(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース由来の糖を含む培地にてキシロース資化酵母を連続培養するに際して、
上記リグノセルロース由来の糖を含む培地のキシロース濃度を測定し、測定したキシロース濃度が予め設定した閾値以下となるように、リグノセルロース由来の糖を含む添加培地の上記リグノセルロース由来の糖を含む培地に対する添加制御を行うことを特徴とするエタノールの製造方法。
【請求項２】
上記閾値は、上記リグノセルロース由来の糖を含む培地に含まれる培養開始前のキシロース濃度の１／３以下の濃度とすることを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
【請求項３】
上記閾値は、１０ｇ／Ｌ以下の濃度とすることを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
【請求項４】
上記キシロース資化酵母と上記培地を用い、上記連続培養と同条件の回分培養における単位時間及び単位液量あたりの菌体生成量と比較して菌体生成量が高くなるように、上記添加培地の上記培養液に対する供給速度を制御することを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
【請求項５】
上記添加培地の上記培養液に対する供給速度は、下記式
Ｆ＝Ｖ×（ｘｍａｘ−ｘ０）／ｘｓ×Ｔ／（ｔｂａｔｃｈ×（Ｔ−ｔｉ））
（ここで、Ｆは添加培地の供給速度、Ｖは上記培養液の液量、ｘｍａｘは上記キシロース資化酵母と上記培地を用い、上記連続培養と同条件の回分培養における最大到達菌濃度、ｘ０は上記キシロース資化酵母と上記培地を用い、上記連続培養と同条件の回分培養における培養開始時の菌濃度、ｘｓは上記培地を用いた連続培養における定常状態での菌濃度、Ｔは上記培養液で定常状態が持続する時間、ｔｂａｔｃｈは上記キシロース資化酵母と上記培地を用い、上記連続培養と同条件の回分培養に必要な全時間、ｔｉは上記培地を用いた連続培養における定常状態が確立するまでの培養に要する全時間を意味する。）
で求められるＦを超える速度とすることを特徴とする請求項４記載のエタノールの製造方法。
【請求項６】
上記添加培地の上記培養液に対する供給速度は、上記キシロース資化酵母と上記培地を用い、上記連続培養と同条件の回分培養における培養終了時のキシロース濃度の１０倍以下の濃度となるように制御することを特徴とする請求項４記載のエタノールの製造方法。
【請求項７】
上記リグノセルロース由来の糖を含む培地は、希酸を用いた蒸煮処理後のリグノセルロースを糖化処理することで得られた糖化液を含むものか、当該蒸煮処理を行わないリグノセルロースを糖化処理することで得られ、且つ、糖化反応における糖過分解物の濃度が４００ｐｐｍ以上、１５００ｐｐｍ以下である糖化液を含むものであることを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
【請求項８】
リグノセルロース由来の糖を含む培地にてキシロース資化酵母を連続培養する培養槽と、
上記培養槽に対して、リグノセルロース由来の糖を含む添加培地を供給する培地供給部と、
上記培養槽内の上記リグノセルロース由来の糖を含む培地に含まれるキシロース濃度を測定するキシロース濃度測定部と、
上記キシロース濃度が予め設定した閾値以下となるように、リグノセルロース由来の糖を含む添加培地の上記リグノセルロース由来の糖を含む培地に対する添加制御を行う制御部とを備える連続培養装置。
【請求項９】
上記閾値は、上記リグノセルロース由来の糖を含む培地に含まれる培養開始前のキシロース濃度の１／３以下の濃度とすることを特徴とする請求項８記載の連続培養装置。
【請求項１０】
上記閾値は、１０ｇ／Ｌ以下の濃度とすることを特徴とする請求項８記載の連続培養装置。
【請求項１１】
上記制御部は、上記キシロース資化酵母と上記培地を用い、上記連続培養と同条件の回分培養における単位時間及び単位液量あたりの菌体生成量と比較して菌体生成量が高くなるように、上記添加培地の上記培養液に対する供給速度を制御することを特徴とする請求項８記載の連続培養装置。
【請求項１２】
上記添加培地の上記培養液に対する供給速度は、下記式
Ｆ＝Ｖ×（ｘｍａｘ−ｘ０）／ｘｓ×Ｔ／（ｔｂａｔｃｈ×（Ｔ−ｔｉ））
（ここで、Ｆは添加培地の供給速度、Ｖは上記培養液の液量、ｘｍａｘは上記キシロース資化酵母と上記培地を用い、上記連続培養と同条件の回分培養における最大到達菌濃度、ｘ０は上記キシロース資化酵母と上記培地を用い、上記連続培養と同条件の回分培養における培養開始時の菌濃度、ｘｓは上記培地を用いた連続培養における定常状態での菌濃度、Ｔは上記培養液で定常状態が持続する時間、ｔｂａｔｃｈは上記キシロース資化酵母と上記培地を用い、上記連続培養と同条件の回分培養に必要な全時間、ｔｉは上記培地を用いた連続培養における定常状態が確立するまでの培養に要する全時間を意味する。）
で求められるＦを超える速度とすることを特徴とする請求項１１記載の連続培養装置。
【請求項１３】
上記添加培地の上記培養液に対する供給速度は、上記キシロース資化酵母と上記培地を用い、上記連続培養と同条件の回分培養における培養終了時のキシロース濃度の１０倍以下の濃度となるように制御することを特徴とする請求項１１記載の連続培養装置。
【請求項１４】
