(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質ベースの認識分子（PBRM）と結合するために有効である式（Id）の高分子足場：
【化１】
0006420331.tif 000197
（式中、
該足場は、2kDa〜40kDaの範囲の分子量を有する、ポリ（1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチル−ホルマール）（PHF）を含み；
Dの各存在は、独立して5kDa以下の分子量を有する治療薬であり、そして、Dとカルボニル基の間の
【化２】
0006420331.tif 000198
はDの直接又は間接的なカルボニル基への結合を意味し、
XはCH2、O、又はNHであり；
mは1〜300の整数であり、
m1は1〜140の整数であり、
m7は1〜40の整数であり、
m3は1〜18の整数であり、そして
m、m1、m3、及びm7の合計は15〜300の範囲である）。
【請求項２】
前記PHFが2kDa〜20kDaの範囲の分子量を有し、m7は1〜20の整数であり、m3は1〜10の整数であり、m1は1〜70の整数であり、そして、m、m1、m3、及びm7の合計は15〜150の範囲である、請求項1に記載の足場。
【請求項３】
前記PHFが3kDa〜15kDaの範囲の分子量を有し、m7は2〜15の整数であり、m3は1〜8の整数であり、m1は2〜50の整数であり、そして、m、m1、m3、及びm7の合計は20〜110の範囲である、請求項1に記載の足場。
【請求項４】
前記PHFが5kDa〜10kDaの範囲の分子量を有し、m7は3〜10の整数であり、m3は1〜5の整数であり、m1は5〜35の整数であり、そして、m、m1、m3、及びm7の合計は40〜75の範囲である、請求項1に記載の足場。
【請求項５】
Dの各存在が、独立して、アウリスタチン化合物、トポイソメラーゼ阻害剤、カリケアマイシン化合物、ビンカ化合物、チューブリシン化合物、デュオカルマイシン化合物、ピロロベンゾジアゼピン化合物、キナーゼ阻害剤、KSP阻害剤、マイタンシノイド、DNA結合剤、DNAアルキル化剤又はDNAインターカレーター、RNAポリメラーゼ阻害剤、タンパク質合成阻害剤；並びにその類似体から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の足場。
【請求項６】
式（Ia）：
【化３】
0006420331.tif 000199
（式中、
m2は1〜40の整数であり、そして
m、m1、m2及びm3の合計は15〜300の範囲である）
を有する、請求項1に記載の足場。
【請求項７】
前記PHFが2kDa〜20kDaの範囲の分子量を有し、m2は1〜20の整数であり、m3は1〜10の整数であり、m1は1〜70の整数であり、そして、m、m1、m2、及びm3の合計は15〜150の範囲である、請求項6に記載の足場。
【請求項８】
前記PHFが3kDa〜15kDaの範囲の分子量を有し、m2は2〜15の整数であり、m3は1〜8の整数であり、m1は2〜50の整数であり、そして、m、m1、m2、及びm3の合計は20〜110の範囲である、請求項6に記載の足場。
【請求項９】
前記PHFが5kDa〜10kDaの範囲の分子量を有し、m2は3〜10の整数であり、m3は1〜5の整数であり、m1は5〜35の整数であり、そして、m、m1、m2、及びm3の合計は40〜75の範囲である、請求項6に記載の足場。
【請求項１０】
式（A）：
【化４】
0006420331.tif 000200
（式中、
PHFは、5kDa〜10kDaの範囲の分子量を有し；
mは1〜75の整数であり、
m1は5〜35の整数であり、
m2は3〜10の整数であり、
m3は1〜5の整数であり、
m、m1、m2、及びm3の合計は40〜75の範囲である）
を有する、請求項６に記載の足場。
【請求項１１】
マレイミド基を介してPHFに結合されるPBRMをさらに含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の足場。
【請求項１２】
PBRMに結合されるとき、式（Ie）：
【化５】
0006420331.tif 000201
（式中、
Xa及びXbの一方がHであり、もう片方がマレイミドブロッキング部分であるか、又はXa及びXbは、それらが結合している炭素原子と一緒に、炭素−炭素二重結合を形成し；
m3aは0〜17の整数であり、
m3bは1〜8の整数であり、ここで、m3aとm3bの合計はm3であり、
m、m1、m7、m3a、及びm3bの合計は15〜300の範囲であり、そして、
m5は1〜10の整数である）
の足場である、請求項11に記載の足場。
【請求項１３】
PBRMに結合されるとき、式（Ib）：
【化６】
0006420331.tif 000202
（式中、
Xa及びXbの一方がHであり、もう片方がマレイミドブロッキング部分であるか、又はXa及びXbは、それらが結合している炭素原子と一緒に、炭素−炭素二重結合を形成し；
m3aは0〜17の整数であり、
m3bは1〜8の整数であり、ここで、m3aとm3bの合計はm3であり、
m、m1、m2、m3a、及びm3bの合計は15〜300の範囲であり、そして、
m5は1〜10の整数である）
となる、請求項11に記載の足場。
【請求項１４】
前記PHFが2kDa〜20kDaの範囲の分子量を有し、m、m1、m2、m3a、及びm3bの合計は15〜150の範囲であり、そして、m1は1〜70の整数であり、m2は1〜20の整数であり、m3aは0〜9の整数であり、m3bは1〜8の整数であり、そして、m5は2〜8の整数である、請求項13に記載の足場。
【請求項１５】
前記PHFが3kDa〜15kDaの範囲の分子量を有し、m、m1、m2、m3a、及びm3bの合計は20〜110の範囲であり、そして、m1は2〜50の整数であり、m2は2〜15の整数であり、m3aは0〜7の整数であり、m3bは1〜8の整数であり、そして、m5は2〜4の整数である、請求項13に記載の足場。
【請求項１６】
前記PHFが5kDa〜10kDaの範囲の分子量を有し、m、m1、m2、m3a、及びm3bの合計は40〜75の範囲であり、そして、m1は5〜35の整数であり、m2は3〜10の整数であり、m3aは0〜4の整数であり、m3bは1〜5の整数であり、そして、m5は2〜4の整数である、請求項13に記載の足場。
【請求項１７】
式（B）：
【化７】
0006420331.tif 000203
（式中、
PHFは、5kDa〜10kDaの範囲の分子量を有し；
mは1〜75の整数であり、
m1は5〜35の整数であり、
m2は3〜10の整数であり、
m3aは0〜4の整数であり、
m3bは1〜5の整数であり、
m、m1、m2、m3a、及びm3bの合計は40〜75の範囲であり、そして、
m5は2〜4の整数である）
を有する、請求項13に記載の足場。
【請求項１８】
前記PBRMが40kDa超の分子量を有する、請求項1〜17のいずれか1項に記載の足場。
【請求項１９】
式（Ic）：
【化８】
0006420331.tif 000204
（式中、
足場は、2kDa〜40kDaの範囲の分子量を有するPHFを含み；
XはCH2、O、又はNHであり；
mは1〜300の整数であり、
m6は2〜180の整数であり、
m3は1〜18の整数であり、
m、m6、及びm3の合計は15〜300の範囲である）
の高分子足場。
【請求項２０】
請求項11〜18のいずれか1項に記載の足場及び医薬的に許容される担体を含んでなる、医薬組成物。
【請求項２１】
治療法における使用のための、請求項1〜19のいずれか1項に記載の足場又は請求項20に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
癌の処置用であり、前記癌は好ましくは、肛門癌、星状細胞腫、白血病、リンパ腫、頭頚部癌、肝臓癌、精巣癌、子宮頚癌、肉腫、血管腫、食道癌、眼癌、喉頭癌、口腔癌（mouth cancer）、中皮腫、皮膚癌、骨髄腫、口腔癌（oral cancer）、直腸癌、咽喉癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、及び胃癌から成る群から選択される、請求項11〜18のいずれか1項に記載の足場又は請求項20に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、35 USC §119（e）に基づき、2013年10月11日に出願された米国特許出願第61／890,046号；2014年4月4日に出願された同第61／975,455号；2014年5月2日に出願された同第61／988,011号；及び2014年6月11日に出願された同第62／010,972号の優先権を主張する。これらの出願の内容は、参照によりその全体を本明細書中に援用する。
【背景技術】
【０００２】
伝統的に、医薬品は、主に、経口的に（固体丸薬及び液剤として）又は注射剤として施与される小分子からなっている。過去30年間で、配合物（すなわち、薬剤送達の経路及び/又は速度を制御し、それが必要とされる部位における治療薬の送達を可能にする組成物）が、ますます普及し複雑化している。それにもかかわらず、新しい治療法の開発、並びにそれらを投与するための機構に関する多くの疑問及び課題は対処されないままである。例えば、多くの薬剤は、一般に、それらが体内の所望の標的又は標的以外の組織に達するか、或いはその両方に蓄積する前に、部分分解にさらされるため、制限されたか、又は別の方法で低減された効力及び治療効果を示す。
【０００３】
そのため、薬剤送達システムの分野における目的の1つは、生理学的又は化学的機構のいずれか、又はその両方を利用した薬剤を安定させることができる、或いは治療薬のインビボ移行を制御することが可能であるシステムを通じて、特に体の標的とされた領域に完全なままの医薬を送達することである。
【０００４】
抗体−医薬コンジュゲートは、標的に特異的な治療薬として開発された。様々な癌細胞表面抗原に対する抗体が、様々な不可欠の細胞標的、例えば、微小管（マイタンシノイド、アウリスタチン、タキサン：米国特許第5,208,020号；同第5,416,064号；同第6,333,410号；同第6,441,163号；同第6,340,701号；同第6,372,738号；同第6,436,931号；同第6,596,757号；及び同第7,276,497号）；DNA（カリケアマイシン、ドキソルビシン、CC-1065類似体：米国特許第5,475,092号；同第5,585,499号；同第5,846,545号；同第6,534,660号；同第6,756,397号；及び同第6,630,579号）などを阻害する種々の細胞毒性薬と結合された。これらの細胞毒性薬の一部を用いた抗体コンジュゲートは、癌療法向けの病院において活発に調査されている（Ricart、A. D.、and Tolcher、A. W.、2007、Nature Clinical Practice、4、245-255; Krop et al.、2010、J. Clin. Oncol.、28、2698-2704）。しかしながら、既存の抗体−医薬コンジュゲートには、いくつかの制限が見られた。主な制限は、限られた数の標的抗原のため、それらが十分な濃度の薬剤を標的部位に送達できないため、並びにメトトレキサート、ダウノルビシン、マイタンシノイド、タキサン、及びビンクリスチンのような制癌剤の比較的中程度の細胞毒性のためである。著しい細胞毒性を達成するための1つのアプローチは、抗体への直接的又は間接的な多くの薬剤分子の連結である。しかしながら、こうした大きく修飾された抗体は、標的抗原への結合障害や、血流からの速いインビボクリアランスを示すことが多い。そのため、薬剤の最大の細胞毒性が達成されるように、十分な濃度の薬剤を標的に送達する能力を改善することが必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、生分解性であり、且つ、生物適合性であり、そして、高い薬剤負荷、並びに標的抗原に対する強い結合を示すタンパク質−高分子−薬剤コンジュゲートに関する。本発明はまた、タンパク質−高分子−薬剤コンジュゲートを得るためにタンパク質ベースの認識分子（PBRM）と結合することに有効である高分子足場にも関する。
【０００６】
別の態様において、本発明は、タンパク質ベースの認識分子（PBRM）と結合するために有効である式（Id）：
【化１】
0006420331.tif 000002
（式中、
足場は、約2kDa〜約40kDaの範囲の分子量を有する、ポリ（1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチル−ホルマール）（PHF）を含み；
Dの各存在は、独立して≦5kDaの分子量を有する治療薬であり、そして、Dとカルボニル基の間の
【化２】
0006420331.tif 000003
はDの直接又は間接的なカルボニル基への結合を意味し、
XはCH2、O、又はNHであり、
mは1〜約300の整数であり、
m1は1〜約140の整数であり、
m7は1〜約40の整数であり、
m3は1〜約18の整数であり、
m、m1、m3、及びm7の合計は約15〜約300の範囲である）
の高分子足場に関する。
【０００７】
式（Id）の足場は、以下の特徴のうちの１以上を含み得る：
【０００８】
式（Id）のPHFが約2kDa〜約20kDaの範囲の分子量を有するとき、m7は1〜約20の整数であり、m3は1〜約10の整数であり、m1は1〜約70の整数であり、そして、m、m1、m3、及びm7の合計は約15〜約150の範囲である。
【０００９】
式（Id）のPHFが約3kDa〜約15kDaの範囲の分子量を有するとき、m7は2〜約15の整数であり、m3は1〜約8の整数であり、m1は2〜約50の整数であり、そして、m、m1、m3、及びm7の合計は約20〜約110の範囲である。
【００１０】
式（Id）のPHFが約5kDa〜約10kDaの範囲の分子量を有するとき、m7は約3〜約10の整数であり、m3は1〜約5の整数であり、m1は約5〜約35の整数であり、そして、m、m1、m3、及びm7の合計は約40〜約75の範囲である。
【００１１】
式（Id）の「m3」ユニットのマレイミド部分の各存在は、PBRMの官能基との共有結合をまだ形成していない。
【００１２】
一実施形態において、m1とm7の合計は2〜約180の整数である。
【００１３】
式（Id）の足場はさらに、タンパク質−高分子−薬剤コンジュゲートを形成するD含有足場の1以上マレイミド基を介してD含有足場に結合されるPBRMを含んでもよい。例えば、式（Id）の足場はさらに、足場の2以上（例えば、最大5）のマレイミド基を介してD含有足場に結合される1つのPBRMを含む。例えば、1つのPBRMが、1又は2以上の式（Id）のD含有高分子足場に接続される。
【００１４】
特定の実施形態において、PBRMに結合されるとき、高分子医薬コンジュゲート（Id）は、式（Ie）：
【化３】
0006420331.tif 000004
（式中、
Xa及びXbの一方がHであり、もう片方がマレイミドブロッキング部分であるか、又はXa及びXbは、それらが結合している炭素原子と一緒に、炭素−炭素二重結合を形成し；
m3aは0〜約17の整数であり、
m3bは1〜約8の整数であり、ここで、m3aとm3bの合計はm3であり、
m、m1、m7、m3a、及びm3bの合計は約15〜約300の範囲であり、そして、
m5は1〜約10の整数である）
のコンジュゲートである。
【００１５】
式（Id）のタンパク質−高分子−薬剤コンジュゲートでは、各Dは、同じ部分であっても異なった部分であってもよく、各PBRMは、同じ部分であっても異なった部分であってもよく。
【００１６】
特定の実施形態において、DとPBRMの間の比が、約30：1、29：1、28：1、27：1、26：1、25：1、24：1、23：1、22：1、21：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1又は6：1であり得る。
【００１７】
いくつかの実施形態において、DとPBRMの間の比は、約20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1又は10：1であり得る。
【００１８】
他の実施形態において、DとPBRMの間の比は、約18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1又は12：1であり得る。
【００１９】
特定の実施形態において、PHFとPBRMの間の比は、約10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、又は2：1であり得る。
【００２０】
いくつかの実施形態において、PHFとPBRMの間の比は、約6：1、5：1、4：1、3：1、又は2：1であり得る。
【００２１】
他の実施形態において、PHFとPBRMの間の比は、約4：1、3：1、又は2：1であり得る。
【００２２】
一実施形態において、Dは、a）アウリスタチン化合物；（b）カリケアマイシン化合物；（c）デュオカルマイシン化合物；（d）トポイソメラーゼ阻害剤；（e）ピロロベンゾジアゼピン化合物；（f）ビンカ化合物；（g）タンパク質合成阻害剤；（h）RNAポリメラーゼ阻害剤；（i）チューブリン結合化合物；又はその類似体である。
【００２３】
特定の実施形態において、Dは、a）アウリスタチン化合物；（b）カリケアマイシン化合物；（c）デュオカルマイシン化合物；（d）カンプトテシン化合物；（e）ピロロベンゾジアゼピン化合物；（f）ビンカ化合物；又はその類似体である。
【００２４】
一実施形態において、アウリスタチン化合物は、アウリスタチン、ドラスタチン、モノメチルアウリスタチンE（MMAE）、モノメチルアウリスタチンF（MMAF）、アウリスタチンFヒドロキシプロピルアミド（AF HPA）、又はアウリスタチンFフェニレンジアミン（AFP）である。
【００２５】
一実施形態において、デュオカルマイシン又はその類似体は、デュオカルマイシンA、デュオカルマイシンB1、デュオカルマイシンB2、デュオカルマイシンC1、デュオカルマイシンC2、デュオカルマイシンD、デュオカルマイシンSA、CC-1065、アドゼレシン、ビゼレシン、又はカルゼレシンである。
【００２６】
一実施形態において、カンプトテシン化合物は、カンプトテシン、CPT-11（イリノテカン）、SN-38、又はトポテカンである。
【００２７】
一実施形態において、ピロロベンゾジアゼピン化合物は、ピロロベンゾジアゼピンモノマー、対称のピロロベンゾジアゼピン二量体又は非対称ピロロベンゾジアゼピン二量体である。
【００２８】
一実施形態において、DはAF HPAであり、AF HPAとPBRMの間の比は、約30：1、29：1、28：1、27：1、26：1、25：1、24：1、23：1、22：1、21：1、25：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1又は6：1である。
【００２９】
別の実施形態において、AF HPAとPBRMの間の比は、約20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1又は10：1である。
【００３０】
更に他の実施形態、AF HPAとPBRMの間の比は、約18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1又は12：1である。
【００３１】
別の態様において、本発明は、タンパク質ベースの認識分子（PBRM）と結合するために有効である式（Ia）：
【化４】
0006420331.tif 000005
（式中、
足場は、約2kDa〜約40kDaの範囲の分子量を有する、ポリ（1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチル−ホルマール）（PHF）を含み；
XはCH2、O、又はNHであり；
mは1〜約300の整数であり、
m1は1〜約140の整数であり、
m2は1〜約40の整数であり、
m3は1〜約18の整数であり、
m、m1、m2、及びm3の合計は約15〜約300の範囲である）
の高分子足場に関する。
【００３２】
式（Ia）の足場は、以下の特徴のうちの1以上を含み得る：
【００３３】
式（Ia）のPHFが約2kDa〜約20kDaの範囲の分子量を有するとき、m2は1〜約20の整数であり、m3は1〜約10の整数であり、m1は1〜約70の整数であり、m、m1、m2、及びm3の合計は約15〜約150の範囲である。
【００３４】
式（Ia）のPHFが約3kDa〜約15kDaの範囲の分子量を有するとき、m2は2〜約15の整数であり、m3は1〜約8の整数であり、m1は2〜約50の整数であり、m、m1、m2、及びm3の合計は約20〜約110の範囲である。
【００３５】
式（Ia）のPHFが約5kDa〜約10kDaの範囲の分子量を有するとき、m2は約3〜約10の整数であり、m3は1〜約5の整数であり、m1は約5〜約35の整数であり、m、m1、m2、及びm3の合計は約40〜約75の範囲である。
【００３６】
式（Ia）の「m3」ユニットのマレイミド部分の各存在は、PBRMの官能基との共有結合をまだ形成していない。
【００３７】
一実施形態において、式（Ia）の足場は、式（A）又は（A1）：
【化５】
0006420331.tif 000006
（式中、
PHFは、約5kDa〜約10kDaの範囲の分子量を有し；
mは1〜約75の整数であり、
m1は約5〜約35の整数であり、
m2は約3〜約10の整数であり、
m3は1〜約5の整数であり、
m、m1、m2、及びm3の合計は40〜約75の範囲である）
の足場である。
【００３８】
例えば、式（A）又は（A1）の「m3」ユニットのマレイミド部分の各存在は、PBRMの官能基との共有結合をまだ形成していない。
【００３９】
式（Ia）の足場はさらに、高分子足場の1又は2以上のマレイミド基を介して足場に結合されるPBRMを含む。例えば、式（Ia）の足場はさらに、足場の2以上（例えば、最大5）のマレイミド基を介して足場に結合される1つのPBRMを含む。
【００４０】
PBRMは、約40kDa超（例えば、60kDa超；80kDa超；100kDa超；120kDa超；140kDa超；160kDa超；180kDa超；若しくは200kDa超、又は40〜200kDa、40〜180kDa、40〜140kDa、60〜200kDa、60〜180kDa、60〜140kDa、80〜200kDa、80〜180kDa、80〜140kDa、100〜200kDa、100〜180kDa、若しくは100〜140kDa）の分子量を有する。
【００４１】
PBRMは、約40kDa超（例えば、60kDa超；80kDa超；100kDa超；120kDa超；140kDa超；160kDa超；180kDa超；若しくは200kDa超、又は40〜200kDa、40〜180kDa、40〜140kDa、60〜200kDa、60〜180kDa、60〜140kDa、80〜200kDa、80〜180kDa、80〜140kDa、100〜200kDa、100〜180kDa、若しくは100〜140kDa）の分子量を有し、且つスルフヒドリル（すなわち、−SH又はチオール）基を有する。
【００４２】
PBRMは、薬剤担持高分子コンジュゲートのマレイミド基に接続されたPBRMのスルフヒドリル基を介して薬剤担持高分子コンジュゲートに結合される、例えば、本明細書中に開示した式のいずれか、例えば、式（Ib）、（B）、（B1）又は（Ie）の括弧内の「m3b」ユニットの硫黄原子（−S−）を参照のこと。実施形態において、硫黄原子は、PBRMの一部であり、薬剤担持高分子コンジュゲートとの結合（スルフィド結合）を形成するマレイミド基と反応されるPBRMのスルフヒドリル（チオール）基から得られる。
【００４３】
1つのPBRMが、1又は2以上の式（Ia）の薬剤担持高分子足場に接続される。
【００４４】
PBRMを含む足場は、式（Ib）：
【化６】
0006420331.tif 000007
（式中、
Xa及びXbの一方がHであり、もう片方がマレイミドブロッキング部分であるか、又はXa及びXbは、それらが結合している炭素原子と一緒に、炭素−炭素二重結合を形成し；
m3aは0〜約17の整数であり、
m3bは1〜約8の整数であり、ここで、m3aとm3bの合計はm3（例えば、1〜約18の整数）であり、
m、m1、m2、m3a、及びm3bの合計は約15〜約300の範囲であり、そして、
m5は1〜約10の整数である）
の足場である。
【００４５】
式（Ib）の足場は、以下の特徴のうちの1以上を含み得る：
【００４６】
PBRMは、約40kDa超（例えば、60kDa超；80kDa超；100kDa超；120kDa超；140kDa超；160kDa超；180kDa超；若しくは200kDa超、又は40〜200kDa、40〜180kDa、40〜140kDa、60〜200kDa、60〜180kDa、60〜140kDa、80〜200kDa、80〜180kDa、80〜140kDa、100〜200kDa、100〜180kDa、若しくは100〜140kDa）の分子量を有する。
【００４７】
PBRMは、スルフヒドリル（すなわち、−SH又はチオール）基を有する。
【００４８】
PHFとPBRMの間で形成された共有結合（例えば、スルフィド結合）の総数（又は、結合点の総数）は10以下である。
【００４９】
式（Ib）のPHFが約2kDa〜約20kDaの範囲の分子量を有するとき、m、m1、m2、m3a、及びm3bの合計は約15〜約150の範囲であり、そして、m1は1〜約70の整数であり、m2は1〜約20の整数であり、m3aは0〜約9の整数であり、m3bは1〜約8の整数であり、m5は2〜約8の整数である。
【００５０】
式（Ib）のPHFが約3kDa〜約15kDaの範囲の分子量を有するとき、m、m1、m2、m3a、及びm3bの合計は約20〜約110の範囲であり、そして、m1は2〜約50の整数であり、m2は2〜約15の整数であり、m3aは0〜約7の整数であり、m3bは1〜約8の整数であり、m5は2〜約4の整数である。
【００５１】
式（Ib）のPHFが約5kDa〜約10kDaの範囲の分子量を有するとき、m、m1、m2、m3a、及びm3bの合計は約40〜約75の範囲であり、そして、m1は約5〜約35の整数であり、m2は約3〜約10の整数であり、m3aは0〜約4の整数であり、m3bは1〜約5の整数であり、m5は2〜約4の整数である。
【００５２】
特定の実施形態において、アウリスタチンFヒドロキシルプロピルアミド（「AF HPA」）とPBRMの間の比は、約30：1、29：1、28：1、27：1、26：1、25：1、24：1、23：1、22：1、21：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1又は6：1である。
【００５３】
いくつかの実施形態において、AF HPAとPBRMの間の比は、約20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1又は10：1である。
【００５４】
他の実施形態において、AF HPAとPBRMの間の比は、約18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1又は12：1である。
【００５５】
特定の実施形態において、PHFとPBRMの間の比は、約10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1又は2：1である。
【００５６】
いくつかの実施形態において、PHFとPBRMの間の比は、約6：1、5：1、4：1、3：1又は2：1である。
【００５７】
他の実施形態において、PHFとPBRMの間の比は、約4：1、3：1又は2：1である。
【００５８】
マレイミド阻害部分（例えば、Xa又はXb）は、式（II）：
【化７】
0006420331.tif 000008
（式中、
R90はNHR91、OH、COOR93、CH（NHR91）COOR93又は置換されたフェニル基であり；
R93は水素又はC1-4アルキルであり；
R91は水素、CH3又はCH3COであり、そして、
dは1〜3の整数である）
のチオール含有化合物とマレイミド基の反応によって2つのオレフィン炭素原子のうちの1つと共有結合され得る部分である。
【００５９】
一実施形態において、式（II）のマレイミドブロッキング化合物は、システイン、N−アセチルシステイン、システインメチルエステル、N−メチルシステイン、2−メルカプトエタノール、3−メルカプトプロパン酸、2−メルカプト酢酸、メルカプトメタノール（すなわち、HOCH2SH）、フェニルが1又は2以上の親水性置換基によって置換されたベンジルチオール、又は3−アミノプロパン-1−チオールであり得る。フェニルに対する1又は2以上の親水性置換基はOH、SH、メトキシ、エトキシ、COOH、CHO、COC1-4アルキル、NH2、F、シアノ、SO3H、PO3Hなどを含む。
【００６０】
別の態様において、マレイミドブロック基は、−S−（CH2）d−R90であって、構造中、R90はOH、COOH、又はCH（NHR91）COOR93であり；
R93は水素又はCH3であり；
R91は水素又はCH3COであり；そして、
dは1又は2である。
【００６１】
別の実施形態において、マレイミドブロック基は、−S−CH2−CH（NH2）COOHである。
【００６２】
いくつかの実施形態において、マレイミドブロック基は、水溶性である。
【００６３】
式（Ib）の足場は、式（B）又は（B1）：
【化８】
0006420331.tif 000009
（式中、
PHFは、5kDa〜10kDaの範囲の分子量を有し；
mは1〜75の整数であり、
m1は約5〜約35の整数であり、
m2は約3〜約10の整数であり、
m3aは0〜約4の整数であり、
m3bは1〜約5の整数であり、
m、m1、m2、m3a、及びm3bの合計は約40〜約75の範囲であり、そして、
m5は2〜約4の整数である）
の足場である。
【００６４】
特定の実施形態において、式（B）又は（B1）では、結合点の合計数は10以下である。
【００６５】
本発明はまた、式（Ic）：
【化９】
0006420331.tif 000010
（式中、
足場は、約2kDa〜約40kDaの範囲の分子量を有するPHFを含み；
XはCH2、O、又はNHであり；
mは1〜約300の整数であり、
m6は2〜約180の整数であり、
m3は1〜約18の整数であり、
m、m6、及びm3の合計は約15〜約300の範囲である）
の高分子足場も提供する。
【００６６】
式（Ic）の足場は、以下の特徴のうちの1以上を含み得る：
【００６７】
式（Ic）のPHFが約2kDa〜約20kDaの範囲の分子量を有するとき、m、m6、及びm3の合計は約15〜約150の範囲であり、m6は2〜約90の整数であり、そして、m3は1〜約10の整数である。
【００６８】
式（Ic）のPHFが約3kDa〜約15kDaの範囲の分子量を有するとき、m、m6、及びm3の合計は約20〜約110の範囲であり、m6は約4〜約65の整数であり、そして、m3は1〜約8の整数である。
【００６９】
式（Ic）のPHFが約5kDa〜約10kDaの範囲の分子量を有するとき、m、m6、及びm3の合計は約40〜約75の範囲であり、m6は約8〜約45の整数であり、そして、m3は1〜約5の整数である。
【００７０】
式（Ic）の「m3」ユニットのマレイミド部分の各存在は、PBRMの官能基との共有結合をまだ形成していない。
【００７１】
式（Ic）の足場は、式（C）又は（C1）：
【化１０】
0006420331.tif 000011
（式中、
PHFは、約5kDa〜約10kDaの範囲の分子量を有し；
mは1〜約75の整数であり、
m6は約8〜約45の整数であり、
m3は1〜約5の整数であり、そして、
m、m6、及びm3の合計は約40〜約75の範囲である）
の足場である。
【００７２】
式（C）又は（C1）の「m3」ユニットのマレイミド部分の各存在は、PBRMの官能基との共有結合をまだ形成していない。
【００７３】
式（Ic）の足場は、PHFに接続された1又は2以上の薬剤分子（「D」）をさらに含み得る。
【００７４】
一実施形態において、式（Ic）のD含有足場は、式（Id）の足場である。
【００７５】
本明細書中に開示された式、例えば式（Ia）、（Ib）、（Ic）、（Id）、（Ie）、（A）、（A1）、（B）、（B1）、（C）、（C1）又は（E）などでは、ポリアセタールユニット間の断線又はギャップは、該ユニットが順不同で互いに接続されることを示す。さらに、本明細書中に開示された特定の式（例えば、表D中の式）では、角括弧付き構造、すなわち、ポリアセタールモノマーユニットは、例示を簡素化する目的で反復単位（例えば、m1、m2、m3など）の数を伴っていないので、それぞれ1つの反復ユニットしか有していないと理解してはいけない。
【００７６】
PBRMの例としては、これだけに限定されるものではないが、完全長の抗体、例えばIgGやIgMなど、抗体フラグメント、例えばFabs、scFv、scFvFc、ラクダ科動物抗体（camelids）、Fab2など、小タンパク質、及びペプチドが挙げられる。
【００７７】
一実施形態において、PBRMは、完全長抗体又はヒト化抗−5T4 scFvFc抗体である。例えば、PBRMは、ヒト癌胎児タンパク質5T4を標的とする免疫グロブリン又はその機能的な断片を含むリガンド（LG）である。
【００７８】
更なる実施形態において、抗腫瘍治療法において有効な治療薬とターゲッティングコンジュゲートが提供される。治療薬とターゲッティングコンジュゲートは、以下を含んでいる：
（a）ヒト癌胎児タンパク質5T4標的とする免疫グロブリン又はその機能的な断片をを含むリガンド（LG）、該リガンド（例えば、いくつかの実施形態において、約40kDa以上の分子量を有する）（b）の高分子足場のm5に結合し；ここで、m5は1〜約10であり；そして、
（b）約2kDa〜約40kDaの範囲の分子量を有するポリ（1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチル−ホルマール）（PHF）を含む高分子足場；ここで、該高分子足場は、ランダムに配列された、以下に規定したモノマーユニットm、m1、m2、m3a、及びm3bを含む：
（i）m3a：
【化１１】
0006420331.tif 000012
構造中、m3aは、不存在であるか、又は1〜約17個のモノマーm3aユニットが高分子足場内に存在し、そして、各ユニットでは、Xa及びXbが独立して、（A）一方がHであり、もう片方がマレイミドブロッキング部分であるか、又は（B）Xa及びXbが、それらが結合している炭素原子と一緒に、炭素−炭素二重結合を形成するか、から選択され；
（ii）m3b：
【化１２】
0006420331.tif 000013
構造中、スルフィド結合（−S−）はLGに対する結合点を形成し；そして、ここで、1〜約8個のモノマーm3bユニットが高分子足場内に存在し；ここで、m3aとm3bの合計は1〜18であり、且つここで、該硫黄原子はリガンド（LG）の一部であり；
（iii）m：
【化１３】
0006420331.tif 000014
構造中、1〜約300個のモノマーmユニットが高分子足場内に存在し；
（iv）m1：
【化１４】
0006420331.tif 000015
構造中、1〜約140個のモノマーm1ユニットが高分子足場内に存在し；そして
（v）m2：
【化１５】
0006420331.tif 000016
構造中、1〜約40個のモノマーm2ユニットが高分子足場内に存在し；
ここで、それぞれモノマーユニットm、m1、m2、m3a、及びm3bでは、XがCH2、O又はNHであり、m、m1、m2、m3a、及びm3bの合計が約15〜約300の範囲であり、そしてここで、Dの各存在は独立して、≦5kDaの分子量を有する治療薬であり、且つDとカルボニル基の間の
【化１６】
0006420331.tif 000017
はDの直接又は間接的なカルボニル基への結合を意味する。
【００７９】
一実施形態において、治療薬とターゲッティングコンジュゲートは、以下の構造：
【化１７】
0006420331.tif 000018
（構造中、
PHFは、5kDa〜10kDaの範囲の分子量を有し；
mは1〜75であり、m1は約5〜約35であり、m2は約3〜約10であり、m3aは0〜約4であり、m3bは1〜約5であり、m、m1、m2、m3a、及びm3bの合計は約40〜約75であり、そして、m5は2〜約4である）
を有する。
【００８０】
更なる実施形態において、抗腫瘍治療法で有効である治療用抗−5T4薬剤ターゲッティングコンジュゲートを提供する。該コンジュゲートは、約2kDa〜約40kDaの分子量を有するポリ（1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチル−ホルマール）（PHF）を含む高分子足場を含み；ここで、該コンジュゲートは、以下の構造：
【化１８】
0006420331.tif 000019
（構造中、
m5は1〜10であり；mは1〜約300の整数であり；m1は1〜約140の整数であり；m2は1〜約40の整数であり；m3aは0〜約17の整数であり；m3bは1〜約8の整数であり；ここで、m3aとm3bの合計は1〜約18の整数であり；且つm、m1、m2、及びm3の合計は約15〜約300の範囲であり；XはNHであり；Xa又はXbの一方がHであり、もう片方がマレイミドブロッキング部分であり；そして、Dの各存在が独立して、≦5kDaの分子量を有する治療薬である場合、Dとカルボニル基の間の
【化１９】
0006420331.tif 000020
はDの直接又は間接的なカルボニル基への結合を意味し；ここで、抗−5T4(ANTI-5T4)は、ヒト癌胎児抗原5T4に関して選択能力がある免疫グロブリン又はその機能的な断片を含む抗−5T4リガンドである）
のコンジュゲートである。例えば、抗−5T4の分子量は、少なくとも約40kDaである。
【００８１】
より一層更なる実施形態において、抗−5T4と、互いにランダムに接続され得る以下に示すユニット：
【化２０】
0006420331.tif 000021
（式中、
抗−5T4は、配列番号Aとして示されたアミノ配列を含む一本鎖抗体構築物であり；PHFは、約2kDa〜約40kDaの範囲の分子量を有し；高分子足場対抗−5T4抗体の比の平均は約2：1〜約3：1又は約3：1〜4：1であり、且つAF HPA対抗−5T4抗体の比は約12：1〜約18：1である）
を含むポリ（1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチル−ホルマール）（PHF）高分子足場を含む、抗腫瘍治療法に有効な治療薬及びターゲッティングコンジュゲートが提供される。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本発明の高分子足場は、ランダムに配列されたモノマーユニットm、m1、m2、m3a、及びm3bを含んでいる。いくつかの実施形態において、本発明の高分子足場は、ランダムに配列されたモノマーユニットm、m1、m2、及びm3bを含んでいる。
【００８３】
いくつかの実施形態において、本発明の高分子足場は、ランダムに配列されたモノマーユニットm、m1、m7、m3a、及びm3bを含んでいる。いくつかの実施形態において、本発明の高分子足場は、ランダムに配列されたモノマーユニットm、m1、m7、及びm3bを含んでいる。
【００８４】
別の態様において、本発明は、コンジュゲートを含んでいる組成物、その調製方法、及びこれだけに限定されるものではないが、癌を含めた様々な疾患の治療におけるその使用方法を提供する。対象とする癌は、肛門、星状細胞腫、白血病、リンパ腫、頭頸部、肝臓、精巣、頸部、肉腫、血管腫、食道、眼、喉頭、口腔（mouth）、中皮腫、皮膚、骨髄腫、口腔（oral）、直腸、咽喉、膀胱、乳房、子宮、卵巣、前立腺、肺、結腸、膵臓、腎臓、又は胃の癌であり得る。
【００８５】
本発明は更に、本明細書中に記載した高分子足場又はコンジュゲート及び医薬的に許容される担体を含んでなる医薬組成物に関する。
【００８６】
更に別の態様において、本発明は、疾患を患っていると疑われる対象における疾患の診断方法に関する。前記方法は、疾患を患っている対象に有効量の、本明細書中に記載のコンジュゲートを投与する方法、或いは対象が標的抗原又は受容体を発現しているか否かを判定するために、対象からのサンプル中の標的抗原／受容体を検出するためのアッセイを実行することを含む。
【００８７】
別段に定義されていない限り、本明細書で使用されている全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって共通して理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において、単数形は、その内容が別段に明確に定義されていない限り、複数形も包含する。本明細書に記載されているのと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、適切な方法及び材料を下記に記載する。本明細書で述べられている全ての出版物、特許出願、特許及び他の参照文献は、参照によって組み込まれる。本明細書で挙げられている参照文献は、特許請求の範囲に記載されている本発明の先行技術であることを認めるものではない。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書を優位とする。加えて、材料、方法及び例は単なる例示であり、制限を意図したものではない。
【００８８】
本発明の利点の1つは、本明細書中に記載するタンパク質−高分子−薬剤コンジュゲート又は高分子足場が、送達される薬剤の生物学的利用能を大いに増強する、及び／又は高分子担体に結合されるタンパク質の生物学的利用能を増強する点である。本発明の別の利点は、本明細書中に記載するタンパク質−高分子−薬剤コンジュゲートの有効性が、当該コンジュゲートの薬剤負荷を増大させるとともに増大するか、又は実質的に同等なまま維持されることである。本発明のさらに別の利点は、タンパク質のシステイン部位へのチオール連結を介したタンパク質−高分子コンジュゲートが、実質的に改善された安定性を示すことである。本発明の他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明及び請求項から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図1は、1日目に単回投与として投与したビヒクル；10mg／kgのPBRM（トラスツズマブ）；2.5mg／kg及び5mg／kgの実施例4又は実施例13に記載のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのIV投与後の、BT474腫瘍（各群n＝10）を皮下接種したマウスにおける腫瘍反応を示す。
【図２】図2は、1日目に単回投与として投与したビヒクル；10mg／kgのPBRM（トラスツズマブ）；2.5mg／kgの実施例4又は実施例7に記載のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのIV投与後の、JIMT-1細胞（各群n＝10）を皮下接種したマウスにおける腫瘍反応を示す。
【図３】図3は、1日目の単回投与として投与したビヒクル；20mg／kgのPBRM（リンツズマブ）；又は20mg／kgの実施例8に記載のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのIV投与後の、HL-60細胞（各群n＝10）を皮下接種したマウスにおける腫瘍反応を示す。
【図４】図4は、1日目の単回投与として投与したビヒクル；20mg／kgのPBRM（トラスツズマブ）；20mg／kgのカドサイラ（Kadcyla）（登録商標）；又は2mg／kg、0.67mg／kg若しくは0.3mg／kgの実施例14に記載のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのIV投与後の、JIMT-1細胞（各群n＝10）を皮下接種したマウスにおける腫瘍反応を示す。
【図５】図5は、1日目の単回投与として投与したビヒクル、又は3mg／kg、1mg／kg若しくは0.3mg／kgの実施例15に記載のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートとしてでIV投与後の、NCI−N87細胞（各群n＝10）を皮下接種したマウスにおける腫瘍反応を示す。
【図６】図6は、1日目の単回投与として投与したビヒクル、0.67mg／kgの実施例14に記載したPBRM−高分子−薬剤コンジュゲート、又は、3mg／kgの実施例16に記載のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのIV投与後の、NCI−N87細胞（各群n＝10）を皮下接種したマウスにおける腫瘍反応を示す。
【図７】図7は、1日目の単回投与として投与したビヒクル、0.67mg／kgの実施例33に記載のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲート；1mg／kgの実施例43Aに記載のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲート又は0.67mg／kg若しくは3mg／kgの実施例43Cに記載のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのIV投与後の、NCI−N87細胞（各群n＝10）を皮下接種したマウスにおける腫瘍反応を示す。
【図８】図8は、1日目の単回投与として投与したビヒクル、0.22mg／kgの実施例5Aに記載の高分子−薬剤コンジュゲート；又は、それぞれ2mg／kgの実施例30B若しくは実施例30Cに記載のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲート；0.67mg／kgの実施例40に記載のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲート、若しくは1mg／kgの実施例43Bに記載のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲート；又は10mg／kgの実施例38に記載のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲート；又は10mg／kgの実施例39に記載のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲート（それぞれ、週に1回、3週間にわたり投与した）のIV投与後の、NCI−N87細胞（各群n＝10）を皮下接種したマウスにおける腫瘍反応を示す。
【図９】図9は、1日目の単回投与として投与したビヒクル；1mg／kgの実施例40及び2mg／kgの実施例43CのIV投与後の、JIMT-1細胞（各群n＝10）を皮下接種したマウスにおける腫瘍反応を示す。
【図１０】図10は、3匹の動物／時点、5mg／kgの実施例4に記載のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのIVボーラス投与後の、BT474腫瘍を皮下接種したマウスにおける結合AF HPA（合計）、非結合AF HPAとAF（「遊離AF−HPA」とも示される）、及びトラスツズマブの血漿PKを示す。
【図１１】図11は、表面プラズモン共鳴法によって評価されたヒト5T4細胞外ドメインへの5T4特異的scADCの親和性と動力学を例示する。結合親和性（＜30pMのKD）は非結合抗−5T4 scFvFcのも結合親和性と類似している。
【図１２】図12は、A431腫瘍異種移植モデルで評価される、5T4特異的scADCの抗腫瘍有効性を例示する。腫瘍体積を指定された日に測定する。値を平均±SEMとして表す。統計解析を、Graph Pad Prism（バージョン5）を使用したBonferroni事後検定が後に続く二元配置分散分析（Two-way ANOVA）によっておこなった。
【図１３】図13は、MDA−MB−231 5T4を過剰発現する形質移入体の腫瘍異種移植片を担持しているヌードマウスにおける5T4特異的scADCの抗腫瘍有効性を例示する。値を平均±SEMとして表す。統計解析を、Graph Pad Prism（バージョン5）を使用したBonferroni事後検定が後に続く二元配置分散分析によっておこなった。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
本発明の特定の好ましい実施形態についての詳細な説明
本発明は、新規なタンパク質−高分子−薬剤コンジュゲート、そのコンジュゲートを作製するための高分子足場、そのコンジュゲート又は高分子足場を作製するための合成方法、それらを含んでなる医薬組成物、及びそのコンジュゲートの様々な用途を供する。
【００９１】
本発明はまた、新規な高分子−薬剤コンジュゲート、そのコンジュゲートを作製するための合成方法、それらを含んでなる医薬組成物、及びそのコンジュゲートの様々な用途を供する。
【００９２】
本発明は、新規な薬剤誘導体、その誘導体を作製するための合成方法、それらを含んでなる医薬組成物、及びその薬剤誘導体の様々な用途を更に供する。
【００９３】
定義／専門用語
本発明のある種の化合物、及び特定の官能基の定義はまた、本明細書中で更に詳細に記述されている。本発明の目的のために、その化学元素は、the Periodic Table of the Elements, CAS version, Handbook of Chemistry and Physics,75th Ed.（内表紙）で同定されており、また、特定の官能基は、一般に、本明細書中で記述のように、定義されている。更に、有機化学の一般的な原理だけでなく、特定の官能部分及び反応性は、“Organic Chemistry”, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999で記述されており、その全内容は、本明細書中で参考として援用されている。更に、本明細書中で記述した合成方法は、種々の保護基を利用することが当業者に理解できる。
【００９４】
下記の明細及び請求項の両方における冠詞「a」、「an」及び「the」の使用は、本明細書中で別段に示されていない限り、又は内容によって明確に否定されていない限り、単数及び複数の両方に及ぶと解釈されるべきである。「含む」、「有する」、「化学式のものである」にあるような「〜のものである」、「包含する」及び「含有する」という用語は、別段に示されていない限り、オープンタームとして（即ち、「これらに限られないが〜を包含する」を意味すると）解釈されるべきである。例えば、特定の式の高分子足場は、式中に示されているすべてのモノマーユニットを含み、また式中に示されていない追加のモノマーユニットを含んでもよい。加えて、「含む」又は他のオープンエンドの用語が実施形態で使用される場合には常に、同じ実施形態を、中間的な用語「主に〜からなる」又はクローズドターム「〜からなる」を使用してより狭く請求することができることを理解されたい。
【００９５】
「約（about）」、「およそ（approximately）」、又は「大体（approximate）」という用語は、数値に関して使用されるとき、集合又は値域が含まれることを意味する。例えば、「X」は、Xが数値であるとき、Xの±20％、±10％、±5％、±2％、±1％、±0.5％、±0.2％、又は±0.1％である数値範囲を含んでいる。一実施形態において、「約」という用語は、所定値の前後5％の範囲の数値を指す。別の実施形態において、「約」という用語は、所定値の前後2％の範囲の数値を指す。別の実施形態において、「約」という用語は、所定値の前後1％の範囲の数値を指す。
【００９６】
値の範囲についての言及は、本明細書中で別段に示されていない限り、範囲内に該当するそれぞれ別々の値を個々に言及することの簡便な方法として役立てることが単に意図されており、本明細書中に個々に言及されているかのように、それぞれ別々の値が、明細書中に組み込まれる。本明細書で使用される範囲には、別段に定義されていない限り、その範囲の２つの限界値が包含される。例えば「ｘは、1から6の間の整数である」及び「ｘは、1から6の整数である」という表現は両方とも、「ｘは、1、2、3、4、5又は6である」ことを意味している、すなわち、「XからYの間」又は「XからYの範囲」という用語は、XとYを含めた、それらの間の整数を意味する。
【００９７】
本明細書に記載されている方法は全て、本明細書中で別段に示されていない限り、又は内容によって別段に明確に否定されていない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書で示されている任意及び全ての例又は例示的な言葉（例えば「など」）の使用は、本発明をより良く説明することを単に意図しており、別段に明示して請求されていない限り、特許請求の範囲に対する制限として解釈されるべきではない。明細書中のどんな言葉も、何らかの請求されていない要素が、請求されていることの必須要素であることを示していると解釈されるべきではない。
【００９８】
「抗体」とは、免疫グロブリンを含む完全長の抗体又は抗体の機能的な断片を指す。「機能的な断片」により、免疫グロブリン又は抗体の十分な部分が意味されるが、但し、該部分が、その標的細胞集団の細胞表面分子、例えばヒト癌胎児抗原、と結合する又は複合体を形成するのに効果的であることを条件とする。
【００９９】
本明細書中に使用される場合、ヒト癌胎児抗原としては、例えば、腫瘍関連タンパク質、例えばアルファフェトプロテインや、癌胎児性抗原や、前立腺特異的抗原や、癌胎児抗原タンパク質（未成熟ラミニン受容体タンパク質としても知られ、そしてそれは、例えば腸管及び腎癌腫に関係していた）などが挙げられる。
