(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）：
（１）配列番号１０〜１２の配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号１０〜１２の配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
（３）配列番号１０〜１２の配列から選択される複数の同一の若しくは異なるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
から成る群から選択されるポリペプチドであって、
アセチルコリン受容体及び／又はＮＭＤＡ受容体を遮断する活性を有する、ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１２のＮ末端から、
１番目のシステインと２番目のシステインがジスルフィド結合を形成し、そして３番目のシステインと４番目のシステインがジスルフィド結合を形成するか；あるいは
１番目のシステインと３番目のシステインがジスルフィド結合を形成し、そして２番目のシステインと４番目のシステインがジスルフィド結合を形成するか；あるいは
１番目のシステインと４番目のシステインがジスルフィド結合を形成し、そして２番目のシステインと３番目のシステインがジスルフィド結合を形成し；ポリペプチドのカルボキシル末端は遊離のＣ末端であるかアミド化されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
以下の（１）〜（３）：
（１）配列番号４〜６の配列から選択されるいずれか１つのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（２）配列番号４〜６の配列から選択されるいずれか１つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；及び
（３）配列番号４〜６の配列から選択される複数の同一若しくは異なるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
から成る群から選択されるポリヌクレオチドである、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のポリヌクレオチドを含む、核酸コンストラクト。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸コンストラクトを含む組み換え発現ベクターである、組み換え発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組み換え発現ベクターを含む形質転換細胞である、形質転換細胞。
【請求項８】
請求項１又は２に記載のポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１又は２に記載のポリペプチド、又は請求項８に記載の融合タンパク質を含み；任意で医薬的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む、医薬組成物。
【請求項１０】
インビトロにおいて、アセチルコリン受容体を遮断するための方法であって、有効量の請求項１若しくは２に記載のポリペプチド又は請求項８に記載の融合タンパク質を用いる工程を含み、ここで、前記アセチルコリン受容体がα９α１０アセチルコリン受容体である、方法。
【請求項１１】
インビトロにおいて、ＮＭＤＡ受容体を遮断するための方法であって、有効量の請求項１若しくは２に記載のポリペプチド又は請求項８に記載の融合タンパク質を用いる工程を含み、ここで、前記ＮＭＤＡ受容体がＮＲ２Ｃ  ＮＭＤＡ受容体である、方法。
【請求項１２】
アセチルコリン受容体を遮断するための医薬又は試薬の製造における、あるいはＮＭＤＡ受容体を遮断するための医薬又は試薬の製造における、請求項１若しくは２に記載のポリペプチド又は請求項８に記載の融合タンパク質の使用であって、前記アセチルコリン受容体がα９α１０アセチルコリン受容体であり、前記ＮＭＤＡ受容体がＮＲ２Ｃ  ＮＭＤＡ受容体である、使用。
【請求項１３】
神経系疾患、癌の化学療法、乳癌、肺癌、創傷治癒、依存症、パーキンソン病、てんかん、虚血、興奮性神経細胞死若しくは認知症の治療及び／又は予防のための医薬の製造における、あるいは害虫の殺滅、鎮痛、禁煙、又は依存症治療のための薬剤の製造における、請求項１若しくは２に記載のポリペプチド又は請求項８に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項１４】
前記神経系疾患が神経痛である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記神経痛は、１又は複数の以下の因子：癌及び癌の化学療法、アルコール依存症、糖尿病、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷及び外科的損傷、ＡＩＤＳ、頭部神経麻痺、薬物中毒、産業公害中毒、骨髄腫、慢性先天性感覚神経症、血管炎、脈管炎、虚血、尿毒症、小児の胆汁性肝疾患、慢性呼吸器疾患、多臓器不全、敗血症／膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、高脂血症、ハンセン病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、又はアレルギーにより引き起される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記神経痛は、坐骨神経痛、三叉神経痛、リンパ神経痛、マルチポイント神経痛、急性自発神経痛、圧迫するような神経痛又は複合的な神経痛である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
前記害虫はヨトウガ（Spodoptera Frugiperda）である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１８】
以下の工程：
１）Ｆｍｏｃアミノ酸の側鎖保護基はＰｍｃ（Ａｒｇ）、Ｔｒｔ（Ｃｙｓ）、Ｂｕｔ（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ）、ＯＢｕｔ（Ａｓｐ）、Ｂｏｃ（Ｌｙｓ）であり；システインはＴｒｔ又はＡｃｍ保護基で保護されており、ジスルフィド結合は対応するシステイン間で部位特異的な方法においてそれぞれ形成される、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ４３３ａ  ポリペプチド合成装置又は手動の方法により線形ポリペプチドを合成し、
２）線形ポリペプチドの粗生成物を沈殿及び洗浄及び回収するために、氷−エーテルを用い、そして精製のための分取用逆相ＨＰＬＣ  Ｃ１８カラムを用いて、工程１）の線形ポリペプチドをレジンから切り出すこと、
３）工程２）において得られた生成物を２工程酸化的フォールディングに供すること
を含む、請求項１又は２に記載のポリペプチドを調製するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、生化学及び分子生物学の分野に属し、αＯ−スーパーファミリーコノトキシンペプチド、これらの医薬組成物、調製方法及び使用に関する。本発明は、さらに、コノトキシンペプチドのプロペプチド、これらの核酸コンストラクト、発現ベクター及び形質転換細胞、並びに融合タンパク質に関する。本発明はさらに、ニコチンアセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）又はＮＭＤＡ受容体（ＮＭＤＡＲ）を遮断する方法、及び医薬の製造におけるコノトキシンペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
ニコチンアセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）は、動物界に高い頻度で見られる膜タンパク質であり、そして重要な生理学的作用及び臨床研究的な重要性を有し、これらは学習、記憶、応答、鎮痛及び運動制御を含む中枢及び末梢神経系の多くの生理学的機能を仲介する。ｎＡＣｈＲは、多くの神経伝達物質、例えばドーパミン、ノルアドレナリン、セロトニン、γ−アミノブチル酸の放出を不活性化する。ｎＡＣｈＲは、重要な疾患の大きな群の診断及び治療における医薬をスクリーニングするための臨床的標的であることが確認されており、これらの疾患は、困難な様々な疾患、例えば依存症（addiction）、疼痛、癌、精神薄弱、パーキンソン病、精神疾患、鬱病、重症筋無力症を含む。これまで、これらの疾患の対処療法のための医薬は存在していない。一般的な非選択的ｎＡＣｈＲアゴニスト、例えばニコチンは、上記の神経疾患の症状を緩和することができるが、これらは、心臓及び胃腸管への強い副作用及び依存性を有する。それ故、上記の疾患の治療のための鍵は、ｎＡＣｈＲの様々なサブタイプに関する高い選択性を有するリガンド医薬を開発することである（Livett BG, Sandall DW, Keays D, Down J, Gayler KR, Satkunanathan N, Khalil Z. Therapeutic applications of conotoxins that target the neuronal nicotinic acetylcholine receptor. Toxicon. 2006,48(7):810-829. Nicke, A., Wonnacott, S. & Lewis, R. J. Alpha-conotoxins as tools for the elucidation of structure and function of neuronal nicotinic acetylcholine receptor subtypes. European journal of biochemistry / FEBS 271, 2004, 2305-2319.  Dani, J. A. & Bertrand, D. Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous. Annual review of pharmacology and toxicology 2007, 47:699-729）。
【０００３】
しかしながら、かかる医薬を開発するための前提条件は、関連する疾患のための治療薬として、又は優れた組成物及び様々なサブタイプの生理学的機能を研究及び同定するためのツール医薬として直接的に用いることができる、ｎＡＣｈＲの様々なサブタイプと特異的に結合することができる選択的な化合物を得ることである。加えて、乳癌及び肺癌の組織において、これらの壊滅的な癌の早期診断又は治療が効果的に行われるように、腫瘍細胞膜上のニコチンアセチルコリン受容体の活性化を、医薬で遮断することができる。
【０００４】
ｎＡＣｈＲは、異なるα及びβサブユニットで組み立てられる多くのサブタイプを有し、各サブタイプは異なる生理学的特徴を有する。様々なサブタイプについての高い選択的なリガンド化合物がないことから、多くの困難は、様々なｎＡＣｈＲサブタイプの詳細な構造及び機能の研究及び説明において克服されるべきである。
【０００５】
研究は、α９α１０  ｎＡＣｈＲが神経障害痛の治療のための医薬の新規の標的であることを示す（McIntosh, J. M.; Absalom, N.; Chebib, M.; Elgoyhen, A. B.; Vincler, M., Alpha9 nicotinic acetylcholine receptors and the treatment of pain. Biochemical pharmacology 2009, 78 (7), 693-702. Satkunanathan, N.; Livett, B.; Gayler, K.; Sandall, D.; Down, J.; Khalil, Z., Alpha-conotoxin Vc1.1 alleviates neuropathic and accelerates functional recovery of injured neurones. Brain research 2005, 1059 (2), 149-58.）。α９α１０  ｎＡＣｈＲ遮断剤は、神経障害痛を緩和し、傷ついた神経細胞の回復を促進する機能を有する（Holtman, J. R.; Dwoskin, L. P.; Dowell, C.; Wala, E. P.; Zhang, Z.; Crooks, P. A.; McIntosh, J. M., The novel small molecule alpha9alpha10 nicotinic acetylcholine receptor antagonist ZZ-204G is analgesic. European journal of pharmacology 2011, 670 (2-3), 500-8. Zheng, G.; Zhang, Z.; Dowell, C.; Wala, E.; Dwoskin, L. P.; Holtman, J. R.; McIntosh, J. M.; Crooks, P. A., Discovery of non-pepitide, small molecule antagonists of alpha9alpha10 nicotinic acetylcholine receptors as novel analgesics for the treatment of neuropathic and tonic inflammatory pain. Bioorganic & medicinal chemistry letters 2011, 21 (8), 2476-9)。角化細胞のα９α１０  ｎＡＣｈＲは、創傷治癒の病態生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす（Chernyavsky, A. I.; Arredondo, J.; Vetter, D. E.; Grando, S. A., Central role of alpha9 acetylcholine receptor in coordinating keratinocyte adhesion and motility at the initiation of epithelialization. Experimental cell research 2007, 313 (16), 3542-55）。近年の研究は、α９  ｎＡＣｈＲサブユニットが、乳癌組織において過剰発現していることを示す。様々なα９サブユニットが、気管支細胞の変質及び増殖に影響を与え、それ故、前記サブユニットは、肺癌の治療において、大変に重要である（Chikova, A.; Grando, S. A., Naturally occurring variants of human Alpha9 nicotinic receptor differentially affect bronchial cell proliferation and transformation. PloS one 2011, 6 (11), e27978.）。
【０００６】
調査は、人口の１／６が関節炎、神経痛及び疼痛（sore pain）を含む疼痛（pain）に罹患し、その中でも人口の４〜８％が神経痛に罹患していることを示す。神経痛の治療のための存在する方法は、末梢神経、神経叢、背根神経及び交感神経系により生ずる疼痛シグナルを遮断するための局所麻酔薬物治療に主に関する。しかしながら、これらの治療は、短期間の鎮痛効果のみを有し、持続的に神経痛を制御することができない。多くの疾患は、癌及び癌の化学療法、アルコール依存症、坐骨神経痛、糖尿病、三叉神経痛、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷及び外科的損傷、ＡＩＤＳ、頭部神経麻痺、薬物中毒、産業公害中毒、骨髄腫、マルチポイント神経痛（multipoint neuralgia）、慢性先天性感覚神経症、急性自発神経痛、圧迫するような神経痛（squeezing neuralgia）、血管炎（angiitis）（脈管炎（vasculitis））／虚血、尿毒症、小児の胆汁性肝疾患、慢性呼吸器疾患、複合的な神経痛、多臓器不全、敗血症／膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、高脂血症、ハンセン病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、又はアレルギー等を引き起し得る。
【０００７】
