(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子の分別及び計量分配を行う方法であって、
流体に囲まれた微粒子をフロースイッチ内へ通すステップであって、前記フロースイッチは、前記微粒子を囲む前記流体を第１の流量で前記フロースイッチ内へ通すように構成された第１の流路と結合されたサンプル入口と、前記フロースイッチ内の前記微粒子を囲む前記流体の流量を第２の流量まで増やすように構成された第２の流路と結合されたフラッシュ入口と、廃棄物出口流路と結合された廃棄物出口と、サンプル出口流路と結合されたサンプル出口と、前記第１の流路、前記第２の流路、前記廃棄物出口流路、及び前記サンプル出口流路の全てが集まる集中領域と、を備える、前記ステップと、
前記微粒子が所定の特性を有していて前記フロースイッチ内に存在する場合に、前記微粒子を囲む前記流体の流量を前記第１の流量から前記第２の流量に変化させるステップと、
前記微粒子を囲む前記流体がほぼ前記第１の流量で前記フロースイッチ内を移動している場合に、前記フロースイッチを通じて前記微粒子を前記廃棄物出口流路内へ通すステップ、又は、
前記微粒子を囲む前記流体がほぼ前記第２の流量で前記フロースイッチ内を移動している場合に、前記フロースイッチを通じて前記微粒子を前記サンプル出口流路内へ通し、前記微粒子を液滴として前記サンプル出口流路から外に計量分配するステップと、を含み、
前記廃棄物出口流路内の流体静圧が前記サンプル出口流路内の流体静圧より低い、
方法。
【請求項２】
前記廃棄物出口流路及び前記サンプル出口流路は両方とも開いている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記廃棄物出口流路に沿って廃棄物容器まで流れる流体流に対する抵抗は、前記サンプル出口流路に沿ってサンプル容器まで流れる流体流に対する抵抗より高い、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記微粒子が前記所定の特性を有することを検出するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記微粒子を囲む前記流体の流量を変化させる前記ステップは、前記微粒子を囲む流体を追加するか減じるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記微粒子は細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記微粒子が前記所定の特性を有することを検出するステップを更に含み、前記所定の特性は、形状、サイズ、及び蛍光強度のうちの１つ以上から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記微粒子を囲む前記流体を所定の圧力又は所定の範囲の圧力まで加圧するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
流体が前記フロースイッチに入る前に前記流体の脱気を行うステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
微粒子の分別及び計量分配を行う方法であって、
流体に囲まれた微粒子を、第１の流量で、第１の流路からフロースイッチ内へ通すステップであって、前記フロースイッチは、前記微粒子を囲む前記流体を第１の流量で前記フロースイッチ内へ通すように構成された前記第１の流路と結合されたサンプル入口と、前記フロースイッチ内の前記微粒子を囲む前記流体の流量を第２の流量まで増やすように構成された第２の流路と結合されたフラッシュ入口と、廃棄物出口流路と結合された廃棄物出口と、サンプル出口流路と結合されたサンプル出口と、前記第１の流路、前記第２の流路、前記廃棄物出口流路、及び前記サンプル出口流路の全てが集まる集中領域と、を備える、前記ステップと、
前記微粒子が所定の特性を有していて前記フロースイッチ内に存在する場合に、前記第１の流量より速い流量で移動する流体を、前記微粒子を囲む前記流体に追加することにより、前記微粒子を囲む前記流体の流量を前記第２の流量まで増やすステップと、
前記微粒子を囲む前記流体がほぼ前記第１の流量で前記フロースイッチ内を移動している場合に、前記フロースイッチを通じて前記微粒子を前記廃棄物出口流路内へ通すステップ、又は、
前記微粒子を囲む前記流体がほぼ前記第２の流量で前記フロースイッチ内を移動している場合に、前記フロースイッチを通じて前記微粒子を前記サンプル出口流路内へ通し、前記微粒子を液滴として前記サンプル出口流路から外に計量分配するステップと、を含み、
前記廃棄物出口流路内の流体静圧が前記サンプル出口流路内の流体静圧より低く、更に、前記廃棄物出口流路に沿って廃棄物容器まで流れる流体流に対する抵抗は、前記サンプル出口流路に沿ってサンプル容器まで流れる流体流に対する抵抗より高い、
方法。
【請求項１１】
流体を追加する前記ステップは、第２の流路を通って前記フロースイッチに入る流れを制御する弁を開くステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記微粒子は細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプル流体内で前記所定の特性を有する前記微粒子を検出するステップを更に含み、前記所定の特性は、細胞形状、細胞サイズ、及び蛍光強度のうちの１つ以上から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプル流体を前記第１の流路から前記フロースイッチ内へ通す前記ステップは、サンプル流体の連続ストリームを前記フロースイッチ内へ通すステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプル流体を所定の圧力又は所定の範囲の圧力まで加圧するステップを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
流体が前記フロースイッチに入る前に前記流体の脱気を行うステップを更に含み、前記流体は、前記サンプル流体、前記追加流体、又は、前記サンプル流体及び前記追加流体の両方である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
フロースイッチを含む、微粒子の分別及び計量分配を行う装置であって、
微粒子を囲む流体を、第１の流量で前記フロースイッチ内へ通すように構成された第１の流路と、
第２の流路を調整する弁であって、前記第２の流路は、前記フロースイッチ内の、前記微粒子を囲む前記流体の流量を第２の流量まで増やすように構成されている、前記弁と、
前記フロースイッチ内の廃棄物出口流路と、
液滴を計量分配するように構成された、前記フロースイッチ内のサンプル出口流路と、を備え、
前記フロースイッチの前記廃棄物出口流路及び前記サンプル出口流路は、前記廃棄物出口流路内の流体静圧が前記サンプル出口流路内の流体静圧より低くなるように構成されており、更に、前記サンプル流体が前記フロースイッチ内を移動して前記サンプル出口流路に入る場合に、前記廃棄物出口流路に沿って廃棄物容器まで流れる流体流に対する抵抗が、前記サンプル出口流路に沿ってサンプル容器まで流れる流体流に対する抵抗より高く、
前記フロースイッチは、前記第１の流路と結合されたサンプル入口と、前記第２の流路と結合されたフラッシュ入口と、前記廃棄物出口流路と結合された廃棄物出口と、前記サンプル出口流路と結合されたサンプル出口と、前記第１の流路、前記第２の流路、前記廃棄物出口流路、及び前記サンプル出口流路の全てが集まる集中領域と、を備える、
装置。
【請求項１８】
前記フロースイッチに入る流体から溶解空気を除去するように構成された脱気装置を更に備える、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
流体が前記第１の流路に入る前に前記流体を加圧するように構成された空気ポンプを更に備える、請求項１７に記載の装置。
【請求項２０】
前記第１の流路、前記第２の流路、又は、前記第１及び第２の流路の両方の中の圧力を調整するように構成された圧力調整器を更に備える、請求項１７に記載の装置。
【請求項２１】
前記微粒子を検出するように構成された画像化モジュールを更に備える、請求項１７に記載の装置。
【請求項２２】
前記微粒子が前記フロースイッチ内にある場合に、前記弁を起動し、前記フロースイッチ内の、前記微粒子を囲む前記流体の流量を増やすように構成された制御装置を更に備える、請求項１７に記載の装置。
【請求項２３】
前記第２の流路の直径は、前記第１の流路の直径より大きい、請求項１７に記載の装置。
【請求項２４】
微粒子の分別及び計量分配を行う装置であって、
第１の入口流路と、第２の入口流路と、廃棄物出口流路と、サンプル出口流路と、を備えるフロースイッチであって、前記第１の流路と結合されたサンプル入口と、前記第２の流路と結合されたフラッシュ入口と、前記廃棄物出口流路と結合された廃棄物出口と、前記サンプル出口流路と結合されたサンプル出口と、前記第１の流路、前記第２の流路、前記廃棄物出口流路、及び前記サンプル出口流路の全てが集まる集中領域と、を備え、前記サンプル出口流路は液滴を計量分配するように構成された、前記フロースイッチと、
