(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮成長因子(VEGF)と結合する抗体であって、
（ｉ）1)配列番号5のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号16のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号36のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、
（ｉｉ）1)配列番号5のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号17のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号37のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、
（ｉｉｉ）1)配列番号5のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号18のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号38のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、
（ｉｖ）1)配列番号5のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号19のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号39のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、
（ｖ）1)配列番号5のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号20のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号40のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、
（ｖｉ）1)配列番号6のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号21のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号38のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、
（ｖｉｉ）1)配列番号6のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号22のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号38のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、
（ｖｉｉｉ）1)配列番号7のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号23のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号41のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、
（ｉｘ）1)配列番号6のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号24のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号38のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、
（ｘ）1)配列番号6のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号25のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号38のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、および
（ｘｉ）1)配列番号8のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号26のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号42のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体
からなる群から選ばれる、抗体。
【請求項２】
血管内皮成長因子(VEGF)と結合する抗体であって、
（ｉ）1)配列番号55のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2)配列番号79のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体、
（ｉｉ）1)配列番号55のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2)配列番号80のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体、
（ｉｉｉ）1)配列番号56のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2)配列番号81のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体、
（ｉｖ）1)配列番号55のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2)配列番号82のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体、
（ｖ）1)配列番号55のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2)配列番号83のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体、
（ｖｉ）1)配列番号57のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2)配列番号84のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体、
（ｖｉｉ）1)配列番号57のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2)配列番号85のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体、
（ｖｉｉｉ）1)配列番号58のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2)配列番号86のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体、
（ｉｘ）1)配列番号57のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2)配列番号87のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体、
（ｘ）1)配列番号57のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2)配列番号88のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体、および
（ｘｉ）1)配列番号59のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2)配列番号89のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体
からなる群から選ばれる、抗体。
【請求項３】
ヒトまたはヒト化抗体である請求項1または2記載のVEGF結合抗体。
【請求項４】
IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM、またはその組み合わせまたは変異体である請求項1または2記載のVEGF結合抗体。
【請求項５】
Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb、scFv、またはVEGFと結合するための主要部分として該抗体のCDRを含む足場コンジュゲートの形の請求項4記載のVEGF結合抗体。
【請求項６】
請求項1または2記載のVEGF結合抗体の軽鎖可変領域をコードするDNA。
【請求項７】
配列番号67〜71からなる群から選ばれる塩基配列で示される請求項6記載のVEGF結合抗体の軽鎖可変領域をコードするDNA。
【請求項８】
請求項1または2記載のVEGF結合抗体の重鎖可変領域をコードするDNA。
【請求項９】
配列番号106〜116からなる群から選ばれる塩基配列で示される請求項8記載のVEGF結合抗体の重鎖可変領域をコードするDNA。
【請求項１０】
VEGFと結合する抗体の軽鎖可変領域を発現する請求項6または7記載のDNAを含む発現ベクター。
【請求項１１】
VEGFと結合する抗体の重鎖可変領域を発現する請求項8または9記載のDNAを含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項10および11の発現ベクターで形質転換された動物細胞株。
【請求項１３】
CHO細胞、HEK細胞、またはNS0細胞である請求項12記載の動物細胞株。
【請求項１４】
請求項1または2記載の抗体を含む、癌またはVEGFの過剰発現によって生じる血管新生関連疾患を予防、診断、または治療するための医薬組成物。
【請求項１５】
該癌またはVEGFの過剰発現によって生じる血管新生関連疾患が、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、および脳癌からなる群から選ばれる癌；および黄斑変性、糖尿病性網膜症、および虚血性網膜症からなる群から選ばれる眼科疾患からなる群から選ばれる請求項14記載の医薬組成物。
【請求項１６】
アルカリ化剤、代謝拮抗剤、葉酸ホモログ、ピリミジンホモログ、プリンホモログ、および関連阻害剤、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、抗生物質、L-アスパラギナーゼ、トポイソメラーゼ阻害剤、インターフェロン、プラチナ配位錯体、アントラセンジオン置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、副腎皮質ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン、アンドロゲン、抗アンドロゲン、およびゴナドトリピン放出ホルモンホモログからなる群から選ばれる化学療法剤と組み合わせて用いる請求項14記載の医薬組成物。
【請求項１７】
