(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流れる媒体中に浸漬された物体を選別するためのデバイス（１）であって、
流れる媒体を照射するための少なくとも部分的にコヒーレントな光源（８）、該光源（８）からの光が通過するピンホール（３２，４２，６４）、および複数のホログラフィック回折像を提供するための複数の撮像素子（２，３７，４５，２０２）を含むホログラフィック撮像ユニットと、
複数のマイクロ流体チャネル（３）を含む流体ハンドリングユニットとを備え、
マイクロ流体チャネル（３）は、流れる媒体中に浸漬された移動物体を撮像するために、対応する撮像素子（２，３７，４５，２０２）に沿って流れる媒体を案内するための撮像領域（４）を含み、
マイクロ流体チャネル（３）は、複数の出口（６）のうち選択した１つに、流れる媒体中の各物体を制御可能に方向付けるために、撮像領域の下流に配置されたマイクロ流体スイッチ（５）をさらに含み、
デバイス（１）は、撮像領域（４）のいずれかを通過する際、物体の各々について得られるホログラフィック回折像のリアルタイム特性評価に適合した処理ユニット（７）をさらに備え、
該特性評価は、少なくとも１つの所定の物体タイプの痕跡を考慮するものであり、
該処理ユニット（７）は、該特性評価に応答して、撮像領域（４）の下流にあるマイクロ流体スイッチ（５）を制御するように構成され、
ホログラフィック撮像ユニットは、複数の有効画素アレイに分割されたＣＭＯＳまたはＣＣＤのイメージセンサを含み、
各有効画素アレイは、それぞれのマイクロ流体チャネル（３）の撮像領域（４）に関連しており、
物体と撮像素子（２，３７，４５，２０２）との間の距離Ｚ１、および物体とピンホール（３２，４２，６４）との間の距離Ｚ２は、Ｚ１＞Ｚ２を満たす、デバイス（１）。
【請求項２】
イメージセンサは、複数のホログラフィック回折像を同時にかつ互いに独立して出力するように、複数の有効画素アレイからの信号を並列的に読み出すように構成された、請求項１記載のデバイス（１）。
【請求項３】
ピンホール（３２，４２，６４）は、物体から４０μｍ〜４００μｍの範囲に設置され、撮像素子（２，３７，４５，２０２）から１ｍｍ〜１０ｍｍの範囲に設置される、請求項１記載のデバイス（１）。
【請求項４】
複数のマイクロ流体チャネルの各々が、撮像領域（４）とマイクロ流体スイッチ（５）との間に配置され、リアルタイム特性評価を実施しながら、撮像領域（４）からマイクロ流体スイッチ（５）への物体の各々の転移を遅延させるための蛇行セグメントをさらに備える、請求項１〜３のいずれかに記載のデバイス（１）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分析および選別(sort)の分野に関し、詳細には、流体中の生体細胞の分析および選別の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞選別の最新の方法は、各細胞の特定の光散乱及び／又は蛍光特性に基づいて、２つ以上の容器への生体細胞の異種混合物の選別を実施するものであり、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）と、フローサイトメトリーをベースとした方法とを含む。こうした選別は、２つの段階で構成でき、例えば、第１段階がいわゆる識別(discrimination)段階であって、細胞の蛍光び／又は光散乱特性に基づいて細胞が分類され、一方、第２段階がいわゆる分別(fractionation)段階であって、流体の流れが、機械的または静電的に偏向可能な帯電液滴に分離し、液滴を異なるビン(bin)に方向転換させている。
【０００３】
ＦＡＣＳが、数多くの理由により、生物学研究者の有用な機械である。例えば、ＦＡＣＳは、単一細胞レベルの高い感度を有し、単一細胞レベルで細胞表面マーカーを検出可能であり、これは、蛍光検出の優れた感度に大きく起因している。さらにＦＡＣＳは、高いスループットの選別及び／又は計数を有し、これは母集団平均の単一細胞データを達成できる。
【０００４】
今日の高速選別システムが、最大で１０００００イベント／秒を分析できる。このスループットは、少なくとも液滴が偏向できる速度によって制限される。さらにＦＡＣＳは、多重パラメータを追跡する能力を有する。現代のＦＡＣＳ機器は、複数のレーザおよび検出器を有し、多用途のマルチスペクトル蛍光染色応用に適合している。ＦＡＣＳシステムは、インシチュ・ハイブリダイゼーション(in situ hybridization)のために、サイズ、形態(morphology)、細胞色素、タンパク質の発現レベル、蛍光プローブに基づいて細胞を識別する各種応用に用いられており、例えば、いわゆるＦｌｏｗ−ＦＩＳＨ、細胞内および細胞核のタンパク質マーカー、緑色蛍光タンパク質、ｐＨ、カルシウム染色などを介して、細胞内のゲノムの１つ以上の領域を視覚化している。この細胞選別機の特定の実施形態を、例えば、モバイルシステムの一部となって、複数の場所間で迅速に輸送することも可能であろう。
【０００５】
現代のＦＡＣＳシステムは、大きな設備サイズおよび高いコスト、異なるサンプル間の汚染、選別の一連の性質、および排出後の低い細胞生存能力という不具合を有することがある。また、選別速度、純度(purity)レート、回復(recovery)レートの間にはトレードオフ(trade-off)が存在する。特に、現代の癌および免疫学の研究において、細胞の全てを細胞選別機から最高の達成可能な純度レートで回復することが重要であろう。
【０００６】
マイクロ流体ＦＡＣＳシステムは、細胞選別に対して小型化および廃棄可能性をもたらす。マイクロ流体ＦＡＣＳシステムは、一般に、巨視的なバージョンより低速であると認識されているが（例えば、文献（Nature Vol. 441, pg. 1179）参照）、並列処理がより容易である。例えば、ＩＭＴ社（サンタバーバラ）は、小型のマイクロ機械弁を備えた３２個の並列チャネル、光学系を使用し、適切な蛍光マーカーの検出に続いて迅速な回収のために細胞を方向転換させる電磁駆動系を使用する希少な細胞精製システムを開発した。Ｃｙｔｏｎｏｍｅ社は、１４４個の同時動作マイクロ流体選別機を使用することによって、チャネル当り２０００細胞／秒の細胞選別を提供する独創性のあるマイクロ流体スイッチを組み立てた。こうしたスイッチは、２８８０００細胞／秒の選別速度に到達できるであろう。
【０００７】
米国特許出願公開第２００８／２１３８２１号は、流れる媒体中の物体を選別するためのこうしたＦＡＣＳデバイスを開示する。このデバイスは、複数のマイクロ流体チャネルを含む流体ハンドリングユニットを備え、マイクロ流体チャネルは、対応する検出器に沿って流れる媒体を案内するための検出領域と、複数の出口に、流れる媒体中の各物体を制御可能に方向付けるために、検出領域の下流に配置されたマイクロ流体スイッチとを備える。さらに、マイクロ流体スイッチを制御するための検出領域を通過する際、物体の各々について得られる検出信号のリアルタイム特性評価が記載されている。
【０００８】
インフロー(In-flow)撮像システムが知られており、例えば、米国公開第２００９／００３６８１号（Ａｍｎｉｓ）で開示されたシステムである。このシステムは、伝統的な光学系、例えば、集光レンズ、光分散素子、結像レンズ、ＣＣＤ検出器を使用し、診断目的のために流体中の細胞撮像を実施する。時間遅延積分手法が、高速移動物体の改善した画像を提供するために使用できる。これは、ここから細胞特徴が導出できる高分解能の画像が得られる。例えば、Ａｍｎｉｓシステムは、最大で４０００細胞／秒の画像化が可能であろう。
【０００９】
さらに、レンズフリーの撮像システムが知られている（例えば、文献（Lab Chip, 2009, 9, 777-787））。この文献は、レンズフリーのホログラフィック・サイトメータ(cytometer)ならびに撮像および再構築方法を開示しており、デジタル的に処理されたホログラフィック像からのより豊富なテクスチャ情報を用いて再構築された像の改善をもたらす。このシステムは、ＣＭＯＳ上に静的に存在する細胞の評価および計数のために用いられる。この文献は、チップ上の非均質セル液の同定及び／又は評価が、各細胞タイプのホログラフィック回折パターンのパターン認識をベースとして実行可能であることを論証している。この文献は、極めて高速でインフロー・撮像システムを行うレンズフリーの撮像の原理の使用を提案する。
【００１０】
しかしながら、上述したシステムは、インフローの分析および細胞選別に適していないであろう。
【００１１】
上述したレンズフリーシステムは、細胞分析のための静的なシステムである。細胞は、マイクロ流体デバイスに存在しているが、細胞はインフローではない。インフローの細胞を分析するには、異なる機構および方法が要求される。
【００１２】
上述したインフロー撮像器は、大型で伝統的な光学系を必要とし、コストが高く、高価であり、輸送に適していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、高いスループットが可能であり、調査対象の細胞間の相違の点で柔軟性があり、信頼性が高く、使用が容易で、コンパクトなインフロー細胞分析／選別システムのニーズがある。これらの特性を持つこうしたシステムは、現時点で入手できない。
本発明の実施形態の目的は、流れる媒体中の物体の高速で効率的な選別を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的は、本発明の実施形態に係る方法およびデバイスによって達成される。
【００１５】
本発明は、流れる媒体中に浸漬された物体を選別するためのデバイスに関する。該デバイスは、複数のホログラフィック回折像を提供するための複数のホログラフィック撮像素子を含むホログラフィック撮像ユニットと、複数のマイクロ流体チャネルを含む流体ハンドリングユニットとを備え、マイクロ流体チャネルは、前記流れる媒体中に浸漬された移動物体、例えば、高速移動物体を撮像するために、対応するホログラフィック撮像素子に沿って流れる媒体を案内するための撮像領域を含む。例えば、ホログラフィック撮像ユニットは、１秒当り５００個以上の通過物体、例えば、１秒当り１０００個の通過物体を撮像するように適合できる。例えば、ホログラフィック撮像ユニットは、撮像領域を１ｃｍ／ｓ以上の速度で通過する物体を撮像するように適合できる。さらに、マイクロ流体チャネルは、複数の出口のうち選択した１つに、流れる媒体中の各物体を制御可能に方向付けるために、前記撮像領域の下流に配置されたマイクロ流体スイッチと、前記撮像領域のいずれかを通過する際、前記物体の各々について得られるホログラフィック回折像のリアルタイム特性評価に適合した処理ユニットとを備え、前記特性評価は、少なくとも１つの所定の物体タイプの痕跡(signature)を考慮するものであり、処理ユニットは、前記特性評価に応答して、前記撮像領域の下流にあるマイクロ流体スイッチを制御するように構成されている。
【００１６】
本発明の実施形態に係るデバイスは、前記撮像領域の各々の上流にある流れる媒体中の各物体の検出された存在を表し、及び／又は、マイクロ流体スイッチの上流にある流れる媒体中の各物体の検出された存在を表す、同期信号を発生するための同期手段をさらに備えてもよい。処理ユニットは、同期信号に応答してリアルタイム特性評価を実施するように構成できる。同期手段は、ホログラフィック撮像素子の中に組み込んでもよい。同期手段は、マイクロ流体チャネル内に組み込んでもよい。
【００１７】
同期手段は、物体によって変調された光、例えば、物体によって反射され、または物体を通過した光を受光するための光検出器を備えてもよい。同期手段は、物体によって影響された電気信号を検出するための、少なくとも１つの電極を備えてもよい。
【００１８】
さらに、ホログラフィック撮像素子は、前記同期手段からの同期信号を受光し処理するように構成してもよい。
【００１９】
実施形態において、複数のマイクロ流体チャネルの各々が、撮像領域とマイクロ流体スイッチとの間に配置され、前記リアルタイム特性評価を実施しながら、撮像領域からマイクロ流体スイッチへの物体の各々の転移を遅延させるための蛇行(meandering)セグメントをさらに備えてもよい。
【００２０】
複数のマイクロ流体チャネルは、カスケード(cascade)状に配置してもよく、その結果、少なくとも１つの第１マイクロ流体チャネルの少なくとも１つの出口は、前記流れる媒体を少なくとも１つの第２マイクロ流体チャネルに供給する。
【００２１】
ホログラフィック撮像ユニットは、ＣＭＯＳまたはＣＣＤのイメージセンサを含んでもよい。本発明の実施形態では、撮像領域での各マイクロ流体チャネルは、ＣＭＯＳまたはＣＣＤのイメージセンサのグリッドアライメントに対してある角度で配置してもよい。処理ユニットは、流体中の物体の各々について得られる複数のホログラフィック回折像から、超分解能ホログラフィック回折像を構築するように構成してもよい。
【００２２】
さらにデバイスは、複数の蛍光画像を提供するための複数の蛍光撮像素子を含んでもよい。さらに撮像領域は、複数の蛍光撮像素子のうち対応する蛍光撮像素子に沿って流れる媒体を案内するように構成してもよい。処理ユニットは、撮像領域を通過する際、物体の各々について得られるホログラフィック回折像および蛍光画像のリアルタイム特性評価のために構成してもよい。複数の蛍光撮像素子の各々は、マルチスペクトルフィルタアセンブリを含んでもよい。複数の蛍光撮像素子の各々は、撮像領域を通過する際、物体の各々について複数の蛍光検知信号を提供するために使用できる。
【００２３】
ホログラフィック撮像素子は、流れる媒体中の物体の存在を検出し、前記検出に応答してホログラフィック回折像データを提供するように適合してもよい。
