(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
米麹または米麹抽出物のうちの少なくとも１種を有効成分として含有するサイトカイン産生抑制剤において、パイエル板構成細胞におけるＴｈ１及びＴｈ２のサイトカイン産生のうちＴｈ１のＩＬ−２産生およびＩＦＮ−γ産生を選択的に抑制し、パイエル板構成細胞のＴｈ１選択的なサイトカイン産生抑制用途に使用されることを特徴とするＴｈ１選択的サイトカイン産生抑制剤。
【請求項２】
米麹または米麹抽出物のうちの少なくとも１種を有効成分として含有する遺伝子発現制御剤において、パイエル板構成細胞における、
１）peroxisome proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1 alpha（Ppargc1a）の遺伝子発現増強、
２）nitric oxide synthase 2（Nos2），IgM variable region（V165-D-J-Cmu），similar to Ig heavy chain V region 93G7 precursor（LOC640614），hydrogen voltage-gated channel 1（Hvcn1）の少なくともいずれか一つの遺伝子発現抑制、
３）stearoyl-Coenzyme A desaturase 2（Scd2）の遺伝子発現抑制、
の前記１）から３）のうち少なくともいずれか一つの用途に用いられることを特徴とするパイエル板構成細胞遺伝子発現制御剤。
【請求項３】
パイエル板構成細胞におけるＴｈ１及びＴｈ２サイトカイン産生のうちＴｈ１のＩＬ−２産生及びＩＦＮ−γ産生が増強している消化管疾患あるいは炎症の抑制に用いられる、請求項１記載のＴｈ１選択的サイトカイン産生抑制剤を含有することを特徴とする消化管免疫制御組成物。
【請求項４】
前記米麹または米麹抽出物のうちの少なくとも１種が、前記米麹の熱水抽出物を凍結乾燥した乾燥粉末体であることを特徴とする請求項３記載の消化管免疫制御組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、消化管免疫制御活性を有する消化管免疫制御組成物に関するものであり、米麹を含有する消化管免疫抑制組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
消化管や呼吸器粘膜に分布する免疫システムは、免疫系全体の６０％以上を占め、その特徴的な免疫活動により、外来異物の認識・排除を行い、生命活動を維持するのに極めて重要な役割を担っている。
【０００３】
粘膜免疫装置の中でも消化管免疫は，食物からの栄養源の取り込みを監視する他、微生物や食物由来の成分，薬物などの影響を受け、腸内環境の保全や食物アレルギー応答の制御、免疫寛容、造血などの生体応答と密接に関連している。この特徴的な消化管免疫反応は、パイエル板という腸の特殊なリンパ組織によって担われ、このリンパの機能を制御するアジュバント活性様のメカニズムが経口可能なワクチンや抗アレルギー薬開発のための新規な薬理学的作用機序として注目されている（例えば、非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Mowat et al. Nature Rev.Immunol., Vol.3, 332
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、このような技術的背景の下、発酵食品及び発酵プロセスに関わる菌体が腸内環境を改善し、生体の健康維持、増進に役立つことを実証し、消化管免疫活性を制御することで健康維持に役立つ消化管免疫制御組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、石川県下で造られる発酵食品の免疫に対する機能性を評価する目的で、いくつかの発酵食品をマウスに投与して粘膜応答に及ぼす影響や作用機序を遺伝子レベルで明らかにすることを課題として研究を進めてきた。
【０００７】
その結果、米麹の抽出物に特定のサイトカイン産生を制御する作用やパイエル板における特定の遺伝子発現を制御する作用があることを見出すに至った。
【０００８】
本発明は、このような知見に基づいて完成されたものである。すなわち、本発明のＴｈ１選択的サイトカイン産生抑制剤は、米麹または米麹抽出物のうちの少なくとも１種を有効成分として含有するサイトカイン産生抑制剤において、パイエル板構成細胞におけるＴｈ１及びＴｈ２のサイトカイン産生のうちＴｈ１のＩＬ−２産生およびＩＦＮ−γ産生を選択的に抑制し、パイエル板構成細胞のＴｈ１選択的なサイトカイン産生抑制用途に使用されることを特徴とする。
また本発明のパイエル板構成細胞遺伝子発現制御剤は、米麹または米麹抽出物のうちの少なくとも１種を有効成分として含有する遺伝子発現制御剤において、パイエル板構成細胞における、
１）peroxisome proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1 alpha（Ppargc1a）の遺伝子発現増強、
２）nitric oxide synthase 2（Nos2），IgM variable region（V165-D-J-Cmu），similar to Ig heavy chain V region 93G7 precursor（LOC640614），hydrogen voltage-gated channel 1（Hvcn1）の少なくともいずれか一つの遺伝子発現抑制、
３）stearoyl-Coenzyme A desaturase 2（Scd2）の遺伝子発現抑制、
の前記１）から３）のうち少なくともいずれか一つの用途に用いられることを特徴とする。
