(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
結腸直腸がんもしくは膀胱がんを有するまたは結腸直腸がんもしくは膀胱がんを有するリスクのある被験者に、結腸直腸がんもしくは膀胱がんの診断、予後またはリスク分類を提供するための、前記被験者の生物学的サンプル中のラミニンガンマ−２モノマー濃度を決定する方法であって：
ａ．被験者からの生物学的サンプル中のラミニンガンマ−２モノマー濃度をイムノアッセイにより決定するステップ；および
ｂ．前記サンプルからのラミニンガンマ−２モノマー濃度を、参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度値と比較するステップ；
を含み、参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度値よりも高い、生物学的サンプル中のラミニンガンマ−２モノマー濃度が、被験者が結腸直腸がんもしくは膀胱がんを有することの、または被験者の結腸直腸がんもしくは膀胱がんを発病するリスクが増大していることの指標である、方法。
【請求項２】
さらに、サンプル中の少なくとも１つの追加の、結腸直腸がんもしくは膀胱がんのバイオマーカーの濃度を決定するステップ；および少なくとも１つの追加のバイオマーカーの濃度を、少なくとも１つのバイオマーカーのための参照濃度値と比較するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
追加のバイオマーカーが、ラミニンガンマ−２フラグメント、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）および炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）から選ばれる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度値が、対照サンプルのラミニンガンマ−２モノマー濃度値、一群の対照被験者からの複数の対照サンプルのメジアンもしくは平均ラミニンガンマ−２モノマー濃度、またはラミニンガンマ−２モノマーカットオフ値である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
対照サンプルが、対照被験者の生物学的サンプルまたはラミニンガンマ−２モノマー濃度標準物質である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
サンプル中のラミニンガンマ−２モノマー濃度が、参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度値の少なくとも２倍である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度値が、患者群の生物学的サンプルからの受信者動作曲線（ＲＯＣ）解析によって決定されたラミニンガンマ−２モノマーカットオフ値である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度値が、患者群の生物学的サンプルの平均プラス２標準偏差解析によって決定されたラミニンガンマ−２モノマーカットオフ値である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度値が、約１０００ｐｇ／ｍＬである、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
生物学的サンプルが、全血、血漿または血清を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
被験者におけるがんの重症度または病期、および被験者ががんを発病する可能性から選ばれる予後を提供するための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
被験者がヒトである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度値が、ヒト対照被験者からの血液を含む生物学的サンプルからのものである、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
イムノアッセイが、ラミニンガンマ−２モノマーに特異的に結合することのできる分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ラミニンガンマ−２モノマーに結合することのできる分子が、ラミニンガンマ−２モノマーに特異的に結合することのできる少なくとも１つの抗体を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ラミニンガンマ−２モノマーに結合することのできる分子が、ラミニンガンマ−２のＮ末端フラグメントに結合しない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法を実施するためのキットであって：
ａ．生物学的サンプル中のラミニンガンマ−２モノマー濃度の定量化を可能とする、ラミニンガンマ−２モノマーに特異的に結合することのできる少なくとも１つの試薬；および
ｂ．参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度を示す参照標準
を含む、キット。
【請求項１８】
生物学的サンプル中の少なくとも１つの追加の結腸直腸がんもしくは膀胱がんのバイオマーカーの濃度の定量化を可能とする、生物学的サンプル中の少なくとも１つの追加のバイオマーカーに特異的に結合することができる少なくとも１つの追加の試薬、および生物学的サンプル中の少なくとも１つの追加の結腸直腸がんもしくは膀胱がんのバイオマーカーの参照濃度を示す参照標準をさらに含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
少なくとも１つの試薬が、ラミニンガンマ−２モノマーに特異的に結合することのできる少なくとも１つの抗体を含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
イムノアッセイが抗体を使用し、抗体がモノクローナル抗体２Ｈ２である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体を参照により本明細書に組み込まれる２０１２年８月１３日出願の米国仮出願第６１／６８２，４６２号に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
本開示は、患者におけるバイオマーカーを検出することおよびその量を決定することによって、患者におけるがんの予後、診断またはリスク識別を決定するための方法およびイムノアッセイプラットフォームに関する。バイオマーカーは、がん患者を同定し、がん治療法の候補者として患者を同定するため、患者のがんを発病するリスクを分類するため、または患者のがんステージもしくはがんの進行のリスクを分類するため、および診断、予後もしくは治療レジメンを決定するために使用され得る。
【背景技術】
【０００３】
がんは、依然として、先進国の成人における罹患および死亡の重要な原因である。ある場合においては、がん治療の進歩が、診断から死までの患者の生存期間を拡大させることができた。しかしながら、がん治療の全体的な成功は、疾患の早期検出によることが多く、これは、原発腫瘍の拡大および／または転移成長が後から起こる前に治療が始まることを可能とする。したがって、早期のおよび／またはより正確ながんの診断を提供する方法およびアッセイが望ましく、なぜなら、そのような方法およびアッセイは、早期の治療介入を可能とし、患者の転帰（例えば、生活の質、生存期待など）を改善することができるからである。
【０００４】
ラミニンは、基底板中に見られる一群のヘテロ三量体タンパク質であり、基底膜の一部を形成する。これらのタンパク質は、お互いに複合してラミニン構造を形成する３つの非同一ポリペプチドに基づいて分類される。これらの３つのポリペプチドは、アルファ（α）鎖、ベータ（β）鎖およびガンマ（γ）鎖として識別され、それぞれが数種の分子種（例えば、α１−α５、β１−β３およびγ１−γ２）を有する。ラミニン５（またはＬＮ５）は、基底板中に存在し、上皮細胞と上皮細胞を裏打ちする結合組織の間に位置する基底膜において豊富であることが知られている。ＬＮ５の構造は、α３鎖およびβ３鎖と複合した場合にＬＮ５を形成するガンマ−２（γ２）鎖を含む構造を有する唯一のラミニンである点で、既知のラミニンの中でも独特である。生理学的に、ＬＮ５は上皮細胞により産生され、細胞の接着、増殖、分化および／または遊走を促進することができることが知られている。例えば、ＬＮ５が上皮細胞から分泌されるとき、それは（例えば、膜型１マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＴ１−ＭＭＰ）による）プロテアーゼ分解を受けやすい。ある場合においては、ＬＮ５は、ガンマ−２鎖配列のＮ末端に向かってプロセシングされて、細胞の遊走および浸潤の促進を含むＥＧＦ様活性を有するフラグメントを生成する（Ｋｏｓｈｉｋａｗａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、（２０００）１４８：６１５−６２４頁）。
【０００５】
そのプロセシングされた形態を含むＬＮ５の既存の検出方法は、（組織の免疫染色などの）組織学的方法、尿検査または（Ｎ末端フラグメントなどの）タンパク質分解フラグメントの検出のいずれかに焦点を当てており、ラミニンガンマ−２モノマー検出のための簡便なおよび／または高感度の方法を提供するものでなはい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｏｓｈｉｋａｗａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、（２０００）１４８：６１５−６２４頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
一態様において、本開示は、がんを有するまたはがんを有するリスクのある被験者に、診断、予後またはリスク分類を提供するための方法を提供し、方法は、被験者から血液を含む生物学的サンプルを得るステップ；被験者からの生物学的サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの濃度を決定するステップ；上記サンプルからのラミニンガンマ−２モノマー濃度を、参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度値と比較するステップであって、参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度値よりも高いサンプル中のラミニンガンマ−２モノマー濃度が、被験者を、がんを有するまたはがんを発病する増大したリスクを有すると同定するステップ、を含む。
【０００８】
ある態様において、本開示は、がんを有するまたはがんを有するリスクのある被験者に、診断、予後またはリスク分類を提供するための方法に関し、方法は、被験者から血液を含む生物学的サンプルを得るステップ；被験者からの上記生物学的サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの濃度を決定するステップ；および参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度値と比較して、上記被験者ががんを有するまたはがんを発病する増大したリスクを有すると同定するために、上記ラミニンガンマ−２モノマー濃度を提供するステップを含む。
【０００９】
さらなる態様において、本開示は、がんを有するまたはがんを有するリスクのある被験者に、診断、予後またはリスク分類を提供するための方法に関し、方法は、被験者から血液を含む生物学的サンプルを得るステップ；被験者からの生物学的サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの濃度を決定するステップ；サンプルからのラミニンガンマ−２モノマー濃度を、参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度値と比較するステップ；および比較を提供するステップであって、比較が参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度値よりも高いサンプル中のラミニンガンマ−２モノマー濃度を含む場合、比較は、被験者を、がんを有するまたはがんを発病する増大したリスクを有すると同定するステップ、を含む。
【００１０】
別の態様において、本開示は、被験者においてがんを検出し、診断しまたは予後判定するための方法を提供し、方法は、被験者からの血液を含むサンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの濃度を決定することを含み、ラミニンガンマ−２モノマーの濃度が、ラミニンガンマ−２モノマーに特異的に結合する抗体とサンプルを接触させ、抗体結合を検出することによって決定され、被験者からのサンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの濃度が参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度よりも高い場合、被験者においてがんが検出され、診断されまたは予後判定される。
【００１１】
さらに別の態様において、本開示は、被験者においてがんを検出し、診断しまたは予後判定するための方法を提供し、方法は、被験者からの血液を含むサンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの濃度を決定することであり、ラミニンガンマ−２モノマーの濃度が、ラミニンガンマ−２モノマーに特異的に結合する抗体とサンプルを接触させ、抗体結合を検出することによって決定されること；および被験者からのラミニンガンマ−２モノマーの濃度を、参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度と比較することであり、被験者からのサンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの濃度が参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度よりも高い場合、被験者においてがんが検出され、診断されまたは予後判定されること、を含む。
【００１２】
実施形態において、上記態様の方法は、さらに、サンプル中の少なくとも１つの追加のがんのバイオマーカーを検出することを含むことができる。方法の実施形態において、診断の提供は、膀胱がんまたは結腸直腸がんなどのがんの診断の提供であることができる。方法の他の実施形態において、予後の提供は、がんの病期の決定であることができるまたは被験者が、例えば膀胱がんまたは結腸直腸がんの侵攻性または侵襲性形態などのがんを発病する可能性またはリスクの決定であることができる。
【００１３】
方法は、さらに、ラミニンガンマ−２フラグメント（例えば、ＥＧＦ様フラグメント）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、炭水化物抗原１９−９（がん抗原１９−９またはＣＡ１９−９とも呼ばれる）などから成る群から選ばれる、少なくとも１つの追加のがんのバイオマーカーの評価を含んでよい。追加のバイオマーカーの評価は、例えば、被験者からの生物学的サンプル中のバイオマーカーの濃度を測定することを含んでよいまたは被験者の臨床的評価を含んでよい。被験者からの生物学的サンプル中のバイオマーカーの濃度を測定することにより評価される追加のバイオマーカーのために、方法は、さらに、少なくとも１つの追加のバイオマーカーの測定された濃度を、バイオマーカーの参照値と比較することを含んでよい。本明細書に開示された方法において使用される任意の追加のバイオマーカーのための参照値は、対照サンプルのバイオマーカー濃度、バイオマーカーカットオフ値または対照被験者群からの複数の対照サンプルのメジアン濃度などに関連し得る。
【００１４】
一態様において、本開示は、膀胱がんまたは結腸直腸がんの治療レジメンの候補者として被験者を同定するための方法を提供し、方法は、被験者からの血清を含む生物学的サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの濃度を決定することおよび上記サンプル中のラミニンガンマ−２モノマー濃度を参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度値と比較すること、ここで、サンプル中のラミニンガンマ−２モノマー濃度が参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度値よりも高い場合、被験者ががん治療レジメンの候補者として同定される、を含む。実施形態において、方法は、さらに、サンプル中の少なくとも１つの追加のがんのバイオマーカーを検出することを含むことができる。
【００１５】
別の実施形態において、本開示は、膀胱がんまたは結腸直腸がんなどのがんを有するまたは有するリスクのある被験者の診断、予後および／またはリスク分類のための方法を提供し、方法は、がんを有さない対照被験者に比較して増大したラミニンガンマ−２モノマー濃度を被験者において検出することを含む。
【００１６】
本明細書に開示された任意の方法において、ラミニンガンマ−２モノマー参照値は、対照サンプルのラミニンガンマ−２モノマー濃度またはラミニンガンマ−２モノマーカットオフ値であることができる。ラミニンガンマ−２モノマー濃度は、例えば、血液（例えば、血漿または血清）中のラミニンガンマ−２モノマー濃度の参照値であることができる。対照サンプルは、対照被験者の生物学的サンプルまたはラミニンガンマ−２モノマー標準であることができる。対照サンプルのラミニンガンマ−２モノマー濃度は、例えば、一群の対照被験者からの複数の対照サンプルのメジアンラミニンガンマ−２モノマー濃度であることができる。あるいはまた、ラミニンガンマ−２モノマーカットオフ値は、患者群の生物学的サンプルからの受信者動作曲線（ＲＯＣ）解析により決定されることができる。あるいはまた、ラミニンガンマ−２モノマーカットオフ値は、患者群の生物学的サンプルの四分位解析により決定されることができる。さらにあるいはまた、ラミニンガンマ−２モノマーカットオフ値は、患者群の生物学的サンプルの平均プラス２標準偏差解析により決定され得る。例えば、ラミニンガンマ−２モノマーカットオフ値は、例えば、膀胱がんまたは結腸直腸がんなどのがんを有する患者から成る患者群のメジアンに相当する値を選ぶことによって決定可能であり、これは、約９００から約１０００ｐｇ／ｍｌ血清であり得る。あるいはまた、ラミニンガンマ−２モノマーカットオフ値は、膀胱がんまたは結腸直腸がんを有する患者から成る患者群の７５パーセンタイルに相当する値を選ぶことによって決定可能であり、これは、例えば、約１，１００から約１，４００ｐｇ／ｍＬ血清であり得る。他の実施形態において、適切なカットオフ値は、血清中約７０ｐｇ／ｍＬから約２，５００ｐｇ／ｍＬであり得る。例えば、約１，０００ｐｇ／ｍＬ血清のカットオフ値は、膀胱がんまたは結腸直腸がんの検体と正常検体を識別するために使用されてよい。同様のカットオフ値が、血漿および全血サンプルのために使用可能である。
【００１７】
任意の上記方法において、方法はイムノアッセイによって実施可能である。そのようなイムノアッセイにおいて採用され得る抗体の例は、モノクローナル抗体２Ｈ２である。
【００１８】
任意の上記方法において、被験者はヒト被験者であることができ、被験者の生物学的サンプルおよび／または対照サンプルは、ヒト被験者から採取されることができる。任意の上記方法において、生物学的サンプルは、例えば、全血、血漿もしくは血清のうちのいずれか１つまたは任意の細胞培養懸濁液もしくはその分画を含む、組織または体液からのものであることができる。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、サンプルは、全血、血漿または血清であり、好適には、血漿または血清である。抗凝固剤が任意の末梢血サンプルに添加されることができる。上記方法において、ラミニンガンマ−２モノマーおよび場合によって少なくとも１つの追加のバイオマーカーの濃度を決定することは、ラミニンガンマ−２モノマーに特異的に結合することのできる試薬および場合によって追加のバイオマーカーに特異的に結合することのできる試薬が使用される、免疫学的アッセイ方法によって実施可能である。
【００１９】
別の態様において、本開示は、本明細書に開示された任意の方法およびアッセイを実施するためのキットを提供し、キットは、被験者からの生物学的サンプル中のラミニンガンマ−２モノマー濃度の定量化を可能とする、ラミニンガンマ−２モノマーに特異的に結合することのできる少なくとも１つの試薬、および参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度を示す参照標準を含む。（膀胱がんまたは結腸直腸がんなどの）がんを有するまたはがんを有するリスクのある被験者の診断、予後またはリスク分類を提供するための方法を実施するためのキットにおいて、キットは、少なくとも１つの試薬であって、生物学的サンプル中の少なくとも１つの追加のバイオマーカーに特異的に結合することができ、生物学的サンプル中の少なくとも１つの追加のバイオマーカーの濃度の定量化を可能とする上記試薬、および生物学的サンプル中の上記少なくとも１つの追加のがんのバイオマーカーの参照濃度を示す参照標準をさらに含んでよい。任意の上記キットにおいて、ラミニンガンマ−２モノマーに特異的に結合することのできる少なくとも１つの試薬は、ラミニンガンマ−２モノマーに特異的に結合することのできる少なくとも１つの抗体を含んでよい。いくつかの実施形態において、キットは、ＥＬＩＳＡアッセイとともに使用するのに適している。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】多様な検体（膀胱がん、膵臓がん、卵巣がん、結腸がん、胃がん、食道がん；および対照サンプル）中のラミニンガンマ−２モノマーの血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。図１Ａおよび１Ｂは同じデータを示し、１Ｂは０ｐｇ／ｍＬから２０００ｐｇ／ｍＬの濃度範囲にわたってｙ軸を拡大している。平均濃度（実線）および１標準偏差（破線）が示される。
【図１Ｂ】多様な検体（膀胱がん、膵臓がん、卵巣がん、結腸がん、胃がん、食道がん；および対照サンプル）中のラミニンガンマ−２モノマーの血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。図１Ａおよび１Ｂは同じデータを示し、１Ｂは０ｐｇ／ｍＬから２０００ｐｇ／ｍＬの濃度範囲にわたってｙ軸を拡大している。平均濃度（実線）および１標準偏差（破線）が示される。