前記第１の入口流路に入る第１の流路であって、微粒子を含むサンプル流体を第１の流量で通すように構成された前記第１の流路と、
前記第２の入口流路に入る第２の流路を調整する弁であって、前記第２の流路は、前記微粒子を囲む前記流体に追加流体を追加することにより、前記微粒子を囲む前記流体の流量を第２の流量まで増やすように構成されている、前記弁と、を備え、
前記フロースイッチの前記廃棄物出口流路及び前記サンプル出口流路は、前記廃棄物出口流路内の流体静圧が前記サンプル出口流路内の流体静圧より低くなるように構成されており、更に、前記廃棄物出口流路に沿って廃棄物容器まで流れる流体流に対する抵抗が、前記サンプル出口流路に沿ってサンプル容器まで流れる流体流に対する抵抗より高い為、前記サンプル流体の流量が前記第１の流量である場合に前記サンプル流体は前記廃棄物出口流路に入り、前記サンプル流体の流量が前記第２の流量である場合に前記サンプル流体は前記サンプル出口流路に入り、液滴として計量分配され、
前記微粒子を検出するように構成された画像化モジュールと、
前記弁を起動し、前記微粒子を囲む前記流体の流量を増やすように構成された制御装置と、
を備える装置。
【請求項２５】
前記フロースイッチに入る流体から溶解空気を除去するように構成された脱気装置を更に備える、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
流体が前記第１の流路に入る前に前記流体を加圧するように構成された空気ポンプを更に備える、請求項２４に記載の装置。
【請求項２７】
前記第１の流路の中の圧力を調整するように構成された圧力調整器を更に備える、請求項２４に記載の装置。
【請求項２８】
前記第２の流路の直径は、前記第１の流路の直径より大きい、請求項２４に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
なし。
【０００２】
文献の引用
本明細書中において言及される全ての刊行物及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物又は特許出願が参照により具体的且つ個別に示されて組み込まれる場合と同程度に、参照により全内容が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本明細書に記載されているのは、単一細胞などの微粒子を自動的に分別して計量分配する装置（機器及びシステム）及び方法である。これらの技術は、特に、生物学や医学の用途において有用となりうる。
【背景技術】
【０００４】
様々なタイプの細胞及び他の同様の小粒子を区別する為に、フローサイトメトリが用いられている。従来のフローサイトメータは、一般に、光学的に透明なフローセルを含み、このフローセルは、通常は石英から作られ、個別識別対象の細胞ストリームがフローセルの中央流路内を流される。フローセル流路内を通る細胞ストリームの動きは、細胞ストリームを同心円状に囲み、細胞ストリームがフローセル流路を通る際に一緒に流れる無細胞系シース液によって、フローセル流路の中央長手軸まで流体同伴される。各細胞は、フローセル流路の細胞状況照会ゾーンを通過する際に、集束放射ビーム（例えば、レーザ）を照射される。レーザビームは、各細胞に当たるとすぐに、その細胞の形態構造、密度、屈折率、及びサイズの特徴を示すパターンで散乱する。更に、レーザビームのスペクトル特性が、選択された細胞に関連する特定の蛍光色素を励起するように働く場合があり、これは、細胞のＤＮＡが既にそのような蛍光色素で染色されている場合、又は、蛍光色素の分子が、選択されたタイプの細胞と直接又は中間物を介して結合している場合が該当する可能性がある。光学的フローセルの周囲に戦略的に配置された光検出器が、各細胞によって散乱した光と、励起された蛍光色素から放出された蛍光と、を電気信号に変換するように働き、これらの電気信号は、適切に処理されると、照射された細胞を識別するように働く。各細胞に対して行われる散乱光及び蛍光の測定に加えて、幾つかのフローサイトメータが、各細胞がフローセルを通過する際に各細胞の特定の物理的特性及び／又は電気的特性を測定することにより、各細胞を更に特徴づける。これらの細胞を分別することにより、既に光学的フローセルを通過して識別された細胞から特定の関心対象細胞（例えば、異常細胞）を選択的に取り出して収集することが可能である。様々な分別技術が開発されており、これには、１つ又は少数の細胞を含む液滴を形成して偏向させることを必要とする方法が含まれる。
【０００５】
例えば、細胞分別コンポーネントは、フローセルから出る、細胞を同伴するシース液から液滴ストリームが発生するようにフローセルを振動させるように働く圧電素子を含んでよい。理想的には、各液滴は、そのような細胞に関して行われたばかりの散乱光及び蛍光の測定により、細胞タイプに関して特徴づけされた１つの細胞だけを含む。その後、液滴ストリーム内の各液滴が、帯電したプレートのペアの間を通る際に静電的に帯電し、帯電した各液滴は、静電的に帯電した偏向プレートのペアの間を通る際に収集容器に向かって選択的に偏向され（又は偏向されず）、そのようなプレートは、関心対象の液滴（及び細胞）を偏向させるタイミングにおいてのみ、液滴を偏向させる極性に帯電する。この、偏向プレートの瞬時極性は、光学的フローセルからの細胞測定信号を処理する細胞特徴づけ処理装置によって決定される。
【０００６】
細胞などの微粒子をこのように分別することは、生物学研究や医療の用途において非常に重要である。最初の細胞分別装置の１つは、マック・フルウィラー（Ｍａｃｋ  Ｆｕｌｗｙｌｅｒ）によって発明された（例えば、米国特許第３，７１０，９３３号）。彼の発明では、非常に小さい液滴が静電気力によって分別された。ほとんどの市販の細胞分別機が依然としてこの技術に基づいているが、他の細胞分別方法も発明されている。細胞の分別は、細胞ストリームの物理的偏向によって可能であり、例えば、ガスインパルスを使用して（例えば、米国特許第４，１７５，６６２号、米国特許出願公開第２０１１／００３０８０８号）、又は圧電ビームによって引き起こされるインパルス状油圧力によって（米国特許第７，３９２，９０８号）、又は磁歪ゲートによって（米国特許第７，１６０，７３０号）、細胞ストリームを所望の流路まで偏向させることにより可能である。細胞の分別は又、光学力によって（米国特許第８，４２６，２０９号、同第７，７４５，２２１号、同第７，４２８，９７１号、米国特許出願公開第２００８／０１３８０１０号）、又は音響力によって（米国特許第８，３８７，８０３号、米国特許出願公開第２０１３／０１９２９５８号、同第２０１２／０１６０７４６号）、又は磁力によって（米国特許第８，０７１，０５４号、同第７，８０７，４５４号、同第６，１２０，７３５号、同第５，９６８，８２０号、同第５，８３７，２００号）、又は誘電泳動力によって（米国特許第８，４５４，８１３号、同第７，４２５，２５３号、同第５，４８９，５０６号、米国特許出願公開第２０１２／０１０３８１７号）、微細加工流路内で単一細胞を操作することによって可能である。これらの方法は全て、典型的には、複雑な流体系と高度な電気制御系を必要とする為、これによる細胞分別装置は、製造コストが高く、且つ、使いにくい。
【０００７】
更に、既知の細胞分別機構の大多数は、種々雑多な細胞を２つ以上の個体群に分別することに重点が置かれている。米国特許第３，７１０，９３３号に記載された、静電気力による液滴分別は、分別された個体細胞を所定の場所までリアルタイムで送達する為の好ましい機構である。残念なことに、液滴分別は、典型的には、分別された個体細胞を比較的広い場所（例えば、直径が５ｍｍを超える場所）に送達することに限定されており、直径が５ｍｍ未満の場所については、液滴が、典型的には、毎秒１ｍを超える速度で移動することから、送達精度が非常に低くなり、（例えば、静電気力により）液滴を直径５ｍｍ未満の場所に正確に送達することは非常に困難であり、特に液滴の速度が一定でない場合には困難である。例えば、ＢＤ  ＡＲＩＡ  ＩＩＩなどの現在入手可能な液滴細胞分別機は、個体細胞を９６ウェル細胞培養プレートに直接分別することが可能であり、この場合、各ウェルの面積は直径が約６．５ｍｍであり、精度は７０％である。しかしながら、直径が約３ｍｍの３８４ウェル細胞培養プレートに個体細胞を分別することは実用的ではない。
【０００８】
これに対し、少量の液体を正確な場所に送達することについては、市販技術が複数存在する。例えば、ＦＬＥＸＤＲＯＰ（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））は、少量の液体を、直径が１ｍｍ未満である面積の場所に正確に送達することが可能な液体計量分配装置である。残念なことに、そのような液体計量分配装置は、細胞を分別することができない。
【０００９】
従って、上述の問題に対処できる微粒子分別機を提供することが有益であろう。具体的には、微粒子（例えば、液体懸濁液中の個体細胞又は小細胞群）を分別し、これらを少量の液体として小径ウェルに送達することを自動的に行うことが可能な方法及び装置を提供することが有益であろう。本明細書に記載されているのは、微粒子の分別を容易に、低コストで、効率的に行うことが可能な装置及び方法である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、背景技術の課題を解決するためのものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
