(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被験体をイメージングするための方法における使用のための組成物であって、
該組成物は、複数のマルチモーダルシリカ系ナノ粒子を含み、該ナノ粒子の各々が、以下：
シリカ系コア；
該コア内の蛍光化合物；および
該コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル；
を含み、
ここで、該ナノ粒子が有機ポリマーでコーティングされており、数が３０個以下の複数のＤ−Ｌｙｓ−ＲｅＣＣＭＳＨ含有ペプチドリガンドが、腫瘍マーカーへの結合のために該ポリマーでコーティングされたナノ粒子に結合しており、該ナノ粒子の各々が、１ｎｍ〜１５ｎｍの範囲内の直径を有し、
該組成物は、０．０１ナノモル／ｋｇ体重〜１ナノモル／ｋｇ体重の範囲の該ナノ粒子の用量で該ヒト被験体に投与され、該ナノ粒子が、投与後２４時間のうちに９０％〜１００％の初期用量（ＩＤ）の範囲内で、該ヒト被験体による腎クリアランスにより排出されることを特徴とし、
ここで、該方法は、（ａ）励起光を該ヒト被験体に向けて、該蛍光化合物を励起する工程；および（ｂ）該ナノ粒子をイメージングする工程を含む、
組成物。
【請求項２】
前記ナノ粒子が１ｎｍ〜８ｎｍの直径を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記有機ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリラクテート、ポリ乳酸、糖、脂質、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ナノ粒子の各々に結合したＤ−Ｌｙｓ−ＲｅＣＣＭＳＨ含有ペプチドリガンドの数が１０個以下である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
造影剤またはキレートが前記ナノ粒子に結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記造影剤が放射性核種である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記放射性核種が、８９Ｚｒ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、１２４Ｉおよび１７７Ｌｕからなる群より選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記キレートが、放射性核種に結合するように適合されている、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記キレートが、ＤＦＯ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡおよびＤＴＰＡからなる群より選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ナノ粒子が、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＣＴ、ＭＲＩ、光学イメージング、生物発光イメージングまたはそれらの組み合わせによって検出可能である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記光学イメージングが蛍光イメージングである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
治療剤が前記ナノ粒子に結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記治療剤が、抗生物質、抗菌剤、抗増殖剤、抗腫瘍薬、抗酸化剤、内皮細胞成長因子、トロンビン阻害剤、免疫抑制剤、抗血小板凝集剤、コラーゲン合成阻害剤、治療抗体、一酸化窒素供与体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、創傷治癒剤、治療遺伝子導入構築物、細胞外マトリックス成分、血管拡張剤、血栓溶解剤、代謝拮抗物質、成長因子アゴニスト、抗有糸分裂薬、スタチン、ステロイド、ステロイド性抗炎症剤および非ステロイド性抗炎症剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、フリーラジカルスカベンジャー、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡならびに抗がん化学療法剤からなる群より選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記治療剤が放射標識されている、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記治療剤が放射性フッ素１８Ｆに結合されている、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記治療剤が放射性核種である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
前記放射性核種が、９０Ｙ、１３１Ｉおよび１７７Ｌｕからなる群より選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ペプチドが、Ｎ−Ａｃ−Ｃｙｓ−（Ａｈｘ）２−Ｄ−Ｌｙｓ−ＲｅＣＣＭＳＨである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ヒト被験体の少なくとも１つまたは複数の画像が細胞異常を検出またはモニターするために使用され、該細胞異常内に存在するか、またはそれに隣接する正常組織構造、神経組織、および／または血管構造が、該正常組織構造を検出またはモニターするためにマークまたは区別される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記細胞異常が、炎症、がん、心血管疾患、呼吸器疾患、皮膚疾患、眼疾患、感染症、免疫疾患、中枢神経系疾患、遺伝性疾患、代謝性疾患、環境疾患、骨関連疾患、神経変性疾患、および手術関連合併症からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記細胞異常が、センチネルリンパ節における転移性黒色腫である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記細胞異常が、末梢神経の異常または結節性疾患である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ナノ粒子をイメージングする工程が、ポータブル検出デバイスにより該ナノ粒子からの蛍光を検出する工程を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ナノ粒子をイメージングする工程が、リンパ節群の少なくとも１つのデュアルチャネル画像を使用者に表示する工程をさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記デュアルチャネル画像は、ＲＧＢカラー画像および近赤外（ＮＩＲ）画像を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ナノ粒子の各々が、γプローブを使用して検出される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
投与４時間後の前記ヒト被験体の肝臓における前記ナノ粒子が、１グラム当たりの注射用量（ＩＤ／ｇ）の０．０１０％未満となるように、前記ナノ粒子が排出されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
励起光を向ける工程および前記γプローブの使用が同時に行われる、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
前記有機ポリマーがポリエチレングリコールを含み、該ポリエチレングリコールが、該有機ポリマーにおける活性化エステル基に結合したアミノシランを介して、前記ナノ粒子のシリカ表面に結合して、アミド結合が生じる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ナノ粒子の少なくとも１つが、数が３０個以下の複数のＤ−Ｌｙｓ−ＲｅＣＣＭＳＨ含有ペプチドリガンドの結合のために、マレイミド末端ポリエチレングリコール鎖でコーティングされている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ナノ粒子の少なくとも１つが、前記数が３０個以下の複数のＤ−Ｌｙｓ−ＲｅＣＣＭＳＨ含有ペプチドリガンドの結合のために、マレイミド末端ポリエチレングリコール鎖でコーティングされており、少なくとも１つのＤ−Ｌｙｓ−ＲｅＣＣＭＳＨ含有ペプチドリガンドが、システインリンカーのチオール基を介して、マレイミド末端ポリエチレングリコール鎖に結合している、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記数が３０個以下の複数のＤ−Ｌｙｓ−ＲｅＣＣＭＳＨ含有ペプチドリガンドが、放射性核種で標識されている、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記数が３０個以下の複数のＤ−Ｌｙｓ−ＲｅＣＣＭＳＨ含有ペプチドリガンドが、チロシン（Ｙ）リンカーを介して前記放射性核種で標識されている、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記蛍光化合物が、Ｃｙ５またはＣｙ５．５である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３５】
ヒト被験体内の領域のデュアルチャネル光学イメージングのための方法における使用のための組成物であって、
該組成物は、複数のマルチモーダルシリカナノ粒子を含み、該ナノ粒子の各々は、
シリカ系コア；
該コア内の蛍光化合物；および
該コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル；
を含み、ここで、該ナノ粒子が有機ポリマーでコーティングされており、数が３０個以下の複数のＤ−Ｌｙｓ−ＲｅＣＣＭＳＨ含有ペプチドリガンドが、腫瘍マーカーへの結合のために該ポリマーでコーティングされたナノ粒子に結合しており、該ナノ粒子の各々が、１ｎｍ〜１５ｎｍの範囲内の直径を有し、
ここで、該方法は、
（ａ）該組成物が投与された該ヒト被験体に光を向ける工程；
（ｂ）第１のチャネルおよび第２のチャネルを介して光を向ける工程であって、デュアルチャネル光学イメージングシステムの該第１のチャネルおよび該第２のチャネルが、異なる波長である、工程；ならびに
（ｃ）検出された光に対応するシグナルを処理して、該ヒト被験体の領域の１つまたは複数の画像を提供する工程；
を含む、組成物。
【請求項３６】
前記第１のチャネルは、赤、緑、および青（ＲＧＢ）光を検出する、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記第２のチャネルがＮＩＲ蛍光を検出する、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記画像がリアルタイムで提供される、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３９】
投与後の前記ナノ粒子の血中滞留半減期が、２時間〜２５時間、または３時間〜１５時間、または４時間〜１０時間である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４０】
投与後の前記ナノ粒子の腫瘍滞留半減期が、５時間〜５日間、または１０時間〜４日間、または１５時間〜３．５日間である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４１】
蛍光シリカ系ナノ粒子であって、該ナノ粒子は、
シリカ系コアであって、該シリカ系コア内に位置する蛍光化合物を含む、シリカ系コア；
該コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル；
該ナノ粒子に結合された有機ポリマー；
該ナノ粒子に結合された１〜３０個のＤ−Ｌｙｓ−ＲｅＣＣＭＳＨ含有ペプチドリガンド；および
該ナノ粒子に結合した造影剤またはキレート；
を含み、
ここで、該ナノ粒子は１ｎｍ〜２５ｎｍの直径を有する、ナノ粒子。
【請求項４２】
１ｎｍ〜８ｎｍの直径を有する、請求項４１に記載のナノ粒子。
【請求項４３】
前記有機ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリラクテート、ポリ乳酸、糖、脂質、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４１に記載のナノ粒子。
【請求項４４】
前記Ｄ−Ｌｙｓ−ＲｅＣＣＭＳＨ含有ペプチドリガンドが少なくとも１つの細胞成分と結合することができる、請求項４１に記載のナノ粒子。
【請求項４５】
前記細胞成分が腫瘍マーカーである、請求項４４に記載のナノ粒子。
【請求項４６】
前記ナノ粒子に結合しているＤ−Ｌｙｓ−ＲｅＣＣＭＳＨ含有ペプチドリガンドの数が１〜１０の範囲である、請求項４１に記載のナノ粒子。
【請求項４７】
前記造影剤が放射性核種である、請求項４１に記載のナノ粒子。
【請求項４８】
前記放射性核種が、８９Ｚｒ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、１２４Ｉおよび１７７Ｌｕからなる群より選択される、請求項４７に記載のナノ粒子。
【請求項４９】
前記キレートが、放射性核種に結合するように適合されている、請求項４１に記載のナノ粒子。
【請求項５０】
前記キレートが、ＤＦＯ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡおよびＤＴＰＡからなる群より選択される、請求項４１に記載のナノ粒子。
【請求項５１】
前記ナノ粒子が、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＣＴ、ＭＲＩ、光学イメージングまたはそれらの組み合わせによって検出可能である、請求項４１に記載のナノ粒子。
【請求項５２】
前記光学イメージングが蛍光イメージングである、請求項５１に記載のナノ粒子。
【請求項５３】
治療剤が前記ナノ粒子に結合している、請求項４１に記載のナノ粒子。
【請求項５４】
前記治療剤が、抗生物質、抗増殖剤、抗酸化剤、内皮細胞成長因子、トロンビン阻害剤、免疫抑制剤、抗血小板凝集剤、コラーゲン合成阻害剤、治療抗体、一酸化窒素供与体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、創傷治癒剤、治療遺伝子導入構築物、細胞外マトリックス成分、血管拡張剤、血栓溶解剤、代謝拮抗物質、成長因子アゴニスト、スタチン、ステロイド、ステロイド性抗炎症剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、フリーラジカルスカベンジャー、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡならびに抗がん化学療法剤からなる群より選択される、請求項５３に記載のナノ粒子。
【請求項５５】
前記治療剤が放射標識されている、請求項５３に記載のナノ粒子。
【請求項５６】
前記治療剤が放射性フッ素１８Ｆに結合されている、請求項５５に記載のナノ粒子。
【請求項５７】
前記治療剤が放射性核種である、請求項５３に記載のナノ粒子。
【請求項５８】
前記放射性核種が、９０Ｙ、１３１Ｉおよび１７７Ｌｕからなる群より選択される、請求項５７に記載のナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９４，４１４号および２０１４年３月１７日に出願された米国特許出願第１４／２１５，８７９号の優先権を主張する。上記の出願の各々の開示は、その全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発に関する声明
ＮＩＨ−ＮＲＲＡ、臨床およびトランスレーショナルサイエンス助成金；ＮＩＨ−ＮＣＩ  Ｒ０１ＣＡ１６１２８０−０１Ａ１、ＮＳＦ  ＳＴＣプログラム同意番号ＥＣＳ−９８７６７７１；ＩＣＭＩＣ  Ｐ５０  ＣＡ８６４３８；ＮＩＨ  ＳＡＩＲＰ助成金番号Ｒ２４  ＣＡ８３０８４；およびＮＩＨセンター助成金番号Ｐ３０  ＣＡ０８７４８の下、政府の支援により本発明がなされた。
【０００３】
発明の分野
本発明は、蛍光シリカ系ナノ粒子、および前記ナノ粒子を使用してがんなどの疾患を検出、診断または処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
治療の成功および長期生存率を達成するためには、早期の腫瘍検出および処置選択が最重要である。多くのがんは初期段階では局在しており、外科的に処置することができる。しかしながら、外科手術の場面では、イメージング技術が十分ではないために、特に構造が複雑な領域における転移性疾患の拡散および腫瘍境界の評価が制限されている。これは、侵襲的生検の数が不均衡であることの原因になっている。コントラスト生成（すなわち、光学ＰＥＴ）標識が組み込まれており、改善された特異性を提供する分子ターゲティングプローブが、正常細胞と腫瘍細胞との間の分子差（例えば、受容体発現レベルのがん特異的変化）の早期イメージング検出に必要である。高感度および高解像度のイメージングツールと組み合わせると、特異的分子ターゲティングプローブは、がんの検出感度、病期分類およびモニタリングおよび／または処置を大きく改善するであろう。現在の蛍光イメージングプローブは、典型的には、従来の単一フルオロフォア（例えば、有機色素、蛍光タンパク質）、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）および半導体量子ドット（Ｑ−ドット）からなる。通常、単一フルオロフォアは安定ではなく、イメージングの輝度が限られている。色素と同様に、蛍光タンパク質は励起状態相互作用を示す傾向があり、これが、確率論的なブリンキング、クエンチングおよびケミカルブリーチングにつながり得る。Ｑ−ドットは、一般に、Ｐｂ２＋またはＣｄ２＋などの重金属イオンから作られるので毒性である。Ｂｕｒｎｓら、“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ  ｓｉｌｉｃａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ｔｏｗａｒｄｓ“Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ”ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，２００６，３５，１０２８−１０４２。
【０００５】
導電性シェルおよびシリカコアを有する蛍光ナノ粒子が公知であり、治療剤送達の調節に有用である。米国特許第６，３４４，２７２号および米国特許第６，４２８，８１１号。既存の蛍光ナノ粒子の欠点は、輝度が限られていること、および分散系における蛍光プローブとしての検出能が低いことである。
【０００６】
本多機能蛍光シリカ系ナノ粒子は、他の典型的なより大きな直径の粒子プローブよりも多くの利点を提供する。ナノ粒子は非毒性であり、優れた光物理的特性（蛍光効率性および光安定性を含む）を示し、増強した結合親和性、効力および区別可能な薬物動態特性（有意な細網内皮系（ＲＥＳ）取り込みを伴わずにバルク腎クリアランスが優位である）を示す。それらの比較的小さなサイズおよび表面のＰＥＧコーティングは、優れた腎クリアランスを容易にする。
【０００７】
本発明の蛍光ナノ粒子は、蛍光コアおよびシリカシェルを含有する。ナノ粒子のコアシェルアーキテクチャ、大きな表面積および多様な界面化学は、多機能性を標的細胞に同時に送達することを可能にする。例えば、ターゲティング部分、医療イメージング用の造影剤、治療剤または他の薬剤でナノ粒子を官能化することができる。ナノ粒子表面上のターゲティング部分は、ナノ粒子コンジュゲート治療剤と組み合わせると、そのナノ粒子をがんのターゲティングおよび潜在的処置に理想的なビヒクルする腫瘍リガンドであり得る。Ｗｅｂｓｔｅｒら、Ｏｐｔｉｃａｌ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｅｎｓｏｒｓ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ａｎａｌｙｓｔ，２００５；１３０：１６３−７０。ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＣＴ、ＭＲＩおよび光学イメージング用の造影剤でシリカ系ナノ粒子を標識することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，３４４，２７２号明細書
【特許文献２】米国特許第６，４２８，８１１号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｕｒｎｓら、“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ  ｓｉｌｉｃａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ｔｏｗａｒｄｓ“Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ”ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，２００６，３５，１０２８−１０４２
【非特許文献２】Ｗｅｂｓｔｅｒら、Ｏｐｔｉｃａｌ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｅｎｓｏｒｓ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ａｎａｌｙｓｔ，２００５；１３０：１６３−７０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
概要
本出願は、腫瘍細胞を検出するための方法であって、（ａ）複数の蛍光シリカ系ナノ粒子を、約０．０１ナノモル／ｋｇ体重〜約１ナノモル／ｋｇ体重の範囲の用量で患者に投与する工程であって、該ナノ粒子が、以下：シリカ系コア内に配置された蛍光化合物を含む該シリカ系コア；該コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル；該ナノ粒子に結合した有機ポリマー；該ナノ粒子に結合したリガンドであって、腫瘍マーカーに結合することができるリガンド；および少なくとも１つの治療剤を含む、工程；ならびに（ｂ）該ナノ粒子を検出する工程を含む方法を提供する。
【００１１】
ナノ粒子は、真皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）投与、腫瘍周囲投与、経口投与、静脈内投与、鼻腔内投与、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）投与、筋肉内投与または経皮投与され得る。蛍光シリカ系ナノ粒子は以下を含む：
【００１２】
本発明はまた、蛍光シリカ系ナノ粒子であって、シリカ系コア内に配置された蛍光化合物を含むシリカ系コア；前記コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル；前記ナノ粒子に結合した有機ポリマー；および前記ナノ粒子に結合したリガンドを含み、約１ｎｍ〜約１５ｎｍの直径を有し、被験体への前記ナノ粒子の投与後において、前記ナノ粒子の腎クリアランスが、約２４時間のうちに約８０％ＩＤ（初期用量）〜約１００％ＩＤまたは約２４時間のうちに約９０％ＩＤ〜約１００％ＩＤの範囲である蛍光シリカ系ナノ粒子を提供する。
【００１３】
本発明は、蛍光シリカ系ナノ粒子であって、シリカ系コア内に配置された蛍光化合物を有するシリカ系コア；前記コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル；前記ナノ粒子に結合した有機ポリマー；前記ナノ粒子に結合した約１〜約３０個のリガンドまたは約１〜約２０個のリガンド；および前記ナノ粒子に結合した造影剤またはキレートを含む蛍光シリカ系ナノ粒子を提供する。
【００１４】
ナノ粒子の直径は、約１ｎｍ〜約２５ｎｍまたは約１ｎｍ〜約８ｎｍの範囲である。ナノ粒子に付加され得る有機ポリマーとしては、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリラクテート、ポリ乳酸、糖、脂質、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００１５】
リガンドは、少なくとも１つの細胞成分、例えば腫瘍マーカーに結合することができるものであり得る。ナノ粒子に結合したリガンドの数はまた、約１〜約３０個、約１〜約２５個または約１〜約１０個の範囲であり得る。リガンドの例としては、ペプチド、タンパク質、バイオポリマー、合成ポリマー、抗原、抗体、微生物、ウイルス、受容体、ハプテン、酵素、ホルモン、化合物、病原体、毒素、表面改変剤またはそれらの組み合わせが挙げられる。トリペプチドＲＧＤ、環状ペプチドｃＲＧＤ、環状ペプチドｃＲＧＤＹＣ、オクトレオテート、ＥＰＰＴ１およびα−ＭＳＨのペプチド類似体などのペプチドは、本発明によって包含される。ＲＧＤまたはα−ＭＳＨ配列を含有する任意の直鎖状ペプチド、環状ペプチドまたは分枝状ペプチドは、本発明の範囲内である。
【００１６】
８９Ｚｒ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、１２４Ｉおよび１７７Ｌｕを含む放射性核種などの造影剤が、ナノ粒子に付加され得る。ナノ粒子は、放射性核種に結合するように適合されたキレート、例えばＤＦＯ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡおよびＤＴＰＡに付加され得る。
【００１７】
本発明のナノ粒子は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、光学イメージング（例えば、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）イメージングを含む蛍光イメージング）、生物発光イメージングまたはそれらの組み合わせによって検出され得る。
【００１８】
治療剤が、ナノ粒子に付加され得る。治療剤としては、抗生物質、抗菌剤、抗増殖剤、抗腫瘍薬、抗酸化剤、内皮細胞成長因子、トロンビン阻害剤、免疫抑制剤、抗血小板凝集剤、コラーゲン合成阻害剤、治療抗体、一酸化窒素供与体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、創傷治癒剤、治療遺伝子導入構築物、細胞外マトリックス成分、血管拡張剤（ｖａｓｏｄｉａｌａｔｏｒ）、血栓溶解剤、代謝拮抗物質、成長因子アゴニスト、抗有糸分裂薬、スタチン、ステロイド、ステロイド性抗炎症剤および非ステロイド性抗炎症剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、フリーラジカルスカベンジャー、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡならびに抗がん化学療法剤が挙げられる。本発明によって包含される治療剤としては、放射性核種、例えば９０Ｙ、１３１Ｉおよび１７７Ｌｕも挙げられる。治療剤は、放射標識され得る（例えば、放射性フッ素１８Ｆに結合することによって標識され得る）。
【００１９】
被験体へのナノ粒子の投与後において、ナノ粒子の血中滞留半減期は、約２時間〜約２５時間、約３時間〜約１５時間または約４時間〜約１０時間の範囲であり得る。被験体へのナノ粒子の投与後におけるナノ粒子の腫瘍滞留半減期は、約５時間〜約５日間、約１０時間〜約４日間または約１５時間〜約３．５日間の範囲であり得る。被験体へのナノ粒子の投与後におけるナノ粒子の腫瘍滞留半減期と血中滞留半減期との比は、約２〜約３０、約３〜約２０または約４〜約１５の範囲であり得る。被験体へのナノ粒子の投与後におけるナノ粒子の腎クリアランスは、約２４時間のうちに約１０％ＩＤ（初期用量）〜約１００％ＩＤ、約２４時間のうちに約３０％ＩＤ〜約８０％ＩＤまたは約２４時間のうちに約４０％ＩＤ〜約７０％ＩＤの範囲であり得る。一実施形態では、被験体へのナノ粒子の投与後において、ナノ粒子の血中滞留半減期は約２時間〜約２５時間の範囲であり、ナノ粒子の腫瘍滞留半減期は約５時間〜約５日間の範囲であり、ナノ粒子の腎クリアランスは約２４時間のうちに３０％ＩＤ〜約８０％ＩＤの範囲である。
【００２０】
ヒト線量当量の約１００倍の量のナノ粒子を被験体に投与した場合、約１０〜約１４日以内に被験体において、貧血、体重減少、動揺、呼吸増加、ＧＩ障害、異常行動、神経機能障害、血液学における異常、臨床化学における異常、臓器病理学における薬物関連病変、死亡またはそれらの組み合わせは実質的に観察されない。
【００２１】
本発明はまた、蛍光シリカ系ナノ粒子であって、シリカ系コア内に配置された蛍光化合物を含むシリカ系コア；前記コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル；前記ナノ粒子に結合した有機ポリマー；および前記ナノ粒子に結合したリガンドを含み、約１ｎｍ〜約１５ｎｍの直径を有する蛍光シリカ系ナノ粒子を提供する。被験体へのナノ粒子の投与後において、ナノ粒子の血中滞留半減期は、約２時間〜約２５時間または約２時間〜約１５時間の範囲であり得；ナノ粒子の腫瘍滞留半減期は、約５時間〜約２日間の範囲であり得；ナノ粒子の腎クリアランスは、約２４時間のうちに約３０％ＩＤ〜約８０％ＩＤの範囲であり得る。ナノ粒子に結合したリガンドの数は、約１〜約２０個または約１〜約１０個の範囲であり得る。ナノ粒子の直径は、約１ｎｍ〜約８ｎｍであり得る。放射性核種などの造影剤が、ナノ粒子に付加され得る。あるいは、キレートが、ナノ粒子に付加され得る。ナノ粒子は、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＣＴ、ＭＲＩ、光学イメージング、生物発光イメージングまたはそれらの組み合わせによって検出され得る。治療剤が、ナノ粒子に付加され得る。被験体へのナノ粒子の投与後において、ナノ粒子の血中滞留半減期はまた、約３時間〜約１５時間または約４時間〜約１０時間の範囲であり得る。被験体へのナノ粒子の投与後におけるナノ粒子の腫瘍滞留半減期はまた、約１０時間〜約４日間または約１５時間〜約３．５日間の範囲であり得る。被験体へのナノ粒子の投与後におけるナノ粒子の腫瘍滞留半減期と血中滞留半減期との比は、約２〜約３０、約３〜約２０または約４〜約１５の範囲であり得る。ナノ粒子の腎クリアランスはまた、被験体へのナノ粒子の投与後約２４時間のうちに約４５％ＩＤ〜約９０％ＩＤの範囲であり得る。
【００２２】
また、蛍光シリカ系ナノ粒子であって、シリカ系コア内に配置された蛍光化合物を含むシリカ系コア；前記コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル；前記ナノ粒子に結合した有機ポリマー；および前記ナノ粒子に結合したリガンドを含み、約１ｎｍ〜約８ｎｍの直径を有する蛍光シリカ系ナノ粒子が本発明において提供される。被験体へのナノ粒子の投与後において、ナノ粒子の腫瘍滞留半減期と血中滞留半減期との比は約２〜約３０の範囲であり、ナノ粒子の腎クリアランスは、約２４時間のうちに約３０％ＩＤ〜約８０％ＩＤの範囲である。
【００２３】
本発明はさらに、細胞の成分を検出するための方法であって、（ａ）シリカ系コア内に配置された蛍光化合物を含むシリカ系コア；前記コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル；前記ナノ粒子に結合した有機ポリマー；前記ナノ粒子に結合した約１〜約３０個のリガンド；および前記ナノ粒子に結合した造影剤またはキレートを含む蛍光シリカ系ナノ粒子を前記細胞と接触させる工程；ならびに（ｂ）少なくとも１つのイメージング技術によって、前記細胞または細胞成分に対する前記ナノ粒子の結合をモニタリングする工程を含む方法を提供する。
【００２４】
本発明はさらに、腫瘍細胞をターゲティングするための方法であって、シリカ系コア内に配置された蛍光化合物を含むシリカ系コア；前記コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル；前記ナノ粒子に結合した有機ポリマー；前記ナノ粒子に結合したリガンドであって、腫瘍マーカーに結合することができるリガンド；および少なくとも１つの治療剤を含む有効量の蛍光シリカ系ナノ粒子をがん患者に投与することを含む方法を提供する。ナノ粒子は放射標識され得る。ナノ粒子は、限定されないが、以下の経路：経口、静脈内、鼻腔内、皮下、局所、筋肉内または経皮によって患者に投与され得る。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（請求項１）
腫瘍細胞を検出するための方法であって、
（ａ）複数の蛍光シリカ系ナノ粒子を、約０．０１ナノモル／ｋｇ体重〜約１ナノモル／ｋｇ体重の範囲の用量で患者に投与する工程であって、該ナノ粒子が、以下：
シリカ系コア内に配置された蛍光化合物を含む該シリカ系コア；
該コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル；
該ナノ粒子に結合した有機ポリマー；
該ナノ粒子に結合したリガンドであって、腫瘍マーカーに結合することができるリガンド；および
少なくとも１つの治療剤；
を含む、工程；ならびに
（ｂ）該ナノ粒子を検出する工程
を含む、方法。
（請求項２）
前記ナノ粒子を真皮下投与、腫瘍周囲投与、経口投与、静脈内投与、鼻腔内投与、皮下投与、筋肉内投与または経皮投与する、請求項１に記載の方法。
（請求項３）
前記ナノ粒子が約１ｎｍ〜約２５ｎｍの直径を有する、請求項１に記載の方法。
（請求項４）
前記ナノ粒子が約１ｎｍ〜約８ｎｍの直径を有する、請求項３に記載の方法。
（請求項５）
前記有機ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリラクテート、ポリ乳酸、糖、脂質、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
（請求項６）
前記ナノ粒子に結合したリガンドの数が約１〜約２５個の範囲である、請求項１に記載の方法。
（請求項７）
前記ナノ粒子に結合したリガンドの数が約１〜約１０個の範囲である、請求項６に記載の方法。
（請求項８）
前記リガンドが、ペプチド、タンパク質、バイオポリマー、合成ポリマー、抗原、抗体、微生物、ウイルス、受容体、ハプテン、酵素、ホルモン、化合物、病原体、毒素、表面改変剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
（請求項９）
前記ペプチドが、トリペプチドＲＧＤ、環状ペプチドｃＲＧＤ、オクトレオテート、ＥＰＰＴ１およびα−ＭＳＨのペプチド類似体からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
（請求項１０）
造影剤またはキレートが前記ナノ粒子に結合している、請求項１に記載の方法。
（請求項１１）
前記造影剤が放射性核種である、請求項１０に記載の方法。
（請求項１２）
前記放射性核種が、８９Ｚｒ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、１２４Ｉおよび１７７Ｌｕからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
（請求項１３）
前記キレートが、放射性核種に結合するように適合されている、請求項１０に記載の方法。
（請求項１４）
前記キレートが、ＤＦＯ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡおよびＤＴＰＡからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
（請求項１５）
前記ナノ粒子が、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＣＴ、ＭＲＩ、光学イメージング、生物発光イメージングまたはそれらの組み合わせによって検出可能である、請求項１に記載の方法。
（請求項１６）
前記光学イメージングが蛍光イメージングである、請求項１５に記載の方法。
（請求項１７）
治療剤が前記ナノ粒子に結合している、請求項１に記載の方法。
（請求項１８）
前記治療剤が、抗生物質、抗菌剤、抗増殖剤、抗腫瘍薬、抗酸化剤、内皮細胞成長因子、トロンビン阻害剤、免疫抑制剤、抗血小板凝集剤、コラーゲン合成阻害剤、治療抗体、一酸化窒素供与体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、創傷治癒剤、治療遺伝子導入構築物、細胞外マトリックス成分、血管拡張剤、血栓溶解剤、代謝拮抗物質、成長因子アゴニスト、抗有糸分裂薬、スタチン、ステロイド、ステロイド性抗炎症剤および非ステロイド性抗炎症剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、フリーラジカルスカベンジャー、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡならびに抗がん化学療法剤からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
（請求項１９）
前記治療剤が放射標識されている、請求項１７に記載の方法。
（請求項２０）
前記治療剤が放射性フッ素１８Ｆに結合されている、請求項１９に記載の方法。
（請求項２１）
前記治療剤が放射性核種である、請求項１７に記載の方法。
（請求項２２）
前記放射性核種が、９０Ｙ、１３１Ｉおよび１７７Ｌｕからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
（請求項２３）
蛍光シリカ系ナノ粒子であって、以下：
シリカ系コア内に配置された蛍光化合物を含む該シリカ系コア；
該コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル；
該ナノ粒子に結合した有機ポリマー；および
該ナノ粒子に結合したリガンド
を含み、
該ナノ粒子が、約１ｎｍ〜約１５ｎｍの直径を有し、被験体への該ナノ粒子の投与後において、該ナノ粒子の腎クリアランスが、約２４時間のうちに約８０％ＩＤ（初期用量）〜約１００％ＩＤの範囲である、蛍光シリカ系ナノ粒子。
（請求項２４）
前記ナノ粒子の腎クリアランスが、被験体への該ナノ粒子の投与後約２４時間のうちに約９０％ＩＤ〜約１００％ＩＤの範囲である、請求項２３に記載のナノ粒子。
（請求項２５）
前記ナノ粒子に結合したリガンドの数が約１〜約２５個の範囲である、請求項２３に記載のナノ粒子。
（請求項２６）
前記ナノ粒子に結合したリガンドの数が約１〜約１０個の範囲である、請求項２５に記載のナノ粒子。
（請求項２７）
約１ｎｍ〜約８ｎｍの直径を有する、請求項２３に記載のナノ粒子。
（請求項２８）
前記有機ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリラクテート、ポリ乳酸、糖、脂質、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２３に記載のナノ粒子。
（請求項２９）
前記リガンドが少なくとも１つの細胞成分に結合することができる、請求項２３に記載のナノ粒子。
（請求項３０）
前記細胞成分が腫瘍マーカーである、請求項２９に記載のナノ粒子。
（請求項３１）
前記リガンドが、ペプチド、タンパク質、バイオポリマー、合成ポリマー、抗原、抗体、微生物、ウイルス、受容体、ハプテン、酵素、ホルモン、化合物、病原体、毒素、表面改変剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２３に記載のナノ粒子。
（請求項３２）
前記ペプチドが、トリペプチドＲＧＤ、環状ペプチドｃＲＧＤ、オクトレオテート、ＥＰＰＴ１およびα−ＭＳＨのペプチド類似体からなる群より選択される、請求項３１に記載のナノ粒子。
（請求項３３）
造影剤が前記ナノ粒子に結合している、請求項２３に記載のナノ粒子。
（請求項３４）
前記造影剤が放射性核種である、請求項３３に記載のナノ粒子。
（請求項３５）
前記放射性核種が、８９Ｚｒ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、１２４Ｉおよび１７７Ｌｕからなる群より選択される、請求項３４に記載のナノ粒子。
（請求項３６）
キレートが前記ナノ粒子に結合している、請求項２３に記載のナノ粒子。
（請求項３７）
前記キレートが、放射性核種に結合するように適合されている、請求項３６に記載のナノ粒子。
（請求項３８）
前記キレートが、ＤＦＯ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡおよびＤＴＰＡからなる群より選択される、請求項３６に記載のナノ粒子。
（請求項３９）
ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＣＴ、ＭＲＩ、光学イメージング、生物発光イメージングまたはそれらの組み合わせによって検出可能である、請求項２３に記載のナノ粒子。
（請求項４０）
前記光学イメージングが蛍光イメージングである、請求項３９に記載のナノ粒子。
（請求項４１）
治療剤が前記ナノ粒子に結合している、請求項２３に記載のナノ粒子。
（請求項４２）
前記治療剤が、抗生物質、抗菌剤、抗増殖剤、抗腫瘍薬、抗酸化剤、内皮細胞成長因子、トロンビン阻害剤、免疫抑制剤、抗血小板凝集剤、コラーゲン合成阻害剤、治療抗体、一酸化窒素供与体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、創傷治癒剤、治療遺伝子導入構築物、細胞外マトリックス成分、血管拡張剤、血栓溶解剤、代謝拮抗物質、成長因子アゴニスト、抗有糸分裂薬、スタチン、ステロイド、ステロイド性抗炎症剤および非ステロイド性抗炎症剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、フリーラジカルスカベンジャー、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡならびに抗がん化学療法剤からなる群より選択される、請求項４１に記載のナノ粒子。
（請求項４３）
前記治療剤が放射標識されている、請求項４１に記載のナノ粒子。
（請求項４４）
前記治療剤が放射性フッ素１８Ｆに結合されている、請求項４１に記載のナノ粒子。
（請求項４５）
前記治療剤が放射性核種である、請求項４１に記載のナノ粒子。
（請求項４６）
前記放射性核種が、９０Ｙ、１３１Ｉおよび１７７Ｌｕからなる群より選択される、請求項４５に記載のナノ粒子。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
特許または出願のファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含有する。カラー図面を伴う本特許または特許出願の公報のコピーは、請求および必要な手数料の納付があれば、特許庁によって提供される。
【００２６】
【図１−１】図１ａは、ベアシリカ（灰色）およびＰＥＧコーティング（黒色）Ｃｙ５含有シリカナノ粒子の粒径の動的光散乱（ＤＬＳ）プロット（数平均）を示す。図１ｂは、ベアシリカナノ粒子を注射した４５分後のヌードマウスの可視光イメージングに重ね合わせたスペクトル偏析Ｃｙ５粒子蛍光（疑似カラー）のインビボイメージングを示す。図１ｃは、ＰＥＧ化Ｃｙ５ナノ粒子を注射した４５分後のヌードマウスの可視光イメージングに重ね合わせたスペクトル偏析Ｃｙ５粒子蛍光（疑似カラー）のインビボイメージングを示す。
【図１−２】図１ｄは、コレジストレーションＰＥＴ−ＣＴを使用したインビボ生体内分布研究を示す。上段は、１２４Ｉ標識ＰＥＧコーティングナノ粒子を注射した２４時間後の連続コレジストレーションＰＥＴ−ＣＴ画像であり、独立して取得したマイクロＣＴおよびマイクロＰＥＴスキャンがその両側にある。下段は、連続マイクロＰＥＴイメージングである。
【００２７】
【図２】図２ａは、Ｃｙ５色素（薄灰色）、直径３．３±０．０６ｎｍ（濃灰色、平均±標準偏差、ｎ＝９）および直径６．０±０．１ｎｍ（黒色、平均±標準偏差、ｎ＝６）のＣｙ５含有ＰＥＧコーティングナノ粒子の蛍光相関分光法（ＦＣＳ）データおよび単一指数関数フィットを示しており、異なる種の異なる流体力学的サイズに起因する拡散時間の差異を示している。図２ｂは、Ｃｙ５色素（薄灰色）、直径３．３ｎｍ（濃灰色）および直径６．０ｎｍ（黒色）のＰＥＧコーティングナノ粒子の吸収スペクトルおよび発光スペクトルを示す。図２ｃは、ＦＣＳ曲線から決定した分子／粒子当たりの計数率として測定した場合の、遊離色素（薄灰色）と、直径３．３ｎｍ（濃灰色）および６．０ｎｍ（黒色）のナノ粒子との相対輝度の比較を示す。図２ｄは、約３．５ｍＷのレーザー励起下における、Ｃｙ５色素（薄灰色）、直径３．３ｎｍ（濃灰色）および直径６．０ｎｍ（黒色）のＰＥＧコーティングナノ粒子のフォトブリーチングデータを示す。
【００２８】
【図３】図３ａは、注射１０分後〜４８時間後の様々な時点における直径６．０ｎｍのナノ粒子に関する、血液（黒色）および組織（肝臓（薄灰色）、肺（中低度の灰色）、脾臓（中度の灰色）および腎臓（中高度の灰色））によって保持された初回粒子用量の割合（％ＩＤ）を示す（ｎ＝マウス３匹、平均±標準偏差）。図３ｂは、直径３．３ｎｍ（薄灰色）および６．０ｎｍ（黒色）のナノ粒子の保持粒子濃度、ならびに関連の対数減衰フィットおよび半減期のプロットを示す。図３ｃは直径３．３ｎｍ（薄灰色）および６．０ｎｍ（黒色）のナノ粒子の推定粒子排泄、ならびに関連の対数フィットおよび半減期のプロットを示す（平均±標準偏差、ｎ＝９（１時点当たりマウス３匹））。
【００２９】
【図４】図４は、非腫瘍担持マウス、および皮下Ｃ６異種移植片を有する腫瘍担持マウスにおけるナノ粒子のインビボ生体内分布を示す。（Ａ）ベアシリカ粒子；（Ｂ）ＰＥＧ化ＲＧＤ粒子。
【００３０】
【図５】図５は、フローサイトメトリーを使用した、ｃＲＧＤドットおよびＰＥＧ化ドット（すなわち、ナノ粒子）のすべての特異的結合データを示す（Ｃｙ５チャネルを時間（ａ）および粒子濃度（ｂ）の関数とする）。
【００３１】
【図６−１】図６は、ανβ３インテグリンターゲティングおよび特性決定のためのマルチモーダルＣドットデザインを示す。図６ａ．放射標識およびペプチドを有する表面と、反応色素分子（挿入図）を含有するコアとを有する１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ化コアシェルシリカナノ粒子の略図。図６ｂ．Ｃｙ５色素溶液（黒色）、ＰＥＧコーティング（ＰＥＧ−ドット、赤色）およびＰＥＧコーティングｃＲＧＤＹ標識ドット（赤色のデータセットの下の青色）の測定に関するＦＣＳ結果および単一指数フィットであり、様々な流体力学的サイズに起因する拡散時間の差異を示している。図６ｃ．流体力学的サイズ（平均±ｓ．ｄ、ｎ＝１５）、ならびにＦＣＳ曲線から求めた、遊離色素とＰＥＧコーティングドットおよびｃＲＧＤＹ−ＰＥＧドットとの相対輝度の比較、ならびに対応する色素および粒子の濃度。
【図６−２】図６は、ανβ３インテグリンターゲティングおよび特性決定のためのマルチモーダルＣドットデザインを示す。図６ａ．放射標識およびペプチドを有する表面と、反応色素分子（挿入図）を含有するコアとを有する１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ化コアシェルシリカナノ粒子の略図。図６ｂ．Ｃｙ５色素溶液（黒色）、ＰＥＧコーティング（ＰＥＧ−ドット、赤色）およびＰＥＧコーティングｃＲＧＤＹ標識ドット（赤色のデータセットの下の青色）の測定に関するＦＣＳ結果および単一指数フィットであり、様々な流体力学的サイズに起因する拡散時間の差異を示している。図６ｃ．流体力学的サイズ（平均±ｓ．ｄ、ｎ＝１５）、ならびにＦＣＳ曲線から求めた、遊離色素とＰＥＧコーティングドットおよびｃＲＧＤＹ−ＰＥＧドットとの相対輝度の比較、ならびに対応する色素および粒子の濃度。
【００３２】
【図７】図７は、サイズ排除カラムクロマトグラフィーを使用した、１２４Ｉ−ＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットの精製および品質管理を示す。各溶出画分における、γ計測によって検出された１２４Ｉ−ＲＧＤドットおよび１２４Ｉ−ＰＥＧ−ドットの放射能（右のカラム）、ならびに１２４Ｉ−ＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットおよび１２４Ｉ−ＰＥＧ−ドットの対応する蛍光シグナル強度（Ｃｙ５、左のカラム）。
【００３３】
【図８−１】図８は、２つの細胞型を使用し、１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドット、ｃＲＧＤＹペプチドおよび抗ανβ３抗体を用いた競合インテグリン受容体結合研究を示す。図８ａ．γ計測による、Ｍ２１細胞に対する１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットの高親和性および特異的結合。挿入図は、結合データのスキャッチャード分析を示しており、受容体結合（Ｂ）対非結合（または遊離、Ｆ）放射性リガンド濃度比、または結合対遊離比Ｂ／Ｆを、受容体結合受容体濃度Ｂと対比してプロットしている；傾きは、解離定数Ｋｄに対応する。図８ｂ．ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットと共にインキュベートする前における、フローサイトメトリーおよび過剰な非放射標識ｃＲＧＤまたは抗ανβ３抗体を使用した、Ｍ２１細胞のανβ３インテグリン受容体遮断。図８ｃ．フローサイトメトリーを使用した、表面インテグリン発現を欠くＭ２１Ｌ細胞と対比した、Ｍ２１に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットの特異的結合。図８ｄ．フローサイトメトリーによる、ＨＵＶＥＣ細胞に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧドットの特異的結合。各バーは、３回の反復の平均±ｓ．ｄ．を表す。
【図８−２】図８は、２つの細胞型を使用し、１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドット、ｃＲＧＤＹペプチドおよび抗ανβ３抗体を用いた競合インテグリン受容体結合研究を示す。図８ａ．γ計測による、Ｍ２１細胞に対する１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットの高親和性および特異的結合。挿入図は、結合データのスキャッチャード分析を示しており、受容体結合（Ｂ）対非結合（または遊離、Ｆ）放射性リガンド濃度比、または結合対遊離比Ｂ／Ｆを、受容体結合受容体濃度Ｂと対比してプロットしている；傾きは、解離定数Ｋｄに対応する。図８ｂ．ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットと共にインキュベートする前における、フローサイトメトリーおよび過剰な非放射標識ｃＲＧＤまたは抗ανβ３抗体を使用した、Ｍ２１細胞のανβ３インテグリン受容体遮断。図８ｃ．フローサイトメトリーを使用した、表面インテグリン発現を欠くＭ２１Ｌ細胞と対比した、Ｍ２１に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットの特異的結合。図８ｄ．フローサイトメトリーによる、ＨＵＶＥＣ細胞に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧドットの特異的結合。各バーは、３回の反復の平均±ｓ．ｄ．を表す。
【００３４】
【図９−１】図９は、ターゲティング粒子プローブおよび非ターゲティング粒子プローブの薬物動態および排泄プロファイルを示す。図９ａ．注射後４〜１６８時間の様々な時点のＭ２１腫瘍担持マウスにおける１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットの生体内分布。挿入図は、滞留半減期（Ｔ１／２）を決定するための、血液に関するこれらのデータの代表的なプロットを示す。図９ｂ．注射４〜９６時間後の１２４Ｉ−ＰＥＧ−ドットの生体内分布。図９ｃ．非放射標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットを注射した後１６８時間までの採取した尿サンプルのクリアランスプロファイル（ｎ＝マウス３匹、平均±ｓ．ｄ．）。図９ｄ．注射後１６８時間までの周期的な糞の対応する累積％ＩＤ／ｇ（ｎ＝マウス４匹）。生体内分布研究について、バーは平均±ｓ．ｄ．を表す。
【図９−２】図９は、ターゲティング粒子プローブおよび非ターゲティング粒子プローブの薬物動態および排泄プロファイルを示す。図９ａ．注射後４〜１６８時間の様々な時点のＭ２１腫瘍担持マウスにおける１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットの生体内分布。挿入図は、滞留半減期（Ｔ１／２）を決定するための、血液に関するこれらのデータの代表的なプロットを示す。図９ｂ．注射４〜９６時間後の１２４Ｉ−ＰＥＧ−ドットの生体内分布。図９ｃ．非放射標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットを注射した後１６８時間までの採取した尿サンプルのクリアランスプロファイル（ｎ＝マウス３匹、平均±ｓ．ｄ．）。図９ｄ．注射後１６８時間までの周期的な糞の対応する累積％ＩＤ／ｇ（ｎ＝マウス４匹）。生体内分布研究について、バーは平均±ｓ．ｄ．を表す。
【００３５】
【図１０】図１０は、急性毒性試験の結果を示す。図１０ａ．代表的なＨ＆Ｅ染色肝臓（４００倍）（上のフレーム）および染色腎臓（２００倍）（下のフレーム）。静脈内注射によって単回用量の非放射標識１２７Ｉ−ＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットまたは１２７Ｉ−ＰＥＧコーティングドット（対照ビヒクル）のいずれかでマウスを処置し、１４日後に臓器を採取した。図１０ｂ．毒性試験の各処置群の毎日の平均体重。図１０ａのスケールバーは１００μｍに対応する。
【００３６】
【図１１−１】図１１は、腫瘍選択的ターゲティングの連続インビボＰＥＴイメージングを示す。図１１ａ．注射４時間後の代表的な全身冠状方向マイクロＰＥＴ画像であり、Ｍ２１（左、矢印）およびＭ２１Ｌ（中央、矢印）腫瘍取り込み（それぞれ３．６および０．７％ＩＤ／ｇ）ならびに２４時間の時点における増強されたＭ２１腫瘍コントラスト（右）を実証している。図１１ｂ．ανβ３インテグリン過剰発現Ｍ２１（黒色、ｎ＝マウス７匹）および非発現Ｍ２１Ｌ（薄灰色、ｎ＝マウス５匹）腫瘍における１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドット、ならびにＭ２１腫瘍（濃灰色、ｎ＝マウス５匹）における１２４Ｉ−ＰＥＧ−ドットのインビボ取り込み。図１１ｃ．１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドット（黒色）および１２４Ｉ−ＰＥＧ−ドット（灰色）に関するＭ２１腫瘍対筋肉比。図１１ｄ．ｃＲＧＤＹ標識プローブおよび非標識プローブのインビボおよびエクスビボＭ２１腫瘍取り込みの相関関係。各バーは平均±ｓ．ｄ．を表す。
