(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第１の成分、第２の成分および第３の成分を含む媒材系であって、該第１の成分は、リン酸緩衝生理食塩水であり、該第２の成分は、植物油、動物油、脂肪酸およびそれらの組合せからなる群から選択され、該第３の成分は、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、プロピレングリコール、ポリソルベート、酢酸エチル、トコフェリルポリエチレングリコールスクシネートおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される媒材系と、
（ｂ）ｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）と、
を含む安定的な医薬組成物。
【請求項２】
前記植物油は、カノーラ油、ココナッツ油、コーン油、綿実油、オリーブ油、パーム油、ピーナッツ油、菜種油、ベニバナ種子油、ごま油、ビーン油、ヘリオトロープ油、アーモンド油、カシューナッツ油、ヘーゼルナッツ油、クルミ油、ヒッコリーナッツ油、松の実油、ピスタチオ油、ヒマシ油およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記動物油は、魚油、魚肝油、ラード油、獣脂油、カプロイン（ｃａｐｒｏｉｎ）、鶏油、アヒル油およびそれらの組合せからなる群から選択される、
ことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記第２の成分は、変性ヒマシ油である、
ことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記変性ヒマシ油は、ポリエトキシル化されたヒマシ油であり、前記第３の成分は、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、ポリプロピレングリコールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、
ことを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記第３の成分は、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、
ことを特徴とする請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記第３の成分は、ポリエチレングリコールおよびジメチルスルホキシドの組み合わせまたはポリエチレングリコールおよびエタノールの組み合わせである、
ことを特徴とする請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記第３の成分は、ポリエチレングリコールおよびジメチルスルホキシドの組み合わせである、
ことを特徴とする請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ｎ−ブチリデンフタリド（ｂ）は、前記媒材系（ａ）の０．００１ｍｇ／ｍＬから１５００ｍｇ／ｍＬの量で存在する、
ことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記媒材系（ａ）のうち、前記第１の成分の前記第２の成分に対する体積比は、１：２から２０：１であり、前記第１の成分の前記第３の成分に対する体積比は、１：２から３０：１である、
ことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、媒材と媒材中で安定的であるｎ−ブチリデンフタリドとを含む医薬組成物に関する。特に、本発明は、鼻腔内投与によって投与され得、悪性脳腫瘍の治療に有効である、ｎ−ブチリデンフタリドを有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
星細胞腫、退形成性星細胞腫及び多形性膠芽腫（ＧＢＭ）は、成人の一般的な悪性脳腫瘍であり、それらの間で、多形性膠芽腫は、最も一般的であり、最も悪性かつ最も侵襲的なものである。
【０００３】
悪性脳腫瘍は、非常に高い死亡率を伴う高度な侵襲性疾患である。この疾患の有効な治療法は、医学的ニーズとしてまだ満たされていない。現在、３種類の治療法、すなわち、外科手術、放射線療法および化学療法がある。手術によって腫瘍の大部分を排除することができるが、それは他の正常な脳組織を傷つけ、それによって患者の運動能力及び言語能力に影響を与える。放射線治療は、部分的に腫瘍を除去するだけでなく、周囲の正常組織細胞に影響を与え得る。化学療法は、通常、血液脳関門（ＢＢＢ）の問題、顕著な毒性の副作用および薬剤耐性のために、有意な治療効果を提供することができない。鼻腔内投与は、新規かつ非侵襲的な投与経路であるため、感染の危険性を減らすことができる。鼻腔を介して薬物が投与されると、肝臓初回通過代謝の影響を受けることなく、急速に鼻粘膜を介して吸収されて、所望の効果をもたらすことができる。さらに、鼻粘膜を介して吸収された薬物は、容易に血液脳関門を通過することができ、直接、中枢神経系に到達するため、毒性効果を低減することができる。
【０００４】
ｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）は、アンジェリカ・シネンシスの抽出物に由来する悪性腫瘍の治療のための潜在的な新規薬剤である。ｎ−ブチリデンフタリドは、１３９℃から１４２℃（５ｍｍＨｇ）の沸点を有し、このため、通常の状態では油状である。ｎ−ブチリデンフタリドは、多形性膠芽腫および乳癌を含む様々な癌の治療に有効であることが知られている。また、最近の研究では、ｎ−ブチリデンフタリドが、運動ニューロンのオートファジーを阻害するのに有効であることが明らかとなった。例えば、特許文献１は、ｎ−ブチリデンフタリドおよびその代謝産物は、運動ニューロンのオートファジーを阻害するのに有効であり、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療するために使用され得ることを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１４／００４５７６５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
残念ながら、ＢＰは疎水性化合物であり、水に溶解しない。ｎ−ブチリデンフタリドのこのような疎水性の特徴は、経口投与、注射および／または鼻腔内投与のための製剤としての使用を限定し、その臨床応用およびラットといった軽量動物が試験に用いられる動物研究を制限する。
【０００７】
