(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆相カラムの試料注入容量が増大された分取逆相高速液体クロマトグラフィー（分取ＲＰ−ＨＰＬＣ）による、ペプチドを含む有機化合物の精製方法であって、サロゲート固定相／追加固定相をＣ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカ固定相と併せて使用し、前記サロゲート固定相／追加固定相が、ポリオキシエチレン類、アルキルグリコシド、胆汁酸、及びグルカミドから選択される界面活性剤であり、前記サロゲート固定相／追加固定相は、前記Ｃ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカ固定相を被覆および／または結合する、精製方法。
【請求項２】
逆相カラムの前記試料注入容量が、前記サロゲート固定相／追加固定相の被覆および／または結合により増大されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリオキシエチレン類がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−８０及びＢｒｉｊ−３５から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アルキルグリコシドが、式：
Ｒ−Ｏ−（ＣＨ２）Ｘ−ＣＨ３
で表される化合物から選択され、
式中、
Ｒ＝グルコースの場合、
ｘ＝８であるｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｘ＝７であるｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｘ＝６であるｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、またはｘ＝５であるｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドである、あるいは
Ｒ＝マルトースの場合、
ｘ＝１１であるドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｘ＝９であるドデシル−β−Ｄ−マルトシド、またはｘ＝９であるデシル−β−Ｄ−マルトシドである、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
胆汁酸が、式：
【化１】
0006343675.tif 000016
で表される化合物から選択され、
式中、
Ｘ＝Ｈ、Ｒ＝ＯＮａであるデオキシコール酸ナトリウム、
Ｘ＝Ｈ、Ｒ＝ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３Ｎａであるタウロデオキシコール酸ナトリウム、
Ｘ＝Ｈ、Ｒ＝ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｎａであるグリコデオキシコール酸ナトリウム、
Ｘ＝ＯＨ、Ｒ＝ＯＮａであるコール酸ナトリウム、
Ｘ＝ＯＨ、Ｒ＝ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３Ｎａであるタウロコール酸ナトリウム、または
Ｘ＝ＯＨ、Ｒ＝ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｎａであるグリココール酸ナトリウムである、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
グルカミドが、式：
【化２】
0006343675.tif 000017
で表される化合物から選択され、
式中、
Ｘ＝８であるＭＥＧＡ−１０、
Ｘ＝７であるＭＥＧＡ−９、または
Ｘ＝６であるＭＥＧＡ−８、
あるいは、式：
【化３】
0006343675.tif 000018
で表される化合物から選択され、
式中、
Ｘ＝ＨであるデオキシＢｉｇ  ＣＨＡＰ、または
Ｘ＝ＯＨであるＢｉｇ  ＣＨＡＰである、
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
分取逆相高速液体クロマトグラフィー（分取ＲＰ−ＨＰＬＣ）による、ペプチドを含む有機化合物の多成分試料の精製方法であって：
（ａ）疎水性固定相を有するカラム内にクロマトグラフィーシステムを構成するステップと、
（ｂ）前記カラム内のクロマトグラフィー固定相を、ポリオキシエチレン類、アルキルグリコシド、胆汁酸、及びグルカミドから選択されるサロゲート固定相／追加固定相用界面活性剤で飽和させるステップと、
（ｃ）有機溶媒と水との混合物を使用して前記カラムを洗浄して、過剰量の未結合界面活性剤を除去するステップと、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）の後の前記カラムを出発移動相で平衡化させて、前記サロゲート固定相／追加固定相用界面活性剤で被覆された固定相を含むクロマトグラフィーベッドを得るステップと、
（ｅ）前記サロゲート固定相／追加固定相用界面活性剤で被覆された固定相を含む前記クロマトグラフィーベッドの一端に多成分試料を注入するステップと、
以下（ｆ）から（ｉ）：
（ｆ）緩衝液Ａが０．１ｍＭ臭化セチルトリメチルアンモニウム及び０．１ｍＭ重炭酸ナトリウムを含む水溶液であり、緩衝液Ｂが０．１ｍＭ臭化セチルトリメチルアンモニウム及び０．１ｍＭ重炭酸ナトリウムを含む５０％アセトニトリル水溶液であり、前記緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂの直線濃度勾配を用いて前記多成分試料を溶出するステップ、
（ｇ）緩衝液Ａが０．１％リン酸の水溶液であり、緩衝液Ｂが０．１％リン酸を含む５０％アセトニトリル水溶液であり、前記緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂの直線濃度勾配を用いて前記多成分試料を溶出するステップ、
（ｈ）緩衝液Ａが１％リン酸の水溶液であり、緩衝液Ｂが１％リン酸を含む５０％アセトニトリル水溶液であり、前記緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂの直線濃度勾配を用いて前記多成分試料を溶出するステップ、及び
（ｉ）緩衝液Ａが２５ｍＭ〜１５０ｍＭのリン酸トリエチルアンモニウムの水溶液であり、緩衝液Ｂが２５ｍＭ〜１５０ｍＭリン酸トリエチルアンモニウムを含む５０％アセトニトリル水溶液であり、前記緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂの直線濃度勾配を用いて前記多成分試料を溶出するステップ
から選ばれるステップと、
