(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ１）、第２のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ２）、および多量体ドメイン（Ｍ）を含むＩＬ−３３拮抗薬であって、Ｄ１はヒトＳＴ２タンパク質の細胞外部分を含み、Ｄ２はヒトＩＬ−１ＲＡｃＰのタンパク質の細胞外部分を含み、そしてＭは免疫グロブリンドメインのＦｃ部分を含み、そして以下：
（ｉ）Ｄ２がＤ１のＮ末端に連結され、さらにＤ１がＭのＮ末端に連結されている；
（ｉｉ）Ｄ１がＭのＮ末端に連結され、さらにＤ２がＭのＣ末端に連結されている；
（ｉｉｉ）Ｄ１がＭのＣ末端に連結され、さらにＤ２がＤ１のＣ末端に連結されている；
（ｉｖ）Ｄ２がＭのＮ末端に連結され、さらにＤ１がＭのＣ末端に連結されている；
（ｖ）Ｄ２がＭのＣ末端に連結され、さらにＤ１がＤ２のＣ末端に連結されている；または
（ｖｉ）Ｄ１がＤ２のＮ末端に連結され、さらにＤ２がＭのＮ末端に連結されている；前記ＩＬ−３３拮抗薬。
【請求項２】
Ｄ２がＤ１のＮ末端に連結され、さらにＤ１がＭのＮ末端に連結されている、請求項１に記載のＩＬ−３３拮抗薬。
【請求項３】
Ｄ１がＭのＮ末端に連結され、さらにＤ２がＭのＣ末端に連結されている、請求項１に記載のＩＬ−３３拮抗薬。
【請求項４】
Ｄ１がＭのＣ末端に連結され、さらにＤ２がＤ１のＣ末端に連結されている、請求項１に記載のＩＬ−３３拮抗薬。
【請求項５】
Ｄ２がＭのＮ末端に連結され、さらにＤ１がＭのＣ末端に連結されている、請求項１に記載のＩＬ−３３拮抗薬。
【請求項６】
Ｄ２がＭのＣ末端に連結され、さらにＤ１がＤ２のＣ末端に連結されている、請求項１
に記載のＩＬ−３３拮抗薬。
【請求項７】
Ｄ１がＤ２のＮ末端に連結され、さらにＤ２がＭのＮ末端に連結されている、請求項１に記載のＩＬ−３３拮抗薬。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＩＬ−３３拮抗薬であって、以下：
（ａ）前記ＩＬ−３３拮抗薬は、２５℃での表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定される１０ｐＭ未満の結合解離平衡定数（ＫD）によってヒトインターロイキン３３（ＩＬ−３３）と結合する；または
（ｂ）前記ＩＬ−３３拮抗薬は、２５℃での表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定される４０分以上の解離半減期（ｔ１／２）によってヒトインターロイキン３３（ＩＬ−３３）と結合する；
前記ＩＬ−３３拮抗薬。
【請求項９】
Ｄ１が、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＩＬ−３３拮抗薬。
【請求項１０】
Ｄ２が、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＩＬ−３３拮抗薬。
【請求項１１】
配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＩＬ−３３拮抗薬。
【請求項１２】
配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＩＬ−３３拮抗薬。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＩＬ−３３拮抗薬、及び薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１４】
炎症性疾患もしくは障害または炎症性疾患もしくは障害に関連する少なくとも一つの症状を治療する方法で使用するための請求項１３に記載の医薬組成物であって、前記方法は、それを必要とする患者に前記医薬組成物を投与することを含み、前記炎症性疾患もしくは障害または炎症性疾患もしくは障害に関連する少なくとも一つの症状が、前記医薬組成物を投与した後で、重症度、持続期間、または発症頻度が、緩和しまたは低減し、任意に前記炎症性疾患または障害は、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節炎、アレルギー性鼻炎、好酸球性食道炎、及び乾癬からなる群から選択される、前記医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の医薬組成物であって：
（ａ）前記炎症性疾患または障害は、喘息であり、任意に前記喘息は、好酸球性または非好酸球性の喘息であり、そして任意に前記喘息は、ステロイド抵抗性またはステロイド感受性の喘息である；または
（ｂ）前記炎症性疾患または障害は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）であり、任意に前記慢性閉塞性肺疾患は、ある程度たばこの煙に起因しまたは原因とする；
前記医薬組成物。
【請求項１６】
アレルゲンに対して感受性を示す患者を治療する方法で使用するための請求項１３に記載の医薬組成物であって、前記方法は、それを必要とする患者に前記医薬組成物の有効量を投与することを含み、前記患者は、アレルゲンに対して低下感受性もしくは減少アレルギー反応を示すか、または抗体もしくは抗体を含む組成物の投与の後で、アレルゲンに対して全くの感受性またはアレルギー反応、またはアナフィラキシー反応を発症しない、前記医薬組成物。
【請求項１７】
喘息、アレルギー、アナフィラキシー、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節炎、アレルギー性鼻炎、好酸球性食道炎、及び乾癬からなる群から選択される炎症性疾患または障害を治療する方法で使用するための、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記炎症性疾患もしくは障害または前記炎症性疾患もしくは障害の少なくとも１つの症状を軽減するために、またはアレルゲンに対するアレルギー反応を減少させるために、有用な第２の治療薬の有効量を投与することをさらに含み、任意に前記第２の治療薬は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、コルチコステロイド、気管支拡張薬、抗ヒスタミン薬、エピネフリン、充血除去剤、胸腺ストローマリンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）拮抗薬、ＩＬ−１３拮抗薬、ＩＬ−４拮抗薬、ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重拮抗薬、ＩＬ−５拮抗薬、ＩＬ−６拮抗薬、ＩＬ−１２／２３拮抗薬、ＩＬ−２２拮抗薬、ＩＬ−２５拮抗薬、ＩＬ−１７拮抗薬、ＩＬ−３１拮抗薬、経口ＰＤＥ４阻害剤、及び他のＩＬ−３３拮抗薬、またはＩＬ−３３に対する異なる抗体からなる群から選択される、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−３３を遮断できる抗原結合分子とその使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−３３（ＩＬ−３３）は、ＳＴ２、付属タンパク質であるＩＬ−１ＲＡｃＰと関連するＴｏｌｌ様／インターロイキン−１受容体スーパーファミリーのメンバーのためのリガンドである（評価のために参照のこと、例えば、非特許文献１，非特許文献２；非特許文献３；特許文献１；特許文献２）。ＩＬ−３３によるＳＴ２／ＩＬ−１ＲＡｃＰの活性化の際に、シグナル伝達カスケードは、ＭｙＤ８８（骨髄分化因子８８）、及びＴＲＡＦ６（ＴＮＦ受容体関連因子６）などの下流分子を介して起こり、ＮＦκＢ（核因子−κＢ）の活性化なども続く。ＩＬ−３３シグナル伝達は、多様な疾病や障害の因子として関係してきた（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＵＳ２０１０／０２６０７７０
【特許文献２】ＵＳ  ２００９／００４１７１８
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｋａｋｋａｒ  ａｎｄ  Ｌｅｅ、  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ７（１０）：８２７−８４０（２００８）
【非特許文献２】Ｓｃｈｍｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２３：４７９−４９０（２００５）
【非特許文献３】Ｌｉｅｗ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  −  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１０：１０３−１１０（２０１０）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、インターロイキン−３３（ＩＬ−３３）拮抗薬を提供する。
【０００６】
一態様では、本発明は、第１のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ１）及び多量体ドメイン（Ｍ）を含むＩＬ−３３拮抗薬を提供する。
【０００７】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬が、多量体ドメイン（Ｍ）に連結された第１のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ１）を含み、そのＤ１は、ＳＴ２タンパク質のＩＬ−３３結合部分を含む．
【０００８】
ある実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬は、さらに１つ以上の追加のＩＬ−３３結合ドメイン（例えば、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４など）を含む。
【０００９】
ある実施形態によると、ＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４など）は、ＳＴ２タンパク質、ＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質の細胞外ドメイン、または他のＩＬ−３３結合ドメインのＩＬ−３３結合部分を含む。
【００１０】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬は、さらにＤ１及び／またはＭに連結した第２のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ２）を含み、そのＤ２はＩＬ−１ＲＡｃＰのタンパク質の細胞外部分を含む。一実施形態では、Ｄ１は、ＭのＮ末端に連結している。一実施形態では、Ｄ１は、ＭのＣ末端に連結している。一実施形態では、Ｄ２は、ＭのＮ末端に連結している。一実施形態では、Ｄ２は、ＭのＣ末端に連結している。一実施形態では、Ｄ１は、Ｄ２のＮ末端に連結し、Ｄ２は、ＭのＮ末端に連結している。
【００１１】
多量体ドメイン（Ｍ）は、Ｎ末端及びＣ末端を有するペプチドまたはポリペプチドであってよい。ＩＬ−３３結合ドメイン成分は、ＭのＮ末端またはＣ末端のいずれかに連結してもよい。ある実施形態によれば、Ｄ１、Ｄ２及びＭ成分は、Ｄ１がＤ２のＮ末端に連結し、そしてそのＤ２は、ＭのＮ末端に連結するようにして直列に連結した。Ｄ１、Ｄ２、及びＭ成分の多くの配置及び構成は、本明細書に記載される例によって本発明の範囲内にあると考える。
【００１２】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬は、２５℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約８０ｐＭ未満の結合解離平衡定数（ＫD）、及び／または３７℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約４００ｐＭ未満の結合解離平衡定数（ＫD）によってヒトインターロイキン３３（ＩＬ−３３）と結合する。
【００１３】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬は、２５℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約６０ｐＭ未満の結合解離平衡定数（ＫD）、及び／または３７℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約１．０ｐＭ未満の結合解離平衡定数（ＫD）によってヒトインターロイキン３３（ＩＬ−３３）と結合する。
【００１４】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬は、２５℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約６０ｐＭ未満の結合解離平衡定数（ＫD）、及び／または３７℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約２００ｐＭ未満の結合解離平衡定数（ＫD）によってサルインターロイキン３３（ＩＬ−３３）と結合する。