【図１１−２】図１１は、腫瘍選択的ターゲティングの連続インビボＰＥＴイメージングを示す。図１１ａ．注射４時間後の代表的な全身冠状方向マイクロＰＥＴ画像であり、Ｍ２１（左、矢印）およびＭ２１Ｌ（中央、矢印）腫瘍取り込み（それぞれ３．６および０．７％ＩＤ／ｇ）ならびに２４時間の時点における増強されたＭ２１腫瘍コントラスト（右）を実証している。図１１ｂ．ανβ３インテグリン過剰発現Ｍ２１（黒色、ｎ＝マウス７匹）および非発現Ｍ２１Ｌ（薄灰色、ｎ＝マウス５匹）腫瘍における１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドット、ならびにＭ２１腫瘍（濃灰色、ｎ＝マウス５匹）における１２４Ｉ−ＰＥＧ−ドットのインビボ取り込み。図１１ｃ．１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドット（黒色）および１２４Ｉ−ＰＥＧ−ドット（灰色）に関するＭ２１腫瘍対筋肉比。図１１ｄ．ｃＲＧＤＹ標識プローブおよび非標識プローブのインビボおよびエクスビボＭ２１腫瘍取り込みの相関関係。各バーは平均±ｓ．ｄ．を表す。
【００３７】
【図１２】図１２は、マルチスケール近赤外蛍光イメージングを使用した、リンパ節マッピングを示す。図１２ａ．注射１時間後の外科的に露出した生動物における腫瘍部位（Ｔ）および流入領域鼠径リンパ節（ＩＬＮ）および腋窩リンパ節（ＡＬＮ）および交通リンパ管（バー、ＬＣ）の全身蛍光イメージング。図１２ｂ．対応するコレジストレーション白色光高解像度蛍光画像（上段）および蛍光画像のみ（下段）であり、高内皮細静脈（ＨＥＶ）を含む局所リンパ節および遠位リンパ節のリンパ節基盤を示している。（ｂ）のより大きなスケールバーは、５００μｍに対応する。
【００３８】
【図１３】図１３ａは、公知の原発性黒色腫腫瘍の部位のリンパを集めるリンパ節群（ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｂａｓｉｎｓ）および所属リンパ管をマッピングするための自然発生ミニブタ黒色腫モデルを使用する実験構成を示す。図１３ｂは、マルチモーダル粒子（１２４Ｉ−ＲＧＤ−ＰＥＧ−ドット）を腫瘍部位付近に皮下注射した５分後の小視野ＰＥＴ画像を示す。
【００３９】
【図１４】図１４ａは、全身動的１８Ｆ−フルオロデオキシグルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）ＰＥＴスキャンを示しており、頸部における結節性疾患の部位を通る矢状方向、冠状方向および軸方向の画像を実証している。図１４ｂは、融合１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴ−ＣＴスキャンを示しており、頸部における結節性疾患の部位を通る矢状方向、冠状方向および軸方向の画像を実証している。図１４ｃは、全身ミニブタ画像を示す。
【００４０】
【図１５】図１５は図１４と同じ画像セットを示すが、原発性黒色腫病変が背中上部の脊椎に隣接しているレベルにある。
【００４１】
【図１６】図１６ａは、１２４Ｉ−ＲＧＤ−ＰＥＧ−ドットを腫瘍部位付近に１時間にわたって四分円的に皮下注射した後の高解像度動的ＰＥＴ画像を示す。図１６ｂは、１２４Ｉ−ＲＧＤ−ＰＥＧ−ドットを腫瘍部位付近に１時間にわたって四分円的に皮下注射した後の融合ＰＥＴ−ＣＴ画像を示す。図１６ｃは、Ｃｙ５イメージング（上の画像）、切除したリンパ節（上から２番目の画像）およびＨ＆Ｅ染色（下の２つの画像）を示す。
【００４２】
【図１７】図１７は、コア内の蛍光色素と、ＰＥＧ表面コーティングとを有するナノ粒子のスキームを示す。ナノ粒子は、アジド基で官能化されたＤＦＯおよびＴｙｒ３−オクトレオテートの両方を用いたその後の「クリックケミストリー」のために三重結合で修飾されている。
【００４３】
【図１８】図１８は、ＰＥＧ誘導体の構造を示す。標準的な化学反応を使用して、三重結合を有する官能化ＰＥＧを生産し、次いで、シラン基を介してこれをナノ粒子に共有結合する。
【００４４】
【図１９】図１９は、ＤＦＯ誘導体の構造を示す。
【００４５】
【図２０−１】図２０ａは、Ｔｙｒ３−オクトレオテートの構造を示す。
【図２０−２】図２０ｂは、Ｔｙｒ３−オクトレオテートに組み込むためのアジド含有酸の合成を示す。
【００４６】
【図２１−１】図２１ａは、そのコア内のＮＩＲ蛍光色素と、ＰＥＧ表面コーティングと、ＤＦＯキレートと、Ｔｙｒ３−オクトレオテートとを有する官能化ナノ粒子の生産スキームを示す。図２１ｂは、Ｔｙｒ３−オクトレオテートで修飾されたマルチモーダル８９Ｚｒ標識ナノ粒子（ＰＥＴおよび蛍光）の生産スキームを示す。
【図２１−２】図２１ｃは、テトラジン−ノルボルネン連結を示す。図２１ｄは、テトラジン−ノルボルネン連結を使用した、放射標識コア−シェルナノ粒子を作製するための戦略スキームを示す。
【図２１−３】図２１ｅは、テトラジン−ノルボルネン連結を使用した、ペプチドターゲティング放射標識コア−シェルナノ粒子を作製するための戦略スキームを示す。一段階経路（プレメタル化キレート剤−ノルボルネン複合体を粒子と反応させる）および二段階経路（コンジュゲーション後にキレート剤をメタル化する）の両方を示す。
【００４７】
【図２２】図２２は、エンドサイトーシス経路におけるｃＲＧＦ−ＰＥＧ−ナノ粒子とｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  ｒｅｄとの間の共局在を実証する顕微鏡画像を示す。
【００４８】
【図２３】画像誘導ＳＬＮ（センチネルリンパ節）マッピング：術前ＰＥＴイメージング。（ａ、ｂ）軸方向ＣＴ画像は、左骨盤軟組織塊（ａ、矢印）および左脇腹ＳＬＮ（ｂ、矢印）を示す。（ｃ、ｄ）軸方向１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴ画像は、トレーサーを静脈内注射した後の腫瘍（ｃ、矢印）および左脇腹ＳＬＮ（ｄ、矢印）内の活性の局在を示す。（ｅ）軸方向および（ｆ）冠状方向１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ＣドットコレジストレーションＰＥＴ−ＣＴ画像は、骨盤病変付近の局所注射部位を示す（ｅ、矢印）。（ｇ）対応する軸方向および（ｈ）冠状方向コレジストレーションＰＥＴ−ＣＴ画像では、活性がＳＬＮに局在している（ｇ、矢印）。（ｉ）ハンドヘルドγプローブを使用した、原発性腫瘍、ＳＬＮ（インビボ、エクスビボ）、および原発性腫瘍から離れた部位（すなわち、バックグラウンド）の放射能レベル。
【００４９】
【図２４−１】画像誘導ＳＬＮマッピング：相関組織学を用いたリアルタイム術中光学イメージング。図２３ａ〜２３ｉに示されている動物に対して、術中ＳＬＮマッピングを実施した。（ａ〜ｉ）露出したリンパ節群の２チャネルＮＩＲ光学イメージング。デュアルチャネルモデル（ａ）ＲＧＢカラーおよび（ｂ）ＮＩＲ蛍光チャネル（白色）で示された、Ｃｙ５．５が組み込まれた粒子の局所注射。（ｃ〜ｆ）注射部位より遠位の流入領域リンパ管。ＳＬＮ（「Ｎ」）に向かって伸びる主な流入領域近位（ｃ、ｄ）、中位（ｅ）および遠位（ｆ）リンパ管（矢印）内の蛍光シグナル。より小さな口径のチャネルも示す（矢頭）。（ｇ）カラーおよび（ｈ）ＮＩＲチャネルで示されたＳＬＮの画像。（ｉ）露出したＳＬＮの画像。（ｊ〜ｍ）それぞれ切除中（ｊ、ｋ）および切除後（ｌ、ｍ）のカラーおよびＮＩＲチャネルにおけるＳＬＮの画像。（ｎ）Ｈ＆Ｅ染色ＳＬＮの低倍率視野は、色素性細胞のクラスタを示す（黒色の囲み枠）（バー＝１ｍｍ）。（ｏ）（ｎ）の高倍率は、円形の色素性黒色腫細胞およびメラノファージを示す（バー＝５０μｍ）。（ｐ）ＨＭＢ４５染色ＳＬＮの低倍率視野は、転移の存在を確認する（黒色の囲み枠、バー＝５００μｍ）。（ｑ）（ｐ）の高倍率は、ＨＭＢ４５＋発現黒色腫細胞のクラスタを示す（バー＝１００μｍ）。
【図２４−２】画像誘導ＳＬＮマッピング：相関組織学を用いたリアルタイム術中光学イメージング。図２３ａ〜２３ｉに示されている動物に対して、術中ＳＬＮマッピングを実施した。（ａ〜ｉ）露出したリンパ節群の２チャネルＮＩＲ光学イメージング。デュアルチャネルモデル（ａ）ＲＧＢカラーおよび（ｂ）ＮＩＲ蛍光チャネル（白色）で示された、Ｃｙ５．５が組み込まれた粒子の局所注射。（ｃ〜ｆ）注射部位より遠位の流入領域リンパ管。ＳＬＮ（「Ｎ」）に向かって伸びる主な流入領域近位（ｃ、ｄ）、中位（ｅ）および遠位（ｆ）リンパ管（矢印）内の蛍光シグナル。より小さな口径のチャネルも示す（矢頭）。（ｇ）カラーおよび（ｈ）ＮＩＲチャネルで示されたＳＬＮの画像。（ｉ）露出したＳＬＮの画像。（ｊ〜ｍ）それぞれ切除中（ｊ、ｋ）および切除後（ｌ、ｍ）のカラーおよびＮＩＲチャネルにおけるＳＬＮの画像。（ｎ）Ｈ＆Ｅ染色ＳＬＮの低倍率視野は、色素性細胞のクラスタを示す（黒色の囲み枠）（バー＝１ｍｍ）。（ｏ）（ｎ）の高倍率は、円形の色素性黒色腫細胞およびメラノファージを示す（バー＝５０μｍ）。（ｐ）ＨＭＢ４５染色ＳＬＮの低倍率視野は、転移の存在を確認する（黒色の囲み枠、バー＝５００μｍ）。（ｑ）（ｐ）の高倍率は、ＨＭＢ４５＋発現黒色腫細胞のクラスタを示す（バー＝１００μｍ）。
【００５０】
【図２５】炎症と転移性疾患の識別：１８Ｆ−ＦＤＧおよび１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ  Ｃドットトレーサーの比較。（ａ〜ｄ）組織相関と共に１８Ｆ−ＦＤＧ−ＰＥＴを使用した、炎症性変化のイメージング。（ａ）１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴ研究の軸方向ＣＴスキャンは、左後頸部内の石灰化を示す（矢印）。（ｂ）融合軸方向１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴ−ＣＴは、この同じ部位における代謝亢進作用を示す（矢印）。代謝的に活性な骨構造では、ＰＥＴシグナルの増加も見られる（アスタリスク）。Ｈ＆Ｅ染色石灰化組織の（ｃ）低倍率および（ｄ）高倍率視野は、炎症性細胞の広範な浸潤を実証する。（ｅ〜ｋ）１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ  Ｃドットを腫瘍部位付近に注射した後の転移性疾患の検出。（ｅ）１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの注射前軸方向ＣＴスキャンは、後頸部内の石灰化軟組織を示す（矢印）。（ｆ）コレジストレーションＰＥＴ−ＣＴは、石灰化領域に対応する明白な活性を示さないが（矢印）、右側の代謝亢進リンパ節を実証する（矢頭）。（ｇ）より上のレベルの軸方向ＣＴスキャンは、両側にリンパ節（矢頭）および石灰化病巣（矢印）を示す。（ｈ）融合ＰＥＴ−ＣＴは、ＰＥＴ−ａｖｉｄリンパ節（Ｎ）およびリンパ排液（曲線矢印）を実証する。石灰化は活性を示さない（矢印）。（ｉ）低倍率および（ｊ）高倍率視野は、リンパ節転移の存在を確認する。（ｋ）三次元（３Ｄ）ＰＥＴ画像再構成からの単一フレームは、複数の両側転移性リンパ節（矢頭）およびリンパ管（矢印）を示す。膀胱の活性が見られ、肝臓にはトレーサーの有意な蓄積がない。スケールバー：５００μｍ（ｃ、ｄ）；１００μｍ（ｉ、ｊ）。
【００５１】
【図２６】３Ｄ統合１８Ｆ−ＦＤＧおよび１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ＣドットＰＥＴ−ＣＴ。（ａ〜ｃ）図７ａ〜７ｋに示されているＣＴおよびＰＥＴイメージングデータから、３Ｄボリュームレンダリング画像を作成した。（ａ）ＰＥＴ−ＣＴ融合画像（冠状図）は、明白なリンパ節転移を示さない（アスタリスク）。骨構造内の活性の増加が認められる。（ｂ、ｃ）粒子トレーサーを局所注射した後の頸部内の両側転移性リンパ節（白色矢印）およびリンパ管（曲線矢印）の冠状図（ｂ）および上面図（ｃ）を示す高解像度ＰＥＴ−ＣＴ融合画像。
【００５２】
【図２７−１】１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットを使用した高周波アブレーション（ＲＦＡ）後の処置応答の評価。（ａ〜ｃ）ＳＬＮの単回用量粒子放射性トレーサーの局在性。（ａ）ベースライン冠状ＣＴ（白色矢頭）。腫瘍周辺注射後の（ｂ）ＰＥＴ（黒色矢頭）および（ｃ）融合ＰＥＴ−ＣＴ画像（白色矢頭）。（ｂ〜ｄ）腫瘍粒子トレーサー活性。（ｂ）ＰＥＴ−ａｖｉｄ外方増殖性左骨盤内腫瘤（黒色矢印）。（ｃ、ｄ）代謝亢進病変（白色矢印）およびＳＬＮ（曲線矢印）に向かう流入領域リンパ管内の粒子トレーサーの流れ（アスタリスク）を示す統合ＰＥＴ−ＣＴ画像。（ｅ、ｆ）アブレーション前軸方向ＣＴ画像は、リンパ節へのＲＦＡ電極配置（ｆ、矢印）前のＳＬＮ（ｅ、白色矢頭）の位置を示す（十字線の下方）。（ｇ）アブレーション前融合ＰＥＴ−ＣＴは、ＳＬＮ活性の増加を示す（十字線の後方）。（ｈ）アブレーション後ＰＥＴ−ＣＴスキャンは、ＳＬＮ部位における活性のわずかな減少を示す（針先の前方）。（ｉ）ＳＬＮ由来のコア生検組織の対応するアブレーション前Ｈ＆Ｅ染色は、色素性腫瘍の浸潤を確認する（バー＝２００μｍ）。（ｊ）（ｉ）における囲み枠領域の高倍率は、黒色腫細胞の大きな円形の色素性クラスタを示す（バー＝５０μｍ）。（ｋ）アブレーション後Ｈ＆Ｅ染色は、部分的に腫瘍が浸潤したリンパ節（囲み枠）内の壊死性変化および多巣性出血を示す（バー＝５００μｍ）。（ｌ）（ｋ）の高倍率は、リンパ組織に加えて、転移性リンパ節内の有意な組織壊死（矢頭）を示す（バー＝５０μｍ）。（ｍ）アブレーション前の転移性ＳＬＮのＴＵＮＥＬ染色（バー＝２０μｍ）。（ｎ）隣接する散在性腫瘍病巣および正常リンパ節組織（ＮＴ）を有する病巣壊死領域を実証するアブレーション後ＴＵＮＥＬ染色（バー＝５００μｍ）。（ｏ）（ｎ）における囲み枠領域の高倍率は、壊死と一致して、陽性ＴＵＮＥＬ染色を示す（バー＝２０μｍ）。
【図２７−２】１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットを使用した高周波アブレーション（ＲＦＡ）後の処置応答の評価。（ａ〜ｃ）ＳＬＮの単回用量粒子放射性トレーサーの局在性。（ａ）ベースライン冠状ＣＴ（白色矢頭）。腫瘍周辺注射後の（ｂ）ＰＥＴ（黒色矢頭）および（ｃ）融合ＰＥＴ−ＣＴ画像（白色矢頭）。（ｂ〜ｄ）腫瘍粒子トレーサー活性。（ｂ）ＰＥＴ−ａｖｉｄ外方増殖性左骨盤内腫瘤（黒色矢印）。（ｃ、ｄ）代謝亢進病変（白色矢印）およびＳＬＮ（曲線矢印）に向かう流入領域リンパ管内の粒子トレーサーの流れ（アスタリスク）を示す統合ＰＥＴ−ＣＴ画像。（ｅ、ｆ）アブレーション前軸方向ＣＴ画像は、リンパ節へのＲＦＡ電極配置（ｆ、矢印）前のＳＬＮ（ｅ、白色矢頭）の位置を示す（十字線の下方）。（ｇ）アブレーション前融合ＰＥＴ−ＣＴは、ＳＬＮ活性の増加を示す（十字線の後方）。（ｈ）アブレーション後ＰＥＴ−ＣＴスキャンは、ＳＬＮ部位における活性のわずかな減少を示す（針先の前方）。（ｉ）ＳＬＮ由来のコア生検組織の対応するアブレーション前Ｈ＆Ｅ染色は、色素性腫瘍の浸潤を確認する（バー＝２００μｍ）。（ｊ）（ｉ）における囲み枠領域の高倍率は、黒色腫細胞の大きな円形の色素性クラスタを示す（バー＝５０μｍ）。（ｋ）アブレーション後Ｈ＆Ｅ染色は、部分的に腫瘍が浸潤したリンパ節（囲み枠）内の壊死性変化および多巣性出血を示す（バー＝５００μｍ）。（ｌ）（ｋ）の高倍率は、リンパ組織に加えて、転移性リンパ節内の有意な組織壊死（矢頭）を示す（バー＝５０μｍ）。（ｍ）アブレーション前の転移性ＳＬＮのＴＵＮＥＬ染色（バー＝２０μｍ）。（ｎ）隣接する散在性腫瘍病巣および正常リンパ節組織（ＮＴ）を有する病巣壊死領域を実証するアブレーション後ＴＵＮＥＬ染色（バー＝５００μｍ）。（ｏ）（ｎ）における囲み枠領域の高倍率は、壊死と一致して、陽性ＴＵＮＥＬ染色を示す（バー＝２０μｍ）。
【００５３】
【図２８−１】コア−シェルハイブリッドシリカナノ粒子プラットフォーム（１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドット）および研究デザインの概要。（Ａ）深紅色色素を含有するコアと、ｃＲＧＤＹペプチドリガンドおよびヒトανβ３インテグリン発現腫瘍（左）を検出するための放射標識を有する表面付加ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖とを示すハイブリッド（光学ＰＥＴ）無機イメージングプローブ（右）の概略図。（Ｂ）カプセル化フルオロフォアの蛍光の増加を示す、遊離色素（青色曲線）およびカプセル化色素（緑色曲線）の吸収マッチスペクトル（左：赤色、黒色曲線）および発光スペクトル（右）。（Ｃ）臨床試験イベントのタイムライン。Ｂｉｏｌ  ｓｐｅｃｓ、生体試料（血液、尿）。
【図２８−２】コア−シェルハイブリッドシリカナノ粒子プラットフォーム（１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドット）および研究デザインの概要。（Ａ）深紅色色素を含有するコアと、ｃＲＧＤＹペプチドリガンドおよびヒトανβ３インテグリン発現腫瘍（左）を検出するための放射標識を有する表面付加ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖とを示すハイブリッド（光学ＰＥＴ）無機イメージングプローブ（右）の概略図。（Ｂ）カプセル化フルオロフォアの蛍光の増加を示す、遊離色素（青色曲線）およびカプセル化色素（緑色曲線）の吸収マッチスペクトル（左：赤色、黒色曲線）および発光スペクトル（右）。（Ｃ）臨床試験イベントのタイムライン。Ｂｉｏｌ  ｓｐｅｃｓ、生体試料（血液、尿）。
【図２８−３】１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの全身分布および薬物動態。（Ｄ）１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットを注射した２時間後（左）、２４時間後（中央）および７２時間後（右）の最大値投影（ＭＩＰ）ＰＥＴ画像は、膀胱（＊）、心臓（黄色矢印）および腸（白色矢頭）の活性を示す。（Ｅ）粒子を注射した約３０分後、４時間後、２４時間後および７２時間後に採取した尿および血漿１グラム当たりの注射用量の割合（％ＩＤ／ｇ）を減衰補正したものをγ計測によって決定した；各患者について、個々のプロットを作成した。各患者のＰＥＴスキャンの主要臓器についてＲＯＩを描写して、標準取り込み値および％ＩＤ／ｇを求めた。
【図２８−４】１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの全身分布および薬物動態。（Ｄ）１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットを注射した２時間後（左）、２４時間後（中央）および７２時間後（右）の最大値投影（ＭＩＰ）ＰＥＴ画像は、膀胱（＊）、心臓（黄色矢印）および腸（白色矢頭）の活性を示す。（Ｅ）粒子を注射した約３０分後、４時間後、２４時間後および７２時間後に採取した尿および血漿１グラム当たりの注射用量の割合（％ＩＤ／ｇ）を減衰補正したものをγ計測によって決定した；各患者について、個々のプロットを作成した。各患者のＰＥＴスキャンの主要臓器についてＲＯＩを描写して、標準取り込み値および％ＩＤ／ｇを求めた。
【図２８−５】１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの全身分布および薬物動態。（Ｄ）１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットを注射した２時間後（左）、２４時間後（中央）および７２時間後（右）の最大値投影（ＭＩＰ）ＰＥＴ画像は、膀胱（＊）、心臓（黄色矢印）および腸（白色矢頭）の活性を示す。（Ｅ）粒子を注射した約３０分後、４時間後、２４時間後および７２時間後に採取した尿および血漿１グラム当たりの注射用量の割合（％ＩＤ／ｇ）を減衰補正したものをγ計測によって決定した；各患者について、個々のプロットを作成した。各患者のＰＥＴスキャンの主要臓器についてＲＯＩを描写して、標準取り込み値および％ＩＤ／ｇを求めた。
【００５４】
【図２９−１】生体試料の代謝分析。（Ａ、Ｂ）注射時間に対して減衰補正したそれぞれ血漿および尿中の時間依存性放射能濃度（％ＩＤ／ｇ×１００）（Ｃ〜Ｈ）血漿試料および尿試料のラジオＴＬＣ（移動相として４：１酢酸：メタノール）（減衰補正カウント毎分、ｃｐｍ）。（Ｃ〜Ｅ）血漿のクロマトグラムは、注射０．５時間後（Ｃ）、３時間後（Ｄ）および２４時間後（Ｅ）の単一ピークを示す。（Ｆ〜Ｈ）尿試料のクロマトグラムは、注射０．５時間後（Ｆ）、３時間後（Ｇ）および２４時間後（Ｈ）の２つのピークを示す。挿入図（Ｇ、Ｈ）は、最大５０ｃｐｍにスケーリングした各データを示す。（Ｉ〜Ｋ）標準のクロマトグラム：注入液（Ｉ）、放射性ヨウ素化（１３１Ｉ）ペプチド（Ｊ）および遊離１３１Ｉ（Ｋ）。縦線は、粒子トレーサーに対応するピークを識別する（長破線；Ｒｆ＝０．０４）、１３１Ｉ−ｃＲＧＤＹ（短破線；Ｒｆ＝０．２）および１３１Ｉ（点線；Ｒｆ＝０．７）。
【図２９−２】生体試料の代謝分析。（Ａ、Ｂ）注射時間に対して減衰補正したそれぞれ血漿および尿中の時間依存性放射能濃度（％ＩＤ／ｇ×１００）（Ｃ〜Ｈ）血漿試料および尿試料のラジオＴＬＣ（移動相として４：１酢酸：メタノール）（減衰補正カウント毎分、ｃｐｍ）。（Ｃ〜Ｅ）血漿のクロマトグラムは、注射０．５時間後（Ｃ）、３時間後（Ｄ）および２４時間後（Ｅ）の単一ピークを示す。（Ｆ〜Ｈ）尿試料のクロマトグラムは、注射０．５時間後（Ｆ）、３時間後（Ｇ）および２４時間後（Ｈ）の２つのピークを示す。挿入図（Ｇ、Ｈ）は、最大５０ｃｐｍにスケーリングした各データを示す。（Ｉ〜Ｋ）標準のクロマトグラム：注入液（Ｉ）、放射性ヨウ素化（１３１Ｉ）ペプチド（Ｊ）および遊離１３１Ｉ（Ｋ）。縦線は、粒子トレーサーに対応するピークを識別する（長破線；Ｒｆ＝０．０４）、１３１Ｉ−ｃＲＧＤＹ（短破線；Ｒｆ＝０．２）および１３１Ｉ（点線；Ｒｆ＝０．７）。
【００５５】
【図３０】１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットを全身注射した後の粒子生体内分布および選択的腫瘍取り込みの全身ＰＥＴ−ＣＴイメージング。（Ａ）再フォーマット冠状ＣＴは、明確に定義された低密度の左肝葉転移を実証する（矢頭）。（Ｂ）注射４時間後の冠状ＰＥＴ画像は、膀胱、消化管（胃、腸）、胆嚢および心臓に加えて、腫瘍周辺（矢頭）に沿った活性の増加を実証する。（Ｃ）コレジストレーションＰＥＴ−ＣＴでは、腫瘍境界に活性が局在する。
【００５６】
【図３１】下垂体病変における粒子取り込みのマルチモーダルイメージング。（Ａ〜Ｂ）注射７２時間での多面コントラスト増強ＭＲ軸方向（Ａ）および矢状方向（Ｂ）画像は、脳下垂体前葉の右側面内におけるセンチメートル以下の嚢胞性病巣（矢印）を実証する。（Ｃ〜Ｄ）コレジストレーション軸方向（Ｃ）および矢状方向（Ｄ）ＭＲＩ−ＰＥＴ画像は、病変部位に局在する病巣活性の増加（赤色）を示す。（Ｅ〜Ｆ）軸方向（Ｅ）および矢状方向（Ｆ）ＰＥＴ−ＣＴ画像では、トルコ鞍の右側面に活性が局在する。（Ｇ〜Ｉ）注射３時間後（Ｇ）、２４時間後（Ｈ）および７２時間後（Ｉ）の軸方向ＰＥＴ画像は、病変付近のバックグラウンド活性の対応する低下と共に、トルコ鞍領域内の活性（ＳＵＶｍａｘ）の進行性蓄積を実証する。（Ｊ）注射後の時間に応じて増加する腫瘍対脳（Ｔ／Ｂ）および腫瘍対肝臓（Ｔ／Ｌ）活性比。
【００５７】
【図３２】ナノ粒子コンジュゲーションに使用したＮ−Ａｃ−Ｃｙｓ−（Ａｈｘ）２−Ｄ−Ｌｙｓ−ＲｅＣＣＭＳＨ（またはαＭＳＨ）ペプチドの構造。
【００５８】
【図３３】元のＲｅＣＣＭＳＨターゲティング分子の構造。
【００５９】
【図３４−１】メラノコルチン−１受容体アゴニスト（１２５Ｉ−ＮＤＰ）を使用した競合結合研究。Ｎ−Ａｃ−Ｃｙｓ−（Ａｈｘ）２−Ｄ−Ｌｙｓ−ＲｅＣＣＭＳＨ（またはα−ＭＳＨ）コンジュゲート粒子（図３４Ａ）は、培養Ｂ１６／Ｆ１黒色腫細胞に対する親和性が、スクランブル配列バージョンの分子（図３４Ｂ）よりも強力であった。
【図３４−２】メラノコルチン−１受容体アゴニスト（１２５Ｉ−ＮＤＰ）を使用した競合結合研究。Ｎ−Ａｃ−Ｃｙｓ−（Ａｈｘ）２−Ｄ−Ｌｙｓ−ＲｅＣＣＭＳＨ（またはα−ＭＳＨ）コンジュゲート粒子（図３４Ａ）は、培養Ｂ１６／Ｆ１黒色腫細胞に対する親和性が、スクランブル配列バージョンの分子（図３４Ｂ）よりも強力であった。
【００６０】
【図３５】Ｂ１６Ｆ１０およびＭ２１黒色腫細胞株の両方について、ターゲティング粒子濃度（図３５Ａ）およびインキュベーション時間（図３５Ｂ）に応じた用量応答データを得た。
【００６１】
【図３６】４８時間の固定インキュベーション時間にわたって一定範囲の粒子濃度で実施したヒトＭ２１細胞生存研究は、細胞生存率の有意な減少がないことを実証した。
【００６２】
【図３７】１２５Ｉ放射標識α−ＭＳＨコンジュゲートナノ粒子は、Ｂ１６Ｆ１０およびＭ２１マウス異種移植モデルの両方において、２４時間にわたる大量の腎排泄を示した。
【００６３】
【図３８−１】Ｂ１６Ｆ１０異種移植モデルおよびＭ２１異種移植モデルはいずれも、細網内皮系（すなわち、ＲＥＳ薬剤ではない）および腎臓におけるターゲティング粒子プローブの有意な蓄積を示さなかった。
【図３８−２】Ｂ１６Ｆ１０異種移植モデルおよびＭ２１異種移植モデルはいずれも、細網内皮系（すなわち、ＲＥＳ薬剤ではない）および腎臓におけるターゲティング粒子プローブの有意な蓄積を示さなかった。
【００６４】
【図３９−１】２つの細胞型に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットおよび抗ανβ３抗体を使用した、競合インテグリン受容体結合および温度依存性取り込み。Ａ．抗ανβ３インテグリン受容体抗体およびフローサイトメトリーを使用した、温度（４℃、２５℃、３７℃）および濃度（２５ｎＭ、１００ｎＭ）に応じた、Ｍ２１細胞におけるｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの特異的結合および取り込み。抗ανβ３インテグリン受容体抗体濃度は、粒子濃度の２５０倍（すなわち、２５０×）であった。Ｂ．フローサイトメトリーによる、正常な表面インテグリン発現を欠くＭ２１Ｌ細胞と対比した、Ｍ２１細胞におけるｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの取り込み。Ｃ．抗ανβ３インテグリン受容体抗体およびフローサイトメトリーを使用した、ＨＵＶＥＣにおける選択的粒子取り込み。Ｄ．Ｍ２１細胞を使用した、４時間の粒子インキュベーション後における、エンドサイトーシス（トランスフェリン−Ａｌｅｘａ−４８８、ＦＩＴＣ−デキストラン、緑色）およびリソソームマーカー（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）を用いた、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドット（１μＭ、赤色）共局在化アッセイ。共局在小胞（黄色）、ヘキスト対比染色（青色）。スケールバー＝１５μｍ。各データポイント（Ａ〜Ｃ）は、３回の反復の平均±ＳＤを表す。
【図３９−２】２つの細胞型に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットおよび抗ανβ３抗体を使用した、競合インテグリン受容体結合および温度依存性取り込み。Ａ．抗ανβ３インテグリン受容体抗体およびフローサイトメトリーを使用した、温度（４℃、２５℃、３７℃）および濃度（２５ｎＭ、１００ｎＭ）に応じた、Ｍ２１細胞におけるｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの特異的結合および取り込み。抗ανβ３インテグリン受容体抗体濃度は、粒子濃度の２５０倍（すなわち、２５０×）であった。Ｂ．フローサイトメトリーによる、正常な表面インテグリン発現を欠くＭ２１Ｌ細胞と対比した、Ｍ２１細胞におけるｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの取り込み。Ｃ．抗ανβ３インテグリン受容体抗体およびフローサイトメトリーを使用した、ＨＵＶＥＣにおける選択的粒子取り込み。Ｄ．Ｍ２１細胞を使用した、４時間の粒子インキュベーション後における、エンドサイトーシス（トランスフェリン−Ａｌｅｘａ−４８８、ＦＩＴＣ−デキストラン、緑色）およびリソソームマーカー（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）を用いた、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドット（１μＭ、赤色）共局在化アッセイ。共局在小胞（黄色）、ヘキスト対比染色（青色）。スケールバー＝１５μｍ。各データポイント（Ａ〜Ｃ）は、３回の反復の平均±ＳＤを表す。
【００６５】
【図４０−１】Ｍ２１細胞におけるリン酸化ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ＭＥＫ、Ｅｒｋ１／２およびＡｋｔの発現レベル。Ａ．ＦＡＫ／Ｓｒｃ複合体は、下流シグナル伝達経路（ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ、Ｒａｓ−ＭＡＰＫ）の活性化を介して、インテグリン細胞表面受容体からのシグナルを伝達して、一定範囲の生物学的応答を誘発する（囲み枠は、アッセイしたタンパク質中間体を示す）。Ｂ．無血清（０．２％ＦＢＳ）培地中の細胞（すなわち、対照）と比べた、Ｇ０／Ｇ１期同期化Ｍ２１細胞を１００ｎＭ  ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットに曝露（２時間、３７℃）した後の、重要な経路中間体のリン酸化タンパク質および全タンパク質の発現レベルのウエスタンブロット。細胞をトリプシン処理し、ペレットを溶解緩衝液に再懸濁した後、４〜１２％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離し、抗ＦＡＫ３９７、ｐＦＡＫ５７６／５７７、ｐ−Ｓｒｃ、ｐＭＥＫ、ｐＥｒｋ１／２およびｐＡｋｔ抗体によって分析した。また、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ＭＥＫ、ＥｒｋおよびＡｋｔに対する抗体を使用して、全タンパク質の量を検出した。Ｃ．粒子に曝露した細胞対無血清細胞に関する、全タンパク質に対するリン酸化タンパク質のシグナル強度変化の割合のグラフ概要（Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ２；方法を参照のこと）。ＧＦ、成長因子；ＥＣ、内皮細胞；ＥＣＭ、細胞外マトリックス。
【図４０−２】Ｍ２１細胞におけるリン酸化ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ＭＥＫ、Ｅｒｋ１／２およびＡｋｔの発現レベル。Ａ．ＦＡＫ／Ｓｒｃ複合体は、下流シグナル伝達経路（ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ、Ｒａｓ−ＭＡＰＫ）の活性化を介して、インテグリン細胞表面受容体からのシグナルを伝達して、一定範囲の生物学的応答を誘発する（囲み枠は、アッセイしたタンパク質中間体を示す）。Ｂ．無血清（０．２％ＦＢＳ）培地中の細胞（すなわち、対照）と比べた、Ｇ０／Ｇ１期同期化Ｍ２１細胞を１００ｎＭ  ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットに曝露（２時間、３７℃）した後の、重要な経路中間体のリン酸化タンパク質および全タンパク質の発現レベルのウエスタンブロット。細胞をトリプシン処理し、ペレットを溶解緩衝液に再懸濁した後、４〜１２％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離し、抗ＦＡＫ３９７、ｐＦＡＫ５７６／５７７、ｐ−Ｓｒｃ、ｐＭＥＫ、ｐＥｒｋ１／２およびｐＡｋｔ抗体によって分析した。また、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ＭＥＫ、ＥｒｋおよびＡｋｔに対する抗体を使用して、全タンパク質の量を検出した。Ｃ．粒子に曝露した細胞対無血清細胞に関する、全タンパク質に対するリン酸化タンパク質のシグナル強度変化の割合のグラフ概要（Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ２；方法を参照のこと）。ＧＦ、成長因子；ＥＣ、内皮細胞；ＥＣＭ、細胞外マトリックス。
【図４０−３】Ｍ２１細胞におけるリン酸化ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ＭＥＫ、Ｅｒｋ１／２およびＡｋｔの発現レベル。Ａ．ＦＡＫ／Ｓｒｃ複合体は、下流シグナル伝達経路（ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ、Ｒａｓ−ＭＡＰＫ）の活性化を介して、インテグリン細胞表面受容体からのシグナルを伝達して、一定範囲の生物学的応答を誘発する（囲み枠は、アッセイしたタンパク質中間体を示す）。Ｂ．無血清（０．２％ＦＢＳ）培地中の細胞（すなわち、対照）と比べた、Ｇ０／Ｇ１期同期化Ｍ２１細胞を１００ｎＭ  ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットに曝露（２時間、３７℃）した後の、重要な経路中間体のリン酸化タンパク質および全タンパク質の発現レベルのウエスタンブロット。細胞をトリプシン処理し、ペレットを溶解緩衝液に再懸濁した後、４〜１２％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離し、抗ＦＡＫ３９７、ｐＦＡＫ５７６／５７７、ｐ−Ｓｒｃ、ｐＭＥＫ、ｐＥｒｋ１／２およびｐＡｋｔ抗体によって分析した。また、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ＭＥＫ、ＥｒｋおよびＡｋｔに対する抗体を使用して、全タンパク質の量を検出した。Ｃ．粒子に曝露した細胞対無血清細胞に関する、全タンパク質に対するリン酸化タンパク質のシグナル強度変化の割合のグラフ概要（Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ２；方法を参照のこと）。ＧＦ、成長因子；ＥＣ、内皮細胞；ＥＣＭ、細胞外マトリックス。
【００６６】
【図４１−１】ＦＡＫ阻害剤ＰＦ−５７３２２８（ＰＦ−２２８）を使用した、Ｍ２１細胞における．シグナル伝達誘導および阻害研究。Ａ．粒子曝露前に２５０ｎＭまたは５００ｎＭ  ＰＦ−２２８を細胞に追加（０．５時間、３７℃）して、図２の上記方法を使用した、リン酸化タンパク質および全タンパク質の発現レベルのウエスタンブロット。Ｂ．ＰＦ−２２８の有無の下での、粒子に曝露した細胞対対照細胞における、全タンパク質発現レベルに対するリン酸化タンパク質発現レベルの強度変化の割合の概要。
【図４１−２】ＦＡＫ阻害剤ＰＦ−５７３２２８（ＰＦ−２２８）を使用した、Ｍ２１細胞における．シグナル伝達誘導および阻害研究。Ａ．粒子曝露前に２５０ｎＭまたは５００ｎＭ  ＰＦ−２２８を細胞に追加（０．５時間、３７℃）して、図２の上記方法を使用した、リン酸化タンパク質および全タンパク質の発現レベルのウエスタンブロット。Ｂ．ＰＦ−２２８の有無の下での、粒子に曝露した細胞対対照細胞における、全タンパク質発現レベルに対するリン酸化タンパク質発現レベルの強度変化の割合の概要。
【００６７】
【図４２−１】タイムラプスイメージングを使用した、Ｍ２１細胞遊走に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの効果。Ａ．補充培地のみ（対照）と対比した、０．２％ＦＢＳ補充ＲＰＭＩ１６４０培地における一定範囲の粒子濃度（０〜４００ｎＭ；３７℃）での、ＯＲＩＳ（商標）コラーゲンコーティングプレートを使用した、細胞遊走の時間依存性変化。時間ｔ＝０（遊走前）に画像をキャプチャし、続いて、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ倒立顕微鏡（５ｘ／．２５ＮＡ対物レンズ）およびスキャンスライドモジュール（Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ＆Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）によってストッパーを除去した後は２４時間間隔で合計９６時間にわたって画像をキャプチャした。Ｂ．ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用した、濃度に応じた平均閉鎖面積（％）の変化のグラフプロット。平均閉鎖面積は、任意の時点およびストッパー除去後（ｔ＝０）におけるアドバンスセル（ピクセル）の境界によって区切られた面積の差異を、後者の面積で割ったものを表す。各群について、片側ｔ検定を使用して、４回反復のサンプルを統計的に試験した：＊、ｐ＝．０１１；＊＊、ｐ＝．０４９；ｐ＝．０３６。スケールバー＝１００μｍおよび３３μｍ（ｘおよびｘｖの拡大画像）。
【図４２−２】タイムラプスイメージングを使用した、Ｍ２１細胞遊走に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの効果。Ａ．補充培地のみ（対照）と対比した、０．２％ＦＢＳ補充ＲＰＭＩ１６４０培地における一定範囲の粒子濃度（０〜４００ｎＭ；３７℃）での、ＯＲＩＳ（商標）コラーゲンコーティングプレートを使用した、細胞遊走の時間依存性変化。時間ｔ＝０（遊走前）に画像をキャプチャし、続いて、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ倒立顕微鏡（５ｘ／．２５ＮＡ対物レンズ）およびスキャンスライドモジュール（Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ＆Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）によってストッパーを除去した後は２４時間間隔で合計９６時間にわたって画像をキャプチャした。Ｂ．ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用した、濃度に応じた平均閉鎖面積（％）の変化のグラフプロット。平均閉鎖面積は、任意の時点およびストッパー除去後（ｔ＝０）におけるアドバンスセル（ピクセル）の境界によって区切られた面積の差異を、後者の面積で割ったものを表す。各群について、片側ｔ検定を使用して、４回反復のサンプルを統計的に試験した：＊、ｐ＝．０１１；＊＊、ｐ＝．０４９；ｐ＝．０３６。スケールバー＝１００μｍおよび３３μｍ（ｘおよびｘｖの拡大画像）。
【００６８】
【図４３】ＨＵＶＥＣ細胞の遊走に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの効果。Ａ．図４と同じ方法を使用して、２４時間の時間間隔で、連続ＨＵＶＥＣ遊走をアッセイした。表示された画像および示された面積閉鎖値は、１回の実験の代表的なものである。Ｂ．ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、一定範囲の粒子濃度（０〜４００ｎＭ）について、この時間間隔で、平均閉鎖面積（％）を決定した。各濃度および時点について、３回反復のアッセイを実施した。片側ｔ検定＊、Ｐ＜０．０５。スケールバー＝７６μｍ。
【００６９】
【図４４−１】ＰＦ−２２８を使用した、ＨＵＶＥＣ細胞遊走の阻害。Ａ．粒子曝露または０．２％ＦＣＳ補充培地中でのインキュベーション前に、細胞を２５０ｎＭおよび５００ｎＭ  ＰＦ−２２８に曝露（０．５時間、３７℃）した以外は、図５と同じ方法。Ｂ．上記条件下でインキュベートした細胞の平均閉鎖面積（％）。Ｃ．片側ｔ検定を使用した、各曝露条件のｐ値の表集計。各阻害剤濃度について、４回反復のサンプルをランした。スケールバー＝５０μｍ。
【図４４−２】ＰＦ−２２８を使用した、ＨＵＶＥＣ細胞遊走の阻害。Ａ．粒子曝露または０．２％ＦＣＳ補充培地中でのインキュベーション前に、細胞を２５０ｎＭおよび５００ｎＭ  ＰＦ−２２８に曝露（０．５時間、３７℃）した以外は、図５と同じ方法。Ｂ．上記条件下でインキュベートした細胞の平均閉鎖面積（％）。Ｃ．片側ｔ検定を使用した、各曝露条件のｐ値の表集計。各阻害剤濃度について、４回反復のサンプルをランした。スケールバー＝５０μｍ。
【００７０】
【図４５−１】ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットを使用した、Ｍ２１細胞伸展および接着の調節。Ａ．細胞接着および伸展の変化を示すタイムラプスイメージング。粒子（４００ｎＭ）の有無の下、０．２％ＦＢＳ補充ＲＰＭＩ中で細胞をプレインキュベート（０．５時間、２５℃）し、続いて、フィブロネクチンコーティング９６ウェルプレートに播種した（５μｇ／ｍｌ）。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ倒立顕微鏡（２０ｘ／．４ＮＡ対物レンズ）およびＭｅｔａｍｏｒｐｈ（登録商標）のスキャンスライドモジュールを使用して、ｔ＝０、０．５時間、１時間および２時間において、画像をキャプチャした。Ｂ．時間に応じた２群内の円形の細胞および細長い細胞の平均数を示すグラフプロット：非粒子曝露（細長、グラフ＃１）および粒子曝露（円形、グラフ＃２）。最低でも３つの高倍率視野（倍率２００倍）において、９６ウェルプレートの３つの各ウェルの細胞を手動で計測し、平均化した。Ｃ．培地または４００ｎＭ  ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ  Ｃ−ドットに曝露し、メチレンブルー試薬で処理（１ｍｌ、１時間、３７℃）した４％パラホルムアルデヒド固定細胞の、細胞接着の指標としての吸光度（λ＝６５０ｎｍ；ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダー）値。スケールバー＝３０μｍ。各群について、４回反復のサンプルをランした。
【図４５−２】ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットを使用した、Ｍ２１細胞伸展および接着の調節。Ａ．細胞接着および伸展の変化を示すタイムラプスイメージング。粒子（４００ｎＭ）の有無の下、０．２％ＦＢＳ補充ＲＰＭＩ中で細胞をプレインキュベート（０．５時間、２５℃）し、続いて、フィブロネクチンコーティング９６ウェルプレートに播種した（５μｇ／ｍｌ）。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ倒立顕微鏡（２０ｘ／．４ＮＡ対物レンズ）およびＭｅｔａｍｏｒｐｈ（登録商標）のスキャンスライドモジュールを使用して、ｔ＝０、０．５時間、１時間および２時間において、画像をキャプチャした。Ｂ．時間に応じた２群内の円形の細胞および細長い細胞の平均数を示すグラフプロット：非粒子曝露（細長、グラフ＃１）および粒子曝露（円形、グラフ＃２）。最低でも３つの高倍率視野（倍率２００倍）において、９６ウェルプレートの３つの各ウェルの細胞を手動で計測し、平均化した。Ｃ．培地または４００ｎＭ  ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ  Ｃ−ドットに曝露し、メチレンブルー試薬で処理（１ｍｌ、１時間、３７℃）した４％パラホルムアルデヒド固定細胞の、細胞接着の指標としての吸光度（λ＝６５０ｎｍ；ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダー）値。スケールバー＝３０μｍ。各群について、４回反復のサンプルをランした。
【００７１】
【図４６−１】細胞周期に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの影響。Ａ．合計９６時間インキュベートしたＧ０／Ｇ１期同期化Ｍ２１細胞に追加した粒子濃度（０、１００、３００ｎＭ）に応じた、細胞周期のＧ１期、Ｓ期およびＧ２期の生存細胞の割合（％）。各バーの上のイタリック体の数字は、フローサイトメトリーによって決定した、Ｓ期、Ｇ１期およびＧ２期の細胞（粒子インキュベート、対照）の割合を表す。Ｂ．対照（すなわち、粒子なし）条件下で、１００および３００ｎＭ粒子と共にインキュベートした後の細胞の代表的な細胞周期ヒストグラムを示す。一元配置ＡＮＯＶＡ：Ｓ期対照に対して、＊、ｐ＜．０５；＊＊、ｐ＜．００５。挿入図：各細胞周期の群平均値（ｎ＝３）±ＳＤ。実験を３回反復で実施した。
【図４６−２】細胞周期に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの影響。Ａ．合計９６時間インキュベートしたＧ０／Ｇ１期同期化Ｍ２１細胞に追加した粒子濃度（０、１００、３００ｎＭ）に応じた、細胞周期のＧ１期、Ｓ期およびＧ２期の生存細胞の割合（％）。各バーの上のイタリック体の数字は、フローサイトメトリーによって決定した、Ｓ期、Ｇ１期およびＧ２期の細胞（粒子インキュベート、対照）の割合を表す。Ｂ．対照（すなわち、粒子なし）条件下で、１００および３００ｎＭ粒子と共にインキュベートした後の細胞の代表的な細胞周期ヒストグラムを示す。一元配置ＡＮＯＶＡ：Ｓ期対照に対して、＊、ｐ＜．０５；＊＊、ｐ＜．００５。挿入図：各細胞周期の群平均値（ｎ＝３）±ＳＤ。実験を３回反復で実施した。
【００７２】
【図４７】ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットおよびανβ３インテグリン発現細胞を使用した、用量応答効果および飽和結合動態。Ａ、Ｂ．フローサイトメトリーによる、粒子濃度（Ａ）およびインキュベーション時間（Ｂ）に応じた、細胞結合／取り込み。Ｍ２１およびＨＵＶＥＣ細胞の単層を、漸増濃度の粒子（５〜６００ｎＭ）と共にインキュベート（４時間、２５℃）するだけではなく、一定範囲のインキュベーション時間（０．５〜４時間；１００ｎＭ）でもインキュベートし、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析によってアッセイした。検出された全イベントの割合を示す。各データポイントは、３回反復の平均±ＳＤを表す。
【００７３】
【図４８】２つの細胞型における、１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ＣドットおよびｃＲＧＤＹペプチドを用いた、競合インテグリン受容体結合。Ａ．γ計測を使用した、過剰なｃＲＧＤＹペプチドと共にインキュベートした後のＭ２１およびＨＵＶＥＣ細胞に対する１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットの特異的結合。ｃＲＧＤＹペプチド（８５、１７０ｎＭ）の存在下および非存在下で、Ｍ２１およびＨＵＶＥＣ細胞の単層を、２５ｎＭの１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットと共にインキュベート（４時間、２５℃）した。対照（すなわち、放射性ヨウ素化ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドット）に対する割合として結合を表す。Ｂ．腫瘍に対する非放射標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの結合。Ｍ２１およびＨＵＶＥＣ細胞を、２つの濃度のターゲティング粒子（２５ｎＭ、１００ｎＭ）または粒子対照（ＰＥＧ−Ｃドット）と共に２５℃で４時間インキュベートし、フローサイトメトリーによってアッセイした。
【００７４】
【図４９】粒子濃度およびインキュベーション時間に応じた、Ｍ２１およびＨＵＶＥＣ細胞の生存率および増殖。Ａ、Ｂ．それぞれ１０％もしくは２％ＦＢＳ補充培地のみを使用した、または粒子（２５〜２００ｎＭ）を追加した、２４時間にわたる、サブコンフルエントなＧ０／Ｇ１期同期化Ｍ２１（Ａ）およびＨＵＶＥＣ（Ｂ）細胞の生存率の指標としての吸光度（λｅｘ＝４４０ｎｍ）。Ｃ、Ｄ．Ａ、Ｂに詳述されている培地のみまたは粒子含有培地を使用した、９３時間の時間間隔にわたる、Ｍ２１（Ｃ）およびＨＵＶＥＣ（Ｄ）細胞における細胞増殖活性。
【００７５】
【図５０−１】Ｍ２１細胞における、粒子のインキュベーション時間に応じたシグナル伝達の変化。８時間にわたる、選択したリン酸化タンパク質および全タンパク質中間体のウエスタンブロット。正規化した強度比（すなわち、リンタンパク質および全タンパク質の差異を後者で割ったもの）をグラフで示す。
【図５０−２】Ｍ２１細胞における、粒子のインキュベーション時間に応じたシグナル伝達の変化。８時間にわたる、選択したリン酸化タンパク質および全タンパク質中間体のウエスタンブロット。正規化した強度比（すなわち、リンタンパク質および全タンパク質の差異を後者で割ったもの）をグラフで示す。
【００７６】
【図５１】Ｍ２１細胞における、粒子濃度に応じた細胞シグナル伝達調節。一定範囲の粒子濃度（すなわち、０〜４００ｎＭ）にわたる、選択したリン酸化タンパク質および全タンパク質中間体のウエスタンブロット。
【００７７】
【図５２−１】Ｍ２１細胞におけるシグナル伝達阻害研究。Ａ．選択したリン酸化タンパク質および全タンパク質中間体のウエスタンブロット（無血清培地、１００ｎＭ粒子のみ、または２５０ｎＭもしくは５００ｎＭ阻害剤を追加後に１００ｎＭ粒子）。Ｂ．対照細胞（０．２％ＦＢＳ）と比べた、Ａにおけるリンタンパク質およびβ−アクチンブロットの相対強度。
【図５２−２】Ｍ２１細胞におけるシグナル伝達阻害研究。Ａ．選択したリン酸化タンパク質および全タンパク質中間体のウエスタンブロット（無血清培地、１００ｎＭ粒子のみ、または２５０ｎＭもしくは５００ｎＭ阻害剤を追加後に１００ｎＭ粒子）。Ｂ．対照細胞（０．２％ＦＢＳ）と比べた、Ａにおけるリンタンパク質およびβ−アクチンブロットの相対強度。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
発明の詳細な説明
本発明は、がんなどの疾患の正確な検出、特性決定、モニタリングおよび処置を可能にする蛍光シリカ系ナノ粒子を提供する。本発明はまた、腫瘍細胞を検出するための方法を提供する。前記方法は、以下：（ａ）複数の蛍光シリカ系ナノ粒子を、約０．０１ナノモル／ｋｇ体重〜約１ナノモル／ｋｇ体重、約０．０５ナノモル／ｋｇ体重〜約０．９ナノモル／ｋｇ体重、約０．１ナノモル／ｋｇ体重〜約０．９ナノモル／ｋｇ体重、約０．２ナノモル／ｋｇ体重〜約０．８ナノモル／ｋｇ体重、約０．３ナノモル／ｋｇ体重〜約０．７ナノモル／ｋｇ体重、約０．４ナノモル／ｋｇ体重〜約０．６ナノモル／ｋｇ体重または約０．２ナノモル／ｋｇ体重〜約０．５ナノモル／ｋｇ体重の範囲の用量で患者に投与する工程、および（ｂ）前記ナノ粒子を検出する工程を含有し得る。一実施形態では、ナノ粒子は、シリカ系コア内に配置された蛍光化合物を有するシリカ系コア；前記コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル；前記ナノ粒子に結合した有機ポリマー；前記ナノ粒子に結合したリガンドであって、腫瘍マーカーに結合することができるリガンド；および少なくとも１つの治療剤を含む。
【００７９】
ナノ粒子は、約０．１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約０．５ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約２５ｎｍ、約１ｎｍ〜約１５ｎｍまたは約１ｎｍ〜約８ｎｍを含む直径範囲を有する。ナノ粒子は、ナノ粒子内に配置された蛍光化合物を有し、遊離蛍光化合物よりも大きな輝度および蛍光量子収率を有する。ナノ粒子はまた、高い生体安定性および生体適合性を示す。ナノ粒子の効率的な尿排泄を容易にするために、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などの有機ポリマーでそれをコーティングし得る。ナノ粒子の小さなサイズ、シリカ基材および有機ポリマーコーティングは、インビボ投与した場合のナノ粒子の毒性を最小化する。特定の細胞型をターゲティングするために、ナノ粒子は、その特定の細胞型に関連する細胞成分（例えば、細胞膜または他の細胞内成分）、例えば腫瘍マーカーまたはシグナル伝達経路中間体に結合することができるリガンドにさらにコンジュゲートされ得る。一実施形態では、治療剤が、ナノ粒子に付加され得る。光学イメージング（例えば、蛍光イメージング）だけではなく、他のイメージング技術、例えば陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）によってもナノ粒子を検出可能にするために、ナノ粒子はまた、造影剤、例えば放射性核種にコンジュゲートされ得る。
【００８０】
ナノ粒子の特性は、腎臓を介した大量排泄、天然ペプチドリガンドと比べて増加した効力、取り込みの増強、および正常組織と比較して選択的な腫瘍内蓄積につながる。これは、インビボ毒性の欠如と共にユニークな製品をもたらし、臨床解釈をもたらした。
【００８１】
本粒子を使用して、腫瘍を選択的に検出および位置決定し得る。例えば、マイクロドージングレジームで投与されるナノモル用量の粒子トレーサーは、疾患部位に選択的に蓄積および局在するが、ターゲティング検出に最適化されていない。
【００８２】
本ナノ粒子は、有意なＲＥＳ取り込みを伴わずに（例えば、約１０％未満）腎クリアランスが優位である（例えば、ナノ粒子の腎クリアランスは、被験体へのナノ粒子の投与後２４時間以内で約９０％超ＩＤである）区別可能かつ再現可能なヒト薬物動態特性を示し得る。
【００８３】
本ナノ粒子は優れた診断プローブであり、ヒトにおいて、それらが比較的短い時間間隔（例えば、数時間、数日間など）で体を「ターゲティングおよびクリアランス」することを可能にする最適な物理化学的特性を示す。
【００８４】
複数の活性なターゲティングリガンド（例えば、ｃＲＧＤＹおよびα−ＭＳＨ）を有する本粒子は、リガンド単独の親和性と比較して増強した、細胞標的に対する結合親和性を実証する。いくつかの実施形態では、本粒子は、リガンド単独よりも約２〜約２０倍超、約３〜約１５倍超、約５〜約１０倍超の細胞標的に結合する。
【００８５】
特定の実施形態では、デュアルモダリティターゲティング粒子は、転移性黒色腫の大型動物モデルにおいて、腫瘍負荷を特異的に評価し、転移性腫瘍を慢性炎症性疾患と識別し得る。
【００８６】
ターゲティング粒子は、受容体結合親和性およびアビディティを増強し、血漿滞留時間、バイオアベイラビリティおよび腫瘍保持を増加させ、ならびに／またはインターナリゼーションを介した細胞内送達を促進し得る。外科的（または医学的）な腫瘍学の場面におけるこのようなターゲティングプローブの利用は、担がん組織の高度に選択的な処置を可能にして、付随する合併症率を潜在的に減少させ得る。受動的ターゲティングナノ担体は、増強した血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）効果によって腫瘍間質内に浸透して非特異的に蓄積するので、本粒子は、受動的ターゲティングナノ担体よりも有利であり得る。
【００８７】