（ｊ）前記多成分試料中の所望の成分を回収するステップと、を含む、方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）の前記疎水性固定相が、Ｃ−８又はＣ−１８アルキル鎖誘導体化シリカである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）の前記サロゲート固定相／追加固定相用界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−８０及びＢｒｉｊ−３５から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）における、前記未結合界面活性剤を除去するための前記カラムの洗浄が、前記カラムをアセトニトリル水溶液で洗浄することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｃ）における、前記未結合界面活性剤を除去するための前記カラムの洗浄が、０．１％トリフルオロ酢酸を含む９０％アセトニトリル水溶液で洗浄することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記平衡化が、前記出発移動相で前記カラムを平衡化させることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記平衡化が、０．１％〜１％のリン酸水溶液、０．１％ＴＦＡの水溶液、及び２５〜１５０ｍＭリン酸トリエチルアンモニウムの水溶液で前記カラムを平衡化させることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
逆相カラムの試料注入容量が増大された分取逆相高速液体クロマトグラフィー（分取ＲＰ−ＨＰＬＣ）による、ペプチドを含む有機化合物の精製方法であって、下記構造を有するＰＥＧ系洗浄剤／界面活性剤をサロゲート固定相／追加固定相として、Ｃ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカ固定相と併用し、前記サロゲート固定相／追加固定相は、前記Ｃ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカ固定相を被覆および／または結合する方法：
【化４】
0006343675.tif 000019
（式中、
「アルキル／アリール」は、直鎖又は分岐のアルキル、環式炭化水素、芳香族基、アルキル置換芳香族基、アリール置換アルキル基を含む群から独立に選択され、
「ｎ」はエチレン−オキシド残基の数であり、１〜２０である。）
【請求項１６】
前記式中の「ｎ」はエチレン−オキシド残基の数であり、６〜１２である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記式中の「ｎ」はエチレン−オキシド残基の数であり、９〜１０である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記試料注入容量の増大が、Ｃ−１８誘導体化シリカに結合した前記サロゲート固定相／追加固定相が可動状態である場合、または前記Ｃ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカ固定相に強くまたは恒久的に結合した場合に生じる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記可動状態が、低級炭素系界面活性剤を用いた観察において、Ｃ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカ固定相への結合及びＣ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカ固定相からの浸出が同時に見られる状態である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記サロゲート固定相／追加固定相が、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｂｒｉｊ−３５及びＴｗｅｅｎ−８０から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
残存シラノール基と水素結合可能であり、かつ十分な濃度の有機修飾剤を有する緩衝液で前記カラムを洗浄して、前記Ｃ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカ固定相用担体から前記サロゲート固定相／追加固定相によるコーティングを除去することを更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記有機修飾剤が、０．２５Ｍ〜０．５Ｍ酢酸アンモニウムを含む５０％〜９０％アセトニトリル水溶液である、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機化合物の精製に関する。より詳細には、本発明は、界面活性剤をサロゲート固定相（ＳＳＰ）／追加固定相（ＡＳＰ）として使用し、ペプチドを含む有機化合物を精製するための従来の分取ＲＰ−ＨＰＬＣと比較して７〜１０倍高い試料注入容量及びアウトプットを有する分取逆相高速液体クロマトグラフィー（分取ＲＰ−ＨＰＬＣ）技術を用いた、ペプチドを含む有機化合物の新規な精製方法に関する。試料注入容量の増大は、追加固定相（ＡＳＰ）として作用する、Ｃ−１８／Ｃ８鎖上に吸着された界面活性剤によるものである。
【背景技術】
【０００２】
逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）は、学術機関、法医学研究所、精製化学薬品分野及び医薬産業等において、ポリペプチド、タンパク質及びヌクレオチド等の小有機分子、天然産物及び生物学的に活性な分子の分析、特性評価、分離、精製及び／又は単離のために普遍的に使用されている。医薬産業においては、分析ＲＰ−ＨＰＬＣは、原材料、中間体及び医薬品有効成分（ＡＰＩ）の分離及び特性評価に使用されている。対照的に、分取クロマトグラフィーは、更なる使用のために十分な量の物質を精製するために使用されている。分析ＲＰ−ＨＰＬＣの主な目標が、分析物の同定及び定量であるのに対し、医薬及び精製化学薬品分野における分取ＲＰ−ＨＰＬＣの主な目的は、ペプチドＡＰＩや、その他多くの結晶化に適さない複雑なＡＰＩなどのＡＰＩ、及び精製化学製品の商業生産である。
【０００３】
溶出モードでの分取ＲＰ−ＨＰＬＣは、溶出モード操作の容易性により、粗ペプチド混合物、及び他の複雑な小有機分子を精製するために最も広く実施されている、好ましいモードである。溶出分取クロマトグラフィーにおいては、精製されるべき化合物の粗混合物を、好適な溶媒（例えば、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液、緩衝液Ａ）に溶解し、Ｃ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカ固定相担体に結合させる。移動相（０．１％ＴＦＡを含む５０％〜１００％アセトニトリル溶液、緩衝液Ｂ）の濃度勾配（通常、ＡからＢへの直線濃度勾配）を流したときに、移動相と固定相との間で平衡が確立される。固定相に対する親和性に応じて、様々な試料種は、固定相に対するそれらの相対的な親和性を反映する速度で、カラムに沿って縦走する。弱く結合した種は最初に溶出し、次いでより強い結合物が溶出する。要約すれば、有機緩衝液成分の濃度が徐々に増大することによって、混合物の成分の脱着及び分離がもたらされる。
【０００４】
溶出分取ＲＰ−ＨＰＬＣモードは、所望の産物とその最も近い溶出関連物質との間の分離能、保持比、及び分取カラムの理論段数等を含むいくつかの要因によって、１回に精製できる試料の量が制限される。Ｄｏｎａｌｄ  Ａ．Ｗｅｌｌｉｎｇｓは、その著書である非特許文献１において、これらの状況の多くを明快に説明している。合成ペプチドの典型的な注入容量は、充填カラム容積の１ｍｌ当たり１〜２ｍｇ（即ち、総カラム容積に対して０．１％〜０．２％）の範囲内である。
【０００５】
