(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたＳＤＣ２またはＳＤＣ２の断片を含む免疫抑制剤であって、ＳＤＣ２の該断片がＳＤＣ２の細胞外ドメインである、免疫抑制剤。
【請求項２】
前記ＳＤＣ２がヒトＳＤＣ２である、請求項１に記載の免疫抑制剤。
【請求項３】
ＳＤＣ２を発現する細胞の上清を含む、免疫抑制剤。
【請求項４】
活性成分としてＳＤＣ２またはＳＤＣ２の断片をコードするベクターを含む免疫抑制剤であって、ＳＤＣ２の該断片がＳＤＣ２の細胞外ドメインである、免疫抑制剤。
【請求項５】
ヒトＳＤＣ２をコードする、請求項４に記載の免疫抑制剤。
【請求項６】
免疫抑制用組成物であって、ＳＤＣ２またはＳＤＣ２の断片をコードするベクターで形質導入された細胞もしくは組織を含み、ＳＤＣ２の該断片がＳＤＣ２の細胞外ドメインである、組成物。
【請求項７】
免疫抑制用組成物の製造方法であって、請求項１に記載の免疫抑制剤と細胞もしくは組織を混合することによる、または請求項４に記載の免疫抑制剤で細胞もしくは組織を処理することによる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節性治療剤および組成物、ならびにそれらの使用に関する。さらに、本発明は、それらの免疫調節特性および／または治療特性に影響を及ぼすように、既存の細胞ベースの製品を試験し、改変することに関する。
【背景技術】
【０００２】
多数の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）関連製品（臨床用）が公知であり、そしてより多くの製品が開発中であり、かつ将来ヒトへの使用について認可されることが期待される。ＭＳＣは、いくつかの免疫調節特性を示し、これは、それらの治療価値に寄与し得る。そしてＭＳＣは、とりわけ自己免疫疾患の治療のために使用される。ヒトＭＳＣの免疫抑制能力は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞およびナチュラルキラー細胞の増殖に対する阻害効果を示す研究によって示されている（Hanら、２０１２）。
【０００３】
ＥＰ１７９５５８８は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の治療のための脂肪組織由来ＭＳＣの使用を記載している。この細胞は、免疫抑制特性を発揮しているといわれる。
【０００４】
ＥＰ２５４５９２８は、ＭＳＣ含有細胞調製物に関する。この調製物の免疫抑制能力は、無血清または低血清培養によって維持される。
【０００５】
ＷＯ２０１２／１１１９９７は組合せ治療法を開示し、この治療法では、ＭＳＣベースの治療に適した免疫抑制を達成するために、ＭＳＣが免疫制御Ｔ細胞と主に与えられる。
【０００６】
ＷＯ２００９／１１０５６２４は、その分子の治療効力を改善するための細胞への分子およびポリペプチドの共送達に関する組成物および方法を開示している。増殖因子の送達は、それらの受容体および共受容体（例えば、シンデカン１、２、３および４）とのこれらの増殖因子の共送達により改善される。増殖因子とのシンデカンの共送達は、増殖因子をタンパク質分解から保護し、それらの活性を高め、そして増殖因子に細胞表面を標的とさせ、増殖因子シグナル伝達を促進する。
【０００７】
ＫＲ１０２０１００１０６７４４は、移動性皮膚炎（migratory dermatitis）またはメラニン形成関連疾患の予防または治療のための組成物に関する。移動性皮膚炎の予防または治療のための組成物は、シンデカン−２を活性成分として含有する。考えられる移動性皮膚炎の症状は、メラノーマ、色素沈着過度、低色素沈着または白斑である。
【０００８】
ＷＯ０２／０８７６０９は、哺乳動物におけるパピローマウイルス感染の予防用の薬学的組成物に関し、これは、ヘパラン硫酸表面グリコサミノグリカン鎖が付着したシンデカンに対するリガンドとして、パピローマウイルス粒子に結合する可溶性ペプチド、タンパク質または融合タンパク質を含む。
【０００９】
ＷＯ０３／０６２３８６は、動物におけるシンデカンレベルおよび血管新生の調節に関連した方法および材料に関する。シンデカンポリペプチドおよびシンデカンポリペプチドをコードする核酸が開示されている。これらは、血管新生を調節するためのポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドアナログを生産するために使用される。シンデカン調節剤および血管新生調節剤を同定する方法もまた考察されている。
【００１０】
Mukhopadhyay, A.ら、J. Trauma Injury Infect. Crit. Care, 2010, vol. 68, pp. 999-1008は、シンデカン−２およびＦＧＦ−２が互いに相互作用して、細胞からのシンデカン−２のシェディング（shedding）を生じ得、これは、次いでケロイド表現型に関与している事象を活性化すると結論付けている。
【００１１】
Kaur, C.ら、Glia, 2009, vol. 57, pp.336-349は、アメーバ様ミクログリア細胞におけるシンデカン−２発現を調べており、これが低酸素によりアップレギュレートされることに留意している。
【００１２】
Contreras, H. R.ら、Biochem. Biophys. Res. Comm., 2001, vol. 286, pp. 742-751は、癌におけるシンデカン−２発現を調べており、シンデカン−２発現が遊走性間葉様表現系への特定の細胞の分化に関与していることに留意している。
【００１３】
Sojoong Choiら, Biochem. Biophys. Res. Comm., 2012, vol. 417, pp. 1260-1264は、大腸癌細胞からのシンデカン−２のシェディングにおけるマトリックスメタロプロテイナーゼ−７（ＭＭＰ−７）の役割を調べた。ＭＭＰ−７がこれらの細胞からのシンデカン−２のシェディングを直接的に媒介することが観察された。
【００１４】
Alexopoulou, A. N.ら、BMC Cell Biol., vol. 9, 2008, doi:10:10.1 186/1471-2121-9-2は、中胚葉への幹細胞分化の間のトランスジーンの長期発現に有用なベクターを調査した。用いたベクターの１つは、シンデカン−２をコードする。
【００１５】
ＷＯ２０１１／１５３４５８は、デング感染を妨害する方法を開示し、これは、デングウイルスにより標的とされる細胞上に存在するシンデカンへのデングウイルス結合を妨害する工程を含む。この目的に関する薬学的組成物もまた開示されている。
【００１６】
Mytilinaiou, M.ら、IUBMB Life, 2013, vol. 65, pp. 134-143は、ＴＧＦβ２／Ｓｍａｄ２により媒介される線維肉腫細胞の細胞接着のレギュレータとしてのシンデカン−２の役割を調べた。
【００１７】
Kim, Y.ら、Oncogene (2003), vol. 22, pp. 826-830は、減少したシンデカン−２発現が、大腸癌腫細胞におけるトリコスタチン−Ａ誘導形態変化および減少した腫瘍原性活性と相関していることを観察した。さらに、アンチセンスｃＤＮＡによるシンデカン−２発現のダウンレギュレーションは、大腸癌細胞の形態変化および減少した足場非依存性増殖を模倣した。
【００１８】
Chung, H.ら、Journal of Biological Chemistry, vol. 287, no. 23, pp. 19326-19335, 2012は、シンデカン−２発現を制御することによりメラノコルチン１受容体がメラノーマ細胞遊走を調節することを見出した。これは、メラノコルチン１受容体がｐ３８  ＭＡＰＫの活性化を阻害し、引き続き、メラノーマ細胞においてシンデカン−２発現および遊走を増大させるためである。
【００１９】
Peterfia, B.ら、PLoS ONE, vol. 7, no. 6, e39474は、シンデカン−１が、シンデカン−２発現の誘導を介して間葉腫瘍細胞株の悪性を増大させることを観察した。したがって、シンデカン−１は、シンデカン−２との協働でヒト線維肉腫細胞株細胞の増殖、遊走、および転移を増大させる。
【００２０】
Ruiz, X.ら、PLoS ONE, vol. 7, no. 8, e43049は、シンデカン−２がインスリン様増殖因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）の新規な標的であり、そしてシンデカン−２が線維症で過剰発現されているという彼らの所見を記載している。増加されたＳＤＣ２発現は、少なくとも部分的には、２つのプロ線維化因子ＴＧＦβおよびＩＧＦＢＰ−３の活性に起因している。
【００２１】
Dieudonne, F-Xら、Journal of Bone and Mineral Research, vol. 27, no. 10, pp. 2118-2129は、いかにしてシンデカン−２発現が骨肉腫細胞においてドキソルビシンによってアップレギュレートされるかを記載している。Ｔ細胞因子（ＴＣＦ）は、シンデカン−２の阻害に関与している。したがって、ＴＣＦ活性の標的化阻害は、マウスにおける骨肉腫細胞および骨腫瘍においてシンデカン−２発現およびドキソルビシンに対する感作を促進する。
【００２２】
ＫＲ２０１２００１３９１５は、シンデカン−２ペプチド断片の発現レベルを測定するための薬剤を含有する大腸癌診断用組成物を記載している。この薬剤は、シンデカン−２ペプチド断片に対して特異的である抗体を含有する。
【００２３】
Huang, X.ら、 Oncology Reports 2009, vol. 21, pp. 1123-1129は、食道扁平上皮癌におけるシンデカン−２（ＳＤＣ２）およびシステインリッチ６１（ＣＹＲ６１）の変化された発現の予後の意義を考察している。
【００２４】
当該分野における一般の問題は、使用されるＭＳＣベースの製品についてそれら自身に不十分な免疫抑制があること、または細胞培養継代において時間がたつにつれて、ＭＳＣの免疫抑制特性が失われる、すなわち維持されないことである。これらの特性を保持し、刺激し、または回復可能であることが望ましい。
【００２５】
免疫抑制療法が移植片拒絶の予防または低減のために使用され得、そして臨床的に使用される免疫抑制療法は、典型的には、同時に使用されるいくつかの薬剤の組合せを含む。代替となる免疫抑制剤および治療法を同定することが望ましい。同様に、血管新生を促進する薬剤および治療法を同定することが望ましい。さらに、この分野における可能性のある治療製品の効力を測定することができることが望ましい。提案されたアッセイは、可溶性ＴＮＦＲ１に基づくが、代替となるアッセイ、および好ましくは改善されたアッセイが必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明の目的は、免疫調節性であり、かつ／または本明細書中に詳述されるような他の治療特性を有する代替となる薬剤および治療法を提供することである。本発明の特定の実施形態の目的は、細胞または組織を含む製品または組成物を免疫原性の低いまたは免疫抑制性の高いものとする際に使用するための薬剤および治療法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明の実施形態の使用において、増加されたシンデカン−２（ＳＤＣ２）発現および／または活性が免疫抑制を高め、かつ／または他の治療特性を有することが示されている。したがって、本発明は、細胞（それらの細胞は、次いで、治療用途用となる）の処理に使用するための、ＳＤＣ２、ＳＤＣ２を含む組成物、ＳＤＣ２をコードするベクター、およびＳＤＣ２の発現を調節する化合物を提供する。これらの組成物、ベクターおよび化合物それ自体は、例えば、免疫調節のため、または本明細書中に記載されるような他の治療用途のために、（特にヒトの）治療的処理（therapeutic treatment）に使用され得る。
