(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺炎連鎖球菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防に使用するための、ヒト用量あたり28μg〜35μgのポリヒスチジントライアドファミリーD(PhtD)、及びヒト用量あたり28μg〜35μgの解毒されたニューモリシン(dPly)を含む免疫原性組成物であって、該免疫原性組成物は、コンジュゲートされた血清型4糖、コンジュゲートされた血清型6B糖、コンジュゲートされた血清型9V糖、コンジュゲートされた血清型14糖、コンジュゲートされた血清型18C糖、コンジュゲートされた血清型19F糖、及びコンジュゲートされた血清型23F糖を含む、肺炎連鎖球菌の莢膜糖コンジュゲートをさらに含み、該免疫原性組成物は0.5mlの投薬体積を有し、かつ該肺炎連鎖球菌の莢膜糖コンジュゲート中の担体タンパク質と肺炎連鎖球菌糖の比率は1:5〜5:1（w/w）である、上記免疫原性組成物。
【請求項２】
PhtDが、配列番号１の配列に対して少なくとも85％、90％、95％、98％、99％又は100％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
ポリヒスチジントライアドファミリー(PhtX)、コリン結合タンパク質ファミリー(CbpX)、CbpXトランケート、LytX(自己溶菌酵素)ファミリー、LytXトランケート、CbpXトランケート-LytXトランケートキメラタンパク質、PcpA(肺炎球菌コリン結合タンパク質A)、PspA(肺炎球菌表面タンパク質A)、PsaA(肺炎球菌表面接着タンパク質A)、Sp128(肺炎連鎖球菌128)、Sp101(肺炎連鎖球菌101)、Sp130(肺炎連鎖球菌130)、SP125(肺炎連鎖球菌125)及びSP133(肺炎連鎖球菌133)からなる群から選択される少なくとも1種のさらなるコンジュゲートされていない又はコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌タンパク質を含む、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
免疫原性組成物が水中油型アジュバントを含まない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
肺炎連鎖球菌の莢膜糖コンジュゲートが、コンジュゲートされた血清型1糖、コンジュゲートされた血清型5糖、及びコンジュゲートされた血清型7F糖をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
肺炎連鎖球菌の莢膜糖コンジュゲートが、コンジュゲートされた血清型6A糖及びコンジュゲートされた血清型19A糖をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
肺炎連鎖球菌の莢膜糖コンジュゲートが、コンジュゲートされた血清型33F糖及びコンジュゲートされた血清型22F糖をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
肺炎連鎖球菌の莢膜糖コンジュゲートが、破傷風トキソイド(TT)、TTの断片C、ジフテリアトキソイド、CRM197(交差反応物質197)、解毒されたニューモリシン、プロテインD(インフルエンザ菌由来)、PhtD(ポリヒスチジントライアドD)、PhtDE(ポリヒスチジントライアドDとポリヒスチジントライアドEの融合タンパク質)及びN19からなる群から独立して選択される担体タンパク質にコンジュゲートされる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
肺炎連鎖球菌の莢膜糖コンジュゲートが、プロテインDにコンジュゲートされた血清型1糖、プロテインDにコンジュゲートされた血清型4糖、プロテインDにコンジュゲートされた血清型5糖、プロテインDにコンジュゲートされた血清型6B糖、プロテインDにコンジュゲートされた血清型7F糖、プロテインDにコンジュゲートされた血清型9V糖、プロテインDにコンジュゲートされた血清型14糖、プロテインDにコンジュゲートされた血清型23F糖、破傷風トキソイドにコンジュゲートされた血清型18C糖及びジフテリアトキソイドにコンジュゲートされた血清型19F糖を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
アジュバントをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物、及び製薬上許容可能な賦形剤を含むワクチン。
【請求項１２】
使用が、成人のヒト宿主、高齢のヒト宿主、又は乳幼児若しくは幼児のヒト宿主への免疫原性組成物の投与を含み、さらに、疾患が、肺炎、侵襲性肺炎球菌疾患(IPD)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)の憎悪、中耳炎、再発性中耳炎、髄膜炎、菌血症及び結膜炎からなる群から選択される少なくとも1つの疾患を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物又は請求項１１に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良された免疫原性組成物及びワクチン、並びに医療におけるそれらの使用に関する。特に、本発明は、ヒト用量あたり26〜46μgのニューモリシン及び/又はPhtDを含む免疫原性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)は、肺炎球菌としても知られているグラム陽性菌である。肺炎連鎖球菌は、世界中の主要な公衆衛生問題であり、特に乳幼児、高齢者及び免疫に障害がある者の間では、かなりの罹患率と死亡率を占めている。肺炎連鎖球菌は、市中肺炎、急性副鼻腔炎、中耳炎、髄膜炎、菌血症、敗血症、骨髄炎、敗血症性関節炎、心内膜炎、腹膜炎、心膜炎、蜂巣炎、及び脳膿瘍を含む、広範囲の重大なヒト病変を引き起こす。肺炎連鎖球菌は、米国だけでも毎年3,000症例の髄膜炎、50,000症例の菌血症、500,000症例の肺炎、及び7,000,000症例の中耳炎における病原菌であると推定されている(Reichler, M. R.ら、1992、J. Infect. Dis.166:1346、Stool, S. E.及びField, M. J.、1989 Pediatr. Infect. Dis J. 8:S11)。肺炎球菌疾患による死亡率は、先進国と途上国の両方の5歳未満の小児では特に高くなっている。高齢者、免疫に障害のある者、及び他の基礎状態(糖尿病、喘息)のある患者も疾患に特にかかりやすい。
【０００３】
肺炎連鎖球菌が引き起こす主要な臨床症候群は広く認識されており、全ての標準的な医学の教科書で説明されている(Fedson D S、Muscher D M. In: Plotkin S A,Orenstein W A編.Vaccines.第4版.Philadelphia WB Saunders Co, 2004a:529〜588)。例えば、侵襲性肺炎球菌疾患(IPD)は、肺炎連鎖球菌が血液又は他の通常は無菌の部位から分離されるあらゆる感染症として定義される(Musher D M. Streptococcus pneumoniae. In Mandell G L, Bennett J E, Dolin R(編). Principles and Practice of Infectious diseases (第5版). New York、Churchill Livingstone、2001、2128〜2147頁)。
【０００４】
慢性閉塞性肺疾患(COPD)は肺の慢性炎症性疾患であり、世界中で罹患率と死亡率の主要な原因となっている。米国では2005年に死亡者20人のうちおよそ1人が根本的な原因としてCOPDを有していた(Drugs and Aging 26:985〜999(2009))。2020年には、COPDは、慢性無効化疾患(chronic invalidating disease)による障害調整生存年(disability adjusted life year)の主因の第5位に上昇し、また、死亡率の最重要原因の第3位に上昇することが予測される(Lancet 349:1498〜1504(1997))。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Reichler, M. R.ら、1992、J. Infect. Dis.166:1346
【非特許文献２】Stool, S. E.及びField, M. J.、1989 Pediatr. Infect. Dis J. 8:S11
【非特許文献３】Fedson D S、Muscher D M. In: Plotkin S A,Orenstein W A編.Vaccines.第4版.Philadelphia WB Saunders Co, 2004a:529〜588
【非特許文献４】Musher D M. Streptococcus pneumoniae. In Mandell G L, Bennett J E, Dolin R(編). Principles and Practice of Infectious diseases (第5版). New York、Churchill Livingstone、2001、2128〜2147頁
【非特許文献５】Drugs and Aging 26:985〜999(2009)
【非特許文献６】Lancet 349:1498〜1504(1997)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
抗菌薬の登場は、肺炎球菌疾患からの全体的な死亡率を減少させたが、肺炎連鎖球菌の抗生物質耐性株の出現が深刻であり、急速に増大する問題となっている。したがって、肺炎連鎖球菌に対する効果的なワクチンを開発することが重要である。効果的な肺炎球菌ワクチンは、肺炎連鎖球菌疾患に関連する罹患率と死亡率に大きな影響を与える可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ヒト用量あたり26〜45μgのニューモリシン又はPhtD(ポリヒスチジントライアドタンパク質D)を含む免疫原性組成物に関する。本発明者らは、ニューモリシン及びPhtDが、肺炎連鎖球菌株に対する抗体媒介性オプソニン活性を、ニューモリシン及び/又はPhtDをその菌株に由来する肺炎連鎖球菌糖と組み合わせて共投与した場合に増大させ得ること、すなわち、肺炎連鎖球菌糖とより高レベルの肺炎連鎖球菌タンパク質との共投与が、糖が由来する菌株に対して生じた抗体媒介性オプソニン活性の増加をもたらすことを驚くべきことに見出した。本発明者らはまた、この効果が、26〜45μgのニューモリシン及び/又はPhtDを含む組成物を投与した場合に、より低用量のニューモリシン及び/又はPhtDを含む組成物を投与した場合よりも高いことを見出した。さらに、本発明者らは、このより高用量のニューモリシン及び/又はPhtDが、より高用量の抗原を投与する場合に予想され得る、統計的に有意に増加した応答性とは関連しないことを見出した。
【０００８】
肺炎球菌糖とタンパク質との間の正の相互作用が従前に(例えば、国際公開第WO02/22167号)実証されたが、国際公開第WO02/22167号は、免疫系の細胞媒介性分岐と免疫系の体液性分岐を同時に刺激することによって得られた結果に言及している。国際公開第WO02/22167号における効果は、肺炎連鎖球菌の菌株に対する抗体媒介性オプソニン活性を増大させず、オプソニン食作用(OPA)アッセイを用いて測定される増大した抗体媒介性オプソニン活性に反映されない。これは、OPAアッセイ(例えば、実施例2に記載されているもの)を用いて測定されるオプソニン活性が、細胞媒介性免疫系の成分の非存在下で測定されるためである。
【０００９】
本発明者らは、26〜45μgのニューモリシン及び/又はPhtD(ポリヒスチジントライアドタンパク質D)を含む免疫原性組成物が、より低用量のニューモリシン及び/又はPhtDを含む組成物より、有意により反応原性ではないこと、そして、より高い(26〜45μg)用量が、肺炎連鎖球菌株に対する抗体媒介性オプソニン活性を、ニューモリシン及び/又はPhtDをその菌株に由来する肺炎連鎖球菌糖と組み合わせて共投与した場合に増大させ得ることを驚くべきことに見出した。
【００１０】
したがって、第一の態様において、ヒト用量あたり、26μg〜45μg(例えば、26μg〜40μg、28μg〜35μg又は約30μg)の解毒されたニューモリシン(dPly)を含む免疫原性組成物が提供される。
【００１１】
第二の態様において、ヒト用量あたり、26μg〜45μg(例えば、26μg〜40μg、28μg〜35μg又は約30μg)のPhtDを含む免疫原性組成物が提供される。
【００１２】
第三の態様において、本発明の免疫原性組成物、及び製薬上許容可能な賦形剤を含むワクチンが提供される。
【００１３】
第四の態様において、本発明の免疫原性組成物又はワクチンの免疫防御用量をヒト宿主に投与することを含む、肺炎連鎖球菌感染によって引き起こされる疾患に対して該宿主に免疫付与する方法が提供される。
【００１４】
第五の態様において、肺炎連鎖球菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防に使用するための、本発明の免疫原性組成物又はワクチンが提供される。
【００１５】
第六の態様において、肺炎連鎖球菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防のための医薬の製造における、本発明の免疫原性組成物又はワクチンの使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】10μgの解毒されたニューモリシン(Ply-10)、30μgの解毒されたニューモリシン(Ply-30)、10μgの解毒されたニューモリシンと10μgのPhtD(PlPh-10)、30μgの解毒されたニューモリシンと30μgのPhtD(PlPh-3)、10μgの解毒されたニューモリシン及び10μgのPhtDと組み合わせた10種の肺炎球菌コンジュゲートを含むワクチン(10vPP10)、30μgの解毒されたニューモリシン及び30μgのPhtDと組み合わせた10種の肺炎球菌コンジュゲートを含むワクチン(10vPP30)、並びに23種のコンジュゲートされていない肺炎球菌糖を含むワクチンを用いた免疫付与後のヒト成人におけるELISAアッセイによる、抗dPly抗体価を示す棒グラフの図である。白色のバーは免疫付与前の免疫原性を表し、灰色のバーはワクチンを1回投与後の免疫原性を表し、黒色のバーはワクチンを2回投与後の免疫原性を表す。
【図２】図2と同様の棒グラフを示す図であるが、抗Ply力価ではなく抗PhtD力価を示す。
【図３】10μgの解毒されたニューモリシン(Ply-10)、30μgの解毒されたニューモリシン(Ply-30)、10μgの解毒されたニューモリシンと10μgのPhtD(PlPh-10)、30μgの解毒されたニューモリシンと30μgのPhtD(PlPh-3)、10μgの解毒されたニューモリシン及び10μgのPhtDと組み合わせた10種の肺炎球菌コンジュゲートを含むワクチン(10vPP10)、30μgの解毒されたニューモリシン及び30μgのPhtDと組み合わせた10種の肺炎球菌コンジュゲートを含むワクチン(10vPP30)、並びに23種のコンジュゲートされていない肺炎球菌糖を含むワクチンを用いた免疫付与後のヒト成人におけるオプソニン食作用アッセイによる、抗PS1オプソニン抗体価を示す棒グラフの図である。白色のバーは免疫付与前の免疫原性を表し、灰色のバーはワクチンを1回投与後の免疫原性を表し、黒色のバーはワクチンを2回投与後の免疫原性を表す。
【図４】図3と同様の棒グラフを示す図であるが、抗PS1力価ではなく抗PS4力価を示す。
【図５】図3と同様の棒グラフを示す図であるが、抗PS1力価ではなく抗PS5力価を示す。
【図６】図3と同様の棒グラフを示す図であるが、抗PS1力価ではなく抗PS6B力価を示す。
【図７】図3と同様の棒グラフを示す図であるが、抗PS1力価ではなく抗PS7F力価を示す。
【図８】図3と同様の棒グラフを示す図であるが、抗PS1力価ではなく抗PS9V力価を示す。
【図９】図3と同様の棒グラフを示す図であるが、抗PS1力価ではなく抗PS14力価を示す。
【図１０】図3と同様の棒グラフを示す図であるが、抗PS1力価ではなく抗PS18C力価を示す。
【図１１】図3と同様の棒グラフを示す図であるが、抗PS1力価ではなく抗PS19F力価を示す。
【図１２】図3と同様の棒グラフを示す図であるが、抗PS1力価ではなく抗PS23F力価を示す。
【図１３】配列表を示す図である。
【図１４】マウスへの注射後に抗糖ELISAアッセイを用いて測定したときの、12種の糖コンジュゲート、PhtD、dPly及びPE-PilAを含む組成物(12V+prot)の免疫原性と、12種の糖コンジュゲートを含む組成物(12V)及び10種の糖コンジュゲートを含む組成物(10V)の免疫原性とを比較したグラフを示す図である。GMC=幾何平均濃度。IC=信頼区間。
【図１５】マウスへの注射後にオプソニン食作用アッセイを用いて測定したときの、12種の糖コンジュゲート、PhtD、dPly及びPE-PilAを含む組成物(12V+prot)の免疫原性と、12種の糖コンジュゲートを含む組成物(12V)及び10種の糖コンジュゲートを含む組成物(10V)の免疫原性とを比較したグラフを示す図である。GMT=幾何平均力価。
【図１６】マウスへの注射後に抗タンパク質ELISAアッセイを用いて測定したときの、12種の糖コンジュゲート、PhtD、dPly及びPE-PilAを含む組成物(12V+prot)の免疫原性と、PhtD、dPly及びPE-PilAのみを含む組成物(prot)の免疫原性とを比較したグラフを示す図である。GMC=幾何平均濃度。IC=信頼区間。
【図１７】モルモットへの注射後にオプソニン食作用アッセイを用いて測定したときの、12種の糖コンジュゲート、PhtD、dPly及びPE-PilAを含む組成物(12V+prot)の免疫原性と、12種の糖コンジュゲートを含む組成物(12V)及び10種の糖コンジュゲートを含む組成物(10V)の免疫原性とを比較したグラフを示す図である。GMT=幾何平均力価。
【図１８】モルモットへの注射後に抗糖ELISAを用いて測定したときの、12種の糖コンジュゲート、PhtD、dPly及びPE-PilAを含む組成物(12V+prot)の免疫原性と、12種の糖コンジュゲートを含む組成物(12V)及び10種の糖コンジュゲートを含む組成物(10V)の免疫原性とを比較したグラフを示す図である。GMC=幾何平均濃度。IC=信頼区間。
【図１９】モルモットへの注射後に抗タンパク質ELISAを用いて測定したときの、12種の糖コンジュゲート、PhtD、dPly及びPE-PilAを含む組成物(12V+prot)の免疫原性と、PhtD、dPly及びPE-PilAのみを含む組成物(prot)の免疫原性とを比較したグラフを示す図である。GMC=幾何平均濃度。IC=信頼区間。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
第一の態様において、本発明は、ヒト用量あたり、26μg〜45μg(例えば、26μg〜40μg、27μg〜39μg、27μg〜37μg、28μg〜35μg、29μg〜33μg、又は約30μg)のニューモリシンを含む免疫原性組成物に関する。一実施形態において、ニューモリシンは化学的に解毒されている。さらなる実施形態において、ニューモリシンは遺伝子的に解毒されている。一実施形態において、組成物はPhtD(ポリヒスチジントライアドタンパク質D)をさらに含む。さらなる実施形態において、組成物は、ヒト用量あたり、26μg〜45μg(例えば、26μg〜40μg、27μg〜39μg、27μg〜37μg、28μg〜35μg、29μg〜33μg、又は約30μg)の解毒されたPhtDを含む。
【００１８】
第二の態様において、本発明は、ヒト用量あたり、26μg〜45μg(26μg〜40μg、27μg〜39μg、27μg〜37μg、28μg〜35μg、29μg〜33μg、又は約30μg)のPhtDを含む免疫原性組成物に関する。一実施形態において、PhtDは、国際公開第WO00/37105号(参照により本明細書に組み込まれる)の配列番号4のアミノ酸21〜838の配列に対して少なくとも85％、90％、95％、98％、99％又は100％同一なアミノ酸配列を含む(国際公開第WO00/37105号の配列番号4のアミノ酸21〜828は、本願の図13における配列番号1の配列を有する)。さらなる実施形態において、組成物は、解毒されたニューモリシン(dPly)をさらに含む。さらなる実施形態において、組成物は、ヒト用量あたり、26μg〜45μg(26μg〜40μg、27μg〜39μg、27μg〜37μg、28μg〜35μg、29μg〜33μg、又は約30μg)の解毒されたニューモリシン(dPly)を含む。
