(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ本のカラムを含むマルチカラムクロマトグラフィー（ＭＣＣ）プロセスにおける単一のカラムの最適な処理結合容量を決定する方法であって、
（ａ）標的生成物を第１の滞留時間及び／又は第１の流量で第１のカラムにロードするステップと、
（ｂ）前記標的生成物を第２の滞留時間及び／又は第２の流量で前記第１のカラムにロードするステップであって、前記第１の滞留時間及び／又は前記第１の流量が、前記第２の滞留時間及び／又は前記第２の流量と異なる、ステップと、
（ｃ）前記第１の滞留時間に基づく、前記第１のカラムでの前記標的生成物の破過を表す第１の破過曲線、及び／又は、前記第１の流量並びに前記第２の滞留時間及び／又は前記第２の流量に基づく、前記Ｎ本のカラムのうちのＮ番目のカラムでの前記標的生成物の破過を表す第２の破過曲線を生成するステップと、
（ｄ）前記破過曲線を利用して、前記ＭＣＣプロセスにおける最適な処理結合容量と等しい、前記Ｎ番目のカラムを前記標的生成物が破過するまでの前記第１のカラムでの前記標的生成物のロード容量を決定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記第２の滞留時間が前記第１の滞留時間の約２倍であり、及び／又は前記第２の流量が前記第１の流量の約半分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｂ’）前記標的生成物を第３の滞留時間及び／又は第３の流量で前記第１のカラムにロードするステップであって、前記第３の滞留時間及び／又は前記第３の流量が、前記第１及び前記第２の滞留時間並びに／又は前記第１及び前記第２の流量と異なる、ステップと、
（ｃ’）前記第３の滞留時間及び／又は前記第３の流量について、第３のカラムでの前記標的生成物の破過を表す第３の破過曲線を生成するステップと、
（ｄ）前記破過曲線を利用して、前記ＭＣＣプロセスにおける最適な処理結合容量と等しい、前記第３のカラムを前記標的生成物が破過するまでの前記第１のカラムでの前記標的生成物のロード容量を決定するステップと
をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第３の滞留時間が前記第１の滞留時間の約３倍であり、及び／又は前記第３の流量が前記第１の流量の約３分の１である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の破過曲線と前記第２の破過曲線は、時間に対する前記標的生成物の濃度の関数として前記標的生成物の破過を示したものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
マルチカラムクロマトグラフィー（ＭＣＣ）プロセスについて処理結合容量を最適化する方法であって、
（ａ）少なくとも、同じサイズの第１のカラム及び第２のカラムを直列に接続するステップと、
（ｂ）標的生成物を一定の流量で前記カラムにロードして前記カラムを通る所定の滞留時間を提供するステップと、
（ｃ）時間に対する前記標的生成物の濃度の関数として前記標的生成物の破過を表す、前記所定の滞留時間の破過曲線を生成するステップと、
（ｄ）前記破過曲線を利用して、前記ＭＣＣプロセスにおける最適な処理結合容量と等しい、前記第２のカラムを前記標的生成物が破過するまでの前記第１のカラムでの前記標的生成物のロード容量を決定するステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
[0001]カラムクロマトグラフィーによる分離には、典型的には入口及び出口を有し、試料流体中に存在する所望の分子（標的生成物）と結合する吸着剤を含むカラムが用いられ、それにより、流体がカラムを通過するとともに標的生成物が結合し、試料流体中の他の分子から分離される。
【０００２】
[0002]カラムクロマトグラフィーサイクルは、順次行われるいくつかの段階を含む。「ロード（ｌｏａｄ）」段階は、試料流体（供給液）を入口から通過させることによってカラムにロードし、それにより供給液を吸着剤に接触させて、いくらかの量の標的生成物を結合させるステップを含む。カラム中の吸着剤に結合する標的生成物の量は、カラムの結合容量と称される。結合しなかった標的生成物、及びその他の分子（夾雑物を含むことがある）は、流体とともに出口を通過する。クロマトグラフィーサイクルにおけるその他の段階は、たとえばカラムの洗浄、標的生成物の溶出、吸着剤の再生、及びカラムの平衡化を含む。
【０００３】
[0003]マルチカラムクロマトグラフィー（ＭＣＣ）は直列に接続された２本以上のクロマトグラフィーカラムへのロードを含み、供給試料は第１のクロマトグラフィーカラム（吸着剤を含む）の入口から第１のカラムの出口を通過し、第２のクロマトグラフィーカラム（吸着剤を含む）の入口に、そして第２のカラムの出口を通って流れ、何本のカラムを接続したかによってこれが繰り返される。これによって第１のカラムにオーバーロード（ｏｖｅｒ−ｌｏａｄ）することができ、第１のカラムを通過する標的生成物（本来なら廃液として失われたであろうもの）は、次のカラムによって捕捉される。ＭＣＣにおいては、１本のカラムにロードする間にもう１本のカラムにおいてサイクルの別の段階を実施することができる。第１のカラムがオーバーロードされ、標的生成物が第２のカラムへ通過する場合には、オーバーロードされた標的生成物が第２のカラムへ通過するので、これを「第２のパス」と称することができる。カラムの本数に応じて、オーバーロードされた標的生成物が第３のカラムへ通過する第３のパスなどがあり得る。クロマトグラフィーサイクルを完全にするため、それぞれのカラムは、たとえば「第２のパス」（前のカラムからのオーバーロード）、「ロード」（供給液がカラムに直接ロードされる）、洗浄、溶出、再生、及び平衡化の段階のそれぞれを経なければならない。
【０００４】
[0004]しかし、ＭＣＣは複雑であり、ＭＣＣのプロセス開発を改善するニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００５】
[0005]１つの実施形態においては、マルチカラムクロマトグラフィー（ＭＣＣ）プロセスの処理結合容量を最適化する方法であって、（ａ）標的生成物を第１の滞留時間及び／又は第１の流量でカラムにロードするステップと、（ｂ）上記標的生成物を第２の滞留時間及び／又は第２の流量で上記カラムにロードするステップであって、上記第１の滞留時間及び／又は第１の流量が上記第２の滞留時間及び／又は第２の流量と異なる、ステップと、（ｃ）上記第１の滞留時間及び／又は第１の流量並びに上記第２の滞留時間及び／又は第２の流量について破過曲線を生成するステップと、（ｄ）上記ＭＣＣプロセスについて最適な処理結合容量を決定するステップとを含む方法が提供される。典型的には、上記第２の滞留時間は上記第１の滞留時間の約２倍であり、及び／又は上記第２の流量は上記第１の流量の約半分である。
【０００６】
[0006]ある実施形態においては、上記方法は、（ｂ’）上記標的生成物を第３の滞留時間及び／又は第３の流量で上記カラムにロードするステップであって、上記第３の滞留時間及び／又は第３の流量が上記第１及び第２の滞留時間並びに／又は上記第１及び第２の流量と異なる、ステップと、（ｃ’）上記第１の滞留時間及び／又は第１の流量、上記第２の滞留時間及び／又は第２の流量、並びに上記第３の滞留時間及び／又は第３の流量について破過曲線を生成するステップと、（ｄ）上記ＭＣＣについて最適な処理結合容量を決定するステップとをさらに含む。典型的には、上記第３の滞留時間は上記第１の滞留時間の約３倍であり、及び／又は上記第３の流量は上記第１の流量の約３分の１である。
【０００７】
[0007]別の実施形態においては、マルチカラムクロマトグラフィー（ＭＣＣ）プロセスについて処理結合容量を最適化する方法は、（ａ）少なくとも２本の同じサイズのカラムを直列に接続するステップと、（ｂ）標的生成物を一定の流量で上記カラムにロードしてカラムを通る所定の滞留時間を提供するステップと、（ｃ）上記ＭＣＣプロセスについて最適な処理結合容量を決定するステップとを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】１Ａ、１Ｂ及び１Ｃは、単一のＭＣＣクロマトグラフィーサイクルの間の３本のカラムを通る流れ（「ロード」、「第２のパス」、及び「休止」）を図式的に示す図であり、「休止」は洗浄、溶出、再生、及び平衡化を意味する。
【図２】実施例１、３、６、及び７に記述したＵＶ検出によって生成した例示的な破過曲線を示す図である。
【図３】実施例２、４、５、及び８に記述した分別及び定量によって生成した例示的な破過曲線を示す図である。
【図４】４Ａは、それぞれＵＶ検出器に接続され、相互に接続された２本のカラムを例示的に示す図である。４Ｂは、それぞれの検出器によって生成された例示的な破過曲線を示す図である。これらの曲線は、最後のカラムにおいて生成物の破過が起こるまでに第１のカラムに結合した量を計算するために用いることができる。４Ｃは、滞留時間とカラムの本数との関係を例示的に図示する図である。
【図５】実施例１及び３〜７に記述した２本及び３本のカラムについて全滞留時間に対する処理結合容量を示す例示的な図である。
【図６】実施例１及び３〜７に記述した２本及び３本のカラムについて全滞留時間に対する理論的生産性を示す図である。
【図７】実施例２及び８に記述した２本及び３本のカラムについて全滞留時間に対する処理結合容量を示す例示的な図である。
【図８】実施例２及び８に記述した２本及び３本のカラムについて全滞留時間に対する理論的生産性を示す図である。
【図９】ＭＣＣプロセス戦略を選択するために有用な最適生産性を提供する予測モデルを示す図であり、プロセスモデル戦略は、単一カラムについて実施した１３回の飽和破過実験から生成した破過曲線に適用される。
【発明の詳細な説明】
【０００９】
[0017]本発明によって、ＭＣＣプロセスにおける最適な処理結合容量（ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）が決定される。即ち、本発明による方法の１つの実施形態においては、単一のカラムについて異なった滞留時間及び／又は異なった流量で２回以上（典型的には２〜１２回）のロード実験を行い、ＭＣＣプロセスにおける最適な処理結合容量を決定する。或いは、別の実施形態においては、同じサイズの２本以上のカラムを直列に設置し（「デイジーチェーン接続し」）、流量を一定に保って、最適な処理結合容量を決定するために所望の滞留時間を得ることができる。
【００１０】
[0018]本発明の実施形態によれば、カラムは常に標的生成物によって飽和までロードしなくてもよい。たとえば、カラムの出口において１０％又は２０％の破過が得られれば十分である。
【００１１】
[0019]本方法の実施形態は、破過のために溶出分画を分析するステップ、又は溶出ラインにおける標的生成物の存在を決定するために溶出ラインに付随した検出器を用いるステップを含み得る。
【００１２】
[0020]ＭＣＣプロセスにおいて、決定された最適な処理結合容量は、シリーズの中の最後のカラムの破過の直前において第１のカラムに結合した標的生成物の量を表すことが有利である。処理パラメーター（たとえばマルチカラムプロセスにおいて流量の範囲にわたってロードすべき生成物の最適量など）は、単一のカラムについて実施したいくつかの単純な実験を用いて決定することが好ましい。処理容量を正確に予測することによって、たとえば生産性、サイクルタイム、カラムの総本数、及び／又は緩衝液の使用などの多くの他のマルチカラムプロセスパラメーターの推定が可能になる。様々な流量を用いることによって、１つ又は複数の対象パラメーターを滞留時間の関数として最適化するために適合させ、内挿することができるデータポイントが得られる。
【００１３】
[0021]その他の利点として、たとえばＭＣＣプロセスが脆弱なタンパク質を迅速に処理するステップを含む場合、ユーザーは最速の処理時間を得るためにどの処理パラメーターが必要かを正確に特定できることが挙げられる。時間がさほど重要でなく、プロセスの重点が設備稼働率にある場合には、設備稼働率を最適化することができる。コストに関心がある場合には、コストを最小化するためにプロセス経済ソフトウェアを用いることができる。所望であれば、生物薬学的製造サイト内におけるマルチカラムクロマトグラフィープロセスに関するものは何でも最適化することができる。
