジストロフィーは、少なくともいくつかのケースでは、βＩＧ−Ｈ３タンパク質（ＴＧＦＢＩタンパク質、ＴＧＦＢＩｐ、及びケラトエピセリン（keratoepithelin）としても知られている）をコードするトランスフォーム増殖因子β誘導（transforming growth factor beta induced）（ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦβＩとも略される）遺伝子の変異により引き起こされることが知られている。
【０００７】
アベリノ角膜ジストロフィーを患うヘテロ接合患者は、年齢とともに視力の喪失を増加させており、人生の晩年において重症化する（severe in the later years of life）。対照的に、ホモ接合の患者は、症状を見つけることが可能であり、６歳までに視力の損失を完了する。アベリノ角膜ジストロフィーは、角膜ジストロフィーの特殊な種類として１９８８年頃に最初に認識された。その前は、顆粒状角膜ジストロフィーとして誤分類されがちであった。今日では、アベリノ角膜ジストロフィーは、世界中で最も一般的な間質角膜ジストロフィーの形態であることが知られている。韓国では、アベリノ角膜ジストロフィーは、おおよそ８７０人に１人の有病率（prevalence）を有すると考えられている（Lee, J. H. et al., Ophthalmic Epidemiol., 17:160, 2010参照; Holland, E. J. et al., Ophthalmology, 99:1564, 1992; Kennedy, S. M. et al., Br. J. Ophthalmol., 80:489, 1996; Dolmetsch, A. M. et al., Can. J. Ophthalmol., 31:29, 1996; Afshari, N. A. et al., Arch. Ophthalmol., 119:16, 2001; Stewart, H. S. Hum. Mutat., 14:126, 1999も参照）。
【０００８】
これまでに、（例えば、野生型ＴＧＦＢＩアレル１つと変異体ＴＧＦＢＩアレル１つとを有する）ヘテロ接合個体は、レーシック手術後の視力喪失の加速に対して非常に影響を受けやすいことが発見されている。特に、手術２年後の角膜の不透明度（opacity）の増加が、これらの悪性が深刻化している（increasing aggressiveness）患者で確認され、最終的には、視力の完全な喪失をもたらす（Jun, R. M. et al., Opthalmology, 111:463, 2004）。以前は、目の手術は、レーシック又はエキシマレーザー手術が角膜ジストロフィーを患う患者の視界の混濁（vision blurriness）を取り除くであろうことを期待して行われていた。レーシック手術の仮定の数３０万例について、アベリノ角膜ジストロフィーを患っているヘテロ接合患者の最小推定の１／１０００に基づくと、３００人がその視力を失っているであろう。レーシック手術を受けた患者は、主に生産活動を行っている２０歳代、３０歳代である。したがって、彼らの視力喪失は、社会と経済との両方に深刻なトラブルを引き起こす。
【０００９】
また、米国では２０００年のレーシック手術の承認後、レーシック手術を受けたアベリノ角膜ジストロフィーを患っているアフリカ系アメリカ人の患者が失明することが発見されており、これにより、世界中で多くの同様のケースが発生する可能性があることが推測される。
【００１０】
従って、レーシック手術によるアベリノ角膜ジストロフィーの進行を防止するためにアベリノ角膜ジストロフィーの正確な診断が必要とされるが、アベリノ角膜ジストロフィーの診断は、単に角膜混濁の顕微鏡的観察（例えば、細隙灯検査（slit-lamp examination））により行っており、したがって、多くの場合、医師が患者の潜在症状を見落とし、視力喪失をもたらすレーシック手術を実行する。従って、角膜ジストロフィーの迅速かつ正確な遺伝子診断が求められている。
【００１１】
アベリノ角膜ジストロフィーの原因であるＴＧＦＢＩ遺伝子における変異検出用ＤＮＡチップが開発された（韓国特許公開第１０−２００７−００７６５３２号公報）。しかし、前記ＤＮＡチップを使用するアベリノ角膜ジストロフィーの診断は、不利益なことに、サンプル中のＤＮＡを増幅する工程、ＤＮＡチップに増幅したＤＮＡをハイブリダイズする工程、ハイブリダイズされたＤＮＡチップを洗浄する工程、及び肯定的な応答を検出する工程を含む複数工程を必要とし、これらは時間がかかり、そしてエラーの一因となる可能性がある。
【００１２】
前記背景を考慮すると、当該技術分野において必要とされるものは、患者からの生物学的サンプル収集の、これらのサンプルからのゲノムＤＮＡ抽出の、そしてそれらからのアベリノ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰの改良された検出方法である。
【００１３】
《概要》
有利には、本開示は、患者からの生物学的サンプル収集の、これらのサンプルからのゲノムＤＮＡ抽出の、そしてそれらからのアベリノ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰの改良された検出方法を提供する。これらの方法は、スループットを向上させ、分析時間を短縮させ、そしてアベリノ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰを含む、疾患関連ＳＮＰの検出に関連する費用を削減する。
【００１４】
いくつかの観点では、本開示は、ヒトの疾患に関連するアレルの改良された検出方法を提供する。以下に記載する方法は、被験者に関する医療情報を得るアッセイの実施に関連する時間と費用とを減少させる。例えば、いくつかの実施態様では、改良された方法は、患者に対して低い費用で、アベリノ角膜ジストロフィーに関連するゲノムマーカーの同日の検出（same-day detection）を可能にする。
【００１５】
いくつかの実施態様では、これらの利点は、アレル検出用に使用されるゲノムサンプルの単離方法を改良することによって提供される。これらの改良された方法は、患者から採取された口腔細胞サンプル（buccal cell sample）からのゲノムＤＮＡの全体の回収率を増加させる。いくつかの実施態様では、これらの改良された収率は、患者の口腔細胞が溶解される温度を増加させることによって実現される。
【００１６】
いくつかの実施態様では、以下に記載の方法は、患者のサンプルの再利用を可能にし、ゲノムテストが繰り返される必要がある場合に、追加サンプルを採取する必要性を減少させる。慣例上、ゲノムテストが失敗した際に、被験者は、再テスト用の追加サンプルを提供する必要がある。これは、数日から数週間にかけて、重要なテスト結果の遅延をもたらす可能性がある。有利なことには、本明細書により提供される方法がゲノム核酸の有効性を向上させることから、患者のサンプルを再利用することができ、追加の患者サンプルの収集に関連する貴重な時間及び費用を潜在的に節約する。
【００１７】
いくつかの実施態様では、以下に記載される方法は、検出アッセイの感度を高め、テストに必要なサンプルの量を減少させる。反応ごとに必要なサンプル量の減少は、患者から単離された単一のサンプルに対して行うことができるアッセイ数を増加させ、再テストが必要な場合に患者から再度追加サンプルが収集される必要の可能性を減少させる。サンプルの必要量の減少はまた、各々のアッセイの実施用に必要な試薬の量の減少をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ−１Ｂ】いくつかの実施態様による、疾患に関連するゲノムのアレル検出用の改善された方法１００を示す。
【００１９】
【図２】いくつかの実施態様による、アベリノ角膜ジストロフィーに関連する一塩基多型のリアルタイムＰＣＲ検出用に有用なフォワード及びリバースプライマー対の配列リスト（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１−２４）を提供している。
【００２０】
【図３】いくつかの実施態様による、アベリノ角膜ジストロフィーに関連する一塩基多型のリアルタイムＰＣＲ検出用に有用な野生型及び変異型検出プローブ対の配列リスト（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：２５−４２）を提供している。
【００２１】
【図４】アベリノ角膜ジストロフィー関連マーカー検出用の改良されたリアルタイムＰＣＲアッセイ条件の同定のために行った実験結果を示す。
【００２２】
【図５】実施例７の表３２に示されている、ＮＮ（ロット＃ＡＬＵ０１２−００６）についての制御安定性の結果のグラフを提供する。
【００２３】
【図６】実施例７の表３３に示されている、ＨＮ（ロット＃ＡＬＵ９１２−００７）についての制御安定性の結果のグラフを提供する。
【００２４】
【図７】実施例７の表３４に示されている、ＨＨ（ロット＃ＡＬＵ９１２−００８）についての制御安定性の結果のグラフを提供する。
【００２５】
《詳細な説明》
Ｉ．序論
疾患関連ＳＮＰの検出は、様々な医学的状態の診断及び予後のためにますます重要なツールとなっている。例えば、ＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４における単一ヌクレオチドの変化の存在が、アベリノ角膜ジストロフィーと強く関連している。このＳＮＰのヘテロ接合の個体が、レーシック手術後の視力喪失のリスクが高いことが見出された。レーシックは多くの人々のクオリティオブライフを大きく向上させる医療処置であるが、Ｇ／Ａ ＴＧＦＢＩ ＳＮＰを保有する個体については、失明につながる可能性がある、４〜１８月の期間にわたる段階的な視力障害の原因となる。視力障害は、より長い又はより短い期間で発生する可能性がある。幸いなことに、スクリーニングにより、レーシック処置を避けるべきである変異を有する個体を同定することができる。
【００２６】
本開示は、改良された、サンプル単離、調製、及び分析方法の発見に少なくとも部分的に基づいている。いくつかの実施態様では、前記方法は、例えば、アッセイが失敗した又は追加のフォローアップテストを実行する必要がある場合、患者サンプルの再使用を可能にするために提供される。いくつかの実施態様では、これらの改良された方法は、患者の口腔粘膜（buccal membrane）から剥離（sloughed-off）した細胞を保有する基材（substrate）（例えば、レーヨンが先端に付いた（a rayon-tipped）又は綿が先端に付いたアプリケーター（cotton-tipped applicator））を、溶解溶液中で（高温で２０分間延長されたインキュベーションよりもむしろ）室温で３０〜４５秒間静かに回転させる工程を含む。次に、前記溶解溶液を４５℃で３０分間インキュベートし、溶解性を改善させそしてゲノムサンプルの収率を向上させる。有利には、前記のレーヨンが先端に付いた又は綿が先端に付いたアプリケーターを、その後、再テスト用に使用されるゲノムＤＮＡの再単離用に保存することができる（例えば、凍結又は冷蔵）。
【００２７】
いくつかの実施態様において、本明細書で提供される改良は、リアルタイムＰＣＲ検出アッセイ用のゲノムＤＮＡテンプレートのより少ない量の使用を通して提供される。いくつかの実施態様では、これは、実施されるリアルタイムＰＣＲのサイクルを増加させること（例えば約４０サイクル）、及び／又は９５℃で３秒の変性サイクルの時間を用いることにより達成される。有利なことには、必要なサンプル量がこれらの方法によって減少することから、リアルタイムＰＣＲに必要な試薬の量もまた減少する。診断アッセイにおいて使用される多くの試薬が特許に守られているので（proprietary）、試薬は高価である可能性がある。使用される試薬の量の減少により、試薬に関連するコストもまた有意に削減することができる。
【００２８】
これらの個々の工程の各々を実施するための特定の条件（サンプルハンドリング、インキュベーション温度、反応ボリューム、反応サイクル数、反応サイクル時間、反応サイクル温度）の組み合わせが、本明細書に記載される疾患関連ＳＮＰ、例えばＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４中に発見されたアベリノ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰの検出方法を実施するために使用されることが期待される。
【００２９】
ＩＩ．定義の選択
本明細書中で使用される用語「発明」又は「本発明」は、本発明の特定の実施態様のいずれかに限定することを意図せず、特許請求の範囲及び明細書に記載したように、本発明の任意の及び全ての実施態様に一般に適用される。
【００３０】
本明細書で使用される場合、文脈が特に明確に指示しない限りは、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の参照（plural references）を含む。したがって、例えば、「方法（the method）」の参照は、本開示を読めば当業者に明らかとなるであろう本明細書に記載の種類の方法の１つ又は複数、及び／又は工程を含む。
【００３１】
本明細書で使用される用語「多型」及びその変形は、異なるゲノム又は個体間の、２又はそれ以上の選択的なゲノム配列又はアレルの発生を意味する。用語「遺伝子変異」又は「遺伝的変異」及びその変形は、多型を含む。
【００３２】
本明細書で使用される用語「一塩基多型」（「ＳＮＰ」）とその変形は、アレル間で変化するヌクレオチドの１つの部位を意味する。一塩基多型（ＳＮＰ）は、単一塩基の変化又は点変異であるが、個体間の遺伝的変異をもたらすいわゆる「インデル（indel）」変異（ヌクレオチドの挿入又は欠失）を含む。人間の全ての遺伝的変異の約９０％を構成するＳＮＰは、３億塩基のヒトゲノムに沿って１００〜３００塩基毎に発生する。しかし、ＳＮＰは、ウイルスのような他の生物においてははるかに頻繁に発生する可能性がある。ＳＮＰは、ゲノムのコード又は非コード領域において生じる可能性がある。コード領域中のＳＮＰは、タンパク質産物のアミノ酸配列を変更することができ又は変更しないこともできる。非コード領域中のＳＮＰは、プロモーター又はプロセシング部位を変更することができ、遺伝子の転写及び／又はプロセシングに影響を及ぼす可能性がある。個人が関心のあるゲノム領域に特定のＳＮＰを有するかどうかを知ることにより、種々の疾患のための、診断、予防、及び治療用途の開発用の十分な情報を提供することができる。いくつかの実施態様において、本開示は、アベリノ角膜ジストロフィーに関連するＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４に位置するグアニンからアデニンのＳＮＰの検出に関する。
【００３３】
用語「プライマー」及びその変形は、ＰＣＲ反応においてＤＮＡ合成の開始点として作用するオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの長さは、通常、約１５〜約３５ヌクレオチドでありそして標的配列に相補的な領域にハイブリダイズする。
【００３４】
用語「プローブ」及びその変形（例えば、検出プローブ）は、ＰＣＲ反応において標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを意味する。標的配列は、分析されるべきである核酸の領域を意味しそして目的の多型部位を含む。
【００３５】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、一般的に、本発明が属する当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法及び材料が、本発明の実施又は試験において使用されることができるが、方法及び材料の様々な実施態様は、本明細書に具体的に記載されている。
【００３６】
ＩＩＩ．サンプル調製
いくつかの実施態様において、本開示は、リアルタイムＰＣＲの一塩基多型検出アッセイで使用されるゲノムサンプルの改良された単離方法を提供する。いくつかの実施態様では、改良された方法１００は、図１Ａ−１Ｂで説明されている工程の組み合わせを使用する。
【００３７】
いくつかの実施態様では、前記方法は、被験者からの細胞サンプルを提供する工程を含む。いくつかの実施態様において、細胞は、患者の細胞表面を基材上に細胞を可逆的に固定化することが可能な基材に接触させることによって収集される。
【００３８】
