(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;及び1つ以上のアルキン部分を含む1種以上のモノマーから形成されたポリマー、並びにb)式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;及び1つ以上のアジド部分を含む1種以上のモノマーから形成されたポリマーを含む組成物。
【化１】
0006343674.tif 000018
[式中、
R1、R2、及びR3は、独立して、-H、-CH3、-CH2CH3、又はM+であり、
R4は-Hであり、
R5は、-H、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、-CH3、-CH2CH3、-NH2、NHCH3、-CH2CH2NHCH3、-N(CH3)2、又は-CH2CH2N(CH2CH3)2であり、
R6は、-H、-CH3、又は-CH2CH3であり、
R7は、-H又は-CH3であり、
R8は、-(CH2)a-、-(CH2CH2O)b-、又は-(CH2OCH2)b-であり、
R9は、-H、-CH3、又はC2〜C20アルキルであり、
R10は、-H、-C(O)CH3、又は-C(O)CH2CH3であり、
R11及びR12は、独立して、-OH又は-NH2であり、
M+は、一価の陽イオンであり、
X及びYは、独立して、-O-又は-NH-であり、
Zは、-H、-CH3、又は
【化２】
0006343674.tif 000019
であり、
aは、0から20の整数であり、
bは、0から2000の整数であり、
nは、1から2000の間の整数であり、
m及びpは、独立して、1から20の範囲の整数であり、
式(B1)のモノマーは、-OH又は-NH2を含む少なくとも1つの末端を有する]
【請求項２】
式(B1)の1種以上のモノマーが使用され、Xが-O-である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
1種以上のモノマーが1つ以上のアルキン部分を有する1種以上のポリオールを含む、又は1種以上のモノマーが1つ以上のアジド部分を有する1種以上のポリオールを含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;及び1つ以上のアルキン部分を含む1種以上のモノマーから形成された第1のポリマー;並びに式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;及び1つ以上のアジド部分を含む1種以上のモノマーから形成された第2のポリマーを含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
アジド-アルキン付加環化生成物を含む、請求項4に記載の組成物。
【請求項６】
ポリマーが、a)式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;1つ以上のアルキン部分を含む1種以上のモノマー;及び式(C1)、(C2)、(C3)、又は(C4)の1種以上のモノマーから形成されたもの、あるいはb)式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;1つ以上のアジド部分を含む1種以上のモノマー及び式(C1)、(C2)、(C3)、又は(C4)の1種以上のモノマーから形成されたものである、請求項1に記載の組成物。
【化３】
0006343674.tif 000020
0006343674.tif 000021
(式中、pは、1から10の範囲の整数である)
【請求項７】
ポリマーが、a)式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;1つ以上のアルキン部分を含む1種以上のモノマー;及び式(D1)又は(D2)の1種以上のモノマーから形成されたもの、あるいはb)式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;1つ以上のアジド部分を含む1種以上のモノマー;及び式(D1)又は(D2)の1種以上のモノマーから形成されたものである、請求項1に記載の組成物。
【化４】
0006343674.tif 000022
(式中、R13は、-H、-CH3、又は-CH2CH3である)
【請求項８】
ポリマーが、a)式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;1つ以上のアルキン部分を含む1種以上のモノマー;及び式(E)の1種以上のモノマーから形成されたもの、あるいはb)式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;1つ以上のアジド部分を含む1種以上のモノマー;及び式(E)の1種以上のモノマーから形成されたものである、請求項1に記載の組成物。
【化５】
0006343674.tif 000023
(式中、R14はアミノ酸又はアルキル置換アミノ酸の側鎖であり、アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、トリプトファン、及びバリンからなる群から選択される)
【請求項９】
R14がアルファ-アミノ酸側鎖である、請求項8に記載の組成物。
【請求項１０】
ポリマーが、a)式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;1つ以上のアルキン部分を含む1種以上のモノマー;及び式(F)の1種以上のモノマーから形成されたもの、あるいはb)式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;1つ以上のアジド部分を含む1種以上のモノマー;及び式(F)の1種以上のモノマーから形成されたものである、請求項1に記載の組成物。
【化６】
0006343674.tif 000024
[式中、
R15、R16、R17、及びR18は、独立して、-H、-CH2(CH2)xNH2、-CH2(CHR19)NH2、又は-CH2(CH2)xCOOHであり、
R19は、-COOH又は-(CH2)yCOOHであり、
xは、0から20の範囲の整数であり、
yは、1から20の範囲の整数である]
【請求項１１】
1つ以上のアジド部分を含む1種以上のモノマーが、式(G1)又は(G2)
【化７】
0006343674.tif 000025
0006343674.tif 000026
(式中、R20は、-CH3又は-CH2CH3である)
のモノマーを含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１２】
1つ以上のアルキン部分を含む1種以上のモノマーが、式(H1)、(H2)、(H3)、(H4)、(H5)、又は(H6)
【化８】
0006343674.tif 000027
0006343674.tif 000028
(式中、
R20は、-CH3又は-CH2CH3であり、
Xは、-NH-である)
のモノマーを含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１３】
1種以上のモノマーが、1つ以上のアルキン部分を有する、ペプチド、ポリペプチド、核酸、又は多糖、あるいは1つ以上のアジド部分を有する、ペプチド、ポリペプチド、核酸、又は多糖を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１４】
ポリマーにより形成されたネットワーク内に分散された粒子状無機物質をさらに含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
粒子状無機物質がヒドロキシアパタイトを含む、請求項14に記載の組成物。
【請求項１６】
粒子状無機物質が、ポリマーネットワークの総重量に基づいて、70重量パーセントまでの量でポリマーネットワーク中に存在する、請求項14に記載の組成物。
【請求項１７】
第1の気孔率を有するコア成分、及び
コア成分を包囲するシェル成分であって、第1の気孔率とは異なる第2の気孔率を有するシェル成分
を含むコア-シェル型ポリマースキャフォールドであって、
コア成分が、式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;アルキン部分を含む1種以上のモノマー;及びアジド部分を含む1種以上のモノマー:
【化９】
0006343674.tif 000029
0006343674.tif 000030
[式中、
R1、R2、及びR3は、独立して、-H、-CH3、-CH2CH3、又はM+であり、
R4は-Hであり、
R5は、-H、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、-CH3、-CH2CH3、-NH2、NHCH3、-CH2CH2NHCH3、-N(CH3)2、又は-CH2CH2N(CH2CH3)2であり、
R6は、-H、-CH3、又は-CH2CH3であり、
R7は、-H又は-CH3であり、
R8は、-(CH2)a-、-(CH2CH2O)b-、又は-(CH2OCH2)b-であり、
R9は、-H、-CH3、又はC2〜C20アルキルであり、
R10は、-H、-C(O)CH3、又は-C(O)CH2CH3であり、
R11及びR12は、独立して、-OH又は-NH2であり、
M+は、一価の陽イオンであり、
X及びYは、独立して、-O-又は-NH-であり、
Zは、-H、-CH3、又は
【化１０】
0006343674.tif 000031
であり、
aは、0から20の整数であり、
bは、0から2000の整数であり、
nは、1から2000の間の整数であり、
m及びpは、独立して、1から20の範囲の整数であり、
式(B1)のモノマーは、-OH又は-NH2を含む少なくとも1つの末端を有する]
から形成された第1のポリマーネットワークを含み、シェル成分が、式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;アルキン部分を含む1種以上のモノマー;及びアジド部分を含む1種以上のモノマーから形成された第2のポリマーネットワークを含む、コア-シェル型ポリマースキャフォールド。
【請求項１８】
コア成分がシェル成分よりも高い気孔率を示す、請求項17に記載のスキャフォールド。
【請求項１９】
第1の気孔率が30%から99%の間であり、第2の気孔率が0%から99%の間である、請求項17に記載のスキャフォールド。
【請求項２０】
第1のポリマーネットワーク及び/又は第2のポリマーネットワーク内に粒子状無機物質が分散された、請求項17に記載のスキャフォールド。
【請求項２１】
粒子状無機物質がヒドロキシアパタイトを含む、請求項20に記載のスキャフォールド。
【請求項２２】
粒子状無機物質が、第1のポリマーネットワーク又は第2のポリマーネットワーク中に、それぞれ第1のポリマーネットワーク又は第2のポリマーネットワークの総重量に基づいて、70重量パーセントまでの量で存在する、請求項20に記載のスキャフォールド。
【請求項２３】
第1のポリマーネットワーク及び第2のポリマーネットワークが、800nmから1000μmの平均気孔径を示す、請求項17に記載のスキャフォールド。
【請求項２４】
コア成分及びシェル成分が同心円筒である、請求項17に記載のスキャフォールド。
【請求項２５】
コア成分の直径が、シェル成分の直径の1パーセントから90パーセントである、請求項17に記載のスキャフォールド。
【請求項２６】
第1のポリマーネットワーク及び/又は第2のポリマーネットワークが、アミン、アミド、又はイソシアネートと、式(A)の1種以上のモノマー、式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー、1つ以上のアルキン部分を含む1種以上のモノマー、及び1つ以上のアジド部分を含む1種以上のモノマーとの反応生成物を含む、請求項17に記載のスキャフォールド。
【請求項２７】
第1のポリマーネットワーク及び/又は第2のポリマーネットワークが、ポリカルボン酸又はポリカルボン酸の機能的等価物と、式(A)の1種以上のモノマー、式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー、アルキン部分を含む1種以上のモノマー、及びアジド部分を含む1種以上のモノマーとの反応生成物を含む、請求項17に記載のスキャフォールド。
【請求項２８】
第1のポリマーネットワーク及び/又は第2のポリマーネットワークが、アミノ酸と、式(A)の1種以上のモノマー、式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー、アルキン部分を含む1種以上のモノマー、及びアジド部分を含む1種以上のモノマーとの反応生成物を含む、請求項17に記載のスキャフォールド。
【請求項２９】
1MPaから45MPaの間の圧縮ピーク応力、50MPaから1500MPaの間の初期モジュラス、及び2%から5%の間の破断点ピーク圧縮歪みの1つ以上を示す、請求項17に記載のスキャフォールド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条によって、そのそれぞれがその全体において参照によって本明細書に組み込まれる、2013年9月5日提出の米国仮特許出願第61/874,287号、及び2014年2月5日提出の米国仮特許出願第61/935,968号の優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府支援の研究に関する陳述
本発明は、国立バイオメディカルイメージング・エンジニアリング研究所(National Institute of Biomedical Imaging and Engineering)(NIBIB)により与えられた契約第EB012575号、及び全米科学財団(NSF)により与えられた契約第DMR1313553号に基づく政府支援を受けてなされたものである。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、ポリマー組成物並びにポリマー組成物を製造及び使用する方法に関し、特に、シトレート含有ポリマー若しくはオリゴマー及び/又はクリック可能な部分を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
近年、エラストマー性ポリマーは組織工学用途において広く適用されており、その理由の一部には、例えば心臓弁、血管、腱、軟骨組織、膀胱などの多くのヒト軟組織の弾性を模倣するいくつかのエラストマー性ポリマーの能力がある。しかしながら、多くの既存のエラストマー性ポリマーは劣った機械的強度を示す。さらに、いくつかのエラストマー性ポリマーの機械的強度は、ポリマーが多孔性スキャフォールドに成形された且つ/又はin vivoの湿潤状態で使用されたときに、さらに低減され得、いくつかの組織工学用途に対するこれらの材料の有用性を大幅に制限する。さらに、多くの以前のポリマーは、in vivoでの微生物の増殖又は細菌感染を効果的に低減又は防止できない。したがって、別個に配合された抗生物質又は他の抗微生物物質を、そのようなポリマーにコーティングするか、そのようなポリマー内に封入するか、又は他の方法でそのようなポリマーと関連付ける必要がしばしばある。さらに、このように処理されたいくつかのポリマー組成物は、限定された抗微生物有効性を有し得る且つ/又は劣った機械的性能を示し得る。
【０００５】
さらに、大きい分節骨欠損(segmental bone defect)の修復は依然として再建的整形外科における重要な課題の一つであるが、そのような骨欠損の管理及び治療は、近年様々な困難を提示している。骨は、外部荷重に耐えるのに最適化された比較的堅くて軽量な器官であり、いくつかの以前の生物工学材料は、多様な生物医学用途について、天然骨の組成及び/又は性能に適合できていなかった。例えば、多くの以前の材料は、十分な機械的強度をもたらすことができず、炎症反応を最小化することができず、骨再生を促進することができず、且つ/又は周囲組織と完全に一体化することができない。さらに、いくつかの以前の材料は、多くの耐荷重用途にとって脆くなりすぎないためには、バイオセラミックス又は他の無機物質を限られた量しか含むことができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、改良された生物工学ポリマー組成物及び分節骨欠損などの状態を治療するための方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、いくつかの実施形態では、いくつかの他の組成物と比較して1つ以上の利点を提供し得る組成物が本明細書で記載される。例えば、いくつかの例では、本明細書に記載の組成物は、エラストマー性及び/又は高強度材料の使用を必要とする用途を含め、多様な生物医学及び/又は生物工学用途に使用することができるシトレート含有ポリマー又はポリマーネットワークを含むことができる。いくつかの場合には、本明細書に記載のポリマー又はポリマーネットワークは、標的組織又は器官の天然細胞外マトリックス(ECM)の代替物として使用することができる。さらに、いくつかのそのような実施形態では、ポリマー又はポリマーネットワークは、天然EMC又は組織と同じ又は類似の機械的安定性、構造的一体性、及び連絡機能をもたらすことができる。本明細書に記載のポリマー又はポリマーネットワークは、高い架橋密度も有することができる。さらに、いくつかの場合には、本明細書に記載の組成物は、機械的に柔軟で弾性であり、標的組織又は器官の機械的特性に適合する他の機械的特性を示す組織スキャフォールドを含むことができる。本明細書に記載の組成物はまた、生体適合性がある且つ/又は細胞結合ペプチド、成長因子、シグナル伝達分子などの生物活性分子による表面修飾を受けやすいものとすることができる。このように、細胞及び組織応答を、本明細書に記載の組成物により媒介することができる。
【０００８】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、患者における1つ以上の疾患、損傷、又は欠損を治療するのに使用することができる。例えば、いくつかの場合には、本明細書に記載の組成物は、分節骨欠損を治療するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物から形成された二相スキャフォールドは、海綿骨及び皮質骨の階層的組織を模倣しながらも、骨再生及び組織一体化のための骨伝導性表面を提供することができる。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、(i)クエン酸、クエン酸塩、又はクエン酸のエステル、例えば、クエン酸トリエチルやクエン酸の別のメチル若しくはエチルエステルなどと、(ii)ジオールなどのポリオール並びに(iii)アルキン部分及び/又はアジド部分を含むモノマーとの反応生成物を含む。例えば、いくつかの場合には、本明細書に記載の組成物は、下式(A)の1種以上のモノマー;下式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;並びに1つ以上のアルキン部分及び/又は1つ以上のアジド部分を含む1種以上のモノマーから形成されたポリマーを含む。いくつかの例では、ポリマーは、複数のアルキン及び/又はアジド部分を有するモノマーから形成される。
【００１０】
さらに、いくつかの例では、本明細書に記載の組成物は、複数の本明細書に記載のポリマー、例えば、式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;及び1つ以上のアルキン部分を含む1種以上のモノマーから形成された第1のポリマー;並びに式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;及び1つ以上のアジド部分を含む1種以上のモノマーから形成された第2のポリマーなどを含む。さらに、いくつかの場合には、本明細書に記載の組成物は、アジド-アルキン付加環化生成物、例えば1,4-トリアゾール環又は1,5-トリアゾール環を含む。そのような付加環化生成物は、本明細書に記載の1種以上のポリマーから形成することができる。例えば、いくつかの場合には、本明細書に記載の組成物の第1のポリマー及び第2のポリマーは、1つ以上のアルキン部分を含むモノマー及び1つ以上のアジド部分を含む1種以上のモノマーから1種以上のアジド-アルキン付加環化生成物を形成することによって、ポリマーネットワークを形成することができる。
【００１１】