以前の分取ＲＰ−ＨＰＬＣの固定相担体は、Ｃ−１８鎖又はＣ−８鎖で誘導体化された不定形のシリカ粒子であり、これらは高い背圧という欠点を有していた。高い背圧ゆえに、１回で精製できる量が限られ、カラムが比較的小径であることから、用途は限定されていた。最近の分取ＲＰ−ＨＰＬＣにおける研究では、球状シリカの製造と、安定性及び選択性が改善された固定相担体を提供するための新しい結合化学の開発とに焦点が当てられてきた。Ｃ−１８、Ｃ−８及び他のリガンドで誘導体化された球状シリカの商業生産では、これらの困難を克服しており、分取ＨＰＬＣ装置実用性は大きく拡大した。プロセスＨＰＬＣ装置類、及び結合シリカ担体の技術的進歩によって、例えば、３６−アミノ酸ペプチドであるＦｕｚｅｏｎ（登録商標）等の複雑なペプチドの商業生産が何百キロもの量で可能となった。しかしこれらの大規模ＨＰＬＣ装置及び関連したカラムハードウェアは非常に高価であり、この方法を使うには制限があった。また、これらの改良のいずれも、所定のカラムの注入容量に対処せず、また精製された産物の量（充填カラムのアウトプット／ｍＬ）の有意な増大をもたらしていない。
【０００６】
このように前述したこれらの進歩にも関わらず、分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより１回で精製できる試料の量を増大させるには、２つの方法しか存在しない：（１）従来の手法は、より大きいカラム（より大量の固定相）を使用すること、及び（２）固定相をより効果的に使用する（しかし、開発に労力を有する）置換クロマトグラフィーの使用である。
【０００７】
置換クロマトグラフィーは、試料成分よりも固定相材料に対して高い親和性を有する移動相ディスプレーサ（displacer）溶液を使用する。置換クロマトグラフィーを溶出クロマトグラフィーと区別する重要な操作上の特徴は、ディスプレーサ分子を使用することである。溶出クロマトグラフィーでは、溶離液は通常、混合物中の分離されるべきいずれの成分よりも、固定相に対する親和性が低く、一方、置換クロマトグラフィーでは、ディスプレーサである溶離液は、より高い親和性を有する。この置換はイオン交換モードに最適であり、多数の最近の出願が見出される。特許文献１は、疎水性相互作用及び逆相クロマトグラフィーモードにおけるタンパク質精製のための低分子量ディスプレーサを開示している。
【０００８】
本発明は、ＳＳＰを使用することによって、より高いアウトプットを達成する。ＳＳＰ及び置換クロマトグラフィーは、相乗的に作用して、分取クロマトグラフィーのアウトプットを増大させる。
【０００９】
本発明者らの特許文献２は、従来の分取ＲＰ−ＨＰＬＣ技術と対比して、７〜１０倍多い試料（合成粗ペプチドを含む有機化合物の粗混合物）の注入容量を達成した独自の分取ＲＰ−ＨＰＬＣ技術について記載している。従来の分取ＲＰ−ＨＰＬＣ技術と比べて増大したアウトプットは、追加されたＣ−１８／Ｃ−８吸着（結合）第四級アンモニウム塩のサロゲート固定相としての特性によるものである。第四級アンモニウム塩は、ファン・デル・ワールス力（疎水性相互作用）と、固定相の残存シラノール基とのイオン相互作用とによって、固定相のＣ−１８／Ｃ−８鎖に結合している。
【００１０】
本発明は、ＡＳＰとしてのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００等の中性界面活性剤で被覆されたＣ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカについて記載する（図３を参照されたい）。本発明は、分取ＲＰ−ＨＰＬＣと、ＳＳＰ／ＡＳＰとしての中性界面活性剤とを使用する、ペプチドのための拡張可能な分離プロセスについて記載する。本発明は、ペプチドのための単純で、費用効率が高く、大規模実施可能な分離プロセスである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第６２３９２６２号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１４／１１８７９７号  Ａ１
【特許文献３】国際公開第２０１３／０５２５３９号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ＨＰＬＣ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の主な目的は、分取逆相高速液体クロマトグラフィー（分取ＲＰ−ＨＰＬＣ）技術を用いた、ペプチドを含む有機化合物の新規な精製方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、従来の分取ＲＰ−ＨＰＬＣ技術と比較して、７〜１０倍高い試料注入容量、及びアウトプットを有する、ペプチドを含む有機化合物の精製方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の更なる目的は、サロゲート固定相（ＳＳＰ）／追加固定相（ＡＳＰ）として界面活性剤を使用する上記方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
従って、一実施形態において、本発明は、サロゲート固定相／追加固定相をＣ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカ固定相と併せて使用する、逆相カラムの試料注入容量が増大された、分取逆相高速液体クロマトグラフィー（分取ＲＰ−ＨＰＬＣ）によるペプチドを含む有機化合物の精製方法を提供する。Ｃ−１８／Ｃ−８逆相カラムの分取注入容量は、Ｃ−１８／Ｃ−８逆相カラムにサロゲート固定相／追加固定相を被覆／結合することにより増大され、サロゲート固定相／追加固定相は、中性界面活性剤又はＰＥＧ化界面活性剤である。
サロゲート固定相／追加固定相となる界面活性剤は、アルキルグリコシド、胆汁酸、グルカミド（glucamide）及びポリ−オキシエチレンから選択されてもよく、ポリ−オキシエチレンは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−８０及びＢｒｉｊ−３５から選択され、好ましくはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【００１７】
アルキルグリコシドは、式：
Ｒ−Ｏ−（ＣＨ２）Ｘ−ＣＨ３
で表される化合物から選択され、上記式において
Ｒ＝グルコースの場合、
ｘ＝８のｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｘ＝７のｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｘ＝６のｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、またはｘ＝５のｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドであり、
Ｒ＝マルトースの場合、
ｘ＝１１のドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｘ＝９のドデシル−β−Ｄ−マルトシド、またはｘ＝９のデシル−β−Ｄ−マルトシドである。
【００１８】
胆汁酸は、式：
【化１】
0006343675.tif 000002
で表される化合物から選択され、上記式において
Ｘ＝Ｈ、Ｒ＝ＯＮａのデオキシコール酸ナトリウム、