がん診断のための粒子ベースのイメージングシステムは、比較的迅速な腎クリアランスを示しながら非毒性でなければならず、原発性疾患および転移性疾患の部位を選択的に検出しなければならない。これらの条件下では、血漿濃度−時間曲線下面積がより小さいことを考慮すると、潜在的毒性の可能性は低下するであろう。一実施形態では、これらの腎クリアランス特性は、１０ｎｍ以下の有効腎糸球体ろ過サイズカットオフを満たす超小型粒子ベースのプラットフォームまたは高分子システムによって達成され得る。単回投与による急性毒性がないこと、およびこのようなリスクの最小化も重要である。プラットフォームの設計は、迅速な全身クリアランス、および細網内皮系（ＲＥＳ）における非特異的取り込みを最小化する生物動態プロファイルの選択を通じて安全性を最大化して、潜在的に有害な曝露を減少させなければならない。
【００８８】
一実施形態では、本粒子は、インビボで安全かつ安定である。粒子は、腎排泄によって定義される明確にユニークで再現可能なＰＫ特性を示す。疾患部位におけるプローブの選択的取り込みおよび局在と相まって、これらの粒子は、がん診断に使用され得る。
【００８９】
ナノ粒子は、リガンドおよび造影剤の両方を有し得る。リガンドは、ナノ粒子が、リガンドと細胞成分との間の特異的結合を介して特定の細胞型をターゲティングするのを可能にする。マルチモーダルイメージングと組み合わせたこのターゲティングは、複数の用途を有する。例えば、転移性疾患をマッピングするために（例えば、センチネルリンパ節（ＳＬＮ）のマッピング）、および腫瘍境界または神経構造を同定するために、直接可視化の下で外科医が悪性病変を切除するのを可能にするために、および手術中の合併症を回避するために、ナノ粒子を使用し得る。リガンドはまた、例えば、細胞内環境をアッセイするために、細胞または輸送障壁へのナノ粒子の進入を容易にし得る。
【００９０】
ナノ粒子は、放射標識の有無にかかわらず、リガンドおよび治療剤とカップリングされ得る。放射標識はさらに、セラノスティックプラットフォームを作製するための治療剤として機能し得る。このカップリングは、リガンドと細胞成分との間の特異的結合を介して治療粒子が特定の細胞型に送達されることを可能にする。治療剤のこの特異的結合は、最小の副作用で疾患部位の選択的処置を保証する。
【００９１】
ナノ粒子の構造
本発明の蛍光ナノ粒子は、コア内に配置された蛍光化合物を含むシリカ系コアと、前記コア上のシリカシェルとを含む。シリカシェルは、コアの少なくとも一部を取り囲み得る。あるいは、ナノ粒子はコアのみを有し得、シェルを有しなくてもよい。ナノ粒子のコアは、反応性蛍光化合物および共反応性オルガノシラン化合物の反応生成物を含有し得る。別の実施形態では、ナノ粒子のコアは、反応性蛍光化合物および共反応性オルガノシラン化合物の反応生成物と、シリカとを含有し得る。コアの直径は、約０．０５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約０．１ｎｍ〜約５０ｎｍ、約０．５ｎｍ〜約２５ｎｍ、約０．８ｎｍ〜約１５ｎｍまたは約１ｎｍ〜約８ｎｍであり得る。ナノ粒子のシェルは、シリカ形成化合物の反応生成物であり得る。ナノ粒子のシェルは、一定範囲の層を有し得る。例えば、シリカシェルは、約１〜約２０枚の層、約１〜約１５枚の層、約１〜約１０枚の層または約１〜約５枚の層であり得る。シェルの厚さは、約０．０１ｎｍ〜約９０ｎｍ、約０．０２ｎｍ〜約４０ｎｍ、約０．０５ｎｍ〜約２０ｎｍ、約０．０５ｎｍ〜約１０ｎｍまたは約０．０５ｎｍ〜約５ｎｍの範囲であり得る。
【００９２】
ナノ粒子のシリカシェルは、ナノ粒子の一部のみまたは粒子全体をカバーし得る。例えば、シリカシェルは、ナノ粒子の約１〜約１００％、約１０〜約８０％、約２０〜約６０％または約３０〜約５０％をカバーし得る。シリカシェルは、固体（すなわち、実質的に非多孔性、メソ多孔性、例えば半多孔性）または多孔性のいずれかであり得る。
【００９３】
ナノ粒子の合成
本蛍光ナノ粒子は、蛍光化合物（例えば、反応性蛍光色素）を、オルガノシラン化合物（例えば、共反応性オルガノシラン化合物）に対する反応性部分（限定されないが、マレイミド、ヨードアセトアミド、チオ硫酸塩、アミン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル（ＳＴＰ）エステル、スルホスクシンイミジルエステル、スルホジクロロフェノールエステル、塩化スルホニル、ヒドロキシル、イソチオシアネート、カルボキシを含む）と共有結合させて、蛍光シリカ前駆体を形成する工程、および前記蛍光シリカ前駆体を反応させて蛍光コアを形成する工程；蛍光化合物（例えば、反応性蛍光色素）をオルガノシラン化合物（例えば、共反応性オルガノシラン化合物）と共有結合させて、蛍光シリカ前駆体を形成する工程、および前記蛍光シリカ前駆体をシリカ形成化合物（例えば、テトラアルコキシシラン）と反応させて、蛍光コアを形成する工程；および、得られたコアをシリカ形成化合物（例えば、テトラアルコキシシラン）と反応させて前記コア上にシリカシェルを形成し、蛍光ナノ粒子を得る工程によって合成され得る。
【００９４】
蛍光単分散コア−シェルナノ粒子の合成は、二段階法に基づいている。最初に、近赤外有機色素分子（例えば、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ））をシリカ前駆体に共有結合させ、縮合して、色素リッチコアを形成する。次に、シリカゲルモノマーを追加して、蛍光コア材料周辺に高密度シリカネットワークを形成し、光安定性に有害であり得る溶媒相互作用を遮蔽する。調製経路の多様性は、目的のナノ粒子の用途に応じて、様々な蛍光化合物（例えば、蛍光有機化合物または色素）の組み込みを可能にする。色素リッチコアに組み込まれ得る蛍光化合物は、紫外可視から近赤外までの吸収スペクトルおよび発光スペクトル全体をカバーし得る。米国特許出願第１０／３０６，６１４号、米国特許出願第１０／５３６，５６９号および米国特許出願第１１／１１９，９６９号。Ｗｉｅｓｎｅｒら、ＰＥＧ−ｃｏａｔｅｄ  Ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍａｎｕｆａｃｔｉｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／７４８９４号。
【００９５】
コンパクトなコア−シェルナノ粒子の合成の場合、適切な量のアンモニア、水および溶媒を含有する反応容器に色素前駆体を追加し、一晩反応させる。防湿下における目的の特定の近赤外色素と３−アミノプロピルトリエトキシシランとの間の１：５０のモル比でのさらなる反応によって、色素前駆体を合成する。コンパクトな色素リッチコアの合成が完了した後、続いて、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）を追加して、コアを取り囲むシリカシェルを成長させる。
【００９６】
拡張コア−シェルナノ粒子の合成は、ＴＥＯＳを色素前駆体と共縮合し、混合物を一晩反応させることによって達成される。拡張コアの合成が完了した後、さらなるＴＥＯＳを追加して、コアを取り囲むシリカシェルを成長させる。
【００９７】
均一なナノ粒子の合成は、すべての試薬、色素前駆体およびＴＥＯＳを共縮合し、混合物を一晩反応させることによって達成される。
【００９８】
蛍光化合物
ナノ粒子は、任意の公知の蛍光化合物、例えば蛍光有機化合物、色素、顔料またはそれらの組み合わせが組み込まれ得る。多種多様な適切な化学反応性蛍光色素が公知であり、例えば、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，ｅｄ．（１９９６）を参照のこと。典型的なフルオロフォアは、例えば、蛍光芳香族またはヘテロ芳香族化合物、例えばピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドールまたはベンズインドール、オキサゾールまたはベンゾオキサゾール、チアゾールまたはベンゾチアゾール、４−アミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、シアニン、カルボシアニン、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチレート、アントラニレート、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、クマリン（ヒドロキシクマリンおよびアミノクマリンおよびそれらのフッ素化誘導体を含む）および類似化合物である。例えば、米国特許第５，８３０，９１２号、米国特許第４，７７４，３３９号、米国特許第５，１８７，２８８号、米国特許第５，２４８，７８２号、米国特許第５，２７４，１１３号、米国特許第５，４３３，８９６号、米国特許第４，８１０，６３６号および米国特許第４，８１２，４０９号を参照のこと。一実施形態では、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）色素Ｃｙ５が、本ナノ粒子のシリカコア内に配置される。近赤外発光プローブは、組織減衰の減少および自家蛍光を示す。Ｂｕｒｎｓら、“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｉｌｉｃａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ”，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００９，９（１），４４２−４４８。
【００９９】
本発明で使用され得る非限定的な蛍光化合物としては、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５（Ｃｙ５＋＋としても公知である）、Ｃｙ２、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フィコエリトリン、Ｃｙ７、フルオレセイン（ＦＡＭ）、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５（Ｃｙ３＋＋としても公知である）、テキサスレッド、ライトサイクラーレッド６４０、ライトサイクラーレッド７０５、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、ローダミン、ローダミン誘導体（ＲＯＸ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、ローダミン誘導体ＪＡ１３３、Ａｌｅｘａ蛍光色素（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７）、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヨウ化プロピジウム、ＡＭＣＡ、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、スペクトラムアクア、リサミン、および蛍光遷移金属錯体、例えばユウロピウムが挙げられる。使用され得る蛍光化合物としては、蛍光タンパク質、例えばＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、強化ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質および誘導体（ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、アズライト、ｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質および誘導体（ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔ）ならびに黄色蛍光タンパク質および誘導体（ＹＦＰ、シトリン、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ）も挙げられる。国際公開第２００８１４２５７１号、国際公開第２００９０５６２８２号、国際公開第９９２２０２６号。
【０１００】
ナノ粒子のシリカシェルの表面は、公知の架橋剤を使用して表面官能基を導入することによって改変され得る。架橋剤としては、限定されないが、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミド、アルキルエーテル、糖、ペプチド、ＤＮＡ断片、または他の公知の機能的に等価な薬剤が挙げられる。例えば、カルボジイミド、カルボキシレート、エステル、アルコール、カルバミド、アルデヒド、アミン、硫黄酸化物、窒素酸化物、ハロゲン化物、または当技術分野で公知の任意の他の適切な化合物を使用するカップリング反応を介して、リガンドが、本発明のナノ粒子にコンジュゲートされ得る。米国特許第６，２６８，２２２号。
【０１０１】
有機ポリマー
有機ポリマーが、本ナノ粒子に付加され得る（例えば、ナノ粒子の表面に付加され得る）。有機ポリマーが、本ナノ粒子のシリカシェルに付加され得る。本発明で使用され得る有機ポリマーはとしては、ＰＥＧ、ポリラクテート、ポリ乳酸、糖、脂質、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）およびそれらの組み合わせが挙げられる。ナノ粒子への有機ポリマーの付加は、共有結合または非共有結合によって、例えばイオン結合、水素結合、疎水結合、配位、接着剤および物理吸着などによって達成され得る。一実施形態では、ナノ粒子は、血清タンパク質の吸着を防止し、効率的な尿排泄を容易にし、ナノ粒子の凝集を減少させるＰＥＧと共有結合される。Ｂｕｒｎｓら、“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｉｌｉｃａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ”，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００９，９（１），４４２−４４８。
【０１０２】
ナノ粒子の表面を改変して、少なくとも１つの官能基を組み込み得る。ナノ粒子に結合した有機ポリマー（例えば、ＰＥＧ）を改変して、少なくとも１つの官能基を組み込み得る。例えば、官能基は、マレイミドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルであり得る。官能基の組み込みは、様々なリガンド、造影剤および／または治療剤をナノ粒子に付加することを可能にする。
【０１０３】
リガンド
リガンドが、本ナノ粒子に付加され得る。リガンドは、少なくとも１つの細胞成分に結合することができる。細胞成分は、特定の細胞型に関連するものであり得るか、または特定の細胞型、例えばがん細胞、もしくは特定の組織および臓器に特異的な細胞でレベルが上昇しているものであり得る。したがって、ナノ粒子は特定の細胞型をターゲティングし得、ならびに／または疾患の処置および診断のためのターゲティング送達を提供する。本明細書で使用される用語「リガンド」は、物理的な状態または症状、例えば疾患状態または症状を同定、検出、ターゲティング、モニタリングまたは改変するのに使用され得る分子または実体を指す。例えば、リガンドは、特定の受容体の存在もしくは非存在、特定の受容体の発現レベル、または特定の受容体の代謝レベルを検出するのに使用され得る。リガンドは、例えば、ペプチド、タンパク質、タンパク質断片、ペプチドホルモン、糖（すなわち、レクチン）、バイオポリマー、合成ポリマー、抗原、抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、ナノボディ）、アプタマー、ウイルスまたはウイルス成分、受容体、ハプテン、酵素、ホルモン、化合物、病原体、微生物またはその成分、毒素、ナノ粒子のまたはナノ粒子がそれに結合する場合には分析物の表面特性または組織適合性を変化させるための表面改質剤（例えば、界面活性剤）、およびそれらの組み合わせであり得る。一実施形態では、リガンドは、抗体、例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。別の実施形態では、リガンドは、受容体リガンドである。さらに別の実施形態では、リガンドは、ポリ−Ｌ−リジン（ｐリジン）である。
【０１０４】
抗原が、ナノ粒子に付加され得る。抗原付加ナノ粒子は、ワクチン接種に使用され得る。
【０１０５】
用語「細胞の成分」または「細胞成分」は、例えば、受容体、抗体、ハプテン、酵素、ホルモン、バイオポリマー、抗原、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、微生物、ウイルス、病原体、毒素、それらの組み合わせおよび類似成分を指す。細胞の成分は、細胞上（例えば、膜貫通受容体）または細胞内に位置し得る。一実施形態では、細胞の成分は、腫瘍マーカーである。本明細書で使用される用語「腫瘍マーカー」は、がん細胞では発現または過剰発現しているが、正常細胞では発現または過剰発現していない分子、実体または物質を指す。例えば、特定の受容体の過剰発現は、多くの種類のがんに関連する。ナノ粒子が腫瘍細胞を特異的にターゲティングし得るように、腫瘍マーカーに結合することができるリガンドが、本ナノ粒子の表面にコンジュゲートされ得る。
【０１０６】
リガンドは、直接的にまたはリンカーを介して本ナノ粒子に付加され得る。ナノ粒子へのリガンドの付加は、共有結合または非共有結合によって、例えばイオン結合、水素結合、疎水結合、配位、接着剤および物理吸着などによって達成され得る。リガンドは、ナノ粒子の表面上にコーティングされ得る。リガンドは、ナノ粒子の表面上に吸収され得る。リガンドは、蛍光ナノ粒子の表面に付加され得るか、またはシェルが多孔性であるか、もしくはコアの一部をカバーしている場合にはコアに付加され得る。リンカーを介してリガンドがナノ粒子に付加される場合、リンカーは、官能化ＰＥＧなどの任意の適切な分子であり得る。ＰＥＧは、ナノ粒子およびリガンドに付加するための複数の官能基を有し得る。粒子は、様々な官能基を有する様々な種類の官能化ＰＥＧであって、複数のリガンドに付加され得る官能化ＰＥＧを有し得る。これは、標的部位における多価効果および／またはコントラストを増強し得るので、インビボにおけるターゲティング検出、処置および検知が改善された複雑なマルチモーダルプラットフォームの設計および最適化が可能になる。
【０１０７】
様々な異なるリガンドが、ナノ粒子に付加され得る。例えば、トリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）が、ナノ粒子に付加され得る。あるいは、環状ペプチドｃＲＧＤ（これは、他のアミノ酸、例えばｃＲＧＤＹを含有し得る）が、ナノ粒子に付加され得る。ＲＧＤ配列を含有する任意の直鎖状ペプチド、環状ペプチドまたは分枝状ペプチドは、本発明の範囲内である。ＲＧＤは、血管新生中の活性化内皮細胞および様々な種類の腫瘍細胞の表面で過剰発現しているανβ３インテグリンに結合する。ανβ３インテグリンの発現レベルは、腫瘍の浸潤性とよく相関することが示されている。Ｒｕｏｓｌａｈｔｉら、Ｎｅｗ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ：ＲＧＤ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８７；２３８：４９１．Ｇｌａｄｓｏｎら、Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ  ｖ  ｂｅｔａ  ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ．Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９１；８８：１９２４−１９３２．Ｓｅｆｔｏｒら、Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ  ｖ  ｂｅｔａ  ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９２；８９：１５５７−１５６１。
【０１０８】
合成ペプチドＥＰＰＴ１は、ナノ粒子に付加されるリガンドであり得る。モノクローナル抗体（ＡＳＭ２）の結合部位に由来するＥＰＰＴ１は、グリコシル化不十分なＭＵＣ１（ｕＭＵＣ１）をターゲティングする。正常組織では、膜貫通受容体ＭＵＣ１は重度にグリコシル化されている；しかしながら、ほぼすべてのヒト上皮細胞腺癌では、それは過剰発現しており、異常にグリコシル化不十分であり、腫瘍発症に関与する。Ｍｏｏｒｅら、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｕｎｄｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ＭＵＣ−１  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４；６４：１８２１−７．Ｐａｔｅｌら、ＭＵＣ  １  ｐｌａｙｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｉｎ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｔｈｒｙｒｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｓｕｒｇｅｒｙ．２００５；１３８：９９４−１００１。あるいは、ｕＭＵＣ１をターゲティングするために、ｕＭＵＣ１に対する特異的抗体（モノクローナル抗体を含む）がナノ粒子にコンジュゲートされ得る。
【０１０９】
一実施形態では、α−メラノトロピン刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）のペプチド類似体は、ナノ粒子に付加されるリガンドである。α−ＭＳＨのペプチド類似体は、メラノコルチン−１受容体（ＭＣ１Ｒ）（黒色腫細胞で過剰発現しているＧタンパク質共役型受容体のファミリー）に結合することができる。Ｌｏｉｒら、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｎｏｉｓｙ−ｌｅ−ｇｒａｎｄ）１９９９，４５：１０８３−１０９２。
【０１１０】
別の実施形態では、オクトレオテート（１４アミノ酸のソマトスタチンのペプチド類似体）は、ナノ粒子に付加されるリガンドである。ソマトスタチンよりも長い半減期を有するオクトレオチドは、ソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ）に結合することができる。ＳＳＴＲ（Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーのメンバー）は、いくつかのヒト腫瘍の表面上で過剰発現している。Ｒｅｕｂｉら、Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ−Ｔｉｓｓｕｅ．Ｍｅｔａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．１９９０；３９：７８−８１．Ｒｅｕｂｉら、Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌ  ｖｅｓｓｅｌｓ．Ｍｅｔａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．１９９６；４５：３９−４１。あるいは、ＳＳＴＲ、例えばＴｙｒ３−オクトレオチド（Ｙ３−ＯＣ）、オクトレオテート（ＴＡＴＥ）、Ｔｙｒ３−オクトレオテート（Ｙ３−ＴＡＴＥ）および１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ＯＣをターゲティングするために、他のソマトスタチン類似体がナノ粒子にコンジュゲートされ得る。これらのソマトスタチン類似体は、がんのＰＥＴ診断イメージングおよびターゲティング放射線治療の両方に利用され得る。ｄｅ  Ｊｏｎｇら、Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ［ＤＴＰＡ０］ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ［ＤＯＴＡ０，Ｔｙｒ３］ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ：ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９８；１９：２８３−８．ｄｅ  Ｊｏｎｇら、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ１１１Ｉｎ−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｕｍｏｒ  Ｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９８；５８：４３７−４１．Ｌｅｗｉｓら、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｆｏｕｒ６４Ｃｕ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ａｎａｌｏｇｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ：ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ＰＥＴ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １９９９；４２：１３４１−７．Ｋｒｅｎｎｉｎｇら、Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｄｉｕｍ−１  １  １−ＤＴＰＡ−Ｄ−Ｐｈｅ−ｌ−Ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ  ｉｎ  Ｍａｎ：Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｉｏｄｉｎｅ−１２３−Ｔｙｒ−３−Ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ．Ｊ  Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ  １９９２；３３：６５２−８。
【０１１１】
センチネルリンパ節（ＳＬＮ）をマッピングするために、様々なリガンドが使用され得る。ＳＬＮマッピングは、がんの診断、病期分類および処置に使用され得る。Ｊ５９１は、抗前立腺特異的膜抗原（すなわち、抗ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体である。Ｊ５９１は、前立腺がんを検出および病期分類するのにこれまで使用されていた。Ｔａｇａｗａら、Ａｎｔｉ−ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂａｓｅｄ  ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ，２０１０，１  １６（４  Ｓｕｐｐｌ）：１０７５−８３．Ｂａｎｄｅｒら、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｊ５９１  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  １７０（５），１７１７−１７２１（２００３）．Ｗｅｒｎｉｃｋｅら、（２０１１）Ｐｒｏｓｔａｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ａｓ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｎｏｖｅｌ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ，Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．２０１１；１３５：１４８６−１４８９。Ｊ５９１のＦ（ａｂ’）２断片は、本ナノ粒子に付加されるリガンドとして使用され得る。また、デュアルモダリティプローブを作製するために、ナノ粒子は放射標識され得る。一実施形態では、Ｊ５９１のＦ（ａｂ’）２断片（例えば、ＨｕＪ５９１−Ｆ（ａｂ’）２断片またはヒト化Ｊ５９１−Ｆ（ａｂ’）２断片）を有するナノ粒子は、前立腺がんまたは子宮内膜がん（例えば、子宮内膜子宮内膜腺癌）を診断するために使用される。別の実施形態では、Ｊ５９１のＦ（ａｂ’）２断片を有するナノ粒子は、処置、疾患進行のモニタリングのために、脳腫瘍血管新生をターゲティングするために使用され得る。高悪性度神経膠腫の切除標本の過去の免疫組織化学評価から示されているように、脳の腫瘍新生血管は、ＰＳＭＡを過剰発現することが見出されている。
【０１１２】
配列ＨＷＧＦを含有する環状ペプチドは、いくつかの他のＭＭＰファミリーメンバーではなくＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の強力かつ選択的な阻害剤である。ペプチドＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣは、ヒト内皮細胞および腫瘍細胞の遊走を阻害する。また、それは、動物モデルにおける腫瘍の成長および浸潤を防止し、ヒト腫瘍担持マウスの生存を改善する。ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣを提示するファージは、インビボにおける血管新生血管を特異的にターゲティングする。このペプチドおよびその伸長体ＧＲＥＮＹＧＨＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣまたはＧＲＥＮＹＧＨＣＴＴＨＷＧＦＴＬＳは、本ナノ粒子に付加されるべきリガンドとして使用され得る。これらのペプチドも放射標識（例えば、放射性ヨウ素標識）され得る。Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７，７６８−７７４（１９９９）．Ｐｅｎａｔｅ  Ｍｅｄｉｎａら、Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ＭＭＰ−２−ａｎｄ  ＭＭＰ−９−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ，Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１１（２０１１），Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  １６０５１５．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：４１０１−４１０６（２００５）。一実施形態では、１２４Ｉ標識マトリックスメタロプロテアーゼペプチド阻害剤（ＭＭＰＩ）が結合したナノ粒子は、子宮内膜がんを病期分類するためのＳＬＮマッピングに使用される。
【０１１３】
ナノ粒子に付加されるリガンドの数は、約１〜約３０個、約１〜約２０個、約２〜約１５個、約３〜約１０個、約１〜約１０個または約１〜約６個の範囲であり得る。ナノ粒子に付加されるリガンドの数が少ないほど、腎クリアランスカットオフサイズ範囲を満たす本ナノ粒子の流体力学的直径を維持するのに役立つ。Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄら、Ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ，１４：７１−９，２０１０。測定されるリガンドの数は、複数のナノ粒子に結合したリガンドの平均数であり得る。あるいは、結合したリガンドの数を決定するために、１個のナノ粒子を測定し得る。ナノ粒子に結合したリガンドの数は、任意の適切な方法（これは、リガンドの特性に関係するものでもよいし、または関係しないものでもよい）によって測定され得る。例えば、粒子に結合されたｃＲＧＤペプチドの数は、粒子の絶対濃度およびｃＲＧＤペプチド用試薬の開始濃度のＦＣＳベース測定を使用して推定され得る。ナノ粒子当たりのＲＧＤペプチドの平均数、および官能化ＰＥＧ基へのＲＧＤのカップリング効率は、アルカリ性条件下で比色分析により、およびビウレット分光光度法で評価され得る。ナノ粒子に結合したリガンドの数はまた、他の適切な方法によって測定され得る。
【０１１４】
造影剤
医学的イメージングまたは生物学的イメージングの場合、造影剤が、本ナノ粒子に付加され得る。本明細書で使用される用語「造影剤」は、医学的イメージングまたは生物学的イメージングにおいて、構造または流体の可視性を高めるのに使用される物質、分子または化合物を指す。用語「造影剤」はまた、コントラスト生成分子を指す。本発明によって包含されるイメージング技術としては、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、光学生物発光イメージング、光学蛍光イメージングおよびそれらの組み合わせが挙げられる。本発明によって包含される造影剤は、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＣＴ、ＭＲＩおよび光学イメージングについて当技術分野で公知の任意の分子、物質または化合物であり得る。造影剤は、放射性核種、放射性金属、陽電子放射体、β放射体、γ放射体、α放射体、常磁性金属イオンおよび超常磁性（ｓｕｐｒａｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ）金属イオンであり得る。造影剤としては、限定されないが、ヨウ素、フッ素、銅、ジルコニウム、ルテチウム、アスタチン、イットリウム、ガリウム、インジウム、テクネチウム、ガドリニウム、ジスプロシウム、鉄、マンガン、バリウムおよび硫酸バリウムが挙げられる。本発明のナノ粒子に付加される造影剤として使用され得る放射性核種としては、限定されないが、８９Ｚｒ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、１２４Ｉおよび１７７Ｌｕが挙げられる。
【０１１５】
造影剤は、ナノ粒子に直接的にコンジュゲートされ得る。あるいは、リンカーまたはキレートに付加することによって、造影剤は、ナノ粒子に間接的にコンジュゲートされ得る。キレートは、放射性核種に結合するように適合され得る。本ナノ粒子に付加され得るキレートとしては、限定されないが、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）およびトリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）が挙げられ得る。
【０１１６】
本ナノ粒子をイメージング、検出、記録または測定するための適切な手段としては、例えば、フローサイトメーター、レーザー走査サイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダー、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、明視野顕微鏡、ハイコンテントスキャニングシステムおよび類似デバイスも挙げられ得る。複数のイメージング技術を同時にまたは連続的に使用して、本ナノ粒子を検出し得る。一実施形態では、高感度ハイスループットスクリーニングツールとして光学イメージングを使用して、同じ被験体における複数の時点を取得し、腫瘍マーカーレベルの半定量的評価を可能にする。これは、ＰＥＴで得られる比較的低い時間分解能を補うが、体積測定データを取得するのに十分な深さの浸透を達成するために、ならびに疾患進行または改善を評価し、適切な処置プロトコールに患者を分類する手段として、受容体および／または他の細胞マーカーレベルの変化を検出、定量およびモニタリングするために、ＰＥＴは必要である。
【０１１７】
治療剤
例えば、疾患のターゲティング処置の場合、治療剤が、蛍光ナノ粒子に付加され得る。治療剤は、疾患部位に高特異的または局所的に送達されて、その疾患部位で治療剤が放出され得る。あるいは、治療剤は放出されなくてもよい。リガンドとコンジュゲートされた蛍光ナノ粒子は、様々な系の所望の位置、例えば細胞もしくは細胞成分の上もしくは細胞もしくは細胞成分の内、生物（例えば、ヒト）の体内に、または血液脳関門を通じて治療剤をターゲティング送達するのに使用され得る。
【０１１８】
治療剤は、ナノ粒子に直接的または間接的に付加され得る。治療剤は、シリカシェルの間隙または孔内に吸収され得るか、または蛍光ナノ粒子のシリカシェル上にコーティングされ得る。シリカシェルが表面全体をカバーしていない他の実施形態では、治療剤は、例えば、物理吸着によって、または結合相互作用によって蛍光コアに結合され得る。治療剤は、蛍光ナノ粒子に付加されるリガンドに結合され得る。治療剤はまた、有機ポリマーまたは造影剤に結合され得る。例えば、治療剤は、ＰＥＧを介してナノ粒子に付加され得る。ＰＥＧは、ナノ粒子および治療剤に付加するための複数の官能基を有し得る。粒子は、複数の治療剤に付加され得る様々な官能基を有する様々な種類の官能化ＰＥＧを有し得る。治療剤は、ナノ粒子に共有結合または非共有結合され得る。
【０１１９】
本明細書で使用される用語「治療剤」は、ヒトまたは他の動物における疾患の診断、治癒、緩和、処置または予防に使用され得る物質である。このような治療剤としては、ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｈｏｍｅｏｐａｔｈｉｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ、ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙで認可されている物質またはそれらのサプリメントが挙げられる。
【０１２０】
本発明の蛍光ナノ粒子またはリガンド蛍光ナノ粒子に組み込まれ得る治療剤としては、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、オリゴペプチド、ポリペプチド、抗体、ＣＯＸ−２阻害薬、アポトーシスプロモーター、尿路用薬、膣用薬、血管拡張薬、神経変性薬（例えば、パーキンソン病）、肥満症用薬、眼科用薬、骨粗鬆症薬、副交感神経遮断薬、副交感神経興奮薬、抗麻酔薬、プロスタグランジン、精神療法用薬、呼吸器用薬、鎮静薬、催眠薬、皮膚および粘膜用薬、抗菌薬、抗真菌薬、抗腫瘍薬、心臓保護薬、心臓血管用薬、抗血栓薬、中枢神経刺激薬、コリンエステラーゼ阻害薬、避妊薬、ドーパミン受容体アゴニスト、勃起不全用薬、排卵誘発剤、胃腸薬、痛風薬、ホルモン、免疫調節薬、適切に官能化された鎮痛薬または全身もしくは局所麻酔薬、抗痙攣薬、抗糖尿病薬、抗線維薬、抗感染症薬、動揺病薬、筋弛緩薬、免疫抑制薬、偏頭痛用薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、禁煙用薬、または交感神経遮断薬が挙げられる（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５５ｔｈ  ｅｄ．，２００１，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．，ｐａｇｅｓ  ２０１−２０２を参照のこと）。
【０１２１】
本ナノ粒子に付加され得る治療剤としては、限定されないが、ＤＮＡアルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、小胞体ストレス誘導剤、プラチナ化合物、代謝拮抗物質、ビンカアルカロイド、タキサン、エポチロン、酵素阻害物質、受容体拮抗剤、治療抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、ホウ素放射線増感剤（すなわち、ベルケイド）および化学療法的併用治療薬が挙げられる。
【０１２２】
ＤＮＡアルキル化剤の非限定的な例は、メクロレタミン、シクロホスファミド（イホスファミド、トロホスファミド）、クロラムブシル（メルファラン、プレドニムスチン）、ベンダムスチン、ウラムスチンおよびエストラムスチンなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（セムスチン）、フォテムスチン、ニムスチン、ラニムスチンおよびストレプトゾシンなどのニトロソウレア；ブスルファン（マンノスルファン、トレオスルファン）などのアルキルスルホン酸塩；カルボコン、チオテパ、トリアジコン、トリエチレンメラミンなどのアジリジン；ヒドラジン（プロカルバジン）；ダカルバジンおよびテモゾロマイドなどのトリアジン；アルトレタミンおよびミトブロニトールである。
【０１２３】
トポイソメラーゼＩ阻害剤の非限定的な例としては、Ｐｏｍｍｉｅｒ  Ｙ．（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ６（１０）：７８９−８０２および米国特許出願第２００５１０２５０８５４号に記載されているように、ＣＰＴ−１１（イリノテカン）、ＳＮ−３８、ＡＰＣ、ＮＰＣ、カンプトテシン、トポテカン、エキサテカンメシラート、９−ニトロカンプトセシン、９−アミノカンプトセシン、ルートテカン、ルビテカン、シラテカン、ジャイマテカン、ジフロモテカン、エキサテカン、ＢＮ−８０９２７、ＤＸ−８９５１ｆおよびＭＡＧ−ＣＰＴを含むカンプトテシン誘導体；Ｌｉら、（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９（２４）：７１０７−７１１６およびＧａｔｔｏら、（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５（１２）：２７９５−２８００に記載されているように、ベルベリンおよびコラリンを含むプロトベルベリンアルカロイドおよびその誘導体；Ｍａｋｈｅｙら、（２００３）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１１（８）：１８０９−１８２０に記載されているように、ベンゾ［ｉ］フェナントリジン、ニチジンおよびファガロニンを含むフェナントロリン誘導体；Ｘｕ（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７（１０）：３５５８−３５６６に記載されているように、ターベンズイミダゾールおよびその誘導体；ならびに、Ｆｏｇｌｅｓｏｎｇら、（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３０（２）：１２３−］２５，Ｃｒｏｗら、（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７（１９）：３１９１３１９４およびＣｒｅｓｐｉら、（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１３６（２）：５２１−８に記載されているように、ドキソルビシン、ダウノルビシンおよびミトキサントロンを含むアントラサイクリン誘導体が挙げられる。トポイソメラーゼＩＩ阻害剤としては、限定されないが、エトポシドおよびテニポシドが挙げられる。デュアルトポイソメラーゼＩおよびＩＩ阻害剤としては、限定されないが、Ｄｅｎｎｙ  ａｎｄ  Ｂａｇｕｌｅｙ（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３（３）：３３９−３５３に記載されているように、サイントピンおよび他のナフタセンジオン、ＤＡＣＡおよび他のアクリジン−４−カルボキサミド、イントプリシンおよび他のベンゾピリドインドール、ＴＡＳ−Ｉ０３および他の７Ｈ−インデノ［２，ｌ−ｃ］キノリン−７−ノン、ピラゾロアクリジン、ＸＲ１１５７６および他のベンゾフェナジン、ＸＲ５９４４および他の二量体化合物、７−オキソ−７Ｈ−ジベンズ［ｆ，ｉｊ］イソキノリンおよび７−オキソ−７Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピリミジン、およびアントラセニル−アミノ酸コンジュゲートが挙げられる。限定されないが、アントラサイクリン（アクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アムルビシン、ピラルビシン、バルルビシン、ゾルビシン）およびアントラキノン（ミトキサントロンおよびピキサントロン）などのいくつかの薬剤は、トポイソメラーゼＩＩを阻害し、ＤＮＡ挿入活性を有する。
【０１２４】
小胞体ストレス誘導剤の例としては、限定されないが、ジメチルセレコキシブ（ＤＭＣ）、ネルフィナビル、セレコキシブおよびホウ素放射線増感剤（すなわち、ベルケイド（ボルテゾミブ））が挙げられる。
【０１２５】
プラチナ系合成物の非限定的な例としては、カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、四硝酸トリプラチン、サトラプラチン、アロプラチン、ロバプラチンおよびＪＭ−２１６が挙げられる（ＭｃＫｅａｇｅら、（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１：１２３２−１２３７および一般にはＣＨＥＭＯＴＨＥＲＡＰＹ  ＦＯＲ  ＧＹＮＥＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＮＥＯＰＬＡＳＭ，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＡＮＤ  ＮＯＶＥＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ，ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ａｎｇｉｏｌｉら、Ｅｄｓ．，２００４を参照のこと）。
【０１２６】
代謝拮抗剤の非限定的な例としては、葉酸ベースのもの、すなわちジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、例えばアミノプテリン、メトトレキサートおよびペメトレキセド；チミジル酸シンターゼ阻害剤、例えばラルチトレキセド、ペメトレキセド；プリンベースのもの、すなわちアデノシンデアミナーゼ阻害剤、例えばペントスタチン、チオプリン、例えばチオグアニンおよびメルカプトプリン、ハロゲン化／リボヌクレオチド還元酵素阻害剤、例えばクラドリビン、クロファラビン、フルダラビンまたはグアニン／グアノシン：チオプリン、例えばチオグアニン；または、ピリミジンベースのもの、すなわちシトシン／シチジン：脱メチル化剤、例えばアザシチジンおよびデシタビン、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、例えばシタラビン、リボヌクレオチド還元酵素阻害剤、例えばゲムシタビン、またはチミン／チミジン：チミジル酸シンターゼ阻害剤、例えばフルオロウラシル（５−ＦＵ）が挙げられる。５−ＦＵの等価物としては、例えばＰａｐａｍｉｃｈｅａｌ（１９９９）Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ４：４７８−４８７に記載されているように、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン（ドキシフルリジン）、ｌ−テトラヒドロフラニル−５−フルオロウラシル（フトラフル）、カペシタビン（ゼローダ）、Ｓ−Ｉ（テガフールと、２つの調節剤、５−クロロ−２，４−ジヒドロキシピリジンおよびオキソン酸カリウムとからなるＭＢＭＳ−２４７６１６）、ラリチトレキセド（トミュデックス）、ノラトレキセド（チミタック、ＡＧ３３７）、ＬＹ２３１５１４およびＺＤ９３３１などのプロドラッグ、類似体およびその誘導体が挙げられる。
【０１２７】
ビンカアルカロイドの例としては、限定されないが、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンフルニン、ビンデシンおよびビノレルビンが挙げられる。
【０１２８】
タキサンの例としては、限定されないが、ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセルおよびテセタキセルが挙げられる。エポチロンの例は、イクサベピロンである。
【０１２９】
酵素阻害剤の例としては、限定されないが、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（チピファルニブ）；ＣＤＫ阻害剤（アルボシジブ、セリシクリブ）；プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブ）；ホスホジエステラーゼ阻害剤（アナグレリド；ロリプラム）；ＩＭＰデヒドロゲナーゼ阻害剤（チアゾフリン）；およびリポキシゲナーゼ阻害剤（マソプロコール）が挙げられる。受容体アンタゴニストの例としては、限定されないが、ＥＲＡ（アトラセンタン）；レチノイドＸ受容体（ベキサロテン）；および性ステロイド（試験ラクトン）が挙げられる。
【０１３０】
治療抗体の例としては、限定されないが、抗ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ（セツキシマブ、パニツムマブ）；抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｅｒｂＢ２）受容体（トラスツズマブ）；抗ＥｐＣＡＭ（カツマキソマブ、エドレコロマブ）、抗ＶＥＧＦ−Ａ（ベバシズマブ）；抗ＣＤ２０（リツキシマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ）；抗ＣＤ５２（アレムツズマブ）；および抗ＣＤ３３（ゲムツズマブ）が挙げられる。米国特許第５，７７６，４２７号および米国特許第７，６０１，３５５号。
【０１３１】
チロシンキナーゼ阻害剤の例としては、限定されないが、ＥｒｂＢ：ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ（エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、バンデタニブ、スニチニブ、ネラチニブ）；ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ラパチニブ、ネラチニブ）；ＲＴＫクラスＩＩＩ：Ｃ−Ｋｉｔ（アキシチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ）、ＦＬＴ３（レストールチニブ）、ＰＤＧＦＲ（アキシチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ）；およびＶＥＧＦＲ（バンデタニブ、セマクサニブ、セディラニブ、アキシチニブ、ソラフェニブ）；ｂｃｒ−ａｂｌ（イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ）；Ｓｒｃ（ボスチニブ）およびヤヌースキナーゼ２（レストールチニブ）の阻害剤が挙げられる。
【０１３２】
本ナノ粒子に付加され得る化学療法剤としては、アムサクリン、トラベクテジン、レチノイド（アリトレチノイン、トレチノイン）、三酸化ヒ素、アスパラギン枯渇剤アスパラギナーゼ／ペガスパルガーゼ、セレコキシブ、デメコルシン、エレスクロモール、エルサミトルシン、エトグルシド、ロニダミン、ルカントン、ミトグアゾン、ミトタン、オブリメルセン、テムシロリムスおよびボリノスタットも挙げられ得る。
【０１３３】
本発明の蛍光ナノ粒子に連結、ライゲーションまたは結合され得る特定の治療剤の例は、フロモキセフ；フォーチミシン；ゲントマイシン；グルコスルホンソラスルホン；グラミシジンＳ；グラミシジン；グレパフロキサシン；グアメサイクリン；ヘタシリン；イセパマイシン；ジョサマイシン；カナマイシン；フロモキセフ；フォーチミン；ゲントマイシン；グルコスルホンソラスルホン；グラミシジンＳ；グラミシジン；グレパフロキサシン；グアメサイクリン；ヘタシリン；イセパマイシン；ジョサマイシン；カナマイシン；バシトラシン；バンバーマイシン；ビアペネム；ブロデモプリム；ブチロシン；カプレオマイシン；カルベニシリン；カルボマイシン；カルモナム；セファドロキシル；セファマンドール；セファトリジン；セフブペラゾン；セフクリジン；セフジニル；セフジトレン；セフェピム；セフェタメト；セフィキシム；セフメノキシム；セフミノクス；クラドリビン；アパラシリン；アピシクリン；アプラマイシン；アルベカシン；アスポキシシリン；アジダムフェニコール；アズトレオナム；セフォジジム；セフォニシド；セフォペラゾン；セフォラニド；セフォタキシム；セフォテタン；セフォチアム；セフォゾプラン；セフピミゾール；セフピラミド；セフピロム；セフプロジル；セフロキサジン；セフテラム；セフチブテン；セフゾナム；セファレキシン；セファログリシン；セファロスポリンＣ；セフラジン；クロラムフェニコール；クロルテトラサイクリン；クリナフロキサシン；クリンダマイシン；クロモサイクリン；コリスチン；シクラシリン；ダプソン；デメクロサイクリン；ジアチモスルホン；ジベカシン；ジヒドロストレプトマイシン；６−メルカプトプリン；チオグアニン；カペシタビン；ドセタキセル；エトポシド；ゲムシタビン；トポテカン；ビノレルビン；ビンクリスチン；ビンブラスチン；テニポシド；メルファラン；メトトレキセート；２−ｐ−スルファニリアニリノエタノール；４，４’−スルフィニルジアニリン；４−スルファニルアミドサリチル酸；ブトルファノール；ナルブフィン；ストレプトゾシン；ドキソルビシン；ダウノルビシン；プリカマイシン；イダルビシン；マイトマイシンＣ；ペントスタチン；ミトキサントロン；シタラビン；リン酸フルダラビン；ブトルファノール；ナルブフィン；ストレプトゾシン；ドキソルビシン；ダウノルイビシン；プリカマイシン；イダルビシン；マイトマイシンＣ；ペントスタチン；ミトキサントロン；シタラビン；リン酸フルダラビン；アセジアスルホン；アセトスルホン；アミカシン；アンホテリシンＢ；アンピシリン；アトルバスタチン；エナラプリル；ラニチジン；シプロフロキサシン；プラバスタチン；クラリスロマイシン；シクロスポリン；ファモチジン；リュープロライド；アシクロビル；パクリタキセル；アジスロマイシン；ラミブジン；ブデソニド；アルブテロール；インジナビル；メトホルミン；アレンドロネート；ニザチジン；ジドブジン；カルボプラチン；メトプロロール；アモキシシリン；ジクロフェナク；リシノプリル；セフトリアキソン；カプトプリル；サルメテロール；キシナホ酸；イミペネム；シラスタチン；ベナゼプリル；セファクロル；セフタジジム；モルヒネ；ドーパミン；ビアラミコール；フルバスタチン；フェナミジン；ポドフォリン酸２−エチルドラジン；アクリフラビン；クロロアゾジン；アルスフェナミン；アミカルビリド；アミノキヌリド；キナプリル；オキシモルフォン；ブプレノルフィン；フロクスウリジン；ジリスロマイシン；ドキシサイクリン；エノキサシン；エンビオマイシン；エピシリン；エリスロマイシン；ロイコマイシン；リンコマイシン；ロメフロキサシン；ルセンソマイシン；リメサイクリン；メクロサイクリン；メロペネム；メタサイクリン；ミクロノマイシン；ミデカマイシン；ミノサイクリン；モキサラクタム；ムピロシン；ナジフロキサシン；ナタマイシン；ネオマイシン；ネチルマイシン；ノルフロキサシン；オレアンドマイシン；オキシテトラサイクリン；ｐ−スルファニリルベンジルアミン；パニペネム；パロモマイシン；バズフロキサシン；ペニシリンＮ；ピパサイクリン；ピペミド酸；ポリミキシン；プリマイシン；キナシリン；リボスタマイシン；リファミド；リファンピン；リファマイシン；ＳＶ；リファペンチン；リファキシミン；リストセチン；リチペネム；ロキタマイシン；ロリテトラサイクリン；ロサラマイシン；ロキシスロマイシン；サラゾスルファジミジン；サンサイクリン；シソマイシン；スパルフロキサシン；スペクチノマイシン；スピロマイシン；ストレプトマイシン；スクシスルホン；スルファクリソイジン；スルファロクス酸；スルファミドクリソイジン；スルファニル酸；スルフォキソン；テイコプラニン；テマフロキサシン；テモシリン；テトロキソプリム；チアンフェニコール；チアゾスルホン；チオストレプトン；チカルシリン；チゲモナム；トブラマイシン；トスフロキサシン；トリメトプリム；トロスペクトマイシン；トロバフロキサシン；ツベラクチノマイシン；バンコマイシン；アザセリン；カンジシジン；クロルフェネシン；デルモスタチン；フィリピン；フンギクロミン；メパルトリシン；ニスタチン；オリゴマイシン；ペリマイシンＡ；ツベルシジン；６−アザウリジン；６−ジアゾー５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン；アクラシノマイシン；アンシタビン；アントラマイシン；アザシタジン；アザセリン；ブレオマイシン；ビスクマセタートエチル；エチリデン・ジクマロール；イロプロスト；ラミフィバン；タプロステン；チオクロマロール；チロフィバン；アミプリロース；ブシラミン；グスペリムス；ゲンチジン酸；グルカメタシン；サリチル酸グリコール；メクロフェナム酸；メフェナム酸；メサラミン；ニフルム酸；オルサラジン；オキサセプロール；Ｓ−エノシルメチオニン；サリチル酸；サルサラート；スルファサラジン；トルフェナム酸；カルビシン；カルジノフィリンＡ；クロロゾトシン；クロモマイシン；デノプテリン；ドキシフルリジン；エダトレキサート；エフロルニチン；エリプチニウム；エノシタビン；エピルビシン；マンノムスチン；メノガリル；ミトブロニトール；ミトラクトール；モピダモール；マイコフェノール酸；ノガラマイシン；オリボマイシン；ペプロマイシン；ピラルビシン；ピリトレキシム；プレドニムスチン；プロカルバジン；プテロプテリン；ピューロマイシン；ラニムスチン；ストレプトニグリン；チアミプリン；マイコフェノール酸；プロコダゾール；ロムルチド；シロリムス（ラパマイシン）；タクロリムス；ブテタミン；フェナルコミン；ヒドロキシテトラカイン；ナエパイン；オルトカイン；ピリドカイン；サリチルアルコール；３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸；アセクロフェナク；アルミノプロフェン；アンフェナク；プロンフェナク；ブロモサリゲニン；ブマジゾン；カルプロフェン；ジクロフェナク；ジフルニサル；ジタゾール；エンフェナム酸；エトドラク；エトフェナマート；フェンドサール；フェプラジノール；フルフェナム酸；トミュデックス（登録商標）（Ｎ−［［５−［［（１，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソ−６−キナゾリニル）メチル］メチルアミノ］−２−チエニル］カルボニル］−Ｌ−グルタミン酸）；トリメトレキサート；ツベルシジン；ウベニメクス；ビンデシン；ゾルビシン；アルガトロバン；クメタロールまたはジクマロールである。