【００１９】
ニューモリシン
ニューモリシン又は「Ply」とは、肺炎球菌由来の天然若しくは野生型ニューモリシン、組換えニューモリシン、並びにその断片及び/又は変異体を意味する。一実施形態において、ニューモリシンは肺炎球菌由来の天然若しくは野生型ニューモリシン、又は組換えニューモリシンである。
【００２０】
Plyは、53kDaの膜孔形成毒素であり、それ自体は、多数の哺乳動物細胞型に溶解効果を有し、溶解濃度以下で、Plyは、抗ニューモリシン抗体の非存在下での補体活性化、及び炎症誘発性メディエータの誘導を含む、多数の他の効果を有する(Hirstら、2000、Mitchell & Andrew、1997、Patonら、1984、Zyskら、2001)。補体活性化は、該毒素の溶血活性とは独立している(Berryら、1995)。現在、ニューモリシンは、Toll様受容体4(TLR-4)と直接相互作用し、骨髄分化マーカー88を介してシグナル伝達を行って、腫瘍壊死因子アルファとインターロイキン6の産生を誘導することが知られている(Malleyら、2003、Trzcinskiら、2008)。ニューモリシンは、血清型及び遺伝子型に関わらずに、肺炎連鎖球菌の公知の全ての臨床分離菌によって産生される。野生型又は天然ニューモリシンの発現及びクローニングは当該技術分野で公知である。例えば、Walkerら(Infect Immun、55:1184〜1189(1987))、Mitchellら(Biochim Biophys Acta、1007:67〜72(1989)及びMitchellら(NAR、18:4010(1990))を参照されたい。国際公開第WO2010/071986号(参照により本明細書に組み込まれる)には、野生型Ply、例えば、配列番号2〜42(例えば配列番号34、35、36、37、41)が記載されている。一態様において、ニューモリシンは国際公開第WO2010/071986号の配列番号34である。別の態様において、ニューモリシンは国際公開第WO2010/071986号の配列番号35である。別の態様において、ニューモリシンは国際公開第WO2010/071986号の配列番号36である。別の態様において、ニューモリシンは国際公開第WO2010/071986号の配列番号37である。別の態様において、ニューモリシンは国際公開第WO2010/071986号の配列番号41である。さらに、EP1601689B1には、肺炎球菌ニューモリシンなどの細菌の細胞溶解素を、界面活性剤と高塩濃度の存在下でのクロマトグラフィーによって、精製する方法が記載されている。
【００２１】
一実施形態において、用語「ニューモリシン」は、野生型配列と比較して、核酸又はアミノ酸配列に差異がある、ニューモリシンの断片及び/又は変異体を含む。ニューモリシンの断片を用いる場合、これらの断片は、長さにして少なくとも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約40個、又は少なくとも約60個の連続したアミノ酸残基である。本発明の一実施形態において、ニューモリシンの免疫原性断片は、全長配列の少なくとも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約40個、又は少なくとも約60個の連続したアミノ酸残基を含み、ここで、前記ポリペプチドは、前記アミノ酸配列に特異的な免疫応答を誘発することが可能である。ニューモリシンは、4つの主要な構造ドメインからなることが知られている(Rossjohnら  Cell.1997年5月30日、89(5):685〜92)。これらのドメインは、これらのドメインの1つ以上を除去及び/又は修飾することによって、改変してよい。一実施形態において、該断片又は各断片は、ちょうど又は少なくとも1つ、2つ若しくは3つのドメインを含む。別の実施形態において、該断片又は各断片は、ちょうど又は少なくとも2つ若しくは3つのドメインを含む。別の実施形態では、該断片又は各断片は少なくとも3つのドメインを含む。該断片又は各断片は野生型ニューモリシン配列に対して50％超、60％超、70％超、80％超、90％超、95％超、98％超、99％超又は100％同一であり得る。
【００２２】
本発明において、ニューモリシンの変異体は、野生型配列と比べて、1つ以上のアミノ酸が置換及び/又は欠失及び/又は挿入されている配列を含む。アミノ酸置換は、保存的又は非保存的であってよい。一態様において、アミノ酸置換は保存的である。置換、欠失、挿入又はこれらの任意の組み合わせは、変異体が免疫原性ポリペプチドである限り、単一の変異体内で組み合わせることができる。ニューモリシンの変異体は、典型的に、野生型ニューモリシン配列、例えば、国際公開第WO2010/071986号の配列番号2〜42(例えば、配列番号34、35、36、37、41)に対して少なくとも80、90、94、95、98又は99％のアミノ酸配列同一性を有する任意のニューモリシン又は任意のニューモリシン断片を含む。一実施形態において、ニューモリシンの変異体は、典型的に、国際公開第WO2010/071986号の配列番号36に対して少なくとも80、90、94、95、98又は99％のアミノ酸配列同一性を有する任意のニューモリシン又は任意のニューモリシン断片を含む。一実施形態において、本発明は、数個、5〜10個、1〜5個、1〜3個、1〜2個、1個、最大10個、最大20個、最大30個又は最大50個のアミノ酸が任意の組み合わせで置換、欠失又は付加された断片及び/又は変異体を含む。別の実施形態において、本発明は、B細胞又はT細胞エピトープを含む断片及び/又は変異体を含む。このようなエピトープは、例えば、PSIPREDプログラム(David Jones、Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences、Brunel University、Uxbridge UB8 3PH、UKから提供)を用いる、2D構造予測と、Jameson及びWolf(CABIOS 4:181〜186[1988])に記載の方法に基づいて算出される抗原指数との組み合わせを用いて、予測し得る。ニューモリシンの変異体は、例えば、国際公開第WO04/43376号、国際公開第WO05/108580号、国際公開第WO05/076696号、国際公開第WO10/071986号、国際公開第WO10/109325号(これら全ては参照により本明細書に組み込まれる)(配列番号44、45及び46)並びに国際公開第WO10/140119号(参照により本明細書に組み込まれる)(配列番号50及び51)に記載されている。一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ニューモリシンの変異体、例えば国際公開第WO05/108580号、国際公開第WO05/076696号、国際公開第WO10/071986号に記載されるものを含む。
【００２３】
本明細書中で使用される用語「断片」は、宿主動物において体液性及び/又は細胞性免疫応答を誘発することができる部分である。タンパク質の断片は、当該技術分野において公知の技術を用いて、例えば、組換え的に、タンパク質分解消化によって、又は化学合成によって生成することができる。ポリペプチドの内部又は末端断片は、ポリペプチドをコードする核酸の一端から(末端断片の場合)又は両端から(内部断片の場合)、1つ以上のヌクレオチドを除去することによって生成することができる。典型的に、断片は、全長配列の少なくとも10、20、30、40又は50個の連続したアミノ酸を含む。断片は、N末端とC末端のいずれか一方又は両方から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40又は50個のアミノ酸を追加又は除去することによって容易に改変し得る。
【００２４】
本明細書中で使用される用語「保存的アミノ酸置換」は、天然のアミノ酸残基を、その位置のアミノ酸残基の大きさ、極性、電荷、疎水性又は親水性に影響がほとんどない又は全くないように、かつ免疫原性の低下をもたらすことなく、非天然の残基で置換することを含む。例えば、これらは、次のグループ内での置換であり得る: バリン、グリシン; グリシン、アラニン; バリン、イソロイシン、ロイシン; アスパラギン酸、グルタミン酸; アスパラギン、グルタミン; セリン、トレオニン; リシン、アルギニン; 及びフェニルアラニン、チロシン。ポリペプチドの配列への保存的アミノ酸改変(及びコード化ヌクレオチドへの対応する改変)は、親ポリペプチドと同様の機能的及び化学的特性を有するポリペプチドを生成し得る。
【００２５】
本明細書中で使用される用語「欠失」は、タンパク質配列から1つ以上のアミノ酸残基が除去されることである。典型的には、約1〜6個以下の残基(例えば、1〜4個の残基)がタンパク質分子内のいずれか1つの部位で欠失される。
【００２６】
本明細書中で使用される用語「挿入」は、タンパク質配列中に1つ以上の非天然のアミノ酸残基が追加されることである。典型的には、約1〜6個以下の残基(例えば、1〜4個の残基)がタンパク質分子内のいずれか1つの部位に挿入される。
【００２７】
本発明の一実施形態において、ニューモリシンとその断片及び/又は変異体は、ニューモリシンの野生型配列、例えば、国際公開第WO2010/071986号の配列番号34、35、36、37、41に対して少なくとも80、85、90、95、98、99又は100％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。本発明の別の実施形態において、ニューモリシンとその断片及び/又は変異体は、ニューモリシンの野生型配列の少なくとも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約40個、又は少なくとも約60個の連続したアミノ酸残基を含む。
【００２８】
ニューモリシンは、解毒された(すなわち、防御に適した投与量で与えられる場合にヒトに対して無毒性にされた)後で投与される。本明細書中で使用するとき、用語「dPly」は、医療用途に適する解毒された(すなわち、無毒性の)ニューモリシンを指すことが理解される。ニューモリシンは、化学的及び/又は遺伝子的に解毒し得る。ニューモリシンの解毒は、化学的手段によって、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなどの架橋剤、並びにN-ヒドロキシスクシンイミドエステル及び/又はマレイミド基を含有する架橋試薬(例えば、GMBS)、又はこれらの組み合わせを用いて行うことができる。一実施形態において、ニューモリシンは、ホルムアルデヒドへの曝露によって解毒される。このような方法は、種々の毒素について当該技術分野において周知であり、例えば、EP1601689B1、国際公開第WO04/081515号、国際公開第WO2006/032499号を参照されたい。化学的解毒に用いられるニューモリシンは、天然若しくは組換えタンパク質、又はその毒性を軽減するために遺伝子操作されたタンパク質(下記参照)であり得る。ニューモリシンの融合タンパク質又はニューモリシンの断片及び/若しくは変異体もまた、化学的手段によって解毒し得る。したがって、一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、例えば、ホルムアルデヒド処理によって、化学的に解毒されたニューモリシンを含んでよい。
【００２９】
ニューモリシンは、遺伝子的に解毒することも可能である。したがって、本発明は、例えば変異型タンパク質であり得る、肺炎球菌タンパク質を包含する。用語「変異型」は、例えば、周知の部位特異的変異誘発の技術又は他のいずれかの従来方法を用いることによって、1つ以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12個のアミノ酸)の欠失、付加又は置換を受けた分子を意味するために本明細書中で用いられる。一実施形態において、分子は、1〜15個、適切には10〜15個のアミノ酸の欠失又は置換を受けている。変異型配列は、ヒトへの投与後に抗ニューモリシン防御及び/又は中和抗体を誘導する能力を保持しながら、毒性を軽減する目的で、例えば膜透過、細胞溶解、及びヒト赤血球や他の細胞に対する細胞溶解活性といった望ましくない活性を取り除き得る。ニューモリシンの融合タンパク質又はニューモリシンの断片及び/若しくは変異体も遺伝子的手段によって解毒してよい。これらの改変はいずれも、標準的な分子生物学的及び生化学的技術を用いて導入し得る。例えば、上述したように、変異型ニューモリシンタンパク質は、その免疫原性エピトープをまだ維持しながら、生物学的に不活性であるように改変してよく、例えば、国際公開第WO90/06951号、Berryら(Infect Immun、67:981〜985(1999))及び国際公開第WO99/03884号を参照されたい。例えば、ニューモリシンタンパク質は、T65からCへの、G293からCへの、及びC248からAへの置換を含む3箇所のアミノ酸置換によって解毒され得る。本発明で用いることができる、遺伝子的に解毒されたニューモリシンの別の例は、国際公開第WO2011/075823号(参照により本明細書に組み込まれる)の配列番号9である。このようにして、さらなる実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、遺伝子的に解毒されたニューモリシンを含んでもよい。
【００３０】
ニューモリシンを解毒するために、技術の組み合わせを用いてもよい。例えば、本発明の免疫原性組成物は、化学的及び遺伝子的に解毒されたニューモリシンを含み得る。
【００３１】
PhtD
本明細書中で使用される用語「PhtD」(ポリヒスチジントライアドD)は、シグナル配列が結合されている全長タンパク質、又はシグナルペプチド(例えばN末端の20アミノ酸)が除去されている成熟全長タンパク質、並びにその断片、変異体及び/又は融合タンパク質、例えば、国際公開第WO00/37105号の配列番号4を含む。PhtDは「Sp036D」とも呼ばれる。一態様では、PhtDはシグナル配列が結合されている全長タンパク質であり、例えば、国際公開第WO00/37105号の配列番号4である。別の態様では、PhtDは、シグナルペプチド(例えばN末端の20アミノ酸)が除去されている成熟全長タンパク質を含む配列であり、例えば、国際公開第WO00/37105号の配列番号4のアミノ酸21〜838(又は本出願の配列番号1)である。好適には、PhtD配列は、N末端メチオニンを含む。本発明はまた、例えば、国際公開第WO00/37105号、国際公開第WO00/39299号、米国特許第6,699,703号及び国際公開第WO09/12588号に記載されるような、PhtDの免疫原性断片、PhtDの変異体及び/又はPhtDの融合タンパク質であるPhtDポリペプチドを含む。
【００３２】
PhtDタンパク質の断片が(別個に又は融合タンパク質の一部として)用いられる場合、これらの断片は、例えば、国際公開第WO00/37105号又は国際公開第WO00/39299号におけるPhtDアミノ酸配列、例えば国際公開第WO00/37105号の配列番号4からの少なくとも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約40個、又は少なくとも約60個の連続したアミノ酸残基の長さである。本発明の一実施形態において、PhtDタンパク質の免疫原性断片は、国際公開第WO00/37105号の配列番号4に示される配列の少なくとも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約40個、又は少なくとも約60個の連続したアミノ酸残基を含み、ここで、前記ポリペプチドは前記アミノ酸配列に特異的な免疫応答を誘発することが可能である。一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、例えば、国際公開第WO09/12601号、国際公開第WO01/98334号及び国際公開第WO09/12588号に記載されるPhtDの断片を含む。PhtDタンパク質の断片が(別個に又は融合タンパク質の一部として)用いられる場合、各断片は、場合により、このようなポリペプチドの1つ以上のヒスチジントライアドモチーフを含有する。ヒスチジントライアドモチーフは、配列HxxHxH(配列番号2)を有するポリペプチドの部分であり、ここで、Hはヒスチジンであり、xはヒスチジン以外のアミノ酸である。本発明の一実施形態において、該断片又は各断片は、ちょうど又は少なくとも2つ、3つ、4つ若しくは5つのヒスチジントライアドモチーフ(場合により、2つ以上のトライアド間の天然のPhtD配列、又はトライアド内配列を有する)を含有し、この場合、該断片は天然の肺炎球菌トライアド内PhtD配列(例えば国際公開第WO00/37105号の配列番号4に示されるトライアド内配列)に対して50％超、60％超、70％超、80％超、85％超、90％超、95％超、98％超、99％超又は100％同一である。PhtDタンパク質の断片は、場合により、このようなポリペプチドの1つ以上のコイルドコイル領域を含有する。コイルドコイル領域は、「Coils」アルゴリズム(Lupus, Aら(1991)Science 252、1162〜1164)により予測される領域である。本発明の一実施形態において、該断片又は各断片は、ちょうど又は少なくとも2つ、3つ若しくは4つのコイルドコイル領域を含有する。本発明の一実施形態において、該断片又は各断片は、ちょうど又は少なくとも2つ、3つ若しくは4つのコイルドコイル領域を含有し、この場合、該断片は天然の肺炎球菌PhtD配列(例えば国際公開第WO00/37105号の配列番号4に示される配列)に対して50％超、60％超、70％超、80％超、90％超、95％超、96％超、98％超、99％超又は100％同一である。本発明の別の実施形態において、該断片又は各断片は、1つ以上のヒスチジントライアドモチーフだけでなく、少なくとも1つ、2つ、3つ又は4つのコイルドコイル領域をも含む。
【００３３】
PhtDポリペプチドが変異体である場合には、その変異は、一般的に、ヒスチジントライアド残基及びコイルドコイル領域以外のその部分にあるが、これらの領域の1つ以上に変異があってもよい。本発明において、ポリペプチド変異体は、野生型配列と比較して、1個以上のアミノ酸が置換及び/又は欠失及び/又は挿入された配列を含む。アミノ酸置換は保存的又は非保存的であり得る。一態様において、アミノ酸置換は保存的である。置換、欠失、挿入又はこれらの任意の組み合わせは、変異体が免疫原性ポリペプチドである限り、単一の変異体内で組み合わせることができる。PhtDの変異体は、典型的には、野生型PhtD配列、例えば国際公開第WO00/37105号の配列番号4に対して少なくとも80、90、95、96、98又は99％のアミノ酸配列同一性を有するPhtDの任意の断片又は変異体を含む。一実施形態において、本発明は、数個、5〜10個、1〜5個、1〜3個、1〜2個、1個、最大10個、最大20個、最大30個又は最大50個のアミノ酸が任意の組み合わせで置換、欠失又は付加された断片及び/又は変異体を含む。別の実施形態において、本発明は、B細胞又はT細胞エピトープを含む断片及び/又は変異体を含む。このようなエピトープは、例えば、PSIPREDプログラム(David Jones、Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences、Brunel University、Uxbridge UB8 3PH、UKから提供)を用いる、2D構造予測と、Jameson及びWolf(CABIOS 4:181〜186[1988])に記載の方法に基づいて算出される抗原指数の組み合わせを用いて予測し得る。変異体は、従来の分子生物学的技術によって生成することができる。本明細書中で用いる変異体はまた、相同なPhtD遺伝子内の1つ以上の部位で多型を示す別の連鎖球菌株からの天然に存在するPhtD対立遺伝子を含み得る。
【００３４】
本発明の一実施形態において、PhtD並びにその断片、変異体及び/又は融合タンパク質は、国際公開第WO00/37105号の配列番号4のアミノ酸配列21〜838に対して少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99又は100％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の別の実施形態において、PhtD並びにその断片、変異体及び/又は融合タンパク質は、国際公開第WO00/37105号の配列番号4のアミノ酸配列21〜838に対して少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99又は100％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。好適には、PhtD並びにその断片、変異体及び/又は融合タンパク質は、N末端メチオニンをもつアミノ酸配列を含む。本発明の別の実施形態において、PhtD並びにその断片、変異体及び/又は融合タンパク質は、国際公開第WO00/37105号の配列番号4に示される配列の少なくとも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約40個、又は少なくとも約60個、又は少なくとも約100個、又は少なくとも約200個、又は少なくとも約400個、又は少なくとも約800個の連続したアミノ酸残基を含む。