開示された方法は、様々な細胞型に適用可能である。いくつかの実施態様では、開示された方法で使用するための細胞型としては、上皮細胞、内皮細胞、結合組織細胞、骨格筋細胞、内分泌細胞、心臓細胞、尿路細胞、メラノサイト及びケラチノサイトが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、細胞は上皮細胞である。いくつかの実施態様では、細胞は白血球である。いくつかの実施態様では、細胞は：血、軟膜、及び唾液の１つ以上から得られる。いくつかの実施態様において、細胞は；被膜下血管周囲（subcapsular-perivascular）（上皮型１）；ペール（pale）（上皮型２）；中間(intermediate)（上皮型３）；暗(dark)（上皮型４）；未分化(undifferentiated)（上皮型５）；及び大髄質(large-medullary)（上皮型６）である。いくつかの実施態様において、細胞は、口腔上皮細胞（例えば、口腔内スワップ（buccal swap）を使用して収集された上皮細胞）である。いくつかの実施態様では、開示される方法において使用される細胞のサンプルは、上記の特定の細胞型の任意の組み合わせを含む。
【００３９】
いくつかの実施態様において、方法は、被験者からの細胞のサンプルを提供する工程（１０２、図１Ａ）を含む。いくつかの実施態様において、提供される細胞は、口腔上皮細胞である。
【００４０】
細胞サンプルは、被験者の細胞の基材への可逆的結合を可能にする様々な方法のいずれかによって収集される。いくつかの実施態様では、基材は、基材に細胞を可逆的に結合するために、対象の細胞を含有するサンプルとの物理的相互作用において用いられる。いくつかの実施態様では、基材に細胞を可逆的に結合するために、被検者の身体との物理的相互作用に直接的に用いられる。いくつかの実施態様では、サンプルは口腔細胞サンプルでありそして口腔細胞のサンプルは、膜から除去される細胞を可逆的に固定化することが可能な基材を用いて被験者の口腔粘膜（例えば、頬の内側）に接触させる（１０４、図１Ａ）ことによって収集される。前記実施態様では、綿棒（swab）は、人の歯のブラッシングに相当する力を用いて被験者の頬の内側に擦り付けられる（例えば、力又は圧力の軽い量）。被験者の細胞が基材に可逆的に結合することを可能にする任意の方法が、開示された方法で使用するために意図される。
【００４１】
いくつかの実施態様において、サンプルは、有利には、非侵襲的な方法で収集されそして前記サンプル収集はどこでも及びほとんど誰でも達成される。例えば、いくつかの実施態様において、サンプルは、診療所、被験者の自宅、又はレーシック手術が行われている又は行われるべき機関で採取される。いくつかの実施態様では、患者、患者の医師、看護師若しくは医師のアシスタント、又は他の臨床担当者がサンプルを収集する。
【００４２】
いくつかの実施態様では、基材は、細胞が可逆的に結合する様々な材料のいずれかで製造されている。典型的な基材は、レーヨン、綿、シリカ、エラストマー、セラック、アンバー、天然若しくは合成ゴム、セルロース、ベークライト（ＢＡＫＥＬＩＴＥ）、ナイロン（ＮＹＬＯＮ）、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル、又は他の材料あるいはこれらの組み合わせから製造されたものを含む。いくつかの実施態様では、基材はレーヨンの先端又は綿の先端を有する綿棒である。
【００４３】
基材の先端（例えば、レーヨン綿棒又は綿の綿棒の先端部）を、次いで、溶解溶液中で撹拌する（１０６、図１Ａ）。いくつかの実施態様において、基材の先端部を、約１０秒〜６０秒（１分）、又は約２０秒〜６０秒、約２０秒〜約４５秒、若しくは約２０秒〜約３０秒、約１５秒〜約６０秒、約１５秒〜約４５秒、若しくは約１５秒〜約３０秒、約１０秒〜約６０秒、約１０秒〜約４５秒、約１０秒〜約３０秒、約１０秒〜約１５秒、若しくは約１０秒〜約２０秒溶解溶液中で撹拌する。いくつかの実施態様では、撹拌は、約６０秒又は約１分間生じる。いくつかの実施態様では、撹拌は１分未満（例えば、６０秒未満）の間生じる。いくつかの実施態様では、撹拌は１５秒、２０秒、３０秒（１０８、図１Ａ）、４５秒、又は６０秒間以下生じる。いくつかの実施態様では、撹拌は４５秒間以下生じる。いくつかの実施態様では、撹拌は３０秒間以下生じる。いくつかの実施態様では、撹拌は２０秒間以下生じる。いくつかの実施態様では、撹拌は１５秒間以下生じる。しかし、撹拌は、６０秒間より長い間実施されることができる（例えば、１２０秒、１８０秒、２４０秒、３００秒、６００秒等）。
【００４４】
いくつかの実施態様において、撹拌は、溶解溶液中の基材の任意の移動を含む。いくつかの実施態様では、撹拌は（１１０、図１Ａ）、溶解溶液中に基材の先端を浸漬する工程及び基材の先端を溶解溶液に浸漬したままで基材を回転させる工程を含む。いくつかの実施態様において、後の時点で及び／又はそれ以降の時間の単離のために口腔細胞の複数が基材に固定されたままであるように、基材の先端（例えば、レーヨン綿棒又は綿の綿棒の先端部）を溶解溶液中で静かに移動させる。溶解溶液中の前記の動きは、いくつかの口腔細胞が溶解溶液中に分散されることを可能にする一方で前記先端部に複数の前記口腔細胞が基材に固定されたままであるような溶解溶液中の基材の渦運動（swirling motions）、左右の動き（side to side motions）、上下の動き（up and down motions）、及び／又は浸漬する動き（dipping motion）、又は任意の他の動きを含む。
【００４５】
いくつかの実施態様では、撹拌工程は、例えば、室温で例えば、約１５℃〜約３０℃（１１２、図１Ａ）、約１８℃〜約２８℃、約１８℃〜２５℃、又は約２０℃〜約２５℃で実施される。
【００４６】
撹拌後、基材（例えば、レーヨン綿棒又は綿の綿棒の先端部）は除去され（１１４、図１Ａ）、そしていくつかの実施態様では、再テスト又はさらなる（異なる又は追加の）テストに備えて後の使用のために貯蔵される。いくつかの実施態様では、基材（例えば、レーヨンの先端又は綿の先端を備えるバッカル綿棒（buccal swab））を容器に入れそして凍結保存する。いくつかの実施態様では、基材（例えば、レーヨンの先端又は綿の先端を備えるバッカル綿棒）を冷蔵する。いくつかの実施態様では、基材は、１つ又はそれ以上の追加の抽出のために未だ有用なままで維持される一方で、様々な温度のいずれか及び様々な時間のいずれかで貯蔵される。
【００４７】
いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、０週、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、若しくは１２週又はそれ以上の間保存されている。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、０週〜１２週、１週〜１２週、２週〜１２週、３週〜１２週、４週〜１２週、５週〜１２週、６週〜１２週、７週〜１２週、８週〜１２週、９週、１０週〜１２週、又は１１週〜１２週の間貯蔵されている及び／又は貯蔵可能である。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、３０、若しくは３６月又はそれ以上の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１月〜３６月、２月〜３６月、３月〜３６月、４月〜３６月、５月〜３６月、６月〜３６月、７月〜３６月、８月〜３６月、９月〜３６月、１０月〜３６月、１２月〜３６月、１４月〜３６月、１６月〜３６月、１８月〜３６月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１月〜３０月、２月〜３０月、３月〜３０月、４月〜３０月、５月〜３０月、６月〜３０月、７月〜３０月、８月〜３０月、９月〜３０月、１０月〜３０月、１２月〜３０月、１４月〜３０月、１６月〜３０月、１８月〜３０月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１月〜２４月、２月〜２４月、３月〜２４月、４月〜２４月、５月〜２４月、６月〜２４月、７月〜２４月、８月〜２４月、９月〜２４月、１０月〜２４月、１２月〜２４月、１４月〜２４月、１６月〜２４月、１８月〜２４月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１月〜２２月、２月〜２２月、３月〜２２月、４月〜２２月、５月〜２２月、６月〜２２月、７月〜２２月、８月〜２２月、９月〜２２月、１０月〜２２月、１２月〜２２月、１４月〜２２月、１６月〜２２月、１８月〜２２月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１月〜２０月、２月〜２０月、３月〜２０月、４月〜２０月、５月〜２０月、６月〜２０月、７月〜２０月、８月〜２０月、９月〜２０月、１０月〜２０月、１２月〜２０月、１４月〜２０月、１６月〜２０月、１８月〜２０月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１月〜１８月、２月〜１８月、３月〜１８月、４月〜１８月、５月〜１８月、６月〜１８月、７月〜１８月、８月〜１８月、９月〜１８月、１０月〜１８月、１２月〜１８月、１４月〜１８月、１６月〜１８月、又は１７月〜１８月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１月〜１２月、２月〜１２月、３月〜１２月、４月〜１２月、５月〜１２月、６月〜１２月、７月〜１２月、８月〜１２月、９月〜１２月、１０月〜１２月、又は１１月〜１２月の間貯蔵される。
【００４８】
いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、又は約８℃で貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約２℃〜約８℃、約３℃〜約８℃、約４℃〜約８℃、約５℃〜約８℃、約６℃〜約８℃、約７℃〜約８℃で貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約−２５℃、約−２４℃、約−２３℃、約−２２℃、約−２１℃、約−２０℃、約−１９℃、約−１８℃、約−１７℃、約−１６℃、又は約−１５℃で貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約−２５℃〜約−１５℃、約−２２℃〜約−１７℃、約−２０℃〜約−１５℃、又は約−２５℃〜約−２０℃で貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約−９０℃、約−８９℃、約−８８℃、約−８７℃、約−８６℃、約−８５℃、約−８４℃、約−８３℃、約−８２℃、約−８１℃、約−８０℃、約−７９℃、約−７８℃、約−７７℃、約−７６℃、約−７５℃、約−７４℃、約−７３℃、約−７２℃、約−７１℃、約−７０℃、約−６９℃、約−６８℃、約−６７℃、約−６６℃、又は約−６５℃で貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約−９０℃〜約−６５℃、約−８５℃〜約−６５℃、約−８０℃〜約−６５℃、約−７５℃〜約−６５℃、又は約−７０℃〜約−６５℃で貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、−９０℃〜−６５℃で貯蔵される。
【００４９】
いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１回又はそれ以上凍結解凍され（例えば、凍結された後、サンプルを含有する基材を解凍し、本発明の方法に使用してそして再凍結する）そして本発明に使用される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の回数凍結解凍される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の回数使用される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１〜２０回、２〜２０回、３〜２０回、４〜２０回、５〜２０回、６〜２０回、７〜２０回、８〜２０回、９〜２０回、１０〜２０回、１１〜２０回、１２〜２０回、１３〜２０回、１４〜２０回、１５〜２０回、１６〜２０回、１７〜２０回、１８〜２０回、１９〜２０回、５〜１５回、５〜１０回、１〜１０回、又は１〜５回凍結解凍される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１〜２０回、２〜２０回、３〜２０回、４〜２０回、５〜２０回、６〜２０回、７〜２０回、８〜２０回、９〜２０回、１０〜２０回、１１〜２０回、１２〜２０回、１３〜２０回、１４〜２０回、１５〜２０回、１６〜２０回、１７〜２０回、１８〜２０回、１９〜２０回、５〜１５回、５〜１０回、１〜１０回、又は１〜５回使用される。したがって、いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、複数回（例えば３回）凍結解凍されそして本発明に使用される。
【００５０】
いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、室温で又は約１５℃〜約３０℃で１週間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約２℃〜約８℃又は約４℃で約１、２、又は３週間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約−２５℃〜約−１５℃又は約−２０℃で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約−９０℃〜約−６５℃又は約−８０℃で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２月の間貯蔵される。
【００５１】
いくつかの実施態様において、基材に付着した口腔細胞を溶解可能な第二溶解溶液中で基材の先端部を撹拌する（１２２、図１Ｂ）。いくつかの実施態様では、第二溶解溶液は、第一溶解溶液と同じである。いくつかの実施態様では、第二溶解溶液は、第一溶解溶液とは異なる。いくつかの実施態様において、基材を凍結保存しそして解凍した後に、基材に付着した口腔細胞を溶解可能な第二溶解溶液中で基材の先端部を撹拌する。いくつかの実施態様では、基材の先端部を溶解溶液中で約４５秒間以下撹拌する工程を含む（１２４、図１Ｂ）。いくつかの実施態様では、撹拌は（１２６、図１Ｂ）、第二溶解溶液中に基材の先端を浸漬する工程及び基材の先端を前記溶解溶液に浸漬したままで基材を回転させる工程を含む。いくつかの実施態様では、溶解溶液の温度は、撹拌中約１８℃〜３０℃（１２８、図１Ｂ）に維持される。
【００５２】
いくつかの実施態様では、基材は第二溶解溶液から除去される（１３０、図１Ｂ）。いくつかの実施態様では、第二溶解溶液は、インキュベートされる。いくつかの実施態様では、第二溶解溶液は、４５±３℃の温度で４５±１５分間インキュベートされる（１３２、図１Ｂ）。いくつかの実施態様では、ゲノムＤＮＡが第二溶解溶液から単離される（１３４、図１Ｂ）。いくつかの実施態様では、疾患又は障害に関連するアレルの存在が、単離されたゲノムＤＮＡにおいて検出される。
【００５３】
図１Ａに示したプロセスのいくつかの特徴は、図１Ｂに示すプロセスに適用可能である。例えば、図１Ａに関して記載したプロセスの様々な条件は、図１（ｂ）に示すプロセス用に使用可能である。簡潔にするために、これらの詳細はここでは繰り返さない。
【００５４】
有利に及び驚くべきことに、基材から抽出された細胞数の減少は、個々の細胞からの核酸の抽出物の増加によって相殺されることが見出された。いくつかの実施態様では、増加した抽出物は、標準的な慣行（standard practices）と比較して細胞を長時間インキュベーションすること、標準的な慣行と比較して高い温度で細胞をインキュベーションすること、又はその組み合わせにより達成される。
【００５５】
いくつかの実施態様では、細胞の核酸の抽出物の増加は、標準的な慣行と比較して増加させた又はより長い期間の抽出物インキュベーションを実施することにより達成される。いくつかの実施態様では、抽出物インキュベーションは、約４５分間、例えば４５±５、４５±１０、４５±１５、又は４５±２０分間実施される（１１６、図１Ａ）。いくつかの実施態様においては、抽出物インキュベーションは、約２５分〜約６５分、約３０分〜約６０分、約３５分〜約５５分、約４５分〜約６５分、約４５分〜約５５分、又は約４０分〜約５０分の間実施される。本発明による抽出物インキュベーション時間は、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、又は約６５分である。
【００５６】
