(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腹膜サンプルにおいてグラム陰性菌感染の可能性を特定するための方法であって、
（ａ）個体の腹膜サンプルを、前記サンプルの全Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞の量及び前記サンプル中のＩＬ−１０の量を決定するために検査するステップ、及び
（ｂ）全Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞の量が、グラム陰性菌に感染していない個体の対照サンプル中の全Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞の量と比べて増加し、且つＩＬ−１０の量が、グラム陰性菌に感染していない個体の対照サンプル中のＩＬ−１０の量と比べて増加している場合に、
（ｃ）前記腹膜サンプルが採取された個体がグラム陰性菌に感染している可能性が高いことが示されるステップを含む方法。
【請求項２】
前記腹膜サンプルが、腹膜腔由来の液体若しくは腹膜透析治療を受けている個体の腹膜排出液由来の液体又は腹膜組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腹膜サンプル中の：
（ｄ）ＨＬＡ−ＤＲを発現しているＶδ２＋Ｔ細胞、
（ｅ）ＴＮＦ−α、
（ｆ）ＩＬ−１β、及び／又は
（ｇ）ＣＤ８６を発現している腹膜白血球集団内の単球
のいずれか１つ又は複数の、前記対照と比べた量を決定する少なくとも１つのさらなる試験を実施し、
（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つ又は複数の量が前記対照中の同一物の量と比べて増加している場合、又は（ｇ）の量が前記対照中の同一物の量と比べて減少している場合、
当該腹膜サンプルが採取された個体がグラム陰性菌に感染している可能性が高いことが示される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（ａ）〜（ｃ）及び前記ステップ（ｄ）〜（ｇ）のいずれか１つ又は複数を使用して実施され、ステップ（ｄ）〜（ｇ）は任意の好ましい組み合わせを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記腹膜サンプルにおいてグラム陽性菌感染の可能性を特定するためにさらなる方法を実施し、その方法が、
（ａ）ＣＸＣＬ１０の量を決定するために個体の前記腹膜サンプルを検査するステップ、及び
（ｂ）ＣＸＣＬ１０の量が、グラム陽性菌に感染していない個体の対照サンプル中のＣＸＣＬ１０の量と比べて増加している場合、
（ｃ）腹膜サンプルが採取された個体がグラム陽性菌に感染している可能性が高いことが示されるステップを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記腹膜サンプルが、腹膜腔由来の液体若しくは腹膜透析治療を受けている個体の腹膜透析物由来の液体又は腹膜の組織である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記腹膜サンプル中：
（ｄ）全Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞、
（ｅ）全ＣＤ４＋Ｔ細胞数、又は
（ｆ）ＩＬ−２２
のいずれか１つ又は複数の、前記対照と比べた量を決定する少なくとも１つのさらなる試験を実施し、
（ｄ）の量が前記対照中の同一物の量と比べて減少している場合、及び／又は（ｅ）及び／又は（ｆ）の量が前記対照中の同一物の量と比べて増加している場合、
腹膜サンプルが採取された個体が、グラム陽性菌に感染している可能性が高いことが示される、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
請求項５に記載のステップ（ａ）〜（ｃ）及び請求項７に記載のステップ（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つ又は複数を使用して実施され、ステップ（ｄ）〜（ｆ）は任意の好ましい組み合わせを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１から４のいずれか一項に記載のグラム陰性菌感染の可能性を特定するための方法が、請求項５から８に記載のグラム陽性菌感染の可能性を特定するための方法の後、あるいはその前に行われ、又はその逆である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれか一項に記載のグラム陰性菌感染の可能性を特定するための方法及び請求項５から８に記載のグラム陽性菌感染の可能性を特定するための方法が、同時に行われる、請求項５から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
腹膜サンプルにおいてグラム陽性菌感染の可能性を特定するための方法であって、
（ａ）ＣＸＣＬ１０の量及び全ＣＤ４＋Ｔ細胞数の量を決定するために個体の前記腹膜サンプルを検査するステップ、及び
（ｂ）ＣＸＣＬ１０の量が、グラム陽性菌に感染していない個体の対照サンプル中のＣＸＣＬ１０の量と比べて増加し、且つ全ＣＤ４＋Ｔ細胞数の量が、グラム陽性の細菌に感染していない個体の対照サンプル中のＣＤ４＋Ｔ細胞数の量と比べて増加している場合、
（ｃ）腹膜サンプルが採取された個体がグラム陽性菌に感染している可能性が高いことが示されるステップ
を含む方法。
【請求項１２】
前記腹膜サンプルが、腹膜腔由来の液体若しくは腹膜透析治療を受けている個体の腹膜透析物由来の液体又は腹膜の組織である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
腹膜サンプル中の：
（ｄ）全Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞、又は
（ｅ）ＩＬ−２２
のいずれか１つ又は複数の前記対照と比べた量を決定する少なくとも１つのさらなる試験を実施し、
全Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞の量が前記対照中の同一物の量と比べて減少し、且つＩＬ−２２の量が前記対照中の同一物の量と比べて増加している場合、
腹膜サンプルが採取された個体がグラム陽性菌に感染している可能性が高いことが示される、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載のステップ（ａ）〜（ｃ）及び請求項１３に記載のステップ（ｄ）〜（ｅ）のいずれか１つ又は複数を使用して実施され、ステップ（ｄ）〜（ｅ）は任意の好ましい組み合わせを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
腹膜サンプルにおいてグラム陰性菌感染の可能性を特定するためにさらなる方法を実施し、その方法が、
