(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも真正塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の産生のためにエシェリキア・コリ宿主で使用するＤＮＡ構築物であって、５’から３’方向に、発現カセットと、真正ヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）をコード化するＤＮＡと、Ｓｃｅ ＶＭＡインテイン配列と、真正塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）をコード化するＤＮＡと、を含む挿入物を含み、前記発現カセットは、５’から３’方向に、プロモータ配列、オペレータ配列、コンセンサスリボソーム結合部位の配列およびＯｍｐＡリーダー配列を含み、前記ＤＮＡ構築物は前記宿主に、前記宿主の細胞質中に前記塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）と前記ヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）の両方を発現し、かつ、真正であり、開裂し、成熟し、溶解可能な形態でｂＦＧＦとＥＧＦを前記宿主が培養される細胞培地に排泄させるように構成された、ＤＮＡ構築物。
【請求項２】
前記プロモータ配列がｌａｃＵＶ５プロモータ（ｌａｃＵＶ５）であり、前記オペレータ配列がｌａｃオペレータ（ｌａｃＯ）である、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３】
真正塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）と真正ヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）の産生のための遺伝子組換え生物系であって、前記系がエシェリキア・コリ宿主であり、細胞質中に発現によって前記真正塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）と前記真正ヒト上皮成長因子(ＥＧＦ)の両方が産生され、かつ、真正であり、開裂し、成熟し、溶解可能なポリペプチドの形態で前記系が培養される細胞培地中に産生され、前記系は、請求項１に記載のＤＮＡ構築物を含む、遺伝子組換え生物系。
【請求項４】
エシェリキア・コリ宿主の細胞質中の細胞内産物としておよび細胞質からの細胞外産物として真正塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）と真正ヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）を同時に発現および産生する方法であって、請求項１に記載のＤＮＡ構築物を使用する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照：本出願は、参照によりそれ全体の内容を本明細書に包含する、２０１３年４月３日に出願された米国特許出願第６１／８０８，０６２号の優先権を主張する。
【０００２】
配列表：本出願は配列表を含み、参照によりそれ全体の内容を包含する。
【０００３】
本発明は、大腸菌（Escherichia coli）の細胞質および／または培地中のヒト上皮成長因子（human epidermal growth factor）および／または塩基性線維芽細胞成長因子（authentic basic fibroblast growth factor）の真正ポリペプチドの発現の手段および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
大腸菌は翻訳後修飾（post-translational modifications）を実施できないが、それでも組換えヒト治療用タンパク質（recombinant human therapeutic proteins）の産生のために用いられる最も一般的な宿主系（host system）である。その中で、生物学的活性と安定性のためにグリコシル化などの翻訳後修飾を必要としない上皮成長因子（ＥＧＦ）と塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む皮膚タンパク質が、様々な方策を使用して大腸菌で発現されてきた。
【０００５】
おそらくサイズが小さいために、イー・コリ（E. coli）においてＥＧＦが効率よく発現し、培地に分泌され（secreted）、さらには排泄（excreted）された。その中で、排泄ＥＧＦは、生物活性であることが示されただけでなく、更に重要なことに、正確な一次（真正）構造を有することが示された。また、排泄によって産生されたＥＧＦは、排泄によるその産生が細胞破壊を必要としないので、内毒素汚染がない。加えて、培地中の低レベルの細胞質タンパク質が、ＥＧＦの精製を促進し、均一性を高めている。重要なことに、その過程は高度な再現性があり、容易に拡張可能である。
【０００６】
ｂＦＧＦに関して、その分泌特性にも関わらず、イー・コリi）において分泌または排泄のいずれによっても発現に成功しなかった。慣例的に、大腸菌におけるｂＦＧＦの発現は、融合法を使用して細胞質に限定され、この場合、ｂＦＧＦの回復は、細胞溶解、融合中間体のタンパク質消化、およびアフィニティークロマトグラフィーによって通常達成されるその後の精製に依存する。ｂＦＧＦの細胞内発現は、融合産物を開裂させるために高価なプロテアーゼを必要とするか、または包含凝集体（inclusion aggregate）が形成される場合にｂＦＧＦを精製するために多大な労力を必要とするプロトコルを必要とするので、高い製造コストを伴う。これらの操作にもかかわらず、結果として得られる生成物が誤って処理されているかまたは生物学的に不活性であることが示されたので、イー・コリにおけるｂＦＧＦ発現は充分に果たされていない。
【０００７】
他の組換え系を使用してｂＦＧＦを産生することが試みられた。１つのそのような試みは、ｂＦＧＦの分泌生産を促進するためのバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）の操作に関する。融合前駆体の正確なペプチダーゼ処理を可能にしたビー・アミロリクエファシエンス（B. amyloliquefaciens）プロテアーゼ遺伝子のＮＰＲシグナルペプチドを、簡易細胞壁不安定化プロトコルとあわせて使用して、真正構造および充分な生物活性を有するｂＦＧＦがビー・サブチリスの培地中に分泌されることが示された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ｂＦＧＦおよび／または他の有用なポリペプチドを確実かつ効率よく産生する代替的および／または改善された方法と系（system）を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
少なくとも第１のポリペプチドの産生のためにエシェリキア・コリ宿主で使用する、本発明の第１の態様のＤＮＡ構築物であって、第１のポリペプチドは真正塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）であり、前記ＤＮＡ構築物は、発現カセットの配列中に、インテイン配列と塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）をコード化するＤＮＡとを含む挿入物を含み、前記宿主に前記宿主の細胞質中で塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を分泌させ、および／または前記宿主が培養される細胞培地に排泄させるように構成した。
