(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一有効化合物としての、または組み合わせた、抗−良性前立腺肥大剤として有効な量または投与量の、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.(Curcuma mangga Val. et. Zipp.)の抽出物および／またはそれに由来するそれの画分を含む良性前立腺肥大の治療用の医薬組成物。
【請求項２】
抽出物および／または画分が、５−アルファ−レダクターゼ−１の遺伝子発現を低下させる、請求項１に記載の良性前立腺肥大の治療用の医薬組成物。
【請求項３】
抽出物および／または画分が、アンドロゲン受容体の遺伝子発現を低下させる、請求項１に記載の良性前立腺肥大の治療用の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はクルクマ・マンガ（トムラワック、マンゴー・ガジュツ） Val. et. Zipp.(Curcuma mangga Val. et. Zipp.)植物からの草本抽出物に関するものであり、その抽出物の抽出法および生物活性の記載を含み、それによりそれが前立腺腫脹の問題を克服する能力を示す。
【背景技術】
【０００２】
前立腺は雄性にのみみられる小さな腺であり、生殖系の一部を形成する。この腺の役割は、精液、すなわち精子輸送液の形成にある。前立腺は一般に年齢と共に成長する。しかし、前立腺の発達は、それが尿道を圧迫するほど大きくなると問題になる可能性がある。良性前立腺肥大（ＢＰＨ）は問題を引き起こす前立腺成長に関する用語である(Guess 2001: 152)。
【０００３】
一般に、ＢＰＨは４０歳を越える男性に起きる。前立腺の腫脹の結果として尿道が閉塞し、したがって排尿プロセスが妨げられて遅滞し、しばしば排尿が困難になる。未処置のまま放置すると、尿路感染および腎損傷の危険性が生じるであろう。腫脹は前立腺の上皮組織および間質組織に起き始めるであろう。前立腺の腫脹は細胞増殖プロセスの異常な変化によって引き起こされる。その疾患を適正に処置しなければ、それは前立腺癌のリスクを高めるであろう(Guess 2001: 152; Beckman et al. 2005: 1356; Fine & Ginsberg 2008: 333)。
【０００４】
現在、前立腺癌は米国における癌による死亡の２番目の主因である(Talcot et al. 2011: 1046; Fei Ye et al. 2007: 100)。Winter et. al. (2001: 1227)によれば、男性に前立腺癌が発症する可能性は４０〜５９歳の男性５５人に１人であり、６０〜７９歳の男性６人に１人である。したがって、前立腺癌が増悪するのを阻止するためには早期処置が必要である。
【０００５】
現在までに、ＢＰＨを克服するために利用できる２タイプの処置法がある；すなわち、薬物療法および外科処置によるもの。一般的な薬物療法による処置は、アルファ遮断薬および５−アルファ−レダクターゼ酵素阻害薬を用いるものである。しかし、現在利用できるこれら２タイプの薬物はある種の副作用をもつことが知られており、それには直立性低血圧、めまい、および脱力感が含まれる(Gjertson et al. 2004: 869)。したがって、本発明、すなわち天然成分に由来するクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物は、それらの薬物に代わることができる１つの代替源および新たな処置であると期待される。
【０００６】
前立腺癌にまで増殖した前立腺腫脹の処置は、前立腺癌の病期に応じて処置を調整することにより実施すべきである。前立腺切除または放射線療法は低リスクの前立腺癌を処置するために行なうことができる。重篤な状態については、低リスク薬物療法と補助的なアンドロゲン抑制剤の組合わせを処置として採用できる(Sanda & Kaplan 2009: 2141)。本発明は前立腺癌の処置にも適用できる。したがって、本発明は外科処置または化学療法による処置を最小限に抑えると期待される。
【０００７】
地方名テムマンガ(temu mangga)をもつクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.はショウガ科(Zingiberaceae)であり、東南アジア由来の香辛料および天然薬用植物の１つとして知られている。それらの植物はやがてインドネシア、インド−マレーシア、オーストラリア、さらにはアフリカにまで広がった。ほぼすべてのインドネシア人およびアジア人がその香辛料植物を、主に調味料として摂取したことがある。本発明者らは、意外にもクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物を前立腺問題の処置に使用できることを見出した。本発明以前には、本明細書に記載するように前立腺腫脹を含めた前立腺問題を克服するためのクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の使用または有益性を記載した研究はなかった。
【０００８】
本発明者らがこれまで調べた種々の文献には、ＢＰＨおよび前立腺癌の処置に対するクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の有益性を述べたものはなかった。Malek et. al. (2011)は、乳癌細胞（ＭＣＦ−７）、鼻咽頭癌細胞（ＫＢ）、肺癌細胞（Ａ５Ａ９）、子宮頚癌細胞（Ｃａ  Ｓｋｉ）、大腸癌細胞（ＨＴ−２９およびＨＣＴ  １１６）、およびヒト線維芽細胞（ＭＲＣ−５）を死滅させる際のクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.植物からのメタノール抽出物（およびその画分）の有益性を述べている。Rumiyati et. al. (2007)は、赤血球（Ｒａｊｉ細胞系）の阻害剤としてのクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.由来の精油の有益性を示した。Tedjo et. al. (2005)による研究は、Ｃｈａｎｇ細胞における抗酸化剤としてのクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の予防的化学療法の有益性を示した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Guess 2001: 152
【非特許文献２】Beckman et al. 2005: 1356
【非特許文献３】Fine & Ginsberg 2008: 333
【非特許文献４】Talcot et al. 2011: 1046
【非特許文献５】Fei Ye et al. 2007: 100
【非特許文献６】Winter et. al. (2001: 1227)
【非特許文献７】Gjertson et al. 2004: 869
【非特許文献８】Sanda & Kaplan 2009: 2141
【非特許文献９】Malek et. al. (2011)
【非特許文献１０】Rumiyati et. al. (2007)
【非特許文献１１】Tedjo et. al. (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、特に保健領域における科学の発展を支援する概念または理論を充実させるために天然成分の利用可能性を開示することである。さらに、本発明は、保健領域において、特に前立腺肥大の処置において、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.の使用に際してより実際的である剤形を生物活性画分の抽出によって調製する調製法および加工法の両方に関して有用な選択肢を提供できる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明から教示される目的および／または解決策を、好ましい態様において説明する。説明する態様は本発明を理解する目的に用いられ、本発明の実施から知ることができる変更および／または組合わせおよび／または他の改変における他の態様の可能性を制限することはない。本発明において教示される目的および／または解決策は、特許請求の範囲に記載する要素および組合わせから理解されるであろう。
【００１２】
本発明の解決策を達成するために、それらの態様に説明し、かつ本明細書に広範に記載するように、本発明の第１観点は、単一活性成分としての、または組み合わせた、前立腺腫脹の予防、治療または療法のための量または有効量の、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物もしくは画分またはそれから誘導される化合物を含有する製剤に関する。さらに、本発明の第１観点に述べたクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物を含有する製剤は、前立腺癌療法に使用できる。本発明による製剤は、医薬的に許容でき、かつ生理的に適切な賦形剤または添加剤をも含有する。
