(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
気体封入マイクロバブルを含む組成物の調製方法であって、
ｉ）熱変性可能なタンパク質の加熱されたタンパク質水溶液であって、初期変性を達成するのに必要な温度であって５０〜１００℃の範囲内の温度に加熱されたタンパク質水溶液を用意するステップと、
ｉｉ）加熱されたタンパク質溶液からの熱によって気体を加熱するステップであって、気体が、加熱されたタンパク質溶液の温度よりも２０℃以内しか低くない温度に加熱されるステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）の加熱された気体とステップｉ）の加熱されたタンパク質溶液とを混合して加熱された気液混合物を得るステップと、
ｉｖ）ステップｉｉｉ）の加熱された気液混合物を機械的剪断力に付すことによって加熱された気体をタンパク質溶液中に分散せしめ、変性タンパク質で被包された気体マイクロバブルの組成物を生成するステップと
を標記の順序で含む方法。
【請求項２】
ステップｉｉｉ）の混合が、ステップｉｖ）の機械的剪断力に付すために用いられる混合デバイスの入口又はその近傍で実施される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
タンパク質溶液が一定の供給圧力下で供給される、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
気体マイクロバブルが平均粒径の２０％未満の標準偏差をもつ粒径を有する、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
タンパク質がヒト血清アルブミンである、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
加熱されたタンパク質溶液の温度が６０〜８０℃の範囲内にある、請求項５記載の方法。
【請求項７】
請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法を実施するのに適した装置であって、
ｉ）高い機械的剪断力を生成し、入口と出口とを有する混合デバイス（２０）と、
ｉｉ）供給管（３０）であって、２本の流路の各々の開口を与える第１の入口（３２）と第２の入口（３４）、２本の流路を隔てる長手方向壁（３１）を含む伝熱部、及び混合デバイス（２０）の入口に連結された１つの出口（３６）を備える供給管（３０）と、
ｉｉｉ）熱交換器（６８）を介して供給管（３０）の第１の入口（３２）に連結された液体組成物用給液槽（４０）と、
ｉｖ）供給管（３０）の第２の入口（３４）に連結された気体槽（５０）と
を備える装置（１）。
【請求項８】
長手方向壁（３１）が供給管（３０）の管部に存在し、長手方向壁（３１）が管部の直径を横断して２本の流路を形成する、請求項７記載の装置（１）。
【請求項９】
長手方向壁（３１）が供給管（３０）の管部に存在し、管部が筒状外壁を有する外側管と内側管とを含み、内側管が外側管内部を貫通する、請求項７記載の装置（１）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超音波造影剤に関する。具体的には、本発明は、超音波造影剤、特に気体マイクロバブルを含む組成物の調製方法に関し、具体的には機械的エネルギーを用いて調製されたタンパク質で被包されたマイクロバブルに関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば脈管系（特に心拍動記録）及び組織の毛細血管系の研究において、超音波画像診断が貴重な診断ツールとなることは周知である。得られる超音波画像が改善されるように、固体粒子、乳化液滴、気体バブル、及び封入気体もしくは液体の懸濁液を始めとする様々な超音波造影剤が提案されている。最も成功を収めている超音波造影剤は、一般には、静脈から注入できる細かい気泡の分散液からなっている。例えば国際公開第９７／２９７８３号及び同第９３／０５８１９号パンフレットが、そのようなマイクロバブル分散液を記載している。マイクロバブルは、適切に安定化されれば、有利なことにはしばしば低用量で、例えば脈管系や組織の毛細血管系などの超音波による非常に有効な可視化を可能にし得る。そのような造影剤は、典型的には、気体を安定化させるのに、例えば乳化剤、油、増粘剤又は糖などの材料を含むか、又は様々な系、例えば多孔性気体含有微粒子又は気体封入マイクロバブルとして気体を閉じ込めるか封入する。マイクロバブルには超音波コントラスト剤の性能に不可欠な気体が含まれるが、様々な気体がマイクロバブルの安定性やエコー源性効果の持続時間などの特性を高めることがわかっている。超音波造影剤の一群は気体封入マイクロバブルの液体組成物を含む既成の調製物として調製され納品されている。
【０００３】
様々な方法がマイクロバブルの調製に用いられ得る。そのような気体を含有するマイクロバブルは、膜形成材料を含む液体を適当な気体又は気体混合物の存在下で振盪又は超音波処理することで製造され得る。他の方法には噴霧乾燥が含まれる。しかし、そのような技法によって製造されたマイクロバブルは、バッチごとに異なり得る大きな気泡径分布を有し、さらには、収率すなわち最終的に適切な気泡径を有するマイクロバブルとなる膜形成材料のパーセンテージもバッチごとに異なり得る。米国特許第５５５２１３３号には、コロイドミルを用いて気体を封入した熱変性可能なタンパク質を含む気体封入マイクロスフィアを作製する方法が記載されている。熱変性可能なタンパク質の水溶液が気体と合わされ、この混合物に機械的剪断力をかけて混合することで気体マイクロバブルの懸濁液を生成するが、ここでタンパク質は変性して気体−溶液界面に堆積している。