【０１００】
免疫グロブリンは、当業者に知られている技術を使用して、精製されても、遺伝子組み換えによって作製されても、合成によって作製されても、又はその組み合わせであってもよい。IgG抗体内又はそれに由来する免疫グロブリンが本願発明における使用に特によく適合するとはいえ、任意のクラス又はサブクラス、例えばIgG、IgA、IgM、IgD、及びIgEからの免疫グロブリンが選択されてもよい。好適には、免疫グロブリンは、これだけに限定されるものではないが、IgGサブクラス（IgG1、2、3、及び4）を含めたクラスIgG、又は抗原上の特定のエピトープに特異的に結合できるクラスIgMの免疫グロブリンである。抗体は、天然起源又は遺伝子組み換え起源から誘導された完全な免疫グロブリンであっても、完全な免疫グロブリンの免疫反応性部分であってもよい。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、細胞内抗体（「intrabodies」）、組み換え抗体、抗イディオタイプ抗体、ドメイン抗体、リニア抗体、多特異的抗体、抗体フラグメント、例えば、Fv、Fab、F（ab）2、F（ab）3、Fab'、Fab'-SH、F（ab'）2、一本鎖可変フラグメント抗体（scFv）、タンデム／ビス−scFv、Fc、pFc'、scFvFc（又はscFv−Fc）、ジスルフィドFv（dsfv）、二重特異性抗体（bc-scFv）、例えばBiTE抗体など；ラクダ科動物抗体、表面再構成抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、単一ドメイン抗体（sdAb、別名NANOBODY（登録商標））、キメラ抗体、少なくとも1つのヒト定常領域を含んでなるキメラ抗体、二重親和性抗体、例えば二重親和性再ターゲッティングタンパク質（DART（商標））、これだけに限定されるものではないが、低分子抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体又は三価抗体、四価抗体など、及び多価抗体を含めた二価（divalent又はbivalent）一本鎖可変フラグメント（di-scFvs、bi-scFvs）を含めた様々な形態で存在し得る。「抗体フラグメント」とは、その標的、すなわち、抗原結合性領域に結合する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部を指す。本明細書中に使用される場合、「抗体」という用語は、別段の定めがない限り、完全長の抗体と抗体フラグメントの両方を指す。
【０１０１】
「タンパク質ベースの認識分子」(Protein based recognition-molecule)又は「PBRM」とは、それが細胞表面マーカー又は受容体、例えば、膜貫通タンパク質、表面不溶化タンパク質、又はプロテオグリカン（protoglycan）などを認識し、そして、それに結合する分子を指す。PBRMの例としては、これだけに限定されるものではないが、抗体（例えば、トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、エプラツズマブ、ベルツズマブ、ラベツズマブB7−H4、B7−H3、CA125、CD33、CXCR2、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、HER2、NaPi2b、c−Met、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PD−L1、c−Kit、MUC1、及び抗−5T4）又はペプチド（LHRH受容体ターゲッティングペプチド、EC-1ペプチド）、リポカリン、例えば、anticalinsなど、タンパク質、例えば、インターフェロン、リンフォカイン、増殖因子、コロニー刺激因子など、ペプチド又はペプチド模倣薬などが挙げられる。修飾高分子コンジュゲートが特定の細胞、組織又は位置を標的化するのに加えて、タンパク質ベースの認識分子はまた、標的細胞又は経路に対して抗増殖（細胞増殖抑制性、及び／又は細胞傷害性）活性などの特定の治療効果も有し得る。タンパク質ベースの認識分子は、化学反応性基、例えば-COOHなど、第一級アミン、第二級アミン-NHR、-SH、又は化学反応性アミノ酸部分又は側鎖、例えば、チロシン、ヒスチジン、システイン、又はリジンなどのうちの少なくとも1つのを含むか、又は含むように設計され得る。一実施形態において、PBRMは、リガンド（LG）であっても、又は所定の標的細胞集団の細胞表面分子、例えば細胞表面受容体又は抗原などと特異的に結合する又は複合体を形成する部分であるターゲッティング部分であってもよい。その受容体とリガンドの特異的な結合又は複合体形成に続いて、細胞はリガンド又はリガンド−薬剤−コンジュゲートの取り込みに許容状態となり、次に、リガンド又はリガンド−薬剤−コンジュゲートが細胞内に取り込まれる。本明細書中に使用される場合、細胞表面分子と「特異的に結合するか、若しくは複合体を形成する」又はそれらを「標的とする」リガンドは、分子間力を介して細胞表面分子と優先的に結び付く。例えば、リガンドは、約50nM未満、約5nM未満、又は500pM未満のKdを有する細胞表面分子と優先的に結合し得る。細胞表面分子へのリガンドの結合親和性を計測するための技術は周知のことである；例えば、1つの好適な技術は、表面プラズモン共鳴法（SPR）と呼ばれるものである。一実施形態において、リガンドは、ターゲッティングに使用されて、それが送達する薬剤と関連がない検出可能な治療効果を有していない。別の実施形態において、リガンドは、ターゲッティング部分として、及び治療薬又は（例えば、活性薬剤又はプロドラッグの活性を上げるための）免疫調節薬としての両方に機能する。
【０１０２】
「生体適合」(biocompatible)は、本明細書中で使用される場合、体液又は生きている細胞若しくは組織と接触している間に最小の破壊的な又はホストの応答作用を発揮する化合物を記述することが意図されている。したがって、生体適合性基は、本明細書で使用される場合、上記及び本明細書で定義した生体適合性という用語の定義内に該当する脂肪族、シクロアルキル、ヘテロ脂肪族、ヘテロシクロアルキル、アリール又はヘテロアリール部分を指す。「生体適合性」という用語もまた本明細書で使用される場合、そのような相互作用が特に望まれない限り、認識タンパク質、例えば天然に生じる抗体、細胞タンパク質、細胞及び生物系の他の成分との最小の相互作用を発揮する化合物を意味することとする。したがって、上記の最小の相互作用をもたらすことが特に意図されている物質及び官能基、例えば薬剤及びプロドラッグは、生体適合性であると解釈される。好ましくは（例えば抗新生物薬などの細胞毒性であることが意図されている化合物を除いて）、意図されている全身インビボ濃度と同様の濃度でのインビトロでの正常細胞へのその添加が、インビボでの化合物の半減期（例えばインビボ投与された化合物のうちの50%が除去／クリアランスされるために必要な期間）と同等の時間の間に１％以下の細胞死をもたらし、そのインビボ投与が、最小限かつ医学的に許容される炎症、異物反応、免疫毒性、化学的毒性、及び／又は他のそのような有害作用を誘発するならば、化合物は「生体適合性」である。上記の文章において、「正常細胞」という用語は、試験されている化合物によって破壊されるか、又は別段に有意な影響を受けることが意図されていない細胞を指す。
【０１０３】
「生分解性」：本明細書中に使用される場合、「生分解性」高分子は、インビボで生物学的なプロセッシングを受け易い高分子である。本明細書で使用される場合、「生分解性」化合物又は部分は、細胞によって取り込まれると、リソソーム若しくは他の化学的機序によって、又は加水分解によって、細胞が再利用するか、細胞に対する有意な毒性作用なしに片付けることができる成分へと壊され得る化合物である。本明細書中で使用される場合、「生体切断性（biocleavable）」という用語は、「生分解性」と同じ意味を有する。分解断片は好ましくは、臓器又は細胞過負荷又はそのような過負荷若しくは他の有害作用が原因である病的プロセスをインビボで誘発しないか、又はほとんど誘発しない。生分解性プロセスの例には、酵素及び非酵素加水分解、酸化ならびに還元が包含される。本明細書中に記載した生分解性タンパク質−高分子−薬剤コンジュゲート（又はそれらの成分、例えば、生分解性高分子担体、及び担体と抗体又は薬剤分子の間のリンカー）を非酵素加水分解するための適切な条件には、例えば、リソソームの細胞内区画の温度及びpHで生分解性コンジュゲートを水に曝露することが包含される。一部のタンパク質−高分子−薬剤コンジュゲート（又はそれらの成分、例えば、生分解性高分子担体、及び担体と抗体又は薬剤分子の間のリンカー）の生分解をまた、細胞外で、例えば動物の身体の低いpH領域、例えば炎症部分で、分解を促進する因子を放出している活性化マクロファージ又は他の細胞の近接で、増大させることができる。特定の好ましい実施形態では、pH〜7.5での高分子担体の有効サイズは、1から7日間にわたって検出可能なほどには変化せず、元の高分子サイズの50%以内を少なくとも数週間は維持する。他方でpH〜5では、高分子担体は、1から5日間にわたって好ましくは検出可能に分解され、2週間から数ヶ月の時間の枠内で、低分子量の断片へと完全に変換される。そのような試験での高分子の完全性は、例えばサイズ排除HPLCによって測定することができる。より早急な分解が一部の場合には好ましいこともあるが、一般に、高分子は細胞内で、細胞による高分子断片の代謝又は排出の速度を超えない速度で分解されることがより望まれ得る。好ましい実施形態では、高分子及び高分子生分解副産物は、生体適合性である。
【０１０４】
「生物学的利用能」(Bioavailability)：「生物学的利用能」という用語は、対象に投与された所定の量の薬剤又は化合物の全身的利用能（すなわち、血液／血漿レベル）を指す。生物学的利用能は、投与された剤形から大循環に達する薬剤又は化合物の時間（速度）と総量（程度）の両方の尺度を示す絶対項である。
【０１０５】
「マレイミドブロッキング化合物」(Maleimido blocking compound)：本明細書中で使用される場合、マレイミドと反応して、それをスクシンイミドに変換できる化学物を指し、さらに、「マレイミドブロッキング部分」(Maleimido blocking moiety)は、変換によってスクシンイミドに結合される化合部分を指す。特定の実施形態において、マレイミドブロッキング化合物は、マレイミドと反応するための末端チオール基を有する化合物である。特定の実施形態において、マレイミドブロッキング化合物は、マレイミドとの反応が水溶液中でおこなわれるように水溶性である。例えば、得られたマレイミドブロッキング部分は、水溶性であるか又は親水性である。一実施形態において、マレイミドブロッキング化合物は、システイン、N−アセチルシステイン、システインメチルエステル、N−メチルシステイン、2−メルカプトエタノール、3−メルカプトプロパン酸、2−メルカプト酢酸、メルカプトメタノール（すなわち、HOCH2SH）、フェニルが1又は2以上の親水性置換基で置換されたベンジルチオール、又は3−アミノプロパン-1−チオールである。
【０１０６】
「親水性」：例えば、高分子モノマーユニット上、又はそれらを親水性若しくは水溶性にするための高分子モノマーユニット上の置換基に関する場合の「親水性」という用語は、当分野においてこの用語に共通する意味と本質的に変わらず、イオン性、極性若しくは極性原子を含有するか、又は別段に水分子によって溶媒和され得る化学的部分を示している。したがって、親水性基は、本明細書で使用される場合、上記で定義した親水性という用語の定義に該当する脂肪族、シクロアルキル、ヘテロ脂肪族、ヘテロシクロアルキル、アリール又はヘテロアリール部分を指す。適切な特定の親水性有機部分の例には、限定ではないが、約1から12個の間の原子範囲の原子からなる鎖を含む脂肪族又はヘテロ脂肪族基、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、アミン、カルボキシル、アミド、カルボン酸エステル、チオエステル、アルデヒド、ニトリル、イソニトリル、ニトロソ、ヒドロキシルアミン、メルカプトアルキル、複素環、カルバメート、カルボン酸及びその塩、スルホン酸及びその塩、スルホン酸エステル、リン酸及びその塩、リン酸エステル、ポリグリコールエーテル、ポリアミン、ポリカルボキシレート、ポリエステルならびにポリチオエステルが包含される。特定の実施形態では、親水性置換基は、カルボキシル基（COOH）、アルデヒド基（CHO）、ケトン基（COC1-4アルキル）、メチロール（CH2OH）又はグリコール（例えばCHOH-CH2OH又はCH-（CH2OH）2）、NH2、F、シアノ、SO3H、PO3Hなどを包含する。
【０１０７】
高分子に関する場合の「親水性」という用語は一般に、当分野におけるこの用語の使用と変わらず、上記で定義した親水性官能基を含む高分子を示す。好ましい実施形態では、親水性高分子は、水溶性高分子である。高分子の親水性は、水和エネルギーの決定を介して直接的に測定することができるか、又は２つの液相の間の検査を介して、又は例えばC4若しくはC18などの既知の疎水性を有する固相上でのクロマトグラフィーによって決定することができる。
【０１０８】
「高分子担体」：高分子担体という用語は、本明細書中に使用される場合、高分子又は修飾高分子を指し、そしてそれは、１又は２以上の薬剤分子を示されたリンカーと、及び／又は１又は２以上のPBRMを示されたリンカーと共有結合させるのに好適であるか、又は共有結合させることができる。
【０１０９】
「生理的条件」：「生理学的条件」という語句は、本明細書で使用される場合、生体組織の細胞外液体中で遭遇するであろう化学的（例えばpH、イオン強度）及び生化学（例えば酵素濃度）条件の範囲に関する。大抵の正常な組織では、生理学的pHは、約7.0から7.4である。循環血漿及び正常な間隙液が、正常な生理学的条件の典型的な例を代表する。
【０１１０】
「多糖類」、「炭水化物」又は「オリゴ糖類」：「多糖類」、「炭水化物」又は「オリゴ糖類」との用語は、当該技術分野で公知であり、一般に、化学式（CH2O）nを有する物質及びそれらの誘導体を意味し、ここで、一般に、n>2である。炭水化物とは、ポリヒドロキシアルデヒド又はポリヒドロキシケトン、又は簡単な化学変換（例えば、加水分解、酸化又は還元）におけるこのような物質への変化である。典型的には、炭水化物は、環状アセタール又はケタール（例えば、グルコース又はフルクトース）の形状で、存在している。該環状ユニット（単糖類）は、互いに結合され得、少数（オリゴ糖類）又は数個（多糖類）の単糖ユニットを備えた分子を形成する。しばしば、はっきりと定義した数、種類及び配置の単糖ユニットを備えた炭水化物はオリゴ糖と呼ばれ、一方、可変の数及び／又は配置の単糖ユニットの分子の混合物からなる炭水化物は、多糖類と呼ばれている。「多糖類」、「炭水化物」又は「オリゴ糖類」との用語は、本明細書中では、交換可能に使用される。多糖類には、天然の糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、リボース及びキシロース）及び／又は天然の糖の誘導体（例えば、2’-フルオロリボース、2’-デオキシリボース及びヘキソース）が挙げられ得る。
【０１１１】
「薬剤」：本明細書中に使用される場合、「薬剤」という用語は、生物学的に活性であり、投与後にそれを必要としている対象に所望の生理作用を提供する化合物（例えば、活性薬剤成分）を指す。
【０１１２】
「プロドラッグ」：本明細書中で使用される場合、「プロドラッグ」という用語は、活性薬剤の前駆体、すなわち、活性薬剤に変換される化合物を指す。一般的に、斯かるプロドラッグは、インビボにおける処理を受け、それが薬剤を生理学的に活性な形態に変換する。いくつかの例において、プロドラッグは、それ自体が所望の生理学的効果を有する。所望の生理学的効果は、例えば治療的効果、細胞傷害性効果、免疫調整効果などであってもよい。
【０１１３】
「細胞傷害性」：本明細書中で使用される場合、「細胞傷害性」という用語は、細胞又は選択された細胞集団（例えば、癌細胞）に対する毒性を意味する。毒性効果は、細胞死をもたらしても、及び／又は細胞溶解をもたらしてもよい。特定の例において、毒性効果は、例えば、細胞増殖を減速するか又は停止する、細胞に対する亜致死的な破壊効果であってもよい。細胞傷害効果を達成するために、薬剤又はプロドラッグは、DNA傷害剤、微小管破壊剤、又は細胞毒性タンパク質若しくはポリペプチドから成る群から選択されるか、或いはその他のものであってもよい。
【０１１４】
細胞増殖抑制性：本明細書中で使用される場合、「細胞増殖抑制性」という用語は、細胞増殖及び／又は増殖を阻害若しくは停止する薬剤又は他の化合物を指す。
【０１１５】
「小分子」：本明細書中で使用する「小分子」との用語は、天然に存在しようと（例えば、化学合成により）人工的に作り出されようと、比較的に低い分子量を有する分子を意味する。好ましい小分子は、動物（好ましくは、哺乳動物、更に好ましくは、ヒト）において局所効果又は全身効果を生じる点で、生体活性である。ある好ましい実施態様では、この小分子は、薬剤であり、そして、小分子は「薬剤分子」若しくは「薬剤」又は「治療薬」と呼ばれる。ある実施形態において、薬剤分子は、約5kDa以下のMWを有する。他の実施形態において、薬剤分子は、約1.5kDa以下のMWを有する。実施形態において、薬剤分子は、ビンカアルカロイド、アウリスタチン、デュオカルマイシン、キナーゼ阻害剤、MEK阻害剤、KSP阻害剤、PI3キナーゼ阻害剤、カリケアマイシン、SN38、カンプトテシン、トポイソメラーゼ阻害剤、非天然カンプトテシン、タンパク質合成阻害剤、RNAポリメラーゼ阻害剤、ピロロベンゾジアゼピン、マイタンシノイド、DNA結合剤、DNA挿入剤、及びその類似体から選択される。好ましくは、必須ではないものの、この薬剤は、適当な政府機関又は行政体、例えばFDA、により既に使用に安全かつ有効であると見なされたものである。例えば、21 C.F.R.330.5,331〜361、及び440〜460にてFDAが挙げたヒトに使用する薬剤；21 C.F.R.500〜589にてFDAが挙げた動物に使用する薬剤（それらの内容は、本明細書中で参考として援用されている）は、全て、本発明の親水性高分子と併用するのに適当であると考えられる。本発明を実施する際に使用できる種類の薬剤分子には、抗癌物質、放射性核種、ビタミン、抗エイズ物質、抗生物質、免疫抑制薬、抗ウイルス物質、酵素阻害剤、神経トキシン、オピオイド、催眠薬、抗ヒスタミン剤、潤滑剤、精神安定薬、抗痙攣薬、筋肉弛緩薬及び抗パーキンソン物質、抗痙攣薬及び筋肉収縮薬（チャネル遮断薬、縮瞳薬及び抗コリン薬を含めて）、抗緑内障化合物、抗寄生虫及び／又は抗原生動物化合物、細胞−細胞外マトリックス相互作用のモジュレーター（細胞成長阻害剤及び抗接着分子を含めて）、血管拡張薬、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質合成の阻害剤、降圧薬、鎮痛薬、解熱薬、ステロイド性及び非ステロイド性抗炎症薬、抗血管原性因子、抗分泌因子、抗凝血薬及び／又は抗血栓薬、局所麻酔薬、眼薬、プロスタグランジン、抗うつ薬、抗精神病物質、制吐薬、造影剤が挙げられるが、これらに限定されない。多くの大分子もまた、薬剤であり、さらに、斯かる大分子は、本明細書中に記載したコンジュゲート及び他の構築物で使用されてもよい。好適な大分子の例としては、例えばアミノ酸ベースの分子が挙げられる。アミノ酸ベースの分子は、例えば、特にペプチド、ポリペプチド、酵素、抗体、免疫グロブリン、又はその機能性断片を包含し得る。
【０１１６】
本発明で使用するのに適当な更に完全な（全てを網羅するものではない）特定の薬剤のリストは、“Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications” by Axel Kleemann and Jurgen Engel, Thieme Medical Publishing, 1999及びthe “Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals”, Edited by Susan Budavari et al., CRC Press, 1996で見られ、両方の内容は、本明細書中で参考として援用されている。好ましい実施形態において、本願発明で使用される薬剤は、標的細胞又は経路に対して抗増殖（細胞増殖抑制性、及び／又は細胞傷害性）の活性を有する治療薬である。前記薬剤は、化学的反応基、例えば、-COOH、第一級アミン、第二級アミン-NHR、-OH、-SH、-C（O）H-、-C（O）R、-C（O）NHR2b、C（S）OH、-S（O）2OR2b、-P（O）2OR2b、-CN、-NC又は-ONO（式中、Rは脂肪族、ヘテロ脂肪族、炭素環、又はヘテロシクロアルキル部分であり、R2bは水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、炭素環、又は複素環部分である）を持ち得る。
【０１１７】
「薬剤誘導体」(drug derivative)又は「改変薬剤」(modified drug)、或いは本明細書中に使用される同様のものは、本発明のコンジュゲートによって送達されることを意図する薬剤分子、及び薬剤分子を高分子担体に結合させることができる官能基を含んでなる化合物を指す。
【０１１８】
「活性型」(active form)とは、本明細書中で使用される場合、インビボ又はインビトロにおいて意図した医薬的な有効性を示す化合物の形態を指す。特に、本発明のコンジュゲートによって供されることを意図する薬剤分子がコンジュゲートから放出されるとき、活性型は、薬剤自体又はその誘導体であり得、そしてそれが意図した治療学的な特性を発揮する。コンジュゲートからの薬剤の放出は、薬剤を高分子担体に結合させているリンカーの生分解性結合の開裂によって達成できる。従って、活性薬剤誘導体は、リンカーの一部を含んでなる。
【０１１９】
「診断ラベル」(diagnostic label)：本明細書で使用される語句診断ラベルは、原子、原子、部分又は官能基の基、ナノ結晶、又は他の個別の物質組成物の要素であって、インビボ又はエクスビボで、当業界で公知の分析方法を使用して検出できるものを言う。本発明のコンジュゲートと結び付けられる時、そのような診断ラベルは、インビボでのコンジュゲートのモニタリングを可能にする。或いは又は加えて、診断ラベルを含む構造及び組成は、生物学的機能又は構造をモニターするために使用することができる。診断ラベルの例として、限定されないが、放射、反射、吸収、散乱できる、又は他の電磁界又は電磁波（例えば、γ線、X線、電波、マイクロ波、光）、粒子（例えば、α粒子、エレクトロン、陽電子、ニュートロン、プロトン）又は例えば超音波のような他の形での放射線に影響をあたえることのできる一般的な部分における、医療診断的処置で使用できるラベル、例えば、γ−シンチグラフィー及びポジトロン放射断層撮影（PET）用放射性アイソトープ（放射性核物質）、磁気共鳴画像法（MRI）（例えば、常磁性原子及び超常磁性ナノ結晶）用造影剤、CT検査法及び他のX線系画像検査法用の造影剤、超音波系診断的方法（断層撮影法）用剤、中性子活性化（例えば、ホウ素、ガドリニウム）剤、種々の光学処置用蛍光体が挙げられる。
【０１２０】
以下に本願で使用されるより一般的な語句を挙げる：
【０１２１】
「動物」：本明細書で使用される語句動物は、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、虫類及び単細胞など、どのような発展段階のものも含む、ヒト及び非ヒト動物を言う。細胞培養及びインビボ組織サンプルは、複数の動物であると考えられる。非ヒト動物は、哺乳類（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、霊長類、又はブタ）であることが好ましい。動物は、遺伝子組み換え動物であってもヒトクローンであってもよい。語句「対象」は動物を包含する。
【０１２２】
「有効量」：一般的に活性な剤又は薬剤送達装置に関して言う場合、語句「有効量」は、所望の生物学的反応を発現させるのに必要な量を言う。当業者には認められているように、剤又は装置の有効量は、所望の生物学的終点、送達すべき剤、封入しているマトリックスの組成、標的体内組織などの因子に依って様々である。例えば、各個を免疫化するために、送達すべき抗原を含む微粒子の有効量は、投与された抗原を持つ生物体の感染を阻止するのに充分な免疫応答を得る結果となる量である。
【０１２３】
「天然アミノ酸」は、本明細書で使用される場合、一般的などのようなもの、天然起源のタンパク質、すなわちグリシン（Gly）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）、ヒスチジン（His）、プロリン（Pro）、セリン（Ser）、スレオニン（Thr）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、トリプトファン（Trp）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、システイン（Cys）及びメチオニン（Met）で見出される天然起源のL-アミノ酸を言う。
【０１２４】
「非天然アミノ酸」は、本明細書中で使用される場合、天然アミノ酸ではないあらゆるアミノ酸を指す。これには、例えばα−、β−、ω−、Ｄ−、Ｌ−アミノアシル残基を含んでなるアミノ酸が含まれる。より一般に、非天然アミノ酸は、一般式：
【化２１】
0006420331.tif 000022
の残基を含んでなり、その側鎖Rは天然に存在するアミノ酸側鎖以外の鎖である。代表的な非天然アミノ酸としては、サルコシン（N-メチルグリシン）、シトルリン（cit）、ホモシトルリン、β-ウレイドアラニン、チオシトルリン、ヒドロキシプロリン、アロスレオニン、ピペコリン酸（ホモプロリン）、α-アミノイソ酪酸、tert-ブチルグリシン、tert-ブチルアラニン、アロ-イソロイシン、ノルロイシン、α-メチルロイシン、シクロヘキシルグリシン、β-シクロヘキシルアラニン、β-シクロペンチルアラニン、α-メチルプロリン、フェニルグリシン、α-メチルフェニルアラニン、及びホモフェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２５】
「アミノアシル」：さらに一般的に、本明細書で使用される語句アミノアシルは、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸を包含する。
【０１２６】
「ポリアミド」：天然アミノ酸及び非天然アミノ酸のホモ又はヘテロ高分子を指す。例示的なホモ高分子としては、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリ-γ-グルタル酸などが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なヘテロ高分子としては、ペプチダーゼ、リゾチーム、メタロプロテイナーゼなどから選択されるペプチド断片を含んでなるが、これらに限定されない。
【０１２７】
「PHF」は、ポリ（1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルムアルデヒド）を指す。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「高分子ユニット」、「モノマーユニット」、「モノマー」、「モノマーユニット」、「ユニット」という用語は全て、高分子中の繰り返し構造ユニットを指す。
【０１２９】
本明細書中に使用される場合、高分子又は高分子担体／足場又は高分子コンジュゲートの「分子量」又は「MW」は、別段の定めがない限り、重量平均分子量を指す。
【０１３０】
本発明は、本化合物において生じる原子の全ての同位体を包含することが意図されている。同位体には、同じ原子番号を有するが、異なる質量数を有する原子が包含される。一般的な例であって限定ではないが、水素の同位体には、トリチウム及びジュウテリウムが包含される。炭素の同位体には、C-13及びC-14が包含される。
【０１３１】
本発明は、化合物のあらゆる異性体を含むことを意図する。この異性体とは、光学異性体及び互変異性異性体を指し、そして、それを含むが、ここで、光学異性体としては、鏡像異性体とジアステレオマー、キラル異性体、及び非キラル異性体をが挙げられ、且つその光学異性体には、単離された光学異性体、並びにラセミ及び非ラセミ混合物を含めた光学異性体の混合物が含まれる；ここで、異性体は、単離された形態か、又は１又は２以上の他の異性体との混合物の状態で存在し得る。
【０１３２】
高分子担体
ある例示的な実施形態では、本発明のコンジュゲートは、生物医学的適用、例えば、薬剤送達及び体内組織エンジニアリングにおける用途を見出し、担体は生体適合性であり生分解性である。ある実施形態では、担体は、可溶性高分子、ナノ粒子、ゲル、リポソーム、ミセル、縫合糸、移植片などである。ある実施形態では、語句「可溶性高分子」は、ポリアルポリアル（例えば、親水性ポリアセタール又はポリケタール）のような生分解性、生体適合性高分子を包含する。ある他の実施形態では、担体は完全な合成、半合成又は天然起源の高分子である。ある他の実施形態では、担体は親水性である。
【０１３３】
ある例示的な実施形態では、本発明で使用される担体は、主鎖内に位置する各モノマーユニット中に加水分解性結合を少なくとも１つ含む生分解性、生体適合性ポリアルである。これは、分解過程（モノマーユニットの加水分解／開裂を介して）が、高分子コンジュゲートのモノマー成分への断片化（すなわち分解）に帰結し、本発明の高分子コンジュゲートに生分解性特性を与えることを保障する。生分解性、生体適合性高分子コンジュゲートの特性（例えば、溶解性、バイオ接着性及び親水性）は、引き続き、付加的な親水性又は疎水性基の置換によって変性することができる。本発明を実施するために適切な生分解性生体適合性高分子の例示としては、特に、米国特許第5,811,510号；同第5,863,990号；同第5,958,398号；同第7,838,619号及び同第7,790,150号；並びに米国特許出願公開第2006/0058512号に見出すことができる。上記で挙げられた文献の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。このタイプの高分子優位性、製造及び用途に関する指針は、前記文献に見出される。ある実施形態では、本発明は、前記特許文献、及び米国特許第5,582,172号及び同第6,822,086号との併用が特に有用であることが見込まれる。前に挙げられた特許文献はそれぞれその全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３４】
本願発明のコンジュゲートは、親水性であり、加水分解性であり、且つ、１又は２以上の生分解性結合を含んでなる連結を介してその高分子担体と共有結合している薬剤分子、（例えば、ビンカアルカロイド若しくは誘導体、トポイソメラーゼ阻害剤、例えばSN38、カンプトテシン、トポテカン、エキサテカン、非天然カンプトテシン化合物若しくは誘導体など；アウリスタチン、ドラスタチン、ネモルビシン（nemorubicine）若しくはその誘導体、PNU-159682、アントラサイクリン、デュオカルマイシン、キナーゼ阻害剤（例えば、PI3キナーゼ阻害剤又はMEK阻害剤）、KSP阻害剤、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、マイタンシノイド、エリナフィド（elinafide）、DNA結合剤、DNAインターカレーター、或いはその立体異性体、同配体、類似体、及び誘導体）及び抗体（例えば、トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、エプラツズマブ、ベルツズマブ、ラベツズマブ、B7−H4、B7−H3、CA125、CD33、CXCR2、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、HER2、NaPi2b、c−Met、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PD−L1、NaPi2b、c−Kit、MUC1、及び抗−5T4）又はペプチド（LHRH受容体ターゲッティングペプチド、EC-1ペプチド）を含んでなる。したがって、ある例示的な実施形態では、本発明の実施に適切な担体は、主鎖内に位置する各モノマーユニットに少なくとも１つのアセタール／ケタール酸素原子を有するポリアルである。先に検討したように、これは、分解過程（高分子アセタール／ケタール基の加水分解／開裂を介して）は、ポリアルコンジュゲートの断片化による低分子量成分化（すなわち分解）に帰結することを保障する。ある実施形態では、本発明の高分子コンジュゲートの製造に使用される、生分解性、生体適合性高分子担体は、天然起源の多糖類、グリコ多糖類、ポリグリコシド、ポリアセタール、ポリアミド、ポリエーテル及びポリエステルの合成高分子、これらの酸化、脚色、修飾、架橋及びコンジュゲート形成製品である。
【０１３５】
ある他の実施形態では、担体は、炭水化物、グリコ多糖類、糖脂質、糖コンジュゲート、ポリアセタール類、ポリケタール類及びこれらの誘導体からなる群より選択される親水性、生分解性高分子である。
【０１３６】
ある例示的な実施形態では、担体は、セルロース、アミロース、デキストラン、レバン、フコイダン、カラギナン、イヌリン、ペクチン、アミロペクチン、グリコーゲン及びリセナン（lixenan）からなる群より選択される、天然起源の直鎖及び／又は分岐状の生分解性、生体適合性ホモ多糖類である。
【０１３７】
ある他の例示的な実施形態では、担体は、アガロース、ハイルロナン（hyluronan）、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、アルギニンサン及びヘパリンからなる群より選択される、天然起源の直鎖及び分岐状の生分解性、生体適合性ヘテロ多糖類である。
【０１３８】
さらに他の例示的な実施形態では、高分子担体は、ポリアセタール／ポリケタールのコポリマー、及びポリアクリレート、ポリビニル高分子、ポリエステル類、ポリオルソエステル類、ポリアミド類、ポリペプチド及びこれらの誘導体からなる群より選択される、親水性高分子である。
【０１３９】
さらに別の実施形態において、高分子担体は、様々な天然物、例えばコムギ、コメ、トウモロコシやタピオカなどから得られたデンプンの加水分解で生じるデキストリンである。デンプン出発物質の構造によって、各デキストリンは、α-1,4連結及びα-1,6連結の独特な分解を含んでいる。α-1,6連結の生分解性の割合が典型的にα-1,4連結より低いので、好ましくはα-1,6連結のパーセンテージは、10%未満より低く、より好ましくは5%未満である。一実施形態において、デキストリンの分子量は、約2kDa〜約40kDa、より好ましくは約2kDa〜約20kDa、又は約3kDa〜約15kDa、又は約5kDa〜約10kDaの範囲内にある。
【０１４０】
ある実施形態では、担体は、1,2-、1,4-、1,6-及び2,6-ピラノシド又は1,2-、1,5-、1,6-フラノシドの環状ビシナルジオールの選択的酸化によって、又は１以上の薬剤分子又はPBRMとの結合の前に、多糖類を含むラテラル6-ヒドロキシ及び5,6-ジオールの酸化によって、活性化された多糖類を含む。
【０１４１】
さらに他の例示的な実施形態では、高分子担体は、生分解性、生体適合性ポリアセタールであって、ポリアセタール繰り返し構造ユニットの少なくとも一部が下記の化学的構造を有するポリアセタールを含む：
【化２２】
0006420331.tif 000023
（ここで、ｎのついたかっこで囲まれた各構造に関して、R1及びR2の１つは水素で、もう一方は生体適合性基であり、該基はC1に共有結合する炭素原子を含み；Rxは、C2に共有結合する炭素原子を含み；ｎ’’は整数であり；各R3、R4、R5及びR6は、生体適合性基であり、該基は、独立して、水素又は有機部分であり；各かっこで囲まれた構造ｎに関し、R1、R2、R3、R4、R5及びR6の少なくとも１つはエステル結合によってスクシンアミドとカップリングするのに適切な官能基を有する。）ある実施形態では、官能基は、ヒドロキシルである。
【０１４２】
一実施形態では、高分子担体は、次の化学構造：
【化２３】
0006420331.tif 000024
（式中、
R7及びR8は独立に、水素、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル（例えば-CH2OH）、-CH（OH）-CH2OH）、-CHO、-CH（OH）-CHO、又は−カルボニルであり；
ｏは、20〜2000の整数である）
によって表されるポリアセタール部分0.1%から100%を含む活性化された親水性の生分解性で生体適合性の高分子を含む。
【０１４３】
さらに他の実施形態では、高分子担体は、生分解性、生体適合性ポリケタールであって、ポリケタール繰り返し構造ユニットの少なくとも一部が下記の化学的構造を有するポリケタールを含む：
【化２４】
0006420331.tif 000025
（ここで、R1及びR2の各存在は、生体適合性基であり、且つRx、R3、R4、R5、及びR6は、本明細書中に定義したとおりのものである）。
【０１４４】
ある実施形態において、ケタールユニットは、式（IIa）又は（IIb）：
【化２５】
0006420331.tif 000026
のモノマーである。
【０１４５】
生分解性、生体適合性ポリケタール高分子とそれらの作製方法は、米国特許第5,811,510号、同第7,790,150号及び同第7,838,619号に記載されており、前記文献の全体を参照により本明細書中に援用する。
【０１４６】
一実施形態では、高分子担体は、還元後に部分的に酸化されたデキストラン（β1→6）-D-グルコース）から得ることができる。この実施形態では、高分子は、下式の構造の未修飾のデキストラン（A）、部分的に酸化されたデキストランアセタールユニット（B）及び網羅的にデキストランアセタールユニット（C）のランダムな混合物を含む：
【化２６】
0006420331.tif 000027
【０１４７】
他の実施形態では、高分子担体は、未修飾のアセタールユニット、即ち、ポリアセタールセグメントを含む。一部の実施形態では、ポリアセタールは、還元後に網羅的に酸化されたデキストランに由来してよい。これらの高分子は、参考文献、例えば米国特許第5,811,510号を参照のこと、に記載されており、これは、２欄の６５行から８欄の５５行のポリアセタールについてのその記載及び１０欄の４５行から１１欄の１４行でのその合成に関して、参照によって本明細書に組み込まれる。一実施形態では、未修飾のポリアセタールポリマーは、ポリ（ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）ポリマー（PHF）である。
【０１４８】
ポリ（ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）ポリマーに加えて、高分子担体の主鎖はまた、ポリ（ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）ブロックと、他のアセタール又は非アセタールモノマー若しくは高分子とのコポリマーを含んでもよい。例えばポリエチレングリコールポリマーは、高分子主鎖中のステルス剤として有用である。それというのも、これらは、付加官能基の高分子側鎖間の相互作用を減少させ得るためである。そのような基はまた、血清因子と修飾高分子との間などの相互作用を制限するのに有用であり得る。高分子主鎖に包含させるための他のステルス剤モノマーには、例えばエチレンイミン、メタクリル酸、アクリルアミド、グルタミン酸及びそれらの組み合わせが包含される。
【０１４９】
アセタール又はケタールユニットは、生体適合性を促進するのに有効な量で、修飾高分子中に存在する。未修飾のアセタール又はケタールユニットは、生体適合性及び溶解性を修飾高分子に与える「ステルス剤」として記載され得る。加えて、ポリアセタール又はポリケタールポリマーへのコンジュゲーションは、それに結合している部分の代謝及び分解に対する感受性を変更し、かつインビボ分布、クリアランス及び分解に影響を及ぼし得る。
【０１５０】
未修飾のアセタールユニットは、式（II）のモノマーである：
【化２７】
0006420331.tif 000028
【０１５１】
未修飾のポリアセタールユニットのモル分率nは、修飾高分子中の高分子ユニットの総数に対して、生体適合性、溶解性を促進し、半減期を長くするために利用可能なモル分率である。モル分率ｎは、生体適合性、溶解性、安定性又は特定の半減期を得るのに必要な未修飾のモノマーアセタールユニットの最小限の分率であってよいか、又は多少より大きな分率であってよい。細胞毒性の最も望ましい程度は、実質的にゼロである、即ち、修飾高分子は、対象に対して実質的に不活性である。しかしながら、当業者であれば理解するとおり、治療されている疾患又は症状の重症度、治療の効力、免疫応答の種類及び程度ならびに同様の検討に応じて、多少の程度の細胞毒性は許容され得る。
【０１５２】
一実施形態において、修飾高分子主鎖は、式（IV）のユニットを含んでなる：
【化２８】
0006420331.tif 000029
（式中、X'は、高分子主鎖のヒドロキシル基の置換基を示す）。本明細書に記載されている式（IV）及び他の式に示されているとおり、ポリアセタールユニットはそれぞれ、そのユニットのグリセロール部分に結合している単一のヒドロキシル基及びそのユニットのグリコールアルデヒド部分に結合しているX'群（又は、-LD-Dなどの別の置換基）を有する。これは単に簡便さのためであって、本明細書に記載されている式（IV）及び他の式のユニットを有する高分子は、そのユニットのグリコールアルデヒド部分に結合しているX'群（又は、マレイミド末端を含むリンカーなどの別の置換基）を有するユニット及びそのユニットのグリセロール部分に結合している単一のX'群（又は、マレイミド末端を含むリンカーなどの別の置換基）を有するユニット、さらに一方はそのユニットのグリコールアルデヒド部分に結合していて、他方はそのユニットのグリセロール部分に結合している２個のX'群（又は、マレイミド末端を含むリンカーなどの別の置換基）を有するユニットのランダムな分布を含有してよいと解釈すべきである。
【０１５３】
一実施形態において、本発明を実施するのに適した生分解性の生物適合性ポリアルは、約0.5〜約300kDaの分子量を有する。本発明の好ましい実施形態において、生分解性、生体適合性ポリアルは、約1〜約300kDa（例えば、約1〜約200kDa、約2〜約300kDa、約2〜約200kDa、約5〜約100kDa、約10〜約70kDa、約20〜約50kDa、約20〜約300kDa、約40〜約150kDa、約50〜約100kDa、約2〜約40kDa、約6〜約20kDa、又は約8〜約15kDa）の分子量を有する。例えば、本発明の高分子足場又はコンジュゲートに使用される生分解性生物適合性ポリアルは、約2〜約40kDa（例えば、2〜20kDa、3〜15kDa、又は5〜10kDa）の分子量を有するPHFである。
【０１５４】
一実施形態において、本発明を実施するのに適した生分解性の生体適合性ポリアルは、薬剤又はPBRMと結合する前に修飾される。例えば、前記ポリアルは、-C（=O）-X-（CH2）v-C（=O）-（式中、XはCH2、O、又はNHであり、そして、vは1〜6の整数である）を含んでいてもよい。以下の表Aは、薬剤、PBRM又はその誘導体を結合するのに適した修飾ポリアルのいくつかの例を提供する。別段の定めがない限り、以下の表AからDの参照番号は、本明細書中に記載した実施例番号に相当する。；「ND」という用語は不検出を意味し；そしてXはCH2、O、又はNHを意味する。
【表１】
0006420331.tif 000030
【０１５５】
治療薬
ある実施形態において、治療薬は、好ましくは≦約5kDa、より好ましくは≦約4kDa、より好ましくは≦約3kDa、最も好ましくは≦約1.5kDa又は≦約1kDaの分子量を有する小分子である。
【０１５６】
ある実施形態において、治療薬は、約1 nM未満のIC50を有する。
【０１５７】
ある実施形態において、治療薬は、約1 nM超のIC50を有し、例えば、治療薬は約1〜50 nMのIC50を有する。
【０１５８】
約1nM超のIC50を有する幾つかの治療薬（例えば「あまり強力ではない薬物」）は、当技術分野で認識されている連結技術を用いる、PBRMとの連結のために適切ではない。理論によって拘束されることを望まないが、かかる治療薬は、従来技術を用いる標的化されたPBRM−薬物コンジュゲートにおける使用のために不十分である活性を有する。なぜならば、薬剤の十分な数の（すなわち８個超の）コピーが、コンジュゲートの薬理学的及び物理化学的特性を減少させることなく、当技術分野で認識されている技術を用いて連結され得ないからである。しかし、これらの強力ではない薬物の十分に高い負荷は、本明細書に記載されている連結法を用いて達成され得る。これにより、所望の薬理学的及び物理化学的特性を維持しつつ、薬物の高い負荷が達成される。したがって、本発明はまた、PBRM、PHF、及び少なくとも８個の治療薬部分を含む、PBRM−高分子−薬物コンジュゲートであって、ここで前記治療薬は、約1 nM超のIC50を有する、PBRM-薬物コンジュゲートに関する。
【０１５９】
ある実施形態において、約0.3〜約15%のモノマーは、治療薬を、より好ましくは約2〜約12%、そして、よりいっそう好ましくは約5〜約10%含んでなる。
【０１６０】
本願発明で使用される小分子治療薬（例えば、高分子担体に連結することが可能である抗増殖（細胞傷害性及び細胞増殖抑制性）作用物質）としては、細胞毒性化合物（例えば、広域）、血管新生阻害剤、細胞周期進行阻害剤、PI3K／m-TOR／AKT経路阻害剤、MAPKシグナル経路阻害剤、キナーゼ阻害剤、タンパク質シャペロン阻害剤、HDAC阻害剤、PARP阻害剤、Wnt／ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、及びRNAポリメラーゼ阻害剤が挙げられる。
【０１６１】
広域細胞毒としては、DNA結合、挿入又はアルキル化剤、微小管安定化又は不安定化剤、白金化合物、トポイソメラーゼI阻害剤、及びタンパク合成阻害剤が挙げられるが、これらに制限されない。
【０１６２】
代表的なDNA結合、挿入又はアルキル化薬としては、CC-1065とその類似体、アントラサイクリン（ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ネモルビシンとその誘導体、PNU-159682）、エリナフィド（LU79553）及びその類似体などのビスナフタルイミド化合物、アルキル化、例えば、カリケアマイシン、ダクチノマイシン、ミトロマイシン、ピロロベンゾジアゼピンなどが挙げられる。代表的なCC-1065類似体としては、デュオカルマイシンSA、デュオカルマイシンA、デュオカルマイシンC1、デュオカルマイシンC2、デュオカルマイシンB1、デュオカルマイシンB2、デュオカルマイシンD、DU-86、KW-2189、アドゼレシン、ビゼレシン、カルゼレシン、セコ-アドゼレシン、及び関連類似体及びプロドラッグ形態、並びに米国特許第5,475,092号；同第5,595,499号；同第5,846,545号；同第6,534,660号；同第6,586,618号；同第6,756,397号；及び同第7,049,316号に記載されている例が挙げられる。ドキソルビシンとしては、米国特許第6,630,579号に記載されているものとその類似体が挙げられる。カリケアマイシンとしては、例えばエンジイン、例えばエスペラマイシン、及び米国特許第5,714,586号に記載されているものが挙げられる。デュオカルマイシンとしては、米国特許第5,070,092号；同第5,101,038号；同第5,187,186号；同第6,548,530号；同第6,660,742号；同第7,553,816B2；及びLi et al., Tet Letts., 50:2932-2935 (2009) に記載されているものが挙げられる。
【０１６３】
ピロロベンゾジアゼピン及びその類似体としては、Denny, Exp. Opin. Ther. Patents., 10(4):459-474 (2000)及びAntonow and Thurston, Chem Rev., 2815-2864 (2010)に記載されているものが挙げられる。
【０１６４】
代表的な微小管安定化及び不安定化薬としては、パクリタキセル、ドセタキセル、テセタキセル（tesetaxel）及びカルバジタキセル（carbazitaxel）などのタキサン化合物；マイタンシノイド、アウリスタチン及びその類似体、ビンカアルカロイド誘導体、エポチロン、及びクリプトフィシンが挙げられる。
【０１６５】
代表的なマイタンシノイド又はマイタンシノイド類似体としては、マイタンシノール及びマイタンシノール類似体、マイタンシンDM-1及びDM-4、並びに米国特許第5,208,020号；同第5,416,064号；同第6,333.410号；同第6,441,163号；同第6,716,821号；同第RE39,151号；及び同第7,276,497号に記載されているものが挙げられる。ある実施形態において、細胞毒性薬はマイタンシノイド、抗チューブリン作用物質の別の群（ImmunoGen, Inc.；Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131も参照のこと）、マイタンシノイド又はマイタンシノイド類似体である。適したマイタンシノイドの例としては、マイタンシノール及びマイタンシノール類似体が挙げられる。適したマイタンシノイドは、米国特許第4,424,219号;同第4,256,746号；同第4,294,757号；同第4,307,016号；同第4,313,946号；同第4,315,929号；同第4,331,598号；同第4,361,650号；同第4,362,663号；同第4,364,866号；同第4,450,254号；同第4,322,348号；同第4,371,533号；同第6,333,410号；同第5,475,092号；同第5,585,499号；及び同第5,846,545号に開示される。
【０１６６】
代表的なアウリスタチンとしては、アウリスタチンE（ドラスタチン-10の誘導体としても知られている）、アウリスタチンEB（AEB）、アウリスタチンEFP（AEFP）、モノメチルアウリスタチンE（MMAE）、モノメチルアウリスタチンF（MMAF）、アウリスタチンF、アウリスタチンFフェニレンジアミン（AFP）、アウリスタチンF HPA、及びドラスタチンが挙げられる。適したアウリスタチンはまた、米国特許公開第2003/0083263号；同第、2011/0020343号；同第、及び2011/0070248号；PCT出願公開WO09/117531、WO2005/081711、WO04/010957；WO02/088172及びWO01/24763、並びに米国特許第7,498,298号；同第6,884,869号；同第6,323,315号；同第6,239,104号；同第6,124,431号；同第6,034,065号；同第5,780,588号；同第5,767,237号；同第5,665,860号；同第5,663,149号；同第5,635,483号；同第5,599,902号；同第5,554,725号；同第5,530,097号；同第5,521,284号；同第5,504,191号；同第5,410,024号；同第5,138,036号；同第5,076,973号；同第4,986,988号；同第4,978,744号；同第4,879,278号；同第4,816,444号；同第4,486,414号にも記載されている、それらの開示の全体を参照により本明細書中に援用する。
【０１６７】
代表的なビンカアルカロイドとしては、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、及びナベルビン（ビノレルビン）が挙げられる。本発明に使用できる適したビンカアルカロイドはまた、米国特許公開第2002/0103136号及び同第2010/0305149号、並びに米国特許第7,303,749B1号で開示されている、それらの開示の全体を参照により本明細書中に援用する。
【０１６８】
代表的なエポチロン化合物としては、エポチロンA、B、C、D、E、F、及びその誘導体が挙げられる。例えば、適したエポチロン化合物及びその誘導体は、米国特許第6,956,036号；同第6,989,450号；同第6,121,029号；同第6,117,659号；同第6,096,757号；同第6,043,372号；同第5,969,145号；同第5,886,026号；WO97/19086；WO98/08849；WO98/22461；WO98/25929；WO98/38192；WO99/01124；WO99/02514；WO99/03848；WO99/07692；WO99/27890；及びWO99/28324に記載されている、それらの開示の全体を参照により本明細書中に援用する。
【０１６９】
代表的なクリプトフィシン化合物は、米国特許第6,680,311号及び同第6,680,311号に記載されている。
【０１７０】
代表的な白金化合物としては、シスプラチン（PLATINOL（登録商標））、カルボプラチン（PARAPLATIN（登録商標））、オキサリプラチン（ELOXATINE（登録商標））、イプロプラチン、オルマプラチン、及びテトラプラチンが挙げられる。
【０１７１】