神経痛の治療のための標的としてα９α１０  ｎＡＣｈＲを用いる医薬は、筋肉内注射により投与・送達されて鎮痛効果を発揮することができ（Vincler, M. Wittenauer, S. Parker, R. Ellison, M. Olivera, B. M. McIntosh, J. M. Molecular mechanism for analgesia involving specific antagonism of alpha9alpha10 nicotinic acetylcholine receptors. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006,103 (47): 17880-4.）、そして現在市販されているω−ＣＴｘ  ＭＶＩＩＡ鎮痛剤であるジコノチドよりもより簡便である。ジコノチドは、インビボにおいて、プログラムされたポンプを介して脊髄に直接的に送達しなければならず、それ故その送達経路は大変に不便であり、前記ポンプは大変高価である。現在、これは、欧州及び米国における先進国においてのみ使用可能であり、そして多くの発展途上国においてとても用いることはできない（Kress HG, Simpson KH, Marchettini P, Ver Donck A, Varrassi G. Intrathecal therapy: what has changed with the introduction of ziconotide. Pain Pract. 2009; 9(5):338-47.  Burton AW, Deer TR, Wallace MS, Rauck RL, Grigsby E. Considerations and methodology for trialing ziconotide. Pain Physician. 2010;13(1):23-33. Wallace MS, Rauck RL, Deer T.  Ziconotide combination intrathecal therapy: rationale and evidence. Clin J Pain. 2010;26(7):635-44)。
【０００８】
喫煙依存症は、煙草中のニコチン（ニコチンアミド）により引き起され、体内のその受容体は、ニコチンアセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）である（Azam L, McIntosh JM. Alpha-conotoxins as pharmacological probes of nicotinic acetylecholine receptors. Acta Pharmacol Sin. 2009; 30(6): 771-783.）。多くのｎＡＣｈＲサブタイプは、ニコチン依存症のための薬物作用標的であるのみならず、モルホリン、コカイン等の薬物乱用のための薬物作用標的でもある。
【０００９】
ＮＭＤＡ受容体（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体）は、中枢神経系における重要な興奮性アミノ酸受容体であり、リガンド依存性イオンチャネル型受容体であり、そして広範な生理学的及び薬理学的な重要性を有する。ＮＭＤＡ受容体は、例えば神経細胞の生存の制御、神経細胞の樹状突起及び軸索の構造展開の制御、及びシナプス可塑性の形成への関与などの神経系の発達における重要な生理学的効果を有し；加えて、ＮＭＤＡ受容体はまた、神経回路の形成において極めて重要な役割を果たす。虚血においては、ＮＭＤＡ受容体を活性化すると、細胞外カルシウム流入が生じ、それ故細胞死をもたらす（Twede, V. D., Miljanich, G., Olivera, B. M. & Bulaj, G. Neuroprotective and cardioprotective conopeptides: an emerging class of drug leads. Current opinion in drug discovery & development 2009, 12: 231-239）。ラット試験を介した研究は、ＮＭＤＡ受容体が中枢神経系、例えば脳、脊髄において主に分布しており；ＮＭＤＡ受容体はまた、末梢神経系、においても見出され、例えばＮＲ３Ｂは運動神経細胞において主に発現している一方で、末梢のＮＭＤＡ受容体は、顔面筋肉痛及び水腫化において大変重要な役割を担うことを示す。
【００１０】
研究は、ＮＭＤＡ受容体が学習、記憶、疼痛などのプロセスにおいて、大変重要な受容体であり、難治性疼痛、薬物及びアルコール依存症、てんかん、虚血、パーキンソン病、認知症、興奮性神経細胞死等を含む多くの神経疾患を攻撃する、そして治療の標的となることを示す（Sattler, R. et al. Specific coupling of NMDA receptor activation to nitric oxide neurotoxicity by PSD-95 protein. Science (New York, N.Y.) 1999, 284, 1845-1848.  Lewis, R. J. & Garcia, M. L. Therapeutic potential of venom peptides. Nature reviews. Drug discovery,  2003, 2:  790-802.  Sheng, Z., Liang, Z., Geiger, J. H., Prorok, M. & Castellino, F. J. The selectivity of conatokin-G for ion channel inhibition of NR2B subunit-containing NMDA receptors is regulated by amino acides in the S2 region of NR2B. Neuropharmacology, 2009, 57, 127-136. Meldrum, B. S. The role of glutamate in epilepsy and other CNS disorders. Neurology, 1994,44:S14-23.  Ulas, J. et al. Selective increase of NMDA-sensitive glutamate binding in the striatum of Parkinson's disease, Alzheimer's disease, and mixed Parkinson's disease/Alzheimer's disease patients: an autoradiographic study. The Journal of neuroscience, 1994, 14, 6317-6324. Ozawa, S., Kamiya, H. & Tsuzuki, K. Glutamate receptors in the mammalian centralnervous system. Progress in neurobiology, 1998,54: 581-618. Bisaga, A. & Popik, P. In search of a new pharmacological treatment for drug and alcohol dependence: N-methyl-D-aspartate (NMDA) antagonists. Drug and alcohol dependence,2000, 59: 1-15）。
【００１１】
現在、熱帯海洋に生息する肉食性軟体動物の一種であるイモガイの毒液中に生じるコノトキシン（ＣＴｘ、コノペプチド）は大変に注目されており、ｎＡＣｈＲの様々なサブタイプについての特異的な遮断剤を系統的に研究及び開発するために用いられている。
【００１２】
コノトキシン（コノペプチド、ＣＴｘ）は、通常、７〜５０アミノ酸残基からなり、システイン（Ｃｙｓ）に富んだ神経ペプチド毒素である。コノトキシンは、前駆体タンパク質小胞体標的化配列及びシステインパターンの類似性に従って、様々な遺伝子ファミリーに分類することができる。これまで、全ての既知のコノトキシンは、１８のスーパーファミリー、即ちＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｓ、Ｍ、Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３、Ｊ、Ｌ、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｐ、Ｔ、Ｖ、Ｙに分類することができる（Kaas Q, Yu R, Jin AH, Dutertre S, Craik DJ (2012) ConoServer: updated content, knowledge, and discovery tools in the conopeptide database. Nucleic Acids Res 40: D325-330. Sulan Luo, Sean Christensen, Dongting Zhangsun, Yong Wu, Yuanyan Hu, Xiaopeng Zhu, Sandeep Chhabra, Raymond S. Norton, and J. Michael McIntosh. A Novel Inhibitor of α9α10 Nicotinic acetylcholine receptors from Conus vexillum Delineates a New conotoxin Superfamily. PLoS ONE, 8(1): e54648 (1-10), 2013）。コノトキシン（コノペプチド）は、これらの受容体標的に従って、薬理学的ファミリーα、ω、μ、δ等に分類することができ、ファミリーα（α＊−ＣＴｘ）のコノトキシンはニコチンアセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）を遮断する機能を有し；システインフリーコノペプチドであるコナントキンは、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）を遮断する特異的な機能を有する。受容体の標的型に従って、コノトキシンの各スーパーファミリーをさらに、α、αＡ、κＡ（Ａ−スーパーファミリー）、ω、δ、κ、μＯ（Ｏ−スーパーファミリー）、μ、ψ、κＭ（Ｍ−スーパーファミリー）等の（サブタイプ）に分類することができる。
【００１３】
コノトキシンは、動物の身体において、様々なイオンチャネルに特異的に結合する特異的な機能を有する。現在、コノトキシンは、大変に注目されており、そしてｎＡＣｈＲの様々なサブタイプについての特異的な遮断剤を系統的に研究及び開発するために用いられている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概要
熱心な研究及び創造的な努力の結果、本発明の発明者らは、新しい種類のαＯ−スーパーファミリーコノトキシンペプチドを発見した。発明者らは、驚くべきことに、本発明のαＯ−スーパーファミリーコノトキシンペプチドが、アセチルコリン受容体及びＮＭＤＡ受容体を特異的に遮断することができ、特に、神経痛医薬、乳癌、肺癌の標的として、並びに鎮痛剤の製造における優れた応用可能性、並びに依存症、てんかん又は癌に対する医薬、並びに神経科学におけるツール医薬として、α９α１０  ｎＡＣｈＲを遮断する強力な活性を有することを発見した。従って、以下の発明が提供される。
【００１５】
本発明の１つの態様は、以下の項目（１）〜（３）：
（１）配列番号７〜１２の配列のいずれか１つで示されるアミノ酸配列；
（２）（１）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、特に最も好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列；又は
（３）１〜５、好ましくは１〜３、より好ましくは１〜２、最も好ましくは１のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加において（１）の配列と異なる、アミノ酸配列；
のいずれか１つから選択される、１若しくは複数の同一若しくは異なるアミノ酸配列である、あるいは含む、ポリペプチドに関する。
【００１６】
ここで、配列番号７又は８は、ＧｅＸＩＶＡＷＴと称される野生型前駆体ペプチドであり；配列番号９はこれの成熟ペプチドである。
【００１７】
配列番号１０又は１１は、ＧｅＸＩＶＡと称される突然変異型前駆体ペプチドであり；配列番号１２はこれの成熟ペプチドである。
【００１８】
ＧｅＸＩＶＡ及び野生型ＧｅＸＩＶＡＷＴ前駆体ペプチドは、３つの領域、即ちシグナルペプチド、プロペプチド、及び成熟ペプチドを含み、これらの特定の配列は及びこれらの分析を、実施例１〜２に記載する。野生型成熟ペプチドは偶数個のシステインのパターンを有する既知のコノトキシンとは異なり、５つのシステインを有する、新規のαＯ−スーパーファミリーコノトキシンである。この毒素はα９α１０  ｎＡＣｈＲを遮断する強力な活性を有するので、これは、αＯ−スーパーファミリー（αＯ−コノトキシン）として称される。
【００１９】
本発明の１つの目的のために、２又は複数のアミノ酸配列の同一性は、以下のパラメーター：ｂｌａｓｔａｌｌ  −ｐ  ｂｌａｓｔｐ−ａ４−  ｅ１０−Ｅ０−ｖ５００−ｂ２５０−Ｉ  ［ｑｕｅｒｙ  ｄｏｃｕｍｅｎｔ］−ｄ  ｐｒｏｔ＿ａｌｌ（−ｐはプログラムの名称を表し、−ａはサーバーの名称を表し、−ｅは予測値を表し、−Ｅはエクステンションギャップのコストを表し、−ｖはオンラインディスクリプションの数を表し、−ｂは表示される数を表し、−Ｉはクエリードキュメントを表し、−ｄはクエリーのために用いられるデータベースを表す）を用いて、ＢＬＡＳＴ２．０タンパク質データベースクエリープログラム（Aaltschul et al., 1997, Nuculeic Acid Research 25: 3389-3402）により決定される。
【００２０】
相同なポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号１〜４とのアミノ酸配列の違いのいずれか１つは、１又は複数の、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３、特に最も好ましくは１〜２、最も好ましくは１アミノ酸残基の置換、挿入付加及び／又は欠失にあってもよい。好ましくは、アミノ酸の変更は、特性の小さい変更であり、即ち、これは従来のアミノ酸置換、通常１〜約５、好ましくは１〜３、より好ましくは１アミノ酸の欠失である小さい断片の欠失；小さいアミノ又はカルボキシル末端伸長、例えばアミノ末端に付加されるメチオニン残基、タンパク質のフォールディング及び／又は活性に著しい影響を与えない最大約２０〜２５残基を有する小さいリンカーペプチド；又は小さい伸長、例えば、ポリヒスチジン断片、エピトープ、電荷又は他の機能を変更することにより精製に寄与する結合ドメインである。
【００２１】
何れかの理論に拘束されることなく、保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、小さな形状を有するアミノ酸（アルギニン及びセリンの間）、１塩基においてシステインコドンと異なるアミノ酸（システイン、アルギニン、セリン、トリプトファン、グリシン、チロシン及びフェニルアラニン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）及び小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン及びメチオニン）の中での置換である。通常、特定の活性を変化させないアミノ酸置換は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、"Proteins", H.Neurath and R.L.Hill, 1979, Academic Press, New Yorkに記載される。最も一般的な置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｒｇ／Ｓｅｒ、Ｃｙｓ／Ｓｅｒ、Ａｒｇ／Ｃｙｓ、Ａｒｇ／Ａｌａ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ及びＡｓｐ／Ｇｌｙ等及びその逆の置換である。
【００２２】
本発明は、αＯ−コノトキシンのＮ末端及び／又はＣ末端が他のペプチド／ポリペプチドと融合された、融合ポリペプチド又は溶解可能な（lysable）融合ポリペプチドをさらに含む。融合ポリペプチドを作成するための技術は、当該技術分野において知られており、それらが１つのリーディングフレーム中に存在し、そして融合ポリペプチドの発現が同一のプロモーター及びターミネーターにより制御されるように、本発明のペプチドをコードするコーディング配列を他のペプチド／ポリペプチドをコードするコーディング配列と連結させることを含む。
