(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の反応ウェルと、
複数の固体支持体であって、前記固体支持体のそれぞれが、前記固体支持体に付着した試薬を有し、前記試薬が、不安定性の前記試薬と前記支持体との結合を介して前記固体支持体に付着し、切断操作を介して前記固体支持体から切断されるように構成されている、複数の固体支持体と、
前記複数のウェルのそれぞれを流体的に単離するための、密封部材または不混和流体とを含み、
前記複数のウェルおよび前記複数の固体支持体を、前記複数の固体支持体のうちの単一のもののみが前記複数のウェルのうちの対応する単一のものの中に維持されるようなサイズとし、かつそのように構成し、使用に際し、前記複数の固体支持体の前記複数のウェルへの充填操作の後、いくつかの前記ウェル内に二の前記固体支持体が充填され得る、マイクロ流体デバイス。
【請求項２】
前記切断操作が、前記試薬と前記支持体との結合への、熱的操作、化学物質の添加、酵素の添加、電位の適用、ならびに／または、光および／もしくは電離放射線の適用を含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３】
前記試薬が、核酸の転写および／または増幅反応のための核酸配列を含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項４】
前記試薬が、ＰＣＲ反応のためのＤＮＡプライマーまたはプローブを含む、請求項３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５】
前記不安定性の前記試薬と前記支持体との結合が、ストレプトアビジン−ビオチン結合および／またはアビジン−ビオチン結合を含む、請求項４に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項６】
前記切断操作が熱的操作を含む、請求項５に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項７】
前記ストレプトアビジン−ビオチン結合が、前記固体支持体が約５０〜９９℃でインキュベートされたときに、前記支持体から前記試薬を放出するよう構成されている、請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項８】
前記固体支持体がマイクロビーズである、請求項１〜２および４〜７のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項９】
前記マイクロビーズが磁気性である、請求項８に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
前記固体支持体が、前記固体支持体および／または前記試薬の特性を同定するように構成されているマーカーを含む、請求項１、２、４〜７および９のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
前記マーカーが、所定の支持体の形状、所定の支持体のサイズ、前記支持体の磁気特性および／または光学特性を含む、請求項１０に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１２】
前記マーカーが蛍光マーカーを含む、請求項１０に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１３】
前記複数のウェルが、固体支持体収容領域と反応領域とを含み、前記固体支持体収容領域が、前記複数の固体支持体のうちの単一のものを受け入れるよう構成されている、請求項１から１２項のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１４】
前記固体支持体収容領域が、前記複数の固体支持体のうちの単一のもののサイズおよび／または形状に一般に相当する断面積を有し、前記固体支持体収容領域が、前記固体支持体収容領域および／または前記反応領域において反応が生じるように構成されている、請求項１３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１５】
前記複数の固体支持体が、第１の複数の固体支持体ならびに前記第１の複数の固体支持体とは異なるサイズおよび／または形状を有する第２の複数の固体支持体を含み、前記固体支持体収容領域が、前記第１の複数の固体支持体を優先的に維持するよう構成されている第１の複数の固体支持体収容領域、および前記第２の複数の固体支持体を優先的に維持するよう構成されている第２の複数の固体支持体収容領域を少なくとも含む、請求項１３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１６】
前記固体支持体収容領域が、約３．５から５．０μｍの直径および約４．０から６．０μｍの深さを有する、請求項１３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１７】
前記複数の固体支持体が、約２．０から約３．５μｍの直径を有する、請求項１６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１８】
前記複数の固体支持体が直径ｄを有し、前記固体支持体収容領域が、１．０５ｄから１．５５ｄの直径および１．２ｄから１．８ｄの深さを有する円柱形状を有する、請求項１５に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１９】
前記反応領域が、前記固体支持体収容領域の断面積より大きい断面積を有する、請求項１５に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２０】
前記密封部材がエラストマー膜である、請求項１から１９のいずいれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２１】
前記密封部材がポリジメチルシロキサンである、請求項２０に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２２】
前記ウェル内に膜を含む、請求項１から２１のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２３】
前記膜が抽出膜を含む、請求項２２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２４】
前記膜がモノリシック酸化アルミニウム膜を含む、請求項２３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２５】
前記膜に結合されたチャンネルをさらに含み、前記チャンネルが、前記膜を介した前記複数のウェルへの流体接続を提供するよう構成されている、請求項２２から２４のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２６】
前記ウェルのうちいくつかが複数の支持体を受け入れるように構成されている、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２７】
前記膜を支持するように、前記膜と前記チャンネルとの間にあり、前記膜を介した前記複数のウェルからの均等な流量を可能にするマイクロポストのパターンをさらに含む、請求項２２から２４のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２８】
前記試薬が、前記複数のウェルのうちの１つにおいて複数のビーズから放出されて、試薬間の反応をもたらすよう構成されている、請求項１から２７のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２９】
前記試薬が、前記複数のウェルのうちの１つにおいて複数のビーズから放出されるように構成され、かつ小さな化学的単位から大きな分子の形成をもたらすよう設計された「クリックケミストリー」試薬である、請求項２８に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３０】
前記複数の反応ウェルを含む基材をさらに含み、前記基材が親水性領域および疎水性領域のパターンを含み、前記複数の反応ウェルが前記親水性領域または疎水性領域のうちの１つの上にある、請求項１から１９のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３１】
前記基材が第１の基材を含み、前記デバイスが、ギャップにより第１の基材から隔てられた第２の基材をさらに含み、前記第２の基材が、前記第１の基材上の交互の親水性および疎水性領域のパターンに面し整列した、対応する交互の親水性および疎水性領域のパターンを有する、請求項３０に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３２】
水性流体が前記第１および第２の基材の間の前記ギャップ内に配置され、続いて非水性流体が前記第１および第２の基材の間の前記ギャップ内に配置される場合に、前記水性流体が前記非水性流体により単離された液滴を前記第１および第２の基材の間に形成するように構成されている、請求項３１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３３】