【００１５】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬は、２５℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約１．０ｐＭ未満の結合解離平衡定数（ＫD）、及び／または３７℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約１．０ｐＭ未満の結合解離平衡定数（ＫD）によってサルインターロイキン３３（ＩＬ−３３）と結合する。
【００１６】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬は、２５℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約１１０ｐＭ未満の結合解離平衡定数（ＫD）、及び／または３７℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約１００ｐＭ未満の結合解離平衡定数（ＫD）によってマウスインターロイキン３３（ＩＬ−３３）と結合する。
【００１７】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬は、２５℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約１０ｐＭ以下の結合解離平衡定数（ＫD）、及び／または３７℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約５ｐＭ以下の結合解離平衡定数（ＫD）によってマウスインターロイキン３３（ＩＬ−３３）と結合する。
【００１８】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬は、２５℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約９分以上の解離半減期（ｔ１／２）、及び／または３７℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約４分以上の解離半減期（ｔ１／２）によってヒトインターロイキン３３（ＩＬ−３３）と結合する。
【００１９】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬は、２５℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約３０分以上の解離半減期（ｔ１／２）、及び／または３７℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約１０００分以上の解離半減期（ｔ１／２）によってヒトインターロイキン３３（ＩＬ−３３）と結合する。
【００２０】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬は、２５℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約４０分より長い解離半減期（ｔ１／２）、及び／または３７℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約１０分以上の解離半減期（ｔ１／２）によってサルインターロイキン３３（ＩＬ−３３）と結合する。
【００２１】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬は、２５℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約１０００分より長い解離半減期（ｔ１／２）、及び／または３７℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約１０００分以上の解離半減期（ｔ１／２）によってサルインターロイキン３３（ＩＬ−３３）と結合する。
【００２２】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬は、２５℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約２５分より長い解離半減期（ｔ１／２）、及び／または３７℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約３０分より長い解離半減期（ｔ１／２）によってサルインターロイキン３３（ＩＬ−３３）と結合する。
【００２３】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬は、２５℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約５００分より長い解離半減期（ｔ１／２）、及び／または３７℃での表面プラズモン共鳴解析によって測定される約１０００分より長い解離半減期（ｔ１／２）によってマウスインターロイキン３３（ＩＬ−３３）と結合する。
【００２４】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬は、ＩＬ−３３及びＳＴ２の相互作用を遮断する。
【００２５】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬は、２５℃での受容体／リガンド結合解析によって体外環境で測定される約１１５ｐＭ未満のＩＣ50値を示すＩＬ−３３及びＳＴ２の相互作用を遮断する。
【００２６】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬は、２５℃での受容体／リガンド結合解析によって体外で測定される約２０ｐＭ未満のＩＣ50値を示すＩＬ−３３及びＳＴ２の相互作用を遮断する。
【００２７】
一実施形態では、Ｄ１は、配列番号５または６のアミノ酸配列か、もしくはそのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２８】
一実施形態では、Ｄ２は、配列番号７または８のアミノ酸配列か、もしくはそのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２９】
一実施形態では、多量体成分は、配列番号９または１０のアミノ酸配列か、もしくはそのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３０】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬は、第１の多量体ドメイン（Ｍ１）に連結した第１のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ１）及び第２の多量体ドメイン（Ｍ２）に連結した第２のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ２）を含み、そのＤ１ドメイン及び／またはＤ２のドメインがＳＴ２とＩＬ−１ＲＡｃＰからなる群から選択される受容体のＩＬ−３３結合部分を含む。
【００３１】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬が、Ｄ１またはＭ１のいずれかに連結した第３のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ３）を含み、そのＤ３はＳＴ２とＩＬ−１ＲＡｃＰからなる群から選択される受容体のＩＬ−３３結合部分を含む。
【００３２】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬が、Ｄ２またはＭ２のいずれかに連結した第３のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ３）を含み、そのＤ４はＳＴ２とＩＬ−１ＲＡｃＰからなる群から選択される受容体のＩＬ−３３結合部分を含む。
【００３３】
一実施形態では、Ｄ１をＭ１のＮ末端に連結し、そしてＤ２をＭ２のＮ末端に連結する。
【００３４】
一実施形態では、Ｄ３をＤ１のＮ末端に連結する。
【００３５】
一実施形態では、Ｄ３をＭ１のＣ末端に連結する。
【００３６】
一実施形態では、Ｄ４をＤ２のＮ末端に連結する。
【００３７】
一実施形態では、Ｄ４をＭ２のＣ末端に連結する。
【００３８】
一実施形態では、Ｄ３をＤ１のＮ末端に連結し、Ｄ１をＭ１のＮ末端に連結する。さらにＤ４をＤ２のＮ末端に連結し、そしてＤ２をＭ２のＮ末端に連結する。
【００３９】
一実施形態では、Ｄ３はＤ４と同一または実質的に同一であり、Ｄ１はＤ２と同一または実質的に同一である。
【００４０】
一実施形態では、Ｄ３とＤ４はともに、ＳＴ２タンパク質のＩＬ−３３結合部分を含み、Ｄ１とＤ２はともに、ＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質の細胞外部分を含む。
【００４１】
一実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬は、配列番号１、２、３、４、及び１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４２】
本発明の第２の態様は、炎症性疾患または炎症性障害、もしくは炎症性疾患または炎症性障害の関与する少なくとも１つの症状を治療するために、その必要のある患者に本明細書に記載のＩＬ−３３拮抗薬を使用する方法、及び本発明の一つ以上のＩＬ−３３拮抗薬、もしくは本発明の一つ以上のＩＬ−３３拮抗薬を含む医薬組成物を、その必要のある患者に投与することを含む方法を提供し、その炎症性疾患または障害での重症度、発症期間、発症頻度などを軽減、または減少させ、もしくはその炎症性疾患または障害に関連する少なくとも一つの症状での重症度、持続期間、発生頻度などを軽減、または減少させることを特徴とする。
【００４３】
一実施形態では、本発明の任意の１つ以上のＩＬ−３３拮抗薬によって治療できる炎症性疾患または障害とは、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節炎、アレルギー性鼻炎、好酸球性食道炎、乾癬などからなる群から選択してもよい。
【００４４】
一実施形態では、本発明の任意の１つ以上のＩＬ−３３拮抗薬によって治療できる炎症性疾患または障害とは、喘息である。喘息とは、好酸球性喘息でも、非好酸球性喘息でも、ステロイド抵抗性喘息でも、ステロイド感受性喘息でもよい。
【００４５】
一実施形態では、本発明の任意の１つ以上のＩＬ−３３拮抗薬によって治療できる炎症性疾患または障害とは、アトピー性皮膚炎である。
【００４６】
一実施形態では、本発明の任意の１つ以上のＩＬ−３３拮抗薬によって治療できる炎症性疾患または障害とは、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。一実施形態では、慢性閉塞性肺疾患とは、ある程度たばこの煙に起因するかもしれないし、その原因であるかもしれない。
【００４７】
関連実施形態では、本発明は、アレルゲンに過敏に反応する患者を治療するための方法、あるいは本発明の１つ以上のＩＬ−３３拮抗薬の有効量、または本発明の１つ以上のＩＬ−３３拮抗薬を含む医薬組成物を投与することを含む方法を、その必要のある患者に提供し、患者のアレルゲンに対する過敏性やアレルギー反応を低下させたり、あるいは抗体や抗体を含む組成物の投与によってアレルゲンに対するいかなる過敏性、アレルギー反応、アナフィラキシー反応も発症させないことを特徴とする。
【００４８】
関連実施形態では、本発明が、炎症性疾患または障害の治療に使用するために本発明の１つ以上のＩＬ−３３拮抗薬を含む医薬組成物を提供し、その炎症性疾患または障害とは、喘息、アレルギー、アナフィラキシー、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節炎、アレルギー性鼻炎、好酸球性食道炎、乾癬などからなる群から選択されることを特徴とする。
【００４９】
一実施形態では、本発明が、炎症性疾患または障害の治療のための薬剤製造における本発明の１つ以上のＩＬ−３３拮抗薬を含む医薬組成物を提供し、その炎症性疾患または障害とは、喘息、アレルギー、アナフィラキシー、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節炎、アレルギー性鼻炎、好酸球性食道炎、乾癬などからなる群から選択されることを特徴とする。
【００５０】
ある実施形態では、本発明が、炎症性疾患または障害、あるいは炎症性疾患または障害の少なくとも１つの症状を回復させるために、さもないとアレルゲンに対するアレルギー反応を減少させるために有効な第２の治療薬の有効量と本発明の１つ以上のＩＬ−３３拮抗薬を組み合わせて投与することによって、炎症性疾患または障害を治療する方法を提供する。
【００５１】
一実施形態では、その第２の治療薬とは、非ステロイド性抗炎症（ＮＳＡＩＤ）、コルチコステロイド、気管支拡張薬、抗ヒスタミン薬、エピネフリン、充血除去剤、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）拮抗薬、ＩＬ−１３拮抗薬、ＩＬ−４拮抗薬、ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重拮抗薬、ＩＬ−５拮抗薬、ＩＬ−６拮抗薬、ＩＬ−１２／２３拮抗薬、ＩＬ−２２拮抗薬、ＩＬ−２５拮抗薬、ＩＬ−１７拮抗薬、ＩＬ−３１拮抗薬、ＰＤＥ４阻害剤と他のＩＬ−３３拮抗薬、またはＩＬ−３３に対する異なる抗体などからなる群から選択できる。