【００１３】
本発明の第２観点は、５−アルファ−レダクターゼ酵素形成の阻害剤として機能するクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物を含有する製剤に関する。
【００１４】
本発明の第３観点は、アンドロゲン受容体形成の阻害剤として機能するクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物を含有する製剤に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明に含まれ、その一部を構成する以下の図面は、本発明の１態様または幾つかの態様を説明する。以下の図面は本発明により教示される原理を説明するために用いられる。
【図１】図１は、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プロフィールを示す；  ａ．メタノール中のクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物  ｂ．７０％エタノール中のクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物  ｃ．９６％エタノール中のクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物  図１Ａ．  ２５４ｎｍのＵＶ線における所見  図１Ｂ．  ３６６ｎｍのＵＶ線における所見  図１Ｃ．  可視光線における所見  図１Ｄ．  １０％  Ｈ２ＳＯ４を吹き付けた後の、３６６ｎｍのＵＶ線における所見  図１Ｅ．  １０％  Ｈ２ＳＯ４を吹き付けた後の、可視光線における所見。
【図２】図２は、ＰＣ３細胞増殖に対するクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の作用を示す。
【図３】図３は、Ａ５４９細胞増殖に対するクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の作用を示す。
【図４】図４は、ＦＡＣＳ実験の結果を示す。ａ．）対照処置、ｂ．）クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.の抽出物５０μｇ／ｍｌによる処置、ｃ．）クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.の抽出物１００μｇ／ｍｌによる処置、ｄ．）クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.の抽出物１５０μｇ／ｍｌによる処置。
【図５】図５は、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物を投与した後の、ＰＣ３細胞における５−アルファ−レダクターゼ−１遺伝子のｑＰＣＲ結果を示す。
【図６】図６は、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物を投与した後の、ＰＣ３細胞におけるアンドロゲン受容体遺伝子のｑＰＣＲ結果を示す。
【図７】図７は、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物を投与した後の、ＰＣ３細胞におけるＰＩ３キナーゼ遺伝子のｑＰＣＲ結果を示す。
【図８】図８は、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物を投与した後の、ＰＣ３細胞における５−アルファ−レダクターゼ−１のウェスタンブロット結果を示す。
【図９】図９は、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物を投与した後の、ＰＣ３細胞におけるジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）のウェスタンブロット結果を示す。
【図１０】図１０は、ＤＨＴのレベルに対するクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の作用を示す。
【図１１】図１１は、前立腺肥大を示したラットにクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物を投与した結果を示す；  ａ．）偽手術した（正常）グループからのラット  ｂ．）陰性対照グループからのラット  ｃ．）クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物９２．３７ｍｇ／体重ｋｇで処置したグループからのラット  ｄ．）クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物１８４．７４ｍｇ／体重ｋｇで処置したグループからのラット  ｅ．）陽性対照グループ（フィナステリド(Finasteride）１ｍｇ／体重ｋｇ）からのラット。
【図１２】図１２は、実験動物としてのラットの精嚢重量発達のパーセントのグラフを示す。
【図１３】図１３は、各実験動物グループのＤＨＴ血漿濃度（ｐｇ／ｍＬ）のグラフを示す。
【図１４】図１４は、各実験動物グループのＬＨ血漿濃度（ｐｇ／ｍＬ）のグラフを示す。
【００１６】
表の簡単な説明
以下の表は本発明に含まれ、その一部を構成し、本発明の１態様または幾つかの態様を説明する。以下の表は本発明により教示される原理を説明するために用いられる。
【００１７】
表１は、ＤＨＴ経路に関連する遺伝子発現の低下倍率を示す。
【００１８】
表２は、ＰＩ３／ＡｋｔおよびＭＡＰＫ経路に関連する遺伝子発現の低下倍率を示す。
【００１９】
表３は、最高の遺伝子発現増大を示した遺伝子を示す。
【００２０】
表４は、最低の遺伝子発現低下を示した遺伝子を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
例を示すことにより本発明を詳細に考察するが、記載するそれらの例に本発明の範囲が限定されることはない。
【００２２】
Ａ．クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.の抽出法
本発明は、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.を抽出して、前立腺腫脹の処置に有用な抽出物を得る方法を教示する。クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.は、通常は低地から海抜１０００ｍの高地まで栽培されている(Gusmaini et. al., 2004)。本発明による抗前立腺肥大剤としての目的をもつ植物は、８〜１２か月目で収穫され、その時点で土壌より上の部分の植物は黄変および乾燥し始めていた。
【００２３】
本発明において、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.植物の最も好ましい部分は根茎(rhizome)である。生物活性をもつ二次代謝産物はより一般的に根茎中にみられ、それに対し収穫時点の植物の他の部分は廃棄物であるとみなされることに基づいて、根茎の研究を実施した。しかし、この植物の他の部分をそれらが将来さらに観察される可能性のある生物活性をもつという可能性から除外すべきではない。
【００２４】
原料のための根茎をまず清浄にし、根、基部および不純物を除き、続いて原料を水洗し、水切りする。その後、原料を風乾し、３〜７ｍｍの長さに細断し、含水率≦１３％が得られるまで乾燥させる。細断した原料の長さは、最適な抽出結果が得られる程度に選択される。切片が小さすぎれば、それは濾過プロセスを妨げる微粒子を含むであろう。一方、切片が大きすぎれば、それは成分（単数または複数）が原料の内側マトリックスから溶出するのを妨げる可能性がある。表面積を拡大し、したがって抽出プロセス中の接触面積がより広くなり、原料に含有される生物活性成分（単数または複数）の抽出に際してより効果的になるために、原料の一定の長さを決定する必要がある。
【００２５】
細断プロセスを行なった後、材料を秤量し、抽出器に入れ、続いて有機溶媒を（１：６）〜（１−１０）  ｗ／ｖの比率で用いて３０〜２４０分間、３０℃〜５０℃の温度範囲でマセレーション(maceration)プロセスおよび／またはパーコレーション(percolation)を行なう。
【００２６】
クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.中の生物活性成分（単数または複数）は半極性および非極性の特性を示し、半極性ないし非極性の非水−有機溶媒に可溶性であるので、本発明における有機溶媒（単数または複数）の使用にはメタノール、エタノール、塩化メチレン、クロロホルム、石油エーテル、およびアセトンが含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
５０℃〜６０℃の温度範囲および１７５〜８７５ｍｂａｒの圧力範囲における蒸発プロセスによりミセルを濃縮しながら、濃縮物が形成されるまで抽出プロセスを継続した。得られた濃縮物に、ベータシクロデキストリン、トウモロコシデンプンおよびアエロジル(aerosil)を含むフィラーを添加し、６０℃〜７０℃の温度範囲のオーブンを用いて２４〜４８時間乾燥させ、そして生成物をミリングした。本発明において得られる抽出物の収率は約±２〜７％である。以下の抽出プロセスの例を実施する。
【００２８】
例１
９．１ｋｇの原料を３〜７ｍｍの長さに切断し、秤量し、抽出器に入れ、メタノールを（１：９）ｂ／ｖの比率で添加し、次いでマセレーションを１８０分間実施する。上記の比率でのメタノール溶媒の添加およびマセレーション時間は、期待する生物活性をもつ生物活性成分（単数または複数）のすべてを抽出液中へ最適状態で抽出できることを保証するためのものである。その後、ミセルが得られるまで生成物を濾過し、続いて温度６０℃および圧力３３７ｍｂａｒにおける蒸発プロセスにより、褐色で芳香臭をもつ濃厚な濃縮物が得られるまでミセルを濃縮する。乾燥抽出素材を得るために、次いでフィラーを濃縮物に添加し、６０℃のオーブンを用いて４８時間乾燥させる。続いて、乾燥抽出物をミリングする。本発明の抽出プロセスにより得られるメタノール抽出物の収率は約±７％である。
【００２９】
例２
６０ｋｇの原料を３〜７ｍｍの長さに切断し、秤量し、抽出器に入れ、７０％エタノールを（１：８）ｗ／ｖの比率で添加する。続いて、マセレーションプロセスを３０分間、パーコレーションを９０分間、温度５０℃で実施する。ミセルが得られるまで生成物を濾過し、続いて温度６０℃および圧力８６６．５９３ｍｂａｒにおける蒸発プロセスにより、黄褐色の液体であって芳香臭をもつ抽出液濃縮物が形成されるまで濃縮する。フィラーを抽出液濃縮物に添加する。フィラーを含む抽出液濃縮物を、次いで６０℃のオーブンを用いて４６時間乾燥させる。本発明の抽出プロセスにより得られるエタノール抽出物の収率は約±４％である。
【００３０】
抽出プロセスにおける溶媒としてメタノールを使用するのとわずかに異なって、７０〜９６％の濃度のエタノールおよび（１：６）〜（１：１０）  ｗ／ｖの原料／溶媒比、ならびにマセレーションおよび明記した温度範囲におけるパーコレーションの期間の採用によって、期待する生物活性成分（単数または複数）をミセル液中へ最適状態で抽出できる。
【００３１】
本発明におけるエタノールの使用は、経済的観点（マセレーションおよびパーコレーションの期間に関する製造コストを含む）と作業員および環境の安全性の観点との両方から、より有利である。本発明に従って最適な生物活性成分（単数または複数）を含有する抽出物を得るために、好ましくは３０℃〜５０℃の温度範囲で抽出プロセスを実施する。より好ましくは、温度５０℃で抽出プロセスを行なう；それによってより高い収率が得られるからである。５０℃を超える温度の採用は、エタノールの引火性のため推奨されない。
【００３２】
７０〜９６％の濃度のエタノールを用いて抽出プロセスを実施できる。しかし、７０％エタノールを用いる抽出が好ましい；製造プロセスで抽出された成分をより採集しやすく、かつさほど多量の残渣が残らないからである。７０％エタノールを用いて得られる最適収率は±６．２％である。この収率は、７０％を超える濃度のエタノールを用いる抽出プロセスから得られる収率と比較すると、より高く、したがってより経済的である。
【００３３】
液−液抽出で、他の抽出プロセスを実施できる。液−液抽出の基本原理は、２種類の非混和性溶媒間での溶質の分配である。本発明の教示に従ったクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.の抽出プロセスは、液−液抽出法で実施できる。
【００３４】
前記の抽出プロセスにより得られた濃縮物に、さらに等量の水を追加し、ヘキサン、酢酸エチル、クロロホルムおよびジクロロメタンを含めた有機溶媒を用いて、液−液抽出を実施した。続いて、水相と有機相を分離し、次いで抽出液濃縮物が得られるまで低圧で蒸発させることによって有機相を濃縮した。
【００３５】
抽出プロセスにおいて、フィラーの添加は、まずミセルとほぼ等体積で水中のフィラー懸濁液を混合することにより実施する方がよい。さらに、フィラー懸濁液を抽出液濃縮物に添加し、再循環によりホモジナイズし、そして元の体積の３０〜５０％に達するまで再濃縮する。抽出液を濃縮するプロセスでフィラーを混合する工程の方がよい；フィラーの添加によって非極性である有効成分を捕獲することができ、したがって機器への有効成分の付着を低減できるからである。本発明によれば、乾燥抽出物素材を得るために濃縮物に添加するフィラーには、ベータシクロデキストリン、トウモロコシデンプンおよびアエロジルが含まれる。ベータシクロデキストリンをフィラーとして選択するのは、それの分子が極性および非極性をもつ“バスケット”様の形状であり、したがってそれはクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.成分からの非極性成分を“包み込む”ことができるからである。さらに、アエロジルの多孔性は精油（それらが生物活性成分を含有すると考えられる）の非極性成分を孔内へ吸収するのを可能にし、したがってクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.の抽出物を乾燥させる際に主要フィラーであるトウモロコシデンプンのキャパシティーを高めるのに役立つ。乾燥プロセスは、乾燥抽出物素材を得るために２４〜４８時間実施される。抽出物とフィラーの混合物の乾燥プロセスに際して、温度を６０℃〜７０℃の範囲に設定する。温度設定は、有効成分を保存し、かつそのプロセスで熱により起きる抽出物中の有効成分の変化または損傷の可能性を阻止するように行なわれる。さらに、そのプロセスに続いて乾燥抽出物を摩砕する。
【００３６】
メタノールを溶媒として用いる抽出プロセスにより得られたクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.は、明るい黄色の色をもち、芳香臭および苦味がある。一方、７０〜９６％の濃度のエタノールを溶媒として用いる抽出プロセスにより得られたクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.は、黄色ないし黄褐色の色をもち、芳香臭および苦味がある。メタノール抽出物は水に難溶性であり、これに対しエタノール抽出物は水またはエタノールに部分的に可溶性である。乾燥に際しての損失率は両抽出物について≦５．００％であった。
【００３７】
植物化学的試験を実施して、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.の抽出物に含まれる二次代謝産物の含量を検査した。植物化学的試験を実施して、アルカロイド類、サポニン類、フェノール類、フラボノイド類、テルペノイド類、およびステロイド類の存在を調べた。一方、テルペノイドおよびステロイドのグループについての試験はＴＬＣによっても実施された。
【００３８】
アルカロイド試験は、ブーシャルダーＬＰ(Bouchardat LP)試薬を用いて行なわれた。ＬＰブーシャルダー試薬は、２グラムのヨウ素(iodium)および４グラムのヨウ化カリウムを水に溶解し、最終体積を１００ｍｌにすることにより調製された。５００ｍｇの抽出物を秤量し、次いで９ｍｌの水および１ｍｌの２Ｎ  ＨＣｌを抽出物に添加することにより、試験を実施した。この溶液を９５℃の温度に５分間加熱し、次いで室温に放置し、そして濾過した。合計６滴の濾液を採取し、４滴のブーシャルダーＬＰ試薬を添加した。褐色ないし黒色の沈殿が形成されれば、アルカロイドに対する陽性反応である。クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物に対するアルカロイド試験の結果は沈殿の形成がないことを示し、したがってこの抽出物はアルカロイド試験に対して陰性であると明記した。
【００３９】