（ａ）個体の前記腹膜サンプルを、前記サンプルの全Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞の量を決定するために検査するステップ、及び
（ｂ）全Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞の量が、グラム陰性菌に感染していない個体の対照サンプル中の全Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞の量と比べて増加している場合、
（ｃ）腹膜サンプルが採取された個体がグラム陰性菌に感染している可能性が高いことが示されるステップ
を含む、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記腹膜サンプルが、腹膜腔由来の液体若しくは腹膜透析治療を受けている個体の腹膜透析物由来の液体又は腹膜の組織である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
腹膜サンプル中：
（ｄ）ＩＬ−１０、
（ｅ）ＨＬＡ−ＤＲを発現しているＶδ２＋Ｔ細胞、
（ｆ）ＴＮＦ−α、
（ｇ）ＩＬ−１β、及び／又は
（ｈ）ＣＤ８６を発現している腹膜白血球集団内の単球
のいずれか１つ又は複数の前記対照と比べた量を決定する少なくとも１つのさらなる試験を実施し、
（ｄ）〜（ｇ）のいずれか１つ又は複数の量が、前記対照中の同一物の量と比べて増加している場合、又は（ｈ）が前記対照中の同一物の量と比べて減少している場合、
腹膜サンプルが採取された個体がグラム陰性菌に感染している可能性が高いことが示される、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載のステップ（ａ）〜（ｃ）及び請求項１７に記載のステップ（ｄ）〜（ｈ）のいずれか１つ又は複数を使用して実施され、ステップ（ｄ）〜（ｈ）は任意の好ましい組み合わせを含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、腹膜サンプルから、細菌感染の性質、特に、感染がグラム陽性菌及び／又はグラム陰性菌によって引き起こされているかを特定するための少なくとも１つの方法に関する。より詳細には、前記方法は、前記サンプル中の１つ又は複数の細胞性及び／又は体液性マーカーの相対量を特定することを含む。さらに、前記発明は、理想的には治療レジメンの選択における情報を得た上での意思決定（ｉｎｆｏｒｍｅｄ  ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｍａｋｉｎｇ）を可能にするための前記方法の使用を含む治療方法、及び／又は良好な治療転帰をモニタリングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌感染は、とりわけ抗生物質耐性の病原体のかつてない蔓延のために、依然として世界的に罹患率及び死亡率の主要な原因である。そのうえ、有効な感染管理は、標準的な診断の性能の低さによって阻まれており、したがって、有効な治療の選択について不適当な選択が行われている。この切迫した状況は、臨床診療、公的医療及び生物医学的研究にとって非常に大きな課題である。
【０００３】
感染の疑いの現在の診断及び治療は主に、１世紀以上前にＲｏｂｅｒｔ  Ｋｏｃｈによって導入されたがそれ以来変化していない概念である、可能性の高い微生物学的病原体のポジティブアイデンティフィケーション（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に依存している。細菌感染の原因となる病原体のポジティブアイデンティフィケーションは、抗生物質治療の選択に関して患者管理に指針を与え、患者管理をさらに正確にするために非常に重要であるだけでなく、これはまた、根底にある炎症機序及びいかにこれらを巧みに処理して感染を消散させるのを助けることができるかに関して、重要な手がかりをもたらす。
【０００４】
現在、感染性生物の検出及び特徴付けは、伝統的な微生物培養技術、分光測定法に基づくアッセイ及び／又は非常に複雑な核酸同定方法を必要とする。Ｍｏｈａｎら（２０１１）は、核酸検出とイムノアッセイ検出を組み合わせた使用、例えば尿路感染を診断するための「イムノアッセイとの統合を容易にするために３７℃でのハイブリダイゼーションに最適化されたオリゴヌクレオチドプローブ」を記述している［５］。Ｐｏｄｓｉａｄｌｙら（２００５）は、泌尿器感染を診断するための特異的なＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡ血清抗体のレベルの検出を記述している［６］。これらの昨今のアッセイは信頼性がないと考えられている。
【０００５】
さらに、病原体特定は、従来の培養技術に依存していることに関連した固有の遅延によって顕著に阻まれている。特異的な標的療法が使用できるようになるのに、治療を行う医師が結果を利用可能になる前に、しばしば２日、又はさらにはそれ以上かかる。結核などの一部の疾患において、これは２カ月かかることもある。最も重要なことに、多くの場合、伝統的な方法によって細菌を培養することができず、このことは患者の臨床症状の根底にある原因が不明のままであることを意味する。
【０００６】
典型的には、感染は、顕著な臨床症状が現れる場合にのみ明らかになる。有効な特定の治療的介入は、早期検出及び原因となる生物の特定によって決まる。従来、患者管理は、症状、初期の臨床所見、及びＣ反応性タンパク質などの炎症の他の基本的な検査室マーカーに基づいて決定される。この手法はしばしば、一般的過ぎで特異度を欠くため最適ではなく、特異度の増加は概して、微生物学的特定及び抗生物質感受性試験によってのみ獲得され、このことは、感染の最適な管理の遅延と関連する可能性がある。多くの考えられる病原因子を対象として含むために広域スペクトル抗生物質を使用する傾向は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染、また細菌耐性などの他の深刻な問題の発生を助長する。よって、１）患者転帰を改善する；２）特定の抗感染薬の使用を改善する；及び３）抗菌薬耐性及び他の重篤な感染の発生を低減させるために、感染のより早くより良好な検出及び特徴付けを達成することが臨床において明白に必要とされている。これを達成することができる技術は、患者経験（ｐａｔｉｅｎｔ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ）を向上させ、患者管理のためのより持続可能で費用対効果の高い手法を確実にするべきである。
【０００７】
腹膜透析（ＰＤ）は、重度慢性腎疾患の患者のための治療である。治療法は、Ｔｅｎｃｋｈｏｆｆチューブを介して特殊な透析液を腹膜腔中に導入することを含み、これは腎不全において蓄積する毒素を拡散によって、また水を前記液体によって生じた浸透圧勾配によって除去することを目的としている。両プロセスは、半透性の腹膜を通過しながら同時発生的に起こる。腹膜炎に至る、グルコースを多量に含有する透析液の感染は、顕著な罹患率及び死亡率への関連を有するＰＤの主な合併症である。