【００５２】
本発明の第３の態様とは、本明細書に記載の任意の１つ以上のＩＬ−３３拮抗薬と薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物を、及びそのような医薬組成物を投与することを含む治療方法を、それを必要とする被検者に提供する。ある実施形態では、追加の治療的な活性成分を、本発明のＩＬ−３３拮抗薬と組み合わせて製剤化し、あるいは投与する。
【００５３】
他の実施形態では、以下の詳細な説明の再検討から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、互いに関係するＩＬ−３３拮抗薬の個々の成分の４つの例示的実施形態を示す。パネルＡでは、第１のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ１）を第１の多量体ドメイン（Ｍ１）のＮ末端に取り付け、第２のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ２）を第２の多量体ドメイン（Ｍ２）のＮ末端に取り付けた構成を示している。Ｄ１とＤ２が別々のＩＬ−３３結合タンパク質に由来することを示すため、Ｄ１を白い四角で示し、Ｄ２を黒い四角で示した。パネルＢでは、第１のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ１）を第１の多量体ドメイン（Ｍ１）のＮ末端に連結し、そして第２のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ２）を第２の多量体ドメイン（Ｍ２）のＣ末端に連結した配列を示す。Ｄ１とＤ２が別々のＩＬ−３３結合タンパク質に由来することを示すため、Ｄ１を白い四角で示し、Ｄ２を黒い四角で示した。パネルＣ及びＤでは、４つのＩＬ−３３結合ドメイン、すなわちＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４を含む配列を示した。これらの配列では、Ｄ３−Ｄ１−Ｍ１及びＤ４−Ｄ２−Ｍ２を直列に連結し、Ｄ３をＤ１のＮ末端に連結し、そのＤ１をＭ１のＮ末端に連結する。一方でＤ４をＤ２のＮ末端に連結し、そのＤ２をＭ２のＮ末端に連結した。パネルＣでは、Ｄ３及びＤ４は、互いに同一または実質的に同一であり、Ｄ１及びＤ２も、互いに同一または実質的に同一である。パネルＤでは、Ｄ１及びＤ４は、互いに同一または実質的に同一であり、Ｄ３とＤ２も、互いに同一または実質的に同一である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明を説明する前に、本発明が説明される特別な方法や実験状態に限定されないこと、例えばその方法や条件は変わるかもしれないことなどを理解すべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するだけの目的のために使用されたものであり、限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものであることも理解すべきである。
【００５６】
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、一般的に本発明が属する技術分野の当業者によって理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で使用される用語「約」は、特定数値に使用される場合、その数値が呈示されたその数値から上下１％まで変化してもよいことを意味する。例えば、本明細書で使用された場合の用語「約１００」は、９９から１００までと、その間の数値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
【００５７】
本明細書に記載の方法及び材料と類似または同等のいかなる方法も材料も、本発明の実施または試験において使用できるが、好ましい方法及び材料は以下に記載されるものである。
【００５８】
ＩＬ−３３拮抗薬
本明細書で使用される用語「インターロイキン−３３」、「ＩＬ−３３」などは、ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿２５４２７４．１（ヒトアイソフォーム１）、ＮＰ＿００１１８６５６９．１（ヒトアイソフォーム２）、ＮＰ＿００１１８６５７０．１（ヒトアイソフォーム３）に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩＬ−３３タンパク質を意味する。本明細書でのタンパク質、ポリペプチド、タンパク質フラグメントの言及すべては、非ヒト種（例えば、「マウスＩＬ−３３」、「サルＩＬ−３３」など）由来として特に明記されない限り、それぞれヒト対応のタンパク質、ポリペプチド、タンパク質フラグメントを指すこととする。
【００５９】
本明細書で使用される場合の用語「ＩＬ−３３拮抗薬」は、ＩＬ−３３に結合でき、そしてシグナルを発するＩＬ−３３及び／またはＩＬ−３３と細胞表面受容体（例えば、ＳＴ２）との間の相互作用を遮断、弱体化または何らかの方法で妨害できる任意の抗原結合分子を意味する。
【００６０】
本発明のＩＬ−３３拮抗薬は、多量体ドメイン（Ｍ）に連結した第１のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ１）を含む。ある実施形態では、本発明のＩＬ−３３拮抗薬は、Ｄ１に連結した第２のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ２）及び／またはＭを含む。ある実施形態によると、Ｄ１は、ＳＴ２タンパク質のＩＬ−３３結合部分を含む。ある実施形態によれば、Ｄ２は、ＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質の細胞外部分を含む。
【００６１】
ＩＬ−３３拮抗薬の個々の成分は、ＩＬ−３３に結合できる機能的な拮抗薬分子をもたらす様々な方法で互いに整えられてもよい。例えば、Ｄ１及び／またはＤ２は、ＭのＮ末端に連結できる。他の実施形態では、Ｄ１及び／またはＤ２は、ＭのＣ末端に連結されている。さらに他の実施形態では、Ｄ１をＤ２のＮ末端に連結し、Ｄ２をＭのＮ末端に連結することで、式Ｄ１−Ｄ２−Ｍで表される拮抗薬分子のＮ末端からＣ末端への直列連結になる。個々の成分の他の配置は、本明細書の他のところに開示する。
【００６２】
本発明のＩＬ−３３拮抗薬の非限定的な例とは、本明細書の作業実施例で示され、「ｈＳＴ２−ｈＦＣ」、「ｈＳＴ２−ｍＦｃ」、「ｈＳＴ２−ｈＩＬ１ＲＡｃＰ−ｍＦｃ」、「ｈＳＴ２−ｈＩＬ１ＲＡｃＰ−ｈＦｃ」、「ｍＳＴ２−ｍＩＬ１ＲＡｃＰ−ｍＦｃ」と指定された拮抗薬を含む。ｈＳＴ２−ｈＦＣとｈＳＴ２−ｍＦｃは、「ＳＴ２受容体タンパク質」としても表現してもよい。ｈＳＴ２−ｈＩＬ１ＲＡｃＰ−ｍＦｃ、ｈＳＴ２−ｈＩＬ１ＲＡｃＰ−ｈＦｃ、ｍＳＴ２−ｍＩＬ１ＲＡｃＰ−ｍＦｃは、本明細書では「ＩＬ−３３トラップタンパク質」としても表現してもよい。
【００６３】
本明細書で使用される用語「連結」とは、第２のポリペプチド成分に「連結」された第１のポリペプチド成分の状況（例えば、「Ｄ１がＭに連結している」、「Ｄ２はＭに連結している」、「Ｄ１はＤ２に連結している」など）において、第１の成分が、第２の成分に物理的に、直接的か間接的かのいずれかで、接続されている状況を意味する。２つのポリペプチド成分の間の直接連結の例にあるように、第１の成分のＣ末端のアミノ酸が、第２の成分のＮ末端のアミノ酸にペプチド結合を介して接続でき、もしくは第１の成分のＮ末端のアミノ酸が、第２の成分のＣ末端アミノ酸にペプチド結合を介して接続できる。一方で、間接的結合とは、第１の成分と第２の成分が、第１の成分と第２の成分との間をつなぐものとして機能する介在構造のいろいろな部分に物理的に、それぞれ接続されることを意味する。その介在構造は、例えば、単一のアミノ酸、ペプチドリンカー、別のポリペプチド成分（例えば、別のＩＬ−３３結合タンパク質など）であってもよい。例えば、配置Ｄ１−Ｄ２−Ｍ（第１のＩＬ−３３結合ドメイン［Ｄ１］が、今度は逆に多量体ドメイン［Ｍ］に接続した第２のＩＬ−３３結合ドメイン［Ｄ２］に連結している）において、Ｄ１は、その連結が介在構造として機能するＤ２と間接的であっても、Ｍに「連結」されていると見なされる。
【００６４】
標準的な分子生物学的技術（例えば、組換えＤＮＡ技術）は、本発明の任意のＩＬ−３３拮抗薬またはその変異体を構築するために使用してもよい。
【００６５】
ＩＬ−３３結合ドメイン
本発明のＩＬ−３３拮抗薬とは、少なくとも一つのＩＬ−３３結合ドメイン（記号「Ｄ」または「Ｄ１」、「Ｄ２」などによって称することもある）を含む。ある実施形態では、ＩＬ−３３結合ドメインは、ＳＴ２タンパク質のＩＬ−３３結合部分を含む。ＳＴ２タンパク質のＩＬ−３３結合部分は、ＳＴ２タンパク質の細胞外ドメインの全部または一部を含むことができるか、またはそれらからなることができる。ある実施形態では、ＳＴ２タンパク質は、ヒトＳＴ２タンパク質である。本明細書で使用の「ヒトＳＴ２タンパク質」は、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＳＴ２タンパク質を指す。ある実施形態では、ＳＴ２タンパク質は、非ヒト種（例えば、マウスＳＴ２、サルＳＴ２など）に由来するＳＴ２タンパク質である。ＳＴ２タンパク質の例示的なＩＬ−３３結合部分は、配列番号５（ヒトＳＴ２［ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿０５７３１６．３のＫ１９−Ｓ３２８］の細胞外ドメインに相当する）のアミノ酸配列として本明細書に記載する。ＳＴ２タンパク質のＩＬ−３３結合部分の別の例は、配列番号６（マウスＳＴ２の細胞外ドメインに対応する［ＮＣＢＩ登録番号Ｐ１４７１９のＳ２７−Ｒ３３２］）のアミノ酸配列として本明細書に記載する。
【００６６】
ある実施形態では、ＩＬ−３３結合ドメインは、ＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質の細胞外部分を含む。ある実施形態では、ＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質である。本明細書で使用の「ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質」は、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質を指す。ある実施形態では、ＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質は、非ヒト種（例えば、マウスＩＬ−１ＲＡｃＰ、サルＩＬ−１ＲＡｃＰなど）由来のＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質である。ＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質の例示的な細胞外部分は、配列番号７（ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰ［ＮＣＢＩ登録番号Ｑ９ＮＰＨ３のＳ２１−Ｅ３５９］の細胞外ドメインに対応）のアミノ酸配列として本明細書に記載する。ＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質の細胞外部分の別の例は、配列番号８（マウスＩＬ−１ＲＡｃＰ［ＮＣＢＩ登録番号Ｑ６１７３０のＳ２１−Ｅ３５９］の細胞外ドメインに対応）のアミノ酸配列として本明細書に記載する。
【００６７】
本発明は、明細書（例えば、配列番号５−８）に記載の例示的なＩＬ−３３結合ドメイン成分の任意のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を有するＤ１成分及び／またはＤ２成分を含むＩＬ−３３拮抗薬を含む。
【００６８】
多量体ドメイン
本発明のＩＬ−３３拮抗薬はまた、少なくとも１つの多量体ドメイン（本明細書で略語「Ｍ」、「Ｍ１」、「Ｍ２」などでも言及）を含む。一般的に、本発明の多量体ドメイン（複数可）は、ＩＬ−３３拮抗薬の様々な構成要素（例えば、ＩＬ−３３結合ドメイン（複数可））を互いに接続することにより機能する。本明細書で使用の「多量体ドメイン」は、同一または類似の構造または構成のもう１つの高分子に（共有結合的にまたは非共有結合的に）結びつけるための能力を有する任意の巨大分子である。例えば、多量体ドメインは、免疫グロブリンＣＨ3ドメインを含むポリペプチドであってもよい。多量体ドメインの非限定的な例としては、例えば、アイソタイプのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ならびに各アイソタイプグループ内の任意のアロタイプから選択されたＩｇＧのＦｃドメインである免疫グロブリンのＦｃ部分である。ある実施形態では、多量体ドメインは、Ｆｃ断片または少なくとも１つのシステイン残基を含む、長さが１アミノ酸から約２００アミノ酸のアミノ酸配列である。他の実施形態では、多量体ドメインは、システイン残基または短いシステイン含有ペプチドである。その他の多量体ドメインは、ペプチドまたはポリペプチドであって、ともにロイシンジッパー、ヘリックス−ループモチーフ、コイルドコイルモチーフなどを含むか、それらから構成される。