上記リグノセルロース由来の糖を含む培地は、希酸を用いた蒸煮処理後のリグノセルロースを糖化処理することで得られた糖化液を含むものか、当該蒸煮処理を行わないリグノセルロースを糖化処理することで得られ、且つ、糖化反応における糖過分解物の濃度が４００ｐｐｍ以上、１５００ｐｐｍ以下である糖化液を含むものであることを特徴とする請求項８記載の連続培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キシロース代謝能を有する組換え微生物を用いた連続培養によるエタノールの製造方法及び連続培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
リグノセルロースに含まれる主要な糖は、セルロースを構成するグルコースと、ヘミセルロースを構成するキシロースである。リグノセルロースを化学的あるいは酵素的に分解すると、こうした単糖を主として含む糖化組成物が得られる。リグノセルロースから有用物質を工業的に製造するためには、糖化組成物中に含まれる糖を効率的に利用し、高収量、高生産性で発酵できる微生物及び製造プロセスが求められる。
【０００３】
サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のエタノール発酵能力の高い酵母に対して、キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）、キシロースレダクターゼ（ＸＲ）、キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）をコードする遺伝子等を導入してキシロース資化性を付与した酵母を利用することで、リグノセルロースに由来する糖を有効に利用してエタノールを製造することができる。
【０００４】
一般に、微生物を用いた物質の発酵生産には、回分（バッチ）培養、連続培養及び流加培養（半回分培養、フェドバッチ培養）が知られている。回分培養は、一回毎に新たな培地を用意し、そこへ微生物を植えて培養終了まで培地を加えない方法である。回分培養では、個々の培養の品質はバラつくが、コンタミネーションのリスクを分散・低減できる。連続培養は、一定の速度で培養系に培地を供給し、同時に同量の培養液を抜き取る培養法である。連続培養には、培養環境を常に一定に保ちやすく、生産性が安定するという特徴がある。流加培養は、培養中に、培地自体や培地中の特定の成分を添加し、培養終了時までその生成物を抜き取らない培養方法である。
【０００５】
特に連続培養に関して、特許文献１には簡便な操作条件で長時間にわたり安定して高生産性を維持することができる連続発酵法による化学品の製造方法が開示されている。特許文献１に開示された方法では、多孔性膜を用いて発酵培養液を濾過処理するとともに発酵培養液から微生物等を系外に抜き出している。しかし、この方法では、リグノセルロース系の原料を用いた場合に多孔性膜の目詰まりが生じてしまい、これに対する対策に大きなコストを要するといった問題がある。
【０００６】
また、特許文献２には、デンプン質原料を基質として酵母によるアルコール発酵により連続的にエタノールを製造する方法が開示されている。特許文献２に開示された方法では、連続発酵の条件として、発酵温度、基質の供給・発酵液の抜き出し速度、通気量及び酵母濃度を特定の値となるように制御し、発酵液中のエタノール濃度が所定の値以下を維持するように培養している。特許文献２に開示された方法によれば、連続発酵中酵母の追加供給を行うことなく効率的にエタノールの生成を持続できるとある。しかしながら、特許文献２に開示された連続培養方法では、リグノセルロース由来の糖を基質として利用した場合には効率的なエタノール生産ができないといった問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−０６５９７０号公報
【特許文献２】特開２０１０−２２７０７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のように、キシロース資化性を有する微生物を利用して、リグノセルロース由来の糖から効率的にエタノールを製造することができなかった。そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、キシロース資化性を有する微生物を用いた連続培養により、リグノセルロース由来の糖から効率的にエタノールを製造できるエタノールの製造方法及び連続培養装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、キシロース資化性を有する微生物を用いた連続培養においては、培養液中のキシロース濃度を指標として培地添加を制御することで、エタノールの効率的な製造が可能となることを見いだし、本発明を完成するに至った。
本発明は以下を包含する。
【００１０】
（１）  リグノセルロース由来の糖を含む培地にてキシロース資化性を有する微生物を連続培養するに際して、
培養液中のキシロース濃度を測定し、測定したキシロース濃度に基づいて、リグノセルロース由来の糖を含む添加培地の上記培養液に対する添加制御を行うことを特徴とするエタノールの製造方法。
（２）  上記キシロース濃度が予め設定した閾値以下となるように、上記添加培地の上記培養液に対する添加制御を行うことを特徴とする（１）記載のエタノールの製造方法。
（３）  上記閾値は、上記培養液に含まれる培養開始前のキシロース濃度の１／３以下の濃度とすることを特徴とする（２）記載のエタノールの製造方法。
（４）  上記閾値は、１０ｇ／Ｌ以下の濃度とすることを特徴とする（２）記載のエタノールの製造方法。