フルオロピリミジンベースの薬剤、パクリタキセル、プラチナベースの薬剤、インターフェロンα-2a、カルボプラチン、ドキソルビシン、シスプラチン、ゲムシタビン、5-フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、オキサラプラチン、カペシタビン、ドセタキセル、およびそれらの混合物からなる群から選ばれる薬剤と組み合わせて用いる請求項14記載の医薬組成物。
【請求項１８】
請求項1または2記載のVEGFと結合する抗体を含む、癌またはVEGFの過剰発現によって生じる血管新生関連疾患の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮成長因子(VEGF)に対する強い結合親和性を有しVEGFと結合する、癌または血管新生関連疾患の治療に有用でありうる新規抗体、およびそれを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生が、固形癌、眼の血管新生に関連する増殖性網膜症または加齢黄斑変性(AMD)などを含む種々の疾患の病因と関連があることはよく知られている。
【０００３】
多くの誘導因子、例えば、aFGF、bFGF、TGF-α、TGF-β、HGF、TNF-β、およびアンギオゲニンなどが血管新生の研究において同定されている。血管新生阻害因子には、トロンボスポンジン、16kDaのプロラクチンN末端断片(Clapp et al.、Endocrinology、133：1292-1299(1993))、アンギオスタチン、およびエンドスタチンなどが含まれうる。
【０００４】
血管新生を誘導するか、阻害するかは、血管新生誘導因子と阻害因子のバランスに依存する(Folkman、J、et al.、J. Biol Chem.、267、10931-10934(1992))。
【０００５】
血管新生誘導因子のうち血管内皮成長因子(VEGF)は、血管とリンパ管の発生と恒常性に関与し、神経細胞にも大きな影響を与える。VEGFは、低酸素状態で、または細胞増殖因子、例えばTGF、インターロイキン、およびPDGFによる刺激に反応して主に血管内皮細胞、造血細胞、および間質細胞で産生される。VEGFはVEGFレセプターと結合し、VEGFの各アイソフォームは特定のレセプターと結合して該レセプターのホモまたはヘテロコンジュゲートの形成を誘導し、各情報伝達経路を活性化する(Karsan A.、Int J. Mol Med.、5(5)：447-56(2000))。VEGFレセプターの情報伝達特異性は、ニューロピリン、ヘパラン硫酸、インテグリン、およびカドヘリンなどのコレセプターによりさらに細かく調節される(Zachary IC、et al.、Mol. Biol. Cell.、22(15)：2766-76(2011))。VEGFは、腫瘍と眼の疾患関連血管新生の重要なメディエーターであることが分かっている。また、VEGF mRNAは、調査した大多数の対象の腫瘍で過剰発現している(Berkman et al.、J. Clin Invest.、91：153-159(1993))。癌は増殖するために栄養供給路および老廃液の排出路として新しい毛細血管を必要とするので、癌細胞とその間質細胞はVEGFを継続的に分泌し、組織全体に分散させて血管内皮細胞の遊走を刺激する(Ferrara. N et al.、Nat Rev. Cancer、2：795-803、(2002))。癌細胞に誘導される血管新生は、周囲の組織の助けを受けないので正常に形成される毛細血管に比べて不完全なことを特徴とする。VEGFはレセプター VEGFR1、2、および3と結合するが、VEGFR2を介してVEGFは内皮細胞の増殖、遊走、および透過性をもたらすシグナルを送達する(H. Zeng et al.、J. Biol Chem、276：26969-26976(2001))。したがって、VEGFを標的とする薬剤を用いて血管新生を調節することにより、癌細胞の増殖および血管新生に関連する疾患を治療することができる。それらのうちVEGFと結合する抗体は、薬剤として用いることができ、VEGFに対する結合親和性を増加し、抗体の免疫原性を減少させるためにヒト化処理を受ける。ヒト化抗体は、文献に記載されている[Bending、Methods：Comp. Meth. Enzy.、8：83-93(1995)。抗VEGF中和抗体はヌードマウスにおける種々のヒト腫瘍細胞株の増殖を抑制し(Kim et al.、Nature、362：841-844(1993)；Warren et al.、etc.、J. Clin Invest.、95：1789- 1797(1995)；Borgstroem et al.、Cancer Res.、56：4032-4039(1996)；およびMelnyk et al.、Cancer Res、56：921-924(1996))、網膜の虚血性血管障害のモデルにおける眼内血管新生を抑制する(Adamis et al.、Arch Ophtalmol.、114：66-71(1996))。抗VEGF抗体を、VEGFの活性を減少させるのに有効な濃度で眼内に局所投与することができる。そのような虚血性網膜障害は、糖尿病性網膜症または加齢黄斑変性を含みうる。
【０００６】
今までに開発された抗VEGF中和抗体には、2004年2月にFDAにより大腸癌に対して承認されたベガシズマブ(Avastin（登録商標）、Genentech/Roche)が含まれる。ベガシズマブの適用は、転移性大腸癌および進行性卵巣癌を含む合計6種の進行性腫瘍の治療に拡大された。さらに、VEGFと結合するよう設計されたAflibercept(Bayer Health Care)の販売許可申請は、2011年にFDAにより黄斑変性の治療について承認された。しかしながら、2011年にFDAは、Avastin（登録商標）の乳癌関連適用を乳癌患者の全体的生存率がプラセボと比べて有意に増加することを示すことができなかったため撤回した。Avastin（登録商標）が乳癌患者の心不全のリスクを増加させることを示す後の報告は、先に開発された抗VEGF中和抗体を改善し、前臨床段階におけるその正確な有効性を決定する必要があることを示唆する。Avastin（登録商標）はマウスVEGFと結合しないので、マウスを用いる前臨床モデルでその効果を正確に判定するのは難しい。したがって、本発明の目的は、マウスおよびヒトVEGFの両方と結合する抗体を開発することにより前臨床モデルの結果の信頼性を得、該抗体のVEGFに対する結合親和性を増加することにより抗腫瘍効果を改善することである。
【０００７】
バイオパンニングと親和性改善を通して、本発明者らは、VEGFに対する特異的結合により腫瘍および種々の眼内血管新生障害の治療を可能にする以前に知られていなかった新規相補性決定領域(CDR)を含む抗体を開発した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の目的は、VEGFと特異的に結合する抗体を提供することである。
本発明の別の目的は、上記抗体を含む医薬組成物を提供することがである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の本発明の目的を達成するために、以下のものを含む、血管内皮成長因子(VEGF)と結合する抗体を提供する：
1)相補性決定領域(CDR)1、CDR2、およびCDR3を含む軽鎖可変領域、ここで、CDR2は配列番号1のアミノ酸配列で示され、CDR3は配列番号2のアミノ酸配列で示される；および
2) CDR1、CDR2、およびCDR3を含む重鎖可変領域、ここで、CDR3は配列番号3のアミノ酸配列で示される。
【００１０】
上記の本発明の目的を達成するため、癌またはVEGFの過剰発現により生じる血管新生関連障害の予防、診断、または治療するための上記抗体を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
本発明の抗体は、ヒトおよびマウスVEGFに対する顕著な結合特性を示し、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の増殖と透過性を抑制し、腫瘍増殖を阻害し、したがって、癌または血管新生関連疾患の予防、診断、または治療のための抗体として有用でありうる。
【００１２】
本発明の上記および他の目的および特徴は添付の図面と共に本発明の下記説明から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】クローンHF2-11とVEGFとの結合と解離のセンサーグラムを示す。
【図２】VEGFとVEGFR2との結合を阻害しない本発明の抗体によるVEGFとVEGFR2との結合の阻害を示すグラフである。
【図３】本発明の抗体とヒトおよびマウスVEGF-Aの特異的結合を示すグラフである。
【図４】HF2-11クローンのSDS-PAGEの結果を示す。
【図５】抗体HF2-4の重鎖(a)と軽鎖(b)の質量分析結果を示す。
【図６】HF2-8クローンのサイズ排除クロマトグラフィ(SEC)の結果を示す。
【図７】本発明の抗体とAvastinのヒトおよびマウスVEGF抗体に対する結合特性のELISAによる測定結果を示す。
【図８】本発明の抗体とAvastinのヒトおよびマウスVEGF抗体に対する結合特性のELISAによる測定結果を示す。
【図９】本発明の抗体とAvastinのヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の増殖に対する抑制活性の結果を示す。
【図１０】本発明の抗体(a)とAvastin(b)のHUVECの透過性に対する抑制効果の結果を示す。
【図１１】本発明の抗体のHUVECの遊走に対する抑制活性の試験結果を示す。
【図１２】本発明の抗体のHT29移植動物モデルの腫瘍増殖に対する阻害活性を示す。
【図１３】本発明の抗体の脈絡膜血管新生に対する抑制活性を示す。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、以下のものを含むVEGFと結合する抗体(以後、「抗VEGF抗体」という)を提供する：1)CDR1、CDR2、およびCDR3を含む軽鎖可変領域、ここで、CDR2は配列番号1のアミノ酸配列で示され、CDR3は配列番号2のアミノ酸配列で示される；および2) CDR1、CDR2、およびCDR3を含む重鎖可変領域、ここで、CDR3は配列番号3のアミノ酸配列で示される。
【００１５】
本発明の抗体の軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、およびCDR3(以後、それぞれLCDR1、LCDR2、およびLCDR3という)、および重鎖可変領域のCDR1、CDR2、およびCDR3(以後、それぞれHCDR1、HCDR2、およびHCDR3という)のアミノ酸配列のリストを下記表1に示す。
【００１６】
[表1] 軽および重鎖可変領域のCDR1、CDR2、およびCDR3のアミノ酸配列
【表１】
0006328231.tif 000002
【００１７】