【００６９】
例示的な多量体ドメインは、本発明のＩＬ−３３拮抗薬を含む領域で使用することができ、そしてヒトＩｇＧ１のＦｃ（配列番号９）またはマウスＩｇＧ２ａのＦｃ（配列番号１０）を含むが、これらに限定されない。本発明は、明細書に記載の例示的な、任意のＭ成分のアミノ酸配列（例えば、配列番号９または１０）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＭ成分を含むＩＬ−３３拮抗薬を含む。
【００７０】
特定の実施形態では、本発明のＩＬ−３３拮抗薬は、２つの多量体ドメインであるＭ１及びＭ２を含み、そのＭ１及びＭ２は、互いに一致していることを特徴とする。例えば、Ｍ１は、特定のアミノ酸配列を有するＦｃドメインであるはずであり、Ｍ２はＭ１と同じアミノ酸配列を有するＦｃドメインである。
【００７１】
あるいは、ある実施形態では、本発明のＩＬ−３３拮抗薬は、１つ以上のアミノ酸位置で互いに異なる２つの多量体ドメイン、Ｍ１及びＭ２を含む。例えば、Ｍ１は、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣH３ドメインを含んでいてもよく、Ｍ２も第２の免疫グロブリン
（Ｉｇ）ＣH３ドメインを含んでもよいが、その第１のＩｇＣH３と第２のＩｇＣH３はともに少なくとも１つのアミノ酸と差異があり、さらに少なくとも１つのアミノ酸の差異が、同一のＭ１配列及びＭ２配列を有する参考構造を比較すると、タンパク質Ａに対して標的構造の結合を弱めている。一実施形態では、Ｍ１のＩｇＣH３ドメインはプロテインＡと結合し、Ｍ２のＩｇＣH３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン番号付けによると、但しＥＵ番号付けによるとＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を減少または無効化する突然変異含む。Ｍ２のＣH３は、さらにＹ９６ｆ修飾（ＩＭＧＴ表記によると、但しＥＵ表記によるとＹ４３６Ｆ）を含んでもよい。Ｍ２のＣH３内で見られるさらなる修正は以下のものを含む。ＩｇＧ１のＦｃドメインの場合には、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｖ８２Ｉ（ＩＭＧＴ表記によると、但しＥＵ表記によるとＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｖ４２２Ｉ）、ＩｇＧ２のＦｃドメインの場合には、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ８２Ｉ（ＩＭＧＴ表記によると、但しＥＵ表記によるとＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ４２２Ｉ）、ＩｇＧ４のＦｃドメインの場合には、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、Ｖ８２Ｉ（ＩＭＧＴ表記によると、但しＥＵ表記のＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、Ｖ４２２Ｉ）。
【００７２】
ＩＬ−３３拮抗薬の構成要素の配置及び配列
本発明のＩＬ−３３拮抗薬の個々の成分（例えば、Ｄ１、Ｄ２、Ｍなど）は、本明細書の他の場所に詳細に記載される例示による様々な方法によって互いに関連して配列できる。多量体ドメイン（Ｍ１及び／またはＭ２）は、Ｎ末端及びＣ末端を有するペプチドまたはポリペプチドであってもよい。したがって、Ｄ１成分及びＤ２成分は、Ｍ成分のＮ末端かＣ末端のいずれかでＭ成分と連結してもよく、例えば、Ｄ１をＭのＮ末端に連結してもよい（この場合は、「Ｄ１−Ｍ」と表される）。あるいは、Ｄ１をＭのＣ末端に連結してもよい（この場合は、「Ｍ−Ｄ１」と表される）。いくつかの実施形態では、Ｄ２をＭのＮ末端に連結し（この場合は、「Ｄ２−Ｍ」と表される）、またはＤ２をＭのＣ末端に連結する（この場合は、「Ｍ−Ｄ２」と表される）。さらに他の実施形態では、Ｄ１をＤ２のＮ末端に連結し、そしてそのＤ２をＭのＮ末端に連結する（この場合は、「Ｄ１−Ｄ２−Ｍ」と表される）。したがって、Ｎ末端からＣ末端への個々の成分の他の例示的な配列は、次のように表せる。それは、Ｄ２−Ｄ１−Ｍ、Ｍ−Ｄ１、Ｍ−Ｄ２、Ｍ−Ｄ１−Ｄ２、Ｍ−Ｄ２−Ｄ１、Ｄ１−Ｍ−Ｄ２、Ｄ２−Ｍ−Ｄ１などである。
【００７３】
２つの異なる多量体ドメイン（Ｍ１及びＭ２）を含む実施形態では、１つ以上のＩＬ−３３結合ドメインは、様々な配列において多量体ドメインと連結してもよい。このような配列の非限定的な例を、図１に図式的に示す。例えば、本発明は、第１の多量体ドメイン（Ｍ１）に連結された第１のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ１）、さらに第２の多量体ドメイン（Ｍ２）に連結された第２のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ２）を含むＩＬ−３３拮抗薬を含む。本発明のＩＬ−３３拮抗薬はまた、１つ以上の追加的なＩＬ−３３結合ドメイン（例えば、Ｄ３、Ｄ４など）を含んでもよい。例えば、第３のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ３）が含まれる例では、Ｄ３成分はＤ１かＭ１のいずれかに連結でき、同じように第４のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ４）が含まれる例でも、Ｄ４成分はＤ２かＭ２のいずれかに連結してもよい。
【００７４】
多数のＩＬ−３３結合ドメインを含む実施形態では、２つ以上のＩＬ−３３結合ドメインが互いに同一、または実質的に同一であってもよい。例えば、４つのＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４）を含む実施形態では、Ｄ１及びＤ２は、互いに同一、または実質的に同一であってもよく、Ｄ３とＤ４も、互いに同一、または実質的に同一であってもよい、などがある。
【００７５】
２つの多量体ドメイン（Ｍ１、Ｍ２）と４つのＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４）を含む本発明のＩＬ−３３拮抗薬の非限定的な、そして実例的な例を、図１に示した。この種の配列では、Ｄ１をＭ１のＮ末端に連結し、Ｄ２をＭ２のＮ末端に連結し、Ｄ３をＤ１のＮ末端に連結し、Ｄ４をＤ２のＮ末端に連結する。パネルＣでは、Ｄ１及びＤ２が互いに同一であり（例えば、それぞれがＩＬ−１ＲＡｃＰの細胞外ドメインを含む）、そしてＤ３及びＤ４も互いに同一である（例えば、それぞれがＳＴ２の細胞外ドメインを含む）という状況を示す。一方でパネルＣでは、Ｄ１及びＤ２が非同一であり、Ｄ３及びＤ４は、非同一であるという状況を示す。いろいろな他の配列も、本開示の教示に基づいて当業者には明らかであり、本発明の範囲内に含まれる。
【００７６】
リンカー
本発明のＩＬ−３３拮抗薬の個々の成分（例えば、Ｄ１、Ｄ２、Ｍ１、Ｍ２など）が、互いに直接的に結合してもよく（例えば、Ｄ１及び／またはＤ２を、直接Ｍに結合してもよい、など）、あるいは、個々の成分が、リンカー成分を介して互いに結合させてもよい（例えば、個々の成分間とリンカーを介して正しくＭに連結させるようにしてもよく、またＤ１を、リンカーを介してＤ２に連結してもよい、など）。本明細書に開示された任意の配列において、ある成分を別の成分に「連結」するとの記載されたその連結方法を、リンカーを介して連結してもよい（それ自体、具体的に指定されていない場合でも）。本明細書で使用する場合、「リンカー」とは２つのポリペプチド成分を連結するための任意の分子のことである。例えば、リンカーはペプチド結合を介して互いに接続された１個から２０個のアミノ酸を含むペプチドでもよい。（しかしながら、ペプチド結合それ自体は、本開示の目的のための「リンカー」とは見なさない）。ある実施形態では、リンカーは、グリシン及びアラニンなどの立体障害のないアミノ酸を含む。ある実施形態では、リンカーは、タンパク質分解に耐性があり、さらに可塑性のある鎖構造を有するアミノ酸である。リンカーは、互いに相互作用する２分子構造を含んでいてもよい。例えば、ある実施形態では、リンカーは、ストレプトアビジン成分やビオチン成分を含んでいてもよく、ストレプトアビジン（１成分に連結）とビオチン（別成分に連結）との間の関係は、ＩＬ−３３拮抗薬の個々の成分間の連結物として機能する。ｈＳＴ２−ｈＩＬ１ＲＡｃＰ−ｍＦｃとｍＳＴ２−ｍＩＬ１ＲＡｃＰ−ｍＦｃのように、本明細書に記載した好ましいＩＬ−３３拮抗薬としては、ＩＬ−１ＲＡｃＰ成分とＦｃ多量体ドメインとの間で作用するセリン−グリシン（ＳＧ）リンカーを含む。他の同様のリンカー配列及びリンカーを含む構造物は、本発明の範囲内にあると考える。
【００７７】
ＩＬ−３３拮抗薬の生物学的特徴
本発明は、高い親和性で可溶性ＩＬ−３３分子に結合するＩＬ−３３拮抗薬を含む。例えば本発明は、例えば本明細書の実施例２に記載の分析形式を使って、表面プラズモン共鳴によって測定される約４００未満ｐＭのＫＤでＩＬ−３３（例えば、２５℃または３７℃で）と結合するＩＬ−３３拮抗薬を含む（本明細書の他の場所に記載のように）。ある実施形態では、本発明のＩＬ−３３拮抗薬を、表面プラズモン共鳴によって測定される約２００ｐＭ未満のＫD、約１００ｐＭ未満のＫD、約９０ｐＭ未満のＫD、約８０ｐＭ未満のＫD、約７０ｐＭ未満のＫD、約６０ｐＭ未満のＫD、約５０ｐＭ未満のＫD、約４０ｐＭ未満のＫD、約３０ｐＭ未満のＫD、約２０ｐＭ未満のＫD、約１０ｐＭ未満のＫD、約９ｐＭ未満のＫD、約８ｐＭ未満のＫD、約６ｐＭ未満のＫD、約１ｐＭ未満のＫDを有するＩＬ−３３と、例えば本明細書の実施例２で明示された分析形式、または実質的に同一分析を使用し、結合する。
【００７８】
また本発明は、例えば本明細書の実施例２に記載のアッセイ形式を、または実質的に同一のアッセイを使用して、２５℃または３７℃にて表面プラズモン共鳴によって測定されるように、具体的には約４分以上の解離半減期（ｔ１／２）においてＩＬ−３３と結合するＩＬ−３３拮抗薬を含む。ある実施形態では、本発明のＩＬ−３３拮抗薬を、例えば本明細書の実施例２に記載のアッセイ形式、または実質的に同一のアッセイを使用し、２５℃または３７℃にて表面プラズモン共鳴により測定して、約１０分より長いｔ１／２、約２０分より長いｔ１／２、約３０分より長いｔ１／２、約４０分より長いｔ１／２、約５０分より長いｔ１／２、約６０分より長いｔ１／２、約７０分より長いｔ１／２、約５００分より長いｔ１／２、約１０００分より長いｔ１／２においてＩＬ−３３と結合する。
【００７９】
本発明はまた、ＩＬ−３３受容体（例えば、ＳＴ２）にＩＬ−３３との結合を遮断するＩＬ−３３拮抗薬を含む。例えば、本発明は、例えば本明細書の実施例３に記載のアッセイ形式または実質的に同一のアッセイを使用し、ＥＬＩＳＡに基づく免疫測定法によって測定されるように約１１５ｐＭより少ないＩＣ50値で、体外環境でのＳＴ２に対するＩＬ−３３の結合を遮断するＩＬ−３３拮抗薬を含む。ある実施形態では、本発明のＩＬ−３３拮抗薬は、ＥＬＩＳＡに基づく免疫測定法によって測定されるように、例えば本明細書の実施例３に記載のアッセイ形式、または実質的に同一のアッセイを使用し、約１２０ｐＭより少ないＩＣ50値で、約９０ｐＭより少ないＩＣ50値で、約８０ｐＭより少ないＩＣ50値で、約７０ｐＭより少ないＩＣ50値で、約６０ｐＭより少ないＩＣ50値で、約５０ｐＭより少ないＩＣ50値で、約４０ｐＭより少ないＩＣ50値で、約３０ｐＭより少ないＩＣ50値で、約２０ｐＭより少ないＩＣ50値で、約１８ｐＭより少ないＩＣ50値で、約１６ｐＭより少ないＩＣ50値で、約１４ｐＭより少ないＩＣ50値で、約１２ｐＭより少ないＩＣ50値で、約１０ｐＭより少ないＩＣ50値で、約９ｐＭより少ないＩＣ50値で、約８ｐＭより少ないＩＣ50値で、約７ｐＭより少ないＩＣ50値で、体外環境でのＳＴ２に対するＩＬ−３３の結合を遮断する。
【００８０】
本発明はまた、ＩＬ−３３媒介細胞シグナル伝達を阻害するＩＬ−３３拮抗薬を含む。例えば、本発明は、細胞に基づくブロッキング生物検定法で測定されるように、例えば本明細書の実施例４に記載のアッセイ形式または実質的に同一のアッセイ使用し、約５００ｐＭより少ないＩＣ50値においてヒトＳＴ２を発現する細胞によってＩＬ−３３媒介性シグナル伝達を阻害するＩＬ−３３拮抗薬を含む。ある実施形態では、本発明のＩＬ−３３拮抗薬は、細胞に基づくブロッキング生物検定法で測定されるように、例えば本明細書の実施例４に記載のアッセイ形式または実質的に同一のアッセイを使用し、約４００ｐＭより少ないＩＣ50値で、約３００ｐＭより少ないＩＣ50値で、約２００ｐＭより少ないＩＣ50値で、約１００ｐＭより少ないＩＣ50値で、約８０ｐＭより少ないＩＣ50値で、約６０ｐＭより少ないＩＣ50値で、約４０ｐＭより少ないＩＣ50値で、約３０ｐＭより少ないＩＣ50値で、約２０ｐＭより少ないＩＣ50値で、約１８ｐＭより少ないＩＣ50値で、約１６ｐＭより少ないＩＣ50値で、約１４ｐＭより少ないＩＣ50値で、約１２ｐＭより少ないＩＣ50値で、約１０ｐＭより少ないＩＣ50値で、約８ｐＭより少ないＩＣ50値で、約７ｐＭより少ないＩＣ50値で、約６ｐＭより少ないＩＣ50値で、約５ｐＭより少ないＩＣ50値で、約４ｐＭより少ないＩＣ50値で、約３ｐＭより少ないＩＣ50値で、約２ｐＭより少ないＩＣ50値で、約１．５ｐＭより少ないＩＣ50値で、ヒトＳＴ２を発現する細胞においてＩＬ−３３媒介シグナル伝達を遮断する。