Ｘ＝Ｈ、Ｒ＝ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３Ｎａのタウロデオキシコール酸ナトリウム、
Ｘ＝Ｈ、Ｒ＝ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｎａのグリコデオキシコール酸ナトリウム、
Ｘ＝ＯＨ、Ｒ＝ＯＮａのコール酸ナトリウム、
Ｘ＝ＯＨ、Ｒ＝ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３Ｎａのタウロコール酸ナトリウム、または
Ｘ＝ＯＨ、Ｒ＝ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｎａのグリココール酸ナトリウムである。
【００１９】
グルカミドは、式：
【化２】
0006343675.tif 000003
で表される化合物から選択され、上記式において
Ｘ＝８のＭＥＧＡ−１０、
Ｘ＝７のＭＥＧＡ−９、または
Ｘ＝６のＭＥＧＡ−８である、
あるいは、式：
【化３】
0006343675.tif 000004
で表される化合物から選択され、上記式において
Ｘ＝ＨのデオキシＢｉｇ  ＣＨＡＰ、または
Ｘ＝ＯＨのＢｉｇ  ＣＨＡＰである。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、分取逆相高速液体クロマトグラフィー（分取ＲＰ−ＨＰＬＣ）による、ペプチドを含む有機化合物の多成分試料の精製方法を提供し、該方法は：
（ａ）疎水性固定相を有するクロマトグラフィーシステムを構成するステップと、
（ｂ）クロマトグラフィー固定相を、アルキルグリコシド、胆汁酸、グルカミド及びポリ−オキシエチレンから選択されるサロゲート固定相／追加固定相用界面活性剤で飽和させるステップと、
（ｃ）有機溶媒と水との混合物を使用してカラムを洗浄して、過剰の未結合界面活性剤を除去するステップと、
（ｄ）カラムを出発移動相で平衡化させるステップと、
（ｅ）界面活性剤で被覆された固定相を含むクロマトグラフィーベッドの一端に多成分試料を適用するステップと、
以下（ｆ）から（ｉ）：
（ｆ）緩衝液Ａが０．１ｍＭ臭化セチルトリメチルアンモニウム及び０．１ｍＭ重炭酸ナトリウムを含む水溶液であり、緩衝液Ｂが０．１ｍＭ臭化セチルトリメチルアンモニウム及び０．１ｍＭ重炭酸ナトリウムを含む５０％アセトニトリル水溶液であり、前記緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂの直線濃度勾配を用いて前記多成分試料を溶出するステップ、
（ｇ）緩衝液Ａが０．１％リン酸水溶液であり、緩衝液Ｂが０．１％リン酸を含む５０％アセトニトリル水溶液であり、前記緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂの直線濃度勾配を用いて前記多成分試料を溶出するステップ、
（ｈ）緩衝液Ａが１％リン酸水溶液であり、緩衝液Ｂが１％リン酸を含む５０％アセトニトリル水溶液であり、前記緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂの直線濃度勾配を用いて前記多成分試料を溶出するステップ、及び
（ｉ）緩衝液Ａが２５ｍＭ〜１５０ｍＭリン酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ３）であり、緩衝液Ｂが２５ｍＭ〜１５０ｍＭリン酸トリエチルアンモニウムを含む５０％アセトニトリル水溶液（ｐＨ３）であり、前記緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂの直線濃度勾配を用いて前記多成分試料を溶出するステップ
から選ばれるステップと、
（ｊ）試料の所望の成分を回収するステップと、を含む。
【００２１】
ステップ（ａ）の疎水性固定相は、Ｃ−８又はＣ−１８アルキル鎖誘導体化シリカであり、ステップ（ｂ）の界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−８０及びＢｒｉｊ−３５から選択される。
【００２２】
未結合界面活性剤を除去するステップ（ｃ）のカラムの洗浄は、カラムをアセトニトリル水溶液、より好ましくは０．１％トリフルオロ酢酸を含む９０％アセトニトリル水溶液で洗浄することを含み、平衡化は、カラムを出発移動相、より好ましくは０．１％〜１％リン酸水溶液、０．１％ＴＦＡ水溶液、及び２５〜１５０ｍＭリン酸トリエチルアンモニウム水溶液で平衡化させることを含む。
【００２３】
別の実施形態において、本発明は、ＡＳＰ／ＳＳＰとなるＰＥＧ系洗浄剤／界面活性剤を、固定相となるＣ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカ又は他の担体と併せて使用する、逆相カラムの試料注入容量が増大された分取逆相高速液体クロマトグラフィー（分取ＲＰ−ＨＰＬＣ）による、ペプチドを含む有機化合物の精製方法を提供し、該ＰＥＧ系洗浄剤／界面活性剤は、以下の構造を有する：
【００２４】
【化４】
0006343675.tif 000005
式中、
「アルキル／アリール等」は、直鎖又は分岐のアルキル鎖、環式炭化水素、芳香族基、アルキル置換芳香族基、アリール置換アルキル基を含む群からそれぞれ独立に選択され、
「ｎ」はエチレン−オキシド残基の数であり、１〜２０、好ましくは６〜１２、より好ましくは９〜１０である。
【００２５】
本発明における試料注入容量の増大は、Ｃ−１８誘導体化シリカに結合したサロゲート固定相が、（低級炭素系界面活性剤を用いた観察において、固定相への結合及び固定相からの浸出が同時に見られる）可動状態である場合、またはＣ−１８／Ｃ−８逆相固定相に強くまたは恒久的に結合した場合に生じ、ここでＣ−１８／Ｃ−８逆相固定相はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｂｒｉｊ−３５及びＴｗｅｅｎ−８０から選択される。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、残存シラノール基と水素結合することが可能であり、かつ十分な濃度の有機修飾剤を有する緩衝液でカラムを洗浄することによる、Ｃ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカ担体からサロゲート固定相／追加固定相を除去するための方法も提供し、ここで有機修飾剤は、０．２５Ｍ〜０．５Ｍ酢酸アンモニウムを含む５０％〜９０％アセトニトリル水溶液である。
【００２７】
本発明は、わずかな溶媒の使用、廃棄物処理量の減少、操作の容易性及び設備規模の縮小等の様々な産業上の利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】Ｃ−１８及びＰＥＧ系サロゲート固定相に結合したロイプロリド。
【図２】Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で被覆された１２ｇのＣ−１８  Ｒｅｖｅｌｅｒｉｓカラム上に注入された純量８００ｍｇのロイプロリドの分取ＲＰ−ＨＰＬＣプロファイル（画分８〜２４は、ロイプロリド用の改変ＥＰ方法を用いた分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって、純度９７．９％超とされたロイプロリドを含んでいた）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
