(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路を有するアッセイ装置において１つ又は２つ以上の対象検体を検出するために液体サンプルに対してアッセイを実行するための方法であって、前記流路が、その上にサンプル区画及び検出区画を含み、前記方法が、
前記サンプル区画上に前記サンプルを分注することと、
前記サンプルと試薬とを化合させることであって、前記サンプル区画への前記サンプルの添加の前に、又は、前記アッセイ装置上で前記サンプルと前記試薬とを化合させることができる、化合させることと、
前記化合させたサンプル／試薬を、毛管現象によって、捕捉要素が結合された前記検出区画内へと、かつ、前記検出区画を通して流すことであって、（１つ又は複数の）検体の存在又は濃度を少なくとも部分的に表す信号が生成され、検出される、流すことと、
反応時間を決定することであって、前記反応時間が、前記サンプル区画の下流にある前記検出区画中のあるポイントで前記信号が最初に検出される第１の時点と、前記検出区画中の前記ポイントにおいて前記信号がもはや検出されない第２の時点とに基づいて決められる試薬溶解時間である、決定することと、
前記検出された信号と前記反応時間の両方を使用することによって、前記検体の濃度を決定することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記濃度が、前記検出された信号を前記反応時間で除算することにより前記検出された信号を調整することによって決定される（調整済み信号（Ｒ）＝応答／反応時間）、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応時間が、前記化合させたサンプル／試薬が前記検出区画を通過するのにかかる時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記反応時間が、検出要素により生成された信号を検出することによって決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記濃度が、Ｓ／ｔとして定義される信号速度Ｒにより前記検出された信号を調整することによって決定され、Ｓは前記検出された信号であり、ｔは前記反応時間である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記濃度が、以下の式によって決定され、
Ｃ＝（Ｒ−α）／β
Ｃは前記検体の濃度であり、Ｒは前記信号速度であり、αは第１の定数であり、βは第２の定数である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記濃度が、Ｓ及びｔを使用することによって決定され、Ｓは前記検出された信号であり、ｔは前記反応時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルと前記試薬とを化合させる前記工程が、前記サンプル区画と前記検出区画との間に前記試薬を収容する試薬区画を提供することを更に含み、前記サンプル区画から流れる前記サンプルが、前記試薬を溶解させ、前記液体サンプルと溶解した試薬とを含む試薬プルームを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記反応時間は、前記試薬プルームが基材に沿ったポイントにおいて最初に検出される時点から、前記試薬プルームがもはや検出されない時点までの時間に比例する、前記試薬溶解時間に比例している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
流路を有するアッセイ装置において１つ又は２つ以上の対象検体を検出するために液体サンプルに対してアッセイを実行するための方法であって、前記流路が、その上にサンプル区画及び検出区画を含み、前記方法が、
前記サンプル区画上に前記サンプルを分注することと、
前記サンプルと試薬とを化合させることであって、前記サンプル区画への前記サンプルの添加の前に、又は、前記アッセイ装置上で前記サンプルと前記試薬とを化合させることができる、化合させることと、
前記化合させたサンプル／試薬を、毛管現象によって、捕捉要素が結合された前記検出区画内へと、かつ、前記検出区画を通して流すことであって、（１つ又は複数の）検体の存在又は濃度を少なくとも部分的に表す信号が生成され、検出される、流すことと、
反応体積を決定することであって、前記反応体積が、前記試薬を溶解させるために使用される前記サンプルの量である、決定することと、
前記検出された信号と前記反応体積の両方を使用することによって前記検体の濃度を決定することと、
を含む、方法。
【請求項１１】
前記反応体積が、反応時間と流速との積である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記反応時間は、前記化合させたサンプル／試薬が前記検出区画を通過するのにかかる時間である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記反応時間が、前記化合させたサンプル／試薬が前記流路に沿ったポイントで最初に検出される時点から、前記化合させたサンプル／試薬が前記流路のそのポイントにおいてもはや検出されない時点までの試薬溶解時間として決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記濃度が、前記検出された信号に反応体積を乗算することにより前記検出された信号を調整することによって決定される（調整済み信号（Ｒ）＝検出された信号×反応体積）、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
アッセイを較正する方法であって、
（ａ）既知の濃度の検体を中に有する複数のキャリブレータ流体を提供することと、
（ｂ）サンプル区画及び検出区画を含む基材を有するアッセイ装置を提供することと、
（ｃ）前記サンプル区画上に前記キャリブレータ流体のうちの１つを分注することと、
（ｄ）前記キャリブレータ流体と試薬とを化合させることであって、前記サンプル区画への前記キャリブレータ流体の添加の前に、又は、前記アッセイ装置上で前記キャリブレータ流体と前記試薬とを化合させることができる、化合させることと、
（ｅ）前記化合させたキャリブレータ流体／試薬を、毛管現象によって、捕捉要素が結合された前記検出区画内へと、かつ、前記検出区画を通して流すことであって、（１つ又は複数の）検体の存在又は濃度を少なくとも部分的に表す信号が生成され、検出される、流すことと、
（ｆ）反応時間を決定することであって、前記反応時間が、前記サンプル区画の下流にある前記検出区画中のあるポイントで前記信号が最初に検出される第１の時点と、前記検出区画中の前記ポイントにおいて前記信号がもはや検出されない第２の時点とに基づいて決められる試薬溶解時間である、決定することと、
（ｇ）各キャリブレータ流体について、工程（ｂ）〜（ｆ）を反復することと、
（ｈ）較正曲線を決定するために、前記検出された信号Ｓ、前記反応時間ｔ及び前記既知の濃度Ｃを使用することと、
を含む、方法。
【請求項１６】
前記反応時間が、前記化合させたサンプル／試薬が前記検出区画を通過するのにかかる時間である、請求項１５に記載のアッセイを較正する方法。
【請求項１７】
前記検出された信号Ｓ、前記反応時間ｔ及び前記既知の濃度Ｃが、関係Ｓ＝ｆ（Ｃ，ｔ）の関数ｆを決定するために使用される、請求項１５に記載のアッセイを較正する方法。
【請求項１８】
アッセイを較正する方法であって、
（ａ）既知の濃度の検体を中に有する複数のキャリブレータ流体を提供することと、
（ｂ）サンプル区画及び検出区画を含む基材を有するアッセイ装置を提供することと、
（ｃ）前記サンプル区画上に前記キャリブレータ流体のうちの１つを分注することと、
（ｄ）前記キャリブレータ流体と試薬とを化合させることであって、前記サンプル区画への前記キャリブレータ流体の添加の前に、又は、前記アッセイ装置上で前記キャリブレータ流体と前記試薬とを化合させることができる、化合させることと、
（ｅ）前記化合させたキャリブレータ流体／試薬を、毛管現象によって、捕捉要素が結合された前記検出区画内へと、かつ、前記検出区画を通して流すことであって、（１つ又は複数の）検体の存在又は濃度を少なくとも部分的に表す信号が生成され、検出される、流すことと、
（ｆ）反応体積を決定することであって、前記反応体積が、前記試薬を溶解させるために使用される前記サンプルの量である、決定することと、
（ｇ）各キャリブレータ流体について、工程（ｂ）〜（ｆ）を反復することと、
（ｈ）較正曲線を決定するために、前記検出された信号Ｓ、前記反応体積及び前記既知の濃度Ｃを使用することと、
を含む、方法。
【請求項１９】
前記反応体積が、反応時間と流速との積によって決定される、請求項１８に記載のアッセイを較正する方法。
【請求項２０】
前記検出された信号Ｓが、前記検出された信号に前記反応体積を乗算することによって調整される、請求項１９に記載のアッセイを較正する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１２年１１月１５日付で出願された米国特許仮出願第６１／７２６，６２６号に基づく優先権を主張し、その開示は参照によってその全体が組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、診断アッセイの分野に関し、特に、検出すべき検体が生体サンプル又は非生体サンプル中に存在する側方流動アッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
診断アッセイは、多くの疾患の診断、処置及び管理について普及しており、その中心である。血液、血清、血漿、尿、唾液、組織生検、便、痰、皮膚又は咽頭スワブ、及び組織サンプル又は処理済みの組織サンプルのような臨床サンプル中の種々の検体の検出を簡略化するために、長年にわたって、様々な種類の診断アッセイが開発されてきた。これらのアッセイは多くの場合において、簡単に使用でき、安価に製造されると同時に、高速で信頼性が高い結果を与えることが期待される。理解できるように、まったく同一のアッセイにおいてこれらの要件全てを満たすことは困難である。実際には、多くのアッセイは、それらの速度により制限される。別の重要なパラメータは感度である。アッセイ技術における最近の開発は、ますます微量の検体の検出、並びに、考えられる最も早い時点でのサンプル中の疾患の兆候の検出を可能にするより高感度の試験につながった。
【０００４】
一般的な種類の使い捨てアッセイ装置は、液体サンプルを収容する区画又は領域、コンジュゲート区画としても知られる試薬区画、及び検出区画としても知られる反応区画を含む。これらのアッセイ装置は一般に、側方流動試験ストリップとして知られている。それらは、毛管流を支持することが可能な流体流の経路を画定する多孔質材料、例えば、ニトロセルロースを採用する。例として、米国特許第５，５５９，０４１号、米国特許第５，７１４，３８９号、米国特許第５，１２０，６４３号、及び米国特許第６，２２８，６６０号に示されるものが挙げられ、これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００５】
サンプル添加区画は多くの場合において、サンプルを吸収することが可能であり、かつ、血球の分離が望まれる時には、赤血球を捕捉するのにも効果的である、より多孔質の材料からなる。このような材料の例は、例えばセルロース、ウール、ガラス繊維、アスベスト、合成繊維、ポリマー若しくはこれらの混合物を含む、紙、フリース、ゲル又は組織のような繊維性材料である。
【０００６】
別の種類のアッセイ装置は、毛管流を引き起こす突起部を有する非多孔質アッセイである。このようなアッセイ装置の例として、国際公開特許第２００３／１０３８３５号、国際公開特許第２００５／０８９０８２号、国際公開特許第２００５／１１８１３９号、及び国際公開特許第２００６／１３７７８５号に開示される開いた側方流動装置が挙げられ、これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００７】
