(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エピゲノム修飾を行う一以上の化合物を有する医薬であって、
一以上のタンパク質における高次構造の障害に関連する遺伝性筋疾患の治療において使用され、
前記化合物が、フェニル酪酸、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド、及び5-アザシチジンより選択され、
前記遺伝性筋疾患が進行性筋ジストロフィーであって、当該進行性筋ジストロフィーが、α−サルコグリカン異常症であり、
前記障害が前記タンパク質の細胞内分解の原因となる、
医薬。
【請求項２】
投与経路が筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、経口投与、又は静脈内投与であることを特徴とする、
請求項１に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はその高次構造の障害により細胞内で分解されるタンパク質における高次構造の障害に関連する遺伝性筋疾患の治療に関する。特にサルコグリカン異常症、ジスフェリン異常症、（アノクタミン５の異常に関連する）アノクタミノパチー（anoctaminopathies）、ＦＫＲＰ（"Fukutin-Related Protein"フクチン関連タンパク質）異常と関連するジストロフィー等を対象とするものに関する。
【０００２】
より具体的には、上記疾病の治療のための薬物療法のためのエピゲノム修飾剤の特定およびこれの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
筋繊維の異常に起因する病態は一般に筋原性疾患と呼ばれ、筋肉の不安定化及び変性により、多くの場合、運動機能の不調又は喪失をもたらすことを特徴とする。
【０００４】
遺伝的原因が特定されている筋原性疾患は80種を超える。これらは優性遺伝、劣性遺伝、又はＸ染色体と関連付けられた遺伝により伝播する。いずれの形態も有病率は低く（１／２００，０００から１／８，５００）、累積的な頻度であっても約１／３，０００である。
【０００５】
このような病態の中で、最も大きなグループとして認識されるのは進行性筋ジストロフィーのグループであり、少なくとも２５個の相異なる病態を含み、さらに肢帯型ジストロフィーと呼ばれる近位型筋ジストロフィー、及び遠位型筋ジストロフィーに分類される。
【０００６】
近位型筋ジストロフィーは肩及び下肢帯の一定の筋に対して選択的に進行性の萎縮が起きることを特徴とする。遠位筋ジストロフィーは最初に手、足、前腕、脚の筋の機能障害が起きることを特徴とする。
【０００７】
遺伝性障害により筋組織の変性／再生が循環する過程で病態の変化自体が起きる。組織レベルでは、繊維において核が集中することに示される壊死及び再生の過程、マクロファージ湿潤及び脂肪湿潤、並びに副次的な繊維形成がかかる過程の特徴である。
【０００８】
臨床像は病態ごとに不均一であり、単なる疲労から歩行能力の喪失まで幅が広く、筋力の低下は筋委縮を伴うのが通常である（Daniele et al., 2007）。かかる病態では筋の喪失が患者の生活の質に強く影響を与え、また呼吸障害又は心臓障害が死因となる。
【０００９】
より具体的には、近位筋ジストロフィー又は肢帯型筋ジストロフィー（LGMD）は遺伝形式により分類され：LGMD1は優性型であり、LGMD2は劣性型である（Bushby and Beckmann, 1995）。
【００１０】
LGMD1に共通の特徴は：若年成人期又は成人期に発症すること、進行が遅いこと、歩行能力の喪失率は低いこと及びクレアチンキナーゼの値が正常であることである。これら優性型は劣性型に比べて頻度が少なく、その割合は全LGMDの10%に満たず（Nigro, 2003）、各種別において報告されているのは一家族又は数家族だけである。
【００１１】
現在、劣性型で常染色体性の肢帯筋ジストロフィー（LGMD2）が16個特定され、大文字を付すことによって（LGMD2Aから2P）注釈がつけられている。これらのジストロフィーに関わる全ての遺伝子が特定されている。対応するタンパク質は様々な部位で様々な働きをしている。
【００１２】
いくつかの遺伝子における変異は遠位型の臨床症状とも関連することが示唆されており、より複雑となっている。例えば次の通り言われている：
−  ジスフェリンが変異すると三好型ミオパチーの原因となる；
−  アノクタミン５が変異すると三好型類似三型ミオパチー（Miyoshi-like type 3 myopathy）の原因となる；
−  チチンが変異すると脛骨筋ジストロフィー（TMD）の原因となる。
【００１３】
LGMD2の中で、各サルコグリカン遺伝子の変異による遺伝病がサルコグリカン異常症である。かかるタンパク質は4種あり、これらは筋細胞の細胞膜に存在するジストロフィンと結合する複合体に含まれており、収縮中に筋繊維を保護するために必須である
【００１４】
またサルコグリカン異常症としては以下のものが挙げられる：
−  LGMD2C、γ−サルコグリカンをコードする遺伝子の変異が原因（Ben Othmane et al., 1995）；
−  LHMD2D、α−サルコグリカンをコードする遺伝子の変異が原因（Passos-Bueno et al., 1993）；