【００２８】
本発明はまた、細胞の集団を処理する方法を提供し、この方法は、細胞をＳＤＣ２と混合する工程、該ＳＤＣ２に結合する抗体または断片で細胞を処理する工程、および／または該細胞または細胞群（the cell or cells）によるＳＤＣ２の発現または活性を調節する工程を含む。この方法により生産された細胞、および処理された細胞から誘導された細胞および組織は、本発明の他の部分を形成する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ＥＬＩＳＡを用いたＡｄ．ＳＤＣ２を発現するＭＳＣの上清中の放出（shed）されたＳＤＣ２の検出を示す。
【図２】図２は、Ａｄ．ＳＤＣ２の過剰発現が、７２時間にわたって増加するＳＤＣ２タンパク質の過剰発現を生じることを示す。
【図３】図３は、Ａｄ．ＳＤＣ２  ＭＳＣ（「Ｓ２」）が、親のＭＳＣに比べて顕著に増加された免疫抑制活性を有したことを示す。
【図４】図４は、Ｔ細胞増殖に対する効果についてＳＤＣ２を含有する細胞培養上清（「Ｓ２」）の分析を示す。
【図５】図５は、ＳＤＣ２タンパク質が、ＴＮＦαおよびＩＬ１βによりＮＦκＢ活性化を抑制することを示す。
【図６】図６は、組換えＳＤＣ２ならびにＴＮＦαおよびＩＬ１βによる活性化に応答したＮＦκＢ誘導を示す。
【図７】図７は、ＴＮＦαおよびＩＬ１βによる活性化後のＳＤＣ２の過剰発現に応答したＮＦκＢ誘導を示す。
【図８】図８は、ＭＳＣのニュートリン−３ａ（nutlin-3a）処理が、ＳＤＣ２シェディングの量依存性増加を引き起こすことを示す。
【図９】図９は、化学療法剤が、ヒトＭＳＣからのＳＤＣ２シェディングを増大させることを示す。
【図１０】図１０は、ＳＤＣ２  Ｃ末端欠失断片（１−６）の過剰発現が、ＩＬ−１βまたはＴＮＦ−αに応答してＮＦ−κＢ活性を減弱することを示す。
【図１１】図１１は、ＳＤＣ２のアデノウイルス発現が、ＩＬ−１β、ＴＮＦαおよびＩＬ−１β／ＴＮＦαに応答してＮＦ−κＢ活性およびＩＬ６／ＩＬ８分泌を減弱することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の実施形態は、ＳＤＣ２を含む組成物、ＳＤＣ２を使用する方法、およびＳＤＣ２の特定の使用を包含する。適切には、これは、可溶性形態であり、そして特定の実施形態では、それはヒトまたはウマＳＤＣ２であるが、一般に哺乳動物由来のＳＤＣ２が本発明内に包含され、特にヒト、マウス、ラット、イヌ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ウシおよびブタ由来のＳＤＣ２である。
【００３１】
組成物は、薬学的に受容され得る賦形剤（excipient）および／または担体（carrier）を含み得、医薬における使用に適している。組成物は、細胞培養培地を含み得るか、または細胞培養培地として処方され得（例えば、細胞培養培地中ＳＤＣ２）、細胞培養における使用（例えば、治療上の細胞ベースの製品の調製において培養される細胞への添加）に適している。組成物は、徐放用に処方され得、そして半減期を改善するように必要に応じて改変され得、例えば、ＳＤＣ２（または断片、改変体、誘導体、もしくはアナログ）がＰＥＧ化またはＰＳＡ化され得る。組成物は、注射用に処方されてもよい（例えば、注射用の水または生理食塩水中）。組成物は、吸入用に処方されてもよい（例えば、噴霧により）。ＳＤＣ２は、組換え型で作製され得るか、またはＳＤＣ２を発現もしくは過剰発現する細胞から単離され得る。試験した例においては、ＳＤＣ２は、ＳＤＣ２を発現する細胞の上清から単離されたものであり、および組換え作製されたものである。他の部分に記載されるように、ＳＤＣ２は培養培地に放出され得、よってＳＤＣ２発現細胞の培養物から回収され得る。
【００３２】
本発明はまた、ＳＤＣ２をコードする発現ベクターを提供する。また、好ましくは、ヒトまたはウマＳＤＣ２であるが、一般には言及した哺乳動物由来のＳＤＣ２をコードするベクターもまた、本発明の実施形態を形成する。用語「発現ベクター」は、その転写を提供する付加的なセグメントに作動可能に連結されたＳＤＣ２をコードするセグメントを含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、線形または環状）をいう。このような付加的なセグメントは、プロモーター（多くは公知であり、適切な例としては、ＣＭＶプロモーターおよびＵｂＣプロモーターが挙げられる）、ターミネーターおよびＵＴＲ配列を含み得、そして必要に応じて、１つまたはそれ以上の複製起点、１つまたはそれ以上の選択可能マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含み得る。発現ベクターは、一般には、プラスミドＤＮＡまたはウイルスＤＮＡに由来するか、または双方のエレメントを含有し得る。本発明の１つの適切なベクター（以下の実施例で使用）は、アデノウイルスベクターである。他の適切なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスが挙げられる。ヒトＳＤＣ２の発現に好ましいベクターは、配列番号１もしくは２からのコード配列（例えば、ポリＡテールなし）またはその対立遺伝子改変体、または配列番号３もしくは４をコードする代替のヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
ＳＤＣ２は、細胞により培養培地に放出され得、そしてこの細胞外ドメインシェディングは、一般にシェダーゼ（sheddases）と言われる酵素の高度に制御された直接的な作用である。マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は、シンデカンのシェダーゼとして知られている。特に、ＭＭＰ−７は、ＳＤＣ２シェディングに必要であることが実証されている（Ryuら、２００７）。しかし、種々の細胞外刺激（増殖因子（Subramanionら、１９９７）、ケモカイン（Liら、２００２；Bruleら、２００６；Charnauxら、２００５）、ヘパラナーゼ（Yangら、２００７）ならびに細胞ストレス（Fitzgeraldら、２０００）を含む）が、ＳＤＣ２のシェディングを誘導することもまた実証されている。
【００３４】
以下に詳述する本発明の具体的な実施形態では、ヒトＭＳＣの表面から培養培地に放出されたＳＤＣ２は、ＳＤＣ２含有培地を別個の細胞集団を処理するために使用した場合に免疫抑制特性を有した。したがって、本発明は、この治療効果である免疫抑制を提供するためにＳＤＣ２の使用を提供する。治療（例えば、移植）用細胞が、それらの免疫原性特性を減少させるために、このようにして（例えば、ＳＤＣ２への曝露により）処理され得る。本発明に従って達成される免疫抑制効果はまた、他の細胞ベースの治療法と平行して使用されてもよい（例えば、患者において免疫副作用の危険性または発生を減少または遅延させるため）。したがって、本発明のＳＤＣ２およびＳＤＣ２含有組成物、ならびに本発明のベクターおよび化合物は、ＭＳＣおよび／または間質幹細胞であり得るかまたは含み得る別の治療用組成物（例えば、細胞治療製品）と組み合わせて患者に投与されてもよい。
【００３５】
本発明によりさらに提供されるのは、細胞の処理に使用するための、細胞によるＳＤＣ２の発現を調節する化合物である。本発明の実施形態において、化合物は、ＳＤＣ２の発現を増加させる。このような化合物の例としては、ｐ５３を活性化する化合物、ＥＲＫ、ｐ３８またはＪＮＫ  ＳＡＰＫキナーゼ経路を活性化する化合物、低酸素誘導性因子（ＨＩＦ）媒介経路を活性化する化合物、ＴＧＦ、ＢＭＰ、レフティ（Lefty）、ノダル（Nodal）およびアクチビン（Activin）の経路を活性化する化合物、ＮＯＴＣＨ経路を作動（agonize）させる化合物（例えば、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、ＤＬＬ１、ＤＬＬ２、ＤＬＬ３およびＤｌｌ４）、ヘッジホッグ（Hedgehog）シグナル伝達経路を作動させる化合物、ＷＮＴ経路を作動させる化合物、アンドロゲン受容体またはエストロゲン受容体経路を活性化する化合物、ならびにＮＦκＢ経路を活性化する化合物が挙げられる。ＳＤＣ２発現の増強に使用するための化合物の例としては、ｐ５３調節化学療法剤（例えば、ニュートリン（nutlins）、５−ＦＵ、ドキソルビシン、シスプラチン、ゲンシタビン、タキソール）、ＨＤＡＣインヒビター、ＰＰＡＲアゴニスト、ＤＭＯＧ（低酸素模倣物）、フォルスコリン、コルホルシン（フォルスコリンの水溶性型、ｃＡＭＰ刺激因子）、ＷＹ４，６４３（ピリニクス酸、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体α（ＰＰＡＲα）アゴニスト）、トログリタゾン（ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγの両方に対するリガンド）、スプライトマイシン、Ｓｉｒ２（クラス３  ＨＤＡＣインヒビター）、トリコスタチンＡ（クラス１／２  ＨＤＡＣインヒビター）、フェニル酪酸ナトリウム（ＨＤＡＣインヒビター）、バルプロ酸（ＨＤＡＣインヒビター）およびＳＡＨＡ（別のＨＤＡＣインヒビター）が挙げられる。したがって、細胞治療製品におけるＳＤＣ２の発現の増強が、それを免疫抑制にするため、またはその免疫抑制特性を増加させるために使用され得る。
【００３６】
本発明において取り組まれる課題は、代替の免疫調節および／または他の治療介入を提供するというものである。本発明の使用において、組成物、ベクターおよび化合物は、治療的処理に使用され得る。
【００３７】
例えば、本発明の一連の実施形態では、組成物、ベクターまたは化合物は、免疫調節を含む治療的処理における使用のためのものである。ＳＤＣ２量および／または発現および／または活性の増加は、免疫抑制を促進する。したがって、本発明は、免疫抑制を含む治療的処理を提供する。
【００３８】
本発明の組成物、ならびにまた本発明のベクターおよび化合物は、肺の疾患（例えば、ＡＲＤＳ、ＣＯＰＤおよびＩＰＦ）を治療するために、単独で、または本明細書中に言及したような組合せ治療法で、使用され得る。試験において、静脈内注射した間質細胞は肺中に蓄積する傾向を示すことが見出され、これは、肺への送達が達成できることを示している。ＳＤＣ２はまた、肺送達のために噴霧投与され得る。
【００３９】
ＳＤＣ発現および／または活性を増強する本発明の組成物および治療、ならびにまた本発明の対応するベクターおよび化合物は、免疫抑制を必要とするかまたはその恩恵を受け得る任意の徴候に一般に適している。これらの徴候としては、移植片移植（graft transplants）、乾癬、喘息、および自己免疫要素を有する徴候（例えば、一般には、アレルギー、大腸炎、皮膚炎および炎症）が挙げられる。
【００４０】
