(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式４〜化学式８の化合物からなる群より選択される化合物または薬学的に許容されるその塩。
［化学式４］
【化７】
0006349456.tif 000060
［化学式５］
【化８】
0006349456.tif 000061
［化学式６］
【化９】
0006349456.tif 000062
［化学式７］
【化１０】
0006349456.tif 000063
［化学式８］
【化１１】
0006349456.tif 000064
【請求項２】
下記化学式３で表される化合物または薬学的に許容されるその塩：
［化学式３］
【化１３】
0006349456.tif 000065
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ次に表される。
【表１】
0006349456.tif 000066
0006349456.tif 000067
【請求項３】
前記化合物は、下記化学式１０で表されるものである、請求項２に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
［化学式１０］
【化１７】
0006349456.tif 000068
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩を含む、蛋白質および蛋白質間の相互作用を抑制するための組成物。
【請求項５】
前記蛋白質および蛋白質間の相互作用は、蛋白質および蛋白質間の結合、または蛋白質および蛋白質間の凝集を含むものである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩を含む、蛋白質および蛋白質間の相互作用を探知するための組成物。
【請求項７】
下記の化学式７、化学式８および化学式１０の化合物からなる群より選択される１種以上の化合物または薬学的に許容されるその塩を含む、パーキンソン疾患の予防または治療用薬学組成物：
［化学式７］
【化２３】
0006349456.tif 000069
［化学式８］
【化２４】
0006349456.tif 000070
［化学式１０］
【化１７】
0006349456.tif 000071
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルファ−ヘリックス類似体としてトリアジン−ピペラジン骨格を有する化合物に関する。前記化合物は、蛋白質の二次構造であるアルファ−ヘリックス構造を効率的に模倣して、アルファ−ヘリックスによって媒介される多様な疾患特異的蛋白質相互作用の阻害剤として作用できる。したがって、このような化合物は、生物学的探針として非常に有用に使用されるだけでなく、疾病の治療剤として高い潜在性を有する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は多様で複雑な蛋白質−蛋白質相互作用（Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ＰＰＩ）により遺伝子調節、細胞成長、細胞周期、代謝、信号伝達などの様々な生物学的機能を行うことによって生命現象を維持している。また、多くの疾病が異常な蛋白質−蛋白質相互作用または蛋白質ミスフォールディング（ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ）に関連していることが知られている。したがって、細胞内における蛋白質−蛋白質相互作用および相互作用の機能を理解することは、生命現象を理解する礎となり、新薬開発および疾病治療の重要な基盤となる。
【０００３】
多くの蛋白質間の相互作用において、蛋白質は、２〜３ターン（ｔｕｒｎ）からなる短いアルファ−ヘリックス（α−ｈｅｌｉｘ）を認知して対象蛋白質と結合すると知られている。アルファ−ヘリックス構造は、約３．１４個のアミノ酸残基ごとに回転（ターン）が存在し、３〜４個の残基ごとに側鎖（ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）が空間的に配置されている。各側鎖の位置する空間をｉ、ｉ＋３／ｉ＋４、ｉ＋７などと称し、ｉ、ｉ＋３／ｉ＋４、ｉ＋７に位置する残基は、標的蛋白質と結合する時、認識部位（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）として作用する。したがって、このようなアルファ−ヘリックスペプチドの構造を模倣できる低分子物質は、蛋白質相互作用の阻害剤として役割を果たすことが期待され、アルファ−ヘリックス類似体の開発に対する研究が非常に活発に行われている。
【０００４】
これに関連して、ターフェニル（ｔｅｒｐｈｅｎｙｌ）骨格を有するアルファ−ヘリックス類似化合物が報告された（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１，１２３，５３８２−３；Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．２０１３，５（３）：１６１−１７３；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１０，１４（３）：３４１−３４６）。前述のように、自然界に存在するアルファ−ヘリックスは、蛋白質と結合する時、認識部位として作用する３個のアミノ酸残基（ｉ、ｉ＋３／ｉ＋４、ｉ＋７位置のアミノ酸残基）が存在するが、前記ターフェニル構造基盤のアルファ−ヘリックス類似体の場合、ターフェニル骨格を構成する３個のベンゼン環にそれぞれ連結された置換基が前記３個のアミノ酸残基に相当する３次元空間位置に置かれて、アルファ−ヘリックスの機能を模倣するようにデザインされた。
【０００５】
しかし、ターフェニル構造基盤のアルファ−ヘリックス類似体は、合成が非常に難しいだけでなく、疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）が強くて水溶液における溶解度が非常に低いため、生理活性を検証することも容易でなく、治療剤としての開発に困難が多い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、水溶液における溶解度および細胞透過性に優れ、かつ、合成が容易な構造を有する低分子アルファ−ヘリックス類似体を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、従来のターフェニル骨格を有するアルファ−ヘリックス類似体の問題点を克服するために、トリアジン−ピペラジンを中心構造とする新たなアルファ−ヘリックス類似体化合物を開発した。また、前記アルファ−ヘリックス類似体化合物がアルファ−ヘリックスに必須の３個のアミノ酸残基（ｉ、ｉ＋３またはｉ＋４、ｉ＋７）の３次元的配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を成功裏に模倣することを確認した。さらに、本発明者らは、前記トリアジン−ピペラジン骨格を有するアルファ−ヘリックス類似体を簡単に合成できる固体相合成法を開発した。
【０００８】
したがって、本発明の一つの目的は、トリアジン−ピペラジンを中心構造とするアルファ−ヘリックス類似体化合物およびその塩を提供することである。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、前記アルファ−ヘリックス類似体化合物の製造方法を提供することである。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、前記アルファ−ヘリックス類似体化合物またはその塩を含む、蛋白質および蛋白質間の相互作用を抑制するための組成物を提供することである。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、前記アルファ−ヘリックス類似体化合物またはその塩を目的蛋白質に処理する段階を含む、蛋白質および蛋白質間の相互作用を抑制する方法を提供することである。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、前記アルファ−ヘリックス類似体化合物またはその塩を含む、蛋白質および蛋白質間の相互作用を探知するための組成物を提供することである。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、前記アルファ−ヘリックス類似体化合物またはその塩を目的蛋白質に処理する段階を含む、蛋白質および蛋白質間の相互作用を探知する方法を提供することである。
【００１４】
本発明のもう一つの目的は、前記アルファ−ヘリックス類似体化合物またはその塩を含む、アルファ−ヘリックスによって媒介される蛋白質間の相互作用に関連する疾患治療用薬学組成物を提供することである。
【００１５】
本発明のもう一つの目的は、前記アルファ−ヘリックス類似体化合物またはその塩の有効量を個体に投与する段階を含む、アルファ−ヘリックスによって媒介される蛋白質間の相互作用に関連する疾患を治療する方法を提供することである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、アルファ−ヘリックス類似体としてトリアジン−ピペラジン骨格を有する化合物を提供し、前記化合物は、蛋白質の二次構造であるアルファ−ヘリックス構造を効率的に模倣して、アルファ−ヘリックスによって媒介される多様な疾患特異的蛋白質相互作用の阻害剤として作用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ａは、アルファ−ヘリックスのｉ、ｉ＋４、ｉ＋７側鎖の位置を示し、Ｂは、従来のターフェニル骨格のアルファ−ヘリックス類似体の構造を示し、Ｃは、本発明のトリアジン−ピペラジン−トリアジン骨格のアルファ−ヘリックス類似体の構造を示す。Ｄは、本発明のトリアジン−ピペラジン−トリアジン骨格のアルファ−ヘリックス類似体をエネルギー最小化された構造（２ａ）に製造した時（つまり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５＝ＣＨ３；Ｒ１、Ｒ４＝Ｈ）、アルファ−ヘリックスとオーバレイ（ｏｖｅｒｌａｙ）された図を示す。Ｅは、ターフェニル骨格のアルファ−ヘリックス類似体とトリアジン−ピペラジン−トリアジン骨格のアルファ−ヘリックス類似体それぞれをエネルギー最小化された構造に製造した時（１ａ、１ｂ）のＣｌｏｇ  Ｐ値を比較した結果である。
【００１８】
【図２】トリアジン−ピペラジン−トリアジンを中心構造とするアルファ−ヘリックス類似体化合物を製造する固体相合成法の概要を示したものである。
【００１９】
【図３】ペプトイドをｃｏｄｉｎｇ  ｔａｇとしてアルファ−ヘリックス類似体化合物ライブラリーを構築する過程を示したものである。
【００２０】
【図４】アルファ−ヘリックス類似体化合物ライブラリーから、所望のターゲット蛋白質に結合するアルファ−ヘリックス類似体化合物を選別する過程を示したものである。
【００２１】
【図５】化合物９ａ、９ｂおよび９ｃを蛍光標識する過程を示したものである。
【００２２】
【図６】Ａは、ＭＣＬ−１に結合するものに選別された化合物９ａ（化学式４）、９ｂ（化学式５）および９ｃ（化学式６）、そして陰性対照群９−ｎｃの構造を示し、Ｂは、化合物９ａ、９ｂおよび９ｃがＭＣＬ−１に結合することを確認した蛍光偏光分析の結果を示し、Ｃは、化合物９ａ、９ｂおよび９ｃが蛍光−標識されたＢＨ−３ペプチドがＭＣＬ−１に結合するのを阻害することを確認した競争的蛍光偏光分析の結果を示す。
【００２３】
【図７】Ａは、ＭＣＬ−１およびＢＨ３ペプチド複合体の結晶構造を示したもので、ＢＨ３の３個の疎水性残基（Ｌｅｕ２１３、Ｖａｌ２１６  ａｎｄ  Ｖａｌ２２０）の側鎖にＭＣＬ−１の主要結合部位であることを示す。Ｂは、化合物９ｃがＭＣＬ−１のＢＨ３結合部位に結合することを示すコンピュータドッキング研究の結果を示す。
【００２４】
【図８】Ａは、多様な濃度の化合物９ｃ（１０、５０、１００μＭ）またはＤＭＳＯをＪｕｒｋａｔ白血病Ｔ細胞に２．５時間処理した後、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞内でＭＣＬ−１／ＢＡＫの相互作用が阻害されるかをＭＣＬ−１免疫沈殿およびＢＡＫウェスタンブロットで確認した結果を示す。Ｂは、Ａ５４９細胞に１μＭの９ｃ−ＦＬまたは５（６）−ｃａｒｂｏｘｙｆｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（Ｆｌｕ）を４時間処理した後、共焦点顕微鏡で分析した結果を示す。Ｃは、多様な濃度の化合物９ｃおよび９−ｎｃ（陰性対照群）をそれぞれＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞（左図）およびＷＳ−１正常線維芽細胞（右図）に処理した時の細胞生存率（％）を示したものである。
【００２５】
【図９】化合物９ｃ（２５、５０μＭ）、化合物９−ｎｃ（１００μＭ）またはＤＭＳＯをＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に２．５時間処理した後、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞内でＭＣＬ−１／ＢＡＫの相互作用が阻害されるかをＭＣＬ−１免疫沈殿およびＢＡＫウェスタンブロットで確認した結果を示す。
【００２６】
【図１０】Ａは、多様な濃度の化合物９ｃおよび９−ｎｃ（陰性対照群）をＵ２６６細胞に２４時間処理した時の細胞生存率（％）を示したものであり、Ｂは、正常ＨＥＫ２９３細胞に処理した時の細胞生存率（％）を示したものである。Ｃは、Ｕ２６６細胞およびＷＳ−１細胞にＤＭＳＯまたは表示された濃度の化合物９ｃを１６時間処理した後、Ｃａｓｐａｓｅ活性を分析した結果を示す。
【００２７】
【図１１】化合物９ｃにおけるＲ１位に相当するＥｔを多様な親水性官能基に置換する過程を示す。
【００２８】
【図１２】化合物９ｃにおけるＲ４位に相当する水素を多様な親水性官能基に置換する過程を示す。
【００２９】
【図１３】Ａは、化合物Ｑ１（化学式７）およびＱ２（化学式８）の構造を示したものであり、Ｂは、化合物Ｑ１、Ｑ２、陰性対照群として化合物９ａ、９ｂ、９ｃおよびｆｌｕｒｏ−ｌｉｎｋｅｒがそれぞれ野生型アルファ−シヌクレインに結合するかを確認した蛍光偏光分析の結果を示したものである。Ｃは、化合物Ｑ１およびＱ２の存在または不在下でアルファ−シヌクレインのｕｎｆｏｌｄｉｎｇをモニタリングしたＣＤ（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）熱変性の結果を示す。
【００３０】
【図１４】Ａは、化合物Ｑ１、Ｑ２、９ａ、９ｂ、９ｃおよびｆｌｕｏｒ−ｌｉｎｋｅｒがそれぞれアルファ−シヌクレイン突然変異Ａ５３Ｔに結合するかを確認した蛍光偏光分析の結果を示したものである。Ｂは、化合物Ｑ１、Ｑ２および陰性対照群９ｃがアルファ−シヌクレイン突然変異Ａ５３Ｔの凝集に影響を及ぼすかを確認したチオフラビン−Ｔ蛍光凝集分析の結果を示したものである。
【００３１】
【図１５】フェニル−ピペラジン−トリアジンを中心構造とするアルファ−ヘリックス類似体化合物を製造する固体相合成法の概要を示したものである。図にて、（ａ）は、４−フルオロ−３−ニトロ安息香酸、ＨＡＴＵ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ、室温、２４時間の反応を示し；（ｂ）は、Ｎ−ノシル保護されたピペラジン誘導体（“３”）、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ、９５℃、１２時間の反応を示し；（ｃ）は、２−メルカプトエタノール、ＤＢＵ、ＤＭＦ、ｒｔ、３時間の反応を示し；（ｄ）は、２２−エチルアミノ−４，６−ジクロロ−［１，３，５］トリアジン（“５”）、ＤＩＥＡ、ＴＨＦ、６０℃、３時間の反応を示し；（ｅ）は、Ｒ３ＮＨ２、ＤＩＥＡ、ＮＭＰ、８０℃、一晩の反応を示し；（ｆ）は、ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＤＭＦ、室温、２４時間の反応を示し、（ｇ）は、条件Ａ（芳香族アルデヒドの場合）：Ｒ１ＣＨＯ、ＣＨ（ＯＭｅ）３／ＤＭＦ／ＭｅＯＨ９：１：２（１％ＨＯＡｃ）、５０℃、１８ｈ；以降、ＮａＣＮＢＨ３、ＴＨＦ、５０℃、６時間の反応、条件Ｂ（脂肪族アルデヒドの場合）：Ｒ１ＣＨＯ、ベンゾトリアゾール、ＣＨ（ＯＭｅ）３／ＤＭＦ／ＭｅＯＨ９：１：２（１％ＨＯＡｃ）、室温、１８時間の反応；以降、ＮａＣＮＢＨ３、ＴＨＦ、室温、６時間の反応を示し；（ｈ）は、９５％ＴＦＡ  ｉｎ  ＣＨ２Ｃｌ２、室温、３時間の反応を示す。
【００３２】
【図１６】フェニル−ピペラジン−トリアジンを中心構造とするアルファ−ヘリックス類似体化合物３６種がＭｃｌ−１およびＢＨ３ペプチド間の相互作用を阻害する効果を確認した競争的蛍光偏光分析（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）の結果を示す。青棒は１０μＭの濃度における阻害効果を、赤棒は５０μＭの濃度における阻害効果を示す。
【００３３】
【図１７】Ａは、ＰＰＴ−３１と名付けられた化合物（化学式１０の化合物）の構造を示し、Ｂは、ＰＰＴ−３１のエネルギー最小化構造およびＢＨ３ヘリックスペプチドと重複させた分子モデリングの結果を示す。Ｃは、蛍光標識されたＢＨ３ペプチドがＭｃｌ−１（黒色）およびＢｃｌ−ＸＬ（灰色）と結合するのを阻害するＰＰＴ−３１の阻害曲線を示す。誤差棒は３回の独立した実験結果に対する標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、トリアジン−ピペラジンを中心構造とするアルファ−ヘリックス類似体化合物およびその塩、そしてその用途に関する。
【００３５】
本発明において、トリアジン−ピペラジンを中心構造とするアルファ−ヘリックス類似体化合物は次の化学式１で表すことができる：
［化学式１］
【化１】
0006349456.tif 000002
式中、
Ｘは、
【化２】
0006349456.tif 000003
または
【化３】
0006349456.tif 000004
であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、−ＮＲ８Ｒ９または−ＯＲ１０であり、
この時、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立に、水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロサイクル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリール、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリールであって、ｍは、０〜３の整数であり、前記それぞれは、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ３−６シクロアルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、Ｃ３−Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ１０ヘテロサイクリック、−Ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリール、−Ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリール、カルボキシ、グアニジル、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、フェニル、フェノキシ、オキソ、およびスルホンアミドから独立に選択される１〜５個の置換体で置換されていてもよく、
前記Ｒ８およびＲ９は、これらと結合するＣ、ＮまたはＯ原子と共に互いに結合して環を形成してもよく、
Ｒ１０は、水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロサイクル、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリール、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリールであって、ｎは、０〜３の整数であり、前記それぞれは、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ３−６シクロアルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、カルボキシ、ヒドロキシル、アミノ、オキソ、フェニル、およびフェノキシから独立に選択される１〜５個の置換体で置換されていてもよく、
Ｒ３は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたは−（ＣＨ２）ｐ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリールであり、ｐは、０〜３の整数であり、
Ｒ６は、−ＮＲ１１であり、この時、Ｒ１１は、水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｑ−（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルケニル、−（ＣＨ２）ｑ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロサイクル、−（ＣＨ２）ｑ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリール、−（ＣＨ２）ｑ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリールであって、ｑは、０〜３の整数であり、前記それぞれは、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ３−６シクロアルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、Ｃ３−Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ１０ヘテロサイクリック、カルボキシ、グアニジル、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、フェニル、フェノキシ、オキソ、およびスルホンアミドから独立に選択される１〜５個の置換体で置換されていてもよく、
前記Ｒ１１は、これと結合するＣまたはＯ原子と共に結合して環を形成してもよく、および
Ｒ７は、−ＮＨ２である。
【００３６】