【００３５】
本発明の一実施形態において、PhtD並びにその断片、変異体及び/又は融合タンパク質は、国際公開第WO00/39299号(参照により本明細書に組み込まれる)の配列番号73のアミノ酸配列に対して少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99又は100％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の別の実施形態において、PhtD並びにその断片、変異体及び/又は融合タンパク質は、国際公開第WO00/39299号の配列番号73のアミノ酸配列に対して少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99又は100％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。本発明の別の実施形態において、PhtD並びにその断片、変異体及び/又は融合タンパク質は、国際公開第WO00/39299号の配列番号73に示される配列の少なくとも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約40個、又は少なくとも約60個、又は少なくとも約100個、又は少なくとも約200個、又は少なくとも約400個、又は少なくとも約800個の連続したアミノ酸残基を含む。本発明の別の実施形態において、PhtD配列は、国際公開第WO2011/075823号の配列番号1又は5である。
【００３６】
本発明はまた、アミノ酸配列に関係しない形で天然に存在する肺炎連鎖球菌ポリペプチドとは異なるPhtDタンパク質を含む。非配列修飾には、アセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化、又はグリコシル化の変更が含まれる。本発明の範囲内には、ペプチドの安定性を高める修飾を有するものもあり、こうした類似体は、例えば、ペプチド配列に1つ以上の非ペプチド結合(ペプチド結合に取って代わる結合)を含有してもよい。本発明の範囲内には、天然に存在するL-アミノ酸以外の残基、例えば、D-アミノ酸又は天然に存在しない若しくは合成のアミノ酸、例えば、β又はγアミノ酸、及び環状類似体を含む類似体もある。
【００３７】
投薬量
本明細書中で使用される用語「ヒト用量」とは、ヒト使用に適した体積中にある投薬量を意味する。一般的に、ヒト患者に投与される最終投薬体積(ワクチン組成物体積)は、0.25〜1.5ml、0.2〜1.0ml、又は0.4〜0.6mlであり得る。一実施形態において、ヒト用量は0.5mlである。さらなる実施形態において、ヒト用量は、0.5mlより多く、例えば、0.6、0.7、0.8、0.9又は1mlである。さらなる実施形態において、ヒト用量は、1mlと1.5mlの間である。別の実施形態において、特に免疫原性組成物が小児集団用である場合、ヒト用量は0.5ml未満、例えば、0.25と0.5mlの間であり得る。
【００３８】
さらなるコンジュゲートされていない又はコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌タンパク質
本発明の免疫原性組成物は、少なくとも1種のさらなるコンジュゲートされていない又はコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌タンパク質を含んでもよい。本出願の目的のため、肺炎連鎖球菌(S.pneumoniae)及び肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)なる用語は、互換可能であって、互いに同等であると見なされる。一実施形態において、少なくとも1種のさらなるコンジュゲートされていない又はコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌タンパク質は、ポリヒスチジントライアドファミリー(PhtX)、コリン結合タンパク質ファミリー(CbpX)、CbpXトランケート、LytX(自己溶菌酵素)ファミリー、LytXトランケート、CbpXトランケート-LytXトランケートキメラタンパク質、PcpA(肺炎球菌コリン結合タンパク質A)、PspA(肺炎球菌表面タンパク質A)、PsaA(肺炎球菌表面接着タンパク質A)、Sp128(肺炎連鎖球菌128)、Sp101(肺炎連鎖球菌101)、Sp130(肺炎連鎖球菌130)、SP125(肺炎連鎖球菌125)及びSP133(肺炎連鎖球菌133)からなる群から選択される。さらなる実施形態において、少なくとも1種のさらなるコンジュゲートされていない又はコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌タンパク質は、コリン結合タンパク質ファミリー(CbpX)、CbpXトランケート、LytXファミリー、LytXトランケート、CbpXトランケート-LytXトランケートキメラタンパク質、PcpA、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、SP125及びSP133からなる群から選択される。
【００３９】
Pht(ポリヒスチジントライアド)ファミリーは、タンパク質PhtA(ポリヒスチジントライアドファミリーA)、PhtB(ポリヒスチジントライアドファミリーB)、PhtD(ポリヒスチジントライアドファミリーB)、及びPhtE(ポリヒスチジントライアドファミリーE)を含む。ポリヒスチジントライアドファミリーはまた、肺炎球菌ヒスチジントライアドファミリーとして知られ、したがって、用語「ポリヒスチジントライアド」及び「肺炎球菌ヒスチジントライアド」は互換可能であり、互いに同等であると見なされる。このファミリーは、脂質付加配列、プロリンリッチ領域と数個のヒスチジントライアドによって分離された2つのドメイン(おそらく金属若しくはヌクレオシド結合又は酵素活性に関与する)、(3〜5つの)コイルドコイル領域、保存されたN末端及び不均一のC末端によって特徴付けられる。これは、試験した全ての肺炎球菌株に存在する。相同タンパク質はまた、他の連鎖球菌及びナイセリア属(Neisseria)において見出されている。本発明の一実施形態において、本発明のPhtタンパク質はPhtDである。しかしながら、用語PhtA、B、D、及びEは、以下の引用文献に開示された配列を有するタンパク質、並びに参照タンパク質に対して少なくとも90％同一である配列相同性を有するその天然に存在する(及び人工の)変異体を指すことが理解される。場合により、それは、少なくとも95％同一である又は少なくとも97％同一である。
【００４０】
PhtXタンパク質に関して、PhtAは、国際公開第WO98/18930号に開示され、Sp36とも呼ばれる。上記の通り、これは、ポリヒスチジントライアドファミリー由来のタンパク質であり、LXXC(配列番号3)のII型シグナルモチーフを有する。PhtDは、国際公開第WO00/37105号に開示され、Sp036Dとも呼ばれる。上記の通り、これはまた、ポリヒスチジントライアドファミリー由来のタンパク質であり、II型LXXCシグナルモチーフを有する。PhtBは、国際公開第WO00/37105号に開示され、Sp036Bとも呼ばれる。PhtBファミリーの別のメンバーは、国際公開第WO00/17370号に開示されるように、C3分解ポリペプチドである。このタンパク質もまた、ポリヒスチジントライアドファミリー由来であり、II型LXXCシグナルモチーフを有する。例えば、免疫学的に機能性の均等物は、国際公開第WO98/18930号に開示されるタンパク質Sp42である。PhtBトランケート(およそ79kD)は、国際公開第WO99/15675号に開示され、これもまたPhtXファミリーのメンバーと見なされる。PhtEは、国際公開第WO00/39299号に開示され、BVH-3と呼ばれる。いずれかのPhtタンパク質が本明細書において言及される場合、Phtタンパク質の免疫原性断片又はその融合体を用いることができることを意味する。例えば、PhtXへの言及は、いずれかのPhtタンパク質由来の免疫原性断片又はその融合体を含む。また、PhtD又はPhtBへの言及は、例えば、国際公開第WO0198334号に見出されるように、PhtDE又はPhtBE融合体への言及である。
【００４１】
コリン結合タンパク質ファミリー(CbpX)に関して、このファミリーのメンバーは、コリンアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る肺炎球菌タンパク質として元々は同定された。全てのコリン結合タンパク質は、細胞壁テイコ酸及び膜結合リポテイコ酸のホスホリルコリン部分に非共有結合している。構造的に、それらは、ファミリー全体にわたって共通するいくつかの領域を有するが、これらのタンパク質の正確な性質(アミノ酸配列、長さなど)は変化し得る。一般的に、コリン結合タンパク質は、N末端領域(N)、保存された反復領域(R1及び/又はR2)、プロリンリッチ領域(P)、及びこのタンパク質のおよそ半分を占める、複数の反復領域で構成された保存されたコリン結合領域(C)を含む。本出願中で使用するとき、用語「コリン結合タンパク質ファミリー(CbpX)」は、国際公開第WO97/41151号で同定されたコリン結合タンパク質、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD、及びCbpGからなる群から選択される。CbpAは国際公開第WO97/41151号に開示される。CbpD及びCbpGは国際公開第WO00/29434号に開示される。PspCは国際公開第WO97/09994号に開示される。PbcAは国際公開第WO98/21337号に開示される。SpsAは国際公開第WO98/39450号に開示されるコリン結合タンパク質である。場合により、コリン結合タンパク質は、CbpA、PbcA、SpsA及びPspCからなる群から選択される。
【００４２】
本発明の一実施形態は、CbpXトランケートを含み、ここで、「CbpX」は先に定義されており、「トランケート」はコリン結合領域(C)の50％以上を欠損しているCbpXタンパク質を指す。場合により、このようなタンパク質はコリン結合領域全体を欠損している。場合により、このようなタンパク質トランケートは、(i)コリン結合領域、及び(ii)該タンパク質のN末端側半分の部分も欠損しているが、なおも少なくとも1つの反復領域(R1又はR2)を保持する。場合により、トランケートは2つの反復領域(R1及びR2)を有する。このような実施形態の例は、国際公開第WO99/51266号又は国際公開第WO99/51188号に示されるNR1xR2及びR1xR2であるが、しかしながら、同様のコリン結合領域を欠損している他のコリン結合タンパク質も本発明の範囲内であることが想定される。
【００４３】
LytXファミリーは、細胞溶解と関連付けられる膜結合型タンパク質である。そのN末端ドメインはコリン結合ドメイン(単数又は複数)を含むが、しかしながら、LytXファミリーは上記のCbpAファミリーに見られる特性を全て備えているわけではなく、したがって、本発明では、LytXファミリーはCbpXファミリーと異なると見なされる。CbpXファミリーと対照的に、C末端ドメインは、LytXタンパク質ファミリーの触媒ドメインを含有する。このファミリーにはLytA、B及びCが含まれる。LytXファミリーに関して、LytAは、Rondaら、Eur J Biochem、164:621〜624(1987)に開示される。LytBは、国際公開第WO98/18930号に開示され、Sp46とも呼ばれる。LytCもまた、国際公開第WO98/18930号に開示され、Sp91とも呼ばれる。本発明の一実施形態はLytCを含む。
【００４４】
別の実施形態はLytXトランケートを含み、ここで、「LytX」は先に定義されており、「トランケート」はコリン結合領域の50％以上を欠損しているLytXタンパク質を指す。場合により、このようなタンパク質はコリン結合領域全体を欠損している。本発明のさらに別の実施形態は、CbpXトランケート-LytXトランケートキメラタンパク質(又は融合体)を含む。場合により、これは、CbpXのNR1xR2(又はR1xR2)及びLytXのC末端部分(Cterm、すなわちコリン結合ドメインを欠損している)(例えば、LytCCterm又はSp91Cterm)を含む。場合により、CbpXは、CbpA、PbcA、SpsA及びPspCからなる群から選択される。場合により、それはCbpAである。場合により、LytXはLytC(Sp91とも呼ばれる)である。本発明の別の実施形態は、コリン結合ドメイン(C)を欠損し、LytXとの融合タンパク質として発現される、PspA又はPsaAトランケートである。場合により、LytXはLytCである。
【００４５】
PsaA及びPspAに関して、いずれも当該技術分野において公知である。例えば、PsaA及びその膜貫通領域欠失変異体は、Berry & Paton、Infect Immun 1996年12月、64(12):5255〜62に記載されている。PspA及びその膜貫通領域欠失変異体は、例えば、米国特許第5,804,193号、国際公開第WO92/14488号、及び国際公開第WO99/53940号に開示されている。
【００４６】
PcpAに関して、このタンパク質は当該技術分野において公知であり、例えば、PcpAは国際公開第WO2011/075823号に記載されている。用語「PcpA」は、国際公開第WO2011/075823号(参照により本明細書に組み込まれる)の配列番号2若しくは7に対して少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％又は100％の同一性を含むタンパク質、あるいは国際公開第WO2011/075823号の配列番号2若しくは7の少なくとも100個、150個、200個、250個又はそれ以上の連続したアミノ酸の断片を指す。
【００４７】
Sp128及びSp130は国際公開第WO00/76540号に開示される。Sp125は、LPXTG(配列番号4)(ここで、Xは任意のアミノ酸である)の細胞壁アンカーモチーフを有する肺炎球菌表面タンパク質の一例である。このモチーフを有する肺炎球菌表面タンパク質のこのクラス内のタンパク質はいずれも、本発明において有用であることが見出され、したがって、本発明のさらなるタンパク質と考えられる。Sp125それ自体は国際公開第WO98/18930号に開示され、ZmpB-亜鉛メタロプロテイナーゼとしても知られている。Sp101は国際公開第WO98/06734号(そこでは、それは参照番号y85993を有する)に開示される。それはI型シグナル配列によって特徴付けられる。Sp133は国際公開第WO98/06734号(そこでは、それは参照番号y85992を有する)に開示される。これもまた、I型シグナル配列により特徴付けられる。
【００４８】
これらのさらなる肺炎連鎖球菌タンパク質のいずれも、非コンジュゲート形態又はコンジュゲート形態で存在してよい。1種以上の肺炎連鎖球菌タンパク質は、場合により、肺炎連鎖球菌糖(以下の肺炎連鎖球菌糖コンジュゲートと題する節で説明される)にコンジュゲートされる。場合により、1種以上の肺炎連鎖球菌タンパク質は、異なる細菌由来の糖にコンジュゲートされる。
【００４９】
この文脈で「〜にコンジュゲートされる」という用語は、タンパク質が糖に共有結合することを意味し、この状況では、タンパク質は担体タンパク質として機能している。
【００５０】
一実施形態において、少なくとも1種のさらなるコンジュゲートされていない又はコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌タンパク質は、PhtB、PhtE、PhtA、並びにPhtBD若しくはPhtDE融合タンパク質からなる群から選択されるポリヒスチジンファミリー(PhtX)タンパク質を含む。
【００５１】
一実施形態において、組成物は、タンパク質あたり、ヒト用量あたり、1μg〜100μg、1μg〜75μg、1μg〜50μg、1μg〜25μg、1μg〜20μg、5μg〜15μg、25μg〜40μg、28μg〜35μg、約10μg又は約30μgの少なくとも1種のさらなるコンジュゲートされていない又はコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌タンパク質を含む。
【００５２】
肺炎連鎖球菌の莢膜糖コンジュゲート
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、1種以上(例えば、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、又は23種)の肺炎連鎖球菌の莢膜糖コンジュゲートをさらに含む。莢膜糖なる用語は、莢膜多糖に由来し得る莢膜の多糖及びオリゴ糖を含む。オリゴ糖は、少なくとも4個の糖残基を含有する。コンジュゲート及びコンジュゲートされたなる用語は、担体タンパク質に共有結合した莢膜糖に関連する。
【００５３】
場合により、糖血清型の総数は、23個以下であり、場合により、免疫原性組成物は、10〜23種の血清型、10〜16種の血清型、10〜15種の血清型、10〜14種の血清型、10〜13種の血清型又は10〜12種の血清型を含む。
【００５４】
一実施形態において、本発明の1種以上の肺炎連鎖球菌の莢膜糖コンジュゲートは、以下の血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及び33Fから選択される血清型由来の糖を含むが、1種又は2種の他の血清型を、免疫原性組成物を受けるレシピエントの年齢、及びワクチンが投与される地理的位置に応じて、代わりに使用してもよいことが理解される。例えば、7価の免疫原性組成物は、血清型4、6B、9V、14、18C、19F及び23F由来の多糖を含んでもよい。10価の免疫原性組成物は、同じ7種の血清型由来の糖を含んでもよく、さらに血清型1、5及び7F由来の糖を含んでもよい。12価の免疫原性組成物は、同じ10種の血清型由来の糖を含んでもよく、さらに血清型6A及び19A由来の糖を含む。13価の免疫原性組成物は、同じ12種の血清型を含んでもよく、さらに血清型3を含んでもよい。15価の免疫原性組成物は、同じ13種の血清型由来の糖を含んでもよく、さらに血清型22F及び33F由来の糖を含んでもよい。
【００５５】
さらなる糖抗原、例えば、23価(例えば、血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及び33F)はまた本発明によって想定される。
【００５６】