【０１３４】
さらなる治療剤のリストは、例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５５ｔｈ  ｅｄ．，２００１，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．；ＵＳＰＮ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ＵＳ  ＡＮ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｎａｍｅｓ，２０００，Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．；およびＴｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，１２ｔｈ  ｅｄ．，１９９６，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｎ．Ｊに見られ得る。
【０１３５】
本ナノ粒子がターゲティング放射線治療で使用される場合、治療剤は放射性核種も含み得る。一実施形態では、１７７Ｌｕキレート化構築物などの低エネルギーβ放出放射性核種がナノ粒子に結合され、比較的小さな腫瘍負荷または微小転移疾患を処置するのに使用される。別の実施形態では、イットリウム−９０（９０Ｙ）などのより高いエネルギーβ放射体は、より大きな腫瘍負荷を処置するのに使用され得る。ヨウ素−１３１（１３１Ｉ）も放射線治療に使用され得る。
【０１３６】
ナノ粒子の表面を改変して、少なくとも１つの官能基を組み込み得る。ナノ粒子に結合した有機ポリマー（例えば、ＰＥＧ）を改変して、少なくとも１つの官能基を組み込み得る。例えば、官能基は、マレイミドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルであり得る。官能基の組み込みは、様々なリガンド、造影剤および／または治療剤をナノ粒子に付加することを可能にする。
【０１３７】
一実施形態では、治療剤は、ＮＨＳエステル官能基を介してナノ粒子（表面または有機ポリマーコーティング）に付加される。例えば、チロシンキナーゼ阻害剤、例えばダサチニブ（ＢＭＳ）または化学療法剤（例えば、タキソール）は、エステル結合を介してナノ粒子にカップリングされ得る。次いで、このエステル結合は、酸性環境でまたはインビボで酵素的に切断され得る。このアプローチは、インビボで粒子から薬物が放出される場所において、プロドラッグを被験体に送達するのに使用され得る。
【０１３８】
本発明者らは、小分子阻害剤ダサチニブをナノ粒子のＰＥＧ分子とカップリングすることによって、プロドラッグアプローチを試験した。生体内分布の結果およびヒト薬物投与の計算に基づいて、ナノ粒子は、ユニークな生物学的特性（腫瘍と比較して比較的迅速な血液からのクリアランスと、それに続く治療剤の腫瘍組織蓄積を含む）を有することが見出されたが、これは、プロドラッグアプローチが実行可能であることを示唆している。官能化ナノ粒子は、腫瘍中の薬物濃度が腫瘍組織内ＩＣ−５０で指定されるものよりも大きいが、他の臓器組織（例えば、心臓、肝臓または腎臓）に対する用量を制限するものではないことを保証して、薬物の複数回投与を可能にする。治療剤およびナノ粒子を放射標識または別個に光学的に標識して、治療剤およびナノ粒子の独立したモニタリングを可能にし得る。一実施形態では、放射性フッ素化（すなわち、１８Ｆ）ダサチニブは、ＮＨＳエステル結合を介してナノ粒子に結合したＰＥＧ−３４００部分とカップリングされる。放射性フッ素は、放射性ヨウ素化（１２４Ｉ）蛍光（Ｃｙ５）ナノ粒子からの薬物の分布および放出の時間依存性変化を独立してモニタリングすることができるために重要である。このように、本発明者らは、プロドラッグ（ダサチニブ）およびナノ粒子を別個にモニタリングし得る。これは、二重標識アプローチが使用されていない従来技術の方法と比較して、プロドラッグ設計の最適化が可能になる。別の実施形態では、放射線治療ヨウ素分子（すなわち、１−１３１）、または他の治療γ放射体もしくはα放射体は、マレイミド官能基を介してＰＥＧとコンジュゲートされ、この場合、治療剤は、インビボでＰＥＧから分離しなくてもよい。
【０１３９】
本明細書では「クリックケミストリー」と称される一般化可能なアプローチを以下で説明する。本ナノ粒子が広範囲のリガンド、造影剤またはキレートを容易に収容するために、ナノ粒子の表面を改変して、官能基を組み込み得る。ナノ粒子はまた、官能基を組み込み得る有機ポリマー（例えば、ＰＥＧ）またはキレートで改変され得る。一方、リガンド、造影剤または治療剤を改変して、適切な条件下で、官能基と反応することができる官能基をナノ粒子上に、またはナノ粒子に結合したＰＥＧもしくはキレート剤上に組み込み得る。したがって、反応性官能基を有する任意のリガンド、造影剤または治療剤は、ナノ粒子に容易にコンジュゲートされ得る。この一般化可能なアプローチは、本明細書では「クリックケミストリー」と称され、マルチモダリティ用途を調査するための多くの多様性を可能にする。「クリックケミストリー」の化学反応では、選択的な、迅速な、清潔な、双直交のおよび／または生体適合性の反応を介して、２つの分子成分が接合され得る。Ｋｏｌｂら、（２００１）Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｆｅｗ  Ｇｏｏｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ４０，２００４−２０２１．Ｌｉｍら、（２０１０）Ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｒｅｃｅｎｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ４６，１５８９−１６００．Ｓｌｅｔｔｅｎら、（２００９）Ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｆｉｓｈｉｎｇ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａ  ｓｅａ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ４８，６９７３−６９９８。
【０１４０】
ナノ粒子へのリガンド、造影剤またはキレートの制御された容易な付加が達成され得る限り、任意の適切な反応機構が本発明において「クリックケミストリー」に適合され得る。一実施形態では、ナノ粒子のシェルと既に共有結合されたＰＥＧにフリー三重結合が導入される。一方、アジド結合は、所望のリガンド（または造影剤、キレート）に導入される。銅触媒の存在下でＰＥＧ化ナノ粒子およびリガンド（または造影剤、キレート）を混合する場合、三重結合へのアジドの付加環化が起こって、リガンドがナノ粒子とコンジュゲートする。クリックケミストリーの一例は、Ｃｕ（Ｉ）によって触媒されるアジドとアルキンとの間の［３＋２］ヒュイゲン付加環化である。Ｍｏｓｅｓら、（２００７）Ｔｈｅ  ｇｒｏｗｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３６，１２４９−１２６２．Ｇｌａｓｅｒら、（２００９）’Ｃｌｉｃｋ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ’  ｉｎ  ＰＥＴ  ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ＆Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ５２，４０７−４１４．Ｍｉｎｄｔら、（２００９）Ａ“Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０，１９４０−１９４９．Ｎｅｗら、（２００９）Ｇｒｏｗｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ“ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”ｆｏｒ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ２４，２８９−３０１．Ｗａｎｇら、（２０１０）Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ“Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２，１５９１−１６０２．Ｓｃｈｕｌｔｚら、（２０１０）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ＤＯＴＡ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｆｏｒ  Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ  Ｃｈｅｌａｔｉｏｎ  ｖｉａ  Ｃｕ−Ｆｒｅｅ  Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２，２３９８−２４０１．Ｍａｒｔｉｎら、（２０１０）Ａ  ＤＯＴＡ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｂｙ  ｃｏｐｐｅｒ−ｆｒｅｅ  ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０，４８０５−４８０７．Ｌｅｂｅｄｅｖら、（２００９）Ｃｌｉｃｋａｂｌｅ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒａｄｉｏｍｅｔａｌ  ｃｈｅｌａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ４６，１７０６−１７０８．Ｋｎｏｒら、（２００７）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  １，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｅｃａｎｅ−１，４，７，１���−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＯＴＡ）ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｔｏ  ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １３，６０８２−６０９０。第２の実施形態では、マレイミド官能基およびチオール基が、ナノ粒子および所望のリガンド（または造影剤、キレート）に導入されて、ナノ粒子がマレイミド官能基を有し得、リガンド（または造影剤、キレート）がチオール基を有し得るか、またはその逆も同様であり得る。マレイミドの二重結合はチオール基と容易に反応して、安定炭素−硫黄結合を形成する。第３の実施形態では、活性化エステル官能基、例えばスクシンイミジルエステル基およびアミン基が、ナノ粒子および所望のリガンド、造影剤またはキレートに導入され得る。活性エステル基はアミン基と容易に反応して、安定炭素−窒素アミド結合を形成する。第４の実施形態では、クリックケミストリーは、テトラジン部分と歪みアルケンとの間の逆電子要請ディールス・アルダー反応を含む（図２１ｃ）。Ｄｅｖａｒａｊら、（２００９）Ｆａｓｔ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｐｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  Ｔｅｔｒａｚｉｎｅ／ｔｒａｎｓ−Ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ４８，７０１３−７０１６．Ｄｅｖａｒａｊら、（２００８）Ｔｅｔｒａｚｉｎｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９，２２９７−２２９９．Ｂｌａｃｋｍａｎら、（２００８）Ｔｅｔｒａｚｉｎｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ：ｆａｓｔ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｉｎｖｅｒｓｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｄｅｍａｎｄ  Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３０，１３５１８−１３５１９。連結は、選択的、高速、生体適合性および／または双直交であり得る。多くのディールス・アルダー反応とは異なり、カップリングは不可逆的であり、反応中間体からの二窒素のレトロディールスアルダー放出後に、安定ピリダジン生成物を形成する。テトラジン部分および歪みアルケンが、ナノ粒子および所望のリガンド（または造影剤、キレート）に導入されて、ナノ粒子がテトラジン部分を有し得、リガンド（または造影剤、キレート）が歪みアルケンを有し得るか、またはその逆も同様であり得る。例えば、３−（４−ベンジルアミノ）−１，２，４，５−テトラジン（Ｔｚ）およびノルボルネン誘導体またはトランスシクロオクテン誘導体の組み合わせを含む多くの異なるテトラジン−歪みアルケンペアがこの反応に使用され得る。Ｓｃｈｏｃｈら、（２０１０）Ｐｏｓｔ−Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  Ｉｎｖｅｒｓｅ−Ｅｌｅｃｔｒｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ  ���ｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３２，８８４６−８８４７．Ｄｅｖａｒａｊら、（２０１０）Ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ｔｕｒｎ−Ｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｉｎｓｉｄｅ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ４９．Ｈａｕｎら、（２０１０）Ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｍｐｌｉｆｉｅｓ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５，６６０−６６５．Ｒｏｓｓｉｎら、（２０１０）Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｈｅｍｉｓｒｙ  ｆｏｒ  ｐｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｌｉｖｅ  ｍｉｃｅ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ４９，３３７５−３３７８．Ｌｉら、（２０１０）Ｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ｔｒａｎｓ−ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １８−Ｆ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｒｏｂｅｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ４６，８０４３−８０４５．Ｒｅｉｎｅｒら、（２０１１）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ａ  １８Ｆ−ｌａｂｅｌｅｄ  ＰＡＲＰ１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｍｅｔｈｏｄ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ５０，１９２２−１９２５。例えば、テトラジン部分でナノ粒子の表面を修飾し得、続いて、これをノルボルネン改変リガンド（または造影剤、またはキレート）にコンジュゲートし得る（図２１ｄおよび２１ｅ）。一態様では、テトラジンでナノ粒子をコーティングし、次いで、テトラジン−ノルボルネン連結を使用して、ＤＯＴＡキレートでこれを改変し、６４Ｃｕで放射標識し得る。
【０１４１】
インビボにおける滞留／クリアランス時間
被験体への本ナノ粒子の投与後において、ナノ粒子の血中滞留半減期は、約２時間〜約２５時間、約３時間〜約２０時間、約３時間〜約１５時間、約４時間〜約１０時間または約５時間〜約６時間の範囲であり得る。より長い血中滞留半減期は、より多くのナノ粒子がインビボで標的部位に蓄積することを可能にするより長い循環を意味する。血中滞留半減期は、以下のように評価され得る。最初に、ナノ粒子を被験体（例えば、マウス、ミニブタまたはヒト）に投与する。投与後の様々な時点において、血液サンプルを採取して、適切な方法によってナノ粒子の濃度を測定する。
【０１４２】
一実施形態では、被験体へのＰＥＧ化（または対照）ナノ粒子の投与後において、ナノ粒子の血中滞留半減期は、約２時間〜約１５時間または約４時間〜約１０時間の範囲であり得る。被験体へのナノ粒子の投与後におけるナノ粒子の腫瘍滞留半減期は、約５時間〜約２日間、約１０時間〜約４日間または約１５時間〜約３．５日間の範囲であり得る。被験体へのナノ粒子の投与後におけるナノ粒子の腫瘍滞留半減期と血中滞留半減期との比は、約２〜約３０、約３〜約２０または約４〜約１５の範囲であり得る。被験体へのナノ粒子の投与後におけるナノ粒子の腎クリアランスは、約２４時間のうちに約１０％ＩＤ（初期用量）〜約１００％ＩＤ、約２４時間のうちに約３０％ＩＤ〜約８０％ＩＤまたは約２４時間のうちに約４０％ＩＤ〜約７０％ＩＤの範囲であり得る。一実施形態では、被験体へのナノ粒子の投与後において、ナノ粒子の血中滞留半減期は約２時間〜約２５時間の範囲であり、ナノ粒子の腫瘍滞留半減期は約５時間〜約５日間の範囲であり、ナノ粒子の腎クリアランスは約２４時間のうちに３０％ＩＤ〜約８０％ＩＤの範囲である。
【０１４３】
被験体への本ナノ粒子の投与後において、本ナノ粒子の腫瘍滞留半減期は、約５時間〜約５日間、約１０時間〜約４日間、約１５時間〜約３．５日間、約２０時間〜約３日間、約２．５日間〜約３．１日間、約１日間〜３日間の範囲であり得るか、または約７３．５時間であり得る。
【０１４４】
ナノ粒子の腫瘍滞留半減期と血中滞留半減期との比は、約２〜約３０、約３〜約２０、約４〜約１５、約４〜約１０、約１０〜約１５の範囲であり得るか、または約１３であり得る。
【０１４５】
一実施形態では、本発明は、蛍光シリカ系ナノ粒子であって、シリカ系コア内に配置された蛍光化合物を含むシリカ系コア；前記コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル；前記ナノ粒子に結合した有機ポリマー；および前記ナノ粒子に結合したリガンドを含み、約１ｎｍ〜約１５ｎｍの直径を有する蛍光シリカ系ナノ粒子を提供する。被験体へのＰＥＧ化（または対照）ナノ粒子の投与後において、ナノ粒子の血中滞留半減期は、約２時間〜約２５時間または約２時間〜約１５時間の範囲であり得；ナノ粒子の腫瘍滞留半減期は、約５時間〜約２日間の範囲であり得；ナノ粒子の腎クリアランスは、約２４時間のうちに約３０％ＩＤ〜約８０％ＩＤの範囲であり得る。ナノ粒子に結合したリガンドの数は、約１〜約３０個または約１〜約１０個の範囲であり得る。ナノ粒子の直径は、約１ｎｍ〜約８ｎｍであり得る。放射性核種などの造影剤が、ナノ粒子に付加され得る。あるいは、キレートが、ナノ粒子に付加され得る。ナノ粒子は、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＣＴ、ＭＲＩ、光学イメージング、生物発光イメージングまたはそれらの組み合わせによって検出され得る。治療剤が、ナノ粒子に付加され得る。被験体への放射標識ターゲティングナノ粒子の投与後において、ナノ粒子の血中滞留半減期はまた、約３時間〜約１５時間または約４時間〜約１０時間の範囲であり得る。被験体へのナノ粒子の投与後におけるナノ粒子の腫瘍滞留半減期はまた、約１０時間〜約４日間または約１５時間〜約３．５日間の範囲であり得る。被験体へのナノ粒子の投与後におけるターゲティングナノ粒子の腫瘍滞留半減期と血中滞留半減期との比は、約２〜約３０、約３〜約２０または約４〜約１５の範囲であり得る。ナノ粒子の腎クリアランスはまた、被験体へのナノ粒子の投与後約２４時間のうちに約４５％ＩＤ〜約９０％ＩＤの範囲であり得る。
【０１４６】
一実施形態では、血液、腫瘍および他の主要臓器／組織中の放射標識ナノ粒子の滞留（またはクリアランス）半減期（Ｔ１／２）の値を推定するために、ナノ粒子投与後の指定時間にマウス群を屠殺することによって、１グラム当たりの注射用量の割合（％ＩＤ／ｇ）値を測定する。血液、腫瘍および臓器を採取し、計量し、シンチレーションγカウンターで計測する。放射性崩壊について注射時に対して、％ＩＤ／ｇ値を補正する。各組織について得られた時間−放射能濃度データを、減少単一指数関数に対してフィッティングして、組織／臓器Ｔ１／２値を推定する。
【０１４７】
被験体への本ナノ粒子の投与後において、本ナノ粒子の腎クリアランスは、約２４時間のうちに約４５％ＩＤ（初期用量）〜９０％超ＩＤ、約２４時間のうちに約２０％ＩＤ〜約９０％ＩＤ、約２４時間のうちに約３０％ＩＤ〜約８０％ＩＤ、約２４時間のうちに約４０％ＩＤ〜約７０％ＩＤ、約２４時間のうちに約４０％ＩＤ〜約６０％ＩＤ、約２４時間のうちに約４０％ＩＤ〜約５０％ＩＤ、約２４時間のうちに約４３％ＩＤ、約２４時間のうちに約１０％ＩＤ〜約１００％ＩＤ、約２４時間のうちに約４０％ＩＤ〜約１００％ＩＤ、約２４時間のうちに約８０％ＩＤ〜約１００％ＩＤ、約２４時間のうちに約９０％ＩＤ〜約９５％ＩＤ、約２４時間のうちに約９０％ＩＤ〜約１００％ＩＤまたは約２４時間のうちに約８０％ＩＤ〜約９５％ＩＤの範囲であり得る。腎クリアランスは、以下のように評価され得る。最初に、ナノ粒子を被験体（例えば、マウス、ミニブタまたはヒト）に投与する。投与後の様々な時点において、尿サンプルを採取して、適切な方法によってナノ粒子の濃度を測定する。
【０１４８】
一実施形態では、腎クリアランス（例えば、経時的に尿中に排泄されるナノ粒子の割合）は、以下のようにアッセイされる。本ナノ粒子を被験体に投与し、一定時間（例えば、１６８時間）にわたって尿サンプルを採取する。蛍光分析、および既知の粒子濃度（％ＩＤ）と混合した尿サンプルのバックグラウンド補正蛍光シグナル測定値から作成した系列希釈較正曲線を使用して、各時点の粒子濃度を決定する。マウスの平均１日尿量の推定値と共に濃度値を使用して、排泄された尿１ｇ当たりの累積％ＩＤを計算する。別の実施形態では、放射標識ナノ粒子の腎クリアランスは、例えば、ナノ粒子の投与後において、γ計測を使用して同様の時間間隔で尿試料の活性（カウント毎分）を測定して、累積尿排泄を計算することによってアッセイされる。
【０１４９】
第３の実施形態では、累積糞排泄を評価するために、ナノ粒子の投与後において、同様の時間間隔で糞を代謝ケージに収集し、γカウンターを使用して試料の活性を決定する。
【０１５０】
ヒト線量当量の約１００倍の量のナノ粒子を被験体に投与した場合、約１０〜約１４日以内に、貧血、体重減少、動揺、呼吸増加、ＧＩ障害、異常行動、神経機能障害、血液学における異常、臨床化学における異常、臓器病理学における薬物関連病変、死亡またはそれらの組み合わせは実質的に観察されない。
【０１５１】
本ナノ粒子が、少なくとも１つの結合したリガンドを含有する場合、（例えば、リガンド単独と比較した）ナノ粒子の多価性の増大は、約１．５倍〜約１０倍、約２倍〜約８倍、約２倍〜約６倍、約２倍〜約４倍の範囲であり得るか、または約２倍であり得る。本発明のナノ粒子は、従来技術の観点から予想外のインビトロおよびインビボ物理化学的および生物学的パラメータを示す。例えば、リガンド付加ナノ粒子の推定血中滞留半減期（例えば、ｃＲＧＤ付加ナノ粒子の場合には約５．５時間）は、対応するリガンドのもの（例えば、ｃＲＧＤの場合には約１３分間）よりも実質的に長い。Ｍｏｎｔｅｔら、Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＲＧＤ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４９，６０８７−６０９３（２００６）。長期の血中滞留半減期は、プローブのバイオアベイラビリティを増強し、腫瘍ターゲティングを容易にし、長時間にわたるより多くの腫瘍取り込みをもたらし得る。一実施形態では、ターゲティングナノ粒子（すなわち、リガンド付加ナノ粒子）の腫瘍滞留半減期は、血中滞留半減期よりも約１３倍大きいのに対して、非ターゲティングナノ粒子（すなわち、対応する非リガンド付加ナノ粒子）の腫瘍滞留半減期は、血中滞留半減期よりも約５倍大きいに過ぎない。この差異は、ターゲティングナノ粒子の腫瘍組織蓄積が、非ターゲティングナノ粒子と比較して実質的に大きいことを示唆している。特定の実施形態では、ナノ粒子に結合したリガンドの数を考慮すると、本ナノ粒子は、予想外の高親和性結合（例えば、ｃＲＧＤ付加ナノ粒子の場合にはＫｄ０．５１ｎＭおよびＩＣ５０１．２ｎＭ）、多価性の増大（例えば、ｃＲＧＤ付加ナノ粒子の場合にはｃＲＧＤペプチド単独と比べて２倍超の増大）、有意な差次的腫瘍取り込み（例えば、ｃＲＧＤ付加ＰＥＧナノ粒子は、ＰＥＧコーティングナノ粒子と比べて、投与後７２時間にわたって差次的腫瘍取り込みの約３〜４倍の増加を示す）、および筋肉対腫瘍取り込み比に基づき、正常筋肉に対して有意な腫瘍コントラスト（例えば、投与後７２時間にわたって約３〜５倍）を示す。
【０１５２】
一実施形態では、インテグリン発現腫瘍におけるリガンド付加ナノ粒子の場合、最大腫瘍取り込み時（ナノ粒子注射約４時間後）において、対照（例えば、非インテグリン発現腫瘍におけるリガンド付加ナノ粒子、またはインテグリン発現腫瘍における対応する非リガンド付加ナノ粒子）よりも３倍の放射能濃度の増加が見出された。加えて、ターゲティングナノ粒子（すなわち、リガンド付加ナノ粒子）の腫瘍対筋肉取り込み比は、正常筋肉に対する腫瘍組織コントラストが、非ターゲティングナノ粒子（すなわち、対応する非リガンド付加ナノ粒子）に関する正常筋肉に対する減少した腫瘍組織コントラストと比較して増強していることを示すが、これは、ターゲティングナノ粒子が腫瘍選択的であることを示唆している。
【０１５３】
別の実施形態では、ターゲティングナノ粒子および非ターゲティングナノ粒子は両方とも、同じ時間にわたって効率的な腎排泄を示す。注射用量の約半分が注射後の最初の２４時間で排泄され、約７２％が９６時間までに排泄されるが、これは、排泄の大部分が注射後１日目に起こったことを示唆している。対照的に、ターゲティングナノ粒子の糞排泄プロファイルは、平均で注射用量の７％および１５％がそれぞれ２４時間および９６時間で排出されることを示す。
【０１５４】
非毒性ナノ粒子の物理化学的パラメータおよび生物学的パラメータは、そのマルチモーダルイメージング機能（例えば、ＰＥＴおよび光学イメージング）と共に、それらの潜在的な生物医学的用途の範囲を拡大する。用途としては、以下のものが挙げられる。（ａ）長期モニタリング：ナノ粒子の長期の血液循環時間および対応するバイオアベイラビリティは、毒性を考慮して課される制限がない、疾患管理（例えば、診断スクリーニング、処置前評価、治療介入および処置後モニタリング）の様々な段階の初期モニタリングおよび長期モニタリングの両方に関するそれらの汎用性を強調する；（ｂ）改善された腫瘍浸透性：ターゲティングナノ粒子のクリアランス特性（例えば、それらの腎クリアランスは、従来技術の分子プローブのものよりも遅い）は、様々な種類の生物学的用途に有用であろう。例えば、ナノ粒子は、血管新生が不十分で相対的にアクセス不可能な固形腫瘍の場合に特に有用であろう（この場合、通常は全身投与後における薬剤の局在化が遅い）；（ｃ）マルチモーダルイメージング機能：深さに応じた相補的生体情報を取得するために、これらのモダリティを複数のスケール（すなわち、全身レベルから細胞レベルまで）で組み合わせ得る。例えば、ＳＬＮマッピングでは、その分布および数に関してＰＥＴによって深リンパ節をマッピングし得る一方、蛍光イメージングによって、浅リンパ節のより正確かつ詳細な局在性を得ることができる；ならびに、（ｄ）ターゲティング治療：血液からのクリアランスと比較して長い、腫瘍からのターゲティングナノ粒子のクリアランスは、放射線治療薬送達ビヒクルまたは薬物送達ビヒクルとしてナノ粒子が機能し得る複合的な診断／治療用途に利用され得る。
【０１５５】
医薬組成物
本発明はさらに、本ナノ粒子を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、適切な医薬単位剤形の形態で経口投与され得る。本発明の医薬組成物は、錠剤、硬ゼラチンカプセルまたは軟ゼラチンカプセル、水溶液、懸濁液およびリポソームならびに他の徐放製剤、例えば成形ポリマーゲルを含む多くの形態で調製され得る。
【０１５６】
本ナノ粒子または組成物の適切な投与様式としては、限定されないが、経口投与、静脈内投与、直腸投与、舌下投与、粘膜投与、鼻腔内投与、眼投与、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、皮内投与、皮下投与、腫瘍周囲投与、脊髄投与、髄腔内投与、関節内投与、動脈内投与、くも膜下投与、気管支投与およびリンパ投与、ならびに有効成分の全身送達のための他の剤形が挙げられる。本医薬組成物は、限定されないが、経皮（パッチ、ゲル、クリーム、軟膏またはイオン泳動によって受動的）；静脈内（ボーラス、注入）；皮下（注入液、デポ）；経粘膜（口腔および舌下、例えば口腔内分散性錠剤、ウエハー、フィルムおよび発泡製剤；結膜（点眼薬）；直腸（坐剤、浣腸））；または皮内（ボーラス、注入、デポ）を含む当技術分野で公知の任意の方法によって投与され得る。組成物は、局所送達され得る。
【０１５７】
経口液体医薬組成物は、例えば水性もしくは油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップもしくはエリキシル剤の形態であり得るか、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルと合わせるための乾燥製品として提供され得る。このような液体医薬組成物は、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油を含み得る）または保存剤などの従来の添加物を含有し得る。
【０１５８】
本発明のナノ粒子医薬組成物はまた、非経口投与（例えば、注射、例えばボーラス注射または連続注入による）用に製剤化され得、保存剤を追加したアンプル、プレフィルドシリンジ、少量注入容器または複数回投与容器内に投与単位剤形で提供され得る。医薬組成物は、懸濁液、溶液または油性もしくは水性ビヒクル中でエマルジョンの形態を取り得、製剤化剤、例えば懸濁化剤、安定剤および／または分散剤を含有し得る。あるいは、本発明の医薬組成物は、使用前に適切なビヒクル（例えば、ピロゲンフリーの滅菌水）と合わせるための、無菌固体の無菌単離によって、または溶液からの凍結乾燥によって得られる粉末の形態であり得る。
【０１５９】
表皮への局所投与の場合、医薬組成物は、軟膏、クリームもしくはローションとして、または経皮的パッチの有効成分として製剤化され得る。適切な経皮送達システムは、例えば、Ａ．Ｆｉｓｈｅｒら、（米国特許第４，７８８，６０３号）またはＲ．Ｂａｗａら、（米国特許第４，９３１，２７９号；米国特許第４，６６８，５０６号；および米国特許第４，７１３，２２４号）に開示されている。軟膏およびクリームは、例えば、適切な増粘剤および／またはゲル化剤を追加して水性または油性基剤で調製され得る。ローションは水性または油性基剤で調製され得、一般に１つ以上の乳化剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤または着色剤も含有する。医薬組成物はまた、例えば米国特許第４，１４０，１２２号；米国特許第４，３８３，５２９号；または米国特許第４，０５１，８４２号に開示されているように、イオン泳動を介して送達され得る。
【０１６０】
口内の局所投与に適切な医薬組成物としては、フレーバー基剤（通常は、スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴム）中に本発明の医薬組成物を含むロゼンジ；不活性基剤（例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴム）中に医薬組成物を含むトローチ；適切な液体担体に医薬組成物を含む粘膜付着性ゲルおよびうがい薬などの投与単位剤形が挙げられる。
【０１６１】
目への局所投与の場合、医薬組成物は、点眼薬、ゲル（Ｓ．Ｃｈｒａｉら、米国特許第４，２５５，４１５号）、粘剤（Ｓ．Ｌ．Ｌｉｎら、米国特許第４，１３６，１７７号）として、または持続放出眼内挿入物（Ａ．Ｓ．Ｍｉｃｈａｅｌｓ，米国特許第３，８６７，５１９号およびＨ．Ｍ．Ｈａｄｄａｄら、米国特許第３，８７０，７９１号）を介して投与され得る。
【０１６２】
所望により、例えば、天然ゲル、合成ポリマーゲルまたはそれらの混合物を含む特定の親水性ポリマーマトリックスと組み合わせることによって、用いられる治療化合物の徐放性が得られるように上記医薬組成物を適合し得る。
【０１６３】
担体が固体である直腸投与に適切な医薬組成物は、最も好ましくは、単位投与坐薬として提供される。適切な担体としては、ココアバター、および当技術分野で一般的に使用されている他の物質が挙げられ、医薬組成物を軟化担体または溶融担体と混合し、続いて冷却し、金型で成形することによって、坐薬を有利に形成され得る。
【０１６４】
膣投与に適切な医薬組成物は、ナノ粒子および治療剤に加えて当技術分野で周知の担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡沫剤またはスプレーとして提供され得る。
【０１６５】
吸入による投与の場合、本発明の医薬組成物は、吹送器、噴霧器もしくは加圧パック、またはエアロゾルスプレーを送達する他の便利な手段から有利に送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体を含み得る。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、一定量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。
【０１６６】
あるいは、吸入または吹送による投与の場合、本発明の医薬組成物は、乾燥粉末組成物、例えば医薬組成物および適切な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプン）の粉末混合物の形態を取り得る。粉末組成物は、例えば、カプセルもしくはカートリッジ中に、または例えばゼラチンもしくはブリスターパック中に単位投与剤形で提供され得、これらから吸入器もしくは吹送器によって粉末を投与し得る。
【０１６７】
鼻腔内投与の場合、本発明の医薬組成物は、液体スプレーを介して、例えばプラスチックボトル噴霧器を介して投与され得る。これらの典型例は、Ｍｉｓｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）（ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ  ｉｎｈａｌｅｒ−Ｗｉｎｔｒｏｐ）およびＭｅｄｉｈａｌｅｒ（登録商標）（ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ  ｉｎｈａｌｅｒ−Ｒｉｋｅｒ）である。
【０１６８】
本発明の医薬組成物はまた、香味料、着色剤、抗微生物剤または保存剤などの他のアジュバントを含有し得る。
【０１６９】
処置に使用するのに必要な医薬組成物の量は、選択される治療剤だけではなく、投与経路、処置される症状の性質、ならびに患者の年齢および状態によっても変化し、最終的には担当医師または臨床医の判断によるものであるとさらに認識されよう。
【０１７０】
これらの要素の評価については、Ｊ．Ｆ．Ｂｒｉｅｎら、Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１４，１３３（１９７８）；およびＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｅ．Ｂａｋｅｒ，Ｊｒ．，Ｐｕｂ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏ．，Ｏｒａｄｅｌｌ，Ｎ．Ｊ．（４１ｓｔ  ｅｄ．，１９８７）を参照のこと。一般に、本発明の蛍光ナノ粒子と組み合わせて使用される場合の治療剤の投与量は、治療剤を単独でまたは従来の医薬剤形として投与する場合よりも少量であり得る。標的部位（例えば、細胞表面に位置する受容体）に対する蛍光ナノ粒子の高い特異性は、治療剤の比較的高い局所濃度、あるいは長時間にわたる治療剤の持続放出を提供し得る。
【０１７１】
本ナノ粒子または組成物は、被験体に投与され得る。被験体は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。哺乳動物としては、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、家畜、競技用動物、ペット、ウマおよび霊長類が挙げられる。
【０１７２】
ナノ粒子の使用
本発明はさらに、細胞の成分を検出するための方法であって、（ａ）シリカ系コア内に配置された蛍光化合物を含むシリカ系コア；前記コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル；前記ナノ粒子に結合した有機ポリマー；前記ナノ粒子に結合した約１〜約２５個のリガンド（（約１〜約２０個のリガンドまたは約１〜約１０個のリガンドまたは他の範囲；本明細書の議論を参照のこと）；および前記ナノ粒子に結合した造影剤またはキレートを含む蛍光シリカ系ナノ粒子を前記細胞と接触させる工程；ならびに（ｂ）少なくとも１つのイメージング技術によって、前記細胞または細胞成分に対する前記ナノ粒子の結合（および／またはその潜在的な細胞内摂取）をモニタリングする工程を含む方法を提供する。イメージング技術は、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＣＴ、ＭＲＩ、生物発光イメージングまたは蛍光イメージングおよびそれらの組み合わせであり得る。
【０１７３】
代謝的に活性な全細胞内において、全細胞溶解物において、透過性細胞において、固定細胞において、または無細胞環境では部分的に精製された細胞成分を用いて、細胞成分の位置を検出および決定し得る。接触の量および継続時間は、例えば、処置方法の診断目的または治療目的、例えばアップレギュレートされたシグナル伝達経路中間体（すなわち、Ａｋｔ、ＮＦ−κＢ）の蛍光または抗体による検出、疾患状態または症状、治療剤の送達またはその両方に依存し得る。接触の量および継続時間はまた、例えば、標的分析物に対する蛍光ナノ粒子の相対濃度、粒子のインキュベーション時間、および処置のための細胞の状態に依存し得る。
【０１７４】
本発明はさらに、腫瘍細胞をターゲティングするための方法であって、シリカ系コア内に配置された蛍光化合物を含むシリカ系コア；前記コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル；前記ナノ粒子に結合した有機ポリマー；前記ナノ粒子に結合したリガンドであって、腫瘍マーカーに結合することができるリガンド；および少なくとも１つの治療剤を含む有効量の蛍光シリカ系ナノ粒子をがん患者に投与することを含む方法を提供する。
【０１７５】
ナノ粒子は、放射標識され得る。ナノ粒子は、任意の適切な技術を使用して放射標識され得る。放射標識は、自動化され得る。一実施形態では、ナノ粒子は、ＦＡＳＴｌａｂ放射化学合成プラットフォーム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して放射標識され得る。合成パラメータを微調整して、高い再現性、放射化学的収率／純度、標識効率および比較的短い合成時間を達成し得る。新たな粒子トレーサーを同じＦＡＳＴｌａｂモジュールに収容し得る。
【０１７６】
ナノ粒子は、限定されないが、以下の経路：経口、静脈内、鼻腔内、皮下、局所、筋肉内または経皮によって患者に投与され得る。
【０１７７】
特定の実施形態では、異なる特性を有する２種類以上の蛍光ナノ粒子の混合物を使用して、異なる組織型を評価することが望ましい場合がある。
【０１７８】
本発明の方法および組成物は、限定されないが、皮膚（黒色腫）、頭頸部、前立腺、脳および腸のがんを含むがんおよび炎症／感染過程などの疾患の領域を医師または外科医が同定および特性決定するのを支援するために、例えば脳手術において、例えば、通常の手術用顕微鏡を使用して検出するのが困難な腫瘍境界を検出して罹患組織および正常組織を区別するために、例えば、病変ががん性であり除去すべきか、もしくは非がん性であり放置するかを決定することによって、または疾患を外科的に病期分類（例えば、術中リンパ節の病期分類、センチネルリンパ節（ＳＬＮ）のマッピング、例えば重要な神経構造（耳下腺内神経）を保存するための神経温存法）することによって、治療介入または外科的介入の決定を支援するために使用され得る。
【０１７９】
本発明の方法および組成物は、転移性疾患の検出、処置応答のモニタリング、ＳＬＮマッピング／ターゲティング、神経温存法、残存疾患の検出、治療薬のターゲティング送達（複合的な診断／治療プラットフォーム）、非ターゲティング薬物担持ナノ粒子の局所送達（カテーテル送達）、血液脳関門治療薬、炎症性／虚血性疾患（すなわち、脳、心臓、尿管、膀胱）の処置、併用処置および疾患の検知（例えば、レシオメトリックｐＨ検知、酸素検知）に使用され得る。
【０１８０】
本発明の方法および組成物はまた、疾患、特に初期疾患、疾患の重症度もしくは疾患関連症状の局在性の検出、特性決定および／もしくは決定、疾患の病期分類、ならびに／または疾患のモニタリングに使用され得る。放出シグナルの存在、非存在またはレベルは、疾患状態を示し得る。本発明の方法および組成物はまた、様々な治療介入、例えば外科的手術およびカテーテルベースの手術をモニタリングおよび／またはガイドするために、ならびに薬物治療（細胞ベースの治療を含む）をモニタリングするために使用され得る。本発明の方法はまた、疾患または疾患症状の予後診断に使用され得る。疾患部位内に残存する細胞亜集団、または疾患部位の縁へ移動する細胞亜集団、例えば幹様細胞（「がん幹細胞」）および／または炎症性細胞／食細胞は、本発明の方法および組成物を使用して同定および特性決定され得る。
【０１８１】
上記のそれぞれに関して、（治療前、治療中または治療後に）検出またはモニタリングされ得るこのような疾患または疾患症状の例としては、がん（例えば、黒色腫、甲状腺がん、結腸直腸がん、卵巣がん、肺がん、乳がん、前立腺がん、頸部がん、皮膚がん、脳がん、消化管がん、口腔がん、腎臓がん、食道がん、骨がん）が挙げられ、これらを使用して、がんおよび／または悪性腫瘍を発症する感受性が増加した被験体を同定し得る（すなわち、前記被験体は、がんおよび／または悪性腫瘍、炎症（例えば、がん性病変の存在によって誘発される炎症症状）、心血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症および血管の炎症症状、虚血、卒中、血栓症）、皮膚疾患（例えば、カポジ肉腫、乾癬）、眼疾患（例えば、黄斑変性症、糖尿病性網膜症）、感染症（例えば、後天性免疫不全症候群を含む細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症および寄生虫感染症）、免疫疾患（例えば、自己免疫疾患、リンパ腫、多発性硬化症、関節リウマチ、真性糖尿病）、中枢神経系疾患（例えば、神経変性疾患、例えばパーキンソン病またはアルツハイマー病）、遺伝性疾患、代謝性疾患、環境疾患（例えば、鉛中毒、水銀中毒および放射性中毒、皮膚がん）、骨関連疾患（例えば、骨粗鬆症、原発性骨腫瘍および転移性骨腫瘍、変形性関節症）および神経変性疾患を発症する素因を有する）。
【０１８２】
したがって、本発明の方法および組成物は、例えば、腫瘍および／または共常在幹様細胞（「がん幹細胞」）の存在および／または局在性、炎症性細胞の存在および／または局在性（例えば、腫瘍周囲領域における活性化マクロファージの存在を含む）、血管疾患の存在および／または局在性（冠状動脈および末梢動脈における急性閉塞（すなわち、不安定プラーク）のリスクを有する領域、拡大している動脈瘤の領域、頸動脈における不安定プラークおよび虚血領域を含む）を決定するために使用され得る。本発明の方法および組成物はまた、細胞死、傷害、アポトーシス、壊死、低酸素症および血管新生の同定および評価に使用され得る。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４９２２２号。
【実施例】
【０１８３】
以下の実施例は、例示目的のみで示されており、本発明を限定するものではない。
【０１８４】
実施例１  ＰＥＧコーティングナノ粒子の調製および特性決定
国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７４８９４号およびＳｔｏｂｅｒら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ  ｓｐｈｅｒｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｎ  ｓｉｚｅ  ｒａｎｇｅ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．１９６８；２６：６２−６９．Ｏｈｎｉｓｈｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ  ２００５，４：１７２−１８１に開示されている十分に確立されたプロトコールにしたがって、近赤外発光色素（Ｃｙ−５）を含有するナノ粒子を合成し、ＰＥＧ化によって官能化した。Ｃｙ５マレイミドを共反応性オルガノシラン化合物（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（ｔｒｏｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）と反応させて、蛍光シリカ前駆体を形成した。この蛍光シリカ前駆体をテトラエチルオルトシリケートと共縮合して、蛍光シリカ系コアを形成した。メトキシ末端ポリ（エチレングリコール）鎖（ＰＥＧ、約０．５ｋＤａ）を有するＰＥＧ−シラン化合物メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］−トリメトキシシランを蛍光シリカ系コアに追加して、コア上にＰＥＧコーティングを形成した。３５００  ＭＷＣＯ  Ｓｎａｋｅｓｋｉｎ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓによって生理食塩水（Ｈ２Ｏ中、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）に対してＰＥＧコーティングナノ粒子を透析し、滅菌ろ過した。注射前に、すべてのサンプルをそれらのピーク吸収波長（６４０ｎｍ）で光学密度マッチングした。動的光散乱（ＤＬＳ）および蛍光相関分光法（ＦＣＳ）によって、流体力学的サイズの測定を達成した。簡潔に言えば、ＨｅＮｅレーザー（λ＝６３２．８ｎｍ）を使用して、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ２００ＳＭ  ｓｔａｔｉｃ／ＤＬＳ  ｓｙｓｔｅｍによって、水に対して透析した粒子を測定した。色素吸収が励起源とオーバーラップするために、１５分間の積分時間を使用して、許容可能な信号対雑音比を達成した。ＦＣＳの場合、水に対して粒子を透析し、０．１５Ｍ  ＮａＣｌに希釈し、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  Ｃｏｎｆｏｃｏｒ  ２  ＦＣＳ（ＨｅＮｅ６３３ｎｍ励起）によって測定した。すべての測定の前に、サイズについて機器を較正した。分子／粒子当たりの計数率として測定したＦＣＳ曲線から、遊離色素を有するＰＥＧ化ナノ粒子の相対輝度の比較を決定した。
【０１８５】
実施例２  ＰＥＧコーティングナノ粒子の腎クリアランス
約３ｎｍの流体力学的半径を有する蛍光コア−シェルシリカナノ粒子を合成した。動的光散乱（ＤＬＳ）の結果（図１ａ）に示されているように、これらのナノ粒子は、６〜１０ｎｍの直径範囲内であることが見出された。ヌードマウスにおける６ｎｍ〜３．３ｎｍのベア（非ＰＥＧコーティング）シリカナノ粒子のインビボ全身ＮＩＲ蛍光イメージングにより、注射４５分後の腎クリアランスがかなりのものであり、有意な蓄積が肝臓に残っていることが示された（図１ｂ）。その後の２４時間の間に、腸肝循環への最終的な排出が起こった。これらの結果に基づいて、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７４８９４号におけるプロトコールにしたがって、メトキシ末端ポリ（エチレングリコール）鎖（ＰＥＧ、約０．５ｋＤａ）で粒子を共有結合的にコーティングしてオプソニン化を防止し、小さな流体力学的サイズを維持しながら、粒子のクリアランスをさらに増強した。ＮＩＲ蛍光イメージングによれば、注射４５分後において、この処理は肝臓保持を減少させ、膀胱への腎ろ過の増加をもたらし（図１ｃ）、膀胱の蛍光は２４時間まで可視的であった。プローブは耐容性良好であり、有害作用または動物の死亡は、研究過程で観察されなかった。１２４Ｉ標識ＰＥＧコーティングナノ粒子を注射した２４時間後の連続コレジストレーションＰＥＴ−ＣＴイメージング（図１ｄ、上段）により、少量の残存膀胱活性、および肝臓／消化管を覆う活性（中央）（独立して取得したマイクロＣＴおよびマイクロＰＥＴスキャンがその両側にある）が実証された。連続マイクロＰＥＴ画像により、近赤外蛍光イメージングの結果が確認された。９６時間にわたる血中放射能の時間依存性変化に基づいて、１２４Ｉ標識ＰＥＧ化ナノ粒子の血中滞留半減期は、７．３時間であることが見出された。１２４Ｉ標識ＲＧＤ結合ナノ粒子の場合、血中滞留半減期は５．６時間であることが見出された。
【０１８６】
これらのインビボデータに基づいて、コーティングナノ粒子のより詳細な生体内分布およびクリアランス研究を、２セットのＰＥＧ化Ｃｙ５含有粒子で行って、生体内分布に対するプローブサイズの効果を評価した。蛍光相関分光法（ＦＣＳ）によって測定した場合に３．３±０．０６および６．０±０．１ｎｍの流体力学的直径を有するナノ粒子を作製した（図２ａ）。インビボ研究の前に、粒子の光物理的特性を調査して、遊離色素に対するそれらの性能レベルを証明した。吸光分光法および発光分光法（図２ｂ）ならびにＦＣＳ（図２ｃ）によって決定したところ、極めて小さな粒径であるにもかかわらず、シリカカプセル化色素分子は、粒径に対応した遊離色素を上回る光物理的増強（輝度の有意な増加を含む）を示した。高出力６３５ｎｍレーザーで照射すると、遊離色素と比較して、直径３．３および６．０ｎｍのナノ粒子は、フォトブリーチング半減期のそれぞれ２倍および３倍の増加を示した（図２ｄ）。したがって、これらのナノ粒子プローブは、それらの遊離色素カウンターパートよりも明るくかつ光安定性であることが見出された。
【０１８７】
全身イメージングからのナノ粒子のインビボ挙動の半定量的評価に加えて、蛍光プレートリーダーを使用して、組織ホモジネートおよび体液のエクスビボ分析を実施することにより、ＮＩＲ蛍光イメージングで観察された変動を較正することができた。サンプルを粒子蛍光の「保持」（肝臓、腎臓、肺、脾臓ホモジネートおよび血液）および「排泄」（尿）源としてグループ分けし、バックグラウンド補正し、較正曲線に基づいて動物１匹当たりの初期用量の割合（％ＩＤ）に換算した。組織分析により、主要臓器における粒子保持は最小であり、蛍光の大部分が循環血液に起因するものであったことが示された（図３ａ）。「保持」成分の合計として計算した正味の粒子保持を、指数関数減衰曲線でフィッティングして、排泄の速度を決定した（図３ｂ）。より大きな粒子は、より長い組織半減期（ｔ１／２（３．３ｎｍ）＝１９０分、ｔ１／２（６．０ｎｍ）＝３５０分）およびより大きな初期臓器保持を示した。４８時間後、６ｎｍの粒子は、最小の体内保持（Ｒｔｏｔａｌ（６．０ｎｍ）＝２．４±０．６％ＩＤ）を示した。屠殺時に採取した尿サンプルを系列希釈較正データと併用して、単位時間当たりの平均排泄尿量の保守的な推定値に基づく総腎クリアランスを推定した。この方法によって、両方の粒径に関する経時的に排泄された％ＩＤ（図３ｃ）を推定した。