さらに他のクラスの化合物又はこれらの若しくは他の細胞傷害様式の作用を有する化合物が選択されてもよく、マイトマイシンC、マイトマイシンA、ダウノルビシン、ドキソルビシン、モルフィリノ−ドキソルビシン、シアノモルフィリノ−ドキソルビシン、アミノプテリン、ブレオマイシン、1−（クロロメチル）−2,3−ジヒドロ-1H−ベンゾ［e］インドール−5−オール、ピロロベンゾジアゼピン（PBD）ポリアミド、及びその二量体が挙げられる。他の好適な細胞毒性薬としては、例えばピューロマイシン、トポテカン、リゾキシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エストラムスチン、クリプトフィシン（cryptophysins）、セマドチン、ディスコデルモリド、エリュテロビン、及びミトキサントロンが挙げられる。
【０１７２】
代表的なトポイソメラーゼI阻害剤としては、カンプトテシン、カンプトテシン誘導体、カンプトテシン類似体、及び非天然型カンプトテシン、例えば、CPT-11（イリノテカン）、SN-38、GI-147211C、トポテカン、9-アミノカンプトテシン、7−ヒドロキシメチルカンプトテシン、7−アミノメチルカンプトテシン、10−ヒドロキシカンプトテシン、（20S）−カンプトテシン、ルビテカン、ギマテカン、カレニテシン、シラテカン、ルルトテカン、エキサテカン、ジフロモテカン、ベロテカン、ルルトテカン、及びS39625が挙げられる。本発明に使用できる他のカンプトテシン化合物としては、例えば、J. Med. Chem., 29:2358-2363 (1986); J. Med. Chem., 23:554 (1980); J. Med. Chem., 30:1774 (1987).に記載されているものが挙げられる。
【０１７３】
血管新生阻害剤としては、MetAP2阻害剤、VEGF阻害剤、PIGF阻害剤、VGFR阻害剤、PDGFR阻害剤、MetAP2阻害剤が挙げられるが、これだけに限定されるない。代表的なVGFR及びPDGFR阻害剤としては、ソラフェニブ（Nexavar）、スニチニブ（Sutent）及びバタラニブが挙げられる。代表的なMetAP-2阻害剤としては、フマギルアミンを含めたフマギリンコア構造を含むあらゆる化合物を意味するフマギロール類似体が挙げられ、そしてそれは、Rodeschini et al., J. Org. Chem., 69, 357-373, 2004 and Liu, et al., Science 282, 1324-1327, 1998に記載のとおり、タンパク質からNH2末端メチオニンを除去するMetAP2の能力を阻害する。「フマギロール類似体」の限定されることの無い例は、J. Org. Chem., 69, 357, 2004; J.Org. Chem., 70, 6870, 2005; European Patent Application 0 354 787; J. Med. Chem., 49, 5645, 2006; Bioorg. Med. Chem., 11, 5051, 2003; Bioorg. Med. Chem., 14, 91, 2004; Tet. Lett. 40, 4797, 1999；WO99/61432；米国特許第6,603,812号；同第5,789,405号；同第5,767,293号；同第6,566,541号；同第6,207,704号に開示されている。
【０１７４】
代表的な細胞周期進行阻害剤としては、CDK阻害剤、例えば、BMS-387032やPD0332991など；Rhoキナーゼ阻害剤、例えばGSK429286など；チェックポイントキナーゼ阻害剤、例えばAZD7762など；オーロラキナーゼ阻害剤、例えばAZD1152、MLN8054及びMLN8237など；PLK阻害剤、例えばBI2536、BI6727（Volasertib）、GSK461364、ON-01910（Estybon）など；KSP阻害剤、例えばSB743921、SB715992（イスピネシブ）、MK-0731、AZD8477、AZ3146及びARRY-520などが挙げられる。
【０１７５】
代表的なPI3K／m-TOR／AKTシグナル伝達経路阻害剤としては、ホスホイノシチド3-キナーゼ（PI3K）阻害剤、GSK-3阻害剤、ATM阻害剤、DNA-PK阻害剤、及びPDK-1阻害剤が挙げられる。
【０１７６】
代表的なPI3キナーゼ阻害剤は、米国特許第6,608,053号で開示されており、そして、BEZ235、BGT226、BKM120、CAL101、CAL263、デメトキシビリジン、GDC-0941、GSK615、IC87114、LY294002、Palomid529、ペリホシン、PI-103、PF-04691502、PX-866、SAR245408、SAR245409、SF1126、Wortmannin、XL147、及びXL765が挙げられる。
【０１７７】
代表的なAKT阻害剤としては、AT7867が挙げられるが、これだけに限定されない。
【０１７８】
代表的なMAPKシグナル経路阻害剤としては、MEK、Ras、JNK、B-Raf、及びp38 MAPK阻害剤が挙げられる。
【０１７９】
代表的なMEK阻害剤は、米国特許第7,517,994号で開示されており、そして、GDC-0973、GSK1120212、MSC1936369B、AS703026、RO5126766、RO4987655、PD0325901、AZD6244、AZD8330、及びGDC-0973が挙げられる。
【０１８０】
代表的なB-raf阻害剤としては、CDC-0879、PLX-4032、及びSB590885が挙げられる。
【０１８１】
代表的なB p38 MAPK阻害剤としては、BIRB796、LY2228820、及びSB202190が挙げられる。
【０１８２】
受容体チロシンキナーゼ（RTK）は、癌細胞の無制限増殖及び血管新生を刺激するシグナル伝達経路に関連している細胞表面受容体であることが多い。（受容体を過剰発現するか、又は受容体の活性化を導く変異を含んでなる）多くのRTKが同定されてきたが、VEGFR、EGFR、FGFR、PDGFR、EphR、及びRET受容体ファミリー受容体が挙げられるが、これらだけに限定されない。代表的な特異的RTK標的としては、ErbB2、FLT-3、c-Kit、及びc-Metが挙げられる。
【０１８３】
代表的なErbB2受容体（EGFRファミリー）の阻害剤としては、AEE788（NVP-AEE788）、BIBW2992、（Afatinib）、Lapatinib、Erlotinib（Tarceva）、及びゲフィチニブ（イレッサ）が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１８４】
２以上のシグナル伝達経路を標的とする代表的なRTK阻害剤（多標的キナーゼ阻害剤）としては、FGFR、FLT-3、VEGFR-PDGFR、及びBcr-Abl受容体を標的とするAP24534（ポナチニブ）；FLT-3及びVEGFR-PDGFR受容体を標的とするABT-869（リニファニブ）；VEGFR-PDGFR、Flt-1及びVEGF受容体を標的とするAZD2171；VEGFR-PDGFR、FGFR、Flt-3、及びc-Kit受容体を標的とするCHR-258（ドビチニブ）；VEGFR、PDGFR、KIT、FLT-3、及びCSF IRを標的とするスニチニブ（Sutent）；VEGFR、PDGFR、並びにRaf／Mek／Erk経路の細胞内セリン／スレオニンキナーゼを標的とするソラフェニブ（Nexavar）及びバタラニブが挙げられる。
【０１８５】
代表的なタンパク質シャペロン阻害剤としては、HSP90阻害剤が挙げられる。代表的なHSP90阻害剤としては、17AAG誘導体、BIIB021、BIIB028、SNX-5422、NVP-AUY-922、及びKW-2478が挙げられる。
【０１８６】
代表的なHDAC阻害剤としては、MS-275のBelinostat（PXD101）、CUDC-101、ドロキシノスタット、ITF2357（ギビノスタット、ガビノスタット）、JNJ-26481585、LAQ824（NVP-LAQ824、ダシノスタット）、LBH-589（パノビノスタット）、MC1568、MGCD0103（モセチノスタット）、（エンチノスタット）、PCI-24781、ピロキシアミド（NSC696085）、SB939、トリコスタチンA、及びボリノスタット（SAHA）が挙げられる。
【０１８７】
代表的なPARP阻害剤としては、イニパリブ（BSI201）、オラパリブ（AZD-2281）、ABT-888（ベリパリブ）、AG014699、CEP9722、MK4827、KU-0059436（AZD2281）、LT-673、3-アミノベンズアミド、A-966492、及びAZD2461が挙げられる。
【０１８８】
代表的なWnt／ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤としては、ビスモデギブ（RG3616／GDC-0449）、シクロパミン（11-デオキソジェルビン）（ヘッジホッグ経路阻害剤）、及びXAV-939（Wnt経路阻害剤）が挙げられる。
【０１８９】
代表的なRNAポリメラーゼ阻害剤としては、アマトキシンが挙げられる。代表的なアマトキシンとしては、α-アマニチン、β-アマニチン、γ-アマニチン、ε-アマニチン、アマヌリン、アマヌリン酸、アマニンアミド、アマニン、及びプロアマヌリンが挙げられる。
【０１９０】
代表的なタンパク質合成阻害剤としては、トリコテセン化合物が挙げられる。
【０１９１】
一実施形態において、本発明の薬剤は、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、非天然カンプトテシン化合物など）、ビンカアルカロイド、キナーゼ阻害剤（例えば、PI3キナーゼ阻害剤（GDC-0941やPI-103））、MEK阻害剤、KSP阻害剤、RNAポリメラーゼ阻害剤、タンパク質合成阻害剤、PARP阻害剤、ドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、アウリスタチン、ドラスタチン、カリケアマイシン、トポテカン、SN38、カンプトテシン、エキサテカン、ネモルビシン及びその誘導体、PNU-159682、CC1065、エリナフィド、トリコテセン、ピロロベンゾジアゼピン、マイタンシノイド、DNA結合剤、白金化合物又は白金化合物、並びにその類似体である。具体的な実施形態において、薬剤は、SN-38、カンプトテシン、トポテカン、エキサテカン、カリケアマイシン、エキサテカン、ネモルビシン、PNU-159682、アントラサイクリン、マイタンシノイド、タキサン、トリコテセン、CC1065、エリナフィド、ビンデシン、ビンブラスチン、PI-103、AZD8330、ドラスタチン、アウリスタチンE、アウリスタチンF、デュオカルマイシン化合物、イスピネシブ、ピロロベンゾジアゼピン、ARRY-520、並びにその立体異性体、同配体、及び類似体である。
【０１９２】
もう1つの実施形態において、本発明に使用される薬剤は、２以上の薬剤の組み合わせ、例えば、PI3キナーゼ阻害剤とMEK阻害剤；広域細胞毒性化合物と白金化合物；PARP阻害剤と白金化合物；広域細胞毒性化合物とPARP阻害剤などである。
【０１９３】
さらに別の実施形態において、本発明に使用される薬剤は、アウリスタチンF−ヒドロキシプロピルアミドL−アラニンである。
【０１９４】
一実施形態において、ビンカアルカロイドは、式（V）の化合物である：
【化２９】
0006420331.tif 000031
（式中、
R14は、水素、-C（O）-C1-3アルキル又は-C（O）-クロロ置換されたC1-3アルキルであり；
R15は、水素、-CH3又は-CHOであり；
R17及びR18は、独立してあるとき、R18は水素であり、且つR16又はR17のどちらかがエチルであり、そして、もう片方がヒドロキシルであり；
R17及びR18は、それらが結合されている炭素と一緒にあるとき、オキシラン環を形成し、R16はエチルであり；
R19は、水素、OH、アミノ基、アルキルアミノ又は-［C（R20R21）］-R22であり；
各R20及びR21は独立して、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、ヒドロキシル化C6-10アリール、ポリヒドロキシル化C6-10アリール、5〜12員複素環化合物、C3-8シクロアルキル、ヒドロキシル化C3-8シクロアルキル、ポリヒドロキシル化C3-8シクロアルキル又は天然若しくは非天然のアミノ酸側鎖であり；
R22は、-OH、-NH2、-COOH、-R82-C（O）（CH2）c-C（H）（R23）-N（H）（R23）、-R82-C（O）（CH2）d-（OCH2-CH2）f-N（H）（R23）又は-R82-（C（O）-CH（X2）-NH）d-R77であり；
各R23は独立して、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、C3-8シクロアルキル、-COOH、又は-COO-C1-6アルキルであり；
X2は、天然又は非天然のアミノ酸側鎖であり；
R77は、水素であるか、又はX2とNR77は、窒素含有複素環部分を形成し；
R82は、-NH又は酸素であり；
aは、1〜6の整数であり；
cは、0〜3の整数であり；
dは、1〜3の整数であり；そして
fは、1〜12の整数である）。
【０１９５】
ビンカアルカロイドに関する更なる例は、US2010/0305149及びUS2002/0103136に記載されている。
【０１９６】
一実施形態において、式（V）のビンカアルカロイドは、式（VI）：
【化３０】
0006420331.tif 000032
（式中、
R40は、水素、-OH、-NH2、又は次の構造：
【化３１】
0006420331.tif 000033
（式中、
aは、1〜6の整数であり；そして
cは、0〜3の整数である）
のいずれである）
の化合物である。
【０１９７】
一実施形態において、式（VI）におけるR40は、
【化３２】
0006420331.tif 000034
である。
【０１９８】
一実施形態において、R40は、
【化３３】
0006420331.tif 000035
である。
【０１９９】
別の実施形態において、式（VI）の化合物は、式（VIa）、（VIb）、（VIc）又は（VId）：
【化３４】
0006420331.tif 000036
【化３５】
0006420331.tif 000037
の化合物である。
【０２００】
もう1つの実施形態において、非天然カンプトテシンは、式（VII）の化合物である：
【化３６】
0006420331.tif 000038
（式中、
R24は、-H、-Cl、-F、-OH又はアルキルであるか；又はR24及びR25は一緒に、5又は6員環を形成してもよく；
R25は、-H、-F、-OH、-CH3CH=N-O-t-ブチル、-CH2CH2Si（CH3）3、Si（（CH3）2）-t-ブチル、-O-C（O）-R29であり；
R29は、-NH2、-R28-C1-6アルキル-R22、5〜12員ヘテロシクロアルキル、R28-C5-12ヘテロシクロアルキル-C1-6アルキル-R22又は-R28-C1-6アルキル-C6-12アリール-C1-6アルキル-R22であり；
R26は、-H、-CH2-N（CH3）2、NH2、又はNO2であり；
R27は、エチル、N-メチルピペリジン、シクロアルキル、-CH2CH2NHCH（CH3）2、又は-N-4-メチルシクロヘキシルアミンであり；
R79は、-H又は-C（O）-R28-［C（R20R21］a-R22であり；
各R20及びR21は独立して、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、ヒドロキシル化C6-10アリール、ポリヒドロキシル化C6-10アリール、5〜12員複素環化合物、C3-8シクロアルキル、ヒドロキシル化C3-8シクロアルキル、ポリヒドロキシル化C3-8シクロアルキル又は天然若しくは非天然のアミノ酸側鎖であり；
R22は、-OH、-NH2、-COOH、-R82-C（O）（CH2）c-C（H）（R23）-N（H）（R23）、-R82-C（O）（CH2）d-（OCH2-CH2）f-N（H）（R23）、又は-R82-（C（O）-CH（X2）-NH）d-R77であり；
各R23は独立して、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、C3-8シクロアルキル、-COOH、又は-COO-C1-6アルキルであり；
X2は、天然又は非天然のアミノ酸側鎖であり；
R77は、水素であるか、又はX2とNR77は、窒素含有環化合物を形成し；
R82は、-NH又は酸素であり；或いは
R26及びR27は、それらが結合された2つの炭素原子と一緒にあり、且つ3番目の炭素原子がその2つの炭素原子と結合しているとき、任意に置換される6員環を形成し；
R28は、存在しない、NH又は酸素であり；
aは、1〜6の整数であり；
cは、0〜3の整数であり；
dは、1〜3の整数であり；
fは、1〜12の整数であり；
uは、0又は1の整数であり；
wは、0又は1の整数であり；そして
但し、式（VII）の化合物は、R29及びR79のうちの少なくとも1つを含まなければならない）。
【０２０１】
一実施形態において、式（VII）のカンプトテシン化合物は、式（VIII）、（VIIIa）、若しくは（VIIIb）、又は式（XXV）若しくは（XXVa）の化合物である：
【化３７】
0006420331.tif 000039
【化３８】
0006420331.tif 000040
（式中、
R30は、-NH2、-R28-C1-6アルキル-R22、5〜12員ヘテロシクロアルキル、R28-C5-12ヘテロシクロアルキル-C1-6アルキル-R22又は-R28-C1-6アルキル-C6-12アリール-C1-6アルキル-R22であり；
R28は、存在しない、NH又は酸素であり；
各R20及びR21は独立して、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、ヒドロキシル化C6-10アリール、ポリヒドロキシル化C6-10アリール、5〜12員複素環化合物、C3-8シクロアルキル、ヒドロキシル化C3-8シクロアルキル、ポリヒドロキシル化C3-8シクロアルキル又は天然若しくは非天然のアミノ酸側鎖であり；
R22は、-OH、-NH2、-COOH、-R82-C（O）（CH2）c-C（H）（R23）-N（H）（R23）、-R82-C（O）（CH2）d-（OCH2-CH2）f-N（H）（R23）又は-R82-（C（O）-CH（X2）-NH）d-R77であり；
各R23は独立して、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、C3-8シクロアルキル、-COOH、又は-COO-C1-6アルキルであり；
X2は、天然又は非天然のアミノ酸側鎖であり；
R77は、水素であるか、又はX2とNR77は、窒素含有環化合物を形成し；
R82は、-NH又は酸素であり；
cは、0〜3の整数であり；
dは、1〜3の整数であり；そして
fは、1〜12の整数である）。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、R30は、次の構造：
【化３９】
0006420331.tif 000041
（式中、
aは、1〜6の整数であり；
cは、0〜3の整数であり；そして
gは、2〜6の整数である）
のうちのいずれかである。
【０２０３】
一実施形態において、式（VII）では、R30は：
【化４０】
0006420331.tif 000042
である。
【０２０４】
別の実施形態において、式（VII）の化合物は、式（VIIa）、（VIIb）、（VIIc）、（VIId）、（VIIe）又は（VIIf）の化合物である：
【化４１】
0006420331.tif 000043
【化４２】
0006420331.tif 000044
【化４３】
0006420331.tif 000045
【０２０５】
もう1つの実施形態において、PI3キナーゼ阻害剤は、式（IX）の化合物である：
【化４４】
0006420331.tif 000046
（式中、
R47は、アミノ基、-R9-［C（R20R21）］a-R10、-R9-C5-12ヘテロシクロアルキル-C1-6アルキル-R10、又は5〜12員ヘテロシクロアルキルであり；
各R20及びR21は独立して、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、ヒドロキシル化C6-10アリール、ポリヒドロキシル化C6-10アリール、5〜12員複素環化合物、C3-8シクロアルキル、ヒドロキシル化C3-8シクロアルキル、ポリヒドロキシル化C3-8シクロアルキル又は天然若しくは非天然のアミノ酸側鎖であり；
R10は、-OH、-NHR83、-N-（R83）R11、-COOH、-R82-C（O）（CH2）c-C（H）（R23）-N（H）（R23）、-R82-C（O）（CH2）d-（OCH2-CH2）f-N（H）（R23）、-R82-（C（O）-CH（X2）-NH）d-R77又は-R82-C（O）-［C（R20R21］-R82-R83であり；
各R23は独立して、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、C3-8シクロアルキル、-COOH、又は-COO-C1-6アルキルであり；
X2は、天然若しくは非天然のアミノ酸側鎖であり；
R77は、水素であるか、又はX2とNR77は、窒素含有環化合物を形成し；
R82は、-NH又は酸素であり；
R9は、存在しない、N-（R83）又は酸素であり；
R83は、水素又はCH3であり；
R11は、
【化４５】
0006420331.tif 000047
であり、
各R12は、独立して、水素、クロリド、-CH3又は-OCH3であり；
R13は、水素又は-C（O）-（CH2）d-（O-CH2-CH2）f-NH2であり；
R82は−NH又は酸素であり；
X4は、リジン、アルギニン、シトルリン、アラニン又はグリシンの側鎖であり；
X5は、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン又はトリプトファンの側鎖であり；
各X6及びX7は独立して、グリシン、アラニン、セリン、バリン又はプロリンの側鎖であり；
aは、1〜6の整数であり；
cは、0〜3の整数であり；
dは、1〜3の整数であり；
fは、1〜12の整数であり；
各uは独立して、0又は1の整数であるか；或いは
R11は、-Yu-Wq-R88であり、
ここで、Yは、以下の構造：
【化４６】
0006420331.tif 000048
（各式中、
Yの末端のNR83は、R88に対して近位であり；
R83は、水素又はCH3であり；
各Wは、アミノ酸単位であり；
各R12'は、独立して、ハロゲン、-C1-8アルキル、-Ｏ-C1-8アルキル、ニトロ又はシアノであり；
R88は、水素又は-C(O)-(CH2)ff-(NH-C(O))aa-Ej-(CH2)bb-R85であり；
R85は、ＮＨ2又はＯＨであり；
Ｅは、-CH2- 又は -CH2CH2O-であり;
uは、0又は1の整数であり；
qは、0〜12の整数であり；
aaは、0又は1の整数であり；
bbは、0又は2の整数であり；
ffは、0〜10の整数であり；
hは、0〜4の整数であり；
jは、0〜12の整数であり；そして
Eが-CH2-であり、bbが０であり、そしてjが0〜10の整数であるとき；そしてEが-CH2CH2-O-であり、bbが2であり、そしてjが1〜12の整数であるときである）
のいずれか１つであり；
或いは、R11は、以下の式：
【化４７】
0006420331.tif 000049
（式中、
R83は、水素又はCH3であり；
R84は、C1-6アルキル又はC6-10アリールであり；
各R12'は、独立して、ハロゲン、-C1-8アルキル、-Ｏ-C1-8アルキル、ニトロ又はシアノであり；
hは、0〜4の整数であり；そして
uは、0又は1の整数である）
である）。
【０２０６】
いくつかの実施形態において、R11は、以下の式：
【化４８】
0006420331.tif 000050
（式中、
R83は、水素又はCH3であり；
R84は、C1-6アルキル又はC6-10アリールであり；
各R12'は、独立して、クロリド、-CH3又は-OCH3であり；
R88は、水素又はC(O)-(CH2)ff-(CH2-CH2O)j-CH2-CH2-NH2であり；
R82は、-NH又は酸素であり；
X4は、リジン、アルギニン、シトルリン、アラニン又はグリシンの側鎖であり；
X5は、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン又はトリプトファンの側鎖であり；
各X6及びX7は独立して、グリシン、アラニン、セリン、バリン又はプロリンの側鎖であり；
ffは、1〜3の整数であり；
jは、1〜12の整数であり；
hは、0〜4の整数であり；そして
各uは独立して、0又は1の整数である）
である。
【０２０７】
いくつかの態様において、
【化４９】
0006420331.tif 000051
は、シトルリンバリン；リジンフェニルアラニン；シトルリンフェニルアラニン；シトルリンロイシン；シトルリンバリングリシングリシン；グリシンフェニルアラニングリシングリシン；バリン；プロリン；ロイシン又はイソロイシンである。
【０２０８】
もう1つの実施形態において、R11は、次の構造のうちのいずれかである：
【化５０】
0006420331.tif 000052
【化５１】
0006420331.tif 000053
【化５２】
0006420331.tif 000054
【０２０９】
いくつかの実施形態において、R47は、次の構造のうちのいずれかである：
【化５３】
0006420331.tif 000055
【化５４】
0006420331.tif 000056
【化５５】
0006420331.tif 000057
（式中、
aは、1〜6の整数であり；
cは、0〜3の整数であり；そして
gは、2〜6のは整数である）。
【０２１０】
もう1つの実施形態において、アウリスタチンは、式（X）の化合物である：
【化５６】
0006420331.tif 000058
（式中、
各R31及びR32は独立して、水素又はC1-8アルキルであり、且つ最大でR31及びR32の1つが水素であり；
R33は、水素、C1-8アルキル、C3-8炭素環、C6-10アリール、C1-8ル-C6-10アリール、X1-（C3-8炭素環）、C3-8複素環化合物又はX1-（C3-8複素環化合物）であり；
R34は、水素、C1-8アルキル、C3-8炭素環、C6-10アリール、X1-C6-10アリール、X1-（C3-8炭素環）、C3-8複素環化合物又はX1-（C3-8複素環化合物）であり；
R35は、水素又はメチルであり；又は
R34及びR35は、それらが結合されている炭素原子と一緒に、式-（CR55R41）b-（式中、各R55及びR41は独立して、水素又はC1-8アルキルであり、且つbは、3〜7の整数である）を有する炭素環式環を形成し；
R36は、水素又はC1-8アルキルであり；
R37は、水素、C1-8アルキル、C3-8炭素環、C6-10アリール、-X1-C6-10アリール、-X1-（C3-8炭素環）、C3-8複素環化合物又は-X1-（C3-8複素環化合物）であり；
各R38は独立して、水素、OH、C1-8アルキル、C3-8炭素環又はO-（C1-8アルキル）であり；
R53は、
【化５７】
0006420331.tif 000059
であるか、又はR54であり；
R39は、H、C1-8アルキル、C6-10アリール、-X1-C6-10-アリール、C3-8炭素環、C3-8複素環化合物、-X1-C3-8複素環化合物、-C1-8アルキレン-NH2、又は（CH2）2SCH3であり；
各X1は独立して、C1-10アルキレン又はC3-10シクロアルキレンであり；
R44は、水素又はC1-8アルキルであり；
R45は、X3-R42又はNH-R19であり；
X3は、O又はSであり；
R19は、水素、OH、アミノ基、アルキルアミノ又は-［C（R20R21）］a-R22であり；
R42は、アミノ基、C1-6アルキルアミノ又は-［C（R20R21）］a-R22であり；
各R20及びR21は独立して、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、ヒドロキシル化C6-10アリール、ポリヒドロキシル化C6-10アリール、5〜12員複素環化合物、C3-8シクロアルキル、ヒドロキシル化C3-8シクロアルキル、ポリヒドロキシル化C3-8シクロアルキル又は天然若しくは非天然のアミノ酸側鎖であり；
R22は、-OH、-NHR23、-COOH、-R82-C（O）（CH2）c-C（H）（R23）-N（H）（R23）、-R82-C（O）（CH2）d-（OCH2-CH2）f-N（H）（R23）又は-R82-（C（O）-CH（X2）-NH）d-R77であり；
各R23は独立して、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、C3-8シクロアルキル、-COOH、又は-COO-C1-6アルキルであり；
X2は、天然若しくは非天然のアミノ酸側鎖であり；
R77は、水素であるか、又はX2とNR77は、窒素含有環化合物を形成し；
R82は、-NH又は酸素であり；
R54は、-C（R56）2-C（R56）2-C6-10アリール、-C（R56）2-C（R56）2-C3-8複素環化合物又は-C（R56）2-C（R56）2-C3-8炭素環であり；
R56は、H、OH、C1-8アルキル、C3-8炭素環、-O-C1-8アルキル、-O-C（O）-R29、及び-O-R23-O-C1-6アルキル-NH2から独立して選択され；
R29は、アミノ基、5〜12員ヘテロシクロアルキル、-R28-C1-6アルキル-R22、R28-C5-12ヘテロシクロル-C1-6アルキル-R22、-［C（R20R21）］a-R22、又は-R28-C1-6アルキル-C6-12アリール-C1-6アルキル-R22であり；
R28は、存在しない、NH又は酸素であり；
aは、1〜6の整数であり；
cは、0〜3の整数であり；
dは、1〜3の整数であり；そして
fは、1〜12の整数である）。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、式（X）のアウリスタチン化合物内で、
R39は、ベンジル又は
【化５８】
0006420331.tif 000060
であり；そして
R44は、水素である。
【０２１２】
別の実施形態において、アウリスタチンは、式（Xa）の化合物である：
【化５９】
0006420331.tif 000061
（式中、
R33からR38まで、及びR44は本明細書中に定義されるとおりのものであり、
R31及びR32のうちの一方が水素又はC1-8アルキルであり、もう片方が以下とおりである：
【化６０】
0006420331.tif 000062
（式中、
R83は、水素又はCH3であり；
R84は、C1-6アルキル又はC6-10アリールであり；
各R12’は独立して、ハロゲン、−C1-8アルキル、−O−C1-8アルキル、ニトロ又はシアノであり；
hは、0〜4の整数であり；そして
uは、0又は1の整数であり；
R53は、
【化６１】
0006420331.tif 000063
であるか、又はR54であり；
R39は、H、C1-8アルキル、C6-10アリール、-X1-C6-10-アリール、C3-8炭素環、C3-8複素環化合物、-X1-C3-8複素環化合物、-C1-8アルキレン-NH2、又は（CH2）2SCH3であり；
各X1は独立して、C1-10アルキレン又はC3-10シクロアルキレンであり；
R45は、X3-R42又はNH-R19であり；
X3は、O又はSであり；
R19は、水素、OH、アミノ基、アルキルアミノ又は-［C（R20R21）］a-R22であり；
R42は、アミノ基、C1-6アルキルアミノ又は-［C（R20R21）］a-R22であり；
各R20及びR21は独立して、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、ヒドロキシル化C6-10アリール、ポリヒドロキシル化C6-10アリール、5〜12員複素環化合物、C3-8シクロアルキル、ヒドロキシル化C3-8シクロアルキル、ポリヒドロキシル化C3-8シクロアルキル又は天然若しくは非天然のアミノ酸側鎖であり；
R22は、-OH、-NHR23、-COOH、-R82-C（O）（CH2）c-C（H）（R23）-N（H）（R23）、-R82-C（O）（CH2）d-（OCH2-CH2）f-N（H）（R23）又は-R82-（C（O）-CH（X2）-NH）d-R77であり；
各R23は独立して、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、C3-8シクロアルキル、-COOH、又は-COO-C1-6アルキルであり；
X2は、天然若しくは非天然のアミノ酸側鎖であり；
R77は、水素であるか、又はX2とNR77は、窒素含有環化合物を形成し；
R82は、-NH又は酸素であり；
R54は、-C（R56）2-C（R56）2-C6-10アリール、-C（R56）2-C（R56）2-C3-8複素環化合物又は-C（R56）2-C（R56）2-C3-8炭素環であり；
R56は、H、OH、C1-8アルキル、C3-8炭素環、-O-C1-8アルキル、-O-C（O）-R29、及び-O-R23-O-C1-6アルキル-NH2から独立して選択され；
R29は、アミノ基、5〜12員ヘテロシクロアルキル、-R28-C1-6アルキル-R22、R28-C5-12ヘテロシクロル-C1-6アルキル-R22、-［C（R20R21）］a-R22、又は-R28-C1-6アルキル-C6-12アリール-C1-6アルキル-R22であるか、又はR29は、本明細書中に定義されるようにR47であり；
R28は、存在しない、NH又は酸素であり；
aは、1〜6の整数であり；
cは、0〜3の整数であり；
dは、1〜3の整数であり；そして
fは、1〜12の整数である）。
【０２１３】
一実施形態において、式（Xa）のアウリスタチン化合物は、式（XIa）又は式（XIb）の化合物である：
【化６２】
0006420331.tif 000064
（式中、
R92は、以下のとおりであり：
【化６３】
0006420331.tif 000065
そして
R83は、水素又はCH3である）。
【０２１４】
一実施形態において、式（X）のアウリスタチンは、式（XI）、式（XII）又は式（XIII）の化合物であって：
ここで、式（XI）の化合物は：
【化６４】
0006420331.tif 000066
（式中、R42は、-CH3又は次の構造のうちのいずれかである：
【化６５】
0006420331.tif 000067
（式中、
aは、1〜6の整数であり；
cは、0〜3の整数である；そして
gは、2〜6の整数である））
であり；
ここで、式（XII）の化合物は：
【化６６】
0006420331.tif 000068
（式中、R40は、水素、-OH、-NH2、又は次の構造のうちのいずれかである：
【化６７】
0006420331.tif 000069
【化６８】
0006420331.tif 000070
（式中、
aは、1〜6の整数であり；
gは、2〜6の整数であり；そして
cは、0〜3の整数である））
であり；
ここで、式（XIII）の化合物は：
【化６９】
0006420331.tif 000071
（式中、
R29は、アミノ基、5〜12員ヘテロシクロアルキル、-R28-C1-6アルキル-R22、R28-C5-12ヘテロシクロル-C1-6アルキル-R22、-R28［C（R20R21）］a-R22、又は-R28-C1-6アルキル-C6-12アリール-C1-6アルキル-R22であるか、又はR29は、本明細書中に定義されるようにR47であり；
各R20及びR21は独立して、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、ヒドロキシル化C6-10アリール、ポリヒドロキシル化C6-10アリール、5〜12員複素環化合物、C3-8シクロアルキル、ヒドロキシル化C3-8シクロアルキル、ポリヒドロキシル化C3-8シクロアルキル又は天然若しくは非天然のアミノ酸側鎖であり；
R22は、-OH、-NHR23、-COOH、-R82-C（O）（CH2）c-C（H）（R23）-N（H）（R23）、-R82-C（O）（CH2）d-（OCH2-CH2）f-N（H）（R23）又は-R82-（C（O）-CH（X2）-NH）d-R77であり；
各R23は独立して、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、C3-8シクロアルキル、-COOH、又は-COO-C1-6アルキルであり；
X2は、天然若しくは非天然のアミノ酸側鎖であり；
R77は、水素であるか又はX2とNR77は、窒素含有環化合物を形成し；
R82は、-NH又は酸素であり；
R28は、存在しない、NH又は酸素であり；
aは、1〜6の整数であり；
cは、0〜3の整数であり；
dは、1〜3の整数であり；そして
fは、1〜12の整数である）
である。
【０２１５】
一実施形態において、式（XII）では、R40は：
【化７０】
0006420331.tif 000072
である。
【０２１６】
別の実施形態において、式（XII）の化合物は、式（XIIb）又は（XIIc）の化合物である：
【化７１】
0006420331.tif 000073
【０２１７】
一実施形態において、式（XIII）の化合物では、
R29は、-NH2、5員ヘテロシクロアルキル、-R28-C1-6アルキル-R22、R28-C5-12ヘテロシクロル-C1-6アルキル-R22又は-R28-C1-6アルキル-C6-12アリールC1-6アルキル-R22であるか、又はR29は、本明細書中に定義されるようにR47であり；
R28は、存在しない、NH又は酸素であり；
R22は、-OH、-NHR23、-COOH、-R82-C（O）（CH2）c-C（H）（R23）-N（H）（R23）、-R82-C（O）（CH2）d-（OCH2-CH2）f-N（H）（R23）又は-R82-（C（O）-CH（X2）-NH）d-R77であり；
各R23は独立して、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、C3-8シクロアルキル、-COOH、又は-COO-C1-6アルキルであり；
X2は、天然若しくは非天然のアミノ酸側鎖であり；
R77は、水素であるか、又はX2とNR77は、窒素含有環化合物を形成し；
R82は、-NH又は酸素であり；
cは、0〜3の整数であり；
dは、1〜3の整数であり；そして
fは、1〜12の整数である。
【０２１８】
更にもう１つの実施形態において、R29は、次の構造のうちのいずれかである：
【化７２】
0006420331.tif 000074
【化７３】
0006420331.tif 000075
（式中、
aは、1〜6の整数であり；
cは、0〜3の整数であり；そして
gは、2〜6の整数である）。
【０２１９】
一実施形態において、MEK阻害剤は、式（XIV）の化合物である：
【化７４】
0006420331.tif 000076
（式中、
R43は、H又は-R46-R47であり；
各R20及びR21は独立して、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、ヒドロキシル化C6-10アリール、ポリヒドロキシル化C6-10アリール、5〜12員複素環化合物、C3-8シクロアルキル、ヒドロキシル化C3-8シクロアルキル、ポリヒドロキシル化C3-8シクロアルキル又は天然若しくは非天然のアミノ酸側鎖であり；
R22は、-OH、-NH2、-COOH、-R82-C（O）（CH2）c-C（H）（R23）-N（H）（R23）、-R82-C（O）（CH2）d-（OCH2-CH2）f-N（H）（R23）又は-R82-（C（O）-CH（X2）-NH）d-R77であり；
各R23は独立して、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、C3-8シクロアルキル、-COOH、又は-COO-C1-6アルキルであり；
X2は、天然若しくは非天然のアミノ酸側鎖であり；
R77は、水素であるか、又はX2とNR77は、窒素含有環化合物を形成し；
R82は、-NH又は酸素であり；
R46は、-C（O）-、C（O）-O-、-C（O）-NH又は存在せず；
R47は、本明細書中に定義されるものであり；
aは、1〜6の整数であり；
cは、0〜3の整数であり；
dは、1〜3の整数であり；そして
fは、1〜12の整数である）。
【０２２０】
MEK阻害剤に関する更なる例は、US7,517,994B2で開示されている。
【０２２１】
いくつかの実施形態において、
R43は、-C（O）-（CH2）a-NH2、又は-C（O）C（H）（CH3）-（CH2）c-NH2であり；式中、aは、1〜6の整数であり；且つcは、0〜3の整数である。
【０２２２】
もう1つの実施形態において、デュオカルマイシン化合物は、式（XV）の化合物である：
【化７５】
0006420331.tif 000077
（式中、
R47は、本明細書中に定義されるものであり；
R48は、水素、-COO-C1-6アルキル、-COOH、-NH2又は-CH3であり；
R49は、Cl、Br又は-OHであり；
R50は、水素、-OCH3、
【化７６】
0006420331.tif 000078
各R51及びR52は独立して、水素又は-OCH3であり；そして
環AAは、フェニル又はピロリル環のうちのいずれかである。
【０２２３】
デュオカルマイシン化合物に関する更なる例は、US7,553,816で開示されている。
【０２２４】
一実施形態において、式（XV）のデュオカルマイシン化合物は、次の式（XVI）、（XVII）、（XVIII）又は（XIX）の化合物である：
【化７７】
0006420331.tif 000079
（式中、
R49は、Cl、Br又は-OHであり；そして
R47は、本明細書中に定義されるとおりのものである）。
【０２２５】
もう1つの実施形態において、デュオカルマイシン化合物は、式（XX）のデュオカルマイシンSA化合物：US5101038；又は（XXI）である：
【化７８】
0006420331.tif 000080
（式中、
R42は、C1-6アルキルアミノ又は-［C（R20R21）］a-R22であり；
各R20及びR21は独立して、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、ヒドロキシル化C6-10アリール、ポリヒドロキシル化C6-10アリール、5〜12員複素環化合物、C3-8シクロアルキル、ヒドロキシル化C3-8シクロアルキル、ポリヒドロキシル化C3-8シクロアルキル又は天然若しくは非天然のアミノ酸側鎖であり；
R22は、-OH、-NH2、-COOH、-R82-C（O）（CH2）c-C（H）（R23）-N（H）（R23）、-R82-C（O）（CH2）d-（OCH2-CH2）f-N（H）（R23）、又は-R82-（C（O）-CH（X2）-NH）d-R77であり；
各R23は独立して、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、C3-8シクロアルキル、-COOH、又は-COO-C1-6アルキルであり；
X2は、天然若しくは非天然のアミノ酸側鎖であり；
R77は、水素であるか、又はX2とNR77は、窒素含有環化合物を形成し；
R82は、-NH又は酸素であり；
aは、1〜6の整数であり；
cは、0〜3の整数であり；
dは、1〜3の整数であり；そして
fは、1〜12の整数である）。
【０２２６】
いくつかの実施形態において、R42は、次の構造のいずれかである：
【化７９】
0006420331.tif 000081
【化８０】
0006420331.tif 000082
（式中、
aは、1〜6の整数であり；
gは、2〜6の整数であり；そして
cは、0〜3の整数である）。
【０２２７】
もう1つの実施形態において、KSP阻害剤化合物は、式（XXVI）の化合物である：
【化８１】
0006420331.tif 000083
（式中、
R30は、本明細書中に定義されるとおりのものである）。
【０２２８】
いくつかの実施形態において、R30は：
【化８２】
0006420331.tif 000084
（式中、
aは、1〜6の整数であり；
cは、0〜3の整数であり；そして
gは、2〜6の整数である）
である。
【０２２９】
別の実施形態において、デュオカルマイシン化合物は、デュオカルマイシンA、デュオカルマイシンB1、デュオカルマイシンB2、デュオカルマイシンC1、デュオカルマイシンC2、デュオカルマイシンD、CC-1065、アドゼレシン、ビゼレシン、又はカルゼレシンである。
【０２３０】
もう1つの実施形態において、KSP阻害剤化合物は、式（XXVII）、（XXVIII）又は（XXIX）の化合物である：
【化８３】
0006420331.tif 000085
（式中、
R11は、本明細書中に定義されるとおりのものである）。
【０２３１】
治療薬分野の当業者は、本明細書中に記載した治療薬の各々を、得られた化合物が本来の化合物の特異性及び／又は活性を保有し続けるような様式で修飾できることを容易に理解するであろう。当業者はまた、これらの化合物の多くが本明細書中に記載した治療薬に代わって使用できることも理解するであろう。これにより、本発明の治療薬には、本明細書中に記載した化合物の類似体や誘導体が含まれる。
【０２３２】
次の表Bは、本発明の高分子−薬剤−タンパク質コンジュゲート又は高分子−薬剤足場を形成するための結合に適した治療薬と誘導体のより多くの例を提供する。特定の化合物に関するスペクトルデータもまた提供する（表中のNDは「不検出」を意味する）。これらの例もまた、薬剤がインビトロ又はインインビボにおいてコンジュゲートから放出される際の、薬剤の活性型であり得る。
【化８４】
0006420331.tif 000086
【化８５】
0006420331.tif 000087
【化８６】
0006420331.tif 000088
【化８７】
0006420331.tif 000089
【化８８】
0006420331.tif 000090
【化８９】
0006420331.tif 000091
【化９０】
0006420331.tif 000092
【化９１】
0006420331.tif 000093
【化９２】
0006420331.tif 000094
【化９３】
0006420331.tif 000095
【化９４】
0006420331.tif 000096
【化９５】
0006420331.tif 000097
【０２３３】
タンパク質ベースの認識分子（PBRM）
タンパク質ベースの認識分子は、細胞内の特定の組織、細胞、又は位置に薬剤−高分子−担体コンジュゲートを向かわせる。タンパク質ベースの認識分子は、標的である培養物に、又は生体全体に、又はそれら両方に修飾した高分子を向かわせることができる。いずれの場合も、タンパク質ベースの認識分子は、標的とされた細胞（複数可）の細胞表面に存在するリガンドを有し、それに、有効な特異性、親和性及び結合活性で結合する。一部の実施形態では、タンパク質ベースの認識分子は、標的である肝臓以外の組織に修飾した高分子を向かわせる。他の実施形態では、タンパク質ベースの認識分子は、標的である肝臓、腎臓、肺又は膵臓などの特異的な組織に修飾した高分子を向かわせる。タンパク質ベースの認識分子は、標的である癌細胞など標的細胞、癌細胞などの細胞で発現される受容体、マトリックス組織又は腫瘍抗原などの癌に関連するタンパク質などに修飾した高分子を差し向けることができる。別法では、腫瘍血管系を含む細胞を標的とすることができる。クッパー細胞とは対照的に肝臓中の肝細胞への特異的ターゲティングなど、タンパク質ベースの認識分子は特異的な種類の細胞に高分子を向かわせることができる。他の場合には、タンパク質ベースの認識分子は高分子を、網様内皮若しくはリンパ系の細胞に、又はマクロファージ若しくは好酸球などの専門の食細胞に向かわせることができる。（そのような場合、高分子自体もまた、特異的ターゲティングを必要としない有効な送達系であることがある）。
【０２３４】
さらに他の実施形態では、タンパク質ベースの認識分子は、標的である、例えば核、細胞質又はエンドソームなどの細胞内のある位置に修飾高分子を差し向ける。具体的な実施形態では、タンパク質ベースの認識分子は、受容体への細胞結合又は核への細胞質輸送及び核進入又はエンドソーム若しくは他の細胞内ベシクルからの放出を増大させ得る。
【０２３５】
具体的な実施形態において、タンパク質ベースの認識分子としては、抗体、タンパク質及びペプチド又はペプチド模倣薬が挙げられる。
【０２３６】
好ましい実施形態において、タンパク質ベースの認識分子はスルフヒドリル基を含み、そして、タンパク質ベースの認識分子はスルフヒドリル基と高分子の官能基を介して共有結合を形成することによって高分子−薬剤コンジュゲートに結合される。
【０２３７】
代表的な抗体、或いはFab、Fab2、scFv又は細胞表面マーカーに対して特異的なラクダ抗体重鎖フラグメントから得られた抗体としては、5T4、AOC3、ALK、AXL、C242、CA-125、CCL11、CCR5、CD2、CD3、CD4、CD5、CD15、CA15−3、CD18、CD19、CA19−9、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD30、CD31、CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD44、CD44 v6、CD51、CD52、CD54、CD56、CD62E、CD62P、CD62L、CD70、CD74、CD79−B、CD80、CD125、CD138、CD141、CD147、CD152、CD154、CD326、CEA、クランピング因子、CTLA-4、CXCR2、EGFR（HER1）、ErbB2、ErbB3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、EPHB4、FGFR（すなわちFGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4）、FLT3、葉酸受容体、FAP、GD2、GD3、GPNMB、HGF、HER2、HER3、HMI．24、ICAM、ICOS−L、IGF-1受容体、VEGFR1、EphA2、TRPV1、CFTR、gpNMB、CA9、Cripto、c−KIT、c−MET、ACE、APP、アドレナリン受容体-β2、クローディン3、メソテリン、MUC1、NaPi2b、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、RON、ROR1、PD−L1、PD−L2、B7−H3、B7−B4、IL-2受容体、IL-4受容体、IL-13受容体、インテグリン（α4、αvβ3、αvβ5、αvβ6、α1β4、α4β1、α4β7、α5β1、α6β4、αIIbβ3インテグリンを含む）、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE、IGF-1受容体、IL-1、IL-12、IL-23、IL-13、IL-22、IL-4、IL-5、IL-6、インターフェロン受容体、ITGB2（CD18）、LFA-1、（CD11a）、L-セレクチン（CD62L）、ムチン、MUC1、ミオスタチン、NCA-90、NGF、PDGFRα、ホスファチジルセリン、前立腺癌腫細胞、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、狂犬病、RANKL、呼吸系発疹ウイルス、リーサス因子、SLAMF7、スフィンゴシン-1-ホスファート、TAG-72、T細胞受容体、テネイシンC、TGF-1、TGF-β2、TGF-β、TNF-α、TRAIL-R1、TRAIL-R2、腫瘍抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR2、ビメンチンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３８】
一実施形態において、抗体、或いはFab、Fab2、scFv又は細胞表面マーカーに対して特異的なラクダ抗体重鎖フラグメントから得られた抗体としては、CA-125、C242、CD3、CD19、CD22、CD25、CD30、CD31、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD54、CD56、CD62E、CD62P、CD62L、CD70、CD138、CD141、CD326、CEA、CTLA-4、EGFR（HER1）、ErbB2、ErbB3、FAP、葉酸受容体、IGF-1受容体、GD3、GPNMB、HGF、HER2、VEGF-A、VEGFR2、VEGFR1、EphA2、EpCAM、5T4、TAG-72、テネイシンC、TRPV1、CFTR、gpNMB、CA9、Cripto、ACE、APP、PDGFRα、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、アドレナリン受容体-β2、クローディン3、ムチン、MUC1、メソテリン、IL-2受容体、IL-4受容体、IL-13受容体、インテグリン（αvβ3、αvβ5、αvβ6、α1β4、α4β1、α5β1、α6β4インテグリンを含む）、テネイシンC、TRAIL-R2、及びビメンチンが挙げられる。
【０２３９】