前記疎水性および親水性領域が、前記第１および第２の基材上にパターニングされた金属層の上にパターニングされた自己組織化単分子層を含む、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３４】
前記金属が金または他の好適な金属である、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３５】
前記第１および／または第２の基材に適用される電位差が、前記固体支持体からの試薬の切断を含むがこれに限定されるものではない電気化学的反応をもたらすか、および／または前記複数の反応ウェル内の電気化学的反応を通じて化学種を生成する、請求項３０から３３のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３６】
前記第１および／または第２の基材に適用される直流または交流電流が、前記固体支持体からの試薬の切断を含むがこれに限定されるものではない化学的反応を誘導するジュール加熱を生み出す、請求項３０から３３のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本願は、２０１２年５月２５日に出願された米国仮出願第６１／６５１，６４８号に基
づく優先権を主張し、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、マイクロ流体デバイス、試薬用固体支持体、および関連する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）または相補的ＤＮＡ（
ｃＤＮＡ）断片の増幅のための感度の高い方法である。ＰＣＲは、例えば、疾患原因生物
の存在、遺伝子発現、遺伝子型決定、遺伝子工学または組換えを判定するための微量の核
酸の検出、および法科学用途等、多くの用途を有する。ＰＣＲ増幅は、広範な分析物濃度
にわたって優れた標的同定および定量を提供する。しかしながら、ＰＣＲによる多くの分
析物の同時定量分析は、きわめて困難であることが知られている。インターカレーティン
グ色素蛍光ベース検出では、総ｄｓＤＮＡ濃度しか判定できず、したがって、単一の反応
容器中での複数の鋳型の同時分析は、この検出方法を使用しては不可能である。蛍光プロ
ーブ技術（すなわち、Ｔａｑｍａｎ、分子標識、または他の化学的手法）は、反応の低レ
ベルマルチプレクシング（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）のために使用できる。なぜなら、
異なる色の蛍光プローブをシグナリングレポーターとして使用して、それぞれの標的が増
幅できるからである。プローブはまた、配列特異的であり、プライマーダイマー形成また
は非特異的増幅からの偽陽性を減少させる。マイクロタイタープレートまたはマイクロ流
体リアルタイムＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）でのマルチプレクシングのための典型的な方法は
、それぞれが３つの異なる色のプローブを含有する少数の反応ウェルを使用するものであ
る。しかしながら、マルチプレックスプライマーおよびプローブセットを設計することは
、一般に困難であるとみなされている。なぜなら、それらは、互いの適合性を保証するた
めに、さらなるレベルの注意深い設計および最適化を必要とするからである。この方法に
よるマルチプレクシングは、器具および色素間のスペクトル重複により、４色の検出に究
極的には制限され、典型的には１色が内部標準色素に取られる。
【０００４】
マルチプレックスＰＣＲの最適化の困難さはまた、新規配列の分析を必要とする新たに
出現する疾患または他の時間的制約のある用途のためのアッセイの、迅速な再構成に障害
をもたらす。マルチプレックスＰＣＲが直面する他の問題には、プライマー相補性が生成
するダイマー、外来ＤＮＡと増幅産物またはプライマー／プローブとの間の非特異的相互
作用、および、短配列が長配列よりも速く増幅される固有バイアスが含まれる。加えて、
少数の反応ウェルに分けられたマルチプレックス反応を使用することは、ＧｅｎｅＸｐｅ
ｒｔ（Ｃｅｐｈｅｉｄ）またはＪＢＡＩＤＳ  （Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉ
ｎｃ．）等のシステムにおける少数の標的（約３〜１２）については効果的であり得る一
方で、このアプローチは、著しく多数の標的については非効率的ものとなる。これら技術
で使用されるカートリッジは、ケアの時点または製造の時点のいずれかで、比較的多量の
液体試薬を伴って個別にロードされなければならない。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ製ＯｐｅｎＡｒｒａｙ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ等の技術は、お
よそ３０００マイクロウェルのアレイ中で乾燥された、プレロードされたプライマー／プ
ローブ配列を使用する。この技術は、試料クリーンアップまたは調製を実施せず、試料を
処理、ロード、および分析するための複数の別々の器具を必要とする。加えて、プライマ
ー／プローブセットのプレローディングは、プリンティングベースの技術（ｐｒｉｎｔｉ
ｎｇ−ｂａｓｅｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してなされなければならず、デバイス
生産に要する時間および費用が大きく増加する。
【発明の概要】
【０００５】
いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、複数の反応ウェルと、複数の
固体支持体とを含む。固体支持体のそれぞれが、それに付着した試薬を有し、試薬は、不
安定性の試薬と支持体との結合（不安定性試薬／支持体結合）を介して固体支持体に付着
し、切断操作を介して支持体から切断されるように構成される。
【０００６】
いくつかの実施形態において、切断操作は、試薬／支持体結合に対する熱的操作、化学
物質の添加、および／または光の適用を含む。試薬は、ＰＣＲ反応のためのプライマーを
含んでいてもよい。不安定性試薬／支持体結合は、ストレプトアビジン−ビオチン結合、
および／または、アビジン−ビオチン結合を含んでいてもよい。切断操作は、熱的操作を
含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ストレプトアビジン−ビオチン結合は
、固体支持体が約５０〜９９℃でインキュベートされたときに、支持体から試薬を放出す
るように構成される。固体支持体は、ミクロビーズ、例えば磁性ミクロスフェアであって
もよい。いくつかの実施形態において、固体支持体はマーカーを含む。マーカーは、所定
の支持体の形状、所定の支持体のサイズ、支持体の磁気特性、および／または、光学特性
を含んでいてもよい。マーカーは、蛍光マーカーを含んでいてもよい。
【０００７】
いくつかの実施形態において、複数のウェルおよび複数の固体支持体を、複数の固体支
持体のうちの単一のもののみが、複数のウェルのうちの対応する単一のものの中に受け入
れられるサイズとし、そのように構成する。複数のウェルは、固体支持体収容領域を含ん
でいてもよく、または固体支持体収容領域および反応領域を含んでいてもよく、固体支持
体収容領域は、複数の固体支持体のうちの単一のものを受け入れるよう構成されていても
よい。固体支持体収容領域は、一般に複数の固体支持体のうちの単一のもののサイズおよ
び／または形状に相当する断面積を有していてもよい。いくつかの実施形態において、反
応は、固体支持体収容領域中で生じるか、または開始されてもよく、この場合には固体支
持体収容領域は反応領域として利用されてもよい。反応領域は、固体支持体収容領域の断
面積より大きい断面積を有していてもよい。マイクロ流体デバイスは、密封部材（エラス
トマー膜、例えばポリジメチルシロキサン）または複数のウェルのそれぞれを流体的に単
離するための不混和流体を含んでいてもよい。マイクロ流体デバイスは、ウェル中の膜を
含んでいてもよい。膜は、抽出膜であってもよい。いくつかの実施形態において、膜は、
モノリシック酸化アルミニウム膜を含む。いくつかの実施形態において、チャンネルが膜
に結合され、膜を介した複数のウェルへの流体接続を提供するように構成される。いくつ
かの実施形態において、ウェルは複数の支持体を受け入れるように構成される。いくつか
の実施形態において、マイクロポストのパターンが、膜を支持するために、膜とチャンネ
ルとの間にあり、膜を介した複数のウェルからの均等な流量を可能にする。いくつかの実
施形態において、試薬は、複数のウェルのうちの１つにおいて複数のビーズから放出され
て、試薬間の反応をもたらすように構成される。
【０００８】
いくつかの実施形態において、複数の反応ウェルを含むマイクロ流体デバイスへの試薬
の提供方法は、複数の反応ウェル中に複数の固体支持体を提供することを含み、固体支持
体のそれぞれが、それに付着した試薬を有し、試薬は、不安定性試薬／支持体結合を介し
て固体支持体に付着し、切断操作を介して支持体から切断されるように構成される。切断
操作を実施して、試薬を複数の反応ウェル中の溶液へと放出する。
【０００９】
