(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における特発性肺線維症（ＩＰＦ）を予後予測するかまたは予後予測を援助する方法であって、患者由来の生物学的試料中の遺伝子の組み合わせの発現、または遺伝子の組み合わせによりコードされるタンパク質の組み合わせの発現を測定することを含み、遺伝子の組み合わせは、ＣＸＣＬ１３、ＹＫＬ−４０、ＯＰＮ、ＣＯＭＰ、ＭＭＰ３、及びＳＡＡ４から選択される少なくとも３つの遺伝子を含み、遺伝子の組み合わせの発現レベルの上昇またはタンパク質の組み合わせの発現レベルの上昇が、生存期間中央値と比較して短くなった生存期間についての予後予測を示し、遺伝子の組み合わせの発現レベルの低減またはタンパク質の組み合わせの発現レベルの低減が、生存期間中央値と比較して増加した生存期間についての予後予測を示す、方法。
【請求項２】
患者が、免疫調節治療を受けている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物学的試料が、肺組織、血清および血漿から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
患者におけるＩＰＦを予後予測するかまたは予後予測を援助する方法であって、患者由来の生物学的試料中の、全ベースラインバイオマーカースコアを決定することを含み、
全ベースラインバイオマーカースコアを決定することが、
（ｉ）ＣＸＣＬ１３、ＯＰＮ、ＣＯＭＰ、及びＹＫＬ−４０のタンパク質発現レベルを測定することと、発現レベルが、ＣＸＣＬ１３、ＯＰＮ、ＣＯＭＰ及びＹＫＬ−４０のそれぞれについての中央値より下であるならば０のスコアを割り当てることと、発現レベルが、ＣＸＣＬ１３、ＯＰＮ、ＣＯＭＰ及びＹＫＬ−４０についてのそれぞれの中央値より上であるならば１のスコアを割り当てること、及び
（ｉｉ）個々のスコアを加算して全ベースラインバイオマーカースコアを得ること
を含み、
２以上の全ベースラインバイオマーカースコアが、生存期間中央値と比較して短くなった生存期間の予後予測を示し、０または１の全ベースラインバイオマーカースコアが、生存期間中央値と比較して増加した生存期間の予後予測を示す、方法。
【請求項５】
患者の全ベースラインバイオマーカースコアが２以上であり、患者が、臨床研究における候補治療剤での処置のために選択され、候補治療剤が、抗ＩＬ−１３剤、抗ＩＬ−４剤、組み合わせ抗ＩＬ−１３／抗ＩＬ−４剤、ピルフェニドン、抗ＬＯＸＬ２抗体（ＧＳ−６６２４）、Ｎ−アセチルシステイン、抗ＴＧＦ−β抗体（ＧＣ１００８）、抗αｖβ６インテグリン抗体（ＳＴＸ−１００）、抗ＣＴＧＦ抗体（ＦＧ−３０１９）、抗ＣＣＬ２抗体（ＣＮＴＯ８８８）、ソマトスタチンアナログ（ＳＯＭ２３０、オクトレオチド）、アンジオテンシンＩＩ阻害剤（ロサルタン）、一酸化炭素、サリドマイド、テトラチオモリブデート、ドキシサイクリン、ミノサイクリンおよびチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＦ１１２０）から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
抗ＩＬ−１３剤が、レブリキズマブである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
抗ＩＬ−１３剤が、３つの重鎖ＣＤＲ、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、および３つの軽鎖ＣＤＲ、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗ＩＬ−１３抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
抗ＩＬ−１３抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抗ＩＬ−１３抗体が、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抗ＩＬ−１３／抗ＩＬ−４剤が、二重特異性抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
患者におけるＩＰＦを予後予測するかまたは予後予測を援助する方法であって、患者由来の生物学的試料中の全ベースラインバイオマーカースコアを決定することとを含み、
全ベースラインバイオマーカースコアを決定することが、
（ｉ）ＭＭＰ３、ＣＯＭＰ及びＹＫＬ−４０のタンパク質発現レベルを測定することと、発現レベルが、ＭＭＰ３、ＣＯＭＰ及びＹＫＬ−４０のそれぞれについての中央値より下であるならば０のスコアを割り当てることと、発現レベルが、ＭＭＰ３およびＣＯＭＰのそれぞれについての中央値より上であるならば１のスコアを割り当てること、及び
（ｉｉ）個々のスコアを加算して全ベースラインバイオマーカースコアを得ること
を含み、
１以上の全ベースラインバイオマーカースコアが、生存期間中央値と比較して短くなった生存期間の予後予測を示し、０の全ベースラインバイオマーカースコアが、生存期間中央値と比較して増加した生存期間の予後予測を示す、方法。
【請求項１２】
生物学的試料が、血清および血漿から選択される、請求項４から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
患者の全ベースラインバイオマーカースコアが、１以上であり、患者が、臨床研究における候補治療剤での処置のために選択され、候補治療剤が、抗ＩＬ−１３剤、抗ＩＬ−４剤、組み合わせ抗ＩＬ−１３／抗ＩＬ−４剤、ピルフェニドン、抗ＬＯＸＬ２抗体（ＧＳ−６６２４）、Ｎ−アセチルシステイン、抗ＴＧＦ−β抗体（ＧＣ１００８）、抗αｖβ６インテグリン抗体（ＳＴＸ−１００）、抗ＣＴＧＦ抗体（ＦＧ−３０１９）、抗ＣＣＬ２抗体（ＣＮＴＯ８８８）、ソマトスタチンアナログ（ＳＯＭ２３０、オクトレオチド）、アンジオテンシンＩＩ阻害剤（ロサルタン）、一酸化炭素、サリドマイド、テトラチオモリブデート、ドキシサイクリン、ミノサイクリンおよびチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＦ１１２０）から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
抗ＩＬ−１３剤が、レブリキズマブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗ＩＬ−１３／抗ＩＬ−４剤が、二重特異性抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
抗ＩＬ−１３剤が、３つの重鎖ＣＤＲ、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、および３つの軽鎖ＣＤＲ、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗ＩＬ−１３抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
抗ＩＬ−１３抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗ＩＬ−１３抗体が、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＩＰＦ患者における疾患進行をモニタリングする方法であって、第１の時点および１つまたは複数のさらなる時点における患者由来の生物学的試料中の遺伝子の組み合わせの発現、または遺伝子の組み合わせによりコードされるタンパク質の組み合わせの発現を測定することを含み、遺伝子の組み合わせがＣＸＣＬ１３、ＹＫＬ−４０、ＯＰＮ、ＣＯＭＰ、ＭＭＰ３、及びＳＡＡ４から選択される少なくとも３つの遺伝子を含み、第１の時点から１つまたは複数のさらなる時点までの発現レベルの増加が、疾患進行を示す、方法。
【請求項２０】
生物学的試料が、肺組織、血清および血漿から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
生物学的試料が、肺組織または血漿であり、遺伝子の組み合わせの発現が、ＰＣＲ法またはマイクロアレイチップを用いて測定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
生物学的試料が、血清であり、タンパク質の組み合わせの発現が、イムノアッセイを用いて測定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
疾患進行をモニタされる患者は、臨床研究において候補治療剤を受けたＩＰＦ患者である、請求項１９から２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
候補治療剤が、抗ＩＬ−１３剤、抗ＩＬ−４剤、組み合わせ抗ＩＬ−１３／抗ＩＬ−４剤、ピルフェニドン、抗ＬＯＸＬ２抗体（ＧＳ−６６２４）、Ｎ−アセチルシステイン、抗ＴＧＦ−β抗体（ＧＣ１００８）、抗αｖβ６インテグリン抗体（ＳＴＸ−１００）、抗ＣＴＧＦ抗体（ＦＧ−３０１９）、抗ＣＣＬ２抗体（ＣＮＴＯ８８８）、ソマトスタチンアナログ（ＳＯＭ２３０、オクトレオチド）、アンジオテンシンＩＩ阻害剤（ロサルタン）、一酸化炭素、サリドマイド、テトラチオモリブデート、ドキシサイクリン、ミノサイクリンおよびチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＦ１１２０）から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
抗ＩＬ−１３剤が、レブリキズマブである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
抗ＩＬ−１３剤が、３つの重鎖ＣＤＲ、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、および３つの軽鎖ＣＤＲ、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗ＩＬ−１３抗体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
抗ＩＬ−１３抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗ＩＬ−１３抗体が、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
遺伝子の組み合わせは、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１７およびＣＣＬ１８から選択される遺伝子をさらに含む、請求項１または１９に記載の方法。
【請求項３０】
ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１７およびＣＣＬ１８から選択される遺伝子のタンパク質発現レベルを測定することをさらに含む、請求項４または１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／６１６，３９４号および２０１２年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／７０７，４１１号（これらはともに本明細書に参照によりそれらの全体が組み込まれている）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットでＥＦＳ−Ｗｅｂを通して提出され、本明細書に参照によりその全体が組み込まれている配列表を含む。２０１３年３月６日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ４８４１Ｒ１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔとの名称であり、２２，８６６バイトのサイズである。
【０００３】
患者における特発性肺線維症の予後を判定するための組成物、キットおよび方法が提供される。さらに、特発性肺線維症のサブタイプを診断するための組成物、キットおよび方法が提供される。特発性肺線維症を処置するための方法も提供される。
【背景技術】
【０００４】
特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、肺実質の進行性間質性線維症を特徴とし、米国でおよそ１００，０００名の患者に影響する拘束性肺疾患である（Ｒａｇｈｕら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ１７４：８１０〜８１６頁（２００６））。ＩＰＦに関連するこの間質性線維症は、肺機能の進行性の喪失を導き、ほとんどの患者において呼吸不全による死をもたらす。診断時からの生存期間中央値は、２〜３年である（Ｒａｇｈｕら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ１８３：７８８〜８２４頁（２０１１））。ＩＰＦの病因ならびに重要な分子的および病態生理学的駆動因子は、わかっていない。ＩＰＦ患者における生存期間を延長することが示された唯一の処置は、肺移植である（Ｔｈａｂｕｔら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ１５１：７６７〜７７４頁（２００９））。肺移植は、しかし、かなりの罹患率と関連し、全てのＩＰＦ患者がその候補として適当なわけでなく、適切なドナー肺が比較的不足している。多くの試みにもかかわらず、ＩＰＦ患者における無作為化プラセボ対照介入試験において生存期間を実質的に延長することが示された薬物療法は、現在までない（いくつかの介入は、いくらかの患者において肺機能の低下速度を遅くすることが示されているが）（Ｒａｇｈｕら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ１８３：７８８〜８２４頁（２０１１）；Ｒｉｃｈｅｌｄｉら、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３６５：１０７９〜１０８７頁（２０１１）；Ｒａｆｉｉら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｄｉｓ．５（１）：４８〜７３頁（２０１３））。
【０００５】
全てのＩＰＦ患者についての予後予測は差し迫っているが、疾患の軌道はかなり不均質である（Ｒａｇｈｕら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ１８３：７８８〜８２４頁（２０１１））。比較的緩慢進行性の経過を示し、１０年以上ほど長くにわたって比較的一定の速度で肺機能を喪失する患者もいれば、肺機能のより急速な低下を経験して、診断の１〜２年以内に死に屈する患者もいる。さらに、肺機能の突然の劇的な減少を典型的に特徴とする疾患の急性の増悪に苦しむ患者もいる。一般的に、これらの患者は、急性事象の後に完全に回復せず、増悪の途中またはすぐ後に頻繁に死亡する。疾患の軌道のこの不均質性は、異なるＩＰＦ患者が、その疾患の根底に異なる病態生理学的因子を有する可能性があり、これらの因子は、分子標的治療に対して異なる感受性を有する可能性があることを示唆する。
【０００６】
単一の時点からのＩＰＦ患者の疾患の軌道を予測するための候補として提案されている臨床的または生物学的マーカーは、わずかだけである（Ｌｅｙら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ１８３：４３１〜４４０頁（２０１１）；Ｌｅｙら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ１８５：６〜７頁（２０１２））。生存期間の減少は、経時的な肺機能の喪失速度と関連することが最も説得力があり、６ヶ月以内の期間に＞１０％の努力肺活量（ＦＶＣ）を喪失する患者は、より安定したＦＶＣを有する患者よりもその後の生存時間がかなりより短い（Ｃｏｌｌａｒｄら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ１６８：５３８〜５４２頁（２００３））。無作為化臨床試験に登録した１１００名を超える患者のより大きい研究により、５〜１０％の２４週ＦＶＣ低下が、その次の年に死亡する危険性の２倍を超える増加と関連するが、＞１０％の低下は、その次の年に死亡する危険性の５倍近い増加と関連したことがわかった（ｄｕ  Ｂｏｉｓら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ１８４：１３８２〜１３８９頁（２０１１））。しかし、このような判定を用いて、臨床研究での患者の登録数を階層化することの不利な点は、６ヶ月の導入期間である。ＭＭＰ７、ＩＬ−８、ＩＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１、Ｓ１００Ａ１２（Ｒｉｃｈａｒｄｓら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、ｄｏｉ：１０．１１６４／ｒｃｃｍ．２０１１０１−００５８ＯＣ（２０１１））、ＫＬ−６（Ｙｏｋｏｙａｍａら、Ｒｅｓｐｉｒｏｌｏｇｙ１１：１６４〜１６８頁（２００６））、ＣＣＬ１８（Ｐｒａｓｓｅら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ１７９：７１７〜７２３頁（２００９））、ＹＫＬ−４０（Ｋｏｒｔｈａｇｅｎら、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ１０５：１０６〜１１３頁（２０１１））およびサーファクタントタンパク質（Ｋｉｎｄｅｒら、Ｃｈｅｓｔ１３５：１５５７〜１５６３頁（２００９））を含む、単一時点にて測定されるある種の末梢血バイオマーカーが、生存期間または疾患進行について予後予測的であることが報告されている。これらのバイオマーカー研究の多くは、しかし、再現することなく小さいコホートにおいて行われており、最適以下で、首尾一貫しない、かつ／または検証されていないバイオマーカー検出技術を採用している。
【０００７】
標的にできる分子的機構に対する理解が限られていること、疾患の軌道の多様性ならびにＩＰＦ患者の非選択的集団において生存期間研究を行う時間および費用に鑑みて、ＩＰＦにおける生存期間を延長するための候補治療の可能性を判定するために、適当な力を有する臨床研究を設計することは、非常に難しい。標的にできる可能性がある経路の活性を同定し、後続の疾患進行の正確な予後予測を提供するバイオマーカーは、介入試験における登録を適切に階層化し、候補治験薬の治療価値をよりよく判定するための助けになると考えられる。
【０００８】
よって、どの患者が他の者よりも迅速に進行するか、またはどの患者が中央値と比較してよりも短くなった生存時間を有するかを決定するため、ならびにこのような決定をＩＰＦ患者についてのより効果的な臨床試験設計および処置計画に組み込むためにより効果的な手段に対する必要性が存在する。
【０００９】
よって、患者における疾患の存在を客観的に同定し、かつ／もしくは疾患を分類し、ＩＰＦの病態生理学的側面、臨床活性および生存期間についての予後を含む予後を定義するために用いることができる、分子ベースの予後予測および診断方法を含むさらなる予後予測および診断方法を得ることは、非常に有利であると考えられる。さらに、疾患の様々な臨床的および／または病態生理学的および／またはその他の生物学的指標と関連する分子ベースの診断および予後予測マーカーを得ることは、有利であると考えられる。よって、ＩＰＦおよびその他の拘束性肺障害と関連する新しい分子バイオマーカーを同定することに対する必要性が連続的に存在する。
【００１０】
本明細書に記載する発明は、上記の必要性を満たし、その他の利益を提供する。
【００１１】
インターロイキン（ＩＬ）−１３は、多面的Ｔヘルパー細胞サブクラス２（Ｔｈ２）サイトカインである。ＩＬ４と同様に、ＩＬ１３は、４α−ヘリックス疎水性束コアにより規定される３次元構造を共有するＩ型サイトカインのファミリーに属する。ＩＬ１３は、ＩＬ４とおよそ３０％のアミノ酸配列相同性を有し、ＩＬ４の特性の多くを共有する（Ｗｙｎｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２１：４２５頁（２００３））。ＩＬ４とＩＬ１３との機能的類似性は、ＩＬ１３受容体アルファ鎖−１（ＩＬ１３Ｒα１）と結合した後にＩＬ１３がＩＬ４受容体アルファ鎖（ＩＬ４Ｒ−α）と結合できるという事実にある（Ｈｅｒｓｈｅｙ、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１１：６７７頁（２００３））。ＩＬ４Ｒαは、ＩＬ４およびＩＬ１３により活性化され、Ｊａｋ１−依存性ＳＴＡＴ６リン酸化をもたらす。ＩＬ４およびＩＬ１３はともにＢ細胞増殖を促進し、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ共刺激との組み合わせでＩｇＧ４およびＩｇＥのクラススイッチを誘導する（Ｐｕｎｎｏｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：３７３０頁（１９９３）、Ｏｅｔｔｇｅｎら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０７：４２９頁（２００１））。
【００１２】
しかし、ＩＬ４と違って、ＩＬ１３は、Ｔｈ２細胞へのナイーブＴ細胞の分化に関与しない（Ｚｕｒａｗｓｋｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１５：１９頁（１９９４））。ＩＬ１３はＦｃεＲＩを上方制御し、よって肥満細胞のＩｇＥプライミングを助ける（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ、Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０２：１６５頁（１９９８））。単球／マクロファージでは、ＩＬ１３は、ＣＤ２３ならびにＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ抗原の発現を上方制御し、ＦｃγおよびＣＤ１４の発現を下方制御し、かつ抗体依存性細胞傷害を阻害する（ｄｅ  Ｗａａｌ  Ｍａｌｅｆｙｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：６３７０頁（１９９３）、Ｃｈｏｍａｒａｔら、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７：１頁（１９９８））。ＩＬ４はそうではないがＩＬ１３は、好酸球の生存期間、活性化および動員を促進する（Ｈｏｒｉｅら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．、３６：１７９（１９９７）、Ｌｕｔｔｍａｎｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：１６７８頁（１９９６）、Ｐｏｐｅら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０８：５９４頁（２００１））。ＩＬ１３は、平滑筋細胞、上皮細胞、内皮細胞および線維芽細胞のような非造血細胞に対して重要な機能も発現する。ＩＬ１３は、平滑筋の増殖およびコリン作動性収縮を増進する（Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０７：９頁（２００１））。上皮細胞では、ＩＬ１３は、ケモカイン生成の効力のある誘導因子であり（Ｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２：２４７７頁（１９９９））、粘膜毛様体分化を変更し（Ｌａｏｕｋｉｌｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０８：１８１７頁（２００１））、線毛上皮細胞の線毛運動周波数を減少させ（Ｌａｏｕｋｉｌｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０８：１８１７頁（２００１））、杯細胞異形成をもたらす（Ｚｈｕら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０３：７７９頁（１９９９）、Ｇｒｕｎｉｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：２２６１頁（１９９８））。内皮細胞では、ＩＬ１３は、好酸球の動員のために重要な血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）の効力のある誘導因子である（Ｂｏｃｈｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４：７９９（１９９５））。ヒト皮膚線維芽細胞では、ＩＬ１３は、ヒト皮膚線維芽細胞における１型コラーゲン合成を誘導する（Ｒｏｕｘら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１０３：４４４頁（１９９４））。
【００１３】
抗ＩＬ−１３抗体を含むＩＬ−１３アンタゴニストは、以前に記載されている。例えば国際特許出願パンフレットＷＯ２００５／０６２９６７を参照されたい。このような抗体は、ヒト治療薬としても開発されている。ある抗ＩＬ−１３抗体、レブリキズマブを用いるある臨床研究の結果が、Ｃｏｒｒｅｎら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：１０８８〜１０９８頁（２０１１）に記載されている。
【００１４】
特許出願および出版物を含む本明細書で引用する全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が全ての目的のために組み込まれている。
【発明の概要】
【００１５】
本発明の組成物および方法は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）の少なくとも３つの新しくかつ特異な分子表現型（本明細書において、分子サブタイプともいう）を規定したことに少なくとも部分的に基づく。本明細書で記載するＩＰＦ分子サブタイプは、サブタイプ間の示差的遺伝子発現に基づいて規定された。さらに、本発明の組成物および方法は、ＩＰＦ患者の生存期間について予後予測的である血清または血液バイオマーカーを規定したことに少なくとも部分的に基づく。このようなバイオマーカーは、本発明の方法に従う治療的処置のためにＩＰＦ患者を同定して選択するために特に有用である。用語「分子表現型」および「分子サブタイプ」は、本明細書において交換可能に用いられる。
【００１６】
したがって、一態様では、特発性肺線維症（ＩＰＦ）を予後予測するかまたは予後予測を援助する方法が提供される。ある種の実施態様では、生体試料が、患者から得られ、遺伝子の１つもしくは組み合わせの発現、または遺伝子の１つもしくは組み合わせによりコードされるタンパク質の１つもしくは組み合わせの発現が、測定される。ある種の実施態様では、遺伝子の１つもしくは組み合わせの発現レベルの上昇、または遺伝子の１つもしくは組み合わせによりコードされるタンパク質の１つもしくは組み合わせの発現の上昇は、生存期間中央値と比較して短くなった生存期間についての予後予測を示す。ある種の実施態様では、遺伝子の１つもしくは組み合わせの発現の低減、または遺伝子の１つもしくは組み合わせによりコードされるタンパク質の１つもしくは組み合わせの発現の低減は、生存期間中央値と比較して増加した生存期間についての予後予測を示す。一実施態様では、遺伝子の１つまたは組み合わせは、表２、表３、表４または表５のいずれかから選択される。一実施態様では、遺伝子の１つまたは組み合わせは、ＭＵＣＬ１、ＭＵＣ４、ＭＵＣ２０、ＰＲＲ７、ＰＲＲ１５、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＳＰＲＲ２Ｄ、ＫＲＴ５、ＫＲＴ６Ｂ、ＫＲＴ１３、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ１７、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＳＥＲＰＩＮＢ１３、ＣＬＣＡ２、ＴＲＰＶ４、ＢＢＳ５、ＭＭＰ３およびＳＡＡ４から選択される。一実施態様では、遺伝子の１つまたは組み合わせは、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ１３、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＤ１９、ＭＳ４Ａ１（ＣＤ２０）、ＢＬＫ、ＢＬＮＫ、ＦＣＲＬＡ、ＦＣＲＬ２、ＦＣＲＬ５、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１Ａ、ＣＤ１Ｂ、ＣＤ１Ｃ、ＣＤ１Ｅ、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＬＪ３、ＩＧＪ、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＬＶ３−２１、ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＨＧ１、ＩＧＫＣ、ＩＧＬＶ６−５７、ＩＧＫ＠、ＩＧＨＡ１、ＩＧＫＶ２−２４、ＩＧＫＶ１Ｄ−８、ＩＧＨＭから選択される。一実施態様では、遺伝子の１つまたは組み合わせは、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１６Ａ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＴＨＲＣ１、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ７、ＳＣＧＦ（ＣＬＥＣ１１Ａ）；ＬＯＸＬ１、ＬＯＸＬ２；ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＳＭＯ；ＳＦＲＰ２、ＤＩＯ２、ＣＤＨ１１、ＰＯＳＴＮおよびＴＧＦＢ３から選択される。ある種の実施態様では、遺伝子発現レベルは、ｍＲＮＡレベルをアッセイすることにより測定される。ある種の実施態様では、アッセイは、ＰＣＲ法および／またはマイクロアレイチップの使用を含む。一実施態様では、ＰＣＲ法は、ｑＰＣＲである。一実施態様では、ＰＣＲ法は、マルチプレックスＰＣＲである。ある種の実施態様では、キットは、ヌクレアーゼ、リガーゼおよびポリメラーゼから選択される少なくとも１つの酵素を含む。ある種の実施態様では、タンパク質発現レベルは、イムノアッセイにより測定される。ある種の実施態様では、上で定義する遺伝子の１つによりコードされる１つまたは複数のタンパク質と結合する１つまたは複数の抗体を含むイムノアッセイキットが提供される。
【００１７】
上記の方法のなおさらなる実施態様では、遺伝子の１つまたは組み合わせは、ＣＨＩ３Ｌ１（ＹＫＬ−４０）、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＯＭＰ、ＣＸＣＬ１３、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＳＡＡ４（構成性ＳＡＡ）、ＰＯＳＴＮ、およびＳＰＰ１（ＯＰＮ）から選択される。別の実施態様では、遺伝子の１つまたは組み合わせは、ＹＫＬ−４０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＭＭＰ７、ＣＸＣＬ１３、ＣＯＭＰ、ＳＡＡおよびＯＰＮから選択される。さらに別の実施態様では、遺伝子の１つまたは組み合わせは、ＳＡＡ、ＭＭＰ３、ＣＸＣＬ１３、ＯＰＮ、ＣＯＭＰおよびＹＫＬ−４０から選択される。別の実施態様では、遺伝子の１つまたは組み合わせは、ＰＯＳＴＮ、ＭＭＰ３およびＣＸＣＬ１３から選択される。なおさらなる実施態様では、ＹＫＬ−４０の発現レベルもしくはＣＣＬ１８の発現レベルおよび／またはＣＸＣＬ１３の発現レベルが測定される。なお別の実施態様では、ＭＭＰ３の発現レベルおよび／またはＳＡＡの発現レベルが測定される。ある種の実施態様では、遺伝子発現レベルは、ｍＲＮＡレベルをアッセイすることにより測定される。ある種の実施態様では、アッセイは、ＰＣＲ法および／またはマイクロアレイチップの使用を含む。一実施態様では、ＰＣＲ法は、ｑＰＣＲである。一実施態様では、ＰＣＲ法は、マルチプレックスＰＣＲである。ある種の実施態様では、キットは、ヌクレアーゼ、リガーゼおよびポリメラーゼから選択される少なくとも１つの酵素を含む。ある種の実施態様では、タンパク質発現レベルは、イムノアッセイにより測定される。ある種の実施態様では、上で定義する遺伝子の１つによりコードされる１つまたは複数のタンパク質と結合する１つまたは複数の抗体を含むイムノアッセイキットが提供される。
【００１８】
上で定義する方法のある種の実施態様では、患者は、免疫調節治療を受けている。別の実施態様では、生体試料は、肺組織、血清および血漿から選択される。
【００１９】