【００１０】
好ましくは、前記ＤＮＡ構築物が第２のポリペプチドをコード化するＤＮＡを含んでもよく、前記第２のポリペプチドをコード化する前記ＤＮＡが前記発現カセットと前記インテイン配列との間に配置されてもよい。前記第２のポリペプチドをコード化する前記ＤＮＡが真正ヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）をコード化してもよい。前記宿主に前記第１および／または第２のポリペプチドを非融合ポリペプチドとして分泌させるように構成してもよい。
【００１１】
実施の形態では、前記インテイン配列がＳｃｅ ＶＭＡインテイン配列であってもよい。
【００１２】
一実施の形態では、前記発現カセットが、プロモータ配列と、オペレータ配列と、コンセンサスリボソーム結合部位の配列と、リーダー配列とを含んでもよい。他の実施の形態では、前記発現カセットが、プロモータ配列の前記配列中に、オペレータ配列と、コンセンサスリボソーム結合部位の配列と、リーダー配列とを含んでもよい。他の実施の形態では、前記プロモータ配列がｌａｃＵＶ５プロモータ（ｌａｃＵＶ５）であってもよく、前記オペレータ配列がｌａｃオペレータ（ｌａｃＯ）であってもよく、前記リーダー配列がｏｍｐＡリーダー配列（ｏｍｐＡ）であってもよい。
【００１３】
少なくとも塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の産生のための、本発明の第２の態様の遺伝子組換え生物系は、前記系がエシェリキア・コリ宿主であり、細胞質中および／または前記系が培養される細胞培地中への分泌によって塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を産生するように構成した。
【００１４】
好ましくは、前記系が上記のＤＮＡ構築物を含んでもよい。
【００１５】
前記系が、第１のポリペプチドを非融合ポリペプチドとして産生するよう構成してもよい。
【００１６】
前記系が、第２のポリペプチドを非融合ポリペプチドとして産生するよう構成してもよい。
【００１７】
エシェリキア・コリ宿主から、および／またはエシェリキア・コリ宿主中の細胞質から細胞質由来の細胞外産物として塩基性線維芽細胞（ｂＦＧＦ）を産生する、本発明の第３の態様の方法であって、前記ｂＦＧＦの発現を促進するためにＤＮＡ構築物においてインテインを使用するステップを含んでいる。
【００１８】
好ましくは、前記インテインがＳｃｅＶＭＡインテインであってもよい。
【００１９】
実施の形態では、同じエシェリキア・コリ宿主中でｂＦＧＦと真正ヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）を同時発現させてもよい。
【００２０】
一実施の形態では、前記方法が、前記宿主の細胞質および／または前記宿主が培養される前記細胞培地中でｂＦＧＦおよび／またはＥＧＦを産生するステップを含んでもよい。
【００２１】
前記方法が、前記ＤＮＡ構築物中のｂＦＧＦおよびＥＧＦのＤＮＡコーディング間に前記インテインを配置するステップを含んでもよい。
【００２２】
実施の形態では、ｂＦＧＦおよびＥＧＦのＤＮＡコーディングが同じＤＮＡ構築物中に配置されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、本発明に至る研究で使用したＤＮＡ構築物を示す略図である。この図の上部は使用した３つのプラスミド、すなわち（Ａ）ｐＷＫＷ２ＦＧＦＲ、（Ｂ）ｐＷＫＷ２０ＶＭＡ、（Ｃ）ｐＷＫ３Ｒを示している。遺伝因子の記号は次の通りである：ｂｆｇｆ＝ｂＦＧＦ遺伝子；ＶＭＡ＝Ｓｃｅ ＶＭＡインテインのコーディング配列；ｅｇｆ＝ＥＧＦ遺伝子；ｏｒｉ＝イー・コリにおける複製起点；ａｍｐＲ＝アンピシリン耐性遺伝子。この図の下部は、ｌａｃＵＶ５プロモータ（ｌａｃＵＶ５）、ｌａｃオペレータ（ｌａｃＯ）、コンセンサスリボソーム結合部位（ＲＢＳ）、およびｏｍｐＡリーダー配列（ｏｍｐＡ）を含むＬａｃＵＶ５発現カセット“----→”の５’‐末端領域を示している。矢印は、ｌａｃＵＶ５プロモータからの転写の方向を表示している。矢印はｌａｃＵＶ５プロモータからの転写の方向を表示している。構築物ｐＷＫＷ２０ＶＭＡおよびｐＷＫ３Ｒ中のＶＭＡインテイン−溶融境界でのＤＮＡコーディング配列およびアミノ酸配列を図の一番下にあるパネル（Ｄ）で示した。
【図２】図２は、様々なプラスミド構築物によって発現されたｂＦＧＦおよびＥＧＦのウェスタンブロット分析の写真である。ＩＰＴＧ誘導のもとで８時間成長させた３つの構築物：ｐＷＫ３Ｒ、ｐＷＫＷ２０ＶＭＡ、ｐＷＫＷ２ＦＧＦＲを有するイー・コリ培養物を細胞上清（ＳＮ）および細胞可溶化（ＣＬ）調製物に分割した。以下のものに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングによって、サンプルをｂＦＧＦおよびＥＧＦ産物について分析した：［ゲルＡ］ｂＦＧＦおよびＭａｚＧ（内部標準）；［ゲルＢ］ｂＦＧＦ、ＥＧＦおよびＭａｚＧ。サンプルをさらに、クーマシー・ブリリアント・ブルーＲ−２５０で染色し、［ゲルＣ］上で顕示した。早熟ｂＦＧＦ（ＯｍｐＡ−ｂＦＧＦ）および早熟ＥＧＦ（ＯｍｐＡ−ＥＧＦ）中間体が示され、一方、成熟ｂＦＧＦ（Ｍａｔ−ｂＦＧＦ）および成熟ＥＧＦ（Ｍａｔ−ＥＧＦ）産物も示される。装入されたＳＮおよびＣＬサンプルの量は、それぞれ１０μｌおよび５μｌの細胞培養物に等しかった。３つの構築物の名称をゲルの下に示して、分画サンプルを調製した細胞培養物を示している。図２ａ（レーン２および３）ならびに図２ｂ（レーン３および４）で示された前駆体：ＯｍｐＡ−ＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦ（Δ）およびＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦ（■）を表示する。使用した他の記号は次のとおりである：Ｍ＝タンパク質マーカー；＋ＶＥ＝正の対照として使用したｂＦＧＦまたはｂＦＧＦ＋ＥＧＦ標準。
【図３】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる、精製されたＥＧＦの質量決定を示す２つのグラフに関する。（ａ）天然の一次構造を有する市販のＥＧＦ標準；（ｂ）ＪＭ１０１［ｐＷＫ３Ｒ］培養物のＳＮから精製されたＥＧＦ（成長および誘導条件については方法を参照のこと）の分析（方法を参照のこと）から得られるプロフィールを示している。両プロットで真正ＥＧＦに由来すると予想される６２１３〜６２１７領域の質量対電荷比（ｍ／ｚ）で顕著なピークを示している。［ａ．ｕ．］は任意単位を表す。
【図４】ＥＧＦおよびｂＦＧＦのバイオアッセイを示す２つのグラフに関する。成熟ＥＧＦおよびｂＦＧＦサンプルを誘導されたＪＭ１０１［ｐＷＫ３Ｒ］の培養上清から精製した（成長および誘導条件については方法を参照のこと）。ＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３線維芽細胞の増殖に関するＥＧＦおよびｂＦＧＦの細胞分裂促進作用についてのアッセイを方法で記載した。２つの成熟因子（・・・■・・・）の生物活性を、正しい一次構造を有するＥＧＦおよびｂＦＧＦ標準（・・・△・・・）の生物活性と比較した。両アッセイによって重ね合わせることができる曲線が得られた。各アッセイを４回繰り返した（σ＜０．０５）。