したがって、ｎ−ブチリデンフタリドが可溶性または安定的であるｎ−ブチリデンフタリドの剤形が、ｎ−ブチリデンフタリドの生物学的利用能を高めるために、また、ｎ−ブチリデンフタリドの輸送および／または送達ならびに前臨床研究を促進にするために当技術分野で求められている。本発明は、上記のニーズを考慮して開発された成果であり、ｎ−ブチリデンフタリドを安定化し、その有効性を高めるために、媒材系を適用するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明の目的は、（ａ）第１の成分、第２の成分および第３の成分を含む媒材系であって、該第１の成分は、リン酸緩衝生理食塩水であり、該第２の成分は、植物油、動物油、脂肪酸およびそれらの組合せからなる群から選択され、該第３の成分は、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、プロピレングリコール、ポリソルベート、ポリオキシエチル化された植物油、酢酸エチル、２−ヒドロキシエチル−１２−ヒドロキシオクタデカノエート、トコフェリルポリエチレングリコールスクシネートおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される媒材系と、（ｂ）ｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）と、を含む医薬組成物を提供することである。
【０００９】
詳細な技術及び本発明のために実施された好ましい実施態様は、この技術分野における当業者が特許請求の範囲に記載された発明の特徴をよく理解できるように、添付された図面とともに後述の段落において記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】本発明による医薬組成物の実施形態の倒立顕微鏡（ＩＭ）の画像（４００×；バー：５０μｍ）の図である。
【図１Ｂ】本発明による医薬組成物の実施形態の電界放出走査型電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）の画像（１００００×；バー：１μｍ）の図である。
【図１Ｃ】本発明による医薬組成物の実施形態の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の画像（８００００×；バー：２００ｎｍ）の図である。
【図２Ａ】４℃での長期保存前の本発明による医薬組成物および比較例医薬組成物の外観を示す写真の図である。
【図２Ｂ】４℃での長期保存後の本発明による医薬組成物および比較例医薬組成物の外観を示す写真の図である。
【図３】本発明による医薬組成物（異なる媒材系を有する）および比較例医薬組成物の活性を示す統計グラフの図であり、縦軸はＧＢＭ８４０１細胞（すなわち、ヒト悪性腫瘍細胞株）の生存率を示し、細胞がｎ−ブチリデンフタリドで処理されていないコントロール群と比較した割合として表され、横軸は活性成分、ｎ−ブチリデンフタリドの濃度を示す。
【図４】本発明による医薬組成物の活性に対する保存時間の影響を示す統計図であり、縦軸はＧＢＭ８４０１細胞の生存率であり（細胞がｎ−ブチリデンフタリドで処理されていないコントロール群と比較した割合として表され、コントロール群の生存率が１００％として定義される）、横軸はｎ−ブチリデンフタリドの濃度を示す。
【図５】フランツ拡散装置の概略図である。
【図６】異なる医学的処置で処理された後のラットの生存率を示す統計図である。
【図７Ａ】ラットを異なる医学的処置で処理した後にラットに頭蓋内移植された腫瘍の増殖を示す写真の図であり、医学的処置の３７日目にラットが死亡したときに写真を撮影した（（Ａ）：未処理（ラットが死亡した日に得られた）、（Ｂ）：純粋なＢＰ１６０ｍｇ／ｋｇ（３７日目）、（Ｃ）：純粋なＢＰ３２０ｍｇ／ｋｇ（３７日目）、（Ｄ）：医薬組成物５  ８０ｍｇ／ｋｇ（３７日目）および（Ｅ）：医薬組成物５  １６０ｍｇ／ｋｇ（３７日目）。
【図７Ｂ】ラットを異なる医学的処置で処理した後にラットに頭蓋内移植された腫瘍の重量を示す統計図であり、ラットが死亡したときまたは医学的処置の３７日目に写真を撮影した。
【図７Ｃ】ラットを異なる医学的処置で処理した後にラットに頭蓋内移植された腫瘍の容積を示す統計図であり、ラットが死亡したときまたは医学的処置の３７日目に写真を撮影した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のいくつかの実施態様が下記に詳細に開示される。しかしながら、本発明の精神から逸脱することなく、本発明は種々の実施態様において具体化され得、本明細書に記載される実施態様に限定されるべきではない。加えて、本明細書において他に言及のない限り、本明細書において（特に特許請求の範囲において）用いられる“一”、“該”又は同様の用語は、単数形式及び複数形式の両方を包含するように理解されるべきであり、本明細書において用いられる用語「ヒドロカルビル」は、一つ以上のπ結合を有する飽和直鎖または分枝鎖ヒドロカルビルおよび不飽和直鎖または分枝鎖ヒドロカルビルを包含するように理解されるべきである。
【００１２】
治療効果を有する活性成分は、通常、活性成分及び活性成分が可溶性または安定的である媒材を含む液体剤形で投与されることが知られている。具体的には、投与の種類（例えば、経口投与、体腔への導入または外用）に応じて、活性成分は、投与に適した溶液、懸濁液またはエマルジョンを提供するように、（それが可溶性である場合）媒材中に溶解され得、または（それが不溶性である場合）媒材中に懸濁され得る。さらに、少量の活性成分を含有する固体剤形を調製するために、最終生成物中の活性成分の濃度（または量）を正確に制御するように、活性成分は、通常、液体媒材中に溶解されるか、または懸濁され、液体媒材が調製のために使用される。
【００１３】
本発明者らは研究によって、ｎ−ブチリデンフタリドの最も高い溶解性に起因して、エタノールがｎ−ブチリデンフタリドの優れた溶媒であることを見出した。例えば、エタノール中のｎ−ブチリデンフタリドの溶解度は、２２２ｍｇ／ｍＬより大きいのに対して、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール３００またはプロピレングリコールでは、約７０〜１２０ｍｇ／ｍＬであった。しかしながら、以前の研究は、新生児および乳児は、未熟なアルコール脱水素酵素を有するために、成人のように効率的にエタノールを代謝することができないことを明らかにしている（Ｚｕｃｃｏｔｔｉ  ＧＶ，  Ｆａｂｉａｎｏ  Ｖ．  Ｓａｆｅｔｙ  ｉｓｓｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｔｈａｎｏｌ  ａｓ  ａｎ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｉｎ  ｄｒｕｇｓ  ｉｎｔｅｎｄｅｄ  ｆｏｒ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｕｓｅ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｓａｆ  ２０１１；  １０（４）：４９９−５０２などを参照、その全体が参考として援用される）。したがって、エタノールがｎ−ブチリデンフタリドの媒材から他の溶媒に置き換えられることができた場合、または媒材中のその含有量が可能な限り低くされ得た場合、ｎ−ブチリデンフタリドの範囲は大幅に拡大されることになる。
【００１４】
本発明者らは、さらに研究を行い、ｎ−ブチリデンフタリドが特定の媒材系において安定的であることを発見した。この媒材系において、ｎ−ブチリデンフタリドが安定的である一方で、その活性は長期保存後（室温で３日間、または４℃で３０日間）でも維持されている。また、所望の治療効果がｎ−ブチリデンフタリドの低用量で得られることができ、副作用が軽減または適宜回避され得るというように、該媒材系は、ｎ−ブチリデンフタリドの生物学的利用能を改善することができる。