一態様では、上記の方法に従う遺伝子発現は、マイクロアレイにより測定される。別の態様では、遺伝子発現は、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により測定される。別の態様では、遺伝子発現は、マルチプレックスＰＣＲにより測定される。別の実施態様によると、遺伝子発現は、上記の遺伝子の１つまたは複数のタンパク質発現レベルを観察することにより測定される。別の実施態様によると、興味対象の遺伝子の発現は、健常対照または参照対象と比較した場合に、興味対象の遺伝子の相対的ｍＲＮＡレベルが、対照または参照遺伝子ｍＲＮＡのレベルの２倍より大きいならば、上昇しているとみなす。別の実施態様によると、興味対象の遺伝子の相対的ｍＲＮＡレベルは、健常対照または参照遺伝子発現レベルと比較して、３倍、倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍または３０倍より大きい。一態様では、遺伝子発現レベルは、ＰＣＲ法、マイクロアレイ法またはイムノアッセイ法から選択される方法により測定される。一実施態様では、マイクロアレイ法は、ストリンジェントな条件下で、上記の遺伝子をコードする核酸分子とハイブリダイズできる１つもしくは複数の核酸分子を有するか、または上記の遺伝子によりコードされるタンパク質の１つもしくは複数と結合できる１つもしくは複数のポリペプチド（例えばペプチドまたは抗体）を有するマイクロアレイチップの使用を含む。一実施態様では、ＰＣＲ法は、ｑＰＣＲである。一実施態様では、ＰＣＲ法は、マルチプレックスＰＣＲである。一実施態様によると、イムノアッセイ法は、患者試料中の上記の遺伝子から発現されるタンパク質を抗体と結合させることと、患者試料からのタンパク質レベルが上昇するかを決定することとを含む。ある種の実施態様では、イムノアッセイ法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。
【００２０】
別の態様では、生体試料が患者から得られ、全ベースラインバイオマーカースコアが決定される、患者におけるＩＰＦを予後予測するかまたは予後予測を援助する方法が提供される。ある種の実施態様では、全ベースラインバイオマーカースコアを決定することは、ＣＸＣＬ１３、ＯＰＮおよびＣＯＭＰの少なくとも１つのタンパク質発現レベルを測定することと、発現レベルが、それぞれＣＸＣＬ１３、ＯＰＮおよびＣＯＭＰについての中央値より下であるならば０のスコアを割り当てることと、発現レベルが、それぞれＣＸＣＬ１３、ＯＰＮおよびＣＯＭＰについての中央値より上であるならば１のスコアを割り当てることとを含み、全ベースラインバイオマーカースコアを決定することが、ＹＫＬ−４０のタンパク質発現レベルを測定することと、発現レベルが、ＹＫＬ−４０についての中央値より下であるならば０のスコアを割り当てることと、発現レベルが、ＹＫＬ−４０についての中央値より上であるならば１のスコアを割り当てることとをさらに含み、全ベースラインバイオマーカースコアを決定することが、各個別のスコアを加算して全ベースラインバイオマーカースコアを得ることをさらに含む。ある種の実施態様では、２以上の全ベースラインバイオマーカースコアは、生存期間中央値と比較して短くなった生存期間の予後予測を示す。ある種の実施態様では、０または１の全ベースラインバイオマーカースコアは、生存期間中央値と比較して増加した生存期間の予後予測を示す。ある種の実施態様では、タンパク質発現レベルは、イムノアッセイにより測定される。ある種の実施態様では、ＣＸＣＬ１３、ＯＰＮ、ＣＯＭＰおよび／またはＹＫＬ−４０によりコードされる１つまたは複数のタンパク質と結合する１つまたは複数の抗体を含むイムノアッセイキットが提供される。
【００２１】
なおまだ別の態様では、患者の全ベースラインバイオマーカースコアが上記のようにして決定して２以上であるならば、患者は、臨床研究における候補治療剤での処置のために選択される。ある種の実施態様では、候補治療剤は、抗ＩＬ−１３剤、抗ＩＬ−４剤、組み合わせ抗ＩＬ−１３／抗ＩＬ−４剤、ピルフェニドン、抗ＬＯＸＬ２抗体（ＧＳ−６６２４）、Ｎ−アセチルシステイン、抗ＴＧＦ−β抗体（ＧＣ１００８）、抗αｖβ６インテグリン抗体（ＳＴＸ−１００）、抗ＣＴＧＦ抗体（ＦＧ−３０１９）、抗ＣＣＬ２抗体（ＣＮＴＯ８８８）、ソマトスタチンアナログ（ＳＯＭ２３０、オクトレオチド）、アンジオテンシンＩＩ阻害剤（ロサルタン）、一酸化炭素、サリドマイド、テトラチオモリブデート、ドキシサイクリン、ミノサイクリンおよびチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＦ１１２０）から選択される。一実施態様では、抗ＩＬ−１３剤は、レブリキズマブである。一実施態様では、抗ＩＬ−１３／抗ＩＬ−４剤は、二重特異性抗体である。一実施態様では、抗ＩＬ−１３剤は、３つの重鎖ＣＤＲ、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、および３つの軽鎖ＣＤＲ、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗ＩＬ−１３抗体である。一実施態様では、抗ＩＬ−１３抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む。一実施態様では、抗ＩＬ−１３抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。ある種の実施態様では、患者が、上記の方法に従って決定して２以上のベースラインスコアを有することを条件として、上で示される有効量のＩＰＦ治療剤を投与する、ＩＰＦ患者を処置する方法が提供される。
【００２２】
別の態様では、患者におけるＩＰＦを予後予測するかまたは予後予測を援助する方法が提供され、ここで、生体試料が患者から得られ、全ベースラインバイオマーカースコアが決定され、全ベースラインバイオマーカースコアを決定することが、ＭＭＰ３およびＣＯＭＰの少なくとも１つのタンパク質発現レベルを測定することと、発現レベルが、それぞれＭＭＰ３およびＣＯＭＰについての中央値より下であるならば０のスコアを割り当てることと、発現レベルが、それぞれＭＭＰ３およびＣＯＭＰについての中央値より上であるならば１のスコアを割り当てることとを含み、全ベースラインバイオマーカースコアを決定することが、ＹＫＬ−４０のタンパク質発現レベルを測定することと、発現レベルが、ＹＫＬ−４０についての中央値より下であるならば０のスコアを割り当てることと、発現レベルが、ＹＫＬ−４０についての中央値より上であるならば１のスコアを割り当てることとをさらに含み、全ベースラインバイオマーカースコアを決定することが、各個別のスコアを加算して全ベースラインバイオマーカースコアを得ることをさらに含む。ある種の実施態様では、１以上の全ベースラインバイオマーカースコアは、生存期間中央値と比較して短くなった生存期間の予後予測を示す。ある種の実施態様では、０の全ベースラインバイオマーカースコアは、生存期間中央値と比較して増加した生存期間の予後予測を示す。ある種の実施態様では、タンパク質発現レベルは、イムノアッセイにより測定される。ある種の実施態様では、ＭＭＰ３、ＣＯＭＰおよび／またはＹＫＬ−４０によりコードされる１つまたは複数のタンパク質と結合する１つまたは複数の抗体を含むイムノアッセイキットが提供される。
【００２３】
なおまだ別の態様では、患者の全ベースラインバイオマーカースコアが、ＭＭＰ３、ＣＯＭＰおよび／またはＹＫＬ−４０の発現に関して上記のようにして決定して１以上であるならば、患者は、臨床研究における候補治療剤での処置のために選択される。ある種の実施態様では、候補治療剤は、抗ＩＬ−１３剤、抗ＩＬ−４剤、組み合わせ抗ＩＬ−１３／抗ＩＬ−４剤、ピルフェニドン、抗ＬＯＸＬ２抗体（ＧＳ−６６２４）、Ｎ−アセチルシステイン、抗ＴＧＦ−β抗体（ＧＣ１００８）、抗αｖβ６インテグリン抗体（ＳＴＸ−１００）、抗ＣＴＧＦ抗体（ＦＧ−３０１９）、抗ＣＣＬ２抗体（ＣＮＴＯ８８８）、ソマトスタチンアナログ（ＳＯＭ２３０、オクトレオチド）、アンジオテンシンＩＩ阻害剤（ロサルタン）、一酸化炭素、サリドマイド、テトラチオモリブデート、ドキシサイクリン、ミノサイクリンおよびチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＦ１１２０）から選択される。一実施態様では、抗ＩＬ−１３剤は、レブリキズマブである。一実施態様では、抗ＩＬ−１３／抗ＩＬ−４剤は、二重特異性抗体である。一実施態様では、抗ＩＬ−１３剤は、３つの重鎖ＣＤＲ、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、および３つの軽鎖ＣＤＲ、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗ＩＬ−１３抗体である。一実施態様では、抗ＩＬ−１３抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む。一実施態様では、抗ＩＬ−１３抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。ある種の実施態様では、患者が、上記の方法に従って決定して１以上のベースラインスコアを有することを条件として、上で示される有効量のＩＰＦ治療剤を投与する、ＩＰＦ患者を処置する方法が提供される。
【００２４】
別の態様では、対象におけるＩＰＦの分子サブタイプを診断する方法が提供される。ある種の実施態様では、方法は、対象から得られた生体試料中の遺伝子の１つもしくは組み合わせの発現、または遺伝子の１つもしくは組み合わせによりコードされるタンパク質の１つもしくは組み合わせの発現を測定することを含む。ある種の実施態様では、遺伝子の１つまたは組み合わせは、ＭＵＣＬ１、ＭＵＣ４、ＭＵＣ２０、ＰＲＲ７、ＰＲＲ１５、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＳＰＲＲ２Ｄ、ＫＲＴ５、ＫＲＴ６Ｂ、ＫＲＴ１３、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ１７、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＳＥＲＰＩＮＢ１３、ＣＬＣＡ２、ＴＲＰＶ４、ＢＢＳ５、ＭＭＰ３およびＳＡＡ４から選択され、遺伝子の１つもしくは組み合わせの発現の上昇、またはタンパク質の１つもしくは組み合わせの発現の上昇は、ＩＰＦ分子サブタイプを示す。ある種の実施態様では、遺伝子の１つまたは組み合わせは、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ１３、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＤ１９、ＭＳ４Ａ１（ＣＤ２０）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡ）、ＢＬＫ、ＢＬＮＫ、ＦＣＲＬＡ、ＦＣＲＬ２、ＦＣＲＬ５、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１Ａ、ＣＤ１Ｂ、ＣＤ１Ｃ、ＣＤ１Ｅ、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＬＪ３、ＩＧＪ、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＬＶ３−２１、ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＨＧ１、ＩＧＫＣ、ＩＧＬＶ６−５７、ＩＧＫ＠（免疫グロブリンカッパ遺伝子座）、ＩＧＨＡ１、ＩＧＫＶ２−２４、ＩＧＫＶ１Ｄ−８、ＩＧＨＭから選択され、遺伝子の１つもしくは組み合わせの発現の上昇、またはタンパク質の１つもしくは組み合わせの発現の上昇は、ＩＰＦ分子サブタイプを示す。ある種の実施態様では、遺伝子の１つもしくは組み合わせは、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１６Ａ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＴＨＲＣ１、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ７、ＳＣＧＦ（ＣＬＥＣ１１Ａ）；ＬＯＸＬ１、ＬＯＸＬ２；ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＳＭＯ；ＳＦＲＰ２、ＤＩＯ２、ＣＤＨ１１、ＰＯＳＴＮおよびＴＧＦＢ３から選択され、遺伝子の１つもしくは組み合わせの発現の上昇、またはタンパク質の１つもしくは組み合わせの発現の上昇は、ＩＰＦ分子サブタイプを示す。ある種の実施態様では、遺伝子発現レベルは、ｍＲＮＡレベルをアッセイすることにより測定される。ある種の実施態様では、アッセイは、ＰＣＲ法および／またはマイクロアレイチップの使用を含む。一実施態様では、ＰＣＲ法は、ｑＰＣＲである。一実施態様では、ＰＣＲ法は、マルチプレックスＰＣＲである。ある種の実施態様では、キットは、ヌクレアーゼ、リガーゼおよびポリメラーゼから選択される少なくとも１つの酵素を含む。ある種の実施態様では、タンパク質発現レベルは、イムノアッセイにより測定される。ある種の実施態様では、上で同定する遺伝子の１つによりコードされる１つまたは複数のタンパク質と結合する１つまたは複数の抗体を含むイムノアッセイキットが提供される。
【００２５】
別の態様では、上記の方法のいずれかに従って用いるための生体試料は、肺組織、全血または血清である。ある種の実施態様では、生体試料は、肺組織または全血であり、遺伝子の１つまたは組み合わせの発現は、ＰＣＲ法またはマイクロアレイチップを用いて測定される。ある種の実施態様では、生体試料は、血清であり、タンパク質の１つまたは組み合わせの発現は、イムノアッセイを用いて測定される。
【００２６】
なおまだ別の態様では、患者におけるＩＰＦを処置する方法が提供される。ある種の実施態様では、方法は、遺伝子の１つもしくは組み合わせの発現の上昇、または遺伝子の１つもしくは組み合わせによりコードされるタンパク質の１つもしくは組み合わせの発現が、患者から得られた生体試料中で検出されたことを条件として、有効量のＩＰＦ治療剤を患者に投与してＩＰＦを処置することを含む。一実施態様では、遺伝子の１つまたは組み合わせは、ＭＵＣＬ１、ＭＵＣ４、ＭＵＣ２０、ＰＲＲ７、ＰＲＲ１５、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＳＰＲＲ２Ｄ、ＫＲＴ５、ＫＲＴ６Ｂ、ＫＲＴ１３、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ１７、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＳＥＲＰＩＮＢ１３、ＣＬＣＡ２、ＴＲＰＶ４、ＢＢＳ５、ＭＭＰ３およびＳＡＡ４から選択される。一実施態様では、遺伝子の１つまたは組み合わせは、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ１３、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＤ１９、ＭＳ４Ａ１（ＣＤ２０）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡ）、ＢＬＫ、ＢＬＮＫ、ＦＣＲＬＡ、ＦＣＲＬ２、ＦＣＲＬ５、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１Ａ、ＣＤ１Ｂ、ＣＤ１Ｃ、ＣＤ１Ｅ、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＬＪ３、ＩＧＪ、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＬＶ３−２１、ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＨＧ１、ＩＧＫＣ、ＩＧＬＶ６−５７、ＩＧＫ＠（免疫グロブリンカッパ遺伝子座）、ＩＧＨＡ１、ＩＧＫＶ２−２４、ＩＧＫＶ１Ｄ−８、ＩＧＨＭから選択される。一実施態様では、遺伝子の１つまたは組み合わせは、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１６Ａ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＴＨＲＣ１、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ７、ＳＣＧＦ（ＣＬＥＣ１１Ａ）；ＬＯＸＬ１、ＬＯＸＬ２；ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＳＭＯ；ＳＦＲＰ２、ＤＩＯ２、ＣＤＨ１１、ＰＯＳＴＮおよびＴＧＦＢ３から選択される。別の実施態様では、遺伝子の１つまたは組み合わせは、ＣＨＩ３Ｌ１（ＹＫＬ−４０）、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＯＭＰ、ＣＸＣＬ１３、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＳＡＡ４（構成性ＳＡＡ）、ＰＯＳＴＮ、およびＳＰＰ１（ＯＰＮ）から選択される。別の実施態様では、遺伝子の１つまたは組み合わせは、ＹＫＬ−４０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＭＭＰ７、ＣＸＣＬ１３、ＣＯＭＰ、ＳＡＡおよびＯＰＮから選択される。まだ別の実施態様では、遺伝子の１つまたは組み合わせは、ＳＡＡ、ＭＭＰ３、ＣＸＣＬ１３、ＯＰＮ、ＣＯＭＰおよびＹＫＬ−４０から選択される。別の実施態様では、遺伝子の１つまたは組み合わせは、ＰＯＳＴＮ、ＭＭＰ３およびＣＸＣＬ１３から選択される。まだ別の実施態様では、ＹＫＬ−４０の発現レベルもしくはＣＣＬ１８の発現レベルおよび／またはＣＸＣＬ１３の発現レベルが測定される。なお別の実施態様では、ＭＭＰ３の発現レベルおよび／またはＳＡＡの発現レベルが測定される。ある種の実施態様では、遺伝子発現レベルは、ｍＲＮＡレベルをアッセイすることにより測定される。ある種の実施態様では、アッセイは、ＰＣＲ法および／またはマイクロアレイチップの使用を含む。一実施態様では、ＰＣＲ法は、ｑＰＣＲである。一実施態様では、ＰＣＲ法は、マルチプレックスＰＣＲである。ある種の実施態様では、キットは、ヌクレアーゼ、リガーゼおよびポリメラーゼから選択される少なくとも１つの酵素を含む。ある種の実施態様では、タンパク質発現レベルは、イムノアッセイにより測定される。ある種の実施態様では、上で同定する遺伝子の１つによりコードされる１つまたは複数のタンパク質と結合する１つまたは複数の抗体を含むイムノアッセイキットが提供される。ある種の実施態様では、ＩＰＦ治療剤は、抗ＩＬ−１３剤、抗ＩＬ−４剤、組み合わせ抗ＩＬ−１３／抗ＩＬ−４剤、ピルフェニドン、抗ＬＯＸＬ２抗体（ＧＳ−６６２４）、Ｎ−アセチルシステイン、抗ＴＧＦ−β抗体（ＧＣ１００８）、抗αｖβ６インテグリン抗体（ＳＴＸ−１００）、抗ＣＴＧＦ抗体（ＦＧ−３０１９）、抗ＣＣＬ２抗体（ＣＮＴＯ８８８）、ソマトスタチンアナログ（ＳＯＭ２３０、オクトレオチド）、アンジオテンシンＩＩ阻害剤（ロサルタン）、一酸化炭素、サリドマイド、テトラチオモリブデート、ドキシサイクリン、ミノサイクリンおよびチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＦ１１２０）である。ある種の実施態様では、ＩＰＦ治療剤は、抗ＩＬ−１３抗体である。一実施態様では、抗ＩＬ−１３剤は、３つの重鎖ＣＤＲ、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、および３つの軽鎖ＣＤＲ、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗ＩＬ−１３抗体である。一実施態様では、抗ＩＬ−１３抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む。一実施態様では、抗ＩＬ−１３抗体（レブリキズマブ）は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。ある種の実施態様では、レブリキズマブは、４週間ごとに１回、１２５ｍｇ、２５０ｍｇおよび５００ｍｇから選択される均一用量にて皮下投与される。一実施態様では、レブリキズマブは、４週間ごとに１回、２５０ｍｇの均一用量にて皮下投与される。
【００２７】
さらなる態様では、上記の方法に従って短くなった生存期間の予後予測を有すると以前に決定されたＩＰＦ患者を処置する方法が提供される。ある種のこのような実施態様では、有効量のＩＰＦ治療剤が投与される。一実施態様では、ＩＰＦ治療剤は、抗ＩＬ−１３剤、抗ＩＬ−４剤、組み合わせ抗ＩＬ−１３／抗ＩＬ−４剤、ピルフェニドン、抗ＬＯＸＬ２抗体（ＧＳ−６６２４）、Ｎ−アセチルシステイン、抗ＴＧＦ−β抗体（ＧＣ１００８）、抗αｖβ６インテグリン抗体（ＳＴＸ−１００）、抗ＣＴＧＦ抗体（ＦＧ−３０１９）、抗ＣＣＬ２抗体（ＣＮＴＯ８８８）、ソマトスタチンアナログ（ＳＯＭ２３０、オクトレオチド）、アンジオテンシンＩＩ阻害剤（ロサルタン）、一酸化炭素、サリドマイド、テトラチオモリブデート、ドキシサイクリン、ミノサイクリンおよびチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＦ１１２０）から選択される。一実施態様では、抗ＩＬ−１３剤は、３つの重鎖ＣＤＲ、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、および３つの軽鎖ＣＤＲ、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗ＩＬ−１３抗体である。一実施態様では、抗ＩＬ−１３抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む。一実施態様では、抗ＩＬ−１３抗体（レブリキズマブ）は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。一実施態様では、抗ＩＬ−１３抗体は、４週間ごとに１回、１２５ｍｇ、２５０ｍｇおよび５００ｍｇから選択される均一用量にて皮下投与される。一実施態様では、抗ＩＬ−１３抗体は、４週間ごとに１回、２５０ｍｇの均一用量にて皮下投与される。
【００２８】
なおまださらなる態様では、上記の抗ＩＬ−１３抗体またはレブリキズマブでＩＰＦ患者を処置する方法は、処置なしと比較して、疾患進行までの時間を延長し、ここで、疾患進行は、以下の１または複数の最初の発生により示される：（ｉ）死亡；（ｉｉ）非待機的入院；（ｉｉｉ）ＦＶＣのベースラインから１０％以上の減少。一実施態様では、疾患進行は、第５２週にてＤＬＣＯのベースラインから≧１５％の減少によりさらに示される。一実施態様では、上記のような抗ＩＬ−１３抗体またはレブリキズマブを用いる処置は、処置後５２週間でベースラインから１５％未満のＤＬＣＯの減少をもたらす。一実施態様では、このような処置は、処置なしと比較して、処置後５２週間で６分間歩行において患者が歩く距離のベースラインからの低下のより少ない低減をもたらす。一実施態様では、歩く距離のベースラインからの低下の低減は、５０メートルより大きいか、または３０メートルより大きいか、または１０メートルより大きい。ある種の実施態様では、処置は、処置なしと比較して、急性ＩＰＦ増悪の最初の事象またはＩＰＦ悪化の最初の事象までの時間を延長する。
【００２９】
一態様では、抗ＩＬ−１３抗体またはレブリキズマブを投与することによりＩＰＦ患者における疾患進行までの時間を延長する方法が提供される。ある種の実施態様では、処置された患者における疾患進行までの時間が、処置なしと比較される。ある種の実施態様では、疾患進行は、以下の１または複数の最初の発生により示される：（ｉ）死亡；（ｉｉ）非待機的入院；（ｉｉｉ）ＦＶＣのベースラインから１０％以上の減少。一実施態様では、疾患進行は、第５２週にてＤＬＣＯのベースラインから≧１５％の減少によりさらに示される。一実施態様では、上記のような抗ＩＬ−１３抗体またはレブリキズマブを用いる処置は、処置後５２週間でベースラインから１５％未満のＤＬＣＯの減少をもたらす。一実施態様では、このような処置は、処置なしと比較して、処置後５２週間で６分間歩行において患者が歩く距離のベースラインからの低下のより少ない低減をもたらす。一実施態様では、歩く距離のベースラインからの低下における低減は、５０メートルより大きいか、または３０メートルより大きいか、または１０メートルより大きい。ある種の実施態様では、処置は、処置なしと比較して、急性ＩＰＦ増悪の最初の事象またはＩＰＦ悪化の最初の事象までの時間を延長する。
【００３０】
まだなお別の態様では、ＩＰＦ患者における疾患進行をモニタリングする方法が提供される。ある種の実施態様では、方法は、第１の時点および１または複数のさらなる時点にて患者から生体試料を得ることと、生体試料中の遺伝子の１つもしくは組み合わせの発現、または遺伝子の１つもしくは組み合わせによりコードされるタンパク質の１つもしくは組み合わせの発現を測定することとを含み、遺伝子の１つまたは組み合わせは、表２、表３、表４または表５のいずれかから選択され、第１の時点から１または複数のさらなる時点までの発現レベルの変化は、疾患進行を示す。一実施態様では、遺伝子の１つもしくは組み合わせまたはタンパク質の１つもしくは組み合わせは、ＭＵＣＬ１、ＭＵＣ４、ＭＵＣ２０、ＰＲＲ７、ＰＲＲ１５、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＳＰＲＲ２Ｄ、ＫＲＴ５、ＫＲＴ６Ｂ、ＫＲＴ１３、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ１７、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＳＥＲＰＩＮＢ１３、ＣＬＣＡ２、ＴＲＰＶ４、ＢＢＳ５、ＭＭＰ３およびＳＡＡ４から選択される。一実施態様では、遺伝子の１つまたは組み合わせは、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ１３、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＤ１９、ＭＳ４Ａ１（ＣＤ２０）、ＢＬＫ、ＢＬＮＫ、ＦＣＲＬＡ、ＦＣＲＬ２、ＦＣＲＬ５、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１Ａ、ＣＤ１Ｂ、ＣＤ１Ｃ、ＣＤ１Ｅ、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＬＪ３、ＩＧＪ、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＬＶ３−２１、ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＨＧ１、ＩＧＫＣ、ＩＧＬＶ６−５７、ＩＧＫ＠、ＩＧＨＡ１、ＩＧＫＶ２−２４、ＩＧＫＶ１Ｄ−８、ＩＧＨＭから選択される。一実施態様では、遺伝子の１つもしくは組み合わせまたはタンパク質の１つもしくは組み合わせは、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１６Ａ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＴＨＲＣ１、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ７、ＳＣＧＦ（ＣＬＥＣ１１Ａ）；ＬＯＸＬ１、ＬＯＸＬ２；ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＳＭＯ；ＳＦＲＰ２、ＤＩＯ２、ＣＤＨ１１、ＰＯＳＴＮおよびＴＧＦＢ３から選択される。一実施態様では、遺伝子の１つもしくは組み合わせまたはタンパク質の１つもしくは組み合わせは、ＣＨＩ３Ｌ１（ＹＫＬ−４０）、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＯＭＰ、ＣＸＣＬ１３、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＳＡＡ４（構成性ＳＡＡ）、ＰＯＳＴＮ、およびＳＰＰ１（ＯＰＮ）から選択される。ある種の実施態様では、生体試料は、肺組織、血清および血漿から選択される。ある種の実施態様では、遺伝子発現レベルは、ｍＲＮＡレベルをアッセイすることにより測定される。ある種の実施態様では、アッセイは、ＰＣＲ法および／またはマイクロアレイチップの使用を含む。一実施態様では、ＰＣＲ法は、ｑＰＣＲである。一実施態様では、ＰＣＲ法は、マルチプレックスＰＣＲである。ある種の実施態様では、キットは、ヌクレアーゼ、リガーゼおよびポリメラーゼから選択される少なくとも１つの酵素を含む。ある種の実施態様では、タンパク質発現レベルは、イムノアッセイにより測定される。ある種の実施態様では、上で同定する遺伝子の１つによりコードされる１つまたは複数のタンパク質と結合する１つまたは複数の抗体を含むイムノアッセイキットが提供される。
【００３１】
別の態様では、上記の疾患進行をモニタリングする方法は、患者を臨床研究において候補治療剤で処置することをさらに含む。ある種の実施態様では、治療剤は、抗ＩＬ−１３剤、抗ＩＬ−４剤、組み合わせ抗ＩＬ−１３／抗ＩＬ−４剤、ピルフェニドン、抗ＬＯＸＬ２抗体（ＧＳ−６６２４）、Ｎ−アセチルシステイン、抗ＴＧＦ−β抗体（ＧＣ１００８）、抗αｖβ６インテグリン抗体（ＳＴＸ−１００）、抗ＣＴＧＦ抗体（ＦＧ−３０１９）、抗ＣＣＬ２抗体（ＣＮＴＯ８８８）、ソマトスタチンアナログ（ＳＯＭ２３０、オクトレオチド）、アンジオテンシンＩＩ阻害剤（ロサルタン）、一酸化炭素、サリドマイド、テトラチオモリブデート、ドキシサイクリン、ミノサイクリンおよびチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＦ１１２０）から選択される。一実施態様では、抗ＩＬ−１３剤は、３つの重鎖ＣＤＲ、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、および３つの軽鎖ＣＤＲ、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗ＩＬ−１３抗体である。一実施態様では、抗ＩＬ−１３抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む。一実施態様では、抗ＩＬ−１３抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】実施例１に記載するようなＩＰＦ患者における遺伝子発現の不均質性を示す。ＩＰＦと対照との間の２４９０のＤＥマイクロアレイプローブの教師なし２元階層的クラスタリングは、ＩＰＦの診断により主に規定される３つの主要クラスタ（群１クラスタ、群２クラスタおよび群３クラスタ）を示した。
【図１Ｂ】実施例１に記載するようなＩＰＦ患者における遺伝子発現の不均質性を示す。群１クラスタの再クラスタリングは、不均質な遺伝子発現サインを同定し、ここでは、ＩＰＦ患者の大多数（対照はほとんどいない）が、気管支上皮に特徴的な遺伝子を高いレベルで発現した（「細気管支サイン」）。
【図１Ｃ】実施例１に記載するようなＩＰＦ患者における遺伝子発現の不均質性を示す。群２クラスタの再クラスタリングは、不均質な遺伝子発現サインを同定し、ここでは、ＩＰＦ患者の多く（対照はいない）が、リンパ濾胞に特徴的な遺伝子を高いレベルで発現した（「リンパ系サイン」）。
【図１Ｄ】実施例１に記載するようなＩＰＦ患者における遺伝子発現の不均質性を示す。群３クラスタの再クラスタリングは、不均質な遺伝子発現サインを同定し、ここでは、ＩＰＦ患者は、筋線維芽細胞への線維芽細胞分化に特徴的な遺伝子を中程度および高いレベルで発現したが、対照の対象は、低いレベルで発現した（「線維芽細胞サイン」、本明細書において「筋線維芽細胞サイン」ともいう）。
【図１Ｅ】実施例１に記載するようなＩＰＦ患者における遺伝子発現の不均質性を示す。細気管支、リンパ系および筋線維芽細胞遺伝子発現サインが、互いに同時に変動しないことを示すプロット。
【図２−１】実施例１に記載するようにしてＩＰＦ肺外植片から得た生検組織の隣接凍結切片に対する免疫組織化学（ＩＨＣ）を示す。Ａはヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、Ｂはトリクローム染色を、Ｃは抗ケラチン１４染色を、Ｄは過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色を、それぞれ示している。
【図２−２】実施例１に記載するようにしてＩＰＦ肺外植片から得た生検組織の隣接凍結切片に対する免疫組織化学（ＩＨＣ）を示す。Ｅは濃く染色された核（矢じり）を有する細胞の凝集体を示すＨ＆Ｅ染色を、Ｆは凝集体を囲むが、凝集体の中には存在しないコラーゲン沈着（矢じり）を示すトリクローム染色を、Ｇは凝集体が高濃度のＣＤ２０陽性Ｂ細胞を有することを示す抗ＣＤ２０染色を、Ｈは、Ｇにおいて（＊）で印をつけた領域のより高い倍率を、Ｉは細気管支様を呈する嚢胞の抗ケラチン１４染色を、Ｊはリンパ系凝集体の抗ＣＤ２０染色を、それぞれ示している。
【図３Ａ】実施例１に記載するようにしてｑＰＣＲにより測定した、ＩＰＦ患者および対照から得られた肺組織における候補バイオマーカー遺伝子の遺伝子発現を示す。ペリオスチン遺伝子発現を示している。
【図３Ｂ】実施例１に記載するようにしてｑＰＣＲにより測定した、ＩＰＦ患者および対照から得られた肺組織における候補バイオマーカー遺伝子の遺伝子発現を示す。ＣＣＬ１３遺伝子発現を示している。
【図３Ｃ】実施例１に記載するようにしてｑＰＣＲにより測定した、ＩＰＦ患者および対照から得られた肺組織における候補バイオマーカー遺伝子の遺伝子発現を示す。ＣＣＬ１８遺伝子発現を示している。
【図３Ｄ】実施例１に記載するようにしてｑＰＣＲにより測定した、ＩＰＦ患者および対照から得られた肺組織における候補バイオマーカー遺伝子の遺伝子発現を示す。オステオポンチン遺伝子発現を示している。
【図３Ｅ】実施例１に記載するようにしてｑＰＣＲにより測定した、ＩＰＦ患者および対照から得られた肺組織における候補バイオマーカー遺伝子の遺伝子発現を示す。ＣＯＭＰ遺伝子発現を示している。
【図３Ｆ】実施例１に記載するようにしてｑＰＣＲにより測定した、ＩＰＦ患者および対照から得られた肺組織における候補バイオマーカー遺伝子の遺伝子発現を示す。ＹＫＬ−４０遺伝子発現を示している。