表１に、様々なクロマトグラフィー技術（項目１〜４）の注入容量を記載する。項目５及び６は、Ｃ−１８／Ｃ−８担体がサロゲート固定相で被覆された場合の注入容量に関する。
【００３０】
【表１】
0006343675.tif 000006
【００３１】
逆相カラムの典型的な注入容量は、充填カラムの容積に対して約０．９０％である（表１、項目＃１）。粗ペプチド混合物中の成分を分離する際、入手可能な固定相（ＰＬＲＰ−Ｓ、ポリスチレンカラム）をより良好に利用できるため、試料注入容量は、置換クロマトグラフィーでより高く、この場合、総カラム容積に対して約２％であった（表１、項目２）。特許文献３には、アンジオテンシン等のペプチドに置換クロマトグラフィー（ＤＣ）精製を用いることが記載されている。アンジオテンシンのＤＣには、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ１３０（Ｃ−１８、５マイクロメートル、１３５オングストローム（Å）、０．４６ｃｍ（ＩＤ）×２５ｃｍ（Ｌ））を使用した。総カラム容積に対する注入容量％は３．６９％であり、従来のＨＰＬＣに対する相対的な注入容量の約４倍であった。
【００３２】
ボックスカー注入（box car injection）技術を用いたエナンチオマーの分離における注入容量は、約６．１１％であった。これは、露出されたシリカ表面全体がクロマトグラフィーに利用可能である順相分取ＨＰＬＣにて観察された試料注入容量と非常に近い。
【００３３】
表１の項目５及び６から、本発明に記載したＡＳＰ／ＳＳＰ技術が、７．１％〜９．９％の範囲内の注入容量を有することが明らかになった。Ｃ−８誘導体化シリカは、立体的解放（Ｃ−８鎖対Ｃ−１８鎖）と、その結果の、より大量の吸着ＳＳＰとにより、Ｃ−１８誘導体化シリカよりも高い試料注入容量を有する。ＳＳＰ補助分取ＲＰ−ＨＰＬＣで観察されたより高い試料注入容量は、ＳＳＰ／ＡＳＰが三次元格子構造に自己集合した結果、利用可能な表面積が増大するためであると考えられる。
【００３４】
Ｃ−１８／Ｃ−８シリカの細孔径は、注入容量と、標的化合物の精製の有効性（成功）とに影響を与えることが知られている。例えば、タンパク質等の巨大分子の分離品質は、３００Å又は１０００Å等の広い細孔の担体のほうが高い。広い細孔のシリカにおいては、結合に利用可能な固定相が減少するため、１回の流通で精製できる産物の量が低下する。
【００３５】
より小さい細孔径の固定相、例えば、８０〜１２０Å（オングストローム）の担体等は、より小さい分子及び小ペプチド（５〜１５アミノ酸）に好ましい一方、広い細孔のシリカは、より大きいペプチド（２５アミノ酸より大きい）及びタンパク質に対して好ましい担体である。
【００３６】
分析物と固定相との間の非特異的相互作用も、試料注入容量、精製効率（分離能）、及びアウトプットに影響する。残存シラノール基とのイオン交換／イオン対相互作用（これは不完全な末端キャッピングの結果である）によって、分析物とＣ−１８／Ｃ−８固定相との間の真の逆相相互作用が低下する。また、Ｃ−１８／Ｃ−８鎖の間の立体障害も、炭素負荷の程度に影響する。カラム容積のカラム空隙容積（ＣＶｏ）は、保持されていない溶質の溶出体積を測定することにより、容易に測定される。これは通常、総カラム容積の約４０％〜５０％である。この空隙容積の一部は、ＡＳＰ／ＳＳＰの被覆に利用される。表１の項目５及び６は、ＳＳＰ被覆Ｃ−１８誘導体化シリカと対比して、ＳＳＰ被覆Ｃ−８誘導体化シリカにおいてより高い注入容量が認められることを示す。
【００３７】
様々な注入容量の粗ロイプロリドを用いた対照実験：
１２ｇの、Ｃ−１８アルキル鎖で誘導体化されたシリカを収容するＲｅｖｅｌｅｒｉｓフラッシュカラムを選択し、約１０カラム容積（ＣＶ）の０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を用いて流速６ｍＬ／分で平衡化させた。次に、表２に示すように、カラムに様々な有限量の粗ロイプロリド（ＨＰＬＣにより純度８６．４％に調整、ペプチドアッセイは、Ｅｄｅｌｈｏｃｈ法により行った）を注入した。４つのパラメータを試験して、クロマトグラフィー性能を評価した。
【００３８】
１．フロースルー：注入時のフロースルー中のロイプロリド量を測定した。これは、注入容量がカラム容量を超過するか否かを確認するために有用であった。
【００３９】
２．少なくとも９５．０％のロイプロリドを含む画分のプール：数個のプール画分を作製し、Ｅｄｅｌｈｏｃｈ法を用いて又は定量的ＨＰＬＣアッセイにより、ロイプロリドの量を定量した。
【００４０】
３．最も純粋なロイプロリド画分（分離能の評価）：最も高い純度のロイプロリドを含む画分を決定した。これは、ロイプロリドをその最も近い溶出不純物から分離することの評価に有用であった。
【００４１】
４．クロマトグラフィーの実行による全溶離液の物質収支：これは、Ｅｄｅｌｈｏｃｈ法を用いて測定した。これは、逆相カラム上に存在する残存シラノール基に対する非特異的イオン結合に起因する、ロイプロリド及び同様の類似体の損失を決定することに有用であった。
【００４２】
【表２】
0006343675.tif 000007
【００４３】
表２の試験によって、以下のことが明らかになった：
１．純度９５％超のロイプロリドのアウトプット（％精製収率）は、１１．９％〜１９．１％の範囲であった。つまり分析物と固定相との間の非逆相タイプの相互作用により、８０．９％〜８８．１％の粗ロイプロリドは精製できなかった。
【００４４】
２．個々のクロマトグラフィーの物質収支は８８．４％〜９６．５％の範囲内であった。これは、「分析物と固定相との間の非逆相タイプの相互作用」が、純度９５％超のロイプロリドのアウトプットに関する乏しい精製性能の大きな原因であることを示唆している。
【００４５】
３．個々の画分の純度は、９７．８％（１００ｍｇの粗ロイプロリドが注入された場合）〜９５．２％（８００ｍｇの粗ロイプロリドが注入された場合）の範囲であった。純度は、１２００ｍｇの粗ロイプロリドが注入された場合、９５．５％であった。これは「自己置換」が原因である可能性がある。
【００４６】
４．残存シラノール基による、分析物の固定相へのイオン結合を効果的に無力化することができれば、「効率」及び「有効性」の観点から、より高い精製能を発揮することが可能となる。
【００４７】
中性ＰＥＧ系界面活性剤の評価：
表３に、ＡＳＰとしてのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−８０及びＢｒｉｊ−３５の性能を示す。Ｒｅｖｅｌｅｒｉｓシリカ誘導体化Ｃ−１８カラム（固定相は１２ｇ、粒径は４０マイクロメートル、及び細孔径は６０オングストローム）を選択し、水に溶解した１２ｇのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００又はＴｗｅｅｎ−８０又はＢｒｉｊ−３５のいずれかで飽和させた。
【００４８】
ＡＳＰ／ＳＳＰとして有用な界面活性剤のリスト
【化５】
0006343675.tif 000008
Ｒ＝グルコースの場合、
ｘ＝８のｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｘ＝７のｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｘ＝６のｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、またはｘ＝５のｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、
