(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−抗体軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット；及び
（ｉｉ）「プロモーター−ＵＴＲ−イントロン−抗体重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−増幅遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含む、
抗体発現用バイシストロニック発現ベクターであって、
ここで、前記プロモーターがＳＶ４０（ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０）初期プロモーター、または、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーターであり、
前記増幅遺伝子は、ＧＳ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）またはＤＨＦＲ（ｄｅｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）であり、
前記第１の発現カセットおよび前記第２の発現カセットはヒトガストリン遺伝子ターミネーター配列（ｈＧＴ）を含まず、
前記第１の発現カセットはＩＲＥＳを含まない、
発現ベクター。
【請求項２】
前記ＵＴＲは、ＣＭＶ由来である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記イントロンは、ＣＭＶ由来である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記プロモーターがＳＶ４０初期プロモーターであり、前記ＵＴＲ及び前記イントロンはＳＶ４０由来である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項５】
前記プロモーターがＣＭＶプロモーターであり、前記ＵＴＲ及び前記イントロンは、ＣＭＶ由来である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記プロモーターは、配列番号１の塩基配列で構成されたＣＭＶプロモーターである、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項７】
前記ＵＴＲは、配列番号２の塩基配列で構成されたＣＭＶ由来ＵＴＲである、請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記イントロンは、配列番号３の塩基配列で構成された、請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記抗体は、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、デノスマブ（ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、ベリムマブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ゴリムマブ（ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）、ウステキヌマブ（ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）またはイピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記抗体軽鎖遺伝子は、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３１、及び配列番号３５からなる群から選択された塩基配列で構成される、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記抗体重鎖遺伝子は、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２及び配列番号３６からなる群から選択された塩基配列で構成される、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項の発現ベクターが形質転換された動物細胞。
【請求項１３】
前記動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である、請求項１２に記載の動物細胞。
【請求項１４】
請求項１２に記載の動物細胞を培養する段階を含む抗体の生産方法。
【請求項１５】
前記動物細胞を培養した培養物から抗体を精製する段階をさらに含む、請求項１４に記載の抗体の生産方法。
【請求項１６】
前記抗体は、ベバシズマブ、トシリズマブ、デノスマブ、ベリムマブ、ゴリムマブ、ウステキヌマブまたはイピリムマブである、請求項１４又は１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−抗体軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット；  及び（ｉｉ）「プロモーター−ＵＴＲ−イントロン−抗体重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−増幅遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含む、抗体発現用バイシストロニック発現ベクター、前記発現ベクターが形質転換された動物細胞及び前記動物細胞を培養する段階を含む抗体の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術を利用して多様なヒト由来のタンパク質が発現されているが、真核細胞特有の糖化、リン酸化などの一連の過程により、哺乳動物細胞を利用する場合にのみ、正常に生物学的活性を有するタンパク質が合成される場合が多い。治療用抗体として多用される免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）遺伝子は、重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）遺伝子と軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）遺伝子で構成される。それぞれの遺伝子から作られる重鎖と軽鎖タンパク質は、細胞内で折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）の過程で互いに結合して細胞外に分泌される。遺伝子組換え抗体タンパク質を生産するために、主に哺乳動物細胞の一つであるＣＨＯ細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞）を多く利用する（非特許文献１）。
【０００３】
哺乳動物細胞において、より強力で安定した遺伝子発現を誘導する組換え発現ベクターを製造するために使用される種々の戦略のうち、代表的な方法は、強力なプロモーターを選別し、遺伝子発現率を増大させる方法である。プロモーターは、多様な転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）の結合位置とＴＡＴＡ  ｂｏｘが存在し、ＲＮＡポリメラーゼが結合してｍＲＮＡ合成が開始されるＤＮＡ上の要素であり、プロモーターの性能に応じて遺伝子発現量が大きく左右される。高い抗体発現のためには、常に高い発現を有するプロモーターが適合するが、代表的な強力なプロモーターとしてＳＶ４０（ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０）プロモーター、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーターとＥＦ１−α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ１−α）プロモーターなどがある。
【０００４】
強力なプロモーターを用いたベクター自体のｍＲＮＡ合成能力を高める方法以外に、治療用タンパク質の生産性を高めるために広く用いられる方法として遺伝子増幅方法がある。その方法を簡単に要約すると、細胞に外部遺伝子を入れ形質転換させた後、化学薬品を処理し、外部の遺伝子が染色体に組み換えされた細胞のみ成長できるように選択培養して細胞を分離した後、さらに多くのタンパク質が発現できるように、増加した量の化学薬品を培地に添加して、染色体に組み換えされた外部遺伝子の増幅を誘導することである。遺伝子増幅に用いられる代表的な遺伝子としては、ＤＨＦＲ（ｄｅｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、以下「ＤＨＦＲ」と略す）とＧＳ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、以下「ＧＳ」と略す）がある。これら増幅遺伝子の増幅に用いた薬品としては、ＤＨＦＲに対してメトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、以下「ＭＴＸ」と略す）が、ＧＳに対してはメチオニンスルホキシイミン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ、以下「ＭＳＸ」という。）がある。このような遺伝子増幅過程を経て、１０００個以上の増幅された外部遺伝子を有する細胞株の作製が可能になる。
【０００５】
通常、抗体遺伝子を継続的に発現する細胞株を作製するためには、発現しようとする重鎖と軽鎖遺伝子を含むプラスミドベクターＤＮＡと増幅遺伝子を有するベクターＤＮＡを共に細胞に同時に形質転換させた後、二つのＤＮＡが同時に染色体に挿入された細胞株を分離するか（非特許文献２）、１つのベクターに、ＳＶ４０プロモーターにより増幅遺伝子が発現できるようにして、そのベクターが染色体に挿入された細胞株を分離する方法が使用される。
【０００６】
他の増幅遺伝子発現方法としてバイシストロニックベクターを作製する方法がある。真核生物は、原核生物とは異なり、原則として一つのプロモーターから１つのｍＲＮＡが作られ、その遺伝子のみ解読してタンパク質を合成する。ところが、一部のウイルスの場合、ｍＲＮＡの中間にリボソームが結合できる配列があり、一つのｍＲＮＡから複数のタンパク質を合成することができるようにする。抗体遺伝子と増幅遺伝子が互いに異なるプロモーターにより発現される場合、遺伝子増幅の時に増幅遺伝子の部分だけ増幅され、抗体遺伝子の増幅は行われないことがあり得るが、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）を用いると、同じプロモーターから発現されるため、このような問題を避けることができる。しかし、このようなバイシストロニックベクター戦略にも依然として目的とするタンパク質を過量で生産することができないという欠点があり、より強力な戦略が求められている。
【０００７】
一方、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、Ａｖａｓｔｉｎとも呼ばれる）は、米国のＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社が開発したＶＥＧＦに対するヒト化抗体であり、新生血管生成（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）抑制剤の役割をし、結腸直腸癌、肺癌、腎臓癌、脳腫瘍などの治療を主な適応症とする抗体治療剤として脚光を浴びている。トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ、Ａｃｔｅｍｒａとも呼ばれる）は、スイス系の製薬会社であるロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社が開発したＩＬ−６受容体に対するヒトモノクローナル抗体であり、アクテムラ（Ａｃｔｅｍｒａ）という製品名で米国、ヨーロッパ、日本で関節リウマチに対して承認された。デノスマブ（ｄｅｎｏｓｕｍａｂ、Ｐｒｏｌｉａ  （登録商標）とも呼ばれる）は、米国のアムジェン（Ａｍｇｅｎ）社が開発したＮＦ−ｋＢ活性化受容体リガンド （Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ-ｋＢ ｌｉｇａｎｄ、 ＲＡＮＫＬ）に対するヒトモノクローナル抗体であり、プロリア（Ｐｒｏｌｉａ）という製品名で米国、カナダ、ヨーロッパで骨粗しょう症の適応症に対して承認されており、エックスジェバ（Ｘｇｅｖａ）という製品名でヨーロッパで固形がんが骨に転移した患者の骨折などを予防する薬物として承認された。
【０００８】
一方、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ、Ｂｅｎｌｙｓｔａとも呼ばれる）は、多国籍製薬会社であるグラクソ・スミスクライン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、ＧＳＫ）社が開発した可溶性Ｂリンパ球刺激因子（Ｂ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ、ＢＬｙＳ）に対するヒトモノクローナル抗体であり、米国、カナダ及びヨーロッパでループス（全身性エリテマトーデス、ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ、ＳＬＥ）に対して承認された。ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ、Ｓｉｍｐｏｎｉとも呼ばれる）は、グローバル製薬会社であるジョンソン・エンド・ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）社の子会社であるヤンセンバイオテック（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、旧セントコア、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）で開発したＴＮＦαに対するヒトモノクローン抗体であり、シンポニー（Ｓｉｍｐｏｎｉ）という製品名で米国、カナダ及び韓国で関節リウマチ、乾癬性関節炎及び強直性脊椎炎の適応症に対して承認された。
【０００９】