【図３Ｇ】実施例１に記載するようにしてｑＰＣＲにより測定した、ＩＰＦ患者および対照から得られた肺組織における候補バイオマーカー遺伝子の遺伝子発現を示す。ＭＭＰ７遺伝子発現を示している。
【図４】実施例１に記載するようにして、中央値レベル（６９％）での予測ＦＶＣパーセントにより階層化したＩＰＦ生存期間を示す。
【図５−１】実施例１に記載するような個別および組み合わせの予後予測バイオマーカーについてのＩＰＦ生存期間のコックスモデルを示す。Ａは血清ＣＸＣＬ１３レベルによるＩＰＦ生存期間のコックスモデルを、Ｂは血清ＹＫＬ−４０レベルによるＩＰＦ生存期間のコックスモデルを、それぞれ示している。
【図５−２】実施例１に記載するような個別および組み合わせの予後予測バイオマーカーについてのＩＰＦ生存期間のコックスモデルを示す。Ｃは血清ＣＯＭＰレベルによるＩＰＦ生存期間のコックスモデルを、Ｄは血漿ＯＰＮレベルによるＩＰＦ生存期間のコックスモデルを、それぞれ示している。
【図６Ａ】実施例１に記載するような６つのバイオマーカー（ＳＡＡ、ＭＭＰ３、ＣＸＣＬ１３、ＯＰＮ、ＣＯＭＰおよびＹＫＬ−４０）の可能な組み合わせの受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を示す。６つのバイオマーカーのそれぞれの可能な組み合わせのＲＯＣ分析は、試料採取後１、２および３年にわたる死亡を予測することを示した。
【図６Ｂ】実施例１に記載するような６つのバイオマーカー（ＳＡＡ、ＭＭＰ３、ＣＸＣＬ１３、ＯＰＮ、ＣＯＭＰおよびＹＫＬ−４０）の可能な組み合わせの受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を示す。６つのバイオマーカー（ＳＡＡ、ＭＭＰ３、ＣＸＣＬ１３、ＯＰＮ、ＣＯＭＰおよびＹＫＬ−４０）の全ての可能な組み合わせの２年でのＲＯＣ分析の曲線下面積および期間重要性を示した。
【図７】実施例１に記載するようなＹＫＬ−４０とＯＰＮとＣＯＭＰとＣＸＣＬ１３との組み合わせについてのベースラインバイオマーカースコアによるＩＰＦ生存期間の組み合わせコックスモデルを示す。
【図８】実施例１に記載するようなバイオマーカーＭＭＰ３、ＣＯＭＰおよびＹＫＬ−４０の０、１、２または３つ全ての中央値レベルより上を発現するＩＰＦ患者のカプラン−マイヤー生存期間プロットを示す。
【図９】実施例２に記載するような対照患者（左側）およびＩＰＦ患者（右側）からの肺組織におけるＩＬ−１３Ｒａ２発現についての定量ＰＣＲの結果を示す。
【図１０】実施例２に記載するようなＩＭＲ９０初代肺線維芽細胞におけるＩＬ−４またはＩＬ−１３によるＩＬ１３Ｒα２発現の誘導を示す。
【図１１Ａ】実施例２に記載するようなＩＬ１３Ｒα２発現を示す。
【図１１Ｂ】ＩＬ−１３の存在または非存在下でのＣＣＬ２６およびペリオスチン発現に対するＴＮＦαの影響を示す。
【図１２】図に示しかつ実施例２に記載するようにしてＴＮＦαで前処理し、次いで様々なＩＬ−１３および／またはＩＬ−４サイトカインならびに遮断抗ＩＬ−１３  ｍＡｂ１および／またはｍＡｂ２抗体処理に供したＩＭＲ９０細胞におけるＣＣＬ２６およびペリオスチン（ＰＯＳＴＮ）の遺伝子発現レベルを示す。
【図１３】実施例２に記載するようにして、ＩＬ−１３（Ａ）またはＩＬ−１３およびＩＬ−４（Ｂ）で処理し、次いで抗ＩＬ−１３  ｍＡｂ２または抗ＩＬ−１３  ｍＡｂ２のいずれかでさらに処理したＩＭＲ９０細胞からのマイクロアレイデータを示す。
【図１４】実施例２に記載するようなＩＰＦコホートにおけるＧＬＩ１発現を示す。
【図１５】実施例２に記載するような添加した様々な因子に応答する初代肺線維芽細胞（ｍａｔｒｉｇｅｌ上で培養）におけるＧＬＩ１遺伝子発現を示す。
【図１６】図に示しかつ実施例２に記載するような添加した様々な因子に応答する初代肺線維芽細胞（ｍａｔｒｉｇｅｌ上で培養）におけるＴＧＦβ１遺伝子発現（Ａ）およびＧＬＩ１遺伝子発現（Ｂ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
ある種の定義
そうでないと定義しない限り、本明細書で用いる当該技術分野の全ての用語、表記およびその他の科学的術語は、本発明が関わる当業者に共通して理解される意味を有することを意図する。共通に理解される意味を有する用語を、明確性および容易に参照できるようにするために本明細書において定義する場合があり、このような定義を本明細書に含めることは、当該技術において一般的に理解されるものに対して実質的な差を示すと必ずしも解釈されるべきでない。本明細書で記載または参照する技術および手順は、当業者により、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に記載されるような広く利用される分子クローニング方法論のような従来の方法論を用いて全般的によく理解され、一般的に採用されている。適当であれば、市販で入手可能なキットおよび試薬の使用を伴う手順は、そうでないと示さない限り、製造者が定義するプロトコールおよび／またはパラメータに従って全般的に行われる。
【００３４】
「細気管支遺伝子サイン」、「細気管支サイン」および「細気管支遺伝子発現サイン」は、本明細書で交換可能に用いられ、表２に示す遺伝子の組み合わせまたは部分組み合わせ（その遺伝子発現パターンは、ある種のＩＰＦ患者と相関する）のことをいう。遺伝子は、ＭＵＣＬ１、ＭＵＣ４、ＭＵＣ２０、ＰＲＲ７、ＰＲＲ１５、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＳＰＲＲ２Ｄ、ＫＲＴ５、ＫＲＴ６Ｂ、ＫＲＴ１３、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ１７、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＳＥＲＰＩＮＢ１３、ＣＬＣＡ２、ＴＲＰＶ４、ＢＢＳ５、ＭＭＰ３、ＳＡＡ４（構成性ＳＡＡをコードする）を含む。細気管支遺伝子サインのポリペプチドは、本明細書で記載するように「標的にされるポリペプチド」である。
【００３５】
「リンパ系遺伝子サイン」、「リンパ系サイン」および「リンパ系遺伝子発現サイン」、「リンパ濾胞遺伝子サイン」、「リンパ濾胞サイン」および「リンパ濾胞遺伝子発現サイン」は、本明細書で交換可能に用いられ、表３に示す遺伝子の組み合わせまたは部分組み合わせ（その遺伝子発現パターンは、ある種のＩＰＦ患者と相関する）のことをいう。遺伝子は、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ１３、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＤ１９、ＭＳ４Ａ１（ＣＤ２０）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡ）、ＢＬＫ、ＢＬＮＫ、ＦＣＲＬＡ、ＦＣＲＬ２、ＦＣＲＬ５、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１Ａ、ＣＤ１Ｂ、ＣＤ１Ｃ、ＣＤ１Ｅ、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＬＪ３、ＩＧＪ、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＬＶ３−２１、ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＨＧ１、ＩＧＫＣ、ＩＧＬＶ６−５７、ＩＧＫ＠（免疫グロブリンカッパ遺伝子座）、ＩＧＨＡ１、ＩＧＫＶ２−２４、ＩＧＫＶ１Ｄ−８、ＩＧＨＭを含む。リンパ濾胞遺伝子サインのポリペプチドは、本明細書で記載するように「標的にされるポリペプチド」である。
【００３６】
「筋線維芽細胞遺伝子サイン」、「筋線維芽細胞サイン」および「筋線維芽細胞遺伝子発現サイン」、「線維芽細胞遺伝子サイン」、「線維芽細胞サイン」および「線維芽細胞遺伝子発現サイン」は、本明細書で交換可能に用いられ、表４に示す遺伝子の組み合わせまたは部分組み合わせ（その遺伝子発現パターンは、ある種のＩＰＦ患者と相関する）のことをいう。遺伝子は、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１６Ａ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＴＨＲＣ１、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ７、ＳＣＧＦ（ＣＬＥＣ１１Ａ）；ＬＯＸＬ１、ＬＯＸＬ２；ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＳＭＯ；ＳＦＲＰ２、ＤＩＯ２、ＣＤＨ１１、ＰＯＳＴＮおよびＴＧＦＢ３を含む。筋線維芽細胞遺伝子サインのポリペプチドは、本明細書で記載するように「標的にされるポリペプチド」である。
【００３７】
本明細書で用いる場合、用語「標的にされるポリペプチド」は、「天然配列」ポリペプチドおよび変異体のことをいう（これらは、本明細書でさらに定義する）。
【００３８】
「天然配列」ポリペプチドは、天然に由来する対応するポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。よって、用語「天然配列ポリペプチド」は、それらに限定されないが、選択的スプライシングされた形、アイソフォームおよび多型を含む、ポリペプチドの自然に存在する短縮された形、増加した形およびフレームシフトした形を含む。
【００３９】
「自然に存在する変異体」は、参照ポリペプチドと少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを意味し、自然に存在する参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を保持する。自然に存在する変異体は、参照ポリペプチドと少なくとも約６５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する変異体ポリペプチドを含むことができる。
【００４０】
本明細書で交換可能に用いる用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーのことをいい、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変ヌクレオチドもしくは塩基および／またはそれらのアナログ、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによりポリマーに組み込むことができる任意の基質であることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログのような改変ヌクレオチドを含むことがある。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する改変は、ポリマーの組み立ての前または後に付与してよい。ヌクレオチドの配列には、非ヌクレオチド成分が介在することがある。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションによるように、重合後にさらに改変されることがある。その他の型の改変は、例えば、１つまたは複数の自然に存在するヌクレオチドのアナログでの「キャップ」置換、ヌクレオチド間改変、例えば非荷電連結（例えばメチルホスホン酸、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）および荷電連結（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有するもの、ペンダント部分を有するもの、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）、インターカレート物質を有するもの（例えばアクリジン、ソラレンなど）、キレート剤を有するもの（例えば金属、放射活性金属、ホウ素、酸化的金属など）、アルキル化剤を有するもの、改変連結を有するもの（例えばアルファアノマー核酸など）、ならびに非改変形のポリヌクレオチドを含む。さらに、糖の中に通常存在するヒドロキシ基のいずれも、例えばホスホネート基、リン酸基により置き換えられるか、標準的な保護基により保護されるか、もしくはさらなるヌクレオチドとのさらなる連結を準備するために活性化されてよいか、または固体支持体にコンジュゲートされてよい。５’および３’末端ＯＨは、リン酸化されるか、またはアミンもしくは１から２０までの炭素原子の有機キャッピング基部分で置換できる。その他のヒドロキシは、標準的な保護基に誘導体化してもよい。ポリヌクレオチドは、例えば２’−Ｏ−メチル−２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖アナログ、α−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースもしくはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログおよび塩基脱落ヌクレオシドアナログ、例えばメチルリボシドを含む、当該技術において一般的に知られるリボースまたはデオキシリボース糖の類似の形を含有することもできる。１つまたは複数のホスホジエステル連結は、代替の連結基で置き換えてよい。これらの代替の連結基は、それらに限定されないが、リン酸がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）（ここで、それぞれのＲまたはＲ’は、独立してＨまたはエーテル（−−Ｏ−−）連結を場合によって含有する置換もしくは非置換のアルキル（１〜２０Ｃ）、ア���ール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）である）で置き換えられた実施態様を含む。ポリヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。先行する記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含んで、本明細書で言及する全てのポリヌクレオチドに当てはまる。
【００４１】
「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で用いる場合、少なくとも約７ヌクレオチドの長さであり、約２５０ヌクレオチド未満の長さである、短い１本鎖ポリヌクレオチドのことをいう。オリゴヌクレオチドは、合成であってよい。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、互いに排他的でない。ポリヌクレオチドについての上記の記載は、オリゴヌクレオチドに対して等しくかつ全面的に当てはめることができる。
【００４２】
用語「プライマー」は、核酸とハイブリダイズでき、通常は遊離の３’−ＯＨ基を提供することにより相補的核酸の重合を可能にする１本鎖ポリヌクレオチドのことをいう。
【００４３】
用語「アレイ」または「マイクロアレイ」は、基体上のハイブリダイズ可能なアレイ要素、好ましくはポリヌクレオチドプローブ（例えばオリゴヌクレオチド）の規則的な配置のことをいう。基体は、固体基体、例えばガラススライド、または半固体基体、例えばニトロセルロースメンブレンであることができる。
【００４４】
用語「増幅」は、参照核酸配列の１つもしくは複数のコピーまたはその相補体を生成するプロセスのことをいう。増幅は、線形的または指数関数的（例えばＰＣＲ）であってよい。「コピー」は、鋳型配列に対する完全配列相補性または同一性を必ずしも意味しない。例えば、コピーは、ヌクレオチドアナログ、例えばデオキシイノシン、意図的な配列変更（例えば鋳型と完全に相補的でないがハイブリダイズ可能な配列を含むプライマーにより導入された配列変更）および／または増幅中に生じる配列の誤りを含むことができる。
【００４５】
用語「検出」は、直接的および間接的検出を含む、任意の検出手段を含む。
【００４６】
「分子表現型」と交換可能に用いられる用語「分子サブタイプ」は、１つもしくは複数の特定の遺伝子または１つもしくは複数の特定のタンパク質の発現、あるいは遺伝子の組み合わせもしくはタンパク質の組み合わせの発現の特定のパターンを特徴とするＩＰＦのサブタイプまたは表現型のことをいう。特定の遺伝子、タンパク質または遺伝子もしくはタンパク質の組み合わせの発現は、ＩＰＦのある種の病理学的、組織学的および／または臨床的特徴とさらに関連することがある。
【００４７】
用語「マルチプレックスＰＣＲ」は、単一反応で２つ以上のＤＮＡ配列を増幅することを目的として、単一供給源（例えば患者）から得られた核酸に対して、１つ超のプライマーセットを用いて行われる単一ＰＣＲ反応のことをいう。
【００４８】
用語「バイオマーカー」は、本明細書で用いる場合、例えば患者の病的状態の指標のことをいい、これは、患者の生体試料中で検出できる。バイオマーカーは、それらに限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物または糖脂質ベースの分子マーカーを含む。
【００４９】
用語「診断」は、分子的もしくは病的状態、疾患または容態の同定または分類のことをいうために本明細書で用いる。例えば、「診断」は、ＩＰＦまたはＵＩＰの特定の型の同定のことをいうことがある。「診断」は、例えば病理組織学によるかもしくはＸ線撮影による基準による、または分子的特徴（例えば特定の遺伝子の１つまたは組み合わせまたは前記遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を特徴とするサブタイプ）によるＩＰＦの特定のサブタイプの分類のことをいうこともある。
【００５０】
用語「診断を援助する」は、ＩＰＦの特定の型の症状または容態の存在または性質に関する臨床的決定を行うことを支援する方法のことをいうために本明細書で用いる。例えば、ＩＰＦの診断を援助する方法は、個体からの生体試料中である種の遺伝子の発現を測定することを含むことができる。
【００５１】
用語「予後予測」は、経時的な生存期間、および経時的に悪くなる１つまたは複数のＩＰＦに帰する疾患症状の見込みの予測のことをいうために本明細書で用いる。
【００５２】
「対照の対象」は、ＩＰＦであると診断されておらず、ＩＰＦと関連するいずれの徴候または症状にも苦しんでいない健常対象のことをいう。
【００５３】
用語「試料」は、本明細書で用いる場合、例えば物理的、生化学的、化学的および／または生理的特徴に基づいて特徴決定および／または同定される細胞性および／またはその他の分子的物体を含有する、興味対象の対象から得られるかまたは該対象に由来する組成物のことをいう。例えば、「疾患試料」との句およびその変形は、特徴決定される細胞性および／または分子的物体を含有すると予測されるかまたは含有することがわかっている、興味対象の対象から得られた任意の試料のことをいう。
【００５４】
「組織」または「細胞試料」により、対象または患者の組織から得られた同様の細胞の収集物を意味する。組織または細胞試料の供給源は、新鮮な、凍結したおよび／もしくは保存された器官もしくは組織試料または生検または吸引物からのような固体組織；血液または任意の血液構成成分；脳脊髄液、羊水、腹水もしくは間質液のような体液；対象の妊娠期間もしくは発達中の任意の時間からの細胞であってよい。組織試料は、初代もしくは培養細胞または株化細胞であってよい。場合によって、組織または細胞試料は、疾患組織／器官から得られる。組織試料は、天然では組織と天然に混ざり合っていない化合物、例えば保存剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定液、栄養分、抗生物質などを含有してよい。「参照試料」、「参照細胞」、「参照組織」、「対照試料」「対照細胞」または「対照組織」は、本明細書で用いる場合、本発明の方法または組成物を用いて同定しようとする疾患または容態に苦しんでいないことがわかっているかまたは苦しんでいないと考えられる供給源から得られた試料、細胞または組織のことをいう。一実施態様では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞または対照組織は、本発明の組成物または方法を用いて疾患または容態を同定しようとする同じ対象または患者の体の健常な部分から得られる。一実施態様では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞または対照組織は、本発明の組成物または方法を用いて疾患または容態を同定しようとする対象または患者でない個体の体の健常な部分から得られる。
【００５５】
本明細書での目的のために、組織試料の「切片」は、組織試料の単一の部分または片、例えば組織試料から切断された組織の薄片または細胞を意味する。組織試料の複数の切片を採取でき、本発明に従って分析に供することができることが理解されるが、但し、組織試料の同じ切片を、形態学的および分子的の両方のレベルで分析するか、またはタンパク質および核酸の両方に関して分析する方法を本発明が含むことが理解されることを条件とする。
【００５６】
「相関させる」または「相関する」により、第１の分析またはプロトコールの性能および／または結果を、第２の分析またはプロトコールの性能および／または結果と任意の方式で比較することを意味する。例えば、第２プロトコールを行う場合に第１の分析もしくはプロトコールの結果を用いることができ、かつ／または第１の分析もしくはプロトコールの結果を用いて、第２の分析もしくはプロトコールを行うべきかを決定することができる。遺伝子発現分析またはプロトコールの実施態様に関して、遺伝子発現分析またはプロトコールの結果を用いて、具体的な治療計画を行うべきかを決定してよい。
【００５７】
用語「遺伝子サイン」は、「遺伝子発現サイン」と交換可能に用いられ、ある種の分子的、病理学的、組織学的、Ｘ線撮影によるおよび／または臨床的特徴を特徴とするＩＰＦの特定のサブタイプをその発現が示す遺伝子の１つまたは組み合わせのことをいう。ある種の実施態様では、遺伝子サインを含む１つまたは複数の遺伝子の発現は、対照の対象における発現と比較して上昇する。
【００５８】
用語「タンパク質サイン」は、「タンパク質発現サイン」と交換可能に用いられ、ある種の分子的、病理学的、組織学的、Ｘ線撮影によるおよび／または臨床的特徴を特徴とするＩＰＦの特定のサブタイプをその発現が示すタンパク質の１つまたは組み合わせのことをいう。ある種の実施態様では、タンパク質サインを含む１つまたは複数のタンパク質の発現は、対照の対象における発現と比較して上昇する。
【００５９】
「ＩＰＦ治療剤」、「ＩＰＦを処置するために効果的な治療剤」およびそれらの文法的変形は、本明細書で用いる場合、有効量で与えられた場合に、ＩＰＦの対象において治療的利益をもたらすことが臨床家によりわかっているか、臨床的に示されているかまたは期待される剤のことをいう。
【００６０】
「候補治療剤」は、その剤が以前に販売承認を受けていない条件（例えば特定の用量、投与計画、適応症）の下で臨床試験を受けているかまたは試験をこれから受ける剤のことをいう。
【００６１】
「抗ＩＬ１３／ＩＬ４経路阻害剤」は、ＩＬ−１３および／またはＩＬ−４シグナル伝達を遮断する薬剤のことをいう。抗ＩＬ１３、抗ＩＬ４または抗ＩＬ１３／ＩＬ４阻害剤の例は、それらに限定されないが、抗ＩＬ１３結合物質、抗ＩＬ４結合物質、抗ＩＬ４受容体アルファ結合物質、抗ＩＬ１３受容体アルファ１結合物質および抗ＩＬ１３受容体アルファ２結合物質を含む。ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＩＬ−１３Ｒアルファ１、ＩＬ−１３Ｒアルファ２またはＩＬ−４Ｒアルファと結合できる単一ドメイン抗体は、阻害剤として具体的に含まれる。１つ超の標的と結合できる分子が含まれることが理解される。
【００６２】
「抗ＩＬ４結合物質」は、ヒトＩＬ−４と特異的に結合する物質のことをいう。このような結合物質は、小分子、アプタマーまたはポリペプチドを含むことができる。このようなポリペプチドは、それらに限定されないが、イムノアドヘシン、抗体、ペプチボディおよびペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含むことができる。一実施態様によると、結合物質は、ヒトＩＬ−４配列と、１ｕＭ〜１ｐＭの間の親和性で結合する。抗ＩＬ４結合物質の具体例は、可溶性ＩＬ４受容体アルファ（例えばヒトＦｃ領域と融合したＩＬ４受容体の細胞外ドメイン）、抗ＩＬ４抗体および可溶性ＩＬ１３受容体アルファ１（例えばヒトＦｃ領域と融合したＩＬ１３受容体アルファ１の細胞外ドメイン）を含むことができる。
【００６３】
「抗ＩＬ４受容体アルファ結合物質」は、ヒトＩＬ４受容体アルファと特異的に結合する物質のことをいう。このような結合物質は、小分子、アプタマーまたはポリペプチドを含むことができる。このようなポリペプチドは、それらに限定されないが、イムノアドヘシン、抗体、ペプチボディおよびペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含むことができる。一実施態様によると、結合物質は、ヒトＩＬ−４受容体アルファ配列と、１ｕＭ〜１ｐＭの間の親和性で結合する。抗ＩＬ４受容体アルファ結合物質の具体例は、抗ＩＬ４受容体アルファ抗体を含むことができる。
【００６４】
「抗ＩＬ１３結合物質」は、ヒトＩＬ−１３と特異的に結合する物質のことをいう。このような結合物質は、小分子、アプタマーまたはポリペプチドを含むことができる。このようなポリペプチドは、それらに限定されないが、イムノアドヘシン、抗体、ペプチボディおよびペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含むことができる。一実施態様によると、結合物質は、ヒトＩＬ−１３配列と、１ｕＭ〜１ｐＭの間の親和性で結合する。抗ＩＬ１３結合物質の具体例は、抗ＩＬ１３抗体、ヒトＦｃと融合した可溶性ＩＬ１３受容体アルファ２、ヒトＦｃと融合した可溶性ＩＬ４受容体アルファ、ヒトＦｃと融合した可溶性ＩＬ１３受容体アルファを含むことができる。例示的な抗ＩＬ１３抗体は、国際公開第２００５／０６２９６７号に記載されている。抗ＩＬ１３抗体のその他の例は、ＷＯ２００８／０８３６９５（例えばＩＭＡ−６３８およびＩＭＡ−０２６）、ＵＳ２００８／０２６７９５９、ＵＳ２００８／００４４４２０およびＵＳ２００８／０２４８０４８に記載されている。
【００６５】
レブリキズマブとよばれる例示的な「抗ＩＬ１３抗体」は、ヒトＩＬ１３と結合するヒト化ＩｇＧ４抗体を意味する。一実施態様では、抗ＩＬ１３抗体は、３つの重鎖ＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号１）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号２）およびＣＤＲ−Ｈ３（配列番号３）を含む。一実施態様では、抗ＩＬ１３抗体は、３つの軽鎖ＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号５）、およびＣＤＲ−Ｌ３（配列番号６）を含む。一実施態様では、抗ＩＬ１３抗体は、３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号１）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号２）、ＣＤＲ−Ｈ３（配列番号３）、ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号５）、およびＣＤＲ−Ｌ３（配列番号６）を含む。一実施態様では、抗ＩＬ１３抗体は、配列番号７および８から選択されるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域ＶＨを含む。一実施態様では、抗ＩＬ１３抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域ＶＬを含む。一実施態様では、抗ＩＬ１３抗体は、配列番号７および８から選択されるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域ＶＨと、配列番号９のアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域ＶＬとを含む。一実施態様では、抗ＩＬ１３抗体は、配列番号１０または配列番号１１または配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。一実施態様では、抗ＩＬ１３抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。一実施態様では、抗ＩＬ１３抗体は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。
【００６６】
「抗ＩＬ１３受容体アルファ１結合物質」は、ヒトＩＬ１３受容体アルファ１と特異的に結合する物質のことをいう。このような結合物質は、小分子、アプタマーまたはポリペプチドを含むことができる。このようなポリペプチドは、それらに限定されないが、イムノアドヘシン、抗体、ペプチボディおよびペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含むことができる。一実施態様によると、結合物質は、ヒトＩＬ−１３受容体アルファ１配列と、１ｕＭ〜１ｐＭの間の親和性で結合する。抗ＩＬ１３受容体アルファ１結合物質の具体例は、抗ＩＬ１３受容体アルファ１抗体を含むことができる。
【００６７】
「抗ＩＬ１３受容体アルファ２結合物質」は、ヒトＩＬ１３受容体アルファ２と特異的に結合する物質のことをいう。このような結合物質は、小分子、アプタマーまたはポリペプチドを含むことができる。このようなポリペプチドは、それらに限定されないが、イムノアドヘシン、抗体、ペプチボディおよびペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含むことができる。一実施態様によると、結合物質は、ヒトＩＬ−１３受容体アルファ２配列と、１ｕＭ〜１ｐＭの間の親和性で結合する。抗ＩＬ１３受容体アルファ２結合物質の具体例は、抗ＩＬ１３受容体アルファ２抗体を含むことができる。
【００６８】
用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多エピトープ特異性を有する抗体、単鎖抗体、多重特異性抗体および抗体の断片を具体的にカバーする。このような抗体は、キメラ、ヒト化、ヒトおよび合成であることができる。このような抗体およびそれらを作製する方法は、以下により詳細に記載する。
【００６９】
用語「可変」は、可変ドメインのある種のセグメントの配列が、抗体間で大幅に異なることをいう。Ｖ領域は、抗原結合を媒介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかし、可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸のスパンにわたって均一に分布しない。代わりに、Ｖドメインは、それぞれ９〜１２アミノ酸の長さである「超可変領域」とよばれる可変性が非常に高いより短い領域で分けられた、１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれる比較的不変のひと続きからなる。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、ベータシート構造を接続し、その一部を形成することもあるループを形成する３つの超可変領域により接続された、ベータシート構造をほぼ採用する４つのＦＲを含む。各鎖中の超可変領域は、ＦＲにより近接して一緒にされ、他の鎖からの超可変領域と一緒に、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１）を参照されたい）。定常ドメインは、抗体と抗原との結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の参加のような様々なエフェクター機能を示す。
【００７０】
用語「超可変領域」（または「ＨＶＲ」）は、本発明で用いる場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基のことをいう。超可変領域は、一般的に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えばＶＬ中の残基約２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）の付近、ならびにＶＨ中の約３１〜３５Ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）の付近（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１））および／または「超可変ループ」からの残基（例えばＶＬ中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６  （Ｌ３）、ならびにＶＨ中の２６〜３２（Ｈ１）、５２Ａ〜５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７頁（１９８７））を含む。
【００７１】
超可変領域は、以下のような「拡大超可変領域」を含んでよい：ＶＬ中の２４〜３６（Ｌ１）、４６〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびにＶＨ中の２６〜３５Ｂ（Ｈ１）、４７〜６５（Ｈ２）および９３〜１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義のそれぞれについてＫａｂａｔら、既出に従って番号付けされる。