（５）  上記培地を用いた回分培養における単位時間及び単位液量あたりの菌体生成量と比較して菌体生成量が高くなるように、上記添加培地の上記培養液に対する供給速度を制御することを特徴とする（１）記載のエタノールの製造方法。
（６）  上記添加培地の供給速度は、下記式
Ｆ＝Ｖ×（ｘｍａｘ−ｘ０）／ｘｓ×Ｔ／（ｔｂａｔｃｈ×（Ｔ−ｔｉ））
（ここで、Ｆは添加培地の供給速度、Ｖは上記培養液の液量、ｘｍａｘは上記培地を用いた回分培養における最大到達菌濃度、ｘ０は上記培地を用いた回分培養における培養開始時の菌濃度、ｘｓは上記培地を用いた連続培養における定常状態での菌濃度、Ｔは上記培養液で定常状態が持続する時間、ｔｂａｔｃｈは上記培地を用いた回分培養に必要な全時間、ｔｉは上記培地を用いた連続培養における定常状態が確立するまでの培養に要する全時間を意味する。）
で求められるＦを超える速度とすることを特徴とする（５）記載のエタノールの製造方法。
（７）  上記添加培地の上記培養液に対する供給速度は、上記培地を用いた回分培養における培養終了時のキシロース濃度の１０倍以下の濃度となるように制御することを特徴とする（５）記載のエタノールの製造方法。
（８）上記リグノセルロース由来の糖を含む培地は、希酸を用いた蒸煮処理後のリグノセルロースを糖化処理することで得られた糖化液を含むものか、当該蒸煮処理を行わないリグノセルロースを糖化処理することで得られ、且つ、糖化反応における糖過分解物の濃度が４００ｐｐｍ以上、１５００ｐｐｍ以下である糖化液を含むものであることを特徴とする（１）記載のエタノールの製造方法。
（９）  リグノセルロース由来の糖を含む培地にてキシロース資化性を有する微生物を連続培養する培養槽と、
上記培養槽に対して、リグノセルロース由来の糖を含む添加培地を供給する培地供給部と、
上記培養槽内の培養液に含まれるキシロース濃度を測定するキシロース濃度測定部と、
上記キシロース濃度に基づいて、上記培地供給部による添加培地の供給制御を行う制御部とを備える連続培養装置。
（１０）  上記制御部は、上記キシロース濃度測定部で測定したキシロース濃度が予め設定した閾値以下となるように、上記添加培地の上記培養液に対する添加制御を行うことを特徴とする（９）記載の連続培養装置。
（１１）  上記閾値は、上記培養液に含まれる培養開始前のキシロース濃度の１／３以下の濃度とすることを特徴とする（１０）記載の連続培養装置。
（１２）  上記閾値は、１０ｇ／Ｌ以下の濃度とすることを特徴とする（１０）記載の連続培養装置。
（１３）  上記制御部は、上記培地を用いた回分培養における単位時間及び単位液量あたりの菌体生成量と比較して菌体生成量が高くなるように、上記添加培地の上記培養液に対する供給速度を制御することを特徴とする（９）記載の連続培養装置。
（１４）  上記添加培地の供給速度は、下記式
Ｆ＝Ｖ×（ｘｍａｘ−ｘ０）／ｘｓ×Ｔ／（ｔｂａｔｃｈ×（Ｔ−ｔｉ））
（ここで、Ｆは添加培地の供給速度、Ｖは上記培養液の液量、ｘｍａｘは上記培地を用いた回分培養における最大到達菌濃度、ｘ０は上記培地を用いた回分培養における培養開始時の菌濃度、ｘｓは上記培地を用いた連続培養における定常状態での菌濃度、Ｔは上記培養液で定常状態が持続する時間、ｔｂａｔｃｈは上記培地を用いた回分培養に必要な全時間、ｔｉは上記培地を用いた連続培養における定常状態が確立するまでの培養に要する全時間を意味する。）
で求められるＦを超える速度とすることを特徴とする（１３）記載の連続培養装置。
（１５）  上記添加培地の上記培養液に対する供給速度は、上記培地を用いた回分培養における培養終了時のキシロース濃度の１０倍以下の濃度となるように制御することを特徴とする（１３）記載の連続培養装置。
（１６）上記リグノセルロース由来の糖を含む培地は、希酸を用いた蒸煮処理後のリグノセルロースを糖化処理することで得られた糖化液を含むものか、当該蒸煮処理を行わないリグノセルロースを糖化処理することで得られ、且つ、糖化反応における糖過分解物の濃度が４００ｐｐｍ以上、１５００ｐｐｍ以下である糖化液を含むものであることを特徴とする（９）記載の連続培養装置。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るエタノールの製造方法及び連続培養装置は、培養液に含まれるキシロース濃度に応じて添加培地の添加を制御するため、キシロース資化性を有する微生物によるエタノールの生産効率を大幅に向上できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明を適用した連続培養装置の一例を示す概略構成図である。
【図２】本発明を適用した連続培養装置の他の例を示す概略構成図である。
【図３】リグノセルロース由来の糖を含む培地（糖化液）の添加速度と、エタノール濃度、キシロース濃度及びグルコース濃度との関係を示す特性図である。
【図４】糖過分解物の濃度とエタノール生産性との関係を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を図面及び実施例を用いてより詳細に説明する。
本発明に係るエタノールの製造方法は、リグノセルロース由来の糖を含む培地にてキシロース資化性を有する微生物を連続培養することでエタノールを製造するものである。特に、本発明に係るエタノールの製造方法では、リグノセルロース由来の糖を含む添加培地を培養液に連続的に添加する際に、添加量の調節、添加速度の調節及び添加タイミングの調節といった添加培地の添加制御を培養液中のキシロース濃度に基づいて判断する。
【００１４】
