(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
心臓筋細胞増殖によって心臓の再生を刺激するための医薬として使用するための、ベクターを含む医薬組成物であって、
前記ベクターが、
ＡＣＵＧＣＣＣＵＡＡＧＵＧＣＵＣＣＵＵＣＵＧＧ  （配列番号１）、
ＣＡＧＵＧＣＣＵＣＧＧＣＡＧＵＧＣＡＧＣＣＣ  （配列番号１０）、
ＡＣＣＵＵＣＵＵＧＵＡＵＡＡＧＣＡＣＵＧＵＧＣＵＡＡＡ  （配列番号３３）、および
ＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＵＣＣＵＣＵＣＣ  （配列番号３５）
からなる群から選択される、少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、もしくはかかるマイクロＲＮＡの１次転写物、もしくはかかるマイクロＲＮＡの前駆体、もしくはかかるマイクロＲＮＡの模倣体、もしくはそれらの組み合わせ、および／または少なくとも前記マイクロＲＮＡをコードするＤＮＡおよび／または少なくとも前記マイクロＲＮＡの１次転写物もしくは前駆体をコードするＤＮＡまたはそれらの組み合わせを含む、
医薬組成物。
【請求項２】
前記ベクターが、天然または人工のいずれかの、任意のキャプシド血清型のアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
心臓筋細胞増殖を誘導することによって心臓の再生を刺激するための医薬として使用するための、
ＡＣＵＧＣＣＣＵＡＡＧＵＧＣＵＣＣＵＵＣＵＧＧ  （配列番号１）、
ＣＡＧＵＧＣＣＵＣＧＧＣＡＧＵＧＣＡＧＣＣＣ  （配列番号１０）、
ＡＣＣＵＵＣＵＵＧＵＡＵＡＡＧＣＡＣＵＧＵＧＣＵＡＡＡ  （配列番号３３）、および
ＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＵＣＣＵＣＵＣＣ  （配列番号３５）
からなる群から選択される、少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、および／または前記マイクロＲＮＡの１次転写物、および／または前記マイクロＲＮＡの前駆体、および／または少なくとも前記マイクロＲＮＡ、１次転写物もしくは前駆体をコードするＤＮＡ、および／または少なくとも前記マイクロＲＮＡの模倣体、またはそれらの組み合わせ、ならびに少なくとも１種の薬学的に許容される媒体または賦形剤を含む、
医薬組成物。
【請求項４】
心臓筋細胞の喪失に関連した心臓病変の治療のための医薬として使用するための請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記病変が、心筋梗塞、虚血性および非虚血性心筋症、心筋炎ならびに心不全の結果からなる群から選択される、請求項３または４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
投与が非経口静脈内、冠動脈内および心臓内からなる群から選択される、請求項３から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
脂質分子、ペプチド、ポリマーおよび他の担体分子をさらに含む、請求項３から６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
脂質分子が陽イオン性脂質である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
遺伝子療法において使用するための請求項３から８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
インビトロもしくはエキソビボにおける幹細胞由来の心筋細胞、または成体心筋細胞を拡大するための方法であって、前記細胞に請求項１に記載のマイクロＲＮＡの少なくとも１種を添加することを含む、方法。
【請求項１１】
細胞培養において心筋細胞の増殖を刺激するための方法であって、前記細胞培養に請求項１に記載のマイクロＲＮＡの少なくとも１種を添加することを含む、方法。
【請求項１２】
心臓筋細胞増殖によって心臓の再生を刺激するための医薬として使用するための、ＲＮＡストレッチを含む医薬組成物であって、
前記ストレッチが、
ＡＣＵＧＣＣＣＵＡＡＧＵＧＣＵＣＣＵＵＣＵＧＧ  （配列番号１）、
ＣＡＧＵＧＣＣＵＣＧＧＣＡＧＵＧＣＡＧＣＣＣ  （配列番号１０）、
ＡＣＣＵＵＣＵＵＧＵＡＵＡＡＧＣＡＣＵＧＵＧＣＵＡＡＡ  （配列番号３３）、および
ＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＵＣＣＵＣＵＣＣ  （配列番号３５）
からなる群から選択されるマイクロＲＮＡ、ならびに／または
それらの１次転写物、前駆体もしくは模倣体の少なくとも１種または組み合わせを含み、
前記ＲＮＡストレッチが、無細胞転写法によってインビトロで得られるか、合成によって生成されるか、関連するＤＮＡコーディング配列の移入によって細胞中で発現されるか、またはプラスミド、ウイルスもしくは他の種類のベクターの投与によって細胞内に導入もしくは発現される、
医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品およびバイオテクノロジーの分野に関する。特に、本発明は、一連のヒトマイクロＲＮＡ、ならびに心筋細胞の喪失に関連した心臓病（心筋梗塞、虚血および非虚血が原因の心筋症、心筋炎ならびに心不全）の治療のために心臓再生を刺激する手段として、心筋細胞の増殖を誘導する医薬としての、特に遺伝子療法としてのそれらの使用を開示する。
【０００２】
さらに、本発明は、心筋細胞の増殖を増加させる能力について生物学的および薬学的に活性のある化合物をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ここ数年、予防および早期診断には非常に多くの進展が見られたが、西欧諸国における疫学的解析によって、心血管障害は６０年にわたって人々の合併症発生率および死亡率の第１の原因に入ることが示されている。ヨーロッパでは心筋梗塞によって約６００，０００人／年が亡くなり、さらにより重要なことに、世界中で１５００万人以上が心不全に罹患していると推定され、主要な死因の１つとなっており、この数は、世界人口の高齢化および医療技術の向上の結果、確実に増加しつつある。薬物治療にも関わらず、心不全患者の長期予後は依然として不良で、これらの患者の６０％超が５年以内に疾患の悪化または突然の心室性不整脈によって亡くなっている。退院後、６ヵ月以内に再度入院する患者は１６％までおよび、この疾患は６５歳以上の人々の入院の最も一般的な原因（約２０％）となっている。
【０００４】
これらの考察を踏まえると、心臓筋細胞増殖、生存率および機能に直接的に影響を及ぼし、したがって、総合的に心臓組織の維持および再生の改善に取り組む新たな治療法の開発が不可欠である。
【０００５】
哺乳類では、胚発生中の心臓の拡張は、主に心筋細胞数の増加に依存するが、誕生の直後に心臓筋細胞は増殖を停止し、存在する心筋細胞の肥大拡張によって心筋のさらなる成長が生じる（Ａｈｕｊａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７；  ｖａｎ  Ａｍｅｒｏｎｇｅｎ  ａｎｄ  Ｅｎｇｅｌ  ２００８）。心筋細胞の成長潜在力のこの切り換えは、様々な種において、発生の様々な段階で生じ、マウスでは誕生直後に生じ、ラットでは出生後３日から４日の間で生じ、一方、ヒト心筋細胞は、７ヵ月齢後に増殖能力の著しい低下を示す。ヒトの心筋細胞ＤＮＡの年代測定によって得られた最近の証拠では、心筋細胞は２５歳で１％、７５歳で０．４５％の割合で生理学的に再生し、心筋細胞の５０％未満が通常の一生の間に入れ替わることが示された（Ｂｅｒｇｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）。
【０００６】
成体の心筋細胞の増殖能力がこのように制限されている結果、哺乳類成体心臓が損傷後に自己修復する能力は非常に限定される（Ｓｅｎｙｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２）。特に、様々な種類の心筋障害の後、一般的には心筋梗塞の後に生じる心筋細胞の喪失は、新たな収縮組織の生成によっては修復されないが、瘢痕の形成によって修復される。注目に値すべきことに、これは、心臓機能を損なわせ、時間と共に悪化する傾向があり、心不全を引き起こす。したがって、損傷後に収縮性心臓組織の再生を促進する新たな手段の確認が絶対に必要であると考えられる。
【０００７】
胚期の特徴である増殖状態から、成体細胞に一般的な分化した肥大表現型への心筋細胞の移行は、非常に調節されたプロセスで、いくつかの細胞周期調節因子、転写因子、成長因子、サイトカインおよびシグナル伝達経路が関わる（Ａｈｕｊａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７；  ｖａｎ  Ａｍｅｒｏｎｇｅｎ  ａｎｄ  Ｅｎｇｅｌ  ２００８）。しかし、この移行を制御する正確な分子機構ならびに心臓筋細胞の増殖および分化の持続を担う分子機構はほとんど不明なままである。
【０００８】
マイクロＲＮＡとは、転写後レベルで遺伝子発現を調節する進化的に保存された小さなノンコーディングＲＮＡである。動物細胞では、マイクロＲＮＡによる遺伝子発現の抑制は、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲにほとんど存在する部分的に相補的な配列と塩基対形成し、翻訳抑制、ｍＲＮＡ分解、またはその両方が引き起こされることによって実現する（Ｅｕｌａｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。マイクロＲＮＡのｍＲＮＡへの結合に必須のマイクロＲＮＡシーズ配列は、マイクロＲＮＡ５’末端から２〜８の位置に一般的に存在する保存された配列である（Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。マイクロＲＮＡとその標的ｍＲＮＡとの塩基対形成は完全でなくても、シーズ配列に対応する領域は完全に相補的でなければならない。したがって、シーズ配列は、標的選択のための主要な特異性決定要素である。シーズ配列の大きさが小さいことは、単一のマイクロＲＮＡが多くの、数百の異なる遺伝子を調節できることを意味している。
【０００９】
マイクロＲＮＡは、一般的にＲＮＡポリメラーゼＩＩによって一次（ｐｒｉｍａｒｙ）マイクロＲＮＡ（ｐｒｉ−マイクロＲＮＡ）に転写されるゲノムコード配列である。ｐｒｉ−マイクロＲＮＡは次に、ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩファミリーの２種類のエンドヌクレアーゼによって順次プロセシングされる：核内で、Ｄｒｏｓｈａがｐｒｉ−マイクロＲＮＡを約６０〜８０ヌクレオチドの前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−マイクロＲＮＡ）にプロセシングし、その後、ｐｒｅ−マイクロＲＮＡは細胞質内でＤｉｃｅｒによってさらにプロセシングされ、約１９〜２３ヌクレオチドの２本鎖を含有する２本鎖構造を形成する。その後、マイクロＲＮＡ２本鎖はほどかれ、成熟マイクロＲＮＡは、特に、マイクロＲＮＡによるサイレンシングに必須のＡｒｇｏｎａｕｔｅおよびＧＷ１８２タンパク質を含有するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。（Ｇｈｉｌｄｉｙａｌ  ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ  ２００９に概括されている）。２０１１年１１月１８日に公開され公表されたマイクロＲＮＡ配列および関連注釈の参照リポジトリ（ｍｉＲＢａｓｅ；ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）には、１６８種における成熟マイクロＲＮＡ生成物２１６４３個を発現するヘアピン型前駆体マイクロＲＮＡを表す１８２２６項目が含まれる。
【００１０】
個々のマイクロＲＮＡが数百の標的を有し得ることを考慮すると、ヒトトランスクリプトームの約３分の１がマイクロＲＮＡによって調節されると予測される。それぞれのｍＲＮＡが複数のマイクロＲＮＡの標的となり得るという事実によって、調節の複雑さはより一層深まる（Ｂａｒｔｅｌ  ２００９）。
【００１１】
マイクロＲＮＡによる遺伝子発現の制御は、発生、細胞分化、増殖、アポトーシス、代謝および免疫応答を含む広範な生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たすことが示された（Ｂｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８；  Ｋｅｄｄｅ  ａｎｄ  Ａｇａｍｉ  ２００８；  Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）。マイクロＲＮＡが遺伝子発現の制御において重要な役割を果たすという認識を踏まえて、マイクロＲＮＡ発現の誤制御は、癌（Ｃｒｏｃｅ  ２００９）およびウイルス感染（Ｕｍｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｅｎ  ２００９）を含むいくつかの病変に関連しており、心血管疾患におけるマイクロＲＮＡの役割を明らかにするために研究が始められている（ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ  ２００７；  Ｌａｔｒｏｎｉｃｏ  ａｎｄ  Ｃｏｎｄｏｒｅｌｌｉ  ２００９；  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９；  Ｓｍａｌｌ  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ  ２０１１）。
【００１２】
治療において調整することが困難な、疾患に関与する多くの細胞因子とは対照的に、マイクロＲＮＡレベルは、マイクロＲＮＡ模倣体（マイクロＲＮＡの作用を代替する）およびａｎｔｉｍｉＲ（成熟マイクロＲＮＡの活性をブロックする成熟マイクロＲＮＡ配列に相補的な配列）を使用することによって、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において容易に調整することができる。実際に、ａｎｔｉｍｉＲの効率的な使用が非ヒト霊長類において示されたことがあり（Ｅｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｌａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）、これらの研究は、ヒト臨床試験へと進んでいる。