この明細書に組み込まれその一部となっている添付の図は、本発明の実施形態を例示し
、説明とともに本発明の原理を解説する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａは、いくつかの実施形態による、付着したプライマーを有するビーズの図である。図１Ｂは、いくつかの実施形態による、異なるコード化特性を有する４つのビーズの図である。
【図２】図１Ａ〜図１Ｂのビーズ／プライマーを保持するための複数のウェルを有するマイクロ流体デバイスのデジタル画像である。
【図３】図２のマイクロ流体デバイスの側面断面図である。
【図４】ＤＮＡの測定量（ｎｇ／μＬ）を示し、室温および９５℃でビーズから放出されたプライマーの量を示す棒グラフ、ならびにプライマービーズなしの試料についての棒グラフである。
【図５】図５Ａ〜図５Ｄは、いくつかの実施形態による、個々のビーズをそれぞれのウェル中に受け入れるよう構成されたマイクロ流体デバイスを示す図である。
【図６】いくつかの実施形態による、３つの異なるビーズセットを使用する、３つの異なる鋳型配列のＰＣＲ増幅を示すデータのプロットである。
【図７】いくつかの実施形態による、増幅された鋳型分子を含有する図２〜図３のデバイスのウェルについてのインターカレーティング色素からの比較的強いシグナル、および、画像中央のブランク反応ウェルからほとんどシグナルがないことを示す、デジタル蛍光顕微鏡画像である。
【図８】いくつかの実施形態による、ｒｔ−ＰＣＲ実験のＰＣＲサイクル数に対してプロットされた、図２〜図３のデバイス内のそれぞれのウェルからの蛍光シグナルのグラフである。
【図９】いくつかの実施形態によるマイクロ流体デバイスの略図である。
【図１０】基材の配置を示す図９のデバイスの斜視図である。
【図１１】図９のデバイスの側面断面図である。
【図１２】いくつかの実施形態による、流量を制御するフォトレジストレーンを有するマイクロ流体デバイスを示す概略図の平面図である。
【図１３】金層が除去された縦１００μｍ横１００μｍのパッドを示す、図１２のデバイスの光学顕微鏡画像である。ビーズウェルは、ウェルの中央に位置する。
【図１４】図１２のデバイス内の４４４個のパッド上に単離された色素溶液の蛍光画像である。つながった液滴は一切見られず、外れた液滴はほとんど見られない。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｂは、フォトレジストスペーサー高さ２５μｍを使用して２５０ｐＬ（図１５Ａ）および７．５μｍスペーサーを使用して７５ｐＬ（図１５Ｂ）を単離する、４４０個の親水性反応領域（１００μｍ×１００μｍウェル）を備える、いくつかの実施形態によるマイクロ流体デバイスの蛍光画像である。図１５Ｃは、９μｍスペーサーで２２．５ｐＬ容量を単離する１５００個の反応領域（５０μｍ×５０μｍウェル）を含む、いくつかの実施形態によるマイクロ流体デバイスの蛍光画像である。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｃは、０．７（図１６Ａ）、０．２（図１６Ｂ）および０．０４（図１６Ｃ）の名目上のコピー数／ウェルである、それぞれのデバイス上の１５００個の反応ウェルでの２２．５μＬ反応物中の単一コピー増幅を示す、いくつかの実施形態によるマイクロ流体デバイス内のデジタルＰＣＲ反応の蛍光画像である。サイクル２０〜２５からのシグナルを合計し、陽性ウェルを同定するための信号対雑音を改善した。
【図１７】図１７Ａは、いくつかの実施形態による、直径４．１５μｍ、深さ５．７μｍのウェル内にロードされた直径３．３μｍのロードされたプライマービーズのＳＥＭ画像である。図１７Ｂは、ビーズによる９０％超のウェル占有率を示す、いくつかの実施形態によるデバイスの蛍光顕微鏡画像である。
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｄは、いくつかの実施形態によるビーズの磁気ローディングを示す一連の蛍光画像である。１５０００個超のビーズの凝集塊が、それぞれのフレームで大きな塊として見られ、矢印は、ビーズの凝集塊がデバイス下の磁石により引かれている方向を示す。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｃは、いくつかの実施形態による、白い四角で囲んだ目的のビーズをハイライトするように異なる蛍光フィルターセットで画像化された、同じ１２個の反応ウェルのデコードされた画像である。図１９Ａは、Ｑｄｏｔ  ６０５およびｍｅｃＡ遺伝子のためのプライマー（３６５／１０ｎｍ  ｅｘ）を同定し、図１９Ｂは、Ｑｄｏｔ  ６５５およびＳ．ｍｕｔａｎｓのためのプライマーを同定し、図１９Ｃは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ｇＤＮＡに見出されるｎｕｃ遺伝子のためのプライマーを担持するＱｄｏｔ標識なしのビーズを同定する。Ｑｄｏｔ  ６０５およびＱｄｏｔ  ６５５の両方で標識化されたビーズは、明るく蛍光を発する。空ビーズウェルが図１９Ｃに示され、白い六角形でハイライトされている。図１９Ｄは、ｍｅｃＡおよびｎｕｃ遺伝子について陽性の結果を示すアッセイ画像である。
【図２０】いくつかの実施形態による、標的ＤＮＡのバルクビーズベース捕捉後の５μＬ反応物中の増幅のグラフである。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｃは、いくつかの実施形態による、カラー蛍光でコードされる３つの異なるプライマーセットについて陽性のウェルにおけるＳＹＢＲ緑色蛍光の増加を示す、３０サイクルのＰＣＲ増幅後のいくつかの実施形態によるマイクロ流体デバイスからのアレイのセクションの画像である。
【図２２】図２２Ａは、いくつかの実施形態による、異なるウェルサイズが優先的には対応するサイズのビーズを維持する、いくつかの実施形態によるマイクロ流体デバイスの模式図である。図２２Ｂ〜図２２Ｃは、図２２Ａのデバイスのビーズ受容パターンを示す蛍光顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明をここで、本発明の実施形態を示す添付の図面および実施例を参照しながら以下
に説明する。しかしながら、本発明は多くの異なる形態で実施されてもよく、本明細書に
提示する実施形態に限定されるものとして解釈されるべきではない。むしろ、これら実施
形態が提供される結果、本開示が周到で完全なものとなり、当業者に本発明の範囲を十分
伝えることになる。
【００１２】
本明細書を通じて、同じ符号は同じ要素を指す。図面において、ある種の線幅、層、構
成部分、要素または特徴は、明確さのため誇張される場合がある。
【００１３】
本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、
本発明を限定することは意図されていない。本明細書において使用される単数形「ａ」、
「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に文脈上そうでないことが明確に示されない限り、複数
形をも含むことが意図されている。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および／または「含
んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書において使用されるとき、
述べられた特徴、工程、操作、要素および／または構成部分の存在を特定するが、１つま
たは複数の他の特徴、工程、操作、要素、構成部分および／またはそれらの群の存在また
は付加をあらかじめ排除しないことが、さらに理解されると考えられる。本明細書におい
て使用される「および／または」という用語は、１つまたは複数の関連する挙げられた項
目の任意のおよびすべての組合せを含む。本明細書において使用される「ＸとＹとの間」
および「約ＸからＹの間」等の文言は、ＸおよびＹを含むものと解釈されるべきである。
本明細書において使用される「約ＸからＹの間」等の文言は、「約Ｘから約Ｙの間」を意
味する。本明細書において使用される「約ＸからＹ」等の文言は、「約Ｘから約Ｙ」を意
味する。
【００１４】
特に断りのない限り、本明細書において使用されるすべての用語（技術用語および科学
用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を
有する。用語、例えば一般に使用される辞書に定義されるものは、本明細書および関連技
術分野の文脈における意味と一貫した意味を有するものとして解釈されるべきであり、本
明細書において明確に定める場合を除き、理想化されたまたは過度に形式的な意味に解釈
されるべきでないことが、さらに理解されると考えられる。よく知られた機能または構造
は、簡潔さおよび／または明確さのため、詳細には説明されない場合がある。
【００１５】
ある要素が他の要素「〜の上にある」、「〜に付着する」、「〜に接続する」、「〜に
連結される」、「〜に接触する」等と言及されるときは、それは直接に他の要素の上にあ
る、他の要素に付着する、他の要素に接続する、他の要素に連結されるもしくは他の要素
に接触することができるか、または介在する要素もまた存在していてもよいことが理解さ
れると考えられる。対照的に、要素が、例えば他の要素「〜の上に直接ある」、「〜に直