【０００４】
マイクロバブルの調製に際しては、製品仕様に準ずる製品を反復的に提供できる堅固な方法を有することが重要である。製造されたマイクロバブルは、所望のマイクロバブル径に近い、一般には１から７μｍ、例えば３〜５μｍの狭い気泡径分布を有することが望ましい。望ましくは、例えば７μｍ超の大径のマイクロバブルのパーセンテージは最低限に抑えるべきである。これを実現するには、マイクロバブル径の標準偏差は小さくなければならない。このことは、従来技術の方法を用いては実現されていない。一つの課題は、製造サイクルを通じて、また製造運転時はいつでも、狭い気泡径分布を有する再生産可能なマイクロバブルを製造することである。変性タンパク質で被包された気体マイクロバブルを含む組成物を調製するためなど、造影剤を調製するための堅固な方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９７／２９７８３号
【特許文献２】国際公開第９３／０５８１９号
【特許文献３】米国特許第５５５２１３３号
【発明の概要】
【０００６】
当技術分野の必要性に鑑み、本発明は、変性タンパク質で被包された気体マイクロバブルを含む組成物のような造影剤の堅固な調製方法を提供する。今回、収率が向上し、過大及び過小マイクロバブルが過度に製造されないような方法を同定して開発することに成功した。本発明のこの方法では、熱変性可能なタンパク質の水溶液を気体と合わせ、これらを高い機械的剪断力を用いて機械的に混合する。タンパク質と気体は共に混合前に加熱しておくべきであり、すると得られるマイクロバブルが狭い気泡径分布を有する堅固な方法が得られるという予想外の知見が得られた。
【０００７】
したがって、第１の態様では、本発明は、気体封入マイクロバブルを含む組成物の調製方法を提供するが、本方法は、
ｉ）熱変性可能なタンパク質のタンパク質水溶液を初期変性を達成するのに必要な温度で用意するステップと、
ｉｉ）加熱されたタンパク質溶液からの熱によって気体を加熱するステップと、
ｉｉｉ）加熱された気体と加熱されたタンパク質溶液とを混合して気液混合物を得るステップと、
ｉｖ）気液混合物を機械的剪断力に付すことによって気体をタンパク質溶液中に分散せしめ、変性タンパク質で被包された気体マイクロバブルの組成物を生成するステップと
を標記の順序で含む。
【０００８】
第２の態様では、本発明は、気体封入マイクロバブルを含む組成物の調製に有用な供給管を提供するが、本供給管は、
ｉ）２本の流路の各々の開口を与える第１の入口と第２の入口と、
ｉｉ）２本の流路を隔てる長手方向壁を含む伝熱部と、
ｉｉｉ）混合デバイスの入口と接続可能な１つの出口と
を含む。
【０００９】
第３の態様では、本発明は、本発明の供給管を含む装置を提供する。本態様に係る装置は、
ｉ）高い機械的剪断力を生成し、入口と出口とを有する混合デバイスと、
ｉｉ）供給管であって、
２本の流路の各々の開口を与える第１の入口と第２の入口、
２本の流路を隔てる長手方向壁を含む伝熱部、及び
混合デバイスの入口に連結された１つの出口
を含む供給管と、
ｉｉｉ）供給管の第１の入口に連結された液体組成物用給液槽と、
ｉｖ）供給管の第２の入口に連結された気体槽と
を備える。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】変性タンパク質で被包された気体マイクロバブルを含む組成物の調製に有用な装置を概略的に示す図である。
【図２】片方は気体の輸送用でありもう片方はタンパク質溶液の輸送用である２本の流路を含む、本発明による供給管を概略的に示す図である。
【図３】本発明による代替の供給管を概略的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
第１の態様では、本発明は、気体封入マイクロバブルを含む組成物の調製方法を提供するが、本方法は、
ｉ）熱変性可能なタンパク質のタンパク質水溶液を初期変性を達成するのに必要な温度で用意するステップと、
ｉｉ）加熱されたタンパク質溶液からの熱によって気体を加熱するステップと、
ｉｉｉ）加熱された気体と加熱されたタンパク質溶液とを混合して気液混合物を得るステップと、
ｉｖ）気液混合物を機械的剪断力に付すことによって気体をタンパク質溶液中に分散せしめ、変性タンパク質で被包された気体マイクロバブルの組成物を生成するステップと
を標記の順序で含む。
【００１２】
本発明の方法を用いると、タンパク質溶液と気体はステップ（ｉｖ）で用いられる混合デバイスに流入する前に両方とも加熱され、混合デバイスに供給されるときの気体の膨張が防止される。このことは、安定した方法及び狭い気泡径分布のマイクロバブルを提供するに際の重要な要因であることが判明した。この方法では、タンパク質溶液と気体を合流させる前に、タンパク質溶液の熱を用いて気体を加熱する。したがって、タンパク質溶液と封入される気体の両方が、混合デバイスに導入される前に予熱されることになる。タンパク質は、そのタンパク質の初期変性が起こる温度まで加熱される。変性温度は、不溶性材料が最初に観察される温度である。変性温度は、文献中のタンパク質熱変性の表から得ることもできるし、或いは公知の方法によって実験的に得ることもできる。溶液中でのタンパク質の変性温度は、通常は５０〜１００℃の範囲であるが、タンパク質の種類や、純度、供給源などによって異なる。本発明の方法では、封入マイクロバブルを提供するタンパク質としてアルブミンが好ましい。