【００１４】
[0022]１つの実施形態においては、マルチカラムクロマトグラフィー（ＭＣＣ）プロセスの処理結合容量を最適化する方法であって、（ａ）標的生成物を第１の滞留時間及び／又は第１の流量でカラムにロードするステップと、（ｂ）上記標的生成物を第２の滞留時間及び／又は第２の流量で上記カラムにロードするステップであって、上記第１の滞留時間及び／又は第１の流量が上記第２の滞留時間及び／又は第２の流量と異なる、ステップと、（ｃ）上記第１の滞留時間及び／又は第１の流量並びに上記第２の滞留時間及び／又は第２の流量について破過曲線を生成するステップと、（ｄ）上記ＭＣＣプロセスについて最適な処理結合容量を決定するステップとを含む方法が提供される。典型的には、上記第２の滞留時間は上記第１の滞留時間の約２倍であり、及び／又は上記第２の流量は上記第１の流量の約半分である。
【００１５】
[0023]ある実施形態においては、上記ＭＣＣプロセスはＮ本のカラムを含み、上記第１の滞留時間及び／又は第１の流量は単一のカラムについて決定され、上記第２の滞留時間及び／又は第２の流量はＮ本のカラムにわたる滞留時間及び／又は流量と等しい。
【００１６】
[0024]ある実施形態においては、上記方法は、（ｂ’）上記標的生成物を第３の滞留時間及び／又は第３の流量で上記カラムにロードするステップであって、上記第３の滞留時間及び／又は第３の流量が上記第１及び第２の滞留時間並びに／又は上記第１及び第２の流量と異なる、ステップと、（ｃ’）上記第１の滞留時間及び／又は第１の流量、上記第２の滞留時間及び／又は第２の流量、並びに上記第３の滞留時間及び／又は第３の流量について破過曲線を生成するステップと、（ｄ）上記ＭＣＣについて最適な処理結合容量を決定するステップとをさらに含む。典型的には、上記第３の滞留時間は上記第１の滞留時間の約３倍であり、及び／又は上記第３の流量は上記第１の流量の約３分の１である。
【００１７】
[0025]別の実施形態においては、マルチカラムクロマトグラフィー（ＭＣＣ）プロセスについて処理結合容量を最適化する方法は、（ａ）少なくとも２本の同じサイズのカラムを直列に接続するステップと、（ｂ）標的生成物を一定の流量で上記カラムにロードしてカラムを通る所定の滞留時間を提供するステップと、（ｃ）上記ＭＣＣプロセスについて最適な処理結合容量を決定するステップとを含む。
【００１８】
[0026]所望であれば例として２本カラムのシステムを用いて、プロセスの最初に、第１のロードステップのロード量を増大させることができる。ロード量は第１のカラムに結合した量（カラム「Ａ」中の量「Ｘ」）と第２のカラムに結合した量（カラム「Ｂ」中の量「Ｙ」）を表すＸ＋Ｙである。これにより直ちに定常状態でシステムを「強制的に」開始させ、いくつかのプロセスで見られる定常状態への遷移を避けることが有利である。
【００１９】
[0027]本発明を理解するための枠組みを提供するため、図１を参照して、ＭＣＣを定常状態で処理してそれぞれのカラムを同様に取り扱い、それぞれのサイクルを同一とすることが望ましい。これにより確実に、生産性及び製品品質を一定に保つことができる。図１において、Ｂカラムはロードゾーンから出て行き、カラムが休止段階に入る（そして引き続いて溶出される）とともに、カラムに結合した標的生成物の量はシステムから除去される。処理が定常状態にあるために、次のロードサイクルにおいて供給試料からの同量の標的生成物がシステムに返されなければならない。これにより、プロセスが処理される結合容量、即ち処理結合容量が同定される。処理容量（ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）は、吸着剤１リットルあたりに結合した標的生成物のグラム数と定義される。理想的な処理結合容量は、生成物の破過の直前までシリーズの中の第２のカラム（第２のパスを受ける）がロードされるときに生じる。理想的な処理結合容量においては、供給試料のロードを直接に受けるカラムの中に、できるだけ多くの標的生成物が生成物の損失なしに結合することになる。
【００２０】
[0028]単一のカラムを通る流れ及びロードゾーンにおけるその時間に続いて、初めにカラム（図１の１Ａ〜１ＣにおけるカラムＡ）がシリーズの中の第２のカラムとして開始する。したがって、カラムＡはシリーズの中の第１のカラム、即ちロードカラム（供給液を直接受ける）であるカラムＢからフロースルーを受ける。初めはロードカラムが全ての標的生成物と結合することになり、したがってカラムＡへのロード（第２のパス）は標的生成物を含まないことになる。ロードカラムがその動的結合容量に近づき、次いでそれを超えるとともに、標的生成物はロードカラムを通過して流れ始める。したがって第２のパスのカラムは初めに生成物をゼロ濃度で受け入れるが、暫くすると、より多くの標的生成物が第１のカラムを破過するとともにロード濃度が増大し始める。この状態が完了した後で第２のパスにあったカラムがロードカラムとなり、これがロードを直接受け入れる。このカラムにロードされる標的生成物の濃度は比較的高く、一定である。
【００２１】
[0029]望まれることは、標的生成物の損失なしにできるだけ多くの標的生成物をロードカラムに適用することである。したがって、第２のパスのカラム（又は、３本以上のカラムが直列に存在する場合には直列に接続された最後のカラム）から標的が破過するよりずっと前にロードを停止する。多重ステップロードであるので、即ちカラムは直接ロードされる前に第２のパスにあるので、ＭＣＣプロセスにおけるロード量の決定は複雑である。このため、どの処理結合容量でプロセスを実施すべきかを理解することは困難である。この困難さは滞留時間を考慮するとさらに複雑になる。滞留時間を増大させると容量が増大し、滞留時間を減少させると容量が減少し得る。しかし、滞留時間の増大はカラムへの流量を低下させることによって達成され、これにはロードステップの時間の増大が必要である。
【００２２】
[0030]生産性は容量／サイクルタイムであると理解され得るので、容量の増大をもたらす滞留時間の増大により、サイクルタイムも増大する。本発明者らは、これら２つの要因、即ち容量とサイクルタイムは、いずれも滞留時間によって影響されることを認識し、ＭＣＣプロセスを実施して最適な生産性で処理するための最適な滞留時間が存在することを認識した。本発明者らは、驚くべきことに、また予期しないことに、この多相ロードがカラムの容量又はカラムからの標的生成物の破過に影響しないことを見出した。即ち、本発明者らは、カラムが直列に接続されていれば（また（カラムの向流の動きを模擬するために切り替えられる弁が存在せずに）飽和まで直線的にロードされれば）、シリーズの中の最後のカラムの破過の直前で第１のカラムに結合した標的生成物の量は理想的な処理結合容量となることを理解した。プロセスは最適化され、標的生成物のロードが多いと標的生成物の損失が生じ、標的生成物のロードが少ないとカラムの利用率が最適に達しなくなる。
【００２３】
[0031]本発明により、以下の定義を用いる。
【００２４】
[0032]バッチクロマトグラフィー−飽和まで単一カラムについて実施される従来のクロマトグラフィープロセスであって、マルチカラム捕捉プロセスにおいて反復してロードされる（直列に接続された）カラムの結合プロファイルとほぼ同一の結合プロファイルをそのカラム内において生成する、プロセス。
【００２５】
[0033]結合容量又は容量−吸着剤１ｍｌあたり結合される標的又は生成物のｍｇ数。
【００２６】
[0034]破過曲線−カラムをその入口で流体によってロードする際のカラムの出口における生成物の濃度のプロット（時間、ロードした量、又はロードした体積に対してプロットすることができる）。
【００２７】
[0035]破過実験−出口で生成物が破過することを確実にするため、カラムに生成物をオーバーロードし、それにより破過曲線のプロットが得られる実験（カラムは典型的にはその動的結合容量の１００％までロードされる）。
【００２８】
[0036]捕捉効率−吸着剤に結合する、カラムの入口にロードされた生成物のパーセント。
【００２９】
[0037]カラム飽和−カラムがその動的結合容量の１００％に近く、入口にさらに生成物をロードしても容量が増大しない点。
【００３０】
[0038]サイクルタイム−１本のカラムがクロマトグラフィー単位処理の完全な一組（ロード、洗浄、溶出、再生、及び平衡化）を完了するために必要な時間。
【００３１】
[0039]動的結合容量−移動相の生成物が固定相を通って流れる条件下で吸着剤１ｍｌあたりに結合する生成物のｍｇ数。
【００３２】
[0040]フロースルー−供給材料によるロードを受けたカラムの出口から出た生成物の総量。
【００３３】
[0041]ロード滞留時間−（生成物を含む）供給材料がカラムにロードされる滞留時間状態。
【００３４】
[0042]ロード時間−マルチカラムクロマトグラフィープロセスのロード相において第１のカラムをロードするために必要な時間。
【００３５】
[0043]ロードゾーン−（直列に接続された）２本以上のカラムが直接又は間接に供給材料を受け入れるマルチカラムクロマトグラフィープロセスのロード相。
【００３６】
[0044]カラムの本数−マルチカラムクロマトグラフィープロセスを処理するために必要な（所与の吸着剤体積で満たされた）全カラム。
【００３７】
[0045]処理結合容量−ロードされる生成物の量をカラム体積で除したもの。
【００３８】
[0046]生産性−１時間あたり、吸着剤１ｌあたりの処理された生成物のｇ数（処理結合容量／サイクルタイム）。
【００３９】
[0047]滞留時間−移動相中の非相互作用粒子が固定相の容積内を通過するために必要な時間（吸着剤容積／流量）。
【００４０】
[0048]休止又は休止プロセス−生成物を吸着剤にロードするステップを含まないクロマトグラフィーサイクル内の全てのステップ（洗浄、溶出、再生、平衡化）。
【００４１】
[0049]休止滞留時間−休止プロセスにおける滞留時間状態。
【００４２】
[0050]吸着剤／樹脂−クロマトグラフィープロセス中で移動相から生成物を捕捉するために必要な所望の化学反応性を有するリガンドで被覆された多孔性ポリマー小粒子からなる材料。
【００４３】
[0051]静的結合容量−非流動条件下で固定相が結合できる生成物の量。
【００４４】
[0052]開始時結合容量−定常状態でマルチカラムプロセスを開始するためにロードが必要な生成物の量。
【００４５】
[0053]定常状態−サイクルごとに容量、純度、及び生産性が一定であるマルチカラムプロセス内の非変動状態。
【００４６】
[0054]１０％ＤＢＣの８０％−カラムの出口において供給濃度の１０％を達成するために必要な体積の８０％（典型的にはカラムの出口において生成物が測定できない動的結合容量０％の推定値として用いられる）。
【００４７】
[0055]先に概要を述べた本発明を理解するための枠組みに加えて、２本のカラムを用いたＭＣＣプロセスにおいて、シリーズの中の第２の（最後の）カラムから生成物が破過する前に第１のカラムに結合した量の測定は、それぞれのカラムの末端に生成物の検知器を設け、直列に接続した２本のカラムを用いて行うことができる。これにより、２本のカラムの間に設置した検出器を用いて、第１のカラムにおける生成物の破過を追跡することが可能になる。生成物の破過はフロースルーにおける時間（又はロードした生成物のロード量）に対する生成物の濃度のグラフとして表すことができる。破過曲線と呼ばれるこのようなグラフにより、標的全体が結合し、したがって検出器における濃度がゼロである初期相が通常は見られる。生成物が破過してグラフがプロットされれば、形状はＳ字状に近づくことが多い。破過曲線の上のグラフの領域はカラムに結合した材料の量を表す。曲線の下の領域はカラムを通過した材料の量を表す。この単一の破過は単一のカラム処理においてロードを止める最適時間、即ち生成物の破過の直前を示す。
【００４８】
[0056]しかし、マルチカラム処理においては、シリーズの中の第１のカラムは生成物がシリーズの中の最後のカラムを破過し始めるまでロードされる。したがって、検出器は、生成物が破過する時点（又はロードされた生成物の体積又は量）を同定するため、シリーズの中の最後のカラムの後に必要である。この情報は、時間に対する標的濃度のチャートにおける時間（ひいてはロードされた量）を制限することによって第１のカラムの破過の面積を制限するために用いられる。これにより、第２のカラムの破過の前に第１のカラムに結合した標的の量である処理容量を決定することができる。