本発明のVEGFと結合する抗体は、1)配列番号4〜14からなる群から選ばれるアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2) 配列番号15〜34からなる群から選ばれるアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号35〜50からなる群から選ばれるアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００１８】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号4のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号15のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号35のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００１９】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号5のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号16のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号36のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００２０】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号5のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号17のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号37のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００２１】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号5のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号18のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号38のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００２２】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号5のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号19のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号39のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００２３】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号5のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号20のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号40のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００２４】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号6のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号21のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号38のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００２５】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号6のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号22のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号38のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００２６】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号7のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号23のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号41のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００２７】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号6のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号24のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号38のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００２８】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号6のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号25のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号38のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００２９】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号8のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号26のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号42のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００３０】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号6のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号27のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号38のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００３１】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号9のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号28のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号43のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００３２】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号5のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号29のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号44のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００３３】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号10のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号30のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号45のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００３４】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号11のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号31のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号42のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００３５】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号11のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号20のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号39のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００３６】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号11のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号32のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号46のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００３７】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号5のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号33のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号45のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００３８】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号5のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号34のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号47のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００３９】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号6のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号25のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号48のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００４０】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号12のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号31のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号38のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００４１】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号9のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号31のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号46のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００４２】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号10のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号17のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号42のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００４３】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号13のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号34のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号49のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００４４】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号14のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域；および2)配列番号17のアミノ酸配列で示されるCDR1；配列番号50のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含みうる。
【００４５】
本発明のVEGFと結合する抗体は、1)配列番号54〜65からなる群から選ばれるアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2)配列番号78〜104からなる群から選ばれるアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる(表2参照)。
【００４６】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号54のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2)配列番号78のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００４７】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号55のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号79のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００４８】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号55のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号80のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００４９】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号56のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号81のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００５０】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号55のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号82のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００５１】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号55のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号83のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００５２】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号57のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号84のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００５３】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号57のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号85のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００５４】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号58のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号86のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００５５】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号57のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号87のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００５６】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号57のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号88のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００５７】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号59のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号89のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００５８】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号57のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号90のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００５９】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号60のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号91のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００６０】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号55のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号92のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００６１】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号61のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号93のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００６２】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号62のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号94のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００６３】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号62のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号95のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００６４】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号62のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号96のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００６５】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号55のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号97のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００６６】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号55のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号98のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００６７】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号57のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号99のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００６８】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号63のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号100のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００６９】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号60のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号101のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００７０】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号61のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号102のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００７１】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号64のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号103のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００７２】
本発明のある態様の抗VEGF抗体は、1)配列番号65のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域；および2) 配列番号104のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含みうる。
【００７３】
本発明の抗体は、軽鎖定常領域および重鎖定常領域を含むことがあり、該軽鎖定常領域および重鎖定常領域は公に知られたヒト抗体の軽鎖定常領域および重鎖定常領域でありうる(U Rutishauser et al.、PNAS、61(4)：1414-1421(1968)；およびTakahashi N.、et al.、Cell、29：671-679(1982))。
【００７４】
本発明の抗体はヒトまたはヒト化抗体でありうる。
本発明の抗体は、免疫グロブリンIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、またはIgMを含むことがあり、VEGF、またはその組み合わせまたは変異体と結合する抗体でありうる。
【００７５】
本発明の抗体は、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb、scFv、または抗体のCDRがVEGFと結合するための主要部分である足場コンジュゲートの形でありうる。
【００７６】
また、本発明は、配列番号54〜65からなる群から選ばれるアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域をコードする配列番号66〜77からなる群から選ばれる塩基配列を提供する。
【００７７】
本発明は、配列番号78〜104からなる群から選ばれるアミノ酸配列で示される重鎖可変領域をコードする配列番号105〜131からなる群から選ばれる塩基配列を提供する。
本発明の抗体の軽および重鎖の可変領域のアミノ酸配列と対応する塩基配列のリストを下記表2に示す。
【００７８】
[表2]
【表２】
0006328231.tif 000003
【００７９】
また、本発明は、配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含むVEGFと結合する抗体の軽鎖可変領域をコードするDNAを提供する。
配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2をコードするDNAは、配列番号51の塩基配列で示すことができ、配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3をコードするDNAは配列番号52の塩基配列で示すことができる。
【００８０】
したがって、本発明の抗体の軽鎖可変領域をコードするDNAは、LCDR2をコードする配列番号51の塩基配列；およびLCDR3をコードする配列番号52の塩基配列を含みうる。
【００８１】
本発明は、配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含むVEGFと結合する抗体の重鎖可変領域をコードするDNAを提供する。
【００８２】
配列番号3のアミノ酸配列CDR3をコードするDNAは配列番号53の塩基配列で示すことができる。
【００８３】
抗VEGF抗体の重鎖可変領域をコードするDNAはHCDR3をコードする配列番号53の塩基配列を含みうる。
【００８４】
本発明は、VEGFと結合する抗体の軽鎖可変領域を発現する、該抗体の軽鎖可変領域をコードするDNAを含む発現ベクターを提供する。
【００８５】
好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2をコードする配列番号51の塩基配列；および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3をコードする配列番号52の塩基配列を含む発現ベクターを提供する。
【００８６】
また、本発明は、VEGFと結合する抗体の重鎖可変領域を発現する、抗VEGF抗体の重鎖可変領域をコードするDNAを含む発現ベクターを提供する。
好ましくは、VEGFと結合する抗体の重鎖可変領域を発現する、配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3をコードする塩基配列を含む発現ベクターを提供する。
【００８７】
本発明の発現ベクターは、限定されるものではないがCHO細胞、HEK細胞、またはNSO細胞などの動物細胞中にトランスフェクトすることができる。
【００８８】
また、本発明は、VEGFと結合する抗体の軽鎖可変領域を発現する、該抗体の軽鎖可変領域をコードするDNAを含む発現ベクターを提供する。
【００８９】
血管新生は、予め存在する毛細血管から生じる新たな毛細血管の形成を表す。本明細書で用いている「血管新生関連疾患」は、VEGFの過剰発現によって生じる血管新生に関連するすべての疾患または障害を含む。「血管新生関連疾患」は、限定されるものではないが、種々の癌や眼科疾患などを含みうる。本発明において、癌またはVEGFの過剰発現によって生じる血管新生関連疾患は、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、および脳癌からなる群から選ばれる癌；および黄斑変性、糖尿病性網膜症、および虚血性網膜症からなる群から選ばれる眼科疾患などからなる群から選ばれうる。
【００９０】
臨床診療において抗VEGF抗体は、フルオロピリミジンベースの薬剤、パクリタキセル、プラチナベースの薬剤、インターフェロンα-2a、カルボプラチンなどの薬剤と組あわせて用いうる(FDA US BL125085 Avastinラベル)。
【００９１】
また、本発明の医薬組成物は、上記抗体に加えて、限定されるものではないが、フルオロピリミジンベースの薬剤、パクリタキセル、プラチナベースの薬剤、インターフェロンα-2a、カルボプラチン、ドキソルビシン、シスプラチン、ゲムシタビン、5-フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、オキサラプラチン、カペシタビン、およびドセタキセルからなる群から選ばれる薬剤と組み合わせて用いうる。
【００９２】
抗癌活性を示すあらゆる化学療法剤を本発明の医薬組成物と組み合わせて用いうる。該化学療法剤は以下からなる群から選ばれうる：アルカリ化剤、代謝拮抗剤、葉酸ホモログ、ピリミジンホモログ、プリンホモログ、および関連阻害剤、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、抗生物質、L-アスパラギナーゼ、トポイソメラーゼ阻害剤、インターフェロン、プラチナ配位錯体、アントラセンジオン置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、副腎皮質ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン、アンドロゲン、抗アンドロゲン、およびゴナドトリピン放出ホルモンホモログ。
【００９３】
本発明は、VEGFと結合する抗体を含む、癌またはVEGFの過剰発現によって生じる血管新生関連疾患の診断キットを提供する。血管新生関連疾患の例は上記の通りである。
【００９４】
本発明の抗体は、VEGFとVEGFレセプターFlt-1(VEGFR-1)の結合に影響を及ぼさないが、VEGFとVEGFレセプターKDR(VEGFR-2)の結合を選択的に阻害する(図2)。また、該抗体は、ヒトVEGF-B、ヒトVEGF-C、ヒトVEGF-D、またはヒト胎盤成長因子(PIGF)と全く結合しないが、ヒトVEGF-AおよびマウスVEGF-Aと高い結合特異性を示す(図3)。
【００９５】
ヒト血管内皮成長因子に対する本発明の抗体の結合親和性を酵素免疫測定法(ELISA)で評価した。結果として、該抗体は、ヒトVEGFと濃度依存性の結合を示した(図7)。該抗体は、マウスVEGFとの結合を示さない既存の抗VEGF抗体であるAvastin（登録商標）と異なりマウスVEGFとも強い結合を示し、本発明の抗体がマウスを用いる前臨床試験に適していることが示唆された(図8)。
【００９６】
さらに、本発明の抗体は、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の増殖、HUVEC透過性、およびVEGF刺激によるHUVECの遊走をAvastin（登録商標）より高度または同程度に抑制し(図9〜11)、ヒト結腸癌細胞株を移植したマウスにおける腫瘍増殖をAvastin（登録商標）よりはるかに高度に抑制した(図12)。また、本発明の抗体は、脈絡膜血管新生モデルにおける血管新生をコントロール群に比べて有意に抑制した(図13)。したがって、本発明のヒト(またはヒト化)抗体は癌または血管新生関連疾患の治療に有用であり得、本発明は癌または血管新生関連疾患を予防および治療するための上記抗体を含む組成物を提供する。
【００９７】
（定義）
本発明において、「VEGF」は、165アミノ酸のヒト血管内皮成長因子および関連121- 189-、および206アミノ酸の血管内皮成長因子、ならびに対立形質形または修飾形の天然ヒト血管内皮成長因子を表す([Leung et al.、Science.、246：1306(1989)；およびHouck et al.、Mol. Endocrin.、5：1806(1991)]参照)。
【００９８】
本発明において、「抗VEGF抗体」は、VEGF活性化細胞を無効化するようにVEGFとVEGFレセプターとの結合を妨げるか、またはVEGFがVEGFレセプターと結合した後の血管内皮細胞の活性化を阻害するように機能する抗体を表す。