実施形態においては、本発明の組成物および治療、ならびにまた本発明のベクターおよび化合物は、抗炎症剤（例えば、抗ＴＮＦ抗体、この抗体の例としては、インフリキシマブ（レミケード(Remicade)）、アダリムマブ（ヒュミラ(Humira)）、セルトリズマブペゴル（シムジア(Cimzia)）およびゴリムマブ（シンポニー(Simponi)）が挙げられる）、または循環受容体融合タンパク質（例えば、エタネルセプト（エンブレル(Enbrel)）と組み合わせて使用され得る。本発明は、抗ＣＤ３抗体と組み合わせて使用され得、このような抗体の例としては、ムロモナブ−ＣＤ３、オテリキシズマブ、テプリズマブおよびビシリズマブが挙げられる。組合せは、免疫抑制療法で使用され得る。それは、移植片拒絶および他の炎症性もしくは自己免疫性の疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎および１型糖尿病）の治療および予防、ならびに免疫寛容の誘導のために使用され得る。
【００４１】
以下に詳述する本発明の具体的な実施形態では、ヒトＭＳＣの表面上の増加されたＳＤＣ２は、その細胞を、コントロールのＭＳＣと比べてより免疫抑制のものとする。したがって、本発明は、この治療効果を提供するためのＳＤＣ２の増加された細胞発現または活性または量を提供する。移植用細胞が、それらの免疫原性特性を減少させるためにこのようにして処理され得る。本発明に従って達成される免疫抑制効果はまた、例えば、細胞ベースの治療法と平行して使用されてもよい（例えば、患者において免疫副作用の危険性または発生を減少または遅延させるため）。本発明の処理された細胞は、ＭＳＣおよび／または間質幹細胞であり得るかまたは含み得る別の治療用組成物（例えば、細胞治療製品）と組み合わせて患者に投与されてもよい。
【００４２】
本発明の細胞は、他の治療製品の前に、それと同時に、またはその後に投与され得る。本発明の細胞は、細胞治療製品（例えば、移植物）の続く投与に対して患者の免疫系を寛容化するために、前もって投与され得る。
【００４３】
本発明の組成物、ならびまた本発明のベクターおよび化合物、ならびにまた、ＳＤＣ発現および／または活性を増強する本発明の組成物、使用、方法および処理は、癌の治療に使用され得る。癌は、一般に、本発明を用いて治療され得、特に、肝細胞癌、子宮頚部癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、大腸癌、線維肉腫、髄芽腫および星状細胞腫が挙げられる。
【００４４】
本発明の実施形態では、治療される癌は、固形腫瘍である。さらに、本発明の実施形態は、癌の維持および成長を支持するのに必須であると考えられる癌間質を治療の標的とすること−有利には癌間質に治療の焦点を合わせることを包含する。
【００４５】
以下に詳述する本発明の具体的な実施形態では、ＳＤＣ２は、膵臓癌、前立腺癌、乳癌および大腸癌の各々に関して抗癌効果を実証した。
【００４６】
本発明の組成物、ならびまた本発明のベクターおよび化合物、ならびにまた、ＳＤＣ発現および／または活性を増強する本発明の組成物、使用、方法および処理は、炎症および／または炎症性疾患の治療に使用され得る。したがって、抗炎症効果は、本発明を用いて達成され得る。
【００４７】
以下に詳述する本発明の具体的な実施形態では、ＳＤＣ２は、アッセイにおいて抗炎症効果を実証した。
【００４８】
本発明の組成物、ならびまた本発明のベクターおよび化合物、ならびにまた、ＳＤＣ発現および／または活性を増強する本発明の組成物、使用、方法および処理は、創傷治癒または骨治癒のため、あるいは、創傷治癒または骨治癒を促進するために使用され得る。
【００４９】
以下に詳述する本発明の具体的な実施形態では、ＳＤＣ２を発現する細胞は、モデルにおいて創傷治癒を顕著に促進した。本明細書中の他のデータとの類似性により、このことは、創傷治癒（糖尿病性創傷治癒および骨折治癒を含む）におけるＳＤＣ２の類似の活性を支持している。
【００５０】
本発明の組成物、ならびまた本発明のベクターおよび化合物、ならびにまた、ＳＤＣ発現および／または活性を増強する本発明の組成物、使用、方法および処理は、種々のウマ症状を治療するのにも使用され得る。蹄葉炎、腱損傷および運動誘発性肺出血（ＥＩＰＨ）は−「出血」または「出血性発作」としても知られる−が挙げられる。
【００５１】
また、本発明によって提供されるのは、動物、特に哺乳動物、および例えばヒトおよびウマにおける疾患または障害を治療するための薬学的組成物である。薬学的組成物は、適切には、動物における疾患または障害を治療するのに有効な量で本発明の化合物、組成物またはベクターを含む。したがって、本発明の活性薬剤は、受容され得る薬学的担体と共に投与され得る。例えば、活性薬剤は、注射用に薬学的に受容され得る液体媒体中で投与され得る。液体媒体の例は、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水であり、また必要に応じて、付加的な材料（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびヒト血清アルブミン）を含有する。治療タンパク質およびペプチドを投与する方法が当該分野で公知である。動物（好ましくはヒト）の治療の方法が提供され、この方法は、本発明の活性薬剤を動物に投与する工程を含む。
【００５２】
本明細書中に開示された薬学的組成物は、医学的適用および獣医学的適用に有用であり、そして単独でまたは他の補足的な活性の成分、薬剤、薬物またはホルモンと組み合わせて、個体に投与され得る。組成物は、必要に応じて、薬学的に受容され得る担体を含み、これは、薬学的に受容され得る溶媒（vehicle）、安定剤、希釈剤、添加剤、助剤または賦形剤が挙げられる。有用な薬学的に受容され得る担体は、限定されないが、水性媒体（例えば、水、生理食塩水、グリシン、ヒアルロン酸などのような）；固形担体（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどのような）；溶媒；分散媒；コーティング剤；抗細菌剤および抗真菌剤；等張剤および吸収遅延剤；または任意の他の不活性成分が挙げられる。薬学的に受容され得る担体の選択は、投与の様式に依存し得る。薬学的に受容され得る担体が活性成分と不適合である場合を除いて、薬学的に受容され得る組成物におけるその使用が熟慮される。このような薬学的に受容され得る担体の具体的な使用の非限定的な例は、以下に見出され得る：Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems（Howard C. Anselら編、Lippincott Williams ＆ Wilkins Publishers, 第７版、１９９９）；REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY（Alfonso R. Gennaro編、Lippincott, Williams ＆ Wilkins, 第２０版、２０００)；Goodman ＆ Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics（Joel G. Hardmanら編、McGraw-Hill Professional, 第１０版、２００１)；およびHandbook of Pharmaceutical Excipients （Raymond C. Roweら、APhA Publications, 第４版、２００３）。
【００５３】
本明細書中に開示された薬学的組成物は、必要に応じて、他の薬学的に受容され得る成分を含み得る。このような成分としては、限定されないが、緩衝液、防腐剤、張度調整剤、塩類、酸化防止剤、浸透圧調整剤、生理学的物質、薬理学的物質、充填剤、乳化剤、湿潤剤、甘味料または矯味矯臭剤などが挙げられる。ｐＨを調整するための種々の緩衝液および手段は、その得られる調製物が薬学的に受容可能である限り、本明細書中に開示された薬学的組成物を調製するために使用され得る。
【００５４】
種々の投与経路は、本明細書中に開示された治療化合物を投与するために有用であり得る。よって、局所（topical）、経腸または非経口の投与経路が適切であり得、そしてこのような経路は、本明細書中に開示された治療化合物または組成物の局部（local）または全身の両方の送達を包含する。組成物は、吸入、局所、鼻腔内、舌下、注射、点滴（infusion）、点眼（instillation）、直腸および／または膣使用が意図され、薬学的組成物の製造分野に公知の任意の方法に従って調製され得る。
【００５５】
上記とは別にまたは上記と合わせて、ＳＤＣ２量および／または発現および／または活性の増加は、血管新生を促進する。したがって、本発明のそのような実施形態は、血管新生を含むかまたは促進する治療的処理を提供する。
【００５６】
細胞の集団を処理する方法が本発明によって提供され、これは、細胞をＳＤＣ２と合わせる工程を含む。これは、細胞を、（ｉ）ＳＤＣ２を発現する細胞、または（ｉｉ）本発明の他の実施形態による組成物または化合物と合わせることにより達成され得る。インビトロおよびエクスビボ処理が包含される。
【００５７】
他の実施形態において、本発明は、免疫活性化および／または免疫刺激を含む治療的処理を提供するために、ＳＤＣ２量および／または発現および／または活性を減少させるように適合され得る。
【００５８】
処理される細胞は、幹細胞、例えば、間質幹細胞またはＭＳＣであり、そして適切には哺乳動物細胞、好ましくは、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ウシまたはブタであり、そして特にウマおよびヒトの細胞である。
【００５９】
本発明は、細胞の集団を処理する方法をさらに提供し、これは、集団中の細胞（単数または複数）によるＳＤＣ２の発現または活性を調節する工程を含む。また、インビトロおよびエクスビボ処理が包含される。ＳＤＣ２の発現または活性を調節する工程は、細胞の免疫抑制特性を調節し得る。それは、細胞の別の免疫抑制特性を増加させるようにＳＤＣ２の発現を増加させ得る。それは、細胞の別の治療特性を増加させるようにＳＤＣ２の発現を増加させ得る。
【００６０】
細胞を処理するために、細胞は、ＳＤＣ２の発現を促進する化合物で処理され得る。本明細書中の他の箇所に例を示す。細胞は、ＳＤＣ２をコードするベクターでトランスフェクトされ得る。
【００６１】
細胞は、それらの外来ＳＤＣ２発現を増加させるように処理され得る。例えば、ＳＤＣ２発現を増加させる培養または環境条件への曝露による。多くのストラテジーが、ＳＤＣ２発現を刺激するために使用され得る（特に幹細胞（間質幹細胞およびＭＳＣを含む）において）。これらとしては、特異的な生物学的因子、化合物またはストレスによるｐ５３活性化；ＥＲＫ、ｐ３８またはＪＮＫ  ＳＡＰＫキナーゼ経路を活性化する化合物、生物学的因子およびストレス；低酸素誘導性因子（ＨＩＦ）媒介経路を活性化する生物学的因子、化合物またはストレス；ＴＧＦ、ＢＭＰ、レフティ、ノダルおよびアクチビンの経路を活性化する生物学的因子、化合物またはストレス；ＮＯＴＣＨ経路を作動させる生物学的因子、化合物またはストレス（Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、ＤＬＬ１、ＤＬＬ２、ＤＬＬ３およびＤｌｌ４を含む）；ヘッジホッグシグナル伝達経路を作動させる生物学的因子、化合物またはストレス；ＷＮＴ経路を作動させる生物学的因子、化合物またはストレス；アンドロゲン受容体またはエストロゲン受容体経路を活性化する生物学的因子、化合物またはストレス；ならびにＮＦκＢ経路を活性化する生物学的因子、化合物またはストレスが挙げられる。
【００６２】
本発明の実施形態では、ＳＤＣ２発現は、ｐ５３（腫瘍抑制タンパク質）の直接または間接活性化により増加された。理論に縛られることを望まないが、これは、ＳＤＣ２遺伝子（例えば、ヒト遺伝子における）のプロモーター中の「推定」ｐ５３結合部位の存在に起因するものであり得る。その活性化は、多数の方法で達成され得、いくつかは当業者に公知である（例えば、ＨＤＡＣ阻害、増殖阻止、飢餓、毒素曝露および／または化学療法）。