【０００８】
腹膜炎は、短期及び長期の両方の患者の健康状態に対して有害な作用を有する可能性がある。短期では、重度の腹膜炎エピソードにより、Ｔｅｎｃｋｈｏｆｆチューブを直ちに取り除くことが必要になり、したがって、治療失敗となる可能性がある。長期では、反復性又は重度の腹膜炎が、腹膜の肥厚（線維化）及び膜透過性／機能の顕著な変化をもたらし、治療失敗となる可能性がある。腹膜炎の発症の早期認識は、迅速な調査、診断、及び有効な治療とともに、良好な転帰のために肝要である。標準的な技術を使用した原因となる微生物の特定は、比較的少ない細菌数及びそれらを培養するために必要とされる時間の長さ（多くの場合は数日間）のために困難であることがある。このことは、０〜５０％の症例において「培養陰性」の腹膜炎、すなわち、すべての臨床及び検査室パラメータが診断を裏付けるが、生物は決して特定されないという現象を引き起こす［３］。その結果として、微生物確定の遅延を考えれば、すべての患者に、グラム陽性及びグラム陰性菌の両方を包含する二重の抗生物質治療が開始される。生物が特定される場合のみ（及び特定されるならば）、抗生物質レジメンはさらに正確になる。ＰＤ液検体が培養陰性のままであるならば、患者は、長期の二重の広域スペクトル抗生物質治療を受ける必要がある。
【０００９】
上記で述べたように、体液中の微生物を特定する分子テストは利用可能であるが、それらは、特異性を欠く、サンプルのコンタミネーション又は無症候性の保菌状態のために偽陽性の割合が許容できないほど高く、非病原性種を高頻度で特定するという欠点を有することが多い。
【００１０】
従って、特に生物の種又は病原性が決定要素である場合に、治療法を指示するポイントオブケア（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）の方法が緊急に必要とされているということになる。
【発明の概要】
【００１１】
本開示は、腹膜疾患における感染の迅速な診断方法に関する。本研究において、本発明者らは、急性腹膜炎の発現の第１日目のＰＤ患者において詳細な免疫学的及び微生物学的分析を実施した。この技術の手がかりは、複雑な細胞性及び体液性の免疫応答の誘導が、免疫系の感染性病原体への曝露の後に迅速に起こるという発見である。驚くべきことに、この応答は曝露の数時間以内に現れ、急性の臨床症状を有する腹膜透析患者のドレーン排出液において、特徴的であるが診断的ではない「バッグの混濁」を呈した時点で測定することができる。したがって、これらの結果は、感染の疑いのある患者の鑑別診断にとって重大な意味を有し、より早いバイオマーカーベースの診断、より良好な予測リスクモデリング並びに治療法及びその最終的な効力の標的化の改善によって、患者管理に指針を与えるのに役立ち得る。
【００１２】
本発明の第１の態様によれば、腹膜サンプルにおいてグラム陰性菌感染を特定するための方法であって、
（ａ）個体の前記腹膜サンプルを、前記サンプルの全Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞の量を決定するために検査するステップ、及び
（ｂ）全Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞の量が、グラム陰性菌に感染していない個体の対照サンプル中の全Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞の量と比べて増加している場合、
（ｃ）腹膜サンプルが採取された個体がグラム陰性菌に感染していると結論づけるステップを含む方法が提供される。
【００１３】
当業者には理解されるように、本明細書におけるグラム陰性菌感染への言及は、グラム染色プロトコールにおいてクリスタルバイオレット色素を保持しない細菌による感染に関する。グラム陰性菌の例は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｉｅｒ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ属、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｈａｆｎｉａ属、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｐａｎｔｏｅａ属、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属を含むがこれらに限定されない。
【００１４】
本明細書での腹膜サンプルという用語は、通常はＰＤ患者の、腹膜排出液を含む腹腔内の液体、又は腹腔の内側を覆う膜（腹膜）から取り出した組織サンプルを指す。
【００１５】
本明細書におけるグラム陰性菌に感染していない個体の対照サンプルという用語は、グラム陰性菌を特定するためのいずれか１つ又は複数の従来技術を使用して、グラム陰性菌に感染していないことが示されているサンプルを言う。
【００１６】
本発明の好ましい一実施形態において、個体の前記腹膜サンプルを、前記サンプルの全Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞の量を決定するために検査するステップは、直接又は間接的に行われてもよい。個体の前記腹膜サンプルの、前記サンプルの全Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞の量を決定するための直接検査は、前記サンプルの全Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞の量を測定することによって行われる。個体の前記腹膜サンプルの、前記サンプルの全Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞の量の間接的な検査は、前記サンプルの全Ｔ細胞集団内の他のＴ細胞の量を測定し、前記サンプルの全Ｔ細胞集団を測定し、次いで、減算を実施して前記サンプルの全Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞の量を決定することによって行われる。代替として、個体の前記腹膜サンプルの、前記サンプルの全Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞の量を決定するための間接的な検査は、代用マーカー、すなわち、典型的にはすべての又は少なくとも大部分の細胞がＶδ２＋Ｔ細胞である場合はＶδ２＋Ｔ細胞の典型的なマーカーについてアッセイすることによって、例えばＶγ９＋Ｔ細胞、ｐａｎ−γδ＋Ｔ細胞、ｐａｎ−αβ−（アルファ／ベータネガティブＴ細胞）又はＣＤ４−ＣＤ８−（「ダブルネガティブ」又はＤＮ）Ｔ細胞を測定することによって行われる。当業者は、この間接的な測定を実施するために求める細胞の性質を理解するであろう。
【００１７】