サポニングループに対する植物化学試験は、５００ｍｇの抽出物を秤量し、さらに１０ｍｌの沸騰水を添加し、１０秒間、激しく振とうし、次いで１０分間放置することにより実施された。この溶液に１滴の２Ｎ  ＨＣｌを添加し、観察した。泡が発生し、その泡が２Ｎ  ＨＣｌ添加後に持続すれば、サポニンに対する陽性反応が起きている。クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.は、２Ｎ  ＨＣｌ添加後に泡が持続するのでサポニンに対して陽性反応を示した。
【００４０】
フラボノイド試験は、５００ｍｇの抽出物を秤量し、次いで１０ｍｌのメタノールを添加し、１０分間還流することにより実施された。まだ熱いうちに溶液を濾過した。濾液を１０ｍｌの水で希釈した。冷却した時点で、５ｍｌの石油エーテルを溶液に添加し、次いで溶液を振とうし、そして放置した。メタノール−水層を採集し、エバポレーターを用いて乾燥させた。残りの乾燥抽出物を５ｍｌの酢酸エチルにより溶解し、濾過した。さらに、１ｍｌの濾液を採取し、試験管に装入し、乾燥するまで再び蒸発させた。続いて、１ｍｌの９５％エタノール、０．１グラムのＭｇ粉末、および１ｍｌの塩酸を徐々に添加した。黄色、橙色および／または赤紫色が生じれば、それはフラボノイドに対する陽性反応を示す。クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.の抽出物のフラボノイド試験は陽性であり、それは濃橙色溶液の形成により指示された。
【００４１】
フェノール試験は、５００ｇの抽出物を秤量し、抽出物を試験管に装入し、次いで２０ｍｌの水を試験管に添加し、煮沸することにより実施された。溶液がまだ熱いうちに濾過し、濾液を採取し、観察ガラスに滴下した。さらに、数滴の塩化鉄（ＩＩＩ）溶液を濾液に添加し、それが暗緑色、青色、および／または紫色の溶液を形成すれば、それはフェノール類に対する陽性反応を示す。この試験の結果から、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.の抽出物は緑色溶液を形成したのでフェノール試験に対して陽性であると明記した。
【００４２】
テルペノイドおよびステロイドの試験は、５００ｍｇの抽出物を秤量し、２ｍｌのクロロホルムに溶解し、次いで濾過することにより実施された。得られた濾液を続いて滴下プレートへ移し、溶媒が蒸発するまで放置した。その後、リーベルマン−バーチャード(Liebermann-Burchard)試薬を添加した（１滴の濃硫酸および３滴の無水酢酸）。赤色、桃色、および／または紫色が生じれば、それはテルペノイドおよび／またはステロイドに対する陽性反応を示す。クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物に対するテルペノイドおよびステロイドの試験は、赤色の発生により陽性結果を示した。
【００４３】
抽出物のＴＬＣ試験は、１ｍｌの無水エタノールに溶解した１０ｍｇの試料を用い、次いで２５μＬの試料をシリカゲル６０  Ｆ２５４プレートにスポットすることにより実施された。ｎ−ヘキサンおよび酢酸エチル（５：１）溶媒を用いて８ｃｍ経路の溶離を実施し、次いでスポットを２５４ｎｍおよび３６６ｎｍのＵＶ線ならびに可視光線の下で観察した（図１）。図１Ａは２５４ｎｍのＵＶ線下でのプレート観察の結果であり、それはＲｆ  ０．２０、０．２９、および０．８０に陽性スポットを示した。図１Ｂのように３６６ｎｍ  ＵＶ線下での観察は、Ｒｆ  ±０．２６、０．３４、および０．４２に蛍光性青色スポット、ならびにＲｆ  ±０．５３に青色スポットを示した。図１Ｃは可視光線下でのプレート観察結果であり、それはスポットを示さなかった。ＴＬＣプレートにさらに水中１０％のＨ２ＳＯ４を吹き付け、次いで温度１５０℃で加熱し、３６６ｎｍのＵＶ線下で観察すると、淡褐色スポットがＲｆ  ±０，２９に、青色スポットがＲｆ  ±０，４７および０．８３に、黄色スポットがＲｆ  ±０，９１に現われた（図１Ｄ）。一方、プレートを可視光線下で観察した場合、紫褐色スポットがＲｆ  ±０．３１に、淡褐色スポットがＲｆ  ±０．６０に現われ、それはテルペノイドおよびステロイドに対する陽性反応を示した（図１Ｅ）。
【００４４】
前記の植物化学試験によれば、抽出物はフラボノイド類、サポニン類、フェノール類、テルペノイド類、およびステロイド類に対して陽性反応を示したが、アルカロイド類に対しては陰性反応を示した。一方、ＴＬＣ分析の結果もクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.の抽出物がステロイド類およびテルペノイド類を含有することを示した。
【００４５】
クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.のエタノールおよびメタノール抽出物に関する植物化学試験およびＴＬＣの結果により、現われた有効スポットがテルペノイド類およびステロイド類のグループであることが確認された。
【００４６】
Ｂ．ＰＣ３細胞増殖阻害剤およびＰＣ３細胞死誘発剤としてのクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物
方法
細胞培養およびクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.の処理投与
本発明に用いた前立腺細胞は、ヒト前立腺癌細胞(ＰＣ３)である。さらに、ヒト肺癌（Ａ５４９）細胞も、細胞生存性の追加支持データとして用いた。血清含有培地を用い、３７℃の温度および５％濃度のＣＯ２のインキュベーター内で、フラスコの表面の８０％が細胞で覆われるまで細胞を培養した。さらに、血清を含まない培地を用いて細胞を９６ウェルプレートへ移し、同じ条件で２４時間インキュベートした。２５μｇ／ｍｌから２００μｇ／ｍｌまでの範囲の濃度をもつクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の形での処理を細胞に施し、さらに同様な条件で２４時間、再インキュベートした。これらの細胞培養方法は、酵素５−アルファ−レダクターゼ−１およびアンドロゲン受容体の形成に対するクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の阻害活性に関するすべての試験ならびにマイクロアレイ分析に適用できた。
【００４７】
ＭＴＴ試験（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド））を用いる細胞生存性試験
ＭＴＴ試験を製造業者からの指示に従って用いて、細胞生存性を判定した。ＰＣ３細胞の標準曲線を用いてＭＴＴ試験の結果を換算し、こうして生細胞数および死細胞数が得られた。次いでそれらの数値を用い、Ｂｉｏｓｔａｔ統計ソフトウェアを用いてＩＣ５０（全集団のうち５０％の細胞死を誘発するのに必要な試料の濃度を示すことができる数値）を決定した。
【００４８】
細胞増殖阻害に対するクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.の活性についての追加データとして、ＰＣ３細胞のほかに肺癌（Ａ５４９）細胞についてもＭＴＴ試験を実施した。Ａ５４９細胞について実施した方法は、ＰＣ３細胞の方法と同様であった。
【００４９】
ＰＣ３細胞周期を観察するためのＦＡＣＳの使用
クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.で処理した後、ＦＡＣＳ機器による分析の前に細胞を固定した。細胞固定は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いる細胞洗浄プロセスおよび処理媒体中に含まれる材料の沈殿により実施された。細胞および沈殿した材料を７０％エタノール７０％中、４℃の温度で２４時間インキュベートした。さらに、ヨウ化プロピジウムを用いて細胞を染色し、ＦＡＣＳ  ＢＤ機器を用いて分析した。
【００５０】
結果
ＭＴＴ試験の結果は、抽出物の濃度が増大するのに伴なって細胞数が減少することを示した（図２）。クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物について得られたＰＣ３細胞に対するＩＣ５０の数値は、９２．６０〜１２７．４５μｇ／ｍｌであった。細胞増殖阻害能はＡ５４９細胞においてもみられ、３９．０７〜４２．５９μｇ／ｍｌのＩＣ５０が得られた（図３）。ＦＡＣＳ実験の結果は、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.の抽出物で処理した後に対照と比較して細胞周期の変化があったことを示した（図４）。投与したクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の濃度が増大するのに伴なって、Ｇ０周期のパーセントが増大し、一方でＧ、ＳおよびＧ２／Ｍの周期は短縮した。
【００５１】
考察