【００６３】
血清飢餓（ＳＳ）および増殖阻止（コンフルエンス）はともにＳＤＣ２発現を刺激した。ＳＳおよび増殖阻止は公知のｐ５３刺激である。
【００６４】
ＨＤＡＣインヒビターおよびサーチュインは、ＳＤＣ２発現を増加させるために使用され得る。本発明の使用において、スプライトマイシン（splitomicin）、バルプロ酸および２−ピロリジノン−ｎ−酪酸（ＰＢＡ）はすべて、２４時間でＳＤＣ２  ＲＮＡレベルを増加させた。スプライトマイシン（クラスＩＩＩ  ＨＤＡＣインヒビター）による刺激は頑健である。ＨＤＡＣのサーチュインファミリー（ＳＩＲＴ１およびＳＩＲＴ２を含む）は、ＳＤＣ２発現を増加させるために使用され得る。サーチュインは、ＮＡＤ依存性ＨＤＡＣであり、ｐ５３タンパク質を脱アセチル化することが報告されている。ｐ５３のアセチル化は、そのトランス活性化／転写活性に重要であることが報告されている。したがって、サーチュインは、ｐ５３活性の鍵となるレギュレーターである。サーチュインの例としては、ニコチンアミド、サーチノール、ＥＸ−５２７およびテノビン（tenovins）が挙げられる。本発明の他の試験において、溶媒ＤＭＳＯもまた、ＳＤＣ２  ＲＮＡレベルを増加させた。ＤＭＳＯもまた、ＨＤＡＣインヒビター（ｐ５３活性化）能力を含むことが報告されている。
【００６５】
細胞において低酸素を誘導するまたは引き起こすことは、ＳＤＣ２発現を増加させるために使用され得る。別の一連の試験において、低酸素模倣物ＤＭＯＧ（ジメチルオキサロイルグリシン）が、ＳＤＣ２  ＲＮＡにおいて非常に頑健な増加を生じた。ＤＭＯＧは、低酸素模倣物であり、そして本発明において使用するための他の低酸素模倣物としては、塩化コバルト、ＥＤＨＢおよびデフェロキサミンが挙げられる。低酸素は、（ＡＴＲ／ＣＨＫ１キナーゼを介して）ｐ５３を刺激することが報告されている。
【００６６】
毒素は、ＳＤＣ２発現を増加させるために使用され得る（例えば、環境毒素のベンゾ［ａ］ピレン−７，８−ジオール−９，１０−エポキシド（ＢＰＤＥ））。本発明においいて使用するための他のｐ５３アクチベーターとしては、γ照射、ＭＤＭ２インヒビター（ニュートリン(nutilins)）および化学療法剤（例えば、シスピラチンおよびゲムシタビン）の使用が挙げられる。
【００６７】
本発明の実施形態は、それ故、ＳＤＣ２発現および／またはシェディングを増加させるためにｐ５３を活性化するよう細胞を処理することを包含する。
【００６８】
処理される細胞は、適切には哺乳動物細胞、好ましくは、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ウシまたはブタ、そして特にウマおよびヒトの細胞である。処理前、細胞によるＳＤＣ２の発現が低いかまたはないものであれば、この処理は、それらの細胞で以前に見られなかったＳＤＣ２レベルを提供する。あるいは、処理前の発現レベルが当初は高かったが時間とともに減少したものであれば、この処理は、以前のＳＤＣ２発現レベルを回復するため、例えば、細胞または組織から経時的に失われた免疫抑制および／または治療特性を回復するためである。
【００６９】
ＳＤＣ２の発現または活性を調節することは、細胞の免疫抑制特性を減少させるようにＳＤＣ２の量および／または活性および／または発現を減少させ得る。それは、細胞の血管新生特性を減少させるようにＳＤＣ２の量および／または活性および／または発現を減少させ得る。本発明のさらなる実施形態は、免疫刺激および／または免疫活性化を誘導するように細胞を処理する工程を含む方法を提供する。細胞は、天然のＳＤＣ２発現を除去するように処理され得る。例えば、アンチセンス療法または他の治療法が、ＳＤＣ２発現をノックアウトまたはノックダウンするために使用され得る。
【００７０】
本発明の全ての方法は、処理された細胞から子孫細胞または組織を誘導する工程をさらに含む。そして本発明はまた、それらの方法から得られた細胞または組織にも及ぶ。
【００７１】
したがって、ＳＤＣ２のレベル（細胞におけるおよび細胞培地中の両方とも）は、本発明の実施形態において、免疫調節特性および／または他の治療特性と関連している。本発明によりなおさらに提供されるのは、細胞治療製品（これは、細胞および／または組織を含み得る）を試験する方法であり、この方法は、ＳＤＣ２について試験する工程を含む。これは、ＳＤＣ２に対する抗体、好ましくはＳＤＣ２特異抗体への結合に基づくアッセイを用いて達成され得る。既存のＳＤＣ２  ＥＬＩＳＡ方法が適切である。ＳＤＣ２は、細胞表面上もしくは培地中または両方で測定され得る。ＳＤＣ２レベルは、予め決められた標準と比較され得る。レベルの上昇は免疫抑制および／または他の治療特性の存在を示し、そしてレベルの減少はその不在を示す。
【００７２】
本発明の実施形態において、細胞を含む治療製品の効力についてのアッセイが提供され、これは、ＳＤＣ２の発現について細胞を測定すること、またはＳＤＣ２の存在について製品（例えば溶液）を測定することを含む。本発明の別の実施形態は、細胞治療製品の効力についてのアッセイにおけるＳＤＣ２レベルの使用にある。
【００７３】
一般に、本発明の試験／アッセイ方法の使用において、ＥＬＩＳＡは、ＳＤＣ２シェディング、およびしたがって、ヒトＭＳＣの特定のバッチの効力をモニターするために用いられ得る。
【００７４】
試験／アッセイに不合格である細胞または製品は廃棄され得るか、またはそれらのＳＤＣ２発現を増加させるように処理され得る。ＳＤＣ２のアッセイは、本発明の他の方法に従って細胞または組織を処理するかどうかを決定する前に使用され得る。
【００７５】
本発明のアッセイプロトコルは、以下を含む：
１．可能性のある製品中のＳＤＣ２レベルを測定する；
２．このレベルを、受容され得る治療製品について予め決められた最小値と比較する；
ａ．レベルが最小値以上の場合、この可能性のある製品は受容される；
ｂ．レベルが最小値未満の場合、この製品は受容されない；
３．必要に応じて、次に、レベルを、受容され得ない治療製品について予め決められた最大値と比較する；
ａ．レベルが最大値未満の場合、この製品は却下される；
ｂ．レベルが受容され得る治療製品についての最小値と受容され得ない治療製品についての最大値との間の中間にある場合、この可能性のある製品は、そのＳＤＣ２レベルを増加させることを試みるように処理され、次いでアッセイが繰り返され得る。
【００７６】
アッセイについてのカットオフＳＤＣ２レベル（上記の予め決められた最小値および最大値）は、他の試験、用いる細胞、治療法の性質および他の要因に従って変動し得る。治療製品についての予め決められた最小レベルは、約１２００ｐｇ／ｍｌ、１３００ｐｇ／ｍｌ、１４００ｐｇ／ｍｌ、１５００ｐｇ／ｍｌまたはより高い値のＳＤＣ２レベルであり得る。受容され得ない調製物についての予め決められた最大レベルは、約２００ｐｇ／ｍｌ、３００ｐｇ／ｍｌ、４００ｐｇ／ｍｌ、５００ｐｇ／ｍｌまたは６００ｐｇ／ｍｌであり得る。それは、これらの記載の値より高いまたは低いものであってもよいが、一般に、受容され得る製品についての最小値より顕著に低くなる。あるいは、予め決められた最小値を下回る任意の調製物は、受容され得ないとみなされ得るが、ＳＤＣ２レベルを受容され得るレベルに上げることを試みる処理に適している。
【００７７】
以下に詳述する本発明の具体的な実施形態では、乏しいＭＳＣドナー細胞調製物はＳＤＣ２アッセイに不合格であったが、受容され得るドナーはそうではなかった。
【００７８】
したがって、本発明は、使用、発送などの前にチェックされるべき幹細胞および他の細胞治療パッチまたは製品についての「バッチ出荷」または品質管理効力アッセイを提供する。
【００７９】
シンデカン−２（ＳＤＣ２）（フィブログリカンとも呼ばれ、そして今やＣＤ３６２とも呼ばれる）は、膜貫通（Ｉ型）ヘパラン硫酸プロテオグリカンであり、そしてシンデカンプロテオグリカンファミリーのメンバーである。本明細書中においてＳＤＣ２という場合、一般には全ての種（そのオルソログを含む）、好ましくはヒト、マウス、ラット、イヌ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ウシおよびブタ、特にウマ、そしてより好ましくはヒトのＳＤＣ２をいう。
【００８０】
本発明は、ＳＤＣ２に対する抗体、ＳＤＣ２に対する抗体を使用する治療方法、ＳＤＣ２に対する抗体の使用およびＳＤＣ２に対する抗体を含む薬学的組成物にさらに関する。抗シンデカン２抗体のｏｒｂ１３４８１、少なくともヒト、マウスおよびラットと反応性であるものは、Biorbyt Ltd.（12 Pembroke Avenue, Denny Industrial Centre, Waterbeach, Cambridge, CB25 9QR, UK）より入手可能である。さらなるＳＤＣ２抗体、カタログ番号：ＭＡＢ２９６５１（Ｃｌｏｎｅ  ３０５５０７）は、R＆D Systems, Incより入手可能であり、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ウサギおよびブタと反応性である。本明細書中に開示されたＳＤＣ２断片に対する抗体もまた、用語抗ＳＤＣ２抗体内に包含される。
【００８１】
ＳＤＣ２の使用の例からのデータは、天然のＳＤＣ２の活性のドミナントネガティブインヒビターとしてのＳＤＣ２の役割を実証する。したがって、本発明は、ＳＤＣ２アンタゴニスト（例えば、ＳＤＣ２またはＳＤＣ２に対する抗体）の治療用途を提供する。これは、本明細書中に開示されたＳＤＣ２およびＷＯ２０１３／１１７７６１に開示されたＳＤＣ２ポジティブ細胞の使用に対応する。したがって、本発明は、免疫抑制、炎症の治療、癌の治療における使用のため、および創傷／骨治癒のために、ＳＤＣ２に対するアンタゴニスト（例えば、抗体）を提供する。
【００８２】
したがって、本発明は、腫瘍抑制因子としての使用のために、ＳＤＣ２に対する抗体をさらに提供する。ＳＤＣ２に対する抗体は、肺疾患の治療のために使用され得、肺疾患としては、急性肺障害（ＡＬＩ）；急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；および特発性肺線維症（ＩＰＦ）が挙げられる。ＳＤＣ２に対する抗体は、以下の治療のために使用され得る：敗血症および敗血症誘発多臓器不全、骨髄移植（ＢＭＴ）または造血幹細胞（ＨＳＣ）拒絶；固形臓器移植（ＳＯＴ）拒絶（肝臓、腎臓、皮膚、角膜、心臓、肺を含む）；急性毒素誘発肝不全；自己免疫性肝炎；原発性胆汁性肝硬変症（ＰＢＣ）および原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）；骨壊死；変性円板疾患；リウマチ性関節炎；骨関節炎および糖尿病患者における骨治癒遅延；自己免疫性腎炎（ヴェグナー肉芽腫症（ＷＧ）を含む）；火傷、重度の火傷；筋消耗症状および萎縮性症候群（サルコペニアを含む）；カヘキシーおよび他の筋消耗症状（筋ジストロフィーを含む（デュシェンヌ型およびベッカー型）；うっ血性心不全、急性心筋梗塞、および脳卒中；１型糖尿病；２型糖尿病；糖尿病性網膜症および他の網膜症；糖尿病性腎障害および他の腎障害；糖尿病性神経障害および他の神経障害；治癒不能糖尿病性潰瘍；糖尿病性心筋症および他の心筋症；末梢動脈疾患および重症虚血肢；ぶどう膜炎；（湿潤もしくは乾燥）加齢黄斑変性（ＡＭＤ）；網膜および角膜傷害；自己免疫症状（例えば、自己免疫胃炎（ＡＩＧ））；移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）；多発性硬化症および脱髄疾患；甲状腺疾患；炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎および瘻管性クローン病（fistulising crohns disease）を含む）；狼瘡（ＳＬＥ）；グレーヴス病；および自己免疫性リンパ球増殖症候群（ＡＬＰＳ）。