【００４９】
[0057]或いは、（ｉ）ロードカラムの破過曲線は、その後ろに検出器を備えた単一のカラムを用いて測定することができ、また（ｉｉ）その他の破過曲線は、２本以上のカラムを直列に接続してカラムの最後に単一の検出器を備えることによって決定することができる。
【００５０】
[0058]予期しないことに、生成物の破過曲線の形状はカラムにロードする際に適用される滞留時間にほぼ完全に依存するという認識に基づいて、破過曲線を生成する別の選択が見出される。この驚くべき結果により、それぞれのカラムの後にそれぞれ検出器を備えた２本のカラムを用いるよりむしろ、単一のカラム及びその後の単一の検出器のみを用いて２つの破過曲線を生成することが可能になる。ＭＭＣの状況を模倣するため、選択された滞留時間において１つの破過曲線が実施され、直列の２本のカラムを模倣するため、選択された滞留時間の２倍でもう１つの破過曲線が実施される。選択された滞留時間における破過曲線はシリーズの中の第１のカラムになるものに結合した量を計算するために用いられ、破過曲線の上の面積はカラムに結合した量を表す。滞留時間の２倍における破過は、シリーズの中の第２のカラムを表し、フロースルーに対する生成物の損失を被ることなしにどれだけの量の生成物をＭＣＣにロードすることができるかの情報を得るために必要である。この破過情報は、どれだけの量の生成物をロードできるかの制限を決定し、初期の破過曲線に対するロード時間又は量の制限を計算するために用いられる。これら２つの破過曲線を用いて、第２のカラムの破過の前に第１のカラムに結合する量、即ち処理結合容量を決定することが可能である。このことは直列の３本以上のカラムに拡張することができる。実例として、直列の３本のカラムについては、選択された滞留時間の３倍において第２の破過曲線が実施される、などである。
【００５１】
[0059]この枠組みを念頭に置いて、ＭＣＣプロセスの生産性の最適化を記述することができる。上の枠組みは単一の滞留時間における処理結合容量を決定するステップを説明している。しかし、ＭＣＣプロセスをより良く最適化するには、一連の滞留時間を検討すべきである。これは、滞留時間が長ければカラム容量が大きくなるからである。しかし、滞留時間が長ければロードの流量が低下し、サイクルタイムが長くなるという問題がある。生産性は容量をサイクルタイムで割ったものに等しいので、滞留時間は分子（容量）及び分母（サイクルタイム）を変化させる。さらに、より多くのカラムをロードゾーンに追加することの利点があるか否かを決定することが有利である。多くのカラムを追加することは容量の増大にも繋げることができる。それは、フロースルー中の生成物を捕捉する追加のカラムがシリーズの中に存在するので、シリーズの中の第１のカラムをより長くロードできるからである。しかし、より多くのカラムをロードゾーンに追加することはサイクルタイムの増大をもたらす。したがって、生産性の最大値を決定する（ＭＣＣプロセスを最適化する）ために、滞留時間並びにロードゾーン中のカラムの本数を評価する必要がある。
【００５２】
[0060]本発明による方法の好ましい実施形態によれば、少なくとも２つ、好ましくは３つ以上の滞留時間について容量を測定する。これにより、容量と滞留時間の関係のモデルを作成することができる。
【００５３】
[0061]直列の２本対３本（又はそれ以上）のカラムの利点を理解するため、これらのシナリオのモデルとなる破過曲線を提供することができる。
【００５４】
[0062]たとえば、単一のカラムに着目し、滞留時間を０．５分、１分、及び１．５分として破過曲線を実施することができる。カラムに結合した量は破過曲線の上の面積によって表される。しかし、ロード量を制限するために、（ＭＣＣプロセスにおける）最後のカラムの生成物破過を表す第２の破過曲線が必要であり、さもなければ、単一カラム破過量をＭＣＣプロセスに移す際に生成物が損失することになる。
【００５５】
[0063]生成物が破過する点を決定するため、直列の２本のカラムに対応する破過曲線を、選択された滞留時間（上の例では０．５分、１分、及び１．５分）の２倍で実施し、滞留時間１分、２分、及び３分における破過曲線を得る。対応する直列の３本のカラムのモデルとするため、滞留時間の３倍（１．５分（３×０．５分）、３分（３×１分）及び４．５分（３×１．５分））などで破過曲線を実施する。
【００５６】
[0064]滞留時間に重複又は冗長（本節において下線で強調している）があり得るので、滞留時間（０．５分（１×）、１分（２×）及び１．５分（３×））を選択することによって、実験空間をモデル化するために必要な破過曲線の全数を６個に限定することができる。上記の例に加え、ＭＣＣプロセスにおいて生成物がどのように第１のカラムに結合するかを決定するため、０．５分、１分、及び１．５分において破過曲線を生成することができる。即ち、曲線の上の面積はカラムに結合した量に等しい。しかし、生成物が最後のカラムを破過しないようにロードを停止する点を決定するために、追加の破過曲線が必要である。カラム２本のロードにおいては、このことは１分（２×０．５）、２分（２×１）及び３分（２×１．５）において破過曲線の追加の組を生成することを意味する。カラム３本のロードにおいては、１．５分（３×０．５）、３分（３×１）及び４．５分（３×１．５）の滞留時間における破過曲線のもう１つの組が必要である。１分、１．５分、及び３分の滞留時間における破過曲線は繰り返しになるので、実験は１回行えば良いが、結果は２つ以上のシナリオに適用することができる。結果として、６個の単一カラム破過曲線のみが必要である。
【００５７】
[0065]それぞれの破過実験について、カラムが飽和点に達するまでカラムにロードする。プロセスサイクルの休止（たとえば洗浄、溶出、再生、及び平衡化など）は、技術者によって特定された条件を用いてカラムについて実施する。
【００５８】
[0066]標的の破過を検出するための特定の検出器が存在しない場合には、ロードステップ中にカラムを出る溶出液を分別する。典型的には、約２５〜５０個の分画から、良好な破過曲線を表すために十分大きな試料の組が得られる。分画中の標的の濃度は、その応用に適した分析手技を用いて定量する。
【００５９】
[0067]このデータから、滞留時間に対する処理結合容量の依存性を観察することができる。一連の標準的な式：
１．ロード時間＝処理結合容量と滞留時間の積をタイターで割ったもの。
２．サイクルタイム＝ロード時間と休止時間の和。
３．生産性＝処理結合容量をサイクルタイムで割ったもの。
を用いることによって、最適な滞留時間及び生産性を決定することができる。
【００６０】
[0068]直列に接続され、供給液を受け入れるＮ本のカラムを用いたマルチカラムプロセスについてロード容量を決定するため、所与の滞留時間及びその滞留時間のＮ倍を用いて得られる１対の破過曲線を用いる。１対の曲線を、時間をｘ軸、濃度をｙ軸として一緒にプロットする。滞留時間を長くした破過曲線により、時間に対してＮ本のカラムを用いたプロセスにおける最後のカラムの出口における生成物の破過の進行が推測される。この曲線は、生成物がカラムの出口をまさに破過する時点Ｔを選択するために用いる。
【００６１】
[0069]曲線は、（ｉ）生成物の濃度が供給試料中の生成物の濃度の１０％に達する時間Ｔ１０％を決定するため、及び（ｉｉ）Ｔ１０％の８０％であるＴを計算するために、用いることができる。或いは、曲線は（ｉ）生成物の濃度が供給試料中の生成物の濃度の５％に達する時間Ｔ５％を決定するため、及び（ｉｉ）Ｔ１０％の７５％であるＴを計算するために、用いることができる。Ｔは、その対からの第２の破過（短い方の滞留時間におけるもの）における積分の上限として用いる。この破過曲線はゼロから予め定義した上限Ｔまで積分され、フロースルー中に存在する生成物の量を表す。ロード容量は｛［（ロードした生成物の質量）−（フロースルー中の生成物の質量）］／（カラムの体積）｝に等しい。ロードした生成物の質量の計算は｛（供給液の濃度）×（ロードした体積−空隙体積）｝によって与えられる。
【００６２】
[0070]この手順は２本のカラムのロードに付随する破過曲線の全ての対に、したがって所与の３種の滞留時間に付随する３種のロード容量に適用することができる。容量を滞留時間に対してプロットし、適合した点の間に容量値を内挿するための２次多項式を用いて適合させることができる。これらのステップを繰り返すことによって、３本のカラムのロードについて同一の曲線を生成し、容量対滞留時間の２つのプロットを得ることができる。内挿した容量はロード時間を計算するために用いられ、これは｛（容量×滞留時間）／（供給タイター）｝に等しい。
【００６３】
[0071]ロード時間はサイクルタイムを計算するために用いられ、これは｛（ロード時間）＋（洗浄／溶出／再生／平衡化ステップを実施するための時間）｝に等しい。サイクルタイムは内挿した容量の範囲について計算する。
【００６４】
[0072]それぞれの滞留時間に付随する生産性は｛（容量）／（サイクルタイム）｝に等しく、内挿した容量の範囲について計算され、滞留時間に対する理論的生産性のプロットが得られる。
【００６５】
[0073]プロセスを実行するために必要なカラムの全本数は、ロードされているカラムの本数と、ロードが連続的かつ中断されないためにサイクルの休止（洗浄、溶出、再生）に必要なカラムの本数との合計である。これは｛（サイクルタイム）／（ロード時間）｝に等しく、必要なカラムの全本数についての非離散的な値の組がこれから得られる。
【００６６】
[0074]計算したカラムの全本数を１桁の離散値にするため、カラムの全本数についての計算値を切り上げて、これらを生産性の式｛（生産性）×（カラムの全本数）／［切り上げ値（カラムの全本数）］｝に分解することにより、サイクルタイムにアイドルタイムを加算する。これにより、理論的な生産性の計算が実際の生産性に変換される。
【００６７】
[0075]このように、一連の滞留時間における処理結合容量を測定することによって、ＭＣＣを処理するための最適な生産性を、その生産性において処理するための種々のパラメーターとともに計算することができる。重要なパラメーターとしては、たとえば処理結合容量、滞留時間、ロードゾーンにおけるカラムの本数、及びサイクルタイムが挙げられる。この手法は異なった生成物タイターにも応用することができる。生産性の頑強さを決定できることが有利である。或いは、又は追加的に、上流のプロセスを改善してより高いタイターを生成させる利点も確認することができる。
【００６８】
[0076]種々の吸着剤（たとえばビーズ）を含む幅広い種類のクロマトグラフィーカラムが本発明における使用に適しており、当技術で公知である。
【００６９】
[0077]いくつかの実施形態においては、クロマトグラフィーカラムは組み立て済みのカラムであり、たとえば（１つ又は複数の）吸着剤は装置のメーカーによってハウジング内にシールされている。他のいくつかの実施形態においては、（１つ又は複数の）吸着剤はエンドユーザーによってハウジング内にシールされる。装置は種々の流体を処理するため、たとえば流体中に存在する１つ又は複数の所望の材料を精製し、及び／又は濃縮するために好適であり得る。たとえば、装置は生体薬学工業において用いられる流体、たとえばタンパク質材料、たとえば抗体（たとえばモノクローナル抗体）、又は成長因子などの組み換えタンパク質などの所望の材料を含む流体などのプロセス流体を処理するために好適であり得る。
【００７０】
[0078]（１つ又は複数の）吸着剤は所望の任意の特徴、たとえばクロマトグラフィータイプを有してよく、市販のビーズを含む種々のビーズを本発明において用いることができ、これらは当技術で公知である。たとえば、種々のイオン交換ビーズを用いることができる。いくつかの実施形態においては、吸着剤は生理学的ｐＨ及び／又はイオン強度で機能することができる。好適な吸着剤（たとえば樹脂）としては、荷電（たとえば正荷電、又は負荷電）媒体、混合モードクロマトグラフィー媒体、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体、アフィニティクロマトグラフィー媒体（たとえば固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ））媒体、生物特異的（たとえば固定化プロテインＡ）アフィニティクロマトグラフィー媒体、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）媒体、及び硫黄親和性クロマトグラフィー（ＴＣ）媒体が挙げられる。