【００２４】
マイクロ流体チャネルは、前記撮像領域内に流れる媒体の中央領域に前記物体を集中させるための集束ユニットをさらに備えてもよい。
【００２５】
処理ユニットは、グラフィックス・プロセッシング・ユニット（ＧＰＵ）、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）、及び／又は特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）を備えてもよい。
【００２６】
流体ハンドリングユニットは、前記複数のマイクロ流体チャネルの少なくとも２つに渡って前記流れる媒体を分配するための入口をさらに備えてもよい。
【００２７】
複数の出口は、着脱可能なキャリアの上に物体を配置(spot)するように適合してもよい。
【００２８】
ホログラフィック撮像ユニットは、流れる媒体を照射するための、少なくとも１つの少なくとも部分的にコヒーレントなパルス光源を備えてもよい。
【００２９】
少なくとも１つの少なくとも部分的にコヒーレントなパルス光源は、レーザまたは、ピンホールと光学的に結合した発光ダイオードを備えてもよい。
【００３０】
少なくとも１つの少なくとも部分的にコヒーレントなパルス光源は、流れる媒体を異なる角度から照射するように構成された複数の光源を備えてもよい。
【００３１】
ホログラフィック撮像ユニットは、イメージセンサを備えてもよく、ここで前記ホログラフィック撮像ユニットは、光源およびイメージセンサと光学的に結合し、光の偏光を選択するように構成された少なくとも１つの偏光子を備える。
【００３２】
部分的にコヒーレントな光源は、１つまたは複数の波長を持つ光源を備えてもよい。
【００３３】
本発明の実施形態に係るデバイスにおいて、部分的にコヒーレントなパルス光源を生成するために、ピンホールアパーチャを各マイクロ流体チャネル上に配置してもよい。
【００３４】
複数の点光源を生成するために、複数のピンホールアパーチャをマイクロ流体チャネル上に配置してもよい。
【００３５】
マイクロ流体スイッチは、熱的または圧電的に駆動されるフロー偏向手段を備えてもよい。
【００３６】
マイクロ流体スイッチは、前記流れる媒体中で物体を変位させるための気泡を発生するためのマイクロヒータを備えてもよい。
【００３７】
マイクロ流体スイッチは、圧電的または熱的なアクチュエータによって調整可能な体積を有し、マイクロ流体チャネル内の物体の軌跡を変化させる流体側方チャンバ(side chamber)を備えてもよい。マイクロ流体スイッチは、外部駆動型の可動膜によって調整可能な体積を有し、マイクロ流体チャネル内の物体の軌跡を変化させる流体側方チャンバを備えてもよい。
【００３８】
マイクロ流体スイッチは、誘電泳動(dielectrophoresis)によって物体の軌跡を変化させるための交流電流駆動手段と電気的に接続された複数の電極エレメントを備えてもよい。
【００３９】
マイクロ流体スイッチは、音響放射力によって物体の軌跡を変化させるための複数の超音波トランスデューサを備えてもよい。
【００４０】
本発明はまた、生物試料からの細胞を選別するための、上述のようなデバイスの使用に関する。
【００４１】
さらに本発明は、流体中に浸漬された物体を選別するための方法に関し、該方法は、下記ステップを含む。
・前記流体の流れを複数のマイクロ流体チャネルに導入するステップ。マイクロ流体チャネルは、撮像領域を含む。
・前記撮像領域のいずれかを通過する際、物体のホログラフィック回折像を記録するステップ。
・前記撮像領域のいずれかを通過する際、前記物体の各々について得られるホログラフィック回折像をリアルタイムで特性評価を行うステップ。前記特性評価は、少なくとも１つの予め定めた物体タイプの痕跡を考慮する。
・各物体を出口に誘導(steer)するステップ。前記出口は、前記物体の前記特性評価の関数として複数の出口から選択される。
【００４２】
記録、特性評価および誘導は、複数のマイクロ流体チャネルについて並列に実施してもよい。
【００４３】
記録は、物体が撮像領域を通過しているか否かを評価することを含んでもよい。
【００４４】
記録は、撮像領域の上流にある流れる媒体中の物体の存在を検出することを含んでもよい。ホログラフィック回折像の特性評価は、前記検出された存在に応答して実施してもよい。
【００４５】
ホログラフィック回折像の特性評価は、前記ホログラフィック回折像を、関心のある物体タイプを表す少なくとも１つの保存した基準ホログラムと比較することを含んでもよい。
【００４６】
ホログラフィック回折像の特性評価は、物体間の差を識別するために、複数のホログラフィック回折像を自己相関(auto-correlation)させることを含んでもよい。
【００４７】
ホログラフィック回折像の特性評価は、撮像した物体の少なくとも部分的なデジタル空間再構築を行うことを含んでもよい。
【００４８】
本発明の実施形態に係る高速な細胞分析および選別デバイスが、インフローの細胞分析および選別に適している。調査対象の細胞間の相違の観点で柔軟性がある。それは、信頼性が高く、使用が容易で、コンパクトである。
【００４９】
本発明の実施形態の利点は、流体中の生物試料のデジタル画像を得るためのシステムおよび方法が提供されることである。生物試料は、デジタル画像に基づいて分画してもよい。
【００５０】
本発明の実施形態の利点は、流体中の物体が、例えば、単一画素の光検出とは対照的に、２次元または３次元でこれらの物体を特性評価することによって、流体中の物体の幾何形状および複雑さを考慮して分類されることである。
【００５１】
本発明の実施形態の利点は、サンプルが、リアルタイムで分画できることである。
【００５２】
本発明の実施形態の利点は、生物細胞、微生物または微生物の一部、例えば、病原体、細胞溶解物、エンドソーム、オルガネラが、異なる寸法及び／又は形態(morphology)を考慮して選別できることである。
【００５３】
本発明の実施形態の利点は、チャネル当り少なくとも１０００個／秒の物体のスループットが達成できることである。例えば、チャネル当り少なくとも２００００個／秒の細胞またはこれより高い。
【００５４】
本発明の実施形態の利点は、高いコンテントを提供でき、例えば、細胞のデジタル画像が、単一光検出器ベースの信号ではなく、ホログラフィック撮像によって得られることである。こうした高いコンテントが、正確な選別、例えば、細胞の分類のための適切な入力を提供できる。
【００５５】
本発明の実施形態の利点は、高いスループットが提供できることである。例えば、公知のマイクロ流体システム、例えば、ＦＡＣＳシステムと同程度またはこれより高い速度で細胞が処理できる。
【００５６】
本発明の実施形態の利点は、連続的なモニタリング、例えば、物体の流れの連続的な分析および選別が提供できることである。従って、多量の細胞が連続的にサンプリングでき、これは、分析中にまたは後続のプロセスおよび選別された出力の分析から得られる情報の統計的な関連性を改善できる。
【００５７】
本発明の実施形態の利点は、ホログラフィック画像から導出可能な１つ以上の特性に基づいて、細胞または他の生物試料を区別できる、ユーザ定義可能で柔軟性のある方法およびシステムが提供されることである。
【００５８】
こうした特性が、形態、サイズ、色素沈着または、例えば、最適な上皮または細胞核のマーカーから到来するもの蛍光特性に関連し得る。この柔軟性により、光学経路を適合させる必要がなく、簡単なユーザ定義のソフトウエア設定によって、細胞計数、サイズ分析、成長曲線または他の形態的分析について、システムを変更することが可能である。
【００５９】
本発明の実施形態の利点は、簡単な方法が提供され、例えば、完全に自動化され、不適切なハンドリングによって生ずる汚染及び／又は誤分析を生じさせる最小の手動操作を必要とするような、使用が容易なシステムで提供されることである。本発明の実施形態の更なる利点は、本発明の実施形態に係るデバイスに試料を導入する前に、最小のサンプル調製が必要であることである。例えば、本発明の実施形態に係るデバイスは、全血または希釈した全血に対して直接に動作できる。
【００６０】
本発明の実施形態の利点は、コンパクトなデバイスが提供されることである。例えば、既存のＦＡＣＳシステムと比べて、本発明の実施形態に係るシステムは、コンパクトで、僅かな高価なコンポーネントで構成でき、その結果、本システムは、通常のＦＡＣＳシステムでは、例えば、介護用途及び／又はバイオプロセス監視用途の点で、大きすぎたり、及び／又は高価すぎたりする状況において使用できる。
【００６１】
本発明の実施形態の利点は、例えば、公知のバイオマス分析器または細胞センサと比べて、例えば、汚染、較正問題及び／又は時間ドリフトに対して脆弱でない、信頼性のある方法およびシステムが提供できることである。さらに、システムに冗長性を追加し、インライン・モニタリングの信頼性を改善するために、複数のチャネルが使用できる。
【００６２】
本発明の実施形態の利点は、幾つかの下流分析法、例えば、選択した細胞の高分解能撮像および、選択した細胞のゲノム、プロテオームおよびメタボロミクスの内容物の分析などと適合した方法およびデバイスが提供されることである。例えば、選別される細胞の優しいハンドリングが提供でき、その結果、選別後に生存できる細胞が残り、細胞のゲノム、プロテオームおよびメタボロミクスの内容物が選別時に変化しないままである。
【００６３】
第１態様において、本発明は、流体中の細胞を分析するデバイスに関する。該デバイスは、選別される細胞を含む生物試料の流体ハンドリングのための流体ハンドリングユニットを備えてもよい。流体ハンドリングユニットは、入口を含み、画像記録システムを横切る複数の細胞フローを許容する。該デバイスは、分析される流れる試料のデジタル撮像のためのホログラフィック撮像ユニットを備えてもよい。ホログラフィック撮像ユニットは、光源およびイメージセンサを含む。該デバイスは、細胞フローの記録した画像についてのリアルタイムで並列の画像処理のためのデジタル信号処理ユニットを備えてもよい。
【００６４】
本発明の実施形態において、流体ハンドリングユニットは、複数のマイクロ流体チャネルまたはストリームを含んでもよく、各チャネルまたはストリームは撮像領域を含む。
【００６５】
本発明の実施形態において、デバイスは、細胞が撮像領域を通過する際、流体ストリームの中央に細胞を集中させるための集束ユニットをさらに備えてもよい。こうした集束ユニットは、例えば、音響的集束、流体力学的集束、誘電泳動的集束、または他の物理的原理に基づくものでもよい。選別される物体は、例えば、マイクロ流体チャネルの中心軸に沿って集束してもよい。マイクロ流体チャネルの寸法は、例えば、物体の平均サイズの１０倍未満、例えば、好ましくは、選別される物体の平均サイズの５倍未満でもよい。例えば、マイクロ流体チャネルは、選別される物体のサイズの２倍の寸法としてもよく、その中心軸にほぼ沿ってマイクロ流体チャネルを通過する物体の連続フローを提供する。
【００６６】
本発明の実施形態において、デバイスは、偏光に敏感な特徴量をフィルタリングするために、光源および検出器に対して追加される偏光子をさらに備えてもよい。
【００６７】
本発明の実施形態において、流体ハンドリングシステムの出口は、後続の分析で使用されるキャリア、例えば、更なる分析用の２Ｄ基板（マイクロスライド）またはマイクロウェルプレートの上に、細胞を配置(spot)するように構成してもよい。
【００６８】
本発明の実施形態において、光源は、部分的または完全にコヒーレントなパルス光源でもよい。
【００６９】
本発明の実施形態において、光源は、ピンホールと組み合わせた発光ダイオード（ＬＥＤ）、または流体中の試料に照射するレーザでもよい。
【００７０】
本発明の実施形態において、複数の光源が流体中の試料を種々の角度から照射してもよい。
【００７１】
本発明の実施形態において、イメージセンサは、ホログラフィック画像を記録するために構成された、ＣＭＯＳまたはＣＣＤをベースとした撮像デバイスでもよい。
【００７２】
本発明の実施形態において、デバイスは、どの画像をさらに処理するかを決定するチップ上の決定アルゴリズムをさらに含んでもよい。
【００７３】
本発明の実施形態において、イメージセンサは、流体チャネルに画素アレイを割り当ててもよく、複数のチャネルがそれ自体の画素アレイを有してもよく、これがイメージセンサの一部を形成する。
【００７４】
本発明の実施形態において、デジタル信号処理ユニットは、ＧＰＵ（グラフィックス・プロセッシング・ユニット）、ＦＰＧＡ（フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ）、ＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）、または流体中の細胞の速度でデジタルホログラムを処理できる他のプロセッサでもよい。
【００７５】
第２態様において、本発明は、流体中の細胞を分析し選別するデバイスに関する。第２態様の実施形態に係るデバイスが、選別される細胞を含む生物試料の流体ハンドリングのための流体ハンドリングユニットを備えてもよい。流体ハンドリングユニットは、入口を含み、画像記録システムを横切る複数の細胞フローを許容する。該デバイスは、選別される流れる試料のデジタル撮像のためのホログラフィック撮像ユニットを備えてもよい。ホログラフィック撮像ユニットは、光源およびイメージセンサを含む。該デバイスは、細胞フローの記録した画像についてのリアルタイムで並列の画像処理および分類（選別アルゴリズム）のためのデジタル信号処理ユニットを備えてもよい。該デバイスは、デジタル信号プロセッサの分類情報に応じて、細胞を異なるシステム出口に誘導する選別ユニットを備えてもよい。
【００７６】