接付着する」、「〜に直接接続する」、「〜に直接連結される」または「〜に直接接触す
る」と言及されるときには、介在する要素は存在しない。他の特徴「〜に隣接して」配置
されている構造または特徴への言及は、隣接する特徴と重複するか、またはその基礎にあ
る部分を有していてもよいこともまた、当業者により認められると考えられる。
【００１６】
空間相対的な用語、例えば「〜の下方」、「〜の下」、「〜より低い」、「〜の上方」
、「より高い」等は、説明の簡略化のため、図示されているある要素または特徴の他の要
素または特徴との関係性を説明するのに本明細書において使用されてもよい。空間相対的
な用語は、図に描かれている配置に加えて、使用または操作中のデバイスの異なる配置を
包含することが意図されていることが理解されると考えられる。例えば、図のデバイスを
逆さにした場合、他の要素または特徴「〜の下方」または「〜の真下」と説明されている
要素は、他の要素または特徴「〜の上方」に配置されると考えられる。したがって、例と
して挙げている「〜の下方」という用語は、「〜の上方」および「〜の下方」の両方の配
置を包含できる。デバイスは、別の仕方で（９０度回転してまたは他の配置で）配置され
ていてもよく、本明細書において使用される空間相対的な記述語はそれに応じて解釈され
る。同様に、「上向きに」、「下向きに」、「垂直の」、「水平の」等の用語は、特に示
されない限り、本明細書において説明の目的でのみ使用される。
【００１７】
様々な要素を説明するのに「第１の」、「第２の」等の用語が本明細書において使用さ
れてもよいとはいえ、これらの要素はこれらの用語により限定されるべきでないことが理
解されると考えられる。これらの用語は、ある要素を他の要素から区別するためにのみ使
用される。したがって、下で論じられる「第１の」要素はまた、本発明の教示から逸脱す
ることなしに「第２の」要素と呼ばれ得る。操作（または工程）の順序は、特に示されな
い限り、請求項または図面に示された順番に限定されない。
【００１８】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、少なくとも約５ヌクレオチドから約５００ヌク
レオチド（例えば、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２１、２２、
２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９
０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５
０または５００ヌクレオチド）の核酸配列を指す。いくつかの実施形態において、例えば
、オリゴヌクレオチドは、約１５ヌクレオチドから約３０ヌクレオチド、または約２０ヌ
クレオチドから約２５ヌクレオチドであり得るのであり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）増幅アッセイのプライマーおよび／またはハイブリダイゼーションアッセイも
しくはマイクロアレイにおけるプローブとして使用され得る。本発明のオリゴヌクレオチ
ドは、当技術分野においてよく知られている、天然または合成の、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ
、ＰＮＡ、ＬＮＡ、修飾骨格等、またはそれらの任意の組合せであり得る。
【００１９】
増幅および／または検出のためのものを含むプローブおよびプライマーは、任意の好適
な長さのオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ等の天然に生じるオリゴヌクレオチドならびに合成
および／または修飾オリゴヌクレオチド）であるが、典型的には、５、６または８ヌクレ
オチド長から４０、５０または６０ヌクレオチド長以上である。かかるプローブおよびま
たはプライマーは、固体支持体、例えばビーズ、チップ、ピンもしくはマイクロタイター
プレートウェル上に固定化されるか、もしくはそれに連結されていてもよく、および／ま
たは、検出可能な基、例えば、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性元素もしくは酵素に
連結されるか、もしくはそれで標識化されていてもよい。
【００２０】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、既知の手法に従い実施されてもよい。例えば、米
国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号およ
び第４，９６５，１８８号を参照のこと。一般にＰＣＲは、最初に、核酸試料を（例えば
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で）ハイブリダイジング条件下で検出されるべき特定
配列のそれぞれの鎖のための１つのオリゴヌクレオチドプライマーで処理する工程を伴い
、その結果特定配列のそれぞれの鎖とハイブリダイズするようそれと十分に相補的である
プライマーで、それぞれの核酸鎖と相補的なそれぞれのプライマーの伸長産物が合成され
る。その結果それぞれのプライマーから合成された伸長産物は、その相補物から分離され
るとき、他のプライマーの伸長産物の合成のための鋳型として役立つことができる。次に
、検出されるべき１つまたは複数の配列が存在する場合、変性条件下で試料を処理し、プ
ライマー伸長産物をその鋳型から分離する工程を伴う。これらの工程は、所望の程度の増
幅が得られるまでサイクルで反復される。増幅配列の検出は、反応産物に、反応産物にハ
イブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、本発明のオリゴヌクレオチド
プローブ）、検出可能な標識を担持するプローブを添加し、次に、既知の手法に従い、ま
たはゲル上での直接可視化により標識を検出することにより実施されてもよい。増幅配列
はまた、インターカレーティング色素を反応混合物に添加し、二本鎖ＤＮＡの総質量に比
例する蛍光シグナル強度をモニターすることにより検出できる。ＰＣＲ反応に関して本発
明による実施形態が説明されるとはいえ、他の核酸増幅方法、例えばローリングサークル
増幅またはループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）等の等温増幅法を含む逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−
ＰＣＲ）を使用できることが理解されるべきである。
【００２１】
前述のもの等のＤＮＡ増幅法は、目的の多型または変異を含有するＤＮＡに特異的に結
合するが、同じハイブリダイゼーション条件下で目的の多型を含有しないＤＮＡには結合
せず、増幅反応におけるＤＮＡまたはその一部の増幅のための１つまたは複数のプライマ
ーとして役立つ、プローブ、１対のプローブ、または２対のプローブの使用を伴い得る。
かかるプローブは、本明細書において増幅プローブまたはプライマーと呼ばれることもあ
る。
【００２２】
「試薬」という用語は、プライマー、核酸鋳型および増幅酵素を含む、任意の物質また
は化合物を指し、化学反応をもたらすためにシステムに添加されるか、または反応が生じ
るかどうかを観察するために添加される。１つまたは複数の増幅試薬は、プライマー、核
酸鋳型および増幅酵素を除く、増幅のために一般に使用される試薬（デオキシリボヌクレ
オチド三リン酸、緩衝液等）を指す。典型的には、増幅試薬は他の反応成分とともに反応
容器（試験管、マイクロウェル等）内に置かれ、収容される。
【００２３】
本明細書において使用される「磁性」という用語は、強磁性、常磁性および超常磁性特
性を含む。
【００２４】
一般に、目的の多型または変異を含有するＤＮＡの検出に使用されるオリゴヌクレオチ
ドプローブは、その変異または多型をコードするＤＮＡに結合するが、同じハイブリダイ
ゼーション条件下でその変異または多型を含有しないＤＮＡには結合しないオリゴヌクレ
オチドプローブである。オリゴヌクレオチドプローブは、好適な検出可能な基、例えば下
に提示するもので標識化されている。かかるプローブは、本明細書において検出プローブ
またはプライマーと呼ばれることもある。
【００２５】
本発明の方法を実施するのに有用なキットは、一般に、付着した試薬を有する１つまた
は複数の固体支持体および上述の方法を実施するための他の試薬、例えば制限酵素を含み
、任意選択的にこの方法を実施するのに好適な説明書とともにパッケージされると考えら
れる。キットはまた、それに含まれる要素を収容する容器を含んでいてもよい。かかる容
器は、バイアル、アンプル、管、カプセル、瓶、シリンジ、バッグ、マイクロ流体チップ
およびカートリッジを含むが、これに限られるものではなく、プレロードされたビーズデ
バイスを含む。
【００２６】
図１Ａに示されるとおり、固体支持体またはビーズ１０は、それに付着するプライマー
２０Ａ、２０Ｂを有していてもよい。プライマー２０Ａ、２０Ｂは、ビオチン化プライマ
ーの対であってもよく、ビーズ１０は、ビオチン化プライマーのビーズへの結合が生じる
ように、ストレプトアビジン標識化されていてもよい。いくつかの実施形態において、ビ
ーズ１０は、それぞれのビーズ１０Ａに固着したプライマー２０Ａ、２０Ｂを同定するた