【図５】ＪＭ１０１［ｐＷＫ３Ｒ］培養物中での成熟ｂＦＧＦおよび成熟ＥＧＦの同時発現を示す２つのグラフに関する。ＪＭ１０１［ｐＷＫ３Ｒ］培養の成長および誘導のための条件は方法に記載されている。上のパネル：ＳＮ中の成熟ｂＦＧＦの濃度（−□−）、ＣＬ中の成熟ｂＦＧＦの濃度（−●−）、ＳＮ中の成熟ＥＧＦの濃度（−−△−−）、およびＣＬ中の成熟ＥＧＦの濃度（＝＝◆＝＝）を示している。示された結果は４つの異なる実験から得られる平均±ＳＥＭ値である。下のパネル：素寒天板（・・・◆・・・）およびＡｍｐ（−■−）を追加した寒天板上で得られる生細胞数を示している；ＣＦＵは細胞形成単位を指している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
イー・コリは、異なる起原、機能およびサイズの膨大な自然に分泌されるタンパク質の細胞外産生のために用いられてきた。本発明に至る研究は、以前は可能でなかったか、または少なくとも確実ではなかった、イー・コリにおける細胞分泌／排泄（excretion）により真正ｂＦＧＦを発現するためのメカニズムを提供する。以下で説明するように、本発明は、効率的な排泄構築物であるｐＷＫＷ２と、自己開裂可能なＳｃｅ ＶＭＡインテインとの間の共同作用（concerted effort）を利用した革新的戦略を利用して、イー・コリにおけるｂＦＧＦの分泌発現を促進する。研究から得られたデータは、真正ｂＦＧＦが、イー・コリで排泄産物として、確実におよび／または効率改善を伴って産生される可能性があり、そして産生されることを初めて証明する。さらに、ＥＧＦを培養上清（ＳＮ）に同時排泄させることもできる。注目すべきことに、そして意外にも、両ポリペプチド因子は、細胞溶解物（ＣＬ）中でも特定され、そしてそれらはそれらの排泄対応物と同一であることが明らかになっている。さらに意外なことには、ＳＮおよびＣＬから回収されるＥＧＦおよびｂＦＧＦはどちらも、それらの生物活性であり、かつ一次構造に関して充分に真正であることが確認される。重要なことに、本発明の結果は、２つの細胞内区画部分が一緒になって、最高品質のＥＧＦおよびｂＦＧＦの費用効率の良い産生のための注目すべき資源を提供するという観念を裏付けている。排泄ｂＦＧＦ、またはＥＧＦに関して、ポリペプチドは既にインサイチュ細胞開裂（cellular cleavage）を受け、例えば、アフィニティーカラムの力を借りた開裂によるその後の処理の必要はない。
【００２５】
実験および結果
ＤＮＡ構築物の操作
本発明に至る研究では、ｐＷＫＷ２を、イー・コリにおけるＥＧＦおよび／またはｂＦＧＦの分泌／排泄発現のための３つの新規ＤＮＡ構築物をもたらす発現ベクターとして使用した。最初の構築物であるｐＷＫＷ２ＦＧＦＲ（図１ａ）では、ｅｇｆ遺伝子を置換することによってｂｆｇｆ遺伝子をクローン化し、ｏｍｐＡリーダー配列とフレーム内で融合させた。第２の構築物であるｐＷＫＷ２０ＶＭＡ（図１ｂ）を形成するために、Ｓｃｅ ＶＭＡインテイン（ＶＭＡ）のコーディング配列を、ちょうどｐＷＫＷ２ＦＧＦＲ中のｏｍｐＡリーダー配列とｂｆｇｆ遺伝子との間に挿入した。最終構築物であるｐＷＫ３Ｒ（図１ｃ）を得るために、ＶＭＡのコーディング配列とｂｆｇｆ遺伝子とを含むＤＮＡ挿入物をｐＷＫＷ２中のｅｇｆ遺伝子とフレーム内で融合させた。
【００２６】
３つのプラスミドを有するイー・コリ形質転換体におけるｂＦＧＦおよびＥＧＦの発現
ＥＧＦの効率的な排泄をもたらすためにｐＷＫＷ２を使用したが、ｂｆｇｆ遺伝子を有するその第１誘導体であるｐＷＫＷ２ＦＧＦＲ（図１ａ）は、同様の性能を提供できなかった（図２ａ）。ｐＷＫＷ２ＦＧＦＲ発現から得られるｂＦＧＦ産物は、本質的に細胞内に限定されることが示され、すなわち、それが排泄されず、ＯｍｐＡ分泌シグナル（ＯｍｐＡ）−ｂＦＧＦ融合物として存在することを示唆する（図２ａ、レーン６）。観察結果は、ＯｍｐＡ−ｂＦＧＦ融合が分泌のための充分な機能を備えていない可能性があることを示唆した。
【００２７】
研究は、インテイン、例えばＶＭＡと融合させたシグナルペプチドは、組換えタンパク質の低レベルの分泌を可能にすることを証明した。ｂＦＧＦの分泌生産でＶＭＡなどのインテインと融合したシグナルペプチドの有効性を確認するために、本発明に至る我々の研究では、ＶＭＡのコーディング配列をｐＷＫＷ２ＦＧＦＲ中のｂｆｇｆ遺伝子とｏｍｐＡリーダーとの間に挿入して、ｐＷＫＷ２０ＶＭＡ（図１ｂ）を形成した。ＪＭ１０１［ｐＷＫＷ２０ＶＭＡ］培養におけるｂＦＧＦ発現のウェスタンブロット分析によって、本質的に大きな（約７３ｋＤａ）非開裂ＶＭＡ−ｂＦＧＦ中間体（ＶＭＡ−ｂＦＧＦ）の形態の低レベルのｂＦＧＦだけが培地中に存在していたことが明らかになった（図２ａ、レーン５）。同様に、ＶＭＡ−ｂＦＧＦの前駆体であるＯｍｐＡ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦはさらに、細胞質中で非開裂ポリペプチドとしても検出された（図２ａ、レーン４）。環境条件の変化は、ＶＭＡとそのフランキング配列との間の開裂効率に対して有益な影響を及ぼさないことを示した（データは不掲載）。おそらくは、ＶＭＡ−ｂＦＧＦもＯｍｐＡ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦもどちらも自己開裂可能な中間体を形成できなかった。それでも、ＶＭＡの大きなサイズおよび細胞内起原にもかかわらず、ＶＭＡ−ｂＦＧＦの排泄が我々の研究ではイー・コリにおいて可能であることが示された。
【００２８】
我々のさらなる研究は、効率的な分泌タンパク質が２つの官能基、すなわち、ＶＭＡ−ｂＦＧＦの分泌／排泄を促進するための「エンジン」としての第１官能基と、ＶＭＡ−ｂＦＧＦの互換性（compatible）Ｎ末端エクステイン」としての第２官能基とを有しているはずであり、かくして後者が排泄前に自己開裂活性を発揮することを可能にすることを示している。我々の研究においてＥＧＦ発現でのｐＷＫＷ２の優れた性能を考慮して、本発明は、ＬａｃＵＶ５発現カセット中のｏｍｐＡリーダーの隣にあらかじめクローン化したｅｇｆ遺伝子とフレーム内で融合したＶＭＡ−ｂＦＧＦをコード化するＤＮＡ配列を採用して、構築物ｐＷＫ３Ｒ（図１ｃ）を形成する。ウェスタンブロット分析から、ｂＦＧＦを効率よく培養上清（ＳＮ）に排泄させることができる（図２ａ、レーン３）だけでなく、高レベルのＥＧＦも同じ培地中で検出された（図２ｂ、レーン３）ことも明らかになった。さらに、両因子は、処理された非融合産物として示された（図２）。ＳＮ中で細胞質マーカーであるＭａｚＧを検出できないことは、意外にも、検出されたＥＧＦおよびｂＦＧＦはどちらも細胞溶解ではなく排泄に起因したという結論を裏付けている（図２Ａ、レーン３および図２Ｂ、レーン３）。
【００２９】
ＪＭ１０１［ｐＷＫ３Ｒ］におけるｂＦＧＦおよびＥＧＦの細胞内の位置
ｐＷＫ３Ｒを有するイー・コリ中で発現されたｂＦＧＦおよびＥＧＦの分布を理解するために、さらなる研究を実施した。特に、ＩＰＴＧで誘導されたＪＭ１０１［ｐＷＫ３Ｒ］培養物を誘導の８時間後に収集し、そして処理して、細胞溶解物（ＣＬ）およびＳＮフラクションを得た。高レベルの非融合ｂＦＧＦがＳＮ（図２ａ、レーン３）およびＣＬ（図２ａ、レーン２）の両方で検出され、ＶＭＡからのｂＦＧＦの開裂がイー・コリ培養物の細胞内および細胞外フラクションの両方で起こったことを意味することに気づいたことは興味深かった。
【００３０】
一方、我々の研究では、ＥＧＦもＪＭ１０１［ｐＷＫ３Ｒ］培養物のＳＮ中に効率よく発現され、排泄されることが判明した（図２ｂ、レーン３）。それでも、高レベルの排泄ＥＧＦにもかかわらず、有意なレベルの処理されたＥＧＦは、非開裂ＯｍｐＡ−ＥＧＦ中間体とあわせてＣＬ中でも検出された（図２ｂ、レーン４）。
【００３１】
ＪＭ１０１［ｐＷＫ３Ｒ］由来のｂＦＧＦおよびＥＧＦの真正性