下でさらに記載するように、他のクリックケミストリー反応生成物も、本明細書に記載の組成物のポリマー又はポリマーネットワーク中に存在していてもよい。
【００１２】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物のポリマー又はポリマーネットワークは、上記のものに加えた1種以上のモノマーから形成される。例えば、いくつかの場合には、ポリマーは、イソシアネート、不飽和ポリカルボン酸若しくはポリカルボン酸等価物、アミノ酸、カテコール含有種、又はペプチド、ポリペプチド、核酸、若しくは多糖を含む1種以上のモノマーから形成される。さらに、式(A)、(B1)、(B2)、又は(B3)のモノマーを使用することなしに、本明細書に記載のポリマーを形成することも可能である。いくつかの場合には、例えば、ポリマーは、1つ以上のラクトン及びアルキン部分又はアジド部分を含む1種以上のモノマーから形成される。
【００１３】
さらに、いくつかの例では、本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載のポリマーにより形成されたネットワーク内に分散された粒子状無機物質をさらに含む。いくつかの場合には、粒子状無機物質はヒドロキシアパタイトを含む。
【００１４】
別の態様では、ポリマーネットワークを製造する方法が、本明細書で記載される。いくつかの実施形態では、ポリマーネットワークを製造する方法は、第1のポリマーと第2のポリマーとを混合することであって、第1及び第2のポリマーが本明細書に記載の組成物のポリマーをそれぞれ含むことを含む。例えば、いくつかの例では、第1のポリマーは、式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;及び1つ以上のアルキン部分を含む1種以上のモノマーから形成され;第2のポリマーは、式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;及び1つ以上のアジド部分を含む1種以上のモノマーから形成される。そのような方法は、第1のポリマーの1つ以上のアルキン部分と第2のポリマーの1つ以上のアジド部分とを反応させて、1種以上のアジド-アルキン付加環化生成物を形成することをさらに含むことができる。
【００１５】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のポリマーネットワークの表面を、例えば、1種以上のペプチド、ポリペプチド、核酸、及び/又は多糖などの1種以上の生物機能種で機能化することをさらに含む。いくつかの例では、ペプチド、ポリペプチド、核酸、及び/又は多糖と、ポリマーネットワーク表面のペンダントアルキン及び/又はアジド部分とを反応させて、ポリマーネットワークとペプチド、ポリペプチド、核酸、及び/又は多糖との間に共有結合を得る。
【００１６】
さらに別の態様では、医療用インプラント及び医療機器が、本明細書で記載される。医療用インプラント及び機器は、本明細書に記載の組成物を含むことができるか、これから形成することができる。いくつかの場合には、そのような医療用インプラント又は機器は、血管、心臓組織、心臓弁、靱帯、腱、肺、膀胱、皮膚、気管、又は尿道を形成する組織工学スキャフォールドを含む。
【００１７】
さらに、いくつかの実施形態では、医療機器又はインプラントはコア-シェル型ポリマースキャフォールドを含む。そのようなスキャフォールドは、いくつかの場合には、第1の気孔率を有するコア成分;及びコア成分を包囲するシェル成分であって、第1の気孔率とは異なる第2の気孔率を有するシェル成分を含むことができる。いくつかの例では、コア成分はシェル成分よりも高い気孔率を示す。さらに、コア成分は、式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;アルキン部分を含む1種以上のモノマー;及びアジド部分を含む1種以上のモノマーから形成された第1のポリマーネットワークを含むことができる。さらに、シェル成分は、式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;アルキン部分を含む1種以上のモノマー;及びアジド部分を含む1種以上のモノマーから同様に形成された第2のポリマーネットワークを含むことができる。いくつかの実施形態では、コア成分及びシェル成分は同心円筒である。さらに、いくつかの場合には、ヒドロキシアパタイトなどの粒子状無機物質が、本明細書に記載のスキャフォールドの第1のポリマーネットワーク及び/又は第2のポリマーネットワーク内に分散されている。
【００１８】
これらの及び他の実施形態を、以下の詳細な説明でより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本明細書に記載の一実施形態による組成物を製造するための反応スキームを示す図である。
【図２（ａ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物を製造するための反応スキームを示す図である。
【図２（ｂ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物を製造するための反応スキームを示す図である。
【図３（ａ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の化学的及び物理的特性を示すグラフである。
【図３（ｂ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の化学的及び物理的特性を示すグラフである。
【図３（ｃ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の化学的及び物理的特性を示すグラフである。
【図３（ｄ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の化学的及び物理的特性を示すグラフである。
【図４】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の吸収スペクトルを示すグラフである。
【図５】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の水接触角を示すグラフである。
【図６（ａ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の多様な機械的特性を示すグラフである。
【図６（ｂ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の多様な機械的特性を示すグラフである。
【図６（ｃ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の多様な機械的特性を示すグラフである。
【図６（ｄ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の多様な機械的特性を示すグラフである。
【図６（ｅ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の多様な機械的特性を示すグラフである。
【図６（ｆ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の多様な機械的特性を示すグラフである。
【図６（ｇ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の多様な機械的特性を示すグラフである。
【図６（ｈ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の多様な機械的特性を示すグラフである。
【図７】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の物理的、化学的及び機械的特性の表である。
【図８】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の機械的特性のプロットである。
【図９】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の機械的特性のプロットである。
【図１０（ａ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の分解特性のプロットである。
【図１０（ｂ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の分解特性のプロットである。
【図１０（ｃ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の分解特性のプロットである。
【図１０（ｄ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の分解特性のプロットである。
【図１１】本明細書に記載の一実施形態による組成物の成分の構造を示す図である。
【図１２】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の生物学的特性のプロットである。
【図１３（ａ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の生物学的特性のプロットである。
【図１３（ｂ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の生物学的特性のプロットである。
【図１４】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の生物学的特性のプロットである。
【図１５】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の顕微鏡像である。
【図１６】本明細書に記載の一実施形態によるスキャフォールドの顕微鏡像である。
【図１７（ａ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の機械的特性のプロットである。
【図１７（ｂ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の機械的特性のプロットである。
【図１７（ｃ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の機械的特性のプロットである。
【図１７（ｄ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物の機械的特性のプロットである。
【図１８（ａ）】それぞれ、本明細書に記載の一実施形態によるスキャフォールドの斜視図及び断面図である。
【図１８（ｂ）】それぞれ、本明細書に記載の一実施形態によるスキャフォールドの斜視図及び断面図である。
【図１９】本明細書に記載のいくつかの実施形態によるスキャフォールドの顕微鏡像である。
【図２０（ａ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態によるスキャフォールドの機械的特性のプロットである。
【図２０（ｂ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態によるスキャフォールドの機械的特性のプロットである。
【図２０（ｃ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態によるスキャフォールドの機械的特性のプロットである。
【図２１（ａ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態によるスキャフォールドにより治療された骨欠損のCT像である。
【図２１（ｂ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態によるスキャフォールドにより治療された骨欠損のCT像である。
【図２１（ｃ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態によるスキャフォールドにより治療された骨欠損のCT像である。
【図２１（ｄ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態によるスキャフォールドにより治療された骨欠損のCT像である。
【図２２（ａ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態によるスキャフォールドの特性のプロットである。
【図２２（ｂ）】本明細書に記載のいくつかの実施形態によるスキャフォールドの特性のプロットである。
【図２３】本明細書に記載のいくつかの実施形態によるスキャフォールドの特性のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書に記載の実施形態を、以下の詳細な説明、実施例及び図面を参照することによってより容易に理解することができる。しかしながら、本明細書に記載の要素、装置及び方法は、詳細な説明、実施例及び図面に提示した特定の実施形態に限定されない。これらの実施形態は、本発明の原理を例示するに過ぎないことが認識されるべきである。多数の変更及び適合が、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、当業者に容易に明らかであろう。
【００２１】
さらに、本明細書に開示した全ての範囲は、その中に包含されるあらゆる下部範囲を含むものと理解されるべきである。例えば、「1.0から10.0」と記載された範囲は、1.0以上の最小値で始まり、10.0以下の最大値で終わるあらゆる下部範囲、例えば、1.0から5.3、又は4.7から10.0、又は3.6から7.9を含むものと考えられるべきである。
【００２２】
本明細書に開示した全ての範囲はまた、別段の明記がない限り、その範囲の端点を含むものと考えられるべきである。例えば、「5から10の間」の範囲は、一般に、端点の5及び10を含むものと考えられるべきである。
【００２３】
さらに、「までの」という語句が量又は数量と関連して使用される場合、その量は少なくとも検出可能な量又は数量であることが理解されるべきである。例えば、特定された量「までの」量で存在する物質は、検出可能な量から特定された量を含めて特定された量までで存在することができる。
【００２４】
I. 組成物
一態様では、組成物が本明細書で記載される。いくつかの実施形態では、組成物は、(i)クエン酸、クエン酸塩、又はクエン酸のエステル、例えば、クエン酸トリエチルやクエン酸の別のメチル若しくはエチルエステルと、(ii)ジオールなどのポリオール及び(iii)アルキン部分及び/又はアジド部分を含むモノマーとの反応生成物を含む。本明細書に記載のいくつかの実施形態での使用に適したポリオールの非限定的な例には、C2〜C20、C2〜C12、又はC2〜C6脂肪族アルカンジオールが含まれ、これには、α,ω-n-アルカンジオール、又はα,ω-アルケンジオールが含まれる。例えば、いくつかの場合には、ポリオールは、1,4-ブタンジオール、1,6-ヘキサンジオール、1,8-オクタンジオール、1,10-デカンジオール、1,12-ドデカンジオール、1,16-ヘキサデカンジオール、又は1,20-イコサンジオールを含む。分岐α,ω-アルカンジオール又はα,ω-アルケンジオールも使用することができる。さらに、ポリオールは芳香族ジオールとすることもできる。さらに、いくつかの実施形態では、ポリオールは、ポリ(エチレングリコール)(PEG)又はポリ(プロピレングリコール)(PPG)を含む。本開示の目的に反しない任意のPEG又はPPGを使用してもよい。いくつかの実施形態では、例えば、PEG又はPPGは、約100から約5000の間又は約200から約1000の間の重量平均分子量を有する。
【００２５】
さらに、いくつかの例では、上記ポリオールは、ヒドロキシル基を1つのみ有するアルコール又はアミン若しくはアミドにより少なくとも部分的に置きかえることができる。さらに、いくつかの場合には、ポリオールは、1つ以上のヒドロキシル、アミン、又はアミド基を有するポリマー又はオリゴマーにより少なくとも部分的に置きかえることができる。そのようなポリマー又はオリゴマーは、いくつかの例では、ポリエステル、ポリエーテル、又はポリアミドとすることができる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、(i)クエン酸、クエン酸塩、又はクエン酸のエステルと、(ii)アルコール、アミン、アミド、ポリエステル、ポリエーテル、又はポリアミド並びに(iii)アルキン部分及び/又はアジド部分を含むモノマーとの反応生成物を含む。
【００２６】
いくつかの場合には、組成物は、式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;並びに1つ以上のアルキン部分及び/又は1つ以上のアジド部分を含む1種以上のモノマー:
【化１】
0006343674.tif 000002
0006343674.tif 000003
[式中、
R1、R2、及びR3は、独立して、-H、-CH3、-CH2CH3、又はM+であり、
R4は-Hであり、
R5は、-H、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、-CH3、-CH2CH3、-NH2、NHCH3、-CH2CH2NHCH3、-N(CH3)2、又は-CH2CH2N(CH2CH3)2であり、
R6は、-H、-CH3、又は-CH2CH3、-(CH3)2、又は-(CH2CH3)2であり、
R7は、-H又は-CH3であり、
R8は、-(CH2)a-、-(CH2CH2O)b-、又は-(CH2OCH2)b-であり、
R9は、-H、-CH3、又はC2〜C20アルキルであり、
R10は、-H、-C(O)CH3、又は-C(O)CH2CH3であり、
R11及びR12は、独立して、-OH又は-NH2であり、
M+は、一価の陽イオンであり、
X及びYは、独立して、-O-又は-NH-であり、
Zは、-H、-CH3、-(CH3)2、-(CH2CH3)2、又は
【化２】
0006343674.tif 000004
であり、
aは、0から20の整数であり、
bは、0から2000の整数であり、
nは、1から2000の間の整数であり、
m及びpは、独立して、1から20の範囲の整数であり、
式(B1)のモノマーは、-OH又は-NH2を含む少なくとも1つの末端を有する]
から形成されたポリマーを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、式(B1)の1種以上のモノマーが使用され、Xが-O-である。したがって、いくつかの場合には、式(B1)のモノマーは、
【化３】
0006343674.tif 000005
を含む。さらなるいくつかの例では、式(B3)のモノマーが使用され、R11及びR12がそれぞれ-OHである。いくつかの実施形態では、式(B3)のモノマーは、
【化４】
0006343674.tif 000006
を含む。
【００２８】
式(A)、(B1)、(B2)、及び(B3)のモノマー並びに1つ以上のアルキン及び/又はアジド部分を含むモノマーは、本開示の目的に反しない任意の比で使用することができる。さらに、モノマーの比を変えることで、いくつかの実施形態では、モノマーから形成されるポリマーの生分解性、機械的強度、及び/又は他の特性を変えることができる。いくつかの実施形態では、モノマー(A)とモノマー(B1)、(B2)、又は(B3)との比は、約1:10から約10:1の間又は約1:5から約5:1の間である。いくつかの実施形態では、モノマー(A)とモノマー(B1)、(B2)、又は(B3)との比は約1:4から約4:1の間である。いくつかの実施形態では、この比は約1:1である。アルキン又はアジド含有モノマーと式(A)、(B1)、(B2)、又は(B3)のモノマーとの比は、約1:20から1:2の間又は約1:10から約1:3の間とすることができる。
【００２９】
さらに、本明細書に記載の反応生成物は、いくつかの場合には、特定されたモノマー又は種の縮合重合又は重縮合反応生成物である。いくつかのそのような実施形態では、反応生成物は、コモノマーの交互コポリマー又は統計コポリマーを形成する。さらに、本明細書でさらに記載するように、上記の種はまた、コポリマーのペンダント基又は側鎖を形成し得る。「モノマー」は、本明細書では参考のために、モノマーを単独で又は異なる種類のモノマーと組み合わせて使用して、重合生成物を提供することができるように、少なくとも2つの官能基又はポリマー主鎖への結合点を有する化学種を含むことができる。
【００３０】