【０００９】 本発明の消化管免疫制御組成物は、消化管疾患制御剤、アレルギー予防剤、炎症抑制剤、肥満抑制剤のうち少なくともいずれか一つの用途に用いられる消化管免疫制御組成物において、Ｔｈ１選択的サイトカイン産生抑制剤またはパイエル板構成細胞遺伝子制御剤を含有することを特徴とする。 
【発明の効果】
【００１０】
本発明の消化管免疫制御組成物は、前記の通り、サイトカイン産生を選択的に抑制する作用や、パイエル板における特定の遺伝子の発現を上昇あるいは低下させる作用を有することから、消化管疾患やアレルギーの予防、炎症抑制、肥満抑制等の効果を得ることができる。したがって、本発明の消化管免疫制御組成物により、健康維持、増進を図ることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】米麹のＴｈ１サイトカイン産生に及ぼす影響を示す特性図である。
【図２】米麹のＴｈ２サイトカイン産生に及ぼす影響を示す特性図である。
【図３】ＤＮＡマイクロアレイを用いたパイエル板構成細胞における発現遺伝子の網羅的解析結果を示す図である。
【発明の実施の形態】
【００１２】
以下、本発明を適用した消化管免疫制御組成物の実施形態について、詳細に説明する。
【００１３】
本発明の米麹を含むことを特徴事項とするものであり、これにより消化管免疫活性を制御する機能を有する。米麹は、例えば清酒製造工程で使用されるもの等を用いることができる。
【００１４】
前記米麹は、米麹そのものであってもよいし、抽出物等の米麹処理物等であってもよい。例えば、米麹抽出物は、水やアルコールで抽出することにより得ることができ、特に、熱水抽出物を凍結乾燥した乾燥粉末体等の形態で用いるのが好適である。また、前記米麹を含む組成物を薬剤等の形態で供する場合には、薬理上許容し得る担体、賦活剤、各種添加物等を加えることも可能である。
【００１５】
本発明の消化管免疫制御組成物は、サイトカイン産生を選択的に抑制する作用や、パイエル板における特定の遺伝子の発現を上昇あるいは低下させる作用を有する米麹を含むものであるので、消化管疾患やアレルギーの予防、炎症抑制、肥満抑制等の効果を得ることができ、健康維持、増進を図る上で極めて有用である。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を適用した具体的な実施例について、実験結果を基に説明する。
【００１７】
消化管免疫応答の評価方法
【００１８】
（１）サンプルの作製
酒造メーカーより提供された米麹１ｋｇを熱水で抽出し、その抽出物を濾過後に凍結乾燥に付し、乾燥粉末体を得た。これをサンプルとして以下の実験に用いた。
（２）実験動物
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ（雄，５ｗ，日本チャールズリバー）を実験時に適宜購入し、金沢大学自然研動物飼育施設で１週間以飼育、上馴化させてから実験に使用した。
【００１９】
（３）サンプルの調製と投与
（１）の方法で得られたサンプルについて、最終投与量が３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙになるよう、用時、精製水に懸濁して投与サンプルを調製した。この投与サンプルを（２）の条件で飼育したマウスに０．１ｍＬ／１０ｇで１日１回（午前１０時）、連続的に５日間、経口投与した。
【００２０】
（４）パイエル板構成細胞の採取
初回のサンプル投与開始から７日後に、マウスを過剰のエーテルにより致死せしめ、無菌条件下に小腸を摘出して、散布するパイエル板を実体顕微鏡下に摘出した。得られたパイエル板を冷えたリン酸緩衝液に入れて洗浄後、７５０Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ（ｔｙｐｅＩ：シグマ・アルドリッチ社製）完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０）に投入し、１時間インキュベートした。インキュベート終了後、分離したパイエル板構成リンパ球を２００μｍのナイロンメッシュを通してシングルセル懸濁液として細胞数を計測した。
【００２１】
パイエル板構成細胞を３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度となるように５％ＦＣＳ化ＲＰＭＩ−１６４０培地に再浮遊して調製し、２４ウエル培養プレートに１ｍＬずつ播種した。５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間の安定培養を行った後に、最終濃度が５μｇ／ｍＬのConcanavalin A（ＣｏｎＡ），あるいは１μｇ／ｍＬのlipopolysaccharide（ＬＰＳ）を各ウエルに添加し、４８〜１４４時間、静置培養した。
【００２２】
（５）培養液上清中のＴｈ１およびＴｈ２関連サイトカインの測定
ＣｏｎＡによる刺激培養終了後に、培養液上清を回収し、ここに含まれるＴヘルパー細胞による免疫調節因子であるＩＬ−２とＩＦＮ−γ（Ｔｈ１），ＩＬ−４とＩＬ−５（Ｔｈ２）を市販のＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて測定した。測定方法は、ｋｉｔの添付文書に従い、形成する発色色素の吸光度を測定し、標準物質による検量線からそれぞれのサイトカイン産生量を算定した。
【００２３】
（６）パイエル板構成細胞からのＲＮＡ抽出
上記のパイエル板構成細胞の培養とは別に、（４）の操作で得られたパイエル板について、市販のＲＮＡ抽出ｋｉｔを使用して、パイエル板から直接ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを採取した。すなわち、ｋｉｔに付属する組織融解用試薬をパイエル板組織に直接添加し、以降はマニュアルに従って操作してｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。ＲＮＡ量は２６０および２８０ｎｍの吸光度差を測定することにより計測し、その後、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ１μｇを１．２％アガロースゲルで電気泳動した後、ＥＢ染色し、１８Ｓおよび２８Ｓのバンドの明瞭さからＲＮＡのクオリティーを確認した。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、以下のＤＮＡマイクロアレイによる発現遺伝子網羅解析を実施するまで−８０℃で保存した。