【００８３】
ＳＤＣ２に対する抗体は、種々のウマ症状を治療するのにも使用され得る。蹄葉炎、腱損傷および運動誘発性肺出血（ＥＩＰＨ）は−「出血」または「出血性発作」としても知られる−が挙げられる。
【００８４】
本発明において有用である抗体は、ＳＤＣ２に結合する特性および第二の標的にも結合する特性を含む抗体を包含する。したがって、これらの抗体は、別の抗原（例えば、細胞表面抗原）に結合する第二の結合ドメインを含み得、そして当該分野で一般に知られるような二重特異性抗体を包含する。
【００８５】
用語「抗体」は、その誘導体または機能的断片であって、なお結合特異性を保持するものを包含する。抗体産生のための技術は当該分野で周知であり、そして例えば、以下に記載されている：HarlowおよびLane「Antibodies, A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988およびHarlowおよびLane「Using Antibodies: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999。用語「抗体」はまた、異なるクラスの免疫グロブリン（Ｉｇ（ｓ））（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）ならびにサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）を包含する。
【００８６】
用語「抗体」はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体のような実施形態、ならびに同様に、抗体断片、とりわけＦａｂ断片を包含する。抗体断片または誘導体は、以下をさらに含む：Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ断片または単一ドメイン抗体、単一可変ドメイン抗体、または単に１つの可変ドメインを含む免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬであり得、他のＶ領域またはドメインとは独立して抗原またはエピトープを特異的に結合する）。このような免疫グロブリン単一可変ドメインは、単離された抗体単一可変ドメインポリペプチドのみならず、より大きいポリペプチド（抗体単一可変ドメインポリペプチド配列の１つまたはそれ以上のモノマーを含む）もまた包含する。
【００８７】
ヒトＳＤＣ２という場合は、以下からなるか、または以下を含むポリペプチドをさらに包含し得る：
（ａ）配列番号３または４に記載されるようなアミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）の天然に存在する改変体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のオルソログ、
（ｄ）その生物学的に活性および診断もしくは治療上有用な断片、アナログ、改変体および誘導体、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の細胞外ドメイン、ならびに
（ｆ）上記の全てのダイマーおよびオリゴマー。
【００８８】
本発明のＳＤＣ２ポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ましくは天然ポリペプチドまたは組換えポリペプチドであり得る。用語「断片」、「誘導体」、「改変体」および「アナログ」は、ＳＤＣ２と本質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをいい得、そして以下であってもよい：（ｉ）アミノ酸残基の１つまたはそれ以上が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）と置換されたもの、または（ｉｉ）アミノ酸残基の１つまたはそれ以上が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物と融合されたものであって、この化合物は、例えば、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコールまたはポリシアル酸）であるがそれに限定されない、または（ｉｖ）付加アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されたものであって、例えば、成熟ポリペプチドの精製の促進のためであるが、これに限定されない。
【００８９】
本発明のポリペプチドは、以下をさらに含む：配列番号３および４のポリペプチド(特に、成熟ポリペプチド)ならびに配列番号３または４のポリペプチドに対して少なくとも６０％の類似性（好ましくは、少なくとも６０％の同一性）、好ましくは、配列番号３または４のポリペプチドに対して少なくとも８０％の類似性（好ましくは、少なくとも８０％の同一性）、およびより好ましくは、少なくとも９０％の類似性（好ましくは、少なくとも９０％の同一性）、なおより好ましくは、配列番号３または４のポリペプチドに対して、少なくとも９５％の類似性（好ましくは、少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプチド。そしてまた、このようなポリペプチドの部分を含むものであり、このようなポリペプチドの部分は、一般には少なくとも１００アミノ酸を含み、好ましくは少なくとも１２０、およびより好ましくは少なくとも１４０アミノ酸を含む。２つのポリペプチド間の「類似性」は、アミノ酸配列と、第二のポリペプチドの配列に対する１つのポリペプチドのその保存されたアミノ酸置換体とを比較することにより決定される。種々の異なるアプローチが、配列類似性および同一性の算出について公知である。一般に、これらの算出を行うのに適切な方法は、プログラム（例えば、Smith-Waterman、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡ）を用いたデータベース検索の実行、および１つまたは好ましくは２つ（または３つですら）の類似性表の使用である。BlosumおよびＰＡＭ（Point Accepted Mutation）行列が、データベース検索および配列アラインメントのために適切なアミノ酸類似性行列である。Smith-WatermanまたはＦＡＳＴＡが使用される場合、オープンギャップペナルティが充分大きいことを確実にすることが適切であり、そして初期ランがいかなる相同配列も見出さない場合、異なるアルゴリズムを試みることが適切であり得る。これは、自発自習アルゴリズムのＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡの１つを用いて開始した場合、特に当てはまる。
【００９０】
以下の実施例において詳述する本発明の具体的な実施形態では、ＳＤＣ２の断片が作製され、そして天然の、すなわち無傷のヒトＳＤＣ２に関する活性について試験された。活性断片が同定された。したがって、本発明また、ＳＤＣ２活性を保持するＳＤＣ２の断片を提供する。これは、本明細書中の他の箇所にあるように、この断片が、実施例２のアッセイにおいてまたは実施例９のアッセイにおいて（必ずしも同一の効力を有するものではないが）ヒトＳＤＣ２の特徴的な活性（すなわち、ＴＮＦαまたはＩＬ１βによるＮＦκＢ活性化の量依存的な抑制を生じる）を例証することを示している。活性断片は、ＳＤＣ２活性を保持し、そして天然のＳＤＣ２の活性を超えてもよい：断片は、天然のＳＤＣ２の活性の好ましくは少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％を保持する。
【００９１】
したがって、本発明は、ＳＤＣ２の断片を含むか、または断片からなるポリペプチドを含み、そして提供する。ここでこのポリペプチドは、ＳＤＣ２活性を有するものである。断片は、適切には、配列番号３の１５０まで、１２０まで、１００まで、または８０までのアミノ酸を含む。さらに、本発明の断片は別に、ＳＤＣ２のシグナル配列、すなわち、配列番号３のアミノ酸１〜１８、を含み得る。断片は、適切には、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０または少なくとも６０アミノ酸の長さである。断片の使用、断片を含む組成物、および断片を用いた処理の方法は、無傷のＳＤＣ２についてと同様である。断片は、ＳＤＣ２の実施形態を構成する。
【００９２】
好ましくは、用語ＳＤＣ２は、天然の（「無傷の」）ＳＤＣ２、ＳＤＣ２の活性断片、ＳＤＣ２の活性改変体、ＳＤＣ２に対する抗体（好ましくはＳＤＣ特異抗体）により認識されるＳＤＣ２型表面タンパク質をいい、好ましくは、ＳＤＣ２という場合、天然のＳＤＣ２およびその活性断片、より好ましくは天然のＳＤＣ２をいう。ＳＤＣ２抗体は、カタログ番号として見出される：ＭＡＢ２９６５１（Ｃｌｏｎｅ  ３０５５０７）、R＆D Systems, Incより入手可能、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ウサギおよびブタと反応性。本発明によるヒトＳＤＣ２は、実施例２または９による免疫抑制についてのアッセイにおいてポジティブの試験結果であり、より好ましくはＳＤＣ２抗体に結合する。
【００９３】
本発明によりなおさらに提供されるのは、ＳＤＣ２の断片を含むまたはからなるポリペプチドに対する抗体である。このような抗体は、ヒトの治療法における使用に、特に（ｉ）免疫抑制、（ｉｉ）炎症の治療、（ｉｉｉ）癌の治療、（ｉｖ）創傷治癒、または（ｖ）骨治癒における使用に、適切である。このような抗体はまた、無傷のＳＤＣ２に対する抗体について本明細書中に記載されるように治療において適切である。
【００９４】
（配列）
配列番号１−ＳＤＣ２ヒトｍＲＮＡ
【００９５】
【化１】
0006438457.tif 000002
【００９６】
【化２】
0006438457.tif 000003
【００９７】
配列番号２−配列番号１のヌクレオチド６０５〜１２１０
（配列番号３をコードする）
【００９８】
配列番号３−ＳＤＣ２ヒトタンパク質
【００９９】
【化３】
0006438457.tif 000004
【０１００】
配列番号４−配列番号３のアミノ酸１９〜２０１
（成熟タンパク質）
【０１０１】
本発明は、以下の実施例に記載され、添付の図面により図示される。
【実施例】
【０１０２】
実施例１−ＳＤＣ２発現の促進による免疫抑制
方法
ＭＳＣの形質導入
ＭＳＣは、６ウェルプレート（ヌンク）のウェルあたり１０５細胞の密度で完全培地（α−ＭＥＭ，１０％ＦＢＳ）中にプレーティングされ、終夜接着のために放置された。細胞はネガティブコントロールとして、形質導入されないで放置されたか、ヒトＳＤＣ２をコードする１μｌ（１０１２ｖｐ／ｍｌで）のアデノウイルス（ＡＤ５ファミリー）で形質導入され、プレートは８００×ｇで９０分間、３７℃で遠心された。該ウイルスは約４時間細胞上に放置され、それから洗浄され、無血清培地と置換された（１ｍｌ/ウェル）。
【０１０３】
ウエスタンブロット分析