本発明の化合物は、その立体化学的異性体を含み、例えば、基本分子構造の全てのジアステレオマーおよびエナンチオマーを含むことができる。特に、立体中心は、（Ｒ）−または（Ｓ）−配位を有してもよいし、２価サイクリック（部分的に）飽和ラジカル上の置換基は、シス−またはトランス−配位を有してもよい。二重結合を含む化合物は、前記二重結合においてＥまたはＺ−立体化学を有してもよい。前記化学式１で表される化合物の立体化学的異性体の形態は、前記発明の範囲内に含まれるものと意図される。
【００３７】
より詳細には、本発明の化合物は、トリアジン−ピペラジン−トリアジンを中心構造とする化合物と、フェニル−ピペラジン−トリアジンを中心構造とする化合物を含むことができる。
【００３８】
以下、本発明で提供する化合物をより詳細に説明する。
【００３９】
一つの態様として、本発明は、トリアジン−ピペラジン−トリアジンを中心構造とするアルファ−ヘリックス類似体化合物およびその塩に関する。
【００４０】
前記トリアジン−ピペラジン−トリアジンを中心構造とする化合物は、下記化学式２で表すことができる：
［化学式２］
【化４】
0006349456.tif 000005
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、−ＮＲ８Ｒ９または−ＯＲ１０であり、
この時、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立に、水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロサイクル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリール、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリールであって、ｍは、０〜３の整数であり、前記それぞれは、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ３−６シクロアルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、Ｃ３−Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ１０ヘテロサイクリック、−Ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリール、−Ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリール、カルボキシ、グアニジル、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、フェニル、フェノキシ、オキソ、およびスルホンアミドから独立に選択される１〜５個の置換体で置換されていてもよく、
前記Ｒ８およびＲ９は、これらと結合するＣ、ＮまたはＯ原子と共に互いに結合して環を形成してもよく、
Ｒ１０は、水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロサイクル、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリール、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリールであって、ｎは、０〜３の整数であり、前記それぞれは、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ３−６シクロアルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、カルボキシ、ヒドロキシル、アミノ、オキソ、フェニル、およびフェノキシから独立に選択される１〜５個の置換体で置換されていてもよく、
Ｒ３は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたは−（ＣＨ２）ｐ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリールであり、および
ｐは、０〜３の整数である。
【００４１】
具体的な一例として、前記化学式２において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、−ＮＲ８Ｒ９であり、この時、Ｒ１およびＲ４の場合、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立に、水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｒＮＨ２、−（ＣＨ２）ｒＮ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）ｒＣ（＝Ｏ）ＯＨ、または−（ＣＨ２）ｒＯＨであり、ｒは、１〜６の整数であり、Ｒ２およびＲ５の場合、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立に、水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル、（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリール、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリールであって、ｍは、０〜３の整数であり、前記それぞれは、Ｃ１−４アルコキシ、ヒドロキシル、またはフェノキシで置換されていてもよく、およびＲ３は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたはベンジルであってもよい。
【００４２】
具体的な他の例として、前記化学式２において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、−ＮＲ８Ｒ９であり、この時、Ｒ１およびＲ４の場合、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立に、水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、Ｒ２およびＲ５の場合、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立に、Ｃ１−Ｃ６アルキル、−（ＣＨ２）ｍ−フェニル、−（ＣＨ２）ｍ−フェノキシフェニル、−（ＣＨ２）ｍ−ベンゾジオキソール、−（ＣＨ２）ｍ−ジアルコキシベンゼン、−（ＣＨ２）ｍ−ジメトキシフェニル、−（ＣＨ２）ｍ−ヒドロキシフェニル、または−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルであり、およびＲ３は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたはベンジルであってもよい。
【００４３】
具体的な他の例として、前記化学式２において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、−ＮＲ８Ｒ９であり、この時、Ｒ１およびＲ４の場合、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立に、水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、Ｒ２およびＲ５の場合、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立に、Ｃ１−Ｃ６アルキル、−（ＣＨ２）ｍ−フェニル、−（ＣＨ２）ｍ−フェノキシフェニル、−（ＣＨ２）ｍ−ベンゾジオキソール、−（ＣＨ２）ｍ−ジアルコキシベンゼン、−（ＣＨ２）ｍ−ジメトキシフェニル、−（ＣＨ２）ｍ−ヒドロキシフェニル、または−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルであり、およびＲ３は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたはベンジルであってもよい。
【００４４】
具体的な他の例として、前記化学式２において、前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、下記の構造式からなる群より選択されてもよい：
【化５−１】
0006349456.tif 000006
【化５−２】
0006349456.tif 000007
【化５−３】
0006349456.tif 000008
【化５−４】
0006349456.tif 000009
【００４５】
具体的な他の例として、前記化学式２において、前記Ｒ３は、下記の構造式からなる群より選択されてもよい：
【化６】
0006349456.tif 000010
【００４６】
具体的な他の例として、前記化学式２の化合物は、下記の化学式４〜化学式８の化合物からなる群より選択されるものであってもよい：
［化学式４］
【化７】
0006349456.tif 000011
［化学式５］
【化８】
0006349456.tif 000012
［化学式６］
【化９】
0006349456.tif 000013
［化学式７］
【化１０】
0006349456.tif 000014
［化学式８］
【化１１】
0006349456.tif 000015
【００４７】
具体的な他の例として、本発明の化合物は、下記化学式９の化合物であってもよい：
［化学式９］
【化１２】
0006349456.tif 000016
前記化学式９において、
Ｒ１およびＲ４は、それぞれ独立に、−ＮＲ８Ｒ９または−ＯＲ１０であり、
この時、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立に、水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロサイクル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリール、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリールであって、ｍは、０〜３の整数であり、前記それぞれは、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ３−６シクロアルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、Ｃ３−Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ１０ヘテロサイクリック、−Ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリール、−Ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリール、カルボキシ、グアニジル、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、フェニル、フェノキシ、オキソ、およびスルホンアミドから独立に選択される１〜５個の置換体で置換されていてもよく、
前記Ｒ８およびＲ９は、これらと結合するＣ、ＮまたはＯ原子と共に互いに結合して環を形成してもよく、および
Ｒ１０は、水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロサイクル、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリール、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリールであって、ｎは、０〜３の整数であり、前記それぞれは、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ３−６シクロアルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、カルボキシ、ヒドロキシル、アミノ、オキソ、フェニル、およびフェノキシから独立に選択される１〜５個の置換体で置換されていてもよい。
【００４８】
あるいは、前記化学式９において、Ｒ１およびＲ４は、それぞれ独立に、−ＮＲ８Ｒ９であり、この時、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立に、水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ｒＮＨ２、−（ＣＨ２）ｒＮ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）ｒＣ（＝Ｏ）ＯＨ、または−（ＣＨ２）ｒＯＨであり、およびｒは、１〜６の整数であってもよい。
【００４９】
もう一つの態様として、本発明は、フェニル−ピペラジン−トリアジンを中心構造とするアルファ−ヘリックス類似体化合物およびその塩に関する。
【００５０】
前記フェニル−ピペラジン−トリアジンを中心構造とする化合物は、下記化学式３で表すことができる：
［化学式３］
【化１３】
0006349456.tif 000017
式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、−ＮＲ８Ｒ９または−ＯＲ１０であり、
この時、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立に、水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロサイクル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリール、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリールであって、ｍは、０〜３の整数であり、前記それぞれは、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ３−６シクロアルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、Ｃ３−Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ１０ヘテロサイクリック、−Ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリール、−Ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリール、カルボキシ、グアニジル、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、フェニル、フェノキシ、オキソ、およびスルホンアミドから独立に選択される１〜５個の置換体で置換されていてもよく、
前記Ｒ８およびＲ９は、これらと結合するＣ、ＮまたはＯ原子と共に互いに結合して環を形成してもよく、
Ｒ１０は、水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロサイクル、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリール、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリールであって、ｎは、０〜３の整数であり、前記それぞれは、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ３−６シクロアルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、カルボキシ、ヒドロキシル、アミノ、オキソ、フェニル、およびフェノキシから独立に選択される１〜５個の置換体で置換されていてもよく、
Ｒ３は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたは−（ＣＨ２）ｐ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリールであり、ｐは、０〜３の整数であり、
Ｒ６は、−ＮＲ１１であり、この時、Ｒ１１は、水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｑ−（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルケニル、−（ＣＨ２）ｑ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロサイクル、−（ＣＨ２）ｑ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリール、−（ＣＨ２）ｑ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリールであって、ｑは、０〜３の整数であり、前記それぞれは、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ３−６シクロアルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、Ｃ３−Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ１０ヘテロサイクリック、カルボキシ、グアニジル、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、フェニル、フェノキシ、オキソ、およびスルホンアミドから独立に選択される１〜５個の置換体で置換されていてもよく、
前記Ｒ１１は、これと結合するＣまたはＯ原子と共に結合して環を形成してもよく、および
Ｒ７は、−ＮＨ２である。
【００５１】
具体的な一例として、前記化学式３において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、−ＮＲ８Ｒ９であり、この時、Ｒ８は、水素であり、Ｒ９は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、または−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリールであり、ｍは、０〜３の整数であり、Ｒ３は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたはベンジルであり、Ｒ６は、−ＮＲ１１であり、この時、Ｒ１１は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたは−（ＣＨ２）ｑ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリールであり、ｑは、０〜３の整数であり、およびＲ７は、−ＮＨ２であってもよい。
【００５２】
具体的な他の例として、前記化学式３において、前記Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、下記の構造式からなる群より選択されてもよい：
【化１４−１】
0006349456.tif 000018
【化１４−２】
0006349456.tif 000019
【化１４−３】
0006349456.tif 000020
【化１４−４】
0006349456.tif 000021
【００５３】
具体的な他の例として、前記化学式３において、前記Ｒ３は、それぞれ独立に、下記の構造式からなる群より選択されてもよい：
【化１５】
0006349456.tif 000022
【００５４】
具体的な他の例として、前記化学式３において、前記Ｒ６は、それぞれ独立に、下記の構造式からなる群より選択されてもよい：
【化１６−１】
0006349456.tif 000023
【化１６−２】
0006349456.tif 000024
【００５５】
具体的な他の例として、前記化学式３において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ次の通り表されてもよい：
【表１】
0006349456.tif 000025
【００５６】
具体的な他の例として、前記化学式３の化合物は、下記化学式１０で具体化されてもよい：
［化学式１０］
【化１７】
0006349456.tif 000026
【００５７】
本発明の化合物において、前記Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、自然界に存在するアルファ−ヘリックスが蛋白質と結合する時、認識部位（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）として作用する３個のアミノ酸残基（ｉ、ｉ＋３／ｉ＋４、ｉ＋７位置のアミノ酸残基）に相当する３次元空間位置に置かれる部分で、アルファ−ヘリックス類似体化合物がターゲット蛋白質と結合できるようにする。
【００５８】
また、本発明の化合物において、前記Ｒ１およびＲ４はこれに制限されないが、好ましくは、親水性残基が導入され、親水性残基が導入される場合、アルファ−ヘリックス類似体化合物が両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｉｃ）を有することができる。自然界に存在する大部分のアルファ−ヘリックスペプチドは、一側の面は疎水性残基からなり、他の蛋白質と結合する時、認識部位（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）として重要な役割を果たし、反対側の面は親水性を有するアミノ酸残基からなり、アルファ−ヘリックスペプチドが蛋白質に結合した時、当該親水性残基が外側へ向かいながら水に露出する部位に置かれるので、エネルギー的に有利な状態となるようにする。また、アルファ−ヘリックスペプチドの親水性残基は、蛋白質と結合する時、蛋白質表面のアミノ酸残基と親水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）をし、疎水性相互作用に加えてこのような親水性相互作用によって、アルファ−ヘリックスペプチドは、ターゲット蛋白質により強く結合することができる。したがって、好ましい一実施形態として、本発明では、アルファ−ヘリックス類似体化合物が疎水性置換基と親水性置換基を共に持たせて、自然界に存在するアルファ−ヘリックスの両親媒性の特徴を模倣することができる。これまで開発されたアルファ−ヘリックス類似化合物の中で両親媒性を有する化合物は開発されたことがほとんどない。
【００５９】
したがって、好ましい一実施形態として、本発明のアルファ−ヘリックス類似体化合物は、トリアジン−ピペラジンを中心構造として有し、かつ、３個の置換基（Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、またはＲ２、Ｒ３、Ｒ６）は主に疎水性相互作用により対象蛋白質との結合で重要な役割を果たし、これら３個の置換基の反対側に位置する２個の置換基（Ｒ１、Ｒ４）は親水性置換基が導入され、自然界に存在する両親媒性アルファ−ヘリックスの機能を効果的に模倣することによって、強力な蛋白質間相互作用の阻害剤として作用するようにデザインされる。図１は、上述した本発明のアルファ−ヘリックス類似体化合物の特性を概略的に示したものである。