本発明の実施形態において、選別ユニットは、関心のある細胞を種々の出口へ偏向させるマイクロ流体スイッチまたはノズルを備えてもよい。
【００７７】
本発明の実施形態において、スイッチまたはノズルのための駆動回路は、熱的または圧電的に駆動されるアクチュエーションをベースとしたものでもよい。
【００７８】
本発明の実施形態において、選別ユニットは、関心のある細胞を含む液体プラグを直接に偏向させるマイクロ流体スイッチを備えてもよい。
【００７９】
本発明の実施形態において、偏向は、液体を横方向に押し出す小型の膜の圧電変形によって行ってもよい。
【００８０】
本発明の実施形態において、選別ユニットは、マイクロヒータを備えてもよく、電気パルスによって生ずる液体の急速加熱が、圧力源として気泡を発生し、流体を変位させる。
【００８１】
本発明の実施形態において、細胞の異なる特性について選別を行うために、捕捉(trap)システムが使用できる。
【００８２】
第３態様において、本発明は、流体中の細胞を分析する方法に関する。該方法は、第１態様に関して説明したようなデバイスを使用してもよい。第３態様の実施形態に係る方法が、マイクロ流体チャネルを含む流体ハンドリングユニット内に、細胞の異種混合物を含む均等に希釈された流体を供給することと、細胞がマイクロ流体チャネルを通過する際、光源を用いて照明を行うことと、イメージセンサによって、細胞の散乱光応答を記録することと、散乱光応答をデジタル信号処理ユニットへ取り込むことと、デジタル信号処理ユニットを用いて、散乱光応答を分析することと、を含んでもよい。
【００８３】
本発明の実施形態において、記録ステップ、取り込みステップおよび細胞の散乱光応答の分析ステップは、複数のマイクロ流体チャネルについて並列に実施してもよい。
【００８４】
本発明の実施形態において、光源は、移動する細胞を照射してストロボ画像を撮影するためにパルス化してもよい。
【００８５】
本発明の実施形態において、該方法は、記録した散乱光応答をイメージセンサへ取り込む前に、特別な分析ステップをさらに含んでもよく、この分析ステップの結果は、どの散乱光応答を信号処理ユニットで分析するかを決定する際に用いられる信号である。
【００８６】
第４態様において、本発明は、流体中の細胞を分析し選別する方法に関する。本発明の実施形態に係る方法が、第２態様の実施形態で説明したデバイスを使用してもよい。本発明の実施形態に係る方法が、流体ハンドリングユニット内に、細胞の異種混合物を含む均等に希釈された流体を供給することと、細胞がマイクロ流体チャネルを通過する際、光源を用いて照明を行うことと、イメージセンサを用いて細胞の散乱光応答を記録することと、散乱光応答をデジタル信号処理ユニットへ取り込むことと、デジタル信号処理ユニットを用いて、散乱光応答を分類し（選別アルゴリズム）、分析することと、信号処理ユニットの分類結果に基づいて細胞を選別することと、を含んでもよい。
【００８７】
本発明の実施形態において、散乱光応答の分類は、関心のある細胞のホログラムの予め保存したライブラリを使用して、記録した回折パターンと予め保存したライブラリとの簡単な比較に基づいて、細胞を分類してもよい。
【００８８】
本発明の実施形態において、散乱光応答の分類は、相互に自己相関させた異なる記録した細胞画像を使用してもよく、これにより細胞間の差を識別する。追加の利点として、先行した情報を必要としないことである。
【００８９】
本発明の実施形態において、散乱光応答の分類は、ホログラムの完全デジタル再構築を実施してもよい。
【００９０】
本発明の実施形態において、該方法は、元の生物試料の部分集団(subpopulation)の下流分析をさらに含んでもよく、高コンテントの細胞選別機は、追加の下流分析のためのサンプル調製ステップとして使用してもよく、この下流分析は、選択した細胞のゲノムまたはプロテオームの情報を解明するために、高分解能の撮像、分子の特性評価手法、および「オーミクス(omics)」または塩基配列決定技術を含む。
【００９１】
本発明の実施形態において、デバイスは、細胞を分析または選別するだけでなく、物体を分析（または撮像）および選別するためにも使用してもよく、ここで、物体形状及び／又は回折パターンが、例えば、結晶の選別、例えば、マイクロ流体システム内に形成できるタンパク質結晶の選別、ナノ粒子の選別、例えば、多分散系の粒子サンプルの選別、ナノ粒子分析の一部であるナノ粒子の選別など、部分集団の弁別にとって重要である。
【００９２】
本発明の特定かつ好ましい態様が、添付した独立および従属の請求項に記述されている。従属請求項からの特徴は、独立請求項の特徴および他の従属請求項と適切に組み合わせてもよく、請求項に明記されたものだけに限らない。
【００９３】
本発明のこれらおよび他の態様が、以下に記載した実施形態を参照して明らかになり解明されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】本発明の実施形態に係る選別デバイスを示す。
【図２】本発明の実施形態に係るデバイスの一部の詳細図を示す。
【図３】本発明の実施形態に係るデバイスでの使用のためのＣＭＯＳバックプレーン(backplane)の設計例を示す。
【図４】本発明の実施形態に係る方法のフローチャートを概略的に示す。
【図５】本発明の実施形態に係るデバイスの一部の他の詳細図を示す。
【図６】本発明の実施形態に係る方法の応用例を示す。
【図７】本発明の実施形態に係るデバイスでのピンホールを示す。
【図８】本発明の実施形態に係る光源および撮像検出器の第１の配置例を示す。
【図９】本発明の実施形態に係る光源および撮像検出器の第２の配置例を示す。
【図１０】本発明の実施形態に係る光源および撮像検出器の第３の配置例を示す。
【図１１】本発明の実施形態に係る光源および撮像検出器の第４の配置例を示す。
【図１２】本発明の実施形態に係る光源および撮像検出器の第４の配置例のための撮像器および空間フィルタのレイアウトを示す。
【図１３】本発明の実施形態に係るデバイスのための例示の層構造を示す。
【図１４】本発明の第１態様に係るデバイスにおいて図１３に示す層構造の配置を示す。
【図１５】本発明の実施形態に係るデバイスのための第２の例示の層構造を示す。
【００９５】
請求項での参照符号は、範囲を限定するものとして解釈すべきでない。異なる図面において、同じ参照符号は、同じまたは類似の要素を参照している。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
本発明は、特定の実施形態に関して一定の図面を参照して説明するが、本発明はこれに限定されず、請求項によってのみ限定される。記載した図面は、概略的かつ非限定的なものである。図面において、幾つかの要素のサイズは、説明目的のために誇張したり、縮尺どおり描写していないことがある。寸法および相対寸法は、本発明の実際の具体化に対応していない。
【００９７】
さらに、説明および請求項での用語「第１」「第２」「第３」などは、類似の要素を区別するために使用しており、必ずしも時間的、空間的、ランキングまたは他の手法での順番を記述するためではない。ここで使用した用語は、適切な状況下で交換可能であり、ここで本発明の実施形態は、ここで説明したり図示したものとは別の順番で動作可能であると理解すべきである。
【００９８】
さらに、説明および請求項での用語「上(top)」、「下(bottom)」、「の上に(over)」、「の下に(under)」等は、説明目的で使用しており、必ずしも相対的な位置を記述するためのものでない。こうして用いた用語は、適切な状況下で交換可能であって、ここで説明した本発明の実施形態がここで説明または図示した以外の他の向きで動作可能であると理解すべきである。
【００９９】
用語「備える、含む(comprising)」は、それ以降に列挙された手段に限定されるものと解釈すべきでなく、他の要素またはステップを除外していないことに留意する。記述した特徴、整数、ステップまたは構成要素の存在を、参照したように特定するように解釈する必要があるが、１つ又はそれ以上の他の特徴、整数、ステップまたは構成要素、あるいはこれらのグループの存在または追加を除外していない。こうして表現「手段Ａ，Ｂを備えるデバイス」の範囲は、構成要素Ａ，Ｂのみから成るデバイスに限定すべきでない。本発明に関して、デバイスの関連した構成要素だけがＡとＢであることを意味する。
【０１００】
本明細書を通じて「一実施形態」または「実施形態」への参照は、実施形態との関連で記載した特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。本明細書を通じていろいろな場所での「一実施形態」または「実施形態」の語句の出現は、必ずしも全て同じ実施形態を参照していないが、そうこともある。さらに、１つ又はそれ以上の実施形態において、本発明から当業者にとって明らかなように、特定の特徴、構造または特性は、いずれか適切な方法で組み合わせてもよい。
【０１０１】
同様に、本発明の例示の実施形態の説明において、本開示を合理化し、本発明の１つ又はそれ以上の種々の態様の理解を支援する目的で、単一の実施形態、図面、または説明において、本発明のいろいろな特徴が一緒にグループ化していることがあると理解すべきである。しかしながら、この開示の方法は、請求項の発明が、各請求項で明示的に記載したものより多くの特徴を必要とするという意図を反映していると解釈すべきでない。むしろ下記の請求項が反映しているように、発明の態様は、単一の前述した実施形態の全ての特徴より少ない場合がある。こうして詳細な説明に追従する請求項は、この詳細な説明の中に明示的に組み込まれており、各請求項は、本発明の別々の実施形態として自立している。
【０１０２】
さらに、ここで説明した幾つかの実施形態が、他の実施形態に含まれる幾つかの他でない特徴を含むとともに、当業者によって理解されるように、異なる実施形態の特徴の組合せが本発明の範囲内にあって、異なる実施形態を構成することを意味する。例えば、下記の請求項において、請求した実施形態の何れも、何れの組合せで使用可能である。
【０１０３】
ここで提供した説明では、多数の具体的な詳細を説明している。しかしながら、本発明の実施形態は、これらの具体的な詳細なしで実施してもよいことは理解されよう。別の例では、本説明の理解を曖昧にしないために、周知の方法、構造、および技法は詳細には示していない。
【０１０４】
本発明の実施形態の説明においてリアルタイム処理を参照する場合、処理ステップ、例えば、典型的には処理ユニット上で実行可能であり、リアルタイム条件、例えば、処理ステップの結果を出力する動作時間の期限が課せられた方法ステップを指す。例えば、ホログラフィック回折像のリアルタイム特性評価を参照する場合、特性評価は、時間内の特定ポイント前、例えば、選別される物体が撮像領域からマイクロ流体チャネルを通ってマイクロ流体スイッチへ移動した時間の前に確立すべきである。その結果、このスイッチは時間内に駆動され、特性評価の結果によって決定された所望の方向に物体を誘導する。
【０１０５】
第１態様において、本発明の実施形態は、流れる媒体中に浸漬された物体を選別するためのデバイスに関する。こうしたデバイスは、ホログラフィック撮像ユニットを備え、これは、複数のホログラフィック回折像を提供するための複数のホログラフィック撮像素子を含む。デバイスは、流体ハンドリングユニットをさらに備え、これは、複数のマイクロ流体チャネルを含む。各マイクロ流体チャネルは、対応するホログラフィック撮像素子に沿って流れる媒体を案内し、流れる媒体中の移動物体を撮像するため、例えば、媒体中の高速移動物体を撮像するための撮像領域を含む。各マイクロ流体チャネルはまた、複数の出口のうち選択した出口に、流れる媒体中の各物体を制御可能に方向付けるために、撮像領域の下流に配置されたマイクロ流体スイッチを含む。
【０１０６】
デバイスはまた、撮像領域のいずれかを通過する際、物体の各々について得られたホログラフィック回折像のリアルタイム特性評価に適合した処理ユニットを備え、この特性評価は少なくとも１つの所定の物体タイプの痕跡を考慮する。さらに処理ユニットは、この特性評価に応答して、撮像領域の下流にあるマイクロ流体スイッチを制御するように適合している。好都合には、流れる媒体中に浸漬された物体を選別するデバイスはまた、撮像領域の各々の上流に流れる媒体中の各物体の検出された存在を表す同期信号、例えば、トリガー信号を発生するための同期手段を備えてもよい。処理ユニットは、この同期信号に応答してリアルタイム特性評価を実施するように構成でき、例えば、処理ユニットは、この同期信号に応答してリアルタイム特性評価を実施するように適合できる。
【０１０７】
図１の概略図および図２と図５の詳細図を参照して、本発明の実施形態に係るデバイス１を図示している。このデバイス１は、流れる媒体、例えば、生物試料中に浸漬された物体、例えば、選別すべき生物細胞を選別するように適合している。これらの物体は、例えば、少なくとも２つのタイプの物体、例えば、白血球と赤血球を含み、これらは寸法的および形態(morphology)的な特性評価に基づいて区別できる。こうしたデバイスは、レンズフリーの撮像および高速画像処理に基づいて、移動する物体、例えば、細胞から１つ以上の特性評価を決定できる。例えば、調査対象の物体の選別が、レンズフリーのホログラフィック画像から計算された特性による物体の分類に基づくものでもよい。デバイスは、リアルタイムで処理したホログラフィック画像に基づいて高速で物体、例えば、細胞を選別してもよい。
【０１０８】