【図２Ａ】バイオマーカー、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）およびラミニンγ−２モノマー（ラミニンγ−２）の受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットである。図２Ａは、膀胱がん中のバイオマーカーを示す。
【図２Ｂ】バイオマーカー、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）およびラミニンγ−２モノマー（ラミニンγ−２）の受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットである。図２Ｂは、結腸直腸がん中のバイオマーカーを示す。
【図３】モノクローナル抗体Ｄ４Ｂ５および２Ｈ２（各１μｇ／ｍＬ）についてのウエスタンブロット分析の結果を示す。データは、モノクローナル抗体２Ｈ２が、ラミニンガンマ−２モノマーに特異的に結合し、それがラミニン５複合体を形成する場合には、ラミニンガンマ−２モノマーに結合しないことを示す。
【図４】２Ｈ２モノクローナル抗体およびラミニンガンマ−２モノマー（「ｇ−２」）の多様な希釈物および正常検体（ＡＢＳ００１）からのアッセイマトリックスを用いる希釈検定実験からのデータセットのグラフ表示である。
【図５Ａ】ラミニンガンマ−２モノマーＥＬＩＳＡを図示する。図５Ａは、本明細書に記載の実施形態において使用される一般的なＥＬＩＳＡアッセイの概略図を示す。
【図５Ｂ】ラミニンガンマ−２モノマーＥＬＩＳＡを図示する。図５Ｂは、０−４，０００ｐｇ／ｍＬの濃度範囲の間のラミニンガンマ−２モノマーのＥＬＩＳＡ標準曲線を示す。分析感度は、３．７ｐｇ／ｍＬであると決定された。
【図６】組換えラミニンガンマ−２モノマーを添加したサンプル希釈物を用いるＡＲＣＨＩＴＥＣＴアッセイの分析感度を図示する。
【図７】正常検体を用いた希釈直線性のさらなる評価の結果を図示する。
【図８】正常検体におけるラミニンガンマ−２モノマーレベルの測定を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
本開示は、いくつかの予期しない新事実および知見に基づく。１つの一般的意味において、本開示は、例えば膀胱がんおよび結腸直腸がんなどの一定のがんの診断、予後およびリスク分類のためのバイオマーカーとしてのラミニンガンマ２モノマーの使用に関する。別の一般的意味において、本開示は、（全血、血漿または血清などの）血液を含む生物学的サンプル中のラミニンガンマ２モノマーの検出を提供する方法、アッセイおよびキットの驚くべき開発に関する。総合すれば、これらの予期しない知見は、ラミニンガンマ−２モノマーならびにそのフラグメントの一般的な測定および定量化のための既存の方法およびアッセイよりも顕著に優れた方法およびアッセイを提供する。したがって、本開示は、膀胱がんおよび結腸直腸がんを含む一定のがんを有する患者における増大した（すなわち、より高い）ラミニンガンマ２モノマーの血清レベルの間に新規な関連性を認める（例えば、がんを有する被験者、がんを発病するリスクの増大した被験者、被験者をがん治療法の候補者として同定すること）。いくつかの非限定的な実施形態の例証を通じて本明細書に全体として開示されるとおり、血液を含む生物学的サンプル中の増大したラミニンガンマ２モノマーの濃度またはレベルは、がん（例えば、結腸直腸がんおよび／または膀胱がん）と関連し得る。増大したラミニンガンマ２モノマーの血液レベルとがんの間の関連は、がんにおける病期、疾患発症、臨床的進行および／または疾患重症度を強力に予測する。（患者の尿排出量に基づくラミニンガンマ−２モノマーの測定および／またはそのＥＧＦ様フラグメントへのラミニンガンマ−２モノマーのタンパク質分解性プロセシングに依存するものなどの）既存の方法およびアッセイとは対照的に、本明細書に提供される方法およびアッセイの実施形態は、任意の被験者から容易に得られることのできる単純で簡便なステップを含む。したがって、血液中のラミニンガンマ２モノマーの評価レベルは、がんを診断するため、がん治療またはがんの重症度の予後を提供するためおよび／または患者のがん発病のリスクを層化もしくは識別するために使用される現行の方法およびアッセイを改善することができ、それによって、がんを有するまたはがんを発病するリスクのある患者に顕著に利益を与える。さらに、ラミニンガンマ２モノマーと追加のバイオマーカーの併用は、さらなる利益を提供することができる。
【００２２】
したがって、本開示は、臨床的バイオマーカーとしてラミニンガンマ２モノマーを用いて、膀胱がんまたは結腸直腸がんなどのがんを有するまたは有するリスクのある被験者または被験者群の診断、予後またはリスク分類／識別を提供する方法を提供する。膀胱がんまたは結腸直腸がんの処置などのがん治療レジメンのための候補被験者または候補被験者群の同定方法も提供され、方法は、バイオマーカーとしてラミニンガンマ２モノマーを利用する。本開示は、開示された方法を実施するためのキットも提供する。
【００２３】
この項および本明細書の開示全体において使用される項見出しは、単に組織化の目的のためであり、限定的であることを意図されない。
【００２４】
Ａ．定義
本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上、別段の明らかな指示がない限り、複数の指示対象を含む。本明細書中の数値範囲の説明に関して、同じ精度を有するその間の数字が明示的に考慮される。例えば、範囲６〜９に関して、数値７および８が、６および９に加えて考慮され、範囲６．０〜７．０に関して、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９および７．０が明示的に考慮される。
【００２５】
別段の記載がない限り、「または」の使用は「および／または」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「有する（ｈａｓ）」および「有する（ｈａｖｅ）」などのこれらの用語の他の形態の使用は限定的なものでない。
【００２６】
「構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」、「構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）」または「少なくとも１つの構成要素」は、一般に、本明細書に記載の方法および本分野で知られた他の方法による、患者の尿、血液、血清または血漿サンプルなどの試験サンプルのアッセイのためのキットに含まれ得る、捕捉抗体、検出またはコンジュゲート  較正物質、対照、感度パネル、容器、バッファー、希釈剤、塩、酵素、酵素の補因子、検出試薬、前処理試薬／溶液、（例えば、溶液としての）基質、停止溶液などをさす。いくつかの構成要素は、アッセイにおける使用のために溶液中にあることができるまたは再構成のために凍結乾燥されることができる。
【００２７】
組成物に言及するときに本明細書中で使用される「対照」は、着目の分析物、例えば、ラミニンガンマ２モノマー（ラミニンガンマ２モノマーもしくはラミニンガンマ２モノマーの変異体もしくはそれらの組合せ）を含まない（「陰性」）；または着目の分析物、例えば、ラミニンガンマ２モノマー（例えば、ヒトラミニンガンマ２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体もしくはそれらの組合せ）を含む（「陽性対照」）ことが知られた組成物をさすことができる。陽性対照は、既知濃度のラミニンガンマ２モノマーを含むことができる。「対照」、「陽性対照」および「較正物質」は、既知濃度のラミニンガンマ２モノマーを含む組成物をさすために、本明細書中で交換可能に使用され得る。「陽性対照」は、アッセイ性能特性を確立するために使用可能であり、（分析物などの）試薬の一貫性の有用な指示薬である。「正常対照者」または「健康対照者」は、被験者から採取されたサンプルもしくは検体またはがんを有さないもしくはがんを発病するリスクのない実際の被験者をさすことができる。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「ラミニンガンマ−２モノマー」、「ラミニン−５ガンマ−２モノマー」、「ＬＮ−５ガンマ−２モノマー」、「ガンマ−２モノマー」、「ガンマ−２」、「ｇ−２モノマー」または単語「ガンマ」または文字「ｇ」の代わりに記号「γ」を有する任意の上記用語は、すべて交換可能であり、（他の類義語のなかでも「カリニン」および「ナイセイン」としても知られる）ラミニン−５を構成し、（ガンマ−１種ではなく）ガンマ−２分子種の（アルファ（α）およびベータ（β）鎖ではなく）ガンマ（γ）鎖として同定されるポリペプチド鎖の１つをさす。いくつかの実施形態において、ラミニンガンマ−２モノマーは、（タンパク質、ポリペプチド、（前駆体もしくは成熟）ペプチド、融合体、誘導体、変異体などのアミノ酸配列またはそのようなアミノ酸配列をコードする（ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメント、切断体、融合体、誘導体、ＳＮＰ、変異体などの）核酸配列を含む任意のラミニンガンマ−２モノマー配列に関連することができる。ラミニンガンマ−２モノマーは、任意の生物に由来することができ、いくつかの実施形態においては、哺乳動物を含む高等真核生物由来のアミノ酸配列を含む。いくつかの非限定的実施形態において、ラミニンガンマ−２モノマーは、（アイソフォームａおよびｂ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｑ１３７５３；ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００５５５３．２を含む）ヒト、マウス（ハツカネズミ（Ｍ．ムスキュルス（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｅ９Ｑ７Ｇ３；ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０３２５１１．３）、ラット（Ｒ．ノーベギクス（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿００１０９４１１０（前駆体タンパク質）；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬ：Ｆ１ＬＲＨ４）およびニワトリ（Ｇ．ガルス（Ｇ．ｇａｌｌｕｓ）、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＳ９２１９７：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬ  Ｑ６ＰＶＺ６（部分配列））ならびにハエおよび線虫のうちのいずれかから選ばれることができる。
【００２９】
いくつかの実施形態において、ラミニンガンマ−２モノマーは、（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００５５６２（ｍＲＮＡ）によりコードされるもしくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｑ１３７５３に関連するアミノ酸配列である）ヒトラミニン−５ガンマ−２モノマーを含む。ヒトにおいて、ラミニンガンマ−２モノマー（または「ＬＡＭＣ２」）遺伝子は、１番染色体のｑアーム上に位置する（１ｑ２５．３）。ヒトラミニンガンマ−２モノマー配列は、切断されて成熟した分泌タンパク質（アミノ酸２２−１１９３）を生成する（通常、アミノ酸１−２１である）シグナルペプチドを含む前駆体タンパク質配列を含むことができる。ラミニンガンマ−２モノマーは、任意の融合タンパク質ならびに任意のアミノ酸配列変異体も含むことができる。上記のように、ラミニンガンマ−２モノマーは、大部分が基底層および基底膜に局在するラミニン５に特有である。
【００３０】
本明細書中で使用される「標識」および「検出可能な標識」は、抗体または分析物に結合されて、抗体と分析物との間の反応を検出可能とする部分をさし、そうして標識化された抗体または分析物は、「検出可能に標識化された」と称される。標識は、視覚または機器的手段によって検出可能なシグナルを生成することができる。多様な標識は、クロモゲン、蛍光化合物、化学発光化合物、放射活性化合物などのシグナル生成物質を含む。標識の代表例は、アクリジニウム化合物などの光を生成する部分およびフルオレッセインなどの蛍光を生成する部分を含む。他の標識は本明細書に記載される。この点で、上記部分自体は検出可能であることができないが、さらなる別の部分との反応に際して検出可能となり得る。用語「検出可能に標識化された」の使用は、そのような標識化を包含することを意図される。
【００３１】
本分野で知られた任意の好ましい検出可能な標識が使用可能である。例えば、検出可能な標識は、（３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐおよび３３Ｐなどの）放射活性標識、（ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリペルオキシダーゼ、グルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼなどの）酵素標識、（アクリジニウムエステル、チオエステルまたはスルホンアミド；ルミノール、イソルミノール、フェナントリジニウムエステルなどの）化学発光標識、（フルオレッセイン（例えば、５−フルオレッセイン、６−カルボキシフルオレッセイン、３’６−カルボキシフルオレッセイン、５（６）−カルボキシフルオレッセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレッセイン、６−テトラクロロフルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアネートなどの）蛍光標識、ローダミン、フィコビリタンパク質、Ｒ−フィコエリトリン、量子ドット（例えば、硫化亜鉛でキャップされたカドミウムセレニド）、サーモメトリック標識または免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識であることができる。標識、標識化手順および標識の検出への序論は、ＰｏｌａｋおよびＶａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９９７）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎにより出版されたハンドブックとカタログが統合されたＨａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）中に見られる。蛍光標識は、ＦＰＩＡにおいて使用可能である（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５９３，８９６号、同第５，５７３，９０４号、同第５，４９６，９２５号、同第５，３５９，０９３号および同第５，３５２，８０３号を参照のこと。）。アクリジニウム化合物は、均一系化学発光アッセイにおいて検出可能な標識として使用可能である（例えば、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１６：１３２４−１３２８頁（２００６）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：２３１３−２３１７頁（２００４）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：３９１７−３９２１頁（２００４）；およびＡｄａｍｃｚｙｋら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．５：３７７９−３７８２頁（２００３）を参照のこと。）。
【００３２】
一態様において、アクリジニウム化合物は、アクリジニウム−９−カルボキサミドである。アクリジニウム−９−カルボキサミドの調製方法は、（それぞれ、これに関する教示のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．６：１０７−１１４頁（１９９１）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：５６３６−５６３９頁（１９９８）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５５：１０８９９−１０９１４頁（１９９９）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１：７７９−７８１頁（１９９９）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１１：７１４−７２４頁（２０００）；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙら、Ｉｎ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｄｙｋｅ，Ｋ．Ｖ．編；ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、７７−１０５頁（２００２）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．５：３７７９−３７８２頁（２００３）；および米国特許第５，４６８，６４６号、同第５，５４３，５２４号および同第５，７８３，６９９号に記載されている。
【００３３】
アクリジニウム化合物の別の例は、アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルである。式ＩＩのアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルの例は、（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩから入手可能な）１０−メチル−９−（フェノキシカルボニル）アクリジニウムフルオロスルホネートである。アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルの調製方法は、（それぞれ、これに関するその教示のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）ＭｃＣａｐｒａら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．４：１１１１−２１頁（１９６５）；Ｒａｚａｖｉら、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １５：２４５−２４９頁（２０００）；Ｒａｚａｖｉら、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １５：２３９−２４４頁（２０００）；および米国特許第５，２４１，０７０号に記載されている。そのようなアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルは、シグナルの強度および／またはシグナルの迅速性に関して、少なくとも１つのオキシダーゼによる分析物の酸化において生成される過酸化水素のための効率的な化学発光指示薬である。アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルのための化学発光による発光の経過は、迅速に、すなわち、１秒足らずで完了するが、アクリジニウム−９−カルボキサミドの化学発光による発光は２秒に及ぶ。しかしながら、アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルは、タンパク質の存在下でその化学発光特性を失う。したがって、その使用においてシグナル生成および検出の間にタンパク質が存在しないことが好適である。サンプル中のタンパク質の分離または除去方法は、本分野の当業者に周知であり、限外濾過、抽出、沈殿、透析、クロマトグラフィーおよび／または消化を含むが、これらに限定されない（例えば、Ｗｅｌｌｓ、Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（２００３）を参照のこと。）。試験サンプルから除去されるまたは分離されるタンパク質の量は、約４０％、約４５％，約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％もしくは約９５％または少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％もしくは少なくとも約９５％であることができる。アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルに関するさらなる詳細およびその使用は、２００７年４月９日に出願された米国特許出願第１１／６９７，８３５号に示されている。アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルは、脱気した無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはコール酸ナトリウム水溶液などの任意の好適な溶媒に溶解可能である。
【００３４】
「所定のカットオフ」および「所定のレベル」は、一般に、アッセイ結果を該所定のカットオフ／レベルと比較することによって、診断、予後または治療の有効性を評価するために使用されるアッセイカットオフ値をさし、該所定のカットオフ／レベルはすでに多様な臨床パラメータ（例えば、疾患の存在、病期、疾患重症度、疾患の進行、非進行または改善）に関連づけられているまたは関係づけられている。本開示は、代表的な所定のレベルを提供する。しかしながら、カットオフ値が（例えば、使用される抗体、反応条件、サンプル純度などの）イムノアッセイの性質によって変化し得ることは周知である。さらに、本開示によって提供される記載に基づいて、他のイムノアッセイのためのイムノアッセイ特異的なカットオフ値を得るために、本明細書の開示をこれらの他のイムノアッセイに適合させることは、十分に本分野の当業者の能力の範囲内にある。所定のカットオフ／レベルの正確な値はアッセイ間で変動し得るが、本明細書に記載の相関関係は一般に適用可能でなくてはならない。
【００３５】
本明細書に記載の診断または予後アッセイにおいて使用される溶解、沈殿および／または可溶化試薬などの「前処理試薬」は、任意の細胞を溶解するおよび／または試験サンプル中に存在する任意の分析物を可溶化するものである。本明細書においてさらに記載されるとおり、前処理はすべての細胞のために必要なわけではない。中でも、（ラミニンガンマ−２モノマーなどの）分析物を可溶化することは、血液サンプルなどのサンプル中に存在する任意の内因性結合タンパク質からの分析物の放出（例えば、結合の解離または減少）を伴う。前処理試薬は、（分離ステップを必要としない）均一なまたは（分離ステップを必要とする）不均一なものであってよい。不均一な前処理試薬の使用により、アッセイの次のステップに進む前に、任意の沈殿した分析物結合タンパク質が試験サンプルから除去される。前処理試薬は、場合によって：（ａ）１つ以上の溶媒および塩、（ｂ）１つ以上の溶媒、塩および界面活性剤、（ｃ）界面活性剤、（ｄ）界面活性剤および塩または（ｅ）細胞溶解および／または分析物の可溶化に適した任意の試薬もしくは試薬の組合せを含むことができる。