【００６０】
図１に示されているように、本発明のトリアジン−ピペラジン−トリアジン骨格の化合物と従来報告されたターフェニル骨格の化合物をそれぞれエネルギー最小化された構造に製造した時、Ｃｌｏｇ  Ｐ（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｌｏｇ  Ｐｏｃｔａｎｏｌ／ｗａｔｅｒ）値が、本発明の化合物は１．３６６、従来のターフェニル骨格の化合物は６．２１となり、本発明の化合物がより改善された親水性性質を示して薬物と類似の特性を実現することを確認することができる。
【００６１】
本発明における置換基に対する定義において、用語「アルキル」は、脂肪族炭化水素ラジカルを意味する。アルキルは、アルケニルやアルキニル部位を含まない「飽和アルキル（ｓａｔｕｒａｔｅｄ  ａｌｋｙｌ）」であるか、少なくとも１つのアルケニルまたはアルキニル部位を含む「不飽和アルキル（ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ａｌｋｙｌ）」であってもよい。「アルケニル（ａｌｋｅｎｙｌ）」は、少なくとも１つの炭素−炭素の二重結合を含むグループを意味し、「アルキニル（ａｌｋｙｎｙｌ）」は、少なくとも１つの炭素−炭素の三重結合を含むグループを意味する。アルキルは、単独でまたはアルコキシと共に組み合わせて使用される場合にそれぞれ分枝状または直鎖状であってもよい。
【００６２】
アルキルグループは、別に定義しない限り、１〜２０個の炭素原子を有することができる。アルキルグループは、１〜１０個の炭素原子を有する中間サイズのアルキルでもよい。アルキルグループは、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキルでもよい。典型的なアルキルグループには、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、エテニル、プロペニル、ブテニルなどが含まれるが、これらにのみ限定されるものではない。例えば、Ｃ１−Ｃ４−アルキルは、アルキル鎖に１〜４個の炭素原子を有し、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔ−ブチルからなるグループより選択されてもよい。
【００６３】
用語「アルコキシ」は、別に定義しない限り、１〜１０個の炭素原子を有するアルキルオキシを意味する。例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｉｓｏ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシなどがある。
【００６４】
用語「シクロアルキル」は、別に定義しない限り、飽和脂肪族３〜１０員環を意味する。典型的なシクロアルキルグループには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれるが、これらにのみ限定されるものではない。
【００６５】
用語「アリール（ａｒｙｌ）」は、共有パイ電子系を有する少なくとも１つの環を含み、例えば、モノサイクリックまたは融合環ポリサイクリック（つまり、炭素原子の隣接した対を分け合う環）グループを含む。つまり、本明細書において、アリールは、別に定義しない限り、フェニル、ナフチルなどを含む４〜１０員、好ましくは６〜１０員芳香族モノサイクリックまたはマルチサイクリック環を意味することができる。
【００６６】
用語「ヘテロアリール」は、別に定義しない限り、Ｎ、ＯおよびＳからなるグループより選択された１〜３個のヘテロ原子を含み、ベンゾまたはＣ３−Ｃ８シクロアルキルと融合可能な芳香族３〜１０員環、好ましくは４〜８員環、より好ましくは５〜６員環を意味する。モノサイクリックヘテロアリールの例としては、チアゾール、オキサゾール、チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、イソオキサゾール、イソチアゾール、ピラゾール、トリアゾール、トリアジン、チアジアゾール、テトラゾール、オキサジアゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、およびこれと類似のグループが挙げられるが、これらに制限されるわけではない。ビサイクリックヘテロアリールの例としては、インドール、インドリン、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、ベンゾジオキソール、ベンズイミダゾール、ベンゾキサゾール、ベンズイソキサゾール、ベンズチアゾール、ベンズチアジアゾール、ベンズトリアゾール、キノリン、イソキノリン、プリン、フロピリジン、およびこれと類似のグループが挙げられるが、これらに制限されるわけではない。
【００６７】
用語「ヘテロサイクル」は、別に定義しない限り、Ｎ、ＯおよびＳからなるグループより選択された１〜３個のヘテロ原子を含み、ベンゾまたはＣ３−Ｃ８シクロアルキルと融合してもよく、飽和しているかもしくは１または２個の二重結合を含む３〜１０員環、好ましくは４〜８員環、より好ましくは５〜６員環を意味する。ヘテロサイクルの例としては、ピロリン、ピロリジン、イミダゾリン、イミダゾリジン、ピラゾリン、ピラゾリジン、ピラン、ピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、ヒドロフランなどが挙げられるが、これらにのみ限定されるものではない。
【００６８】
用語「アリールアルキル」は、アリール基で追加的に置換されたＣ１−Ｃ４アルキレン、例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−などを意味し、例えば、ベンジル、フェネチレンなどがある。
【００６９】
用語「シクロアルケニル」は、４〜１０個の環炭素および１個以上の二重結合を含有する非芳香族環ラジカルを示し、一部の実施態様は、４〜６個の炭素を含有し、一部の実施態様は、４または５個の炭素を含有し、一部の実施態様は、４個の炭素を含有する。例としては、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニルなどがある。
【００７０】
用語「シクロアルキル」は、３〜１０個の炭素を含有する飽和した環ラジカルを示し、一部の実施態様は、３〜６個の炭素を含有し、一部の実施態様は、３〜５個の炭素を含有し、一部の実施態様は、５〜７個の炭素を含有し；一部の実施態様は、３または４個の炭素を含有する。例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなどがある。
【００７１】
用語「ハロゲン」または「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード基を示す。
【００７２】
用語「ハロアルキル」は、アルキルが１個のハロゲンで置換乃至完全置換された、本願に定義されたＣ１−６アルキル基を示し、完全置換されたＣ１−６ハロアルキルは、化学式ＣｎＬ２ｎ＋１（ここで、Ｌは、ハロゲンであり、ｎは、１、２、３、４、５または６である）で表されてもよく、１個以上のハロゲンが存在する場合、これらは同一であるかまたは異なっていてもよく、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群より選択されてもよい。ハロアルキル基の例としては、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロジフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、ペンタフルオロエチルなどがあるが、これらに制限されない。
【００７３】
用語「アミノ」は、−ＮＨ２基を示す。
【００７４】
用語「ベンジル」は、基−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５を示す。
【００７５】
用語「カルボキシ」または「カルボキシル」は、基−ＣＯ２Ｈ基を示し、また、カルボン酸基と称することもある。
【００７６】
用語「ヒドロキシル」は、基−ＯＨ基を示す。
【００７７】
用語「ニトロ」は、基−ＮＯ２基を示す。
【００７８】
本願に使用される用語「オキソ」は、置換体＝Ｏを称するので、炭素がオキソ基によって置換された場合、炭素およびオキソから共に生成された新たな基は、カルボニル基である。
【００７９】
用語「フェノキシ」は、Ｃ６Ｈ５Ｏ−基を示す。
【００８０】
用語「フェニル」は、Ｃ６Ｈ５−基を示す。
【００８１】
用語「スルホンアミド」は、−ＳＯ２ＮＨ２基を示す。
【００８２】
その他本明細書で使用された用語と略語は、別に定義されない限り、本発明の属する技術分野における当業者に通常理解される意味として解釈される。
【００８３】
本発明に係る化合物はまた、薬学的に許容される塩を形成することができる。このような「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容される陰イオンを含有する無毒性酸付加塩を形成する酸、例えば、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などのような無機酸；酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、サリチル酸などのような有機カルボン酸；メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などのようなスルホン酸などによって形成された酸付加塩が含まれる。また、薬学的に許容される塩基付加塩、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどによって形成されたアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩；リシン、アルギニン、グアニジンなどのアミノ酸塩；ジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、ジエタノールアミン、コリン、トリエチルアミンなどのような有機塩などが含まれる。本発明に係る化合物は、通常の方法によってその塩に転換され、塩の製造は、別途の説明なくても前記化学式の構造に基づいて当業者によって容易に行われる。
【００８４】
もう一つの態様として、本発明は、トリアジン−ピペラジン−トリアジンを中心構造とするアルファ−ヘリックス類似体化合物の製造方法に関する。
【００８５】
一例として、本発明の製造方法は、次の段階を含むことができる：
アミン（ＮＨ２）で改質されたポリマービーズに化学式ａの化合物を結合して、化学式ｂの化合物を製造する段階、
前記化学式ｂの化合物に２−ニトロベンゼンスルホニルで保護された化学式ｃの化合物をカップリングさせて、化学式ｄの化合物を製造する段階、
前記化学式ｄの化合物から２−ニトロベンゼンスルホニル保護基を除去した後、化学式ｅの化合物を導入して、化学式ｆの化合物を製造する段階、
前記化学式ｆの化合物のクロライド位にアミン基（Ｒ２’Ｒ２”ＮＨ）を置換させる段階、および
アミン（ＮＨ２）で改質されたポリマービーズを除去する段階。
［化学式ａ］
【化１８】
0006349456.tif 000027
［化学式ｂ］
【化１９】
0006349456.tif 000028
［化学式ｃ］
【化２０】
0006349456.tif 000029
［化学式ｄ］
【化２１】
0006349456.tif 000030
［化学式ｅ］
【化２２】
0006349456.tif 000031
［化学式ｆ］
【化２３】
0006349456.tif 000032
【００８６】
前記製造方法により、本発明で提供するアルファ−ヘリックス類似体化合物を非常に簡単な固体相合成法で製造することができ、アミン（ＮＨ２）で改質されたポリマービーズに複数段階の順次的なカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）反応により所望の化合物を平均９２％の収率で得ることができた。前記製造方法を図２に基づいてより詳細に説明すれば、第１段階として、単一置換されたジクロロトリアジン（“３”）をＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡレジン上にローディングしてレジンに結合させて、レジンに結合されたトリアジン誘導体“４”を生成することができる。第２段階として、２−ニトロベンゼンスルホニル（Ｎｓ）で保護されたピペラジン誘導体（“５”）をレジンに結合されたトリアジン誘導体（“４”）にカップリングさせて、化合物“６”を製造することができる。第３段階として、前記カップリングされた化合物（“６”）からＮ−Ｎｓ保護基を除去した後、これに２−エチルアミノ−４，６−ジクロロ−［１，３，５］トリアジン（“７”）を導入して、化合物“８”を製造することができる。第４段階として、前記製造された化合物（“８”）のクロライド位に多様なアミン基（Ｒ２Ｒ２’ＮＨ）を代替してもよい。第５段階として、ＴＦＡ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を加えて切断反応を行って、３個の置換基で機能化された化合物“９”を製造することができる。
【００８７】
もう一つの態様として、本発明は、フェニル−ピペラジン−トリアジンを中心構造とするアルファ−ヘリックス類似体化合物の製造方法に関する。
【００８８】
アミン（ＮＨ２）で改質されたポリマービーズに４−フルオロ−３−ニトロ安息香酸を結合して、化学式ｂ’の化合物を製造する段階、
前記化学式ｂ’の化合物に２−ニトロベンゼンスルホニルで保護された化学式ｃ’の化合物をカップリングさせて、化学式ｄ’の化合物を製造する段階、
前記化学式ｄ’の化合物から２−ニトロベンゼンスルホニル保護基を除去した後、化学式ｅ’の化合物を導入して、化学式ｆ’の化合物を製造する段階、
前記化学式ｆ’の化合物のクロライド位にアミン基（Ｒ３ＮＨ）を置換させてニトログループを還元させて、化学式ｇ’の化合物を製造する段階、
前記化学式ｇ’の化合物にＲ１官能基を導入して、化学式ｈ’の化合物を製造する段階、および
アミン（ＮＨ２）で改質されたポリマービーズを除去する段階。
［化学式ｂ’］
【化２４】
0006349456.tif 000033
［化学式ｃ’］
【化２５】
0006349456.tif 000034
［化学式ｄ’］
【化２６】
0006349456.tif 000035
［化学式ｅ’］
【化２７】
0006349456.tif 000036
［化学式ｆ’］
【化２８】
0006349456.tif 000037
［化学式ｇ’］
【化２９】
0006349456.tif 000038
［化学式ｈ’］
【化３０】
0006349456.tif 000039
【００８９】
前記製造方法により、本発明で提供するアルファ−ヘリックス類似体化合物を非常に簡単な固体相合成法で製造することができ、アミン（ＮＨ２）で改質されたポリマービーズに複数段階の順次的なカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）反応により所望の化合物を平均９０％の収率で得ることができた。
【００９０】
もう一つの態様として、本発明は、前記アルファ−ヘリックス類似体化合物またはその塩を含む、蛋白質および蛋白質間の相互作用を抑制するための組成物に関する。
【００９１】
もう一つの態様として、本発明は、前記アルファ−ヘリックス類似体化合物またはその塩を目的蛋白質に処理する段階を含む、蛋白質および蛋白質間の相互作用を抑制する方法に関する。
【００９２】
もう一つの態様として、本発明は、前記アルファ−ヘリックス類似体化合物またはその塩を含む、蛋白質および蛋白質間の相互作用を探知するための組成物に関する。
【００９３】
もう一つの態様として、本発明は、前記アルファ−ヘリックス類似体化合物またはその塩を目的蛋白質に処理する段階を含む、蛋白質および蛋白質間の相互作用を探知する方法に関する。
【００９４】
本発明で提供するアルファ−ヘリックス類似体化合物は、自然界に存在するアルファ−ヘリックスペプチドの構造を模倣し、アルファ−ヘリックスペプチドの機能を効果的に模倣することによって、強力な蛋白質−蛋白質間相互作用の阻害剤として用いられる。また、ターゲット蛋白質と結合する性質を利用して、蛋白質および蛋白質間の相互作用を探知するための探針として用いられる。
【００９５】
本発明では、本発明のアルファ−ヘリックス類似体化合物を含むライブラリーが提供される。前記ライブラリーは、トリアジン−ピペラジンの中心構造を有し、両親媒性を示すアルファ−ヘリックス類似体化合物から構成されており、ターゲット蛋白質の種類によって、これに特異的に結合する化合物をスクリーニングすることができる。これらのターゲット蛋白質は、抗体、酵素、受容体または細胞株になってもよいが、これに制限されるわけではない。
【００９６】
本発明において、蛋白質および蛋白質間の相互作用とは、蛋白質および蛋白質間の結合、または蛋白質および蛋白質間の凝集を含む。このような相互作用は、例えば、２つの膜−結合された蛋白質の間、膜−結合された蛋白質と細胞質性蛋白質との間（例えば、受容体とリガンド）、細胞質性蛋白質の間などにおいてあり得る。好ましくは、アルファ−ヘリックス構造を通して起こる蛋白質−蛋白質の相互作用に対して本発明が適用可能である。
【００９７】
本発明の具体的な実施例では、ＭＣＬ−１（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ−１）蛋白質とＢＣＬ−２（Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ２）蛋白質との間の相互作用（つまり、蛋白質間の結合）と、アルファ−シヌクレイン蛋白質間の相互作用（つまり、蛋白質間の凝集）を対象にかかる相互作用を阻害および探知するアルファ−ヘリックス類似体化合物をスクリーニングした結果を示したが、これは代表的な例示に過ぎず、本発明の範囲がこれに制限されるわけではない。
【００９８】
もう一つの態様として、本発明は、前記アルファ−ヘリックス類似体化合物またはその塩を含む、アルファ−ヘリックスによって媒介される疾患治療用薬学組成物に関する。
【００９９】
もう一つの態様として、本発明は、前記アルファ−ヘリックス類似体化合物またはその塩の有効量を個体に投与する段階を含む、アルファ−ヘリックスによって媒介される蛋白質間の相互作用に関連する疾患を治療する方法に関する。
【０１００】
一例として、本発明は、下記の化学式４〜化学式６、化学式９および化学式１０の化合物からなる群より選択される１種以上の化合物または薬学的に許容されるその塩を含む、癌の予防または治療用薬学組成物に関し、他の例として、下記の化学式４〜化学式６、化学式９および化学式１０の化合物からなる群より選択される１種以上の化合物または薬学的に許容されるその塩の有効量を個体に投与する段階を含む、癌の治療方法に関する：
［化学式４］
【化３１】
0006349456.tif 000040
［化学式５］
【化３２】
0006349456.tif 000041
［化学式６］
【化３３】
0006349456.tif 000042
［化学式９］
【化３４】
0006349456.tif 000043
式中、
Ｒ１およびＲ４は、それぞれ独立に、−ＮＲ８Ｒ９または−ＯＲ１０であり、
この時、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立に、水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロサイクル、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリール、−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリールであって、ｍは、０〜３の整数であり、前記それぞれは、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ３−６シクロアルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、Ｃ３−Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ１０ヘテロサイクリック、−Ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリール、−Ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリール、カルボキシ、グアニジル、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、フェニル、フェノキシ、オキソ、およびスルホンアミドから独立に選択される１〜５個の置換体で置換されていてもよく、
前記Ｒ８およびＲ９は、これらと結合するＣ、ＮまたはＯ原子と共に互いに結合して環を形成してもよく、および
Ｒ１０は、水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロサイクル、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）アリール、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリールであって、ｎは、０〜３の整数であり、前記それぞれは、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ３−６シクロアルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、カルボキシ、ヒドロキシル、アミノ、オキソ、フェニル、およびフェノキシから独立に選択される１〜５個の置換体で置換されていてもよい。
［化学式１０］
【化３５】
0006349456.tif 000044
【０１０１】
ＭＣＬ−１（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ−１）は、抗−アポトーシス活性を有するＢＣＬ−２（Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ２）ファミリー蛋白質の１つで、ＢＡＫのようなＢＨ３（ＢＣＬ−２  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｏｍａｉｎ３）ファミリー蛋白質と相互作用をすることによって、ＢＨ３による細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を抑制し、細胞を生存させる役割を果たす。したがって、癌細胞内でＭＣＬ−１蛋白質とＢＨ３蛋白質との間の相互作用を防止すれば、効果的に癌の生存を防止できるため、非常に有望な抗癌戦略と評価されている。