デバイス１は、ホログラフィック撮像ユニットを備え、これは、複数のホログラフィック回折像を提供するための複数のホログラフィック撮像素子２を含む。ホログラフィック撮像ユニットは、イメージセンサ、例えば、ＣＭＯＳまたはＣＣＤのイメージセンサを含んでもよい。例えば、ホログラフィック撮像ユニットは、ホログラフィック撮像素子２に区分されたＣＭＯＳイメージセンサを備えてもよく、各ホログラフィック撮像素子２は、例えば、ＣＭＯＳ画素アレイ、例えば、６×６画素アレイまたは１２８×１２８画素アレイを含む。しかしながら、本発明の実施形態はこれらの寸法に限定されない。ＣＭＯＳまたはＣＣＤのイメージセンサは、例えば、マイクロ流体チャネルを通過する単一物体のホログラフィック回折像を、例えば、高い撮影レート、例えば、１０００フレーム／秒より大きい、例えば、２０００フレーム／秒またはこれ以上で記録するように適合してもよい。
【０１０９】
こうしてイメージセンサは、ホログラフィック画像を記録するように構成されたＣＭＯＳまたはＣＣＤベースの撮像器でもよい。イメージセンサ上の有効画素エリアが、流体ハンドリングユニットを通って流れる物体、例えば、細胞の画像を記録するために使用できる。有効画素エリアは、例えば、細胞がマイクロ流体チャネル３の撮像領域４を通過する際に、細胞の散乱光応答を記録するセンサエリアとして定義できる。画素アレイは、マイクロ流体チャネル３からの予め定めた距離に位置決めできる。画素アレイは、一例では、チップ、例えば、シリコンチップなどの半導体チップの一部を形成してもよい。こうしたチップはまた、例えば、集積化の方法で例えば、図３に示すように、他の機能を備えてもよい。一例では、チップは、ある面内に位置決めされ、マイクロ流体は、ある面内に位置決めされ、ここで２つの面は一致していない。イメージセンサは、有効画素アレイに分割され、各画素アレイは、各マイクロ流体チャネル３の撮像領域４に関連している。イメージセンサは、画素アレイの並列読み出しに適合してもよく、例えば、ホログラフィック回折像がホログラフィック撮像素子２によって同時にかつ互いに独立に供給される。イメージセンサは、画素アレイの並列読み出しのための読み出し回路を備えてもよく、各画素アレイが独立して読み出し可能である。従って、処理ユニット７は、ほぼ平行な異なる画素アレイによって供給されたホログラフィック画像を処理できる。一例では、イメージセンサは、高い分解能が得られるように可能な限り小さい画素サイズを有し、可能な限り大きい画素当りのビット数で、可能な限り迅速な読み出しを有するように選択される。イメージセンサは、上記特性の適切な組合せを有するように選択してもよい。
【０１１０】
本発明の実施形態において、撮像領域４は、ＣＭＯＳまたはＣＣＤのイメージセンサのグリッドアライメントに対してある角度、例えば、例えば１°〜４４°の範囲の角度、例えば５°〜３０°の範囲の角度、例えば１０°〜２０°の範囲の角度で配置できる。こうした実施形態では、処理ユニット７は、流体中の物体の各々について得られる複数のホログラフィック回折像から、超分解能ホログラフィック回折像を構築するように適合してもよい。並進(translation)している同じ物体に関連した多重画像での情報を組み合わせることによって、こうした超分解能画像、例えば、ＣＭＯＳまたはＣＣＤのイメージセンサによって取得可能な単一像分解能の２倍の空間分解能を有する画像を得るための方法が知られている。イメージセンサのグリッドアライメントとマイクロ流体チャネルの撮像領域との間の角度は、他方の画像、例えば、次の撮影した画像に対して一方の画像内に撮像した流体中の物体のシフトを誘導してもよい。このシフトは、全ての撮像グリッド軸に沿って非ゼロ成分を有している。
【０１１１】
本発明の実施形態において、デバイス１は、撮像領域４の各々の上流に流れる媒体中の各物体の検出された存在を表し、及び／又は、マイクロ流体スイッチ５の上流に媒体中の各物体の検出された存在を表す同期信号、例えば、トリガー信号を発生するための同期手段を備えてもよい。処理ユニット７は、前記同期信号に応答して、例えば、撮像領域４の各々の上流における検出された存在に応答して、リアルタイム特性評価を実施するように構成できる。この同期手段は、物体によって変調された光、例えば、物体によって反射した光または物体を透過した光を受けるための光検出器を備えてもよい。例えば、こうした光検出器は、変調され、例えば、物体がマイクロ流体チャネルを通過する際に減少した光強度の検出に応答して、同期信号を発生してもよい。同期手段は、代替または追加として、前記物体によって影響された電気信号を検出するために、例えば、物体がマイクロ流体チャネルを通過する際、インピーダンスの変化を検出するために、少なくとも１つの電極を備えてもよい。さらに、同期手段は、ホログラフィック撮像素子の中に組み込んでもよく、例えば、同期手段は、ホログラフィック撮像素子内の画素、例えば、対応する撮像領域の上流に設置されたホログラフィック撮像素子内の画素を含んでもよい。同期手段はまた、マイクロ流体チャネル３内に組み込んでもよく、例えば、マイクロ流体チャネルの壁に配置された少なくとも１つの電極を備えてもよい。
【０１１２】
これらの同期手段の利点は、簡単で計算効率の良い検出が実施でき、流体浮遊した物体を分類するための処理ユニット７の計算負荷を低減できることである。
【０１１３】
これらの同期手段はまた、この物体の存在が検出された場合、物体の速度及び／又は加速度に関連した情報を提供するための少なくとも１つのフロー監視デバイスを備えてもよい。例えば、マイクロ流体チャネルにおいて流量(flow)測定を実施してもよく、または、ポンプ位相検出を行ってもよく、撮像領域及び／又はマイクロ流体スイッチでの物体の到着時間が予測できる追加の情報を提供できる。こうして、例えば、時間依存のポンプ効率によって生ずるフロー速度の変化を、各物体の撮像および選別の正確な同期のために考慮してもよい。
【０１１４】
本発明の実施形態において、ホログラフィック撮像素子２は、同期手段からの同期信号を受信するように適合してもよい。例えば、本発明の実施形態において、ホログラフィック撮像素子２は、流れる媒体中の物体の存在を検出するように、そして、こうした検出に応答してホログラフィック回折像データを供給するように適合してもよい。こうしてＣＭＯＳイメージセンサ上の集積回路が、検出基準を繰り返し評価し、例えば、同期信号を評価し、例えば、画像強度閾値を評価することによって、ホログラフィック撮像素子の視野における物体の存在を検出でき、そして、こうした基準を満足した場合、ホログラフィック撮像素子から得られた画像データを処理ユニット７に送信してもよい。こうした実施形態の利点は、簡単で計算効率の良い検出が局所的に実施でき、流体浮遊した物体を分類するための処理ユニット７の計算負荷を低減できることである。
【０１１５】
例えば、処理ユニット７、例えば、コンピュータシステムまたは専用の集積回路デバイスなどのデジタル処理ユニットによって、どの画像をさらに処理すべきかを決定するために、決定アルゴリズムをホログラフィック撮像ユニット上、例えば、撮像器チップ上に実装してもよい。例えば、記録を行ったときに撮像領域４に細胞が存在しない場合、幾つかの画像が細胞応答を含まないことから、これらはハンドリングに有用でなく、これらの画像を廃棄する直接の決定機構が、撮像および選別をかなり促進できる。
【０１１６】
本発明の第１態様の実施形態に係るデバイス１において、複数のマイクロ流体チャネルの各々が、撮像領域４とマイクロ流体スイッチ５との間に配置され、リアルタイム特性評価を実施しながら、撮像領域４からマイクロ流体スイッチ５への物体の各々の転移を遅延させるための蛇行(meandering)セグメントをさらに備えてもよい。こうして処理時間オーバーヘッドを考慮することができ、その結果、マイクロ流体スイッチ５は、選別される物体の特性評価に従って時間制御できる。
【０１１７】
ホログラフィック撮像ユニットは、流れる媒体を照射するための、少なくとも１つの少なくとも部分的にコヒーレントなパルス光源８をさらに備えてもよい。この少なくとも１つの少なくとも部分的にコヒーレントなパルス光源８は、レーザを備えてよい。代替として、この少なくとも１つの少なくとも部分的にコヒーレントなパルス光源８は、ピンホールと光学的に結合した、発光ダイオード（ＬＥＤ）またはレーザ光源、例えば、レーザダイオードを備えてもよい。例えば、複数のホログラフィック撮像素子の各々が、対応する光源８を有してもよく、その結果、マイクロ流体チャネルの対応する撮像領域に存在する場合、光源が放出した光が、選別される物体と相互作用する。こうした物体と相互作用した後の光（物体ビーム）と、光源が放出した光の基準部分（基準ビーム）、例えば、物体と相互作用することなく物体を通り過ぎた部分との間の干渉が、ホログラフィック干渉パターンをホログラフィック撮像素子２の撮像面に生じさせる。この干渉パターンから、本発明の実施形態によれば、この物体についての情報、例えば、予め定めたタイプのこうした物体の分類が取得できる。
【０１１８】
少なくとも１つの少なくとも部分的にコヒーレントなパルス光源８は、ほぼ単色でもよいが、少なくとも１つの少なくとも部分的にコヒーレントなパルス光源８は、多波長の少なくとも部分的にコヒーレントなパルス光源を含んでもよく、例えば、２つ以上の波長の少なくとも部分的にコヒーレントな光を、例えば、４つの波長で放出してもよい。こうして少なくとも部分的にコヒーレントな光源は、１つまたは複数の波長、例えば、複数の離散した波長を持つ光源を含んでもよい。
【０１１９】
少なくとも１つの少なくとも部分的にコヒーレントなパルス光源８は、流れる媒体を種々の角度から照射するように構成された複数の光源、例えば、レーザダイオードまたは発光ダイオードを含んでもよい。こうした複数の光源は、回折パターンに含まれる３Ｄ情報を改善できる。
【０１２０】
さらに、ホログラフィック撮像ユニットは、光源およびイメージセンサと光学的に結合し、光の偏光を選択するための少なくとも１つの偏光子を備えてもよい。こうした偏光子は、偏光に敏感な特徴量をフィルタリングするために、光源およびイメージセンサに対して追加してもよい。
【０１２１】
実施形態において、少なくとも１つの少なくとも部分的にコヒーレントなパルス光源８は、レンズ無しの撮像構成に配置してもよい。少なくとも部分的にコヒーレントなパルス光源８で放出された光をコリメート（平行化）するために、ピンホールアパーチャをマイクロ流体チャネルに配置してもよい。少なくとも１つの少なくとも部分的にコヒーレントなパルス光源は、各マイクロ流体チャネルに配置されたピンホール、例えば、マイクロ流体チャネルの壁に設けた透明なピンホール窓を含んでもよい。
【０１２２】
レンズ無しの撮像構成の利点は、高密度の集積化、例えば、単一のコンパクトなデバイスでの多数マイクロ流体チャネルの並列化が達成できることである。ピンホールアパーチャ配置の利点は、流体中の物体を短い距離から照明する略点状光源を達成でき、例えば、マイクロ流体チャネルの壁から放出され、点状光源に類似した空間光分布を達成できることである。こうした点状光源と撮像物体との間の短い距離が特に有利である。大きなポイントズーム率を達成できるからである。例えば、物体から４０μｍ〜４００μｍの範囲に設置され、そして、撮像器から１ｍｍ〜１０ｍｍの範囲、例えば、２ｍｍ〜５ｍｍの範囲に設置されたこうした点状光源を使用することによって、散乱光と基準ビームとの間の角度が減少する。こうして同じ散乱パターンが、ほぼ平坦な波面を形成する光と比較して、点状光源ではかなり幅広いフリンジを持つ干渉パターンが得られるようになる。このため、より多くの情報を記録でき、例えば、フリンジパターンは、光散乱物体について多くの情報を提供する。好都合には、例えば、１０〜２５の範囲のズーム率を有するズーム効果が得られる。
【０１２３】
図７は、こうしたピンホール配置を示す。ほぼ平坦な波面３１、例えば、コリメートビームまたは遠く離れたピンホールからの単色光が、ピンホール３２によってコリメートされる。このピンホール３２は、撮像物体３３からの距離Ｚ２、例えば、マイクロ流体チャネルの中心軸からの距離Ｚ２に配置でき、この中心軸に沿って媒体３４内の流体中の物体が集束されている。そして、ピンホール３２によってコリメートされた光は物体３３と相互作用して、撮像器に入射する。この撮像器は、物体３３からの距離Ｚ１、例えば、マイクロ流体チャネルの中心軸からの距離Ｚ１に配置される。この場合、Ｚ１＞Ｚ２が成立する。物体によって散乱した光３５は、基準ビームとして働く透過光３６、例えば、媒体３４をほぼ無変調で通過した光と相互作用し、干渉パターン３８を撮像器３７の上に形成する。
【０１２４】
物体およびピンホールがアライメント状態にある場合、ピンホール下方のカメラ上のフリンジは、典型的には、より遠くにあるフリンジより幅広い形状で、より高い強度を有する。従って、撮像器は、適合した画素構成を有してもよく、例えば、ピンホールとアライメントした撮像器の位置でより低い空間分解能を有し、撮像器のエッジでより高い空間分解能を有することができる。こうした画素配列は、図７において箱(boxes)として図示した、撮像器３７の画素で示している。さらに、フリンジパターンの強度は、中央からの距離が大きくなるほど低くなるため、撮像器は、これらの画素がより感度が高くなるように設計してもよい。こうして画素の完全な量子化スケールが、内側フリンジと外側フリンジの両方について使用できる。
【０１２５】
図８を参照して、２つの少なくとも部分的にコヒーレントな光源のための例示の配置を示している。２つの発光器４１、例えば、レーザが、例えば、光ファイバ４３およびファイバコリメータ４４を通して２つのピンホール４２と光学的に結合している。さらに、撮像器４５には、チェッカーボード状のフィルタを設けてもよく、その結果、画素が第１発光器および第２発光器に対して交互に同調している。こうして物体４６の２つの側方照射ホログラムが同時に取得できる。
【０１２６】