さらに、本明細書に記載の組成物の「ポリマー」は、ポリマーであってもオリゴマーであってもよいことが理解されるべきである。さらに、いくつかの場合には、本明細書に記載の組成物のポリマーはプレポリマーであってもよく、ここで「プレポリマー」とは、より大きなポリマー又はポリマーネットワークを形成し得る比較的低分子量の重合種を指し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物の「ポリマー」は、約5000未満、約3000未満、約2000未満、約1000未満、又は約500未満の重量平均分子量を有する。他の場合には、本明細書に記載の組成物のポリマーは、約1000超、約2000超、約3000超、又は約5000超の重量平均分子量を有する。いくつかの例では、本明細書に記載の組成物のポリマーは、約500から約10,000の間、約500から約5000の間、約1000から約10,000の間、又は約2000から約10,000の間の重量平均分子量を有する。本明細書に記載の組成物のポリマーは他の分子量も有することができる。
【００３１】
さらに、「シトレート含有(citrate-containing)」又は「シトレートベースの(citrate-based)」ポリマーとは、式(A)のモノマーから少なくとも部分的に形成された且つ/又は式(A)を有する部分を含有するポリマーを指し得る。ポリマーが式(A)の部分を含む場合、R1、R2、及びR3は、ポリマーの残部への結合点をさらに表し得る。
【００３２】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物のポリマーは、上記のものに加えて、1種以上のさらなるモノマーから形成される。例えば、いくつかの場合には、本明細書に記載の組成物のポリマーは、(i)クエン酸、クエン酸塩、又はクエン酸のエステルと、(ii)ポリオール、(iii)1種以上のアルキン及び/又はアジド、並びに(iv)アミン、アミド、又はイソシアネートとの反応生成物を含むことができる。そのような例では、ポリオールは上記の任意のポリオールを含むことができ、クエン酸のエステルは上記の任意のクエン酸のエステルを含むことができる。さらに、アミンは、いくつかの実施形態では、2個から10個の炭素原子を有する1種以上の第一級アミンを含む。他の場合には、アミンは、2個から15個の炭素原子を有する1種以上の第二級又は第三級アミンを含む。イソシアネートは、いくつかの実施形態では、モノイソシアネートを含む。他の例では、イソシアネートは、4個から20個の炭素原子を有するアルカンジイソシアネートなどのジイソシアネートを含む。例えば、いくつかの実施形態では、組成物のポリマーは、式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;1つ以上のアルキン部分及び/又は1つ以上のアジド部分を含む1種以上のモノマー;並びに式(C1)、(C2)、(C3)、又は(C4)
【化５】
0006343674.tif 000007
0006343674.tif 000008
(式中、pは、1から10の範囲の整数である)
の1種以上のモノマーから形成される。
【００３３】
さらに、式(A)、(B1)、(B2)、(B3)、(C1)、(C2)、(C3)、及び(C4)のモノマー並びに1つ以上のアルキン及び/又はアジド部分を含むモノマーは、本開示の目的に反しない任意の比で使用することができる。さらに、モノマーの比を変えることで、いくつかの実施形態では、モノマーから形成されるポリマーの生分解性、機械的強度、及び/又は他の特性を変えることができる。いくつかの実施形態では、モノマー(A)とモノマー(B1)、(B2)、又は(B3)との比は、約1:10から約10:1の間又は約1:5から約5:1の間である。いくつかの実施形態では、モノマー(A)とモノマー(B1)、(B2)、又は(B3)との比は、約1:4から約4:1の間である。いくつかの実施形態では、この比は約1:1である。さらに、いくつかの実施形態では、モノマー(A)とモノマー(C)との比は、約1:10から約10:1の間である。いくつかの実施形態では、モノマー(A)とモノマー(C1)、(C2)、(C3)、又は(C4)との比は約1:1である。アルキン又はアジド含有モノマーと式(A)、(B1)、(B2)、(B3)、(C1)、(C2)、(C3)、又は(C4)のモノマーとの比は、約1:20から1:2の間又は約1:10から約1:3の間とすることができる。
【００３４】
さらに、本明細書に記載のいくつかの実施形態では、式(B1)、(B2)、又は(B3)のモノマーは、式(B1)、(B2)、又は(B3)の式を有しないアルコールにより置きかえることができる。例えば、いくつかの実施形態では、不飽和アルコール又は不飽和ポリオールを使用することができる。さらに、いくつかの場合には、式(C)のモノマーは、本明細書に記載のアミノ酸により少なくとも部分的に置きかえることができる。
【００３５】
同様に、他の場合には、ポリマーは、(i)クエン酸、クエン酸塩、又はクエン酸のエステルと、(ii)ポリオール、(iii)1種以上のアルキン及び/又はアジド、並びに(iv)ポリカルボン酸、例えば、ジカルボン酸又はポリカルボン酸の機能的等価物、例えば、ポリカルボン酸の環状無水物又は酸塩化物などとの反応生成物を含む。そのような場合には、ポリオールは上記の任意のポリオールを含むことができ、クエン酸のエステルは上記の任意のクエン酸のエステルを含むことができる。さらに、ポリカルボン酸又はその機能的等価物は飽和であっても不飽和であってもよい。例えば、いくつかの例では、ポリカルボン酸又はその機能的等価物は、マレイン酸、無水マレイン酸、フマル酸、又はフマリルクロリドを含む。例えば、アリルマロン酸、アリルマロン酸クロリド、イタコン酸、又はイタコン酸クロリドなどの、ビニル含有ポリカルボン酸又はその機能的等価物も使用してもよい。さらに、いくつかの場合には、ポリカルボン酸又はその機能的等価物は、ポリカルボン酸であってもなくてもよいオレフィン含有モノマーで少なくとも部分的に置きかえることができる。いくつかの実施形態では、例えば、オレフィン含有モノマーは、ビニル含有ジオールなどの不飽和ポリオールを含む。いくつかの例では、本明細書に記載の組成物のポリマーは、式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;1つ以上のアルキン部分及び/又は1つ以上のアジド部分を含む1種以上のモノマー;並びに式(D1)又は(D2)
【化６】
0006343674.tif 000009
(式中、R13は、-H、-CH3、又は-CH2CH3である)
の1種以上のモノマーから形成される。
【００３６】
さらに、式(A)、(B1)、(B2)、(B3)、(D1)、及び(D2)のモノマー並びに1つ以上のアルキン及び/又はアジド部分を含むモノマーは、本開示の目的に反しない任意の比で使用することができる。さらに、モノマーの比を変えることで、いくつかの実施形態では、モノマーから形成されるポリマーの機械的特性及び/又は他の特性を変えることができる。いくつかの実施形態では、モノマー(A)とモノマー(B1)、(B2)、又は(B3)との比は、約1:10から約10:1の間又は約1:5から約5:1の間である。いくつかの実施形態では、モノマー(A)とモノマー(B1)、(B2)、又は(B3)との比は、約1:4から約4:1の間である。いくつかの場合には、この比は約1:1である。さらに、いくつかの実施形態では、モノマー(A)とモノマー(D1)又はモノマー(D2)との比は、約1:10から約10:1の間である。いくつかの実施形態では、モノマー(A)とモノマー(D1)又はモノマー(D2)との比は約1:1である。アルキン又はアジド含有モノマーと式(A)、(B1)、(B2)、(B3)、(D1)又は(D2)のモノマーとの比は、約1:20から1:2の間又は約1:10から約1:3の間とすることができる。
【００３７】
さらに他の実施形態では、本明細書に記載の組成物のポリマーは、(i)クエン酸、クエン酸塩、又はクエン酸のエステルと、(ii)ポリオール、(iii)1種以上のアルキン及び/又はアジド、並びに(iv)アルファ-アミノ酸などのアミノ酸との反応生成物を含む。さらに、いくつかの場合には、本明細書に記載のポリマーは、(i)クエン酸、クエン酸塩、又はクエン酸のエステルと、(ii)ポリオール、(iii)1種以上のアルキン及び/又はアジド、(iv)アミノ酸、並びに(v)ジイソシアネートなどのイソシアネートとの反応生成物を含む。さらに、いくつかの例では、酸無水物及び/又は酸塩化物を、クエン酸、クエン酸塩、又はクエン酸のエステルと併せて使用することができる。ポリオールは上記の任意のポリオールとすることができ、クエン酸のエステルは上記の任意のクエン酸のエステルとすることができ、イソシアネートは上記の任意のイソシアネートとすることができる。さらに、酸無水物及び/又は酸塩化物は上記の任意の酸無水物及び/又は酸塩化物を含むことができ、これには、例えば、ポリ酸無水物又はポリ酸塩化物が含まれる。
【００３８】
本明細書に記載のポリマーのアルファ-アミノ酸は、いくつかの実施形態では、L-アミノ酸、D-アミノ酸、又はD,L-アミノ酸を含む。いくつかの場合には、アルファ-アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、トリプトファン、バリン、又はこれらの組合せを含む。さらに、いくつかの例では、アルファ-アミノ酸は、アルキル置換アルファ-アミノ酸、例えば、22の「標準」又はタンパク質構成アミノ酸のいずれかから誘導されるメチル置換アミノ酸、例えばメチルセリンなどを含む。さらに、いくつかの場合には、アミノ酸は、本明細書に記載の組成物のポリマーのペンダント基又は側基を形成する。そのようなアミノ酸ペンダント基は本開示の目的に反しない任意の様式でポリマーの主鎖に結合することができる。例えば、いくつかの場合には、アミノ酸は、アミノ酸部分とシトレート部分との間のエステル及び/又はアミド結合によって主鎖に結合している。さらに、いくつかの例では、アミノ酸はシトレート部分と6員環を形成している。理論に束縛されることを意図するものではないが、本明細書に記載の6員環の形成はポリマーに蛍光性をもたらすことが考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物のポリマーは蛍光性ポリマーであり得る。
【００３９】
いくつかの場合には、本明細書に記載の組成物のポリマーは、式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)又は(B3)の1種以上のモノマー;1つ以上のアルキン部分及び/又は1つ以上のアジド部分を含む1種以上のモノマー;並びに式(E)
【化７】
0006343674.tif 000010
(式中、R14はアミノ酸側鎖である)
の1種以上のモノマーから形成される。
【００４０】
さらに、式(A)、(B1)、(B2)、(B3)、及び(E)のモノマー並びに1つ以上のアルキン及び/又はアジド部分を含むモノマーは、本開示の目的に反しない任意の比で使用することができる。さらに、モノマーの比を変えることで、いくつかの実施形態では、モノマーから形成されるポリマーの機械的特性、発光特性及び/又は他の特性を変えることができる。いくつかの実施形態では、モノマー(A)とモノマー(B1)、モノマー(B2)、又はモノマー(B3)との比は、約1:10から約10:1の間又は約1:5から約5:1の間である。いくつかの実施形態では、モノマー(A)とモノマー(B1)、モノマー(B2)、又はモノマー(B3)との比は、約1:4から約4:1の間である。いくつかの場合には、この比は約1:1である。さらに、いくつかの実施形態では、モノマー(A)とモノマー(E)との比は、約1:10から約10:1の間である。アルキン又はアジド含有モノマーと式(A)、(B1)、(B2)、(B3)、又は(E)のモノマーとの比は、約1:20から1:2の間又は約1:10から約1:3の間とすることができる。
【００４１】
他の例では、本明細書に記載の組成物のポリマーは、(i)クエン酸、クエン酸塩、又はクエン酸のエステルと、(ii)ポリオール、(iii)1種以上のアルキン及び/又はアジド、並びに(iv)カテコール含有種との反応生成物を含む。クエン酸塩又はクエン酸のエステルは上記の任意のクエン酸塩又はクエン酸のエステル、例えば、クエン酸のメチル若しくはエチルエステルなどとすることができる。同様に、ポリオールは上記の任意のポリオールとすることができる。
【００４２】
カテコール含有種は本開示の目的に反しない任意のカテコール含有種を含むことができる。いくつかの場合には、本明細書に記載のポリマーを形成するのに使用されるカテコール含有種は、ポリマーを形成するのに使用される別の化学種とエステル又はアミド結合を形成し得る少なくとも1つの部分を含む。例えば、いくつかの場合には、カテコール含有種は、アミン部分又はカルボン酸部分を含む。さらに、いくつかの例では、カテコール含有種は、カテコール部分の一部ではないヒドロキシル部分を含む。いくつかの実施形態では、カテコール含有種はドーパミンを含む。他の実施形態では、カテコール含有種は、L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン(L-DOPA)又はD-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン(D-DOPA)を含む。いくつかの場合には、カテコール含有種は3,4-ジヒドロキシヒドロケイ皮酸を含む。さらに、いくつかの実施形態では、カテコール含有種はアミド結合によってポリマーの主鎖に結合している。他の実施形態では、カテコール含有種はエステル結合によってポリマーの主鎖に結合している。
【００４３】
いくつかの場合には、本明細書に記載の組成物のポリマーは、式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)又は(B3)の1種以上のモノマー;1つ以上のアルキン部分及び/又は1つ以上のアジド部分を含む1種以上のモノマー;並びに式(F)
【化８】
0006343674.tif 000011
[式中、
R15、R16、R17、及びR18は、独立して、-H、-CH2(CH2)xNH2、-CH2(CHR19)NH2、又は-CH2(CH2)xCOOHであり、
R19は、-COO又は-(CH2)yCOOであり、
xは、0から20の範囲の整数であり、
yは、1から20の範囲の整数である]
の1種以上のモノマーから形成される。
【００４４】
さらに、式(A)、(B1)、(B2)、(B3)、及び(F)のモノマー並びに1つ以上のアルキン及び/又はアジド部分を含むモノマーは、本開示の目的に反しない任意の比で使用することができる。さらに、モノマーの比を変えることで、いくつかの実施形態では、モノマーから形成されるポリマーの機械的特性及び/又は他の特性を変えることができる。いくつかの実施形態では、モノマー(A)とモノマー(B1)、(B2)、又は(B3)との比は、約1:10から約10:1の間又は約1:5から約5:1の間である。いくつかの実施形態では、モノマー(A)とモノマー(B1)、(B2)、又は(B3)との比は、約1:4から約4:1の間である。いくつかの場合には、この比は約1:1である。さらに、いくつかの実施形態では、モノマー(A)とモノマー(F)との比は、約1:10から約10:1の間である。アルキン又はアジド含有モノマーと式(A)、(B1)、(B2)、(B3)、又は(F)のモノマーとの比は、約1:20から1:2の間又は約1:10から約1:3の間とすることができる。
【００４５】
さらに、本明細書に記載のポリマーを形成するのに使用される1つ以上のアルキン及び/又はアジド部分を含むモノマーは、本開示の目的に反しない任意のアルキン及び/又はアジド含有化学種を含むことができる。例えば、いくつかの例では、1種以上のそのようなモノマーはジオールなどのポリオールを含む。そのようなモノマーは、いくつかの場合には、モノマーの1つ以上のヒドロキシル部分と、式(A)のモノマー又は本明細書に記載の別のカルボキシル含有モノマーのカルボキシル又はカルボン酸部分との反応によってポリマーに組み入れることができる。さらに、いくつかの例では、そのようなモノマーを式(B1)、(B2)、又は(B3)のモノマーの代わりに使用することができる。他の例では、そのようなモノマーは、式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマーと併せて使用される。さらに、そのようなモノマーは、ジアジド-ジオール(DAzD)又はアルキンジオール(AlD)とすることができる。
【００４６】
いくつかの場合には、1つ以上のアジド部分を含む1種以上のモノマーは、式(G1)又は(G2)
【化９】
0006343674.tif 000012
(式中、R20は、-CH3又は-CH2CH3である)
のモノマーを含む。
【００４７】
さらに、いくつかの実施形態では、1つ以上のアルキン部分を含む1種以上のモノマーは、式(H1)、(H2)、(H3)、(H4)、(H5)、又は(H6)
【化１０】
0006343674.tif 000013
(式中、
R20は、-CH3又は-CH2CH3であり、
Xは、-NH-又は-O-である)
のモノマーを含む。
【００４８】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリマーは生物活性種で機能化することができる。いくつかの場合には、ポリマーは、生物活性種を含むさらなるモノマーから形成される。さらに、そのようなさらなるモノマーは、1つ以上のアルキン及び/又はアジド部分を含むことができる。例えば、いくつかの例では、本明細書に記載のポリマーは、ペプチド、ポリペプチド、核酸、又は多糖を含む1種以上のモノマーから形成され、ここで、ペプチド、ポリペプチド、核酸、又は多糖は、1つ以上のアルキン及び/又はアジド部分で官能化されている。いくつかの場合には、本明細書に記載のポリマーの生物活性種は、成長因子又はシグナル伝達分子である。さらに、ペプチドは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、又はより長いペプチドを含むことができる。下でさらに記載するように、そのようなモノマーからポリマーを形成することで、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物にさらなる生物学的機能性を付与することができる。
【００４９】
さらに、いくつかの実施形態では、組成物は複数の本明細書に記載のポリマーを含む。いくつかの例では、ポリマーは、クリックケミストリー反応スキームによって互いに反応性であるように選択される。いくつかの場合には、例えば、本明細書に記載の組成物は、式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;及び1つ以上のアルキン部分を含む1種以上のモノマーから形成された第1のポリマーを含み;式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;及び1つ以上のアジド部分を含む1種以上のモノマーから形成された第2のポリマーをさらに含む。したがって、いくつかのそのような実施形態では、本明細書に記載の組成物は、1,4又は1,5-トリアゾール環などのアジド-アルキン付加環化生成物を含み得る。このように、本明細書に記載の組成物の第1のポリマー及び第2のポリマーは、ポリマーネットワークの架橋結合として機能する1種以上のアジド-アルキン付加環化生成物を形成することによって、ポリマーネットワークを形成することができる。
【００５０】
そのようなポリマーネットワークは高い架橋密度を有し得る。「架橋密度」とは、本明細書では参考のために、下記のように計算される、ポリマー主鎖間の架橋結合の数又は架橋部位間の分子量を指し得る。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリマーネットワークの架橋結合は、アジド-アルキン付加環化生成物架橋結合を含む。架橋結合は、隣接するポリマー主鎖の1つ以上のペンダントカルボキシル又はカルボン酸基と1つ以上のペンダントヒドロキシル基とのエステル化又は反応により形成されるエステル結合も含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリマーネットワークは、少なくとも約500、少なくとも約1000、少なくとも約5000、少なくとも約7000、少なくとも約10,000、少なくとも約20,000、又は少なくとも約30,000mol/m3の架橋密度を有する。いくつかの場合には、架橋密度は、約5000から約40,000の間又は約10,000から約40,000mol/m3の間である。