また一方で、ウステキヌマブ（Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ、Ｓｔｅｌａｒａ  （登録商標）とも呼ばれる）は、多国籍製薬会社であるヤンセン製薬会社（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．）が開発したインターロイキン１２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２、ＩＬ−１２）とインターロイキン２３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−  ２３、ＩＬ−２３）に対するヒトモノクローナル抗体であり、米国食品医薬品局（ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ＦＤＡ）から乾癬性関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）に対して承認され、重症乾癬（ｓｅｖｅｒｅ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）及び中等症−重症尋常性乾（ｍｏｄｅｒａｔｅ−ｔｏ−ｓｅｖｅｒｅ  ｐｌａｑｕｅ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）及びサルコイドーシス（ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ）などに対する臨床が進行中である。イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ、Ｙｅｒｖｏｙ  （登録商標）とも呼ばれる）は、米国の製薬会社であるブリストル−マイヤーズスクウィプ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏ．、ＢＭＳ）社が開発した細胞毒性Ｔリンパ球抗原−４（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＴＬＡ  −４）に対するヒトモノクローナル抗体であり、エルボイ（Ｙｅｒｖｏｙ）という製品名で米国食品医薬品局（ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ＦＤＡ）から黒色腫及び皮膚癌に対して承認されており、非小細胞がん（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  、ＮＳＣＬＣ）、小細胞がん（ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ、ＳＣＬＣ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）及び転移ホルモン無反応性前立腺癌（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）に対して臨床進行中である。
【００１０】
このようなブロックバスター級の抗体治療剤の大量生産方法の開発が求められている。  
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋａｕｆｍａｎ等、 Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ. Ｂｉｏｌ. (１９８５)５、１７５０  ）
【非特許文献２】Ｋａｕｆｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ．（１９９０）１８５、４８７
【非特許文献３】Ｊａｎｇ等、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．（１９８９）６３、１６５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、多様な哺乳動物細胞から強力で安定して遺伝子発現を誘導する方法を見出すべく鋭意努力した結果、従来の発現ベクターにＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）及びイントロンを含むバイシストロニック発現ベクターを作製し、増幅遺伝子と共に多様な抗体治療剤の軽鎖及び重鎖の遺伝子を同時に高発現させることができることを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一つの目的は、「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−抗体軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット及び「プロモーター−ＵＴＲ−イントロン−抗体重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−増幅遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含む抗体発現用バイシストロニック発現ベクターを提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記発現ベクターが形質転換された動物細胞を提供することである。
【００１５】
本発明のもう一つの目的は、前記動物細胞を培養する段階を含む抗体の生産方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係るＵＴＲ及びイントロンを含む抗体発現用バイシストロニック発現ベクターを利用すると、目的とする抗体を高効率で発現させる発現ベクターを作製することができ、前記発現ベクターが形質転換された動物細胞を培養して抗体を安定的かつ高効率で生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明に係る遺伝子断片Ｇｌｎ−ＬＣ及びＧｌｎ−ＨＣの製作された構成を示した図である。
【図２】本発明のＧＳ−Ｇｌｎ−ＬＣの製作過程を示した図である。
【図３】本発明のＧＳ−Ｇｌｎ−ＬＣにＧｌｎ−ＨＣを挿入し、本発明に係るＧＳ遺伝子を含むｐＣＹＢＩＧベクターの製作過程を示した図である。
【図４】本発明のｐＣＹＢＩＧベクターから、本発明に係るＤＨＦＲ遺伝子を含むｐＣＹＢＩＤベクターの製作過程を示した図である。
【図５】本発明に係るＧＳ遺伝子を含むベバシズマブの軽鎖／重鎖発現ベクターｐＣＹＢ２０４ＩＧの製作過程を示した図である。
【図６】本発明に係るＤＨＦＲ遺伝子を含むベバシズマブの軽鎖／重鎖発現ベクターｐＣＹＢ２０４ＩＤの製作過程を示した図である。
【図７ａ】ＭＳＸの濃度である５００ｕＭでｐＣＹＢ２０４ＩＧを形質転換させた細胞株の抗体発現量を確認した結果である。
【図７ｂ】ＭＴＸの濃度である８００ｎＭでｐＣＹＢ２０４ＩＤを形質転換させた細胞株の抗体発現量を確認した結果である。
【図８】本発明で用いた発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００１の制限酵素マップの模式を示したものである。
【図９】本発明で用いた発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００２の制限酵素マップのを模式を示したものである。
【図１０】本発明で用いた発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００３の制限酵素マップのを模式を示したものである。
【図１１】本発明で用いた発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００４の制限酵素マップのを模式を示したものである。
【図１２】本発明で用いた発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００５の制限酵素マップのを模式を示したものである。
【図１３】本発明で用いた発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００６の制限酵素マップのを模式を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、（ｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−抗体軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット；  及び（ｉｉ）「プロモーター−ＵＴＲ−イントロン−抗体重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−増幅遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含む抗体発現用バイシストロニック発現ベクターを提供する。
【００１９】
本発明は、多様な哺乳動物細胞において強力で安定的に遺伝子発現を誘導するように、ＵＴＲ及びイントロンを含めて、抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子と増幅遺伝子が一つの遺伝子のように発現されるよう設計したバイシストロニック発現ベクターを提供することにその特徴がある。特に、本発明は、ＵＴＲ及びイントロンが含まれる新たな発現カセットを提供する。
【００２０】
具体的には、本発明は、（ｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）の軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット；  及び（ｉｉ）「プロモーター−ＵＴＲ−イントロン−ベバシズマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−増幅遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含む、抗体発現用バイシストロニック発現ベクターを提供する。本発明は、（ｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット；  及び（ｉｉ）「プロモーター−ＵＴＲ−イントロン−トシリズマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−増幅遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含む、抗体発現用バイシストロニック発現ベクターを提供する。本発明は、（ｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット；  及び（ｉｉ）「プロモーター−ＵＴＲ−イントロン−デノスマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−増幅遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含む、抗体発現用バイシストロニック発現ベクターを提供する。本発明は、（ｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット；  及び（ｉｉ）「プロモーター−ＵＴＲ−イントロン−ベリムマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−増幅遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含む、抗体発現用バイシストロニック発現ベクターを提供する。本発明は、（ｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット；  及び（ｉｉ）「プロモーター−ＵＴＲ−イントロン−ゴリムマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−増幅遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含む、抗体発現用バイシストロニック発現ベクターを提供する。本発明は、（ｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−ウステキヌマブ（Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット；  及び（ｉｉ）「プロモーター−ＵＴＲ−イントロン−ウステキヌマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−増幅遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含む、抗体発現用バイシストロニック発現ベクターを提供する。本発明は、（ｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）軽鎖遺伝���−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット；  及び（ｉｉ）「プロモーター−ＵＴＲ−イントロン−イピリムマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−増幅遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含む、抗体発現用バイシストロニック発現ベクターを提供する。
【００２１】
本発明における用語「バイシストロニック（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）」とは、真核細胞内でｍＲＮＡの内部でもリボソームがポリペプチドを合成することができるようになって、一つのｍＲＮＡから複数のタンパク質が合成可能になったシステムを意味し、本発明では、抗体遺伝子と増幅遺伝子が同時に発現されるようにベクターをデザインした。
【００２２】
一般的には、大腸菌のような原核細胞が一つのｍＲＮＡの複数の位置にリボソームが結合して一回に複数のタンパク質を合成することができるポリシストロニック（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）システムを有することとは異なり、真核細胞では、ｍＲＮＡからタンパク質を解読（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ）するときに、リボソームがｍＲＮＡの５  ’末端に付着された後、スキャン（ｓｃａｎｎｉｎｇ）方法により開始コドンであるＡＵＧを見つけ、このＡＵＧコドンからタンパク質の合成が開始するにつれて一つのｍＲＮＡから必ず一つのポリペプチドが形成されるモノシストロニック（ｍｏｎｏｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）システムを有することになり、ＡＴＧの認識及びタンパク質合成の開始にコザック配列（Ｋｏｚａｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が重要な役割を果たすと知られている。しかし、ＥＭＣウイルス（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ、以下「ＥＭＣＶ」と略する）の場合は、内部リボソーム導入点（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ、ＩＲＥＳ、以下「ＩＲＥＳ」と略する）と呼ばれる特殊な構造のＲＮＡ配列を有しており、真核細胞内で１つのｍＲＮＡから複数のタンパク質の合成が可能である（非特許文献３）。本発明では、抗体遺伝子と増幅遺伝子が同時に発現されるようにするために、抗体の重鎖遺伝子の後にＩＲＥＳがくるようにして、その後に増幅遺伝子がくるようにベクターをデザインした。