【０１０２】
そこで、本発明では、トリアジン−ピペラジン−トリアジン系の化合物が蛋白質間の相互作用を抑制するアルファ−ヘリックス類似体として役割を果たせるかを証明するために、本発明で構築したライブラリーからＢＨ３蛋白質およびＭＣＬ−１蛋白質間の相互作用を阻害する化合物を選別することとした。ＭＣＬ−１／ＢＨ３蛋白質の相互作用を阻害するアルファ−ヘリックス類似体化合物を選別するために、本発明者らは、トリアジン−ピペラジン−トリアジンの中心構造を有する化合物ライブラリーをポリマービーズ上で構築し、図４に示したビーズ上のスクリーニング（ｏｎ−ｂｅａｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）方法を用いて、ＭＣＬ−１蛋白質に直接結合する化合物を選別した。
【０１０３】
その結果、化学式４〜６の化合物がＭＣＬ−１に結合し、ＭＣＬ−１とＢＨ３蛋白質との間の相互作用を阻害することが確認され、これらの化合物が癌細胞の死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導することが確認された（図６〜図１０）。さらに、本発明では、化学式６の化合物のＲ４およびＲ５位に多様な親水性基を導入してＭＣＬ−１との結合力が増進した誘導体を多量確保することができ（図１１および図１２）、当該誘導体を化学式９で表した。
【０１０４】
また、そこで、本発明では、フェニル−ピペラジン−トリアジン系の化合物が蛋白質間の相互作用を抑制するアルファ−ヘリックス類似体として役割を果たせるかを証明するために、本発明で構築したライブラリーからＢＨ３蛋白質およびＭＣＬ−１蛋白質間の相互作用を阻害する化合物として、化学式１０の化合物を選別した。化学式１０の化合物がＭＣＬ−１に結合し、ＭＣＬ−１とＢＨ３蛋白質との間の相互作用を阻害することが確認され、これらの化合物が癌細胞の死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導することが確認された（図１６および図１７）。
【０１０５】
したがって、化学式４〜６および化学式９、１０の化合物を癌の予防または治療物質として用いることができる。
【０１０６】
さらに他の例として、本発明は、下記の化学式７および化学式８の化合物からなる群より選択される１種以上の化合物または薬学的に許容されるその塩を含む、パーキンソン疾患の予防または治療用薬学組成物に関し、他の例として、下記の化学式７および化学式８の化合物からなる群より選択される１種以上の化合物または薬学的に許容されるその塩の有効量を個体に投与する段階を含む、パーキンソン疾患の治療方法に関する：
［化学式７］
【化３６】
0006349456.tif 000045
［化学式８］
【化３７】
0006349456.tif 000046
【０１０７】
アルファ−シヌクレインの凝集は、レビー小体（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ）の形成を誘導し、これは、パーキンソン疾患の病理的特性として知られている。そこで、本発明では、本発明で開発したアルファ−ヘリックス類似体化合物がアルファ−シヌクレインのフォールディング構造を安定化してアルファ−シヌクレインの凝集を阻害できるかを証明するために、本発明で構築したライブラリーからアルファ−シヌクレインの凝集を阻害する化合物を選別することとした。その結果、化学式７〜８の化合物がアルファ−シヌクレインに結合し、アルファ−シヌクレインの凝集を阻害することが確認された（図１３および図１４）。
【０１０８】
したがって、化学式７〜８の化合物をパーキンソン疾患の予防または治療物質として用いることができる。
【０１０９】
前記組成物は、薬学的組成物の製造に通常使用する適切な担体、賦形剤、および希釈剤をさらに含んでもよく、通常の方法により、酸剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤、または滅菌注射溶液などの形態に剤形化して用いられる。
【０１１０】
前記組成物を製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤、または賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、酸剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、少なくとも１種以上の賦形剤および／または潤滑剤などを含んでもよい。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが相当するが、俗に使用される単純希釈剤の水、リキッドパラフィンのほか、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれてもよい。
【０１１１】
前記組成物の好ましい投与量は、患者の状態および体重、疾病の程度、薬物の形態、投与経路および期間に応じて異なるが、当業者によって適宜選択可能である。より好ましい効果のために、本発明の組成物の投与量は、有効成分を基準として、１日０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇとするのが良いが、これに制限されるわけではない。投与は、１日に１回投与してもよく、数回分けて投与してもよい。本発明の組成物は、動物、好ましくは、ヒトを含む哺乳動物に多様な経路で投与される。投与の全ての方式は予想できるが、例えば、経口、静脈、筋肉、皮下注射などによって投与される。本発明の組成物の薬学的投与形態は、有効成分の薬学的許容可能な塩の形態としても用いられ、また、単独でまたは他の薬学的活性化合物と結合だけでなく、適当な集合として用いられる。
【実施例】
【０１１２】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明を例示するに過ぎず、本発明が下記の実施例によって限定されるものではない。
【０１１３】
実施例１．トリアジン−ピペラジン−トリアジンを中心構造とするアルファ−ヘリックス類似体化合物の製造
１−１．実験材料の準備
ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｂ  ＮＨ２／Ｂｏｃレジン（１３０μｍ、０．２５ｍｍｏｌ／ｇ）およびＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ  ＮＨ２レジン（１３０μｍ、０．２９ｍｍｏｌ／ｇ）はＲａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅから購入した。Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡレジン（０．９６ｍｍｏｌ／ｇ）はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから購入した。ＬＣ−ＭＳ（ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００  ＬＣ／ＭＳシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でＣ１８逆相カラム（Ｋｉｎｅｔｅｘ、２μｍ、４．６ｍｍ＊５０ｍｍ）を用いて行った。流速０．８ｍＬ／ｍｉｎで、９０％Ａ溶媒の勾配溶離（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｅｌｕｔｉｏｎ）で２分間および１００％Ｂ溶媒で１４分間行った（Ａ溶媒は９５％水、５％メタノール、０．０１％ＴＦＡ；Ｂ溶媒はメタノール、０．０１％ＴＦＡ）。ＨＰＬＣ精製は、Ａｇｉｌｅｎｔ１１２０  Ｃｏｍｐａｃｔ  ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でＣ１８逆相カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５μｍ、２５ｍｍ＊１２５ｍｍ）を用いて行った。４０分ごとに溶媒の組成を変えながら、１０％Ｂ溶媒から１００％Ｂ溶媒を用いてｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔを用いた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳは、ＡＢＩ４８００およびＡＢＩ５８００質量分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行い、基質としてはα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を用いた。
【０１１４】
１−２．固体相合成法によるアルファ−ヘリックス類似体化合物の製造
トリアジン−ピペラジン−トリアジン系の化合物を合成するために、図２に示しているような固体相合成法を開発した。アミン（ＮＨ２）で改質されたポリマービーズに５段階の順次的なカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）反応により所望の化合物を平均９２％の収率で得ることができた。
【０１１５】
図２を基準として説明すれば、第１段階として、単一置換されたジクロロトリアジン（“３”）をＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡレジン上にローディングしてレジンに結合させて、レジンに結合されたトリアジン誘導体“４”を生成した。第２段階として、２−ニトロベンゼンスルホニル（Ｎｓ）で保護されたピペラジン誘導体（“５”）をレジンに結合されたトリアジン誘導体（“４”）にカップリングさせて、化合物“６”を製造した。第３段階として、前記カップリングされた化合物（“６”）からＮ−Ｎｓ保護基を除去した後、これに２−エチルアミノ−４，６−ジクロロ−［１，３，５］トリアジン（“７”）を導入して、化合物“８”を製造した。第４段階として、前記製造された化合物（“８”）のクロライド位に多様なアミン基（Ｒ２’Ｒ２”ＮＨ）を代替させた。第５段階として、ＴＦＡ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を加えて切断反応を行って、３個の置換基で機能化された化合物“９”を製造した。
【０１１６】
以下、前記製造過程をより詳細に説明する。
【０１１７】
Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡレジン（１００ｍｇ、６９μｍｏｌ）を５ｍＬ  ｆｒｉｔｔｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ内のＤＭＦ（２ｍＬ）で１時間処理し、ＤＭＦ（２Ｘ１０ｍｉｎ）で２０％ピペリジンを処理してＦｍｏｃ基を除去した。ＤＭＦ（３Ｘ）、ＭｅＯＨ（２Ｘ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ）、およびＤＭＦ（３Ｘ）で洗浄した後、単置換されたジクロロトリアジン（“３”）をレジンにローディングさせるために、ＤＭＦ（１ｍＬ）でＥｔ３Ｎ（５ｅｑｕｉｖ）と室温で一晩反応させた。２−ニトロベンゼンスルホニル（Ｎｓ）で保護されたピペラジン誘導体（“５”）（１０ｅｑｕｉｖ）をレジンに結合されたトリアジン誘導体（“４”）にカップリングさせるために、ＤＭＦでＥｔ３Ｎ（５ｅｑｕｉｖ）の存在下に６０℃で一晩反応させた。特別な言及がない限り、各反応段階の最後の過程でレジンをＤＭＦ（３Ｘ）、ＭｅＯＨ（２Ｘ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ）、およびＤＭＦ（３Ｘ）で完全に洗浄した。前記カップリングされた化合物（“６”）からＮ−Ｎｓ保護基を除去するために、ＤＭＦで２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（２０ｅｑｕｉｖ）およびＤＢＵ（１０ｅｑｕｉｖ）と室温で２時間反応させた。次に、２−エチルアミノ−４，６−ジクロロ−［１，３，５］トリアジン（“７”）を導入して、化合物“８”を製造するために、ＮＭＰで化合物７（５ｅｑｕｉｖ）およびＤＩＥＡ（５ｅｑｕｉｖ）をビーズに処理して、６０℃で一晩反応させた。前記製造された化合物（“８”）のクロライド位に多様なアミン基（Ｒ２’Ｒ２”ＮＨ）を代替させた。最後に、ＴＦＡ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を加えて切断反応を行って、３個の置換基で機能化されたトリアジン−ピペラジン−トリアジン化合物“９”を製造した。
【０１１８】
前記固体相合成法で合成された化合物の純度（ｐｕｒｉｔｙ）と特徴（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）をＬＣ−ＭＳで確認した結果、最終物の平均純度が９２％以上となり、前記固体相合成法の効率を確認することができた。
【０１１９】
［表２］代表的な最終化合物４０種の質量（Ｍａｓｓ）および精製（ｐｕｒｉｔｙ）データ
【表２】
0006349456.tif 000047
0006349456.tif 000048
【０１２０】
実施例２．トリアジン−ピペラジン−トリアジンを中心構造とするアルファ−ヘリックス類似体化合物ライブラリーの構築
本発明では、アミン（ＮＨ２）で改質されたポリマービーズを用いて、トリアジン−ピペラジン−トリアジンを中心構造とするアルファ−ヘリックス類似体化合物ライブラリーを構築し、これをＯＢＯＣ（ｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）ライブラリーと名付けた。その過程を図３に示した。
【０１２１】
図３に示されているように、本発明では、ビーズの表面（ｅｘｔｅｒｉｏｒ）にはＢＯＣ（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）基で保護されたアミンが結合され、ビーズの内側（ｉｎｔｅｒｉｏｒ）にはアミン（ｆｒｅｅａｍｉｎｅ）が結合されている、ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌビーズを用いた。前記ビーズの表面では、実施例１に記載した固体相合成法に基づいてアルファ−ヘリックス類似体を合成し、前記合成過程でアルファ−ヘリックス類似体に置換基が導入されるたびに、同時に各置換基に相応するペプトイド残基を１つずつビーズの内側に連結させて、最終的に１つのビーズに２種類の化合物が結合するようにした。言い換えると、ビーズの表面上にはアルファ−ヘリックス類似体が存在し、ビーズの内側には前記アルファ−ヘリックス類似体に特異的なペプトイドが存在するようにした。このペプトイドは、ビーズの表面に結合されたアルファ−ヘリックス類似体の構造を知らせるｃｏｄｉｎｇ  ｔａｇの役割を果たす。場合によっては、アルファ−ヘリックス類似体の各置換基に相当するペプトイドの置換基が同一の場合もあるが、アルファ−ヘリックス類似体の置換基が二次アミンであるか、ピペラジンに相当する場合、ペプトイドの置換基は異なるものを使用するようにした。
【０１２２】
この方式で、本発明では、Ｒ５置換基１８種、Ｒ３置換基３種、およびＲ２置換基２７種をそれぞれペプトイドでタギングして多様な組み合わせのアルファ−ヘリックス類似体を製造し、その結果、計１，４５８種（＝１８Ｘ３Ｘ２７）の化合物を含むライブラリーを構築することができた。
【０１２３】
［表３］ライブラリー合成のためにペプトイドタグを結合させた置換基の構造。括弧内の構造は、各置換基が同一でない場合、コーディングペプトイド合成のために用いたアミン類を示す。
【表３】
0006349456.tif 000049
0006349456.tif 000050
【０１２４】
このように構築されたアルファ−ヘリックス類似体化合物ライブラリーは、ビーズ上の高効率スクリーニングに用いられる。その過程を図４に示した。
【０１２５】
図４に示されているように、標的蛋白質とのビーズ上のスクリーニング過程で、ビーズ表面のアルファ−ヘリックスはターゲット蛋白質に露出するが、ビーズ内側のペプトイドは露出しない。スクリーニング後、ビーズ表面のアルファ−ヘリックス類似体の構造は、ビーズ内部のペプトイドのｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇにより分析が可能である。
【０１２６】
以下、前記製造過程をより詳細に説明する。
【０１２７】
ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｂ  ＮＨ２／Ｂｏｃレジン（２５０ｍｇ、ＮＨ２：６２．５μｍｏｌ／Ｂｏｃ：１．３μｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２ｍＬ）で２時間処理した。ＤＭＦ（１ｍＬ）中、ＨＯＢｔ（５ｅｑｕｉｖ）、ＨＢＴＵ（５ｅｑｕｉｖ）、およびＤＩＥＡ（１０ｅｑｕｉｖ）の存在下、ビーズにＦｍｏｃ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ（Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ）（５ｅｑｕｉｖ）を処理し、室温で反応させた。２時間撹拌後、反応混合物を取り出し、ＤＭＦ（３Ｘ）、ＭｅＯＨ（２Ｘ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ）、およびＤＭＦ（３Ｘ）で洗浄した。次に、同様のペプチドカップリングの条件を用いて、Ｆｍｏｃ−４−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ（Ａｂｕ）（５ｅｑｕｉｖ）を添加した。前記過程を２回繰り返して３個のＡｂｕリンカー残基をカップリングした。Ｆｍｏｃを脱保護させた後、結果物のアミンに、室温でＤＭＦ（２ｍＬ）で１Ｍ  ｂｒｏｍｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄおよび１Ｍ  ＤＩＣを処理してブロモアセチル化させた。ビーズを同量で１８ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｖｅｓｓｅｌに分けて、各部分に１８個の他のアミン（２Ｍ  ａｍｉｎｅ  ｉｎ  ２ｍＬ  ＤＭＦ）を処理して、室温で２時間反応させた。ペプトイドのＮ−末端をａｌｌｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ（Ａｌｌｏｃ）ｇｒｏｕｐで保護させるために、無水ＣＨ２Ｃｌ２中、ａｌｌｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ（５ｅｑｕｉｖ）およびＥｔ３Ｎ（６ｅｑｕｉｖ）を処理して、４℃で一晩反応させた。ビーズ表面のＢｏｃグループを除去するために、ＣＨ２Ｃｌ２中、５０％ＴＦＡを処理して１時間反応させた。結果物の一次アミンを１８個の他の単一置換されたトリアジン誘導体（“４”）（５ｅｑｕｉｖ）とカップリングした。ＤＭＦ（３Ｘ）、ＭｅＯＨ（２Ｘ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ）、およびＮＭＰ（３Ｘ）で完全に洗浄した後、全てのビーズを２５０ｍＬ  ｖｅｓｓｅｌに混合してランダム化し、３ｖｅｓｓｅｌに分けた。トリアジンのクロライドを３個の他のピペラジンに置換させるために、ＤＩＥＡ（１０ｅｑｕｉｖ）中、Ｂｏｃ保護されたピペラジン（１０ｅｑｕｉｖ）およびＮＭＰ（１ｍＬ）を処理して、６０℃で一晩反応させた。ＤＭＦ（３Ｘ）、ＭｅＯＨ（２Ｘ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ）で洗浄した後、Ａｌｌｏｃグループを除去するために、無水ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）中、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（０．２ｅｑｕｉｖ）およびＰｈＳｉＨ３（１０ｅｑｕｉｖ）を処理した。ｓｕｂｍｏｎｏｍｅｒ  ｒｏｕｔｅを用いて、２番目のペプトイド残基（Ｒ２”）をカップリングさせた。ビーズを再び混合してランダム化した。ブロモアセチル化（ｂｒｏｍｏａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）後、ビーズを２７ｖｅｓｓｅｌに分けて、２７個の他のアミンと反応させた。ペプトイドのＮ−末端をブロモアセチル化およびそれに続くピペリジンとの反応でｂｌｏｃｋした。次に、Ｂｏｃグループを除去するために、ＣＨ２Ｃｌ２中、５０％ＴＦＡを処理して１時間反応させた。ＤＭＦ中、１０％ＤＩＥＡで中和した後、ビーズに、ＮＭＰ中、ＤＩＥＡと４，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅを添加して、６０℃で一晩反応させた。ＤＭＦ（３Ｘ）、ＭｅＯＨ（２Ｘ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ）で洗浄し���後、全てのビーズを混合し、９５％ＴＦＡを処理して、グローバル脱保護（ｇｌｏｂａｌ  ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）した。切断のために、各ビーズに対して、ＡＣＮ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（５：４：１）中、２０μＬ  ＣＮＢｒ（４０ｍｇ／ｍＬ）を処理し、室温で１２時間反応させた。
【０１２８】
ライブラリー合成の効率を確認するために、ライブラリーから３０個のビーズをランダムに選んだ。ＣＮＢｒによる切断反応後、結果物のペプトイドをＭＳで分析した。表面にあるアルファ−ヘリックス類似分子は切断されず、単にメチオニンを介してビーズに付着したペプトイドのみＣＮＢｒ処理によって放出された。実験対象の全てのビーズにおいて有意な不純物ピーク（ｉｍｐｕｒｉｔｙ  ｐｅａｋｓ）が現れず高い精製率を示し、ライブラリー合成の効率性を確認することができた。
【０１２９】
実施例３．ＢＨ３（ＢＣＬ−２  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｏｍａｉｎ３）蛋白質およびＭＣＬ−１（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ−１）蛋白質間の相互作用を阻害するアルファ−ヘリックス類似体化合物の選別および効能確認
３−１．化合物の選別
本発明では、トリアジン−ピペラジン−トリアジン系の化合物が蛋白質間の相互作用を抑制するアルファ−ヘリックス類似体として役割を果たせるかを証明するために、実施例２で構築したライブラリーからＢＨ３蛋白質およびＭＣＬ−１蛋白質間の相互作用を阻害する化合物を選別することとした。
【０１３０】