【００１５】
したがって、本発明は、（ａ）媒材系と、（ｂ）媒材系（ａ）中で安定的であるｎ−ブチリデンフタリドと、を含む安定的な医薬組成物に関する。
【００１６】
ｎ−ブチリデンフタリドは、市販され（例えば、ＥＣＨＯ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ社（台湾）から購入することができる）、化学合成により製造され、または天然材料（例えば、アンジェリカ・シネンシス）から抽出され得る。抽出によって提供されるｎ−ブチリデンフタリドは、さらに、使用前に、フラッシュカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー又は結晶化法などの技術によって精製され得る。
【００１７】
本発明によれば、媒材系（ａ）は、第１の成分、第２の成分および第３の成分を含み、該第１の成分は、リン酸緩衝生理食塩水であり、該第２の成分は、植物油、動物油、脂肪酸およびそれらの組合せからなる群から選択され、該第３の成分は、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、プロピレングリコール、ポリソルベート、ポリオキシエチル化された植物油、酢酸エチル、２−ヒドロキシエチル−１２−ヒドロキシオクタデカノエート、トコフェリルポリエチレングリコールスクシネートおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１８】
媒材系（ａ）の第１の成分としてのリン酸緩衝生理食塩水は、等張性であり、細胞に対して非毒性である。任意の適切なリン酸緩衝生理食塩水が、本発明において使用され得る。リン酸緩衝生理食塩水の例としては、限定されることなく、水中でのＮａＣｌ（１３７ｍＭ）及びＫＣｌ（２．７ｍＭ）の組み合わせ、ならびに水中でのＮａ２ＨＰＯ４（１０ｍＭ）、ＫＨ２ＰＯ４（１．８ｍＭ）、ＮａＣｌ（１３７ｍＭ）およびＫＣｌ（２．７ｍＭ）の組み合わせが含まれる。
【００１９】
媒材系（ａ）の第２の成分に関しては、植物油の例としては、限定されることなく、カノーラ油、ココナッツ油、コーン油、綿実油、オリーブ油、パーム油、ピーナッツ油、菜種油、ベニバナ種子油、ごま油、ビーン油、ヘリオトロープ油、アーモンド油、カシューナッツ油、ヘーゼルナッツ油、クルミ油、ヒッコリーナッツ油、松の実油、ピスタチオ油およびヒマシ油から１または２以上選択され、動物油の例としては、限定されることなく、魚油、魚肝油、ラード油、獣脂油、カプロイン（ｃａｐｒｏｉｎ）、鶏油およびアヒル油から１または２以上選択され、脂肪酸は、飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸（例えば、シス−不飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸及びトランス不飽和脂肪酸）であってもよい。本発明のいくつかの実施形態において、第２の成分は、修飾されたヒマシ油である。修飾されたヒマシ油の例としては、限定されることなく、ポリエトキシル化されたヒマシ油および水素化されポリエトキシル化されたヒマシ油が含まれる。ポリエトキシル化されたヒマシ油はまた、例えば、商品名「Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ」（旧商品名：Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ、ＢＡＳＦ社）のもと市販されているような、グリセロールポリエチレングリコールリシノレートとして知られている。Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬは、ヒマシ油とエチレンオキシドとを反応させることによって得ることができる非イオン性可溶化剤及び乳化剤である。水素化され、エトキシル化されたヒマシ油の例としては、限定されることなく、ポリオキシル４０水素化ヒマシ油およびポリオキシル６０水素化ヒマシ油が含まれ、前者は、ＢＡＳＦ社からＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＲＨ  ４０（ＨＬＢ＝１４−１６）との商品名で商業的に入手可能であり、後者は、ＢＡＳＦ社からＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＲＨ６０（ＨＬＢ＝１５−１７）との商品名で商業的に入手可能である。
【００２０】
媒材系（ａ）の第３の成分に関しては、ポリソルベートは、「Ｔｗｅｅｎ」の商品名で販売されている。本発明に適したポリソルベートの例としては、限定されることなく、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０およびポリソルベート８５が含まれる。ポリオキシエチル化された植物油は、「Ｅｍｕｌｐｈｏｒ」の商品名で市販されている。２−ヒドロキシエチル１２−ヒドロキシオクタデカノエートは、ＢＡＳＦ社からＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＨＳ１５（または商品名Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５）といった商品名のもと商業的に入手可能である。本発明に適したトコフェリルポリエチレングリコールスクシネート（ＴＰＧＳ）の例としては、限定されることなく、Ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸スクシネート（ＨＬＢ＝１３．２）が含まれる。しかしながら、媒材系（ａ）の第３の成分は、上記の例に限定されるものではない。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態では、媒材系（ａ）は、リン酸緩衝生理食塩水（第１の成分）と、ポリエトキシル化されたヒマシ油（第２の成分）と、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、ポリプロピレングリコールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択された成分（第３の成分）と、からなる混合物である。これらのうち、ｎ−ブチリデンフタリドは、第３の成分がポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド及びエタノールから選択される媒材系においてはるかに安定的であるので、医薬組成物が二層に分離することなく長期間保存することができ、ｎ−ブチリデンフタリドの活性が維持され得る。特に、本発明の医薬組成物の有効性は、第３の成分がポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシドまたはポリエチレングリコールとエタノールとの組み合わせである場合に、特に、第３の成分がポリエチレングリコールおよびジメチルスルホキシドの組み合わせである場合に、より良好である。したがって、本発明の医薬組成物の媒材系において、第３の成分は、好ましくは、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され、より好ましくはポリエチレングリコールおよびジメチルスルホキシドまたはポリエチレングリコールの組み合わせ、特にポリエチレングリコールおよびジメチルスルホキシドの組み合わせである。