【００８１】
本発明はまた、ＩＬ−３３誘導性好塩基球の活性化を阻害するＩＬ−３３拮抗薬を含み、そしてＩＬ−３３誘導性ＩＦＮ−γを阻害するＩＬ−３３拮抗薬はヒトＰＢＭＣから放出される。好塩基球が活性化されるということは、ヒスタミンやロイコトリエンなどの脱顆粒、細胞表面マーカーの発現、サイトカイン放出、他の免疫メディエーターの放出を起因することとして定義できる。
【００８２】
本発明のＩＬ−３３拮抗薬は、１つ以上の上記生物学的特性、またはそれらの任意の組み合わせを有してもよい。本発明の抗体の他の生物学的特徴は、本明細書の作業実施例を含む本開示の説明から当業者には明らかであろう。
【００８３】
治療用製剤及びその投与
本発明は、本発明のＩＬ−３３拮抗薬を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、適切な担体、賦形剤、及び改良された移動法、送達法、耐性法などを提供する他の薬剤とともに製剤化してもよい。適切な製剤設計の多くは、すべて薬剤師に知られている処方集（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’Ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、  Ｅａｓｔｏｎ、  ＰＡ）で見られる。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、小胞（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、ライフ・テクノロジーズ、カールズバッド、ＣＡなど）を含む脂質（カチオン性またはアニオン性）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型及び油中水型エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（いろいろな分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカーボワックスを含む半固体混合物、を含む。また、パウエルらによる「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」  ＰＤＡ  （１９９８）  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８−３１１を参照のこと。
【００８４】
患者に投与されるＩＬ−３３拮抗薬の用量は、患者の年齢及び体重、対象疾患、症状、投与経路などに応じて変えてもよい。好適用量とは、主に体重または体表面積に従って算出される。本発明のＩＬ−３３拮抗薬を、成人患者におけるＩＬ−３３活性に関連する症状または疾患を治療するために使用する場合、静脈内に、通常、単回投与で、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇから約２０ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり約０．０２ｍｇから約７ｍｇ、約０．０３ｍｇから約５ｍｇ、約０．０５ｍｇから約３ｍｇとするのが適切としてよい。症状の重症度に応じて、治療頻度及び治療期間を調整してもよい。ＩＬ−３３拮抗薬の投与の有効な用量とスケジュールは、経験的に決定できる。例えば、患者の進行状況は、定期的な評価によって観察し、その用量は観察状況に応じて調整してもよい。また、投与量の種間基準は、当該分野で周知の方法を用いて実行できる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．  Ｒｅｓ．  ８：１３５１）。
【００８５】
様々な送達系が公知であり、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができ、例えば、リポソームのカプセル化、微粒子化、マイクロカプセル化、変異体ウイルスを発現可能な組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７、Ｊ．  ＢＩＯＬ  ＣＨＥＭ２６２：４４２９−４４３２）などがある。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口経路があるが、これらに限定されない。本組成物は、任意の適切な経路によって投与してよく、その経路とは、例えば点滴法または急速静注法、上皮内層または皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を通しての吸収などがあり、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与してもよい。投与方法は、全身投与も局所投与とも可能である。
【００８６】
本発明の医薬組成物は、標準的な注射針及び注射器によって皮下または静脈内に投与できる。また、皮下投与に関して、ペン型投与装置は、容易に本発明の医薬組成物を投与するのに有用である。このようなペン型投与装置は、再使用可能または使い捨てであってもよい。再使用可能なペン型投与装置は、一般に、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを使用する。一度カートリッジ内の医薬組成物すべてを投与し、カートリッジは空になれば、その空のカートリッジを容易に取り外し、医薬組成物を含む新しいカートリッジと交換できる。ペン型投与装置は、再利用できる。使い捨てのペン型投与装置では、交換可能なカートリッジがないものもある。使い捨てのペン用投与装置は、カートリッジの代わりに、装置内のタンク内に医薬組成物を予め充填するものである。タンクの医薬組成物が空になると、装置全体を廃棄する。
【００８７】
多数の再利用可能なペン型で、自己注入型の投与装置は、本発明の医薬組成物の皮下投与において有用である。例としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる。オートペン（商標）（オーウェン・マンフォード社、ウッドストック、イギリス）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃメディカルシステムズ、バーグドルフ、スイス）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ヒューマリン７０／３０（商標）ペン（イーライリリー社、インディアナポリス、ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（ノボノルディスク、コペンハーゲン、デンマーク）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（ノボノルディスク、コペンハーゲン、デンマーク）、ＢＤ（商標）ペン（ベクトン・ディッキンソン、ほんの数名にフランクリンレイクス、ニュージャージー州）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮスターレット（商標）、及びＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（サノフィ−アベンティス、フランクフルト、ドイツ）。本発明の医薬組成物の皮下送達において応用を有する使い捨てペン送達装置の例としては、限定されないものの、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン  （ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）  （Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、  ＫＷＩＫＰＥＮ（商標）  （Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ  （Ａｍｇｅｎ、  Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、  ＣＡ）、  ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、  Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ  （Ｄｅｙ、  Ｌ．Ｐ．）、  ＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン  （Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ、  Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ  ＩＬ）を提示する。
【００８８】
ある状況では、医薬組成物は、制御放出系で送達できる。一実施形態では、ポンプを用いてもよい（「Ｌａｎｇｅｒ、  ｓｕｐｒａ；  Ｓｅｆｔｏｎ、  １９８７、  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  １４：２０１」を参照のこと）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用できる（「Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ」Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ  （ｅｄｓ．）、  １９７４、  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、  Ｆｌｏｒｉｄａ）を参照のこと）。さらに別の実施形態では、制御放出系は組成物の標的の近傍に配置でき、その結果、全身性投与量の一部のみの投与で済ますことができる（参照のこと、例えば「Ｇｏｏｄｓｏｎ、  １９８４、  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、  ｓｕｐｒａ、  ｖｏｌ．  ２、  ｐｐ．  １１５−１３８」）。他の制御放出系は、以下の著作による検討で議論されている（Ｌａｎｇｅｒ、  １９９０、  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３）。
【００８９】
注射用製剤は、静脈内、皮下、皮内及び筋肉内注射剤、点滴剤などのための剤形を含んでいてもよい。これらの注射剤は、公知の方法によって調製できる。例えば、注射用製剤は、例えば、注射剤に通常に用いられる滅菌水性媒体または油性媒体中において上記の拮抗薬またはその塩を溶解、懸濁または乳化させることによって調製してもよい。注射用の水性媒体としては、例えば、生理食塩水、アルコール、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などがあり、それらのものは、例えばアルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。油性媒体としては、例えばゴマ油、大豆油などが使用され、それらは安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。このようにして調製された注射液は、好ましくは、適当なアンプルに充填される。
【００９０】
有利には、上述の経口または非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような単位用量の投与形態として調製される。単位用量中のそのような剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐薬などを含む。上記の含まれる拮抗薬分子量は、単位用量での１投薬形態当たり約５〜約５００ｍｇが一般的であり、特に注射剤の場合では、上記拮抗薬分子は、他の剤形のために約５から約１００ｍｇ及び約１０〜約２５０ｍｇに含まれることが好ましい。
【００９１】
ＩＬ−３３拮抗薬の治療的使用