ＭＴＴ試験の結果は、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.がＰＣ３細胞増殖を阻害する能力をもつことを示した。この能力は、投与したクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の濃度が増大するのに伴なってＰＣ３細胞数が減少することから分かる。減少は５０μｇ／ｍｌの濃度から起き始めて２００μｇ／ｍｌまで続き、ＩＣ５０は約９２．６０〜１２７．４５μｇ／ｍｌであった。細胞増殖阻害プロセスはＡ５４９細胞においてもみられた。その阻害は２５μｇ／ｍｌの濃度で開始し、７５μｇ／ｍｌの濃度まで減少し続け、４２．５９μｇ／ｍｌまでＩＣ５０は約３９．０７であった。得られたデータによれば、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物をＰＣ３細胞増殖の阻害剤として、またＡ５４９細胞増殖の阻害剤として使用できることが分かる。
【００５２】
ＦＡＣＳ実験の結果は、投与したクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の濃度が増大するのに伴なってＧ０期の細胞数が増加することを示した。Ｇ０期はアポトーシスおよび細胞死の発生を示した。この周期における細胞数の増加は、細胞死の誘発によるＰＣ３細胞増殖阻害を示す。この結果は、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の濃度が増大するのに伴なって細胞周期Ｇ、ＳおよびＧ２／Ｍが短縮したというデータによって確実なものになった。これらの周期は細胞分裂活性のサインであり、したがってそれらの細胞周期が短縮すれば、それは細胞増殖の低減を示す(Reynolds & Schecker 1995: 64; Nunez 2001: 67)。
【００５３】
クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物が前立腺癌細胞増殖を阻害する能力は、男性においてＢＰＨおよび前立腺癌を含めた前立腺問題を克服するために有用である。細胞増殖の阻害は無制御な細胞増殖の速度を停止することができ、一方、ＢＰＨにおいてはそれは腫脹を軽減できる。この抽出物は肺癌細胞増殖を阻害するために開発することもできる。
【００５４】
結論
ＭＴＴ試験およびＦＡＣＳにおいて得られた結果によれば、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物は前立腺癌細胞増殖を阻害する能力およびＰＣ３細胞死を誘発する能力をもつと結論できる。それは、投与したクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の濃度が増大するのに伴なって細胞数が減少することから分かる。
【００５５】
Ｃ．クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物は５−アルファ−レダクターゼ−１およびアンドロゲン受容体の発現を低下させることによりＤＨＴの形成を阻害し、かつそれらの活性を低下させることができる
方法
ＲＮＡ単離およびリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
ＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて２４時間処理した後、細胞から総ＲＮＡを単離した。単離はＴＲＩｚｏｌ製造業者からの指示に従って実施された。さらに、Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐツールを用いて単離結果に基づき総ＲＮＡの濃度を計算した。
【００５６】
得られたＲＮＡはさらにｒｔ−ＰＣＲを行なうための鋳型である。その後、ｒｔ−ＰＣＲから得られたＤＮＡを鋳型として用いてｑＰＣＲを行なった。ｑＰＣＲプロセスは、マスターミックスｉＱ  ＳＹＢＲ、ならびに５−アルファ−レダクターゼ−１、アンドロゲン受容体、およびＰＩ３キナーゼの特異的プライマーを用いて実施された。ｑＰＣＲのための条件は、以前の実験に基づく最適化結果であった。
【００５７】
５−アルファ−レダクターゼ−１およびＤＨＴのタンパク質単離およびウェスタンブロット
クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.の抽出物で処理した２４時間後に総タンパク質を単離した。単離は細胞溶解用緩衝液およびＴＲＩｚｏｌ法を用いて実施された。総タンパク質単離の結果をさらにローリー(Lowry)法を用いて計算した。得られたタンパク質を、その後、５−アルファ−レダクターゼおよびＤＨＴに対するウェスタンブロットならびにＡｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのＥｌｉｓａキットを用いるＤＨＴ試験の試料として用いた。準ウェスタンブロットの分析プロセスを、５−アルファ−レダクターゼ−１およびＤＨＴに対して特異的な抗体を用いる一般法に従って実施した。ウェスタンブロットの検出は、ＨＲＰコンジュゲートした（西洋わさびペルオキシダーゼ）二次抗体およびルミノールによる染色を用いて実施された。製造業者が提供するプロトコルに従ってＥｌｉｓａキットを用いて定量分析を実施した。本発明に用いたＰＣ３細胞を、過剰の、すなわち８．８μｇ／ｍｌのテストステロンで処理し、１５０μｇ／ｍｌのクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物および２μｇ／ｍｌのフィナステリド(finasteride)で別グループにおいて処理した。本発明において、フィナステリド処理グループは陽性対照であった。
【００５８】
結果
ｑＰＣＲ結果は、５−アルファ−レダクターゼ−１遺伝子発現、アンドロゲン受容体遺伝子、およびＰＩ３キナーゼ遺伝子の低減を示した（図５、６、および７）。この低減は濃度５０μｇ／ｍｌで開始し、濃度１５０μｇ／ｍｌまで低減し続けた。ウェスタンブロット結果は、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の投与が５−アルファ−レダクターゼ−１のタンパク質発現低下を引き起こし（図８）、結果的にＤＨＴレベルも低下した（図９）ことを示した。
【００５９】
同様な結果がＥｌｉｓａキットによる定量においても生じた。ＰＣ３細胞を過剰のテストステロンで処理して、ＤＨＴレベルの変化を観察した。過剰のテストステロンで処理したＰＣ３細胞は、対照細胞より高いＤＨＴ産生を示した。過剰のテストステロンおよびクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物で処理した細胞は、過剰のテストステロンおよびフィナステリドで処理した細胞と同様にＤＨＴレベルの低下を生じた（図１０）。
【００６０】
考察
５−アルファ−レダクターゼは、アンドロゲンであるテストステロンをＤＨＴに変換する際に役割を果たす酵素である。アンドロゲンの機能の１つは、前立腺癌細胞の分裂にある。５−アルファ−レダクターゼは２種類のアイソザイムをもつ：１型および２型。これら２種類のアイソザイムは、最適ｐＨおよびコーディング遺伝子が異なる。遺伝子発現のレベルも異なる。１型および２型はＢＰＨ状態では正常より多く発現し、一方、前立腺癌状態では１型のみが正常より多く発現する(Smith et al. 1998: 1361; Soderstrom et al. 2001: 855; Schmidt et al. 2004: 944)。ＢＰＨおよび前立腺癌が本発明の範囲内の疾患であるので、５−アルファ−レダクターゼ−１のみをパラメーターとして用いた。
【００６１】
テストステロンは５−アルファ−レダクターゼ−１酵素によりＤＨＴに変換され、これが次いでアンドロゲン受容体に結合し、前立腺癌細胞増殖の調節を活性化する(Soderstrom et al. 2001: 855; Asada et al. 2001: 2875)。この実験結果は、ｑＰＣＲ分析において５−アルファ−レダクターゼ−１の遺伝子発現の低下を示し、ウェスタンブロット分析において発現タンパク質の数の減少を示した。遺伝子発現およびタンパク質数の低減は、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の投与後に前立腺癌細胞中の５−アルファ−レダクターゼ−１の数が減少したことを示した。５−アルファ−レダクターゼ−１酵素の数の減少は、投与したクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の濃度が増大するのに伴なってＤＨＴレベルが低下したという結果によっても支持された。５−アルファ−レダクターゼ−１酵素の数の減少により、テストステロンからＤＨＴへの変換が低減し、したがって前立腺癌細胞中のＤＨＴ濃度が低下するであろう。ＤＨＴ濃度の低下は、アンドロゲン受容体へのＤＨＴの結合が低減するため前立腺癌細胞の増殖調節低下をもたらすであろう。それは前立腺癌細胞の増殖低下をもたらすことができ、これは先の実験結果（ＭＴＴおよびＦＡＣＳ）と一致する。