ＭＣＬ−１は、ＢＣＬ−２（Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ２）ファミリー蛋白質の１つで、ＢＨ３蛋白質と相互作用をすることによって、ＢＨ３による細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を抑制し、細胞を生存させる役割を果たす。したがって、癌細胞内でＢＣＬ−２蛋白質とＢＨ３蛋白質との間の相互作用を防止すれば、効果的に癌の生存を防止できるため、非常に有望な抗癌戦略と評価されている。
【０１３１】
ＭＣＬ−１／ＢＨ３蛋白質の相互作用を阻害するアルファ−ヘリックス類似体化合物を選別するために、本発明者らは、実施例２に記載しているように、化合物ライブラリーをポリマービーズ上で構築し、図４に示したビーズ上のスクリーニング（ｏｎ−ｂｅａｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）方法を用いて、ＭＣＬ−１蛋白質に直接結合する化合物を選別した。まず、ビーズに結合された化合物を含むライブラリー２５ｍｇ（〜０，２００ｂｅａｄｓ、〜ｃｏｐｉｅｓ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）を２００ｎＭのビオチン化されたＭＣＬ−１ΔＮΔＣ（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ＭＣＬ−１）と共に、４℃で一晩培養した。結合を形成していない蛋白質を洗い落とし、ストレプタビジンがカップリングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を処理して、磁力分離（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）によって陽性ビーズ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂｅａｄ）のみを選別した。一次スクリーニングにおいて、数百個のビーズが選別された。ストレプタビジンと結合されたビーズ（偽陽性の可能性あり）は、ＭＣＬ−１とスクリーニングする前に除去した。選別されたビーズは、１％ＳＤＳで加熱して結合された蛋白質を除去した。洗浄後、ビーズを再び１００ｎＭのビオチン化されたＭＣＬ−１ΔＮΔＣと共に、４℃で４時間培養し、ストレプタビジンが結合されたアルカラインホスファターゼで標識した。最適な化合物を選別するために、より厳しい条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；つまり、より少量の蛋白質およびより短い培養時間）で二次スクリーニングを実施した。次に、ビーズに５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートを処理して、アルカラインホスファターゼを比色検出（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）した。１０個の青色ビーズが候補化合物として分離された。各ビーズ由来のペプトイドをＭＳ／ＭＳで分析した結果、１０個のビーズが同一のペプトイド配列を含んでおり、大きく３種類のペプトイドに区分することができた。５個はペプトイド−１、３個はペプトイド−２、２個はペプトイド−３を含んでいた。
【０１３２】
【表４】
0006349456.tif 000051
【０１３３】
この結果は、ライブラリーに各化合物が７コピー程度ずつ含まれていたためと考えられ、これは、本発明で開発したスクリーニングシステムがよく作動していることを示すのである。前記３種類のペプトイドを分析した結果、選別された化合物は次の構造を有しており、これを９ａ（化学式４）、９ｂ（化学式５）および９ｃ（化学式６）でそれぞれ表した。これらの化合物をＨＰＬＣで分離し、水溶性であることを確認した（ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水で〜１００μｇ／ｍＬ溶解し、これは薬物としての使用時に経口吸収可能な程度の水溶解度の範囲を示すものである）。
［化学式４］
【化３８】
0006349456.tif 000052
［化学式５］
【化３９】
0006349456.tif 000053
［化学式６］
【化４０】
0006349456.tif 000054
【０１３４】
３−２．蛍光標識された化合物の合成
前記選別された化学式４〜６の化合物に蛍光を標識する過程を図５に示し、蛍光標識された化合物をそれぞれ９ａ−ＦＬ、９ｂ−ＦＬおよび９ｃ−ＦＬで表した。
【０１３５】
まず、ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ  ＮＨ２レジン（１００ｍｇ、２９μｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）で１時間処理した。ＤＭＦ（１ｍＬ）中、ＨＯＢｔ（５ｅｑｕｉｖ）、ＨＢＴＵ（５ｅｑｕｉｖ）、およびＤＩＥＡ（１０ｅｑｕｉｖ）の存在下、ビーズにＦｍｏｃ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ（Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ）（５ｅｑｕｉｖ）を処理し、室温で反応させた。２時間撹拌後、反応混合物を取り出して洗浄した。Ｆｍｏｃ保護基を除去するために、ＤＭＦ（１ｍＬ、２Ｘ１０ｍｉｎ）中、２０％ピペリジンを処理した。次に、同様のペプチドカップリングの条件下、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ａｂｕ−ＯＨをカップリングした。Ｆｍｏｃを脱保護させた後、ＤＭＦ中、ＤＩＥＡ（５ｅｑｕｉｖ）および単一置換されたジクロロトリアジンを処理して、室温で一晩反応させた。反応混合物を取り出し、ＤＭＦ（３Ｘ）、ＭｅＯＨ（２Ｘ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ）、およびＮＭＰ（３Ｘ）で洗浄した。ＮＭＰ（１ｍＬ）中、ビーズにＢｏｃ保護されたピペラジン誘導体（１０ｅｑｕｉｖ）およびＤＩＥＡ（１０ｅｑｕｉｖ）を添加した。混合物を６０℃で一晩かき混ぜた。洗浄後、Ｂｏｃ基を除去するために、ＣＨ２Ｃｌ２中、５０％ＴＦＡを１時間処理した。ＤＭＦ（１ｍＬ）中、１０％ＤＩＥＡでレジンを１時間中和した後、ＤＭＦ（３Ｘ）、ＭｅＯＨ（２Ｘ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ）、およびＮＭＰ（３Ｘ）で洗浄した。次に、ビーズに、ＮＭＰ中、ＤＩＥＡ（５ｅｑｕｉｖ）と４，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅを添加して、６０℃で一晩反応させた後、ＤＭＦ（３Ｘ）、ＭｅＯＨ（２Ｘ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ）、およびＮＭＰ（３Ｘ）で洗浄した。その後、レジンに、ＮＭＰ中、ＤＩＥＡ（２０ｅｑｕｉｖ）およびアミン（２０ｅｑｕｉｖ）を処理して、６０℃で一晩反応させた後、ＤＭＦ（３Ｘ）、ＭｅＯＨ（２Ｘ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ）で洗浄した。無水ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）中、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（０．２ｅｑｕｉｖ）およびＰｈＳｉＨ３（１０ｅｑｕｉｖ）を１時間処理してＡｌｌｏｃを脱保護化した後、ペプチドカップリングの条件を用いて、生成されたＬｙｓ残基上のＮＨ２を５，６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（５ｅｑｕｉｖ）とカップリングした。切断のために、ビーズに対して、ＡＣＮ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（５：４：１）中、２０μＬ  ＣＮＢｒ（４０ｍｇ／ｍＬ）を処理し、室温で１２時間反応させた。切断された粗生成物（ｃｒｕｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ）はＨＰＬＣで精製した。
【０１３６】
３−３．コンピュータを用いた分子ドッキング研究
化合物の構造は、Ｍａｅｓｔｒｏ（Ｍａｅｓｔｒｏ  ｖ９．０，Ｓｃｈｒｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて構築し、ＣＨＡＲＭＭ  Ｇｅｎ−ｅｒａｌ  Ｆｏｒｃｅ  Ｆｉｅｌｄ（Ｖａｎｏｍｍｅｓｌａｅｇｈｅ，Ｋ；Ｈａｔｃｈｅｒ，Ｅ．；Ａｃｈａｒｙａ，Ｃ．；Ｋｕｎｄｕ，Ｓ．；Ｚｈｏｎｇ，Ｓ．；Ｓｈｉｍ，Ｊ．；Ｄａｒｉａｎ，Ｅ．；Ｇｕｖｅｎｃｈ，Ｏ．；Ｌｏｐｅｓ，Ｐ．；Ｖｏｒｏｂｙｏｖ，Ｉ．；Ｍａｃｋｅｒｅｌｌ，Ａ．Ｄ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．２０１０，３１，６７１）を用いてエネルギー最小化を行った。ドッキングのためのリガンドと受容体の構造は、Ｒａｃｃｏｏｎ（Ｆｏｒｌｉ，Ｓ．Ｒａｃｃｏｏｎ：ａｕｔｏｄｏｃｋ  ＶＳ：ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ＡｕｔｏＤｏｃｋ  ｖｉｒｔｕａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｓ）を用いて予め分析した。ＢＨ３ヘリックス残基のｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｃｅｎｔｅｒを用いてドッキングボックスセンター（ｄｏｃｋｉｎｇ  ｂｏｘ  ｃｅｎｔｅｒ）を組織化し、ボックスのサイズをＸ、ＹおよびＺで２５に設定した。ＭＣＬ−１結晶構造（ＰＤＢ  ｅｎｔｒｙ：３ＭＫ８）でｐｏｓｅ  ｄｅｃｏｙを生成するために、各化合物に対して独立した２０ＡｕｔｏＤｏｃｋ  Ｖｉｎａ（Ｔｒｏｔｔ，Ｏ．；Ｏｌｓｏｎ，Ａ．Ｊ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．２０１０，３１，４５５）ドッキングを行った。各化合物に対して４００ｐｏｓｅ  ｄｅｃｏｙを得ており、最終モデルはｂｅｓｔ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｐｏｓｅで決定した。ソフトウェアＰｙＭｏｌを用いて分子構造を可視化した。
【０１３７】
３−４．蛋白質の精製
ヒトＭＣＬ−１ΔＮΔＣ蛋白質中、ＢＨ３−結合ドメイン（１７２−３２０番目のアミノ酸）をコーディングする発現プラスミドをＧＳＴでタギングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に導入した。１ｍＭ  ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を処理して蛋白質の発現を誘導した。細胞ペレットを溶解バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｔａｂｌｅｔ（Ｒｏｃｈｅ））に再懸濁させ、音波処理して溶解した。遠心分離後、細胞溶解物を５−ｍＬ  ＧＳＴｒａｐ  ＨＰ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用し、製造会社の指示に従って行った。ＭＣＬ−１蛋白質をトロンビンプロテアーゼによる切断反応により得ており、ＧＳＴを除去するために、ＧＳＴｒａｐ  ＨＰ  ｃｏｌｕｍｎを再びローディングし、サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。
【０１３８】
ＭＣＬ−１蛋白質をビオチニル化するために、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．３）中、ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に、室温で４５分間インキュベーティングした（実験に使用したＭＣＬ−１ΔＮΔＣ蛋白質は、表面に露出してＢＨ３結合活性部位と離れている複数のリシン残基を有しているため、変更（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）なくビオチニル化した）。１．５Ｍ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅを添加して反応を中断した。標識された蛋白質を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．４）を含有する１ｘＰＢＳバッファーで透析して分離した。標識の程度は製造者の指示に従って決定した（ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ：１．０５ｂｉｏｔｉｎ  ｐｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【０１３９】
３−５．蛍光偏光分析（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）
蛍光標識された化合物（５０ｎＭ）をｂｌａｃｋ  Ｃｏｓｔａｒ３８４−ウェルプレート内で最終濃度が６０μＭに調整された結合バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を用いて、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣまたはＢＣＬ−ＸＬΔＣと共に、常温で暗存在下、３０分間インキュベーションした。蛍光偏光値は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５  Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈは４８５ｎｍとし、ｅｍｉｓｓｉｏｎは５３５ｎｍで測定した。ＫＤはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４  ｓｏｆｔｗａｒｅで計算した。競争的蛍光偏光分析（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）のために、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣをＦＩＴＣ−ｌａｂｅｌｅｄ  ＭＣＬ−１  ＢＨ３  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＦＩＴＣ−ＭＣＬ−１−ＢＨ３  ｐｅｐｔｉｄｅ）に置き換えた。Ｎ−末端標識されたＦＩＴＣ−ＭＣＬ−１−ＢＨ３  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＦＩＴＣ−Ａｂｕ−ＫＡＬＥＴＬＲＲＶＧＤＧＶＱＲＮＨＥＴＡＦ−ＮＨ２）を合成し、ＨＰＬＣで精製した。多様な濃度の化合物を、ＦＩＴＣ−ＭＣＬ−１−ＢＨ３（５０ｎＭ）を０．８μＭ  ＭＣＬ−１ΔＮΔＣと共に、結合バッファー内で３０分間インキュベーションした後、ＦＩＴＣ−ＭＣＬ−１−ＢＨ３（５０ｎＭ）を添加した。多様な濃度の化合物を添加して３０分間インキュベーションした後、蛍光偏光値を測定した。Ｋｉ値は以前に知られた方法通りに計算した（Ｎｉｋｏｌｏｖｓｋａ−Ｃｏｌｅｓｋａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌ．ＢｉｏＣｈｅｍ．２００４，３３２，２６１）。
【０１４０】
３−６．細胞生存力分析（Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ）
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳが含まれているＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、４Ｘ１０４細胞を１００μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内の９６−ウェルプレートにシーディングした。ＷＳ−１細胞は、１０％ＦＢＳが含まれているＭＥＭ培地で培養し、２Ｘ１０４細胞を１０％ＦＢＳが含まれている１００μＬ  ＭＥＭ培地内の９６−ウェルプレートに２４時間プレーティングし、ＰＢＳで洗浄した後、１００μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地内で培養した。６時間細胞をｓｅｒｕｍ−ｓｔａｒｖｅｄに維持し、化合物を処理した。２４時間培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、製造者の指示に従って細胞の生存を分析した。
【０１４１】
３−７．カスパーゼ分析（Ｃａｓｐａｓｅ  Ａｓｓａｙｓ）
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地内のｗｈｉｔｅ−ｗａｌｌｅｄ  ９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓに２ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでプレーティングし、多様な濃度の化合物またはＤＭＳＯを１６時間処理した。ＷＳ−１細胞をｗｈｉｔｅ−ｗａｌｌｅｄ  ９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓに１ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでプレーティングし、１０％ＦＢＳが含まれているＭＥＭ培地内で２４時間培養した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞と同様に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地内で化合物を処理した。ｃａｓｐａｓｅ３／７活性をＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ３／７  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、製造者の指示に従って測定した。
【０１４２】
３−８．共焦点顕微鏡実験（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）
Ａ５４９ｃｅｌｌｓ（５ｘ１０３ｃｅｌｌｓ）細胞を１０％ＦＢＳが含まれているＭＥＭ培地内の９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにプレーティングした。２４時間細胞を維持し、ＰＢＳで洗浄した後、蛍光標識された化合物または５（６）−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ１μＬをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地内処理して２．５時間インキュベーションした。１ＸＰＢＳ（２ｔｉｍｅｓ）で細胞を洗浄した後、蛍光イメージ分析を行った。
【０１４３】
３−９．共免疫沈殿分析（Ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地で、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ（１Ｘ１０７ｃｅｌｌｓ）にＤＭＳＯを処理するか、化合物を処理した。２．５時間培養後、細胞を収穫し、ＰＢＳで１回洗浄した後、溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％ＮＰ−４０、ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔａｂｌｅｔ）に氷で溶解した。細胞溶解物を４℃で一晩抗−ＭＣＬ−１抗体（Ｓ−１９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）と培養させ、プロテインＡ／Ｇアガロース培養を１時間実施した。ビーズを沈殿させ、溶解バッファーで３回洗浄し、変性した蛋白質に対して、ａｎｔｉ−ＢＡＫ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）およびａｎｔｉ−ＭＣＬ−１抗体を用いてウェスタンブロットを実施した。ウェスタンブロットは、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅで実施し、二次抗体としてＧｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩＲＤｙｅ６８０抗体（Ｌｉｃｏｒ）を用い、シグナルはＯｄｙｓｓｅｙ３．０  ｓｏｆｔｗａｒｅで分析した。
【０１４４】
３−１０．実験結果
まず、化合物の蛍光偏光分析（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）により、選別された３種の化合物のＭＣＬ−１蛋白質に対する結合力を測定した結果、化学式４〜６の化合物がＭＣＬ−１に結合するＫＤ値がそれぞれ２．８、３．０、１．１μＭと測定され、３種の化合物とも効果的にＭＣＬ−１蛋白質に結合することを確認した。陽性対照群として用いた周知のＢＨ３ペプチドのＫＤ値は０．３μＭとなった。陰性対照群として用いたＦｌｕｏｒ−ｌｉｎｋｅｒはＭＣＬ−１と結合しておらず、これは、各化合物に結合された蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）およびリンカーがＭＣＬ−１との結合には影響を及ぼさないことを意味する（図６のＢ）。また、これらの化合物が実際にＭＣＬ−１とＢＨ３蛋白質との間の相互作用を阻害するかを調べるために、競争的蛍光偏光分析（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を実施した結果、化学式５および６の化合物がＭＣＬ−１およびＢＨ−３の相互作用を解離させるＫｉ値がそれぞれ１７．２および９．３μＭと測定され、化学式４の化合物は弱い活性を示した。陰性対照群として用いた化合物９−ｎｃはＭＣＬ−１に結合しなかった（図６のＣ）。次に、コンピュータを用いたドッキングモデル研究（ｄｏｃｋｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ  ｓｔｕｄｙ）の結果、化学式６の化合物がＭＣＬ−１のＢＨ３結合部位によく結合すると予測された（図７のＢ）。
【０１４５】
上記で言及した通り、ＭＣＬ−１とＢＨ３の間の蛋白質相互作用を抑制すると、ＢＨ３が自由になるにつれて癌細胞の細胞死滅を誘発する。したがって、選別された化合物がＭＣＬ−１と結合してＭＣＬ−１とＢＨ３との間の蛋白質相互作用を抑制することによって、癌細胞の死滅を誘発するかを確認した。