本発明者らの実験は、ＩＬ−３３拮抗作用によって、治療、防止及び／または改善させることのできる様々な疾患及び症状の同定に貢献している。例えば、マウスＩＬ−３３ＤＮＡの流体力学的投与は、マウスにおける総血清ＩｇＥの肺粘液での蓄積と増加を誘導した。また、ＭＩＬ−３３ＤＮＡの投与は、マイクロアレイ分析によって測定されるようにＳＴ２と様々な下流サイトカインの上方調整をもたらした。ＩＬ−３３ノックアウトマウスを用いて本発明者らが行った実験はまた、ＩＬ−３３拮抗作用の様々な潜在的な治療効果を明らかにした。例えば、肉眼的得点及び皮膚浸潤では、ＩＭＱ誘発性乾癬のモデルで野生型マウスとＩＬ−３３-/-マウスは同等であることが判明した。さらに、ＩＬ−３３-/-マウスは、アレルゲン誘発性肺炎症モデルにおいて、好酸球増加症及び残留粘液蓄積の低下を示した。本発明のＩＬ−３３拮抗薬は、ＩＬ−３３の発現、シグナル伝達、または活性によって関連する、または媒介される、あるいはＩＬ−３３及びＩＬ−３３リガンド（例えば、ＳＴ２）との間の相互作用を遮断すること、さもなければＩＬ−３３活性及び／またはシグナル伝達を阻害することによって治療可能な、任意の疾患または障害を治療、予防及び／または改善するために、とりわけ有用である。例えば、本発明は、感染症（例えば、リーシュマニア感染症、鞭感染症、マイコバクテリア感染症、リステリア感染症、トキソプラズマ感染症、住血吸虫の感染症、呼吸器合胞体ウイルス感染、インフルエンザウイルス感染など）、喘息（例えば、好酸球性または非好酸球性喘息、ステロイド抵抗性またはステロイド感受性の喘息、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息、重度の難治性の喘息、喘息増悪［例えば、ウイルスまたはアレルゲンの誘発］など）、アトピー性皮膚炎、乾癬、他の炎症性疾患、アレルギー、アナフィラキシー、心臓血管疾患、中枢神経系疾患、痛み、及び関節炎（例えば、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎など）、巨細胞性動脈炎、炎症性腸疾患（例えばクローン病または潰瘍性大腸炎）、多発性硬化症、アレルギー性鼻炎、好酸球性食道炎の血管炎、及びヘノッホ・シェーンライン紫斑病を治療するための方法を提供する。本発明のＩＬ−３３拮抗薬は、１つ以上の線維性疾患の治療、予防及び／または改善するのに有用である。本発明のＩＬ−３３拮抗薬を投与することによって治療可能である例示な線維症とは、肺線維症（例えば、特発性肺線維症、ブレオマイシン誘発性肺線維症、アスベスト誘発性肺線維症、及び閉塞性細気管支炎症候群）、慢性喘息、急性肺損傷及び急性呼吸窮迫との関連性線維症（例えば、アレルゲン誘導性線維症、細菌性肺炎誘導性線維症、外傷誘導性線維症、ウイルス性肺炎誘導性線維症、人工呼吸器誘発性線維症、肺以外の敗血症誘発性線維症及び吸引誘導性線維症）、珪肺、放射線誘発性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ、ＣＯＰＤ増悪を含む、たばこの煙の直接喫煙または受動喫煙による部分的に起因または原因とするＣＯＰＤ、眼線維症、皮膚線維症（例えば、強皮症）、肝線維症（例えば、肝硬変、アルコール誘発肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、胆汁性ダクト損傷、原発性胆汁性肝硬変、伝染性またはウイルス性肝線維症［例えば、慢性ＨＣＶ感染］、自己免疫性肝炎）、腎臓（腎）線維症、心臓線維症、アテローム性動脈硬化症、ステント再狭窄、及び骨髄線維症を含む。
【００９２】
本明細書に記載される治療方法の文では、ＩＬ−３３拮抗薬は、単剤療法（すなわち、単体の治療剤として）としても、あるいは１つ以上の追加治療薬との混合薬（その例は、本明細書の他の場所に記載）としても投与してもよい。
【００９３】
併用療法及び製剤
本発明は、それを必要とする被験体に、１つ以上の追加の治療的活性のある成分と混合薬、及びこのような混合薬を投与することを含む治療方法において、本明細書に記載の任意のＩＬ−３３拮抗薬を含む組成物及び治療用製剤を含む。また、本発明のＩＬ−３３拮抗薬は、例えば、サイトカイン阻害剤または拮抗薬と共製剤化及び／または混合薬として投与してもよく、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−３１、ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重拮抗薬、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３拮抗薬、ＰＤＥ４阻害剤（一実施形態では、経口ＰＤＥ４阻害剤）などのサイトカインと結合し、さらに別のＩＬ−３３拮抗薬または異なる抗体をＩＬ−３３、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、またはそれらのそれぞれの受容体の拮抗薬に結合した小分子サイトカイン阻害剤及び抗体を含む。
【００９４】
本発明のＩＬ−３３拮抗薬はまた、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、コルチコステロイド、ステロイド、酸素、酸化防止剤、金属キレート剤、ＩＦＮ−γ、及び／または非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、気管支拡張薬、抗ヒスタミン剤、エピネフリン、または充血除去剤と組み合わせて投与しも、及び／または共製剤化してもよい。
【００９５】
追加の治療的に活性な成分（複数可）を、本発明のＩＬ−３３拮抗薬を投与した後、直前、同時、または直後に投与してもよい（本開示の目的として、そのような投与計画は、「追加の治療的に活性な成分と組み合わせにおける」ＩＬ−３３拮抗薬の投与と見なされる）。本発明のＩＬ−３３拮抗薬は、本明細書の他の箇所に記載されるように、一つ以上の追加の治療的活性のある成分（複数可）と同時処方された薬学的組成物を、本発明は含む。
【００９６】
投与計画
本発明のある実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬（またはＩＬ−３３拮抗薬と本明細書に記載の追加の治療的活性のある任意の薬剤との混合物を含む医薬組成物）の複数回投与の場合、決められた時間経過を超えて被検者に投与してもよい。本発明のこの態様による方法は、被験体に本発明のＩＬ−３３拮抗薬の連続複数回投与を含む。本明細書で使用する場合の「連続投与」とは、時間通りの決められた時点で、例えば所定の間隔で区切られた別の日（例えば、数時間、数日、数週間または数ヶ月）に、ＩＬ−３３拮抗薬のそれぞれの用量を、被検者に投与することを意味する。本発明は、患者にＩＬ−３３拮抗薬の単体の初回用量を連続的に投与することを含む方法を含み、続いてＩＬ−３３拮抗薬の１つ以上の２回目の用量、そして必要に応じてＩＬ−３３拮抗薬の一つ以上の３回目の用量と続く。
【００９７】
用語「初回用量」、「２回目用量」及び「３回目用量」は、本発明のＩＬ−３３拮抗薬の投与の時間的順序を指す。したがって、「初回用量」とは、治療計画の開始時に投与される用量（「基準量」ともいう）であり、「２回目用量」とは、初回の後に投与される用量であり、そして「３回目用量」とは、２回目の後に投与される用量である。初回、２回目、及び３回目の用量はすべて、ＩＬ−３３拮抗薬を同じ量を含有してもよいが、一般に投与の頻度の点でそれぞれが異なってもよい。しかしながら、ある実施形態では、治療中、初回、２回目及び／または３回目の用量に含まれるＩＬ−３３拮抗薬の量は、それぞれに変化する（例えば、必要に応じて上下に調節）。ある実施形態では、２回目以降（例えば、２回目、３回目、４回目、または５回目）の用量は、「負荷用量」として治療計画の開始時に投与され、より少ない頻度で投与されるその後の容量（例えば、「維持用量」）が続く。
【００９８】
本発明のある例示的な実施形態では、２回目及び／または３回目の用量それぞれは、前回用量直後１〜２６週目（例えば、１、１・１／２、２、２・１／２、３、３・１／２、  ４、４・１／２、５、５・１／２、６、６・１／２、７、７・１／２、  ８、８・１／２、９、９・１／２、１０、１０・１／２、１１、１１・１／２、１２、１２・１／２、１３、１３・１／２、１４、１４・１／２、１５、１５・１／２、１６、１６・１／２、１７、  １７・１／２、１８、１８・１／２、１９、１９・１／２、２０、２０・１／２、２１、２１・１／２、２２、２２・１／２、２３、２３・１／２、２４、２４・１／２、２５、２５・１／２、２６、２６・１／２、またはそれ以上）に投与される。本明細書で使用される用語「前回用量直後」とは、複数回用量において、中断なしで連続して患者に投与されるＩＬ−３３拮抗薬用量を意味する。
【００９９】
本発明のこの局面による方法では、ＩＬ−３３拮抗薬の２回目及び／または３回目の任意の用量数で患者に投与してもよい。例えば、ある実施形態では、ＩＬ−３３拮抗薬単体で２回目用量までのみが患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、またはそれ以上）の２回目用量が患者に投与される。同様に、ある実施形態では、単一の第３の用量が患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、またはそれ以上）の第３回目の用量が患者に投与される。
【０１００】
複数の２回目を含む実施形態では、各２回目用量は、他の２回目用量と同じ頻度で投与してもよい。例えば、各２回目用量は、直前の投与後、１〜２週間以降または１〜２カ月以降の患者に投与してもよい。同様に、複数の３回目用量を含む実施形態では、各第３回目用量は、他の３回目投与量と同じ頻度で投与してもよい。例えば、各３回目用量は、２〜１２週間前投与以降に患者に投与してもよい。本発明のある実施形態では、２回目及び／または３回目用量が患者に投与される頻度は、治療計画の過程で変化することができる。投与の頻度も、臨床検査以下、個々の患者のニーズに応じて、医師による治療の過程の間に調整されてもよい。
【０１０１】
本発明は、２回目〜６回目の負荷用量は、患者の１回目の頻度（例えば、一週間に一回、２週間に１回、３週間に１回、月に一度、２カ月に１回）で投与される投与計画を含み、より少ない頻繁で２回以上の維持用量の投与が続く。例えば、本発明のこの態様では、負荷用量が、月に一度の頻度で投与している場合、その後、維持用量は、６週間に１回、２カ月に１回、３カ月に１回などで患者に投与してもよい。
【実施例】
【０１０２】
以下の実施例は、本発明の方法及び組成物を作製し、使用する方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために記載されており、したがって本発明者らが本発明と考えるものの範囲を限定するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関する正確さを保証するための取組みがなされているが、いくつかの実験誤差及び偏差は考慮されるべきである。特に断らない限り、部品は重量であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
【０１０３】
実施例１  ＩＬ−３３拮抗薬の構築
本発明の別の例示的な５種類のＩＬ−３３拮抗薬は標準的な分子生物学的技術を用いて構築した。第１のＩＬ−３３拮抗薬（ｈＳＴ２−ｈＦｃ、配列番号１）は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（配列番号９）のＮ末端にヒトＳＴ２（配列番号５）のＣ末端を融合させ、その可溶性細胞外領域から構成する。第２のＩＬ−３３拮抗薬（ｈＳＴ２−ｍＦｃ、配列番号２）は、マウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域（配列番号１０）のＮ末端にヒトＳＴ２（配列番号５）のＣ末端を融合させ、その可溶性細胞外領域から構成する。第３のＩＬ−３３拮抗薬（ｈＳＴ２−ｈＩＬ１ＲＡｃＰ−ｍＦｃ、配列番号３）は、そのＮ末端にヒトＳＴ２（配列番号５）、続いてヒトＩＬ−１ＲＡｃＰ（配列番号７）の細胞外領域、さらにそのＣ末端にマウスのＩｇＧ２ａのＦｃ（配列番号１０）とを有するインライン融合で構成する。第４のＩＬ−３３拮抗薬（ｍＳＴ２−ｍＩＬ１ＲＡｃＰ−ｍＦｃ、配列番号４）は、そのＮ末端にマウスＳＴ２（配列番号６）、続いてマウスＩＬ−１ＲＡｃＰ（配列番号８）の細胞外領域、さらにそのＣ末端にマウスのＩｇＧ２ａのＦｃ（配列番号１０）とを有するインライン融合で構成する。第５のＩＬ−３３拮抗薬（ｈＳＴ２−ｈＩＬ１ＲＡｃＰ−ｈＦｃ、配列番号１３）は、そのＮ末端に配列番号５のヒトＳＴ２を、続いてヒトＩＬ−１ＲＡｃＰの細胞外領域（配列番号７）を、さらにＣ末端にヒトＩｇＧ１のＦｃ（配列番号９）を有するライン融合で構成される。表１ａに記載の異なるＩＬ−３３拮抗薬及びその付属品の概要説明を設定する。表１Ｂに記載のＩＬ−３３拮抗薬及びその付属品のアミノ酸配列を設定する。
【０１０４】
【表１】
0006404314.tif 000002
【０１０５】
【表２】
0006404314.tif 000003
【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
【表４】
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【０１０８】
【表５】
0006404314.tif 000006
【０１０９】
【表６】
0006404314.tif 000007
【０１１０】
本実施例に従って生成された例示的なＩＬ−３３拮抗薬のある生物学的特性は、以下に記載する実施例において詳細に記す。
【０１１１】
実施例２  ヒト、マウス及びサルＩＬ−３３へのＩＬ−３３拮抗薬の結合は表面プラズモン共鳴による測定