好ましくは、前記腹膜サンプルは腹膜腔由来の液体であり、これは、当業者に理解されるように、針及びシリンジなどであるがこれらに限定されない非常に多くの手段によって取り出すことができる。代替として、より好ましくは、前記サンプルは、腹膜透析治療を受けている人の腹膜透析物すなわち、理想的には、腹膜排出液から得てもよい。
【００１８】
対照サンプルは、理想的には、テストと同じ部位であるが感染していない個体（いわゆる「安定した患者」）から採取されたサンプルを指す。
【００１９】
グラム陰性菌に感染していない個体は、体温上昇、腹痛若しくは腹部不快感又は排出液の混濁又は、ＰＤを受けている患者の場合、目視したときに混濁していない透析物の存在などの感染の症状を有しても又は有さなくてもよい。加えて、又は代替として、感染していない前記個体は、培養テストに曝露させて増殖を試み、細菌感染を特定する場合に、又は他の従来技術に曝露させて細菌感染を特定する場合に、細菌感染、特にグラム陰性感染について陰性であることによって特定される。
【００２０】
当業者に知られているように、Ｖδ２＋Ｔ細胞は、ＴＣＲ−Ｖδ２鎖の陽性発現によって、及び典型的にはＶγ９鎖（代替の命名法によればＶγ２）の共発現によって特徴付けられるＣＤ３＋Ｔ細胞の別個の部分集合である。これらのＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞は、末梢血及び炎症組織において一般に見出され、微生物感染の間の免疫プロセスにおいて重要な役割を果たす。
【００２１】
本発明のさらに好ましい実施形態において、前記対照と比べた腹膜サンプル中の以下：
ｄ）ＩＬ−１０、
ｅ）ＩＬ−１β、
ｆ）ＴＮＦ−α、
ｇ）ＨＬＡ−ＤＲを発現しているＶδ２＋Ｔ細胞、及び／又は
ｈ）ＣＤ８６を発現している全白血球集団内の単球
のいずれか１つ又は複数の量を決定する少なくとも１つのさらなる試験が行われ、ｄ）〜ｇ）のいずれか１つ又は複数の量が、前記対照中の同一物の量と比べて増加している、又はｈ）の場合には、前記対照中の同一物の量と比べて減少している場合、
腹膜サンプルが採取された個体がグラム陰性菌に感染していると結論づける。
【００２２】
本発明の好ましい一実施形態において、本発明の前記方法は、ステップａ〜ｃ）及び任意の好ましいその組合せを含むステップｂ）〜ｆ）のいずれか１つ又は複数を使用して実施されてもよい。
【００２３】
ヒトサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）としても知られているインターロイキン１０（ＩＬ−１０又はＩＬ１０）は、抗炎症性サイトカインである。ヒトにおいて、ＩＬ−１０は、免疫制御及び炎症において多面的作用を有することが知られている。
【００２４】
ＩＬ−１βは、活性化された免疫細胞により生成されるインターロイキン１サイトカインファミリーのメンバーであり、炎症応答の重要なメディエーターであることが知られている。
【００２５】
ＴＮＦ−αは、ＴＮＦサイトカインファミリーのメンバーであり、多くの異なる細胞タイプによって生成され、炎症応答の重要なメディエーターであることが知られている。
【００２６】
ＨＬＡ−ＤＲは、ヒト白血球抗原複合体によってコードされているＭＨＣクラスＩＩ細胞表面受容体であり、シグナリングに応答して上方制御されることが知られている。詳細には、感染に応答して、細菌抗原がＤＲ分子に結合し、Ｔヘルパー細胞上に見出されるＴ細胞受容体に提示される。
【００２７】
分化抗原群（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）８６（ＣＤ８６及びＢ７−２としても知られている）は、Ｔ細胞活性化及び生存に必要な共刺激シグナルをもたらす抗原提示細胞において発現するタンパク質である。
【００２８】
本発明の第２の態様によれば、腹膜サンプルにおいてグラム陽性菌感染を特定するための方法であって、
（ａ）ＣＸＣＬ１０の量を決定するために個体の前記腹膜サンプルを検査するステップ、及び
（ｂ）ＣＸＣＬ１０の量が、グラム陽性菌に感染していない個体の対照サンプル中のＣＸＣＬ１０の量と比べて増加している場合、
（ｃ）腹膜サンプルが採取された個体がグラム陽性菌に感染していると結論づけるステップを含む方法が提供される。
【００２９】
ＣＸＣＬ１０は、ＣＸＣケモカインファミリーに属するサイトカインであり、ＩＦＮ−γに応答していくつかの細胞タイプによって分泌される。これらの細胞タイプは、単球、Ｔ細胞、内皮細胞及び線維芽細胞を含む。ＣＸＣＬ１０は、多くの感染に応答して増加することが知られている。
【００３０】
当業者には理解されるように、本明細書におけるグラム陽性菌感染への言及は、グラム染色プロトコールにおいてクリスタルバイオレット色素を保持する細菌による感染に関する。グラム陽性菌の例は、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属を含むがこれらに限定されない。
【００３１】
本明細書での腹膜サンプルという用語は、典型的にはＰＤ患者の、腹膜排出液を含む腹腔内の液体又は腹腔の内側を覆う膜（腹膜）から取り出された組織のサンプルを指す。
【００３２】
本明細書におけるグラム陽性菌に感染していない個体の対照サンプルという用語は、グラム陽性菌を特定するためのいずれか１つ又は複数の従来技術を使用してグラム陽性菌に感染していないことが示されているサンプルへを言う。
【００３３】
好ましくは、前記腹膜サンプルは腹膜腔由来の液体であり、これは、当業者に理解されるように、針及びシリンジなどであるがこれらに限定されない非常に多くの手段によって取り出されてよい。代替として、より好ましくは、前記サンプルは、腹膜透析治療を受けている人の腹膜透析物すなわち、理想的には、腹膜排出液から得られてもよい。
【００３４】
対照サンプルは、理想的には、テストと同じ部位であるが感染していない個体（いわゆる「安定した患者」）から採取されたサンプルを指す。
【００３５】
グラム陽性菌に感染していない個体は、体温上昇、腹痛若しくは腹部不快感又は排出液の混濁又は、ＰＤを受けている患者の場合、目視したときに混濁していない透析物の存在などの感染の症状を有しても又は有さなくてもよい。加えて、又は代替として、感染していない前記個体は、培養テストに曝露させて増殖を試み、細菌感染を特定する場合に、又は他の従来技術に曝露させて細菌感染を特定する場合に、細菌感染、特にグラム陽性感染について陰性であることによって特定される。
【００３６】
本発明の第２の態様のさらに好ましい実施形態において、前記対照と比べた腹膜サンプル中の以下：
（ｄ）全Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞、
（ｅ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の合計数、又は
（ｆ）ＩＬ−２２
のいずれか１つ又は複数の量を決定する少なくとも１つのさらなる試験が行われ、
ｄ）の量が、前記対照中の同一物の量と比べて減少し、且つ／又はｅ）及び／又はｆ）の量が、前記対照中の同一物の量と比べて増加している場合、