【００２３】
本発明の任意の項目に記載のポリペプチドにおける、配列番号１２のＮ末端において、１番目のシステインと２番目のシステインがジスルフィド結合を形成し、そして３番目のシステインと４番目のシステインがジスルフィド結合を形成するか；あるいは１番目のシステインと３番目のシステインがジスルフィド結合を形成し、そして２番目のシステインと４番目のシステインがジスルフィド結合を形成するか；あるいは１番目のシステインと４番目のシステインがジスルフィド結合を形成し、そして２番目のシステインと３番目のシステインがジスルフィド結合を形成し；具体的には、前記ポリペプチドのカルボキシル末端は遊離のＣ末端であるかアミド化されている。
【００２４】
本発明のポリペプチドは、コノトキシンペプチドであり；具体的には、αＯ−コノトキシンである。
【００２５】
コノトキシンペプチドは、中国の海南省において産生されるアカシマミナシガイ（Conus C. generalis）から抽出してもよく、あるいはその遺伝子に由来する成熟ペプチド配列であり；あるいは化学的合成のアミノ酸（例えば実施例３の方法）でもよく；あるいは遺伝子組み換えを介したそのヌクレオチドを発現することにより（前記ヌクレオチド配列は、実施例１〜２の方法又は直接的な人工的合成により調製することができる）；あるいは以下の方法を参照することにより、得られるポリペプチドでもよい。本発明の別の態様は、以下の工程：
１）Ｆｍｏｃアミノ酸の側鎖保護基はＰｍｃ（Ａｒｇ）、Ｔｒｔ（Ｃｙｓ）、Ｂｕｔ（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ）、ＯＢｕｔ（Ａｓｐ）、Ｂｏｃ（Ｌｙｓ）であり；システインは保護基としてＴｒｔ又はＡｃｍで保護されており、ジスルフィド結合は対応するシステイン間で部位特異的な方法においてそれぞれ形成され；又は全てのシステインがランダムに酸化及びフォールディングの一工程方法を介してＴｒｔ保護基とジスルフィド結合を形成する、ABI Prism 433aポリペプチド合成装置又は手動の方法により線形ポリペプチドを合成し、
２）線形ポリペプチドの粗生成物を沈殿及び洗浄及び回収するために、氷−エーテルを用い、そして精製のための分取用逆相ＨＰＬＣ  Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）を用いて、工程１）の線形ポリペプチドをレジンから切り出すこと、
３）工程２）において得られた生成物を２工程又は１工程酸化的フォールディングに供すること
を含む、本発明のペプチドのいずれか１つを調製するための方法に関する。
【００２６】
本発明の別の態様は、本発明の項目のいずれか１つのポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００２７】
本発明の項目のいずれか１つのポリヌクレオチドは、以下の項目（１）〜（３）：
（１）配列番号１〜６のいずれか１つの配列に示されるようなヌクレオチド配列；
（２）配列番号１〜６のいずれか１つの配列の相補的配列；又は
（３）ストリンゲジェントな条件下で（１）又は（２）のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列
のいずれか１つから選択される１又は複数の同一又は異なったヌクレオチド配列を含む。
【００２８】
配列番号１〜６は、配列番号７〜１２の配列を別々にコードしている。
【００２９】
ここで、配列番号１又は２は、ＧｅＸＩＶＡＷＴとして称される野生型前駆体ペプチドをコードし；配列番号３はこれの成熟ペプチドをコードする。
【００３０】
配列番号４又は５は、ＧｅＸＩＶＡとして称される突然変異型前駆体ペプチドをコードし；配列番号６はこれの成熟ペプチドをコードする。
【００３１】
配列番号１〜６の特定の配列及びこれらの分析は、実施例１〜２に記載される。
【００３２】
ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションに関しては、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, Edition 2, Sambrook, etc., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, 1989を含む、当該技術分野における多くの文献を参考にすることができる。ハイブリダイゼーションは、様々な程度のストリンジェントな条件、例えば、中程度にストリンジェントな条件、やや高度にストリンジェントな条件、又は高度にストリンジェントな条件を用いることができる。よりストリンジェントな条件は、二重らせんを形成するために要求される、より高度な相補的な程度である。ストリンジェントの程度は、温度、プローブ濃度、プローブ長、イオン強度、時間等により調整することができる。二重鎖ＤＮＡについて、ハイブリダイゼーションは、６Ｘ  ＳＳＰＥ、５Ｘ  デンハルト液、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍ変性ＤＮＡ中で、一晩、ＤＮＡヘテロ接合体の融点［Ｔｍ］より２０〜２５℃低い温度において行なわれる。洗浄は、通常、以下：０．２Ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で、Ｔｍ−２０℃において１回、１５分間（中程度にストリンジェントな条件下での洗浄）のように行なわれる。
【００３３】
本発明のさらに別の態様は、配列番号１３及び配列番号１４に示されるようなヌクレオチド配列である、あるいは含む、プライマー対に関する。前記プライマー対は、配列番号１又は配列番号２に示されるようなポリヌクレオチド配列を得るために、ＰＣＲ増幅に用いることができる。
【００３４】
本発明のさらに別の態様は、本発明の項目のいずれか１つのポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトに関する。
【００３５】
本発明のさらに別の態様は、本発明の核酸コンストラクトを含む組み換え発現ベクターに関し；具体的には、前記組み換えベクターは組み換えｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターである。
【００３６】
本発明のさらに別の態様は、本発明の組み換え発現ベクターを含む形質転換細胞に関し；具体的には、前記形質転換細胞は形質転換されたＳｆ９細胞である。
【００３７】
本発明のさらに別の態様は、本発明の項目のいずれか１つのポリペプチドを含む融合タンパク質に関する。
【００３８】
本発明のさらに別の態様は、本発明の項目のいずれか１つのポリペプチド、又は本発明の融合タンパク質を含み；任意で、医薬的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む、医薬組成物に関する。
【００３９】
本発明の更なる態様は、有効量の本発明の項目のいずれか１つのポリペプチド又は融合タンパク質を用いる工程を含む、アセチルコリン受容体及びＮＭＤＡ受容体を遮断する方法に関し；具体的には、前記アセチルコリン受容体はα９α１０アセチルコリン受容体、又は他のアセチルコリン受容体サブタイプ及びＮＭＤＡ受容体である。
【００４０】
本発明の更なる態様は、アセチルコリン受容体及びＮＭＤＡ受容体をスクリーニングする、あるいはアセチルコリン受容体及びＮＭＤＡ受容体のサブタイプを決定するための方法であって、前記方法は、候補化合物の存在又は不在下において、アセチルコリン受容体又はＮＭＤＡ受容体サブタイプと、本発明の項目のいずれか１つのポリペプチド又は融合タンパク質とを接触させる工程を含み；具体的には、前記アセチルコリン受容体はα９α１０アセチルコリン受容体であり；又は前記ＮＭＤＡ受容体はＮＲ２Ｃ  ＮＭＤＡ受容体である、方法に関する。αＯ−コノトキシンＧｅＸＩＶＡが大変に低濃度においてα９α１０アセチルコリン受容体を特異的に遮断することができる場合、アセチルコリン受容体はα９α１０サブタイプアセチルコリンであると決定することができ；あるいはαＯ−コノトキシンＧｅＸＩＶＡが比較的低濃度においてＮＲ２Ｃ  ＮＭＤＡ受容体を特異的に遮断することができる場合、ＮＭＤＡ受容体がＮＲ２Ｃ  ＮＭＤＡ受容体であると決定することができる。
【００４１】
本発明の更なる態様は、アセチルコリン受容体及びＮＭＤＡ受容体の遮断における、本発明の項目のいずれか１つのポリペプチド又は融合タンパク質の使用に関し；具体的には、前記アセチルコリン受容体はα９α１０アセチルコリン受容体若しくは他のアセチルコリン受容体サブタイプ；又はＮＲ２Ｃ  ＮＭＤＡ受容体若しくは他のサブタイプである。
【００４２】
本発明の更なる態様は、アセチルコリン受容体及びＮＭＤＡ受容体を遮断するための医薬又は試薬の製造における、本発明の項目のいずれか１つのポリペプチド又は融合タンパク質の使用に関し、具体的には、前記アセチルコリン受容体はα９α１０アセチルコリン受容体、及びＮＲ２Ｃ  ＮＭＤＡ受容体である。
【００４３】
本発明の更なる態様は、神経系疾患、例えば神経痛、乳癌、肺癌、依存症、てんかん、虚血、パーキンソン病、認知症又は興奮性神経細胞死の治療又は予防のための医薬の製造における、本発明の項目のいずれか１つのポリペプチド又は融合タンパク質の使用、あるいは害虫（例えば、ヨトウガ（Spodoptera Frugiperda））の殺滅、鎮痛、禁煙又は依存症の治療のための薬剤の製造における使用であって；具体的には、前記神経痛は、以下の因子：癌及び癌の化学療法、アルコール依存症、坐骨神経痛、糖尿病、三叉神経痛、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷及び外科的損傷、ＡＩＤＳ、頭部神経麻痺、薬物中毒、産業公害中毒、リンパ神経痛、骨髄腫、マルチポイントモーター神経痛（multipoint motor neuralgia）、慢性先天性感覚神経症、急性自発神経痛、圧迫するような神経痛、血管炎、脈管炎、虚血、尿毒症、小児の胆汁性肝疾患、慢性呼吸器疾患、複合的な神経痛、多臓器不全、敗血症／膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、高脂血症、ハンセン病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、アレルギー等により引き起される。
【００４４】
本発明の更なる態様は、神経系疾患、例えば神経痛、乳癌、肺癌、依存症、てんかん、虚血、パーキンソン病、認知症若しくは興奮性神経細胞死の治療及び／又は予防及び／又は補助療法のための方法、あるいは害虫（例えば、ヨトウガ（Spodoptera Frugiperda））の殺滅、鎮痛、禁煙、又は依存症の治療のための方法であって、有効量の本発明のポリペプチド（コノトキシンペプチド若しくはこれらのプロペプチド）若しくは融合タンパク質、又は本発明の医薬組成物を投与する工程を含み、具体的には、前記神経痛は、以下の理由：癌及び癌の化学療法、アルコール依存症、坐骨神経痛、糖尿病、三叉神経痛、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷及び外科的損傷、ＡＩＤＳ、頭部神経麻痺、薬物中毒、産業公害中毒、リンパ神経痛、骨髄腫、マルチポイントモーター神経痛、慢性先天性感覚神経症、急性自発神経痛、圧迫するような神経痛、血管炎、脈管炎、虚血、尿毒症、小児の胆汁性肝疾患、慢性呼吸器疾患、複合的な神経痛、多臓器不全、敗血症／膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、高脂血症、ハンセン病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、アレルギー等により誘導される。
【００４５】
本発明のコノトキシンペプチドは、α９α１０アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）又は／及びＮＲ２Ｃ  ＮＭＤＡ受容体と結合することにより、効果を発揮することができ、そして鎮痛作用を有し、神経系疾患、例えば神経痛、乳癌、肺癌、パーキンソン病、認知症、依存症、てんかん、虚血の研究、診断及び／又は治療のために、そして研究における有用な分子プローブとして用いることができる。脊椎動物（vertebrate）受容体に対する様々なα  ＣＴｘのアフィニティーは、例えば、桁が幾つか異なるなど、大変に多様である。生殖細胞系におけるかかる多様性により、α  ＣＴｘは、脊椎動物の系統発生を研究するための有用なプローブとして用いられ、あるいはｎＡｃｈＲサブタイプを決定するための分子プローブとして用いられる。これらは、新規薬物の開発における、候補薬物、基礎的な薬物、及び治療薬である。
【００４６】
本発明に用いられる用語を、以下に説明する。
【００４７】
神経痛
本発明のポリペプチドは、様々な神経痛の治療のための使用に関する。神経痛は、末梢若しくは中枢神経系の一次若しくは二次疾患、又は機能性疾患、又は一過性疾患により引き起され、自発性疼痛、感覚過敏性等として現れる。神経痛は、癌及び癌の化学療法、アルコール依存症、坐骨神経痛、糖尿病、三叉神経痛、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷及び外科的損傷、ＡＩＤＳ、頭部神経麻痺、薬物中毒、産業公害中毒、リンパ神経痛、骨髄腫、マルチポイント神経痛、慢性先天性感覚神経症、急性自発神経痛、圧迫するような神経痛、血管炎、脈管炎、虚血、尿毒症、小児の胆汁性肝疾患、慢性呼吸器疾患、複合的な神経痛、多臓器不全、敗血症／膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、高脂血症、ハンセン病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、アレルギー等を含む、多くの疾患より引き起される疼痛である。
【００４８】
核酸コンストラクト
本発明は、さらに、本発明の核酸配列、及びそれに作動式に連結される１又は複数の制御配列を含み、前記制御配列は、これらの適合する条件下で、好適な宿主細胞中で発現するためのコーディング配列を導く、核酸コンストラクトに関する。前記発現は、限定することなく、転写、転写後修飾、翻訳、修飾、及び翻訳後分泌を含むポリペプチドの生産に関する任意の工程を含むことは理解されるべきである。
【００４９】
本明細書において、「核酸コンストラクト」は、天然の遺伝子から分離された一本鎖又は二本鎖核酸分子として定義され、修飾により非天然の態様において組み合わされ、且つ配置された核酸断片を含む。前記核酸コンストラクトが本発明のコーディング配列を発現するために必要な全ての制御配列を含む場合、用語「核酸コンストラクト」は、発現カセットと同一の意味を有する。本明細書において、用語「コーディング配列」は、タンパク質生成物のアミノ酸配列を直接的に決定するための核酸配列の一部として定義される。コーディング配列の境界は、通常、ｍＲＮＡ５’末端のオープンリーディングフレーム上流に密接する（原核細胞に対応する）リボソーム結合部位、及びｍＲＮＡ３’末端のオープンリーディングフレーム下流に密接する転写終結配列により決定される。コーディング配列は、限定することなく、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び組み換え核酸配列を含むことができる。
【００５０】
本発明のペプチドをコードする分離された核酸配列は、ペプチドを発現するように多くの方法で操作することができる。発現ベクターに依存して、前記核酸配列は、必要であれば、ベクターへの挿入の前に処理され得る。組み換えＤＮＡ法を用いた核酸配列を修飾する技術は、当該技術分野においてよく知られている。
【００５１】
本明細書において、用語「制御配列」は、本発明のペプチドの発現に必須の全ての要素、あるいは貢献する全ての要素として定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列中に生来存在する、あるいは外来的に付加される。これらの制御配列としては、限定することなく、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナル配列及び転写終結因子が挙げられる。最低限度、制御配列は、転写及び翻訳のためのプロモーター及び終結因子を含むべきである。制御配列と連結するための特異的な制限酵素認識部位を、ポリペプチドをコードする核酸配列のコーディング領域に導入するために、コネクターを有する制御配列が提供されてもよい。本明細書において、用語「作動式に連結される」とは、制御配列がポリペプチドの発現を導くように、前記制御配列が、ＤＮＡ配列に対応するコーディング配列の好適な位置に存在する配置を意味する。
【００５２】
