(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検出物質と特異的に結合する物質を標識した標識試薬、ならびに被検出物質と特異的に結合する捕捉物質を固相化した第１検出領域および前記標識試薬に結合する物質を固相化した第２検出領域を有する試験片を用いるイムノクロマト法において、第１検出領域から発せられる第１のシグナルと第２検出領域から発せられる第２のシグナルを同時に測定し、両検出領域から発せられるシグナル強度を比較し、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度が第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度よりも低い場合には、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度により被検出物質を定量し、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度が第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度よりも高い場合には、第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度により被検出物質を定量する、被検出物質の定量範囲を拡大する方法。
【請求項２】
あらかじめ濃度の異なる被検出物質を標準品として準備し、該標準品を用いて、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度および第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度を測定し、第１検出領域における被検出物質の濃度に対するシグナル強度の第１の標準曲線、および第２検出領域における被検出物質の濃度に対するシグナル強度の第２の標準曲線の２つの標準曲線を作成し、第１検出領域について作成した第１の標準曲線を用いて第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度から被検出物質濃度を算出し、第２検出領域について作成した第２の標準曲線を用いて第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度から被検出物質濃度を算出する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
被検出物質が抗原であり、標識試薬が前記抗原に特異的に結合する第１の抗体の標識物であり、第１検出領域に固相化する捕捉物質が前記抗原に特異的に結合する第２の抗体であり、第２検出領域に固相化する物質が標識試薬に結合する物質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第２検出領域に固相化する物質が、第１の抗体に特異的に結合する抗原、抗体、Protein A、Protein G、またはProtein Lである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
被検出物質が抗体であり、標識試薬が前記抗体に特異的に結合する抗体または抗原の標識物であり、第１検出領域に固相化する捕捉物質が被検出物質である抗体に特異的に結合する抗原であり、第２検出領域に固相化する物質が標識試薬に結合する物質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
第２検出領域に固相化する物質が、標識試薬の抗体または抗原に結合する、抗原、抗体、Protein A、Protein G、またはProtein Lである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
標識試薬が不溶性コロイドで標識されており、第２検出領域に固相化する物質が前記コロイドに結合する陽イオン性ポリマーである、請求項３または５に記載の方法。
【請求項８】
被検出物質と特異的に結合する物質を標識した標識試薬、ならびに被検出物質と特異的に結合する捕捉物質を固相化した第１検出領域および前記標識試薬に結合する物質を固相化した第２検出領域を有するイムノクロマト法用試験片であって、第１検出領域から発せられる第１のシグナルと第２検出領域から発せられる第２のシグナルを同時に測定し、両検出領域から発せられるシグナル強度を比較し、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度が第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度よりも低い場合には、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度により被検出物質を定量し、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度が第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度よりも高い場合には、第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度により被検出物質を定量することにより、被検出物質の定量範囲を拡大することができるイムノクロマト法用試験片。
【請求項９】
被検出物質が抗原であり、標識試薬が前記抗原に特異的に結合する第１の抗体の標識物であり、第１検出領域に固相化する捕捉物質が前記抗原に特異的に結合する第２の抗体であり、第２検出領域に固相化する物質が標識試薬に結合する物質である、請求項８記載のイムノクロマト法用試験片。
【請求項１０】
第２検出領域に固相化されている物質が、第１の抗体に特異的に結合する抗原、抗体、Protein A、Protein G、またはProtein Lである、請求項９記載のイムノクロマト法用試験片。
【請求項１１】
被検出物質が抗体であり、標識試薬が前記抗体に特異的に結合する抗体または抗原の標識物であり、第１検出領域に固相化されている捕捉物質が被検出物質である抗体に特異的に結合する抗原であり、第２検出領域に固相化されている物質が標識試薬に結合する物質である、請求項８記載のイムノクロマト法用試験片。