誘導されたＪＭ１０１［ｐＷＫ３Ｒ］培養物（上記）の、ＣＬおよびＳＮ両方から精製された処理されたｂＦＧＦ産物を、その真正性を確認するために液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法によって分析した。結果によって示されるように、両フラクションからのｂＦＧＦ産物は、天然のｂＦＧＦのものと同じＮ末端配列およびＣ末端配列を含み（表２）、２つの前駆体：ＯｍｐＡ−ＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦ（細胞質中）（図２ａ、レーン２）およびＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦ（培地中）（図２ａ、レーン３）からの切除は自動的かつ正確であり、その結果、真正ｂＦＧＦがうまく得られたことを意味する。
【００３２】
ＯｍｐＡ−ＥＧＦ融合が正確に処理されてＪＭ１０１［ｐＷＫＷ２］の培地中で真正ＥＧＦが得られることが示されたが、ＳＮ中のＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦ中間体の開裂から回収されるＥＧＦ（図２ｂ、レーン３）が天然のＥＧＦと構造的に異なるかどうかを判別することは興味深い。質量決定によって裏付けられるように、回収されたＥＧＦおよび天然のＥＧＦは同一であると結論づけられた（図３）。
【００３３】
ＪＭ１０１［ｐＷＫ３Ｒ］由来のｂＦＧＦおよびＥＧＦの有効性
ＪＭ１０１［ｐＷＫ３Ｒ］のＳＮから精製されたｂＦＧＦおよびＥＧＦのサンプルを、我々の研究グループによって以前に発現させ、特性化したそれらの真正対応物を参照して、生物活性についてさらに綿密に調査し、分析した。結果から、両産物は標準と明らかに同じ有効性を有することが明らかになり（図４）、ＪＭ１０１［ｐＷＫ３Ｒ］中の排泄されたｂＦＧＦおよびＥＧＦが真正であるだけでなく、充分生物活性でもあるという結論が裏付けられた。ＣＬから精製されたｂＦＧＦ成分はそのＳＮ対応物と構造的に同じである（表２）ことが判明したので、このことは、前者が後者と等しく有効であることを意味する。
【００３４】
ＪＭ１０１［ｐＷＫ３Ｒ］中のｂＦＧＦおよびＥＧＦの発現
ＩＰＴＧ誘導下で８時間成長させたＪＭ１０１［ｐＷＫ３Ｒ］の細胞サンプルを収集し、ＣＬおよびＳＮフラクションを調製した。２つのフラクション中のｂＦＧＦおよびＥＧＦのウェスタンブロット分析によって、両因子またはポリペプチドが培養物中で効率よく発現されたことが明らかになった。さらに重要なことには、中間体産物：ＣＬ中で同定されたＯｍｐＡ−ＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦ（図２ａ、レーン２）およびＳＮ中で同定されたＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦ（図２ａ、レーン３）はどちらも的確に処理されて、真正ｂＦＧＦが得られた。両フラクションを組み合わせて、約１０３ｍｇ／ｌ−１の優れた収率のｂＦＧＦが得られた（図４）。同様に、ＳＮ中約３８ｍｇ／ｌ−１（図２ｂ、レーン３；図４）およびＣＬ中約３６ｍｇ／ｌ−１（図２ｂ、レーン４）の高レベルの真正ＥＧＦも得られた。
【００３５】
別の特筆すべき観察結果は、ＪＭ１０１［ｐＷＫ３Ｒ］が試験期間中、培養物中で起こる中間体の混合物（図５）：ＯｍｐＡ−ＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦ、ＯｍｐＡ−ＥＧＦ−ＶＭＡおよびＯｍｐＡ−ＥＧＦの効率的な発現および分泌にもかかわらず、良好な成長速度を保持したことであった（図２ａ、レーン２および３；図２ｂ、レーン３および４）。上記で特定されたタンパク質複合体の分泌発現がなぜ以前に報告されたはるかに小さなＯｍｐＡ−ＥＧＦ中間体から構成される均一な集団と同じほどの消耗性でしかないのかはまだ解明されていない。
【００３６】
考察
これまでに、イー・コリにおけるｂＦＧＦの発現は、概して通常の融合法に限定され、この方法では、細胞内融合中間体をその後回収し、プロテアーゼで開裂させて、ｂＦＧＦをせいぜい誘導体として放出させた。さらなる手作業の開裂ステップは面倒であり、費用がかかり、不確実になる。本発明はｂＦＧＦを分泌タンパク質として効率よく発現するためにイー・コリを使用し、さらに重要なことには、組換えｂＦＧＦと天然の対応物は同じタンパク質配列を有していた。上述の結果は、イー・コリが潜在的な宿主としても機能し得る細胞外発現の我々の発見を裏付けている。本発明はしたがって、真正ｂＦＧＦを産生するための技術的に実行可能でありかつ費用効率の良い代替法を提供した。
【００３７】
我々は、以前に真正ＥＧＦの産生を促進するための効率的な排泄イー・コリ系であるＪＭ１０１［ｐＷＫＷ２］を開発した。上記の発明は、真正構造（表２）および強力な生物活性（図４）を有する非融合産物としてｂＦＧＦをうまく発現するための汎用イー・コリ系の操作への構築物ｐＷＫＷ２の適用を示した。さらに、真正および生物活性ＥＧＦ（図３および図４）は同じ宿主で効率よく同時発現することもできることを示している。
【００３８】
ｐＷＫＷ２中のｏｍｐＡリーダーへのｂｆｇｆ遺伝子の直接融合（ｅｆｇ遺伝子を置換することによる）は、ＥＧＦ発現で既に観察されたように、ｂＦＧＦの効率的な排泄産生に至らない（図２ａ、レーン６および７）。興味深いことに、そして予想外に、ＯｍｐＡとｂＦＧＦとの間にＶＭＡを挿入すると、ＳＮにおいて大きな（約７３ｋＤａ）ＶＭＡ−ｂＦＧＦ中間体が排泄産生される（図２ａ、レーン５）。細胞内タンパク質であるＶＭＡがＪＭ１０１［ｐＷＫＷ２０ＶＭＡ］におけるＯｍｐＡ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦの分泌を阻止しなかったということは全く予想外であった（図１）。それでも、ＳＮ中のＶＭＡ−ｂＦＧＦのさらなる処理は阻止された（図２ａ、レーン５）；おそらくは、大きなサイズのＶＭＡが切断過程を物理的に妨害したためである。
【００３９】
しかしながら興味深いことに、ＥＧＦをＶＭＡ−ｂＦＧＦのＮ末端に添加することによって、後者の分泌および開裂の両方が向上されることが示される（図２ａ、レーン３；図２ｂ、レーン３）。結果としての中間体ＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦは、ＶＭＡ−ｂＦＧＦよりもサイズが大きいのに、はるかに効率よく分泌・開裂されて、ｂＦＧＦだけでなくＥＧＦも排泄産物として生じた（図２ｂ、レーン３）。ＯｍｐＡ−ＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦ前駆体は拡張構造を達成できるようであり、これはさらに効率よく分泌されてＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦを生じることが示される（図２ａ、レーン２；図２ｂ、レーン４）。
【００４０】