図９において、２つの少なくとも部分的にコヒーレントな光源のための他の例示の配置を示している。２つの発光器４１、例えば、レーザが、１つのピンホール４２と光学的に結合している。ここで、撮像器４５にもチェッカーボード状のフィルタを設けてもよく、その結果、画素が第１発光器および第２発光器に対して交互に同調している。こうして異なる基準ビーム波長に対応して、物体４６の２つのホログラムが同時に取得できる。
【０１２７】
図１０において、２つの少なくとも部分的にコヒーレントな光源のための第３の例示の配置を示している。発光器４１のうちの１つ、例えば、レーザが、１つのピンホール４２と光学的に結合しており、一方、他の発光器は、ファイバコリメータ４４によってコリメートされている。ここで、撮像器４５は、ホログラフィック撮像部４８と、蛍光撮像部４９とを備え、蛍光撮像部には、ハイパースペクトル(hyperspectral)フィルタ４７が設けられ、対応する画素によって種々の蛍光波長に対応した信号が得られるようにしている。
【０１２８】
１つの少なくとも部分的にコヒーレントな光源のための第４の例示の配置を図１１に示している。ここで、ピンホール４２が幅広い照射野を提供し、物体４６は、マイクロ流体チャネルに沿って移動しながら、撮像器４５の第１撮像部および第２撮像部によって撮像されることになる。これらの撮像部は、２つの対応するスペクトルフィルタ５１，５２と適合しており、各撮像部は、異なる蛍光波長に対応した画像が得られる。さらに、図１２に示すように、これらの異なるスペクトルフィルタ５１，５２によって覆われていない撮像器の一部を残すことによって、ホログラフィック回折像が、覆われていない撮像器４５のエリア５４によって得られる。
【０１２９】
本発明の一実施形態によれば、撮像器は、スナップショットハイパースペクトル撮像器であり、撮像器は、少なくとも２つのスペクトルフィルタ（例えば、タイル状のレイアウト）を含む。本発明の実施形態の利点として、異なるスペクトルデータが、単一画像を得ることによって取得可能であり、こうして細胞選別のスループットを増加させる。大きなエリアの高分解能画像を製作するために、我々は、ピンホールの上方にある光ファイバによって別個に駆動可能である、近接した間隔のピンホールのアレイを製作することを提案する。このタイプの配置を図３に示す。
【０１３０】
本発明の実施形態において、デバイス１は、複数の蛍光画像を供給するための複数の蛍光撮像素子をさらに備える。さらに、撮像領域４は、この複数の蛍光撮像素子のうち対応する蛍光撮像素子に沿って流れる媒体を案内するように適合してもよい。例えば、両方とも撮像領域４に対応したホログラフィック撮像素子および蛍光撮像素子は、同じＣＭＯＳまたはＣＣＤのイメージセンサ上に集積化してもよく、あるいは、両方とも同じＣＭＯＳまたはＣＣＤのイメージセンサ領域上に集積化してもよい。
【０１３１】
処理ユニット７は、前記撮像領域４を通過する際、物体の各々について得られるホログラフィック回折像および蛍光画像のリアルタイム特性評価に適合してもよい。例えば、撮像した物体の特性評価は、例えば、高い特異性を持つ物体の分類が有利に得られるように、回折像および蛍光画像の両方の情報を考慮して実施してもよい。
【０１３２】
例えば、撮像領域４は、マイクロ流体チャネル内の流れ方向に沿って２つの撮像ゾーンに分割してもよく、物体が、第１ゾーンでホログラフィック回折撮像の対象となり、第２ゾーンで蛍光撮像の対象となり、逆も同様に、第１ゾーンで蛍光撮像の対象となり、第２ゾーンでホログラフィック回折撮像の対象となる。蛍光撮像は、単一の蛍光痕跡(signature)を検出することに限定してもよいが、マルチスペクトルまたはハイパースペクトルの蛍光検出を含んでもよい。複数の蛍光撮像素子の各々は、マルチスペクトルフィルタアセンブリを含んでもよい。例えば、各蛍光撮像素子は、複数の撮像画素を含んでもよく、少なくとも１つの第１撮像画素には第１波長フィルタが設けられ、少なくとも１つの第２撮像画素には第２波長フィルタが設けられ、そして、少なくとも１つの第１撮像画素および少なくとも１つの第２撮像画素は、異なる波長範囲で放出される蛍光信号を検出するように適合している。複数の蛍光撮像素子の各々は、前記撮像領域を通過する際、前記物体の各々について複数の蛍光検知信号を供給するために使用でき、例えば、各蛍光検知信号は異なる波長範囲に対応している。
【０１３３】
蛍光撮像およびホログラフィック回折撮像は、マイクロ流体チャネルの撮像領域における物体の改善した分類のために組み合わせてもよい。例えば、単一段階選別が、ホログラフィック回折撮像および蛍光撮像の両方をベースとしてもよく、カスケード配置では、例えば、第１マイクロ流体チャネルでは、物体が第１基準に従って選別され、第２マイクロ流体チャネルでは、第１基準に従って既に選別された物体の部分セット(subset)が第２基準に従ってさらに選別され、カスケードの第１段階が、ホログラフィック回折撮像に基づいて選別を実施でき、カスケードの更なる段階が蛍光撮像に基づいて選別を実施できる。
【０１３４】
デバイスは、流体ハンドリングユニットをさらに備え、これは複数のマイクロ流体チャネル３を含む。本発明の実施形態において、流体ハンドリングユニットは、この複数のマイクロ流体チャネル３のうちの少なくとも２つに渡って、好ましくは、多数のこれらのマイクロ流体チャネルに渡って、流れる媒体を分配するための入口９をさらに備えてもよい。例えば、入口９が、１０個より多い並列マイクロ流体チャネルに渡って、例えば、２０個以上の並列マイクロ流体チャネルに渡って、より好ましくは、１００個より多い並列マイクロ流体チャネル、例えば、１０００個より多い並列マイクロ流体チャネルに渡って、流れる媒体を分配してもよい。この複数のマイクロ流体チャネル３は、単一の集積マイクロ流体チャネルに、例えば、単一チップ上に集積してもよく、その結果、流体浮遊した多数の物体が、本発明の第２態様の実施形態に係るデバイス１によって並列的に選別できるとともに、こうしたデバイス１は、コンパクトのままであり、先行技術で知られている標準のマイクロ流体チップ設計方法によって生産するのが容易である。例えば、本発明の一実施形態において、イメージセンサは、マイクロ流体チャネル３ごとに専用の画素アレイを有してもよく、多重チャネルがそれ自体の画素アレイを有してもよく、これはイメージセンサの一部を形成する。
【０１３５】
本発明の一実施形態において、ホログラフィック撮像ユニット、例えば、イメージセンサは、異なるホログラフィック撮像素子２、例えば、イメージセンサの画素アレイ上にある異なるマイクロ流体チャネル３から到来する異なる散乱光応答に露光してもよい。イメージセンサは、画素ブロックが細胞の流れを撮像するように割り当てられ、多重ブロックが細胞の多重の流れを並列で撮像できるように、配置できる。本発明の一実施形態において、典型的な画素アレイが、６４×６４画素または１２８×１２８画素を有してもよい。ホログラフィック回折パターン、例えば、ホログラムの必要な分解能に応じて、このアレイは、より大きくても、より小さくてもよい。
【０１３６】
前記複数のマイクロ流体チャネル３はまた、カスケードで配置してもよい。例えば、図１に概略図で示すように、少なくとも１つの第１マイクロ流体チャネル３の少なくとも１つの出口６は、流れる媒体を、少なくとも１つの第２マイクロ流体チャネル３の中に供給する。例えば、カスケード式の流体ハンドリングユニットが、例えば、１０００個の並列マイクロ流体チャネルを含み、粗い選別（例えば、赤血球と白血球を選別、またはリンパ球と他の白血球を選別）を実施するための第１選別段階と、例えば、２０個のマイクロ流体チャネルを含み、更なる差別化を実施するための第２選別段階とを含んでもよい。粗い選別が、例えば、血液サンプルから赤血球を選別してもよく、他の細胞を第２選別段階に供給してもよく、第２選別段階は、例えば、白血球及び／又は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を選別する。
【０１３７】
例示の実施形態において、極めて希少な細胞を分類する場合、第１の粗い選別を１つの特性に基づいて行い、そして第２、第３等を行うカスケードシステムを使用してもよい。本発明の第２態様の一実施形態において、第１システムが、極めて迅速に達成できる情報、例えば、閾値と比較できる、画素アレイ上の全体積分強度または、単一画素光検出器によって記録された強度などに基づいて、赤血球から白血球を粗く選別する多くのチャネル、例えば、１０００個のチャネルを備えてもよい。第２捕捉(trap)システムは、異なる亜型(subtype)の白血球を識別し、極めて希少な細胞、例えば、循環腫瘍細胞または幹細胞を取り出せるより少ないチャネルを備えてもよい。
【０１３８】
本発明の第１態様または第２態様の一実施形態において、流体ハンドリングユニットは、複数のマイクロ流体チャネル３を備えてもよく、それぞれが多数の細胞を、対応するホログラフィック撮像素子２を通過させる。
【０１３９】
各マイクロ流体チャネルが、流れる媒体中にある物体を撮像するために、対応するホログラフィック撮像素子に沿って流れる媒体を案内するための撮像領域４を備えてもよい。従って、流体ハンドリングユニットは、ホログラフィック撮像ユニット、例えば、画像記録システムを横切る物体、例えば、細胞の複数の流れを許容してもよい。こうした各チャネル３が、流体中の物体、例えば、細胞の撮像を実施し、続いて撮像データが処理ユニット７に送信できるような撮像領域４を備えてもよい。
【０１４０】
各マイクロ流体チャネル３が、複数の出口６のうち選択した出口に、流れる媒体中の各物体を制御可能に方向付けるために、例えば、処理ユニット７、例えば、デジタル信号プロセッサによって提供された分類情報に応じて、物体、例えば、細胞を異なるシステム出口に誘導するために、撮像領域４の下流に配置されたマイクロ流体スイッチ５を備えてもよい。マイクロ流体スイッチ５は、物体、例えば、関心のある細胞を異なる出口へ偏向させてもよく、ここで、スイッチが物体を誘導する駆動回路は、任意の適切な手法、例えば、熱的または圧電的に駆動されるアクチュエーションをベースとしたものでもよい。
【０１４１】
インクジェットプリンタヘッドを含む異なる目的のための液滴ベースのスイッチが知られている。こうしたスイッチが、流体選別の目的に充分に高速なものに最適化でき、例えば、生物細胞選別での特定応用では、秒当り少なくとも１０００個、そして２００００個に近い細胞が選別できる。今日の最新のプリンタヘッドは、ノズル当り３００００個／秒までの液滴を形成、誘導、印刷できる。しかし、スイッチの際、生存可能であることが必要な細胞が受ける機械力のため、駆動のための最大印加可能駆動力の意味における境界条件は、液滴と細胞とで異なる。市販のプリンタを用いた細胞プリンティング(printing)の成功は、幾つかの研究者グループに、細胞プリンティング手法を開始する動機を与えた。液滴の駆動は、流れる細胞と同期させて、各液滴が、選別される細胞を含み、正しい出口に誘導されるようにする必要がある。
【０１４２】
マイクロ流体スイッチ５は、熱的または圧電的に駆動されるフロー偏向手段を備えてもよい。例えば、マイクロ流体スイッチ５は、関心のある細胞を含む液体プラグ(plug)を直接に偏向させてもよい。こうしたマイクロ流体スイッチ５は、小さな膜の圧電変形の原理を使用し、粒子または細胞が他の出口に向けて移動するように液体を側方へ押すようにしてもよい。３０００個／秒の細胞のインラインマイクロ流体選別がこの原理を用いて論証されている。
【０１４３】
マイクロ流体スイッチ５は、圧電的または熱的なアクチュエータによって調整可能な体積を有し、マイクロ流体チャネル内の物体の軌跡を変化させる流体側方チャンバを備えてもよい。マイクロ流体スイッチ５は、外部駆動型の可動膜によって調整可能な体積を有し、マイクロ流体チャネル内の物体の軌跡を変化させる流体側方チャンバを備えてもよい。
【０１４４】
マイクロ流体スイッチ５は、流れる媒体中で物体を変位させるための気泡を発生するためのマイクロヒータ１０を備えてもよい。こうしたマイクロヒータは、圧力源として気泡を発生する電気パルスによって生ずる液体の急速加熱を行ってもよい。こうした手法の利点は、簡単で高速なマイクロ流体スイッチングを実施できることである。例えば、文献（Sensors and Actuators B 117 (2006) 523-529 and in Dynamics in microfluidic systems with microheaters, Technical Proceedings of the 1999 Conference on Modelling and Simulation of Microsystems）で報告されたように、気泡が数マイクロ秒で発生できる。圧力によって生ずるこうした気泡および流体変位の核生成(nucleation)が、細胞を含む液体プラグを特定の方向に所望の速度で誘導するのに充分に高速である。この原理は、文献（Sensors and Actuators B 117 (2006) 523-529）において、２０マイクロメータのマイクロ球体の成功した選別を論証するために用いられており、異なる出口方向での単一細胞の選別が論証されている。ここでも、液体変形のアクチュエーションが、選別される細胞と完全に同期させることが必要であろう。
【０１４５】
実施形態において、マイクロ流体スイッチ（５）は、誘電泳動（ＤＥＰ： dielectrophoresis）によって物体の軌跡を変化させるための交流電流駆動手段と電気的に接続された複数の電極エレメントを備えてもよい。こうした誘電泳動をベースとした選別が知られている。例えば、ＤＥＰ操作において、例えば、交流電流ポテンシャル場を通って移動することによって不均一の電界中での分極効果によって、インパルスモーメントが電荷中性物質の物体に付与できる。
【０１４６】