【請求項１２】
第２検出領域に固相化されている物質が、標識試薬の抗体または抗原に結合する、抗原、抗体、Protein A、Protein G、またはProtein Lである、請求項１１記載のイムノクロマト法用試験片。
【請求項１３】
標識試薬が不溶性コロイドで標識されており、第２検出領域に固相化されている物質が前記コロイドに結合する陽イオン性ポリマーである、請求項９または１１に記載のイムノクロマト法用試験片。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか１項に記載のイムノクロマト法用試験片、ならびに、あらかじめ濃度の異なる被検出物質を標準品として準備し、該標準品を用いて、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度および第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度を測定し作成した第１検出領域における被検出物質の濃度に対するシグナル強度の標準曲線および第２検出領域における被検出物質の濃度に対するシグナル強度の標準曲線の２つの標準曲線を含む、イムノクロマト法用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料中の被検出物質をイムノクロマト法によって半定量的または定量的に検出する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
液体試料中の被検出物質をイムノクロマト法によって半定量的または定量的に検出する方法として、イムノクロマト法において得られた被検出物質のシグナルを特別な装置を使って測定する方法が挙げられる。例えば、金コロイドや着色ラテックスを使用したイムノクロマト法による被検出物質のシグナルは、目視によって確認できる着色像を示すが、これを特別な装置で測定することで、その濃淡を数値化し、定量する方法がある（特許文献１）。また、蛍光色素を利用するイムノクロマト法においては、被検出物質のシグナルである蛍光をフォトダイオードやPDMで検出することで数値化し、定量する方法がある（特許文献２）。
【０００３】
これらの方法では、予め既知濃度である被検出物質を用いて標準曲線を作成し、未知濃度の被検出物質で得られた数値を前記の標準曲線から算出する。この時に作成される標準曲線は、被検出物質を捕らえたシグナルのみから作られる。そのため、一定量以上の被検出物質が存在する場合、そのシグナルは飽和となり、被検出物質の量が非常に多い場合に、定量できず、定量範囲が狭いという問題があった。
【０００４】
一方、既知濃度である被検出物質を用いて、第１の抗体により得られるシグナルと第２の抗体により得られるシグナルを測定し、第１の抗体により得られるシグナル強度と、第１の抗体により得られるシグナルと第２の抗体により得られるシグナルの和、との比率を算出し、標準曲線を作成し、被検出物質の量を定量する方法がある（特許文献３）。
【０００５】
この方法を用いたとしても定量範囲が狭く、被検出物質が多い場合には定量できない問題は解決されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2000-338106号公報
【特許文献２】特開2010-197248号公報
【特許文献３】特開2013-205374号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
イムノクロマト法において、被検出物質の定量範囲が広い定量方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
検体中の被検出物質を定量するためのイムノクロマト法においては、イムノクロマト試験片を用いて想定される範囲の濃度の被検出物質を測定できる必要がある。しかしながら、被検出物質濃度が想定される範囲を超えることがある。また、想定される濃度範囲が広く、従来のイムノクロマト法では、全範囲に渡って定量することは不可能な被検出物質もあった。このような場合、例えば、検体を希釈して被検出物質濃度を定量可能範囲内に低下させることにより定量が可能であるが、１つの検体について複数回の測定が必要になってしまっていた。
【０００９】
本発明者らは、イムノクロマト法において１つの試験片を用いた１回の測定で、広い濃度範囲で被検出物質を定量できる方法について鋭意検討を行った。
【００１０】
本発明者らは、１つのイムノクロマト法用試験片に、被検出物質に特異的に結合する捕捉物質を固相化した第１検出領域と標識試薬に結合する物質を固相化した第２検出領域を設けて検討を行った。その結果、第１検出領域および第２検出領域における被検出物質濃度とシグナル強度との間に直線性が成立する濃度範囲が異なるため、第１検出領域および第２検出領域を用いることにより、定量範囲を拡大することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  被検出物質と特異的に結合する物質を標識した標識試薬、ならびに被検出物質と特異的に結合する捕捉物質を固相化した第１検出領域および前記標識試薬に結合する物質を固相化した第２検出領域を有する試験片を用いるイムノクロマト法において、第１検出領域から発せられる第１のシグナルと第２検出領域から発せられる第２のシグナルを同時に測定し、両検出領域から発せられるシグナル強度を比較し、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度が第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度よりも低い場合には、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度により被検出物質を定量し、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度が第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度よりも高い場合には、第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度により被検出物質を定量する、被検出物質の定量範囲を拡大する方法。
