(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質を含む、細胞死滅検出用組成物であって、
前記ホスファチジルイノシトールリン酸が、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３）またはホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２）である組成物。
【請求項２】
前記ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質が、ＣＤ１４タンパク質またはその変異体、ＰＨ（Pleckstrin Homology）ドメイン含有タンパク質、ＰＫＣ（Protein kinase C）のＣ２ドメイン含有タンパク質、またはその混合物を含むものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＰＨドメイン含有タンパク質が、Ａｋｔ（タンパク質キナーゼＢ）、Ｂｔｋ（Bruton’s tyrosine kinase）、ＰＤＫ１（pyruvate dehydrogenase kinase 1）、及びＧＲＰ１（general receptor of phosphoinositides 1）からなる群から選択されるものである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記Ｃ２ドメイン含有タンパク質が、Ｍｙｃが結合されたＰＫＣβ１Ｃ２ドメインタンパク質である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質が、抗−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３抗体または抗−ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、カルシウム；及びホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質としてアネキシンＶ（Annexin V）を含むものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞死滅検出がイン・ビトロで行われる、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質が、標識物質で標識されたものであり、前記標識物質が、蛍光物質、発色酵素、放射性同位元素、クロモフォア、常磁性粒子、及び超常磁性粒子からなる群から選択されるいずれか一つである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の組成物を含む、細胞死滅検出用キット。
【請求項１０】
請求項８に記載の組成物を、細胞を含む試料に処理する第１段階；
前記試料から標識物質を感知する第２段階を含む、細胞死滅検出方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の組成物を含む、抗がん剤のスクリーニング用組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物と候補物質を、癌細胞を含む試料に処理する第１段階；及び
前記試料から標識物質を感知する第２段階を含む、抗がん剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記方法において、第２段階で標識物質が感知された場合には、前記候補物質を抗がん剤で決定する第３段階をさらに含むものである、請求項１２に記載の抗がん剤のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項８に記載の組成物と候補物質を、細胞を含む試料に処理する第１段階；
前記第１段階の細胞の死滅を誘導する第２段階；及び
前記試料から標識物質を定量する第３段階を含む、細胞死滅阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
前記第２段階は、細胞に死滅誘導剤を処理して細胞死滅を誘導するものである、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質を用いた細胞死滅検出方法、抗がん剤スクリーニング方法、細胞死滅阻害物質のスクリーニング方法、及び食作用抑制方法に関する(Use of Phosphatidylinositolphosphate binding materials for detection of cell apoptosis)。
【背景技術】
【０００２】
ホスファチジルセリン（phosphatidylserine、PS）は、大食細胞が死滅細胞（apoptotic cell）を認識して除去する重要なマーカーである（非特許文献１）。正常の状態においてホスファチジルセリンは、細胞膜の内部に存在するが、細胞が死滅信号を受けたり、赤血球が老化すると、細胞膜の外部に露出され、これを大食細胞が細胞表面の受容体を通じて認識して貪食作用を起こす（非特許文献２）。
【０００３】
アネキシンＶ（Annexin V）は、ホスファチジルセリンと効果的に結合することができるタンパク質である（特許文献１）。細胞死滅の初期段階で細胞膜の構造が破壊されることにより細胞内のみで露出されていたホスファチジルセリンが細胞の外部に露出されるため、このような点を利用して開発されたアネキシンＶを含むキットが細胞死滅検出のために広く使用されている。特許文献２はホスファチジルセリンと特異的に結合するポリペプチドを有効成分として含む死滅細胞検出用組成物について記載している。
【０００４】
一方、韓国の健康保険審査評価院の最近１０年間の健康保険資料を分析した結果、糖尿病患者は、２０２０年頃、国民の７人に１人の割合である７２２万人（全国民の１４．４％）と推定されている（非特許文献３）。したがって、これに伴う社会経済的費用の損失も計り知れないほどのものと予想されている。
【０００５】
糖尿病の治療には、経口血糖降下剤及びインスリンを用いた治療方法と膵臓及び膵島を用いた移植がある（非特許文献４）。最近インスリンを分泌する他人の膵島のみを移植してインスリン分泌機能を回復させる施術に関する関心が集中され、それにより成績が好転している。膵島移植は、膵臓移植に比べて侵襲程度が少なく、施術が簡単であるため、施術に伴う副作用が少なく、入院期間が短いため、繰り返し施術が可能という長所がある。また、膵臓移植が不可能な場合にも、膵島を採取して移植することが可能である。
【０００６】
しかし、現在多く使用されているＥｄｍｏｎｔｏｎ移植法（非特許文献５）で移植された場合、血管の中での免疫反応により、超急性血液媒介性炎症反応（ＩＢＭＩＲ）により、膵島の細胞死滅が引き起こされることができる。また、二人以上のドナーの細胞を移植する場合、互いに異なるＨＬＡ抗原により炎症反応が深化され、拒否反応をもたらす可能性がある。したがって、膵島移植の時、細胞死滅を抑制する治療法の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１３／０３０２８２７号明細書
【特許文献２】国際公開第２００９／１０７９７１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Schlegel、RA et al., Cell Death and Differentiation, 2001, 8:551-563
【非特許文献２】Fadok、VA et al., J immunol 1992, 148:2207-2216
【非特許文献３】パク・ヨンス、HANYANG MEDICAL REVIEWS 29(2), 2009年
【非特許文献４】ギム・ファジョン外、J Korean Soc Transplant、December 2009; 23(3):214-226
【非特許文献５】Shapiro AM et al., N Engl J Med 2006; 355:1318-30
【非特許文献６】LC Cantley、Science 296、1655、2002
【非特許文献７】T. Balla、J Cell Sci 118、2093-2104、2005
【非特許文献８】Benchun Miaoa et al., Proc Natl Acad Sci US A. 2010 Nov 16; 107(46):20126-31
【非特許文献９】Toda et al., Mol cell biol 32、118、2012
【非特許文献１０】JI Kim et al., J Biol Chem 280、11347-11351、2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、死滅細胞で示される標識物質を利用して細胞の死滅を検出して、死滅細胞を食作用から保護する方法を開発するために鋭意研究努力した。その結果、細胞死滅が誘導される場合、ホスファチジルイノシトールリン酸が死滅細胞の表面に外在化され、これにより、大食細胞がＣＤ１４受容体を通じて細胞死滅を認識することができることを確認した。また、これを利用してホスファチジルイノシトールリン酸と効果的に結合することができる物質が細胞死滅検出、細胞死滅の保護、及び抗がん剤スクリーニングに使用されることを導出することにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の主な目的は、ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質を含む、細胞死滅検出用組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記細胞死滅検出用組成物を含む、細胞死滅検出用キットを提供することにある。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、前記細胞死滅検出用組成物を、細胞を含む試料に処理する第１段階；前記試料から標識物質を感知する第２段階を含む、細胞死滅検出方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、前記細胞死滅検出用組成物を含む、抗がん剤のスクリーニング用組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、抗がん剤のスクリーニング用組成物と候補物質を、癌細胞を含む試料に処理する第１段階；及び前記試料から標識物質を感知する第２段階を含む、抗がん剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、前記細胞死滅検出用組成物と候補物質を、細胞を含む試料に処理する第１段階；前記細胞の死滅を誘導する第２段階；及び前記試料から標識物質を定量する第３段階を含む、細胞死滅阻害物質のスクリーニング方法を提供することにある。
【００１４】
本発明のもう一つの目的は、ホスファチジルイノシトールリン酸への結合物質を含む、食作用抑制用組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記食作用抑制用組成物を、細胞、組織、または臓器に処理する段階を含む、食作用抑制方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１５】