本発明に係るエタノールの製造方法は、例えば、図１に示す連続培養装置１により実現することができる。
【００１５】
連続培養装置１は、リグノセルロース由来の糖を含む培地にてキシロース資化性を有する微生物を連続培養する培養槽２と、培養槽２に対して、リグノセルロース由来の糖を含む添加培地を供給する培地供給部３と、培養槽２内の培養液に含まれるキシロース濃度を測定するキシロース濃度測定部４と、上記キシロース濃度に基づいて培地供給部３による添加培地の供給制御を行う制御部５とを備えている。また、連続培養装置１は、培地供給部３から供給された添加培地と略同量の培養液を抜き出すための排出部６を備えている。
【００１６】
培養槽２は、例えば、内部の培養液を無菌的に引き抜くサンプリング部１０を備え、サンプリング部１０を介してキシロース濃度測定部４と接続することができる。また、培養槽２は、特に限定されないが、攪拌翼１１と、攪拌翼１１を駆動制御する駆動制御部１２とを備えていてもよい。このとき、駆動制御部１２は、制御部５からの制御信号により、攪拌翼１１を駆動制御することができる。また、図示しないが、培養槽２は、内部の培養液に含まれる細胞数を測定する手段、培養液の溶存酸素濃度や溶存二酸化炭素濃度を測定する手段、培養液に含まれるグルコースやエタノール等の濃度を測定する手段、培養液に含まれる糖過分解物の濃度を測定する手段を備えることもできる。
【００１７】
培地供給部３は、例えば、リグノセルロース由来の糖を含む添加培地を充填した添加培地槽１３と、添加培地槽１３及び培養槽２を連結する培地流路１４に配設されたポンプ１５とから構成される。培地供給部３は、制御部５からの制御信号によりポンプ１５の駆動を制御し、添加培地槽１３から培養槽２に対する添加培地の添加タイミング、添加量や添加流速を調節することができる。
【００１８】
キシロース濃度測定部４は、上述のように、一例としてサンプリング部１０を介して培養槽２に接続され、培養槽２内の培養液中のキシロース濃度を測定する。培養液中のキシロース濃度を測定する方式としては、特に限定されず、例えば、酵素法を使用することができる。酵素法では、キシロースを基質とする酵素によって酵素反応を行い、生成物を吸光度の変化により定量することでキシロース濃度を測定することができる。また、キシロース濃度は、高速液体クロマトグラフィーを利用する方法を使用してもよい。
【００１９】
また、キシロース濃度測定部４は、上述のようにサンプリング部１０を介して培養槽２に接続されず、培養槽２とは独立した装置としてもよい。この場合、培養槽２内の培養液を操作者が無菌的に引き抜き、引き抜いた培養液についてキシロース濃度測定部４にてキシロース濃度を測定すれば良い。
【００２０】
キシロース濃度測定部４で測定した培養液に含まれるキシロース濃度は、制御部５に入力される。制御部５は、入力されたキシロース濃度に基づいて、添加培地の添加を制御する制御信号を培地供給部３に出力する。具体的に制御部５は、培養液に含まれるキシロース濃度について予め設定された閾値と入力されたキシロース濃度とを比較し、培養槽２内の培養液に含まれるキシロース濃度が当該閾値以下となるように添加培地を培養槽２へ供給する制御信号を出力する。このとき、添加培地に含まれるキシロース濃度に基づいて、添加培地の流速と添加時間を制御することで、培養槽２内の培養液に含まれるキシロース濃度を上記閾値以下とすることができる。
【００２１】
ここで、上述した閾値としては、特に限定されず、培養液に含まれるキシロースが十分に消費されたときの値とすることができる。一例として、上記閾値は、培養槽２に充填された培養液に含まれる培養開始前のキシロース濃度の１／３以下の濃度とすることができる。より具体的に、上記閾値は、１０ｇ／Ｌ以下の濃度とすることができる。
【００２２】
以上のように培養液に含まれるキシロース濃度を閾値以下とすることで、リグノセルロース由来の糖、すなわちグルコースとキシロースを利用したエタノール発酵を十分に進行させることができ、その結果、エタノールを高効率で製造することができる。
【００２３】
一方、制御部５は、培養液に含まれるキシロース濃度について予め設定された値（以下下限値と称す）と入力されたキシロース濃度とを比較し、培養槽２内の培養液に含まれるキシロース濃度が当該下限値以上となるように添加培地を培養槽２へ供給する制御信号を出力することが好ましい。ここで、当該下限値とは、連続培養装置１を用いた連続培養によるエタノール製造の生産性が、回分培養によるエタノール製造における生産性よりも上回るように決められたキシロース濃度である。
【００２４】
詳細には、制御部５は、同じ培養液を用いた回分培養における単位時間及び単位液量あたりの菌体生成量と比較して、連続培養装置１を用いた連続培養における菌体生成量が高くなるように、添加培地の供給速度を制御することが好ましい。より具体的に、添加培地の供給速度は、下記式（１）により求められるＦを超える速度とすることができる。
【００２５】
Ｆ＝Ｖ×（ｘｍａｘ−ｘ０）／ｘｓ×Ｔ／（ｔｂａｔｃｈ×（Ｔ−ｔｉ））  …（１）
【００２６】
ここで、Ｆは添加培地の供給速度、Ｖは上記培養液の液量、ｘｍａｘは上記培地を用いた回分培養における最大到達菌濃度、ｘ０は上記培地を用いた回分培養における培養開始時の菌濃度、ｘｓは上記培地を用いた連続培養における定常状態での菌濃度、Ｔは上記培養液で定常状態が持続する時間、ｔｂａｔｃｈは上記培地を用いた回分培養に必要な全時間、ｔｉは上記培地を用いた連続培養における定常状態が確立するまでの培養に要する全時間を意味する。
【００２７】