代表的な抗体としては、3F8、アバゴボマブ、アブシキシマブ（REOPRO）、アダリムマブ（HUMIRA）、アデカツムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、ALD518、アレムツズマブ（CAMPATH）、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ（CEA-SCAN）、アセリズマブ、アトリズマブ（トシリズマブ、アクテムラ、ロアクテムラ）、アトロリムマブ、バピノイズマブ、バシリキシマブ（シムレクト）、バビツキシマブ、ベクツモマブ（LYMPHOSCAN）、ベリムマブ（BENLYSTA）、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ（SCINITIMUN）、ベバシズマブ（AVASTIN）、ビシロマブ（FIBRISCINT）、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ（ILARIS）、カンツズマブ、カプロマブ、カツマキソマブ（REMOVAB）、CC49、セデリズマブ、セルトリズマブ、セツキシマブ（(ERBITUX）、シタツズマブ、シキスツムマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、CR6261、ドアセツズマブ、ダクリズマブ（ZENAPAX）、ダラツムマブ、デノスマブ（PROLIA）、デツモマブ、ドルリモマブ、ドルリキシズマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ（SOLIRIS）、エドバコマブ、エドレコロマブ（PANOREX）、エファリズマブ（RAPTIVA）、エフングマブ（MYCOGRAB）、エロツズマブ、エルシリモマブ、エンリモマブ、エピツモマブ、エプラツズマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ（REXOMUN）、エタラシズマブ（ABEGRIN）、エキスビビルマブ、ファノレソマブ（NEUTROSPEC）、ファラリモマブ、ファルレツズマブ、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィギツムマブ、ホントリズマブ（HuZAF）、ホラビルマブ、フレソリムマブ、ガリキシマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブギレンツキシマブ、グレンバツムマブ、ゴリムマブ（SIMPONI）、ゴミリキシマブ、イバリズマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ（INDIMACIS-125）、イムシロマブ（MYOSCINT）、インフリキシマブ（REMICADE）、インテツムマブ、イノリモマブ、イノツズマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ（CEA-CIDE）、レブリキズマブ、レマレソマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ、リビビルマブ、リンツズマブ、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マスリモマブ、マツズマブ、メポリズマブ（BOSATRIA）、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モロリムマブ、モタビズマブ（NUMAX）、ムロモナブ-CD3（ORTHOCLONE OKT3）、ナコロマブ、ナプツモマブ、ナタリズマブ（TYSABRI）、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネレリモマブ、ニモツズマブ（THERACIM）、ノフェツモマブ、オクレリズマブ、オズリモマブ、オファツムマブ（ARZERRA）、オララツマブ、オマリズマブ（XOLAIR）、オンテシズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ（OVAREX）、オテリキシズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ（SYNAGIS）、パニツムマブ（VECTIBIX）、パノバクマブ、パスコリズマブ、ペムツモマブ（THERAGYN）、ペルツズマブ（OMNITARG）、ペキセリズマブ、ピンツモマブ、プリリキシマブ、プリツムマブ、PRO140、ラフィビルマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ（LUCENTIS）、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リツキシマブ（RITUXAN）、ロバツムマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ（LEUKARREST）、ルプリズマブ（ANTOVA）、サツモマブペンデチド、セビルマブ、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シプリズマブ、ソラネズマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ（LEUKOSCAN）、タカツズマブ（AFP-CIDE）、テトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリツモマブパプトキス、テフィバズマブ（AUREXIS）、テリモマブ、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、TGN1412、チシリムマブ（トレメリムマブ）、チガツズマブ、TNX-650、トシリズマブ（アトリズマブ、ACTEMRA）、トラリズマブ、トシツモマブ（BEXXAR）、トラスツズマブ（HERCEPTIN）、トレメリムマブ、ツコツズマブ、ツビルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ（STELERA）、バパリキシマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ビシリズマブ（NUVION）、ボロシキシマブ（HUMASPECT）、ボツムマブ、ザルツムマブ（HuMEX-EGFr）、ザノリムマブ（HuMAX-CD4）、ジラリムマブ及びゾリモマブが挙げられる。
【０２４０】
いくつかの実施形態において、抗体は、5T4、CA-125、CEA、CD3、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD44、CD51、CTLA-4、EpCAM、HER2、EGFR（HER1）、FAP、葉酸受容体、HGF、インテグリンαvβ3、インテグリンα5β1、IGF-1受容体、GD3、GPNMB、ムチン、MUC1、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、PDGFRα、TAG-72、テネイシンC、TRAIL-R2、VEGF-A、及びVEGFR2の細胞表面マーカーに向けられる。この実施形態において、抗体は、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アラシズマブ、アルツモマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベバシズマブ（AVASTIN）、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、カプロマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ドアセツズマブ、エドレコロマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィギツムマブ、ゲムツズマブ、グレンバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、インテツムマブ、イノツズマブ、ラベツズマブ、レキサツムマブ、リンツズマブ、ルカツムマブ、マツズマブ、ミツモマブ、ナプツモマブ、エスタフェナトキス、ネシツムマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、プリツムマブ、リツキシマブ（RITUXAN）、リロツムマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、シブロツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テナツモマブ、チシリムマブ（トレメリムマブ）、チガツズマブ、トラスツズマブ（HERCEPTIN）、トシツモマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブ、セルモロイキン、ボロシキシマブ及びザルツムマブである。
【０２４１】
具体的な実施形態において、HER2の細胞表面マーカーに向けられる抗体は、パーツズマブ又はトラスツズマブであり、そして、EGFR（HER1）に関して、抗体はセツキシマブ又はパニツムマブであり；そして、CD20に関して、抗体はリツキシマブであり、VEGF-Aに関して、抗体はベバシズマブであり、そして、CD-22に関して、抗体はエプラツズマブ又はベルツズマブであり、そして、CEAに関して、抗体はラベツズマブである。
【０２４２】
代表的なペプチド又はペプチド模倣薬としては、インテグリンターゲッティングペプチド（RGDペプチド）、LHRH受容体ターゲッティングペプチド、ErbB2（HER2）受容体ターゲッティングペプチド、前立腺特異的膜結合抗原（PSMA）ターゲッティングペプチド、リポタンパク質受容体LRP1ターゲッティング、ApoEタンパク質由来ペプチド、ApoAタンパク質ペプチド、ソマトスタチン受容体ターゲッティングペプチド、クロロトキシン由来ペプチド、及びボンベシンが挙げられる。
【０２４３】
具体的な実施形態において、ペプチド又はペプチド模倣薬は、LHRH受容体ターゲッティングペプチド及びErbB2（HER2）受容体ターゲッティングペプチドである。
【０２４４】
代表的なタンパク質には、インスリン、トランスフェリン、フィブリノーゲンγ断片、トロンボスポンジン、クローディン、アポタンパク質E、Affibody分子、例えばABY-025、アンキリン反復タンパク質、アンキリン様反復タンパク質、及び合成ペプチドが含まれる。
【０２４５】
本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質−高分子−薬剤コンジュゲートには、HER2の細胞表面マーカーと組み合わせて広域細胞毒、例えばパーツズマブ又はトラスツズマブなど；EGFRに関して、セツキシマブ及びパニツムマブなど；CEAに関して、ラベツズマブなど；CD20に関して、リツキシマブなど；VEGF-Aに関して、ベバシズマブなど；CD-22に関して、エプラツズマブ又はベルツズマブなどを含んでなる。
【０２４６】
本発明の他の実施形態において、本発明で使用されるタンパク質−薬剤−高分子コンジュゲート又はタンパク質−高分子コンジュゲートには、２以上のタンパク質ベースの認識分子の組み合わせ、例えば、腫瘍細胞上のEGF受容体（EGFR）と、T細胞上のCD3及びCD28に対する二重特異性抗体の組み合わせ；抗体、或いはFab、Fab2、scFv又はラクダ抗体重鎖フラグメント由来の抗体と、ペプチド又はペプチド模倣体の組み合わせ；抗体、或いはFab、Fab2、scFv又はラクダ抗体重鎖フラグメント由来の抗体と、タンパク質の組み合わせ；2つの二重特異性抗体、例えばCD3xCD19やCD28xCD22二重特異性抗体などの組み合わせが含まれる。
【０２４７】
本発明の他の実施形態において、本発明に使用されるタンパク質−薬剤−高分子コンジュゲート又はタンパク質−高分子コンジュゲートは、例えばトラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、エプラツズマブ、ベルツズマブ、ラベツズマブ、B7−H4、B7−H3、CA125、CD33、CXCR2、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、HER2、NaPi2b、c−Met、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PD−L1、c−Kit、MUC1及び5T4などの抗原に対する抗体であるタンパク質ベースの認識分子を含んでいる。
【０２４８】
本発明の具体的な実施形態において、タンパク質−薬剤−高分子コンジュゲート又はタンパク質−高分子コンジュゲートは、5T4に対する抗体、例えばヒト化抗−5T4 scFvFc抗体などであるタンパク質ベースの認識分子を含んでいる。
【０２４９】
好適な5T4ターゲッティングリガンド又は免疫グロブリンの例としては、市販されているもの、又は特許若しくは非特許文献、例えばUS8,044,178、US8,309,094、US7,514,546、EP1036091（市販のTroVax（商標）、Oxford Biomedica）、EP2368914A1A1、WO2013041687（Amgen）、US2010／0173382、及びP. Sapra, et al., Mol. Cancer Ther. 2013, 12:38-47に記載のあったものが挙げられる。抗−5T4抗体は、2013年9月13日に出願された米国特許仮出願第61／877,439号及び2013年6月17日に出願された同第61／835,858号で開示される。それぞれの特許文献及び科学刊行物の内容全体を、参照によって本明細書中に援用する。
【０２５０】
本明細書中に使用される場合、「5T4抗原結合部分」という用語は、5T4抗原に選択的に結合できるポリペプチド配列を指す。代表的なコンジュゲートでは、5T4抗原結合部分は通常、抗−5T4抗体から改変された一本鎖scFv−Fc形態を含む。一本鎖可変フラグメント（scFv−Fc）は、リンカーペプチドに接続され、更に抗体のヒンジ部、CH2及びCH3領域を含むFc領域に接続された、免疫グロブリンの重鎖（VH）及び軽鎖（VL）の可変領域の融合タンパク質である（互いに又は他のペプチド配列との斯かる任意の組み合わせの抗体部分が、本明細書中で「免疫融合」分子と呼ばれることもある）。斯かるscFvFc分子内で、scFv切片が、末端にリンカーペプチドによってFc切片のN末端にC末端が連結されていてもよい。
【０２５１】
免疫融合分子の5T4抗原結合部分の少なくとも一部は、マウス起源に由来していてもよい。例えば、当業者は、少なくとも配列番号Aによるポリペプチド配列を有するマウス抗−5T4 scFv領域をコードするように設計されたポリヌクレオチドを発現することによって免疫融合分子を得てもよい（例えば、2013年6月17日に出願された米国特許仮出願第61／835,858号を参照のこと）。さらに、5T4抗原結合部分の少なくとも一部は、周知の方法に従ってキメラになる又はヒト化するように作製されてもよい。Borras et al., J. Biol. Chem. 2010 Mar 19; 285(12):9054-66を参照のこと。よって、当業者は、少なくとも配列番号Bによるポリペプチド配列をコードするように設計されたポリヌクレオチドを発現することによってヒト化scFv部分を伴う5T4抗原結合部分を有する免疫融合分子を得てもよい（例えば、2013年6月17日に出願された米国特許仮出願第61／835,858号を参照のこと）。
【０２５２】
いくつかの例において、5T4抗原結合部分のFv部分がVH領域内に1又は2以上のアミノ酸置換を含むように、周知の分子生物学技術によって設計され得る。5T4抗原結合部分のFc部分が、抗−5T4抗体のヒトヒンジ、CH2及びCH3領域から改変されたのポリペプチド配列を含んでいるのが好ましい。例えば、少なくとも配列番号Cによるポリペプチド配列を有するFc部分をコードするようにポリヌクレオチドを設計することが可能である（例えば、2013年6月17日に出願された米国特許仮出願第61／835,858号を参照のこと）。
【０２５３】
一本鎖FvとFc領域が一つに連結されているペプチドをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも配列番号Dによるポリペプチド配列を有するコンジュゲートのキメラ5T4抗原結合部分をコードしていても、又は配列番号E又はFによるポリペプチド配列を有するヒト化5T4抗原結合部分をコードしていてもよい。
【０２５４】
ポリペプチドリンカー、例えばポリペプチド配列ASTC（配列番号Y）又はASTX（配列番号Z）（ここで、「X」は、任意のアミノ酸又は隣接しているアミノ酸間の直接的なペプチド結合を指す）を有するポリペプチドリンカーなどは、5T4抗原結合部分のFc部分のN末端にScFv部分のC末端を融合してもよい。よって、当業者は、少なくとも配列番号Y又はZによるポリペプチド配列を有するリンカーをコードするようにポリヌクレオチドを設計することが可能である。配列番号Y又はZのいずれがリンカーとして使用されてもよいが、システイン部分の存在により、配列番号Yによるペプチドリンカーを有する免疫融合分子が、部位選択的結合から恩恵を受ける。
【０２５５】
好ましくは、いずれのアミノ酸置換、挿入、欠失又はペプチド模倣体の使用も、実質的に5T4抗原結合部分の親和性又は特異性を低減しない。5T4抗原結合部分におけるアミノ酸置換、挿入、欠失又はペプチド模倣体の使用がある免疫融合分子は、未修飾5T4抗原結合部分を有するコンジュゲートと比較して、5T4抗原を結合する親和性又は特異性を好ましくは75％超、好ましくは80％超、好ましくは85％超、好ましくは90％超、又は好ましくは95％超維持する。
【０２５６】
抗−5T4一本鎖抗体−Fc融合タンパク質（「抗−5T4 scFv−Fc」）は、2013年6月17日に出願された米国特許仮出願第61／835,858号で開示されるように、CHO DG44細胞内で調製された。
【０２５７】
配列番号A：5T4特異的マウスscFv：
EVQLQQSGPDLVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSPGKGLEWIGRINPNNGVTLYNQKFKDKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSIVMTQTPTSLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLISYTSSRYAGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDAAVYFCQQDYNSPPTFGGGTKLEIK
【０２５８】
配列番号B：5T4特異的ヒト化scFv：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGKGLEWVSRINPNNGVTLYNQKFKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYTSSRYAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYNSPPTFGGGTKLEIK
【０２５９】
配列番号C：ヒトヒンジ−CH2−CH3（Fcgamma1）：
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０２６０】
配列番号Y：部位選択的結合−1：ASTC
【０２６１】
配列番号Z：部位選択的結合−1なし：ASTX
【０２６２】
配列番号D：キメラ抗−5T4 scFv−Fc：
EVQLQQSGPDLVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSPGKGLEWIGRINPNNGVTLYNQKFKDKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSIVMTQTPTSLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLISYTSSRYAGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDAAVYFCQQDYNSPPTFGGGTKLEIKASTCEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０２６３】
配列番号E：ヒト化抗−5T4 scFv−Fc（ASTC）：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGKGLEWVSRINPNNGVTLYNQKFKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYTSSRYAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYNSPPTFGGGTKLEIKASTCEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０２６４】
配列番号F：ヒト化抗−5T4 scFv−Fc（ASTX）：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGKGLEWVSRINPNNGVTLYNQKFKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYTSSRYAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYNSPPTFGGGTKLEIKASTXEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０２６５】
これらの抗体は、合成、遺伝子組み換え、又は当該技術分野で知られている他の適切な方法によって製造され得る。斯かる方法及び構築物は、本明細書中に同定したポリペプチド及びペプチド配列をコードする核酸配列を利用する。或いは、抗体産生のための斯かる方法及び構築物は、天然又は人工的に改変された配列、例えば、天然の変異体又は本明細書中に提供した配列番号（例えば、A）のコドン最適化変異体、を利用する。さまざまなコドン最適化スキームが当該技術分野で知られている。例えば、ウェブベースの最適化手法であるUpGene（商標）及びOptimizer（商標）を参照のこと。さらに、多くの営利団体が、独自のスキーム、とりわけ、例えばSignGen Laboratories、DNA2.0、OpenXを使用してコドン最適化をおこなう。
【０２６６】
本明細書中に記載したこれらのターゲッティングリガンド、リンカー及び薬剤又はプロドラッグ断片は、例えば、開示されている技術及び方法に従って、本発明の治療薬及びターゲッティングコンジュゲートへと組み立てられる。本発明の治療薬やターゲッティングコンジュゲート、及びそれらを製造する方法は、制限されることのない例を通じて以下に記載される。
【０２６７】
コンジュゲート又は高分子足場
本発明のコンジュゲートは、１又は２以上のDの存在を含んでなり、ここで、Dは、治療薬、例えば、薬剤であり、式中、１又は２以上のDの存在は、同じであっても、異なっていてもよい。
【０２６８】
他のある実施形態において、１又は２以上のPBRMの存在は、高分子担体に結合され、式中、１又は２以上のPBRMの存在は、同じであっても、異なっていてもよい。他のある実施形態において、１又は２以上のDの存在を含む１又は２以上の高分子担体は、PBRM（例えば、抗体）に結合される。
【０２６９】
先により一般に議論されたとおり、ある実施形態において、各高分子担体は独立して、約0.1〜約25%、より好ましくは約0.5〜約20%、より好ましくは約1〜約15%、そして、よりいっそう好ましくは約2〜約10%のDを含めたモノマーを含む。例えば、高分子担体は、約2kDa〜約40kDaの分子量を有するPHFであり、アウリスタチンFを含む約0.3％〜約15％、より好ましくは約2％〜12％、より好ましくは約5％〜10％のモノマーを有する。
【０２７０】
特定の実施形態において、Dが広範囲な細胞株における増殖抑制作用に関してIC50＜10pMを有する薬剤であるとき、高分子担体は、約2kDa〜約40kDaの分子量を有するPHFであり、Dを含む約0.1％〜約25％、より好ましくは約2％〜10％、より好ましくは約2％〜5％のモノマーを有する。
【０２７１】
特定の実施形態において、本願発明のコンジュゲートは、式（Id）：
【化９６】
0006420331.tif 000098
（式中、
Dの各存在は、独立して≦5kDaの分子量を有する治療薬であり、そして、Dとカルボニル基の間の
【化９７】
0006420331.tif 000099
はDの直接又は間接的なカルボニル基への結合を意味し、
m1は1〜約140の整数であり、
m7は1〜約40の整数であり、ここで、m1とm7の合計がm6（すなわち、2〜約180）である）
のコンジュゲートである。
【０２７２】
一実施形態において、Dは、a）アウリスタチン化合物；（b）カリケアマイシン化合物；（c）デュオカルマイシン化合物；（d）トポイソメラーゼ阻害剤；（e）ピロロベンゾジアゼピン化合物；（f）ビンカ化合物；（g）タンパク質合成阻害剤；（h）RNAポリメラーゼ阻害剤；（i）チューブリン結合化合物；又はその類似体である。
【０２７３】
特定の実施形態において、Dは、a）アウリスタチン化合物；（b）カリケアマイシン化合物；（c）デュオカルマイシン化合物；（d）カンプトテシン化合物；（e）ピロロベンゾジアゼピン化合物；（f）ビンカ化合物；又はその類似体である。
【０２７４】
例えば、アウリスタチン化合物は、アウリスタチン、ドラスタチン、モノメチルアウリスタチンE（MMAE）、モノメチルアウリスタチンF（MMAF）、アウリスタチンF、AF HPA、又はアウリスタチンFフェニレンジアミン（AFP）である。
【０２７５】
例えば、デュオカルマイシン又はその類似体は、デュオカルマイシンA、デュオカルマイシンB1、デュオカルマイシンB2、デュオカルマイシンC1、デュオカルマイシンC2、デュオカルマイシンD、デュオカルマイシンSA、CC-1065、アドゼレシン、ビゼレシン、又はカルゼレシンである。
【０２７６】
例えば、カンプトテシン化合物は、カンプトテシン、CPT-11（イリノテカン）、SN-38、又はトポテカンである。
【０２７７】
例えば、ピロロベンゾジアゼピン化合物は、ピロロベンゾジアゼピンモノマー、対称のピロロベンゾジアゼピン二量体又は非対称ピロロベンゾジアゼピン二量体である。
【０２７８】
式（Id）の高分子−薬剤コンジュゲートは、約40kDa超（例えば、60kDa超；80kDa超；100kDa超；120kDa超；140kDa超；160kDa超；180kDa超；又は200kDa超、或いは40〜200kDa、40〜180kDa、40〜140kDa、60〜200kDa、60〜180kDa、60〜140kDa、80〜200kDa、80〜180kDa、80〜140kDa、100〜200kDa、100〜180kDa、又は100〜140kDa）の分子量を有するPBRMとの結合に有効である。
【０２７９】
例えば、40kDa超（例えば、60kDa超、80kDa超、100kDa超、120kDa超、140kDa超、160kDa超又は180kDa超）の分子量を有するPBRMの結合のために、本発明の足場の高分子担体はポリアセタール、例えば、約2kDa〜約40kDa（例えば、2〜20kDa、3〜15kDa、又は5〜10kDa）の範囲の分子量（すなわち、未修飾PHFのMW）を有するPHFである。
【０２８０】
例えば、40kDa〜200kDaの分子量を有するPBRMを結合するために、本発明の足場の高分子担体はポリアセタール、例えば、約2kDa〜約40kDa（例えば、2〜20kDa、3〜15kDa、又は5〜10kDa）の範囲の分子量（すなわち、未修飾PHFのMW）を有するPHFである。
【０２８１】
例えば、40kDa〜80kDaの分子量を有するPBRMを結合するために、本発明の足場の高分子担体はポリアセタール、例えば、約2kDa〜約40kDa（例えば、2〜20kDa、3〜15kDa、又は5〜10kDa）の範囲の分子量（すなわち、未修飾PHFのMW）を有するPHFである。例えば、PHFは、約5kDa、10kDa又は15kDaの分子量を有する。
【０２８２】
この分子量範囲内のPBRMとしては、これだけに限定されるものではないが、例えば抗体フラグメント、例えばFabsなどが挙げられる。
【０２８３】
例えば、60kDa〜120kDaの分子量を有するPBRMを結合するために、本発明の足場の高分子担体はポリアセタール、例えば、約2kDa〜約40kDa（例えば、2〜20kDa、3〜15kDa、又は5〜10kDa）の範囲の分子量（すなわち、未修飾PHFのMW）を有するPHFである。例えば、PHFは、約5kDa、10kDa又は15kDaの分子量を有する。
【０２８４】
この分子量範囲内のPBRMとしては、これだけに限定されるものではないが、例えばラクダ科動物抗体、Fab2、scFvFcなどが挙げられる。
【０２８５】
例えば、140kDa〜180kDaの分子量を有するPBRMを結合するために、本発明の足場の高分子担体はポリアセタール、例えば、約2kDa〜約40kDa（例えば、2〜20kDa、3〜15kDa、又は5〜10kDa）の範囲の分子量（すなわち、未修飾PHFのMW）を有するPHFである。例えば、PHFは、約5kDa、10kDa又は15kDaの分子量を有する。
【０２８６】
この分子量範囲内のPBRMとしては、これだけに限定されるものではないが、完全長抗体、例えばIgG、IgMなどが挙げられる。
【０２８７】
特定の実施形態において、PBRMに結合されるとき、高分子医薬コンジュゲート（Id）は、式（Ie）：
【化９８】
0006420331.tif 000100
（式中、
Xa及びXbの一方がHであり、もう片方がマレイミドブロッキング部分であるか、又はXa及びXbは、それらが結合している炭素原子と一緒に、炭素−炭素二重結合を形成し；
m3aは0〜約17の整数であり、
m3bは1〜約8の整数であり、ここで、m3aとm3bの合計はm3であり、
m、m1、m7、m3a、及びm3bの合計は約15〜約300の範囲であり、そして、
m5は1〜約10の整数である）
のコンジュゲートである。
【０２８８】
PBRMは、約40kDa超（例えば、60kDa超；80kDa超；100kDa超；120kDa超；140kDa超；160kDa超；180kDa超；若しくは200kDa超、又は40〜200kDa、40〜180kDa、40〜140kDa、60〜200kDa、60〜180kDa、60〜140kDa、80〜200kDa、80〜180kDa、80〜140kDa、100〜200kDa、100〜180kDa、若しくは100〜140kDa）の分子量を有する。
【０２８９】
例えば、PBRMは、約40kDa超（例えば、60kDa超；80kDa超；100kDa超；120kDa超；140kDa超；160kDa超；180kDa超；若しくは200kDa超、又は40〜200kDa、40〜180kDa、40〜140kDa、60〜200kDa、60〜180kDa、60〜140kDa、80〜200kDa、80〜180kDa、80〜140kDa、100〜200kDa、100〜180kDa、若しくは100〜140kDa）の分子量を有し、且つスルフヒドリル（すなわち、−SH又はチオール）基を有する。
【０２９０】
例えば、PHFとPBRMの間で形成されたスルフィド結合の総数（又は、結合点の総数）は10以下である。
【０２９１】
例えば、m7とm3bの間の比は、1：1超〜10：1以下である。
【０２９２】
例えば、m7とm3bの間の比は、約9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、又は2：1である。
【０２９３】
例えば、m7とm3bの間の比は、2：1〜8：1である。
【０２９４】
例えば、m7とm3bの間の比は、約8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、又は2：1である。
【０２９５】
例えば、m7とm3bの間の比は、2：1〜4：1である。
【０２９６】
例えば、m7とm3bの間の比は、約4：1、3：1、又は2：1である。
【０２９７】
例えば、式（Ie）のPHFが約2kDa〜約20kDaの範囲の分子量を有するとき、m、m1、m7、m3a、及びm3bの合計は約15〜約150の範囲であり、そして、m1は1〜約70の整数であり、m7は1〜約20の整数であり、m3aは0〜約9の整数であり、m3bは1〜約8の整数であり、及びm5は2〜約8の整数である。
【０２９８】
例えば、式（Ie）のPHFが約3kDa〜約15kDaの範囲の分子量を有するとき、m、m1、m7、m3a、及びm3bの合計は約20〜約110の範囲であり、そして、m1は2〜約50の整数であり、m7は2〜約15の整数であり、m3aは0〜約7の整数であり、m3bは1〜約8の整数であり、及びm5は2〜約4の整数である。
【０２９９】
例えば、式（Ie）のPHFが約5kDa〜約10kDaの範囲の分子量を有するとき、m、m1、m7、m3a、及びm3bの合計は約40〜約75の範囲であり、そして、m1は約5〜約35の整数であり、m7は約3〜約10の整数であり、m3aは0〜約4の整数であり、m3bは1〜約5の整数であり、及びm5は2〜約4の整数である。
【０３００】
特定の実施形態において、本願発明のタンパク質−高分子−薬剤コンジュゲートは、本明細書中に記載した式（Ib）：
【化９９】
0006420331.tif 000101
（式中、
Xa及びXbの一方がHであり、もう片方がマレイミドブロッキング部分であるか、又はXa及びXbは、それらが結合している炭素原子と一緒に、炭素−炭素二重結合を形成し；
m3aは0〜約17の整数であり、
m3bは1〜約8の整数であり、ここで、m3aとm3bの合計はm3であり、
m、m1、m2、m3a、及びm3bの合計は約15〜約300の範囲であり、そして、
m5は1〜約10の整数である）
のものである。
【０３０１】
例えば、PBRMは、約40kDa超（例えば、60kDa超；80kDa超；100kDa超；120kDa超；140kDa超；160kDa超；180kDa超；若しくは200kDa超、又は40〜200kDa、40〜180kDa、40〜140kDa、60〜200kDa、60〜180kDa、60〜140kDa、80〜200kDa、80〜180kDa、80〜140kDa、100〜200kDa、100〜180kDa、若しくは100〜140kDa）の分子量を有する。
【０３０２】
例えば、PHFとPBRMの間で形成されたスルフィド結合の総数（又は、結合点の総数）は10以下である。
【０３０３】
例えば、m2とm3bの間の比は、1：1超〜10：1以下である。
【０３０４】
例えば、m2とm3bの間の比は、約9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、又は2：1である。
【０３０５】
例えば、m2とm3bの間の比は、2：1〜8：1である。
【０３０６】
例えば、m2とm3bの間の比は、約8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、又は2：1である。
【０３０７】
例えば、m2とm3bの間の比は、2：1〜4：1である。
【０３０８】
例えば、m2とm3bの間の比は、約4：1、3：1、又は2：1である。
【０３０９】
例えば、式（Ib）のPHFが約2kDa〜約20kDaの範囲の分子量を有するとき、m、m1、m2、m3a、及びm3bの合計は約15〜約150の範囲であり、そして、m1は1〜約70の整数であり、m2は1〜約20の整数であり、m3aは0〜約9の整数であり、m3bは1〜約8の整数であり、及びm5は2〜約8の整数である。
【０３１０】
例えば、式（Ib）のPHFが約3kDa〜約15kDaの範囲の分子量を有するとき、m、m1、m2、m3a、及びm3bの合計は約20〜約110の範囲であり、そして、m1は2〜約50の整数であり、m2は2〜約15の整数であり、m3aは0〜約7の整数であり、m3bは1〜約8の整数であり、及びm5は2〜約4の整数である。
【０３１１】
例えば、式（Ib）のPHFが約5kDa〜約10kDaの範囲の分子量を有するとき、m、m1、m2、m3a、及びm3bの合計は約40〜約75の範囲であり、そして、m1は約5〜約35の整数であり、m2は約3〜約10の整数であり、m3aは0〜約4の整数であり、m3bは1〜約5の整数であり、及びm5は2〜約4の整数である。
【０３１２】
例えば、マレイミド阻害部分は、式（II）：
【化１００】
0006420331.tif 000102
（式中、
R90はNHR91、OH、COOR93、CH（NHR91）COOR93又は置換されたフェニル基であり；
R93は水素又はC1-4アルキルであり；
R91は水素、CH3又はCH3COであり、そして、
dは1〜3の整数である）
のチオール含有化合物とマレイミド基の反応によって2つのオレフィン炭素原子のうちの1つと共有結合され得る部分である。
【０３１３】
例えば、式（II）のマレイミドブロッキング化合物は、システイン、N−アセチルシステイン、システインメチルエステル、N−メチルシステイン、2−メルカプトエタノール、3−メルカプトプロパン酸、2−メルカプト酢酸、メルカプトメタノール（すなわち、HOCH2SH）、フェニルが1又は2以上の親水性置換基によって置換されたベンジルチオール、又は3−アミノプロパン-1−チオールであり得る。フェニルに対する1又は2以上の親水性置換基はOH、SH、メトキシ、エトキシ、COOH、CHO、COC1-4アルキル、NH2、F、シアノ、SO3H、PO3Hなどを含む。
【０３１４】
例えば、マレイミドブロック基は、−S−（CH2）d−R90であって、構造中、R90はOH、COOH、又はCH（NHR91）COOR93であり；
R93は水素又はCH3であり；
R91は水素又はCH3COであり；そして、
dは1又は2である。
【０３１５】
例えば、マレイミドブロック基は、−S−CH2−CH（NH2）COOHである。
【０３１６】
例えば、PHFが2kDa〜40kDaの範囲（例えば、約2〜20kDa、約3〜15kDa、又は約5〜10kDa）の分子量を有するとき、PHF（例えば、m2）あたりの薬剤の数は1〜約40（例えば、約1〜20、約2〜15又は約3〜10）の整数である。この足場は、例えば、40kDa超（例えば、60kDa超；80kDa超；100kDa超；120kDa超；140kDa超；160kDa超又は180kDa超）の分子量を有するPBRMを結合するのに使用され得る。この実施形態において、PHFあたりのPBRMの比は、約1：1〜約1：10、約1：1〜約1：9、約1：1〜約1：8、約1：1〜約1：7、約1：1〜約1：6、約1：1〜約1：5、約1：1〜約1：4、約1：1〜約1：3、約1：1〜約1：2、約1：2〜約1：6、約1：2〜約1：5、約1：2〜約1：4、又は約1：2〜1：3にある。
【０３１７】
例えば、PHFが2kDa〜40kDaの範囲（例えば、約2〜20kDa、約3〜15kDa、又は約5〜10kDa）の分子量を有するとき、PHF（例えば、m2）あたりの薬剤の数は1〜約40（例えば、約1〜20、約2〜15又は約3〜10）の整数である。この足場は、例えば、140kDa〜180kDaの分子量を有するPBRMを結合するのに使用され得る。この実施形態において、PHFあたりのPBRMの比は、約1：1〜約1：10、約1：1〜約1：9、約1：1〜約1：8、約1：1〜約1：7、約1：1〜約1：6、約1：1〜約1：5、約1：1〜約1：4、約1：1〜約1：3、約1：1〜約1：2、約1：2〜約1：6、約1：2〜約1：5、約1：2〜約1：4、又は約1：2〜1：3にある。
【０３１８】
この分子量範囲におけるPBRMとしては、これだけに限定されるものではないが、例えば、完全長抗体、例えばIgG、IgMなどが挙げられる。
【０３１９】
例えば、PHFが2kDa〜40kDaの範囲（例えば、約2〜20kDa、約3〜15kDa、又は約5〜10kDa）の分子量を有するとき、PHF（例えば、m2）あたりの薬剤の数は、1〜約40（例えば、約1〜20、約2〜15又は約3〜10）の整数である。この足場は、例えば、60kDa〜120kDaの分子量を有するPBRMを結合するのに使用され得る。この実施形態において、PHFあたりのPBRMの比は、約1：1〜約1：10、約1：1〜約1：9、約1：1〜約1：8、約1：1〜約1：7、約1：1〜約1：6、約1：1〜約1：5、約1：1〜約1：4、約1：1〜約1：3、約1：1〜約1：2、約1：2〜約1：6、約1：2〜約1：5、約1：2〜約1：4、又は約1：2〜1：3にある。
【０３２０】
この分子量範囲におけるPBRMとしては、これだけに限定されるものではないが、例えば、抗体フラグメント、例えばFab2、scFcFv及びラクダ科動物抗体などが挙げられる。
【０３２１】
例えば、PHFが2kDa〜40kDaの範囲（例えば、約2〜20kDa、約3〜15kDa、又は約5〜10kDa）の分子量を有するとき、PHF（例えば、m2）あたりの薬剤の数は、1〜約40（例えば、約1：20、約2−15又は約3：10）の整数である。この足場は、例えば、40kDa〜80kDaの分子量を有するPBRMを結合するのに使用され得る。この実施形態において、PHFあたりのPBRMの比は、約1：1〜約1：10、約1：1〜約1：9、約1：1〜約1：8、約1：1〜約1：7、約1：1〜約1：6、約1：1〜約1：5、約1：1〜約1：4、約1：1〜約1：3、約1：1〜約1：2、約1：2〜約1：6、約1：2〜約1：5、約1：2〜約1：4、又は約1：2〜1：3にある。
【０３２２】
この分子量範囲におけるPBRMとしては、これだけに限定されるものではないが、例えば、抗体フラグメント、例えばFabsなどが挙げられる。
【０３２３】
別の態様において、本発明は、タンパク質ベースの認識分子（PBRM）と治療薬（D）の両方と結合するために有効である高分子足場を特徴とする。D不含足場は、高分子担体、PBRMを高分子担体に接続するのに好適な高分子担体に接続された1又は2以上のリンカー、及び薬剤（D）を高分子担体に接続するのに好適な1又は2以上のリンカーを含む。
【０３２４】
ある実施形態において、コンジュゲートは、数ステップで形成される。これらのステップには、（1）薬剤又はその誘導体の官能基と反応し得る官能基を含むように高分子を修飾するステップ；（2）修飾高分子を薬剤又はその誘導体を、薬剤が高分子に連結されるように反応させるステップ；（3）PBRM又はその誘導体の官能基と反応し得る官能基を高分子が含むように高分子−薬剤コンジュゲートを修飾するステップ；そして（4）修飾した高分子−薬剤コンジュゲートをPBRM又はその誘導体と反応させて、本願発明のコンジュゲートを形成するステップを含んでいる。ステップ（1）で生じた修飾した高分子が、PBRM又はその誘導体の官能基と反応し得る官能基を含んでいれば、ステップ（3）が除かれてもよい。
【０３２５】
もう1つの実施形態において、コンジュゲートは、次の数ステップ：（1）高分子が第一の薬剤又はその誘導体の官能基と反応し得る官能基を含むように、高分子を修飾するステップ；（2）第一の薬剤が高分子に連結されるように、修飾高分子を第一の薬剤又はその誘導体と反応させるステップ；（3）それが第二の薬剤又はその誘導体の官能基と反応し得る異なった官能基を含むように、高分子−薬剤コンジュゲートを修飾するステップ；（4）第二の薬剤が高分子−薬剤コンジュゲートに連結されるように、修飾した高分子−薬剤コンジュゲートを第二の薬剤又はその誘導体と反応させるステップ；（5）高分子がPBRM又はその誘導体の官能基と反応し得る官能基を含むように、2つの異なった薬剤を有する高分子−薬剤コンジュゲートを修飾するステップ；そして（6）ステップ（5）の修飾した高分子−薬剤コンジュゲートをPBRM又はその誘導体と反応させて、本願発明のコンジュゲートを形成するステップにおいて形成される。2つの異なった薬剤及び2つの異なったPBRMを含んでなる高分子−薬剤コンジュゲートを形成するために、2つの異なるPBRM又はその誘導体が結合されるのであれば、ステップ（5）及び（6）が繰り返されてもよい。
【０３２６】
更にもう１つの実施形態において、コンジュゲートは、次の数ステップ：（1）高分子が薬剤又はその誘導体の官能基と反応し得る官能基を含むように、高分子を修飾するステップ；（2）高分子がPBRM又はその誘導体の官能基と反応し得る官能基を含むように、高分子を更に修飾するステップ；（3）薬剤が高分子に連結されるように、修飾した高分子を薬剤又はその誘導体と反応させるステップ；（4）修飾した高分子−薬剤コンジュゲートをPBRM又はその誘導体と反応させて、本願発明のコンジュゲートを形成するステップにおいて形成される。ステップ（3）と（4）又はステップ（1）と（2）の順序は、逆にもできる。さらに、修飾した高分子が薬剤又はその誘導体の官能基とPBRM又はその誘導体の官能基の両方と反応し得る官能基を含んでいるのであれば、ステップ（1）又は（2）のいずれかが除かれてもよい。
【０３２７】
もう1つの実施形態において、コンジュゲートは、次の数ステップ：（1）第一の薬剤又はその誘導体の官能基と反応し得る官能基を含むように、高分子を修飾するステップ；（2）高分子がPBRM又はその誘導体の官能基と反応し得る官能基を含むように、高分子を更に修飾するステップ；（3）第一の薬剤が高分子に連結されるように、修飾高分子を第一の薬剤又はその誘導体と反応させるステップ；（4）それが第二の薬剤又はその誘導体の官能基と反応し得る異なった官能基を含むように、高分子−薬剤コンジュゲートを修飾するステップ；（5）第二の薬剤が高分子−薬剤コンジュゲートに連結されるように、修飾した高分子−薬剤コンジュゲートを第二の薬剤又はその誘導体と反応させるステップ；（6）PBRM又はその誘導体を伴った高分子が本願発明のコンジュゲートを形成するように、2つの異なる薬剤を含んでなる修飾した高分子−薬剤コンジュゲートを反応させるステップにおいて形成される。2つの異なったPBRM又はその誘導体が2つの異なった薬剤及び2つの異なったPBRMを含んでなる高分子−薬剤コンジュゲートを形成するために結合されるのであれば、ステップ（6）が繰り返されてもよい。修飾した高分子が2つの異なった薬剤又はその誘導体と反応し得る2つの異なった官能基を含むように、ステップ（4）がステップ（1）の後に実施されてもよい。この実施形態において、2つの異なった薬剤又はその誘導体と反応し得る2つの異なった官能基を含んでなる修飾した高分子は、修飾した高分子と2つの異なった薬剤（ステップ（3）及びステップ（5））又はPBRM（ステップ（6））のいずれかとの反応前に；その高分子がPBRM又はその誘導体の官能基と反応し得る官能基を含むように、更に修飾され得る。
【０３２８】
本発明の生分解性、生体適合性コンジュゲートは、生体分解性及び親水性の所望の要求基準に合うように製造することができる。例えば、生理学的条件下で、生体分解性と安定性との間のバランスに達することができる。例えば、ある閾値を超える分子量（分子の物理的形状に依るが、一般的に40〜100kDaを超える）を持つ分子は、腎臓を介して排泄せず、一方、低分子は、細胞による摂取及び細胞内区画、最も著しくはリソソームにおける分解を通してのみ体から除去することは知られている。この観察は、一般的な生理学的条件（pH=7.5±0.5）及びリソソームpH（pH約5）下で、それらの安定性を調整することによって、いかに機能的に安定な生分解性材料を設計できるかを実証する。例えば、アセタール及びケタール基の加水分解には酸の触媒作用が働くため、ポリアルは、一般的に、酸性リソソーム環境では、例えば、血漿中より不安定なことが知られている。当業者は、水性媒体中、例えば、pH=5及びpH=7.5、37℃で、高分子分解プロファイルを比較し、したがって、正常な生理学的環境、細胞による摂取後の「消化性」リソソーム区画における、高分子安定性の期待バランスを測定する検査を設計できる。そのような検査における高分子完全性は、サイズ排除HPLCによって測定することができる。当業者は、本発明の分解したコンジュゲートの種々の断片を研究する、他の適切な方法を選択することができる。
【０３２９】
多くの場合、pH=7.5での高分子の有効サイズは、1〜7日では検出できるほど変化せず、少なくとも数週間は元のサイズから50％以内のサイズを保つことが好ましいであろう。一方、pH=5での高分子は、1〜5日で検出できるほど分解し、2週間から数ヶ月の時間枠で、低分子量完全に断片に移行するのが好ましい。より速い分解が好ましい場合もあるが、一般的には、高分子は細胞による高分子片の代謝又は排泄速度を超えない速度で、細胞内で分解するのがより望ましい。したがって、ある実施形態では、本発明のコンジュゲートは、特に細胞による摂取の際、生分解性であり、生体系に関して比較的「非活性」であることが期待される。キャリア分解性生物は、変化せず、環境のpHを大きくシフトしないことが好ましい。アルコール基が大量であると、細胞レセプター、特に食細胞による高分子の認識速度が低下するかもしれないと考えられている。本発明の高分子骨格は、一般的に、抗原決定因子（特性、例えば、ある多糖類及びポリペプチド用）を、たとえあっても殆ど含まず、一般的に、後で望まれない限り、インビボで「キーインロック」型の相互作用に従事しうる硬い構造は含まない。したがって、本発明の可溶性、架橋された個体コンジュゲートは、数種の生物医学的応用に適切なコンジュゲートを造る、低毒性及びバイオ接着性を持つことが推定できる。
【０３３０】
本発明のある実施形態では、生分解性、生体適合性コンジュゲートは、直鎖又は分岐状の構造を形成することができる。例えば、本発明の該生分解性、生体適合性ポリアルコンジュゲートは、キラル（光学的に活性）でありうる。場合によっては、本発明の生分解性、生体適合性ポリアルコンジュゲートは、ラセミ形でもありうる。
【０３３１】
ある実施形態では、本発明のコンジュゲートは、水溶性である。ある実施形態では、本発明のコンジュゲートは水不溶性である。ある実施形態では、コンジュゲートは、個体形状である。ある実施形態では、本発明のコンジュゲートはコロイドである。ある実施形態では、本発明のコンジュゲートは、粒状の形態である。ある実施形態では、本発明のコンジュゲートは、ゲル状である。ある実施形態では、本発明のコンジュゲートは、繊維状である。ある実施形態では、本発明のコンジュゲートはフィルム状である。
【０３３２】
本願発明はまた、PBRMと結合して、本明細書中に記載したPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを形成するために有効である高分子足場を特徴とする。前記足場は、タンパク質ベースの認識分子（PBRM）、例えば、約40kDa超の分子量を有するPBRM、を結合するために有効である式（Ia）：
【化１０１】
0006420331.tif 000103
（式中、
足場は、約2kDa〜約40kDaの範囲の分子量を有する、ポリ（1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチル−ホルマール）（PHF）を含み；
XはCH2、O、又はNHであり；
mは1〜約300の整数であり、
m1は1〜約140の整数であり、
m2は1〜約40の整数であり、
m3は1〜約18の整数であり、
m、m1、m2、及びm3の合計は約15〜約300の範囲である）
の高分子担体を含む。
【０３３３】
例えば、式（Ia）の「m3」ユニットのマレイミド部分の各存在は、PBRMの官能基との共有結合をまだ形成していない。
【０３３４】
例えば、40kDa超（例えば、60kDa超、80kDa超、100kDa超、120kDa超、140kDa超、160kDa超又は180kDa超、或いは約40〜200kDa、40〜180kDa、40〜140kDa、60〜200kDa、60〜180kDa、60〜140kDa、80〜200kDa、80〜180kDa、80〜140kDa、100〜200kDa、100〜180kDa、又は100〜140kDa）の分子量を有するPBRMの結合のために、本発明の足場の高分子担体はポリアセタール、例えば、約2kDa〜約40kDa（例えば、2〜20kDa、3〜15kDa、又は5〜10kDa）の範囲の分子量（すなわち、未修飾PHFのMW）を有するPHFである。
【０３３５】
例えば、40kDa〜200kDaの分子量を有するPBRMを結合するために、本発明の足場の高分子担体はポリアセタール、例えば、約2kDa〜約40kDa（例えば、2〜20kDa、3〜15kDa、又は5〜10kDa）の範囲の分子量（すなわち、未修飾PHFのMW）を有するPHFである。
【０３３６】
例えば、40kDa〜80kDaの分子量を有するPBRMを結合するために、本発明の足場の高分子担体はポリアセタール、例えば、約2kDa〜約40kDa（例えば、2〜20kDa、3〜15kDa、又は5〜10kDa）の範囲の分子量（すなわち、未修飾PHFのMW）を有するPHFである。例えば、PHFは、約5kDa、8kDa、10kDa、13kDa又は15kDaの分子量を有する。
【０３３７】
この分子量範囲内のPBRMとしては、これだけに限定されるものではないが、例えば抗体フラグメント、例えばFabsなどが挙げられる。
【０３３８】
例えば、60kDa〜120kDaの分子量を有するPBRMを結合するために、本発明の足場の高分子担体はポリアセタール、例えば、約5kDa〜約40kDa（例えば、約5〜30kDa、約5〜20kDa、約5〜15kDa、又は約5〜10kDa）の範囲の分子量（すなわち、未修飾PHFのMW）を有するPHFである。例えば、PHFは、約10kDa、20kDa、30kDa又は40kDaの分子量を有する。
【０３３９】
この分子量範囲内のPBRMとしては、これだけに限定されるものではないが、例えばラクダ科動物抗体、Fab2、scFcFvなどが挙げられる。