細胞は、トリプシン処理により回収され、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１０％グリセロール、０．５％ＮＰ４０、１５０ｍＭＮａＣｌおよびコンプリートミニプロテアーゼインヒビター（ロッシュ）を含む細胞溶解緩衝液中で溶解された。細胞溶解物は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、５０μｇのタンパク質がレーンにロードされた。タンパク質検出は抗ヒトシンデカン−２Ａｂ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）をＴＢＳ  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ，３％ＢＳＡ中で１：５００に希釈することにより行った。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合された二次抗ラットＩｇＧ抗体（サンタクルーズ）が１：１０００の希釈で添加された。その後、ＥＣＬウエスタンブロット化学発光試薬（ピアス）およびフルオロケムイメージングシステムを用いて検出された。
【０１０４】
酵素結合免疫吸着測定法
ｈＭＳＣから回収された上清中のヒトシンデカン−２のレベルは、酵素結合免疫吸着測定法を用いて測定された。市販のＥＬＩＳＡアッセイは、ＳＤＣ２（ＣＵＳＡＭＢＩＯ）のレベルを測定するために使われた。アッセイは製造者の指示により行った。較正曲線は、ＳＤＣ２の精製標準品を用いて作られた。曲線適合はシグモイドロジスティック回帰により製造者の指示に従ってなされた。
【０１０５】
ヒト末梢血の単核細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、抗凝固血液試料が集められ（７〜８ｍｌ）、液体密度勾配媒体（ＧＥヘルスケア）上に上層し、常温で３０分間、４００×ｇで遠心分離した。上層は、吸引され、捨てられ、ＰＢＭＣｓは、対応する密度の中間層（軟膜）の注意深いピペッティングにより回収され、新しい５０ｍｌチューブに移された。ＰＢＭＣは２０ｍｌのＰＢＳを添加して２回洗浄され、１０分間４００×ｇで遠心分離された。これは、血小板を除くために２００×ｇで１０分間で一回低速遠心された。ＰＢＭＣは、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地中に１０％ＦＢＳ、５０μＭ  βメルカプトエタノール、１％ＮＥＡＡ、１％Ｌ−グルタミンを含むＴ細胞培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０、ギブコ）に再懸濁された。この懸濁液の１０μｌの一定分量が取り除かれ、細胞数が血球計を用いて決定された。
【０１０６】
ヒトＴ細胞増殖アッセイ
ヒトＰＢＭＣは、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄され、予め温められた（３７℃）１０μＭ  Ｖｙｂｒａｎｔカルボキシフルオロセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）／ＰＢＳ染色液（インビトロゲン）中で、２×１０７細胞／ｍｌの濃度で染色した。細胞は、遮光され３７℃で６分間保温され、反応は、５容量の１０％ＦＢＳを含む氷冷培地を添加することにより停止された。ＰＢＭＣは、培養培地で３回洗浄され、非結合のＣＦＳＥの全ての痕跡を除かれた。１０万のＣＦＳＥ染色ＰＢＭＣｓが９６ウェルの丸底プレート中で、Ｔ細胞培地中で抗ヒトＣＤ３／抗ヒトＣＤ２８可溶性ポリクローナル抗体で刺激された。その後、ＭＳＣの様々な割合が、刺激されたＰＢＭＣに添加された（１：１０、１：５０、１：１００、１：２００および１：４００）。刺激していないＰＢＭＣもまたコントロールとして培養された。ＰＢＭＣは、４日後に回収され、その後、上清が取り除かれ、細胞は、２％ＦＢＳを含む１００μｌのオートＭＡＣＳ洗浄溶液中で洗浄された。これは、続いて抗ヒトＣＤ４＋ＡＰＣでカウンター染色された。ＰＢＭＣのＣＦＳＥ蛍光は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏを用いて分析された。全ての増殖は分析され、ＭＳＣ共培養をしない刺激されたＰＢＭＣと比較された。
【０１０７】
結果
ＭＳＣを過剰発現するＡｄ．ＳＤＣ２の上清由来の放出されたＳＤＣ２は、ＳＤＣ２  ＥＬＩＳＡにより検出可能である
Ａｄ．ＥＧＦＰまたはＡｄ．ＳＤＣ２で形質導入２４時間後、培地は吸引除去され、無血清培地で置換され、２４、４８および７２時間後に集められた。この上清は、新鮮な無血清培地をコントロールとして含んで、ＳＤＣ２  ＥＬＩＳＡのために用いられた。
【０１０８】
シンデカンは、通常細胞膜の近くで、シェディングとして知られているプロセスにおいて、制御された切断を受ける。シンデカンの細胞外ドメインの遊離は、単にシグナル伝達をダウンレギュレートするだけでなく、膜結合受容体を可溶なエフェクタ／またはアンタゴニストに変え得る（Manon-Jensenら、２０１０）。
【０１０９】
ヒト特異的ＳＤＣ２  ＥＬＩＳＡテクニックを採用することで、我々はｈｕＭＳＣにより放出されたＳＤＣ２タンパク質を検出し、定量することができた。我々は、Ａｄ．ＥＧＦＰとＡｄ．ＳＤＣ２の両方を発現するＭＳＣの培養培地中の放出されたＳＤＣ２タンパク質レベルを決定した。ＳＤＣ２は、Ａｄ．ＥＧＦＰ細胞の培養培地中で４８時間後（３４６．４ｐｇ／ｍｌ）に検出され、これは７２時間後に６８９．２ｐｇ／ｍｌまで増加した。ＳＤＣ２過剰発現細胞は、４８時間において培養培地中の放出されたＳＤＣ２の上昇したレベルを示し（４５６ｐｇ／ｍｌ）、これは、７２時間でのＡｄ．ＥＧＦＰの約２倍であった（１４１２．７ｐｇ／ｍｌ）（図１参照）。
【０１１０】
図１を参照して、形質導入２４時間後、完全培地を無血清培地に置換した（１ｍｌ／ウェル）。無血清の上清は４８時間後と７２時間後に回収された。市販のＳＤＣ２  ＥＬＩＳＡキットが、上清中に存在する、放出されたＳＤＣ２を検出するために使用された。Ａｄ．ＳＤＣ２上清は、Ａｄ．ＥＧＦＰ発現細胞と比較すると、放出されたＳＤＣ２量の増加を示した（約２倍）。
【０１１１】
次に無血清培地が過剰発現に影響しないことを確認するためにＳＤＣ２タンパク質の発現を試験した。
【０１１２】
Ａｄ．ＳＤＣ２過剰発現結果は、高レベルのＳＤＣ２タンパク質発現につながった
ｈｕＭＳＣは、１×１０５細胞／６ウェルプレートのウェルの濃度で接種され、２４時間接着させた。その後、ｈｕＭＳＣは、Ａｄ．ＥＧＦＰまたはＡｄ．Ｓ２（１×１０１２ｖｐ／ｍｌ）で形質導入された。形質導入２４時間後、完全培地は無血清培地に置換された。タンパク質溶解物は２４、４８および７２時間後に回収された。これらの溶解物は、ＳＤＣ２（Ｒ＆Ｄ）のためのウエスタンブロットに供され、ＳＤＣ２タンパク質発現は顕著に増加したことがわかった。我々は、コアタンパク質の分子量（約２５ｋＤａ）と２量体（約４８ｋＤａ）に相当するＳＤＣ２バンドの増加を観察した（図２参照）。
【０１１３】
免疫抑制能力はＳＤＣ２の過剰発現とともに増加した
ＳＤＣ２タンパク質発現がＡｄ．ＳＤＣ２形質導入後に増加し、また、細胞表面から放出されるＳＤＣ２の可溶性形態もまた増加することを確認し、我々はまた、もしあれば、ＳＤＣ２過剰発現が、ｈｕＭＳＣの免疫抑制能力に持つ効果を調査した。
【０１１４】
親であるＡｄ．ＥＧＦＰおよびＡｄ．ＳＤＣ２  ｈＭＳＣ細胞の免疫抑制能力は、Ｔ細胞増殖アッセイを用いて評価された。ＰＢＭＣのＴ細胞（ＣＤ４＋）画分の増殖が、ＣＦＳＥ発現のフローサイトメトリー分析により測定された。ＣＦＳＥは、細胞増殖を評価するために使われる蛍光細胞染色色素である。それにより、蛍光が各々の細胞分裂後に娘細胞で半分に漸減する。ＭＳＣの存在による刺激されたＴ細胞の免疫抑制は、増殖の抑制につながる。これは、Ａｄ．ＳＤＣ２過剰発現ＭＳＣの存在下で顕著に減少した。結果は、３世代にわたる増殖の百分率として表示された。１：２００のＭＳＣ：ＰＢＭＣの比率において、Ａｄ．ＳＤＣ２  ＭＳＣは、刺激されたＴ細胞陽性コントロールと比べて顕著なＴ細胞免疫抑制能力を示した（同様な結果が１：１０、１：５０および１：１００の比率を用いても得られた）。Ａｄ．ＥＧＦＰ細胞は、親のＭＳＣと比べて同等のＴ細胞免疫抑制を示した（図３参照）。
【０１１５】
図３を参照すると、親のＡｄ．ＥＧＦＰおよびＡｄ．ＳＤＣ２細胞集団の免疫抑制能力は、刺激されたＴ細胞との共培養で測定され、フローサイトメトリーにより定量された。結果は、刺激されたＴ細胞陽性コントロールに比べ、Ｔ細胞の増殖を抑制し得るＡｄ．ＳＤＣ２細胞による顕著な免疫抑制を証明した。Ａｄ．ＥＧＦＰの集団は、親のＭＳＣと同等の免疫抑制能力を維持したが、Ａｄ．ＳＤＣ２の集団は、親およびＡｄ．ＥＧＦＰのＭＳＣの両者に対し、顕著に増大された免疫抑制能力を示した（＊＝Ｐ≦０．０５、＊＊＝Ｐ≦０．００１  独立ｔ検定を用いて決定した）。
【０１１６】
それゆえ、ｈｕＭＳＣにおけるＳＤＣ２の過剰発現は、親のｈｕＭＳＣに比べると増大された免疫抑制効果につながった。
【０１１７】
実施例２−ＳＤＣ２を過剰発現する細胞（ＭＳＣ）由来上清は、Ｔ細胞の増殖を抑制した
我々は、ＳＤＣ２を過剰発現するＭＳＣの集団由来の上清について免疫抑制活性のアッセイを行った。
【０１１８】
図４を参照して、結果は、本発明の細胞、つまり、Ｓ２過剰発現ＭＳＣ（「Ｓ２」）、由来の培地は、２つのコントロール：（１）親のＭＳＣ（「親」）、および（２）ＣＤ３／ＣＤ２８刺激されたＴ細胞（「Ｔ細胞Ｓｔ」）由来の培地に比べた場合、ＣＤ３／ＣＤ２８が誘導するＴ細胞増殖を抑制するのに十分であった。それゆえ、上清は免疫抑制性であった。
【０１１９】
実施例３
治療製品のための効力アッセイとしてのＳＤＣ２アッセイ手順
我々は、ＳＤＣ２アッセイに基づく製品効力試験のためのプロトコルを開発した。
【０１２０】
このプロトコルは以下を含む：
１．可能性のある製品中のＳＤＣ２レベルを測定する
２．受容され得る治療製品のための予め決定された最小値と比較する
ａ．最小値以上のレベル＝受容（試験終了）
ｂ．最小値未満のレベル＝非受容
３．受容され得ない治療製品の最高値と比較する
ａ．最高値未満のレベル＝却下（試験終了）
ｂ．受容され得る治療製品の最小値と受容され得ない治療製品の最高値との間の中間レベル＝ＳＤＣ２レベルを増加させる処理をして、その後アッセイを繰り返す
【０１２１】
実施例４
治療製品のための効力アッセイとしてのＳＤＣ２アッセイ
我々は、ヒト細胞調製物の特定のアッセイに実施例３のアッセイを実行した。
【０１２２】
このプロトコルは、次の予め決められたレベルと共に使われた：
１．我々は可能性のある製品中のＳＤＣ２レベルを測定した
２．ＳＤＣ２レベルが１４００ｐｇ／ｍｌ以上の調製物は、可能性のある治療製品としてさらなる処理に適切な物として受容された；そのレベル未満の調製物は受容されなかった
３．ＳＤＣ２レベルが５００ｐｇ／ｍｌ未満の調製物は、さらなる処理には不適切であるとして初期に表明された
４．５００と１４００ｐｇ／ｍｌの間の中間であるとわかった調製物は、ＳＤＣ２レベルを増加させるためのＳＤＣ２活性化物で処理するのに適しているものとして同定された
５．続いて、我々はまた、ＳＤＣ２レベルが５００ｐｇ／ｍｌさえも未満である調製物はそれらのＳＤＣ２レベルを増加させるためにＳＤＣ２活性化物で処理することができることを表明した
６．ＳＤＣ２レベルが１４００ｐｇ／ｍｌを超えて上がった処理集団は、その後、可能性のある治療製品としてさらなる処理に適したものとして受容された。
【０１２３】
実施例５−内生ＳＤＣ２を増加させるためのｐ５３の活性化
我々は、様々なＨＤＡＣインヒビターを、初期にはＳＤＣ２発現を基礎として単離され、その後培養中で維持されたヒト細胞集団に関してＳＤＣ２発現に与えるそれらの影響を試験した。
【０１２４】
スプリトマイシン、バルプロ酸および２−ピロリジノン−ｎ−酪酸（ＰＢＡ）は全て、ＳＤＣ２のＲＮＡレベルを２４時間において増加させた。スプリトマイシンにより最も刺激された。