腹膜サンプルが採取された個体がグラム陽性菌に感染していると結論づける。
【００３７】
ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、ＣＤ４糖タンパク質の細胞表面発現によって特徴付けられる、ヒト免疫系の必須部分である白血球の小部分である。ＣＤ４は、抗原提示細胞との情報伝達においてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を援助する共受容体である。
【００３８】
ＩＬ−２２は、ＩＬ−１０ファミリー又はＩＬ−１０スーパーファミリーと呼ばれるサイトカインのグループのメンバーであるサイトカインであり、細胞性炎症応答のメディエーターであることが知られている。ＩＬ−２２は、活性化された樹状細胞及びＴ細胞によって生成され、細菌病原体に対して自然免疫応答を開始する。
【００３９】
本発明の好ましい一実施形態において、本発明の第２の態様の前記方法は、ステップａ）及び任意の好ましいその組合せを含むステップｄ）〜ｆ）のいずれか１つ又は複数を使用して実施されてもよい。
【００４０】
本発明の第３の態様、又は本発明の第１及び／若しくは第２の態様の好ましい実施形態によれば、グラム陰性菌感染を特定するための前記方法は、グラム陽性菌感染を特定するための前記方法の後、若しくは代替としてその前に行われ、又はその逆である。代替として、前記方法は同時に行われてもよい。
【００４１】
本発明の第４の態様によれば、上記の方法のいずれか１つ又は複数によって特定される細菌感染に罹患している個体を治療するための方法であって、前記上記の方法によって特定された細菌感染の性質に応じて、グラム陰性及び／又はグラム陽性菌感染を治療するための治療薬を前記個体に投与するステップをさらに含む方法が提供される。
【００４２】
本発明の第４の態様の好ましい実施形態によれば、細菌感染に罹患している個体を治療するための前記方法は、グラム陰性及び／又はグラム陽性感染を特定するための上記の方法のいずれか１つ又は複数を定期的に反復するステップ、及び、前記個体が依然として感染していると結論づけられる場合、前記治療薬を投与し続けるステップ又は治療薬レジメンを変更するステップをさらに含む。
【００４３】
本発明の第４の態様の好ましい実施形態によれば、前記治療薬は、ペニシリン系薬及びβ−ラクタマーゼ阻害剤、セファロスポリン系薬、マクロライド系薬及びリンコサミン系薬（ｌｉｎｃｏｓａｍｉｎｅｓ）、キノロン系薬及びフルオロキノロン系薬、カルバペネム系薬、モノバクタム系薬、アミノグリコシド系薬、テトラサイクリン系薬、スルホンアミド系薬、リファンピン、オキサゾリドノン系薬のファミリーに属するものなどの抗生物質、並びにその誘導体を含むがこれらに限定されない。
【００４４】
当業者には理解されるように、前記抗生物質は広域スペクトルで、グラム陽性及び／又はグラム陰性菌の両方に効果があってよく、例えば、β−ラクタム／阻害剤の組合せを含むすべてのβ−ラクタム系薬、すべてのマクロライド系薬、すべてのテトラサイクリン系薬、すべてのアミノグリコシド系薬、すべてのポリミキシン系薬、すべてのキノロン系薬、すべてのグリコペプチド系薬、すべてのリンコサミド系薬、すべてのストレプトマイシン誘導体、並びにクロラムフェニコール、リファンピシン、ホスホマイシン、ホスミドマイシン、ニトロフラントイン、メトロニダゾール、ダプトマイシン、キヌプリスチン、リネゾリド、テラバンシン、ムピロシン、及び葉酸合成阻害剤などの、一般的なクラスに包含されないすべての抗生物質、並びにその構造類似体及び誘導体などであるがこれらに限定されない。
【００４５】
より理想的には、前記抗生物質は、グラム陰性菌に対して特異的であり、効果があり、例えば、β−ラクタム／阻害剤の組合せを含むすべてのβ−ラクタム系薬、すべてのマクロライド系薬、すべてのテトラサイクリン系薬、すべてのアミノグリコシド系薬、すべてのポリミキシン系薬、すべてのキノロン系薬、すべてのリンコサミド系薬、すべてのストレプトマイシン誘導体、並びにクロラムフェニコール、リファンピシン、ホスホマイシン、ホスミドマイシン、ニトロフラントイン、メトロニダゾール、及び葉酸合成阻害剤などの、一般的なクラスに包含されないすべての抗生物質、並びにその構造類似体及び誘導体などであるがこれらに限定されない。
【００４６】
代替として、前記抗生物質は、グラム陽性菌に対して特異的であり、効果があり、例えば、β−ラクタム／阻害剤の組合せを含むすべてのβ−ラクタム系薬、すべてのマクロライド系薬、すべてのテトラサイクリン系薬、すべてのアミノグリコシド系薬、すべてのキノロン系薬、すべてのグリコペプチド系薬、すべてのリンコサミド系薬、すべてのストレプトマイシン誘導体、並びにクロラムフェニコール、リファンピシン、ホスホマイシン、ホスミドマイシンダプトマイシン、キヌプリスチン、リネゾリド、テラバンシン、ムピロシン、及び葉酸合成阻害剤などの、一般的なクラスに包含されないすべての抗生物質、並びにその構造類似体及び誘導体などであるがこれらに限定されない。
【００４７】
この明細書の記載及び特許請求の範囲の全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という語、並びにこれらの語の変化形、例えば「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、は、「含むがそれらに限定されない」を意味し、他の部分、添加物、成分、整数又はステップを排除しない。この明細書の記載及び特許請求の範囲の全体にわたって、文脈上別段の解釈を要する場合を除き、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、その項目は、文脈上別段の解釈を要する場合を除き、複数並びに単数を意図すると理解されるべきである。
【００４８】
この明細書において引用されている、任意の特許又は特許出願を含むすべての参考文献は、参照により本明細書に援用される。いかなる参考文献も先行技術を構成することを承認するものではない。さらに、従来技術のいずれも、当技術分野における共通の一般的な知識の部分を構成することを承認するものではない。
【００４９】
本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかに関連して記述される場合もあり得る。
【００５０】
本発明の他の特徴は、以下の実施例から明らかとなるであろう。一般的に言えば、本発明は、この明細書において開示されている特徴（添付の特許請求の範囲及び図面を含む）の任意の新規な１つ、又は任意の新規な組合せに及ぶ。よって、本発明の特定の態様、実施形態又は実施例とともに記述されている特徴、整数、特性、化合物又は化学的部分は、それらと矛盾しない限り、本明細書において記述されている任意の他の態様、実施形態又は実施例に適用できると理解されるべきである。
【００５１】
さらに、別段の記述がない限り、本明細書において開示されている任意の特徴は、同じ又は同様の目的にかなう代替の特徴によって置き換えてもよい。