【００１３】
心筋細胞機能におけるマイクロＲＮＡ調節の重要性は、マイクロＲＮＡ生合成に必要な酵素（ＤｉｃｅｒおよびＤｇｃｒ８）が心臓において特異的にノックアウトされたマウスのいくつかの研究において、はっきりと示された（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７；  Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）。これらの研究によって、出生後の心臓の筋肉組織におけるＲＮＡｉ経路の機能障害が、心不全および心筋症の徴候を有する動物の早期死亡を招くことが示された（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７；  Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）。
【００１４】
様々な種類の心臓病変のマイクロＲＮＡのプロファイリングによって、変化したマイクロＲＮＡ発現パターンが示され（Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｍａｔｋｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｔｈｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）、疾患に関連したマイクロＲＮＡは強力な診断手段ならびに心疾患を治療する有望な治療的アプローチとなり得ることを示している。特定のマイクロＲＮＡは、心臓肥大（Ｃａｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｃａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）、心不全（Ｃａｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｃａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）、心不整脈（Ｃａｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）、線維症（Ｔｈｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）および代謝障害（Ｎａｊａｆｉ−Ｓｈｏｕｓｈｔａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）を含む心疾患と関係があるとされてきた。さらに、特定のマイクロＲＮＡは、機能獲得および機能喪失実験を実施することによって、心臓病変を誘導するために必要であり、十分であることが示された（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；  Ｓｍａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０に概括されている）。
【００１５】
今まで、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３、ごく最近ではｍｉＲ−１５ファミリーの構成要素を含む２、３のマイクロＲＮＡのみが心筋細胞増殖に明らかに関与するとされてきた。胚心臓におけるｍｉＲ−１の過剰発現は、心筋細胞増殖を阻害し、胚形成中の心臓の成長に必要な転写因子であるＨａｎｄ２の抑制につながることが示された（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）。ｍｉＲ−１３３は、筋肉細胞分化の２つの必須調節因子であるＳＲＦおよびサイクリンＤ２を抑制することによって、心筋細胞の増殖を阻害する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。最終的に、ｍｉＲ−１５ファミリーは、Ｃｈｅｋ１の発現の下方制御によって、マウス心筋細胞の出生後の有糸分裂停止を調節することが示された（Ｐｏｒｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１）。今のところ、心臓再生を誘導することができるマイクロＲＮＡの網羅的な研究は、まだ実施されたことがない。
【００１６】
先行技術は、診断マーカーおよび治療薬としてのマイクロＲＮＡの使用に関する開示が豊富である。
【００１７】
これらの特許のリスト例は、
ＷＯ２０１１１３３２８８；ＷＯ２０１２１６０５５１；ＵＳ２０１２０２９５９６３；ＷＯ２０１２１４９５５７；ＵＳ２０１２０２７０８２６；ＷＯ２０１２１２２４４７；ＥＰ２４９６７１１；ＷＯ２０１２１１９０５１；ＷＯ２０１２１１５８８５；ＵＳ２０１２０２０７７４４；ＥＰ２２８８７０３；ＥＰ２４７５３７２；ＷＯ２０１２０９４３６６；ＥＰ２４７４６１６；ＵＳ２０１２０１６５３９２；ＷＯ２０１２０８３００４；ＥＰ２４６２２２８；ＷＯ２０１２０７２６８５；ＵＳ２０１２０１３７３７９；ＵＳ２０１２０１２８７６１；ＷＯ２０１２０６１８１０；ＷＯ２０１２０５２９５３；ＵＳ２０１２００９３８８５；ＵＳ２０１２００８８６８７；ＥＰ２４２５０１６；ＵＳ２０１２００５３２２７；ＵＳ２０１２００５３３３３；ＷＯ２０１２０２０３０８；ＷＯ２０１２０２０３０７；ＷＯ２０１２０１２８７０；ＷＯ２０１２０１０９０５；ＥＰ２４０１３６５；ＷＯ２０１１１５７２９４；ＵＳ２０１１０２６２９２８；ＷＯ２０１１１３３０３６；ＥＰ２３７７５５９；ＣＡ２７９５７７６；ＷＯ２０１１１１２７３２；ＵＳ２０１１０１６０２９０；ＵＳ２０１１０１６０２８５；ＵＳ２０１１０１５２３５２；ＵＳ２０１１０１４４９１４；ＥＰ２３２２６１６；ＵＳ２０１１００８６３５３；ＵＳ２０１１００８６３４８；ＥＰ２３０５８１０；ＵＳ２０１１０００３７０４；ＥＰ２２５７６２５；ＥＰ２２５４５８６；ＵＳ２０１００２６７８０４；ＥＰ２２３４４８３；ＥＰ２２２８４４４；ＵＳ２０１００２２７３２５；ＥＰ２２０２３０９；ＵＳ７７０９６１６；ＥＰ２１７９０６０；ＷＯ２０１００３３８７１；ＵＳ２０１０００２９００３；ＵＳ２００９０３０６１８１；ＵＳ２００９０２９８９１０；ＵＳ２００９０２９１１３１；ＵＳ２００９００８１６４０；ＵＳ２００８０２６１９０８；ＵＳ２００８０２５６０７２；ＵＳ２００５０２５６０７２である。
【００１８】
ＷＯ２０１１１１１８２４は、心筋細胞の増殖を促進するマイクロＲＮＡ、特にｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１５２およびｍｉＲ−３７３を開示している。
【００１９】
ＷＯ２００６／１０７８２６は、心臓および骨格筋細胞の分化、増殖および死を調節するマイクロＲＮＡを開示している。これらは、前駆細胞における分化を誘導する活性剤として使用することができ、その下方制御によって前駆細胞群の維持および拡大が可能になる。
【００２０】
ＷＯ２００８／０６３９１９は、β−ミオシンマイクロＲＮＡおよびその発現を調整する活性物質をスクリーニングするためにその発現を低下させるかまたは阻害する方法および心血管障害の危険性を診断する方法を提供している。
【００２１】
ＷＯ２００９／０５８８１８は、心筋細胞におけるエネルギー代謝を変化させ、心臓のリモデリングに寄与するｍｉＲ−２１を同定している。その阻害は、心臓肥大、心不全および／または心筋梗塞の治療法として開示されている。
【００２２】
ＵＳ２０１０／００１００７３は、心筋梗塞、心不全、慢性心不全および／または心臓肥大などの心臓病の診断、防御および／または治療のためのマイクロＲＮＡの２９配列を開示している。
【００２３】
ＣＮ１０１６４３７９１は、マイクロＲＮＡ−３２８ならびに心臓病の診断および制御のためのそれらのアンチセンスの適用を開示している。アンチセンスヌクレオチドは、予防および治療効果を有する。
【００２４】
ＷＯ２０１０／１１７８６０は、心不全の予後を予測するマイクロＲＮＡシグナチュアを開示している。そのマイクロＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａおよびｈｓａ−ｍｉＲ−５６５である。
【００２５】
ＷＯ２０１０／１２９９５０は、心臓細胞におけるｍｉＲ−４５１の発現または活性を阻害することによって病的な心臓肥大、心臓リモデリング、心筋梗塞または心不全を治療または予防する方法を開示している。
【００２６】
ＵＳ２０１２０１６５３９２は、場合によっては、阻害剤またはアゴニストのいずれかを投与することによって、ある種のマイクロＲＮＡの発現を調整して心血管疾患を治療する方法を開示している。ＥＰ２４２５０１６は、阻害剤または機能的マイクロＲＮＡが投与される類似の方法を開示している。ＷＯ２０１２０２０３０８およびＷＯ２０１２０２０３０７は、組織修復を誘導することができる細胞群または微小胞を投与することによって、急性の組織損傷を治療する方法を開示している。これらの細胞は、かなりの数の不均一なタンパク質およびマイクロＲＮＡを発現する。例えば、ＰＤＰＣ細胞は、心臓の虚血による損傷のために指示されるが、個々のマイクロＲＮＡと心臓再生の間には特定の関係はなく、したがって、これらの非常に不均一に発現した因子およびマイクロＲＮＡは、特定の治療薬というよりも細胞独自のマーカーと考えられる。
【００２７】
ＥＰ２２２８４４４は、心血管疾患、特に肥大性疾患の治療に使用するためにいくつかのマイクロＲＮＡを開示している。これらのマイクロＲＮＡは、肥大した心臓を再修正する範囲によって心臓筋細胞の大きさの表現型の変化を誘導する。
【００２８】
前記リストで参照されるその他のものは、心血管疾患とは異なる疾患または心血管疾患を診断するためのマイクロＲＮＡのプロファイリングであり、いくつかのマイクロＲＮＡが治療用阻害剤のための標的として示される。
【００２９】
しかし、損傷を受けているか、または生理学的な機能が不十分な心臓組織において、成体の心筋細胞の増殖を刺激し、したがってインビボにおいて心臓再生を可能とする能力について特異的に選択されたマイクロＲＮＡが明白に述べられた開示はない。
【００３０】
心血管疾患、特に心筋細胞の喪失に関連した疾患（特に、心筋梗塞、虚血および非虚血が原因の心筋症、心筋炎ならびに心不全）の治療に効果的な方法を見出すことが依然として必要とされている。
【００３１】
特に、損傷を受けているか、または生理学的な機能が不十分な心臓組織の部分において、心筋細胞の増殖を刺激し、したがってインビボにおいて特異的に心臓再生を可能とする活性物質の発見が極めて重要である。
【００３２】
ＷＯ２０１０／１３８２６３は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、標的組織にデリバリーすることができるマイクロＲＮＡを開示しており、標的組織候補の長いリストの中に心臓がある。Ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０およびｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐは、前記文書で開示されている。２種類のマイクロＲＮＡは、非常に長いリストの一部分である。リストに挙げた標的組織のいずれかとリストに挙げたマイクロＲＮＡのいずれかについて、特に実施可能な程度の開示はない。さらに、リストに挙げた標的組織のいずれかとリストに挙げたマイクロＲＮＡのいずれかについて特に関連はない。ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０およびｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐが心臓筋細胞増殖によって心臓の再生を刺激するために有用であるという明白明瞭で実施可能な程度の開示はない。
【００３３】
マイクロＲＮＡ−２１０は、心筋細胞において発現し、いくつかの血管新生因子を上方制御することができ、細胞のアポトーシスを予防し、心筋梗塞および虚血性心臓病の治療において有用であることが開示されている（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。当業者であれば、血管新生因子の上方制御および細胞アポトーシスの予防は、梗塞の急性期には有用な機構であるが、心筋細胞の再生が必要な心臓病の長期にわたる状態ではほとんど、または全く役に立たないことを知っている。この場合、当業者である心臓病学を専門とする医師は、血管新生の促進および細胞アポトーシスの予防に基づく療法（この療法は、心筋梗塞などの心血管疾患の急性期の治療に適している）と、心筋梗塞、虚血性および非虚血性心筋症、心筋炎ならびに心不全の結果などの心筋細胞再生に基づく療法との間の異なる臨床的重要性を十分承知している。医師はまた、急性期の治療のための療法は、心臓の再生に心筋細胞増殖が必要な心臓病の治療には適していないことに気づいている。
【００３４】
今では、２０８種のヒトマイクロＲＮＡがインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において、ラット心筋細胞の増殖を著しく増加させることができることが見出されている。これらのうち、３６種のマイクロＲＮＡはまた、新生仔マウス心臓から単離した心筋細胞およびヒト幹細胞由来心筋細胞の増殖を増加させた。
【００３５】
さらに、選択されたマイクロＲＮＡが、特に、ラットにおいて合成マイクロＲＮＡを心臓内注射した後、またはマウスにおいてマイクロＲＮＡを発現するアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）を腹腔内注射した後に、動物モデルの心筋細胞の増殖を誘導することも見出された。もちろん、これらのマイクロＲＮＡは、心臓再生を誘導することによって、冠動脈結紮によって引き起こされた心筋梗塞の動物モデルの心臓機能を改善する。
【００３６】
十分に評価され、承認された動物モデルで得られたこれらの結果は、ヒト対象における心疾患の治療のための医薬の開発を可能にする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３７】
本発明の目的は、添付の特許請求の範囲で明記されているが、本発明の他の目的および範囲は前述の明細書から明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００３８】
本発明の目的は、以下の通りである。
ｉ）心臓筋細胞の増殖を刺激する活性を備え、したがって、心筋細胞増殖を刺激することによってインビボにおいて心臓の再生を刺激するための方法および医薬を利用可能にするマイクロＲＮＡ、好ましくはヒト由来で、特に３６種の選択されたマイクロＲＮＡ群、ならびにこれをもとにして、心臓筋細胞の喪失（特に、心筋梗塞、虚血または非虚血が原因の心筋症、心筋炎および心不全の結果）に関連した心臓病変の治療のために投与するための方法、医薬および組成物、ベクターならびに製剤。