概して、本明細書に記載されているのは、微粒子を分別する装置（例えば、システム及び機器）及び方法であって、単一細胞又は小細胞群などの個々の微粒子を分別して微小な場所に計量分配することを効率的に、且つ高精度で行う装置及び方法である。これらの方法及び装置は、複雑な流体系及び制御系を必要としない。具体的には、本明細書に記載されているのは、微粒子の流量及び／又は微粒子を囲む流体の流量に基づいて微粒子の差動分別を行う為に使用可能なフロースイッチである。これらのフロースイッチは、フロースイッチ内を流れる流体の方向づけを、流体の流量に基づいて差動的に行う。更に、これらのフロースイッチは、所定の特性を有する微粒子がフロースイッチ内にあるタイミングを特定することが可能であって、微粒子を分別する為に、微粒子を運ぶ流体の流量を増減することが可能である識別及び制御モジュールとの組み合わせで使用されてよい。本明細書においては、フロースイッチは、フロースイッチを通過する際の物質の流量に基づいて、フロースイッチからの２つ（以上）の出力の間で物質を分別するスイッチである。具体的には、本明細書に記載のフロースイッチは、各出力を通る流れに対する抵抗の差、並びに、各出力とフロースイッチとの間のインタフェース（例えば、フロースイッチの集中領域）における異なる流体静圧に基づいて、差動流れ分別を達成することが可能である。
【００１２】
フロースイッチは、典型的には、フロースイッチの集中（例えば、交差）領域から出る別々の出口流路（例えば、廃棄物出口流路及びサンプル出口流路）につながれた少なくとも２つの出口を使用することによって動作し、これらの別々の出口流路は、異なる流れ抵抗を有し、各出口流路は流体静圧が異なる。変形形態によっては、低流量（例えば、低いほうの閾値より低い流量）では、フロースイッチからの流れは第１の出口流路を通り、高流量（例えば、高いほうの閾値より高い流量）では、フロースイッチからの流れは第２の出口流路を通る。具体的には、第１の（例えば、「低流量の」）出口流路の流体静圧が第２の（例えば、「高流量の」）出口流路の流体静圧より低くてよく、第１の出口流路に沿って第１の容器まで流れる流体流に対する抵抗が、第２の出口流路に沿って第２の容器まで流れる流体流に対する抵抗より高くてよい。従って、分別は、物質（例えば、流体に囲まれた微粒子）が第１の出力から第２の出力に切り替えられるようにフロースイッチ内の流体の流量を変化させることによって達成可能である。
【００１３】
本明細書に記載の流体装置はいずれも、細胞の分別と細胞の計量分配とを同時に達成する為に、マイクロ流体構造とマクロ流体構造の両方を含んでよい。例えば、流れ抵抗及び／又は流体静圧、並びに、フロースイッチ内での流体の流量は、マイクロ流体構造又はマクロ流体構造によって操作可能である。
【００１４】
更に、本明細書に記載の装置はいずれも、フロースイッチ内の流体に関して、流量の混乱を阻止する機能（例えば、意図的でない、又は制御されていない流量変化、例えば、乱流を防ぐ機能）を含んでよい。又、これらのシステムはいずれも、気泡の除去又は気泡の形成の阻止の為の脱気装置を含んでよい。更に、フロースイッチを通る各流路は、乱流を防ぐか抑えるように構成されてよい。
【００１５】
フロースイッチに入る流体、及びフロースイッチ内の流体の流量は、制御可能である。記載の装置のいずれにおいても、流量は、流体を加圧することによって引き起こされてよい。従って、これらの装置、並びにそれらを使用する方法は、いずれも、システム及び／又は真空を加圧するポンプ（例えば、空気ポンプ）、及び／又は圧力センサを動作させて圧力を調整することを含んでよい。
【００１６】
フロースイッチに入る流体、又はフロースイッチ内の流体の流量は、動作中に何らかの適切な方法で変更可能である。例えば、流体の流量は、フロースイッチに入る流体、又はフロースイッチ内の流体のストリームに作用する駆動力を増減することによって変更されてよく、これは、例えば、圧力を変更することによって、且つ／又は、（本明細書ではサンプル流体と称されている場合が多く、微粒子を含む）流体ストリームに流体を追加することによって行われてよく、追加される流体は、異なる流量（例えば、より速いか、より遅い流量）で流れてよい。他の変形形態では、フロースイッチ内のサンプル流体、又はフロースイッチに入る前のサンプル流体の流量は、流体が移動している流路の形状を変化させる（例えば、絞る／広げる）ことによって変更可能である。
【００１７】
本明細書に記載の装置は、動作の為の呼び水又は準備が可能であるように構成されてもよい。例えば、システムの呼び水の間のマイクロ流体構造内の液体流量が低いことは、マイクロ流体構造内の流れを逆にすることにより、且つ、流れ抵抗が液体より格段に低い空気で埋め戻すことにより、克服可能である。
【００１８】
本明細書に記載の装置は、いずれも、所定の特性（例えば、サイズ、形状、蛍光、又は他のマーカ等）を有する微粒子を識別する為に、デジタルカメラと結合された顕微鏡レンズによる可視化を含んでよい。本明細書に記載の装置は、いずれも、微粒子から放出される蛍光を測定する光学式光収集システムを含んでよい。
【００１９】
本明細書に記載の微粒子分別方法は、いずれも、流体の流量、及び／又は、流れの方向づけを流量に基づいて差動的に行うフロースイッチ内の流量を変更するステップを含んでよい。例えば、微粒子を分別する方法が、サンプル流体を第１の流量でフロースイッチ内へ通すステップと、所定の特性を有する微粒子がフロースイッチ内に存在する場合にサンプル流体の流量を第２の流量に変化させるステップと、サンプル流体がほぼ第１の流量でフロースイッチ内を移動している場合に、フロースイッチ内を流れるサンプル流体を廃棄物出口流路内へ通すステップと、サンプル流体がほぼ第２の流量でフロースイッチ内を移動している場合に、フロースイッチ内を流れるサンプル流体をサンプル出口流路内へ通すステップと、を含んでよい。フロースイッチは、フロースイッチを通る流れの方向づけを、サンプル出口流路と廃棄物出口流路との間で、サンプル流体の流量に基づいて差動的に行うことが可能であり、これは、サンプル出口流路及び廃棄物出口流路が、差動的な流体特性、例えば、異なる流体静圧や異なる流れ抵抗を有しうることによる。例えば、廃棄物出口流路内の流体静圧は、サンプル出口流路内の流体静圧より低くてよく、廃棄物出口流路に沿って（例えば、廃棄物出口流路及びその他の全ての廃棄物流路を含む）廃棄物容器まで流れる流体流に対する抵抗は、サンプル出口流路に沿って（例えば、サンプル出口流路及びその他の全てのサンプル流路を含む）サンプル容器まで流れる流体流に対する抵抗より高くてよい。これらの例のいずれにおいても、廃棄物出口流路とサンプル出口流路は入れ替えられてよい（例えば、サンプル出口流路内の流体静圧が廃棄物出口流路内の流体静圧より低くてよく、サンプル出口流路に沿って流れる流体流に対する抵抗が、廃棄物出口流路に沿って流れる流体流に対する抵抗より高くてよい）。
【００２０】
本方法及び本装置は、いずれも、サンプル流体中の、所定の特性を有する微粒子を検出するように構成されてよく、更に、微粒子がフロースイッチ内に入る際に、微粒子を囲む流体の流量を変化させてよい。概して、任意の適切な、流量を変化させる方法又は装置が使用されてよい。例えば、流量を変化させるステップは、流体にエネルギを追加すること、流体に１つ以上の作用物質（例えば、粘度改良剤）を加えること、又は流量を機械的に増減することにより、流体の流量を加速又は減速するステップを含んでよい。具体的には、サンプル流体の流量を変化させるステップは、流れている流体に追加流体を加えるステップ、例えば、第２の流路からフロースイッチ内に追加流体を加えて、フロースイッチ内の流体の流量を増やすステップを含んでよい。
【００２１】
例えば、微粒子を分別する方法が、流体に囲まれた微粒子をフロースイッチ内へ通すステップと、微粒子が所定の特性を有していてフロースイッチ内に存在する場合に、微粒子を囲む流体の流量を第１の流量から第２の流量に変化させるステップと、微粒子を囲む流体がほぼ第１の流量でフロースイッチ内を移動している場合に、フロースイッチを通じて微粒子を廃棄物出口流路内へ通すステップ、又は、微粒子を囲む流体がほぼ第２の流量でフロースイッチ内を移動している場合に、フロースイッチを通じて微粒子をサンプル出口流路内へ通すステップと、を含んでよい。廃棄物出口流路内の流体静圧がサンプル出口流路内の流体静圧より低い場合、且つ／又は、廃棄物出口流路に沿って流れる流体流に対する抵抗が、サンプル出口流路に沿って流れる流体流に対する抵抗より高い場合（例えば、微粒子がフロースイッチ内を移動してサンプル流路に入る場合）に、微粒子が流動分別されることが可能になる。
【００２２】
本明細書に記載の方法は、いずれも、微粒子が所定の特性を有することを検出するステップを含んでよい。一般に、微粒子は細胞であってよい（或いは、変形形態によっては細胞のクラスタであってよい）。微粒子を囲む流体の流量を増減し、それによって粒子を分別する装置によって、又はそのような方法の一部として、任意の適切な（例えば、視認検出可能であることを含めて検出可能な）所定の特性が用いられてよい。例えば、所定の特性は、形状、サイズ、及び蛍光強度のうちの１つ以上から選択されてよい。
【００２３】