【実施例】
【００７１】
[0079]以下の実施例により本発明をさらに説明するが、もちろん、決して本発明の範囲を限定するものと解釈するべきではない。
【００７２】
[0080]以下の実施例のそれぞれにおいて、最短の滞留時間は、吸着剤の物理的限界に基づいて選択する。最長の滞留時間は、滞留時間が１．５分を超えても生産性に顕著な利点は得られないとの仮定に基づいて選択する。
【００７３】
[0081]実施例１〜９において、（３つの）処理容量の組を全滞留時間に対してプロットし、適合した点の間にＯＢＣ値を内挿するための２次多項式を用いて適合させる。ＯＢＣ値はＡ−Ｂｅ−Ｃ（ｔ）の形式の指数関数などの種々の式を用いて適合させることができる。この式により最も正確な適合が得られるが、適切に実施するにはより大きな実験努力が必要になることがある。
【００７４】
[0082]或いは、ユーザーは２次多項式を用いた内挿によってＯＢＣ値を近似するよりも、より多くの破過実験を行って全滞留時間の範囲にわたって真のＯＢＣを見出すことができる。
【００７５】
[0083]プロセスのシナリオは、（滞留時間の範囲にわたる）計算したマルチカラムプロセスの組から、生産性に基づいて選択する。或いは、本方法の実施形態を用いてモデル化されるそれぞれのシナリオを、特化された任意のソフトウェアに入力して、製品のプロセスコストを推定し、コスト削減を最適化することもできる。
【００７６】
[0084]実施例１〜４及び９は単一カラムを用い、実施例５〜８は多重デイジーチェーン接続カラムを用いている。
【００７７】
実施例１
[0085]本実施例においては、１本のカラム（マブセレクトシュアプレパックトハイトラップ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ｐｒｅ−ｐａｃｋｅｄ  Ｈｉ−Ｔｒａｐ）カラム（０．９６２ｍＬ））を用い、精製したＩｇＧ２モノクローナル抗体（濃度２ｍｇ／ｍＬ）及び１個のインラインＵＶ検出器を用いて、本発明の実施形態に従ってＯＢＣを決定するステップを説明する。
【００７８】
[0086]（１）単一のカラムについてロード滞留時間を０．５分、１分、及び１．５分として３回の破過実験を行う。（２）滞留時間を２分、３分、及び４．５分として３回の追加の実験を行う。
【００７９】
[0087]典型的には、ロードゾーンにおける２本及び３本のカラムのモデル化において、全部で９回の実験について（１）で特定した滞留時間の２倍及び３倍で、バッチ破過実験も行う。しかし、選択した滞留時間の中で重複又は冗長があるので（表は以下の重複時間を示す）、（２）で行った実験に加えて３回の破過実験のみを行う。
【表１】
0006349571.tif 000002
【００８０】
[0088]ロードゾーンにおけるＮ本のカラムをモデル化するため、（１）で特定した滞留時間のＮ倍でバッチ破過実験を行う。
【００８１】
[0089]以下の表に概略を示すように、それぞれのロードステップの間で、カラムを洗浄、溶出、再生、及び平衡化（まとめて「休止」プロセスと称する）に供する。
【表２】
0006349571.tif 000003
【００８２】
[0090]それぞれのバッチ破過実験におけるロードステップについて、飽和（即ちカラムから出てくる生成物の濃度がカラムに入る生成物の濃度に等しい状態）に達するまでカラムをロードする。
【００８３】
[0091]インラインＵＶ検出器を用いて、カラムの出口における濃度を測定する。時間に対する生成物の破過をソフトウェアによって記録し、処理結合容量を計算するためにエクスポートする。例示的な曲線を図２に示す。
【００８４】
[0092]ロードゾーンに２本のカラムを有するプロセスについて生成物の破過を理解するために、滞留時間によって破過曲線を組にする。たとえば、選択された０．５分の滞留時間に対応する破過曲線を、１分の滞留時間に対応する破過曲線と組にする。滞留時間の２倍において、ロードゾーンに２本のカラムを有するマルチカラムプロセスにおいて生成物がどのように時間とともに破過するかを模倣することができる。（１）に列挙した選択した滞留時間の全てについてこれを行う。
【００８５】
[0093]ロードゾーンに３本のカラムを有するプロセスを模倣するために、滞留時間によって破過曲線を組にする。たとえば、選択された０．５分の滞留時間に対応する破過曲線を、１．５分の滞留時間に対応する破過曲線と組にする。滞留時間の３倍において、ロードゾーンに３本のカラムを有するマルチカラムプロセスにおいて生成物がどのように時間とともに破過するかを模倣することができる。
【００８６】
[0094]ロードゾーンにＮ本のカラムを有するマルチカラムプロセスについての理想的な処理結合容量は、Ｎ番目のカラムの出口において破過が起こる直前に第１のカラムに結合した量である。前の２つのパラグラフにおいて、（図４の４Ａ及び４Ｂに示すように）滞留時間を用いて、通常２本のカラムをデイジーチェーン接続し、２つのＵＶ検出器を用いて生成物の破過を追跡することによって生成される破過曲線を模倣する。単一カラムについて滞留時間を変動させることによって、（図４の４Ｃに示すように）マルチカラムにわたる生成物の破過を模倣することができる。
【００８７】
[0095]上で同定した組からのより長い滞留時間に対応するそれぞれの破過曲線を用いて、生成物が破過し始める時間、ｔＤＢＣを決定する。
【００８８】
[0096]生成物の破過の１０％を生じるために必要な生成物の質量の８０％がロードされた時点を同定することによってｔＤＢＣを計算する。
【００８９】
[0097]ｔＤＢＣは、それぞれの組からの第２の破過（短い方の滞留時間に対応する）における積分の上限として用いられる。この破過曲線をゼロから予め定義した上限ｆＲ×ｔＤＢＣまで積分し、式１に示されるフロースルー中に存在する生成物の量を決定する。ここでｍＦＴはフロースルー中の生成物の量であり、Ｃｏｕｔは上で同定した組からの短い方の滞留時間に対応する破過曲線を表す。
式１
【数１】
0006349571.tif 000004
【００９０】
[0098]ロードされた生成物の量ｍＬを、式２に示す公式を適用することによって計算する。ここでＣ０は供給物濃度、ｖＬはロードした体積、ｖ０はカラム内の空隙体積である。
式２：ｍＬ＝Ｃ０×（ｖＬ−ｖ０）
【００９１】
[0099]理想的な処理結合容量（ＯＢＣ）を、式３の公式を適用することによって計算した。
式３：ＯＢＣ＝（ｍＬ−ｍＦＴ）／ｖＣｏｌ
【００９２】
[00100]上述のプロセスを破過曲線の全ての組に適用して、ロードゾーンに２本のカラムを有するプロセスに対応する３つの処理結合容量及びロードゾーンに３本のカラムを有するプロセスに対応する３つの処理結合容量を生成する。
【００９３】
[00101]（３つの）処理容量のそれぞれの組を全滞留時間に対してプロットし、適合した点の間にＯＢＣ値を内挿するための２次多項式を用いて適合させる。ＯＢＣ値はＡ−Ｂｅ−Ｃ（ｔ）の形式の指数関数などの種々の式を用いて適合させることができる。この式により最も正確な適合が得られるが、適切に実施するにはより大きな実験努力が必要になることがある。全滞留時間に対する処理結合容量の例を図５に示す。
【００９４】
[00102]内挿した処理結合容量を用いて、式４の公式を適用することにより、全滞留時間の範囲にわたってロード時間を計算する。ここでＲＴは１本のカラムにわたる滞留時間（全滞留時間ではない）、Ｃ０は供給濃度である。
式４：ｔＬ＝ＯＢＣ×ＲＴ／Ｃ０
【００９５】
[00103]ロード時間を用いて、全滞留時間の範囲にわたってサイクルタイムを計算する。式５（下記）に示す計算をそれぞれの滞留時間に適用する。ここでｔＣはサイクルタイム、ｔＬはロード時間、ＮＬはロードゾーンにおけるカラムの本数、ｔＲは休止時間、即ち洗浄、溶出、及び再生を行う時間である。
式５：ｔＣ＝ｔＬ×ＮＬ＋ｔＲ
【００９６】
[00104]それぞれの滞留時間に付随する生産性を、式６（下記）を用いて計算する。ここでＰは生産性である。
式６：Ｐ＝ＯＢＣ／ｔＣ
【００９７】
[00105]全滞留時間に対する理論的生産性のプロットを図６に示す。
【００９８】
[00106]プロセスを実行するために必要なカラムの全本数は、ロードされるカラムの本数と、ロードが連続的かつ中断されないために休止（洗浄／溶出／再生）において必要なカラムの本数との合計である。これは式７（下記）を用いて計算する。ここでＮＣはカラムの全本数である。
式７：ＮＣ＝切り上げ値（ｔＣ／ｔＬ）
【００９９】
[00107]サイクルタイムはカラムの本数で割り切れなければならない。割り切れない場合には、サイクルタイムにアイドルタイムを加算する。サイクルタイムが増大すると生産性が低下する。実際の生産性は式８（下記）を用いて計算する。
式８：Ｐａｃｔｕａｌ＝ＯＢＣ／（ＮＣ×ｔＬ）
【０１００】
[00108]プロセスのシナリオは、（（１）に列挙した滞留時間の範囲にわたる）計算したマルチカラムプロセスの組から、生産性に基づいて選択する。或いは、本方法のこの実施形態を用いてモデル化されるそれぞれのシナリオを、特化された任意のソフトウェアに入力して、製品のプロセスコストを推定し、コスト削減を最適化することもできる。
【０１０１】
実施例２
[00109]本実施例においては、１本のカラム（マブセレクトシュアプレパックトハイトラップカラム（０．９６２ｍＬ））を用い、精製したモノクローナルＩｇＧ２抗体（ＣＨＯフィードストック中濃度約２．２ｍｇ／ｍＬ）及び市販のバイオセンサーを用いる分画の定量によって、本発明の実施形態に従ってＯＢＣを決定するステップを説明する。
【０１０２】
[00110]（１）単一のカラムについてロード滞留時間を０．５分、１分、及び１．５分として３回の破過実験を行う。（２）滞留時間を２分、３分、及び４．５分として３回の追加の実験を行う。
【０１０３】
[00111]典型的には、ロードゾーンにおける２本及び３本のカラムのモデル化において、全部で９回の実験について（１）で特定した滞留時間の２倍及び３倍で、バッチ破過実験も行う。しかし、選択した滞留時間の中で重複又は冗長があるので（表は以下の重複時間を示す）、（２）で行った実験に加えて３回の破過実験のみを行う。
【表３】
0006349571.tif 000005
【０１０４】
[00112]ロードゾーンにおけるＮ本のカラムをモデル化するため、（１）で特定した滞留時間のＮ倍でバッチ破過実験を行う。
【０１０５】
[00113]以下の表に概略を示すように、それぞれのロードステップの間で、カラムを洗浄、溶出、再生、及び平衡化（まとめて「休止」プロセスと称する）に供する。
【表４】
0006349571.tif 000006
【０１０６】
[00114]それぞれのバッチ破過実験におけるロードステップについて、飽和（即ちカラムから出てくる生成物の濃度がカラムに入る生成物の濃度に等しい状態）、又は吸着剤１ｍＬあたり約１２０ｍｇに達するまで、カラムをロードする。
【０１０７】
[00115]カラムの出口における濃度を、ＡＫＴＡ（商標）アヴァント（Ａｖａｎｔ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて６０個の１ｍＬ分画に分別する。希釈剤（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ＬＬＣ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）を用いてそれぞれの分画を１０倍希釈し、プロテインＡバイオセンサー（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ＬＬＣ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）を用いて濃度を定量する。処理結合容量を計算するため、時間に対して濃度値をプロットする。例示的なエクスポートされた破過曲線を図３に示す。
【０１０８】
[00116]ロードゾーンに２本のカラムを有するプロセスについて生成物の破過を理解するために、滞留時間によって破過曲線を組にする。たとえば、選択された０．５分の滞留時間に対応する破過曲線を、１分の滞留時間に対応する破過曲線と組にする。滞留時間の２倍において、ロードゾーンに２本のカラムを有するマルチカラムプロセスにおいて生成物がどのように時間とともに破過するかを模倣することができる。（１）に列挙した選択した滞留時間の全てについてこれを行う。