【００９９】
本発明において、「抗体」は、ある抗原との結合特異性を示す糖タンパク質を表す。「ヒト化」形の非ヒト(例えば齧歯類)抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。主に、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンの超可変領域残基に対する望ましい特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、または非ヒト霊長類の超可変領域残基と置換することにより構築される。ある場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基を対応する非ヒト残基と置換する。
【０１００】
本発明において、「一本鎖Fv」または「scFv」抗体断片は、単一ポリペプチド鎖で存在する抗体のVHおよびVLドメインを含む。一般的には、Fvポリペプチドは、さらにscFvが抗原との結合に適した構造を形成するのを助けるVHドメインとVLドメインの間のポリペプチドリンカーを含む。
【０１０１】
本発明において、「Fab抗体断片」は、該抗体のVHおよびVLドメインとCH1およびCLドメインがS-S結合で結合している、抗原結合機能を有する、抗原をプロテアーゼパパインで消化することにより得られる断片である。
【０１０２】
本発明において、「F(ab')2抗体断片」は、Fc(CH2およびCH3)断片を除く抗体の部分を表す。それは抗体をそのヒンジ領域の下で開裂することにより構築することができる。
【０１０３】
本発明において、「Fab'」は、F(ab')2抗体断片をヒンジ領域で切断した形であり、2つの-SH基を有する。
【０１０４】
本発明において、「Fv」は抗体の可変領域を表し、「dAb」は単一ドメイン抗体断片を表す。
【０１０５】
本発明において、「VEGFレセプター」は、VEGFの細胞レセプター、一般的には細胞表面レセプター、またはhVEGFと結合する能力を有するその変異体を表す。VEGFレセプターの一例は、チロシンキナーゼ、特にfms-タイプチロシンキナーゼ(flt)中の貫膜レセプターである([DeVries et al.、Science.、255：989(1992)；Shibuya et al.、Oncogene.、5；519(1990)]参照)。Fltレセプターは、細胞外ドメイン、貫膜ドメイン、およびチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインはVEGF結合に関連し、細胞内ドメインは情報伝達に関連する。VEGFレセプターの別の例はflk-1レセプター(以後、「KDR」という)である([Matthews et al.、Proc. Nat. Acad. Sci.、88：9026(1991)；Terman et al.、Oncogene.、6：1677(1991)参照)。
【０１０６】
以下に、本発明を下記実施例でより詳細に説明する。下記実施例は本発明の例示であって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１０７】
VEGF免疫およびcDNAライブラリー構築
VEGFと特異的に結合する抗体を選択するために、抗体ライブラリーを免疫動物から構築した。該ライブラリーを、抗原で免疫した動物の免疫細胞からmRNAを得、抗体遺伝子用のプライマーの組み合わせを用いるPCRにより抗体遺伝子を増幅し、ファージディスプレイ用のベクター中に該遺伝子をクローニングすることにより構築した。
【０１０８】
具体的には、ヒトVEGFおよびマウスVEGF(R&D Systems、USA)を完全フロインドアジュバントおよび不完全フロインドアジュバント(Sigma、USA)と混合し、その混合物を3羽の白色レグホン鶏に3週間間隔で5回、皮下注射した。免疫動物の血清を得、PBSB(3％ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝液)を用いて1：100、1：500、1：2500、および1：12500に希釈して保存し、次いで、それらとヒトVEGFおよびマウスVEGFとの結合を酵素免疫測定法で評価した。ELISAプレートに、それぞれ0.2μg/mLのヒトVEGF(VEGF-165、R&D Systems、USA)、およびマウスVEGF(VEGF-164、R&D Systems、USA)をそれぞれ4℃で一夜コートし、次いで上記の希釈血清を加え、2時間反応させた。PBST(0.1％tween-20含有PBS)で3回洗浄した後、抗ニワトリ免疫グロブリン-ホースラディッシュパーオキシダーゼ(HRP)(1：3000)を加え、1時間反応させた。PBSTで3回洗浄した後、ultra-TMB(Thermo、USA)を加え、7分間発色させ、次いで650nmの吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。免疫前血清はVEGFと結合しなかった。ヒトおよびマウスVEGFの両方と強く結合する血清を産生する動物を選んだ。
【０１０９】
最終注射後5日に骨髄、脾臓、およびファブリキウス嚢組織を選んだニワトリから回収した。組織を10mLのTRI試薬(Molecular Research Center、USA)と混合し、ホモゲナイズし、20mLのTRI試薬を加えた後に遠心分離して上清を得た。3mLの1-ブロモ-3-クロロプロパン(BCP)を加え、次いで遠心分離した後に上清を得た。全RNAを15mLのイソプロパノールで処理して沈殿させた。逆転写反応(65℃で5分間；4℃で5分間；50℃で50分間；85℃で5分間；および4℃)を、Super Script転写システム(Invitrogen、USA)およびプライマーとしてランダムヘキサマーを用いて行った。5μLの逆転写反応から得たcDNAを含む反応溶液を1％アガロースゲルにロードして電気泳動を行い、種々の長さのcDNAバンドを確認した。
【実施例２】
【０１１０】
抗体ライブラリーの構築
(2-1)免疫抗体遺伝子の増幅
ニワトリ抗体の重よび軽鎖の可変領域(VHおよびVLドメイン)を増幅するためPCR反応を以下のごとく行った。
PCR反応を、鋳型として実施例1で調製したcDNA、ならびにVHおよびVL、およびVHおよびVLを結合する一本鎖Fv(scFv)用に設計した表3のプライマー混合物を用いて行った。各0.5μLのVHおよびVLのcDNAライブラリー、30pモルのフォワードプライマー、30pモルのリバースプライマー、10xPCR緩衝液、200μM dNTPs、および0.5μLのTaq DNAポリメラーゼを混合し、終量を50μLとした。混合物を94℃で5分間反応させ、次いで94℃で15秒間、56℃で30秒間、および72℃で90秒間を30サイクル反復して反応させた。
【０１１１】
[表3] PCR反応に用いたプライマー
【表３】
0006328231.tif 000004
【０１１２】
PCR増幅抗体DNAを、1％アガロースゲルで電気泳動して大きさに基づいて各増幅したDNAを分離し、次いでゲル抽出キット(Qiagen、USA)を用いて精製した。
scFv DNAを得るため、各50ngの精製VHおよびVL DNAを鋳型として用い、これを30pmoleのフォワードプライマーおよび30pmoleのリバースプライマー(表3)、10x PCR緩衝液、200μM dNTPs、および0.5μLのTaq DNAポリメラーゼと混合し終量を50μLとした。該混合物を94℃で5分間、次いで94℃で30秒間、56℃で30秒間、および72℃で2分間を20サイクルのPCR反応にかけた。PCR増幅した抗体DNAを1％アガロースゲルを用いる電気泳動にかけて各該増幅DNAを大きさに従って分離し、次いでゲル抽出キット(Qiagen、USA)を用いて精製した。
【０１１３】
(2-2)制限酵素による抗体DNAの開裂
上記で作製したscFvおよびファージミッドベクター、pComb3X(the Scripps Research Institute、CA、USA)を制限酵素SfiI(Roche、USA)で開裂した。
10μgのscFvをコードするPCR断片、360単位のSfiI(Roche、USA)、および20μgの10x緩衝液を混合して終量200μLとし、50℃で一夜反応した。
さらに、20μgのpComb3Xベクター、120単位のSfiI、および20μLの10x緩衝液を混合して終量200μLとし、50℃で一夜反応した。制限酵素開裂により得た断片を電気泳動にかけ、次いでゲル抽出キット(Qiagen、USA)を用いて精製した。
【０１１４】
(2-3)抗体DNAの結合とライブラリーの作製
scFv断片をpComb3Xベクターに挿入するために、700ngの(2-2)でSfiIを用いて開裂したscFvをコードするPCR断片および1.4μgのpComb3Xを混合した。T4 DNAリガーゼ(Invitrogen、USA)を添加後、該混合物を16℃で一夜反応させた。結合混合物をエタノール沈殿で精製した。次に、E.coli ER2738(New England Biolab、USA)をエレクトロポーレーションにより該混合物で形質転換し、46μg/mLカルベニシリンおよび70μg/mLカナマイシンの存在下で培養して1.5x109の複雑さのライブラリーを作製した。
【実施例３】
【０１１５】
抗VEGF scFvを含むファージクローンの選択
実施例2で得られたscFv形のランダム化した重鎖と軽鎖を含むライブラリーから、ヒトおよびマウスVEGFの両方と結合する抗体を固体固定化VEGFを用いて選んだ。
【０１１６】
(3-1)VEGFと結合する抗体の選択
最初に、各10ugのヒトVEGF(R&D systems、USA)およびマウスVEGF(R&D systems、USA)を磁気ビーズと結合した。
【０１１７】
scFv形の抗体をファージコートタンパク質PIIIとの融合型で表現するように構築した実施例2で得られた抗体ライブラリーDNAをエレクトロポーレーションによりE.coli ER2738(New England Biolab)にトランスフェクトし、次いで37℃で培養した。VCSM13ヘルパーファージ(Stratagene、USA)を添加後、46ug/mlのカルベニシリンおよび70ug/mlのカナマイシンをさらに加え、次いでSB培養液(30g/Lトリプトン、20g/L酵母エキス、および10g/LMOPS、pH7.0)中で一夜培養した。
【０１１８】
E.coliとファージを含む上記で得られた培養液を遠心分離してE.coliペレットを除去した。上清を回収した後、40mg/mlのポリエチレングリコール8000および30mg/mlのNaClを加え、次いで遠心分離してPEG沈殿ファージを回収し、PBSに再懸濁した。
【０１１９】
磁気ビーズと結合したヒトまたはマウスVEGFを室温で2時間ファージと反応させてファージにVEGFと結合する親和性をもたせ、次いで得られた試料を0.5％Tween20を含むPBSで洗浄し、0.1Mグリシン(pH2.2)で溶出し、次いで2Mトリス溶液で中和した。次回のパンニングのために溶出したファージをE.coli ER2738に感染させて一夜培養した。パンニングはこのプロセスを4回繰り返すことにより行った。
【０１２０】