−  LHMD2E、β−サルコグリカンをコードする遺伝子の変異が原因（Lim et al., 1995）；
−  LHMD2F、δ−サルコグリカンをコードする遺伝子の変異が原因（Passos-Bueno et al., 1996）。
【００１５】
これらの遺伝子における原因となる変異は特定可能であった：このため、LGMD2Dで最もよく見られる変異は77番アルギニンがシステインで置換されるもの（R77C）である。γ-SG遺伝子に特有の変異、C283YはLGMD2Cの原因であり、欧州のジプシーの集団（Piccolo et al., 1996; Todorova et al., 1999）中によく見られる。γ-SG遺伝子の他の変異であるdel521Tは、ほぼチュニジア人の家族にのみ見られる。アメリカのアーミッシュ派のコミュニティの患者では、LGMD2Eがよく見られ、T151Rの変異を有する（Duclos, et al., 1998; Lim et al., 1995）。
【００１６】
各例において、事実上これらの疾患に対して効果的な治療法は現在、存在しない。しかしながら患者にとっては体を楽になることが必要なため運動療法が行われており、患者の生活の質を向上させるための様々な薬物療法及び／又は技術を代替している。
【００１７】
サルコグリカン異常症の治療と関連し、文献WO2008/009802によればI型αマンノシダーゼの使用が提唱している。これに関連してサルコグリカン遺伝子中の変異がいくつか示されているが、かかる変異ではタンパク質が機能を喪失しているのではなく、細胞内の品質管理機構により異常な高次構造を有するタンパク質が分解されている。ここで上記機構に対抗しタンパク質を保護するための阻害物質があれば変異タンパク質の分解を妨げることでタンパク質は膜に局在するようになり改めて機能するようになると考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
サルコグリカン異常症のような遺伝性筋疾患の新しい治療法を開発することが現に必要とされている。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】HER911ヒト細胞における免疫組織化学的標識
【図２】HER911ヒト細胞における免疫組織化学的標識
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は全体として新しい治療法を提供する。発明者はエピゲノム修飾を行う化合物を用いて、高次構造の障害すなわちミスフォールディングを有する筋タンパク質の機能を回復できることを実際に示す。
【００２１】
より詳細には、第一の態様において、本発明はエピゲノム修飾を行う一以上の化合物を有する医薬（医薬組成物又は組み合わせ医薬、原文におけるcomposition pharmaceutique）に関連する。かかる医薬は一以上のタンパク質における高次構造の障害に関連する遺伝性筋疾患の治療において使用される。かかる異常はそのタンパク質の細胞内分解の原因となるものである。
【００２２】
換言すれば、かかるエピゲノム修飾を行う化合物を有する（医薬）組成物又は組み合わせ（医薬）（原文におけるcomposition）は一以上のタンパク質における高次構造の障害であってそのタンパク質の細胞内分解の原因となる障害に関連する遺伝性筋疾患の治療のための薬物を調製するために用いることが好ましい。したがって本発明は一以上のタンパク質における高次構造の障害であってそのタンパク質の細胞内分解の原因となる障害に関連する遺伝性筋疾患の治療方法に関連し、エピゲノム修飾を行う化合物を有する（医薬）組成物又は組み合わせ（医薬）を効果的な用量で投与するものである。
【００２３】
かかる（医薬）組成物又は組み合わせ（医薬）はさらに許容範囲内、特に薬学的に許容範囲内の化合物又は賦形剤を含有してもよい。また同一の疾患又は他の疾患の治療のための他の有効成分を含有してもよい。特定の実施形態においては、エピゲノム修飾を行う化合物は当該（医薬）組成物又は組み合わせ（医薬）中、唯一の有効成分であってもよい。
【００２４】
一の（医薬）組成物又は組み合わせ（医薬）において、互いに異なる性質を有するエピゲノムに対して修飾を行う二以上の化合物を、同時に又は互いに異なる時点で投与することが想定される。
【００２５】
投与経路は筋肉内投与でもよく、局所投与でもよく、静脈内投与でもよく、また皮下投与でも、腹腔内投与でも、経口投与でもよい。
【００２６】
投与経路、投与量、あるいは投与頻度は当業者に知られる通常の手順に基づき症例ごとに決定される。
【００２７】
「エピゲノム」の用語は、遺伝するが可逆的な生化学的シグナルであって、遺伝子と相互作用し、その発現を支配し、かつ分化した細胞において、DNA配列が修飾されていないこれらの遺伝子の活性化及び不活性化に関連する遺伝プログラムの実行を担保するものを表す。
【００２８】
また、遺伝子を構成するDNA配列が同じ個体の全ての細胞と同一であっても、遺伝子上に存在するエピジェネティックな標識によって、これらの遺伝子にコードされるタンパク質は互いに異なる時点又は異なる部位で生成される。
【００２９】
エピゲノムの生化学な基盤は複合的でありかつ複雑であるが、以下を含む：
−  DNAレベルにおける修飾；