なお、上記式は、回分培養における単位時間及び単位液量あたりの菌体生成量Ｒｂａｔｃｈが下記式により求められること、及び連続培養装置１を用いた連続培養における菌体生成量Ｒｃｏｎｔが下記式により求められることに基づいている。すなわち、上記式（１）は、Ｒｂａｔｃｈ＝Ｒｃｏｎｔとして、Ｆについて整理した式である。
【００２８】
Ｒｂａｔｃｈ＝（ｘｍａｘ−ｘ０）／ｔｂａｔｃｈ
Ｒｃｏｎｔ＝Ｄ×ｘｓ×（１−ｔｉ／Ｔ）[ここでＤは希釈率であり、Ｄ＝Ｆ／Ｖ]
【００２９】
また、制御部５には、他の下限値の例として、同じ培地を用いた回分培養における培養終了時のキシロース濃度に基づいて設定してもよい。すなわち、同じ培地を用いた回分培養における培養終了時のキシロース濃度よりも高い濃度（例えば１０倍の濃度）を下限値とすることで、回分培養によるエタノール製造における生産性を上回ることができる。
【００３０】
以上のように、リグノセルロース由来の糖を含む培地から連続培養にてエタノールを製造するに際して、添加量の調節、添加速度の調節及び添加タイミングの調節といった添加培地の添加制御を培養液中のキシロース濃度に基づいて判断することで、非常に優れたエタノール生産効率を達成することができる。
【００３１】
つまり、培養液に含まれるグルコースやキシロースといったリグノセルロース由来の糖をエタノール発酵に高効率で利用することができる。一般に、連続培養による物質の発酵生産プロセスでは、培養液中の菌濃度をモニターして、添加培地の添加制御を行っている。しかし、菌濃度の増減プロファイルは、リグノセルロース由来の糖を含む培地を用いたエタノール製造において、培養液中のエタノール濃度のプロファイルと連動せず遅れて反応しているため、エタノール発酵の進行度合いの指標としては感度が悪い。また、リグノセルロース由来の糖のうちグルコース濃度のプロファイルについては、培養液中のエタノール濃度のプロファイルとは相関しないため、エタノール発酵の進行度合いの指標とならない。さらに、培養液からの排気ガス濃度は、二酸化炭素を測定する測定装置を備える必要があり装置自体のコスト高を招き、また、エタノール発酵では通気を積極的には行わないことから排気ガスを測定するのは有効でない。さらにまた、培養液中のエタノール濃度は、生産対象物であるため直接的にエタノール発酵の進行度合いをモニターできるが、エタノールの生産量はキシロース量の半分であるため、キシロース濃度の半分量しか変動しない。よって、キシロース濃度を測定したときと比較して、エタノール濃度はエタノール発酵の進行度合いの指標としては感度が不十分である。
【００３２】
以上のように、リグノセルロース由来の糖を含む培地から連続培養にてエタノールを製造するに際して、培養液中のキシロース濃度に基づいて、添加培地の添加制御を行うことで非常に優れたエタノール生産効率を達成することができる。
【００３３】
なお、上述のように製造されたエタノールについては、排出部６から排出された培養液からエタノールを定法に従って回収することができる。エタノールの回収方法は、特に限定されず、従来公知のいかなる方法も適用することができる。例えば、上述したエタノール発酵が終了した後、固液分離操作によってエタノールを含む液層と、組換え微生物や固形成分を含有する固層とを分離する。その後、液層に含まれるエタノールを蒸留法によって分離・精製することで、純度の高いエタノールを回収することができる。なお、エタノールの精製度は、エタノールの使用目的にあわせて適宜調整することができる。
【００３４】
また、本発明を適用した連続培養装置１としては、図１に示したような構成に限定されず、図２に示すように、培養槽２と、培養槽２に接続された第２段培養槽２０とを備える構成であっても良い。すなわち、図２に示す連続培養装置１は、培養槽２と第２段培養槽２０とが配管２１を介して連結され、エタノール発酵終了後の培養液を抜き取る排出部６が第２段培養槽２０に配設されている。図２に示したような連続培養装置１においても、同様に、培養槽２及び第２段培養槽２０それぞれのキシロース濃度を測定し、キシロース濃度に基づいて添加培地の添加制御を行うことができる。
【００３５】
＜キシロース資化性を有する微生物＞
キシロース資化性を有する微生物とは、キシロース代謝能を本来的に有する微生物、キシロース代謝能を本来的に有する微生物若しくはキシロース代謝能を有しない微生物に対してキシロース代謝関連遺伝子を導入した組換え微生物のいずれも含む意味である。ここで、キシロース代謝関連遺伝子とは、キシロースイソメラーゼ遺伝子、キシロースをキシリトールに変換するキシロースリダクターゼをコードするキシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールをキシルロースに変換するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロースをリン酸化してキシルロース5-リン酸を生成するキシルロキナーゼをコードするキシルロキナーゼ遺伝子を含む意味である。なお、キシルロキナーゼにより生成されたキシルロース5-リン酸は、ペントースリン酸経路に入り代謝されることとなる。
【００３６】