【０３４０】
例えば、140kDa〜180kDaの分子量を有するPBRMを結合するために、本発明の足場の高分子担体はポリアセタール、例えば、約2kDa〜約40kDa（例えば、2〜20kDa、3〜15kDa、又は5〜10kDa）の範囲の分子量（すなわち、未修飾PHFのMW）を有するPHFである。例えば、PHFは、約5kDa、8kDa、10kDa、13kDa又は15kDaの分子量を有する。
【０３４１】
この分子量範囲内のPBRMとしては、これだけに限定されるものではないが、完全長抗体、例えばIgG、IgMなどが挙げられる。
【０３４２】
例えば、式（Ia）のPHFが約2kDa〜約40kDaの範囲の分子量を有する（すなわち、m、m1、m2、及びm3の合計が約1〜約300の範囲である）とき、m2は1〜約40の整数であり、m3が1〜約18の整数であり、及び／又はm1は1〜約140の整数である（例えば、m1は約1〜90である）。
【０３４３】
例えば、式（Ia）のPHFが約2kDa〜約20kDaの範囲の分子量を有する（すなわち、m、m1、m2、及びm3の合計が約1〜約150の範囲である）とき、m2は1〜約20の整数であり、m3が1〜約10の整数であり、及び／又はm1は1〜約70の整数である（例えば、m1は約4〜45である）。
【０３４４】
例えば、式（Ia）のPHFが約3kDa〜約15kDaの範囲の分子量を有する（すなわち、m、m1、m2、及びm3の合計が約1〜約110の範囲である）とき、m2は2〜約15の整数であり、m3が1〜約8の整数であり、及び／又はm1は2〜約50の整数である（例えば、m1は約4〜30である）。
【０３４５】
例えば、式（Ia）のPHFが約5kDa〜約10kDaの範囲の分子量を有する（すなわち、m、m1、m2、及びm3の合計が約1〜約75の範囲である）とき、m2は3〜約10の整数であり、m3が1〜約5の整数であり、及び／又はm1は5〜約35の整数である（例えば、m1は約10〜25である）。
【０３４６】
例えば、1又は2以上の薬剤担持高分子担体が1つのPBRMに接続される。例えば、前記足場（例えば、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲート）は、約40kDa超の分子量を有するPBRM、及びPBRMに接続された1又は2以上のD担持高分子担体を含んでいる。
【０３４７】
例えば、前記足場は更に、マレイミド基を介して高分子担体に接続されたPBRMを含む。
【０３４８】
本発明はまた、約2kDa〜約40kDaの範囲の分子量の式（Ic）：
【化１０２】
0006420331.tif 000104
（式中、
Xは、CH2、O、又はNHであり；
mは1〜約300の整数であり、
m6は2〜約180の整数であり、
m3は1〜約18の整数であり、そして
m、m6、及びm3の合計は約15〜約300の範囲である）
の高分子足場も提供する。
【０３４９】
例えば、式（Ic）の「m3」ユニットのマレイミド部分の各存在は、PBRMの官能基との共有結合をまだ形成していない。
【０３５０】
例えば、式（Ic）のPHFが約2kDa〜約20kDaの範囲の分子量を有する（すなわち、m、m6、及びm3の合計が約15〜約150の範囲である）とき、m3は1〜約9の整数であり、及び／又はm6は2〜約90の整数である（例えば、m6は約6〜60である）。
【０３５１】
例えば、式（Ic）のPHFが約3kDa〜約15kDaの範囲の分子量を有する（すなわち、m、m6、及びm3の合計が約20〜約110の範囲である）とき、m3は1〜約8の整数であり、及び／又はm6は4〜約65の整数である（例えば、m6は約6〜45である）。
【０３５２】
例えば、式（Ic）のPHFが約5kDa〜約10kDaの範囲の分子量を有するとき、m、m6、及びm3の合計は約40〜約75の範囲であり、m6は約8〜約45の整数であり、及びm3は1〜約5の整数である。
【０３５３】
いくつかの実施形態において、高分子足場(例えば、ＰＨＦなどのポリアセタール高分子)はシステインをベースとするバイオ結合（bioconjugation）法を用いることにより、PBRMと結合される。例えば、WO2010100430及びUS 7,595,292を参照されたい。それらの内容の全体を参照により本明細書中に取り込む。１つの実施形態において、高分子足場(例えば、ＰＨＦなどのポリアセタール高分子)は抗体ヒンジ領域においてシステインによりPBRM（例えば、抗体）と結合する。理論に拘束されることを望まないが、得られるコンジュゲートは鎖間橋掛け構造の形成により安定化される。
【０３５４】
したがって、本発明は、高分子足場（例えば、ポリアル高分子）に結合した少なくとも２つの部分を含む高分子足場であって、タンパク質−高分子コンジュゲートを形成するように各-GXがPBRM中のアミノ酸（例えば、システイン）からのチオール基に結合することができる高分子足場にも関する。一実施形態において、高分子足場に接続された少なくとも2つの部分はマレイミド基である。
【０３５５】
ある実施形態において、PBRMの1つ以上の遊離チオール基はタンパク質を還元することにより生成される。その後、PBRMの1つ以上の遊離チオール基は高分子足場とPBRMを結合するように、アミノ酸のチオール基に結合できる高分子足場中に含まれる少なくとも２つの部分と反応する。一実施形態において、高分子足場に接続された少なくとも2つの部分はマレイミド基である。
【０３５６】
ある実施形態において、結合のために使用されるＰＢＲＭの遊離チオール基は天然タンパク質のジスルフィド橋掛け、又は、ジスルフィド橋掛けにより結合された2つ以上のタンパク質鎖からなるタンパク質複合体のジスルフィド橋掛けから得られる。ジスルフィド橋掛けは鎖内橋掛け又は鎖間橋掛けであることができる。又は、ＰＢＲＭの遊離チオール基はシステインから得られるか、又は、相互又は内部ジスルフィド橋掛け形成に関与していない天然タンパク質の非対チオール基である。
【０３５７】
ジスルフィド結合は、例えば、従来の方法を用いて、ジチオスレイトール、メルカプトエタノール、トリス-カルボキシエチルホスフィン、デヒドロアスコルビン酸、硫酸銅により還元されうる。タンパク質は1つ以上のジスルフィド橋掛けを含むことができる。遊離チオールを提供するための還元はタンパク質中の1つ以上の特定のジスルフィド橋掛けを還元するように制御されうる。ジスルフィド還元の程度及び高分子足場の-GX部分の化学量論比によって、1つ以上の高分子足場をタンパク質に結合することができる。ジスルフィドの総数よりも少量を還元することが望まれているならば、異なる反応条件又は変性剤の添加を用いる部分還元が可能な時には、固定化された還元剤を使用することができる。
【０３５８】
チオールを介した高分子のタンパク質への結合の利点としては、限定するわけではないが、最適化された効力、改良された投与毎のコンシステンシー及び均一性(タンパク質1つ当たりの結合高分子の数は各タンパク質分子に関して実質的に同一であるから)、各タンパク質上の特定の残基（1つ又は複数）に対する特異的な結合、及び、より容易な精製が挙げられる。また、チオール結合を介したタンパク質−高分子コンジュゲートは、非コンジュゲート化タンパク質と比較して、実質的に改良された半減期、平均残留時間及び／又は循環におけるクリアランス率を示す。
【０３５９】
幾つかの実施形態において、本明細書中に記載されている薬物−高分子−ＰＢＲＭコンジュゲート、薬物−高分子コンジュゲート、薬物保有高分子足場又はＰＢＲＭ−保有高分子足場は一般的に、各々多分散指数（PDI）が≦1.5、例えば＜1.2である。
【０３６０】
PBRM−高分子−薬物コンジュゲート、薬物運搬高分子足場、又はPBRM運搬高分子足場は、広範囲にわたる透析濾過によって精製（すなわち、残留未反応薬物、PBRM、又は高分子出発物質を除去）される。必要であれば、サイズ排除クロマトグラフィーによる追加の精製が、あらゆる凝集PBRM−高分子−薬物高分子コンジュゲートを除去するために実施され得る。一般に、精製された場合に高分子コンジュゲートは、典型的にSECによって測定される5%（例えば、＜2％w／w）未満の凝集PBRM−高分子−薬物；RP−HPLCによって測定される0.5％未満（例えば、＜0.1％w／w）の遊離（非結合）薬剤；SECによって測定される1％未満の高分子−薬剤コンジュゲート及びHIC-HPLCによって測定される2％（未満例えば、＜1％w／w）の非結合PBRMを含む。
【０３６１】
次の表C及びDは、それぞれ本発明の薬物運搬高分子足場及び高分子−薬物−タンパク質コンジュゲートの例を供する。表Dでは、化学構造のm5が、本明細書中に記載した式（Ib）内で定義されている。
【表２】
0006420331.tif 000105
【表３】
0006420331.tif 000106
【表４】
0006420331.tif 000107
【表５】
0006420331.tif 000108
【表６】
0006420331.tif 000109
【表７】
0006420331.tif 000110
【表８】
0006420331.tif 000111
【表９】
0006420331.tif 000112
【表１０】
0006420331.tif 000113
【表１１】
0006420331.tif 000114
【表１２】
0006420331.tif 000115
【表１３】
0006420331.tif 000116
【表１４】
0006420331.tif 000117
【表１５】
0006420331.tif 000118
【表１６】
0006420331.tif 000119
【表１７】
0006420331.tif 000120
【表１８】
0006420331.tif 000121
【０３６２】
更なる例において、治療薬とターゲッティングコンジュゲートが提供される。前記コンジュゲートは、以下を含んでいる：（a）ヒト癌胎児タンパク質5T4を標的とする免疫グロブリン又はその機能的な断片であるリガンド（LG）、該リガンドは約40kDa超の分子量を有し、且つ（b）の高分子足場のm5に結合し；ここで、m5は1〜約10であり；並びに（b）約2kDa〜約40kDaの範囲の分子量を有するポリ（1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチル−ホルマール）（PHF）を含む高分子足場；ここで、該高分子足場は、ランダムに配列された、以下に規定したモノマーユニットm、m1、m2、m3a、及びm3bを含む：
（i）m3a：
【化１０３】
0006420331.tif 000122
構造中、m3aは、不存在であるか、又は1〜約17個のモノマーm3aユニットが高分子足場内に存在し、そして、各ユニットでは、Xa及びXbが独立して、（A）一方がHであり、もう片方がマレイミドブロッキング部分であるか、又は（B）Xa及びXbが、それらが結合している炭素原子と一緒に、炭素−炭素二重結合を形成するか、から選択され；
（ii）m3b：
【化１０４】
0006420331.tif 000123
構造中、スルフィド結合はLGに対する結合点を形成し；そして、ここで、1〜約8個のモノマーm3bユニットが高分子足場内に存在し；ここで、m3aとm3bの合計は1〜18であり、且つここで、該硫黄原子はLGの一部であり；
（iii）m：
【化１０５】
0006420331.tif 000124
構造中、1〜約300個のモノマーmユニットが高分子足場内に存在し；
（iv）m1：
【化１０６】
0006420331.tif 000125
構造中、1〜約140個のモノマーm1ユニットが高分子足場内に存在し；そして
（v）m2：
【化１０７】
0006420331.tif 000126
構造中、1〜約40個のモノマーm2ユニットが高分子足場内に存在し；
ここで、それぞれモノマーユニットm、m1、m2、m3a、及びm3bでは、XがCH2、O又はNHであり、m、m1、m2、m3a、及びm3bの合計が約15〜約300の範囲であり、そしてここで、Dの各存在は独立して、≦5kDaの分子量を有する治療薬であり、且つDとカルボニル基の間の
【化１０８】
0006420331.tif 000127
はDの直接又は間接的なカルボニル基への結合を意味する。好適なことには、抗−5T4リガンドは、本明細書中に定義された免疫グロブリン又はその機能的な断片である。例えば、前記免疫グロブリン又はその機能的な断片は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、免疫付着因子（immunoadhesin）、F（Ab）2、ミニボディ、Fab’、単一ドメイン抗体、ナノボディ、一本鎖Fv、タンデム／ビス−scFv、F（ab）3、scFv−Fc（又はscFvFc）、dsFv、二重特異性抗体、三重特異性抗体、及び四重特異性抗体から成る群から選択される。
【０３６３】
更なる例において、治療薬及びターゲッティングコンジュゲートは、式（E）：
【化１０９】
0006420331.tif 000128
（式中、
PHFは、約5kDa〜約10kDaの範囲の分子量を有し；
mは1〜75であり、m1は約5〜約35であり、m2は約3〜約10であり、m3aは0〜約4であり、m3bは1〜約5であり、m、m1、m2、m3a、及びm3bの合計は約40〜約75であり、そして、m5は2〜約4である）
に例示した構造を特徴とする。
【０３６４】
更なる実施形態において、抗腫瘍治療法で有効である治療用抗−5T4薬剤ターゲッティングコンジュゲートを提供し、該コンジュゲートは、約2kDa〜約40kDaの分子量を有するPHFを含む高分子足場を含み；ここで、該コンジュゲートは、以下の構造：
【化１１０】
0006420331.tif 000129
、構造中、m5は1〜10であり；mは1〜約300の整数であり；m1は1〜約140の整数であり；m2は1〜約40の整数であり；m3aは0〜約17の整数であり；m3bは1〜約8の整数であり；ここで、m3aとm3bの合計は1〜約18の整数であり；且つm、m1、m2、及びm3の合計は約15〜約300の範囲であり；XはNHであり；Xa又はXbの一方がHであり、もう片方がマレイミドブロッキング部分であり；そして、Dの各存在が独立して、≦5kDaの分子量を有する治療薬である場合、Dとカルボニル基の間の
【化１１１】
0006420331.tif 000130
はDの直接又は間接的なカルボニル基への結合を意味し；ここで、抗−5T4(ANTI-5T4)は、ヒト癌胎児抗原5T4に関して選択能力がある免疫グロブリン又はその機能的な断片を含む抗−5T4リガンドである）
のコンジュゲートである。例えば、抗−5T4の分子量は、少なくとも約40kDaである。一実施形態において、Dは、ヒドロキシプロピルアミド−L−アラニン部分を介してm2のカルボニル部分に結合されたアウリスタチン又はその類似体である。一実施形態において、薬剤対抗−5T4の比は、約5：1〜約30：1、又は約12：1〜約18：1である。別の実施形態において、PHF薬剤コンジュゲート対抗−5T4抗体の平均の比は、約2：1〜約4：1である。
【０３６５】
これらのコンジュゲートは、コンジュゲートを形成する様々なユニットのモルパーセンテージ又はモル分率によってさらに定義されてもよい。例えば、リガンドに連結されたジエチレングリコールマレイミド（EG2−MI）部分を含むモノマーユニットは、約2モル％から約5モル％のモル分率を有する。より一層更なる例において、薬剤を担持するモノマーユニットは、約5モル％から約10モル％のモル分率を有する。例えば、薬剤対抗−5T4の比は、約5：1〜約30：1又は約12：1〜約18：1である。更なる実施例において、薬剤を含むPHF足場対抗−5T4抗体の平均の比は、約2：1〜約3：1又は約3：1〜約4：1である。一実施形態において、コンジュゲートは、抗−5T4−（（EG2−MI（3％）−（10kDaのPHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（8％））である。このコンジュゲートは、実施例10、そしてより一般的には、スキーム5に記載のように調製されてもよい。
【０３６６】
より一層更なる実施形態において、抗−5T4と、互いにランダムに接続され得る以下に示すユニット：
【化１１２】
0006420331.tif 000131
（式中、
抗−5T4（ANTI-5T4）は、配列番号Aのアミノ配列を含む一本鎖抗体構築物であり；PHFは、約2kDa〜約40kDaの範囲の分子量を有し；高分子足場対抗−5T4抗体の比の平均は約2：1〜約3：1又は約3：1〜4：1であり、且つAF HPA対抗−5T4抗体の比は約12：1〜約18：1である）
を含むPHF高分子足場とを含む、抗腫瘍治療法に有効な治療薬及びターゲッティングコンジュゲートが提供される。
【０３６７】
これらのコンジュゲートは、本明細書中に記載したように調製され、そして、対象への送達に好適な組成物への好適な担体に組み合わせられてもよい。これらの組成物はこれらの抗−5T4薬剤ターゲッティングコンジュゲートの混合物を含んでもよい、すなわち、単一の組成物が異なった薬剤及び／又は異なった高分子足場を有する抗−5T4薬剤ターゲッティングコンジュゲートを含んでもよい。
合成方法
【０３６８】
本発明によると、本発明のコンジュゲート又はそれらを含有する組成物、並びにそれらを製造するのに有用な中間体及び成分（例えば、担体やモディファイヤー）を製造するのに、任意の利用可能な技術が使用できる。例えば、半合成方法及び完全合成方法が使用され得る。
担体
【０３６９】
モディファイヤーと結合するのに適当な高分子担体（例えば、生体適合性で生分解性の高分子担体）を調製する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、合成指針は、米国特許第5,811,510号；同第5,863,990号；同第5,958,398号；同第7,838,619号；同第7,790,150号；同第8,685,383号；及び同第8,815,226号で見られる、そして、それらそれぞれの内容の全体を参照により本明細書中に援用する。当業者は、いかにして、本発明を実施する際に使用する高分子担体を製造するようにこれらの方法を改造するかを知っている。
【０３７０】
一実施形態において、本発明の生分解性の生体適合性ポリアルコンジュゲートを形成する方法は、適した多糖類をグリコール特異的酸化剤の有効量と組み合わせて、アルデヒド中間体を形成するプロセスを含んでなる。次に、アルデヒド中間体（ポリアル自体である）は、対応するポリオールに還元され、コハク酸化され、そして、１又は２以上の適したモディファイヤーと合わせられて、スクシンアミド含有リンカーを含んでなる生分解性の生体適合性ポリアルコンジュゲートを形成する。
【０３７１】
別の好ましい実施形態において、本発明で使用するための完全合成の生分解性、生物適合性ポリアルは、適当な開始剤を適当な前駆体化合物と反応させることによって調製できる。
【０３７２】
例えば、完全合成ポリアルは、ビニルエーテルを保護し置換したジオールで縮合することにより調製され得る。他の方法、例えば開環重合などは、使用され得、ここで、この方法の有効性は、置換の程度及び保護基のかさばりに依存し得る。
【化１１３】
0006420331.tif 000132
【０３７３】
当業者は、溶媒系、触媒及び他の要素が高分子量生成物を得るために最適化され得ることを理解する。
【０３７４】
ある実施形態において、担体はPHFである。
【０３７５】
実施形態において、高分子担体は、1.5未満、例えば＜1.2、の多分散性指数（PDI）を有するPHFである。
【０３７６】
薬剤と薬剤誘導体
ある実施形態において、薬剤は、高分子担体への結合前に修飾されてもよい。スキーム1及び2は、ビンカアルカロイドを修飾する方法の実例である。スキーム3は、非天然カンプトテシン誘導体を修飾する方法を示している。スキーム4は、アウリスタチンFを修飾する方法を示している。より多くの修飾方法が、US2010/0305149に記載されており、この文献を参照により本明細書中に援用する。
【化１１４】
0006420331.tif 000133
【０３７７】
ビンカアルカロイドのC23エステルをヒドラジンと反応させ、続いて、得られる生成物をNaNO2で処理すると、活性なアジドエステルが得られる。アジドエステルをプロパノールアミン又は1-アミノプロパン-2-オールなどのアミノ化合物と反応させると、官能化されたヒドロキシルを有するビンカアルカロイド誘導体が得られ、高分子との結合のための、例えばアラニン又はメチルアラニン誘導体などのアミノ含有化合物でさらに誘導体化することができる（スキーム1を参照のこと）。
【化１１５】
0006420331.tif 000134
【０３７８】
ビンカアルカロイドのヒドロキシル誘導体を、t-ブトキシエステル化されたアミノ酸などの保護されたアミノ含有テザーで処理し、続いて、エステルのTFA加水分解すると、ビンカアルカロイドのトリフラート塩が得られる。（スキーム2）ビンカアルカロイドの官能化された高分子へのコンジュゲーションは、PBRM又はその誘導体とさらに結合されて、タンパク質−高分子−薬剤コンジュゲートをもたらすことができる薬剤−高分子コンジュゲートをもたらす。
【化１１６】
0006420331.tif 000135
【０３７９】
非天然カンプトテシン誘導体、例えば、SN38の10-ヒドロキシ基を、トリエチルアミンの存在下で誘導体をtert-ブチルジフェニルシリルクロリド（TBDPSiCl）と反応させることによって選択的に保護する。アラニン誘導体を形成するために、Sapra, P. et al., Clin. Cancer Res., 14: 1888-1896 (2008)に記載の手順を用いて、t-ブチルカルボニル-アラニンと反応させることによる20-ヒドロキシ基を形成できる。或いは、他のアミノ酸、例えばグリシンを用いることができる。第一級アミンを、トリフルオロ酢酸での処理によりBoc保護基を除去することにより脱マスクし、続いて、フッ化テトラブチルアンモニウムでTBDPS保護基を除去する（スキーム3を参照のこと）。得られたアミノ誘導体化SN38化合物は、官能化高分子と結合されて、薬剤−高分子コンジュゲートを形成する。
【化１１７】
0006420331.tif 000136
【０３８０】
t-ブトキシエステル化2-ヒドロキシプロピルアミンなどの保護されたアミノ含有テザーによるアウリスタチンFの処理と、それに続く、エステルのHCl加水分解は、アウリスタチンFの2-ヒドロキシルプロピルアミノ誘導体をもたらす（スキーム4を参照のこと）。アウリスタチンF誘導体の官能化高分子への結合は、PBRM又はその誘導体とさらに結合されて、タンパク質−高分子−薬剤コンジュゲートをもたらす薬剤−高分子コンジュゲートをもたらす。
【０３８１】
コンジュゲート又は高分子足場
以下のスキーム5は、本発明の高分子薬剤足場を作り出す合成スキームを示す。一実施形態において、コンジュゲートは、以下の数ステップで形成される：（1）COOH部分を含むように、高分子PHFを改変し（例えば、−C（O）−X−（CH2）2−COOH）；（2）次に、高分子がPBRMの官能基と反応できるマレイミド部分（例えば、EG2−MI）を含むように、高分子をさらに改変し；（3）異なった2つの官能基を含んでいる修飾高分子を薬剤又はその誘導体（例えば、AF−HPA−Ala）の官能基と反応させて、高分子−薬剤コンジュゲートを形成し；（4）PBRMのジスルフィド結合を還元し；（5）次に、還元したPBRMを高分子−薬剤コンジュゲートと反応させて、タンパク質−高分子−薬剤コンジュゲートを形成し；そして（6）適宜、残っているマレイミド部分を、マレイミドブロッキング化合物（例えば、システイン）と反応させる。
【０３８２】
別の実施形態において、以下のスキーム5の右側の経路で示されるように、ステップ（2）と（3）の順番は逆にしてもよい。
【化１１８】
0006420331.tif 000137
【化１１９】
0006420331.tif 000138
【０３８３】
さらに別の実施形態において、以下のスキーム6で示されるように、前記ステップ（2）と（3）は同時におこなわれる。
【化１２０】
0006420331.tif 000139
【０３８４】
医薬組成物
安定剤、緩衝剤などの許容される担体中に本明細書に開示されているとおりの１又は２以上のタンパク質−高分子−薬剤コンジュゲートを含む医薬組成物もまた包含される。コンジュゲートは、標準的な手段によって、医薬組成物を形成するための安定剤、緩衝剤などを用いて、又は用いずに、対象に投与及び導入することができる。投与は、局所投与（眼ならびに膣及び直腸送達を包含する粘膜への投与を包含する）、例えばネブライザーによる投与を包含する散剤又はエアロゾルの吸入又は注入による肺投与；気管内、鼻腔内、表皮及び経皮、経口投与、又は静脈内、動脈内、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射若しくは点滴若しくは頭蓋内、例えばクモ膜下若しくは脳室内投与を包含する非経口投与であってよい。コンジュゲートは、注射投与のための無菌液剤及び／又は懸濁剤；注射／点滴の前に再構成するための凍結乾燥散剤；局所組成物として；経口投与のための錠剤、カプセル剤又はエリキシル剤；又は直腸投与のための坐剤ならびに当分野で公知の他の組成物として製剤化し、使用することができる。
【０３８５】
薬理学的組成物又は製剤は、投与、例えば細胞又は例えばヒトを包含する対象に全身投与するために適した形態の組成物又は製剤を指す。適切な形態は一部では、使用又は進入経路、例えば経口、吸入、経皮、又は注射／点滴に左右される。そのような形態は、組成物又は製剤が標的細胞（即ち、薬剤が送達されることが望ましい細胞）に達するのを妨げるべきではない。例えば血流に注入された薬理学的組成物は、可溶性であるべきである。他の因子は当分野で公知であり、組成物又は製剤がその作用を発揮することを妨げる毒性及び形態などの検討を包含する。
【０３８６】
「全身投与」とは、血流への修飾高分子のインビボでの全身吸収又は蓄積、それに続く身体全体への分布を意味する。全身吸収をもたらす投与経路には、限定ではないが：静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内及び筋肉内が包含される。これらの投与経路はそれぞれ、修飾高分子をアクセス可能な疾患組織に曝露する。循環への活性薬剤の進入速度は、分子量又はサイズと相関していることが判明している。本願発明のコンジュゲートを使用することによって、薬剤送達をPBRMの特異性を介して、癌細胞などの特定の細胞へと局在化することができる。
【０３８７】
「薬学的に許容される製剤」は、その所望の活性に最も適した身体的位置にコンジュゲートを有効に分布させることを可能にする組成物又は製剤を意味する。一実施形態では、有効な送達は、細網内皮系によるクリアランスの前か、又は効力の低下又は毒性をもたらし得る標的外結合の生じる前に生じる。コンジュゲートを有する製剤に適した薬剤の非限定的例には：CNSへの活性薬剤の進入を増大させ得るP-糖タンパク質阻害因子（Pluronic P85など）；脳内インプラント後に持続放出送達するためのポリ（DL-ラクチド−コグリコリド）マイクロスフェアなどの生分解性高分子；及び血液脳関門を通過させて活性薬剤を送達することができ、神経取り込み機構を変えることができるポリブチルシアノアクリレートから製造されるものなどの負荷ナノ粒子が包含される。
【０３８８】
薬学的有効量の所望のコンジュゲートを薬学的に許容される担体又は希釈剤中に包含する貯蔵又は投与のために調製された医薬組成物もまた、本明細書には包含される。治療のための使用に許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤は医薬分野で周知である。例えば緩衝剤、保存剤、増量剤、分散剤、安定剤、染料を加えることができる。加えて、抗酸化剤及び懸濁化剤を使用することができる。好適な担体、希釈剤、及び／又は賦形剤の例としては、（1）ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、pH約6.5（約1mg／ml〜25mg／mlヒト血清アルブミンを含む）、（2）0.9%の生理食塩水（0.9% w／vのNaCl）及び（3） 5%（w／v）のデキストロースが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８９】
「薬学的有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、同定された疾患若しくは状態を治療、改善若しくは予防するか、又は検出可能な治療若しくは阻害効果を示す薬剤の量を指す。当分野で公知の任意のアッセイ方法によって、効果を検出することができる。対象についての厳密な有効量は、対象の体重、体格及び健康；状態の性質及び規模；ならびに投与のために選択される治療物質又は治療物質の組み合わせに左右される。臨床家の技能及び判断の範囲内である常套的な実験によって、所定の状況での薬学的有効量を決定することができる。好ましい態様では、遺伝子サイレンシングを介して、疾患又は状態を治療することができる。
【０３９０】
任意のコンジュゲートについて、初めに例えば腫瘍細胞の細胞培養アッセイで、又は動物モデル、通常はラット、マウス、ウサギ、イヌ又はブタで、薬学的有効量を推定することができる。また、動物モデルを使用して、適切な濃度範囲及び投与経路を決定することもできる。次いで、そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量及び投与経路を決定することができる。細胞培養又は実験動物における標準的な医薬手順によって、治療的／予防的効力及び毒性、例えばED50（個体群の50％において治療的に有効な用量）及びLD50（個体群の50％に対して致命的な用量）を決定することができる。毒性と治療効果との用量比は、治療指数であり、比、LD50／ED50として表され得る。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。使用される剤形、患者の感度及び投与経路に応じて、投薬はこの範囲内で変動し得る。
【０３９１】
例えば、薬物又はその誘導体、薬物-高分子コンジュゲート、又はPBRM-薬物-高分子コンジュゲートは、Cell titer Gloを用いて、幾つかの細胞株中における腫瘍増殖を阻害するそれらの能力に関して評価され得る。容量応答曲線は、SoftMax Proソフトウェアを使用して生じさせることができ、IC50値は、４つのパラメータの曲線フィッティングから決定され得る。使用される細胞株は、PBRMの標的である細胞株、及び試験コンジュゲート中に含まれる、PBRMの標的ではない対照細胞株を含み得る。
【０３９２】
一実施形態では、従来のカテーテル技術又は点滴の使用を包含する注射による非経口投与のために、コンジュゲートを製剤化する。注射用の製剤は、ユニット剤形で、例えばアンプルで、又は複数回投与用の容器で、保存剤を添加して提供することができる。コンジュゲートは、無菌媒体中で非経口投与することができる。コンジュゲートは、使用されるビヒクル及び濃度に応じて、ビヒクル中に懸濁又は溶解させることができる。有利には、局所麻酔薬、保存剤及び緩衝剤などのアジュバントをビヒクルに溶かすことができる。「非経口」という用語には、本明細書で使用される場合、経皮、皮下、血管内（例えば静脈内）、筋肉内又はクモ膜下注射又は点滴技術などが包含される。加えて、コンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む医薬製剤を提供する。コンジュゲートのうちの１又は２以上は、１又は２以上の非毒性で薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤及び／又はアジュバント及び所望の場合には他の活性成分と一緒に存在してよい。
【０３９３】
無菌の注射用調剤はまた、非毒性で非経口で許容される希釈剤又は溶媒中の、例えば1,3-ブタンジオール中の溶液としての無菌の注射用液剤又は懸濁剤であってよい。特に使用することができる許容されるビヒクル及び溶媒は、水、リンゲル液及び等張性塩化ナトリウム溶液である。加えて、無菌、不揮発性油が、溶媒又は懸濁媒として従来使用されている。この目的で、合成モノ−又はジグリセリドを包含する無刺激の不揮発性油を使用することができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が、注射用の製剤で使用される。
【０３９４】
本明細書中に記載したコンジュゲート及び組成物は、適当な形態で、好ましくは非経口的に、より好ましくは静脈内に投与され得る。非経口投与において、コンジュゲート又は組成物は、水溶性若しくは非水性の無菌液、懸濁液又は乳濁液であり得る。プロピレングリコール、植物油及び、例えばオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが、溶媒又はビヒクルとして使用できる。組成物はまた、アジュバント、乳化剤又は分散剤を含むこともできる。
【０３９５】
１日当たり体重１キログラム当たり約0.001mgから約140mgの間のオーダーの投薬レベルが、上記で示された条件を治療する際には有用である（１日当たり１対象当たり約0.05mgから約7gの間）。いくつかの実施形態において、患者に投与される投薬量は、対象の体重に対して約0.001mg／kgから約100mg／kgの間にある。いくつかの実施形態において、患者に投与される投薬量は、対象の体重に対して約0.01mg／kgから約15mg／kgの間にある。いくつかの実施形態において、患者に投与される投薬量は、対象の体重に対して約0.1mg／kgから約15mg／kgの間にある。いくつかの実施形態において、患者に投与される投薬量は、対象の体重に対して約0.1mg／kgから約20mg／kgの間にある。いくつかの実施形態において、投与される投薬量は、対象の体重に対して約0.1mg／kgから約5mg／kg又は約0.1mg／kgから約10mg／kgの間にある。いくつかの実施形態において、投与される投薬量は、対象の体重に対して約1mg／kgから約15mg／kgの間にある。いくつかの実施形態において、投与される投薬量は、対象の体重に対して約1mg／kgから約10mg／kgの間にある。単一剤形を製造するために担体物質と合わせることができるコンジュゲートの量は、治療される受容者及び特定の投与方法に応じて変動する。投薬ユニット形態は一般に、約0.001mgから約100mgの間；約0.01mgから約75mgの間；又は約0.01mgから約50mgの間；或いは約0.01mgから約25mgの間のコンジュゲートを含有してよい。
【０３９６】
静脈内投与も関して、投与量レベルは、前段落に記載の範囲、又は動物の体重1kgあたり約0.01〜約200mgのコンジュゲートを含んでなる。一態様において、組成物は、動物の体重の1kgあたり約1〜約100mgのコンジュゲートを含んでいる。別の態様において、投与される量は、約0.1〜約25mg／kg体重の化合物の範囲にある。
【０３９７】
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、次のとおり投与できる。コンジュゲートは、約5日間、毎日のi.v.、ボーラスとして又は約5日間の連続点滴として、約5日間、毎日与えられ得る。
【０３９８】
或いは、コンジュゲートは、6週間以上にわたり1週間に一度投与され得る。別の代替手段として、コンジュゲートは、2週間又は3週間に一度投与され得る。ボーラス投与量は、約5〜約10mlのヒト血清アルブミンが加えられ得る約50〜約400mlの通常の生理的食塩水中に与えられる。連続滴は、約250〜約500mlの通常の生理的食塩水中に与えられ、それには、24時間あたり約25〜約50mlのヒト血清アルブミンが加えられ得る。
【０３９９】
いくつかの実施形態において、処置の約1〜約4週間後に、患者は、第二の治療ユニットを受けることがある。投与経路、賦形剤、希釈剤、投薬量、及び回数に関する特定の臨床試験計画書が、臨床的症状が保証するように当業者によって決定される。
【０４００】
他の実施形態において、治療上有効な量は、別の規則的なスケジュール、すなわち、日、週、月、又は年を基準にしたスケジュール、又は異なった投与日、週、月などの不規則なスケジュールで提供されてもよい。或いは、投与されるべき治療上有効な量は異なってもよい。一実施形態において、初回投与のための治療上有効な量は、1回以上のその後の用量の治療上有効な量より多い。別の実施形態において、初回投与のための治療上有効な量は、1回以上のその後の用量の治療上有効な量より少ない。同等な投薬量が、これだけに限定されるものではないが、
越えるのにカ月、カ月を含んでいる
約2時間毎、約6時間毎、約8時間毎、約12時間毎、約24時間毎、約36時間毎、約48時間毎、約72時間毎、約1週間毎、約2週間毎、約3週間毎、約1カ月毎、及び約2カ月毎を含めた様々な期間にわたり投与されてもよい。治療が完了するまでの期間に応じた投薬回数と頻度が、健康管理の医療関係者の判断に従って決定される。本明細書中に記載した治療上有効な量は、所定の期間にわたって投与された総量を指す；すなわち、本明細書中に記載した2以上の別々のコンジュゲートを投与するなら、治療上有効な量は投与された総量に相当する。特定の対象に関する具体的な用量水準が、特定のコンジュゲートの活性、年齢、体重、健康全般、性別、食事、投与時期、投与経路、及び排出速度、他の活性物質との組み合わせ、及び治療を受ける特定の疾患の重症度を含めたさまざまな因子に依存することが理解される。
【０４０１】
ヒト以外の動物への投与では、コンジュゲートを動物用の食餌又は飲料水に加えることもできる。動物が治療的に適切な量のコンジュゲートをその食事と共に摂取できるように、動物用の食餌及び飲料水を配合するのが簡便であり得る。また、コンジュゲートを食餌又は飲料水に加えるためのプレミックスとして提供することも簡便であり得る。
【０４０２】
コンジュゲートをまた、対象に他の治療用化合物と組み合わせて投与して、治療効果全体を上げることができる。適応症を治療するために複数の化合物を使用することで、有益効果を上げることができる一方で、副作用の存在を減らすことができる。いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、例えば米国特許第7,303,749号で開示されているものなどの化学療法薬と組み合わせて使用できる。他の実施形態において、化学療法薬としては、レトロゾール、オキサリプラチン、ドセタキセル、5-FU、ラパチニブ、カペシタビン、ロイコボリン、エルロチニブ、パーツズマブ、ベバシズマブ、及びゲムシタビンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明はまた、１又は２以上の化学療法薬を含んでいる、１又は２以上の本発明のコンジュゲート及び／又は組成物の入った１又は２以上のコンテナを含んでなる医薬キットも提供する。そのようなキットはまた、例えば、他の化合物及び／又は組成物、その化合物及び／又は組成物を投与するための（単数若しくは複数の）デバイス、並びに医薬又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を管轄する政府機関によって定められた様式の書面による取扱説明書を含む。本明細書中に記載した組成物は、単回投与として又は連続若しくは周期的な不連続投与のためにパッケージされてもよい。連続投与のために、パッケージ又はキットには、それぞれの投薬単位（例えば先に記載した又は薬剤送達で利用される溶液又は他の単位）のコンジュゲート、及び適宜、予定された期間にわたる毎日、毎週、若しくは毎月の又は処方される用量を投与するための取扱説明書を含んでいる。経時的に組成物の、組成物の成分の濃度、又はコンジュゲート若しくは組成物の作用物質の相対比を変えることが望まれる場合、パッケージ又はキットが所望の変動を提供する一連の投薬ユニットを含んでいてもよい。
【０４０３】
周期的な経口使用のための医薬剤を施薬するための多くのパッケージ又はキットが当該技術分野で知られている。一実施形態において、パッケージには、各期間に関する指標がある。別の実施形態において、パッケージは、標識されたブリスタ包装、ダイヤルディスペンサーパッケージ、又はボトルである。キットの包装手段は、それから配合物が体の患部に適用され得る、対象に注入され得る、又は適用されたうえでキットの他の成分と混合され得る、例えばシリンジ、ピペット、点眼容器、又は他の斯かる装置など、それ自体が投与に適合していてもよい。
【０４０４】
使用方法
処置方法
本発明のある好ましい実施形態では、本発明のタンパク質−高分子−薬剤コンジュゲートコンジュゲートは、動物（好ましくは哺乳類、最も好ましくは男性、女性、幼児、子供、及び成人を含めたヒト）を処置する方法において使用される。一実施形態では、本発明のコンジュゲートは、本発明の生分解性、生体適合性コンジュゲートを動物に投与することを含む、動物を処置する方法において使用されてもよい。例えば、本発明によるコンジュゲートは、可溶性直鎖重合体、共重合体、コンジュゲート、コロイド、粒子、ゲル、固形状物、繊維、フィルムなどの形で投与することができる。本発明の生分解性、生体適合性コンジュゲートは、薬剤キャリア、薬剤キャリア成分、管理された薬剤放出、低侵入式外科用処置用の製剤などとして、使用することができる。医薬品製剤は、注射可能であり、移植可能である。
【０４０５】
さらに他の態様では、本発明は、被験体に、本発明のコンジュゲートを少なくとも１つ有効量で投与することを含む、それを必要とする被験体の疾患又は障害を処置する方法を提供し、前記コンジュゲートは生分解により１以上の治療剤を放出する。
【０４０６】
もう1つの実施形態において、コンジュゲートは、患者を処置するため、及び／又は、例えば癌を含めた、選択された細胞集団の成長を調節するために、インビトロ、インビボ、及び／又はエクスビボにおいて投与できる。いくつかの実施形態において、コンジュゲートで処置できる癌の具体的なタイプとしては、これらに限定されないが、次のものが挙げられる：（1）これらに限定されないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、骨癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、口腔癌、鼻腔癌、咽喉癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌胆汁腺管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、肺癌、上皮性癌腫、神経膠腫、神経膠芽腫、多形性星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、皮膚癌、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫を含めた固形腫瘍；（2）これらに限定されないが、急性リンパ芽球性白血病「ALL」、急性リンパ芽球性B細胞白血病、急性リンパ芽球性T細胞性白血病、急性骨髄芽球性白血病「AML」、急性前骨髄球性白血病「APL」、急性単芽球性白血病、急性赤白血病、急性巨核芽球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性非リンパ性白血病、急性未分化白血病、慢性骨髄性白血病「CML」、慢性リンパ球性白血病「CLL」、ヘアリー細胞白血病、多発性骨髄腫、急性及び慢性白血病、例えば、リンパ芽球性、骨髄性、及びリンパ球性、骨髄性白血病を含めた血液−骨由来の癌；並びに（3）リンパ腫、例えばホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、H鎖病、及び真性多血症など。
【０４０７】
別の実施形態において、コンジュゲートは、肛門の癌、星状細胞腫、白血病、リンパ腫、頭頚部の癌、肝臓の癌、精巣の癌、肉腫、子宮頚部の癌、血管腫、食道の癌、目の癌、喉頭の癌、口の癌、中皮腫、皮膚の癌、骨髄腫、口腔の癌、直腸の癌、喉の癌、膀胱の癌、乳房の癌、子宮の癌、卵巣の癌、前立腺の癌、肺の癌、結腸の癌、膵臓の癌、腎の癌、又は胃の癌を患っている患者を治療する、及び／又は患者において選択された細胞集団の増殖を調節するためにインビトロ、インビボ、及び／又はエクスビボで投与され得る。
【０４０８】
別の実施形態において、癌は、乳癌、胃癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、及び卵巣癌から成る群から選択される。
【０４０９】
別の実施形態において、コンジュゲートは、特定の病状、例えば、癌、を処置する、予防する、進行の危険性を低減する、及び／又は発症を遅らせるためにインビトロ、インビボ、及び／又はエクスビボで投与され得る。例えば、本発明のコンジュゲートは、肛門癌、星状細胞腫、白血病、リンパ腫、頭頚部癌、肝臓癌、精巣癌、子宮頚癌、肉腫、血管腫、食道癌、眼癌、喉頭癌、口腔癌（mouth cancer）、中皮腫、皮膚癌、骨髄腫、口腔癌（oral cancer）、直腸癌、咽喉癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、及び胃癌から成る群から選択される癌を処理する、予防する、進行を遅らせる又はそうでなければ、症状を改善するのに有効である。
【０４１０】
もう1つの実施形態において、コンジュゲートは、自己免疫疾患、例えば全身性ループス、関節リウマチ、乾癬、及び多発性硬化症など；移植片拒絶反応、例えば腎臓移植拒絶反応、肝移植拒絶反応、肺移植拒絶反応、心臓移植拒絶反応、及び骨髄移植拒絶反応など；移植片対宿主拒絶反応；ウイルス感染症、例えばCMV感染症、HIV感染症、及びAIDSなど；並びに寄生虫感染症、例えばランブル鞭毛虫症、アメーバ症、住血吸虫病などを処置するためにインビトロ、インビボ、そして／又はエクスビボで投与し得る。
【０４１１】
ある実施形態において、コンジュゲートはまた、例えば異常な細胞増殖（例えば、癌）を特徴とする疾患を処置するか、又はその重症度を軽減するのに有効である薬剤の製造に使用されることもできる。
【０４１２】
ある実施形態において、治療薬は、特定の標的細胞、組織、又は臓器に局所的に提供される。
【０４１３】
ある実施形態では、本発明の方法を実施において、コンジュゲートは、診断ラベルを更に含む、或いは結びつく。ある例示的な実施形態では、診断ラベルは、γシンチグラフィー及びＰＥＴ用放射性医薬品又は放射性アイソトープ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用造影剤、ＣＴ検査法用造影剤、Ｘ線画像検査法用造影剤、超音波診断的法用剤、中性子活性化用剤、Ｘ線、超音波、電波及びマイクロ波を反射、散乱又はこれらに作用しうる部分及び蛍光体からなる群より選択される。ある例示的な実施形態では、コンジュゲートはさらにインビボでモニターされる。
【０４１４】
診断ラベルの例示として、γシンチグラフィー及びＰＥＴ用の診断的放射性医薬品又は放射性アイソトープ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用造影剤（例えば、常磁性原始及び超常磁性ナノ結晶）、ＣＴ検査法用造影剤、Ｘ線画像検査法用造影剤、超音波診断的方法用剤中性子活性化剤、及びＸ線を超音波、電波及びマイクロ波を反射、散乱又はこれらに作用することのできる部分、種々の光学処置における蛍光体が挙げられるが、これらに限定されない。診断的放射性医薬品としては、γ−放出放射性核物質、例えば、インジウム１１１、テクネチウム９９ｍ及びヨウ素１３１などが挙げられる。ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）用造影剤としては、磁性化合物、例えば、常磁性イオン、鉄、マンガン、ガドリニウム、ランタン系、有機常磁性部分、及び超常磁性、強常磁性及び反強常磁性化合物、例えば酸化鉄コロイド、フェライトコロイドなどが挙げられる。ＣＴ検査法及び他のＸ線系画像検査法用の造影剤としては、Ｘ線を吸収する化合物、例えば、ヨウ素、バリウムなどが挙げられる。超音波系方法用の造影剤としては、超音波を吸収、反射、及び散乱する化合物、例えば、乳剤、結晶、気泡などが挙げられる。さらに他の例示として、中性子活性化に有用な物質、例えばホウ素及びガドリニウムが挙げられる。反射、屈折、散乱、その他、Ｘ線、超音波、電波、マイクロ波及び診断的処置に有用なほかの放射線に作用することのできるラベルも使用することができる。蛍光性ラベルは、写真撮影のために使用することもできる。ある実施形態では、修飾物質は、常磁性イオン又は基を含む。
【０４１５】
他の態様では、本発明は、対象の疾患又は障害を処置する方法であって、少なくとも１つの本発明のコンジュゲートの水性製剤を準備し、該製剤を前記対象に非経口的に注射することを含む方法を提供する。
【０４１６】
他の態様では、本発明は、対象の疾患又は障害を処置する方法であって、本発明のコンジュゲートを少なくとも１つ含む移植片を準備し、該移植片を前記対象に移植することを含む方法を提供する。ある例示的な実施形態では、移植片は、生分解性ゲルマトリックスである。
【０４１７】
他の態様では、本発明は、それを必要とする動物を処置する方法であって、前記方法によってコンジュゲートを投与することを含む方法を提供する。
【０４１８】
他の態様では、本発明は、動物において免疫応答を発現させる方法であって、先に記載した方法に従ってコンジュゲートを投与することを含む方法を提供する。
【０４１９】
他の態様では、本発明は、動物において疾患を診断する方法であって、前記方法によりコンジュゲートを投与する工程であって、該コンジュゲートは検出可能な分子を含む工程と、検出可能な分子を検出する工程とを含む方法を提供する。
【０４２０】
ある例示的な実施形態では、前記検出可能な分子を検出する工程は、非侵襲的に行われる。ある例示的な実施形態では、前記検出可能な分子を検出する工程は、適切な画像機器を使用して行われる。
【０４２１】
ある一実施形態では、動物を処置する方法は、動物に本発明の生分解性、生体適合性コンジュゲートを、腫瘍又は増殖が取り除かれた外科創傷の包装体として、投与することを含む。生分解性、生体適合性コンジュゲート包装体は、回復中に腫瘍部位と取り替えられ、創傷が癒えた時、分解し消える。
【０４２２】
ある実施形態では、コンジュゲートは、インビボでモニタリングするために診断ラベルと結びつく。
【０４２３】
前記コンジュゲートは、動物の処置、予防、及び分析（診断的）処置のために使用することができる。コンジュゲートは、一般的に、経口的投与されるものであるが、他の経路で投与されてもよい場合がある。
【０４２４】
一実施形態では、可溶性又はコロイド状コンジュゲートは、静脈内投与される。他の実施形態では、可溶性又はコロイド状コンジュゲートは、局所（例えば、皮下、筋肉）注射によって投与される。他の実施形態では、個体コンジュゲート（例えば、粒子、移植片、薬剤送達システム）は、移植又は注射によって投与される。
【０４２５】
他の実施形態では、検出可能なラベルを含むコンジュゲートは、動物体内のラベル分布のパターンと動特性を研究するために投与される。
【０４２６】
ある実施形態では、本明細書に開示するいずれか１以上のコンジュゲートは、前記方法のいずれかの実施において使用してもよい。ある例示的な実施形態において、コンジュゲートは、トラスツズマブ-PHF-、リツキシマブ-PHF-、リンツズマブ−PHF又は抗−5T4−PHF−薬剤コンジュゲートである。
【０４２７】
明細書を通じて、組成物が具体的な成分を含む（having、including、又はcomprising）と記載されている場合、その組成物が記載した成分から実質的に成るか、又はそれから成ることを企図している。同様に、方法又はプロセスが具体的な工程を含む（having、including、又はcomprising）と記載されている場合、そのプロセスが記載した工程から実質的に成るか、又はそれから成ることを企図している。さらに、工程の指示又は操作を行うための指示は、本発明を実施し続けられる程度に理解されなければならない。そのうえ、2以上の工程又は操作が同時に行われることもある。
【０４２８】
本発明の合成過程は、幅広い官能基を許容し得る；そのため、様々な置換された出発物質が使用できる。前記プロセスは、一般に、全プロセスの最後又はその付近に所望の最終化合物を供するか、或いは、場合によっては、化合物を医薬的に許容され得るその塩、エステル又はプロドラッグへとさらに変換することが望まれることもある。
【０４２９】
本発明のコンジュゲートに使用される薬剤は、市販の出発物質、文献で知られている化合物を使用して、又は、容易に調製された中間体から、当業者に知られているか、又は本明細書中の教示を踏まえて当業者に明らかになった標準的な合成方法又は手順を用いることによって、様々な方法で調製できる。有機分子の調製及び官能基の形質転換や操作のための標準的な合成方法及び手順は、関連科学文献又はその分野の標準教本から得られる。或いは、これらに限定されないが、いくつかの起源、古典原本、例えばSmith, M. B., March, J., March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5th edition, John Wiley & Sons: New York, 2001; and Greene, T.W., Wuts, P.G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons: New York, 1999（本明細書中に援用）などが、当業者に知られている有機合成の有用、且つ認識された参考教本である。合成方法に関する次の説明は、例示することを目的としており、本発明の化合物の調製のための一般手法を限定するためのものではない。
【０４３０】