いくつかの実施態様では、細胞の核酸の抽出物の増加は、標準的な慣行と比較して増加した又は高い温度の抽出物インキュベーションにより達成される。いくつかの実施態様では、抽出物インキュベーションは、約４５℃、例えば４５±２℃、４５±５℃、又は４５±１０℃で実施される（１１６、図１Ａ）。いくつかの実施態様では、抽出物インキュベーション温度は、約３５℃〜約５５℃、約４０℃〜約５０℃、又は約４３℃〜約４７℃である。いくつかの実施態様では、抽出物インキュベーション温度は、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、又は約５５℃である。
【００５７】
いくつかの実施態様では、実質的に少ない数の細胞が基材から次に続く本発明の方法の溶解のために放出される。いくつかの実施態様では、細胞の少なくとも１個、細胞の少なくとも２個、細胞の少なくとも５個、細胞の少なくとも１０個、細胞の少なくとも１５個、細胞の少なくとも２０個、細胞の少なくとも５０個、細胞の少なくとも７５個、細胞の少なくとも１００個、細胞の少なくとも１２５個、細胞の少なくとも１５０個、細胞の少なくとも１７５個、細胞の少なくとも２００個、細胞の少なくとも２５０個、細胞の少なくとも３００個、細胞の少なくとも３５０個、細胞の少なくとも４００個、細胞の少なくとも４５０個、細胞の少なくとも５００個、又はそれ以上が撹拌中に基材から放出される。いくつかの実施態様では、純度約０．５５〜２．００、約０．６〜約２．００、約０．７〜約２．００、約０．８〜約２．００、約０．９〜約２．００、約１．０〜約２．００、約１．１〜約２．００、約１．２〜約２．００、約１．３〜約２．００、約１．４〜約２．００、約１．５〜約２．００、約１．６〜約２．００、約１．７〜約２．００、約１．８〜約２．００、又は約１．９〜約２．００の核酸約１ｎｇ／μＬ〜約５０ｎｇ／μＬ、約１ｎｇ／μＬ〜約４０ｎｇ／μＬ、約１ｎｇ／μＬ〜約３０ｎｇ／μＬ、約１ｎｇ／μＬ〜約２０ｎｇ／μＬ、約１ｎｇ／μＬ〜約１０ｎｇ／μＬ、約１ｎｇ／μＬ〜約５ｎｇ／μＬ、約１ｎｇ／μＬ〜約４ｎｇ／μＬ、約１ｎｇ／μＬ〜約３ｎｇ／μＬ、約１ｎｇ／μＬ〜約２ｎｇ／μＬが、記載される方法に採用される。いくつかの実施態様では、純度約０．５５〜２．００の核酸約１ｎｇ／μＬ〜５０ｎｇ／μＬが、記載される方法に採用される。いくつかの実施態様では、純度約０．５５〜２．００の核酸約１ｎｇ／μＬ〜４０ｎｇ／μＬが、記載される方法に採用される。いくつかの実施態様では、純度約０．５５〜２．００の核酸約１ｎｇ／μＬ〜３０ｎｇ／μＬが、記載される方法に採用される。いくつかの実施態様では、純度約０．５５〜２．００の核酸約１ｎｇ／μＬ〜２０ｎｇ／μＬが、記載される方法に採用される。いくつかの実施態様では、純度約０．５５〜２．００の核酸約１ｎｇ／μＬ〜１０ｎｇ／μＬが、記載される方法に採用される。いくつかの実施態様では、純度約０．５５〜２．００の核酸約１ｎｇ／μＬ〜５ｎｇ／μＬが、記載される方法に採用される。いくつかの実施態様では、純度約０．５５〜２．００の核酸約１ｎｇ／μＬ〜４ｎｇ／μＬが、記載される方法に採用される。いくつかの実施態様では、純度約０．５５〜２．００の核酸約１ｎｇ／μＬ〜３ｎｇ／μＬが、記載される方法に採用される。いくつかの実施態様では、純度約０．５５〜２．００の核酸約１ｎｇ／μＬ〜２ｎｇ／μＬが、記載される方法に採用される。いくつかの実施態様では、純度約０．５５〜２．００の核酸少なくとも約１ｎｇ／μＬが、記載される方法に採用される。
【００５８】
ＩＶ．溶解溶液
様々な溶解溶液が記載されておりそして当業者に公知である。これらの周知の溶解溶液のうちのいくつかは、本方法に使用することができ、サンプルから核酸を単離する。典型的な溶解溶液は、市販されているもの、例えばＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、ＱＩＡＧＥＮ、ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ及び他の製造業者によって販売されているもの、並びに実験室の環境で当業者により生成することができるものが含まれる。溶解バッファもまた十分に記載されており、そして溶解バッファは記載された方法、例えば、Molecular Cloning (three volume set, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012)及びCurrent Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)に記載されたもの、を用いた使用を見出すことができ、これらの文献の両方は全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
細胞溶解は、細胞内の核酸を回収するために一般的に実施される方法である。多くの場合、細胞を溶解溶液、一般に界面活性剤を含むアルカリ溶液と、又は溶菌酵素溶液と接触させる。前記溶解溶液は、典型的には、塩、界面活性剤、及びバッファ、並びに当業者が使用することを理解するであろう他の薬剤を含む。完全な及び／又は部分的な溶解後、核酸は溶解溶液から回収される。
【００６０】
いくつかの実施態様では、細胞は、ｐＨ約４〜約１０、約５〜約９、約６〜約８、又は約７〜約９のｐＨ範囲で水溶液バッファ中で再懸濁される。
【００６１】
いくつかの実施態様では、バッファ塩の濃度は約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、又は約２０ｍＭ〜約８０ｍＭである。
【００６２】
いくつかの実施態様では、バッファは、キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）又はエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）をさらに含む。
【００６３】
いくつかの実施態様では、溶解溶液は、細胞からの核酸の放出を支援する他の化合物、例えばこれには限定されないが例としてスクロースを含むポリオール、並びに糖アルコール例えばマルチトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、及び／又はイソマルトをさらに含む。いくつかの実施態様では、ポリオールは、約２％〜約１５％ｗ／ｗ、又は約５％〜約１５％ｗ／ｗ、又は約５％〜約１０％ｗ／ｗの範囲である。
【００６４】
いくつかの実施態様では、溶解溶液は、界面活性剤例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、Ｘ−１１４、ＣＨＡＰＳ、ＤＯＣ、及び／又はＮＰ−４０をさらに含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、前記の界面活性剤は、約１％〜約５％ｗ／ｗ、約１％〜約４％ｗ／ｗ、又は約１％〜約３％ｗ／ｗの範囲である。
【００６５】
実施態様では、溶解溶液はカオトロープ（chaotropes）例えば尿素、ドデシル硫酸ナトリウム、及び／又はチオ尿素をさらに含むがこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、カオトロープは、約０．５Ｍ〜８Ｍ、又は約１Ｍ〜約６Ｍ、約２Ｍ〜約６Ｍ、又は約１Ｍ〜３Ｍの範囲の濃度で使用されている。
【００６６】
いくつかの実施態様では、溶解溶液は、追加の溶解試薬の１種又はそれ以上をさらに含み、例えば、溶解試薬は当該分野で周知である。いくつかの実施態様では、溶解試薬は、細胞壁溶解酵素例えばリゾチームを含むが、これには限定されない。いくつかの実施態様において、溶解試薬は、アルカリ性界面活性剤溶液、例えば０．５％ドデシル硫酸ナトリウムを含む０．１水酸化ナトリウム水溶液を含む。
【００６７】
いくつかの実施態様では、溶解溶液は水性糖溶液、例えばスクロース溶液及びキレート化剤例えばＥＤＴＡ例えばＳＴＥＴバッファをさらに含む。特定の実施態様において、溶解試薬は、細胞懸濁液と所望の２倍の濃度を有する溶解溶液等量とを混合することによって調製される（例えば０．２水酸化ナトリウム、１．０％ドデシル硫酸ナトリウム）。
【００６８】
いくつかの実施態様では、所望の程度の溶解が達成された後、溶解溶液と溶解した細胞とを含む混合物を中和又はクエンチ剤と接触させ、溶解試薬が所望の生成物に悪影響を与えないような条件に調整する。いくつかの実施態様では、ｐＨを約５〜約９、約６〜約８、約５〜約７、約６〜約７、又は約６．５〜７．５に調整し、例えばこれには限定されないが核酸を含む細胞内容物の分解を最小化及び／又は防止する。いくつかの実施態様では、溶解試薬がアルカリ性溶液を含む場合、中和試薬は、酸性バッファ例えばアルカリ金属酢酸塩／酢酸バッファを含む。いくつかの実施態様では、溶解条件例えば温度及び溶解試薬の組成物は、核酸を含むがこれに限定されるものではない所望の生成物の劣化を最小限に抑えながら、溶解が実質的に完了するように選択される。
【００６９】
いくつかの実施態様では、第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、又は第二十溶解溶液が本方法に使用される。いくつかの実施態様では、使用される溶解バッファは、約１０μＬ、約２０μＬ、約３０μＬ、約４０μＬ、約５０μＬ、約６０μＬ、約７０μＬ、約８０μＬ、約９０μＬ、約１００μＬ、約１２０μＬ、約１３０μＬ、約１４０μＬ、約１５０μＬ、約１６０μＬ、約１７０μＬ、約１８０μＬ、約１９０μＬ、約２００μＬ、約２２０μＬ、約２３０μＬ、約２４０μＬ、約２５０μＬ、約２６０μＬ、約２７０μＬ、約２８０μＬ、約２９０μＬ、約３００μＬ、約３２０μＬ、約３３０μＬ、約３４０μＬ、約３５０μＬ、約３６０μＬ、約３７０μＬ、約３８０μＬ、約３９０μＬ、約４００μＬ、約５００μＬ、約６００μＬ、約７００μＬ、約８００μＬ、約９００μＬ、又は約１０００μＬである。いくつかの実施態様では、溶解バッファは、約１０μＬ〜約４００μＬ、約２０μＬ〜約４００μＬ、約５０μＬ〜約３００μＬ、約５０μＬ〜約２００μＬ、約５０μＬ〜約４００μＬ、約１００μＬ〜約４００μＬ、約１０μＬ〜約３００μＬ、約１００μＬ〜約２００μＬ、約２００μＬ〜約５００μＬ、約１００μＬ〜約１０００μＬ、約２００μＬ〜約１０００μＬ、約３００μＬ〜約２００μＬ、約５００μＬ〜約１０００μＬ、又は約６００μＬ〜約１０００μＬである。
【００７０】
他の公知の及び通常の方法の組み合わせと同様に上記の任意の組み合わせが当業者によって使用されることができ、前記の組合せは、本発明によって意図される。
【００７１】
Ｖ．溶解溶液からの核酸の精製
いくつかの実施態様では、例えば、ゲノムＤＮＡを含むがこれに限定されない核酸は、その後の分析を実施する前に、溶解バッファ（１１８、図１Ａ）から単離される。いくつかの実施態様では、核酸は、追加の分析例えばこれには限定されないがリアルタイムＰＣＲ分析を実施する前に、溶解バッファから単離される。少量の核酸の単離に有用な様々な任意の方法が、開示された方法の様々な実施態様によって使用される。これらには、沈殿、ゲル濾過、密度勾配、及び固相結合が含まれるが、これらに限定されない。前記の方法は、例えば、全ての目的のために本明細書に参照として組み込まれる、Molecular Cloning (three volume set, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012)及びCurrent Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)に記載されている。
【００７２】
核酸の沈殿は、当業者に知られている周知の単離方法である。様々な固相結合法（solid phase binding methods）もまた、当該技術分野で公知であり、ビーズ、（例えば、シリカ、磁性体）、カラム、膜、又は他の様々な当該技術分野で公知の物理的形態を含む固相結合法を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、開示された方法において使用される固相は、可逆的に核酸と結合する。前記の固相の例は、少なくとも２種の固相の混合物であるいわゆる「混合床（mixed-bed）」固相を含み、各々のそれらは、異なる溶液条件下での核酸の限度容量、そして異なる条件下；例えば、全ての目的のために本明細書にその全体が参照として組み込まれる米国特許出願公開第２００２／０００１８１２号明細書、での核酸を放出する能力及び／又は限度容量を有する。開示された方法による核酸の固相の親和性は、典型的には、基材への溶質を結合するために使用される多くの手段のいずれかを介してであることができる。前記の手段の例は、イオン性相互作用（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー）及び疎水性相互作用（例えば、逆相クロマトグラフィー）、ｐＨ値の差及び変化、塩の差及び変化（例えば、濃度変化、カオトロピック塩／エージェント）が含まれるが、これらに限定されない。ｐＨに基づいた固相の典型的な例は、これには限定されないがＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ Ｂｕｃｃａｌ Ｋｉｔ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓにおいて使用されているものを含み、これは低ｐＨ（＜６．５）で核酸に結合し、そして高ｐＨ（＞８．５）で核酸を放出し、そしてモノ−アミノ−Ｎ−アミノエチル（ＭＡＮＡＥ）は７．５より低いｐＨで核酸と結合し、そして８より大きいｐＨで核酸を放出する。典型的なイオン交換系基材（ion exchange based substrates）としては、ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ, Ｎ.Ｊ.）からの、ＤＥＡ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ、Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ、及びＤＥＡＥ−ＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭ、Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ （Ｍｉｄｌａｎｄ, Ｍｉｃｈ.）からのＤＯＷＥＸ（登録商標）Ｉ、Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａｓ （Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ, Ｐａ.）からのＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）、Ｄｕｏｌｉｔｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ, Ｉｎ.（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ, Ｏｈｉｏ）からのＤＵＯＬＩＴＥ（登録商標）、ＤＩＡＬＯＮ ＴＩ及びＤＩＡＬＯＮ ＴＩＩが含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
任意の個々の方法が、単独での又は他の方法と組み合わせた使用が意図され、そして前記の有用な組み合わせは当業者には周知であり、よく理解されている。
【００７４】
ＶＩ．核酸分析
開示された方法は、核酸例えば、ゲノム分析を含む様々な核酸分析のためのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離するために使用される。いくつかの実施態様において、本方法は、単離されたゲノムＤＮＡにおける疾患又は障害に関連するアレルの存在を検出する工程を含む。いくつかの実施態様では、前記の分析は、様々な遺伝的変異の検出を含み、この遺伝的変異は、欠失、挿入、トランジション、及びトランスバージョンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、変異は一塩基多型（ＳＮＰ）である。
【００７５】
前記の単離された核酸例えばこれには限定されないがゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の様々な分析方法は、当該技術分野で公知であり、そして核酸の構成（nucleic acid compositions）が分析され当業者に公知である様々な方法並びにＰＣＲ法例えばリアルタイムＰＣＲ分析、マイクロアレイ分析、ハイブリダイゼーション分析、及び核酸シーケンス分析を含む。例えば、Molecular Cloning (three volume set, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012)及びCurrent Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)参照。