前記制御配列は、任意の好適なプロモーター配列、即ち、核酸配列を発現する宿主細胞により認識され得る核酸配列であってもよい。前記プロモーター配列は、ポリペプチド発現を調整する転写制御配列を含む。前記プロモーターは、例えば突然変異誘発された、切断された、及びハイブリダイズされたプロモーターを含む、選択された宿主細胞中で転写活性を有する任意の核酸配列でもよく、宿主細胞と同種の又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られてもよい。
【００５３】
前記制御配列は、さらに、好適な転写終結配列、即ち、転写を終結させるように、宿主細胞において認識され得る配列でもよい。前記終結配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動式に連結される。選択された宿主細胞においてかかる機能を有する任意の終結因子を、本発明において用いることができる。
【００５４】
前記制御配列は、さらに、好適なリーダー配列、即ち、宿主細胞の翻訳に大変重要なｍＲＮＡ非翻訳領域でもよい。前記リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動式に連結される。選択された宿主細胞において機能を発揮することができる任意のリーダー配列を、本発明において用いることができる。
【００５５】
前記制御配列は、さらに、シグナルペプチドのコーディング領域でもよく、そして前記領域は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞分泌経路に導くことができる。核酸配列のコーディング領域の５’末端は、翻訳リーディングフレームに一致したシグナルペプチドコーディング領域を本来含み、そして分泌されたポリペプチドのコーディング領域に本来連結される。あるいは、コーディング領域の５’末端は、コーディング配列に対して、外来のシグナルペプチドコーディング領域を含んでもよい。コーディング配列が通常の条件下でシグナルペプチドコーディング領域を含まない場合、外来のシグナルペプチドコーディング領域が付加されてもよい。あるいは、外来のシグナルペプチドコーディング領域は、ポリペプチドの分泌を増大させるように、生来のシグナルペプチドコーディング領域を単に置換するために用いられてもよい。しかしながら、発現されたポリペプチドを、用いられる宿主細胞の分泌経路への移行を導くことができる任意のシグナルペプチドコーディング領域を、本発明において用いることができる。
【００５６】
前記制御配列は、さらに、プロペプチドコーディング領域でもよく、前記領域はポリペプチドのアミノ末端におけるアミノ酸配列をコードする。得られたポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチドと称される。前記プロポリペプチドは、通常、活性を有さず、触媒又は自己触媒によりプロポリペプチドからプロペプチドを切断することにより、成熟活性ポリペプチドに変換される。
【００５７】
ポリペプチドのアミノ末端がシグナルペプチド及びプロペプチドの両者を有する場合、プロペプチドは、アミノ末端に隣接する一方で、シグナルペプチドは、プロペプチドのアミノ末端に隣接する。
【００５８】
宿主細胞の増殖条件に従ってポリペプチド発現を制御することができる制御配列を付加することが必要であってもよい。制御系の例としては、遺伝子発現を開始又は終了するために、（制御化合物を有する条件において誘導される）化学的又は物理的刺激に応答することができる系である。制御配列の他の例は、遺伝子を増幅することができる制御配列である。これらの例において、ポリペプチドをコードする核酸配列は、制御配列に作動式に連結されるべきである。
【００５９】
発現ベクター
本発明は、さらに、本発明の核酸配列、並びに転写及び翻訳のためのプロモーター及びターミネーターを含む組み換え発現ベクターに関する。上記核酸及び制御配列は、組み換え発現ベクターを調製するために一緒に連結され得、そして前記ベクターは、前記ポリペプチドをコードする核酸配列をこれらの部位において挿入又は置換することができるような、１又は複数の便利な制限酵素部位を含んでもよい。あるいは、核酸配列又は前記配列を含む核酸コンストラクトは、本発明の核酸配列を発現するために、好適な発現ベクターに挿入されてもよい。前記発現ベクターが調製される場合、前記コーディング配列は、好適な発現制御配列に作動式連結されるように、ベクター中に存在してもよい。
【００６０】
前記組み換え発現ベクターは、組み換えＤＮＡ操作を行なうことができ、核酸を発現することができる任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）でもよい。ベクターの選択は、通常、ベクターと、ベクターが導入される宿主細胞の適合性に依存する。前記ベクターは、線形又は環状プラスミドでもよい。
【００６１】
前記ベクターは、自己複製することができるベクター（即ち、染色体から独立して複製することができる染色体外の完全なコンストラクト）、例えばプラスミド、染色体外要素、微小染色体又は人工染色体でもよい。前記ベクターは、自己複製を確実にする任意の機構を含んでもよい。あるいは、前記ベクターは、前記ベクターが宿主細胞に導入される場合、ゲノムに統合され、それに統合される染色体と一緒に複製されるベクターである。加えて、用いられるベクターは、１つのベクター又はプラスミドでもよく、あるいは、一般的に、２又はそれ以上の宿主細胞ゲノム又はトランスポゾンに導入される全ＤＮＡのベクター又はプラスミドを含んでもよい。
【００６２】
好ましくは、本発明のベクターは、形質転換細胞を選択するのに簡便な１又は複数の選択マーカーを含む。前記選択マーカーは、殺生物剤に対する抵抗性、重金属に対する抵抗性を提供するか、あるいは栄養素要求株原栄養性（auxotroph prototrophy）を提供する、かかる遺伝子である。細菌の選択マーカーの例は、バチルス・サブチリス（bacillus subtilis）又はバチラス・リケニホルミス（bacillus licheniformis）のｄａｌ遺伝子であり、耐性マーカーとしてはアンピシリン、カナマイシン、クロロマイシン又はテトラサイクリンが挙げられる。
【００６３】
好ましくは、本発明のベクターは、宿主細胞のゲノムに安定的に統合されるベクターを確実にする、あるいは細胞中の細胞ゲノムから独立して自己複製されるベクターを確実にする要素を含む。
【００６４】
自己複製に関して、前記ベクターが宿主細胞において自己複製できるように、前記ベクターは、さらに複製起源を含む。前記複製起源は、宿主細胞において、温度感受性タイプとなる、突然変異を有してもよい（例えば，fEhrlich, 1978, National Academy of Sciences, 75:1433を参照のこと）。
【００６５】
本発明の核酸配列の１超のコピーは、遺伝子産物の生産を増加させるために、宿主細胞に挿入されてもよい。核酸配列のコピー数は、少なくとも１つの更なる配列のコピーを宿主細胞のゲノムに挿入することにより、あるいは増幅選択マーカーとともに核酸配列を挿入し、好適な選択的な試薬の存在下で細胞を培養し、コピー増幅のための選択マーカー遺伝子を有し、それにより核酸の更なるコピーを有する細胞を選択することにより、増加させることができる。
【００６６】
本発明の組み換え発現ベクターを構築するための上記要素と連結するための工程は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Edition 2, Sambrook, etc., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, 1989を参照のこと）。
【００６７】
宿主細胞
本発明はさらに、ポリペプチドの組み換え産物のための、本発明の核酸配列を含む組み換え宿主細胞に関する。本発明の核酸配列を含むベクターは、前記ベクターが上記の染色体の統合された体（body）又は自己複製可能な染色体外ベクターの形態において維持されるように、宿主細胞に導入することができる。用語「宿主細胞」は、複製期間の突然変異により、親細胞と異なる任意の子孫（offspring）を網羅する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドコーディング遺伝子及びそれらの起源に主に依存する。
【００６８】
前記宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞、例えば細菌又は酵母菌でもよい。前記ベクターは、当該技術分野においてよく知られている技術により、宿主細胞に導入することができる。
【００６９】
調製方法
本発明はさらに、本発明のペプチドの組み換え生産のための方法であって、（ａ）ペプチドを生産するのに好適な条件下で核酸コンストラクトを有する宿主細胞を培養すること、ここで前記核酸コンストラクトは前記ペプチドをコードする核酸配列を含む；及び前記ペプチドを回収することを含む、方法に関する。
【００７０】
本発明の調製方法において、前記細胞は、当該技術分野において知られている方法により、ポリペプチド生産に好適な栄養培地中で培養される。例えば、前記細胞は、ポリペプチド発現及び／又は分離を可能にする条件下で、好適な培養培地中で、振盪フラスコ培養、実験室培養、工業的な発酵タンク中での小又は大スケール発酵（連続型、バッチ型、バッチ投入型、又は固相発酵型を含む）により培養される。前記培養は、炭素源及び窒素源及び無機塩類を含む好適な培養培地中で、当該技術分野において知られている工程により行なうことができる。好適な培養培地は、供給者から提供されてもよく、あるいは当該技術分野において知られている組成（例えば、American Type Culture Collectionのカタログ中のもの）に従って調製されてもよい。前記ポリペプチドが培養中に分泌される場合、前記ポリペプチドを、培養培地から直接回収することができる。前記ポリペプチドが外側に分泌される場合、これを、細胞溶解液から回収することができる。
【００７１】
生産されたポリペプチドは、当該技術分野において知られている方法により回収することができる。例えば、前記ポリペプチドは、従来の工程（限定することなく、遠心分離、濾過、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿を含む）により培養培地から回収することができる。
【００７２】
本発明のポリペプチドは、当該技術分野において知られている工程により精製することができ、これらの工程としては、限定することなく、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、クロマト分画（chromatofocusing）及びサイズ排除クロマトグラフィー）、ＨＰＬＣ、電気泳動（例えば、分取用等電点電気泳動分画）、異なる溶解性（例えば硫酸アンモニュウム沈殿法）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は抽出（例えば、Protein Purification, edited by J.C.Janson and Lars Ryden, VCH Publishers, New York, 1989を参照のこと）が挙げられる。
【００７３】
害虫駆除のための方法及び調製
当業者によりよく知られている多くの方法は、本発明のコノトキシンペプチド又はポリヌクレオチドで害虫を駆除するために用いることができる。これらの方法としては、例えば、害虫（又はこれらの場所）に組み換え微生物を施用すること、及び本発明のコノトキシンペプチドをコードする遺伝子で植物を形質転換することを含む。形質転換は、当業者に知られる従来の方法により行なうことができる。かかる形質転換のために必要な物質は、本明細書において開示されるか、あるいは当業者による他の経路により容易に得ることができる。
【００７４】
コノトキシンペプチド又は本発明のポリヌクレオチドの組み換え微生物を含む調製物を、土壌に施用することができる。調製された生成物を、植物増殖サイクルの後期において、種子被覆、又は根の処理、又は植物全体への施用のためにさらに用いることができる。前記調製物は、散布濃縮アジュバンド（diffusion-thickening adjuvant）、安定化剤、他の殺虫剤添加物、又は界面活性剤を含んでもよい。液体調製物は、水性、又は非水性でもよく、泡状、ゲル、懸濁液、乳化可能な濃縮物の形態において用いてもよい。成分は、レオロジー剤、界面活性剤、乳化剤、分散剤、又はポリマーを含んでもよい。
【００７５】
当業者は、前記殺虫剤は、特定の調製物の性質のために、広く変化する濃度を有しうること、特に、それが濃縮物であってもよく、あるいは直接用いられてもよいことを理解する。殺虫剤は、少なくとも１重量％、又は１００重量％の量でもよい。乾燥調製物は、通常、殺虫剤の約１〜９５重量％を有する一方で、液体調製物は、通常、液相中の約１〜６０重量％の固体含量を有する細胞を含有する。調製物は、通常約１０２〜約１０４細胞／ｍｇを有する。これらの調製物は、１へクタールあたり、５０ｍｇ（液体又は乾燥）〜１ｋｇ／へクタールの量で施用され得る。前記調製物は、害虫環境、例えば土壌及び植物に、噴霧、散布又は飛沫により施用することができる。
【００７６】
医薬組成物
本発明は、さらに、本発明のペプチド、並びに医薬的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。前記医薬組成物は、神経痛、乳癌、肺癌、精神薄弱、依存症、疼痛、パーキンソン病、精神疾患、鬱病、重症筋無力症、てんかん、虚血等に関する疾患又は障害の研究、診断、緩和又は治療するために用いることができる。１つの実施形態においては、治療的有効量の本発明のペプチドを含む医薬組成物は、調製され、そして医薬適用を容易にする方法において投与され、そして患者個人の臨床状態、送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医者により知られている他の要因は考慮されるべきである。従って、本明細書における目的のための「有効量」とは、これらの態様において考慮しつつ決定される。
【００７７】
本発明の治療的有効量のペプチドを含む医薬組成物を、非経口、経口、嚢内、髄腔内に投与することができる。「医薬的に許容される担体」とは、非毒性固体、半固体若しくは液体充填剤、希釈剤、カプセル剤又は任意の種類の製剤アシスタントを意味する。本明細書において、用語「非経口的に」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸腔内、皮下、髄腔内及び関節内注射又は注入を含む投与方法を意味する。本発明のポリペプチドが、持続放出系により投与されてもよい。
【００７８】
本発明はさらに、ｎＡＣｈＲ及び／又はＮＭＤＡ受容体を特異的に遮断するための医薬組成物に関する。
【００７９】
本発明のコノトキシンペプチドは、動物のｎＡＣｈＲ及び／又はＮＭＤＡＲの系統発生を研究するためのプローブとして；ｎＡＣｈＲ又は／及びＮＭＤＡＲの様々なサブタイプを決定するためのプローブとして；新規薬物を設計するための分子モデルとして；神経疾患、例えばパーキンソン病、統合運動障害、総合失調症、てんかん、虚血の研究及び／又は診断のためのツール薬物及び治療薬物して；神経痛、依存症、乳癌、肺癌、小細胞肺癌、てんかん、虚血の治療のための候補薬物として；又は新しい種類のバイオ殺虫剤を開発するためのポリペプチド殺虫剤として用いることができる。
【００８０】
本発明の副作用
本発明のαＯ−コノトキシンペプチドは、アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）及びＮＭＤＡ受容体を特異的に遮断することができ、鎮痛作用、及び乳癌及び肺癌細胞の増殖を阻害するための機能、並びに依存症、てんかん及び虚血の治療のための機能を有する。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
注釈：様々なｎＡＣｈＲ及びＮＭＤＡ受容体サブタイプの起源が図面中に与えられない場合、これらは全て、対応するラット受容体であり、ラット受容体種の起源は、凡例及び図面において省略される。
【００８２】
【図１】図１は、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ成熟ペプチド配列（配列番号１）、及び３つの可能性のあるジスルフィド結合連結方法を有する異性体：ＧｅＸＩＶＡ１２は、Ｉ−ＩＩ、ＩＩＩ−ＩＶのジスルフィド結合連結方法を有し；ＧｅＸＩＶＡ１３は、Ｉ−ＩＩＩ、ＩＩ−ＩＶのジスルフィド結合連結方法を有し；ＧｅＸＩＶＡ１４は、Ｉ−ＩＶ、ＩＩ−ＩＩＩのジスルフィド結合連結方法を有する、を示す。
【００８３】