【０１８８】
実施例３  ανβ３インテグリンターゲティングペプチドとコンジュゲートした蛍光シリカナノ粒子（黒色腫モデル）
腫瘍マーカーανβ３インテグリンに対して高い親和性を有するマルチモーダル（光ＰＥＴ）ナノ粒子を合成するために、Ｃｙｓ−マレイミド結合を介して、環状ＲＧＤペンタペプチド（ＲＧＤＹＣ）をナノ粒子にコンジュゲートした。続いて、チロシンリンカーＹを使用して、放射標識を付加した。Ｃ６ラット神経膠腫細胞を雄性無胸腺ヌードマウスの脇腹に皮下注射した。直径約０．５ｃｍで、ベアシリカナノ粒子（図４Ａ）またはＰＥＧ化ＲＧＤナノ粒子（図４Ｂ、約５００ｎｍ／ｋｇ）のいずれかを静脈内注射した。図４は、全身光学イメージングを使用した、非腫瘍担持マウスおよび腫瘍担持マウスにおけるインビボ生体内分布を示す。
【０１８９】
ανβ３インテグリン陽性ヒト黒色腫細胞株（Ｍ２１）に対するターゲティング（ＲＧＤ結合）ナノ粒子および非ターゲティング（ＰＥＧコーティング）ナノ粒子のインビトロ結合を、フローサイトメトリーを使用した用量応答研究の一環として調査した（図５Ａ、５Ｂ）。時間（図５Ａ）および濃度（図５Ｂ）に応じた粒子結合／取り込みを評価した。
【０１９０】
実施例４  ανβ３インテグリンターゲティングペプチドとコンジュゲートした蛍光シリカナノ粒子およびリンパ節マッピング（黒色腫モデル）
本発明者らは、腎クリアランスに最適な粒径に正確に調整することができる構造を有する生体適合性材料シリカを利用した。本発明者らは、十分に特性決定されたインビボヒト黒色腫モデルにおける連続ＰＥＴイメージング測定のために、小さなターゲティングペプチドおよび放射標識を粒子表面に付加し、カプセル化近赤外（ＮＩＲ）色素およびマルチスケール光学蛍光イメージング方法を使用して、流入領域リンパ節およびリンパ管をマッピングした。Ｂａｌｌｏｕら、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１８，３８９−３９６（２００７）．Ｋｉｍら、Ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ  ｆｏｒ  ｓｅｎｔｉｎｅｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｍａｐｐｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２，９３−９７（２００３）．Ｔａｎａｋａら、Ｉｍａｇｅ−ｇｕｉｄｅｄ  ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎｖｉｓｉｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ：ｃｏｍｐｌｅｔｅｄ  ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｅｎｔｉｎｅｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｍａｐｐｉｎｇ．Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ．１３，１６７１−１６８１（２００６）。毒性試験も実施し、ヒト正常臓器の放射線量を求めた。具体的には、本発明者らは、直径約７ｎｍの近赤外（ＮＩＲ）色素を含むコア−シェルシリカナノ粒子であって、ＰＥＧ鎖でコーティングされており、少数（約６〜７個）のターゲティングペプチドおよび放射標識で表面官能化されたコア−シェルシリカナノ粒子を合成した。
【０１９１】
本発明者らは、これらのプローブが同時に非毒性であり、高い結合親和性／アビディティ、効率的な排出および有意な差次的取り込みを示し、腫瘍と正常組織との間でコントラストを生み出すことを、マルチモーダル分子イメージングアプローチを使用して実証する。ＮＩＲ色素蛍光が可能にするリンパ節およびリンパ管の高感度の検出、位置決定および照合は、検出可能なリンパ節サイズの低範囲を拡大しながら、臨床場面で転移性疾患を検出および病期分類するための、このマルチモーダルプラットフォームの明確な潜在的利点を強調する。
【０１９２】
材料および方法
ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧナノ粒子およびＰＥＧ−ナノ粒子の合成
以前に記載されているように、改変ストーバー型シリカ縮合によって、粒子を調製した。Ｗｉｅｓｎｅｒら、ＰＥＧ−ｃｏａｔｅｄ  Ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍａｎｕｆａｃｔｉｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ，国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／７４８９４号．Ｌａｒｓｏｎら、Ｓｉｌｉｃａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｒａｄｉａｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．２０，２６７７−２６８４（２００８）．Ｂｏｇｕｓｈら、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ：Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｓｉｚｅ  ａｎｄ  Ｍａｓｓ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｎｏｎ−Ｃｒｙｓｔ．Ｓｏｌｉｄｓ，１０４，９５−１０６（１９８８）．Ｓａｄａｓｉｖａｎら、Ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ＮＭＲ  ａｎｄ  ＤＬＳ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．Ｌ  Ｓｏｌ−Ｇｅｌ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１２，５−１４（１９９８）．Ｈｅｒｚら、Ｌａｒｇｅ  Ｓｔｏｋｅｓ−Ｓｈｉｆｔ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｖｅｒ  Ｆｒｅｅ  Ｄｙｅ  ｆｏｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．３０，１９０７−１９１０（２００９）。放射性ヨウ素または安定ヨウ素部分の付加のために、チロシン残基をＰＥＧ鎖にコンジュゲートした。Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｅｄ．２，２００８）。放射標識前に、すべてのサンプルをそれらのピーク吸収波長（６４０ｎｍ）で光学密度マッチングした。システイン−マレイミド結合を介してｃＲＧＤペプチドを官能化ＰＥＧ鎖に付加し、粒子の絶対濃度およびｃＲＧＤペプチド用試薬の開始濃度のＦＣＳベース測定を使用して、粒子に結合したｃＲＧＤペプチドの数を推定した。
【０１９３】
蛍光相関分光法（ＦＣＳ）による流体力学的サイズおよび相対輝度の比較測定
水に対して透析した粒子を生理食塩水（Ｈ２Ｏ中、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）に希釈し、ＨｅＮｅ６３３ｎｍ励起を使用してＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  Ｃｏｎｆｏｃｏｒ  ２  ＦＣＳによって測定した。すべての測定の前に、サイズについて機器を較正した。拡散時間の差異を使用して、色素および粒子種の流体力学的サイズの変動を評価した。分子／粒子当たりの計数率を使用して、遊離色素およびＰＥＧナノ粒子およびＲＧＤＹ−ＰＥＧナノ粒子の相対輝度の比較を実施した。
【０１９４】
Ｃドットコンジュゲートの放射標識
ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧナノ粒子およびＰＥＧナノ粒子の放射標識を実施した。Ｐｉａｔｙｓｚｅｋら、Ｉｏｄｏ−ｇｅｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．Ｊ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２，３５６−３５９（１９８８）。ガンマ（γ）計測によって活性を測定し、バリアン蛍光光度計（励起６５０ｎｍ／発光６８０）を使用して蛍光を測定した。
【０１９５】
細胞および細胞培養
ＲＰＭＩ１６４０培地／１０％胎児ＢＳＡ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｃｏｒｅ  Ｍｅｄｉａ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）中で、ヒト黒色腫Ｍ２１およびＭ２１変異体（Ｍ２１−Ｌ、αν陰性）細胞株を維持した。Ｍｌ９９培地／１０％ウシ胎児血清、２０μｇ／ｍｌ内皮細胞成長因子、５０μｇ／ｍｌヘパリン、ペニシリンおよびストレプトマイシン中で、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を培養した。
【０１９６】
１２４Ｉ−ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ナノ粒子のインビトロ細胞結合および分子特異性
Ｍ２１細胞に対する粒子の結合および特異性をアッセイするために、１０μｇ／ｍｌ  Ｉ型コラーゲン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液で２４ウェルプレートをコーティングし、インキュベート（３７℃、３０分間）した。Ｍ２１細胞（細胞３．０〜４．０×１０５個／ウェル）をコンフルエントまで成長させ、ＲＰＭＩ１６４０培地／０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で洗浄した。１２４Ｉ−ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ナノ粒子（０〜４．０ｎｇ／ｍｌ）をウェルに追加し、細胞をインキュベート（２５℃、４時間）し、ＲＰＭＩ１６４０培地／０．５％ＢＳＡで洗浄し、０．２Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。ヨウ素−１２４について較正した１４８０  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、放射能をアッセイした。１０００倍過剰なｃＲＧＤ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）の存在下で、非特異的結合を決定した。結合データのスキャッチャードプロットを作成し、線形回帰分析（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ２００７）を使用して分析して、受容体結合パラメータ（Ｋｄ、Ｂｍａｘ、ＩＣ５０）を求めた。
【０１９７】
光学的検出方法を使用したインビトロ細胞結合研究
競合結合研究および特異性研究で使用した最適値を用いたフローサイトメトリーを使用して、一定範囲のインキュベーション時間および粒子濃度について、Ｍ２１細胞に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ナノ粒子およびＰＥＧ−ナノ粒子の最大差次的結合を決定した。ＲＰＭＩ１６４０培地／０．５％ＢＳＡで細胞（細胞３．０×１０５個／ウェル）を洗浄し、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを使用して剥離し、微小遠心管中でペレット化した（１４００ｒｐｍ、２５℃で５分間）。ペレットをＢＤ  ＦＡＣＳＦｌｏｗ溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に再懸濁し、Ｃｙ５チャネルで分析して、粒子結合プローブの割合を決定した（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）。過剰なｃＲＧＤおよび／またはマウスモノクローナル抗ヒトインテグリンανβ３フルオレセイン結合抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）の存在下で、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ナノ粒子（２．５ｎｇ／ｍｌ）をＭ２１、Ｍ２１ＬおよびＨＵＶＥＣ細胞と共にインキュベートした後に、競合結合研究をさらに実施し、フローサイトメトリーによって分析した。ｃＲＧＤペプチドと比べたＲＧＤＹ−ＰＥＧナノ粒子の効力を評価するために、抗接着アッセイを実施した。ビトロネクチンＰＢＳ溶液（５μｇ／ｍｌ）で９６ウェルマイクロタイタープレートをコーティングし、続いて２００μｌのＲＰＭＩ／０．５％ＢＳＡ（１時間、３７℃）でコーティングした。ＲＰＭＩ／０．１％ＢＳＡ中で、細胞（３×１０４個／１００μｌ／ウェル）を様々な濃度のｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ナノ粒子またはｃＲＧＤペプチドと共に４組でインキュベートし（３０分間、２５℃）、ビトロネクチンコーティングプレートに追加した（３０分間、３７℃）。ＲＰＭＩ／０．１％ＢＳＡでウェルを穏やかに洗浄して、非接着細胞を除去した；４％ＰＦＡで接着細胞を固定（２０分間、２５℃）し、光学密度を決定するためにメチレンブルーで染色（１時間、３７℃）し、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅプレートリーダー（λｅｘ＝６５０ｎｍ、λｅｍ＝６８０ｎｍ、バンド幅１２ｎｍ）を使用して測定した。ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットのＩＣ５０値に対するｃＲＧＤペプチドの比として、多価性増大係数を計算した。Ｍｏｎｔｅｔら、Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＲＧＤ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４９，６０８７−６０９３（２００６）。
【０１９８】
動物モデルおよび腫瘍接種
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒによって承認されたプロトコールにしたがって、および動物保護に関するＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈガイドラインにしたがって、すべての動物実験を行った。甲状腺によって遊離放射性ヨウ素がインビボで取り込まれるのを阻止するためのヨウ化カリウム溶液を含有する水と共に、雄性無胸腺ｎｕ／ｎｕマウス（６〜８週齢、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ  Ｉｎｃ，Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＹ）を用意し、他の場所１０（ｅｌｓｅｗｈｅｒｅ  １０）で詳述されているようにＨａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｄｉｅｔ  ２０１６を自由に摂取させた。Ｍ２１またはＭ２１Ｌ異種移植片を作製するために、等量の細胞（約５×１０６個／１００μｌ）およびマトリゲルを異なるマウスの後肢に同時に皮下注射した。２００ｍｍ３の平均腫瘍体積まで、キャリパーを用いて腫瘍サイズを定期的に測定した。
【０１９９】
インビボ薬物動態および滞留半減期（Ｔ１／２）の測定
１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ナノ粒子または１２４Ｉ−ＰＥＧ−ナノ粒子（約２０μＣｉ／マウス）を静脈内注射した後、指定時間にマウス群を屠殺し、血液、腫瘍および臓器を採取し、計量し、１２４Ｉについて較正したシンチレーションγカウンターで計測することによって、時間依存性放射能濃度（％ＩＤ／ｇ）（放射性崩壊について注射時に対して補正したもの）を測定した。各組織について得られた時間−放射能濃度データを減少単一指数関数に対してフィッティングして、関数のＴ１／２およびＡ、組織／臓器滞留半減期ならびにゼロ時間切片の値をそれぞれ決定した。
【０２００】
以前に記載されている方法を使用して、経時的に尿中に排泄された粒子の割合を推定した。Ｂｕｒｎｓら、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｕｒｉｎａｒｙ  Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ９，４４２−８（２００９）。簡潔に言えば、２００μｌの非標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ナノ粒子またはＰＥＧ−ナノ粒子をマウスに静脈内注射し、１６８時間にわたって尿サンプルを採取した（ｎ＝マウス３匹／時点）。蛍光分析、および既知の粒子濃度（％ＩＤ）と混合した尿サンプルのバックグラウンド補正蛍光シグナル測定値から作成した系列希釈較正曲線を使用して、各時点の粒子濃度を決定した。次いで、マウスの平均１日尿量の推定値と共に濃度値を使用して、経時的に排泄された尿１ｇ当たりの累積％ＩＤを計算した。累積糞排泄を評価するために、２００μｌの１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ナノ粒子を静脈内注射した後に、代謝ケージを使用して同様の時間間隔で糞を収集した（ｎ＝マウス４匹／時点）。１２４Ｉについて較正したγ計測を使用して、試料の放射能を決定した。
【０２０１】
線量測定
各組織について求めた時間−放射能関数を（放射性崩壊の効果を含めて）分析統合して、対応する累積放射能（すなわち、放射性崩壊の合計数）を求めた。次いで、このような放射線の局所吸収が完全であると仮定し、貫通放射線（すなわち、γ線）の寄与を無視して、非貫通放射線（陽電子）の１２４Ｉ平衡線量定数を累積放射能に乗じることによって、マウス臓器が吸収した１２４Ｉ線量を計算した。Ｅｃｋｅｒｍａｎら、Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ  Ｄａｔａ  ａｎｄ  Ｄｅｃａｙ  Ｓｃｈｅｍｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒｅｓｔｏｎ，ＶＡ：Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；１９８９。マウスとヒト（７０ｋｇ標準男性）との間の全体重および臓器重量の差異を調整することによって、マウス正常臓器の累積放射能をヒト正常臓器の累積放射能に変換した。Ｃｒｉｓｔｙら、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｂｓｏｒｂｅｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｅｎｅｒｇｙ  ａｔ  ｖａｒｉｏｕｓ  ａｇｅｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐｈｏｔｏｎ  ｓｏｕｒｃｅｓ（Ｉ−ＶＩＩ）．Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｒｅｐｏｒｔ  ＯＲＮＬ／ＴＭ−８３８１／Ｖ１−７．Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＶＡ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｄｅｐｔ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｅｒｃｅ；１９８７。計算したヒト正常臓器の累積放射能をＯＬＩＮＤＡ線量測定コンピュータプログラムに入力し、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ（ＭＩＲＤ）Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの形式を使用して、標準男性臓器の吸収線量を計算した。Ｌｏｅｖｉｎｇｅｒら、ＭＩＲＤ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  Ａｂｓｏｒｂｅｄ  Ｄｏｓｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）．Ｓｔａｂｉｎら、ＯＬＩＮＤＡ／ＥＸＭ：ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄｏｓｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４６，１０２３−１０２７（２００５）。
【０２０２】
急性毒性研究および組織病理学
６群の雄性および雌性Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウス（７週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）において、急性毒性試験を実施した。非標識ターゲティングプローブ（１２７Ｉ−ＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ナノ粒子）を処置群（ｎ＝雄６匹、ｎ＝雌６匹）に単回静脈内注射（２００μｌ）し、非標識ヨウ化ＰＥＧナノ粒子（ビヒクル、１２７Ｉ−ＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ナノ粒子）を対照群（ｎ＝雄６匹、ｎ＝雌６匹）に単回静脈内注射（２００μｌ）した。未処置対照（ｎ＝雄２匹、ｎ＝雌２匹）をさらに試験した。罹患率／死亡率および体重変化について、マウスを注射後１４日間にわたって毎日観察し、血液学および血清化学評価のために、注射７〜１４日後に解剖、組織病理学および血液採取を実施した（図１０、表３）。
【０２０３】
腫瘍特異的ターゲティングの連続ＰＥＴイメージング
小動物専用ＰＥＴスキャナー（Ｆｏｃｕｓ  １２０  ｍｉｃｒｏＰＥＴ；Ｃｏｎｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）を使用して、イメージングを実施した。スキャン期間全体において、酸素２Ｌ／分の２％イソフルラン麻酔下で、Ｍ２１またはＭ２１Ｌ後肢腫瘍担持マウスを維持した。すべてのマウスにおいて、２００μＣｉの１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ナノ粒子または１２４Ｉ−ＰＥＧ−ナノ粒子を静脈内注射した際に、ワンアワーリストモードの取得を開始し、続いて９６時間間隔で連続３０分間の静止画像を得た。スキャナー応答の不均一性、デッドタイムカウント損失、ランダム数および物理的崩壊について、画像データを注射時に対して補正した。測定システムの較正係数を使用することによって、再構成画像のボクセル計数率を放射能濃度（％ＩＤ／ｇ）に換算した。ＡＳＩＰｒｏソフトウェア（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）を使用することによって、再構成画像の三次元関心領域（ＲＯＩ）分析を実施して、腫瘍におけるプローブ取り込みの平均、最大およびＳＤを決定した。画像から求めた腫瘍％ＩＤ／ｇ値を、γカウンターの筋肉％ＩＤ／ｇ値で割ることによって、腫瘍対筋肉放射能濃度比を求めた。
【０２０４】
ＮＩＲ蛍光イメージングおよび顕微鏡検査を併用したリンパ節マッピング
等量５０μｌのｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットサンプルを使用して四分円的な腫瘍周囲投与によって、後肢腫瘍担持ヌードマウスに注射し、自由に歩き回らせた。３０分〜１時間後、２％イソフルレン／９８％酸素混合物でマウスを麻酔し、マウスの腹側面に沿って垂直に表面パラミヂン切開を行って、腫瘍と同側の後肢から腋窩までの領域を外科的に露出させた。６５０±２０ｎｍ  ＮＩＲ励起および７１０ｎｍロングパス発光フィルタを備える巨視的蛍光顕微鏡を使用して、局所所属リンパ節（すなわち、鼠径、腋窩）および流入領域リンパ節（腋窩領域を含む）のインサイチュー光学イメージングを実施した。全身光学画像（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｍａｅｓｔｒｏ  ｉｍａｇｅｒ）をさらに取得し、以前に報告されているようにスペクトルデコンボリューションした。Ｂｕｒｎｓら、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｕｒｉｎａｒｙ  Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ９，４４２−８（２００９）。
【０２０５】
統計分析
ターゲティング／非ターゲティングプローブを投与した腫瘍マウス群またはＭ２１／Ｍ２１Ｌ腫瘍担持マウス群を比較する統計分析を、片側マン・ホイットニーＵ検定を使用して実施した（Ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなす）。生体内分布研究の場合、１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ナノ粒子（ｎ＝マウス７匹）または１２４Ｉ−ＰＥＧ−ナノ粒子（対照、ｎ＝マウス５匹）の組織特異的な平均％ＩＤ／ｇ値を各時点で比較したところ、血液、腫瘍および主要臓器では、注射２４時間後だけではなく注射４時間後および９６時間後においても、腫瘍および他の組織について、トレーサー活性の統計的有意差が観察された（表１）。腫瘍ターゲティング研究の場合、Ｍ２１腫瘍マウス（ｎ＝７）とＭ２１Ｌ腫瘍マウス（ｎ＝５）と対照プローブ投与マウス（ｎ＝５）との間の平均％ＩＤ／ｇ値の差異は、注射４時間後に最大であり（両対照についてｐ＝０．００１５）、２４時間（それぞれｐ＝０．００１５およびｐ＝０．００４）、４８時間（それぞれｐ＝０．００１およびｐ＝０．００３）、７２時間（それぞれｐ＝０．０１５および０．００５）および９６時間（Ｍ２１−Ｍ２１Ｌについてｐ＝０．００５）の時点で依然として有意に上昇していることが見出された。１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ナノ粒子（ｎ＝７）対１２４Ｉ−ＰＥＧ−ナノ粒子（ｎ＝５）の腫瘍対筋肉比は、注射２４時間後（ｐ＝０．００１）および注射７２時間後（ｐ＝０．００６）では統計的に有意であるが、注射４時間後（ｐ＝．３５）では統計的に有意ではないことが見出された。尿較正曲線（Ｒ２＝０．９７３、ｐ＝０．０１）について、ならびに尿（Ｒ２＞０．９５、ｐ＝０．０４７）および糞（Ｒ２＞０．９９５、ｐ＜０．００２）累積％ＩＤ排泄曲線について、非線形回帰分析（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ，Ｓｙｓｔａｔ，ｖ．１１．０）を使用して、適合度（Ｒ２）を関連ｐ値と共に決定した。
【０２０６】
結果
ナノ粒子の設計および特性決定
以前に発表されているプロトコールにしたがって、メトキシ末端ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖（ＰＥＧ約０．５ｋＤａ）でコーティングしたＣｙ５色素含有コア−シェルシリカナノ粒子（最大発光＞６５０ｎｍ）を調製した。Ｂｕｒｎｓら、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｕｒｉｎａｒｙ  Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，９，４４２−８（２００９）．Ｏｗら、Ｂｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｉｌｉｃａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．５，１１３−１１７（２００５）。中性ＰＥＧコーティングは、細網内皮系（オプソニン作用）によって非特異的取り込みを防止した。二官能性ＰＥＧを使用して、少数（粒子当たり約６〜７個）のανβ３インテグリンターゲティング環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ｃＲＧＤＹ）ペプチドリガンドを付加して、効率的な腎クリアランスを容易にする小さな流体力学的サイズを維持した。ＰＥＴによって三次元的に定量イメージング可能なシグナルを得るために、チロシンリンカーを使用して、１２４Ｉでペプチドリガンドをさらに標識した（１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドット、図６Ａ）；比較的長命である１２４Ｉ（物理的半減期：４．２日間）の重要な実用的利点は、バックグラウンド活性の大部分を排除し、腫瘍対バックグラウンドのコントラストを最大化すると、最低でも投与後数日間にわたって放射性検出を可能にするのに十分なほど長く、十分なシグナルが持続することである。放射性薄層クロマトグラフィーによれば、放射標識ターゲティングナノ粒子の純度は＞９５％であった。ＦＣＳ測定によれば、非放射標識ターゲティングナノ粒子の安定性は約１年間である。ＦＣＳ分析によれば、粒子は尿中にそのまま排泄される。本明細書で使用される「ドット」および「ナノ粒子」は、互換的に使用される。１２４Ｉ標識のためのチロシン残基を含有するＰＥＧコーティング粒子は、対照プローブ（１２４Ｉ−ＰＥＧ−ドット）の役割を果たした。サイズ排除クロマトグラフィーによる放射標識サンプルの精製（図７）は、＞９５％の放射化学的収率をもたらした。非放射性ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧドットおよびＰＥＧ−ドットについて、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）（図６Ｂおよび６Ｃ）によって、直径約７ｎｍの流体力学的直径を測定した。以前の結果と一致して、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧドットの相対輝度は、遊離色素のものよりも平均２００％大きいと決定した（図６Ｃ）。Ｂｕｒｎｓら、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｕｒｉｎａｒｙ  Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，９，４４２−８（２００９）．Ｌａｒｓｏｎら、Ｓｉｌｉｃａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｒａｄｉａｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．２０，２６７７−２６８４（２００８）。これらの物理化学的特性に基づいて、本発明者らは、ターゲティング粒子の選択的腫瘍取り込みおよび保持と腎クリアランスとの良好なバランスを達成することにより、正常組織の毒性および放射線量を最小化しながら、標的組織の局在化が最大化されると予想した。
【０２０７】
インビトロ受容体結合研究
腫瘍および血管内皮表面に対する１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットおよび１２４Ｉ−ＰＥＧドットのインビトロ結合親和性および特異性を調べるために、ανβ３インテグリン過剰発現黒色腫細胞株（Ｍ２１）およびανβ３インテグリン非発現黒色腫細胞株（Ｍ２１Ｌ）およびヒト臍帯静脈内皮細胞株（ＨＵＶＥＣ）を使用した。フローサイトメトリーを使用したところ、一定範囲の粒子濃度（０〜８ｎｇ／ｍｌ）およびインキュベーション時間（最大約５時間）で、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットの高特異的な線形飽和結合が観察され、４時間および約２．０ｎｇ／ｍｌの粒子濃度において、差次的結合が最大であった（データは示さず）。最初に、Ｍ２１細胞を過剰な非放射標識ｃＲＧＤと共にインキュベートし、次いで、様々な濃度の放射標識ターゲティングプローブを追加した後、γ計測法を使用して、１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧドットの受容体結合特異性を試験した（図８Ａ）。結合データのスキャッチャード分析により、０．５１ｎＭの解離平衡定数Ｋｄ（図８Ａ、挿入図）および２．５ｐＭの受容体濃度Ｂｍａｘが得られた。Ｂｍａｘ値に基づいて、ανβ３インテグリン受容体密度は、Ｍ２１細胞当たり１．０×１０４であると推定したが、これは、この細胞株について以前に発表された推定値５．６×１０４と合理的に一致する。Ｃｒｅｓｓｍａｎら、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ＲＧＤ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ανβ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．１５，４９−５９（２００９）。インテグリン特異的なＭ２１細胞取り込みの増加は４〜３７℃の温度範囲でも観察されたが、これは、受容体媒介性の細胞インターナリゼーションが全体的な取り込みに寄与していたことを示唆している（データは示さず）。ターゲティングプローブを使用したさらなる競合結合研究では、抗ανβ３インテグリン抗体によって受容体媒介性結合が完全に遮断されることがフローサイトメトリーにより示された（図８Ｂ）。過剰なｃＲＧＤＹまたは抗体ανβ３インテグリン抗体のいずれかを使用したところ、Ｍ２１Ｌ細胞と結合（Ｍ２１の約１０％）した受容体の程度に関して、有意な減少は見られなかった（図８Ｃ）。さらなるγ計測研究によってこれらの結果を確認し、１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットについて、５０％結合阻害濃度ＩＣ５０が１．２ｎＭであると決定した。抗接着アッセイおよびＭ２１細胞を使用して、単量体ｃＲＧＤペプチドに対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットの関連する多価性増大係数が２．０超であることが見出された（データは示さず）。Ｍｏｎｔｅｔら、Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＲＧＤ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４９，６０８７−６０９３（２００６）．Ｌｉら、６４Ｃｕ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  ｏｃｔｏｍｅｒｉｃ  ＲＧＤ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｓｍａｌｌ−ａｎｉｍａｌ  ＰＥＴ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒανβ３ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ．Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．４８，１１６２−１１７１（２００７）。フローサイトメトリーによれば、Ｍ２１細胞と同様に、過剰な抗体は、ＨＵＶＥＣ細胞に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドット受容体結合を有効に遮断した（図８Ｄ）。
【０２０８】
生体内分布およびクリアランスの研究
微量（約０．２ナノモル）の１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧドットおよび１２４Ｉ−ＰＥＧ−ドットをＭ２１腫瘍異種移植マウスモデルに静脈内投与することによって、時間依存生体内分布ならびに腎クリアランスおよび肝胆道クリアランスを評価した（図９）。ターゲティングプローブの組織放射能濃度（１グラム当たりの注射用量の割合（％ＩＤ／ｇ））を注射後（ｐ．ｉ．）１９６時間の時間間隔で測定したが、１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧドット（図９Ａ）および１２４Ｉ−ＰＥＧ−ドットトレーサー（図９Ｂ）の比較は、後者のデータが１週間の時点で得られなかったので、９６時間の時間枠に制限した。トレーサー活性の統計的有意差（ｐ＜０．０５）は、血液、腫瘍および主要臓器では注射４時間後および注射９６時間後に観察され、腫瘍およびいくつかの他の組織では注射２４時間後に観察された（表１）。注射１週間後において、ターゲティングプローブは、死体からほぼ完全に排除された（約３％ＩＤ）。これらのトレーサーの血液、腫瘍および主要臓器の滞留半減期（Ｔ１／２）を表２に示す（カラム２および５）。代表的なデータセット（血中滞留）を図９Ａの挿入図に示す。１２４Ｉ−ＰＥＧ−ドットについて、７．３±１．２時間の比較的長い血中Ｔ１／２値を決定した。１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットを合成するためにｃＲＧＤＹペプチドを付加すると、Ｔ１／２値は５．６±０．１５時間にわずかに減少したが、プローブのバイオアベイラビリティがより大きくなった（表２、カラム３）。１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットの腫瘍Ｔ１／２値は、血液のものよりも約１３倍大きいのに対して、１２４Ｉ−ＰＥＧ−ドットではわずか５倍の違いであることが見出された（表２、カラム２および５）。
【表１】
0006412918.tif 000002
【表２】
0006412918.tif 000003
【０２０９】
上記生体内分布データのヒトへの適切な質量調整換算によって、ヒト正常臓器の放射線量を求めたところ、一般的に使用される他の診断放射性トレーサーのものと同程度であることが見出された（表２、カラム８、９）。ターゲティングプローブは非毒性であり、組織特異的な病理学的効果をもたらさなかった（すなわち、急性毒性がない）という発見（図１０および表３）と共に、これらの薬剤を用いたヒトにおける初めてのターゲティングおよび非ターゲティング分子イメージングの適用を計画する。
【表３】
0006412918.tif 000004
【０２１０】
マウスにおける静脈内投与後において、１２７Ｉ−ＲＧＤ−ＰＥＧドットが非毒性であることを確認するための別の研究では、ヒト線量当量の約１００倍の１２７Ｉ−ＲＧＤ−ＰＥＧドットを使用して、正式な単回投与毒性試験を２週間にわたって実施した。１２７Ｉ−ＰＥＧドットは、対照粒子としての役割を果たした。要約すると、手順は以下の通りであった。急性毒性研究では、２８匹の８週齢Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスを使用し、処置群および対照群に分けた。単回用量の１２７Ｉ−ＰＥＧ化ＲＧＤシリカナノ粒子を処置群（ｎ＝雄６匹＋雌６匹）に１×１０−９モル／マウスの用量で静脈内投与し、同量のビヒクルを対照群（ｎ＝雄６匹＋雌６匹）に投与した。投与後７日目に、１群当たり２匹のマウス（１群当たり雄１匹および雌１匹）を屠殺し、臨床化学、血液学および組織特異的組織病理学を解剖時に行った。処置後１４日間にわたって、残りの動物すべて（１群当たり雄５匹および雌５匹）を観察した。４匹の未処置マウス（雄２匹および雌２匹）を参照として使用した。投与中または１４日間の観察期間後に有害事象は観察されなかったというのが研究の結論であった。死亡も病的状態も観察されなかった。臨床観察結果には、以下の欠如が含まれていた：貧血、体重減少、動揺、呼吸増加、ＧＩ障害、異常行動、神経機能障害、血液学における異常、臨床化学における異常、または臓器病理学における薬物関連病変。したがって、１×１０−９モル／マウスでの１２７Ｉ−ＰＥＧ化ＲＧＤシリカナノ粒子の単回注射（これは、第０相イメージング研究に必要なＰＥＧ化ＲＧＤシリカナノ粒子用量の約１００倍過剰に相当する用量である）は、Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスにおいて安全かつ非毒性である。
【０２１１】
尿サンプルの蛍光分析によって、直径約７ｎｍのターゲティングプローブおよび非ターゲティングプローブについて、１６８時間にわたる効率的な腎排泄が見出された。蛍光シグナルをバックグラウンド補正し、系列希釈較正スキームに基づいて粒子濃度（％ＩＤ／μｌ）に換算した（図９Ｃ、挿入図；表４、カラム２）。Ｂｕｒｎｓら、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｕｒｉｎａｒｙ  Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，９，４４２−８（２００９）。濃度値は、平均尿中排泄率の年齢依存性保守的推定値と共に、累積排泄％ＩＤの計算を可能にした（表４、カラム４）。Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｒａｔｅｓ  ｏｆ  ｕｒｉｎｅ  ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｏｕｓｅ  ｍｏｕｓｅ（ｍｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）：ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｙ  ａｇｅ，ｓｅｘ，ｓｏｃｉａｌ  ｓｔａｔｕｓ，ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｃｏｌ．２１，１４８１−１４９３（１９９５）。注射用量の約半分（約４３％ＩＤ）が注射後の最初の２４時間で排泄され、約７２％ＩＤが９６時間までに排泄されることが観察されたが（図９Ｃ）、これは、排泄の大部分が注射後１日目に起こったことを示唆している。注射１６８時間後において、有意な粒子蛍光を尿中で検出することができなかった。１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットの糞排泄プロファイルにより、平均で注射用量の７％ＩＤおよび１５％ＩＤがそれぞれ２４時間および９６時間で排出されることが示された（図９Ｄ）。ターゲティングプローブの注射後の複数の時点で得た尿サンプルのＦＣＳ分析により、粒子はそのまま排泄され、封入されていた色素は放出されなかったことが明らかになった（データは示さず）。
【表４】
0006412918.tif 000005
【０２１２】
連続全身ＰＥＴ研究
Ｍ２１およびＭ２１Ｌ皮下後肢異種移植マウスモデルにおけるインテグリン発現のＰＥＴイメージングを、１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットまたは１２４Ｉ−ＰＥＧ−ドット（対照）の注射後の複数の時点で実施した。注射４時間後（左：Ｍ２１腫瘍；中央：Ｍ２１Ｌ腫瘍）および２４時間後（右：Ｍ２１腫瘍）における代表的な全身冠状方向マイクロＰＥＴ画像を図１１Ａに示す。ανβ３インテグリン過剰発現Ｍ２１腫瘍の特異的ターゲティングは、これらの画像から明確に目に見える。ターゲティング１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットを投与したＭ２１（ｎ＝７）およびＭ２１Ｌ（対照）腫瘍（ｎ＝５）群について、ならびに非ターゲティング１２４Ｉ−ＰＥＧ−ドットトレーサーを投与したＭ２１腫瘍マウス（ｎ＝５）について、平均腫瘍％ＩＤ／ｇおよび標準偏差を示す（図１１Ｂ）。最大腫瘍取り込み（注射約４時間後）の時点において、Ｍ２１腫瘍では、対照に対して３倍の放射能濃度の増加（％ＩＤ／ｇ単位）が見られた。１時間の時点（ｐ＝０．２７）を除く注射後のすべての時点（ｐ＜０．０５）において、差異は統計的に有意であった。
【０２１３】
１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットに関する画像から求めた腫瘍対筋肉取り込み（％ＩＤ／ｇ）比により、より後の時間（注射約２４〜７２時間後）における腫瘍コントラストの増強が明らかになったが、１２４Ｉ−ＰＥＧ−ドットに関する比は減少した（図１１Ｃ）。この知見により、１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットは実際に腫瘍選択的であり、最初の２４時間の間に血中放射能が排除されたために、これがより明白になったことが示唆された（図１１Ｃと図９Ａの挿入図とを比較のこと）。１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットおよび１２４Ｉ−ＰＥＧドットの両方に関する画像から求めたＰＥＴ由来の腫瘍組織％ＩＤ／ｇ値と、対応するエクスビボγ計測腫瘍％ＩＤ／ｇ値との間で、統計的に有意な相関が見出されたが（相関係数ｒ＝０．９４、Ｐ＜０．００１６；図１１Ｄ）、これは、非侵襲的に得た定量的生体内分布データに関するＰＥＴの精度を裏付けている。
【０２１４】
インビボＮＩＲ蛍光イメージングおよび顕微鏡検査
本発明者らは、局所／所属リンパ節およびリンパ管をマッピングして上記制限を克服するために、本発明者らの小さなターゲティングナノ粒子を使用して、インビボ蛍光イメージング研究を実施した。重要なことに、本発明者らのターゲティング粒子プローブのマルチモーダル性および小サイズを利用して、四分円的腫瘍周囲投与後の本発明者らの黒色腫モデルにおける一定範囲のリンパ節サイズおよびリンパ枝を可視化し、術中ヒトセンチネルリンパ節マッピング手順をシミュレートすることができる。最初に、ターゲティング粒子プローブまたは非ターゲティング粒子プローブのいずれかを使用して、無傷のマウスにおいて、連続ＮＩＲ蛍光顕微鏡検査を４時間にわたって実施した。ターゲティングプローブの腫瘍周囲投与により、この間隔にわたる、隣接する鼠径リンパ節および膝窩リンパ節への排液およびそれらの持続的な可視化が明らかになったが、リンパ節およびリンパ管がより小さくおよび／またはより多いほど、可視化がより困難であった。対照的に、非ターゲティングプローブは、局所リンパ節のより短期的（約１時間）な可視化をもたらし、観察された蛍光シグナルは徐々に弱くなった（データは示さず）。外科的な露出により、この観察結果は、ターゲティングプローブで観察された長期保持と比較してより迅速な腫瘍部位からの粒子拡散の結果であることが見出された。
【０２１５】
本発明者らは次に、生動物全身光学的イメージング（図１２Ａ）およびＮＩＲ蛍光顕微鏡技術（図１２Ｂ）を使用して、複数の空間スケールにわたる代表的なリンパ節のマッピングを実施して、外科的に露出した生動物の腫瘍周囲領域から鼠径リンパ節および腋窩リンパ節へのリンパ排液を可視化した。加えて、高解像度蛍光画像（図１２Ｂ、下段）は、高内皮細静脈（これは、リンパ節への循環ナイーブリンパ球の通過を容易にし、リンパ節分類、および疾患の初期段階における微小転移の検出能力に重要な意味を持ち得る）を含むより詳細なリンパ節内構造の可視化を可能にした。腋窩領域における蛍光顕微鏡検査によって、より小さくてあまり強くないリンパ枝も可視化した（データは示さず）。したがって、小サイズのターゲティングプローブは、腫瘍の近位にある最初の流入領域（またはセンチネルリンパ節）の可視化を可能にするだけではなく、より遠位のリンパ節および可視化すべきリンパ排液のパターンの可視化も可能にする。
【０２１６】
考察
本発明者らは、腫瘍選択的ターゲティングおよびリンパ節マッピングのための、効率的に排出される非毒性かつ高親和性なシリカナノ粒子であって、他の粒子技術に関連する多くの現在の課題に対処するのに成功したシリカナノ粒子について報告する。これは、その好ましい特性に基づいて、複合光学−ＰＥＴプローブとして臨床的に解釈可能であると言うことができる最初のターゲティングナノ粒子である。このマルチモーダルプローブの相補的性質は、その小さなサイズ（直径約７ｎｍ）と結び付いており、異なる空間スケール、時間スケールおよび感度スケールで取得された画像データのシームレスな統合を可能にすることによって臨床的評価を容易にすることができ、腫瘍生物学を支配する基本的な分子プロセスについての新たな洞察を提供する可能性がある。
【０２１７】
本発明者らのインビトロ結果は、Ｍ２１細胞およびＨＵＶＥＣ細胞に対する約７ｎｍのターゲティング粒子プローブの受容体結合特異性を示す。同じ細胞型を使用しているが、一価型ペプチドを用いている受容体結合アッセイで、同様の知見が報告されている。Ｃｒｅｓｓｍａｎら、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ＲＧＤ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ανβ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．１５，４９−５９（２００９）。重要なことに、ｃＲＧＤＹ結合粒子プローブの多価性の増大は、長期の血中滞留時間および腫瘍滞留時間Ｔ１／２値と共に、この粒子プラットフォームに関連する重要な特性であって、一価型粒子では見られない特性である。
【０２１８】
１２４Ｉ−ＰＥＧ−ドットトレーサーについて推定された７．３±１．２時間という比較的長い血中Ｔ１／２値は、化学的に中性のＰＥＧコーティング表面に関係する可能性があり、プローブを生物学的に不活性し、網内系によるファゴサイトーシスに対して著しく低感受性にする。１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットトレーサーでは、Ｔ１／２値が５．６±０．１５時間に減少することが見出されたが、これは、標的インテグリンおよび／またはより活性なマクロファージ活性による認識の結果である可能性が最も高い。しかしながら、それは、既存のｃＲＧＤＹペプチドトレーサーの公開されている血中Ｔ１／２値（約１３分間）よりも実質的に長く、より大きなプローブバイオアベイラビリティをもたらし、腫瘍ターゲティングを容易にし、長期間にわたるより多くの腫瘍取り込みをもたらす。Ｍｏｎｔｅｔら、Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＲＧＤ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４９，６０８７−６０９３（２００６）。加えて、１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットの腫瘍Ｔ１／２値は、血液のものよりも約１３倍大きかったのに対して、１２４Ｉ−ＰＥＧ−ドットではわずか５倍の違いに過ぎず、これは、前者の腫瘍組織局在性が後者よりも実質的に大きいことを示唆している。インビボデータのこのような機構的解釈は、臨床診断、処置計画および処置モニタリングプロトコールを改良するのに利用することができる。
【０２１９】
この研究の結果は、ＰＥＴ（これは、受容体発現レベル、結合親和性および特異性に関する分子情報を非侵襲的に抽出するための強力で定量的かつ高感度なイメージングツールである）によって提供される明確な利点を強調している。周囲の正常構造と比べた、Ｍ２１腫瘍におけるより大きな蓄積およびＭ２１腫瘍からのより遅いクリアランスは、特異的な腫瘍取り込み機構と、正常組織における非特異的な機構（すなわち、組織灌流、漏出）との識別を可能にする。しかしながら、おそらくは、Ｍ２１腫瘍取り込みの小さな構成要素は、血管透過性の変化（すなわち、血管透過性・滞留性亢進効果）に起因し得る。Ｓｅｙｍｏｕｒ，Ｐａｓｓｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．９，１３５−１８７（１９９２）。対照トレーサー（１２４Ｉ−ＰＥＧ−ドット、図１１Ｂ）を投与したマウスで観察された％ＩＤ／ｇの増加に基づくと、この非特異的な取り込み様式は、注射後のより早い時点における全体的な腫瘍取り込みの比較的小さな部分を反映している。注射１時間後において、Ｍ２１腫瘍では、対照に対して有意な％ＩＤ／ｇの増加は見られなかった。この観察結果は、最初の１時間における差次的灌流の効果と、注射後のより後の時点（すなわち、２４時間）で主に見られた腫瘍蓄積および保持を反映している可能性がある。さらに、臨床的に承認されたペプチドトレーサーＦ１８−ガラクトＲＧＤと比較して、１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドット３４では、多価結合、長期の血液循環時間およびより大きな腎クリアランスという利点をさらに提供しながら、Ｍ２１腫瘍における取り込みがほぼ２倍多いことが見出された。
【０２２０】
複合光学−ＰＥＴプローブの利点の１つは、病変における活性の検出および定量を損ない得る、ＰＥＴスキャナーの解像限界以下のサイズを有する解剖学的構造を評価する能力（すなわち、いわゆる部分容積効果）である。例えば、小動物モデルでは、観察されるリンパ節のサイズは、通常、システムの空間分解能（１〜２ｍｍ）に従うことを考慮すると、小さな局所／所属リンパ節内の転移性疾患の評価（これは、黒色腫の病期分類および処置にとって臨床的に重要である）は、ＰＥＴイメージングによって適切に解像されない場合がある。第２の相補的かつ高感度なイメージングモダリティである近赤外（ＮＩＲ）蛍光イメージングを利用することによって、結節性疾患およびリンパ排液パターンを明らかにする機能マップを得ることができる。Ｂａｌｌｏｕら、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１８，３８９−３９６（２００７）。転移巣の高感度な位置決定が達成可能であるかを決定するためには、転移巣に関係する結節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ）ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧドット蛍光の分布を調査するさらなる研究が必要であるが、これらの結果は、このような複合光学−ＰＥＴプローブを利用することの利点を明確に実証している。
【０２２１】
臨床では、腫瘍の病期分類および処置のためのこのような複合プラットフォームの利益を誇張することはできない。このナノプローブの長期の血液循環時間およびその結果得られるバイオアベイラビリティは、毒性を考慮して課される制限がない、疾患管理（例えば、診断スクリーニング、処置前評価、治療介入および処置後モニタリング）の様々な段階の初期モニタリングおよび長期モニタリングの両方に関する汎用ツールとしてのその用途を強調する。さらなる重要な利点は、迅速に排出されるプローブは、標的組織局在化がそれ自体迅速である特定の用途に有用であり得る一方で、多くの場合に不十分に可視化され、さもなければ固形腫瘍に比較的アクセス不可能な多くの薬剤の局在化は、全身投与後に遅くなりそうであるということである。したがって、標的組織局在化の速度はもはや制限要因ではないので、本ナノ粒子プラットフォームは、このような薬剤の適用範囲を拡大する。さらに、分布および数の点では、ＰＥＴによって深リンパ節をマッピングすることができる一方、ＮＩＲ蛍光イメージングによって、表面リンパ節のより正確かつ詳細な局在性を得ることができる。最後に、その多価性の増大に加えて、ターゲティングプローブの腫瘍滞留が血中滞留と比べて比較的長時間であることは、放射線治療薬送達ビヒクルまたは薬物送達ビヒクルとして将来のセラノスティック用途に利用することができる。