−  ヒストンレベルにおける修飾；
−  ポリコームのような特定のタンパク質の関与；
−  非コードRNAの関与、小さなもの（マイクロRNA）及び大きなもの（長鎖非コードRNA）がある。
【００３０】
換言すれば、本発明に係るエピゲノム修飾を行う化合物はエピジェネティックな作用因子に対するモジュレーターであり、少なくとも部分的に、その発現及び／又は活性を調節することができる。「モジュレーター」の用語は活性化物質（又は誘導物質）あるいは阻害物質（又は抑制物質）を表す。
【００３１】
かかる化合物はいかなる性質のものでもよく、例えばタンパク質、ペプチド、抗体、化学分子、又は核酸（アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、・・・）がある。
【００３２】
第一の実施形態においてはエピジェネティックな作用因子の発現レベル及び／又は産生レベルを上記化合物により調節する（低下させる、又は増加させる）。上記は当業者であれば容易に評価することができ、評価法として特に以下の技術が挙げられる：
−  ノーザンブロット又はＰＣＲ転写物の発現レベル；
−  適切な抗体によって検出されるタンパク質産生レベル（ウェスタンブロット又はELISA（enzyme linked immunosorbent assay））。
【００３３】
他の実施形態においては、上記化合物によりエピジェエティックな作用因子を生成し、その活性を調節する（低下させる、又は増加させる）。この場合、かかる活性は作用因子ごとの適切な評価法により定量することができる。
【００３４】
エピゲノム修飾を行う化合物の性質に関連し、エピジェネティックな制御の第一段階はDNAメチル化に関係することが知られている。DNAメチル化はCpGジヌクレオチドにおいてなされ、発生のごく初期の段階で確立する。DNAメチル化は３個のDNAメチル基転移酵素（又はDNMT）の協調的な作用によって行われる。
【００３５】
このため特定の形態において、エピゲノム修飾をする化合物はDNAメチル化阻害物質であり、特にDNAメチル基転移酵素の阻害物質である。この分類にあてはまる分子は特にin vitroでの利用に適している。
【００３６】
上記の範疇には数ある中で以下のものが含まれる：
−  ヌクレオシド類似体：これらは複製DNAに取り込まれる。このためDNAメチル化を阻害し、形質発現していなかった遺伝子を再活性化する。かかる分子として以下のものがある：
【００３７】
○  下記式で表される5-アザシチジン（又は5-アザ）：
【００３８】
【化１】
0006324378.tif 000002
【００３９】
○  下記式で表される5-アザ-2’-デオキシシチジン又はデシタビン：
【００４０】
【化２】
0006324378.tif 000003
【００４１】
○  ゼブラリン；
【００４２】
−  非ヌクレオシド類似体：これらはDNMTの酵素活性部位を遮断することで、又はDNAのCpGアイランドに結合することでDNMTを阻害する。かかる分子として以下のものがある：
【００４３】
○  プロカインアミド
○  プロカイン
○  没食子酸エピガロカテキン、エピガロカテキン  ３−ガラート（EGCG）；
【００４４】
−  アンチセンスオリゴヌクレオチド：
【００４５】
○  DNMT1 ASO（antisense oligonucleotide）；
【００４６】
−  ：下記式で表されるヒドララジン：
【００４７】
【化３】
0006324378.tif 000004
；
【００４８】
−  ：下記式で表されるSGI110（S110）：
【００４９】
【化４】
0006324378.tif 000005
【００５０】
他の態様においてエピゲノム修飾を行う化合物はDNAメチル化の誘導因子又は活性化因子であることがin vivoでの応用に好ましい。
【００５１】
一般に、DNAメチル化を調節する化合物の作用は容易に評価することができる：DNAのメチル化プロファイルはDNAを重硫酸塩で処理することで決定することができる。ここで重硫酸塩は非メチル化シトシンをウラシルに変換するがメチル化シトシンには影響を与えない。直接シーケンス法、ピロシーケンス法、PCR法、又はハイブリダイズ法に基づく異なる方法を、対立遺伝子を区別するために用いることができる。
【００５２】
このため上記の簡単な評価法により本発明に用いることのできるDNAメチル化阻害物質又は活性化物質を容易に特定できる。
【００５３】
他のレベルでの作用は共有結合性のヒストン修飾に関連する。かかる修飾は以下のものが好ましい：リシン残基のアセチル化、リシン残基及びアルギニン残基のメチル化、スレオニン残基及びセリン残基のリン酸化、リシン残基のメチル化並びにリシン残基のSUMO化。
【００５４】
ここでヒストンレベルの上記修飾は遺伝子発現に対して正の効果及び負の効果をもたらす。ここで取り上げる化合物の類型は活性化因子でありまた阻害因子である。
【００５５】
さらにヒストン修飾酵素に対してそれらの活性のレベルで直接作用するものでもよく、あるいはそれらの発現レベルにおいて遺伝的なメカニズムで作用するものでもよい。
【００５６】
実際にヒストンの転写後修飾について分析することができるので、関心のある化合物による影響をよく知られたウェスタンブロット法又はヒストン修飾に特異的な抗体の板（Egelhofer et al., 2011）を用いたELISA法によって評価できる。