既知の非多孔質アッセイ装置を図１に示す。アッセイ装置１は、少なくとも１つのサンプル添加区画２と、試薬区画３と、少なくとも１つの検出区画４と、少なくとも１つの吸上区画５とを有する。これらの区画は、サンプル添加区画から吸上区画までサンプルが流れる流路を形成する。また、検出区画４には、任意選択で（コーティングなどにより）装置に堆積する検体に結合することが可能な抗体のような捕捉要素が含まれ、試薬区画には、装置に堆積した検体の濃度の決定を可能にするであろう、反応に関与することが同様に可能な標識コンジュゲート物質が含まれ、標識コンジュゲート物質は、検出区画における検出のための標識を担持する。このコンジュゲート物質は、サンプルが試薬区画を通して流れる際に溶解し、溶解した標識コンジュゲート物質とサンプルとのコンジュゲートプルームを形成し、コンジュゲートプルームは、検出区画へと下流に流れる。コンジュゲートプルームが検出区画に流入すると、コンジュゲート物質は、捕捉要素によって、例えば（「サンドイッチ」アッセイにおけるように）コンジュゲート物質と検体との複合体を介して、又は（「競合」アッセイにおけるように直接的に捕捉されるであろう。結合していない溶解したコンジュゲート物質は、検出区画を通過し、少なくとも１つの吸上区画５へと掃引されるであろう。また、図１には、突起部又はマイクロピラー７が示されている。米国特許出願公開第２００６０２８９７８７（Ａ１）号、米国特許出願公開第２００７０２３１８８３（Ａ１）号、米国特許第７，４１６，７００号及び米国特許第６，１３９，８００号に開示された器具は、検出区画において、結合したコンジュゲート物質を検出することが可能であり、これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一般的な標識として蛍光染料が挙げられ、蛍光染料は、蛍光染料を励起し、かつ蛍光染料を検出することができる検出器を組み込んだ器具によって検出することができる。
【０００８】
測定信号、例えば、蛍光信号から報告可能な結果を生成するために、測定信号を解析されるサンプル中の対象の検体の濃度と相関させるための較正曲線を策定する必要がある。較正曲線の開発は、当技術分野では周知であり、詳細に説明する必要はない。簡潔に言うと、既知の変動する濃度の検体を有する複数のサンプル（キャリブレータ流体とも呼ばれる）は、エンドユーザが、未知の濃度の検体のサンプルに対してアッセイを実行するのと同様に、アッセイ装置上で実行される。検体／標識抗体コンジュゲートのような複合体を生成する検体信号により生成された信号を読み取り、複数のサンプルの各々についてのデータポイントとして記録する。データポイントは、濃度対信号強度の曲線にプロットされる。次いで、その特定のアッセイの信号強度の関数として検体濃度を提供する式に、データポイントを曲線当てはめすることができる。例えば、線形相関は、Ｃ＝ｍＳ＋ｂで表すことができ、ただし、Ｃは検体の濃度であり、Ｓは測定信号であり、ｍ及びｂは実験により決定された定数である。非線形相関は、ｌｏｇｉｔ／ｌｏｇ４関係のような非線形数学モデルを用いて表すことができる。
【０００９】
多くの市販のアッセイの場合、アッセイが作られる工場において較正曲線が開発される。原材料の変更及びアッセイが作られた時の他の因子に起因して、生産されたアッセイの各ロットについて、異なるロット固有の較正曲線が開発され得る。したがって、エンドユーザに販売されるアッセイの各ロットに、較正曲線データを含めることができる。代替的には、較正曲線は、顧客がアッセイ材料のロット、それらのアナライザ、及び製造業者が提供した一連のキャリブレータ材料を用いて較正プロセスを実行した時に、顧客のアナライザによって自動的に生成される。
【００１０】
工場で較正曲線を作る時には、アッセイ装置のエンドユーザが使用するであろう実際のサンプルの特性に近似するように、標準的なキャリブレータ流体が使用される。例えば、アッセイが血漿サンプルとともに使用される場合、キャリブレータ流体は、一般に、典型的な血漿サンプルの特性を模倣するように処方されるであろう。この結果として、分析されるサンプル中の検体の未知の濃度は、等価の測定信号についてのキャリブレータ流体中の検体の濃度と同じである。
【００１１】
側方流動アッセイのための典型的な測定信号は、検出区画に沿った蛍光強度対距離のトレースのピーク高さ又はピーク面積である。ただし、サンプルにおける測定信号が濃度のみには依存しない場合が時々ある。他の因子は、特に毛管駆動型側方流動アッセイ装置の場合、検体濃度だけでなく、測定信号に影響を及ぼすことがある。これらの因子を考慮しない場合、分析されるサンプルについての測定信号は、サンプル中の検体の真の濃度に正確には相関しないであろう。これは、もちろん、例えば、患者の診断又は予後に対して、大きな影響を与えることがある。
【００１２】
したがって、毛管駆動型側方流動アッセイ装置の測定信号に影響を及ぼす他の因子を考慮に入れることができる方法が必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上記の従来の問題うちの１つ又は２つ以上を緩和するアッセイ装置を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一態様は、流路の上にサンプル区画及び検出区画を含む流路を有するアッセイ装置において、対象の１つ又は２つ以上の検体を検出するために液体サンプルに対してアッセイを実行するための方法を対象とする。本方法は、サンプル区画上にサンプルを分注することと、サンプルと試薬とを化合させることであって、サンプル区画へのサンプルの添加の前に、又は、アッセイ装置上でサンプルと試薬とを化合させることができる、化合させることと、化合させたサンプル／試薬を、毛管現象によって、捕捉要素が結合された検出区画内へと、かつ、検出区画を通して流すことであって、（１つ又は複数の）検体の存在又は濃度を少なくとも部分的に表す信号が生成され、検出される、流すことと、反応時間を決定することと、検出された信号と反応時間の両方を使用することによって、検体の濃度を決定することとを含む。
【００１５】
本発明の別の態様は、アッセイを較正する方法に対象とする。本方法は、（ａ）既知の濃度の検体を中に有する複数のキャリブレータ流体を提供することと、（ｂ）サンプル区画及び検出区画を含む基材を有するアッセイ装置を提供することとを含み、本方法は更に、（ｃ）サンプル区画上にキャリブレータ流体のうちの１つを分注することと、（ｄ）キャリブレータ流体と試薬とを化合させることであって、サンプル区画へのキャリブレータ流体の添加の前に、又は、アッセイ装置上でキャリブレータ流体と試薬とを化合させることができる、化合させることと、（ｅ）化合させたキャリブレータ流体／試薬を、毛管現象によって、捕捉要素が結合された検出区画内へと、かつ、検出区画を通して流すことであって、（１つ又は複数の）検体の存在又は濃度を少なくとも部分的に表す信号が生成され、検出される、流すことと、（ｆ）反応時間を決定することと、（ｇ）各キャリブレータ流体について、工程（ｂ）〜（ｆ）を反復することと、（ｈ）較正曲線を決定するために、検出された信号Ｓ、反応時間ｔ及び既知の濃度Ｃを使用することとを含む。
【００１６】
本発明の別の態様にしたがって、流路の上にサンプル区画及び検出区画を含む流路を有するアッセイ装置において、対象の１つ又は２つ以上の検体を検出するために液体サンプルに対してアッセイを実行するための方法が提供された。本方法は、サンプル区画上にサンプルを分注することと、サンプルと試薬とを化合させることであって、サンプル区画へのサンプルの添加の前に、又は、アッセイ装置上でサンプルと試薬とを化合させることができる、化合させることと、化合させたサンプル／試薬を、毛管現象によって、捕捉要素が結合された検出区画内へと、かつ、検出区画を通して流すことであって、（１つ又は複数の）検体の存在又は濃度を少なくとも部分的に表す信号が生成され、検出される、流すことと、反応体積を決定することと、検出された信号及び反応体積を使用することによって検体の濃度を決定することとを含む。
【００１７】
本発明の更に別の態様にしたがって、アッセイを較正する方法が提供された。本方法は、（ａ）既知の濃度の検体を中に有する複数のキャリブレータ流体を提供することと、（ｂ）サンプル区画及び検出区画を含む基材を有するアッセイ装置を提供することと、（ｃ）サンプル区画上にキャリブレータ流体のうちの１つを分注することと、（ｄ）キャリブレータ流体と試薬とを化合させることであって、サンプル区画へのキャリブレータ流体の添加の前に、又は、アッセイ装置上でキャリブレータ流体と試薬とを化合させることができる、キャリブレータ流体と試薬とを化合させることと、（ｅ）化合させたキャリブレータ流体／試薬を、毛管現象によって、捕捉要素が結合された検出区画内へと、かつ、検出区画を通して流すことであって、（１つ又は複数の）検体の存在又は濃度を少なくとも部分的に表す信号が生成され、検出される、流すことと、（ｆ）反応体積を決定することと、（ｇ）各キャリブレータ流体について、工程（ｂ）〜（ｆ）を反復することと、（ｈ）較正曲線を決定するために、検出された信号Ｓ、反応体積及び既知の濃度Ｃを使用することとを含む。
【００１８】
当業者には、以下の好ましい実施形態の詳細な考察から、本発明の更なる目的、特徴及び利点が明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明とともに使用可能な既知のアッセイ装置の概略図を示す。
【図２】本発明とともに使用可能なアッセイ装置の概略図を示す。
【図３】本発明とともに使用可能なアッセイ装置の概略図を示す。
【図４】アッセイ装置における総フロー時間と粘度との間の関係を示すグラフである。
【図５】一定の濃度のＮＴ−ＰｒｏＢＮＰについての信号強度と溶解時間試薬との間の関係を示すグラフである。
【図６】濃度と流体の種類との関数として信号強度を示すグラフである。
【図７】反応体積と反応時間との間に関係を示すグラフである。
【図８】流速と反応体積との間の関係を示すグラフである。
【図９】コンジュゲート（すなわち、試薬）溶解時間と総フロー時間との間の関係を示すグラフである。
【図１０Ａ】反応時間を補正した流体と反応時間を補正していない流体との間の違いを示すグラフである。
【図１０Ｂ】反応時間を補正した流体と反応時間を補正していない流体との間の違いを示すグラフである。
【図１１Ａ】反応時間を考慮する構成モデル及び反応時間を考慮しない較正モデルについての予測濃度対有効濃度を示す。
【図１１Ｂ】反応時間を考慮する構成モデル及び反応時間を考慮しない較正モデルについての予測濃度対有効濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用される時、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その文脈において別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。
【００２１】
明細書及び請求項を通じて数値に関連して使用される用語「約」は、当業者にとって周知であり許容される正確度の区間を示す。正確度の区間は好ましくは±１０％である。
【００２２】
用語「サンプル」は、本明細書では、成分の有無、成分の濃度のような、その特性のうちのいずれかを定性的又は定量的な決定の対象とすることが意図される、一定の体積の液体、溶液、又は懸濁液を意味する。本発明の文脈における典型的なサンプルは、血液、血漿、血清、リンパ、尿、唾液、精液、羊水、胃液、喀痰、痰、粘液、涙、便などのようなヒト又は動物の体液である他の種類のサンプルは、ヒト又は動物の組織サンプルに由来し、組織サンプルは、検査のために特定の組織成分を明らかにするために、液体、溶液、又は懸濁液へと処理済みである。本発明の実施形態は、全ての身体的サンプルに適用可能であるが、好ましくは、全血、尿又は痰のサンプルに適用される。
【００２３】
他の例において、サンプルは食品試験、環境試験、生物学的脅威又は生物災害試験などに関係し得る。これは、本発明において使用することができるサンプルのわずかな例にすぎない。
【００２４】
サンプルの側方流動と、サンプル中に存在する成分と装置中に存在する又は手技中に装置を加えられた試薬との相互作用、並びに定性的か又は定量的のそのような相互作用の検出に基づく決定は、診断目的など、任意の目的のためであり得る。そのような試験は、しばしば、側方流動アッセイと呼ばれる。
【００２５】
診断判定の例として、様々な疾患、例えば、血糖、血中ケトン、尿中ブドウ糖（糖尿病）、血中コレストロール（アテローム性動脈硬化症、肥満など）のような慢性的な代謝異常に特有のマーカーとも呼ばれる検体、冠状動脈梗塞マーカー（例えば、トロポニンＴ、ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ）のような、他の特定の疾患、例えば、急性疾患のマーカー、甲状腺機能のマーカー（例えば、甲状腺刺激ホルモンの判定（ＴＳＨ））、ウイルス感染のマーカー（特定のウイルス抗体の検出のための側方流動イムノアッセイの使用）などの判定が挙げられるが、これらには限定されない。
【００２６】
更に別の重要な分野は、薬剤のような治療薬が、そのような薬剤を必要とする個人に投与されるコンパニオン診断の分野である。次いで、薬剤がその所望の効果を有するかどうかを判定するための適切なマーカーのレベルを判定するために、適切なアッセイが実行される。代替的には、本発明とともに使用可能なアッセイ装置を治療薬の投与の前に使用して、治療薬がそれを必要とする個人に役立つであろうかどうかを判定することができる。
【００２７】
更に別の重要な分野は、薬剤乱用を示す薬剤及び薬物代謝産物の容易かつ迅速な検出、例えば、尿サンプル中の特定の薬物及び薬物代謝産物（例えば、ＴＨＣ）の判定の分野である。
【００２８】
用語「検体」は、用語「マーカー」の同義語として使用され、定性的又は定量的に測定され、かつ小分子、タンパク質、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸、ウイルス成分又は無傷ウイルス、細菌成分又は無傷細菌、細胞成分又は無傷細胞、並びにこれらの複合体及び誘導体を含み得る任意の化学的物質又は生物学的物質を包含することが意図される。