【００５２】
以下の実施例及び図面を参照して、以下に本発明をより詳細に記述する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】細胞性指標に関する図である。（Ａ）急性腹膜炎の１日目の、安定な及び感染しているＰＤ患者における、腹膜好中球（ＣＤ１５＋）、単球／マクロファージ（ＣＤ１４＋）及びＴ細胞（ＣＤ３＋）の合計数及び相対頻度（％）。（Ｂ）急性腹膜炎の１日目の、安定な及び感染しているＰＤ患者における、腹膜ＣＤ３＋Ｔ細胞集団内のヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）及びγδＴ細胞（Ｖδ２＋）の合計数及び比率。感染している患者を、微生物培養結果に従って培養陰性（ｎ／ｃ）の患者又はグラム陽性若しくはグラム陰性感染の確定した患者にグループ分けした。データ点は個々の患者を表し、水平線はグループごとの値を意味する。
【図２】体液性指標に関する図である。急性腹膜炎の１日目の、安定な及び感染しているＰＤ患者におけるＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−β１及びＭＭＰ−３の腹膜レベル（ｎｇ／ｍｌで表す）。感染している患者を、微生物培養結果に従って培養陰性（ｎ／ｃ）の患者又はグラム陽性若しくはグラム陰性感染の確定した患者にグループ分けした。データ点は個々の患者を表し、水平線はグループごとの値を意味する。
【図３】体液性及び細胞性指標に関する図である。微生物培養結果に基づく、１日目に「バッグの混濁」を呈する患者における免疫学的バイオマーカーの例。（Ａ）グラム陰性感染と非グラム陰性感染の識別。（Ｂ）グラム陽性感染と非グラム陽性感染の識別。データ点は、個々のエピソードを表す（白色、培養陰性；青色、グラム陽性感染の確定；赤色、グラム陰性感染の確定。破線は、陽性又は陰性の識別のための計算されたカットオフ値を示す。
【図４】１日目のすべての腹膜Ｔ細胞のうちのＶδ２＋Ｔ細胞の頻度に基づく、急性腹膜炎患者の累積治療継続率（ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す図である。カットオフ値は、ＲＯＣ分析によって決定した。３０日目の治療失敗（ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆａｉｌｕｒｅ）予測のためのＡＵＲＯＣ：０．９１７±０．０４８、９５％信頼区間：０．８２３〜１．０００、Ｙｏｕｄｅｎ  Ｉｎｄｅｘ：０．８５、感度：１００％、特異度：８５％。２つの曲線の統計学的差異はログランク検定によって分析した。
【図５】テスト結果に基づく、免疫フィンガープリントベースの診断テストを指針としたＰＤ腹膜炎治療案のフローチャートである。
【００５４】
表１．安定した患者及び１日目に「バッグの混濁」を呈する患者における免疫学的バイオマーカー（平均±ＳＥＭ）。ｎ．ｓ．、有意でない。
表２．確定したグラム陰性感染の非存在又は存在に基づく、１日目に「バッグの混濁」を呈する患者における免疫学的バイオマーカー（平均±ＳＥＭ）。ｎ．ｓ．、非有意。
表３．免疫学的バイオマーカーの、１日目における腹膜炎のグラム陰性エピソードと非グラム陰性エピソードを識別する能力。
表４．急性腹膜炎の発現の第１日目におけるグラム陰性感染の予測。
表５．１日目における腹膜炎のグラム陰性エピソードの予測に関する診断的意義を示す免疫学的バイオマーカー。
表６．確定したグラム陽性感染の非存在又は存在に基づく、１日目に「バッグの混濁」を呈する患者における免疫学的バイオマーカー（平均±ＳＥＭ）。ｎ．ｓ．、非有意。
表７．免疫学的バイオマーカーの、１日目における腹膜炎のグラム陽性エピソードと非グラム陽性エピソードを識別する能力。
表８．急性腹膜炎の発現の第１日目におけるグラム陽性感染の予測。
表９．１日目における腹膜炎のグラム陽性エピソードの予測に関する診断的意義を示す免疫学的バイオマーカー。
表１０．微生物培養結果に基づく、１日目に「バッグの混濁」を呈する患者において潜在的な診断的価値を有するバイオマーカー。
【００５５】
材料及び方法
患者
本発明者らは、ウェールズ大学病院、カーディフ、英国（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｗａｌｅｓ，Ｃａｒｄｉｆｆ、ＵＫ）でＰＤを受けており、２００８年９月１日から２０１２年１月３１日の間に急性腹膜炎の１日目に入院した５２人の成人患者を募集し、過去３カ月のうちに感染のなかった１５人の安定した患者を、非感染対照としてこの試験に含めた。ＰＤ排出液のサンプリングは、南東ウェールズ地域の倫理委員会によって承認され（０４ＷＳＥ０４／２７）、ヘルシンキ宣言において言明されている原則に従って実施された。すべての患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。急性腹膜炎の診断は、腹痛及び１００ＷＢＣ／ｍｍ３超の混濁した腹膜排出液の存在に基づいていた。ウェールズ大学病院の中央診断研究室（ｃｅｎｔｒａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で実施された排出液の微生物学的分析の結果に従って、感染を培養陰性、グラム陽性エピソード及びグラム陰性エピソードにグループ分けした。
【００５６】
フローサイトメトリー
腹膜細胞を、８色ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において取得し、ＦｌｏＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）で、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＣＤ３に対するモノクローナル抗体（ＵＣＨＴ１）、ＣＤ４（ＳＫ３）、ＣＤ８（ＲＰＡ−Ｔ８）、ＣＤ１５（ＨＩ９８）、ＣＤ６９（ＦＮ５０）、ＣＤ８６（２３３１−ＦＵＮ１）、ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２３４）及びＴＣＲ−Ｖδ２（Ｂ６．１）；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＣＤ１４（６１Ｄ３）；及びＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ製のＴＣＲ−Ｖγ９（Ｉｍｍｕ３６０）を、適切なアイソタイプ対照と一緒に使用して分析した。白血球集団は、側方散乱光及び前方散乱光面積／高さにおけるその外観、生細胞／死細胞染色（ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の除外、及び表面染色：ＣＤ１５＋好中球、ＣＤ１４＋単球／マクロファージ及びＣＤ３＋Ｔ細胞に基づいて特定した。Ｔ細胞部分集合は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞及びＶδ２＋γδＴ細胞として特定した。
