(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
反芻動物における産褥性子宮炎を予防するための方法であって、反芻哺乳動物に動物用組成物を皮下投与することを含み、前記動物用組成物が、
（１）大腸菌（E. coli）の不活性化全細胞、トゥルエペレラ・ピオゲネス（T. pyogenes）の不活性化全細胞、および、フソバクテリウム・ネクロホラム（F. necrophorum）の不活性化全細胞；または
（２）Ｆ．ネクロホラム ロイコトキシン（ＬＫＴ）タンパク質、大腸菌タイプ１ 線毛アドヘシン（ＦｉｍＨ）タンパク質、およびＴ．ピオゲネス ピオリシン（ＰＬＯ）タンパク質；または
（３）（１）および（２）の組み合わせ
を含む方法。
【請求項２】
前記動物用組成物が、大腸菌の不活性化全細胞、Ｔ．ピオゲネスの不活性化全細胞、およびＦ．ネクロホラムの不活性化全細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記動物用組成物が、ＦｉｍＨタンパク質、ＰＬＯタンパク質、およびＬＫＴタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記動物用組成物が、大腸菌の不活性化全細胞、Ｔ．ピオゲネスの不活性化全細胞、およびＦ．ネクロホラムの不活性化全細胞、および、
ＦｉｍＨタンパク質、ＰＬＯタンパク質、およびＬＫＴタンパク質
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記反芻哺乳動物が乳牛である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記乳牛が、乳牛の群れの一員であり、前記方法が、前記群れにおける産褥性子宮炎の発生率が低下するように、前記群れの他の乳牛に前記動物用組成物を皮下投与することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
反芻動物の繁殖機能を改善するための方法であって、反芻動物に
（１）大腸菌（E. coli）の不活性化全細胞、トゥルエペレラ・ピオゲネス（T. pyogenes）の不活性化全細胞、およびフソバクテリウム・ネクロホラム（F. necrophorum）の不活性化全細胞；または
（２）Ｆ．ネクロホラム ロイコトキシン（ＬＫＴ）タンパク質、大腸菌タイプ１ 線毛アドヘシン（ＦｉｍＨ）タンパク質、およびＴ．ピオゲネス ピオリシン（ＰＬＯ）タンパク質；または
（３）（１）および（２）の組み合わせ
を含む動物用組成物を、反芻動物の繁殖機能が改善されるように、皮下投与することを含む方法。
【請求項８】
前記動物用組成物が、大腸菌の不活性化全細胞、Ｔ．ピオゲネスの不活性化全細胞、およびＦ．ネクロホラムの不活性化全細胞を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記動物用組成物が、ＦｉｍＨタンパク質、ＰＬＯタンパク質、およびＬＫＴタンパク質を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記動物用組成物が、大腸菌の不活性化全細胞、Ｔ．ピオゲネスの不活性化全細胞、およびＦ．ネクロホラムの不活性化全細胞、および、
ＦｉｍＨタンパク質、ＰＬＯタンパク質、およびＬＫＴタンパク質
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記反芻動物が雌牛である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
産褥性子宮炎を予防するため、及び／又は繁殖機能を改善するために、反芻動物に皮下投与される動物用組成物であって、
（１）大腸菌（E. coli）の不活性化全細胞、トゥルエペレラ・ピオゲネス（T. pyogenes）の不活性化全細胞、およびフソバクテリウム・ネクロホラム（F. necrophorum）の不活性化全細胞；または
（２）Ｆ．ネクロホラム ロイコトキシン（ＬＫＴ）タンパク質、大腸菌タイプ１ 線毛アドヘシン（ＦｉｍＨ）タンパク質、およびＴ．ピオゲネス ピオリシン（ＰＬＯ）タンパク質；または
（３）（１）および（２）の組み合わせ
を含む動物用組成物。
【請求項１３】
大腸菌の不活性化全細胞、Ｔ．ピオゲネスの不活性化全細胞、およびＦ．ネクロホラムの不活性化全細胞を含む、請求項１２に記載の動物用組成物。
【請求項１４】
ＦｉｍＨタンパク質、ＰＬＯタンパク質、およびＬＫＴタンパク質を含む、請求項１２に記載の動物用組成物。
【請求項１５】
大腸菌の不活性化全細胞、Ｔ．ピオゲネスの不活性化全細胞、およびＦ．ネクロホラムの不活性化全細胞、および、
ＦｉｍＨタンパク質、ＰＬＯタンパク質、およびＬＫＴタンパク質
を含む、請求項１２に記載の動物用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願の開示は、一般的には反芻動物の健康に関し、より具体的には、子宮疾患に関連する細菌感染症の作用を軽減する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳牛の分娩後の子宮疾患は、動物の福祉を危険にさらし、群れからの早期の離脱をもたらし、あるいは繁殖能力を損なう可能性がある。産褥性子宮炎は、分娩後２１日以内の、異常に拡張した子宮および全身性疾患の徴候（乳量減少、鈍麻、あるいは毒素血症の他の徴候）に関連する悪臭のする水っぽい赤褐色の子宮分泌物、および３９．５℃より高い体温によって定義され、一方、子宮内膜炎は、全身性疾患を伴わない子宮の炎症であり、分娩後２１日を過ぎて発症する。北米では、子宮炎は雌牛の１０〜２０％に発症し、一方で、子宮内膜炎の発生率は、約２８％である（５．３〜５２．６％わたる）。産褥性子宮炎は、通常、ペニシリンや第三世代セファロスポリンのような抗生物質で治療される。しかしながら、抗生物質に対する耐性は世界的に、公衆衛生の大きな課題として認識されており、それゆえ、食用動物における抗生物質の大量使用（後世代セファロスポリンを含む）の潜在的な影響に関する関心が高まっている。子宮炎の各症例のコストは、抗生物質による治療、および、子宮炎が繁殖能力、ミルクの生産および生存性に与える有害な影響のため、約３２９〜３８６米ドルと報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このように、子宮疾患の予防に使用するための組成物および方法に対する継続した満たされていない要求が存在する。本願の開示はこれらの要求を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本願の開示は、一面では、反芻動物における産褥性子宮炎を予防するための方法を提供する。前記方法は一般に、反芻動物に動物用組成物（獣医学用組成物）を皮下投与することを含む。前記動物用組成物は、（１）大腸菌（E. coli）、トゥルエペレラ・ピオゲネス（T. pyogenes）、フソバクテリウム・ネクロホラム（F. necrophorum）の全細胞およびその組み合わせから選択される全細胞；及び／又は、（２）Ｆ．ネクロホラム ロイコトキシン（ＬＫＴ）、大腸菌タイプ１ 線毛アドヘシン（ＦｉｍＨ）、Ｔ．ピオゲネス ピオリシン（ＰＬＯ）から選択されるタンパク質、および、（３）前記全細胞および前記タンパク質の全ての組み合わせ、を含むことができる。ある実施形態では、前記動物用組成物は、大腸菌、Ｔ．ピオゲネス、Ｆ．ネクロホラムの全細胞を含む。ある実施形態では、前記組成物は、ＦｉｍＨ、ＰＬＯおよびＬＫＴタンパク質を含む。ある実施形態では、前記動物用組成物は、大腸菌、Ｔ．ピオゲネス、Ｆ．ネクロホラムの全細胞およびＦｉｍＨ、ＰＬＯおよびＬＫＴタンパク質を含む。
【０００５】
前記方法は、反芻動物への使用に適していると予期される。ある実施形態では、前記反芻動物は、ウシ、 雌牛あるいは水牛等のウシ属のメンバーであり、ある実施形態では、前記反芻動物は、乳牛である。
【０００６】
１つのアプローチでは、前記乳牛は、乳牛の群れのメンバーであり、前記方法は、群れの産褥性子宮炎の発生率を減らすように、群れの他の乳牛に前記動物用組成物を皮下投与することを含む。
【０００７】
別の面では、前記開示は反芻動物の繁殖機能を改良することを含む。反芻動物の繁殖機能を改良する方法は、前記反芻動物に、反芻動物の繁殖機能が改善されるように、本出願に開示される動物用組成物を皮下投与することを含む。
【０００８】
別の面では、前記開示は、大腸菌、Ｔ．ピオゲネス、Ｆ．ネクロホラムの全細胞およびその組み合わせから選択される全細胞、Ｆ．ネクロホラムＬＫＴ、大腸菌ＦｉｍＨ、ＰＬＯおよびその組み合わせから選択されるタンパク質、および前記全細胞と前記タンパク質の何らかの組み合わせを含む動物用組成物を含む。
【０００９】
別の面では、製品が提供される。前記製品は、パッケージおよび少なくとも１つの密封容器を含む。前記容器は、大腸菌、Ｔ．ピオゲネス、Ｆ．ネクロホラムの全細胞およびその組み合わせから選択される全細胞、Ｆ．ネクロホラムＬＫＴ、大腸菌ＦｉｍＨ、ＰＬＯおよびその組み合わせから選択されるタンパク質、および前記全細胞と前記タンパク質の何らかの組み合わせを含む動物用組成物を含む。前記パッケージはさらに、前記動物用組成物が、産褥性子宮炎の予防のため、及び／または、反芻動物の繁殖機能を増加させるために、反芻動物に皮下投与されるためのものであるという表示を提供する印刷物を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、３つの異なる乳汁産生段階における、細菌種特有の病原性因子、lktA（フソバクテリウム・ネクロホラム）、fimH（大腸菌）、および fimAとplo（アルカノバクテリウム・ピオゲネス）の有病率の例を示す。*V.F.≧１＝少なくとも１種の病原性因子の存在。