【００２２】
本発明によれば、成分（ｂ）、すなわち、ｎ−ブチリデンフタリドの濃度は、ｎ−ブチリデンフタリドが媒材系（ａ）中で安定的である限り、特に限定されるものではない。したがって、ｎ−ブチリデンフタリドが媒材系（ａ）中に溶解された場合には、ｎ−ブチリデンフタリドの量は、典型的には、媒材系（ａ）中での溶解度よりも多くなく、ｎ−ブチリデンフタリドが媒材系（ａ）中に懸濁された場合には、ｎ−ブチリデンフタリドの量は、典型的には、医薬組成物が層に分離しないように制御されている。これらの原理によれば、本発明のいくつかの実施形態では、ｎ−ブチリデンフタリドの量は、媒材中、０．００１ｍｇ／ｍＬから１５００ｍｇ／ｍＬである。
【００２３】
例えば、添付の実施例に示すように、媒材系（ａ）が、第１の成分としてリン酸緩衝生理食塩水（［Ｎａ２ＨＰＯ４］＝１０ｍＭ、［ＫＨ２ＰＯ４］＝１．８ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１３７ｍＭ及び［ＫＣｌ］＝２．７ｍＭ）、第２の成分としてポリエトキシル化されたヒマシ油、第３の成分としてポリエチレングリコールおよびジメチルスルホキシドまたはポリエチレングリコールとエタノールとの組み合わせ（実施例１、５および６を参照）を使用して提供される場合、成分（ｂ）（ｎ−ブチリデンフタリド）は１０００ｍｇ／ｍＬまでの量で媒材系中で安定的である。この結果は、提供される医薬組成物中でのｎ−ブチリデンフタリドの量が媒材系１ｍＬ当たり少なくとも１０００ｍｇであり得ることを示唆する。さらに、媒材系（ａ）は、第１の成分としてリン酸緩衝生理食塩水（［Ｎａ２ＨＰＯ４］＝１０ｍＭ、［ＫＨ２ＰＯ４］＝１．８ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１３７ｍＭ及び［ＫＣｌ］＝２．７ｍＭ）、第２の成分としてポリエトキシル化されたヒマシ油、第３の成分としてエタノールおよびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）の組み合わせを使用して提供される場合、成分（ｂ）（ｎ−ブチリデンフタリド）は２０８ｍｇ／ｍＬまでの量で媒材系中で安定的である。この結果は、提供される医薬組成物中でのｎ−ブチリデンフタリドの量が媒材系１ｍＬ当たり少なくとも２０８ｍｇであり得ることを示唆する。
【００２４】
本発明の医薬組成物の媒材系（ａ）の中で、成分の割合は、このテキストで提供される開示に基づいて、選択された成分の組み合わせに応じて、本技術分野の当業者によって選択され、調整され得る。例えば、第１の成分の第２の成分に対する体積比は、１：２〜２０：１、例えば１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、８：１、１０：１、１３：１、１５：１、１７：１および２０：１であってもよく、第１の成分の第３の成分に対する体積比は、１：２〜３０：１、例えば１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、８：１、１０：１、１３：１、１５：１、１７：１、２０：１、２５：１および３０：１であってもよい。また、第３の成分が複数の成分の混合物である場合には、成分の割合は、成分の特性などに応じて、ユーザによって選択されてもよい。例えば、第３の成分がエタノールおよびポリエチレングリコールの混合物である場合には、エタノールのポリエチレングリコールに対する体積比は、エタノールとポリエチレングリコールとは任意の割合で均一に混合され得るため、特に限定されない。エタノールのポリエチレングリコールに対する体積比は、例えば、１０：１から１：１００、好ましくは６：１から１：５０、より好ましくは１：１から１：１０であってもよい。
【００２５】
例えば、媒材系（ａ）が、第１の成分としてリン酸緩衝生理食塩水（［Ｎａ２ＨＰＯ４］＝１０ｍＭ、［ＫＨ２ＰＯ４］＝１．８ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１３７ｍＭ及び［ＫＣｌ］＝２．７ｍＭ）、第２の成分としてポリエトキシル化されたヒマシ油、第３の成分としてポリエチレングリコールを使用して提供される場合、リン酸緩衝生理食塩水のポリエトキシル化されたヒマシ油に対する体積は、３：０．５〜５（例えば、３：１）であってもよく、リン酸緩衝生理食塩水のポリエチレングリコールに対する体積は、３：０．５〜５（例えば、３：１）であってもよい。媒材系（ａ）が、第１の成分としてリン酸緩衝生理食塩水、第２の成分としてポリエトキシル化されたヒマシ油、第３の成分としてポリエチレングリコールおよびジメチルスルホキシドの組み合わせを使用して提供される場合、リン酸緩衝生理食塩水のポリエトキシル化されたヒマシ油に対する体積は、１〜１０：１（例えば、５：１）であってもよく、リン酸緩衝生理食塩水のポリエチレングリコールおよびジメチルスルホキシドの組み合わせに対する体積は、１〜５：１（例えば、３：１）であってもよく、ポリエチレングリコールのジメチルスルホキシドに対する体積は、１〜２：１〜２（例えば、１：１）であってもよい。
【００２６】
本発明の医薬組成物において、成分（ｂ）、ｎ−ブチリデンフタリドは、媒材系において可溶性又は安定的であり、組成物は、ｎ−ブチリデンフタリドの輸送またはその投与に適した溶液またはエマルジョンもしくは懸濁液としての形態であってもよい。例えば、医薬組成物は、経口投与、注射および／または鼻腔内投与によって必要とする対象に投与され得る。
【００２７】
さらに、ｎ−ブチリデンフタリドは媒材系において可溶性又は安定的であるため、本発明の医薬組成物は、約２５ｇのマウスのような軽量動物が用いられる動物モデルを用いた研究を容易にする。例えば、約２５ｇのマウスがｎ−ブチリデンフタリドの効果の研究のための動物モデルとして使用される場合、２〜３μＬといった少量のｎ−ブチリデンフタリドを計量するのは難しいが、それが研究において用いられる。本発明の医薬組成物を用いれば、ｎ−ブチリデンフタリドは媒材系において安定的であり、媒材系により希釈されるため、所望の少量のｎ−ブチリデンフタリドが比較的大きな量での医薬組成物として提供され得、計量は、はるかに簡単かつ正確となる。従って、本発明の医薬組成物は、最終生成物中のｎ−ブチリデンフタリドの濃度（または量）を正確に制御するように、ｎ−ブチリデンフタリドの固体剤型を調製するために用いられ得る。
【００２８】
本発明の医薬組成物は、単に媒材系（ａ）と成分（ｂ）、ｎ−ブチリデンフタリドとを混合することで調製され得る。ｎ−ブチリデンフタリドは媒材系に可溶性であり、ｎ−ブチリデンフタリドを溶解するように、直接、媒材系に加えられる。ｎ−ブチリデンフタリドが媒材系に可溶性ではない場合、ｎ−ブチリデンフタリドは、マイクロまたはナノ液滴として懸濁されたｎ−ブチリデンフタリドを有する安定なエマルジョンまたは懸濁液を提供するように、撹拌しながら培材系に添加される。