めに分析中に使用されてもよいマーカー、例えば光学マーカーを含んでいてもよい。例え
ば、図１Ｂに示すように、異なるコード化ビーズ１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄが、分
析中の異なる付着したプライマーセットの同定のためにマークされてもよい。様々なプレ
コード化方法を、ビーズ１０または他の固体支持体上にマーカーを提供するために使用し
てもよく、単独でまたは他のコード化方法と組み合わせて使用される、所定のサイズ、形
状、磁気特性および／または蛍光ドーピングを含む。カスタム配列ビオチン化プライマー
およびストレプトアビジン標識化常磁性磁気ビーズの両方を、容易に業者から購入できる
か、または好適な量で適切な設備を有する研究室において作製できる。
【００２７】
本発明による実施形態は、ビーズ１０（例えば磁性ミクロスフェア）に関して本明細書
において説明されるとはいえ、多孔性、表面多孔性、または非多孔性にかかわらず、任意
の好適な固体支持体を使用してもよいことが理解されるべきである。支持体は、ポリマー
もしくはプラスチック、ガラス、二酸化ケイ素または金属もしくは半金属酸化物（酸化ア
ルミニウム、酸化チタン、酸化ジルコニウムまたは他の酸化物を含むが、これに限られる
ものではない）等の材料でできた磁性もしくは非磁性粒子もしくは顆粒、量子ドット、フ
ォトリソグラフィ加工粒子もしくは構造（離散的または非離散的）、フィルター膜もしく
はエレメント、バイアルの固体表面、マイクロタイタープレート、マイクロ流体もしくは
マクロ流体反応ウェル、シリコーンもしくは他のゴム、金属および金属粒子、天然に生じ
る支持体またはこれら目的に適した吸収剤を含んでいてもよいが、これに限られるもので
はない。
【００２８】
本発明による実施形態はまた、ＰＣＲ反応に関して本明細書において説明されるとはい
え、本明細書において説明されるマイクロ流体デバイス、ビーズおよび反応方法を、様々
な他の反応において、例えば試薬がビーズからウェル中に切断されて反応に関与する場合
に使用してもよいことが理解されるべきである。例えば、任意の核酸転写および／または
増幅関連反応は、本発明の範囲内であり、ＰＣＲ反応、リアルタイムＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣ
Ｒ）、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写（ＲＴ）、前述のＲＴ
工程からのｃＤＮＡのＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムまたはデジタル定量を使用
したＲＴ−ＰＣＲ、イムノＰＣＲ（ｉＰＣＲ）およびその変型形態、ループ介在等温増幅
（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル複製および／または非酵素的核酸増幅方法（例えば、
「ＤＮＡ回路（ＤＮＡ  ｃｉｒｃｕｉｔ）」）を含むが、これに限られるものではない。
本発明の範囲内に含まれる他の反応は、蛍光発生基質が支持体表面と結合し、ある時点で
後続反応のために切断される酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光発生基質が
支持体表面と結合し、ある時点で後続反応のために切断される単一分子アレイ（ＳｉＭｏ
Ａ）またはデジタルＥＬＩＳＡ、コンビナトリアルケミストリーのための異なる試薬を送
達する複数のビーズを使用する反応、ビーズが触媒試薬を送達する反応、および／または
確率的ビーズローディングにより決定される化学量論量で「クリック」ケミストリー試薬
を送達する反応を含むが、これに限られるものではない。
【００２９】
任意の好適なカップリングケミストリーを、プライマー２０Ａ、２０Ｂをビーズ１０に
結合するために使用してもよい。いくつかの実施形態において、プライマー２０Ａ、２０
Ｂは、不安定性化学結合、例えば様々な手法を使用して切断され得る結合を使用してビー
ズ１０に付着してもよい。例えば、化学結合を破断または切断するために、熱エネルギー
を適用してもよく、光切断性結合を破断するために光を適用してもよい。加熱は、高温表
面との伝導接触、溶液のジュール加熱、ビーズ１０に隣接する基材の抵抗加熱、電磁放射
線への曝露および／または電磁誘導により達成されてもよい。いくつかの実施形態におい
て、化学結合は、電離放射線、化学剤、酵素、電気化学的プロセス、ｐＨの変化、または
他の好適な切断操作を使用して切断されてもよい。例えば、ｐＨの変化は、ビーズ１０を
保持する領域の表面で生じる電気化学的反応により引き起こされてもよく、または、条件
の変化は、開始試薬の活性化により直接または間接に引きこされてもよく、この活性化自
体は物理的変化、例えば、熱、光、電気化学的プロセス、ｐＨの変化等により活性化され
てもよい。プライマー２０Ａ、２０Ｂは、ＰＣＲ前の貯蔵、試料調製および／または洗浄
工程中も固着されたままであり得るように、ビーズ１０に固着されてもよい。切断操作は
、プライマー２０Ａ、２０Ｂをビーズ１０から引き離すために、ＰＣＲ反応を行うときに
実施されてもよい。使用される特定の不安定性化学結合によって、切断操作は、プライマ
ー２０Ａ、２０Ｂをビーズ１０から引き離すため、熱、光の適用および／または化学物質
の添加を含んでいてもよい。プライマー２０Ａ、２０Ｂがビーズ１０から引き離されると
き、プライマーは直ちにＰＣＲ反応に関与してもよく、プライマー２０Ａ、２０Ｂがビー
ズ１０に固着されているとき、プライマー２０Ａ、２０Ｂは一般に、鋳型ＤＮＡが近接し
ていない限り、ＰＣＲ反応において反応しない。本発明による実施形態はプライマー２０
Ａ、２０Ｂに関して説明されるとはいえ、任意の好適な試薬を要素２０Ａ、２０Ｂとして
使用して、任意の好適な化学結合で結合してもよいことが理解されるべきである。例えば
、任意の試薬、プローブまたはオリゴヌクレオチドを使用してもよい。ストレプトアビジ
ン−ビオチンに加えて、好適な切断可能な結合は、光切断可能なビオチン、アビジン、ス
トレプトアビジンおよびカプトアビジン（ｃａｐｔａｖｉｄｉｎ）を含むが、これに限ら
れるものではなく、市販のもの、例えばＡｍｂｅｒｇｅｎ製のもの（ＰＣ  Ｂｉｏｔｉｎ
Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、ＰＣ  Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｐｈｏｓｐ
ｈｏｒａｍｉｄｉｔｅおよびＰＣ  Ｓｐａｃｅｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）で
あってもよい。
【００３０】
図２〜図３に示すように、マイクロ流体デバイス５０は、複数のウェル６０を含んでい
てもよい。ビーズ１０およびそれに付着するプライマー２０Ａ、２０Ｂは、ウェル６０内
にプレロードされていてもよい。デバイス５０は、基材６２（例えばガラス）およびウェ
ル６０に流体的に接続するチャンネル６６を有するマイクロ流体部６４をさらに含んでい
てもよい。図３に示すように、ウェル６０は、モノリシック酸化アルミニウム膜（ＡＯＭ
）等の膜６８上に形成されてもよい。膜６８は、試料からＤＮＡを精製するのに使用され
てもよい。固相抽出または他の分離方法を実施できるポリマー膜または無機もしくはポリ
マー表面を含む、試料クリーンアップのための他の好適な材料が用いられてもよい。膜は
、膜が十分に支持されるが、流体は依然としてそれを自由に均一に通過して流れるように
、チャンネルに接続されたマイクロポスト７０のパターニングされたグリッドまたはアレ
イ上で支持され得る。したがって、ビーズ１０上のプライマー２０Ａ、２０Ｂは、ウェル
６０内へプレロードされ、使用前の期間貯蔵されていてもよい。ウェル６０はそれぞれ、
単一のプライマー対の多くのコピーを有するビーズ１０を含有し、分析しやすいように標
識化されていてもよい。
【００３１】
いくつかの実施形態において、プライマー２０Ａ、２０Ｂは、ストレプトアビジン−ビ
オチン結合を介してビーズ１０に付着する。ストレプトアビジン−ビオチン結合は、生物
系に見出される最も強力な既知の非共有結合の１つであるが、熱不安定性である。ビオチ
ン化プライマーがＰＣＲ前にストレプトアビジン被覆ミクロスフェアと反応するとき、プ
ライマーはビーズの表面上に著しく捕捉される。好適な緩衝液中での洗浄または他の試料
の処理工程は、一般にプライマーを放出することなしに行うことができる。しかしながら
、ビーズ１０の加熱あるいはストレプトアビジンの変性の際、多量のプライマーが表面か
ら放出され、ＰＣＲ反応に関与できる。図４は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００  ＵＶ−Ｖ
ｉｓ吸光度検出器を使用した、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ標的ＤＮＡ
の一領域に特異的なプライマーでこのようにして標識化されたビーズの懸濁液からの上澄
液の測定値のグラフである。図示されているように、室温（ＲＴ）から＜５０℃までの温
度の範囲で、４℃での数日の貯蔵後またはマイクロ流体デバイスのウェル内で２カ月超、
室温で乾燥貯蔵されたときであっても、検出可能なプライマーの放出はない。９５℃でイ