用語「担体タンパク質」は、小さいペプチド及び大きいポリペプチド(10kDaを超える)の両方を包含することが意図される。担体タンパク質は、任意のペプチド又はタンパク質であってよい。それは、1つ以上のTヘルパーエピトープを含んでもよい。担体タンパク質は以下であってもよい: 破傷風トキソイド(TT)、破傷風トキソイド断片C、破傷風毒素の非毒性突然変異体[TTのこのような変異体は全て、本発明の目的にとって同じタイプの担体タンパク質であると考えられることに留意されたい]、N19などの破傷風毒素T細胞エピトープを含むポリペプチド(国際公開第WO2006/067632号)、ジフテリアトキソイド(DT)、CRM197(交差反応物質197)、ジフテリア毒素の他の非毒性突然変異体[CRM176、CRM197、CRM228、CRM45(Uchidaら、J.Biol.Chem.218、3838〜3844、1973); CRM9、CRM45、CRM102、CRM103及びCRM107(この場合、CRMは交差反応物質を表す)並びにNicholls及びYoule、Genetically Engineered Toxins、Frankel(編)、Maecel Dekker Inc、1992により記載された他の突然変異; 欠失、又はGlu-148からAsp、Gln若しくはSer、及び/又はAla158からGlyへの突然変異並びに米国特許第4,709,017号若しくは米国特許第4,950,740号に開示された他の突然変異; Lys516、Lys526、Phe530及び/若しくはLys534の少なくとも1つ又はそれ以上の残基の突然変異並びに米国特許第5,917,017号若しくは米国特許第6,455,673号に開示された他の突然変異; 又は米国特許第5,843,711号に開示された断片など](DTのこのような変異体は全て、本発明の目的にとって同じタイプの担体タンパク質であると考えられることに留意されたい)、肺炎球菌ニューモリシン(Kuoら(1995)Infect Immun 63、2706〜13)、OMPC(外膜タンパク質C)(髄膜炎菌外膜タンパク質-通常は髄膜炎菌(N. meningitidis)血清群Bから抽出される-EP0372501)、合成ペプチド(EP0378881、EP0427347)、熱ショックタンパク質(国際公開第WO93/17712号、国際公開第WO94/03208号)、百日咳タンパク質(国際公開第WO98/58668号、EP0471177)、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子若しくはホルモン(国際公開第WO91/01146号)、様々な病原体由来抗原に由来する複数のヒトCD4+ T細胞エピトープを含む人工タンパク質(Falugiら(2001)Eur J Immunol 31、3816〜3824)、例えば、N19タンパク質(Baraldoiら(2004)Infect Immun 72、4884〜7)、肺炎球菌表面タンパク質PspA(肺炎球菌表面タンパク質A)(国際公開第WO02/091998号)、鉄取込みタンパク質(国際公開第WO01/72337号)、クロストリジウム・ディフィシル(C.difficile)の毒素A若しくはB(国際公開第WO00/61761号)、インフルエンザ菌プロテインD(EP594610及び国際公開第WO00/56360号)、肺炎球菌PhtA(ポリヒスチジントライアドタンパク質A)(国際公開第WO98/18930号、Sp36とも呼ばれる)、肺炎球菌PhtD(ポリヒスチジントライアドタンパク質D)(上記PhtDの節に記載される)、肺炎球菌PhtB(ポリヒスチジントライアドタンパク質B)(国際公開第WO00/37105号に開示され、Sp036Bとも呼ばれる)、又はPhtE(ポリヒスチジントライアドタンパク質E)(国際公開第WO00/30299号に開示され、BVH-3と呼ばれる)。
【００５７】
一実施形態において、1種以上の肺炎連鎖球菌の莢膜糖コンジュゲートは、破傷風トキソイド(TT)、TTの断片C、ジフテリアトキソイド、CRM197(交差反応物質197)、解毒されたニューモリシン、プロテインD(インフルエンザ菌由来)、PhtD、PhtDE及びN19からなる群から独立して選択される担体タンパク質にコンジュゲートされる。さらなる実施形態において、1種以上の肺炎連鎖球菌の莢膜糖コンジュゲートは、全て独立してCRM197にコンジュゲートされる。
【００５８】
一実施形態において、免疫原性組成物は、プロテインDにコンジュゲートされた少なくとも1種の肺炎連鎖球菌の莢膜糖を含む。一実施形態において、コンジュゲートされた肺炎連鎖球菌糖の少数は、プロテインDにコンジュゲートされる。さらなる実施形態において、免疫原性組成物は、プロテインDにコンジュゲートされた1〜20、1〜18、1〜16、1〜14、1〜12、1〜10、1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、又は1〜2種の肺炎連鎖球菌の莢膜糖を含む。一実施形態において、免疫原性組成物は、ジフテリアトキソイドにコンジュゲートされた少なくとも1種の肺炎連鎖球菌の莢膜糖を含む。さらなる実施形態において、免疫原性組成物は19F糖コンジュゲートを含み、ここで19F糖はジフテリアトキソイドにコンジュゲートされる。一実施形態において、免疫原性組成物は、破傷風トキソイドにコンジュゲートされた少なくとも1種の肺炎連鎖球菌の莢膜糖を含む。さらなる実施形態において、免疫原性組成物は18C糖コンジュゲートを含み、ここで18C糖は破傷風トキソイドにコンジュゲートされる。
【００５９】
一実施形態において、免疫原性組成物は、プロテインD又はCRM197にコンジュゲートされた血清型1糖を含む。一実施形態において、免疫原性組成物は、プロテインD又はCRM197にコンジュゲートされた血清型4糖を含む。一実施形態において、免疫原性組成物は、プロテインD又はCRM197にコンジュゲートされた血清型5糖を含む。一実施形態において、免疫原性組成物は、プロテインD又はCRM197にコンジュゲートされた血清型6B糖を含む。一実施形態において、免疫原性組成物は、プロテインD又はCRM197にコンジュゲートされた血清型7F糖を含む。一実施形態において、免疫原性組成物は、プロテインD又はCRM197にコンジュゲートされた血清型9V糖を含む。一実施形態において、免疫原性組成物は、プロテインD又はCRM197にコンジュゲートされた血清型14糖を含む。一実施形態において、免疫原性組成物は、破傷風トキソイド又はCRM197にコンジュゲートされた血清型18C糖を含む。一実施形態において、免疫原性組成物は、ジフテリアトキソイド又はCRM197にコンジュゲートされた19F糖を含む。一実施形態において、免疫原性組成物は、プロテインD又はCRM197にコンジュゲートされた23F糖を含む。一実施形態において、免疫原性組成物は、CRM197にコンジュゲートされた19A糖を含む。一実施形態において、免疫原性組成物は、CRM197にコンジュゲートされた6A糖を含む。
【００６０】
一実施形態において、1種以上の肺炎連鎖球菌コンジュゲートは、プロテインDにコンジュゲートされた血清型1糖、プロテインDにコンジュゲートされた血清型4糖、プロテインDにコンジュゲートされた血清型5糖、プロテインDにコンジュゲートされた血清型6B糖、プロテインDにコンジュゲートされた血清型7F糖、プロテインDにコンジュゲートされた血清型9V糖、プロテインDにコンジュゲートされた血清型14糖、プロテインDにコンジュゲートされた血清型23F糖、破傷風トキソイドにコンジュゲートされた血清型18C糖及びジフテリアトキソイドにコンジュゲートされた19F糖を含む。
【００６１】
場合により、担体タンパク質と肺炎連鎖球菌糖の比率は、1:5〜5:1、1:2〜2.5:1、1:1〜2:1(w/w)である。一実施形態において、大部分のコンジュゲート、例えば、6、7、8、9種又はそれ以上のコンジュゲートは、1:1を超える、例えば、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1又は1.6:1である担体タンパク質と糖の比率を有する。
【００６２】
本明細書を通して、用語「糖」は、多糖又はオリゴ糖を示してよく、その両方を含む。多糖を細菌から単離し、公知の方法(例えば、EP497524及びEP497525を参照されたい)並びに場合によりマイクロ流体化によって、ある程度までサイズ変更し得る。多糖をサイズ変更して、多糖サンプルにおける粘度を低下させ、及び/又はコンジュゲート産物について濾過性を改善することができる。オリゴ糖は、少数の反復単位(典型的には、5〜30個の反復単位)を有し、典型的には加水分解された多糖である。
【００６３】
肺炎連鎖球菌の莢膜多糖は、最大で8個の糖残基を含有してもよい反復オリゴ糖単位を含む。重要な肺炎連鎖球菌血清型のオリゴ糖単位の概説については、JONES, Christopher. Vaccines based on the cell surface carbohydrates of pathogenic bacteria. An. Acad. Bras. Cienc.、2005年6月、77巻、2号、293〜324頁、ISSN 0001-3765を参照されたい。一実施形態において、莢膜糖抗原は完全長多糖であってよいが、しかしながら、他において、それは、1個のオリゴ糖単位であっても、又は反復オリゴ糖単位の天然の長さの糖鎖よりも短いものであってもよい。一実施形態において、ワクチン中に存在する全ての糖は多糖である。完全長多糖を「サイズ変更する」ことができ、すなわち、酸加水分解処理、過酸化水素処理、オリゴ糖断片を作製するためのemulsiflex(登録商標)、次いで過酸化水素処理によるサイズ変更又はマイクロ流体化などの様々な方法によって、それらのサイズを下げることができる。
【００６４】
コンジュゲーション
本発明の免疫原性組成物に存在する糖コンジュゲートは、いずれかのコンジュゲーション技術を用いて担体タンパク質にコンジュゲートされ得る。
【００６５】
一実施形態において、肺炎連鎖球菌糖は、リンカー、例えば、二官能性リンカーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。リンカーは、場合により、例えば、1つの反応性アミノ基及び1つの反応性カルボン酸基、2つの反応性アミノ基又は2つの反応性カルボン酸基を有する、ヘテロ二官能性又はホモ二官能性である。リンカーは、例えば、4〜20、4〜12、5〜10個の炭素原子を有する。可能性のあるリンカーは、ADHである。他のリンカーとしては、B-プロピオンアミド(国際公開第WO00/10599号)、ニトロフェニル-エチルアミン(Geverら(1979)Med. Microbiol. Immunol、165、171〜288)、ハロゲン化ハロアルキル(米国特許第4,057,685号)、グリコシド結合(米国特許第4,673,574号、米国特許第4,808,700号)、ヘキサンジアミン及び6-アミノカプロン酸(米国特許第4,459,286号)が挙げられる。一実施形態において、ADHは、血清型18Cに由来する糖をコンジュゲートするためのリンカーとして用いられる。
【００６６】
本発明の免疫原性組成物に存在する糖コンジュゲートは、任意の公知のカップリング技術によって調製し得る。コンジュゲーション方法は、シアン酸エステルを形成するための1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート(CDAP)による糖の活性化に依存し得る。このようにして、活性化された糖を担体タンパク質上のアミノ基に、直接的に又はスペーサー(リンカー)基を介して結合させ得る。例えば、スペーサーは、マレイミドにより活性化される担体タンパク質(例えば、GMBSを用いる)又はハロアセチル化担体タンパク質(例えば、ヨードアセトイミド[例えば、エチルヨードアセトイミドHCl]若しくはN-スクシンイミジルブロモアセテート若しくはSIAB、若しくはSIA、若しくはSBAPを用いる)との反応後に得られるチオエーテル結合を介して担体に結合させることができるチオール化多糖を与えるシスタミン又はシステアミンであってよい。場合により、シアン酸エステル(場合により、CDAP化学により作製される)をヘキサンジアミン又はADHと結合させ、アミノ誘導体化された糖をタンパク質担体上のカルボキシル基を介するカルボジイミド(例えば、EDAC又はEDC)化学を用いて担体タンパク質にコンジュゲートさせる。このようなコンジュゲートは、PCT出願公開第WO93/15760号  Uniformed Services University並びに国際公開第WO95/08348号及び国際公開第WO96/29094号に記載されている。
【００６７】
他の適切な技術は、カルボジイミド、カルビイニド(carbiinide)、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、p-ニトロ安息香酸、N-ヒドロキシスクシンイミド、S-NHS、EDC、TSTUを用いる。多くが国際公開第WO98/42721号に記載されている。コンジュゲーションは、糖の遊離ヒドロキシル基とCDIとの反応(Bethellら、J. Biol. Chem.1979、254、2572〜4、Hearnら、J. Chromatogr.1981、218、509〜18)、次いで、カルバメート結合を形成させるためのタンパク質との反応により形成し得るカルボニルリンカーを含んでもよい。これは、一次ヒドロキシル基へのアノマー末端の還元、場合により、CDIカルバメート中間体を形成する一次ヒドロキシル基とCDIとの一次ヒドロキシル基の反応の保護/脱保護、及びCDIカルバメート中間体とタンパク質上のアミノ基とのカップリングを含んでもよい。
【００６８】
コンジュゲートはまた、米国特許第4,365,170号(Jennings)及び米国特許第4,673,574号(Anderson)に記載の直接的還元アミノ化方法によって調製され得る。他の方法は、EP0-161-188、EP-208375及びEP-0-477508に記載されている。
【００６９】
さらなる方法は、例えば、EDAC(1-エチル-2-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)を用いて、カルボジイミド縮合(Chu C.ら、Infect. Immunity、1983、245 256)による、アジピン酸ジヒドラジド(ADH)で誘導体化されたシアノゲンブロミド(又はCDAP)活性化糖をタンパク質担体にカップリングさせることを含む。
【００７０】
一実施形態においては、糖上のヒドロキシル基(場合により、活性化されたヒドロキシル基、例えば、シアン酸エステルを作製するために活性化された[例えば、CDAPを用いて]ヒドロキシル基)はタンパク質上のアミノ基又はカルボキシル基に直接的又は間接的に(リンカーを介して)連結される。リンカーが存在する場合、糖上のヒドロキシル基は、例えば、CDAPコンジュゲーションを用いることによって、リンカー上のアミノ基に場合により連結される。リンカー(例えば、ADH)中のさらなるアミノ基は、例えば、カルボジイミド化学を用いることによって、例えば、EDACを用いることによって、タンパク質上のカルボン酸基にコンジュゲートさせてよい。一実施形態において、肺炎球菌の莢膜糖(単数又は複数)を最初にリンカーにコンジュゲートさせた後、リンカーを担体タンパク質にコンジュゲートさせる。あるいは、リンカーを担体にコンジュゲートさせた後、糖にコンジュゲートさせてもよい。
【００７１】
いくつかの糖-タンパク質コンジュゲートをCDAPによって、及びいくつかを還元アミノ化によって調製する技術の組み合わせを用いてもよい。
【００７２】
一般的に、タンパク質担体上の以下のタイプの化学基をカップリング/コンジュゲーションに用いることができる:
【００７３】
A)カルボキシル基(例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸を介する)。一実施形態において、この基は、糖上のアミノ基に直接的に又はカルボジイミド化学、例えばEDACを用いてリンカー上のアミノ基に連結される。
【００７４】
B)アミノ基(例えば、リジンを介する)。一実施形態において、この基は、糖上のカルボキシル基に直接的に又はカルボジイミド化学、例えばEDACを用いてリンカー上のカルボキシル基に連結される。別の実施形態において、この基は、糖上のCDAP若しくはCNBrで活性化されたヒドロキシル基に直接的に又はリンカー上のこのような基に、アルデヒド基を有する糖若しくはリンカーに、スクシンイミドエステル基を有する糖若しくはリンカーに連結される。
【００７５】
C)スルフヒドリル基(例えば、システインを介する)。一実施形態において、この基は、マレイミド化学を用いて、ブロモ若しくはクロロアセチル化糖又はリンカーに連結される。一実施形態において、この基は、ビスジアゾベンジジンを用いて活性化/改変される。
【００７６】
D)ヒドロキシル基(例えば、チロシンを介する)。一実施形態において、この基は、ビスジアゾベンジジンを用いて活性化/改変される。
【００７７】
E)イミダゾリル基(例えば、ヒスチジンを介する)。一実施形態において、この基は、ビスジアゾベンジジンを用いて活性化/改変される。
【００７８】
F)グアニジル基(例えば、アルギニンを介する)。
【００７９】
G)インドリル基(例えば、トリプトファンを介する)。
【００８０】
糖上で、一般的に、以下の基をカップリングのために用いることができる: OH、COOH又はNH2。アルデヒド基を過ヨウ素酸塩、酸加水分解、過酸化水素などの当該技術分野で公知の様々な処理の後に生成することができる。
【００８１】
直接的カップリング手法:
【００８２】
糖-OH+CNBr又はCDAP----->シアン酸エステル+NH2-Prot---->コンジュゲート
【００８３】
糖-アルデヒド+NH2-Prot---->シッフ塩基+NaCNBH3---->コンジュゲート
【００８４】
糖-COOH+NH2-Prot+EDAC---->コンジュゲート
【００８５】
糖-NH2+COOH-Prot+EDAC---->コンジュゲート
【００８６】
スペーサー(リンカー)を介する間接的カップリング手法:
【００８７】
糖-OH+CNBr又はCDAP--->シアン酸エステル+NH2----NH2---->糖----NH2+COOH-Prot+EDAC----->コンジュゲート
【００８８】
糖-OH+CNBr又はCDAP---->シアン酸エステル+NH2-----SH----->糖----SH+SH-Prot(システインが露出した天然タンパク質、又は例えばSPDPによるタンパク質のアミノ基の改変後に得られる天然タンパク質)----->糖-S-S-Prot
【００８９】
糖-OH+CNBr又はCDAP--->シアン酸エステル+NH2----SH------->糖----SH+マレイミド-Prot(アミノ基の改変)---->コンジュゲート
【００９０】
糖-OH+CNBr又はCDAP--->シアン酸エステル+NH2-----SH--->糖-SH+ハロアセチル化-Prot---->コンジュゲート
【００９１】
糖-COOH+EDAC+NH2-----NH2--->糖------NH2+EDAC+COOH-Prot---->コンジュゲート
【００９２】
糖-COOH+EDAC+NH2----SH----->糖----SH+SH-Prot(システインが露出した天然タンパク質、又は例えばSPDPによるタンパク質のアミノ基の改変後に得られる天然タンパク質)----->糖-S-S-Prot
【００９３】
糖-COOH+EDAC+NH2----SH----->糖----SH+マレイミド-Prot(アミノ基の改変)---->コンジュゲート
【００９４】
糖-COOH+EDAC+NH2----SH--->糖-SH+ハロアセチル化-Prot---->コンジュゲート
【００９５】
糖-アルデヒド+NH2-----NH2---->糖---NH2+EDAC+COOH-Prot---->コンジュゲート
【００９６】
注記: 上記のEDACの代わりに、任意の適切なカルボジイミドを用いてよい。
【００９７】
まとめると、糖とのカップリングに一般的に用い得るタンパク質担体化学基のタイプは、アミノ基(例えば、リジン残基上の)、COOH基(例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸残基上の)並びにSH基(アクセス可能である場合)(例えば、システイン残基上の)である。
【００９８】
一実施形態において、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、又は23種の肺炎連鎖球菌糖は、還元アミノ化を介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。一実施形態において、23種未満、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1種の肺炎連鎖球菌糖は、還元アミノ化を介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。一実施形態において、1〜23、2〜22、3〜21、4〜20、5〜19、6〜18、7〜17、8〜16、9〜15、10〜14、11〜13、1〜23、〜22、1〜21、1〜20、1〜19、1〜18、1〜17、1〜16、1〜15、1〜14、1〜13、1〜12、1〜11、1〜10、1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3、又は1〜2種の肺炎連鎖球菌糖は、還元アミノ化を介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。さらなる実施形態において、肺炎連鎖球菌の莢膜糖の全てが還元アミノ化を介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００９９】