インテインの切断点でのプロリン残基の存在は、その点での開裂を妨害する可能性がある。興味深いことに、プロリン残基がｂＦＧＦのＮ−エクステインで見いだされるにもかかわらず（図１Ｄ）、前駆体ＯｍｐＡ−ＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦおよびＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦにおけるＶＭＡおよびｂＦＧＦ間の開裂は、ＪＭ１０１［ｐＷＫ３Ｒ］培養物において非常に効率よく起こり、ＳＮおよびＣＬフラクションの両方でＥＧＦおよびｂＦＧＦを生じさせた（図２Ａおよび２Ｂ）。おそらく、タンパク質のらせん構造に「もつれ」を導入する傾向があるプロリンの存在にもかかわらず、前駆体は拡張された、したがってよりオープンな構造を提供して、開裂過程を促進する。さらに、中間体ＶＭＡ−ｂＦＧＦは開裂不可能のようであるので（図２Ａ、レーン６）、それがＪＭ１０１［ｐＷＫ３Ｒ］のＣＬでもＳＮでも中間体として存在しないこと（図２Ａ、レーン２および３）は、前駆体ＯｍｐＡ−ＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦおよびＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦからのｂＦＧＦの開裂が、ＥＧＦの開裂よりも早く、またはＥＧＦの開裂と同時に起こったという仮説を裏付けた。
【００４１】
前駆体ＯｍｐＡ−ＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦおよびＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦの切断がＳＮおよびＣＬフラクションの両方で自発的に起こったことも特筆すべきことである（図２Ａおよび２Ｂ）。前駆体ＯｍｐＡ−ＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦおよびＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦからのＥＧＦおよびｂＦＧＦのインサイチュ開裂およびＳＮおよびＣＬ調製物からの高レベルの両ポリペプチドの回収が実証されたことで、インテインが介在する発現から誘導される標的タンパク質を回収するための簡易な方法が提供される。しかしながら、我々の結果は、ＶＭＡ融合物からのエクステインの放出が還元剤および／または低ｐＨの使用を必要とすることが示された以前の知見とは明らかに矛盾する。我々の観察結果の潜在的な有用性にもかかわらず、ＳＮおよびＣＬにおいて検出される開裂活性が、上記で仮定された２つの前駆体の拡張構造に起因するか、またはそれらの兆候について他の説があるかは依然として不明である。
【００４２】
それでもなお、この研究における融合タンパク質改変を、ＶＭＡの開裂に対するフランキング配列における変化の影響の研究のための優れたモデルタンパク質として使用することができる。今までのところ、インテインの開裂に対するエクステインの状況の影響はほとんど解明されていない。
【００４３】
ＯｍｐＡ−ＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦがＪＭ１０１［ｐＷＫ３Ｒ］で発現されてからまもなく、この大きな（約８２ｋＤａ）前駆体は、細胞質中にとどまるか、または分泌経路にはいるかのいずれかである；同時に、ＶＭＡに隣接する２つの開裂部位で処理して、ＯｍｐＡ−ＥＧＦ−ＶＭＡ、ＯｍｐＡ−ＥＧＦ、ＶＭＡ−ｂＦＧＦおよびｂＦＧＦを含む小さな中間体が生じる；最初の２つの中間体は分泌性であると予想され、最後の２つは細胞質中にとどまる。特に、正しく処理されて真正構造が得られることが示されたｂＦＧＦ分子（表２）は、ＳＮおよびＣＬの両方で共存することが確認された（図２ａ、レーン２および３）。この新しい発見は、費用がかかり多大な労力を必要とする従来の融合手順を経る必要のない細胞質中での成熟分泌タンパク質の発現についての新たな見識を提供できる。
【００４４】
要するに、ＯｍｐＡ−ＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦ前駆体およびその中間体は、成熟ｂＦＧＦおよびＥＧＦの２つの別個のプールを形成し、一方は分泌されたプールであり、他方は細胞内のものである。特筆すべきことには、ＪＭ１０１［ｐＷＫ３Ｒ］の細胞ペレットは、その分泌された対応物よりも一層大きなｂＦＧＦのリザーブであったことである（図２ａ、レーン２および３；図５）。さらに、有意なレベルの処理済ＥＧＦもＣＬ中で検出された。おそらく、ＣＬで検出された処理済ＥＧＦは、ＳｅｃＹＥＧ経路においてペプチダーゼ開裂の後でトラップされた。タンパク質排泄に関する我々の以前の研究の発見と同様に、ペリプラズムでは低レベルのＥＧＦおよびｂＦＧＦだけが検出された（データは不掲載）。これらの結果は、ＯｍｐＡ−ＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦの開裂が細胞質中で効率よく起こり、ｂＦＧＦを放出したという考えを裏付けている。しかしながら、ＥＧＦ融合を形成するためにインテインを使用した以前の試みの結果、イー・コリの細胞質中で不溶性凝集体が生じた。ｐＷＫＷ２中で微調整されたＬａｃＵＶ５カセットの制御下で発現された、高レベルのＯｍｐＡ−ＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦにもかかわらず、この大きな前駆体が細胞中で可溶性のままであることができることは、ＥＧＦおよびｂＦＧＦの両方を生物活性および真正産物としてその後に獲得するために非常に重要であった。
【００４５】
一方、ＯｍｐＡ−ＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦ（図２Ｂ、レーン４）の大きなサイズにもかかわらず、おそらくはＳｅｃＹＥＧ転位機序によってこれを容易に分泌させることができ、排泄中間体：ＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦ（図２Ｂ、レーン３）が形成される。しかしながら、排泄中間体には効率的な自己開裂活性が賦与される可能性があり、その結果、さらに真正ｂＦＧＦおよびＥＧＦ（図２Ｂ、レーン３）が得られることが示される。概して、折り畳み構造を形成すると推測される細胞質タンパク質は、分泌経路に入るのに適さない。したがって、ＶＭＡに隣接するＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦにおいてＮ末端およびＣ末端エクステインとして機能を果たすＥＧＦおよびｂＦＧＦで、ＶＭＡが折り重なる傾向は無効にされ、阻止されたようである。結果として、ＥＧＦ−ＶＭＡ−ｂＦＧＦは分泌に適した拡張構造を得ることができる。これらの発見は、その他の方法では細胞質発現が唯一の選択肢である場合に結局、融合タンパク質または封入体となる広範囲の細胞内タンパク質の発現にとって重要である。
【００４６】
結論として、この開示に導入される汎用イー・コリ系は、少なくとも真正ＥＧＦおよびｂＦＧＦ、または他のタンパク質を同時発現する効率的な製造工場であることが示された。
【００４７】
方法
細菌株および化学物質
イー・コリ株ＪＭ１０１がこの試験で用いた宿主であった。Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ、制限、および修飾酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）から購入した。すべてのオリゴはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州カールズバッド）から購入した。特別の指定がない限り、他の化学物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。ｂＦＧＦおよびＥＧＦに対する抗体ならびに細胞質マーカーとしての機能を果たすＭａｚＧはウサギで産生した。
【００４８】
発現構築物の構築