【０２２２】
実施例５  ανβ３インテグリンターゲティングペプチドおよび／またはｕＭＵＣ１ターゲティングペプチドとコンジュゲートした蛍光シリカナノ粒子（甲状腺がんおよび扁平上皮癌（ＳＣＣ）モデル）
システイン末端官能性を有するｃＲＧＤペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、チオール−マレイミド結合を介してＰＥＧ化ナノ粒子に付加する。場合により、合成ペプチドリガンドＥＰＰＴ１によって、ナノ粒子をさらに官能化し得る。粒径、サイズ分布およびフォトブリーチングに基づいて、ナノ粒子を特性決定する。
【０２２３】
ナノ粒子−ペプチドコンジュゲートの特性決定
粒子当たりの光物理的特性を評価するために、分光測光法、分光蛍光分析および多光子蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を使用して、粒径、輝度およびサイズ分布を決定する。走査電子顕微鏡検査および動的光散乱（ＤＬＳ）測定によって、サイズデータを確認する。Ｏｗら、Ｂｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｉｌｉｃａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００５；５，１１３。アルカリ条件下で、ビウレット分光光度法（λ＝４５０ｎｍ、最大吸光度）によって、ナノ粒子当たりのＲＧＤペプチドの平均数、および官能化ＰＥＧ基に対するＲＧＤのカップリング効率を比色分析で評価する。
【０２２４】
チロシンリンカーを介してナノ粒子コンジュゲートをヨウ素化し、Ｉｏｄｏｇｅｎ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用することによって、放射標識（１２４Ｉ）（Ｔ１／２約４日間）および安定（１２７Ｉ）型を作製する。サイズ排除クロマトグラフィーを使用することによって、最終生成物を精製する。
【０２２５】
ＲＧＤ−ナノ粒子およびＲＧＤ−ＥＰＰＴ−ナノ粒子のインビトロにおけるターゲティング特異性および生体内分布パターンの評価
甲状腺癌および扁平上皮癌（ＳＣＣ）細胞株におけるανβ３インテグリンおよびｕＭＵＣ１発現パターンを、抗インテグリンおよび抗ｕＭＵＣ１抗体を使用して、公知のανβ３インテグリン陰性およびανβ３インテグリン陽性（それぞれＭ２１−ＬおよびＭ２１ヒト黒色腫細胞株）ならびにｕＭＵＣ１陰性およびｕＭＵＣ１陽性（それぞれＵ８７２８、Ｈ−２９細胞株）対照に対して評価する。ＲＧＤ−ナノ粒子およびＲＧＤ−ＥＰＰＴ−ナノ粒子を用いた差次的結合研究ならびにインビボイメージングのために、ανβ３インテグリンおよび／またはＭＵＣ１を高発現する細胞株を選択する。
【０２２６】
定量的な細胞結合アッセイでは、腫瘍細胞の標識効率を評価し、放射性ヨウ素化ナノ粒子コンジュゲート（１２４Ｉ−ＲＧＤ−ナノ粒子、１２４Ｉ−ＲＧＤ−ＥＰＰＴ−ナノ粒子）を使用して、腫瘍、臓器および流体における取り込みをアッセイする生体内分布研究を実施する。ナノ粒子コンジュゲートのＰＥＴ取り込みデータと、光学ＮＩＲＦイメージングを使用して最初に観察されたものとを比較するために、各ナノ粒子コンジュゲートをヨウ素化して、放射標識（１２４Ｉ）および安定（１２７Ｉ）型を作製する。
【０２２７】
ＲＧＤ−ドットおよびＲＧＤ−ＥＰＰＴ−Ｃ−ドットを用いた蛍光顕微鏡検査。ανβ３インテグリンおよび／またはＭＵＣ１を高発現する甲状腺癌／ＳＣＣ細胞株ならびに対照株に対するＲＧＤ−ナノ粒子およびＲＧＤ−ＥＰＰＴ−ナノ粒子の差次的結合を、蛍光顕微鏡検査によって可視化する。
【０２２８】
動物モデル。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコールにしたがって、および動物保護に関するＮＩＨガイドラインにしたがって、すべての動物実験を行う。
【０２２９】
インビボ生体内分布：異なる組織由来のインテグリン陰性／陽性またはｕＭＵＣ１陰性／陽性腫瘍（ｎ＝３／各腫瘍）を雄性無胸腺ヌードマウス（６〜８週齢、ｎ＝５／腫瘍）の両脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）注射する。直径（ｉ．ｄ．）０．５ｃｍで、１２４Ｉ標識ナノ粒子コンジュゲート（約５００ｎｍ／ｋｇ）をマウスに静脈内（ＩＶ）注射する。０．５時間後、１時間後および２４時間後に動物を屠殺し、計量および計測（γカウンター）のために、腫瘍、臓器および流体を採取する。組織１グラム当たりの注射用量の割合として、生体内分布の結果を表す。
【０２３０】
定量的細胞結合アッセイ。ανβ３インテグリンおよび／またはＭＵＣ１を高発現する一定数の癌細胞を、事前に選択した濃度の１２４Ｉ標識ナノ粒子コンジュゲートと共に、３７℃の加湿ＣＯ２雰囲気下で１時間インキュベートすることによって、標識効率を評価する。細胞を十分に洗浄し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸで溶解し、γカウンターで細胞溶解物を計測する。
【０２３１】
インビボマルチモダリティ（ＰＥＴ−ＮＩＲＦ）イメージングを使用した、腫瘍特異的ターゲティングの相対的差異の評価
ハイスループット診断スクリーニングツールとして光学ＮＩＲＦイメージングを使用して、感度および時間分解能の増加と共に徐々に官能化したナノ粒子コンジュゲートのインビボにおける生体内分布の相対的差異を評価し得る。腫瘍特異的ターゲティングに関する半定量的データも得ることができる。ＰＥＴを使用して生体内分布および腫瘍特異的ターゲティングをさらに詳細に定量するために、これらの予備的研究は、目的のマーカーを強く発現する細胞株の選択を容易にする。
【０２３２】
全身マイクロＰＥＴ（商標）およびＮＩＲＦ光学イメージングを１週間実施して、側腹部腫瘍における差次的取り込みを評価する。エクスビボにおける腫瘍の蛍光顕微鏡検査によって、これらの研究の結果を検証する。
【０２３３】
連続インビボＮＩＲＦイメージング。ανβ３インテグリン陰性およびανβ３インテグリン陽性細胞またはｕＭＵＣ１陰性およびｕＭＵＣ１陽性細胞（ｎ＝５／腫瘍）をマウスに両側注射した。腫瘍が直径約０．５ｃｍに達した後、安定ヨウ素化および非ヨウ素化ナノ粒子コンジュゲート（ＲＧＤ、１２７Ｉ−ＲＧＤ、ＲＤＧ−ＥＰＰＴ、１２７Ｉ−ＲＧＤ−ＥＰＰＴ）を静脈内注射する。０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間および２４時間の時点において、Ｍａｅｓｔｒｏ（商標）インビボ蛍光イメージングシステム（ＣＲＩ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を使用して、連続イメージングを実施する。２４時間の時点でマウスを安楽死させ、主要組織／臓器を切開し、計量し、エクスビボイメージングのために６ウェルプレートに入れる。自己蛍光を排除するためのスペクトル非混合アルゴリズムを用いて、腫瘍の関心領域（ＲＯＩ）、選択組織および参照注入液を使用して、蛍光発光を分析する。組織の平均蛍光強度を注入液の値で割ることにより、注射した各ナノ粒子コンジュゲートについて、様々な組織／臓器間で比較を行うことが可能になる。
【０２３４】
動的マイクロＰＥＴイメージングの取得および分析。放射標識１２４Ｉ−ナノ粒子コンジュゲート（放射性トレーサー）を２群の腫瘍担持マウス（ｎ＝５／腫瘍）に注射し、Ｆｏｃｕｓ  １２０  ｍｉｃｒｏＰＥＴ（商標）（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＴＮ）を使用して、動的ＰＥＴイメージングを１時間実施する。約２５．９ＭＢｑ（７００μＣｉ）の放射性トレーサーを静脈内注射した際に、ワンアワーリストモードの取得を開始する。フィルタ逆投影によって１２８×１２８×９６のマトリックスにおいて、得られたリストモードデータを再構成する。ＡＳＩＰｒｏ（商標）ソフトウェア（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＴＮ）を使用して、再構成画像のＲＯＩ分析を実施して、腫瘍、他の臓器／組織および左心室（ＬＶ）における放射性トレーサー取り込み（％ＩＤ／ｇ）の平均およびＳＤを決定する。注射２４時間後、４８時間後および７２時間後の時点の静止画像から、さらなるデータを得る。３コンパートメント４パラメータ動態モデルを使用して、インビボにおけるトレーサーの挙動を特性決定する。この分析のために、左心室（ＬＶ）に置かれた関心領域（ＲＯＩ）を使用して、動脈入力を測定する。
【０２３５】
実施例６−ミニブタにおけるリンパ節マッピング
これらのシステムは、一般に、手術室で使用するには非常に煩雑かつ高価であるか、または必要な視野もしくは組織コントラストを提供することができない場合があるので、現時点では、リンパ節群のリアルタイム術中スキャンを部分的に達成することができない。さらに、フルオロフォアを含有する臨床的に有望かつ生体安定な薬剤であって、拡大リンパ節マッピング／切除手順のために、組織コントラストを増強するのに利用可能な、親色素よりも改善された光物理的特徴およびより長い循環寿命を提供する薬剤は存在しない。この動物研究では、本発明者らは、マルチモーダル粒子プローブおよびリアルタイム分子イメージングデバイス技術の両方の進歩を様々な将来のヒト臨床試験に容易につなげることができることを示す。このような形成的技術は、転移性ＳＬＮの検出を容易にし、隣接生体構造からのリンパ節の正確な描写を可能にして、重要な構造に対する損傷リスクを最小化するための最先端のターゲティング可視化ツールを提供することによって、標準的な術中がん治療に大きな影響を与え得る。利点としては、頭頸部における結節性疾患拡大および腫瘍範囲に関する長期のリアルタイムインビボ術中マッピングが挙げられる。ＰＥＴによって深リンパ節をマッピングすることができる一方、ＮＩＲ蛍光イメージングによって、表面リンパ節の正確かつ詳細な局在性を得ることができる。小サイズの粒子プローブはまた、高感度に検出可能なリンパ節の下限を拡大することができる。提案した非毒性マルチモーダルプラットフォームの正味の効果は、複合的な診断／処置手順の適用と共に、致死率が高いこの疾患の病期分類、予後および臨床転帰に重要な意味を持つ。
【０２３６】
疾患標的。黒色腫に加えて、多くの他の腫瘍（すなわち、乳房、肺および脳）はανβ３インテグリン受容体を過剰発現し、疾患標的として役立ち得る。転移性黒色腫は非常に予後不良であり、生存期間の中央値は１年未満である。管理の成功は、早期発見とがんの適切な外科的切除に依拠する。原発性疾患の外科的除去、スクリーニング、および所属リンパ節拡大の処置は、疾患を適切に病期分類して処置を調整するための米国における標準治療である。最近改訂された病期分類ガイドラインでは、微小リンパ節転移の存在が、生存の劇的な減少につながる進行期疾患の顕著な特徴と認識されている。病理学的リンパ節の状態に関する知識は、早期のリスク層別化、転帰予測の改善、およびアジュバント処置（治療的リンパ節切除、化学療法）から恩恵を受ける可能性がある患者サブグループの選択、または臨床試験に重要である。
【０２３７】
センチネルリンパ節（ＳＬＮ）マッピング。黒色腫の病期分類で通常使用されるＳＬＮマッピング技術は、腫瘍転移リスクが最も高い特定のリンパ節を同定する。この手順は、さらなる処置のために、転移性疾患を有する患者を同定する。標準治療技術は、ＳＬＮの位置決定のために、放射性テクネチウム（９９Ｔｃ）硫黄コロイド色素を原発性腫瘍周囲に注射し、続いて、γプローブを術中使用して、露出したリンパ節群内のリンパ構造における放射能を測定することに依拠する。原発性腫瘍付近に注射された青色色素は、隣接組織からの小さなＳＬＮを描写するのに役立ち得るが、この技術は信頼性がなく、合併症にかかりやすい。現在のＳＬＮマッピングおよび生検技術は限界があり、頭頸部において位置決定されていないＳＬＮの割合が他の解剖学的部位と比較して高い原因である。頭頸部領域は、その転移性疾患のパターンが予測不可能であるために悪名高い。この領域で原発性疾患がリンパ節転移に近接していると、注射部位からの干渉により、γプローブの術中使用が困難になる。重要なことに、現在の技術では、このリンパ節を同定および摘出するために、外科医は、センチネルリンパ節を視覚化し、それと隣接脂肪または他の組織とを確実に区別して、切開中に損傷リスクがある重要な構造（すなわち、神経）を判別することができない。小サイズのリンパ節および排液パターンの幅広いバリエーションはさらなる課題をもたらし、位置決定されていない割合は約１０％になる。
【０２３８】
ナノ粒子。大部分の前臨床試験では、ανβ３インテグリン発現をイメージングするためのターゲティングリガンドとして、ＲＧＤペプチドまたはペプチドコンジュゲート放射性トレーサーが使用されている。１８Ｆ−ガラクト−ＲＧＤおよび９９ｍＴｃ−ＮＣ１００６９２は、疾患を診断するのに患者で使用されて成功しているペプチドトレーサーである。ペプチドトレーサーは迅速に排出されると、受容体結合が減少し、非特異的な組織分散からのバックグラウンドシグナルが増加し得る。これらの特性は、より長期のモニタリングのためのペプチドトレーサーの可能性を制限する。対照的に、ナノ粒子プローブ（約１０〜１００ｎｍ）は、腫瘍の新生血管構造に沿ってインテグリン発現をイメージングするためにも使用されており、長期モニタリング（すなわち、数日間）を実施するための長期の循環半減期を有する。ナノ粒子は、典型的には、抗体および放射性医薬品（＜１０ｋＤａ）よりも大きく、腫瘍の変化した血管透過性に起因するより遅い膜貫通輸送、細網内皮系（ＲＥＳ）取り込みの増加および非特異的取り込みの増強に関連する。本ＳＬＮマッピング研究に使用した直径７ｎｍのターゲティングナノ粒子は、アルブミン分子の平均直径とほぼ同程度であり、典型的な抗体の平均直径よりも２〜３倍小さい。ペプチドトレーサーと比べて、ターゲティング粒子プローブは血液溢出されにくく、腫瘍ターゲティングを増強する長期の循環半減期に関連する。重要なことに、１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットは、Ｍ２１腫瘍において、臨床解釈に必要な重要なインビトロおよびインビボ特性を示す。
【０２３９】
材料および方法。
【０２４０】
リンパ節転移および／または臓器転移の全身スクリーニングのために、５ｍＣｉの１８Ｆ−フルオロ−デオキシグルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）を自然発生黒色腫シンクレアミニブタ（１０〜１２ｋｇ、Ｓｉｎｃｌａｉｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＭＯ）に静脈内注射した。注射４０分後に、臨床ＰＥＴスキャナーを使用して、動的１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴ全身ＰＥＴスキャンをミニブタに対して１時間行って、転移性疾患をスクリーニングし、続いて、解剖学的位置決定のためにＣＴスキャンを取得した。次いで、１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴの４８時間後に、マルチモーダル１２４Ｉ−ＲＧＤ−ＰＥＧ−ドットをミニブタの腫瘍部位（選択的に頭頸部）付近に四分円的に皮下注射し、２回目の動的ＰＥＴ−ＣＴスキャンを実施して、さらなるリンパ節転移について評価した。
【０２４１】
リンパ節を同定するために、ミニブタを手術室に運んだ。露出した手術台内で高解像度の蛍光画像を得るために、大視野近赤外蛍光カメラシステム、小視野改良型内視鏡および改良型実体顕微鏡を使用して、光学蛍光イメージングを実施した。
【０２４２】
手術台内で、臨床的に承認されたハンドヘルドＰＥＴデバイスを用いてγ計測によって、蛍光シグナルの検証を手術中に実施して、リンパ節群内の皮膚およびリンパ節から手術中に取得したターゲティングドットを経皮的に位置決定した。
【０２４３】
原発性黒色腫皮膚病変を切除し、切開して、センチネルリンパ節へのアクセスを可能にした。ハンドヘルドＰＥＴおよびマルチスケール光学イメージングシステムを使用して、リンパ節の同一性を確認し、問題のリンパ節を切除した。組織学的転移評価および光学共焦点顕微鏡検査に試料を送って、悪性腫瘍およびナノ粒子蛍光の両方の存在を確認した。
【０２４４】
センチネルリンパ節の摘出後、リンパ節群全体を切除し、（必要に応じて、黒色腫の免疫組織化学的マーカーを用いる）組織学的方法、蛍光顕微鏡検査、および相関目的の場合にはハンドヘルドＰＥＴプローブを使用してさらに評価した。この工程は、イメージングへの出現によって、リンパ節群内の任意の他の悪性リンパ節と、隣接リンパ節に存在する１２４Ｉ−ＲＧＤ−ＰＥＧ−ドットの数とを同定するのに役立った。
【０２４５】
１２４Ｉ−ＲＧＤ−ＰＥＧ−ドットを動物の肢に逐次に皮下投与した。光学イメージングシステムおよびハンドヘルドＰＥＴプローブを使用して、鼠径／腋窩リンパ節への１２４Ｉ−ＲＧＤ−ＰＥＧ−ドットの移行を追跡して、リンパ経路に沿って移行時間を確認した。流入領域リンパ節群を外科的に露出させ、リンパ節排液のパターンを観察した。各部位からセンチネルリンパ節を摘出して、組織のリンパ性を確認した。動物施設の解剖室において、動物を安楽死させ、イメージングで認められたさらなる病変を切除した。
【０２４６】
考察
全身１８Ｆ−フルオロデオキシグルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）ＰＥＴ−ＣＴスキャンにより、動物の右側後方の頸部の単一リンパ節だけではなく背中上部の脊椎に隣接する原発性黒色腫病変が明らかになったが、これらはＦＤＧ−ａｖｉｄであり、転移性疾患が疑われた。１２４Ｉ−ＲＧＤ−ＰＥＧ−ドットを腫瘍部位付近に四分円的に皮下注射した後に、この知見を確認し、２つ以上の代謝亢進リンパ節および流入領域リンパ管を同定した。最終スキャンの解釈は、３つの潜在的な転移性リンパ節を示した。ハンドヘルドＰＥＴプローブが、センチネルリンパ節の位置における計数率の上昇を同定および確認した後に、頸部の他のリンパ節群からの原発性病変、代謝亢進リンパ節および組織の外科的切除を実施した。組織学的分析によれば、切除した右後部センチネルリンパ節組織で測定された斑点状の蛍光シグナルは、黒色腫転移の部位と相関していた。すべての代謝亢進リンパ節試料を黒色に着色したところ、黒色腫細胞の明確なクラスタの存在と相関することが見出された。したがって、他の公知の黒色腫マーカーのＨ＆Ｅ染色病理学に供した外科的に切除した組織の結果により、マルチモーダルイメージングの知見が裏付けられた。
【０２４７】
図１３ａは、公知の原発性黒色腫腫瘍の部位のリンパを集めるリンパ節群および所属リンパ管をマッピングするための自然発生ミニブタ黒色腫モデルを使用する実験設定を示す。この中間サイズのミニブタモデルは、ヒトにおけるセンチネルリンパ節（ＳＬＮ）生検手順の適用をシミュレートするのに必要であり、ヒト疾患をより正確に再現する。図１３ｂは、マルチモーダル粒子（１２４Ｉ−ＲＧＤ−ＰＥＧ−ドット）を腫瘍部位付近に皮下注射した５分後の小視野ＰＥＴ画像を示す。腫瘍領域、リンパ節、および腫瘍部位のリンパを集めるリンパ管は、活性が増加した領域（黒色）として見られる。
【０２４８】
図１４は、全身動的１８Ｆ−フルオロデオキシグルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）ＰＥＴスキャン（図１４ａ）および融合１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴ−ＣＴスキャン（図１４ｂ）を示しており、頸部における結節性疾患の部位を通る矢状方向、冠状方向および軸方向の画像を実証している。１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴスキャンを実施して、放射標識ナノ粒子プローブの静脈内投与後および投与前の転移性疾患の部位をマッピングした。単一の代謝亢進リンパ節は、全身ミニブタ画像でも同定された動物の右側後方の頸部（矢印、軸方向画像、上／下パネル）に見られる（図１４ｃ）。
【０２４９】
図１５は図１４と同じ画像セットを示すが、原発性黒色腫病変が背中上部の脊椎に隣接しているレベルにある。全身ミニブタ画像と同様に、ＰＥＴ−ａｖｉｄ病変（矢印、軸方向画像、上／下パネル）が同定されている（図１５ｃ）。
【０２５０】
図１６は、１２４Ｉ−ＲＧＤ−ＰＥＧ−ドットを腫瘍部位付近に四分円的に皮下注射し、臨床プロトコールを１時間にわたってシミュレートした後の高解像度動的ＰＥＴ（図１６ａ）および融合ＰＥＴ−ＣＴ（図１６ｂ）画像を示す。３つの代謝亢進リンパ節（矢印）が頸部に見出されたが、これは、転移性疾患を示唆している。切除した右後部ＳＬＮを切除し、全身近赤外（ＮＩＲ）蛍光イメージングを実施した。全身光学イメージングの切除リンパ節（図１６ｃ、上、Ｃｙ５イメージング）内では、Ｃｙ５蛍光シグナルが検出可能であった。
【０２５１】
この黒色に着色したリンパ節（矢印、ＳＬＮ）の病理学的分析により、Ｈ＆Ｅ染色によるリンパ節の低倍率（矢印）および高倍率断面図において、浸潤性黒色腫細胞のクラスタが実証されたので（下の２つの画像）、本発明者らは、特殊な染色を使用すれば黒色腫特異性がさらに確認されると予想する（Ｍｅｌａｎ  Ａ、ＨＭＢ４５、ＰＮＬ２および「黒色腫関連抗原」ｂｉｏｇｅｎｅｘクローンＮＫＩ／Ｃ３）。本発明者らはさらに、転移性疾患の検出を確認する共焦点蛍光顕微鏡検査および高解像度デジタルオートラジオグラフィーにおいて、前記粒子がこれらの転移性細胞クラスタと共局在すると予想する。
【０２５２】
実施例７  ＭＣ１Ｒターゲティングペプチドとコンジュゲートした蛍光シリカナノ粒子（黒色腫モデル）
マルチモダリティ（ＰＥＴ−ＮＩＲＦ）診断イメージング実験のために、ナノ粒子表面上のターゲティングペプチドおよび放射標識を交換して、標的特異性、親和性／アビディティおよび検出感度を決定する。続いて、ＭＣ１Ｒを発現する黒色腫細胞を標的殺傷するための治療放射標識（ルテチウム−１７７、１７７Ｌｕ、ｔ１／２＝６．６５日間）を使用して、治療粒子も合成する。複合的な定量ＰＥＴおよび光学イメージングの知見を、空間スケールで腫瘍組織オートラジオグラフィーおよび光学イメージングと相関させる。細胞顕微鏡検査の場合、複合反射率蛍光イメージングのためのインビボ共焦点蛍光スキャナーを使用する。
【０２５３】
実施例８  ターゲティング放射線治療のための蛍光ナノ粒子
１３１Ｉ−ＲＧＤナノ粒子を用いた用量漸増試験を実施し、１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴを使用して、処置応答を６週間にわたって週１回モニタリングする。プラナーガンマカメライメージングを使用して、ナノプラットフォームの時間依存性腫瘍取り込みおよび線量測定を実施する。インビボイメージングデータを、切除腫瘍試料のγ計測と相関させる。
【０２５４】
Ｍ２１ヒト黒色腫細胞（ＰＢＳ中、５×１０５個）の注射後に、後肢異種移植モデルを作製するために、雄性ヌードマウス（６〜８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，ＭＡ）を使用する。０．５〜０．９ｃｍ３のサイズまで、腫瘍を１０〜１４日間成長させる。
【０２５５】
１３１Ｉベースのターゲティング放射線治療研究。ターゲティング放射線治療用の放射標識として、治療放射性核種１３１Ｉを使用する。動物の死亡および２０％未満の体重減少をもたらさない可能な最高１３１Ｉ用量（ＭＴＤ）を推定するために、腫瘍担持ヌードマウスにおいて、用量漸増試験を行う。血液５４に対して線量２００ｒａｄの場合、２７０ｒａｄの線量を腫瘍に送達する１０ＭＢｑの投与放射能が必要である。骨髄の修復および温存を可能にするように設計された線量分割では、４用量の１０ＭＢｑを投与して、１０００ｒａｄ超の腫瘍線量を達成する。１３１Ｉは、ピンホールコリメータを使用するプラナーガンマカメライメージングが、ナノ粒子の時間依存性腫瘍取り込みおよび線量測定を測定することを可能にする。１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴは、腫瘍反応の定量的なモニタリングを可能にして、相補的情報を提供する。
【０２５６】
このデータ、およびパクリタキセルをロードしたナノ粒子の効果に関するインビボデータに基づいて、１３１Ｉ−ＲＧＤナノ粒子コンジュゲートを用いた治療研究を行う。１３１Ｉ−ＲＧＤナノ粒子コンジュゲートまたは生理食塩水ビヒクル（対照、ｎ＝１０）を２群の腫瘍担持マウス（ｎ＝１０／群）に４週間にわたって週１回静脈内投与して１０．４ＭＢｑの放射能を４回与え、６週間モニタリングする。（キャリパー測定による）腫瘍体積に基づいて、治療反応／進行を定量する。また、ＳＰＥＣＴイメージング（Ｇａｍｍａ  Ｍｅｄｉｃａ）によって、処置群のすべてのマウスを６週間にわたって週１回（約１時間のセッション）イメージングする。
【０２５７】
１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴイメージングの取得および分析。２群の腫瘍担持マウス（ｎ＝１０／群）に対して、最初のＰＥＴスキャンを６週間間隔の処置の前に行い、その後は週１回行う。５００μＣｉの１８Ｆ−ＦＤＧをマウスに静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、処置の前後に、Ｆｏｃｕｓ  １２０  ｍｉｃｒｏＰＥＴ（商標）（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＴＮ）を使用して、１０分間の静止ＰＥＴ画像を取得する。フィルタ逆投影によって１２８×１２８×９６のマトリックスにおいて、取得したデータを再構成する。ＡＳＩＰｒｏ（商標）ソフトウェア（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＴＮ）を使用して、再構成画像の関心領域（ＲＯＩ）分析を実施して、腫瘍における放射性トレーサー取り込み（％ＩＤ／ｇ）の平均およびＳＤを決定する。研究終了時に動物を屠殺し、γ計測のために腫瘍を切除する。
【０２５８】
実施例９  放射性核種キレートおよびＭＣ１Ｒターゲティングペプチドとコンジュゲートした蛍光ナノ粒子
ターゲティングペプチド、および高比活性放射標識と結合する大環状キレートとＰＥＧ化ナノ粒子をコンジュゲートする。
【０２５９】
ＮＨＳエステルまたはマレイミドで誘導体化された市販の高純度活性化２アームＰＥＧを、標準的な手順を使用して、ナノ粒子のシリカシェルに付加する。２つの官能基化ＰＥＧ基（ＮＨＳエステルまたはマレイミド）のいずれかが、ペプチド−キレート構築物（環状ペプチドＲｅ−［Ｃｙｓ３，４，１０，Ｄ−Ｐｈｅ７］α−ＭＳＨ３−１３（ＲｅＣＣＭＳＨ（Ａｒｇ１１））または１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）リンカーキレート剤のいずれかとのさらなるコンジュゲーションに利用可能である。下記のように、ＤＯＴＡおよびペプチドキレート構築物を連結するための異なる官能基を露出させるように、ナノ粒子表面への誘導体化ＰＥＧの共有結合を実施する。
【０２６０】
官能化ナノ粒子の合成および物理化学的特性決定。
【０２６１】
以下の部分と誘導体化ＰＥＧ基と共有結合を確立することによって、官能化ナノ粒子を合成する。
【０２６２】
（Ａ）ＰＥＴイメージングによる診断検出を可能にするための、陽電子放出放射性金属（すなわち、６４Ｃｕ）によるその後の高比活性放射標識のためのＤＯＴＡキレート。標準的なＦｍｏｃ化学を使用してＤＯＴＡを官能化ＰＥＧにコンジュゲートし、クロマトグラフィーによってキレート化ナノ粒子の精製を実施する。反応混合物を６０℃で３０分間インキュベートすることによって、６４Ｃｕおよび１７７ＬｕをＤＯＴＡに付加し、続いて、ゲルろ過または高圧液体クロマトグラフィー精製を行う。あるいは、ＤＯＴＡ官能化ＰＥＧ（放射性金属）またはチロシン官能化ＰＥＧ（１２４Ｉ）のいずれかを介して、１２４Ｉ、８６Ｙ、６８Ｇａおよび８９ＺｒなどのＰＥＴ核種をナノ粒子にコンジュゲートし得る。放射線治療の場合、１７７ＬｕＣｌ３の形態で得られた単光子放射体１７７ＬｕをＤＯＴＡと錯化させる。
【０２６３】
（Ｂ）レニウムによって、αＭＳＨ黒色腫ターゲティングペプチド類似体（ＲｅＣＣＭＳＨ（Ａｒｇ１１））を環化する。ＤＯＴＡキレートと、ＰＥＧ化ナノ粒子表面上のＲｅＣＣＭＳＨ（Ａｒｇ１１）部分との比を確認する必要がある。
【０２６４】
官能化ナノ粒子調製物の特性決定を以下のように実施する：
（Ａ）６４Ｃｕを用いた標準的な同位体希釈アッセイによって、ナノ粒子当たりのＤＯＴＡキレートの平均数を決定する。簡潔に言えば、既知量のＲｅＣＣＭＳＨ（Ａｒｇ１１）−ナノ粒子を含有する溶液に６４Ｃｕを追加する。インキュベートした溶液をシリカゲルコーティングガラスプレート上にスポットし、１：１  １０％酢酸アンモニウム−メタノール（ＥＤＴＡを含む）中で現像し、ラジオＴＬＣによって分析する。６４Ｃｕ標識ＲｅＣＣＭＳＨ（Ａｒｇ１１）−ナノ粒子は発生部位に留まるが、ＥＤＴＡに結合した６４Ｃｕは移動する。反応混合物に追加した６４Ｃｕの総ナノモルに対して、％標識効率をプロットする。この曲線の変曲点から、ナノ粒子当たりの結合したキレートの数を決定し得る。
【０２６５】
（Ｂ）分光光度法（λ＝４３５ｎｍ、最大吸光度）およびＲｅＣＣＭＳＨ（Ａｒｇ１１）の公知の吸光係数を使用して、ナノ粒子当たりのＲｅＣＣＭＳＨ（Ａｒｇ１１）ペプチドの平均数、および官能化ＰＥＧ基に対するＲｅＣＣＭＳＨ（Ａｒｇ１１）のカップリング効率を評価する。レニウムの組み込みは、少サンプルの生成物において、レニウム濃度の高感度吸光度測定を行うことができるという利点を提供する。
【０２６６】
腫瘍特異的ターゲティングおよび処置応答を評価するための、黒色腫モデルにおけるマルチモーダルナノ粒子ナノ粒子のインビトロおよびインビボ光学ＰＥＴイメージング。
【０２６７】
６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＲｅＣＣＭＳＨ（Ａｒｇ１１）−ナノ粒子をネイティブな６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＲｅＣＣＭＳＨ（Ａｒｇ１１）構築物と比較して、ナノ粒子のターゲティング能力を試験する。
【０２６８】
競合結合アッセイ。ＭＣ１Ｒ受容体陽性Ｂ１６／Ｆ１マウス黒色腫株を使用する。１２５Ｉ−（Ｔｙｒ２）−ＮＤＰ７（ＭＣ１Ｒに対してピコモル親和性を有する放射性ヨウ素化α−ＭＳＨ類似体）を使用して、ＲｅＣＣＭＳＨ（Ａｒｇ１１）ペプチドのＩＣ５０値（放射性リガンド結合の５０％を阻害するのに必要なペプチドの濃度）を決定する。２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ−（２−エタンスルホン酸）、０．２％ＢＳＡおよび０．３ｍｍｏｌ／Ｌ  １，１０−フェナントロリン］を含む０．５ｍｌの結合培地中で、１０−１３〜１０−５の範囲の（Ａｒｇ１１）ＣＣＭＳＨ濃度で、単一ウェルを約５０，０００ｃｐｍの１２５Ｉ−（Ｔｙｒ２）−ＮＤＰと共に２５℃で３時間インキュベートする。細胞および培地中の放射能を別々に回収および測定し、データを処理し、Ｋｅｌｌソフトウェアパッケージ（Ｂｉｏｓｏｆｔ，ＭＯ）を用いて、Ｒｅ（Ａｒｇ１１）ＣＣＭＳＨペプチドのＩＣ５０値を計算する。
【０２６９】
受容体定量アッセイ。５×１０５個のＢ１６／Ｆ１細胞のアリコートをウェルに追加し、２００μＬのＲＰＭＩ培地中で培養し、０．５ｍＬの結合培地（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＭＥＭ、ｐＨ７．４）中、漸増濃度の１２５Ｉ−（Ｔｙｒ２）−ＮＤＰ（２．５〜１００ｎＣｉ）の存在下で、３７℃で１．５時間インキュベートする。０．５ｍＬの冷０．２％ＢＳＡ／０．０１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で細胞を２回洗浄し、細胞画分に関連する放射能のレベルをγカウンターで測定する。細胞および１２５Ｉ−（Ｔｙｒ２）−ＮＤＰを最終濃度１０μＭの非放射性ＮＤＰとインキュベートすることによって、非特異的結合を決定する。特異的結合と遊離１２５Ｉ−（Ｔｙｒ２）−ＮＤＰとの比を特異的結合の濃度（ｆｍｏｌ／細胞１００万個）と対比してプロットすることによって、スキャッチャードプロットを得る；Ｂｍａｘ（結合部位の最大数）は、線形回帰直線のＸ切片である。
【０２７０】
Ｂ１６／Ｆ１マウス黒色腫株（ＰＢＳ中、５×１０５個）を雄性ヌードマウス（６〜８週齢）の後肢に皮下注射する。０．５〜０．９ｃｍ３のサイズまで、腫瘍を１０〜１４日間成長させる。
【０２７１】
生体内分布：少量の６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＲｅＣＣＭＳＨ（Ａｒｇ１１）−ナノ粒子コンジュゲート（約１０μＣｉ、０．２０μｇ）を、触知可能なＢ１６／Ｆ１腫瘍を有する各マウスに静脈内注射する。注射後の選択時点（２時間、４時間、２４時間、４８時間、７２時間；ｎ＝４〜５／時点）で動物を屠殺し、所望の組織を採取し、計量し、累積放射能を計測する。ネイティブな放射標識構築物６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＲｅＣＣＭＳＨ（Ａｒｇ１１）（約１０μＣｉ、０．２０μｇ）を注射したさらなるマウス（ｎ＝５）は、対照群としての役割を果たし、注射１時間後に評価する。インビボ取り込み特異性を調べるために、６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＲｅＣＣＭＳＨ（Ａｒｇ１１）−ナノ粒子コンジュゲートの注射直前に、受容体遮断薬として作用する２０μｇのＮＤＰを追加群のマウス（２時間の時点）に前注射する。主要臓器および組織を計量し、γ計測し、１グラム当たりの注射用量の割合（％ＩＤ／ｇ）を決定する。
【０２７２】
連続インビボＮＩＲＦイメージング。以下のＰＥＴ研究と並行して、腫瘍担持動物（ｎ＝１０）の静脈内注射の前後に、調整可能な６８０ｎｍ走査ＮＩＲレーザービームおよびＣＣＤを使用して、ＮＩＲ（蛍光断層撮影、ＦＭＴ２２５，Ｖｉｓｅｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を実施する。連続的なイソフルラン麻酔下でマウスを維持し、注射前後（１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間および７２時間）に、ＦＭＴスキャンのために（ＦＭＴ２５００およびＦｏｃｕｓ１２０マイクロＰＥＴの両方に対応）ポータブルマルチモーダルイメージングカセットに入れる。Ｖｉｓｅｎ専用フトウェアを使用して、１〜１０分間にわたって測定したＮＩＲ蛍光画像を再構成し、マウスの通常の写真に重ね合わせる。測定強度はＮＩＲフルオロフォア濃度に直接関係するので、画像データは定量的であり、取得したＰＥＴイメージングデータへのコレジストレーションにより、絶対フルオロフォア濃度のパラメトリックマップを作成することができる。
【０２７３】
動的ＰＥＴイメージングの取得および分析。２群の腫瘍担持マウス（ｎ＝５／群）をコレジストレーション連続ＰＥＴ−光学研究用のイメージングカセット内に入れる。放射標識６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＲｅＣＣＭＳＨ（Ａｒｇ１１）−ナノ粒子コンジュゲートを第１のマウスに静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、ネイティブな６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＲｅＣＣＭＳＨ（Ａｒｇ１１）構築物を第２のマウスに静脈内注射する。注射後、Ｆｏｃｕｓ  １２０  ｍｉｃｒｏＰＥＴＴＭ（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＴＮ）を使用して、１時間の動的ＰＥＴ画像を取得する。放射標識プローブ（約１ｍＣｉ）の静脈内注射時に、ワンアワーリストモードの取得を開始する。フィルタ逆投影によって１２８×１２８×９６のマトリックスにおいて、得られたリストモードデータを再構成する。ＡＳＩＰｒｏ（商標）ソフトウェア（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＴＮ）を使用して、再構成画像の関心領域（ＲＯＩ）分析を実施して、腫瘍、他の臓器／組織および左心室（ＬＶ）における放射性トレーサー取り込み（％ＩＤ／ｇ）の平均およびＳＤを決定する。データのトレーサー動態モデリングは、送達、クリアランスおよび分布容積を含む薬物動態パラメータの推定を可能にする。前述のように、（血中放射能の指標として）左心室（ＬＶ）に置かれた関心領域（ＲＯＩ）を使用して、動脈血入力を測定する。注射２４時間後、４８時間後および７２時間後の時点の静止画像から、さらなるデータを得る。
【０２７４】
組織の蛍光顕微鏡検査およびオートラジオグラフィー。より小さな空間スケールを徐々に示す光学イメージング技術の組み合わせ（すなわち、全身蛍光イメージング、蛍光顕微鏡検査およびインビボ蛍光共焦点レーザー走査顕微鏡検査）を、注射７２時間後の生無傷動物における腫瘍のイメージングに利用する。連続的なイソフルラン麻酔下でマウスを維持することにより、倍率の範囲全体にわたって細胞レベルに対する全動物／臓器レベルからの蛍光シグナルの検出および位置決定が可能になる。Ｃｙ５蛍光フィルタセットおよびＣＣＤカメラを備える蛍光実体顕微鏡（Ｖｉｓｅｎ；Ｎｉｋｏｎ  ＳＭＺ１５００）を用いて、全動物／巨視的イメージングを実施する。蛍光共焦点レーザー走査顕微鏡の機能を開発する。続いて、腫瘍体積全体にわたって高解像度でトレーサーの生体分布をマッピングするためのオートラジオグラフィーのために、マウスを安楽死させる。腫瘍を切除し、急速冷凍し、連続切片化し（１００μ切片）、遮光カセット内のフルオロフォアプレートと接触して置かれたスライスを交互にしてスライドにマウントする（最大１週間）。残りの連続切片に対して、Ｈ＆Ｅ染色を実施する。オートラジオグラフィーの知見を、ＰＥＴイメージングデータおよび組織学的結果と相関させる。
【０２７５】
あるいは、治療用放射性核種１７７Ｌｕまたは９０Ｙをターゲティング放射線治療に使用し得る。動物の死亡および２０％未満の体重減少をもたらさない可能な最高１７７Ｌｕ用量（ＭＴＤ）を推定するために、腫瘍担持ヌードマウスにおいて、用量漸増試験を行う。１７７Ｌｕの文献値に基づいて、ＭＴＤ（またはその付近）にあると疑われる用量の放射性医薬品を評価する。
【０２７６】
実施例１０  「クリックケミストリー」を介してリガンドおよび造影剤とコンジュゲートするために官能化した蛍光ナノ粒子
リガンド（例えば、ペプチド）および造影剤（例えば、放射性核種）のその後のコンジュゲーションのための汎用官能基を含有するナノ粒子の合成
高比活性放射標識に適切なナノ粒子−ペプチド−キレート構築物を合成するために、「クリックケミストリー」アプローチを使用して、ナノ粒子表面を官能化し得る（図１７）。この方法は、銅触媒による、三重結合へのアジドの付加環化に基づくものである。このようなアプローチは、マルチモダリティ用途を調べるための大きな汎用性を可能にするであろう。
【０２７７】
ナノ粒子の合成および特性決定。図１４のスキームにしたがって、共有結合するＰＥＧ基を生産する。シラン基を介して、ＰＥＧをナノ粒子に共有結合する。三重結合を有する官能化ＰＥＧを生産するために、標準的な化学経路を使用する。
【０２７８】
三重結合を有するナノ粒子の官能化。二官能化ＰＥＧを合成するために、第１工程では、活性化カルボン酸エステルと脂肪族アミンとの十分に研究されている反応を用いる（図１８）。あるいは、三重結合を有する別の適切なアミン、例えばｐ−アミノフェニルアセチレンを使用し得る。合成の第２工程は、周知のコンジュゲーション反応に依拠する。
【０２７９】
モデルペプチドおよびキレートとコンジュゲートした官能化ナノ粒子の合成および物理化学的特性決定。
【０２８０】
官能化ナノ粒子は、（Ａ）陽電子放射体ジルコニウム−８９（８９Ｚｒ）によるその後の高比活性放射標識のためのデスフェリオキサミンＢ（ＤＦＯ）および（Ｂ）ＳＳＴＲターゲティングペプチドオクトレオテートの両方を含有する。
【０２８１】
アジド結合を有するＤＦＯの合成。ＤＦＯ−Ｂをｐアジド安息香酸と反応させることによって、アジド基を有するＤＦＯを生産（図１９）および精製する。「クリックケミストリー」反応は、室温における１，３−両性付加環化であり、条件は、「Ｈｕｉｇｓｅｎ条件」と称されることが多い。一般に、反応はエタノール中、室温で完了し得るが、反応物を加熱することが適切な場合がある。触媒は多くの場合にＣｕ（Ｉ）Ｂｒであるが、代替物としては、Ｃｕ（Ｉ）ＩまたはＣｕ（ＩＩ）ＳＯ４（還元剤と併用）が挙げられる。Ｋｎｏｒら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  １，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｅｃａｎｅ−１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＯＴＡ）ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｔｏ  ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７；１３：６０８２−９０。クリック反応は、触媒の非存在下でも実行され得る。あるいは、ＤＦＯ−Ｂ中のＮＨ３＋基をアジド基に直接変換し得る。
【０２８２】
アジドを有するＴｙｒ３−オクトレオテートの合成。ペプチド合成装置によって、Ｔｙｒ３−オクトレオテートの固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）（図２０Ａ）を実施する。簡潔に言えば、このペプチドについて前記のように、合成は、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）法を含む。簡潔に言えば、機器プロトコールは、続いて、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）および２−（１Ｈベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）の組み合わせによって、２５μｍｏｌのＦｍｏｃ保護アミノ酸の活性化を必要とする。特に明記しない限り、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸は商業的に購入する；プレパックアミノ酸は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）から入手するが、プレパック形態で入手不可能なもの、例えばＤ−アミノ酸およびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）は、ＢＡＣＨＥＭ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．（Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）またはＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が供給している。ペプチドのＮ末端へのアジド含有酸のカップリングを介して、（「クリック」ケミストリーのための）アジド基をペプチド骨格に導入する一方、ペプチドを保護して樹脂に付加する（図２０Ｂ）。
【０２８３】
官能化ナノ粒子の合成。次の工程は、アジド結合を有するＤＦＯおよびアジド結合を有するＴｙｒ３−オクトレオテートの両方（図２１ＡおよびＢ）をナノ粒子にコンジュゲートすることである。「クリックケミストリー」は、高度に選択的で定量的であり、穏やかな条件を使用して非常に高速に実施し得る。ＤＦＯおよびＴｙｒ３−オクトレオテートからのアジド基の合計数を調整して、利用可能な三重結合の数を決して超えないようにする；三重結合は常に＜５％過剰である。
【０２８４】
官能化ナノ粒子の特性決定。８９Ｚｒ（または６８Ｇａ）を用いた標準的な同位体希釈アッセイを実施することによって、ナノ粒子当たりのＤＦＯキレートペプチドの平均数を決定する。８９Ｚｒをサイクロトロンで生産し、精製する。簡潔に言えば、既知量のＤＦＯ由来ナノ粒子を含有する溶液に、１０濃度の８９Ｚｒ−オキサレートを追加する。室温で３０分間インキュベートした後、この溶液をシリカゲルコーティングガラスプレート上にスポットし、１：１  １０％酢酸アンモニウム−メタノール（ＥＤＴＡを含む）中で現像し、ラジオＴＬＣによって分析する。８９Ｚｒ−ＤＦＯ由来ナノ粒子は発生部位に留まるが、ＥＤＴＡに結合した非特異的結合８９Ｚｒは移動する。反応混合物に追加した８９Ｚｒの総ナノモルの関数として、％標識効率をプロットする。次いで、この曲線の変曲点から、ナノ粒子に結合したキレートの数を決定し得る。
【０２８５】
Ｔｙｒ３−オクトレオテートのジスルフィド架橋をアッセイすることによって、ナノ粒子当たりのＴｙｒ３−オクトレオテートペプチドの平均数を決定する。簡潔に言えば、ｐＨ９．５および室温における過剰な亜硫酸ナトリウムによって、Ｔｙｒ３−オクトレオテートのジスルフィド結合を定量的に切断し得る。ＤＴＮＢまたはエルマン試薬を使用して、吸収測定によって、タンパク質中のチオールを定量し得る。それはチオールとの混合ジスルフィドを容易に形成し、発色団５−メルカプト（ｍｅｒａｐｔｏ）−２−ニトロ安息香酸（最大吸収４１０ｎｍ）を放出する。この水溶性試薬にアクセス可能なタンパク質チオールのみを改変する。あるいは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＭｅａｓｕｒｅ−ｉＴ（商標）Ｔｈｉｏｌ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを使用し得る。
【０２８６】
適切な腫瘍モデルにおけるインビボ試験。
【０２８７】
ＡＲ４２Ｊ腫瘍担持雌性ＳＣＩＤマウスを使用して皮下異種移植モデルを作製する。簡潔に言えば、ＡＲ４２Ｊ細胞（１×１０７個）を雌性ＳＣＩＤマウスの脇腹に皮下注射する。０．５〜０．９ｃｍ３のサイズまで、腫瘍を１０〜１２日間成長させる。
【０２８８】
８９ＺｒによるＤＦＯ−ナノ粒子の放射標識は、室温で＜１５分で進むと予想される。ＥＤＴＡを追加し、続いてゲルろ過工程によって、非特異的結合８９Ｚｒを除去する。
【０２８９】
受容体結合アッセイ。ＡＲ４２Ｊ腫瘍から得られた膜上に対して８９Ｚｒ−ＤＦＯナノ粒子を使用して、受容体結合アッセイを実施する。高純度の天然ジルコニウムシュウ酸を、それぞれＤＦＯ−オクトレオテートおよびＤＦＯ−ナノ粒子と反応させることによって、競合リガンドｎａｔＺｒ−ＤＦＯ−ナノ粒子およびｎａｔＺｒ−ＤＦＯ−オクトレオテートを調製する。ＨＰＬＣによって、最終生成物の純度を確認する。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して、以前に発表されている方法にしたがって、ＩＣ５０値を決定する。プログラムＧｒａＦｉｔ（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｕ．Ｋ．），ＬＩＧＡＮＤ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）およびＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭＴＭ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、データ分析を実施する。
【０２９０】
インビトロアッセイ。細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、単層からＡＲ４２Ｊ細胞を採取し、細胞２×１０６個／ｍＬの濃度で新鮮ＤＭＥＭ培地に再懸濁する。約０．３ｐｍｏｌアリコートの８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ナノ粒子を１０ｍＬの細胞に追加し、連続撹拌しながら３７℃でインキュベートする。１分間、５分間、１５分間、３０分間、４５分間、６０分間および１２０分間の時点において、３組の２００μＬアリコートを回収し、氷上に置く。遠心分離によって細胞を直ぐに単離し、細胞への化合物の取り込み％を計算する。
【０２９１】
生体内分布。少量の８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ナノ粒子（約１０μＣｉ、０．２０μｇ）を、触知可能なＡＲ４２Ｊ陽性腫瘍を有する各マウスに静脈内注射する。注射後の選択時点（１時間、４時間、２４時間、４８時間、７２時間；ｎ＝４〜５）で動物を屠殺し、所望の組織を採取し、計量し、累積放射能を計測する。注射１時間後において、２つの追加対照群（（Ａ）ネイティブな放射標識ペプチド８９Ｚｒ−ＤＦＯ−オクトレオテート（約１０μＣｉ、０．２０μｇ）を注射したマウスおよび（Ｂ）遮断薬Ｔｙｒ３−オクトレオテート（１５０μｇ）を前注射したマウス）を研究して、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ナノ粒子の受容体媒介性蓄積を実証する。血液、肺、肝臓、脾臓、腎臓、副腎（ＳＴＴＲ陽性）、筋肉、皮膚、脂肪、心臓、脳、骨、膵臓（ＳＴＴＲ陽性）、小腸、大腸およびＡＲ４２Ｊ腫瘍を含む組織を計測する。計量し、計測した標準溶液との比較によって、１グラム当たりの注射用量の割合（％ＩＤ／ｇ）および臓器当たりの注射用量の割合（％ＩＤ／ｇ）を決定する。
【０２９２】
インビボＮＩＲＦイメージング。０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間および７２時間の時点において、Ｍａｅｓｔｒｏ（商標）Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＲＩ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を使用して、連続イメージングを実施する。７２時間の時点でマウスを安楽死させ、主要組織／臓器を切開し、計量し、エクスビボイメージングのために６ウェルプレートに入れる。自己蛍光を排除するためのスペクトル非混合アルゴリズムを用いて、腫瘍の関心領域（ＲＯＩ）、選択組織および参照注入液を使用して、蛍光発光を分析する。５匹の動物の群について、蛍光強度および標準偏差（ＳＤ）を平均化する。組織の平均蛍光強度を注入液の値で割ることにより、注射した各ナノ粒子コンジュゲートについて、様々な組織／臓器間で比較を行うことが可能になる。
【０２９３】
インビボ小動物ＰＥＴイメージング。ｍｉｃｒｏＰＥＴ（登録商標）−ＦＯＣＵＳ（商標）ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ  ＴＮ）によって、小動物ＰＥＴイメージングを実施する。１〜２％イソフルランＡＲ４２Ｊ腫瘍担持マウス（ｎ＝５／群）を麻酔し、仰臥位で置き、カスタム調製クレードルに固定化する。尾静脈を介して、２００μＣｉの８９Ｚｒ−ＤＦＯ−オクトレオテート−ナノ粒子複合体をマウスに投与し、同時にイメージングする。最初に、１時間の時間枠で注射時から連続的に連続１０分マルチスキャンを取得し、続いて、注射２時間、４時間、２４時間、４８時間および７２時間後に１０分間の静止データを取得することによって、動物をイメージングする。目的の腫瘍および他の臓器に描かれた関心領域（ＲＯＩ）から、標準取り込み値（ＳＵＶ）を求める。高解像度のＸ線ＣＴ解剖学的画像を提供するｍｉｃｒｏＣＡＴ−ＩＩ  ｃａｍｅｒａ（Ｉｍｔｅｋ  Ｉｎｃ．，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）との組み合わせによって、ＰＥＴ画像のコレジストレーションを達成する。ランドマークレジストレーション技術およびＡＭＩＲＡ画像表示ソフトウェア（ＡＭＩＲＡ，ＴＧＳ  Ｉｎｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用することによって、マイクロＣＴおよびＰＥＴ画像間の画像レジストレーションを達成する。動物ベッドに直接取り付けられた基準点によって提供されるランドマークからのマイクロＣＴ画像の厳格な変換によって、このレジストレーション方法は進行する。
【０２９４】
薬物動態測定。生体内分布および動的ＰＥＴデータは、組織中の８９Ｚｒ−ＤＦＯ−オクトレオテート−ナノ粒子の時間濃度を提供し、それにより、薬剤の薬物動態パラメータの特性決定が可能になる。
【０２９５】
エクスビボにおける組織の蛍光顕微鏡検査およびオートラジオグラフィー。組織中のナノ粒子コンジュゲートの位置決定を凍結切片で実施する。マイクロＰＥＴによるイメージングにより、腫瘍および他の非標的組織中の全体的な分布を十分に評価することができる。イメージング試験の急性期の後、オートラジオグラフィーも腫瘍で実施し、このデータをＰＥＴイメージングおよび組織学的結果の両方と相関させる。オートラジオグラフィーおよび組織学的分析のために、連続切片（約１０μｍ）を切り取って、切片を交互にする。ＮＩＲチャネルにおける多チャネル蛍光顕微鏡検査によって、これらの切片を分析する。
【０２９６】
実施例１１  粒子のインターナリゼーション研究
本研究の目的は、本ナノ粒子の結合およびインターナリゼーションを評価して、細胞内小臓器およびエキソサイトーシスにおけるそれらの局在性を評価することである。これは、異なるターゲティング部分と、結合した治療薬とを有する官能化粒子の運命を研究するのに役立つ。例えば、診断ナノ粒子（例えば、非ターゲティングＰＥＧコーティングナノ粒子対ｃＲＧＤ−ＰＥＧコーティングナノ粒子）および治療ナノ粒子（例えば、放射線治療のためのヨウ素が結合したｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ナノ粒子、チロシンキナーゼ阻害剤が結合したｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ナノ粒子、またはタキソールなどの化学療法薬が結合したｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ナノ粒子）の両方。
【０２９７】
材料および方法
インターナリゼーション／取り込み研究。特異的取り込み経路を同定するために、インターナリゼーションアッセイおよび共局在研究を実施した。
【０２９８】
ヒトＭ２１およびマウスＢ１６細胞を含む黒色腫細胞（細胞約２×１０５個／ウェル）を、１２ｍｍ円形カバーガラスを用いて８ウェルチャンバースライド（１．７ｃｍ２／ウェル）スライドまたは２４ウェルプレート（１．９ｃｍ２／ウェル）にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。ターゲティングナノ粒子のインターナリゼーションをモニタリングするために、細胞をｃＲＧＤ−ＰＥＧドット（０．０７５ｍｇ／ｍｌ）と共に３７℃で３時間インキュベートした。培地中の未結合粒子を除去し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。ＨＣＸ  ＰＬ  ＡＰＯ：６３ｘ  １．２ＮＡ  Ｗａｔｅｒ  ＤＩＣＤ対物レンズを備えるＬｅｉｃａ倒立共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ）上で共焦点顕微鏡検査を実施して、細胞小臓器特異的な染色または抗体とのｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ドットの共局在性を評価した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアバージョン１．３７（ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ；ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を使用して、画像を分析した。