Ｒ＝マルトースの場合、
ｘ＝１１のドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｘ＝９のドデシル−β−Ｄ−マルトシド、またはｘ＝９のデシル−β−Ｄ−マルトシド
【００４９】
【化６】
0006343675.tif 000009
Ｘ＝Ｈ、Ｒ＝ＯＮａのデオキシコール酸ナトリウム、
Ｘ＝Ｈ、Ｒ＝ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３Ｎａのタウロデオキシコール酸ナトリウム、
Ｘ＝Ｈ、Ｒ＝ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｎａのグリコデオキシコール酸ナトリウム、
Ｘ＝ＯＨ、Ｒ＝ＯＮａのコール酸ナトリウム、
Ｘ＝ＯＨ、Ｒ＝ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３Ｎａのタウロコール酸ナトリウム、または
Ｘ＝ＯＨ、Ｒ＝ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｎａのグリココール酸ナトリウム
【００５０】
【化７】
0006343675.tif 000010
Ｘ＝８のＭＥＧＡ−１０、
Ｘ＝７のＭＥＧＡ−９、または
Ｘ＝６のＭＥＧＡ−８
【００５１】
【化８】
0006343675.tif 000011
Ｘ＝ＨのデオキシＢｉｇ  ＣＨＡＰ、または
Ｘ＝ＯＨのＢｉｇ  ＣＨＡＰ
【００５２】
【化９】
0006343675.tif 000012
【００５３】
０．１％トリフルオロ酢酸を含む９０％アセトニトリル水溶液で洗浄することにより、過剰量の未結合界面活性剤を除去した。このステップを省略した場合、過剰量の界面活性剤がその臨界ミセル濃度を超える濃度で存在したため、粗ＡＰＩの溶出が早すぎるタイミングで観察された。
【００５４】
次に、粗ＡＰＩ（８００ｍｇの８１．７％ロイプロリド、ロイプロリドの補正重量は６５３．３ｍｇであった）を注入し、カラムを５ＣＶｏ容積の緩衝液Ａ（０．１ｍＭ臭化セチルトリメチルアンモニウム及び０．１ｍＭ重炭酸ナトリウムを含む水溶液）で洗浄した。「フロースルー」溶離液の分析ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によりロイプロリドが存在しないことが確認された。
【００５５】
緩衝液Ｂ（０．１ｍＭ臭化セチルトリメチルアンモニウム及び０．１ｍＭ重炭酸ナトリウムを含む５０％アセトニトリル水溶液）の直線濃度勾配を開始して、カラムから産物を溶出した。
【００５６】
従来の分取ＲＰ−ＨＰＬＣで観察されたガウスピークとは対照的に、ＳＳＰ補助分取ＲＰ−ＨＰＬＣでは「Ｍ字形のピーク」が見られた。純度９５％超のロイプロリドを含む画分のプールを、ＨＰＬＣアッセイによって定量した。これはカラムの性能／処理能力の評価基準としての役割を果たした。プールを構成する個々の画分の％純度を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定した。個々の画分の平均最高純度（５回の精製）は、９８．８４％であった。定量的ＨＰＬＣアッセイにより測定した精製プールの平均重量は、４０９ｍｇであり（理論量は６５３．３ｍｇである）、平均％ロイプロリド回収率は、６２．６％であった。
【００５７】
カラムを０．２５Ｍ酢酸アンモニウムを含む５０％〜８０％アセトニトリル水溶液で洗浄することにより、逆相カラムから付着ＡＳＰ／ＳＳＰを除去した。
【００５８】
【表３】
0006343675.tif 000013
【００５９】
Ｔｗｅｅｎ−８０を用いて、同様の実験を（平均２回）行ったところ、以下のデータが得られた：（１）画分の最高平均個別純度は、９６．２５％であった、（２）純度９５％超の精製プールの平均重量は、３４３．６ｍｇであり（理論量は６５３．３ｍｇであり）、平均％ロイプロリド回収収率は、４２．９５％であった。
【００６０】
Ｂｒｉｊ−３５を用いて、同様の実験を（平均２回）行ったところ、以下のデータが得られた：（１）画分の最高平均個別純度は、９８．１５％であった、（２）純度９５％超の精製プールの平均重量は、３９４．４ｍｇであり（理論量は６５３．３ｍｇであり）、平均％ロイプロリド回収収率は、６０．３５％であった。
【００６１】
上記の結果は、ロイプロリドの精製に関して評価した３つのＳＳＰのうち、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が最適であったことを示唆する。
【００６２】
次の一連の実験では、分取ＨＰＬＣ収率に対するＣ−１８誘導体化シリカ粒子の細孔径及び直径の変化の影響を試験し、表４にまとめた。２つのＲｅｖｅｌｅｒｉｓカラム（カラムパラメータ：１２ｇのＣ−１８、４０μｍ、６０オングストローム、及びカラムパラメータ：１２ｇのＣ−１８、２０μｍ、１５０オングストローム）と、１つのＰｅｅｒｌｅｓｓ  Ｂａｓｉｃ  Ｃ−１８カラム（自家充填、カラムパラメータ：約１２ｇのＣ−１８、１０μｍ、１００オングストローム）を、Ｃ−１８誘導体化シリカカラムとして使用した。水に溶解した１２ｇのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００でカラムを飽和させた。０．１％トリフルオロ酢酸を含む９０％アセトニトリル水溶液で洗浄することにより、過剰量の未結合界面活性剤を除去した。
【００６３】
カラムを５ＣＶｏ容積の緩衝液Ａ（０．１％リン酸水溶液）で平衡化させた。次に、粗ＡＰＩ（８００ｍｇの８１．７％ロイプロリド、ロイプロリドの補正重量は６５３．３ｍｇ）を注入し、カラムを５ＣＶｏ容積の緩衝液Ａで洗浄した。「フロースルー」溶離液の分析ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、ロイプロリドが存在しないことが確認された。
【００６４】
緩衝液Ｂ（０．１％リン酸水溶液を含む５０％アセトニトリル水溶液）の直線濃度勾配を開始して、カラムから産物を溶出した。
【００６５】
純度９５％超のロイプロリドを含む画分のプールを、ＨＰＬＣアッセイによって定量した。これはカラムの性能／処理能力の評価基準としての役割を果たした。プールを構成する個々の画分の％純度を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定した。
【００６６】
（４０μｍ担体を用いて行った２回の精製における）個々の画分の平均最高純度は、９９．３％であった。定量的ＨＰＬＣアッセイにより測定した精製プールの平均重量は、４６７ｍｇであり（理論量は６５３．３ｍｇであり）、平均％ロイプロリド回収率は、７１．５％であった。
【００６７】
【表４】
0006343675.tif 000014
【００６８】
（Ｒｅｖｅｌｅｒｉｓ  Ｃ−１８  ２０μｍ担体を用いて行った１回の精製における）個々の画分の平均最高純度は、９９．３％であった。定量的ＨＰＬＣアッセイにより測定した精製プールの平均重量は、５２８ｍｇであり（理論量は６５３．３ｍｇである）、％ロイプロリド回収率は、８０．８％であった。
【００６９】
結果は、Ｒｅｖｅｌｅｒｉｓ  Ｃ−１８  ２０μｍ担体と、従来品であるＰｅｅｒｌｅｓ  Ｂａｓｉｃ  Ｃ−１８  １０μｍ担体カラムと同等であった。
【００７０】
表５からリン酸トリエチルアンモニウムの濃度が増大すると、精製収率が低下することがわかる。