【００５７】
一例として、上述の通りヒストンアセチル化レベルは調節されている。ここで、該調節は拮抗性の二種の酵素の活性により行われる：抑圧されたクロマチン形成するヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）及び遺伝子を発現させるヒストンアセチル基転移酵素。
【００５８】
このため、本発明の特定の態様において、エピゲノム修飾を行う化合物はヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）の阻害物質でもよい。
【００５９】
これらの阻害の態様及びこれらが標的とするHDACの類型によってHDAC阻害物質はいくつかに分類されることに留意する。ヒストン脱アセチル化阻害物質は以下のものを含む：
【００６０】
○  ヒドロキサム酸及びその塩：
【００６１】
■  トリコスタチン  Ａ  （TSA）；
■  APHAコンパウンド８；
■  MC1568；
■  チューバシン（原文においてTubucine）；
■  下記式で表されるヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド（SAHA又はボリノスタット）：
【００６２】
【化５】
0006324378.tif 000006
【００６３】
○  環状テトラペプチド及びデプシペプチド：
【００６４】
■  トラポキシンＢ；
■  アピシジン；
【００６５】
○  ベンズアミド：
【００６６】
■  下記式で表されるエンチノスタット（MS-275）；
【００６７】
【化６】
0006324378.tif 000007
【００６８】
■  CI-994；
■  106
■  モセチノスタット（MGCD0103）
【００６９】
○  求電子性ケトン：
【００７０】
■  トリフルオロメチルケトン；
■  α−ケトアミド；
【００７１】
○  脂肪族酸化合物：
【００７２】
■  下記式で表されるフェニル酪酸：
【００７３】
【化７】
0006324378.tif 000008
【００７４】
■  バルプロ酸；
【００７５】
○  ベリノスタット（PXD101）；
○  LAQ 824；
○  パノビノスタット（LBH589）；
【００７６】
−  他の化合物
【００７７】
○  ニコチンアミド；
○  ジヒドロクマリン；
○  ナフトピラノン（naphthopyranone）；
○  ２−ヒドロキシナフトアルデヒド（2-hydroxynaphaldehyde）；
○  １０−ヒドロキシ−２−デセン酸（10HDA）；
○  アベキシノスタット（Abexinostat, PCI-24781）；
○  SB939；
○  レスミノスタット（Resminostat, 4SC-201）；
○  ギビノスタット（Givinostat, ITF2357）；
○  CUDC-101；
○  AR-42；
○  CHR-2845；
○  CHR-3996；
○  4SC-202；
○  CG200745；
○  ACY-1215；
○  スルホラファン；
○  ケベトリン（Kevetrin）；
○  アピシジン；         
○  酪酸ナトリウム；
○  （−）−デプデシン（(-)-Depudecin）；
○  サーチノール（Sirtinol）；
○  N-ヒドロキシ-1,3-ジオキソ-1H-ベンゾ[de]イソキノリノン-2(3H)-ヘキサンアミド又はスクリプタイド（Scriptaid）
○  酪酸のヒドロキサメート誘導体（Le derive hydroxamate de l'acide butyrique）；
○  イソブチルアミド（L'isobutyramide）；
○  CBHA（m-カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキシアミド、m-carboxycinnamic acid bishydoxyamide）；
○  HC毒素（L'HC toxin）；
○  M344（4-ジメチルアミノ-N-(6-ヒドロキシカルバノミル-ヘキシル)-ベンズアミド）；
○  ヌルスクリプト（Nullscript）（4-(1,3-ジオキソ-1H,3H-ベンゾ[de]イソキノリノン-2-イル)-N-ヒドロキシブタンアミド）；
○  下記式で表されるPCI-34051：
【００７８】
【化８】
0006324378.tif 000009
【００７９】
これらの阻害物質のうちのいくつかの化学式は文献Kazantsev and Thompson（Nature Reviews Drug Discovery, vol. 7, no. 10, 2008, 854-866）に記載されいている。またHDAC阻害物質のスクリーニング方法は例えば文献WO 03/066885に記載されている。
【００８０】
上記の通り分類される化合物のうちSAHAを用いることが好ましい。
【００８１】
さらにヒストンメチル化阻害物質は以下のものでもよい：
【００８２】
−  下記式で表されるSL11144
【００８３】
【化９】
0006324378.tif 000010
【００８４】
−  下記式で表されるDZNep（3-デアザンプラノシン（3-Deazaneplanocin）：S‐アデノシルホモシステイン加水分解酵素の阻害物質）