【０１０９】
[00117]ロードゾーンに３本のカラムを有するプロセスを模倣するために、滞留時間によって破過曲線を組にする。たとえば、選択された０．５分の滞留時間に対応する破過曲線を、１．５分の滞留時間に対応する破過曲線と組にする。滞留時間の３倍において、ロードゾーンに３本のカラムを有するマルチカラムプロセスにおいて生成物がどのように時間とともに破過するかを模倣することができる。
【０１１０】
[00118]ロードゾーンにＮ本のカラムを有するマルチカラムプロセスについての理想的な処理結合容量は、Ｎ番目のカラムの出口において破過が起こる直前に第１のカラムに結合した量である。前の２つのパラグラフにおいて、図４の４Ａ及び４Ｂに示すように、滞留時間を用いて、通常２本のカラムをデイジーチェーン接続し、２つのＵＶ検出器を用いて生成物の破過を追跡することによって生成される破過曲線を模倣する。単一カラムについて滞留時間を変動させることによって、図４の４Ｃに示すように、マルチカラムにわたる生成物の破過を模倣することができる。
【０１１１】
[00119]上で同定した組からのより長い滞留時間に対応するそれぞれの破過曲線を用いて、生成物が破過し始める時間、ｔＤＢＣを決定する。
【０１１２】
[00120]生成物の破過の１０％を生じるために必要な生成物の質量の８０％がロードされた時点を同定することによってｔＤＢＣを計算する。
【０１１３】
[00121]ｔＤＢＣは、それぞれの組からの第２の破過（短い方の滞留時間に対応する）における積分の上限として用いられる。この破過曲線をゼロから予め定義した上限ｆＲ×ｔＤＢＣまで積分し、式１に示されるフロースルー中に存在する生成物の量を決定する。ここでｍＦＴはフロースルー中の生成物の量であり、Ｃｏｕｔは上で同定した組からの短い方の滞留時間に対応する破過曲線を表す。
式１
【数２】
0006349571.tif 000007
【０１１４】
[00122]ロードされた生成物の量ｍＬを、式２に示す公式を適用することによって計算する。ここでＣ０は供給物濃度、ｖＬはロードした体積、ｖ０はカラム内の空隙体積である。
式２：ｍＬ＝Ｃ０×（ｖＬ−ｖ０）
【０１１５】
[00123]理想的な処理結合容量（ＯＢＣ）を、式３の公式を適用することによって計算した。
式３：ＯＢＣ＝（ｍＬ−ｍＦＴ）／ｖＣｏｌ
【０１１６】
[00124]上述のプロセスを破過曲線の全ての組に適用して、ロードゾーンに２本のカラムを有するプロセスに対応する３つの処理結合容量及びロードゾーンに３本のカラムを有するプロセスに対応する３つの処理結合容量を生成する。
【０１１７】
[00125]（３つの）処理容量のそれぞれの組を全滞留時間に対してプロットし、適合した点の間にＯＢＣ値を内挿するための２次多項式を用いて適合させる。ＯＢＣ値はＡ−Ｂｅ−Ｃ（ｔ）の形式の指数関数などの種々の式を用いて適合させることができる。この式により最も正確な適合が得られるが、適切に実施するにはより大きな実験努力が必要になることがある。全滞留時間に対する処理結合容量の例を図７に示す。
【０１１８】
[00126]内挿した処理結合容量を用いて、式４の公式を適用することにより、全滞留時間の範囲にわたってロード時間を計算する。ここでＲＴは１本のカラムにわたる滞留時間（全滞留時間ではない）、Ｃ０は供給濃度である。
式４：ｔＬ＝ＯＢＣ×ＲＴ／Ｃ０
【０１１９】
[00127]ロード時間を用いて、全滞留時間の範囲にわたってサイクルタイムを計算する。式５（下記）に示す計算をそれぞれの滞留時間に適用する。ここでｔＣはサイクルタイム、ｔＬはロード時間、ＮＬはロードゾーンにおけるカラムの本数、ｔＲは休止時間、即ち洗浄、溶出、及び再生を行う時間である。
式５：ｔＣ＝ｔＬ×ＮＬ＋ｔＲ
【０１２０】
[00128]それぞれの滞留時間に付随する生産性を、式６（下記）を用いて計算する。ここでＰは生産性である。
式６：Ｐ＝ＯＢＣ／ｔＣ
【０１２１】
[00129]全滞留時間に対する理論的生産性のプロットを図８に示す。
【０１２２】
[00130]プロセスを実行するために必要なカラムの全本数は、ロードされるカラムの本数と、ロードが連続的かつ中断されないために休止（洗浄／溶出／再生）において必要なカラムの本数との合計である。これは式７（下記）を用いて計算する。ここでＮＣはカラムの全本数である。
式７：ＮＣ＝切り上げ値（ｔＣ／ｔＬ）
【０１２３】
[00131]サイクルタイムはカラムの本数で割り切れなければならない。割り切れない場合には、サイクルタイムにアイドルタイムを加算する。サイクルタイムが増大すると生産性が低下する。実際の生産性は式８（下記）を用いて計算する。
式８：Ｐａｃｔｕａｌ＝ＯＢＣ／（ＮＣ×ｔＬ）
【０１２４】
実施例３
[00132]本実施例においては、１本のカラム（マブセレクトシュアプレパックトハイトラップカラム（０．９６２ｍＬ））を用い、精製したＩｇＧ２モノクローナル抗体（濃度２ｍｇ／ｍＬ）及び破過曲線の積分の代わりに溶出液の定量（溶出液は分画に採取し、希釈し、オフライン検出器を用いて測定する）によって、本発明の実施形態に従ってＯＢＣを決定するステップを説明する。
【０１２５】
[00133]（１）単一のカラムについてロード滞留時間を０．５分、１分、及び１．５分として３回のロード実験を行う。（２）滞留時間を１分、１．５分、２分、３分、及び４．５分として５回の破過実験を行う。
【０１２６】
[00134]それぞれのバッチ破過実験におけるロードステップについて、飽和（即ちカラムから出てくる生成物の濃度がカラムに入る生成物の濃度に等しい状態）に達するまでカラムをロードする。
【０１２７】
[00135]インラインＵＶ検出器を用いて、カラムの出口における濃度を測定する。時間に対する生成物の破過をソフトウェアによって記録し、処理結合容量を計算するためにエクスポートする。例示的な曲線を図２に示す。
【０１２８】
[00136]生成物の破過の１０％を生じるために必要な生成物の質量の８０％がロードされた時点を同定することによって、それぞれの破過実験からの破過曲線を用いてロード時間ｔＤＢＣを計算する。
【０１２９】
[00137]ロードゾーンに２本のカラムを有するプロセスについて処理結合容量（ＯＢＣ）を決定するため、選択された滞留時間（たとえば０．５分）でカラムにロードする。ロード時間としては、上記の選択されたロード滞留時間の２倍（たとえば０．５×２＝１分の滞留時間）でカラムにロードすることによって生成された曲線の１０％破過の８０％を取ることによって決定されたロード時間を用いる。３回の単一カラム実験の全体について、（１）で特定した選択されたロード滞留時間の組についてこれを繰り返す。
【０１３０】
[00138]ロードの後、結合した材料を９５％〜１００％回収することが保証された緩衝液を用いてカラムを溶出し、溶出液を測定してどれだけの量がカラムに結合したかを決定する。結合した量は、ロードゾーンに２本のカラムを有するＭＣＣプロセスについての処理結合容量に等しい。
【０１３１】
[00139]ロードゾーンにＮ本のカラムを有するマルチカラムプロセスについての理想的な処理結合容量は、Ｎ番目のカラムの出口において破過が起こる直前に第１のカラムに結合した量である。前の２つのパラグラフにおいて、図４の４Ｂ（下の曲線）に示すように、滞留時間を用いて、通常２本のカラムをデイジーチェーン接続し、２つのＵＶ検出器を用いて生成物の破過を追跡することによって生成される破過曲線を模倣する。この破過曲線を用いて、シリーズの中の第１のカラムに注入すべき量（図４の４Ａの第１のカラム中のＸ、第２のカラム中のＹ）を決定する。滞留時間は２分の１に低減され、カラムにはこの量（Ｘ＋Ｙ）がロードされる。フロースルーする量はＹに等しい。結合する量はＸに等しく、処理結合容量、即ちＯＢＣを表す。
【０１３２】
[00140]３回の実験のそれぞれについて溶出液を定量することによって、選択した滞留時間にそれぞれ対応する３つのＯＢＣが得られ、これらをプロットし、適合した点の間にＯＢＣ値を内挿するための２次多項式を用いて適合させることができる。
【０１３３】
[00141]ＯＢＣ値はＡ−Ｂｅ−Ｃ（ｔ）の形式の指数関数などの種々の式を用いて適合させることができる。この式により最も正確な適合が得られるが、適切に実施するにはより大きな実験努力が必要になることがある。全滞留時間に対する処理結合容量の例を図５に示す。
【０１３４】
[00142]ロードゾーンに３本のカラムを有するプロセスをモデル化するため、選択された滞留時間の３倍に対応する破過曲線から計算したロード時間を用いて、選択されたロード滞留時間の組についての実験を繰り返す。
【０１３５】
[00143]ロードゾーンにおける３本のカラムに対応する滞留時間に対してＯＢＣをプロットするために繰り返した実験に、溶出及び溶出液の定量を適用する。
【０１３６】
[00144]上のグラフからの内挿された処理結合容量を用いて、式１（下記）の公式を適用することによって、全滞留時間の範囲にわたってロード時間を計算することができる。ここでＲＴは１本のカラムにわたる滞留時間（全滞留時間ではない）、Ｃ０は供給濃度である。
式１：ｔＬ＝ＯＢＣ×ＲＴ／Ｃ０
【０１３７】
[00145]ロード時間を用いて、全滞留時間の範囲にわたってサイクルタイムを計算することができる。式２（下記）に示す計算をそれぞれの滞留時間に適用する。ここでｔＣはサイクルタイム、ｔＬはロード時間、ＮＬはロードゾーンにおけるカラムの本数、ｔＲは休止時間、即ち洗浄、溶出、及び再生を行う時間である。
式２：ｔＣ＝ｔＬ×ＮＬ＋ｔＲ
【０１３８】
[00146]それぞれの滞留時間に付随する生産性は式３（下記）を用いて計算した。ここでＰは生産性である。全滞留時間に対する理論的生産性のプロットを図６に示す。
式３：Ｐ＝ＯＢＣ／ｔＣ
【０１３９】
[00147]プロセスを実行するために必要なカラムの全本数は、ロードされるカラムの本数と、ロードが連続的かつ中断されないために休止（洗浄／溶出／再生）において必要なカラムの本数との合計である。これは式４（下記）を用いて計算した。ここでＮＣはカラムの全本数である。
式４：ＮＣ＝切り上げ値（ｔＣ／ｔＬ）
【０１４０】
[00148]サイクルタイムはカラムの本数で割り切れなければならない。割り切れない場合には、サイクルタイムにアイドルタイムを加算した。サイクルタイムが増大すると生産性が低下する。実際の生産性は式５（下記）を用いて計算する。
式５：Ｐａｃｔｕａｌ＝ＯＢＣ／（ＮＣ×ｔＬ）
【０１４１】
実施例４
[00149]本実施例においては、１本のカラム（マブセレクトシュアプレパックトハイトラップカラム（０．９６２ｍＬ））を用い、精製したモノクローナル抗体（濃度２ｍｇ／ｍＬ）及び市販のバイオセンサーを用いる分別による溶出液の定量によって、本発明の実施形態に従ってＯＢＣを決定するステップを説明する。
【０１４２】
[00150]（１）単一のカラムについてロード滞留時間を０．５分、１分、及び１．５分として３回のロード実験を行う。（２）滞留時間を１分、１．５分、２分、３分、及び４．５分として５回の破過実験を行う。
【０１４３】
[00151]それぞれのバッチ破過実験におけるロードステップについて、飽和（即ちカラムから出てくる生成物の濃度がカラムに入る生成物の濃度に等しい状態）に達するまでカラムをロードする。
【０１４４】
[00152]カラムの出口における濃度を、ＡＫＴＡ（商標）アヴァント（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて６０個の１ｍＬ分画に分別する。希釈剤（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ＬＬＣ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）を用いてそれぞれの分画を１０倍希釈し、プロテインＡバイオセンサー（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ＬＬＣ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）を用いて濃度を定量する。処理結合容量を計算するため、時間に対して濃度値をプロットする。例示的なエクスポートされた破過曲線を図３に示す。
【０１４５】
[00153]生成物の破過の１０％を生じるために必要な生成物の質量の８０％がロードされた時点を同定することによって、それぞれの破過実験からの破過曲線を用いてロード時間ｔＤＢＣを計算する。
【０１４６】