【００５７】
ＥＬＩＳＡ
ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）において、細胞を含まない腹膜排出液を、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＣＸＣＬ８及びｓＩＬ−６Ｒについて分析した。ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＣＸＣＬ１０及びＭＭＰ−３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）並びにＴＧＦ−β１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、Ｄｙｎｅｘ  ＭＲＸ  ＩＩリーダーにおいて、通常のＥＬＩＳＡキットを使用して２連で測定した。
【００５８】
統計分析
統計分析は、ＳＰＳＳ１６．０及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４．０ソフトウェアを使用して実施した。Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定を使用して正規分布ですべての変数を検定した。正規分布したデータではＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を、又はノンパラメトリックデータではＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を使用して、患者群間の差異を分析した。カイ二乗検定を使用してカテゴリーデータを検定した。単変量解析を使用して予測バイオマーカーを評価した；単変量解析の統計学的に有意な（ｐ＜０．０５）変数は多変量解析に含めた。表に示すように、データの変数増加法（ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）及び／又は変数減少法（ｂａｃｋｗａｒｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）に基づいて多重ロジスティック回帰分析を実施した。ＡＵＲＯＣ曲線を使用して識別を評価し、ノンパラメトリック手法を使用して比較した；カットオフ値、感度及び特異度を計算するためにもＡＵＲＯＣ分析を使用した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ手法を使用して時間の関数としての累積生存曲線を作成し、ログランク検定を使用して比較した。すべての統計学的検定は両側であった；図面及び表に示すように、差異は統計学的に有意であると考えられた：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【００５９】
結果
腹膜炎の急性エピソードは、重度の腹膜炎症と関連する
急性腹膜炎を呈する患者を、免疫細胞、主にＣＤ１５＋好中球、ＣＤ１４＋単球／マクロファージ及びＣＤ３＋Ｔ細胞の顕著な腹膜流入によって特徴付けた（表１）。これは、腹膜炎の培養陰性エピソード並びにグラム陰性又はグラム陽性菌による確定した感染の場合にも当てはまった（図１）。安定した患者における腹膜白血球は、主に単球／マクロファージ及びＴ細胞を含んでなるが、急性腹膜炎では好中球の大量動員が優勢であり、時に合計ですべての腹膜細胞の９５％超及び１０１１細胞超に達した。腹膜白血球集団の詳細なフローサイトメトリー分析により、急性腹膜炎患者における局所的な免疫細胞浸潤物の組成のさらに際立った変化が明らかになった。したがって、急性腹膜炎におけるＴ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞の頻度は優先的に増加し、一方、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントは、事実上変化しないままであった（表１）。
【００６０】
急性腹膜炎において顕著に増加した可溶性メディエーターは、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、ＩＬ−６、可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１０、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）及びマトリクスメタロプロテイナーゼ−３（ＭＭＰ−３）を含んでいた；同時に、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１７及び顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのサイトカインのレベルは、ベースラインを超えて上昇せず、又は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の場合には、有意には上昇しなかった（図２、表１）。まとめると、これらの測定は、ＰＤ患者における急性炎症反応を示す広範囲の体液性及び細胞性バイオマーカーを特定し、そのいくつかは診断的価値を有する可能性がある。
【００６１】
グラム陰性感染を有する患者における別個の免疫フィンガープリントは、１日目における診断の可能性を有する
本発明者らは次に、特定のグループの細菌による感染を予測することができる病原体特異的な免疫フィンガープリントが存在するかどうかをテストした。臨床におけるグラム陰性菌の重要性及びより不良な転帰とのその関連を考えて、本発明者らは最初に、グラム陰性感染の予測に専念した。１日目にバッグの混濁を呈するすべての患者のうち、グラム陰性感染の確定した患者は、より多数の浸潤好中球を示し、その結果として、残りの患者、すなわち培養陰性又はグラム陽性感染の個体より低い比率の単球／マクロファージ及びＴ細胞を示した（表２）。Ｔ細胞集団内で、グラム陰性感染においてＶδ２＋Ｔ細胞は顕著に増加し、より高いレベルの活性化マーカーＨＬＡ−ＤＲを発現した。引き続いて、腹膜の単球／マクロファージは、残りの患者と比較して、グラム陰性感染においてより低いレベルのＣＤ８６を発現した。グラム陰性感染において顕著に増加した炎症性マーカーは、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０及びＴＮＦ−αを含んでいた（図３Ａ；表２）。ＡＵＲＯＣ計算は、Ｖδ２＋Ｔ細胞頻度とＩＬ−１０の腹膜レベルとの組合せを、グラム陰性感染を予測するための優れた識別因子（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒ）と特定した（表３）。この組合せはまた、グラム陰性腹膜炎の正確な予測に関して１００％の感度及び９３％の特異度で、最も高い全体の精度を有した（表４）。すべての細胞中の単球／マクロファージの比率（＜１０．７％）及びそのＣＤ８６発現（＜６７．９％）、Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞の頻度（≧６．