【００６２】
この実験結果は、ｑＰＣＲ分析におけるアンドロゲン受容体の遺伝子発現低下も示した；これは、前立腺癌細胞中のアンドロゲン受容体の数の減少により示される。先の実験結果はＤＨＴの濃度が低下したため前立腺癌細胞増殖の阻害が起きたことを示し、一方でこの実験結果は、アンドロゲン受容体へのＤＨＴ結合が阻害されたため同様に細胞増殖の阻害が起きたことを示した。アンドロゲン受容体の数の減少は受容体へのＤＨＴ結合の低減の原因でもあり、それが最終的に前立腺癌細胞の増殖調節低下をもたらす。
【００６３】
５−アルファ−レダクターゼおよびアンドロゲン受容体の遺伝子発現低下はＰＩ３／Ａｋｔ経路と関係する。それら２種類の遺伝子はＰＩ３／Ａｋｔ経路により調節される。ＰＩ３キナーゼは、雄性の性徴および表現型の発達におけるものを含めた細胞機能の調節において役割を果たす酵素である。この実験結果は、ＰＣ３細胞においてクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物処理がＰＩ３キナーゼの数をｍＲＮＡレベルで低減できることを示した。この低減はＡｋｔリン酸化の調節に影響を及ぼし、続いてそれが他の転写因子の活性化に影響を及ぼし、その結果、５−アルファ−レダクターゼおよびアンドロゲン受容体の転写が低減するであろう。先に考察したように、それら２種類の遺伝子の発現低下は、前立腺癌細胞を減少させることができる。
【００６４】
結論
５−アルファ−レダクターゼ−１およびアンドロゲン受容体の遺伝子発現低下は、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物が前立腺癌細胞の増殖を阻害することによりＢＰＨまたは前立腺癌を処置できることを示した。５−アルファ−レダクターゼ−１遺伝子発現の低下は、前立腺癌細胞が前立腺癌細胞増殖の調節を活性化するのに必要なＤＨＴの濃度を低下させることにより、前立腺癌細胞の増殖を阻害するであろう。アンドロゲン受容体の発現低下は、前立腺癌細胞増殖プロセスの活性化帯域を低減することにより、前立腺癌細胞の増殖を阻害した。ＤＨＴの濃度を低下させる作用をもつそれら２種類の遺伝子の発現低下は、前立腺癌細胞増殖の調節を阻害した。
【００６５】
Ｄ．クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の支持データとしてのマイクロアレイ分析
方法
ＲＮＡ単離およびマイクロアレイ分析
ＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて２４時間処理した後、細胞から総ＲＮＡを単離した。単離はＴＲＩｚｏｌ製造業者からの指示に従って実施された。さらに、分光光度計（Ｂｉｏ  Ｓｐｅｃ  Ｍｉｎｉ，島津）を用いて総ＲＮＡの濃度を計算し、一方、品質面を測定するためにＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いた。続いてこのＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ａｎｄ  Ｎｕ  Ｇｅｎが推奨するプロトコルに従って処理した。要約すると、合計１００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡハイブリッドを調製し、それを一端にユニークＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖をもつ二本鎖ｃＤＮＡの調製のための鋳型として用いる。その後、一本鎖アンチセンスＤＮＡを生成するＳｉｎｇｌｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＰＩＡ）で増殖プロセスを実施した。ＳＰＩＡ修飾から得られたｃＤＮＡをフラグメント化し、ビオチンで標識し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴアレイ内へ、１８時間、温度４５℃および６０ｒｐｍの回転でハイブリダイズした。続いてアレイを洗浄し、ＦＳ  ４５０＿０００７プロセスに従って染色し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ３０００  ７６スキャナーを用いてスキャンした。得られたデータをＰａｒｔｅｋ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）により分析し、こうして遺伝子発現の変化が分かった。遺伝子発現の変化を最高から最低までソーティングし、５０の最高遺伝子および最低遺伝子を採取した。続いて、遺伝子と経路の相関性を見出すために、それらの遺伝子をソーティング、選択および分析した。遺伝子のソーティング、選択および分析は、Ｒｅａｃｔｏｍｅ(www.reactome.com)を用いて実施された。
【００６６】
結果
マイクロアレイ結果は、前立腺増殖に関係する遺伝子である５−アルファ−レダクターゼ−１または２およびアンドロゲン受容体などの遺伝子の発現が低下倍率をもつことを示した（表１）。
【００６７】
【表１】
0006343339.tif 000002
【００６８】
さらに、マイクロアレイ結果は、ＭＡＰＫ機序経路に関係する遺伝子の発現も低下倍率をもつことを明らかにした。それらの遺伝子は上皮増殖因子（ＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＧＦＲ）、ホスホイノシチド−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ｖ−Ｈａ−Ｒａｓ  Ｈａｒｖｅｙラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ(rat sarcoma viral oncogene homolog)（ＲＡＳ）、ｖ−ｒａｆネズミ肉腫３６１１ウイルス癌遺伝子ホモログ(murine sarcoma 3611 viral oncogene homolog)（ＲＡＦ）、ｖ−ａｋｔネズミ胸腺腫ウイルス癌遺伝子ホモログ３(murine thyoma viral oncogene homolog 3)（Ａｋｔ）、およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ(mitogen-activated protein kinase kinase)（ＭＥＫ）である（表２）。
【００６９】
【表２】
0006343339.tif 000003
【００７０】
マイクロアレイ結果を最高増大倍率から最低低下倍率までソーティングし、次いで５０ずつの遺伝子を採取し、Ｒｅａｃｔｏｍｅを用いてソーティングおよび分析すると、他の疾患についての指標として種々の経路が示された（表３および４）。
【００７１】
【表３】
0006343339.tif 000004
【００７２】
【表４】
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【００７３】
考察
マイクロアレイ結果は、前立腺癌細胞増殖がＤＨＴ阻害経路によって阻害されたという指示を確実なものにした。マイクロアレイ結果によれば、５−アルファ−レダクターゼ−２（５−アルファ−レダクターゼ−１のアイソザイム）およびアンドロゲン受容体をコードする遺伝子の発現が低下した。マイクロアレイ結果は、ＰＩ３キナーゼおよびＡｋｔの遺伝子発現の低下のため前立腺癌細胞増殖がＰＩ３キナーゼおよびＡｋｔ阻害経路によって阻害されたという指示も確実なものにした。さらに、やはりＰＩ３／Ａｋｔ経路に関係するＭＡＰＫ経路の遺伝子発現も低下した。
【００７４】
他の疾患の処置に対する適応も、マイクロアレイ結果からみられた。アップレギュレートされた５０の遺伝子の配列決定から得られたＲｅａｃｔｏｍ分析結果は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）経路に関連する遺伝子発現に変化があることを示した。これらの経路は免疫系および血流遮断プロセスに関係づけることができる。アップレギュレートされた遺伝子についての分析結果は、生物学的酸化に関係する遺伝子に対するクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の作用も示した。一方、ダウンレギュレートされた５０の遺伝子に基づけば、発現変化を生じた遺伝子の大部分は類似の経路にあった。細胞周期、糖尿病、コレステロール、ならびに脂質およびリポタンパク質の代謝と関連する遺伝子において、幾つかの相異が生じた。クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物は、前立腺疾患の処置に対するそれの適応のほかに、それの遺伝子を表３および４に述べた他の疾患の処置にも適応した。