本発明による細胞死滅検出用組成物、キット、及び細胞死滅検出方法は、ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質を利用して細胞死滅の有無及びその程度を容易に検出することができる。
【００１６】
これを利用して本発明は、抗がん剤または細胞死阻害物質を容易にスクリーニングすることができ、食作用を抑制して細胞を保護し、移植時に発生する副作用を減少させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１ａ】ホスファチジルイノシトールリン酸に結合するＰＨドメイン、ＣＤ１４、及びそれらによるキャッピング（capping）を模式図で表したものである。
【図１ｂ】細胞死滅誘導剤処理によるホスファチジルイノシトールリン酸の外在化及びそれに伴うホスファチジルイノシトールリン酸の製造を模式図で表したものである。
【図１ｃ】ホスファチジルイノシトールリン酸のＣＤ１４を介した活性化された大食細胞との結合を模式図で示したものである。
【図２ａ】細胞死滅誘導剤処理によるホスファチジルイノシトールリン酸の外在化を示したもので、細胞死滅の初期段階で外在化したＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を示したものである。
【図２ｂ】細胞死滅誘導剤処理によるホスファチジルイノシトールリン酸の外在化を示したもので、２次壊死段階に外在化したＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を示したものである。
【図２ｃ】細胞死滅誘導剤処理によるホスファチジルイノシトールリン酸の外在化を示したもので、細胞死滅誘導剤によるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の外在化を示したものである。
【図２ｄ】細胞死滅誘導剤処理によるホスファチジルイノシトールリン酸の外在化を示したもので、外在化したＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２を示したものである。
【図３ａ】時間の経過に伴うＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の総ＰｄｔＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の濃度を示したものである。
【図３ｂ】時間の経過に伴うＨｅＬａ細胞の総ＰｄｔＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の濃度を示したものである。
【図４ａ】タンパク質−脂質アッセイ及び免疫ブローティングの結果を示したものである。
【図４ｂ】タンパク質−脂質アッセイ及び免疫ブローティングの結果を示したものである。
【図４ｃ】ＰＩＰ−親密度ビーズプルダウンの結果を示したものである。
【図５】ＩＣ−ＩｎｓＰ６の化学構造を示したものである。
【図６ａ】腹腔大食細胞により吸収されたＩＣ−ＩｎｓＰ６を示したものである。
【図６ｂ】ＲＡＷ２６４．７大食細胞により吸収されたＩＣ−ＩｎｓＰ６を示したものである。
【図６ｃ】ＲＡＷ２６４．７大食細胞により吸収されたＩＣ−ＩｎｓＰ６を示したものである。
【図７ａ】ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の１−、３−、４−、５−リン酸グループとＣＤ１４のＲ９３、Ｒ１４８、Ｒ１５０、Ｒ２３０のアミノ酸残基との結合を示したものである。
【図７ｂ】種間保存されているアミノ酸残基を示したものである。
【図８】野生型組換えＣＤ１４受容体または変異されたＣＤ１４受容体とＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３との結合を示したものである。
【図９ａ】ＣＤ１４が欠損されたマウスまたは野生型マウスの肝臓クッパー細胞のＩＣ−ＩｎｓＰ６捕食を示したものである。
【図９ｂ】ＣＤ１４が欠損されたマウスまたは野生型マウスの大食細胞のｐＨｒｏｄｏ−標識された死滅細胞の捕食を示したものである。
【図９ｃ】ＣＤ１４が欠損されたマウスまたは野生型マウスの大食細胞のｐＨｒｏｄｏ−標識された死滅細胞の捕食を示したものである。
【図１０】死滅細胞の表面に外在化したＰｄｔＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の役割を示した模式図である。
【図１１ａ】Ａｋｔタンパク質の作用の模式図を示したものである。
【図１１ｂ】組換えＡｋｔタンパク質のＰＨドメインと死滅細胞の表面に外在化したＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３との結合を示したものである。
【図１１ｃ】組換えＡｋｔタンパク質のＰＨドメインと死滅細胞の表面に外在化したＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３との結合を示したものである。
【図１２ａ】ヒトＡｋｔ  ＰＨドメインを含むｐＥＴ２８ａを示したものである。
【図１２ｂ】製造された組換えＰＨドメインを確認して示したものである。
【図１２ｃ】製造された組換えアネキシンＶを確認して示したものである。
【図１３】レーザー−スキャン共焦点顕微鏡でＰＨドメインが結合する外在化したＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３及び、アネキシンＶが結合するＰｄｔＳｅｒを示したものである。
【図１４】フローサイトメトリーでＰＨドメインまたはＣＤ１４タンパク質が結合する外在化したＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３及び、アネキシンＶが結合するＰｄｔＳｅｒを示したものである。
【図１５ａ】Ｃ２ドメインタンパク質に対するタンパク質−脂質アッセイ及び免疫ブローティングの結果を示したものである。
【図１５ｂ】図１５ａの右側の結果を統計処理して示したグラフである。
【図１６】ＡｎｎｅｘｉｎＶに対するタンパク質−脂質アッセイ及び免疫ブローティングの結果を示したものである。
【００１８】
前記図面の各グラフの誤差バーは、３回以上の独立した実験の平均±標準偏差で示した。各グループ間の統計的有意性は、スチューデントｔ検定で決定し、Ｐ＜０．０５を有意と判断した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
［発明の実施のための最良の形態］
細胞死滅検出用組成物、キット、及び検出方法
前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質を含む、細胞死滅検出用組成物を提供する。
【００２０】
ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰｔｄＩｎｓＰｓ）は、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３、Ｉｎｓ（１，３，４，５）Ｐ４のようなｍｙｏ−イノシトールリン酸及びジアシルグリセロールで構成される、細胞膜の細胞質層に位置する物質である。ホスファチジルイノシトールリン酸は、エフェクタータンパク質のＰＩＰ−結合ドメインをもたらす細胞でのアンカー（anchor）であり、多様な刺激により誘導されるシグナル伝達を増幅するタンパク質活性剤として生物学的回路のオン／オフスイッチを提供する役割をする（非特許文献６）。しかし、ホスファチジルイノシトールリン酸と大食細胞との捕食作用関係、または細胞死滅認識との関係については知られていない。
【００２１】
本発明者らは、死滅した細胞においてホスファチジルイノシトールリン酸が外在化し（図１ｂ、図２ａ、２ｂ、及び２ｄ）、そのため、大食細胞のＣＤ１４受容体とホスファチジルイノシトールリン酸が特異的に結合して、細胞死滅を認識することを最初に確認した。したがって、ホスファチジルイノシトールリン酸と特異的に結合する物質を利用すると、効果的に細胞死滅を検出することができる。
【００２２】
前記ホスファチジルイノシトールリン酸は、ホスファチジルイノシトール−３−リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ）、ホスファチジルイノシトール−４−リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ）、ホスファチジルイノシトール−５−リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐ）、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２）、ホスファチジルイノシトール−３，５−二リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（３，５）Ｐ２）、ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２）、またはホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３）であることができる。本発明による一実施例において、細胞死滅を誘導する場合、特にＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３及びＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２が細胞の表面に外在化し、細胞死滅信号として作用することを確認した（図２ａ〜図２ｄ）。
【００２３】
前記ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質は、ＣＤ１４タンパク質またはその変異体を含むものであり得る。前記ＣＤ１４タンパク質の配列は当業界において公知となっている。本発明による一実施例において、ＣＤ１４は多様なホスファチジルイノシトールリン酸に対してのみ６．３ｐｍｏｌの強度で強い結合親和性を示したのに対し、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、スフィンゴシン１リン酸に対しては親和性を示さないことを確認した（図４ａ、図４ｂ）。このような結果は、ＣＤ１４タンパク質を利用してイノシトールリン酸グループを有しているホスファチジルイノシトールリン酸を検出することができることを示唆する。また、ＰＩＰ−親密度ビーズプルダウン結果、ホスファチジルイノシトールリン酸と結合することができないように変異されたＣＤ１４タンパク質の場合、ＰＩＰビーズとは結合しないのに対し、野生型ＣＤ１４タンパク質の場合、ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３と結合することを確認した（図４ｃ）。
【００２４】