３％）及びそのＨＬＡ−ＤＲ発現（≧１６．１％）、及び腹膜ＩＬ−１０レベル（≧１１０．１ｐｇ／ｍｌ）の予後予測的価値は、単変量解析によってすべて裏付けられた。これらのパラメータの多変量解析は、Ｖδ２＋Ｔ細胞頻度を、１日目にバッグの混濁を呈するすべての患者におけるグラム陰性腹膜炎の予測のための独立した予後バイオマーカーと特定した（表５）。グラム陰性感染は、より高い割合の治療失敗及び死亡率と関連しているため、本発明者らは、腹膜Ｖδ２＋Ｔ細胞頻度が、急性腹膜炎のエピソードからの臨床転帰に関して何らかの間接的な予測力を有するかどうか最終的にテストした。図４において示されているように、発現日において比較的低い比率及び比較的高い比率の腹膜Ｖδ２＋Ｔ細胞を有する患者間に明白な差異が存在した。Ｖδ２＋Ｔ細胞レベルが４．３％のカットオフ値より低い患者は、その後の３カ月にわたって治療失敗が非常に低い割合であり、一方、Ｖδ２＋Ｔ細胞レベルが４．３％より高い患者は、治療失敗のリスクが顕著に上昇し、Ｖδ２＋Ｔ細胞が急性腹膜炎を有するＰＤ患者において診断的及び予後予測的価値の両方を有することを裏付けた。
【００６２】
グラム陽性感染を有する患者における別個の免疫フィンガープリントは、１日目における診断の可能性を有する
類似した方法で、本発明者らは次に、グラム陽性感染の予測因子の特定を試みた。１日目にバッグの混濁を呈するすべての患者のうち、グラム陽性感染の確定した患者は、残りの患者、すなわち培養陰性又はグラム陰性感染の個体より多数の浸潤ＣＤ４及びＣＤ８＋Ｔ細胞を示し（表６）、一方、Ｔ細胞集団内のＶδ２＋Ｔ細胞の比率はグラム陽性感染において顕著に低かった。グラム陽性感染において顕著に増加した炎症性マーカーは、ＩＬ−２２及びＣＸＣＬ１０を含んでいた（図３Ｂ；表８）。ＡＵＲＯＣ計算は、ＣＸＣＬ１０（＞３０１．２ｐｇ／ｍｌ）とＩＬ−２２レベル（＞５４．３ｐｇ／ｍｌ）とＶδ２＋Ｔ細胞頻度（＜２．７％）との組合せを、グラム陽性感染を予測するための優れた識別因子と特定した（表７）。この組合せはまた、グラム陽性腹膜炎の正確な予測に関して８９％の感度及び６７％の特異度で、最も高い全体の精度を有していた。引き続いて、全ＣＤ４＋Ｔ細胞カウント（≧１５．２・１０６）と組み合わせたＣＸＣＬ１０レベル（＞３０１．２ｐｇ／ｍｌ）は、グラム陽性腹膜炎の予測に関して、感度は５３％だけであるが特異度は９５％を有し（表８）、ＣＤ４＋Ｔ細胞カウント並びにＶδ２＋Ｔ細胞頻度及びＣＸＣＬ１０レベルは、単変量解析によって裏付けられたように、予後予測的価値を有した。単独での及び組み合わせたこれらのパラメータの多変量解析は、ＣＤ４＋Ｔ細胞カウントとＣＸＣＬ１０レベルとの組合せを、１日目にバッグの混濁を呈するすべての患者におけるグラム陽性腹膜炎の予測のための独立したバイオマーカーと特定した（表９）。
【００６３】
まとめると、本発明者らの発見は、免疫フィンガープリントベースの診断テストは、急性感染患者の治療に指針を与えることができることを示す（図５）。テスト結果に応じて、患者は、比較的良性の転帰と関連した腹膜炎の培養陰性エピソードを有する（すなわち細菌感染が存在しない）と診断される可能性がある。そのような患者には、外来患者としてのより短期の治療が有益である可能性がある（且つエピソードが非感染性起源であれば抗生物質を全く必要としない可能性がある）。グラム陽性又はグラム陰性感染と診断された患者には、より良い標的療法が有益である可能性があり、特に、高い割合の治療失敗及び死亡率と関連したグラム陰性感染の場合には、綿密なモニタリング及び管理の改善が有益である可能性がある。未知の細菌感染の場合、患者は、広域スペクトルの抗生物質を用いた通常の治療を受ける可能性がある。
【００６４】
要旨
本発明者らの研究は、体液性及び細胞性パラメータを組み合わせて、正確な「免疫フィンガープリント」を確立することの重要性を強調する。疾患特異的免疫フィンガープリントの定義において特に有望な体液性及び細胞性パラメータは、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＴＮＦ−α及びＣＸＣＬ１０の局所レベル、並びに全腹膜細胞中の好中球及び単球／マクロファージの相対比率並びに腹膜Ｔ細胞集団内のγδＴ細胞の頻度を含む（表１０）。
【００６５】
結果として、したがって、細菌感染の免疫フィンガープリントが存在すること、及び特徴的な免疫学的バイオマーカーが、早期の細菌感染を区別し、そのため直接の適切な治療様式を予測する潜在能力を有することが示された。
【００６６】
参考文献
3. Fahim M, Hawley CM, McDonald SP, Brown FG, Rosman JB, Wiggins KJ, Bannister KM, Johnson DW: Culture-negative peritonitis in peritoneal dialysis patients in Australia: predictors, treatment, and outcomes in 435 cases. Am J Kidney Dis 55: 690-697, 2010
5. Mohan R, Mach KE, Bercovici M, Pan Y, Dhuiipala L, Wong PK, Liao JC: Clinical validation of integrated nucleic acid and protein detection on an electrochemical biosensor array for urinary tract infection diagnosis. PLoS One 6(10): e26846, 2011
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【００６７】
【表１】
0006406551.tif 000002
【００６８】
【表２】
0006406551.tif 000003
【００６９】
【表３】
0006406551.tif 000004
【００７０】
【表４】
0006406551.tif 000005
【００７１】
【表５】
0006406551.tif 000006
【００７２】
【表６】
0006406551.tif 000007
【００７３】
【表７】
0006406551.tif 000008
【００７４】
【表８】
0006406551.tif 000009
【００７５】
【表９】
0006406551.tif 000010
【００７６】
【表１０】
0006406551.tif 000011
【図１】
0006406551.tif 000012
【図２】
0006406551.tif 000013
【図３】
0006406551.tif 000014
【図４】
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【図５】
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