【０２９９】
共局在化アッセイ／色素結合マーカー。Ｃドットのインターナリゼーションに関与するエンドサイトーシス小胞を同定するために、色素結合マーカーを使用して、生細胞における共局在化アッセイを実施した。細胞をナノ粒子および異なる色素と共にコインキュベートした。色素としては、エンドソーム経路に沿って酸性細胞小臓器を３０分間標識するための１００ｎＭ  Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  ｒｅｄ；リサイクリングエンドソームおよびソーティングエンドソーム（クラスリン依存性経路）を標識するための２μｇ／ｍＬトランスフェリンＡｌｅｘａ  ４８８コンジュゲート；マクロピノソームを３７℃で３０分間標識するための１ｍｇ／ｍＬ７０ｋＤａデキストラン−ＦＩＴＣコンジュゲートが挙げられる。
【０３００】
共局在／細胞内小臓器特異的抗体。ゴルジ体およびリソソームの公知のマーカーを用いて、免疫細胞化学を実施する。ゴルジ体の場合、Ｇｉａｎｔｉｎ（Ａｂｅａｍ、ウサギポリクローナル、１：２０００）をヒト細胞に使用し、ＧＭ−１３０（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、１ｇ／ｍｌ）をマウス細胞に使用する。リソソームの場合、ＬＣ３Ｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ウサギポリクローナル、０．５ｇ／ｍｌ）を使用する。
【０３０１】
ＧｉａｎｔｉｎまたはＬＣ３Ｂ染色の場合、１０％正常ヤギ血清／０．２％ＢＳＡのＰＢＳ溶液中で、細胞を３０分間ブロッキングする。一次抗体のインキュベーション（ウサギポリクローナル抗Ｇｉａｎｔｉｎ抗体（Ａｂｅａｍ  ｃａｔａｌｏｇ＃ａｂ２４５８６、１：２０００希釈）またはＬＣ３Ｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｃ＃２７７５、０．５ｕｇ／ｍｌ）を３時間行い、続いて、１：２００希釈のビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ，ｃａｔ＃：ＰＫ６１０１）と共に６０分間インキュベートする。製造業者の説明書にしたがって、二次抗体遮断薬、遮断薬Ｄ、ストレプトアビジン−ＨＲＰＤ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＤＡＢ検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、検出を実施する。
【０３０２】
ＧＭ−１３０染色の場合、マウスＩｇＧブロッキング試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｃａｔ＃：ＭＫＢ−２２１３）のＰＢＳ溶液中で、細胞を３０分間ブロッキングする。一次抗体のインキュベーション（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製のモノクローナル抗ＧＭ１３０；Ｃａｔ＃６１０８２２、濃度１ｕｇ／ｍＬ）を３時間行い、続いて、１：２００希釈のビオチン化マウス二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，ＭＯＭ  Ｋｉｔ  ＢＭＫ−２２０２）と共に６０分間インキュベートする。製造業者の説明書にしたがって、二次抗体遮断薬、遮断薬Ｄ、ストレプトアビジン−ＨＲＰＤ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＤＡＢ検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、検出を実施する。
【０３０３】
温度依存性研究の場合、ナノ粒子をｃＲＧＤ−ＰＥＧナノ粒子と共に４℃、２５℃および３７℃でインキュベートして、表面結合粒子対インターナリゼーション粒子の割合を評価する。
【０３０４】
エキソサイトーシス研究の場合、ナノ粒子（０．０７５ｍｇ／ｍｌ）を４時間インキュベートし、ＰＢＳでチャンバースライドを洗浄し、続いて、新鮮培地を追加する。０．５時間、１．０時間、１．５時間、２．５時間、４．５時間、８．０時間の時間間隔で、細胞を洗浄し、トリプシン処理し、細胞および培地の蛍光シグナルを蛍光定量法によって測定する。用量応答研究では、細胞を一定範囲の濃度およびインキュベーション時間でインキュベートし、フローサイトメトリーを使用してアッセイする。生存研究では、毒性を評価するためのインキュベーションの前後に、トリパンブルー排除アッセイを使用して、細胞生存率を測定する。タイムラプス研究では、細胞をナノ粒子コンジュゲートと共に様々なインキュベーション温度（４℃、２５℃および３７℃）でインキュベートした後に、２０分間隔で１２時間にわたって倒立共焦点顕微鏡を使用して、生細胞におけるナノ粒子のインターナリゼーション機構を調査する。
【０３０５】
考察
Ｍ２１およびＢ１６細胞では、ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ドットおよびＰＥＧ−ドットはＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄと共局在することが見出されたが、これは、エンドソーム経路での取り込みを示唆している（図２２）。データにより、これらの粒子は、トランスフェリンおよびデキストランと強く共局在することが示された。表面の機能性および全電荷に関係なく、研究したナノ粒子（流体力学的直径６〜７ｎｍ）は同じ経路を進むように思われた。両方の細胞型におけるタイムラプスイメージングにより、官能化ナノ粒子は、ほんの一部のプレートした細胞内にインターナリゼーションしたことが実証された。粒子は、核周辺領域の小胞構造に最終的に送達された。Ｇｉａｎｔｉｎ（またはＧＭ−１３０）を用いた共局在化アッセイは、ゴルジ体におけるナノ粒子の蛍光シグナルを示すとは予想されない。
【０３０６】
実施例１２  画像誘導術中ＳＬＮマッピングおよび治療介入のためのデュアルモダリティシリカナノ粒子
画像誘導術中ＳＬＮマッピングのためのデュアルモダリティシリカナノ粒子
排液腫瘍リンパ管およびリンパ節転移のリアルタイム評価、ならびに腫瘍負荷の評価を実施するために、γプローブを使用した放射性検出と共にポータブルＡｒｔｅＭＩＳ（商標）蛍光カメラシステムを使用する光学イメージングに、これらの研究を拡大した。代表的なミニブタ（図２３ａ〜２３ｉ）において、上記イメージング手順を使用して、１８Ｆ−ＦＤＧおよび１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットを使用して、最初の術前ＰＥＴ−ＣＴスキャンを実施した。軸方向ＣＴ画像により、対応する１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴスキャン（図２３ｃ、２３ｄ）における活性増加領域として見られた原発性骨盤腫瘍（図２３ａ）および流入領域ＳＬＮ（図２３ｂ）が明らかになった。粒子トレーサーを腫瘍部位付近に四分円的に皮下注射した約５分後の動的ＰＥＴ−ＣＴイメージングによって、これらの知見が２日後に裏付けられた；コレジストレーション軸方向像（図２３ｅ、２３ｇ）および冠状方向像（矢印、２３ｆ、２３ｈ）は、これらの知見を実証する。術前スキャン後に、ＳＬＮ部位を覆う皮膚を術中局在化のためにマーキングし、ミニブタを手術室に運んだ。ポータブルγプローブを使用した、原発性腫瘍およびＳＬＮ部位のベースライン活性測定（図２３ｉ）により、ＳＬＮ内の活性がバックグラウンドシグナルと比べて２０倍増加していることが示された。
【０３０７】
リンパ系のリアルタイム光学イメージングの場合、１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの第２の真皮下注射を、皮膚を傷つけずに腫瘍部位付近に行い、カラー（図２４ａ）およびＣｙ５．５蛍光チャネル（図２４ｂ）でシグナルを観察した。隣接するリンパ節群を露出させたところ、注射部位（図２４ｃ）から、ＳＬＮに向かって排液される主な近位（図２４ｃ、２４ｄ）、中位（図２４ｅ）および遠位（図２４ｆ）リンパ枝に流れるＮＩＲチャネルで蛍光シグナルが見られた。より小さな口径のリンパ管も可視化した（図２４ｄ、２４ｅ）。デュアルチャネルモード（図２４ｇ、２４時間）で観察した黒色着色ＳＬＮを、連続リンパ節切除前（図２４ｊ〜２４ｍ）にさらに露出させた（図２４ｉ）。γプローブ（図２４ｉ）を使用してγ線放射によって、インサイチュー（図２４ｋ）およびエクスビボ（図２４ｍ）リンパ節試料内の蛍光シグナルを確認したところ、Ｈ＆Ｅ染色組織切片からの低倍率（囲み枠、図２４ｎ）および高倍率（図２４ｏ）視野の散在した腫瘍細胞クラスタに対応することが分かった。転移性黒色腫と一致して、ＨＭＢ４５の陽性発現を低倍率（図２４ｐ）および高倍率（図２４ｑ）視野で確認した。
【０３０８】
驚くべきことに、観察された１８Ｆ−ＦＤＧの知見とは対照的に、１２４Ｉ−ＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｃドットは、これらのミニブタにおける転移性腫瘍浸潤と炎症過程とを特異的に識別することが見出された。細胞レベルおよび細胞内レベルにおける、ならびに粒子表面上のインテグリンターゲティング部分の存在下におけるこれらの薬剤の挙動の機構的差異は、観察されたイメージング知見を説明し得る。肉芽腫性疾患に起因する病理学的に証明された炎症性変化を有する複数のミニブタ（ｎ＝３）では、１８Ｆ−ＦＤＧは、転移性疾患を検出することができなかったが、炎症部位および他の代謝的に活性な部位を同定することができた。これらの矛盾する知見により、この粒子トレーサーが転移性疾患を選択的にターゲティング、位置決定および病期分類する能力が示された一方、１８Ｆ−ＦＤＧは、多くの場合、がんの転移を正確に病期分類することができなかったが、その代わりに炎症部位を同定することができた。
【０３０９】
これらの知見を示す代表的なミニブタ研究では、最初の軸方向１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴ−ＣＴスキャンにより、ＣＴ（図２５ａ）において左後頸部内の石灰化（１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴ（図２５ｂ）の強い活性領域に対応する）が示された。Ｈ＆Ｅ染色組織切片の低倍率（図２５ｃ）および高倍率（図２５ｄ）視野により、肉芽腫性疾患と一致して、広範囲の炎症性変化が明らかになった。強い１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴ活性は、これらの幼若ミニブタの代謝的に活性な骨髄区画内においても見られた（図２５ａ、図２５ｂ）。対照的に、粒子トレーサイメージング研究では、両側転移性頸部リンパ節が同定された。軸方向ＣＴ画像（図２５ｅ）の右頸部リンパ節は、コレジストレーションＰＥＴ−ＣＴでＰＥＴ−ａｖｉｄであることが分かった（図２５ｆ）；より上位のＣＴ画像（図２５ｇ）のさらなる両側リンパ節も、融合ＰＥＴ−ＣＴ（図２５ｈ）では代謝亢進性であった。また、コレジストレーションスキャン（図２５ｆ、２５ｈ）では、左頸部の石灰化（図２５ｅ、２５ｇ）はＰＥＴ活性を示さなかった。対応するＨ＆Ｅ染色ＳＬＮ組織切片により、黒色腫細胞およびメラノファージから構成されると思われる、低倍率（囲み枠、図２４ｉ）および高倍率（図２４ｊ）視野における暗色の黒色腫クラスタが明らかになった。３Ｄ  ＰＥＴ再構成画像から選択した単一フレーム（図２５ｋ）においてもやはり、複数の両側ＰＥＴ−ａｖｉｄ頸部リンパ節および関連の流入領域リンパ管が示された。重要なことに、注射１時間後の膀胱では大量の活性が見られたが、トレーサーの蓄積は肝臓領域に対して有意ではなかった。
【０３１０】
上記知見は、１８Ｆ−ＦＤＧ（図２６ａ）または粒子トレーサーの局所投与（図２６ｂ、２６ｃ）後１時間にわたって取得した動的イメージングデータセットから作成したＰＥＴ−ＣＴ融合ＭＩＰ画像の優れた利点であると認められた。１８Ｆ−ＦＤＧの場合、リンパ節転移の明確な欠如が認められ、代謝的に活性な骨構造内で活性の散在的な増加が見られる。これらの知見とは対照的に、１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットは、流入領域リンパ管と共に、両側転移性頸部リンパ節を検出した。
【０３１１】
画像誘導治療介入のためのデュアルモダリティシリカナノ粒子：処置応答。処置応答評価は、解釈を困難にする炎症性変化の存在に振り回されることが多いため、粒子トレーサーが転移性疾患を組織炎症性変化と識別する能力は、様々な治療場面（手術ベースまたは治療介入主導型）で利用され得る可能性がある。治療的腫瘍アブレーションなどの画像誘導治療介入は、（１）応答のより早い術後評価を可能にし；（２）完全なアブレーションを確認し、または処置失敗を表す残存腫瘍を検出し、および（３）腫瘍監視戦略を改善する新たな粒子のプラットフォームおよびイメージングデバイス技術の革新的組み合わせから特に恩恵を受け得る。マイクロ波アブレーション、凍結アブレーション、高周波アブレーション（ＲＦＡ）および間質性レーザー療法を含む局所的なアブレーション治療は、腫瘍へのエネルギーアプリケータの挿入を介して、局所的な熱損傷を誘発する。外科的切除が不適格と判断された患者の代替オプションとして、これらの方法が典型的に用いられる。さらに、アブレーション治療を受けている患者は、多くの場合、併存疾患を理由に外科的治療の対象とならない。臨床業務で広く使用されているように、それらは、罹患率が有意に低い外来手術として経皮的に実施することができ、選択された患者コホートにおける生活の質および生存を改善することができるので、明確な利点を提供する。
【０３１２】
正確な治療後イメージングでは、典型的には、アブレーション手術後に１〜３カ月を得、ＣＴまたはＭＲＩなどの造影容積イメージングを利用した。これらの技術は、多数の欠点に悩まされている。第１に、それらは、腫瘍領域サイズの異常な増強または成長の存在を同定するのに限定され、残存腫瘍または再発性疾患の主要な指標と考えられる。術後評価におけるアブレーション領域付近の広範なリムの増強（Ｄｉｆｆｕｓｅ  ｒｉｍ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）は、アブレーション領域内の炎症および充血に関係する可能性があり、多くの場合、必ずしも残存腫瘍を表すものではない。特に不規則なまたは結節性の増強の増加は、腫瘍の疑いがあると考えられる。しかしながら、アブレーション領域は、術後数カ月にわたって予想よりも大きく見える場合があり、増強が肉芽または瘢痕組織形成を反映している可能性もあるため、これらの解釈には議論がある。
【０３１３】
１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴなどの機能的方法は、局所的なアブレーション手術の有効性および効果を評価するのにも使用されているが、腫瘍を炎症性変化と正確に識別不可能なのが悩みであり得る。したがって、特に初期の間隔で現在の形態学的または機能的評価を使用するアブレーション手術に応じて、組織レベルでイメージングの変化（すなわち、炎症、腫瘍）を解釈することが重要な課題である。アブレーションの成功、およびアブレーション後の期間における残存疾患の明確な検出に関する信頼性の高いエンドポイントが必要である。
【０３１４】
転移性肝病変の将来的なアブレーションを実施する先駆けとして、転移性黒色腫を有するミニブタにおいて、より大きな（すなわち、１〜２ｃｍ）ＳＬＮの概念実証高周波アブレーション（ＲＦＡ）研究を実施して、粒子トレーサーの存在下における早期処置応答を評価した。ＲＦＡ前後のＰＥＴ−ＣＴ画像の知見は、組織学的に相関していた。１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドット（約０．６ｍＣｉ）を原発性左骨盤腫瘍付近に皮下注射した後、最初のベースライン冠状ＣＴにより、ＰＥＴ−ａｖｉｄ（図２７ｂ、２７ｃ）な２．２×１．６ｃｍのＳＬＮ（図２７ａ）が腫瘍部位の上に示された。代謝亢進左骨盤腫瘍も示されているが（図２７ｂ）、これは、融合ＰＥＴ−ＣＴ画像における流入領域リンパ管内のさらなる粒子トレーサーの流れを示している（図２７ｃ、２７ｄ）。さらなる連続ＣＴスキャンを取得して、アブレーション手術前のリンパ管（図２７ｅ）を位置決定し、リンパ節（十字線のレベルよりも下方）へのＲＦＡプローブの挿入（図２７ｆ）をガイドした。対応するアブレーション前コレジストレーションＰＥＴ−ＣＴスキャンでは、ＰＥＴ−ａｖｉｄ  ＳＬＮが十字線の直ぐ後方に見られた（図２７ｇ）。２ｃｍ  ａｃｔｉｖｅ  ｔｉｐ  ＲＦＡ  ｐｒｏｂｅ（Ｃｏｏｌ−ｔｉｐ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｏｖｉｄｉｅｎ  ｐｉｃ，Ｄｕｂｌｉｎ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を使用して、部分的なリンパ節アブレーションを１２分間実施した。アブレーション後ＰＥＴ−ＣＴにより、電極チップ前方のアブレーション領域のトレーサー活性がわずかに減少していることが示された（図２７ｈ）。アブレーション前後のイメージング知見を組織学的に確認した。ＳＬＮ由来のアブレーション前コア生検組織のＨ＆Ｅ染色により、低倍率（図２７ｉ）および高倍率（図２７ｊ）視野における広範な転移性腫瘍浸潤が確認された。対応する低倍率（図２７ｋ）および高倍率（図２７ｌ）視野で見られるように、Ｈ＆Ｅ染色結節組織では、アブレーション後に、転移性浸潤の程度が減少した。多巣性出血と一緒に、凝固壊死およびリンパ組織も同定した（それぞれ図２７ｋ、２７ｌ）。アブレーション前のＴＵＮＥＬ染色高倍率視野は、散在性の新生細胞を明らかにする（図２７ｍ）。アブレーション後のＴＵＮＥＬ染色では、低倍率（図２７ｎ）および高倍率（図２７ｏ）視野の両方において、壊死の病巣領域（赤色）が見られた。
【０３１５】
結論
リンパ節転移は、黒色腫の転帰の強力な転帰予測因子である。ＳＬＮマッピングを使用した所属リンパ節における微小転移の早期検出は、患者を適切な処置群に適時に層別化することを可能にし得、患者の転帰を潜在的に改善し得る。現在の標準治療ＳＬＮマッピングおよび生検技術は、放射能ベースのＳＬＮ同定の使用に依拠しているが、この技術には多くの制限が存在する。これらとしては、低い空間分解能、病期分類精度の低下、標的特異性の欠如、手術野を遮ぎ得る遅いトレーサークリアランス、およびＳＬＮに近接する重要な構造の損傷を防止するための正確な術中可視化の欠如が挙げられる。
【０３１６】
重要ながん標的の選択的なプロービングを可能にしながら、重要な設計基準によるこれらの欠点を克服するために積極的に調整および改良することができる新世代の生体適合性粒子プラットフォームの最近の導入は、転移性疾患の拡大を支配する細胞および分子プロセスに重要な洞察をもたらし得る。マルチモダリティイメージングのためのこのようなプラットフォームのさらなる適合は、様々な画像誘導手術の場面における執刀医または治療介入者によるこれらのプロセスの調査の向上に生かされ得る。
【０３１７】
このようなデュアルモダリティプラットフォーム（光学イメージングおよびＰＥＴイメージングの両方のために開発された臨床解釈インテグリンターゲティングシリカナノ粒子）の１つは、それを、ポータブルリアルタイム光学カメラシステムと組み合わせたＳＬＮ生検方法におけるＳＬＮの位置決定および病期分類に理想的な薬剤にする多くの重要な設計基準（小さなサイズ、優れた輝度、増強された腫瘍組織保持、および低いバックグラウンドシグナル）を満たす。黒色腫モデルにおける転移性疾患と組織の炎症性変化（多くの場合、これらは併発するプロセスである）とを識別する能力は、将来の処置応答の評価のためのより正確で信頼性の高いマーカーを提供し得る。手術ベースの治療または治療介入主導型の治療のいずれかを使用した、広範ながんの種類および処置に関するさらなる調査が必要である。
【０３１８】
実施例１３  前立腺がんのＳＬＮマッピング
ＨｕＪ５９１−Ｆ（ａｂ’）２断片を有するマルチモーダルナノ粒子は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合するための新規診断プローブである。クリアランスおよび取り込みは、抗体それ自体よりも粒子の速度論的挙動によって支配されるので、複数のＦ（ａｂ’）２断片を有する粒子を合成することによって、本発明者らは、（１）多価効果による結合親和性／効力を増強し、（２）インビボ分布を変化させ得る。直径１０ｎｍの腎カットオフ以下に粒径を維持することによって、腎クリアランスを促進する。さらに、（１）および（２）の改善により、標的対バックグラウンド比が増加して、診断特異性および疾患分類が潜在的に改善される。
【０３１９】
１２４Ｉ−Ｊ５９１  Ｆ（ａｂ’）２結合粒子の合成／特性決定。
【０３２０】
ＰＥＧ化Ｆ（ａｂ’）２構築物を作製するために、１００μｌのＰＢＳを含むエッペンドルフチューブに１００ｕｇのＦ（ａｂ’）２を追加し、続いて、４μｌの２ｍｇ／ｍｌトラウト試薬と共に室温で１時間インキュベートした。次いで、緩衝液に溶解したマレイミドＰＥＧ−（６ｍｇ）を追加した。この溶液を一晩インキュベートし、ＰＤ−１０カラムで精製してから、粒子を付加した。ヨウ素−１２４（１２４Ｉ）でＦ（ａｂ’）２断片を放射標識して、デュアルモダリティ粒子プラットフォームを作製し、比活性、純度および放射化学的収率を求める。ＦＣＳによって、粒径および濃度をさらに評価する。
【０３２１】
実施例１４  黒色腫におけるインテグリンターゲティングのためのインヒューマンデュアルモダリティシリカナノ粒子
ナノ材料（特に、ナノ粒子プローブ）は、ユニークな物理化学的特性および生物学的特性だけではなく表面多様性も有する。その表面多様性を利用することによって、重要ながん標的を認識して位置決定する分子マーカーを用いて、生体適合性多官能性粒子を選択的に改変し得る。原発性腫瘍部位付近の局所／局部疾患の拡大のリアルタイムターゲティング検出を改善して処置を容易にし得る、よりロバストな光学的に駆動される多官能性粒子プローブの必要性は、手術場面でますます重要となっている。術中場面における重要な神経および／または血管構造の疾患のリアルタイム描写も最重要である。Ｄｕｎｃａｎ，Ｒ，Ｔｈｅ  ｄａｗｎｉｎｇ  ｅｒａ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２，３４７−３６０（２００３）．Ｗａｇｎｅｒら、Ｔｈｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４，１２１１−１２１７（２００６）．Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇら、Ｃｏｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ａｒｍａｄａ：ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ７，２６６−２７６（２０１０）．Ｍｉｙａｔａら、Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ  ｆｏｒ  ｎａｎｏ−ｓｃａｌｅ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｒｅａｃｔ．Ｆｕｎｃ．Ｐｏｌｙｍ．７１，２２７−２３４（２０１１）．Ｌｅｅら、Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ  ｓｉｌｉｃａ  ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  ４４，８９３−９０２（２０１１）．Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら、Ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １２，３９−５０（２０１２）．Ｒｏｓｅｎｈｏｌｍら、Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ  ｓｉｌｉｃａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｅｎｔｅｒｉｎｇ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｓｔａｇｅ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）７，１１１−１２０（２０１２）．Ａｓｈｌｅｙら、Ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｃａｒｇｏｓ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｎａｎｏｐｏｒｏｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒｓ，Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ  １０，３８９−３９７（２０１１）．Ｖｉｖｅｒｏ−Ｅｓｃｏｔｏら、Ｓｉｌｉｃａ−ｂａｓｅｄ  ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｒｅｖ  ４１，２６７３−２６８５（２０１２）．Ｔａｄａら、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＨＥＲ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｔｕｍ���ｒｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７，１１３８−１１４４（２００７）。しかし、粒子のこれまでの幅広い発展にもかかわらず、標的化多官能性プラットフォーム技術として臨床解釈に成功した無機蛍光粒子イメージングプローブはない。Ａｌｔｉｎｏｇｌｕら、Ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ−ｄｏｐｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ２，２０７５−２０８４（２００８）．Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄら、Ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １４，７１−７９（２０１０）．Ｃｈｏｉら、Ｄｅｓｉｇｎ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｕｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５，４２−４７（２０１０）．Ｈｅら、Ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ：ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １６，５７４−５８３（２０１０）。
【０３２２】
本明細書で、本発明者らは初めて、放射標識および環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−チロシン（ｃＲＧＤＹ）ペプチドの付加によって、ハイブリッド（光／ＰＥＴ）ターゲティングプラットフォームとして改変された約７ｎｍの蛍光ナノ粒子が、転移性黒色腫患者において耐容性良好であるだけではなく、高い信号対雑音比のマイクロドージング法で、推定インテグリン発現腫瘍を選択的に検出および位置決定し得ることを説明する。有意な血清タンパク質結合は観察されず、粒子およびその表面成分の完全性がインビボで維持される。安全性、薬物動態、線量測定およびターゲティングの結果は、がん診断における、および処置計画を潜在的にガイドするための、この腎排泄粒子の一般的有用性を示唆している。このデュアルモダリティプローブは、特定の腫瘍型に合わせて調整可能なプラットフォームであって、光学および／またはＰＥＴベースの病変検出ならびにヒトにおけるがんの病期分類ならびに薬物送達を改善して、より優れたより個別的ながん治療に潜在的につながり得るプラットフォームを構成する。
【０３２３】
本発明者らは、超小型（直径約７ｎｍ）のデュアルモダリティ（光／ＰＥＴ）無機ナノ粒子プローブを、ανβ３インテグリン発現がんのターゲティング分子イメージングに使用した。このナノ粒子プローブは、ファースト・イン・ヒューマン試験でそのクラスおよび特性が承認された最初のＦＤＡ治験新薬である（図２８ａ）。蛍光シリカナノ粒子（コーネルまたはＣドット）は、シリカシェルによってカプセル化されたコア内に色素分子を共有結合的に隔離して、色素の浸出を防止し、輝度および光安定性を増強する。Ｏｗ，ら、Ｂｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｉｌｉｃａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  ５，１１３−１１７（２００５）．Ｂｕｒｎｓら、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｉｌｉｃａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ，９，４４２−４４８（２００９）。吸収マッチスペクトルは、カプセル化色素および遊離色素の間の発光強度の差異として、この色素当たりの輝度の増強を実証する（図２８ｂ）。表面ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）鎖の中性層は、強力かつ選択的なインテグリン受容体結合のために、少数の環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−チロシン（ｃＲＧＤＹ）ペプチドを付加することを可能にする。Ｂｅｎｅｚｒａら、Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  ｓｉｌｉｃａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｒｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃａｎｃｅｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１２１，２７６８−２７８０（２０１１）。活性化インテグリンは、分化経路の調節、接着特性の媒介、細胞遊走、生存および細胞周期の進行の促進に加えて、細胞内の多くの構造的変化およびシグナル伝達の変化を誘導する。Ｈｏｏｄら、Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，２，９１−１００（２００２）。チロシン残基を介して核イメージング標識（例えば、１２４Ｉ）を付加することにより、連続ＰＥＴイメージングのシグナル感度が増幅される。最終生成物である高い生体適合性かつ高い生体安定性の腫瘍選択粒子トレーサー（１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドット）は以前に、ヒト黒色腫異種移植片におけるＰＥＴイメージングによるインテグリン受容体の状態の読み出しを提供して、ナノ医療について腎排出されるセラノスティックプラットフォームの明確なクラスを定義した。Ｊｏｋｅｒｓｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ，４４，１０５０−１０６０（２０１１）。
【０３２４】
ＰＥＴを用いてファースト・イン・ヒューマン臨床試験を開始して、転移性黒色腫を有する５人の患者のコホートにおいて、この薬剤の時間依存性腫瘍取り込みおよび生体内分布、放射線量測定および安全性を定量的に評価した。ＰＥＴイメージングを使用することの間接的な論理的根拠は、粒子放射性トレーサーが薬理学的効果、放射性効果および他の証明可能な生物学的効果を有しないという前臨床証拠である。Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｍ．Ｐｈａｓｅ  ０  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ，８５，２０４−２０７（２００９）．Ｋｕｍｍａｒら、Ｐｈａｓｅ  ０  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ：ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，４５，７４１−７４６（２００９）。約１８５メガベクレル（ＭＢｑ）（約３．４〜６．７ナノモル、ｎｍｏｌ）の１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−粒子トレーサー（比活性範囲２７．８〜５７．４ＧＢｑ／μｍｏｌ）をヒト被験者に単回投与で静脈内（ｉ．ｖ．）注射した後（図２８ａ）、３回の全身ＰＥＴ−ＣＴスキャンを７２時間にわたって取得して薬物動態を評価し、それに加えて、γ計測および薄層ラジオクロマトグラフィー（ラジオＴＬＣ）によって、血液および尿試料中の代謝産物を２週間間隔で分析した。
【０３２５】
５人の患者には有害事象がなく、薬剤は、試験期間にわたって耐容性良好であった。薬物動態学的挙動（組織１グラム当たりの注射用量の割合（％ＩＤ／ｇ）として表す）対注射後時間および対応する平均臓器吸収線量（図２８ｄ）は、他の一般的に使用されている診断放射性トレーサーで見られるものと同程度であった。この代表的な患者の連続ＰＥＴイメージング（図２８ｄ）により、主要臓器および組織の推定血液プール活性の進行性消失が示され、認識可能な活性は注射後（ｐ．ｉ．）７２時間まで見られなかった。これらの患者における全身クリアランス半減期は、１３〜２１時間の範囲であると推定された。興味深いことに、多くの疎水性分子、タンパク質、より大きな粒子プラットフォーム（＞１０ｎｍ）とは対照的に、肝臓、脾臓または骨髄では顕著な局在性がなかった。ヨウ化カリウム（ＫＩ）で患者を前処置して甲状腺組織取り込みを遮断したが、この患者では、他の組織と比べて高い平均吸収甲状腺線量が得られた。粒子はまた、腎臓壁および膀胱壁の両方によって腎臓から主に排泄されたが（その次に甲状腺および腫瘍。以下を参照のこと）、これは、注射７２時間までの最高％ＩＤ／ｇ値の１つを実証している（図２８ｄ）；腎排泄される放射性医薬品の場合の多くがそうであるように、膀胱壁は、他の主要臓器および組織よりも高い平均吸収線量を受けた。詳細な臨床プロトコール（図２８Ｃ）およびその設計の論理的根拠は、材料および方法においてさらに記載されている。
【０３２６】
これらの知見は、肝胆道排泄ではなく腎排泄が、体からの主要なクリアランス経路であるという事実を強調している。効率的な腎クリアランスは、およその有効腎糸球体ろ過サイズカットオフが約１０ｎｍ以下の超小型粒子ベースのプラットフォームまたは高分子システムの設計次第である。Ｃｈｏｉら、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｋｉｄｎｅｙ  ｍｅｓａｎｇｉｕｍ  ｂｙ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｚｅ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１０８，６６５６−６６６１（２０１１）。イメージング期間にわたって徐々に排出された遊離ヨウ素と一致して、この患者の胃および唾液腺では、ごくわずかな投与放射能（５％未満）が取り込みとして見られた。粒子は、その取り込みが主に肝臓内のマクロファージ機能を反映する網内系薬剤（すなわち、テクネチウム−９９ｍ硫黄コロイド）に典型的な特性を示さない。ｃＲＧＤ放射性トレーサーについて取得された以前のデータに基づいて、予想外の病巣活性は観察されなかった。Ｈａｕｂｎｅｒ，Ｒ．ら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ（９９ｍ）Ｔｃ−ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ＲＧＤ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａｖｂｅｔａ３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｎｕｋｌｅａｒｍｅｄｉｚｉｎ，４３，２６−３２（２００４）。
【０３２７】
重要なことに、これらの特性は、腎排出される薬剤としてこの無機デュアルモダリティイメージング粒子が、かなりユニークな薬物動態挙動を示したことを示している。γ計測による血液（図２９ａ）および尿（図２９ｂ）試料の代謝分析により、トレーサー活性は７２時間で少なくとも１桁低下し、この期間の終了時において、活性は本質的に残っていないことが明らかになった。粒子活性は主に血漿画分に限定されており、有意な血清タンパク質結合の証拠はなかった（データは示さず）。血漿サンプルのラジオＴＬＣ分析により、注射後２４時間を通じて単一ピーク（これは、インタクトな放射標識ナノ粒子に対応する）が明らかになった（図２９ｃ〜２９ｅ）。尿試料では、２つのピーク（一方はインタクトなナノ粒子に対応し、他方はより移動性の種（遊離ヨウ素として同定）に対応する）が２４時間で見られた（図２９ｆ〜２９ｈ）。粒子トレーサー（放射性ヨウ素化ペプチド（１３１Ｉ−ｃＲＧＤＹ、図２９ｊ）および遊離放射性ヨウ素（１３１Ｉ、図２９ｋ））のラジオＴＬＣ分析（図２９ｉ）により、ラジオクロマトグラムにおける第１および第２のピークがインタクトなナノ粒子および遊離ヨウ素にそれぞれ対応することが確認された。したがって、これらの知見により、腎臓を介した排泄後であっても、研究期間の間に、粒子の完全性の測定可能な消失は起こらなかったことが示唆された。
【０３２８】
腫瘍の検出は、このＰＥＴマイクロドージング試験の目的ではなかったが、驚くべきことに、低注射用量にもかかわらず、粒子トレーサーの腫瘍局在性の証拠があった。第１の事例では、肛門直腸粘膜黒色腫を有する患者において、１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットを静脈内投与した４時間後に、全身ＰＥＴ−ＣＴスキャンを取得した。冠状ＣＴ画像（図３０ａ）では、肝臓の左下葉（過去のフルオロデオキシグルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）ＰＥＴ／ＣＴイメージングによって転移性病変であることが判明している部位（データは示さず））において、密度が減少した大きな円形領域（矢頭）が見られた。冠状ＰＥＴ（図３０ｂ）ならびにコレジストレーションＰＥＴおよびＣＴスキャン（図３０ｃ）では、取り込みがより多いリムがこの病変を囲んでおり（図３０ｂ矢頭；図３０ｃ）、その後、２４時間の時点のＰＥＴスキャンまでに排出されたが、これは、この推定インテグリン発現転移におけるある程度の選択的な局在性を示唆している。膀胱、消化管（胃、腸）、心臓および胆嚢内では、有意な活性が見られた。第２の被験者では、軸方向（図３１ａ）および矢状方向（図３１ｂ）磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）によって、明確に定義された嚢胞性病変が下垂体前葉の右側に見られた。
【０３２９】
この病変（先のＭＲＩスキャンの安定した知見）は、下垂体微小腺腫（悪性の特性、例えば血管新生および腫瘍周辺組織への浸潤を示すことが公知の頭蓋内新生物）であると推定された。多断面ＭＲＩ（図３１ｃ、３１ｄ）およびＣＴ（図３１ｅ、３１ｆ）画像によるこのトレーサーａｖｉｄ病巣の正確なコレジストレーションにより、下垂体前葉内の位置が確認された。それは、強い活性の病巣として最初に見られ、７２時間間隔で活性が徐々に増加し（矢印、図３１ｇ〜３１ｉ）、それに伴って、周囲のバックグラウンド骨髄シグナルが減少して、腫瘍対バックグラウンド比（すなわち、腫瘍対脳（Ｔ／Ｂ）約６）および腫瘍対肝臓（Ｔ／Ｌ）約２））がより高くなった（図３１ｊ）。一部の腺腫の実質におけるανβ３インテグリン発現の増加、および正常結合組織細胞に関する腺腫様間質細胞におけるインテグリン発現レベルの増強を示す過去の研究の知見に基づいて、ＰＥＴイメージングの結果を説明することができる。Ｆａｒｎｏｕｄら、Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，６７，４５−５３（１９９６）。
【０３３０】
本発明者らの最初のデータは、このターゲティングイメージングビヒクルを用いたヒトＰＥＴ研究が、推定インテグリン発現腫瘍の検出および位置決定に対する論理的アプローチであるという考えを支持している。本発明者らは、より進んだ臨床試験において、安全性、全身クリアランスおよび腫瘍ターゲティング効率の間の最適なバランスを決定するための用量漸増法を計画している。このようなＰＥＴ主導型研究はまた、最大ターゲティング効率を達成するためにインテグリン受容体の発現レベルを正確に定量することだけではなく、これらのレベルの変化を検出することも可能にし得る。さらに、これらの定量的な分子イメージングツールを使用することにより、腫瘍内の粒子の取り込みおよび蓄積の時間依存性変化に関する情報を得ることができる。Ｋｅｌｌｏｆｆ，Ｇ．Ｊら、Ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１１，７９６７−７９８５（２００５）。下垂体腺腫の場合、本発明者らは、この病変内の粒子の蓄積取り込みを計算することができた。具体的には、本発明者らは、７２時間のイメージング期間でこの部位に蓄積した粒子の全注射放射能および数の割合を計算した。部分容積効果および病変の概算重量（すなわち、病変の生産量および想定密度１ｇ／ｃｍ３）について補正した、注射７２時間後における病変の測定された最大標準取り込み値（ＳＵＶｍａｘ。方法を参照のこと）（すなわち、４６．５）（正常な下垂体組織のものよりも１０倍高い）、ならびに患者の体重を使用して、本発明者らは、２×１０５の注射粒子負荷に対して、約１．７８×１０１１個の粒子（注射用量の０．０１％、％ＩＤ）または１／１０，０００部が病変部位に蓄積したことを見出した。標準取り込み値（ＳＵＶ）は、組織１グラム当たりの放射能を体重１グラム当たりの投与放射能で割ったものとして定義される。主要臓器および組織に関するこの病変の％ＩＤ／ｇおよび線量測定の時間依存性変化を図２８ｃおよび２８ｄに示す。
【０３３１】
結果は、全身注射した粒子トレーサーが耐容性良好かつ安全であったことを示唆している。安全性対策には、正常臓器における取り込みおよび実験室の毒性指標をモニタリングすることが含まれていた。第２の目的は、放射線量を推定し、血漿および尿の代謝活性を評価することであった。安全性評価は、線量測定、臨床症候の欠如、および粒子（薬物）毒性の実験室指標の非存在に基づいていた。
【０３３２】
このファースト・イン・ヒューマン臨床試験から得られた結果は、全身注射した粒子トレーサーが、腎排泄によって定義される好ましい再現可能なＰＫ特性を示したことを示している。細網内皮薬剤（すなわち、テクネチウム−９９ｍ硫黄コロイド）および高分子、例えば抗体とは対照的に、肝臓、脾臓または骨髄内には認識可能な粒子トレーサー蓄積はなかった。本発明者らのデータは、投与放射能の大部分が泌尿系を介して排除されたことを明確に示している（図２８ｅ、２９ｂ）；例えば、膀胱内の放射能濃度は、肝臓内のものよりも最大で１桁高かった。すべての肝臓放射能が肝胆道経路を介して最終的に排泄されるという保守的な仮定に基づけば、これらのデータは、投与放射能の約９０％が泌尿系を介して排出され、わずか約１０％が肝胆道経路を介して排出されることと一致している。残りの臓器／組織では、特に初期の時点（２〜４時間）において、残存放射能は、血液プールの放射能を主に反映している。
【０３３３】
ターゲティング検出は、研究のエンドポイントとしての役割を果たさなかったため、疾患部位における最大取り込みを達成するための用量漸増法を試験デザインに組み込まなかった（すなわち、腫瘍ターゲティングを最適化するために、粒子用量を調整しようとはしなかった）。しかしながら、ナノモルの少量を使用したにもかかわらず、いくつかの腫瘍では、粒子トレーサーの選択的局在化および蓄積が起こった。推定下垂体腺腫を有する患者の１人では、ＰＥＴイメージングの結果により、病変部位における粒子トレーサー活性の正味の進行性蓄積が示された。この研究の結果は、全身注射した本発明者らの粒子が耐容性良好であり、非常にユニークな「高分子」ＰＫ特性（ＲＥＳ取り込みを伴わずにバルク腎クリアランスが優位である）を示すことを示唆している。これは、多くの疎水性分子、タンパク質およびより大きな粒子プラットフォーム（＞１０ｎｍ）とは対照的である。この特徴は、ナノ粒子（これは、一般に、推定腎カットオフ値よりも大きな直径を示すので、腎排泄は少量であり、クリアランスは遅い）に関して非常に特殊なものであり、本発明者らの超小型ナノ粒子プラットフォームの臨床評価を保証する。
【０３３４】
これらの結果は、デュアルモダリティＣドットイメージングプラットフォームの安全性、薬物動態および線量測定に関する本質的なデータと共に、がん診断の重要な腫瘍特異的な読み出し情報をもたらすという点で、このヒトマイクロドージング技術の一般的有用性を示唆している。このような推定腫瘍蓄積粒子トレーサー負荷（または濃度）は、細胞阻害応答（すなわち、ＩＣ５０または５０％阻害濃度）の知識と共に、所定の薬物の治療投与要件を予測するのに使用され得る可能性がある。
【０３３５】
方法
ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットの合成および特性決定。有機色素Ｃｙ５を含むＰＥＧ化ｃＲＧＤＹ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  ＫＹ）表面官能化蛍光コア−シェルシリカナノ粒子（ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドット）の合成および特性決定に関する詳細については、この種の過去の刊行物およびそこで引用されている参考文献を参照のこと。Ｂｅｎｅｚｒａ，Ｍら、Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  ｓｉｌｉｃａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｒｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃａｎｃｅｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１２１，２７６８−２７８０（２０１１）。簡潔に言えば、改変ストーバー型シリカ縮合によって、粒子を調製した。Ｂｏｇｕｓｈら、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｓｉｌｉｃａ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ：Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｍａｓｓ  ｆｒａｃｔｉｏｎ，Ｊ  Ｎｏｎ−Ｃｒｙｓｔ  Ｓｏｌｉｄｓ，１０４，９５−１０６（１９８８）．Ｈｅｒｚら、Ｌａｒｇｅ  ｓｔｏｋｅｓ−ｓｈｉｆｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｉｌｉｃａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｖｅｒ  ｆｒｅｅ  ｄｙｅ  ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ，Ｍａｃｒｏｍｏｌ  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ，３０，１９０７−１９１０（２００９）．Ｓａｄａｓｉｖａｎら、Ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｓｉｌｉｃａ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ＮＭＲ  ａｎｄ  ＤＬＳ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，Ｊ  Ｓｏｌ−Ｇｅｌ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ，１２，５−１４（１９９８）。シリカ表面への付加のために、およびペプチド結合のために、シランで二官能性ＰＥＧを誘導体化した。配列シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ）を含有し、システイン残基を有するｃＲＧＤＹペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、システイン−マレイミド結合を介して官能化ＰＥＧ鎖に付加した。ＨｅＮｅ６３３ｎｍ励起を使用してＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  Ｃｏｎｆｏｃｏｒ  ２  ＦＣＳによって、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの流体力学的半径、輝度および濃度を、遊離Ｃｙ５色素と比べて分析した。
【０３３６】
ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットの放射標識。放射性ヨウ素部分（すなわち、１２４Ｉ、１３１Ｉ）の付加のためにチロシン残基をＰＥＧ鎖にコンジュゲートした。Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２００８）．Ｙｏｏｎ，Ｔ．Ｊら、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ，ａｎｄ  ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｍａｒｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｉｌｉｃａ  ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ  ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｓｍａｌｌ，２，２０９−２１５（２００６）。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットの放射標識を実施した。Ｐｉａｔｙｓｚｅｋら、Ｉｏｄｏ−Ｇｅｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１７２，３５６−３５９（１９８８）。ＰＤ−１０カラムから放射標識生成物を溶出し、投与量較正器（Ｃａｐｉｎｔｅｃ，Ｒａｍｓｅｙ  ＮＪ）およびラジオＴＬＣを使用してアッセイした；１２４Ｉ−結合粒子画分の特異的活性は、約１４５０ミリキュリー（ｍＣｉ）／μモルであり、放射化学的純度は９５％超であった。
【０３３７】
患者の選択。疾患が組織学的に確認された転移性黒色腫被験体であって、新たに診断された腫瘍または再発腫瘍を有する転移性黒色腫被験体が試験の有適格者であった。粒子トレーサーの投与を妨げる黒色腫とは無関係の内科的疾患を有していた者を試験から除外した。放射性ヨウ素化粒子トレーサー（１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドット、１８５ＭＢｑ／５ｍｌ）の静脈注射前２日間、およびその静脈注射後最大２週間にわたってヨウ化カリウム溶液（ＳＳＫＩ、１３０ｍｇ／日）を投与して、甲状腺機能を遮断した。このプロトコールは、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒの施設内倫理委員会によって承認された。ＰＥＴの前後に、血液学的機能、腎機能および肝機能について患者を試験し、署名入りのインフォームドコンセントを得た。
【０３３８】
画像の取得および処理。粒子トレーサーの注射４時間、２４時間および７２時間後に、標準的な手順によって低線量スパイラルＣＴスキャンを得、続いて、専用ＧＥ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＳＴＥ  ＰＥＴ／ＣＴスキャナーによって３つの全身ＰＥＴスキャンを取得した。順序部分集合期待値最大化（ＯＳＥＭ）アルゴリズムを使用して、陽電子放出データを再構成した。発光イメージングと同じ領域で収集したＣＴ伝送データを使用して、画像を減衰補正し、ＣＴデータセットを使用して、連続データセットのレジストレーションを実施した。
【０３３９】
イメージングおよび代謝分析。薬物動態分析および線量測定分析の場合、ＰＥＴ画像データ（ＡＷ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｒｉｄｇｅｗｏｏｄ，ＮＪ）上に関心領域（ＲＯＩ）を描写して、脳、肺、左心室、肝臓、脾臓、腸、腎臓、膀胱、筋肉、乳房および腫瘍を含む主要な正常増殖および組織について、平均および最大標準取り込み値（ＳＵＶ）を求めた。薬物動態評価の場合、ＳＵＶを％ＩＤ／ｇ値（すなわち、ＳＵＶ＝％ＩＤ／ｇ組織×患者体重／１００）に換算した。血液および尿の時間−放射能データによって、臓器／組織の取り込みデータを補完した。１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹＰＥＧ−Ｃ−ドットを注射した約３０分後、３時間後、２４時間後、７２時間後および最大２週間後に、静脈血および尿試料を採取した。全血試料の遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分間）後、１２４Ｉについて較正したシンチレーションウェルカウンター（１４８０  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｓｈｅｌｔｏｎ  ＣＴ）において、血漿上清を尿試料と一緒にアッセイした。生物学的試料に対して、ラジオＴＬＣ分析をさらに実施した。粒子トレーサー（１３１Ｉおよび遊離ヨウ素（１３１Ｉ）で標識した天然ペプチド（ｃＲＧＤＹ））のラジオＴＬＣ分析は、解釈を助けるための対照としての役割を果たした。放射能（カウント毎分、ｃｐｍ）をマイクロキュリーに換算し、減衰補正し、等分した量について調整した。最終値を％ＩＤ／ｇとして表した。トレーサーの保持係数（Ｒｆ）値を求め、親化合物および代謝産物候補の同定に使用した。
【０３４０】