【図２】図２は、繁殖能力への、乳汁産生日数（days in milk：DIM）１〜３におけるfimH検出の影響の例を示す。黒の実線は、fimH陰性の雌牛を示し、破線はfimH陽性の雌牛を示す。fimH陽性の雌牛は、fimH陰性の雌牛より2.1倍妊娠が確認される可能性が低かった（P＜0.001）。
【図３】図３は、6±1 DIMにおける、直腸温度へのワクチン接種の影響の例を示す。ワクチンは、別々に評価され（A；P値＝0.14)、および、グループ化されて評価された（B；P値＝0.018）。平均値の標準誤差は、エラー・バーで表される。
【図４】図４は、E. coli（A）、FimH（B）、 F. necrophorum（C）、LKT（D）、T. pyogenes（E）および PLO（F）に対するELISA検出血清IgGへの、ワクチン接種の影響の例を示す。Ｘ軸は、分娩に対する日数を表し、Ｙ軸は、複数の抗原に対するELISA検出血清IgGのOD650を示す。平均値の標準誤差は、エラー・バーで表される。
【図５】図５は、コントロール、皮下ワクチンおよび膣内ワクチンとしてグループ化された処置による分娩〜受胎間隔のカプラン・マイヤー生存分析の例を示す。皮下ワクチン（内側の破線）、膣内ワクチン（中間の破線）およびコントロール（実線）に対する分娩〜受胎間隔の中央値は、それぞれ、94、114、および120であった（P値＝0.04）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書の開示は、一般に、反芻動物の健康を改善するための組成物および方法に関係し、より具体的には反芻動物の子宮内疾患の予防に関する。
【００１２】
我々は、反芻動物における子宮内疾患を軽減することを目的とする組成物および方法を開発するために複数の異なるアプローチを評価し、これらのアプローチを、数ある応答の中でもとりわけ、子宮炎および子宮内膜炎への様々な影響について評価した。当業界で知られているように、子宮炎は通常、子宮壁の炎症を伴い、子宮内膜炎は通常、子宮内膜の炎症を伴う。我々のアプローチは、特徴的なワクチン製剤を製造する事および、反芻動物の健康面への、様々な製剤および投与ルートの影響の評価を含んだ。これらの影響は、細菌および細菌タンパクに対する免疫応答の刺激、子宮内膜炎および子宮炎への影響、子宮内細菌汚染への影響、直腸温度等の子宮疾患に関連する症状への影響、繁殖機能への影響を含む。我々が得た結果は、皮下投与のみが産褥性子宮炎に予防効果があり、皮下投与のみが反芻動物における繁殖機能の改善に有効であることを発見するという予期しなかったものであった。我々は膣内および皮下ワクチン接種が、全ての抗原に対する血清ＩｇＧ力価における有意な増加を誘導するが、皮下ワクチン接種は、ＩｇＧ産生の刺激により効果的であることも特定した。しかしながら、皮下投与により得られた子宮炎の予防に対するポジティブな結果および繁殖機能の改善にもかかわらず、どのワクチンも、投与ルートにかかわらず、子宮内膜炎を防がず、あるいは子宮内細菌汚染の可能性を有意に減少しなかった。それゆえ、以下により十分に記載されるように、本発明は、反芻動物における産褥性子宮炎を予防するため、および繁殖機能を改善するため、並びに、本明細書の開示から当業者に明らかである他の利益を与えるための新規で効果的な組成物および方法を提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物を投与される反芻動物は、ウシ、雌牛あるいは水牛等のウシ属のメンバーである。一実施形態では、前記反芻動物は乳牛である。
【００１４】
本明細書の開示は、全細胞及び／又は一以上の他の免疫源を含有する組成物を含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は、大腸菌（E. coli）、トゥルエペレラ・ピオゲネス（T. pyogenes）、フソバクテリウム・ネクロホラム（F. necrophorum）の全細胞およびその組み合わせから選択される全細胞を含有する。いくつかの実施形態では、前記組成物は、Ｆ．ネクロホラム ロイコトキシン（ＬＫＴ）、大腸菌タイプ１ 線毛アドヘシン （ＦｉｍＨ）、Ｔ．ピオゲネス ピオリシン（ＰＬＯ）およびその組み合わせから選択されるタンパク質を含有する。いくつかの実施形態では、前記組成物は前記全細胞と前記タンパク質の任意の組み合わせを含む。このように、前記組成物は、１、２あるいは３つの異なるタイプの細菌及び／又は１，２あるいは３つのタンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、任意の細菌種の二以上の菌株が、前記動物用組成物中に含まれてもよい。別の種の細菌やタンパク質も含まれてもよい。
【００１５】
本明細書に記載されたタンパク質はいずれも、前記タンパク質を内因的に産生する細菌から単離することができ、必要に応じて、任意の純度に精製できる。前記タンパク質はいずれも、任意の適切な発現ベクターおよび発現システムを用いた発現によるなど、従来技術を使用して組換えで複製されることができる、本明細書に記載される各タンパク質のアミノ酸配列および前記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列は、当該分野において既知である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、前記組成物は、前記組成物が動物用組成物であるように、獣医学的に許容されるキャリア、賦形剤あるいは希釈剤を含む。適切なキャリア、賦形剤および希釈剤は当該分野において既知である。いくつかの実施形態において、前記動物用組成物はワクチンとして機能する。
【００１７】
前記動物用組成物中の全細菌細胞は、多種多様な方法のいずれかを使用して不活性化されることできる。不活性化された細菌とは、それらが同様に処理されていない細菌に対してより少ない病原性を有するように処理された細菌である。いくつかの実施形態において、前記細菌は、有機溶媒（一つの非限定的な例はホルマリン）への暴露等によって不活性化される。
【００１８】
前記動物用組成物は、抗生物質及び／又はアジュバントのような、レシピエントに治療的及び／又は予防的利益を提供すると予期される他の剤も含んでもよい。動物用組成物とともに使用するのに好適なアジュバントは、当該分野においてよく知られている。一実施形態では、前記アジュバントは水酸化アルミニウムである。他のアジュバントの非限定的な例には、リポソームおよびアルカソーム（archaeosome）、カルシウム塩、油性エマルション、ナノ粒子およびミクロ粒子、サポニン、免疫刺激複合体、非イオン性ブロック・コポリマー、誘導体化多糖類、キャリア・タンパク質、細菌産物およびそれらの派生物、サイトカイン、補体派生物、などが含まれる。ある実施形態では、前記方法は、従来の抗菌及び抗炎症アプローチ（抗生物質レジメンを含むがこれに限定されない）の前に、同時に、あるいは後に行われることができる。
【００１９】
ある実施形態では、本明細書の開示は、パッケージおよび少なくとも１つの密封容器を含む製品を含む。前記密封容器は、前記動物用組成物を含むことができる。前記動物用組成物は、大腸菌、Ｔ．ピオゲネス、Ｆ．ネクロホラムおよびその組み合わせから選択される全細胞を含む。前記容器は、Ｆ．ネクロホラムＬＫＴ、大腸菌ＦｉｍＨ、Ｔ．ピオゲネスＰＬＯおよびその組み合わせから選択されるタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、前記容器は、前記全細胞と前記タンパク質の任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記パッケージは、前記細胞及び／又は前記タンパク質のいずれか一つあるいはいずれかの組み合わせを別々に含む二以上の容器を有することができる。前記パッケージは、前記動物用組成物が反芻動物投与用であることの表示を提示する印刷物を含み、皮下投与の説明、および、前記投与が反芻動物における子宮炎の予防用であること、及び／又は反芻動物の繁殖機能の改善用であることの表示を含むことができる。
【００２０】
前記開示は、動物用組成物の製造方法および製品を提供する。前記動物用組成物の製造方法は、反芻動物の子宮炎の予防に使用するための及び／又は繁殖機能の改善に使用するための動物用組成物を提供するために、大腸菌、及び／又はＴ．ピオゲネス、及び／又はＦ．ネクロホラムの全細胞、及び／又はＬＫＴ、及び／又はＦｉｍＨ、及び／又はＰＬＯを提供すること、及び、一以上のこれらの剤を獣医学的に許容されるキャリア、賦形剤及び／又は希釈剤と配合することを含む。製品を作るために、前記動物用組成物は、適切な容器に入れられ、パッケージされる。前記パッケージは、前記動物用組成物が、反芻動物の子宮炎の予防、及び／又は繁殖機能を改善するために皮下投与で使用するためのものであることの表示を提示する印刷物を含むように作られる。前記印刷物は、パッケージ材の一部であってもよく、あるいは紙の挿入物であってもよく、あるいは例えば容器（単数または複数）に貼付されたラベルであってもよい。