アルブミン溶液を使用する場合は、６０〜８０℃に、より好ましくは６５〜７５℃に、最も好ましくは６８〜７２℃に加熱する。実際に必要な温度はいくつかのパラメータによって左右されるが、気体−タンパク質溶液混合物が混合デバイスに流入した後で機械的エネルギーに晒される結果、温度がわずかに上昇することがあることも考慮に入れるべきである。これらの成分が混合デバイスに流入するとき、タンパク質溶液から気体に熱が伝達されて、気体は混合デバイス内の温度に近い温度になっているので、混合デバイスに流入するとき気体が大きく膨張することはない。このように、気体は加熱されたタンパク質の温度に近い温度に、例えば、少なくとも変性温度マイナス２０℃の温度に、より好ましくは変性温度マイナス１５℃の温度に、より好ましくは変性温度マイナス１０℃の温度に加熱されるはずである。最も好ましくは、タンパク質溶液と気体は、混合デバイスに流入するとき、ほぼ同じ温度である。タンパク質は、例えば熱交換器を用いて加熱される。タンパク質溶液から気体への熱伝達は、気体と加熱されたタンパク質を、これらの２種類の別個の流れが合流して混合デバイスに流入するまで互いに近接し平行に走る２本の流路で輸送することで実現できる。したがって、熱は、タンパク質溶液から気体流に、好ましくは管の別個の流路を隔てる熱伝導壁を通して伝達される。
【００１３】
本発明のさらなる実施形態では、加熱された気体と加熱されたタンパク質溶液の混合は、混合デバイスの入口又はその近傍で起こる。このように、気体とタンパク質溶液は、分散ステップが行われる直前に予混合される。気体とタンパク質溶液を混合デバイスの入口のずっと手前で合流させると、プラグ流が生じ、そのせいで製造されたマイクロバブルの気泡径分布にばらつきが生じることが今回判明した。２種類の成分を混合デバイスの入口で合流させると、混合工程がより制御しやすくなる。したがって、タンパク質溶液と気体は、混合デバイスに流入する直前又は流入時に合流させる。このことは、タンパク質溶液と気体を、これらの２種類の加熱された流れを混合デバイスの入口近くで合流させるまで、互いに密接し平行に走る２本の流路で輸送することによって実現される。こうすることで、気体流とタンパク質溶液流は、一つの均等に分配された均質な混合物としてプラグ流なしに混合デバイスに流入し、次いでマイクロバブルを製造する機械的混合に付される。ミルなどの混合デバイスではバブルの製造は極めて迅速に進行するので、混合デバイスに流入する際に、気体とそれを封入するタンパク質が、均等に分配され、製造サイクルを通して安定な濃度を有していることが重要であると今回判明した。
【００１４】
さらに、例えば蠕動ポンプなどを用いてタンパク質溶液を混合装置内へと押し出すよりも、タンパク質溶液を一定の供給圧力下で、例えば流量を制御する制御弁と組合せて提供するほうが、製造されたマイクロバブルの気泡径によい影響を及ぼすことが見いだされている。加熱されたタンパク質溶液をコロイドミルなどの混合デバイス内へと押し出すことを含む製造ラインを備えたとき、ポンプが圧力パルスを生成し、混合デバイス内で生成されたマイクロバブルの気泡径分布が広がった、という経験がある。したがって、本発明のさらなる実施形態では、方法は、圧力パルスを生成することなく、タンパク質溶液が加熱され気体と混合される前に該タンパク質溶液を安定圧力下で供給するステップを含む。そのような一定の供給圧力は、加圧給液槽を用いることで実現する。このように、方法は、タンパク質溶液の供給流の安定圧力を好ましくは用い、それによって毎分０．５〜３．０リットルなどの、例えば毎分１〜２リットルの速度で安定流量を提供する。給液槽からのタンパク質溶液の流れ及びこの流量は、好ましくは加熱が開始される前に、制御され任意に調節される。
【００１５】
好ましい実施形態では、方法は、気体流及びタンパク質溶液流を加熱し、加熱された気体と加熱されたタンパク質溶液を混合デバイス入口のところで合わせ、タンパク質溶液を安定圧力下で供給する、全要素を含む。
【００１６】
本発明の方法では、気体とタンパク質溶液の混合物は、機械的剪断力をかけられることで、完全に混合される。使用される機械的剪断力によって、所望の気泡径のマイクロバブルが調製される。このことは、内部で高い機械的剪断力が生成される、高速ミキサ、ミル、ロータ・ステータ、フリューダイザなどの混合デバイスを使用することによって実現される。本発明の好ましい実施形態では、コロイドミルやコーンミルなどのミルが、タンパク質溶液と気体を分散させるステップ（ｉｖ）で使用される。そのようなミルは、対向面をもつ高速ロータと付随するステータとを含む。ロータ及び固定ステータを利用するミキサは、典型的には、相当速い回転速度で作動してロータ先端部で高速を生じさせる。ロータとステータとの速度差は、ロータとステータ間の間隙において非常に高い剪断及び乱流エネルギーを与える。したがって、先端部速度は、製品への剪断力のインプット量を考慮する際の非常に重要な要因である。本発明の方法では、ロータ表面とステータ表面の相対速度は、少なくとも２０ｍ／ｓであるべきである。ロータが好ましくも円錐形である場合、表面における速度は直径次第となるので、コーンの先端から基部までで変化する。このように、加熱された気体とタンパク質溶液の混合物は、互いに対し相対的に少なくとも２０ｍ／ｓの速度で、好ましくは少なくとも速度２５ｍ／ｓで、特に好ましくは少なくとも速度３０ｍ／ｓで、一層特に好ましくは速度３５ｍ／ｓで、先端部では例えば最高１００ｍ／ｓで、より具体的には最高６０ｍ／ｓで、特に最高５０ｍ／ｓで動く表面が及ぼす剪断力をかけられるゾーンを通過する。
【００１７】