一実施形態において、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、又は23種の肺炎連鎖球菌糖は、CDAP化学を介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。一実施形態において、23種未満、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1種の肺炎連鎖球菌糖は、CDAP化学を介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。一実施形態において、1〜23、2〜22、3〜21、4〜20、5〜19、6〜18、7〜17、8〜16、9〜15、10〜14、11〜13、1〜23、〜22、1〜21、10〜23、10〜22、10〜21、10〜20、10〜19、10〜18、10〜17、10〜16、10〜15、10〜14、10〜13、10〜12、10〜11、1〜20、1〜19、1〜18、1〜17、1〜16、1〜15、1〜14、1〜13、1〜12、1〜11、1〜10、1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3、又は1〜2種の肺炎連鎖球菌糖は、CDAP化学を介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。さらなる実施形態において、肺炎連鎖球菌の莢膜糖の全てがCDAP化学を介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【０１００】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、還元アミノ化を介して担体タンパク質にコンジュゲートされた少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21又は22種の糖を含み、還元アミノ化以外の化学、例えばCDAP化学を介して担体タンパク質にコンジュゲートされた少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、又は22種の糖を含む。
【０１０１】
一実施形態において、血清型1、3、19A及び19Fからなる群から選択される血清型の少なくとも1つに由来する莢膜糖は、還元アミノ化以外の化学を介してコンジュゲートされ、血清型4、5、6A、6B、6C、7F、9V、14、18C及び23Fからなる群から選択される血清型の少なくとも1つに由来する莢膜糖は、還元アミノ化を介してコンジュゲートされる。一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、還元アミノ化以外の化学を介してタンパク質担体にコンジュゲートされた、血清型1又は3又は19A又は19F; 1及び3; 1及び19A; 1及び19F; 3及び19A; 3及び19F; 19A及び19F; 1、3及び19A; 1、3及び19F; 1、19A及び19F; 3、19A及び19F又は1、3、19A及び19Fに由来する肺炎連鎖球菌の莢膜糖(単数又は複数)を含む。一実施形態において、19Fは、還元アミノ化以外の化学を介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、CDAP化学などのシアニル化の化学を介してタンパク質担体にコンジュゲートされた、血清型1又は3又は19A又は19F; 1及び3; 1及び19A; 1及び19F; 3及び19A; 3及び19F; 19A及び19F; 1、3及び19A; 1、3及び19F; 1、19A及び19F; 3、19A及び19F又は1、3、19A及び19Fに由来する肺炎連鎖球菌の莢膜糖を含む。一実施形態において、19Fは、CDAP化学によって担体タンパク質にコンジュゲートされる。本発明の一実施形態において、以下の肺炎連鎖球菌の莢膜糖又はその群は、還元アミノ化によって担体タンパク質にコンジュゲートされる; 血清型4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C若しくは23F、4及び5、4及び6A、4及び6B、4及び7F、4及び9V、4及び14、4及び18C、4及び23F、5及び6A、5及び6B、5及び7F、5及び9V、5及び14、5及び18C、5及び23F、6A及び6B、6A及び7F、6A及び9V、6A及び14、6A及び18C、6A及び23F、6B及び7F、6B及び9V、6B及び14、6B及び18C、6B及び23F、7F及び9V、7F及び14、7F及び18C、7F及び23F、9V及び14、9V及び18C、9V及び23F、14及び18C、14及び23F又は18C及び23F。一実施形態において、23Fは、還元アミノ化の化学によって担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【０１０２】
糖コンジュゲートの投薬量
一般的に、本発明の免疫原性組成物は、コンジュゲートあたり0.1〜20μg、1〜5μg、1〜10μg又は1〜3μgの糖の用量を含んでもよい。
【０１０３】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、0.1〜20μg、0.5〜10μg、0.5〜5μg又は1〜3μgの糖の用量でそれぞれの肺炎連鎖球菌の莢膜糖を含むコンジュゲートを含有する。一実施形態において、莢膜糖は、様々な用量で存在してもよく、例えば、いくつかの莢膜糖は正確に1μgの用量で存在してもよく、又はいくつかの莢膜糖は正確に3μgの用量で存在してもよい。一実施形態において、血清型3、18C及び19F(又は4、18C及び19F)由来の糖は、他の糖よりも高い用量で存在する。この実施形態の一態様において、血清型3、18C及び19F(又は4、18C及び19F)は、約3μg又は正確に3μgの用量で存在し、一方、免疫原性組成物中の他の糖は、約1μg又は正確に1μgの用量で存在する。一実施形態において、血清型1、5、6B、7F、9V、14及び23Fは、約1μg又は正確に1μgの用量で存在する。
【０１０４】
アジュバント
一実施形態において、組成物は、リポソームの形態で提示される、QS21、モノホスホリルリピドA(MPL)、リン脂質及びステロールを含むアジュバントを含まない。リポソームの形態で提示されるQS21、モノホスホリルリピドA(MPL)、リン脂質及びステロールを含むアジュバントを含む組成物は、PCT出願第WO2012/156391号に記載されている。一実施形態において、免疫原性組成物は、QS21含むアジュバントを含まない。さらなる実施形態において、免疫原性組成物は、モノホスホリルリピドA(MPL)を含むアジュバントを含まない。一実施形態において、免疫原性組成物は、QS21及びMPLをともに含まない。QS21は、キラヤ(Quillaja saponaria)木に由来するアジュバントである。
【０１０５】
一実施形態において、免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む。
【０１０６】
適切なアジュバントとしては、限定されないが、アルミニウム塩(リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム)、モノホスホリルリピドA(例えば、3D-MPL)、サポニン(例えば、QS21)、水中油型エマルジョン、グラム陰性菌株由来のブレブ又は外膜小胞調製物(例えば、国際公開第WO02/09746号に教示されているもの)、リピドA若しくはその誘導体、アルキルグルコサミドホスフェート又はこれらのアジュバントの2つ以上の組み合わせが挙げられる。一実施形態において、アジュバントはリン酸アルミニウムである。さらなる実施形態において、アジュバントは、ヒト用量あたりのリン酸アルミニウムとして、100〜750、150〜600、200〜500、250〜450、300〜400、又は約350μgのアルミニウムを含む。さらなる実施形態において、アジュバントは水酸化アルミニウムである。一実施形態において、アジュバントは水中油型アジュバントを含まない。
【０１０７】
ワクチン
本発明は、本発明の免疫原性組成物を含むワクチンを提供する。本発明の「免疫原性組成物」に関する本明細書中の実施形態はまた、本発明の「ワクチン」に関する実施形態にも適用可能であり、逆もまた同様である。一実施形態において、ワクチンは、本発明の免疫原性組成物及び製薬上許容可能な賦形剤を含む。
【０１０８】
本発明のワクチンは、皮内、粘膜、例えば鼻腔内、経口、筋肉内又は皮下などの任意の適切な送達経路によって投与し得る。他の送達経路は当該技術分野で周知である。ワクチン調製物は、Vaccine Design(「The subunit and adjuvant approach」(Powell M.F. & Newman M.J.編)(1995)Plenum Press New York)に一般的に記載されている。
【０１０９】
一態様において、本発明の免疫原性組成物は、筋肉内送達経路によって投与される。筋肉内投与は太もも又は上腕に行い得る。注射は、典型的には、針(例えば、皮下注射針)によるが、代わりに無針注射を使用してもよい。典型的な筋肉内用量は0.5mlである。
【０１１０】
ワクチンの皮内投与は、本発明の一実施形態を構成する。ヒト皮膚は、角質層と呼ばれる外側の「角質」キューティクルを含み、それが表皮を覆っている。この表皮の下には真皮と呼ばれる層があり、同様に、真皮は皮下組織を覆っている。皮内注射の従来技術である「マントー法」(mantoux procedure)は、皮膚を消毒してから片手で引き伸ばすステップと、続いて、細いゲージ針(26〜31ゲージ)のベベル(刃面)を上方に向けて針を10〜15°の角度で挿入するステップを含む。針のベベルが挿入されたら、針のバレルを下げて、それを皮膚の下で持ち上げるためにわずかな圧力を加えながら、さらに前進させる。その後、液体を極めてゆっくり注入し、それによって皮膚表面に水泡(bleb)又は隆起(bump)を形成し、続いて針をゆっくり引き抜く。
【０１１１】
ごく最近、液剤を皮膚に又は皮膚を通して投与するために特に設計されたデバイスが記載されており、例えば、国際公開第WO99/34850号及びEP1092444に記載されたデバイス、さらに例えば、国際公開第WO01/13977号、米国特許第5,480,381号、米国特許第5,599,302号、米国特許第5,334,144号、米国特許第5,993,412号、米国特許第5,649,912号、米国特許第5,569,189号、米国特許第5,704,911号、米国特許第5,383,851号、米国特許第5,893,397号、米国特許第5,466,220号、米国特許第5,339,163号、米国特許第5,312,335号、米国特許第5,503,627号、米国特許第5,064,413号、米国特許第5,520,639号、米国特許第4,596,556号、米国特許第4,790,824号、米国特許第4,941,880号、米国特許第4,940,460号、国際公開第WO97/37705号及び国際公開第WO97/13537号に記載されたジェット式注射デバイスである。ワクチン調製物の皮内投与の代替方法には、従来の注射器と針、又は固体のワクチンの弾道的(ballistic)送達用に設計されたデバイス(国際公開第WO99/27961号)、若しくは経皮パッチ(国際公開第WO97/48440号、国際公開第WO98/28037号)、又は皮膚の表面への適用(経皮的(transdermal, transcutaneous)送達、国際公開第WO98/20734号、国際公開第WO98/28037号)が含まれ得る。
【０１１２】
本発明のワクチンが皮膚に又はより具体的には真皮に投与される場合、ワクチンは低液体量、特に約0.05ml〜0.2mlの量である。
【０１１３】
別の適切な投与経路は皮下経路である。皮下送達のために任意の適切なデバイス、例えば古典的な針を使用することができる。本発明の一態様において、無針のジェット式注射器サービスが用いられ、例えば、それは国際公開第WO01/05453号、国際公開第WO01/05452号、国際公開第WO01/05451号、国際公開第WO01/32243号、国際公開第WO01/41840号、国際公開第WO01/41839号、国際公開第WO01/47585号、国際公開第WO01/56637号、国際公開第WO01/58512号、国際公開第WO01/64269号、国際公開第WO01/78810号、国際公開第WO01/91835号、国際公開第WO01/97884号、国際公開第WO02/09796号、国際公開第WO02/34317号に公開されたものである。本発明の別の態様において、デバイスは液体ワクチン製剤が予め充填されている。
【０１１４】
あるいは、ワクチンは鼻腔内に投与される。典型的には、ワクチンは、例えば、肺に吸入されずに、鼻咽頭領域に局所的に投与される。ワクチン製剤が肺に入ることなく又は実質的に入ることなく、ワクチン製剤を鼻咽頭領域に送達する鼻腔内送達デバイスを使用することが望ましい。本発明によるワクチンの鼻腔内投与のための好ましいデバイスは、スプレーデバイスである。適切な市販の鼻スプレーデバイスとしては、Accuspray(商標)(Becton Dickinson)が挙げられる。
【０１１５】
一実施形態において、鼻腔内使用のためのスプレーデバイスは、該デバイスの性能が使用者によって加えられる圧力に依存しないデバイスである。こうしたデバイスは圧力閾値デバイスとして知られている。液体は、閾値圧力が加えられたときだけノズルから放出される。これらのデバイスにより、規則的な液滴サイズのスプレーを達成することが容易となる。本発明で使用するのに適した圧力閾値デバイスは当該技術分野で公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第WO91/13281号及びEP311863及びEP516636に記載されている。このようなデバイスは、Pfeiffer GmbHから市販されており、また、Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe、1999年9月にも記載されている。
【０１１６】
別の実施形態において、鼻腔内デバイスは、1〜200μm、例えば10〜120μmの範囲の液滴(液体として水を用いて測定)を生成する。10μm未満では、吸入の危険性があるため、したがって、10μm未満の液滴が約5％以下であることが望ましい。120μm超の液滴は、より小さい液滴と同様にはうまく広がらないため、120μm超の液滴は約5％以下であることが望ましい。
【０１１７】
2回用量(bi-dose)送達は、本発明によるワクチンで使用するための鼻腔内送達システムの別の実施形態である。2回用量デバイスは、単回ワクチン用量の2つの分割用量を含有し、各鼻孔に1つの分割用量が投与される。一般的に、2つの分割用量は、単一のチャンバ内に存在し、該デバイスの構成が一度に1回の分割用量の効率的な送達を可能にする。あるいは、本発明によるワクチンを投与するために単回用量(monodose)デバイスを使用してもよい。
【０１１８】
本発明のさらなる態様は、コンジュゲートされていない肺炎連鎖球菌タンパク質をアジュバント組成物と混合するステップを含む、本発明のワクチンを作製する方法である。
【０１１９】
本発明のワクチンは単回用量として投与し得るが、その成分はまた、同時に又は異なる時間に共投与してもよい(例えば、肺炎球菌糖コンジュゲートは、別々に、同時に、又は互いに対する免疫応答の最適な調整のためにワクチンの任意の細菌タンパク質成分の投与の1〜2週間後に投与され得る)。最初のワクチン接種後、被験体は、適切な間隔を置いて1回又は数回の追加免疫を受けてよい。
【０１２０】
本発明の一態様において、本発明の免疫原性組成物又はワクチンの免疫防御用量をヒト宿主に投与することを含む、肺炎連鎖球菌感染によって引き起こされる疾患に対して該宿主に免疫付与する方法が提供される。本発明のさらなる態様において、肺炎連鎖球菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防に使用するための、本発明の免疫原性組成物又はワクチンが提供される。本発明のさらなる態様において、肺炎連鎖球菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防のための医薬の製造における、本発明の免疫原性組成物又はワクチンの使用が提供される。
【０１２１】
一実施形態において、宿主は成人のヒトであり、成人のヒトは18歳を超えるヒトである。さらなる実施形態において、宿主は高齢のヒトであり、好適には60歳、62歳、65歳、67歳又は70歳以上の高齢者である。さらなる実施形態において、宿主は若年成人(すなわち、18〜64歳)であり、場合により、健康機関で働いている若年成人などの若年高リスクの成人、又は心血管及び肺疾患若しくは糖尿病などの危険因子を有する若年成人である。さらなる実施形態において、宿主は、6カ月齢を超える小児、特に6〜23カ月齢の小児などの乳幼児のヒトである。場合により、宿主は、9カ月齢から3歳の間の小児などの幼児である。
【０１２２】
本発明のさらなる実施形態において、肺炎連鎖球菌感染によって引き起こされる疾患は、肺炎、侵襲性肺炎球菌疾患(IPD)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)の憎悪、中耳炎、再発性中耳炎、髄膜炎、菌血症及び結膜炎からなる群から選択される。
【０１２３】
一般
「約」又は「およそ」は、本発明の目的で、所与の数字の上下10％の範囲内と定義される。
【０１２４】
「含んでいる(comprising)」、「含む(comprise)」、及び「含む(comprises)」という用語は、本明細書において、いかなる場合も、それぞれ「からなる(consisting of)」、「からなる(consist of)」、及び「からなる(consists of)」という用語で場合により置き換えられるものと本発明者らは意図している。
【０１２５】
本明細書において、本発明の「ワクチン組成物」に関する実施形態はまた、本発明の「免疫原性組成物」に関する実施形態に適用可能であるし、逆もまた同様である。
【０１２６】
「肺炎球菌(pneumococcal)」及び「肺炎連鎖球菌(S.pneumoniae)」への言及は、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)への言及であると見なされ得る。
【０１２７】
この特許明細書の中で引用された参考文献又は特許出願は全て、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１２８】
本発明がより良く理解されるように、以下の実施例を示す。これらの実施例は、説明だけを目的としており、いかなる形でも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【０１２９】
[実施例1]
臨床試験研究用のワクチンの生成
6種のワクチンを設計した:
【０１３０】
dPly-10-AlPO4:リン酸アルミニウムでアジュバント化された、10μgのdPlyを含むワクチン。
【０１３１】
dPly-30-AlPO4:リン酸アルミニウムでアジュバント化された、30μgのdPlyを含むワクチン。
【０１３２】
dPly/PhtD-10-AlPO4:リン酸アルミニウムでアジュバント化された、10μgのdPlyと10μgのPhtDを含むワクチン。
【０１３３】
dPly/PhtD-30-AlPO4:リン酸アルミニウムでアジュバント化された、30μgのdPlyと30μgのPhtDを含むワクチン。
【０１３４】
10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4:リン酸アルミニウムに対してアジュバント化された以下の抗原を含むワクチン:
プロテインDにコンジュゲートされた血清型1由来の1μgの莢膜糖(1-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型4由来の3μgの莢膜糖(4-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型5由来の1μgの莢膜糖(5-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型6B由来の1μgの莢膜糖(6B-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型7F由来の1μgの莢膜糖(7F-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型9V由来の1μgの莢膜糖(9V-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型14由来の1μgの莢膜糖(14-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型23F由来の1μgの莢膜糖(23F-PD)
破傷風トキソイドにコンジュゲートされた血清型18C由来の3μgの莢膜糖(18C-TT)
ジフテリア毒素にコンジュゲートされた血清型19F由来の1μgの莢膜糖(19F-DT)
10μgのdPly
10μgのPhtD
【０１３５】
10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4:リン酸アルミニウムに対してアジュバント化された以下の抗原を含むワクチン:
プロテインDにコンジュゲートされた血清型1由来の1μgの莢膜糖(1-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型4由来の3μgの莢膜糖(4-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型5由来の1μgの莢膜糖(5-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型6B由来の1μgの莢膜糖(6B-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型7F由来の1μgの莢膜糖(7F-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型9V由来の1μgの莢膜糖(9V-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型14由来の1μgの莢膜糖(14-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型23F由来の1μgの莢膜糖(23F-PD)
破傷風トキソイドにコンジュゲートされた血清型18C由来の3μgの莢膜糖(18C-TT)
ジフテリア毒素にコンジュゲートされた血清型19F由来の1μgの莢膜糖(19F-DT)
30μgのdPly
30μgのPhtD
【０１３６】
10PCV:リン酸アルミニウムに対してアジュバント化された以下の抗原を含むワクチン:
プロテインDにコンジュゲートされた血清型1由来の1μgの莢膜糖(1-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型4由来の3μgの莢膜糖(4-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型5由来の1μgの莢膜糖(5-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型6B由来の1μgの莢膜糖(6B-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型7F由来の1μgの莢膜糖(7F-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型9V由来の1μgの莢膜糖(9V-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型14由来の1μgの莢膜糖(14-PD)
プロテインDにコンジュゲートされた血清型23F由来の1μgの莢膜糖(23F-PD)
破傷風トキソイドにコンジュゲートされた血清型18C由来の3μgの莢膜糖(18C-TT)
ジフテリア毒素にコンジュゲートされた血清型19F由来の1μgの莢膜糖(19F-DT)
30μgのdPly
30μgのPhtD
【０１３７】
抗原の調製
dPlyの調製: 肺炎球菌ニューモリシンは、ホルムアルデヒド解毒を用いて、国際公開第WO2004/081515号及び国際公開第WO2006/32499号に記載されるように調製し、解毒した。
【０１３８】
PhtDの発現及び精製:
PhtDの発現: PhtDタンパク質は、ヒスチジントライアドの存在によって特徴付けられる、肺炎球菌ヒスチジントライアド(Pht)タンパク質ファミリーのメンバーである。PhtDは、838aaの分子であり、5個のヒスチジントライアドを有する(MedImmune国際公開第WO00/37105号を参照されたい、アミノ酸配列について配列番号4及びDNA配列について配列番号5)。PhtDはまた、中央においてプロリンリッチ領域(アミノ酸位置348〜380)を含有する。PhtDは、20aaのN末端シグナル配列を有する。PhtDの調製及び精製は、国際公開第WO2007/071710号に記載されている(例えば、実施例1bを参照されたい)。
【０１３９】
プロテインDの発現
プロテインDを国際公開第WO2007/071710号に記載されるように発現させた。
【０１４０】
コンジュゲートの調製
精製された肺炎球菌多糖を作製する方法は当該技術分野において周知である。これらの実施例の目的のために、多糖は、基本的には、EP072513に記載されるように、又は密接に関連した方法によって作製された。コンジュゲーション前に、多糖は、後述するマイクロ流体化によってサイズ変更されてもよい。
【０１４１】
活性化及びカップリング条件は、それぞれの多糖に特異的である。これらを表1に示す。サイズ変更された多糖(6B及び23Fを除く)をNaCl 2M、NaCl 0.2M又は注射用の水(WFI)に溶解した。最適な多糖の濃度を全ての血清型について評価した。血清型18Cを除く全ての血清型を、以下に詳述するように、担体タンパク質に直接コンジュゲートさせた。
【０１４２】
アセトニトリル又はアセトニトリル/水(50％/50％)溶液中の100mg/mlストック溶液から、CDAP(1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート)(CDAP/PS比0.5〜1.5mg/mg PS)を多糖溶液に添加した。1.5分後、0.2M〜0.3M NaOHを添加し、特異的活性化pHを得た。多糖の活性化を、このpHで3分間、25℃にて行った。精製されたタンパク質(プロテインD、CRM197又はDT)(その量は初期PS/担体タンパク質比に依存する)を活性化させた多糖に添加し、カップリング反応を、pH調節下、最大2時間(血清型に依存する)、特異的pHで行った。未反応のシアン酸エステル基をクエンチするために、次に、2Mグリシン溶液を混合物に添加した。pHをクエンチングpH(pH9.0)に調整した。溶液を30分間、25℃にて撹拌し、その後、連続的にゆっくりと撹拌しながら、2〜8℃にて一晩インキュベートした。
【０１４３】
18Cの調製
18Cをリンカー-アジピン酸ジヒドラジド(ADH)を介して担体タンパク質に連結させた。
【０１４４】
多糖血清型18Cをコンジュゲーション前にマイクロ流体化した。
【０１４５】
EDAC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)を用いた破傷風トキソイドの誘導体化
破傷風トキソイドを誘導体化するために、精製されたTTを0.2M NaCl中に25mg/mlで希釈し、ADHスペーサーを0.2Mの最終濃度に達するように添加した。スペーサーの溶解が完了したとき、pHを6.2に調整した。次に、EDAC(1-エチル-3-(3-ジメチル-アミノプロピル)カルボジイミド)を0.02Mの最終濃度に達するように添加し、混合物をpH調節下で1時間撹拌した。少なくとも30分間、25℃にてpHを9.0まで増加させることによって縮合反応を停止させた。
【０１４６】
次に、残渣ADHとEDAC試薬を除くために、誘導体化されたTTを透析濾過した(10kDa COメンブレン)。
【０１４７】
TTAH(ADHリンカーにコンジュゲートされた破傷風トキソイド)バルクを、最後にカップリングステップまで滅菌濾過し、-70℃で保存した。
【０１４８】
PS 18CへのTTAHの化学カップリング
コンジュゲーションパラメータの詳細を表1に見出だすことができる。
【０１４９】
2gのマイクロ流体化されたPSを水中の所定濃度に希釈し、NaCl粉末の添加によって2M NaClに調整した。
【０１５０】
CDAP溶液(50/50 v/vアセトニトリル/WFI中に新たに調製された100mg/ml)を添加し、適切なCDAP/PS比に到達させた。
【０１５１】
0.3M NaOHの添加によって、pHを活性化pH9.0に上昇させ、TTAHを添加するまでこのpHで安定化させた。
【０１５２】
3分後、誘導体化されたTTAH(0.2M NaCl中、20mg/ml)を添加し、TTAH/PS比を2に到達させた。pHをカップリングpH9.0に調節した。溶液をpH調節下で1時間放置した。
【０１５３】
クエンチングのために、2Mグリシン溶液を混合物PS/TTAH/CDAPに添加した。
【０１５４】
pHをクエンチングpH(pH9.0)に調整した。
【０１５５】
溶液を30分間、25℃にて撹拌し、次に、連続的にゆっくり撹拌しながら一晩、2〜8℃にて撹拌した。
【０１５６】
肺炎連鎖球菌の莢膜糖-プロテインD/TT/DT/PhtD/Plyコンジュゲートの特異的活性化/カップリング/クエンチング条件
「μ流体」が列の見出しに見られる場合、コンジュゲーション前にマイクロ流体化によって糖をサイズ変更したことを示す。マイクロ流体化後の糖のサイズを表2に示す。
【０１５７】
0006412500.tif 000002
0006412500.tif 000003
【０１５８】
コンジュゲートの精製:
0.15M NaClで平衡化したセファクリルS400HRゲル濾過カラムを用いたゲル濾過によって、コンジュゲートを精製し(ただし、S500HRを18C用のバッファーとして使用し、1.15M NaCl pH6.2を含有する20mM酢酸を19A用に使用した)、小分子(DMAPを含む)、並びにコンジュゲートされていない糖及びタンパク質を除いた。反応成分の様々な分子サイズに基づいて、PS-PD、PS-TT、PS-CRM197又はPS-DTコンジュゲートを最初に溶出させ、続いて遊離PS、次に遊離タンパク質担体、最後にDMAPと他の塩(NaCl、グリシン)を溶出させる。
【０１５９】
コンジュゲートを含有する画分をUV280nmによって検出する。画分を、それらのKdに従ってプールし、滅菌濾過(0.22μm)し、+2〜8℃で保存する。コンジュゲート調製物中のPS/タンパク質比を決定した。
【０１６０】
[実施例2]
成人において行った高用量及び低用量のdPly及びPhtDを含むワクチンの有効性を研究するための臨床試験
臨床試験を、7つの並行グループを用いて行った。
【０１６１】
1. dPly-10-AlPO4グループ(結果の表及び図中の「Ply-10」): 実施例1に記載されているdPly-10-ALPO4ワクチン(167μg AlPO4、150mM NaCl及び0.78mM PO4緩衝液で製剤化)を受ける被験体。
【０１６２】
2. dPly-30-AlPO4グループ(結果の表及び図中の「Ply-30」): 実施例1に記載されているdPly-30-ALPO4ワクチン(500 AlPO4、150nM NaCl及び0.78mM PO4緩衝液で製剤化)を受ける被験体。
【０１６３】
3. dPly/PhtD-10-AlPO4グループ(結果の表及び図中の「PlPh-10」): 実施例1に記載されているdPly/PhtD-10-AlPO4ワクチン(500μg AlPO4、150mM NaCl及び0.72mM PO4緩衝液で製剤化)を受ける被験体。
【０１６４】
4. dPly/PhtD-30-AlPO4グループ(結果の表及び図中の「PlPh-30」): 実施例1に記載されているdPly/PhtD-30-AlPO4ワクチン(500μg AlPO4、150mM NaCl及び0.86mM PO4緩衝液で製剤化)を受ける被験体。
【０１６５】
5. 10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4グループ(結果の表及び図中の「10vPP10」): 実施例1に記載されている10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4ワクチン(500μg AlPO4、150mM NaCl及び0.72mM PO4緩衝液で製剤化)を受ける被験体。
【０１６６】
6. 10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4グループ(結果の表及び図中の「10vPP30」): 実施例1に記載されている10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4ワクチン(500μg AlPO4、150mM NaCl及び0.86mM PO4緩衝液で製剤化)を受ける被験体。
【０１６７】
7. 23PPV比較グループ(結果の表及び図中の「23PPV」): 0日目(0月目)でPneumovax 23(商標)と称する市販の許可された23価のc多糖ワクチン(23PPV)の1回用量を受け、続いて60日目(2月目)でプラセボを受ける被験体。
【０１６８】
全てのグループの被験体は、0日目(0月目)に1回と60日目(2月目)に1回、それぞれの研究ワクチンの2回用量を受けた。23PPV比較グループは、0日目(0月目)で許可された23PPVワクチンと60日目(2月目)でプラセボを受けた。ワクチンは、利き腕でない三角筋における筋肉内注射として投与された。被験体は、最初のワクチン接種時に18歳と40歳を含むそれらの年齢間の健常な男性又は女性であった。
【０１６９】
安全性/反応原性法
ワクチン接種後31日間の追跡期間中の応答型(solicited)及び/又は非応答型の局所的及び全身的AE(有害事象)の発生率を、症状の種類、強度及びワクチン接種に対する関連性にしたがって、それぞれのワクチン投薬の後と全体の後で、95％CI(信頼区間)で計算した。ワクチン接種後7日間の追跡期間中に報告されたそれぞれの局所的及びそれぞれの全身的応答型症状の発生率を、症状の種類、強度及びワクチン接種に対する関連性にしたがって、それぞれのワクチン投薬の後と全体の後で、95％CIで計算した。ワクチン接種後31日間の追跡期間内に報告された非応答型症状を有する被験体/用量のパーセンテージを、強度及びワクチン接種に対する関連性にしたがって95％CI(信頼区間)で、国際医薬用語集(MedDRA)にしたがいまとめた。ワクチン接種後7日間の追跡期間中、及びワクチン接種後31日間の追跡期間中の同時の解熱剤/医薬の患者数を、それぞれのワクチン投薬の後と全体の後で、95％CIで計算した。全研究期間中に報告された重篤な有害事象(SAE)及び有害事象(単数又は複数)に起因する離脱を詳細に記載した。それぞれの血液学及び生化学パラメータについて、正常範囲未満、正常範囲内及び正常範囲を超えるレベルを有する被験体の数とパーセンテージを、それぞれの評価された時点で研究グループごとに一覧にした。等級分けと基準(基準: 0日目の評価)からの等級の変化を、それぞれの評価された時点で研究グループごとにまとめた。それぞれの尿パラメータについて、等級分け、及び基準(基準: 0日目の評価)からの等級の変化を、それぞれの評価された時点で研究グループごとにまとめた。経時的に検尿で定量されたpHを研究グループごとに示した。
【０１７０】
免疫原性評価についての実験室アッセイ及び時点
全ての被験体について、全静脈血のおよそ20mLのサンプルを、血清学的検査のために、来診1[Pre]、来診4[(PI(D30)(30日目での投薬I後)]及び来診8[(PII(D90)(90日目での投薬II後)]に回収した。血液を遠心分離し、血清を分離した後、スポンサーに回収されるまで、サンプルを-20℃で保存した。血清の分注液(およそ10mL)を、以下の段落に記載される血清学的試験のためにGSK Biologicalsに送付した。
【０１７１】
10種の肺炎球菌血清型のそれぞれに対する抗体(1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23Fに対する抗体)についてのオプソニン食作用活性を、HL60細胞株を用いた死滅アッセイによって測定した。結果を、アッセイ条件下で生肺炎球菌の50％の死滅を維持することができる血清の希釈(オプソニン力価)として示した。アッセイのカットオフは、オプソニン力価8であった。
【０１７２】
抗dPly抗体及び抗PhtD抗体をELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)を用いて定量した。
【０１７３】
ELISAプロトコールの例を以下に説明する:
マイクロタイタープレートを、精製された血清型特異的肺炎球菌PS(多糖)を用いて被覆し、メチル化したヒト血清アルブミン(PSに応じて0.5〜7.5μg/ml)と混合する。血清サンプルを、10μg/mlのCWPS(莢膜壁多糖)(SSI)及び2μg/mlの血清型22FのPS(ATCC)を含有する吸着緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水[PBS]、10％ウシ胎仔血清[FCS]、0.1％ポリビニルアルコール)に希釈し、一晩4℃にてインキュベートする。89-SF参照血清サンプル(FDA)(89-SFは世界保健機関によって調整(calibrate)された参照血清の番号である)を、同じ吸着緩衝液であるが、10μg/mlのCWPSのみを含む該吸着緩衝液に希釈し、混合物を一晩4℃にてインキュベートする。標準血清サンプル89-SFに対して調整された内部参照血清サンプルは、全てのプレートに含まれる。作業標準血清サンプルとは異なり、WHOの推奨に沿って、89-SF参照血清サンプルは、22Fではなく、CWPSのみで予め吸着される。これは、89-SF参照血清サンプルの抗PS濃度の値が、22F PSの使用なしに割り当てられているためである。結合した抗体を、アルカリホスファターゼをコンジュゲートさせた抗ヒトIgGを用いることによって検出する。
【０１７４】
OPA(オプソニン食作用アッセイ)の例を以下に説明する:
OPAアッセイを以下の通り行う: 血清サンプルを40分間、56℃にて加熱し、いずれもの残存する内因性補体を不活性化する。それぞれ1:2に希釈した血清サンプルの25μlの分注液を、96ウェルの丸底マイクロタイタープレート(Nalge Nunc International、Rochester、NY、USA)のウェルあたり、25μlのOPA緩衝液(ハンクス平衡塩溶液又はHBSS-14.4％不活性化FBS(ウシ胎仔血清))中に連続して2倍希釈する。特定の肺炎球菌血清型について既知のオプソニン食作用力価を有する2つの陽性対照サンプルを、アッセイ有効性を決定するためにそれぞれのアッセイプレート上で試験する。1つの列には、血清サンプルを添加せず、オプソニン食作用抗体の非存在下で、0％死滅に対応する平均CFU(コロニー形成単位)を推定する。その後、例えば、4/2/2.82比(体積/体積/体積(v/v/v)、該比は、補体のロットに依存して変更してもよい)である活性化HL-60細胞(1×107細胞/ml)、新たに融解した肺炎球菌のワーキングシード(working seed)及び新たに融解したベビーウサギ補体の25μlの混合物を、希釈した血清に添加し、最終体積を50μlとする。結果として、血清サンプルの最終連続希釈は1:8〜1:1024である。アッセイプレートを、食作用プロセスを促進させるために、環状に振とう(210rpm)させながら、2時間、37℃にてインキュベートする。少なくとも1分間、氷上にマイクロプレートを置くことによって反応を停止させる。次に、プレートのそれぞれのウェルの20μlの分注液を96ウェル平底マイクロプレート(Nalge Nunc International)の対応するウェルに移し、100μlのTodd-Hewitt Broth-0.9％寒天をそれぞれのウェルに添加する。37℃、5％CO2にて一晩インキュベートした後、寒天中に出現する肺炎球菌コロニーを、自動化画像分析システム(KS 400、Zeiss、Oberkochen、Germany)を用いてカウントする。血清サンプルを含まない8個のウェルを、ウェルあたりの肺炎球菌数を決定するために、細菌対照として使用する。対照ウェルのCFUの平均数を決定し、それぞれの血清サンプルについて死滅活性の計算に用いる。血清サンプルについてのOPA力価を、肺炎球菌の50％死滅を促進することができる血清の逆希釈によって決定する。オプソニン食作用力価を、4パラメータ曲線フィット分析を用いることによって計算する。それぞれのサンプル力価を、それぞれのアッセイに含まれる2つの陽性対照サンプルの実測力価/既知力価の平均比に基づいた調整係数を通じて調整した。全ての血清型のカットオフOPA力価は、逆血清希釈8である。8未満のOPA力価を有する血清サンプルを、データ分析の目的で4の力価に割り当てる。
【０１７５】
抗PhtD及び抗Ply ELISAの例を以下に説明する。
プレートを、ウェルあたり100μlの、PBS中の2μg/mlのPhtD(1021μg/ml)、TR034(Na 50mM pH9.5)中の3μg/mlのPly(3675μg/ml)を用いて一晩4℃にて被覆する。
【０１７６】
次に、プレートを3回、TR112(Na2K 39.65mM-NaCl 1.73M-ポリソルベート20 0.275％ 5P/V°pH6.6〜6.8)で洗浄する。
【０１７７】
1回目の洗浄後、プレートを、振とうしながら200μl/ウェルの希釈緩衝液(CaとMgを含まないPBS-PhtDについてはBSA 1％又はPlyについてはBSA 5％-ポリソルベート20 0.1％-ProClin 300(商標)0.2％ pH7.0)を用いて、1時間室温にて飽和させる。
【０１７８】
2回目の洗浄(同じ緩衝液)後、100μlの血清を希釈緩衝液で1/100、1/1000及び1/10000希釈でマイクロウェルに添加する。