【００７６】
ａ．リアルタイムＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲアッセイの設計のために、いくつかの部分は、多くの場合、アンプリコンと頻繁に呼ばれる、プライマーの２つによって挟まれその後増幅されるＤＮＡ断片を含み、プライマーの２つ及び検出プローブの１つ又は複数が使用されるべきである。
【００７７】
リアルタイムＰＣＲは、配列特異的様式でゲノムのアレルに結合する短いポリヌクレオチド（検出プローブと称する）と結合する蛍光色素の視覚的な放出に依存している。単一ヌクレオチドが異なるリアルタイムＰＣＲプローブは、異なる波長で蛍光を発するプローブの結合及び検出によるリアルタイムＰＣＲアッセイにおいて区別することができる。リアルタイムＰＣＲは、検出用途（診断用途）、定量化用途、及びジェノタイピング用途における使用を見出す。
【００７８】
リアルタイムＰＣＲ実施のための関連するいくつかの方法は、ＴａｑＭａｎプローブ（米国特許第５，２１０，０１５号明細書及び米国特許第５，４８７，９７２号明細書、並びにLee et al., Nucleic Acids Res. 21:3761-6, 1993）、分子ビーコンプローブ（molecular beacon probes）（米国特許第５，９２５，５１７号明細書及び米国特許第６，１０３，４７６号明細書、並びにTyagi and Kramer, Nat. Biotechnol. 14:303-8, 1996）、自己プローブ化アンプリコン（self-probing amplicons）（ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ）（米国特許第６，３２６，１４５号明細書、及びWhitcombe et al., Nat. Biotechnol. 17:804-7, 1999）、Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ（Chen et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:4210-6, 1998）、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（米国特許第６，１１７，６３５号明細書、及びNazarenko et al., Nucleic Acids Res. 25:2516-21, 1997）、置換ハイブリダイゼーションプローブ（displacement hybridization probes）（Li et al., Nucleic Acids Res. 30:E5, 2002）、ＤｚｙＮＡ−ＰＣＲ（Todd et al., Clin. Chem. 46:625-30, 2000）、蛍光制限酵素検出（fluorescent restriction enzyme detection）（Cairns et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 318:684-90, 2004）、並びに近接ハイブリダイゼーションプローブ（adjacent hybridization probes）（米国特許第６，１７４，６７０号明細書、及びWittwer et al., Biotechniques 22:130- 1, 134-8, 1997）に依存するアッセイを含むものが、当該技術分野において公知である。
【００７９】
いくつかの例では、リアルタイムＰＣＲは、例えばＳＮＰを含むがこれに限定されるものではない遺伝子変異の様々な検出をもたらすことができる。いくつかの実施態様では、特定の遺伝子候補（gene candidates）におけるＳＮＰの検出は、繋留消光部分（tethered quenching moiety）を使用することによる蛍光分子の分子内消光の使用に基づいて、リアルタイムＰＣＲを用いて行われる。したがって、例示的な実施態様によれば、リアルタイムＰＣＲ法はまた、分子ビーコン技術の使用を含む。分子ビーコン技術は、関心のあるＤＮＡ標的に結合することによってその蛍光を復元される内部消光蛍光体を用いたヘアピン状分子を利用する（例えば、Kramer, R. et al. Nat. Biotechnol. 14:303-308, 1996参照）。いくつかの実施態様では、蓄積しているＰＣＲ産物に対する分子ビーコンプローブの増加された結合は、ゲノムＤＮＡにおけるＳＮＰの存在を特異的に検出するために使用される。
【００８０】
多くの適切なジェノタイピング手順の１つは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アレル識別アッセイである。このアッセイのいくつかの例では、プローブの５’末端で蛍光レポーター色素によりそしてプローブの３’末端でクエンチャーダイ（quencher dye）により標識されるオリゴヌクレオチドプローブが利用される。インタクトプローブ（intact probe）に対するクエンチャーの近接は、レポーター用の低い蛍光を維持する。ＰＣＲ反応の間、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性がプローブを切断し、そして色素とクエンチャーとを分離する。これは、レポーターの蛍光の増加をもたらす。ＰＣＲ産物の蓄積は、レポーター色素の蛍光の増加を監視することにより直接的に検出される。プローブが標的にハイブリダイズしそしてＰＣＲの間に増幅されている場合にのみ、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性が、レポーターとクエンチャーとの間でプローブを切断する。プローブは、標的ＳＮＰ位置にまたがり（straddle）、特定のＳＮＰアレルが存在する場合にのみ核酸分子にハイブリダイズするように設計されている。
【００８１】
例として、ＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４に位置するアベリノ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰを増幅するために、米国特許出願番号２０１２／００７７２００号に記載されているように、フォワード及びリバースのＰＣＲプライマー対が設計された（図２のＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１〜２４）。いくつかの実施態様では、その中に開示されているフォワード及びリバースプライマー対のいずれかが、本明細書で開示されている改良された方法で使用されている。好ましい実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ (フォワード)及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２(リバース)のプライマー対が、本明細書で開示されている改良された方法で使用される。
【００８２】
ＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４におけるグアニンからアデニンへの変異を検出するために、米国特許出願番号２０１２／００７７２００号に記載されているように、図３に示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：２５〜４２によるヌクレオチド配列を有する、野生型（「Ｇ」）及びアベリノ角膜ジストロフィー関連変異（「Ａ」）検出用に蛍光標識されたリアルタイムＰＣＲプローブ対が設計された。いくつかの実施態様では、野生型及び変異型プローブのいずれかが、本明細書中に開示される改良された方法において使用される。好ましい実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：２５（野生型）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：２６（変異体）の野生型及び変異体プローブ対が、本明細書で提供される改善された方法において使用される。疾患関連アレルから野生型アレルを識別するために、野生型プローブはＶＩＣで標識し、そして変異型プローブはＦＡＭで標識した。相補的な遺伝子断片への結合を促進するようにマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）をプローブに結合した。
【００８３】
ｂ．リアルタイムＰＣＲサイクル
リアルタイムＰＣＲ法は、増幅のための方法の一部として、様々な工程又はサイクルを含む。これらのサイクルは、二本鎖核酸を変性させる工程、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び標的ゲノムＤＮＡ配列の検出プローブをアニーリングする工程、そしてアニーリングされたフォワードプライマー及びリバースプライマーから第二鎖ＤＮＡを合成（すなわち、複製）する工程を含む。この３段階のプロセスは、本明細書ではサイクルと称する。
【００８４】
いくつかの実施態様では、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０サイクルが採用される。いくつかの実施態様では、約１０〜約６０サイクル、約２０〜約５０サイクル、又は約３０〜約４０サイクルが採用される。いくつかの実施態様では、４０サイクルが採用される。
【００８５】
いくつかの実施態様では、二本鎖核酸の変性工程は、約１秒〜約５秒、約２秒〜約５秒、又は約３秒〜約４秒の間、約８０℃〜１００℃、約８５℃〜約９９℃、約９０℃〜約９５℃の温度で生じる。いくつかの実施態様では、二本鎖核酸の変性工程は、約３秒の間、９５℃の温度で生じる。
【００８６】
いくつかの実施態様では、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び標的ゲノムＤＮＡ配列の検出プローブをアニーリングする工程は、約１５秒〜約４５秒、約２０秒〜約４０秒、約２５秒〜約３５秒の間、約４０℃〜約８０℃、約５０℃〜約７０℃、約５５℃〜約６５℃で生じる。いくつかの実施態様では、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び標的ゲノムＤＮＡ配列の検出プローブをアニーリングする工程は、約３０秒の間、約６０℃で生じる。
【００８７】
いくつかの実施態様では、アニーリングされたフォワードプライマー及びリバースプライマーから第二鎖ＤＮＡを合成（すなわち、複製）する工程は、約１５秒〜約４５秒、約２０秒〜約４０秒、約２５秒〜約３５秒の間、約４０℃〜約８０℃、約５０℃〜約７０℃、約５５℃〜約６５℃で生じる。いくつかの実施態様では、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び標的ゲノムＤＮＡ配列の検出プローブをアニーリングする工程は、約３０秒の間、約６０℃で生じる。
【００８８】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載される方法に従って調製したゲノムＤＮＡサンプルの約１μＬ、約２μＬ、約３μＬ、約４μＬ、又は約５μＬが、３０Ｘ、３５Ｘ、４０Ｘ、４５Ｘ、５０Ｘ、又は１００ＸのリアルタイムＰＣＲマスターミックスの、約０．０５μＬ、約０．１０μＬ、約０．１５μＬ、約０．２０μＬ、又は約０．２５μＬ以下と組み合わされることが見出された。いくつかの実施態様では、上記のように調製されたゲノムＤＮＡサンプル２μＬが、４０Ｘのカスタムジェノタイピングアッセイのわずか０．１５μＬと組み合わされることが見出された。
【００８９】
例示的な反応が本明細書に記載されているが、当業者は、プローブの設計に基づいて、温度と時間を変更する方法を理解するであろう。また、本方法は、前記の時間及び温度の任意の組み合わせを意図する。
【００９０】
ｃ．ＰＣＲプライマー及びプライマー設計
いくつかの実施態様において、プライマーは、実験室の設定において試験されそして設計される。いくつかの実施態様において、プライマーは、インシリコ方法（in silico methods）に基づいて、コンピュータによって設計される。プライマー配列は、アンプリコン又は増幅される標的核酸配列の配列に基づいている。より短いアンプリコンは、典型的には、より長いアンプリコンと比較して、より効率的に複製しそしてより効率的な増幅につながる。
【００９１】
プライマーの設計において、当業者は、二次構造の考慮事項と同様に設計されるプライマーのＧＣ及びＡＴ含量に基づき（増加されたＧＣ含量は、二次構造の増加をもたらす可能性がある）、融解温度（melting temperature）（Ｔｍ；プライマー標的二重鎖の半分が解離しそして一本鎖になるとされ、そして二本鎖の安定性の指標となる温度；Ｔｍの増加は安定性の増加を示す）を考慮に入れる必要があることを理解するであろう。ＴＭは、当該技術分野において公知の様々な方法を用いて計算されそして当業者は前記の様々なＴＭの計算方法を容易に理解するであろう；前記方法は例えばこれには限定されないが、promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htmでワールドワイドウェブで使用可能なＴＭ計算機のようなオンラインで使用可能なものが含まれる。プライマーの特異性は、Ｔａｑポリメラーゼにより伸長する部分である３’末端配列と組み合わせたその完全な配列によって定義される。いくつかの実施態様では、３’末端は、誤った増幅産物の偽プライミング（false-priming）及び生成を軽減するために、標的配列のどこにも見られない、固有のヌクレオチド少なくとも５〜７個を有していなければならない。フォワード及びリバースプライマーは、典型的には、同様の効率で標的と結合する。いくつかの例では、ツール例えばＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（ncbi.nlm.nih.govのワールドワイドウェブ上に位置する）がアラインメントを実行するためにに使用され、プライマー設計を支援する。
【００９２】
当業者は、標的核酸配列についてのプライマー設計についての基本、並びに前記の方法に対して広範な教示を持つ様々なリファレンスマニュアル及びテキスト、例えば、Molecular Cloning (three volume set, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012)及びCurrent Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)及びReal-time PCR in Microbiology: From Diagnostics to Characterization (Ian M. MacKay, Calster Academic Press; 2007); primerdigital.com/tools/PrimerAnalyser.htmlのワールドワイドウェブ上で使用可能なプライマーアナライザーＪａｖａツール、及びKalendar R, et al. (Genomics, 98(2): 137-144 (2011))を十分に承知しており、これらの全てが全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００９３】