【００７１】
【表５】
0006343675.tif 000015
【００７２】
Ｒｅｖｅｌｅｒｉｓ（カラムパラメータ：１２ｇのＣ−１８、４０μｍ、６０オングストローム）を、水に溶解した１２ｇのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で飽和させた。０．１％トリフルオロ酢酸を含む９０％アセトニトリル水溶液で洗浄することにより、過剰量の未結合界面活性剤を除去した。
【００７３】
カラムを５ＣＶｏ容積の緩衝液Ａ（２５ｍＭリン酸トリエチルアンモニウム水溶液、ｐＨ３）で平衡化させた。次に、粗ＡＰＩ（８００ｍｇの８１．７％ロイプロリド、ロイプロリドの補正重量は６５３．３ｍｇであった）を注入し、カラムを５ＣＶｏ容積の緩衝液Ａで洗浄した。「フロースルー」溶離液の分析ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によりロイプロリドが存在しないことが確認された。
【００７４】
緩衝液Ｂ（２５ｍＭリン酸トリエチルアンモニウム水溶液を含む５０％アセトニトリル水溶液（ｐＨ３））の直線濃度勾配を開始して、カラムから産物を溶出した。
【００７５】
純度９５％超のロイプロリドを含む画分のプールを、ＨＰＬＣアッセイによって定量した。これはカラムの性能／処理能力の評価基準としての役割を果たした。プールを構成する個々の画分の％純度を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定した。
【００７６】
個々の画分の平均最高純度は、９８．６％であった。定量的ＨＰＬＣアッセイにより測定した精製プールの平均重量は、３１４．５ｍｇであり（理論量は６５３．３ｍｇであり）、％ロイプロリド回収率は、４８．１％であった。
【００７７】
続いてより高濃度のリン酸トリエチルアンモニウム、即ちｐＨ３の１５０ｍＭリン酸トリエチルアンモニウム水溶液を用いた実験を行った。カラムを５ＣＶｏ容積の緩衝液Ａ（１５０ｍＭリン酸トリエチルアンモニウム水溶液、ｐＨ３）で平衡化させた。次に、粗ＡＰＩ（８００ｍｇの８１．７％ロイプロリド、ロイプロリドの補正重量は６５３．３ｍｇであった）を注入し、カラムを５ＣＶｏ容積の緩衝液Ａで洗浄した。「フロースルー」溶離液の分析ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によりロイプロリドが存在しないことが確認された。
【００７８】
緩衝液Ｂ（１５０ｍＭリン酸トリエチルアンモニウム水溶液を含む５０％アセトニトリル水溶液（ｐＨ３））の直線濃度勾配を開始して、カラムから産物を溶出した。
【００７９】
純度９５％超のロイプロリドを含む画分のプールを、ＨＰＬＣアッセイによって定量した。これはカラムの性能／処理能力の評価基準としての役割を果たした。プールを構成する個々の画分の％純度を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定した。
【００８０】
個々の画分の平均最高純度は、９８．３％であった。定量的ＨＰＬＣアッセイにより測定した精製プールの平均重量は、２８０ｍｇであり（理論量は６５３．３ｍｇであり）、％ロイプロリド回収率は、４２．９％であった。
【００８１】
リン酸緩衝液（７１％〜８０％）に比べ、リン酸トリエチルアンモニウム緩衝液では収率（４３％〜４８％）が低いことから、シラノール基に結合したＳＳＰが部分的に失われたことが明らかになった。
【００８２】
上述したように、従来のＲＰ−ＨＰＬＣハードウェアシステムを分離に使用することができ、用語「クロマトグラフィーシステムを構成する」は、カラム又はカラム、ポンプ及び検出器のシステムを、当技術分野にて周知のように構成することを指す。
【００８３】
用語「クロマトグラフィーの固定相を飽和させる」は、溶液中の界面活性剤を特定の濃度で固定相中に流通させることによって、サロゲート固定相を準備することを指す。
【００８４】
本発明の好ましい方法を、以下に述べる。
【００８５】
界面活性剤をサロゲート固定相として使用する、ペプチドなどの有機分子を精製するための例示的な方法：
以下は、例示を目的として記載される単なる例であり、ＳＳＰ補助分取ＲＰ−ＨＰＬＣ技術の範囲及び実用性を限定することを意図するものではないことをここに強調する。これらの試験で使用したＣ−１８カラムは、１２ｇのＣ−１８誘導体化シリカ（粒径が１０μｍ、２０μｍ又は４０μｍの粒子、細孔径は６０Å、１００Å又は１５０Å）を収容していた。Ｃ−１８誘導体化シリカ逆相カラムを、界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−８０若しくはＢｒｉｊ−３５等、又は水素結合受容体部位を含む任意の中性界面活性剤）の水溶液で平衡化させた。界面活性剤の重量は、固定相の重量の１％〜１００％の範囲内であった。追加（サロゲート）固定相への付着を最大とするために、５００ｍＬの水に溶解した１２ｇの界面活性剤を使用した。次いで、カラムを、０．１％トリフルオロ酢酸を含む９０％アセトニトリル水溶液で洗浄して、未結合界面活性剤を除去した。
【００８６】
次に、カラムを出発移動相（１０カラム容積（ＣＶｓ）、例えば０．１％リン酸水溶液）で平衡化させ、粗産物を注入した。緩衝液Ｂ（例えば、０．１％リン酸を含む５０％アセトニトリル水溶液）の直線濃度勾配を流した。対象産物（ＡＰＩ）が溶出する直前に、そのときの勾配の濃度を保持し、これをＡＰＩの全量がカラムから溶出するまで維持してもよい（図２を参照されたい）。あるいは産物を濃縮した形態で溶出することが望まれる場合には、勾配をそのままかけ続けてもよい。純度９５％超のＡＰＩ産物を含む画分を一つにまとめる。有機揮発物を減圧下で除去する。水性残留物をＣ−１８カラムに通して（酢酸水溶液及びアセトニトリルを使用して）、カウンターリン酸イオンを所望のカウンターイオン（例えば酢酸イオン）と交換する。
【００８７】
本発明は、薬剤及び精製化学薬品産業におけるクロマトグラフィー用途に使用される任意のサイズのカラム又はＨＰＬＣ設備に適用可能である。
【００８８】
本開示のいくつかの態様及び実施形態を、以下の実施例に記載する。これらは例示を目的とし、本開示の範囲をいかなる形においても限定することを意図しない。
実施例：
【実施例１】
【００８９】
追加固定相としてのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と、水性リン酸緩衝液とを使用した酢酸ロイプロリドの分取ＲＰ−ＨＰＬＣ：
Ｃ−１８逆相カラム（Ｒｅｖｅｌｅｒｉｓ  Ｃ−１８、１２ｇ、４０μｍ、細孔径６０Å）をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（１２ｇを５００ｍＬの水に溶解）で飽和させた。０．１％トリフルオロ酢酸を含む９０％アセトニトリル水溶液で洗浄することにより、過剰量の未結合界面活性剤を除去した。次に、カラムを５カラム容積（ＣＶ）の０．１％リン酸水溶液（緩衝液Ａ）で平衡化させた。緩衝液Ａに溶解した粗ロイプロリド（８００ｍｇ、Ｅｄｅｌｈｏｃｈ法による正味重量）をカラム上に注入した。このカラムを５ＣＶの緩衝液Ａで洗浄した。「フロースルー」溶離液の分析ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によりロイプロリドが存在しないことが確認された。この先行するステップを省略した場合、過剰量の界面活性剤がその臨界ミセル濃度を超える濃度で存在したため、粗ＡＰＩの溶出が早すぎるタイミングで観察された。次に、勾配溶出プロセスを開始した。緩衝液Ｂは、０．１％リン酸を含む５０％アセトニトリル水溶液であった。６０分間に亘る０％〜１００％緩衝液Ｂの直線濃度勾配を溶出に用いた。ＡＰＩの全量がカラムから溶出するまで勾配を保持した。純度９５％超のＡＰＩ産物を含む画分を一つにまとめた。分取ＨＰＬＣプロファイルを図２に示す。この実験を２回行った。