【０１２５】
我々は、環境毒素ベンゾ［ａ］ピレン−７，８−ジオール−９，１０−エポキシド（ＢＰＤＥ）を同様に試験し、６００ｎＭのＢＰＤＥがＳＤＣ２の分泌を約３倍増加させることを見出した。
【０１２６】
実施例６−ドナー細胞集団中のＳＤＣ２レベル
３つのヒトＭＳＣドナー（ドナー細胞調製物）は、ＳＤＣ２分泌のレベルを試験された。結果は、良い物（ドナー１０９および１１０と名付けられた）として同定された２つのドナーが、ＳＤＣ２の高いレベルであることを示した。一方、悪い物（ドナー１１１）として同定された第３のドナーは、低いＳＤＣ２レベルであり、実施例４のＳＤＣ２アッセイに不合格であった。
【０１２７】
実施例７
糖尿病創傷治癒におけるＳＤＣ２＋、ＳＤＣ２−およびＰＡ−ＳＳＣの局所投与の比較
我々は、エクセラゲン（Excellagen）（登録商標）（繊維状ウシタイプＩコラーゲンの高度に精製され調製されたホモジェネート）を用いる創傷治癒モデルにおいて、様々な幹細胞集団の活性を比較した。
【０１２８】
インビボ実験モデル
オスのニュージーランド白ウサギ（３〜３．５ｋｇ）が研究に使用された。糖尿病は、これらのウサギにアロキサン（１５０ｍｇ／ｋｇ）を耳翼辺縁静脈を介して投与することにより誘導された。血清グルコースは、毎日アキュチェック  アドバンテージ  ストリップ（ロシュ）を用いて確認した。高血糖５週間後、ウサギは、キシラジンとケタミンを用いて麻酔された。滅菌した使い捨ての６ｍｍのパンチバイオプシが５つの傷を作るのに使用された（１つの耳に３つの傷、他の耳に２つの傷）。各々の傷は、５つのランダムな処理グループの１つで処理された：
１．無処理
２．エクセラゲン（登録商標）足場のみ（２５μｌ）
３．１×１０６野生型ＭＳＣとともにエクセラゲン（登録商標）（エクセラゲン（登録商標）中に再懸濁した細胞ペレットの２５μｌ溶液）
４．１×１０６ＳＤＣ２陽性（「ＳＤＣ２＋」）型ＭＳＣとともにエクセラゲン（登録商標）（エクセラゲン（登録商標）中に再懸濁した細胞ペレットの２５μｌ溶液）
５．１×１０６ＳＤＣ２陰性（「ＳＤＣ２−」）型ＭＳＣとともにエクセラゲン（登録商標）（エクセラゲン（登録商標）中に再懸濁した細胞ペレットの２５μｌ溶液）
【０１２９】
処理の適用後、傷はポリウレタン包帯（オプサイト、スミス・アンド・ネフュー）で覆われ、耳は縫い合わされ、７日目まで接着性の包帯（オペルフィックス（Ｏｐｅｒｆｉｘ）；プロメディケア、クローニー、アイルランド）で覆われた。研究処理は、バイアスのない評価のためにランダム化され、ブラインドで行われた。７日後、ウサギは、ペントバルビタールナトリウム（２ｍＬ）の静脈注射により犠牲にされた。
【０１３０】
結果分析
１週間の処理後、異なる処理グループ内で傷の治癒に顕著な変化があった。各々の傷は犠牲の日にトレースされた。新鮮な傷が犠牲の日に作られ、１週間にわたる傷面積減少の百分率が計算された。
【０１３１】
創傷閉鎖百分率評価
犠牲の日に、各々の傷は６回トレースされた。各々の画像の面積がセルＢソフトウエア（オリンパス）を用いて測定され、平均面積が計算された。各々の処理グループでの１週間にわたる傷面積減少の百分率が計算された。
【０１３２】
創傷閉鎖百分率
創傷閉鎖百分率分析は、エクセラゲン（登録商標）が、無処理の傷に比べ、傷の治癒速度を促進したことを明らかにした。エクセラゲン（登録商標）足場中の１００万のＳＤＣ２＋細胞で処理された傷は、１週間の無処理グループと比べて、最高で最も顕著な創傷閉鎖の百分率を示した。エクセラゲン（登録商標）の傷の閉鎖効果は、ＳＤＣ２＋細胞と混合した際に、顕著に増大した。
【０１３３】
全ての傷切片は、さらに、組織学と立体的解析で処理された。
【０１３４】
組織学
傷は正中線で切られ、１０％ホルマリンで２４時間固定された。組織は組織処理装置（ＡＳＰ３００：マイヤーインスツルメンツ、ヒューストン、テキサス）を用いて処理され、パラフィンに埋め込まれた。切片（５ｍｍ）は、標準プロトコルを用いて、ヘマトキシリンとエオシンとマッソントリクロームで染色された。
【０１３５】
組織学的染色から、エクセラゲン（登録商標）で処理した傷は、傷の箇所に新しい組織を形成し、よい傷の治癒を示したことが観察され得た。エクセラゲン（登録商標）と混合されたＳＤＣ２＋細胞で処理された傷は、最も効果的な傷の治癒を示した。ＳＤＣ２＋細胞の混合は、エクセラゲン（登録商標）単独の治癒能力を増加させた。無処理グループと比較すると、ＳＤＣ２＋処理傷は、創傷床の基部にコラーゲン形成と共に、新しい組織を傷箇所に形成したことが示された。
【０１３６】
ＳＤＣ２＋細胞で処理した創傷についての創傷床における血管新生
ＭＳＣは、皮膚の創傷の治癒を改善することに加え、血管新生を促進することが知られている。ＳＤＣ２＋細胞で処理された創傷において同様の効果が観察された。これらの創傷において、新血管の形成は創傷床内で観察され得た。それゆえ、顕著な創傷治癒は、ＳＤＣ２＋処理創傷において、創傷閉鎖の百分率の増加により観察され、より効果的な血管新生を伴い得る。
【０１３７】
要約
エクセラゲン（登録商標）と混合されたＭＳＣは、細胞の生存率に関してエクセラゲン（登録商標）マトリックスの副作用を示さず、よい代謝活性を保持していた。細胞は、エクセラゲン（登録商標）マトリックスを通して適切な分布で、細胞塊を形成せず、高密度に存在した。最近の研究では、エクセラゲン（登録商標）と混合したＳＤＣ２＋細胞で処理された創傷は、エクセラゲン(登録商標)で処理したコントロールのみと比べて創傷閉鎖の百分率が上がることが示された。ＳＤＣ２＋細胞は、エクセラゲン（登録商標）の創傷治癒能力を顕著に増加させた。ＭＳＣはまた、血管新生も促進することが報告される。本研究では、創傷床内で、ＳＤＣ２＋細胞処理グループにおいて血管形成の増加が観察された。それゆえ、ＳＤＣ２＋処理創傷は、より顕著な血管新生とともに、創傷閉鎖の百分率の増加により顕著な創傷治癒の利益を示した。それゆえ、ＳＤＣ２＋処理創傷は、より顕著な血管新生とともに、創傷閉鎖の百分率の増加により顕著な創傷治癒の利益を示した。それゆえ、マトリックス中の本発明のＳＤＣ２＋細胞は、より短い治癒時間で改善された創傷治癒能力を示した。
【０１３８】
実施例８−癌細胞遊走
細胞遊走は、インビトロの細胞培養関連研究にとって決定的なパラメータである。異なる条件下で細胞集団のダイナミックな変化をモニターすることが必要である。インピーダンスに基づく装置であるリアルタイム細胞分析装置（ＲＴＣＡ、エクセリジェンス、ロシュ）を用いて、我々は、次の性質：増殖、遊走および細胞接着をリアルタイムでモニターすることができる。そのような性質は癌の進化に含まれる。我々は、癌細胞が馴化培地に向かう遊走能力を確立するために、この方法を用いた。このモデルは、癌治療における効力の予測−該モデルにおける遊走の減少は、抗癌特性を示す−として受け入れられている。
【０１３９】
我々の研究では、細胞遊走は、前述のエクセリジェンス装置を用いて、リアルタイムで読み取られる１６ウェルのＣＩＭプレートを用いて決定された。これらの研究のために、乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４８６、ＭＣＦ−１０Ａ）、前立腺癌（ＤＵ１４５）、膵臓癌（ＳＵ−８６−８６）および大腸癌（ＨＣＴ１１６）由来の様々な癌細胞株が使用された。
【０１４０】
結果を表１に要約する。
【０１４１】
【表１】
0006438457.tif 000005
【０１４２】
乳癌細胞株
・組換えＳＤＣ２（５００ｎｇ／ｍｌ  ｒＳＤＣ２（ｎ＝５）および１００ｎｇ／ｍｌ（ｎ＝２））は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の遊走を阻害した。Ａｄ．ＳＤＣ２（３μｌ）−ＣＭ（ｎ＝３）について同様の遊走結果が得られた。
・ＭＤＡ−ＭＢ−４８６細胞は、Ａｄ．ＳＤＣ２−ＣＭ（３μｌ；ｎ＝１）に向かう遊走の減少を示した。
・Ａｄ．ＳＤＣ２（３μｌ）は、ＭＣＦ−１０Ａ細胞（ｎ＝１）の遊走を変えなかった。
【０１４３】
前立腺癌株
・５００ｎｇ／ｍｌのｒＳＤＣ２を無血清ＭＳＣ−ＣＭに添加すると、馴化培地のみと比べて、１つの実験においてＤＵ１４５細胞の遊走が減少し、２つ目の実験では変化しなかった。Ａｄ．ＳＤＣ２（３μｌ）は、ＤＵ１４５細胞（ｎ＝１）の遊走を減少させた。これは、ＳＤＣ２のＥＣドメインが、この前立腺癌細胞株の遊走を阻害したことを示す。
【０１４４】
膵臓癌細胞株
・ＳＵ−８６−８６細胞の遊走能力は、多様である；１つの実験は、ｒＳＤＣ２−ＣＭへの遊走を増加させ（１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌおよび１０００ｎｇ／ｍｌにおいて；ｎ＝１）、他の実験は、ｒＳＤＣ２−ＣＭへの遊走の減少を示した（１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌおよび１０００ｎｇ／ｍｌにおいて；ｎ＝１）。
【０１４５】
大腸癌細胞株
・ＨＣＴ１１６細胞は、試験した全ての濃度（１００〜１０００ｎｇ／ｍｌ）において、ｒＳＤＣ２−ＣＭへの遊走の減少を示した。
【０１４６】
結論
全体として、これらの結果は、異なる癌細胞の培地中のＳＤＣ２に対する挙動の変化を示す。一般的に、ＳＤＣ２は、癌の遊走能力を減少させ、このモデルにおける抗癌効果、特にＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（乳癌）における抗癌活性を示した。
【０１４７】
最初の試験において、この分野における、後の拡大された研究プログラムによって確認されるべきだが、ＳＤＣ２に対する抗体が、抗癌効果を示す乳癌遊走の同様の阻害を示した。
【０１４８】
実施例９−免疫抑制
実施例８で使用された様にｒＳＤＣ２を用いて、我々は、免疫抑制モデルにおけるＳＤＣ２の活性を調査した。我々は、ＳＤＣ２タンパク質が、ＴＮＦαおよびＩＬ１βによるＮＦκＢ活性化を抑制することを見出した。これは、ＳＤＣ２タンパク質それ自体の中の免疫抑制活性を証明した。
【０１４９】
κＢルシフェラーゼプラスミドにより安定に形質導入されたＡ５４９細胞は、ＳＤＣ２組換えタンパク質で１時間前処理された。１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α／ＩＬ−１βが培地に添加され、ルシフェラーゼアッセイが２４時間後に行われた。結果を図５に示す。＊＊＊＝０ｎｇ／ｍＬ  Ｓ２に対してｐ＜０．０００１。
【０１５０】
Ａ５４９細胞は、κＢルシフェラーゼプラスミドで安定に形質導入され、組換えＳＤＣ２で２４時間処理した。結果を図６に示す。最上部のパネル：サイトカインが培地に２４時間添加され、ルシフェラーゼアッセイが行われた。下部のパネル：培地はサイトカインを２４時間添加される前に置換された。＊＝０ｎｇ／ｍＬ  Ｓ２に対してｐ＜０．０１；＊＊＊＝０ｎｇ／ｍＬ  Ｓ２に対してｐ＜０．０００１；＋＋＋＝１００ｎｇ／ｍＬ  Ｓ２に対してｐ＜０．０００１。
【０１５１】
Ａ５４９κＢＬ細胞は、１μＬ／ｍＬまたは３μＬ／ｍＬのＡｄ．ＮｕｌｌまたはＡｄ．ＳＤＣ２で形質導入され、ルシフェラーゼアッセイが行われる前にサイトカインで２４時間処理された。結果を図７に示す。＊＊＝０ｎｇ／ｍＬ  Ｓ２に対してｐ＜０．００１
【０１５２】
これらの結果は、ＳＤＣ２タンパク質の免疫抑制効果を示した。
【０１５３】
実施例１０−ＳＤＣ２のｐ５３制御
ＳＤＣ２タンパク質シグナル伝達におけるｐ５３の役割を決定するために、我々は、ＳＤＣ２の反応を正確に記述するためにｐ５３アゴニスト（ニュートリン−３ａ）を使用することにより、ＭＳＣ内のｐ５３経路を薬理学的に混乱させた。ニュートリン−３ａは、明確なｐ５３反応を誘導し、成長を阻害する。