（微粒子を囲む流体を含み、サンプル流体と称されてよい）流体の流量は、フロースイッチに送られる流体を加圧することによって設定されてよい。従って、分別方法は、微粒子を囲む流体を、所定の圧力又は所定の範囲の圧力まで加圧するステップを含んでよい。
【００２４】
別の例では、微粒子を分別する方法が、流体に囲まれた微粒子を、第１の流量で、第１の流路からフロースイッチ内へ通すステップと、微粒子が所定の特性を有していてフロースイッチ内に存在する場合に、微粒子を囲む流体に流体を追加することにより、微粒子を囲む流体の流量を第２の流量まで増やすステップと、微粒子を囲む流体がほぼ第１の流量でフロースイッチ内を移動している場合に、フロースイッチを通じて微粒子を廃棄物出口流路内へ通すステップ、又は、微粒子を囲む流体がほぼ第２の流量でフロースイッチ内を移動している場合に、フロースイッチを通じて微粒子をサンプル出口流路内へ通すステップと、を含んでよく、廃棄物出口流路内の流体静圧は、サンプル出口流路内の流体静圧より低く、更に、廃棄物出口流路に沿って廃棄物容器まで流れる流体流に対する抵抗は、微粒子がフロースイッチ内を通ってサンプル出口流路に入りサンプル容器（例えば、マルチウェルプレート、培養皿等）まで移動する場合にサンプル出口流路に沿って流れる流体流に対する抵抗より高い。上述のように、流体を追加するステップは、第２の流路を通ってフロースイッチに入る流れを制御する弁を開くステップを含んでよい。
【００２５】
これらの方法は、いずれも、サンプル流体中の、所定の特性を有する微粒子を検出するステップを含んでよい（例えば、所定の特性は、細胞形状、細胞サイズ、及び蛍光強度のうちの１つ以上から選択されてよい）。検出が行われるのは、（例えば、微粒子のソースからフロースイッチ内へ開いている第１の流路において）微粒子がフロースイッチに入る際又は入る前であってよい。例えば、検出器が、センサ及び／又はカメラ、並びに画像を拡大する１つ以上のレンズ（顕微鏡対物レンズ）と、センサ／カメラから取得された画像を評価して、フロースイッチ内の、又はフロースイッチに入ろうとしている微粒子（例えば、細胞）が視野内にあるかどうかを判定する検出ソフトウェアと、を含んでよい。
【００２６】
本明細書に記載の、微粒子を分別する方法及び装置は、連続流式と称されてもよく、これは、偏向／分別される液滴を形成するのではなく、微粒子を含む流体ストリームが、フロースイッチ内で連続的に保持されてよい為である。これにより、微粒子及び微粒子を囲む流体がフロースイッチの流体出口から標的（例えば、マルチウェルプレート）に置かれる際に、分別された物質の（例えば、９６ウェルプレート等への）より高精度の位置決めが可能であってよい。
【００２７】
本明細書では、微粒子分別装置についても記載されている。装置は、機器又はシステムであってよい。本明細書に記載の微粒子分別装置は、いずれも、典型的には、１つ以上の入力（例えば、フロースイッチに入る流管路）と、２つ以上の出力（例えば、フロースイッチから出る流管路）と、を含むフロースイッチを含んでよい。少なくとも１つの入力及び全出力の全てが、フロースイッチ内の交差領域において交差してよい。
【００２８】
例えば、微粒子分別装置が、フロースイッチと、微粒子を囲む流体を、第１の流量でフロースイッチ内へ通すように構成された第１の流路と、第２の流路を調整する弁であって、第２の流路は、フロースイッチ内の、微粒子を囲む流体の流量を第２の流量まで増やすように構成されている、弁と、フロースイッチから出る廃棄物出口流路と、フロースイッチから出るサンプル出口流路と、を含んでよく、廃棄物出口流路、サンプル出口流路、及びフロースイッチは、廃棄物出口流路内の流体静圧がサンプル出口流路内の流体静圧より低くなるように構成されており、更に、廃棄物出口流路に沿って（廃棄物容器まで）流れる流体流に対する抵抗が、微粒子がフロースイッチ内を移動してサンプル出口流路に入る場合に、サンプル出口流路に沿って（サンプル容器まで）流れる流体流に対する抵抗より高い。これらの微粒子分別装置は、いずれも、フロースイッチに入る流体から気体（例えば、溶解空気）を除去するか、且つ／又は、他の方法でフロースイッチまたは接続されている流体管路における気泡の発生を防ぐように構成された脱気装置を含んでもよい。
【００２９】
上述のように、本装置内の流体流路（管路）は、いずれも、流体の流れを駆動する為に加圧されてよい。例えば、本装置は、流体が第１の流路に入る前に流体を加圧するように構成された空気ポンプを含んでよい。複数の空気ポンプが使用されてよく、或いは、単一の空気ポンプが複数の管路を加圧してよい。これらの装置は、いずれも、流路内の（例えば、第１の流路、第２の流路、又は、第１及び第２の流路の両方の中の）圧力を調整するように構成された１つ以上の圧力調整器を含んでよい。
【００３０】
上述のように、これらの装置は、いずれも、所定の特性を有する微粒子を検出し、検出された微粒子をフロースイッチによって分別する為に流れの変化をトリガする検出サブシステム（本明細書では画像化モジュールと称されてもよい）を含んでよい。検出サブシステムは、カメラ又は光電子倍増管などのセンサ、及び／又は、カメラ又は光電子倍増管からの情報を処理するように構成された処理装置を含んでよい。このサブシステムは又、１つ以上のレンズ（顕微鏡レンズ）、及び／又は、微粒子を含む可能性がある流体を照らすように構成された光源を含んでよい。概して、検出サブシステム（例えば、画像化モジュール）は、所定の特性を有する微粒子を検出するように構成されてよい。所定の特性が蛍光信号を含む場合、このサブシステムは、蛍光検出システムを含んでよい。
【００３１】
これらの装置は、いずれも、微粒子がフロースイッチ内にある場合に、弁を起動し、フロースイッチ内の、微粒子を囲む流体の流量を増やすように構成された制御装置を含んでよい。制御装置は、微粒子がフロースイッチ（の、例えば、交差領域）内に適正に配置されたと予測されるまで、流量の増加を有効にすることを遅延するように構成されたタイマ（例えば、遅延タイマ）を含んでよい。変形形態によっては、画像化サブシステムは、微粒子の移動速度を特定することが可能であり、従って、本装置は、タイマ遅延の遅延を計算することが可能であり、これは、画像化サブシステムの画像化センサ／カメラ間の距離が既知（並びに固定）であってよい為である。
【００３２】
ソレノイド弁などの、しかるべき弁が使用されてよい。上述のように、弁は、遅延の後に活性化されるように構成されてよい。概して、弁は、（例えば、微粒子の移動速度、及び微粒子の、フロースイッチの交差領域からの距離に基づいて）弁を開くタイミング、並びに弁を開いている時間の長さを決定する制御装置に接続される。
【００３３】
概して、フロースイッチを通る流量は、部分的には流路の形状によって決定されてよい。例えば、変形形態によっては、第２の流路の直径は、第１の流路の直径より大きい。これにより、微粒子を囲む流体と異なる（例えば、より速い）流量で移動する流体の追加を見込むことが可能になり、従って、微粒子を囲む流体の流量の、結果としての変化が、フロースイッチによる微粒子の分別を可能にすることができる。
【００３４】
上述のように、フロースイッチは、フロースイッチの一部を成す１つ以上の入口及び２つ以上の出口、並びに、入口と出口とを結合する交差領域を含んでよい。入口／出口と交差領域との間の部分は、入口／出口流路と称されてよく、例えば、第１の（例えば、サンプル）入口流路、第２の（例えば、フラッシュ）入口流路、第１の（又は廃棄物）出口流路、及び第２の（又はサンプル）出口流路と称されてよい。フロースイッチは、サンプル入口流路と結合されて、微粒子を含むサンプル流体のソースとつながっているサンプル入口と、フラッシュ入口流路と結合されて、フラッシュ流体のソースとつながっているフラッシュ入口と、廃棄物出口流路と結合されて、廃棄物流路（及びその先の廃棄物容器）とつながっている廃棄物出口と、サンプル出口流路と結合されて、分別された微粒子をサンプル容器（例えば、マルチウェルプレート）の標的部分に計量分配するサンプル流路とつながっているサンプル出口と、を含んでよい。
【００３５】
例えば、本明細書に記載されているのは微粒子分別装置であり、この装置は、フロースイッチと、フロースイッチに入る第１の流路であって、微粒子を囲む流体を、第１の流量で通すように構成された第１の流路と、フロースイッチに入る第２の流路を調整する弁であって、第２の流路は、微粒子を囲む流体に追加流体を加えることによって、微粒子を囲む流体の流量を第２の流量まで増やすように構成されている、弁と、フロースイッチから出る廃棄物出口流路と、フロースイッチから出るサンプル出口流路であって、フロースイッチの廃棄物出口流路及びサンプル出口流路は、廃棄物出口流路内の流体静圧がサンプル出口流路内の流体静圧より低くなるように構成されており、更に、廃棄物出口流路に沿って廃棄物容器まで流れる流体流に対する抵抗は、サンプル出口流路に沿ってサンプル容器（例えば、マルチウェルプレート）まで流れる流体流に対する抵抗より高く、それによって、サンプル流体の流量が第１の流量の場合には、サンプル流体は廃棄物出口流路内に通され、サンプル流体の流量が第２の流量の場合には、サンプル流体はサンプル出口流路内に通される、サンプル出口流路と、微粒子を検出するように構成された画像化モジュールと、弁を起動し、フロースイッチ内の、微粒子を囲む流体の流量を増やすように構成された制御装置と、を含む。
【００３６】