本発明のコンジュゲート及びそこに含まれる薬剤化合物は、当業者にとって身近な様々な方法によって都合よく調製できる。本明細書中に記載した各式を有する本願発明のコンジュゲート又は化合物は、以下の手順に従って、市販の出発物質からでも、文献手順を用いることで調製できる出発物質からでも調製できる。これらの手順では、本願発明の代表的なコンジュゲートの調製方法を示している。
【０４３１】
製造時に、先に記載した方法によって設計され、選択され、及び／又は最適化されたコンジュゲートは、そのコンジュゲートに生物学的活性があるか否かを判定するために、当業者に知られている様々なアッセイを使用することで特徴づけできる。例えば、コンジュゲートは、それらが予測された活性、結合活性が及び／又は結合特異性を有するか判定するために、これらに限定されないが、次に記載したアッセイを含めた従来のアッセイによって特徴づけできる。
【０４３２】
さらに、ハイスループット・スクリーニングが、そのようなアッセイを使用した分析のスピード化のために使用できる。その結果、当該技術分野で知られている技術を使用して、活性に関して本明細書中に記載したコンジュゲートを迅速にスクリーニングすることを可能にできた。ハイスループット・スクリーニングを行うための一般的な方法論は、例えば、Devlin (1998) High Throughput Screening, Marcel Dekker；及び米国特許第5,763,263号に記載されている。ハイスループットアッセイは、これらに限定されないが、以下で記載したものを含めた１又は２以上の異なったアッセイ技術を使用できる。
【０４３３】
本明細書に引用される全ての刊行物及び特許文献は、該刊行物又は文書の各々が明確に及び個別に、参照することにより本明細書に組み込まれと示されているかのように、参照することにより本明細書に組み込まれる。刊行物及び特許文書の引用は、該文書がいずれも妥当な先行技術であることを承認することを意図せず、それは該在中物又はその日付についての承認を構成もしない。本発明を書面としてここに記載したことで、当業者は、本発明が様々な実施形態で実施されることができること、そして、上記の説明と以下の実施例が以下の請求項を限定するためではなく、例示のためのものであることを認識するであろう。
【実施例】
【０４３４】
以下の実施例は、リンカー、薬剤分子及びPBRM、並びにそれを調製するための方法を例証する。これらは限定されることを意図していないので、他の試薬又は方法が利用されてもよいことは、当業者によって容易に理解される。
【０４３５】
本明細書中に記載したコンジュゲートは、一般に、先に概説したスキーム及び次の実施例に記載した方法によって調製できる。「含有量」という用語は、次の特定の実施例で使用される場合、別段の定めがない限り、目的の部分、例えば、リンカー、薬剤分子、又はPBRMなどで置換される高分子の構造ユニットのモル分率又はモルパーセンテージを意味する。従って、以下の実施例に使用される高分子−薬剤又はPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートの様々な高分子ユニットに関して報告されるパーセンテージは、別段の定めがない限り、モルパーセンテージである。
【０４３６】
略語
下記の略語を、下記の反応スキーム及び合成例において使用する。このリストは、本出願で使用される略語の包括的なリストであることを意図したものではなく、したがって有機合成の分野の当業者には容易に理解される追加の標準的な略語もまた、合成スキーム及び実施例において使用され得る。
ACN    アセトニトリル
AF−HPA    アウリスタチンF−ヒドロキシプロピルアミド
Ala    アラニン
BA    β−アラニン
BOC    tert-ブチロキシカルボニル
DCC    N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
DCM    ジクロロメタン
DIEA    N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DMA    ジメチルアセトアミド
DMAP    N,N−ジメチルピリジン-4−アミン
DMF    ジメチルホルムアミド
DMSO    ジメチルスルホキシド
EDAC    N1−（（エチルイミノ）メチレン）−N3，N3−ジメチルプロパン-1,3−ジアミンヒドロクロリド
EDC.HCl    1-エチル-3-［3-ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド
GA    グルタル酸
HPLC−HIC    疎水性相互作用高圧液体クロマトグラフィー
HOAt    1−ヒドロキシ-7−アザベンゾトリアゾール
HOBt    1−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物
HPLC    高圧液体クロマトグラフィー
HPSEC    高性能サイズ排除クロマトグラフィー
HPV    ヒドロキシプロピルビンデシン
2HPV    2-ヒドロキシプロピルビンデシン
MWCO    分子量排除
NHS    1−ヒドロキシピロリジン−2,5−ジオン（すなわち、N−ヒドロキシ−スクシンイミド）
NMP    N-メチル−2-ピロリドン
PBS    リン酸緩衝生理食塩水、0.9%のNaCl
EG    エチレングリコール
EG2    ジエチレングリコール
MI    マレイミド（Maleimide又はmaleimide）
HPA−Ala    ヒドロキシプロピルアミド−L−アラニン
PHF    ポリ（1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシルメチルホルマル）又はFLEXIMER（登録商標）
RP−HPLC    逆相高速液体クロマトグラフィー
SEC    サイズ排除クロマトグラフィー
TBSCl    tert−ブチルジメチルシリルエーテルクロリド
TCEP    Tris［2-カルボキシエチル］ホスフィン
TEA    トリエチルアミン
TEAA    トリエチルアンモニウムアセテート
TFA    トリフルオロ酢酸
WCX    弱陽イオン交換クロマトグラフィー
【０４３７】
一般情報
マレイミド−EG2−NHSエステルをBiomatrik, Chinaから購入した。
【０４３８】
Boc−ジアミノエタンHClをChem-Impex International Inc., Wood Dale, ILから購入した。
【０４３９】
Genentechによって製造された注射のためのKadcyla（登録商標）（アド−トラスツズマブエムタンシン）を購入した。
【０４４０】
HPLC精製を、Phenomenex Gemini 5μm 110A、250×10mm、5ミクロン、準調製カラムによりおこなった。
【０４４１】
SECを、Tosoh Biosciences TSKゲルG5000カラム（7.8mm×30cm、10μm）又はSuperose12カラム（GE Healthcare）によりおこなった。
【０４４２】
WCXを、ProPac WCX-10（94mm×250mm）カラム（ThermoFisher）によりおこなった。
【０４４３】
コンジュゲートの薬剤含量を分光光度測定で決定可能なときにはいつでも、薬剤含量の定量測定のために、別の方法であるLC／MS又は1H−NMRをおこなった。
【０４４４】
タンパク質−高分子−薬剤コンジュゲートのタンパク質量は、ELISAによって280nmにおける分光光度測定で測定した。
【０４４５】
（見掛けの重量平均分子量又はピーク分子量として報告される）高分子コンジュゲートの分子量を、多糖又はタンパク質分子量基準のいずれかを用いたSECによって測定した。より詳しく述べると、高分子又は高分子−薬剤コンジュゲートに関して、多糖分子量基準を使用し、そして、タンパク質−薬剤−高分子コンジュゲートに関して、タンパク質基準を使用する。特に示さない限り、報告した高分子担体分子量はPHFの重量平均分子量である；そして、高分子−薬剤コンジュゲート及びタンパク質−高分子−薬剤コンジュゲートの分子量はピーク分子量である。PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、約160kDa〜約260kDaのピーク分子量を有する。一般的に合成又は計測した高分子及び高分子コンジュゲートは、多分散度≦1.5を有する。
【０４４６】
PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、示量的な透析濾過によって残留未反応薬剤−高分子コンジュゲートから分離した。必要であれば、サイズ排除クロマトグラフィー及び／又はWCXクロマトグラフィーよる追加精製をおこなって、あらゆる凝集PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートも除去した。一般に、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、SECによって測定されるとき、＜5％（w／w、例えば、＜2％ w／w）；RP−HPLC又はLC−MS／MSによって測定されるとき、＜0.5％（w／w、例えば、＜0.1％ w／w）の遊離（非結合）薬剤；SEC及び／又はRP−HPLCで測定されるとき、1％（w／w）の遊離高分子−薬剤コンジュゲート及び＜HIC-HPLC及び／又はWCX HPLCによって測定されるとき、＜2％（w／w、例えば、＜1％ w／w）の非結合PBRMを通常含んだ。還元又は部分的に還元された抗体を、文献に記載の手順を使用して調製した、例えば、Francisco et al., Blood 102 (4): 1458-1465 (2003)を参照のこと。総薬剤（結合及び非結合）濃度をLC−MS／MSによって決定した。
【０４４７】
薬剤動態学的特性、すなわち、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートの吸収、分散、代謝、及び排泄の経時変化を試験するために、例えば、血漿、腫瘍、及び組織サンプル中のPBRM−PHF−AF−HPAコンジュゲート（すなわち、結合したAF−HPA）の濃度、及び放出された、非結合AF−HPAとAF（遊離薬剤）の濃度を計測するためのアッセイを開発した。サンプル中の遊離薬剤の濃度を測定するために、酸性化サンプルをアセトニトリルで処理した。遊離薬剤を、上清から抽出し、LC−MS／MSによって分析した。結合AF−HPAの濃度を測定するために、酸性化血漿、腫瘍又は組織ホモジネートを、塩基性加水分解と、その後に続く、酸性化処理とアセトニトリルを用いたタンパク質沈殿がかけた。放出されたAF−HPA及びAFを含むアセトニトリル上清を、LC−MS／MSによって分析した。血漿、腫瘍、及び組織ホモジネート中の遊離薬剤及び結合AF−HPAの検量線は、それぞれ、0.3〜3,000ng／mL及び10〜20,000ng／mLの濃度領域のわたる直線であった。総トラスツズマブ濃度をELISAによって測定した。
【０４４８】
本明細書中に記載したすべてのインビトロ又はインビボの実験において、別段の定めがない限り、使用する用量は、すべて、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのPBRM（例えば、抗体）に基づいた。
【０４４９】
PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのシステイン生物コンジュゲート部位の特異性と分散を特徴づけるために、RP−HPLC、SDS−PAGE又はキャピラリ電気泳動を使用した。結果は、PBRMの重鎖（H）及び軽鎖（L）に対する薬剤−高分子コンジュゲートの位置的分布をもたらし、PBRMへの結合が重鎖の鎖間システインヒンジ部に主に起こったことを示した。同様の結果をLC−MS PBRMペプチドマップで得た。
【０４５０】
一般的な手法
一般的な手法A．リンカー又は薬剤と高分子との結合
通常、例えば、EG2−マレイミドなどのアミン含有リンカー又は例えば、AF−HPA−Ala、HPV−Alaなどのアミン含有リンカー薬剤を用いた高分子（PHF−BA又はPHF−GA）の結合は、例えば、EDC.HClなどの活性化剤の存在下で水性溶媒又は10〜90％の有機／水性溶媒混合物中でおこなわれる。典型的な有機溶媒としては、これだけに限定されるものではないが、例えば、DMSO、DMF、DMA、NMP及びACNなどの水混合性溶媒が挙げられる。カップリングを促進するために、例えば、NHSなどの補助活性化因子を加える。高分子を最初に、アミノ含有化合物と混合し、続いて補助活性化因子（NHS）を添加し、次に、活性化因子（EDC.HCl）を添加する。反応を、0〜10℃、pH4.5〜7.5、周囲温度にて1時間〜24時間おこなう。得られた高分子結合生成物を透析濾過又はSECによって精製する。その生成物を2〜50mg／mLまで濃縮し、そして、pHを4.5〜6.5に調整して、薬剤−高分子リンカーの安定性を確保し、そして、該コンジュゲートを更なる使用まで−20〜−80℃にて冷凍して保存する。
【０４５１】
アミン含有リンカー又は薬剤を用いた高分子の結合は、連続して、順不同で、又は同時に実施できる。
【０４５２】
一般的な手法B．タンパク質（PBRM）の部分的な選択的還元
高分子−薬剤コンジュゲートとの結合前の関連PBRM内の鎖間ジスルフィド基又は不対ジスルフィドの部分的な選択的還元を、例えば、TCEP、DTT又はβ−メルカプトエタノールなどの還元剤を使用することによって達成する。還元が過剰量の還元剤を用いておこなわれるとき、還元剤は結合前にSECによって取り除かれる。PBRMジスルフィド基の反応性スルフヒドリル基への反応率は、PBRMの化学量論、還元剤、pH、温度、及び／又は反応の持続性による。PBRMのジスルフィド基のすべてではなく一部が還元されるとき、還元PBRMは部分的還元PBRMである。
【０４５３】
一般的な手法C．高分子医薬コンジュゲートと部分的に還元したPBRMの結合
高分子−薬剤コンジュゲートへの部分的に還元したPBRMの結合を、1〜10mg／mLのPBRM濃度及び0.5〜10mg／mLの高分子−薬剤コンジュゲート濃度にて中性又は弱塩基性条件下（pH6.5〜8.5）で実施する。高分子−薬剤コンジュゲートは一般的に、所望のタンパク質−高分子−薬剤コンジュゲートの化学量論に対して1〜5.0倍過剰量で使用する。PBRMを高分子−薬剤コンジュゲートのマレイミド基に結合するとき、結合は適宜、例えば、N−アセチルシステイン、システインメチルエステル、N−メチルシステイン、2−メルカプトエタノール、3−メルカプトプロパン酸、2−メルカプト酢酸、メルカプトメタノール（すなわち、HOCH2SH）、ベンジルチオールなどの水溶性マレイミドブロッキング化合物の添加によって停止させる。
【０４５４】
得られたPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは通常、透析濾過によって精製し、あらゆる非結合高分子−薬剤コンジュゲート、非結合薬剤、及び小分子不純物を取り除く。或いは又は更に、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィー、例えばWCXクロマトグラフィーなど；逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー又はその組み合わせなどのクロマトグラフィー分離手法を、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを精製するために使用しもよい。得られた精製PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは通常、pH5.0〜6.5にてバッファー中に処方する。
【０４５５】
実施例1．EG2−マレイミド：（O−［N−（3−マレイミドプロピオニル）アミノエチル］−O’−［3−（N−（2−アミノエチル）アミノ）−3−オキソプロピル］エチレングリコール）の合成
【化１２１】
0006420331.tif 000140
【０４５６】
ACN（15mL）中のマレイミド−EG2−NHSエステル（O−［N−（3−マレイミドプロピオニル）アミノエチル］−O’−［3−（N−スクシンイミジルオキシ）−3−オキソプロピル］エチレングリコール、1.2g、2.82mmol）とBoc−ジアミノエタンハイドロクロライド（560mg、2.82mmol）の氷冷懸濁液に、撹拌しながら、TEA（0.571g、5.64mmol）を滴下して加えた。得られた混合物を室温にし、そして、室温にて一晩撹拌を続けた。追加のBOC−ジアミノエタンハイドロクロライドを加え（110mg）、完了まで反応を進めた。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣をRP−HPLC（水中の0〜100％のACN）で精製して、無色の固形物としてBoc−ジアミノエタン−EG2−マレイミド（1.18g、89％の収率）を得た。ESI MS：計算値 C21H35N4O8 [M+H+] 471.3；実測値 471.2。
【０４５７】
Boc−ジアミノエタン−EG2−マレイミド（1.18g、2.508mmol）を、DCM（20mL）中の30％ TFA溶液中に0℃にて溶解し、得られた溶液を室温にて2時間撹拌した。未精製の反応混合物を、減圧下で濃縮し、次に、RP−HPLC（0.1％ TFA含有水中の0〜10％ ACN）で精製して、無色の油状物質として表題化合物（EG2−マレイミド）（1.04g、86％）を得た。
【０４５８】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6+D2O)：δ 6.95 (s, 2 H), 3.66-3.54 (m, 10 H), 3.34 (t, 2 H, J = 5.6 Hz), 3.27 (t, 2 H, J = 6.7 Hz), 3.18-3.10 (m, 2 H), 2.84 (t, 2 H, J = 6.2 Hz), 2.33 (q, 4 H, J = 6.7 Hz)；ESI MS：計算値 C16H27N4O6 [M+H+] 371.2；実測値 371.2。
【０４５９】
実施例2．10K PHF−BA（30％）−EG2−MI（3％）の合成
【化１２２】
0006420331.tif 000141
【０４６０】
水（10mL）中の10K PHF−BA（30％）（588mg、3.46mmol、US13/493,899、本明細書中では米国特許第8,685,383号、実施例1に記載のものに類似した様式で調製した）の溶液に、水（5mL）中のEG2−マレイミド（102mg、0.211mmol、実施例1に記載のものに類似した様式で調製した）の溶液を加え、続いて、N−ヒドロキシスクシンイミド（NHS、25mg、0.211mmol）を加えた。得られた混合物を5〜10℃に冷やし、そして、0.1NのNaOH溶液を使用して、pHを（5.3〜）5.8に調整した。そして、水（2mL）中のEDC.HCl（94mg、0.486mmol）を40分間かけて反応混合物に加えた。反応混合物を室温にし、そして、室温にて18時間撹拌を続けた。得られた生成物を、3K MWCO膜による透析濾過によって精製し、凍結乾燥して、オフホワイトの固体生成物として表題化合物を得た（0.460g、71％の収率）。
【０４６１】
1H-NMR (400 MHz, D2O)：6.9 ppm (幅広一重線, MI), 5.0-4.7 ppm (m, 1H, O-CH-O-, アセタール−プロトン高分子), 4.3-3.6 ppm (m, O-CH2-高分子骨格及びリンカープロトン), 3.4-3.3 ppm (m, CH2-NH-, β−アラニン及びリンカープロトン), 2.7-2.4 ppm (m, CH2-COOH-, β−アラニン及びリンカープロトン)。1H-NMRによって測定されるEG2−MIリンカー負荷量（すなわち、EG2−MIリンカーを含む高分子ユニットの含有量）は、高分子構造ユニットの3％molであった。
【０４６２】
実施例3．10K PHF−BA（30％）−EG2−MI（3％）−AF−HPA−Ala（8％）の合成
【化１２３】
0006420331.tif 000142
【０４６３】
水（4.2g）中の10K PHF−BA（30％）EG2−MI（3％）（144mg、11.08μmol、実施例2に記載のものに類似した様式で調製した）の均一溶液を5〜10℃に冷却した。溶液のpHを、1NのHClを使用して5.8に調整し、それに続いてNMP（1.4mL）中に溶解したアウリスタチンF−ヒドロキシプロピルアミド−L−アラニン.2TFA（AF−HPA−Ala.2TFA）（85mg、77.52μmol、US13／493,899、本明細書中では米国特許第8,685,383号、実施例50に記載のものに類似した様式で調製した）及びNHS（0.5mLの水中に16mg）を加えた。混合物を5〜10℃にて激しく撹拌し、そして、溶液のpHを0.1NのNaOHを用いて5.8に調整した。得られた混合物に、新たに調製したEDC.HClの水溶液（0.5mLの水中に30mg）を加えた。45分後に、追加のEDC.HCl（0.5mLの水中に30mg）を加え、そして、5.8にpHを維持しながら、得られた混合物を18〜24時間撹拌した。反応混合物のRP−HPLC分析で出発物質アウリスタチン化合物の＞95％の消費を示した。生成物を、3K MWCO膜による透析濾過によって精製し、それに続いてHPLC及び凍結乾燥によって精製して、表題化合物を得た（143mg、78％の収率）。
【０４６４】
1H-NMR (400 MHz, D2O)：7.15 ppm (幅広一重線, AF−HPA 芳香族プロトン), 6.9 ppm (幅広一重線, MI), 5.0-4.8 ppm (m, 1H, O-CH-O-アセタール−プロトン高分子), 4.4-3.6 ppm (m, O-CH2-高分子骨格及び薬剤／リンカープロトン), 3.4-2.8 ppm (m, CH2-NH-, β−アラニン及び薬剤／リンカープロトン), 2.2-1.8 ppm (m, CH2-COOH-, β−アラニン及び薬剤／リンカープロトン)及び1.6-0.9 ppm (m, 薬剤／リンカープロトン)。
【０４６５】
1H−NMRによって測定される結合生成物の薬剤負荷量（すなわち、薬剤を含む高分子ユニットの含有量）は、高分子構造ユニットの8％mol（又は1個の高分子鎖あたり平均で約6個のAF−HPA分子）であった。表題コンジュゲートの分子量は約17kDaであった。
【０４６６】
実施例4．トラスツズマブ−（（EG2−MI（3％））−（10kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（8％））の合成
【化１２４】
0006420331.tif 000143
【０４６７】
TEAAバッファー中のトラスツズマブ（TRASTUZUMAB）（6.19mL、100mg、0.676μmol）の溶液に、TCEP（0.6mL、2.36μmol、0.678mg）の溶液を撹拌しながら加えた。混合物を37℃にて1時間インキュベートし、次に〜0℃に冷やした。そして、部分的に還元したトラスツズマブをTEAAバッファー、pH7.4（26.5mL）中の10K PHF−BA（30％）−EG2−MI（3％）−AF−HPA−Ala（8％）（76mg、実施例3に記載のものに類似した様式で調製した）の激しく撹拌している溶液に0℃にて追加した。撹拌を0℃にて30分続けた。反応を塩酸システインの水溶液（65mg、371μmol、1.9mL）でクエンチした。pH7.0、周囲温度にて1時間撹拌した後に、反応混合物をpH5.0に酸性化した。未精製の生成物を、クロマトグラフィーによって精製し、それに続いて、SEC精製して、表題化合物を得た（61mg、61％の収率）。
【０４６８】
AF−HPA対トラスツズマブの比は約12：1〜約17：1であった。表題コンジュゲートの分子量は180kDa、PDI 1.15であった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約3：1又は約3：1〜約4：1であった。
【０４６９】
PBRM−高分子−薬剤コンジュゲート、トラスツズマブ−（（PEG2−MI（3％））−（10kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（8％））（2.5μg、先に記載したものに類似した様式で調製した）を、非還元及び還元条件下でSDS−PAGE、すなわち、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、Odyssey IRDye（登録商標）Blue Protein Stain Bufferで可視化した。非還元条件下では、コンジュゲートを、SDS−PAGE分析前に70℃にて10分間加熱したか、又は加熱しなかった。
【０４７０】
SGS-PAGEゲルは、コンジュゲートが安定していて、70℃にて10分間などの非還元条件下で解離しなかったことを示した。還元条件下では、コンジュゲートは重鎖と軽鎖に分離した。他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０４７１】
実施例5．10K PHF−BA（30％）−AF−HPA−Ala（9％）の合成
【化１２５】
0006420331.tif 000144
【０４７２】
水（20mL）中の10K PHF−BA（30％）（700mg、US13／493,899、本明細書中では米国特許第8,685,383号、実施例1に記載のものに類似した様式で調製した）の均一溶液に、NMP（6.7g）中に溶かしたアウリスタチンF−ヒドロキシプロピルアミド−L−アラニン.2TFA（AF−HPA−Ala.2TFA）（460mg、417μmol、US13／493,899、本明細書中では米国特許第8,685,383号、実施例50に記載のものに類似した様式で調製した）を加えた。得られた混合物を、5〜10℃に冷やしながら、激しく撹拌した。溶液のpHを5.8に調整し、それに続いて、NHS（1mLの水中に129mg）を添加した。得られた混合物に、新たに調製したEDC.HCl（1mLの水中に223mg）の水溶液を加えた。30分後に、追加のEDC.HCl（1mLの水中に220mg）を加え、5.8にpHを維持しながら、得られた混合物を18時間撹拌した。RP−HPLC分析は、出発物質アウリスタチン化合物の＞95％消費を示した。生成物をHPLC及び凍結乾燥によって精製して、表題化合物を得た（859mg、83％の収率）。
【０４７３】
1H-NMR (400 MHz, D2O)：7.7 - 7.2 ppm (幅広一重線, AF−HPA 芳香族プロトン), 5.0-4.8 ppm (m, 1H, O-CH-O-アセタール−プロトン高分子、部分的に水のシグナルに埋もれる), 4.4-3.6 ppm (m, O-CH2-高分子骨格及び薬剤／ リンカープロトン), 3.5-2.8 ppm (m, CH2-NH-, β−アラニン及び薬剤／リンカープロトン), 2.2-1.6 ppm (m, CH2-COOH-, β−アラニン及び薬剤／リンカープロトン)及び1.6-0.8 ppm (m, 薬剤／リンカープロトン)。
【０４７４】
1H−NMRによって測定される結合生成物の薬剤負荷は、高分子構造ユニットの8.7％mol（又は、1個の高分子鎖あたり平均で約6個のAF−HPA分子）であった。
コンジュゲートA：10K PHF−BA（30％）−AF−HPA−Ala（9.5％）を、10K PHF−BA（30％）（100mg）から先に記載した手法を使用して調製した。
【０４７５】
実施例6．10K PHF−BA（30％）−EG2−MI（2％）−AF−HPA−Ala（9％）の合成
【化１２６】
0006420331.tif 000145
【０４７６】
水（13.7mL）中の10K PHF−BA（30％）−AF−HPA−Ala（9％）（500mg、35μmol、実施例5に記載のものに類似した様式で調製した）の溶液に、EG2−マレイミド（83mg、0.139mmol、実施例1に記載のものに類似した様式で調製した）の溶液、続いて、N−ヒドロキシスクシンイミド（NHS、40mg、0.348mmol）を加えた。得られた混合物を5〜10℃に冷やし、そして、pHを、0.1NのNaOH溶液を使用して（4.6〜）5.8に調整した。そして、水（2mL）中のEDC.HCl（174mg、0.91mmol）を二等分して、40分かけて反応混合物に加えた。反応混合物のRP−HPLC分析は、EG2−マレイミドの＞95％の消費を示した。反応混合物を室温にし、そして、室温にて18時間撹拌を続けた。得られた生成物を、3KのMWCO膜による透析濾過及び凍結乾燥によって精製して、オフホワイトの固体生成物として表題化合物を得た（0.57g、100％の収率）。
【０４７７】
1H-NMR (400 MHz, D2O)：7.4 - 7.2 ppm (幅広一重線, AF−HPA 芳香族プロトン), 6.9 ppm (幅広一重線, MI), 5.0-4.8 ppm (m, 1H, O-CH-O-アセタール−プロトン高分子、部分的に水ピーク下に埋もれる), 4.4-3.6 ppm (m, O-CH2-高分子骨格及び薬剤／リンカープロトン), 3.5-2.8 ppm (m, CH2-NH-, β−アラニン及び薬剤／リンカープロトン), 2.2-1.6 ppm (m, CH2-COOH-, β−アラニン及び薬剤／リンカープロトン)及び1.6-0.8 ppm (m, 薬剤／リンカープロトン)。
1H−NMRによって測定されるEG2−MIリンカー荷重は、高分子構造ユニットの〜2％molであった。表題化合物の分子量は約20kDaであった。1個の高分子鎖あたり平均で6個のAF−HPA分子が存在した。
【０４７８】
実施例7．トラスツズマブ−（（EG2−MI（2％）−（10kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（9％））の合成
【化１２７】
0006420331.tif 000146
【０４７９】
TEAAバッファー中のトラスツズマブ(TRASTUZUMAB)（6.4mL、100mg、0.68μmol）の溶液に、TCEP（0.993mg、3.4μmol）の溶液を撹拌しながら加えた。混合物を室温にて1.5時間インキュベートした。そして、部分的に還元したトラスツズマブをTEAAバッファー、pH7.4（26.5mL）中の10K PHF−BA（30％）−EG2−MI（2％）−AF−HPA−Ala（9％）（86mg、4.7μmol、実施例6に記載のものに類似した様式で調製した）の激しく撹拌した溶液に、0℃にて追加した。室温にて45分間撹拌を続けた。反応を、TEAAバッファー、pH6.8中のシステインの水溶液（65mg、371μmol、1.9mL）でクエンチした。pH7.0、周囲温度にて1時間撹拌した後に、反応混合物をpH5.8に酸性化した。未精製の生成物をSEC精製によって精製して、表題化合物を得た（35mg、35％の収率）。
【０４８０】
AF−HPA対トラスツズマブの比は約16：1〜約21：1であった。表題コンジュゲートの分子量は210kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約3：1又は約3：1〜約4：1であった。
【０４８１】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０４８２】
実施例8．リンツズマブ−（（EG2−MI（2％）−（10kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（9％））の合成
【化１２８】
0006420331.tif 000147
【０４８３】
表題化合物を、10K PHF−BA（30％）−EG2−MI（2％）−AF−HPA−Ala（9％）（実施例3又は実施例6に記載のものに類似した様式で調製する）、リンツズマブ(LINTUZUMAB)、及びTCEP：リンツズマブ 3.5：1を使用したことを除いて、実施例4又は実施例7に記載の手法を使用して調製した。
【０４８４】
AF−HPA対リンツズマブの比は約10：1〜約15：1であった。表題コンジュゲートの分子量は184kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対リンツズマブの比は、約2：1〜約3：1又は約3：1〜約4：1であった。
【０４８５】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０４８６】
実施例9．リツキシマブ−（（EG2−MI（3％）−（10kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（8％））の合成
【化１２９】
0006420331.tif 000148
【０４８７】
表題化合物を、10K PHF−BA（30％）−EG2−MI（3％）−AF−HPA−Ala（8％）（実施例3又は実施例6に記載のものに類似した様式で調製する）、リツキシマブ(LITUXIMAB)、及びTCEP：リツキシマブ 3.5：1を使用したことを除いて、実施例4又は実施例7に記載の手法を使用して調製した。
【０４８８】
AF−HPA対リツキシマブの比は約13：1〜約18：1であった。表題コンジュゲートの分子量は163kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対リツキシマブの比は、約2：1〜約3：1又は約3：1〜約4：1であった。
【０４８９】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０４９０】
実施例10．抗−5T4−（（EG2−MI（3％）−（10kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（8％））の合成
【化１３０】
0006420331.tif 000149
【０４９１】
表題化合物（「抗−5T4 scFvFc高分子医薬コンジュゲート」又は「抗−5T4 scADC」）を、10K PHF−BA（30％）−EG2−MI（3％）−AF−HPA−Ala（8％）（実施例3又は実施例6に記載のものに類似した様式で調製する）、及び抗−5T4(ANTI-5T4) scFvFc抗体及びTCEP：抗−5T4 scFvFc抗体 3：1を使用したことを除いて、実施例7に記載のものに類似した様式で調製した。抗−5T4 scFvFc抗体（抗−5T4一本鎖抗体−Fc融合タンパク質）を、参照により本明細書中に援用される、2013年6月17日に出願した米国特許仮出願第61／835,858号で開示したように、CHO DG44細胞で遺伝子組み換えにより調製した。
【０４９２】
AF−HPA対抗−5T4抗体の比は約12：1〜約18：1であった。表題コンジュゲートの分子量は200kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対抗−5T4抗体の比は、約2：1〜約3：1又は約3：1〜約4：1であった。
【０４９３】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０４９４】
実施例11．10K PHF−GA（29％）−EG2−MI（1％）の合成
【化１３１】
0006420331.tif 000150
【０４９５】
水（35mL）中の10K PHF−GA（29％）（1.7g、10.1mmol、US13/493,899、本明細書中では米国特許第8,685,383号、実施例2に記載のものに類似した様式で調製した）の溶液に、DMA（3mL）中のEG2−マレイミド（204mg、0.42mmol、実施例1に記載のものに類似した様式で調製した）の溶液を加え、続いて、N−ヒドロキシスクシンイミド（NHS、70.3mg、0.611mmol）を加えた。得られた混合物を5〜10℃に冷やした。そして、水（2mL）中のEDC.HCl（269mg、1.402mmol）を二等分して、40分間かけて反応混合物に加えた。反応混合物を室温にし、そして、室温にて18時間撹拌を続けた。得られた生成物を、3K MWCO膜による透析濾過によって精製し、凍結乾燥して、オフホワイトの固体生成物として表題化合物を得た（1.7g、91％の収率）。
【０４９６】
1H-NMR (400 MHz, D2O)：6.9 ppm (幅広一重線, MI), 5.0-4.7 ppm (m, 1H, O-CH-O-, アセタール−プロトン高分子、部分的に水ピーク下に埋もれる), 4.4-3.6 ppm (m, O-CH2-高分子骨格及びリンカープロトン), 3.3-2.6 ppm (m, リンカープロトン), 2.5 ppm (m, CH2-CO-, グルタル酸プロトン), 2.3 ppm (幅広一重線, CH2-COO-, グルタル酸プロトン), 1.9 ppm (幅広一重線, -CH2-CH2- CH2-CO-, グルタル酸プロトン)。
【０４９７】
1H−NMRによって測定されるEG2−MIリンカー荷重は、高分子構造ユニットの1％molであった。
【０４９８】
実施例12．10K PHF−GA（29％）−EG2−MI（1％）−AF−HPA−Ala（6％）の合成
【化１３２】
0006420331.tif 000151
【０４９９】
水（5.4g）中の10K PHF−BA（29％）−EG2−MI（1％）（214mg、15μmol、実施例11に記載のものと類似した様式で調製した）の均一溶液を、NMP（1.85mL）中に溶解したAF−HPA−Ala.2TFA（98mg、90μmol、US13／493,899、本明細書中では米国特許第8,685,383号、実施例50に記載のものに類似した様式で調製する）及びNHS（0.5mLの水中に25mg）に加えた。混合物を5〜10℃にて激しく撹拌した。得られた混合物を、新たに調製したEDC.HCl（0.8mLの水中に40mg）の水溶液に加えた。30分後に、追加EDC.HCl（0.8mLの水中に44mg）を加え、そして、得られた混合物を、5.8にpHを維持しながら、18〜24時間撹拌した。RP−HPLC分析は、出発物質のアウリスタチン化合物の＞95％の消費を示した。生成物を、3KのMWCO膜による透析濾過によって精製し、そして、10mLまで濃縮して、表題化合物を得た（177mg、63％の収率）。
【０５００】
1H-NMR (400 MHz, D2O)：7.4 - 7.2 ppm (幅広一重線, AF−HPA 芳香族プロトン), 6.9 ppm (幅広一重線, MI), 5.0-4.8 ppm (m, 1H, O-CH-O-, アセタール−プロトン高分子), 4.4-3.6 ppm (m, O-CH2-高分子骨格及びリンカープロトン), 3.4-2.9 ppm (m, 薬剤 リンカープロトン), 2.5 ppm (幅広triplet, CO- CH2-, グルタル酸プロトン), 24-2.2 ppm (m, CH2-COO-, グルタル酸プロトン及び薬剤／リンカープロトン), 2.0 - 1.8 ppm (m, -CH2-CH2- CH2-CO-, グルタル酸プロトン), 1.5- 0.8 (m, 薬剤／リンカープロトン)。
【０５０１】
1H−NMRによって測定される結合生成物の薬剤負荷は、高分子構造ユニットの5.9％mol（又は、1個の高分子鎖あたり平均で約4.5個のAF−HPA分子）であった。表題コンジュゲートの分子量は約17kDaであった。
【０５０２】
実施例13．トラスツズマブ−（（EG2−MI（1％））−（10kDa PHF−GA（29％）−（AF−HPA−Ala（6％））の合成
【化１３３】
0006420331.tif 000152
【０５０３】
表題化合物を、10K PHF−GA（29％）−EG2−MI（1％）−AF−HPA−Ala（8％）（78mg、実施例12に記載のものに類似した様式で調製する）、トラスツズマブ(TRASTUZUMAB)（25mg）、及びTCEP：トラスツズマブ 3.5：1を使用したことを除いて、実施例4又は実施例7に記載の手法を使用して調製した。AF−HPA対トラスツズマブの比は約18：1〜約23：1であった。表題コンジュゲートの分子量は200kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約4：1〜約5：1であった。
【０５０４】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０５０５】
実施例14．トラスツズマブ−（（EG2−MI（2％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（9％））の合成
【化１３４】
0006420331.tif 000153
【０５０６】
表題化合物を、10K PHF−BA（28％）−EG2−MI（2％）−AF−HPA−Ala（9％）（11mg、実施例3又は実施例6に記載の手順を使用して調製する）、トラスツズマブ(TRASTUZUMAB)（620mg）、及びTCEP：トラスツズマブ 3.5：1を使用したことを除いて、実施例4又は実施例7に記載の手法を使用して調製した。
【０５０７】
AF−HPA対トラスツズマブの比は約10：1〜約15：1であった。表題コンジュゲートの分子量は183kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約4：1であった。
【０５０８】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０５０９】
実施例15．トラスツズマブ−（（EG2−MI（2％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（9％））の合成
【化１３５】
0006420331.tif 000154
【０５１０】
表題化合物を、10K PHF−BA（28％）−EG2−MI（2％）−AF−HPA−Ala（9％）（243mg、実施例3又は実施例6に記載の手順を使用して調製する）、トラスツズマブ(TRASTUZUMAB)（435mg）、及びTCEP：トラスツズマブ 3：1を使用したことを除いて、実施例4又は実施例7に記載の手法を使用して調製した。
【０５１１】
AF−HPA対トラスツズマブの比は約11：1〜約16：1であった。表題コンジュゲートの分子量は197kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約4：1であった。
【０５１２】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０５１３】
実施例16．リツキシマブ−（（EG2−MI（2％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（9％））の合成
【化１３６】
0006420331.tif 000155
【０５１４】
表題化合物を、10K PHF−BA（28％）−EG2−MI（2％）−AF−HPA−Ala（9％）（170mg、実施例3又は実施例6に記載した手順を使用して調製する）、300mgのリツキシマブ(RITUXIMAB)、及びTCEP：リツキシマブ 3：1を使用したことを除いて、実施例4又は実施例7に記載の手法を使用して調製した。
【０５１５】
AF−HPA対リツキシマブの比は約13：1〜約18：1であった。表題コンジュゲートの分子量は180kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対リツキシマブの比は、約3：1〜約4：1であった。
【０５１６】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０５１７】
実施例17．トラスツズマブ−（（EG2−MI（2％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（9％））の合成
【化１３７】
0006420331.tif 000156
【０５１８】
表題化合物を、10K PHF−BA（28％）−EG2−MI（2％）−AF−HPA−Ala（9％）（8.4mg、実施例3又は実施例6に記載の手順を使用して調製する）、及びTCEP：トラスツズマブ(TRASTUZUMAB) 3.5：1を使用したことを除いて、実施例4又は実施例7に記載の手法を使用して調製した。AF−HPA対トラスツズマブの比は約5：1〜約10：1であった。表題コンジュゲートの分子量は183kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約4：1であった。
【０５１９】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０５２０】
実施例18．トラスツズマブ−（（EG2−MI（2％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（9％））の合成
【化１３８】
0006420331.tif 000157
【０５２１】
表題化合物を、実施例4又は実施例7に記載の手法を使用して調製した。
【０５２２】
コンジュゲートA：AF−HPA対トラスツズマブの比は約19：1〜約24：1であった。表題コンジュゲートの分子量は201kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約4：1であった。
【０５２３】
コンジュゲートB：AF−HPA対トラスツズマブの比は約20：1〜約25：1であった。表題コンジュゲートの分子量は224kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約4：1であった。
【０５２４】
コンジュゲートC：AF−HPA対トラスツズマブの比は約23：1〜約28：1であった。表題コンジュゲートの分子量は259kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約4：1であった。
【０５２５】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０５２６】
実施例19．10K PHF−BA（30％）EG2−MI（2.7％）−（HPV−Ala（14％））の合成
【化１３９】
0006420331.tif 000158
【０５２７】
水（0.612mL）及びNMP（0.14mL）中の10K PHF−BA（30％）EG2−MI（2.7％）（25.00mg、2.80μmol、実施例2に記載のものと類似した様式で調製する）の均一溶液を0℃に冷却した。NMP（0.14mL）中の1−ヒドロキシピロリジン−2,5−ジオン（8.06mg、0.07mmol）を加え、続いて、水（0.250mL）中のHPV−アラニン（15.56mg、0.018mmol、米国特許第8,524,214号、実施例1に記載のものに類似した様式で調製した）を加えた。混合物をすべての材料が溶解するまで激しく撹拌し、次に、新たに調製したEDC.HCl（0.125mLの水中に6.71mg）の水溶液を加えた。45分後に、追加EDC.HCl（0.125mLの水中に6.71mg）を加え、そして、5.8にpHを維持しながら、得られた混合物を18時間撹拌した。反応混合物のRP−HPLC分析は、反応が不完全であることを示した。混合物を0℃に冷やし、そして、EDC.HCl（0.250mL中の12mg）を加えた。溶液のpHを0.1NのNaOHで5.9に調整し、そして、混合物を更に2時間撹拌し、そのときに、反応混合物のRP−HPLC分析は出発物質の完全な消費を示した。生成物をカラムクロマトグラフィー（Sephadex G25 Gel）によって精製し、続いて、HPLC及び凍結乾燥によって精製して、表題化合物を得た（10.18mg、24％の収率）
【０５２８】
コンジュゲートA：10K PHF−BA（30％）EG2−MI（2.7％）−（HPV−Ala（14％））を、先に記載したものと類似した様式で調製した。1H−NMRによって測定される結合生成物の薬剤負荷（すなわち、薬剤を含む高分子ユニットの含有量）は、高分子構造ユニットの14％mol（すなわち、1個の高分子鎖あたり平均で2.4個のHPV−Ala分子）であった。
【０５２９】
コンジュゲートB：10K PHF−BA（30％）EG2−MI（2.7％）−（HPV−Ala（7.7％））を、先に記載した手法を使用して調製した。1H−NMRによって測定される結合生成物の薬剤負荷（すなわち、薬剤を含む高分子ユニットの含有量）は、高分子構造ユニットの28.3％mol（すなわち、1個の高分子鎖あたり平均で4.6個のHPV−Ala分子）であった。
【０５３０】
コンジュゲートC：10K PHF−BA（30％）EG2−MI（3.5％）−（HPV−Ala（4.3％））を、先に記載した手法を使用して調製した。HPLCによって測定される結合生成物の薬剤負荷（すなわち、薬剤を含む高分子ユニットの含有量）は、高分子構造ユニットの4.3％mol（すなわち、1個の高分子鎖あたり平均で2.6個のHPV−Ala分子）であった。
【０５３１】
実施例20．トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.7％）−（10kDa PHF−BA（30％）−（HPV−Ala（14％））の合成
【化１４０】
0006420331.tif 000159
【０５３２】
表題化合物を、10K PHF−BA（30％）EG2−MI（2.7％）−（HPV−Ala（14％）（1.5mg、実施例19に記載のものに類似した様式で調製した）、トラスツズマブ(TRASTUZUMAB)及びTCEP：トラスツズマブ 4：1を使用したことを除いて、実施例4又は実施例7に記載の手法を使用して調製した。
【０５３３】
コンジュゲートA：トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.7％）−（10kDa PHF−BA（30％）−（HPV−Ala（14％））。HPV−Ala対トラスツズマブの比は約13：1〜約18：1であった。表題コンジュゲートの分子量は約168kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約4：1であった。
【０５３４】
コンジュゲートB：トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.7％）−（10kDa PHF−BA（30％）−（HPV−Ala（7.7％））を、10K PHF−BA（30％）EG2−MI（2.7％）−（HPV−Ala（7.7％）（5.7mg、実施例19、コンジュゲートB）、トラスツズマブ及びTCEP：トラスツズマブ 4：1を使用したことを除いて、上記の手法を使用して調製した。HPV−Ala対トラスツズマブの比は約10：1〜約14：1であった。表題コンジュゲートの分子量は約180kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約4：1であった。
【０５３５】
コンジュゲートC：トラスツズマブ−（（EG2−MI（3.5％）−（10kDa PHF−BA（30％）−（HPV−Ala（4.3％））を、10K PHF−BA（30％）EG2−MI（2.7％）−（HPV−Ala（4.3％）（4.2mg、実施例19、コンジュゲートCに記載のものに類似した様式で調製した）、トラスツズマブ及びTCEP：トラスツズマブ 4：1を使用したことを除いて、この実施例に記載のものに類似した様式で調製した。HPV−Ala対トラスツズマブの比は約8.5：1〜約12：1であった。表題コンジュゲートの分子量は約181kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約4：1であった。
【０５３６】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０５３７】
実施例21．10K PHF−BA（28％）EG2−MI（2.7％）−（イスピネシブ−PABA−Val−Cit（3.5％）の合成
【化１４１】
0006420331.tif 000160
【０５３８】
5mLのNMP中の10K PHF−BA（28％）EG2−MI（2.7％）（60.8mg、実施例2に記載のものに類似した様式で調製した）の溶液に、NMP（0.5mL）中のイスピネシブ−PABA−Val−Cit−NH2（TFA塩、10.0mg、米国特許第8,815,226号、実施例84に記載のものに類似した様式で調製した）を加えた。この混合物に、NMP（0.5mL）中のHATU（5.5mg）、それに続いて、DIEA（4.4mg）を加えた。反応混合物を室温にて5〜10分撹拌した。未精製の混合物を限外濾過によって精製して、表題化合物を得た（収量：64％、イスピネシブ基準）。
【０５３９】
UVによって測定される結合生成物の薬剤負荷（すなわち、薬剤を含む高分子ユニットの含有量）は、高分子構造ユニットの3.5％mol（又は、1個の高分子鎖あたり平均で約2.5個のイスピネシブ−PABA−Val−Cit分子）であった。
【０５４０】
実施例22．トラスツズマブ−（EG2−MI（28％）−（10kDa PHF−BA（2.7％）−（イスピネシブ−PABA−Val−Cit−（3.5％））の合成
【化１４２】
0006420331.tif 000161
【０５４１】
表題化合物を、10K PHF−BA（28％）−EG2−MI（2.7％）−（イスピネシブ−PABA−Val−Cit（3.5％）（5.6mg、実施例21に記載のものに類似した様式で調製する）、トラスツズマブ(TRASTUZUMAB)及びTCEP：トラスツズマブ 3.5：1を使用したことを除いて、実施例4又は実施例7に記載の手法を使用して調製した。イスピネシブ対トラスツズマブの比は約7.5：1〜約10：1であった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約4：1であった。