より詳細に、キシロース代謝関連遺伝子のうちキシロースイソメラーゼ遺伝子（XI遺伝子）としては、特に限定されず、如何なる生物種由来の遺伝子を使用しても良い。例えば、特開2011-147445号公報に開示されたシロアリの腸内原生生物由来の複数のキシロースイソメラーゼ遺伝子を、特に制限されることなく使用することができる。また、キシロースイソメラーゼ遺伝子としては、嫌気性のカビであるピロマイセス（Piromyces）sp. E2種由来（特表2005-514951号公報）、嫌気性のカビであるシラマイセス・アベレンシス（Cyllamyces aberensis）由来、バクテリアであるバクテロイデス・セタイオタミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）由来、バクテリアであるクロストリディウム・ファイトファーメンタス由来、ストレプトマイセス・ムリナスクラスター由来の遺伝子を利用することもできる。具体的に、キシロースイソメラーゼ遺伝子としては、ヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）腸内原生生物由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子を使用することが好ましい。
【００３７】
また、キシロース代謝関連遺伝子としては、特に限定されないが、Pichia stipitis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子及びキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、Saccharomyces cerevisiae由来のキシルロキナーゼ遺伝子を挙げることができる（Eliasson A. et al., Appl. Environ. Microbiol, 66:3381-3386及びToivari MN et al., Metab. Eng. 3:236-249参照）。その他にも、キシロースリダクターゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子を利用することができる。キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を利用することができる。キシルロキナーゼ遺伝子としては、Pichia stipitis由来のキシルロキナーゼ遺伝子を利用することもできる。
【００３８】
宿主として用いることができる微生物としては、特に限定されず、麹菌などのカビや酵母、細菌等の微生物、特にアルコール発酵能を有する酵母やアルコール発酵性細菌を挙げることができる。より詳細には、麹菌としては、アスペルギルス・アキュリータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus orizae）等のアスペルギルス属が挙げられる。また、酵母としては、公知の各種酵母を利用できるが、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属の酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属の酵母、キャンディダ・シェハーテ（Candida shehatae）等のキャンディダ属の酵母、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）等のピキア属の酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属の酵母、クロッケラ属（Klocckera）の酵母、スワニオマイセス属（Schwanniomyces）の酵母及びヤロイア属（Yarrowia）の酵母、トリコスポロン（Trichosporon）属の酵母、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属の酵母、パチソレン（Pachysolen）属の酵母、ヤマダジマ（Yamadazyma）属の酵母、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）等のクルイベロマイセス属の酵母、イサトケンキア・オリエンタリス（Issatchenkia orientalis）等のイサトケンキア属の酵母が挙げられる。なかでも、工業的利用性等の観点からサッカロマイセス属酵母が好ましい。なかでも、サッカロマイセス・セレビジエが好ましい。また、アルコール発酵性細菌としては、ザイモナス属細菌、例えばZymomonas mobilisを挙げることができる。
【００３９】
また、導入するキシロース代謝関連遺伝子のプロモーターとしては、特に限定されないが、例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（HOR7）のプロモーターなどが利用可能である。なかでもピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーターが下流の目的遺伝子を高発現させる能力が高いために好ましい。
【００４０】
すなわち、上述した遺伝子は、発現を制御するプロモーターやその他の発現制御領域とともに酵母のゲノムに導入してもよい。または、上述した遺伝子は、宿主となる酵母のゲノムに本来的に存在する遺伝子のプロモーターやその他の発現制御領域により発現制御されるように導入してもよい。
【００４１】
また、上述した遺伝子を導入する方法としては、微生物の形質転換方法として知られている従来公知のいかなる手法をも適用することができる。具体的には、例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
【００４２】
＜リグノセルロース由来の糖を含む培地＞