本発明の一実施形態では、方法は、ステップ（ｉｖ）の後にさらなるステップを含み、ここでは調製済み組成物がバルク容器又は直接充填槽に移される。バルク容器は、例えば可撓性のある大きな袋であり、例えばその容積は１０〜１００リットルである。調製済み製品すなわち気体封入マイクロバブルを含む組成物を混合デバイスからバルク容器又は充填槽に移す前に、例えば熱交換器を用いて組成物の温度を下げる。混合デバイスから流出する製品の温度は、例えば２５〜２８℃など２０〜３０℃の温度まで下げられる。
【００１８】
本発明の方法を用いると、生成されたマイクロバブルの狭い気泡径分布が実現し、また、この方法は製品仕様に準ずる製品を反復的に提供する。このことは、使用される成分が高価なものであるだけに、経済的に成り立ち得る方法を提供するために重要であり、仕様要件に適合しないマイクロバブルの製造による材料損失はこの方法によって回避される。請求項記載の方法の改良に加えて、気体の流れとタンパク質溶液の流れ、及びそれらの比率、タンパク質溶液の温度、及びミキサの速度（ロータの速度）のようなパラメータが、製品の特性及び最適化されるべきニーズに影響を及ぼす。所与の製品はどれでも、その特性が臨床的に定義される。例えばＯｐｔｉｓｏｎ（商標）では、平均直径は３．０〜４．５μｍの範囲であり、その９５％は１０μｍ未満である。濃度規定は、５．０〜８．０×１０8マイクロバブル／ｍｌである。本発明の方法により調製されたマイクロバブルは、狭い気泡径分布と、低い標準偏差を有する明確に規定される平均粒径とを有する。製造されたマイクロバブルは、所望のマイクロバブル径に近い、一般には１〜７μｍ、例えば３〜５μｍの狭い気泡径分布を有することになり、標準偏差も小さい。実施例１に示すように、一連の実例の実施では、得られた平均粒径は非常に安定しており、２．８〜４．３μｍの差があった。本発明の方法を、例えばヒト血清アルブミンと全フッ素置換気体のマイクロバブルを製造する際に用いることで、０．１８〜０．２５μｍの粒径の標準偏差が得られた。パーセンテージでは、２０％未満の、例えば１０％未満の粒径の標準偏差がこの方法によって得られる。３．０〜４．５μｍの範囲の平均粒径を有する粒子を調製する場合、７．３％以下の標準偏差が得られる。加えて、明確に規定されるマイクロバブル濃度（粒子数／体積）が低い標準偏差で得られた。実施例１で報告するように、３．１から１１．８×１０8マイクロバブル／ｍｌで異なる濃度が得られたが、実施の大半では濃度は５．０から８．０×１０8マイクロバブル／ｍｌであった。濃度の標準偏差は例えば０．４０から０．７０×１０8マイクロバブル／ｍｌであった。パーセンテージでは、得られた濃度の標準偏差は１５％未満であり、より好ましくは１２％である。したがって、濃度と粒径に関する製品仕様による要件は、請求項記載の方法によって実現される。
【００１９】
本発明の方法により調製された気体マイクロバブルは、気体マイクロバブルを封入し、気体が周囲の液体に拡散するのを遅延させ、マイクロバブル同士の融合を防止する安定化剤によって安定化される。本発明の方法では、そのような安定化剤は感熱性なので、製造工程の間加熱されて部分的に不溶性となることができる。マイクロバブルを形成するための好ましい材料は、アミノ酸ポリマーである。そのようなポリマーは、タンパク質分解酵素の作用によって生分解する。使用可能なアミノ酸ポリマーには、天然アミノ酸（タンパク質）及び合成アミノ酸ポリマーが含まれる。好ましいタンパク質はアルブミンであるが、動物のアルブミンでもヒトのアルブミンでもよく、ただし最も好ましくはヒト血清アルブミンである。ヘモグロビンなどの他の水溶性タンパク質、好ましくはヒトのヘモグロビンをアルブミンの代わりとしてもよい。使用可能な合成アミノ酸ポリマーには、ポリ−Ｌ−リジン及びポリ−Ｌ−グルタミン酸が含まれる。例えば、分子量２０，０００〜５０，０００のポリ−Ｌ−リジン又はポリ−Ｌ−グルタミン酸を単独で又はアルブミンなどの別のポリマーと併用で用いることができる。タンパク質誘導体又はタンパク質画分も、本発明の範囲内である。実際の変性温度の範囲は、使用されるタンパク質又はタンパク質誘導体による。
【００２０】
生体適合性気体を組成物のマイクロバブルに使用することができるが、「気体」という用語は、ヒトの正常体温３７℃で実質的又は完全に気体の形態である（蒸気を含む）あらゆる物質（混合物を含む）を含むことが理解できる。したがって、気体には、例えば空気、窒素、酸素、二酸化炭素、水素、亜酸化窒素、ヘリウム、アルゴン、キセノンもしくはクリプトンなどの不活性ガス、六フッ化硫黄、五フッ化硫黄もしくはトリフルオロメチル五フッ化硫黄などのフッ化硫黄、
六フッ化セレン、
テトラメチルシランなどの任意でハロゲン化されているシラン、
低分子量の炭化水素（例えば炭素原子を最高７個含むもの）、例えばメタン、エタン、プロパン、ブタンもしくはペンタンなどのアルカン、シクロブタンもしくはシクロペンタンなどのシクロアルカン、プロペンもしくはブテンなどのアルケン、又はアセチレンなどのアルキン、
エーテル、ケトン、エステル、
ハロゲン化低分子量炭化水素（例えば炭素原子を最高７個含むもの）、又はこれらの任意の混合物が含まれる。
【００２１】