【０１４６】
まず、化学式５の化合物が細胞内でＭＣＬ−１／ＢＨ３蛋白質相互作用を阻害するかを確認するために、癌細胞のＪｕｒｋａｔ白血病Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）に化学式６の化合物を処理し、細胞溶解物に抗−ＭＣＬ−１抗体を処理して免疫沈殿させ、抗−ＢＡＫおよび抗−ＭＣＬ−１抗体を用いてウェスタンブロットを実施した結果、化学式５の化合物は、効果的にＭＣＬ−１とＢＡＫ（ＢＨ３蛋白質の１つ）との蛋白質相互作用を阻害することが確認された（図８のＡ）。しかし、陰性対照群の化合物９ｎｃは、ＭＣＬ−１とＢＡＫとの蛋白質相互作用を阻害しなかった（図９）。また、化学式６の化合物は、細胞を透過して競争的にＭＣＬ−１に結合してＢＡＫ蛋白質を放出させることが確認された。共焦点顕微鏡分析は、前記化合物が細胞に透過することを示す（図８のＢ）。また、化学式６の化合物は、癌細胞のＪｕｒｋａｔ白血病Ｔ細胞と多発性骨髄腫細胞のＵ２６６細胞の生存を効果的に抑制したが、正常細胞のＷＳ−１ヒト線維芽細胞（ＷＳ−１  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌ）およびＨＥＫ２９３胚腎臓細胞の生存には影響を及ぼさないことが明らかになった。したがって、化学式６の化合物が癌細胞に対して選択的に効果を示すことが確認された（図８のＣおよび図１０のＢ、Ｃ）。
【０１４７】
化学式６の化合物による癌細胞の死滅がａｐｏｐｔｏｓｉｓによるかを調べるためにｃａｓｐａｓｅ３／７ａｓｓａｙを施した結果、化学式６の化合物は、Ｕ２６６細胞では濃度依存的にｃａｓｐａｓｅ活性を増加させるが、正常細胞のＷＳ−１では効果がないことが確認された（図１０のＣ）。
【０１４８】
結果的に、化学式４〜６の化合物が全てＢＨ３蛋白質およびＭＣＬ−１蛋白質間の相互作用を阻害し、なかでも特に、化学式６の化合物は、癌細胞で選択的に細胞毒性を示した。したがって、これらの化合物は今後抗癌剤として非常に有望な可能性を有しているといえる。また、本発明で開発したトリアジン−ピペラジン−トリアジン骨格の化合物がアルファ−ヘリックス類似体として機能して、蛋白質−蛋白質間の相互作用を効果的に抑制できることが確認された。
【０１４９】
実施例４．トリアジン−ピペラジン−トリアジンを中心構造とするアルファ−ヘリックス類似体化合物の親水性を増進させた誘導体の製造
ＢＨ３蛋白質およびＭＣＬ−１蛋白質間の相互作用を阻害する効果に優れているとされる化学式６の化合物に対して、Ｒ１位に相当するＥｔおよびＲ４位に相当するＨを代替して多様な親水性官能基を導入して、化学式６の化合物よりＭＣＬ−１に強く結合する誘導体を発掘した。
【０１５０】
まず、化学式６の化合物において、Ｒ１位に相当するＥｔを多様な親水性官能基に置換して、ＭＯ−０１〜ＭＯ−１０と名付けられた１０種の誘導体を製造し、その製造過程を図１１に示した。
【０１５１】
また、化学式６の化合物において、Ｒ４位に相当するＨを多様な親水性官能基に置換して、ＭＯ−１１〜ＭＯ−２０と名付けられた１０種の誘導体を製造し、その製造過程を図１２に示した。
【０１５２】
前記製造したＭＯ−０１〜ＭＯ−２０誘導体は次の通りである：
【表５】
0006349456.tif 000055
0006349456.tif 000056
【０１５３】
実施例５．アルファ−シヌクレイン（α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）の凝集を阻害するアルファ−ヘリックス類似体化合物の選別および効能確認
５−１．化合物の選別
本発明では、トリアジン−ピペラジン−トリアジン系の化合物が蛋白質フォールディングを安定化し、蛋白質の凝集を阻害できるかを証明するために、代表的な蛋白質フォールディング関連の疾患因子としてアルファ−シヌクレインを用いた。アルファ−シヌクレインの凝集は、レビー小体（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ）の形成を誘導し、これは、パーキンソン疾患の病理的特性として知られている。レビー小体形成の機序はまだ明確にされていないが、アルファ−シヌクレインのミスフォールディングとこれによる不適切な自己連合（ｓｅｌｆ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）がレビー小体の形成に関与するとされている。また、アルファ−シヌクレインは、〜６５％程度がアルファ−ヘリックスから構成されていると知られている。したがって、本発明では、本発明で開発したアルファ−ヘリックス類似体化合物がアルファ−シヌクレインのフォールディング構造を安定化してアルファ−シヌクレインの凝集を阻害できるかを実験した。
【０１５４】
このために、アルファ−シヌクレインのＮ−末端にＭＫＣＫクォード−ペプチド（つまり、メチオニン−リシン−システイン−リシンから構成されたペプチド）を導入したコンストラクトを製造して、蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）とビーズの化学的架橋が可能となるように反応性システインを導入した（野生型アルファ−シヌクレインはシステインを含まない）。このようにシステインを含むアルファ−シヌクレイン（ｃｙｓ−Ｓｙｎ）をビオチン化した後、前記実施例３−１に記載した方法通りに化合物をスクリーニングした。その結果、次の化学式７（Ｑ１）および化学式８（Ｑ２）の化合物を選別した。
［化学式７］
【化４１】
0006349456.tif 000057
［化学式８］
【化４２】
0006349456.tif 000058
【０１５５】
５−２．蛋白質の精製
ｐＲＳベクターからＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＭＫＣＫ  ｑｕａｄ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅとアルファ−シヌクレインのコンストラクトを増幅した。この時、ＳａｍＩ制限酵素部位を含む正方向プライマー（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＡＡＴＧＴＧＴＧＴＡＴＴＣＴＧＣＡＡＡＧＧＡＣＴＴＴＣＡＡＡＧＧＣ−３’）、およびＸｈｏＩ制限酵素部位を含む逆方向プライマー（５’−ＧＣＣＴＴＴＧＡＡＡＧＴＣＣＴＴＴＧＣＡＧＡＡＴＡＣＡＣＡＣＡＴＴＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＣ−３’）を用いた。増幅されたＤＮＡは、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ｐｌａｓｍｉｄ（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローニングして、ＧＳＴ融合コンストラクトを生成した。発現プラスミドをｒｏｓｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌに導入し、２０℃で１ｍＭ  ＩＰＴＧを処理して蛋白質の発現を誘導した。細胞ペレットを溶解バッファー（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％ＢＯＧ、Ｈａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に再懸濁させ、音波処理して溶解した。遠心分離後、細胞溶解物を２０−ｍＬ  ＧＳＴＰｒｅｐ  ＨＰ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用し、製造会社の指示に従って行った。アルファ−シヌクレイン蛋白質をＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）による一晩切断反応により得た。バッファー交換後、ＧＳＴを除去するために、ＧＳＴＰｒｅｐ  ｃｏｌｕｍｎを再びローディングし、サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。
【０１５６】
アルファ−シヌクレイン蛋白質をビオチニル化するために、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．３）中、ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に、室温で４５分間インキュベーティングした。１．５Ｍ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅを添加して反応を中断した。標識された蛋白質を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．４）を含有する１ｘＰＢＳバッファーで透析して分離した。標識の程度は製造者の指示に従って決定した（ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ：１．０７  ｂｉｏｔｉｎ  ｐｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【０１５７】
５−３．チオフラビン−Ｔ凝集分析（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ−Ｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）
化合物および２〜１０ｕＬ  ＤＭＳＯ（ａｓ  ｂｌａｎｋ）をそれぞれ１００ｕＬの０．２ｍＭアルファ−シヌクレイン疾患−関連突然変異Ａ５３Ｔに処理し、バッファー（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％ＢＯＧ  ａｎｄ  ５ｕＭ  Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ−Ｔ）を用いて、最終濃度が１００μＭとなるようにして、３７℃でｆｒｅｑｕｅｎｔ  ａｇｉｔａｔｉｏｎとインキュベーションした。チオフラビン−Ｔの蛍光（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ４４０ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ４８２ｎｍ、ｃｕｔｏｆｆ  ｗａｖｅ−ｌｅｎｇｔｈ４７５ｎｍ）は、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、３７℃で１時間間隔で測定して、計３０時間測定した。
【０１５８】
５−４．円偏光二色性熱変性研究（Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ（ＣＤ）  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ）
化合物の存在または不在におけるアルファ−シヌクレインの熱変性過程を、１−ｃｍ  ｐａｔｈｌｅｎｇｔｈ  ｑｕａｒｔｚ  ｃｕｖｅｔｔｅを用いて、Ｐｅｌｔｉｅｒ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ付きのＢｉｏＬｏｇｉｃ  ＭＯＳ−４５０  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ上の２２２ｎｍ  ＣＤ  ｓｉｇｎａｌでモニタリングした。ＤＭＳＯ溶液および化合物を蛋白質サンプル（０．０５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＬ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％ＢＯＧ、１％ｔａｕｒｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）に分けて添加して最終濃度が１ｕＭおよび１％ＤＭＳＯとなるようにした。２５〜６０℃の範囲および１℃／ｍｉｎの比率とした。
【０１５９】
５−５．実験結果
選別された化学式７および化学式８の化合物がアルファ−シヌクレインに結合するかを確認するために、前記実施例３−５に記載の方法でアルファ−シヌクレインに対するＫＤ値を測定した結果、それぞれ６８ｎＭおよび１４８ｎＭと測定され、２種の化合物とも効果的にアルファ−シヌクレインに結合することを確認した（図１３のＢ）。化学式７および化学式８の化合物は、Ｒ３およびＲ５の置換基が同一であり、Ｒ２が全て１，２−ジアルコキシベンゼンから構成されている点で構造が類似している（図１３のＡ）。
【０１６０】
化学式７および８の化合物がアルファ−シヌクレインと結合する時、化合物の骨格と蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）リンカーがどのような作用をするかを調べるために、化学式７および８のような骨格を有する化学式４〜６の化合物（９ａ〜９ｃ）およびＦｌｕｏｒ−ｌｉｎｋｅｒがアルファ−シヌクレインに結合する程度を確認した。その結果、化学式６の化合物（化学式７、８と２個の置換基が同一である）はアルファ−シヌクレインに親和力を示したが（図１３のＢ）、これは、ターゲット蛋白質に対する化合物の結合と選択性が化合物の側鎖によって決定されることを裏付ける。
【０１６１】
化学式７、８の化合物との結合がアルファ−シヌクレインの熱安定性に影響を及ぼすかを確認するためにＣＤ（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）熱安定性分析を行った結果、化学式７、８の化合物がアルファ−シヌクレインの融解温度（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を３７℃でそれぞれ４０、４１℃に変化させることを確認することができた。アルファ−シヌクレインのアルファ−ヘリックスは、長い疎水性表面を有し、かつ、両親媒性を示すと知られているが、相対的に疎水性である化学式７、８の化合物がアルファ−シヌクレインの疎水性表面と相互作用すると見られる。
【０１６２】
次に、選別された化学式７および化学式８の化合物がアルファ−シヌクレインの凝集に影響を及ぼすかを確認するために、疾患に関連するアルファ−シヌクレインの突然変異型（Ａ５３Ｔ）を用いた。まず、前記突然変異（Ａ５３Ｔ）に対する化学式７、８の化合物のＫＤ値を測定した結果、それぞれ２６８ｎＭおよび３７２ｎＭと測定され、２種の化合物とも効果的にアルファ−シヌクレイン突然変異に結合することを確認した（図１４のＡ）。また、化学式７、８の化合物、化学式４の化合物（９ａ）をそれぞれ前記突然変異と共に化合物を培養した後、チオフラビン−Ｔ蛍光凝集分析により凝集阻害の有無をモニタリングした。その結果、化学式７、８の化合物ともアルファ−シヌクレインの凝集の開始を有意に遅延させ、実験を実施した３０時間の間凝集されたフィブリル（ｆｉｂｒｉｌ）の量を顕著に減少させたのに対し、化学式４の化合物および陰性対照群のＤＭＳＯ処理群の場合、凝集を阻害する効果が現れなかった（図１４のＢ）。
【０１６３】
結果的に、本発明で提供するアルファ−ヘリックス類似体ライブラリーの化合物がアルファ−シヌクレインに結合してアルファ−シヌクレインの凝集を阻害できることが確認された。したがって、本発明で提供する、多様な置換基で置換されたトリアジン−ピペラジン−トリアジン骨格の化合物ライブラリーは、ＭＣＬ−１やアルファ−シヌクレインだけでなく、一般的なアルファ−ヘリックスによって媒介される蛋白質相互作用を制御できる阻害剤発掘のために幅広く使用できる。
【０１６４】
実施例６．フェニル−ピペラジン−トリアジンを中心構造とするアルファ−ヘリックス類似体化合物の製造
フェニル−ピペラジン−トリアジン系の化合物を合成するために、図１３に示しているような固体相合成法を開発した。アミン（ＮＨ２）で改質されたポリマービーズに順次的なカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）反応により所望の化合物を平均９０％以上の収率で得ることができた。
【０１６５】
図１５を基準として説明すれば、第１段階として、４−フルオロ−３−ニトロ安息香酸をＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡレジン上にローディングしてレジンに結合させて、レジンに結合された化合物“２”を生成した。第２段階として、Ｎ−ノシル（Ｎｓ）で保護されたピペラジン誘導体（“３”）をレジンに結合された化合物（“２”）にカップリングさせて、化合物“４”を製造した。第３段階として、２−メルカプトエタノールを処理して前記カップリングされた化合物（“４”）からＮ−Ｎｓ保護基を除去した後、これに２−エチルアミノ−４，６−ジクロロ−［１，３，５］トリアジン（“５”）を導入して、化合物“６”を製造した。第４段階として、前記製造された化合物（“６”）のクロライド位に多様なアミン基（Ｒ３ＮＨ２）を代替させて、化合物“７”を製造した。第５段階として、ＤＭＦ中、ＳｎＣｌ２を反応させて化合物のニトログループを還元させて、化合物“８”を製造した。その結果生じたアミンを、多様なアルデヒドを用いた還元−アミノ化（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ａｍｉｎａｔｉｏｎ）反応によりアルキル化して、Ｒ１官能基を導入した。芳香族アルデヒドとの反応は、意図したアルキル化された産物を高い収率で生成するが、同じ条件で脂肪族アルデヒドとの反応は、ジアルキル化された産物を主要産物として生成するので、過度のアルキル化（ｏｖｅｒ−ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ）による副産物の生成を防止するために、反応混合物にベンゾトリアゾールを添加した。ベンゾトリアゾールは、還元−アミノ化においてジアルキル化された副産物の形成を阻害することが知られている。最後の段階として、９５％ＴＦＡを加えて切断反応を行って、３個の置換基で機能化されたフェニル−ピペラジン−トリアジン誘導体を製造した。
【０１６６】
以下、前記製造過程をより詳細に説明する。
【０１６７】
Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡレジン（１００ｍｇ、９３μｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）で１時間処理し、ＤＭＦ（２Ｘ１０ｍｉｎ）で２０％ピペリジンを処理してＦｍｏｃ基を除去した。特別な言及がない限り、各反応段階の最後の過程でレジンをＤＭＦ（３Ｘ）、ＭｅＯＨ（２Ｘ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ）、およびＤＭＦ（３Ｘ）で完全に洗浄した。ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中の４−フルオロ−３−ニトロ安息香酸（７０ｍｇ、３７８μｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１４２ｍｇ、３７８μｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（１３０μＬ、７５６μｍｏｌ）の溶液にレジンを添加し、混合物を室温で１２時間反応させた。ノシルで保護されたピペラジン（Ｎｏｓｙｌ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｐｉｐｅｒａｚｉｎ）（４ｅｑｕｉｖ）をレジンに導入させるために、ＤＭＦでＤＩＥＡ（１０ｅｑｕｉｖ）を用いて９５℃で１２時間反応させて、レジンに結合されたピペラジン誘導体“４”を生成した。誘導体“４”のノシル基を除去するために、ＤＭＦで２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（２０ｅｑｕｉｖ）およびＤＢＵ（１０ｅｑｕｉｖ）を処理して室温で反応させた。次に、２−ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−４，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−［１，３，５］ｔｒｉａｚｉｎｅ（１０ｅｑｕｉｖ）をレジンにカップリングさせるために、ＴＨＦでＤＩＥＡ（５ｅｑｕｉｖ）を用いて６０℃で３時間反応させて、化合物“６”を生成した。化合物“６”のクロライドを多様なアミン基（Ｒ３ＮＨ２、５ｅｑｕｉｖ）に置換させるために、ＮＭＰでＤＩＥＡ（１０ｅｑｕｉｖ）の存在下に８０℃で一晩反応させて、化合物“７”を生成した。ＤＭＦでＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（６０ｅｑｕｉｖ）溶液をレジンに添加し、混合物を室温で２４時間撹拌した。レジンが結合されたアミン（“８”）を、乾燥されたＣＨ（ＯＭｅ）３：ＤＭＦ＝９：１中のアルデヒド（１０ｅｑｕｉｖ）溶液０．４Ｍおよびメタノール中の酢酸溶液２０％（ｖ／ｖ）を処理して、５０℃で１８時間反応させた。次に、ＴＨＦ中、ＮａＣＮＢＨ３（５０ｅｑｕｉｖ）溶液５Ｍを添加し、混合物を５０℃で６時間撹拌して、アルキル化された産物を製造した。脂肪族アルデヒドを用いる場合には、ベンゾトリアゾール（１００ｅｑｕｉｖ）を添加して、ジアルキル化（ｄｉａｌｋｙｌａｔｅｄ）された副産物が生成されないようにした。最後に、ＴＦＡを加えて切断反応を行って、３個の置換基で機能化されたフェニル−ピペラジン−トリアジン誘導体を製造した。
【０１６８】
前記固体相合成法で合成された化合物の純度（ｐｕｒｉｔｙ）と特徴（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）をＬＣ−ＭＳで確認した結果、最終物の平均純度が９０％以上となり、前記固体相合成法の効率を確認することができた。以降、逆相ＨＰＬＣで化合物を精製し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、およびＨＲＭＳ（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）で化合物を同定した。
【０１６９】
このように合成されたアルファ−ヘリックス類似体３６種は次の通りである。
【表６】
0006349456.tif 000059
【０１７０】
実施例７．ＢＨ３蛋白質およびＭＣＬ−１蛋白質間の相互作用を阻害するアルファ−ヘリックス類似体化合物の選別および効能確認
７−１．蛋白質の精製