【００２１】
別の面では、本明細書の開示は、反芻動物における免疫応答を刺激する方法を含む。前記方法は、本明細書に記載された動物用組成物を反芻動物に投与することを含む。前記免疫応答は、体液性及び／又は細胞性応答を含むことができる。前記体液性応答は、細菌によって発現された抗原に特異的な、及び／又は前記動物用組成物で投与されたいずれかのタンパク質に特異的な免疫グロブリンの増加を含むことができる。いくつかの実施形態において、前記刺激される免疫グロブリンはＩｇＧである。ある実施形態における前記免疫応答は、産褥性子宮炎に対する予防効果を提供する。「予防」および「予防的な」という用語は、本明細書において、子宮疾患（特に産褥性子宮炎）に関連する症状の形成及び／又は持続を少なくとも部分的に阻害する意味で用いられる。
【００２２】
当業者は、本明細書の開示の利益により、いつ及びどの程度の頻度で組成物を投与するか、およびどの程度の量の免疫原を含有させるかを決定できるであろう。一般的に、この決定に関与するファクターは、反芻動物の種類、大きさ、年齢および健康全般を含むが、必ずしもこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記組成物は、分娩の前に反芻動物に投与されるが、妊娠中に、あるいはライフサイクルの間の任意の時期に投与されることもできる。
【００２３】
本明細書の開示のある実施形態では、動物用組成物の反芻動物への皮下投与は、細菌感染があり、前記動物用組成物を投与されていない反芻動物の直腸温度と比べて、細菌感染による反芻動物の直腸温度の増加を低減させる。
【００２４】
一実施形態において、本明細書に開示された動物用組成物を反芻動物へ投与することは、反芻動物の繁殖機能を改善する。繁殖機能の改善は、動物用組成物を投与されなかった反芻動物の分娩〜受胎間隔と比べた、分娩〜受胎間隔の縮小を含むことができる。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本明細書の開示は、動物の群れにおける産褥性子宮炎の発生率が、前記組成物を投与されなかった場合と比べて低くなるように、動物の群れのメンバーに、本明細書に開示された動物用組成物を皮下投与することを含む、動物の群れにおいて産褥性子宮炎の発生率を低下させることを含む。ある実施形態では、前記動物の群れは乳牛である。前記動物の群れは、例えば、任意の大きさの酪農場（数頭の乳牛〜何千もの乳牛を収容できる商業用の酪農場）に存在することできる。
【００２６】
以下の実施例は、本明細書の開示を説明するために提示される。それらはいかなる方法における限定も意図していない。
【実施例１】
【００２７】
この実施例は、乳汁産生の３つの異なる段階（1〜3、8〜10および34〜36 DIM [Days In Milk]）での子宮中に存在する細菌種特異的病原性因子（VF）と、乳牛における子宮炎および臨床的子宮内膜炎の発生率の間の関係を示す。以下のVF遺伝子が調査された：アルカノバクテリウム・ピオゲネス特異的であるplo（ピオリシン）、cbpA（コラーゲン結合タンパク質）、およびfimA（線毛発現）；大腸菌特異的なfimH（タイプ１線毛コンポーネント）；およびフソバクテリウム・ネクロホラム特異的なlktA（ロイコトキシン）。子宮スワブは、111頭の分娩後の乳牛から収集された。PCRは、plo、cbpA、fimA、fimH、およびlktA遺伝子の存在を検出するために使用された。A. ピオゲネス cbpAは、５つのサンプルでのみ検出され、それゆえ、さらなる分析にはかけられなかった。大腸菌（fimH）は、1〜3 DIMで検出された場合は子宮炎および子宮内膜炎と有意に関連した。F.ネクロホラム（lktA）は、1〜3および8〜12 DIMで検出された場合は子宮炎と、34〜36 DIMで検出された場合は子宮内膜炎と有意に関連した；また、A.ピオゲネス（fimA および plo）は、1〜3 DIMで検出された場合は子宮炎（fimA）と、8〜10および34〜36 DIMで検出された場合は子宮内膜炎（fimA および plo）と関連した。
【００２８】
農場、管理およびサンプル収集
子宮スワブは、ニューヨークのイサカの近郊に位置する商業的な酪農場で飼育されている111頭の分娩後の乳牛から収集された。サンプルは、2010年の4月から2010年の6月にかけて収集された。繁殖管理は、プレシンク（Presynch）、オブシンク（Ovsynch）およびレシンク（Resynch）の組み合わせ、および、TAIにより繁殖された25〜30％の雌牛、並びに単に活動モニター（ALPRO; DeLaval, Kansas City, MO）による発情期の検出後に繁殖された残りを用いた発情期の検出を利用した。子宮分泌物サンプルは、研究期間の間に３回、各雌牛から収集された（1〜3 DIMに、8〜10 DIMに、および34〜36 DIMに）。２種類の子宮サンプル収集法が使用された：第一および第二サンプル用の子宮スワブおよび第三サンプルのための子宮洗浄。34〜36 DIMで、子宮は通常元の大きさにもどり、子宮液量は減少した。それゆえ、この時点にて、子宮洗浄を行うことは、おそらく、よりよいサンプリング方法である。さらに、子宮洗浄は、子宮内膜炎の診断のために、34〜36 DIMでも使用された。子宮スワブは、以下のようにして収集された：雌牛は拘束され、会陰部が洗浄され、70%のエタノールで消毒された。その後、滅菌ピペット（内側はプラスチック鞘）によって覆われた滅菌綿棒（Har-Vet[登録商標] McCullough Double-Guarded Uterine Culture Swab, Spring Valley, WI）が、膣（cranial vagina）に導入された。前記ピペットは、子宮頚部を通って子宮内へと操作され、前記鞘はその後破裂させられ、前記綿棒（スワブ）が子宮分泌物にさらされた。前記スワブは、前記ピペットの内側に引き入れられ、研究所で処理されるまで４℃にて輸送媒体中で保管された。子宮洗浄サンプルが収集された。手短に言えば、雌牛は拘束され、会陰部を洗浄され、70%エタノールで消毒された。プラスチック注入ピペット（内側はプラスチック鞘）が膣に導入された。前記鞘はその後破裂され、清潔なピペットチップが子宮頚部を通って子宮内へと操作された。合計40mLの無菌生理食塩水が子宮内に注入され、穏やかに撹拌され、液体のサンプルが吸引された。回収された液体の体積は、5〜15mLの範囲であった。サンプルは、研究室での処理前は氷の中で保管された。この企画案は、コーネル・ユニバーシティの動物実験委員会（＃2011−0111）によって見直され承認された。
【００２９】
症例定義
産褥性子宮炎は、分娩後８〜１０日の異常に拡張した子宮および全身性疾患の徴候（乳量減少、鈍麻あるいは毒素血症の他の徴候）を伴う、悪臭のする水っぽい赤褐色の子宮分泌物として臨床的に定義され、研究チームの獣医師の一人によって診断された。得られた子宮洗浄サンプルの臨床的な子宮内膜炎は、視診によって34〜36 DIMに評価された。この方法において、我々は、炎症の目に見える兆候（化膿性あるいは粘液膿性の浸出液）が、別の部位からよりもむしろ子宮から生じることを確認することができた。子宮洗浄サンプルは全て、子宮洗浄サンプル中の化膿性あるいは粘液膿性分泌物の存在を評価する一人の研究者によって、視覚的にスコア化された。０〜２に渡るスコアは、０が洗浄サンプル中に化膿性あるいは粘液膿性分泌物が存在しないことを示し、１が血性であるが化膿性ではないサンプルを示し、２が洗浄サンプル中の膿汁の存在を示す。スコア２の雌牛は、臨床的な子宮内膜炎と診断されるとみなされた。ボディ・コンディション・スコアは、クォーター・ポイントシステムによる５ポイントスコアを使用して、各子宮洗浄の時点で記録された。さらに、農場が記録した分娩容易スコア１〜５（１と２は補助なしの分娩であり、３〜５は、困難性の増加の程度を伴う補助された分娩）、死産分娩および胎盤遺残発生は、リスク要因として使用された。
【００３０】
DNA抽出、PCR、ゲル電気泳動および配列決定
スワブサンプルは、15mLのファルコン（Falcon）チューブ内の1mLのリン酸緩衝食塩水（PBS）中に浸され、粘液、細菌、細胞、あるいは輸送培地を分散するために、ボルテックスされた。全DNAの単離は、400μLの懸濁液から、血液および体液からのDNA精製のための製造者の指示書に従って、QIAmp DNA minikit（Qiagen, Santa Clara, CA）を使用することにより実施された。細菌DNA抽出を最大にするため、いくつかの好都合な変更（400μgのリゾチームの添加および56℃での12時間のインキュベーション等）が行われた。全DNAは、100μLの無菌DNase/RNase-フリー水（Promega, Madison, WI）中に溶出された。DNA濃度および純度は、Nanodrop ND-1000 spectrophotometer（Nanodrop Technologies, Rockland, DE）を使用して光学密度によって評価された。
【００３１】