プライマー設計の追加の観点は、プライマーの複雑性（primer complexity）又は言語的配列複雑性（linguistic sequence complexity）である（Kalendar R, et al. (Genomics, 98(2): 137-144 (2011)参照）。多大な言語的配列複雑性を有しているプライマー（例えばヌクレオチドの配列及び組成）は、典型的にはより有効である。いくつかの実施態様では、言語的配列複雑性の計算方法は、単純反復配列（simple sequence repeats）、不完全直接又は逆方向反復（imperfect direct or inverted repeats）、ポリプリン及びポリピリミジン三本鎖ｃＤＮＡ構造（triple-stranded cDNA structures）、及び四本鎖構造（four-stranded structures）（例えば、Ｇ四重鎖）を含む低複雑領域の検出のために、比較配列間の保存領域を探索するために使用される。いくつかの実施態様では、言語的複雑性（ＬＣ）測定は、アルファベットキャパシティーＬ−グラム法（alphabet-capacity L-gram method）（A. Gabrielian, A. Bolshoy, Computer & Chemistry 23:263-274 (1999)及びY.L. Orlov, V.N. Potapov, Complexity: an internet resource for analysis of DNA sequence complexity, Nucleic Acids Res. 32: W628-W633(2004)参照）を用いて全長配列に沿って実施され、配列の長さについての期待された値の合計（Ｅ）により除算された、配列における１〜Ｌの大きさの言葉（ｗｏｒｄ）の観察された範囲（ｘｉ）の合計として計算される。いくつかのＧリッチ（及びＣリッチ）核酸配列は、Ｇカルテットのスタックを含有する四本鎖ＤＮＡ構造に折り畳まれる（quadruplex.orgでのワールドワイドウェブ参照）。いくつかの例では、これらの四重鎖は、ＤＮＡ分子２個又は４個の分子間集合、Ｇ塩基２つを含む配列の二量体化により、又はグアニンの４ブロックを含む一本鎖分子間の折り畳みにより形成される（P.S. Ho, PNAS, 91:9549-9553 (1994); I.A. Il'icheva, V.L. Florent'ev, Russian Journal of Molecular Biology 26:512-531(1992); D. Sen, W. Gilbert, Methods Enzymol. 211:191-199 (1992); P.A. Rachwal, K.R. Fox, Methods 43:291-301  (2007); S. Burge, G.N. Parkinson, P. Hazel, A.K. Todd, K. Neidle, Nucleic Acids Res. 34:5402-5415  (2006); A. Guedin, J. Gros, P. Alberti, J. Mergny, Nucleic Acids Res. 38:7858-7868 (2010); O. Stegle, L. Payet, J.L. Mergny, D.J. MacKay, J.H. Leon, Bioinformatics 25:i374-i382  (2009)参照。いくつかの例では、これらは、それらの低言語的複雑性のためにプライマー設計から排除される、（ＴＴＡＧＧＧ）４についてＬＣ＝３２％。）。
【００９４】
これらの方法は、ＣＧ含量及び融解温度に関する、ＧＣスキュー（GC skew）、（Ｇ−Ｃ）／（Ｇ＋Ｃ）、ＡＴスキュー、（Ａ−Ｔ）／（Ａ＋Ｔ）、ＣＧ−ＡＴスキュー、（Ｓ−Ｗ）／（Ｓ＋Ｗ）、又はプリン−ピリミジン（Ｒ−Ｙ）／（Ｒ＋Ｙ）スキューを有する配列におけるパターン分析用の様々なバイオインフォマティクスツールを含み、そして言語的配列複雑性プロファイルを決定するためのツールを提供する。例えば、ｎ塩基（ｎは正の整数である）のスライディングウィンドウにおけるＧＣスキューは、ウインドウにおける全配列についての、Ｇがグアニンの総数でありＣがシトシンの総数である式（Ｇ−Ｃ）／（Ｇ＋Ｃ）に従って、１塩基のステップを用いて計算される（Y. Benita, et al., Nucleic Acids Res. 31:e99 (2003)）。負のＧＣ−スキュー値はＣ塩基の過剰を示すのに対し、正のＧＣ−スキュー値は、Ｇ塩基の過剰を示した。同様に、他のスキューが順次算出される。前記の及び他の方法は、いくつかの実施態様では、プライマーの複雑性を決定するために使用される。
【００９５】
非限定的な例の実施態様によれば、リアルタイムＰＣＲは、エキソヌクレアーゼプライマー（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）を用いて実施される。前記の実施態様では、プライマーは、熱安定性ポリメラーゼ例えばＴａｑのエキソヌクレアーゼ活性を利用して、増幅反応中に存在する二重標識プローブを切断する（例えばWittwer, C. et al. Biotechniques 22:130-138, 1997参照）。ＰＣＲ産物と相補的である一方で、このアッセイで使用されたプライマープローブは、ＰＣＲプライマーとは異なり、そして蛍光可能な分子と蛍光を消光することができる分子との両方で二重標識されている。プローブがインタクトである場合、ＤＮＡプローブ内の蛍光シグナルの分子内消光が少ないシグナルをもたらす。蛍光分子が増幅中にＴａｑのエキソヌクレアーゼ活性によって遊離されると、消光が大幅に減少しそして蛍光シグナルの増加をもたらす。非限定的な例として、蛍光プローブは、６−カルボキシ−蛍光部分などが挙げられる。代表的なクエンチャーは、ブラックホールクエンチャー１部分（Black Hole Quencher 1 moiety）などが挙げられる。
【００９６】
様々なＰＣＲプライマーが、本発明の方法における使用を見出すことができる。例示的なプライマーは、本明細書に記載したものを含むがこれらに限定されない。開示された方法における使用のためのプライマーはまた、米国特許出願２０１２００７７２００号において見出され、この出願は全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施態様では、本発明の方法において使用されるためのＰＣＲプライマーは、これに限定されるものではないが、以下の表１のリストを含み、そしてＴＧＦＢＩ遺伝子の検出における使用を見出す。表２及び３は、primerdigital.com/tools/PrimerAnalyser.htmlでのワールドワイドウェブを使用して掲載されたような、各々のプライマーのための生物物理学的パラメータを提供する。
【表１】
0006412101.tif 000002
【表２】
0006412101.tif 000003
【表３】
0006412101.tif 000004
【００９７】
いくつかの実施態様において、開示された方法で使用するためのリアルタイムＰＣＲプライマーは、言語的配列複雑性の少なくとも７０％、少なくとも７２％、少なくとも７５％、少なくとも７７％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％を有する。
【００９８】
ｄ．検出プローブ設計及び検出プローブ
様々な検出プローブが開示された発明と一緒の使用を見出すことができそしてジェノタイピング及び／又は定量化のために用いられる。当業者に一般的に採用される検出プロ―ブは、加水分解プローブ（Ｔａｑ−Ｍａｎプローブ、５’ヌクレアーゼプローブ、又は二重標識プローブとしても公知である）、ハイブリダイゼーションプローブ、及びスコーピオンプライマー、（プライマーを組み合わせそして検出プローブは１つの分子内にある）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、検出プローブの設計は、プローブが用いられたＰＣＲプライマーと互換性があるように、所望のプローブの標的に基づいて当業者によって決定される（例えば、プライマー及びプローブは、リアルタイムＰＣＲアッセイにおいてお互いの機能を妨害してはならない）。いくつかの実施態様では、プローブは、効果的なシグナルの生成を促進するために、プライマーよりも高いＴｍを有するように設計される。Ｔｍは、当該技術分野で公知の様々な方法のいずれかを使用して計算され、当業者はＴｍを計算するための様々な方法を容易に理解するであろう；前記の方法には、オンラインツールで使用可能なもの例えば、promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm.でのワールドワイドウェブで使用可能な計算機が含まれる。いくつかの実施態様では、検出プローブの増加したＴｍは、プライマーがポリメラーゼによって伸長される前に検出プローブが結合していることを提供する。
【００９９】
いくつかの実施態様において、検出プローブは、様々な修飾を含む。いくつかの実施態様では、検出プローブには核酸残基の修飾、例えば２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド修飾、ホスホロチオエート骨格修飾、ホスホロジチオエート骨格修飾、ホスホロアミデート骨格修飾、メチルホスホネート骨格修飾、３’末端リン酸修飾、及び３’アルキル置換が含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】
いくつかの実施態様では、検出プローブは、修飾のために、標的配列に対する増加した親和性を有する。前記の検出プローブは、化学修飾を含む検出プローブと同様に、長さが増加した検出プローブを含む。前記の修飾は、２’−フルオロ（２’−デオキシ−２’−フルオロ−ヌクレオシド）修飾、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＺＮＡ（ジッパー核酸）、モルホリノ、メチルホスホネート、ホスホロアミド酸、ポリカチオン複合体、及び２’−ピレン修飾を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施態様において、検出プローブは、２’フルオロ修飾（別名、２’−デオキシ−２’−フルオロ−ヌクレオシド）、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＺＮＡ（ジッパー核酸）、モルホリノ、メチルホスホネート、ホスホロアミド酸、及び／又はポリカチオン複合体を含む修飾の１つ又はそれ以上を含む。
【０１０１】
いくつかの実施態様において、検出プローブは、検出可能な部分、例えば当業者に公知の任意の検出可能な部分と本明細書で記載したものとを含む。前記の検出可能な部分は、例えば蛍光標識及び化学発光標識を含むがこれらに限定されない。前記の検出可能な部分の例としてはまた、ＦＲＥＴ対の群を含むことができる。いくつかの実施態様において、検出プローブは、検出可能な実体（detectable entity）を含んでいる。
【０１０２】
蛍光標識の例としては、ＡＭＣＡ、ＤＥＡＣ（７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸）、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン−３；ＭＣＡ（７−メトキシクマリン−４−酢酸）；７−メトキシクマリン−３；ＡＭＦ（４’−（アミノメチル）フルオレセイン）； ５−ＤＴＡＦ（５−（４，６−ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン）；６−ＤＴＡＦ（６−（４，６−ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン）；６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、５（６）−ＦＡＭカダベリン；５−ＦＡＭカダベリン；５（６）−ＦＡＭエチレンジアミン；５−ＦＡＭエチレンジアミン；５−ＦＩＴＣ（ＦＩＴＣ異性体Ｉ；フルオレセイン−５−イソチオシアネート）；５−ＦＩＴＣカダベリン；フルオレセイン−５−マレイミド；５−ＩＡＦ（５−ヨードアセトアミドフルオレセイン）；６−ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ―２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）；５−ＣＲｌ １０−（５−カルボキシローダミン１１０）；６−ＣＲｌ １０−（６−カルボキシローダミン１１０）；５−ＣＲ６Ｇ（５−カルボキシローダミン６Ｇ）；６−ＣＲ６Ｇ（６−カルボキシローダミン６Ｇ）；５（６）−カルボキシローダミン６Ｇカダベリン；５（６）−カルボキシローダミン６Ｇエチレンジアミン；５−ＲＯＸ（５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）；６−ＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）；５−ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）；６−ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）；５−ＴＡＭＲＡカダベリン；６−ＴＡＭＲＡカダベリン；５−ＴＡＭＲＡエチレンジアミン；６−ＴＡＭＲＡエチレンジアミン；５−ＴＭＲ Ｃ６マレイミド；６−ＴＭＲ Ｃ６マレイミド；ＴＲ Ｃ２マレイミド；ＴＲカダベリン；５−ＴＲＩＴＣ；Ｇ異性体（テトラメチルローダミン−５−イソチオシアネート）；６−ＴＲＩＴＣ；Ｒ異性体（テトラメチルローダミン−６−イソチオシアネート）；ダンシルカダベリン（５−ジメチルアミノナフタレン−１−（Ｎ−（５−アミノペンチル））スルホンアミド）；ＥＤＡＮＳ Ｃ２マレイミド；フルオレスカミン（fluorescamine）；ＮＢＤ；及びピロメテン（pyrromethene）並びにそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
化学発光標識の例は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（例えば全体が参照として本明細書に組み込まれるSambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (3rd ed.) (2001)参照）と共に用いられる標識を含むが、これらに限定されない。例としては、−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）；アクリジニウムエステル、及びアダマンチル安定化１，２−ジオキセタン並びにそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
プローブの標識は、当該技術分野で公知である。標識プローブは、増幅中に増幅された領域内でハイブリダイズするために使用される。プローブは修飾され、増幅用プライマーとして作用することから回避する。検出プローブは蛍光色素の２つを用いて標識され、１つは、他の色素の蛍光を消光することができるものである。色素の１つがプローブの５’末端に結合され、そして他方は、内部部位に結合されており、プローブは、非ハイブリダイズ状態（non-hybridized state）にあるときに消光が起こる。
【０１０５】
典型的には、リアルタイムＰＣＲプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関与している染料の対（レポーター色素とアクセプター色素）から成り、それによってアクセプター色素は、レポーター色素の発光を消光する。一般に、蛍光標識したプローブはアンプリコン定量の特異性を高める。
【０１０６】
開示された方法のいくつかの実施態様において使用されるリアルタイムＰＣＲはまた、本開示を考慮して、当業者によって決定されるように、ハイブリダイゼーションプローブ（すなわち、検出プローブ）の１つ以上の使用を含む。非限定的な例として、前記のハイブリダイゼーションプローブとしては、記載された方法において提供されたものの１つ又はそれ以上が含まれるが、これには限定されない。例示的プローブ例えばＨＥＸチャネル（HEX channel）及び／又はＦＡＭチャネル（FAM channel）プローブは、当業者により理解される。
【０１０７】
例示的な実施態様によれば、検出プローブ及びプライマーは、好都合には、例えばプライマー設計ソフトウェアを用いたインシリコ分析、並びにＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）に寄託された遺伝子及びゲノムの利用可能なヌクレオチドデータベースに対する相互参照を使用して選択される。いくつかの追加的なガイドラインが、いくつかの実施態様において、プライマー及び／又はプローブの選択のために使用されることができる。例えば、いくつかの実施態様において、プライマー及びプローブは、それらが互いに近くにあるものの重複しないように選択される。いくつかの実施態様において、プライマーは、同じ（又は近いＴＭ）（例えば、約５８℃〜約６０℃）を有することができる。いくつかの実施態様では、プローブのＴＭは、プライマーのＴＭのために選択されたものよりも約１０℃高い。いくつかの実施態様では、プローブ及びプライマーの長さは、約１７〜３９塩基対などであるように選択される。これら及び他のガイドラインは、適切なプライマー及び／又はプローブを選択する際に、いくつかの場合において当業者により使用されている。
【０１０８】
本発明の方法において使用するためのプローブとしては、以下の表４に示す例示的なプローブが含まれるが、これらに限定されない。
【表４】
0006412101.tif 000005
【０１０９】
ＶＩＩ．診断テスト
いくつかの実施態様において、診断テストは、様々な変異の検出により遺伝的条件の１つ又はそれ以上を決定するために使用される。いくつかの実施態様において、診断テストは、特定の条件が、例えば物理的な症状、徴候及び／又は症状、並びに家族歴情報に基づいて疑われる場合に、診断を確定するために使用される。いくつかの実施態様では、診断テストの結果は、任意の患者に対する適切な治療計画の決定において医学分野の当業者を支援し、そしてより個人化されさらにより効果的な治療計画を可能にする。いくつかの実施態様において、治療計画は、当業者によって決定されるような、様々な薬剤治療、外科的治療、ライフスタイルの変化、又はそれらの組み合わせのいずれかを含む。