リグノセルロース由来の糖を含む培地とは、リグノセルロースを含むセルロース系バイオマスを糖化処理することで得られる糖を含む糖化液を含む組成物を意味する。セルロース系バイオマスを糖化処理する際には、従来公知の前処理を施してもよい。前処理としては、特に限定されないが、例えば、リグニンを微生物によって分解する処理や、セルロース系バイオマスの粉砕処理等を挙げることができる。また、前処理としては、例えば、粉砕したセルロース系バイオマスを希硫酸溶液やアルカリ溶液、イオン液体に浸漬する処理、水熱処理、微粉砕処理、希酸を用いた蒸煮処理といった処理を適用しても良い。これら前処理により、バイオマスの糖化率を向上させることができる。
【００４３】
糖化処理の対象となるセルロース系バイオマスとは、セルロース繊維の結晶構造とヘミセルロース及びリグニンとの複合体を含むバイオマスを意味する。特に、セルロース繊維の結晶構造及びヘミセルロースをセルロース系バイオマスに含まれる多糖類として扱う。セルロース系バイオマスには、間伐材、建築廃材、産業廃棄物、生活廃棄物、農産廃棄物、製材廃材及び林地残材及び古紙等の廃棄物が含まれる。また、セルロース系バイオマスとしては、段ボール、古紙、古新聞、雑誌、パルプ及びパルプスラッジ等も含む。さらに、セルロース系バイオマスとしては、おが屑や鉋屑等の製材廃材、林地残材又は古紙等を粉砕、圧縮し、成型したペレットをも含む。
【００４４】
セルロース系バイオマスは、いかなる形状で使用しても良いが、いわゆるソフトバイオマスについては圧搾処理しておくことが好ましく、いわゆるハードバイオマスについては粉砕処理しておくことが好ましい。ソフトバイオマスの圧搾処理とは、ソフトバイオマスに対して所定の圧力を加えることで、バイオマスの組織を緩和・破壊する処理を意味する圧搾処理には、食品分野、農業分野で通常使用されている圧搾装置を利用することができる。また、ハードバイオマスの粉砕処理とは、例えばカッターミルなどの装置によってバイオマスを粉砕する処理を意味する。粉砕処理では、ハードバイオマスを例えば0.1〜2mm（平均径）程度に粗粉砕することが好ましい。
【００４５】
糖化処理とは、以上のようなセルロース系バイオマスに対して、セルラーゼ及び/又はセルラーゼ分泌生産能を有する微生物を作用させる処理である。糖化処理によりセルロース系バイオマスに含まれるセルロース及びヘミセルロースが、グルコース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース等の単糖（可溶糖）まで糖化される。
【００４６】
特に、以上のようにして得られる、リグノセルロース由来の糖を含む培地としては、希酸を用いた蒸煮処理（前処理の一種）を行った後のリグノセルロースを糖化処理することで得られた糖化液を含むものであるか、当該蒸煮処理を行わないリグノセルロースを糖化処理することで得られ、且つ、糖化反応における糖過分解物の濃度が４００ｐｐｍ以上、１５００ｐｐｍ以下である糖化液を含むものとすることが好ましい。ここで糖過分解物とは、５−ＨＭＦやフルフラール等を意味する。すなわち、希酸を用いた蒸煮処理を行わない場合には、リグノセルロースを糖化処理し、５−ＨＭＦやフルフラール等の合計の濃度が４００ｐｐｍ以上、１５００ｐｐｍ以下である糖化液を使用することが好ましい。なお、希酸を用いた蒸煮処理を行わない場合であっても、糖過分解物を上記濃度範囲としてもよい。
【００４７】
希酸を用いた蒸煮処理（前処理の一種）を行った後、リグノセルロースを糖化処理することで得られた糖化液を培地として使用した場合、上述したエタノール発酵を行ったときに雑菌の繁殖が長期間に亘って抑えられ、長期間の連続培養によるエタノール製造が可能となる。
【００４８】
また、希酸を用いた蒸煮処理を行わない場合であっても、４００ｐｐｍ以上の糖過分解物を含む糖化液を培地として使用した場合、エタノール発酵を行ったときに雑菌の繁殖が長期間に亘って抑えられる。さらに、糖過分解物の濃度が１５００ｐｐｍ以下である場合には、エタノール発酵におけるエタノール生産量を高く維持することができる。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５０】
〔実施例１〕
本実施例では、キシロース資化酵母（Saccharomyces cerevisiae）を用いて連続培養を行い、添加培地（リグノセルロース由来の糖を含む糖化液）の添加速度と、エタノール濃度、グルコース濃度及びキシロース濃度との関係を検討した。
【００５１】
連続発酵試験は、図１に示した連続培養装置１を使用した。本装置は、１Ｌの培養槽、ポンプ及びそれらを連結するチューブからなる。本例で使用した培養槽は、槽中程に排出口が取り付けられており、液面レベルが上がると発酵液が排出される機構となっている。添加培地（糖化液）の添加速度は、ポンプの流量により制御した。
【００５２】
<試験方法> 
[糖化液の作製]
希硫酸を使用して水蒸気爆砕処理（ネピアグラス乾燥重量の2％重量となるように硫酸を添加した上で、ネピアグラスの水分含量約70％に調整した後、190℃、9分蒸煮処理後、爆砕処理（高温高圧条件から瞬時に圧力を開放し、大気圧にする物理的粉砕方法））したネピアグラスを含む培地（ネピアグラス処理物15%（w/w（乾燥重量基準）)、セルラーゼ1.2%（w/w）及び水83.8%）を4980g仕込んだロッキングミキサー（愛知電機（株）製RM-10-3）で糖化反応を実施した。糖化条件は50℃、72時間、回転数80rpmとした。ついで、本反応液を回収し、以下の連続発酵試験に使用する糖化液とした。
【００５３】
[連続発酵試験]