【００２９】
本発明の医薬組成物はさらに、他の添加剤または他の活性成分が媒材中のｎ−ブチリデンフタリドの効果またはｎ−ブチリデンフタリドの安定性および／または溶解性に悪影響を与えない限り、他の添加剤または他の活性成分を含んでいてもよい。例えば、本発明の医薬組成物の保存性を向上させるために、医薬組成物は、適切な量の保存剤（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ）、保存剤（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）、防腐剤、防カビ剤等を含んでいてもよく、本発明の医薬組成物は、さらに提供された医薬組成物の有効性を向上させるために、または医薬組成物の適用の柔軟性および適応性を増大させるために、酸化防止剤（例えば、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン）、化学療法薬、免疫調節剤等といった１または２以上の他の活性成分を含んでいてもよい。
【００３０】
本発明はさらに、下記の通り特定の実施例により詳細に記述される。しかしながら、下記の実施例は本発明を記述するために単に提供されたものにすぎず、本発明の範囲はそれにより限定されない。実施例では、ｎ−ブチリデンフタリドは、体積で計量され、対応する重量を得るために１ｇ／ｍＬの密度で変換される。
【実施例】
【００３１】
１．常温安定性試験
１．１試験方法
医薬組成物の安定性試験は、（１）３または７日間室温で保存した後の医薬組成物の外観を観察し、（医薬組成物が均質のままであれば）結果を「Ｖ」および（医薬組成物が二層に分離または沈殿していた場合）「Ｘ」に分類し、外観安定性を評価し、（２）以下の条件を用いてＬＣＭＳ機器を使用して相対保持時間（ＲＲＴ）を介して医薬組成物中の不純物を測定することでｎ−ブチリデンフタリドの純度を分析することにより行われた。
【００３２】
【表１−１】
0006312281.tif 000002
【００３３】
１．２医薬組成物の調製
（実施例１）
表１に示される比にしたがって、５０μＬのｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）（長弘生物科技股▲ふん▼有限公司、ロット番号Ｆ２１２ＴＲ１２００１）、１０μＬのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（シグマ社、ロット番号ＭＫＢＧ２１５２Ｖ、ＣＡＳ：２５３２２−６８−３）および１０μＬのポリエトキシル化ヒマシ油（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ、以下「Ｋ−ＥＬ」、シグマ社、ロット番号ＢＣＢＣ５４７８０、ＣＡＳ：６１７９１−１２−６）を混合して混合物を提供し、その後、３０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」、［Ｎａ２ＨＰＯ４］＝１０ｍＭ、［ＫＨ２ＰＯ４］＝１．８ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１３７ｍＭおよび［ＫＣｌ］＝２．７ｍＭ）を攪拌しながら混合物に滴下して、医薬組成物１のエマルジョンを得た。
【００３４】
（実施例２）
表１に示すように成分の量を調整したことを除いて、実施例１の調製手順を繰り返して医薬組成物２のエマルジョンを調製した。
【００３５】
（実施例３）
第３の成分としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いて、表１に示すように成分の量を調整したことを除いて、実施例１の調製手順を繰り返して医薬組成物３のエマルジョンを調製した。
【００３６】
（実施例４）
表１に示すように成分の量を調整したことを除いて、実施例１の調製手順を繰り返して医薬組成物４のエマルジョンを調製した。
【００３７】
（実施例５）
第３の成分としてＰＥＧおよびＤＭＳＯを用いて、表１に示すように成分の量を調整したことを除いて、実施例１の調製手順を繰り返して医薬組成物５のエマルジョンを調製した。
【００３８】
（実施例６）
第３の成分としてＰＥＧおよびエタノールを用いて、表１に示すように成分の量を調整したことを除いて、実施例１の調製手順を繰り返して医薬組成物６のエマルジョンを調製した。
【００３９】
（比較例１）
第２の成分（Ｋ−ＥＬ）を添加せず、表１に示すように第３の成分としてＰＥＧおよびＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＨＳ１５（以下、「ＨＳ１５」、ＢＡＳＦ社より；ロット番号１４２２５５１６Ｋ０、ＣＡＳ番号：６１９０９−８１−７）の組み合わせを用いたことを除いて、実施例１の調製手順を繰り返して比較例医薬組成物１のエマルジョンを調製した。
【００４０】
【表１−２】
0006312281.tif 000003
【００４１】
１．３室温での安定性試験の結果
医薬組成物１−６および比較例医薬組成物１について、外観を観察し、１．１に記載の試験方法によって不純物の量を測定することにより試験し、安定性を評価した。結果を表２、表３−１〜３−７および表４にまとめ、表２は、エマルジョンの外観を示し、表３−１〜３−７は各々、医薬組成物１〜６および比較医薬組成物１中の不純物の量（体積％）を示し、表４は、表３−１〜３−７のデータに由来する異なる期間後の医薬組成物中で維持された活性成分（ＢＰ）の体積比率を示す。
【００４２】
【表２】
0006312281.tif 000004
【００４３】
【表３−１】
0006312281.tif 000005
【００４４】
【表３−２】
0006312281.tif 000006
【００４５】
【表３−３】
0006312281.tif 000007
【００４６】
【表３−４】
0006312281.tif 000008
【００４７】
【表３−５】
0006312281.tif 000009
【００４８】
【表３−６】
0006312281.tif 000010
【００４９】
【表３−７】
0006312281.tif 000011
【００５０】
【表４】
0006312281.tif 000012
【００５１】
表２に示すように、本発明の医薬組成物は二層に分離することなく、少なくとも３日間室温で保存することができ、いくつかの医薬組成物は二層に分離することなく７日間室温で保存することができた（実施例２〜４）。表４に示すように、本発明の医薬組成物中のｎ−ブチリデンフタリドの維持は、ｎ−ブチリデンフタリドの量の変動が室温での長期保存後でも非常に小さいため、優れている。
【００５２】
上記の結果は、本発明の医薬組成物の安定性が優れており、活性成分が媒材系中で安定的であることを証明する。医薬組成物１、５および６において、活性成分（ＢＰ）の量は、媒材系１ｍＬあたり約１０００ｍｇである。
【００５３】
２．医薬組成物の物性解析
２．１分析方法
２．１．１液滴サイズ、電気伝導度およびゼータ電位分析
医薬組成物を製造して、ｎ−ブチリデンフタリドの濃度が２００μｇ／ｍＬであるサンプルを提供した。試料の液滴サイズ、電気伝導度及びゼータ電位を、高濃度のナノ液滴サイズおよびゼータ電位計（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏ−ＺＳ  ＺＥＮ−３６００）を用いて分析した。