代替として、マイクロ流体スイッチ５は、音響放射力によって物体の軌跡を変化させるための複数の超音波トランスデューサを備えてもよい。
【０１４７】
出口６は、着脱式のキャリア、例えば、２Ｄ基板（例えば、マイクロスライド）、またはマイクロウェルプレートの上に、物体を配置するように構成してもよい。例えば、並列に配置された複数のマイクロ流体チャネル３の対応する出口６が、出力チャネル１１と接続されてもよく、これは、選別された物体を後続の分析用のキャリア上に堆積させるための対応するスプレーノズルに送り込んでもよい。
【０１４８】
本発明の実施形態において、マイクロ流体チャネル３は、撮像領域４内に流れる媒体の中央領域に物体を集中させるため、例えば、これらの物体を撮像領域内でのフローの中央断面エリアに集束させるための集束ユニット１２をさらに備えてもよい。こうして集束ユニットは、撮像領域を通過する際に、生体細胞などの物体を流体システムの中央に集中させる。こうした集束の利点は、画像記録が、同じタイプの複数の物体についてより均等になり、例えば、標準化できることである。こうした集束方法が、多くのＦＡＣＳおよびマイクロ流体システムにおいて使用されており、光源、例えば、レーザの前方において細胞のアライメントを改善し、典型的には、選別の感度および精度を改善する。こうした集束ユニットは、任意の適切な集束手法、例えば、音響的集束、流体力学的集束、誘電泳動的集束、または他の物理的原理に基づくものでもよい。一例として、図面では流体力学的集束を示したが、本発明の実施形態はこれに限定されない。
【０１４９】
本発明の実施形態に係るデバイスの例示の実装を図１３に示しており、これは半導体プロセス技術によって製造できる。ここで、基板６１、例えば、シリコン基板の上に、熱ヒータ用の金属導体６２、接合パッド６３、およびピンホールを形成するための金属コリメータエレメント６４が第１プロセス工程で絶縁層６５内に設けられる。第２プロセス工程において、マイクロ流体チャネル６６は、ポリマースペーサを用いて、またはポリマースペーサとカバーガラス６７との組合せによって形成できる。光をピンホールに投射するための開口が、シリコンの裏面エッチング、例えば、ＫＯＨ裏面エッチング処理によって設けられる。
【０１５０】
図１４は、本発明の第１態様に係るデバイスにおける図１３の半導体デバイスを示しており、金属コリメータエレメント６４で形成されたピンホールに光を結合させるための発光器４１を含む。イメージセンサ４５は、マイクロ流体チャネルの壁、例えば、カバーガラス６７から適切な距離で配置される。
【０１５１】
図１５は、ガラスウエハ基板６１の上における他の例示の実装を示す。ピンホールは、基板の裏面に配置されたコリメータエレメント６４によって形成され、基板は、好都合には、ピンホールと撮像物体との間のスペーサエレメントとして機能し得る。
【０１５２】
デバイスは、これらの撮像領域４のいずれかを通過する際、前記物体の各々について得られるホログラフィック回折像のリアルタイム特性評価に適合した処理ユニット７を備えてもよい。ここで、特性評価は、少なくとも１つの予め定めた物体タイプの痕跡を考慮する。
【０１５３】
処理ユニットはさらに、この特性評価に応答して、この撮像領域、例えば、画像撮影の際に物体が通過する撮像領域の下流側にあるマイクロ流体スイッチを制御するように適合してもよい。この処理ユニット７は、グラフィックス・プロセッシング・ユニット（ＧＰＵ）、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）、及び／又は特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）を備えてもよい。マイクロ流体選別は、デジタルホログラフィック回折像への分類アルゴリズムのアプリケーションに基づいて、本発明の実施形態によって提供してもよい。分類の結果に応じて、細胞を誘導し、例えば、側方へ押し出すことができ、マイクロ流体スイッチによってマイクロ流体チャネルの異なる出口に到達する。
【０１５４】
処理ユニット７、例えば、デジタル信号プロセッサは、ホログラフィック回折像、例えば、細胞の画像を分析し分類してもよい。こうした分類は、再構築してないか、部分的または完全に再構築されたデジタルホログラムから抽出された痕跡に基づいて、選別アルゴリズムを実行することを含んでもよい。
【０１５５】
単一のＣＭＯＳバックプレーン(backplane)に集積された処理ユニット７およびホログラフィック撮像ユニットの例示の実施形態を図３に示す。この集積した実装は、複数のホログラフィック撮像素子２を備えてもよく、イメージセンサ信号のアナログ信号の調整のためのアナログ・フロントエンドと、画像を保存し、画像を伝送し、及び／又は、外部受信機と通信し、例えば、ユーザインタフェースを提供するための集積回路エレメント１５と、マイクロ流体スイッチ駆動回路１６と、上述のような処理ユニット７の特性評価機能を提供するための回路とを含む。代替として、イメージセンサ信号のアナログ信号の調整のためのアナログ・フロントエンドの一部または全部が、処理ユニット７の一部でもよい。
【０１５６】
第２態様において、本発明は、流体中に浸漬された物体を選別するための方法に関する。こうした方法は、前記流体の流れを複数のマイクロ流体チャネルに導入するステップを含み、各マイクロ流体チャネルは、撮像領域を含む。該方法は、前記撮像領域のいずれかを通過する際、各物体のホログラフィック回折像を記録するステップと、撮像領域のいずれかを通過する際、物体の各々について得られるホログラフィック回折像をリアルタイムで特性評価を行うステップであって、前記特性評価は、少なくとも１つの予め定めた物体タイプの痕跡を考慮するステップと、各物体を出口に誘導するステップであって、この出口は物体の特性評価の関数として、複数の出口から選択されるようにしたステップと、をさらに含む。
【０１５７】
本発明の実施形態に係る方法が、前記複数の出口の少なくとも１つから液体の流れを、少なくとも１つの追加のマイクロ流体チャネルに導入するステップをさらに含んでもよく、少なくとも１つの追加のマイクロ流体チャネルは、追加の撮像領域を含む。こうした方法は、追加の撮像領域のいずれかを通過する際、各物体の像、例えば、ホログラフィック回折像または蛍光画像を記録することと、こうして得られた画像を、少なくとも１つの物体タイプの痕跡を考慮して特性評価することと、物体の特性評価の関数として、複数の追加出口から選択された追加出口に物体を誘導することと、をさらに含んでもよい。
【０１５８】
本発明の実施形態に係る、流体中に浸漬された物体を選別するための例示の方法２０を、図４に示している。こうした方法が、例えば、本発明の第１態様に関連して説明したようなデバイスを用いて、移動する物体、例えば、細胞から１つ以上の特性を決定してもよい。本発明の実施形態の利点は、これらの物体を特性評価するために極めて短い時間フレームで画像が記録され、マイクロ流体チャネルを通る物体の流れに追従することである。こうした方法２０はさらに、レンズフリー画像から計算される特性に従って、物体の分類に基づいて、物体、例えば、細胞を分析し選別できる。該方法は、リアルタイムで処理したホログラフィック像に基づいて、細胞を高速で分析し選別できる。
【０１５９】
本発明の実施形態において、方法２０は、前記流体の流れを複数のマイクロ流体チャネルに導入するステップを含み、各マイクロ流体チャネルは、撮像領域を含む。例えば、物体の異種混合物、例えば、生体細胞を含む均等に希釈された流体を流体ハンドリングユニット内に導入してもよい。こうした流体ハンドリングユニットにおいて、細胞がこれらのマイクロ流体チャネルの撮像領域を通過する際、細胞の照明、例えば、光源による照明を行ってもよい。細胞がホログラフィック撮像システムの前を個別に流れる程度に、流体を均等に希釈することが好都合であろう。光源およびセンサアレイの１つの可能性ある光学的構成は、流体ハンドリングシステムを通る光伝送を提供でき、その結果、光源が光を放出して、この光が流体ハンドリングシステム中の試料によって散乱され、位相感度情報が、イメージセンサ上の流体ハンドリングシステムの他方の側で記録される。これは、流体ハンドリングシステム、例えば、特にマイクロ流体チャネルの撮像領域が、使用する光にとって透明であることを要求するであろう。
【０１６０】
一実施形態において、光源は、少なくとも部分的にコヒーレントでもよく、移動する細胞を照射してストロボ画像を撮影するためにパルス化してもよい。細胞は、典型的には、数ｃｍ／ｓから数ｍ／ｓの速度で撮像器の前方を移動する。パルス光源は、光検出システムとともに、これらの速度で物体を撮像するように適切に構成できる。例えば、１００ｎｓの光パルスが、１ｍ／ｓの速度で移動する細胞に適しており、１０ｎｓの光パルスが、１０ｍ／ｓの速度で移動する細胞に適しているであろう。鮮鋭なホログラフィック回折像を取得するために、短い光パルスを使用して、移動する細胞によるぼやけを回避できる。物体、例えば、細胞を光と熱で損傷することなく、イメージセンサにおいて充分なフォトンを有するように充分なパルス出力が必要になる。ストロボ画像が、分析目的のデジタル信号処理ユニットに取り込まれる。通常の撮像器と比べて少ない数のホログラフィックストロボ撮像用の画素が、フロー撮像での高いスループットに対して利点を提供できる。
【０１６１】
方法２０は、前記撮像領域の何れかを通過する際、各物体のホログラフィック回折像を記録する、例えば、イメージセンサを用いて細胞の散乱光応答を記録するステップ２２をさらに含む。この記録ステップ２２は、物体が撮像領域を通過しているか否かを評価すること、例えば、こうしたホログラフィック回折像を記録する前に物体が撮像領域を通過しているか否かを評価することを含んでもよい。例えば、局所的な決定アルゴリズムを撮像器上で実行して、どの画像、例えば、どのストロボ画像を分析用のデジタル信号処理ユニットに送り込むかを決定してもよい。多くの画像が有用な情報を全く含んでいないことがあるため、例えば、選別される物体に関する情報を含んでいない場合、局所的な決定アルゴリズムは、例えば、撮像器チップ上で、分析することなくどの画像を廃棄するかを決定してもよい。例えば、６４×６４画素の画像フレームを３．２マイクロ秒ごとに記録して、一方、５０マイクロ秒中の１フレームだけが実際に細胞画像を含み、信号処理ユニットに送り込む必要がある場合、要求されるバンド幅は、１２８０ＭＢ／秒から８２ＭＢ／秒の平均バンド幅に減少できる。決定アルゴリズムは、どの画像をさらに処理すべきかを決定してもよい。いくつかの画像が細胞情報を含んでおらず、これらはハンドリングにとって有用ではないことから、これらの画像を廃棄するための直接の決定機構が、撮像および選別をかなり高速化できる。この決定は、統合した記録光応答データに依存するであろう。
【０１６２】
デジタルホログラフィは、物体から透過または反射した光の偏光状態の空間分布を分析するために適用できる。これは、光学経路に、例えば、光源と照射された物体との間、及び／又は照射された物体と光電検知アレイとの間に、偏光フィルタを挿入することによって簡単に実施できる。偏光は、細胞の構成要素の既知の特性である。組織／細胞の偏光ベースの光学特性は、とりわけ最も少なく調査される特性であり、より多くの注目を集めている。偏光撮像は、視覚化の際、コントラストを改善し、細胞タイプを区別するために使用できる。本発明の実施形態は、偏光フィルタを、光源とマイクロ流体システムとの間およびマイクロ流体システムと撮像器との間に追加することによって、偏光分析を含むように拡張できる。
【０１６３】
方法２０はまた、撮像領域のいずれかを通過する際、物体の各々について得られたホログラフィック回折像をリアルタイムで特性評価するステップ２３を含む。この特性評価は、少なくとも１つの予め定めた物体タイプの痕跡を考慮する。特性評価ステップ２３は、デジタル信号処理ユニットを用いて、ホログラフィック回折像に記録された散乱光応答を分析することを含んでもよい。例えば、この特性評価は、デジタル信号処理ユニットを用いて、例えば、選別(sorting)アルゴリズムを用いて、散乱光応答を分類し分析することを含んでもよい。例えば、デジタル信号プロセッサが、散乱光応答を分析し分類してもよく、分類は、再構築してないか、部分的または完全に再構築されたデジタルホログラムから抽出された痕跡に基づく選別アルゴリズムを含む。細胞フローと同期して決定できる。従って、高速分類アルゴリズムがレンズフリー画像に対して使用でき、これは、物理的選別機(sorter)、例えば、マイクロ流体スイッチを駆動する電気回路への入力として使用できる。
【０１６４】
例えば、ホログラフィック回折像の特性評価ステップ２３は、ホログラフィック回折像を、関心のある物体タイプを表す少なくとも１つの保存した基準ホログラムと比較することを含んでもよい。例えば、画像を、予め保存したホログラムのライブラリの各々と比較して、ホログラフィック回折像内の物体がどの物体タイプに対応するかを決定する。この比較は、少なくとも１つの保存した基準ホログラム各々について、一方のホログラフィック回折像と他方の保存した基準ホログラムとの間の相関測度を計算することと、この相関測度が最善の相関を示す物体タイプを選択することとを含んでもよい。例えば、散乱光応答の分類は、関心のある細胞のホログラムの予め保存したライブラリを使用して、例えば、相関を用いて、記録した回折パターンと予め保存したライブラリとの簡単な比較に基づいて、細胞を分類してもよい。
【０１６５】
代替として、ホログラフィック回折像のこの特性評価ステップ２３は、複数のホログラフィック回折像を自己相関させて、物体間の差を識別することを含んでもよい。例えば、散乱光応答の分類は、相互に自己相関させた異なる記録した細胞画像を使用してもよく、これにより細胞間の差を識別する。こうした手法の利点は、先行した情報を必要としないことである。