【図２−１】図２は、α９α１０  ｎＡＣｈＲの電流に関する３３ｎＭ  αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２の影響を示す。ダイアグラムＡにおいて、「Ｃ」とは、対照電流を表し、矢印は、３３ｎＭ  αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２を５分間インキュベート後に１秒のＡｃｈパルス時間を用いた最初のＡｃｈパルスにより形成される電流軌道（〜０ｎＡ）を示し；縦軸は、ｎＡの単位で電流強度を表し、横軸は、ｍｓの単位での累積時間を表し、任意の２つの隣接した電流軌道間の時間間隔は、インキュベーションの前後６０秒である。３３ｎＭαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２は、α９α１０  ｎＡＣｈＲ電流を完全に遮断し、そして溶出は大変迅速である。図において、Ｂ、Ｃ、Ｄは別々に、α９α１０  ｎＡＣｈＲに対する、３つの異性体であるαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４の濃度用量応答曲線を表す。ダイアグラムＢ、Ｃ、Ｄにおいて、横軸はαＯ−ＧｅＸＩＶＡ異性体のモル濃度（Ｍ）のログ値（Ｌｏｇ［毒素濃度］Ｍ）を表し；縦軸は用量応答パーセンテージ（％応答）を表し、これは、対応する濃度の毒素の作用下で、対照電流に対するアセチルコリン受容体電流の比率パーセンテージであり、各用量応答パーセンテージは、６〜１２のフリカツメガエル卵母細胞のデータの平均値（mean）であり、曲線は、同時に標準偏差（ＳＥＭ）を示す。
【図２−２】同上
【００８４】
【図３−１】図３は、他のｎＡＣｈＲサブタイプに対するαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２の濃度用量応答曲線（Ａ〜Ｅ）を示す。図において、横軸は、用いられるαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２のモル濃度（Ｍ）のログ値（Ｌｏｇ［毒素濃度］Ｍ）であり；縦軸は、用量応答パーセンテージ（％応答）であり、これは、対応する濃度の毒素の作用下で、対照電流に対するアセチルコリン受容体電流の比率パーセンテージであり、各用量応答パーセンテージは、６〜１２のアフリカツメガエル卵母細胞のデータの平均値（mean）であり、曲線は、同時に標準偏差（ＳＥＭ）を示す。図は、対応するｎＡＣｈＲサブタイプ及び前記サブタイプに対する半数遮断濃度（ＩＣ５０）を示す。αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２は、α＊β４及びα＊β２  ｎＡＣｈＲの遮断における多様な活性を示し、α＊β４  ｎＡＣｈＲのものよりも著しく高いα＊β２  ｎＡＣｈＲを遮断する活性を有し、そしてマウス筋肉型ｎＡＣｈＲ（Ｍα１β１δε）及びα７  ｎＡＣｈＲサブタイプの遮断において同様の活性を有する。
【図３−２】同上
【００８５】
【図４】図４は、従来のＮＤ９６潅流液が、バリウムイオンＮＤ９６潅流液（Ｂａ＋＋−ＮＤ９６）と置き換えられる場合における、α９α１０  ｎＡＣｈＲに対する、３つの異性体であるαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、ＧｅＸＩＶＡ１３及びＧｅＸＩＶＡ１４の濃度用量応答曲線を示し、横軸は、用いられる３つのαＯ−ＧｅＸＩＶＡ異性体のモル濃度（Ｍ）のログ値（Ｌｏｇ［毒素濃度］Ｍ）を表し；縦軸は、用量応答パーセンテージ（％応答）であり、これは、対応する濃度の毒素の作用下で、対照電流に対するアセチルコリン受容体電流の比率パーセンテージであり、各用量応答パーセンテージは、９のアフリカツメガエル卵母細胞のデータの平均値（mean）であり、曲線は、同時に標準偏差（ＳＥＭ）を示す。図は、対応する異性体のα９α１０  ｎＡＣｈＲサブタイプに対する半数遮断濃度（ＩＣ５０）も示す。
【００８６】
【図５】図５は、様々なＮＭＤＡ受容体サブタイプに対するαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２の濃度用量応答曲線を示し、横軸は、用いられるαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２のモル濃度（Ｍ）のログ値を表し；縦軸は、用量応答パーセンテージ（％応答）であり、これは、対応する濃度の毒素の作用下で、対照電流に対するＮＭＤＡ受容体電流の比率パーセンテージであり、各用量応答パーセンテージは、３〜５のアフリカツメガエル卵母細胞のデータの平均値（mean）であり、曲線は、同時に９５％信頼区間の標準偏差（ＳＥＭ）を示す。図は、対応するＮＭＤＡＲサブタイプの前記サブタイプに対する半数遮断濃度（ＩＣ５０）も示す。
【００８７】
【図６−１】図６は、様々な他のサブタイプのｎＡＣｈＲ受容体に対する３つの異性体である、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３及びαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４の濃度用量応答曲線（Ａ〜Ｊ）を示し、ここで記号は図３と同様の意味を有する。
【図６−２】同上
【図６−３】同上
【図６−４】同上
【００８８】
【図７−１】図７は、サブタイプに関連するヒトｎＡＣｈＲ受容体に対する、３つの異性体であるαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３及びαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４の濃度用量応答曲線（Ａ〜Ｆ）を示し、ここで記号は図３と同様の意味を有する。
【図７−２】同上
【００８９】
【図８−１】図８は、様々な突然変異型のラットα９α１０  ｎＡＣｈＲ受容体に対する、３つの異性体であるαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３及びαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４の濃度用量応答曲線（Ａ〜Ｋ）を示し、ここで記号は図３と同様の意味を有する。
【図８−２】同上
【図８−３】同上
【図８−４】同上
【００９０】
【図９】図９は、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２が、α９α１０  ｎＡＣｈＲを遮断後に、α９α１０  ｎＡＣｈＲに関するα−ＣＴｘ  ＲｇＩＡ［Ｓ４Ｔ；Ｒ９Ｃｉｔ；Ｙ１０Ｉｏｄｏ，Ｒ１１Ｑ］の遮断作用を妨害することができ、これは、これらが様々な部位においてα９α１０  ｎＡＣｈＲと結合することを確実にする。Ａ．１μＭ  αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２  ５分；Ｂ．２０ｎＭ  α−ＣＴｘ  ＲｇＩＡ［Ｓ４Ｔ；Ｒ９Ｃｉｔ；Ｙ１０Ｉｏｄｏ，Ｒ１１Ｑ］５分；Ｃ．１μＭ  αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２  １分＋［１μＭ  αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２＋２０ｎＭ  α−ＣＴｘ  ＲｇＩＡ［Ｓ４Ｔ；Ｒ９Ｃｉｔ；Ｙ１０Ｉｏｄｏ，Ｒ１１Ｑ］５分］。
【００９１】
【図１０】図１０は、Ｓｆ９細胞に関する、組み換えαＯ−スーパーファミリーコノトキシン野生型ＧｅＸＩＶＡＷＴ（ｒＣＴｘ−Ｋ４１）の阻害作用を示し、横軸は、μｇ／ｍｌのユニットを有する組み換えＧｅＸＩＶＡＷＴの濃度であり、縦軸は、波長４９０ｎｍにおいて酵素標識されたイムノアッセイ装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＭＯＤＥＬ  ５５０）により測定された光吸収値である。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
本発明を実施するための特定の態様
本発明の実施形態は、以下の実施例と組み合わせて説明される。当業者は、以下の実施例が、本発明の範囲を限定するためというよりはむしろ、単に本発明を説明するために用いられることを理解する。本明細書に与えられない特定の技術又は条件は、参考文献又は明細書に対応する当該技術分野における文献（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Edition 3, J. Sambrook, etc., translated by HUANG Peitang, etc., Science Press）に記載される技術又は条件に従って実施される。製造者が与えない全ての試薬又は装置は、市販されている従来品である。
【実施例】
【００９３】
実施例１：新規のαＯ−スーパーファミリーコノトキシン遺伝子野生型（ＧｅＸＩＶＡＷＴ）のクローニング及び配列解析
アカシマミナシガイ（Conus generalis（C. generalis））の生きた身は、海南島及び西沙諸島の沿岸地区から収集された。少量カラム遠心組織／細胞総ＲＮＡ抽出キット（Shanghai Huashun Bioengineering Co., Ltd.）を用いて、その取扱説明書に従って、総ＲＮＡを抽出し、その後ｃＤＮＡ合成を行なった。特定の工程は、文献に従って行なった（例えば、QUAN Yaru, LUO Sulan, LIN Qiujin, ZHANGSUN Dongting, ZHANG Ben, Studying on extraction of conotoxin RNA and synthesis of cDNA thereof, Chinese Journal of Marine Drugs, 2005, 24(2): 1-5）。
【００９４】
上記の合成されたｃＤＮＡは、テンプレートとして用い、プライマーをＯ１−遺伝子スーパーファミリー前駆体遺伝子の非翻訳領域配列に従って設計し、そしてＲＴ−ＰＣＲ増幅を行ない、特定のＰＣＲ増副産物を得た。用いられるプライマーは、以下：
プライマー１：５’−ＣＡＴＣＧＴＣＡＡＧＡＴＧＡＡＡＣＴＧＡＣＧＴＧ−３’（配列番号１３）；
プライマー２：５’−ＣＡＣＡＧＧＴＡＴＧＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＧ−３’（配列番号１４）
である。
【００９５】
ＲＴ−ＰＣＲサイクルプログラムは、３分間９４℃での初期変性、３０秒間９４℃での変性、３０秒間５６℃でのアニーリング、３０秒間７２℃での伸長、の３０サイクルの繰り返し、その後の２分間７２℃での伸長であった。
【００９６】
上記の特定のＰＣＲ産物を回収し、Ｔ−ｅａｓｙベクター（Promega）に連結し、大腸菌ＸＬ１株（他の市販のコンピテント大腸菌細胞も用いることができる）を形質転換するために用い、組み換え体を、青色及び白色コロニー及びアンピシリン耐性を用いて選択し、組み換えプラスミドを抽出及び精製し、配列決定のために用い、同一のＰＣＲ産物の異なるコロニー（例えば、３〜５個の異なるクローン）を配列決定及び解析のために用いた。
【００９７】
配列解析及び比較を通じて、Ｏ１−スーパーファミリーコノトキシンの新規メンバー、即ち、野生型プロペプチドＧｅＸＩＶＡＷＴのｃＤＮＡ遺伝子を得た。ＧｅＸＩＶＡＷＴプロペプチド遺伝子をＤＮＡＳｔａｒソフトウェアを用いて解析し、以下のような、それのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列、即ち、配列番号１及び配列番号２を得た。
【００９８】
ＧｅＸＩＶＡＷＴプロタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（対立遺伝子突然変異を有し、枠で囲まれた１９番目のＴ及びＧは、これらの一塩基突然変異部位を表し；下線部分は成熟ペプチドをコードするＤＮＡ配列を表す）：
【化１】
0006324952.tif 000002
【００９９】
上記の配列によりコードされるＯ１−スーパーファミリーコノトキシンの新規メンバー、即ち、野生型プロペプチドＧｅＸＩＶＡＷＴ（αＯ−コノトキシンＧｅＸＩＶＡＷＴ前駆体又はαＯ−ＧｅＸＩＶＡＷＴ前駆体又はＧｅＸＩＶＡＷＴ前駆体とも称する、以下同じ）は、以下のアミノ酸配列を有する（枠で囲まれた７番目のＬ及びＶは、突然変異部位のアミノ酸を表し；下線部分はシグナルペプチドのアミノ酸を表し；矢印↓は成熟ペプチドの前後の翻訳後修飾プロセッシング部位を表し；イタリック体は、Ｎ末端のプロペプチド領域を表す）：
【化２】
0006324952.tif 000003
【０１００】
野生型ＧｅＸＩＶＡＷＴの前駆体ペプチドｃＤＮＡ遺伝子によりコードされる、生じたシグナルペプチド及び成熟ペプチドは、オンラインＰｒｏＰ  １．０サーバー（Duckert, P.; Brunak, S.; Blom, N., Prediction of proprotein convertase cleavage sites. Protein engineering, design & selection : PEDS 2004, 17 (1), 107-12.）により解析及び予測された。
【０１０１】
ＧｅＸＩＶＡＷＴ成熟ペプチドをコードするヌクレオチド配列は以下の通りである（枠で囲まれた部分はシステインをコードするコドンを表す）：
【化３】
0006324952.tif 000004
【０１０２】
ＧｅＸＩＶＡＷＴ野生型成熟ペプチド（以下、αＯ−コノトキシンＧｅＸＩＶＡＷＴ又はαＯ−ＧｅＸＩＶＡＷＴ又はＧｅＸＩＶＡＷＴとしても引用する）のアミノ酸配列を以下に示す（枠で囲まれた部分はシステインを表す）：
【０１０３】
【化４】
0006324952.tif 000005
【０１０４】
野生型ＧｅＸＩＶＡＷＴ前駆体ペプチドは、３つの領域；シグナルペプチド、プロペプチド及び成熟ペプチドを含み、シグナルペプチド中の７番目アミノ酸残基は、対応するコドンがＴＴＧ又はＧＴＧである、ロイシン又はバリン（Ｌ又はＶ）であった。野生型成熟ペプチド領域（配列番号９）は５個のシステイン（Ｃｙｓ）を含み、これは既知のコノトキシンと異なり、関連する遺伝子スーパーファミリーメンバーとの比較を表１に示す。
【０１０５】
表１：αＯ−遺伝子スーパーファミリーに関するコノトキシン前駆体タンパク質配列との比較
【表１】
0006324952.tif 000006
【０１０６】
上記表において、網掛け文字はシグナルペプチドを表し、イタリック体はＮ末端のプロペプチド領域を表し、下線は成熟ペプチドを表し、矢印↓は成熟ペプチド前後の翻訳後修飾プロセッシング部位を表し；枠で囲まれた部分はアミノ酸の突然変異部位を指す。
【０１０７】
実施例２：新規のαＯ−スーパーファミリーコノトキシン遺伝子突然変異型（ＧｅＸＩＶＡ）の調製及び配列解析
野生型ＧｅＸＩＶＡＷＴ前駆体ペプチド遺伝子の１８１番目から１８３番目の塩基であるＴＧＣはシステイン（Ｃｙｓ）をコードし、これらは、点突然変異に供され（配列番号４の直接的な人工化学合成により得られてもよい）、即ち、一塩基突然変異誘発され、アルギニンＡｒｇ（Ｒ）をコードするためのコドン
【化５】
0006324952.tif 000007
となり、即ち、１８１番目の部位のＴはＣに変化し、この点突然変異はＧｅＸＩＶＡ前駆体ペプチド遺伝子と称され、この配列は以下の通りである。
【０１０８】
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（対立遺伝子突然変異を有し、枠で囲まれた１９番目のＴ及びＧは、その一塩基突然変異部位を表し；二重下線は、１８１番目の突然変異部位を表し、そして下線部分は成熟ペプチドをコードするＤＮＡ配列を表す）：
【０１０９】
【化６】
0006324952.tif 000008
【０１１０】
上記配列は、Ｏ１−スーパーファミリーコノトキシンの新規メンバー、即ち、突然変異体前駆体ペプチドＧｅＸＩＶＡ（以下、αＯ−コノトキシンＧｅＸＩＶＡ前駆体又はαＯ−ＧｅＸＩＶＡ前駆体又はＧｅＸＩＶＡ前駆体としても引用する）アミノ酸配列（枠で囲まれた７番目のＬ及びＶは、突然変異部位のアミノ酸を表し、二重下線は、６１番目の人工突然変異部位を表し、下線部分はシグナルペプチドのアミノ酸配列を表し、矢印↓は成熟ペプチド前後の翻訳後修飾プロセッシング部位を表し、イタリック体はＮ末端のプロペプチド領域を表す）；
【化７】
0006324952.tif 000009
をコードする。
【０１１１】
突然変異体ＧｅＸＩＶＡの前駆体ペプチドｃＤＮＡ遺伝子によりコードされる生じたシグナルペプチド及び成熟ペプチドは、オンラインＰｒｏＰ  １．０サーバー（Duckert, P.; Brunak, S.; Blom, N., Prediction of proprotein convertase cleavage sites. Protein engineering, design & selection : PEDS 2004, 17 (1), 107-12.）により解析及び予測された。
【０１１２】