【０１１０】
開示された方法により得られた核酸は、変異、例えば欠失、挿入、トランスバージョン及びトランジションを検出するためのテストを含む様々な診断テストに有用である。いくつかの実施態様では、前記の診断は、発現されるべき病気のために２コピーを必要とする病気について遺伝子の１コピーを保有する影響を受けていない個体を同定するのに有用であり、遺伝子の１コピーを保有する影響を受けていない個体の同定における情報は、治療計画、着床前遺伝子診断、出生前診断検査、新生児スクリーニング、家系ＤＮＡテスト（遺伝的系譜目的）、成人発症型障害例えばハンチントン病予測用の前駆症状テスト、成人発症型がん及びアルツハイマー病発症リスク推定用前駆症状テスト、症候性個体の確定診断（confirmational diagnosis of a symptomatic individual）、及び／又は法医学/同一性試験の開発における使用を見出すことができる。いくつかの実施態様では、本方法は、角膜ジストロフィーの検出における例えばＴＧＦＢＩ遺伝子のＲ１２４変異（例えばＣ（Ｇ／Ａ）Ｃ ＳＮＰとも称される、ＴＧＦＢＩ遺伝子の第４１８塩基のＧからＡへのトランジションにより生じるＲ１２４Ｈ変異）をもたらすものなどのアベリノ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰの検出を介した使用を見出す。
【０１１１】
いくつかの実施態様では、新生児スクリーニングは、遺伝的障害を識別するためにのみ使用される任意の出生後遺伝子スクリーニングを含む。いくつかの実施態様では、新生児スクリーニングは、遺伝的疾患の識別における使用を見出し、治療計画が人生の早い段階で決定される。前記のテストとしては、フェニルケトン尿症（phenylketonuria）及び先天性甲状腺機能低下症（congenital hypothyroidism）のために幼児をテストすることが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
いくつかの実施態様では、保因者テスト（carrier testing）は、遺伝子変異の単一のコピーを保有する人の識別用に使用される。いくつかのケースでは、コピー２つが存在する場合に、変異は遺伝的障害を引き起こす可能性がある。いくつかのケースでは、コピー１つが遺伝病を引き起こすのに十分である。いくつかのケースでは、コピー２つの存在が、特定の治療計画について例えばアベリノ突然変異の存在下で及び外科的処置実行前のスクリーニングで禁忌とされており（contra-indicated）、任意の患者のために追及する適切な治療計画を保証する。いくつかの実施態様では、前記の情報はまた、個々の生殖力検討（contemplating procreation）のために有用でありそして個々の患者に重要なアドバイスを提供する医学分野の当業者を支援するのと同様に個人の詳細な情報を得たうえでの決断（informed decision）を支援する。
【０１１３】
いくつかの実施態様では、テストの予測の及び前駆症状の種類は、様々な障害に関連する遺伝的変異を検出するために使用される。いくつかのケースでは、これらのテストは、遺伝性疾患を持つ家族を有するがテスト時には障害のない特徴を示す可能性がある人に有用である。いくつかの実施態様では、予測テストは、例えば特定の種類のがんを含むがこれには限定されない遺伝的背景を有する障害の発症の機会を増加させる変異を同定する。いくつかの実施態様では、発症前検査は、任意の物理的な徴候や症状が現れる前に、人が、遺伝性疾患を発症するかどうかを決定するのに有用である。予測及び発症前検査テストの結果は、特定の障害を発症する人のリスクに関する情報を提供し、適切な医療処置計画に関する意思決定を行う助けとなる。いくつかの実施態様では、予測テストはまた、アベリノ角膜ジストロフィー存在下での禁忌であるレーザ眼科手術、例えば屈折矯正手術（例えば、ＬＡＳＩＫ、ＬＡＳＥＫ、ＰＴＫ、及びＰＲＫ）の実施のような特定の治療計画において禁忌となる変異を検出するために使用される。例えば、アベリノ角膜ジストロフィーを示す患者は、レーザ眼科手術（例えば、ＬＡＳＩＫ、ＬＡＳＥＫ、ＰＴＫ、及びＰＲＫ）を受けるべきではない。
【０１１４】
いくつかの実施態様において、診断テストはまた、薬物応答における遺伝的変異の影響を決定する遺伝子テストを含む薬理ゲノミクスを含む。前記の薬理ゲノミクス分析からの情報は、適切な治療計画の決定及び開発における使用が見出される。医学分野の当業者は、適切な治療計画を設計する際の遺伝子変異の存在及び／又は不存在に関する情報を使用する。
【０１１５】
いくつかの実施態様において、その遺伝子プロファイルが本発明の方法を用いて決定される疾患は、角膜ジストロフィー、がん、糖尿病（diabetes mellitus）、高血圧症、統合失調症、並びに最も一般的な先天性奇形、例えば口唇裂（cleft lip）、口蓋裂（cleft palate）、神経管欠陥（neural tube defects）、軟骨無形成症（Achondroplasia）、α−１アンチトリプシン欠損症（Alpha-1 Antitrypsin Deficiency）、抗リン脂質症候群（Antiphospholipid Syndrome）、自閉症、常染色体優性多発性嚢胞腎病（Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease）、シャルコー・マリー・トゥース（Charcot-Marie-Tooth）、大腸癌、猫鳴き症候群（Cri du chat）、クローン病、嚢胞性線維症（Cystic fibrosis）、有痛脂肪症（Dercum Disease）、ダウン症、デュアン症候群（Duane Syndrome）、デュシェンヌ筋ジストロフィー（Duchenne Muscular Dystrophy）、第Ｖ因子ライデン血栓形成（Factor V Leiden Thrombophilia）、家族性高コレステロール血症（Familial Hypercholesterolemia）、家族性地中海熱（Familial Mediterranean Fever）、脆弱Ｘ症候群（Fragile X Syndrome）、ゴーシェ病（Gaucher Disease）、ヘモクロマトーシス（Hemochromatosis）、血友病（Hemophilia）、全前脳症（Holoprosencephaly）、ハンチントン病、クラインフェルター症候群（Klinefelter syndrome）、マルファン症候群（Marfan syndrome）、筋緊張性ジストロフィー（Myotonic Dystrophy）、神経線維腫症（Neurofibromatosis）、ヌーナン症候群（Noonan Syndrome）、骨形成不全症（Osteogenesis imperfecta）、パーキンソン病（Parkinson's disease）、フェニルケトン尿症、ポーランド異常（Poland Anomaly）、ポルフィリン症（Porphyria）、早老症（Progeria）、網膜色素変性症（Retinitis Pigmentosa）、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）（Severe Combined Immunodeficiency）、鎌状赤血球症（Sickle cell disease）、脊髄性筋萎縮症（Spinal Muscular Atrophy）、テイ・サックス（Tay-Sachs）、サラセミア（Thalassemia）、トリメチルアミン尿症（Trimethylaminuria）、ターナー症候群（Turner Syndrome）、口蓋心顔面症候群（Velocardiofacial）、ＷＡＧＲ症候群（WAGR Syndrome）、ウィルソン病（Wilson Disease）、並びに遺伝的要素を有するその他の疾患が含まれるがこれらに限定されない。角膜ジストロフィーとしては、アベリノ角膜ジストロフィー、課粒状角膜ジストロフィー（タイプ２）、ティール−ベンケ角膜ジストロフィー、格子状角膜ジストロフィー、及びレイス・バックラー角膜ジストロフィーが含まれるが、これらに限定されない。がんとしては、癌腫、肉腫、芽細胞腫、リンパ腫、白血病、及び生殖細胞腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、がんとしては、頭頸部、皮膚、結腸、経口、神経膠芽腫、胸部、喉頭、食道、内皮細胞、子宮内膜、卵巣、肺、泌尿生殖器、直腸、前立腺、腎臓、黒色腫、腎臓、膵臓、消化管、血液、肝臓、子宮、脳、及びウイルス誘導性のがん例えばパピローマウイルス誘発性のものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１６】
いくつかの実施態様では、本方法は、個人の遺伝子プロファイルの決定に使用されたゲノムＤＮＡを提供することにより、個別化医療処置計画の開発における使用を見出す。いくつかの実施態様では、前記の遺伝子プロファイル情報は、治療計画を開発及び／又は決定するために当業者によって使用される。いくつかの実施態様において、記載された方法により単離された核酸において同定された様々な遺伝的変異及び変異の存在及び／又は不存在は、個別化医療処置計画又は計画の一部として、当業者によって使用される。例えば、いくつかの実施態様では、開示された方法を用いた情報は、データベース又は他の確立された情報と比較され、特定の疾患の診断を決定する及び／又は治療計画を決定する。いくつかのケースでは、特定の患者における遺伝子変異の有無に関する情報は、データベース又は他の権威ある情報源と比較され、提案された治療計画に対する決定をする。いくつかの場合において、遺伝子変異の存在は、特定の治療計画を追求することを示す。いくつかのケースでは、遺伝子変異の不存在は、特定の治療計画を追求しないことを示す。
【０１１７】
いくつかの実施態様では、特定の遺伝子変異の存在及び／又は不存在に関する情報は、治療的実体での治療の治療効果を決定するため、並びに治療的実体での治療のための治療計画を調整するために使用される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び／又は不存在に関する情報は、治療計画を追求するかどうかを決定するために使用される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び／又は不存在に関する情報は、治療計画を継続するか否かを決定するために使用される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び／又は不存在は、治療計画を中止するかどうかを決定するために使用される。他の実施態様では、遺伝子変異の存在及び／又は不存在は、治療計画を変更するかどうかを決定するために使用される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び／又は不存在は、治療計画の一部として投与される治療の投薬量を増加又は減少させるかどうかを決定するために使用される。他の実施態様では、遺伝子変異の存在及び／又は不存在は、治療計画の一部として投与される治療の投与頻度を変更するかどうかを決定するために使用される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び／又は不存在は、一日当たりの、週当たりの投薬数、治療の一日当たりの回数を変更するかどうかを決定するために使用される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び／又は不存在は、治療の投薬量を変更するかどうかを決定するために使用される。いくつかの実施態様において、遺伝子変異の存在及び／又は不存在は、治療計画を開始する前及び／又は治療計画を開始した後に決定される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び／又は不存在は、遺伝子変異の有無に関する所定の基準情報と比較されそして決定される。
【０１１８】
いくつかの実施態様では、遺伝子変異の１つ又はそれ以上の存在及び／又は不存在の複合体（composite）は、開示された方法を用いて生成され、前記の複合体は、複数の遺伝子変異の存在及び／又は不存在に関する情報の任意の集合を含む。いくつかの実施態様において、遺伝子変異の２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、又は４０以上の存在及び／又は不存在が検査され、複合体の生成に使用される。いくつかの実施態様における例示的な情報は、核酸及び／又はタンパク質の遺伝子変異の両方に関する組み合わせの、又は核酸若しくはタンパク質の情報が含まれる。一般に、複合体は、遺伝子変異の存在及び／又は不存在に関する情報を含む。いくつかの実施態様では、前記の複合材料は、所定の基準情報と比較されそして治療計画が、追求、維持、又は中止される。
【０１１９】
ＶＩＩＩ．実施例
実施例１：少ないＤＮＡ量を用いてシグナルを改善するためのリアルタイムＰＣＲ条件
少量の分離されたゲノムＤＮＡ及びＰＣＲ試薬を用いる場合に改善されたシグナルを提供したリアルタイムＰＣＲ条件を確認するために、行われた変性時間及びリアルタイムＰＣＲサイクルの回数を変化させながら実験を行った。簡単に、標準収集慣例に従ってバッカル綿棒で収集したヒト細胞を溶解することによりゲノムサンプルを調製した。前記バッカル綿棒を溶解溶液内で簡単に回転させ（例えば、約３０秒間）、後の再使用のために凍結させた。前記バッカル綿棒から回収された細胞を含有する溶解溶液を、以後４５℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーションの後、製造者の説明書に従ってＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）磁気ビード−基礎核酸精製（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてゲノムＤＮＡを回収した。バッカル綿棒上に収集された経口上皮細胞からゲノムＤＮＡを回収するために商業的に利用可能なＯｍｅｇａ  Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）ＴｉｓｓｕｅＤＮＡを用いた。Ｏｍｅｇａ  Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡキットは、収集細胞からゲノムＤＮＡを精製するための特殊なバッファシステムを伴うシリカ膜技術を用いる。
【０１２０】
アベリノ角膜ジストロフィーと関連した、ＴＧＦＢＩ遺伝子内のＣ（Ｇ／Ａ）Ｃ一塩基多形（ＳＮＰ）を検出するように設計されたリアルタイムＰＣＲアッセイを、バッカル細胞から単離されたゲノム材料の減少した体積（２μＬ）及び前記ＴＧＦＢＩ遺伝子のアベリノ角膜ジストロフィーＳＮＰ含有領域を増幅するように設計されたフォワード（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びリバース（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）プライマー；及び蛍光的にラベリングされた野生型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）及び突然変異（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）リアルタイムＰＣＲプローブを含有する４０Ｘ濃縮カスタムジェノタイピングアッセイの減少した量（０．１μＬ〜０．２μＬ）を用いて行った。
【０１２１】
ＡＢＩ  ７５００  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）又はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかを用いて、３６〜４０ＰＣＲサイクルでリアルタイムＰＣＲアッセイを行った。各々のサイクルは、３又は５秒の変性時間を含んでいる。図４に示したように、前記反応での４０ＰＣＲサイクルの使用は、さらに少量の出発材料を十分に補償した。際立って、標準５秒ステップよりさらに短い３秒変性時間は、遥かに良くはなくとも、同様に作用した。まとめると、前記結果は、ここで開示された方法がさらに少ない細胞数、減少したレベルのゲノムＤＮＡ、及び減少したリアルタイムＰＣＲ試薬を用いてアベリノ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰの効果的な検出を可能とするということを証明している。
【０１２２】