前記ＣＤ１４タンパク質の変異体は、ＣＤ１４タンパク質のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の類似性を示すアミノ酸配列を有し、実質的にＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３と結合する活性を有するタンパク質であれば、すべて含むことができる。このような類似性を有する配列として前記ＣＤ１４タンパク質と同一または相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質変異体も本発明の範囲内に含まれることは自明である。また、前記変異体は、発現しようとする宿主細胞によりコドン最適化（codon optimization）されたものであり得る。
【００２５】
例えば、前記ＣＤ１４タンパク質の変異体は、ヒト（Homo sapiens）ＣＤ１４タンパク質のアミノ酸配列において、９３、１４８、１５０、３２０番目のアルギニン残基であるＲ９３、Ｒ１４８、Ｒ１５０、Ｒ２３０残基を含むものであり得る。本発明による一実施例において、ホスファチジルイノシトールリン酸、及びこれを模倣して行動するイノシトール−６−リン酸（ＩｎｓＰ６）に対する腹腔大食細胞の吸収を評価した結果、ＩｎｓＰ６またはＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の１−、３−、４−、５−リン酸グループは、ＣＤ１４のＲ９３、Ｒ１４８、Ｒ１５０、Ｒ２３０のアミノ酸残基と塩ブリッジにより固定されることが確認された（図７ａ）。したがって、Ｒ９３、Ｒ１４８、Ｒ１５０、Ｒ２３０残基を含むＣＤ１４タンパク質は、ホスファチジルイノシトールリン酸を認識し、結合して細胞死滅を検出することができる。
【００２６】
他の一例として、前記ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質は、ＰＨ（Pleckstrin Homology）ドメイン含有タンパク質を含むものであり得る。ＰＨドメインは、細胞内ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３に結合するバイオセンサーである（図１１ａ、非特許文献７及び非特許文献８）。本発明による一実施例においては、組換えＡｋｔタンパク質がＰＨドメインを通じて死滅細胞の表面に外在化したＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３に結合することを確認した（図１１ｂ、図１１ｃ）。また、大腸菌で発現させた組換えＰＨドメインも細胞死滅を検出することを確認した（図１３、図１４）。
【００２７】
非限定的な例として、前記ＰＨドメイン含有タンパク質は、Ａｋｔ（タンパク質キナーゼＢ）、Ｂｔｋ（Bruton’s tyrosine kinase）、ＰＤＫ１（pyruvate dehydrogenase kinase 1）、及びＧＲＰ１（general receptor of phosphoinositides 1）からなる群から選択されるものであり得る。前記Ａｋｔ、Ｂｔｋ、ＰＤＫ１、ＧＲＰ１は、その配列が当業界において公知となっており、ＰＨドメインを含むタンパク質として知られている。しかし、ホスファチジルイノシトールリン酸と結合するＰＨドメインを含むタンパク質であれば、これに限定されずに含めることができる。
【００２８】
他の一例として、前記ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質は、Ｃ２ドメイン含有タンパク質を含むものであり得る。Ｃ２ドメインはＰＫＣ（Protein kinase C）に含まれることを意味する（非特許文献９）。
【００２９】
非限定的な例として、前記Ｃ２ドメイン含有タンパク質は、転写因子であるＭｙｃが結合されたＰＫＣβ１Ｃ２ドメインタンパク質（PKCβ1C2 domain-Myc）であることができる。前記タンパク質は、その配列が当業界において公知となったＰＫＣβ１Ｃ２ドメインタンパク質にＭｙｃが直接または間接的に連結されたものであり得る。たとえば、ＰＫＣβ１Ｃ２ドメインタンパク質とＭｙｃはリンカーで連結されたものであり得る。ホスファチジルイノシトールリン酸と結合するＣ２ドメインを含むタンパク質であれば、これに限定されずに含めることができる。
【００３０】
たとえば、Ｃ２ドメイン含有タンパク質を含む細胞死滅検出用組成物は、カルシウムをさらに含むことができる。前記カルシウムは全組成物に対し、０．０００１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．００１ｍＭ〜１０ｍＭ、より好ましくは０．００１ｍＭ〜０．５ｍＭ、さらに好ましくは０．００１ｍＭ〜０．１ｍＭで含めることができる（図１５ａ及び図１５ｂ）。前記濃度でカルシウムが含まれる場合、Ｃ２ドメイン含有タンパク質がホスファチジルイノシトールリン酸、特にＰＩ（３，４，５）Ｐ３またはＰＩ（４，５）Ｐ２に対する結合力に優れるため、細胞死滅検出効果に、より効果的である。
【００３１】
他の一例として、前記ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質は、ＣＤ１４タンパク質またはその変異体、ＰＨ（Pleckstrin Homology）ドメイン含有タンパク質、Ｃ２ドメイン含有タンパク質、またはその混合物を含むものであり得る。
【００３２】
前記ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質は、抗−ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ抗体、抗−ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ抗体、抗−ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐ抗体、抗−ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２抗体、抗−ＰｔｄＩｎｓ（３，５）Ｐ２抗体、抗−ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２抗体、または抗−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３抗体を含むことができる。前記それぞれの抗体は、ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３，５）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を認識、結合するため、細胞死滅を検出するのに効果的に使用することができる。
【００３３】
一例として、本発明の組成物は、カルシウム；及びホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質としてアネキシンＶ（Annexin V）を含むものであり得る。アネキシンＶは、カルシウムと共に処理する場合は、ホスファチジルイノシトールリン酸と非常に強く結合するため、前記組成物は、細胞死滅をより高い精度で検出することができる（図１６）。
【００３４】
前記カルシウムは、全組成物に対して０．１μＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１μＭ〜１００ｍＭ、より好ましくは２．５μＭ〜７５ｍＭで含めることができる。前記濃度でカルシウムが含まれる場合、アネキシンＶは、ホスファチジルイノシトールリン酸、特にＰＩ（３，５）Ｐ２、ＰＩ（４，５）Ｐ２、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３に対する結合力に優れるため、細胞死滅検出効果に、より優れる。
【００３５】
前記細胞死滅検出は、イン・ビトロで行われるものであり得る。例えば、前記細胞死滅検出用組成物を利用してイン・ビトロで培養された細胞から細胞死滅の有無及び程度を確認することができる。
【００３６】
前記細胞死滅検出用組成物において、ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質は、標識物質として標識されたものであり得る。前記標識物質は、一例として、蛍光物質、発色酵素、放射性同位元素、クロモフォア（chromophore）、常磁性粒子（super paramagnetic particles）、及び超常磁性粒子（ultrasuper paramagnetic particles）からなる群から選択されるいずれか一つであり得るが、これに限定されるものではなく、当該技術分野において物質の存在を確認するために通常使用される標識物質であれば、いずれのものでも使用することができる。前記標識物質は、ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質と結合することにより、その物質を可視化することができる。したがって、細胞死滅の信号であるホスファチジルイノシトールリン酸の有無及び量を容易に確認することができる。
【００３７】
前記蛍光物質は、蛍光を示す物質であり、蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨＲＰ（horseradish peroxidase）、塩基性脱リン酸化酵素（alkaline phosphatase）、金コロイド（coloid gold）、ＦＩＴＣ（poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate）、ＲＩＴＣ（rhodamine-B-isothiocyanate）、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄなど、当業界において蛍光標識物質として使用するものであれば、制限なく使用することができる。非限定的な例として、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ａｌｅｘａ  ６４７、ＡＰＣ、蛍光タンパク質（GFP、Green Fluorescent Protein); ＥＧＦＰ(Enhanced Green Fluorescent Protein)、ＲＦＰ(Red Fluorescent Protein); ＤｓＲｅｄ(Discosoma sp. red fluorescent protein); ＣＦＰ (Cyan Fluorescent Protein)、ＣＧＦＰ(Cyan Green Fluorescent Protein)、ＹＦＰ(Yellow Fluorescent Protein）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはＣｙ７．５であることができる。
【００３８】
前記発色酵素は、非限定的な一例としてペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼを含むことができるが、当業界において発色酵素として使用するものであれば、制限なく含むことができる。
【００３９】