プラスミドｐＷＫＷ２ＦＧＦＲ、ｐＷＫＷ２０ＶＭＡ、およびｐＷＫ３Ｒを、以下の修飾を有するｐＷＫＷ２の誘導体として構築した。ｅｇｆ遺伝子が含まれるＬａｃＵＶ５発現カセットを含むＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを取り出した。オリゴＰ１〜Ｐ５（表１）をプライマーとして使用し、ベクターｐＳＯおよびｐＷＫＷ２をテンプレートとして使用して、オーバーラップエクステンションＰＣＲによってｂｆｇｆ遺伝子を含む同じカセットをまず合成し、続いてＥｃｏＲＩ制限およびｐＷＫＷ２での再ライゲートをおこなって、プラスミドｐＷＫＷ２ＦＧＦＲ（図１ａ）を得た。構築物ｐＴＹＢ２１およびｐＷＫＷ２ＦＧＦＲをテンプレートとして使用し、オリゴＰ６〜Ｐ９（表１）をプライマーとして使用してオーバーラップエクステンションＰＣＲをまず実施することによってサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）血管膜ＡＴＰａｓｅ遺伝子のＳｃｅＶＭＡインテインがｂｆｇｆと上流で融合されたプラスミドｐＷＫＷ２０ＶＭＡ（図１ｂ）を構築して、予想されるカセットを形成し、続いてカセットをＮｒｕｌおよびＢａｍＨｌで制限し、それをｐＷＫＷ２ＦＧＦＲとライゲートした。プラスミドｐＷＫ３Ｒ（図１ｃ）を得るために、ｐＷＫＷ２をテンプレートとして、そしてオリゴＰ１０〜Ｐ１１（表１）をプライマーとして用いるオーバーラップエクステンションＰＣＲを用いて、発現カセットをまず操作し、続いてＮｒｕｌおよびＫｐｎｌで制限し、ｐＷＫＷ２０ＶＭＡとライゲートした。
【００４９】
振とうフラスコ培養
イー・コリ形質転換体を、７０μｇ／ｍｌ−１のアンピシリンを追加したＭＭＢＬ培地中で成長させた。経時的実験では、５０ｍｌの成長培地を含む２５０ｍｌのフラスコに、新たに成長させたコロニーを接種し、２５０ｒｐｍおよび３４℃で培養物がＡ５５０＝８の密度に達するまで振とうした。続いて、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、培養物を連続して８時間成長させた。その後、培養物を遠心分離し、上清（ＳＮ）を貯蔵した。細胞ペレットを１２０μｌのＴｒｉｓ．Ｃｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）中に再懸濁させ、続いて８３μｌのＥＤＴＡ溶液（０．２５Ｍ、ｐＨ８．０）を添加した。細胞混合物を氷上で５分間インキュベートし、次いで１２０μｌのリゾチーム溶液（１０μｇ／ｍｌ）で３７℃にて２０分間処理した。８３μｌの溶解緩衝液（１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および５０ｍＭのＴｒｉｓ．Ｃｌ、ｐＨ８．０）の添加後、試験管を穏やかに反転させ、続いて１３，０００ｒｐｍで１０分間スピンさせた。上清は細胞溶解物（ＣＬ）であった。ＳＮおよびＣＬフラクションの両方をウェスタンブロット分析によってｂＦＧＦおよびＥＧＦについて分析し、その画像をＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、米国）を使用して濃度測定によって定量化した。
【００５０】
硫酸アンモニウム沈降
ｂＦＧＦを含むＳＮに硫酸アンモニウムを添加して、３５％飽和に達した。遠心分離後、ｂＦＧＦを含んだ沈殿物（Ａと表示）をその後の精製のために５ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ（ｐＨ７．５）中に溶解させた。上清については、硫酸アンモニウムを添加して６５％飽和を達成した。ＥＧＦ活性を含んだ沈殿物（Ｂと表示）を遠心分離によって集め、後の使用のために、５ｍｌのリン酸塩緩衝液（ＰＢ；１リットルあたり１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ４および０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）中に溶解させた。
【００５１】
細胞溶解
４００ｍｌ培養物から得られた細胞ペレット（上述の振とうフラスコ培養を参照）を５０ｍＭのＴｒｉｓ．Ｃｌ（ｐＨ７．５）中に溶解させ、そして再懸濁液を２５ｋＰａでの圧力設定を使用して細胞破壊システム（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ．）で５回処理した。溶解物を１３，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を細胞内ｂＦＧＦの精製のために貯蔵した。
【００５２】
ＥＧＦの精製
ＱＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）イオン交換クロマトグラフィーを使用するＥＧＦの精製は以前に記載した。ＥＧＦ活性を含むフラクションをプールし、Ａｍｉｃｏｎ遠心濾過ユニット（１０ｋＤａカットオフ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過した。その後、１３，５００ｒｐｍで１時間遠心分離することによって、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ５００遠心ろ過ユニット（３ｋＤａカットオフ）（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりろ液を清澄化した。
【００５３】
ＥＧＦの分析
３５５ｎｍで操作されるスマートビーム−ＩＩレーザーを備えたＢｒｕｋｅｒ  ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、独国ブレーメン）を用いて、精製されたＥＧＦを分析した。ＦｌｅｘＣｏｎｔｒｏｌ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．３，  Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）ソフトウェアを使用して計器の操作を制御した。ＭＡＬＤＩレーザー強度はオペレータが調節して最適強度および質量スペクトルの解像度を得た。１μｌのサンプルを１μｌのマトリックスであるシナピン酸（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）と予備混合し、混合物を次いでＧｒｏｕｎｄ  Ｓｔｅｅｌ  Ｔａｒｇｅｔプレート（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）上にスポットした。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を使用して外部較正を実施した。陽イオン質量スペクトルを質量分析法実験のために線形モードで取得した。
【００５４】
ｂＦＧＦの精製および分析
ヘパリン‐アガロースクロマトグラフィーを使用したｂＦＧＦの精製および液体クロマトグラフィータンデム質量分析法による精製ｂＦＧＦの分析は既に記載した。
【００５５】
ＥＧＦおよびｂＦＧＦの生物学的アッセイ
ＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３線維芽細胞の増殖に対する精製ＥＧＦおよびｒｂＦＧＦの細胞分裂促進作用を、既に記載したようなＭＴＴアッセイによって分析した。手短に言うと、ＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３細胞を５×１０４細胞の密度で蒔き、１．５％ウシ胎仔血清を追加したＤＭＥＭ培地中で３７℃にて２４時間培養した。その後、細胞を個別に以下の混合物と３日間インキュベートした：（１）ＤＭＥＭ＋ＥＧＦサンプル；（２）ＤＭＥＭ＋市販のＥＧＦ；（３）ＤＭＥＭ＋ｂＦＧＦサンプル；（４）ＤＭＥＭ＋市販のｂＦＧＦ２１；（５）ＤＭＥＭ。続いて、２０μｌのＭＴＴ溶液（３−（４，５−ジメチルチアゾール‐２‐イル）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を各ウェルに添加し、続いてプレートを３７℃にて４時間インキュベーションした。液体を各ウェルから除去し、これに次いで１５０μｌのＤＭＳＯを添加して、紫色結晶を溶解させた。マイクロプレートリーダーを使用してプレートを５７０ｎｍで読み取った。同じアッセイを４回繰り返した。紫色ホルマザンの形成（ＯＤ５７０ｎｍで測定）をもたらす、細胞を成長させることによって生じるＮＡＤＰＨ‐リダクターゼによるＭＴＴの還元は、細胞増殖を定量化するのを助ける手段を提供する。