本明細書に記載の装置は、いずれも、画像化サブシステムによって微粒子を識別することに適する照明光源を含んでよい。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】微粒子分別装置の一例を示す図である。
【図２】微粒子分別装置の一変形形態を概略的に示す図である。
【図３Ａ】フロースイッチの一実施形態を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ａに示されたようなフロースイッチの断面を示す図である。
【図４】フロースイッチアセンブリの一実施形態を示す図であり、これには、図示されたソース、廃棄物、及び計量分配の各流路（チューブ）が取り付けられている。変形形態によっては、これらの取り付けられた流路は、フロースイッチと一体化されてよい。
【図５】微粒子を分別する流体システムがどのように制御されうるかを示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本明細書に記載されているのは、流体に囲まれた微粒子を分別する装置及び方法であり、これには、検出された微粒子を、微粒子を囲む流体の流量（流速）に基づいて分別するフロースイッチを使用する。
【００３９】
例えば、微粒子を分別する方法が、少なくとも１つの入口と少なくとも２つの出口を含むフロースイッチを使用して流体流路を交互に切り替えるステップを含んでよく、流体流路を交互に切り替えるステップは、フロースイッチシステムに入る流量を変化させることによって達成される。変形形態によっては、フロースイッチは、少なくとも２つの入口と少なくとも２つの出口を含む。この方法は、１つの流路を低流量に維持するステップを含んでよく、その場合は、一方の流出口の圧力が他方の流出口の圧力より低く保たれる。フロースイッチの一方の流出口の圧力を他方の流出口の圧力より低くしてもよく、これは、例えば、一方の流出口の開口部を他方の流出口の開口部より低くすることによって行われる。他方の流路は高流量に維持されてよく、その場合は、一方の流出口の流れ抵抗が他方の流出口の流れ抵抗より低い。
【００４０】
概して、本明細書に記載の装置（例えば、システム及び機器）は、任意の適切な微粒子を分別することに使用されてよく、そのような微粒子は、単一細胞、細胞クラスタ、無機粒子、又は他の任意の物体であって、典型的には小さなサイズ（例えば、＜１ｍｍ、＜１００μｍ等）である微粒子を含む。
【００４１】
分別は、フロースイッチ内に供給される流体（ソース流体と称されてよい）の中の微粒子を画像化する画像化サブシステムによって制御されてよい。画像化サブシステムは、フロースイッチに流入する前又は流入する際のソース流体を連続的又は離散的に監視することにより、１つ以上の所定の特性を有する微粒子の出現のタイミングを特定することが可能である。例えば、本システムは、細胞形状、細胞サイズ、細胞形態構造に基づいて、細胞上の／細胞に貼り付けられたラベル（例えば、蛍光ラベル化された細胞の蛍光強度）を分別するように構成されてよい。所望の特性を有する微粒子が識別されたら、その微粒子が、主「廃棄物」出口（例えば、低速流出口）とは別の出口（例えば、高速流出口）に向かうように、その微粒子の周囲の溶液の流量を変化させることによって、その微粒子を分別することが可能である。フロースイッチ内への（又はフロースイッチ内の）サンプル入口は、所定の特性を有する微粒子が画像化サブシステムの視野内に離散的に出現するように構成されてよい。サンプル入口流路は、例えば、狭い流路領域、具体的には、画像化サブアセンブリの視野に入る領域を含むことにより、１度に１つの微粒子だけが通過できるように適合又は構成されてよい。代替又は追加として、微粒子が視野内に出現することが比較的まれであるように（例えば、低い確率で出現するように）、微粒子を含むサンプル流体を希釈してよい。
【００４２】
上述のように、フロースイッチの一部分として形成された１つ以上の入口流体路が、マイクロ流体流路であってよい。流体（サンプル流体）は、流路内で、圧力（例えば、空気ポンプによって与えられる空気圧）によってある程度決まる流速で駆動されてよい。本システムは、特にフロースイッチに入力されるソース流体を含む、フロースイッチの様々な領域内での流体圧力を調整するフィードバックを含んでよい。
【００４３】
概して、１つの出口流体路の流体抵抗をそれ以外の出口流体路の流体抵抗より低くすることにより、流体流量に基づく差動スイッチングがフロースイッチ内で達成されてよい。更に、出口流路の、フロースイッチの交差領域の近く（例えば、出口経路に入った直後）の領域における静水圧が異なってよい。例えば、１つの出口の（廃棄物容器又はサンプル容器などの容器につながる）開口部が、他の出口の開口部より低くてよく、この結果として、フロースイッチの出口間に異なる静水圧が発生する。
【００４４】
概して、本明細書に記載のフロースイッチは、任意の適切な材料で作られてよく、例えば、ガラス、ポリカーボネート、これらの組み合わせ、又は他の何らかの材料で作られてよい。概して、フロースイッチへの１つの入口（サンプル入口）は、断面積が１００μｍ２から１００，０００μｍ２であってよい。他方の入口は、断面積が１０００μｍ２から１，０００，０００μｍ２であってよい。
【００４５】
記載の装置の入口及び出口は、断面が円形、楕円形、三角形、矩形、又は他の形状であってよい。例えば、１つの入口は、内部寸法が３０μｍ×３００μｍ（Ｈ×Ｗ）であってよく、他方の入口は、円形断面であって内径が４００μｍであってよい。この例では、２つの出口の断面積が１０００μｍ２から１，０００，０００μｍ２である。一方の出口は、円形断面であって内径が４００μｍであってよく、他方の出口は、円形断面であって内径が３００μｍであってよい。
【００４６】
概して、本明細書に記載のフロースイッチは、いずれも、ポリマーの熱エンボス加工などの方法で、１片の材料から製造されてよい。フロースイッチは、２つのステップで製造されてよい。例えば、断面が小さい１つの入口は、１つの材料で製造されてよい。フロースイッチの他の部分は別の材料で製造されてよく、これら２つのピースが接着剤で接合される。
【００４７】
本明細書に記載の、細胞などの微粒子を分別する装置は、いずれも、微粒子のソースを自動的且つ効率的に分別することが可能なシステム（例えば、ベンチトップシステム又はデスクトップシステム）に組み込まれてよい。例えば、図１は、細胞を直接９６ウェル細胞培養プレートに分別できるデスクトップ装置を示す。この例では、本システムは、システム全体に組み込まれたフロースイッチを含む。本システムは又、流体（ソース流体、フラッシュ流体）に圧力をかける空気ポンプ並びにセンサ（圧力調整器）と、（動作と動作の間又は動作後に本システムの呼び水／清掃を行う為の）真空源と、（ラインを開閉して、フロースイッチを通る微粒子の流量を増やすか、且つ／又は減らす為の）弁と、画像化サブシステムの少なくとも一部分（例えば、光源、レンズ、カメラ、光電子倍増管等）と、を含む。これらの要素を、図２において、より詳細に示した。図１に示されるように、システム全体がハウジングに封入されてよい。ハウジング及び本システムは、コンピュータ、ラップトップ、スマートフォン等のような処理装置と（直接接続及び／又は無線接続により）インタフェースするように構成されてよい。変形形態によっては、本装置は、微粒子を分析して、フロースイッチによる分別をいつ行うかを決定する、組み込まれた／専用の処理装置を含む。
【００４８】
図２は、分別がいかにして行われるかを示す図である。図２では、細胞などの微粒子がボトル１４に格納される。ボトル１６は、液体のみを収容し、細胞分別の場合には、細胞用培地又は緩衝生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）を収容する。両ボトルは、マイクロダイヤフラムガスポンプ１０によって加圧される。ボトル１４及びボトル１６の内部圧力は、圧力調整器１２によって調整される。ボトル１４及びボトル１６の内部圧力は、０〜３０ｐｓｉであってよい。一実施形態では、ボトル１４及びボトル１６の内部圧力は、２ｐｓｉである。ボトル１４は、シリコーンチューブを介して、フロースイッチ２２の１つの入口に直接つながっている。ボトル１４が加圧されると、ボトル１４内の液体が、シリコーンチューブを通って、フロースイッチ２２に常に流入する。ボトル１６は、シリコーンチューブを介して、フロースイッチ２２の他方の入口につながっている。ボトル１６からフロースイッチ２２への液体の流れは、ソレノイド弁２０によって制御される。細胞がフロースイッチ２２内を流れると、顕微鏡レンズ２４と結合されたカメラを通して可視化される。同時に、細胞の蛍光強度が光電子増倍管（ＰＭＴ）２８によって測定される。細胞が、サイズ、形状、蛍光強度などの事前設定条件を満たさない場合、ソレノイド弁２０は閉じたままである。細胞は、フロースイッチから廃棄物ボトル１８に流入する。細胞が事前設定条件を満たす場合、ソレノイド弁２０は、短時間だけ開く。培地がフロースイッチ２２に流入する。培地は、大部分がサンプル流路３２から流出する。培地の流れによって、標的細胞が、サンプル流路３２のノズルから外へ運ばれる。このようにして、単一細胞の分別と計量分配が同時に達成される。
【００４９】