【００８５】
【化１０】
0006324378.tif 000011
【００８６】
第三の制御レベルはPRC複合体のレベルで行われるものでもよい。具体的にはポリコームグループ（PcG）であるタンパク質は、発生中にこれらの標的遺伝子の転写が抑制された状態を維持することが知られているクロマチン因子である。これらの因子はポリコーム抑制複合体（Polycomb Repressive Complex, PRC）と呼ばれる大きな多量体の複合体の形態で機能することでDNAに結合し、PcGレスポンスエレメント（PcG response elements, PRE）と呼ばれる制御配列のレベルでメチル化によって遺伝子を抑制する。具体的には
PRC複合体はもともとヒストンメチル基転移酵素（histone methyltransferase, HMTase）活性を含んでおりヒストンメチル化によって発現を抑制する。
【００８７】
本発明においてはPRC複合体の調節因子を用いてもよい。
【００８８】
ポリコームタンパク質を標的としてもよく、特にアンチセンス若しくはエキソンスキッピングによって、それらの発現レベルで抑制又は不活性化してもよい。ポリコームタンパク質の発現又は活性は次のような通常の方法で測定してもよい：ウェスタンブロットによる発現レベルの測定；ゲル易動度シフト又はクロマチン沈降によるDNAとの結合の測定。
【００８９】
最後に、非コードRNA遺伝子、マイクロRNA及び長鎖非コードRNAの発現の制御との関連について示す。
【００９０】
マイクロRNA（miRNA）には約22ヌクレオチドの非コードRNAが分類され、遺伝子発現に対して負の転写後調節を行う。標的RNAに対して相補的に結合することで、該RNAを分解させ、その翻訳を阻害する。またmiRNAは新生転写産物に関するレベルで複合体を導くことでDNAメチル化及びヒストン修飾を制御することによりエピジェネティックな機構に影響を及ぼす。
【００９１】
他の型のエピジェネティックな作用因子は長鎖非コードRNAである。これらは遺伝子配列又は遺伝子間配列のレベルで転写され、オープンリーディングフレームは有しないか、わずかに有するだけである。これらのRNAはクロマチン又は転写の異なる面を標的とする上で異なる因子（転写活性化因子又は転写抑制因子）と結合し、あるいは細胞質中でコードRNAを不安定化し又はそれとは逆に安定化する。
【００９２】
このため他の態様において、エピゲノム修飾を行う化合物は非コードRNA、特にmiRNA及びlncRNAの調節因子でもよい。かかる化合物の果たす役割はいわゆるスポンジであり、これは標的となる非コードRNA（例えば相補配列又はアンチセンス）のコピー数を減らすものである。あるいは「模倣物（mimic）」であり、これは標的となる非コードRNA（例えばmiRNAを有するベクター）を増やすものある。
【００９３】
なお、非コードRNAの化合物の発現に対する効果は例えばノーザンブロット又は定量RT-PCRといった知られた方法で容易に分析できる。
【００９４】
本発明で用いるエピゲノム修飾を行う化合物は活性化物質又は阻害物質であることが好ましい：
−  DNAメチル化に係るもの；若しくは
−  ヒストン修飾に係るもの；若しくは
−  PRC複合体に係るもの；若しくは
−  非コードRNAに係るもの、好ましくはマイクロRNA及び／又は長鎖非コードRNAに係るもの。
【００９５】
利用可能な化合物は上に列挙した化合物、特にSAHAである。しかしながらかかる化合物の列挙は請求項を限定するものではない。このため、エピゲノム調節を行うことができる、あらゆる化合物、特に上述の機構を通じて行うものを本発明に用いることができる。
【００９６】
すでに述べたとおり、本発明は一以上のタンパク質の高次構造の障害であって自身の細胞内分解を起こすものに係る遺伝性筋疾患の治療に関連する。
【００９７】
遺伝性疾患とは一又は二以上の遺伝子における一又は二以上の変異によって起こる疾患と定義される。
【００９８】
本発明は一遺伝子性の疾患を対象とするものであることが好ましく、これは高次構造の障害を有するタンパク質をコードする点では、単一の遺伝子に係る疾患である。
【００９９】
産物タンパク質の高次構造の障害の原因となる変異は点変異でもよい。しかしながら高次構造の障害は点よりも大きな変異に係るものでもよく、例えばタンパク質をコードする遺伝子中のコドンの欠失であって、分解されなければタンパク質が活性を有するものでもよい。
【０１００】
本発明は劣性の筋疾患を対象とするものであることが好ましい。
【０１０１】
すでに述べたとおり、本発明の対象は筋疾患であり、好ましくは骨格筋あるいは心筋に、特に好ましくは骨格筋に影響を与えるものである。
【０１０２】
本発明において
「一以上の高次構造の障害」又は「タンパク質の高次構造の障害」とは疾患の原因となるタンパク質がそれをコードする遺伝子中の一以上の変異によりミスフォールドされており、該障害により細胞によって該タンパク質が分解されることを指す。また対象となる疾患は例えば変異タンパク質を標的とする抗体によって容易に特定できる。実際には、たとえ（転写産物レベルで確認できており）正常に発現していても、分解されているため該抗体によって検出できない。
【０１０３】