【００２３】
本発明における用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、適切な宿主細胞内で目的の遺伝子が発現するようにプロモーターなどの必要不可欠な調節要素を含む遺伝子操作物であり、本発明の目的上、好ましくは、抗体を発現するためのベクターを意味し、バイシストロニック発現ベクターであってもよい。例えば、本発明のベクターは、（ｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−ベバシズマブ軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット；  及び（ｉｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−ベバシズマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−増幅遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含むベバシズマブ発現用バイシステムトロニック発現ベクターであってもよい。
【００２４】
もう一つの例として、本発明のベクターは、（ｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット；  及び（ｉｉ）「プロモーター−ＵＴＲ−イントロン−トシリズマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−増幅遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含む、トシリズマブ発現用バイシストロニック発現ベクターであってもよい。もう一つの例として、本発明のベクターは、（ｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット；  及び（ｉｉ）「プロモーター−ＵＴＲ−イントロン−デノスマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−増幅遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含む、デノスマブ発現用バイシストロニック発現ベクターであってもよい。もう一つの例として、本発明のベクターは、（ｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット；  及び（ｉｉ）「プロモーター−ＵＴＲ−イントロン−ゴリムマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−増幅遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含む、ゴリムマブ発現用バイシストロニック発現ベクターであってもよい。もう一つの例として、本発明のベクターは、（ｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−ベリムマブ軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット；  及び（ｉｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−ベリムマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−増幅遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含むベリムマブ発現用バイシストロニック発現ベクターであってもよい。もう一つの例として、本発明のベクターは、（ｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−ウステキヌマブ軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット；  及び（ｉｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−ウステキヌマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−増幅遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含むウステキヌマブ発現用バイシストロニック発現ベクターであってもよい。もう一つの例として、本発明のベクターは、（ｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−イピリムマブ軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット；  及び（ｉｉ）「プロモーター−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）−イントロン−イピリムマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍ���  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−増幅遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含むイピリムマブ発現用バイシステムトロニック発現ベクターであってもよい。
【００２５】
本発明における用語「プロモーター」とは、転写調節因子が結合するＤＮＡ塩基配列部位を意味し、本発明の目的上、遺伝子発現率を高めるために、強力で安定した遺伝子発現を誘導するプロモーターを使用することができる。
【００２６】
前記プロモーターは、これに限定されないが、好ましくは、ＳＶ４０（ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０）初期プロモーター、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター及びＥＦ１−α（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ１−α）プロモーターからなる群から選択されたものであってもよく、前記ＥＦ１−αはｈＥＦ１−α（ｈｕｍａｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ１−α）であってもよい。より好ましくは、サイトメガロウイルスプロモーターであってもよく、最も好ましくはｓｔｒａｉｎのサイトメガロウイルス  ｓｔｒａｉｎＡＤ１６９のプロモーターであってもよい。本発明の一実施例では、高い抗体発現を誘導するために、これまで知られている最も強力な動物細胞用プロモーターの一つであるサイトメガロウイルス  ｓｔｒａｉｎＡＤ１６９  ｇｅｎｏｍｅ（ｇｅｎＢａｎｋ：Ｘ１７４０３．１）配列上のプロモーターを使用し、これを挿入して発現ベクターを作製した。
【００２７】
本発明における用語「ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ、非解読の部分）」とは、ｍＲＮＡの非解読の部分を指す言葉であり、一般に、コーディング領域の両末端を意味する。特に、５  ’末端部分を５’  ＵＴＲと、３  ’末端部分を３’ＵＴＲと指す。特に、本発明において、ＵＴＲは、本発明のバイシストロニックベクターに含まれ、遺伝子の発現量を増大させる効果を有する限り、制限されない。特に、ＣＭＶから由来したＵＴＲであってもよい。本発明は、このようなＵＴＲ及びイントロンを同時に含む発現カセットを含むバイシストロニック発現ベクターが導入された遺伝子の発現量が増加することを最初に究明し、新たな抗体発現ベクターを提供することに特徴がある。
【００２８】
本発明のＵＴＲは、これに限定されないが、好ましくは、配列番号２のサイトメガロウイルス  ｓｔｒａｉｎＡＤ１６９のＵＴＲであってもよい。本発明の一実施例では、より強力な遺伝子発現のために、サイトメガロウイルス  ｓｔｒａｉｎＡＤ１６９  ゲノム（ｇｅｎＢａｎｋ：Ｘ１７４０３．１）配列上のＵＴＲを用い、これをプロモーターと抗体軽鎖及び重鎖の遺伝子との間にそれぞれ挿入して発現ベクターを作製した。
【００２９】
本発明における用語「イントロン（ｉｎｔｒｏｎ）」とは、真核細胞で発見される特徴的な配列で遺伝情報を有してないため、タンパク質を作ることができないＤＮＡ領域を意味し、核からのＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡが合成される時に転写されるが、核外に抜けていく過程で、スプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）プロセスを通じて除去される部分である。このようなイントロンと非解読エクソン（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｅｘｏｎ）を含むプラスミドの遺伝子発現量がイントロンを含まない場合に比べて、より高いという研究結果が蓄積するにつれて組換え発現ベクターに異種イントロンを導入することにより、より安定して継続的な遺伝子発現が可能であるように改善されたベクターが開発されて使用されている。しかし、従来のイントロン挿入ベクターの場合には、モノシストロニックベクターに使用されて単に一つの遺伝子だけを発現させる欠点があった。そこで、本発明者らは、このような欠点を克服するためにバイシストロニックベクターシステムにおいて、外部イントロン遺伝子をプロモーターの後に挿入する場合、高効率の遺伝子発現ができることを考案した。特に、本発明のイントロンは、ＣＭＶに由来したイントロンであってもよい。
【００３０】
本発明のイントロンは、これに限定されないが、好ましくは、配列番号３のサイトメガロウイルス  ｓｔｒａｉｎＡＤ１６９のイントロンであってもよい。本発明の一実施例では、より強力なプロモーターの構成のために、サイトメガロウイルス  ｓｔｒａｉｎＡＤ１６９  ゲノム（ｇｅｎＢａｎｋ：Ｘ１７４０３．１）配列上のイントロンを用い、これをプロモーターと抗体軽鎖及び重鎖の遺伝子との間にそれぞれ挿入して発現ベクターを作製した。
【００３１】
本発明の発現ベクターは、プロモーター、ＵＴＲ、イントロンの由来が同一または異なってもよい。例えば、前記のプロモーターがＳＶ４０の初期プロモーターであり、前記ＵＴＲ及び前記イントロンはＳＶ４０由来であってもよく  、前記プロモーターはＣＭＶプロモーターであり、前記ＵＴＲ及び前記イントロンは、ＣＭＶ由来であってもよく、前記プロモーターがｈＥＦ１−αプロモーターであり、前記ＵＴＲ及び前記イントロンがｈＥＦ１−α由来であってもよい。
【００３２】
本発明における用語「増幅遺伝子」とは、本発明において安定して高発現しようとする抗体遺伝子と共に発現させるように誘導するため増幅される遺伝子を意味し、細胞内の染色体で前記増幅遺伝子及び抗体遺伝子が組み換えされた細胞だけ成長可能になるように、増幅遺伝子が挿入されていない細胞は、処理された化学薬品の存在下では成長しない原理を利用して、化学薬品の処理により遺伝子を増幅させることができる。本発明のバイシストロニック発現ベクターを用いると、前記増幅遺伝子と抗体遺伝子が一つの遺伝子のように共に発現されるように誘導され、最終的に目的とする抗体遺伝子を高発現させることができる。
【００３３】
前記増幅遺伝子は、これに限定されないが、好ましくは、ＧＳ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）またはＤＨＦＲ（ｄｅｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）であってもよい。本発明の一実施例では、増幅遺伝子としてＧＳを用いたｐＣＹＢ２０４ＩＧ発現ベクター及び増幅遺伝子のＤＨＦＲを用いたｐＣＹＢ２０４ＩＤ発現ベクターを作製し（図５及び６）、ｐＣＹＢＢＳＳ００１（図８）、ｐＣＹＢＢＳＳ００２（図９）、ｐＣＹＢＢＳＳ００３（図１０）、ｐＣＹＢＢＳＳ００４（図１１）、ｐＣＹＢＢＳＳ００５（図１２）、ｐＣＹＢＢＳＳ００６（図１３）発現ベクターを作製して、前記発現ベクターが抗体遺伝子を高発現させるのに有用であることを確認した。
【００３４】
本発明における用語「抗体」とは、免疫系内で抗原の刺激により作られる物質であり、特定の抗原と特異的に結合してリンパと血液を漂い抗原抗体反応を起こす物質を意味する。本発明の目的上、前記抗体は、継続的に高発現するための目的となるものであり、本発明の発現ベクターを用いて前記抗体遺伝子を強力かつ安定的に発現できるように誘導することができ、前記発現ベクターを形質転換させた動物細胞を用いて抗体を効率的に生産することができる。
【００３５】
前記抗体は、アミノ酸と糖鎖で結合されたタンパク質であり、軽鎖２本と重鎖２本がジスルフィド結合によりＹ字型のタンパク質に形成される。本発明の一実施例では、一つのベクターでＵＴＲ及びイントロンを含む抗体の軽鎖発現カセット及び重鎖発現カセットを含むベクターを作製することにより、軽鎖及び重鎖の両方を有する抗体を生産することができる発現ベクターを作製した。
【００３６】
本発明の抗体は、これに限定されないが、好ましくは、当該分野において、通常、使用される治療用抗体をすべて含むことができる。その例として、ＶＥＧＦ−Ａ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−Ａ）を標的とする抗体であるベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ＩＬ−６受容体を標的とする抗体であるトシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、ＮＦ−ｋＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）を標的とする抗体であるデノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、可溶性Ｂリンパ球刺激因子（Ｂ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ、ＢＬｙＳ）に対する抗体であるベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ＴＮＦαを標的とする抗体であるゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）  、インターロイキン１２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２、ＩＬ−１２）とインターロイキン２３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２３、ＩＬ−２３）に対する抗体であるウステキヌマブ（Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）及び細胞毒性Ｔリンパ球抗原−４（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ−４  ）を標的とする抗体であるイピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）からなる群から選択されたものであってもよい。