【００３９】
ｉｉ）研究室で使用するために（ヒト疾患の診断）またはインビボ臨床適用において（前述の適用のための心臓修復）心筋細胞の生成を刺激するという最終目標のために、細胞培養において心筋細胞増殖を刺激する能力を備え、したがって、胚性幹細胞（ｉＰＳ細胞技術または任意の他の技術による胚培養、核移植および動物のクローニングから得られた）からまたは成体組織からの心筋細胞の獲得および拡大を改善する能力を備える、マイクロＲＮＡ、好ましくはヒト由来で、特に項目ｉ）と同じ３６種のマイクロＲＮＡ。
【００４０】
関連する方法も、本発明の目的である。
【００４１】
ｉｉｉ）インビトロおよびインビボ適用のための前記マイクロＲＮＡのデリバリー法。特に、ベクター、組成物および製剤は本発明の範囲内である。
【００４２】
ｉｖ）生物活性化合物の心筋細胞の増殖を増加させる能力によるハイコンテンツ顕微鏡をベースとしたハイスループットスクリーニング法で、この方法は、本明細書では、本発明の目的でもあるマイクロＲＮＡの選択のために使用される。
【００４３】
本発明の目的は、本発明によるマイクロＲＮＡまたはそれらの組み合わせを投与することによって、特にそれを必要とする対象に、心臓筋細胞増殖によって心臓の再生を刺激するための方法である。
【００４４】
特に、この方法は、例えば、心筋梗塞、虚血性および非虚血性心筋症、心筋炎ならびに心不全の結果である心臓筋細胞の喪失に関連した心臓病変の治療に関する。
【００４５】
好ましい実施形態では、前記方法は、遺伝子療法によって実施される。
【００４６】
表１に挙げたように、由来の様々な（ラット、マウスおよびヒト）心臓筋細胞の増殖を誘導することができる本発明のヒトマイクロＲＮＡ、特に３６種の個々のヒトマイクロＲＮＡ、またはこのようなマイクロＲＮＡの模倣体、またはこのようなマイクロＲＮＡの前駆体、またはこのようなマイクロＲＮＡの第１転写物、またはそれらの組み合わせは、本発明の目的である。
【００４７】
表１．心筋増殖を誘導するマイクロＲＮＡのリスト
【表１−１】
0006420865.tif 000002
【表１−２】
0006420865.tif 000003
【表１−３】
0006420865.tif 000004
【００４８】
本発明の別の目的は、心臓筋細胞の喪失に関連した心臓病変（限定はしないが、心筋梗塞、虚血性および非虚血性心筋症、心筋炎ならびに心不全の結果を含む）の心臓再生の誘導による治療において、インビボにおける心筋細胞増殖の促進において使用するための、前記マイクロＲＮＡの１つまたはそれらの組み合わせである。
【００４９】
本発明のさらなる目的は、心筋細胞増殖の促進および胚性幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞もしくは他の方法によって得られる幹細胞から得られた心筋細胞または成体心筋細胞の拡大において、インビトロまたはエキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で使用するための前記マイクロＲＮＡの１つまたはそれらの組み合わせである。
【００５０】
本発明のさらなる目的は、生物学的および薬学的に活性のある化合物の心筋細胞の増殖を増加させる能力についてのハイスループットスクリーニングのための方法である。前記方法は、本発明の目的でもあるマイクロＲＮＡの選択に使用される。
【００５１】
本発明のさらなる目的は、前述のマイクロＲＮＡの１つまたは組み合わせを含むＲＮＡストレッチである。前記ＲＮＡストレッチは、インビトロにおいて無細胞転写法によって得られるか、合成によって生成されるか、または関連するＤＮＡコーディング配列の移入によって細胞内で発現されるか、またはプラスミド、ウイルスもしくは他の種類のベクターの投与によって細胞内に導入もしくは発現されるが、但し、天然には生じないＲＮＡである。
【００５２】
本発明は、心臓筋細胞増殖によって心臓の再生を刺激するための医薬として使用するための前記ＲＮＡストレッチを提供する。
【００５３】
本発明はまた、医薬として使用するための前記マイクロＲＮＡの１つまたはそれらの組み合わせを提供する。
【００５４】
本発明の別の目的は心臓筋細胞の喪失に関連した心臓病変（限定はしないが、心筋梗塞、心筋症、心筋炎および心不全の結果を含む）の治療のための活性成分としての、前記マイクロＲＮＡの１つまたはそれらの組み合わせを含む医薬組成物である。
【００５５】
本発明のさらに別の目的は、心臓関連疾患の治療のための、前記マイクロＲＮＡの１つまたは複数の発現レベルを増加させるように設計された薬剤である。前記薬剤は、マイクロＲＮＡ、化合物、医薬組成物、インビトロで得られるか、関連するＤＮＡ配列の移入によって細胞内で発現されるか、またはベクターの投与によって細胞内で発現される組換えタンパク質である。
【００５６】
本発明のこれらのおよび他の目的はまた、前記明細書において、実施例および図面によって詳細に開示される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、マイクロＲＮＡによる心筋細胞増殖の誘導のスクリーニング結果を示す。各点は、２回の同じ実験における個々のマイクロＲＮＡによる心筋細胞増殖への効果を示す。対照マイクロＲＮＡは下の四角の中に入り（点線）、本発明の対象である３６種のマイクロＲＮＡは上の四角内に入る（増殖数、ＥｄＵ＋、Ｋｉ−６７＋心筋細胞、３５％から５５％まで）。
【図２】図２は、ＥｄＵおよびＫｉ−６７陽性によって評価した、インビトロにおいてラット新生仔心筋細胞増殖を増加させるマイクロＲＮＡの例を示す。Ｃｅｌ−ｍｉＲ−６７は、対照として使用した効果のないマイクロＲＮＡである。
【図３】図３は、ＥｄＵ陽性によって評価した、インビトロにおいてヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から得られた心筋細胞の増殖を増加させるマイクロＲＮＡの例を示す。Ｃｅｌ−ｍｉＲ−６７は、対照として使用した効果のないマイクロＲＮＡである。
【図４】図４は、ヒストンＨ３のリン酸化（左）および中心体におけるオーロラＢの局在（右）によって評価した、インビトロにおいてラット新生仔心筋細胞増殖および細胞質分裂を増加させるマイクロＲＮＡの例を示す。Ｃｅｌ−ｍｉＲ−６７は、対照として使用した効果のないマイクロＲＮＡである。
【図５】図５は、ＥｄＵ陽性によって評価した、成体（２ヵ月齢）動物から単離された完全に分化したラット心筋細胞のエキソビボにおける増殖を増加させるマイクロＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ）の例を示す（左図）。これらのマイクロＲＮＡによる治療は、治療の４および７日後に心筋細胞の数を著しく増加させた（右図）。ｃｅｌ−ｍｉＲ−６７は、対照として使用した効果のないマイクロＲＮＡである。
【図６】図６は、治療した心臓のＥｄＵ陽性によって評価した、インビボにおいてラット新生仔心筋細胞増殖を増加させるマイクロＲＮＡの例を示し、ｃｅｌ−ｍｉＲ−６７は、対照として使用した効果のないマイクロＲＮＡである。
【図７】図７は、ＡＡＶベクターを使用した梗塞マウスの心臓へのデリバリーによるマイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐおよびマイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐの効果を示す。Ａ．心筋梗塞（ＭＩ）領域。Ｂ．棒グラフは、左から右へ、治療して１２および３０日後の左心室駆出率（ＥＦ）、左心室短縮率（ＦＳ）および左心室前壁収縮期肥厚（ＬＶＡＷ）を示す。対照は、関連のないマイクロＲＮＡで治療した梗塞動物である。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
発明の詳細な説明
本発明は、インビトロおよびインビボにおいて心筋細胞の増殖を誘導する特性を有し、特にハイコンテンツな画像解析をベースにしたハイスループットスクリーニング法によってライブラリーから選択される、好ましくはヒト由来のマイクロＲＮＡを提供する。好ましい方法は、注釈を付けたヒトマイクロＲＮＡ（２００９年公開のｍｉＲＢａｓｅ  １３．０）全てに対応する合成マイクロＲＮＡ成熟配列を使用した、ラット新生仔心筋細胞における蛍光顕微鏡をベースにしたハイスループットスクリーニングである。
【００５９】
好ましくはヒト由来のマイクロＲＮＡをスクリーニングするための本発明の目的である方法は、
ａ．マイクロＲＮＡのライブラリーを得ること、
ｂ．第１の動物対象から単離された第１の心筋細胞内に各マイクロＲＮＡを遺伝子導入すること、
ｃ．前記第１の遺伝子導入した心筋細胞を培養すること、
ｄ．前記第１の遺伝子導入した心筋細胞の増殖能力を試験すること、
ｅ．前記第１の遺伝子導入した心筋細胞において増殖を誘導することができるマイクロＲＮＡを選択すること、
ｆ．前記第１の動物とは異なる種の第２の動物対象から単離された第２の心筋細胞内に工程ｅ）の選択された各マイクロＲＮＡを遺伝子導入すること、
ｇ．前記第２の遺伝子導入した心筋細胞を培養すること、
ｈ．前記第２の遺伝子導入した心筋細胞の増殖能力を試験すること、
ｉ．工程ｈ）の前記第２の遺伝子導入した心筋細胞において増殖を誘導することができるマイクロＲＮＡを選択すること
を含む。
【００６０】
前記方法の一実施形態では、
工程ｉ）の後、以下の、
ｊ．工程ｉ）の選択された各マイクロＲＮＡをヒト対象から以前に単離された第３の心筋細胞に遺伝子導入する工程、
ｋ．前記第３の遺伝子導入した心筋細胞を培養する工程、
ｌ．前記第３の遺伝子導入した心筋細胞の増殖能力を試験する工程、
ｍ．工程ｌ）の前記第３の遺伝子導入した心筋細胞において増殖を誘導することができるマイクロＲＮＡを選択する工程
がさらに行われる。
【００６１】
好ましくは、前記選択工程ｅ）、ｉ）またはｍ）において、心筋細胞増殖を少なくとも２倍超著しく増加させることができる少なくとも１種のマイクロＲＮＡを選択する。
【００６２】
本発明に有用なライブラリーは、商用供給業者、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｉｇｍａ、Ａｍｂｉｏｎから入手可能である。
【００６３】
実施例１でより詳細に説明するように、初代ラット心筋細胞をライブラリー内のマイクロＲＮＡそれぞれで処理し、従来の核染色、例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３４３２、心筋細胞マーカーサルコメアアルファアクチニンおよび増殖抗原Ｋｉ−６７に対する抗体ならびに新たに合成されたＤＮＡに組み込まれるウリジン類似体、ＥｄＵで染色した。
【００６４】
この方法で、心筋細胞増殖を著しく増加させることができる２０８種のマイクロＲＮＡを同定する。
【００６５】
心臓筋細胞を単離するために、実験動物、例えば、ラットを使用する。好ましくは、筋細胞は、よく知られた方法に従って新生仔動物から単離する。心室の筋細胞を使用することが好ましい。
【００６６】
ライブラリーの個々のマイクロＲＮＡをマイクロウェルプレートの個々のウェルに１種ずつ移す。その後、これらのマイクロＲＮＡのそれぞれを動物の心筋細胞に遺伝子導入する。接種した細胞の大きさの好ましい単位は、１ウェル当たり１×１０４細胞である。標準的な逆転写方法を、マイクロＲＮＡの適切な最終濃度、例えば、２５ｎＭで使用することができる。スクリーニングは、正確な実験のために、何回か、例えば、２回反復する。
【００６７】
遺伝子導入および細胞接種の後、例えば、２４時間後、培養培地を新鮮な培地と交換することができる。それから２８時間後、すなわちプレーティングしてから５２時間後、培養培地を細胞の生存力を試験するために適切な培地と交換し、少なくとも２種類の増殖マーカー、例えば、ＥｄＵおよびＫｉ−６７を適切な時間（２０時間など）使用する。通常、プレーティングして約７２時間後に細胞を固定し、当技術分野で知られているように、免疫蛍光法のために処理する。次に、細胞は、好ましくは一晩通常の温度で（例えば、４℃）、ブロッキング溶液で希釈した１次抗体で染色する。１次抗体の例は、サルコメアアルファアクチンに対するマウスモノクローナル抗体、Ｋｉ−６７に対するウサギ抗体である。他の抗体を使用してもよい。次に、細胞を培地、例えば、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、検出可能な標識と結合させたそれぞれの２次抗体で十分な時間（２ｈなど）インキュベートする。細胞はさらに、ＥｄＵ組み込みを明らかにするために処理し、当技術分野で知られているように染色する。
【００６８】
次に、ハイコンテンツスクリーニング蛍光顕微鏡のような市販の装置で画像を取得し、画像解析を実施する。細胞は、少なくとも２つの増殖マーカーの両方が陽性の場合のみ増殖と判定し、心筋細胞は、サルコメアアルファアクチンが陽性であることによって初代培養（例えば、線維芽細胞および内皮細胞）に存在する他の細胞から区別する。
【００６９】
心筋細胞増殖を誘導するマイクロＲＮＡの選択はまた、成体心筋細胞において反復する。これらは、心臓左心室から、分化した成体心筋細胞単離の標準的手順を使用して得ることが好ましいが、限定はしない。次に、これらは前記マイクロＲＮＡで処置し、処置後、成体心筋細胞の増殖は、新生仔心筋細胞で説明したように、ＥｄＵおよびＫｉ−６７などの様々な増殖マーカーの陽性を評価することによって確認する。
【００７０】
マイクロＲＮＡの選択は、保存された一連の標的を標的化することによって機能するマイクロＲＮＡをスクリーニングするために、第１の選択で使用した動物とは異なる実験動物で反復する。
【００７１】
次に、ヒトにおける心筋細胞増殖を増加させるマイクロＲＮＡの選択は、第２の選択から生じるマイクロＲＮＡを市販の胚性幹細胞から得られたヒト心筋細胞（例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＣｙｔｉｖａ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）に遺伝子導入することによって実施する。これらの細胞は、心室、心房および結節サブタイプを含み、大部分が心室筋細胞であり、形態、電気生理および心臓マーカーの発現を用いて特徴付けられ、したがって、予測試験のためにヒトドナーから得ることが困難な初代細胞の生物学的に適切な代替物となる。
【００７２】
総合的に、本明細書で記載した結果によって、胚細胞、新生仔個体または成体個体から得られた、ヒト細胞を含む様々な種の心臓筋細胞の増殖を増加させることができるマイクロＲＮＡのサブセットが同定される。これに関連して、これらのマイクロＲＮＡは、ヒトにおける心疾患に対する新たな治療的アプローチの開発のための基礎となり、心筋細胞増殖を促進することによって成体心臓組織の再生を誘導するという特定の目的を有する。
【００７３】