上述の通り、高次構造の障害を有するタンパク質が筋細胞により分解されるが、かかる分解はエピジェネティックな機構によって制御されることを示した。このためこれを解決すべく変異したタンパク質の分解を回避するためエピゲノム修飾を行う化合物を使用することで、これらを最終的な細胞内の区画に導き、もって正常な表現型を回復する。
【０１０４】
特定の態様において、高次構造の障害を有し細胞内分解がなされるタンパク質は膜タンパク質又は膜結合性タンパク質であり、これらはタンパク質複合体に取り込まれていてもよい。
【０１０５】
タンパク質の高次構造の障害に係る遺伝性筋疾患の中でも特に近位型あるいは遠位型の進行性筋ジストロフィーが挙げられる。
【０１０６】
進行性の筋ジストロフィーの中でも特に以下の疾患が挙げられる：
【０１０７】
−  サルコグリカン異常症、これはα−サルコグリカン異常症若しくはα−サルコグリカンのLGMD2Dの異常（原文におけるdefaut）に係るLGMD2D、β−サルコグリカン異常症若しくはβ−サルコグリカンの異常に係るLGMD2E、γ−サルコグリカン異常症若しくはγ−サルコグリカンの異常に係るLGMD2C、又はδ−サルコグリカン異常症若しくはδ−サルコグリカンの異常に係るLGMD2F；
【０１０８】
−  ジスフェリンの異常に係るジスフェリン異常症（LGMD2B又は三好型ミオパチー）；
【０１０９】
−  アノクタミン５の異常に関連するアノクタミノパチー（anoctaminopathies、LGMD2L、三好型三型ミオパチー（Miyoshi type 3 myopathy））；
【０１１０】
−  FKRP又はLGMD2Iに係る肢帯型ミオパチーであってFKRP（"Fukutin-Related Protein"、フクチン関連タンパク質）の異常に係るもの。
【０１１１】
より一般的には、対象となる疾患は以下の群より選ばれる：
【０１１２】
−  進行性の筋ジストロフィーは：
【０１１３】
○  ジスフェリン（DYSF）に係る
○  γ−サルコグリカンに係る
○  α−サルコグリカンに係る
○  β−サルコグリカンに係る
○  δ−サルコグリカンに係る
○  アノクタミン5（Ano5）に係る
○  フクチン関連タンパク質（FKRP）に係る
○  フクチン（FKTN）に係る
○  プロテイン-O-マンノシルトランスフェラーゼ1（POMT1）に係る
○  プロテイン-O-マンノシルトランスフェラーゼ2（POMT2）に係る
○  プロテイン-O-関連マンノースβ 1,2-アセチルグルコサミニル-転移酵素（POMGT1）に係る
○  カベオリン3（Cav3）に係る
○  UDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼ（GNE）に係る
【０１１４】
−  先天性筋ジストロフィー（CMD）は：
【０１１５】
○  α−ジストログリカン（DAG1）に係る
○  ラミニンアルファ-2（LAMA2）に係る
○  ライク−グリコシルトランスフェラーゼ（LARGE）に係る
○  コラーゲン6A1、6A2、又は6A3に係る
○  セレンプロテイン1（SEPN1）に係る
○  インテグリンアルファ7（ITGA7）に係る
○  リアノジン受容体（RYR）に係る
【０１１６】
−  骨格筋又は心筋に影響する、あるいは他の器官の機能障害に関連する他の疾患は：
【０１１７】
○  膜貫通型タンパク質43（TMEM43）に係る不整脈源性右心室心筋症（la cardiomyopathie ventriculaire droite arrhythmogenique）
○  polymerase I and transcript release factor（PTRF）に係る四型脂肪異栄養症筋ジストロフィー（la liposdystrophie congenitale de type 4 avec dystrophie musculaire）
○  ヘパラン硫酸（HSPG2）に係る軟骨形成異常型筋緊張症（la Chondrodystrophic myotonia）又はシュワルツ・ヤンペル（Schwartz Jampel）症候群
○  リソソーム膜タンパク質2（lysosomal-associated membrane protein 2, LAMP2）に係るダノン病
○  I型アクチビンA受容体（ACVR1）に係る進行性骨化性線維形成異常症（Fibrodysplasia ossificans progressiva）である。
【０１１８】
同じ疾患において、異なる変異が同じ遺伝子に影響することで、コードされたタンパク質の立体配置が悪化することがある。またサルコグリカン異常症を例として現在までに知られる主な点変異はWO2008/009802に列挙されている。
【０１１９】
本発明において実施可能な一例としてα−サルコグリカンのR77C変異に係るものを示す。サブユニットδのE262K変異又はサブユニットβのQ11E変異を有するタンパク質に対してもまた本発明に係る処置を好適に用いることができる。
【０１２０】
同様に、疾患の原因となる変異タンパク質はジストロフィンではなく、また治療対象疾患はデュシェンヌ筋ジストロフィー（DMD）又はベッカー筋ジストロフィー（BMD）ではないことが適切である。これらではジストロフィンが切り詰められており、本発明のようにミスフォールドされることで分解されるものではない。
【０１２１】