ＧｅＸＩＶＡ成熟ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、以下の通りである（枠で囲まれた部分は、システインをコードするコドンを示し；二重下線の文字Ｃは、点突然変異アミノ酸に対応する一塩基突然変異部位を表す）。
【化８】
0006324952.tif 000010
【０１１３】
ＧｅＸＩＶＡ突然変異成熟ペプチドのアミノ酸配列（以下、αＯ−コノトキシンＧｅＸＩＶＡ又はαＯ−ＧｅＸＩＶＡ又はＧｅＸＩＶＡとしても引用する）を以下に示す（枠で囲まれた部分は、システインを表し；二重下線の文字Ｒは、点突然変異アミノ酸を示す）：
【化９】
0006324952.tif 000011
【０１１４】
突然変異体ＧｅＸＩＶＡＷＴ前駆体ペプチドは、３つの領域：シグナルペプチド、プロペプチド及び成熟ペプチドを含み、シグナルペプチド中の７番目のアミノ酸残基は、ロイシン又はバリン（Ｌ又はＶ）であり、対応するコドンは、ＴＴＧ又はＧＴＧである。突然変異成熟ペプチド領域（配列番号１２）は、４つのシステイン（Ｃｙｓ）を含み、これは、全ての既知のコノトキシンと異なり、関連する遺伝子スーパーファミリーメンバーとの比較を上記表１に示す。
【０１１５】
以下の研究は、ＧｅＸＩＶＡがｎＡＣｈＲ及びＮＭＤＡＲについての遮断剤であり、α９α１０  ｎＡＣｈＲに対する強力な遮断活性を有することを示し、それ故、これは、形式的にαＯ−コノトキシンＧｅＸＩＶＡとして名付けられ、別名αＯ−ＧｅＸＩＶＡ又はＧｅＸＩＶＡである。
【０１１６】
実施例３：αＯ−コノトキシンＧｅＸＩＶＡの人工合成
αＯ−コノトキシンＧｅＸＩＶＡ成熟ペプチドのアミノ酸配列（配列番号１２、Ｃ末端はアミド化されない）に従って、ＧｅＸＩＶＡの３つの可能性のある異性体線形ペプチドＧｅＸＩＶＡ１２、ＧｅＸＩＶＡ１３、ＧｅＸＩＶＡ１４（図１）をＦｍｏｃ法により人工的に合成した。特定の方法は、以下の通りである。
【０１１７】
３つの異性体のレジンペプチドは、Ｆｍｏｃ化学法により人工的に合成され、システインを除く残るアミノ酸は、標準的な側鎖保護基を用いて保護された。ＧｅＸＩＶＡ１２に関して、２つ一組で、その３番目及び４番目のシステイン（Ｃｙｓ）の−ＳＨ基は、Ｔｒｔ（Ｓ−トリチル）により保護され、そして１番目及び２番目のシステイン（Ｃｙｓ）の−ＳＨ基は、Ａｃｍ（Ｓ−アセトアミドメチル）により保護され；ＧｅＸＩＶＡ１３に関して、２つ一組で、その２番目及び４番目のシステイン（Ｃｙｓ）の−ＳＨ基は、Ｔｒｔ（Ｓ−トリチル）により保護され、そして１番目及び３番目のシステイン（Ｃｙｓ）の−ＳＨ基は、Ａｃｍ（Ｓ−アセトアミドメチル）により保護され；ＧｅＸＩＶＡ１４に関して、２つ一組で、その番２目及び３番目のシステイン（Ｃｙｓ）の−ＳＨ基は、Ｔｒｔ（Ｓ−トリチル）により保護され、そして１番目及び４番目のシステイン（Ｃｙｓ）の−ＳＨ基は、Ａｃｍ（Ｓ−アセトアミドメチル）により保護された。前記合成工程は、固相合成方法のＦｍｏｃ及びＦａｓｔＭｏｃ法を用いること、ABI Prism 433aポリペプチド合成装置により３つの異性体線形ペプチドを合成することを含む。Ｆｍｏｃアミノ酸の側鎖保護基は、Ｐｍｃ（Ａｒｇ）、Ｔｒｔ（Ｃｙｓ）、Ｂｕｔ（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ）、ＯＢｕｔ（Ａｓｐ）、Ｂｏｃ（Ｌｙｓ）である。Ｆｍｏｃ  ＨＯＢＴ  ＤＣＣ法が用いられ、その工程は、装置の合成マニュアルに従って行なわれた。合成を完了するために、ピペリジン脱保護時間及びカップリング時間はそれぞれ適切に延長され、二重結合は、結合することが困難なアミノ酸に用いられ、このようにしてレジンペプチドを得た。線形ペプチドを試薬Ｋ（トリフルオロ酢酸／水／エタンジチオール／フェノール／チオアニソール；９０：５：２．５：７．５：５、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を用いてレジンから切断し、そして氷ジエチルエーテル沈殿及び洗浄に供し、そして線形ペプチドの粗生成物を回収し、分取用逆相ＨＰＬＣ  Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）を、精製のために用い、そして溶出線形勾配は０〜４０分で１０〜５０％  Ｂ６０であった。溶液Ｂは６０％ＡＣＮ（アセトニトリル）、４０％  Ｈ２０、０．９２％  ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；溶液Ａは１％  ＴＦＡ水溶液である。
【０１１８】
精製された線形ペプチドを、ＨＰＬＣ  Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）での純度検出に供し、その純度は９６％超であることを示し、その後、これを酸化フォールディングのために用いることができる。３つの異性体であるＧｅＸＩＶＡ１２、ＧｅＸＩＶＡ１３及びＧｅＸＩＶＡ１４の線形ペプチドを、文献（Dowell, C.; Olivera, B. M.; Garrett, J. E.; Staheli, S. T.; Watkins, M.; Kuryatov, A.; Yoshikami, D.; Lindstrom, J. M.; McIntosh, J. M., Alpha-conotoxin PIA is selective for alpha6 subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors. The Journal of neuroscience  2003, 23 (24), 8445-52.）に従って、２工程の酸化フォールディング反応に供し、そしてこれらの方法は手短に、以下のように記載される。
【０１１９】
まず、Ｔｒｔ保護基を有する２つのシステイン間のジスルフィド結合の一つ目の対をフェリシアン化カリウム法（２０ｍＭ  フェリシアン化カリウム、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、３０分）により形成させた。一環式ペプチドを逆相ＨＰＬＣ  Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）で精製後、ヨウ素酸化を行い（Ｈ２Ｏ中１０ｍＭ  ヨウ素：トリフルオロ酢酸：アセトニトリル（容量で７８：２：２０、１０分）、別の２つのシステインのＡｃｍを除去し、そして同時に２つのシステイン間のジスルフィド結合の２つ目の対を形成させた。二環式ペプチドを逆相ＨＰＬＣ  Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）で精製し、ジスルフィド結合がＮ末端からＣ末端の順番に対応するシステイン間で指向的に形成される、αＯ−コノトキシンを得て、質量分析（ＭＳ）により確認した。酸化フォールディング後の３つの異性体の理論的な分子量（モノアイソトピック質量）は、３４５１．９６Ｄａであり、ＧｅＸＩＶＡ１２の測定された分子量は、３４５１．８３Ｄａであり；ＧｅＸＩＶＡ１３の測定された分子量は、３４５１．７２Ｄａであり；ＧｅＸＩＶＡ１４の測定された分子量は、３４５２．０５Ｄａであった。比色分析アッセイを、２８０ｎｍの波長下でポリペプチド濃度を検出するために用い、そしてポリペプチド濃度及び質量を、ランベルト・ベール（方程式）に従って、計算した。これらの定量された異性体は、その後の活性アッセイ（例えば、実施例５〜１０）に連続的に用いた。
【０１２０】
実施例４：アフリカツメガエル卵母細胞におけるラット、マウス及びヒトｎＡＣｈＲサブタイプの発現
文献（Azam L, Yoshikami D, McIntosh JM. Amino resudues that confer high selectivity of the alpha6 nicotinic acetylcholine receptor subunit to alpha-conotoxin MII[S4A,E11A,L15A]. J Biol Chem. 2008;283(17):11625-32.）の方法、インビトロ転写キット（mMessage mMachine in vitro transcription kit (Ambion, Austin, TX)）の取扱説明書は、様々なラット神経型ｎＡＣｈＲサブタイプ（α３β２、α６／α３β２β３、α６／α３β４、α９α１０、α４β２、α４β４、α３β４、α２β２、α２β４、α７）、ヒト神経型ｎＡＣｈＲサブタイプ（α９α１０、α６／α３β２β３、α７）、ラット９α１０  ｎＡＣｈＲの様々な突然変異体、並びにマウス及びヒト筋肉型ｎＡＣｈＲ（α１β１δε）のｃＲＮＡを調製するために参照され、これらの濃度は、ＵＶ  ２６０ｎｍにおいてＯＤ値により測定及び計算された。カエル（Xenopus）（アフリカツメガエル（Xenopus laveis））の卵母細胞（カエルの卵）を回収及び解剖し、ｃＲＮＡをカエルの卵に注入し、各サブタイプについての注入容量は５ｎｇ  ｃＲＮＡであった。筋肉ｎＡＣｈＲについて、各サブタイプを、０．５〜２．５ｎｇＤＮＡ注入した。カエルの卵を、ＮＤ−９６中で培養した。回収されたカエルの卵に、１〜２日間、ｃＲＮＡを注入し、そしてｎＡＣｈＲ電圧クランプを用い、注入後１〜４日間記録した。Ｂａ２＋含有ＮＤ−９６バッファ溶液を等量のモル濃度においてＣａＣｌ２をＢａＣｌ２で置換することにより得た。調製されたサンプルを、例えば以下の実施例５〜１０に用いた。
【０１２１】
実施例５：αＯ−コノトキシンＧｅＸＩＶＡの３つの異性体を用いて様々なラットｎＡＣｈＲを遮断する実験
ｃＲＮＡが注入されたカエルの卵の１つは、３０ｕＬのＳｙｌｇａｒｄレコードタンク（直径４ｍｍ×深さ２ｍｍ）中に置かれ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含有するＮＤ９６潅流液（９６．０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．０ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１〜７．５）、又は１ｍＭアトロピンを含有するＮＤ９６（ＮＤ９６Ａ）で重力潅流し、流速は１ｍｌ／分であった。全てのコノトキシン溶液は、毒素の非特異的吸着を減少させるために０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含み、切換弁（SmartValve, Cavro Scientific Instruments, Sunnyvale, CA）を、毒素及びアセチルコリン（ＡＣｈ）の潅流の間に自由に切り替えるために用いることができ、一組みの三方電磁弁（solenoid valves, model 161TO31, Neptune Research, Northboro, MA）を、ＮＤ９６及びＡＣｈの潅流の間に、自由に切り替えるために用いた。二電極式電圧クランプ増幅器（model OC-725B, Warner Instrument Corp., Hamden, CT）を用いて、Ａｃｈ依存性電流（Ach gating current）を「slow」クランプに設定し、最大値（×２０００）配置（position）においてクランプ上昇（clamp gain）のオンライン記録を行った。ガラス電極を、外径１ｍｍｘ内径０．７５ｍｍのガラスキャピラリー（fiber-filled borosilicate capillaries, WPI Inc., Sarasota, FL）から引き出し、電圧及び電流電極において３Ｍ  ＫＣｌを充填した。膜電圧を、−７０ｍＶにおいて保った。全システム及びデータ記録の制御を、コンピューターで行った。ＡＣｈパルスを５分間隔で１秒間、自動的にＡＣｈを潅流した。ＡＣｈは筋肉型ｎＡＣｈＲ及び神経型α９α１０  ｎＡＣｈＲの卵母細胞に対して１０μＭ；神経型のｎＡＣｈＲのα７に対して２００μＭ、及び他のサブタイプに対して１００μＭの濃度を有した。少なくとも４つの卵母細胞を、様々な毒素濃度下において、サブタイプの電流応答及び電流軌道の刺激を記録するために用いた。
【０１２２】
測定された電流データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（San Diego, CA）を用いて統計的解析に供し、用量反応曲線はプロットし、コノトキシンの半数遮断濃度（ＩＣ５０）及び毒素が遮断するｎＡＣｈＲに関連する多くの他のパラメーターを計算した。
【０１２３】
結果は、３３ｎＭ  αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２（実施例３において調製される）が、Ａｃｈ依存性α９α１０  ｎＡＣｈＲ開口により生じる電流を完全に遮断し、そして早い溶出及び可逆的な遮断の特徴を有したことを示す（図２Ａ）。３つの異性体の全ては、α９α１０  ｎＡＣｈＲに対する強力な遮断活性を有した。３つの異性体の中でも、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２は、強力な活性を有し、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４は二番目であり、そしてαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３は、最も弱い活性を有した（図２Ｂ、Ｃ、Ｄ）。これらの半数遮断用量（ＩＣ５０）及び誤差範囲は、それぞれＧｅＸＩＶＡ１２、４．６ｎＭ（３．１８−６．６５ｎＭ）；ＧｅＸＩＶＡ１３、２２．７ｎＭ（１１．８−４３．５ｎＭ）；ＧｅＸＩＶＡ１４、７ｎＭ（３．６−１３．４ｎＭ）であった。３つの異性体の用量反応曲線は、それぞれ、以下：ＧｅＸＩＶＡ１２、０．５６（０．４４−０．６９）；ＧｅＸＩＶＡ１３、０．７８（０．２９−１．２６）、ＧｅＸＩＶＡ１４、０．７９（０．２３−１．３６）の傾き（山地斜面）及び誤差範囲を有した。αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２は、様々なｎＡＣｈＲサブタイプに関する様々な遮断活性を有し、そしてその半数遮断用量ＩＣ５０及び用量反応曲線の傾きを表２に示す。
【０１２４】
【表２】
0006324952.tif 000012
【０１２５】
α＊β４及びα＊β２  ｎＡＣｈＲに対するαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２の遮断活性の違いは比較的大きく、α＊β２  ｎＡＣｈＲに対する遮断活性は、α＊β４  ｎＡＣｈＲに対するものよりも著しく大きく（図３、Ａ〜Ｅ）；マウス筋肉型ｎＡＣｈＲ（Ｍα１β１δε）に対する遮断活性とα７  ｎＡＣｈＲサブタイプに対する遮断活性は、比較的近かった。これは、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２が、より好ましくは、α６／α３β２β３、α４β２、α３β２及びα２β２を含むβ２含有ｎＡＣｈＲを遮断したことを示す。α９α１０  ｎＡＣｈＲに対するαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２の遮断活性は、他のサブタイプに対するものよりも少なくとも５６〜６６３倍高かった。２００ｎＭ未満の低濃度において、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２は、α９α１０  ｎＡＣｈＲに対する特異的な遮断薬であるが、他のｎＡＣｈＲサブタイプに対する遮断活性は著しく弱いか、ほぼ遮断活性を有さない。αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２及び他のスーパーファミリーコノトキシンの作用標的生物学的活性の比較を表３に示す。
【０１２６】
【表３】
0006324952.tif 000013
【０１２７】