精製したＩＬ−３３のトラップタンパク質とＳＴ２受容体タンパク質に結合したＣ末端ヘキサヒスチジンタグ（ＭｆＩＬ−３３−６Ｈｉｓ；  配列番号１２）と共に発現したヒトＩＬ−３３（Ｒ＆Ｄシステムズ、♯３６２５−ＩＬ−０１０／ＣＦ）、マウスＩＬ−３３（Ｒ＆Ｄシステムズ、＃３６２６−ＭＬ−０１０／ＣＦ）及びサルＩＬ−３３の平衡解離定数（ＫD値）は、２５℃及び／または３７℃でＢｉａｃｏｒｅ社のＴ−２００機器によってリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いて測定した。Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面は、Ｃ末端のマウスＩｇＧ２ａのＦｃタグまたはＣ末端のヒトＩｇＧ１のＦｃタグでＩＬ−３３トラップ及び受容体タンパク質を捕捉するために、ポリクローナルウサギ抗マウス抗体（ＧＥ、  ♯  ＢＲ−１００８−３８）を結合アミンによってまたはモノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ、  ♯  ＢＲ−１００８−３９）で、最初にそれぞれを誘導体化した。運動実験は、０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳｐＨ７．４、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、そして３ｍＭのＥＤＴＡ０．００５％のｖ／ｖ界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０（ＨＢＳＴランニング緩衝液）中で実施した。ＨＢＳＴランニング緩衝液中（トラップタンパク質を６０ｎｍから３倍希釈の２７．４ｐＭまでの範囲で及びＳＴ２受容体タンパク質を６０ｎｍから３倍希釈の０．２５ｎＭまでの範囲で）で調製したヒトＩＬ−３３、マウスＩＬ−３３またはＭｆＩＬ−３３−６Ｈｉｓの異なる濃度は、５０μＬ／分の流速で捕捉したＩＬ−３３トラップ及び受容体タンパク質の表面に注入した。異なる捕捉表面に異なるＩＬ−３３タンパク質の融合は、トラップタンパク質の７分またはＳＴ２受容体タンパク質の４分間モニターし、ＨＢＳＴランニング緩衝液での解離がトラップタンパク質で１４分またはＳＴ２受容体タンパク質では８分間モニターした。運動結合（ｋa）及び運動解離（ｋd）の速度定数は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ  ２．０Ｃ−フィッティングソフトウェアを使用してリアルタイム結合センサーグラムを１：１結合モデルに適合することによって決定した。結合解離平衡定数（ＫD）及び解離半減期（ｔ１／２）は以下のように反応速度定数から計算した：
ＫD（Ｍ）＝ｋd／ｋa及びｔ１／２（分）＝ｌｎ（２）／（６０*ｋd）
【０１１２】
２５℃及び３７℃において、ヒト、サル、及びマウスＩＬ−３３に結合するＩＬ−３３トラップタンパク質の運動パラメータは、表２〜７に示す。一方、２５℃でのヒト及びマウスＩＬ−３３に結合するＳＴ２受容体タンパク質の結合速度は、表２〜６に示す。表２に示すように、ＩＬ−３３トラップ及び受容体タンパク質は、２５℃で約０．５３ｐＭから５４ｐＭの範囲のＫＤ値でヒトＩＬ−３３と結合した。表３に示すように、ＩＬ−３３トラップタンパク質は、３７℃で約０．５６９ｐＭから３５３ｐＭの範囲のＫＤ値でヒトＩＬ−３３と結合した。表４に示すように、ＩＬ−３３トラップタンパク質は、２５℃で約０．５９６ｐＭから５３．５ｐＭの範囲のＫD値でＭｆＩＬ−３３−６ＨＩｓと結合した。表５に示すように、ＩＬ−３３トラップタンパク質は、３７℃で約０．５５１ｐＭから１９０ｐＭの範囲のＫD値でＭｆＩＬ−３３−６ＨＩｓと結合した。表６に示すように、ＩＬ−３３トラップ及び受容体タンパク質は、２５℃で約６．１ｐＭから１０２ｐＭの範囲のＫD値でマウスＩＬ−３３と結合した。表７に示すように、ＩＬ−３３トラップタンパク質は、３７℃で約２．７８ｐＭから９３．３ｐＭの範囲のＫD値でマウスＩＬ−３３と結合した。
【０１１３】
【表７】
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【０１１４】
【表８】
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【０１１５】
【表９】
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【０１１６】
【表１０】
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【０１１７】
【表１１】
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【０１１８】
【表１２】
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【０１１９】
実施例３  ヒトＳＴ２受容体へのＩＬ−３３の結合を遮断するＩＬ−３３拮抗薬
ヒトＳＴ２受容体と結合するヒトＩＬ−３３（ｈＩＬ−３３）を遮断する本発明の例示的なＩＬ−３３拮抗薬の能力は、競合サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定した。
Ｃ末端マウスＦｃタグ（配列番号２）を発現したヒトＳＴ２タンパク質のエクトドメインの部分は４℃で一晩、９６ウェルマイクロタイタープレートにＰＢＳ緩衝液中で１μｇ／ｍＬの濃度でコーティングした。非特異的結合部位は、その後、ＰＢＳで０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ溶液を遮断した。ビオチン化ｈＩＬ−３３タンパク質（Ｒ＆Ｄシステム、＃３６２５−ＩＬ／  ＣＦ）は（ｂｉｏｔ−ＨＩＬ−３３）を、０〜１００ｎＭの範囲のＩＬ−３３拮抗薬の連続希釈液に２０ｐＭの一定の最終濃度にするために添加した。ｈＳＴ２−ｈＦｃでコーティングしたマイクロタイタープレートに移す前に、混合物を室温（ＲＴ）で１時間培養した。ＲＴで１時間培養した後、次いでウェルを洗浄し、プレートに結合したｂｉｏｔ−ＨＩＬ−３３はＨＲＰ結合ストレプトアビジンで検出した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ｎ２００）。全サンプルは、比色反応を生成するためにＴＭＢ溶液（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、＃５１−２６０７ＫＣ）で作業を進め、ビクターＸ５プレートリーダー（パーキンエルマー）上、４５０ｎｍで吸光度を測定する前に、１Ｍの硫酸で酸性化することにより反応を止めた。データ分析はＰｒｉｓｍ（商標）ソフトウェア内のシグモイド用量反応モデルを用いて行った。ｈＳＴ２−ｍＦｃに結合するｂｉｏｔ−ｈＩＬ−３３の５０％を遮断するのに必要な拮抗薬分子の濃度として決められた計算済みＩＣ50値を、遮断効果の指標として用いた。最大遮断値は、基準値へのＩＬ−３３結合の相対関係を遮断する拮抗薬の能力を表す。用量曲線上の一定量のｈＩＬ−３３を測定した吸光度は、０％遮断と定義し、ＩＬ−３３追加なしの場合に吸光度は、１００％遮断と定義した。各拮抗薬について試験した最高濃度を含むウェルの吸光度値は、最大遮断割合を決めるのに使われた。
【０１２０】
【表１３】
0006404314.tif 000014
【０１２１】
表８に示すように、４つのテストしたＩＬ−３３拮抗薬は、９７％〜１００％の範囲の最大遮断率で１１２ｐＭから６．３４ｐＭに至るまでのＩＣ50値でｈＳＴ２−ｍＦｃに結合するｂｉｏｔｉｎ−ｈＩＬ−３３を遮断した。
【０１２２】
実施例４  ＩＬ−３３拮抗薬によるＩＬ−３３媒介性受容体シグナル伝達の阻害
インターロイキン３３（ＩＬ−３３）は、ＳＴ２のリガンドであり、付属タンパク質であるＩＬ−１ＲＡｃＰと結合するＴｏｌｌ様／インターロイキン−１受容体スーパーファミリーのメンバーでもある（検討のために参照のこと、Ｋａｋｋａｒ  ａｎｄ  Ｌｅｅ、  （２００８）、  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、  Ｏｃｔ；  ７（１０）：  ８２７−８４０）。ＩＬ−３３によるＳＴ２／ＩＬ−１ＲＡｃＰの活性化の際に、シグナル伝達カスケードは、ＭｙＤ８８（骨髄分化因子８８）、及びＴＲＡＦ６（ＴＮＦ受容体関連因子６）などの下流分子を介して起こり、ＮＦκＢ（核因子−κＢ）の活性化なども続く。ＩＬ−３３拮抗剤をテストするための生物学的に関連するバイオアッセイ系を開発するには、ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３）を安定的にルシフェラーゼレポーターとともにヒトＳＴ２（受託番号ＮＰ＿０５７３１６の１から５５６アミノ酸）を発現するように形質移入した（ＮＦκＢ応答エレメント（５×）−ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）（ＨＥＫ２９３／ｈＳＴ２／ＮＦｋＢ−ルシフェラーゼ細胞株）。ＨＥＫ２９３細胞株は内生的にＩＬ−１ＲＡｃＰを発現し、ＨＥＫ２９３細胞におけるＩＬ−３３によるＮＦκＢの活性化は、以前に示されている（Ｓｃｈｍｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、（２００５）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２３：４７９−４９０）。安定な細胞株を単離し、１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ、ＮＥＡＡ、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びＧ４１８中に維持した。
【０１２３】
バイオアッセイのために、ＨＥＫ２９３／ｈＳＴ２／ＮＦκＢルシフェラーゼ細胞を、０．１％ＦＢＳ及びＯＰＴＩＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、＃３１９８５−０７０）を含有する低血清培地中でウェルあたり１０，０００細胞で９６ウェルアッセイプレートに播種した後、一晩中３７℃、５％二酸化炭素で培養した。翌日、ＩＬ−３３の用量応答を決めるために、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（ＭｆＩＬ−３３−６Ｈｉｓ；配列番号１１）で発現するヒトＩＬ−３３（ｈＩＬ−３３；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、♯３６２５−ＩＬ）、カニクイザルＩＬ−３３またはマウスＩＬ３３（ｍＩＬ−３３；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、♯３６２６−ＩＬ）のいずれかを、連続的に１：３の割合（ｈＩＬ３３：１５ｎＭ−０．３ｐＭまたは１０ｎＭ−０．２ｐＭ、ｍｆＩＬ３３：１．５ｎＭ−０．０３ｐＭまたは１ｎＭ−０．０５ｐＭ、ｍＩＬ３３：１５ｎＭ−０．３ｐＭまたは１０ｎＭ−０．２ｐＭ）で希釈し、細胞を添加した。対照区には希釈緩衝液を含むが、ＩＬ−３３を含まず、一つの細胞をサンプルとして添加した。阻害度を測定するために、ＩＬ−３３トラップ及び可溶性受容体タンパク質を連続希釈し、そして一定の濃度のＩＬ−３３を添加した細胞に添加した（ｈＩＬ−３３の場合５ｐＭまたは２０ｐＭ、ＭｆＩＬ−３３−６Ｈｉｓの場合５ｐＭまたは３ｐＭ、及びｍＩＬ−３３の場合３０ｐＭ）。細胞に添加する前に、可溶性受容体とトラップの連続希釈は１：３であり、〜１５、１５０、１００、または２００ｎＭで開始し、下まで、〜０．３、３、または２ｐＭ、プラスなしのトラップまたは可溶性受容体タンパク質を含まない対照試料を制御する。ヒトＦｃタンパク質（対照タンパク質）もまた、直列に７９８ｎＭから０．０１ｎＭにまたは１００ｎＭから０．００２ｎＭの範囲で１：３で希釈し、そしてトラップ及び受容体タンパク質と同様に、ＨＩＬ−３３、ＭｆＩＬ−３３−６Ｈｉｓ、及びＭＩＬ−３３を試験した。ルシフェラーゼ活性は、ビクターＸ（パーキンエルマー）プレートリーダーを用いて３７℃で５％二酸化炭素で培養し、５．５時間後に測定し、その結果は、プリズム５のソフトウェアでの非線形回帰（４−パラメータロジスティクス）を用いて分析した。その結果は、表９に示した。
【０１２４】
【表１４】
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【０１２５】
表９に示されるように、試験されたＩＬ−３３拮抗薬の５つすべてが、この細胞基準アッセイで強力にヒト、カニクイザル、そしてマウスのＩＬ−３３の刺激を遮断した（ＩＣ50＜１ｎＭ）。
【０１２６】
実施例５  ＩＬ−３３拮抗薬はＩＬ−３３媒介性好塩基球の活性化を阻害する
さらに、ＩＬ−３３拮抗薬ｈＳＴ２−ｈＩＬ１ＲＡｃＰ−ｍＦｃ及びｈＳＴ２−ｈＩＬ１ＲＡｃＰ−ｈＦｃの外部環境での特性を評価するために、ＩＬ−３３誘導性の好塩基球活性化を遮断する能力を測定した。