【００３７】
前記ベバシズマブは、アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）とも呼ばれ、結腸直腸癌、肺癌、腎臓癌、脳腫瘍に対する抗体治療薬として知られている、米国Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社が開発したヒト化抗体である。本発明の実施例によれば、代表的な治療用抗体であるベバシズマブを、本発明の抗体発現用バイシストロニック発現ベクターに導入する場合、効果的に前記抗体を生産することを確認した。
【００３８】
前記トシリズマブは、スイス系製薬会社であるロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社の日本子会社である中外（Ｃｈｕｇａｉ）が開発したヒトモノクローナル抗体であり、アクテムラ（Ａｃｔｅｍｒａ）という製品名で米国、ヨーロッパ、日本で関節リウマチの治療薬として承認された。本発明の実施例では、トシリズマブを本発明の抗体発現用バイシストロニック発現ベクターに導入する場合、効果的に前記抗体を生産することを確認することにより、本発明のバイシストロニック発現ベクターがトシリズマブ抗体を高発現させるシステムであることを確認した。
【００３９】
前記デノスマブは、米国アムジェン（Ａｍｇｅｎ）社が開発したヒトモノクローナル抗体であり、プロリア（Ｐｒｏｌｉａ）という製品名で米国、カナダ、ヨーロッパで骨粗しょう症の適応症に対して承認されており、エックスジェバ（Ｘｇｅｖａ）という製品名でヨーロッパで固形がんが骨に転移した患者の骨折などを予防する薬物として承認された。本発明の実施例によると、デノスマブを本発明の抗体発現用バイシストロニック発現ベクターに導入する場合、効果的に前記抗体を生産することを確認することにより、本発明のバイシストロニック発現ベクターがデノスマップ抗体を高発現させるシステムであることを確認した。
【００４０】
前記ベリムマブは、多国籍製薬会社であるグラクソ・スミスクライン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、ＧＳＫ）社が開発した可溶性Ｂリンパ球刺激因子（Ｂ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ、ＢＬｙＳ；またはＢ細胞の活性化因子、Ｂ  ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ、ＢＡＦＦ）に対するヒトモノクローナル抗体であり、米国、カナダ及びヨーロッパでループス（全身性エリテマトーデス、ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ、ＳＬＥ）に対して承認された。本発明の実施例では、ベリムマブを本発明の抗体発現用バイシストロニック発現ベクターに導入し、効果的に前記抗体を生産することを確認することにより、本発明のバイシストロニック発現ベクターがベリムマブ抗体を高発現させるシステムであることを確認した。
【００４１】
前記ゴリムマブは、グローバル製薬会社であるジョンソン・エンド・ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）社の子会社であるヤンセンバイオテック（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、旧セントコア、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）で開発したヒトモノクローナル抗体であり、シンポニー（Ｓｉｍｐｏｎｉ）という製品名で米国、カナダ、韓国で関節リウマチ、乾癬性関節炎及び強直性脊椎炎の治療薬として承認された。本発明の実施例では、ゴリムマブを本発明の抗体発現用バイシストロニック発現ベクターに導入する場合、効果的に前記抗体を生産することを確認することにより、本発明のバイシストロニック発現ベクターがゴリムマブ抗体を高発現させるシステムであることを確認した。
【００４２】
前記ウステキヌマブは、多国籍製薬会社であるヤンセン製薬会社（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．）が開発したインターロイキン１２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２、ＩＬ−１２）とインターロイキン２３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２３、ＩＬ−２３）に対するヒトモノクローナル抗体であり、米国食品医薬品局（ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ＦＤＡ）から乾癬性関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）に対して承認されており、重症乾癬（ｓｅｖｅｒｅ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、中等症−重症尋常性乾癬（ｍｏｄｅｒａｔｅ−ｔｏ−ｓｅｖｅｒｅ  ｐｌａｑｕｅ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）及びサルコイドーシス（ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ）などに対する臨床が進行中である。本発明の実施例では、ウステキヌマブを本発明の抗体発現用バイシストロニック発現ベクターに導入し、効果的に前記抗体を生産することを確認することにより、本発明のバイシストロニック発現ベクターがウステキヌマブ抗体を高発現させるシステムであることを確認した。
【００４３】
前記イピリムマブは、米国系製薬会社であるブリストル−マイヤーズスクウィプ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏ．、ＢＭＳ）社が開発した細胞毒性Ｔリンパ球抗原−４（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＴＬＡ−４）に対するヒトモノクローナル抗体であり、エルボイ（Ｙｅｒｖｏｙ）という製品名で米国食品医薬品局（ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ＦＤＡ）から黒色腫及び皮膚癌に対して承認されており、非小細胞がん（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＮＳＣＬＣ）、小細胞がん（ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ、ＳＣＬＣ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）及び転移ホルモン無反応性前立腺癌（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）に対して臨床進行中である。特に、黒色腫の治療薬としてＦＤＡから承認されたエルボイは静脈注射剤の形式で投与され、人体の免疫システムが黒色腫を形成する腫瘍細胞を標的として認識し攻撃することを助けることにより薬効を発揮する。本発明の実施例では、イピリムマブを本発明の抗体発現用バイシストロニック発現ベクターに導入し、効果的に前記抗体を生産することを確認することにより、本発明のバイシストロニック発現ベクターがイピリムマブ抗体を高発現させるシステムであることを確認した。
【００４４】
本発明における用語「抗体軽鎖遺伝子」とは、軽鎖２本と重鎖２本がアミノ酸と糖鎖で結合されたＹ字型のタンパク質である抗体の中で軽鎖部分を暗号化する遺伝子を意味する。本発明において抗体の軽鎖遺伝子は、本発明のバイシストロニックベクターを用いて発現量が増加する任意の抗体に対する軽鎖遺伝子の場合は制限なく含まれ、例えば、治療用抗体であるベバシズマブ、トシリズマブ、デノスマブ、ベリムマブ、ゴリムマブ、ウステキヌマブまたはイピリムマブの軽鎖部分を暗号化する塩基配列であってもよい。具体的には、ベバシズマブの軽鎖部分における配列番号１３、トシリズマブの軽鎖部分における配列番号１７、デノスマブの軽鎖部分における配列番号２１、ベリムマブの軽鎖部分における配列番号２５、ゴリムマブの軽鎖部分における配列番号２９、ウステキヌマブの軽鎖部分における配列番号３３及びイピリムマブの軽鎖部分における配列番号３７からなる群から選択されたアミノ酸配列を暗号化する塩基配列で構成されたものであってもよく、より具体的には、ベバシズマブの軽鎖部分を暗号化する配列番号１１、トシリズマブの軽鎖部分を暗号化する配列番号１５、デノスマブの軽鎖部分を暗号化する配列番号１９、ベリムマブの軽鎖部分を暗号化する配列番号２３、ゴリムマブの軽鎖部分を暗号化する配列番号２７、ウステキヌマブの軽鎖部分を暗号化する配列番号３１及びイピリムマブの軽鎖部分を暗号化する配列番号３５からなる群から選択された塩基配列で構成されたものであってもよい。
【００４５】
本発明における用語「抗体重鎖遺伝子」とは、軽鎖２本と重鎖２本がアミノ酸と糖鎖で結合されたＹ字型のタンパク質である抗体の中で重鎖部分を暗号化する遺伝子を意味する。本発明において抗体重鎖遺伝子は、本発明のバイシストロニックベクターを用いて発現量が増加する任意の抗体に対する重鎖遺伝子の場合は制限なく含まれ、例えば、治療用抗体であるベバシズマブ、トシリズマブ、デノスマブ、ベリムマブ、ゴリムマブ、ウステキヌマブまたはイピリムマブの重鎖部分を暗号化する塩基配列であってもよい。具体的には、ベバシズマブの重鎖部分における配列番号１４、トシリズマブの重鎖部分における配列番号１８、デノスマブの重鎖部分における配列番号２２、ベリムマブの重鎖部分における配列番号２６、ゴリムマブの重鎖部分における配列番号３０、ウステキヌマブの重鎖部分における配列番号３４及びイピリムマブの重鎖部分における配列番号３８からなる群から選択されたアミノ酸配列を暗号化する塩基配列で構成されたものであってもよく、より具体的には、ベバシズマブの重鎖部分を暗号化する配列番号１２、トシリズマブの重鎖部分を暗号化する配列番号１６、デノスマブの重鎖部分を暗号化する配列番号２０、ベリムマブの重鎖部分を暗号化する配列番号２４、ゴリムマブの重鎖部分を暗号化する配列番号２８、ウステキヌマブの重鎖部分を暗号化する配列番号３２とイピリムマブの重鎖部分を暗号化する配列番号３６からなる群から選択された塩基配列で構成されたものであってもよい。
【００４６】
本発明における用語「ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ、内部リボソーム流入点、配列番号４）」とは、真核細胞内の１つのｍＲＮＡから複数のタンパク質の合成が可能になるように、リボソームが直接に結合するｍＲＮＡの内部に存在している特定の領域を意味し、本発明の発現ベクターがバイシストロニック発現ベクターになれるようにする役割を果たす。
【００４７】
真核細胞においてｍＲＮＡの解読は、一般的に、ｍＲＮＡの５  ’末端に付着されたキャップ（ｃａｐ）構造依存的であるが、このようなキャップ構造非依存性翻訳をする場合、リボソームがｍＲＮＡの内部に存在している特定の領域に直接結合して翻訳を開始する場合があり、これを内部開始機構という。前記内部開始機構において、リボソームが直接結合するｍＲＮＡ上の部位をＩＲＥＳと言うが、ポリオウイルス、ＥＭＣウイルスなどのウイルスｍＲＮＡ以外に、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）ｍＲＮＡ、ショウジョウバエのアンテナ遺伝子（Ａｎｔｐ）ｍＲＮＡなどの細胞ｍＲＮＡでも発見される。
【００４８】
本発明における用語「ｐｏｌｙＡ」とは、ポリアデニル酸またはポリアデニル酸切片と呼ばれ、真核生物のｍＲＮＡの３  ’末端に普遍的に存在するアデニル酸の連続した配列を意味する。その長さは、１０〜２００ヌクレオチド程度であり、発現ベクターバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）の許容サイズに応じて多様に調節することができる。ｐｏｌｙＡは、ｍＲＮＡの安定化、解読、核から細胞質への輸送などに関与することが知られている。
【００４９】
本発明の抗体生産用バイシストロニック発現ベクターは、これに限定されないが、好ましくは、図５に図示されたｐＣＹＢ２０４ＩＧ、図６に図示されたｐＣＹＢ２０４ＩＤ、図８に図示されたｐＣＹＢＢＳＳ００１、図９に図示されたｐＣＹＢＢＳＳ００２、図１０に示したｐＣＹＢＢＳＳ００３、図１１に図示されたｐＣＹＢＢＳＳ００４、図１２に図示されたｐＣＹＢＢＳＳ００５または図１３に図示されたｐＣＹＢＢＳＳ００６であってもよい。  
【００５０】
前記ｐＣＹＢ２０４ＩＧ発現ベクターは、「ＣＭＶプロモーター−ＵＴＲ−イントロン−ベバシズマブ軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット及び「ＣＭＶプロモーター−ＵＴＲ−イントロン−ベバシズマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ−ＧＳ−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含む発現ベクターであり、ｐＣＹＢ２０４ＩＤ発現ベクターは、「ＣＭＶプロモーター−ＵＴＲ−イントロン−ベバシズマブ軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット及び「ＣＭＶプロモーター−ＵＴＲ−イントロン−ベバシズマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲ−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含む発現ベクターである。前記ｐＣＹＢＢＳＳ００１発現ベクターは、「ＣＭＶプロモーター−ＵＴＲ−イントロン−トシリズマブ軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット及び「ＣＭＶプロモーター−ＵＴＲ−イントロン−トシリズマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲ−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含む発現ベクターである。前記ｐＣＹＢＢＳＳ００２発現ベクターは、「ＣＭＶプロモーター−ＵＴＲ−イントロン−デノスマブ軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット及び「ＣＭＶプロモーター−ＵＴＲ−イントロン−デノスマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲ−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含む発現ベクターである。前記ｐＣＹＢＢＳＳ００３発現ベクターは、「ＣＭＶプロモーター−ＵＴＲ−イントロン−ベリムマブ軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット及び「ＣＭＶプロモーター−ＵＴＲ−イントロン−ベリムマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲ−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含む発現ベクターである。前記ｐＣＹＢＢＳＳ００４発現ベクターは、「ＣＭＶプロモーター−ＵＴＲ−イントロン−ゴリムマブ軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット及び「ＣＭＶプロモーター−ＵＴＲ−イントロン−ゴリムマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲ−ｐｏｌｙＡ」を含む第２の発現カセットを含む発現ベクターである。前記ｐＣＹＢＢＳＳ００５発現ベクターは、「ＣＭＶプロモーター−ＵＴＲ−イントロン−ウステキヌマブ軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット及び「ＣＭＶプロモーター−ＵＴＲ−イントロン−ウステキヌマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲ−ｐｏｌｙＡ  ’」を含む第２の発現カセットを含む発現ベクターである。併せて、前記ｐＣＹＢＢＳＳ００６発現ベクターは、「ＣＭＶプロモーター−ＵＴＲ−イントロン−イピリムマブ軽鎖遺伝子−ｐｏｌｙＡ」を含む第１の発現カセット及び「ＣＭＶプロモーター−ＵＴＲ−イントロン−イピリムマブ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲ−ｐｏｌｙＡ  ’」を含む第２の発現カセットを含む発現ベクターである。