α９α１０  ｎＡＣｈＲは、カルシウムイオン（Ｃａ＋＋）に対する著しく高い透過性を有することが知られている。ｎＡＣｈＲのカルシウムイオン内部流動は、アフリカツメガエル卵母細胞において、塩化物イオン（Ｃｌ−）の外部流動の発生を活性化することができ、この種類のカレントは、観察されるα９α１０ｎ  ＡＣｈＲ開口カレント（current）の９０％以上であった。反対に、カルシウムイオンに近いバリウムイオン（Ｂａ＋＋）は、塩化物イオンカレントを活性化しない。従って、我々は、従来のＮＤ９６潅流液に置き換えてバリウムイオンＮＤ９６潅流液（Ｂａ＋＋−ＮＤ９６、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２をＢａＣｌ２で置き換えた）を用い、α９α１０ｎＡＣｈＲの観察された開口カレントが従来のＮＤ９６潅流液のものよちも著しく低いことを見出し、これは先の研究と一致した。バリウムイオンＮＤ９６潅流液の条件下で、ＧｅＸＩＶＡ１２は、α９α１０ｎＡＣｈＲに対して強力な遮断活性を示し、ＧｅＸＩＶＡ１４は２番目であり、ＧｅＸＩＶＡ１３の活性は最も弱かった（図４）。Ｉ−ＩＩ及びＩＩＩ−ＩＶジスルフィド結合を有する異性体であるαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２に関して、α９α１０  ｎＡＣｈＲに対するその半数遮断用量（ＩＣ５０）及びその誤差範囲は、３．８ｎＭ（３．１−４．８ｎＭ）であり、曲線の傾き（山地斜面、ｎＨ）及びその誤差範囲は０．７１（０．５８−０．８４）であり；Ｉ−ＩＩＩ及びＩＩ−ＩＶジスルフィド結合を有する異性体であるαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３に関して、α９α１０  ｎＡＣｈＲに対するその半数遮断用量（ＩＣ５０）及びその誤差範囲は、３７ｎＭ（２５．０−５５．７ｎＭ）であり、曲線の傾き（山地斜面）及びその誤差範囲は０．５４（０．４２−０．６５）であり；Ｉ−ＩＶ及びＩＩ−ＩＩＩジスルフィド結合を有する異性体であるαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４に関して、α９α１０  ｎＡＣｈＲに対するその半数遮断用量（ＩＣ５０）及びその誤差範囲は、５．８ｎＭ（４．７−７．１ｎＭ）であり、曲線の傾き（山地斜面、ｎＨ）及びその誤差範囲は０．６５（０．５６−０．７３）であった。バリウムイオンＮＤ９６潅流液の条件下で、αＯ−ＧｅＸＩＶＡの３つの異性体は、カルシウムイオンを含有する通常のＮＤ９６潅流液下のものと同様の活性の結果を有した。加えて、バリウムイオン−ＮＤ９６下で、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２及びαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４の活性は、カルシウムイオン含有する通常のＮＤ９６下のものよりも強力である一方で、バリウムイオン−ＮＤ９６下のαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３の活性は、通常のＮＤ９６下のものよりも強力であった。従って、ＧｅＸＩＶＡの３つの異性体は、カルシウムイオンのために活性化される塩化物イオンカレントを遮断する代わりに、α９α１０ｎＡＣｈＲを遮断した。
【０１２８】
実施例６：ラットＮＭＤＡ受容体を遮断するαＯ−コノトキシンＧｅＸＩＶＡの３異性体の実験
文献（Twede, V. D. et al. conantokin-Br from Conus brettinghami and selectivity determinants for the NR2D sununit of the NMDA receptor. Biochemistry, 2009, 48: 4063-4073）の方法は参照され、アフリカツメガエル卵母細胞におけるｎＡＣｈＲの発現と同様の方法を、ラットＮＭＤＡ受容体の４つのサブタイプ：ＮＲ１−２ｂ／ＮＲ２Ａ、ＮＲ１−２ｂ／ＮＲ２Ｂ、ＮＲ１−２ｂ／ＮＲ２Ｃ、ＮＲ１−２ｂ／ＮＲ２Ｄに対応するｃＲＮＡを調製するために用い、その濃度を測定し、ＵＶ  ２６０ｎｍにおけるＯＤ値により測定及び計算した。カエル（Xenopus）（アフリカツメガエル（Xenopus laveis））の卵母細胞（カエルの卵）を回収及び解剖し、ｃＲＮＡをカエルの卵に注入し、各サブタイプについての注入容量は５ｎｇ  ｃＲＮＡであった。カエルの卵を、ＮＤ−９６中で培養した。回収されたカエルの卵に、１〜２日間ｃＲＮＡを注入し、注入後１〜４日間ｎＡＣｈＲ電圧クランプ記録に用いた。用いられた灌流液がマグネシウムフリーＮＤ９６灌流液（Ｍｇ２＋フリーＮＤ９６バッファ）（その組成物は、９６．０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．０ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ、２．５ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２〜７．５）を含む）であることを除いて、電圧クランプ記録ＮＭＤＡ受容体電流を、ｎＡＣｈＲと同様の方法により行った。その理由は、Ｍｇ２＋が、−７０ｍＶクランプ電圧下で、ＮＭＤＡ受容体を遮断することができるからである。ＮＭＤＡ受容体アゴニスト溶液は、最終濃度において２００μＭグルタミン酸及び２０μＭグリシンを含有するＭｇ２＋フリーＮＤ９６であった。αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２は、ＮＲ２Ｃ  ＮＭＤＡＲサブタイプに対する強力な遮断活性を有し、迅速に溶出することができる。αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２に関して、４種類のＮＭＤＡ受容体サブタイプに対するその半数遮断用量（ＩＣ５０）及びその誤差範囲は、それぞれＮＲ２Ｃ、０．６６μＭ（０．３８−１．１μＭ）；ＮＲ２Ｂ、４．０μＭ（２．２−７．３μＭ）；ＮＲ２Ａ、３．７μＭ（２．８−５．０μＭ）；ＮＲ２Ｄ、５．２μＭ（１．７−１５．７μＭ）であり；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２に関して、４種類のＮＭＤＡ受容体サブタイプに対するその用量反応曲線の傾き（山地斜面）及びその誤差範囲は、それぞれＮＲ２Ｃ、０．１３（０．４２−０．９７）；ＮＲ２Ｂ、０．２２（０．３６−１．３）；ＮＲ２Ａ、０．１０（０．６１−１．０７）；ＮＲ２Ｄ、０．１５（０．１０−０．７８）であった（図５）。様々なＮＭＤＡＲのサブタイプに対するαＯ−ＧｅＸＩＶＡの３つの異性体の半数遮断用量（ＩＣ５０）及び用量反応曲線の傾きを表４に示す。
【０１２９】
【表４】
0006324952.tif 000014
【０１３０】
４種類のＮＭＤＡ受容体サブタイプに対するαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２の活性は、以下：ＮＲ２Ｃ＞ＮＲ２Ａ＞ＮＲ２Ｂ＞ＮＲ２Ｄの順に弱くなる。αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４は、２種類のＮＭＤＡ受容体サブタイプであるＮＲ２Ｂ及びＮＲ２Ａに対する比較的弱い遮断活性を有する一方で、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３は、４種類のＮＭＤＡ受容体サブタイプに対する、大変に弱い遮断活性を有するか、遮断活性を有さない。
【０１３１】
実施例７：他のラットｎＡＣｈＲ及びマウス筋肉型ｎＡＣｈＲを遮断するαＯ−コノトキシンＧｅＸＩＶＡの３つの異性体の実験
実施例４及び５の同一の実験方法を、他のラットｎＡＣｈＲ及びマウス筋肉型ｎＡＣｈＲの遮断に関するαＯ−コノトキシンＧｅＸＩＶＡの３つの異性体の効果を研究するために、用いた。３つの異性体であるαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３及びαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４の濃度用量応答曲線を図６（Ａ〜Ｊ）に示す。一般的に、α＊β２  ｎＡＣｈＲに対する３つの異性体の遮断活性は、α＊β４  ｎＡＣｈＲに対するものより高く（図６）；
マウス筋肉型ｎＡＣｈＲ（Ｍα１β１δε）に対する３つの異性体の遮断活性は同様であり、そしてこれらの半数遮断用量（ＩＣ５０）は、それぞれαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、３９４ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３、６７１ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４、４７３ｎＭである。しかしながら、α７  ｎＡＣｈＲサブタイプに対する３つの異性体の遮断活性は、一般的に多様であり、これらのＩＣ５０活性の順序は、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、４１５ｎＭ＞αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４、１７４０ｎＭ＞αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３、４９６０ｎＭであった。αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２＞ＧｅＸＩＶＡ１４＞ＧｅＸＩＶＡ１３の活性の順序は、マウス筋肉型ｎＡＣｈＲ及び神経細胞型α３β２  ｎＡＣｈＲにおいても生じ、Ｍα１β１δε及びα３β２  ｎＡＣｈＲに対する３つの異性体間の遮断活性の多様性は、著しく小さかった。
【０１３２】
α２β２、α２β４、α４β２、α４β４  ｎＡＣｈＲに対する遮断活性に関して、ＧｅＸＩＶＡ１４の遮断活性は強力であり、α２β２に対するＩＣ５０はたったの１２２ｎＭであり、α４β２に対するＩＣ５０は２００ｎＭであった。α３β４、α６／α３β４  ｎＡＣｈＲに対する遮断活性に関して、ＧｅＸＩＶＡ１３の遮断活性は強力であり、そのＩＣ５０は４８３ｎＭであり；ＧｅＸＩＶＡ１４は２番目であり、そのＩＣ５０は６１１ｎＭである一方で；ＧｅＸＩＶＡ１２は最も弱い遮断活性を示し、そのＩＣ５０は８０６ｎＭであった。しかしながら、全ての他のｎＡＣｈＲサブタイプに対する３つの異性体の遮断活性は、α９α１０ｎ  ＡＣｈＲに対するものよりも著しく弱かった。異なるｎＡＣｈＲサブタイプに対する３つの異性体の遮断活性の違いは、異なるサブタイプについてのテンプレートとしてＧｅＸＩＶＡを用いる一連の選択的遮断剤を設計するための理論的基礎を提供する。
【０１３３】
実施例８：ヒトｎＡＣｈＲを遮断するαＯ−コノトキシンＧｅＸＩＶＡの３つの異性体の実験
実施例４及び５と同一の実験方法を、ヒトｎＡＣｈＲの遮断に関するαＯ−コノトキシンＧｅＸＩＶＡの３つの異性体の効果を研究するために用いた。３つの異性体の中でも、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２及びＧｅＸＩＶＡ１４の両者が、ヒトα９α１０  ｎＡＣｈＲに対して著しく強力な遮断活性を示し、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２は強力な活性を有し、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４は２番目であり、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３は最も弱い活性を示した（図７、Ａ〜Ｆ）。これらの半数遮断用量（ＩＣ５０）及びこれらの誤差範囲は、それぞれＧｅＸＩＶＡ１２、２０ｎＭ（１２．４−３３．２ｎＭ）；ＧｅＸＩＶＡ１３、１１６ｎＭ（６５．４−２０４ｎＭ）；ＧｅＸＩＶＡ１４、４７ｎＭ（２９．７−７５．３ｎＭ）であった。３つの異性体の用量反応曲線の傾き（山地斜面）及びこれらの誤差範囲は、それぞれＧｅＸＩＶＡ１２、０．９１（０．４９−１．３２）；ＧｅＸＩＶＡ１３、０．７３（０．４５−１．０１）、ＧｅＸＩＶＡ１４、０．６７（０．４６−０．８８）であった。ヒト筋肉型ｎＡＣｈＲ（ヒトα１β１δε）に対する３つの異性体の遮断活性は同様であり、これらの半数遮断用量（ＩＣ５０）は、それぞれαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、４９７ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３、４８５ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４、３６５ｎＭであった。しかしながら、α７  ｎＡＣｈＲサブタイプに対する３つの異性他の遮断活性は、著しく多様であり、これらのＩＣ５０活性の順序は、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、５５５ｎＭ＞αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４、８６５ｎＭ＞αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３、３３００ｎＭであった。ヒトα９α１０及びα７  ｎＡＣｈＲに対する遮断活性の順序は、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２＞ＧｅＸＩＶＡ１４＞ＧｅＸＩＶＡ１３であり、マウスα９α１０及びα７  ｎＡＣｈＲに対する遮断活性の順序と一致した。しかしながら、ヒトα６／α３β２β３  ｎＡＣｈＲに対する３つの異性他の遮断活性の順序は、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３≧ＧｅＸＩＶＡ１４＞ＧｅＸＩＶＡ１２であり、これらの半数遮断用量（ＩＣ５０）は、それぞれαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３、１４１ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４、１９７ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、５０５ｎＭであった。異なるヒトｎＡＣｈＲサブタイプに対する３つの異性体の異なる遮断活性は、異なるサブタイプに対して選択的な遮断剤を得るために、一連のαＯ−ＧｅＸＩＶＡアナログを設計するのに有利である。
【０１３４】
実施例９：ラットα９α１０  ｎＡＣｈＲ受容体の様々な突然変異体を遮断するαＯ−コノトキシンＧｅＸＩＶＡの３つの異性体の実験
コノトキシンと結合する部位において野生型α９α１０  ｎＡＣｈＲ受容体の可能性のある重要なアミノ酸を点突然変異、即ち一アミノ酸変化に供し、α９α１０  ｎＡＣｈＲ受容体の様々な突然変異体を調製した。突然変異部位を図８に示し、例えば、「ｒα９Ｒ７１Ｇα１０」とは、ラット（ｒ）野生型α９α１０  ｎＡＣｈＲ受容体のα９サブタイプにおけるものを表し、７１番目のアルギニンＲ（Ａｒｇ）をグリシンＧ（Ｇｌｙ）に突然変異誘発し、他の突然変異体の表現方法は、同様の方法である。受容体突然変異体をＰＣＲ法による調製し、即ち野生型α９α１０  ｎＡＣｈＲ受容体のα９又はα１０サブタイプの遺伝子における点突然変異アミノ酸に対応するコドンを突然変異に供した。得られる突然変異体に関して、様々なα９α１０  ｎＡＣｈＲ突然変異体の遮断に関するαＯ−コノトキシンＧｅＸＩＶＡの３つの異性体の効果を、実施例４及び５の同一の実験方法に従って研究した（図８）。
【０１３５】
１１のラットα９α１０  ｎＡＣｈＲ受容体突然変異体に対する、３つの異性体であるαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３及びαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４の遮断活性を試験した。これらの濃度用量応答曲線を図８（Ａ〜Ｋ）に示す。一般的な傾向は、３つの異性体の全てが、α９α１０  ｎＡＣｈＲの様々な突然変異体に対して著しく強力な遮断活性を有することであり、様々な突然変異体に対するαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２及びαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４の遮断活性は同様であり、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３の活性よりも強力であり、これは野生型α９α１０  ｎＡＣｈＲの遮断活性順序と一致した。３つの異性体の遮断活性の順序は、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２≧ＧｅＸＩＶＡ１４＞ＧｅＸＩＶＡ１３であった。活性の相対的に著しい変化を有する５つの突然変異体が存在し、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２の半数遮断用量ＩＣ５０は４６〜５９ｎＭであり；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４の半数遮断用量は３４〜９６ｎＭであり；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３の半数遮断用量は１０６〜２３２ｎＭであった。これらの５つのα９α１０  ｎＡＣｈＲ突然変異体に対する３つの異性体の半数遮断用量ＩＣ５０は、それぞれ（１）ｒα９Ｒ７１Ｇα１０、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、５９ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３、２３２ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４、６１ｎＭ；（２）α９Ｓ１４Ｎα１０、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、５３ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３、１０８ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４、６０ｎＭ；（３）α９Ａ２４Ｋα１０、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、５２ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３、１７０ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４、９６ｎＭ；（４）α９Ｅ１９２Ｑα１０、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、５０ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３、１４３ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４、６３ｎＭ；（５）α９Ｓ１３６Ｎα１０、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、４６ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３、１０６ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４、３４ｎＭであった。