【００７２】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。例えば、軽鎖フレームワーク１（ＬＣ−ＦＲ１）、フレームワーク２（ＬＣ−ＦＲ２）、フレームワーク３（ＬＣ−ＦＲ３）およびフレームワーク４（ＬＣ−ＦＲ４）領域は、それぞれ、抗体の１〜２３、３５〜４９、５７〜８８および９８〜１０７と番号付けされる残基を含むことがある（Ｋａｂａｔ番号付けシステム）。別の例では、重鎖フレームワーク１（ＨＣ−ＦＲ１）、重鎖フレームワーク２（ＨＣ−ＦＲ２）、重鎖フレームワーク３（ＨＣ−ＦＲ３）および重鎖フレームワーク４（ＨＣ−ＦＲ４）は、それぞれ、抗体の残基１〜２５、３６〜４８、６６〜９２および１０３〜１１３を含むことがある（Ｋａｂａｔ番号付けシステム）。
【００７３】
本明細書で言及する場合、「コンセンサス配列」またはコンセンサスＶドメイン配列は、既知のヒト免疫グロブリン可変領域配列のアミノ酸配列の比較に由来する人工配列である。
【００７４】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で用いる場合、実質的に均質な抗体の集団（すなわち、モノクローナル抗体の生成中に生じ得る可能性のある変異体を除いて（このような変異体は、一般的により少ない量で存在する）、集団に含まれる個別の抗体が同一であり、かつ／または同じエピトープと結合する）からの抗体のことをいう。このようなモノクローナル抗体は、標的と結合するポリペプチド配列を含む抗体を典型的に含み、ここで、標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスにより得られたものである。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローンまたは組換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンからのユニーククローンの選択であり得る。選択される標的結合配列は、さらに変更して、例えば、標的についての親和性を改善すること、標的結合配列をヒト化すること、細胞培養でのその生成を改善すること、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその免疫原性を低減すること、多重特異性抗体を創出することなどができ、変更された標的結合配列を含む抗体も、本発明のモノクローナル抗体であることが理解される。異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物中のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基を指向する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には他の免疫グロブリンが混入していないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られたという抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の生成が要求されると解釈されない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（例えばＫｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５頁（１９７５）；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ５６３〜６８１頁、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、１９８１））、組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）、ファージディスプレイ技術（例えばＣｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８頁（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７頁（１９９１）；Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９〜３１０頁（２００４）；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３〜１０９３頁（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１（３４）：１２４６７〜１２４７２頁（２００４）；ならびにＬｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２８４（１〜２）：１１９〜１３２頁（２００４）を参照されたい）およびヒトまたはヒト様抗体を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部または全部を有する動物から生成する��めの技術（例えばＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９１／１０７４１、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１頁（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５〜２５８頁（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．、７：３３頁（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，５９１，６６９号（全てＧｅｎＰｈａｒｍのもの）；第５，５４５，８０７号；ＷＯ９７／１７８５２、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；および第５，６６１，０１６号、ならびにＭａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３頁（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９頁（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８１２〜８１３頁（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８４５〜８５１頁（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８２６（１９９６）；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５〜９３頁（１９９５）を参照されたい）を含む様々な技術により作製してよい。
【００７５】
本明細書においてモノクローナル抗体は、具体的に、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りの部分は、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに所望の生物活性を示す限りそのような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５頁（１９８４））。キメラ抗体を作製する方法は、当該技術において既知である。
【００７６】
非ヒト（例えばネズミ）抗体の「ヒト化」形は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体のその他の抗原結合サブシークエンス）である。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体でも、取り入れられたＣＤＲまたはフレームワーク配列でも見出されない残基を含むことがある。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練して最大限にするために一般的に行われる。典型的に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する超可変ループの全てまたは実質的に全てとＦＲ領域の全てまたは実質的に全てとがヒト免疫グロブリン配列に由来する（ＦＲ領域は、例えば結合親和性を改善するために１つまたは複数のアミノ酸置換を含むことがあるが）少なくとも１つの可変ドメインの全てを実質的に含む。好ましい一実施態様では、ヒト化抗体は、典型的にヒト免疫グロブリンまたはヒトコンセンサス定常配列のものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含む。さらなる詳細について、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５頁（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２９頁（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６頁（１９９２）を参照されたい。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合領域が例えば興味対象の抗原でマカクザルを免疫することにより生成された抗体に由来するＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体を含む。ヒト化抗体を作製する方法は、当該技術において既知である。
【００７７】
ヒト抗体も、ファージディスプレイライブラリーを含む当該技術において既知の様々な技術を用いて生成できる。ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１頁（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１頁（１９９１）。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術も、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用可能である。Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５頁（１９９１）。ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３頁（１９９５）も参照されたい。ＰＣＴ公開パンフレットＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０５９８８７７号；米国特許第５，４１３，９２３号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，５６９，８２５号；第５，６６１，０１６号；第５，５４５，８０６号；第５，８１４，３１８号；第５，８８５，７９３号；第５，９１６，７７１号；および第５，９３９，５９８号。
【００７８】
「抗体断片」は、全長抗体の一部分、一般的にその抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。
【００７９】
「Ｆｖ」は、完全抗原認識部位および抗原結合部位を含有する最小限の抗体断片である。この断片は、緊密な非共有的会合をしている１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインとの２量体からなる。これらの２つのドメインの折り畳みから、６つの超可変ループ（ＨおよびＬ鎖からそれぞれ３ループ）が出て、これらが、抗原結合のためのアミノ酸残基をもたらし、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一可変ドメイン（またはある抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）は、結合部位全体よりも低い親和性であるが、抗原を認識して抗原と結合する能力を有することがある。
【００８０】
本発明の抗体の「機能的断片」は、由来するインタクトな完全鎖分子と実質的に同じ親和性でのポリペプチドとの結合を保持し、少なくとも１つのアッセイ（例えばマウスモデルにおけるような線維症の阻害または抗体断片とｉｎ  ｖｉｔｒｏで結合する抗原の生物活性の阻害）において活性である断片である。
【００８１】
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に帰することができ、抗体アイソタイプによって異なる生物活性のことをいう。抗体エフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御；ならびにＢ細胞活性化を含む。「天然配列Ｆｃ領域」は、天然で見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。
【００８２】
本明細書で同定するポリペプチドおよび抗体配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」または「相同性」は、いずれの保存的置換も配列同一性の一部とみなして配列を整列させた後の、比較するポリペプチド中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公共で利用可能なコンピュータソフトウェアを用いる当該技術における能力の範囲内である様々な方式で達成できる。当業者は、比較する配列の全長にわたって最大限のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適当なパラメータを決定できる。本明細書での目的のために、しかし、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により制作され、ソースコードは、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２０５５９にユーザ文書とともに提出され、ここに米国著作権第ＴＸＵ５１００８７号の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通して公共に入手可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄで用いるためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変動しない。
【００８３】
用語「Ｆｃ領域含有ポリペプチド」は、Ｆｃ領域を含むポリペプチド、例えば抗体またはイムノアドヘシン（以下の定義を参照されたい）のことをいう。Ｆｃ領域のＣ末端リシン（ＥＵ番号付けシステムに従って残基４４７）は、例えばポリペプチドの精製中に、またはポリペプチドをコードする核酸の組換え工学的操作により取り除かれることがある。したがって、本発明によるＦｃ領域を有するポリペプチド（抗体を含む）を含む組成物は、全てＫ４４７残基が取り除かれたポリペプチドの集団、Ｋ４４７残基が取り除かれていないポリペプチドの集団、またはＫ４４７残基を有するポリペプチドと有さないポリペプチドとの混合物を有するポリペプチドの集団を含むことができる。
【００８４】
本明細書および特許請求の範囲を通して、可変ドメイン（軽鎖のほぼ残基１〜１０７および重鎖の残基１〜１１３）中のある残基に言及する場合にＫａｂａｔ番号付けシステムを全般的に用いる（例えばＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵ番号付けシステム」または「ＥＵインデックス」を、免疫グロブリン重鎖定常領域中のある残基に言及する場合に全般的に用いる（例えばＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）中で報告されているＥＵインデックス（本明細書に参照により明示的に組み込まれている））。本明細書でそうでないと述べない限り、抗体の可変ドメイン中の残基番号への言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる残基番号付けを意味する。本明細書でそうでないと述べない限り、抗体の定常ドメイン中の残基番号への言及は、ＥＵ番号付けシステムによる残基番号付けを意味する（例えば米国仮特許出願第６０／６４０，３２３号、ＥＵ番号付けについての図を参照されたい）。
【００８５】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者により容易に決定され、全般的に、プローブの長さ、洗浄温度および塩濃度に依存する経験的な算出である。全般的に、より長いプローブは、適当なアニーリングのためにより高い温度を要し、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、全般的に、相補鎖がそれらの融解温度未満の環境中に存在する場合に、変性ＤＮＡが再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高いほど、用いることができる相対的温度がより高い。その結果、より高い相対的温度は、反応条件をよりストリンジェントにする傾向があり、より低い温度はその傾向がより低いことになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明について、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、（１９９５）を参照されたい。
【００８６】
「ストリンジェント条件」または「高いストリンジェンシー条件」は、本明細書で定義するように、（１）洗浄のために低いイオン強度および高い温度、例えば０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、５０℃を採用するか、（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミドのような変性剤、例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５と、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、４２℃を採用するか、または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％デキストラン硫酸、４２℃を採用する溶液中での終夜のハイブリダイゼーションと、４２℃、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で１０分間の洗浄と、その後のＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣ、５５℃からなる１０分間の高いストリンジェンシーでの洗浄により同定できる。
【００８７】
「中程度のストリンジェント条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９により記載されるように同定でき、上記のものよりもストリンジェントでない洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば温度、イオン強度および％ＳＤＳ）を用いることを含む。中程度にストリンジェントな条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸３ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸および２０ｍｇ／ｍｌ変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で３７℃にて終夜のインキュベーションと、その後の１×ＳＳＣ中、約３７〜５０℃でのフィルタの洗浄である。当業者は、プローブ長さなどのような因子を適応させるために必要なように温度、イオン強度などをどのようにして調整するかを認識している。
【００８８】
本明細書で用いる場合、処置される対象は、哺乳動物（例えばヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなど）である。対象は、臨床患者、臨床試験ボランティア、実験動物などであってよい。対象は、特発性肺線維症を有することが疑われるかもしくは有する危険性があるか、または特発性肺線維症と診断されていることがある。好ましい一実施態様に従って、本発明に従って処置される対象は、ヒトである。
【００８９】
「処置する」または「処置」または「緩和」は、尺度のことであり、ここで、目的は、標的にする病的容態もしくは障害を妨げるかもしくは遅くする（小さくする）か、または該障害の症状のいくらかを軽減することである。処置を必要とするものは、既に障害を有するもの、および障害を有する傾向があるものまたは障害を妨げようとするものを含むことができる。対象または哺乳動物は、本発明の治療剤を受けた後に、患者が、以下の１つまたは複数において経時的（例えば３ヶ月間［１２週間］または６ヶ月間［２４週間］または９ヶ月間［３６週間］または１２ヶ月間［１年、５２週間］）にベースラインからの観察可能なおよび／もしくは測定可能な減少もしくは変化ならびに／またはベースラインからの測定可能な変化率を示すならば、特発性肺線維症について「処置」が成功している：努力肺活量（ＦＶＣ）、一酸化炭素肺拡散能力（ＤＬＣＯ）、患者報告結果ツール、例えばＩＰＦの生活の質判定ツール（ＡＴＡＱ−ＩＰＦ）またはＥｕｒｏＱｏｌ５元質問票（ＥＱ−５Ｄ）、６分間歩行距離（６ＭＷＤ）、安静時酸素流量、定量肺線維症（ＱＬＦ）スコアを含む肺高分解能コンピュータ断層撮影（ＨＲＣＴ）でのＸ線撮影による知見、それらに限定されないがペリオスチン、ＣＣＬ１８、ＹＫＬ４０、ＣＯＭＰ、ＯＰＮ、ＣＣＬ１３を含む血清バイオマーカー。
【００９０】
本明細書で用いる場合、「ＩＰＦ増悪」は、以下の基準に合致する事象を意味する：過去３０日以内の呼吸困難の説明のつかない悪化または発生；通常の間質性肺炎（ＵＩＰ）と矛盾しない、網状または蜂巣背景パターンと重なりあう新しい両側スリガラス異常および／または硬化の放射線学的証拠；ならびに代替の原因、例えば左心不全、肺塞栓症、肺感染（気管内吸引液もしくは利用可能であれば気管支肺胞洗浄、または調査者の判断に基づく）または急性肺傷害を導くその他の事象（例えば敗血症、誤嚥、外傷、再灌流肺水腫）が存在しないこと。
【００９１】
本明細書で用いる場合、「ＩＰＦ悪化」または「疾患のＩＰＦ悪化」は、以下の（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）に合致する事象を意味する：（ｉ）過去３０日以内の呼吸困難の説明のつかない悪化または発生ならびに（ｉｉ）以下のいずれか２つ：（ａ）ＵＩＰと矛盾しない、網状または蜂巣背景パターンと重なりあう新しい両側スリガラス異常および／または硬化の放射線学的証拠；（ｂ）以下の基準の少なくとも１つに合致する肺機能の悪化：（Ｉ）少なくとも１０％のＦＶＣ（Ｌ）；（ＩＩ）ＤＬＣＯ（ｍＬ  ＣＯ／ｍｉｎ−１／ｍｍＨｇ−１）、少なくとも１５％；（ＩＩＩ）酸素飽和（ＳｐＯ２）少なくとも４％；ならびに（ｉｉｉ）代替の原因が存在しないこと。
【００９２】
「有効量」は、投与量および必要な期間にて、所望の治療的または予防的結果を達成するために有効な量のことをいう。
【００９３】
用語「治療有効量」は、対象における疾患または障害を「緩和」または「処置」するために有効な本発明のポリペプチドの量のことをいう。治療剤の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重ならびに個体において所望の応答を惹起する抗体の能力のような因子によって変動することがある。治療有効量は、治療の利益的な効果が治療剤のいずれの毒性または有害な影響にも勝るものでもある。「予防有効量」は、投与量および必要な期間にて、所望の予防的結果を達成するために有効な量のことをいう。典型的には（しかし必ずしもではない）、予防的用量は疾患の早期段階の前または早期段階にて対象において用いられるので、予防有効量は、治療有効量より少ない。
【００９４】
「慢性」投与は、急性モードに対して、連続的なモードで剤を投与して、初期治療効果（活性）を長期間維持することをいう。「間欠的」投与は、中断なく連続的に行うのでなく、むしろ周期的な性質での処置である。
【００９５】
「強制呼気量（ＦＥＶ１）」は、強制呼気の最初の１秒において排出される空気の容量を測定する標準的な試験のことをいう。ＦＥＶ１は、結果を記録してそれをグラフ上に示す機械に接続されたマウスピースと使い捨ての配管とからなる肺活量計により測定される。肺活量測定を行うためには、深く息を吸って、管の周りで口を固く閉じ、次いで配管を通して息を吐き出し、その間に測定が行われる。吐き出された空気の容量および各呼吸にかかった時間を記録して分析する。肺活量測定の結果は、パーセンテージとして表される。肺活量測定の正常な結果の例は、１秒後に肺活量の７５パーセントのＦＥＶ１を含む。肺活量測定の異常な結果の例は、正常に予測される値の８０パーセント未満の読み取り値を含む。異常な結果は、通常、喘息、肺気腫もしくは慢性気管支炎のような閉塞性肺疾患、または肺線維症のような拘束性肺疾患のある程度の存在を示す。例えば、ＦＥＶ１値（予測値に対するパーセンテージ）を用いて、喘息および肺気腫または慢性気管支炎のようなその他の閉塞性肺疾患で生じることがある閉塞を分類できる：予測ＦＥＶ１  ６５パーセントから７９パーセント＝穏やかな閉塞、予測ＦＥＶ１  ４０パーセントから５９パーセント＝中程度の閉塞、および予測ＦＥＶ１  ４０パーセント未満＝重度の閉塞。さらに、閉塞性および拘束性肺疾患は、以下の点で少なくとも異なる。閉塞性疾患では、ＦＥＶ１／ＦＶＣ比は正常より低いことがあり、ＦＶＣは正常であることがあるが、拘束性疾患では、ＦＥＶ１およびＦＶＣはともに、正常より低いことがあるが、ＦＥＶ１／ＦＶＣ比は正常であることがある。このような場合、ＦＥＶ１は、ＦＶＣが低減していることによってのみ低減する。
【００９６】
本明細書で用いる場合、「ＦＶＣ」は、完全吸気量と残気量までの最大呼気との間の肺空気量の変化（ＦＥＶ１においては１秒で吐き出された空気の容量であるのに対して）を測定する標準的な試験のことである「努力肺活量」のことをいう。これは、機能的肺能力の尺度である。ＩＰＦ、過敏性肺臓炎、サルコイドーシスおよび全身性強皮症を含む間質性肺疾患のような拘束性肺疾患の患者では、ＦＶＣは、典型的に肺実質の瘢痕により低減する。
【００９７】
本明細書で記載するようにして（例えばマイクロアレイ分析により）遺伝子（および遺伝子によりコードされるタンパク質）を同定するために用いることができる核酸プローブの例は、それらに限定されないが、表２、３および４に記載するプローブを含む。
【００９８】
「発現レベルの上昇」または「レベルの上昇」は、ＩＰＦに罹患していない１つまたは複数の個体のような対照に対する、患者（例えばＩＰＦを有することが疑われるかまたはＩＰＦであると診断された患者）におけるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の増加のことをいう。
【００９９】
全般的な技術
本発明の実施は、そうでないと示さない限り、当該技術の熟練の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の慣習的な技術を用いる。このような技術は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７および周期的な改訂）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）のような文献に十分に説明されている。
【０１００】
本発明で用いるプライマー、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、当該技術において既知の標準的な技術を用いて作製できる。
【０１０１】
ＩＰＦおよびＩＰＦのある種のサブタイプと関連する遺伝子発現サインが、本明細書において示される。これらのサインは、ＩＰＦおよび／もしくはＩＰＦのサブタイプについてのバイオマーカーであり、かつ／またはＩＰＦの発展、持続および／もしくは進行の素因をつくるかもしくは発展、持続および／もしくは進行に貢献し、かつＩＰＦ患者の生存期間の予後予測となる。したがって、本明細書で開示する発明は、様々な背景、例えばＩＰＦ予後予測、診断および治療に関わる方法および組成物において有用である。
【０１０２】
遺伝子発現レベルの検出
本明細書で記載する方法のいずれかに従う核酸は、ゲノムＤＮＡから転写されたＲＮＡまたはＲＮＡから作製されたｃＤＮＡであってよい。核酸は、脊椎動物、例えば哺乳動物に由来してよい。核酸は、それがその供給源から直接得られるか、またはそれがその供給源で見出される核酸のコピーであるならば、ある特定の供給源に「由来する」と言われる。
【０１０３】
核酸は、核酸のコピー、例えば増幅により得られるコピーを含む。増幅は、例えば変動を検出するために所望の量の物質を得るために、ある種の場合において望ましいことがある。アンプリコンを、次いで、以下に記載するもののような変動検出法に供して、ある種の遺伝子の発現を決定してよい。
【０１０４】
マイクロアレイは、例えばｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ試料と高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするための整列された一連の数千の核酸プローブを典型的に用いるマルチプレックス技術である。プローブ−標的ハイブリダイゼーションは、標的における核酸配列の相対的豊富さを決定するための蛍光体、銀または化学発光で標識された標的の検出により典型的に検出および定量される。典型的なマイクロアレイでは、プローブを、化学的マトリクスとの共有結合（エポキシ−シラン、アミノ−シラン、リシン、ポリアクリルアミドなどを用いて）により固体表面に付着させる。固体表面は、例えばガラス、シリコンチップまたは顕微鏡規模のビーズである。様々なマイクロアレイが、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．およびＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．により製造されるものを含んで、市販で入手可能である。
【０１０５】
タンパク質発現レベルの検出
タンパク質の発現レベルは、全血、血漿または血清の試料中で検出できる。このような生体試料中でタンパク質発現レベルを検出するための様々な方法が、様々なイムノアッセイ法を含んで、当該技術において既知である。広範囲のイムノアッセイ技術が、以前に記載されており、例えば米国特許第４，０１６，０４３号、第４，４２４，２７９号および第４，０１８，６５３号を参照されたい。これらは、非競合型の単一部位および２部位または「サンドイッチ」アッセイの両方、ならびに伝統的な競合的結合アッセイを含む。これらのアッセイは、標的バイオマーカーとの標識された抗体の直接結合も含む。
【０１０６】
サンドイッチアッセイは、なかでも、最も有用で一般的に用いられるアッセイである。サンドイッチアッセイ技術のいくつかの変形が存在し、これらの全てを本発明に包含することを意図する。簡単に述べると、典型的なフォワードアッセイでは、未標識の抗体を固体基体上に固定化し、試験される試料を結合した分子と接触させる。抗体−抗原複合体の形成を可能にするのに十分な期間にわたる適切な期間のインキュベーションの後に、抗原に特異的で、検出可能なシグナルを生成できるレポーター分子で標識した第２の抗体を次いで加えてインキュベートし、抗体−抗原−標識抗体の別の複合体の形成のために十分な時間を与える。いずれの未反応物質も洗い流され、抗原の存在が、レポーター分子により生成されるシグナルを観察することにより決定される。結果は、可視化されたシグナルの単純観察により定性的であってよいか、または既知の量のバイオマーカーを含有する対照試料と比較することにより定量してよい。
【０１０７】
フォワードアッセイの変形は、同時アッセイを含み、ここでは、試料および標識された抗体をともに同時に、結合した抗体に加える。これらの技術は、容易に明らかになる任意のわずかな変形を含んで、当業者に公知である。典型的なフォワードサンドイッチアッセイでは、バイオマーカーについての特異性を有する第１の抗体を、固体表面に共有的または受動的に結合させる。固体表面は、典型的に、ガラスまたはポリマーであり、最も一般的に用いられるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は、管、ビーズ、マイクロプレートのディスクまたはイムノアッセイの実行のために適切な任意のその他の表面であってよい。結合プロセスは、当該技術において公知であり、一般的に、架橋共有結合または物理的吸着することからなり、ポリマー−抗体複合体を、試験試料の調製において洗浄する。分割量の試験される試料を次いで固相複合体に加え、十分な時間（例えば２〜４０分間またはより簡便であるならば終夜）、適切な条件下（例えば室温から４０℃まで、例えば２５℃以上３２℃以下）でインキュベートして、抗体中に存在する任意のサブユニットの結合を可能にする。インキュベーション期間の後に、抗体サブユニット固相を洗浄し、乾燥し、バイオマーカーの一部分に特異的な第２の抗体とインキュベートする。第２の抗体はレポーター分子に連結されており、これを用いて分子マーカーとの第２の抗体の結合を示す。
【０１０８】
代替法は、試料中の標的バイオマーカーを固定化し、次いで、固定化された標的を、レポーター分子で標識されるかまたはされなくてよい特異的抗体に曝露することを含む。標的の量およびレポーター分子シグナルの強度に依存して、結合した標的を、抗体で直接標識することにより検出できる。代わりに、第１の抗体に特異的な第２の標識された抗体を、標的−第１の抗体複合体に曝露して、標的−第１の抗体−第２の抗体の３元複合体を形成する。この複合体は、レポーター分子が発するシグナルにより検出される。「レポーター分子」により、本明細書で用いる場合、その化学的性質により、抗原と結合した抗体の検出を可能にする分析的に同定できるシグナルを与える分子を意味する。この型のアッセイで最も一般的に用いられるレポーター分子は、酵素、蛍光体または放射性核種含有分子（すなわち放射性同位体）および化学発光分子のいずれかである。