PCRは、特異的VF遺伝子部の増幅のために使用された。A.ピオゲネスの病原性ポテンシャルに寄与するVF遺伝子の中で、３つが増幅された：plo、cbpAおよびfimA。大腸菌をカテゴリー化するために、fimH遺伝子が選択された。F.ネクロホラムに特有であると思われるロイコトキシン遺伝子（lktA）が、その細菌のVFとして使用された。プライマー配列、アニーリング温度、および増幅産物のサイズに関する詳細は、表１に示される。既知のおよび推定上のA.ピオゲネス、大腸菌およびF.ネクロホラム VF遺伝子の存在は、独立して評価された。温度サイクル・パラメーターは、表１に示されるように、標的配列によって調節された。全ての反応は、24μLの１×Green GoTaq Master Mix（Green GoTaqReaction Buffer、400μM dATP、400μM dGTP、400μM dCTP、400μM dTTP、および3 mM MgCl2で構成される２×Green GoTaq Master Mixからなる; Promega Corp., Madison, WI）およびプライマー、および1μLのDNA抽出物を使用して、25μL容積中で実施された。全ての温度サイクル・プロトコルは、2720 Thermal Cycler（Applied Biosystems, Foster City, CA）で行われた。DNA無しのPCR混合物からなるネガティブ・コントロールは、全てのPCRランに含まれた。増幅産物は、1.2%（wt/vol）のアガロースゲルを通じた電気泳動によって分離され、0.5μg/mLの臭化エチジウムで染色され、Kodak Gel Logic 100 Imaging System（GL 100, Scientific Imaging Systems, Eastman Kodak Co., New Haven, CT）で可視化された。陽性の結果は、予期された分子サイズの増幅産物であると考えられた。
【００３２】
【表１】
0006301945.tif 000002
【００３３】
PCR産物の起源を確認するために、遺伝子fimH、plo、fimA、およびlktaのそれぞれから、５つのPCRポジティブサンプルのうち一つの無作為サンプルが精製され、配列決定のために提出された。得られた配列は、BLASTアルゴリズムを用いて、GenBankの配列と比較された。全ての配列は、98%を超える配列相同性で、それぞれの遺伝子と一致した。
【００３４】
統計分析
雌牛は、VFポジティブ（1）あるいはVFネガティブ（0）に数回にわたり二分された。VF遺伝子の存在と、子宮炎および臨床的子宮内膜炎のオッズの間の関係を評価するために、二つの多変量ロジスティック回帰モデルが、データに適合された；従属変数は、子宮炎（yes - no）および臨床的子宮内膜炎（yes - no）であった。モデルにオファーされた独立変数は、補助分娩（分娩容易スコア≧3）、胎盤遺残、出産数グループ（1、2、≧3）、ボディ・コンディション・スコア、およびDIM 1〜3、8〜10、および34〜36におけるVF fimH、plo、fimA、およびlktAであった。全ての可能性のある二方向相互作用項が、前記モデルに付加された。変数は手動で且つ段階的にモデルから、P値の降順に取り除かれた（変数減少法）。統計学的有意性は、P＜0.05が観察された場合と考えられた。多変量ロジスティック回帰の別のセットは、リスク因子（補助分娩、胎盤遺残、出産数、ボディ・コンディション・スコア）、および子宮疾患に有意に関連する前述のVFの間の関連を評価するために実施された。
【００３５】
カプラン・マイヤー生存分析は、VF遺伝子（plo、cbpA、fimA、fimH、およびlktA）と繁殖能力との関係を評価するために、Medcalc version 10.4.0.0（Mariakerke, Belgium）を使用して行われた；ログランク検定は、P値を算出するために使用された。このモデルの時系列変数は、分娩〜受胎間隔あるいは分娩から追跡調査期間の終わりまでの日数であった；最少追跡調査期間は150日であり、最大は250日であった。統計学的有意性は、P＜0.05が観察された場合と考えられた。
【００３６】
以下の結果が、上述した物質と方法を使用して得られた。
【００３７】
記述統計学
合計で111頭のホルスタインの雌牛がこの研究で使用され、そのうち56頭（50.4%）が初産であり、34頭（30.6%）が2回目の出産であり、21頭（18.9%）が3回目以上の出産であった。前記のA.ピオゲネス VF cbpAは、第一サンプリング（1〜3 DIM）では確認されず、2頭および3頭の雌牛が8〜10と34〜36 DIMにてそれぞれ確認された。その低い有病率のため、VF cbpAは、全ての疾患に関連する分析から排除された。A.ピオゲネス VF fimAと ploは、３つの異なるサンプリング（1〜3、8〜10、および34〜36 DIM）全てで高頻度に見られ、最も高い有病率は、8〜10 DIMで観察された（図１）。最も蔓延しているVFは、外毒素（ロイコトキシン）をコードするF.ネクロホラム VF lktAであった。大腸菌 VF fimHは、３つのサンプリング期間全てで検出され、8〜10 DIMで最も蔓延していた（図１）。この調査対象母集団における子宮炎の総発生率は、40.5%であり、34〜36 DIMで診断された臨床的子宮内膜炎の有病率は、19.8%であった。
【００３８】
細菌種特異的病原性因子と子宮炎の有病率との関係
２つの変数が、子宮炎の有病率に有意に（P＜0.05）影響を与えることが発見された：1〜3 DIMにおける大腸菌 fimHの存在、および8〜10 DIMで診断されたF.ネクロホラム lktA（表２）。fimH陽性大腸菌で汚染された雌牛は、fimH陰性の雌牛と比較して、子宮炎を発症するオッズが4.7倍高かった（P値＜0.001）。F.ネクロホラム VF lktAは、8〜10 DIMで検出された、子宮炎と有意に関連する唯一のVFであった；子宮炎の有病率は、lktA陽性雌牛で54.1%、およびlktA陰性雌牛で24%であった（表２）。
【００３９】
【表２】
0006301945.tif 000003
【００４０】
細菌種に特異的な病原性因子と、臨床的な子宮内膜炎の有病率の関連
３つの変数が、子宮炎の有病率に有意に（P＜0.05）影響を与えることが発見された：1〜3 DIMでの大腸菌 fimHの存在、および、8〜10と34〜36 DIMで診断されるA.ピオゲネス fimA（表３）。大腸菌 VF fimHは、第一サンプル収集（DIM 1〜3）で検出されたときのみ、子宮内膜炎の有意に増加する有病率と関連した；子宮内膜炎の有病率は、fimH陽性および陰性の雌牛でそれぞれ、38.1%と15.6%であった（P値＜0.01）。アルカノバクテリウム・ピオゲネス fimAは、分娩後8〜10および34〜36日で検出された場合、臨床的な子宮内膜炎と大きく関連した；34〜36 DIMでfimA陽性であった雌牛は、陰性の雌牛に比べて、臨床的な子宮内膜炎のオッズが、8.8倍高かった。
【００４１】
【表３】
0006301945.tif 000004
【００４２】
1〜3 DIMでのfimH、8〜10および34〜36 DIMでのfimA、および、8〜10 DIMでのlktAのリスク因子
特異的VF（1〜3 DIMでのfimH、8〜10および34〜36 DIMでのfimA、および、8〜10 DIMでのlktA）の有病率に有意な影響を持つリスク因子に関する結果が、表４に示される。胎盤遺残を有する雌牛は、胎盤遺残の無い雌牛と比較して、fimH陽性大腸菌で汚染されているオッズが44.8倍高く、これは観察された強力な影響であった。
【００４３】
【表４】
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【００４４】
細菌種に特異的な病原性因子と繁殖能力の関連
繁殖能力に有意に関連する唯一のVFは、1〜3 DIMにおけるfimHであった；最初のサンプリングでfimH陽性であった雌牛は、fimH陰性の雌牛と比較したとき、妊娠が確認される可能性が2.1倍低かった（P＜0.01、図２）。前述から明らかなように、この実験では、1〜3 DIMにおけるfimH保有大腸菌の存在は、子宮炎および臨床的な子宮内膜炎と強く関連した。しかしながら、大腸菌は、乳汁産生のより遅い段階（8〜10および34〜36 DIM）で検出された場合、子宮疾患とは関連せず、これは大腸菌が、子宮内環境でコロニー形成する最初の細菌の中に存在すると思われ、最終的に子宮疾患の臨床徴候を引き起こす偏性（F.ネクロホラム）および通性（A.ピオゲネス）嫌気性細菌による将来のコロニー形成を支持する変化を潜在的に導きうることを示唆する。子宮内の病原性大腸菌（IUPEC）は、腸外の病原性大腸菌（ExPEC）と関連するVF（fimH、hlyA、cdt、kpsMII、ibeA、およびastA）の宝庫を保有する。子宮炎および子宮内膜炎に関連する前記６つのVFのうち、fimHは、その高い有病率および子宮疾患と生殖障害との強い関連のため、最重要である。
【００４５】
FimHは、様々なターゲット（宿主哺乳類細胞を含む）への細菌付着に関連するタンパク質ファミリーに属するアドヘシン（type-1 線毛由来）である。従前のある研究の結果は、子宮炎の雌牛から単離されたクローン大腸菌が、臨床的に健常な動物から単離されたクローン細菌より、子宮内膜上皮および間質細胞により付着しやすく、湿潤性であることを示した。別の研究も、前記細菌が、大腸菌中の病原性と典型的に関連する病原性遺伝子を欠くと結論付けた（彼らは、１７のVF遺伝子を評価し、子宮疾患に関連していることが確認されたものは一つもなかった）。
【００４６】