[２]  あらかじめ濃度の異なる被検出物質を標準品として準備し、該標準品を用いて、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度および第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度を測定し、第１検出領域における被検出物質の濃度に対するシグナル強度の第１の標準曲線、および第２検出領域における被検出物質の濃度に対するシグナル強度の第２の標準曲線の２つの標準曲線を作成し、第１検出領域について作成した第１の標準曲線を用いて第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度から被検出物質濃度を算出し、第２検出領域について作成した第２の標準曲線を用いて第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度から被検出物質濃度を算出する、[１]の方法。
[３]  被検出物質が抗原であり、標識試薬が前記抗原に特異的に結合する第１の抗体の標識物であり、第１検出領域に固相化する捕捉物質が前記抗原に特異的に結合する第２の抗体であり、第２検出領域に固相化する物質が標識試薬に結合する物質である、[１]または[２]の方法。
[４]  第２検出領域に固相化する物質が、第１の抗体に特異的に結合する抗原、抗体、Protein A、Protein G、またはProtein Lである、[３]の方法。
[５]  被検出物質が抗体であり、標識試薬が前記抗体に特異的に結合する抗体または抗原の標識物であり、第１検出領域に固相化する捕捉物質が被検出物質である抗体に特異的に結合する抗原であり、第２検出領域に固相化する物質が標識試薬に結合する物質である、[１]または[２]の方法。
[６]  第２検出領域に固相化する物質が、標識試薬の抗体または抗原に結合する、抗原、抗体、Protein A、Protein G、またはProtein Lである、[５]の方法。
[７]  標識試薬が不溶性コロイドで標識されており、第２検出領域に固相化する物質が前記コロイドに結合する陽イオン性ポリマーである、[３]または[５]の方法。
[８]  被検出物質と特異的に結合する物質を標識した標識試薬、ならびに被検出物質と特異的に結合する捕捉物質を固相化した第１検出領域および前記標識試薬に結合する物質を固相化した第２検出領域を有するイムノクロマト法用試験片であって、第１検出領域から発せられる第１のシグナルと第２検出領域から発せられる第２のシグナルを同時に測定し、両検出領域から発せられるシグナル強度を比較し、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度が第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度よりも低い場合には、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度により被検出物質を定量し、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度が第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度よりも高い場合には、第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度により被検出物質を定量することにより、被検出物質の定量範囲を拡大することができるイムノクロマト法用試験片。
[９]  被検出物質が抗原であり、標識試薬が前記抗原に特異的に結合する第１の抗体の標識物であり、第１検出領域に固相化する捕捉物質が前記抗原に特異的に結合する第２の抗体であり、第２検出領域に固相化する物質が標識試薬に結合する物質である、[８]のイムノクロマト法用試験片。
[１０]  第２検出領域に固相化されている物質が、第１の抗体に特異的に結合する抗原、抗体、Protein A、Protein G、またはProtein Lである、[９]のイムノクロマト法用試験片。
[１１]  被検出物質が抗体であり、標識試薬が前記抗体に特異的に結合する抗体または抗原の標識物であり、第１検出領域に固相化されている捕捉物質が被検出物質である抗体に特異的に結合する抗原であり、第２検出領域に固相化されている物質が標識試薬に結合する物質である、[８]のイムノクロマト法用試験片。
[１２]  第２検出領域に固相化されている物質が、標識試薬の抗体または抗原に結合する、抗原、抗体、Protein A、Protein G、またはProtein Lである、[１１]のイムノクロマト法用試験片。
[１３]  標識試薬が不溶性コロイドで標識されており、第２検出領域に固相化されている物質が前記コロイドに結合する陽イオン性ポリマーである、[９]または[１１]のイムノクロマト法用試験片。
[１４]  [８]〜[１３]のいずれか１のイムノクロマト法用試験片、ならびに、あらかじめ濃度の異なる被検出物質を標準品として準備し、該標準品を用いて、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度および第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度を測定し作成した第１検出領域における被検出物質の濃度に対するシグナル強度の標準曲線および第２検出領域における被検出物質の濃度に対するシグナル強度の標準曲線の２つの標準曲線を含む、イムノクロマト法用キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のイムノクロマト法により、従来のイムノクロマト法よりも、被検出物質を広い濃度範囲で定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のイムノクロマト法に用いる試験片の上面図および切断断面図である。
