(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞をトロンビンを含む培地で培養する段階、および
前記培地から、幹細胞由来のエキソソームを分離する段階
を含む、幹細胞当たりの幹細胞由来のエキソソームの生成量を増加する方法。
【請求項２】
前記幹細胞は胚性幹細胞または成体幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記成体幹細胞は間葉系幹細胞、ヒト組織由来の間葉系基質細胞、ヒト組織由来の間葉系幹細胞、多分化能幹細胞および羊膜上皮細胞で構成された群から選択される１種以上の成体幹細胞であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記間葉系幹細胞は臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜および胎盤で構成された群から選択される１種以上の組織から由来した間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記培地はＤＭＥＭ  （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ  （Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ  （Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ  １６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ−１０（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１０）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２  （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２）、α−ＭＥＭ（α−Ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｏｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、およびＫｎｏｃｋＯｕｔ（登録商標）  ＤＭＥＭからなる群から選択された１種以上の培地であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記トロンビンは培地内に１〜１０００Ｕ／ｍｌの濃度で含まれることを特徴とする、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記培養は１２時間〜４８時間の間実行されることを特徴とする、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
トロンビンを含む、幹細胞当たりの幹細胞由来のエキソソームの生成量増加用培地組成物。
【請求項９】
幹細胞をトロンビンを含む培地で培養する段階、および
前記培地から、幹細胞由来のエキソソームを分離する段階
を含む、幹細胞当たりの幹細胞由来のエキソソーム内成長因子の生成量を増加する方法。
【請求項１０】
前記成長因子は脳由来神経成長因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ  ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）、繊維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＮＧＦ）および血管上皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）からなる群から選択された１種以上であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はトロンビンを利用した幹細胞由来のエキソソームの生成促進方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）は色々な種類の細胞から分泌される膜構造の小さい小胞である。エキソソームの直径は概略３０−１００ｎｍであると報告されている。エキソソームは電子顕微鏡を通した研究によって、原形質膜から直接離れて行くのではなく、多胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｂｏｄｉｅｓ、ＭＶＢｓ）と呼ばれる細胞内特定区画に始まり細胞外に放出、分泌されるものと観察された。すなわち、多胞体と原形質膜の融合が起きると、小胞は細胞外環境に放出されるが、これをエキソソームと呼ぶ。このようなエキソソームがどのような分子的メカニズムによって作られるのかは確実に明らかになっていないが、赤血球細胞だけでなく、Ｂ−リンパ球、Ｔ−リンパ球、樹枝状細胞、血小板、大食細胞などを含む多様な種類の免疫細胞と腫瘍細胞、幹細胞なども、生きている状態でエキソソームを生産して分泌すると知られている。特に、幹細胞から由来したエキソソームは受容体および蛋白質だけでなく核成分を含有しており、細胞間コミュニケーションに重要な役割をするものとして知られている。また、エキソソームは幹細胞に比べて動物血清を相対的に少なく含有しており、動物血清感染による症状（ｚｏｏｎｏｓｉｓ）の危険性も排除できる。このようなエキソソームの特性を考慮する時、エキソソームを利用した細胞治療法は既存の幹細胞治療法の限界を克服し得る新しいパラダイムになるものと期待される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで、本発明者らは前記のように利用可能性が優秀なエキソソームの生産効率を上げるための方法に対する研究を継続した結果、トロンビンを利用する場合、幹細胞当たりの幹細胞由来のエキソソームの生成量が増加することを確認することによって本発明を完成した。
【０００４】
したがって、本発明の目的はトロンビンを利用した幹細胞由来のエキソソームの生成促進方法を提供することである。
【０００５】
本発明の他の目的はトロンビンを含む幹細胞由来のエキソソームの生成促進用培地組成物を提供することである。
【０００６】
本発明のさらに他の目的はトロンビンを利用した幹細胞由来のエキソソーム内成長因子発現増進方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明は幹細胞をトロンビンを含む培地で培養する段階を含む幹細胞由来のエキソソームの生成促進方法を提供する。
【０００８】
また、本発明はトロンビンを含む幹細胞由来のエキソソームの生成促進用培地組成物を提供する。
【０００９】
また、本発明は幹細胞をトロンビンを含む培地で培養する段階を含む幹細胞由来のエキソソーム内成長因子発現増進方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る方法は、幹細胞由来のエキソソームの生成を促進させる優秀な効果を有しており、これを通じて従来の公知の方法に比べて効率的にエキソソームを収得することができ、関連研究に有用に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明に係る方法を利用して収得した幹細胞由来のエキソソームの形態をＳＥＭイメージを通じて観察した結果を示した図面。