生物学的酸化に関係する遺伝子に対するVal. et. Zipp.抽出物。一方、ダウンレギュレートされた５０の遺伝子に基づけば、発現変化を生じた遺伝子の大部分は類似の経路にあった。細胞周期、糖尿病、コレステロール、ならびに脂質およびリポタンパク質の代謝と関連する遺伝子において、幾つかの相異が生じた。クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物は、前立腺疾患の処置に対するそれの適応のほかにも適応した。
【００７５】
結論
得られたマイクロアレイ結果は、本発明によるクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物がＤＨＴ、ＰＩ３／Ａｋｔ、およびＭＡＰＫ経路の変化により前立腺疾患（ＢＰＨおよび前立腺癌）を処置できるという指示をさらに確実なものにした。さらに、それが幾つかの遺伝子の調節に及ぼす作用の考察に基づいて、マイクロアレイ結果は、他の疾患、主にＧＰＣＲに関係する疾患（免疫系および血流遮断、細胞周期経路、生物学的酸化、糖尿病、コレステロール、ならびに脂質およびリポタンパク質の代謝を含む）の処置にクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物を使用できることも明らかにした。
【００７６】
Ｅ．ラットにおける前立腺増殖の阻害
方法
動物の飼育
本発明に用いた動物は、Ｉｎｄｏａｎｉｌａｂ（インドネシア、ボゴール）からの体重２００〜２５０グラムの雄ラット(Rattus norvegicus)  Ｗｉｓｔａｒ系統であった。動物を特殊なケージ内においてグループで、１２時間の明および１２時間の暗の普通照明セッティングで飼育し、飼料および飲用水を自由に摂取させた。
【００７７】
動物飼育の手順は、Guide for the care and use of Laboratory Animals, 8th editionを参照した適宜な規則に従った。動物の使用に関するすべての手順は動物実験倫理委員会により概説および承認され、プロトコル番号DOC-DLBS-BIOL-VVR-APC-015を用いた。
【００７８】
動物グループ
動物を５グループに分けた：偽手術グループ（正常グループ）、陰性対照グループ、すなわち何ら処置しないＢＰＨグループ、１ｍｇ／体重ｋｇのフィナステリドで処理した陽性対照グループ、ならびに処理グループ：これは、それらに投与したクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の用量、すなわち９２，３７ｍｇ／体重ｋｇおよび１８４，７４ｍｇ／体重ｋｇに基づいて２グループに分けた。偽手術グループ以外のすべての動物において、それの前立腺の増殖を誘発した。
【００７９】
前立腺増殖の誘発
前立腺の増殖を刺激するために、それらのラットを１０ｍｇ／体重ｋｇ、毎日、７日間のテストステロン注射の皮下投与で誘発した。テストステロン注射の投与は、ラットの精巣摘除（去勢）および偽手術後に実施された。去勢操作は、各ラットが産生するテストステロン量の差により起きるバイアスを避けるために実施された。
【００８０】
すべての動物を手術前に麻酔した。それぞれ７５ｍｇ／体重ｋｇおよび２．５ｍｇ／体重ｋｇのケタミン(ketamine)およびマレイン酸アゼプロマジン(azepromazine maleic)の混合物を用いて麻酔薬を投与した。
【００８１】
処置は虚脱状態の仰臥位動物に施され、手術目的に従って調整された。恥骨前領域の皮膚に白線(linea alba)を通る切開を行なった。皮膚および皮下領域への切開を行なった後、精巣が見えた。精巣および精管の上方の血管を４／０のクロムガット(chromic gut)で固定した。続いて、腹腔を４／０のクロムガットで縫合し、皮膚を４／０の絹糸で縫合した。
【００８２】
手術の後、手術により起きる細菌感染および痛みを避けるために、抗生物質および鎮痛薬をラットに投与した。フルニキシン(Flunixin)を１日２回、１，１〜２，５ｍｇ／体重ｋｇの用量で鎮痛薬として皮下投与し、ゲンタマイシン(gentamicin)を１日１回、５〜８ｍｇ／体重ｋｇの用量で、二次感染を防ぐための抗生物質として皮下投与した。
【００８３】
結果
図１１は、各ラットグループから最終週に撮影した写真である。陰性対照グループについての解剖学的病理検査では、それぞれの膀胱が有意量の尿を含むことが認められた。それは、膀胱(vesica urinary)を取り巻く前立腺が腫脹して排尿路を締め付けているので生じた。追加情報として、前立腺は２領域、すなわち前と後の領域に分かれており、それが膀胱を取り囲んでいる。同様に腫脹のため、下腹部の触診による各日のルーティン検査では、特に第３週から第６週まで、固体および水分変動のためしばしば硬化が認められた。
【００８４】
精嚢および前立腺の秤量結果により、動物の最終体重と比較した数値データが得られた。図１２に、各処置からの各動物の臓器重量のグラフを示した；前立腺のサイズも各動物からの個々の応答に依存する。同様な投与量および処置期間で、有意に、より大きな前立腺をもつ幾つかの個体があり、他は十分に大きな前立腺をもたなかった。
【００８５】
ラット血漿中のＤＨＴ濃度に関しては図１３から見ることができる。このグラフから、医療処置なしのテストステロン投与（プラセボ）はＤＨＴレベルを増大させたことが分かった。一方、フィナステリド１ｍｇ／ｋｇ、ならびに９２，３７ｍｇ／体重ｋｇおよび１８４，７４ｍｇ／体重ｋｇのクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物による処置は、ＤＨＴ血漿濃度の抑制をもたらすことができる。
【００８６】
前立腺腫脹を伴なう患者の処置は幾つかの機序で施すことができ、それにはアルファ−遮断薬処置、抗−アンドロゲン薬、およびテストステロンをＤＨＴに変換する際の５−アルファ−レダクターゼ酵素の作用を阻害することにより作用する他のタイプの医薬が含まれる。
【００８７】
考察
この実験に基づけば、前立腺腫脹の誘発は、特にＢＰＨグループのラットにおいて黄体形成ホルモン（ＬＨ）の血漿濃度レベルに影響を及ぼす結果となる。図１４から、ＬＨ濃度が増大したことが分かる。ＬＨ濃度の増大は、前立腺および下垂体におけるアンドロゲン遮断プロセスのため起きた。しかし、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物による処置はＬＨ血漿濃度の有意の増大を生じなかった。
【００８８】
実施した幾つかの観察から、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.は抗アンドロゲンとして作用するＬＨの濃度に影響をもたなかった。しかし、得られたデータは、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の機序の現われは５−アルファ−レダクターゼ酵素阻害剤であるフィナステリドの機序に類似するという結果を示した。それは、予め前立腺腫脹を誘発したラットにおいてクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物およびフィナステリドで処置した後に起きたＤＨＴの濃度低下から分かる。この結果は先に得られた分子データを確実なものにした。
【００８９】
病理解剖結果の分析、ＤＨＴ濃度、および前立腺の発達と動物の体重との比較によれば、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物は、前立腺癌の発症に際して最も効力の高い形態のテストステロンであるＤＨＴの阻害による前立腺癌形成阻害に使用できる。
【００９０】
Ｆ．医薬製剤および栄養補助食品
本発明は、有効成分としてクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物を有効な量で、医薬的に許容でき、かつ生理的に適したキャリヤー、賦形剤または添加剤を含む１回分のハーブおよび／または混合ハーブ中に含有する、医薬組成物および剤形を含む。
【００９１】