ヒトＭｃｌ−１１７２−３２０（１７２−３２０番目のアミノ酸）またはヒトＢｃｌ−ｘＬ１−２１２（１−２１２番目のアミノ酸）のＢＨ３−結合ドメインを発現するプラスミドをＧＳＴでタギングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に導入した。１ｍＭ  ＩＰＴＧを処理して蛋白質の発現を誘導した。細胞ペレットを溶解バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｔａｂｌｅｔ（Ｒｏｃｈｅ））に再懸濁させ、音波処理して溶解した。遠心分離後、細胞溶解物を５−ｍＬ  ＧＳＴｒａｐ  ＨＰ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用し、製造会社の指示に従って行った。Ｍｃｌ−１１７２−３２０およびＢｃｌ−ｘＬ１−２１２蛋白質をトロンビンプロテアーゼによる切断反応により得ており、ＧＳＴを除去するために、ＧＳＴｒａｐ  ＨＰ  ｃｏｌｕｍｎを再びローディングし、サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。
【０１７１】
７−２．蛍光偏光分析（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）
競争的蛍光偏光分析（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）のために、Ｍｃｌ−１１７２−３２０から蛍光標識されたＢａｋ−ＢＨ３ペプチドの置換をモニタリングした。より詳細には、１０ｎｍのＴＡＭＲＡ−標識されたＢａｋ−ＢＨ３（ＴＡＭＲＡ−Ａｂｕ−ＫＡＬＥＴＬＲＲＶＧＤＧＶＱＲＮＨＥＴＡＦ−ＮＨ２）ペプチドを、ｂｌａｃｋ  Ｃｏｓｔａｒ３８４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ内で最終体積が６０μＬの結合バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｎＭ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、ｐＨ８．０）で、暗中で３０分間０．８μＭのＭｃｌ−１１７２−３２０とインキュベーションさせた。４０μＬの結合バッファー内の多様な濃度のフェニル−ピペラジン−トリアジンを混合物に添加した。室温で１５分間インキュベーション後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００  ＰＲＯ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）で蛍光偏光値（ｍＰ  ｕｎｉｔｓ）を測定した。Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈは４８５ｎｍとし、ｅｍｉｓｓｉｏｎは５３５ｎｍで測定した。Ｋｉ値は以前に知られた方法通りに計算した（Ｗａｎｇ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｔｒ  Ｐａｐ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓ２００４，２２８，Ｕ９２６−Ｕ９２６）。
【０１７２】
７−３．実験結果
実施例６に記載した固体相合成法により、フェニル−ピペラジン−トリアジン化合物ライブラリーを構築した。ＢＨ３ヘリックスペプチドの３個の疎水性残基（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、およびＶａｌ）を模倣するために、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６位に多様な疎水性側鎖が導入された化合物を製造した。３６種のライブラリー化合物の中で、２つの異なる濃度（１０μＭおよび５０μＭ）で、Ｍｃｌ−１１７２−３２０（ＢＨ３−結合グルーブを含む結実構造体）および周知の蛍光標識されたＢＨ３ペプチド間の相互作用を阻害する化合物を選別した。
【０１７３】
図１６に示されているように、ＰＰＴ−３１が１０μＭおよび５０μＭともにおいてＭｃｌ−１／ＢＨ３間相互作用の阻害効果に最も優れ、濃度−依存度に優れていることが明らかになった。図１７に示されているように、ＰＰＴ−３１は、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６位にそれぞれフェニル基を含んでおり（図１７のＡ）、分子モデリングによれば、各フェニル基は、ＢＨ３ペプチドのアルファヘリックス上でＭｃｌ−１の疎水性部分（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃｌｅｆｔ）と結合する核心残基のＶａｌ２２０、Ｖａｌ２１６およびＬｅｕ２１３位に位置すると予想される（図１７のＢ）。ＰＰＴ−３１の結合親和度は同一の競争的ＦＰ分析（Ｋｉ＝７．３μＭ）を用いて決定した（図１７のＣ）。
【０１７４】
また、Ｍｃｌ−１のＢＨ３結合ポケットは、Ｂｃｌ−ｘＬのようなＢｃｌ−２ファミリー蛋白質のＢＨ３結合ポケットと類似しているため、本発明者らは、ＰＰＴ−３１が選択性を有するかを調べた。ＰＰＴ−３１がＢｃｌ−ｘＬに結合親和力を有するかを確認した結果、ＰＰＴ−３１は、ＢＨ３のＢｃｌ−ｘＬ１−２１２（ＢＨ３−結合ポケットを含む結実構造体）とＢＨ３の間の相互作用は阻害しないことが明らかになった（図１７のＣ）。これは、ＰＰＴ−３１が選択的Ｍｃｌ−１阻害剤であることを示す。
【０１７５】
製造例Ｉ．トリアジン−ピペラジン−トリアジン骨格の化合物の合成
図３に示されているように、Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ  ｒｅｓｉｎ（１００ｍｇ、９３μｍｏｌ）を５ｍＬ  ｆｒｉｔｔｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ内のＤＭＦ（２ｍＬ）で１時間処理した。ＤＭＦ（２Ｘ１０ｍｉｎ）で２０％ピペリジンを処理してＦｍｏｃ基を除去した。ＤＭＦ（３Ｘ）、ＭｅＯＨ（２Ｘ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ）、およびＤＭＦ（３Ｘ）で完全に洗浄した後、単一置換されたジクロロトリアジンをレジンにローディングさせるために単一置換されたジクロロトリアジン（“３”）（５ｅｑｕｉｖ）をＤＭＦ（１ｍＬ）でＤＩＥＡ（５ｅｑｕｉｖ）と室温で一晩反応させた。２−ニトロベンゼンスルホニル（Ｎｓ）で保護されたピペラジン誘導体（“５”）（１０ｅｑｕｉｖ）をレジンに結合されたトリアジン誘導体（“４”）にカップリングさせるために、ＤＭＦでＥｔ３Ｎ（５ｅｑｕｉｖ）の存在下に６０℃で一晩反応させた。特別な言及がない限り、各反応段階の最後の過程でレジンをＤＭＦ（３Ｘ）、ＭｅＯＨ（２Ｘ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ）、およびＤＭＦ（３Ｘ）で完全に洗浄した。前記カップリングされた化合物（“６”）からＮ−Ｎｓ保護基を除去するために、ＤＭＦ（１０ｅｑｕｉｖ）で２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（２０ｅｑｕｉｖ）およびＤＢＵ（１０ｅｑｕｉｖ）と室温で２時間反応させた。次に、２−エチルアミノ−４，６−ジクロロ−［１，３，５］トリアジン（“７”）を導入して、化合物“８”を製造するために、ＮＭＰで化合物ｅ（５ｅｑｕｉｖ）およびＤＩＥＡ（５ｅｑｕｉｖ）をビーズに処理して、６０℃で一晩反応させた。前記製造された化合物（“８”）のクロライド位に多様なアミン基（Ｒ２’Ｒ２”ＮＨ）を代替させた。最後に、ＴＦＡ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を加えて切断反応を行って、３個の置換基で機能化されたトリアジン−ピペラジン−トリアジン化合物“９”を製造した。
【０１７６】
前記固体相合成法で合成された化合物の純度（ｐｕｒｉｔｙ）と特徴（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）をＬＣ−ＭＳで確認し、最終物の平均純度が９２％以上となり、前記固体相合成法の効率を確認することができた。以降、逆相ＨＰＬＣで化合物を精製し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、およびＨＲＭＳ（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）で化合物を同定した。
【０１７７】
製造例１．化学式４の化合物の製造
６−（４−（４−ａｍｉｎｏ−６−（（ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１，３］ｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ）−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ）−２−ｂｅｎｚｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎ−１−ｙｌ）−Ｎ２−ｂｅｎｚｙｌ−Ｎ４−ｅｔｈｙｌ−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎｅ−２，４−ｄｉａｍｉｎｅ・ＴＦＡ。
Ｙｉｅｌｄ：２５．８ｍｇ（４３％）ｆｒｏｍ  １００ｍｇ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎ．１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ４）δ１．２６（ｍ，３Ｈ）２．６１−２．７７（ｍ，２Ｈ），３．０５−３．１５（ｍ，２Ｈ），３．３１−３．３５（ｍ，３Ｈ），４．３１（ｍ，１Ｈ），４．４５−４．６５（ｍ，６Ｈ），５．０４（ｍ，１Ｈ），５．７１（ｄ，Ｊ＝３６．０Ｈｚ，１Ｈ），５．８３（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），６．６５−６．８１（ｍ，３Ｈ），６．９８−７．０８（ｍ，５Ｈ），７．１９（ｍ，１Ｈ），７．２５−７．２７（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４．４，３５．９，３９．１，４３．４，４４．３，４４．５，４４．７，５３．２，５３．５，５５．３，１０１．２，１０７．９，１０８．４，１２０．８，１２１．１，１２７．０，１２７．５，１２７．７，１２８．５，１２８．８，１２９．２，１３０．７，１３６．９，１３７．２，１４７．２，１４７．９，１５５．７，１５６．２，１５７．５，１６２．６；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ３４Ｈ３９Ｎ１２Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋：６４７．３３１９；Ｆｏｕｎｄ：６４７．３３１９。
【０１７８】
製造例２．化学式５の化合物の製造
６−（４−（４−ａｍｉｎｏ−６−（（ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｙｌ）（ｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ）−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ）−２−ｂｅｎｚｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎ−１−ｙｌ）−Ｎ２−（ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１，３］ｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌｍｅｔｈｙｌ）−Ｎ４−ｅｔｈｙｌ−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎｅ−２，４−ｄｉａｍｉｎｅ・ＴＦＡ。
Ｙｉｅｌｄ：１８．８ｍｇ（３１％）ｆｒｏｍ  １００ｍｇ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎ．１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ４）δ０．４０（ｍ，２Ｈ），０．６２（ｍ，２Ｈ），１．００（ｍ，３Ｈ），１．１２（ｂｒｓ，１Ｈ），１．２５（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），１．７２（ｍ，２Ｈ），２．９１−３．００（ｍ，２Ｈ），３．３３（ｍ，２Ｈ），３．４９−３．５６（ｍ，７Ｈ），４．４６−４．６１（ｍ，４Ｈ），４．７３（ｍ，１Ｈ），５．１９（ｍ，１Ｈ），５．９１（ｓ，１Ｈ），５．９４（ｓ，１Ｈ）．６．７６−６．８８（ｍ，３Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），７．２０−７．２５（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ３．７，９．３，９．６，１０．７，１１．５，１４．４，２０．９，３５．９，３９．１，４３．４，４４．３，４９．４，５０．１，５１．８，５２．９，５５．４，１０１．２，１０７．６，１０８．３，１２０．４，１２１．１，１２７．１，１２８．６，１２９．２，１３０．０，１３０．８，１３１．０，１３６．９，１４７．２，１４８．１，１５５．６，１５６．０，１５８．２，１６２．６；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ３４Ｈ４５Ｎ１２Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋：６５３．３７８８；Ｆｏｕｎｄ：６５３．３７８７。
【０１７９】
製造例３．化学式６の化合物の製造
４−（２−（（４−（４−（４−ａｍｉｎｏ−６−（（４−ｐｈｅｎｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ）−２−ｂｅｎｚｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎ−１−ｙｌ）−６−（ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｏｌ・ＴＦＡ。
Ｙｉｅｌｄ：２７．０ｍｇ（４１％）ｆｒｏｍ  １００ｍｇ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎ．１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ４）δ１．２５（ｍ，３Ｈ），２．８２（ｍ，２Ｈ），２．９１（ｂｒｓ，２Ｈ），３．３０（ｍ，２Ｈ），３．４９（ｍ，３Ｈ），３．６６（ｍ，２Ｈ），４．５７−４．６８（ｍ，３Ｈ），５．１３（ｍ，１Ｈ），６．７３（ｍ，２Ｈ），６．９０（ｂｒｓ，１Ｈ），７．０３−７．０７（ｍ，６Ｈ），７．１７−７．２４（ｍ，５Ｈ）７．４１（ｍ，３Ｈ），７．５８（ｂｒｓ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１４．６，１４．８，３４．２，３５．７，３６．０，４２．５，４３．２，４４．１，５３．９，１１５．６，１１８．７，１１９．５，１２２．９，１２３．７，１２６．７，１２８．７，１２９．２，１２９．６，１３０．０，１３０．１，１３０．５，１３８．２，１５２．５，１５５．１，１５５．４，１５６．３，１５７．６，１６２．１，１６３．８；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ３９Ｈ４３Ｎ１２Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋：７１１．３６３２；Ｆｏｕｎｄ：７１１．３６１３。
【０１８０】
製造例４．化学式７の化合物の製造
６−（４−（４−ａｍｉｎｏ−６−（４−ｐｈｅｎｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ）−２−ｂｅｎｚｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎ−１−ｙｌ）−Ｎ２−（ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１，３］ｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌｍｅｔｈｙｌ）−Ｎ４−ｅｔｈｙｌ−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎｅ−２，４−ｄｉａｍｉｎｅ・ＴＦＡ。
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．２８（ｍ，３Ｈ）２．８０−２．８６（ｍ，２Ｈ），３．１４−３．２２（ｍ，２Ｈ），３．３６−３．４３（ｍ，１Ｈ），３．４８−３．５３（ｍ，２Ｈ），４．５０−４．５６（ｍ，２Ｈ），４．６３−４．７７（ｍ，３Ｈ），５．１２（ｂｓ，１Ｈ），５．９３−５．９８（ｍ，２Ｈ），６．７６−６．８９（ｍ，４Ｈ），７．０１−７．２０（ｍ，７Ｈ），７．２６−７．２９（ｍ，１Ｈ），７．３８−７．４１（ｍ，３Ｈ），７．５８（ｄｄ，Ｊ＝３．０，９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７６−７．８２（ｍ，１Ｈ），８．０５−８．１６（ｍ，１Ｈ），１０．５８（ｍ，１Ｈ），１４．５９（ｂｓ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４．３，３５．９，３６．２，３９．１，３９．２，４３．６，４４．２，４４．５，５３．４，１０１．２，１０７．６，１０８．４，１１８．９，１２０．４，１２１．０，１２３．２，１２３．７，１２７．１，１２８．６，１２９．０，１２９．３，１２９．８，１３１．３，１３６．７，１４７．２，１４８．１，１５４．２，１５４．７，１５５．８，１５６．２，１５７．０，１５７．６，１６２．５；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ３９Ｈ４１Ｎ１２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋：７２５．３４２５；Ｆｏｕｎｄ：７２５．３４２７。
【０１８１】
製造例５．化学式８の化合物の製造
６−（４−（４−ａｍｉｎｏ−６−（４−ｐｈｅｎｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ）−２−ｂｅｎｚｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎ−１−ｙｌ）−Ｎ２−（３，４−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）−Ｎ４−ｅｔｈｙｌ−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎｅ−２，４−ｄｉａｍｉｎｅ・ＴＦＡ（Ｑ２）。
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．２８（ｍ，３Ｈ）２．８１−２．８６（ｍ，２Ｈ），３．１６−３．２２（ｍ，２Ｈ），３．３６−３．４３（ｍ，１Ｈ），３．４７−３．５１（ｍ，２Ｈ），３．８０−３．９１（ｍ，５Ｈ），４．５５−４．５９（ｍ，２Ｈ），４．６５−４．６９（ｍ，２Ｈ），４．７４−４．７６（ｍ，１Ｈ），５．１２（ｂｓ，１Ｈ），６．８１−６．８９（ｍ，４Ｈ），７．００−７．２１（ｍ，７Ｈ），７．２６−７．２９（ｍ，１Ｈ），７．３８−７．４１（ｍ，３Ｈ），７．５８（ｄｄ，Ｊ＝３．０，９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６９−７．７７（ｍ，１Ｈ），８．２３−８．３０（ｍ，１Ｈ），１０．５８（ｍ，１Ｈ），１４．３１（ｂｓ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４．３，３５．９，３６．３，３９．２，４３．６，４４．３，４４．５，５３．４，５５．９，１１０．６，１１０．１，１１１．３，１１８．９，１１９．１，１１９．４，１１９．９，１２３．２，１２３．６，１２７．１，１２８．６，１２９．０，１２９．３，１２９．９，１３１．３，１３６．７，１４８．７，１４９．３，１５４．２，１５４．７，１５５．７，１５６．０，１５７．０，１５７．５，１６２．５；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ４０Ｈ４０Ｎ１２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋：７４１．３７４８；Ｆｏｕｎｄ：７４１．３７４１。
【０１８２】
製造例６．９−ｎｃの化合物の製造
６−（４−（４−ａｍｉｎｏ−６−（ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎ−１−ｙｌ）−Ｎ２，Ｎ４−ｄｉｅｔｈｙｌ−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎｅ−２，４−ｄｉａｍｉｎｅ・ＴＦＡ。
Ｙｉｅｌｄ：１８．０ｍｇ（５０％）ｆｒｏｍ  １００ｍｇ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎ．１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ４）δ１．１４（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，９Ｈ），３．３８（ｍ，６Ｈ），３．８９（ｂｒｓ，８Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１４．６，３５．７，４３．４，１５５．８，１５７．４，１６２．１；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ１６Ｈ２９Ｎ１２［Ｍ＋Ｈ］＋：３８９．２６３８；Ｆｏｕｎｄ：３８９．２６３１。
【０１８３】
製造例ＩＩ．フェニル−ピペラジン−トリアジン骨格の化合物の合成