【００３６】
本明細書に記載のイムノアッセイおよびキットとの関連で「品質管理試薬」は、較正物質、対照および感度パネルを含むがこれらに限定されない。（例えば、複数などの１つ以上の）「較正物質」または「標準物質」は、典型的に、抗体または分析物などの分析物の濃度の内挿のための較正（標準）曲線を確立するために使用される。あるいはまた、所定の陽性／陰性カットオフに近い単一の較正物質が使用可能である。複数の較正物質（すなわち、１つを超える較正物質または可変量の較正物質）を、「感度パネル」を構成するために一緒に使用することができる。
【００３７】
「サンプル」、「試験サンプル」、「検体」、「被験者からのサンプル」および「患者サンプル」は、本明細書において交換可能に使用され得る。血液、組織、尿、血清、血漿、羊水、脳脊髄液、胎盤細胞もしくは組織、内皮細胞、白血球もしくは単球のサンプルなどのサンプルが、患者から得られて直接使用可能である、または本明細書で検討された何らかの方法もしくは本分野で知られた他の方法でサンプルの特性を改変するために、ろ過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、妨害成分の不活性化、試薬の添加などにより前処理されることが可能である。
【００３８】
「一連の較正組成物」は、既知濃度のラミニンガンマ−２モノマーを含む複数の組成物をさし、各組成物は、ラミニンガンマ−２モノマーの濃度によって上記一連の組成物の中の他の組成物と異なる。
【００３９】
「特異的結合パートナー」は、特異的結合対のメンバーをさす。特異的結合対は、２つの異なる分子を含み、これらは、化学的または物理的手段によって相互に特異的に結合する。したがって、一般的なイムノアッセイの抗原および抗体の特異的結合対に加えて、他の特異的結合対は、ビオチンおよびアビジン（またはストレプトアビジン）、炭化水素およびレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターおよびレセプター分子、補因子および酵素、酵素および酵素阻害剤などを含むことができる。さらに、特異的結合対は、元の特異的結合メンバーの類似体であるメンバー、例えば、分析物−類似体を含み得る。免疫反応性の特異的結合メンバーは、抗原、抗原フラグメントおよび抗体を含み、抗体は、単離されたか組換え生産されたかにかかわらないモノクローナルおよびポリクローナル抗体ならびにそれらの複合体およびフラグメントを含む。
【００４０】
本明細書中で使用される「トレーサー」は、フルオレッセイン部分にコンジュゲーションされたラミニンガンマ−２モノマーなどの、標識にコンジュゲーションされた分析物または分析物フラグメントをさし、標識にコンジュゲーションされた分析物は、抗体上の分析物に特異的な部位に関して分析物と効果的に競合することができる。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「がん」は、未制御の細胞増殖、成長、浸潤および転移または（血管新生性、新生物性もしくは腫瘍原性の細胞増殖などの）腫瘤に関連した任意の悪性疾患をさす。いくつかの実施形態において、がんは、膀胱がんまたは結腸直腸がんを含むことができる。
【００４２】
典型的に、膀胱がんは（移行細胞と呼ばれる）膀胱を裏打ちする細胞に由来し、腫瘍の成長のしかたに基づいて分類される。乳頭腫瘍は、外見がこぶ様であり、柄に結合している。非乳頭（固着）腫瘍は、はるかに一般的でないが、より浸潤性であり、典型的により悪い転帰に関連する。喫煙、化学物質への曝露、長期の膀胱感染症ならびに化学療法薬シクロホスファミドおよび放射線治療を含む多くのリスク因子が、膀胱がんを発病する可能性の増大と関連する。
【００４３】
膀胱がんは通常、腹痛、血尿、骨痛、疲労、排尿痛、頻尿および／または尿しぶり、失禁ならびに体重減少を含み得る多数の症状に関連する。膀胱がんを検出するための既存の検査は、腹部ＣＴスキャン、骨盤ＣＴスキャン、膀胱生検、膀胱鏡検査、経静脈腎盂造影、検尿および尿細胞診を含む。膀胱がんは、典型的に、０とＩＶの間のステージで段階的にランク付けされ、ステージ０は、膀胱内膜内のみにある非浸潤性の腫瘍を含み；ステージＩは、膀胱内膜を貫く、膀胱の筋層には達していない穿通を含み；ステージＩＩは、筋層に達する腫瘍を含み；ステージＩＩＩは、筋肉を貫く膀胱周囲の組織へ穿通する腫瘍を含み；およびステージＩＶは、（隣接するリンパ節または遠隔部位などへの）転移性疾患を含む。膀胱がんが広がると、前立腺、直腸、尿管、子宮および膣を含む器官および組織に最初に見られることが多い。転移性膀胱がんは、しばしば、骨、肝臓および／または肺を含む。
【００４４】
処置は、典型的に、疾患の多様なステージに基づき、ステージ０およびＩの疾患のための処置は、特異的に膀胱に対する化学療法および／または免疫療法を伴う（局所的な部分切除などの）腫瘍を除去するための手術を含む。ステージＩＩおよびＩＩＩにおいて、治療法は、膀胱の部分的もしくは全体的な除去、その後の放射線および化学療法、手術前に腫瘍の退縮を試みるための術前化学療法、または手術の適格性のない患者のための放射線および化学療法の組合せを含み得る。ステージＩＶにおいて、膀胱がんは、典型的に末期とみなされ、治療方針は典型的に化学療法を含む。
【００４５】
ステージ０またはＩの膀胱がん患者は、予後がかなり良好である。がんが再発するリスクが高い一方、再発する膀胱がんのほとんどは、手術により除去され、治癒することが可能である。ステージＩＩＩの腫瘍を有する人々の治癒率は、５０％未満である。ステージＩＶの膀胱がんは、めったに治癒しない。
【００４６】
いくつかの実施態様において、がんは結腸直腸（または結腸）がんを含むことができ、これは、典型的に、大腸（結腸）または直腸（結腸の末端）に由来するがん腫である。米国において、結腸直腸がんは、がん関連死の主要原因の一つとして挙げられることが多い。早期診断は、しばしば、疾患の完治と関連する。結腸がんには単一の原因はない一方、ほとんどすべての結腸がんは、最初に良性でゆっくりと悪性のがんになるポリープから始まる。結腸直腸がんに関連するリスク因子は、年齢（６０歳超）、喫煙、アルコール消費、赤肉および／または加工肉に富む食事、結腸直腸ポリープ、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎またはクローン病）、結腸直腸がんの家族歴、リンチ症候群を含む遺伝的素質および家族性腺腫様ポリープ（ＦＡＰ）を含む。
【００４７】
多くの場合、結腸直腸がんは症状を示さない可能性がある。しかしながら、ある場合には、腹痛および圧痛、血便、下痢、便秘、細い便ならびに未解明の体重減少も示す。上記のとおり、結腸直腸がんの早期検出は、優れた予後（治癒）をもたらすことが多い。結腸直腸がんの既存の検査およびスクリーニングは、腹部の身体的検査、便潜血反応検査（ＦＯＢＴ）、結腸内視鏡検査、Ｓ状結腸鏡検査および貧血と適切な肝機能に関する血液検査を含む。結腸がんの多様なステージ（０−ＩＶ）は、典型的に以下のように特徴づけられる：ステージ０、小腸の最も内側の層におけるがん；ステージＩ、結腸の数個の内部層中のがん；ステージＩＩ、がんは結腸の筋肉壁まで広がっている；ステージＩＩＩ、がんはリンパ節まで広がっている；ステージＩＶ、がんは他の器官まで広がっている。
【００４８】
結腸直腸がんの処置は、（結腸切除などの）手術、化学療法および放射線療法のいずれか１つまたはその組合せを含むことができ、それは、典型的に疾患のステージに依存する。典型的に、結腸直腸がんが検出され、（ステージ０−ＩＩＩなどの）早期に処置される患者は、診断後５年間生存可能で、疾患が治癒したとみなされることができる。ステージＩＶの結腸直腸がんは、典型的に治癒可能であると考えられる。
【００４９】
がんの診断は、典型的に、上記の任意の１つ以上の臨床検査または診断検査によって行われ、身体的検査、画像検査、放射線写真（Ｘ線）および本明細書に記載のまたは本分野で知られた実験室診断のうちのいずれか１つまたはその組合せを含み得る。がん胎児性抗原（ＣＥＡ）および炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）を含む数種のバイオマーカーが、結腸直腸がんの診断において使用される。
【００５０】
ＣＥＡは、細胞接着に関与する糖タンパク質であり、通常は胚発生の間に産生され、誕生前に停止する。ＣＥＡは、最初にヒト結腸がん抽出物からの組織抽出物中で検出され、増大した血清中レベルは、結腸直腸がん腫ならびに消化器官、膵臓、肺、乳房および髄様甲状腺のがん腫に伴っている。ＣＥＡの正常レベルは約２．５ｎｇ／ｍＬである。それにもかかわらず、ＣＥＡマーカーは、がんを診断するためにまたはがんの早期検出のためのスクリーニング検査として完全に信頼できるものではない。
【００５１】
ＣＡ１９−９は、結腸および膵臓がんのマーカーとして関係付けられ、同定された一方、偽陰性結果および偽陽性結果の両方の高い発生率と関連づけられてきた。さらに、ルイス抗原を有さない患者においては、該患者が腫瘍に罹患している場合にさえ、ＣＡ１９−９は発現されない。それにもかかわらず、ＣＡ１９−９が結腸直腸がん、食道がんおよび肝細胞がん腫などの多くの種類の胃腸がんにおいて上昇し得るため、（結腸直腸がんなどの）がんバイオマーカーとして使用される。
【００５２】
したがって、ＣＥＡおよびＣＡ１９−９はどちらも一定の種類のがんと関連しており、（膀胱がんまたは結腸直腸がんなどの）疾患を診断するためのバイオマーカーとして使用される。しかしながら、これらのマーカーは、望ましい感度を有さず、患者におけるがんの正確なおよび／または早期の診断に必要とされる感度および特異性を有さない。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語、（患者などの）被験者の「リスク評価」、「リスク分類」、「リスク識別」または「リスク層化」は、被験者に関する治療決定がさらに多くの情報に基づいて行われ得るように、疾患の発症または疾患の進行を含む将来のイベントの発生リスクを予知するためのバイオマーカーを含む因子の評価をさす。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語、被験者の「がんリスク」または「がんを発病するリスク」は、増大したがん発症の確率、がんの進行およびがんに伴う臨床症状の発生／重症度を含む、がんを発病するリスクを予測するためのバイオマーカーを含む因子の評価をさす。ラミニンガンマ−２モノマーレベルに加えて、疾患の予後不良を示し得る他の因子は、腫瘍サイズ、病期、ＣＡ１９−９および／またはＣＥＡの血清濃度、がんの家族歴および／または個人歴、ならびに任意の主症状の増大した臨床的重症度を含む。したがって、いくつかの実施形態において、上記方法は、患者からのサンプル中のラミニンガンマ−２モノマーのレベルを、本明細書に記載のまたは本分野で知られた任意の１つ以上の予後因子とともに検出／決定することを含む、がんの発症またはがんの進行の予後を提供することに関する。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、用語「特異的結合」または「特異的に結合すること」は、抗体、タンパク質またはペプチドと第２の化学種の相互作用をさし、該相互作用は、該化学種上の特別な構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存し；例えば、抗体は、一般的にタンパク質にではなく、特定のタンパク質構造を認識してそれに結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、標識化された「Ａ」および抗体を含有する反応中のエピトープＡ（または遊離の標識化されないＡ）を含む分子の存在は、抗体に結合された標識化されたＡの量を減少させる。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、イムノグロブリン分子またはその免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原結合部分をさす。イムノグロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、ペプシンなどの酵素で抗体を処理することによって作製可能なＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられる。本開示において使用可能な抗体の例としては、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、組換え抗体、一本鎖Ｆｖｓ（「ｓｃＦｖ」）、親和性成熟抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド連結Ｆｖｓ（「ｓｄＦｖ」）および抗イディオタイプ（「抗−Ｉｄ」）抗体および上記のいずれかの機能活性エピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、用語「被験者」および「患者」は、該被験者が任意の形態の処置を受けていたか現在受けているかにかかわらず、交換可能に使用される。本明細書中で使用される場合、用語「被験者」は、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザル、チンパンジーなどのサル）およびヒト）を含むが、これらに限定されない任意の脊椎動物を指すことができる。いくつかの実施形態において、被験者はヒトまたは非ヒトであってよい。いくつかの実施形態において、被験者は、膀胱がんまたは結腸直腸がんなどのがんを発病するリスクのあるまたは既に有するヒト患者であってよい。
【００５８】
本明細書中で使用される用語「サンプル」および「生物学的サンプル」は、一般に、ラミニンガンマ−２モノマーなどの着目の分析物を含有することに関して試験されるおよび／または含有することが疑われる生物学的材料をさす。サンプルは、被験者から採取されたまたは由来する任意の組織サンプルであってよい。いくつかの実施形態において、被験者からのサンプルはタンパク質を含んでよい。いくつかの実施形態において、被験者からのサンプルは（ポリヌクレオチド、ｍＲＮＡなどの）核酸を含んでよい。
【００５９】
サンプルを得るために、任意の細胞型、組織または体液が利用されてよい。そのような細胞型、組織および体液は、生検および剖検サンプルなどの組織の切片、組織学の目的のために採取された凍結切片、（全血などの）血液、血漿、血清、痰、便、涙、粘液、唾液、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液、毛、皮膚、赤血球、血小板、間質液、眼球水晶体液、脳脊髄液、汗、鼻汁、滑液、帯下、羊水、精液などを含み得る。細胞型および組織は、リンパ液、腹水、婦人科学的な液体、尿、腹腔液、脳脊髄液、膣のすすぎによって集めた体液または膣洗浄によって集めた体液を含んでよい。組織または細胞型は、動物から細胞のサンプルを除去することによって提供され得るが、先に単離された（例えば、別の人から、別の時におよび／または別の目的のために単離された）細胞を用いることによって達成されることもできる。処置または転帰歴を有するものなどの保存記録用組織も使用されてよい。タンパク質またはヌクレオチドの単離および／または精製が不必要な場合もある。
【００６０】
例えば、本明細書に提供される抗体が免疫診断試薬として採用されるおよび／またはラミニンガンマ−２モノマーアッセイキットにおいて採用される場合、尿、血液、血清および血漿ならびに他の体液を収集し、取扱いおよび加工するための本分野で周知の方法が、本開示の実施において使用される。抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、薬物、酵素、受容体、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドなどの着目の分析物に加えて、試験サンプルはさらなる部分を含むことができる。例えば、サンプルは、被験者から得られた全血サンプルであることができる。試験サンプル、特に全血が本明細書に記載の免疫アッセイの前に、例えば、前処理試薬により処理されることが必要または望ましいことがある。（ほとんどの尿サンプル、あらかじめ加工された保存記録用サンプルなどの）前処理が必要でない場合でさえ、サンプルの前処理は、単に便宜上、（例えば、商業的プラットフォームのプロトコールの一部として）実施され得る選択肢である。サンプルは、被験者から得られて直接使用されてよい、またはサンプルの特性を改変するための前処理に続いて使用されてよい。前処理は、抽出、濃縮、妨害成分の不活性化および／または試薬の添加を含んでよい。
【００６１】
前処理試薬は、本明細書に記載のイムノアッセイなどのアッセイおよびキットとともに使用するのに適した任意の試薬であることができる。前処理は、場合によって：（ａ）１つ以上の（メタノールおよびエチレングリコールなどの）溶媒および塩、（ｂ）１つ以上の溶媒、塩および界面活性剤、（ｃ）界面活性剤、または（ｄ）界面活性剤および塩を含む。前処理試薬は、本分野で知られており、そのような前処理は、例えば、文献に記載の（例えば、Ｙａｔｓｃｏｆｆら、Ａｂｂｏｔｔ  ＴＤｘ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｓｓａｙ  Ｅｖａｌｕａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  ｉｎ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３６：１９６９−１９７３頁（１９９０）およびＷａｌｌｅｍａｃｑら、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  ＡｘＳＹＭ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａｓｓａｙ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＴＤｘ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ＥＭＩＴ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａｓｓａｙｓ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：４３２−４３５頁（１９９９）を参照のこと。）Ａｂｂｏｔｔ  ＴＤｘ、ＡｘＳＹＭ（登録商標）およびＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）アナライザー（Ａｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）におけるアッセイのために使用されるものおよび／または市販のものとして採用可能である。さらに、前処理は、（前処理に関するその教示のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）Ａｂｂｏｔｔの米国特許第５，１３５，８７５号、ヨーロッパ特許公開第０４７１２９３号および米国特許出願公開第２００８／００２０４０１号に記載のとおりに行われることができる。前処理試薬は、不均一な作用物質または均一な作用物質である。
【００６２】
不均一な前処理試薬の使用により、サンプル中に存在する分析物結合性タンパク質（例えば、ラミニンガンマ−２モノマーに結合可能なタンパク質）を前処理試薬が沈殿させる。そのような前処理ステップは、サンプルへの前処理剤の添加により形成された混合物の上清を、沈殿した分析物結合性タンパク質から分離することによって、任意の分析物結合性タンパク質を除去することを含む。そのようなアッセイにおいて、いかなる結合性タンパク質も含まない混合物の上清がアッセイにおいて使用され、抗体捕捉ステップへ直接進む。
【００６３】
均一な前処理試薬の使用により、そのような分離ステップはない。試験サンプルおよび前処理試薬の混合物全体が、標識化された特異的結合パートナーラミニンガンマ−２モノマーまたは標識化された抗ラミニンガンマ−２モノマーモノクローナル抗体（またはその抗原反応性フラグメント）などのラミニンガンマ−２モノマーの変異体と接触させられる。そのようなアッセイのために採用される前処理試薬は、典型的に、第１の特異的結合パートナーによる捕捉の前またはその間に前処理された試験サンプル混合物中で希釈される。そのような希釈にもかかわらず、一定量の前処理試薬（例えば、５Ｍメタノールおよび／または０．６Ｍエチレングリコール）が、捕捉の間、試験サンプル混合物中になお存在する（または残留する）。
【００６４】
本明細書中に別段の定めのない限り、本開示との関係において使用される科学的および技術的用語は、本分野の当業者により一般に理解される意味を有するものとする。例えば、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションとの関係で使用される任意の命名法およびその技術は、本分野において周知であり、よく使用されるものである。用語の意味および範囲は明確でなければならず；それでも、任意の潜在的なあいまいさがある場合には、本明細書中に提供される定義が任意の辞書または外部の定義に優先する。さらに、文脈上、別段の要求のない限り、単数形の用語は複数を包含し、複数形の用語は単数形を包含するものとする。
【００６５】
Ｂ．方法
方法は、被験者の診断または予後を提供することを包含し、がんに関して、被験者ががんを有すると決定すること、がんの重症度を決定すること、被験者のがんを発病するリスク（すなわち、疾患発症の可能性）を決定すること、がん治療レジメンの有効性を決定すること、被験者をがん治療法の候補者として同定することおよびがんを有する被験者における疾患の進行に関するリスク評価のうちの任意の１つ以上を含む。方法は、部分的に、被験者からの（血液、血清または血漿などの）生物学的サンプル中のラミニンガンマ−２モノマー濃度が、被験者における（膀胱がんまたは結腸直腸がんなどの）がんを予測できるまたは診断でき、したがって、ラミニンガンマ−２モノマーが、がんの予後または診断バイオマーカーとして使用可能であるという予期しない知見に基づく。
【００６６】
方法は、被験者からの生物学的サンプルを提供するまたは得ることを含み、サンプルは、針刺し、針生検、スワブなどを含む任意の知られた手段によって得られることができる。方法のある実施形態において、生物学的サンプルは血液サンプル、好ましくは、血漿サンプルまたは血清サンプルであり、静脈穿刺などの標準的な技術のいずれかによって得られてよい。方法において使用される生物学的サンプルは、好適な組織貯蔵条件下で貯蔵または預託されてよいまたは好適な条件下で先に貯蔵または預託されたサンプルから入手可能である。いくつかの実施形態において、方法は、被験者からの生物学的サンプルの先のアッセイまたは分析からのデータを再調査すること（例えば、ラミニンガンマ−２モノマーおよび／またはＣＥＡおよびＣＡ１９−９のうちのいずれか１つ以上などの別のバイオマーカーの測定）を含む。