【０１２７】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、密度勾配遠心分離によって４人の別々なヒトドナーからの新鮮な全血から精製した。注意深くフィコール・パック（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃１７−１４４０−０３）上で積層し、及びＰＢＭＣを分離するために遠心分離し、ＲＰＭＩ１６４０中で１：Ｋ２  ＥＤＴＡ全血を１：１に希釈した。ＰＢＭＣを含む相間層を吸引し、新しい試験管に移し、及びＭＡＣＳすすぎ溶液（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、  ♯１３０−０９１−２２２）中でＭＡＣＳのＢＳＡ溶液（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、  ♯１３０−０９１−３７６）を１：２０で希釈して構成されたＭＡＣＳ緩衝液を使って２回洗浄した。次に、精製されたＰＢＭＣを、ｖ底で、ＭＡＣＳの緩衝液入りのポリプロピレンの９６ウェルプレート（ウェルあたり１００μＬ）に、最終濃度〜３．０×１０6細胞／ｍＬで播種した。ＰＢＭＣ集団内に含まれ好塩基球を得るために、Ｃａ++またはＭｇ++（ＤＰＢＳ）を含まない５０μＬダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水における１ｎｇのＩＬ−３（シグマ、＃のＨ７１６６−１０ＵＧ）を、細胞懸濁液に添加し、それから３７℃で１０分間、培養した。連続希釈（１：３希釈、ドナー６５５６７５そして６５５６７６及び、１：４希釈、ドナー６５５６８５、６５５６８６、６９８８４６そして６９８８４７）は、ヒトＩＬ−３３拮抗薬（ｈＳＴ２−ｈＩＬ１ＲＡｃＰ−ｍＦｃまたはｈＳＴ２−ｈＩＬ１ＲＡｃＰ−ＨＦＣ）で作り、濃度差は、ドナー６５５６７５そして６５５６７６には１０ｎＭから４．６ｐＭの範囲であり、ドナー６５５６８５、６５５６８６、６９８８４６及び６９８８４７には５ｎＭから０．３ｐＭの範囲で行われ、対照区では無関係の制御タンパク質が作られた。さらに、ＩＬ−３３拮抗薬を含まない対照区では、無関係の制御タンパク質を含めた。溶液は、ヒトＩＬ−３３の１００ｐＭの（最終濃度）の固定濃度（Ｒ＆Ｄシステムズ、＃６３２５−ＩＬ／ＣＦ）、またはＰＢＭＣを添加する前の無ＩＬ−３３陰性対照と混合した。すべてのサンプルを正副二回に試験した。
【０１２８】
細胞に対するヒトＩＬ−３３及びヒトＩＬ−３３拮抗薬を添加した後、好塩基球の活性化を促進するために２０分間３７℃で培養した。活性化は、５分間氷上にアッセイプレートを冷却することによって停止させた。活性化の測定のために使用される好塩基球集団の分析を可能するために、２０μＬの抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、  ♯  ＩＭ０４６３Ｕ）、抗ＣＤ１２３−ＡＰＣ（ＢＤ、  ♯  ５６００８７）、及び抗ＣＤ２０３ｃ−ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、  ♯  ＩＭ３５７５）のそれぞれ（製造者の指示に従って）を各試料に添加し、その試料を暗所で２０分間、４℃で保持した。次いで、細胞を遠心分離してＤＰＢＳで洗浄し、続いて４℃の２％ホルムアルデヒド（固定緩衝液）で再懸濁した。翌日、固定した細胞を好塩基球の活性化のレベルを決定するためにＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩで分析した。翌日、その固定細胞を好塩基球の活性化のレベルを決定するためにＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩで解析した。好塩基球は、以下のフローサイトメトリーパラメータ（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｇａｔｅ／ＣＤ１２３+／ＨＬＡ−ＤＲ２-）に従って識別される。好塩基球の活性化を刺激した好塩基球上の細胞表面発現マーカー（ＣＤ２０３ｃ）の増加として定義する。活性化を、ＣＤ２０３ｃ陽性の好塩基球（％）の頻度として定義する。結果を表１０及び１１（「ＮＤ」＝個々の実験では決定不能、「ＮＢ」＝非遮断）に要約される。データは、各ドナーのための３つの生物学的反復の平均として示される。
【０１２９】
【表１５】
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【０１３０】
【表１６】
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【０１３１】
表１０に示すように、ヒトＩＬ−３３は、１００ｐＭで、２２．１％から５２．６０％までの範囲の平均％活性化と６人の異なるドナーに好塩基球の活性化を誘導した。
【０１３２】
表１１に示すように、ＩＬ−３３拮抗薬ｈＳＴ２−ｈＩＬ１ＲＡｃＰ−ｍＦｃは、ドナー６５５６７５のために１９ｐＭのＩＣ50値、ドナー６５５６７６のために１５．１ｐＭのＩＣ50値、ドナー６５５６８５のための２３ｐＭの値、ドナー６５５６８６のために２０．９ｐＭのＩＣ50値、ドナー６９８８４６のための３６ｐＭのＩＣ50値及びドナー６９８８４７のために１１．１ｐＭのＩＣ50値で、１００ｐＭのヒトＩＬ−３３抗原投与により誘導される好塩基球の活性化を遮断した。ＩＬ−３３拮抗薬ｈＳＴ２−ｈＩＬ１ＲＡｃＰ−ｈＦｃは、ドナー６９８８４６のための１９．７ｐＭのＩＣ50値とドナー６９８８４７のための９．７９ｐＭのＩＣ50値で１００ｐＭのヒトＩＬ−３３抗原投与により誘導される好塩基球の活性化を遮断した。無関係対照タンパク質は、試験したドナーのいずれも活性化による好塩基球を遮断はなかった。
【０１３３】
実施例６  ＩＬ−３３拮抗薬を阻害するＩＬ−３３媒介細胞活性化
さらに、ヒトＩＬ−３３拮抗薬ｈＳＴ２−ｈＩＬ１ＲＡｃＰ−ｍＦｃとｈＳＴ２−ｈＩＬ１ＲＡｃＰ−ｈＦｃの遮断性を試験するために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いた一次細胞に基づくアッセイを使用した（例えば、  Ｓｍｉｔｈｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、  ２００８、  ｖｏｌ．  ２０  （８）  ｐｐ．  １０１９−１０３０を参照）。
【０１３４】
ＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって６つの異なるドナーによる新鮮なヒト全血から精製した。簡潔には、Ｋ２のＥＤＴＡ全血をＲＰＭＩ１６４０中で２倍に希釈し、続いて注意深くフィコール・パック（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、  ♯１７−１４４０−０３）上で層にし、そして２０分間、遠心分離した。ＰＢＭＣを含む相間層を吸引し、新しい試験管に移し、ＰＢＳで２回洗浄した。単離ＰＢＭＣを、５×１０5細胞／ｍＬの最終濃度で、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補った及びＲＰＭＩの１６４０内の丸底９６ウェルプレート中に播種（２００μＬウェル）した。次いで、細胞を、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−１２（ｈＩＬ−１２；  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、  ♯２１９−ＩＬ−０２５／ＣＦ）、及び連続希釈のヒトＩＬ−３３（ｈＩＬ−３３；  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、  ♯３６２５−ＩＬ−０１０／ＣＦ）の１０ｎＭから０．６４ｐＭだけの場合と、もしくは２０ｎＭから０．４３ｐＭのヒトＩＬ−３３拮抗薬と、または対照タンパク質を含む無関係ｍＩｇＧと連続希釈との組み合わせた２６０ｐＭのｈＩＬ−３３と培養した。最終容量はウェル当たり２００μＬであった。各試料を３回試験した。ＩＬ−３３拮抗薬または無関係ｍＩｇＧ含む対照タンパク質が存在したとき、ｈＩＬ−３３とともに３０分間、初めに前培養し、それから細胞に添加した。
【０１３５】
細胞は、５％二酸化炭素の加湿式培養装置内で３７℃で一晩、培養し、その後、培養上清中のＩＦＮγレベルをＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、  ♯ＤＹ２８５）により測定した。ＥＬＩＳＡのために、９６ウェル平底プレートを、製造者の指示に従って、捕捉抗体でコーティングした。洗浄及び遮断した後、希釈していない培養上清１００μＬをプレートに添加し、２時間、培養した。その後の洗浄及び検出は、製造業者の説明書に従って行った。結果を表１２及び１３に要約する（「ＮＢ」＝非遮断、「ＮＤ」＝非決定）。
【０１３６】
【表１７】
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【０１３７】
【表１８】
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【０１３８】
この例に示すように、ヒトＩＬ−３３が、ｈＩＬ−１２の存在下で、表１２に示すように２０４ｐＭから３１５ｐＭの間のＥＣ50値で、試験した４つの異なるドナーからのヒト全ＰＢＭＣからのＩＦＮγの放出を誘導した。表１３に示すように、ヒトＩＬ−３３拮抗薬ｈＳＴ２−ｈＩＬ１ＲＡｃＰ−ｍＦｃは、２６０ｐＭのＩＬ−３３によって誘導されたヒトＰＢＭＣからＩＦＮγの放出を、２．１３ｐＭから３３４ｐＭのまでの範囲のＩＣ50値で遮断した。対照タンパク質を含む無関係なｍＩｇＧは、試験ドナーのいずれにおいてＩＦＮγ放出を確認できなかった。
【０１３９】
実施例７  炎症性関節痛のモデルでのｍＳＴ２−ｍＩＬ１ＲａｃＰ−ｍＦｃの効能
生体内的モデルの関係からｍＳＴ２−ｍＩＬ１ＲａｃＰ−ｍＦｃの効果を決定するために、その研究を、片一方だけに痛みのある、１２週齢の炎症性関節疼痛モデルを、ジャクソン研究所（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＭＥ）から入手したオスのＣ５７ＢＬ／６マウスで行った。実験の０日目、マウスの別集団のマウスの皮下に、５０ｍｇ／ｋｇのｍＳＴ２−ｍＩＬ１ＲａｃＰ−ｍＦｃ（ｎ＝１５−１６）または５０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体（ｎ＝１５−１６）のいずれかを投与した。初期治療投与の２４時間後、マウス半分に、パーフェクトフロイントアジュバント（ＩＡ−ＣＦＡ；Ｓｉｇｍａ、  ♯Ｆ５８８１）（ｎ＝７−８）の３０μＬの関節内注射及び５０μＬ関節周囲注射をした。残りの半分のマウスには、同じ場所（ｎ＝７−８）の制御生理食塩水注射をした。一週間前に関節炎症の治療開始し、次の４週間も継続し、ダイナミック体重支持アッセイ（ＢｉｏＳｅｂ、  Ｖｉｔｒｏｌｌｅｓ、  ＦＲ）テストの２４時間前に、すべてのマウスが、５０ｍｇ／ｋｇのｍＳＴ２−ｍＩＬ１ＲａｃＰ−ｍＦｃまたはアイソタイプ対照抗体のそれぞれいずれかを、皮下ブースト注射した。患肢の負担重量の割合、及び患肢にかかる時間の割合は、すべてのマウスから記録した。この実験の結果は、全体重の平均として、または５分の試験期間中の患肢に費やした平均時間として表し、表１４及び表１５に示す（すべてのデータは平均±ＳＥＭをグループとして表す）。ＩＡ−ＣＦＡを受けたマウス集団は、影響を受けるすべての手足の体重負担が有意に少ないこと（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡによる）を示した。表１４及び１５に示すように、ＩＡ−ＣＦＡ投与後、ｍＳＴ２−ｍＩＬ１ＲａｃＰ−ｍＦｃを受けたマウスは、より高い割合の体重負荷及びＩＡ−ＣＦＡ投与後、アイソタイプ対照処置マウスと比較して、試験したすべての時点で患肢に費やされた時間を示した。
【０１４０】
４週後に、すべての動物を安楽死させ、影響を受けた関節を解剖し、パラフィン包埋し、切片、及び組織学的分析のためにヘマトキシリン及びエオシンで染色した。セクションでは、Ｃｈｏｅ  ｅｔ．  ａｌ．が概説したのと同様の方法に従い、０から５段階（０＝正常、１＝最小限、２＝軽度、３＝中程度、４＝著しい、５＝重度）で等級分けする炎症活性（関節破壊、滑膜肥厚、骨びらん、及び免疫細胞の浸潤を含む）の主観的な評価尺度を使用して盲検法でデジタル化したり、記録する（Ｃｈｏｅ、  ＪＹ  ｅｔ．  ａｌ．、  （２００３）、  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  Ｆｅｂ  １７；  １９７（４）：５３７−５４２）。表１６に示すように、ＩＡ−ＣＦＡ投与後、ｍＳＴ２−ｍＩＬ１ＲａｃＰ−ｍＦｃを処置したマウスは、ＩＡ−ＣＦＡ投与後、アイソタイプ対照処置マウスと比較して、より「中等度」及び小さい「深刻な」膝関節を実証した。したがって、この例では、本発明のＩＬ−３３拮抗薬は、炎症性関節痛を緩和するのに有用であることを示している。
【０１４１】
【表１９】
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【０１４２】
【表２０】
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【０１４３】
【表２１】
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【０１４４】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際に、本明細書に記載したものに加えて、本発明の種々の改変は、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
【図１】
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【配列表】
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