放射性同位元素は、非限定的な一例として１２５Ｉ、３２Ｐ、または３５Ｓを含むことができるが、当業界において放射性同位元素として使用するものであれば、制限なく含むことができる。
【００４０】
前記クロモフォアは、例えば、ヘム（Ｈｅｍｅ）と結合して酸素を運搬する鉄（Ｆｅ２＋）または細胞の呼吸で電子の伝達に関与する銅（Ｃｕ＋）であることができる。前記物質以外にも、ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質を可視化する物質であれば、制限されずに標識物質として使用することができる。
【００４１】
標識による検出方法は、当業界において広く知られているが、例えば、次のような方法により行うことができる。もし検出可能な標識として蛍光物質を利用する場合には、免疫蛍光染色法を利用することができる。例えば、ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質を蛍光物質を用いて標識した後、試料と反応させ、未結合または非特異的な結合産物を削除した後、蛍光顕微鏡でホスファチジルイノシトールリン酸の存在による蛍光を観察したり、蛍光値を測定することができる。また、検出可能な標識として酵素を用いる場合には、酵素反応を通じた基質の発色反応により吸光度を測定し、放射性物質である場合には、放射線放出量を測定することにより行うことができる。
【００４２】
他の態様として、本発明は、前記細胞死滅検出用組成物を含む、細胞死滅検出用キットを提供する。細胞死滅検出用組成物は前記の通りである。前記細胞死滅検出用組成物は、ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質を可視化することができる標識物質を含むため、リアルタイムで細胞死滅の有無及びその程度を容易に検出することができる。
【００４３】
他の態様として、本発明は、前記細胞死滅検出用組成物を、細胞を含む試料に処理する第１段階；前記試料から標識物質を感知する第２段階を含む、細胞死滅検出方法を提供する。
【００４４】
まず、第１段階は、細胞を含む試料にホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質を含む細胞死滅検出用組成物を処理する段階である。試料に組成物を処理する方法は、当業界において使用される方法を制限なく使用することができる。
【００４５】
第２段階は、前記試料から標識物質を検出する段階である。前記標識物質を検出する方法は、前記の通りである。
前記細胞死滅検出用組成物は、細胞死滅信号であるホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質を可視化する標識物質を含むため、リアルタイムで細胞死滅の有無及びその程度を容易に検出することができる。
【００４６】
抗がん剤のスクリーニング用組成物、スクリーニング方法
他の態様として、本発明は、前記細胞死滅検出用組成物を含む、抗がん剤のスクリーニング用組成物を提供する。前記細胞死滅検出用組成物は、前記の通りである。
【００４７】
本発明者らは、ホスファチジルイノシトールリン酸が死滅した細胞の信号として作用することができることを確認し、ホスファチジルイノシトールリン酸を検出することにより癌細胞の細胞死滅を誘導する抗がん剤をスクリーニングすることができることを最初に明らかにした。
【００４８】
前記抗がん剤は、がん細胞の細胞死滅を誘導または促進する物質を意味し、本明細書において細胞毒性薬または細胞死滅誘導剤と同じ意味で使用することができる。例えば、前記の抗がん剤は、シスプラチン、ビンブラスチン（vinblastine）、マイトマイシン（mitomycin）、シスプラチン（cisplatin、cis-diamminedichloroplatinum）、ドキソルビシン（doxorubicin）、エトポシド（etoposide）、タモキシフェン（tamoxifen）、カンプトテシン（camptothecin）、イノスタマイシン（inostamycin）、またはネオカルジノスタチン（neocarzinostatin）であり得るが、当業界において細胞毒性薬物として使用されるものであれば、それに限定されない。
【００４９】
他の態様として、本発明は、前記抗がん剤のスクリーニング用組成物と候補物質を、癌細胞を含む試料に処理する第１段階；及び前記試料から標識物質を感知する第２段階を含む、抗がん剤のスクリーニング方法を提供する。前記方法は、第２段階において標識物質が検出された場合、前記候補物質を抗がん剤として決定する第３段階をさらに含むことができる。
【００５０】
第１段階は、前記抗がん剤のスクリーニング用組成物及び候補物質を、癌細胞を含む試料に処理する段階である。前記候補物質は、抗がん剤と疑われる任意の物質を意味することができる。前記処理方法は、当業界において広く使用される方法を制限なく使用することができる。
【００５１】
第２段階は、前記処理された試料からスクリーニング用組成物に含まれた標識物質を検出する段階である。前記標識物質を検出する方法は、前記の通りである。
前記スクリーニング用組成物は、細胞死滅時に外在化されるホスファチジルイノシトールリン酸を検出する標識物質を含むため、リアルタイムで抗がん剤による細胞死滅の有無及びその程度を容易に検出することができる。したがって、標識物質によりホスファチジルイノシトールリン酸が感知された場合、前記候補物質を抗がん剤として決定することができる。
【００５２】
細胞死滅阻害物質のスクリーニング用組成物、スクリーニング方法
他の態様として、本発明は、前記細胞死滅検出用組成物を含む、細胞死滅阻害物質のスクリーニング用組成物を提供する。前記細胞死滅検出用組成物は、前記の通りである。
【００５３】
他の態様として、本発明は、前記細胞死滅検出用組成物と候補物質を、細胞を含む試料に処理する第１段階；前記細胞の死滅を誘導する第２段階；及び前記試料から標識物質を定量する第３段階を含む、細胞死滅阻害物質のスクリーニング方法を提供する。前記方法は、第３段階で試料から感知された標識物質の量が、候補物質を処理せずに細胞死滅を誘導した試料から感知された標識物質の量よりも少ない場合には、前記候補物質を細胞死滅阻害物質として決定する第４段階をさらに含むことができる。
【００５４】
まず、第１段階は、前記細胞死滅検出用組成物と候補物質を、細胞を含む試料に処理する段階である。前記候補物質は、細胞死滅阻害物質として疑われる物質を意味することができる。前記処理方法は、当業界において広く使用される方法を制限なく使用することができる。
【００５５】
第２段階は、前記試料に含まれた細胞の死滅を誘導する段階である。前記細胞の死滅を誘導する方法は、当業界において一般に細胞の死滅を誘導するために使用する手段を制限なく使用することができる。例えば、細胞死滅が誘導されることができる条件で細胞を培養することができる。または、例えば、細胞に死滅誘導剤を処理し、前記試料に含まれた細胞の死滅を誘導することができる。前記死滅誘導剤は、抗がん剤であることができる。本発明の一実施例では、死滅誘導剤としてカンプトテシン（camptothecin）、シクロヘキシミド（cycloheximide）、デキサメタゾン（dexamethasone）、エトポシド（etoposide）を使用した。前記デキサメタゾンは１５〜２５μＭの濃度で、前記カンプトテシンは２〜５μＭの濃度で、前記エトポシドは８０〜１２０μＭの濃度で、前記シクロヘキシミドは１５０〜２５０μＭの濃度で試料に処理されることができるが、それに限定されない。
【００５６】
前記第２段階において死滅誘導剤は、１〜１０時間処理されることができる。好ましくは、２〜８時間処理することができる。前記時間処理した場合、ホスファチジルイノシトールリン酸をより効果的に感知することができる（図３ａ及び図３ｂ）。
【００５７】
第３段階は、前記試料から標識物質を定量する段階である。前記定量方法は、当業界において蛍光物質、発色酵素、放射性同位元素、クロモフォア、常磁性粒子、及び超常磁性粒子などの標識物質を定量する方法であれば限定されずに使用することができる。例えば、検出可能な標識として蛍光物質を利用する場合には、免疫蛍光染色法を利用することができる。例えば、ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質を蛍光物質で標識した後、試料と反応させ、未結合または非特異的な結合産物を削除した後、蛍光顕微鏡でホスファチジルイノシトールリン酸の存在に伴う蛍光値を測定することができる。また、検出可能な標識として酵素を用いる場合には、酵素反応を通じた基質の発色反応により吸光度を測定し、放射性物質である場合には、放射線放出量を測定することにより行うことができる。
【００５８】
第４段階は、前記第３段階において試料から感知された標識物質の量が、候補物質を処理せずに細胞死滅を誘導した試料から感知された標識物質の量より少ない場合、前記候補物質を細胞死滅阻害物質として決定する段階である。死滅した細胞の信号として作用するホスファチジルイノシトールリン酸が、候補物質が処理された試料において処理しない試料に比べてより少ない量で検出された場合、前記候補物質は、細胞死滅を阻害するものと判断することができる。
【００５９】
食作用抑制用組成物、抑制方法
他の態様として、本発明は、ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質を含む、食作用抑制用組成物を提供する。
【００６０】
本発明による一実施例おいては、ホスファチジルイノシトールリン酸が死滅した細胞の信号として作用し、これにより、食作用が誘導されることが確認されたところ、細胞死滅時に外在化されるホスファチジルイノシトールリン酸をキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）する場合、食作用を抑制することができる。従って、前記食作用抑制用組成物は、不必要な食作用を抑制して細胞保護効果を示すことができる。
【００６１】
前記ホスファチジルイノシトールリン酸は、ホスファチジルイノシトール−３−リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ）、ホスファチジルイノシトール−４−リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ）、ホスファチジルイノシトール−５−リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐ）、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２）、ホスファチジルイノシトール−３，５−二リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（３，５）Ｐ２）、ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２）、またはホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３）であることができ、これは前記の通りである。
【００６２】