[00154]ロードゾーンに２本のカラムを有するプロセスについて処理結合容量（ＯＢＣ）を決定するため、選択された滞留時間（たとえば０．５分）でカラムにロードする。ロード時間としては、上記の選択されたロード滞留時間の２倍（たとえば０．５×２＝１分の滞留時間）でカラムにロードすることによって生成された曲線の１０％破過の８０％を取ることによって決定されたロード時間を用いる。３回の単一カラム実験の全体について、（１）で特定した選択されたロード滞留時間の組についてこれを繰り返す。
【０１４７】
[00155]ロードの後、結合した材料を９５％〜１００％回収することが保証された緩衝液を用いてカラムを溶出し、溶出液を測定してどれだけの量がカラムに結合したかを決定する。結合した量が、ロードゾーンに２本のカラムを有するＭＣＣプロセスについての処理結合容量に等しい。
【０１４８】
[00156]ロードゾーンにＮ本のカラムを有するマルチカラムプロセスについての理想的な処理結合容量は、Ｎ番目のカラムの出口において破過が起こる直前に第１のカラムに結合した量である。前の２つのパラグラフにおいて、図４の４Ｂ（下の曲線）に示すように、滞留時間を用いて、通常２本のカラムをデイジーチェーン接続し、２つのＵＶ検出器を用いて生成物の破過を追跡することによって生成される破過曲線を模倣する。この破過曲線を用いて、シリーズの中の第１のカラムに注入すべき量（図４の４Ａの第１のカラム中のＸ、第２のカラム中のＹ）を決定する。滞留時間は２分の１に低減され、カラムにはこの量（Ｘ＋Ｙ）がロードされる。フロースルーする量はＹに等しい。結合する量はＸに等しく、処理結合容量、即ちＯＢＣを表す。
【０１４９】
[00157]３回の実験のそれぞれについて溶出液を定量することによって、選択した滞留時間にそれぞれ対応する３つのＯＢＣが得られ、これらをプロットし、適合した点の間にＯＢＣ値を内挿するための２次多項式を用いて適合させることができる。
【０１５０】
[00158]ＯＢＣ値はＡ−Ｂｅ−Ｃ（ｔ）の形式の指数関数などの種々の式を用いて適合させることができる。この式により最も正確な適合が得られるが、適切に実施するにはより大きな実験努力が必要になることがある。全滞留時間に対する処理結合容量の例を図５に示す。
【０１５１】
[00159]ロードゾーンに３本のカラムを有するプロセスをモデル化するため、選択された滞留時間の３倍に対応する破過曲線から計算したロード時間を用いて、選択されたロード滞留時間の組についての実験を繰り返す。
【０１５２】
[00160]ロードゾーンにおける３本のカラムに対応する滞留時間に対してＯＢＣをプロットするために繰り返した実験に、溶出及び溶出液の定量を適用する。
【０１５３】
[00161]上のグラフからの内挿された処理結合容量を用いて、式１（下記）の公式を適用することによって、全滞留時間の範囲にわたってロード時間を計算することができる。ここでＲＴは１本のカラムにわたる滞留時間（全滞留時間ではない）、Ｃ０は供給濃度である。
式１：ｔＬ＝ＯＢＣ×ＲＴ／Ｃ０
【０１５４】
[00162]ロード時間を用いて、全滞留時間の範囲にわたってサイクルタイムを計算することができる。式２（下記）に示す計算をそれぞれの滞留時間に適用する。ここでｔＣはサイクルタイム、ｔＬはロード時間、ＮＬはロードゾーンにおけるカラムの本数、ｔＲは休止時間、即ち洗浄、溶出、及び再生を行う時間である。
式２：ｔＣ＝ｔＬ×ＮＬ＋ｔＲ
【０１５５】
[00163]それぞれの滞留時間に付随する生産性は式３（下記）を用いて計算した。ここでＰは生産性である。全滞留時間に対する理論的生産性のプロットを図６に示す。
式３：Ｐ＝ＯＢＣ／ｔＣ
【０１５６】
[00164]プロセスを実行するために必要なカラムの全本数は、ロードされるカラムの本数と、ロードが連続的かつ中断されないために休止（洗浄／溶出／再生）において必要なカラムの本数との合計である。これは式４（下記）を用いて計算した。ここでＮＣはカラムの全本数である。
式４：ＮＣ＝切り上げ値（ｔＣ／ｔＬ）
【０１５７】
[00165]サイクルタイムはカラムの本数で割り切れなければならない。割り切れない場合には、サイクルタイムにアイドルタイムを加算した。サイクルタイムが増大すると生産性が低下する。実際の生産性は式５（下記）を用いて計算する。
式５：Ｐａｃｔｕａｌ＝ＯＢＣ／（ＮＣ×ｔＬ）
【０１５８】
実施例５
[00166]本実施例においては、互いにデイジーチェーン接続した２本及び３本のカラム（マブセレクトシュアプレパックトハイトラップカラム（０．９６２ｍＬ））を用い、精製したＩｇＧ２モノクローナル抗体（濃度２ｍｇ／ｍＬ）を用いた、市販のバイオセンサーを用いる分別による溶出液の定量によって、本発明の実施形態に従ってＯＢＣを決定するステップを説明する。
【０１５９】
[00167]（１ａ）連鎖中の単一のカラムにわたるロード滞留時間を０．５分、１分、及び１．５分として、互いにデイジーチェーン接続した２本のカラムについて３回の破過実験を行う。（１ｂ）ロード滞留時間を０．５分、１分、及び１．５分として、互いにデイジーチェーン接続した３本のカラムについて３回の破過実験を行う。
【０１６０】
[00168]デイジーチェーン接続カラムの出口における濃度を、ＡＫＴＡ（商標）アヴァント（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて６０個の１ｍＬ分画に分別する。ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む希釈剤（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ＬＬＣ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）を用いてそれぞれの分画を１０倍希釈し、プロテインＡバイオセンサー（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ＬＬＣ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）を用いて濃度を定量する。処理結合容量を計算するため、時間に対して濃度値をプロットする。例示的なエクスポートされた破過曲線を図３に示す。
【０１６１】
[00169]生成物の破過の１０％を生じるために必要な生成物の質量の８０％がロードされた時点を同定することによって、それぞれの破過実験（１ａ；１ｂ）からの破過曲線を用いてロード時間ｔＤＢＣを計算する。
【０１６２】
[00170]ロードゾーンに２本のカラムを有するプロセスについて処理結合容量（ＯＢＣ）を決定するため、選択された滞留時間（たとえば０．５分）で単一のカラムにロードする。ロード時間としては、２本のデイジーチェーン接続カラム（これらの個別の滞留時間は同じである）にロードすることによって生成された曲線の１０％破過の８０％を取ることによって決定されたロード時間を用いる。３回の単一カラム実験の全体について、（１ａ）で特定した選択されたロード滞留時間の組についてこれを繰り返す。
【０１６３】
[00171]ロードゾーンに３本のカラムを有するプロセスについて処理結合容量（ＯＢＣ）を決定するため、選択された滞留時間（たとえば０．５分）で単一のカラムにロードする。ロード時間としては、３本のデイジーチェーン接続カラム（これらの個別の滞留時間は同じである）にロードすることによって生成された曲線の１０％破過の８０％を取ることによって決定されたロード時間を用いる。３回の単一カラム実験の全体について、（１ｂ）で特定した選択されたロード滞留時間の組についてこれを繰り返す。
【０１６４】
[00172]ロードの後、結合した材料を９５％〜１００％回収することが保証された緩衝液を用いてカラムを溶出し、溶出液を測定してどれだけの量がカラムに結合したかを決定する。結合した量は、ロードゾーンに２本のカラムを有するＭＣＣプロセス、及びロードゾーンに３本のカラムを有するＭＣＣプロセスについての処理結合容量に等しい。
【０１６５】
[00173]ロードゾーンにＮ本のカラムを有するマルチカラムプロセスについての理想的な処理結合容量は、Ｎ番目のカラムの出口において破過が起こる直前に第１のカラムに結合した量である。（１ａ）及び（１ｂ）において、図４の４Ａ及び４Ｂ（下の曲線）に示すように、２本のカラム及び３本のカラムをデイジーチェーン接続し、１つのＵＶ検出器を用いて生成物の破過を追跡することによって破過曲線を生成する。次いで別の実験で、カラムを切り離して生成物がデイジーチェーン接続配置における最後のカラムを破過する時点までロードする。ロードの後、溶出液を定量することによって、カラムに結合する材料の量を決定する。これは、最後のカラムで破過が起こる前に最初のカラムに結合した量Ｘである。
【０１６６】
[00174]３回の実験の２つの組のそれぞれについて溶出液を定量することによって、選択した滞留時間にそれぞれ対応する３つのＯＢＣが得られ、これらをプロットし、適合した点の間にＯＢＣ値を内挿するための２次多項式を用いて適合させることができる。
【０１６７】
[00175]ＯＢＣ値はＡ−Ｂｅ−Ｃ（ｔ）の形式の指数関数などの種々の式を用いて適合させることができる。この式により最も正確な適合が得られるが、適切に実施するにはより大きな実験努力が必要になることがある。全滞留時間に対する処理結合容量の例を図５に示す。
【０１６８】
[00176]ロードゾーンに３本のカラムを有するプロセスをモデル化するため、３本のデイジーチェーン接続カラムに対応する破過曲線から計算したロード時間を用いて実験を繰り返す。ロードゾーンにおける３本のカラムに対応する滞留時間に対してＯＢＣをプロットするために繰り返した実験に、溶出及び溶出液の定量を適用する。
【０１６９】
[00177]上のグラフからの内挿された処理結合容量を用いて、式１（下記）の公式を適用することによって、全滞留時間の範囲にわたってロード時間を計算することができる。ここでＲＴは１本のカラムにわたる滞留時間（全滞留時間ではない）、Ｃ０は供給濃度である。
式１：ｔＬ＝ＯＢＣ×ＲＴ／Ｃ０
【０１７０】
[00178]ロード時間を用いて、全滞留時間の範囲にわたってサイクルタイムを計算することができる。式２（下記）に示す計算をそれぞれの滞留時間に適用する。ここでｔＣはサイクルタイム、ｔＬはロード時間、ＮＬはロードゾーンにおけるカラムの本数、ｔＲは休止時間、即ち洗浄、溶出、及び再生を行う時間である。
式２：ｔＣ＝ｔＬ×ＮＬ＋ｔＲ
【０１７１】
[00179]それぞれの滞留時間に付随する生産性は式３（下記）を用いて計算した。ここでＰは生産性である。全滞留時間に対する理論的生産性のプロットを図５に示す。
式３：Ｐ＝ＯＢＣ／ｔＣ
【０１７２】
[00180]プロセスを実行するために必要なカラムの全本数は、ロードされるカラムの本数と、ロードが連続的かつ中断されないために休止（洗浄／溶出／再生）において必要なカラムの本数との合計である。これは式４（下記）を用いて計算した。ここでＮＣはカラムの全本数である。
式４：ＮＣ＝切り上げ値（ｔＣ／ｔＬ）
【０１７３】
[00181]サイクルタイムはカラムの本数で割り切れなければならない。割り切れない場合には、サイクルタイムにアイドルタイムを加算した。サイクルタイムが増大すると生産性が低下する。実際の生産性は式５（下記）を用いて計算する。
式５：Ｐａｃｔｕａｌ＝ＯＢＣ／（ＮＣ×ｔＬ）
【０１７４】
実施例６
[00182]本実施例においては、互いにデイジーチェーン接続した２本及び３本のカラム（マブセレクトシュアプレパックトハイトラップカラム（０．９６２ｍＬ））を用い、精製したＩｇＧ２モノクローナル抗体（濃度２ｍｇ／ｍＬ）及び破過曲線の積分の代わりに溶出液の定量（オフライン検出器を用いる）によって、本発明の実施形態に従ってＯＢＣを決定するステップを説明する。
【０１７５】
[00183]（１ａ）ロード滞留時間を０．５分、１分、及び１．５分として、互いにデイジーチェーン接続した２本のカラムについて３回の破過実験を行う。（１ｂ）ロード滞留時間を０．５分、１分、及び１．５分として、互いにデイジーチェーン接続した３本のカラムについて３回の破過実験を行う。
【０１７６】
[00184]インラインＵＶ検出器を用いて、デイジーチェーン接続カラムの出口における濃度を測定する。時間に対する生成物の破過をソフトウェアによって記録し、処理結合容量を計算するためにエクスポートする。例示的な曲線を図２に示す。
【０１７７】