本発明における細胞の分別及び計量分配の成功は、フロースイッチの独自設計によるものと言ってよい。図３Ａの概略図を参照すると、この例では、フロースイッチは、２つの流入口３４及び３８が、それぞれ、入口流路４０及び４２とつながっており、２つの流出口３２及び３６が、それぞれ、フロースイッチの出口流路４６及び４４とつながっている。全ての入口流路及び出口流路が、共通集中領域５８に集まっている。入口３４はボトル１４とつながっており、入口３８はボトル１６とつながっている。微粒子は、サンプル入口流路４０を通ってフロースイッチに流入する。別の流体がフラッシュ入口流路４２内を流れて、フロースイッチ内での、微粒子を囲む流体の流量を低流量から高流量へ変化させる。出口３２はサンプル流路５１とつながっており、出口３６は廃棄物流路５３とつながっており、廃棄物流路５３は廃棄物容器（ボトル）１８とつながっている。フロースイッチは、マイクロ流体流路及びマクロ流体流路の両方を含む。サンプル入口流路４０は、マイクロ流体流路である。フラッシュ入口流路４２、廃棄物出口流路４４、及びサンプル出口流路４６は、マクロ流体流路である。一実施形態では、サンプル入口流路４０はガラス毛細管で作られており、その断面は矩形であって、３０μｍ×３００μｍ（Ｈ×Ｖ）の寸法を有する。一実施形態では、フラッシュ入口流路４２、廃棄物出口流路４４、及びサンプル出口流路４６は、ポリカーボネートの単一片から作られる。フラッシュ入口流路４２、廃棄物出口流路４４、及びサンプル出口流路４６の断面は、円形であってよい。一実施形態では、フラッシュ入口流路４２及びサンプル出口流路４６の直径は４００μｍである。廃棄物出口流路４４の直径は３００μｍである。サンプル入口流路４０、フラッシュ入口流路４２、廃棄物出口流路４４、及びサンプル出口流路４６は、フロースイッチの中心部５８に集まっている。
【００５０】
細胞分別を達成する為には、少なくとも２つの流出口が必要である。一方は必要（サンプル）細胞用であり、他方が不要（廃棄物）細胞用である。２つの流出口の間で流路を切り換える簡単な方法の１つが、弁を通る２つの流出口の間で流れ抵抗を変化させることである。例えば、流路Ａ及びＢのそれぞれに弁Ａ及びＢがある。液体を流路Ａのみに流し、流路Ｂに流れないようにする場合は、単純に、流路Ａの弁Ａをオンにし、流路Ｂの弁Ｂをオフにする。しかしながら、２つの出口流路に２つの制御可能弁があると、デッドボリュームが大きくなる。この為、そのような方法は、細胞分別装置ではめったに使われない。従来、細胞分別は、両出口流路を開いたままにすることにより、且つ、特定量の物理的外力、例えば、本明細書の背景技術セクションにおいて記載された機械力、音響力、油圧力、光学力、磁力、誘電泳動力、又は静電気力を、標的細胞に直接かけて、これを一方の流路から他方の流路に移動させることにより、達成された。これに対し、本明細書に記載のフロースイッチでは、両方の出口流路が開いていて（図４）、流路の切替に外力は用いられない。２つの流路の切り替えは、フロースイッチに入る流量を変化させるだけで達成可能である。図４では、細胞は、サンプル入口流路４０を通ってフロースイッチに流入する。シリコーンチューブ５４を通ってフロースイッチに流入する培地が弁２０によってブロックされると、フロースイッチへの流入は細胞の流れだけになる。普通なら、細胞は、廃棄物出口流路４４又はサンプル出口流路４６のいずれかを通って、フロースイッチの２つの出口から流出することが可能である。しかしながら、フロースイッチは、廃棄物流路の開口部５２がサンプル流路の開口部５０より下にあるように組み立てられている。図４において、廃棄物流路の開口部５２とサンプル流路の開口部５１との間の距離をＤとする。一実施形態では、Ｄは７０ｍｍに等しい。マイクロ流体流路４０を通る細胞の流量は低い。一実施形態では、細胞の流量は２０μｌ／分である。廃棄物流路５３の断面積はサンプル入口流路４０の断面積より格段に大きい為、細胞が廃棄物流路５３内を流れることによって引き起こされる圧力低下は、典型的には、図４の静水圧Ｄより小さい。従って、細胞は、廃棄物出口流路４４にのみ流入し、最終的に廃棄される。サンプル出口流路４６に流入してサンプル流路５１から出る細胞はない。細胞がサンプル入口流路４０内を流れる間、それらの細胞は、デジタル高速カメラによって検査され、それらの細胞の蛍光強度が、検査窓４１（図３Ｂ）からＰＭＴによって測定される。細胞が、サイズ、形状、蛍光強度などの事前設定条件を満たすと、特定量の遅延の後に弁２０が開き、培地がシリコーンチューブ５４を通ってフロースイッチに流入する。フロースイッチに流入する培地の流量は、細胞の流れの流量より格段に大きい。一実施形態では、培地の流量は５００μｌ／分である。シリコーンチューブ５４の直径は、廃棄物流路５３の直径より大きい。一実施形態では、シリコーンチューブ５４の直径が０．７６２ｍｍであるのに対し、シリコーンチューブ５２の直径は０．３０ｍｍである。大きな流れがシリコーンチューブ５４を通ってフロースイッチ��入ると、流れのパターンが変化する。サンプル流路５１内の流れ抵抗が廃棄物流路５３内の流れ抵抗より低い為、培地のほとんどがサンプル出口流路４６に流入し、サンプル流路５１から出る。培地がサンプル出口流路４６内へ動くと、標的細胞もサンプル出口流路４６内へと動いてサンプル流路５１から出る。弁２０は、標的細胞がサンプル流路５１の外に計量分配されるのに十分な時間だけ開く。一実施形態では、弁２０が開く時間は２５ミリ秒である。従って、単一細胞の分別及び計量分配は、フロースイッチ内の流量を２０μｌ／分から５２０μｌ／分まで変化させることによって達成される。標的細胞は、サンプル流路５１を通る液滴としてフロースイッチから外に計量分配される為、計量分配される液滴の場所は、１ｍｍ未満の精度まで精密に制御されることが可能である。
【００５１】
廃棄物流路５３の開口部５２がサンプル流路５１の開口部５０より下にある為、弁２０が閉じられると、図４の廃棄物出口流路４４内の圧力は、サンプル出口流路４６内の圧力より低くなる。廃棄物出口流路４４内の圧力がサンプル出口流路４６内の圧力より低くなることは、廃棄物流路５３の開口部をサンプル流路５１の開口部５０より下に置くことの代わりに、廃棄物ボトル１８を真空ポンプに接続することによっても達成可能である。
【００５２】
図５は、マシンビジョンシステムの一変形形態のフローチャートである。この実施形態（サブシステム）では、細胞が本装置によって分別される。培地の流れは、コンピュータがソレノイド弁２０によって制御する。流体系が呼び水され、液体で満たされた後、コンピュータは、カメラによる画像取り込みを開始し、ソレノイド弁２０を閉状態に設定する。コンピュータは、単一細胞を検出すると、その細胞が事前設定条件を満たすかどうかを判定する。細胞がそのような条件を満たす場合、コンピュータは、選択された細胞を計量分配する為に、特定量の遅延の後、ソレノイド弁２０を短時間だけ開いてよい。一実施形態では、コンピュータは、ソレノイド弁２０を２５ミリ秒だけ開いて、選択された細胞を計量分配する。マシンビジョンシステムは、各個体細胞を検出するだけでなく、各個体細胞がサンプル入口流路４０内を移動する速度を測定する（図３Ｂ）。検査窓４１と、複数の流路が集まる箇所５８との間の距離をＧとする。遅延時間＝Ｇ／細胞速度−システムレイテンシ。システムレイテンシに寄与する因子は幾つかある。１）。カメラが細胞画像を取り込んで、カメラからコンピュータまで転送することに時間がかかる。２）。コンピュータが、カメラから送られた各画像の中の細胞を識別することに時間がかかる。３）。コンピュータがソレノイド弁制御シトラスに信号を送出することに時間がかかる。４）。ソレノイド弁が閉状態から開状態に移行することに時間がかかる。一実施形態では、細胞速度は２４ｍｍ／秒であり、Ｇ＝４ｍｍであり、システムレイテンシは２２ミリ秒である。従って、遅延時間は１４５ミリ秒である。弁が開くタイミングがクリティカルである場合がある。ソレノイド弁２０を開くのは、複数の流路が集まる箇所５８に標的細胞がまさに到達しようとしているときでなければならない。
【００５３】
このシンプルなフロースイッチが、細胞分別の効果的な方法を提供することが可能である。しかしながら、これらのフロースイッチは、フロースイッチ内の気泡に対して敏感である場合がある。廃棄物出口流路４４内の気泡によって、廃棄物出口流路４４内の静圧が上昇する場合がある。普通なら廃棄物出口流路４４に入る不要な細胞の流れが、サンプル出口流路４６にそれてサンプル流路５１から外に出る。これが起こると、分別の精度が大幅に低下する。培地の流れが加圧空気によって押される為、培地中には大量の溶解空気が発生する。弁２０が開いて培地がサンプル流路５１から流出すると、培地の減圧によって、培地内の溶解空気の放出が引き起こされ、フロースイッチ内に気泡が発生する可能性がある。細胞の分別を正確に行う為に、培地がフロースイッチに流入する前に、培地内の溶解空気の除去が行われてよい。これを達成する為の１つの方法が、脱気装置を追加することである。
【００５４】
フロースイッチの２つの出口の間の静圧差を使用することと、廃棄物容器に向かう途中の廃棄物出口流路と、サンプル容器に向かう途中のサンプル出口流路との間の流れ抵抗の差を使用することで、複雑な流体系を用いない、細胞の分別及び計量分配のシンプルな方法が達成される。分別される細胞の秒当たりの数は、１００個に達しうる。この数は、毎秒数千個の細胞を分別できる現行の市販の細胞分別機に比べるとかなり少ないが、単一細胞を所定の場所に計量分配する精度はより高い。これは、ノズルから生成される液滴がより大きく、液滴がノズルを離れる速度がより低い為である。本機器は、設計がシンプルであることから、完全自動化が可能であり、広範な訓練を行わなくても操作が可能である。本機器は、細胞株の開発、モノクローナル抗体選択、並びに、幹細胞研究、単一細胞の遺伝子発現プロファイリング、単一細胞の変異分析等のような単一細胞研究に非常に有用となりうる。