【０１７９】
プレートを振とうしながら1時間、室温にてインキュベートする。5回の洗浄後、プレートを、PhtDについて1/20000希釈し、Plyについて1/12500希釈した、ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトIgG Fc抗体(ウェルあたり100μl)を用いて、室温にて1時間、振とうしながらインキュベートする。プレートを上記の通り洗浄し、100μlのTMB基質コンジュゲートをそれぞれのウェルに10分間、暗所にて添加する。
【０１８０】
H2SO4(0.18M)100μlの添加によって反応を停止させ、吸光度を450nm及び650nmで読み取る。
【０１８１】
免疫原性
免疫原性分析は、免疫原性についてのプロトコールに従う(ATP)コホートについて行った。被験体の5％未満を免疫原性についてのATPコホートから除外したため、全体のワクチン接種コホートにおける第2の分析は行わなかった。血清を、dPly、PhtD、並びに肺炎連鎖球菌の莢膜糖血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F及び23Fに対する抗体の存在について分析した。
【０１８２】
抗Ply抗体についての血清反応陽性率とGMCを以下の表1に記載し、これらのデータを図1に示す。
【０１８３】
【表１】
0006412500.tif 000004
【０１８４】
抗dPly抗体GMCの増加は、dPlyを受けなかった23PPVグループを除いて、全てのグループ内のそれぞれのワクチン接種後に観察された。抗dPly抗体GMCは、Ply-10グループ及びPly-30グループと比較して、それぞれPlPh-10グループ及びPlPh-30グループにおいて、より高い傾向にあるが、PhtDとdPlyの間の抗原干渉が予測され得るため、これは予想外である。最も高い抗dPly抗体GMCは、30μgのdPly及びPhtDタンパク質を含有する製剤(すなわち、PlPh-30グループ及び10vPP30グループ)について観察された。
【０１８５】
抗PhtD抗体についての血清反応陽性率とGMC(免疫原性のATPコホート)を以下の表2に記載し、図2に示す。
【０１８６】
【表２】
0006412500.tif 000005
【０１８７】
抗PhtD抗体GMCの増加は、PhtDを受けなかったPly-10グループ、Ply-30グループ及び23PPVグループを除いて、それぞれの用量で観察された。投薬1後及び投薬2後の抗PhtD抗体GMCは、PlPh-10グループ及びPlPh-30グループと比較して、それぞれ、10vPP10グループ及び10vPP30グループにおいて、より低い傾向にあった。最も高い抗PhtD抗体GMCは、30μgのdPly及びPhtDタンパク質を含有する製剤(すなわち、PlPh-30グループと10vPP30グループ)について観察された。
【０１８８】
血清型1抗体についての血清反応陽性率とGMTを以下の表3に記載し、これらのデータを図3に示す。
【０１８９】
【表３】
0006412500.tif 000006
【０１９０】
血清型4抗体についての血清反応陽性率とOPA(オプソニン食作用)GMTを以下の表4に記載し、これらのデータを図4に示す。
【０１９１】
【表４】
0006412500.tif 000007
【０１９２】
血清型5抗体についての血清反応陽性率とOPA(オプソニン食作用)GMTを以下の表5に記載し、これらのデータを図5に示す。
【０１９３】
【表５】
0006412500.tif 000008
【０１９４】
血清型6B抗体についての血清反応陽性率とOPA(オプソニン食作用)GMTを以下の表6に記載し、これらのデータを図6に示す。
【０１９５】
【表６】
0006412500.tif 000009
【０１９６】
血清型7F抗体についての血清反応陽性率とOPA(オプソニン食作用)GMTを以下の表7に記載し、これらのデータを図7に示す。
【０１９７】
【表７】
0006412500.tif 000010
【０１９８】
血清型9V抗体についての血清反応陽性率とOPA GMTを以下の表8に記載し、これらのデータを図8に示す。
【０１９９】
【表８】
0006412500.tif 000011
【０２００】
血清型14抗体についての血清反応陽性率とOPA GMTを以下の表9に記載し、これらのデータを図9に示す。
【０２０１】
【表９】
0006412500.tif 000012
【０２０２】
血清型18C抗体についての血清反応陽性率とOPA GMTを以下の表10に記載し、これらのデータを図10に示す。
【０２０３】
【表１０】
0006412500.tif 000013
【０２０４】
血清型19F抗体についての血清反応陽性率とOPA GMTを以下の表11に記載し、これらのデータを図11に示す。
【０２０５】
【表１１】
0006412500.tif 000014
【０２０６】
血清型23F抗体についての血清反応陽性率とOPA GMTを以下の表12に記載し、これらのデータを図12に示す。
【０２０７】
【表１２】
0006412500.tif 000015
【０２０８】
結果の概要
全ての候補ワクチン製剤は、安全であり、十分に許容された。血液学、生化学及び尿パラメータの臨床的に有意な変化は、経時的に観察されなかった。
【０２０９】
投薬1から7日間のワクチン接種後期間中に、候補ワクチン製剤の投薬の最大4.2％〜12.5％の後に、それぞれ、グレード3の応答型の局所的及び全身的AEが続いた。これらの発生率は、23PPV比較グループ(投薬の4.2％)において観察されたものと同じ範囲内であった。グレード3の発熱(口腔体温>39.5℃)は報告されなかった。
【０２１０】
グレード3の応答型の局所的及び/又は全身的AEのより高い発生率に対する傾向は、一般的に、候補ワクチン製剤を連続投薬した全てのグループにおいて観察されなかった。
【０２１１】
グレード3の非応答型のAEは、候補ワクチン製剤についての投薬の4.5％〜13.3％に続いて報告された。ワクチン接種と因果関係があると、研究者によって考えられた非応答型AEは、候補ワクチン製剤についての投薬の10.4％〜33.3％に続いて報告され、主に局所的反応であった。
【０２１２】
SAEは、候補ワクチン製剤を受けた被験体では報告されなかった。
【０２１３】
PhtDの有無にかかわらず、肺炎球菌タンパク質dPlyを含有する製剤は免疫原性であった。抗Ply抗体GMCの増加は、dPly含有製剤を用いてワクチン接種されたグループ内のそれぞれのワクチン接種後に観察された。抗PhtD抗体GMCの増加は、PhtD含有製剤を用いてワクチン接種されたグループ内のそれぞれのワクチン接種後に観察された。最も高い抗Ply抗体及び抗PhtD抗体GMCは、30μgのdPly及びPhtDタンパク質を含有する製剤について観察された(すなわち、グループPlPh-30において、続いて10vPP30グループにおいて)。
【０２１４】
遊離タンパク質製剤(アラム吸着)は、ワクチン肺炎球菌血清型のそれぞれに対して、投薬1から1カ月後と投薬2から1カ月後にOPA応答を誘導せず、肺炎球菌タンパク質(dPly及びPhtD)及び10Pn-PD-DiTを組み合わせた製剤を受ける被験体の少なくとも95.7％は、OPA力価8以上を有した。OPA GMTの増加は、肺炎球菌血清型のいくつかについて、投薬1後〜投薬2後の時点に観察された。試験された血清型(6B、7F、9V、18C、19F、23F)の大部分について、投薬1後又は投薬2後の計算されたOPA GMT推定値は、10vPP10グループと比較して10vPP30グループにおいて、より高かった。
【０２１５】
[実施例3]
乳幼児において行われた高用量及び低用量のdPly及びPhtDを含むワクチンの有効性を研究するための臨床試験
生後6カ月(エポック1)の期間にDTPa-HBV-IPV/Hibワクチンと共投与される3回投薬の一次ワクチン接種コースとして、及び12〜15カ月齢(エポック2)で追加抗原投与として与えられる、GlaxoSmithKline(GSK) Biologicalsの肺炎連鎖球菌タンパク質含有ワクチンの2つの製剤の安全性、反応原性及び免疫原性を評価するための第II相の無作為化され、制御された、試験者盲検試験。
【０２１６】
この臨床試験は、4つの並列グループを用いて行った。
【０２１７】
1. 10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4グループ(結果の表及び図における「10vPP10」): DTPa-HBV-IPV/Hibワクチンと共投与されるGSK Biologicalsの10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4ワクチンを受けた被験体。
【０２１８】
2. 10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4グループ(結果の表及び図における「10vPP30」): DTPa-HBV-IPV/Hibワクチンと共投与されるGSK Biologicalsの10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4ワクチンを受けた被験体。
【０２１９】
3. 10PCVグループ(結果の表及び図における「10Pn」): DTPa-HBV-IPV/Hibワクチンと共投与されるGSK Biologicalsの10PCVワクチンを受けた被験体。
【０２２０】
4. Prev13グループ(結果の表及び図における「13Pn-DTPa」): DTPa-HBV-IPV/Hibワクチンと共投与されるPfizerから市販されている13価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン(Prevenar 13)を受けた被験体。
【０２２１】
ワクチンは、2、3、4カ月齢(エポック1、完了)での3回投薬の1次ワクチン接種スケジュールにしたがって健常な乳幼児に与えられ、12〜15カ月齢(エポック2、研究は進行中である)での追加抗原投与が続く。
【０２２２】
安全性/反応原性法
グループ内評価(記述的分析):
7日間(0日目〜6日目)の応答型の追跡期間中のそれぞれ個々の応答型の局所的及び全身的AE(有害事象)を報告する被験体のパーセンテージを、それぞれのワクチン投薬後と全体的な一次投薬後に、それぞれのグループについて正確に95％ CI(信頼区間)で一覧にした。それぞれ個々の応答型の局所的及び全身的AEが引き続いて起こる投薬のパーセンテージを、完全な一次ワクチン接種経過にわたって、それぞれのグループについて正確に95％ CIで一覧にした。同じ集計を、グレード3の応答型AEについて、及びワクチン接種と因果関係がある応答型AEについて行った。赤み及び腫れについて、グレード2又は3のAEもまた一覧にした。発熱の発生を0.5℃の累積増分ごとに報告した。また、それぞれ個々の応答型の有害事象に関する上記集計の全ては、それぞれのワクチン接種後の4日間の追跡期間(0日目〜3日目)に行った。
【０２２３】
国際医薬用語集(MedDRA)によって分類され、一次ワクチン接種から最大30日後までに報告された非応答型のAEの少なくとも1つの報告を有する被験体/用量の比率を、それぞれのグループについて正確に95％ CIで一覧にした。同じ集計を、グレード3の非応答型のAEについて、及びワクチン接種と関係がある非応答型のAEについて行った。
【０２２４】
また、医学的に付随する来診をもたらしたAEの比率を一覧にした。SAE(重篤な有害事象)とSAE(単数又は複数)に起因する離脱(単数又は複数)とを詳細に記載した。
【０２２５】
免疫原性評価のための実験室アッセイ及び時点
エポック001中の来診1と来診4で血液サンプルを回収した。血液を遠心分離し、血清を分離した後、スポンサーに回収されるまで、サンプルを-20℃で保存した。血清の分注液(およそ2.5mL)を、以下の段落に記載される血清学的試験のためにGSK Biologicalsに送付した。
【０２２６】
肺炎球菌血清型特異的な全IgG抗体(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及び23Fに対する抗体)を、実施例2に記載されるように、それぞれ、22F阻害ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)により測定した。抗体濃度を、10種の血清型に対するIgG及びIgMの濃度がμg/mLにおいて知られている、米国食品医薬品局(FDA)から入手可能な標準参照血清89-SFを用いて、ELISA曲線のロジスティック対数比較によって決定した。アッセイのカットオフは0.05μg/mLであった。
【０２２７】
肺炎球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及び23Fのそれぞれに対する抗体に関するオプソニン食作用活性(OPA)をOPAアッセイによって測定した(実施例2に記載したものと類似する)。結果を、アッセイ条件下で生肺炎球菌の50％の死滅を維持することができる血清の希釈(オプソニン力価)として示した。アッセイのカットオフは、オプソニン力価8であった。
【０２２８】
抗Ply抗体及び抗PhtD抗体を個々のELISAを用いて定量した。特異的抗Ply抗体及び抗PhtD抗体の濃度を、標準参照血清を用いて決定した。アッセイのカットオフは、PDについて100EL.U/mL、dPlyについて12EL.U/mL、及びPhtDについて17EL.U/mLであった。
【０２２９】
安全性及び反応原性結果(本研究の主要結果)
安全性分析を全ワクチン接種コホートについて行った。7日間のワクチン接種後期間中の応答型有害事象。
【０２３０】
赤みは、それぞれのグループにおいて最も頻繁に報告された応答型の局所的AEであった(10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4、10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4、10PCV及びPrev13グループにおいて、それぞれ43.6％、44.7％、40.1％及び41.1％の投薬後)。3.3％以下の投薬の後に、それぞれのグループにおいて、所与のカテゴリーのグレード3の応答型の局所的AEが続いた。
【０２３１】
興奮性は、それぞれのグループにおいて最も頻繁に報告された応答型の全身的AEであった(10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4、10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4、10PCV及びPrev13グループにおいて、それぞれ55.5％、55.5％、55.0％及び56.6％の投薬後)。4.8％以下の投薬の後に、それぞれのグループにおいて、所与のカテゴリーのグレード3の全身的応答型のAEが続き、それらの大部分は、ワクチン接種と因果関係があると研究者らによってみなされた。
【０２３２】
応答型の局所的及び全身的AEの発生率の増加は、3回投薬の一次ワクチン接種経過中に、10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4又は10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4ワクチンのいずれかの連続投薬では観察されなかった。
【０２３３】
非応答型の有害事象
31日間の一次ワクチン接種後期間中:
10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4、10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4、10PCV及びPrev13グループにおけるそれぞれ16.9％、21.1％、20.1％及び19.7％の投薬の後に、少なくとも1つの非応答型のAEが続いた。
【０２３４】
グレード3の非応答型AEは、10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4、10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4、10PCV及びPrev13グループにおいて、それぞれ0.0％、0.2％、0.5％及び0.2％の投薬後に報告された。これらのうち、10PCVグループにおいて報告された1つのグレード3のAE(低張性低応答性エピソード)は、ワクチン接種と因果関係があると研究者らによってみなされた。
【０２３５】
ワクチン接種と因果関係があると研究者らによってみなされた非応答型AEは、10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4、10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4、10PCV及びPrev13グループにおいて、それぞれ0.2％、0.5％、0.9％及び0.0％の投薬について報告された。
【０２３６】
重篤な有害事象:
一次エポック(投薬1から最大来診4まで)中に、少なくとも1つのSAEが、20人の被験体について報告された: 10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4グループにおける146人のワクチン接種された被験体のうち5人(3.4％)、10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4グループにおける142人のワクチン接種された被験体のうちの2人(1.4％)、10PCVグループにおける145人のワクチン接種された被験体のうちの10人(6.9％)、及びPrev13グループにおける142人のワクチン接種された被験体のうちの3人(2.1％)。これらのうち、10Pnグループにおける31日間の追跡期間中に、グレード3のAEとして報告された1つのSAE(低張性低応答性エピソード)は、ワクチン接種と因果関係があると研究者らによってみなされた。来診4の時点では解決されなかった10Pnグループにおける1つのSAE(精神運動遅滞)を除いて、全てのSAEは後遺症を伴わないで解決された。致命的なSAEは報告されなかった。
【０２３７】
有害事象/重篤な有害事象に起因する離脱:
10PCVグループにおける1人の被験体(被験体番号607)は、ワクチン接種と因果関係があると研究者らによってみなされたSAE(低張性低応答性エピソード)に起因して、本研究から離脱した。この事象は、6日後、後遺症を伴わないで解決された。
【０２３８】
免疫原性
これらの結果は、10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4及び10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4ワクチンが、全てのワクチン抗原(すなわち、dPly及びPhtD肺炎球菌タンパク質、肺炎球菌血清型特異的な莢膜多糖及びNTHiプロテインD)に対する免疫応答を誘導したことを示唆した。
【０２３９】
[実施例4]
PE-PilA融合タンパク質を含む多価ワクチンの製剤化
3種のワクチンを設計した:
【０２４０】
10V: 以下の10種の肺炎連鎖球菌の莢膜糖コンジュゲートを含有する10価(10V)ワクチン: プロテインDにコンジュゲートされた血清型1由来の莢膜糖(1-PD)、プロテインDにコンジュゲートされた血清型4由来の莢膜糖(4-PD)、プロテインDにコンジュゲートされた血清型5由来の莢膜糖(5-PD)、プロテインDにコンジュゲートされた血清型6B由来の莢膜糖(6B-PD)、プロテインDにコンジュゲートされた血清型7F由来の莢膜糖(7F-PD)、プロテインDにコンジュゲートされた血清型9V由来の莢膜糖(9V-PD)、プロテインDにコンジュゲートされた血清型14由来の莢膜糖(14-PD)、プロテインDにコンジュゲートされた血清型23F由来の莢膜糖(23F-PD)、破傷風トキソイドにコンジュゲートされた血清型18C由来の莢膜糖(18C-TT)、及びジフテリア毒素にコンジュゲートされた血清型19F由来の莢膜糖(19F-DT)。
【０２４１】
12V: 追加の2種の肺炎連鎖球菌糖コンジュゲートのCRM197にコンジュゲートされた19A(19ACRM)とCRM197にコンジュゲートされた6A(6ACRM)を含む、10Vと同じ10種の肺炎連鎖球菌の莢膜糖コンジュゲートを含有する12価(12V)ワクチン。
【０２４２】
12V+タンパク質(12V+prot): PhtD、dPly及びPE-PilA融合タンパク質の追加を含む、12Vと同じ12種の肺炎連鎖球菌の莢膜糖コンジュゲートを含有するワクチン。
【０２４３】
抗原の調製
抗原を実施例1に記載されるように調製した。PEPilA抗原は、国際公開第WO2012/139225号に記載されているように調製した。