【０１６６】
ホログラフィック回折像の特性評価ステップ２３はまた、撮像した物体の少なくとも部分的なデジタル空間再構築を実施することを含んでもよい。例えば、インフロー(in-flow)撮像機能が追加分析のために細胞の画像を収集するために使用できる場合、ホログラムの完全デジタル再構築は有用であろう。
【０１６７】
該方法はさらに、各物体を出口に誘導(steer)するステップ２４を含み、前記出口は、この物体の特性評価の関数として、複数の出口から選択される。こうして分類結果に基づいた物体、例えば、細胞の選別が、本発明の実施形態によって提供できる。
【０１６８】
本発明の実施形態によれば、記録ステップ２２、特性評価ステップ２３および誘導ステップ２４は、複数のマイクロ流体チャネルについて並列に実施してもよい。
【０１６９】
本発明の実施形態において、方法２０は、流体中に浸漬した物体の部分集団(subpopulation)の下流分析をさらに含んでもよく、第１選別が、追加の下流分析のためのサンプル調製ステップとして使用できる。追加の下流分析は、選択した生体細胞のゲノムまたはプロテオームの情報を解明するために、高分解能の撮像、分子の特性評価手法、および「オーミクス(omics)」または塩基配列決定技術を含んでもよい。
【０１７０】
本発明の実施形態において、記録ステップ２２は、撮像領域４の上流にある流れる媒体中の物体の存在を検出することを含んでもよく、ホログラフィック回折像の特性評価ステップ２３は、例えば、本発明の第１態様に関連して上述したように、検出された存在に応答して実施してもよい。記録ステップ２２は、物体が撮像領域４を通過しているか否かを評価することを含んでもよい。
【０１７１】
ホログラフィック回折像の特性評価ステップ２３は、ホログラフィック回折像を、関心のある物体タイプを表す少なくとも１つの保存した基準ホログラムと比較すること、物体間の差を識別するために、複数のホログラフィック回折像を自己相関(auto-correlation)させること、および撮像した物体の少なくとも部分的なデジタル空間再構築を行うことのうちの１つまたは組合せを含んでもよい。
【０１７２】
記録ステップ２２、特性評価ステップ２３および誘導ステップ２４は、複数のマイクロ流体チャネル３について並列に実施してもよい。
【０１７３】
本発明の実施形態に係る方法およびシステムの例示の応用を図６に示す。血液サンプル中の細胞２０１がマイクロ流体チャネルの中を移動しており、その撮像領域において、コヒーレントまたは部分的にコヒーレントな光源２００、例えば、ストロボパルス化ＬＥＤによって照射される。ホログラフィック撮像素子２０２が、細胞２０１のホログラフィック回折像を記録する。そして、このデータは、リアルタイムでさらに処理される。例えば、物体が撮像領域に存在するか否か、例えば、ホログラフィック回折像に撮影されているか否かの初期評価を、例えば、ホログラフィック撮像ユニットの専用回路によって実施してもよい。肯定であれば、データは処理ユニットに転送してもよく、その画像を、例えば、赤血球、白血球および循環腫瘍細胞の原型に対応した、予め保存した基準画像のライブラリと比較してもよい。
【０１７４】
例えば、撮像領域とスイッチとの間のマイクロ流体システムでの経路長によって決定される予め定めた時間ウインドウ、およびマイクロ流体チャネル内で移動する流体の予め定めたフロー速度の範囲内で、これらのカテゴリーへの分類が確立できる。マイクロ流体選別デバイス２０３のマイクロ流体スイッチが、選別２０３のために、その結果に応答して駆動される。例えば、白血球と赤血球は、それぞれ異なる出力チャネル、例えば、出口に方向転換させてもよい
【０１７５】
以下、幾つかの例および技術的な考察について説明する。本発明が、こうした例及び／又は技術的な考察によって限定されることは何ら意図していない。
【０１７６】
本発明の実施形態の利点は、制限されたサイズのイメージセンサで高品質が達成できることである。調査対象の物体、例えば、生体細胞は、マイクロ流体チャネルの内部に、光源からの一定の距離ｄ１およびイメージセンサからの一定の距離ｄ２に設置してもよい。両方の距離ｄ１，ｄ２は、イメージセンサ上の回折フリンジの倍率を決定する。最適な距離では、制限されたサイズのイメージセンサ上での再構築は、種々の細胞タイプの最善の識別(discrimination)をもたらす最高品質のものとなり得る。
【０１７７】
本発明の実施形態の利点は、ホログラム内の良質の情報および高分解能の再構築した画像が得られることである。高い空間周波数が、例えば、微細な特徴部分に対応して広がっている。回折フリンジの倍率が画素マトリクスを最適に網羅している場合、重要で微細な特徴部分をカバーするフリンジが有効画素アレイ上に投射されることを意味し、ホログラムの分解能は、画素アレイ内の画素数によって設定される。ホログラム内の情報の品質および再構築画像の分解能は、撮像のために使用されるブロックのサイズに依存することになる。そこには、高速信号処理および物体選別を可能にしつつ、高分解能のホログラムを生成するために使用される画素数に関してなされる妥協がある。具体的な値は、選別用途に依存して相違する。正確な選別のためのホログラムの要件は、物体、例えば、細胞を選別する充分な速度に対して比較検討する必要があるためである。
【０１７８】
現行のＦＡＣＳシステムは、測定用に単一画素検出器（即ち、光電子増倍管またはアバランシェフォトダイオード）を使用している。本発明の実施形態では、これらの単一画素検出器は、細胞の画像を撮影できる光学ＣＭＯＳ撮像器によって置換できる。細胞を撮像するために増加した空間分解能は、得られた画像データのリアルタイム信号処理に対して極端に高い要求を課す。さらに、同じ時間での撮像の多重（例えば、Ｎ個）フローが、処理すべき画像データセットをさらにＮ倍に拡大する。増加した空間分解能および極めて高いスループットのこうした組合せは、現在の最新技術では知られていないであろう。本発明の実施形態が、レンズフリーまたはデジタルホログラフィック撮像として知られた手法を使用して、リアルタイムで処理すべきデータ情報での要件を緩和できる。光学顕微鏡検査は、伝統的にレンズに依拠して、小さな物体の顕微鏡画像を生成する。しかしながら、レンズフリーのオンチップホログラフィック顕微鏡検査は、デジタル手法を採用し、高い分解能の撮像を達成する。細胞または微生物から散乱した光は、部分的にコヒーレントな照明の未散乱部分と干渉して、光学的拡大なしで物体のホログラム記録を生じさせる。さらに、撮像画素の数は、従来の顕微鏡と比較して大幅に低減できる。再構築した画像の分解能は、例えば、いわゆる画素超分解能（ＰＳＲ）手法を使用することによって、センサアレイの画素サイズによって決定される分解能を超えてデジタル的に増加させることができ、サブミクロン横方向分解能を達成できる。
【０１７９】
従って、流体中の物体、例えば、細胞についての高速でレンズフリーのインフロー細胞分析および選別が本発明の実施形態によって提供できる。
【０１８０】
デジタルホログラフィック顕微鏡検査法は、デジタル記録および回折パターンの再構築に依拠しており、物体の画像または画像痕跡が得られる。典型的には、小さなアパーチャからの（部分的に）コヒーレントな照明（例えば、ピンホールと組み合わせたＬＥＤ、またはピンホールを備えた複数ＬＥＤ）が使用され、高分解能光電センサアレイ（例えば、ＣＣＤまたはＣＭＯＳのカメラ）上で物体からの回折パターンを取得する。レンズフリー顕微鏡検査は、回折像にエンコードされた位相情報を持つ物体のホログラムを出力する。ホログラフィは、物理学者デニス・ガボールによって６０年以上前に発明され、物体から散乱した光を記録し、後に再構築できる手法である。デジタルホログラフィは、回折パターンのデジタル再構築を使用する。幾つかの再構築アルゴリズムが文献に記載されている。
【０１８１】
（血液細胞の計数および選別への応用）
一滴の血液は、酸素を運ぶ赤血球、感染と戦って免疫システムの基本要素を形成する白血球(leukocytes)およびその亜型、血小板、血漿の複雑な混合物を含む。各細胞集団の総数を計数する血液計数は、多くの形態の病気の存在を示すために使用でき、従って、医療分野で最も一般的に実施される血液検査の１つである。看護師がサンプルを収集し、凝固を停止する抗凝固剤（ＥＤＴＡ，時にはクエン酸）を含む検査チューブに血液を吸引する。そして、サンプルは研究室に搬送される。ＦＡＣＳ、フィコール勾配、磁気ビーズベースの分離、手動計数などの方法が、典型的には研究室において使用され、種々の亜型の血液細胞を計数または分離している。
【０１８２】
自動化した分析器が、血液細胞の個数、平均サイズ、サイズ変動に関して高速で信頼性のある結果を提供しているが、これらは細胞の形状を検出するにはあまり良くないため、手動計数が未だに用られている理由である。従って、提示した本発明の実施形態が、上記の先行技術の方法のいずれかと置換して、必要とされるポイントでの血斑計数を行うケアテストのポイントとして使用可能である。
【０１８３】
多くの臨床および研究応用が、診断のためおよび病状の研究のために、特定の白血球タイプを計数または隔離している。亜型、即ち、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）、単球、リンパ球（Ｂ細胞とＴ細胞）のいずれかの上昇または下方制御した量が、感染症、炎症性または癌性の症状を含む多くの種々の健康表示を測定し監視するために使用できる。さらに、白血球および赤血球の分離および収集が、典型的には、多くの種々の臨床および基本研究の分析にとって最初に必要なステップである。
【０１８４】
例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、ＣＤ４分子と結合して、ＣＤ４＋  Ｔ細胞に侵入して感染できる。病状が進行すると、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の数が約１０００個／マイクロリットルの通常レベル未満に減少する。本発明の実施形態が、診療所、患者の家、またはよく整備された病院設備へのアクセスがない、設備の乏しい環境においてＨＩＶ進行を定期的に監視するために使用できる。
【０１８５】
例えば、白血球が、身体内の毛細血管の通過時に酸化ストレスを検知し、反応性酸素種を生成することによって反応する（文献：Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine (2008) 5, 811-820）。従来のＦＡＣＳが、循環器疾患の指標として、白血球の数および酸化ストレスのこれらのレベルを患者サンプルから決定するために、臨床研究において今日使用されている。同様な結果が、急性冠動脈症候群および糖尿病状態を示すために見られる。
【０１８６】
本発明の実施形態に係る高コンテントで高いスループットの細胞選別機が、広範囲の新規な応用、特に、希少な生物学的事象の隔離に関連したものを実現できる。希少な事象の選別への極端に困難な要求を伴う応用が、全血からの循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出である。従来の癌治療は、原発腫瘍の生態をベースとしている。しかしながら、否定的な予後(prognosis)および死をもたらすものは、通常、身体の他の部分への腫瘍の播種である。この理由により、癌患者の血液からの循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出および特性評価は、高い予後的および治療的な重要性があると考えられている。本発明の実施形態によれば、本発明の実施形態に係る細胞選別デバイスにおいて血液から循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）または癌関連の循環細胞（ＣＲＣＣ）を分類し選別することに基づいて、癌を検出する方法が提案される。
【０１８７】
ＣＴＣは、全血サンプル内の白血球（ｗｂｃ）より少なくとも１０６倍、数が少なく、赤血球（ｒｂｃ）より少なくとも１０９倍、数が少ない。現行の検出方法が、初期の磁気ビーズベースの細胞濃縮手法を必要とする表現型特性評価にしばしば依拠しており、続いて細胞表現型の顕微鏡分析を行う。ＣＴＣ分析用の標準が現在検討されているが、これらの手法は煩雑であり、専門知識を必要とし、ある程度主観的なものである。
【０１８８】
癌診断用の手段として、循環腫瘍細胞の列挙および分子検出のために用いられる種々の手法について優れた見解が提示されている（文献：Cancers 2010, 2, 1236-1250）。現在の代表的なものが、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（ＴＭ）技術であり、ＥｐＣＡＭ、上皮マーカーを目標とする抗体でコートされた磁気ナノ粒子からなる強磁性流体を採用している。免疫磁性的な取り込みおよび濃縮の後、細胞が固定され、蛍光プローブ（例えば、ＤＡＰＩ、サイトケラチンおよびＣＤ４５に対する抗体）で染色し、ＣＴＣを識別し列挙する。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（ＴＭ）アナライザ、自動化した高分解能の蛍光顕微鏡は、画像を取り込んで、熟練した分析者によって最終の分類のために形態(morphology)および蛍光染色の一群の画像を表示する。感度は、全血の７．５ｍＬ当り１個のＣＴＣというオーダーである。
【０１８９】