【図２】本発明に係る方法を利用して収得した幹細胞由来のエキソソームでエキソソームマーカーであるＣＤ６３およびＣＤ９の発現を確認した結果を示した図面。
【図３】本発明に係る方法を利用して収得した幹細胞由来のエキソソームで成長因子であるＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現を確認した結果を示した図面。
【図４】トロンビン処理濃度による幹細胞由来のエキソソームの生成程度を示した図面。
【図５】ＬＰＳ、Ｈ２Ｏ２またはトロンビンの処理濃度による幹細胞由来のエキソソームの生成程度を示した図面。
【図６】トロンビン処理による幹細胞内小胞体の形成程度を観察した結果を示した図面。
【図７】トロンビン処理によるエキソソーム内成長因子の発現を確認した結果を示した図面。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
本発明は幹細胞をトロンビンを含む培地で培養する段階を含む幹細胞由来のエキソソームの生成促進方法を提供する。
【００１４】
前記トロンビンは培地内に１〜１０００Ｕ／ｍｌの濃度で含むことができ、好ましくは１０〜２００Ｕ／ｍｌの濃度で含むことができる。
【００１５】
前記培養時間は、エキソソームが生成できる時間であれば制限はなく、好ましくは１２時間〜４８時間の間遂行され得る。
【００１６】
本発明において、「幹細胞」とは、未分化な細胞であって、自己複製能力を有しつつ二つ以上の互いに異なる種類の細胞に分化する能力を有する細胞である。
【００１７】
本発明の幹細胞は自家または同種由来の幹細胞であり得、ヒトおよびヒト以外の哺乳類を含む任意の類型の動物由来であり得、前記幹細胞が成体から由来したものであれ胎芽から由来したものであれ、これに限定されない。本発明の幹細胞は胚性幹細胞または成体幹細胞を含み、好ましくは成体幹細胞である。前記成体幹細胞は間葉系幹細胞、ヒト組織由来の間葉系間質細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）、ヒト組織由来の間葉系幹細胞、多分化能幹細胞または羊膜上皮細胞であり得、好ましくは間葉系幹細胞であるが、これに限定されない。前記間葉系幹細胞は臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜または胎盤などから由来した間葉系幹細胞であり得るが、これに限定されない。
【００１８】
本発明で「培地」とは、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で細胞の成長と増殖に必要な必須成分を含む組成物を意味するもので、当該分野で通常的に使われる幹細胞培養用培地をすべて含み、例えば、ＤＭＥＭ  （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ  （Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ  （Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ  １６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ−１０（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１０）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２  （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２）、α−ＭＥＭ（α−Ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｏｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＫｎｏｃｋＯｕｔ（登録商標）  ＤＭＥＭなどの商業的に製造された培地または人為的に合成した培地を利用することができるが、これに限定されない。本発明の培地は一般的に炭素源、窒素源および微量元素成分を含み、アミノ酸、抗生剤などをさらに含むことができる。
【００１９】
本発明の具体的な一実施例では、間葉系幹細胞に１０〜１００Ｕ／ｍｌのトロンビンを含む血清フリー培養培地（ＭＥＭ  ａｌｐｈａ  ｍｅｄｉａ）を処理した後、２４時間の間培養して幹細胞由来のエキソソームの生成を促進し、超高速遠心分離を通じてこれを分離した。
【００２０】
本発明に係る方法は、幹細胞由来のエキソソームの生成を促進させる優秀な効果を有しており、これを通じて従来の公知の方法に比べて効率的にエキソソームを収得することができる。
【００２１】
また、本発明はトロンビンを含む幹細胞由来のエキソソームの生成促進用培地組成物を提供する。
【００２２】
前記トロンビンは、培地内に１〜１０００Ｕ／ｍｌの濃度で含むことができ、好ましくは１０〜２００Ｕ／ｍｌの濃度で含むことができる。
【００２３】
本発明の培地組成物はトロンビンの他に公知のエキソソーム生成促進物質を１種以上さらに含むことができるが、これに限定されない。
【００２４】
また、本発明は幹細胞をトロンビンを含む培地で培養する段階を含む幹細胞由来のエキソソーム内成長因子発現増進方法を提供する。
【００２５】
本発明で「成長因子」とは、細胞分裂や生長、分化を促進する蛋白質性の生理活性物質を意味するもので、例えば、脳由来の神経成長因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ  ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）、繊維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＮＧＦ）、血管上皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）、類似インスリン成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＩＧＦ）、形質転換成長因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＴＧＦ）、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）、骨由来成長因子（ｂｏｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＦ）、コロニー刺激因子（ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ、ＣＳＦ）、表皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）、角質細胞成長因子（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＫＧＦ）などを含む。
【００２６】
前記成長因子は、好ましくは脳由来神経成長因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ  ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）、繊維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＮＧＦ）または血管上皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）を含むが、これに限定されない。