上記で作製したネピアグラス由来の糖を含む培地477.3g入りの１Ｌ発酵槽に、YPD培地で増殖させたキシロース資化酵母を含む培養液を22.7g植菌し、発酵（32℃、250rpm、pH5.5）を開始した。発酵開始48時間目から上記で作製した糖化液の連続添加を開始し、同時に排出口を開くことで発酵液の排出を開始した。ここで糖化液の添加速度は、97g/h（48〜383h）、181g/h（383〜623h）、139g/h（623〜815h）とした。
【００５４】
発酵中適宜サンプリングを行い、エタノール、グルコースおよびキシロース濃度を測定した。ここで各濃度は、高速液体クロマトグラフ法（LC-10A（島津製作所製）、検出器RI、カラムAminex HPX-87H、温度30℃、移動相0.01N、流速0.6mL/min）にて測定した。結果を図３に示した。なお、本連続発酵試験に際しては、雑菌汚染は確認されず、約1か月の連続発酵運転が可能であった。
【００５５】
図３に示したように、試験期間中、エタノール、キシロース及びグルコース濃度は、糖化液の供給速度に依存し、高くするとエタノール濃度は低下、キシロース濃度が向上（グルコースはわずかに向上）し、供給速度を低くすると逆にエタノール濃度が向上、キシロース濃度は低下（グルコースはわずかに低下）することが確認された。
【００５６】
以上の結果から、培地中に含まれるキシロース濃度に基づいて、エタノール発酵の進行度合いをモニターすることができ、これに基づいて添加培地の添加制御を行うことでエタノールの生産性が向上することが示された。特に、本実施例では、培養液中のキシロース濃度が10g/L以下となるような速度で添加培地を供給することで、エタノール濃度が高い状態を維持できることが確認された。
【００５７】
〔実施例２〕
本実施例では、リグノセルロース由来の糖を含む培養液の調整方法と雑菌汚染との関係及び当該培養液に含まれる糖過分解物の濃度と雑菌汚染との関係を検証した。
【００５８】
<試験方法> 
ネピアグラスを各種条件（表1）で蒸煮処理した後、乾燥重量換算で6％の割合で水に懸濁した。なお、表１において、処理時間0分は、温度が規定に達した後、すぐに温度を下げる処理を意味する。
【００５９】
【表１】
0006303984.tif 000002
【００６０】
次に、セルラーゼを添加し、１Ｌ容器で糖化処理（pH6、55℃、75時間、900rpm）を実施した。得られた糖化液を50mL遠心チューブに入れたのち、蓋をせずに室温で放置した。その後、目視で雑菌汚染の発生有無を観察した。
【００６１】
結果を表２に示した。なお、表２における表記は以下の意味である。+：わずかに雑菌が発生、++：液面の半分が雑菌でおおわれている、+++：液面全体が雑菌でおおわれている。
【００６２】
【表２】
0006303984.tif 000003
【００６３】
表２に示すように、条件(1)(2)では4日間、(3)では1週間、(4)(5)(6)では雑菌の発生までに2週間以上の時間を要した。また、(6)では1か月で若干の雑菌の発生が確認されたがそれ以上の雑菌の増殖はなかった。以上の結果から、希酸を用いた蒸煮処理を行った後、リグノセルロースを糖化処理することで得られた培養液は、上述したエタノール発酵を行ったときに雑菌の繁殖が長期間に亘って抑えられ、長期間の連続培養によるエタノール製造が可能となることが示された。
【００６４】
また、糖化処理終了時の糖過分解物濃度は、表３に示した通りであった。なお、表３に示した数値の単位はppmである。
【００６５】
【表３】
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【００６６】
表３に示した結果から、希酸を用いた蒸煮処理を行わない場合であっても、400ppm以上の糖過分解物を含む培養液では、エタノール発酵を行ったときに雑菌の繁殖が長期間に亘って抑えられることが示された。
【００６７】
また、糖過分解物の濃度が高くなったときのエタノール生産に対する影響を検証した。先ず、表４に示した組成の培地100gを仕込んだ500mL三角フラスコ(1)〜(5)にYPD培地で増殖させたキシロース資化酵母を含む培養液を1mlずつ植菌し、発酵試験（32℃、80rpm）を開始した。発酵48時間でサンプリングを行い、エタノール濃度を測定した。ここでエタノール濃度は、高速液体クロマトグラフ法（LC-10A（島津製作所製）、検出器 RI、カラム Aminex HPX-87H、温度30℃、移動相 0.01N 硫酸、流速 0.6mL/min）にて測定した。
【００６８】
【表４】
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【００６９】
発酵48時間目のエタノール濃度を測定した結果を図４に示した。図４から分かるように、発酵阻害物となる糖過分解物（フルフラール、5HMF）の濃度が、1200ppmである三角フラスコ(3)では、エタノール発酵に何ら影響がないことが分かった。また糖過分解物濃度が1800ppmを超える三角フラスコ(4)及び(5)では、エタノールの生産性が低下するといった影響が見られた。
【００７０】
以上の結果より、希酸を用いた蒸煮処理を行わない場合であっても、糖過分解物の濃度が400ppm以上、1500ppm以下である場合には、雑菌汚染の発生を防止して長期間に亘ってエタノールの高い生産性を維持できることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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