前記ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質は、ＣＤ１４タンパク質またはその変異体、ＰＨ（Pleckstrin Homology）ドメイン含有タンパク質、ＰＫＣ（Protein kinase C）のＣ２ドメイン含有タンパク質、抗−ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ抗体、抗−ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ抗体、抗−ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐ抗体、抗−ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２抗体、抗−ＰｔｄＩｎｓ（３，５）Ｐ２抗体、抗−ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２抗体、抗−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３抗体またはその混合物を含むものであり得、これは前記の通りである。
【００６３】
前記組成物は、カルシウム；及びホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質としてアネキシンＶ（Annexin V）を含むものであり得る。アネキシンＶは、カルシウムと共に処理される場合、多様な種類のホスファチジルイノシトールリン酸との結合力に優れ、食作用を効果的に抑制することができる。前記カルシウムは全組成物に対して０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１ｍＭ〜１００ｍＭ、より好ましくは２．５ｍＭ〜７５ｍＭで含めることができる。前記濃度でカルシウムが含まれる場合、アネキシンＶは、ホスファチジルイノシトールリン酸、特にＰＩ（３，５）Ｐ２、ＰＩ（４，５）Ｐ２、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３に対する結合力に優れるため、食作用抑制効果により優れる。
【００６４】
前記食作用抑制用組成物は、移植用細胞、移植用組織または移植用臓器に処理されるものであり得る。例えば、前記移植用細胞は、膵島（pancreatic islet）細胞であることができる。例えば、前記移植用組織は、膵臓組織であることができる。例えば、前記移植用臓器は膵臓であることができる。
【００６５】
移植用細胞、移植用組織または移植用臓器を分離する過程における種々の段階で細胞死滅が誘導されることができる。従って、前記食作用抑制用組成物は、移植用細胞、組織、または臓器の分離、摘出時に処理することができる。食作用抑制用組成物のキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）を通じて分離、抽出する時の細胞死滅及びそれに伴う食作用を阻害することによって、細胞、組織などの生存率を高めることができる（図１ａ）。
【００６６】
他の一例として、前記組成物は、分離、抽出された細胞、組織または臓器の保管過程で処理することができる。食作用抑制用組成物のキャッピング（capping）を通じて不要な食作用を抑制して細胞を保護し、移植の副作用を減らすことができる。ただし、これに限定されず、当業界において食作用抑制物質を処理する方法であれば、いくらでも本発明の組成物の処理方法で適用可能である。
【００６７】
また他の態様として、本発明は、前記食作用抑制用組成物を、細胞、組織、または臓器に処理する段階を含む、食作用抑制方法を提供する。前記食作用抑制用組成物は、移植用細胞、組織、または臓器に前処理されることにより、不必要な食作用を抑制して細胞を保護し、かつ、移植の副作用を減らすことができる。前記処理方法は、当業界において広く使用される方法を制限なく使用することができる。
【００６８】
前記処理する段階は、個体の体外で行われるものであり得る。例えば、第１の個体から分離または分離されて培養、または別途に製造された細胞、組織、または臓器に前記食作用抑制用組成物を処理した後、その細胞、組織、または臓器を第２の個体に移植することにより、移植の副作用、例えば、移植片対宿主反応（graft-versus-host reaction）を防止することができる。したがって、本発明による食作用の抑制方法を利用し、移植と関連する免疫疾患を治療することができる。
【００６９】
［発明を実施するための形態］
以下、本発明を下記例により詳しく説明する。ただし、下記例は本発明を例示するためのものであり、下記例により、本発明の範囲が制限されるものではない。
【００７０】
実施例１．ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰｔｄＩｎｓＰｓ）の細胞死滅検出効果の確認
１−１．細胞死滅誘導
具体的には、ＨｅＬａ細胞、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞、またはＣＨＯ（Chinese hamster ovary）Ｋ１細胞を、それぞれ１０％のＦＢＳと１％のペニシリン／ストレプトマイシン抗生剤を含むＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地、またはＦ１２培地で培養した。その後、それぞれの細胞を６−ウェルプレートのカバーグラス上で１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で２４時間培養した後、細胞死滅誘導キット（ａｂ１０２４８０；  Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を６時間、３７℃で処理した。具体的には、カンプトテシン（camptothecin）４μＭ、シクロヘキシミド（cycloheximide）２００μＭ、デキサメタゾン（dexamethasone）２０μＭ、エトポシド（etoposide）１００μＭを処理した。
【００７１】
１−２．死滅細胞でホスファチジルイノシトールリン酸の観察
死滅が誘導された細胞の表面にホスファチジルイノシトールリン酸が露出されるかを確認するために、まず、前記実施例１−１で死滅を誘導した細胞を１０％の中性に緩衝されたホルマリンで５分間固定した後、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、前記細胞を無血清タンパク質ブロック溶液（ＤＡＫＯ）で処理し、モノクローナルマウスＩｇＭ抗−ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２または抗−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３抗体（1:100、Echelon Biosciences、Salt Lake City、UT、USA）と共に３０分間処理して、ＦＩＴＣ−標識されたロバ抗−マウスＩｇＭ２次抗体で３０分間処理した。
【００７２】
前記細胞を顕微鏡に載せた後、適切な励起及び放出フィルターセットを用いてＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０レーザー−スキャン共焦点顕微鏡（Carl Zeiss）で撮影した。画像は４０ｘ油浸対物レンズで撮影した。操作されていないオリジナル画像の蛍光強度の定量のためにＺＥＮ  ２０１０ソフトウェア（Carl Zeiss）を使用した。
【００７３】
その結果、細胞死滅の初期段階（図２ａ）及び２次壊死段階（図２ｂ）で死滅細胞の表面に外在化したＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を観察することができた。前記外在化は、細胞死滅誘導剤の種類や細胞の種類とは無関係に示された（図２ｃ）。したがって、細胞に死滅が誘導されると、死滅細胞が原形質膜の外層にホスファチジルイノシトールリン酸を外在化するため、ホスファチジルイノシトールリン酸の観察から細胞死滅を検出することができることを確認した。
【００７４】
ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２の場合でも、ヨウ化プロピジウムで染色される細胞死滅の最後の段階で外在化し、細胞死滅を検出することができることを確認した（図２ｄ）。
実施例２．ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質の探索
２−１．ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の分離
ホスファチジルイノシトールリン酸を検出する物質を探索するために、まず、下記のように死滅が誘導された細胞からＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を分離した。
【００７５】
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞またはＨｅＬａ細胞を、それぞれ１ｘ１０７細胞／ｍｌの濃度にして１００ｃｍ３プレートで１６時間培養した。その後、１０μＭデキサメタゾン、４μＭカンプトテシン、または１００μＭシクロヘキシミドを多様な時点（０、１、２、４、６、８、１８、２４時間）に処理して細胞死滅を誘導した後、細胞を回収してメーカー（Echelon Biosciences）のマニュアルにより下記方法で酸性脂質を抽出した。
【００７６】
まず、１０ｍＬの冷たい０．５Ｍ  ＴＣＡ（trichloroacetic acid）で細胞を洗浄し、フラスコに付着した細胞を回収して、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。前記細胞ペレットを１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を含む５％のＴＣＡ  ３ｍＬで２回洗浄し、ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３：１２Ｍ  ＨＣｌ（８０：４０：１、ｖ／ｖ）を２．２５  ｍＬ加えた後、常温で１５分間４回ボルテックスした。その後、５分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清液を回収して０．７５ｍＬのＣＨＣｌ３及び１．３５ｍＬの０．１Ｍ  ＨＣｌを加えて酸性脂質を分離し、有機相を真空乾燥機で乾燥させた後、用途に応じて−８０℃（長期保管）または４℃（すぐに実験）で保管した。
【００７７】