【００５１】
アジド-アルキン付加環化生成物を必ずしも形成しないクリックケミストリー反応スキームを使用して、ポリマーネットワークを形成することも可能である。例えば、いくつかの場合には、本明細書に記載のアルキン及び/又はアジド部分を含む1種以上のモノマーは、クリックケミストリー反応スキームに関与し得る異なる部分を含む1種以上のモノマーにより少なくとも部分的に置きかえることができる。例えば、いくつかの実施形態では、ポリマー又はポリマーネットワークは、チオール-エン/インクリック反応による、チオール部分を含む1種以上のモノマーと、アルケン(又はアルキン)部分を含む1種以上のモノマーとの反応から形成される。そのようなチオール-エン/インクリック反応は、フリーラジカル又はイオン機構による、炭素-炭素二重結合又は三重結合へのS-H結合の付加を含み得る。より一般に、いくつかの場合には、本明細書に記載のポリマーは、式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;並びにクリックケミストリー反応に関与可能な1つ以上の第1の部分及び/又は同じクリックケミストリー反応に関与可能な1つ以上の第2の部分を含む1種以上のモノマーから形成することができ、ここで第1の部分と第2の部分とは異なる。本開示の目的に反しない任意のクリックケミストリー反応を使用してもよい。いくつかの例では、クリックケミストリー反応は、Huisgenアルキン-アジド付加環化などの[3+2]付加環化;チオール-エン/イン反応;Diels-Alder反応;逆電子要請型Diels-Alder反応;イソシアニドとテトラジンとの付加環化反応などの[4+1]付加環化;又はエポキシ若しくはアジリジン環などの歪み環を伴う求核置換反応を含む。理論に束縛されることを意図するものではないが、クリックケミストリー反応スキームを使用してポリマーネットワークに架橋をもたらすことで、いくつかの場合には、ヒドロキシアパタイト(HA)のカルシウムキレート化など、他の目的のためのペンダントクエン酸カルボキシル部分を犠牲にすることなく、ポリマーネットワークの機械的強度を改善することができることが考えられる。
【００５２】
さらに、本明細書に記載のポリマー又はポリマーネットワークは、必ずしも式(A)、(B1)、(B2)、又は(B3)の構造を有するモノマーではないモノマーから形成することができることが理解されるべきである。例えば、いくつかの場合には、本明細書に記載の組成物のポリマーは、ラクトンを含む1種以上のモノマー並びにクリック反応に関与可能な1つ以上の部分、例えば、1つ以上のアルキン部分及び/又は1つ以上のアジド部分などを含む1種以上のモノマーから形成される。いくつかのそのような場合には、ラクトンを含む1種以上のモノマーは、全てのモノマーの総量に基づいて、ポリマーを形成するのに使用されるモノマーの少なくとも約60mol%、少なくとも約70mol%、少なくとも約80mol%、少なくとも約90mol%、少なくとも約95mol%、又は少なくとも約99mol%を構成し得る。したがって、いくつかの例では、本明細書に記載の組成物のポリマーは、ポリマーのペンダント又は側基として、1つ以上のアジド部分及び/又は1つ以上のアルキン部分などの1つ以上のクリック可能な部分を含むように修飾されたポリラクトンを含む。そのようなポリマーを形成するのに、本開示の目的に反しない任意のラクトンを使用してもよい。例えば、いくつかの場合には、ラクトンは、L-ラクチド、D-ラクチド、D,L-ラクチド、グリコリド、及び/又はε-カプロラクトンを含む。したがって、いくつかの例では、本明細書に記載のポリマーは、ポリ(ε-カプロラクトン)(PCL)、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)、又はこれらの組合せとすることができる。
【００５３】
同様に、他の実施形態では、本明細書に記載の組成物のポリマーは、式(A)により記載される種とは異なるポリカルボン酸又はポリカルボン酸の機能的等価物を含む1種以上のモノマーから形成される。そのようなポリカルボン酸はジカルボン酸とすることができ、ポリカルボン酸の「機能的等価物」は、例えば、本明細書に記載のポリカルボン酸の環状無水物又は酸塩化物など、本明細書に記載の反応スキームでポリカルボン酸が形成するのと同じポリマー生成物を形成する種とすることができる。さらに、ポリカルボン酸又はその機能的等価物は飽和であっても不飽和であってもよい。例えば、いくつかの例では、ポリカルボン酸又はその機能的等価物は、マレイン酸、無水マレイン酸、フマル酸、又はフマリルクロリドを含む。例えば、アリルマロン酸、アリルマロン酸クロリド、イタコン酸、又はイタコン酸クロリドなどの、ビニル含有ポリカルボン酸又はその機能的等価物も使用してもよい。
【００５４】
いくつかの場合には、ポリマーは、ポリカルボン酸又はポリカルボン酸等価物を含む1種以上のそのようなモノマー;ポリオールを含む1種以上のモノマー;並びに1つ以上のクリック可能な部分、例えば、1つ以上のアルキン部分及び/又は1つ以上のアジド部分などを含む1種以上のモノマーから形成される。例えば、いくつかの場合には、ポリカルボン酸はセバシン酸などのジカルボン酸を含む。同様に、ポリオールは、上に提示したジオールなどのジオール又はグリセロールなどのトリオールを含むことができる。さらに、いくつかのそのような場合には、1つ以上のアルキン及び/又はアジド部分などの1つ以上のクリック可能な部分を含む1種以上のモノマーは、全てのモノマーの総量に基づいて、ポリマーを形成するのに使用されるモノマーの約40mol%まで、約30mol%まで、約20mol%まで、約10mol%まで、約5mol%まで、又は約1mol%までを構成し得る。したがって、いくつかの例では、本明細書に記載の組成物のポリマーは、ポリマーのペンダント又は側基として、1つ以上のアジド部分及び/又は1つ以上のアルキン部分を含むように修飾されたポリ(グリセロールセバケート)(PGS)などのポリエステルを含む。
【００５５】
さらに、本明細書に記載のポリマーネットワークはヒドロゲルとすることができる。ヒドロゲルは、いくつかの場合には、水性連続相及びポリマー分散又は不連続相を含む。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の架橋ポリマーネットワークは水溶性ではない。
【００５６】
本明細書に記載のポリマー又はポリマーネットワークは、いくつかの場合には、ポリマーの主鎖中に少なくとも1つのエステル結合も有することができる。いくつかの例では、ポリマーは、ポリマーの主鎖中に複数のエステル結合、例えば、少なくとも3つのエステル結合、少なくとも4つのエステル結合、又は少なくとも5つのエステル結合などを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリマーは、ポリマーの主鎖中に、2つのエステル結合から50のエステル結合を有する。さらに、本明細書に記載の構造を有するポリマー及びポリマーネットワークは、いくつかの場合には、生分解性であり得る。生分解性ポリマー又はポリマーネットワークは、いくつかの実施形態では、通常の生物学的プロセスにより体内から排出され得る無毒成分にin vivoで分解される。いくつかの実施形態では、生分解性ポリマーは、約90日以下、約60日以下、又は約30日以下の間に完全に又は実質的にin vivoで完全に分解され、ここで、分解の程度は生分解性ポリマーの質量損失パーセントに基づき、完全な分解は質量損失100%に相当する。具体的には、質量損失は、式(1)に示す通り、ポリマーの初期重量(W0)と所定の時点(30日など)で測定した重量(Wt)とを比較することによって、計算される:
【数１】
0006343674.tif 000014
【００５７】
さらに、本明細書に記載のポリマー又はポリマーネットワークは、本開示の目的に反しない任意の量で組成物中に存在することができる。いくつかの場合には、組成物は、ポリマー又はポリマーネットワークからなるか、これから本質的になる。他の例では、組成物は、組成物の総重量に基づいて、約95重量パーセントまで、約90重量パーセントまで、約80重量パーセントまで、約70重量パーセントまで、約60重量パーセントまで、約50重量パーセントまで、約40重量パーセントまで、又は約30重量パーセントまでのポリマー又はポリマーネットワークを含む。いくつかの例では、本明細書に記載の組成物は、組成物の総重量に基づいて、約10重量パーセントから約99重量パーセントの間、約10重量パーセントから約90重量パーセントの間、約10重量パーセントから約80重量パーセントの間、約20重量パーセントから約70重量パーセントの間、約30重量パーセントから約70重量パーセントの間、約30重量パーセントから約60重量パーセントの間、約50重量パーセントから約99重量パーセントの間、約50重量パーセントから約80重量パーセントの間、又は約60重量パーセントから約90重量パーセントの間のポリマー又はポリマーネットワークを含む。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物の残部は、水又は水溶液とすることができる。
【００５８】
さらに、いくつかの実施形態では、ポリマーネットワークを含む本明細書に記載の組成物は、ポリマーネットワーク中に分散された粒子状物質をさらに含むことができる。本開示の目的に反しない任意の粒子状物質を使用してもよい。いくつかの場合には、粒子状物質は、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、二相性リン酸カルシウム(biphasic calcium phosphate)、バイオガラス、セラミックス、マグネシウム粉末、マグネシウム合金、及び脱細胞化骨組織粒子の1つ以上を含む。他の粒子状物質も使用してもよい。
【００５９】
さらに、本明細書に記載の粒子状物質は、本開示の目的に反しない任意の粒径及び/又は粒子形状を有することができる。いくつかの実施形態では、例えば、粒子状物質は、少なくとも1つの寸法において、約1000μm未満、約800μm未満、約500μm未満、約300μm未満、約100μm未満、約50μm未満、約30μm未満、又は約10μm未満の平均粒径を有する。いくつかの場合には、粒子状物質は、少なくとも1つの寸法において、約1μm未満、約500nm未満、約300nm未満、約100nm未満、約50nm未満、又は約30nm未満の平均粒径を有する。いくつかの例では、粒子状物質は、2つの寸法又は3つの寸法において本明細書に記載した平均粒径を有する。さらに、粒子状物質は、略球状粒子、板状粒子、針状粒子、又はこれらの組合せで形成されていてもよい。他の形状を有する粒子状物質も使用してもよい。
【００６０】
粒子状物質は、本開示の目的に反しない任意の量で本明細書に記載の組成物中に存在することができる。例えば、いくつかの場合には、組成物は、組成物の総重量に基づいて、約70重量パーセントまで、約60重量パーセントまで、約50重量パーセントまで、約40重量パーセントまで、又は約30重量パーセントまでの粒子状物質を含む。いくつかの例では、組成物は、組成物の総重量に基づいて、約1から約70重量パーセントの間、約10から約70重量パーセントの間、約15から約60重量パーセントの間、約25から約65重量パーセントの間、約25から約50重量パーセントの間、約30から約70重量パーセントの間、約30から約50重量パーセントの間、約40から約70重量パーセントの間、又は約50から約70重量パーセントの間を含む。例えば、いくつかの場合には、本明細書に記載のポリマーネットワークを含む組成物は、約65重量パーセントまでのヒドロキシアパタイトを含む。
【００６１】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、ポリマーネットワークを形成するのに使用されるポリマーが低い重量平均分子量、例えば、約2000未満、約1000未満、又は約500未満の重量平均分子量を有する場合でも、多量の粒子状物質、例えば約70重量パーセントまでの量を含むことができる。例えば、いくつかの例では、本明細書に記載の組成物は、約2000未満、約1000未満、又は約500未満の重量平均分子量を有する本明細書に記載のポリマーから形成されたポリマーネットワークを含み、約70重量パーセントまでの量でポリマーネットワーク中に分散されたヒドロキシアパタイト粒子をさらに含む。さらに、いくつかの場合には、ポリマーネットワークは、ヒドロキシアパタイト粒子によりもたらされ得る架橋の他には、架橋していないか、実質的に架橋していない。
【００６２】
さらに、本明細書に記載の粒子状物質は、本開示の目的に反しない任意の様式でポリマーネットワーク中に分散させることができる。いくつかの実施形態では、例えば、粒子状物質はポリマーネットワークに混ぜ入れられるかすり入れられる。さらに、本明細書に記載の粒子状物質は、いくつかの場合には、ポリマーネットワークの1つ以上のペンダント官能基によりキレート化され得るか他の方法で結合され得る。例えば、いくつかの場合には、組成物は、本明細書に記載のポリマーネットワーク中に分散されたヒドロキシアパタイト粒子を含み、ヒドロキシアパタイトはポリマーネットワークの1つ以上のペンダント官能基によりキレート化されている。いくつかの実施形態では、ポリマーネットワークの1つ以上のカルボキシル部分又は1つ以上のシトレート部分は、ヒドロキシアパタイトの1つ以上のカルシウム含有部分をキレート化している。
【００６３】
本明細書に記載のポリマーネットワークは、本開示の目的に反しない任意の様式で調製することができる。いくつかの場合には、ポリマーネットワークを製造する方法は、第1のポリマーと第2のポリマーとを混合すること及び/又は反応させることを含み、第1及び第2のポリマーはそれぞれ本明細書に記載の組成物のポリマーを含む。さらに、第1及び第2のポリマーは、クリックケミストリー反応スキームによるものを含め、架橋反応を実施するのに相補的な官能基を含むことができる。例えば、いくつかの例では、第1のポリマーは1つ以上のアルキン部分を含み、第2のポリマーは1つ以上のアジド部分を含む。いくつかの場合には、第1のポリマーは、式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;及び1つ以上のアルキン部分を含む1種以上のモノマーから形成され;第2のポリマーは、式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;及び1つ以上のアジド部分を含む1種以上のモノマーから形成される。そのような場合には、ポリマーネットワークは、第1のポリマーの1つ以上のアルキン部分と第2のポリマーの1つ以上のアジド部分とを反応させて、1種以上のアジド-アルキン付加環化生成物を形成することによって形成され得る。
【００６４】
アルキン部分とアジド部分とを反応させることは、本開示の目的に反しない任意の様式で実施することができる。いくつかの実施形態では、アルキン部分とアジド部分とを反応させることは、第1及び第2のポリマーの混合物を、架橋反応を誘発するのに十分な温度、例えば、熱的クリックケミストリー反応又はエステル化反応を誘発するための約80℃から約120℃の温度などに加熱することを含む。アルキン部分とアジド部分とは、金属触媒などの触媒を混合物に供給することによって、反応させてもよい。本明細書に記載のいくつかの実施形態で使用するのに適した金属触媒は、銅、ルテニウム、及び銀の1種以上を含むことができる。他の例では、銅触媒などの金属含有触媒は使用されない。さらに、本明細書に記載の第1及び第2のポリマーのアルキン部分とアジド部分とを反応させることは、アジド部分とアルキン部分との間でクリックケミストリー反応を誘発することを含むことができる。そのようなクリックケミストリー反応は、熱的クリックケミストリー反応又は別の種類のクリックケミストリー反応、例えば、歪み促進アルキン-アジド付加環化(SPAAC: strain promoted alkyne-azide cycloaddition)又は銅触媒アルキン-アジド付加環化(CuAAC)などとすることができる。さらに、本明細書に記載の様式でアルキン部分とアジド部分との間で反応を実施することは、架橋ポリマーネットワークを形成することができ、ネットワークの架橋結合は1,4-又は1,5-トリアゾール環などのアジド-アルキン付加環化反応生成物によって形成されている。さらに、いくつかの実施形態では、第1及び/又は第2のポリマーは、ポリマーネットワークをもたらすのにさらなる架橋結合を形成し得る1つ以上のさらなる部分を含むことができる。例えば、いくつかの場合には、第1のポリマー及び/又は第2のポリマーは、1つ以上のカルボン酸基及び/又はヒドロキシル基を含む。いくつかのそのような例では、さらなる架橋が、カルボン酸基とヒドロキシル基との間で1つ以上のエステル結合が形成されることによって起こり得る。
【００６５】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリマーネットワークを製造する方法は、ポリマーネットワークの表面を、1種以上の生物機能種、例えば、1種以上のペプチド、ポリペプチド、核酸、及び/又は多糖などで機能化することをさらに含む。そのような機能化は、本開示の目的に反しない任意の様式で実施することができる。例えば、いくつかの例では、本明細書に記載の方法は、ペプチド、ポリペプチド、核酸、及び多糖の1種以上と、架橋ポリマーネットワークのペンダントアルキン及び/又はアジド部分とを反応させて、架橋ポリマーネットワークとペプチド、ポリペプチド、核酸、及び/又は多糖との間に共有結合をもたらすことをさらに含む。いくつかの場合には、ペプチド、ポリペプチド、核酸、及び/又は多糖はアルキン又はアジド部分を含み、共有結合の形成は、ポリマーネットワークの1つ以上のアルキン及び/又はアジド部分と、ペプチド、ポリペプチド、核酸、及び/又は多糖の1つ以上のアルキン及び/又はアジド部分との間で、さらなるクリックケミストリー反応、例えば歪み促進アルキン-アジド付加環化反応などを誘発することによって実施される。そのような反応は、いくつかの例では、水性環境中37℃で実施することができる。さらに、ペプチド、ポリペプチド、又は他の生物機能種は、ペプチド、ポリペプチド、又は他の種と、Berry & Associatesから市販されているClick-easy(登録商標)BCN N-ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの試薬とを反応させることによって、クリック可能となるように修飾することができる。
【００６６】
組成物の多様な成分を本明細書で記載した。本開示による組成物が、本開示の目的に反しない成分及び特徴の任意の組合せを含むことができることが理解されるべきである。さらに、いくつかの実施形態では、そのような組合せは、本明細書に記載の任意の生分解性、機械的特性、及び/又は化学的官能性を有する組成物を提供するように選択することができる。
【００６７】
II. 医療用インプラント及び機器
別の態様では、医療用インプラント及び機器が、本明細書で記載される。いくつかの実施形態では、医療用インプラント又は医療機器は、セクションIで上記の組成物を含むか、これから形成される。セクションIで上述した任意の組成物を使用してもよい。さらに、いくつかの場合には、本明細書に記載の医療用インプラントは組織工学スキャフォールドを含む。本明細書に記載の医療用インプラントはまた、軟組織構造、例えば、血管、心臓組織、心臓弁、靱帯、腱、肺、膀胱、皮膚、気管、又は尿道などを含むか形成することができる。さらに、本明細書に記載の組成物は、それぞれ約1000μm未満又は約1000nm未満の直径を有するマイクロファイバー又はナノファイバーに形成することができる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、二相ポリマースキャフォールドを含む。「二相」スキャフォールドは、本明細書では参考のために、コア-シェル構造などの二成分構造を有し得、ここで、二成分は異なる化学的及び/又は機械的特性を有する。いくつかの場合には、例えば、本明細書に記載のコア-シェル型ポリマースキャフォールドは、第1の気孔率を有するコア成分;及びコア成分を包囲するシェル成分であって、第1の気孔率とは異なる第2の気孔率を有するシェル成分を含む。さらに、いくつかのそのような実施形態では、コア成分はシェル成分よりも高い気孔率を示す。例えば、いくつかの場合には、第1の気孔率は約30%から約99%の間であり、第2の気孔率は約0%から約99%の間である。いくつかの実施形態では、第1の気孔率は約65%から約75%の間であり、第2の気孔率は約0%から約50%の間又は約5%から約50%の間である。そのような気孔構造は、いくつかの例では、それぞれ、海綿骨及び皮質骨の二様式分布を、模倣することができる。第1の気孔率と第2の気孔率との間の他の気孔率差もまた可能である。さらに、いくつかの例では、コア成分はシェル成分よりも低い気孔率を示し得る。ポリマー部の気孔率は、本開示の目的に反しない任意の様式で測定することができる。いくつかの場合には、例えば、気孔率は、多孔性試料のかさ体積を測定し、ポリマーネットワーク材料の体積を減算することによって、測定される。他の方法も使用してもよい。