[00185]生成物の破過の１０％を生じるために必要な生成物の質量の８０％がロードされた時点を同定することによって、それぞれの破過実験（１ａ；１ｂ）からの破過曲線を用いてロード時間ｔＤＢＣを計算する。
【０１７８】
[00186]ロードゾーンに２本のカラムを有するプロセスについて処理結合容量（ＯＢＣ）を決定するため、選択された滞留時間（たとえば０．５分）で単一のカラムにロードする。ロード時間としては、２本のデイジーチェーン接続カラム（これらの個別の滞留時間は同じである）にロードすることによって生成された曲線の１０％破過の８０％を取ることによって決定されたロード時間を用いる。３回の単一カラム実験の全体について、（１ａ）で特定した選択されたロード滞留時間の組についてこれを繰り返す。
【０１７９】
[00187]ロードゾーンに３本のカラムを有するプロセスについて処理結合容量（ＯＢＣ）を決定するため、選択された滞留時間（たとえば０．５分）で単一のカラムにロードする。ロード時間としては、３本のデイジーチェーン接続カラム（これらの個別の滞留時間は同じである）にロードすることによって生成された曲線の１０％破過の８０％を取ることによって決定されたロード時間を用いる。３回の単一カラム実験の全体について、（１ｂ）で特定した選択されたロード滞留時間の組についてこれを繰り返す。
【０１８０】
[00188]ロードの後、結合した材料を９５％〜１００％回収することが保証された緩衝液を用いてカラムを溶出し、溶出液を測定してどれだけの量がカラムに結合したかを決定する。結合した量が、ロードゾーンに２本のカラムを有するＭＣＣプロセス、及びロードゾーンに３本のカラムを有するＭＣＣプロセスについての処理結合容量に等しい。
【０１８１】
[00189]ロードゾーンにＮ本のカラムを有するマルチカラムプロセスについての理想的な処理結合容量は、Ｎ番目のカラムの出口において破過が起こる直前に第１のカラムに結合した量である。（１ａ）及び（１ｂ）において、図４の４Ａ及び４Ｂ（下の曲線）に示すように、２本のカラム及び３本のカラムをデイジーチェーン接続し、１つのＵＶ検出器を用いて生成物の破過を追跡することによって破過曲線を生成する。次いで別の実験で、カラムを切り離して生成物がデイジーチェーン接続配置における最後のカラムを破過する時点までロードする。ロードの後、溶出液を定量することによって、カラムに結合する材料の量を決定する。これは、最後のカラムで破過が起こる前に最初のカラムに結合した量Ｘである。
【０１８２】
[00190]３回の実験の２つの組のそれぞれについて溶出液を定量することによって、選択した滞留時間にそれぞれ対応する３つのＯＢＣが得られ、これらをプロットし、適合した点の間にＯＢＣ値を内挿するための２次多項式を用いて適合させることができる。
【０１８３】
[00191]ＯＢＣ値はＡ−Ｂｅ−Ｃ（ｔ）の形式の指数関数などの種々の式を用いて適合させることができる。この式により最も正確な適合が得られるが、適切に実施するにはより大きな実験努力が必要になることがある。全滞留時間に対する処理結合容量の例を図５に示す。
【０１８４】
[00192]ロードゾーンに３本のカラムを有するプロセスをモデル化するため、３本のデイジーチェーン接続カラムに対応する破過曲線から計算したロード時間を用いて実験を繰り返す。ロードゾーンにおける３本のカラムに対応する滞留時間に対してＯＢＣをプロットするために繰り返した実験に、溶出及び溶出液の定量を適用する。
【０１８５】
[00193]上のグラフからの内挿された処理結合容量を用いて、式１（下記）の公式を適用することによって、全滞留時間の範囲にわたってロード時間を計算することができる。ここでＲＴは１本のカラムにわたる滞留時間（全滞留時間ではない）、Ｃ０は供給濃度である。
式１：ｔＬ＝ＯＢＣ×ＲＴ／Ｃ０
【０１８６】
[00194]ロード時間を用いて、全滞留時間の範囲にわたってサイクルタイムを計算することができる。式２（下記）に示す計算をそれぞれの滞留時間に適用する。ここでｔＣはサイクルタイム、ｔＬはロード時間、ＮＬはロードゾーンにおけるカラムの本数、ｔＲは休止時間、即ち洗浄、溶出、及び再生を行う時間である。
式２：ｔＣ＝ｔＬ×ＮＬ＋ｔＲ
【０１８７】
[00195]それぞれの滞留時間に付随する生産性は式３（下記）を用いて計算した。ここでＰは生産性である。全滞留時間に対する理論的生産性のプロットを図６に示す。
式３：Ｐ＝ＯＢＣ／ｔＣ
【０１８８】
[00196]プロセスを実行するために必要なカラムの全本数は、ロードされるカラムの本数と、ロードが連続的かつ中断されないために休止（洗浄／溶出／再生）において必要なカラムの本数との合計である。これは式４（下記）を用いて計算した。ここでＮＣはカラムの全本数である。
式４：ＮＣ＝切り上げ値（ｔＣ／ｔＬ）
【０１８９】
[00197]サイクルタイムはカラムの本数で割り切れなければならない。割り切れない場合には、サイクルタイムにアイドルタイムを加算した。サイクルタイムが増大すると生産性が低下する。実際の生産性は式５（下記）を用いて計算する。
式５：Ｐａｃｔｕａｌ＝ＯＢＣ／（ＮＣ×ｔＬ）
【０１９０】
実施例７
[00198]本実施例においては、２本及び３本のデイジーチェーン接続カラム（マブセレクトシュアプレパックトハイトラップカラム（０．９６２ｍＬ））を用い、精製したＩｇＧ２モノクローナル抗体（濃度２ｍｇ／ｍＬ）及び１つのインラインＵＶ検出器を用いた、本発明の実施形態に従ってＯＢＣを決定するステップを説明する。
【０１９１】
[00199]（１ａ）ロード滞留時間を０．５分、１分、及び１．５分として、互いにデイジーチェーン接続した単一のカラムについて３回の破過実験を行う。（１ｂ）ロード滞留時間を０．５分、１分、及び１．５分として、互いにデイジーチェーン接続した２本のカラムについて３回の破過実験を行う（即ち、流量を一定に保ち、それぞれのカラムにわたる滞留時間を一定に保ち、結合した全滞留時間を２倍とする）。（１ｃ）ロード滞留時間を０．５分、１分、及び１．５分として、互いにデイジーチェーン接続した３本のカラムについて３回の破過実験を行う（即ち、流量を一定に保ち、それぞれのカラムにわたる滞留時間を一定に保ち、結合した全滞留時間を３倍とする）。
【０１９２】
[00200]ロードゾーンにおけるＮ本のカラムをモデル化するため、（１ａ）で特定した滞留時間を用いて、Ｎ本のデイジーチェーン接続カラムにおいてバッチ破過実験を行う。
【０１９３】
[00201]以下の表に概略を示すように、それぞれのロードステップの間で、カラムを洗浄、溶出、再生、及び平衡化（まとめて「休止」プロセスと称する）に供する。
【表５】
0006349571.tif 000008
【０１９４】
[00202]それぞれのバッチ破過実験におけるロードステップについて、飽和（即ちカラムから出てくる生成物の濃度がカラムに入る生成物の濃度に等しい状態）に達するまでカラムをロードする。
【０１９５】
[00203]インラインＵＶ検出器を用いて、カラムの出口における濃度を測定する。時間に対する生成物の破過をソフトウェアによって記録し、処理結合容量を計算するためにエクスポートする。例示的な曲線を図２に示す。
【０１９６】
[00204]ロードゾーンに２本のカラムを有するプロセスについて生成物の破過を模倣するために、１本のカラム及び２本のデイジーチェーン接続カラムを用いて生成された破過曲線（ロード流量が同じもの）を互いに組にする。たとえば、１本のカラムでロード流量を１ｍｌ／分として生成された破過曲線と、２本のカラムでロード流量を１ｍｌ／分として生成された破過曲線とを組にすることができる。（１ａ）で選択した滞留時間に付随する全てのロード流量についてこれを行う。
【０１９７】
[00205]ロードゾーンに３本のカラムを有するプロセスについて生成物の破過を模倣するために、１本のカラム及び３本のデイジーチェーン接続カラムを用いて生成された破過曲線（ロード流量が同じもの）を互いに組にする。たとえば、１本のカラムでロード流量を１ｍｌ／分として生成された破過曲線と、２本のカラムでロード流量を１ｍｌ／分として生成された破過曲線とを組にすることができる。（１ａ）で選択した滞留時間に付随する全てのロード流量についてこれを行う。
【０１９８】
[00206]ロードゾーンにＮ本のカラムを有するマルチカラムプロセスについての理想的な処理結合容量は、Ｎ番目のカラムの出口において破過が起こる直前に第１のカラムに結合した量である。前の２つのパラグラフにおいて、図４の４Ａ及び４Ｂ（下の曲線）に示すように、２本のカラム及び３本のカラムをデイジーチェーン接続し、１つのＵＶ検出器を用いて生成物の破過を追跡することによって破過曲線を生成する。次いで別の実験で、カラムを切り離して、シリーズの中の本当に最初のカラムにわたる生成物の破過を模倣するために、単一ユニットのカラムについて実験を行い、図４の４Ｂ（上の曲線）に示す曲線を得る。
【０１９９】
[00207]上で同定した２本又は３本のカラムに対応する破過曲線を用いて、生成物が破過し始める時間、ｔＤＢＣを決定することができる。
【０２００】
[00208]生成物の破過の１０％を生じるために必要な生成物の質量の８０％がロードされた時点を同定することによってｔＤＢＣを計算する。
【０２０１】
[00209]ｔＤＢＣは、単一ユニットカラムをロードすることによって生成される破過における積分の上限として用いられる。この破過曲線をゼロから上限ｆＲ×ｔＤＢＣまで積分し、式１に示されるフロースルー中に存在する生成物の量を決定する。ここでｍＦＴはフロースルー中の生成物の量であり、Ｃｏｕｔは所与のロード流量における単一ユニットカラムに対応する破過曲線を表す。
式１
【数３】
0006349571.tif 000009
【０２０２】
[00210]ロードされた生成物の量ｍＬを、式２に示す公式を適用することによって計算する。ここでＣ０は供給物濃度、ｖＬはロードした体積、ｖ０はカラム内の空隙体積である。
式２：ｍＬ＝Ｃ０×（ｖＬ−ｖ０）
【０２０３】
[00211]理想的な処理結合容量（ＯＢＣ）を、式３の公式を適用することによって計算する。
式３：ＯＢＣ＝（ｍＬ−ｍＦＴ）／ｖＣｏｌ
【０２０４】
[00212]上述のプロセスを破過曲線の全ての組に適用して、ロードゾーンに２本のカラムを有するプロセスに対応する３つの処理結合容量及びロードゾーンに３本のカラムを有するプロセスに対応する３つの処理結合容量を生成する。
【０２０５】
[00213]（３つの）処理容量のそれぞれの組を全滞留時間に対してプロットし、適合した点の間にＯＢＣ値を内挿するための２次多項式を用いて適合させる。ＯＢＣ値はＡ−Ｂｅ−Ｃ（ｔ）の形式の指数関数などの種々の式を用いて適合させることができる。この式により最も正確な適合が得られるが、適切に実施するにはより大きな実験努力が必要になることがある。全滞留時間に対する処理結合容量の例を図５に示す。
【０２０６】
[00214]内挿した処理結合容量を用いて、式４の公式を適用することにより、全滞留時間の範囲にわたってロード時間を計算する。ここでＲＴは１本のカラムにわたる滞留時間（全滞留時間ではない）、Ｃ０は供給濃度である。
式４：ｔＬ＝ＯＢＣ×ＲＴ／Ｃ０
【０２０７】
[00215]ロード時間を用いて、全滞留時間の範囲にわたってサイクルタイムを計算する。式５（下記）に示す計算をそれぞれの滞留時間に適用する。ここでｔＣはサイクルタイム、ｔＬはロード時間、ＮＬはロードゾーンにおけるカラムの本数、ｔＲは休止時間、即ち洗浄、溶出、及び再生を行う時間である。
式５：ｔＣ＝ｔＬ×ＮＬ＋ｔＲ
【０２０８】
[00216]それぞれの滞留時間に付随する生産性を、式６（下記）を用いて計算する。ここでＰは生産性である。
式６：Ｐ＝ＯＢＣ／ｔＣ
【０２０９】
[00217]全滞留時間に対する理論的生産性のプロットを図６に示す。
【０２１０】
[00218]プロセスを実行するために必要なカラムの全本数は、ロードされるカラムの本数と、ロードが連続的かつ中断されないために休止（洗浄／溶出／再生）において必要なカラムの本数との合計である。これは式７（下記）を用いて計算する。ここでＮＣはカラムの全本数である。
式７：ＮＣ＝切り上げ値（ｔＣ／ｔＬ）
【０２１１】
[00219]サイクルタイムはカラムの本数で割り切れなければならない。割り切れない場合には、サイクルタイムにアイドルタイムを加算する。サイクルタイムが増大すると生産性が低下する。実際の生産性は式８（下記）を用いて計算する。
式８：Ｐａｃｔｕａｌ＝ＯＢＣ／（ＮＣ×ｔＬ）
【０２１２】
実施例８