【０１０９】
酵素イムノアッセイの場合、酵素は、一般的にグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩により第２の抗体にコンジュゲートされる。容易に認識されるように、しかし、様々な種類の異なるコンジュゲーション技術が存在し、これらは、当業者が容易に利用可能である。一般的に用いられる酵素は、なかでもセイヨウワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む。特異的酵素とともに用いられる基質は、全般的に、対応する酵素による加水分解による、検出可能な色の変化の生成について選択される。適切な酵素の例は、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼを含む。上に記載する色素産生基質よりもむしろ蛍光生成物を産出する蛍光産生基質を採用することもできる。全ての場合では、酵素で標識した抗体を、第１の抗体−分子マーカー複合体に加え、結合させ、次いで過剰な試薬を洗い流す。適当な基質を含有する溶液を、次いで、抗体−抗原−抗体の複合体に加える。基質は、第２の抗体に連結された酵素と反応し、定性的な可視化シグナルが得られ、これをさらに、通常は分光光学的に定量でき、試料中に存在したバイオマーカーの量の表示を得る。代わりに、フルオレセインおよびローダミンのような蛍光化合物を、それらの結合能を変更することなく抗体に化学的にカップリングさせてよい。特定の波長の光で照射することにより活性化されると、蛍光色素で標識された抗体は光エネルギーを吸着し、分子の励起状態を誘導し、その後に、光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色で光を放射する。ＥＩＡでのように、蛍光で標識された抗体を、第１の抗体−分子マーカー複合体と結合させる。未結合の試薬を洗い流した後に、残りの３元複合体を、次いで、適当な波長の光に曝露し、観察される蛍光は、対象の分子マーカーの存在を示す。免疫蛍光およびＥＩＡ技術はともに、当該技術において十分に確立されている。しかし、放射性同位体、化学発光または生物発光分子のようなその他のレポーター分子も採用してよい。
【０１１０】
生体試料は、当業者に既知のある種の方法を用いて得ることができる。生体試料は、脊椎動物、特に哺乳動物から得ることができる。ある種の場合では、生体試料は、肺組織、全血、血漿、血清または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。このような体試料をスクリーニングすることにより、単純な早期の予後予測（例えば生存期間の）または診断（例えば分子サブタイプの）をＩＰＦについて達成できる。さらに、治療の進行を、標的核酸（またはコードされるポリペプチド）の発現レベルの変動についてこのような体試料を試験することにより、より容易にモニタリングできる。
【０１１１】
対象、組織または細胞試料が本明細書で開示する遺伝子発現サインを含むことを決定した後に、有効量の適当なＩＰＦ治療剤を対象に投与して、対象におけるＩＰＦを処置することが企図される。本明細書で記載する様々な病的容態の哺乳動物における臨床診断は、熟練した医師が行うことができる。例えば哺乳動物におけるＩＰＦの診断または検出を可能にする臨床診断技術は、当該技術において利用可能である。
【０１１２】
ＩＰＦ治療剤は、急速投与もしくはある期間にわたる連続注入による静脈内投与、筋内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、くも膜下腔内、経口、局部または吸入経路によるような既知の方法に従って投与できる。場合によって、投与は、様々な市販のデバイスを用いるミニポンプ注入により行ってよい。
【０１１３】
ある種の治療剤
ある種の治療剤が、ＩＰＦの処置のための候補または剤として以前に記載されている。これらは、公開された文献に記載され、例えばＲａｆｉｉら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｄｉｓ（２０１３）５（１）：４８〜７３頁において見直すことができる。このような剤は、Ｎ−アセチルシステインのような抗酸化、免疫抑制および／または抗炎症活性を有する薬剤；ＩＰＦの処置における臨床的使用について承認されているピルフェニドン、経口投与用ピリジンのような抗線維化、抗炎症および／または抗酸化活性を有する薬剤；全てのＴＧＦ−βアイソフォームを標的にする抗ＴＧＦ−β抗体（例えば  ＧＣ１００８）またはαｖβ６インテグリンに対する抗体（例えばＳＴＸ−１００）のようなトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）を阻害する薬剤；抗ＣＴＧＦ抗体（例えばＦＧ−３０１９）のような結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）を阻害する薬剤；ソマトスタチンアナログ（例えばＳＯＭ２３０、オクトレオチド）のようなソマトスタチン受容体を阻害する薬剤；抗ＩＬ１３抗体（例えばＱＡＸ５７６、トラロキヌマブ、レブリキズマブ［以下にさらに記載する］）、抗ＩＬ４抗体、組み合わせ抗ＩＬ１３／抗ＩＬ４剤（例えばＳＡＲ１５６５９７のような二重特異性抗ＩＬ１３／抗ＩＬ４抗体）、抗ＣＣＬ２抗体（例えばＣＮＴＯ８８８）のようなＩＬ−１３、ＩＬ−４およびＣＣＬ２を阻害する薬剤；サリドマイドまたはミノサイクリンのような抗血管新生、免疫調節および／または抗炎症活性を有する薬剤；抗ＬＯＸＬ２抗体（例えばＧＳ−６６２４［シムツズマブ］）のような酵素リシルオキシダーゼ様２（ＬＯＸＬ２）を阻害する薬剤；チロシンキナーゼ阻害剤、ＢＩＢＦ１１２０、テトラチオモリブデートのような血管新生を阻害する薬剤；剤ドキシサイクリンのような細胞外マトリクスの沈着を阻害し、かつ／またはコラーゲン沈着を混乱させる剤；ロサルタンのようなレニン−アンジオテンシンシステムを標的にする薬剤；ならびに一酸化炭素のような抗増殖および／または抗線維化活性を有するその他の薬剤を含む。
【０１１４】
特発性肺線維症の処置のためのある治療剤が本明細書で提供される。一実施態様では、治療剤は、レブリキズマブともよばれる抗ＩＬ１３抗体である。レブリキズマブは、ＩｇＧ４抗体である。一実施態様では、抗ＩＬ１３抗体は、３つの重鎖ＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号１）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号２）およびＣＤＲ−Ｈ３（配列番号３）を含む。一実施態様では、抗ＩＬ１３抗体は、３つの軽鎖ＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号５）およびＣＤＲ−Ｌ３（配列番号６）を含む。一実施態様では、抗ＩＬ１３抗体は、３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号１）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号２）、ＣＤＲ−Ｈ３（配列番号３）、ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号５）およびＣＤＲ−Ｌ３（配列番号６）を含む。一実施態様では、抗ＩＬ１３抗体は、配列番号７および８から選択されるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域ＶＨを含む。一実施態様では、抗ＩＬ１３抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域ＶＬを含む。一実施態様では、抗ＩＬ１３抗体は、配列番号７および８から選択されるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域ＶＨと、配列番号９のアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域ＶＬとを含む。一実施態様では、抗ＩＬ１３抗体は、配列番号１０または配列番号１１または配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。一実施態様では、抗ＩＬ１３抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。一実施態様では、抗ＩＬ１３抗体は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。抗ＩＬ１３抗体は、国際公開パンフレット第２００５／０６２９６７号にさらに記載されている。
【０１１５】
別の態様では、抗ＩＬ−１３抗体は、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある種の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、この配列を含む抗ＩＬ−１３抗体は、ヒトＩＬ−１３と結合する能力を保持する。ある種の実施態様では、配列番号８において合計で１から１０のアミノ酸が置換、変更、挿入および／または欠失されている。ある種の実施態様では、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわちＦＲ中）で生じる。場合によって、抗ＩＬ１３抗体は、配列番号８中にＶＨ配列（その配列の翻訳後改変を含む）を含む。
【０１１６】
別の態様では、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗ＩＬ−１３抗体が提供される。ある種の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、この配列を含む抗ＩＬ−１３抗体は、ＩＬ−１３と結合する能力を保持する。ある種の実施態様では、配列番号９において合計で１から１０のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある種の実施態様では、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわちＦＲ中）で生じる。場合によって、抗ＩＬ１３抗体は、配列番号９中にＶＬ配列（その配列の翻訳後改変を含む）を含む。
【０１１７】
なお別の実施態様では、抗ＩＬ−１３抗体は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＬ領域と、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＨ領域とを含む。
【０１１８】
キット
本明細書で記載または示唆する用途で用いるために、キットまたは製品も提供される。このようなキットは、バイアル、チューブなどのような１または複数の容器手段を緊密に閉じ込めて収容するように区画化された担持手段を含んでよく、各容器手段は、方法において用いるための分離要素の１つを含む。例えば、容器手段の１つは、検出可能に標識されているかまたは標識できるプローブを含んでよい。このようなプローブは、遺伝子発現サインの１つまたは複数の遺伝子を含むポリヌクレオチドに特異的なポリヌクレオチドであってよい。キットが核酸ハイブリダイゼーションを用いて標的核酸を検出する場合、キットは、標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチドを含有する容器および／または酵素、蛍光もしくは放射性同位体標識のようなレポーター分子と結合したアビジンもしくはストレプトアビジンのようなビオチン結合タンパク質のようなレポーター手段を含む容器も含んでよい。
【０１１９】
キットは、上記の容器と、緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、シリンジおよび使用説明のための包装挿入物を含む、商業的およびユーザの観点から望ましい物質を含む１または複数の他の容器とを典型的に含む。組成物を特定の治療または非治療的用途のために用いることを示し、上記のもののようなｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のいずれかについての指示も示すことがあるラベルが容器上に存在することがある。キット中のその他の任意選択の構成成分は、１または複数の緩衝剤（例えばブロック緩衝剤、洗浄緩衝剤、基質緩衝剤など）、酵素標識により化学的に変更される基質（例えば色原体）、エピトープ修復溶液、対照試料（陽性および／または陰性対照）、対照スライドなどのようなその他の試薬を含む。
【０１２０】
マーケティングの方法
本明細書における発明は、本明細書で開示するように遺伝子もしくはタンパク質または遺伝子とタンパク質との組み合わせの発現レベルを示す試料が得られたＩＰＦの患者または患者集団を処置するために、治療剤またはその医薬組成物の使用を標的消費者に対して販売促進、指示および／または明示することを含む、ＩＰＦ治療剤またはその薬学的に許容される組成物をマーケティングする方法も包含する。
【０１２１】
マーケティングは、通常、出資者が同定され、メッセージが制御される非個人媒体による有給の通信である。本明細書における目的のためのマーケティングは、周知、広告活動、プロダクトプレースメント、財政援助、引受業務および販売促進を含む。この用語は、本明細書における発明を購入、支持または承認する好ましいパターンに向けて説得、認知、促進、動機づけ、または挙動を変更するように多数の消費者に訴えるように設計された任意の印刷通信媒体に現れる出資された情報公示も含む。
【０１２２】
本明細書における診断方法のマーケティングは、任意の手段により達成してよい。これらのメッセージを送達するために用いられるマーケティング媒体の例は、テレビ、ラジオ、映画、雑誌、新聞、インターネットおよび放送媒体に現れるメッセージであるコマーシャルを含む広告掲示版を含む。
【０１２３】
用いられるマーケティングの型は、多くの因子、例えば到達する標的消費者の性質、例えば病院、保険会社、診療所、医師、看護師および患者、ならびに費用の点および医薬品および診断薬のマーケティングを管轄する関連する管轄の法および規則に依存する。マーケティングは、サービス相互作用ならびに／またはユーザ人口統計および地理的位置のようなその他のデータにより規定されるユーザの特徴に基づいて個別化またはカスタマイズしてよい。
【０１２４】
本明細書で引用する全ての出版物（特許および特許出願を含む）は、本明細書にそれらの全体が参照により組み込まれている。
【０１２５】
本明細書および特許請求の範囲を通して、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、記載する整数または整数の群の包含を意味するが、任意のその他の整数または整数の群の除外を意味しないことが理解される。
【０１２６】
上記の記載は、当業者が本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。以下の実施例は、説明の目的のみのために与えられ、本発明の範囲をいずれの方式でも限定することを意図しない。実際に、本明細書で示し記載するものに加えて本発明の様々な改変が、上記の記載から当業者に明らかになり、添付の特許請求の範囲内にある。
【０１２７】
特許出願および出版物を含む本明細書で引用する全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が全ての目的のために組み込まれている。
【実施例】
【０１２８】
実施例１：ＩＰＦにおける生存期間予後予測のための全身性バイオマーカーの同定
ＩＰＦ生存期間を予後予測するために有用になり得る分子バイオマーカーを同定するために、我々は、まず、４０名のＩＰＦ患者および８名の未使用ドナー対照からの肺組織（「コホート１」）においてマイクロアレイおよびｑＰＣＲ法を用いて遺伝子発現分析を行った。遺伝子発現の結果から、我々は、次いで、候補予後予測血清バイオマーカーを同定した。それぞれの候補予後予測血清バイオマーカーの血清レベルおよび肺機能を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏの間質性肺疾患診療所への提示の時に採取された８０名のＩＰＦ患者の別のコホート（「コホート２」）において判定した。生存状態を、試料採取後２〜８年にわたって追跡した。
【０１２９】
方法
ヒト肺組織
組織は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒにて生検または肺移植の時にＩＰＦ患者から採集した。非ＩＰＦ対照は、ドナー肺から採集した。さらなる詳細は、結果の項に示す。
【０１３０】
組織培養
ＩＭＲ−９０細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ；カタログ＃ＣＣＬ−１８６）を、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；カタログ＃Ｆ２４４２）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；カタログ＃１５１４０）を補ったＤＭＥＭ培地で培養した。細胞を、増殖因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＧＦＲ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ；カタログ＃３５４２３０）の床の上に播種した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を氷上で終夜融解し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を３７℃にて３０分間固まらせることにより、１２ウェルプレート中に４５０ｕｌ／ウェルの充填容積を得た。細胞（１Ｅ５−２Ｅ５）を次いでＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）の床の上に播種した。そうでないと示さない限り、ＩＬ−１３刺激は、１０ｎｇ／ｍｌ（ＩＬ−１３およびＴＮＦα）および３ｎｇ／ｍｌ（ＩＬ−４）を用いて行った。
【０１３１】
ＲＮＡ調製
急速凍結肺生検試料を、予め冷却した（液体窒素中で）Ｂｅｓｓｍａｎ組織粉砕機（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ；カタログ＃１８９４７５）中で粉砕した。Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）を粉砕した物質に加え、数回ピペット操作した。可溶化液を氷上で１０〜１５分間インキュベートした。可溶化液をさらなる処理まで−８０℃にて貯蔵した。ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）可溶化液から、製造者のプロトコールに従って単離した。Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）で単離したＲＮＡを、次いで、製造者のプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙカラムを用いることによる別の精製ステップに供した。
【０１３２】
組織培養した細胞を、１ｍｌ（１２ウェルプレートのウェルあたり）のＴｒｉｚｏｌ（登録商標）を加え、混合物を数回ピペット操作することにより採集した。Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）可溶化液を、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙプロトコールに示されるように鋼鉄ビーズ／Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）法（２０ｓ−１、４分間）を用いてホモジナイズした。ホモジナイゼーションの際に、ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）の製造者のプロトコールに従って単離した。Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）で単離したＲＮＡを、次いで、製造者のプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙカラムを用いることによる別の精製ステップに供した。
【０１３３】
ＲＮＡ濃度は、分光分析（Ｎａｎｏｄｒｏｐ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により決定し、全てのマイクロアレイ試料は、バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ）により分析した。
【０１３４】
ＲＴ−ｑＰＣＲ
１００〜３００ｎｇのトータルＲＮＡを、製造者のプロトコールに従って高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＡＢＩ、カタログ＃４３６８８１４）を用いてランダムプライマーを用いる逆転写に供した。リアルタイムｑＰＣＲは、Ｔａｑｍａｎアッセイを用いて行った。全ての反応は、ＡＢＩ  ７９００ＨＴ装置またはＦｌｕｉｄｉｇｍプラットフォーム（４８．４８または９６．９６フォーマット）のいずれかで行った。
【０１３５】
ＩＬ−１３レポーターアッセイ
Ｌ−Ｌｕｃ−ＢＥＡＳ−２Ｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより構築された株化細胞；ＢＥＡＳ−２Ｂ、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡに由来；ｃａｔ．ｎｏ．ＣＲＬ−９６０９）を、以下に示すような試薬を包埋したＧＦＲ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で成長させた：１２ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃２１３−ＩＬ）および抗ＩＬ−１３遮断抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）。ホタルルシフェラーゼ活性を、ホタルルシフェラーゼのみを測定するように改変して製造者のプロトコールに従ってＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ＃Ｅ２９２０）を用いて測定した。
【０１３６】
マイクロアレイ分析
ＲＮＡを、Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ標識化キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５１９０−０４４４）を用いて増幅および標識して、１ｕｇのトータルＲＮＡから標識されたｃＲＮＡを作製した。実験試料を、Ｃｙ５で標識した。ユニバーサルヒト参照ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を参照チャネルのために用い、Ｃｙ３で標識した。Ｃｙ５およびＣｙ３で標識されたｃＲＮＡを、２色全ヒトゲノム４×４４Ｋ遺伝子発現マイクロアレイプラットフォーム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ４１１２Ｆ）と競合的にハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたマイクロアレイを製造者のプロトコール（Ａｇｉｌｅｎｔ）に従って洗浄し、全ての特徴強度を、Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイスキャナを用いて収集した。走査したスライドのＴＩＦＦ画像を、特徴抽出ソフトウェアバージョン７．５（Ａｇｉｌｅｎｔ）、プロトコールＧＥ２−ｖ５＿９５（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて分析した。フラグが付けられたアウトライアーは、いずれの後続の分析にも含めなかった。全てのデータを、染料で標準化したＣｙ５／Ｃｙ３比のｌｏｇ２値として報告する。全ての試料のｌｏｇ２比を、対応する模擬処理試料（または非ＩＰＦ対照）の平均ｌｏｇ２比に対して標準化した。
【０１３７】
異なる発現プロファイリングデータセットを比較した場合、公共で利用可能なデータセットを、元の研究と同様にまずフィルタにかけ、標準化し、中心にした。Ｋａｍｉｎｓｋｉデータセット（ＧＳＥ１０６６７）（Ｋｏｎｉｓｈｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１８０（２）：１６７〜７５頁（２００９））を、全ヒトゲノムＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイプラットフォームについて運転し、よって、プラットフォーム特異的プローブ識別子を用いてデータセットを接続した。ヒートマップを、Ｊａｖａ  Ｔｒｅｅｖｉｅｗを用いて作成した。
【０１３８】
示差的に発現される遺伝子を、Ｒ（ＬＩＭＭＡ）において、３つの因子、すなわち診断、組織供給源および性別（Ｙ連鎖遺伝子の発現分析から推測される）を取り込んだ線形モデルを構築することにより同定した。
【０１３９】
血液バイオマーカーアッセイ
以下のマーカーのレベルを、製造者の使用説明に従って市販のアッセイを用いて血清中で判定した：ＣＯＭＰ（Ａｂｎｏｖａ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ、カタログ＃ＫＡ００２１）；ＭＭＰ７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、カタログ＃ＤＭＰ７００）；ＣＸＣＬ１３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、カタログ＃ＤＣＸ１３０）；ＣＣＬ１３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、カタログ＃ＤＹ３２７）；ＹＫＬ−４０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、カタログ＃ＤＹ２５９９）；ＭＭＰ３（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、カタログ＃Ｋ１５０３４Ｃ）；ＳＡＡ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、カタログ＃Ｋ１５１ＥＯＣ−１）；ＣＣＬ１１（エオタキシン）およびＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、カタログ＃１５０３１Ｃ）。ＯＰＮのレベルは、血漿中で、製造者の使用説明に従って市販のアッセイを用いて判定した（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＤＯＳＴ００）。血清ペリオスチンは、以前に記載されるようにして、特許権により保護されているアッセイを用いて分析した（例えば国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６５４１０号）。血清ＣＣＬ１８について、マトリクス干渉を以下のようにして改善するための改変を製造者のプロトコールに加えて、市販のアッセイを用いた（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＤＹ３９４）：９６ウェルプレートを、マウス抗ヒトＣＣＬ１８モノクローナル抗体で４℃にて終夜被覆し、次いで、１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．５％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．２５％  ＣＨＡＰＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ＰＰＭプロクリンを含有する緩衝液を用いてブロックした。５％ＦＢＳ含有アッセイ希釈剤で１：１０００に希釈した血清試料を二重に加え、プレートを、室温（２０℃）にて２時間インキュベートした。洗浄の後に、５％ヤギ血清含有アッセイ希釈剤中のビオチン化ヤギ抗ヒトＣＣＬ１８モノクローナル抗体をプレートに加え、室温（２０℃）にて１時間インキュベートした。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよび基質ＴＭＢを用いて洗浄の後に発色させた。このアッセイの検出限界は、およそ７．８ｐｇ／ｍｌであった。
【０１４０】
結果
研究コホートの特徴決定
コホート１から得られた試料について、４０名のＩＰＦ患者および８名の対照からの生検組織を、マイクロアレイおよびｑＰＣＲ研究において用いた。ＩＰＦ試料のうち１１は、胸腔鏡下生検から得て、２９の試料は、肺移植の時に得られた外植片から得た。対照組織は全て、未使用のドナー肺から外植した。ドナー肺は、肺以外の原因（例えば外傷）で死亡したが、死亡からの時間が過剰であることまたは血液型、血管もしくはＨＬＡミスマッチによる適切なレシピエントが入手可能でないことのような理由により移植のために用いることができなかった、間質性肺疾患の証拠がない対象から全般的に得られた。全てのＩＰＦ生検検体からの隣接組織は、通常の間質性肺炎（ＵＩＰ）パターンを有することを確認した。３１のＩＰＦおよび１５の対照試料からなる公共でダウンロードして入手した再現データセットは、以前に記載されている（Ｋｏｎｉｓｈｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１８０（２）：１６７〜７５頁（２００９））。
【０１４１】
コホート２から得られた試料について、血清および血漿はともに、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏの間質性肺疾患診療所への提示の時に８０名のＩＰＦ患者のそれぞれから採取した。このコホートの臨床的および人口統計学的特徴を、以下の表１に記載する。健常対照からの血清（Ｎ＝２９）または血漿（Ｎ＝１０）を用いて、バイオマーカーレベルについての正常範囲を確立した。
0006404208.tif 000002
FVC=努力肺活量;TLC=全肺気量;DLCO=拡散能力(一酸化炭素を用いて測定);IQR=四分位範囲、25〜75パーセンタイル;1=Wattersら、Ann.Rev.Resp.Dis.133:97頁(1986)による1〜20の尺度での呼吸困難スコア;2=Bestら、Radiology246:935頁(2008)に記載される方法に従う、線維性である肺のパーセントのX線撮影によるスコア見積もり。
【０１４２】
ＩＰＦにおいて示差的に発現される遺伝子の同定
我々は、コホート１（４０名のＩＰＦ患者および８名の未使用ドナー対照の対象）からの肺組織から単離したＲＮＡのゲノム規模のトランスクリプトーム分析を、全ヒトゲノムマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ４１１２Ｆ）を用いて行った。限られて利用可能であったメタデータ（性別、組織供給源（生検または肺移植の時に採集された組織）、診断）を、用いた線形モデルに含めて、ＩＰＦ患者と対照との間で示差的に発現される（ＤＥ）遺伝子を同定した。我々は、対照組織と比較してＩＰＦ組織において示差的に発現される（ｑ＜０．０５、倍数変化＞１．５）２９４０のマイクロアレイプローブを同定した（部分的なリストを表２に示す）。ここで観察される全体的なＩＰＦ発現プロファイルが試料採取方法またはその他の混乱させる因子により与えられる系統的バイアスの影響を受ける可能性を低減させるために、我々は、発現プロファイルを、類似するが独立して作製されたＩＰＦデータセット（Ｋｏｎｉｓｈｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１８０（２）：１６７〜７５頁（２００９））と比較した。このデータセット（ＧＳＥ１０６６７）は、３１名のＩＰＦ患者および肺腫瘍切除の後に周囲の非悪性領域から採集した１５名の対照肺組織からの肺生検の発現プロファイルについて表した。我々は、各遺伝子について、対照試料と比較した、ＩＰＦ試料の発現レベルの偏差について示すＴ統計量を算出した。互いに対してプロットした場合に、我々は、高い程度の類似性を見出した（データは示さず）。２つのデータセットを独立して作製したので、同様のｔ統計量は、各研究の妥当性を支持し、トランスクリプトーム規模の効果が研究特異的因子または技術的アーチファクトによる見込みを低減する。
【０１４３】
ＩＰＦにおける細気管支、リンパ系および線維芽細胞／筋線維芽細胞遺伝子発現サイン
ＩＰＦと対照との間の２４９０のＤＥマイクロアレイプローブの教師なし２元階層的クラスタリング（上で定義するような）は、図１Ａに示すような、診断（例えばＩＰＦまたは対照）により主に規定される３つの主要クラスタ；群１クラスタ、群２クラスタおよび群３クラスタを示した。我々は、群１（図１Ｂに示すヒートマップ）、群２（図１Ｃに示すヒートマップ）および群３（図１Ｄに示すヒートマップ）を再クラスタリングした。図１Ｂ〜Ｄに示すヒートマップのうち、我々は、ＩＰＦ患者のうちで不均質であるとみられる同時調節される遺伝子のいくつかの群を観察した。同時調節される遺伝子のこれらの群のうち３つは、それぞれ気管支上皮（表２を参照されたい；群１クラスタともいう）、濾胞ともいうリンパ系凝集体（表３を参照されたい、群２クラスタともいう）および筋線維芽細胞（表４を参照されたい、群３クラスタともいう）において発現される遺伝子が濃縮されていた。