【０１３６】
大変小さい活性の変化を有する６つの突然変異体が存在し、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２の半数遮断用量ＩＣ５０は１４〜３２ｎＭであり；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４の半数遮断用量ＩＣ５０は２４〜５５ｎＭであり；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３の半数遮断用量ＩＣ５０は６８〜１８２ｎＭであった。２つの突然変異体であるｒα９Ｓ１３６Ｎα１０及びｒα９α１０Ｅ５６Ｓに関して、３つの異性体の遮断活性の順序は、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４≧ＧｅＸＩＶＡ１２＞ＧｅＸＩＶＡ１３であった。ｒα９Ｓ１３６Ｎα１０突然変異体に関して、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４（ＩＣ５０、３４ｎＭ）は、ＧｅＸＩＶＡ１２（ＩＣ５０、４６ｎＭ）よりも強力な遮断活性を示した。これらの６つのα９α１０  ｎＡＣｈＲ突然変異体に対する３つの異性体の半数遮断用量ＩＣ５０は、それぞれ（１）ｒα９Ｓ１１７Ａα１０、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、３２ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３、１８２ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４、４７ｎＭ；（２）αα１０Ｄ１１６Ｌ、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、２８ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３、１２２ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４、４５ｎＭ；（３）α９α１０Ｅ５６Ｓ、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、２５ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３、６８ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４、２４ｎＭ；（４）α９Ｔ５６Ｉα１０、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、２３ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３、７６ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４、３３ｎＭ；（５）α９Ｓ６Ｎα１０、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、２０ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３、１１９ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４、５５ｎＭ；（６）α９Ｔ６４Ｉα１０、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２、１４ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１３、７９ｎＭ；αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１４、２４ｎＭであった。
【０１３７】
これらのα９α１０  ｎＡＣｈＲ突然変異体の突然変異部位は、α−コノトキシンと結合することが予め見出されている受容体の重要なアミノ酸であり（Ellison M, Feng ZP, Park AJ, Zhang X, Olivera BM, McIntosh JM, Norton RS. Alpha-RgIA, a novel conotoxin that blocks the alpha9alpha10 nAChR: structure and identification of key receptor-binding residues. J Mol Biol. 2008;377(4):1216-27）、αＯ−ＧｅＸＩＶＡの３つの異性体は、これらの突然変異体の活性に関して著しい影響を与えず、即ち、これらの活性変化は、野生型α９α１０  ｎＡＣｈＲのものの約１０倍未満であった。これは、α９α１０  ｎＡＣｈＲに対するαＯ−ＧｅＸＩＶＡの結合部位又は部分は、先に開示された結合部位と完全に異なり、即ちこれらは新規の作用部位であることを示す。
【０１３８】
実施例１０：α９α１０  ｎＡＣｈＲを特異的に遮断するαＯ−コノトキシンＧｅＸＩＶＡ１２の新規部位
α９α１０  ｎＡＣｈＲを遮断するαＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２の溶出は大変迅速である（図９Ａ）。α−ＣＴｘ  ＲｇＩＡ［Ｓ４Ｔ；Ｒ９Ｃｉｔ；Ｙ１０Ｉｏｄｏ，Ｒ１１Ｑ］（又は略してＲｇＩＡＭ）は、α９α１０  ｎＡＣｈＲ対する特異的な遮断剤であるが、その溶出は、著しく緩徐に回復し（実験により確認にされる）、即ち、毒素ＲｇＩＡＭが溶出された場合、α９α１０  ｎＡＣｈＲは著しく緩徐にＡＣｈ通常ゲート開口状態に戻った（図９Ｂ）。
【０１３９】
２つの異なる溶出速度に従って、本発明の発明者らは、競合試験を設計した（図９Ｃ）。即ち、１分間、α９α１０  ｎＡＣｈＲを遮断するために１μＭ  αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２でのインキュベーション後、２０ｎＭ  α−ＣＴｘＲｇＩＡＭ及び１μＭ  αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２をカエルの卵の同一の細胞タンクにおいて用い、α９α１０ｎＡＣｈＲを遮断するために５分インキュベーションを継続し、Ａｃｈゲート電流記録はその溶出が大変緩徐であることを示し、そしてこれは溶出のために２０ｎＭ  α−ＣＴｘ  ＲｇＩＡＭを単に用いる同様の状況であった。その間、陽性及び陰性対照として、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２及びα−ＣＴｘ  ＲｇＩＡＭをそれぞれ置き換えるためにＮＤ９６を用いるように設定された。結果は、αＯ−ＧｅＸＩＶＡ１２がα９α１０  ｎＡＣｈＲに対するα−ＣＴｘ  ＲｇＩＡ  Ｍの遮断活性を阻害することができないことを示し、これは、α９α１０  ｎＡＣｈＲに対する２つの結合部位が完全に異なることを確実にし、αＯ−コノトキシンＧｅＸＩＶＡ１２はα９α１０  ｎＡＣｈＲの新規部位に結合し、これはα−コノトキシンの予め開示されている結合部位とは異なり、重複していない。
【０１４０】
研究は、α９α１０  ｎＡＣｈＲが神経痛、癌の化学療法、乳癌、肺癌、創傷治癒の治療のための新規の標的であることを示す（McIntosh, J. M.; Absalom, N.; Chebib, M.; Elgoyhen, A. B.; Vincler, M., Alpha9 nicotinic acetylcholine receptors and the treatment of pain. Biochemical pharmacology 2009, 78 (7), 693-702. Satkunanathan, N.; Livett, B.; Gayler, K.; Sandall, D.; Down, J.; Khalil, Z., Alpha-conotoxin Vc1.1 alleviates neuropathic pain and accelerates functional recovery of injured neurones. Brain research 2005, 1059 (2), 149-58.   Holtman, J. R.; Dwoskin, L. P.; Dowell, C.; Wala, E. P.; Zhang, Z.; Crooks, P. A.; McIntosh, J. M., The novel small molecule alpha9alpha10 nicotinic acetylcholine receptor antagonist ZZ-204G is analgesic. European journal of pharmacology 2011, 670 (2-3), 500-8. Zheng, G.; Zhang, Z.; Dowell, C.; Wala, E.; Dwoskin, L. P.; Holtman, J. R.; McIntosh, J. M.; Crooks, P. A., Discovery of non-peptide, small molecule antagonists of alpha9alpha10 nicotinic acetylcholine receptors as novel analgesics for the treatment of neuropathic and tonic inflammatory pain. Bioorganic & medicinal chemistry letters 2011, 21 (8), 2476-9.  Chernyavsky, A. I.; Arredondo, J.; Vetter, D. E.; Grando, S. A., Central role of alpha9 acetylcholine receptor in coordinating keratinocyte adhesion and motility at the initiation of epithelialization. Experimental cell research 2007, 313 (16), 3542-55; Chikova, A.; Grando, S. A., Naturally occurring variants of human Alpha9 nicotinic receptor differentially affect bronchial cell proliferation and transformation. PloS one 2011, 6 (11), e27978.）。それ故、本発明の新規αＯ−スーパーファミリーコノトキシンＧｅＸＩＶＡは、上記疾患の機構の研究、診断及び治療において大変有望である。
【０１４１】
実施例１１：Ｓｆ９細胞増殖を阻害する組み換えαＯ−コノトキシンＧｅＸＩＶＡＷＴの実験
野生型毒素（αＯ−ＧｅＸＩＶＡＷＴ）の遺伝子を、大腸菌発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）の制限酵素切断部位であるＮｃｏ  ＩとＸｈｏ  Ｉの間に挿入し、Ｎ末端がｐｅｌＢリーダーと融合し、Ｃ末端がＨｉｓ−ｔａｇ精製標識と融合した、融合タンパク質発現ベクターを構築した。αＯ−ＧｅＸＩＶＡＷＴ組み換えタンパク質を分離し、精製した。Ｓｆ９細胞（米国のInvitrogen Company社から購入されるSpodoptera frugiperda 9（Ｓｆ９）細胞）の増殖に関する組み換えコノトキシンαＯ−ＧｅＸＩＶＡＷＴの影響は、ＭＴＴ法により研究した（図１０）。前記方法は、ＭＴＴが細胞膜を透過し、細胞に進入することができ、生細胞のミトコンドリア中のコハク酸デヒドロゲナーゼは、外因性のＭＴＴを細胞中で沈殿する不溶性の針状青紫色ホルマザン結晶に還元することができる一方で、死細胞はかかる機能を有さないことに従って行なわれた。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、細胞中の青紫結晶を溶解することができ、そして得られる溶液の色の強度は、含まれるホルマザン含量に直接的に比例する。その光学密度値（ＯＤ値）は、ＥＬＩＡＳＡにおいて５７０ｎｍの波長下で測定され、細胞の数を間接的に反映することができる。結果は、αＯ−ＧｅＸＩＶＡＷＴがＳｆ９細胞の増殖を著しく阻害し、用量効果を有し、高濃度（＞１０μｇ／ｍｌ）において、Ｓｆ９細胞を死滅させることができることを示した。Ｓｆ９昆虫細胞株は、害虫であるヨトウガ（Spodoptera Frugiperda）の卵巣細胞株Ｓｆ２１に由来し、この昆虫細胞は、バイオ殺虫剤として、アルファルファカルフォニルア核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶバキュロウイルス）で感染させ易く、そして全てのバキュロウイルスについて発現ベクターとして用いることができる。それ故、野生型組み換えコノトキシンαＯ−ＧｅＸＩＶＡＷＴは、害虫駆除において有望である（Bruce C, Fitches EC, Chougule N, Bell HA, Gatehouse JA (2011) Recombinant conotoxin, TxVIA, produced in yeast has insecticidal activity. Toxicon 58:93-100.）。
【０１４２】
本発明の実施形態は詳細に記載されるが、当業者は、これらの詳細が、開示される教示に従って、改変及び変更され得ることを理解し、これらの全ての変更は、本発明の保護範囲内である。本発明の全体の範囲は、添付の特許請求の範囲及びこれらの任意の等価物により与えられる。
【図１】
0006324952.tif 000015
【図２−１】
0006324952.tif 000016
【図２−２】
0006324952.tif 000017
【図３−１】
0006324952.tif 000018
【図３−２】
0006324952.tif 000019
【図４】
0006324952.tif 000020
【図５】
0006324952.tif 000021
【図６−１】
0006324952.tif 000022
【図６−２】
0006324952.tif 000023
【図６−３】
0006324952.tif 000024
【図６−４】
0006324952.tif 000025
【図７−１】
0006324952.tif 000026
【図７−２】
0006324952.tif 000027
【図８−１】
0006324952.tif 000028
【図８−２】
0006324952.tif 000029
【図８−３】
0006324952.tif 000030
【図８−４】
0006324952.tif 000031
【図９】
0006324952.tif 000032
【図１０】
0006324952.tif 000033
【配列表】
0006324952000001.app