本発明に基づき他の方法又は他の使用がなされてもよい。
【０１２２】
他の態様において、本発明はエピゲノム修飾を行う化合物の効果を確認する又は評価する方法に関連する。かかる方法は以下の工程を含む：
【０１２３】
−  ミスフォールドされたタンパク質であって遺伝性筋疾患の原因となるものを産生する細胞を上記化合物と接触させ、
−  正常にフォールディングされたタンパク質の割合を測定する。細胞内で正常に局在していることに基づくのが好ましい。
【０１２４】
本発明はミスフォールディングが原因となってタンパク質が細胞により分解されるものに好適である。
【０１２５】
遺伝性筋疾患の原因となるミスフォールドされたタンパク質を細胞で産生するために、かかるタンパク質をコードする変異遺伝子を細胞に導入してもよい。
【０１２６】
遺伝性筋疾患の原因となる、ミスフォールドされたタンパク質は、サルコグリカン異常症の原因となるサルコグリカンでもよい。特にα−サルコグリカンが適しており、例えばR77C変異を有するα−サルコグリカンが適している。いかなる場合でも上述の方法において、かかるタンパク質を陽性対照として用いることができる。これは本願において、かかる変異タンパク質がエピゲノム修飾を行う化合物に対して良好に反応することが示されていることによる。
【０１２７】
細胞及び化合物は数分間あるいは数時間互いに接触させることが好ましい。
【０１２８】
タンパク質が正常にフォールディングされる割合は、評価を受けた化合物のエピゲノム修飾化合物として効率と相関する。かかる割合はタンパク質若しくはこれが属するタンパク質複合体を検出することで、あるいはその局在によって決定することが好ましい。タンパク質若しくはタンパク質複合体の検出は、かかるタンパク質に反応する抗体又はこれが属するタンパク質複合体中の一タンパク質に反応する抗体を用いて免疫組織化学的に行うことが好ましい。
【０１２９】
変形例として関心のあるタンパク質又は関心のある複合体中の一のタンパク質を標識してもよく、特に蛍光標識したのち顕微鏡又はソーティングによって検出してもよい。
かかる方法は免疫学的な検出法よりも検出工程の重要性が低いため好ましい。ただし融合タンパク質（関心のあるタンパク質＋標識）がタンパク質複合体の形成を妨げないことを確認することが重要である。
【０１３０】
タンパク質又はタンパク質複合体が検出された場合、あるいは最終的な細胞区画に局在した場合、評価を受けた化合物はエピゲノム修飾を行う化合物として有効な化合物であると結論される。
【０１３１】
好ましくは上記方法の実施と平行して：
−  タンパク質の局在の陽性対照として変異の無いタンパク質を発現する細胞でも実施し；
−  対照群として、評価を受ける化合物の非存在下で細胞を放置することで、評価を受けるタンパク質の正の効果によるものと結論される。
【０１３２】
他の態様において、本発明はその細胞内分解の原因となる一以上のタンパク質の高次構造の障害に関連する遺伝性筋疾患の治療のための化合物を特定する方法であり、化合物のエピゲノム修飾の可能性を評価することを含む。
【０１３３】
このため、本発明はその細胞内分解の原因となる一以上のタンパク質の高次構造の障害に関連する遺伝性筋疾患の治療のための化合物を特定する方法であり、以下の工程を含む：
【０１３４】
−  ミスフォールドされたタンパク質であって遺伝性筋疾患の原因となるものを産生する細胞を上記化合物と接触させ；
−  正常にフォールディングされたタンパク質の割合を測定する。
【０１３５】
他の態様において、本発明は一以上のタンパク質の高次構造の障害であって細胞内で自身が分解されるものに関連する遺伝性筋疾患を特定する方法に関し、以下の工程を含む：
【０１３６】
−  ミスフォールドされたタンパク質であって筋の遺伝性疾患の原因となるものを産生することができる細胞を、エピゲノム修飾を行う化合物に接触させる；
−  正常にフォールディングされたタンパク質の割合を測定する。
【０１３７】
かかる実施形態では細胞を評価するが、一以上のタンパク質の高次構造の障害であって細胞内で自身が分解されるものに関連する遺伝性筋疾患の影響を受け得る患者の筋細胞であることが好ましい。変形例として、患者の遺伝子であって一又は二以上の変異を有していると考えられるものを細胞内に導入してin vitroで試験を行う。
【０１３８】
もしも患者が影響を強く受けるのであれば高次構造の障害を有するタンパク質は分解されており検出されないことが予想される。このことは上述の通り特にかかるタンパク質に反応する抗体によって容易に評価することができる。
【０１３９】
エピゲノム修飾を行う化合物の存在下では正常にフォールディングされるタンパク質の割合が増加し、特に先の工程で実行する検出試験においてタンパク質が検出可能となることが予想される。
【０１４０】
もしも実際に、エピゲノム修飾を行う化合物の追加に応じて、正常にフォールディングされたタンパク質が増加するならば、事実上、評価を受けたタンパク質の高次構造の障害であって自身の細胞内分解の原因になるものに関連した遺伝性筋疾患であると結論される。
【０１４１】
より一般的には、他の態様において本発明は細胞によりタンパク質を生成する方法であり、組み換えタンパク質でもよく、積極的にエピゲノム修飾を行う化合物に係る細胞と接触させるものでもよい。
【実施例】
【０１４２】