[00220]本実施例においては、２本及び３本のデイジーチェーン接続カラム（マブセレクトシュアプレパックトハイトラップカラム（０．９６２ｍＬ））を用い、精製したＩｇＧ２モノクローナル抗体（ＣＨＯフィードストック中濃度約２．２ｍｇ／ｍＬ）及び市販のバイオセンサーを用いる分別によって、本発明の実施形態に従ってＯＢＣを決定するステップを説明する。
【０２１３】
[00221]（１ａ）ロード滞留時間を０．５分、１分、及び１．５分として、互いにデイジーチェーン接続単一のカラムについて３回の破過実験を行う。（１ｂ）ロード滞留時間を０．５分、１分、及び１．５分として、互いにデイジーチェーン接続２本のカラムについて３回の破過実験を行う（即ち、流量を一定に保ち、それぞれのカラムにわたる滞留時間を一定に保ち、結合した全滞留時間を２倍とする）。（１ｃ）ロード滞留時間を０．５分、１分、及び１．５分として、互いにデイジーチェーン接続した３本のカラムについて３回の破過実験を行う（即ち、流量を一定に保ち、それぞれのカラムにわたる滞留時間を一定に保ち、結合した全滞留時間を３倍とする）。
【０２１４】
[00222]ロードゾーンにおけるＮ本のカラムをモデル化するため、（１ａ）で特定した滞留時間を用いて、Ｎ本のデイジーチェーン接続カラムにおいてバッチ破過実験を行う。
【０２１５】
[00223]以下の表に概略を示すように、それぞれのロードステップの間で、カラムを洗浄、溶出、再生、及び平衡化（まとめて「休止」プロセスと称する）に供する。
【表６】
0006349571.tif 000010
【０２１６】
[00224]それぞれのバッチ破過実験におけるロードステップについて、飽和（即ちカラムから出てくる生成物の濃度がカラムに入る生成物の濃度に等しい状態）に達するまでカラムをロードする。
【０２１７】
[00225]カラムの出口における濃度を、ＡＫＴＡ（商標）アヴァント（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて６０個の１ｍＬ分画に分別する。希釈剤（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ＬＬＣ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）を用いてそれぞれの分画を１０倍希釈し、プロテインＡバイオセンサー（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ＬＬＣ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）を用いて濃度を定量する。処理結合容量を計算するため、時間に対して濃度値をプロットする。例示的なエクスポートされた破過曲線を図３に示す。
【０２１８】
[00226]ロードゾーンに２本のカラムを有するプロセスについて生成物の破過を模倣するために、１本のカラム及び２本のデイジーチェーン接続カラムを用いて生成された破過曲線（ロード流量が同じもの）を互いに組にする。たとえば、１本のカラムでロード流量を１ｍｌ／分として生成された破過曲線と、２本のカラムでロード流量を１ｍｌ／分として生成された破過曲線とを組にすることができる。（１ａ）で選択した滞留時間に付随する全てのロード流量についてこれを行う。
【０２１９】
[00227]ロードゾーンに３本のカラムを有するプロセスについて生成物の破過を模倣するために、１本のカラム及び３本のデイジーチェーン接続カラムを用いて生成された破過曲線（ロード流量が同じもの）を互いに組にする。たとえば、１本のカラムでロード流量を１ｍｌ／分として生成された破過曲線と、２本のカラムでロード流量を１ｍｌ／分として生成された破過曲線とを組にすることができる。（１ａ）で選択した滞留時間に付随する全てのロード流量についてこれを行う。
【０２２０】
[00228]ロードゾーンにＮ本のカラムを有するマルチカラムプロセスについての理想的な処理結合容量は、Ｎ番目のカラムの出口において破過が起こる直前に第１のカラムに結合した量である。前の２つのパラグラフにおいて、図４の４Ａ及び４Ｂ（下の曲線）に示すように、２本のカラム及び３本のカラムをデイジーチェーン接続し、１つのＵＶ検出器を用いて生成物の破過を追跡することによって破過曲線を生成する。次いで別の実験で、カラムを切り離して、シリーズの中の本当に最初のカラムにわたる生成物の破過を模倣するために、単一ユニットのカラムについて実験を行い、図４の４Ｂ（上の曲線）に示す曲線を得る。
【０２２１】
[00229]上で同定した２本又は３本のカラムに対応する破過曲線を用いて、生成物が破過し始める時間、ｔＤＢＣを決定することができる。
【０２２２】
[00230]生成物の破過の１０％を生じるために必要な生成物の質量の８０％がロードされた時点を同定することによってｔＤＢＣを計算する。
【０２２３】
[00231]ｔＤＢＣは、単一ユニットカラムをロードすることによって生成される破過における積分の上限として用いられる。この破過曲線をゼロから上限ｆＲ×ｔＤＢＣまで積分し、式１に示されるフロースルー中に存在する生成物の量を決定する。ここでｍＦＴはフロースルー中の生成物の量であり、Ｃｏｕｔは所与のロード流量における単一ユニットカラムに対応する破過曲線を表す。
式１
【数４】
0006349571.tif 000011
【０２２４】
[00232]ロードされた生成物の量ｍＬを、式２に示す公式を適用することによって計算する。ここでＣ０は供給物濃度、ｖＬはロードした体積、ｖ０はカラム内の空隙体積である。
式２：ｍＬ＝Ｃ０×（ｖＬ−ｖ０）
【０２２５】
[00233]理想的な処理結合容量（ＯＢＣ）を、式３の公式を適用することによって計算する。
式３：ＯＢＣ＝（ｍＬ−ｍＦＴ）／ｖＣｏｌ
【０２２６】
[00234]上述のプロセスを破過曲線の全ての組に適用して、ロードゾーンに２本のカラムを有するプロセスに対応する３つの処理結合容量及びロードゾーンに３本のカラムを有するプロセスに対応する３つの処理結合容量を生成する。
【０２２７】
[00235]（３つの）処理容量のそれぞれの組を全滞留時間に対してプロットし、適合した点の間にＯＢＣ値を内挿するための２次多項式を用いて適合させる。ＯＢＣ値はＡ−Ｂｅ−Ｃ（ｔ）の形式の指数関数などの種々の式を用いて適合させることができる。この式により最も正確な適合が得られるが、適切に実施するにはより大きな実験努力が必要になることがある。全滞留時間に対する処理結合容量の例を図７に示す。
【０２２８】
[00236]内挿した処理結合容量を用いて、式４の公式を適用することにより、全滞留時間の範囲にわたってロード時間を計算する。ここでＲＴは１本のカラムにわたる滞留時間（全滞留時間ではない）、Ｃ０は供給濃度である。
式４：ｔＬ＝ＯＢＣ×ＲＴ／Ｃ０
【０２２９】
[00237]ロード時間を用いて、全滞留時間の範囲にわたってサイクルタイムを計算する。式５（下記）に示す計算をそれぞれの滞留時間に適用する。ここでｔＣはサイクルタイム、ｔＬはロード時間、ＮＬはロードゾーンにおけるカラムの本数、ｔＲは休止時間、即ち洗浄、溶出、及び再生を行う時間である。
式５：ｔＣ＝ｔＬ×ＮＬ＋ｔＲ
【０２３０】
[00238]それぞれの滞留時間に付随する生産性を、式６（下記）を用いて計算する。ここでＰは生産性である。
式６：Ｐ＝ＯＢＣ／ｔＣ
【０２３１】
[00239]全滞留時間に対する理論的生産性のプロットを図８に示す。
【０２３２】
[00240]プロセスを実行するために必要なカラムの全本数は、ロードされるカラムの本数と、ロードが連続的かつ中断されないために休止（洗浄／溶出／再生）において必要なカラムの本数との合計である。これは式７（下記）を用いて計算する。ここでＮＣはカラムの全本数である。
式７：ＮＣ＝切り上げ値（ｔＣ／ｔＬ）
【０２３３】
[00241]サイクルタイムはカラムの本数で割り切れなければならない。割り切れない場合には、サイクルタイムにアイドルタイムを加算する。サイクルタイムが増大すると生産性が低下する。実際の生産性は式８（下記）を用いて計算する。
式８：Ｐａｃｔｕａｌ＝ＯＢＣ／（ＮＣ×ｔＬ）
【０２３４】
実施例９
[00242]本実施例においては、本発明の実施形態を用いて捕捉効率を正確に予測するステップを説明する。
【０２３５】
[00243]４つのＭＣＣプロセス（２本のカラムがロードゾーンにあり、２本のカラムがプロセスの休止状態にある）を、５つの処理容量において実施する。結果は下記の通りである。
【表７】
0006349571.tif 000012
【０２３６】
[00244]測定した捕捉効率の全ては、予測した捕捉効率の２％以内にある。これにより、ＯＢＣを計算するための手法はＭＣＣプロセスの真のＯＢＣと緊密に近似していることが確認される。
【０２３７】
[00245]本明細書で引用した出版物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照により組み込まれることが個別にかつ具体的に示され、またその全体が本明細書で説明されているかのように、同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３８】
[00246]本発明を記述する文脈で使用する（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「1つの」及び「その」及び「少なくとも１つの」並びに同様の指示対象は、本明細書において別に指示しない限り、又は文脈によって明白に否定しない限り、単数と複数の両方に及ぶと解釈される。用語「少なくとも１つの」に続く１つ又は複数の項目（たとえば「Ａ及びＢの少なくとも１つ」）の使用は、本明細書において別に指示しない限り、又は文脈によって明白に否定しない限り、列挙した項目（Ａ又はＢ）から選択される１つの項目又は列挙した２つ以上の項目（Ａ及びＢ）の任意の組み合わせを意味すると解釈される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、他に注釈しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むが、それに限らない」を意味する）と解釈される。本明細書における値の範囲の言及は、本明細書において別に指示しない限り、その範囲内にあるそれぞれの別々の値に個別に言及する略記法として働くことを意図しているのみであって、それぞれの別々の値はそれが本明細書において個別に言及されているかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載した全ての方法は、本明細書において別に指示しない限り、又は文脈によって明白に否定しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書において提供される任意の及び全ての実施例、又は例示的な用語（たとえば「など」）の使用は、本発明をより良く説明することを意図しているのみであって、他に主張しない限り、本発明の範囲に限定を設けるものではない。本明細書中のいかなる言語も、特許請求の範囲にない要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈すべきではない。
【０２３９】
[00247]本発明を実施するための、本発明者らによって知られた最良の形態を含む本発明の好ましい実施形態を本明細書に記載する。これらの好ましい実施形態の変形は、上記の記述を読んだ上で当業者には明白となろう。本発明者らは、当業者がそのような変形を適切なものとして用いることを期待する。本発明者らは、本明細書に具体的に記載したものの他に本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明はここに添付した特許請求の範囲において言及した主題の、適用可能な法律によって許される全ての変形及び等価物を含む。さらに、全ての可能な変形に含まれる上述の要素の任意の組み合わせは、本明細書において別に指示しない限り、又は文脈によって明白に否定しない限り、本発明によって包含される。
【図１】
0006349571.tif 000013
【図２】
0006349571.tif 000014
【図３】
0006349571.tif 000015
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006349571.tif 000019
【図８】
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【図９】
0006349571.tif 000021