【図２】CRP濃度に対する抗CRPモノクローナル抗体固定化領域のシグナル強度を示す図である。
【図３】CRP濃度に対する抗CRPモノクローナル抗体固定化領域および抗マウスIgGsポリクローナル抗体固定化領域のシグナル強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、イムノクロマト法（イムノクロマトグラフィー法）を用いて被検出物質を定量する方法であって、被検出物質の定量範囲が広い定量方法である。
【００１５】
本発明のイムノクロマト法を用いた定量においては、被検出物質と特異的に結合する物質を標識した標識試薬、ならびに被検出物質と特異的に結合する物質である捕捉物質を固相化した第１検出領域および標識試薬に結合する物質を固相化した第２検出領域を有する試験片を用いる。被検出物質を含む検体試料液と標識試薬を混合した状態で試験片に添加すると被検出物質と標識試薬は結合し、試験片中を毛細管現象を利用して移動し、第１検出領域に固相化された被検出物質に特異的に結合する捕捉物質と結合することにより、試験片上の第１検出領域に、捕捉物質-被検出物質-標識試薬の複合体を形成する。さらに、第１検出領域に捕捉されなかった標識試薬は第２検出領域に固相化された、標識試薬に結合する物質に結合し捕捉される。第１検出領域または第２検出領域において標識試薬より発せられるシグナルを検出装置により測定することにより、被検出物質を定量することができ、第１検出領域および第２検出領域における被検出物質濃度とシグナル強度との間に直線性が成立する濃度範囲が異なるため、第１検出領域および第２検出領域を用いることにより、定量範囲を拡大することができる。本発明により、上記のイムノクロマト法を用いて、被検出物質を定量する方法において、被検出物質の定量範囲を広くすることができる。ここで「被検出物質の定量範囲を広くする」とは、被検出物質の広い濃度範囲に渡って、被検出物質濃度とシグナル強度との直線性を維持することによりシグナル強度に基づいて被検出物質濃度を算出できることをいう。
【００１６】
本発明で用いる試験片において、第１検出領域は第２の検出領域の上流に位置する。ここで、上流に位置するとは、上記試験片を用いてイムノクロマト法により測定を行うときの被検出物質を含む検体試料液の流れる方向における上流に位置することをいう。検体試料液は、第１検出領域の上流に添加し、第１検出領域を通って第２検出領域に向かって流れ、最初に第１検出領域に達し、次いで第２検出領域に達する。
【００１７】
第１検出領域には、被検出物質と特異的に結合する捕捉物質が固相化される。被検出物質は抗原抗体反応を生じ得る抗原または抗体であり、被検出物質が抗原の場合、捕捉物質は該抗原に特異的に結合する抗体であり、被検出物質が抗体の場合、捕捉物質は該抗体が特異的に結合する抗原または該抗体に特異的に結合する抗体である。
【００１８】
第２検出領域には、標識試薬と結合する物質が固相化される。標識試薬は、被検出物質と特異的に結合する抗原または抗体を標識したものであり、第２検出領域に固相化される標識試薬と結合する物質は、標識されている抗原または抗体に結合する物質でもよいし、標識に用いる標識物質に結合し得る物質でもよい。
【００１９】
被検出物質が抗原であり、標識試薬が該抗原に特異的に結合する第１の抗体の標識物である場合、第１検出領域には、前記抗原に特異的に結合する第２の抗体を固相化すればよい。第２検出領域に固相化する物質として、前記第１の抗体に結合する抗体や前記抗体に結合する抗原を用いることができる。例えば、標識試薬がマウス抗体を標識したものである場合、第２検出領域に、抗マウスIgG抗体を固相化すればよい。また、標識試薬の抗体に結合するProtein A、Protein GまたはProtein Lを用いることもできる。
【００２０】
被検出物質が抗体であり、標識試薬が該抗体に特異的に結合する抗原である場合、第１検出領域には、被検出物質である抗体に特異的に結合する抗原を固相化すればよい。第２検出領域に固相化する物質として、前記抗原に結合する抗体を用いることができる。また、被検出物質が抗体であり、標識試薬が該抗体に特異的に結合する抗体である場合、第１検出領域には、被検出物質である抗体に特異的に結合する抗原を固相化し、第２検出領域には、標識試薬に結合する抗原、抗体を固相化すればよい。例えば、標識試薬がマウス抗体を標識したものである場合、第２検出領域に、抗マウスIgG抗体を固相化すればよい。また、標識試薬の抗体に結合するProtein A、Protein GまたはProtein Lを用いることもできる。さらに、前記抗原とリガンドとレセプターの関係にあり、前記抗原に結合し得る物質を用いることもできる。
【００２１】
第２検出領域に固相化する物質は、標識試薬の標識物質に結合する物質でもよく、この場合、被検出物質は抗原でも抗体でもよい。例えば、標識物質が金コロイド、セレニウムコロイド、ラテックス等のコロイドである不溶性担体の場合、該コロイドに結合し得る陽イオン性のポリマーを用いることができる。陽イオン性ポリマーとしてポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミンが挙げられる。ポリエチレンイミンには、直鎖PEIと1級、2級、3級アミンを含む分岐したポリエチレンイミンとが存在するがいずれも用いることができる。また、ポリエチレンイミンの分子量も限定されない。さらに脱アシル化等の化学修飾されたものも含まれる。また、ポリアリルアミンとしてポリ（アリルビグアニド-co-アリルアミン）やポリ（アリル-N-カルバモイルグアニジノ-co-アリルアミン）等の誘導体も含まれる。陽イオン性のポリマーの試験片の第２検出領域への固相化は、陽イオン性のポリマーを試験片に吸収させて乾燥することにより行うことができる。
【００２２】
第１検出領域においては、「被検出物質と特異的に結合する捕捉物質」-「被検出物質」-「標識試薬」からなる複合体が形成され、標識試薬から第１のシグナルが発せられる。
【００２３】
第２検出領域においては、「標識試薬と結合する物質」-「標識試薬」からなる複合体が形成され、標識試薬から第２のシグナルが発せられる。
【００２４】