【００２７】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより簡単に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明の内容は実施例によって限定されるものではない。
【００２８】
実施例１．幹細胞由来のエキソソームの分離
幹細胞由来のエキソソームを分離するために、トロンビンおよび超遠心分離機（Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を利用した。より具体的に、１×１０６個の臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）由来間葉系幹細胞を６０ｍｍ培養皿（ｏｒａｎｇｅ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｃａｔ＃  ４４５０２００）に分注した後、１週間の間培養した。培養皿に細胞がいっぱいに増殖したのを確認した後、濃度別（１０、２０、５０、１００Ｕ／ｍｌ）トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）が希釈されている血清フリー培養培地（ＭＥＭ  ａｌｐｈａ  ｍｅｄｉａ）に取り替え、さらに２４時間の間培養した。その後、培養液を遠心分離チューブに分けて入れて４℃、１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄み液を新しいチューブに移して細胞破片（ｄｅｂｒｉｓ）を除去した。前記上澄み液を再び４℃、１００、０００ｒｐｍで２時間の間超遠心分離した後、上澄み液を除去してエキソソームを分離した（最終濃度：１５μｇ／ｍｌ）。
【００２９】
実施例２．幹細胞由来のエキソソームの確認
前記実施例１の過程を通じて分離したエキソソームが従来の公知のエキソソーム固有の特性を有しているかを確認するために、下記のような実験を遂行した。まず、分離したエキソソームをＳＥＭイメージを通じて観察し、ウェスタンブロットを利用して公知のエキソソームマーカーであるＣＤ６３およびＣＤ９（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）の発現を確認した。また、溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を利用してエキソソーム膜を溶解した後、エキソソーム内の蛋白質を分離し、Ｐｒｏｃａｒｔａ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ａｆｆｙｍａｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を利用してエキソソーム内成長因子であるＨＧＦとＶＥＧＦの量を測定した。その結果をそれぞれ図１〜図３に示した。
【００３０】
図１に示した通り、前記実施例１と同じ方法を通じて分離したエキソソームは約１００ｎｍ直径の球状を呈する正常な形態を示していることを確認した。
また、図２および図３に示した通り、前記実施例１と同じ方法を通じて分離したエキソソームは正常にエキソソームマーカーであるＣＤ６３およびＣＤ９を発現しており、エキソソーム内に成長因子であるＶＥＧＦおよびＨＧＦが存在することを確認した。
【００３１】
実施例３．トロンビン処理によるエキソソーム生成促進効果
３−１．トロンビン処理濃度によるエキソソーム生成程度検証
トロンビン処理濃度による幹細胞由来のエキソソームの生成程度を確認するために、幹細胞培養時にトロンビンの濃度を異ならせて前記実施例１と同じ方法でエキソソームを分離してこれを定量した。その結果を図４に示した。
【００３２】
図４に示した通り、トロンビンの処理濃度が高くなるにつれて、幹細胞由来のエキソソームの生成が有意義に促進されることを確認した。
【００３３】
３−２．トロンビンを利用したエキソソーム生成促進方法の効率性検証
トロンビンを利用したエキソソーム生成促進方法の効率性を検証するために、トロンビンの代わりに培養培地にＬＰＳまたはＨ２Ｏ２を処理したことを除いては前記実施例１と同じ方法でエキソソームを分離してこれを定量した。その結果を図５に示した。
【００３４】
図５に示した通り、幹細胞培養時にトロンビンを処理する場合、他の物質を処理した群に比べて幹細胞由来のエキソソームの生成が顕著に増加することを確認した。
【００３５】
３−３．トロンビン処理による幹細胞内小胞体形成観察
トロンビン処理が幹細胞内小胞体の形成に及ぼす影響を確認するために、臍帯血由来間葉系幹細胞を５０Ｕ／ｍｌのトロンビンが希釈されている血清フリー培養培地（ＭＥＭ  ａｌｐｈａ  ｍｅｄｉａ）で６時間の間培養した後、前記実施例１と同じ方法でエキソソームを分離してこれを電子顕微鏡で観察した。その結果を図６に示した。
【００３６】
図６に示した通り、トロンビン処理によって幹細胞内小胞体の形成が増加し、エキソソームの分泌が誘導されるたことを確認した。
【００３７】
３−４．トロンビン処理によるエキソソーム内成長因子発現観察
トロンビン処理がエキソソーム内成長因子の発現に及ぼす影響を確認するために、臍帯血由来間葉系幹細胞を５０Ｕ／ｍｌのトロンビンが希釈されている血清フリー培養培地（ＭＥＭ  ａｌｐｈａ  ｍｅｄｉａ）で６時間の間培養した後、前記実施例１と同じ方法でエキソソームを分離した。溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を利用してエキソソーム膜を溶解した後、エキソソーム内の蛋白質を分離し、Ｐｒｏｃａｒｔａ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ａｆｆｙｍａｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を利用してエキソソーム内成長因子であるＢＤＮＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＩＬ−６およびＶＥＧＦの量を測定した。その結果を図７に示した。
【００３８】
図７に示した通り、トロンビン処理によってエキソソーム内成長因子であるＢＤＮＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＩＬ−６およびＶＥＧＦの発現が増加したことを確認した。
【００３９】
以上の実験結果を通じて、トロンビンを利用して幹細胞由来のエキソソームの生成を促進させることができ、エキソソーム内成長因子の発現を増加させ得ることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明に係る方法は、幹細胞由来のエキソソームの生成を促進させる優秀な効果を有しており、これを通じて従来の公知の方法に比べて効率的にエキソソームを収得することができ、関連研究に有用に利用することができる。
【図１】
0006343671.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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