図１５に示されているように、Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡレジン（１００ｍｇ、９３μｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）で１時間処理し、ＤＭＦ（２Ｘ１０ｍｉｎ）で２０％ピペリジンを処理してＦｍｏｃ基を除去した。特別な言及がない限り、各反応段階の最後の過程でレジンをＤＭＦ（３Ｘ）、ＭｅＯＨ（２Ｘ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ）、およびＤＭＦ（３Ｘ）で完全に洗浄した。ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中、４−フルオロ−３−ニトロ安息香酸（７０ｍｇ、３７８μｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１４２ｍｇ、３７８μｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（１３０μＬ、７５６μｍｏｌ）の溶液にレジンを添加し、混合物を室温で１２時間反応させた。ノシルで保護されたピペラジン（Ｎｏｓｙｌ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｐｉｐｅｒａｚｉｎ）（４ｅｑｕｉｖ）をレジンに導入させるために、ＤＭＦでＤＩＥＡ（１０ｅｑｕｉｖ）を用いて９５℃で１２時間反応させて、レジンに結合されたピペラジン誘導体“４”を生成した。誘導体“４”のノシル基を除去するために、ＤＭＦで２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（２０ｅｑｕｉｖ）およびＤＢＵ（１０ｅｑｕｉｖ）を処理して室温で反応させた。次に、２−ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−４，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−［１，３，５］ｔｒｉａｚｉｎｅ（１０ｅｑｕｉｖ）をレジンにカップリングさせるために、ＴＨＦでＤＩＥＡ（５ｅｑｕｉｖ）を用いて６０℃で３時間反応させて、化合物“６”を生成した。化合物“６”のクロライドを多様なアミン基（Ｒ３ＮＨ２、５ｅｑｕｉｖ）に置換させるために、ＮＭＰでＤＩＥＡ（１０ｅｑｕｉｖ）の存在下に８０℃で一晩反応させて、化合物“７”を生成した。ＤＭＦでＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（６０ｅｑｕｉｖ）溶液をレジンに添加し、混合物を室温で２４時間撹拌した。レジンが結合されたアミン（“８”）を乾燥されたＣＨ（ＯＭｅ）３：ＤＭＦ＝９：１中のアルデヒド（１０ｅｑｕｉｖ）溶液０．４Ｍおよびメタノール中の酢酸溶液２０％（ｖ／ｖ）を処理して、５０℃で１８時間反応させた。次に、ＴＨＦ中、ＮａＣＮＢＨ３（５０ｅｑｕｉｖ）溶液５Ｍを添加し、混合物を５０℃で６時間撹拌して、アルキル化された産物を製造した。脂肪族アルデヒドを用いる場合には、ベンゾトリアゾール（１００ｅｑｕｉｖ）を添加してジアルキル化（ｄｉａｌｋｙｌａｔｅｄ）された副産物が生成されないようにした。最後に、ＴＦＡを加えて切断反応を行って、３個の置換基で機能化されたフェニル−ピペラジン−トリアジン誘導体を製造した。
【０１８４】
前記固体相合成法で合成された化合物の純度（ｐｕｒｉｔｙ）と特徴（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）をＬＣ−ＭＳで確認した結果、最終物の平均純度が９０％以上となり、前記固体相合成法の効率を確認することができた。以降、逆相ＨＰＬＣで化合物を精製し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、およびＨＲＭＳ（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）で化合物を同定した。
【０１８５】
製造例７．ＰＰＴ−３の化合物の製造
２−｛４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ−４−ｃａｒｂａｍｏｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ｝−４−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ−６−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌ−［１，３，５］ｔｒｉａｚｉｎｅ（ＰＰＴ−３）。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．９２（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），０．９７（ｄｄ，Ｊ＝６．３，９．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２０（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．３３（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），１．５５−１．６２（ｍ，１Ｈ），１．７６−１．９１（ｍ，２Ｈ），２．６０−２．８４（ｍ，２Ｈ），３．０５−３．３２（ｍ，５Ｈ），３．４２−３．４８（ｍ，２Ｈ），４．６１（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），４．８４（ｔ，，Ｊ＝１４．７Ｈｚ，１Ｈ），４．９８−５．０３（ｍ，１Ｈ），６．９３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．０７−７．１３（ｍ，２Ｈ），７．２４−７．３７（ｍ，４Ｈ），７．６０−７．６２（ｍ，１Ｈ），７．９７−８．００（ｍ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６．１，１６．２，１６．６，２４．４，２４．５，２４．９，２６．７，３７．７，４０．４，４０．７，４１．８，４６．０，４６．１，４６．３，５２．０，５２．７，５５．９，１１１，４，１１７．９，１２１．１，１２９．０，１２９．５，１２９．８，１３２．１，１３９．２，１４３．７，１４５．０，１５７．４，１５７．９，１６４．１，１７３．０．ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ２９Ｈ４２Ｎ９Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋５３２．３５１２，ｆｏｕｎｄ：５３２．３５０９。
【０１８６】
製造例８．ＰＰＴ−５の化合物の製造
２−｛４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ−４−ｃａｒｂａｍｏｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２−ｂｅｎｚｙｌ−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ｝−４−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ−６−ａｍｉｎｏｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−［１，３，５］ｔｒｉａｚｉｎｅ（ＰＰＴ−５）。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．２０−１．３０（ｍ，６Ｈ），１．３６（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ），２．６９−２．７８（ｍ，１Ｈ），２．８３（ｄｄ，Ｊ＝３．９，１２．０Ｈｚ，１Ｈ），３．１１−３．５４（ｍ，９Ｈ），４．０７−４．２０（ｍ，１Ｈ），４．７９−４．８６（ｍ，１Ｈ），５．１７（ｂｒｓ，１Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．０５（ｄｄ，Ｊ＝１．８，８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．１６−７．４３（ｍ，６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６．１，１６．３，１６．８，２４．０，２４．２，３７．６，４０．２，４２．２，４５．１，５３．１，５４．６，５５．２，１１１．４，１１７．７，１２１．２，１３０．４，１３０．９，１３１．０，１３１．６，１３９．７，１４３．５，１４５．１，１５６．６，１５７．３，１６４．３，１６４．６，１７２．７．ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ２８Ｈ３９Ｎ９Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋５１８．３３５６，ｆｏｕｎｄ：５１８．３３５５。
【０１８７】
製造例９．ＰＰＴ−１５の化合物の製造
２−｛４−（２−ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｌ−４−ｃａｒｂａｍｏｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ｝−４−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ−６−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌ−［１，３，５］ｔｒｉａｚｉｎｅ（ＰＰＴ−１５）。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８９（ｄｄ，Ｊ＝３，６．６Ｈｚ，３Ｈ），０．９８（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．０３（ｄｄ，Ｊ＝３，６．６Ｈｚ，６Ｈ），１．２０−１．２６（ｍ，３Ｈ），１．５０−１．５７（ｍ，１Ｈ），１．６７−１．７４（ｍ，１Ｈ），１．９２−２．０４（ｍ，２Ｈ），２．６７−２．８３（ｍ，２Ｈ），２．９８−３．１２（ｍ，４Ｈ），３．３１−３．４９（ｍ，３Ｈ），４．５８−４．６２（ｍ，２Ｈ），４．７８（ｔ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ，１Ｈ），５．０２−５．０５（ｍ，１Ｈ），６．９３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．０６−７．１１（ｍ，２Ｈ），７．２８−７．３３（ｍ，２Ｈ），７．６０−７．６３（ｍ，１Ｈ），８．０１−８．０３（ｍ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１２．３，１２．４，１８．７，２０．８，２１．０，２２．８，２６．２，３３．９，３７．０，３８．０，４２．４，４２．６，４８．１，４８．２，４９．２，４９．８，５２．２，１０７．６，１１３．９，１１７．４，１２５．３，１２５．７，１２６．８，１２７．１，１３５．２，１３５．４，１４０．１，１４１．５，１５３．５，１５３．８，１６０．１，１６９．８．ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ３１Ｈ４６Ｎ９Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋５６０．３８２５，ｆｏｕｎｄ：５６０．３８２７。
【０１８８】
製造例１０．ＰＰＴ−１９の化合物の製造
２−｛４−（２−ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｌ−４−ｃａｒｂａｍｏｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２−ｂｅｎｚｙｌ−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ｝−４−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ−６−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌ−［１，３，５］ｔｒｉａｚｉｎｅ（ＰＰＴ−１９）。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．０６−１．０８（ｍ，６Ｈ），１．２０−１．２６（ｍ，３Ｈ），１．９６−２．０５（ｍ，１Ｈ），２．５７−２．６８（ｍ，２Ｈ），２．８４−２．９４（ｍ，１Ｈ），３．０６−３．２３（ｍ，５Ｈ），３．３５−３．４９（ｍ，３Ｈ），４．５０−４．６５（ｍ，２Ｈ），４．７８（ｔ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ，１Ｈ），５．１０−５．１６（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｄｄ，Ｊ＝１．８，８．１Ｈｚ，２Ｈ），６．９８−７．０４（ｍ，２Ｈ），７．１１−７．３４（ｍ，７Ｈ），７．５７−７．６５（ｍ，１Ｈ），７．９６−８．０３（ｍ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１３．９，１４．０，２０．２，２７．８，３５．４，３５．６，４０．１，４４．０，５１．１，５１．９，１０９．０，１１５．０，１１８．８，１２６．４，１２７．１，１２８．２，１２８．３，１２８．７，１２９．８，１３７．３，１４０．８，１４３．１，１５５．６，１６２．１，１６９．９．ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ３４Ｈ４３Ｎ９Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋５９４．３６６９，ｆｏｕｎｄ：５９４．３６６５。
【０１８９】
製造例１１．ＰＰＴ−２３の化合物の製造
２−｛４−（２−ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｌ−４−ｃａｒｂａｍｏｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ｝−４−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ−６−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌ−［１，３，５］ｔｒｉａｚｉｎｅ（ＰＰＴ−２３）。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．０５（ｑ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，６Ｈ），１．２６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．３８（ｄｄ，Ｊ＝６．９，２５．５Ｈｚ，３Ｈ），１．９５−２．０７（ｍ，１Ｈ），２．７４−２．８５（ｍ，２Ｈ），２．９７−３．１８（ｍ，４Ｈ），３．３２−３．５０（ｍ，３Ｈ），４．５２−４．６３（ｍ，３Ｈ），４．８８−５．０２（ｍ，１Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．９８−７．０９（ｍ，２Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，３Ｈ），７．６７−７．７４（ｍ，１Ｈ），８．１２−８．２１（ｍ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６．１，１７．３，２２．５，３０．１，３７．７，４１．６，４６．４，４９．４，５２．８，５３．５，５７．３，１１１．２，１１７．３，１２０．８，１２９．４，１３０．５，１３１．８，１４３．３，１４５．２，１７２．１．ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ２８Ｈ４０Ｎ９Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋５１８．３３５６，ｆｏｕｎｄ：５１８．３３５３。
【０１９０】
製造例１２．ＰＰＴ−２８の化合物の製造
２−｛４−（２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌ−４−ｃａｒｂａｍｏｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ｝−４−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ−６−ａｍｉｎｏ−２−ｎａｐｈｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌ−［１，３，５］ｔｒｉａｚｉｎｅ（ＰＰＴ−２８）。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．６１（ｄｄ，Ｊ＝６．０，１４．７Ｈｚ，３Ｈ），０．７８（ｄｄ，Ｊ＝６．０，１４．７Ｈｚ，３Ｈ），１．１８−１．２６（ｍ，３Ｈ），１．３０−１．４４（ｍ，２Ｈ），１．７２−１．８１（ｍ，１Ｈ），２．６０−２．８６（ｍ，２Ｈ），３．０１−３．４９（ｍ，５Ｈ），４．２７−４．４３（ｍ，２Ｈ），４．６８−５．０７（ｍ，４Ｈ），６．９３（ｄｄ，Ｊ＝４．２，７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．１０−７．１４（ｍ，２Ｈ），７．３１−８．０４（ｍ，１２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１３．８，２２．１，２４．３，３５．５，３８．２，３８．３，３９．５，４１．３，４８．１，４９．７，４９．８，５０．５，５３．６，５３．９，１０９．２，１１６．１，１１７．２，１１８．９，１２２．４，１２２．６，１２４．９，１２５．６，１２６．１，１２７．４，１２８．１，１２８．５，１２８．７，１３０．６，１３０．８，１３１．８，１３２．１，１３３．５，１３８．２，１４１．７，１４２．６，１５５．１，１５５．３，１５５．５，１６１．６，１６１．７，１６２．１，１７１．０．ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ３８Ｈ４６Ｎ９Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋６４４．３８２５，ｆｏｕｎｄ：６４４．３８２７。
【０１９１】
製造例１３．ＰＰＴ−３１の化合物の製造
２−｛４−（２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌ−４−ｃａｒｂａｍｏｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２−ｂｅｎｚｙｌ−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ｝−４−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ−６−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌ−［１，３，５］ｔｒｉａｚｉｎｅ（ＰＰＴ−３１）。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．１８−１．２５（ｍ，３Ｈ），２．６３−３．１４（ｍ，６Ｈ），３．２２−３．３１（ｍ，１Ｈ），３．３６−３．４５（ｍ，２Ｈ），４．４５（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，２Ｈ），４．５３−４．６４（ｍ，２Ｈ），４．７６（ｔ，Ｊ＝１３．８Ｈｚ，１Ｈ），５．０６−５．１２（ｍ，１Ｈ），６．９１−７．３７（ｍ，１６Ｈ），７．５７−７．６８（ｍ，１Ｈ），７．９６−８．０３（ｍ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４．４，３５．８，４０．４，４４．１，４４．２，４４．４，４８．１，５１．２，５１．３，５２．３，５２．４，５３．２，５３．３，１０９．７，１１６．３，１１９．４，１２６．７，１２７．３，１２７．６，１２８．６，１２８．９，１２９．０，１３０．０，１３７．６，１３８．９，１４１．５，１４３．０，１５５．５，１５６．０，１６２．４，１７０．４．ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ３７Ｈ４２Ｎ９Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋６２８．３５１２，ｆｏｕｎｄ：６２８．３５１０。
【０１９２】
製造例１４．ＰＰＴ−３６の化合物の製造
２−｛４−（２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌ−４−ｃａｒｂａｍｏｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ｝−４−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ−６−ａｍｉｎｏ−２−ｎａｐｈｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌ−［１，３，５］ｔｒｉａｚｉｎｅ（ＰＰＴ−３６）。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．０８−１．２４（ｍ，６Ｈ），２．６５−２．８４（ｍ，２Ｈ），３．０３−３．２９（ｍ，３Ｈ），３．４０（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），４．２８（ｑ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ，２Ｈ），４．６５（ｔ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ，１Ｈ），４．８７−５．１０（ｍ，３Ｈ），６．９３（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．０９−７．１２（ｍ，２Ｈ），７．３０−７．５２（ｍ，８Ｈ），７．７６−７．８７（ｍ，１Ｈ），８．０１−８．１７（ｍ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６．０，１７．１，３７．８，４４．１，４９．４，５０．３，５２．６，５７．１，１１１．４，１１８．５，１２０．９，１２４．８，１２７．２，１２７．８，１２８．０，１２８．３，１２９．５，１２９．６，１３０．４，１３０．７，１３０．８，１３３．０，１３４．４，１３５．７，１４０．４，１４０．８，１４４．１，１４４．６，１５７．６，１６３．５，１６３．６，１６４．０，１７３．５．ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ３５Ｈ４０Ｎ９Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋６０２．３３５６，ｆｏｕｎｄ：６０２．３３５８。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
0006349456.tif 000073
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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