実現した結果を基本的に改変しない前述の方法の改変法は、本発明の範囲内である。
【００７４】
他の実施形態を本明細書で提示する。
【００７５】
好ましくはヒト由来のマイクロＲＮＡをスクリーニングするための方法およびマイクロＲＮＡのライブラリーのスクリーニングから得ることができるマイクロＲＮＡは本発明のさらなる目的であり、前記スクリーニングには、ａ）第１の動物対象から単離された心筋細胞に各マイクロＲＮＡを遺伝子導入すること、ｂ）前記遺伝子導入した心筋細胞を培養すること、ｃ）前記遺伝子導入した心筋細胞の増殖能力を試験すること、ｄ）前記遺伝子導入した心筋細胞において増殖を誘導することができるマイクロＲＮＡを選択することが含まれる。
【００７６】
好ましくはヒト由来のマイクロＲＮＡをスクリーニングするための方法およびマイクロＲＮＡのライブラリーのスクリーニングから得ることができるマイクロＲＮＡは、本発明のさらなる目的であり、前記スクリーニングには、ａ）第１の動物対象から単離された心筋細胞に各マイクロＲＮＡを遺伝子導入すること、ｂ）前記遺伝子導入した心筋細胞を培養すること、ｃ）前記遺伝子導入した心筋細胞の増殖能力を試験すること、ｄ）前記遺伝子導入した心筋細胞において増殖を誘導することができるマイクロＲＮＡを選択すること、ｅ）前記第１の動物とは異なる第２の動物対象から単離された心筋細胞に工程ｄ）の選択された各マイクロＲＮＡを遺伝子導入すること、ｆ）前記遺伝子導入した心筋細胞を培養すること、ｇ）前記遺伝子導入した心筋細胞の増殖能力を試験すること、ｈ）工程ｇ）の前記遺伝子導入した心筋細胞において増殖を誘導することができるマイクロＲＮＡを選択することが含まれる。
【００７７】
好ましくはヒト由来のマイクロＲＮＡをスクリーニングするための方法およびマイクロＲＮＡのライブラリーのスクリーニングから得ることができるマイクロＲＮＡは、本発明のさらなる目的であり、前記スクリーニングには、ａ）第１の動物対象から単離された心筋細胞に各マイクロＲＮＡを遺伝子導入すること、ｂ）前記遺伝子導入した心筋細胞を培養すること、ｃ）前記遺伝子導入した心筋細胞の増殖能力を試験すること、ｄ）前記遺伝子導入した心筋細胞において増殖を誘導することができるマイクロＲＮＡを選択すること、ｅ）前記第１の動物とは異なる第２の動物対象から単離された心筋細胞に工程ｄ）の選択された各マイクロＲＮＡを遺伝子導入すること、ｆ）前記遺伝子導入した心筋細胞を培養すること、ｇ）前記遺伝子導入した心筋細胞の増殖能力を試験すること、ｈ）工程ｇ）の前記遺伝子導入した心筋細胞において増殖を誘導することができるマイクロＲＮＡを選択すること、ｉ）ヒト幹細胞から得られた単離された心筋細胞に工程ｈ）の選択された各マイクロＲＮＡを遺伝子導入すること、ｊ）前記遺伝子導入した心筋細胞を培養すること、ｋ）前記遺伝子導入した心筋細胞の増殖能力を試験すること、ｌ）工程ｋ）の前記遺伝子導入した心筋細胞において増殖を誘導することができるマイクロＲＮＡを選択することが含まれる。
【００７８】
前記方法の試験および選択の工程は、特にハイコンテンツ画像解析をベースにしたハイスループットスクリーニング法で行われることが好ましい。好ましい方法は、蛍光顕微鏡をベースにしたハイスループットスクリーニングである。
【００７９】
前記方法から得られたマイクロＲＮＡは、インビトロおよびインビボにおいて、心筋細胞における増殖を誘導することができ、特に動物対象の、さらに特に、様々な動物対象において、またさらに特にヒトにおいて、心筋細胞の増殖を誘導することができる。
【００８０】
本発明はまた、本明細書で開示したマイクロＲＮＡの１次転写物、前駆体および模倣体を含む。ｍｉＲＮＡ１次転写物、前駆体および模倣体の概念は、当技術分野では周知である。
【００８１】
マイクロＲＮＡ主鎖または天然のマイクロＲＮＡ機能をいかなる方法であっても模倣する合成核酸の改変も本発明で提供する。これらの改変は、前記改変が本発明のマイクロＲＮＡの機能を変化させない条件で、周知の技術によって行うことができる。このような改変には、限定はしないが、リン酸基の非結合性の酸素原子の置換、ヌクレオチドの糖分子へのアルキル基の導入、ヌクレオチドの糖の炭素または酸素原子を連結する他の結合の組み入れ（例えば、ＬＮＡ技術）などが含まれる。これらの改変は、当技術分野では周知であり、さらに特定の開示を必要としない。
【００８２】
本発明のマイクロＲＮＡは、以下の実施例に示したように、心臓筋細胞の有糸分裂、細胞分裂（細胞質分裂）ならびにインビトロおよびインビボにおける細胞数を増加させることができる。
【００８３】
特に、心筋細胞の喪失に関連した心臓病（心筋梗塞、虚血および非虚血が原因の心筋症、心筋炎ならびに心不全の結果）の治療のための医薬としてのマイクロＲＮＡに関する本発明の実施形態では、心筋細胞の増殖を刺激することによって心臓再生を誘導する特定の目的で、マイクロＲＮＡは従来の方法によって前記疾患に罹患した対象に投与することができる。
【００８４】
前記医薬は、非経口、冠動脈内、静脈内または心臓内投与のための調製物の形態であると好都合であるが、他の形態も本発明を実施するために同じように適している。当業者であれば、患者の状態、疾患の重症度、患者の応答およびこの場合の一般的知識内の任意の他の臨床的パラメータに応じて、投与の効果的な時間を決定するだろう。
【００８５】
医薬組成物は、以下の少なくとも１つを含有する：本発明のマイクロＲＮＡまたはその１次代謝物または前駆体に対応する合成ＲＮＡ、前記マイクロＲＮＡをコードするＤＮＡ、マイクロＲＮＡなどの前記ＲＮＡの１次転写物または前駆体がこのＤＮＡを含有する細胞内で産生される、１次転写物または前駆体をコードするＤＮＡ。本発明のマイクロＲＮＡ（もしくは１次転写物もしくは前駆体）または対応するコーディングＤＮＡの１つの投与は、陽イオン性脂質などの脂質分子またはペプチドと一緒に、ポリマースキャフォールドの状態で投与することができ、当技術分野によれば、これによってデリバリーが容易になり得る。このようなマイクロＲＮＡまたはそれらの対応するＤＮＡを投与する別の方法は、ＲＮＡまたはＤＮＡの投与のために知られている適切なベクターを用いる。より好ましいベクターは、天然（限定はしないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９など）または人工の任意のキャプシド血清型のアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）で、インビボにおいてＤＮＡを投与するためによく知られたウイルスベクターである（Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１）。本発明のマイクロＲＮＡに対応する前記合成ＲＮＡ、前記マイクロＲＮＡをコードするＤＮＡ、マイクロＲＮＡなどの前記ＲＮＡの１次転写物または前駆体がこのＤＮＡを含有する細胞内で産生される、１次転写物または前駆体をコードするＤＮＡを投与するためのこれらの方法および製剤は全て、従来のものであり、当技術分野では周知であり、さらなる説明を必要としない。
【００８６】
注射は、好ましい投与経路である。しかし、当業者は、従来の医薬組成物によってマイクロＲＮＡを投与することを決定することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最終版を参照にすることができる。
【００８７】
投与計画、投薬量および用量は、医師の経験、治療する疾患および患者の状態によって医師が決定する。
【００８８】
選択した投与経路によって、組成物は、経口、非経口、静脈内または動脈内投与に適した固形または液状である。遺伝子療法はまた、別の実施形態である。本発明による組成物は、活性成分と共に、少なくとも１種の薬学的に許容される媒体または賦形剤を含有する。これらは、特に有用な製剤共補助剤、例えば、可溶化剤、分散剤、懸濁剤および乳化剤であってもよい。
【００８９】
本発明で使用するための活性物質は、医薬、すなわち、医薬組成物として投与することができる。この組成物は、適切な担体と共に本発明の少なくとも１種の活性物質を含有する。様々な投与経路および技術、中でも、静脈内、心臓内および動脈内注射、カテーテル法などの非経口技術を利用することができる。活性物質の平均量は変化してもよく、特に、資格のある医師の推奨および指示に基づくべきである。
【００９０】
生物学的および治療的に活性のある化合物を心筋細胞の増殖を増加させる能力によってスクリーニングするための方法はまた本発明の目的であり、前記方法には、ａ）前記マイクロＲＮＡのいずれかで遺伝子導入した心筋細胞を提供する工程、ｂ）治療的に活性のある化合物の候補と前記心筋細胞とを接触させる工程、ｃ）前記遺伝子導入した心筋細胞の増殖能力を試験する工程、ｄ）前記遺伝子導入した心筋細胞の増殖を誘導することができる化合物を選択する工程が含まれる。
【００９１】
以下の実施例はさらに本発明を例示する。
【実施例１】
【００９２】
機能スクリーニングは、インビトロにおけるラット新生仔心筋細胞の増殖を制御するマイクロＲＮＡを同定する。
細胞増殖を含むいくつかの生物学的プロセスの調節においてマイクロＲＮＡが関与することを考え、マイクロＲＮＡがエキソビボにおいて初代心臓筋細胞の増殖を制御できるかどうかを調べ、これらの細胞の増殖能力を増加させるのに最も有効なマイクロＲＮＡを同定することを所望した。
【００９３】
この問題に取り組むために、注釈を付けたヒトマイクロＲＮＡ（２００９年公開のｍｉＲＢａｓｅ  １３．０）による全てに対応する９８８種のマイクロＲＮＡ模倣体の市販のライブラリー（ｍｉＲＩＤＩＡＮ  マイクロＲＮＡ模倣体、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ラット新生仔心筋細胞において蛍光顕微鏡をベースにしたハイスループットスクリーニングを実施した。細胞を核色素Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３４３２、心筋細胞マーカーサルコメアアルファアクチニンおよび増殖抗原Ｋｉ−６７に対する抗体ならびに新たに合成されたＤＮＡに組み込まれるウリジン類似体、ＥｄＵで染色した。増殖細胞の同定の信頼性を高めるために、２種類の増殖マーカー（Ｋｉ−６７およびＥｄＵ組み込み）を使用し、自動画像解析は、実験条件当たり約３０００細胞について実施した。
【００９４】
このアプローチを使用して、ラット新生仔心筋細胞増殖を２倍超（１２．５％の基準増殖から４０％超まで）著しく増加させることができる２０８種のマイクロＲＮＡを同定した。
【００９５】
図１は、マイクロＲＮＡによる心筋細胞増殖の誘導のスクリーニング結果を示す。各点は、２回の同じ実験における個々のマイクロＲＮＡによる心筋細胞増殖に対する効果を示す。対照マイクロＲＮＡは下の四角の中に入り（点線）、本発明の対象である３６種のマイクロＲＮＡは上の四角内に入る（増殖数、ＥｄＵ＋、Ｋｉ−６７＋心筋細胞、３５％から５５％まで）。
【００９６】
図２は、ＥｄＵおよびＫｉ−６７陽性によって評価した、インビトロにおいて心筋細胞増殖を増加させるマイクロＲＮＡの例を示す。
【００９７】
方法
動物の飼育および世話は、国内外の法律および政策に従った機関ガイドラインに基づいて実施した（ＥＥＣ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ８６／６０９，  ＯＪＬ  ３５８，  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １２，  １９８７）。
【００９８】
ウィスターラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｔａｌｉａ  Ｓｒｌ．から購入した。新生仔ラットの心臓筋細胞は、わずかな改変を加えて既に記載されたように単離した（Ｃｏｌｌｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。簡単に説明すると、新生仔ラット（０日目）の心室を心房から分離し、小片に切断し、１．７５ｍｇ／ｍｌ  トリプシン（ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ）および１０マイクロｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩＩ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＨＥＰＥＳ（ＣＢＦＨＨ）緩衝液を含み、カルシウムおよび炭酸水素を含まないハンクス中で絶え間なく撹拌しながら解離させた。消化は、室温での１０分工程８回から１０回で実施し、各工程後に上清をウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に収集した。上清を遠心して細胞を単離し、５％  ＦＢＳおよび２０μｇ／ｍｌ  ビタミンＢ１２（Ｓｉｇｍａ）を補給したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）４．５ｇ／ｌ  グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。収集した細胞をセルストレーナー（４０μｍ、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に通し、その後、コーティングしていない１００ｍｍのプラスティック皿に５％ＣＯ２および湿潤雰囲気中で３７℃で２時間接種した。ほとんど心筋細胞から構成される上清をその後収集し、細胞を計数してプレーティングした；この手順を使用して調製したラット新生仔心室心筋細胞の培養物の純度は＞９０％である。
【００９９】
ヒト成熟マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＩＤＩＡＮ  マイクロＲＮＡ模倣体）全てに対応するマイクロＲＮＡライブラリーは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。個々のマイクロＲＮＡは、ロボットによってＰｒｉｍａｒｉａ  ９６ウェルプレート（ＢＤ−Ｆａｌｃｏｎ）に移し、カラム１および１２は対照マイクロＲＮＡ（ｃｅｌ−ｍｉＲ−６７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１）を添加するために空のままにした。マイクロＲＮＡは、リポフェクタミンＲＮＡｉｍａｘ遺伝子導入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した標準的な逆転写方法によって、最終濃度２５ｎＭでラット新生仔心筋細胞（１．０×１０４細胞をウェル毎に接種した）に遺伝子導入し、スクリーニングは２連で実施した。
【０１００】