【００５４】
２．１．２粘度分析
粘度分析を、ＡＲ２０００ｅｘレオメーター（ストレスコントロール）（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、金型測定、４０ｍｍ及び４度（４  ｄｅｇｒｅｅ）のコーンおよびプレート、サンプル量１ｍＬ）を用いて、サンプルの粘度とずり速度および流動学的特性との関係を測定することで行った。粘度がずり速度で変化しない場合、サンプルは、ニュートン流体であり、粘度がずり速度で変化した場合、サンプルは、非ニュートン流体である。
【００５５】
２．１．３微細構造分析
医薬組成物を元の体積の５００倍に純水で希釈して、サンプルを提供した。サンプルの微細構造を、倒立顕微鏡（ＩＭ）、電界放射型走査電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて観察した。
【００５６】
２．２薬学的組成物の調製
（実施例７−１１）
表５に示すように成分の量を調整したことを除いて、実施例１の調製手順を繰り返して医薬組成物７−１１を調製した。医薬組成物７−１１におけるｎ−ブチリデンフタリドの濃度は、各々、媒材系１ｍＬ当たり１０５ｍｇ（医薬組成物７）、媒材系１ｍＬ当たり１５６ｍｇ（医薬組成物８）、媒材系１ｍＬ当たり２０８ｍｇ（医薬組成物９）、媒材系１ｍＬ当たり１６３ｍｇ（医薬組成物１０）および媒材系１ｍＬ当たり１１１ｍｇ（医薬組成物１１）である。
【００５７】
【表５】
0006312281.tif 000013
【００５８】
２．３分析結果
２．３．１液滴サイズ、電気伝導度およびゼータ電位の分析結果
医薬組成物１、５〜１１及び比較例医薬組成物１において、純粋なｎ−ブチリデンフタリドの乳化液滴の電気伝導度、ゼータ電位および平均サイズを、２．１．１に記載した分析法を用いて測定した。その結果を表６にまとめた。表６に示すように、本発明の医薬組成物に含まれるｎ−ブチリデンフタリドの液滴は、２９．８９ｎｍから１．２２μｍの範囲のサイズを有し、ゼータ電位は、−６．８０ｍＶから−１．５５ｍＶの範囲であり、電気伝導度は、１２．１ｍＳ／ｃｍから１４．９３ｍＳ／ｃｍの範囲であった。これにより、本発明の医薬組成物が水中油型（Ｏ／Ｗ）であることが示された。
【００５９】
【表６】
0006312281.tif 000014
【００６０】
２．３．２粘度の分析結果
医薬組成物１、５〜１１及び比較例医薬組成物１において、純粋なｎ−ブチリデンフタリドの乳化液滴の粘度を、２．１．２に記載した分析法を用いて測定し、平均粘度をそれに応じて計算した。その結果を表７にまとめた。表７に示すように、純粋なｎ−ブチリデンフタリド及び医薬組成物は、それらの粘度がずり速度とともに減少したため、ニュートン流体である。また、医薬組成物の粘度は、０．６２×１０−２Ｐａ．ｓから１０．８９×１０−２Ｐａ．ｓの範囲であった。
【００６１】
【表７】
0006312281.tif 000015
【００６２】
２．３．３微細構造の分析結果
医薬組成物５の微細構造を、２．１．３に記載の分析法を用いて測定した。結果を図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃに示した。図１Ａは、医薬組成物５の倒立顕微鏡（ＩＭ）画像（４００×、バー、５０μｍ）であり、図１Ｂは、医薬組成物５の電界放出走査電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）像（１００００×、バー、１μｍ）であり、図１Ｃは、医薬組成物５の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像（８００００×、バー、２００ｎｍ）である。図１Ａから図１Ｃに示されるように、本発明の医薬組成物中のｎ−ブチリデンフタリドの液滴は、ナノメートルからマイクロメートルの範囲であり、ほぼ球状の形態を有していた。
【００６３】
３．医薬組成物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
３．１分析対象
実験群：医薬組成物１、医薬組成物５及び医薬組成物６
コントロール群：比較例医薬組成物１
【００６４】
３．２分析方法
３．２．１低温安定性試験
医薬組成物を３０日間、４℃で保存して撮影し、医薬組成物の外観が層に分離したか否かを観察した。保存前後の医薬組成物の外観を比較した。
【００６５】
３．２．２細胞毒性試験（ＩＣ５０値）
ＧＢＭ８４０１細胞（すなわち、ヒト脳神経膠芽腫多細胞株）をウェル当たり６×１０３の細胞数で、９６ウェル培養プレート中で培養し、２４時間、純粋なｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）または医薬組成物のいずれかで処理した。活性成分、ｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）の処理濃度は、各々、０μｇ／ｍＬ（すなわち、コントロール群）、１２．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬおよび２００μｇ／ｍＬであった。その後、各医薬組成物のＧＢＭ８４０１細胞に対する半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を、ＭＴＴ（３−（４，５−シメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）細胞生存アッセイによって分析し、細胞毒性効の影響を評価した。
【００６６】
３．２．３細胞傷害性安定性試験
医薬組成物５を５つのバッチに分離し、バッチを各々、０、７、１４、３０および６０日間保存した。ＧＢＭ８４０１細胞を、ウェル当たり細胞数６×１０３で９６ウェル培養プレートにて培養し、２４時間、医薬組成物５の保存されたバッチのいずれかで処理した。その後、医薬組成物５の保存されたバッチのＧＢＭ８４０１細胞に対する半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を、ＭＴＴ細胞生存アッセイによって分析し、医薬組成物の細胞毒性の影響に対する保存期間の影響を評価した。活性成分、ｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）の処理濃度は、各々、０μｇ／ｍＬ（すなわち、コントロール群）、１２．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬおよび２００μｇ／ｍＬであった。
【００６７】
３．２．４  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ人工セルロース膜試験
図５に示したフランツ拡散装置（ＳＵＮＭＥＩ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、台湾）を用いて、純粋なｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）液体および医薬組成物の人工セルロース膜浸透能を評価し、鼻粘膜を介した浸透をシミュレートした。装置の拡散の表面積は、約４．５ｃｍ２であり、装置の受容チャンバーの最大容積は、約２３ｍＬである。