本発明において教示される医薬組成物を調製するプロセスでは、有効成分クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物を賦形剤（単数または複数）と混合し、またはそれに溶解し、あるいはカプセル、サッシェ、紙、および他のパッケージング材料の形態で作成できるキャリヤーに収容することができる。医薬的に許容できる賦形剤を溶媒として用いる場合、賦形剤は有効成分のキャリヤーまたは媒体として作用する固体、半固体または液体の形態であってよい（経口および注射）。したがって、本発明による医薬組成物は、丸剤、カプセル剤、錠剤、散剤、サッシェ剤、液剤、シロップ剤、乳剤、懸濁液剤、発泡錠、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、マウスウオッシュ、マッサージオイル、坐剤または注射剤の形態で作成できる。さらに、本発明によるクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物を含む医薬組成物は、サプリメント、ビタミン剤、ならびに食品および飲料として調製することもできる。
【００９２】
本発明による組成物は、医薬産業で適用されている方法であって患者にそのような剤形を投与した後に有効成分を直接、持続的または制御下に放出させる方法を用いて調製できる。本発明による錠剤または丸剤をコーティングして抽出物の半減期を延長し、したがってそれの使用頻度を低減することができる。
【００９３】
この組成物を固体剤形、たとえば錠剤に配合する方法は、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の有効成分を賦形剤（単数または複数）と混合して、本発明による組成物から均一な混合物を含有する初期配合物を調製することにより実施できる。この初期配合物は、均質に分散したクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.の有効成分を含有する混合物であり、したがって適正量がたとえばカプセル剤、錠剤または丸剤などの剤形に適合するように、それを均一に分布させることができる。
【００９４】
組成物または有効成分クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物からの苦味を軽減または遮蔽するために、本発明による錠剤または丸剤に追加の保護コートを付与することができる。
【００９５】
本発明による有効量または投与量のクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物は、前立腺癌細胞の増殖を阻害することができる投与量の抽出物である。有効量は、体重、年齢を含めた患者の身体状態、前立腺癌細胞のタイプ、サイズおよび数ならびに標的とする他の病理学的状態を含めたその他の要因に依存する。
【００９６】
液体剤形、たとえばハーブドリンク配合物は、有効成分クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物を、水、および界面活性剤、たとえばヒドロキシプロピルセルロースまたはそれに類する他の材料と混合することにより調製できる。
【００９７】
ハーブシロップ製剤を調製するためには、ハーブドリンク配合物においてこれまで説明されている物質のうちあるものが必要である。ただし、シロップ製剤には他の成分、たとえば増粘剤、安定剤が必要である。半固体剤形、たとえばゼリー剤は、有効成分クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物をある種のヒドロコロイドと混合することにより調製でき、それにはゼラチン、カラゲニン、ペクチン、アラビアゴム、グアーゴム、およびこれらに類する他の材料が含まれる。
【００９８】
固形食品状のハーブ配合物、たとえばビスケット、パン、およびクッキーは、有効成分クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物を身体の健康に重要な効果をもつ成分として用いて調製できる。本発明によるビスケット、パン、およびクッキーなどの固形食品の調製は、一般的な調製法、ならびにバター、砂糖、卵および他の補助材料を含めた他の材料を用いて行なうことができる。
【００９９】
本発明は、放射線療法と併用するかまたはその後に実施する療法としてのクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の使用も想定する。
【０１００】
本発明は、市販されている抗ＢＰＨ薬または他の医薬と組み合わせるかまたはそれに追加したクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の使用も想定する。
【０１０１】
産業上の利用
クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.抽出物の抽出物および他の医薬組成物は、抗ＢＰＨ（前立腺腫脹）および前立腺癌の薬物として前立腺増殖低減経路でそれを使用する際に、抽出物、乾燥粉末抽出物、および／または医薬組成物、特に固体、半固体または液体の経口剤形を製造するために、産業的規模で製造できる。
【０１０２】
本発明の態様
態様１
下記の工程を含む方法により得られる、クルクマ・マンガ Val. et. Zipp.(Curcuma mangga Val. et. Zipp.)の抽出物および／またはそれに由来するそれの画分：
ａ）乾燥したクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.を少なくとも３〜７ｍｍの長さに細断する；
ｂ）工程（ａ）からの細断した材料を、有機溶媒を用いてマセレーション法および／またはパーコレーション法で抽出し、その際、固体−対−溶媒比は（１：６）〜（１：１０）ｗ／ｖであり、マセレーションおよび／またはパーコレーションの期間は３０〜２４０分であり、そして固体を濾過して濾液を得る；
ｃ）工程（ｂ）からの濾液を、抽出液濃縮物が得られるまで蒸発させることによって濃縮する；
ｄ）工程（ｃ）からの抽出液濃縮物にフィラーを添加する；
ｅ）工程（ｄ）からの抽出液濃縮物およびフィラーの混合物を乾燥させて、乾燥抽出物を得る；
ｆ）工程（ｅ）からの乾燥抽出物をミリングする。
態様２
工程（ａ）で用いるクルクマ・マンガ Val. et. Zipp.(Curcuma mangga Val. et. Zipp.)の部分が根茎である、態様１に記載の方法により得られる抽出物および／または画分。
態様３
工程（ｂ）で生成する濾液を、液−液分配法を用いてさらに抽出することができる、態様１に記載の方法により得られる抽出物および／または画分。
態様４
工程（ｃ）の蒸発プロセスを、５０℃〜６０℃の温度範囲および１７５〜８７５ｍｂａｒの圧力範囲で実施する、態様１に記載の方法により得られる抽出物および／または画分。
態様５
工程（ｅ）の乾燥プロセスに、６０℃〜７０℃の温度範囲のオーブンを２４〜４８時間使用する、態様１に記載の方法により得られる抽出物および／または画分。
態様６
抽出物および／または画分が、少なくともフラボノイド類、サポニン類、フェノール類、テルペノイド類、ステロイド類、またはそれの組合わせを含む群の化合物（単数または複数）を含む、態様１に記載の抽出物および／または画分。
態様７
単一有効化合物としての、または組み合わせた、抗−良性前立腺肥大剤および前立腺癌細胞増殖の阻害剤として有効な量または投与量の、態様１に記載の抽出物および／または画分。
態様８
抽出物および／または画分が、５−アルファ−レダクターゼ−１の遺伝子発現を低下させる、態様７に記載の抽出物および／または画分。
態様９
抽出物および／または画分が、アンドロゲン受容体の遺伝子発現を低下させる、態様７に記載の抽出物および／または画分。
態様１０
抽出物および／または画分が、ＰＩ３キナーゼおよびＡｋｔ経路を阻害する、態様７に記載の抽出物および／または画分。
態様１１
肺癌細胞増殖の阻害剤としての、態様１に記載の抽出物および／または画分の使用。
態様１２
免疫系および血流遮断、細胞周期経路、生物学的酸化、糖尿病、コレステロール、ならびに脂質およびリポタンパク質の代謝を含めたＧＰＣＲ経路に関係する疾患（単数または複数）に対する処置としての、態様１に記載の抽出物および／または画分の使用。
態様１３
単一活性成分としての、または組み合わせた、態様１に記載の抽出物および／または画分、ならびに医薬的に許容でき、かつ生理的に適切なキャリヤー、賦形剤（単数または複数）または添加剤（単数または複数）を含む、医薬組成物。
態様１４
単一活性成分としての、または組み合わせた、態様１に記載の抽出物および／または画分、ならびに医薬的に許容でき、かつ生理的に適切なキャリヤー、賦形剤（単数または複数）または添加剤（単数または複数）を含む、医薬組成物であって、固体、半固体または液体の形態で、滅菌製剤または非滅菌製剤（単数または複数）の形態で調製される医薬組成物。
態様１５
単一活性成分としての、または組み合わせた、態様１に記載の抽出物および／または画分を含む、健康増進効果を目的とする食品または飲料。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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