【００２９】
用語「区画」、「領域」及び「部位」は、本明細書、実施例及び請求項の文脈では、従来技術の装置又は本発明の実施形態の装置のいずれかにおける基材上の流体流経路の部分を定義するために使用される。
【００３０】
用語「反応」は、基材上又は基材中のサンプルの成分と少なくとも１つの試薬又は複数の試薬との間で、あるいはサンプル中に存在する２つ以上の成分の間で起こる任意の反応を定義するために使用される。用語「反応」は特に、検体の定性的又は定量的な決定の一部として検体と試薬との間で起こる反応を定義するために使用される。
【００３１】
用語「基材」とは、サンプルが添加され、その上若しくはその中で判定が行われる、又は検体と試薬との間の反応が生じる、キャリア又はマトリックスを意味する。
【００３２】
図２及び図３は、本発明によるそのような装置の好適な実施形態の概略図を示す。アッセイ装置１０は、少なくとも１つのサンプル添加区画２０と、少なくとも１つの試薬区画３０と、少なくとも１つの検出区画４０と、少なくとも１つの吸上区画５０とを有する。これらの区画は、サンプル添加区画から吸上区画までサンプルが流れる流路を形成する。また、検出区画４０には、（コーティングなどによって）任意選択で装置に堆積した検体に結合することが可能な捕捉要素が含まれ、試薬区画には、検体又は装置上に配置された捕捉要素に結合することが同様に可能な標識試薬物質が含まれ、標識試薬物質は、検出区画における検出のための第１の標識を担持する。
【００３３】
本発明で使用可能なアッセイ装置の構成要素（すなわち、装置の他の部分とは別個の部品であるか否かにかかわらず、装置の物理的構造）は、コポリマー、ブレンド、ラミネート、金属ホイル、金属フィルム又は金属から準備することができる。代替的には、装置の構成要素は、以下の材料、すなわち、ポリオレフィン、ポリエステル、スチレン含有ポリマー、ポリカーボネート、アクリルポリマー、塩素含有ポリマー、アセタールホモポリマー及びコポリマー、セルロース類及びそのエステル、硝酸セルロース、フッ素含有ポリマー、ポリアミド、ポリイミド、ポリメチルメタクリレート、硫黄含有ポリマー、ポリウレタン、シリコン含有ポリマー、ガラス、並びにセラミック材料のうちの１つを堆積させたコポリマー、ブレンド、ラミネート、金属ホイル、金属フィルム又は金属から準備することができる。代替的には、装置の構成要素は、プラスチック、エラストマー、ラテックス、シリコンチップ又は金属を用いて作製され、エラストマーは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリラート、シリコンエラストマー又はラテックスを含み得る。代替的には、装置の構成要素は、ラテックス、ポリスチレンラテックス又は疎水性ポリマーから準備することができ、疎水性ポリマーは、ポリプロピレン、ポリエチレン又はポリエステルを含み得る。代替的には、装置の構成要素は、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）、ポリスチレン、ポリアクリラート又はポリカーボネートを含み得る。代替的には、装置の構成要素は、エンボス加工、フライス加工又は射出成形することが可能であるプラスチックから、あるいはその上に種々の長鎖アルカンチオールを吸着することができる銅フィルム、銀フィルム及び金フィルムの表面から作製される。フライス加工又は射出成形することが可能なプラスチックの構造は、ポリスチレン、ポリカーボネート又はポリアクリラートを含み得る。特に好ましい実施態様では、アッセイ装置は、商品名Ｚｅｏｎｏｒ（登録商標）で販売されるもののようなシクロオレフィンポリマーから射出成形される。好ましい射出成形技術は、米国特許第６，３７２，５４２号、米国特許第６，７３３，６８２号、米国特許第６，８１１，７３６号、米国特許第６，８８４，３７０号、及び米国特許第６，７３３，６８２号に記載され、これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３４】
１つの実施形態では、流路は、非多孔質であり、開いた又は閉じた経路、溝及び毛管を含むことができる。好ましい１つの実施形態では、流路は、流路を通して毛管流が維持されるようなサイズ、形状及び相互間隔を有する、隣接する突起部からなる側方流路を備える。１つの実施形態では、流路は、底面と側壁とを有する基材内のチャネルの中にある。この実施形態では、突起部は、チャネルの底面から突出している。側壁は、液体の毛管現象に寄与することも、あるいは寄与しないこともある。側壁が液体の毛管現象に寄与しない場合、突起部により画定された流路中に液体が収容された状態を保つために、最も外側の突起部と側壁との間に間隙を提供することができる。図１には、突起部７が図示されている。
【００３５】
１つの実施形態では、流路は、少なくとも部分的に開いている。別の実施形態では、流路は、完全に開いている。「開いている」とは、毛管距離に蓋又はカバーが存在しないことを意味する。したがって、蓋は、流路に対する物理的保護として存在する場合、流路における毛管流に寄与しない。開いた側方流路は、例えば、国際公開第２００３／１０３８３５号、国際公開第２００５／０８９０８２号、国際公開第２００５／１１８１３９号、国際公開第２００６／１３７７８５号、及び国際公開第２００７／１４９０４２号に記載されており、これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。突起部は、高さ（Ｈ）、直径（Ｄ）、及び突起部の間の１つの距離又は複数の距離（ｔ１、ｔ２）を有し、それにより、その区画における血漿、好ましくはヒトの血漿のような流体の側方毛管流が達成される。これらの寸法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０２８５９９６号に示されている。上記の高さ、直径、及び突起部間の１つの距離又は複数の距離を最適化することに加え、例えば、突起部の表面を変更することによって、突起部に所望の化学的機能、生物学的機能又は物理的機能を与えることができる。１つの実施形態では、突起部は、約１５〜約１５０μｍ、好ましくは約３０〜約１００μｍの範囲の高さ、約１０〜約１６０μｍ、好ましくは３０〜約１００μｍの直径、及び互いから約３〜約２００μｍ、好ましくは５〜約５０μｍの突起部間の１つの間隔又は複数の間隔を有する。流路は、約２〜約１００ｍｍ、好ましくは約５〜約５０ｍｍの長さ、約０．１〜約５ｍｍ、及び好ましくは約０．５〜１．２ｍｍの幅を有し得る。
【００３６】
別の実施形態では、流路は多孔質であり、毛管流を支持することが可能な流路を画定する多孔質材料、例えば、ニトロセルロースを含む。例として、米国特許第５，５５９，０４１号、米国特許第５，７１４，３８９号、米国特許第５，１２０，６４３号、及び米国特許第６，２２８，６６０号に示されるものが挙げられ、これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３７】
液体サンプル添加区画とも称される液体サンプル区画２０は、ピペットのようなサンプルディスペンサからサンプルを収容する。サンプルは典型的には、この区画の上に堆積する。サンプル添加区画は、サンプルが堆積するポイントから任意選択のフィルター及び試薬添加区画を通して反応区画まで、好ましくは毛管流によって液体サンプルを移送することができる。毛管流を引き起こす構造は、上述したニトロセルロースのような多孔質材料を含むことができ、又は好ましくは、図１に示し上記でも説明したマイクロピラーのような突起部による。指先穿刺量の血液を使用することができるこれらの装置では、指から直接サンプルを採取する、又は毛管ピペットによってサンプルを採取することができる。
【００３８】
血漿が装置を通してより遠くまで移動することができるようにサンプルから粒子を濾過する、又は血液から血球を濾過するために、サンプル添加区画にフィルター材料（図示せず）を配置することができる。
【００３９】
サンプル添加区画と検出区画との間に、試薬区画３０が配置される。試薬区画は、分析要素に組み込まれる（１つ又は複数の）試薬を含み得、一般的には、反応において有用な試薬（イムノアッセイのための抗体又は抗原のような結合パートナー、酵素アッセイのための基材、分子診断アッセイのためのプローブ）である、あるいは、組み込まれた試薬を安定化させる材料、反応に対する干渉を抑制する材料のような補助剤である。一般的には、反応において有用な試薬のうちの１つは、以下に論じるような検出可能な信号を有する。いくつかの場合には、試薬は、直接的に又は反応の連鎖を通して検体と反応して、着色又は蛍光分子のような、分光法を使用して検出可能な分子が挙げられるがこれらに限定されない検出可能な信号を形成することができる。試薬区画における試薬量は、同じ試薬幅を維持しながら装置中へと堆積する試薬の長さによって調整することができる。また、試薬量は、長さを維持しながら幅を変えることによっても調整することができる。更に、試薬量は、幅と長さの両方を同時に変えることによって調整することができる。好ましい１つの実施形態では、試薬区画は、コンジュゲート物質を含む。用語「コンジュゲート」とは、検出要素と結合パートナーの両方を担持する任意の部分を意味する。代替的には、検出要素とコンジュゲートとを含む試薬は、サンプル添加区画への添加の前にサンプルに添加することができる。サンプル添加区画の前で全ての試薬をサンプルと化合させる場合は、もちろん、別個の試薬区画は必要なくなるであろう。
【００４０】
検出要素は、その物理的分布及び／又はそれが送出する信号（発光分子（例えば、蛍光剤、リン発光性剤、化学発光性剤、生物発光剤など）、着色分子、反応時に色を生成する分子、酵素、放射性同位体、固有の結合を呈するリガンドなどが挙げられるがこれらには限定されない）の強度に関して検出可能な薬剤である。標識とも称される検出要素は、好ましくは、発色団、蛍光団、放射性標識及び酵素から選択される。好適な標識は、抗体、タンパク質及び核酸の標識のための広範な染料を提供する供給業者から入手可能である。例えば、実際に全可視及び赤外スペクトルに及ぶ蛍光団が存在する。好適な蛍光剤又はリン発光性標識として、例えば、フルオレセインＣｙ３、Ｃｙ５などが挙げられるが、これらには限定されない。好適な化学発光性標識は、例えば、ルミノール、サイリュームなどであるが、これらには限定されない。
【００４１】
同様に、放射性標識は市販されているか、又は検出要素は、それらが放射性標識を組み込むように合成することができる。好適な放射性標識は、例えば、放射性ヨード及びリン、例えば１２５Ｉ及び３２Ｐであるが、これらには限定されない。
【００４２】
好適な酵素標識は、例えば、わさび大根ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼなどが挙げられるが、これらには限定されない。２つの標識は、互いに著しく妨害する、干渉する又は抑制することなく、これらを個別に検出し、好ましくは同時に定量化することができる時に、「区別可能」である。例えば、複数の検体又はマーカーを検出した時に、２つ以上の標識を使用することができる。
【００４３】
結合パートナーは、検体の存在又は量を決定するために使用することができる複合体を形成することができる材料である。例えば、「サンドイッチ」アッセイでは、コンジュゲート中の結合パートナーは、検体及び検出要素を含む複合体を形成することができ、その複合体は、検出区画に組み込まれた捕捉要素とも称される別の結合パートナーに更に結合することができる。競合イムノアッセイでは、検体は、検出区画に組み込まれる捕捉要素とも称される別の結合パートナーへのコンジュゲート中の結合パートナーの結合に干渉するであろう。コンジュゲートに含まれる例示的な結合パートナーとして、抗体、抗原、検体又は検体擬似体、タンパク質などが挙げられる。
【００４４】
任意選択で、流体流経路の、試薬区画の前又は後、かつ検出区画の前に試薬添加区画を配置する。試薬添加区画は、図２及び図３において３５と示されている。試薬添加区画により、装置から外に試薬を添加することが可能になり得る。例えば、試薬添加区画は、サンプルと流体経路に存在する他の結合されていない成分とを吸上区画内へと洗い流すために使用され得る中断試薬を添加するために使用され得る。好ましい実施形態では、試薬添加区画３５は、試薬区画３０の後に配置される。好適な実施形態によれば、試薬区画からの試薬プルームは、可能な限り、検出区画の幅のほとんどを覆うことが可能な幅とすべきである。プルームの幅を増大させるための１つの好ましい実施形態は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１２年１月２０日付で出願された「Ａｓｓａｙ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ」と題する同時係属出願（米国特許仮出願第６１／５８８７３８号、代理人整理番号：ＣＤＳ５１０４ＵＳＰＳＰ、第１発明者：Ｚｈｏｎｇ  Ｄｉｎｇ）に記載されている。要約すれば、複数の領域が、試薬区画中に試薬材料（以下「試薬セル」と称する）を、複数の試薬セルから生じる複数のフローストリームを１つのフローストリームに合流させるための要素とともに有することにより、試薬プルームは、試薬区画から出て検出区画に入る際に、より望ましく混合され、幅が広くなる結果となる。