この実験において、1〜3 DIMでFimH陽性の雌牛は、8〜10 DIMでF.ネクロホラムの子宮内汚染を発症する可能性が16.2倍高かった。これらの発見は、F.ネクロホラムおよび他のグラム陰性嫌気性細菌による子宮感染の確立と持続が、先行する大腸菌感染によって確立された適切な子宮内環境の存在によって影響を受けるという概念をサポートする。さらに、現在の研究では、8〜10または34〜36 DIMにおけるfimH保有大腸菌の存在は、子宮炎、臨床的子宮内膜炎あるいは生殖障害と関連しなかった。実際、8〜10 DIMにおけるfimH陽性雌牛は、fimH陰性雌牛（43.4%）と比較して、子宮炎の発生率が数値的に低かった（32.1%）。この事実は、分娩後子宮疾患の多因子性病因学および雌牛が乳汁産生へと進むにつれ、子宮内の微生物個体群が変化するという仮説を強調する。1〜3 DIMでfimH陽性の雌牛の90%以上が、一週間後F.ネクロホラムで汚染され、F.ネクロホラムの存在は、A.ピオゲネスの出現の重要なリスク因子であった。
【００４７】
8〜10 DIMにて収集されたサンプルは、乳汁産生の他の２つの段階と比較して、最も高い細菌有病率を示し、少なくとも１つのVFが雌牛の71%に存在した。興味深いことに、A.ピオゲネスとF.ネクロホラムが、第二収集期間のサンプルにおいて優勢であることが発見された。8〜10 DIMにて、VF lktAは、子宮炎に強く関連する唯一のVFであった：子宮炎の有病率は、F.ネクロホラム陽性の雌牛では54.1%、陰性の雌牛では24%であった。
【００４８】
この実施例では、F.ネクロホラムとA.ピオゲネスによる子宮の汚染が、分娩の間補助が必要であった雌牛において、第二および第三サンプリング期間中にそれぞれ最も高いことが発見された。この実施例の研究において、A.ピオゲネスとF.ネクロホラムはどちらも、第三サンプリング期間（DIM 34〜36）で検出された場合、臨床的な子宮内膜炎と強く関連した。
【００４９】
この実施例では、胎盤遺残が、fimH陽性の大腸菌による子宮内汚染のオッズを44.8倍増大させた。さらに、補助分娩の雌牛は、F.ネクロホラムおよびA.ピオゲネス汚染のリスクがより高かった。このように、子宮疾患は分娩イベントによって影響を受け、環境性の細菌汚染は、重要な役割を果たす。
【００５０】
この実験は、分娩後の子宮疾患の細菌性の病因が、少なくとも３種の異なる細菌（大腸菌、フソバクテリウム・ネクロホラム、およびアルカノバクテリウム・ピオゲネス）からの有意な寄与を伴い、動的で多因子性であるというエビデンスを提供する。
【００５１】
最終的に、第一サンプリング（DIM 1〜3）でfimH陽性であった雌牛は、fimH陰性の雌牛と比べて妊娠する可能性が2.1倍少なかった；fimHは、繁殖能力の低下と有意に関連する唯一のVF遺伝子であった。
【００５２】
大腸菌特異的fimHおよびF.ネクロホラム特異的lktA VF遺伝子は、1〜3および8〜10 DIMでそれぞれ検出された場合、子宮炎のより高い有病率と有意に関連した。大腸菌特異的fimHおよびA.ピオゲネス特異的fimA VF遺伝子は、1〜3日（fimH）に、および8〜10と34〜36（fimA）DIMに検出された場合、臨床的な子宮内膜炎と有意に関連した。
【実施例２】
【００５３】
この実施例では、分娩後子宮疾患の予防のために、タンパク質（FimH；ロイコトキシン, LKT；およびピオリシン, PLO）及び／又は不活性化全細胞（大腸菌、フソバクテリウム・ネクロホラム、およびトゥルエペレラ・ピオゲネス）の異なる組み合わせを含む５つのワクチン製剤の有効性が研究された。我々は最初、分娩後の子宮疾患の関連抗原に対する分娩前の免疫化が、産褥性子宮炎と子宮内膜炎の発生を妨げるだろうと予想した。
【００５４】
以下にさらに説明するように、不活性化全細胞は、各細菌種（大腸菌、F.ネクロホラム、T.ピオゲネス）の２つの遺伝的に異なる菌株を使用して製造された。FimHおよびPLOサブユニットは、組換タンパク質発現を使用して製造され、LKTは、野生F.ネクロホラム株の培養から回収された。３種類の皮下ワクチンが製剤化された：ワクチン１は、不活性化細菌の全細胞とタンパク質から構成され、ワクチン２は、タンパク質のみから構成され、ワクチン３は不活性化細菌全細胞のみから構成された。２種類の膣内ワクチンが製剤化された：ワクチン４は、不活性化細菌の全細胞とタンパク質から構成され、ワクチン５は、PLOとLKTから構成された。ワクチンの有効性を評価するために、無作為化臨床試験が、商業的酪農場で行われ、371頭の春季の若い雌牛が、無作為に６つの異なる治療群（コントロール、ワクチン１、ワクチン２、ワクチン３、ワクチン４およびワクチン５）の１つに割り当てられた。ワクチン群の１つに割り当てられた妊娠後期の若い雌牛は、それぞれ２度ワクチン接種された（妊娠230日および260日）。ワクチンが評価され、皮下および膣内としてグループ化されたとき、皮下が産褥性子宮炎の発生率を有意に減少させることが発見された。さらに、皮下ワクチン接種は、乳汁産生日数６±１における直腸温度を有意に低下させた。繁殖能力は、皮下ワクチンを受けた雌牛で向上した。一般に、ワクチン接種は、全ての抗原に対する血清IgG力価の有意な増加を誘導し、再度の皮下ワクチン接種はより有効であった。結論として、大腸菌、F.ネクロホラムおよびT.ピオゲネスの不活性化細菌成分及び／又はタンパク質サブユニットの皮下ワクチン接種は、乳牛の最初の乳汁産生の間、産褥性子宮炎を成功裏に防止でき、改善された繁殖能力をもたらした。
【００５５】
物質および方法  不活性化細菌成分：大腸菌株4612-2および12714-2がこの実施例のために使用された。菌株は好気的に、LB（Luria-Bertani）ブロス（Sigma-Aldrich）で37℃にて生育された。それらは、1%の一夜培養物を播種され、撹拌しながら（150 rpm）、800mLの培養液中で生育された。菌株12714-2では、細胞は４時間で収集され、0.432のOD600と、1.0×109 CFU/mLを有し、菌株4612-2では、細胞は3.5時間で収集され、0.473のOD600と、1.2×109 CFU/mLを有した。培養物は、0.1%のホルマリンで12時間不活性化され、各菌株0.25mLが最終ワクチン製剤中に存在し、一投与量あたり約109 CFUとなるように、細胞は４倍に濃縮された（最終容積200mL）。
【００５６】
トゥルエペレラ・ピオゲネス菌株10481-8および6375-1は、乳牛の子宮腔から単離された。菌株は、37℃、7% CO2中で、VersaTREK REDOX 1（Trek Diagnostic Systems, OH）で生育された。細胞は、48時間で収集され、菌株10481-8および6375-1でそれぞれ、1.3×108および0.5×108 CFU/mLであった。培養物は、0.1%のホルマリンで12時間不活性化され、各菌株1 mLが最終ワクチン製剤に添加された（一投与量あたり約108 CFU）。
【００５７】
フソバクテリウム・ネクロホラム菌株5663および513は、乳牛の子宮腔から単離された。菌株は、37℃で嫌気的に、VersaTREK REDOX 2（Trek Diagnostic Systems, OH）で生育された。全ての培養物は、細胞が濃縮される前に、0.1%のホルマリンで12時間不活性化された。細胞は、12時間で収集され、菌株513および5663でそれぞれ、1.6×1012および1.8×1012 CFU/mLであった。培養物は、0.1%のホルマリンで12時間不活性化され、各菌株0.01 mLが最終ワクチン製剤に添加された（一投与量あたり約1010 CFU）。
【００５８】
組換タンパク質発現と精製  細菌株の生育およびインダクション条件：大腸菌TOP10（Invitrogen, NY）は、LBアガー上あるいはLBブロス内（Sigma-Aldrich, MO）のどちらかで37℃にて生育された。アンピシリン（50μg/mL）が必要に応じて添加された。T.ピオゲネス49698（American Type Culture Collection, VA）が、5%の馬脱繊維素血が補充されたブレインハートインフュージョン（BHI）アガー上であるいはBHIブロス中（BD BBL, MD）で、37℃、7% CO2で生育された。
【００５９】
His-tagタンパク質（His-PLOあるいはFimH1-156-His）の調製のため、適切な大腸菌培養物が、600nmにて〜0.6の光学密度となるように、37℃で撹拌（200 rpm）しながら生育された。この時点で、イソプロピル 1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド（IPTG; Sigma）が、前記培地に1 mMとなるように添加され、さらに少なくとも３時間撹拌しながらインキュベートされた。
【００６０】
DNA操作および構築物
大腸菌形質転換およびプラスミド抽出、DNA制限、連結、およびアガロースゲル電気泳動のための標準的な手順が行われた。プライマーはIDTで合成され、PCRはGeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems, CA）で実施された。PCRによって変異が誘発されなかったことを確認するために、全てのDNA構築物が、自動DNAシーケンサー（Cornell Biotechnology Resource Center, NY）を使用して配列決定され、LaserGene software（DNASTAR, WI）を使用して解析された。
【００６１】
組換His-PLOのクローニングおよび精製