遺伝子導入および細胞接種の２４時間後、培養培地を新鮮な培地と交換し、２８時間後、すなわちプレーティングしてから５２時間後、培養培地を５μＭ  ＥｄＵを含有する培地で２０時間交換した。プレーティングして約７２時間後に細胞を固定し、免疫蛍光法のために処理した。簡単に説明すると、細胞を４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）に溶かした０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で１０分間透過処理し、その後１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間ブロックした。その後、細胞は、ブロッキング溶液で希釈した以下の１次抗体、サルコメアアルファアクチンに対するマウスモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）およびＫｉ−６７に対するウサギ抗体（Ｍｏｎｏｓａｎ）で４℃で一晩染色した。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８または６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と結合させたそれぞれの２次抗体で２時間インキュベートした。細胞はさらに、ＥｄＵ組み込みを明らかにするために、Ｃｌｉｃｋ−ＩＴ  ＥｄＵ５５５イメージングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造者の指示に従って処理し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３４３２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。
【０１０１】
画像取得は、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ自動ハイコンテンツスクリーニング蛍光顕微鏡（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を１０倍で使用して実施し、全部で１６枚の画像を波長、ウェルおよび複製毎に取得し、条件毎に分析した細胞は約３０００個に相当した。画像分析は、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェアで実施される「多波長細胞スコアリング」アプリケーションモジュールを使用して実施した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）。細胞は、両方の増殖マーカー（Ｋｉ−６７およびＥｄＵ）が陽性の場合のみ増殖と判定し、心筋細胞は、サルコメアアルファアクチンが陽性であることによって初代培養（例えば、線維芽細胞および内皮細胞）中に存在する他の細胞から区別した。
【実施例２】
【０１０２】
マイクロＲＮＡのサブセットは、様々な生物（ラット、マウスおよびヒト）の心筋細胞のインビトロ増殖を制御する。
発生中、マウス心臓の心筋細胞はラット心臓の心筋細胞よりも早く分割を停止する（それぞれ、誕生直後および誕生の３から４日後）。この結果として、新生仔のマウスから単離された心筋細胞は、同齢のラットから単離された心筋細胞よりも増殖能力が著しく低く、新生仔ラット（出生後０日目）から単離された心筋細胞の増殖は約１２．５％で、マウスの心筋細胞では約５％である。
【０１０３】
したがって、ラット心筋細胞の増殖を増加させることが示された２０８種の選択されたマイクロＲＮＡを使用して、マウス新生仔心筋細胞において実施例１で記載した蛍光顕微鏡をベースにしたハイスループット実験を反復した。これらの実験の結果は、試験した２０８種のマイクロＲＮＡからの３６種のマイクロＲＮＡはまたマウス心筋細胞の増殖を増加させることを示しており、これらは、保存された一連の標的を標的とすることによって機能し得ることが示唆された。
【０１０４】
ヒトにおける心筋細胞増殖を増加させるためにマイクロＲＮＡを適用する潜在性を評価するために、市販されている（Ｃｙｔｉｖａ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）胚性幹細胞（ＥＳＣ）から得られたヒト心筋細胞に、ラットおよびマウス初代心筋細胞で実施された実験から選択された３６種のマイクロＲＮＡを遺伝子導入した。これらの細胞には、心室、心房および結節サブタイプが含まれるが、大部分が心室筋細胞であり、形態、電気生理および心臓マーカーの発現を用いて詳細に特徴付けられており、したがって、予測試験のためにヒトドナーから得ることが困難な初代細胞の生物学的に適切な代替物となっている。これらの実験の結果は、胚性幹細胞から得られたヒト心筋細胞を選択したマイクロＲＮＡで処理すると、心筋細胞増殖の非常に著しい増加が引き起こされることを示しており（約３％から約３０％）、ＥＳＣ由来のヒト心筋細胞の増殖を増加させるマイクロＲＮＡの例を図３に示す。
【０１０５】
総合的に、本明細書で記載した結果によって、ヒト細胞を含む様々な種の心臓筋細胞の増殖を増加させることができる３６種のマイクロＲＮＡのサブセットが同定される。これらのマイクロＲＮＡは、ヒトにおける心疾患に対する新たな治療的アプローチの開発のための基礎となり、インビボにおいて心筋細胞増殖を刺激することによって心臓組織の再生を誘導することを特に目的とする。
【０１０６】
方法
ＣＤ１マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｔａｌｉａ  Ｓｒｌ．から購入した。マウス心筋細胞は、ラット心筋細胞について実施例１で説明したように、新生仔マウス（出生後０日目）から単離した。
【０１０７】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来の心筋細胞（Ｃｙｔｉｖａ心筋細胞）はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。これらの細胞は詳細に特徴付けられており、したがって、初代細胞の適切な代替物となっている。細胞は、業者の指示に従って解凍した。
【０１０８】
選択された個々のマイクロＲＮＡは、ロボットによってマイクロＲＮＡライブラリー保存プレートから移し、コラーゲンをコーティングした黒色透明底９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に再度アレイした。選択したマイクロＲＮＡのマウスおよびヒト細胞への遺伝子導入は、ウェル当たり接種する細胞の数がマウス細胞では１．５×１０４個、ヒト細胞では１×１０４個であり、最終的なマイクロＲＮＡ濃度はマウス細胞では５０ｎＭであり、ヒト細胞では２５ｎＭであることを除けば、実施例１の方法で記載したように実施した。
【０１０９】
自動画像取得および解析を含む他の試薬および方法は、実施例１の方法で記載したのと同じである。
【実施例３】
【０１１０】
マイクロＲＮＡは、インビトロにおける心臓筋細胞の有糸分裂、細胞分裂（細胞質分裂）および細胞数を増加させる。
Ｋｉ−６７増殖マーカーによる染色およびＤＮＡ合成中のＥｄＵ組み込みによって評価した心筋細胞増殖の増加が、心筋細胞の細胞分裂事象（細胞質分裂）の増加と相関することを示すために、心筋細胞を個々のマイクロＲＮＡで処理し、他のマーカー、すなわち、ｉ）Ｇ２後期／有糸分裂の細胞を検出する、セリン１０（Ｐ−Ｓ１０−Ｈ３）でリン酸化されたヒストンＨ３の染色、ｉｉ）分裂する細胞の完全な分離直前の細胞質分裂の最後近くに出現し、分離後短期間維持される一時的な構造である中心体の成分、ＡｕｒｏｒａＢキナーゼの染色、およびｉｉｉ）マイクロＲＮＡを遺伝子導入して６日後の心筋細胞数を評価した。
【０１１１】
心筋細胞を選択したマイクロＲＮＡで処理すると、図４で示したように、Ｐ−Ｓ１０−Ｈ３陽性の細胞数（対照マイクロＲＮＡの１．７％から８％まで）ならびに中心体を表す細胞数（０．５％から４％）の両方の著しい増加が引き起こされた。予測通り、Ｐ−Ｓ１０−Ｈ３および中心体が陽性の細胞の割合が、Ｋｉ−６７およびＥｄＵが陽性の細胞よりも著しく少ないのは、前者が比較的短い期間の事象のマーカーだからである。
【０１１２】
細胞周期の効果的な進行および順調な細胞質分裂と一致して、選択したマイクロＲＮＡで６日間処理した心筋細胞の解析によって、選択したマイクロＲＮＡはまた、対照と比較すると、心筋細胞の数を著しく増加させることが明らかになった。
【０１１３】
方法
選択された個々のマイクロＲＮＡは、ロボットによってＰｒｉｍａｒｉａ  ９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に移された。選択したマイクロＲＮＡのラット新生仔心筋細胞への遺伝子導入および免疫蛍光法は、実施例１の方法で記載したように実施した。細胞は、以下の１次抗体、サルコメアアルファアクチニンに対するマウスモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）、セリン１０でリン酸化されたヒストンＨ３に対するウサギ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＡｕｒｏｒａＢキナーゼに対するウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ）で染色した。
【０１１４】
自動画像取得および解析を含む他の試薬および方法は、実施例１の方法で記載したのと同じである。ＡｕｒｏｒａＢ抗体で染色した中心体の定量は、ウェル毎に取得された１６枚の画像の手動による検査および計数によって実施した。
【実施例４】
【０１１５】
マイクロＲＮＡは完全に分化した成体心筋細胞の増殖を増加させる。
新生仔動物から単離された心筋細胞の一部分はまだ細胞周期と連動しており、増殖することができ（種に応じて心筋細胞の約３〜１５％）、したがって、マイクロＲＮＡがこれらの細胞の増殖能力を高めると考えることができる。
【０１１６】
選択したマイクロＲＮＡが、新生仔心筋細胞に加えて、完全に分化した細胞の細胞周期への再入を誘導することもできるかどうかを試験するために、心筋細胞を成体（２ヵ月齢）ラットから単離し、選択したマイクロＲＮＡで遺伝子導入した。１例として、図５において、選択したマイクロＲＮＡの２つ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐ（それぞれインビトロにおいてマウスおよびラットの心筋細胞増殖の誘導を最も良く実施するマイクロＲＮＡ）の効果を示す。
【０１１７】
意外なことに、マイクロＲＮＡ処理によって、時間に依存した細胞の細胞周期への再入が決定され（培養して７日目のほとんど無しからｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐによるＥｄＵ＋心筋細胞約６％およびｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐによるＥｄＵ＋心筋細胞約８％まで）、最終的にプレート内の細胞の数の著しい増加が引き起こされた。
【０１１８】
これらの実験は明らかに、マイクロＲＮＡが新生仔心臓細胞だけでなく、分裂しない、成体個体から回収した完全に分化した心筋細胞の増殖も誘導することができることを示している。
【０１１９】
方法
心室の心筋細胞は、わずかな変更を加えて、以前記載されたように（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）、雌成体ウィスターラット（２ヵ月齢）のランゲンドルフ灌流心臓から単離した。簡単に説明すると、心臓を取り出し、カルシウムを含まないクレブス−ヘンゼライト炭酸水素（ＫＨＢ）緩衝液で逆方向に灌流した。次に、１ｍｇ／ｍｌ  リベラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＫＨＢ緩衝液で心臓を１０分間灌流した。心房および大血管を除去した後、心臓をＫＨＢ緩衝液中で細かく刻み、細胞混合物をセルストレーナー（１００μｍ、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）で濾過した。次に細胞を室温で５３０ｇで３分間遠心することによってペレットにした。細胞ペレットを、ＤＭＥＭ  １．０ｇ／ｌ  グルコース（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および灌流緩衝液（１：１）の混合物中に再懸濁し、他の細胞種からの心筋細胞の分離は、６％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）クッション上で１５分間沈降させることによって実施した。心筋細胞ペレットを再懸濁し、２ｇ／ｌ  ＢＳＡ、２ｍＭ  Ｌ−カルニチン（Ｓｉｇｍａ）、５ｍＭ  クレアチニン（Ｓｉｇｍａ）、５ｍＭ  タウリン（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭ  ２，３−ブタンジオンモノオキシム（ＢＤＭ；Ｓｉｇｍａ）を補給し、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ  １．０ｇ／ｌ  グルコースにプレーティングした。ラミニン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングした２４ウェルプレートに細胞をプレーティングし、５％ＣＯ２および湿潤雰囲気中で３７℃で維持した。培地は、２４時間後に５％  ＦＢＳ、２０μｇ／ｍｌ  ビタミンＢ１２を補給したＤＭＥＭ  ４．５ｇ／ｌ  グルコースに交換し、以下に説明したように細胞を遺伝子導入した。
【０１２０】
成体動物から単離したラット心筋細胞の遺伝子導入は、細胞接種して２４時間後にフォワードトランスフェクション方法を使用して、マイクロＲＮＡの最終的な濃度が５０ｎＭで遺伝子導入を実施すること以外は、基本的に新生仔心筋細胞について実施例１の方法で説明したように実施した。培地は、遺伝子導入して４８時間後、その後、遺伝子導入後６日間は細胞が固定するまで２４時間毎に、５μＭ  ＥｄＵを含有する培地と交換した。
【０１２１】
自動画像取得および解析を含む他の試薬および方法は、実施例１の方法で記載したのと同じである。
【実施例５】
【０１２２】
マイクロＲＮＡは、インビボにおいて心筋細胞増殖を増加させる。
インビトロにおいて、選択したマイクロＲＮＡで処理して心筋細胞増殖の増加が観察されたことを考え、これらのマイクロＲＮＡがインビボにおいても増殖を増加させるかどうかを測定することを所望した。１例として、ここでは、選択したマイクロＲＮＡの２つ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐ（それぞれインビトロにおいてマウスおよびラットの心筋細胞増殖の誘導を最も良く実施するマイクロＲＮＡ）の効果を示す。
【０１２３】