ンキュベートされたとき、プライマーは放出され、上澄中に容易に検出できる。
【００３２】
これまで試験されたすべてのビオチン化プライマーで高度のビーズ官能化が観察された
。付着は、室温で乾燥貯蔵されたとき、６０日を超えて安定であり、４℃で＞１１カ月間
溶液中で貯蔵されたビーズが試験され、ＰＣＲ反応における活性が依然として観察された
。
【００３３】
いくつかの実施形態において、図１Ｂに示すように、ビーズセットはＰＣＲ反応のため
の様々なプライマー（例えば、フォワードおよびリバースプライマー、ならびに／または
ハイブリダイゼーションプローブ）で標識化されていてもよい。ビーズ１０は、所定のプ
ライマー対を有するそれぞれのビーズセットが互いに識別され得るように、色素、サイズ
、形状、磁気特性、または他の検出可能なおよび／もしくは光物理学的特性または特性の
組合せによりデコードされてもよい。図５Ａに示すように、微量反応ウェルアレイ１００
は、複数のウェル１１０を含んで提供されてもよい。それぞれのウェル１１０は、支持体
またはビーズ収容領域１１２および反応領域１１４を含む。ビーズおよびウェルの寸法は
、適量の試薬（プライマー、プローブ等）が送達されるように調整されるべきである。ビ
ーズ収容領域１１２は、使用される場合、ビーズ直径と同様のサイズとされてもよい。反
応領域１１４は、サブミクロンからミリメートルの範囲の寸法、サブフェムトリットルか
ら数百マイクロリットルの範囲の体積であり得る。ビーズ収容領域１１２およびビーズ１
０は、所望の反応に適切なサブミクロンからミリメートルのサイズの範囲であり得る。ビ
ーズ収容領域１１２は、単一のビーズ１０を収容するサイズとし、そのように構成される
。したがって、ビーズ１０は、個々の反応ウェル１１０に別々にロードされてもよい。図
５Ｂに示すように、反応溶液１２０はウェル１１０に添加され、ウェルは、カバー１３０
または他の密封部材、例えば不混和流体または油で、反応ウェル１１０が流体的に互いに
単離されるように密封されてもよい。図５Ｃに示すように、切断操作を実施して、プライ
マー２０Ａ、２０Ｂをビーズ１０から分離できる。例えば、デバイス１００を加熱して、
プライマー２０Ａ、２０Ｂをストレプトアビジン−ビオチン結合から放出してもよい。し
かしながら、プライマー２０Ａ、２０Ｂとビーズ１０との間の結合のタイプに応じて、光
または化学物質の適用を含む他の切断操作を使用してもよい。図５Ｄに示すように、ビー
ズコード化およびＰＣＲ反応の結果は、（１）ウェル１１０内のビーズ１０のタイプ（お
よびウェル１１０内の反応における対応するプライマー）、ならびに（２）検出されてい
るそれぞれの鋳型分子の存在および／または濃度を決定するために解読されてもよい。例
えば、特定の波長の蛍光コード化がビーズ１０上で使用されて関連するプライマー２０Ａ
、２０Ｂを同定した場合、次に蛍光コード化シグナルはその波長でＰＣＲ前、ＰＣＲ中、
またはＰＣＲの最後に解読される。増幅産物の濃度または存在を決定するために使用され
るインターカレーティング色素またはプローブからのシグナルは、他の波長で解読され得
る。次に、コード化情報を伴うこのシグナルは、それぞれの鋳型分子の存在および／また
は濃度を決定するために使用される。
【００３４】
したがって、この構成においてビーズ１０は、複雑な決定性ローディングまたはプリン
ティング技術なしに、マイクロウェル１１０内に確率的に配置されていてもよい。マイク
ロウェル１１０内のビーズ１０のそれぞれのプライマーセットおよび／またはプローブは
、ビーズ１０がロードされた後および／または反応が実施された後に決定されてもよい。
したがって、すべての所望のビーズセットの混合物から確率的にロードされ得る、比較的
多数の非常に小さな反応ウェル１１０を使用してもよい。デバイス１００は、それぞれの
ＰＣＲ反応が十分に単離されるよう、それぞれのウェル１１０がその近隣のウェルから流
体的に単離される仕方で密封する密封部材またはカバー１３０または不混和流体、例えば
油、液体ポリマー、もしくはフルオロカーボン液のオーバーレイと一体化する基材内へと
パターニングされたマイクロウェル１１０のセットを使用してもよい。いくつかの実施形
態において、デバイス１００（基材およびウェルを有する）およびカバー１３０は、１つ
の剛体材料と１つの変形可能エラストマー材料との組合せから作製されてもよく、その結
果デバイス１００の外表面への圧力の適用により十分密封され得る。プレコード化方法（
とりわけ、サイズ、蛍光ドーピング、形状、磁気特性、単独でまたは組み合わせて使用さ
れる）の使用は、非常に小さな反応体積（例えば、約１ｃＬから１μＬの間または約１μ
Ｌ未満）について実行されてもよく、必要なプライマーまたは他の特異的試料を提供する
のに、単一のビーズ１０のみが必要とされる。この場合、ビーズ１０は、それぞれのウェ
ル１１０が１つのビーズ１０のみおよびＰＣＲ反応が生じるのに十分な体積を含有するよ
うに、微量反応ウェル１１０内へとロードされてもよい。いくつかの場合、ビーズに占め
られていないビーズウェルの体積は、反応が生じるのに十分な体積であってもよい。この
場合、ビーズウェルは、ビーズを保持することと、同時に反応体積を定義することとの両
方に役立ち得る。プライマー標識化および／またはプローブ標識化ビーズ１０の異なるセ
ットを、単一の溶液中へと混合できる。次に、プライマーセット（または他の試薬）の同
一性を、ビーズ１０のコード化から決定できる。試料採取を、ウェル１１０内への単純な
封入により（一般に高濃度の鋳型）、または、ビーズ１０に結合されたプライマーセット
もしくは他の親和性試薬（抗体またはアプタマーを含むが、これに限られるものではない
）に対する直接ハイブリダイゼーションにより（一般的に低濃度の鋳型）行ってもよい。
いくつかの実施形態において、数百から数十億のパラレルな、シングルプレックス定量Ｐ
ＣＲ反応を、単一の、設置面積の小さいデバイス１００内で実施してもよい。
【００３５】
図９〜図１１に示すように、マイクロ流体デバイス２００は、チャンネル形成フォトレ
ジストまたは他のスペーサーにより隔てられた２つの基材２１０、２２０を含む。スペー
サー２３０の高さは、基材２１０、２２０とチャンネル２３２との間のギャップを画定す
る。基材２１０、２２０は、基材２１０、２２０が組み合わされた構成のとき（図１０）
、疎水性領域２１２、２２２および親水性領域２１４、２２４が互いと整列するように、
空間的に互いに対応するそれぞれの疎水性領域２１２、２２２および親水性領域２１４、
２２４を含む。基材の１つである２１０は、流体的にチャンネル２３２に接続する開口部
２４０を含む。基材の１つである２２０は、エッチングされたビーズウェル２６０をさら
に含む。
【００３６】
この構成において、本明細書に記載のビーズ１０は、ビーズウェル２６０内に配置され
てもよい。非水性流体２４２および水溶液２４４は、チャンネル２３２内に配置され、ビ
ーズ１０のそれぞれと流体接触する概ね単離された水溶液２４４の反応領域２４６を形成
する。
【００３７】
いくつかの実施形態において、以下のとおり、ビーズ１０、非水性溶液２４２および水
溶液２４４が、デバイス２００内にロードされてもよい。複数のビーズ１０が、開口部２
４０内に挿入され、ウェル２６０内にロードされてもよい。例えば、ビーズ１０は磁気ビ
ーズであってもよく、基材２１０、２２０のうちの１つの外部に適用される磁石は、ビー
ズ１０がウェル２６０内に落ちてその場に留まるように、チャンネル２３２全体にビーズ
１０を引きずるために使用されてもよい。ウェル２６０は、単一のビーズ１０が収まるサ
イズとし、そのように構成されてもよい。ウェル２６０内にロードされなかった過剰なビ
ーズ１０を除去するために、チャンネル２３２を通じて緩衝液が流されてもよい。次に、
開口部２４０に水性流体、続いて非水性流体が添加されてもよい。水性流体が、非水性流
体２４２により隔てられる親水性領域２１４、２２４に隣接する反応領域２４６を形成し
てもよい。
【００３８】
マイクロ流体デバイス２００が、親水性領域２１４、２２４におけるウェル２６０およ
び反応領域２４６に関して上で説明されたとはいえ、反応領域２４６およびウェル２６０
は、代わりに、所望の反応環境に応じて反応が非水性流体中で生じるように、疎水性領域
に配置されてもよいことが理解されるべきである。いくつかの実施形態において、水性流
体は、所望の反応の成分を含む流体、例えばＰＣＲマスターミックスである。基材２１０
、２２０は、任意の好適な材料、例えばプラスチック、ガラス、またはシリコンまたはそ
れらの組合せから形成されてもよい。疎油性パターニングもまた使用でき、例えばフルオ
ロカーボン系油相でのフルオロカーボン系コーティングである。
【００３９】
親水性領域２１４、２２４および疎水性領域２１２、２１４は、基材２１０、２２０上
に親水性または疎水性の層を堆積させることにより形成されてもよく、基材２１０、２２
０の親水性または疎水性特性に応じて、続いて層の一部を除去することを要しても要さな
くてもよい。例えば、金が親水性基材、例えばシリコンまたはガラス上に堆積され、次に
エッチングされて、基材の親水性領域および金の疎水性領域を形成してもよい。あるいは
パターニングは、存在する表面の選択的改質、例えばプラスチック基材の未改質表面の領
域のプラズマ処理によりなされてもよい。
【００４０】
上述のとおり、ビーズ１０は、ウェル２６０内にランダムにロードされてもよく、どの