【００５５】
細胞の分別及び計量分配は、フロースイッチに入る流量を変化させることによって達成可能である。細胞の流量は、非常に低いレベルに保たれてよい。細胞分別中のサンプル入口流路４０内の流量が非常に低いことは、本機器の性能にとっては有効であっても、サンプル入口流路４０内に液体が存在している場合にはシステムの呼び水の間に問題になる可能性がある。この場合、ボトル１４内の細胞がサンプル入口流路４０に到達するまで非常に長い時間がかかる可能性がある。これは、ボトル１４とサンプル入口流路４０とをつないでいるシリコーンチューブの容積が、サンプル入口流路４０の容積より格段に大きい為である。サンプル入口流路４０内の液体の流量が非常に低いことを克服する為に、真空ポンプ１１（図２）を使用してサンプル入口流路４０内の流れを逆にし、流れ抵抗が液体より格段に低い空気でサンプル入口流路４０を埋め戻してよい。サンプル入口流路４０、並びに、ボトル１４とサンプル入口流路４０とをつないでいるシリコーンチューブが空気で満たされている限り、細胞をボトル１４からサンプル入口流路４０まで移動させることは、ボトル１４内の圧力が１ｐｓｉほどの低さであっても、非常に迅速に達成可能である。
【００５６】
本明細書において、ある特徴又は要素が別の特徴又は要素の「上に（ｏｎ）」あると言及された場合、その特徴又は要素は、直接その別の特徴又は要素に接していてよく、或いは、介在する特徴及び／又は要素が存在してもよい。これに対し、ある特徴又は要素が別の特徴又は要素の「直接上に（ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｏｎ）」あると言及された場合、介在する特徴及び／又は要素は存在しない。又、当然のことながら、ある特徴又は要素が別の特徴又は要素に「接続されている（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」、「取り付けられている（ａｔｔａｃｈｅｄ）」、又は「結合されている（ｃｏｕｐｌｅｄ）」と言及された場合、その特徴又は要素は、直接その別の特徴又は要素に接続されているか、取り付けられているか、結合されていてよく、或いは、介在する特徴又は要素が存在してもよい。これに対し、ある特徴又は要素が別の特徴又は要素に、「直接接続されている（ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」、「直接取り付けられている（ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ａｔｔａｃｈｅｄ）」、又は「直接結合されている（ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ）」と言及された場合、介在する特徴又は要素は存在しない。そのように記載又は図示された特徴及び要素は、１つの実施形態に関して記載又は図示されているが、他の実施形態にも当てはまってよい。又、当業者であれば理解されるように、ある構造又は特徴が別の特徴に「隣接して（ａｄｊａｃｅｎｔ）」配置されていて、その構造又は特徴が言及された場合、その言及は、隣接する特徴と部分的に重なり合うか、隣接する特徴の下層となる部分を有してよい。
【００５７】
本明細書において使用された術語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本開示の限定を意図したものではない。例えば、本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに矛盾する場合を除き、複数形も同様に包含するものとする。更に、当然のことながら、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（備える）」及び／又は「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（備える）」という語は、本明細書で使用された際には、述べられた特徴、手順、操作、要素、及び／又は構成要素の存在を明記するものであり、１つ以上の他の特徴、手順、操作、要素、構成要素、及び／又はこれらの集まりの存在又は追加を排除するものではない。本明細書では、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」という用語は、関連付けられて列挙された１つ以上のアイテムのあらゆる組み合わせを包含するものであり、「／」と略記されてよい。
【００５８】
「下に（ｕｎｄｅｒ）」、「下方に（ｂｅｌｏｗ）」、「下方の（ｌｏｗｅｒ）」、「上方の（ｏｖｅｒ）」、「より上方の（ｕｐｐｅｒ）」などのような空間的相対的な語句は、本明細書では、図面に示されるような、１つの要素又は特徴と別の要素又は特徴との関係を説明する場合に説明を簡単にする為に使用されてよい。当然のことながら、この空間的相対的な語句は、使用時又は操作時の器具の、図面で描かれる向きに加えて、それ以外の向きも包含するものとする。例えば、図面内の器具が反転された場合、別の要素又は特徴の「下に（ｕｎｄｅｒ）」又は「真下に（ｂｅｎｅａｔｈ）」あると記載された要素は、その別の要素又は特徴の「上に（ｏｖｅｒ）」方向づけられることになる。従って、例えば、「下に（ｕｎｄｅｒ）」という語句は、「上に（ｏｖｅｒ）」及び「下に（ｕｎｄｅｒ）」の両方の向きを包含しうる。本装置は、他の方向づけ（９０度回転又は他の方向づけ）が行われてよく、それに応じて、本明細書で使用された空間的相対的な記述子が解釈されてよい。同様に、「上方に（ｕｐｗａｒｄｌｙ）」、「下方に（ｄｏｗｎｗａｒｄｌｙ）」、「垂直方向の（ｖｅｒｔｉｃａｌ）」、「水平方向の（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ）」などの用語は、本明細書では、特に断らない限り、説明のみを目的として使用される。
【００５９】
「第１の」及び「第２の」という語句は、本明細書では様々な特徴／要素を説明する為に使用されてよいが、これらの特徴／要素は、文脈上矛盾する場合を除き、これらの語句によって限定されるべきではない。これらの語句は、ある特徴／要素を別の特徴／要素と区別する為に使用されてよい。従って、本発明の教示から逸脱しない限り、第１の特徴／要素が後述時に第２の特徴／要素と称されてもよく、同様に、第２の特徴／要素が後述時に第１の特徴／要素と称されてもよい。
【００６０】
実施例において使用される場合も含め、本明細書及び特許請求の範囲において使用されているように、且つ、特に断らない限り、あらゆる数値は、「約（ａｂｏｕｔ）」又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という語句が前置されているものとして読まれてよく、たとえ、その語句が明示的に現れていなくても、そのように読まれてよい。「約（ａｂｏｕｔ）」又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という語句は、大きさ及び／又は位置を示す場合に、記載された値及び／又は位置が、妥当な、期待される範囲の値及び／又は位置に収まっていることを示す為に使用されてよい。例えば、数値は、述べられた値（又は値の範囲）の±０．１％の値であってよく、述べられた値（又は値の範囲）の±１％の値であってよく、述べられた値（又は値の範囲）の±２％の値であってよく、述べられた値（又は値の範囲）の±５％の値であってよく、述べられた値（又は値の範囲）の±１０％の値であってよく、他のそのような値であってよい。本明細書に記載のいかなる数値範囲も、そこに包含される全ての副範囲を包含するものとする。
【００６１】
ここまで様々な例示的実施形態を説明してきたが、特許請求の範囲によって示される本発明の範囲から逸脱しない限り、様々な実施形態に対して、幾つかある変更のいずれが行われてもよい。例えば、記載された各種方法ステップが実施される順序は、代替実施形態では変更されてよい場合が多く、代替実施形態によっては、１つ以上の方法ステップがまとめてスキップされてもよい。装置及びシステムの様々な実施形態の任意選択の特徴が、実施形態によっては含まれてよく、実施形態によっては含まれなくてよい。従って、上述の説明は、主に例示を目的としたものであり、特許請求の範囲に明記されている本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【００６２】
本明細書に含まれる実施例及び具体例は、本発明対象が実施されうる具体的な実施形態を、限定ではなく例示として示す。言及されたように、他の実施形態が利用されたり派生したりしてよく、本開示の範囲から逸脱しない限り、構造的な、或いは論理的な置換又は変更が行われてよい。本発明対象のそのような実施形態は、本明細書においては、個別に参照されてよく、或いは、「本発明」という言い方でまとめて参照されてよく、「本発明」という言い方で参照することは、あくまで便宜上であって、本出願の範囲を、実際には２つ以上が開示されていても、いずれか１つの発明又は発明概念に自発的に限定することを意図するものではない。従って、本明細書では特定の実施形態を図示及び説明してきたが、この、示された特定の実施形態を、同じ目的を達成するように作られた任意の構成で置き換えてよい。本開示は、様々な実施形態のあらゆる翻案又は変形を包含するものである。当業者であれば、上述の説明を精査することにより、上述の複数の実施形態の組み合わせ、及び本明細書に具体的な記載がない他の実施形態が明らかになるであろう。