サイズによる隔離（例えば、ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ社によってＩＳＥＴ中で行われる）サイズ排除を用いて上皮細胞の直接濃縮を可能とし、これにより選択した組の上皮マーカーの発現への検出依存性を低減している。末梢血がＩＳＥＴバッファで希釈され、８μｍの較正した細孔を持つ膜の上に投入される（文献：Vona, G et al. Am. J. Pathol. 2000, 156, 57-63.）。白血球の大部分は、細孔を通過するのに充分に小さく、一方、より大きな腫瘍細胞が膜の上で捕獲される。この手法は、上皮特異抗体を用いた免疫標識の回避によって、循環腫瘍細胞を失うリスクを最小化する。
【０１９０】
現行のＣＴＣ検出は、診断的または治療的な腫瘍マーカー（ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルで）を、例えば、上皮マーカーまたはサイズを用いて、バイアス予備選択された組のＣＴＣに基づいて評価している。事実、全ての癌タイプによって均等に発現したものとして知られた上皮マーカーは存在せず、ＥｐＣＡＭでさえも１００％の腫瘍タイプで発現せず、可変癌タイプの７０〜８０％だけである（文献：Went et al. Hum. Pathol. 2004, 35, 122-128）。癌転移に必要であるとして主張されているＥＭＴ（上皮間葉移行）のプロセスは、上皮細胞がより侵襲的になる際に、細胞の一部において表現型の変化を含む。従って、転移能を持つＣＴＣが本質的に異種的であり、現行の細胞濃縮手法は常に、ある程度バイアスを生成することが予想できる。
【０１９１】
本発明の実施形態に従って説明した高コンテントで高いスループットの細胞撮像選別機は、癌検出のために使用できる。患者血液サンプルまたは希釈した患者血液サンプルは、システムに導入できる。ＣＴＣまたは癌に関連した循環細胞が、システムで撮影されたホログラフィック画像に基づいて計数される。本発明の実施形態に係る方法が、何れのバイアスも導入せず、ユーザ設定パラメータに基づいて選別する。本撮像器／選別機を用いた患者血液からのＣＴＣ計数の正確な検出が、癌治療の臨床診療において診断方法または治療経過観察方法として使用できる。
【０１９２】
極めて希少な細胞を選別する場合の一例が、カスケードシステム、例えば、捕捉システムを使用することであり、そこでは、例えば、ＣＴＣとは極めて異なる細胞間で識別するために（例えば、赤血球を白血球および白血球類似の細胞から分離）、第１の粗い選別が行われ、そして第２、第３等の選別事象が、他の特性、例えば、白血球およびＣＴＣのサイズおよび形態などに基づいて選別を精密化できる。該手法は、非破壊的であり、結果を確認する手段として、サンプルをシステムに再導入することによって反復分析が可能である。細胞を選別するために画像を使用した場合、続いて細胞は分子特性評価のために使用できる。また部分集団をシステムに再導入して、結果を確認したり、異なるパラメータまたは異なる染色に基づいて後続の選別を行うことができる。
【０１９３】
本発明の実施形態から利益が得られる他の応用は、血液から他の希少な細胞、例えば、異種幹細胞集団を隔離または選別、母性血液から胎児細胞の選別を含む。
【０１９４】
さらに、他の応用例では、特定の病気の発生を回避するために、または、どの治療法を使用するかを決定する手段として、早期の病原体検出が極めて重要である。病原体検出の迅速性および適切な抗生物質の適用は、現在、細菌感染を治療する基礎であるが、ウイルス感染を治療できない。しかしながら、抗生物質への耐性が、これらの乱用に大きく関与できる、増えている公衆衛生の問題である。従って、可能な限り早く病原体を検出し識別することがより重要になり、そのため、最も適切な治療が時間内に開始できる。
【０１９５】
細菌が典型的には単一細胞のサイズを有するが、ウイルスが約１００ｎｍのサイズを有し、これは従来の顕微鏡で見るのには小さすぎる。これらは自分自身では増殖できず、より多くのウイルス粒子を作成できるためには、「ホスト」細胞に侵入して、その機構を乗っ取っとる必要がある。ウイルス増殖を防止し、病気をより速く自然治癒させるワクチンおよび多くの抗ウイルス治療が開発されつつある。
【０１９６】
現在、血液培養が、全身感染症の疑いのある患者において病原体検出のための代表的な方法である。検出方法は、典型的には２つの目的があり、１）細胞培養の生化学および顕微鏡分析、２）感染を識別するために、これらの細胞培養で実施されるＤＮＡ／ＲＮＡ検査である。血液培養から結果を得るには、通常３〜５日を要しており、有効な治療を開始するには遅すぎる。蛍光活性細胞選別（ＦＡＣＳ）が、病原体に対する細胞免疫応答を研究するツール、より詳細には、感染細胞と非感染細胞を識別し計数し、これらの細胞へのワクチン剤を含む種々の治療の効果を研究するツールとして使用されている。細菌については、細菌の直接選別のためにＦＡＣＳを使用することが可能である。細菌は細胞と同様なサイズを有するからである。ウイルスは、現行のＦＡＣＳシステムで選別するには小さすぎると考えられる。
【０１９７】
既存のＦＡＣＳまたはインフロー撮像システムがルーチンの臨床分析ツールとして使用されていない幾つかの理由がある。高スループットで高コンテントの細胞撮像選別機の設置は、患者サンプル中の病原体検出にとって、そして、食品または環境サンプル、例えば、飲料水において明確な利点を有する
【０１９８】
第１のものは、サンプル中に存在する病原体によるＦＡＣＳまたは撮像システムの汚染のリスクである。実際、現行のＦＡＣＳシステムは、極めて高価なツールであり、典型的には、消耗品として実装されたコンポーネントはない。これが、中央配置されたＦＡＣＳコア設備が、有害な病原体によって汚染される可能性のあるサンプルを分析するのをしばしば拒絶する理由である。本発明の実施形態において、流体ハンドリングシステムは、消耗品として設計でき、異なるサンプル間の汚染が生じない。汚染の結果としての偽陽性の結果が生じない。
【０１９９】
本発明の実施形態の第２の利点は、進歩した撮像分析機能は、細菌自体の形態を分析することによって、サンプル中に存在する細菌の直接識別を可能にすることである。細菌は、大きな鞭毛および精巧に分岐した構造を持つ棒状、球体、コンマ状の細菌など、幅広いサイズおよび形状をなす。これらの幾つかは、群れまたはフィラメントを形成する。高コンテントの撮像器で撮影したホログラフィック画像は、エッジに対して特に敏感であり、異なる形態を区別するのに極めて適している。高コンテントの撮像器は、細菌の形態の認識および細菌群の数の計数に基づいて、生物試料中の細菌感染を識別できる。細菌は細胞分裂で成長するため、時間とともにコロニーを形成し、本発明の実施形態が、コロニー形成群のコロニーサイズを推測し、細菌成長曲線を予測するためにも使用できる。
【０２００】
ＦＡＣＳおよび蛍光共焦点撮像が、感染ホスト細胞と非感染ホスト細胞の応答を計数し分析するために典型的に用いられる方法であり、ウイルス感染が、蛍光マーカー、例えば、ＦＩＴＣラベル付けした抗体または蛍光タンパク質などを介して可視化される。本発明の実施形態に係る高コンテントの撮像器／選別機は、蛍光マーカーの場所についてのより多くの空間情報を提供する。さらに、ホログラフィック撮像は、より小さな物体を撮像するのにかなり有効であることを証明しているため、ウイルスを蛍光マーカーなしで直接に計数し、識別することも可能であろう。研究分野全体が、超分解能方法に専念され、より多くの空間情報を得るために、軸外(off axis)照射、人工アパーチャおよび時間情報の使用などの秘訣を用いて、デジタルホログラフィック顕微鏡検査でのアッベの光学回折限界を克服している。本発明の実施形態に係る撮像選別方法は、ＬＥＤまたはレーザを、深ＵＶまたはＸ線の（部分的に）コヒーレントな照明用光源で置換することによって、ウイルスなどの極めて小さい物体を撮像するために拡張できる。
【０２０１】
さらに追加の応用では、バイオプロセス技術が生細胞（酵母と細菌を含む）を使用し、ファインケミカル、抗体、組み換えタンパク質、ワクチン、そしてワイン、ビームを含む発酵ベース製品などの製品を製造する。プロセス監視システムの目標は、一般に、より良好で一貫した生産歩留まりを達成すること、バッチ間変動を最小化すること、そして、可能性ある不良、汚染または、例えば、外部微生物による汚染による進化するバッチの非許容度の警告を早期に受けることである。こうしたプロセスの制御のための重要な変数は、細胞計数、細胞サイズ分布、および細胞の形態である。他の例が、プロセスを監視するために、タンパク質結晶化サイズおよび形態測定値を使用する。ｐＨ、温度、酸素含量などのパラメータがオンラインで監視できるが、細胞レベルでの現行のプロセス監視方法が、典型的には、手動サンプリングと、かなり退屈なプロセスである従来の顕微鏡分析とを含む。バイオセンサ、バイオマス測定法を含むオンライン測定方法が開発途上であるが、汚染(fouling)、ドリフトなどの例示の問題を含み、これらは精度および使用期間を制限する。
【０２０２】
バイオリアクタでのバイオプロセス監視のために可能性ある、その場(in situ)撮像方法が文献（Anal Bioanal Chem. 2010 Nov;398(6):2429-38）に記載されている。下記の説明は、この文献に基づいている。センサは、全体プロセスの期間、媒体中に直接浸漬され、プロセスを中断することなく周期的に画像が撮影される。画像が撮影される頻度は、生物プロセスに依存する。哺乳類細胞の監視では１時間周期で充分であり、細菌の監視では、プロセスの関連する分析情報を得るために、分サイクルを選択すべきである。
【０２０３】
画像撮影後、データセットは、洗練された画像分析アルゴリズムを用いて分析される。セルサイズ、形態、および他の関連した変数に関する情報がプロセス制御に使用できる。説明したシステム全てが、光源（ＬＥＤまたはレーザ、時にはファイバベース）、レンズシステム、または対物レンズ、ＣＣＤカメラを含み、これらは全て従来の反射ベースの撮像方法を使用している。バイオリアクタでのサンプリングゾーンは、典型的には、従来の光学顕微鏡の焦点深さまたは機械的サンプリング装置、例えば、バイオリアクタから新しいサンプルを採取するために移動するスライダによって定義される。両方の場合、撮像は静的であり、細胞または微生物を流すことを意味しない。
【０２０４】
２つのその場(in situ)撮像事例があり、１つは、文献（oeris K, Frerichs JG, Konstantinov K, Scheper T (2002) Cytotech 38:129-134）に、もう１つは、文献（Camisard V, Brienne JP, Baussart H, Hammann J, Suhr H (2002) BiotechnolBioeng 78:73-80)）に透過型の明視野撮像器を記載している。しかし、両方とも、対物レンズおよび対物チューブを用いた従来の撮像方法を使用し、物体から来る光を収集し、それをＣＣＤカメラシステムに集光している。最後に、細胞密度の並列的監視のために、実験的なフロースルー顕微鏡システムが記載されている（Journal of Biotechnology Volume 150, Issue 1, 1 October 2010, Pages 87-93）。このシステムは、初めて連続監視のためにフローセルを使用しているが、撮像器は、上述のようなその場(in situ)撮像器と類似している。
【０２０５】
本発明の実施形態に係るデバイスは、バイオリアクタに関して種々の可能性ある場所で実装できる。
・バイオリアクタを連続的にサンプリングするバイパス流での連続的監視。光学システムがバイオリアクタの外部に置くことができる。
・バイオリアクタ壁の一部であるマイクロ流体消耗品での連続的監視。例えば、バイオリアクタ自体が、消耗品材料で製作されることを意味する場合。
・既存のインライン方法に類似したバイオリアクタ内部での連続的監視。
・いくつかの場所でバイオリアクタ内部での連続的監視。理由として、ホログラフィック撮像器がかなりコンパクトであり、多重監視が大型リアクタ容器内で使用できる。その結果、より完全な測定が行われ、結果が、混合などのプロセスパラメータにあまり依存しない。
・マイクロ流体バイオリアクタの場合、撮像システムは、バイオリアクタの流体ハンドリングシステムの一部として実装できる。
【０２０６】
本発明の実施形態に係る選別はまた、物体を撮像し選別するために使用可能であり、物体形状および回折パターンが部分集団の識別に重要である。下記の例がある。
・マイクロ流体システム内に形成できる結晶、例えば、タンパク質結晶の選別。
・ナノ粒子、例えば、多分散系の粒子サンプルの選別。
・ナノ粒子分析試料の一部であるナノ粒子の選別。
【０２０７】
例えば、ナノ粒子は、親和結合反応（例えば、抗体および対応する抗原またはＤＮＡ相補鎖）を行うためにしばしば用いられ、これにより溶液中の検体の存在を認識する。個々の粒子を粒子クラスターから選別し計数することによって、溶液中の結合画分を測定できる。
【図１】
0006420297.tif 000002
【図２】
0006420297.tif 000003
【図３】
0006420297.tif 000004
【図４】
0006420297.tif 000005
【図５】
0006420297.tif 000006
【図６】
0006420297.tif 000007
【図７】
0006420297.tif 000008
【図８】
0006420297.tif 000009
【図９】
0006420297.tif 000010
【図１０】
0006420297.tif 000011
【図１１】
0006420297.tif 000012
【図１２】
0006420297.tif 000013
【図１３】
0006420297.tif 000014
【図１４】
0006420297.tif 000015
【図１５】
0006420297.tif 000016