【０５４２】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、上記のセツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０５４３】
実施例23．リツキシマブ−（（EG2−MI（2.7％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（イスピネシブ−PABA−Val−Cit−（3.5％））の合成
【化１４３】
0006420331.tif 000162
【０５４４】
表題化合物を、リツキシマブ(RITUXIMAB)及びTCEP：リツキシマブ 3.5：1を使用したことを除いて、実施例22に記載の手法を使用して調製した。イスピネシブ対リツキシマブの比は約6.5：1〜約10：1であった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約4：1であった。
【０５４５】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、上記のセツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０５４６】
実施例24．THP-2−メチル−イスピネシブの合成
【化１４４】
0006420331.tif 000163
【０５４７】
化合物1：25mLのDMA中の4−（ヒドロキシメチル）−2,6−ジメトキシフェノール（2.77g）の溶液に、イミダゾール（1.13g）を加えた。混合物をアルゴン下で0℃に冷やし、そして次に、TBSCl（2.49g）を加えた。反応混合物を、室温に温め、そして、アルゴン下、遮光して3日間撹拌した。反応混合物を、DCM（300mL）で希釈し、そして、飽和NH4Cl（100mL）、次いで、塩水（100mL）で洗浄した。有機相を、Na2SO4上で乾燥させ、濃縮して、未精製の生成物を得、そしてそれを、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィー（Hex／EtOAc、0％のB−30％のB）によって精製して、無色の油状物質を得た（2.24g、50％の収率）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.17 (s, 1H), 6.54 (s, 2 H), 4.59 (s, 2 H), 3.72 (s, 6 H), 0.89 (s, 9 H), 0.05 (s, 6 H)。
【０５４８】
化合物2：5mLの乾燥THF中の化合物1（0.508g）、TEA（0.603g）及びDMAP（0.021g）の氷冷溶液に、〜3mLのTHF中の4−ニトロフェニルクロロホルマート（0.68g）の溶液を加えた。氷浴を取り外し、そして、室温にて撹拌を続けた。反応をNH4Cl（20mL）でクエンチし、次いで、酢酸エチル（60mL）で抽出した。有機物を、塩水（20mL）で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、次に、濃縮して、未精製の生成物を得、そしてそれをシリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィー（Hex：酢酸エチル、0％のB−20％のB）によって精製して、無色の固形物として化合物2を得た（0.724g、92％の収率）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.32-8.28 (m, 2 H), 7.51-7.48 (m, 2 H), 7.12 (s, 1 H), 6.64 (s, 1 H), 4.75 (d, 2 H, J = 12.9 Hz), 3.93 (d, 3 H, J = 13.5 Hz), 3.88 (s, 3 H), 1.0-0.94 (m, 9 H), 0.15 (s, 3 H), 0.12 (s, 3 H)。
【０５４９】
化合物3：5mLの乾燥THF中の化合物2（0.5g）の溶液にHOBt（0.291g）を加え、そして、得られた混合物を〜5分間撹拌した。この混合物に、2−アミノプロパノール（0.324g）及びTEA（0.546g）を加えた。得られた混合物を0℃にて1時間撹拌し、その時点で、TLCは反応が完了していることを示した。混合物を、DCM（60mL）で希釈し、塩水（20mL）、続いて、飽和NH4Cl（20mL）で洗浄した。有機物を、乾燥させ（Na2SO4）、濃縮して、黄色い油状物質を得た。未精製の生成物をシリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィー（Hex：酢酸エチル、0％のB−80％のB）によって精製して、黄色い固形物として化合物3を得た（0.356g、83％の収率）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.50 (t, 1 H J = 5.8 Hz), 6.64 (s, 2 H), 4.68 (s, 2 H), 4.64 (d, 1 H, J = 4.8 Hz), 3.71 (s, 6 H), 3.70-3.61 (m, 1 H), 3.04-2.96 (m, 1 H), 2.96-2.86 (m, 1 H), 1.05 (d, 3 H, J = 6.1 Hz), 0.10 (s, 6 H)；ESI MS：理論値 C19H33NO6Si (M + H) 400.2, 実測値 400.2。
【０５５０】
化合物4：5mLの乾燥DCM中の化合物3（0.358g）及びDMAP（0.219g）の氷冷溶液に、アルゴン下、〜5mLのDCM中のDCC（0.369g）の溶液を加えた。氷浴を取り外し、そして、混合物を室温にて一晩撹拌した。反応混合物を、濾過し、DCM（〜60mL）で希釈し、そして、飽和NH4Cl（2x20mL）、続いて、塩水（〜20mL）で洗浄した。有機相を、Na2SO4上で乾燥させ、そして、濃縮して、未精製の生成物を得、そしてそれを、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、無色の油状物質として化合物4を得た（0.422g、75％の収率）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.65 (s, 1 H), 7.39 (s, 1 H), 6.64 (s, 2 H), 4.93-4.84 (m, 1 H), 4.68 (s, 2 H), 3.71 (s, 6 H), 3.68-3.62 (m, 1 H), 3.62-3.47 (m, 4 H) 3.16 (t, 2 H, J = 5.9 Hz), 2.88 (s, 4 H), 2.01-1.93 (m, 2 H), 1.91-1.77 (m, 3 H), 1.75-1.66 (m, 1 H), 1.57-1.47 (m, 1 H), 1.39 (s, 9 H), 1.35-1.29 (m, 1 H), 1.28-1.22 (m, 1 H), 1.15-1.10 (m,3 H), 0.92 (s, 9 H)；ESI MS：理論値 C30H50N2O10Si (M + H) 627.3, 実測値 527.2 (M - Boc + H)。
【０５５１】
化合物5：EtOH／水（7.25mL、9：1）中の化合物4（0.400g）及びSnCl2二水和物（0.144g）の溶液を、アルゴン下、室温にて〜3時間撹拌した。反応（TLC）の完了時点で、反応混合物を、60mLのEtOAcで希釈し、次に、飽和NH4Cl（20mL）そして塩水（20mL）で洗浄した。有機相を、Na2SO4上で乾燥させ、そして、濃縮して、未精製の生成物を得、そしてそれを、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィー（Hex：酢酸エチル、0％のB−100％のB）によって精製して、無色の油状物質として化合物5を得た（0.220g、67％の収率）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.61 (s, 2 H), 5.82 (brs, 1 H), 5.16 (brs, 1 H), 4.87 (m, 1 H), 4.64 (s, 2 H), 3.90-3.75 (m, 8 H), 3.75-3.62 (m, 2 H), 3.62-3.51 (m, 1 H), 3.41-3.18 (m, 1 H), 2.31-2.13 (m, 2 H), 1.93-1.81 (m, 2 H), 1.44 (s, 9 H), 1.29 (d, 3 H, J = 6.6 Hz)；ESI MS：理論値 C24H36N2O10 (M + H) 513.2, 実測値 413.2 (M - Boc + H)。
【０５５２】
化合物6：2mLの乾燥THF中の化合物5（0.220g）の溶液に、TEA（0.152g）を加えた。混合物を0℃に冷やし、そして、p−ニトロフェニルクロロホルマート（0.087g）を固形物として加えた。混合物を、室温に温め、そして、〜4時間撹拌した。追加のクロロホルマート（〜1mLのTHF中に〜0.05g）を加え、そして、混合物を一晩撹拌した。反応混合物を、30mLのEtOAcで希釈し、次に、飽和NH4Cl（10mL）と、それに続いて、塩水（10mL）で洗浄した。有機相を、Na2SO4上で乾燥させ、そして、濃縮して、油状物質として未精製の生成物を得た。その未精製の生成物をシリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：EtOAc 0％のB−90％のB）によって精製して、無色の固形物として化合物6を得た（0.257g、88％の収率）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.28 (d, 2 H, J = 9.3 Hz), 7.39 (d, 2 H, J = 9.8 Hz), 6.67 (s, 2 H), 5.90 (brs, 1 H), 5.23 (s, 2 H), 5.21-5.13 (m, 1 H), 4.87 (brs, 1 H), 3.89-3.76 (m, 8 H), 3.75-3.64 (m, 2 H), 3.63-3.53 (m, 1 H), 2.30-2.19 (m, 1 H)1.95-1.83 (m, 2 H), 1.44 (s, 9 H), 1.29 (d, 3 H, J = 6.7 Hz)；ESI MS：理論値 C31H39N3O14 (M + H) 678.2, 実測値 578.2 (M - Boc + H)。
【０５５３】
化合物7：0.5mLの乾燥DMA中の化合物6（53.5mg）の溶液に、イスピネシブ（37.1mg）、DIEA（9.27mg）、及びHOAt（2.93mg）を連続して加えた。混合物を、窒素下、室温にて一晩撹拌した。未精製の反応混合物を、調製用RP−HPLC（Hex：酢酸エチル 25分かけて50％のB−90％のB、両移動相中に0.1％のTFA）によって精製して、無色の固形物として化合物7を得た（64mg、84％の収率）。ESI MS：理論値 C55H67ClN6O13 (M + H)  1055.5, 実測値 1055.4。
【０５５４】
化合物8：2mLの乾燥DCM中の化合物7（64mg）の氷冷溶液に、窒素下、1 mLのTFAを加えた。氷浴を取り外し、そして、混合物を室温にて1時間撹拌し、その時点で、LC／MSは反応が完全であることを示した。溶媒をロータリーエバポレーターによって除去し、そして、残渣を凍結乾燥して無色の固形物として化合物8（64mg、99％）を得た。ESI MS：理論値 C50H59ClN6O11 (M + H) 955.4, 実測値 955.3。
【０５５５】
実施例25．10K PHF−BA（28％）EG2−MI（2.7％）−（THP-2−メチル−イスピネシブ）（2.4％）の合成
【化１４５】
0006420331.tif 000164
【０５５６】
表題化合物を、10K PHF−BA（28％）EG2−MI（2.7％）（58.9mg、実施例2に記載のものに類似した様式で調製した）及びTHP-2−メチル−イスピネシブ（10.0mg、実施例24に記載のものに類似した様式で調製した；46％の収率（イスピネシブ基準））を使用して、実施例21に記載のものと類似した様式で調製した。
【０５５７】
UVによって測定される結合生成物の薬剤負荷（すなわち、薬剤を含む高分子ユニットの含有量）は、高分子構造ユニットの2.4％mol（又は、1個の高分子鎖あたり平均で約1.7個のTHP-2−メチル−イスピネシブ分子）であった。
【０５５８】
実施例26．トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.7％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（THP-2−メチル−イスピネシブ）（2.4％））の合成
【化１４６】
0006420331.tif 000165
【０５５９】
表題化合物を、10K PHF−BA（28％）−EG2−MI（2.7％）−（THP-2−メチル−イスピネシブ）（2.4％mg、実施例25に記載のものに類似した様式で調製する）、トラスツズマブ(TRASTUZUMAB)及びTCEP：トラスツズマブ 3.5：1を使用したことを除いて、実施例4又は実施例7に記載の手法を使用して調製した。イスピネシブ対トラスツズマブの比は約5：1〜約8：1であった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約3：1〜約4：1であった。
【０５６０】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、上記のセツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０５６１】
実施例27．リツキシマブ−（（EG2−MI（2.7％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（THP-2−メチル−イスピネシブ）（2.4％））の合成
【化１４７】
0006420331.tif 000166
【０５６２】
表題化合物を、リツキシマブ(RITUXIMAB)及びTCEP：リツキシマブ 3.5：1を使用したことを除いて、実施例26に記載の手法を使用して調製した。平均したイスピネシブ対リツキシマブの比は約4.5：1〜約7：1であった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約4：1であった。
【０５６３】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、上記のセツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０５６４】
実施例28．バリン−アシルオキシイソプロピルオキシ−MMAEの合成
【化１４８】
0006420331.tif 000167
【０５６５】
化合物1：（S）−2−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−3−メチルブタン酸（4.76g、18.93mmol）、1−クロロ-2−メチルプロピル4−（メチルチオ）フェニルカルボナート（2.6g、9.46mmol）、及びモノシルバー（I）モノシルバー（III）モノオキシド（2.193g、9.46mmol）を90℃にて1時間加熱した。反応混合物を室温に冷やし、そして、残渣をエチルエーテルと一緒に粉砕し、そして、固形物はエーテルによって洗浄した。有機物を、水（4X）、含水NaHCO3で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、そして、薄黄色の油状物質に濃縮した。DCM中の未精製の油状物質を、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：EtOAc 0％のB−20％のB）によって精製し、それに続いて、0.1％のTFAで緩衝化した20−95％のアセトニトリルによるアセトニトリル／水のグラジエントを使用したC-18逆相HPLCによって精製して、無色の油状物質を得た（2.78g、60％の収率）。化合物を1H、13C NMR及び質量分析によって特徴づけした、M／z＝490.3。
【０５６６】
化合物2：DCM（20ml）中の化合物1（2.5g、5.11mmol）の氷冷溶液に、酢酸中の過酢酸の溶液（12.14g、51.1mmol）を滴下して加え、そして、添加が完了してから2時間撹拌した。反応をLC／MSによって観察した。2時間後に、反応混合物に、25mLの水を加え、そして、冷やして30分間撹拌し、有機物を100mLのDCMで希釈し、氷冷水（5x）、含水NaHCO3で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、そして、濃縮した。未精製の生成物をシリカゲル（ヘキサン：EtOAc 0％のB−50％のB）によるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【０５６７】
化合物3：MMAE（300mg、0.418mmol）、化合物2（436mg、0.836mmol）、3H−［1,2,3］トリアゾロ［4,5-b］ピリジン−3−オール水和物（129mg、0.836mmol）及びTHF（25ml）を合わせ、そして、氷浴中で撹拌した。得られた混合物に、トリエチルアミン（0.291ml、2.089mmol）を加え、そして、15分間冷やしながら撹拌し、次いで、LC／MSによって反応の完了が示されるまで、40℃にて撹拌した。4時間後に、反応混合物を、酢酸エチルで希釈し、含水NaHCO3、5％のクエン酸水溶液で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、濃縮し、そして、逆相クロマトグラフィーで精製して、白い非結晶性固体としてTFA塩としての化合物3を得た。LC／MS、M／z＝1067.6。
【０５６８】
化合物4：THF（10ml）及びEtOH（10.00ml）中の化合物3（150mg、0.141mmol）に、アルゴンをバブリングした。この混合物に、10％のパラジウム炭素（29.9mg、0.028mmol）を加え、それに続いて、水素（0.283mg、0.141mmol）のバルーンを取り付け、そして、反応をLC／MSで観察した。反応が完了した時点で、混合物を、移動相として0.1％のTFAで緩衝化した水中のアセトニトリルのグラジエントを使用した逆相クロマトグラフィーによって精製して、白い非結晶性固形物としてTFA塩としての表題化合物を得た（56％の収率）。M／z＝933.6。
【０５６９】
実施例29．10K PHF−BA（28％）EG2−MI（2.7％）−（バリン−アシルオキシイソプロピルオキシ−MMAE）（3％）の合成
【化１４９】
0006420331.tif 000168
【０５７０】
1mLのNMP中の10K PHF−BA（28％）EG2−MI（2.7％）（20mg、実施例2に記載のものに類似した様式で調製した）の溶液に、バリン−アシルオキシイソプロピルオキシ−MMAE（9.98mg、実施例28に記載のものに類似した様式で調製した）を加えた。この混合物に、HOAt（5.41mg）、EDC.HCl（7.62mg）、及びDIEA（3.1mg）を加えた。反応混合物を、室温にて一晩撹拌し、次いで、撹拌したNaCl（1％、〜50mL）の水溶液にゆっくり加えた。未精製の混合物を透析濾過によって精製して、表題化合物を得た（MMAE基準で21％の収率）。
【０５７１】
LC／MSによって測定される結合生成物の薬剤負荷（すなわち、薬剤を含む高分子ユニットの含有量）は、高分子構造ユニットの3.1％mol（又は、1個の高分子鎖あたり平均で約2.2個のMMAE−valイソプロピルアシルオキシイソプロピルオキシ分子）であった。表題コンジュゲートの分子量は約8.3kDaであった。
【０５７２】
実施例30．トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.7％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（バリン−アシルオキシイソプロピルオキシ−MMAE）（3％））の合成
【化１５０】
0006420331.tif 000169
【０５７３】
コンジュゲートA：トラスツズマブ(TRASTUZUMAB)−（（EG2−MI（2.7％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（バリン−アシルオキシイソプロピルオキシ−MMAE）（3％））を、10K PHF−BA（28％）EG2−MI（2.7％）−（バリン−アシルオキシイソプロピルオキシ−MMAE（3％）（5.6mg、実施例29に記載のものに類似した様式で調製した）、及びTCEP、TCEP：トラスツズマブ 3.5：1を使用したことを除いて、実施例4又は実施例7に記載の手法を使用して調製した。平均したMMAE：トラスツズマブの比は約11：1〜約15：1であった。表題コンジュゲートの分子量は約171kDaであった。
【０５７４】
コンジュゲートB：トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.7％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（バリン−アシルオキシイソプロピルオキシ−MMAE）（9％））を、10K PHF−BA（28％）EG2−MI（2.7％）−（バリン−アシルオキシイソプロピルオキシ−MMAE（9％）（31.7mg、実施例30に記載のものに類似した様式で調製した）、トラスツズマブ（57mg）、TCEP：トラスツズマブ 3.5：1を使用したことを除いて、実施例4又は実施例7に記載の手法を使用して調製した。平均したMMAE：トラスツズマブの比は約12：1〜約16.5：1であった。表題コンジュゲートの分子量は約224kDaであった。
【０５７５】
コンジュゲートC：リツキシマブ−（（EG2−MI（2.7％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（バリン−アシルオキシイソプロピルオキシ−MMAE）（9％））を、コンジュゲートAに関して先に記載した手法において還元リツキシマブを置換することによって調製した。MMAE：リツキシマブの比は約9.5：1〜約13：1であった。表題コンジュゲートの分子量は約202kDaであった。
【０５７６】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、上記のセツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０５７７】
実施例31．t−ブチルグリシンAF−HPAトリフルオロ酢酸の合成
【化１５１】
0006420331.tif 000170
【０５７８】
DCM（5ml）中の（R）−2−（tert−ブトキシカルボニルアミノ）−3,3−ジメチルブタン酸（67.6mg、0.292mmol）の氷冷溶液に、DCC（0.046ml、0.292mmol）を加え、そして、反応混合物を15〜20分間冷やしながら撹拌した。別々に、AF−HPA（134mg、0.146mmol、米国特許第8,685,383号、実施例18に記載のものに類似した様式で調製した）とDCM（5ml）中のDMAP（53.6mg、0.438mmol）を冷やし、2つの反応混合物を合わせ、次いで、室温にて20〜30分間冷やしながら撹拌した。反応混合物をLC／MSによって観察した。4時間後に、LC／MSは反応が完了していないことを示した。活性化したアミノ酸活性化DCCエステル（DCM中にそれぞれ1eq）の第二のアリコートを加え、そして、反応混合物を、室温にて一晩撹拌し、それに続いて、0.1％のTFAで緩衝化した移動相を用いた25−90％のアセトニトリル／水によるグラジエントを使用してHPLC精製した。AF−HPA−Boc−t−ブチルグリシンを、白い非結晶性固形物としてTFA塩として得た（85％の収率）。M／z＝1016.6。
【０５７９】
DCM（5ml）中のAF−HPA−Boc−t−ブチルグリシン（140mg、0.124mmol）の氷冷溶液に、TFA（0.477ml、6.19mmol）を加え、そして、反応混合物を1時間冷やしながら撹拌し、次いで、LC／MSによって示される完了まで室温にて撹拌した。混合物を濃縮し、そして、得られた残渣を、移動相として0.1％のTFAで緩衝化した10−90％のアセトニトリルによるアセトニトリル／水のグラジエントを使用したHPLC精製によって精製した。表題化合物を白い非結晶性固形物のTFA塩として得た。M／z＝917.6。
【０５８０】
実施例32．10K PHF−BA（28％）EG2−MI（2.7％）−（t−ブチルグリシンAF−HPA）（7.5％）の合成
【化１５２】
0006420331.tif 000171
【０５８１】
水（5.5ml）とNMP（1.375ml）中の10K PHF−BA（28％）−PEG2−MI（2.7％）（137mg、10.84μmol、実施例2に記載のものに類似した様式で調製した）の氷冷溶液に、AF−HPA−t−ブチルグリシン（67mg、0.065mmol、実施例31に記載のものに類似した様式で調製した）を加え、そして、得られた混合物を、15分間冷やしながら撹拌し、それに続いて、1−ヒドロキシピロリジン−2,5−ジオン（15.59mg、0.135mmol）を加えた。反応混合物に、EDAC（51.9mg、0.271mmol）を加えた。30分後に、同じ量の試薬から成る第二の追加分を加えた。4時間後に、0.1NのNaHCO3を用いてpHを5.6に調整し、そして、EDAC（50mg）の追加アリコートを加え、そして、反応混合物を一晩撹拌した。生成物をゲル濾過、及び逆相HPLCによって精製した。
1H−NMRによって測定される結合する生成物の薬剤負荷（すなわち、薬剤を含む高分子ユニットの含有量）は、高分子構造ユニットの7.5％mol（又は、1個の高分子鎖あたり平均で約5.7個のt−ブチルグリシンAF−HPA分子）であった。
【０５８２】
実施例33．トラスツズマブ（（EG2−MI（2.7％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（t−ブチルグリシンAF−HPA）（7.5％））の合成
【化１５３】
0006420331.tif 000172
【０５８３】
表題化合物を、10K PHF−BA（28％）−EG2−MI（2.7％）−（t−ブチルグリシンAF−HPA）（7.5％）（45.7mg、実施例32に記載のものに類似した様式で調製する）、トラスツズマブ(TRASTUZUMAB)及びTCEP：トラスツズマブ 3.5：1を使用したことを除いて、実施例4又は実施例7に記載の手法を使用して調製した。AF−HPA対トラスツズマブの比は約4：1〜約6：1であった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約4：1であった。表題コンジュゲートの分子量は約215kDaであった。
【０５８４】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、上記のセツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０５８５】
実施例34．リツキシマブ−（（EG2−MI（2.7％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（t−ブチルグリシン−AF−HPA）（7.5％））の合成
【化１５４】
0006420331.tif 000173
【０５８６】
表題化合物を、リツキシマブ(RITUXIMAB)及びTCEP：リツキシマブ 3.5：1を使用したことを除いて、実施例33に記載の手法を使用して調製した。平均したAF−HPA対リツキシマブの比は約2.5：1〜約3.5：1であった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約4：1であった。表題コンジュゲートの分子量は約202kDaであった。
【０５８７】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、上記のセツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０５８８】
実施例35．val-AF−HPAトリフルオロ酢酸の合成
【化１５５】
0006420331.tif 000174
【０５８９】
AF−HPA−Boc−バリンを、（（R）−2−（tert−ブトキシカルボニルアミノ）−3−メチルブタン酸（63.5mg、0.292mmol）を使用したこと以外、実施例31に記載のものに類似した様式で調製した。AF−HPA−Boc−バリンを、白い非結晶性固形物のTFA塩として得た（85％の収率）。M／z＝1002.6。
【０５９０】
表題化合物を、AF−HPA−Boc−バリン（128mg、0.115mmol）を使用したこと以外、実施例31に記載のものに類似した様式で調製して、106mg、91％の収率を得た。M／z＝903.3。
【０５９１】
実施例36．トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.7％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（val-AF−HPA）（7.2％））の合成
【化１５６】
0006420331.tif 000175
【０５９２】
表題化合物を、10K PHF−BA（28％）−EG2−MI（2.7％）−（val AF−HPA）（7.2％）（52.3mg、実施例32に記載の手順を使用して調製する）、トラスツズマブ(TRASTUZUMAB)及びTCEP：トラスツズマブ 3.5：1を使用したことを除いて、実施例4又は実施例7に記載の手法を使用して調製した。AF−HPA対トラスツズマブの比は約14.5：1〜約20：1であった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約3：1〜約4：1であった。表題コンジュゲートの分子量は約235kDaであった。
【０５９３】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、上記のセツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０５９４】
実施例37．10K PHF−BA（28％）EG2−MI（2.7％）−（Val−Cit−PABA−Arry 520）（2.9％）の合成
【化１５７】
0006420331.tif 000176
【０５９５】
23mLのNMP中の10K PHF−BA（28％）EG2−MI（2.7％）（252mg、実施例2に記載のものに類似した様式で調製する）の溶液に、NMP（1mL）中のArry 520−PABA−Val−Cit−NH2（37.6mg、米国特許第8,815,226号、実施例84に記載の手法を使用して調製した）を加えた。この混合物に、NMP（1mL）中のHATU（22.8mg）、それに続いて、DIEA（20.7mg）を加えた。反応混合物を室温にて30分間撹拌した。未精製の混合物を透析濾過によって精製し、表題化合物を得た（Arry 520基準で47％の収率）。
【０５９６】
UVによって測定される結合生成物の薬剤負荷（すなわち、薬剤を含む高分子ユニットの含有量）は、高分子構造ユニットの2.9％mol（又は、1個の高分子鎖あたり平均で約2.1のArry 520−PABA−Val−Cit分子）であった。表題コンジュゲートの分子量は約9.0kDaであった。
【０５９７】
実施例38．トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.7％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（Val−Cit−PABA−Arry 520（2.9％））の合成
【化１５８】
0006420331.tif 000177
【０５９８】
表題化合物を、10K PHF−BA（28％）−EG2−MI（2.7％）−（Val−Cit−PABA−Arry 520（2.9％）（55.6mg、実施例38に記載のものに類似した様式で調製する）、トラスツズマブ(TRASTUZUMAB)及びTCEP：トラスツズマブ 2.5：1を使用したことを除いて、実施例4又は実施例7に記載の手法を使用して調製した。Arry 520対トラスツズマブの比は約4：1〜約6：1であった。表題コンジュゲートの分子量は約245kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約4：1であった。
【０５９９】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、上記のセツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０６００】
実施例39．リツキシマブ−（（EG2−MI（2.7％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（Val−Cit−PABA−Arry 520（2.9％））の合成
【化１５９】
0006420331.tif 000178
【０６０１】
表題化合物を、リツキシマブ(RITUXIMAB)及びTCEP：リツキシマブ 2.5：1を使用したことを除いて、実施例38に記載の手法を使用して調製した。平均したArry 520対リツキシマブの比は約4：1〜約6：1であった。表題コンジュゲートの分子量は約231kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約4：1であった。
【０６０２】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、上記のセツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０６０３】
実施例40．sc−FvFc−トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.8％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（8％））の合成
【化１６０】
0006420331.tif 000179
【０６０４】
表題化合物（「scFvFc−トラスツズマブ高分子医薬コンジュゲート」又は「トラスツズマブscADC」）を、10K PHF−BA（28％）−EG2−MI（2.8％）−AF−HPA−Ala（8％）（2.2mg、実施例3又は実施例6に記載のものに類似した様式で調製した）及びscFvFcトラスツズマブ(TRASTUZUMAB)抗体、そして、TCEP：scFvFcトラスツズマブ抗体 3：1を使用したこと以外、実施例4又は実施例7に記載のものに類似した様式で調製した。scFvFcトラスツズマブ抗体（トラスツズマブ一本鎖抗体Fc融合タンパク質）の配列は、定常領域内に3つの修飾を有するOlafsenら（Cancer Res. 65(13):5907-16, 2005）に公開されたものである：ヒンジに、軽鎖定常領域と通常結合している不対システインを排除するように1つの突然変異（C−＞S）がある（Yang and Rader, Cloning, Expression, and Purification of Monoclonal Antibody in scFv-Fc Format. Antibody Methods and Protocols. Ed. Proetzel and Ebersback, 2012）。その他の2つの修飾もIgG1配列内に存在する。Olafsenら2005は、造影用途を改善するように抗体フラグメントの半減期を短くするためのトラスツズマブ−scFv−Fc（H310A、H435Q）二重変異体を作り出した。修飾を元の標準的なIgG1配列に戻した。
【０６０５】
AF−HPA対scFvFcトラスツズマブ抗体の比は約14：1〜約19：1であった。表題コンジュゲートの分子量は約182kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対scFvFcトラスツズマブ抗体の比は約2：1〜約4：1であった。
【０６０６】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０６０７】
実施例41．トポテカン−アラニン
【化１６１】
0006420331.tif 000180
【０６０８】
トポテカン（0.500g、1.19mmol）、BOC−ala−OH（0.449g、2.37mmol）、及びN,N−ジメチルピリジン-4−アミン（0.145g、1.19mmol）を無水CH2Cl2（5.93mL）中に溶解した。無水のCH2Cl2（1mL）中のN,N’−メタンジイリデンジシクロヘキサンアミン（DCC）（0.580g、2.81mmol）を加え、そして、混合物を室温にて18時間撹拌した。追加DCC（300mg、1.45mmol）を加え、混合物を48時間撹拌した。固形物を濾過によって取り除き、そして、溶液を、0.1NのHCl（2x5mL）、水（5mL）、及び塩水（5mL）で洗浄し、次に、MgSO4上で乾燥させ、0.1％のTFA／CH3CN：0.1％のTFA／水（combiflash、C18、100Gカラム；5分間0％のB、20分間かけて100％のBに飛びかかる）で溶出するRP−HPLCをその後に続けて、固形物としてトポテカン−BOC−アラニンを得た（186.6mg、0.315mmol、26.5％の収率）。
【０６０９】
トポテカン−BOCアラニン（186.6mg、0.315mmol）を無水CH2Cl2（1.5mL）中に溶解した。2,2,2−トリフルオロ酢酸（1.205ml、15.74mmol）を加え、そして、混合物を室温にて1時間撹拌し、RP−HPLC（C18、0.1％のTFA：AcN／0.1％のTFA；水で溶出するHPLC）をその後に続けて、オレンジ色／黄色の固形物として表題化合物を得た（93.0mg、0.189mmol、60.0％の収率）。
【０６１０】
実施例42．トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.4％）−（10kDa PHF−BA（22.3％）−（トポテカン アラニン）（6.5％））の合成
【化１６２】
0006420331.tif 000181
【０６１１】
コンジュゲートA：トラスツズマブ(TRASTUZUMAB)−（（EG2−MI（2.4％）−（10kDa PHF−BA（22.3％）−（トポテカン アラニン）（6.5％））を、10K PHF−BA（22.3％）EG2−MI（2.4％）−（トポテカン アラニン（6.5％）（19.3mg、1個の高分子鎖あたり平均で約4.2個のトポテカン分子を有し、実施例3又は実施例6に記載のものに類似した様式で調製した）、トラスツズマブ及びTCEP：トラスツズマブ 3：1を使用したことを除いて、実施例4又は実施例7に記載の手法を使用して調製した。表題コンジュゲートの分子量は約256kDaであった。平均したトポテカン：トラスツズマブの比は約19：1〜約26：1であった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート：トラスツズマブの比は約2：1〜約5：1であった。
【０６１２】
コンジュゲートB：リツキシマブ−（（EG2−MI（2.4％）−（10kDa PHF−BA（22.3％）−（トポテカン アラニン）（13％））を、先に記載した手法において還元リツキシマブを置換することによって調製した。表題コンジュゲートの分子量は約212kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート：リツキシマブの比は約16：1〜約22：1であった。
【０６１３】
トラスツズマブ−（（EG2−MI）−（10kDa PHF−BA）−（トポテカン バリン）を、実施例41に記載の手法を使用して調製した10K PHF−BA EG2−MI−（トポテカン バリン）を使用したことを除いて、先に記載した手法を使用して調製した。
【０６１４】
他のPBRM−薬剤コンジュゲートを、例えば、上記のセツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０６１５】
実施例43．トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.8％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（7.3％））の合成
【化１６３】
0006420331.tif 000182
【０６１６】
表題化合物を、10K PHF−BA（28％）EG2−MI（2.8％）−（HPV−Ala（7.2％）（8.36mg、実施例3又は実施例6に記載のものに類似した様式で調製した）、トラスツズマブ(TRASTUZUMAB)及びTCEP：トラスツズマブ 2.5：1を使用したことを除いて、実施例4又は実施例7に記載の手法を使用して調製した。
【０６１７】
コンジュゲートA：トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.8％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（7.3％））。AF−HPA対トラスツズマブの比は約6：1〜約9：1であった。表題コンジュゲートの分子量は約183kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約4：1であった。
【０６１８】
コンジュゲートB：トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.5％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（8.4％））を、10K PHF−BA（28％）EG2−MI（2.5％）−（HPV−Ala（8.4％）（実施例3又は実施例6に記載のものに類似した様式で調製した）、トラスツズマブ及びTCEP：トラスツズマブ 3.5：1を使用したことを除いて、先のこの実施例に記載のものに類似した様式で調製した。AF−HPA対トラスツズマブの比は約12：1〜約17：1であった。表題コンジュゲートの分子量は約218kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約4：1であった。
【０６１９】
コンジュゲートC：トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.5％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（8.4％））を、10K PHF−BA（28％）EG2−MI（2.8％）−（HPV−Ala（8.4％）（実施例3又は実施例6に記載のものに類似した様式で調製した）、トラスツズマブ及びTCEP：トラスツズマブ 2.75：1を使用したことを除いて、この実施例に記載のものに類似した様式で調製した。AF−HPA対トラスツズマブの比は約12：1〜約16：1であった。表題コンジュゲートの分子量は約247kDaであった。平均したPHF−薬剤コンジュゲート対トラスツズマブの比は、約2：1〜約4：1であった。
【０６２０】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０６２１】
実施例44．トラスツズマブ−（（EG2−MI）−（10kDa PHF−BA）−（SN38アラニン）の合成
【化１６４】
0006420331.tif 000183
【０６２２】
表題化合物を、実施例42及び41に記載の手法を使用して調製される10K PHF−BA EG2−MI−（SN38アラニン）を除いて、実施例42に記載の手法を使用して調製する。
【０６２３】
トラスツズマブ−（（EG2−MI）−（10kDa PHF−BA）−（SN-38バリン）を、実施例41及び42に記載の手法を使用して調製される10K PHF−BA EG2−MI−（SN-38バリン）を除いて、先に記載した手法を使用して調製する。
【０６２４】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０６２５】
実施例45．トラスツズマブ−（（EG2−MI）（10kDa PHF−BA）−（カンプトテシンアラニン）の合成
【化１６５】
0006420331.tif 000184
【０６２６】
表題化合物を、実施例42及び41に記載の手法を使用して調製される10K PHF−BA EG2−MI−（カンプトテシン アラニン）を除いて、実施例42に記載の手法を使用して調製できる。
【０６２７】
トラスツズマブ−（（EG2−MI）−（10kDa PHF−BA）−（カンプトテシン バリン）を、実施例41及び42に記載の手法を使用して調製される10K PHF−BA EG2−MI−（カンプトテシン バリン）を除いて、先に記載した手法を使用して調製する。
【０６２８】
他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、例えば、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リンツズマブ、抗−5T4又は抗−メソテリン抗体の部分的還元形態などの他のPBRM誘導体が関与する、先に記載した手法に類似した方法で合成する。同様に、異なった薬剤対PBRMの比を有するPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、PBRMスルフヒドリル基の数や薬剤−高分子コンジュゲートの薬剤負荷を変えることによって得られる。
【０６２９】
実施例46．PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートに関する細胞生存率アッセイ
PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを、インビトロの腫瘍細胞株におけるその抗細胞増殖特性について、Cell Titer-Glo（Promega Corp）を使用して評価した。細胞を、黒色の壁面で囲まれた96ウェルプレート内で平板培養し、5%のCO2の湿気のある環境内で37℃にて一晩定着させた。SKBR3、BT474、NCI-N87細胞（HER2発現細胞）、MCF7細胞（HER2低発現レベル細胞）及びJIMT1細胞（HER2中程度発現レベル細胞）を、1ウェルあたり5,000細胞の密度で平板培養した。次の日に、培地を50μLの新鮮な培地に交換し、そして、50μLの2x PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートの原液、薬剤−高分子コンジュゲート又は薬剤を、適当なウェルに加え、混合し、そして、72時間インキュベートした。Cell Titer-Glo試薬を、室温にてウェルに加え、そして、発光シグナルをSpectraMax M5プレートリーダー（Molecular Devices）を使用して10分後に評価した。用量反応曲線を、SoftMax Proソフトウェアを使用して作成した。IC50値を4つのパラメーター曲線の当てはめから決定した。
【０６３０】
HL-60を細胞に発現するCD33を、1ウェルあたり5,000細胞の密度で継代し、その日のうちにPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートで処理した。72時間のインキュベーション後に、細胞を先に記載した同じ手法を使用して分析した。
【０６３１】
OVCAR-3、TF−1α及びHCT-15発現細胞を、先に記載した同じ手法を使用して平板培養し、そして、分析した。
【０６３２】
5T4発現細胞株A431（A431、受入番号ATCCRCRL-1555でアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）、Manassas Virginia USから入手可能な類表皮癌細胞株）；PC3（ヒト前立腺細胞株、ATCCR CRL-1435）、MDAMB231-5T4 OE、及び標的陰性対照細胞株LLC1発現細胞（5T4発現陰性の肺細胞の癌細胞）を先に記載した同じ手法を使用して平板培養し、そして、分析した。「MDAMB231-5T4 OE」は、（2013年6月17日に出願された、米国特許仮出願第61／835,858号（参照により本明細書中に援用する）で開示されている安定的なトランスフェクションによって作製される）5T4を過剰発現する遺伝子組み換えMDA Mb231細胞を意味する。
【０６３３】
表I〜IIIは、HER2発現細胞（表I）、CD33発現細胞（表II）、又は5T4発現細胞（表III）のいずれかにおけるPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートの抗細胞増殖特性に関する例示的な結果である。
【０６３４】
表IVは、OVCAR-3及びTF−1α細胞株における薬剤AF−HPAの抗細胞増殖特性に関する例示的な結果である。
【０６３５】
表Iは、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのトラスツズマブ−（（EG2−MI（3％））−（10kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（8％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約12：1〜約17：1）、実施例4；トラスツズマブ−（（EG2−MI（2％）−（10kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（9％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約16：1〜約21：1）、実施例7；トラスツズマブ−（（EG2−MI（1％））−（10kDa PHF−GA（29％）−（AF−HPA−Ala（6％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約18：1〜約23：1）、実施例13；トラスツズマブ−（（EG2−MI（2％））−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（9％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約10：1〜約15：1）、実施例14；トラスツズマブ−（（EG2−MI（2％））−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（9％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約11：1〜約16：1）、実施例15；リツキシマブ−（（EG2−MI（2％））−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（9％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約13：1〜約18：1）、実施例16；トラスツズマブ−（（EG2−MI（2％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（9％）、（AF−HPA：トラスツズマブ 約5：1〜約10：1）、実施例17；トラスツズマブ−（（EG2−MI（2％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（9％）、（AF−HPA：トラスツズマブ 約19：1〜約24：1）、実施例18A；（AF−HPA：トラスツズマブ 約20：1〜約25：1）、実施例18B；（AF−HPA：トラスツズマブ 約23：1〜約28：1）、実施例18C；トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.7％）−（10kDa PHF−BA（30％）−（HPV−Ala（14％））、実施例20A；トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.7％）−（10kDa PHF−BA（30％）−（HPV−Ala（7.7％））、実施例20B；トラスツズマブ−（（EG2−MI（3.5％）−（10kDa PHF−BA（30％）−（HPV−Ala（4.3％））、実施例20C；sc−FvFcトラスツズマブ−（（EG2−MI（2.8％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（8％））、実施例40；トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.8％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（7.3％）、AF−HPA：トラスツズマブ 約6：1〜約9：1）、実施例43A；トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.5％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（8.4％）、AF−HPA：トラスツズマブ 約12：1〜約16：1）、実施例43C；遊離薬剤（AF−HPA）；及びKadcyla（登録商標）に関する結果を列挙する。
【表１９】