【００２４】
（７）ＤＮＡマイクロアレイ
パイエル板構成細胞から抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡについて発現遺伝子の網羅的解析を実施した。すなわち、（６）の方法で得たＲＮＡ（７００  ｎｇ）を市販の商品名MessageAmp II-Biotin Enhanced kit（Ａｍｂｉｏｎ社製）でｃＲＮＡを作製し、遺伝子標的ハイブリダイゼーションをマウスＧｅｎｅＣｈｉｐ（商品名）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）で測定した。すなわち、ｃＲＮＡから作製した２重鎖ＤＮＡをＧｅｎｅＣｈｉｐに滴下し、４５℃、１６時間作用させた。作用終了後にチップをFluidic
Station 450で洗浄して染色し、ハイブリッド染色された遺伝子をGeneChip Operating
software（商品名）を搭載したワークステーションでイメージ化し、そのイメージのヒートマップを計算機上で数値化した。ミスマッチする発現遺伝子と完全にマッチした遺伝子との差を計算機上で演算し、その後、対象となるマウスから得た遺伝子との相対的な変動をチェックし、１．５倍以上の変動する遺伝子群を抽出した。抽出された遺伝子群で変化が認められたものについては、適宜、Ingenuity Pathway Analysis（ＩＰＡ）解析（データベースアクセスは米国）に付し、そのメカニズム解析を実施した。
【００２５】
米麹のＴｈサイトカイン産生に及ぼす影響
米麹熱水抽出物を３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で５日間、マウスに経口投与した結果、図１に示す通り、パイエル板構成細胞におけるＩＬ−２及びＩＦＮ−γ産生を有意に抑制し、その作用は４８時間目まで持続した。
【００２６】
一方、図２に示す通り、パイエル板構成細胞におけるＩＬ−４及びＩＬ−５のＴｈ２サイトカイン産生に対し、米麹抽出物は全く影響しないこともわかった。
【００２７】
ＤＮＡマイクロアレイを用いたパイエル板構成細胞における発現遺伝子の網羅的解析
図３は、何も処置しないマウスから得たパイエル板構成細胞における発現遺伝子の変動を示すものであり、図中、左下は発現が少ない遺伝子であり、右上は頻繁に発現している遺伝子を表す。中線を軸に上下の閾線を設け、上に発現するドットは遺伝子中で上方調節（up-regulation）される遺伝子群を、閾線の下側は下方調節（down-regulation）される遺伝子群をそれぞれ表す。
【００２８】
定常状態にある場合には、発現方向に向かう遺伝子はなく、中線を境に２倍以上の変動を示す遺伝子は１０個から１００個程度に収まる。正常マウスのパイエル板では、おおよそ８の遺伝子の調節発現が認められた（表１を参照）。
【００２９】
【表１】
0006255644.tif 000002
【００３０】
これに対して、表２及び表３に示す通り、米麹抽出物を投与したマウスでは、何も処置しないマウスに比べて３９個の重複しない遺伝子に変動が認められ、その変動はラクトバチルス（Lactobacillus）乳酸菌あるいはエンテロコックス（Enterococcus）乳酸菌よりも顕著である。また、変動した遺伝子群のうち半分の２０個がup-regulationされ、残りはdow-regulationすることがわかった。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
【表３】
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【００３３】
米麹の消化管免疫制御
米麹抽出物は，パイエル板構成細胞におけるＴｈ１およびＴｈ２サイトカイン産生のうち、Ｔｈ１のＩＬ−２及びＩＦＮ−γの産生を選択的に抑制する作用が認められた。これらの一連のサイトカインは、過剰に産生された場合に、自己免疫疾患を誘発することが知られており、このことから、米麹には穏やかな摂取でクローン病など消化管系の疾患やアレルギーの予防、及び腸内悪玉菌の増殖による炎症抑制に効果があるものと考えられる。
【００３４】
ＤＮＡマイクロアレイの結果で、米麹の摂取はパイエル板における（１）peroxisome
proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1 alphaの発現を上昇させた。この遺伝子にコードされるＰＰＡＲ−γは、腸組織の再構築に関連することから，、度な米麹摂取は腸環境保全に役立つものと考えられる。さらに、（２）nitric oxide synthase 2，IgM
variable region，hydrogen voltage-gated channel 1の発現を低下させたことから、米麹抽出物は、腸管の過剰な炎症反応を押さえる抗炎症効果を有するものと考えられる。また、（３）stearoyl-Coenzyme
A desaturase 2の発現を低下させることから、これにコードされる酵素によって脂質合成が抑制され（文献：PNAS, 2005 vol. 102
,12501-12506参照）、肥満抑制にも応用できるものと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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