前記リアルタイムＰＣＲアッセイを変更させることにより、減少した量のゲノム物質（例えば、ＤＮＡ）が使用可能であることが明らかになった。例えば、上述したように調製されたゲノムＤＮＡサンプル２μＬは、単に４０Ｘカスタムジェノタイピングアッセイの約０．１５μＬと組み合わせ可能であることが明らかになった。いくつかの場合には、これは、前記アッセイで行われたＰＣＲサイクルの回数を約４０まで増加させることにより達成された。前記添加的なＰＣＲサイクルを行うために要求される前記増加した時間は、前記ＰＣＲサイクルの変性時間を約３秒に減少させることにより解消された。前記ＰＣＲ反応の変性サイクルは、９５℃で行われる。前記リアルタイムＰＣＲアッセイは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列を有するフォワードＰＣＲプライマー及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列を有するリバースＰＣＲプライマーを用いて行われた。前記アッセイで用いられた野生型検出プローブは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のヌクレオチド配列を有し、前記アッセイで用いられた変異型検出プローブは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６のヌクレオチド配列を有している。
【０１２３】
一塩基多形を検出するための標準手順と比較して、これらの方法は、医学的診断と関連した時間及び費用を減少させた。
【０１２４】
実施例２：安定性研究プロトコル
この安定性研究プロトコルは開発され、試薬安定性及び凍結融解サイクルに対する試験要件を含んでいる。
【０１２５】
Ａｖｅｌｌｉｎｏ  Ｌａｂ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（Ａｖｅｌｌｉｎｏ）で（ＤＮＡ抽出及びリアルタイムＰＣＲ）試験用に用いられた試薬を、製品安定性を確立するために、この安定性研究で試験した。適切な試薬の有効期限は、実施例５−１０に示したような様々な温度条件で安定性試験を通して決定された。
【０１２６】
前記試薬に加えて、商業用のバッカル綿棒サンプル及びバッカル綿棒から抽出されたＤＮＡに対して安定性試験を行った。凍結融解サイクルを有する適切な保管条件に従ってバッカル綿棒及びＤＮＡの安定性及び性能を確立するために実験を行った。
【０１２７】
下記の実施例は、試薬、バッカル綿棒、及びバッカル綿棒から抽出されたＤＮＡの安定性を試験する工程を略述し、実施例５−１０で用いられたプロトコルであった。
【０１２８】
試薬
Ｏｍｅｇａ  Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．ＴｉｓｓｕｅＤＮＡキット、ＴａｑＭａｎジェノタイピングマスターミックス及びカスタムＴａｑＭａｎ  ＳＮＰジェノタイピングアッセイを含む次の試薬を実施例５−１０で用いた。
【０１２９】
サンプル
バッカル綿棒及びバッカル綿棒から抽出されたＤＮＡを含めて次のサンプルを実施例５−１０で検査した。
【０１３０】
実施例５−１０で用いられた用語に対する定義は、下記を含む：
ＲＴ＝１５℃〜３０℃に設定された室温
４℃の冷蔵庫＝２℃〜８℃の温度設定
−２０℃の冷凍庫＝−２５℃〜−１５℃の温度設定
−８０℃の冷凍庫＝−９０℃〜−６５℃の温度設定
バッカル綿棒＝口腔上皮細胞を収集するために用いられた綿棒（例えば、レーヨン、ナイロン、綿等）
抽出されたＤＮＡ＝口腔上皮細胞から抽出されたＤＮＡ
【０１３１】
前記手順は、下記の試薬及びサンプルを用いた。用いられた試薬は、Ｏｍｅｇａ  Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．ＴｉｓｓｕｅＤＮＡキット、ＴａｑＭａｎジェノタイピングマスターミックス及びカスタムＴａｑＭａｎ  ＳＮＰジェノタイピングアッセイを含んでいる。用いられたサンプルは、バッカル綿棒及びバッカル綿棒から抽出されたＤＮＡを含んでいる。択一的に、Ｃｏｐａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．により製造された輸送綿棒（transport swab）も用いられた。
【表５】
0006412101.tif 000006
【０１３２】
手順
安定性試験用のバッカル綿棒及び抽出されたＤＮＡ
結果としての遺伝子型が易感染性になる時の時間及び条件を決定するために、検査サンプルを安定性について試験した。これらの研究を縦断的に行った。
【０１３３】
新たに収集されたドナー綿棒をこの研究に用いた。それぞれの条件に対して、異なるサンプル綿棒３個を試験した。
【０１３４】
前記正確性研究からのＤＮＡを集めた。前記綿棒安定性ＤＮＡサンプルに加えてＮＮ正常遺伝子型ＤＮＡサンプル７０個があった。１プレート当たりウェル２０個を有し、１ウェル当たり１００μＬ  ＤＮＡを有するプレート５個を調製した。
【０１３５】
一つのプレートを４℃の冷蔵庫に貯蔵した。一つのプレートを−２０℃の冷凍庫に貯蔵して凍結させた。全体凍結融解サイクルの回数は８であり、３ヶ月の期間にわたった。プレートの一つを前記−８０℃の冷凍庫に貯蔵して凍結させた。全体凍結融解サイクルの回数は１０であり、１年の期間にわたった。６ヶ月及び１年のデータポイントに対して二つのプレートを−８０℃の冷凍庫に貯蔵して凍結させた。ＤＮＡに対する凍結融解効果を評価するために、前記凍結融解されたプレートと共にこれらのプレートを試験した。
【０１３６】
０日後、下記表で記載された様々な温度にサンプルを貯蔵した。それぞれのサンプルを下記表で表示されたデータ収集日に作動させ、凍結融解サイクルを記録した。
【表６】
0006412101.tif 000007
【表７】
0006412101.tif 000008
【０１３７】
試薬の安定性研究
下記の試薬のそれぞれに対して一つのロットを隔離させた：Ｏｍｅｇａ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡキット、ＴａｑＭａｎジェノタイピングマスターミックス及びカスタムＴａｑＭａｎ  ＳＮＰジェノタイピングアッセイ。
【０１３８】
前記バッカル綿棒及び抽出されたＤＮＡ安定性試験に対して同じ試薬を用いた。
【０１３９】
解釈
各々のアレルのリアルタイムＰＣＲ結果の評価
それぞれのアレルに対する結果は、確立されたサンプル範囲内に属しなければならない。仮に、いかなる結果でも前記サンプル範囲の外側に属したら、前記研究の特定部分を中断し、前記安定性が前記データポイントにより決定される。
【表８】
0006412101.tif 000009
【表９】
0006412101.tif 000010
【０１４０】
実施例３：
この実施例は、実施例５−１０に対して口腔上皮綿棒からのＤＮＡ抽出を行う方法に関する手順を提供する。
【０１４１】
手順
試験手順
前処理。１２．５ｍＬのシリンジを有するリピーターピペットを用いて、ＰＢＳ１．０ｍＬを１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブに添加した。綿棒をＰＢＳ内で回転させ、綿棒を絞って乾燥させた。チューブを１３，０００ＲＰＭで２分間遠心分離させた。遠心分離しながら、前記カラムを標識し、溶出チューブ２セット及び１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブ１セットを調製した。ペレットを確認した。上清をピペットで捨てて、いかなるペレットも失わないように注意した。
【０１４２】
ＤＮＡ抽出。５．０ｍＬのシリンジを有するリピーターピペットを用いて、ＴＬバッファ２００μＬを添加した。再構成されたＯＢプロテアーゼ２５μＬを添加し、ボルテックスして混合した。加熱ブロック内で５６℃（許容可能な温度範囲５０−６０℃）で７分間インキュベーションした。チューブを約３分混合させた。１２．５ｍＬのシリンジを有するリピーターピペットを用いてＢＬバッファ２５０μＬを添加した。１２．５ｍＬのシリンジを有するリピーターピペットを用いてエタノール２５０μＬを添加した。前記チューブをプラスチックホールディングブロック内で１５回反転させた。混合しながら体積を確認した。２５０ＲＰＭ以下で迅速回転させた。チューブからカラムに内容物をピペッティングした。チューブ識別番号が一致するかを確認した。前記カラムを１３，０００ＲＰＭで１分間遠心分離させた。前記収集チューブを捨てて、カラムを新たな２ｍＬの収集チューブ内に挿入した。１２．５ｍＬのシリンジを有するリピーターピペットを用いてＨＢバッファ５００μＬを添加した。１３，０００ＲＰＭで１分間遠心分離させた。前記収集チューブを捨てて、新たな収集チューブ内に挿入した。１２．５ｍＬのシリンジを有するリピーターピペットを用いてＤＮＡ洗浄バッファ７００μＬを添加した。１３，０００ＲＰＭで１分間遠心分離させ、液体を捨てて、同じ収集チューブ内に再び入れた。１２．５ｍＬのシリンジを有するリピーターピペットを用いて二次ＤＮＡ洗浄バッファ７００μＬを添加した。１３，０００ＲＰＭで１分間遠心分離させた。液体を捨てて、チューブを前記収集チューブ内に再び配置した。
【０１４３】
乾燥ステップ。チューブを１３，０００ＲＰＭで２分間遠心分離させた。収集チューブを捨てて、カラムを１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブ内に入れ、キャップを開けておいた。加熱ブロック内で５６℃（許容可能な温度範囲５０−６０℃）で１分間インキュベーションした。前記１分の最後にエタノールが残っているかどうかを決定するために臭いを嗅いだ。必要であれば、さらにインキュベーションした。５ｍＬのシリンジを有するリピーターピペット（Ｄｉａｌ  １）を用いて加熱ブロック内から抜け出るように１００μＬの蒸留水を添加した。キャップを閉じた。５６℃（許容可能な温度範囲５０−６０℃）で２分間インキュベーションした。カラムキャップを閉じて１．５ｍＬの蓋を開けたまま１３，０００ＲＰＭで１分間遠心沈殿した。カラムを捨てて、マイクロ遠心分離チューブ６個のグループを垂直にチューブラック上に水平に配置した。
【０１４４】
ＴＥＣＡＮ  ＮａｎｏＱｕａｎｔ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  ＰＲＯによるＤＮＡ定量。前記溶出液１００μＬを適宜標識された透明な９６−ウェルＵＶプレートにピペッティングする。定量測定値を得るためにＴＥＣＡＮシステムを備えた「Ｍａｇｅｌｌａｎ」プログラムを用いた。前記ＴＥＣＡＮシステムは、商業的に利用可能であった（ｗｗｗ．ｔｅｃａｎ．ｃｏｍ；Ｔｅｃａｎ  Ｔｒａｄｉｎｇ  ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ参照）。
【０１４５】
ＤＮＡ濃度及び純度限界値。濃度及び純度限界値を確立した。正確な結果を得ることができる適切な濃度の範囲は、１ｎｇ／μＬ〜５０ｎｇ／μＬであり、純度の範囲は、０．５５〜２．００である。この限界値の外側に属するいかなるサンプルも前記抽出工程から繰り返される必要がある。
【０１４６】
実施例４：ＰＣＲ手順
この実施例は、実施例５〜１０で用いられたリアルタイムＰＣＲ手順を提供する。これらの実施例は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００／７５００  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳｔｅｐＯｎｅ及びＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステムを用いており、これらは、いずれもＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）から商業的に利用可能である。
【０１４７】
手順
マスターミックス（ＭＭ）調製。１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブ内でＭＭを調製した。Ｔａｑジェノタイピングマスターミックスの特定量を添加した。水の特定量を添加した。Ｐｒｉｍｅｒ（４０Ｘアッセイミックス）の特定量を添加した。フリッキング及び以後の迅速回転により前記ＭＭを混合させた。
【０１４８】
プレート調製。９６−ウェルＰＣＲプレート（適宜標識されている）を支持台上に配置した。自動ピペット又はＲａｉｎｉｎ手動ピペットを用いることによりＭＭ８．０μＬをそれぞれのウェルに添加した。１０μＬの１２チャネルマルチチャネルピペットを用いることによりサンプル２．０μＬを適切なウェルに添加した。適切なコントロールを添加した。これらが混合及び遠心沈殿されたことを確認した。正常（ＮＮ）→陰性（ＮＴＣ）→ヘテロ接合（ＨＮ）→ホモ接合（ＨＨ）→陰性（ＮＴＣ）の順に配置した。ＰＣＲプレートをＡＢＩ光学接着フィルムで覆い、前記ウェルの周辺周囲に固定されたことを確認した。プレートを１０００ＲＰＭで１分間回転させ、泡について確認した。仮に、泡が存在すれば、フリックし、再び回転させた。
【０１４９】
機器駆動。使用されるＰＣＲ機器、７５００Ｆａｓｔ又はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓに電源を供給し、使用のために準備させた。サンプルをランした：ＮＮ（ポジティブコントロールアレル１／アレル１）；ＮＴＣ（ネガティブコントロール）；ＨＮ（ポジティブコントロールアレル１／アレル２）；ＨＨ（アレル２／アレル２）；及びＮＴＣ（ネガティブコントロール）。次のサイクリングステップを作動させるために設定させた：プレ−ＰＣＲ読み取り（ホールディングステップ）→３０秒間６０℃；ホールディングステップ→１０分間９５℃；サイクリングステップ→３秒間９５℃と３０秒間６０℃の３６サイクル；及びポスト−ＰＣＲ読み取り（ホールディングステップ）→３０秒間６０℃。前記ＰＣＲプレートを前記機器内にローディングし、始動させた。
【０１５０】
実施例５：０〜６週時点までの綿棒安定性
この実施例は、例示的な安定性研究データを提供する。前記研究は、試験用に用いられた商業的バッカル綿棒、バッカル綿棒から抽出されたＤＮＡ及び様々な試薬の許容可能な安定性を決定するように設計された。
【０１５１】
バッカル綿棒
表１０で示されたように、バッカル綿棒を本実施例の手順の間、様々な温度で貯蔵した。
【表１０】
0006412101.tif 000011
【０１５２】
次に、ＤＮＡ抽出前に下記の表１１で示されたように、バッカル綿棒を、様々な温度及び時点で貯蔵及び融解した。示された温度での適切な時間後、バッカル綿棒を融解し、ＤＮＡを前記バッカル綿棒から９６−ウェルプレートフォーマット内で抽出した。
【表１１】
0006412101.tif 000012
【０１５３】
結果
最初の７個のデータポイントから収集された結果が下記表に要約される。
第１週時点
【表１２】
0006412101.tif 000013
【表１３】
0006412101.tif 000014
【０１５４】
第１週時点の結論
全ての抽出されたＤＮＡ、バッカル綿棒、及び試薬は、第１週についての様々な保管条件で信頼できる結果を出した。従って、全てが前記様々な温度で第１週について適している。
第二週時点
【表１４】
0006412101.tif 000015
【０１５５】
第２週時点の結論
前記室温綿棒は、さらに低い温度で貯蔵されたものより信頼性が低い結果を示した。従って、室温で貯蔵されたバッカル綿棒の安定性は、１週であった。室温で貯蔵されたバッカル綿棒に対して、それ以上の時点を取ることはなかった。
【０１５６】
全ての抽出されたＤＮＡ、バッカル綿棒（前記室温綿棒以外）、及び試薬は、第２週時点に対して様々な保管条件で信頼できる結果を出した。
【０１５７】
従って、安定性は、様々な冷蔵された温度及びさらに冷たい温度で２週と決定された。
第３週時点
【表１５】
0006412101.tif 000016
【０１５８】
第３週時点の結論：
全ての抽出されたＤＮＡ、バッカル綿棒（前記室温綿棒以外）、及び試薬は、３週に対して様々な保管条件で信頼できる結果を出した。従って、安定性は、様々な冷蔵された温度及びさらに冷たい温度で３週と決定された。
第４週時点
【表１６】
0006412101.tif 000017
【０１５９】
第４週時点の結論：
前記４℃の温度の綿棒のうちの一つは、信頼できない結果を示した（アレル１は、０．３３であった）。従って、４℃の温度で貯蔵冷蔵されたバッカル綿棒の安定性は、３週と決定された。この部分の研究を中断した。
【０１６０】
全ての抽出されたＤＮＡ、バッカル綿棒（前記４℃の温度の綿棒以外）、及び試薬は、４週で様々な保管条件で信頼できる結果を出した。従って、安定性は、前記ＤＮＡ抽出物に対して全ての試験温度で、及び前記バッカル綿棒に対して−２０℃及び−８０℃で４週と決定された。
第６週時点
【表１７】
0006412101.tif 000018