その後、ビオチニルモノクローナルＩｇＧ抗−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３抗体及びストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（streptavidin-horseradish peroxidase）を用いたＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）でＰｄｔＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の濃度を測定し、（Ｋ−２５００ｓ、Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ＰｄｔＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３が生産されたことを確認した（図３ａ、図３ｂ）。図３ａは、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞から分離されたＰｄｔＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の濃度を時間別に、処理物質別に示したものであり、図３ｂは、ＨｅＬａ細胞から分離されたＰｄｔＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の濃度を時間別、処理物質別に示したものである。
【００７８】
２−２．組換えＣＤ１４タンパク質及びその変異体製造
組換えＣＤ１４タンパク質は、下記方法で製造した：まず、下記プライマー（Genemed Synthesis、Inc.）を使用してＣＤ１４（１−３６５の残基）全長をコードするヒト野生型ＣＤ１４  ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅した。
【００７９】
全方向プライマー
５’−ＴＴＧＧＴＧＣＣＡＡＣＡＧＡＴＧＡＧＧＴＴＣＡＣ−３’−配列番号１
逆プライマー
５’−ＴＴＣＴＴＴＣＣＴＡＣＡＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＣ−３’−配列番号２
その後、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Invitrogen）を用いてｐｃＤＮＡ６  Ｖ５  ＨｉｓＡ（Invitrogen）のＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ切断位置に複製し、Ｃ末端にＶ５とＨｉｓ６タグを有するタンパク質を生産して、配列分析によりその配列を検証した。その後、メーカーのマニュアルに従ってリポフェクタミンプラス試薬（Lipofectamine Plus reagent）を用いて前記線状ベクター１０ｕｇをＣＨＯ  Ｋ１細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの２日経過後、ＣＨＯ  Ｋ１細胞に２日ごとにブラストサイジン（blasticidin）５μｇ／ｍｌで処理してブラストサイジン（blasticidin）−抵抗性のある安定した細胞株を得た。抗−ＣＤ１４抗体で免疫ブローティングを行い、ＣＨＯ  Ｋ１−ＣＤ１４細胞をブラストサイジン１μｇ／ｍｌを含むＦ１２培地に培養した。安定した各細胞株を３日間、２０個の１５０ｃｍ３のプレートの中で培養して収集した。その後、収集された細胞を溶解バッファー（50mM Tris pH7.6、500mM NaCl、20mM imidazole、EDTA-free protease inhibitor cocktail(Roche、Germany)）に懸濁し、超音波分解した。各組換えタンパク質をＮｉ−ＮＴＡアガロースレジン（Ｑｉａｇｅｎ）上で精製して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び３００ｍＭのイミダゾールで溶かして分離した。その後、精製された組換えタンパク質を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６、２０ｍＭ  ＮａＣｌで透析し、ゲル濾過（Superdex-200 FPLC）クロマトグラフィーで追加精製して組換えＣＤ１４受容体タンパク質を得た。
【００８０】
同様な方法で、４重変異された（quadruple mutant）ＣＤ１４受容体タンパク質（ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を遮断）を製造した。
２−３．ＣＤ１４タンパク質とホスファチジルイノシトールリン酸の結合確認：タンパク質−脂質オーバーレイアッセイ及び免疫ブローティング
多様なホスファチジルイノシトールリン酸のイノシトールリン酸グループが大食細胞ＣＤ１４受容体と直接結合するかを確認するために、前記実施例２−２で製造した全長の組換えヒトＣＤ１４タンパク質及び変異ＣＤ１４タンパク質を利用してタンパク質−脂質オーバーレイアッセイを行った。ＰＩＰストリップまたはＰＩＰアレイは、Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。
【００８１】
３％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ（50 mM Tris、 0.15 M NaCl 及び0.05% Tween-20、 pH7.4、 EDTA-free protease inhibitor cocktail; Roche、Germany）を使用して膜を１５分間培養して膜に対する非特異的な結合をブロッキングした。前記ブロッキングした後、膜を３０分間、各精製された組換えＣＤ１４タンパク質１００ρｍｏｌと共に培養し、ＰＢＳで３回洗浄して、抗−ＣＤ１４（ｒａｂｂｉｔ、ＨＰＡ００２１２７；  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に再び培養した後、３０分間ＨＲＰ（horseradish peroxidase）−標識された２次抗体（goat; HAF007; R&D Systems）と培養した。前記結合は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００（Fujifilm、Japan）から感知した。非特許文献９で記載されたようにＰＩＰ−親密度ビーズプルダウン（PIP-affinity bead pulldowns）を行った。
【００８２】
その後、精製された野生型または変異タンパク質をタンパク質濃度に応じて、４倍希釈し、ホスホイノシトールビーズ４０μｌ、または２０ｍＭ  ＩＣ−ＩｎｓＰ６（Iron-Calcium-InsP6(Phytate)）を含むＴＢＳ−Ｔ  ３０μｌに移し、３０分間穏やかに混合した。沈んだビーズはＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した。前記タンパク質は、ＳＤＳサンプルバッファーを使用して溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、免疫ブローティング（anti-CD14 antibody; HPA002127; Sigma）より感知した。
【００８３】
その結果、ＣＤ１４は、多様なホスファチジルイノシトールリン酸に対してのみ強い結合親和性を示したのに対し、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、スフィンゴシン１リン酸に対しては、親和性を示さないことを確認した（図４ａ）。
【００８４】
また、免疫ブローティングの結果、ＣＤ１４は、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３と６．３  ｐｍｏｌの強度を示し、最も強く結合することを確認した（図４ｂ）。このような結果は、ＣＤ１４受容体がホスファチジルイノシトールリン酸とイノシトールリン酸グループとを介して直接結合することを示唆する。
【００８５】
また、ＰＩＰ−親密度ビーズプルダウンの結果、ＣＤ１４が変異されたタンパク質の場合では、ＰＩＰビーズと結合していないのに対し、野生型ＣＤ１４タンパク質の場合では、ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（４、５）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３と結合することを確認した（図４ｃ）。
【００８６】
実施例３．ＣＤ１４タンパク質のＰｔｄＩｎｓＰｓとの特異的結合による細胞死滅検出効果の確認
３−１．ＩＣ−ＩｎｓＰ６の製造
ＰｔｄＩｎｓＰｓはＩｎｓ（１，４，５）Ｐ３、Ｉｎｓ（１，３，４，５）Ｐ４のようなｍｙｏ−イノシトールリン酸及びジアシルグリセロールで構成されるため、ＩｎｓＰ６はＰｔｄＩｎｓＰｓを模倣して行動する。したがって、ＩｎｓＰ６を利用して下記実験を行った。
【００８７】
一方、鉄イオンは、プルシアンブルーにより染色されるため、ＩｎｓＰ６の細胞内の位置を容易にモニタリングするためにＩｎｓＰ６に鉄を結合させた（Ｆｅ３＋−ＩｎｓＰ６）。具体的には、等モル濃度のＦｅ３＋イオンとＩｎｓＰ６（フィチン酸、hexakisphosphate）溶液（ｐＨ６．０）とを混合してＦｅ３＋−ＩｎｓＰ６溶液１０ｍＭを製造した。その後、Ｆｅ３＋−ＩｎｓＰ６が血液内のカルシウムをキレーティングする可能性を最小限にするために等モル濃度のＣａ２＋イオンをＦｅ３＋−ＩｎｓＰ６溶液に添加した。そして、１Ｎ  ＮａＯＨを添加してｐＨ６．０に調整したＩＣ−ＩｎｓＰ６（Ｆｅ３＋−Ｃａ２＋−ＩｎｓＰ６）溶液を製造した。図５は、ＩＣ−ＩｎｓＰ６の化学構造を示したものである。
【００８８】
３−２．腹腔大食細胞によるＩＣ−ＩｎｓＰ６の吸収評価
動物実験は、動物管理使用委員会で承認を受け、あらゆる使用される動物は、嘉泉大学のイ・ギルヨ癌、糖尿病研員の動物実験のための倫理ガイドライン及び遺伝子操作実験のための安全ガイドラインにより行われた。
【００８９】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスからチオグリコール酸塩により誘発された腹腔大食細胞（Thio-pMacs; thioglycollate-elicited peritoneal macrophages）を得た。具体的には、２ｍｌの３％Ｂｒｅｗｅｒチオグリコール酸塩培地（Difco、Detroit、MI、USA）をマウスに腹腔内注射し、３〜５日後、冷たいＰＢＳで腹腔を洗浄して腹腔大食細胞を回収した。前記細胞を１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。前記細胞ペレットをＰＢＳで３回洗浄し、１０％のＦＢＳ（Gibco）を含むＤＭＥＭ培地に再懸濁した後、１ｘ１０５細胞／ｍｌの密度で６ウェルプレートのカバーグラス（Nunc、Fisher Scientific）上で培養した。細胞を１６時間付着培養し、浮遊細胞を除去するために、前記スライドを洗浄した。その後、付着したＴｈｉｏ−ｐＭａｃｓ細胞を０．５μｇ／ｍｌのＬＰＳの有無に応じて６時間培養した。ＬＰＳは、Ｔｈｉｏ−ｐＭａｃｓの活性化を誘導する。
【００９０】
培養後、前記細胞を０〜０．５ｍＭ  ＩＣ−ＩｎｓＰ６で４時間処理した。細胞をＰＢＳで洗浄して自由ＩＣ−ＩｎｓＰ６を除去し、１０％中性に緩衝されたホルマリンで５分間固定した後、細胞内の鉄の吸収を確認するために、次のように染色を行った。具体的にはカバーグラスを染色溶液（5％potassium ferrocyanide、12％HCl）に１時間放置しておいた後、蒸留水で３回洗浄し、プルシアンブルーで染色した。その後、ヌクレアファストレッドで対比染色し、マウント培地（Thermoscientific、Somerset、NJ、USA）に置いた。