【０１４４】
群１クラスタまたは細気管支群は、ムチン（ＭＵＣＬ１、ＭＵＣ４、ＭＵＣ２０）；プロリンリッチ分泌因子（ＰＲＲ７、ＰＲＲ１５、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＳＰＲＲ２Ｄ）；ケラチン（ＫＲＴ５、ＫＲＴ６Ｂ、ＫＲＴ１３、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ１７）、セリンプロテアーゼ阻害剤（ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＳＥＲＰＩＮＢ１３）、イオンチャネルおよび関連因子（ＣＬＣＡ２、ＴＲＰＶ４）ならびに線毛成分（ＢＢＳ５）ならびにＭＭＰ３およびＳＡＡ４を含有した。これらの遺伝子は、正常肺実質において期待されると考えられる肺胞上皮よりもむしろ分化気管支上皮の典型であり、このような遺伝子の発現は、重度の瘢痕と関連する蜂巣状嚢胞空間の上皮化を表す可能性がある、ＩＰＦにおける肺胞空間の異常な「細気管支化」についての以前の報告と一貫する（Ｃｈｉｌｏｓｉら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．８２（１０）：１３３５〜４５頁（２００２））。細気管支サインは、ＴＰ６３、ＣＬＣＡ２、ＦＧＦ１４、ＰＴＰＲＺ１、ＳＯＸ２、ＤＳＣ３、ＣＰ、ＭＭＰ１、ＭＵＣ４、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ１３および複数のケラチンを含む、随伴性の肺線維症および肺動脈高血圧症の患者からの肺組織において上方制御されることが報告されている遺伝子サインと著しく類似する（Ｍｕｒａら、Ｃｈｅｓｔ１４１：６６１〜６７３頁（２０１２））。よって、組織コンプライアンスの減少ならびに瘢痕、蜂巣化および細気管支化と関連するガス交換の減損は、肺血管耐性およびその後の肺高血圧の増加に貢献すると思われる。我々は、ある種の遺伝子が、このクラスタ内で下方制御され、これらがＮｏｔｃｈ４、カドヘリン、Ｗｎｔ７ＡおよびＤＫＫ２を含んだことにも注目した。
0006404208.tif 000003
0006404208.tif 000004
プローブID=Agilent全ヒトゲノムマイクロアレイ上のプローブの識別番号;遺伝子記号=NCBI Entrez遺伝子記号;遺伝子名=NCBI Entrez遺伝子名;ENTREZ ID=NCBI Entrez遺伝子ID;logFC=IPF試料中の2を底とするlog発現レベルの平均から健常対照試料中の2を底とするlog発現レベルの平均を減じたもの;p値=プローブごとにIPFと対照との間の示差的発現についてt検定を用いて算出;調整p値=ボンフェローニ法を用いて複数の試験について調整。
【０１４５】
ＩＰＦにおいて不均質性を示した、高度に同時調節される遺伝子の第２のクラスタ（群２クラスタ；図１Ａ）は、リンパ濾胞（凝集体ともいう）に関する遺伝子を含んだ。遺伝子の以下の群が、ＩＰＦ患者において群２クラスタで上方制御された：Ｂ細胞特異的遺伝子（ＣＤ１９、ＣＤ２０［ＭＳ４Ａ１］、ＢＣＭＡ［ＴＮＦＲＳＦ１７］、ＢＬＫおよびＢＬＮＫ）；複数の免疫グロブリン遺伝子ならびにＣＤ７９ＡおよびＣＤ７９Ｂ；Ｔ細胞およびＡＰＣ遺伝子（ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１）；Ｆｃ受容体遺伝子（ＦＣＲＬＡ、ＦＣＲＬ２、ＦＣＲＬ５）；ならびにケモカインおよびそれらの受容体（ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７）。このパターンの遺伝子発現は、ＩＰＦ生検における活動性線維症の領域中のリンパ球の数の増加を示す以前の報告と一貫する（Ｎｕｏｖｏら、Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．（２０１１）１〜１８頁）。我々は、高度に同時調節される遺伝子のこの群を選択し、これらの「リンパ系」遺伝子の発現パターンに拘束されるデータセットを再クラスタリングした（図１Ｃ）。この分析により、リンパ系遺伝子の低い、中程度または高い協調発現を特徴とする３つの主要サブセットが得られた。低い発現群は、全ての対照といくらかのＩＰＦ対象とを含んだが、中程度および高い発現群は、残りのＩＰＦ対象を含んだ。
0006404208.tif 000005
0006404208.tif 000006
プローブID=Agilent全ヒトゲノムマイクロアレイ上のプローブの識別番号;遺伝子記号=NCBI Entrez遺伝子記号;遺伝子名=NCBI Entrez遺伝子名;ENTREZ ID=NCBI Entrez遺伝子ID;logFC=IPF試料中の2を底とするlog発現レベルの平均から健常対照試料中の2を底とするlog発現レベルの平均を減じたもの;p値=プローブごとにIPFと対照との間の示差的発現についてt検定を用いて算出;調整p値=ボンフェローニ法を用いて複数の試験について調整。
【０１４６】
ＩＰＦにおいて不均質性を示した、高度に同時調節される遺伝子の第３のクラスタは、筋線維芽細胞への線維芽細胞の分化および創傷治癒に関する遺伝子を含んだ。このクラスタは、コラーゲンをコードする複数の遺伝子（ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１６Ａ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＴＨＲＣ１）；増殖因子（ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ７、ＳＣＧＦ）；リシルオキシダーゼ（ＬＯＸＬ１、ＬＯＸＬ２）；ヘッジホッグシグナル伝達のメディエータ（ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＳＭＯ）；Ｗｎｔシグナル伝達のメディエータ（ＳＦＲＰ２、ＤＩＯ２）、ＣＤＨ１１、ペリオスチンおよびＴＧＦＢ３を含んだ。このパターンは、ＩＰＦにおける筋線維芽細胞および／または線維芽細胞巣と関連するこれらのメディエータの多くの発現の上昇を示す以前の報告と一貫する（Ｅｌｌｉｏｔｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ１２５：１２１〜１３２頁（２０１２）；Ｂａｒｒｙ−Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１６：１００９〜１０１７頁（２０１０）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、ＦＡＳＥＢ２６：５０３〜５１２頁（２０１２）；Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｊｏｕｒｎａｌ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ３７：１１１９〜１１２７頁（２０１１）；Ｇｕｙら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｅｐ．２５５５９（２０１１）、Ｌａｍら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｒｈｅｕｍ．２３：５６２〜５６７頁（２０１１）；Ｌｏｍａｓら、Ｉｎｔｎ’ｌ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．ａｎｄ  Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．５：５８〜７１頁（２１０２））。我々は、高度に同時調節される遺伝子のこの群を選択し、これらの「筋線維芽細胞」遺伝子の発現パターンに拘束されるデータセットを再クラスタリングした（図１Ｄ）。この分析により、筋線維芽細胞関連遺伝子の低い、中程度または高い協調発現を特徴とする３つの主要サブセットが得られた。低い発現群は、全ての対照といくらかのＩＰＦ対象とを含んだが、中程度および高い発現群は、残りのＩＰＦ対象を含んだ。
0006404208.tif 000007
0006404208.tif 000008
プローブID=Agilent全ヒトゲノムマイクロアレイ上のプローブの識別番号;遺伝子記号=NCBI Entrez遺伝子記号;遺伝子名=NCBI Entrez遺伝子名;ENTREZ ID=NCBI Entrez遺伝子ID;logFC=IPF試料中の2を底とするlog発現レベルの平均から健常対照試料中の2を底とするlog発現レベルの平均を減じたもの;p値=プローブごとにIPFと対照との間の示差的発現についてt検定を用いて算出;調整p値=ボンフェローニ法を用いて複数の試験について調整。
【０１４７】
細気管支、リンパ系および筋線維芽細胞サインが、個別の対象において互いに関連するかを決定するために、我々は、各クラスタにおける全ての遺伝子の標準化された平均発現をとることにより、各サインについての発現の指標を導いた。このことにより、個別の患者ベースで各サインの強さを比較できた。ほとんどのＩＰＦ対象は対照よりも高い細気管支、リンパ系または筋線維芽細胞サインスコアを有したが、各スコアには広い範囲の変動性があり、２つのサインは、ＩＰＦの個別の対象内でいずれの著しい相関パターンも示さなかった（図１Ｅ）。この結果は、３つのサインが、ＩＰＦ患者にわたって不均質に発現される直交プロセスおよび／またはＩＰＦ組織において反映される不均質なプロセスの示差的なサンプリングを反映し得ることを示唆する。
【０１４８】
３つのサインのそれぞれに含まれる選択した遺伝子がＩＰＦ肺組織の空間的に別個の領域で発現されたかを決定するために、我々は、ＩＰＦ肺外植片（Ｎ＝５）から採取した生検組織の凍結切片に対して免疫組織化学（ＩＨＣ）を行った。我々は、蜂巣状嚢胞を特徴とする細気管支化の領域が、コラーゲン沈着の領域の近くであるがそれとは別個の領域で（図２Ｂ）、豊富な細胞質を有する円柱上皮細胞（図２Ａ）で裏打ちされていたことを見出した。これらの上皮細胞は、細気管支サインに含まれる遺伝子によりコードされるタンパク質であるケラチン１４についての染色が陽性であり（図２Ｃ）、ＰＡＳ染色により検出されるようにムチンを発現した（図２Ｄ）。空間的に別個の領域では、我々は、高いコラーゲン沈着の領域の近くであるがそれとは別個の領域で（図２Ｆ）、Ｈ＆Ｅにより濃く染色される核を有する細胞の凝集体（図２Ｅ）を観察した。これらの凝集体は、リンパ系サインに含まれる遺伝子によりコードされるＢ細胞表面マーカーであるＣＤ２０についての染色が陽性であった（図２Ｇ〜Ｈ）。細気管支化領域は、リンパ系凝集体とは空間的に別個であり（図２ＩおよびＪ）、細気管支化領域およびリンパ系凝集体はともに、高いコラーゲン沈着の領域の近くであるが空間的に別個の領域で頻繁に出現した（図２ＢおよびＦ）。複数のコラーゲン遺伝子が、線維芽細胞サインに含まれる。
【０１４９】
候補血清バイオマーカーをコードする示差的に発現される遺伝子の同定
候補血清バイオマーカーをコードすることを評価するための候補遺伝子のリストを狭め、バイオマーカーとして評価するための候補血液タンパク質を同定するために、我々は、ＵＣＳＦコホート１データセットおよびＧＳＥ１０６６７データセット（Ｋｏｎｉｓｈｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１８０（２）：１６７〜７５頁（２００９））の両方において、ＩＰＦにおける＞２倍の上方制御（ｑ＜０．０５）というより厳しいカットオフを用いた。この分析により、両方のデータセットにおいて共通して上方制御される２９１の遺伝子を得た（表５を参照されたい）。これらの共通遺伝子のうち、末梢血中で検出できる可能性がある細胞外および／または分泌タンパク質をコードし、よって、可能性のある血清またはその他のバイオマーカーとしてのさらなる評価のための良好な候補となるものがいくつかあった。これらの結果および以前に発表されたデータおよび血清バイオマーカー検出についての容易に利用可能なアッセイに基づいて、我々は、ＹＫＬ−４０、ＣＯＭＰ、ＯＰＮ、ＭＭＰ７、ペリオスチン、ＣＸＣＬ１３、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８、ＭＭＰ３および血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、特に構成性ＳＡＡであるＳＡＡ４をＩＰＦにおける候補予後予測血液バイオマーカーとして選択した。（例えばＫｏｒｔｈａｇｅｎら、Ｒｅｓｐ．Ｍｅｄ．１０５：１０６〜１１３頁（２０１１）、Ｐａｒｄｏら、ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ．２（９）：８９１〜９０３頁（２００５）、Ｒｉｃｈａｒｄｓら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、ｄｏｉ：１０．１１６４／ｒｃｃｍ．２０１１０１−００５８ＯＣ（２０１１）、Ｙｏｋｏｙａｍａら、Ｒｅｓｐｉｒｏｌｏｇｙ１１：１６４〜１６８頁（２００６）、Ｋｉｎｄｅｒら、Ｃｈｅｓｔ１３５：１５５７〜１５６３頁（２００９）を参照されたい）。さらに、ＣＣＬ１８は、ＩＰＦにおける生存期間についての予後予測バイオマーカーとして以前に報告されている（Ｐｒａｓｓｅら、Ａｍ  Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１７９：７１７〜７２３頁（２００９））が、これは、我々のマイクロアレイ実験において著しくＤＥとして検出されなかった。
【０１５０】
血液バイオマーカーを、それらの予測される生物学に関連する様々な範疇に従って選択した。ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１７およびＣＣＬ１８は、２型炎症と関連するケモカインである。我々は、ＣＣＬ１３およびＣＣＬ１７が、喘息においてＩＬ１３遮断に応答して薬力学的に調節されることを以前に示した（Ｃｏｒｒｅｎ  Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ３６５：１０８８〜１０９８頁（２０１１））。ペリオスチンは、ＩＬ１３生物学と関連し（Ｃｏｒｒｅｎ  Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ３６５：１０８８〜１０９８頁（２０１１）；Ｗｏｏｄｒｕｆｆら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ１０４：１５８５８〜１５８６３頁（２００７）；Ｗｏｏｄｒｕｆｆら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ１８０：３８８〜３９５頁（２００９）；Ｊｉａら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３０（３）：６４７〜６５４．ｅ１０（２０１２））、上記の線維芽細胞遺伝子サインにおける代表的な遺伝子でもある。ＣＸＣＬ１３は、リンパ系凝集体で高度に発現されるＢ細胞化学誘引物質であり、上記のリンパ系遺伝子サインにおける代表的な遺伝子でもある。ＭＭＰ３およびＳＡＡ４は、上記の細気管支遺伝子サインにおける代表的な遺伝子である。ＹＫＬ−４０は、骨髄系細胞活性化と関連するキチナーゼ様タンパク質であり、全身レベルは、複数の疾患状態において上昇する。以前に発表された研究は、ＹＫＬ−４０がＩＰＦにおいて高度に発現され、ＹＫＬ−４０の血清レベルが生存期間について予後予測的であることを示している（Ｋｏｒｔｈａｇｅｎら、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ１０５：１０６〜１１３頁（２０１１））。ＣＯＭＰは、ＴＧＦβにより誘導され、強皮症において筋線維芽細胞中で高度に発現される（Ｆａｒｉｎａら、Ｍａｔｒｉｘ  ｂｉｏｌｏｇｙ：ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌｏｇｙ２５：２１３〜２２２頁（２００６）；Ｆａｒｉｎａら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ６８：４３５〜４４１頁（２００９））。ＯＰＮおよびＭＭＰ７は、ＩＰＦ組織で高度に発現される。ＯＰＮの血液レベルは、ＩＰＦにおける肺機能と負に相関することが示されており（Ｋａｄｏｔａら、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ９９：１１１〜１１７頁（２００５））、ＭＭＰ７の血液レベルは、ＩＰＦにおける生存期間について予後予測的であることが示されている（Ｒｉｃｈａｒｄｓら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ１８５（１）：６７〜７６頁（２０１２））。
【０１５１】
ＩＰＦ肺におけるこれらの候補バイオマーカー遺伝子の示差的な発現を確認するために、我々は、定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）（方法を参照されたい）を、マイクロアレイ実験において用いたのと同じＲＮＡ試料について行った。表６は、マイクロアレイ遺伝子発現データを示し、図３Ａ〜Ｇは、ｑＰＣＲデータを示す。表６および図３Ａ〜Ｇに示すように、我々は、対照と比べてＩＰＦ患者において、それぞれの選択した候補バイオマーカー遺伝子の発現が著しく上昇したことを観察した。 
0006404208.tif 000009
遺伝子記号=NCBI Entrez遺伝子記号;logFC=IPF試料中の2を底とするlog発現レベルの平均から健常対照試料中の2を底とするlog発現レベルの平均を減じたもの;調整p値=ボンフェローニ法を用いて複数の試験について調整。
0006404208.tif 000010
【０１５２】
対照と比べてＩＰＦにおける選択したマーカーの遺伝子発現レベルの上昇が、末梢血中のこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルの上昇と対応するかを決定するために、我々は、コホート２ＩＰＦ試料（Ｎ＝８０）および健常対照からの試料において、血漿（ＯＰＮ）または血清（その他全て）中のそれらのレベルを評価した。血漿対照についてＮ＝１０；血清対照についてＮ＝２９。血液バイオマーカーアッセイはそれぞれ、上記のようにして行った。
【０１５３】
全てのＩＰＦ患者を全ての対照と比較すると、ＹＫＬ−４０、ＣＯＭＰ、ＯＰＮ、ＭＭＰ７、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＳＡＡおよびＣＸＣＬ１３の末梢血レベルは、ＩＰＦにおいて著しく上昇した（表７）。ＩＰＦ  対  対照についてウィルコクソン順位和検定を用いて、我々は、以下のｐ値を得た：ＹＫＬ−４０、ＣＯＭＰ、ＭＭＰ７、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１８およびＣＸＣＬ１３、ｐ＜１０−４；ＯＰＮ、ｐ＝０．０４。いくらかのＩＰＦ患者は、対照と比べて血清ペリオスチンまたはＭＭＰ３のレベルが上昇したが、全体的に、この差は、統計的有意性に到達しなかった。以前の報告は、ペリオスチンのレベルの上昇が、ＩＰＦ肺および末梢血において検出できることを示唆した（Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｊｏｕｒｎａｌ  ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ３７：１１１９〜１１２７頁（２０１１））。免疫調節治療（具体的には副腎皮質ステロイド）がペリオスチンの遺伝子発現レベルを低減できることが以前に示されており（Ｗｏｏｄｒｕｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０４（４０）：１５８５８〜６３頁（２００７）；Ｗｏｏｄｒｕｆｆら、Ａｍ  Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１８０（５）：３８８〜９５頁（２００９））、ペリオスチンの末梢血レベルがそのような治療の存在下で同様に低減されることが予期される。よって、ＩＰＦ患者における血清ペリオスチンレベルの変動および対照との有意差の欠如は、２１／８０のＩＰＦ患者が、試料採取時に免疫調節治療（ＩＴ、全身性副腎皮質ステロイドまたはアザチオプリン）を受けていたという事実により説明できると考えられた。
【０１５４】
我々は、よって、ペリオスチンを含むバイオマーカーのいずれかの末梢血レベルが、ＩＴを受けているＩＰＦ患者とＩＴを受けていないＩＰＦ患者との間で異なるかを調べた。ＩＴを受けているＩＰＦ患者は、ＩＴを受けていないＩＰＦ患者と比較して、より低いレベルのＣＯＭＰおよびペリオスチンを示す傾向を示した。これとは対照的に、ＩＴを受けているＩＰＦ患者は、ＩＴを受けていないＩＰＦ患者と比較して、ＣＸＣＬ１３、ＭＭＰ３およびＳＡＡのレベルが著しく上昇した（表７）。ＩＴ状態によるその他のバイオマーカーのいずれのレベルにおける差に向かっても、著しい差または傾向はなかった。
0006404208.tif 000011
1=オステオポンチンおよびMMP3以外の全てのバイオマーカーについて、N=29の対照およびN=80のIPF患者、かつ値は血清レベルである;オステオポンチンについて、N=10の対照およびN=80のIPF患者、かつ値は血漿レベルである;MMP3について、N=29の対照およびN=78のIPF患者;IQR=四分位範囲、25〜75パーセンタイル。
2=対照よりもIPFにおいて有意に高い、ウィルコクソン順位和検定によりp<0.05。
3=免疫調節治療(IT)状態によるIPF患者間の有意な差に向かう傾向、ウィルコクソン順位和検定によりp<0.1。
【０１５５】
我々は、次に、個別のバイオマーカーと人口統計学的および臨床的変数との間の相関について評価した。試験した８つのバイオマーカーのうち、ＯＰＮだけが以前の喫煙状態により著しい差を示したが、血漿ＯＰＮレベルは、喫煙経験のない者よりも喫煙経験者においてより低かった（ｐ＝０．０１、データは示さず）。臨床的変数を比較する際に、我々は、期待されるように、予測全肺気量（ＴＬＣ）％と予測努力肺活量（ＦＶＣ）％との間と、各肺活量変数と拡散能力（予測ＤＬＣＯ％）との間に、名目上の著しい正の相関を観察した。我々は、呼吸困難スコア（Ｗａｔｔｅｒｓら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１３３（１）：９７〜１０３頁（１９８６））、予測ＦＶＣ％および予測ＤＬＣＯ％の間にも負の相互相関を観察した（表８）。血液バイオマーカーのうち、我々は、ＭＭＰ７、ペリオスチンおよびＣＯＭＰの間；ならびにＯＰＮ、ＹＫＬ−４０、ＳＡＡ、ＭＭＰ３、ＣＣＬ１１およびＣＸＣＬ１３の間に全般的に弱い相互相関を観察し、ＣＣＬ１３とＣＣＬ１７との間に強い相互相関を観察した。観察された全般的に低い相関係数は、合計で、バイオマーカーのレベルが、集団全体にわたって互いにほぼ直交することを示唆する（表８）。我々は、個別のバイオマーカーと臨床的／人口統計学的変数との間に比較的少ない数の著しい相関も観察した。これらのうち、ＣＸＣＬ１３は、予測ＤＬＣＯ％と負に相関し、呼吸困難スコアと正に相関した。ＣＣＬ１１は、Ｘ線撮影によるスコアと正に相関した。ＳＡＡは、予測ＴＬＣ％と負に相関し、Ｘ線撮影によるスコアおよび呼吸困難スコアと正に相関した。ＭＭＰ３は、予測ＦＶＣ％と負に相関し、呼吸困難スコアと正に相関した。そして、ＯＰＮおよびＣＯＭＰは、年齢と弱く相関した（表８）。
0006404208.tif 000012
rs=スピアマンの順位相関;p値は、スピアマン相関のことをいう。
【０１５６】
血液バイオマーカーの予後予測価値の確立
以前の研究は、ＩＰＦ患者におけるその後の生存期間について肺機能、拡散能力、喫煙状態および年齢の単一時点の値が予後予測価値を弱く有するかまたは全く有さないことを示した。これらの知見と一貫して、我々は、個別に得られたこれらの変数のいずれについても、予測ＦＶＣ％を除いては、生存期間におけるいずれの劇的な差も観察しなかったが、集団についての予測ＦＶＣ％の中央値（＞６９％）よりも大きい値を示した患者は、＜６９％の予測ＦＶＣ％を示す患者よりも生存期間において有利であった（ＨＲ＝０．３７、ｐ＝０．０２、図４）。
【０１５７】
様々な血液バイオマーカーのその後の生存期間についての予後予測価値を判定するために、我々は、コックス比例ハザードモデルを当てはめて、各血液バイオマーカーの予後予測価値を個別に判定した（ペリオスチン、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１８、オステオポンチン、ＣＯＭＰ、ＹＫＬ−４０、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＳＡＡおよびＣＸＣＬ１３）。これらのバイオマーカーのうち、我々は、ＣＸＣＬ１３、ＹＫＬ−４０、ＣＯＭＰ、ＯＰＮ、ＭＭＰ３およびＳＡＡのベースラインでのレベルが、その後の移植のない生存期間によってＩＰＦ患者を著しく区別したことを見出した（図５Ａ〜Ｄおよび表９）。以前に発表された報告とは反対に（Ｒｉｃｈａｒｄｓら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、ｄｏｉ：１０．１１６４／ｒｃｃｍ．２０１１０１−００５８ＯＣ（２０１１）；Ｐｒａｓｓｅら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ１７９：７１７〜７２３頁（２００９））、我々は、このコホートにおいてＭＭＰ７またはＣＣＬ１８のレベルについていずれの予後予測価値も観察せず、このコホートにおいて試験したいずれのその他のバイオマーカー（ＣＣＬ１３およびペリオスチンを含む）についても統計的に有意な予後予測価値を観察しなかった。
0006404208.tif 000013
【０１５８】
個別の予後予測マーカーＣＸＣＬ１３、ＹＫＬ−４０、ＯＰＮ、ＣＯＭＰ、ＭＭＰ３およびＳＡＡのレベルはＩＰＦ患者内で高度に相互相関しなかったので、我々は、これらのマーカーの組み合わせが、予後予測価値をさらに強化するかについて調べた。我々は、上記の６つのバイオマーカーのそれぞれの可能な組み合わせの複合値を判定して、試料採取後１、２および３年にわたる死亡を、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を用いて予測した。我々は、全般的に、単一バイオマーカーまたは対のバイオマーカーが、３つ以上のバイオマーカーの組み合わせと比較して不利に作動したことを見出した（図６Ａ）。組み合わせにおけるバイオマーカーの最適な最小限の数を決定するために、我々は、２年でのＲＯＣ分析の曲線下面積（ＡＵＣ）および６つのバイオマーカーの全ての可能な組み合わせの期間重要性を判定し、３バイオマーカーの多くの組み合わせが、４つ以上のバイオマーカーの組み合わせと同等に作動したことを見出した（図６Ｂ）。
【０１５９】
範疇にわたってＩＰＦ患者の数の比較的同等な分布を達成するために、我々は、単純な評点システムを考案したが、これにより、コホート全体についての中央値レベルより上のベースラインバイオマーカーレベルは、それぞれのバイオマーカーについて１のスコアを獲得した。よって、４つ全てのバイオマーカーについて中央値レベルより下のバイオマーカーレベルを有する患者は、０のスコアを割り当てられ、１つのバイオマーカーについて中央値より上で、その他の３つのバイオマーカーについて中央値より下であると１のスコアを割り当てられる、などであった。我々は、各バイオマーカーについて以下の値を導いた。ＣＸＣＬ１３についての中央値レベルは、８０ｐｇ／ｍｌであった。ＹＫＬ−４０についての中央値レベルは、１０５ｎｇ／ｍｌであった。ＣＯＭＰについての中央値レベルは、９０１ｎｇ／ｍｌであった。そして、ＯＰＮについての中央値レベルは、６９ｎｇ／ｍｌであった（表７を参照されたい）。この評点システムは、コックス比例ハザードモデルを用いて、患者の群を生存期間により劇的に区別した（ｐ＜１０−６、図７）。
【０１６０】
ＲＯＣ分析において最高に作動する３バイオマーカーの組み合わせ（ＭＭＰ３、ＣＯＭＰおよびＹＫＬ４０）を用いて、範疇にわたってＩＰＦ患者の数の比較的同等な分布を達成するために、我々は、上記の評点システムを当てはめたが、ここでは、３つ全てのバイオマーカーについて中央値より下の患者は０のスコアを割り当てられ、１つのバイオマーカーについて中央値より上であり他の２つのバイオマーカーについて中央値より下である患者は１のスコアを割り当てられ、いずれか２つのバイオマーカーについて中央値より上であるが３番目のバイオマーカーについて中央値より下の患者は２のスコアを割り当てられ、３つ全てのバイオマーカーについて中央値より上の患者は３のスコアを割り当てられた。この評点システムは、コックス比例ハザードモデルを用いて、患者の群を生存期間により劇的に区別した（ｐ＜１０−９、図８；カプラン−マイヤー生存期間データをプロットする）。スコアが０の１５名の患者のうち、フォローアップ期間において１件の死亡だけが記録されたが、スコアが３の患者は全て、試料採取の５００日以内に死亡した。
【０１６１】
したがって、我々は、ある種のバイオマーカー、ＣＸＣＬ１３、ＹＫＬ−４０、ＣＯＭＰ、ＯＰＮ、ＭＭＰ３およびＳＡＡの血液レベルを測定し、各バイオマーカーの値が中央値レベルより上または下であるかを決定することを用いて、診断時にＩＰＦ患者の生存期間予後予測を判定できることを示した。さらに、本明細書で記載する評点システムを用いて血液バイオマーカーレベルが中央値レベルより上または下であるかをＩＰＦ患者について、バイオマーカーＣＸＣＬ１３、ＹＫＬ−４０、ＣＯＭＰおよびＯＰＮの０、１、２、３もしくは４つ全て、またはバイオマーカーＭＭＰ３、ＣＯＭＰおよびＹＫＬ−４０の０、１、２もしくは３つ全てについて判定することは、生存期間予後予測の正確性を増加できる。このようなシステムは、積極的な治療的介入のためまたは肺移植のための患者を同定するため、および治療剤の臨床試験のために患者を階層化するために有用である。
【０１６２】
ＩＰＦにおける危険性予測は、肺移植のような処置および患者管理について決定するために重要であり、治験治療薬の臨床試験の登録を階層化するために有用である。肺の直接サンプリングはＩＰＦ患者において頻繁に実際的でないかまたは実行不可能であるので、疾患活動性および進行の非侵襲的判定は、非常に価値がある。高分解能コンピュータ断層撮影（ＨＲＣＴ）によるイメージング、肺活量測定およびその他の肺機能の測定、例えば拡散能力および運動耐容能は、経時的な反復尺度により個別の患者の疾患の進行をモニタリングすることにおいていくらかの有用性を有するが、肺機能の単一点判定は、集団ベースで与える情報は比較的わずかである（Ｌｅｙら、Ａｍ  Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１８３：４３１〜４４０頁（２０１１））。本明細書で記載する血液ベースのバイオマーカーは、ＩＰＦについての薬物開発およびＩＰＦの臨床的管理を、疾患活動性の予測的、予後予測的、薬力学的および代用の指標としていくつかのレベルで可能にする能力を有する。
【０１６３】
予測的バイオマーカーは、処置前に特定の分子経路の活性の証拠を示し、標的治療により最も利益を受ける可能性がある患者の部分集団を同定する。ある所定の経路はＩＰＦ患者の集団にわたって不均質に発現されることがあり、その経路を標的にする薬剤からの臨床的利益を同定する能力は、そうでなければ将来を見越して同定できない患者の部分集合だけが利益を示すならば、脅かされる可能性がある。標的治療から最も利益を受ける可能性があるＩＰＦ患者を同定する予測的バイオマーカーは、治療的仮定をより厳密に試験するために臨床試験における登録を階層化する助けとなり得る。
【０１６４】
予後予測バイオマーカーは、将来の疾患進行または死亡の危険性を階層化する。ＩＰＦでの高い死亡率に鑑みて、プラセボと比べて寿命を著しく延長するために、治療的介入の成功が期待される。疾患の軌道の多様性に鑑みて、しかし、多数の患者を長年にわたって処置することなく、早期段階の臨床試験で生存期間利益を評価することは難しい。１〜２年の期間内に著しい疾患進行または死亡に苦しむ可能性が最も高いＩＰＦ患者を同定する予後予測バイオマーカーは、試験中に進行する可能性が最も高い患者において短期間の生存期間利益があるかを判定するために臨床試験における登録を階層化するために有用である。さらに、ある所定の治療的介入が比較的良い予後予測を有する患者に利益をもたらすことが可能であるが、ある種の引き返し限界点を超えて疾患が進行した患者においては有効でない。例えば、ＢＩＢＦ１１２０の最近の第２相研究の部分群の分析は、肺機能のプラセボで調整した利益のほとんどがベースラインにて７０％より大きい予測ＦＶＣを有する患者で観察されたが、７０％未満の予測ＦＶＣの患者は、それほど利益を示さなかったことを示した（Ｒｉｃｈｅｌｄｉ  Ｌら、アブストラクト、ＥＲＳ  ２０１１  Ａｎｎｕａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ）。
【０１６５】
薬力学的バイオマーカーは、疾患プロセスに関与する特定の分子経路の基部に近い活性を反映し、具体的な治療的介入に応答して変化するはずである。処置による薬力学的マーカーの変化は、分子的介入がその標的に影響しているかおよびどの程度で影響するかを示し、よって、これらのマーカーは、用量範囲探索研究において適当な用量を選択できる助けとなることができる。ＩＰＦのような短期間臨床転帰尺度がほとんど規定されていない疾患では、いずれの臨床的利益も存在しない場合の著しい薬力学的効果は、試験の失敗の理由として、不適当な標的選択と、不適当な投薬との間を識別する助けとなることができる。代用バイオマーカーは、薬力学的マーカーと同様に、処置に応答して変化するはずであるが、標的経路から離れていることがあり、疾患および臨床転帰の下流の顕在化とより密接に連結している。短期間での代用バイオマーカーの変化は、例えば生存期間転帰に対する継続処置の長期間の効力の見込みを示すことができる。ある所定のバイオマーカーは、予測的、予後予測的、薬力学的および代用の範疇のいずれか、いくつかまたは全てを示すことができる。