【００６７】
方法は、被験者におけるラミニンガンマ−２モノマー濃度を決定することによる、がんを有するまたはがんを有することが疑われる被験者にけるがんの診断、予後および／またはリスク層化のための方法を包含する。診断の提供は、例えば、被験者におけるがんの診断を提供することであることができ、該被験者は、先に、がんを有すると診断されていない（またはがんを有するリスクがあると同定されていない）、がんを有するか否かが疑われた可能性がある。これに代えてまたは追加して、予後の提供は、例えば、がんの重症度もしくは病期を決定することであることができるまたはリスク評価、すなわち、被験者ががんを発病する可能性の決定、であることができる。方法は、がんを発病するリスクの増大した１人以上の患者または患者亜群を同定することも包含する。すべての方法が共有する特徴は、本明細書に記載の生物学的サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの濃度の決定であり、ラミニンガンマ−２モノマーの参照値に比較して増大したサンプル中のラミニンガンマ−２モノマー濃度が、がんまたはがんを発病する増大したリスクを示す。
【００６８】
ラミニンガンマ−２モノマー濃度は、参照値または所定のレベル、すなわち、本明細書に記載の参照ラミニンガンマ−２モノマー濃度値に比較して増大したとみなされる。例えば、参照濃度値として有用なラミニンガンマ−２モノマーの血清濃度は、約５００ｐｇ／ｍｌであるが、より高くてもまたは低くてもよく、例えば、血清中約２００ｐｇ／ｍｌまたは約１０００ｐｇ／ｍｌ（例えば、約２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０もしく１０００ｐｇ／ｍｌまたはそれよりも高い）であることができる。ラミニンガンマ−２モノマー濃度は、検出可能に高い（例えば、約１％から約１０％高い）または顕著に高い、例えば、少なくとも２０％高い（１．２倍）、少なくとも３０％高い（１．３倍）、少なくとも４０％高い（１．４倍）、少なくとも５０％高い（１．５倍）、少なくとも６０％高い（１．６倍）、少なくとも７０％高い（１．７倍）、少なくとも８０％高い（１．８倍）、少なくとも１００％高い（２．０倍または２倍）、少なくとも１５０％高い（２．５倍）、少なくとも２００％高い（３．０倍または３倍）場合に、参照値に比較して増大したとみなされてよい。
【００６９】
生物学的サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの存在、濃度または量は、本分野で知られた任意の好適なアッセイを用いて容易に決定され得る。例としては、サンドイッチイムノアッセイ（例えば、放射性同位体検出（ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））および酵素検出（エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）または酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（例えば、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡアッセイ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ））を含むモノクローナル−ポリクローナルサンドイッチイムノアッセイ）、競合阻害イムノアッセイ（例えば、フォワードおよびリバース）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、酵素増幅イムノアッセイ法（ＥＭＩＴ）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）および均一系化学発光アッセイなどが挙げられるが、これらに限定されない。ＳＥＬＤＩに基づくイムノアッセイにおいて、着目のラミニンガンマ−２モノマー（またはその部分）に特異的に結合する捕捉試薬が、あらかじめ活性化されたタンパク質チップアレイなどの質量分析プローブの表面に結合される。次いで、ラミニンガンマ−２モノマー（ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）がバイオチップ上に特異的に捕捉され、捕捉されたラミニンガンマ−２モノマーが質量分析によって検出される。あるいはまた、ラミニンガンマ−２モノマーは、捕捉試薬から溶出されて、伝統的なＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）によってまたはＳＥＬＤＩによって検出されることができる。化学発光微粒子イムノアッセイ、特に、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）自動アナライザー（Ａｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を採用するものは、好ましいイムノアッセイの一例である。他の方法は、例えば、質量分析および（モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、ヒトなどの）抗体またはラミニンガンマ−２モノマーに特異的に結合するそのフラグメントを用いる（組織生検からの切片によるなどの）免疫組織化学を含む。抗ラミニンガンマ−２モノマー抗体およびそれらのフラグメントは、本明細書に記載され本分野で知られた方法によって作製可能である。あるいはまた、市販の抗ラミニンガンマ−２モノマー抗体が、本明細書に記載のとおりに使用可能である。他の検出方法は、例えば、それぞれ、その全が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１４３，５７６号；同第６，１１３，８５５号；同第６，０１９，９４４号；同第５，９８５，５７９号；同第５，９４７，１２４号；同第５，９３９，２７２号；同第５，９２２，６１５号；同第５，８８５，５２７号；同第５，８５１，７７６号；同第５，８２４，７９９号；同第５，６７９，５２６号；同第５，５２５，５２４号；および同第５，４８０，７９２号中に記載されたものを含む。
【００７０】
ラミニンガンマ−２モノマーまたはその変異体またはそれらの任意の組合せは、イムノアッセイを用いて分析されてよい。ラミニンガンマ−２モノマーの存在または量は、抗体を用い、ラミニンガンマ−２モノマーへの特異的結合を検出することによって決定されることができる。所望により、本明細書に記載の抗体の１つ以上が、１つ以上の市販のモノクローナル／ポリクローナル抗体とともに使用されることができる。そのような抗体は、ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）、Ａｔｌａｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＩＭＧＥＮＥＸ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＧｅｎｅＴｅｘ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｎｔｏｎ、ＭＡ）、ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、ＭＡ）、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ（Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、Ａｂｎｏｖａ（Ｔａｉｗａｎ  ＆  Ｗａｌｎｕｔ、ＣＡ）およびＥｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ）などの会社から市販されている。
【００７１】
任意のイムノアッセイが利用されてよい。イムノアッセイは、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フォワードもしくはリバース競合阻害アッセイなどの競合阻害アッセイ、蛍光偏光イムノアッセイまたは競合結合アッセイなどであってよい。ＥＬＩＳＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡであってよい。
【００７２】
不均一系フォーマットが使用され得る。例えば、試験サンプルが被験者から得られた後、第１の混合物が調製される。該混合物は、（ラミニンガンマ−２モノマーの変異体または任意のそれらの組合せを含む）ラミニンガンマ−２モノマーに関して評価される試験サンプルおよび第１の特異的結合パートナーを含有し、該第１の特異的結合パートナーおよび試験サンプル中に含有される任意のラミニンガンマ−２モノマーが、第１の特異的結合パートナー−ラミニンガンマ−２モノマー複合体を形成する。好ましくは、第１の特異的結合パートナーは、抗ラミニンガンマ−２モノマー抗体またはそのフラグメントである。混合物を形成するために試験サンプルと第１の特異的結合パートナーが添加される順序は、重要でない。好ましくは、第１の特異的結合パートナーは固相上に固定化される。イムノアッセイにおいて（第１の特異的結合パートナーおよび場合によって、第２の特異的結合パートナーのために）使用される固相は、磁性粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、メンブレン、足場分子、フィルム、ろ紙、ディスクおよびチップなどの、しかしこれらに限定されない本分野で知られた任意の固相であってよい。
【００７３】
第１の特異的結合パートナー−ラミニンガンマ−２モノマー複合体を含有する混合物が形成された後、任意の未結合のラミニンガンマ−２モノマーが、本分野で知られた任意の技術を用いて複合体から除去される。例えば、未結合のラミニンガンマ−２モノマーは、洗浄により除去されることができる。しかしながら、好適には、試験サンプル中に存在するすべてのラミニンガンマ−２モノマーが第１の特異的結合パートナーにより結合されるように、第１の特異的結合パートナーは、試験サンプル中に存在する任意のラミニンガンマ−２モノマーよりも過剰に存在する。
【００７４】
任意の未結合のラミニンガンマ−２モノマーが除去された後、第２の特異的結合パートナーが混合物に添加されて、第１の特異的結合パートナー−ラミニンガンマ−２モノマー−第２の特異的結合パートナー複合体を形成する。第２の特異的結合パートナーは、好ましくは、第１の特異的結合パートナーにより結合されるラミニンガンマ−２モノマー上のエピトープとは異なる、ラミニンガンマ−２モノマー上のエピトープに結合する坑ラミニンガンマ−２モノマー抗体である。さらに、第２の特異的結合パートナーは、上記の検出可能な標識で標識化されるまたはそれを含有することも好ましい。
【００７５】
上記のとおり、固定化された抗体またはそのフラグメントの使用がイムノアッセイに組み込まれてよい。抗体は、磁性またはクロマトグラフィー用のマトリックス粒子、（マイクロタイターウエルなどの）アッセイプレートの表面、固体基材材料片などの多様な支持体上に固定化されてよい。アッセイストリップは、固体支持体上の整列した抗体または複数の抗体をコーティングすることによって調製可能である。次いで、このストリップは生物学的試験サンプル中に浸され、洗浄および検出ステップを介して素早く処理されて、着色されたスポットなどの測定可能なシグナルを生じる。
【００７６】
サンドイッチＥＬＩＳＡは、２層の抗体（すなわち、捕捉抗体（すなわち、少なくとも１つの捕捉抗体））および検出抗体（すなわち、少なくとも１つの検出抗体））の間の抗原の量を測定する。捕捉抗体および検出抗体は、ラミニンガンマ−２モノマーなどの抗原上の異なるエピトープに結合する。望ましくは、エピトープへの捕捉抗体の結合は、検出抗体のエピトープへの結合を妨害しない。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかが、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて捕捉および検出抗体として使用されてよい。
【００７７】
一般に、試験サンプル中の（ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せを含めた）ラミニンガンマ−２モノマーを分離し、定量化するために、少なくとも２つの抗体が採用される。より具体的には、少なくとも２つの抗体は、ラミニンガンマ−２モノマーまたはラミニンガンマ−２モノマーの一部の一定のエピトープに結合し、「サンドイッチ」と呼ばれる免疫複合体を形成する。１つ以上の抗体が、試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマーまたはラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）を捕捉するために使用されることができ（これらの抗体は、しばしば、「捕捉」抗体（と呼ばれる。）、１つ以上の抗体が、検出可能な（すなわち、定量化可能な）標識をサンドイッチに結合するために使用される（これらの抗体は、しばしば、「検出」抗体と呼ばれる。）。サンドイッチアッセイにおいて、抗体のそのエピトープへの結合は、アッセイ中のいかなる他の抗体のそれぞれのエピトープへの結合によっても減少させられないことが望ましい。言い換えれば、抗体は、ラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマーまたはラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）を含有するまたは含有することが疑われる試験サンプルと接触させられた１つ以上の第１の抗体が、第２のまたは続く抗体により認識されるエピトープの全体または一部に結合せず、それによって１つ以上の第２の検出抗体がラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）に結合する能力を妨害しないように、選択される。
【００７８】
抗体は、上記イムノアッセイにおいて第１の抗体として使用されてよい。好ましくは、抗体は、４．２×１０−１１Ｍから７．４×１０−１３ＭのＫＤを有する、ラミニンガンマ−２モノマーの少なくとも３つの連続したアミノ酸を含むエピトープに免疫特異的に結合する。イムノアッセイは、ラミニンガンマ−２モノマーの少なくとも３つの連続したアミノ酸を含むエピトープに免疫特異的に結合する第２の抗体を含んでよく、第２の抗体が結合する上記３つの連続したアミノ酸は、第１の抗体が結合する３つの連続したアミノ酸とは異なる。いくつかの実施形態において、抗体は、ラミニン−５よりもまたはラミニンガンマ−２モノマーのフラグメント（例えば、ラミニンガンマ−２モノマーのＥＧＦ様フラグメント）よりも、ラミニンガンマ−２モノマーに優先的に結合することができる。
【００７９】
ある実施形態において、ラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマーもしくはラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）を含有することが疑われる試験サンプルは、少なくとも１つの捕捉抗体および少なくとも１つの検出抗体と同時にまたは連続して接触させられることができる。サンドイッチアッセイフォーマットにおいて、ラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマーまたはラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）を含有することが疑われる試験サンプルは、最初に、抗体−ラミニンガンマ−２モノマー複合体の形成を可能とする条件下で特定のエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの捕捉抗体と接触させられる。１つを超える捕捉抗体が使用される場合、複数の捕捉抗体−ラミニンガンマ−２モノマー複合体が形成される。サンドイッチアッセイにおいて、抗体、好ましくは、少なくとも１つの捕捉抗体は、試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーまたはラミニンガンマ−２モノマーの変異体の予測される最大量のモル過剰量で使用される。例えば、微粒子コーティングバッファー１ｍＬあたりから約５μｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬの抗体が使用されてよい。
【００８０】
場合によって、試験サンプルを少なくとも１つの第１の捕捉抗体と接触させる前に、該少なくとも１つの捕捉抗体は、試験サンプルからの抗体−ラミニンガンマ−２モノマー複合体の分離を容易にする固体支持体に結合されることができる。ウエル、管またはビーズの形態のポリマー材料から作られた固体支持体を含むがこれらに限定されない、本分野で知られた任意の固体支持体が使用可能である。抗体は、抗体がラミニンガンマ−２モノマーまたはラミニンガンマ−２モノマー変異体を結合する能力をそのような結合が妨害しない限り、吸着により、化学カップリング剤を用いる共有結合により、または本分野で知られた他の手段により固体支持体に結合されることができる。さらに、必要に応じて、固体支持体は、抗体上の多様な官能基との反応性を可能とするために誘導体化されることができる。そのような誘導体化は、無水マレイン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどの、しかしこれらに限定されない、一定のカップリング剤の使用を必要とする。
【００８１】
ラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）を含有することが疑われる試験サンプルが少なくとも１つの捕捉抗体と接触させられた後、試験サンプルは、捕捉抗体−ラミニンガンマ−２モノマー複合体の形成を可能とするためにインキュベートされる。インキュベーションは、約４．５から約１０．０のｐＨ、約２℃から約４５℃の温度において、少なくとも約１分から約１８時間、約２〜６分、または約３〜４分の間、実施されることができる。
【００８２】
捕捉抗体−ラミニンガンマ−２モノマー複合体の形成後、該複合体は次いで、（捕捉抗体）−ラミニンガンマ−２モノマー−検出抗体複合体の形成を可能とする条件下で）少なくとも１つの検出抗体と接触させられる。捕捉抗体−ラミニンガンマ−２モノマー複合体が１つを超える検出抗体と接触させられる場合、捕捉抗体−ラミニンガンマ−２モノマー−検出抗体複合体が形成される。捕捉抗体と同様に、少なくとも１つの検出（および続く）抗体が、捕捉抗体−ラミニンガンマ−２モノマー複合体と接触させられる場合、捕捉抗体−ラミニンガンマ−２モノマー−検出抗体複合体の形成のために、上記と同様の条件下でのインキュベーション期間が必要である。好ましくは、少なくとも１つの検出抗体は、検出可能な標識を含有する。捕捉抗体−ラミニンガンマ−２モノマー−検出抗体複合体の形成の前に、それと同時にまたはその後に、検出可能な標識が少なくとも１つの検出抗体に結合されることができる。本分野で知られた任意の検出可能な標識が、本明細書で検討され、本分野で知られたとおりに使用されることができる。
【００８３】
Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、５７９（１）：６１−６７頁（２００６）に記載の方法によって、化学発光アッセイが実施可能である。任意の好適なアッセイフォーマットが使用可能であるが、マイクロプレートケミルミノメーター（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ−９４０、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，ＬＬＣ、Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ、ＴＮ）が、少量の複数サンプルの迅速なアッセイを可能とする。ケミルミノメーターは、９６ウエルの黒色ポリスチレンマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ＃３７９２）を用いる複数試薬用の注入器を備えることができる。各サンプルは別々のウエルに添加され、採用されるアッセイの種類により決定された他の試薬の同時の／連続した添加が続く。アクリジニウムアリールエステルを使用する中性または塩基性溶液中の疑似塩基の形成が、酸化などによって回避されることが望ましい。次いで、化学発光反応がウエルごとに記録される。これに関して、化学発光反応の記録時間は、部分的に、試薬と使用される具体的なアクリジニウムの添加の間の遅れに依存する。
【００８４】
化学発光アッセイのための混合物を形成するために試験サンプルと特異的結合パートナーが添加される順序は重要でない。第１の特異的結合パートナーがアクリジニウム化合物で検出可能に標識化された場合、検出可能に標識化された第１の特異的結合パートナー−ラミニンガンマ−２モノマー複合体が形成する。あるいはまた、第２の特異的結合パートナーが使用され、第２の特異的結合パートナーがアクリジニウム化合物で検出可能に標識化される場合、検出可能に標識化された第１の特異的結合パートナー−ラミニンガンマ−２モノマー−第２の特異的結合パートナー複合体が形成する。標識化されるか標識化されないかにかかわらず、任意の未結合の特異的結合パートナーが、洗浄などの本分野で知られた任意の技術を用いて混合物から除去されることができる。
【００８５】
過酸化水素が、上記アクリジニウム化合物の添加の前、それと同時またはその後に、混合物中、インサイチュで生成されるまたは混合物に提供されるもしくは供給されることができる。過酸化水素は、当業者に明らかな多くの方法においてインサイチュで生成されることができる。
【００８６】
あるいはまた、単純に過酸化水素の供給源が混合物に添加されることができる。例えば、過酸化水素の供給源は、過酸化水素を含有することが知られている１つ以上のバッファーまたは他の溶液であることができる。この点については、単純に過酸化水素の溶液が添加されることができる。
【００８７】
少なくとも１つの塩基性溶液のサンプルへの添加と同時のまたはそれに続く添加に際して、検出可能なシグナル、すなわち、ラミニンガンマ−２モノマーまたはその変異体の存在を示す化学発光シグナルが生成される。塩基性溶液は、少なくとも１つの塩基を含有し、１０以上、好ましくは、１２以上のｐＨを有する。塩基性溶液の例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムおよび重炭酸カルシウムが挙げられるが、これらに限定されない。サンプルに添加される塩基性溶液の量は、塩基性溶液の濃度に依存する。使用される塩基性溶液の濃度に基づいて、当業者はサンプルに添加する塩基性溶液の量を容易に決定することができる。
【００８８】