予測シグナル配列のコード領域が欠損しているPLO遺伝子が、XhoIサイト（5'-ACAGCATCCTCGAGTGCCGGATTGGGAAAC-3'[配列番号NO:11]）を含む5'プライマーとEcoRIサイト（5'-TGGAATTCCCTAGGATTTGACATTGT-3'[配列番号NO:12]）を含む3'プライマーを用いたPCRによって、A.ピオゲネス ATCC49698 ゲノムDNAから増幅された。50μLの反応は、1 mM MgSO4（Invitrogen, NY）を含む1×Pfx増幅バッファー（Invitrogen）、0.3 mMの各dNTP、0.3μMの各プライマー、1 Uの白金Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen, NY）および約50 ngの鋳型DNAを含んだ。増幅のためのサイクリングパラメ−タは、以下の通りであった：94℃にて5分の初期変性、引き続き30サイクルの変性（94℃・１分）、アニーリング（58℃・１分）、伸長（72℃・3分）、および72℃にて7分間の最終伸長。1.5-kbの増幅産物が、XhoI-EcoRIで消化され、XhoI-EcoRI-消化pTrcHisB（Invitrogen, NY）中にクローン化された。
【００６２】
３時間のインダクション後、細胞は、10,000×g・10分間の遠心分離によって収集され、ペレットは、1Ｘ抽出/洗浄バッファー（50 mMのリン酸ナトリウム、300 mMのNaCl）(pH 7.0）中に再懸濁された。リゾチームが、0.75 mg/mLの最終濃縮物に添加され、混合物は30分間振盪下で4℃にてインキュベートされた。細胞は、20,000 psi（138 Mpa）のFrench pressure cell（Amicon）を通る２つの通路によって破壊され、不溶性物質は、12,000×g・30分間の遠心分離によって除去された。His-PLOは、TALON metal affinity resin（Clontech, CA）を用いて、製造者の指示書に従って可溶性画分から精製された。単離された精製タンパク質画分は、10 kDaの分子量を排除するフィルター（Amicon ultra 100K, Millipore, MA）を使用した繊維濃縮／脱塩システムを使用して濃縮され、Mini-PROTEAN Tetra Cell 電気泳動システム（Bio-Rad, CA）を使用して、SDS-PAGE（15%）にかけられ、続いて、標準プロトコルにかけられた。タンパク質濃度は、ブラッドフォード法によって決定された。
【００６３】
合計30リットルの培養物が、合計321.24 mgのHis-PLOを製造するために生育された。His-PLOの最終容積は、41 mLであり、最終濃度は7.83 mg/mLとなった。
【００６４】
組換え FimH1-156-Hisのクローニングおよび精製
シグナルペプチドをコードするfimH遺伝子の一部と、成熟タンパク質の最初の156アミノ酸（マンノース-結合レクチンドメイン、LD）が、ワシントン州、ワシントン大学のDr. Evgeni Sokurenkoによって提供されたプラスミドpET-22b(+)-F3-LDから増幅された。使用された5'プライマーは、BamHIサイト（5'-CGCGGATCCATGAAACGTGTTATTACCCTG-3'[配列番号NO:13]）を含み、と3'プライマーは、HindIIIサイト（5'-CCCAAGCTTCTAGTGATGGTGATGGTGATGGCCGCCAGTAGGCACCAC-3'[配列番号NO:14]）と前記タンパク質の真の配列に続く６-ヒスチジンタグを含んだ。PCRコンポーネントは、PLO遺伝子増幅のために記載された。増幅のためのサイクリングパラメ−タは、以下の通りであった：94℃にて5分の初期変性、引き続き25サイクルの変性（94℃・１分）、アニーリング（61℃・１分）、伸長（72℃・3分）、および72℃にて7分間の最終伸長。増幅産物約0.6 kbが、BamHI-HindIIIで消化され、BamHI-HindIII-消化pTrcHisA（Invitrogen）中にクローン化された。５時間のインダクション後、FimH1-156-Hisの精製がPLOに記載されているように実施された。
【００６５】
合計92リットルの培養物が、216.34 mgのFimH1-156-Hisを製造するために生育された。FimH1-156-Hisの最終容積は、172.5 mLであり、濃度は1.25 mg/mLとなった。
【００６６】
ロイコトキシンの培養濃縮上清およびアフィニティ−精製
F.ネクロホラム菌株6586は、VersaTREK REDOX 2中で、37℃にて嫌気的に12時間生育された。培養上清は、4℃にて、100 kDaの分子量を排除するフィルター（Amicon ultra 100K, Millipore, MA）を使用した中空繊維濃縮／脱塩システムで濃縮され、F.ネクロホラム6586培養濃縮上清中のLKT濃度を調べるために、LKTのアフィニティー精製が行われた。手短に述べると、精製されたmAb F7B10（3.5 mg）が、5 mLのAffi-Gel 10 affinity support（Bio-Rad, CA）にカップルされ、1×20 cmのカラムに充填された。F.ネクロホラム6586培養濃縮上清がカラムに塗布され、非結合物質が、カラムに15 mLの0.5 M NaClのPBSを通過させることによって除去された。精製LKTは、0.2 Mグリシン-HCl（pH 3.0）を用いて溶出され、直ちにNaOHで中和され、洗浄され、Amicon ultra 10Kを用いて濃縮された。毒素の純度は、SDS-PAGEによって決定された。
【００６７】
全10 LのF.ネクロホラム6586が、0.186 mg/mLのLKTを含む220mLの濃縮上清を製造するために生育された。前記濃縮上清中のLKTの存在と濃度は、アフィニティ−精製によって決定された。
【００６８】
ワクチン製剤：５つの異なるワクチン製剤が製造された：３つの皮下ワクチン（ワクチン１〜３）および２つの膣内ワクチン（ワクチン４〜５）。ワクチン１は、不活性化細菌の全細胞（大腸菌、T.ピオゲネス、F.ネクロホラム）とタンパク質（FimH、PLO、 LKT）から構成され、ワクチン２は、タンパク質（FimH、PLO、 LKT）のみから構成され、ワクチン３は不活性化細菌全細胞（大腸菌、T.ピオゲネス、F.ネクロホラム）のみから構成された。ワクチン４は、不活性化細菌の全細胞（大腸菌、T.ピオゲネス、F.ネクロホラム）とタンパク質（FimH、PLO、 LKT）から構成され、ワクチン５は、タンパク質（PLOとLKT）のみから構成された。皮下ワクチンのアジュバントは、水酸化アルミニウム（Rehydragel HPA, General Chemical, NJ）であった。皮下ワクチンで使用されたアジュバントの容積は、最終ワクチン容積の25%であった。水酸化アルミニウムは、各成分に別々に添加され、一晩ゆっくりと撹拌された。膣内ワクチンのアジュバントは、20μg/doseのCholera toxin（List Biological Laboratories, Inc., CA）であった。
【００６９】
全てのワクチン成分は、最終ワクチンを構築しボトル詰めされる前に無菌性を試験された。無菌性は、100μLのワクチン成分をLBブロス中で好気的に、VersaTREK REDOX 1上で7% CO2中で好気的に、VersaTREK REDOX 2上で48時間37℃にて嫌気的に培養することによって評価された。成分は、インキュベーション期間の終わりに、３つの培地のいずれかにおいて細菌の増殖があった場合に汚染されているとみなされた。
【００７０】
エンドトキシン・レベルの評価は、LAL Endpoint Assay（Hycult Biotech, The Netherlands）を使用して、製造者の指示書に従って実施された。全てのワクチン製剤は、105 EU/mL未満のエンドトキシン・レベルを有していた。
【００７１】
農場および管理：野外試験は、ニューヨークのイサカの近郊に位置する商業的な酪農場で行われた。雌牛は、2012年5月24日〜2012年8月16日に登録された；追跡調査期間は2013年4月30日まで続いた。この農場は、コーネル・ユニバーシティの「Ambulatory and Production Medicine Clinic」との長い仕事上の関係のために選択された。研究プロトコルは、コーネル・ユニバーシティの動物実験委員会（プロトコルNo：2011−0111）によって見直され承認された。前記農場はダブル52-牛房パラレル搾乳室中で、１日３回、3300頭のホルスタインの雌牛を搾乳していた。雌牛は、マットレスで覆われ固形肥料を敷き詰めたコンクリートの牛房のあるフリーストール牛舎で飼育された。全ての雌牛は、食餌の乾物ベースで約55%の飼料（コーンサイレージ、低水分サイレージ、および麦わら）および45%の濃縮物（コーンミール、大豆ミール、キャノーラ、綿の実、およびシトラス・パルプ）からなる混合飼料（total mixed ration：TMR）を提供された。食餌は、650kgの重量があり、3.5%の脂肪補正乳45kgを産生する泌乳期ホルスタイン雌牛のNRC栄養所要量を満たすか超えるように処方された。繁殖管理は、プレシンク（Presynch）、オブシンク（Ovsynch）およびレシンク（Resynch）の組み合わせ、および、時限人工授精により繁殖された25〜30％の雌牛、並びに単に活動モニター（ALPRO; DeLaval, Kansas City, MO）による発情期の検出後に繁殖された残りを用いた発情期の検出を利用した。