【００５１】
本発明の一実施例では、増幅遺伝子としてＧＳを用い、軽鎖発現カセット及び重鎖発現カセットを用いてｐＣＹＢＩＧを作製し、前記ｐＣＹＢＩＧ発現ベクターでの増幅遺伝子としてＧＳの代わりにＤＨＦＲを含むｐＣＹＢＩＤ発現ベクターを作製した。
【００５２】
本発明のバイシストロニック発現ベクターは、前記で説明したように、抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子と増幅遺伝子が一つの遺伝子のように発現するよう設計され、前記抗体を安定的かつ高効率で発現させる用途を有することができる。
【００５３】
もう一つの態様として、本発明は、前記発現ベクターが形質転換された動物細胞を提供する。
【００５４】
本発明において、動物細胞に形質転換された発現ベクターは、抗体発現用バイシストロニック発現ベクターであり、前記で説明した通りである。  
【００５５】
本発明における用語「形質転換（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」とは、培養動物細胞にＤＮＡを直接導入し、細胞の遺伝形質を変化させる方法であり、一般的に、目的とする遺伝子をプラスミドなどの媒体に入れて導入する方法を使用してする。前記形質転換は、当分野の通常の方法により実施することができ、好ましくは、その例として、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法、電気穿孔法、リポフェクタミン処理法、再分布法（リボソームという人工膜とＤＮＡ複合体を作らせる細胞と融合させる方法）などがある。本発明の一実施例では、リポフェクタミンを使用し、軽鎖／重鎖発現ベクターを細胞内に形質転換させた。
【００５６】
前記動物細胞は、抗体を生産することができる限り、当分野で使用される動物細胞を制限なく使用することができ、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を使用することができる。
【００５７】
本発明の具体的な一実施例では、増幅遺伝子をＧＳとＤＨＦＲに変えた、ベクターにベバシズマブの軽鎖及び重鎖の遺伝子を挿入し、ベバシズマブ抗体発現用ｐＣＹＢ２０４ＩＧ及びｐＣＹＢ２０４ＧＳバイシストロニックベクターを作製した。前記２つのベクターで、それぞれ形質転換された細胞株においてベバシズマブ抗体の発現量を比較した結果、ｐＣＹＢ２０４ＩＤベクターを形質転換された細胞株の場合、ｐＣＹＢ２０４ＩＧベクターを形質転換させた細胞株よりベバシズマブが２倍以上高発現されることを確認した。
【００５８】
また、本発明の具体的な一実施例では、増幅遺伝子としてＤＨＦＲを含むベクターにトシリズマブの軽鎖及び重鎖の遺伝子を挿入し、トシリズマブ抗体発現用ｐＣＹＢＢＳＳ００１バイシストロニックベクターを作製した。前記ベクターで形質転換された細胞株においてトシリズマブ抗体の発現量を確認した結果、８００  ｎＭのＭＴＸ濃度の遺伝子増幅条件で５０．８μｇ／ｍｌと５１．７μｇ／ｍｌと高発現されることを確認した。
【００５９】
本発明の具体的な一実施例では、増幅遺伝子としてＤＨＦＲを含むベクターにデノスマブの軽鎖及び重鎖の遺伝子を挿入し、デノスマブ抗体発現用ｐＣＹＢＢＳＳ００２バイシストロニックベクターを作製した。前記ベクターで形質転換された細胞株において、デノスマブ抗体の発現量を確認した結果、８００  ｎＭのＭＴＸ濃度の遺伝子増幅条件で８１．４μｇ／ｍｌと高発現されることを確認した。
【００６０】
本発明の具体的な一実施例では、増幅遺伝子としてＤＨＦＲを含むベクターにベリムマブの軽鎖及び重鎖の遺伝子を挿入し、ベリムマブ抗体発現用ｐＣＹＢＢＳＳ００３バイシストロニックベクターを作製した。前記ベクターで形質転換された細胞株においてベリムマブ抗体の発現量を確認した結果、４μｇ／ｍｌと高発現されることを確認した。
【００６１】
本発明の具体的な一実施例では、増幅遺伝子としてＤＨＦＲを含むベクターにゴリムマブの軽鎖及び重鎖の遺伝子を挿入し、ゴリムマブ抗体発現用ｐＣＹＢＢＳＳ００４バイシストロニックベクターを作製した。前記ベクターで形質転換された細胞株において、ゴリムマブ抗体の発現量を確認した結果、５００  ｎＭのＭＴＸ濃度の遺伝子増幅条件で１２０．３μｇ／ｍｌと高発現されることを確認した。
【００６２】
本発明の具体的な一実施例では、増幅遺伝子としてＤＨＦＲを含むベクターにウステキヌマブの軽鎖及び重鎖の遺伝子を挿入し、ウステキヌマブ抗体発現用ｐＣＹＢＢＳＳ００５バイシストロニックベクターを作製した。前記ベクターで形質転換させた細胞株においてウステキヌマブ抗体の発現量を確認した結果、２．５μｇ／ｍｌと高発現されることを確認した。
【００６３】
併せて、本発明の具体的な一実施例では、増幅遺伝子としてＤＨＦＲを含むベクターにイピリムマブの軽鎖及び重鎖の遺伝子を挿入し、イピリムマブ抗体発現用ｐＣＹＢＢＳＳ００６バイシストロニックベクターを作製した。前記ベクターで形質転換された細胞株においてイピリムマブ抗体の発現量を確認した結果、５００  ｎＭのメトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、ＭＴＸ）濃度の遺伝子増幅条件で８μｇ／ｍｌと高発現されることを確認した。
【００６４】
まとめると、前記で説明したように、本発明では、実際に本発明の抗体発現用バイシストロニック発現ベクターを、多様な治療用抗体に適用して発現量を測定し、その結果、本発明の発現ベクターを用いた結果として多様な抗体の発現能に優れていることを確認した。  
【００６５】
もう一つの態様として、本発明は、前記動物細胞を培養する段階を含む抗体の生産方法を提供する。
【００６６】
本発明において、前記動物細胞は、本発明に係るイントロンを含むバイシストロニック発現ベクターが形質転換された動物細胞であり、これは前述した通りである。
【００６７】
本発明の抗体の生産方法は、前記動物細胞を培養することにより、抗体を安定的かつ高効率で生産することができる。前記方法は、好ましくは、前記動物細胞を培養した培養物から抗体を精製する段階をさらに含むことができる。
【００６８】
本発明により作製される前記の抗体については、前記で説明した通りであり、これに限定されないが、ベバシズマブ、トシリズマブ、デノスマブ、ベリムマブ、ゴリムマブ、ウステキヌマブまたはイピルクリームマプであってもよい。
【００６９】
以下、本発明を実施例を通じてより詳しく説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７０】
実施例１：軽鎖発現用遺伝子セットＧｌｎ−ＬＣの製作
ヒトサイトメガロウイルス（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）ｓｔｒａｉｎ  ＡＤ１６９のｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ１７４０３．１）の塩基配列によりＵＴＲ部分とイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）部分を含むＣＭＶプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）のＤＮＡ配列を確保した。目的タンパク質の発現のためには、少なくともプロモーター、クローニングサイト、ｐｏｌｙ  Ａ  要素が必要なので、前記サイトメガロウイルスのゲノムから確認された塩基配列を利用し、ＣＭＶプロモーター部分とＵＴＲ部分、イントロン、ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ、ＳＶ４０  ｐｏｌｙ  ＡのＤＮＡをＧｅｎｏｔｅｃｈ（韓国）に依頼して合成した。
【００７１】
併せて、イントロンとｐｏｌｙ  Ａとの間には、抗体タンパク質の軽鎖部分をクローニングするために制限酵素Ｘｂａ  ＩとＮｏｔ  Ｉ認識部位をそれぞれ添加し、ＣＭＶプロモーターの５  ’末端には制限酵素Ａｓｃ  Ｉの認識部位を、ｐｏｌｙ  Ａ  ３’末端に制限酵素ＢａｍＨ  ＩとＸｈｏ  Ｉの認識部位を添加し、その後のクローニングステップで使用されるようにした。
【００７２】
前記のような過程を経て、［Ａｓｃ  Ｉ］  −ＣＭＶプロモーター−ＵＴＲ−イントロン−  ［Ｘｂａ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉ］  −ｐｏｌｙＡ−  ［ＢａｍＨ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉ］の構成を有する軽鎖発現用遺伝子セット（Ｇｌｎ−ＬＣ）を作製した（図１）。
【００７３】
実施例２：重鎖発現用遺伝子セットＧｌｎ−ＨＣの作製
前記実施例１で作製したＧｌｎ−ＬＣ遺伝子セットを鋳型とし、下記表１にまとめたＢａｍＨ  Ｉ  Ｇｌｎ−Ｆプライマー（配列番号７）とＮｈｅ  Ｉ  Ｇｌｎ−Ｒプライマー（配列番号８）を用いてＰＣＲ反応を行った。
【００７４】
【表１】
0006343011.tif 000002
【００７５】
重鎖発現用遺伝子セットＧｌｎ−ＨＣには、ＣＭＶプロモーターの３  ’末端に制限酵素ＢａｍＨ  Ｉ認識部位を添加し、ＣＭＶプロモーターの後にＵＴＲ、イントロン、そして抗体タンパク質の重鎖部分をクローニングするために制限酵素Ｎｈｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉ認識部位を添加し、その後のクローニングステップで使用するようにした。
【００７６】
前記ＰＣＲ反応は、９４℃で５分間の初期変性させた後、９４℃で５０秒、５０℃で３０秒及び７２℃で２分３０秒からなるサイクルを３０回繰り返し、最終的に７２℃で７分間増幅させた。ＰＣＲ反応溶液は、Ｐｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ（Ｅｘ  Ｔａｑ  ｖｅｒｓｉｏｎ）（ＴＡＫＡＲＡ社）２５μｌ、配列番号７と８のプライマー（１０  ｐｍｏｌｅ  ／μｌ）各２μｌを含み、総体積が５０μｌになるように蒸留水を添加した。
【００７７】
前記のような過程を経て、［ＢａｍＨ  Ｉ］  −ＣＭＶプロモーター−ＵＴＲ−イントロン−  ［Ｎｈｅ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉ］−［Ｎｈｅ  Ｉ］の構成を有する重鎖発現用遺伝子セット（Ｇｌｎ−ＨＣ）を作製した（図１）。
【００７８】
ＰＣＲで増幅されたＧｌｎ−ＨＣ遺伝子は、メーカーの指示に従ってｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に挿入した。  
【００７９】
実施例３：軽鎖発現用遺伝子セットであるＧＳベクターのクローニングを通じたＧＳ−Ｇｌｎ−ＬＣプラスミドの製作
増幅用遺伝子としてＧＳ（Ｇｌｕｔａｍｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）遺伝子を含む発現ベクターを作製するために、当社が開発したＩＲＥＳ−ＧＳベクターを使用した。ＩＲＥＳとＧＳ遺伝子、ｐｏｌｙ  Ａを含むＩＲＥＳ−ＧＳベクターを、制限酵素Ｍｌｕ  ＩとＸｈｏ  Ｉで３７℃、４時間処理してＩＲＥＳ−ＧＳ遺伝子−  ｆ１  ｏｒｉｇｉｎ−カナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子−  Ｐｏｌｙ  Ａ−ｐＵＣ  ｏｒiｇｉｎが含まれたＤＮＡベクター切片を回収した。
【００８０】
一方、実施例１で合成した軽鎖発現用遺伝子セットＧｌｎ−ＬＣはＡｓｃ  ＩとＸｈｏ  Ｉを処理して切断した。
【００８１】
前記切断したＩＲＥＳ−ＧＳベクター切片及びＧｌｎ−ＬＣ遺伝子セット切片をそれぞれ１％のアガロースゲル電気泳動をした後、ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎして回収した。それぞれの回収したＤＮＡを連結して、ＧＳ−Ｇｌｎ−ＬＣプラスミドを作製した（図２）。
【００８２】
実施例４：軽鎖及び重鎖の発現用プラスミドｐＣＹＢＩＧの製作
前記実施例２で作製したＴ−ｅａｓｙベクターに挿入されている軽鎖発現用遺伝子セットであるＧｌｎ−ＨＣ  ＤＮＡを得するために、作製したベクターに制限酵素ＢａｍＨ  ＩとＸｈｏ  Ｉを３７℃で４時間処理して切断した。制限酵素を処理したＤＮＡは、１％のアガロースゲル電気泳動によりＧｌｎ−ＨＣの大きさに対応するＤＮＡを回収した。
【００８３】
一方、実施例３で作製したＧＳ−Ｇｌｎ−ＬＣプラスミドは、制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩを３７℃で４時間処理して切断した。制限酵素処理したＤＮＡは、１％のアガロースゲル電気泳動によりＧＳ−Ｇｌｎ−ＬＣプラスミドの大きさに対応するＤＮＡを回収した。
【００８４】
前記の過程により回収したＧｌｎ−ＨＣ遺伝子セット切片とＧＳ−Ｇｌｎ−ＬＣプラスミド切片を連結し、ｐＣＹＢＩＧベクターを作製した（図３）。
【００８５】
実施例５：軽鎖及び重鎖の発現用プラスミドｐＣＹＢＩＤの製作