ハロゲン化低分子量炭化水素を含む組成物が好ましい。ハロゲン化気体中のハロゲン原子の少なくとも一部は有利にはフッ素原子である。したがって、生体適合性ハロゲン化炭化水素気体は、例えば、ブロモクロロジフルオロメタン、クロロジフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、クロロトリフルオロメタン、クロロペンタフルオロエタン、ジクロロテトラフルオロエタン及びパーフルオロカーボン、例えばパーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン（例えばパーフルオロ−ｎ−ブタン、任意にパーフルオロイソブタンなどの他の異性体との混合体である）、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘキサン及びパーフルオロヘプタンなどのパーフルオロアルカン、パーフルオロプロペン、パーフルオロブテン（例えばパーフルオロブタ−２−エン）及びパーフルオロブタジエンなどのパーフルオロアルケン、パーフルオロブタ−２−インなどのパーフルオロアルキン、及びパーフルオロシクロブタン、パーフルオロメチルシクロブタン、パーフルオロジメチルシクロブタン、パーフルオロトリメチルシクロブタン、パーフルオロシクロペンタン、パーフルオロメチルシクロペンタン、パーフルオロジメチルシクロペンタン、パーフルオロシクロヘキサン、パーフルオロメチルシクロヘキサン及びパーフルオロシクロヘプタンなどのパーフルオロシクロアルカンから選択され得る。他のハロゲン化気体には、フッ化ケトン例えばパーフルオロアセトンなどの全フッ素置換されたケトン、及びフッ化エーテル例えばパーフルオロジエチルエーテルなどの全フッ素置換されたエーテルが含まれる。本発明の方法を、特に安定なマイクロバブル懸濁液を形成することで知られるフッ化硫黄又はフルオロカーボン（例えばパーフルオロカーボン）などのフッ化気体を含む組成物に使用することはさらに有利であり得、ここでＳＦ6、パーフルオロプロパン及びパーフルオロブタンが好ましく、特にパーフルオロプロパンが好ましい。
【００２２】
最も好ましくは、本発明の方法は、タンパク質を含むマイクロバブル、最も好ましくはアルブミンを含み、パーフルオロカーボン気体、最も好ましくはパーフルオロプロパン、別名オクタフルオロプロパン（ＯＦＰ）又はパーフルトレンを封入するマイクロバブルを含む組成物の調製用である。好ましい実施形態では、請求項記載の方法によりＯｐｔｉｓｏｎ（商標）という製品が製造される。
【００２３】
第２の態様では、本発明は、第１の態様の方法により調製される組成物を提供する。組成物は、治療又は診断目的であり得、又は併用され得るが、好ましくは超音波造影剤としての診断用途が望ましい。この組成物は、好ましくは既成の調製物である。すなわち、この組成物は、好ましくは注射用水などの生理学的に許容可能な水系担体中の気体マイクロバブルの分散液である。バイアルや瓶などの小型容器に充填し封をした後、患者に注入する前に均質な懸濁液を準備するためにそっと振盪して再懸濁させることが必要な場合がある。こうして組成物をヒト又は動物の患者に注入する準備ができる。マイクロバブルが生体標的と親和性のあるベクターを含んでいる超音波造影剤も包括される。様々な撮像技法が超音波の適応に利用され得る。例えば、ファンダメンタル及びハーモニックＢモード撮像、並びにファンダメンタル及びハーモニックドップラー撮像が含まれる。所望であれば、三次元撮像技法も使用できる。
【００２４】
第３の態様では、本発明は、気体封入マイクロバブルを含む組成物の調製に有用な供給管を提供するが、本供給管は、
ｉ）２本の流路の各々の開口を与える第１の入口と第２の入口、
ｉｉ）２本の流路を隔てる長手方向壁を含む伝熱部、
ｉｉｉ）混合デバイスの入口と接続可能な１つの出口
を備える。
【００２５】
２つの入口が、例えばツリー・クランプなどの密封連結を提供するクランプを用いて輸送ライン又はチューブと連結されるように設計されている。好ましくは、一方の入口は熱変性可能なタンパク質の水溶液などの液体組成物を輸送するチューブと連結可能であり、他方の入口はパーフルオロカーボン気体などの気体を輸送するチューブと連結可能である。この２つの入口は隔てられ、外部から見ると伝熱部の開始部のところで合体している２つの管部の開口部を設けている。
【００２６】
伝熱部は、好ましくは管の主要な部分をなし、２本の流路が平行に走って、一方の流路内を輸送される流れから他方の流路の流れに熱が伝達され得る。好ましくは、管は、少なくとも伝熱部において、１本の筒状管内で２本の別々の流路を提供する筒状外表面を有し、これらの流路は、それらを通る流れが混合されるのを防止する長手方向内壁で隔てられている。１つの実施形態では、内部の筒状部分は長手方向壁によって２つの半体に分けられて、２本の半体管を１本ずつ各流路に提供する。別の実施形態では、２本の流路は、１本の内側管を外側管内に通すことによって隔てられる。このように、この実施形態では、長手方向壁は筒状内側管をなし、したがって１本の流路が他方の流路内を通っており、これら２本の管は好ましくは同じ中央線を有する。好ましくは、気体流が内側流路を通り、液体組成物が外側流路を通る。２本の流路内の流れに温度差がある場合、この温度差はこれらの流れが出口へと平行に移動するとき消滅することになる。管の長さは、一方の流路の流れから他方に熱伝達が可能な十分な長さでなければならない。伝熱部の長さは、所望の熱交換を確保するのに十分であり、例えば、１５〜５０ｃｍなど、１０〜１００ｃｍであり、好ましくは２０〜４０ｃｍである。液体組成物の入口として適切な内径寸法は、１５〜２５ｍｍなど、５〜４０ｍｍである。気体の入口として適切な径寸法は、０．５〜４０ｍｍである。管が２本の半体管に分けられる実施形態では、気体入口は、タンパク質溶液の入口と同じ寸法であり得る。気体流が内側管を通る実施形態では、気体管の直径は、好ましくはタンパク質溶液の管の直径よりもかなり小さく、例えばわずか０．５〜３．０ｍｍであるのが好ましい。伝熱部では、外径は、タンパク質溶液の第１の管部の外径とだいたい同じ、例えば１０〜４５ｍｍであるのが好ましい。