【００４５】
液体サンプル区画及び試薬区画の下流には、サンプル添加区画と流体連通する検出区画４０がある。検出区画４０は、上述したもののような突起部を含むことができる。上記でも言及したように、これらの突起部は、射出成形又はエンボス加工のように、Ｚｅｏｎｏｒ（登録商標）のような光学プラスチック材料から基材へと一体成形される。検出区画における流路の幅は、典型的に、従来的な大きさの装置の場合には２ｍｍのオーダーであるが、上述したもの、及び参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１３年１月２０日付で出願された「Ｌｏｗｅｒ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ」と題する同時係属出願（米国特許仮出願第６１／５８８７５８号、代理人整理番号：ＣＤＳ５１１１ＵＳ、第１発明者：Ｐｈｉｌ  Ｈｏｓｉｍｅｒ）に記載したもののようないくつかの体積がより低い装置は著しく狭く、例えば、１．５ｍｍ以下である。
【００４６】
検出区画では、任意の検出可能な信号が読み取られる。好ましい実施形態では、検出区画中の突起部に捕捉要素が取り付けられる。捕捉要素は、上述したように、コンジュゲートを含有する試薬又は複合体の結合パートナーを含むことができる。例えば、検体が特定のタンパク質である場合、コンジュゲートは、蛍光プローブのような検出要素に連結されたそのタンパク質を特異的に結合するであろう抗体とすることができる。次いで、捕捉要素は、そのタンパク質に同じく特異的に結合する別の抗体であり得る。別の例では、マーカー又は検体がＤＮＡである場合、捕捉分子は、合成オリゴヌクレオチド、その類似体又は特定の抗体であり得るが、これらには限定されない。他の好適な捕捉要素として、検出される抗体に特異的に抗体、抗体断片、アプタマー、及び核酸配列が挙げられる。好適な捕捉要素の非限定的な例は、ビオチン官能基を含有するコンジュゲートに結合するアビジン官能基を担持する粒子である。検出区画は、複数の検出区画を含むことができる。複数の検出区画は、１つ又は２つ以上のマーカーを含むアッセイのために使用することができる。複数の検出区画がある場合には、捕捉要素は、第１の捕捉要素及び第２の捕捉要素のような複数の捕捉要素を含むことができる。上述のように、例えば試薬区画におけるコーティングによって、アッセイ装置上にコンジュゲートを予め堆積させることができる。同様に、アッセイ装置の検出区画上に捕捉要素を予め堆積させることができる。好ましくは、アッセイ装置の検出区画及び検出区画上に、検出要素と捕捉要素の両方をそれぞれ予め堆積させる。
【００４７】
サンプルは、サンプル区画に送達した後、試薬区画に達するであろう。サンプルが試薬区画及び任意選択で試薬添加区画を通して流れ、それらと相互作用した後には、サンプル及び試薬プルームが流体流に収容されるであろう。試薬プルームは、試薬区画において溶解した試薬材料又は試薬添加区画を通して添加される試薬材料のいずれかを含有することができる。試薬プルームは、検出要素と結合パートナーの両方を有するコンジュゲートを含むことがあり、その場合には、試薬プルームはしばしば、コンジュゲートプルームと称される。
【００４８】
上述したように、発明者及び当業者が直面する課題は、側方流動アッセイにおける測定信号をサンプル中の検体の実際の濃度に正確かつ精密に相関させることであった。例えば工場において実際の解析の前に実行される較正曲線に基づくサンプル中の検体の予測濃度は、時には有意量だけ実際の濃度から逸脱することがあった。検体の濃度以外のものが、器具が測定している信号に影響を及ぼしていた。上述したように、側方流動アッセイでは、サンプルを含有する検体は、検出区画の上流で検出要素と化合し、次いで、検出区画へと流れ、検出要素又は検出要素を含有する複合体が捕捉され、検出要素により生成された信号が器具により測定される。
【００４９】
粘度が異なるサンプルの側方流動装置における流速又はフロー時間は、流体流を駆動する毛管力に応じて異なるであろう。図４は、図２及び図３に示した側方流動装置に関する粘度と総フロー時間との間の線形関係を示す。本発明の発明者は、側方流動アッセイ装置において、他の全ての条件が同じであると仮定すると、例えば、装置設計、堆積した検出要素の量などが同じであると仮定すると、濃度は等しいがフロー時間が異なるであろう２つのサンプルにより生成される信号は異なることを発見した。これは、（上述したように、一般的には結合パートナーとコンジュゲートした）検出要素が（サンドイッチアッセイのために）サンプル中の検体と相互作用することが可能な時間と、検出要素又は検出要素を含有する複合体が検出区画において捕捉要素と相互作用し、それと結合することが可能な時間とに起因すると考えられる。
【００５０】
前述したように、側方流動アッセイ装置において、試薬プルーム中の検出要素を含有するサンプルは、検出区画へと流れる。サンプルが検出区画を通して流れるにつれて、検体濃度の関数である検出要素が、主に拡散を通して捕捉要素に接触する。この拡散は、フローストリーム中の検出要素が、結合された捕捉要素を有する側方流動装置の特徴部（例えば、マイクロポスト又はファイバー）のそばを通る際に生じる。検出要素を含有するサンプル（例えば、コンジュゲートプルーム）が検出区画を通過した後、残りのサンプル又は添加された洗浄液が、検出区画を通過し、検出区画から結合しなかった検出要素を洗い流す。次いで、結合した検出要素を器具によって読み取り、信号を記録する。フローストリームから結合した捕捉要素へと拡散する検出要素の能力は、多くの因子に依存し、それらの因子のうちの主要なものは、コンジュゲートした検出要素が結合した捕捉要素に近接している時間量である。上述のように、検出要素が（直接的又は間接的に）検体と相互作用しなければならない時間量は、信号にも影響を及ぼすことがあるが、捕捉要素との相互作用よりもはるかに小さい程度である。したがって、フロー時間が長くなると、検出要素を捕捉要素に近接させる時間が長くなり、したがって、コンジュゲートした検出要素を結合した捕捉要素へと拡散させるための機会が増える。この時、捕捉要素に結合する検出要素の量は、検体の濃度と、フローストリームから固定された捕捉要素へと拡散する検出要素の能力とに依存することになるであろう。器具により検出又は測定された信号は、検出区画におけるコンジュゲートした検出要素の量に依存する。
【００５１】
アッセイを較正するために使用されるキャリブレータ流体と分析されているサンプル流体とで流動特性（例えば、粘度）が異なる場合、同じ濃度の検体について、異なる量の信号が生じるであろう。これは、上述したような、コンジュゲートした検出要素がフローストリームから固定された捕捉要素へと拡散する能力（すなわち、時間量）が異なることに起因する。それに応じて、本発明の発明者は、較正曲線が、検体濃度だけではなく、アッセイ装置を通る流体フロー時間と信号強度に対するその影響とを考慮に入れることが可能である必要があると判定した。したがって、検出された信号Ｓは濃度Ｃのみの関数（Ｓ＝ｆ（Ｃ））ではなく、検出された信号は、濃度とフロー時間ｔの両方の関数である（Ｓ＝ｇ（Ｃ，ｔ））。それに応じて、本発明の広範な態様は、濃度とフロー時間の両方を考慮する、サンプル中の検体の濃度を決定するための方法を提供する。
【００５２】
フロー時間は、用語「反応時間」によって表すことができ、検出要素が検出区画において捕捉要素と結合しなければならない時間として広く定義される。好ましい実施形態では、反応時間自体は、流路中のポイントで検出要素によって生成される信号を使用して測定され、かつ、報告可能な結果を生成するために使用される信号を検出するために使用される同一の器具によって検出される。ただし、検出要素により提供された信号を検出することに依拠しない、反応時間を決定するための他の方法を使用することもできる。
【００５３】
反応時間の表現を測定するためのいくつかの決定可能な方法が存在する。１つは、化合させたサンプル／試薬が、試薬区画の後ろの基材流路に沿ったポイントで最初に検出される時点から、化合させたサンプル／試薬が、基材のそのポイントではもはや検出されない時点までの「試薬溶解時間」である。
【００５４】
反応時間に比例する又は反応時間を表す別の時間は、サンプル区画から吸上区画の終点までサンプルが流れるのにかかる時間である総フロー時間を測定することによって取得することができる。
【００５５】
また、反応時間に比例する又は反応時間を表す別の時間は、サンプルが吸上区画に入って吸上区画の終点に達する時間である総吸上時間を測定することによって取得することができる。これは、検出区画から洗い流される検出要素からの信号を検出するによって行うことができる。
【００５６】
代替的には、反応時間に比例する時間は、サンプルが側方流動装置全体に完全に浸透するのに必要な時間である湿潤時間として決定することができる。
【００５７】
最終的には、反応時間に反比例する速度も、アッセイ装置を通して移動するサンプルの流速を単に測定することによって決定することができる。流速は、装置上の１つのポイントから、第１のポイントから既知の距離の装置上の別のポイントまで流頭が進むのに必要な時間を測定することなど、任意の既知の方法によって測定することができる。反応時間の表現を測定するための上記の技術のいずれかの場合、アッセイ装置を通して流れる、報告可能な結果を生成するために測定される検出要素を反応時間の測定においても使用することができる。これは、サンプル中の検体を表す信号を測定するために使用される同一の器具を、反応時間を測定するためにも使用することができるという利点を有する。異なる標識のような、追加の検出可能な薬剤は必要とされない。しかしながら、いくつかの実施形態では、例えば、赤外線検出器を使用してアッセイ装置の一部分の湿潤時を検出することなど、別の信号を読み取ることが望ましいことがある。
【００５８】
図５は、同じ濃度のＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ（サンドイッチアッセイ）を有するが、異なる流体粘度により試薬溶解速度（すなわち、反応時間）が変動するサンプルによって生成される信号の量に対して試薬溶解時間が与える影響をグラフに示している。この例では、異なる粘度の患者血清サンプルを表すために、変動量のポリマーポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を流体の異なるアリコート中に溶解させることによって、同じ濃度のＮＴ−ＰｒｏＢＮＰを含有するが流体粘度が異なるサンプルを準備した。図５が示すように、試薬溶解時間が増大した結果、同じ濃度の検体についての測定信号が増大する。
【００５９】
図６は、反応時間に対する、したがって信号強度に対するサンプルの種類の影響の別の例を示している。図６では、無傷副甲状腺ホルモン（ｉＰＴＨ）の濃度を変動させて、（粘度が高く、したがって反応時間が長い）血清及び（粘度が低い、反応時間が短い）緩衝液におけるサンドイッチアッセイを信号強度に対してプロットしている。図示のように、同じ濃度の場合、緩衝液では、血清と比較して著しく小さい信号が生成される。したがって、図５及び図６において明らかであるように、濃度と反応時間の両方を考慮に入れるアッセイを実行する方法が必要である。換言すると、異なる流動特性を有するサンプル間の反応時間の変動が算出された検体の濃度に対して与える影響を最小限に抑える方法が必要とされる。
【００６０】
反応時間が検出された信号に対して影響を与えることに加えて、本発明の発明者は、所与の濃度の検体についての検出された信号に影響を及ぼし得る更なる因子も発見した。詳細には、反応体積の変化が溶解試薬濃度の変化につながる（堆積した試薬の総量が同じである）ので、特に競合アッセイの場合、反応体積は、反応時間に加えて検出された信号にも影響を及ぼす。好ましい実施形態では、反応体積は、流速と反応時間との積として決定される。サンプルがアッセイ装置に適用されると、サンプルは最初に、試薬区画において試薬に接触するであろう。サンプルは、試薬区画を通して流れるにつれて、試薬を溶解させるであろう。試薬が溶解すると、試薬区画を通して流れる残りのサンプルは、もはや試薬には衝突せず、したがって、試薬を含まないであろう。サンプルのこの部分は、結合していない試薬を検出区画から洗い流すために使用されるであろう。したがって、サンプルには２つの部分が存在する。試薬区画において試薬を溶解させるために使用されるサンプル、及び試薬を含まずに洗浄液として使用される、サンプルの後続部分サンプル。試薬を溶解させるために使用されるサンプルの部分は、反応体積と称される。上述のように、反応体積は、好ましくは、反応時間と流速の積として決定される（反応体積＝流速×反応時間）。したがって、反応体積の発見は、いくつかのアッセイ（例えば、競合アッセイ）の場合、検出された信号が反応体積並びに検体濃度に依存すると認識することである。
【００６１】