0006420331.tif 000185
【０６３６】
表Iの結果は、HER2発現細胞株SKBR3、BT474、N87及びJIMT1に関して、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲート（実施例4、実施例7、実施例13〜15、実施例17、実施例18A〜18C、実施例20A、実施例43A、及び実施例43C）が、低HER2発現細胞株MCF7や対照PBRM−高分子−薬剤コンジュゲート（実施例16）又はKadcyla（登録商標）と比較して、より高い増殖抑制作用を発揮した。
【０６３７】
表IIは、リンツズマブ−（（EG2−MI（2％）−（10kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（9％））、（AF−HPA：リンツズマブ 約10：1〜約15：1）、実施例8；及びリツキシマブ−（（EG2−MI（3％）−（10kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（8％））（AF−HPA：リツキシマブ 約13：1〜約18：1）、実施例9；並びに遊離薬剤（AF−HPA）に関する結果を列挙する。
【表２０】
0006420331.tif 000186
【０６３８】
表IIの結果は、CD33発現細胞株HL-60について、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲート（実施例8）が、対照PBRM−高分子−薬剤コンジュゲート（実施例9）に比較して、より高い増殖抑制作用を発揮したことを示した。
【０６３９】
表IIIは、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲート抗−5T4−（（EG2−MI（3％）−（10kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（8％））、（AF−HPA：抗−5T4約12：1〜約18：1）、実施例10；及びリツキシマブ−（（EG2−MI（3％）−（10kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（8％）））、（AF−HPA：リツキシマブ 約13：1〜約18：1）、実施例9；及び遊離薬剤（AF−HPA）に関する結果を列挙する。
【表２１】
0006420331.tif 000187
【０６４０】
表IIIの結果は、5T4発現細胞株のA431、PC3、及びMDAMB231OEについて、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲート（実施例10）が、対照PBRM−薬剤コンジュゲート（実施例9）及び非発現標的細胞LLC1に対してより高い増殖抑制作用を発揮したことを示す。
【０６４１】
表IVは、遊離薬剤（AF−HPA）に関する結果を列挙する。
【表２２】
0006420331.tif 000188
【０６４２】
実施例47．BIAcore Surface Plasmon Resonance（SPR）によるリガンド結合試験
固定した受容体へのPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートの動的結合を、BIAcore SPRによって測定する。PBRM−高分子−薬剤コンジュゲート及びPBRM単独内のPBRMの結合定数を、標準的なBIAcore手順を用いて測定できる。
【０６４３】
標準的なアミンカップリング化学反応を使用して、hErbB2を、3つの類似密度で表面プラズモン共鳴センサチップ表面に3つのフローチャネルで固定する。その結果、固定されたhErbB2にすぐに結合されたトラスツズマブは、両結合パートナーが活性であったことを実証している。結合パラメータka（結合又は親和性速度定数）及びKD（解離定数）を、GLCセンサーチップを備え、且つ泳動バッファーで平衡化したBioRad ProteOn XPR36光学バイオセンサを使用してPBRM−高分子−薬剤コンジュゲート及びPBRMについて25℃にて計測した。
【０６４４】
結果は、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲート内のPBRMがPBRM受容体によって認識され、且つ、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲート内のPBRMの結合が非結合PBRMに対して有意に影響を受けないことを示す。
【０６４５】
実施例48．FACSの結合アッセイ
PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのトラスツズマブ−（（EG2−MI（3％））−（10kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（8％））（AF−HPA：トラスツズマブ 約12：1〜約17：1）（実施例4）の細胞表面結合を、様々なヒト癌細胞株においてMACSQuant（登録商標）Analyzer 10デジタルベンチトップフローサイトメーターを使用して評価した。100,000個の細胞を、氷上、6％のヤギ血清中でインキュベートした。PBRM−高分子−薬剤コンジュゲート又は非結合PBRMを細胞に加え、氷上で3時間インキュベートし、次に、細胞を、氷冷PBSで洗浄し、氷中で二次蛍光ラベル抗体と一緒に1時間インキュベートした。完了時に、細胞を、PBSで洗浄し、1％のパラホルムによって固定し、フローサイトメータによって分析した。PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートの細胞表面結合を滴定によって測定し、そして、非結合PBRMのものと比較した。
【０６４６】
表Vは、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのトラスツズマブ−（（EG2−MI（3％））−（10kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（8％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約12：1〜約17：1）、実施例4、及びトラスツズマブ単独のJIMT-1細胞に対する結合定数（Kd）を与える。
【表２３】
0006420331.tif 000189
【０６４７】
結果は、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲート内のPBRMの細胞表面結合が非結合PBRMの結合に匹敵していたことを示す。
【０６４８】
他のヒト癌細胞に対する他のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲート内のPBRMの細胞表面結合も測定できるので、非結合PBRMの結合に匹敵しているはずである。
実施例49．BIAcore Surface Plasmon Resonance（SPR）によるリガンド結合試験
【０６４９】
固定した受容体へのPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートの動的結合を、BIAcore SPRによって測定した。例えば、トラスツズマブ−（（EG2−MI（2％）−（10 kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（9％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約16：1〜約21：1）、実施例7、トラスツズマブ−（（EG2−MI（2％）−（10 kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（9％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約5：1〜約10：1）、実施例17；及びトラスツズマブ−（（EG2−MI（2％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（9％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約19：1〜約24：1）、実施例18A；（AF−HPA：トラスツズマブ 約20：1〜約25：1）、実施例18B；（AF−HPA：トラスツズマブ 約23：1〜約28：1）、実施例18C；PBRM−薬剤コンジュゲート（すなわち、Kadcyla（登録商標））内のPBRM、並びにPBRM（すなわち、トラスツズマブ）単独内のPBRMの結合定数を、標準的なBIAcore手順を用いて測定した。
【０６５０】
標準的なアミンカップリング化学反応を使用して、hErbB2を、3つの類似密度で表面プラズモン共鳴センサチップ表面に3つのフローチャネルで固定した。その結果、固定されたhErbB2にすぐに結合されたトラスツズマブは、両結合パートナーが活性であったことを実証している。表VIは、GLCセンサーチップを備え、且つ泳動バッファーで平衡化したBioRad ProteOn XPR36光学バイオセンサを使用して実施例4及び実施例7のコンジュゲート、並びにトラスツズマブについて25℃にて計測される結合パラメータka（結合又は親和性速度定数）、kd（解離速度定数）及びKD（解離定数）を提供する。
【表２４】
0006420331.tif 000190
【０６５１】
結果は、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲート内のPBRMがPBRM受容体によって認識されることを示す。
【０６５２】
実施例50．インビボにおける有効性、薬剤動力学、及び生体内分布の検討  タンパク質薬剤コンジュゲートの有効性及び薬剤動力学を評価するために、マウス及びラット皮下及び同所性異種移植モデルを使用する。
【０６５３】
試験品を、適当な対照と共に、尾静脈注射を介して静脈内（IV）に、又は腹腔内に投与する。試験品の循環レベルを評価するために、血液サンプルを、所定の時間における終末の心穿刺によって採取する。サンプルを、室温にて30分間維持して、凝固させ、次に、4℃、1,000x gにて10分間遠心分離し、そして、すぐに−80℃にて冷凍した。血清サンプル中の総PBRM濃度は、ELISAを使用して評価する。循環薬剤濃度（結合及び遊離）を、LC／MS／MS法によって測定した。
【０６５４】
PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートの有効性を評価するために、腫瘍サイズを、デジタルノギスを使用して計測する。腫瘍体積を計算し、そして、腫瘍増殖の遅延を測定するのに使用する。
【０６５５】
薬剤の生体内分布の測定のために、腫瘍及び主要組織、例えば、肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓、筋肉、及び脳を採取し、そして、液体窒素中ですぐに冷凍し、−80℃にて保存した。PBRM及び／又は薬剤濃度を、標準的な方法、例えば、それぞれELISA又はLC／MS／MS法などによって組織ホモジネート中で測定する。
【０６５６】
実施例51．PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートの投与後のマウス組織分布
雌CB-17SCIDマウスに、BT474腫瘍（各群n＝4）を皮下に接種した。ビヒクル又はPBRM−高分子−薬剤コンジュゲート：トラスツズマブ−（（EG2−MI（3％））−（10kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（8％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約12：1〜約17：1）、実施例4、5mg／kg；及びトラスツズマブ−（（EG2−MI（1％））−（10kDa PHF−GA（29％）−（AF−HPA−Ala（6％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約18：1〜約23：1）、実施例13、5mg／kg、を1日目に単回投与としてIV投与した。
【０６５７】
投与後48時間の時点で、マウスを屠殺し、そして、血液を終末心臓穿刺（terminal cardiac）によって採血した。臓器：腎臓、肝臓、肺、骨格筋、脾臓及び腫瘍を、採取し、液体窒素中ですぐに冷凍し、そして、結合及び遊離AF−HPA及びAFの分析まで−80℃にて保存した。
【０６５８】
表VII、VIII、及びVIIIAは、様々な組織内の結合薬剤（結合AF−HPA、すなわちPBRM−PHF−AF−HPA）；非結合（遊離）薬剤（すなわち、AF−HPA及びAF）；遊離AF−HPA及び遊離AFの濃度を示す。濃度は、平均値±標準偏差としてng AF−HPA（及び／又はAF）同等物／g組織として報告する。
【表２５】
0006420331.tif 000191
【表２６】
0006420331.tif 000192
【表２７】
0006420331.tif 000193
【０６５９】
結果は、組織では、放出された非結合AF−HPAがAFへとさらに代謝されるのに対して、血漿では、非結合AF−HPAがAFに変換されないことを示す。
実施例52．PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートの投与に対する腫瘍増殖応答
【０６６０】
雌CB-17SCIDマウスに、BT474腫瘍（各群n＝10）、JIMT-1細胞（各群n＝10）又はNCI−N87細胞（各群n＝10）を皮下接種した。雌NCr nu／nuマウスに、HL-60細胞（各群n＝10）を皮下接種した。試験化合物又はビヒクルを、1日目に単回投与としてIV投与した。腫瘍サイズを、デジタルノギスを使用して図1〜9で示した時点で計測した。腫瘍体積を計算し、そして、腫瘍増殖の遅延を決定するために使用した。腫瘍が1000mm3のサイズに達したとき、マウスを屠殺した。腫瘍体積を、各群について平均±SEMとして報告する。
【０６６１】
図1は、ビヒクル；PBRM（トラスツズマブ）、10mg／kg；PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのトラスツズマブ−（（EG2−MI（3％））−（10kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（8％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約12：1〜約17：1）、実施例4、2.5mg／kgと5mg／kg；又はトラスツズマブ−（（EG2−MI（1％））−（10kDa PHF−GA（29％）−（AF−HPA−Ala（6％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約18：1〜約23：1）、実施例13、2.5mg／kgと5mg／kg、の1日目の単回投与としてのIV投与後の、BT474腫瘍を皮下接種したマウス（各群n＝10）における腫瘍反応の結果を提供する。結果は、実施例4及び13の腫瘍体積の低減を示し、5mg／kgの用量における100％の退縮と、それぞれ100％及び80％の無腫瘍生存による。ビヒクルとトラスツズマブ単独では、腫瘍体積の増大を示した。PBRM単独では腫瘍体積の低減を示さなかったので、薬剤−高分子コンジュゲートへのHER2（トラスツズマブ）特異的PBRMの結合は、腫瘍体積の低減に必要であった。
【０６６２】
図2は、ビヒクル； PBRM（トラスツズマブ）、10mg／kg；PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのトラスツズマブ−（（EG2−MI（3％））−（10 kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（8％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約12：1〜約17：1）、実施例4、2．5mg／kg；又はトラスツズマブ−（（EG2−MI（2％）−（10 kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（9％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約16：1〜約21：1）、実施例7、2．5mg／kgのIV投与後の、JIMT-1細胞を皮下接種したマウス（各群n＝10）における腫瘍反応の結果を提供する。結果は、実施例4及び7の両方について腫瘍体積の低減を示す。特に、実施例4に記載のコンジュゲートを投与した試験群では、9匹の完全退縮（1匹の動物は処置に関連しない死のために死んだ）と3匹の無腫瘍生存者から成る100％の退縮が2.5用量にて存在した。実施例7に記載のコンジュゲートを投与した試験群では、すべてが無腫瘍を維持した（2匹の動物が処置に関連しない死のため試験終了時点で腫瘍なしに死んだ）完全退縮から成る、100％の退縮が存在した。ビヒクル及びトラスツズマブ単独が腫瘍体積の増大を示した。PBRM単独では腫瘍体積の低減を示さなかったので、薬剤−高分子コンジュゲートへのHER2（トラスツズマブ）特異的PBRMの結合は、腫瘍体積の低減に必要であった。
【０６６３】
雌NCr nu／nuマウスにHL-60の細胞を皮下接種した（各群n＝10）。試験化合物又はビヒクルを、1日目の単回投与としてIV投与した。腫瘍の大きさを、デジタルノギスを使用して図3に示した時点で計測した。腫瘍体積を計算し、腫瘍増殖の遅延を測定するために使用した。腫瘍が2000mm3のサイズに達したとき、マウスを屠殺した。腫瘍体積は、各群について平均±SEMとして報告する。
【０６６４】
図3は、ビヒクル； PBRM（リンツズマブ）、20mg／kg；又は、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのリンツズマブ−（（EG2−MI（2％）−（10kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（9％））、（AF−HPA：リンツズマブ 約10：1〜約15：1）、実施例8、20mg／kgの1日目の単回投与としてのIV投与後の、HL-60の細胞（各群n＝10）を皮下接種したマウスにおける腫瘍反応の結果を提供する。結果は、44日目の100％の退縮と70％の無腫瘍生存による実施例8に関する腫瘍体積の低減を示す。ビヒクル及びリンツズマブ単独が腫瘍体積の増大を示した。PBRM単独では腫瘍体積の低減を示さなかったので、薬剤−高分子コンジュゲートへのCD33（リンツズマブ）特異的PBRMの結合は、腫瘍体積の低減に必要であった。
【０６６５】
図4は、ビヒクル；PBRM（トラスツズマブ）、20mg／kg；Kadcyla（登録商標）（PBRM−薬剤コンジュゲート）、20mg／kg；又はPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのトラスツズマブ−（（EG2−MI（2％））−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（9％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約10：1〜約15：1）、実施例14、2mg／kg、0.67mg／kg若しくは0.3mg／kgの1日目の単回投与としてのIV投与後の、JIMT-1細胞を皮下接種したマウス（各群n＝10）における腫瘍反応の結果を提供する。結果は、2.0用量での100％の退縮及び100％の無腫瘍生存により実施例14での腫瘍体積の低減を示す。ビヒクル、Kadcyla（登録商標）及びトラスツズマブ単独が腫瘍体積の増大を示した。PBRM単独では腫瘍体積の低減を示さなかったので、薬剤−高分子コンジュゲートへのHER2（トラスツズマブ）特異的PBRMの結合は、腫瘍体積の低減に必要であった。
【０６６６】
図5は、ビヒクル、又はPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのトラスツズマブ−（（EG2−MI（2％））−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（9％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約11：1〜約16：1）、実施例15、3mg／kg、1mg／kg又は0.3mg／kgの1日目の単回投与としてのIV投与後の、NCI−N87細胞を皮下接種したマウス（各群n＝10）における腫瘍反応の結果を提供する。結果は、3mg／kgの最も高い用量が100の完全応答による腫瘍体積の完全退縮を示すPBRM−高分子−薬剤コンジュゲート（実施例15）の用量応答を示した。1mg／kgの中程度の用量では、10匹の動物のうち7匹の部分的及び1匹の完全退縮が存在した。
【０６６７】
図6は、ビヒクル；PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのトラスツズマブ−（（EG2−MI（2％））−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（9％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約11：1〜約16：1）、実施例14、0.67mg／kg又はリツキシマブ−（（EG2−MI（2％））−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（9％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約13.7〜約18.7）、実施例16、3mg／kgの1日目の単回投与としてのIV投与後の、NCI−N87細胞を皮下接種したマウス（各群n＝10）における腫瘍反応の結果を提供する。結果は、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲート（実施例14）の腫瘍成長遅滞応答を示す。ビヒクル又は3mg／kgの用量におけるリツキシマブ−薬剤−高分子コンジュゲート（実施例16）が腫瘍増殖に対して効果がないことを示す。
【０６６８】
図7は、ビヒクル、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのトラスツズマブ−（（EG2−MI（2.7％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（t−ブチルグリシンAF−HPA）（7.5％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約4：1〜約6：1）、実施例33、0.67mg／kg；トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.8％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（7.3％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約6：1〜約9：1）実施例43A、1mg／kg；又はトラスツズマブ−（（EG2−MI（2.5％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（8.4％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約12：1〜約16：1）、実施例43C、0.67mg／kg又は3mg／kgの1日目の単回投与としてのIV投与後の、NCI−N87細胞を皮下接種したマウス（各群n＝10）における腫瘍反応の結果を提供する。結果は、115日目に90％の無腫瘍生存を示した0.67mg／kgの用量及び3mg／kgの用量において実施例43CのPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートに関して腫瘍成長の遅滞応答を示す。
【０６６９】
図8は、ビヒクル、高分子−薬剤コンジュゲートの10K PHF−BA（30％）AF−HPA−Ala（9.5％）、実施例5A、0.22mg／kg；又はPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのトラスツズマブ−（（EG2−MI（2.7％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（バリン−アシルオキシイソプロピルオキシ−MMAE）（9％））、（MMAE：トラスツズマブ 約12：1〜約16.5：1）、実施例30B、2mg／kg；リツキシマブ−（（EG2−MI（2.7％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（バリン−アシルオキシイソプロピルオキシ−MMAE）（9％））、（MMAE：リツキシマブ 約9.5：1〜約13：1）、実施例30C、2mg／kg；sc−FvFc−トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.8％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（8.1％））、（AF−HPA：scFvFcトラスツズマブ抗体 約14：1〜約19：1）、実施例40、0.67mg／kg；又はトラスツズマブ−（（EG2−MI（2.5％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（8.4％）、（AF−HPA：トラスツズマブ 約12：1〜約17：1）、実施例43B、1mg／kgの1日目の単回投与；或いは、トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.65％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（Val−Cit−PABA−Arry 520（2.9％））、（Arry 520：トラスツズマブ 約4：1〜約6：1）、実施例38、10mg／kgを3週間にわたり毎週投与；或いはリツキシマブ（EG2−MI（2.65％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（Val−Cit−PABA−Arry 520（2.9％））、（Arry 520：トラスツズマブ 約4：1〜約6：1）、実施例39、10mg／kgを3週間にわたり毎週投与としてのIV投与後の、NCI−N87細胞を皮下接種したマウス（各群n＝10）における腫瘍反応の結果を提供する。結果は、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲート（実施例40及び実施例43B）の腫瘍成長の遅滞応答を示す。
【０６７０】
図9は、ビヒクル、又はsc−FvFc−トラスツズマブ−（（EG2−MI（2.8％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（8.1％））、（AF−HPA：scFvFcトラスツズマブ抗体約14：1〜約19：1）、実施例40、1mg／kg；又はトラスツズマブ−（（EG2−MI（2.5％）−（10kDa PHF−BA（28％）−（AF−HPA−Ala（8.4％））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約12：1〜約16：1）、実施例43C、2mg／kgの1日目の単回投与としてのIV投与後の、JIMT-1細胞（各群n＝10）を皮下接種したマウスにおける腫瘍反応の結果を提供する。
【０６７１】
実施例53．PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートの投与後のマウス血漿PK
雌CD-1マウスは、最初の投薬前の少なくとも4日間、順応させた。すべてのマウスには、通常の食餌及び水が自由摂取で与えられ、化合物投与前にも断食しなかった。試験化合物又はビヒクルを、1日目の単回投与としてIV投与した。
【０６７２】
マウスに、ビヒクル（n＝3）又はPBRM−高分子−薬剤コンジュゲート、トラスツズマブ−（（EG2−MI（3％））−（10kDa PHF−BA（30％）−（AF−HPA−Ala（8％）））、（AF−HPA：トラスツズマブ 約12：1〜約17：1）、実施例4、5mg／kg、各群n＝3を静脈内に注射した。血漿を、投薬後5分、1時間、3時間、6時間、24時間、48時間、72時間、7日目、及び14日目に採取した。体重を、1日目の投与前、並びに1、7及び14日目に計測した。すべての動物を、死亡率又は罹患率に関して14日間にわたり観察した。
【０６７３】
結合AF−HPA及び非結合（遊離）薬剤（AF−HPAやAFなど）の濃度をLC／MS分析で測定した。総トラスツズマブ濃度をELISAによって測定した。
【０６７４】
図10の結果は、トラスツズマブが〜100μg／mLの血漿中濃度と〜12日間の半減期を有したのに対して、非結合AF−HPA及びAFは1＜ng／mLの総血漿濃度を有したことを示した。PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートは、AUC0と共に〜300μg・日／mLのAUC0-infで＞5日間の半減期を有した。
実施例54．PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートの投与の後のマウス血漿PK
【０６７５】
雌CD-1マウスは、最初の投薬前の少なくとも4日間、順応させた。すべてのマウスには、通常の食餌及び水が自由摂取で与えられ、化合物投与前にも断食しなかった。試験化合物又はビヒクルを、1日目の単回投与としてIV投与した。
【０６７６】
マウスに、ビヒクル（n＝3）又は実施例4、7、18A、18B及び18Cに記載のPBRM−高分子−薬剤コンジュゲートを静脈内に注射した。血漿を、投薬後5分、1時間、3時間、6時間、24時間、48時間、72時間、7日目、及び14日目に採取した。体重を、1日目の投与前、並びに1、7及び14日目に計測した。すべての動物を、死亡率又は罹患率に関して14日間にわたり観察した。
【０６７７】
総AF−HPA（結合AF−HPA及び非結合（遊離）薬剤（AF−HPAやAFなど））の濃度をLC−MS／MS分析で測定した。
【表２８】
0006420331.tif 000194
【０６７８】
表IXの結果は、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートが〜19〜25μg・時／mLのAUC0-336で〜120−154時間（〜5−6.4日間）の半減期を有したことを示し、それは、PBRM−高分子−薬剤コンジュゲートのAF−HPA対トラスツズマブの比とは関係がなかった。
【０６７９】
実施例55：PBRM−高分子医薬コンジュゲートの耐容性（MTD試験）
PBRM−高分子医薬コンジュゲートの耐容性を、CD-1雌マウスで推定した。PBRM−高分子−薬剤コンジュゲート（実施例4）を、単回IV用量として20mg／kg、40mg／kg、60mg／kg（各群n＝6）の用量にて投与した。ビヒクル対照群には生理的塩類溶液を与えた。動物は21日間にわたり臨床徴候に関して観察した。すべての試験動物の個別の体重を、ゼロ日目（ベースライン）、最初の5日間は毎日、そして、それ以降はほぼ1日おきに記録した。結果を表Xにまとめる。
【表２９】
0006420331.tif 000195
【０６８０】
20mg／kgの用量は良好に許容され、この群ではすべてのマウスで体重減少は観察されなかった。40mg／kgの用量では、〜20％の最大体重減少が7日目に観察された。この群の1匹の動物が、7日目に死体で発見され、前日に〜12％の体重減少があった。試験の終わり（21日目）までに、この試験群のすべての生存動物（6匹中5匹）で、対照群に対して体重が増加した。60mg／kgの用量は、この群のすべての動物が7日目に有意に体重減少し、そして、9日目に瀕死のため屠殺したので、明らかに最大耐量を超えていた。
【０６８１】
結果は、マウスの最大耐量が20 mg／kgと40mg／kgの間に存在することを示す。
【０６８２】
実施例56：アウリスタチンF−ヒドロキシプロピルアミドの耐容性（MTD試験）
アウリスタチンF−ヒドロキシプロピルアミド（AF−HPA）の耐容性を、CD-1雌マウスで推定した。AF−HPA（US13／493,899、本明細書中では米国特許第8,685,383号、実施例48に記載のものと類似した様式で調製する）を、単回IV用量として1.6mg／kg、3.2mg／kg、4.7mg／kg（各群n＝6）の用量にて投与した。ビヒクル対照群には生理的塩類溶液を与えた。動物は21日間にわたり臨床徴候に関して観察した。すべての試験動物の個別の体重を、ゼロ日目（ベースライン）、最初の5日間は毎日、そして、それ以降はほぼ1日おきに記録した。結果を表XIにまとめる。
【表３０】
0006420331.tif 000196
【０６８３】
1.6mg／kgの用量では、7日目で11.6％の体重減少を観察し、許容可能な耐容性であった。動物は、21日目までにその群のベースラインに対して5.5％の体重増加があり完全に回復した。3.2mg／kgの用量では、1匹の動物が7日目で死に、3匹の動物が、7日目で瀕死だったので屠殺した。試験終了（21日目）までに、6匹の動物のうち2匹が生き残った。この群のすべての動物が死んだか、又は瀕死だったため屠殺したかのいずれかだったので、4.7mg／kgの用量は明らかに最大耐量を超えていた。
【０６８４】
実施例57．表面プラズモン共鳴法によるヒト5T4（細胞外ドメイン）に結合する抗−5T4 scFvFc高分子医薬コンジュゲートの親和性及び動態の推定
5T4抗原に対する、実施例10に記載のものと類似した様式で調製した抗−5T4 scFvFc高分子医薬コンジュゲートの結合の親和性及び動態学的パラメーターを、GE Healthcare製のBIAcore T200装置を使用した表面プラズモン共鳴法によって計測した。5T4−ECD−Fc抗原（ヒトIgG1サブタイプのFcドメインに融合したヒト5T4細胞外ドメイン）を、キット（GE Healthcare）として提供された試薬を使用したアミンカップリング法によってBIAcore CM5センサーチップ上に共有結合で固定した。結合研究では、抗−5T4 scFvFc高分子医薬コンジュゲート又は対照タンパク質を、BIAcore泳動バッファーHBS EP＋（EDTA及びP20を補ったHEPES緩衝化生理食塩水）で濃度系列に連続希釈し、結合させるための一定期間にわたり固定した抗原上に流し、それに続いて、抗原を解離するために泳動バッファーのみを流し、そして最後に、低pH溶液（10mMのグリシン−HCl、pH2）を使用して表面を再生した。すべてのBIAcore試薬をGE Healthcareから調達した。得られたデータ曲線をセンサーグラムと呼び、未加工の結合データを構成する。データを、BIAevaluationソフトウェア（GE Healthcare）を使用して1：1ラングミュア結合モデルに当てはめ、そして、結合速度、解離速度、及び親和性などの親和性／動態学的パラメーターを推定した。親和性推定値は複数の計測の平均である。
【０６８５】
図11で例示したように、抗−5T4 scFvFc高分子医薬コンジュゲート（実施例10）は、高い親和性（＜30pMのKD）でヒト5T4細胞外ドメインに結合した。この値は、非結合抗−5T4 scFvFcについて測定された値に類似している。
【０６８６】
実施例58．細胞表面5T4抗原への抗−5T4 scFvFc高分子医薬コンジュゲートの結合
抗−5T4 scFvFc高分子医薬コンジュゲート（抗−5T4 scADC）（実施例10）の細胞表面結合を、様々なヒト癌細胞株においてFACS Calibreフローサイトメーター（Beckton Dickinson）を使用して計測した。抗−5T4 scFvFc高分子医薬コンジュゲートの細胞表面結合を、滴定によって測定し、そして、非結合抗−5T4 scFvFc抗体について計測した細胞表面結合と比較した。
【０６８７】
5T4を過剰発現する遺伝子組み換えMDA−MB−231（MDA−MB231−5T4 OE）、MDA−MB−231（5T4に関して陰性、受入番号HTB-26でアメリカンタイプカルチャーコレクション、Manassas Virginia USから入手可能）及びA431（5T4を自然に発現する）細胞（A431、受入番号CRL-1555でアメリカンタイプカルチャーコレクション、Manassas Virginia USから入手可能）を、抗−5T4 scFvFc高分子医薬コンジュゲートと非結合抗−5T4 scFvFcの力価測定するために使用した。対数増殖期の細胞を、0.5mMのPBS／EDTAバッファーを使用して培養フラスコから剥がした。細胞を、PBSで2回洗浄し、そして、1％のBSA−PBS中で抗−5T4 scFvFc、抗−5T4 scADC、又は非結合scFvFc融合タンパク質（0.01〜10μg／mL）と一緒に室温にて1時間インキュベートした。細胞を、PBSで3回洗浄し、そして、抗Fc特異的FITC抗体と一緒に4℃にて45分間インキュベートした。抗Fc特異的FITC抗体のインキュベーション後に、細胞を、PBSで3回洗浄し、そして、フローサイトメトリー（FACS Calibre, Becton Dickinson）を使用して分析した。中央蛍光強度（MFI）をサンプルについて測定した。
【０６８８】
抗−5T4 scFvFc高分子医薬コンジュゲート（実施例10）の特異的な用量依存的細胞表面結合は、A431及び5T4を過剰発現するMDA−MB−231細胞の両方で非結合抗−5T4 scFvFcのものに匹敵していた。無関係なscFvFc融合タンパク質の結合は、5μg／mLにて200倍少ない。加えて、MDA−MB−231細胞（5T4発現が陰性）は、抗−5T4 scFvFc又は結合抗−5T4 scFvFc ADCのいずれに対しても細胞表面結合を全く示さなかった。
【０６８９】
実施例59．抗−5T4 scFvFc高分子医薬コンジュゲートのインビボにおける有効性
材料：BD 1mLシリンジ（271／2 Gauge）、無菌培養培地、無菌リン酸緩衝生理食塩水、Matrigel−BD Biosciences（カタログNo．354248）、無菌綿栓、無菌Eppendrofチューブ（1.5mL及び2mL）、ピペット、濾紙、70％ アルコール／イソプロピルアルコール、Vernier Caliper（Mitutoyo）。使用したその他の不可欠なアイテムはすべて分析用のものであった。
【０６９０】
動物：雌無胸腺ヌードマウス（Hsd：Athymic Nude−Foxn1nu）5〜6週齢、体重20〜22gを、Harlan, Netherlandsから得た。動物を、Regulations of Committee for the Purpose of Control and Supervision of Experiments on Animals（CPCSEA）、Government of India and Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care（AAALAC）コンプライアンスに従って取り扱った。動物実験実施のための「形式B」を再検討し、Institutional Animal Ethics Committeeによる承認を受けた。
【０６９１】
ハウジングと給餌：動物を、22±3℃の温度、50±20％の湿度、それぞれ12時間の明／暗サイクル及び1時間あたり15〜20回の外気交換を伴う制御環境内で維持した。動物は群ごとに収容し、そして、寝具材料としてオートクレーブ処理した穂軸を使用した。動物は、研究期間中、認定されたIrradiated Laboratory Rodent Dietを食餌として自由摂取させた。
【０６９２】
動物の準備と動物の識別：動物は、少なくとも5日間にわたり実験室内で順化環境下に置かれた。動物には個別に付番し、そして、実験、研究番号、腫瘍接種の日付、無作為化の日付、腫瘍型、マウス系統、性別、及び個々のマウス番号を示すケージカードを対応するケージに表示した。無作為化後に、群の識別、試験化合物、投薬量、スケジュール、及び投与経路を加えた。
【０６９３】
腫瘍細胞の調製：すべての手法を、無菌技術に準じて層状流フードでおこなった。癌細胞（a）A431（類上皮腫）、（b）5T4を過剰発現する遺伝子組み換えMDA−MB−231（乳房）（MDA−MB−231 5T4＋＋）（5T4 OE）、及び（c）70〜80％コンフルエント且つ＞90％の生存率を有するH1975（非小細胞肺癌）を試験のために選択した。5X106個の細胞を、氷中に保持して200μlのPBS又は50％のマトリゲルを含む血清不含培地中に再懸濁した。
【０６９４】
細胞の皮下注射：Individual Ventilated Cages（IVCs）内に収容したヌードマウス（Hsd：Athymic Nude-Foxn1nu）を使用した。動物で動物の側部又は背部に皮下注射することによって、癌細胞株を接種した。移植領域を腫瘍の増殖について観察した。腫瘍が触知可能になり、且つ、必要な体積（TV≒150mm3）のものになった時点で、動物を腫瘍体積に基づいて無作為化し、そして、投薬を開始した。腫瘍体積は、無作為化した日（0日目）、その後、3日おきに（すなわち、マウスの体重を計測した日と同じ日に）、ノギスを用いて二次元計測によって測定した。ノギスを使用して、腫瘍の長さ（L）と幅（W）を計測した。腫瘍体積（TV）を、以下の式を使用して計算した：
【０６９５】
腫瘍体積（mm3）＝LXW2／2
【０６９６】
ここで、L＝長さ（mm）；W＝幅（mm）。
【０６９７】
抗−5T4 scFvFc高分子医薬コンジュゲート（実施例10）を、すべての調製濃度にて透明の溶液をもたらす無菌の1xPBS中に溶解し、そして、尾静脈を介して静脈内に投与した。試験品は投与日に新たに調製し、そして、用量体積は5mL／kg体重を維持した。各群を区別するために、新しいシリンジ及び針を使用した。
【０６９８】
体重：ケージサイド観察、体重は研究期間中、3日おきに計測した。個々のマウスの体重変動率（％）を計算した。
【０６９９】
抗腫瘍活性：抗腫瘍活性を、ビヒクル対照群に対する最大腫瘍体積阻害として計測した。データ評価を統計ソフトウェアGraph Padバージョン5を使用しておこなった。
【０７００】
％単位の試験／対照値（％T／C）：特定の日の腫瘍抑制（％単位のT／C）を、試験の平均TV値対対照群の比に100％を掛けて、次のように計算した：T／C（X日目）＝（X日目の試験群の平均TV−0日目の試験群の平均TV）／（X日目の対照群の平均TV−0日目の対照群の平均TV）×100％
【０７０１】
最小（最適）％T／C値は、それぞれの処置の最大抗腫瘍活性を示した実験中に特定の試験群に関して記録した。TV＝腫瘍体積（mm3）
【０７０２】
腫瘍増殖阻害（TGI）：TGIは、以下の式を使用して計算した：
【０７０３】
TGI＝（1−T／C）×100
【０７０４】
ここで、T＝（X日目の試験群の平均TV−0日目の試験群の平均TV）及びC＝（X日目の対照群の平均TV−0日目の対照群の平均TV）。
【０７０５】
臨床徴候：罹患と死亡：動物は、研究期間にわたり3日おきに目視できる一般的な臨床徴候に関して個別に観察した。すべての動物を罹患と死亡について確認した。
【０７０６】
統計解析：腫瘍抑制の統計的有意性の評価のために、二元配置分散分析、それに続いてBonferroni事後検定を、GraphPad Prism v5を使用して実施した。p値＜0.05は群間の統計的に有意の相違を示す。
【０７０７】
結果：
A431の皮下異種移植での抗腫瘍活性：
A431細胞株［「Characterization of the A431 tumor xenograft as an in vivo model for testing epidermal growth factor-receptor antagonists」, S. Robinson et al., Int. J. Oncol. 1992, 1(3):293-8］の異種移植実験では、実施例10に記載のものに類似した様式で調製した抗−5T4 scADCを、以下の用量にて癌を担持するマウスにIV投与した：10mg／kg、単回投与；1mg／kg、Q4D×4；3mg／kg、Q4D×4；6mg／kg、Q4D×4。「Q4D×4」とは、合計4回の用量に関して、4日おきの投与を意味する。別々の群の癌を担持するマウスに、非結合抗−5T4 scFvFc（10mg／kgのIV、Q4D×4）を投与した。この試験では、抗−5T4 scADC治療法が、上記の投与量レベルにて単回投与又は繰返し投与として投与した場合に、A431癌移植片に対して強い抗腫瘍活性を実証した（図12）。単回投与（10mg／kgのIV）にて抗−5T4 scADCを用いた処置は、24日目に−4％の最適T／C値をもたらした。10mg／kgのIV単回投与群の腫瘍増殖阻害（TGI）率（％）が104％（24日目、p＜0.001）であることがわかった。反復投与群（1mg／kg、3mg／kg、及び6mg／kgのIV、Q4D×4）における最適T／C値は、24日目にそれぞれ−2％、−4％、及び−3％であったことがわかった。さらに、反復投与群（1mg／kg、3mg／kg、及び6mg／kgのIV、Q4D×4）の腫瘍増殖阻害（TGI）率（％）が、それぞれ102％（24日目、p＜0.001）、104％（24日目、p＜0.001）及び103％（24日目、p＜0.001）であったことがわかった。単回投与と反復投与の抗−5T4 scADC処置群の間には、有意差がなかった。10mg／kgのIV、Q4D×4の用量での非結合抗−5T4 scFvFcの投与は、A431異種移植の腫瘍体積の有意な低減をまったく引き起こさなかった。24日目の％T／Cが87％であることがわかった。ビヒクル投与群と抗−5T4 ScFvFc投与群の間の腫瘍サイズにおける相違は統計的に有意でなかった、そして、この用量における腫瘍増殖阻害（TGI）率（％）が13％（24日目）であることがわかった。治療計画後、抗−5T4 scADC試験群の動物を90日目まで観察し、その時点で試験を終了させた。6mpk、i.v、Q4D×4にて処置した抗−5T4 scADC反復投与群では、24日目までに処置関連の激しい体重減少と死亡（7／10匹の動物）があった；この用量群における生き残り動物を90日目まで観察した。完全な腫瘍増殖退縮を抗−5T4 scADC投与群のすべてで観察し、腫瘍再増殖の徴候は研究期間の終了までなかった（6mpk、i.v、Q4D×4用量群の3／10匹を含む）。
【０７０８】
MDA−MB−231 5T4＋＋の皮下異種移植での抗腫瘍活性：
MDA−MB231-5T4 OEの異種移植による実験では、実施例10に記載のものに類似した様式で調製した抗−5T4 scADCを、以下の用量にて癌を担持するマウスに投与した：10mg／kgのIV、単回投与；1mg／kgのIV、Q4D×4；3mg／kgのIV、Q4D×4；及び6mg／kgのIV、Q4D×4。別々の群に、非結合抗−5T4 scFvFc（10mg／kgのIV、Q4D×4）を投与した。この試験では、抗−5T4 scADC治療法が、上記の投与量レベルにて単回投与又は繰返し投与として投与した場合に、MDA−MB−231−5T4 OE異種移植に対して強い抗腫瘍活性を実証した（図13）。単回投与（10mg／kgのIV）にて抗−5T4 scADCを用いた処置は、18日目に−25％の最適T／C値をもたらした。10mg／kgのIV単回投与群の腫瘍増殖阻害（TGI）率（％）が125％（18日目、p＜0.001）であることがわかった。反復投与群（1mg／kg、3mg／kg、及び6mg／kgのIV、Q4D×4）における最適T／C値は、18日目にそれぞれ−26％、−32％及び−38％であることがわかった。さらに、反復投与群（1mg／kg、3mg／kg、及び6mg／kgのIV、Q4D×4）の腫瘍増殖阻害（TGI）率（％）が、それぞれ126％（18日目、p＜0.001）、132％（18日目、p＜0.001）及び138％（18日目、p＜0.001）であったことがわかった。単回投与と反復投与の抗−5T4 scADC処置群の間には、有意差がなかった。10mg／kgのIV、Q4D×4の用量における非結合抗−5T4 scFvFc治療法が、MDA−MB−231 5T4 OE異種移植に対して抗腫瘍活性を抑えることを示した。18日目の％T／Cが45％であることがわかったので、この用量での腫瘍増殖阻害（TGI）は55％（18日目、p＜0.001）であった。さらに、Vehicle対照群の66日目の平均腫瘍体積は1763mm3であることがわかった。抗−5T4 scADC反復投与群（i.v；1mpk、3mpk、Q4D×4）及び単回投与群（10mpk、i.v）では、45日目から90日目まで完全な腫瘍増殖退縮があった。その時点で試験を終了させた。上記の抗−5T4 scADC投与群において、腫瘍再増殖の徴候は研究期間の終了までなかった。しかしながら、6mpk、i.v、Q4D×4にて処置した抗−5T4 scADC反復投与群では、21日目に処置関連の激しい体重減少と死亡（10／10）があった。72日目の非結合抗−5T4 scFvFc抗体投与群の平均腫瘍体積は1502mm3であることがわかった。この抗体投与群に関する66日目の％T／Cが60％であることがわかったので、この用量での腫瘍増殖阻害（TGI）は40％（66日目、p＜0.001）であった。
【０７０９】
H1975の皮下異種移植での抗腫瘍活性：
H1975肺癌細胞株を用いて同じようにおこなった異種移植実験では、実施例10に記載のものに類似した様式で調製した抗−5T4 scADCを、以下の用量にて癌を担持するマウス（各群n＝5匹のマウス、最初の腫瘍体積〜150mm3）にIV投与した：0.3mg／kg、Q4D×4；1mg／kg、Q4D×4；及び3mg／kg、Q4D×4。別々の群に、3mg／kg、IV、Q4D×4にて非結合抗−5T4 scFvFc抗体を投与した。上記の投薬量レベルにて繰返し投与として投与した場合に、抗−5T4 scADC（0.3及び1mg／kg、i.v、Q4D×4）を用いた処置が、H1975腫瘍異種移植の部分寛解（39日目）をもたらした。3mg／kg、i.v、Q4D×4にて抗−5T4 scADCを用いた処置が、H1975腫瘍異種移植の完全寛解をもたらした（39日目）。0.3、1及び3mpk、i.v；Q4D×4にて抗−5T4 scADCを用いた処置が、39日目にそれぞれ−0.7％、−4％及び−5％の最適T／C値をもたらし、そして、腫瘍増殖阻害（TGI）率（％）は101％、104％及び完全寛解（CR）であることがわかった（39日目、p＜0.001）。
非結合抗−5T4 scFvFc抗体を用いた処置が、％TGIが12％である39日目に88％の％T／Cを有する乏しい抗腫瘍活性をもたらした。治療計画後、試験群の動物を81日目まで観察し、その時点で試験を終了させた。60日目に、抗−5T4 scADC治療法（i.v；0.3mg／kg、Q4D×4）は、H1975異種移植を担持するヌードマウスにおいて完全寛解を実証したが、腫瘍再増殖が39日目以降60日目まで2匹の動物で観察され、この時点でこの群の動物を屠殺した（3／5）。しかしながら、81日目には、抗−5T4 scADC（i.v；1及び3mg／kg、Q4D×4）を用いた治療法は、H1975異種移植片を担持しているヌードマウスにいて完全寛解（5／5；81日目）をもたらした。
【０７１０】
NCI−N87の皮下異種移植での抗腫瘍活性：
上記腫瘍異種移植試験に類似した様式で、異種移植実験をNCI−N87（胃癌）細胞株を用いておこなった。実施例10に記載のものに類似した様式で調製した抗−5T4 scADCを、以下の用量にて癌を担持するSCIDマウス（各群n＝10匹のマウスに、最初の腫瘍体積〜135mm3）にIV投与した：3mg／kg、単回投与；及び3mg／kg、Q4D×3。別々の群に、3mg／kg、IV、Q4D×3にて非結合抗−5T4 scFvFc抗体を投与した。1匹の処置に関連しない死亡を、抗−5T4 scADC、3mg／kg、単回投与群において評価し、この動物のデータを分析から除外した。19日目には、抗−5T4 scADC処置群は3mg／kg、単回投与；及び3mg／kg、Q4D×3にて、それぞれ92％及び87％の腫瘍増殖阻害を示した。両方の抗−5T4 scADC処置群で100％の完全退縮があり、そしてそれらは、75日目の試験の終了まで続いた。非結合抗−5T4 scFvFc抗体を用いた処置は、19日目の14％の腫瘍増殖阻害値を有する乏しい抗腫瘍活性をもたらした；この処置群のすべての動物が56日目までに800mm3の腫瘍体積エンドポイントに達した。
【０７１１】
この明細書で引用した、例えば、非特許文献、特許出願及び特許を含めたすべての刊行物を、あらゆる目的のために参照によって本明細書中に援用する。  本発明は、その主旨又は本質的な特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態で実施することができる。したがって、前述の実施形態はあらゆる点で、本明細書中に記載されている本発明を限定するものではなく、例示するものであると見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の明細書ではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び同等性の範囲内にある変形形態はすべて、本明細書に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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