ビーズタイプがデバイス２００の特定の位置に相当するのかを決定するために、その後の
操作を使用してもよい。例えば、ビーズ１０が、ビーズ１０に付着する特定のプライマー
または他の試薬と関連する光学マーカーを含む場合、次に、その後の分析のため、どのプ
ライマーが所定のウェル位置と関連するのかを光学的に同定するために、光学画像装置、
例えば顕微鏡を使用してもよい。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ウェル２６０は、優先的には、サイズおよび／または形
状に基づいて、特定のビーズタイプを維持するようなサイズとし、かつそのように構成さ
れてもよく、その結果、例えば、大きなビーズは大きなウェルにより維持され、小さなビ
ーズは小さなウェルにより維持されると考えられる。例えば、図２２Ａに示すように、そ
れぞれ３μｍおよび６μｍ直径ビーズを保持する２．１μｍビーズウェル３６０Ａおよび
５．６μｍビーズウェル３６０Ｂを有するシリコーンチップ設計の模式図を示す。チップ
設計において、小さいシリコーンウェルは、わずかに直径の大きいビーズを受け入れるよ
うに拡張するが、小さいビーズは、大きな直径のビーズウェルに維持されないと考えられ
る。外側の輪郭は、それぞれのビーズウェルの周りの反応ウェルの形状を示す。図２２Ｂ
は、３μｍビーズのみでロードされたチップを示す蛍光顕微鏡画像である。図２２Ｃは、
３および６μｍビーズの混合物でロードされたチップを示す画像であり、サイズコード化
に基づいて、特定のウェル内にビーズを優先的にロードする能力を示す。
【００４２】
さらに、いくつかの実施形態において、固体反応ウェル内の固体支持体を使用して、反
応を複数の小さい体積に単離することにより、非特異的な、「寄生」反応を実質的に減少
させ、例えばプライマーダイマーを減少させ得る。これらの原理を使用した複数の小さな
反応への反応の分節化は、多くの異なる反応に適用可能である。いくつかの実施形態によ
るビーズ１０を使用したマルチプレクシングにより、（例えばエマルジョンＰＣＲで使用
される）エマルジョンの形成は、反応分節化を達成するのに一般に必要とされない。エマ
ルジョンは、調製の複雑さおよび／または費用を増加させ、反応体積の範囲を限定し、エ
マルジョンを形成する傾向を有する化学種を必要とし得る。
【００４３】
加えて、本明細書において説明されるプロセスの一部または全部が、例えば、ポンプ、
バルブ、光学画像化デバイス等を使用して、自動化されてもよいことが理解されるべきで
ある。
【００４４】
本発明による実施形態について、ここで以下の非限定的な実施例に関して詳細に説明す
る。
【００４５】
［実施例１］
ＰＣＲは、標準的２００μＬのＰＣＲグレードポリプロピレンチューブ内で、１０μＬ
の総反応体積で、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から購入し、ストレプトアビジ
ン被覆ビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、製品ナンバーＰＭ
Ｓ３Ｎ／１００９８）に結合された、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕ
ｓ（ＭＲＳＡ）に見出されるｍｅｃＡ遺伝子、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕ
ｔａｎｓに対するビオチン化プライマー配列を含有する、ビーズのセットで実施された。
１つは２．５μｇのビーズ（約６０ｎＭ当量プライマー濃度）を含有し、１つは５μｇの
ビーズ（約１２０ｎＭプライマー濃度）を含有する、２つの異なる濃度のビーズを使用し
た。およそ３００〜４００コピーのそれぞれの種に由来する精製ｇＤＮＡを、対応する反
応試験管に添加した。プライマー以外のＰＣＲに必要とされるすべての試薬を含有するＰ
ＣＲマスターミックスを添加し、試験管を５０サイクルの熱サイクルにかけた。図６は、
ＤＮＡ１０００キットを使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００を
使用して上澄に対し実施されたその後の分析を示す。それぞれの分析物の第１のレーンは
、２．５μｇのビーズを含有するＰＣＲ反応の結果を示し、第２のレーンは、５μｇのビ
ーズを含有する反応の結果を示す。ブランクもまた、それぞれのビーズ濃度について走ら
せた。プライマーダイマー（典型的には高いプライマー濃度の指標である）は、メチシリ
ン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）およびＭＲＳＡブランク反応について明瞭である
。ビーズの量を２．５μｇまで減少させると、これら反応についてダイマー形成はなくな
った。強い増幅産物バンドが、２．５μｇビーズ濃度でＭＳＳＡおよびＭＲＳＡならびに
５μｇビーズ濃度でＳ．ｍｕｔａｎｓについて鋳型ＤＮＡを含有する試験管について見ら
れた。どちらのビーズ濃度でも、鋳型ＤＮＡを含有する試料でダイマーは顕著ではなかっ
た。これらの結果は、どのようにしてプライマーがビーズに付着し、反応ウェルに送達さ
れ、次に切断操作後の特異的ＰＣＲ増幅反応に関与することができるのかを示す。
【００４６】
図２〜図３のデバイス５０を、ビーズを特定のウェル６０内に（すなわち、決定性ロー
ディング）既知のパターンで配置するために使用した。単一ウェル内のマルチプレックス
反応とは対照的に、それぞれの反応はシングルプレックスであり、それゆえインターカレ
ーティング色素を検出のために使用でき、異なるフルオロフォアを有する複数のプライマ
ー／プローブセットを要する従来のマルチプレックスＰＣＲと比較して最適化時間を大幅
に減少させる。異なるアッセイのための新しいビーズセットの再構成または組込みは、ビ
ーズセットを置き換えることまたはより多くの反応ウェルをチップもしくはデバイス５０
に追加することにより容易に達成され得る。
【００４７】
デバイス５０への液体の移入は手動により行われたが、液体の取扱いは容易に自動化さ
れ得ることが理解されるべきである。固有のプライマーを有する前もって標識化されたビ
ーズが、単純な試薬分注技術を使用して個々のウェル６０内にロードされてもよい。溶液
は乾燥させておき、ビーズをＡＯＭ６８（または他の固相抽出表面もしくは材料）の表面
に放置する。
【００４８】
試料は、熱、試薬添加、遠心分離、酵素消化、または他の方法により前処理できる。試
料は、すでにプレロードされたプライマービーズを含有するそれぞれのウェル６０内に分
注され、廃棄物槽またはチャンネル６６に減圧を適用して、ＡＯＭ６８を通じて試料流体
を引き出し、ＡＯＭ上で分析物を捕捉する。次に、望ましい場合、洗浄緩衝液を反応ウェ
ル６０内に分注し、チャンネル６６に適用される減圧により除去できる。プライマーはビ
ーズに固着されるので、これらの試料クリーンアップ工程の間に洗い流されることはない
と考えられる。試料クリーンアップ後、プライマー以外のＰＣＲに必要とされるすべての
試薬を含有するＰＣＲマスターミックスを、反応ウェル６０に添加し、デバイス５０を熱
サイクルにかける。マスターミックスは鋳型特異的プライマーを一切含有しないので、同
じマスターミックスをすべての反応において使用できる。ＰＣＲ中のＤＮＡの変性に使用
される昇温はまた、ストレプトアビジンを変性させ、その後の第１のｒｔ−ＰＣＲサイク
ル中のビオチン化プライマーの放出を引き起こし、そのことにより標的ＤＮＡの増幅を開
始する。放出されたプライマーは、標的ＤＮＡがＰＣＲが開始される前にビーズ上のプラ
イマーと直接ハイブリダイズされていたかどうかにかかわらず、反応ウェル内で標的ＤＮ
Ａと自由に相互作用する。ストレプトアビジン−ビオチン以外のカップリングケミストリ
ーをいくつかの実施形態において使用でき、熱、結合の化学誘導変化、または光誘導変化
を使用して切断できる化学結合を使用した、ビーズへのプライマーの付着が含まれる。プ
ライマーは反応ウェル６０内に含有される溶液中に自由に放出されるので、固相抽出膜６
８（例えばＡＯＭ）に捕捉されたハイブリダイズしていないＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ（
ｄｓＤＮＡ）は早期に検出される。したがって、一本鎖（ｓｓＤＮＡ）およびｄｓＤＮＡ
の両方に対し、試料ＤＮＡをビーズに結合されたオリゴマーに直接ハイブリダイズする前
に通常は必要なｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡに変換する変性工程なしに、迅速な試料クリーン
アップを実施できる。プライマーはビーズに付着するので、いくつかの実施形態において
、ＤＮＡを洗い流すことなしＡＯＭで抽出でき、次にプライマーの溶液中への放出が、抽
出ＤＮＡの増幅／検出するためのＰＣＲを可能にする。ＡＯＭは、迅速な試料クリーンア
ップを可能にしてもよい。ＤＮＡ抽出はまた、ビーズに連結されたプライマーへの標的ｓ
ｓＤＮＡのハイブリダイゼーションまたはビーズ表面への標的ＤＮＡの吸着を通じて実施
できる。
【００４９】
上の例はＰＣＲ反応に関して論じられたとはいえ、同様の手順が任意の好適な反応、例
えば任意の核酸転写および／または増幅関連反応、蛍光発生基質もまた支持体表面と結合
する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光発生基質もまた支持体表面と結合す