図７は、反応体積と反応時間との間の関係を示している。図７が実証するように、反応体積が増大した結果、反応時間が減少する。
【００６２】
図８は、流速と反応体積との間の関係を示している。図８が実証するように、流速が増大した結果、反応体積が増大する。
【００６３】
図９は、総フロー時間とコンジュゲート溶解時間（すなわち、反応時間）との間の関係を示している。図９が実証するように、総フロー時間が増大した結果、コンジュゲート溶解時間が増大する。したがって、図７〜図９は、流速の低下は、フロー時間の増大、試薬溶解時間の増大、及び反応体積の減少を意味することを示している。
【００６４】
上記で論じたように、反応体積は、本質的には、上述の堆積したコンジュゲートを溶解させて、サンプル−コンジュゲート混合物を生成するために使用されるサンプル体積である。側方流動アッセイでは、洗浄流体が添加されないと仮定すると、サンプルの一部分のみが、堆積したコンジュゲートを溶解させ、それと混合する。コンジュゲートを溶解させる総サンプルのその部分（すなわち、コンジュゲート溶解時間中に試薬区画を通して流れるサンプルのその体積）が反応体積である。
【００６５】
流速がより速い（すなわち、粘度はより低い）時、コンジュゲートを溶解させるために使用されるサンプルの総量は大きくなるであろう（すなわち、反応体積が大きくなる）。したがって、コンジュゲート濃度は低くなるであろう（すなわち、反応体積が大きくなる）。サンプル中の所与の濃度の検体については、反応体積中の検体の総量は、流速がより低い場合と比較して増大するであろう。流速がより遅い（すなわち、粘度がより高い）時には反対のことが当てはまる。つまり、コンジュゲートを溶解させるために使用されるサンプルの総量が少なくなるであろう。サンプル中の所与の濃度の検体については、反応体積中の検体の総量は、流速がより高い場合と比較して減少するであろう。
【００６６】
サンドイッチタイプアッセイの場合、コンジュゲート区画中の標識コンジュゲートは、典型的には、検体と結合する必要があるものに比較して非常に多くなり過ぎる（典型的には１００倍以上になる）。したがって、反応体積が大きくなることに起因して標識コンジュゲート濃度はいくらか低くなるが、これは、標識コンジュゲートが非常に多くなり過ぎることに起因して、標識コンジュゲートへの検体の結合には有意な影響を及ぼさないであろう。したがって、検体−標識コンジュゲート複合体の濃度は、検体濃度によって左右される。したがって、流速変動に起因するコンジュゲート濃度のわずかな増大又は低下は、検体−コンジュゲート濃度に対して小さな影響しか与えない。検体濃度が同じであると仮定すると、反応時間が長くなると、信号を生成するためのピラー表面への検体−コンジュゲート複合体の結合が増大する。したがって、信号は、反応時間による影響を受ける。図７に示すように反応時間は反応体積にも関係するので、反応体積を使用して、サンドイッチタイプアッセイのために信号を調整することができる。
【００６７】
競合タイプアッセイの場合、反応体積が大きくなると、標識検体の濃度が低くなるであろう。標識検体は、検出区画においてサンプル中の非標識検体と競合するので、サンプル中の遊離検体／標識検体の比率が増大した結果、検出区画において捕捉される標識検体が少なくなる。濃度（したがって反応体積）と反応時間の両方が信号に影響を及ぼす。反応体積と反応時間とは相関している（反応時間の延長は反応体積の減少に対応する）ので、体積調整法（すなわち、反応体積）と時間調整法（すなわち、反応時間）の両方を使用することができる。
【００６８】
図２及び図３に示したような側方流動装置を通る流速は、本質的に、吸上区画を通じて一定である。したがって、吸上区画の体積が既知であり、吸上区画におけるフロー時間が既知である場合、簡単に流速を算出することができる。例えば、図３において、
・ｔ２は、サンプル流体が吸上区画の始点（図３の位置２）に達するための時間である。
・ｔ３は、サンプル流体が吸上区画の終点（図３の位置３）に達するための時間である。
・吸上区画の体積は、Ｖｗｚ（μＬ）である。
・吸上区画における流速は定数であり、以下の式を使用して算出される。
流速＝Ｖｗｚ（ｕＬ）／（ｔ３−ｔ２）（μＬ／分）
【００６９】
上述のように、流速が分かると、反応体積＝流速×反応時間によって反応体積が決定される。
【００７０】
反応時間及び反応体積を使用すると、アッセイの信号又は応答にする２つの調整を行うことができ、以下、調整済応答（又は調整済み信号）と称される。上述のように、信号自体は、吸上区画の終点までサンプルが流れた後に検出区画を通して走査することによって取得されるピーク面積又はピーク高さである。
【００７１】
調整済応答（調整済み信号とも称される）には２つのタイプがある。
【００７２】
タイプ１：信号又は応答は、反応体積を乗算することによって調整される。すなわち、調整済応答＝応答×（反応体積）＝応答×流速×反応時間
【００７３】
タイプ２：信号又は応答を反応時間で除算される。すなわち、調整済応答＝応答／反応時間以下の実施例が示すように、いずれかの調整済応答を使用すると、精度を著しく向上させることができる。
【００７４】
検体濃度を決定する際に反応時間及び反応体積の変動を考慮に入れるための１つの好適な方法は、反応時間又は反応体積の変動も考慮する較正曲線を開発すること、すなわち、信号が、濃度と反応時間又は反応体積の両方の関数であることを認める式を開発することである。（常にではないが通常はアッセイ装置が作製される工場で実行される）較正モデルは、変動する既知の濃度の標準的なキャリブレータ流体と複数のアッセイ装置とを使用して判定される。キャリブレータ流体が、アッセイ装置に適用される。各キャリブレータ流体について、選択位置における信号及びフロー時間を測定する。測定値に基づいて流速及び反応時間を算出する。次いで、各信号及び各反応時間を使用して、較正モデルを決定し、較正モデルは、以下に記載するように、線形であっても、より複雑な非線形であってもよい。
【００７５】
本発明の１つの利点は、反応時間に対して流体状態が与える影響を考慮に入れるために、流体状態（例えば、粘度）を知る必要がないことである。必要なことは、反応時間、例えば試薬溶解時間又は反応体積の何らかの指標を決定することが可能であることのみである。
【００７６】
本発明の１つの態様によれば、アッセイを実行するための方法は、上述したようにアッセイを行うための工程、例えば、アッセイ装置上にサンプルを分注すること、サンプルを装置を通して流すこと、得られた信号を読み取ることなどを含む。上記工程に加えて、当該方法はまた、上記で定義したように、反応時間及び任意選択で流速を決定することと、サンプル中の検体の濃度を決定するために反応時間又は反応体積並びに検出された信号の両方を使用することとを含む。
【００７７】
タイプ２の調整済応答（すなわち、反応時間のみを使用する）場合、アッセイに依存して、関数Ｓ＝ｆ（Ｃ，ｔ）は、線形関数又はより複雑な非線形関数となり得る。１つの実施形態では、較正モデルは線形であり、関数は、以下のように表すことができる。
Ｓ＝（βｔ＋α）（ｋＣ＋ｂ）        （１）
上記式において、Ｓは検出された信号であり、ｔは反応時間であり、αは第１の定数であり、βは第２の定数であり、ｋは第３の定数であり、ｂは第４の定数である。これらの定数は、当技術分野で周知の連立方程式を解くことに関する技法を使用して、少なくとも２つの異なる濃度と少なくとも２つの異なる反応時間とを有するキャリブレータ流体を使用することによって決定される。
【００７８】
上記の式（１）において、濃度は、以下のように表すことができる。
【００７９】
【数１】
0006328655.tif 000002
【００８０】
較正プロセス中に定数を決定すると、その定数は、アッセイのその特定のロットについてのロットデータ中に含められる。好ましい実施形態では、器具は、アッセイが実行されている時の較正定数を含むロットデータを自動的に読み取ることができる。また、器具は、工場較正の間に行われたもの、例えば、試薬溶解時間、総吸上時間、流速など、並びアッセイが実行される時に得られた信号と同様に又はそれに比例して反応時間を決定することができるであろう。上記の式を使用して、器具は、濃度と反応時間の両方の変動を考慮する濃度を報告するであろう。
【００８１】
同様にして、非線形アッセイを較正することができる。例えば、検体の濃度Ｃは、ｌｏｇｉｔ／ｌｏｇ４数学モデルを使用して、以下の式によって表すことができる。
【００８２】
【数２】
0006328655.tif 000003
ただし、Ｃは検体の濃度であり、Ｓは信号であり、β０〜β３はそれぞれ、第１の定数、第２の定数、第３の定数、第４の定数である。定数β０〜β３は、反応時間と信号強度の両方を測定する本発明による較正手順中に決定される。
【００８３】
別の好適な本発明の態様では、反応時間ｔは、信号速度を使用して検体濃度を決定することによって、較正モデルにおいて考慮される。信号速度Ｒは、反応時間ｔにわたって器具が測定する信号Ｓとして定義される。
Ｒ＝Ｓ／ｔ                            （４）
【００８４】
これは、上述のタイプ２調整済応答と同じである。線形関係を有するアッセイの場合、濃度は次のように表すことができる。
Ｃ＝（Ｒ−α）／β                    （５）
ただし、Ｃは検体の濃度であり、Ｒは信号速度であり、αは第１の定数であり、βは第２の定数である。一般的には、上述したように工場において行われる較正モデルの開発中に求められた定数。検体濃度を決定するために信号速度法を使用することの利点は、上記の式（２）について４つの定数を解くのとは対照的に２つの定数しか解かないので、較正プロセス中に必要な方程式が少ないということである。
【００８５】
較正プロセス中に定数を決定すると、その定数は、アッセイのその特定のロットについてのロットデータ中に含められる。使用中に、器具は、較正定数を含むロットデータを自動的に読み取ることができる。また、器具は、工場較正の間に行われるのと同様に、例えば、試薬溶解時間、総吸上時間、流速など、並びアッセイが実行される時に得られた信号と同様に反応時間を決定することができるであろう。上記式を使用して、器具は、濃度と反応時間の両方の変動を考慮する濃度を報告するであろう。
【００８６】
同様にして、信号速度Ｒを使用して非線形アッセイを較正することができる。例えば、検体の濃度Ｃは、ｌｏｇｉｔ／ｌｏｇ４関係を使用して、以下の式によって表すことができる。
【００８７】
【数３】
0006328655.tif 000004
ただし、Ｃは検体の濃度であり、Ｒは信号速度であり、β０〜β３は、第１の定数、第２の定数、第３の定数、第４の定数である。定数β０〜β３は、反応時間と信号強度の両方を測定する本発明による較正手順中に決定される。
【００８８】
タイプ１調整済応答（Ｒ＝Ｓ／ｔ）と同様にし、上記の較正式を使用してタイプ２調整応答Ｒ＝Ｓ×反応体積、好ましくはＲ＝（Ｓ＊ｔ＊流量）を決定することができる。
【００８９】
本発明とともに使用可能な装置は、好ましくは、使い捨てアッセイ装置である。アッセイ装置は、取り扱い及び保護の容易性のためにハウジングに収容されることがある。アッセイ装置がそのようなハウジングに収容される場合、ハウジングは、好ましくは、サンプルをアッセイ装置に添加するためのポートを含むであろう。
【００９０】
本発明のアッセイ装置は、本発明のアッセイに対して実行されたアッセイ装置の結果を読み取るための装置（読み取り機）とともに使用することができる。読み取り機は、光検出器のような、検出要素により射出された、又はそこで反射した信号を読み取る手段と、一体型の読み取り機又は別個のコンピュータ内に含まれ得るマイクロプロセッサのような、信号を処理し結果を示す手段とを含む。好適な読み取り機は、例えば、米国特許出願公開第２００７／０２３１８８３号、及び米国特許第７，４１６，７００号に記載され、これらは両方とも参照によりその全体が組み込まれる。
【００９１】
本発明の別の態様は、対象の１つ又は２つ以上の検体を検出するために液体サンプルに対してアッセイを実行する方法を対象とする。例えば、アッセイ装置のハウジングのポートを通じて、又は、指先穿刺採血の場合にはサンプル添加区画に直接指で触れることによって、対象の（１つ又は複数の）検体を含有する液体サンプルをアッセイ装置のサンプル区画上に堆積させる。サンプルは、毛管作用によって、任意選択のフィルターを通して試薬区画へと移動し、そこで試薬材料を溶解させる。代替的には上述したように、検出区画の前にある何らかのポイントでサンプルと試薬材料とを化合させる。好ましい実施形態では、サンドイッチタイプアッセイの場合には、サンプルを検出要素と直接的に、又は、例えば抗体を介して間接的に反応させる。サンプルは、検出区画へと流れるにつれて、溶解した試薬プルームを有する試薬区画から離れるように流れる。
【００９２】