前記実施例４で作製したｐＣＹＢＩＧベクターのＧＳ増幅遺伝子をＤＨＦＲ（ｄｅｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子に代替したｐＣＹＢＩＤベクターを製作しようとした。
【００８６】
具体的には、ＤＨＦＲ遺伝子を鋳型とし、下記表２にまとめたｓａｌ  Ｉ  ＤＨＦＲ−Ｆプライマー（配列番号９）とＮｈｅ  Ｉ  ＤＨＦＲ−Ｒプライマー（配列番号１０）を用いてＰＣＲ反応を行った。
【００８７】
【表２】
0006343011.tif 000003
【００８８】
前記ＰＣＲ反応は、９４℃で５分間の初期変性させた後、９４℃で５０秒、５０℃で３０秒及び７２℃で２分３０秒からなるサイクルを３０回繰り返し、最終的に７２℃で７分間増幅させた。ＰＣＲ反応溶液は、Ｐｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ（Ｅｘ  Ｔａｑ  ｖｅｒｓｉｏｎ）（ＴＡＫＡＲＡ社）２５μｌ、配列番号９と１０のプライマー（１０  ｐｍｏｌｅ  ／μｌ）各２μｌを含み、総体積が５０μｌになるように蒸留水を添加した。前記のようにＰＣＲで増幅されたＤＨＦＲ遺伝子は、メーカーの指示に従ってｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に挿入した。
【００８９】
一方、実施例４で作製したｐＣＹＢＩＧベクターは、制限酵素ｓａｌ  ＩとＸｂａ  Ｉを処理して切断し、Ｔ−ｅａｓｙベクターにクローニングされたＤＨＦＲ遺伝子は、ｓａｌ  ＩとＮｈｅ  Ｉを処理してＤＮＡを切断した。
【００９０】
それぞれの切断したＤＮＡは、１％のアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを回収した後、二つのＤＮＡを連結し、ＧＳの代わりにＤＨＦＲ遺伝子で置換されたｐＣＹＢＩＤベクターを製作した（図４）。
【００９１】
実施例６：ベバシズマブ発現プラスミドを作製
６−１．ベバシズマブ軽鎖遺伝子の挿入 
前記実施例４及び５で作製したｐＣＹＢＩＧベクター及びｐＣＹＢＩＤベクターにベバシズマブ軽鎖遺伝子を挿入し、ベバシズマブ軽鎖発現プラスミドを作製した。
【００９２】
具体的には、ｐＣＹＢＩＧベクター及びｐＣＹＢＩＤベクターに対しては、Ｘｂａ  ＩとＮｏｔ  Ｉに切断した。
【００９３】
ベバシズマブの軽鎖遺伝子は、ベバシズマブのアミノ酸配列（配列番号１３）を、ＤＮＡ塩基配列で置換した（配列番号１１）。ＤＮＡ配列の置換の際には、抗体発現細胞株であるＣＨＯ細胞に最適化されたＤＮＡ塩基配列で置換し、５’−、３’−両末端に制限酵素Ｎｈｅ  ＩとＮｏｔ  Ｉ認識部位を挿入した。開始コドンであるＡＴＧの前にコザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）を入れて発現量が高くなるように誘導し、シグナル配列としてＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳを添加して遺伝子を合成した。合成された遺伝子は、Ｎｈｅ  ＩとＮｏｔ  Ｉを処理して切断した。
【００９４】
それぞれの切断したＤＮＡは、１％のアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを回収した後、二つのＤＮＡを連結し、それぞれのｐＣＹＢＩＧ及びｐＣＹＢＩＤベクターにベバシズマブ軽鎖遺伝子が挿入されたベクターを作製した。
【００９５】
６−２．ベバシズマブ重鎖遺伝子の挿入
前記実施例６−１で製作された軽鎖発現用ベクターｐＣＹＢＩＧ−ベバシズマブ軽鎖遺伝子ベクターと、ｐＣＹＢＩＤ−ベバシズマブ軽鎖遺伝子ベクターをＮｈｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉに切断した。ベバシズマブの重鎖アミノ酸配列（配列番号１４）からＤＮＡ塩基配列で置換した（配列番号１２）。その後、実施例６のように開始コドンであるＡＴＧの前にコザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）を入れてデザインし、両末端に制限酵素ＮｈｅＩとＸｈｏＩ認識部位を入れて遺伝子を合成した後、ＮｈｅＩとＸｈｏＩを処理して切断した。それぞれの切断したＤＮＡは、１％のアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを回収した後、二つのＤＮＡを連結し、それぞれのｐＣＹＢベクターにベバシズマブ軽鎖及び重鎖の遺伝子が挿入されたベクターを作製した（図５、図６）。
【００９６】
図５及び図６は、本発明のｐＣＹＢ２０４ＩＧベクター及びｐＣＹＢ２０４ＩＤベクターをベバシズマブ軽鎖及び重鎖をクローニングする方法を図式化して示した概略図である。
【００９７】
実施例７：ｐＣＹＢ２０４ＩＧベクターの抗体発現率の測定
７−１．形質転換
抗体タンパク質を安定的に発現する細胞株を開発するために、まずＧＳ欠乏ＣＨＯ−Ｋ１細胞を形質転換実験の前日に６ウェルプレートにウェル当り４×１０  ５細胞の濃度で分譲した後、３７℃、二酸化炭素培養器で培養した。細胞の生存能力が９８％以上であることを確認した後、通常であるが、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｐＣＹＢ２０４ＩＧベクターを細胞内に形質転換させた。この時、形質転換は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ−１（Ｉｎｖｉｔｒｇｅｎ社）に、前記発現ベクターＤＮＡ  ２０μｇとリポフェクタミン１０μｌを添加した培地を用いて行った。これから、ｐＣＹＢ２０４ＩＧが形質転換されたＣＨＯ−Ｋ１細胞を選抜した。
【００９８】
７−２．抗体遺伝子増幅
前記実施例７−１によいてｐＣＹＢ２０４ＩＧが形質転換されたＣＨＯ−Ｋ１細胞株にＭＳＸ（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ）の初期濃度で２５μＭを処理した後、細胞の生長が正常に回復するまで生長の推移を観察した。ＭＳＸ２５μＭを処理した後、７日以降の継代では、ＭＳＸの濃度を２５０μＭに増加させ、同様の方法でＭＳＸによる外部からの圧力に対して生長が回復される継代の時点でＭＳＸの濃度を増加させ、最終的に５００μＭまで増加させた。５００μＭのＭＳＸの濃度で作製された細胞株のプール（ｐｏｏｌ１及びｐｏｏｌ２）の発現量を測定した。発現量の測定は、Ａｎｔｉ−Ｆｃを用いたＥＬＩＳＡ方法により確認した（図７ａ）。
【００９９】
実施例８：ｐＣＹＢ２０４ＩＤベクターの抗体発現率の測定
８−１：形質転換
前記ｐＣＵＢ２０４ＩＧベクターの増幅遺伝子ＧＳの代わりに増幅遺伝子ＤＨＦＲを含むｐＣＹＢ２０４ＩＤ発現ベクターが形質転換された細胞株の発現量を比較するために、前記実施例７−１と同様の方法でＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（Ｇｉｂｃｏ、１２６０９−  ０１２）にｐＣＹＢ２０４ＩＤを細胞内に形質転換させた後、形質転換されたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を選抜した。
【０１００】
８−２：抗体遺伝子の増幅
実施例８−１においてｐＣＹＢ２０４ＩＤが形質転換されたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株にＭＴＸ（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）を処理して遺伝子増幅を行った。実施例７−２と同様に、細胞の生長が正常に回復したときにＭＴＸの濃度を増加させる方法により発現量を測定した。ＭＴＸ処理濃度は５０ｎＭ／２００ｎＭ／８００ｎＭの濃度で行った。発現量の測定は、Ａｎｔｉ−Ｆｃを用いたＥＬＩＳＡ方法により確認した（図７ｂ）。
【０１０１】
前記７−２と８−２で測定したベクター別の抗体の発現量を比較した結果、ｐＣＹＢ２０４ＩＤベクターを形質転換させた細胞株の場合、ｐＣＹＢ２０４ＩＧベクターを形質転換させた細胞株よりベバシズマブが２倍以上高発現されることを確認した。  
【０１０２】
実施例９：トシリズマブ発現プラスミドの作製
９−１．トシリズマブ軽鎖遺伝子の挿入
前記実施例５で作製したｐＣＹＢＩＤベクターにトシリズマブ軽鎖遺伝子を挿入し、トシリズマブ軽鎖発現プラスミドを作製した。
【０１０３】
具体的には、ｐＣＹＢＩＤベクターに対してＸｂａ  ＩとＮｏｔ  Ｉに切断した。
【０１０４】
トシリズマブの軽鎖遺伝子は、トシリズマブの軽鎖アミノ酸配列（配列番号１７）を暗号化するＤＮＡ塩基配列で置換した（配列番号１５）。ＤＮＡ配列の置換の際には、抗体発現細胞株であるＣＨＯ細胞に最適化されたＤＮＡ塩基配列で置換し、５’−、３’−両末端に制限酵素Ｎｈｅ  ＩとＮｏｔ  Ｉ認識部位を挿入した。開始コドンであるＡＴＧの前にコザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）を入れて発現量が高くなるように誘導し、シグナル配列としてＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳを添加して遺伝子を合成した。合成された遺伝子は、Ｎｈｅ  ＩとＮｏｔ  Ｉを処理して切断した。
【０１０５】
それぞれ切断したＤＮＡは、１％のアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを回収した後、二つのＤＮＡを連結し、ｐＣＹＢＩＤベクターにトシリズマブ軽鎖遺伝子が挿入されたベクターを作製した。
【０１０６】
９−２．トシリズマブ重鎖遺伝子の挿入
前記実施例９−１で製作された軽鎖発現用ベクターｐＣＹＢＩＤ−トシリズマブ軽鎖遺伝子ベクターをＮｈｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉに切断した。トシリズマブの重鎖アミノ酸配列（配列番号１８）からＤＮＡ塩基配列で置換した（配列番号１６）。その後、実施例９−１のように開始コドンであるＡＴＧの前にコザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）を入れてデザインし、両末端に制限酵素Ｎｈｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉ認識部位を入れて遺伝子を合成した後、Ｎｈｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉを処理して切断した。それぞれの切断したＤＮＡは、１％のアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを回収した後、二つのＤＮＡを連結し、ｐＣＹＢベクターにトシリズマブ軽鎖及び重鎖の遺伝子が挿入されたベクターを作製した（図８）。
【０１０７】
図８は、本発明の発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００１の制限酵素マップを模式で示したものである。
【０１０８】
実施例１０：ｐＣＹＢＢＳＳ００１ベクターの抗体発現率の測定
１０−１．形質転換
抗体タンパク質を安定的に発現する細胞株を開発するために、まず、ＤＨＦＲ欠乏ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（Ｄｒ．Ｃｈａｓｉｎ、Ｕｎｉｖ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ．ＵＳＡ）を形質転換実験の前日に６ウェルプレートにウェル当り８×１０５細胞の濃度で分譲した後、３７℃、二酸化炭素培養器で培養した。細胞がプレートに７０〜８０％程度成長したことを確認した後、リポフェクタミンＬＴＸとＰＬＵＳ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  ａｎｄ  ＰＬＵＳ  ｒｅａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて軽鎖／重鎖発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００１を細胞内に形質転換した。この時、形質転換には、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、前記発現ベクターＤＮＡ各２．５μｇとリポフェクタミンＬＴＸ  １０μｌを添加した培地を使用した。これから、軽鎖／重鎖発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００１が形質転換されたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を選別した。
【０１０９】
１０−２．抗体遺伝子増幅
前記実施例１０−１においてｐＣＹＢＢＳＳ００１が形質転換されたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株にＭＴＸ（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）を処理して遺伝子増幅を行った。細胞の生長が正常に回復したときにＭＴＸの濃度を増加させる方法により発現量を測定した。ＭＴＸ処理濃度は、５０  ｎＭ／２００  ｎＭ／８００  ｎＭの濃度で行った。その結果、ｐＣＹＢＢＳＳ００１ベクターを形質転換させた細胞株の場合、８００  ｎＭのＭＴＸ濃度で最高の発現量を示した。発現量の測定は、Ｏｃｔｅｔ  ｔｉｔｅｒ  ａｓｓａｙを用い、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｄｉｐ  ａｎｄ  Ｒｅａｄ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（ｆｏｒｔｅＢＩＯ、ｃａｔ．ｎｏ．１８−５０１０、ｌｏｔ  ｎｏ．１２０７１６）を１  Ｘ  ＰＢＳで１０分以上平衡化した後、培養液に反応させた。Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒの再生／中和は、各試料を分析した後、３  サイクル実行し、培養液は、スタンダード範囲内で分析されるように、１  Ｘ  ＰＢＳを使用して希釈し分析した。８００  ｎＭのＭＴＸ濃度で発現量は、２つのプールでそれぞれ５０．８μｇ／ｍｌと５１．７μｇ／ｍｌで確認され、そのような結果は、本発明のイントロンが挿入された発現ベクターを形質転換した場合、遺伝子が継続的に高発現できることを意味する。
【０１１０】
実施例１１：デノスマブ発現プラスミドの作製
１１−１．デノスマブ軽鎖遺伝子の挿入
前記実施例５において作製したｐＣＹＢＩＤベクターにデノスマブ軽鎖遺伝子を挿入し、デノスマブ軽鎖発現プラスミドを作製した。
【０１１１】
具体的には、ｐＣＹＢＩＤベクターに対してＸｂａ  ＩとＮｏｔ  Ｉに切断した。
【０１１２】