【００９１】
その結果、ＬＰＳにより刺激され、活性化されたＴｈｉｏ−ｐＭａｃｓは刺激しないＴｈｉｏ−ｐＭａｃｓと比べて、ＩＣ−ＩｎｓＰ６を効果的に捕食することを示し、このような効果は、処理濃度依存的に増加した（図６ａ）。
【００９２】
同様の実験結果、ＲＡＷ２６４．７大食細胞の場合でも、ＩＣ−ＩｎｓＰ６を濃度依存的に、かつ、効果的に捕食することを確認した（図６ｂ、図６ｃ）。このような結果は、ＩＣ−ＩｎｓＰ６は活性化された大食細胞により選択的に捕食されることを示唆する。
【００９３】
３−３．分子モデリング及び配列の整列
ＣＤ１４受容体と結合するＩｎｓＰ６の残基を確認するために、下記のように分子モデリングを行った。
【００９４】
まず、ＡｕｔｏＤｏｃｋ  ＰｙＲｘ（http：//pyrx.sourceforge.net/）を利用してｈＡＤＡＲ２（ＰＤＢｉｄ：１ＺＹ７）で高度に精製されたＩｎｓＰ６座標をＣＤ１４（ＰＤＢｉｄ：１ＷＷＬ）結晶構造にドッキングした。ドッキングする間はＣＤ１４を受容体に処理し、堅固さを維持しながらＣＤ１４の回転可能な結合の柔軟性を維持した。グリッドボックスはＣＤ１４タンパク質全体のｘ、ｙ、ｚ方向にカバーされた。ＡｕｔｏＤｏｃｋ  ＰｙＲｘにより報告された１０個の最低エネルギー構造は、ＰｙＭＯＬ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（www.pymol.org）により確認された。１０個の最低エネルギー構造（energy conformation）の中、如何なる立体配座に対するＲＭＳＤ（平均平方根偏差、root-mean-square deviation）なしに、一番目の分子（-6.2 kcal/mol、binding affinity）を追加実験のために選定した。すべてのコンピュータの計算は、出版されたＣＤ１４の構造（ＩＷＷＬ）を用いて行った（非特許文献１０）。ＣＤ１４ファミリーに該当する５つの配列（ウシ、ウサギ、ヒト、マウス、ラット）はすべてＳｗｉｓｓＰｒｏｔからダウンロードし、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアラインメントした。
【００９５】
その結果、ＩｎｓＰ６またはＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の１−、３−、４−、５−リン酸グループは、Ｒ９３、Ｒ１４８、Ｒ１５０、Ｒ２３０のアミノ酸残基との塩ブリッジにより固定されることが確認された（図７ａ）。このような結果は、タンパク質−脂質オーバーレイ実験において、組換えＣＤ１４がＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３と最も強い結合力を表した結果（図３ｂ）を説明することができる。構造に基づいた配列アラインメントは前記のアミノ酸残基が種間でよく保存されていることを示す（図７ｂ）。酸性イノシトールリン酸グループは、タンパク質の塩基性アミノ酸残基に結合するのに必須であるため、ＣＤ１４において塩基性の残基であるＲ９３、Ｒ１４８、Ｒ１５０、Ｒ２３０がタンパク質−脂質結合を仲裁することが可能であることが分かる。
【００９６】
３−４．ＣＤ１４タンパク質と死滅細胞の相互作用の確認
死滅細胞に漏出されたＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３をＣＤ１４タンパク質が直接認識するかを確認するために、下記実験を行った。
【００９７】
まず、４μＭのカンプトテシンを６時間処理してＨｅＬａ細胞及びＣＨＯ細胞に死滅を誘導した後、１０％中性に緩衝されたホルマリンで５分間固定した後、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、前記細胞を無血清タンパク質ブロック溶液（ＤＡＫＯ）で処理し、２μｇの精製された組換え野生型（ＷＴ）ＣＤ１４または４重変異された（quadruple mutant）ＣＤ１４受容体タンパク質（ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を遮断）と３０分間培養した。その後、組換えタンパク質−結合された前記のそれぞれの細胞をウサギ抗−ＣＤ１４抗体（HPA00212; 1:200、Sigma-Aldrich USA）またはモノクローナルマウス抗−Ａｋｔ１抗体のＰＨ（Pleckstrin Homology）ドメイン（05-591、1: 100、Millipore）で３０分間処理し、ＦＩＴＣ−標識された２次抗体で３０分間処理した。その後、ＤＡＰＩで対比染色して核を可視化し、ヨウ化プロピジウム（propidium iodide）で対比染色して死滅細胞を見分けることができるようにした。
【００９８】
その後、前記それぞれの細胞を微分干渉コントラスト（DIC:differential interference contrast）顕微鏡に載せた後、適切な励起及び放出フィルターセットを用いてＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０レーザー−スキャン共焦点顕微鏡（Carl Zeiss）を使用して撮影した。画像は４０ｘ油浸対物レンズで撮影した。操作されていないオリジナル画像の蛍光強度を定量するためにＺＥＮ  ２０１０ソフトウェア（Carl Zeiss）を使用した。
【００９９】
その結果、図８で示されたように、野生型組換えＣＤ１４受容体はすぐに死滅細胞の表面に結合するのに対し、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の結合を遮断するように変異されたＣＤ１４受容体は死滅細胞をひきつけることができなかった。このような結果は、ＣＤ１４が死滅細胞に外在化されたＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３と直接結合することにより、死滅細胞を認識し、食作用の信号として作用することを示唆する。
【０１００】
３−５．ＣＤ１４−／−マウス大食細胞のＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３に対する結合能力消失
（１）肝臓クッパー細胞（Ｋｕｐｆｆｅｒ  ｃｅｌｌ）の食作用の評価
Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＵＳＡから購入したＣＤ１４が欠損した（ＣＤ１４−／−）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＩＣ−ＩｎｓＰ６を動脈注射し、そこから肝臓を分離した後、ＩＣ−ＩｎｓＰ６に対する食作用を免疫組織化学法（Immunohistochemistry）及びプルシアンブルー染色により下記のようなことを確認した。
【０１０１】
まず、ＣＤ１４が欠損したＣ５７ＢＬ／６マウス（各グループ当りｎ＝５）からそれぞれ肝臓の組織を分離し、１０％中性に緩衝されたホルマリンで固定した後、パラフィンに入れておいた。その後、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ（ｐＨ９．０）で２分間電子レンジで沸かしながら抗原を回収した。細胞質の大食細胞からのＩＣ−ＩｎｓＰ６を検出するために、肝臓組織をラットモノクローナル−Ｆ４／８０（Bm8、1:100; eBioscience、San Diego、CA、USA）と共に常温で９０分間培養した。その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼが結合された２次抗体を３０分間共に培養し、３，３’−ジアミノ−ベンジジンテトラヒドロクロライド基質（3,3’-diamino-benzidine tetrahydrochloride; Dako、Glostrup、 Denmark）を用いてＩＣ−ＩｎｓＰ６を感知した。その後、プルシアンブルー染色を行った。Ｆ４／８０抗体でクッパー細胞を確認し、プルシアンブルー染色により食作用を確認した。
【０１０２】
その結果、ＣＤ１４が欠損したマウスの肝臓クッパー細胞はＩＣ−ＩｎｓＰ６をほとんど捕食していなかったのに対し、野生型の場合は効果的にＩＣ−ＩｎｓＰ６を捕食した（図９ａ）。このような結果は、大食細胞のＣＤ１４がＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を模倣するＩＣ−ＩｎｓＰ６の捕食を直接的に調節することを示唆する。
【０１０３】
（２）イン・ビトロ食作用アッセイ
ＣＤ１４媒介食作用においてＰｄｔＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の外在化が必要であることを確認するために、野生型またはＣＤ１４欠損マウスから分離されたものとして、ＬＰＳにより刺激された大食細胞により、ＰＨｒｏｄｏで標識された死滅Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に対するイン・ビトロ食作用アッセイを行った。この時、抗−ＰｄｔＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３抗体処理の有無を異にした。
【０１０４】
まず、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を５ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度に一晩培養し、２０μｇ／ｍＬのデキサメタゾンを６時間処理した。増殖したり、死滅したＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞をＰＢＳで洗浄した後、ｐＨｒｏｄｏ  Ｒｅｄ  ＡＭ（P353721、Life Technologies、USA）と共に常温で３０分間培養した。次に、ＰＨｒｏｄｏで標識された前記Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞をｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（A14291DJ、Life Technologies、USA）で洗浄した。
【０１０５】
一方、Ｔｈｉｏ−ｐＭａｃｓを６ウェルプレートで５ｘ１０５細胞／ｗｅｌｌの濃度に１６時間培養し、０．５μｇ／ｍｌ  ＬＰＳを６時間処理した。
その後、ＰＨｒｏｄｏ標識された前記Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に、ＬＰＳで刺激されたＴｈｉｏ−ｐＭａｃｓを２．５時間処理した。培養後、前記プレートをＰＢＳで洗浄してＰＨｒｏｄｏで標識したＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を除去し、１０％中性に緩衝されたホルマリンで５分間固定した後、核を可視化するためにＤＡＰＩで対比染色した。食作用の程度は、前記実施例で記載したように、共焦点顕微鏡を使用して観察した。
【０１０６】