次に、サンプルは、毛管現象により検出区画へと移動する。検出区画において、検体又は制御を表す信号を生成する。好ましい実施形態では、サンプルあるいは検出要素を有する１つ又は２つ以上の試薬は、検出区画において、例えば、検出区画の表面上で抗体によって捕捉され、（１つ又は複数の）検体又は（１つ又は複数の）制御の存在又は濃度を表す信号が生成される。次いで、（１つ又は複数の）検体又は（１つ又は複数の）制御の存在又は濃度を決定するために、読み取り機又は上述したような検出器具を使用して、検出区画において生成された信号を読み取る。サンプルは、検出区画から吸上区画内へと移動する。読み取り機は、サンプルが検出区画を通して移動した後直ちに又は短時間で、検出区画における信号を読み取ることができる。また、１つ又は２つ以上の洗浄液は、検出区画から検出要素のような任意の結合していない試薬を洗い流すために、装置を通してサンプルに追従することができる。また、上記で説明した技術のうちの１つを使用して、反応時間を決定する。
【００９３】
器具は、次いで、アッセイを用いて提供されたロット較正データ、検出区画において読み取られた信号及び反応時間を使用して、検体の濃度を自動的に決定する。代替的には、工場設定以外の較正モデルを決定することができる。例えば、較正曲線は、既知のアナライザ濃度の、一般的にはアッセイ製造業者により提供されるキャリブレータと連携してアッセイロットを使用した時に、アナライザによって自動的に生成され得る。次いで、アナライザは、それが生成した較正曲線を使用して、サンプルを試験した時の検体の濃度を算出するであろう。代替的には、上記で導かれた式を使用して、手動で検体の濃度を算出することができる。
【００９４】
本発明の一実施形態による方法、アッセイ装置及び読み取り機は、免疫化学反応の反応動態の向上及びアッセイの感度の増大に主に関係する多くの利点を有する。
【００９５】
本発明は、本明細書に示す特定の実施形態には限定されないことを理解されたい。以下の実施例は、例示を目的として提供されるものであり、添付の特許請求の範囲及びその等価物によってのみ本発明は限定されるので、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００９６】
（実施例１）
シッフ塩基結合によるタンパク質の共有結合固定のために、表面上に酸化デキストランを有する、Ｚｅｏｎｏｒ（登録商標）（ゼオンジャパン）で作製されたプラスチック基材チップを使用した。蛍光標識された抗ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰモノクローナル抗体を堆積させ、乾燥させて、試薬区画を生成した。抗ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰモノクローナル抗体を堆積させ、乾燥させて、検出区画を生成した。より良好な毛管流のためにサンプルの湿潤性を増大させるために、少量のトリトンＸ−４５を装置に堆積させた。以下の表１に示すサンプル濃度を有するサンプルを装置のサンプル区画に添加し、マイクロピラーアレイの毛管現象により、サンプルをフローチャネルを通して吸上区画内へと分散させた。異なる反応時間を提供するために、異なるチップ設計（Ａ及びＢ）を使用し、それにより、表１並びに図１０Ａ及び図１０Ｂに示される２つの反応時間が提供された。検出区画における蛍光標識された複合体からの信号強度を、プロトタイプのライン照明蛍光スキャナに記録した。以下に述べる図１０Ａ及び図１０Ｂに結果を示す。
【００９７】
【表１】
0006328655.tif 000005
【００９８】
図１０Ａは、信号強度対ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰの濃度のプロットを示している。図１０Ａは等しい濃度の検体について示しているので、検出された信号は、アッセイの反応時間がより長い場合に著しく大きくなる（５分対３分２０秒）。従来的な較正モデルを使用した結果、アッセイのＮＴ−ＰｒｏＢＮＰの濃度が同じ場合の報告結果が大幅に異なることになる。図１０Ｂは、信号速度対ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰの濃度のプロットである。このグラフでは、信号とは対照的に信号速度自体を使用することによって、反応時間が考慮される。その結果、異なる反応時間についての信号速度は、ほぼ同じとなる。したがって、反応時間が異なる２つの異なるサンプル間の検体濃度の報告結果は、ほぼ同じであろう。
【００９９】
（実施例２）
全て同じチップ設計を使用して実施例１と同様にアッセイ装置を準備した。粘度が異なるが同じ濃度のＮＴ−ＰｒｏＢＮＰのサンプルの２つのセットを準備をした。表２のサンプルは、４３．３ｐｇ／ｍＬの検体を有した。表３のサンプルは、７５０ｐｇ／ｍＬのＮＴ−ＰｒｏＢＮＰを有した。
【０１００】
【表２】
0006328655.tif 000006
【０１０１】
【表３】
0006328655.tif 000007
【０１０２】
表２及び図３が示すように、異なる粘度のサンプルは、同じ濃度の検体について、異なる反応時間（ＣＤ時間）及び異なる信号強度を生じる。その結果、信号のみと信号のみを使用する較正モデルとを使用した、４３．３ｐｇ／ｍＬの検体（表２）を含有するサンプルの予測濃度は、２４．６１〜６７．６５の範囲となり、その結果、変動係数が５０．４％になる。信号のみと信号のみを使用する較正モデルとを使用した、７５０ｐｇ／ｍＬを含有するサンプルについては、５２２〜９７１ｍｇ／Ｌの範囲となり、その結果、変動係数が２９．８％になる。一方、信号速度と信号速度（信号／反応時間）を使用する較正モデルとを使用すると、１．０％のｃｖ％について４２．６６〜４３．５２ｍｇ／ｍＬ（表２）の、又は８．２％のｃｖ％について６７９〜７９７ｍｇ／ｍＬ（表３）の濃度範囲を生じる。
【０１０３】
図１１Ａ及び図１１Ｂは、表３から得られたデータを図式的に表している。各図が示すように、信号のみを使用する較正モデルとともに信号のみを使用して得られる予測濃度（図１１Ａ）の実際の濃度（Ｒ２＝０．８８１５）との相関は乏しく、信号及び反応時間（すなわち、信号速度）と信号速度を使用する較正モデルとを使用する予測濃度（図１１Ｂ）の実際の濃度（Ｒ２＝０．９９）との相関は優れている。
【０１０４】
（実施例３）
シッフ塩基結合によるタンパク質の共有結合固定のために、表面上に酸化デキストランを有する、Ｚｅｏｎｏｒ（登録商標）（ゼオンジャパン）で作製されたプラスチック基材チップを使用した。ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰを多重化するために２つの検出区画を提供し、リスペリドンを提供し、蛍光標識された抗ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰモノクローナル抗体を堆積させ、乾燥させて、試薬区画を生成した。抗ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰモノクローナル抗体を堆積させ、乾燥させて、検出区画を生成した。共有結合したリスペリドンをもつ蛍光標識されたＢＳＡを堆積させ、乾燥させて、試薬区画を生成した。抗リスペリドンモノクローナル抗体を堆積させ、乾燥させて、第２の検出区画を生成するために乾燥された。より良好な毛管流のためにサンプルの湿潤性を増大させるために、少量のトリトンＸ−４５を装置に堆積させた。以下の表４に示すサンプル濃度を有するサンプルを装置のサンプル区画に添加し、マイクロピラーアレイの毛管現象により、サンプルをフローチャネルを通して吸上区画内へと分散させた。異なる反応時間を提供するために、ＰＶＰを使用して粘度を変更して、異なる粘度血清を提供した。検出区画における蛍光標識された複合体からの信号強度を、プロトタイプのライン照明蛍光スキャナに記録した。以下の表５に結果を示す。表４及び表５について、「平均ＣＪ溶解時間」は試薬溶解時間であり、「近似ＣＪ溶解体積」は反応体積であり、「平均領域」は信号強度の表示である。
【０１０５】
【表４】
0006328655.tif 000008
【０１０６】
表５は、フロー時間が増大するにつれて、ＮＴｐｒｏ−ＮＢＰとリスペリドンの両方についての応答が増大することを示している。
【０１０７】
【表５】
0006328655.tif 000009
【０１０８】
表４及び図５が示すように、異なる粘度サンプルは、検体の濃度が同じ場合、異なる反応時間（ＣＤ時間）及び異なる信号強度を生じる。
【０１０９】
表６は、粘度が異なるサンプルから得られる元の応答の精度（％  ＣＶ）と実施例３のデータから得られる２つのタイプの調整済応答とを比較する。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰはサンドイッチアッセイであり、リスペリドンは競合アッセイである。
【０１１０】
【表６】
0006328655.tif 000010
【０１１１】
サンプル流体Ｌｖ１について、未補正のＣＶは５７％であるが、タイプ１の補正は２９％であり、タイプ２は１７％であり、大幅に改善される。リスペリドンについて、未補正のＣＶは７９％であるが、タイプ１は５２％であり、タイプ２は３７％であり、やはり大幅に改善される。サンプル流体Ｌｖ２について、未補正のＣＶは２９％であるが、タイプ１の補正は８％であり、タイプ２は８％であり、大幅に改善される。リスペリドンについて、未補正のＣＶは７４％であるが、タイプ１は４０％であり、タイプ２は３９％であり、やはり大幅に改善される。
【０１１２】
実験の別のセットでは、プロカルシトニン（ＰＣＴ）及びサンドイッチタイプアッセイを試験した。
【０１１３】
（実施例４）
シッフ塩基結合によるタンパク質の共有結合固定のために、表面上に酸化デキストランを有する、Ｚｅｏｎｏｒ（登録商標）（ゼオンジャパン）で作製されたプラスチック基材チップを使用した。蛍光標識された抗ＰＣＴモノクローナル抗体を堆積させ、乾燥させて、試薬区画を生成した。抗ＰＣＴモノクローナル抗体を堆積させ、乾燥させて、検出区画を生成した。より良好な毛管流のためにサンプルの湿潤性を増大させるために、少量のトリトンＸ−４５を装置に堆積させた。以下の表７に示すＰＣＴ濃度を有するサンプルを装置のサンプル区画に添加し、マイクロピラーアレイの毛管現象により、サンプルをフローチャネルを通して吸上区画内へと分散させた。表７に示された濃度でサンプルに同じく添加されたトリグリセリド（Ｔｒｉｇ）（表７では「干渉物質」と称される）を添加することによって粘度を変更した。トリグリセリドの濃度を高めることによって、サンプルの粘度を高めた。検出区画中の蛍光標識された複合体からの信号強度（ピーク面積）をプロトタイプのライン照明蛍光スキャナに記録した。
【０１１４】
【表７】
0006328655.tif 000011
【０１１５】
表７が示すように、粘度が増大すると（すなわち、Ｔｒｉｇの濃度が増大すると）、フロー時間（すなわち、反応時間の測定値）が長くなり、したがって信号が高くなる。これは、反応時間の増大に伴う信号の増大を実証する他のアッセイ（サンドイッチと競合の両方）についてのデータと一致する。実験の別のセットでは、（アルブミン及びガンマグロブリンからの）総タンパク質を粘度調整剤として添加した。以下の表８は、総タンパク質濃度の増大は、信号（ピーク面積）の減少につながるが、フロー時間は長くなることを示している。これは、発明者の他の発見とは一致しなかった。総フロー時間影響を及ぼすために粘度を変更すること又はアッセイ装置を変更することのいずれかによってフロー時間（すなわち、反応時間）を変更するための更なる実験により、反応時間の増大が信号の増大につながるという発明者の当初の発見を確認した。タンパク質は、ＰＣＴにいくらか干渉し、その後、誤った結果を与えたと考えられる。
【０１１６】
【表８】
0006328655.tif 000012
【０１１７】
追加の実施形態
１．流路を有するアッセイ装置において対象の１つ又は２つ以上の検体を検出するために液体サンプルに対してアッセイを実行するための方法であって、流路が、その上にサンプル区画及び検出区画を含み、方法が、サンプル区画上にサンプルを分注することと、サンプルと試薬とを化合させることであって、サンプル区画へのサンプルの添加の前に、又は、アッセイ装置上でサンプルと試薬とを化合させることができる、化合させることと、化合させたサンプル／試薬を、毛管現象によって、捕捉要素が結合された検出区画内へと、かつ、検出区画を通して流すことであって、（１つ又は複数の）検体の存在又は濃度を少なくとも部分的に表す信号が生成され、検出される、流すことと、反応時間を決定することと、検出された信号と反応時間の両方を使用することによって、検体の濃度を決定することとを含む、方法。
【０１１８】
２．流速を決定することと、反応時間、流速及び検出された信号によって濃度を決定することとを更に含む、実施形態１に開示の方法。
【０１１９】
３．流速が、反応時間と流速との積である反応体積によって表される、実施形態２に開示の方法。
【０１２０】
４．濃度が、（１）検出された信号に反応体積を乗算することにより検出された信号を調整することによって決定される（調整済み信号（Ｒ）＝検出された信号×反応体積）、又は（２）検出された信号を反応時間で除算することにより検出された信号を調整することによって決定される（調整済み信号（Ｒ）＝応答／反応時間）、実施形態３に開示の方法。
【０１２１】