デノスマブの軽鎖遺伝子は、デノスマブのアミノ酸配列（配列番号２１）を、ＤＮＡ塩基配列で置換した（配列番号１９）。ＤＮＡ配列の置換の際には、抗体発現細胞株であるＣＨＯ細胞に最適化されたＤＮＡ塩基配列で置換し、５’−、３’−両末端に制限酵素Ｎｈｅ  ＩとＮｏｔ  Ｉ認識部位を挿入した。開始コドンであるＡＴＧの前にコザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）を入れて発現量が高くなるように誘導し、シグナル配列としてＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳを添加して遺伝子を合成した。合成された遺伝子は、Ｎｈｅ  ＩとＮｏｔ  Ｉを処理して切断した。
【０１１３】
それぞれ切断したＤＮＡは、１％のアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを回収した後、二つのＤＮＡを連結し、ｐＣＹＢＩＤベクターにデノスマブ軽鎖遺伝子が挿入されたベクターを作製した。
【０１１４】
１１−２．デノスマブ重鎖遺伝子の挿入
前記実施例１１−１で製作された軽鎖発現用ベクターｐＣＹＢＩＤ−デノスマブ軽鎖遺伝子ベクターをＮｈｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉに切断した。デノスマブの重鎖アミノ酸配列（配列番号２２）をＤＮＡ塩基配列で置換した（配列番号２０）。その後、実施例１１−１のように開始コドンであるＡＴＧの前にコザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）を入れてデザインし、両末端に制限酵素Ｎｈｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉ認識部位を入れて遺伝子を合成した後、Ｎｈｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉを処理して切断した。それぞれの切断したＤＮＡは、１％のアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを回収した後、二つのＤＮＡを連結し、ｐＣＹＢベクターにデノスマブ軽鎖及び重鎖の遺伝子が挿入されたベクターを作製した（図９）。
【０１１５】
図９は、本発明の発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００２の制限酵素のマップを模式で示したものである。
【０１１６】
実施例１２：ｐＣＹＢＢＳＳ００２ベクターの抗体発現率の測定
１２−１．形質転換
抗体タンパク質を安定的に発現する細胞株を開発するために、まず、ＤＨＦＲ欠乏ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（Ｄｒ．Ｃｈａｓｉｎ、Ｕｎｉｖ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ．ＵＳＡ）を形質転換実験の前日に６ウェルプレートにウェル当り８×１０５細胞の濃度で分譲した後、３７℃、二酸化炭素培養器で培養した。細胞がプレートで７０〜８０％程度成長したことを確認した後、リポフェクタミンＬＴＸ  と  ＰＬＵＳ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  ａｎｄ  ＰＬＵＳ  ｒｅａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて軽鎖／重鎖発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００２を細胞内に形質転換した。この時、形質転換には、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、前記発現ベクターＤＮＡ各２．５μｇとリポフェクタミンＬＴＸ  １０μｌを添加した培地を使用した。これから、軽鎖／重鎖発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００２が形質転換されたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を選別した。
【０１１７】
１２−２．抗体遺伝子増幅
前記実施例１２−１においてｐＣＹＢＢＳＳ００２が形質転換されたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株にＭＴＸ（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）を処理して遺伝子増幅を行った。細胞の生長が正常に回復したときにＭＴＸの濃度を増加させる方法により発現量を測定した。ＭＴＸ処理濃度は、５０  ｎＭ／２００  ｎＭ／８００  ｎＭの濃度で行った。その結果、ｐＣＹＢＢＳＳ００２ベクターを形質転換させた細胞株の場合、８００  ｎＭのＭＴＸ濃度で最高の発現量を示した。発現量の測定は、Ｏｃｔｅｔ  ｔｉｔｅｒ  ａｓｓａｙを用い、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｄｉｐ  ａｎｄ  Ｒｅａｄ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（ｆｏｒｔｅＢＩＯ、ｃａｔ．ｎｏ．１８−５０１０、ｌｏｔ  ｎｏ．１２０７１６）を１  Ｘ  ＰＢＳで１０分以上平衡化した後、培養液に反応させた。Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒの再生／中和は、各試料を分析した後、３  サイクルで実行し、培養液は、スタンダードの範囲内で分析されるように、１  Ｘ  ＰＢＳを使用して希釈し分析した。８００  ｎＭのＭＴＸ濃度で発現量は８１．４μｇ／ｍｌで確認され、そのような結果は、本発明のイントロンが挿入された発現ベクターを形質転換した場合、遺伝子を継続的に高発現することを意味する。
【０１１８】
実施例１３：ベリムマブ発現プラスミドの作製
１３−１．ベリムマブ軽鎖遺伝子の挿入
前記実施例５で作製したｐＣＹＢＩＤベクターにベリムマブ軽鎖遺伝子を挿入し、ベリムマブ軽鎖発現プラスミドを作製した。
【０１１９】
具体的には、ｐＣＹＢＩＤベクターに対してＸｂａ  ＩとＮｏｔ  Ｉに切断した。
【０１２０】
ベリムマブの軽鎖遺伝子は、ベリムマブの軽鎖アミノ酸配列（配列番号２５）を暗号化するＤＮＡ塩基配列で置換した（配列番号２３）。ＤＮＡ配列の置換の際には、抗体発現細胞株であるＣＨＯ細胞に最適化されたＤＮＡ塩基配列で置換し、５’−、３’−両末端に制限酵素Ｎｈｅ  ＩとＮｏｔ  Ｉ認識部位を挿入した。開始コドンであるＡＴＧの前にコザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）を入れて発現量が高くなるように誘導し、シグナル配列としてＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳを添加して遺伝子を合成した。合成された遺伝子は、Ｎｈｅ  ＩとＮｏｔ  Ｉを処理して切断した。
【０１２１】
それぞれ切断したＤＮＡは、１％のアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを回収した後、二つのＤＮＡを連結し、ｐＣＹＢＩＤベクターにベリムマブ軽鎖遺伝子が挿入されたベクターを作製した。
【０１２２】
１３−２．ベリムマブ重鎖遺伝子の挿入
前記実施例１３−１で製作された軽鎖発現用ベクターｐＣＹＢＩＤ−ベリムマブ軽鎖遺伝子ベクターをＮｈｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉに切断した。ベリムマブの重鎖アミノ酸配列（配列番号２６）をＤＮＡ塩基配列で置換した（配列番号２４）。その後、実施例１３−１のように開始コドンであるＡＴＧの前にコザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）を入れてデザインし、両末端に制限酵素Ｎｈｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉ認識部位を入れて遺伝子を合成した後、Ｎｈｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉを処理して切断した。それぞれの切断したＤＮＡは、１％のアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを回収した後、二つのＤＮＡを連結し、それぞれのｐＣＹＢベクターにベリムマブ軽鎖及び重鎖の遺伝子が挿入されたベクターを作製した（図１０）。
【０１２３】
図１０は、本発明の発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００３の制限酵素のマップを模式で示したものである。
【０１２４】
実施例１４：ｐＣＹＢＢＳＳ００３ベクターの抗体発現率の測定
１４−１．形質転換
【０１２５】
抗体タンパク質を安定的に発現する細胞株を開発するために、まず、ＤＨＦＲ欠乏ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（Ｄｒ．Ｃｈａｓｉｎ、Ｕｎｉｖ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ．ＵＳＡ）を形質転換実験の前日に６ウェルプレートにウェル当り８×１０５細胞の濃度で分譲した後、３７℃、二酸化炭素培養器で培養した。細胞がプレートで７０〜８０％程度成長したことを確認した後、リポフェクタミンＬＴＸ  と  ＰＬＵＳ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  ａｎｄ  ＰＬＵＳ  ｒｅａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて軽鎖／重鎖発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００３を細胞内に形質転換した。この時、形質転換には、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、前記発現ベクターＤＮＡの各２．５μｇとリポフェクタミンＬＴＸ  １０μｌを添加した培地を使用した。これから、軽鎖／重鎖発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００３が形質転換されたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を選別した。
【０１２６】
１４−２．抗体遺伝子発現量の測定
前記実施例１４−１においてｐＣＹＢＢＳＳ００３ベクターが形質転換されたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株のベリムマブの発現量を測定した。発現量の測定は、Ａｎｔｉ−Ｆｃを用いたＥＬＩＳＡ方法により、ＰＣＤ（Ｐｉｃｏｇｒａｍｓ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）を計算し、細胞当りの発現量を求めた。その結果、ｐＣＹＢＢＳＳ００３ベクターを形質転換させた細胞株の場合、４μｇ／ｍｌの発現量を示すことが確認し、そのような結果は、本発明のイントロンが挿入された発現ベクターを形質転換した場合、遺伝子を継続的に高発現することができることを意味する。
【０１２７】
実施例１５：ゴリムマブ発現プラスミドの作製
１５−１．ゴリムマブ軽鎖遺伝子の挿入
前記実施例５で作製したｐＣＹＢＩＤベクターにゴリムマブ軽鎖遺伝子を挿入し、ゴリムマブ軽鎖発現プラスミドを作製した。
【０１２８】
具体的には、ｐＣＹＢＩＤベクターに対してＸｂａ  ＩとＮｏｔ  Ｉに切断した。
【０１２９】
ゴリムマブの軽鎖遺伝子は、ゴリムマブの軽鎖アミノ酸配列（配列番号２９）を暗号化するＤＮＡ塩基配列で置換した（配列番号２７）。ＤＮＡ配列の置換の際には、抗体発現細胞株であるＣＨＯ細胞に最適化されたＤＮＡ塩基配列で置換し、５’−、３’−両末端に制限酵素Ｎｈｅ  ＩとＮｏｔ  Ｉ認識部位を挿入した。開始コドンであるＡＴＧの前にコザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）を入れて発現量が高くなるように誘導し、シグナル配列としてＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳを添加して遺伝子を合成した。合成された遺伝子は、Ｎｈｅ  ＩとＮｏｔ  Ｉを処理して切断した。
【０１３０】
それぞれ切断したＤＮＡは、１％のアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを回収した後、二つのＤＮＡを連結し、ｐＣＹＢＩＤベクターにゴリムマブ軽鎖遺伝子が挿入されたベクターを作製した。
【０１３１】
１５−２．ゴリムマブ重鎖遺伝子の挿入
前記実施例１５−１で製作された軽鎖発現用ベクターｐＣＹＢＩＤ−ゴリムマブ軽鎖遺伝子ベクターをＮｈｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉに切断した。ゴリムマブの重鎖アミノ酸配列（配列番号３０）をＤＮＡ塩基配列で置換した（配列番号２８）。その後、実施例１５−１のように開始コドンであるＡＴＧの前にコザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）を入れてデザインし、両末端に制限酵素Ｎｈｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉ認識部位を入れて遺伝子を合成した後、Ｎｈｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉを処理して切断した。それぞれの切断したＤＮＡは、１％のアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを回収した後、二つのＤＮＡを連結し、ｐＣＹＢベクターにゴリムマブ軽鎖及び重鎖の遺伝子が挿入されたベクターを作製した（図１１）。
【０１３２】
図１１は、本発明の発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００４の制限酵素のマップを模式で示したものである。
【０１３３】
実施例１６：ｐＣＹＢＢＳＳ００４ベクターの抗体発現率の測定
１６−１．形質転換
【０１３４】