すなわち、第１検出領域においては、被検出物質が存在する場合に、標識試薬が捕捉され、標識試薬から発せられるシグナルを測定することができるが、第２検出領域においては、被検出物質が存在しなくても、標識試薬が捕捉され、標識試薬から発せられるシグナルを測定することができる。
【００２５】
本発明においては、第１検出領域から発せられる第１のシグナルと第２検出領域から発せられる第２のシグナルを同時に測定し、両検出領域から発せられるシグナル強度を比較し、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度が第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度よりも低い場合には、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度により被検出物質を定量し、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度が第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度よりも高い場合には、第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度により被検出物質を定量する。この方法により、被検出物質を広い濃度範囲で定量することができる。この方法は、イムノクロマト法において、被検出物質の定量範囲を拡大する方法でもある。
【００２６】
すなわち、あらかじめ濃度の異なる被検出物質を標準品として準備し、該標準品を用いて、第１検出領域から発せられるシグナル強度および第２検出領域から発せられるシグナル強度を測定し、第１検出領域における被検出物質の濃度に対するシグナル強度の第１の標準曲線、および第２検出領域における被検出物質の濃度に対するシグナル強度の第２の標準曲線の２つの標準曲線を作成しておく。未知濃度の被検出物質を用いて測定した場合の、第１検出領域から発せられるシグナル強度と第２検出領域から発せられるシグナル強度を同時に測定し、第１検出領域から発せられるシグナル強度が第２検出領域から発せられるシグナル強度よりも低い場合に、第１検出領域について作成した第１の標準曲線を用いて第１検出領域のシグナル強度から被検出物質濃度を算出する。一方、第１検出領域から発せられるシグナル強度が第２検出領域から発せられるシグナル強度よりも高い場合に、第２検出領域について作成した第２の標準曲線を用いて第２検出領域のシグナル強度から被検出物質濃度を算出する。
【００２７】
第１検出領域における標準曲線は、被検出物質の濃度が一定以下の場合、被検出物質濃度が高くなるにつれ直線的にシグナル強度が高くなるが、被検出物質濃度が一定以上になるとシグナル強度はプラトーに達し、シグナル強度はほぼ一定の値となる。これは、被検出物質濃度が一定以下の場合、標識試薬および第１検出領域に固相化された捕捉物質は、被検出物質に対して過剰量存在し、被検出物質のほとんどすべてが第１検出領域における「被検出物質と特異的に結合する捕捉物質」-「被検出物質」-「標識試薬」からなる複合体の形成に用いられ、被検出物質濃度に比例して、第１検出領域に捕捉される標識試薬の量が多くなるからである。被検出物質濃度が高くなり、一定以上になると、第１検出領域に固相化した捕捉物質のほとんどすべてが被検出物質と結合し、それ以上の被検出物質を捕捉できなくなるので、第１検出領域に捕捉される標識試薬の量もそれ以上増加しなくなる。このため、第１検出領域におけるシグナル強度はプラトーに達する。第１検出領域におけるシグナル強度がプラトーに達した場合、もはや被検出物質濃度とシグナル強度は比例しなくなるので、被検出物質を定量することはできなくなる。従来法では、第１検出領域のみを用いて被検出物質を定量していたため、被検出物質濃度が一定以上になると定量が不可能になる。
【００２８】
一方、第２検出領域における標準曲線は、被検出物質の濃度が一定以下の場合、高いシグナル強度を示し被検出物質の濃度が一定以上になるまで変化しない。被検出物質濃度が高くなると、第２検出領域から発せられるシグナル強度は低下し、被検出物質の濃度が高くなるにつれ、被検出物質の濃度に比例して、シグナル強度が低下する。これは、被検出物質濃度が低い場合、標識試薬は被検出物質に対して過剰量存在するため、標識試薬の多くは第１検出領域で捕捉されずに、試験片上を下流に流れ、下流の第２検出領域において、標識試薬に結合する物質に結合し、捕捉される。この時点では、標識試薬は、第２検出領域に固相化された標識試薬と結合する物質に対して過剰に存在するため、第２検出領域に固相化された標識試薬と結合する物質のほとんどすべてが標識試薬を捕捉するので、第２検出領域におけるシグナル強度は、被検出物質濃度が一定以上になるまで、高い値を維持する。この濃度範囲では、第２検出領域から発せられるシグナル強度を用いて被検出物質を定量することは不可能である。被検出物質濃度が高くなり一定以上になると、第１検出領域に捕捉される標識試薬の量が多くなる。この結果、第１検出領域に捕捉されずに、第２検出領域に達する標識試薬の量は、被検出物質の濃度が高くなるほど、少なくなり、第２検出領域に達して、第２検出領域に固相化されている標識試薬に結合する物質に結合する標識試薬の量も少なくなる。このため、被検出物質の濃度が高くなるにつれて、第２検出領域におけるシグナル強度は、被検出物質の濃度に比例して、低下する。従って、被検出物質濃度が一定以上になると、第２検出領域におけるシグナル強度を用いて、被検出物質を定量することができる。
【００２９】