【００６９】
さらに、コア成分及び/又はシェル成分は、本開示の目的に反しない任意の範囲の気孔径を示すことができる。いくつかの場合には、例えば、コア成分及び/又はシェル成分は、約800nmから約1000μmの平均気孔径を示す。いくつかの実施形態では、コア成分及び/又はシェル成分は、約1μmから約800μm、約5μmから約500μm、約10μmから約1000μm、約10μmから約100μm、約50μmから約500μm、約100μmから約1000μm、約100μmから約500μm、又は約500μmから約1000μmの平均気孔径を示す。
【００７０】
さらに、本明細書に記載のコア-シェル型スキャフォールドのコア成分とシェル成分の両方は、セクションIで上記の組成物から形成することができることが理解されるべきである。任意の上記の組成物を、スキャフォールドのコア及びシェル成分に使用してもよい。したがって、いくつかの場合には、コア成分は、セクションIで上記のポリマーから形成された第1のポリマーネットワークを含み、シェル成分は、セクションIで上記のポリマーから形成された第2のポリマーネットワークを含む。例えば、いくつかの例では、コア成分は、上記式(A)の1種以上のモノマー;上記式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;アルキン部分を含む1種以上のモノマー;及びアジド部分を含む1種以上のモノマーから形成された第1のポリマーネットワークを含む。そのようなスキャフォールドのシェル成分は、式(A)の1種以上のモノマー;式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー;アルキン部分を含む1種以上のモノマー;及びアジド部分を含む1種以上のモノマーから形成された第2のポリマーネットワークを含むことができる。第1及び第2のポリマーネットワークのポリマーは、化学組成において同一であっても異なっていてもよい。
【００７１】
同様に、他の実施形態では、本明細書に記載のスキャフォールドの第1のポリマーネットワーク及び/又は第2のポリマーネットワークは、アミン、アミド、又はイソシアネートと、式(A)の1種以上のモノマー、式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー、並びに1つ以上のアルキン部分及び/又はアジド部分を含む1種以上のモノマーとの反応生成物を含む。いくつかの場合には、第1のポリマーネットワーク及び/又は第2のポリマーネットワークは、ポリカルボン酸又はポリカルボン酸の機能的等価物と、式(A)の1種以上のモノマー、式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー、アルキン部分を含む1種以上のモノマー、及びアジド部分を含む1種以上のモノマーとの反応生成物を含む。スキャフォールドの第1のポリマーネットワーク及び/又は第2のポリマーネットワークは、アミノ酸と、式(A)の1種以上のモノマー、式(B1)、(B2)、又は(B3)の1種以上のモノマー、アルキン部分を含む1種以上のモノマー、及びアジド部分を含む1種以上のモノマーとの反応生成物を含むこともできる。
【００７２】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスキャフォールドのポリマーネットワークは、セクションIで上記の複合ポリマーネットワークを含め、複合ポリマーネットワークを含むことができる。例えば、いくつかの場合には、粒子状無機物質が、第1のポリマーネットワーク及び/又は第2のポリマーネットワーク内に分散される。本開示の目的に反しない任意の粒子状無機物質を使用してもよい。いくつかの例では、例えば、粒子状無機物質はヒドロキシアパタイトを含む。さらに、セクションIで上記のように、粒子状無機物質は、ポリマーネットワーク中に多様な量で存在することができる。いくつかの場合には、例えば、粒子状無機物質は、本明細書に記載のスキャフォールドの第1のポリマーネットワーク及び/又は第2のポリマーネットワーク中に、それぞれ第1のポリマーネットワーク及び/又は第2のポリマーネットワークの総重量に基づいて、約70重量パーセントまでの量で存在する。
【００７３】
さらに、本明細書に記載のコア-シェル型スキャフォールドは、多様なコア-シェル型構成を有することができる。いくつかの実施形態では、例えば、コア成分及びシェル成分は同心円筒である。いくつかのそのような場合には、コア成分の直径は、シェル成分の直径の約1パーセントから約90パーセントである。直径の他の比もまた可能である。さらに、本明細書に記載の二相スキャフォールドは、同心円筒コア-シェル構造に加えて、他の構造も有することができる。
【００７４】
さらに、本明細書に記載の二相スキャフォールドは、いくつかの例では、in vivoでの分節骨欠損の修復に使用することができる。例えば、いくつかの場合には、スキャフォールドのシトレートベースのポリマー-ヒドロキシアパタイト複合材料は、骨再生及び組織一体化のための骨伝導性表面をもたらすことができ、一方、二相スキャフォールド設計が海綿骨及び皮質骨の階層的組織を模倣することができる。具体的には、そのようなスキャフォールド設計は、いくつかの例では、組織の内部成長のために必要な内(又はコア)相における気孔率と、広範囲分節骨欠損の修復のための機械的要求を満たすのに必要な外(又はシェル)相における低減した気孔率との両方を提供することができる。したがって、そのような組成物は、いくつかの実施形態では、天然骨組織の組成特性と構造特性の両方を模倣することができ、移植後に広範囲分節欠損に対して即時の構造的支持をもたらすことができる。
【００７５】
例えば、下でさらに記載するように、本明細書に記載の二相スキャフォールドは、ウサギにおける10mmの分節橈骨欠損の修復にin vivoで使用することができる。そのようなスキャフォールドはまた、良好な生体適合性及び宿主骨との広範な骨統合性(osteointegration)を示し得る。さらに、本明細書に記載の二相スキャフォールドは、いくつかの例では、移植後の初期段階においてより高い骨密度の新生骨形成の有効性を大幅に増強する。いくつかの他の材料と比較して、本明細書に記載の二相スキャフォールドは、15週前の時点など、移植後早期の時点で、増加した曲げ強度、界面骨内部成長、及び骨膜性リモデリングも示し得る。例えば、いくつかの場合には、本明細書に記載のスキャフォールドは、本明細書に記載のように測定したとき、約1MPaから約45MPaの間、約10MPaから約45MPaの間、約20MPaから約45MPaの間、約25MPaから約45MPaの間、又は約30MPaから約40MPaの間の圧縮ピーク応力を示す。さらに、スキャフォールドの各部分の圧縮強度は、所与の部分の壁厚及び/又は気孔率を変更することによって少なくとも部分的に制御することができることが理解されるべきである。本明細書に記載のスキャフォールドはまた、本明細書に記載のように測定したとき、約50MPaから約1500MPaの間、約100MPaから約1500MPaの間、約100MPaから約1000MPaの間、約300MPaから約1500MPaの間、約500MPaから約1500MPaの間、約500MPaから約1000MPaの間、約750MPaから約1500MPaの間、又は約750MPaから約1250MPaの間の初期モジュラスを示し得る。さらに、本明細書に記載のスキャフォールドはまた、本明細書に記載のように測定したとき、約2%から約5%の間、約2%から約4%の間、又は約3%から約5%の間の破断点ピーク圧縮歪みを示し得る。
【００７６】
したがって、別の態様では、分節骨欠損を治療する方法が、本明細書で記載される。いくつかの場合には、そのような方法は、本明細書に記載のスキャフォールドを分節骨欠損部位に配置することを含む。さらに、いくつかの例では、分節骨欠損を治療する方法は、スキャフォールドを分節骨欠損部位に15週までの間維持することをさらに含む。
【００７７】
本明細書に記載のいくつかの実施形態を、以下の非限定的な実施例でさらに例示する。以下の実施例では、以下の用語を使用する。「シトレートベースの生分解性エラストマー」(「CABE」)は、ポリ(1,8-オクタンジオールシトレート)(「POC」)、架橋ウレタンドープ型ポリエステル(「CUPE」)エラストマー、ポリ(アルキレンマレエートシトレート)(「PAMC」)、及び生分解性フォトルミネセンスポリマー(「BPLP」)を含み得る。「官能化」、「官能性」、又は「クリック可能な」CABEとは、1つ以上のクリック可能な部分、例えば、1つ以上のアルキン又はアジド部分などを含むように修飾されたCABEを指し得る。「POC」とは、式(A)のモノマー及び1,8-オクタンジオールから形成されたポリマーを指す。官能化POC(又はBPLPなどの他のポリマー)は、それが含有するクリック可能な部分の種類に関連して表示され得る。例えば、「POC-N3」とは、さらなるアジド含有モノマーから形成されたPOCを指す。「POC-Al」とは、さらなるアルキン含有モノマーから形成されたPOCを指す。異なる官能化POCの混合物は、POC-N3, Al(1/1)と称することができ、ここで(1/1)という挿入句は、混合物がPOC-N3とPOC-Alの1/1重量比からなることを表す。「CUPE」とは、式(A)のモノマー、式(B1)、(B2)、又は(B3)のモノマー、式(C)のモノマー、及び、場合により、式(D1)又は(D2)のモノマーの重縮合から形成されたポリマーを指す。「PAMC」とは、式(A)のモノマー、式(B1)、(B2)、又は(B3)のモノマー、及び式(D1)又は(D2)のモノマーの重縮合から形成されたポリマーを指す。「BPLP」とは、式(A)のモノマー、式(B1)、(B2)、又は(B3)のモノマー、及び式(E)のモノマーの重縮合から形成されたポリマーを指す。さらに、「BPLP-Aaa」とは、アミノ酸Aaaから形成されたBPLPを指し、例えば、「BPLP-Ser」はセリンから形成されたBPLPを指す。「官能化」、「官能性」、又は「クリック可能な」CUPE、PAMC、又はBPLPとは、1つ以上のアルキン又はアジド部分などの1つ以上のクリック可能な部分を含むさらなるモノマーを使用して形成されたポリマーを指す。同様に、例えば「官能性ジオール」などの、「官能化」又は「官能性」化学種は、アルキン又はアジド部分などのクリック可能な部分をさらに含む、ジオールなどの化学種を指す。さらに、「プレポリマー」とは、本明細書に記載の低分子量ポリマー又はオリゴマーを指し得る。
【実施例】
【００７８】
[実施例1]
ポリマー組成物
本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物を以下の通りに調製した。一般に、クリック官能性PLGA、PCL、及びこれらのコポリマーは、二段階プロセスによって合成した。まず、官能性ジオールを、トリエチルアミン(TEA)を触媒として使用して、クロロギ酸エチルとの反応によって、6員環状カーボネートに変換した。次に、官能性カーボネートモノマーを開環重合によって、ラクチド(LA)、グリコリド(GA)、又はエプシロン-カプロラクトン(ε-PL)と共重合させた。図1は、官能性PLGA、PCL、及びこれらのコポリマーのそのような二段階合成についての反応スキームを例示する。
【００７９】
官能化POC、CUPE、PAMC、BPLP、及び官能化ポリ(グリセロールセバケート)(PGS)は、多カルボキシルモノマー(シトレート含有モノマーなど)、官能性(クリック可能な)ジオール、及び脂肪族ジオールの一段階共重縮合によって合成した。図2(a)は、アルキン基又はアジド基を含むプレポリマーを合成するためのスキームを示す。図2(b)は、プレポリマーから架橋エラストマーを形成するためのスキームを例示する。図2(a)に示すように、アジド及びアルキン官能性ジオールを導入することによって、アジド(pre-POC-N3)及びアルキン(pre-POC-Al)官能性POCプレポリマーを合成することができる。POC-N3及びPOC-Alプレポリマーは、混合して、銅触媒アジド-アルキン付加環化(CuAAC)プロセスによって架橋することもでき、加熱して銅不含熱的架橋プロセスを誘発することもできる。熱的架橋プロセスでは、アジド基とアルキン基との間に熱的クリック反応が起こる。さらに、図2(b)に示すように、POC-N3及びPOC-Alプレポリマー鎖からのペンダント-COOH基と-OH基との間でエステル化もまた同時に起こり、一段階後重合プロセスを介して熱的同時二元(TSB: thermal synchronous binary)架橋(エステル化及び熱的クリック反応)POC-クリックエラストマーを形成し得る。
【００８０】
さらに、架橋POC-クリックポリマーの表面の残余のアジド基は、別の銅不含クリック反応、歪み促進アルキン-アジド付加環化(SPAAC)による生体分子コンジュゲーションのための便利な経路を可能にし得る。内皮細胞(EC)の接着及び増殖を効果的に促進することができるコラーゲン模倣ペプチドp15を、SPAACによってPOC-クリックエラストマー性フィルム及びスキャフォールドにコンジュゲートすることができる(図2(b))。
【００８１】
上記のように、アジド(pre-POC-N3)又はアルキン(pre-POC-Al)基を有する官能性POCプレポリマーを、クエン酸(CA)、1,8-オクタンジオール(OD)、及びアジド又はアルキン官能性ジオール(図2(a)中、ジアジド-ジオール[DAzD]又はアルキン-ジオール[AlD])の共重縮合により合成することができる。プレポリマーへのアジド又はアルキン基の導入が成功したことは、フーリエ変換赤外(FTIR)及び核磁気共鳴(NMR)分光法により示すことができ、アジド基の特徴的なIR吸収ピーク(FTIRで2100cm-1)又はアルキン基の隣りの-CH2-基のプロトンの1H-NMRピーク(1H-NMRで約4.5ppm)の出現により示される。両ピークの強度は、ODモノマーに対する官能性ジオールの供給比を増加することで増強され得る。用語目的のために、供給比は、以下の通りに示すことができる:POC-N3-x又はPOC-Al-x(x=1、2、又は3)、ここで、「x」は、ODに対するDAzD又はAIDの比を表す。具体的には、xの所与の値について、ODに対するDAzD又はAIDの比はx/10である。
【００８２】
アジド基の熱的安定性は、POC-N3-1(CA:OD:DAzDのモル比は1:1:0.1であった)プレポリマーを80、100又は120℃で異なる期間加熱することによって評価した。得られたPOC-N3-1フィルムのFTIRスペクトルを図3(a)に示す。2100cm-1におけるアジド基の特徴的な赤外吸収ピークが、80又は100℃で1日間、2日間、又はさらに3日間加熱した後でも変化しないままであるが、120℃で3日間加熱した後に減少したことが分かり、アジド基が80及び100℃でその安定性及び反応性を維持し得ることを示している。別の試験では、POC-N3-1及びPOC-Al-1プレポリマーの等重量ブレンドを、80又は100℃で異なる持続期間加熱した。図3(b)に示すように、POC-クリックフィルムのFTIRスペクトルからは、2100cm-1におけるアジド吸収ピークの強度は、80℃で4日間まで加熱した後に変化しないままであったが、100℃で1、2、又は3日間加熱した後に急速に減少し、100℃が熱的クリック反応に適切な温度であることを示唆している。
【００８３】
本明細書に記載のポリマー及びポリマーネットワークの架橋密度は、架橋時間及びクリック可能なプレポリマーの比(pre-POC-N3-x/pre-POC-Al-y(x、y=1、2又は3))を変更することによっても制御することができた。いくつかの例では、いくつかのアジド基が、クリック架橋の完了後にさらなる生体連結（bioconjugation）のために保存され(図4)、これは各DAzD分子が2つのアジド基を含有する一方、各AlD分子はアルキン基を1つだけ含有する(図2(a))からである。
【００８４】
POC-N3-x及びPOC-Al-xプレポリマー(x=1、2、又は3)の等重量混合物を加熱することによって作製したPOCフィルム(100℃、3d)及び一連のPOC-クリックフィルム(100℃、3d、図3(b))の熱的特性は、示差走査熱量測定(DSC)及び熱重量分析(TGA)によっても特徴付けた。図3(c)中のDSC曲線は、全てのポリマーについての見かけのガラス転移温度(Tg)を示した。架橋ポリマーフィルム中のクリック部分の量を増加させることで、Tgが急速に増加したが、これはおそらく熱的クリック反応によって堅固なトリアゾール環が形成されたことによる。TGA曲線(図3(d))は、熱分解温度(Td)が218℃超であり、全てのポリマーが比較的安定であることを示した。POCは、241.6℃のTdを示した。POC-Al-3ホモポリマーは最も高いTdを有し、POC-N3-3ホモポリマーは最も低いTdを有し、POC-クリックポリマーのTd値はその中間であった。
【００８５】
一連のPOC-クリックポリマーの濡れ性は、POC及びPLLAを対照として使用して、空気中水接触角試験により評価した。結果を図5に示す。POC-クリック1及びPOC-クリック2は、とりわけ水と接触させて30分後に、POCと同様の濡れ性を示した。POC-クリック3の接触角は、最初はPLLAの接触角よりも大きかったものの、30分後にはPLLAの接触角よりもはるかに小さくなり、POC主鎖の親水性を示した。
【００８６】
POC及びPOC-クリックポリマーの機械的特性を図6(a)〜6(h)に示す。POC-N3-x, Al-x(1/1)及びPOC-N3-x, Al-x(1/2)(x=1、2、又は3)ポリマーフィルムの両方の引張応力は、POCの引張応力(5MPa)よりも10〜40MPa高く、対応するPOC-N3-x及びPOC-Al-xホモポリマーフィルムのものよりも10〜20MPa高かった(図6(a))。図7は、多様なポリマーの架橋密度(N)及びいくつかの機械的特性の概要を提示する。全ての架橋フィルムは、100℃で3日間加熱することによって得た。他の組成物についての機械的特性を図8に例示する。具体的には、図8は、異なる重量比のPOC-N3-x及びPOC-Al-y(x、y=1、2又は3且つx≠y)の混合物から作製されたPOC-クリック TSB架橋ポリマーについての特性を提示する。フィルムの伸びは、全て100%未満であるPOC-N3-3, Al-3(1/1)及びPOC-N3-3, Al-3(1/2)の伸びを除いて、約200〜300%であり、架橋密度に全体的に逆相関した(図6(c)及び図7)。POC-N3-1, Al-1(1/1)、及びPOC-N3-2, Al-2(1/1)は全て、POCと類似したエラストマー性を示した(図6(d))。POC-N3-3, Al-3(1/1)の応力-歪み曲線はプラスチックポリマーの特徴である降伏点を有したものの(図6(d))、材料をPBS中に約24h浸漬した後に、このポリマーはエラストマー特性(図6(e))を示し、POC-N3-3, Al-3(1/1)がin vivo(湿潤状態)でのエラストマー性グラフトとしてやはり機能できることを示している。POC-クリック湿潤機械的強度はCUPEのものよりも良好であった。架橋時間を0.5日から3日に増やしたとき、POC-クリックポリマーの引張応力及びヤング率は、とりわけPOC-N3-1, Al-1(1/1)及びPOC-N3-2, Al-2(1/1)について、連続的な増加を示した一方、POCはこの期間中にごく限られた改善を示したにすぎなかった(図6(f)及び6(g))。ポリマーフィルムの伸びは、架橋時間を変化させた場合に、POC-N3-3, Al-3(1/1)の場合を除いて、顕著な変化を示さなかった(図6(h))。上記の調査は、クリック反応を導入することでTSB架橋POC-クリックポリマーの機械的強度を有意に改善することができることを示唆した。この方法の汎用性は、熱的クリック反応を導入してCUPE-クリックポリマーフィルムを形成した後の、架橋CUPEの増強した機械的強度によりさらに示された(図9)。