【００５６】
明確にするために、実施の形態または実験の内容で記載された本発明の特徴は、１つの実施の形態または実験の組み合わせで提供できることは理解されるべきである。反対に、簡潔のために１つの実施の形態または実験の内容で記載される本発明の様々な特徴は、個別に、または任意の適切な小結合で提供することができる。実施の形態または実験のある特徴は、非限定的例によって説明されることに留意すべきである。また、当業者は、簡潔のために上記で説明されていない先行技術をご存知のことと思う。
【００５７】
以下の文献はその全体が参照により援用される。
Aliboiandi M, Mirzahoseini H (2011) Purification and refolding of overexpressed human basic fibroblast growth factor in Escherichia coii. Biotechnol Res Int 2011:1-6
Andrades J A, Santamaria JA, Wu LT, Hall FL, Nimni ME, Becerra J (2001) Production of a recombinant human basic fibroblast growth factor with a collagen binding domain. Protopl asma 218:95-103
Asubel F, Brent R, Kingston R, Moore D, Seidman j, Smith J, Stroh! K (1993) Curr Protoc Mol Biol 2: 11.2.1-11.2.5
Ban- PJ, Cousens LS, Lee-Ng CT, Medina-Seiby A, Masiarz FR, Hailewell RA, Chamberlain SH, Bradley JD, Lee D, Steimer KS (1988) Expression and processing of biologically active fibroblast growth factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 263 : 16471- 16478
Bikfalvi A, Klein S, Pmtucci G, Rifkm DB (1997) Biological Roles of Fibroblast Growth Factor-2. Endocr Rev 18:26-45
Chan AKN, Wang YY, Ng KL, Fu Z, Wong WKR (2012) Cloning and characterization of a novel celiobiase gene, cba3, encoding the first known β-glucosidase of glycoside hydrolase family 1 of Cellulomonas biazotea. Gene 493:52-61
Cottingham IR, Millar A, Emslie E, Colman A, Schiiieke AE, Mc ee C (2001) A method for the amidation of recombinant peptides expressed as intein fusion proteins in Escherichia coli. Nat Biotechnol 19:974-977
El!euche S, Poggeler S (2010) Inteins, valuable genetic elements in molecular biology and biotechnology. Appl Microbiol Biotechnol 87:479-489
Esipov RS, Stepanenko VN, Chupova LA, Boyarskikh UA, Filipenko ML, Miroshnikov AI (2008) Production of recombinant human epidermal growth factor using Ssp dnaB mini-intein system. Protein Expr Purif 61 : 1 -6
Ferrer-Miralles N, Domingo-Espin J, Corchero JL, Vazquez E, Viilaverde A (2009) Microbial factories for recombinant pharmaceuticals. Microb Cell Fact 8: 17
Fu ZB, Ng L, Lam TL, Wong WKR (2005) Cell death caused by hyper-expression of a secretory exoglucanase in Escherichia coli. Protein Expr Purif 42:67-77
Fu ZB, Ng KL, Lam CC, Leung KC, Yip WH, Wong WKR (2006) A two-stage refinement approach for the enhancement of excretory production of an exoglucanase from Escherichia coli. Protein Expr Purif 48:205-214
Garke G, Deckwer WD, Anspach FB (2000) Preparative two-step purification of recombinant human basic fibroblast growth factor from high-cell-density cultivation of Escherichia coli. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 737:25-38
Huang RC, Lam E, Chen YH, Hackett J, Lam TL, Liu D, Ma MC, Siu KL, Sivakesava S, Xu ZN, Wong RSC, Wong WKR (1999) Human epidermal growth factor excreted by recombinant Escherichia coli K-12 has the correct 'N -terminus and is fully bioactive. Process Biochem 35: 1-5
Ingham AB, Sproat KW, Tizard MLV, Moore RJ (2005) A versatile system for the expression of nonmodified bacteriocins in Escherichia coli. J Appl Microbiol 98:676-683