生成された化学発光シグナルは、本分野の当業者に知られた日常的技術を用いて検出されることができる。生成されたシグナルの強度に基づいて、サンプル中のラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）の量が定量化されることができる。具体的には、サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの量は、生成されたシグナルの強度に比例する。存在するラミニンガンマ−２モノマーの量は、生成された光の量をラミニンガンマ−２モノマーのための標準曲線と比較することによりまたは参照標準への比較によって定量化可能である。標準曲線は、既知濃度のラミニンガンマ−２モノマーの連続的な希釈液または溶液を用いて、質量分析法、重量分析法および本分野で知られた他の技術により作成可能である。
【００８９】
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）（またはその後継機種）アナライザーを採用する化学発光微粒子アッセイにおいて、コンジュゲート希釈液のｐＨは、約５．８±０．２でなければならず、微粒子コーティングバッファーは、室温に維持されなければならず（すなわち、約１７℃から約２７℃）、微粒子コーティングバッファーのｐＨは、約５．５±０．２でなければならず、微粒子希釈液のｐＨは、約６．０±０．２でなければならない。固体は、約０．２％未満、例えば、約０．１５％未満、約０．１４％未満、約０．１３％未満、約０．１２％未満、約０．１１％未満、約０．１０％未満、約０．０９％未満、約０．０８％未満、約０．０７％未満、約０．０６％未満、約０．０５％未満、約０．０４％未満または約０．０３％未満、例えば約０．０２５％未満であることが好ましい。
【００９０】
フォワード競合フォーマットにおいて、既知濃度の標識化されたラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）のアリコートが、（固定化されたラミニンガンマ−２モノマー抗体などの）ラミニンガンマ−２モノマー抗体への結合に関して試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーと競合するために使用される。
【００９１】
フォワード競合アッセイにおいて、（ラミニンガンマ−２モノマー抗体などの）固定化された抗体が、試験サンプルおよび標識化されたラミニンガンマ−２モノマーまたはラミニンガンマ−２モノマー変異体と連続的にまたは同時に接触させられることができる。ラミニンガンマ−２モノマータンパク質またはラミニンガンマ−２モノマー変異体は、抗ラミニンガンマ−２モノマー抗体に関して上で検討された検出可能な標識を含む任意の検出可能な標識で標識化されることができる。このアッセイにおいて、抗体は、固体支持体上に固定化されることができる。あるいはまた、抗体は、微粒子などの固体支持体上に固定化された抗種抗体などの抗体にカップリングされることができる。
【００９２】
標識化されたラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）、試験サンプルおよび抗体は、サンドイッチアッセイフォーマットに関して上記したものと同様の条件下でインキュベートされる。次いで、２つの異なる種の抗体−ラミニンガンマ−２モノマー複合体が生成され得る。具体的には、生成された抗体−ラミニンガンマ−２モノマー複合体のうちの一方は、検出可能な標識を含有するが、他の抗体−ラミニンガンマ−２モノマー複合体は、検出可能な標識を含有しない。抗体−ラミニンガンマ−２モノマー複合体は、検出可能な標識の定量化の前に残りの試験サンプルから分離されることができるが、そうしなくてはならないわけではない。抗体−ラミニンガンマ−２モノマー複合体が残りの試験サンプルから分離されるか否かにかかわらず、抗体−ラミニンガンマ−２モノマー複合体中の検出可能な標識の量が次に定量化される。次いで、試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）の濃度が、抗体−ラミニンガンマ−２モノマー複合体中の検出可能な標識の量を、標準曲線と比較することによって決定されることができる。標準曲線は、既知濃度のラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）の連続的な希釈液を用いて、質量分光、重量分析、および本分野で知られた他の技術により作成可能である。
【００９３】
抗体−ラミニンガンマ−２モノマー複合体は、サンドイッチアッセイフォーマットに関して上で検討された固体支持体などの固体支持体に抗体を結合させ、次いで、固体支持体との接触から残りの試験サンプルを除去することによって、試験サンプルから分離されることができる。
【００９４】
リバース競合アッセイにおいて、固定化されたラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）が、試験サンプルおよび少なくとも１つの標識化された抗体と連続的にまたは同時に接触させられることができる。好ましくは、抗体は、ラミニンガンマ−２モノマーの少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個または少なくとも３０個のアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合する。
【００９５】
ラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）は、サンドイッチアッセイフォーマットに関して上で検討された固体支持体などの固体支持体に結合されることができる。
【００９６】
固定化されたラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）、試験サンプルおよび少なくとも１つの標識化された抗体が、サンドイッチアッセイフォーマットに関して上記したものと同様の条件下でインキュベートされる。次いで、２つの異なる種のラミニンガンマ−２モノマー−抗体複合体が生成される。具体的には、生成されたラミニンガンマ−２モノマー−抗体複合体のうちの一方は固定化され、検出可能な標識を含有するが、他のラミニンガンマ−２モノマー−抗体複合体は、固定化されず、検出可能な標識を含有する。固定化されないラミニンガンマ−２モノマー−抗体複合体および残りの試験サンプルは、固定化されたラミニンガンマ−２モノマー−抗体複合体の存在から、洗浄などの本分野で知られた技術によって除去される。固定化されないラミニンガンマ−２モノマー−抗体複合体が除去されると、固定化されたラミニンガンマ−２モノマー−抗体複合体中の検出可能な標識の量が定量化される。次いで、試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）の濃度が、ラミニンガンマ−２モノマー−複合体中の検出可能な標識の量を、標準曲線と比較することによって決定されることができる。標準曲線は、既知濃度のラミニンガンマ−２モノマーまたはラミニンガンマ−２モノマーの変異体の連続的な希釈液を用いて、質量分光、重量分析、および本分野で知られた他の技術により作成可能である。
【００９７】
蛍光偏光アッセイにおいて、抗体またはその機能活性フラグメントが最初に、ラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）を含有することが疑われる非標識化試験サンプルと接触させられて、非標識化ラミニンガンマ−２モノマー−抗体複合体を形成することができる。次いで、非標識化ラミニンガンマ−２モノマー−抗体複合体は、蛍光で標識化されたラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）と接触させられる。標識化されたラミニンガンマ−２モノマーは、抗体またはその機能活性フラグメントへの結合に関して、試験サンプル中の任意の非標識化ラミニンガンマ−２モノマーと競合する。形成された標識化ラミニンガンマ−２モノマー−抗体複合体の量が決定され、標準曲線の使用により、試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）の量が決定される。
【００９８】
蛍光偏光アッセイにおいて使用される抗体は、ラミニンガンマ−２モノマーの少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個または少なくとも３０個のアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合する。
【００９９】
抗体、標識化されたラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）、試験サンプルおよび少なくとも１つの標識化された抗体は、サンドイッチイムノアッセイに関して上記したものと同様の条件下でインキュベートされてよい。
【０１００】
あるいはまた、抗体またはその機能活性フラグメントは、蛍光で標識化されたラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）およびラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）を含有することが疑われる非標識化試験サンプルと同時に接触させられて、標識化されたラミニンガンマ−２モノマー−抗体複合体および非標識化ラミニンガンマ−２モノマー−抗体複合体の両方を形成することができる。形成された標識化ラミニンガンマ−２モノマー−抗体複合体の量が決定され、標準曲線の使用により、試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの量が決定される。このイムノアッセイにおいて使用される抗体は、ラミニンガンマ−２モノマーの少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個または少なくとも３０個のアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合する。
【０１０１】
あるいはまた、抗体またはその機能活性フラグメントは最初に、蛍光で標識化されたラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）と接触させられて、標識化されたラミニンガンマ−２モノマー−抗体複合体を形成する。次いで、標識化されたラミニンガンマ−２モノマー−抗体複合体は、ラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）を含有することが疑われる非標識化試験サンプルと接触させられる。試験サンプル中の任意の非標識化ラミニンガンマ−２モノマーは、抗体またはその機能活性フラグメントへの結合に関して、ラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）と競合する。形成された標識化ラミニンガンマ−２モノマー−抗体複合体の量は、標準曲線の使用により、試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの量を決定するために使用される。このイムノアッセイにおいて使用される抗体は、ラミニンガンマ−２モノマーの少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個または少なくとも３０個のアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合する。
【０１０２】
質量分光（ＭＳ）分析は、単独でまたは他の方法と組み合わせて使用されてよい。他の方法は、イムノアッセイおよび特定のポリヌクレオチドを検出するための上記のものを含む。質量分光法は、１つ以上のバイオマーカーの存在および／または量を決定するために使用されてよい。ＭＳ分析は、例えば、ダイレクテッドスポット（ｄｉｒｅｃｔｅｄ−ｓｐｏｔ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦまたは液体クロマトグラフィーＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析などのマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間（ＴＯＦ）ＭＳ分析を含み得る。いくつかの実施形態において、ＭＳ分析は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）ＥＳＩ−ＭＳなどのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ＭＳを含む。質量分析は、市販の分光計を用いて達成可能である。生物学的サンプル中のバイオマーカーペプチドの存在および量を検出するためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳおよびＥＳＩ−ＭＳを含むＭＳ分析の利用方法が使用されてよい。手引きのために、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９２５，３８９号；同第６，９８９，１００号；および同第６，８９０，７６３号を参照のこと。
【０１０３】
対照サンプルまたは一連の較正物質などの較正物質を含むことが望ましい場合がある。対照サンプルは、被験者からのサンプルと同時に上記のとおりに分析されてよい。被験者サンプルから得られた結果は、対照サンプルから得られた結果と比較されることができる。生物学的サンプルについてのアッセイ結果がそれに比較され得る標準曲線が提供されてよい。そのような標準曲線は、アッセイ単位、すなわち、蛍光標識が使用される場合には蛍光シグナル強度、の関数としてレベルを表す。複数のドナーから採取されたサンプルを用いて、正常組織中のラミニンガンマ−２モノマーの対照レベルおよび上で示された特徴の１つ以上を有し得るドナーから採取された組織中のラミニンガンマ−２モノマーの「リスクのある」レベルが提供されることができる。
【０１０４】
したがって、上記観点から、試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）の存在、量または濃度を決定する方法が提供される。方法は、ラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）についてイムノアッセイによって試験サンプルをアッセイすること、例えば、少なくとも１つの抗体および少なくとも１つの検出可能な標識を採用すること、および試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの存在、量または濃度の直接的または間接的な指標として検出可能な標識により生成されるシグナルを、較正物質中のラミニンガンマ−２モノマーの存在、量または濃度の直接的または間接的な指標として生成されるシグナルと比較することを含む。較正物質は、場合によって、そして好ましくは、その中の各較正物質が他の較正物質とラミニンガンマ−２モノマーの濃度が異なる、一連の較正物資の一部である。少なくとも１つの抗体のうちの１つは、単離された抗体であり、これは、ラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）に特異的に結合し、該抗体は、（ｉ）可変重鎖ドメイン領域または（ｉｉ）可変重鎖ドメイン領域および可変軽鎖ドメイン領域から選ばれるドメインまたは領域を有する。あるいはまた、少なくとも１つの抗体のうちの１つは、単離された抗体であり、これは、ラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）に特異的に結合し、該抗体は、（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む可変重鎖およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む可変軽鎖を有する。使用可能な少なくとも１つの抗体の例は、ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、  ＧＡ）、Ａｔｌａｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＩＭＧＥＮＥＸ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、  ＣＡ）、ＧｅｎｅＴｅｘ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｎｔｏｎ、ＭＡ）、ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、ＭＡ）、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ（Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、Ａｂｎｏｖａ（Ｔａｉｗａｎ  ＆  Ｗａｌｎｕｔ、ＣＡ）およびＥｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ）などの会社から購入可能なものなどのラミニンガンマ−２モノマーに特異的に結合する抗体である。
【０１０５】
方法は、（ｉ）捕捉抗体／ラミニンガンマ−２モノマー複合体を形成するために、試験サンプルを、少なくとも１つの捕捉抗体であって、ラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）上のエピトープに結合する上記捕捉抗体と接触させること、（ｉｉ）捕捉抗体／ラミニンガンマ−２モノマー複合体を、少なくとも１つの検出抗体であって、検出可能な標識を含み、ラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）上の、捕捉抗体によって結合されないエピトープに結合する上記検出抗体と接触させて、捕捉抗体／ラミニンガンマ−２モノマー／検出抗体複合体を形成することおよび（ｉｉｉ）（ｉｉ）において形成された捕捉抗体／ラミニンガンマ−２モノマー／検出抗体複合体中の検出可能な標識により生成されたシグナルに基づいて、試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの量を決定することを含むことができる。
【０１０６】
あるいはまた、方法は、（ｉ）捕捉抗体／ラミニンガンマ−２モノマー複合体を形成するために、試験サンプルを、少なくとも１つの捕捉抗体であって、ラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）上のエピトープに結合する上記捕捉抗体と接触させ、それと同時にまたはいずれかの順序で連続的に、試験サンプルを、少なくとも１つの捕捉抗体への結合に関して試験サンプル中の任意のラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）と競合することのできる、検出可能に標識化されたラミニンガンマ−２モノマーと接触させることを含むことができる。試験サンプル中に存在する任意のラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）および検出可能に標識化されたラミニンガンマ−２モノマーは、お互いに競合して、捕捉抗体／ラミニンガンマ−２モノマー複合体および捕捉抗体／検出可能に標識化されたラミニンガンマ−２モノマー複合体をそれぞれ形成する。方法はさらに、（ｉｉ）（ｉｉ）において形成された捕捉抗体／検出可能に標識化されたラミニンガンマ−２モノマー複合体中の検出可能な標識によって生成されたシグナルに基づいて、試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの存在、量または濃度を決定することを含む。捕捉抗体／検出可能に標識化されたラミニンガンマ−２モノマー複合体中の検出可能な標識により生成されたシグナルは、試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの量または濃度に反比例する。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、方法は、サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの量を測定するために本分野で使用される任意の技術およびアッセイを含むことができる。例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化またはヒト抗ラミニンガンマ−２モノマー抗体（Ａｂ）が、直接的にまたはヒツジ（または他の種の）抗ヒトＡｂなどにより間接的に、固体支持体に結合されることができる。サンプル中に存在し、固体支持体に接触させられる任意のラミニンガンマ−２モノマーが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラヒト化またはヒト抗ラミニンガンマ−２モノマーＡｂにより結合される。ビオチン標識化マウス抗ラミニンガンマ−２モノマーＡｂもラミニンガンマ−２モノマーに結合する。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）に連結されたストレプトアビジンは、マウス抗ラミニンガンマ−２モノマーＡｂ上のビオチンに結合する。ｏ−フェニレンジアミンとの接触に際して、ＨＲＰＯは、ｏ−フェニレンジアミンを２，３−ジアミノフェナジンに変換し、これは４９２ｎｍにおいて分光光度法により測定可能であって色がオレンジ色−茶色である。
【０１０８】
方法はさらに、試験サンプルが得られた患者を診断すること、予後を決定することまたは処置（治療的または予防的）の有効性を評価することを含むことができる。方法がさらに、試験サンプルが得られた患者の治療的／予防的処置の有効性を評価することを含む場合、方法は、場合によって、有効性を改善するために、必要に応じて患者の治療的／予防的処置を改変することをさらに含む。方法は、自動化システムまたは半自動化システムにおける使用に適合されることができる。
【０１０９】
一般に、ラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）に関して試験サンプルをアッセイして得られた結果をそれに対して評価する基準として、所定のレベルが採用されることができる。一般に、そのような比較を行うに際して、分析物の存在、量または濃度と、疾患、障害または病状（例えば、がん）の特別な病期もしくはエンドポイントまたは特別な兆候とを、つなぐまたは関連づけることができるように、十分な回数および適切な条件下で特別なアッセイを実行することによって所定のレベルが得られる。典型的に、所定のレベルは、参照被験者（または被験者集団）のアッセイによって得られる。測定されるラミニンガンマ−２モノマーは、そのフラグメント、その分解産物および／またはその酵素切断産物を含むことができる。
【０１１０】