【０１６６】
ＩＬ−１３は線維症のメディエータであり、ＩＰＦにおける可能性のある治療標的として関与している（Ｗｙｎｎ，ＴＡ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０８：１３３９〜１３５０頁（２０１１））。上で論じたように、我々は、ＩＬ−１３、ならびにＩＬ−１３により調節される可能性がある遺伝子、例えばＩＬ１３Ｒα２、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８およびペリオスチンが、ＩＰＦ患者からの肺生検において上昇したレベルで発現されることを見出した。ある第ＩＩ相研究では、治療的ＩＬ−１３遮断が喘息において臨床的利益を示し、この利益は、血清ペリオスチンレベルにより決定されるそれらの気道でのＩＬ−１３発現の上昇が予測される患者の部分集合において増進された（Ｃｏｒｒｅｎら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：１０８８〜１０９８頁（２０１１））。上で論じた実験では、我々は、ＩＰＦ患者のコホート全体にわたって、血清ペリオスチンレベルが、健常対照で測定したものより有意に高くなかったことを見出した（表７）。しかし、ペリオスチンレベルは、ＩＰＦ患者の部分集合において明らかに上昇しており（表７）、ＩＰＦにおける血清ペリオスチンレベルの分布は、重度の喘息で観察されたものと同様である（Ｊｉａら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３０（３）：６４７〜６５４．ｅ１０（２０１２））。ペリオスチンは、本明細書で記載する線維芽細胞／筋線維芽細胞サインにおいて発現され、ＩＨＣによりＩＰＦにおいて線維芽細胞巣に限局されている（Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｊｏｕｒｎａｌ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ３７：１１１９〜１１２７頁（２０１１））。ＩＬ−１３遮断がＩＰＦ患者において臨床的効力を有するならば、血清ペリオスチンレベルが処置前に上昇している患者の部分集合においてのみ明白である可能性がある。同様に、我々は、ＣＣＬ１３およびＣＣＬ１７レベルが喘息患者において上昇し、治療的ＩＬ−１３遮断に応答して著しく減少することを見出した（Ｃｏｒｒｅｎら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：１０８８〜１０９８頁（２０１１））。ＣＣＬ１３およびＣＣＬ１７レベルはＩＰＦ患者において上昇するので、ＣＣＬ１３およびＣＣＬ１７もＩＰＦにおけるＩＬ−１３経路活性の薬力学的マーカーとして働く可能性がある。ＣＣＬ１１は、ＩＬ−１３に応答して上方制御される間質細胞の生成物である（Ｍａｔｓｕｋｕｒａら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：７５５〜７６１頁（２００１））。ＣＣＬ１８は、それら自体がＩＬ−１３の供給源であり得る（Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１４：６３３〜６４０頁（２００８））選択的活性化マクロファージの生成物である（Ｐｒａｓｓｅら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍ．５６：１６８５〜１６９３頁（２００７））。よって、ＣＣＬ１１およびＣＣＬ１８も、ＩＰＦにおけるＩＬ−１３遮断の治療的研究において予測的および／または薬力学的バイオマーカーとして働く可能性がある。
【０１６７】
ＯＰＮ、ＹＫＬ−４０、ＣＯＭＰ、ＣＸＣＬ１３、ＭＭＰ３およびＳＡＡの血清レベルはそれぞれ、ＩＰＦにおけるその後の疾患進行を著しく予測した。しかし、これらのレベルは、調べた集団にわたって患者内で劇的に相互相関しなかった。各マーカーは、異なる細胞供給源により生成され、ＩＰＦ損傷内で異なる発症プロセスの活性を反映することがある。
【０１６８】
ＯＰＮは、ＩＰＦにおける発現が上昇し（Ｐａｒｄｏら、ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ２：ｅ２５１（２００５））、その発現は、線維芽細胞巣およびＵＩＰ損傷における過形成性肺胞上皮に限局される（Ｋｅｌｌｙら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ１７４：５５７〜５６５頁（２００６））。ＯＰＮは、細胞接着、遊走、炎症および組織リモデリングにおいて役割を有すると考えられ（Ｏ’Ｒｅｇａｎ，Ａ．、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ＆ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｖｉｅｗｓ１４：４７９〜４８８頁（２００３））、ＯＰＮ欠損マウスは、ブレオマイシン誘発性肺線維症から保護される（Ｂｅｒｍａｎら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｌｕｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ２８６：Ｌ１３１１〜１３１８頁（２００４））。血漿ＯＰＮレベルは、ＩＰＦ患者において上昇し、ＩＰＦ内で、ＯＰＮレベルは、酸素飽和と負に相関したことが他の調査者により報告されている（Ｋａｄｏｔａら、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ９９：１１１〜１１７頁（２００５））。
【０１６９】
ＹＫＬ−４０は、活性化マクロファージのような骨髄由来細胞により主に生成されるキチナーゼ様タンパク質である（Ｒｅｈｌｉら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７８：４４０５８〜４４０６７頁（２００３））。その全身レベルは、組織リモデリングと関連するいくつかの炎症性および腫瘍性の容態において上昇し（Ｌｅｅら、Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ７３：４７９〜５０１頁（２０１１））、我々の知見は、ベースライン血清ＹＫＬ−４０レベルがＩＰＦ患者におけるその後の死亡について予後予測的であることを示す以前の報告と一貫する（Ｋｏｒｔｈａｇｅｎら、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ１０５：１０６〜１１３頁（２０１１））。
【０１７０】
ＣＯＭＰは、軟骨、靭帯、腱および骨において線維芽細胞により主に発現される細胞外基質タンパク質である。全身性強皮症の患者では、損傷性皮膚筋線維芽細胞のＣＯＭＰ発現レベルが上昇したことが見出され、その発現は、ＴＧＦβにより誘導された可能性がある（Ｆａｒｉｎａら、Ｍａｔｒｉｘ  ｂｉｏｌｏｇｙ：ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌｏｇｙ２５：２１３〜２２２頁（２００６）；Ｆａｒｉｎａら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ６８：４３５〜４４１頁（２００９））。
【０１７１】
ＣＸＣＬ１３は、濾胞性樹状細胞により生成されるケモカインである。これは、その同族受容体ＣＸＣＲ５と結合することによりＢ細胞を２次および３次リンパ構造に動員し、これらはともにリンパ濾胞形成のために必要である（Ａｎｓｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ４０６：３０９〜３１４頁（２０００））。最近、リンパ系凝集体が、ＩＰＦ生検においてＵＩＰ損傷と関連することが報告され（Ｎｕｏｖｏら、Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．（２０１１）１〜１８頁）、高いＣＸＣＬ１３発現とともにＢ細胞浸潤が、腎線維症において報告されている（Ｈｅｌｌｅｒら、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ１７０：４５７〜４６８頁（２００７））。血清ＣＸＣＬ１３は、関節びらんの重症度（Ｍｅｅｕｗｉｓｓｅら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ６３：１２６５〜１２７３頁（２０１１））、および関節リウマチにおけるリツキシマブ処置後のＢ細胞再増殖（Ｒｏｓｅｎｇｒｅｎら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ）５０：６０３〜６１０頁（２０１１））のバイオマーカーとして記載されている。ＣＸＣＬ１３発現は、本明細書で記載するリンパ系サインとともにクラスタを形成する。
【０１７２】
ＭＭＰ３およびＳＡＡ４は、本明細書で記載する細気管支サインにおいて発現される。ＭＭＰ３タンパク質レベルの上昇は、ＩＰＦ患者からのＢＡＬ液で表されている（Ｒｉｃｈｔｅｒら、Ｔｈｏｒａｘ６４：１５６〜１６１頁（２００９））が、ＩＰＦのバイオマーカーとしてのＭＭＰ３の全身レベルは、以前に記載されていない。ＳＡＡは、多くの炎症性の容態において上昇している急性相反応物質であるが、ＩＰＦについてのバイオマーカーであると記載されていない。
【０１７３】
まとめると、ＩＰＦ患者におけるこれらの６つのバイオマーカー（ＯＰＮ、ＹＫＬ−４０、ＣＯＭＰ、ＣＸＣＬ１３、ＭＭＰ３およびＳＡＡ）のそれぞれの全身レベルは、別個の発症プロセスの変動性の相対的貢献を反映し得る。
【０１７４】
ＩＰＦ病理学の地理的不均質性およびまだらな性質に鑑みて、これらのバイオマーカーの末梢血レベルは、単一の小さい生検からの遺伝子発現レベルよりもＩＰＦにおける累積的な疾患の負担についてのより包括的な図を与えることができる。６つのバイオマーカー（ＯＰＮ、ＹＫＬ−４０、ＣＯＭＰ、ＣＸＣＬ１３、ＭＭＰ３およびＳＡＡ）のほとんどは健常対照と比較してＩＰＦ患者において全般的に上昇したが、ＩＰＦ集団内のこれらのバイオマーカーのそれぞれの相対的レベルは広く変動し、疾患進行に対して異なって影響することがある。よって、本明細書で記載する様々なバイオマーカーの組み合わせの値は、単一マーカーよりもさらなる利益さえ与えることができる。臨床的疾患進行に関して経時的にこれらのマーカーの動態を判定することは興味深い。
【０１７５】
実施例２−ＩＰＦにおけるシグナル伝達経路の特徴決定
ＩＬ−１３、ＴＧＦβおよびヘッジホッグ（Ｈｈ）経路を含む上皮−間葉通信のメディエータは、特発性肺線維症（ＩＰＦ）の病因に関わる。例えば、マウス肺におけるトランスジェニックＩＬ−１３過剰発現は、深在性肺線維症を誘発するために十分であることが示されており（Ｚｈｕら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３（６）：７７９〜８８頁（１９９９））、ＩＬ−１３欠損マウスは、ブレオマイシン誘発性線維症および住血吸虫誘発性肝線維症から部分的に保護される。ＩＬ−１３は、ＩＬ−１３Ｒα１およびＩＬ−４Ｒαを含むヘテロマー受容体複合体と結合し、それによりＪａｋファミリーキナーゼが、ＩＬ−１３およびＩＬ−４の下流のシグナル伝達を媒介する転写因子であるＳＴＡＴ６をリン酸化する。第２のＩＬ１３受容体であるＩＬ１３Ｒα２は、ＩＬ１３結合についてＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒα複合体と競合できる非シグナル伝達デコイ受容体として関わり、それによりＳＴＡＴ６活性化を低減する。ＩＬ１３Ｒα２は、ＳＴＡＴ６依存性およびＳＴＡＴ６非依存性シグナルにより誘導でき、線維性組織において発現レベルが上昇する。いくつかの報告（Ｆｉｃｈｔｎｅｒ−Ｆｅｉｇｌら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２（１）：９９〜１０６頁（２００６）；Ｍａｎｄａｌら、Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．１６（５）：７５３〜６４頁（２０１０））は、ＩＬ１３Ｒα２が、線維症に貢献し得るＳＴＡＴ６非依存性シグナルを伝達できることを示唆するが、これらの研究は、株化細胞での異所性ＩＬ１３Ｒα２過剰発現に頼っており、ＩＬ１３Ｒα２シグナル伝達についての機構は不明なままである。ＩＬ１３Ｒα２欠損動物は、組織線維症の増加を示すが、ＩＬ１３Ｒα１欠損動物は、組織線維症の減少を示す（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７（１０）：２９４１〜５１頁（２００７）；Ｍｅｎｔｉｎｋ−Ｋａｎｅら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１４１（６）：２２００〜２２０９頁（２０１１））。ノックアウト動物において行われたこれらの研究は、線維症の開始におけるＩＬ１３およびその受容体の役割に関して情報を与えるが、これらは、ヒト線維性疾患のような確立された線維症の関係で解釈することがより困難である。ＩＬ１３Ｒα２が、リガンド−受容体係合によりシグナル伝達できないデコイ受容体を形成することを示唆する研究がある一方で、線維形成におけるＩＬ１３Ｒα２の正の役割を指摘する、明らかに矛盾した研究がある。よって、ヒトＩＰＦにおける内因性ＩＬ１３およびＩＬ１３Ｒα２の役割は、ほとんど理解されていない。
【０１７６】
ＩＰＦにおける分子経路の我々の理解を増進するために、我々は、ＩＰＦおよび非ＩＰＦ、対照組織におけるゲノム規模の転写プロファイルを特徴決定した。これらの実験により、初代肺線維芽細胞におけるＩＬ１３の下流のシグナル伝達経路の同定および特徴決定が可能になった。
【０１７７】
材料および方法
ヒト肺組織試料
ヒト肺組織試料は、上記、実施例１に記載するようにして得た。
【０１７８】
組織培養
ＩＭＲ−９０細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ；カタログ＃ＣＣＬ−１８６）を、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；カタログ＃Ｆ２４４２）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；カタログ＃１５１４０）を補ったＤＭＥＭ培地で培養した。細胞を、増殖因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＧＦＲ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ）［ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ；カタログ＃３５４２３０］の床の上に播種した。Ｍａｔｒｉｇｅｌを氷上で終夜融解し、ｍａｔｒｉｇｅｌを３７℃にて３０分間固まらせることにより、１２ウェルプレート中に４５０μｌ／ウェルの充填容積を得た。細胞（１Ｅ５−２Ｅ５）を次いでＭａｔｒｉｇｅｌの床の上に播種した。そうでないと示さない限り、ＩＬ−１３刺激は、１０ｎｇ／ｍｌ（ＩＬ−１３およびＴＮＦα）および３ｎｇ／ｍｌ（ＩＬ４）を用いて行った。
【０１７９】
ＲＮＡ調製
急速凍結肺生検試料を、予め冷却した（液体窒素中で）Ｂｅｓｓｍａｎ組織粉砕機（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ；カタログ＃１８９４７５）中で粉砕した。Ｔｒｉｚｏｌを粉砕した物質に加え、数回ピペット操作した。可溶化液を氷上で１０〜１５分間インキュベートした。可溶化液をさらなる処理まで−８０℃にて貯蔵した。ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ可溶化液から、製造者のプロトコールに従って単離した。Ｔｒｉｚｏｌで単離したＲＮＡを、次いで、製造者のプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙカラムを用いることによる別の精製ステップに供した。
【０１８０】
組織培養した細胞を、１ｍｌ（１２ウェルプレートのウェルあたり）のＴｒｉｚｏｌを加え、混合物を数回ピペット操作することにより採集した。Ｔｒｉｚｏｌ可溶化液を、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙプロトコールに示されるように鋼鉄ビーズ／Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）法（２０ｓ−１、４分間）を用いてホモジナイズした。ホモジナイゼーションの際に、ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌの製造者のプロトコールに従って単離した。Ｔｒｉｚｏｌで単離したＲＮＡを、次いで、製造者のプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙカラムを用いることによる別の精製ステップに供した。
【０１８１】
ＲＮＡ濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐにより決定し、全てのマイクロアレイ試料は、バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ）により分析した。
【０１８２】
ＲＴ−ｑＰＣＲ
１００〜３００ｎｇのトータルＲＮＡを、製造者のプロトコールに従って高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＡＢＩ、カタログ＃４３６８８１４）を用いてランダムプライマーを用いる逆転写に供した。リアルタイムｑＰＣＲは、Ｔａｑｍａｎアッセイを用いて行った。全ての反応は、ＡＢＩ７９００ＨＴ装置またはＦｌｕｉｄｉｇｍプラットフォーム（４８．４８または９６．９６フォーマット）のいずれかで行った。
【０１８３】
ＩＬ−１３レポーターアッセイ
Ｌ−Ｌｕｃ−Ｂｅａｓ２Ｂ細胞（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ  Ｎｏ．ＣＲＬ−９６０９）を、以下の試薬を包埋したＧＦＲ  ｍａｔｒｉｇｅｌで成長させた：１２ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃２１３−ＩＬ）および抗ＩＬ−１３遮断抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）。ホタルルシフェラーゼ活性を、ホタルルシフェラーゼのみを測定するように改変して製造者のプロトコールに従ってＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ＃Ｅ２９２０）を用いて測定した。
【０１８４】
マイクロアレイ分析
ＲＮＡを、Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ標識化キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて増幅および標識して、１ｕｇのトータルＲＮＡから標識されたｃＲＮＡを作製した。実験試料を、Ｃｙ５で標識した。ユニバーサルヒト参照ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を参照チャネルのために用い、Ｃｙ３で標識した。Ｃｙ５およびＣｙ３で標識されたｃＲＮＡを、２色全ヒトゲノム４×４４Ｋ遺伝子発現マイクロアレイプラットフォームと競合的にハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたマイクロアレイを製造者のプロトコール（Ａｇｉｌｅｎｔ）に従って洗浄し、全ての特徴強度を、Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイスキャナを用いて収集した。走査したスライドのＴＩＦＦ画像を、特徴抽出ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）、プロトコールＧＥ２−ｖ５＿９５（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて分析した。フラグが付けられたアウトライアーは、いずれの後続の分析にも含めなかった。全てのデータを、染料で標準化したＣｙ５／Ｃｙ３比のｌｏｇ２値として報告する。全ての試料のｌｏｇ２比を、対応する模擬処理試料（または非ＩＰＦ対照）の平均ｌｏｇ２比に対して標準化した。
【０１８５】
異なる発現プロファイリングデータセットを比較した場合、公共で利用可能なデータセットを、元の研究と同様にまずフィルタにかけ、標準化し、中心にした。Ｋａｍｉｎｓｋｉデータセット（ＧＳＥ１０６６７）を、全ヒトゲノムＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイプラットフォームで運転し、よって、プラットフォーム特異的プローブ識別子を用いてデータセットを接続した。ヒートマップを、Ｊａｖａ  Ｔｒｅｅｖｉｅｗを用いて作成した。
【０１８６】
示差的に発現される遺伝子を、Ｒコード（ＬＩＭＭＡ）において、３つの因子、すなわち診断、組織供給源および性別（Ｙ連鎖遺伝子の発現分析から推測される）を取り込んだ線形モデルを構築することにより同定した。
【０１８７】
結果
Ｉｌ１３Ｒα２は、ＩＰＦ肺組織において最も示差的に発現される遺伝子である
我々は、４０名のＩＰＦ患者および８名の非ＩＰＦ対照の対象から生検で採取した肺組織のゲノム規模トランスクリプトーム分析を行った。我々は、これらの臨床試料からＲＮＡを単離し、全ヒトゲノムＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ（ＧＥＯ受託ＩＤ）を用いて転写産物を分析した。限られて利用可能であったメタデータ［性別、組織供給源（生検または肺移植の時に採集された組織）、診断］を、用いた線形モデルに含めて、示差的に発現される遺伝子を同定した。
【０１８８】
我々は、１５０８の遺伝子を、対照組織と比較してＩＰＦ組織において示差的に発現される（ｑ＜０．０５、倍数変化＞｜２｜）と同定した。部分的なリストを表１０に示す。ＩＰＦにおいて著しく上方制御される遺伝子は、マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ１、３、７、１０、１１、１２、１３、１６）、コラーゲン（ＣＯＬ１５Ａ、１０Ａ１、８Ａ２、１Ａ１、２４Ａ１、６Ａ３、７Ａ１、１Ａ２、５Ａ２、３Ａ１、１７Ａ１、１４Ａ１）およびＩＬ−１３経路遺伝子（ＩＬ−１３、ＩＬ１３Ｒα２、ＰＯＳＴＮ、ＣＣＬ１３）を含んだ。実際に、ＩＰＦにおいて最も著しく上昇した遺伝子はＩＬ１３Ｒα２であり、これは、４４倍の変化を示した（ｑ＝３．４×１０−１４）。我々は、定量ＲＴ−ＰＣＲを行うことによりこの観察結果を検証した（図９）。
0006404208.tif 000014
プローブID=Agilent全ヒトゲノムマイクロアレイ上のプローブの識別番号;遺伝子記号=NCBI Entrez遺伝子記号;遺伝子名=NCBI Entrez遺伝子名;ENTREZ ID=NCBI Entrez遺伝子ID;logFC=IPF試料中の2を底とするlog発現レベルの平均から健常対照試料中の2を底とするlog発現レベルの平均を減じたもの;p値=limma分析からの線形モデルにおいて診断期間の効果有意性の名目上のp値;調整p値=遺伝子が統計的に有意であり得る最大p値での推定偽発見率。
【０１８９】
ＩＬ１３Ｒα２発現は、培養初代肺線維芽細胞においてＩＬ−１３により誘導される
上で論じたように、ＩＬ１３Ｒα２は、対照である非ＩＰＦ試料と比較してＩＰＦ試料において最も高度に示差的に発現される遺伝子であり、ＩＰＦにおいて、対照におけるよりも平均で４４倍大きい発現を示した。我々は、ＩＬ１３Ｒα２の役割をよりよく理解するために、追跡可能で適切な肺組織培養系を開発することを試みた。初代肺線維芽細胞（ＩＭＲ９０）を、増殖因子低減（ＧＦＲ）ｍａｔｒｉｇｅｌ上で成長させて、プラスチックよりも生理的成長基材により近くなるようにした。（そうでないと記載しない限り、本実施例における全ての培養実験は、ＧＦＲ−Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で成長した細胞を用いて行った。）ＩＬ−１３またはＩＬ−４で刺激したＩＭＲ９０細胞は、ＩＬ１３Ｒα２の実質的な（およそ８〜１０倍）誘導を導いた（図１０）。よって、これは、遮断抗体および小分子阻害剤を用いて異所的に過剰発現されるよりも内因的に誘導されたＩＬ１３Ｒα２の機能を研究するための実験系を提供する。
【０１９０】
ＩＬ１３Ｒα２誘導は、初代肺線維芽細胞においてＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒαからのシグナルを減弱する
ＩＬ１３Ｒα２は、規範的なシグナル伝達ドメインを欠く、短い細胞質尾部を有する。いくつかの証拠が、ＩＬ−１３と結合できるＩＬ１３Ｒα２の細胞外ドメインが、ＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒα受容体複合体に対してデコイとして機能し、ＳＴＡＴ６依存性ＩＬ−１３シグナルを減弱するというモデルを支持する。組織培養系の開発中に、我々は、ＴＮＦα刺激がＩＭＲ９０細胞においてＩＬ１３Ｒα２発現を誘導したことを観察した（図１１Ａ）。ＴＮＦαはＩＬ−１３依存性ＩＬ１３Ｒα２誘導を強化することが示されているが、ＴＮＦα処理単独は、他の系においてＩＬ１３Ｒα２を上方制御することが示されていない。この培養系におけるある重要な違いは、細胞がＭａｔｒｉｇｅｌ上で成長したことである。ＩＬ−１３がＧＦＲ  ｍａｔｒｉｇｅｌ中に存在した可能性を試験するために、我々は、高感度ＩＬ−１３バイオアッセイを行い、これは、増殖因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で培養した細胞でＩＬ−１３が検出可能でなかったことを示した（データは示さず）。
【０１９１】
ＩＬ１３Ｒα２発現の上昇を示すＴＮＦαで刺激されたＩＭＲ９０細胞は、ＩＬ−１３刺激の下流の事象に対するＩＬ１３Ｒα２の発現の上昇が与える影響を調べる機会を提供した。我々は、ＩＬ−１３およびＩＬ−４に対する用量応答性を、その発現がＴＮＦα処理により影響されない既知のＳＴＡＴ６応答性遺伝子（ＣＣＬ２６およびペリオスチン）の転写産物レベルを測定することによりモニタリングした（図１１Ｂ）。ＴＮＦαで予め刺激された細胞（これは、ＩＬ１３Ｒα２発現の増加をもたらした）は、ＣＣＬ２６およびペリオスチン遺伝子誘導により判定して（図１１Ｂ）、ＩＬ−１３に対する感受性の低減を示したが、ＩＬ−４に対しては示さず（データは示さず）、このことは、ＩＬ−１３の用量を増加することにより克服できた。ＴＮＦαで予め刺激され、ＩＬ１３Ｒα２発現の上昇を示す細胞においてＩＬ−１３により同じレベルのＣＣＬ２６またはペリオスチン遺伝子誘導を達成するために、１０倍近くより高い濃度のＩＬ−１３が必要であったが、ＩＬ−４刺激に対する感受性（データは示さず）は、ＴＮＦαでの前処理により変わらなかった。まとめると、これらのデータは、ＴＮＦα媒介ＩＬ１３Ｒα２誘導が、デコイ受容体としてのＩＬ１３Ｒα２の役割と一貫して、ＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒα受容体複合体と結合し、該複合体を介してシグナル伝達するＩＬ−１３の能力を特異的に減弱することを示す。
【０１９２】
異なる抗ＩＬ１３抗体は、ＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４ＲαまたはＩＬ１３Ｒα２との結合を選択的に遮断する
上記のデータは、ＩＬ１３Ｒα２がＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒαシグナル伝達に関してデコイ受容体であるというモデルと一貫するが、代替の下流シグナルがＩＬ１３Ｒα２を起源とする可能性が残される。我々は、不偏遺伝子発現プロファイリングアプローチを用いて、可能性のあるＩＬ１３Ｒα２シグナルを、特異的ＩＬ１３／ＩＬ４受容体複合体からのシグナル伝達を遮断する特異的遮断抗体を用いることにより同定した。一方の抗体（抗ＩＬ−１３  ｍＡｂ１）は、ＩＬ４ＲαをＩＬ１３Ｒα１に動員するＩＬ−１３の能力を遮断するが、ＩＬ１３Ｒα２とのＩＬ−１３の結合に影響しない。第２の抗体（抗ＩＬ−１３  ｍＡｂ２）は、ＩＬ１３Ｒα１およびＩＬ１３Ｒα２の両方と結合するＩＬ−１３の能力を遮断する。これらの抗体はともに、ＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒα受容体複合体を介するＩＬ−４シグナル伝達に影響することなくＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒα依存性ＳＴＡＴ６活性化を妨げることができるが、抗ＩＬ−１３  ｍＡｂ２だけが、ＩＬ１３Ｒα２とのＩＬ−１３の結合も妨げることができる。初代線維芽細胞培養系におけるこれらの抗体のそれぞれの活性を評価するために、細胞を、ｍＡｂ１またはｍＡｂ２遮断抗ＩＬ−１３抗体の存在下または非存在下で、ＩＬ−１３および／またはＩＬ−４で処理した。以下に記載するように、我々は、ＳＴＡＴ６の下流のＩＬ−１３／ＩＬ−４シグナル伝達のマーカーであるＣＣＬ２６およびペリオスチンの転写産物レベルを測定した。
【０１９３】
我々は、まず、初代肺線維芽細胞培養系においてＩＬ−１３またはＩＬ−４単独により誘導される遺伝子発現プロファイルを特徴決定した。細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３または３ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４のいずれかで４８時間刺激し、その後、ＲＮＡを抽出し、ゲノム規模の発現プロファイリングに供した。各サイトカインにより誘導されるプロファイルは、模擬処理細胞と比べてほぼ同一の遺伝子発現変化を示した（データは示さず）。我々は、ＩＬ−４で刺激された条件とＩＬ−１３で刺激された条件との間に統計的に有意な差を同定せず、このことは、これらのサイトカインがともに、ＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒα受容体複合体の下流の同一シグナル伝達経路を活性化することを強く示唆した。
【０１９４】
我々は、次に、遮断抗ＩＬ−１３抗体ｍＡｂ１および／またはｍＡｂ２を用いるかまたは用いずに様々なサイトカイン処理条件下で、ＩＭＲ９０初代肺線維芽細胞培養系（ＴＮＦαで予め刺激した）におけるＣＣＬ２６およびペリオスチン（ＰＯＳＴＮ）の転写産物レベルを測定した。図１４では、様々な処理条件を、各条件についての遺伝子発現の結果とともに図に示す。
【０１９５】
ＩＬ１３Ｒα２は後続のＩＬ−１３シグナル伝達を調節する役割が示唆される先行するシグナルに応答して内因的に上方制御されるので、図１２に示す実験結果について、我々は、細胞をＴＮＦαで前処理した後に２次刺激を行うことにより、ＩＬ１３Ｒα２発現を誘導した。ＩＬ−４での刺激により、またはＩＬ１３Ｒα２の負の調節の影響を克服するのに十分に高いレベルのＩＬ−１３により、ＣＣＬ２６およびペリオスチン転写産物は、著しく誘導された（すなわちＣＣＬ２６およそ＞１００×；ペリオスチンおよそ＞１０×）（図１２）。細胞をＩＬ−１３と抗ＩＬ−１３  ｍＡｂ１もしくは抗ＩＬ−１３  ｍＡｂ２またはｍＡｂの組み合わせとで処理した場合、ＣＣＬ２６およびペリオスチンの誘導は、ほぼ完全に廃止された（図１２）。しかし、抗ＩＬ−１３  ｍＡｂ１または抗ＩＬ−１３  ｍＡｂ２はいずれも、ＣＣＬ２６またはペリオスチンのＩＬ−４により媒介される誘導を遮断せず（図１２）、このことは、ＩＬ−４よりもＩＬ−１３に対する各ｍＡｂの選択性と一貫する。ＣＣＬ２６およびペリオスチン発現レベルを測定することにより、ＩＬ１３Ｒα１を遮断すること（抗ＩＬ−１３  ｍＡｂ１を用いて）と、ＩＬ１３Ｒα１およびＩＬ１３Ｒα２の両方を遮断すること（抗ＩＬ−１３  ｍＡｂ２を用いて）との間に、認識可能な差は検出できなかった。
【０１９６】
我々は、次に、全体的な遺伝子発現プロファイルに対するＩＬ１３Ｒα２の貢献度を判定することを試みた。これらの実験を設定するにあたり我々が有していたある懸念は、ＩＬ１３Ｒα２シグナル伝達が、ＩＬ４Ｒα／ＩＬ１３Ｒα１受容体複合体から発せられる同時共シグナルを必要とする可能性であった。ＩＭＲ９０細胞は共通ガンマ鎖（ＩＬ２Ｒγ、データは示さず）を欠くので、ＩＬ−４媒介シグナル伝達は、ＩＬ４Ｒα／ＩＬ１３Ｒα１受容体複合体の活性化によってのみ生じる。したがって、ＩＭＲ９０細胞をサイトカインＩＬ−４で処理することは、ＩＬ−１３での処理と同様の様式でＩＬ４Ｒα／ＩＬ１３Ｒα１によるシグナル伝達を活性化し、よって、これらの細胞のＩＬ−４処理は、ＩＬ４Ｒα／ＩＬ１３Ｒα１受容体複合体を介するＩＬ−１３シグナル伝達の代用である。
【０１９７】