上記のように、第１検出領域から発せられる第１のシグナルと第２検出領域から発せられる第２のシグナルを同時に測定し、両検出領域から発せられるシグナル強度を比較し、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度が第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度よりも低い場合には、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度により被検出物質を定量し、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度が第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度よりも高い場合には、第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度により被検出物質を定量することにより、定量範囲を広げるためには、被検出物質濃度が一定濃度の場合に、第１検出領域から発せられる第１のシグナル強度と第２検出領域から発せられる第２のシグナル強度が等しくなり、被検出物質濃度が前記一定濃度以下の場合に、第１検出領域における第１のシグナル強度が被検出物質濃度と比例関係にあり、被検出物質濃度が前記一定濃度以上の場合に、第２検出領域における第２のシグナル強度が被検出物質濃度と比例関係にある必要がある。このようにするためには、第１検出領域に固相化する被検出物質と特異的に結合する捕捉物質の量、第２検出領域に固相化する標識試薬と結合する物質の量、および標識試薬の量を調整すればよい。例えば、第１検出領域における標準曲線と第２検出領域における標準曲線を重ねた場合に、図３のように１点で交差するように試薬量を調整する。この場合、交差する点より低い被検出物質の濃度範囲においては、第１検出領域における標準曲線を用い、交差する点より高い被検出物質の濃度範囲においては、第２検出領域における標準曲線を用いればよい。
【００３０】
すなわち、第１検出領域に固相化する捕捉物質の被検出物質の捕捉能力、および第２検出領域の固相化する物質の標識物質の捕捉能力に応じて、標識物質の量を調整する。ここで、固相化する物質の捕捉能力は、固相化する物質の捕捉しようとする物質への親和性や量により決まる。
【００３１】
本発明の方法により、第１検出領域のみを有するイムノクロマト法用試験片を用いる従来法に比べ、被検出物質の定量できる濃度範囲の上限が２倍以上、好ましくは３倍以上、さらに好ましくは５倍以上、特に好ましくは１０倍以上になる。
【００３２】
本発明のイムノクロマト法は、上記の第１検出領域と第２検出領域を有する試験片および標識試薬を用いる限り、公知のイムノクロマト法で用いるイムノクロマト法用試験片を用いて、公知の方法で行うことができる。
【００３３】
本発明のイムノクロマト法用試験片は、多孔性の吸水性の材質でできており、検体試料液が毛細管現象により移動し得る材質でできた部材を有し、該部材をメンブレンと呼ぶ。被検出物質に特異的に結合する捕捉試薬を固相化した位置を第１検出領域と呼び、標識試薬に結合する物質を固相化した位置を第２検出領域と呼ぶ。メンブレンは、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース、これらの混合繊維からなる材質からできており、好ましくはニトロセルロースメンブレンでできている。メンブレンの厚さは特に限定されないが、好ましくは100〜200μm程度である。また、メンブレンは長方形のストリップとして用い、その大きさは、特に限定されないが、通常、３mm〜９mm×40mm〜60mm程度である。
【００３４】
第１検出領域における抗体または抗原は、例えばライン状やドット状に固定化すればよく、好ましくはライン状に固定化する。固定化は、タンパク質をニトロセルロースメンブレン等の固相に固定化するための公知の方法で行うことができる。例えば、吸着による方法、アミノ基、カルボキシル基等の官能基を利用して化学的に結合させる方法等が挙げられる。
【００３５】
第２検出領域における、標識試薬と結合する物質もライン状やドット上に固定化すればよい。
【００３６】
抗体は、精製したポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が用いられる。抗原は、精製した天然の抗原またはリコンビナント抗原が用いられる。
【００３７】
本発明における被検出物質の例としては、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、RSウイルス、HAV、HBV、HCV、HIV、EBV、ノロウイルス、ロタウイルス、パルボウイルス、等のウイルスもしくはそれらの構成部分またはそれらに対する抗体、大腸菌、サルモネラ、ブドウ球菌、カンピロバクター、ウェルシュ菌、腸炎ビブリオ菌、クラミジア・トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター・ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、トキソプラズマ・ゴンディ、ボレリア、炭疽菌、MRSA等の細菌もしくはそれらの構成部分またはそれらに対する抗体、マイコプラズマ脂質、ヒトトランスフェリン、ヒトアルブミン、ヒト免疫グロブリン、マイクログロブリン、C反応性蛋白（CRP）、トロポニン、β−グルカン、ＲＦもしくはそれらの構成部分またはそれらに対する抗体、あるいは、ヒト繊毛性ゴナドトロピン等のペプチドホルモンまたはそれらに対する抗体、ステロイドホルモン等のステロイドまたはそれらに対する抗体、エピネフリンやモルヒネ等の生理活性アミン類またはそれらに対する抗体、ビタミンＢ類等のビタミン類またはそれらに対する抗体、プロスタグランジン類またはそれらに対する抗体、テトラサイクリン等の抗生物質またはそれらに対する抗体、細菌等が産生する毒素またはそれらに対する抗体、各種腫瘍マーカーまたはそれらに対する抗体、農薬またはそれらに対する抗体等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明において標識試薬とは、被検出物質に特異的に結合する物質に適当な標識物質を結合させた結合体である。標識物質は、通常物質の標識に用いられる標識物質ならばいずれも用いることができる。例えば、金コロイド粒子等の金属コロイド粒子、セレニウムコロイド粒子等の非金属コロイド粒子、着色樹脂物質、染料コロイド粒子および着色リポソーム等の不溶性粒子やアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等の発色反応を触媒する酵素、蛍光色素、放射性同位体等が挙げられる。本発明において用いる標識物質は、一般に入手可能な市販品であってよい。