【００７２】
治療群および症例定義：妊娠後期の若い雌牛が、週ベースで登録された；登録の選択基準は以下の通りである：妊娠230±3日、年齢629〜734日、ボディ・コンディション・スコア（BCS）＞2.5。目視で脚の不自由な雌牛は、研究に含められなかった。全無作為野外試験研究が使用された；若い雌牛は、エクセル（Microsoft, Redmond, MA）の乱数機能を使用して、６つの異なる治療群の１つに無作為に割り当てられた。合計371頭の妊娠した若い雌牛がこの研究に登録された；105、54、54、53、53、53頭の若い雌牛がそれぞれ、コントロール、ワクチン１、ワクチン２、ワクチン３、ワクチン４、ワクチン５群に無作為に割り当てられた。ワクチン群に割り当てられた若い雌牛は、ワクチンを２回受けた：妊娠230±3日目および妊娠260±3日目。
【００７３】
ボディ・コンディション・スコアは、全ての研究用の雌牛のために、妊娠期間230±3日、妊娠期間260±3日、2±1 DIM（乳汁産生日数）、6±1 DIMおよび35±3 DIMに、治療群を知らされていない一人の研究者によって、クォーター・ポイントスコアによる５ポイントスケールを使用して決定された。血清サンプルを得るために、血液は、抗凝血剤無しのバキュテナー・チューブおよび20ゲージ×2.54cmのバキュテナー・ニードル（Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ）を使用して、尾静脈／動脈から採取された。全ての血液サンプルは、氷の上に乗せた状態で研究室に輸送され、4℃にて15分間、2000×gの遠心分離機内で回転された；血清は収集され、-80℃で凍結された。血清サンプルは、妊娠期間230±3日、妊娠期間260±3日、1±2 DIM、6±1 DIMおよび35±3 DIMに採取された。
【００７４】
子宮頚部スワブは、2±1 DIMと6±1 DIMに採取された：雌牛は拘束され、会陰部が洗浄され、70%のエタノール溶液で消毒された。スワブは子宮頚部の内側で処置され、子宮分泌物にさらされた。スワブは研究室中で処理されるまで、4℃にて無菌バイアルの内側で保管された。2±1 DIMに採取されたスワブは、37℃にてChromagar（Difco）上で好気的に培養され、大腸菌コロニーは青色で識別された；6±1 DIMに採取されたスワブはLKVアガー（Anaerobe Systems）上で嫌気的に培養され、F.ネクロホラムコロニーは、形態で識別された。
【００７５】
胎盤遺残、産褥性子宮炎、ケトーシス、および臨床的乳腺炎は、コーネル・ユニバーシティの「Ambulatory and Production Medicine Clinic」の獣医師によって設計された特定の診断プロトコルに従う訓練を受けた農場職員によって診断され治療された。農場職員は前記処置を知らされなかった。
【００７６】
分娩後、雌牛は20 DIMあたりまで同じ囲いの中で飼育された。この囲いは、農場の従業員によって集中的にモニターされ、雌牛は、鈍麻や抑うつの徴候を示している場合は、詳細な身体検査にかけられた；熱があり、悪臭のする、水っぽい、赤褐色の子宮分泌物を伴う雌牛は、産褥性子宮炎と診断され、農場の従業員によって治療された。胎盤遺残は、雌牛が分娩から24時間以内に胎膜を放出できなかった状態として定義された。研究チームによる産褥性子宮炎の診断は、6±1 DIMに行われた。産褥性子宮炎は、悪臭のする、水っぽい、赤褐色の子宮分泌物の存在および39.5℃より高い直腸温度として定義された。産褥性子宮炎の診断に関する情報は、農場職員と研究チームの間で交換されなかった。健康形質および生殖に関するデータは、農場のDairyComp 305[登録商標]データベース（Valley Agricultural Software, Tulare, CA）から抽出された。
【００７７】
臨床的な子宮内膜炎の診断は、化膿性分泌物の存在のための子宮洗浄サンプルの視診によって35±3 DIMに評価された。子宮洗浄サンプルを得るために、雌牛は拘束され、会陰部が洗浄され、70%のエタノールで消毒され、プラスチック製の注入ピペットが、膣（cranial vagina）に導入され、子宮頚部を通って子宮内へと操作された。合計20 mLの無菌生理食塩水が子宮内へ注入され、ゆっくりと撹拌され、前記液体のサンプルが吸引された。回収された液体の容積は5〜15 mLの範囲となった。全てのサンプルは、子宮洗浄サンプル中の化膿性あるいは粘液膿性の分泌物の存在を評価する一人の研究者によって視覚的にスコア化された。０〜２に渡るスコアは、０が化膿性あるいは粘液膿性分泌物が存在しないことを示し、１が血性であるが化膿性ではないサンプルを示し、２が洗浄サンプル中の膿汁の存在を示す。スコア２の雌牛は、臨床的な子宮内膜炎と診断されるとみなされた。サンプルは、5%の羊脱繊維素血が補充されたMueller-Hintonアガー・プレート（BBL[登録商標]）上で、38℃、5% CO2中にて好気的に48時間培養されるまで、氷の上で保管された。典型的なT.ピオゲネス コロニーが、コロニー形態、インキュベーション後の溶血、グラム染色の特徴的所見によって識別された。
【００７８】
酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）：ワクチン調製のために製造された抗原の一部が、ELISAで使用された。大腸菌の菌株は、単一の抗原として一緒に保存された。同じことが、F.ネクロホラムとT.ピオゲネスの菌株でも行われた。
【００７９】
ウシ血清サンプルは、解析前に解凍され混合された。選択的ELISAプロトコルは以下の通りであった。ELISAマイクロタイタープレート（Greiner Bio-One, Germany）は、それぞれ抗-FimH、抗-LKT、抗-PLO、抗-大腸菌、抗-F.ネクロホラム、および抗-T.ピオゲネス IgG解析のために、 0.295μg/mLのFimH1-156-His、0.036μg/mLのHis-PLO、0.186μg/mLのLKT、107 cells/mLの大腸菌、1010 cells/mLのＦ．ネクロホラム、および107 cells/mLのＴ．ピオゲネスのいずれかを含むPBS（リン酸緩衝食塩水 10X、pH 7.4、Ambion[登録商標]）でコートされた。マイクロタイター・ウェルへの抗原の結合は、4℃にて一晩実施され、非特異的結合サイトはPBS含有1%カゼイン（Thermo Scientific, Rockford, IL）でブロックされた。ウシ血清サンプルの希釈は、その後、ELISAプレートに添加された；血清サンプルは、抗-FimH、抗-LKT、抗-PLO、抗-大腸菌、抗-F.ネクロホラム、および抗-T.ピオゲネス IgG解析のために、それぞれ、1：1000、1：5000、1：5000、1：150、1：500、および1：150の比率で希釈された。最適な抗原および抗体濃度は、様々な濃度の定量的ELISAプロトコルを行うことによって決定された。ELISAプレートに結合された血清型-特異的抗体は、西洋わさびペルオキシダーゼと抱合した抗-ウシIgG抗体で検出され、製造者の指示書（Sigma Aldrich, St. Louis, MO）に従って希釈され、基質、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン-TMB（Sigma Aldrich, St. Louis, MO）を添加された。各ウェルの光学密度は、ELISAプレート・リーダー（Synergy HTmicroplate reader BioTek Instruments, VT）を使用して、650nmにて20分後に測定された。生じた色量は、ウェル底部のタンパク質に結合した一次抗体の量に比例した。解析の各ステップの間に、マイクロタイター・ウェルは吸引され、洗浄液（1X Phosphate Buffered Saline Tween-20）で３回すすがれた。
【００８０】
統計解析：記述統計学解析が、FREO手順（SAS Institute INC., Cary, NC）を使用するSASで行われた。RDPMET、FDPMET、子宮内膜炎、大腸菌、F.ネクロホラム、およびT.ピオゲネス培養成績のオッズに対するワクチン接種の効果を評価するために、ロジスティック回帰モデルが、ロジスティック手順を使用するSASに当てはめられた。皮下および膣内ワクチンの繁殖への効果が、SASにおける比例ハザード回帰手順を使用したコックスの比例ハザードによって解析された。6±1 DIMでの直腸温度へのワクチン接種の効果を評価するために、混合一般線形モデルが、JMP[登録商標]PRO9を使用するデータに当てはめられた。ワクチン抗原に対するELISA検出血清IgGへのワクチン接種の効果を評価するために、混合一般線形モデルが、JMP[登録商標]PRO9を使用するデータに当てはめられた。ストリンジェント・タイプＩエラーリスクを5%に維持する間、タイプIIエラーリスクを減じるために、上述した全てのモデルについて、独立変数およびそれぞれの相互作用はP＜0.10に保たれた。可変の処理は、統計学的有意性がない場合でさえ、全ての統計モデルに強制された。登録時の日齢、および登録時のBCSは、全てのモデルに提供された。
【００８１】
この実施例では、上述した材料および方法を使用して、以下の結果が得られた。
【００８２】