【０１６１】
第６週時点の結論：
全ての抽出されたＤＮＡ、バッカル綿棒（室温及び４℃の温度の綿棒以外）、及び試薬は、６週について様々な保管条件で信頼できる結果を出した。従って、安定性は、５凍結／融解サイクルを有する前記ＤＮＡ抽出物に対して全ての試験温度で、及び前記バッカル綿棒に対して−２０℃及び−８０℃で６週と決定された。
【０１６２】
要約結論
前記一次許容基準は、前記検証研究から確立されたアレル１及びアレル２の範囲であった。アレル１及びアレル２の平均結果を様々な保管温度で計算した。前記データは、次の安定性の主張を検証した：
【表１８】
0006412101.tif 000019
【０１６３】
実施例６：８週、１０週及び１２週での安定性研究
この実施例は、実施例５での研究から続いた例示的な安定性研究データを提供する。前記研究は、試験用に用いられた商業的バッカル綿棒、バッカル綿棒から抽出されたＤＮＡ及び様々な試薬の許容可能な安定性を決定するように設計された。この実施例は、行われた安定性研究の第８週、第１０週、及び第１２週の間に発生したデータの要約を含む。
【０１６４】
バッカル綿棒
表１９で示されたように、バッカル綿棒を本実施例の手順の間、様々な温度で貯蔵した。
【表１９】
0006412101.tif 000020
【０１６５】
バッカル綿棒を、以後、ＤＮＡ抽出以前に下記の表２０で示されたような様々な温度及び時点で貯蔵及び融解した。示された温度での適切な時間後、前記バッカル綿棒を融解し、ＤＮＡを９６−ウェルプレートフォーマット内で前記バッカル綿棒から抽出した。
【表２０】
0006412101.tif 000021
【０１６６】
結果
第８週、第１０週、及び第１２週のデータポイントからの結果が下記表に要約される。
第８週時点
【表２１】
0006412101.tif 000022
【０１６７】
第８週時点の結論：
全ての抽出されたＤＮＡ、バッカル綿棒（室温及び４℃の温度の綿棒以外）及び試薬は、８週について前記様々な保管条件で信頼できる結果を出した。従って、安定性は、６凍結／融解サイクルを有する前記ＤＮＡ抽出物に対して全ての試験温度で、及び前記バッカル綿棒に対して−２０℃及び−８０℃で８週と決定された。
第１０週時点
【表２２】
0006412101.tif 000023
【０１６８】
第１０週時点の結論：
全ての抽出されたＤＮＡ、バッカル綿棒（室温及び４℃の温度の綿棒以外）及び試薬は、１０週について前記様々な保管条件で信頼できる結果を出した。従って、安定性は、７凍結／融解サイクルを有する前記ＤＮＡ抽出物に対して全ての試験温度で、及び前記バッカル綿棒に対して−２０℃及び−８０℃で１０週までと決定された。
第１２週時点
【表２３】
0006412101.tif 000024
【０１６９】
第１２週時点の結論：
全ての抽出されたＤＮＡ、バッカル綿棒（室温及び４℃の温度の綿棒以外）及び試薬は、１２週について前記様々な保管条件で信頼できる結果を出した。従って、安定性は、８凍結／融解サイクルを有する前記ＤＮＡ抽出物に対して全ての試験温度で、及び前記バッカル綿棒に対して−２０℃及び−８０℃で１２週までと決定された。
【０１７０】
結論
アレル１及びアレル２に対する平均結果を様々な保管温度で計算した。前記データは、次の安定性の主張を検証した：
【表２４】
0006412101.tif 000025
【０１７１】
実施例７：６ヶ月での安定性研究；０ヶ月及び６ヶ月でのコントロール
この実施例で記述された研究は、試験用に用いられた商業的バッカル綿棒、バッカル綿棒から抽出されたＤＮＡ、様々な試薬、及びコントロールの許容可能な安定性を決定するように設計された。この実施例は、実施例５及び６から続いた、６ヶ月で生成された安定性データの要約を含む。この報告書は、第０日〜６ヶ月で生成されたコントロール安定性データの要約もまた含む。
バッカル綿棒
【表２５】
0006412101.tif 000026
【表２６】
0006412101.tif 000027
【０１７２】
隔離された試薬を前記バッカル綿棒及び抽出されたＤＮＡ安定性試験に用いた。この研究の末期に、前記並んでいる試薬の使用に対する有効期限を確立した。
【０１７３】
結果
６ヶ月データポイントからの結果が下記表に要約される。
６ヶ月時点
【表２７】
0006412101.tif 000028
【表２８】
0006412101.tif 000029
【０１７４】
６ヶ月時点の結論：
７５００  ＰＣＲ機器上で作動させた、抽出されたＤＮＡ（−２０℃及び−８０℃で貯蔵された）、バッカル綿棒（−８０℃で貯蔵された）、及び試薬を含む全てのサンプルは、６ヶ月について様々な保管条件で信頼できる結果を出した。７５００  ＰＣＲ機器に対する安定性は、９凍結／融解サイクルを有し、−２０℃及び−８０℃で貯蔵された前記ＤＮＡ抽出物及び−８０℃で貯蔵されたバッカル綿棒に対して６ヶ月と決定された。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  ＰＣＲ機器に対する安定性は、８凍結／融解サイクルを有し、４℃、−２０℃及び−８０℃で貯蔵された全てのＤＮＡ抽出物及び−８０℃で貯蔵されたバッカル綿棒に対して依然として１２週と決定された。
【０１７５】
コントロールに対する０及び６ヶ月時点
第０日乃至６ヶ月データポイントでの結果が下記表及び下記グラフに要約される：
【表２９】
0006412101.tif 000030
【表３０】
0006412101.tif 000031
0006412101.tif 000032
【表３１】
0006412101.tif 000033
0006412101.tif 000034
【表３２】
0006412101.tif 000035
【表３３】
0006412101.tif 000036
0006412101.tif 000037
【表３４】
0006412101.tif 000038
0006412101.tif 000039
【０１７６】
全てのコントロール、ＮＮ（ロット＃  ＡＬＵ−０９１２−００６）、ＨＮ（ロット＃  ＡＬＵ−０９１２−００７）、及びＨＨ（ロット＃  ＡＬＵ−０９１２−００８）は、それぞれの時点で全ての許容可能なアレルの範囲を通過した。コントロール安定性は、６ヶ月と決定された。
【０１７７】
結論
アレル１及びアレル２の平均結果を様々な保管温度で計算した。前記データは、用いられたそれぞれの機器に対して次の安定性の主張を検証した：
【表３５】
0006412101.tif 000040
【表３６】
0006412101.tif 000041
【０１７８】
下記表でのデータは、それぞれのコントロールに対して次の安定性の主張を検証した。
【表３７】
0006412101.tif 000042
【０１７９】
実施例８：８ヶ月での安定性研究
この実施例で記述された研究は、試験用に用いられた商業的バッカル綿棒、バッカル綿棒から抽出されたＤＮＡ、様々な試薬、及びコントロールの許容可能な安定性を決定するように設計された。この実施例は、実施例５、６及び７から続いた、８ヶ月で生成された安定性データの要約を含む。この実施例は、８ヶ月で生成されたコントロール安定性データの要約もまた含む。
バッカル綿棒
【表３８】
0006412101.tif 000043
【表３９】
0006412101.tif 000044
【０１８０】
隔離された試薬を、前記バッカル綿棒及び抽出されたＤＮＡ安定性試験に用いた。この研究の末期に、前記並んでいる試薬の組み合わせ使用に対して有効期限を確立する。
【０１８１】
結果
８ヶ月データポイントからの結果が下記表に要約される。
８ヶ月時点
【表４０】
0006412101.tif 000045
【０１８２】
８ヶ月時点の結論：
７５００  ＰＣＲ機器上で作動させた、抽出されたＤＮＡ（−２０℃及び−８０℃で貯蔵された）、バッカル綿棒（−２０℃及び−８０℃で貯蔵された）、及び試薬を含む全てのサンプルは、８ヶ月について様々な保管条件で信頼できる結果を出した。従って、７５００  ＰＣＲ機器に対する安定性は、１０凍結／融解サイクルを有する−２０℃及び−８０℃で貯蔵された前記ＤＮＡ抽出物、及び−２０℃及び−８０℃で貯蔵されたバッカル綿棒に対して８ヶ月と決定された。
【０１８３】
コントロール安定性
８ヶ月データポイントでの結果が７５００  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステムに対して下記表に要約される。
【表４１】
0006412101.tif 000046
【表４２】
0006412101.tif 000047
【表４３】
0006412101.tif 000048
【０１８４】
全てのコントロール、ＮＮ（ロット＃  ＡＬＵ−０９１２−００６）、ＨＮ（ロット＃  ＡＬＵ−０９１２−００７）、及びＨＨ（ロット＃  ＡＬＵ−０９１２−００８）は、８ヶ月時点で全ての許容可能なアレルの範囲を通過した。コントロール安定性は、７５００  Ｆａｓｔ  ＰＣＲ機器に対して８ヶ月と決定された。
【０１８５】
結論
アレル１及びアレル２の平均結果を様々な保管温度で計算した。前記データは、用いられたそれぞれの機器に対して次の安定性の主張を検証した：
【表４４】
0006412101.tif 000049
【表４５】
0006412101.tif 000050
【０１８６】
次の７５００機器データは、それぞれのコントロールに対して下記表４６に示したように、次の安定性の主張を検証した。
【表４６】
0006412101.tif 000051
【０１８７】
実施例９：１０ヶ月での安定性研究
この実施例で記述された研究は、試験用に用いられた商業的バッカル綿棒、バッカル綿棒から抽出されたＤＮＡ、様々な試薬、及びコントロールの許容可能な安定性を決定するように設計された。この実施例は、実施例５、６、７及び８から続いた、１０ヶ月で生成された安定性データの要約を含む。この報告書は、１０ヶ月で生成されたコントロール安定性データの要約もまた含む。
バッカル綿棒
【表４７】
0006412101.tif 000052
【表４８】
0006412101.tif 000053
【０１８８】
試薬
隔離された試薬を前記バッカル綿棒及び抽出されたＤＮＡ安定性試験に用いた。この研究の末期に、割り当てられた有効期限を前記並んでいる試薬の組み合わせ使用に対して確立した。
【０１８９】
結果
１０ヶ月データポイントからの結果が下記表に要約される。
１０ヶ月時点
【表４９】
0006412101.tif 000054
【０１９０】
１０ヶ月時点の結論：
前記７５００  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲ機器上で作動させた、抽出されたＤＮＡ（−２０℃及び−８０℃で貯蔵された）、バッカル綿棒（−２０℃及び−８０℃で貯蔵された）、及び試薬を含む全てのサンプルは、１０ヶ月に対して様々な保管条件で信頼できる結果を出した。従って、７５００  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲ機器に対する安定性は、１１凍結／融解サイクルを有する−２０℃及び−８０℃で貯蔵された前記ＤＮＡ抽出物及び−２０℃及び−８０℃で貯蔵されたバッカル綿棒に対して１０ヶ月と決定された。
【０１９１】
１０ヶ月コントロール安定性
１０ヶ月データポイントでの結果が７５００  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステムに対して下記表に要約される。
【表５０】
0006412101.tif 000055
【表５１】
0006412101.tif 000056
【表５２】
0006412101.tif 000057
【０１９２】
全てのコントロール、ＮＮ（ロット＃  ＡＬＵ−０９１２−００６）、ＨＮ（ロット＃  ＡＬＵ−０９１２−００７）、及びＨＨ（ロット＃  ＡＬＵ−０９１２−００８）は、１０ヶ月の時点で全ての許容可能なアレルの範囲を通過した。コントロール安定性は、７５００  Ｆａｓｔ  ＰＣＲシステムに対して１０ヶ月と決定された。
【０１９３】
結論
アレル１及びアレル２の平均結果を様々な保管温度で計算した。前記データは、用いられたそれぞれの機器に対して次の安定性の主張を検証した：
【表５３】
0006412101.tif 000058
【表５４】
0006412101.tif 000059
【０１９４】
次の７５００  Ｆａｓｔリアルタイム機器データは、それぞれのコントロールに対して次の安定性の主張を検証した：
【表５５】
0006412101.tif 000060
【０１９５】
実施例１０：１２ヶ月での安定性研究
この実施例で記述された研究は、試験用に用いられた商業的バッカル綿棒、バッカル綿棒から抽出されたＤＮＡ、様々な試薬、及びコントロールの許容可能な安定性を決定するように設計された。この実施例は、実施例５、６、７、８及び９から続いた、１２ヶ月で生成された安定性データの要約を含む。この報告書は、１０ヶ月で生成されたコントロール安定性データの要約もまた含む。
【０１９６】
１２ヶ月データポイントからの結果が下記表に要約される。
１２ヶ月時点
【表５６】
0006412101.tif 000061
【０１９７】
１２ヶ月時点の結論：
前記７５００  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲ機器上で作動させた、抽出されたＤＮＡ（−２０℃及び−８０℃で貯蔵された）、バッカル綿棒（−２０℃及び−８０℃で貯蔵された）、及び試薬を含む全てのサンプルは、１２ヶ月に対して様々な保管条件で信頼できる結果を出した。従って、前記７５００  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲ機器に対する安定性は、１２凍結／融解サイクルを有し、−２０℃及び−８０℃で貯蔵された前記ＤＮＡ抽出物及び３凍結／融解サイクルを有し、−２０℃及び−８０℃で貯蔵されたバッカル綿棒に対して１２ヶ月と決定された。
【０１９８】
１２ヶ月コントロール安定性
１２ヶ月データポイントでの結果が７５００  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステムに対して下記表に要約される。
【表５７】
0006412101.tif 000062
【表５８】
0006412101.tif 000063
【表５９】
0006412101.tif 000064
【０１９９】
全てのコントロール、ＮＮ（ロット＃  ＡＬＵ−０９１２−００６）、ＨＮ（ロット＃  ＡＬＵ−０９１２−００７）、及びＨＨ（ロット＃  ＡＬＵ−０９１２−００８）は、前記１２ヶ月の時点で全ての許容可能なアレルの範囲を通過した。コントロール安定性は、７５００  Ｆａｓｔ  ＰＣＲシステムに対して１０ヶ月と決定された。
【０２００】
結論
アレル１及びアレル２の平均結果を様々な保管温度で計算した。前記データは、次の安定性を検証した。
【表６０】
0006412101.tif 000065
【表６１】
0006412101.tif 000066
【０２０１】
次の７５００  Ｆａｓｔリアルタイム機器データは、それぞれのコントロールに対して次の安定性の主張を検証した：
【表６２】
0006412101.tif 000067
【０２０２】
《参照文献》
すべての見出しとセクションの指定は、明確性及び参照のみを目的として使用され、そして決して限定と考えるべきではない。例えば、当業者は、本明細書に記載の本発明の精神及び範囲に従って、異なる見出しの様々な観点の組み合わせの有用性を適宜理解するであろう。
【０２０３】
各々の個々の刊行物若しくは特許又は特許出願が、特別に及び個々にその全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれた場合と同視し得る程度、本明細書で引用される全ての参照文献は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まる。
【０２０４】
当業者に明らかであるように、本出願の多くの変更及び変形は、その精神及び範囲から逸脱することなく行うことが可能である。本明細書に記載の特定の実施態様及び実施例は、例としてのみ提供され、用途は、特許請求の範囲が権利を有しているために等価物の全範囲とともに、添付の請求項によってのみ限定されるものである。
【図１Ａ】
0006412101.tif 000068
【図１Ｂ】
0006412101.tif 000069
【図２】
0006412101.tif 000070
【図３】
0006412101.tif 000071
【図４】
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【図５】
0006412101.tif 000073
【図６】
0006412101.tif 000074
【図７】
0006412101.tif 000075
【配列表】
0006412101000001.app