抗体タンパク質を安定的に発現する細胞株を開発するために、まず、ＤＨＦＲ欠乏ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（Ｄｒ．Ｃｈａｓｉｎ、Ｕｎｉｖ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ．ＵＳＡ）を形質転換実験の前日に６ウェルプレートにウェル当り８×１０５細胞の濃度で分譲した後、３７℃、二酸化炭素培養器で培養した。細胞がプレートに７０〜８０％程度成長したことを確認した後、リポフェクタミンＬＴＸ  と  ＰＬＵＳ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  ａｎｄ  ＰＬＵＳ  ｒｅａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて軽鎖／重鎖発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００４を細胞内に形質転換した。この時、形質転換には、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、前記発現ベクターＤＮＡの各２．５μｇとリポフェクタミンＬＴＸ  １０μｌを添加した培地を使用した。これから、軽鎖／重鎖発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００４が形質転換されたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を選別した。
【０１３５】
１６−２．抗体遺伝子増幅
前記実施例１６−１においてｐＣＹＢＢＳＳ００４が形質転換されたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株にＭＴＸ（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）を処理して遺伝子増幅を行った。細胞の生長が正常に回復したときにＭＴＸの濃度を増加させる方法により発現量を測定した。ＭＴＸ処理濃度は、５０  ｎＭ／２００  ｎＭ／５００  ｎＭ／８００  ｎＭの濃度で行った。その結果、ｐＣＹＢＢＳＳ００４ベクターを形質転換させた細胞株の場合、８００  ｎＭのＭＴＸ濃度で最高の発現量を示した。発現量の測定は、Ｏｃｔｅｔ  ｔｉｔｅｒ  ａｓｓａｙを用い、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｄｉｐ  ａｎｄ  Ｒｅａｄ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（ｆｏｒｔｅＢＩＯ、ｃａｔ．ｎｏ．１８−５０１０、ｌｏｔ  ｎｏ．１２０７１６）を１  Ｘ  ＰＢＳで１０分以上平衡化した後、培養液に反応させた。Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒの再生／中和は、各試料を分析した後、３  サイクルで実行し、培養液は、スタンダードの範囲内で分析されるように、１  Ｘ  ＰＢＳを使用して希釈し分析した。５００  ｎＭのＭＴＸ濃度で発現量は１２０．３μｇ／ｍｌで確認され、そのような結果は、本発明のゴリムマブ発現ベクターを形質転換した場合、遺伝子を継続的に高発現することができることを意味する。
【０１３６】
実施例１７：ウステキヌマブ発現プラスミドの作製
１７−１．ウステキヌマブ軽鎖遺伝子の挿入
【０１３７】
前記実施例５で作製したｐＣＹＢＩＤベクターにウステキヌマブ軽鎖遺伝子を挿入し、ウステキヌマブ軽鎖発現プラスミドを作製した。
【０１３８】
具体的には、ｐＣＹＢＩＤベクターに対してＸｂａ  ＩとＮｏｔ  Ｉに切断した。
【０１３９】
ウステキヌマブの軽鎖遺伝子は、ウステキヌマブの軽鎖アミノ酸配列（配列番号３３）を暗号化するＤＮＡ塩基配列で置換した（配列番号３１）。ＤＮＡ配列の置換の際には、抗体発現細胞株であるＣＨＯ細胞に最適化されたＤＮＡ塩基配列で置換し、５’−、３’−両末端に制限酵素Ｎｈｅ  ＩとＮｏｔ  Ｉ認識部位を挿入した。開始コドンであるＡＴＧの前にコザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）を入れて発現量が高くなるように誘導し、シグナル配列としてＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳを添加して遺伝子を合成した。合成された遺伝子は、Ｎｈｅ  ＩとＮｏｔ  Ｉを処理して切断した。
【０１４０】
それぞれ切断したＤＮＡは、１％のアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを回収した後、二つのＤＮＡを連結し、ｐＣＹＢＩＤベクターにウステキヌマブ軽鎖遺伝子が挿入されたベクターを作製した。
【０１４１】
１７−２．ウステキヌマブ重鎖遺伝子の挿入
前記実施例１７−１で製作された軽鎖発現用ベクターｐＣＹＢＩＤ−ウステキヌマブ軽鎖遺伝子ベクターをＮｈｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉに切断した。ウステキヌマブの重鎖アミノ酸配列（配列番号３４）をＤＮＡ塩基配列で置換した（配列番号３２）。その後、実施例１７−１のように開始コドンであるＡＴＧの前にコザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）を入れてデザインし、両末端に制限酵素Ｎｈｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉ認識部位を入れて遺伝子を合成した後、Ｎｈｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉを処理して切断した。それぞれの切断したＤＮＡは、１％のアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを回収した後、二つのＤＮＡを連結し、それぞれのｐＣＹＢベクターにウステキヌマブ軽鎖及び重鎖の遺伝子が挿入されたベクターを作製した（図１２）  。
【０１４２】
図１２は、本発明の発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００５の制限酵素地図を模式で示したものである。
【０１４３】
実施例１８：ｐＣＹＢＢＳＳ００５ベクターの抗体発現率の測定
１８−１．形質転換
抗体タンパク質を安定的に発現する細胞株を開発するために、まず、ＤＨＦＲ欠乏ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（Ｄｒ．Ｃｈａｓｉｎ、Ｕｎｉｖ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ．ＵＳＡ）を形質転換実験の前日に６ウェルプレートにウェル当り８×１０５細胞の濃度で分譲した後、３７℃、二酸化炭素培養器で培養した。細胞がプレートで７０〜８０％程度成長したことを確認した後、リポフェクタミンＬＴＸ  と  ＰＬＵＳ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  ａｎｄ  ＰＬＵＳ  ｒｅａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて軽鎖／重鎖発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００５を細胞内に形質転換した。この時、形質転換には、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、前記発現ベクターＤＮＡの各２．５μｇとリポフェクタミンＬＴＸ  １０μｌを添加した培地を使用した。これから、軽鎖／重鎖発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００５が形質転換されたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を選別した。
【０１４４】
１８−２．抗体遺伝子発現量の測定
前記実施例１８−１においてｐＣＹＢＢＳＳ００５ベクターが形質転換されたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株のウステキヌマブの発現量を測定した。発現量の測定は、Ａｎｔｉ−Ｆｃを使用したＥＬＩＳＡ方法を使用し、ＰＣＤ（Ｐｉｃｏｇｒａｍｓ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）を計算し、細胞当りの発現量を求めた。その結果、ｐＣＹＢＢＳＳ００５ベクターを形質転換させた細胞株の場合、２．５μｇ／  ｍｌの発現量を示すことが確認され、そのような結果は、本発明のイントロンが挿入された発現ベクターを形質転換した場合、遺伝子を継続的に高発現することができることを意味する。
【０１４５】
実施例１９：イピリムマブ発現プラスミドの作製
１９−１．イピリムマブ軽鎖遺伝子の挿入
前記実施例５で作製したｐＣＹＢＩＤベクターにイピリムマブ軽鎖遺伝子を挿入し、イピリムマブ軽鎖発現プラスミドを作製した。
【０１４６】
具体的には、ｐＣＹＢＩＤベクターに対してＸｂａ  ＩとＮｏｔ  Ｉに切断した。
【０１４７】
イピリムマブの軽鎖遺伝子は、イピリムマブの軽鎖アミノ酸配列（配列番号３７）を暗号化するＤＮＡ塩基配列で置換した（配列番号３５）。ＤＮＡ配列の置換の際には、抗体発現細胞株であるＣＨＯ細胞に最適化されたＤＮＡ塩基配列で置換し、５’−、３’−両末端に制限酵素Ｎｈｅ  ＩとＮｏｔ  Ｉ認識部位を挿入した。開始コドンであるＡＴＧの前にコザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）を入れて発現量が高くなるように誘導し、シグナル配列としてＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳを添加して遺伝子を合成した。合成された遺伝子は、Ｎｈｅ  ＩとＮｏｔ  Ｉを処理して切断した。
【０１４８】
それぞれ切断したＤＮＡは、１％のアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを回収した後、二つのＤＮＡを連結し、ｐＣＹＢＩＤベクターにイピリムマブ軽鎖遺伝子が挿入されたベクターを製作した。
【０１４９】
１９−２．イピリムマブ重鎖遺伝子の挿入
前記実施例１９−１で製作された軽鎖発現用ベクターｐＣＹＢＩＤ−イピリムマブ軽鎖遺伝子ベクターをＮｈｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉに切断した。イピリムマブの重鎖アミノ酸配列（配列番号３８）をＤＮＡ塩基配列で置換した（配列番号３６）。その後、実施例１９−１のように開始コドンであるＡＴＧの前にコザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）を入れてデザインし、両末端に制限酵素Ｎｈｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉ認識部位を入れて遺伝子を合成した後、Ｎｈｅ  ＩとＸｈｏ  Ｉを処理して切断した。それぞれの切断したＤＮＡは、１％のアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを回収した後、二つのＤＮＡを連結し、それぞれのｐＣＹＢベクターにイピリムマブ軽鎖及び重鎖の遺伝子が挿入されたベクターを作製した（図１３）。
【０１５０】
図１３は、本発明の発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００６の制限酵素のマップを模式で示したものである。
【０１５１】
実施例２０：ｐＣＹＢＢＳＳ００６ベクターの抗体発現率の測定
２０−１．形質転換
抗体タンパク質を安定的に発現する細胞株を開発するために、まず、ＤＨＦＲ欠乏ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（Ｄｒ．Ｃｈａｓｉｎ、Ｕｎｉｖ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ．ＵＳＡ）を形質転換実験の前日に６ウェルプレートにウェル当り８×１０  ５細胞の濃度で分譲した後、３７℃、二酸化炭素培養器で培養した。細胞がプレートで７０〜８０％程度成長したことを確認した後、リポフェクタミンＬＴＸ  と  ＰＬＵＳ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  ａｎｄ  ＰＬＵＳ  ｒｅａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて軽鎖／重鎖発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００６を細胞内に形質転換した。この時、形質転換には、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、前記発現ベクターＤＮＡの各２．５μｇとリポフェクタミンＬＴＸ  １０μｌを添加した培地を使用した。これから、軽鎖／重鎖発現ベクターｐＣＹＢＢＳＳ００６が形質転換されたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を選別した。
【０１５２】
２０−２．抗体遺伝子増幅
前記実施例２０−１においてｐＣＹＢＢＳＳ００６が形質転換されたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株にＭＴＸ（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）を処理して遺伝子増幅を行った。細胞の生長が正常に回復したときにＭＴＸの濃度を増加させる方法により発現量を測定した。ＭＴＸ処理濃度は、５０  ｎＭ／２００  ｎＭ／５００  ｎＭ／８００  ｎＭの濃度で行った。その結果、ｐＣＹＢＢＳＳ００６ベクターを形質転換させた細胞株の場合、５００  ｎＭのＭＴＸ濃度で最高の発現量を示した。発現量の測定は、Ｏｃｔｅｔ  ｔｉｔｅｒ  ａｓｓａｙを用いており、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｄｉｐ  ａｎｄ  Ｒｅａｄ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（ｆｏｒｔｅＢＩＯ、ｃａｔ．ｎｏ．１８−５０１０、ｌｏｔ  ｎｏ．１２０７１６）を１  Ｘ  ＰＢＳで１０分以上平衡化した後、培養液に反応させた。Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒの再生／中和は、各試料を分析した後、３  サイクルで実行し、培養液は、スタンダードの範囲内で分析されるように、１  Ｘ  ＰＢＳを使用して希釈し分析した。５００  ｎＭのＭＴＸ濃度で発現量は８μｇ／ｍｌで確認されており、そのような結果は、本発明のイントロンが挿入された発現ベクターを形質転換した場合、遺伝子を継続的に高発現することを意味する。
【０１５３】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形で実施されることができることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解しなければならない。本発明の範囲は前記詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そして、その等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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