５．濃度が、検出された信号を反応時間で除算することにより検出された信号を調整することによって決定される（調整済み信号（Ｒ）＝応答／反応時間）、実施形態１に開示の方法。
【０１２２】
６．反応時間が、化合させたサンプル／試薬が検出区画を通過するのにかかる時間である、実施形態１に開示の方法。
【０１２３】
７．反応時間が、化合させたサンプル／試薬が流路に沿ったポイントで最初に検出される時点から、化合させたサンプル／試薬が流路のそのポイントにおいてもはや検出されない時点までの試薬溶解時間として決定される、実施形態６に開示の方法。
【０１２４】
８．反応時間が、検出要素により生成された信号を検出することによって決定される、実施形態６に開示の方法。
【０１２５】
９．サンプルと試薬とが、サンプル区画上に分注される前に化合させられる、実施形態１に開示の方法。
【０１２６】
１０．流路が、検出区画の下流に配置された吸上区画を更に備え、前記吸上区画が、検出区画から流れて、サンプルを検出区画から吸上区画内へと更に流す液体を収容する容量を有する、実施形態１に開示の方法。
【０１２７】
１１．サンプルがサンプル区画から吸上区画の終点まで流れるのにかかる時間である総フロー時間を測定することによって、反応時間に比例する時間が取得される、実施形態１０に開示の方法。
【０１２８】
１２．サンプルが吸上区画に入って吸上区画の終点に達する時間である総吸上時間を測定することによって、反応時間に比例する時間が取得される、実施形態１０に記載された方法。
【０１２９】
１３．反応時間に比例する時間が、サンプルがアッセイ装置全体に完全に浸透するのに必要な時間である湿潤時間として決定される、実施形態１０に開示の方法。
【０１３０】
１４．反応時間に反比例する速度が、流速として決定される、実施形態１に開示の方法。
【０１３１】
１５．濃度が、Ｓ／ｔとして定義される信号速度Ｒにより検出された信号を調整することによって決定され、Ｓは検出された信号であり、ｔは反応時間である、実施形態５に開示の方法。
【０１３２】
１６．濃度が、以下の式によって決定され、
Ｃ＝（Ｒ−α）／β
Ｃは検体の濃度であり、Ｒは信号速度であり、αは第１の定数であり、βは第２の定数である、
実施形態１５に開示の方法。
【０１３３】
１７．α及びβアッセイの較正中に決定される、実施形態１６に開示の方法。
【０１３４】
１８．濃度が、以下の式によって決定され、
【数４】
0006328655.tif 000013
Ｃは検体の濃度であり、Ｒは信号速度であり、β０〜β３はそれぞれ、第１の定数、第２の定数、第３の定数及び第４の定数である、実施形態１５に開示の方法。
【０１３５】
１９．β０〜β３が、アッセイの較正中に決定される、実施形態１８に開示の方法。
【０１３６】
２０．濃度が、Ｓ及びｔを使用することによって決定され、Ｓは検出された信号であり、ｔは反応時間である、実施形態１に開示の方法。
【０１３７】
２１．濃度Ｃが、以下の式によって決定され、
【数５】
0006328655.tif 000014
Ｓは検出された信号であり、ｔは反応時間であり、αは第１の定数であり、βは第２の定数であり、ｋは第３の定数である、
実施形態２０に開示の方法。
【０１３８】
２２．α、β及びｋが、アッセイの較正中に決定される、実施形態２１に開示の方法。
【０１３９】
２３．濃度Ｃが、以下の式によって決定され、
【数６】
0006328655.tif 000015
Ｃは検体の濃度であり、Ｒは信号速度であり、β０〜β３はそれぞれ、第１の定数、第２の定数、第３の定数及び第４の定数である、
実施形態２０に開示の方法。
【０１４０】
２４．β０〜β３が、アッセイの較正中に決定される、実施形態２３に開示の方法。
【０１４１】
２５．サンプルと試薬とを化合させる工程が、サンプル区画と検出区画との間に試薬を収容する試薬区画を提供することを更に含み、サンプル区画から流れるサンプルが、試薬を溶解させ、液体サンプルと溶解した試薬とを含む試薬プルームを形成する、実施形態１に開示の方法。
【０１４２】
２６．反応時間は、試薬プルームが基材に沿ったポイントにおいて最初に検出される時点から、試薬プルームがもはや検出されない時点までの時間に比例する、試薬溶解時間に比例している、実施形態２５に開示の方法。
【０１４３】
２７．検出区画が、基材から実質的に垂直方向に延びた突起部を備え、突起部が、基材表面に対して平行な毛管流を生成することが可能な毛管空間を突起部の間に画定する高さ、断面積及び相互距離を有する、実施形態１に開示の方法。
【０１４４】
２８．試薬が、サンドイッチタイプアッセイの場合にはサンプル中の検体に結合することが可能である標識抗体コンジュゲートを備え、又は試薬が、競合アッセイの場合には標識抗体が結合させた検体を備える、実施形態１に開示の方法。
【０１４５】
２９．アッセイが、サンドイッチタイプアッセイである、実施形態２８に開示の方法。
【０１４６】
３０．流路を有するアッセイ装置において、対象の１つ又は２つ以上の検体を検出するために液体サンプルに対してアッセイを実行するための方法であって、前記流路が、その上にサンプル区画及び検出区画を含み、前記方法が、サンプル区画上にサンプルを分注することと、サンプルと試薬とを化合させることであって、サンプル区画へのサンプルの添加の前に、又は、アッセイ装置上でサンプルと試薬とを化合させることができる、化合させることと、化合させたサンプル／試薬を、毛管現象によって、捕捉要素が結合された検出区画内へと、かつ、検出区画を通して流すことであって、（１つ又は複数の）検体の存在又は濃度を少なくとも部分的に表す信号が生成され、検出される、流すことと、反応体積を決定することと、検出された信号と反応体積を使用することによって検体の濃度を決定することとを含む、方法。
【０１４７】
３１．反応体積が、反応時間と流速との積である、実施形態３０に開示の方法。
【０１４８】
３２．反応時間は、化合させたサンプル／試薬が検出区画を通過するのにかかる時間である、実施形態３１に開示の方法。
【０１４９】
３３．反応時間が、化合させたサンプル／試薬が流路に沿ったポイントで最初に検出される時点から、化合させたサンプル／試薬が流路のそのポイントにおいてもはや検出されない時点までの試薬溶解時間として決定される、実施形態３３に開示の方法。
【０１５０】
３４．アッセイを較正する方法であって、（ａ）既知の濃度の検体を中に有する複数のキャリブレータ流体を提供することと、（ｂ）サンプル区画及び検出区画を含む基材を有するアッセイ装置を提供することと、（ｃ）サンプル区画上にキャリブレータ流体のうちの１つを分注することと、（ｄ）キャリブレータ流体と試薬とを化合させることであって、サンプル区画へのキャリブレータ流体の添加の前に、又は、アッセイ装置上でキャリブレータ流体と試薬とを化合させることができる、化合させることと、（ｅ）化合させたキャリブレータ流体／試薬を、毛管現象によって、捕捉要素が結合された検出区画内へと、かつ、検出区画を通して流すことであって、（１つ又は複数の）検体の存在又は濃度を少なくとも部分的に表す信号が生成され、検出される、流すことと、（ｆ）反応時間を決定することと、（ｇ）各キャリブレータ流体について、工程（ｂ）〜（ｆ）を反復することと、（ｈ）較正曲線を決定するために、検出された信号Ｓ、反応時間ｔ及び既知の濃度Ｃを使用することとを含む、方法。
【０１５１】
３５．反応時間が、化合させたサンプル／試薬が検出区画を通過するのにかかる時間である、実施形態３４に開示のアッセイを較正する方法。
【０１５２】
３６．検出された信号Ｓ、反応時間ｔ及び既知の濃度Ｃが、関係Ｓ＝ｆ（Ｃ，ｔ）の関数ｆを決定するために使用される、実施形態３４に開示のアッセイを較正する方法。
【０１５３】
３７．関数ｆが線形であり、較正曲線が、
Ｓ＝（βｔ＋α）（ｋＣ＋ｂ）
によって定義され、β、α、ｋ及びｂは定数である、
実施形態３４に開示のアッセイを較正する方法。
【０１５４】
３８．関数ｆが非線形であり、較正曲線が、
【数７】
0006328655.tif 000016
によって定義され、β０〜β３はそれぞれ、第１の定数、第２の定数、第３の定数及び第４の定数である、
実施形態３５に開示のアッセイを較正する方法。
【０１５５】
３９．信号変化速度Ｒが、Ｒ＝Ｓ／ｔとして算出され、関数ｆが関係Ｒ＝ｆ（Ｃ）であると決定するために信号速度及び濃度が使用される、実施形態３４に開示のアッセイを較正する方法。
【０１５６】
４０．関数が線形であり、較正曲線が、
Ｒ＝ｍＣ＋ｂ
によって定義され、ｍ及びｂは定数である、
実施形態３９に開示のアッセイを較正する方法。
【０１５７】
４１．関数が非線形であり、較正曲線が、
【数８】
0006328655.tif 000017
によって定義され、β０〜β３はそれぞれ、第１の定数、第２の定数、第３の定数及び第４の定数である、
実施形態３９に開示のアッセイを較正する方法。
【０１５８】
４２．試薬区画を提供することを更に含み、サンプルが、試薬区画において試薬を溶解させ、それと化合する、実施形態３４に開示のアッセイを較正する方法。
【０１５９】
４３．試薬区画を提供することを更に含み、サンプルが、試薬区画において試薬を溶解させ、それと化合する、実施形態１に開示の方法。
【０１６０】
４４．アッセイを較正する方法であって、（ａ）既知の濃度の検体を中に有する複数のキャリブレータ流体を提供することと、（ｂ）サンプル区画及び検出区画を含む基材を有するアッセイ装置を提供することと、（ｃ）サンプル区画上にキャリブレータ流体のうちの１つを分注することと、（ｄ）キャリブレータ流体と試薬とを化合させることであって、サンプル区画へのキャリブレータ流体の添加の前に、又は、アッセイ装置上でキャリブレータ流体と試薬とを化合させることができる、キャリブレータ流体と試薬とを化合させることと、（ｅ）化合させたキャリブレータ流体／試薬を、毛管現象によって、捕捉要素が結合された検出区画内へと、かつ、検出区画を通して流すことであって、（１つ又は複数の）検体の存在又は濃度を少なくとも部分的に表す信号が生成され、検出される、流すことと、（ｆ）反応体積を決定することと、（ｇ）各キャリブレータ流体について、工程（ｂ）〜（ｆ）を反復することと、（ｈ）較正曲線を決定するために、検出された信号Ｓ、反応体積及び既知の濃度Ｃを使用することとを含む、方法。
【０１６１】
４５．反応体積が、反応時間と流速との積によって決定される、実施形態４４に開示のアッセイを較正する方法。
【０１６２】
４６．検出された信号Ｓが、検出された信号に反応体積を乗算することによって調整される、実施形態４５に開示のアッセイを較正する方法。
【０１６３】
当業者には、本発明及び本明細書に記載したその実施形態は、具体的に記載されたもの以外の変化形態及び修正形態が可能であることが了解されよう。本発明は全てのそのような変化形態及び修正形態を含むことを理解されたい。本発明はまた、本明細書で参照される全ての工程及び特徴部を個別に又は包括的に、かつ工程又は特徴部のうちの任意の２つ以上の任意の組み合わせ及び全ての組み合わせを含む。
【０１６４】
「Ｌｏｗ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ」（米国特許仮出願第６１／５８８７５８号、代理人整理番号；ＣＤＳ  ５１１１ＵＳＰＳＰ、第１発明者：Ｐｈｉｌ  Ｈｏｓｉｍｅｒ）、「Ａｓｓａｙ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ」（米国特許仮出願第６１／５８８７７９号、代理人整理番号：ＣＤＳ  ５１１３ＵＳＰＳＰ、第１発明者：Ｓｕｅ  Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ）、「Ａｓｓａｙ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ」（米国特許仮出願第６１／５８８７３８号、代理人整理番号：ＣＤＳ５１０４ＵＳＰＳ、第１発明者：Ｚｈｏｎｇ  Ｄｉｎｇ）、「Ａｓｓａｙ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｆｌｏｗ  Ａｒｏｕｎｄ  Ｃｏｒｎｅｒｓ」（米国特許仮出願第６１／５８８７４５号、代理人整理番号：ＣＤＳ５１１０ＵＳＰＳＰ、第１発明者：Ｊａｍｅｓ  Ｋａｎａｌｅｙ）、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｆｌｕｉｄ  Ｆｌｏｗ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｖｉｃｅ」（米国特許仮出願第  ６１／５８８７７２号、代理人整理番号：ＣＤＳ５１１２ＵＳＰＳＰ、第１発明者：Ｊａｍｅｓ  Ｋａｎａｌｅｙ）、及び「Ａｓｓａｙ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｓｉｚｅ」（米国特許仮出願第６１／５８８８９９号、代理人整理番号：ＣＤＳ５１１４ＵＳＰＳＰ、第１発明者：Ｅｄ  Ｓｃａｌｉｃｅ）と題する同時係属出願は全て、２０１２年１月２０日付で出願され、これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
〔実施の態様〕