【００８７】
異なるポリマーのin vitro及びin vivoの分解挙動を図10(a)及び10(b)に示す。POC-クリックポリマーは、0.05M NaOH溶液中で、POCよりも緩慢に分解され、12hrのインキュベーション後に、POC及びPOC-クリック1は100%分解したが、POC-クリック3は約80%しか分解しなかった。分解速度は、架橋密度の増加に伴い減少した(図10(a))。同様の傾向が、架橋時間を1日から3日に増やしたときに見られた(図10(b))。POC-クリック3、POC、及びCUPEのPBS(pH7.4)中の分解曲線を図10(c)に示す。最初の12週間、POC-クリック3は、たった5%の質量損失を示した一方、POCはその初期質量の約25%を失った。12週目後、POC-クリック3は比較的急速な分解期間に入り、このポリマーの質量損失はPOCの質量損失に32週目で追いついた。POC-クリック3及びPOCは34週で完全に分解され、一方CUPEのたった40%が分解された。理論に束縛されることを意図するものではないが、POC-クリック3の「最初は緩慢で、その後に迅速な」分解現象は、その化学構造(図11)の点で説明され得ることが考えられる。エステル結合とトリアゾール環の両方がTSB架橋POC-クリック3フィルム中に存在し、エステル結合はトリアゾール環よりもはるかに迅速に分解した。POC-クリック3ネットワーク中にトリアゾール環が存在するので、最初は、POC-クリック3はPOCよりもはるかに緩慢に分解された。DAzDの周囲の全てのエステル結合(図11中の円内)が加水分解された後、DAzD架橋点が完全に破壊された。DAzD架橋点の破壊に伴って、POC-クリック3の分解速度がPOCの分解速度よりもさらに速くなり、最終的にPOC-クリック3の質量損失がPOCの質量損失に追いつくこととなった。POC-クリックポリマーのこれらの分解特性は、組織が再生される前の移植後初期の期間に機械的強度が良好に保存されるので、組織工学などの多くの生物医学用途にとって好ましい。
【００８８】
Sprague Dawley(SD)ラットの背部における20週の皮下移植後、POC-クリック1、POC-クリック3、POC、及びPLLAの質量損失は、それぞれ、6.28%、3.28%、9.54%及び5.71%であった(図10(d))。
【００８９】
POC-クリックポリマーの細胞適合性は、3T3線維芽細胞に対するメチルテトラゾリウム(MTT)アッセイにより評価した。POC及びPLLAを対照として使用した。MTT結果を図12に示す。細胞は、POC-クリックポリマー及びPOC並びにPLLAで増殖しなかったものの、同様の成長パターンを示した。POC-クリックポリマーでの3T3細胞の増殖はまた、POCでの増殖よりも良好であることが見出された。MTTの結果は、ポリエステルエラストマーへのクリック部分の導入は、そのようにして得られるポリマーの細胞適合性を減じないことを示唆した。
【００９０】
異物反応は、POC及びPLLAを対照として、SDラットにおけるPOC-クリック1及びPOC-クリック3フィルムの皮下移植により評価した。1週間移植された全ての試料は、わずかな急性炎症反応を生じたが、これは異物の体内への導入に予期され一致している一般的なプロセスであり、ポリマーフィルムの周囲組織における白血球及びマクロファージ(H&E染色)並びにCD11b陽性細胞(CD11b染色)の出現により確認することができる。細胞計数結果を図13(a)及び13(b)に示す。周囲組織において少ないマクロファージ及びCD11b陽性細胞が4週の移植後にまだ観察することができたが、細胞数は1週の移植後にはるかに少なかった。12週の移植後に、試料周囲の細胞の大半が線維芽細胞であり、細胞密度も減少した。CD11b陽性細胞は12週後にほとんど見られず、慢性炎症反応が起こらなかったことを示している。穏便な炎症反応は、POC-クリックポリマー及びこれらの分解生成物がPOC及びPLLAと同程度に細胞適合性があることを示唆し、クリック部分の導入がそのようにして得られるポリマーの生体適合性を損なわないことをさらに示している。
【００９１】
上記のように、POC-クリックポリマーの残余のアジド基は、第2の銅不含クリック反応、SPAACを介するPOC-クリックフィルム又はスキャフォールドの表面への生物活性分子の便利なコンジュゲーション(図2(b))をもたらした。一例として、コラーゲン模倣ペプチドp15をSPAACによりPOC-クリック3フィルムの表面にコンジュゲートし、POC-クリック3-p15フィルムでのヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の生存性/増殖も調査した。POC-クリック3フィルムの表面へのp15のコンジュゲーションが成功したことは、フィルムのFTIRスペクトルにおけるp15コンジュゲーション後のアジド吸収ピーク(2100cm-1)の減少により消極的に確認され、坂口反応(定量化のため、各p15分子は1つのグアニジン基を含有する)後のフィルムのUV-vis曲線におけるグアニジン基の特徴的なピークの出現により積極的に確認された。HUVEC増殖特性に対するp15コンジュゲーションの効果を、無処理のPOC-クリック3フィルムを対照として使用して、MTTアッセイ、Live/Deadアッセイ及びSEMにより調査した。結果を図14及び図15に示す。MTTの結果(図14)から、同じ播種密度(5000細胞/ウェル)で、p15コンジュゲートPOC-クリック3(POC-クリック3-p15)フィルムでの初期HUVEC細胞数(1日目)は、無処理のPOC-クリック3フィルムでのものよりも多かったことが確認され得る。初期細胞接着後に、POC-クリック3-p15フィルムでのHUVEC増殖速度は、無処理のPOC-クリック3フィルムでのものよりも明らかに速かった。7日目におけるPOC-クリック3-p15フィルムでのHUVEC細胞密度は、POC-クリック3フィルムのデータと比較して、二倍近かった。Live/Dead画像(図15)は同じ成長傾向を示す。Live/Deadアッセイ画像とSEM画像(図15)の両方が、生細胞の特徴的な敷石の形態を示した。死細胞はLive/Dead画像においてほとんど見られなかった。POC-クリック3-p15フィルムでのHUVEC死細胞の数は、POC-クリック3フィルムでのものよりも少なかった(図14)。HUVEC細胞増殖の結果は、POC-クリック3表面でのp15コンジュゲーションがHUVEC細胞接着及び増殖を促進することができることを示した。
【００９２】
組織工学のために、とりわけ組織工学血管グラフト(TEVG)用途のために、POC-クリックポリマーをさらに評価するために、管状三相スキャフォールド(TTS)に成形する代表としてPOC-クリック3を選んだ。スキャフォールドの機械的特性を試験し、POC及びCUPEから形成したTTSと比較した。さらに、POC-クリック3 TTSの内面へのp15のコンジュゲーションもまた実施した。
【００９３】
TTSは、粗い管腔内面、1〜20μmの気孔径を有する多孔性スキャフォールド材料の中間層、及び150〜250μmの気孔径を有する多孔性スキャフォールドの外層で構成された。この設計は、天然血管の微小構造に対応する。粗い表面は内皮細胞の成長にとってより好適であり、1〜20μmの気孔径は内皮細胞と平滑筋細胞との区画化(compartmentalization)にとって好ましく、天然血管における弾性板を模倣している。150〜250μmの気孔径は、線維芽細胞の成長及び細胞外マトリックス(ECM)の形成に適している。
【００９４】
図16は、POC-クリック3 TTSの走査型電子顕微鏡(SEM)画像を例示する。図17(a)〜17(d)はTTSのいくつかの機械的特性を例示する。単軸引張におけるPOC-クリック3 TTSの引張強度及びヤング率(それぞれ約5及び17MPa)は、POC TTSのもの(それぞれ約1及び1.2MPa)よりもはるかに高く、さらにCUPE TTSのもの(それぞれ約3.8及び4MPa)よりも少し高く、POC-クリック3多孔性スキャフォールドが血管グラフトとして使用するのに十分強いことを示している。POC-クリック3 TTSの破裂圧力は約5000mmHgであり、類似のPOC(1000mmHg未満)及びCUPE(約3500mmHg)TTSのものよりも高く、また人工血管の「ゴールドスタンダード」として現在使用されている伏在静脈と胸部動脈の両方のもの(それぞれ1599±877及び4225±1368mmHg.)よりも高かった。POC-クリック3 TTS部品の厚み及び気孔率を調整することによって、標的血管の破裂圧力に適合し得る。
【００９５】
移植のために、適切な破裂圧力に加えて、TTSなどの導管にとって縫合されることも望ましい。POC-クリック3 TTSの縫合糸保持強度(suture retention strength)値は約3.75Nであり、POC TTS(約0.75N)及びCUPE TTS(約3.0N)対照の両方よりも高く、また動脈血管グラフトを縫合するのに必要とされる1.20±0.23Nの報告値よりも有意に高かった。
【００９６】
SPAACによって、p15をPOC-クリック3 TTSの内層の表面にコンジュゲートし、FTIRスペクトルの変化により消極的に確認し、坂口反応後の内層のUV-visスペクトルの変化により積極的に確認した。理論に束縛されることを意図するものではないが、気孔の存在がPOC-クリックスキャフォールドの表面の官能基(ここでは、アジド基)の密度を減少させ得るが、官能基の反応性には顕著な影響を与えず、それにより生物活性分子が表面に容易にコンジュゲートすることができることが考えられる。
【００９７】
この実施例において主にPOC-ベースのエラストマーについて詳細に記載したものの、他のシトレートベースのエラストマー性ポリマー(PAMC、CUPE、及びBPLPなど)並びに他のエラストマー性ポリマー(PCL及びPGSなど)も使用してもよいことが理解されるべきである。本明細書に提示したバイオエラストマーは、組織工学、薬物送達、整形外科固定具(骨ネジ、プレート、及びピンなど)及び他の医療用インプラントなどの生物医学用途に使用することができる。さらに、本明細書に提示したバイオエラストマー、例えばPOC-クリック生分解性エラストマーなどは、HAと直接複合体化させて、骨再生のための生分解性骨パテを形成するために使用することができる。実験のさらなる詳細を以下に提示する。
【００９８】
材料
2,2-ビス(アジドメチル)プロパン-1,3-ジオール(ジアジド-ジオールモノマー、DAzD)は、Zhangら、Macromolecules 2011、44、1755-1759、及びXuら、Macromolecules 2011、44、2660-2667に記載の通りに合成した。プロパルギル2,2-ビス(ヒドロキシルメチル)プロピオネート(アルキン-ジオールモノマー、AlD)は、Luら、J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem. 2007、45、3204-3217、及びShiら、Biomaterials 2008、29、1118-1126によって合成した。本明細書に記載の他のアジド/アルキン官能性ジオールモノマーの合成は、下に提示する。2-(アジドメチル)-2-メチルプロパン-1,3-ジオール及び2-(アジドメチル)-2-エチルプロパン-1,3-ジオールの合成及び精製手順は、DAzDのものと同じである。p15ペプチド(NH2-Gly-Thr-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-Arg-Gly-Val-Val-CONH2)はUnited Peptide Corp.(Rockville、MD)から購入した。Click-easy(登録商標)BCN N-ヒドロキシスクシンイミドエステルI(SPAACに使用)は、Berry & Associates, Incから購入した。他の全ての試薬はSigma-Aldrichからであり、さらなる精製なしに使用した。
【００９９】
一般的測定
プレポリマーの1H-NMRスペクトルは、DMSO-d6中、JNM ECS 300分光計(JEOL、東京、日本)で記録した。減衰全反射フーリエ変換赤外(ATR-FTIR)スペクトルは、Nicolet 6700 FTIR分光計で、1,4-ジオキサン溶液中のプレポリマーのフィルム又は架橋ポリマーフィルムを直接使用して測定した。管状スキャフォールドの形態は、SEM(Hitachi 3500 N、EPIC)により観察した。UV-visスペクトルは、最小波長分解能0.2nmのUV-2450分光計(島津、日本)を使用して記録した。
【０１００】
ポリマー合成及びフィルム作製
POCは、Yangら、Adv. Mater. 2004、16、511-516;Yangら、Biomaterials 2006、27、1889-1898;Deyら、Biomaterials 2008、29、4637-4649;Deyら、J. Biomed. Mater. Res. A 2010、95A、361-370;及びYangら、Tissue Eng. 2005、11、1876-1886によって合成した。簡潔には、クエン酸(CA)と1,8-オクタンジオール(OD)(CA:ODのモル比は1:1.1であった)との混合物を160℃で約20分溶融した。次いで、温度を140℃に下げ、60rpmの撹拌速度で撹拌子がぴくぴく動く(twitch)まで、反応をさらに約1時間継続した。オリゴマー/1,4-ジオキサン溶液を水中に沈殿させることによって、粗生成物を精製した後、凍結乾燥した。1H NMR (300 MHz; DMSO-d6; δ, ppm)、pre-POC: 1.15 (s, -OCH2CH2(CH2)4-、OD由来), 1.50 (s,-OCH2CH2-), 2.50-2.90 (m, -OCO-CH2-C(OH)(COO-)-、CA由来), 3.60 (br, -CH2-OH、OD由来), 3.90-4.05 (br, -COOCH2-、OD由来).  FTIR、pre-POC (薄膜, cm-1): 1733 (COOR)。
【０１０１】
POCプレポリマーは、オーブン中100℃で3日間加熱することによって後重合させ、POCフィルムを作製した。このプロセスでは、pre-POCの未反応の-COOH及び-OH基の部分を架橋させた。さらに、1又は2日の架橋時間のPOC試料もまた温度は変化させずに調製した。FTIR、POCフィルム (cm-1): 1735(COOR)。
【０１０２】
POC-クリック
アジド(POC-N3)又はアルキン(POC-Al)基を有する官能性POCプレポリマーは、CA、OD、及びアジド又はアルキン官能性ジオール(図2(a)中のDAzD又はAlD)の共重合により合成した。CAとODとの混合物を160℃で溶融した後、反応温度を120℃に下げ、続いて官能性モノマー(DAzD又はAlD)を添加した。次いで、60rpmで撹拌子がぴくぴく動くまで、ベントプラグを使用して窒素パージしながら反応を120℃で継続した。反応にはしばしば2時間超かかった。精製プロセスはPOCプレポリマーのものと同じである。POC-N3系列について、POC-N3-1、POC-N3-2、及びPOC-N3-3プレポリマーについてのCA:OD:DAzDのモル比は、それぞれ1:1:0.1、1:0.9:0.2、及び1:0.8:0.3であった。1H NMR (300 MHz; DMSO-d6; δ, ppm)、pre-POC-N3: 1.15 (s, -OCH2CH2(CH2)4-、OD由来), 1.50 (s, -OCH2CH2-), 2.60-2.90 (m, -OCO-CH2-C(OH) (COO-)-、CA由来), 3.20-3.50 (br, -CH2-N3、DAzD由来;-CH2-OH、OD及びDAzD由来), 3.80-4.05 (br, -COOCH2-、OD及びDAzD由来).  FTIR、pre-POC-N3(薄膜, cm-1): 2109 (-N3, 強い), 1735 (COOR)。同様に、POC-Al系列について、POC-Al-1、POC-Al-2、及びPOC-Al-3プレポリマーについてのCA:OD:AlDのモノマー比も、それぞれ1:1:0.1、1:0.9:0.2及び1:0.8:0.3であった。1H NMR (300 MHz; DMSO-d6; δ, ppm)、pre-POC-Al: 1.05 (s, CH3-、AlD由来), 1.20 (s, -OCH2CH2(CH2)4-、OD由来), 1.55 (s, -OCH2CH2-、OD由来), 2.60-2.90 (m, -OCO-CH2-C(OH)(COO-)-、CA由来), 3.20-3.65 (br, -CH2-OH、OD及びAlD由来;-C≡CH、AlD由来), 3.85-4.15 (br, -COOCH2-、OD及びAlD由来), 4.60-4.70 (br, -CH2-C≡CH、AlD由来).  FTIR、pre-POC-Al (薄膜, cm-1): 2130 (-C≡CH, 弱い), 1735 (COOR)。
【０１０３】
同時二元(SB)架橋POCフィルム(POC-Click)は、pre-POC-N3とpre-POC-Alとの混合物を100℃で3日間加熱することによって形成した。このプロセスでは、両プレポリマーの未反応の-COOH基と-OH基の間の後エステル化並びにpre-POC-Alのアルキン基とpre-POC-N3のアジド基との間の熱的アルキン-アジド付加環化(AAC、又は熱的クリック反応)が同じ後重合プロセスにおいて起こるので、同時二元(SB)架橋POCという名前に至ったが、便宜のためにはPOC-クリックと呼ぶ。
【０１０４】
異なる架橋密度を有するPOC-クリック試料は、POC-N3及びPOC-Alプレポリマー間の重量比を調整する(1/1から1/2、1/4、及び1/6まで)ことによって得た。POC-N3(POC-N3-1から、POC-N3-2、POC-N3-3まで)及びPOC-Al(POC-Al-1から、POC-Al-2、POC-Al-3まで)プレポリマー中の官能基含有量、並びに加熱時間(1日から、2日、3日まで)を図7に示す。FTIR、POC-Clickフィルム (cm-1): 2109(-N3、まだ有している), 1736(COOR)。
【０１０５】
CUPE及びCUPE-クリック
架橋ウレタン-ドープ型ポリエステルプレポリマー(pre-CUPE)は、1,6-ヘキサメチルジイソシネート(HDI)を鎖延長剤として使用して、Liuら、Prog. Polym. Sci. 2012、37、715-765;Serranoら、Adv. Funct. Mater. 2010、20、192-208;Wuら、Nat. Med. 2012、18、1148-1153に記載の通りに合成した。pre-POCとHDIとの間の重量比は、1:0.22であった。同様に、pre-CUPE-N3及びpre-CUPE-Alも、それぞれ、POC-N3-1及びPOC-Al-1プレポリマーを使用してPOCプレポリマーを置きかえて合成した。プレポリマーとHDIとの間の重量比は、pre-CUPEのものと同じであった。CUPEフィルムは、pre-CUPEを100℃で3日間加熱することによって調製した。同様に、CUPE-N3、CUPE-Al及びCUPE-N3, Al(pre-CUPE-N3とpre-CUPE-Alとの等重量混合物)フィルムもまた同じ条件下で形成した。
【０１０６】
CBPLP-Ser及びCBPLP-Ser-クリック
BPLP-Serは、1.0:1.1:0.2の比のCA、OD、及びL-Serを使用して、Avci-Adaliら、Biomaterials 2008、29、3936-3945に記載のように合成した。同様に、BPLP-Ser-N3及びBPLP-Ser-Alもまた、1.0:1.0:0.1:0.2のモル比のCA、OD、DAzD又はAlD(N3又はアルキン官能性モノマー)及びL-Serを使用して合成した。架橋BPLP-Ser(cBPLP-Ser)フィルムは、BPLP-Serを100℃で3日間加熱することによって形成した。また、cBPLP-Ser-N3、cBPLP-Ser-Al、並びにcBPLP-Ser-N3, Al(BPLP-Ser-N3とBPLP-Ser-Alとの等重量混合物)フィルムを、cBPLP-Serと同じ条件下で対応するポリマーを架橋させることによって調製した。
【０１０７】
ポリマー特徴付け
架橋ポリマーの熱的特性は、窒素雰囲気下、10℃/分の加熱速度で、示差走査熱量測定(DSC、-50℃から約150℃)及び熱重量分析(TGA、20℃から約800℃)により特徴付けた。ガラス転移温度(Tg)は、測定プロセスにおけるさらなる架橋の影響を避けるために、最初の加熱ランにより決定した。分解温度(Td)は試料の重量損失が5%である温度と定義した。