特に、疾患の進行および／または処置をモニタリングするために採用される所定のレベルに関して、ラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）の量または濃度は、「未変化の」、「好ましい」（または「好ましく変更された」）または「好ましくない」（または好ましくなく変更された）ものであることができる。「上昇した」または「増大した」は、典型的なもしくは正常のレベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）よりも高い、または別の参照レベルもしくは範囲（例えば、以前のまたはベースラインのサンプル）よりも高い試験サンプル中の量または濃度をさす。用語「低下した」または「減少した」は、典型的なもしくは正常のレベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）よりも低い、または別の参照レベルもしくは範囲（例えば、以前のまたはベースラインのサンプル）よりも低い試験サンプル中の量または濃度をさす。用語「変更された」は、典型的なもしくは正常のレベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）からまたは別の参照レベルもしくは範囲（以前のまたはベースラインのサンプル）から変更された（増大したまたは減少した）サンプル中の量または濃度をさす。
【０１１１】
ラミニンガンマ−２モノマーの典型的なもしくは正常のレベルもしくは範囲は、標準慣行によって定義される。所謂変更されたレベルまたは変更は、典型的なもしくは正常のレベルもしくは範囲または参照レベルもしくは範囲に比較した任意の正味変化であって、実験誤差またはサンプルのばらつきにより説明できないものがある場合に、発生したとみなされることができる。したがって、特別なサンプルにおいて測定されたレベルは、所謂正常被験者からの同様のサンプル中で決定されたレベルまたはレベルの範囲と比較される。これに関連して、「正常被験者」は、検出可能な疾患または障害を有さない個人であり、例えば、（時には「対照」と呼ばれる）「正常」患者または集団は、それぞれ、検出可能な疾患または障害を示さない人である。「見かけ上正常な被験者」は、ラミニンガンマ−２モノマーが評価されなかったまたはされていない人である。分析物のレベルは、分析物が通常では検出不可能（例えば、正常レベルがゼロまたは正常集団の約２５から約７５パーセンタイルの範囲内）であるが、試験サンプル中で検出される場合、ならびに分析物が正常レベルよりも高いレベルで試験サンプル中に存在する場合に、「上昇した」と言われる。したがって、中でも、本開示は、がんを有するまたはがんを有するリスクのある被験者に関するスクリーニングの方法を提供する。
【０１１２】
アッセイの方法は、本明細書で検討され、本分野で知られた他のマーカーなどのアッセイも含むことができる。例えば、アッセイの方法は、例えば、ラミニンガンマ−２モノマーおよび／またはラミニンガンマ−２モノマーフラグメント、ＣＥＡおよびＣＡ１９−９のアッセイ（検出）も含むことができる。
【０１１３】
本明細書に記載の方法は、本明細書で検討され、本分野で知られたように、被験者が（膀胱がんまたは結腸直腸がんなどの）がんを有するまたは発病するリスクがあるか否かを決定するためにも使用されることができる。具体的に、そのような方法は、以下のステップ：
（ａ）被験者からの試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）の濃度または量を、本明細書に記載の方法または本分野で知られた方法を用いて決定するステップ；および
（ｂ）ステップ（ａ）において決定されたラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）の濃度または量を、所定のレベルと比較するステップであって、ステップ（ａ）において決定されたラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量が、所定のレベルに関して好ましい場合、上記被験者が、本明細書で検討され、本分野で知られたように、がんを有さないまたはがんのリスクがないと決定される、ステップ
を含むことができる。しかしながら、ステップ（ａ）において決定されたラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量が、所定のレベルに関して好ましくない（例えば、増大したような）場合、被験者は、本明細書で検討され、本分野で知られたように、がんを有するまたはがんのリスクがあると決定される。
【０１１４】
さらに、被験者における疾患の進行をモニタリングする方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、方法は、以下のステップ：
（ａ）被験者からの試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）の濃度または量を決定するステップ；
（ｂ）被験者からの後の試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量を決定するステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）において決定されたラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量を、ステップ（ａ）において決定されたラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量と比較するステップであって、ステップ（ｂ）において決定された濃度または量が、ステップ（ａ）において決定されたラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量と比較した場合に未変化であるまたは好ましくない（例えば、増大したような）場合、被験者における疾患が継続した、進行したまたは悪化したと決定される、ステップ
を含む。比較して、ステップ（ｂ）において決定されたラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量が、ステップ（ａ）において決定されたラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量に比較して好ましい場合、被験者における疾患が中断した、退行したまたは改善されたと決定される。
【０１１５】
本明細書に記載のとおり、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の多様な方法は、該多様な方法のステップにおいて決定されたラミニンガンマ−２モノマーの濃度、量または比較のいずれかを提供することを含む。提供されると、サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの濃度、量または比較は、（疾患の進行の評価または疾患を発病する可能性の評価などの）疾患の診断、予後もしくはリスク評価を提供するためまたは被験者における（例えば、処置を受けている被験者または処置を受けてきており、疾患の再発についてモニターされた被験者における）疾患の経過をモニターするために使用されることができる。場合によって、方法はさらに、ステップ（ｂ）において決定されたラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量を、例えば、所定のレベルと比較することを含む。さらに、場合によって、方法は、上記比較が、ステップ（ｂ）において決定されたラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量が、例えば、所定のレベルに関して好ましくなく変更された（例えば、増大した）ことを示す場合、被験者を一定期間、１つ以上の医薬組成物で処置することを含む。
【０１１６】
さらに、方法は、１つ以上の医薬組成物による処置を受けている被験者における処置をモニターするために使用されることができる。具体的に、そのような方法は、被験者が１つ以上の化学療法剤または生物学的製剤などの１つ以上の医薬組成物を投与される前に、被験者からの第１の試験サンプルを提供することを含む。次に、被験者からの第１の試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量が（例えば、本明細書に記載の方法または本分野で知られた方法を用いて）決定される。ラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量が決定された後、場合によって、該ラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量が所定のレベルと比較される。決定された第１の試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量が所定のレベルよりも低い場合、被験者は１つ以上の医薬組成物により処置されない。しかしながら、決定された第１の試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量が所定のレベルよりも高い場合、被験者は一定期間、１つ以上の医薬組成物により処置される。被験者が１つ以上の医薬組成物により処置される期間は、当業者により決定されることができる（例えば、上記期間は、約１日から約３０日であることができ、その時点で処置の成功が（例えば、臨床的指標を用いてまたは処置が開始した後のラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量を決定して）評価されることができる。
【０１１７】
１つ以上の医薬組成物による治療の経過中、第２のおよび続く試験サンプルが被験者から得られる。試験サンプルの数および上記試験サンプルが被験者から得られる時点は重要でない。例えば、第２の試験サンプルは、被験者が最初に１つ以上の医薬組成物を投与された７日後に得られることができ、第３の試験サンプルは、被験者が最初に１つ以上の医薬組成物を投与された２週間後に得られることができ、第４の試験サンプルは、被験者が最初に１つ以上の医薬組成物を投与された３週間後に得られることができ、第５の試験サンプルは、被験者が最初に１つ以上の医薬組成物を投与された４週間後に得られることができる。
【０１１８】
第２のまたは続く試験サンプルそれぞれが被験者から得られた後、第２のまたは続く試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）の濃度または量が、（例えば、本明細書に記載の方法または本分野で知られた方法を用いて）決定される。次いで、第２のまたは続く試験サンプルそれぞれにおいて決定されたラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量が、第１の試験サンプル（例えば、始めに場合によって所定のレベルと比較された試験サンプル）中で決定されたラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量と比較される。ステップ（ｃ）において決定されたラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量が、ステップ（ａ）において決定されたラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量に比較して好ましい場合、被験者における疾患または感染症が、中断した、退行したまたは改善されたと決定され、被験者はステップ（ｂ）の１つ以上の医薬組成物を投与され続けなくてはならない。しかしながら、ステップ（ｃ）において決定された濃度または量が、ステップ（ａ）において決定されたラミニンガンマ−２モノマーの濃度または量に比較して未変化であるまたは好ましくない（例えば、増大したような）場合、疾患が、継続した、進行したまたは悪化したと決定され、被験者はより高濃度のステップ（ｂ）において被験者に投与された１つ以上の医薬組成物で処置されなければならないまたは被験者はステップ（ｂ）において被験者に投与された１つ以上の医薬組成物と異なる１つ以上の医薬組成物で処置されなければならない。具体的には、被験者は、該被験者が先に受容した１つ以上の医薬組成物と異なる１つ以上の医薬組成物により処置されることができ、該異なる医薬組成物の、上記被験者のラミニンガンマ−２モノマーレベルを減少させるもしくは低下させるおよび／または疾患の症状を改善する効力を評価することができる。
【０１１９】
一般に、（疾患の進行および／または処置に対する応答をモニタリングすることなどの）反復試験が行われ得るアッセイのために、第２のまたは続く試験サンプルが、第１の試験サンプルが被験者から得られた後のいずれかの時点で得られる。具体的には、被験者からの第２の試験サンプルは、第１の試験サンプルが被験者から得られた数分、数時間、数日、数週間または数年後に得られることができる。例えば、第２の試験サンプルは、被験者からの第１の試験サンプルが得られた約１分、約５分、約１０分、約１５分、約３０分、約４５分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１３週間、約１４週間、約１５週間、約１６週間、約１７週間、約１８週間、約１９週間、約２０週間、約２１週間、約２２週間、約２３週間、約２４週間、約２５週間、約２６週間、約２７週間、約２８週間、約２９週間、約３０週間、約３１週間、約３２週間、約３３週間、約３４週間、約３５週間、約３６週間、約３７週間、約３８週間、約３９週間、約４０週間、約４１週間、約４２週間、約４３週間、約４４週間、約４５週間、約４６週間、約４７週間、約４８週間、約４９週間、約５０週間、約５１週間、約５２週間、約１．５年、約２年、約２．５年、約３．０年、約３．５年、約４．０年、約４．５年、約５．０年、約５．５年、約６．０年、約６．５年、約７．０年、約７．５年、約８．０年、約８．５年、約９．０年、約９．５年もしくは約１０．０年、もしくはそれを超える期間の後または少なくともおよそ上記期間のうちの１つの後に被験者から得られることができる。疾患の進行をモニターするために使用される場合、上記アッセイは、がんおよび／またはがんに伴う任意の病状に罹った被験者における疾患の進行をモニターするために使用されることができる。そのような病状は、がんが治癒していない場合に典型的に慢性であることができ、またはそのような病状は（救命救急診療状態（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｃａｒｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）としても知られる）急性であることができる。急性の病状は、生命を危うくする疾患または心血管系、神経系または排泄系などを含む他の重篤な医学的状態であることが多い。典型的に救急救命診療状態は、（救急救命室、集中治療室、外傷センターまたは他の緊急診療設定を含むが、これらに限定されない）病院に基盤を置く設定における急性の医療介入または救急救命士もしくは他の現場ベースの医療従事者による投与を必要とする病状をさす。救命救急診療状態のために、一般に、反復したモニタリングが、より短い時間枠内、すなわち、（約１分ごと、約５分ごと、約１０分ごと、約１５分ごと、約３０分ごと、約４５分ごと、約６０分ごと、約２時間ごと、約３時間ごと、約４時間ごと、約５時間ごと、約６時間ごと、��７時間ごと、約８時間ごと、約９時間ごと、約１０時間ごと、約１１時間ごと、約１２時間ごと、約１３時間ごと、約１４時間ごと、約１５時間ごと、約１６時間ごと、約１７時間ごと、約１８時間ごと、約１９時間ごと、約２０時間ごと、約２１時間ごと、約２２時間ごと、約２３時間ごと、約２４時間ごと、約２日ごと、約３日ごと、約４日ごと、約５日ごと、約６日ごともしくは約７日ごとまたは少なくとも上記時間枠のうちの１つごとなどの数分、数時間または数日内に行われ、同様の最初のアッセイが一般に、疾患または病状の発症の約数分、数時間または数日以内などのより短い時間枠内で行われる。
【０１２０】
好適には、アッセイは、慢性または非急性の病状に罹った被験者における疾患の進行をモニターするためにも使用されることができる。非救急救命診療状態または非急性の病状は、生命を脅かす急性の疾患または他の重篤な医学的状態以外の病状をさす。典型的に、非急性の病状は、より長期のまたは慢性的に持続するものを含む。非急性の病状のために、一般に、（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１３週間、約１４週間、約１５週間、約１６週間、約１７週間、約１８週間、約１９週間、約２０週間、約２１週間、約２２週間、約２３週間、約２４週間、約２５週間、約２６週間、約２７週間、約２８週間、約２９週間、約３０週間、約３１週間、約３２週間、約３３週間、約３４週間、約３５週間、約３６週間、約３７週間、約３８週間、約３９週間、約４０週間、約４１週間、約４２週間、約４３週間、約４４週間、約４５週間、約４６週間、約４７週間、約４８週間、約４９週間、約５０週間、約５１週間、約５２週間、約１．５年、約２年、約２．５年、約３．０年、約３．５年、約４．０年、約４．５年、約５．０年、約５．５年、約６．０年、約６．５年、約７．０年、約７．５年、約８．０年、約８．５年、約９．０年、約９．５年もしくは約１０．０年、もしくは（被験者の寿命などの）それを超える期間の後などの）数時間、数日、数か月または数年などのより長い時間枠で反復したモニタリングが行われ、同様の最初のアッセイが一般に、疾患または病状の発症から約数時間、数日、数か月もしくは数年などのより長い時間枠内で行われる。
【０１２１】
さらに、上記アッセイは、被験者から得られた第１の試験サンプルを用いて実施されることができ、第１の試験サンプルは、血液、尿、血清または血漿などの１つの供給源から得られる。場合によって、上記アッセイは、被験者から得られた第２の試験サンプルを用いて反復されることができ、第２の試験サンプルは、同じまたは別の供給源から得られる。例えば、第１の試験サンプルが尿から得られた場合、第２の試験サンプルは血清または血漿から得られることができる。第１の試験サンプルおよび第２の試験サンプルを用いるアッセイから得られた結果が比較されることができる。比較は、被験者における疾患または病状の状態を評価するために使用されることができる。
【０１２２】
さらに、本開示は、がんに罹りやすいまたは罹っている被験者が処置の利益を得るか否かを決定する方法にも関する。特に、本開示は、ラミニンガンマ−２モノマーコンパニオン診断方法および製品に関する。したがって、本明細書に記載の「被験者における疾患の処置のモニタリング」方法は、さらに最適には、化学療法剤、生物学的製剤、放射線、緩和療法、ホルモン療法および／または手術などの治療法の候補者を選択することまたは同定することも包含し得る。
【０１２３】
したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、（本明細書で検討され、本分野で知られた）がんを有するまたはがんを有するリスクのある被験者が、特別ながん治療法の候補者であるか否かを決定する方法も提供する。一般に、被験者は、疾患のなんらかの症状を経験したまたはがんを有しているもしくはがんを有するリスクがあると実際に診断されたおよび／またはラミニンガンマ−２モノマー、もしくは本明細書に記載のその変異体の好ましくない濃度もしくは量（例えば、所定のレベルと比較した場合に、増大したラミニンガンマ−２モノマーの濃度）を示す者である。
【０１２４】
方法は場合によって、本明細書に記載のアッセイを含み、分析物は１つ以上の医薬組成物による被験者の処置の前にもしくはそれに続いて評価されるまたは分析物はそのような処置に続いて評価され、分析物の濃度もしくは量が所定のレベルに対して比較される。処置後に観察された分析物の（例えば、所定のレベルと比較された場合に、増大した濃度のような）好ましくない濃度または量は、被験者がさらなる処置または継続された処置を受容することから利益を得ないことを確認するが、処置後に観察された分析物の好ましい濃度または量は、被験者がさらなる処置または継続された処置を受容することから利益を得ることを確認する。この確認は、臨床試験の管理および改善された患者ケアの提供を支援する。
【０１２５】
本明細書中の或る実施形態は、がんまたはがん発症のリスクを評価するために採用される場合に有益であるが、アッセイおよびキットは、場合によって、適宜、他の疾患、障害および病状におけるラミニンガンマ−２モノマーを評価するためにも採用されることができる。
【０１２６】
一般に、サンプル中のバイオマーカーを検出または定量化可能な任意の方法が、本明細書に記載の方法において使用されることができる。これらの方法は、免疫学的方法に加えて、物理学的方法および分子生物学の方法を含む。例えば、好適な物理学的方法は、質量分析法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイ、クロマトグラフィーアッセイおよび色素検出アッセイを含む。使用することのできる好適な分子生物学の方法は、ノーザンブロットもしくはサザンブロットハイブリダイゼーション、核酸ドットブロットもしくはスロットブロットハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、核酸チップアッセイ、ＰＣＲ、リバーストランスクリプターゼＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）またはリアルタイムＰＣＲ（ｔａｑ−ｍａｎ  ＰＣＲ）を含むが、これらに限定されない。バイオマーカーを検出するための他の方法は、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、蛍光分析、比色分析、放射線分析、照度分析または他の分光法、（ＢＩＡＣＯＲＥなどの）プラズモン共鳴および１次元または２次元ゲル電気泳動を含む。
【０１２７】
測定されると、ラミニンガンマ−２モノマーの濃度および評価される任意の他の追加のバイオマーカーの濃度が、個別のバイオマーカーのための所定の参照値と比較される。参照ラミニンガンマ−２モノマー値を超える、測定された、すなわち、決定されたラミニンガンマ−２モノマー濃度は、被験者におけるがんまたは増大したがんのリスクを示す。参照値は、数種の方法のうちの１つにより決定されてよい。例えば、ラミニンガンマ−２モノマー参照値は、対照被験者から採取されたサンプル中で測定されたラミニンガンマ−２モノマー濃度であることができ、または対照被験者群から採取された複数の対照サンプル中で測定された濃度から計算されたメジアンラミニンガンマ−２モノマー濃度であってよい。メジアンラミニンガンマ−２モノマー濃度は、少なくとも２０人の対照被験者群、少なくとも３０人の対照被験者群または少なくとも４０人の対照被験者群から得られることが好ましい。バイオマーカーのための所定の参照値は、所定のカットオフ値であることができる。
【０１２８】
「対照被験者」は、健康な被験者、すなわち、がんの臨床的兆候または症状のない被験者である。対照被験者は、別の方法では検出されないがんの兆候または症状に関して臨床的に評価されることが好ましく、該評価は日常的な身体検査および／または実験室検査を含んでよい。
【０１２９】