【００６８】
具体的な試験方法は、（ｉ）適当な大きさに人工セルロース膜を切断し、Ｈｅｐｅｓ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルフォニル酸）緩衝液（１１８ｍＭ  ＮａＣｌ＋１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４＋４．８ｍＭ  ＫＣｌ＋５．５ｍＭ  Ｄ−グルコース＋２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２＋２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ）に切断した膜を置いて１０分間浸し、（ｉｉ）ドナーチャンバーに純粋なｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）の液体または２ｍＬの医薬組成物（３ｍｇ／ｍＬ）を加え、（ｉｉｉ）受容チャンバーにＨｅｐｅｓ緩衝液を添加し、磁気攪拌法（速度：３００回転）で混合物を攪拌し、（ｉｖ）３７℃で試験を行い、１時間ごとに（合計１０時間）受容チャンバーのサンプリングプローブから１ｍＬのサンプルをサンプリングし、同時に受容チャンバーに予熱した１ｍＬのＨｅｐｅｓ緩衝液を再供給し、（ｖ）３１０ｎｍの波長で分光光度計によってサンプリングされた溶液の吸収スペクトルを測定し、ｎ−ブチリデンフタリドの濃度を計算し、および（ｖ）各々、下記の式１および式２を用いて透過係数（Ｐｅｆｆ）および流動（Ｊ）を算出することを含む。
【００６９】
【数１】
0006312281.tif 000016
【００７０】
３．２．５インビトロ細胞株透過試験
ＲＰＭＩ２６５０細胞（すなわち、ヒト鼻中隔扁平上皮細胞株）を、０．４μｍの孔径を有するコラーゲンコーティングされた細胞インサートに播種し、２日間培養して、インサートにおいて細胞の単層を形成させた。細胞インサートを、その後、内部にＨｅｐｅｓ緩衝液１．５ｍＬを有する１２ウェルプレートに移した。純粋なｎ−ブチリデンフタリドまたは医薬組成物を含む０．５ｍＬのＨｅｐｅｓ緩衝液を、１２ウェルプレートに添加した。次に、１２ウェルプレートをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中に入れ、インキュベートした。１２ウェルプレートの各ウェル内の緩衝液を１時間毎に採取し（合計で６時間）、採取された緩衝液の吸収スペクトルを３１０ｎｍの波長で分光光度計により検出し、ｎ−ブチリデンフタリドまたは医薬組成物の濃度を計算した。透過係数（Ｐｅｆｆ）および流動（Ｊ）を、上記の式１及び式２を用いて計算した。
【００７１】
３．３  試験結果
３．３．１低温安定性試験の結果
低温での医薬組成物１、比較例医薬組成物１、医薬組成物５及び医薬組成物６の安定性を、３．２．１に記載の方法で調べた。結果を図２Ａおよび図２Ｂに示す。図２Ａは保存前に撮影され、図２Ｂは保存後に撮影された。図２Ａおよび図２Ｂに示すように、４℃での保存前後の本発明の医薬組成物（医薬組成物１、５及び６）の外観は、同じままであり、医薬組成物は、均質なままであり、層に分離しなかった一方で、比較例医薬組成物１は４℃での保存後に層に分離した。これにより、本発明の医薬組成物は、低温で優れた安定性を有することが示される。
【００７２】
３．３．２細胞毒性試験の結果
純粋なｎ−ブチリデンフタリド、医薬組成物１、比較例医薬組成物１、医薬組成物５及び医薬組成物６の細胞毒性試験を、３．２．２に記載の方法により行った。結果を図３および表８に示した。図３に示されるように、「コントロール群」に比して、ＧＢＭ８４０１細胞の生存率は、活性成分ｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）の用量の増加に伴い減少した。また、医薬組成物の中で、医薬組成物５は、最大の細胞毒性効果を有し、医薬組成物５の細胞生存に対するＩＣ５０は２８．２０μｇ／ｍＬであった。
【００７３】
【表８】
0006312281.tif 000017
【００７４】
３．３．３細胞傷害性試験の結果
医薬組成物５の細胞傷害性試験を３．２．３に記載の方法により行った。結果を図４に示す。図４に示すように、「コントロール群」に比して、保存期間がどれくらいかに関係なく、各群の処理されたＧＢＭ８４０１細胞の生存率は、生存率が活性成分、ｎ−ブチリデンフタリドの用量の増加に伴って減少したという規則にしたがって維持された。以上の結果により、脳多形性神経膠芽腫細胞に対する医薬組成物５の細胞毒性効果は、保存期間の影響を受けず、したがって、安定的な製剤であることが示される。
【００７５】
３．３．４  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ人工セルロース膜試験の結果
純粋なｎ−ブチリデンフタリド、医薬組成物１、比較例医薬組成物１、医薬組成物５及び医薬組成物６のｉｎ  ｖｉｔｒｏ人工セルロース膜試験を、３．２．４に記載の方法で行った。結果を下記の表９に示した。表９に示すように、医薬組成物５及び医薬組成物６は、最も高い透過係数（Ｐｅｆｆ）を有する一方で、純粋なｎ−ブチリデンフタリドは、最も低い透過係数を有する。上記の結果により、本発明の医薬組成物の浸透性は、純粋なｎ−ブチリデンフタリドのそれよりも有意に良好であり、かつ医薬組成物５及び医薬組成物６は、最良の浸透能力を有することが示される。
【００７６】
【表９】
0006312281.tif 000018
【００７７】
３．３．５  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞株透過試験の結果
純粋なｎ−ブチリデンフタリド、医薬組成物１、比較例医薬組成物１、医薬組成物５及び医薬組成物６のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞株透過試験を、３．２．５に記載の方法で行った。結果を下記の表１０に示した。表１０に示すように、薬学的組成物５の透過係数（Ｐｅｆｆ）が最も高い一方で、純粋なｎ−ブチリデンフタリド液の透過係数が最も低い。上記の結果により、本発明の医薬組成物の細胞透過能は、純粋なｎ−ブチリデンフタリドのそれよりも有意に良好であり、かつ医薬組成物５及び医薬組成物６の細胞透過能は、最良であることが示される。
【００７８】
【表１０】
0006312281.tif 000019
【００７９】
４  医薬組成物の動物実験
４．１分析方法