【００３９】
本発明のイムノクロマト法用試験片は、さらに、試料添加部位、吸収帯、標識部位を有していてもよい。
【００４０】
試料添加部位は、検体試料液を添加する部位で、検体試料液を上記のメンブレン上に直接添加してもよいが、吸水性のある材質、例えばスポンジ、ガラス繊維などの不織布等のパッドを試験片上に設けその部分に添加してもよい。パッドを用いる場合、該パッドをサンプルパッドと呼ぶことができる。試料添加部位は試験片上の一端に設けるのが好ましい。
【００４１】
吸収帯は、吸収パッド部位とも呼び、本発明のイムノクロマト法用試験片の試料添加部位とは異なる一端に設けられ、試料添加部位に添加した後、試験片上を移動する試料液体を吸収することにより試験片上の試料液体の流れを促進する。吸収帯は、多量の液を吸収できるよう、吸水性の材質でできており、例えば、セルロース、ガラス繊維などでできた不織布等が用いられる。また、その大きさは、特に限定されないが、通常、３mm〜15mm×10mm〜40mm、厚さ0.5mm〜３mm程度である。
【００４２】
標識部位は、標識試薬が含有された部位である。標識部位は、吸水性の材質、例えばスポンジおよびガラス繊維などでできた不織布等の材質が用いられ、その大きさは、特に限定されないが、通常、３mm〜10mm×３mm〜10mm、厚さ0.5mm〜３mm程度で、標識試薬が乾燥状態で含有されている。標識部位として上記の吸水性の材質に標識された標識試薬を含有させて用いる場合、該標識部位を乾燥パッドまたはコンジュゲートパッドと呼ぶことができる。標識部位は、上記の吸水性の材質に標識試薬を含浸させ、乾燥させればよい。試験片上を検体試料液が試料添加部位から吸収帯に流れるときの試料添加部位側を上流、吸収帯側を下流とした場合、標識部位は、試料添加部位の下流であって、検出部位の上流に設ければよい。この場合、試料添加部位のサンプルパッドと標識部位の乾燥パッドは接触していてもいなくてもよい。
【００４３】
本発明の試験片はバッキングシートを有していてもよい。バッキングシートは支持シートということもでき、上記のメンブレン、試料添加部位、吸収帯、標識部位を裏張りするために用いられる。メンブレン、試料添加部位、吸収帯、標識部位は、バッキングシートに貼り付けてもよい。バッキングシートは、液体を透過しないポリエチレンテレフタレート（PET)等のプラスチック等でできたシートであり、メンブレンやその他の試料添加部位等の部材が一定の構造や強度を保つように支持し、かつ試料検体が試験片から流出してしまうのを防止することができる。バッキンングシートがある場合、バッキングシートも含めて試験片と呼ぶ。
【００４４】
図１に本発明の方法に用いるイムノクロマト法用試験片の一例を示す。
本発明の方法は、例えば、図１に記載の試験片を用いて以下のようにして行えばよい。例えば、被検出物質を含む検体試料液中の抗原を定量するイムノクロマト法においては、イムノクロマト法用試験片上の第１検出領域６に被検出物質である抗原と特異的に結合し得る抗体を固相化し、第２検出領域７に標識試薬に結合する物質を固相化する。さらに、標識部位３には、検出しようとする抗原が特異的に結合する抗体を標識した標識試薬を固相化しておく。試験片の試料添加部位４に、検体試料液を添加し、毛管現象を利用して、標識試薬をニトロセルロースメンブレン２上を展開移動させる。この際、予め試験片上に標識試薬を固相化しておき添加した検体試料液により標識試薬を溶解させる代わりに、標識試薬と被検出物質を混合した後に、試験片上の試料添加部位４に混合物を添加してもよい。検体試料液は、ニトロセルロースメンブレン２上を下流に流れ、吸収帯５に吸収される。この結果、固相化した抗体-被検出物質（抗原）-標識試薬の複合体が試験片上の第１検出領域６に形成される。第１検出領域６よりも下流に位置する第２検出領域７には、標識試薬と結合する物質が固相化されており、第１検出領域６で捕捉されなかった標識試薬は第２検出領域７に達し、第２検出領域７において、標識試薬に結合する物質-標識試薬の複合体が形成される。
【００４５】
第１検出領域および第２検出領域で捕捉された標識試薬から発せられるシグナルは標識物質に応じた検出装置を用いて測定することができる。検出装置は、例えば、標識物質がコロイド粒子やポリスチレン粒子等の着色不溶性担体粒子の場合、デンシトメーターを用いることができ、標識物質が蛍光色素の場合、蛍光検出装置を用いることができる。また、イムノクロマトリーダーを用いてもよい。
【００４６】
本発明のイムノクロマト法に供される検体試料液としては、尿、液状便、血液、血清、上気道拭い液、吸引液等の液状臨床検体や、環境由来の水検体、飲料水を始めとする液状食品、あるいは微生物、固形便、土壌、汚泥、固形食品、大気中の成分等を液体に溶解、懸濁して得た溶液、乳剤やその上清等を選択することができる。
【実施例】
【００４７】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４８】
実施例１  イムノクロマト法用試験片の調製
１．抗C反応性蛋白（CRP：C-reactive protein）モノクローナル抗体の作製
CRPをBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（P3×63）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、37℃インキュベーター中で維持し、CRPを固相したプレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。
【００４９】
得られた腹水からプロティンＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により、それぞれIgGを精製し、結合するエピトープが異なる２種類の精製抗CRPモノクローナル抗体を得た。
【００５０】
２．抗CRPモノクローナル抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