【０１０８】
POC;POC-N3-1, Al-1(1/1);POC-N3-2, Al-2(1/1);POC-N3-3, Al-3(1/1)及びPLLAフィルムの空気中水接触角は、室温で液滴法を用いてRame-Hartゴニオメーター及び画像化システム(Rame-Hart Inc.、Mouttain Lake、NJ)により滴下後10秒以内に測定した。Yangら、Biomaterials 2002、23、2607-2614参照。異なる部位における4回の独立した測定を平均した。空気中水接触角の経時変化もまた、水をフィルムの表面に滴下した後0から30分までモニタリングした。エラストマー密度は、アルキメデスの原理に基づいた密度測定キットを伴うMettler Toledo天秤(Greifense、スイス)により測定した。蒸留水を補助液体として使用した。
【０１０９】
機械的試験は、500 Nロードセルを取り付けたMTS Insight 2マシンで実施した。試料を細長い長方形に切断して、破断するまで伸ばした。ヤング率は、応力-歪み曲線の伸びの10%における勾配を測定することによって計算した。試料1つにつき8つの試験片を試験し平均した。
【０１１０】
架橋密度及び架橋部位間の分子量は、式(2)
【数２】
0006343674.tif 000015
(式中、nは、単位体積あたりの活性ネットワーク鎖セグメントの数(mol/m3)を表し;Mcは、架橋部位間の分子量(g/mol)を表し;E0はヤング率(Pa)を表し;Rは普遍気体定数(8.3144J/mol K)であり;Tは絶対温度(K)であり;ρは、上述の方法により測定したエラストマー密度(g/m3)である)
を用いてゴム弾性の理論によって評価した。
【０１１１】
フィルムの湿潤機械的特性は、フィルムの湿潤重量の増加が止まるまでフィルムをPBS(pH7.4)中に約24時間浸漬した後に測定した。
【０１１２】
in vitro及びin vivoの分解
in vitroの分解について、ディスク形状の試験片(直径7mm、厚さ約0.15〜0.30mm)を10mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.4)又はNaOH溶液(0.05M)を含有するチューブ内に置き、37℃で所定の時間インキュベートした。とりわけPBS分解のために、試験片を脱イオン化(DI)水(3回超)で入念に洗浄し、残った塩を除去して、凍結乾燥した。質量損失は、上記式(1)により計算した。ここで、W0及びWtはそれぞれ初期重量及び分解後の重量である。各試料について4つ(NaOH分解)又は6つ(PBS分解)の試験片を行い、平均した。結果を平均±標準偏差として提示する。
【０１１３】
in vivo分解について、POC;POC-N3-1, Al-1(1/1);POC-N3-3, Al-3(1/1)及びPLLA試料のディスク形状の試験片(8mm直径、厚さ約0.75〜0.95mm)を、70%エタノール、滅菌PBS(pH7.4)、及びUV光で順に処理することによって滅菌し、続いて細胞培養フードで一夜乾燥させた後に、健康な3月齢の雌性Sprague Dawley(SD)ラット(Harlan Sprague Dawley Inc.、Indianapolis、IN)の背部に皮下移植した。4つの試験片を各試料について使用して、4匹のラットを合計で使用した。
【０１１４】
20週後に、試料をラットから回収し、PBS溶液及びDI水で入念に洗浄した後、凍結乾燥させた。質量損失もまた上の質量損失式を用いて計算した。
【０１１５】
in vitroの細胞毒性
POC-N3-1, Al-1(1/1);POC-N3-2, Al-2(1/1);POC-N3-3, Al-3(1/1)の相対細胞毒性は、3T3線維芽細胞に対するMTT(メチルチアゾリルジフェニル-テトラゾリウムブロミド)アッセイで評価した。POC及びPLLAをそれぞれ陽性及び陰性対照として使用した。試料を96-ウェルプレートの内径に合うようにディスク(7mm)に切断した。次いで、試料を70%エタノール、滅菌PBS(pH7.4)、及びUV光で順に処理することによって滅菌した。その後に、密度が5x104細胞/mLである200μLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、10%ウシ胎児血清(FBS)を含む)中3T3細胞を、ディスク形状の試験片が底にある96-ウェルプレートの各ウェルに添加した。細胞を播種しない試験片を対照として使用した。以前の研究に記載のように、インキュベータ(37℃、5%CO2)内で1、3、及び7日間インキュベートした後に、MTTアッセイ分析を行った。Tranら、Soft Matter 2010、6、2449-2461参照。
【０１１６】
異物反応
in vivoにおける二元架橋POC-Clickポリマーフィルムの安全性を評価するために、H&E染色及びH&C(CD11b)染色を使用して異物反応研究を行うPOC-クリックポリマーの代表として、POC-N3-1, Al-1(1/1)及びPOC-N3-3, Al-3(1/1)を選択した。POC及びPLLAフィルムをそれぞれ陽性及び陰性対照として使用した。ディスク形状のフィルム(8mm直径、厚さ約0.75〜0.95mm)を、上記のように滅菌して細胞培養フード内で乾燥させた後に、健康な3月齢の雌性Sprague Dawley(SD)ラット(Harlan Sprague Dawley Inc.、Indianapolis、IN)の上背部又は下背部にランダムに皮下移植した。9匹のSDラットを、試験の3つの異なる時点(1、4及び12週)のために3匹ずつの3群に分けた。各時点の最後に、3匹のラットを過剰なCO2でと殺し、周囲組織を伴うポリマーフィルムを回収し、10%ホルマリン中に2日間浸漬することによって固定した。試料を自動組織処理装置で処理した。次いで、パラフィンワックスに包埋し、4μmの切片に切断した。外植体の異なる領域からの6枚のスライドをヘマトキシリン及びエオシン染色で染色した。Gyawaliら、Biomaterials 2010、31、9092-9105参照。炎症細胞を評価するために、別の6枚のスライドを、炎症細胞マーカーCD11b(ラット抗マウスMAC-1、Santa Cruz Biotechnology)及びペルオキシダーゼ-コンジュゲートヤギ抗ラット二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories、PA)で染色した。Zhouら、Biomaterials 2011、32、9383-9390参照。次いで、CD11b染色スライドを3,3-ジアミノベンジジン基質系で処理し、ヘマトキシリンで対比染色した。陽性免疫反応は青色の背景に暗褐色の染色として現れた。Nikon E500 CCDカメラ(株式会社ニコン、日本)を取り付けたLeica DMLP顕微鏡(Leica Microsystems Inc.、Bannockbum、IL)を使用して断面を調査した。定量分析のために、H&E染色の400X画像から、インプラントフィルム近くの皮膚側組織の200x200μm2領域内の全ての細胞を計数した。1つの試料につき、異なる試験片からの異なる正方形領域(異なるラットに移植された)を少なくとも8つ分析し、数を平均した。H&C染色の400X画像からのCD11b+細胞(青色の背景に暗褐色の染色)もまた同じ方法を使用して計数した。
【０１１７】
POC-N3-3, Al-3(1/1)(POC-Click3)フィルムでのp15コンジュゲーション並びに内皮細胞(EC)の付着及び増殖
P15はまず銅不含のクリック可能な部分により修飾して、クリック可能なp15を得た。簡潔には、DMSO溶液中、室温で24時間、p15をClick-easy(登録商標)BCN N-ヒドロキシスクシンイミドエステルIと反応させて、クリック可能なp15を得た。次いで、指定量のクリック可能なp15のDMSO溶液をDI水(水/DMSOのv/v=1/1)で希釈して、POC-クリック3フィルムとの歪み促進アルキン-アジド付加環化(SPAAC)(37℃、3d)に直接使用した。P15コンジュゲートPOC-クリック3フィルムは、DI水で洗浄し、続いて凍結乾燥した後に得られた。p15コンジュゲートPOC-クリック3フィルムは、FTIR及びUV-visスペクトル(p15のグアニジン基のWeber改変坂口反応を使用して)により特徴付けた。Zhangら、Biomaterials 2010、31、7873-7882参照。フィルムにコンジュゲートされたp15の量もまた、UV-visスペクトル(各p15分子は1つのグアニジン基を含有する)により、10.6nmol/cm2であると決定され、文献によれば内皮細胞の付着に十分である。J. Biomater. Sci. Polymer Ed. 2005、16、875-891参照。
【０１１８】
純粋なPOC-クリック3(100℃、3d、対照として使用)試料と共に、P15コンジュゲートPOC-クリック3を、96-ウェルプレートの内径に適合する直径7mmのディスクに打ち抜いた。試料は全て、70%エタノール、滅菌PBS(pH7.4)、及びUV光で順に処理することによって滅菌し、細胞播種の前にダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中37℃で3〜7日間インキュベートした。初代ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)をLonzaからのEndothelial Cell Growth Medium Bulletkit(EGM-2 BulletKit)中で製造業者の指示に従って培養した。EGM-2 BulletKitは、500mLのEBM-2 Basal Medium及びサプリメントのセット、EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factorsを含有する。使用前に全てのサプリメントを500mLのEBM-2 Basal Mediumに添加した。細胞を37℃で98%湿度及び5%CO2でインキュベートした。培地は1日おきに取り替えた。Lonzaからの冷凍の初代HUVEC細胞(第1継代、P1)を最初に2500〜5000細胞/cm2の負荷密度で組織培養ポリスチレン(PS)フラスコ(75cm2、Corning Acton、MA USA)で培養した。細胞が約75〜90%コンフルエントレベルに到達した(通常約6〜7日後)後、0.05%トリプシン/EDTA(Lonza)を使用して細胞を回収し、液体窒素で凍結して、保存した。この手順を繰り返して、P2細胞からP3細胞に培養した。P3 HUVEC細胞を96-ウェルプレート(5000細胞/ウェル)内のフィルムに播種し、1、3、及び7日間インキュベートした後、MTT試薬(5mg/mL、20uL/ウェル)を試験ウェルに加え、混合物を37℃でさらに4時間インキュベートした。MTTアッセイ後の試料の吸光度をマイクロプレートリーダーにより570nmで測定した。各時点(1、3、及び7日目)について同時に、p15コンジュゲートPOC-クリック3試料とPOC-クリック3試料との両方のHUVECをLive/Dead Viability/Cytotoxicity Kit(Invitrogen、分子プローブ、Eugene、OR)により染色し、ANDOR DL-604M-#VPカメラ及びPrior Lumen 200を備えた倒立光学顕微鏡(Nikon Eclipse Ti-U)を使用して細胞の形態及び拡散を観察した。さらに、細胞を2.5%(wt/v)グルタルアルデヒド-PBS溶液で固定し、続いて段階的な一連のエタノール(50%、75%、95%及び100%)で処理することによって順次脱水し、凍結乾燥した後に、7日目におけるp15コンジュゲートPOC-クリック3及びPOC-クリック3試料のHUVECの形態及び拡散を、走査型電子顕微鏡(SEM、FEI、Quanta 200)により画像化した。
【０１１９】
管状三相スキャフォールド(TTS)調製及びp15コンジュゲーション
POC-クリック3(w/w=1/1の混合POC-N3-3及びPOC-Al-3)、POC、並びにCUPEの三相小径血管グラフトスキャフォールドは、天然血管の階層構造を再現するために、粗い管腔内面、1〜20μmの気孔径を有する多孔性中間層、及び150〜250μmの気孔径を有する多孔性外層で構成された。Yangら、Tissue Eng. 2005、11、1876-1886;Deyら、J. Biomed. Mater. Res. A、2010、95A、361-370;及びZhangら、Biomaterials 2013、34、4048-4056参照。簡潔には、外径3mmの鋼ロッドを1,4-ジオキサン中のプレポリマー溶液(POC及びPOC-クリック3について30%w/w、CUPEについて3%w/w)で浸漬コーティングして、平均サイズ1〜20μmのNaCl(99%純度)でコーティングした。次に、サイズ1〜20μmのNaClをプレポリマー溶液と1:5のポリマーと塩の重量比で混合して、粘性のペーストが形成されるまで混合した。次いで、ペーストを鋼ロッド上に移し、200μm厚の層を作製した。構築物全体を空気乾燥させた後、100℃で1日間架橋させた。次に、別の粘性プレポリマー-塩ペーストを、1:10のポリマーと塩の重量比における混合NaCl(150〜250μm)及びプレポリマー溶液から作製し、前の層上に移して、800μm厚の層を作製した。鋼ロッド/材料アセンブリを層流フードに一夜置いて全ての溶媒を除去し、次いでオーブンに移し、100℃でさらに3日間維持して架橋させた。架橋後、ロッド/材料アセンブリをDI水中に浸漬することによって、6時間おきに水替えが完了する塩浸出(salt leaching)を実施した。塩の完全な除去は、硝酸銀で試験することによって決定した。スキャフォールドを水中50%(v/v)エタノール溶液中で膨潤させることによって型から外し、続いて凍結乾燥した。スキャフォールド形態を走査型電子顕微鏡法(SEM)(Hitachi S-3000N、日立サイエンスシステムズ、茨城県、日本)により調査した。
【０１２０】
POC-クリック3、POC及びCUPE PTBSのピーク負荷、縫合糸保持、及び破裂圧力を含む機械的特性を文献の方法によって測定した。Deyら、J. Biomed. Mater. Res. A、2010、95A、361-370参照。P15コンジュゲートPOC-クリック3 TTSは、DMSO中のクリック可能なp15溶液を、一端をクリップで留めた二相スキャフォールドの内孔に加えることによって、クリック可能なp15とPOC-クリック3 PTBSの内層との間のSPAACにより得た。37℃で3日間反応させた後、スキャフォールドをDI水で洗浄し、次いで凍結乾燥させた。そのようにして得たp15コンジュゲートPOC-クリック3スキャフォールドを、FTIR並びにUV-vis分光計(p15のグアニジン基のWeber改変坂口反応によりp15コンジュゲーションを確認するために)により特徴付けた。
【０１２１】
[実施例2]
二相スキャフォールド
本明細書に記載のいくつかの実施形態による二相スキャフォールドを以下の通りに調製した。
【０１２２】
A. 材料及び方法
材料
ヒドロキシアパタイト[Mw:502.32、アッセイ>90%(Ca3(PO4)2として);粒径:>75μm(0.5%)、45〜75μm(1.4%)、<45μm(98.1%)]は、Fluka(St. Louis、MO、USA)から購入した。1,8-オクタンジオール(98%)、クエン酸(99.5%)、及び全ての残りの化学薬品はSigma-Aldrich(St. Louis、MO、USA)から購入し、別段の記載がない限り、受け取ったままで使用した。
【０１２３】
ポリ(オクタンジオールシトレート)-クリック(POC Click)合成
2,2-ビス(アジドメチル)プロパン-1,3-ジオール(ジアジド-ジオールモノマー、DAzD)及びプロパルギル2,2-ビス(ヒドロキシル-メチル)プロピオネート(アルキン-ジオールモノマー、AlD)は前述の通りに合成した。アジド官能基を有するPOC Clickプレポリマー(POC Click-N3)は、それぞれ1.0:0.7:0.3のモル比におけるクエン酸、1,8-オクタンジオール、及びAlDの共重合により合成した。簡潔には、クエン酸と1,8-オクタンジオールとの混合物を入口及び出口アダプタを取り付けた100mLの三つ口丸底フラスコに加えた。混合物を、シリコーン油浴中160℃で撹拌することによって、窒素ガス流下で溶融した。続いて系の温度を120℃に下げた後、AlDモノマーを添加し、2時間反応させて、POC Click-N3プレポリマーを作製した。未反応のモノマー及びオリゴマーを除去するために、プレポリマーを1,4-ジオキサンに溶解し、Direct-Q 5Water Purification System(Millipore、Billerica、MA)から生成した脱イオン水中に滴下して沈殿させることにより精製した。溶解していないプレポリマーを含有する沈殿物を収集し、Freezone 6 Freeze Dryer(Labconco、Kansas City、MO)内で凍結乾燥させ、精製pre-POC Click-N3を得た。アルキン官能基(POC Click-Al)を有するPOC Clickプレポリマーは、クエン酸、1,8-オクタンジオール、及びDAzDをそれぞれ1.0:0.7:0.3のモル比で使用して、上記の通りに合成した。
【０１２４】
二相スキャフォールド作製
類似の内相気孔率及び多様な外相気孔率からなる二相スキャフォールドを作製した(図18)。外相を作製するために、等モル量のpre-POC Click-N3及びpre-POC Click-Alを1,4-ジオキサンに溶解し、ヒドロキシアパタイト(65wt.%)と混合した。200〜400μmの範囲内の平均サイズを有する塩化ナトリウム塩を外相の気孔率を制御するために多様な濃度(5〜50wt.%)で混合物に添加した。気孔率をさらに制御するために、約800nmから約1000μmの間の平均サイズを有する塩化ナトリウム結晶を使用することも可能である。さらに、濃度は0〜50wt.%とすることもでき、又はいくつかの場合には、50wt.%超とすることもできる。均一な粘性ペーストが形成されるまで、混合物をTeflon皿で撹拌した。次に、粘性ペーストをMcMaster-Carr(Aurora、OH、USA)から購入したTeflonチューブ(5x10mm;内径x長さ)内に挿入することによって、円筒形のスキャフォールドを形成した。溶媒の蒸発後に、スキャフォールドを1日間100℃に維持されたオーブン中で後重合させた。
【０１２５】
内相を作製するために、3mmの孔をスキャフォールドの中央に旋盤であけ、上述の手順に類似したペーストを70wt.%塩濃度で作製した。約50wt.%から約80wt.%の間の濃度など、他の塩濃度も使用することができる。生じたペーストを外相の管腔に挿入し、層流フード内で一夜乾燥させた。溶媒蒸発後に、スキャフォールドを100℃に維持されたオーブン内で2日間後重合させ、続いて120℃で2Paの真空下1日間加熱した。塩を、12時間おきに水が交換される脱イオン水中に72時間浸漬することによって、スキャフォールドから浸出させた。最後に、凍結乾燥を用いてスキャフォールドを乾燥させ、最終的な二相スキャフォールド(5x10mm;直径x長さ)を得た。二相スキャフォールドはbiphasic-Xと称され、ここでXは作製中に外相を作製するのに使用した塩の重量百分率を示す。
【０１２６】
単相スキャフォールド作製
均一な気孔率(70%)のスキャフォールドを作製するために、内相作製に類似したペーストをTeflonチューブ(5x10mm;内径x長さ)に挿入した。溶媒の蒸発後に、スキャフォールドを100℃で維持されたオーブン内で3日間後重合させ、続いて120℃で2Paの真空下1日間おき、上述の通りに処理した。
【０１２７】
二相スキャフォールド形態及び気孔率特徴付け
スキャフォールド断面形態を観察するために、試料を金でスパッタコーティングして、FEI Quanta 200 Environmental Scanning Electron Microscope (SEM)(FEI、Hillsboro、OR、USA)で観察した。スキャフォールド形状を特徴付けるために、3つのランダムな位置を選択し、NIH Image J分析ソフトウェア(国立衛生研究所、MD、USA)を使用して合計で30の測定値を記録した。
【０１２８】
スキャフォールド機械的特徴付け