あるいはまた、ラミニンガンマ−２モノマーカットオフ値（または所定のカットオフ値）は、患者群の生物学的サンプルからの受信者動作曲線（ＲＯＣ）解析によって決定されることができる。生物学の分野で一般に知られたＲＯＣ解析は、正常ケースから罹患ケースを識別するなどの１つの状態を別の状態から識別するためまたは２つ以上の実験室検査または診断検査の診断性能を比較するための試験の能力の決定である。本開示によって適用されるＲＯＣ解析の記述は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐ．Ｊ．Ｈｅａｇｅｒｔｙら、Ｔｉｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＲＯＣ  ｃｕｒｖｅｓ  ｆｏｒ  ｃｅｎｓｏｒｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｄａｔａ  ａｎｄ  ａ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  ５６：３３７−４４頁（２０００）中に提供されている。あるいはまた、ラミニンガンマ−２モノマーカットオフ値は、患者群の生物学的サンプルの四分位分析によって決定されることができる。例えば、ラミニンガンマ−２モノマーカットオフ値は、２５パーセンタイル〜７５パーセンタイル値の範囲内の任意の値に相当する値、好ましくは、２５パーセンタイル値、５０パーセンタイル値または７５パーセンタイル値、より好ましくは、７５パーセンタイル値に相当する値を選択することによって決定されることができる。あるいはまたさらに、ラミニンガンマ−２モノマーカットオフ値は、患者群の生物学的サンプルの平均プラス２標準偏差解析によって決定されることができる。関連する患者群のメジアンから得られた代表的なラミニンガンマ−２モノマー参照値は、血清中、約９５０ｐｇ／ｍｌである。７５パーセンタイルにおける四分位分析から得られた代表的なラミニンガンマ−２モノマー参照値は、血清中、約１２００ｐｇ／ｍｌである。そのような統計解析は、本分野で知られた任意の方法を用いて実施可能であり、（Ａｎａｌｙｓｅ−ｉｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｌｔｄ．、Ｌｅｅｄｓ、ＵＫ；ＳｔａｔａＣｏｒｐ  ＬＰ、Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＴＸ；ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ．などからの）任意の数の市販のソフトウェアパッケージにより実行可能である。平均プラス２標準偏差解析から得られた代表的なラミニンガンマ−２モノマー参照値は、血清中、約１０５０ｐｇ／ｍｌである。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、方法は、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０、約２８０、約２９０、約３００、約３１０、約３２０、約３３０、約３４０、約３５０、約３６０、約３７０、約３８０、約３９０、約４００、約４１０、約４２０、約４３０、約４４０、約４５０、約４６０、約４７０、約４８０、約４９０、約５００、約５１０、約５２０、約５３０、約５４０、約５５０、約５６０、約５７０、約５８０、約５９０、約６００、約６１０、約６２０、約６３０、約６４０、約６５０、約６６０、約６７０、約６８０、約６９０、約７００、約７１０、約７２０、約７３０、約７４０、約７５０、約７６０、約７７０、約７８０、約７９０、約８００、約８１０、約８２０、約８３０、約８４０、約８５０、約８６０、約８７０、約８８０、約８９０、約９００、約９１０、約９２０、約９３０、約９４０、約９５０、約９６０、約９７０、約９８０、約９９０または約１，０００ｐｇ／ｍＬのラミニンガンマ−２モノマーカットオフ値を含む。
【０１３１】
方法は、さらに、少なくとも１つの追加のがんのバイオマーカーを、例えば、生物学的サンプル中の少なくとも１つの追加のバイオマーカーの濃度を測定し、測定された濃度を評価される各追加のバイオマーカーの参照値と比較することによって評価することを含む。１つ、２つ、３つ、４つまたはそれを超える追加のバイオマーカーが評価されてよい。そのような追加のがんのバイオマーカーは、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９および（ＭＴ１−ＭＭＰにより生成されたＥＧＦ様フラグメントなどの）ラミニンガンマ−２モノマーのフラグメントを含むが、これらに限定されない。ラミニンガンマ−２モノマーのための参照値を決定することに関して本明細書に記載されたと同様に、任意の他のがんのバイオマーカーのために参照値（または所定のレベル）が決定されてよい。典型的に、任意の追加のバイオマーカーのための参照値を超える、測定された、すなわち、決定された該バイオマーカーの生物学的サンプル中の濃度も、被験者におけるがんまたは増大したがん発症のリスクを示す。それでも、バイオマーカーの参照値よりも低いと決定された該バイオマーカー濃度が被験者におけるがんまたは増大したがん発症のリスクを示すような、逆が真であるバイオマーカー、すなわち、生物学的サンプル中の濃度とがんまたは増大したがん発症のリスクの事例の間の関係が逆であるバイオマーカーの例も可能である。
【０１３２】
例えば、血液中のＣＥＡの上昇したレベルは、結腸直腸がんなどのがんの診断バイオマーカーとして使用されてきた。ＣＥＡは、陽性の結果が他の原因によるものであり、陰性の結果が疾患を除外しないという可能性があるにもかかわらず、なんらかの形態のがんを有することが疑われる患者においてしばしば評価される。それにもかかわらず、兆候および症状との組合せで、ＣＥＡは診断および疾患予後の両方において役割を果たし、いくつかの種類のがんの通常の疾患診断基準の一部である。ＣＥＡレベルの増大はがんにおいて発生し得る。典型的に、サンプル中のＣＥＡのより高いレベルは、がんの存在または発症のより高い確率と相関する。したがって、本明細書に記載の方法の実施形態は、サンプル中のＣＥＡ（および／またはＣＡ１９−９、ラミニンガンマ−２モノマーのフラグメントなど）およびラミニンガンマ−２モノマーの濃度を決定することを含む。
【０１３３】
したがって、いくつかの実施形態において、方法は、ラミニンガンマ−２モノマーならびにＣＥＡ、ＣＥＡ１９−９、およびラミニンガンマ−２モノマーのフラグメントから選ばれる少なくとも１つのマーカーの検出を包含する。いくつかの実施形態において、方法は、ラミニンガンマ−２モノマーおよびＣＥＡおよび場合によって、ＣＥＡ１９−９およびラミニンガンマ−２モノマーのフラグメントから選ばれる少なくとも１つのマーカーの検出を包含する。いくつかの実施形態において、方法は、ラミニンガンマ−２モノマーおよびＣＡ１９−９および場合によって、ＣＥＡおよびラミニンガンマ−２モノマーのフラグメントから選ばれる少なくとも１つのマーカーの検出を包含する。いくつかの実施形態において、方法は、ラミニンガンマ−２モノマーおよびラミニンガンマ−２モノマーのフラグメントおよび場合によって、ＣＥＡおよびＣＥＡ１９−９から選ばれる少なくとも１つのマーカーの検出を包含する。いくつかの実施形態において、方法は、ラミニンガンマ−２モノマー、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９およびラミニンガンマ−２モノマーのフラグメントの検出を包含する。
【０１３４】
Ｃ．キット
本明細書において先に記載されたように、がんに罹っているもしくはがんのリスクが増大した被験者を処置するため、またはがんを有していると患者を診断するために使用され得るキットが、本明細書中に提供される。
【０１３５】
患者を処置するために使用されるキットは、ラミニンガンマ−２モノマーに特異的な抗体を含有する。キットは、本明細書に記載の抗体を用いて被験者を処置するための指示を含むことが好ましい。キットに含まれる指示は、包装材料に添付されることができるまたは添付文書として含まれることができる。指示は典型的に書かれたまたは印刷された資料であるが、そのようなものに限定されない。そのような指示を記憶し、最終使用者にそれらを伝えることのできる任意の媒体が本開示により考慮される。そのような媒体は、電子的記憶媒体（例えば、磁性ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）などを含むが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「指示」は、該指示を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
【０１３６】
ラミニンガンマ−２モノマー（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）に関して試験サンプルをアッセイするためのキットも提供される。キットは、ラミニンガンマ−２モノマーに関して試験サンプルをアッセイするための少なくとも１つの構成要素および（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）に関して試験サンプルをアッセイするための指示を含む。少なくとも１つの構成要素は、（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）に特異的に結合する単離された抗体を含む少なくとも１つの組成物を含む。抗体は、可変重鎖ドメイン領域および可変軽鎖ドメイン領域を有する。抗体は、場合によって検出可能に標識化される。
【０１３７】
例えば、キットは、化学発光微粒子イムノアッセイなどのイムノアッセイによって（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）に関して試験サンプルをアッセイするための指示を含むことができる。指示は、紙の形態またはディスク、ＣＤ、ＤＶＤなどのコンピュータで読み取り可能な形態であることができる。抗体は、ラミニンガンマ−２モノマー捕捉抗体および／またはラミニンガンマ−２モノマー検出抗体であることができる。これに代えてまたは加えて、キットは、精製され、場合によって凍結乾燥された（例えば、ラミニンガンマ−２モノマー、ラミニンガンマ−２モノマーの変異体またはそれらの任意の組合せ）などの較正物質または対照および／またはアッセイを実行するための少なくとも１つの容器（例えば、抗ラミニンガンマ−２モノマーモノクローナル抗体ですでにコーティングされていることができる管、マイクロタイタープレートまたはストリップ）および／またはそのいずれも濃縮溶液として提供され得るアッセイバッファーもしくは洗浄バッファーなどのバッファー、検出可能な標識（例えば、酵素標識）のための基質溶液または停止溶液を含むことができる。好ましくは、キットは、すべての構成要素、すなわち、アッセイを実施するために必要な試薬、標準物質、バッファー、希釈剤などを含む。指示は、ラミニンガンマ−２モノマーを定量化する目的のための標準曲線または参照標準の作製のための指示も含むことができる。
【０１３８】
キット中に提供される、ラミニンガンマ−２モノマーに特異的な組換え抗体などの任意の抗体は、フルオロフォア、放射活性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、クロモフォア、化学発光標識などの検出可能な標識を取り込むことができるまたはキットは、抗体もしくは（検出抗体などの）抗体を検出するための試薬を標識化するための試薬および／または分析物もしくは分析物を検出するための試薬を標識化するための試薬を含むことができる。抗体、較正物質および／または対照は、別個の容器中で提供されるまたは適切なアッセイフォーマット、例えば、マイクロタイタープレート中に予め分注されることができる。
【０１３９】
場合によって、キットは、品質管理用構成要素（例えば、感度パネル、較正物質および陽性対照）を含む。品質管理試薬の調製は、本分野で周知であり、多様な免疫診断製品のための挿入シートに記載される。感度パネルメンバーは、場合によって、アッセイ性能特性を確立するために使用され、さらに、場合によって、イムノアッセイキット試薬の一貫性およびアッセイの標準化の有用な指示薬である。
【０１４０】
キットは、場合によって、診断アッセイを実行するためまたは品質管理評価を容易化するために必要な他の試薬、例えば、バッファー、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬、も含むことができる。バッファーおよび試験サンプルの単離および／または処理のための（前処理試薬などの）溶液などの他の構成要素も、キットに含まれることができる。キットはさらに、１つ以上の他の対照を含むことができる。キットの構成要素の１つ以上は、凍結乾燥されることができ、その場合、キットはさらに、凍結乾燥された構成要素の再構成に好適な試薬を含むことができる。
【０１４１】
キットの多様な構成要素は、場合によって、必要に応じてマイクロタイタープレートなどの好適な容器中で提供される。キットはさらに、サンプルを保持するためまたは貯蔵するための（血液サンプルのための容器またはカートリッジなどの）容器を含むことができる。適宜、キットは場合によって、反応容器、混合容器および試薬または試験サンプルの調製を容易化する他の構成要素も含むことができる。キットは、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーンなどの試験サンプルを得ることを支援するための１つ以上の器具も含むことができる。
【０１４２】
検出可能な標識が少なくとも１つのアクリジニウム化合物である場合、キットは、少なくとも１つのアクリジニウム−９−カルボキサミド、少なくとも１つのアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルまたはそれらの任意の組合せを含むことができる。検出可能な標識が少なくとも１つのアクリジニウム化合物である場合、キットは、バッファー、溶液および／または少なくとも１つの塩基性溶液などの過酸化水素の供給源も含むことができる。
【０１４３】
所望により、キットは、磁性粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、メンブレン、足場分子、フィルム、ろ紙、石英結晶、ディスクまたはチップなどの固相を含むことができる。キットは、検出抗体として機能する抗体などの抗体にコンジュゲーション可能なまたはコンジュゲーションされた検出可能な標識も含んでよい。検出可能な標識は、例えば、直接的標識であることができ、これは、酵素、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子ケミルミノフォア、フルオロフォア、蛍光消光剤、化学発光消光剤またはビオチンであってよい。キットは場合によって、標識を検出するために必要な任意の追加の試薬を含んでよい。
【０１４４】
所望により、キットはさらに、別の分析物に関して試験サンプルをアッセイするための１つ以上の構成要素を単独でまたはさらに指示とともに含むことができ、該分析物は、がんのバイオマーカーなどのバイオマーカーであることができる。分析物の例として、ラミニンガンマ−２モノマー、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９およびラミニンガンマ−２モノマーのフラグメント、さらに本明細書で検討したまたは本分野で知られた他の分析物およびバイオマーカーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ラミニンガンマ−２モノマーに関して試験サンプルをアッセイするための１つ以上の構成要素は、ラミニンガンマ−２モノマーの存在、量または濃度の決定を可能とする。血清サンプルなどのサンプルは、ＴＯＦ−ＭＳおよび内部標準を用いてラミニンガンマ−２モノマーに関してアッセイされることもできる。
【０１４５】
キット（またはその構成要素）および本明細書に記載のイムノアッセイによって試験サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの濃度を決定する方法は、例えば、米国特許第５，０８９，４２４号および同第５，００６，３０９号に記載され、例えば、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）により、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）として市販される（固相が微粒子を含むものを含む）多様な自動化および半自動化システムに適合されることができる。
【０１４６】
（ＥＬＩＳＡなどの）非自動化システムと比較した自動化または半自動化システムのいくつかの相違点は、（分析物抗体または捕捉抗体などの）第１の特異的結合パートナーが結合される基材（これはサンドイッチ形成および分析物の反応性に影響し得る）、捕捉、検出および／または任意の場合による洗浄ステップの長さおよびタイミングを含む。ＥＬＩＳＡなどの非自動化フォーマットは、サンプルおよび捕捉試薬との比較的長いインキュベーション時間（例えば、約２時間）を必要とし得るが、自動化または半自動化フォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）および任意の後継プラットフォーム、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、比較的短いインキュベーション時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）については約１８分）を有し得る。同様に、ＥＬＩＳＡなどの非自動化フォーマットは、コンジュゲート試薬などの検出抗体を比較的長いインキュベーション時間（例えば、約２時間）、インキュベートし得るが、自動化または半自動化フォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）および任意の後継プラットフォーム）は、比較的短いインキュベーション時間を有し得る（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）および任意の後継プラットフォームについては、約４分）。
【０１４７】
Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な他のプラットフォームは、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＩＭｘ（登録商標）（例えば、その全体をが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２９４，４０４号を参照のこと）、ＰＲＩＳＭ（登録商標）、ＥＩＡ（ビーズ）およびＱｕａｎｔｕｍ（商標）ＩＩならびに他のプラットフォームを含むが、これらに限定されない。さらに、アッセイ、キットおよびキットの構成要素は、他のフォーマット、例えば、電気化学的アッセイシステムまたは他の携帯式アッセイシステムもしくはポイントオブケアアッセイシステムにおいて採用されることができる。本開示は、例えば、サンドイッチイムノアッセイを実施する市販のＡｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学的イムノアッセイシステムに適用可能である。イムノセンサーおよびその製造方法および使い捨て検査装置における操作は、例えば、これに関するそれらの教示のためにその全体が参照により本明細書に組まれる、米国特許第５，０６３，０８１号、米国特許出願公開第２００３／０１７０８８１号、米国特許出願公開第２００４／００１８５７７号、米国特許出願公開第２００５／００５４０７８号および米国特許出願公開第２００６／０１６０１６４号に記載されている。
【０１４８】
特に、アッセイのＩ−ＳＴＡＴ（登録商標）システムへの適合に関して、以下の構成が好ましい。微細化されたシリコンチップが、一対の金電流測定作用電極および銀−塩化銀参照電極により製造される。作用電極のうちの１つにおいて、捕捉抗体が固定化されたポリスチレンビーズ（直径０．２ｍｍ）が、電極上のパターン化されたポリビニルアルコールのポリマーコーティングに接着される。このチップは、イムノアッセイに好適なフルイディクスフォーマットのＩ−ＳＴＡＴ（登録商標）カートリッジに組み立てられる。カートリッジのサンプル保持チャンバー壁の一部の上に、アルカリホスファターゼ（または他の標識）で標識化された検出抗体を含む層がある。カートリッジの流体パウチ内には、ｐ−アミノフェノールホスフェートを含む水性試薬がある。
【０１４９】
操作中、ラミニンガンマ−２モノマーを含有することが疑われるサンプルが、試験カートリッジの保持チャンバーに添加され、カートリッジがＩ−ＳＴＡＴ（登録商標）リーダーに挿入される。第２の抗体（検出抗体）がサンプル中に溶解された後、カートリッジ内のポンプ要素がチップを含有する導管中にサンプルを押し込む。ここで、これが振動させられて、第１の捕捉抗体、ラミニンガンマ−２モノマーおよび標識化された第２の検出抗体の間のサンドイッチ形成を促進する。アッセイの最後から２番目のステップにおいて、流体がパウチから導管中に押し出されて、チップから排出チャンバー中へサンプルを洗い出す。アッセイの最後のステップにおいて、アルカリホスファターゼ標識がｐ−アミノフェノールホスフェートと反応して、ホスフェート基を切断し、遊離したｐ−アミノフェノールが作用電極において電気化学的に酸化されることを可能とする。測定された電流に基づいて、リーダーが組み込みアルゴリズム（ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）および工場で決定された較正曲線によってサンプル中のラミニンガンマ−２モノマーの量を計算することができる。
【０１５０】
本明細書に記載の方法およびキットが、イムノアッセイを実施するための他の試薬および方法を必然的に包含することが理解される。例えば、本開示は、本分野で知られたバッファーおよび／または洗浄などのために採用されるコンジュゲート希釈剤および／または較正物質希釈剤として容易に調製または最適化可能なバッファーなどの多様なバッファーを包含する。代表的なコンジュゲート希釈剤は、一定のキット（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）において採用され、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、塩、タンパク質ブロッカー、抗微生物薬および界面活性剤を含有する、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）コンジュゲート希釈剤である。代表的な較正物質希釈剤は、一定のキット（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）において採用され、ＭＥＳ、他の塩、タンパク質ブロッカーおよび抗微生物薬を含有するバッファーを含む、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ヒト較正物質希釈剤である。さらに、２００８年１２月３１日に出願された米国特許出願第６１／１４２，０４８号に記載のとおり、例えば、Ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）カートリッジフォーマットにおいて、シグナル増幅因子としてのシグナル抗体に連結された核酸配列を用いて、改善されたシグナル生成が得られることができる。