遺伝子導入試薬と結合させた合成マイクロＲＮＡを新生仔ラットの心臓に直接注射し、４日後、選択した２種類のマイクロＲＮＡそれぞれを注射した動物おいてＥｄＵを組み込んだ細胞数を、対照マイクロＲＮＡ（ｃｅｌ−ｍｉＲ−６７）を注射した動物と比較することによって、その効果を評価した。選択したマイクロＲＮＡを注射した動物の心臓において増殖した細胞数の著しい増加が観察された（ｃｅｌ−ｍｉＲ−６７を注射した動物における３％から、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐを注射した動物の約１０％まで）。注目すべきことに、共焦点蛍光顕微鏡によって、増殖する細胞のかなりの画分が本当に心筋細胞であることが確認された。著しい結果が図６に示されており、ＥｄＵ陽性によって評価した、インビボにおいて心筋細胞増殖を増加させるマイクロＲＮＡの例である。
【０１２４】
合成マイクロＲＮＡを使用する代わりに、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａおよびｈｓａ−ｍｉＲ−５９０をコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をベースにしたベクターを新生仔マウスに腹腔内（ＩＰ）注射することによってさらに実験を実施した。様々な血清型のＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２、投与経路による）は心臓を効率よく形質導入するが（Ｉｎａｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，  ２００６；  Ｃｏｌｌｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）、これらのベクターからのマイクロＲＮＡの発現は、構成的ＣＭＶプロモーターによって行われる。心臓における細胞の増殖は、注射して１２日後に後期Ｇ２／有糸分裂期の細胞を検出するためのアルファアクチニンおよびＰ−Ｓ１０−Ｈ３に対する抗体で染色することによって評価した。対照ＡＡＶを注射した動物と比較すると、選択したマイクロＲＮＡを注射した動物の心臓において増殖する細胞数の著しい増加が観察された。
【０１２５】
これらのアプローチを使用して、実施例１、２および３で説明したインビトロ研究をベースにして、選択したマイクロＲＮＡがインビボにおいて新生仔ラットおよびマウス両方の心筋細胞の増殖を著しく増加させることができることを測定した。さらに、これらのマイクロＲＮＡが、合成された成熟配列として導入されるか、またはウイルスベクターから発現するかに関わりなく活性があることを示した。
【０１２６】
方法
新生仔ウィスターラット（出生後１日目）を氷床上で５分間冷却することによって麻酔した。皮膚切開後、肋間筋を切離することによって、第４肋間腔で側方開胸術を実施した。３０ゲージ針を組み込んだインスリンシリンジ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してマイクロＲＮＡ複合体を心臓内注射した後、新生仔を氷床から取り出し、胸壁および皮膚切開を縫合した。次に、新生仔を加熱ランプの下に置き、回復するまで数分間温めた。マイクロＲＮＡ複合体は、マイクロＲＮＡ（ｃｅｌ−ｍｉＲ−６７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐまたはｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐの約２．８μｇ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をリポフェクタミンＲＮＡｉｍａｘ遺伝子導入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と３０分間室温で混合することによって調製した。ラット心臓毎に注射した混合物の全容量は、３０μｌであった。
【０１２７】
ＡＡＶベクターの産生のために、ｐｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａおよびｐｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０ならびに上流および下流隣接配列（全部で約３００ｂｐ）を、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造者の指示に従って、ＨｅＬａ細胞から単離したヒトゲノムＤＮＡから増幅した。増幅した配列をｐＺａｃベクターにクローニングした。
【０１２８】
組換え体ＡＡＶベクターは、既に記載されたように得られた（Ｚｅｎｔｉｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。簡単に説明すると、ＡＡＶベクターは、パッケージング用の３つのプラスミドの同時遺伝子導入を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞において生成した（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４）。ウイルス保存物は、ＣｓＣｌ２勾配遠心によって得られた。ＡＡＶウイルス粒子の滴定は、以前に記載されたように（Ｚｅｎｔｉｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１）ウイルスゲノムの数のリアルタイムＰＣＲ定量によって実施し、この研究で使用したウイルス調製物の力価は、１ｍｌ当たり１×１０１２ウイルスゲノム（ｖｇ）と１×１０１３ウイルスゲノム（ｖｇ）との間であった。
【０１２９】
ＡＡＶベクターを使用する実験では、新生仔ＣＤ１マウス（出生後１日目）に、３０ゲージ針を組み込んだインスリンシリンジ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ＡＡＶ−ＬａｃＺ、ＡＡＶ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａまたはＡＡＶ−ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０を動物当たり１ｘ１０１１ｖｇの用量で腹腔内注射した。
【０１３０】
注射したラットおよびマウスの心臓をそれぞれ注射後４日目および１２日目に収集し、心室から残存する血液を除去するためにＰＢＳで軽く濯いだ。心臓は、１０％ホルマリンで室温で固定し、パラフィン包埋のために常法通り処理した。ヘマトキシリン／エオジンおよびマッソントリクローム染色を標準的手順に従って実施し、通常の形態および線維症の範囲を分析した。免疫蛍光染色のために、試料切片を脱パラフィンして再水和し、実施例１で説明したように処理した。以下の１次抗体、サルコメアアルファアクチニンに対するマウスモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）およびセリン１０でリン酸化されたヒストンＨ３に対するウサギ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、その後Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８または５５５に結合した抗マウスおよび抗ウサギ２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２次抗体染色した。核は、ＴＯＴＯ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で区域を対比染色することによって同定した。スライドは、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｔｏｒ  Ｌａｂｓ）に載せ、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ自動ハイコンテンツスクリーニング蛍光顕微鏡（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）またはレーザー共焦点５１０  ＭＥＴＡ顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ）を使用して撮像した。
【０１３１】
様々な心臓切片におけるＥｄＵまたはＰ−Ｓ１０−Ｈ３陽性細胞の定量は、実施例１および３で説明したように、自動画像解析によって実施した。
【実施例６】
【０１３２】
マイクロＲＮＡは心筋梗塞後の心臓機能を保持する。
インビトロおよびインビボにおいて選択したマイクロＲＮＡで処理すると心筋細胞増殖の増加が観察されることを考慮して、マウスにおける心筋梗塞後の心臓機能に対するマイクロＲＮＡの効果を評価した。
【０１３３】
この目的のために、マウスに持続的な左冠動脈前下行枝結紮を行った直後に、左心室梗塞周囲領域に選択したマイクロＲＮＡを発現するＡＡＶベクターまたは対照ベクターを注射した。心筋梗塞の１２日後および１ヵ月後の心エコー検査によって評価すると、左心室駆出率（ＬＶＥＦ）および短縮率（ＬＶＦＳ）は、対照ＡＡＶで処理された動物と比較して、ＡＡＶ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａまたはＡＡＶ−ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０を注射した梗塞マウスでは著しく保持されていた（１ヵ月目；対照、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａおよびｈｓａ−ｍｉＲ−５９０動物では、それぞれＬＶＥＦが４２％、５３％、５４％；ＬＶＦＳが２０％、２７％、２６％であった、ｐ＜０．０５）。選択したマイクロＲＮＡを発現するＡＡＶベクターを注射した梗塞心臓のＬＶ収縮末期の壁肥厚はまた、対照群と比較したとき非常に改善されていた（対照ＡＡＶを注射した動物の０．７７ｍｍから、ＡＡＶ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａおよびＡＡＶ−ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０を注射した動物においてそれぞれ０．９８および０．９７ｍｍまで）。
【０１３４】
選択したマイクロＲＮＡによって誘導された心臓機能の改善が、梗塞の大きさの減少と相関するかどうかを測定するために、動物の小群（ｎ＝６）を心筋梗塞の１２日後に殺処分し、心臓の梗塞後線維症を調べた。トリクローム染色した心臓の横断面の分析によって、ＡＡＶ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａおよびＡＡＶ−ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０で処理したマウスは対照の梗塞マウスと比較したとき、梗塞の大きさが著しく低下したことが示された（対照ＡＡＶを注射した動物のＬＶ領域２８％から、ＡＡＶ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａおよびＡＡＶ−ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０を注射した動物においてそれぞれ１４％および１３％まで）。
【０１３５】
一緒にすると、これらのデータは、心筋梗塞の動物モデルにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａおよびｈｓａ−ｍｉＲ−５９０の発現は、梗塞の大きさを低下させ、心臓機能を著しく改善することができることを示す。
【０１３６】
図７は、ＡＡＶベクターを使用した、梗塞マウスの心臓へのデリバリーに対するマイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐおよびマイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐの効果を示す。
【０１３７】
方法
心筋梗塞は、雌ＣＤ１マウス（８〜１２週齢）で、持続的な左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）結紮によって作製した。簡単に説明すると、マウスにケタミンおよびキシラジンを腹腔内注射して麻酔し、気管内挿管し、げっ歯類人工呼吸器を装着した。体温は加熱パッドで３７℃に維持した。左開胸術によって拍動する心臓に接近した。心膜除去後、ＬＡＤ冠動脈の下行枝を、実体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で目視し、ナイロン製縫合糸で閉塞した。結紮は結紮直後に左心室領域が白くなることによって確認した。実施例５で説明したように作製した組換えＡＡＶベクターを動物１匹当たり１×１０１１ｖｇの用量で、ＬＡＤ結紮直後に、梗塞領域辺縁の心筋に、３０ゲージ針を組み込んだインスリンシリンジ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して注射した（単回注射）。ＡＡＶ−ＬａｃＺ、ＡＡＶ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａまたはＡＡＶ−ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０を投与された動物３群（ｎ＝１２／群）について研究した。胸部を閉じ、動物は自発呼吸が出現するまで腹臥位をとらせた。
【０１３８】
左心室の機能および寸法を評価するために、心筋梗塞の１２日後および１ヵ月後に、５％イソフルランで鎮静させたマウスで、３０−ＭＨｚリニアアレイトランスデューサーを装備したＶｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃｓ  Ｖｅｖｏ  ７７０超音波（Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃｓ）を使用して経胸壁２次元心エコー法を実施した。左心室前壁および後壁の厚さおよび収縮末期および拡張終期の内径、短縮率および駆出率を測定するために、Ｍモードで追跡した。
【０１３９】
実施例５で説明したように、心エコー検査の最後に（梗塞の１２日後および１ヵ月後）、心臓を収集し、組織学的検査および免疫蛍光のために処理した。梗塞の大きさは、線維化した領域の左心室全域の割合として測定した。
【０１４０】
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Ｂｕｅｎｏ，  Ｍ．Ｊ．，  Ｐｅｒｅｚ  ｄｅ  Ｃａｓｔｒｏ，  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ，  Ｍ．  （２００８）．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．  Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  （Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ，  Ｔｅｘ  ７，  ３１４３−３１４８．