〔付記１〕
微粒子の分別及び計量分配を行う方法であって、
流体に囲まれた微粒子をフロースイッチ内へ通すステップと、
前記微粒子が所定の特性を有していて前記フロースイッチ内に存在する場合に、前記微粒子を囲む前記流体の流量を第１の流量から第２の流量に変化させるステップと、
前記微粒子を囲む前記流体がほぼ前記第１の流量で前記フロースイッチ内を移動している場合に、前記フロースイッチを通じて前記微粒子を廃棄物出口流路内へ通すステップ、又は、
前記微粒子を囲む前記流体がほぼ前記第２の流量で前記フロースイッチ内を移動している場合に、前記フロースイッチを通じて前記微粒子をサンプル出口流路内へ通し、前記微粒子を液滴として前記サンプル出口流路から外に計量分配するステップと、を含み、
前記廃棄物出口流路内の流体静圧が前記サンプル出口流路内の流体静圧より低い、
方法。
〔付記２〕
前記廃棄物出口流路及び前記サンプル出口流路は両方とも開いている、付記１に記載の装置。
〔付記３〕
前記廃棄物出口流路に沿って廃棄物容器まで流れる流体流に対する抵抗は、前記サンプル出口流路に沿ってサンプル容器まで流れる流体流に対する抵抗より高い、付記１に記載の方法。
〔付記４〕
前記微粒子が前記所定の特性を有することを検出するステップを更に含む、付記１に記載の方法。
〔付記５〕
前記微粒子を囲む前記流体の流量を変化させる前記ステップは、前記微粒子を囲む流体を追加するか減じるステップを含む、付記１に記載の方法。
〔付記６〕
前記微粒子は細胞である、付記１に記載の方法。
〔付記７〕
前記微粒子が前記所定の特性を有することを検出するステップを更に含み、前記所定の特性は、形状、サイズ、及び蛍光強度のうちの１つ以上から選択される、付記１に記載の方法。
〔付記８〕
前記微粒子を囲む前記流体を所定の圧力又は所定の範囲の圧力まで加圧するステップを更に含む、付記１に記載の方法。
〔付記９〕
流体が前記フロースイッチに入る前に前記流体の脱気を行うステップを更に含む、付記１に記載の方法。
〔付記１０〕
微粒子の分別及び計量分配を行う方法であって、
流体に囲まれた微粒子を、第１の流量で、第１の流路からフロースイッチ内へ通すステップと、
前記微粒子が所定の特性を有していて前記フロースイッチ内に存在する場合に、前記第１の流量より速い流量で移動する流体を、前記微粒子を囲む前記流体に追加することにより、前記微粒子を囲む前記流体の流量を第２の流量まで増やすステップと、
前記微粒子を囲む前記流体がほぼ前記第１の流量で前記フロースイッチ内を移動している場合に、前記フロースイッチを通じて前記微粒子を廃棄物出口流路内へ通すステップ、又は、
前記微粒子を囲む前記流体がほぼ前記第２の流量で前記フロースイッチ内を移動している場合に、前記フロースイッチを通じて前記微粒子をサンプル出口流路内へ通し、前記微粒子を液滴として前記サンプル出口流路から外に計量分配するステップと、を含み、
前記廃棄物出口流路内の流体静圧が前記サンプル出口流路内の流体静圧より低く、更に、前記廃棄物出口流路に沿って廃棄物容器まで流れる流体流に対する抵抗は、前記サンプル出口流路に沿ってサンプル容器まで流れる流体流に対する抵抗より高い、
方法。
〔付記１１〕
流体を追加する前記ステップは、第２の流路を通って前記フロースイッチに入る流れを制御する弁を開くステップを含む、付記１０に記載の方法。
〔付記１２〕
前記微粒子は細胞である、付記１０に記載の方法。
〔付記１３〕
前記サンプル流体内で前記所定の特性を有する前記微粒子を検出するステップを更に含み、前記所定の特性は、細胞形状、細胞サイズ、及び蛍光強度のうちの１つ以上から選択される、付記１０に記載の方法。
〔付記１４〕
前記サンプル流体を前記第１の流路から前記フロースイッチ内へ通す前記ステップは、サンプル流体の連続ストリームを前記フロースイッチ内へ通すステップを含む、付記１０に記載の方法。
〔付記１５〕
前記サンプル流体を所定の圧力又は所定の範囲の圧力まで加圧するステップを更に含む、付記１０に記載の方法。
〔付記１６〕
流体が前記フロースイッチに入る前に前記流体の脱気を行うステップを更に含み、前記流体は、前記サンプル流体、前記追加流体、又は、前記サンプル流体及び前記追加流体の両方である、付記１０に記載の方法。
〔付記１７〕
フロースイッチを含む、微粒子の分別及び計量分配を行う装置であって、
微粒子を囲む流体を、第１の流量で前記フロースイッチ内へ通すように構成された第１の流路と、
第２の流路を調整する弁であって、前記第２の流路は、前記フロースイッチ内の、前記微粒子を囲む前記流体の流量を第２の流量まで増やすように構成されている、前記弁と、
前記フロースイッチ内の廃棄物出口流路と、
液滴を計量分配するように構成された、前記フロースイッチ内のサンプル出口流路と、を備え、
前記フロースイッチの前記廃棄物出口流路及び前記サンプル出口流路は、前記廃棄物出口流路内の流体静圧が前記サンプル出口流路内の流体静圧より低くなるように構成されており、更に、前記サンプル流体が前記フロースイッチ内を移動して前記サンプル出口流路に入る場合に、前記廃棄物出口流路に沿って廃棄物容器まで流れる流体流に対する抵抗が、前記サンプル出口流路に沿ってサンプル容器まで流れる流体流に対する抵抗より高い、
装置。
〔付記１８〕
前記フロースイッチに入る流体から溶解空気を除去するように構成された脱気装置を更に備える、付記１７に記載の装置。
〔付記１９〕
流体が前記第１の流路に入る前に前記流体を加圧するように構成された空気ポンプを更に備える、付記１７に記載の装置。
〔付記２０〕
前記第１の流路、前記第２の流路、又は、前記第１及び第２の流路の両方の中の圧力を調整するように構成された圧力調整器を更に備える、付記１７に記載の装置。
〔付記２１〕
前記微粒子を検出するように構成された画像化モジュールを更に備える、付記１７に記載の装置。
〔付記２２〕
前記微粒子が前記フロースイッチ内にある場合に、前記弁を起動し、前記フロースイッチ内の、前記微粒子を囲む前記流体の流量を増やすように構成された制御装置を更に備える、付記１７に記載の装置。
〔付記２３〕
前記第２の流路の直径は、前記第１の流路の直径より大きい、付記１７に記載の装置。
〔付記２４〕
前記フロースイッチは、前記第１の流路と結合されたサンプル入口と、前記第２の流路と結合されたフラッシュ入口と、前記廃棄物出口流路と結合された廃棄物出口と、前記サンプル出口流路と結合されたサンプル出口と、前記第１の流路、前記第２の流路、前記廃棄物出口流路、及び前記サンプル出口流路の全てが集まる集中領域と、を備える、付記１７に記載の装置。
〔付記２５〕
微粒子の分別及び計量分配を行う装置であって、
第１の入口流路と、第２の入口流路と、廃棄物出口流路と、サンプル出口流路と、を備えるフロースイッチであって、前記サンプル出口流路は液滴を計量分配するように構成された、前記フロースイッチと、
前記第１の入口流路に入る第１の流路であって、微粒子を含むサンプル流体を第１の流量で通すように構成された前記第１の流路と、
前記第２の入口流路に入る第２の流路を調整する弁であって、前記第２の流路は、前記微粒子を囲む前記流体に追加流体を追加することにより、前記微粒子を囲む前記流体の流量を第２の流量まで増やすように構成されている、前記弁と、を備え、
前記フロースイッチの前記廃棄物出口流路及び前記サンプル出口流路は、前記廃棄物出口流路内の流体静圧が前記サンプル出口流路内の流体静圧より低くなるように構成されており、更に、前記廃棄物出口流路に沿って廃棄物容器まで流れる流体流に対する抵抗が、前記サンプル出口流路に沿ってサンプル容器まで流れる流体流に対する抵抗より高い為、前記サンプル流体の流量が前記第１の流量である場合に前記サンプル流体は前記廃棄物出口流路に入り、前記サンプル流体の流量が前記第２の流量である場合に前記サンプル流体は前記サンプル出口流路に入り、液滴として計量分配され、
前記微粒子を検出するように構成された画像化モジュールと、
前記弁を起動し、前記微粒子を囲む前記流体の流量を増やすように構成された制御装置と、
を備える装置。
〔付記２６〕
前記フロースイッチに入る流体から溶解空気を除去するように構成された脱気装置を更に備える、付記２５に記載の装置。
〔付記２７〕
流体が前記第１の流路に入る前に前記流体を加圧するように構成された空気ポンプを更に備える、付記２５に記載の装置。
〔付記２８〕
前記第１の流路の中の圧力を調整するように構成された圧力調整器を更に備える、付記２５に記載の装置。
〔付記２９〕
前記第２の流路の直径は、前記第１の流路の直径より大きい、付記２５に記載の装置。
〔付記３０〕
前記フロースイッチは、前記第１の入口流路、前記第２の入口流路、前記廃棄物出口流路、及び前記サンプル出口流路の全てが集まる集中領域を備える、付記２５に記載の装置。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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