精製した抗CRPモノクローナル抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液、抗マウスIgGsポリクローナル抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液をPETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレン（Unisart CN 95；Sartorius Stedim Biotech社製）の所定の位置にそれぞれ線状に塗布し、45℃、30分間乾燥させ、抗CRPモノクローナル抗体／抗マウスIgGsポリクローナル抗体固定化メンブレンを得た（以下抗体固定化メンブレンとする）。
【００５１】
３．抗CRPモノクローナル抗体の着色ポリスチレン粒子への固定化
ニトロセルロースメンブレンへの固定化に使用しなかったもう一つの精製した抗CRPモノクローナル抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈し、これに着色ポリスチレン粒子（Thermo scientific社製）を0.1％になるように加え、攪拌後、カルボジイミドを1％になるように加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、50mM Tris（pH9.0）、3％BSAに再浮遊し、抗B型インフルエンザウイルスNP抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。
【００５２】
４．抗CRPモノクローナル抗体結合着色ポリスチレン粒子の塗布・乾燥
３．で得た抗CRPモノクローナル抗体結合着色ポリスチレン粒子をグラスファイバー不織布（Merck Millipore社製：製品名；GFCP）に所定量1.0μgを塗布し、45℃、30分間乾燥させ、乾燥パッドを製造した。
【００５３】
５．固定化メンブレン、乾燥パッド、他部材との貼り合わせ
２．および４．で調製した抗体固定化メンブレンと乾燥パッドを他部材（バッキングシート；Merck Miilipore社製、吸収帯；Merck Millipore社製、サンプルパッド；Merck Millipore社製）と貼り合せて5mm幅に切断し、CRP試験片とした。
【００５４】
実施例２  CRP検出イムノクロマト法における定量方法の検証
既知濃度のCRP溶液を10mM Tris（pH7.0）、3％BSA、0.2％Triton X-100に希釈し、CRP試験片のサンプルパッドに50μLを滴加する。所定時間経過後、デンシトメーター（GS-800；Bio-rad社製）を用いて、抗CRPモノクローナル抗体固定化領域（第１検出領域）のシグナル強度および抗マウスIgGsポリクローナル抗体固定化領域（第２検出領域）のシグナル強度を数値化した（表1）。
【００５５】
抗CRPモノクローナル抗体固定化領域のシグナル強度のみを横軸にCRP濃度、縦軸にシグナル強度をプロットしたグラフ（図２）と抗CRPモノクローナル抗体固定化領域のシグナル強度および抗マウスIgGsポリクローナル抗体固定化領域のシグナル強度を同時に横軸にCRP濃度、縦軸にシグナル強度をプロットしたグラフ（図３）を作成し、比較および直線性の検証を行った。
【００５６】
【表１】
0006312555.tif 000002
【００５７】
結果、抗CRPモノクローナル抗体固定化領域のシグナル強度のみでプロットしたグラフ（図２）を見ると、直線性の得られる範囲は、0.001800537〜0.23046875mg/dLの範囲であり、それ以上の濃度においては直線性が失われていた。一方、抗CRPモノクローナル抗体固定化領域および抗マウスIgGsポリクローナル抗体固定化領域のシグナル強度を同時にプロットしたグラフ（図３）を見ると、抗CRPモノクローナル抗体固定化領域のシグナル強度の直線性が失われる濃度以降、すなわち抗CRPモノクローナル抗体固定化領域のシグナル強度が抗マウスIgGsポリクローナル抗体固定化領域のシグナル強度を超え逆転する濃度以降でも、抗マウスIgGsポリクローナル抗体固定化領域のシグナル強度の減衰に直線性が得られ、最大で3.6875mg/dLの濃度まで直線性が得られた。
【００５８】
以上の結果より、抗CRPモノクローナル抗体固定化領域（第１検出領域）および抗マウスIgGsポリクローナル抗体固定化領域（第２検出領域）のシグナル強度を同時に測定し、抗CRPモノクローナル抗体固定化領域（第１検出領域）のシグナル強度が抗マウスIgGsポリクローナル抗体固定化領域（第２検出領域）のシグナル強度（第２のシグナル強度）より低い場合には、抗CRPモノクローナル抗体固定化領域（第１検出領域）のシグナル強度（第１のシグナル強度）からCRP濃度の算出が可能であり、抗CRPモノクローナル抗体固定化領域（第１検出領域）のシグナル強度（第１のシグナル強度）が抗マウスIgGsポリクローナル抗体固定化領域（第２検出領域）のシグナル強度（第２のシグナル強度）より高い場合には、抗マウスIgGsポリクローナル抗体固定化領域（第２検出領域）のシグナル強度（第２のシグナル強度）からCRP濃度の算出が可能であった。
【００５９】
これにより、抗CRPモノクローナル抗体固定化領域のシグナル強度のみで定量できる範囲が0.001800537〜0.23046875mg/dLであるのに対し、本法を用いることで、定量できる範囲が0.001800537〜3.6875mg/dLとなり、10倍高い濃度まで定量できることが明らかになった。
【００６０】
以上の結果より、イムノクロマト法による被検出物質の定量において、本発明の定量方法を用いることで、被検出物質の定量範囲が広くできることを見出した。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の方法および装置は、被検体中の特定の物質の広い濃度範囲での定量に用いることができる。
【符号の説明】
【００６２】
１．バッキングシート
２．ニトロセルロースメンブレン
３．標識部位（乾燥パッド）
４．試料添加部位（サンプルパッド）
５．吸収帯
６．第１検出領域
７．第２検出領域
【図１】
0006312555.tif 000003
【図２】
0006312555.tif 000004
【図３】
0006312555.tif 000005