図１３Ａは、ＩＬ−１３またはＩＬ−１３およびＩＬ−４でかつそれぞれの場合においてｍＡｂ１またはｍＡｂ２で処理した細胞からのマイクロアレイデータの分析を示す。図から観察できるように、この分析は、ＩＬ−１３での細胞の処理とｍＡｂ１もしくはｍＡｂ２での細胞の処理との間、またはＩＬ−１３およびＩＬ−４での細胞の処理とｍＡｂ１もしくはｍＡｂ２での細胞の処理との間で、有意に示差的な発現された遺伝子（調整ｐ値＜０．０１）がないことを明らかにした（全ての場合において、細胞はＴＮＦαで前処理した）。ＩＬ−４の非存在下でのＩＬ−１３刺激細胞では、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２による抑制はほぼ同一であったが（図１３Ａ）、ＩＬ−４の存在下では、ｍＡｂ１またはｍＡｂ２はいずれも遺伝子発現における意味のある変化をもたらさなかった（図１３Ｂ）。まとめると、これらのデータは、リガンド−受容体ＩＬ１３−ＩＬ１３Ｒα２係合が、遺伝子発現変化をもたらすシグナル伝達事象を誘導しないことを示唆する。
【０１９８】
ＩＰＦおよびＩＬ１３／ＩＬ４で刺激した初代肺線維芽細胞におけるＧＬＩ１発現の上昇
ＩＰＦコホートにおいて最も著しく発現された遺伝子は、発生経路における重要な転写因子であるＧＬＩ１を含む（図１４）。ヘッジホッグ（Ｈｈ）およびＴＧＦβシグナル伝達は、ＧＬＩ１発現を誘導することが示されている。ＧＬＩ１およびＩＬ１３Ｒα２発現レベルは、ＩＰＦ試料内で著しく相関した（ｒＳ＝０．６９、ｑ値＜０．０１）。細胞培養マイクロアレイ実験では、我々は、ＧＬＩ１発現がＩＬ１３刺激により上方制御されたことを見出した（データは示さず）。よって、我々は、ＧＬＩ１が、ＩＬ１３Ｒα２と同様に、ＩＬ１３シグナル伝達により直接的または間接的に調節されると仮定した。この観察結果を確認するために、我々は、初代肺線維芽細胞（ｍａｔｒｉｇｅｌ上で培養）をＩＬ１３で刺激して、ＧＬＩ１発現をＲＴ−ｑＰＣＲにより測定した。ＧＬＩ１発現は、ＩＬ１３刺激により誘導された（およそ４×）（データは示さず）。
【０１９９】
ＨｈまたはＴＧＦβシグナル伝達の遮断は、ＩＬ１３により誘導されるＧＬＩ１発現を廃止しない
Ｈｈ経路活性はＧＬＩ１発現を誘導できるので、我々は、ＩＬ１３刺激がＨｈ経路のＨｈ依存性自己分泌／傍分泌刺激を導くと仮定した。この可能性を試験するために、我々は、まだらな結合により滑らかな抑制解除を誘導するＨｈリガンドの能力を遮断する小分子Ｈｈ経路阻害剤（本明細書でＭ１という）を用いた（Ｙａｕｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ４５５：４０６〜４１０頁（２００８）、これはＣｕｒ−６９１またはＨｈＡｎｔａｇ６９１に言及する）。Ｍ１での前処理は、ＳＨＨ媒介ＧＬＩ１誘導を遮断したが、ＩＬ１３依存性ＧＬＩ１誘導には影響しなかった（図１５）。
【０２００】
ＴＧＦβによる細胞の刺激は、ＧＬＩ１発現を誘導することが示されており、ＩＬ１３は、いくつかの実験系でＴＧＦβ活性を誘導できる。ＧＬＩ１のＩＬ１３依存性誘導がＴＧＦβ依存性自己分泌／傍分泌機構により生じるかを評価するために、細胞を２つのＴＧＦβ経路阻害剤（抗体１Ｄ１１［Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｊ．ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓ．２５：２４１９〜２４２６頁、２０１０］およびＴＧＦＢＩＩＲｂ−Ｆｃ［Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１００３−ＲＴ−０５０）で前処理した。両方のＴＧＦβ経路阻害剤はＴＧＦβ１（既知のＴＧＦβ応答性遺伝子）のＴＧＦβ媒介誘導を遮断したが（図１６Ａ）、これらはいずれもＩＬ１３依存性ＧＬＩ１誘導に影響しなかった（図１６Ｂ）。
【０２０１】
これらのデータは、以前は記載されていなかったＩＬ１３とＧＬＩ１誘導との間の関係を示唆し、これは、以前に特徴決定されたＨｈおよびＴＧＦβシグナル伝達経路により媒介されない。
【０２０２】
肺組織の遺伝子発現分析により、非ＩＰＦ対照と比較した場合にＩＰＦ患者においてトランスクリプトームが著しく変更されていることが明らかになる。線維性の素因と一貫して、我々は、細胞外基質のリモデリングに関与する多くの遺伝子の発現レベルがＩＰＦにおいて上昇したことを見出した。さらに、本研究と以前に発表された同様のサイズの研究からの発現マイクロアレイデータとの間のトランスクリプトーム規模の程度が著しく類似することは、本研究で観察された遺伝子発現パターンが誤診または技術的もしくは分析的アーチファクトによる偽シグナルではなくヒトＩＰＦにおいて真に活性であるプロセスを広く示すという我々の結論を支持する。
【０２０３】
ＩＬ１３は、線維症の潜在的駆動因子として前臨床モデルに関わる。ＩＰＦ生検では、我々は、ＩＬ１３経路活性化の転写的証拠と、ペリオスチン、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１８およびＩＬ１３Ｒα２を含む以前に記載されたＩＬ１３標的遺伝子の発現の上昇とを観察した。さらに、ＩＬ１３自体の発現レベルは、ＩＰＦにおいて上昇した。ＩＰＦにおいて最も強くかつ一貫して上方制御された遺伝子は、ＩＬ１３Ｒα２であった。以前の研究は、ＩＬ１３Ｒα２の役割に関して異なる結論、すなわち１）ＩＬ１３Ｒα２は、線維症の増加を支持し得るシグナルを伝達できるか、または２）ＩＬ１３Ｒα２はＩＬ１３についてデコイ受容体であり、シグナル伝達能力を有さないという結論に達した。これらの対照的な可能性に鑑みて、我々の生検マイクロアレイデータにおけるＩＬ１３関連遺伝子発現パターンが、ＩＬ１３Ｒα２の高い発現がＩＰＦにおけるＩＬ１３活性の正味の正の役割または正味の負の役割を反映することを示すかどうか、そしてＩＬ１３Ｒα２の見込みのある機能は何であるかを決定することは難しい。
【０２０４】
ＩＰＦと関連する追跡可能な系においてＩＬ１３Ｒα２の役割を明らかにするために、我々は、増殖因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で成長したＩＭＲ９０細胞（ヒト初代肺線維芽細胞株化細胞）を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を開発した。ＩＬ１３で刺激した場合に、これらの細胞は、ＩＬ１３Ｒα２発現の増加を示した。我々は、この系においてＩＬ１３Ｒα２がＴＮＦαによっても強く誘導可能であったことを観察した。ＴＮＦαはＳＴＡＴ６を介してシグナル伝達することが知られていないので、我々は、この特徴を探索して、ＩＬ１３Ｒα２レベルを異所的にではなく内因的に調節して、ＩＬ１３シグナル伝達に対するＩＬ１３Ｒα２発現の影響を決定した。細胞をＴＮＦαで予め刺激した場合に、これらは、２つのＩＬ１３標的遺伝子（ペリオスチンおよびＣＣＬ２６）により判定して、ＩＬ１３刺激に対する感受性の減少を示した。ＴＮＦαで予め刺激した細胞は、ＴＮＦαで予め刺激していない細胞と比べて同等のペリオスチンおよびＣＣＬ２６誘導を達成するために、およそ１０倍のＩＬ１３濃度を必要とした。しかし、ＴＮＦα前処理に関わらず細胞はＩＬ４に対して同様に感受性のままであったので、ＴＮＦαでの予めの刺激は、ＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒα複合体の固有のシグナル伝達能力に影響しないことがわかった。これらの観察は、ＩＬ１３Ｒα２がＩＬ１３−ＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒα相互作用についてのデコイ受容体として作用するモデルを支持する。しかし、これらのデータは、ＩＬ１３Ｒα２がそれ自体の独特の細胞内シグナルを増加させ得るという可能性を排除しない。この可能性をより徹底的に調査するために、我々は、ＩＬ１３と２つの受容体複合体との相互作用の選択的遮断を可能にする試薬を利用した。ＭＡｂ２は、ＩＬ１３Ｒα１およびＩＬ１３Ｒα２の両方と結合するＩＬ１３の能力を混乱させる遮断抗体である。ＭＡｂ１は、しかし、ＩＬ４Ｒαと結合し、それを介してシグナル伝達するＩＬ１３の能力を遮断するが、ＩＬ１３Ｒα２結合を遮断しない。我々は、これらの遮断抗体のいずれか一方の存在下で、ＩＬ１３で処理した細胞の発現プロファイルを比較することにより、存在するならば、ＩＬ１３Ｒα２特異的な下流の転写事象を同定できると推論した。我々は、細胞がいずれかの抗体で遮断される条件の間で単一の統計的に有意な差を同定することができず、このことは、この細胞培養系では、ＩＬ１３のみとのＩＬ１３Ｒα２の係合は、遺伝子発現に影響する細胞内シグナル伝達カスケードを上昇させないことを強く示唆する。ＩＬ１３−ＩＬ１３Ｒα２結合はｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＬ１３とＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒαとの係合と同時に生じる見込みがあるので、我々は、ＩＬ１３Ｒα２シグナルが、ＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒα複合体の同時係合に依存し得るかを決定することを試みた。しかし、ＩＬ１３−ＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒαシグナル伝達に影響することなくＩＬ１３−ＩＬ１３Ｒα２相互作用を選択的に遮断する試薬は同定されなかった。ＩＬ１３およびＩＬ４はともにＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒαシグナル伝達複合体と結合し、それを介してシグナル伝達し、同一の発現プロファイルを上昇させるので、我々は、上記のようなＭＡｂ１対ＭＡｂ２遮断実験にＩＬ４を導入す���ことにより、活性ＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒαシグナルを模倣できると推論した。この関係において、我々は、いずれのＩＬ１３Ｒα２依存性シグナル伝達事象もまだ同定できなかった。まとめると、これらのデータは、ＩＬ１３Ｒα２が肺線維芽細胞においてデコイ受容体であるモデルを強く支持する。
【０２０５】
我々は、肺発生、ＥＭＴ、腫瘍形成および組織修復において重要であることが知られているＧＬＩ１が、対照の対象と比べてＩＰＦ患者において上方制御されることも示した。我々は、ＩＬ１３が、培養線維芽細胞においてＧＬＩ１発現の増加を導くことも観察した。これらの結果は、ＧＬＩ１が、創傷治癒消散の最終段階を遮断し、継続的な線維症を支持し得る線維芽細胞の継続的な成長および生存期間を支持し得ることを示唆する。
【０２０６】
実施例３：第ＩＩ相臨床研究
研究原理
ＩＰＦは、様々な程度の間質性線維症を特徴とする。Ｉ、ＩＩＩおよびＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンならびにテネイシン−Ｃを含むいくつかの細胞外基質タンパク質が、間葉系細胞の異常増殖、肺構造の歪みおよび上皮下線維芽細胞巣の発生と一緒に、ＩＰＦ患者における線維症のプロセスに関わる。ＩＬ−１３およびＩＬ−４は、組織線維症の強い誘発物質である。非臨床モデルでは、マウスの肺におけるＩＬ−１３のトランスジェニック過剰発現は、コラーゲン遺伝子発現および深在性上皮下線維症を誘発するために十分である（Ｌｅｅら、２００１、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１９４：８０９〜２２頁；Ｚｈｕら、１９９９、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ１０３：７７９〜８８頁）。逆に、ＩＬ−１３が標的化により混乱させられたマウスおよびＩＬ−１３に特異的な遮断抗体で処置されたマウスは、ブレオマイシンおよびフルオレセインイソチオシアネートで誘発された肺線維症モデルにおいて細胞外基質沈着の低減を示す（Ｂｅｌｐｅｒｉｏら、２００２、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２７：４１９〜２７頁；Ｋｏｌｏｄｓｉｃｋら、２００４、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１７２：４０６８〜７６頁；Ｌｉｕら、２００４、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１７３：３４２５〜３１頁）。
【０２０７】
複数の研究が、ＩＬ−１３の発現および活性がＩＰＦ患者において上昇すると結論付けている。ＩＬ−１３およびＩＬ−１３受容体（ＩＬ−１３Ｒ）であるＩＬ−１３Ｒα１およびＩＬ−１３Ｒα２の発現は、正常対照と比較して、メッセンジャーＲＮＡおよびタンパク質の両方のレベルにてＩＰＦ患者からの肺生検試料において増加することが見出された（Ｊａｋｕｂｚｉｃｋら、２００４、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ１６４：１９８９〜２００１頁）。ＩＬ−１３は、正常対照と比較してＩＰＦ患者からの気管支肺胞洗浄液中で上昇することも見出された。重要なことに、これらの試料中のＩＬ−１３のレベルは、肺機能の重要な尺度、予測努力肺活量（ＦＶＣ）および一酸化炭素肺拡散能力（ＤＬＣＯ）のパーセンテージと負に相関し（Ｐａｒｋら、２００９、Ｊ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ２４：６１４〜２０頁）、このことは、ＩＰＦ患者におけるＩＬ−１３の病原性機能を示唆した。
【０２０８】
ＩＬ−１３自体に加えて、ＩＬ−１３シグナル伝達から下流で発現されることが知られている血清バイオマーカーも、ＩＰＦ患者において上昇することが示された。喘息患者におけるレブリキズマブを用いる処置からの利益と相関する血清レベルを有するＩＬ−１３誘発性タンパク質である（Ｃｏｒｒｅｎら、２０１１、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ３６５（１２）：１０８８〜９８頁）ペリオスチンも、ＩＰＦ患者の血清中で上昇し、これらのレベルは、肺機能パラメータ（ＦＶＣおよびＤＬＣＯ）と６ヶ月の期間にわたって負に相関したことが示されている（Ｏｋａｍｏｔｏら、２０１１、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ３７：１１１９〜２７頁）。ペリオスチンは、ペリオスチン欠損マウスにおいて観察されたブレオマイシン誘発肺線維症の低減に基づいて、ＩＰＦにおける病原性因子であることが提案され（Ｕｃｈｉｄａら、２０１２、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ４６：６７７〜８６頁）、このことは、ＩＬ−１３が疾患に貢献する原因となり得るさらなる機構を示唆する。ＩＬ−１３シグナル伝達は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマクロファージおよびＩＰＦ患者から単離され（しかし、正常対照からではない）、ＣＣＬ−１８タンパク質を構成的に発現する肺胞マクロファージからのケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１８（ＣＣＬ−１８）の堅固な生成も誘導する（Ｐｒａｓｓｅら、２００６、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ１７３：７８１〜９２頁）。ペリオスチンと同様に、ＣＣＬ−１８は、ＩＰＦ患者の血清中で増加し、ＣＣＬ−１８レベルは、疾患進行および予後予測と相関することが報告されており、ベースラインＣＣＬ−１８のレベルがより高い患者は、ＦＶＣのより大きい低下とより高い死亡率とを経験する（Ｐｒａｓｓｅら、２００７、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ５６：１６８５〜９３頁；Ｐｒａｓｓｅら、２００９、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｏｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ１７９：７１７〜２３頁）。まとめると、これらのデータは、ＩＬ−１３発現がＩＰＦ患者において上昇し、このサイトカインから複数の型の線維症関連細胞へのシグナルが疾患発生を駆動することにおいて重要な役割を有することを強く示唆する。
【０２０９】
抗ＩＬ１３抗体（レブリキズマブ）アミノ酸配列
以下の表は、レブリキズマブのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列を、ＶＨ、ＶＬ、重鎖配列および軽鎖配列とともに示す。以下の表１１に示すように、ＶＨおよび重鎖は、Ｎ末端グルタミンを含むことがあり、重鎖は、Ｃ末端リシンも含むことがある。当該技術において公知であるように、Ｎ末端グルタミン残基はピログルタメートを形成でき、Ｃ末端リシン残基は、製造プロセス中に切り取ることができる。
0006404208.tif 000015
0006404208.tif 000016
【０２１０】
用量、投薬計画および原理
これは、ＩＰＦの患者におけるレブリキズマブの無作為化、多施設、二重盲検、プラセボ対照、並行群間研究である。およそ２５０名の患者（処置群あたり１２５名の患者）が、全世界にあるおよそ１００の場所で研究に登録する。全処置期間は、盲検処置の少なくとも１３回の用量（ｑ４ｗｋｓ）と、最長で２．５年の期間にわたる主要評価項目についての少なくとも７５の事象の観察を受ける全ての対象に基づく。
【０２１１】
書面でのインフォームドコンセントを提出する患者は、参加時基準を確立するためにスクリーニング期間（≦４週間）を開始する。スクリーニング期間の最後に、対象となる患者は、皮下注射（ＳＣ）レブリキズマブ２５０ｍｇでの二重盲検処置またはプラセボ（それぞれ予め充填されたシリンジから投与する）に１：１の比で無作為化される。ブロック無作為化を中央で行い、肺機能（予測ＦＶＣ＜５０％、５０％〜７５％、＞７５％）および領域（北米、欧州、その他）で階層化する。
【０２１２】
研究薬物は、ＳＣ注射により４週間ごとに投与し、１回目の注射は、無作為化訪問時に行う（第１日）。ＳＣ注射は、腕、大腿または腹部で行い、全ての患者は、投薬訪問あたり合計で２回の注射を受ける。患者は、最短投薬期間（第０週〜第４８週）中に最小限で１３回の用量の盲検処置を受ける。患者は、主要評価項目についての少なくとも７５の事象が生じ、かつ登録した最後の患者が少なくとも１３回の用量の盲検処置を受ける機会を有するまでの延長処置期間中に、４週間ごとに盲検研究処置を受け続ける。これらの事象が一旦生じたら、全ての進行中の患者は、研究薬物の最後の用量のおよそ４週間後に診療所に戻り、処置終了（ＥＯＴ）訪問時と、１８週間の安全性フォローアップ期間中の２回のその後の訪問時にフォローアップ判定を完了する。登録および事象頻度の割合に応じて、処置の合計期間は、１年から最長で２．５年までの範囲であると期待される。処置期間は、各患者について２．５年を超えず、最長研究期間は、２．８年と期待される。時期尚早に研究薬物を中止することを選択した患者は、研究に残って全ての残りの判定を完了することを奨励される。このことが実行可能でない場合、患者は、同意が撤回されない限り、安全性フォローアップ期間に入ってそれを完了するべきである。
【０２１３】
用量および投薬計画原理は、以下のとおりである。レブリキズマブは、ＩＬ−１３シグナル伝達を阻害するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。非臨床および臨床データはともに、ＩＬ−１３シグナル伝達がＩＰＦの病原性において重要な役割を有することを示唆する（上記を参照されたい）。レブリキズマブの作用の機構は、ＩＬ−１３とその受容体との間の相互作用を遮断し、よってＩＬ−１３の細胞内シグナル伝達を遮断することである。サイトカインの代謝回転が速いので、最適なＩＬ−１３遮断は、肺において持続濃度のレブリキズマブを維持することを必要とすると仮定される。肺におけるＩＬ−１３レベルが文献で報告される範囲であり（２００〜２０００ｐｇ／ｍＬ；Ｈａｒｔ  ２００１、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ７９：１４９〜５３頁）、血清：肺の分配比が１：５００であると仮定して、１０μｇ／ｍＬの血清濃度が、ＩＬ−１３を中和するための肺における十分に高い薬物レベルを維持すると期待される。この目標濃度は、第ＩＩ相研究の観察第１２週トラフ濃度の下端とも一貫したが（平均±ＳＤ：２８．８±１１．９μｇ／ｍＬ）、この研究では、レブリキズマブは、吸入副腎皮質ステロイド治療にもかかわらず喘息を管理できなかった患者において、重症喘息の増悪速度の低減についての有効性を示した。喘息患者と同様に、ＩＰＦ患者は、ＩＬ−１３生物学と関連するバイオマーカーのレベルが上昇しており、このことは、喘息において臨床的利益をもたらすレブリキズマブの濃度がＩＰＦにおいても生物活性を生じ得ることを示唆する。
【０２１４】
ＩＰＦ患者における第ＩＩ相研究のために、４週間ごとの２５０ｍｇ（ｑ４ｗｋ）の用量を選択して、この目標濃度以上の定常状態血清トラフ濃度を維持した。ＩＰＦ患者でのレブリキズマブの薬物動態は喘息患者におけるものと同様であると仮定して、この用量／計画は、およそ３０μｇ／ｍＬの平均定常状態トラフ濃度を維持すると期待される。目標濃度よりも３倍高い濃度は、より厚い間質、および自己抗体が存在するならばより速い可能性があるレブリキズマブのクリアランスのために、ＩＰＦ患者における肺分配の低減を可能にする（Ｐａｐｉｒｉｓら、２０１２、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｕｌｍ  Ｍｅｄ１８：４３３〜４０頁）。２５０ｍｇ用量ｑ４ｗｋを選択することは、喘息におけるレブリキズマブの以前の臨床研究からの安全性データベースによっても支持される。
【０２１５】
レブリキズマブおよびプラセボは、予め充填されたシリンジで提供される。各シリンジは、単回用量ＳＣ投与のみのためであり、保存剤を含有しない。活性研究薬物のそれぞれの予め充填されたシリンジは、１２５ｍｇ／ｍＬレブリキズマブの濃度の１ｍＬの滅菌液を含有する。この製剤は、酢酸ヒスチジン（２０ｍＭ）、ショ糖（６０ｍｇ／ｍＬ）、ポリソルベート２０（およそ０．０３％）および注射用滅菌水ＵＳＰ、ｐＨ５．４〜６．０も含有する。プラセボのそれぞれの予め充填されたシリンジは、酢酸ヒスチジン（２０ｍＭ）、ショ糖（７５ｍｇ／ｍＬ）およびポリソルベート２０（およそ０．０３％）、ｐＨ５．４〜６．０を含む注射用滅菌水からなる１ｍＬの滅菌液プラセボ製剤を含有する。研究薬物およびプラセボの予め充填されたシリンジは、２℃〜８℃にて冷蔵し、過剰の光および熱から保護されるべきである。シリンジは、凍結するべきでなく、振動させるべきでなく、室温で貯蔵すべきでない。
【０２１６】
参加および除外基準
ＩＰＦを有する３５〜８０歳のおよそ２５０名の患者が、本研究に登録する。参加基準は、以下のとおりである：スクリーニング時より５年前以内で、ベースライン時に確認された、２０１１  ＡＴＳ／ＥＲＳガイドラインに基づく確定的または高可能性のＩＰＦの診断；スクリーニング時の予測ＦＶＣ＞４０％および≦９０％；スクリーニング時の予測ＤＬＣＯ＞２５％および≦９０％；経口副腎皮質ステロイド治療を受けている患者について：第１日より≧４週間前に定常用量≦１０ｍｇプレドニゾン（または同等）；支援なしで≧１００メートルの歩行能力。除外基準は、以下を含む：生物学的薬剤に対する重度のアレルギー反応もしくはアナフィラキシー反応の履歴、またはレブリキズマブ注射の成分のいずれかに対する既知の過敏症；間質性肺疾患の他の既知の原因の証拠；６ヶ月以内に予期される肺移植；著しい閉塞性肺疾患またはＩＰＦ以外のその他の臨床的に著しい肺疾患または感染性疾患を含むその他の臨床的に著しい医療疾患の証拠；クラスＩＶのＮｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎの慢性心不全または左室駆出率＜３５％の証拠の履歴；スクリーニングの３０日前以内のＩＰＦの増悪による入院；体重＜４０ｋｇ。
【０２１７】
有効性評価項目
主要有効性評価項目は、進行のない生存期間（ＰＦＳ）であり、これは、研究処置無作為化から以下のいずれかの事象の最初の発生までの時間と定義される：任意の原因での死亡；任意の原因での非待機的入院；および≧１０％のＦＶＣ（Ｌ）におけるベースラインからの減少。副次有効性評価項目は、絶対ＦＶＣ（Ｌ）の年率変化；第５２週での≧１５％のＤＬＣＯ（ｍＬ  ＣＯ／ｍｉｎ−１／ｍｍＨｇ−１）のベースラインからの減少；無作為化から任意の原因での死亡または非待機的入院までの時間；ベースラインから第５２週までのＩＰＦの生活の質判定ツール（ＡＴＡＱ−ＩＰＦ）における変化；無作為化からベースラインと比べて≧１０％のＦＶＣ（Ｌ）の最初の減少までの時間；絶対ＤＬＣＯ（ｍＬ  ＣＯ／ｍｉｎ−１／ｍｍＨｇ−１）の年率変化；ならびにベースラインから第５２週までの６分間歩行距離（６ＭＷＤ）の変化である。探索評価項目は、ベースラインから第５２週までのＦＶＣの変化（［Ｌ］および予測パーセント）；ベースラインから第５２週までのＦＶＣ（Ｌ）のパーセント変化；ベースラインから第５２週までの絶対ＦＶＣ（Ｌ）の２００ｍＬまたは１０％の変化の発生；ベースラインから第５２週までのＤＬＣＯの変化（［ｍＬ  ＣＯ／ｍｉｎ−１／ｍｍＨｇ−１］および予測パーセント）；ベースラインから第５２週までのＤＬＣＯのパーセント変化（ｍＬ  ＣＯ／ｍｉｎ−１／ｍｍＨｇ−１）；ベースラインにて酸素補給療法を受けている患者についてベースラインから第５２週までの安静時酸素流量の変化；ベースラインにて酸素補給療法を受けていない患者について無作為化から酸素補給療法の追加までの時間；無作為化から任意の原因での非待機的入院までの時間；無作為化から急性ＩＰＦ増悪の最初の事象までの時間；無作為化からＩＰＦ悪化の最初の事象までの時間；ベースラインから第２４週および第５２週までの、定量肺線維症（ＱＬＦ）スコアを含む肺ＨＲＣＴでのＸ線撮影による知見の変化；６分間歩行試験（６ＭＷＴ）において歩いた距離のベースラインからの変化；血清バイオマーカー（例えばペリオスチン、ＣＣＬ−１８、ＹＫＬ４０、ＣＯＭＰ、ＯＰＮ、ＣＣＬ−１３）のベースラインからの変化；ならびにＥｕｒｏＱｏｌ５元質問票（ＥＱ−５Ｄ）におけるベースラインから第５２週までの変化である。
【０２１８】
研究判定
特発性肺線維症増悪
ＩＰＦ増悪は、以下の基準に合致する事象と定義する：過去３０日以内の説明のつかない呼吸困難の悪化または発生；通常の間質性肺炎（ＵＩＰ）と矛盾しない、網状または蜂巣背景パターンと重なりあう新しい両側スリガラス異常および／または硬化の放射線学的証拠；ならびに代替の原因、例えば左心不全、肺塞栓症、肺感染（気管内吸引液もしくは利用可能であれば気管支肺胞洗浄、または調査者の判断に基づく）または急性肺傷害を導くその他の事象（例えば敗血症、誤嚥、外傷、再灌流肺水腫）が存在しないこと。
【０２１９】
疾患の特発性肺線維症悪化
疾患のＩＰＦ悪化は、以下に合致する事象と定義する：（ｉ）過去３０日以内の呼吸困難の説明のつかない悪化または発生ならびに（ｉｉ）以下のいずれか２つ：
・ＵＩＰと矛盾しない、網状または蜂巣背景パターンと重なりあう新しい両側スリガラス異常および／または硬化の放射線学的証拠；
・以下の基準の少なくとも１つに合致する肺機能の悪化：
−  少なくとも１０％のＦＶＣ（Ｌ）、
−  ＤＬＣＯ（ｍＬ  ＣＯ／ｍｉｎ−１／ｍｍＨｇ−１）、少なくとも１５％、
−  酸素飽和（ＳｐＯ２）少なくとも４％
ならびに（ｉｉｉ）ＩＰＦ増悪について上に列挙したもののような代替の原因が存在しないこと。
【０２２０】
肺活量測定
気管支拡張剤試験についての手順を含む肺活量測定は、ＡＴＳ／ＥＲＳコンセンサス声明に基づく研究Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌに従って行う（Ｍｉｌｌｅｒら、２００５、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ２６：３１９〜３８頁）。この手引きは、装置、手順、患者指示および注意事項に関する情報を含む。収集される肺活量の尺度は、ＦＥＶ１およびＦＶＣの値ならびに最大呼気流量の値、ならびに流量−容量および容量−時間曲線を含む。予測ＦＥＶ１およびＦＶＣのパーセンテージは、これらの容量測定から、Ｈａｎｋｉｎｓｏｎおよび同僚（Ｈａｎｋｉｎｓｏｎら、１９９９、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ１５９：１７９〜８７頁）により記載されるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙデータベースから得られる等式を用いて得る。
【０２２１】
肺活量測定は、研究の要件に合い、肺活量測定のＡＴＳ／ＥＲＳ規格化により発表されたガイドラインに従う（Ｍｉｌｌｅｒら、２００５、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ２６：３１９〜３８頁）ように設定されたコンピュータ化された肺活量測定システムで行う。
【０２２２】
ＤＬＣＯは、血清ヘモグロビン濃度についての補正を含んでＡＴＳ／ＥＲＳガイドラインに従って行い、主要および副次評価項目判定の一部としてＦＶＣとともに測定される。この計略の図画表示を含むデータの許容可能性は、盲検オーバーリーダーにより決定される。許容できる計略の再現性についての算出は、プログラム化される。
【０２２３】
高分解能コンピュータ断層撮影
腹臥位肺ＨＲＣＴスキャンを行って記録する。肺ＨＲＣＴスキャンによるＩＰＦの診断は、両肺底部、周辺または胸膜下小葉内中隔肥厚の対称的パターン、線維性の変化、蜂巣化および牽引性気管支拡張症または細気管支拡張症を示すはずである。これらは、肺のスリガラス影を伴うことがある。
【０２２４】
６分間歩行試験
６ＭＷＴ試験は、集中的ＡＴＳガイドライン（ＡＴＳ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ２００２、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ１６６：１１１〜１１７頁）に従って行う。
【０２２５】
患者報告結果
患者報告結果（ＰＲＯ）データは、レブリキズマブの臨床プロファイルをより完全に特徴決定するために、本研究における患者から引き出す。患者は、必要に応じて現地の言語に翻訳されたＰＲＯ文書を、研究中の特定の時点で完成する。２つのＰＲＯツールを用いる：
【０２２６】
特発性肺線維症の生活の質判定ツール（ＡＴＡＱ−ＩＰＦ）
ＡＴＡＱ−ＩＰＦは、７４項目のＩＰＦ特異的生活の質文書である（Ｓｗｉｇｒｉｓら、２０１０、Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ８：７７頁）。生活の質判定ツール（ＡＴＡＱ）は、１３のドメインからなる：咳（６項目）、呼吸困難（６項目）、先見（５項目）、睡眠（６項目）、死亡（６項目）、消耗（５項目）、感情的幸福（７項目）、社交的参加（５項目）、財政（６項目）、独立性（５項目）、性的健康（５項目）、親族関係（６項目）および治療（６項目）。ＡＴＡＱの各項目は、１（強く反対）から５（強く賛成）までの範囲の尺度で判定される。想起期間はＡＴＡＱで特定されない。ＡＴＡＱ−ＩＰＦスコアとＩＰＦにおいて重要であることが知られている生理的変数との間の相関のパターンは、補充酸素を用いる対象と補充酸素を用いない対象との間のＡＴＡＱ−ＩＰＦスコアの著しい差とともに、その妥当性を支持する。
【０２２７】
ＥｕｒｏＱｏｌ５元質問票
ＥＱ−５Ｄは、健康状態についての単一指標の値を与える、包括的な嗜好に基づく健康に関する生活の質の質問票である（Ｒａｂｉｎおよびｄｅ  Ｃｈａｒｒｏ  ２００１、Ａｎｎ  Ｍｅｄ３３：３３７〜４３頁）。このツールは、患者の複合的健康状態を構築するために用いられる可動性、自己ケア、通常の活動、疼痛／不快感および不安／うつに関する質問を含む。
【図１Ａ】
0006404208.tif 000017
【図１Ｂ】
0006404208.tif 000018
【図１Ｃ】
0006404208.tif 000019
【図１Ｄ】
0006404208.tif 000020
【図１Ｅ】
0006404208.tif 000021
【図２−１】
0006404208.tif 000022
【図２−２】
0006404208.tif 000023
【図３Ａ】
0006404208.tif 000024
【図３Ｂ】
0006404208.tif 000025
【図３Ｃ】
0006404208.tif 000026
【図３Ｄ】
0006404208.tif 000027
【図３Ｅ】
0006404208.tif 000028
【図３Ｆ】
0006404208.tif 000029
【図３Ｇ】
0006404208.tif 000030
【図４】
0006404208.tif 000031
【図５−１】
0006404208.tif 000032
【図５−２】
0006404208.tif 000033
【図６Ａ】
0006404208.tif 000034
【図６Ｂ】
0006404208.tif 000035
【図７】
0006404208.tif 000036
【図８】
0006404208.tif 000037
【図９】
0006404208.tif 000038
【図１０】
0006404208.tif 000039
【図１１Ａ】
0006404208.tif 000040
【図１１Ｂ】
0006404208.tif 000041
【図１２】
0006404208.tif 000042
【図１３】
0006404208.tif 000043
【図１４】
0006404208.tif 000044
【図１５】
0006404208.tif 000045
【図１６】
0006404208.tif 000046
【配列表】
0006404208000001.app