【００２７】
供給管の出口は、例えばツリー・クランプなどの密封連結を提供するクランプを用いて、混合デバイスの入口と連結可能である。管の出口のところか又はその付近で長手方向内壁は終わって管の２本の流路は合体し、その結果これらの内部を通る流れは混ざり合って、工程の間中常に同じ均質な組成物を提供する。したがって、供給管が混合デバイスに連結されているとき、新しく混合された組成物が混合デバイスに流入するか、液体組成物と気体が入口のところかもしくは入口に流入した直後に混合するか、いずれかとなる。気体が内側管内を通る実施形態では、この管はタンパク質溶液の出口と同じ場所で終わって出口を有することができる。つまり、その場合は内側管と外側管は同じ長さである。或いは、内側管は外側管の出口よりもわずかに手前で終わり、２種類の成分が混合デバイスに流入する前に確実に混合されるようにしてもよい。さらに別の代替では、内側管は外側管よりも長く、外側管の出口の外側に延出していてもよい。この代替では、供給管が混合デバイスに連結されているとき、内側管は混合デバイスの内部に延出することになる。管の伝熱部が長手方向壁によって２本の半体管に分けられている実施形態では、この壁は管の出口のところで、或いは出口よりもわずかに手前で終わって、成分が混合デバイスに流入する前に確実に混合されるようにできる。
【００２８】
供給管は、いかなる便利な材料又は材料の組合せで作製してもよいが、金属又はセラミック製であること、具体的には鋼、好ましくはステンレス鋼などの金属であることが望ましい。
【００２９】
別の態様では、本発明は、気体封入マイクロバブルを含む組成物を調製する装置を提供するが、本装置は本発明の第３の態様に記載の供給管を含む。
【００３０】
したがって、本発明の装置は、
ｉ）高い機械的剪断力を生成し、入口と出口とを有する混合デバイスと、
ｉｉ）供給管であって、２本の流路の各々の開口を与える第１の入口と第２の入口、２本の流路を隔てる長手方向壁を含む伝熱部、及び混合デバイスの入口に連結された１つの出口を備える供給管と、
ｉｉｉ）供給管の第１の入口に連結された液体組成物用給液槽と、
ｉｖ）供給管の第２の入口に連結された気体槽と
を備える。
【００３１】
混合デバイスは、内部で高い機械的剪断力が生成される、高速ミキサ、ミル、ロータ・ステータ、フリューダイザなどのデバイスである。本発明の好ましい実施形態では、混合デバイスはコロイドミルやコーンミルなどのミルであり、タンパク質溶液と気体を分散させるのに使用される。そのようなミルは、対向する面を有する高速ロータと、付随するステータとを含む。すなわち、出発混合物が、２種類の表面、つまり一方はロータと呼ばれる要素であり他方はステータと呼ばれる要素の相対的な回転による剪断力を及ぼされるゾーンを通過する、ミキサである。ロータ及び固定ステータを利用するミキサは、典型的には、相当速い回転速度で作動してロータ先端部で高速を生じさせる。ロータとステータとの速度差は、ロータとステータ間の間隙において非常に高い剪断及び乱流エネルギーを与える。本発明の装置の混合デバイスでは、互いに対し相対的に動いて剪断力ゾーンを作る表面は、互いに２ｍｍ未満、好ましくは１ｍｍ未満、特に好ましくは６００μｍ、例えば３００〜５００μｍ離れているのが望ましい。ロータとステータ間の距離は、例えば０．２〜０．６ｍｍ調節可能であることが好ましい。最適な隔離は、剪断力ゾーンを通過する混合物の粘度に左右されることになり、最低限の隔離が製造上の制限により課せられ得る。タンパク質溶液と気体の混合物は、分散され、ロータ表面とステータ表面間で空洞を作る。混合デバイスは、好ましくはさらに、ロータと、モータや軸受を含め該ロータの駆動手段とが配置された混合チャンバを含む。ミキサは、ロータと対面関係のステータを有し、ステータとロータは、滑らかな表面を有するか、又は一実施形態では、半径方向に延出する流体輸送手段を設けられた軸方向に延出し噛み合う隆起部と溝部を有し、それによって入口からロータとステータ間を半径方向に流れる流体の複数の剪断力ゾーンを画成することができる。本発明のミキサ装置では、入口は剪断力ゾーンの半径方向内側で、好ましくはロータの回転軸のところかその付近に配置されるのが好ましい。望ましくは混合デバイスの入口はロータの駆動シャフトに隣接しているので、供給管出口からの気体とタンパク質溶液の混合物は、剪断力ゾーンに流入する前に、必要に応じて予混合チャンバ内でさらに予混合され得る。
【００３２】
適切な混合が確実に行われるように、同じ駆動手段によって、好ましくは回転する駆動シャフトによって駆動される、第２のロータ及び所望であればさらなるロータ、例えば最高５枚のロータを備えることができる。第２のロータを備えるところでは、ミキサは、第１のチャンバの出口ポートと連通する入口ポートを有しかつそれ自体の出口ポートも有する第２の混合チャンバを、望ましくも有することになる。
【００３３】
ロータ及びステータは、いかなる便利な材料又は材料の組合せで作製してもよいが、金属又はセラミック製であること、具体的には鋼などの金属であることが望ましい。さらに、ロータ及びステータの表面は、所望であれば、最終製品の最適な収率又は特性を提供するためにコーティング又は処理をすることができる。ロータ及びステータの構成要素の寸法は、ロータを作製する材料、所期の小胞の上限寸法、回転速度、ロータ直径、及び混合物の粘度に左右されることになるが、一般には、ステンレス鋼の構成要素で、回転速度が５０００〜１２０００ｒｐｍ、水系混合物であれば、最大２５ｃｍ、例えば７．５〜１５ｃｍのロータ直径が使用できる。しかし、これらのパラメータは、限定的なものではなく、本発明の装置において有用な混合デバイスは、他の寸法、材料、及び運転速度でも製造され得る。