【０２４４】
ワクチンの製剤化
10Vワクチンは、1、3、1、1、1、1、1、3、3、1μgのヒト用量でともにリン酸アルミニウムに吸着させた肺炎連鎖球菌の莢膜糖血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F及び23Fコンジュゲートを含有する(糖は、リン酸アルミニウムに個別に吸着され、次に、一緒に混合し、リン酸アルミニウムのレベルを500μgに調整した)。
【０２４５】
12Vワクチンは、10Vワクチンと同様にして作製され、添加されたリン酸アルミニウムに吸着させた2μgの投薬量の追加の血清型19A及び6Aコンジュゲートを含む。
【０２４６】
12V+タンパク質ワクチンは、12Vワクチンと同様にして作製したが、ただし、タンパク質PhtD、dPly及びPE-PilAを添加した。12種のコンジュゲート及びタンパク質は、上記の12Vについて記載した投薬量及びそれぞれ30μgの投薬量のタンパク質(これは、30μgのPE-PilAを意味し、30μgのPEと30μgのPilAを意味しないことに留意されたい)を用いて、ともに混合された。
【０２４７】
[実施例5]
マウスにおける10V、12V及び12V+タンパク質ワクチンの免疫原性の比較
抗肺炎球菌多糖PS(多糖)ELISAの説明
マイクロプレートを、莢膜多糖(CPS)(ウェルあたり100μlの、PBS中の2.5μg/mlのPS1及びPS3、5μg/mlのPS4、5、6A、6B、7F、9V若しくは14、10μg/mlのPS19A及び23F又は40μg/mlのPS18C及びPS19F)を用いて2時間、37℃にて被覆した。プレートをNaCl 150mM(0.9％)-ポリソルベート20 0.05％で3回洗浄した。血清を、CPS(2.5mg/mlであった6A及び6Bを除いて、1mg CPS/mlの未希釈血清)V/Vを含有するPBS-ポリソルベート20 0.05％に希釈し(6Aと6Bについては1/2及び他の血清型については1/10)、1時間、37℃にてインキュベートし、CPSに対する抗体を中和した。「マウスにおける3種のワクチン製剤の免疫原性」と題する節において記載したように免疫付与されたマウス由来の血清又は参照血清(クロムピュアマウスIgGを用いて調整された内部参照)をマイクロウェルに添加し、PBS、ポリソルベート20 0.05％中に連続希釈して100μl(2倍希釈段階)とした。プレートを30分間、室温にて撹拌下でインキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、ペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗マウスIgG抗体(ウェルあたり100μl)を添加し、プレートを振とうしながら30分間、室温にてインキュベートした。洗浄後、基質(10mlのクエン酸塩0.1M pH4.5〜4.6と5μlのH2O2中の4mgのOPDA(オルトフェニレン-ジアミン))を各ウェルに添加し(100μl)、プレートを15分間、暗所にてインキュベートした。HCl 1N(50μl)の添加によって反応を停止させた。分光光度計を用いて、490nm又は参照として620nmで吸光度を読み取った。発色は血清中に存在する抗体量に正比例する。
【０２４８】
PD、PE及びPilA抗体を測定するためのELISAの説明
プレートを、一晩、4℃にて、ウェルあたり100μlの、炭酸塩緩衝液pH9.6中の2μg/mlのPD(1mg/ml)、2μg/mlのPE(1500μg/ml)、2μg/mlのPilA(3660μg/ml)を用いて被覆した。プレートをNaCl 0.9％、ポリソルベート20 0.05％で4回洗浄した。PE及びPilA ELISAについて、プレートを30分間、室温にて(振とうしながら)PBS-BSA1％を用いて飽和させた。洗浄後、「マウスにおける3種のワクチン製剤の免疫原性」と題する節において記載したように免疫付与されたマウス由来の血清又は参照血清(クロムピュアマウスIgGを用いて調整された内部参照)をマイクロウェルに添加し、PBS、ポリソルベート20 0.05％(PDアッセイ用)及びPBS、ポリソルベート20 0.05％、BSA 0.1％(PE及びPilAアッセイ用)中に連続希釈して100μl(2倍希釈段階)とした。次に、プレートを撹拌しながら30分間、室温にてインキュベートした。洗浄後、プレートを振とうしながら室温にて30分間、ペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗マウスIgG抗体(ウェルあたり100μl)とともにインキュベートした。次に、プレートを上記のように洗浄し、基質コンジュゲート(10mlのクエン酸塩0.1M pH4.5〜4.6及び5μlのH2O2中の4mgのOPDA(オルトフェニレン-ジアミン))を暗所にて15分間、それぞれのウェルに添加した(100μl)。HCl 1N 50μlの添加によって反応を停止させ、吸光度を490nm(参照については620nm)で読み取った。
【０２４９】
PhtD抗体及びdPly抗体を測定するためのELISAの説明
プレートを、ウェルあたり100μlの、1μg/mlのPhtD(1021μg/ml)又は4μg/mlのPly(367μg/ml)を用いて、2時間、37℃にて被覆した。次に、プレートをNaCl 0.09％、ポリソルベート0.05％で3回洗浄した。洗浄後、「マウスにおける3種のワクチン製剤の免疫原性」と題する節において記載したように免疫付与されたマウス由来の血清又は参照(クロムピュアマウスIgGを用いて調整された内部参照)をマイクロウェルに添加し、PBS、ポリソルベート20 0.05％に連続希釈して100μl(2倍希釈段階)とした。プレートを撹拌しながら30分間、室温にてインキュベートした。洗浄後、プレートを振とうしながら室温にて30分間、ペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗マウスIgG抗体(ウェルあたり100μl)とともにインキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、基質コンジュゲート(10mlのクエン酸塩0.1M pH4.5及び5μlのH2O2中の4mgのOPDA)を暗所にて15分間、それぞれのウェルに添加した(100μl)。HCl 1N 50μlの添加によって反応を停止させ、吸光度を490nm(参照フィルターについては620nm)で読み取った。
【０２５０】
オプソニン食作用アッセイ(OPA)の説明
血清サンプルを45分間、56℃にて加熱し、いずれもの残存する内因性補体を不活性化した。それぞれ1:2に希釈した血清サンプルの25μlの分注液を、96ウェルの丸底マイクロタイタープレートのウェルあたり、25μlのOPA緩衝液(HBSS(ハンクス平衡塩溶液)-14.4％不活性化FCS(ウシ胎仔血清))中に連続して2倍希釈した。その後、例えば、4/2/1比(v/v/v)(血清型1、6B及び6Aを除くが、その比は4/2/2であった)である活性化HL-60細胞(1×107細胞/ml)、新たに融解した肺炎球菌のワーキングシード及び新たに融解したベビーウサギ補体の25μlの混合物を、希釈した血清に添加し、最終体積を50μlとした。アッセイプレートを、食作用プロセスを促進させるために環状に振とう(210rpm)させながら、2時間、37℃にてインキュベートした。少なくとも1分間、氷上にマイクロプレートを置くことによって、反応を停止させ、使用するまでプレートを氷上に維持する。次に、プレートのそれぞれのウェルの20μlの分注液を96ウェル平底マイクロプレートの対応するウェルに移し、50μlのTodd-Hewitt Broth-0.9％寒天をそれぞれのウェルに添加した。37℃、5％CO2にて一晩インキュベートした後、寒天中に出現した肺炎球菌コロニーを、自動化画像分析システム(KS 400、Zeiss、Oberkochen、Germany)を用いてカウントした。血清サンプルを含まない8個のウェルを、ウェルあたりの肺炎球菌数を決定するために、細菌対照として使用した。対照ウェルのCFUの平均数を決定し、それぞれの血清サンプルについて死滅活性の計算に用いた。血清サンプルについてのOPA力価を、肺炎球菌の50％死滅を促進することができる血清の逆希釈によって決定した。オプソニン食作用力価を、4パラメータ曲線フィット分析を用いることによって計算した。
【０２５１】
マウスにおける3種のワクチン製剤の免疫原性
27匹の雌性Balb/cマウスの2つのグループに、タンパク質単独(PhtD、dPly及びPEPilA-結果を示さず)、Prevnar 13(商標、市販の連鎖球菌ワクチン-結果を示さず)、10V、12V(DSP2A017)及び12V+タンパク質(DSP2A012)GMPロットを含む異なる製剤の1/10のヒト用量を用いて、0日目、14日目及び28日目に筋肉内(IM)注射によって免疫付与した。マウスは、異なる肢(臨床試験において、乳幼児の異なる部位での共投与を模倣している)に、Infanrix Hexa(商標、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、線維状赤血球凝集素、パータクチン、B型肝炎表面抗原、不活性化ポリオウイルス1型、2型及び3型、並びにインフルエンザ菌b糖(PRP)を含むワクチン)の1/10のヒト用量を受けた。
【０２５２】
抗IgGレベル及びオプソニン食作用力価を、42日目に回収した個々の及びプールされた血清においてそれぞれ決定した。
【０２５３】
12V+タンパク質ワクチンがIgG抗体価とオプソニン活性を誘導する可能性を評価し、12V及び10Vワクチンと比較した。
【０２５４】
様々な製剤で注射されたマウス由来の血清を、多糖血清型とタンパク質に対するELISA(上に記載される)において、及び12種の多糖血清型に対するOPAにおいて試験した。
【０２５５】
12V+タンパク質ワクチンは、大部分の血清型について、12Vと類似した応答を誘導した(図14及び15)。
【０２５６】
図16の結果は、12V+製剤、及び肺炎連鎖球菌糖コンジュゲートを含まない製剤について測定されたPE、PilA、PhtD、Ply及びPD抗体応答の間において統計差がないことを実証した。
【０２５７】
[実施例6]
モルモットにおける10V、12V及び12V+タンパク質ワクチンの免疫原性の比較
ELISA抗肺炎球菌多糖PSの説明
マイクロプレートを、2時間、37℃にて、ウェルあたり100μlの、PBS中、2.5μg/mlのPS1、5μg/mlのPS4、5、6A、6B、7F、9V若しくは14、10μg/mlのPS19A及び23F、40μg/mlのPS18C及びPS19F又は参照ウェルについて2μg/mlに希釈したアフィニピュアヤギ抗モルモットIgG(2.4mg/ml)を用いて被覆した。プレートをNaCl 150mM(0.9％)-ポリソルベート20 0.05％で3回洗浄した。それぞれのグループ由来のプールされた血清を、CPS(2.5mg/mlの6Aと6Bを除いて、1mg CPS/mlの未希釈血清)V/Vを含有するPBS-ポリソルベート20 0.05％中に希釈し(PS 6Aと6Bについては1/2、他の全ての血清型については1/10)、1時間、37℃にてインキュベートし、CPSに対する抗体を中和した。「モルモットにおける3種のワクチン製剤の免疫原性」と題する節において記載したように免疫付与されたモルモット由来の血清をマイクロウェルに添加し、PBS-ポリソルベート20 0.05％中に連続希釈して100μl(2倍希釈段階)とし、又は参照血清(PBS-ポリソルベート20 0.05％中で0.25μg/mlに希釈したクロムピュアモルモットIgG(11mg/ml))を添加した。プレートを30分間、室温にて撹拌下でインキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、ペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗モルモットIgG抗体(ウェルあたり100μl)を添加し、プレートを振とうしながら30分間、室温にてインキュベートした。洗浄後、基質(10mlのクエン酸塩0.1M pH4.5〜4.6と5μlのH2O2中の4mgのOPDA)を各ウェルに添加し(100μl)、15分間、暗所にてインキュベートした。HCl 1Nの添加によって反応を停止させた。分光光度計を用いて、490nm(参照について620nm)で吸光度を読み取った。発色は血清中に存在する抗体量に正比例する。
【０２５８】
抗PD、PE及びPilA抗体を測定するためのELISAの説明
プレートを、2時間、37℃にて、ウェルあたり100μlの、PBSにおける炭酸塩緩衝液pH9.6中の2μg/mlのPD(1mg/ml)、2μg/mlのPE(1500μg/ml)、若しくは2μg/mlのPilA(3660μg/ml)、又はPBS中の参照ウェルについては2μg/mに希釈したアフィニピュアヤギ抗モルモットIgG(2.4mg/ml)を用いて被覆した。プレートをNaCl 0.9％、ポリソルベート20 0.05％で4回洗浄した。PE及びPilA ELISAについて(このステップはPDとPly ELISAについて行われなかった)、プレートを30分間、室温にてPBS-BSA1％を用いて飽和させた。洗浄後、「モルモットにおける3種の製剤の免疫原性」と題する節において記載したように免疫付与されたモルモット由来の血清又は参照血清サンプル(クロムピュアモルモットIgGを用いて調整された内部参照)をマイクロウェルに添加し、PBS、ポリソルベート20 0.05％(PD ELISA用)、及びPEとPilA ELISA用のPBS、ポリソルベート20 0.05％、BSA 0.1％中に連続希釈して100μl(2倍希釈段階)とした。プレートを30分間、室温にてインキュベートした。洗浄後、プレートを振とうしながら室温にて30分間、ペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗モルモットIgG抗体(ウェルあたり100μl)とともにインキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、基質コンジュゲート(10mlのクエン酸塩0.1M pH4.5〜4.6及び5μlのH2O2中の4mgのOPDA)を暗所にて15分間、それぞれのウェルに添加した(100μl)。HCl 1N 50μlの添加によって反応を停止させ、吸光度を490nm(参照フィルターについては620nm)で読み取った。
【０２５９】
PhtD抗体及びdPly抗体を測定するためのELISAの説明
プレートを、ウェルあたり100μlの、PBS中の1μg/mlのPhtD(1021μg/ml)又は2μg/mlのPly(376μg/ml)を用いて、2時間、37℃にて被覆した。次に、プレートをNaCl 0.9％、ポリソルベート20 0.05％で4回洗浄した。洗浄後、「モルモットにおける3種のワクチン製剤の免疫原性」と題する節において記載したように免疫付与されたモルモット由来の血清又は参照(クロムピュアモルモットIgGを用いて調整された内部参照)をマイクロウェルに添加し、PBS、ポリソルベート20 0.05％に連続希釈して100μl(2倍希釈段階)とした。プレートを撹拌しながら30分間、室温にてインキュベートした。洗浄後、プレートを振とうしながら室温にて30分間、ペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗モルモットIgG抗体(ウェルあたり100μl)とともにインキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、基質コンジュゲート(10mlのクエン酸塩0.1M pH4.5〜4.6及び5μlのH2O2中の4mgのOPDA)を暗所にて15分間、それぞれのウェルに添加した(100μl)。HCl 1N 50μlの添加によって反応を停止させ、吸光度を490nm(参照フィルターについては620nm)で読み取った。
【０２６０】
オプソニン食作用アッセイ
血清サンプルを45分間、56℃にて加熱し、いずれもの残存する内因性補体を不活性化した。それぞれ1:2に希釈した血清サンプルの25μlの分注液を、96ウェルの丸底マイクロタイタープレートのウェルあたり、25μlのOPA緩衝液(HBSS(ハンクス平衡塩溶液)-14.4％不活性化FCS(ウシ胎仔血清))中に連続して2倍希釈した。その後、例えば、4/2/1比(v/v/v)(血清型1、6B及び6Aを除くが、その比は4/2/2であった)である活性化HL-60細胞(1×107細胞/ml)、新たに融解した肺炎球菌のワーキングシード及び新たに融解したベビーウサギ補体の25μlの混合物を、希釈した血清に添加し、最終体積を50μlとした。アッセイプレートを、食作用プロセスを促進させるために環状に振とう(210rpm)させながら、2時間、37℃にてインキュベートした。少なくとも1分間、氷上にマイクロプレートを置くことによって、反応を停止させた(プレートは、さらに使用するまで氷上に維持しなければならない)。次に、プレートのそれぞれのウェルの20μlの分注液を96ウェル平底マイクロプレートの対応するウェルに移し、50μlのTodd-Hewitt Broth-0.9％寒天をそれぞれのウェルに添加した。37℃、5％CO2にて一晩インキュベートした後、寒天中に出現する肺炎球菌コロニーを、自動化画像分析システム(KS 400、Zeiss、Oberkochen、Germany)を用いてカウントした。血清サンプルを含まない8個のウェルを、ウェルあたりの肺炎球菌数を決定するために、細菌対照として使用した。対照ウェルのCFUの平均数を決定し、それぞれの血清サンプルについて死滅活性の計算に用いた。血清サンプルについてのOPA力価を、肺炎球菌の50％死滅を促進することができる血清の逆希釈によって決定した。オプソニン食作用力価を、4パラメータ曲線フィット分析を用いることによって計算した。
【０２６１】
モルモットにおける3種の製剤の免疫原性
17匹のモルモットの2つのグループに、タンパク質単独(PhtD、dPly及びPEPilA-結果を示さず)、Prevnar 13(商標、市販の連鎖球菌ワクチン-結果を示さず)、10V、12V(DSP2A017)及び12V+タンパク質(DSP2A012)GMPロットを含む異なる製剤の1/4ヒト用量を用いて、0日目、14日目及び28日目に筋肉内(IM)注射によって免疫付与した。モルモットは、異なる肢(臨床試験において、乳幼児の異なる部位での共投与を模倣している)に、Infanrix Hexa(商標、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、線維状赤血球凝集素、パータクチン、B型肝炎表面抗原、不活性化ポリオウイルス1型、2型及び3型、並びにインフルエンザ菌b糖(PRP)を含むワクチン)の1/4のヒト用量を受けた。
【０２６２】
抗IgGレベル及びオプソニン食作用力価を、42日目に回収した個々の及びプールされた血清においてそれぞれ決定した。
【０２６３】
IgG抗体価とオプソニン活性を評価し、12V+タンパク質、12V及び10Vワクチン間で比較した。
【０２６４】
様々な製剤で注射されたモルモット由来の血清を、多糖血清型とタンパク質に対するELISAにおいて、及び製剤における12種の血清型に対するOPAにおいて試験した。
【０２６５】
12V+タンパク質は、12V製剤と類似した応答を誘導した。
【０２６６】
図17と18の結果は、PEPilAと組み合わせたとき、12価のコンジュゲートの免疫原性に対して負の影響がないことを実証した。
【０２６７】
12V+タンパク質GMP製剤を用いて得られた結果は、10V多糖とタンパク質の免疫原性を実証し、この製剤の臨床評価を支持する。
【図１】
0006412500.tif 000016
【図２】
0006412500.tif 000017
【図３】
0006412500.tif 000018
【図４】
0006412500.tif 000019
【図５】
0006412500.tif 000020
【図６】
0006412500.tif 000021
【図７】
0006412500.tif 000022
【図８】
0006412500.tif 000023
【図９】
0006412500.tif 000024
【図１０】
0006412500.tif 000025
【図１１】
0006412500.tif 000026
【図１２】
0006412500.tif 000027
【図１３】
0006412500.tif 000028
【図１４】
0006412500.tif 000029
【図１５】
0006412500.tif 000030
【図１６】
0006412500.tif 000031
【図１７】
0006412500.tif 000032
【図１８】
0006412500.tif 000033
【図１９】
0006412500.tif 000034
【配列表】
0006412500000001.app