（１）  流路を有するアッセイ装置において対象の１つ又は２つ以上の検体を検出するために液体サンプルに対してアッセイを実行するための方法であって、前記流路が、その上にサンプル区画及び検出区画を含み、前記方法が、
前記サンプル区画上に前記サンプルを分注することと、
前記サンプルと試薬とを化合させることであって、前記サンプル区画への前記サンプルの添加の前に、又は、前記アッセイ装置上で前記サンプルと前記試薬とを化合させることができる、化合させることと、
前記化合させたサンプル／試薬を、毛管現象によって、捕捉要素が結合された前記検出区画内へと、かつ、前記検出区画を通して流すことであって、（１つ又は複数の）検体の存在又は濃度を少なくとも部分的に表す信号が生成され、検出される、流すことと、
反応時間を決定することと、
前記検出された信号と前記反応時間の両方を使用することによって、前記検体の濃度を決定することと、
を含む、方法。
（２）  前記検体がＮＴ−ｐｒｏＢＮＰである、実施態様１に記載の方法。
（３）  前記検体がリスペリドンである、実施態様２に記載の方法。
（４）  前記検体がプロカルシトニンである、実施態様３に記載の方法。
（５）  前記濃度が、前記検出された信号を前記反応時間で除算することにより前記検出された信号を調整することによって決定される（調整済み信号（Ｒ）＝応答／反応時間）、実施態様１に記載の方法。
【０１６６】
（６）  前記反応時間が、前記化合させたサンプル／試薬が前記検出区画を通過するのにかかる時間である、実施態様１に記載の方法。
（７）  前記反応時間が、前記化合させたサンプル／試薬が前記流路に沿ったポイントで最初に検出される時点から、前記化合させたサンプル／試薬が前記流路のそのポイントにおいてもはや検出されない時点までの試薬溶解時間として決定される、実施態様６に記載の方法。
（８）  前記反応時間が、検出要素により生成された信号を検出することによって決定される、実施態様６に記載の方法。
（９）  前記サンプルと前記試薬とが、前記サンプル区画上に分注される前に化合させられる、実施態様１に記載の方法。
（１０）  前記流路が、前記検出区画の下流に配置された吸上区画を更に備え、前記吸上区画が、前記検出区画から流れて、前記サンプルを前記検出区画から前記吸上区画内へと更に流す液体を収容する容量を有する、実施態様１に記載の方法。
【０１６７】
（１１）  前記サンプルが前記サンプル区画から前記吸上区画の終点まで流れるのにかかる時間である総フロー時間を測定することによって、反応時間に比例する時間が取得される、実施態様１０に記載の方法。
（１２）  前記サンプルが前記吸上区画に入って前記吸上区画の終点に達する時間である総吸上時間を測定することによって、反応時間に比例する時間が取得される、実施態様１０に記載の方法。
（１３）  前記反応時間に比例する時間が、前記サンプルが前記アッセイ装置全体に完全に浸透するのに必要な時間である湿潤時間として決定される、実施態様１０に記載の方法。
（１４）  前記反応時間に反比例する速度が、流速として決定される、実施態様１に記載の方法。
（１５）  前記濃度が、Ｓ／ｔとして定義される信号速度Ｒにより前記検出された信号を調整することによって決定され、Ｓは前記検出された信号であり、ｔは前記反応時間である、実施態様５に記載の方法。
【０１６８】
（１６）  前記濃度が、以下の式によって決定され、
Ｃ＝（Ｒ−α）／β
Ｃは前記検体の濃度であり、Ｒは前記信号速度であり、αは第１の定数であり、βは第２の定数である、実施態様１５に記載の方法。
（１７）  α及びβが、前記アッセイの較正中に決定される、実施態様１６に記載の方法。
（１８）  前記濃度が、以下の式によって決定され、
【数９】
0006328655.tif 000018
Ｃは前記検体の濃度であり、Ｒは前記信号速度であり、β０〜β３はそれぞれ、第１の定数、第２の定数、第３の定数及び第４の定数である、実施態様１５に記載の方法。
（１９）  β０〜β３が、前記アッセイの較正中に決定される、実施態様１８に記載の方法。
（２０）  前記濃度が、Ｓ及びｔを使用することによって決定され、Ｓは前記検出された信号であり、ｔは前記反応時間である、実施態様１に記載の方法。
【０１６９】
（２１）  前記濃度Ｃが、以下の式によって決定され、
【数１０】
0006328655.tif 000019
Ｓは前記検出された信号であり、ｔは前記反応時間であり、αは第１の定数であり、βは第２の定数であり、ｋは第３の定数である、実施態様２０に記載の方法。
（２２）  α、β及びｋが、前記アッセイの較正中に決定される、実施態様２１に記載の方法。
（２３）  前記濃度Ｃが、以下の式によって決定され、
【数１１】
0006328655.tif 000020
Ｃは前記検体の濃度であり、Ｒは前記信号速度であり、β０〜β３はそれぞれ、第１の定数、第２の定数、第３の定数及び第４の定数である、実施態様２０に記載の方法。
（２４）  β０〜β３が、前記アッセイの較正中に決定される、実施態様２３に記載の方法。
（２５）  前記サンプルと前記試薬とを化合させる前記工程が、前記サンプル区画と前記検出区画との間に前記試薬を収容する試薬区画を提供することを更に含み、前記サンプル区画から流れる前記サンプルが、前記試薬を溶解させ、前記液体サンプルと溶解した試薬とを含む試薬プルームを形成する、実施態様１に記載の方法。
【０１７０】
（２６）  前記反応時間は、前記試薬プルームが基材に沿ったポイントにおいて最初に検出される時点から、前記試薬プルームがもはや検出されない時点までの時間に比例する、試薬溶解時間に比例している、実施態様２５に記載の方法。
（２７）  前記検出区画が、基材から実質的に垂直方向に延びた突起部を備え、前記突起部が、基材表面に対して平行な毛管流を生成することが可能な毛管空間を前記突起部の間に画定する高さ、断面積及び相互距離を有する、実施態様１に記載の方法。
（２８）  前記試薬が、サンドイッチタイプアッセイの場合には前記サンプル中の前記検体に結合することが可能である標識抗体コンジュゲートを備え、又は前記試薬が、競合アッセイの場合には標識抗体が結合された検体を備える、実施態様１に記載の方法。
（２９）  前記アッセイが、サンドイッチタイプアッセイである、実施態様２８に記載の方法。
（３０）  流路を有するアッセイ装置において対象の１つ又は２つ以上の検体を検出するために液体サンプルに対してアッセイを実行するための方法であって、前記流路が、その上にサンプル区画及び検出区画を含み、前記方法が、
前記サンプル区画上に前記サンプルを分注することと、
前記サンプルと試薬とを化合させることであって、前記サンプル区画への前記サンプルの添加の前に、又は、前記アッセイ装置上で前記サンプルと前記試薬とを化合させることができる、化合させることと、
前記化合させたサンプル／試薬を、毛管現象によって、捕捉要素が結合された前記検出区画内へと、かつ、前記検出区画を通して流すことであって、（１つ又は複数の）検体の存在又は濃度を少なくとも部分的に表す信号が生成され、検出される、流すことと、
反応体積を決定することと、
前記検出された信号と前記反応体積の両方を使用することによって前記検体の濃度を決定することと、
を含む、方法。
【０１７１】
（３１）  前記反応体積が、反応時間と流速との積である、実施態様３０に記載の方法。
（３２）  前記反応時間は、前記化合させたサンプル／試薬が前記検出区画を通過するのにかかる時間である、実施態様３１に記載の方法。
（３３）  前記反応時間が、前記化合させたサンプル／試薬が前記流路に沿ったポイントで最初に検出される時点から、前記化合させたサンプル／試薬が前記流路のそのポイントにおいてもはや検出されない時点までの試薬溶解時間として決定される、実施態様３２に記載の方法。
（３４）  前記濃度が、前記検出された信号に反応体積を乗算することにより前記検出された信号を調整することによって決定される（調整済み信号（Ｒ）＝検出された信号×反応体積）、実施態様３０に記載の方法。
（３５）  アッセイを較正する方法であって、
（ａ）既知の濃度の検体を中に有する複数のキャリブレータ流体を提供することと、
（ｂ）サンプル区画及び検出区画を含む基材を有するアッセイ装置を提供することと、
（ｃ）前記サンプル区画上に前記キャリブレータ流体のうちの１つを分注することと、
（ｄ）前記キャリブレータ流体と試薬とを化合させることであって、前記サンプル区画への前記キャリブレータ流体の添加の前に、又は、前記アッセイ装置上で前記キャリブレータ流体と前記試薬とを化合させることができる、化合させることと、
（ｅ）前記化合させたキャリブレータ流体／試薬を、毛管現象によって、捕捉要素が結合された前記検出区画内へと、かつ、前記検出区画を通して流すことであって、（１つ又は複数の）検体の存在又は濃度を少なくとも部分的に表す信号が生成され、検出される、流すことと、
（ｆ）反応時間を決定することと、
（ｇ）各キャリブレータ流体について、工程（ｂ）〜（ｆ）を反復することと、
（ｈ）較正曲線を決定するために、前記検出された信号Ｓ、前記反応時間ｔ及び前記既知の濃度Ｃを使用することと、
を含む、方法。
【０１７２】
（３６）  前記反応時間が、前記化合させたサンプル／試薬が前記検出区画を通過するのにかかる時間である、実施態様３５に記載のアッセイを較正する方法。
（３７）  前記検出された信号Ｓ、前記反応時間ｔ及び前記既知の濃度Ｃが、関係Ｓ＝ｆ（Ｃ，ｔ）の関数ｆを決定するために使用される、実施態様３５に記載のアッセイを較正する方法。
（３８）  前記関数ｆが線形であり、前記較正曲線が、
Ｓ＝（βｔ＋α）（ｋＣ＋ｂ）
によって定義され、β、α、ｋ及びｂは定数である、実施態様３５に記載のアッセイを較正する方法。
（３９）  前記関数ｆが非線形であり、前記較正曲線が、
【数１２】
0006328655.tif 000021
によって定義され、β０〜β３はそれぞれ、第１の定数、第２の定数、第３の定数及び第４の定数である、実施態様３６に記載のアッセイを較正する方法。
（４０）  信号変化速度Ｒが、Ｒ＝Ｓ／ｔとして算出され、前記関数ｆが関係Ｒ＝ｆ（Ｃ）であると決定するために前記信号速度及び濃度が使用される、実施態様３５に記載のアッセイを較正する方法。
【０１７３】
（４１）  前記関数が線形であり、前記較正曲線が、
Ｒ＝ｍＣ＋ｂ
によって定義され、ｍ及びｂは定数である、実施態様４０に記載のアッセイを較正する方法。
（４２）  前記関数が非線形であり、前記較正曲線が、
【数１３】
0006328655.tif 000022
によって定義され、β０〜β３はそれぞれ、第１の定数、第２の定数、第３の定数及び第４の定数である、実施態様４０に記載のアッセイを較正する方法。
（４３）  試薬区画を提供することを更に含み、前記サンプルが、前記試薬区画において前記試薬を溶解させ、それと化合する、実施態様３５に記載のアッセイを較正する方法。
（４４）  試薬区画を提供することを更に含み、前記サンプルが、前記試薬区画において前記試薬を溶解させ、それと化合する、実施態様１に記載の方法。
（４５）  アッセイを較正する方法であって、
（ａ）既知の濃度の検体を中に有する複数のキャリブレータ流体を提供することと、
（ｂ）サンプル区画及び検出区画を含む基材を有するアッセイ装置を提供することと、
（ｃ）前記サンプル区画上に前記キャリブレータ流体のうちの１つを分注することと、
（ｄ）前記キャリブレータ流体と試薬とを化合させることであって、前記サンプル区画への前記キャリブレータ流体の添加の前に、又は、前記アッセイ装置上で前記キャリブレータ流体と前記試薬とを化合させることができる、化合させることと、
（ｅ）前記化合させたキャリブレータ流体／試薬を、毛管現象によって、捕捉要素が結合された前記検出区画内へと、かつ、前記検出区画を通して流すことであって、（１つ又は複数の）検体の存在又は濃度を少なくとも部分的に表す信号が生成され、検出される、流すことと、
（ｆ）反応体積を決定することと、
（ｇ）各キャリブレータ流体について、工程（ｂ）〜（ｆ）を反復することと、
（ｈ）較正曲線を決定するために、前記検出された信号Ｓ、前記反応体積及び前記既知の濃度Ｃを使用することと、
を含む、方法。
【０１７４】
（４６）  前記反応体積が、反応時間と流速との積によって決定される、実施態様４５に記載のアッセイを較正する方法。
（４７）  前記検出された信号Ｓが、前記検出された信号に前記反応体積を乗算することによって調整される、実施態様４６に記載のアッセイを較正する方法。
【図１】
0006328655.tif 000023
【図２】
0006328655.tif 000024
【図３】
0006328655.tif 000025
【図４】
0006328655.tif 000026
【図５】
0006328655.tif 000027
【図６】
0006328655.tif 000028
【図７】
0006328655.tif 000029
【図８】
0006328655.tif 000030
【図９】
0006328655.tif 000031
【図１０Ａ】
0006328655.tif 000032
【図１０Ｂ】
0006328655.tif 000033
【図１１Ａ】
0006328655.tif 000034
【図１１Ｂ】
0006328655.tif 000035