Ｃａｌｌｉｓ，  Ｔ．Ｅ．，  Ｐａｎｄｙａ，  Ｋ．，  Ｓｅｏｋ，  Ｈ．Ｙ．，  Ｔａｎｇ，  Ｒ．Ｈ．，  Ｔａｔｓｕｇｕｃｈｉ，  Ｍ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｚ．Ｐ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｊ．Ｆ．，  Ｄｅｎｇ，  Ｚ．，  Ｇｕｎｎ，  Ｂ．，  Ｓｈｕｍａｔｅ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）．  ＭｉｃｒｏＲＮＡ−２０８ａ  ｉｓ  ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ａｎｄ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１９，  ２７７２−２７８６．
Ｃａｒｅ，  Ａ．，  Ｃａｔａｌｕｃｃｉ，  Ｄ．，  Ｆｅｌｉｃｅｔｔｉ，  Ｆ．，  Ｂｏｎｃｉ，  Ｄ．，  Ａｄｄａｒｉｏ，  Ａ．，  Ｇａｌｌｏ，  Ｐ．，  Ｂａｎｇ，  Ｍ．Ｌ．，  Ｓｅｇｎａｌｉｎｉ，  Ｐ．，  Ｇｕ，  Ｙ．，  Ｄａｌｔｏｎ，  Ｎ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）．  ＭｉｃｒｏＲＮＡ−１３３  ｃｏｎｔｒｏｌｓｃａｒｄｉａｃｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３，  ６１３−６１８．
Ｃｈｅｎ，  Ｊ．Ｆ．，  Ｍｕｒｃｈｉｓｏｎ，  Ｅ．Ｐ．，  Ｔａｎｇ，  Ｒ．，  Ｃａｌｌｉｓ，  Ｔ．Ｅ．，  Ｔａｔｓｕｇｕｃｈｉ，  Ｍ．，  Ｄｅｎｇ，  Ｚ．，  Ｒｏｊａｓ，  Ｍ．，  Ｈａｍｍｏｎｄ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｓｅｌｚｍａｎ，  Ｃ．Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．（２００８）．  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｃｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅａｒｔ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ  ａｎｄ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０５，  ２１１１−２１１６．
Ｃｏｌｌｅｓｉ，  Ｃ．，  Ｚｅｎｔｉｌｉｎ，  Ｌ．，  Ｓｉｎａｇｒａ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｇｉａｃｃａ，  Ｍ．  （２００８）．  Ｎｏｔｃｈ１  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １８３，  １１７−１２８．
Ｃｒｏｃｅ，  Ｃ．Ｍ．  （２００９）．  Ｃａｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  １０，  ７０４−７１４．
Ｅｌｍｅｎ，  Ｊ．，  Ｌｉｎｄｏｗ，  Ｍ．，  Ｓｃｈｕｔｚ，  Ｓ．，  Ｌａｗｒｅｎｃｅ，  Ｍ．，  Ｐｅｔｒｉ，  Ａ．，  Ｏｂａｄ，  Ｓ．，  Ｌｉｎｄｈｏｌｍ，  Ｍ．，  Ｈｅｄｔｊａｒｎ，  Ｍ．，  Ｈａｎｓｅｎ，  Ｈ．Ｆ．，  Ｂｅｒｇｅｒ，  Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）．  ＬＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４５２，  ８９６−８９９．
Ｅｕｌａｌｉｏ，  Ａ．，  Ｈｕｎｔｚｉｎｇｅｒ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｉｚａｕｒｒａｌｄｅ，  Ｅ．  （２００８）．  Ｇｅｔｔｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｒｏｏｔ  ｏｆ  ｍｉＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．  Ｃｅｌｌ  １３２，  ９−１４．
Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ，  Ｗ．，  Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ，  Ｓ．Ｎ．，  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，  Ｎ．  （２００８）．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ：  ａｒｅ  ｔｈｅ  ａｎｓｗｅｒｓ  ｉｎ  ｓｉｇｈｔ？  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ９，  １０２−１１４．
Ｇａｏ，  Ｇ．，  Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ，  Ｌ．Ｈ．，  Ａｌｖｉｒａ，  Ｍ．Ｒ．，  Ｌｕ，  Ｙ．，  Ｃａｌｃｅｄｏ，  Ｒ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｘ．，  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｊ．Ｍ．  （２００４）．  Ｃｌａｄｅｓ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｒｅ  ｗｉｄｅｌｙ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８，  ６３８１−６３８８．
Ｇｈｉｌｄｉｙａｌ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ，  Ｐ．Ｄ．  （２００９）．  Ｓｍａｌｌ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ＲＮＡｓ：  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｕｎｉｖｅｒｓｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  １０，  ９４−１０８．
Ｈｕ，  Ｓ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｍ．，  Ｌｉ，  Ｚ．，  Ｊｉａ，  Ｆ．，  Ｇｈｏｓｈ，  Ｚ．，  Ｌｉｊｋｗａｎ，  Ｍ．，  Ｆａｓａｎａｒｏ，  Ｐ．，  Ｓｕｎ，  Ｓ．，  Ｗａｎｇ，  Ｘ．，  Ｍａｒｔｅｌｌｉ，  Ｆ．，  Ｒｏｂｂｉｎｓ，  Ｒ．Ｃ．，  Ｗｕ，  Ｊ．，  ＭｉｃｒｏＲＮＡ−２１０  ａｓ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｓｃｈｅｍｉｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２０１０  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １４；  １２２（１１  Ｓｕｐｐｌ．）：  Ｓ１２４−Ｓ１３１．
Ｈｕａｎｇ，  Ｚ．Ｐ．，  Ｎｅｐｐｌ，  Ｒ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｗａｎｇ，  Ｄ．Ｚ．  （２０１０）．  ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３，  ２１２−２１８．
Ｉｋｅｄａ，  Ｓ．，  Ｋｏｎｇ，  Ｓ．Ｗ．，  Ｌｕ，  Ｊ．，  Ｂｉｓｐｉｎｇ，  Ｅ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｈ．，  Ａｌｌｅｎ，  Ｐ．Ｄ．，  Ｇｏｌｕｂ，  Ｔ．Ｒ．，  Ｐｉｅｓｋｅ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｐｕ，  Ｗ．Ｔ．  （２００７）．  Ａｌｔｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３１，  ３６７−３７３．
Ｉｎａｇａｋｉ，  Ｋ．，  Ｆｕｅｓｓ，  Ｓ．，  Ｓｔｏｒｍ，  Ｔ．Ａ．，  Ｇｉｂｓｏｎ，  Ｇ．Ａ．，  ＭｃＴｉｅｒｎａｎ，  Ｃ．Ｆ．，  Ｋａｙ，  Ｍ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｎａｋａｉ，  Ｈ．  （２００６）．  Ｒｏｂｕｓｔ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＡＡＶ９  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ：  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｌｏｂａｌ  ｃａｒｄｉａｃ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｏ  ｔｈａｔ  ｏｆ  ＡＡＶ８．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １４，  ４５−５３．
Ｋｅｄｄｅ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ａｇａｍｉ，  Ｒ．  （２００８）．  Ｉｎｔｅｒｐｌａｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｎｄ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．  Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  （Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ，  Ｔｅｘ  ７，  ８９９−９０３．
Ｌａｎｆｏｒｄ，  Ｒ．Ｅ．，  Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ−Ｅｒｉｋｓｅｎ，  Ｅ．Ｓ．，  Ｐｅｔｒｉ，  Ａ．，  Ｐｅｒｓｓｏｎ，  Ｒ．，  Ｌｉｎｄｏｗ，  Ｍ．，  Ｍｕｎｋ，  Ｍ．Ｅ．，  Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｏｒｕｍ，  Ｈ．  （２０１０）．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１２２  ｉｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  ３２７，  １９８−２０１．
Ｌａｔｒｏｎｉｃｏ，  Ｍ．Ｖ．，  ａｎｄ  Ｃｏｎｄｏｒｅｌｌｉ，  Ｇ．  （２００９）．  ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ６，  ４１９−４２９．
Ｌｉｎ，  Ｚ．，  Ｍｕｒｔａｚａ，  Ｉ．，  Ｗａｎｇ，  Ｋ．，  Ｊｉａｏ，  Ｊ．，  Ｇａｏ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｌｉ，  Ｐ．Ｆ．  （２００９）．  ｍｉＲ−２３ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｏｆ  ＮＦＡＴｃ３  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０６，  １２１０３−１２１０８．
Ｌｉｕ，  Ｎ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ａ．Ｈ．，  Ｋｉｍ，  Ｙ．，  ＭｃＡｎａｌｌｙ，  Ｊ．，  Ｂｅｚｐｒｏｚｖａｎｎａｙａ，  Ｓ．，  Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，  Ｌ．Ｂ．，  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ｊ．Ａ．，  Ｂａｓｓｅｌ−Ｄｕｂｙ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，  Ｅ．Ｎ．  （２００７）．  Ａｎ  ｉｎｔｒａｇｅｎｉｃ  ＭＥＦ２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｍｕｓｃｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  １  ａｎｄ  １３３．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０４，  ２０８４４−２０８４９．
Ｍａｔｋｏｖｉｃｈ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｖａｎ  Ｂｏｏｖｅｎ，  Ｄ．Ｊ．，  Ｙｏｕｋｅｒ，  Ｋ．Ａ．，  Ｔｏｒｒｅ−Ａｍｉｏｎｅ，  Ｇ．，  Ｄｉｗａｎ，  Ａ．，  Ｅｓｃｈｅｎｂａｃｈｅｒ，  Ｗ．Ｈ．，  Ｄｏｒｎ，  Ｌ．Ｅ．，  Ｗａｔｓｏｎ，  Ｍ．Ａ．，  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  Ｋ．Ｂ．，  ａｎｄ  Ｄｏｒｎ，  Ｇ．Ｗ．，  ２ｎｄ  （２００９）．  Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｂｙ  ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｓｕｐｐｏｒｔ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１９，  １２６３−１２７１．
Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  Ｆ，  Ｈｉｇｈ  ＫＡ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ＡＡＶ：  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１１；  １２：  ３４１−３５５．
Ｎａｊａｆｉ−Ｓｈｏｕｓｈｔａｒｉ，  Ｓ．Ｈ．，  Ｋｒｉｓｔｏ，  Ｆ．，  Ｌｉ，  Ｙ．，  Ｓｈｉｏｄａ，  Ｔ．，  Ｃｏｈｅｎ，  Ｄ．Ｅ．，  Ｇｅｒｓｚｔｅｎ，  Ｒ．Ｅ．，  ａｎｄ  Ｎａａｒ，  Ａ．Ｍ．  （２０１０）．  ＭｉｃｒｏＲＮＡ−３３  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＳＲＥＢＰ  ｈｏｓｔ  ｇｅｎｅｓ  ｃｏｏｐｅｒａｔｅ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  ３２８，  １５６６−１５６９．
Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，  Ｒ．Ｍ．，  Ｒａｏ，  Ｄ．Ｓ．，  Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，  Ａ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｄ．  （２０１０）．  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０，  １１１−１２２．
Ｐｏｒｒｅｌｌｏ，  Ｅ．Ｒ．，  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｂ．Ａ．，  Ａｕｒｏｒａ，  Ａ．Ｂ．，  Ｓｉｍｐｓｏｎ，  Ｅ．，  Ｎａｍ，  Ｙ．Ｊ．，  Ｍａｔｋｏｖｉｃｈ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｄｏｒｎ，  Ｇ．Ｗ．，  ２ｎｄ，  ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，  Ｅ．Ｎ．  （２０１１）．  ＭｉＲ−１５  ｆａｍｉｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ａｒｒｅｓｔ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０９，  ６７０−６７９．
Ｒａｏ，  Ｐ．Ｋ．，  Ｔｏｙａｍａ，  Ｙ．，  Ｃｈｉａｎｇ，  Ｈ．Ｒ．，  Ｇｕｐｔａ，  Ｓ．，  Ｂａｕｅｒ，  Ｍ．，  Ｍｅｄｖｉｄ，  Ｒ．，  Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ，  Ｆ．，  Ｌｉａｏ，  Ｒ．，  Ｋｒｉｅｇｅｒ，  Ｍ．，  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）．  Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ  ａｎｄ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０５，  ５８５−５９４．
Ｓｅｎｙｏ，  Ｓ．Ｅ．，  Ｓｔｅｉｎｈａｕｓｅｒ，  Ｍ．Ｌ．，  Ｐｉｚｚｉｍｅｎｔｉ，  Ｃ．Ｌ．，  Ｙａｎｇ，  Ｖ．Ｋ．，  Ｃａｉ，  Ｌ．，  Ｗａｎｇ，  Ｍ．，  Ｗｕ，  Ｔ．Ｄ．，  Ｇｕｅｒｑｕｉｎ−Ｋｅｒｎ，  Ｊ．Ｌ．，  Ｌｅｃｈｅｎｅ，  Ｃ．Ｐ．，  Ｌｅｅ，  Ｒ．Ｔ．  ２０１２．  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｈｅａｒｔ  ｒｅｎｅｗａｌ  ｂｙ  ｐｒｅ−ｅｘｉｓｔｉｎｇ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ
Ｓｍａｌｌ，  Ｅ．Ｍ．，  Ｆｒｏｓｔ，  Ｒ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，  Ｅ．Ｎ．  （２０１０）．  ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｄｄ  ａ  ｎｅｗ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｔｏ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２１，  １０２２−１０３２．
Ｓｍａｌｌ，  Ｅ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，  Ｅ．Ｎ．  Ｐｅｒｖａｓｉｖｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４６９，  ３３６−３４２．
Ｔｈｕｍ，  Ｔ．，  Ｇａｌｕｐｐｏ，  Ｐ．，  Ｗｏｌｆ，  Ｃ．，  Ｆｉｅｄｌｅｒ，  Ｊ．，  Ｋｎｅｉｔｚ，  Ｓ．，  ｖａｎ  Ｌａａｋｅ，  Ｌ．Ｗ．，  Ｄｏｅｖｅｎｄａｎｓ，  Ｐ．Ａ．，  Ｍｕｍｍｅｒｙ，  Ｃ．Ｌ．，  Ｂｏｒｌａｋ，  Ｊ．，  Ｈａｖｅｒｉｃｈ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）．  ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｒｔ：  ａ  ｃｌｕｅ  ｔｏ  ｆｅｔａｌ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１６，  ２５８−２６７．
Ｔｈｕｍ，  Ｔ．，  Ｇｒｏｓｓ，  Ｃ．，  Ｆｉｅｄｌｅｒ，  Ｊ．，  Ｆｉｓｃｈｅｒ，  Ｔ．，  Ｋｉｓｓｌｅｒ，  Ｓ．，  Ｂｕｓｓｅｎ，  Ｍ．，  Ｇａｌｕｐｐｏ，  Ｐ．，  Ｊｕｓｔ，  Ｓ．，  Ｒｏｔｔｂａｕｅｒ，  Ｗ．，  Ｆｒａｎｔｚ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）．  ＭｉｃｒｏＲＮＡ−２１  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４５６，  ９８０−９８４．
Ｕｍｂａｃｈ，  Ｊ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｅｎ，  Ｂ．Ｒ．  （２００９）．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＲＮＡｉ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２３，  １１５１−１１６４．
ｖａｎ  Ａｍｅｒｏｎｇｅｎ，  Ｍ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｅｎｇｅｌ，  Ｆ．Ｂ．  （２００８）．  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２，  ２２３３−２２４４．
ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，  Ｅ．Ｎ．  （２００７）．  ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ：  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｎｅｗ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｖｏｃａｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１７，  ２３６９−２３７６．
ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ，  Ｅ．，  Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，  Ｌ．Ｂ．，  Ｌｉｕ，  Ｎ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ａ．Ｈ．，  ＭｃＡｎａｌｌｙ，  Ｊ．，  Ｇｅｒａｒｄ，  Ｒ．Ｄ．，  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ｊ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，  Ｅ．Ｎ．  （２００６）．  Ａ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ｓｔｒｅｓｓ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｅｖｏｋｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ａｎｄ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０３，  １８２５５−１８２６０．
ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ，  Ｅ．，  Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，  Ｌ．Ｂ．，  Ｑｉ，  Ｘ．，  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ｊ．Ａ．，  Ｈｉｌｌ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，  Ｅ．Ｎ．  （２００７）．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓｔｒｅｓｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃａｒｄｉａｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  ３１６，  ５７５−５７９．
ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ，  Ｅ．，  Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，  Ｌ．Ｂ．，  Ｔｈａｔｃｈｅｒ，  Ｊ．Ｅ．，  ＤｉＭａｉｏ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｎａｓｅｅｍ，  Ｒ．Ｈ．，  Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ｗ．Ｓ．，  Ｈｉｌｌ，  Ｊ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，  Ｅ．Ｎ．  （２００８）．  Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｉＲ−２９  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０５，  １３０２７−１３０３２．
Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ａ．Ｈ．，  Ｌｉｕ，  Ｎ．，  ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，  Ｅ．Ｎ．  （２００９）．  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍｕｓｃｌｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１，  ４６１−４６９．
Ｘｉａｏ，  Ｌ．，  Ｐｉｍｅｎｔａｌ，  Ｄ．Ｒ．，  Ａｍｉｎ，  Ｊ．Ｋ．，  Ｓｉｎｇｈ，  Ｋ．，  Ｓａｗｙｅｒ，  Ｄ．Ｂ．，  Ｃｏｌｕｃｃｉ，  Ｗ．Ｓ．  ２００１．  ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａｌｐｈａ１−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ３３，  ７７９−８７．
Ｙａｎｇ，  Ｂ．，  Ｌｉｎ，  Ｈ．，  Ｘｉａｏ，  Ｊ．，  Ｌｕ，  Ｙ．，  Ｌｕｏ，  Ｘ．，  Ｌｉ，  Ｂ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．，  Ｘｕ，  Ｃ．，  Ｂａｉ，  Ｙ．，  Ｗａｎｇ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）．  Ｔｈｅ  ｍｕｓｃｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｍｉＲ−１  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ａｒｒｈｙｔｈｍｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＧＪＡ１  ａｎｄ  ＫＣＮＪ２．  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３，  ４８６−４９１．
Ｚｅｎｔｉｌｉｎ，  Ｌ．，  Ｍａｒｃｅｌｌｏ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｇｉａｃｃａ，  Ｍ．  （２００１）．  Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｂｒｅａｋ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５，  １２２７９−１２２８７．
Ｚｈａｏ，  Ｙ．，  Ｓａｍａｌ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，  Ｄ．  （２００５）．  Ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ａ  ｍｕｓｃｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｔｈａｔ  ｔａｒｇｅｔｓ  Ｈａｎｄ２  ｄｕｒｉｎｇ  ｃａｒｄｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４３６，  ２１４−２２０．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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