洗浄回数をパンニングのサイクルの増加とともに増加し、高結合親和性を有するファージの蓄積をもたらした。ヒトおよびマウスVEGFの両方と結合するものをみいだすためにヒトVEGFのみまたはヒトおよびマウスVEGFを交互に抗原として用いた。
【０１２１】
第4パンニングの各生成物から選んだ個々のクローンを100ug/mlのカルベニシリン、70ug/mlのカナマイシン、およびVCSM13ヘルパーファージ(1：1000)の存在下、96深ウェルプレート中で一夜培養し、抗体を発現するファージの増殖を誘導した。
【０１２２】
そのように得られた培養ブロスを遠心分離してファージを含む培養上清を得た。得られた上清をVEGFをコートしたELISAプレートに加え、37℃で2時間インキュベーションした。VEGF結合抗体をELISAでHRP結合抗M13抗体を二次抗体に用いて同定した。
【０１２３】
(3-2)選んだ抗体のシーケンシング
実施例3-1で選んだヒトおよびマウスVEGF両方に陽性シグナルを示すクローンを含むER2738をSB培養液中で一夜培養し、次いで遠心分離してE.coliを得た。DNA mini-prepキット(GeneAll、Korea)を用いてプラスミドDNAを得、その塩基配列を分析した。表4に示すシーケンシングプライマー(配列番号138および139)を用いて塩基配列を決定した。選んだクローンを「クローンF」と名付けた。クローンF抗体の詳細な塩基配列情報を表1に示す。
【０１２４】
[表4]
【表４】
0006328231.tif 000005
【実施例４】
【０１２５】
ヒト化および親和性改善
動物を免疫した抗体ライブラリーから得られた抗体クローンFのフレームワークをヒト抗体のフレームワークに変換したが、抗原結合に重要ないくつかの残基は変更しなかった(Nishibori et al.、Molecular Immunology、43(2006))。
【０１２６】
親和性改善のために重鎖と軽鎖のCDR配列をランダム化し、新規ファージライブラリーを作製した。実施例2に示したのと同じ方法により得られたファージライブラリーを磁気ビーズに固定した10μgのヒトVEGFと室温で2時間反応させ、0.5％Tween20を含むPBSで5回洗浄した。洗浄後、抗原と結合したファージを0.1Mグリシン(pH2.2)溶液で溶出し、2Mトリス溶液で中和した。2回目のパンニング時に試料をTween20を含むPBSで10回洗浄し、3回目のパンニング時にTween20を含むPBSで20回洗浄して選択圧を増加させた。
【０１２７】
上記プロセスを経たクローンFの変異体クローンを「HF2-1〜HF2-26」と名付け、それらの結合親和性をELISAおよびBIAcoreで確認した。その結果、上記プロセスから得られた抗体は母クローンFより少なくとも10倍高い親和性でヒトおよびマウスVEGFと結合し、該クローンのいくつかは少なくとも100倍高い親和性を示した。
【実施例５】
【０１２８】
抗体の作製
得られた上記抗体の親和性測定と活性分析のためにscFvまたは免疫グロブリン(IgG)タンパク質を作製した。
scFvタンパク質を作製するためE.coli HB2151を選んだクローンのDNAを含むpComb3Xプラスミドで形質転換し、次いで発現したscFvを精製した。
【０１２９】
具体的には、1mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)をO.D.値が1に達した時に加え、次いで37℃で一夜培養した。次に、E.coliと培養液を遠心分離により分離した。scFvを精製するため、scFvタンパク質をC末端Hisタグと結合するニッケルNTAカラム(GE、USAA.)に結合させ、次いで250〜300mMのイミダゾール溶液で溶出し、PBS緩衝液で一夜透析した。
【０１３０】
IgGを作製するため、重鎖と軽鎖の可変および定常領域の断片を実施例2の条件と表5に示すプライマーの組み合わせを用いるPCRを行ってscFvを含むpComb3xから得た。
【０１３１】
重鎖および軽鎖可変および定常領域(CHおよびCk)を表5のHCおよびLCプライマーの組み合わせを用いるPCRを行なうことにより得、pcDNATM3.3-TOPO（登録商標）TAクローニングキットおよびpOptiTMVEC-TOPO（登録商標）TAクローニングキット(Invitrogen、USA)を用いて哺乳動物細胞発現プラスミドに移した。1μLの各ベクター(pcDNATM3.3-TOPO（登録商標）ベクターおよびpOptiTM VEC-TOPO（登録商標）ベクター)および該断片を200mMのNaClおよび10mMのMgCl2を含む緩衝液に総量6μLとなるように加え、室温で5分間反応させた。DH 5a E. coliコンピテント細胞を熱ショックを適用して形質転換し、そうして得られたコロニーを大規模に培養してプラスミドを得た。
【０１３２】
上記で作製したプラスミドをHEK293F細胞(Invitrogen、USA)にトランスフェクトし、7日間培養後に得られた抗体をプロテインAカラム(GE、USA)を用いて精製した。培養液をカラムにロードし、培養液中の該抗体(IgG)をプロテインAと結合させた。次に、抗体を20mMのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH3.0)で溶出した。軽および重鎖の分子量と理論計算値の一致をSDS-PAGEで確認した。
【０１３３】
[表5]
【表５】
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【実施例６】
【０１３４】
結合親和性の測定
ELISAプレートをそれぞれ0.2μg/mlのヒトVEGFおよびマウスVEGF(R&D systems、USA)でコートし、HB2151が発現するscFvまたは293F細胞が発現するIgGの形の実施例5で得られた精製タンパク質を連続希釈濃度でインキュベーションした。結果として、実施例3-2で得られたクローンFおよび親和性改善により得られたその変異体は、濃度依存性にヒトおよびマウスVEGFと良好な結合を示した。
【０１３５】
その一方で、親和性を測定するため、ヒトVEGFおよびマウスVEGFをカルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5、GE)と使用説明書に従って結合させた。結合および解離速度を測定するため、IgGタンパク質を5nM、2.5nM、1.25nM、0.625nM、0.313nM、および0.156nMに連続2倍希釈し、注入した。
【０１３６】
結合および解離速度を結合および解離センサーグラムで表し、簡単な1：1 Langmuir結合モデル(BIAcore X100評価ソフトウエア、ver.2.0)を用いて計算した。解離速度定数(Kd)を結合速度定数(Ka)で割って計算した平衡解離定数(KD)が高親和性を示すナノモルレベル以下であることを確認した。ヒトVEGF(hVEGF)に対する抗体 HF2-1〜HF2-11、HF2-13、およびHF2-14の測定値を表6に示し、HF2-11のセンサーグラムを典型例として図1に示す。
【０１３７】
[表6]
【表６】
0006328231.tif 000007
【実施例７】
【０１３８】
リガンド-レセプター結合の阻害の確認
VEGFとVEGFレセプターKDR(以後、VEGFR2)またはVEGFレセプターFlt-1(以後、VEGFR1)との結合に対する本発明の選んだ抗体(HF2-1、HF2-5、HF2-9、およびHF2-11)の阻害効果を確認するため、以下のごとく実験を行った。
【０１３９】
0.5μg/mlのヒトVEGFを96ウェルELISAプレートにコートし、3％BSAおよび0.05％Tween20を含むPBS溶液でブロックした。各ウェルに、6nMのFlt-1 ECD IgG Fc融合タンパク質(27-687、R&D systems、USA)または9nMのKDR ECD IgG-Fc融合タンパク質(R&D systems、USA)を2倍希釈(0.01nM、0.1nM、0.3nM、1nM、3nM、10nM、および100nM)した各抗体HF2-1、HF2-5、HF2-9、およびHF2-11と共に加え、37℃で1時間インキュベーションした。該抗体で阻害されるにも関わらず結合したFlt-1 ECD IgG-Fc融合タンパク質およびKDR ECD IgG-Fc融合タンパク質を、抗ヒトIgG-Fc抗体-HRPコンジュゲート(Jackson Immunoresearch、USA)を用い、次いでABTSを発色させ、405nmで吸光度を測定して検出した。
【０１４０】
結果として図2に示すように、本発明の抗体は濃度依存性にVEGFとKDR(VEGFR2)との結合を阻害したが、VEGFとFlt-1(VEGFR1)の結合を阻害しなかった。したがって、本発明の選ばれた抗体は、VEGFとVEGFレセプターとの結合を選択的に阻害することが確認された。
【実施例８】
【０１４１】
結合特異性の確認
本発明の選んだ抗体 HF2-1、HF2-5、HF2-9、およびHF2-11とヒトVEGF-A(hVEGF-A)、マウスVEGF-A(mVEGF-A)、ヒトVEGF-B(hVEGF-B)、ヒトVEGF-C(hVEGF-C)、ヒトVEGF-D(hVEGF-D)、およびヒト胎盤成長因子(PlGF)との結合特異性を測定するための実験を以下のごとく行った。
【０１４２】
各0.2μg/mlの各タンパク質(hVEGF-A、mVEGF-A、hVEGF-B、hVEGF-C、hVEGF-D、およびPlGF)(R&D systems)をそれぞれELISAプレートのウェルにコートした。3％BSAおよび0.05％Tween20を含むPBSでそれらを37℃30分間ブロックした後、増加する濃度の抗体クローンタンパク質を37℃で2時間インキュベーションした。次に、ウェルを3％BSAおよび0.05％Tween20を含むPBSで3回洗浄し、抗ヒトIgG-Fab-HRPコンジュゲート(Jackson Immunoresearch、USA)をそれに加え、室温で1時間インキュベーションした。次に、ウェルを3％BSAおよび0.05％Tween20を含むPBSで3回洗浄し、TMBを用いて発色させ、次いで吸光度を650nmで測定した。Avastin（登録商標）(Roche、Switzerland)をコントロールとして用いた。図3に示すように、本発明の抗体クローンは、hVEGF-AおよびmVEGF-Aと良好な結合を示すが、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、またはPlGFとはまったく結合せず、VEGFに対する高い特異性を示唆した。
【実施例９】
【０１４３】
物理化学的特性の分析
本発明の抗体の物理化学特性を分析した。
NuPAGE 4〜12％ビス-トリスゲル(Invitrogen Co.)を用いるジスルフィド結合を除去するためにDTT存在下の還元条件下およびDTT処理なしの非還元条件下のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)分析で全抗体の軽および重鎖の存在を確認した。HF2-11の分子量測定結果を典型例として図4に示す。
【０１４４】
図4に示すように、非還元条件下で分析した試料(NR、5μg)は116kDaサイズマーカーと205kDaサイズマーカーの間に1本の主なバンドを示し、全抗体のサイズに対応するバンドの存在を確認した。還元条件下で分析した試料(R、2μg)は、それぞれ55kDaおよび20.1kDaサイズマーカー周辺に主なバンドを示し、抗体の重および軽鎖に対応するバンドの存在を確認した。したがって、全抗体、重鎖、および軽鎖に対応するバンドがSDS-PAGEで同定され、他の大きな不純物のバンドはみられなかった。