放射線量測定。標準的な線量測定法は、ＭＩＲＤ（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ  Ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ）Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって公布されているものの変法であり、投与した放射性核種（１２４Ｉ）の物理的特性だけではなく、個々の患者における放射性医薬品の生物学的特性（薬物動態および生体内分布）も説明する。ＭＩＲＤの放射性核種データおよび崩壊スキームの刊行物から、１２４Ｉの発光ならびにそれらの各周波数およびエネルギーを入手する。連続全身ＰＥＴスキャンにより、ＲＯＩの時間−放射能データを使用して、正常臓器の吸収線量（ｒａｄおよびｒａｄ／ｍＣｉ）推定値を求めることができた。スキャン時間を含むすべてのパラメータを同一にして、ＰＥＴスキャンを取得した。患者の総体重（ｋｇ単位）および７０ｋｇ標準男性の臓器重量を使用して、全身および臓器のＲＯＩデータ（すなわち、平均標準取り込み値（ＳＵＶ））を放射能（注射用量の割合）に換算した。最小二乗フィッティングアルゴリズムを使用して、画像から求めた上記時間−放射能データを指数関数に対してフィッティングし、得られた時間−放射能関数を分析的に積分し、１２４Ｉの物理的減衰の効果を組み込んで、臓器および全身における累積放射能（または滞留時間）をμＣｉ−時間／μＣｉ単位で求めた。ＯＬＩＮＤＡ  ＥＸＭ  ＭＩＲＤプログラムを用いて、７０ｋｇ標準男性解剖学的モデルの臓器への１２４Ｉ標識粒子の平均吸収線量（ｒａｄ／ｍＣｉ）および実効線量（ｒｅｍ／ｍＣｉ）を計算するために、累積放射能を使用した。Ｌｏｅｖｉｎｇｅｒら、ＭＩＲＤ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  Ａｂｓｏｒｂｅｄ  Ｄｏｓｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９１。
【０３４１】
血清タンパク質結合アッセイ。転移性黒色腫ミニブタモデル（Ｓｉｎｃｌａｉｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＭＯ）から全血試料を血清分離チューブに採取し、続いて、遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分間）して血漿画分を単離した。γ計測のために、１アリコートの血清を確保した；残りの画分をエタノール（２００ｐｒｏｏｆ，Ｄｅｃｏｎ  Ｌａｂｓ，Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）で処理し、混濁するまでボルテックスし、ドライアイスに置いて（５分間）、血清タンパク質の沈殿を促進した。遠心分離後、γ計測のために上清を採取し、リン酸緩衝生理食塩水でペレットを繰り返し洗浄し、遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分間）して、γ計測（１４８０Ｗｉｚａｒｄ３”）のために１００μＬアリコートの上清を回収した。
【０３４２】
実施例１５  α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃｙ５−粒子（ＭＳＨペプチド結合粒子）
ナノ粒子コンジュゲーションに使用したＮ−Ａｃ−Ｃｙｓ−（Ａｈｘ）２−Ｄ−Ｌｙｓ−ＲｅＣＣＭＳＨ（またはαＭＳＨ）ペプチドは、図３２に示されている構造を有する。Ｎ末端システインのチオール基を介して、それをナノ粒子に付加する。２つのアミノヘキサン酸ユニットのスペーサーが、ナノ粒子の付加点をＤ−Ｌｙｓ−ＲｅＣＣＭＳＨターゲティング分子から分離する。元のＲｅＣＣＭＳＨターゲティング分子を図３３に示す。それは、イメージングおよび治療のために、放射性核種を黒色腫腫瘍にターゲティングするように設計されたものである。このＭＳＨペプチド類似体を、９９ｍＴｃもしくは１８８Ｒｅ（Ｒｅの部位で）で直接放射標識することもできるし、または金属キレート剤を介してアミノ末端に付加することもできる。
【０３４３】
図３２に示されているαＭＳＨペプチド類似体は、図３３に示されている元のＭＳＨ類似体とは全く異なる。元のＭＳＨ分子をナノ粒子に付加することはできない。ナノ粒子ＭＳＨペプチドは、放射標識のための側鎖を含有する遊離アミノ基を含有する。今回、これはＤ−リジンであるが、長さが１個の炭素〜多数の炭素からなるアミノ基末端側鎖とすることができる。
【０３４４】
ナノ粒子へのＮ−Ａｃ−Ｃｙｓ−（Ａｈｘ）２−Ｄ−Ｌｙｓ−ＲｅＣＣＭＳＨ（またはα−ＭＳＨ）のコンジュゲーションは、ナノ粒子が黒色腫細胞および腫瘍にターゲティングおよび結合することを可能にする。ＦＣＳを使用したところ、得られた粒子またはα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃｙ５Ｃドットは直径約６〜７ｎｍであり、粒子当たり平均約２．６個の色素を含有していた。粒子当たりのα−ＭＳＨリガンドの数は、１０個未満と推定された。
【０３４５】
Ｎ−Ａｃ−Ｃｙｓ−（Ａｈｘ）２−Ｄ−Ｌｙｓ−ＲｅＣＣＭＳＨ（またはα−ＭＳＨ）コンジュゲート粒子を使用した競合結合研究：メラノコルチン−１受容体アゴニスト（１２５Ｉ−ＮＤＰ）を用いた競合結合アッセイでは、α−ＭＳＨコンジュゲートナノ粒子は、培養Ｂ１６／Ｆ１黒色腫細胞について６．６×１０−１０ＭのＩＣ５０を有しており（図３４Ａ）、この分子のスクランブル配列バージョンは、２．３×１０−７ＭのＩＣ５０を有していた（図３４Ｂ）。加えて、結合には３桁の差異があった。例えば、同じ種類の競合結合アッセイでは、元のＤＯＴＡ−ＲｅＣＣＭＳＨは、２．１×１０−９ＭのＩＣ５０を有していた。
【０３４６】
Ｎ−Ａｃ−Ｃｙｓ−（Ａｈｘ）２−Ｄ−Ｌｙｓ−ＲｅＣＣＭＳＨ（またはα−ＭＳＨ）結合ペプチドナノ粒子コンジュゲートは、元のＤＯＴＡ−ＲｅＣＣＭＳＨよりも優れたＢ１６／Ｆ１細胞親和性を有しており、スクランブルペプチドナノ粒子よりもかなり大きな親和性を有していた。
【０３４７】
Ｂ１６Ｆ１０およびＭ２１黒色腫細胞株の両方について、ターゲティング粒子濃度（図３５Ａ）およびインキュベーション時間（図３５Ｂ）に応じた用量応答データをさらに得た。フローサイトメトリー研究に基づいて、これらの株の飽和濃度は、これら２つの細胞型については約１００ｎＭであることが見出され、結合を最大化するには、少なくとも２時間のインキュベーション時間が必要であった。
【０３４８】
一定範囲の粒子濃度にわたって４８時間の一定のインキュベーション時間で実施したヒトＭ２１細胞生存研究により、細胞生存率の有意な減少はないことが実証された（図３６）。
【０３４９】
１２５Ｉ−放射標識α−ＭＳＨコンジュゲートナノ粒子は、Ｂ１６Ｆ１０およびＭ２１マウス異種移植モデルにおいて、２４時間にわたる大量の腎排泄を示した（図３７Ａ、３７Ｂ）；それよりも後の時点（すなわち、＞２４時間）において、認識可能な粒子トレーサーは測定されなかった。加えて、Ｂ１６Ｆ１０およびＭ２１異種移植モデルはいずれも、細網内皮系（すなわち、ＲＥＳ薬剤ではない）および腎臓（図３８Ａ、３８Ｂ）におけるターゲティング粒子プローブの有意な蓄積を示さなかった（その正味の正電荷を考慮すると、後者の臓器は、通常、α−ＭＳＨを非特異的に蓄積する部位である）。したがって、粒子プローブへのα−ＭＳＨの付加は、その腎クリアランス特性を有意に改善し、腎臓内の蓄積を排除した。
【０３５０】
実施例１６  腫瘍生物学のインテグリン媒介性シグナル伝達および調節
インテグリンシグナル伝達は、腫瘍細胞における多様な機能（接着／伸展、遊走、浸潤、増殖および生存を含む）を調節する。黒色腫を含むいくつかの腫瘍型では、特定のインテグリンの発現が疾患進行の増大および患者生存の減少と相関する。インテグリン媒介接着相互作用は、細胞生存機構および分岐シグナル伝達経路の活性化における新規インテグリン機能を同定した。ＲＧＤ配列を含有するペプチド（またはペプチドのクラスタ）がインテグリン受容体に結合すると、インテグリンが架橋またはクラスタリングされて、それにより今度は上記のプロセスが調節されることが周知である。しかしながら、このようなインテグリンシグナル伝達イベントは、複数の粒子ベース要因（サイズ、電荷、組成、表面化学、リガンド数／種類）、腫瘍（または内皮）細胞型、細胞受容体密度および粒子投与への複雑な依存関係を反映するものであるため、複数のＲＧＤペプチドリガンドを有するナノ粒子がこのようなインテグリンシグナル伝達イベントを誘発し得るかについては不明である。本発明者らの用量応答研究は、細胞を１００ｎＭ超の粒子濃度に曝露すると分岐シグナル伝達経路が適度に活性化されて、それにより今度はＭ２１およびＨＵＶＥＣ細胞の遊走、増殖活性が促進され、接着特性が変化することを実証する。
【０３５１】
Ｍ２１およびＨＵＶＥＣ細胞に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットの結合
ανβ３インテグリン受容体は、血管リモデリングおよび血管新生において重要な役割を果たすが、これは、様々な腫瘍細胞株について、内皮細胞および腫瘍細胞の表面上で発現が増加していることを実証している。このことが、この受容体を診断および治療目的の標的として使用することにつながる。本発明者らの場合、濃度および時間に応じた、黒色腫細胞（Ｍ２１）またはヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対する結合能について、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットを試験した。最初の用量応答研究では、フローサイトメトリーによって、Ｍ２１およびＨＵＶＥＣ細胞に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの結合が、濃度に応じて進行的に増加することが示された（図３９、図４７Ａ）。粒子の結合は、両方の細胞株について約１００ｎＭの飽和度を示し、平均％ゲート値はＭ２１細胞では約８０％であり、ＨＵＶＥＣ細胞では９６％であった。１００ｎＭ  ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットと共にインキュベートした後に、両方の細胞型について、粒子のインキュベーション時間に応じた用量−応答挙動をさらに調査した。インキュベーションの２時間後に最大結合が観察され、その後は比較的一定であった（図４７Ｂ）。
【０３５２】
ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットのエンドサイトーシスおよび細胞内輸送
Ｍ２１細胞におけるインキュベーション後にｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットが利用する経路の性質（これが、ανβ３インテグリン受容体媒介性および／または非特異的取り込みプロセスであるか）を解明するために、本発明者らは、３つの温度（４℃、２５℃および３７℃）において、４時間のインキュベーション時間の間のこれらの粒子の温度依存性取り込みを調べた。図３９Ａ、Ｃに要約されている結果は、試験した両方の細胞株において、３７℃では、細胞結合ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットが２５℃または４℃と比較して増加していることを示している。また、Ｍ２１およびＨＵＶＥＣ細胞（図３９Ａ、３９Ｃ）において、ανβ３受容体に対する過剰な（２５０倍）抗体の存在下では、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットのインターナリゼーションが部分的に遮断されたが、これは、受容体媒介性結合の構成要素を示唆している。加えて、それぞれ３７℃および２５℃（図３９Ｂ）の両方において、ανβ３陰性Ｍ２１Ｌ細胞における取り込みは、ανβ３発現細胞で見られるものよりも約４〜８倍低かった。
【０３５３】
ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットのインターナリゼーションに関与する細胞区画をさらに特性決定するために、本発明者らは、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットおよび様々なエンドサイトーシス小胞のバイオマーカーを用いて、Ｍ２１細胞において共局在化アッセイを実施した。ＨＣＸ  ＰＬ  ＡＰＯ対物レンズ（６３ｘ１．２ＮＡ  Ｗａｔｅｒ  ＤＩＣＤ）を備える倒立型共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ）によって、ターゲティング粒子（約１μΜ、赤色、４時間のインキュベーション）のインターナリゼーションを高感度に検出した（図３９Ｄ）。エンドサイトーシスマーカーＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（１００ｎＭ、緑色）（図３９Ｄ）およびトランスフェリン−Ａｌｅｘａ４８８を使用して、酸性エンドサイトーシス構造への取り込みを確認したが、これは、クラスリン依存性経路活性および小胞の段階的な酸性化を示唆している。図３９Ｄは、粒子と３０個の酸性エンドサイトーシス小胞（黄色の斑点）との間の共局在化データを示す。ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットと共局在化した７０ｋＤａデキストラン−ＦＩＴＣを用いて、マクロピノサイトーシス（ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｅｓ）への取り込みも観察した；この知見により、第２のインターナリゼーション経路が示唆された。ヘキストを用いて、核対比染色（青色）を行った。核に侵入した粒子はなかった。タイムラプスイメージングは、Ｍ２１細胞への粒子の取り込みおよびリソソームマーカーＬａｍｐｌとの共局在化を裏付けている。
【０３５４】
競合ανβ３インテグリン受容体結合および分子特異性
過剰（５０倍〜１００倍）なｃＲＧＤＹペプチドを使用し、放射標識粒子トレーサー（１２４Ｉ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤＹ−Ｃドット）をγ計測した競合結合アッセイにより、Ｍ２１およびＨＵＶＥＣ細胞における受容体媒介性粒子結合（図４８Ａ）が、前者では８０％〜８５％遮断され、後者では３０％〜４０％遮断されたことが示された。ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットとは対照的に、非ターゲティング（すなわち、ＰＥＧ−Ｃドット）粒子プローブと共にインキュベートした後に、Ｍ２１（約３０％〜４３％）およびＨＵＶＥＣ（約１３％〜２７％）細胞における受容体結合の規模の有意な減少がフローサイトメトリーによって見られた（図４８Ｂ）。
【０３５５】
細胞生存率および増殖に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの影響
ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットが細胞の生存および増殖に悪影響を与えなかったことを実証するために、３７℃の血清補充培地（２％、１０％ＦＢＳ）中で、Ｇ０／Ｇ１期同期化Ｍ２１およびＨＵＶＥＣ細胞を一定範囲の粒子濃度（２５〜２００ｎＭ  ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドット；１５分間または２４時間）およびインキュベーション時間（０〜９３時間）に曝露し、光プレートリーダー（λ＝４４０ｎｍ）を使用して吸光度の時間依存性変化を測定した。対照（すなわち、血清補充培地）と比べて、吸光度の測定値は、試験した前記粒子濃度範囲で比較的一定であることが認められたが、これは、細胞生存の有意な減少がないことを示唆している（図４９Ａ、４９Ｂ）。さらに、１００ｎＭ  ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ＣドットをＭ２１およびＨＵＶＥＣ細胞に複数回（ｎ＝５）追加した後に、吸光度の時間依存性減少は見られなかったが、これは、細胞の増殖特性に変化がないことを示唆している（図４９Ｃ、４９Ｄ）。
【０３５６】
ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットによるＦＡＫ経路の活性化
ανβ３インテグリン受容体に対するリガンドの結合は、シグナル伝達経路を開始することが公知である。結合するとインテグリンのクラスタリングが起こり、チロシン３９７（これは、Ｓｒｃファミリーキナーゼの結合部位である）における非受容体キナーゼＦＡＫの自己リン酸化につながる。Ｓｒｃキナーゼが動員されると、カルボキシル末端領域において、ＦＡＫのチロシン５７６／５７７およびＦＡＫのチロシン９２５がリン酸化される。チロシン３９７におけるＦＡＫのリン酸化はまた、Ｒａｆ／ＭＥＫ／Ｅｒｋおよびホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ＡＫＴ経路（ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、Ｓ６Ｋ）の活性化を誘導する多数のシグナル伝達カスケードおよび下流経路の中間体（例えばＲａｓ−マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰＫ）シグナル伝達）を活性化することが公知である（図４０Ａ）。
【０３５７】
ανβ３インテグリン結合ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットがこれらの経路の活性を調節するかを決定するために、本発明者らは、１００ｎＭのｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットで無血清（０．２％ＦＣＳ）Ｍ２１細胞を３７℃で２時間処理した；０．２％ＦＣＳのみで処理した無血清細胞は、対照としての役割を果たした。粒子に曝露した細胞由来の溶解物のウエスタンブロット分析により、複数のタンパク質中間体（ｐＦＡＫ−３９７およびｐＦＡＫ−５７６／５７７、Ｓｒｃ、ｐＭＥＫ、ｐＥｒｋおよびＡｋＴ）のリン酸化レベルの増強が明らかになったが（図４０Ｂ）、これは、下流シグナル伝達の活性化を示唆している。標準強度比としてグラフで示されているこれらの知見をそれらの各全タンパク質レベルに対して表し、対照条件下で測定した対応する値に対して正規化した（図４０Ｃ）。細胞をＰＥＧ−Ｃドットと共にインキュベートしても、試験タンパク質のリン酸化レベルは増強されなかった（データは示さず）。
【０３５８】
本発明者らは、小分子阻害剤ＰＦ−５７３２２８でこの経路を遮断することによって、観察された下流シグナル伝達経路の活性化が、チロシン３９７におけるＦＡＫのリン酸化に依存していたかを評価した。この阻害剤はＡＴＰ結合ポケットでＦＡＫと相互作用し、ＦＡＫタンパク質の触媒活性、およびそれに続くＴｙｒ３９７におけるＦＡＫリン酸化の両方を有効に遮断する。１００ｎＭ  ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットに予め曝露した無血清Ｍ２１細胞に２つの濃度のＰＦ−５７３２２８を追加した後、ウエスタンブロット分析により、図４１Ｂにグラフで示されているように、ＦＡＫのＴｙｒ３９７およびＳｒｃ（図４１Ａ）のリン酸化の阻害が明らかになった。ＭＥＫまたはＥｒｋのリン酸化の阻害は、より高濃度の阻害剤でのみ観察された（図４１Ａ、４１Ｂ）。
【０３５９】
細胞遊走に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの効果
多くの種類の腫瘍および血管新生細胞上で高発現しているανβ３インテグリン受容体は、細胞遊走、接着、増殖、浸潤および血管新生を含む多数の下流生物学的プロセスを調節することが公知である。以下の実験において、本発明者らは、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ＣドットがＭ２１およびＨＵＶＥＣ細胞の遊走を変化させるかを決定しようとした。最初の実験セットでは、９６時間にわたって３つの漸増粒子濃度（０ｎＭ〜４００ｎＭ；３７℃）でタイムラプスイメージングを使用して、平均面積閉鎖に反映されるＭ２１細胞の遊走の時間依存性変化を調べた（図４２Ａ、ｉ〜ｘｘ）。ベースライン値（ｔ＝０）に対する割合として、平均面積閉鎖の統計的に有意な増加が９６時間にわたって観察され、使用した粒子濃度範囲（すなわち、約８７％〜約９２％）（図４２Ａ、Ｂ）では、対照サンプル（７３％；ｐ＜０．０５）と比較して比較的一定であった。それよりも早い時間間隔では、有意な変化は見られなかった（図４２Ｂ）。
【０３６０】
０．２％ＦＣＳの存在下で、ＨＵＶＥＣ細胞を一定範囲の濃度のｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドット（１００〜４００ｎＭ）と共にインキュベート（３７℃、２０時間）すると、４００ｎＭの濃度（すなわち、３４％）（図４３Ａ、４３Ｂ）では、粒子に曝露されていない細胞の１９％（ｐ＜０．０５）と比較して、平均面積閉鎖の統計的に有意な増加が示された。使用したより低い粒子濃度では、遊走に関する認識可能な変化は観察されなかった（図４３Ａ、４３Ｂ）。粒子に曝露した細胞は、対照細胞と比較して高い遊走速度を示すことが認められた。
【０３６１】
本発明者らはさらに、ＦＡＫ阻害剤ＰＦ−５７３２２８の追加によって、細胞遊走速度の増加が減衰されたことを示した。ＨＵＶＥＣ細胞を４００ｎＭ粒子と共に２４時間の時間間隔でインキュベートした後に、最初の位相差画像を取得し（図４４Ａ、ｉ〜ｖｉｉｉ）、平均面積閉鎖を決定し、血清のみと比べてグラフで示した（図４４Ｂ）。阻害剤の追加の前後において、対照に対する平均面積閉鎖の変化率は、＋３４％から＋３％に減少することが認められた。阻害剤なしで粒子に曝露した細胞（ｐ＜０．０３）、および様々な阻害剤濃度で処理した粒子（２５０ｎＭ、５００ｎＭ；ｐ＜０．００１）の値の間では、無血清対照と比べて統計的有意差が見られた；最初の２群間の差異も統計的に有意であった（図４４Ｃ）。
【０３６２】
細胞接着および伸展に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの効果
ＲＧＤトリペプチドは、細胞外マトリックスの構成要素であるフィブロネクチンおよびビトロネクチンの成分であることが公知である。細胞をフィブロネクチンコーティングウェルに移した後、４００ｎＭ  ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットおよびフィブロネクチンの有無の下でプレインキュベート（２５℃、３０分間）したＭ２１細胞（細胞１０４個／ウェル）を使用して、競合結合アッセイを実施した。ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットと共にプレインキュベートしなかった細胞の約６０％は、最初の３０分位内にフィブロネクチンでコーティングプレート上に付着して伸展した。対照的に、４００ｎＭ  ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットと共にプレインキュベートしたＭ２１細胞のごく一部（１５％）は、播種の１２０分後であっても、フィブロネクチンコーティングウェル上に付着して伸展した（図４５Ａ、４５Ｂ）。２時間の期間にわたる「細長い」細胞（伸展細胞）対「円形の」細胞の平均細胞数により、粒子の非存在下（すなわち、対照条件）では、細胞の大部分において伸展細胞（「細長い」細胞）が観察されたが、粒子に曝露した細胞の場合には、主に「円形の」外観が認められたことが明らかになった（図４５Ａ）。これらの結果をそれぞれ図４５Ｂおよび４５Ｃにグラフで示す。メチレンブルーを追加した後の細胞の光学密度（吸光度）の定量により、フィブロネクチン上に付着して伸展した細胞（すなわち、粒子のプレインキュベーションなし）は、粒子に曝露されていない細胞よりも２倍多くのメチレンブルーを取り込んだことが明らかになった（図４５Ｄ）。本発明者らは、ビトロネクチンコーティングウェルを使用した場合に同じ現象を観察した（データは示さず）。要するに、これらのデータは、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットが、Ｍ２１およびＨＵＶＥＣ細胞上に見られるインテグリンανβ３受容体に対する結合を介して、細胞の遊走および伸展を増強したことを実証している。
【０３６３】
Ｍ２１細胞の細胞周期に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの影響
インテグリン受容体は、細胞の生存および増殖に関与するので、本発明者らは、細胞周期に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットの効果を分析した。０．２％ＦＣＳ補充培地中で、２つの濃度のｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドット（１００ｎＭ、３００ｎＭ）を使用して、Ｇ０／Ｇ１期同期化Ｍ２１細胞を４８時間インキュベートした。この範囲にわたって、Ｓ期の細胞の割合は１１％上昇し、１００ｎＭ（ｐ＜０．０５）および３００ｎＭ（ｐ＜０．００５）では、対照と比べて統計的有意性が達成された（図４６Ａ、４６Ｂ）。それぞれ細胞周期のＧ１期およびＧ２期では、６％および５％の対応する減少が見られた。要するに、これらのデータは、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットの存在下におけるＳ期の増強を示している。
【０３６４】
材料および方法
試薬、抗体および化学物質。ＲＰＭＩ１６４０、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＨＢＳＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含まず、０．２５％トリプシンおよび０．０５％ＥＤＴＡを含有する）は、Ｃｏｒｅ  Ｍｅｄｉａ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）から入手した。抗ポリクローナルウサギ：ホスホ−Ｅｒｋ１／２（ｐ−Ｅｒｋ１／２Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、ホスホ−ＡＫＴ（ｐ−ＡｋｔＳｅｒ４７３）ホスホ−Ｓｒｃ（ｐ−ＳｒｃＴｙｒ４１９）、ホスホ−ｐ７０Ｓ６（ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｔｈｒ３８９）、ホスホ−ＭＥＫ１／２（ｐ−ＭＥＫ１／２Ｓｅｒ２１７／２２１）、ホスホ−ＦＡＫ−Ｔｙｒ３９７、ホスホ−ＦＡＫ−Ｔｙｒ５７６／５７７ホスホ−ＦＡＫＴｙｒ９２５、Ｅｒｋ、ＡＫＴ、Ｓｒｃ、ｐ７０Ｓ６、ＭＥＫ１／２（４７Ｅ６）およびＦＡＫは、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）から入手した。ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ヤギ抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から入手した。ヨウ化プロピジウム、ＲＮａｓｅＡ、トランスフェリン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲート、ＦＩＴＣ−デキストラン、フルオレセイン、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＤＮＤ−９９、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−２６、ｐＨｒｏｄｏ  Ｒｅｄデキストランおよびヘキストは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。ＰＦ−５７３２２８は、ＴＯＣＲＩＳ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｅｌｌｉｓｖｉｌｌｅ，ＭＯ）から入手した。シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）製であった。
【０３６５】
ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ＣドットおよびＰＥＧ−ドットの合成。前記のように、改変ストーバー型シリカ縮合によって、有機色素Ｃｙ５を含有するフルオロフォア粒子を調製した。放射性ヨウ素の付加のために、チロシン残基をＰＥＧ鎖にコンジュゲートした。配列シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ）を含有し、システイン残基を有するｃＲＧＤＹペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、システイン−マレイミド結合を介して官能化ＰＥＧ鎖に付加した。ナノ粒子当たりのｃＲＧＤリガンドの数を実験的に計算した。
【０３６６】
Ｃドット表面へのＰＥＧ付加の機構。シリカ表面への付加のために、および誘導体化ＰＥＧのスルフヒドリル基およびマレイミド部分の間の反応を介したペプチド結合のために、シラン（特に３−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｇａｌｅｔ））で二官能性ＰＥＧ（ＭＡＬ−ｄＰＥＧ（登録商標）１２−ＮＨＳエステル（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎｓ，Ｌｔｄ））を誘導体化した。加えて、改変プロトコールにしたがって、官能性有機ケイ素化合物（Ｓｉ化合物）、具体的には（ＭｅＯ）３Ｓｉ−ＰＥＧ（Ｇｅｌｅｓｔ）を使用して、メトキシキャッピングＰＥＧ鎖を粒子表面に追加した。簡潔に言えば、水／アルコール基本混合物（約１：５ｖ／ｖ）中で、（ＭｅＯ）３Ｓｉ−ＰＥＧを約３モル過剰で粒子に追加し、混合物を室温で一晩撹拌した。
【０３６７】
蛍光相関分光法（ＦＣＳ）による流体力学的サイズおよび相対輝度の比較測定。最初に、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−ドットおよびＰＥＧ−ドットを水に対して透析し、生理食塩水（Ｈ２Ｏ中、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）に希釈し、得られた試料を、ＨｅＮｅ６３３ｎｍ励起を使用してＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  Ｃｏｎｆｏｃｏｒ  ２  ＦＣＳによって分析することによって、これらの粒子サンプルの流体力学的半径、輝度および濃度を、遊離Ｃｙ５色素と比べて決定した。すべての測定の前に、粒径について機器を較正した。拡散時間の差異に基づいて、色素および粒子種の平均流体力学的サイズを推定し、分子／粒子当たりの計数率を使用して相対輝度を評価した。
【０３６８】
細胞および細胞培養：ヒト黒色腫細胞株Ｍ２１およびＭ２１変異体Ｍ２１Ｌ（ａν陰性）は、Ｄ．Ａ．Ｃｈｅｒｅｓｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよびペニシリンストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０中で、細胞を維持した。ＬＯＮＺＡ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を入手し、２％ＦＢＳおよび成長因子ＬＯＮＺＡを含有するＥＧＭ−２培地中で培養した。
【０３６９】
光学的検出方法を使用したインビトロ細胞結合研究：Ｍ２１、Ｍ２１−ＬまたはＨＵＶＥＣ細胞に対する粒子の結合をアッセイするために、１０μｇ／ｍｌコラーゲンＩ型（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ＰＢＳ溶液で２４ウェルプレートをコーティングし、３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで１回洗浄した。細胞（細胞３．０×１０５個／ウェル〜細胞４．０×１０５個／ウェル）をコンフルエントになるまで成長させた。フローサイトメトリーを使用して、一定範囲のインキュベーション時間（最大４時間）および粒子濃度（１０〜６００ｎＭ）にわたって、Ｍ２１またはＨＵＶＥＣ細胞に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットの差次的結合を評価した。インキュベーション後、ＲＰＭＩ１６４０培地／０．５％ＢＳＡで細胞を洗浄し、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを使用して剥離し、微小遠心管中でペレット化した（１５３ｇ、２５℃で５分間）し、ＢＤ  ＦＡＣＳＦｌｏｗ溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁し、Ｃｙ５チャネルで分析して、粒子結合プローブの割合を決定した（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）。
【０３７０】
インターナリゼーション研究：３つの異なる温度（４℃、２５℃および３７℃）で４時間インキュベートした以外は、上記のように実験を行った。過剰な（２５０倍）ｃＲＧＤＹ抗ヒトインテグリンανβ３フルオレセイン結合抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）とｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットとのコインキュベーションを受容体のブロッキングに使用して、特異性を評価した。固定細胞および生細胞を使用して、アッセイを実施した。固定Ｍ２１細胞の場合、ＨＣＸ  ＰＬ  ＡＰＯ対物レンズ（６３ｘ１．２ＮＡ  Ｗａｔｅｒ  ＤＩＣＤ）を備える倒立共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ）を使用し、タイムラプスイメージングを使用して生Ｍ２１細胞を追跡した。いくつかの濃度のターゲティング（または対照）粒子を以下の色素マーカーと共に４時間コインキュベートした後、画像を取得した：マクロピノソームを標識するための７０ｋＤａデキストラン−ＦＩＴＣコンジュゲート（１ｍｇ／ｍＬ、３７℃で３０分間；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。エンドサイトーシス経路を標識するためのＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（１００ｎＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびトランスフェリンＡｌｅｘａ４８８（２μｇ／ｍＬ）。
【０３７１】
競合結合研究：特異的結合をアッセイするために、Ｍ２１細胞を１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドット（２５ｎＭ）および過剰なｃＲＧＤＹペプチドと共にインキュベート（２５℃、４時間）した。次いで、ＲＰＭＩ１６４０培地／０．５％ＢＳＡで細胞を洗浄し、０．５ｍｌの０．２Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。ヨウ素１２４について較正した１４８０  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、放射能をアッセイした。
【０３７２】
ウエスタンブロット（ＷＢ）：コラーゲン（１０ｍｇ／ｍｌ）でコーティングした６つのウェル中でＭ２１細胞（細胞１×１０６個／６ウェルプレート）を成長させた。無血清条件下で成長させることによって静止させた。次いで、培地を０．２％ＦＣＳに交換し、様々な濃度（２５〜４００ｎＭ）のｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットを追加した（３７℃、０．５〜８時間）。氷冷ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、トリプシン処理によって回収し、ペレットを溶解緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ−８．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；ＡＣＲＯＳ  ｏｒｇａｎｉｃｓ，ＮＪ）、１％デオキシコール酸Ｎａ、０．１％ＳＤＳ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）およびホスファターゼ阻害剤カクテルタブレット−ＰｈｏｓＳＴＯＰ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に再懸濁した。溶解物を遠心分離した（１０分間、４℃）。ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって、タンパク質濃度を決定した。４〜１２％勾配ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、各画分の５０μｇアリコートのタンパク質を分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に転写した。５％脱脂粉乳（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）のトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）−Ｔｗｅｅｎ０．１％溶液で膜をブロッキングし、一次（１：１０００）および二次（１：２０００〜１：５０００）抗体をアプライした後に、ＥＣＬ化学発光（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）またはＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）によって可視化した。
【０３７３】
細胞周期分析：培地を０．２％ＦＣＳに交換した後、２つの濃度（１００および３００ｎＭ）のｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットを使用して、Ｇ０／Ｇ１期同期化Ｍ２１細胞を４８時間インキュベートした。トリプシン処理後、細胞を遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）し、ペレットをＰＢＳに懸濁し、続いて、７０％エタノールで固定（４℃、０．５〜１時間）した。１％ＦＣＳおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する１ｍｌのＰＢＳ、２５μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムおよび１００ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡを含有する２００μｌのＰＢＳに細胞を連続して再懸濁した（４℃、６０分間）。フローサイトメトリー、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）およびＰｈｏｅｎｉｘ  Ｆｌｏｗ  ＭｕｌｔｉＣｙｃｌｅソフトウェア（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｆｌｏｗ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって、細胞周期分析を実施した。
【０３７４】
細胞増殖：インビトロ細胞結合研究に記載されているように、コラーゲンでコーティングした９６ウェルプレート中で、細胞を分割した（細胞１×１０４個／ウェル）。様々な濃度のｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットを３７℃で２４〜４８時間にわたって追加した（２５〜２００ｎＭ）。次いで、２０ｍｌの増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）をプレートに追加した（３７℃、１時間）。光学密度を決定するために、本発明者らは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ５マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用した。吸光度を４４０ｎｍで測定した。
【０３７５】
遊走アッセイ：Ｍ２１細胞：遊走キット（Ｏｒｉｓ（商標）コラーゲンＩコーティングプレート、ＰＬＡＴＹＰＵＳ  ＴＥＣ）を使用して、Ｍ２１細胞を播種（細胞６×１０４個／ウェル）した。細胞を播種した２４時間後に、プレート内のストッパーを除去した。０．２％ＦＢＳを補充した新鮮培養培地は、（１００μｌ）を入れ、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットをいくつかの濃度（２５、１００および４００ｎＭ）で追加した。その後２４時間ごとに、７２時間の時間間隔で培地を新たな粒子と一緒に交換した。プレートを３７℃で一晩インキュベートする前に、５ｘ（．１５ＮＡ）対物レンズを使用して、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ，ＰＡ）のスキャンスライドモジュールを使用して、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）によって、時間ゼロの画像をキャプチャした。次いで、連続顕微鏡検査を実施し、インキュベーション後合計９６時間にわたって２４時間ごとに画像をキャプチャした。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用することによって、データを分析した。ＨＵＶＥＣ細胞：ＨＵＶＥＣ細胞をさらに播種（細胞５×１０４個／ウェル）し、２４時間後に培地を交換してから、いくつかの濃度の粒子（１００、２００および４００ｎＭ）と共にインキュベートした。Ｍ２１細胞のものと同様の顕微鏡検査手順を実施し、２０時間後に連続イメージングを取得した。
【０３７６】
接着および伸展アッセイ：最初に、フィブロネクチンのＰＢＳ溶液（５μｇ／ｍｌ）で９６ウェルマイクロタイタープレートをコーティングし、続いて、２００μｌのＲＰＭＩ／０．５％ＢＳＡ（３７℃、１時間）でコーティングすることによって、フィブロネクチンコーティングプレートに対するＭ２１細胞の結合に対するｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットの効果を評価した。ＲＰＭＩ／０．１％ＢＳＡ中、４００ｎＭのｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ−ドットの有無の下で、細胞（細胞１〜３×１０４個／１００μｌ／ウェル）をインキュベートし（２５℃、３０分間）、フィブロネクチンコーティングウェルに追加（３７℃、３０〜１２０分間）した。付着細胞の数を定量するために、ＲＰＭＩ／０．１％ＢＳＡでウェルを洗浄し、非接着細胞を除去した。４％ＰＦＡで接着細胞を固定（２５℃、２０分間）し、メチレンブルーで染色（３７℃、１時間）した。２００ｍｌの０．１Ｍ  ＨＣｌを追加（３７℃、１時間）することによって、細胞からメチレンブルーを抽出した。光学密度を決定するために、本発明者らは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ５マイクロプレートリーダーを使用し、吸光度を６５０ｎｍで測定した。伸展アッセイ：タイムラプスを実施（３７℃、２時間）し、２０ｘ（．１５ＮＡ）対物レンズを使用して、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）のスキャンスライドモジュールを使用して、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）によって、画像をキャプチャした。
【０３７７】
定量分析：ウエスタンブロットのバンド間のサイズおよび強度の差異を定量するために、本発明者らは、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ２（Ａｄｏｂｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、リン酸化タンパク質中間体および全タンパク質中間体のデンシトメトリーを実施した。３００  ｄｐｉ（Ｓｃａｎｊｅｔ  ７６５０，Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）でバンドをスキャンし、グレースケールに変換した。次いで、以下：面積（ピクセル数）、選択領域内の平均グレースケール値（０〜２５５）および関連する標準偏差を求めるために、投げ縄ツールを使用して、各バンドの境界内の関心領域（ＲＯＩ）を描いた。各バンドの最初の２つの値の積を計算し、各セットの最初のバンド（対照バンド）の積で割って、対照に対する各サンプルの強度値を求めた。最後に、相対強度を使用して、各サンプルについて、リン酸化タンパク質と全タンパク質との比および対応する伝搬誤差（ＳＤ）を計算した。
【０３７８】
Ｍ２１細胞およびＨＵＶＥＣの細胞遊走の程度（すなわち、面積閉鎖）を定量するために、ＩｍａｇｅＪ  １．４５ｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）を使用して、遊走研究のためにキャプチャした位相差画像を分析した。高倍率視野では、ストッパー除去後に、各画像で見られる付着細胞のリムに隣接する閉鎖領域が描かれた。各画像の閉鎖領域を測定（ピクセル）し、これを使用して、（粒子を追加して培地を交換した後）時間ゼロに対する閉鎖率を以下のように計算した：所定の時点（２４時間、４８時間、７２時間または９６時間）と時間ゼロとの間の面積の差異を時間ゼロの同じ面積で割って、１００を乗じた。得られた値を平均化し、各群の標準誤差を計算した。
【０３７９】
統計：特に指定のない限り、すべてのグラフ値は平均±ＳＥとしてプロットされている。片側スチューデントｔ検定を使用して、血清のみまたはｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットと共にインキュベートしたＨＵＶＥＣまたはＭ２１細胞間の細胞遊走の差異の統計的有意性を試験した。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、血清のみ、１００ｎＭまたは３００ｎＭ  ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットと共にインキュベートしたＳ期のＭ２１細胞の割合の間の統計的なペアワイズ比較を実施した。本発明者らは、すべての試験について、Ｐ＜０．０５で統計的有意性があるとした。
【０３８０】
実施例１７  シリカ診断／治療粒子の腫瘍送達の増強のためのスフィンゴミエリンリポソーム
薬物送達ビヒクルとして、１０ｎｍ以下の粒子（例えば、Ｃドット）の治療可能性が検討されている。薬物結合粒子は、薬物を粒子結合二官能性ＰＥＧ鎖に付加することによって開発されている。この概念実証研究に利用されるモデル薬物は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤である。光学イメージングおよび／またはＰＥＴイメージングによって粒子取り込みの増強および腫瘍内分布を評価するための用量漸増戦略を用いることによって、標的部位における粒子治療ペイロードの送達および蓄積を最大化し得る。粒子負荷送達を増強するための別のアプローチでは、治療粒子プローブをカプセル化するリポソーム製剤を利用する。リポソームは、循環中の分解からペイロードを保護しながら、増強した血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）効果によって腫瘍を受動的にターゲティングする。粒子のカプセル化前に、標的部位への送達を最大化するための能動的ターゲティング機構として、ｃＲＧＤＹまたはリンカー−薬物コンジュゲートのいずれかを粒子表面に付加する。
【０３８１】
腫瘍に存在する酵素系がアップレギュレートされた結果として、標的部位において一度に、リポソーム製剤から腫瘍間質への粒子の放出が起こり得る。Ｘ線照射および毒素などの細胞ストレスに応じて、腫瘍細胞から酸スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭａｓｅ、酸ＳＭａｓｅまたはＳＭａｓｅ）が細胞外放出されると、迅速なセラミド媒介性細胞傷害とそれに続いてアポトーシスが起こる。酸ＳＭａｓｅは、リポソーム製剤内に存在するスフィンゴミエリンをセラミドに加水分解する。セラミドは、生物系において、アポトーシス過程の二次メッセンジャーとしての役割を有する。セラミドは、親分子スフィンゴミエリンと有意に異なる膜特性を有する。スフィンゴミエリンを含有するリポソームがＳＭａｓｅで切断されると、膜剛性の劇的な変化が起こる。スフィンゴミエリンは、リポソーム製剤に適切な脂質である；リポソームのビルディングブロックとしてセラミドを組み込むことはリポソーム漏出につながるので、これはセラミドには当てはまらない。この漏出は、リポソーム内容物の放出につながる。これは、疾患をモニタリングおよび／または処置するための薬物および／または細胞インターナリゼーションマーカー（すなわち、ペプチドＫＬＡＫＬＡＣおよび小分子阻害剤）で官能化された大ペイロードのシリカナノ粒子の細胞内ターゲティングの可能性を開く。
【０３８２】
リポソームカプセル化が、腫瘍部位への粒子送達を、非カプセル化粒子プローブと比べて有意に増加させるかを決定するために、本発明者らは、光学イメージング法およびＰＥＴイメージング法を利用して、ＥＧＦＲｍｔ＋を発現する腫瘍異種移植モデル（すなわち、Ｈ１６５０、Ａ４３１）におけるリポソームカプセル化スフィンゴミエリナーゼおよび非カプセル化粒子バッチの両方の取り込みをモニタリングする（リポソームおよび粒子プローブは両方とも、可視化のための光学マーカーを含有する）。
【０３８３】
参考文献：Ｓｏｃｈａｎｉｋ  Ａｌ，Ｍｉｔｒｕｓ  Ｉ，Ｓｍｏｌａｒｃｚｙｋ  Ｒ，Ｃｉｃｈｏｎ  Ｔ，Ｓｎｉｅｔｕｒａ  Ｍ，Ｃｚａｊａ  Ｍ，Ｓｚａｌａ  Ｓ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｖａｓｃｕｌａｒ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｅｎｔｒａｐｐｅｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ．Ａｒｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｅｘｐ（Ｗａｒｓｚ）．２０１０  Ｊｕｎ；５８（３）：２３５−４５。
【０３８４】
ストレスを受けた細胞を検出およびターゲティングするための上記方法は、リポソーム形成脂質、スフィンゴミエリンまたはそれらの混合物の第１の外層と、リポソーム形成脂質、スフィンゴミエリンまたはそれらの混合物の第２の内層とをそれぞれが有する二重層リポソームから構成される製剤であって、前記第１の層および第２の層が、二重層リポソームを形成してその中の内部空間を規定し、前記内部空間がシリカナノ粒子を含有する製剤を含む。シリカナノ粒子および／またはリポソームは、光学マーカーおよび／またはＰＥＴラベル（色素、フルオロフォア、放射標識、造影剤）、酵素基質および／または治療剤（細胞毒性薬、ＤＮＡセグメントまたは放射性トレーサーインジケーターラベルを含む）から構成される。スフィンゴミエリナーゼが細胞中に存在するかまたは細胞によって放出される条件下で、スフィンゴミエリンリポソーム内に含まれるマーカーおよび／または薬物標識シリカ粒子は細胞サンプルと接触する。今度は、この酵素的接触により、リポソーム中のスフィンゴミエリンが加水分解されて、リポソームの親水性（内部）または疎水性（二重層）区画から、シリカナノ粒子および／またはマーカー標識および／または薬物が放出される。
【０３８５】
本発明の範囲は、本明細書の上記で具体的に示され説明されたものによって限定されない。当業者であれば、示されている実施例の材料、組成物、構造およびサイズの適切な代替手段があることを認識するであろう。特許および様々な刊行物を含む多数の参考文献が引用され、本発明の説明で議論されている。このような参考文献の引用および議論は、本発明の説明を明確にするために示されているに過ぎず、いかなる参考文献も本明細書に記載される発明に対する先行技術であると認めるものではない。本明細書で引用および議論されているすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。当業者であれば、発明の要旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されるもののバリエーション、改変および他の実施を想到するであろう。本発明の特定の実施形態を示して説明したが、本発明の要旨および範囲から逸脱することなく変更および改変を行い得ることは当業者には明らかであろう。上記説明および添付の図面において記載されている事項は、例示目的で示されているに過ぎず、限定するものではない。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２８−３】
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【図２８−４】
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【図２８−５】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０Ａ−３０Ｃ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４０−３】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４２−１】
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【図４２−２】
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【図４３】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４５−１】
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【図４５−２】
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【図４６−１】
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【図４６−２】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０−１】
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【図５０−２】
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【図５１】
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【図５２−１】
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【図５２−２】
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【配列表】
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