【００３４】
本発明の装置の混合デバイスは顕著な加熱効果を生じることがあり、また、マイクロバブルの径及び安定性は温度に影響され得るので、混合デバイスに温度制御手段を設けることは特に好ましく、それは混合チャンバを包囲する冷却ジャケット、或いはステータかロータの内部のもしくはそれと熱連通している熱交換器などの冷却要素、又は代わりにもしくは加えてロータ駆動シャフトか該ロータ駆動シャフトを取り囲む機械的シールの内部のもしくはそれと熱連通している冷却要素などの、例えばサーモスタット制御の加熱又は冷却手段である。混合物の温度は、各混合チャンバの出口のところか、又はロータの縁部のところで監視され得、そのような温度制御手段の制御に使用され得る。混合デバイスには、混合デバイスの出口から流出する製品の流れと熱連通する熱交換器などの冷却要素を設けて、混合デバイスから流出する製品の流れの温度を例えば２０〜３０℃に（２５〜２８℃などに）下げることが、さらに望ましい。出口はミル底部に向けて配置されるのが好ましい。
【００３５】
装置の供給管を第３の態様に記載する。
【００３６】
装置は、さらに、以下に記載するような他の要素によって供給管の第１の入口と連結されたタンパク質溶液などの液体組成物用の給液槽を含む。給液槽は、一定の供給圧力を提供する加圧給液槽であるが、これは生成されたマイクロバブルの気泡径分布によい影響を及ぼし、狭い気泡径分布を提供することが見いだされている。給液槽は、例えば圧縮空気又は窒素ガスなどの不活性ガスを給液槽内に吐出することによって加圧される。好ましくは、このガスは、無菌フィルタを通じて添加される。給液槽内の圧力は、例えば０．５〜３．０ｂａｒＧ（１．５〜４．０ｂａｒＡに等しい）であり、好ましくは１〜２ｂａｒＧである。そのような加圧給液槽は、さらに、スターラなどの混合手段を含んで、加熱されて混合デバイスに送達される均質な溶液を提供し得る。給液槽は、例えば、５０〜１５０リットルなど、１０〜２００リットルであり、毎分０．５〜３．０リットルなど、例えば毎分１〜２リットルの速度で安定した流量を提供する。給液槽からのタンパク質溶液の流れ及びこの流量は、好ましくは加熱が開始される前に、制御され任意に調節される。このことは、給液槽の出口のところにフロー・コントローラ及び調節弁を含むことによって実施され得る。さらに、給液槽と供給管との間で、タンパク質溶液の供給流がタンパク質の初期変性を得るのに必要な温度に加熱される。供給流には、例えば供給流内のもしくは供給流と熱連通する熱交換器などのサーモスタット制御の加熱などの温度制御手段を設けるのが望ましい。タンパク質溶液の供給流の温度は、タンパク質溶液の供給流から熱が気体に伝達される供給管に流入する前に、監視することができる。
【００３７】
装置は、さらに、以下に記載するような他の要素によって供給管の第２の入口と連結された気体槽を含む。気体槽は、気体マイクロバブル内に封入される気体の供給源である。気体槽の気体流量は、好ましくは気体が加熱される供給管に流入する前に、制御され任意に調節される。この調節は、気体槽の出口のところにフロー・コントローラ及び調節弁を含むことによって実施され得る。気体槽は、圧力下で、例えば１〜４ｂａｒＧの圧力下で、気体を提供する。気体流量は、例えば０．５〜２．５リットル／分である。しかし、ミルに流入する気体の圧力は、毎分の回転数及び流量の数値によって設定されるので、気体によって容易に調節することはできない。
【００３８】
感染性因子を含めあらゆる形態の微生物を除去すなわち殺すために、１以上の無菌フィルタを装置に含むことができる。
【００３９】
次に本発明の好ましい実施形態を単に例として添付の図面を参照しながら記載する。図１は、本発明による装置を概略的に示し、該装置は変性タンパク質で被包された気体マイクロバブルを含む組成物の調製に便利である。このように、図１は装置１を示し、その主要な構成要素は、混合デバイス２０、供給管３０、液体組成物用の給液槽４０、及び気体槽５０である。給液槽４０は、例えば変性可能な血清アルブミン溶液などの溶液４２を含む。給液槽４０には溶液を構成する成分４１が供給されている。好ましい実施形態では、そのような成分は、例えば５％溶液で提供される血清アルブミン４１ａ、注射用水４１ｂ、及び好ましくは０．９％溶液の塩化ナトリウム４１ｃであり、これらが１％のヒト血清アルブミン溶液４２を構成している。圧縮空気又は窒素ガスが無菌フィルタ４４を通じて給液槽４０内に吐出されて内容物を圧縮する。さらに、温度制御ユニット４７が給液槽４０に連結される。均質な溶液４２を提供するために給液槽４０内にはスターラ４６がさらに含まれる。給液槽４０からのタンパク質溶液の流れは、給液槽４０の出口付近でフロー・コントローラ６２と調節弁６４によって制御され任意に調節される。次いで溶液は好ましくは無菌フィルタ６６を通過する。さらに、給液槽４０と供給管３０との間で、タンパク質溶液４２の供給流が、タンパク質の初期変性を得るのに必要な温度に熱交換器６８を用いて加熱される。所望の温度に加熱された後、タンパク質溶液は入口３２から供給管３０に流入する。
【００４０】