本発明及びその作用効果を以下の実施形態及び添付した図面によって詳述する。ただし以下は発明を限定するものではない。
【０１４３】
α−サルコグリカンのR77C変異に係るα−サルコグリカン異常症並びに5-アザシチジン（又は5-アザ、DNAメチル化阻害物質）及びSAHA（“SuberoylAnilide Hydroxamic Acid”の頭文字の略、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害物質）を例にとって本発明を詳細に説明する。
【０１４４】
図１：4個の形質を移入したHER911ヒト細胞におけるα−サルコグリカンタンパク質（α-SG）の免疫組織化学的標識：
【０１４５】
Ａ／非変異α-SGによるもの
Ｂ／R77C変異を有するα-SGによるもの
Ｃ／R77C変異を有するα-SGによるものであって5-μMの5-aza存在下のもの。
【０１４６】
図２：4個の形質を移入したHER911ヒト細胞におけるα−サルコグリカンタンパク質（α-SG）の免疫組織化学的標識：
【０１４７】
Ａ／非変異α-SGによるもの
Ｂ／R77C変異を有するα-SGによるもの
Ｃ／R77C変異を有するα-SGによるものであって1-μMのSAHA存在下のもの。
【０１４８】
１／材料と方法
【０１４９】
１．１  細胞培養、形質移入、及び処理
【０１５０】
HER-911細胞（ヒト胚網膜芽細胞、“Human Embryonic Retinoblast”）はバイアルに播種し、コンフルエントな状態の80%になるまでダルベッコ改変イーグル＋グルタMAX（GlutaMAX；ギブコ、インビトロジェン）の培地で培養した。培地は10%のウシ胎仔血清、0.01 mg/mlのゲンタマイシン、及び1%のMEM非必須アミノ酸（MEM Non-Essential Amino Acids）を含むものとした。細胞を5%CO2、37℃の加湿雰囲気下で維持した。
【０１５１】
2μｇのプラスミド（HER-911細胞に対してサルコグリカン（SG）のコンストラクト4個を0.5μｇずつ）に対して12μｌのFuGENE 6トランスフェクション試薬（Roche）を用いてHER-91細胞に形質移入した。SGを発現するプラスミド、pcDNA3.V5-his_hα-SG、pcDNA3.V5-his_hβ-SG、pcDNA3.V5-his_hγ-SG、及びpcDNA3.V5-his_hδ1-SG (transcriptional type-1 variant)、は、CMVプロモーターに制御によって各サルコグリカンのコード配列が発現されるプラスミドとした。
【０１５２】
48時間経過後、細胞を5μＭの5-アザ-2’-デオキシシチジン又は1μＭのSAHA（ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド）で24時間処理した。
【０１５３】
１．２  免疫蛍光
HER-911細胞を3.7%ホルムアルデヒドで室温15分間にて固定した。必要な場合は0.2%トリトンX-100で20分間、易透化処理をした。20%のウシ胎仔血清で30分間飽和させた後、適切な濃度（PBS中）の一次抗体で1時間、室温にて細胞をインキュベートした。α-SG特異的なマウスモノクローナル抗体（NCL-A-SARC）はNovocastraより入手できる。細胞をPBSで3回洗浄し、PBSで1/1,000倍に薄めた二次抗体で1時間インキュベートした。最後に細胞をPBSで洗浄し、Vectashield Mounting Medium with DAPI（Vector, H-1200）を用いてマウントし、共焦点免疫蛍光顕微鏡（Leica）で観察した。
【０１５４】
２／結果
【０１５５】
HER 911ヒト細胞はβ−、γ−及びδ−サルコグリカンをコードするプラスミド及び非変異α−サルコグリカン（図１Ａ及び図２Ａ）又はR77C変異α−サルコグリカン（図１Ｂ及び１Ｃ；図２Ｂ及び２Ｃ）をコードするプラスミドによって4個の遺伝子が導入された。
【０１５６】
免疫標識は非易透化細胞に対してα−サルコグリカンの細胞外領域を標的とする抗体を用いて行った。かかる抗体はタンパク質の内、細胞膜レベルのものだけを可視化するので変異タンパク質の到達状態を通常のタンパク質と比較することができる。
【０１５７】
非変異型のα−サルコグリカンタンパク質（図１Ａ及び図２Ａ）とは逆に、このタンパク質の変異型であるR77CはHER 911細胞の膜に局在しなかった（図１Ｂ及び図２Ｂ）。細胞を5-アザシチジン（図１Ｃ）又はSAHA（図２Ｃ）で処理したものは、R77C変異タンパク質の膜への局在が回復した。
【０１５８】
このためサルコグリカンの複合体を再構成させることができるよう4個の形質を移入した細胞をモデルとして、複合体の膜への到達状態を分析することで、本発明の作用効果をin vitroで確認することができた。DNAメチル化阻害物質5-アザシチジン、又はヒストン脱アセチル化酵素阻害物質SAHAのようなエピゲノム修飾する薬剤によって、膜において複合体を再構成することができた。
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【図１】
0006324378.tif 000012
【図２】
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