記述統計学：登録時の平均年齢（日）登録時と分娩後6±1日の平均BCS、登録時の平均妊娠期間長さ、および、登録された動物の合計数に関する記述統計学を表５に示す。動物間の変動をできる限り少なくするために、妊娠した若い雌牛のみがこの研究に登録された。
【００８３】
【表５】
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【００８４】
研究者に診断された産褥性子宮炎（RDPMET）、農場で診断された産褥性子宮炎（FDPMET）の発生率、および6±1 DIMでの直腸温度に対するワクチン接種の効果：RDPMETの発生率に対するワクチン接種の効果が表６に示される。別々に評価されたとき、ワクチン１，２および３は、RDPMETの発生率の数値的減少に関連したが、ワクチン４および５は発生率の増加に関連した。しかしながら、これらの差は統計的に有意ではなかった（P値＝0.21）。ワクチンが、皮下あるいは膣内ワクチンのどちらかとしてグループ化されて評価された場合、皮下ワクチンは、RDPMETの発生率の有意な減少と関連した（P値＝0.03）。
【００８５】
【表６】
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【００８６】
FDPMETの発生率に対するワクチン接種の効果を表７に示す。ワクチンが別々に評価されたとき、FDPMETの発生率は、治療間で異なる傾向があった（P値＝0.064）。さらに、ワクチンが皮下あるいは膣内ワクチンとしてグループ化されて評価された場合、皮下ワクチンは、FDPMETの有意に低いオッズと関連した（P値＝0.047）。
【００８７】
【表７】
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【００８８】
6±1 DIMにおける直腸温度へのワクチン接種の効果を図３に示す。直腸温度は、ワクチンが別々に評価された場合、治療群の間で統計的に異ならなかった（P値＝0.14）。しかしながら、ワクチンが、コントロール、皮下ワクチン、膣内ワクチンにグループ化されて評価された場合、直腸温度は、治療群の間で統計的に異なった（P値＝0.018）。皮下ワクチン接種は、6±1 DIMにおける直腸温度の有意な低下と関連した。
【００８９】
子宮内膜炎の発生率および子宮分泌物培養結果に対するワクチン接種の効果：ワクチンは別々に評価された場合または皮下および膣内ワクチンにグループ化された場合、子宮内膜炎の予防に有効ではなかった（P値＝0.99）。子宮内膜炎の発生率は、コントロール、ワクチン１、ワクチン２、ワクチン３、ワクチン４、およびワクチン５でそれぞれ、8.57%、7.89%、12.12%、7.50%、9.09%、および9.76%であった。子宮内膜炎の発生率は、皮下および膣内ワクチンでそれぞれ9.01%および9.46%であった。さらに、子宮内細菌汚染の尤度へのワクチン接種の有意な効果は観察されなかった（表８）。
【００９０】
【表８】
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【００９１】
繁殖に対するワクチン接種の効果：皮下ワクチン接種を受けた雌牛は、コントロールの雌牛と比較したとき、1.36倍妊娠する可能性が高かった（P値＝0.04）。しかしながら、膣内ワクチンを受けた雌牛では、妊娠する尤度は、コントロールの雌牛と統計的に異ならなかった（ハザード比＝1.12、P値＝0.46）。登録時の日齢および登録時のBCSは、この解析用のモデルで保持された（それぞれP値＝0.02と0.01）。繁殖能力の改善は、皮下ワクチンを接種された雌牛が、コントロールの雌牛および膣内ワクチン接種を受けた雌牛より有意に早く妊娠したことを実証する生存率分析（図５）によってさらに説明される。
【００９２】
ワクチン接種に対する血清学的応答：複数の抗原に対するELISA-検出血清IgGへのワクチン接種の効果が図４に示される。一般に、ワクチン接種は、全ての抗原に対する血清IgG力価の有意な増加を誘導した；皮下ワクチン接種は、膣内ワクチン接種より血清IgG力価の増加に有効であった。
【００９３】
図５は、コントロール、皮下ワクチンおよび膣内ワクチンにグループ化された治療による分娩〜受胎間隔のカプラン・マイヤー生存分析の例を示す。ワクチン投与は以下の通りであった：コントロール（ワクチン無し）、皮下ワクチン（ワクチン１，２と３の組み合わせ）、膣内ワクチン（ワクチン４と５の組み合わせ）。Ｙ軸は、妊娠しなかった雌牛の％であり、Ｘ軸は、分娩から妊娠までの日数である。皮下ワクチン（内側の破線）、膣内ワクチン（中間の破線）およびコントロール（実線）に対する分娩〜受胎間隔の中央値はそれぞれ、94、114および120であった（P値＝0.04）。皮下ワクチンを表す線のスロープは、最も急であり、膣内ワクチン群およびコントロール群と比べて、皮下ワクチン群における妊娠した雌牛の数の増加を実証する。
【００９４】
この実施例で示された前述の結果から明らかなように、タンパク質（FimH、Ｆ．ネクロホラム ロイコトキシン(LKT)、T.ピオゲネス ピオリシン(PLO)）および不活性化全細胞（大腸菌、F.ネクロホラムおよびT.ピオゲネス）の異なる組み合わせを含有する５つの異なるワクチン製剤（３つの皮下ワクチンと２つの膣内ワクチン）の、乳牛の子宮の健康に対する効果は、皮下ワクチン接種が産褥性子宮炎の発生率を有意に低下させる一方、膣内ワクチン接種は有効ではなかったという点で、異なる。
【００９５】
産褥性子宮炎は、子宮壁の全層の炎症を特徴とし、さらに、鈍麻、乳量減少および熱等の全身性疾患の徴候と関連する。本明細書に記載の通り診断される場合、産褥性子宮炎の発生率は12.12%であり、農場の従業員によって診断される場合、27.62%であった。この相違は、雌牛がモニターされる期間に起因する可能性がある；農場の従業員は、分娩後最初の20日の間毎日雌牛をモニターし、これに対して研究チームは分娩後6±1に雌牛を試験した。雌牛は、子宮炎が分娩後最初の７日でピークに達するため、この時点で試験された。しかしながら、概して、産褥性子宮炎に対するワクチン接種の効果は、研究者グループの診断と農場従業員の診断の間で一貫していた；皮下ワクチン接種は、産褥性子宮炎の発生率を有意に低下させる一方、膣内ワクチンはこの疾患の予防に有効ではなかった。
【００９６】
大腸菌とF.ネクロホラムは、グラム陰性菌であり、その外膜中のリポ多糖類（LPS）の存在を特徴とし、産褥性子宮炎の既知の病原因子である；LPSは、ウシにおいて体温上昇を引き起こすことが知られている。ワクチン接種は、子宮内の大腸菌およびF.ネクロホラムに陽性な雌牛のパーセントを有意に減少しなかったが、皮下ワクチン接種された雌牛は、6±1 DIMの直腸温度がより低かった。これは、たとえ子宮内に細菌が存在しても、免疫化された雌牛は、大腸菌およびF.ネクロホラムから放出されるLPSによって引き起こされる全身的徴候を発症しにくいということを示唆する。大腸菌の細菌負荷の減少は、疾患の重症度を低下させることが知られており、それゆえ、免疫化は子宮内部の病原体負荷を減少させた。
【００９７】
粘膜の免疫応答は、粘膜表面へのワクチン投与によって効果的に誘導できるが、皮下および筋肉内ワクチンは、一般に粘膜の免疫を誘導できず、粘膜表面の感染防止に効果が少ない。全細胞ワクチンを用いた膣内免疫化によるヒトUTIの予防に関する期待できる結果がすでに報告されている。しかしながら、子宮の抗体分泌細胞による特異的抗体の局所合成が、どのように子宮免疫に寄与するかは知られていない。本研究では、膣内免疫化は、子宮疾患の予防に効果的ではなかった。
【００９８】
一般に、皮下ワクチン接種は、大腸菌、FimH、F.ネクロホラム、LKT、T.ピオゲネス、およびPLOに対するIgGの血清濃度を増加させた。
【００９９】
F.ネクロホラム LKTは、ウシPMNに毒性が高く、それらのアポトーシス性の死滅を誘導することが知られている；この毒性は用量依存的である。LKTに対する雌牛の免疫化は、子宮内PMNへのこの毒の有毒な影響を減じる可能性があり、食作用を通じて子宮から細菌感染を除去するために、自然免疫システムの能力を向上させうる。漸加したPMNは、子宮の免疫防御における中心的存在である；分娩前２週間のPMNの遊走の低下は、胎盤遺残と関連し、PMNの低下した食作用活性および酸化バースト能は、子宮炎および子宮内膜炎の発生と関連する。
【０１００】
産褥性子宮炎の発生率は、タンパク質（FimH、LKT、PLO）と不活性化全細胞（大腸菌、F.ネクロホラム、T.ピオゲネス）の様々な組み合わせを含むワクチンを用いた分娩前の皮下ワクチン接種によって有意に低下した。対照的に、膣内ワクチン接種は、産褥性子宮炎の発生率の減少に有効ではなかった。それゆえ、商業的に製造された子宮炎のワクチンは、子宮炎に対する予防戦略に不可欠な部分となり得、この疾患の発生率を減じ、抗生物質の使用を減じ、それによって酪農業における子宮炎による動物の苦痛と全体的なネガティブな経済的影響の両方を軽減すると予想される。
【０１０１】
本開示は、特定の実施形態（そのいくつかは好ましい実施形態）を参照して具体的に示され記載されてきたが、形式および詳細における様々な変化が、本明細書に開示された精神と範囲から逸脱することなく行なわれうることが当業者に理解されるはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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