その結果、図９ｂ及びこれを定量化して示された図９ｃのように、ＣＤ１４が欠損したマウスから分離され活性化された大食細胞（LPS-stimulated Thio-pMacs）は、野生型の大食細胞に比べてｐＨｒｏｄｏ−標識された死滅細胞（Jurkat T cell）をほとんど捕食することができないことが示された。また、抗−ＰｄｔＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３抗体処理によるＰｄｔＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の外在化を抑制すると、捕食作用が抑制されることが示された。
【０１０７】
即ち、このような結果は、図１０で示されたように、ＣＤ１４は、ＰｄｔＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３との特異的結合することにより細胞死滅を認識し、死滅細胞に対する食作用を誘導することができることを示唆する。
【０１０８】
実施例４．Ａｋｔタンパク質のＰＨドメインの細胞死滅検出の確認
Ａｋｔタンパク質のＰＨドメインは、細胞内ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３に結合するバイオセンサーである（図１１ａ、非特許文献７）。したがって、これを利用してＰＨドメインを含有するタンパク質が細胞死滅を検出することができるかどうかを確認する実験を行った。
【０１０９】
まず、４μＭのカンプトテシンを６時間処理してＨｅＬａ細胞及びＣＨＯ細胞に死滅を誘導した後、１０％中性に緩衝されたホルマリンで５分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、前記細胞を無血清タンパク質ブロック溶液（ＤＡＫＯ）で処理し、２μｇの組換えＡｋｔタンパク質（Millipore）と３０分間培養した。その後、組換えタンパク質−結合された前記それぞれの細胞をウサギ抗−ＣＤ１４抗体（HPA00212; 1:200、Sigma-Aldrich USA）またはモノクローナルマウス抗−Ａｋｔ１抗体のＰＨ（Pleckstrin Homology）ドメイン（05-591、1: 100、Millipore）に３０分間処理し、ＦＩＴＣ−標識された２次抗体で３０分間処理した。その後、ＤＡＰＩで対比染色して核を可視化し、ヨウ化プロピジウム（propidium iodide）で対比染色して死滅細胞を見分けることができるようにした。
【０１１０】
その後、前記細胞を顕微鏡に載せた後、適切な励起及び放出フィルターセットを用いてＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０レーザー−スキャン共焦点顕微鏡（Carl Zeiss）で撮影した。画像は４０ｘ油浸対物レンズで撮影した。操作されていないオリジナル画像の蛍光強度の定量のためにＺＥＮ  ２０１０ソフトウェア（Carl Zeiss）を使用した。
【０１１１】
その結果、組換えＡｋｔタンパク質はＰＨドメインを介して死滅細胞の表面に外在化したＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３と結合し、細胞死滅を認識することを確認した（図１１ｂ、図１１ｃ）。
【０１１２】
実施例５．組換えＰＨドメインの細胞死滅検出の確認
５−１．組換えＰＨドメインの製造
図１２ａで示されたように、ヒトＡｋｔ  ＰＨドメイン（１−１４４番目アミノ酸）をｐＥＴ２８ａにクローニングした。これを大腸菌で発現させた後、Ｎｉ−ＮＴＡカラム及びゲル浸透クロマトグラフィー（Gel permeation chromatography）を使用して分離し、組換えＰＨドメインを製造した。
【０１１３】
図１２ｂのように、前記製造したタンパク質のサイズは２１ｋＤａで確認され、ＰＨドメインであることを確認した。
同様な方法で、ヒトアネキシンＶ（Annexin V、１−３１９アミノ酸）をｐＥＴ２８ａにクローニングし、大腸菌で発現させた後、分離して組換えアネキシンＶを製造した。図１２ｃのように製造されたタンパク質のサイズが３７ｋＤａで確認され、アネキシンＶであることを確認した。
【０１１４】
５−２．組換えＰＨドメインの細胞死滅検出の確認
まず、ＣＨＯ細胞に４μＭのカンプトテシンを６時間処理して死滅を誘導した後、１０％中性に緩衝されたホルマリンで５分間固定した後、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、前記細胞を無血清タンパク質ブロック溶液（ＤＡＫＯ）で処理し、前記５−１で製造した組換えＰＨドメインと３０分間培養した。その後、前記細胞をモノクローナルマウス抗−Ａｋｔ１抗体のＰＨドメイン（05-591、1:100、Millipore）で３０分間処理し、ＦＩＴＣ−標識された２次抗体で３０分間処理した。その後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、１０％中性に緩衝されたホルマリンで５分間固定した後、染色を行った。ヨウ化プロピジウムで対比染色し、死滅細胞を見分けることができるようにした。
【０１１５】
前記５−１で製造した組換えアネキシンＶに対しても同様な方法で実験してＦＡＣＳ分析した。
その後、前記細胞を顕微鏡に載せた後、適切な励起及び放出フィルターセットを用いてＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０レーザー−スキャン共焦点顕微鏡（Carl Zeiss）で撮影した。画像は４０ｘ油浸対物レンズで撮影した。操作されていないオリジナル画像の蛍光強度の定量のためにＺＥＮ  ２０１０ソフトウェア（Carl Zeiss）を使用した。
【０１１６】
その結果、ＰＨドメイン及びアネキシンＶは死滅細胞の表面上で互いに異なる位置に結合することが示された。また、死滅された細胞の表面には、ＰＨドメインが結合する外在化したＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３及びアネキシンＶが結合するＰｄｔＳｅｒが同時に検出されることを確認した（図１３）。
【０１１７】
また、このような細胞死滅をフローサイトメトリーを用いて分析した結果、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３に結合する組換えＡｋｔ  ＰＨドメインまたは組換えＣＤ１４タンパク質が示される死滅細胞において、アネキシンＶが結合するＰｄｔＳｅｒが同時に検出されることを確認した（図１４）。
【０１１８】
実施例６．Ｃ２ドメインタンパク質とホスファチジルイノシトールリン酸結合の確認：タンパク質−脂質オーバーレイアッセイ及び免疫ブローティング
ＰＫＣβ１Ｃ２ドメイン−Ｍｙｃタンパク質と多様なホスファチジルイノシトールリン酸のイノシトールリン酸グループが直接的に結合するかどうかを確認するために、前記実施例２−３と同様の方法でタンパク質−脂質オーバーレイアッセイ及び免疫ブローティングを行った。ＰＩＰストリップまたはＰＩＰアレイは、Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。
【０１１９】
その結果、ＰＫＣβ１Ｃ２ドメインタンパク質は、１００ρｍｏｌの濃度であっても、多様なホスファチジルイノシトールリン酸に対して強い結合親和性を示する反面、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、スフィンゴシン一リン酸に対しては親和性を示さないことを確認した（図１５ａ左側）。
【０１２０】
また、Ｃ２ドメインタンパク質は、カルシウム依存的にホスファチジルイノシトールリン酸と結合することが示された（図１５ａ右側）。これを統計処理して図１５ｂに示した。特に、０．０１〜０．２５  ｍＭの濃度ではほぼ１００％の結合率を示した。
【０１２１】
実施例７．アネキシンＶのカルシウム依存的結合の確認
ホスファチジルセリンと特異的に結合することが知られているアネキシンＶに、前記実施例２−３と同様の方法でタンパク質−脂質オーバーレイアッセイ及び免疫ブローティングを行った。
【０１２２】
図１６の左側で示されたように、アネキシンＶを５ｍＭ  ＥＤＴＡと混合して実験した場合はホスファチジルイノシトールリン酸との結合が示されてなかった。
しかし、図１６の右側で示されたように、アネキシンＶを５μＭ  ＣａＣｌ２と混合して実験した場合は、アネキシンＶの濃度が１００ρｍｏｌであっても多様な種類のホスファチジルイノシトールリン酸に結合することが示された。具体的には、ＰＩ（３，５）Ｐ２、ＰＩ（４，５）Ｐ２、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３に最も強い結合を示し、ＰＩ（３，４）Ｐ２以外にも、ＰＩ（５）Ｐ、ＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）Ｐとも結合することが示された。しかし、ホスファチジルセリンとは結合してなかった。
【０１２３】
このように、アネキシンＶは、カルシウムと共に処理する場合は、ホスファチジルイノシトールリン酸と非常に強く結合するため、細胞死滅をより高い精度で検出することができる。
【０１２４】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更しなくて他の具体的な形で実施されることがあることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解しなければならない。本発明の範囲は前記詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明は、細胞死滅検出、抗がん剤または細胞死滅阻害物質のスクリーニング、食作用の抑制、細胞死滅保護、移植する時に発生する副作用の減少のための用途に使用することができる。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
0006404950.tif 000004
【図２ａ】
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【図２ｂ】
0006404950.tif 000006
【図２ｃ】
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【図２ｄ】
0006404950.tif 000008
【図３ａ】
0006404950.tif 000009
【図３ｂ】
0006404950.tif 000010
【図４ａ】
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【図４ｂ】
0006404950.tif 000012
【図４ｃ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
0006404950.tif 000034
【図１６】
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【配列表】
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