【０１５４】
方法
細胞培養および処理
ＭＳＣは、６−ウェルプレート（ヌンク）のウェルあたり１０５細胞の密度で完全培地（ａ−ＭＥＭ，１０％ＦＢＳ）にプレーティングし、終夜接着させた。培地は、その後、ニュートリン−３ａまたは担体コントロールとしてＤＭＳＯを含む無血清に置換された。誘導２４時間後に、細胞はＲＮＡとタンパク質の両方のために回収され、無血清の上清はＥＬＩＳＡのために収集された。
【０１５５】
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
ｈＭＳＣから収集された上清中のヒトシンデカン−２の濃度は、市販のＥＬＩＳＡアッセイ（ＣＵＳＡＢＩＯ）を用いて測定した。アッセイは、製造者の指示通り行った。較正曲線は、ＳＤＣ２の精製標準品を用いて作成した。曲線適合は、製造者の指示に従い、シグモイドトジスティック回帰により達成された。
【０１５６】
結果
ＭＳＣのニュートリン−３ａ処理は、ＳＤＣ２シェディングの量依存的な増加につながる
ニュートリン−３ａ（５、１０、２０μＭ）またはＤＭＳＯ担体コントロール（５、２０μＭ）で２４時間処理した後、ＭＳＣの上清が回収され、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離され、非馴化無血清培地を追加のコントロールとして含むＳＤＣ２  ＥＬＩＳＡに供された。
【０１５７】
図８は、ＭＳＣのニュートリン−３ａ処理が、ＳＤＣ２シェディングの量依存的増加を引き起こすことを示す。ＭＳＣは、無血清培地中で２４時間ニュートリン−３ａまたは担体コントロールとしてのＤＭＳＯで処理された。無血清上清は、回収され、市販のＳＤＣ２  ＥＬＩＳＡキットが上清中に存在する放出されたＳＤＣ２を検出するために使われた。ニュートリン−３ａ処理された細胞は、ＤＭＳＯコントロールに比べ、ＳＤＣ２シェディングが増加することを示した。
【０１５８】
図８は、３つの異なるヒトＭＳＣドナーを用いた３つの独立した実験の代表例である。切断されたＳＤＣ２量は、２０μＭのＤＭＳＯコントロール中の２５０ｐｇ／ｍｌから、ニュートリン−３ａ  ２０μＭ量中の平均１０００ｐｇ／ｍｌ近くまで増加する。
【０１５９】
それゆえ、この実験は、ｐ５３活性をアップレギュレートする化合物（ニュートリン−３ａ）は、ＳＤＣ２シェディングもまた増加させることを証明する。
【０１６０】
実施例１１
化学療法剤は、ヒトＭＳＣからのＳＤＣ２シェディングを促進する
我々は、ヒトＭＳＣからのＳＤＣ２シェディングに関する効果について、様々な化学療法剤インヒビター、特に、タキソール、カンプトセシン、エトポシドおよびＢＰＤＥ（ベンゾ（ａ）ピレン  ジオールエポキシド）を試験した。
【０１６１】
ＭＳＣは、２４時間の血清飢餓に先立って化学療法剤で２４時間処理された。該細胞上清は、回収され、放出されたＳＤＣ２タンパク質発現における相対的倍数変化が、ＥＬＩＳＡにより分析された。
【０１６２】
図９は、これらの実験結果と、化学療法剤がヒトＭＳＣからのＳＤＣ２シェディングを促進することとを示す。
【０１６３】
実施例１２
ＮＦ−κＢの制御に関与するＳＤＣ２ドメインの同定
ＳＤＣ２のどの断片またはドメインが、ＮＦ−κＢシグナル伝達の制御に関与しうるかを決定するために、我々は、κＢモチーフの制御下のルシフェラーゼレポーター遺伝子システムを使用した。我々は、空のベクターコントロールのアデノウイルス（ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４）またはＳＤＣ２（１．４から１２．４）の１２断片を発現するベクターでこれらの細胞を形質導入し、ＮＦ−κＢの転写活性に与える効果を決定した。
【０１６４】
図１０は、ＳＤＣ２のＣ末端欠失断片（１−６）の過剰発現が、ＩＬ−１βまたはＴＮＦ−αに反応してＮＦ−κＢ活性を減衰させることを示す。ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ発現細胞は、空のベクター（ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４）または１．４から１２．４断片を発現するベクターでトランスフェクトされた。２４時間後、細胞は、サイトカインＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理され、その後ルシフェラーゼアッセイを行った。
【０１６５】
断片は、図１０において、番号１〜１２として参照される。これらは、次のＳＤＣ−２のペプチドフラグメント：１、１−７９；２、１−８７；３、１−１００；４、１−１４４；５、１−１６９；６、１−２０１；７、１９−７９；８、１９−８７；９、１９−１００；１０、１９−１４４；１１、１９−１６９；１２、１９−２０１に対応する。
【０１６６】
ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βのような炎症誘発性のサイトカインは、ＮＦ−κＢの転写活性を活性化し得る。そのことは、空ベクターのコントロールの列で観察される。ＮＦ−κＢ転写活性は、コントロール細胞中でＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βによりそれぞれ約３倍および４倍誘導される。しかしながら、断片１−６を発現する細胞中では、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α／ＩＬ−１β誘導によるＮＦ−κＢの転写活性の増加は、顕著に減少される（図１０）。特に、Ｎ末端のシグナルペプチド（１−１８）を発現する断片は、顕著にＮＦ−κＢのＩＬ１βおよびＴＮＦ−αの活性化を阻害した。断片１．４（１−７９）および２．４（１−８７）は、ＮＦ−κＢ活性化を強く阻害した。このことは、ヘパラン硫酸結合部位およびシグナルペプチドの両方がＮＦκＢの抑制に必要であることを示している。
【０１６７】
このデータは、ＳＤＣ２の免疫抑制特性およびおそらく遊走特性が、ＳＤＣ２のＮ末端に起因し得ることを示唆している。ＮＦ−κＢ活性を阻害することにより、ＳＤＣ２断片は、免疫応答を減少させ得、抗炎症剤として、および創傷治癒、癌治療および炎症のために使用し得る。
【０１６８】
実施例１３
シンデカン−２は、ＮＦ−κＢシグナル伝達を阻害し、ＩＬ−１β、ＴＮＦαおよびＩＬ１β／ＴＮＦαに応答してＩＬ６およびＩＬ８分泌を制限する
ＳＤＣ−２がＮＦ−κＢのシグナル伝達に影響を与え得るかを決定するために、我々は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子システムをκＢモチーフの制御下で使用した。我々は、これらの細胞を空ベクターコントロールのアデノウイルス（Ａｄ−コントロール）またはＳＤＣ２発現アデノウイルス（Ａｄ−ＳＤＣ２）で形質導入し、ＮＦ−κＢ転写活性に与える影響を決定した。ＴＮＦα、ＩＬ−１βのような炎症誘発性のサイトカインおよびＴＮＦα／ＩＬ−１βの組合せが、図１１Ａに示すようにＮＦ−κＢ転写活性を活性化し得る。ＮＦ−κＢ転写活性は、コントロール細胞において、ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＴＮＦα／ＩＬ−１βにより、約３倍、３．５倍および４倍誘導された。しかしながら、ＳＤＣ−２発現細胞において、ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＴＮＦα／ＩＬ−１β誘導によるＮＦ−κＢ転写活性の増加は、顕著に減少される（図１１）。
【０１６９】
ＮＦ−κＢ転写活性の減少に加えて、ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＴＮＦα／ＩＬ−１β誘導によるＩＬ−６およびＩＬ−８放出の顕著な減少が伴った。ＩＬ−６およびＩＬ−８の両者は、ＮＦ−κＢにより制御される（図１１Ｂおよび１１Ｃ）。
【０１７０】
総合すると、このデータは、ＮＦ−κＢ経路の制御によるＳＤＣ２の抗炎症特性を示す。
【０１７１】
実施例１４
癌間質中に局在するＳＤＣ２に対するＳＤＣ２抗体のターゲッティング
我々は、初期の研究を確認し、癌治療における治療介入の戦略を決定するために、癌モデルにおけるＳＤＣ２＋細胞の局在を研究した。
【０１７２】
ＭＭＴＶ  ＰｙＭＴ−Ｐ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐ２Ａ−ＯＶＡ(ＰｙＭＴ  ＣｈＯＶＡ)マウスは、ＵＣＳＦのマット・クルメル（Ｍａｔｔ  Ｋｒｕｍｍｅｌ）教授により親切にも作成された。ｍＣｈｅｒｒｙおよびＯＶＡ（オボアルブミン）配列は、ポリオーマウイルスのミドルＴ抗原（ＰｙＭＴ）に連結され、全配列はＭＭＴＶ（マウス乳癌ウイルス）プロモーターにより動かされる。
【０１７３】
腫瘍増殖−雌のＰｙＭＴ  ＣｈＯＶＡマウスは、乳腺の触診により腫瘍発症をモニターされ、ノギスで腫瘍サイズを測定することにより、全腫瘍量を毎週モニターした。合わせた腫瘍量は、全ての触診可能な腫瘍面積の合計により算出された。腫瘍面積は、腫瘍の長さ×幅として決定された。マウスは、ＡＣＲＥＣの動物プロトコルに従って腫瘍量が２００ｍｍ２を超えたとき犠牲にされた。
【０１７４】
腫瘍消化−ＰｙＭＴ腫瘍は、マウスから切断され、切除された腫瘍の総重量が決定された。腫瘍は、その後外科用メスを使って細かく刻まれ、０．３ｇの腫瘍重量あたり２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ（シグマ）と２００μｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅで１．５時間消化された。腫瘍は、その後、消化されていない腫瘍の大きな部分を除くために１００μｍのセルストレーナーを通された。その後、死んだ細胞と赤血球細胞を取り除くために７０％／３７％／３０％パーコール密度勾配がなされ、両者の界面が収集された。
【０１７５】
フローサイトメトリー−全ての抗体は、Ｒ＆Ｄシステム、ＢＤファーミンゲン、イーバイオサイエンス、インビトロゲンまたはバイオレジェンドから購入した。表面染色のために、細胞は、抗Ｆｃ受容体抗体（２４Ｇ２）とともにインキュベートされ、適切な抗体で、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で染色された。全てのフローサイトメトリーは、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス）上で行われた。フローサイトメトリーのデータの分析はＦｌｏｗＪｏ（ツリースター）を用いて行われた。
【０１７６】
腫瘍間質細胞は、次のマーカー、ＣＤ４５−、ｍＣｈｅｒｒｙ−、ｇｐ３８＋、ＣＤ３６２＋およびＤＡＰＩ−に基づいてソートされた。上皮腫瘍細胞は、ＣＤ４５−、ＤＡＰＩ−およびｍＣｈｅｒｒｙ＋であることに基づいてソートされた。
【０１７７】
結果は、ＳＤＣ２（ＣＤ３６２／シンデカン−２）タンパク質発現は、ＣＤ４５−、ｍＣｈｅｒｒｙ−、ｇｐ３８＋、ＣＤ３６２＋およびＤＡＰＩ腫瘍間質に局在した。それゆえ、ＳＤＣ２陽性細胞は、癌間質中に局在し、さらに、癌治療におけるＳＤＣ２アンタゴニスト、例えばＳＤＣ２抗体、の抗癌効果を示す早期の研究を支持した。
【０１７８】
それゆえ、本発明は、ＳＤＣ２レベルおよび／または活性を調節することで、免疫調節および他の療法を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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