wong WY, Ng L, Lam CC,Wang YY, WongWKR (2013) Authentic human basic fibroblast growth factor produced by secretion in Bacillus subtilis. Appl Microbiol Biotechnoi 97:6803-6811
Lam TL,Wong RSC,Wong W R (1997) Enhancement of extracellular production of a Celluiomonas flmi exogiucanase in Escherichia coli by the reduction of promoter strength. Enzyme Microb Technol 20:482-488
Lee C, Li P, Inouye H, Brickman ER, Beckwith J (1989) Genetic studies on the inability of beta-galactosidase to be translocated across the Escherichia coli cytoplasmic membrane. J Bacterioi 171 :4609 4616
Li Y (2011) Self-cleaving fusion tags for recombinant protein production. Biotechnoi Lett 33:869-881
Mirzahoseini H, Mehraein F, Omidinia E, Razavi MR (2004) Differential expression of human basic fibroblast growth factor in Escherichia coli: potential role of promoter. World J Microbiol Biotechnoi 20: 161-165
Mu X, Kong N, Chen W, Zhang T, Shen M, Yan W (2008) High-level expression, purification, and characterization of recombinant human basic fibroblast growth factor in Pichia pastoris. Protein Expr Purif 59:282-288
Nakayama A, Ando K, Kawamura K, Mita I, Fukazawa K, HoriM, Honjo M, Furutam Y (1988) Efficient secretion of the authentic mature human growth hormone by Bacillus subtilis. J Biotechnoi 8: 123-134
Selike FW, Laham RJ, Edelman ER, Peaiiman JD, Simons M (1998) Therapeutic Angiogenesis With Basic Fibroblast Growth Factor: Technique and Early Results. Ann Thorac Surg 65:1540-1544
Sheng Z, Chang SB, Chirico WJ (2003) Expression and purification of a biologically active basic fibroblast growth factor fusion protein. Protein Expr Purif 27:267-271
Sivakesava S, Xu ZN, Chen YH, Hackett J, Huang R, Lam E, Lam TL, Siu KL, Wong RSC,
Wong WKR (1999) Production of excreted human epidermal growth factor (hEGF) by efficient recombinant Escherichia coli svstem. Process Biochem 34:893-900
Wang L, Kang JH, Kim KH, Lee EK (2010) Expression of intein-tagged fusion protein and its applications in downstream processing. J Chem Technol Biotechnol 85 : 11 -18
Wang YY, Fu ZN, Ng KL, Lam CC, Chan AKN, Sze KF, Wong WKR (201 1 ) Enhancement of excretory production of an exoglucanase from Escherichia coli with phage shock protein A (PspA) overexpression. J Microbiol Biotechnol 21 :637-645
Wong WKR (2008) Application of recombinant microbial systems to the production of commercially valuable proteins. Res .1 Biotechnol 3
Wong WKR, Sutherland ML (1997) Excretion of heterologous proteins incR system of Salmonella typhimurium. J IndMicrobiol Biotechnol 21 :31-36
Wong WKR, Lam E, Huang RC,Wong RS, Morris C, Hackett J (2001) Applications, and efficient large-scale production, of recombinant human epidermal growth factor. Biotechnol Genet Eng Rev 18: 51-71
Wong WKR, Ali AB, Ma MC (2003) Cloning, expression, and characterization of diuretic hormone Manduca diuresin from Manduca sexta in Escherichia coli. Protein Expr Purif 29: 51 -57
Wong WKR, Lam KH, Tsang MW (2009) Method and composition for treating skinwounds with epidermal growth factor.
US Patent 7517528 Wong WKR, Fu ZB.Wang YY, Ng KL,, Chan AKN (2012) Engineering of efficient Escherichia coli excretion systems for the production of heterologous proteins for commercial applications. Recent Patents Chem Eng 5 :45-55
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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