【００９０】
純度９５％超のロイプロリドを含む画分のプールを、ＨＰＬＣアッセイによって定量した。（２回の精製における）個々の画分の平均最高純度は、９９．３％であった。定量的ＨＰＬＣアッセイにより測定した精製プールの平均重量は、４６６．９ｍｇであり（理論量は６５３．３ｍｇであり）、平均％ロイプロリド回収率は、７１．５％であった。
【実施例２】
【００９１】
追加固定相としてのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と、０．１ｍＭ臭化セチルトリメチルアンモニウム緩衝液とを使用した酢酸ロイプロリドの分取ＲＰ−ＨＰＬＣ：
Ｒｅｖｅｌｅｒｉｓシリカ誘導体化Ｃ−１８カラム（固定相１２ｇ、粒径４０マイクロメートルの粒子、及び細孔径６０オングストローム）を選択し、水に溶解した１２ｇのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で飽和させた。
【００９２】
０．１％トリフルオロ酢酸を含む９０％アセトニトリル水溶液で洗浄することにより、過剰量の未結合界面活性剤を除去した。このステップを省略した場合、過剰量の界面活性剤がその臨界ミセル濃度を超える濃度で存在したため、粗ＡＰＩの溶出が早すぎるタイミングで観察された。
【００９３】
次に、粗ＡＰＩ（８００ｍｇの８１．７％ロイプロリド、ロイプロリドの補正重量は６５３．３ｍｇであった）を注入し、カラムを５ＣＶの緩衝液Ａ（０．１ｍＭ臭化セチルトリメチルアンモニウム及び０．１ｍＭ重炭酸ナトリウムを含む水溶液）で洗浄した。「フロースルー」溶離液の分析ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によりロイプロリドが存在しないことが確認された。
【００９４】
緩衝液Ｂ（０．１ｍＭ臭化セチルトリメチルアンモニウム及び０．１ｍＭ重炭酸ナトリウムを含む５０％アセトニトリル水溶液）の直線濃度勾配を開始して、カラムから産物を溶出した。
【００９５】
純度９５％超のロイプロリドを含む画分のプールを、ＨＰＬＣアッセイによって定量した。これはカラムの性能／処理能力の評価基準としての役割を果たした。プールを構成する個々の画分の％純度を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定した。（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いた５回の精製における）個々の画分の平均最高純度は、９８．８％であった。定量的ＨＰＬＣアッセイにより測定した精製プールの平均重量は、４０８．９ｍｇであり（理論量は６５３．３ｍｇであり）、平均％ロイプロリド回収率は、６２．６％であった。
【実施例３】
【００９６】
追加固定相としてのＴｗｅｅｎ−８０と、０．１ｍＭ臭化セチルトリメチルアンモニウム緩衝液とを使用した酢酸ロイプロリドの分取ＲＰ−ＨＰＬＣ：
Ｒｅｖｅｌｅｒｉｓシリカ誘導体化Ｃ−１８カラム（固定相１２ｇ、粒径４０マイクロメートルの粒子、及び細孔径６０オングストローム）を選択し、水に溶解した１２ｇのＴｗｅｅｎ−８０で飽和させた。
【００９７】
０．１％トリフルオロ酢酸を含む９０％アセトニトリル水溶液で洗浄することにより、過剰量の未結合界面活性剤を除去した。このステップを省略した場合、過剰量の界面活性剤がその臨界ミセル濃度を超える濃度で存在したため、粗ＡＰＩの溶出が早すぎるタイミングで観察された。
【００９８】
次に、粗ＡＰＩ（８００ｍｇの８１．７％ロイプロリド、ロイプロリドの補正重量は６５３．３ｍｇであった）を注入し、カラムを５ＣＶの緩衝液Ａ（０．１ｍＭ臭化セチルトリメチルアンモニウム及び０．１ｍＭ重炭酸ナトリウムを含む水溶液）で洗浄した。「フロースルー」溶離液の分析ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、ロイプロリドが存在しないことが確認された。
【００９９】
緩衝液Ｂ（０．１ｍＭ臭化セチルトリメチルアンモニウム及び０．１ｍＭ重炭酸ナトリウムを含む５０％アセトニトリル水溶液）の直線濃度勾配を開始して、カラムから産物を溶出した。
【０１００】
純度９５％超のロイプロリドを含む画分のプールを、ＨＰＬＣアッセイによって定量した。これはカラムの性能／処理能力の評価基準としての役割を果たした。プールを構成する個々の画分の％純度を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定した。
【０１０１】
実験を２回行い、以下のデータを得た：（１）画分の最高平均個別純度は、９６．３％であった、（２）純度９５％超の精製プールの平均重量は、３４３．６ｍｇであり（理論量は６５３．３ｍｇであり）、平均％ロイプロリド回収収率は、５２．６％であった。
【実施例４】
【０１０２】
追加固定相としてのＢｒｉｊ−３５と、０．１ｍＭ臭化セチルトリメチルアンモニウム緩衝液とを使用した酢酸ロイプロリドの分取ＲＰ−ＨＰＬＣ：
Ｒｅｖｅｌｅｒｉｓシリカ誘導体化Ｃ−１８カラム（固定相１２ｇ、粒径４０マイクロメートルの粒子、及び細孔径６０オングストローム）を選択し、水に溶解した１２ｇのＢｒｉｊ−３５で飽和させた。
【０１０３】
０．１％トリフルオロ酢酸を含む９０％アセトニトリル水溶液で洗浄することにより、過剰量の未結合界面活性剤を除去した。このステップを省略した場合、過剰量の界面活性剤が、その臨界ミセル濃度を超える濃度で存在したため、粗ＡＰＩの溶出が早すぎるタイミングで観察された。
【０１０４】
次に、粗ＡＰＩ（８００ｍｇの８１．７％ロイプロリド、ロイプロリドの補正重量は６５３．３ｍｇであった）を注入し、カラムを５ＣＶの緩衝液Ａ（０．１ｍＭ臭化セチルトリメチルアンモニウム及び０．１ｍＭ重炭酸ナトリウムを含む水溶液）で洗浄した。「フロースルー」溶離液の分析ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によりロイプロリドが存在しないことが確認された。
【０１０５】
緩衝液Ｂ（０．１ｍＭ臭化セチルトリメチルアンモニウム及び０．１ｍＭ重炭酸ナトリウムを含む５０％アセトニトリル水溶液）の直線濃度勾配を開始して、カラムから産物を溶出した。
【０１０６】
純度９５％超のロイプロリドを含む画分のプールを、ＨＰＬＣアッセイによって定量した。これはカラムの性能／処理能力の評価基準としての役割を果たした。プールを構成する個々の画分の％純度を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定した。
【０１０７】
実験を２回行い、以下のデータを得た：（１）画分の最高平均個別純度は、９８．２％であった、（２）純度９５％超の精製プールの平均重量は、３９４．４ｍｇであり（理論量は６５３．３ｍｇであり）、平均％ロイプロリド回収収率は、６０．４％であった。
【図１】
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【図２】
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