気体槽５０は、マイクロバブル内に封入される気体５２を供給する。気体槽５０からの気体の流れは、気体槽５０の出口付近でフロー・コントローラ７２と調節弁７４によって制御され任意に調節される。供給管３０に流入する前に、気体５２は好ましくは無菌フィルタ７６を通過する。次いで気体は、タンパク質溶液用の入口３２とは隔てられている入口３４から供給管３０に流入する。供給管３０内ではタンパク質溶液から気体へと温度伝達が生じるので、気体が混合デバイス２０に流入するときになんら重大な膨張が生じることはない。タンパク質溶液４２及び気体５２は管３０の出口３６から流出し、入口２４から混合組成物として混合デバイス２０に流入する。供給管３０の出口３６と混合デバイス２０の入口２４とは、例えばクランプによって連結され得る。混合デバイス２０は、ロータ２５とステータ２６とを含むミル２２を含み、ロータ２５はモータ２９とその駆動手段によって駆動され、該駆動手段は軸受２８及び任意の冷却系を含む。生成された製品８０、すなわち好ましくは変性タンパク質で被包された気体マイクロバブルの組成物は、混合デバイスから、好ましくはミル２２の底部のところから抜かれる。製品流８０の温度は、例えば熱交換器を含む温度制御ユニット８２を用いて任意に測定され調節される。
【００４１】
図２及び図３は、本発明による代替の供給管を示す。図２ａは、第１の管部３３に開口を提供する第１の入口３２を有する供給管３０を示す。入口３２は、好ましくはタンパク質溶液の供給用であり、クランプを用いてチューブ又は輸送ラインと連結可能な周辺部３２ａを有する。第２の入口３４は周辺部３４ａを有し、好ましくは気体の供給用に第２の管部３５に開口を提供する。管部３３と３５は、外部から見ると合体ポイント３７のところで合体し、１本の管に筒状外壁３８及び２種類の流れを隔てる長手方向内壁３１を提供する。合体ポイント３７から出口３６付近の長手方向壁３１端部までの管３０の部分は、伝熱部を提供する。図示のように、長手方向壁３１は出口３６のわずかに手前で終わっている。他の実施形態では、壁は出口３６のより近くか又は出口３６のところで終わり得る。管３０の出口３６は、例えばクランプを用いて混合デバイスの入口と連結可能な周辺部３６ａを有する。図２ｂは、長手方向壁３１と筒状外壁３８とを有する管３０の伝熱部の断面を示す。図２ｃは、周辺部３２ａを有する第１の入口３２と、周辺部３４ａを有する第２の入口３４と、筒状外壁３８とを有する管３０を出口３６から見た側面図を示す。
【００４２】
図３は、代替の供給管を示し、図３ａは、第１の管部３３に開口を提供する第１の入口３２を有する供給管３０を示す。入口３２は好ましくはタンパク質溶液の供給用であり、周辺部３２ａを有する。第２の入口３４は周辺部３４ａを有し、好ましくは気体の供給用に第２の管部３５に開口を提供する。管部３３と３５は、外部から見ると合体ポイント３７のところで合体し、１本の管に筒状外壁３８及びその内部を通る気体供給用の内側管３１を提供する。合体ポイント３７から出口３６までの管３０の部分は、伝熱部を提供する。図示のように、内側管３１は出口３６のわずかに外側で終わり、出口３９を有する。他の実施形態では、この管は出口３６のより近くか又は出口３６のところか又は出口３６のわずかに手前で終わり得る。管３０の出口３６は、例えばクランプを用いて混合デバイスの入口と連結可能な周辺部３６ａを有する。図３ｂは、内側管３１と筒状外壁３８とを有する管３０の伝熱部の断面を示す。図３ｃは、周辺部３２ａを有する第１の入口３２と、周辺部３４ａを有する第２の入口３４と、筒状外壁３８とを有する、出口３６から見た管３０を示す。
【００４３】
次に、本発明を以下の非限定的実施例を参照しながら例示する。
【実施例】
【００４４】
実施例１：Ｏｐｔｉｓｏｎ（商標）の調製
本発明の方法により製造されたＯｐｔｉｓｏｎ（商標）のバッチを、信頼性及び予測可能性について評価し、第三者の方法と比較した。その目的は、２つの製造方法の予測可能性を比較して、製品品質の将来の予測可能性を理解することであった。
【００４５】
材料及び方法
Ｏｐｔｉｓｏｎ（商標）のバッチを調製する２５回の実験をＧＥヘルスケア社（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が請求項記載の方法により製造し、Ｏｐｔｉｓｏｎ（商標）のバッチを調製する１９回の実験を第三者の方法により製造し、信頼性及び予測可能性について評価を行い比較した。
【００４６】
ＧＥの方法には、供給管を含む図１に示す装置の使用が含まれ、ここで熱はタンパク質溶液（ヒト血清アルブミン）から気体（パーフルオロプロパン＝ＯＦＰ）に伝達され、タンパク質溶液と気体はミルを用いる分散ステップの直前に混合される。タンパク質溶液をミルに送達するのに加圧給液槽を用いた。
【００４７】
第三者の方法には、加熱されたタンパク質溶液（ヒト血清アルブミン）が加熱されていない気体（ＯＦＰ）とミルの入口の約１メートル手前のところで混合される装置が含まれた。タンパク質溶液をミルに送達するのに蠕動ポンプを用いた。
【００４８】
結果
２種類の方法で用いたパラメータを提供する生データを表１及び表２に示す。得られた平均粒径及び濃度が特定された。
【００４９】
【表１】
0006420761.tif 000002
【００５０】
【表２】
0006420761.tif 000003
得られた粒径及び濃度の標準偏差（ＳＤ）（較正の二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥＣ））は以下の通りであった。
【００５１】
第三者の方法：
平均粒径：ＳＤ  ０．３３μｍ
濃度：ＳＤ  １．１９×１０8マイクロバブル／ｍｌ
請求項記載の方法：
平均粒径：ＳＤ  ０．２２μｍ
濃度：ＳＤ  ０．５５×１０8マイクロバブル／ｍｌ
標準偏差は製造時の再現性の増大を示すので、本発明の新規な改良方法を用いることによって製品の品質が向上すると予測される。
【図１】
0006420761.tif 000004
【図２】
0006420761.tif 000005
【図３】
0006420761.tif 000006