【０１４５】
また、HF2-4の分子量とその理論的アミノ酸配列から推定した値との一致を、液体クロマトグラフィ/質量分析(LC/MS)を用いて確認した。HF2-4の重および軽鎖の質量分析結果を典型例として図5(a)および(b)に示す。
【０１４６】
試料を部分的に還元した後、重および軽鎖の質量を分析した。重鎖は50.6kDaサイズの、軽鎖は23.3kDaサイズの主なピークを示し、推定分子量値と一致した。グリコシル化などの翻訳後修飾の結果であると思われる小さなピークも観察された。
【０１４７】
さらに、本発明の抗体HF2-8の凝集状態(すなわち、可溶性凝集物、不純物の一種)をTSKgel G3000SWxlカラム(Tosoh Co.)を用いるサイズ排除クロマトグラフィ(SEC)により分析し、結果を図6に示す。100mMリン酸緩衝液(pH6.6)を移動相に用いる定組成溶離による分離を用い、280nmでモニターしてモノマーピーク面積が総ピーク面積の98％またはそれ以上であるが、凝集物のピーク面積は2％未満であり、高純度であることを示した。
【実施例１０】
【０１４８】
ヒトまたはマウスVEGFと結合する抗体の分析
本発明の抗体(HF2-1〜HF2-26)のヒト血管内皮成長因子(VEGF)に対する結合特性をELISA法を用いて確認した。
【０１４９】
150μLの緩衝溶液で希釈した1.5ngのヒトVEGFを96ウェル免疫プレート(Nunc、USA)中に入れ、4℃で一夜吸着させ、次いで0.1％Tween20を含む緩衝溶液で3回洗浄した。次に、それを1％ウシ血清アルブミン(Sigma、USA)を含む緩衝溶液と室温で1時間反応させ、次いで3回洗浄した。次に、各ウェルを150μLの連続希釈抗体(1ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、および3000ng/mL)で処理した。それらを室温で1時間反応させて抗原を抗体と結合させ、次いで緩衝溶液で3回洗浄した。
【０１５０】
各ウェルを150μL/ウェルの1：20000希釈抗ヒト免疫グロブリンFc-HRP抗体(AbSerotec、USA)で処理し、室温で1時間反応させた。反応が完結した後、緩衝溶液で3回洗浄し、次いで、150μLのTMB(Sigma、USA)を加え、10分間発色させた。1N硫酸溶液で反応を終わらせ、分光光度計(Molecular Device、USA)を用いて450nmで吸光度を測定した。結果を図7に示す。Avastin（登録商標）をコントロール群として用い、その吸光度を同様に測定した。
【０１５１】
図7に示すように、クローンF(a)のヒト化クローンであるHFクローン(b)の結合特性は親和性改善プロセスにより増加することが確認された。これらHFクローン(HF2-1〜HF2-26)のほとんどがAvastin（登録商標）より高いVEGFに対する結合特性を示すことがわかった。
【０１５２】
該抗体のマウスVEGFに対する結合特性が上記と同様にELISAにより確認された。図8に示す結果は、Avastin（登録商標）と異なり本発明の抗体HF2-1、HF2-5、HF2-8、およびHF2-9がヒトVEGFのみならずマウスVEGFと結合することを示し、本発明の抗体がマウスを用いる前臨床試験に適していることを示唆した。
【実施例１１】
【０１５３】
本発明の抗体のVEGF誘導HUVEC増殖に対する抑制活性の確認
本発明の抗体のVEGF誘導HUVEC増殖の抑制活性を確認した。
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC、Clonetics、USA)を遠心分離してペレットを得、次いで増殖因子とウシ血清を除いたEBM-2基礎培地(Clonetics、USA)に浮遊させた。細胞浮遊液を同数の細胞/ウェルで96ウェル細胞培養プレートに分注し、一定温度の加湿インキュベーター中で24時間インキュベーションした。インキュベーションを完結した後、培地を捨て、ウェルを連続濃度(30ng/mL、60ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、1000ng/mL、および3000ng/mL)に希釈した各抗体と30〜90ng/mLの一定濃度に希釈したヒトVEGFの混合溶液で処理した。該抗原および抗体で処理した該細胞を一定温度の加湿インキュベーター中で4日間培養し、次いで10μL/ウェルのレサズリン溶液(Invitrogen、USA)で処理した。3〜4時間後、蛍光を530nm/590nmで測定した。Avastin（登録商標）をコントロールとして用い、抗体の細胞増殖に対する抑制効果を、VEGFのみで処理したウェルの蛍光値に対して定量した。抗体 HF-1、HF-4、HF-5、およびHF-8で処理したHUVEC増殖率の結果を図9(b)に示し、抗体HF-1〜HF-5、HF-9、およびHF-11で処理した時の細胞生存率の結果を図9(c)および(d)に示す。
【０１５４】
図9に示すように、本発明の抗体HF2-5は、Avastin（登録商標）と同程度にHUVECのVEGF誘導増殖を抑制した(図9(b)および(d))。また、該抗体の活性はFクローン(a)のヒト化および親和性改善(b、c、d)により増加することも示された。
【実施例１２】
【０１５５】
本発明の抗体のHUVECのVEGF誘導透過性に対する抑制活性の確認
本発明の抗体のHUVEC(Clonetics、USA)のVEGF誘導透過性に対する抑制活性を評価した。
試験1日前に、0.4μm微細孔膜を有するTranswellを細胞の付着を促進するためコラーゲン溶液(Sigma、USA)で処理した。細胞をトリプシンを用いて回収し、5x104細胞/mLの濃度で浮遊させた。Transwell中のコラーゲン溶液を捨て、Transwellを緩衝溶液で1回洗浄した。100ulの細胞浮遊液を各ウェルに分注した。600μLの容量のEGM-2培地(Clonetics、USA)をボトムチャンバーに加えた。単層の内皮細胞を形成した後、希釈抗体(HF2-5、HF2-9、HF2-11、またはAvastin（登録商標）(コントロール)、各1xまたは10x)および30〜90ng/mLに希釈したヒトVEGFを含む混合溶液を各100μLおよび600μLの容量でTranswellおよびボトムチャンバーに加え、インキュベーター中で一夜反応させた。反応が完結した後、Transwell中の溶液を除去し、Transwellを100μLのデキストラン-FITC溶液で処理した。1時間後、蛍光を490nm/520nmで測定し、Transwellを横切って通過したデキストランを検出した。VEGFを含まないEBM培地をコントロールとして用いた。
【０１５６】
図10に示すように、VEGFによる内皮細胞の透過性増強は本発明の抗体により濃度依存性に抑制され(a)、これは陽性コントロールのAvastin（登録商標）(b)と同様であった。
【実施例１３】
【０１５７】
VEGF誘導HUVEC遊走に対する本発明抗体の抑制活性の確認
HUVEC(Clonetics、USA)のVEGF誘導遊走特性に対する本発明の抗体HF2-4およびHF2-8の抑制活性を評価した。
【０１５８】
内皮細胞の遊走特性を定量的に評価するため、Boydenチャンバー試験を3μm微細孔膜を有するTranswellを用いて行った。VEGFの反応性を増加させるため、フラスコ中で培養した細胞を試験前に0.1％BSAを含むEBM-2基礎培地中で4時間以上欠乏させた。細胞浮遊液を容量100μL中50,000細胞/ウェルで上側チャンバー中に入れ、3ng/mLの基礎培地で希釈したVEGFおよび9ng/mLまたは90ng/mLの抗体(HF2-4またはHF2-8)を含む混合溶液を容量600uLの下側チャンバーに入れた。
【０１５９】
24時間のインキュベーション後、VEGFの濃度勾配に従ってTranswellの反対側に遊走した細胞をトリプシンを用いて剥がした。剥がした細胞を遠心分離して回収し、次いで溶解緩衝液(Invitrogen、USA)で溶解した。溶解した細胞中のDNAをDNA染料(Invitrogen、USA)で染色し、蛍光を480nm/520nmで測定した。結果を図11に示す。
【０１６０】
図11の結果は、内皮細胞の遊走特性はヒトVEGFにより増強され、増強された遊走特性は抗体HF2-4およびHF2-8より濃度依存性に抑制することができることを示唆する。
【実施例１４】
【０１６１】
本発明抗体の腫瘍増殖に対する抑制活性の確認
腫瘍増殖に対する該抗体の抑制活性を評価するため、本発明の抗体を、ヒト癌細胞を移植して腫瘍を形成したヌードマウスに注射した。
【０１６２】
具体的には、10％FBSおよび1％ペニシリン ストレプトマイシンを含むMcCoy's 5A培地中で培養した2〜5x106個のHT-29細胞(ヒト結腸癌細胞株HTB-38、ATCC)をBALB/cヌードマウス(Orient Bio)に皮下注射した。マウスの腫瘍が平均体積約200〜300mm3まで十分に増殖した時に、抗体HF2-1、HF2-5、HF2-9、およびHF2-11をそれぞれ分割した群に注射した。該抗体を、3mg/kgまたは10mg/kgの用量を1週間に2回腹腔内注射した。腫瘍の体積(mm3)を異なる時点で測定した(第7日、第14日、第21日、第28日、および第35日)。緩衝溶液(PBS)を陰性コントロール群として用い、Avastin（登録商標）を陽性コントロール群に投与した。結果を図12に示す。
【０１６３】
図12に示すように、該抗体を注射したマウスでは腫瘍増殖がコントロール群と比べて有意に抑制された。特に、抗体注射群は、Avastin（登録商標）注射群と比べてはるかに優れた腫瘍増殖抑制効果を示した。
【実施例１５】
【０１６４】
網膜血管新生に対する本発明抗体の抑制活性の確認
網膜血管新生に対する本発明抗体の抑制活性を確認するため、以下のごとく実験を行った。
【０１６５】
最初に、網膜に血管新生を誘発するため、150mWおよび530nmのレーザーを実験の第0日に光凝固装置(ビリディスレーザー、Quantel、France)を用いて0.1秒間マウスの右目に適用した。放射後病変を0.1uMに調整した。第0日および第7日に、抗体HF2-4およびHF2-11をそれぞれ1ugおよび5ugの用量で右眼球内に注射した。フルオレセイン眼底血管造影法を第7日と第14日に行って眼底血管新生の程度を評価した。PBSを陰性コントロール群（ビークル）として用い、Aflibercept(Bayer health care)を陽性コントロール群(対照薬剤)として用いた。眼底血管造影スコアをダネット多重比較検定により分析し、結果を図13に示す。
【０１６６】
図13に示すように、本発明の抗体を注射した群は、陰性コントロール群と比べて脈絡膜血管新生に対する優れた抑制効果を示し、市販の比較薬剤と少なくとも同じであった。
【０１６７】
本発明を上記具体的態様について説明したが、当業者は本発明に種々の修飾と変化をなすことができ、それらも添付の特許請求の範囲により定義した本発明の範囲内に含まれると認識すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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