【０１５１】
所望により、試験サンプル中で検出されたシグナルがそれに対して比較される標準曲線の作成を容易化するために、複数の濃度の各抗体がキットに含められることができる。あるいはまた、標準曲線は、キット中に提供される単一の抗体溶液の希釈液を調製することによって作成されることができる。
【０１５２】
本明細書に記載の本開示の方法の他の好適な改変および適合化が、容易に適用可能であり認識でき、本開示または本明細書中に開示された態様および実施形態の範囲を逸脱することのない好適な均等物を用いて行われ得ることは、本分野の当業者に容易に明らかである。ここまで本開示を詳細に記載してきたが、本開示は、本開示のいくつかの態様と実施形態を単に例示することのみを目的とし本開示の範囲を制限するものとみなされるべきではない、以下の実施例を参照することによって、より明確に理解される。本明細書で言及されるすべての定期刊行物の参考文献、米国特許および公開は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１５３】
材料および方法
実施例において使用したウサギポリクローナル抗体は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で組換え発現させたヒトラミニンガンマ−２鎖の精製したドメインＩＩＩによりウサギを免疫化することによって樹立した（ドメインＩＩＩ（３８３−６０８ａａ）を、Ｇａｔｅｗａｙ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いてＧＳＴ融合タンパク質として発現させた。）。マウスモノクローナル抗体２Ｈ２は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＴｏｋｙｏのＤｒ．ＫｏｓｈｉｋａｗａおよびＤｒ．Ｓｅｉｋｉから提供された（モノクローナル抗体２Ｈ２は、Ｋｏｓｈｉｋａｗａ  Ｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８年；６８：（２）、２００８年１月１５日、に記載されている。）。モノクローナル抗体Ｄ４Ｂ５および１Ｈ３（Ｄ４Ｂ５は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから市販されている。１Ｈ３は、Ｋｏｓｈｉｋａｗａ  Ｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８年；６８：（２）２００８年１月１５日に記載されている。）。膀胱がん患者からの検体を、ＰｒｏＭｅｄＤｘ（Ｎｏｒｔｏｎ、ＭＡ）から購入した。結腸直腸がん患者からの検体を、ＰｒｏＭｅｄＤｘ（Ｎｏｒｔｏｎ、ＭＡ）およびＫＡＣ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）から購入した。膵臓がん患者からの検体を、ＰｒｏＭｅｄＤｘ（Ｎｏｒｔｏｎ、ＭＡ）、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  ＬＬＣ（Ｌｏｎｇ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）およびＫＡＣ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）から購入した。卵巣がん患者からの検体を、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  ＬＬＣ（Ｌｏｎｇ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）およびＫＡＣ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）から購入した。胃がん患者からの検体を、ＰｒｏＭｅｄＤｘ（Ｎｏｒｔｏｎ、ＭＡ）およびＫＡＣ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）から購入した。食道がん患者からの検体を、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  ＬＬＣ（Ｌｏｎｇ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から購入した。全部で１０９の正常検体を、ＫＡＣ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  ＬＬＣ（Ｌｏｎｇ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、ＳｅｒａＣａｒｅ  ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）およびＣｏｍｐｌｅｘ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｆｏｒｔ  Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ、ＦＬ）から購入した。
【０１５４】
［実施例１］  抗体およびプロトタイプＥＬＩＳＡの確認
ラミニンガンマ−２モノマーのための代表的ＥＬＩＳＡの確立における使用のための多様な抗体の結合特性を特徴づけするために、一連の実験を実施した。
【０１５５】
モノクローナル抗体２Ｈ２のガンマ−２モノマーへの結合特異性
モノクローナル抗体２Ｈ２のガンマ−２モノマーに対する特異性およびそのラミニン５との交差反応性を評価するために、ウエスタンブロットアッセイを実施した。図３に図示するように、（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから購入した）抗体モノクローナルＤ４Ｂ５は、ラミニン５複合体（２０ｎｇ；図３のレーン１）およびガンマ−２モノマー（４ｎｇ；図３のレーン２）の両方に対する結合活性を示す。対照的に、モノクローナル抗体２Ｈ２は、ラミニン５複合体に対するいかなる結合活性も示さず、ガンマ−２モノマーに対する結合特異性を示す。各モノクローナル抗体を、１μｇ／ｍＬの濃度で使用した。
【０１５６】
添加回収および希釈直線性
希釈直線性における抗体性能を評価するために、モノクローナル抗体Ｄ４Ｂ５（５μｇ／ｍＬ）、１Ｈ３（１０μｇ／ｍＬ）および２Ｈ２（１０μｇ／ｍＬ）（Ｄ４Ｂ５を購入した供給源、Ｄ４Ｂ５は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから市販されている。２Ｈ２および１Ｈ３は、Ｄｒ．ＫｏｓｈｉｋａｗａおよびＤｒ．Ｓｅｉｋｉ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｋｙｏ）から提供され、Ｋｏｓｈｉｋａｗａ  Ｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８年；６８（２）、２００８年１月１５日に記載されている。）を、標準的手順を用いて９６ウエルマイクロタイタープレートの壁にコーティングした。すなわち、ウエルを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中、様々な濃度の抗体で４℃において一夜コーティングした。３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間、３７℃においてウエルをブロッキングした。多様な希釈率（４００ｘ、２０００ｘ、１００００ｘおよび添加／スパイクなし）の組換えラミニンガンマ−２モノマーを、希釈剤（ＰＢＳ）に、および正常血清検体サンプル（Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の２つの異なる希釈液（３ｘおよび１０ｘ）に添加した。各抗体は、ラミニンガンマ−２モノマーの希釈およびマトリックス（すなわち、正常血清サンプル）の希釈に対して良好な反応直線性を示した。この実験からのデータの実例を、２Ｈ２モノクローナル抗体に関して図４中に示す。
【０１５７】
モノクローナル抗体２Ｈ２を、１０μｇ／ｍＬで９６ウエルマイクロタイタープレートにおいてコーティングし、添加回収アッセイを用いてさらに評価した。組換えラミニンガンマ−２モノマーを、希釈剤（ＰＢＳ）中および正常血清検体サンプル（ＰｒｏＭｅｄＤｘ）中に添加した。この実験のためのラミニンガンマ−２モノマーの標的濃度範囲は、０〜２０ｎｇ／ｍＬ（０．００、０．３１、０．６３、１．２５、２．５０．５．００、１０．００および２０．００ｎｇ／ｍＬ）にわたった。正常検体サンプル中の濃度を内因性シグナル（すなわち、添加なし）について調節したところ、ラミニンガンマ−２モノマーの平均添加回収率は８６．３％と計算された。
【０１５８】
２Ｈ２を捕捉抗体として使用するＥＬＩＳＡの感度の確立
ラミニンガンマ−２モノマーＥＬＩＳＡの分析感度および信頼できる濃度範囲を評価するために、捕捉抗体として２Ｈ２モノクローナル抗体を使用し、検出抗体としてのヒトラミニンガンマ−２のドメインＩＩＩに対するウサギポリクローナルおよびホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲーションされた二次抗ウサギ抗体を使用してＥＬＩＳＡアッセイを実施した。すなわち、９６ウエルプレートのウエルを５０μＬの２Ｈ２抗体（１０μｇ／ｍＬ）によって、一夜、４℃でコーティングした。２００μＬ／ウエルのＰＢＳでウエルを３回洗浄した。２００μＬのＰＢＳ中、ＢＳＡ（３％）を含有する溶液により、３７℃において１時間、ウエルをブロッキングした。２００μＬのＰＢＳ中、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０による３回の洗浄後、プレートを使用まで−２０℃で貯蔵した。
【０１５９】
ＥＬＩＳＡのために、以下の溶液を調製した。
【０１６０】
サンプル溶液を、１％ＢＳＡ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％Ｔｗｅｅｎ２０、０．２ｍｇ／ｍＬ  ＨＢＲを含有するＰＢＳ中、１０倍希釈検体として調製した。
【０１６１】
洗浄溶液は、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳであった。
【０１６２】
検出抗体溶液（または「第１の」抗体溶液）は、１％ＢＳＡ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．２ｍｇ／ｍＬ  ＨＢＲを含有するＰＢＳ中のポリクローナルウサギ抗体を含有した。この溶液を、室温においてウエルに添加し（５０μＬ）、１時間インキュベートした。
【０１６３】
二次抗体溶液（または「第２の」抗体溶液）は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲーションされたロバ抗ウサギＩｇＧ抗体またはヤギ抗ウサギＩｇＧのＦ（ａｂ’）２フラグメントのいずれかを、５０００倍過剰で、１％ＢＳＡ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．２ｍｇ／ｍＬ  ＨＢＲ中に含有した。
【０１６４】
ＥＬＩＳＡプロトコール：５０μＬのサンプル溶液をウエルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。２００μＬ／洗浄で、３回、洗浄溶液によりウエルを洗浄した。洗浄に続いて、検出抗体溶液を室温でウエルに添加し（５０μＬ／ウエル）、１時間インキュベートした。洗浄１回あたり２００μＬの洗浄溶液により、３回ウエルを再度洗浄した。二次抗体溶液（５０μＬ／ウエル）を室温においてウエルに添加し、１時間インキュベートした。４ラウンドの洗浄後（２００μＬ／洗浄）、１００μＬのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を各ウエルに添加した。１００μＬ／ウエルの０．６％硫酸溶液を添加することによって反応を停止し、２０分間インキュベートした。ＯＤ読み取りを、４５０ｎｍおよび６３０ｎｍにおいて行った（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。
【０１６５】
図５Ｂに示すように、確立された標準曲線は、アッセイの分析感度が約３．７ｐｇ／ｍＬであると実証し、このＥＬＩＳＡについての信頼できる検出限界が約４ｐｇ／ｍＬ、線形検出範囲が少なくとも０〜４，０００ｐｇ／ｍＬとされた。
【０１６６】
ラミニンガンマ−２モノマーが添加されたがん検体および正常検体を用いる希釈直線性解析
２つのがん検体（１つの膀胱がん検体、１つの膵臓がん検体）および２つの正常検体を用いて、希釈直線性のさらなる評価を実施した。正常検体に組換えラミニンガンマ−２モノマーを添加した。１：８から１：１にわたる希釈因子（すなわち、８倍から１倍希釈）に関して、結果は、がん検体において９５〜１１６％（対無添加（ｎｅａｔ））、および正常検体において９３〜１１３％の回収率を実証した。
【０１６７】
［実施例２］  ラミニンガンマ−２モノマーの測定
種々のバイオマーカーの濃度の決定のために、膀胱がん患者からの１０個の血清検体および結腸直腸がん患者からの２５個の血清検体を、正常検体（１０９）とともに調製した。サンプルの測定は、ＣＥＡおよびＣＡ１９−９についてＡＲＣＨＩＴＥＣＴシステムを用いて実施したが、ラミニンガンマ−２モノマー濃度は、上で詳述したＥＬＩＳＡを用いて決定した。すべての市販キットを、製造者の指示に従って使用した。
【０１６８】
結果
図１は、膀胱がん（ｎ＝１０）および結腸直腸がん（ｎ＝２５）を含む多様ながんを有する患者からの血清サンプルならびに健康な対照患者からの血清サンプル中のラミニンガンマ−２モノマーのレベルのドットプロットを示す。［膀胱がん患者からのラミニンガンマ−２モノマーのメジアンレベルは、９９２ｐｇ／ｍＬ、結腸直腸がん患者については、９２９ｐｇ／ｍＬ、健康な対照については、４８５ｐｇ／ｍＬであった。スチューデントｔ−検定を用いて：膀胱がん対健康な対照は、ｐ＝０．００００４１、結腸直腸がん対健康な対照は、ｐ＝０．０００３１であった。］正常検体または他のがん（例えば、膵臓がん、卵巣がん、胃がんおよび食道がん）の検体中のラミニンガンマ−２モノマーの濃度と比較した場合、ラミニンガンマ−２モノマーの濃度は、膀胱がんおよび結腸直腸がん検体からの検体からの血清サンプル中で有意に高かった。
【０１６９】
ＬＮガンマ−２モノマー−膀胱がんおよび結腸直腸がんのための鋭敏で特異的な血清マーカー
正常検体中の測定した３つのバイオマーカー（ラミニンガンマ−２モノマー、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９）レベルの観察された偽陽性率に対する、膀胱がんおよび結腸直腸がん検体中の測定した３つのバイオマーカーレベルの観察された真陽性率から、受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットを作成した（図２）。左下の軸からプロットを横切って右上角までの対角線（例えば、（１，１）の座標）は、マーカーレベルががん検体と正常検体を全く識別しない、最悪の予測方法を有するプロットを示す。最良の予測方法は、（偽陰性のない）１００％の感度および（偽陽性のない）１００％の特異性を示す、ＲＯＣ空間の左上角または座標（０，１）にポイントを得ることが予測される。したがって、１．０の値に近づく実際のデータのプロットから導かれた曲線下面積（ＡＵＣ）は、最良の予測方法を表す。図２に示すように、ＲＯＣプロット曲線は、膀胱がんおよび結腸直腸がんの診断に関連する他のバイオマーカー（ＣＥＡおよびＣＡ１９−９）と比較した場合、ラミニンガンマ−２モノマーマーカーの、膀胱がんおよび結腸直腸がんの両方のための感度および特異性を実証する。このデータから、既存の膀胱がんおよび結腸直腸がんのためのマーカーに比べて、ラミニンガンマ−２モノマーは、これらの疾患のためのマーカーとしての優れた感度および特異性を示す。
【０１７０】
【表１】
0006328103.tif 000002
【０１７１】
【表２】
0006328103.tif 000003
【０１７２】
このデータは、ａ）血清中のラミニンガンマ−２モノマーを検出する能力およびｂ）（正常（健康な）対照ならびに他のがんの種類からのサンプル中の濃度に比較して）増大した血清中ラミニンガンマ−２モノマー濃度と患者サンプル中の膀胱がんおよび結腸直腸がんの発生との予期しない関連を最初に確立した。さらに、上記データは、他の既存の臨床的に関連するバイオマーカーに比較して、ラミニンガンマ−２モノマーが、膀胱がんおよび結腸直腸がんのための優れた診断精度を示すことも確立した。本開示は、血清中のラミニンガンマ−２モノマーを検出するために使用可能であり、検出のためにラミニンガンマ−２モノマーのタンパク質プロセシングを必要としない（すなわち、該アッセイは、ＭＴ１−ＭＭＰにより生成されるラミニンガンマ−２Ｎ末端フラグメントに特異的でない。）、感度および特異性の増大した（すなわち、ラミニン５を検出しない）診断試験も最初に確立する。
【０１７３】
したがって、ラミニンガンマ−２モノマーは、膀胱がんおよび結腸直腸がんなどのがんを、患者サンプル中で診断するため、または被験者もしくは患者における膀胱がんおよび結腸直腸がんなどのがんのリスクもしくは進行の予後を提供するために使用可能である。同様に、ラミニンガンマ−２モノマーの上昇したレベルは、患者を、１つ以上のがん治療法を含む治療法の候補者として同定するために使用可能である。
【０１７４】
［実施例３］  自動化イムノアッセイ装置ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（商標）のためのプロトタイプ試薬の確立
ラミニンガンマ−２モノマーの検出のための自動化イムノアッセイ試薬中にＥＬＩＳＡ試薬を移行させるために、一連の実験を実施した。
【０１７５】
Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）上にモノクローナル抗体２Ｈ２をコーティングした。次いで、カルボキシル基で修飾した微粒子をＭＥＳバッファー（ｐＨ５．５）で洗浄し、その後、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチル−カルボジイミドハイドロクロライド（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＭＥＳバッファーを微粒子に添加した。室温における３０分間のインキュベーション後、試薬を洗い流し、ＭＥＳバッファーで希釈した抗体を微粒子に添加した。この反応における抗体の最終濃度は、０．３ｍｇ／ｍＬであった。室温における２時間のインキュベーション後、１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳで微粒子を洗浄し、セ氏２−８度で貯蔵した。
【０１７６】
（ＥＬＩＳＡにおいて検出抗体として使用する）ヒトラミニンガンマ−２のドメインＩＩＩに対するウサギポリクローナル抗体を、０．５％ＣＨＡＰＳを含有するＰＢＳバッファー中でアクリジニウムとコンジュゲーションした。Ｚｅｂａ  Ｍｉｃｒｏ  Ｄｅｓａｌｔ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）によって、過剰のアクリジニウムを除去した。１％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸バッファーに基づいて、アッセイサンプル希釈剤を調製した。
【０１７７】
ｉ２０００  ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（商標）アナライザーにおいてＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（商標）アッセイを実施した。組換えラミニンガンマ−２モノマーをサンプル希釈剤（１％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）中に添加した。この実験のためのラミニンガンマ−２モノマーの較正物質範囲は、０−２０ｎｇ／ｍＬに及んだ（０．００、０．０１、０．０２、０．１０、１．００、１０．００および２０．００ｎｇ／ｍＬ）。
【０１７８】
図６に示すように、予備的標準曲線は、アッセイの分析感度が、約またはおよそ１０ｐｇ／ｍＬであると実証した。したがって、該アッセイはかなり鋭敏である。
【０１７９】
ラミニンガンマ−２モノマーを添加したがん検体および正常検体を用いる希釈直線性分析
５つの正常検体を用いて、希釈直線性のさらなる評価を実施した。正常検体に、組換えラミニンガンマ−２モノマーを添加した。添加された検体を、サンプル希釈剤で希釈して、一連の３倍希釈物を作製した。図７に示すように、希釈係数は、１：８１から１：３（すなわち、８１倍から３倍希釈）に及ぶ。結果は、５つの正常検体における（無添加に対して）１００−１１３％の平均回収率を実証した。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（商標）における予備的アッセイは、希釈直線性試験に関して良好な性能を示した。
【０１８０】
市販の正常検体の評価
全部で６６個の正常検体を、ＰｒｏＭｅｄＤｘ（Ｎｏｒｔｏｎ、ＭＡ）、ＫＡＣ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）、ＳｅｒａＣａｒｅ  ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）およびＣｏｍｐｌｅｘ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｆｏｒｔ  Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ、ＦＬ）を含む数社の製造供給元から購入した。正常検体中のラミニンガンマ−２モノマーレベルを、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（商標）により測定した。結果を図８に示す。正常検体のメジアン値は、４６．０ｐｇ／ｍＬ、９５パーセンタイルは９５．０ｐｇ／ｍＬであった。平均値（６４個の正常検体：２４９６ｐｇ／ｍＬおよび３０２ｐｇ／ｍＬの２検体を除外した）は、５０．２ｐｇ／ｍＬであった。（２４９６ｐｇ／ｍＬおよび３０２ｐｇ／ｍＬの２検体を除外した）標準偏差の分析から、標準偏差値は、１７．８ｐｇ／ｍＬ、平均プラス２標準偏差（適切なカットオフ値）は、８５．８ｐｇ／ｍＬであった。
【０１８１】
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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