９Ｌ（すなわち、ラット脳神経膠肉腫細胞株）の腫瘍組織を、ラットに頭蓋内移植した。薬物治療の試験を、頭蓋内腫瘍形成の後に行った。試験方法は、（ｉ）４００ｍｇ／ｋｇの抱水クロラール（株式会社シグマアルドリッチ社）を用いてラットを麻酔し、昏睡状態の後のラットの頭の毛を剃り、定位固定装置（Ｌａｂ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（登録商標）、定位固定装置）にラットを固定し、（ｉｉ）頭皮を鋏によって切って頭蓋を露出し、中心としてブレグマを設定し、ドリルによって頭蓋上のブレグマの右に３ｍｍ、下に５ｍｍの位置決めされたドリル部位で５ｍｍの穴を開け、（ｉｉｉ）調製された９Ｌ腫瘍組織（１×１×１ｍｍ３）を鉗子によりクランプし、脳内の３ｍｍの深さにそれを移植し、その後、１分間放置して血液を凝固させ、鉗子を除去し、穴を骨ろうでコーティングし、最後に、ラットの頭皮を縫合し、抗生物質をラットに投与し、（ｉｖ）腫瘍組織の移植７日後、表１１のように、ラットをランダムにグループ化し、その後、ピペットで薬剤（ｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）または医薬組成物５）を吸引し、ラットの鼻腔に薬物を滴下して鼻腔内投与を行い、３０日間投与を繰り返し、ラットの体重およびこの治療中に死亡したラットの数を記録し、（ｖ）腫瘍を除去し、その後、電子ノギスによって腫瘍長を計測し、以下の式３を用いて腫瘍の総体積を計算し、同時に腫瘍の重量を測定し、得られた値を棒グラフおよび曲線図に描出し、治療効果を決定することを含む。
【００８０】
【表１１】
0006312281.tif 000020
【数２】
0006312281.tif 000021
【００８１】
４．２動物実験の結果
動物実験を４．１に記載の方法により行った。結果を図６および図７Ａから図７Ｃに示す。図６および図７Ａから図７Ｃに示すように、「コントロール群」に比して、１６０ｍｇ／ｋｇまたは３２０ｍｇ／ｋｇの濃度の純粋なｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）は、腫瘍の増殖を阻害するのに有効である。上記の結果により、純粋なｎ−ブチリデンフタリドの鼻腔内投与が実際に悪性腫瘍の治療効果を提供できることが示される。
【００８２】
図６および図７Ａから図７Ｃに示すように、純粋なｎ−ブチリデンフタリド（１６０ｍｇ／ｋｇ）及び医薬組成物５（８０ｍｇ／ｋｇ）の鼻腔内投与３０日後、これらの群のラットでは大幅に生存率が増加し、腫瘍の容積および重量が大幅に減少した。このことから、本発明の医薬組成物は、純粋なｎ−ブチリデンフタリドの場合における有効量の単に半分であるｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）のより低い有効量を有する純粋なｎ−ブチリデンフタリドと同様の治療効果を達成し得ることが示される。
【００８３】
図７Ｂおよび図７Ｃに示すように、医薬組成物５（１６０ｍｇ／ｋｇ）の投与３０日後、腫瘍の重量は約９２％減少し（図７Ｂ）、腫瘍の容積は約９４％減少した（図７Ｃ）。この結果により、本発明の医薬組成物５（１６０ｍｇ／ｋｇ）は、悪性腫瘍を治療するのに非常に効果的であることが示される。
【００８４】
上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび動物実験の全てによって、本発明の医薬組成物にｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）を製造したことにより、鼻腔内投与後の活性成分の鼻粘膜透過効果が増大され得、治療効果、特に悪性腫瘍の治療効果が相乗的であることが示される。
【００８５】
上述の実施例は、本発明の原理及び有効性を示すために単に例示されたにすぎず、本発明を限定することを意図していない。本技術分野における当業者であれば、本発明の技術的範囲において種々の変更及び修正を行い得ることが明白である。それゆえ、これらの変更及び修正は添付された特許請求の範囲及び同等物の範囲内に含まれることが明らかである。
【００８６】
（付記１）
（ａ）第１の成分、第２の成分および第３の成分を含む媒材系であって、該第１の成分は、リン酸緩衝生理食塩水であり、該第２の成分は、植物油、動物油、脂肪酸およびそれらの組合せからなる群から選択され、該第３の成分は、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、プロピレングリコール、ポリソルベート、ポリオキシエチル化された植物油、酢酸エチル、２−ヒドロキシエチル−１２−ヒドロキシオクタデカノエート、トコフェリルポリエチレングリコールスクシネートおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される媒材系と、
（ｂ）ｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）と、
を含む安定的な医薬組成物。
【００８７】
（付記２）
前記植物油は、カノーラ油、ココナッツ油、コーン油、綿実油、オリーブ油、パーム油、ピーナッツ油、菜種油、ベニバナ種子油、ごま油、ビーン油、ヘリオトロープ油、アーモンド油、カシューナッツ油、ヘーゼルナッツ油、クルミ油、ヒッコリーナッツ油、松の実油、ピスタチオ油、ヒマシ油およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記動物油は、魚油、魚肝油、ラード油、獣脂油、カプロイン（ｃａｐｒｏｉｎ）、鶏油、アヒル油およびそれらの組合せからなる群から選択される、
ことを特徴とする付記１に記載の医薬組成物。
【００８８】
（付記３）
前記第２の成分は、変性ヒマシ油である、
ことを特徴とする付記１に記載の医薬組成物。
【００８９】
（付記４）
前記変性ヒマシ油は、ポリエトキシル化されたヒマシ油であり、前記第３の成分は、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、ポリプロピレングリコールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、
ことを特徴とする付記３に記載の医薬組成物。
【００９０】
（付記５）
前記第３の成分は、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、
ことを特徴とする付記４に記載の医薬組成物。
【００９１】
（付記６）
前記第３の成分は、ポリエチレングリコールおよびジメチルスルホキシドの組み合わせまたはポリエチレングリコールおよびエタノールの組み合わせである、
ことを特徴とする付記５に記載の医薬組成物。
【００９２】
（付記７）
前記第３の成分は、ポリエチレングリコールおよびジメチルスルホキシドの組み合わせである、
ことを特徴とする付記６に記載の医薬組成物。
【００９３】
（付記８）
ｎ−ブチリデンフタリド（ｂ）は、前記媒材系（ａ）の０．００１ｍｇ／ｍＬから１５００ｍｇ／ｍＬの量で存在する、
ことを特徴とする付記１乃至７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【００９４】
（付記９）
前記媒材系（ａ）のうち、前記第１の成分の前記第２の成分に対する体積比は、１：２から２０：１であり、前記第１の成分の前記第３の成分に対する体積比は、１：２から３０：１である、
ことを特徴とする付記１乃至７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【図１Ａ】
0006312281.tif 000022
【図１Ｂ】
0006312281.tif 000023
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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