一軸圧縮試験は、5900シリーズ上級電気機械的試験システム(Instron、Norwood、MA、USA)を使用して行った。簡潔には、円筒形のスキャフォールド5x10mm(直径×高さ)を2mm min-1の速度で破断するまで圧縮した。値は応力-歪みに変換し、初期モジュラス(MPa)を生じた曲線(0〜10%圧縮歪み)の初期勾配から計算した。ピーク応力(MPa)及び破断点圧縮歪み(%)もまた記録した。
【０１２９】
二相スキャフォールドin vivo評価
Laboratory Animal Center of Southern Medical University(Guangzhou、中国)からのニュージーランドホワイトウサギ(体重2.0〜2.2kg)を使用して、スキャフォールドのin vivoにおいて10mm分節骨欠損を修復する能力を評価した。全ての動物実験は、Southern Medical University’s Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認されたプロトコルを遵守して実施した。ウサギを最初に3%ナトリウムペントバルビタール(1.5mL/kg)の耳静脈注射で麻酔した。左橈骨の中間の3分の1にわたり20mmの切開を作成し、重なった組織を切断して、橈骨骨幹を曝露した。次に、10mmの分節欠損を低速電動ノコギリで作成し、即座に以下の実験群:1.単相スキャフォールド(70%の均一な気孔率)(「単相」群)及び2. Biphasic-50スキャフォールド(内相気孔率70%;外相気孔率50%)(「Biphasic-50」群)で処置した。対照のために、動物はまた自家骨グラフトで処置する(陽性対照;「自家骨」群)か、無処置の欠損として空のまま残された(陰性対照;「空の欠損」群)。特定の骨誘導性又は骨形成因子が試験グラフト代替物に組み入れられていなかったので(陽性対照に固有のものを除いて)、より厳しい20mmの臨界サイズ欠損モデルは使用せず、グラフト代替物の骨伝導能及び骨誘導能をより良好に特徴付けるために、10mm欠損の治療を採用した。ウサギを手術後5、10、及び15週でと殺し、以下の評価に付した。
【０１３０】
放射線検査
全ての試料は、コンピュータ断層撮影分析によりMicro-CT画像化システム(ZKKS-MCT-Sharp-IIIスキャナ、Caskaisheng、中国)を使用して分析した。ZKKS-MicroCT 3.0ソフトウェアを使用して画像を再構築し、0から255の範囲のグレースケール画像を生成し、これは0.81〜3.34g cm-3の密度範囲に等しい。新生骨形成は、スキャフォールド(2.5g cm-3)と新たに形成している類骨又は天然骨リモデリング(1.2〜1.7g cm-3)との密度差により定義された。具体的には、光学密度を使用して、移植の総面積における新たに形成された骨の百分率を測定した。新たに形成された骨は自家インプラントとは分離できないので、報告された骨光学密度データは、再生した骨並びにリモデリングした自家骨の両方を含む。欠損部位内の合計骨形成もまた測定し、これは石灰化した骨間靱帯結合を含んだが、尺骨を除いた。骨-インプラント領域は、マイクロCT画像に基づいて、インプラントと直接接触している新たに形成した骨の表面境界長さを総インプラント周囲で除したものとして計算した。
【０１３１】
組織学的分析
組織学的分析のために、パラフィン包埋脱灰組織を4μm厚の切片に切断し、次いでこれを脱パラフィンし、水和して、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)及びゴールドナートリクローム（Goldner's Trichrome）で染色した。顕微鏡検査後に、新たに形成された骨のコンピュータ支援組織形態計測測定値を、光学顕微鏡にCCDカメラ(Kodak DCS、Atlanta、GA、USA)を備えた自動画像分析システム(FreeMaxver 3.0、Zhongrui、台湾)を使用して得た。
【０１３２】
生体力学的試験
各群からのウサギを移植後15週でと殺した。骨膜を含む前肢の軟組織を橈骨から注意深く切断して、骨に触ることなく骨欠損の領域を曝露した。次いで外植した橈骨を治癒について評価した。試験片(4の橈骨)の2つの切断端を平均スパン20mmでクランプで固定した。橈骨セグメントの最大曲げ強度をElectroForce 3510Universal Material Testing Machine(Bose、Eden Prairie、MN、USA)で測定した。試験は2mm min-1の速度でモーションコントロールした。値を応力-歪みに変換し、初期モジュラスを生じた曲線の初期勾配(0〜10%圧縮歪み)から計算した。
【０１３３】
統計分析
データを平均±標準偏差として表す。2セットのデータ間の統計的有意性は、スチューデントの両側t検定を用いて計算した。分散分析(ANOVA)と共にNewman-Keuls多重比較試験事後分析を使用して、3つ以上の群間の有意差を決定した。データ分析はSPSSソフトウェア(SPSS、Chicago、IL、USA)を用いて行った。0.05以下のP-値が得られたときに、データを有意であるとみなした。
【０１３４】
B. 結果
二相スキャフォールド形態
多様な外相気孔率で作製した二相POC-Click-HAスキャフォールドのSEM画像を図19に示すが、これは2つの異なるスキャフォールド構成の存在を示している。図19中の外相は、biphasic-5(図19(a))、biphasic-10(図19(b)、biphasic-24(図19(c))、及びbiphasic-50(図19(d))に対応する。二相の内相及び外相の直径は、それぞれ、2.96±0.05mm及び5.02±0.07mmと測定された。全てのスキャフォールドについての平均気孔径は338.12±42.06μmと測定された。
【０１３５】
二相スキャフォールド機械的特性
作製したスキャフォールドをそれらの圧縮ピーク応力、初期モジュラス、及び破断点ピーク歪みについて評価した。図20(a)及び20(b)に示すように、ピーク応力及び初期モジュラスにおける減少傾向が、外相の気孔率が増加するにつれて見られた。圧縮ピーク応力値は、biphasic-5及び50スキャフォールドについて、それぞれの、37.45±3.83から2.26±0.27MPaに有意に減少した(p<0.05)。同様の逆相関が初期モジュラスについて見られ、これは外相気孔率が5%から50%に増加したときに、1250.01±230.60から55.15±15.83MPaへの減少を示す(図20(b))。対照的に、図20(c)は、破断点圧縮歪みが外相気孔率に相関して上昇したが、有意差はない(p>0.05)ことを示す。
【０１３６】
全体的な評価
長管骨欠損の修復におけるPOC-Click-HA二相スキャフォールドの有効性を評価するために、biphasic-50スキャフォールドをウサギの10mm分節左橈骨骨幹欠損に移植した。手術又は術後合併症は全ての実験群について起こらなかった。移植部位における創傷感染の証拠はなく、全てのウサギは、紅斑、腫脹、又は洞管形成の兆候なしに良好に回復した。移植の15週後、肉眼的評価は、単相及び二相スキャフォールドの両方について実験時間枠を通して移植部位が欠損部位に維持されたことを明らかにした。新生骨内部成長は実験及び陽性対照群で顕著であった。POC-Click-HAスキャフォールドは、完全に近い吸収を示した。しかしながら、明らかな欠損が陰性対照群で存在した。
【０１３７】
放射線検査
マイクロCT画像を使用して、各時点における新生骨成長の程度を評価した。図21(a)は、空の欠損(無処置の陰性対照)についてのCT画像を示し、図21(b)は自家骨グラフト(陽性対照)を示し、図21(c)はPOC-Click-HA単相スキャフォールドを示し、図21(d)はPOC-Click-HA biphasic-50スキャフォールドを示す。図21に示すように、橈骨欠損が放置され、充填材料で処置されなかったとき、15週後に髄腔は修復されないままであり、骨再生が観察できなかった(図21(a))。対照的に、自家骨グラフト処置した動物は、密な新たに形成された骨を5週までに示し、手術後10週で骨再生が増加した。15週までに、骨欠損が修復され、髄腔が橋渡しされた。しかしながら、再生した橈骨の直径は、実験群と比較したとき小さかった(図21(b))。単相スキャフォールドで処置した動物は、骨膜反応を示し、新骨再生が移植の5週後に見られた。骨膜性仮骨が試験を通して厚くなり、70%の骨-インプラント接触(BIC)値でスキャフォールドの周辺を囲んだ。15週までに、欠損はほとんど修復され、髄腔は部分的に橋渡しされた(図21(b))。biphasic-50スキャフォールドの場合には、高密度の移植骨が、内相の明らかな吸収の形跡を伴って、移植の5週後に観察された。二相スキャフォールドは新たに形成された骨で囲まれ、宿主骨組織に首尾良く固着した。10週後、骨欠損は大幅に修復され、元は分離されていた骨髄腔が橋渡しされた。欠損は15週後に完全に修復され、スキャフォールドは完全に近く吸収された(図21(c))。BICの定量的分析は、5週時点で自家骨グラフトと比較して、実験群において有意に高い値を示した(表1)。
【０１３８】
【表１】
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【０１３９】
組織学的分析
組織学的評価において、インプラント-骨界面で炎症又はマクロファージ若しくは巨細胞の存在が観察されなかった。線維組織が単相スキャフォールド内及びインプラント-骨界面で存在したものの、biphasic-50スキャフォールド内には線維組織がほとんど存在せず、このことは二相スキャフォールド構成が線維性浸潤を低減させ得ることを示した。新生骨内部成長は実験群において顕著であり、注目すべきことに、単相及び二相スキャフォールドの両方で処置された動物は移植の5週後に骨膜性リモデリングを示した。組織学の定量的決定は、15週で実験処置群(単相及びbiphasic-50スキャフォールド処置群)と自家骨グラフト処置動物間で同等の結果を実証した(図22)。図22では、報告された面積は、骨-インプラント接触面積の百分率を表す。報告された光学密度はインプラント領域における新生骨の百分率を表す。
【０１４０】
生体力学的試験
単相及びbiphasic-50スキャフォールドで処置した橈骨の圧縮特性において、対照群(無処置及び自家骨)と比較したとき、5週後に有意な増加があった。さらに、二相スキャフォールドで処置した橈骨の耐荷重能は、単相スキャフォールドで処置したものよりも高かったが、15週で統計的に有意ではなかった。生体力学的試験は、単相スキャフォールド、biphasic-50スキャフォールド、陰性対照(無処置)、及び陽性対照(自家骨)について、それぞれ、移植の5週後で、582.8±45.1N、608.0±53.6N、445.2±38.2N、及び514.0±60.9Nの破壊点を示した。15週の試験期間の最後に、それぞれ、1008.8±54.2N、1066.4±69.2N、637.0±29.6N、及び1034.6±84.4Nの破壊点が記録された。5週におけるウサギ橈骨-尺骨複合体の曲げ試験は、単相スキャフォールド及び自家骨群と比較したとき、二相スキャフォールドにおける有意に良好な弾性モジュラス及び曲げ強度回復を明らかにした(表2、図23)。
【０１４１】
【表２】
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【０１４２】
C. 検討
天然骨組織の天然の組成特性及び構造特性を再現する生体模倣シトレートベース二相スキャフォールドが本明細書で記載され、これは広範囲分節骨欠損に対して即座の構造的支持及び長期の組織再生をもたらすことができる。さらに、本明細書に記載のように、以下が発見された。1)シトレートベースの材料の使用は、自然骨に見られる有機細胞ニッチを再現して、生体適合性を改善し骨形成を増強する高度に有効な手段を提供することができる。2)材料の大部分に位置するシトレートが、HA粒子とキレート化するためのペンダントカルボキシル化学反応を提供し、天然無機ミネラル含有量に適合する65wt.%までの組込みを可能にする。3)POC-Click生体材料は、HAと複合体化して、クリック可能な部分を通して架橋させて、価値のあるシトレートカルボキシル化学反応をHA結合のために保存することができ、強固な複合材料がもたらされる。4)二相スキャフォールド設計は、高度に多孔性の海綿骨と皮質骨の緻密な構造の二様式分布をより良好に模倣して、移植後に即座の構造的支持をもたらすことができる。4)グラフトに多孔性を付与するために、費用効率的及び容易な溶媒キャスト微粒子浸出(solvent casting particulate leaching)技術を使用することができる。この手法の1つの大きな利点は、多様なTeflon成形型及び旋盤ドリルビット寸法を使用して、全体的寸法、形状、及び相気孔率を制御して、得られるスキャフォールド構造及び得られる機械的特性を多様な解剖学的位置への要件を満たすように微調整することができることである。
【０１４３】
POC-Click-HA二相スキャフォールドのSEM分析は、それぞれ天然皮質骨及び海綿骨を再現している、多孔性内相を囲む密な外相の明らかな存在を示している(図19)。得られる気孔率は、皮質骨について10%であり、骨梁骨について50〜90%であることが見出されている、天然骨のそれぞれの気孔率に適合するように選択された。気孔の径は200〜400μmの範囲内となるように選択された。天然骨組織は、高度に動的で堅固な組織である。本試験で作製したPOC-Click-HA二相スキャフォールドの機械的特性は、外相の得られた気孔率に高度に依存していた。理論に束縛されることを意図するものではないが、図20は、外相の気孔率が減少するにつれ、圧縮強度における対応する増加を示し、スキャフォールドの機械的強度が主に外相に起因するものであることを示している。
【０１４４】
機械的試験に加えて、作製したPOC-Click-HA二相スキャフォールドを10mmウサギ橈骨欠損を使用して、単相スキャフォールド及び自家骨グラフトとin vivoで比較して、広範囲分節骨欠損を再生するそれらの能力を決定した。均一な気孔率(70%)のPOC-Click-HAスキャフォールドは、二相スキャフォールドの内相に類似した気孔率で作製し、POC-Click-HA biphasic-50スキャフォールドは、外相気孔率と強度とのバランスによって、移植のために選択された。組織学的結果は、単相及び二相POC-Click-HAスキャフォールドの両方への新生骨内部成長の存在を示す。理論に束縛されることを意図するものではないが、マイクロCT分析と組み合わせて、結果は、自家骨グラフトと比較したときに、シトレートベースのスキャフォールドは移植の5週後にBMCを有意に増加させたことを示し、おそらくスキャフォールド構造における多孔性部の重要性を強調しており、多孔性部は骨形成細胞の遊走のための適切な空間を提供し、骨橋結合を促進して、最終的に回復時間を短縮し得る(表1)。試験の最後までに、単相及び二相スキャフォールド構造の両方が、欠損を完全に修復することができ、完全に近い吸収を示した。
【０１４５】
さらに、本明細書に記載の2つの実験群の包括的な生体力学的分析は、二相群の曲げ強度、BMC、及び靭性の回復が、全て単相群よりも有意に大きかったことを明らかにした。理論に束縛されることを意図するものではないが、二相スキャフォールド設計の低気孔率の外相が、天然皮質骨を模倣して、欠損を横切る生体力学的力に耐えるように機能するだけでなく、コラーゲン膜に類似した障壁として機能することによって線維組織の内部成長を防止することが考えられる。長管骨再生に関する上に提示したin vivo結果が、サプリメント又は成長因子を含まない素のPOC-Click-HAスキャフォールドに基づいたことは特筆に値する。
【０１４６】
結論として、単純で費用効果的な塩化ナトリウム微粒子浸出技術を使用して、皮質骨及び海綿骨の天然構造を再現する生体模倣シトレートベース二相スキャフォールドが作製された。この設計を用いて、多様な二相スキャフォールドを、調整可能な構造形状及び強度で製造することができる。得られたスキャフォールドをそれらの形状、機械的特性、及びin vivo性能に基づいて評価した。そのような構造的及び組成的に生体模倣性のシトレートベーススキャフォールドは、広範囲骨欠損に対する即座の構造的支持をもたらすための既成インプラントとして機能することができる。
【０１４７】
本発明の多様な実施形態を本発明の多様な目的の実施において記載した。これらの実施形態は本発明の原理を例示するものに過ぎないことが認識されるべきである。本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、多数のこれらの変更及び適合が当業者に容易に明らかとなろう。
【図１】
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【図２（ａ）】
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【図２（ｂ）】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図３（ｃ）】
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【図３（ｄ）】
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【図４】
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【図５】
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【図６（ａ）】
0006343674.tif 000041
【図６（ｂ）】
0006343674.tif 000042
【図６（ｃ）】
0006343674.tif 000043
【図６（ｄ）】
0006343674.tif 000044
【図６（ｅ）】
0006343674.tif 000045
【図６（ｆ）】
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【図６（ｇ）】
0006343674.tif 000047
【図６（ｈ）】
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【図７】
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【図８】
0006343674.tif 000050
【図９】
0006343674.tif 000051
【図１０（ａ）】
0006343674.tif 000052
【図１０（ｂ）】
0006343674.tif 000053
【図１０（ｃ）】
0006343674.tif 000054
【図１０（ｄ）】
0006343674.tif 000055
【図１１】
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【図１２】
0006343674.tif 000057
【図１３（ａ）】
0006343674.tif 000058
【図１３（ｂ）】
0006343674.tif 000059
【図１４】
0006343674.tif 000060
【図１５】
0006343674.tif 000061
【図１６】
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【図１７（ａ）】
0006343674.tif 000063
【図１７（ｂ）】
0006343674.tif 000064
【図１７（ｃ）】
0006343674.tif 000065
【図１７（ｄ）】
0006343674.tif 000066
【図１８（ａ）】
0006343674.tif 000067
【図１８（ｂ）】
0006343674.tif 000068
【図１９】
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【図２０（ａ）】
0006343674.tif 000070
【図２０（ｂ）】
0006343674.tif 000071
【図２０（ｃ）】
0006343674.tif 000072
【図２１（ａ）】
0006343674.tif 000073
【図２１（ｂ）】
0006343674.tif 000074
【図２１（ｃ）】
0006343674.tif 000075
【図２１（ｄ）】
0006343674.tif 000076
【図２２（ａ）】
0006343674.tif 000077
【図２２（ｂ）】
0006343674.tif 000078
【図２３】
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