る単一分子アレイ（ＳｉＭｏＡ）、コンビナトリアルケミストリーのための異なる試薬を
送達する複数のビーズを使用する反応、ビーズが触媒試薬を送達する反応、および／また
は確率的ビーズローディングにより決定される化学量論量で「クリック」ケミストリー試
薬を送達する反応に使用されてもよいことが理解されるべきである。
【００５０】
マイクロ流体部６６がＰＤＭＳで構築されており、基材６２がガラスで構築されている
、図２〜図３のデバイス５０等のｒｔ−ＰＣＲチップを使用して、システムを試験した。
フォワードＰＣＲプライマーで標識化されているビーズセットを、リバースＰＣＲプライ
マーで標識化されているビーズのセットと、１／１の比で、反応ウェル１〜３内で混合し
た（図７）。付着したフォワードおよびリバースプライマーの両方を有するビーズのセッ
トからの１−μＬアリコート（約１０μｇのビーズを含有する）を、ウェル４〜６のそれ
ぞれに添加した（図７）。ゲノムＤＮＡを１０μＬの体積でウェル１〜６に添加し、全部
で３００〜４００コピーの鋳型ＤＮＡをそれぞれのウェルに送達した。ウェルが乾燥する
まで廃棄物に減圧を適用した。次に、０．２８単位のＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ
ポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１×Ｐｌａｔｉｎｕ
ｍ  ｑＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘ−ＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃ
Ａ）、１％Ｂｌｏｃｋｅｒ  ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆ
ｏｒｄ、ＩＬ）および１×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを含有する５μＬのマスターミックスを
、それぞれのウェルに添加した。追加のプライマーは添加しなかった。廃棄物槽にＰＤＭ
Ｓプレモリマーを添加し、それを密封した。デバイス５０を６０サイクル、６６℃から９
５℃の熱サイクルにかけ、それぞれのサイクルの最後に蛍光画像を撮影した。
【００５１】
図７は、５０回目の増幅サイクル後のｒｔ−ＰＣＲチップのバックグラウンド除去され
た蛍光顕微鏡画像を示す。バックグラウンド除去された画像のセットを、ＳＹＢＲ  Ｇｒ
ｅｅｎインターカレーティング色素からの平均シグナル強度を計算するために使用した。
図８は、それぞれのウェルからの増幅プロットのグラフである。増幅が最初に明白となる
サイクル閾値（ＣＴ）は、すべての反応ウェルで一致している。この実験は、この技術を
使用して、成功し、再現性のあるオンチップｒｔ−ＰＣＲを実施できることを示す。単一
の反応において２つのプライマーの混合物がビーズに付着した単一ビーズセットと、フォ
ワードプライマーのみが一方のビーズセットに付着し、リバースプライマーが他方のビー
ズセットに付着した２つのビーズセットの混合物との間で、識別可能な差異はなかった。
プレロードされたビオチン化プライマーは、試料クリーンアップ工程中はビーズに強固に
付着したままだったが、ＰＣＲ中に溶液中に放出され、鋳型配列の増幅の成功が示された
。
【００５２】
［実施例２］
図９〜図１１のデバイス２００は、フォトリソグラフィを使用して、シリコン基材（基
材２２０）およびガラス基材（基材２１０）から作製される。シリコンウェハーを、マグ
ネトロンスパッタリングを使用して、５ｎｍのチタン（Ｔｉ）および１００ｎｍの金（Ａ
ｕ）で被覆した。金属化ウェハーを、ポジ型フォトレジストで被覆し、フォトリソグラフ
ィでパターニングし、その結果、５０μｍ×５０μｍまたは１００μｍ×１００μｍ平方
の領域のアレイが露出した。王水での処理により露出領域からＡｕ層を除去し、非常に親
水性である酸化チタンの層を残した。基材を、１−オクタデカンチオールで処理し、非常
に疎水性であるＡｕ表面上のみに自己組織化単分子層を形成した。（１−オクタデカンチ
オール等のチオールは、Ａｕとの強力な結合を形成するが、酸化チタンとは形成しない。
）
【００５３】
色素を含有する水性緩衝液でウェハーを被覆することにより、ウェハー側のみ（すなわ
ち、開放され、ガラスなし）の初期試験を実施した。鉱油を表面上に穏やかに流し、水相
の大部分は金−アルキルチオール表面から押し流された。水性緩衝液の小滴が、Ａｕが除
去された領域に残存した。それぞれの液滴により被覆されたウェハー状の範囲は、パター
ンによりよく画定されていたが、液滴の高さ（したがって、体積）は大きく異なっていた
。
【００５４】
パターニングされたガラスカバーを有するマイクロ流体デバイス２００または基材２１
０を、液滴サイズをよりよく制御するために作製した（図９〜図１１）。シリコンウェハ
ーを上述のとおり製作したが、光パターニングされた境界幅１ｍｍおよび高さ９〜２５μ
ｍを、エポキシ系ネガ型フォトレジスト（ＫＭＰＲ１０１０、Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ  Ｃｏ
ｒｐ．、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）で作製した。ガラス基材を、５ｎｍのＴｉおよび２０ｎｍ
のＡｕで被覆した。フォトリソグラフィによりＡｕを除去し、シリコン基材２２０上の対
応する四角部分（領域２２４）と相補的な親水性の四角部分（領域２１４）のアレイを残
した（図９）。ビアまたは開口部２４０を、研磨剤噴射を使用してガラス基材２１０を貫
通して穿孔した。ガラス基材２１０を、Ｆｉｎｅｔｅｃｈダイボンダ（ＦＩＮＥＰＬＡＣ
ＥＲ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してシリコン基材上に整列させ、エポキシ
（ＬＯＣＴＩＴＥ  Ｈｙｓｏｌ  Ｅ−１２０ＨＰ）を使用して永久的に結合した。図１０
は整列配置の模式図を示し、図１１はチップの断面の図を示す。ガラス上の金属フィルム
は、これらの厚さでほぼ透明であり、疎水性領域の整列配置および光学的照合を可能にす
る。オクタデカンチオールで飽和させたエタノール中で≧１２時間の処理後、チップを純
エタノールですすぎ、次に乾燥貯蔵した。
【００５５】
基材２１０、２２０上の金属フィルムをパターニングする代替的方法を、親水性および
疎水性領域を形成するために使用してもよく、フォトレジストで基材をパターニングし、
次にリフトオフおよび／または様々なスパッタリング手法、例えばアルゴンイオンスパッ
タリングで金属を堆積させることを含む。親水性および疎水性領域を形成するさらなる手
法は、当業者に容易に明らかであると考えられる。
【００５６】
アレイを分離領域へと分割するため、ネガ型フォトレジストの障壁または「レーン」２
５０を含むようチップを設計し、その結果不混和相の流れをよりよく調節できた（図１２
〜図１３）。製法は上述のものと類似しており、チップのレーンおよび外縁を、フォトリ
ソグラフィの同じ工程中にパターニングした。フォトレジストをパターニングした範囲か
らＡｕを除去した。なぜなら、アルキルチオール処理が、持続的な処理後にＡｕからのレ
ジストの層間剥離を引き起こすからである。色素の溶液を添加し、前述のとおりチップを
満たした。次に、鉱油を添加し、減圧を使用してそれをチップ中から引き出した。図１４
に見られるように、間隙（基材上の疎水性領域により画定される）を満たす鉱油で液滴を
単離した。少数の小さい、外れた液滴が観察されたが、ウェル間でつながったものはほと
んどまたはまったく観察されなかった。液滴の大多数が、類似し整然とした形態を示す。
【００５７】
２５０ｐＬまたは７５ｐＬの反応体積を形成するために高さ２５μｍまたは７．５μｍ
のＫＭＰＲ境界を使用して、１００μｍ×１００μｍの大きさの４４０個の反応領域を有
するデバイスを製作した。同じ全体面積内に２２．５ｐＬの体積をそれぞれ有する１５０
０個の反応ウェルを組み込んだ高い密度のアレイ（高さ９μｍのＫＭＰＲを有する５０μ
ｍ×５０μｍのパッド）もまた、製作して試験した。図１５Ａ〜図１５Ｃは、フルオレセ
イン色素を含有する水性緩衝液で満たされた３つのチップを示す。２．５〜５μＬの液滴
として水溶液を一方のビアに添加し、他方のビアに減圧を適用してチップを満たした。緩
衝液で満たした後、鉱油をビアに添加し、チップ中から引き出した。鉱油は、Ａｕ／アル
キルチオール表面を濡らし、水溶液をチップの大部分から追い出し、親水性の画定された
反応領域に単離された液滴を残す。充填／液滴単離プロセスは、非常に迅速であり得るの
であり、典型的には単離された反応ウェルを画定するのに約２分以下しか要さない。
【００５８】
［ｒｔ−ＰＣＲおよびデジタルＰＣＲ実験におけるチップの使用］
２２．５ｐＬ反応物（１チップ当たり１５００個）における単一標的分子レベルでのチ
ップ性能を検証するために、自由溶液プライマーを２５０ｎＭで使用するデジタルＰＣＲ
を使用した。図１６Ａ〜図１６Ｃは、０．７コピー、０．２コピー、および０．０４コピ
ーの鋳型ＤＮＡ／ウェルからの結果を示す（名目上の濃度）。少なくとも１つの標的コピ
ーを示す陽性ヒットは、全１５００個のウェル中、それぞれ総計で約１１００個（７３％
）、３６０個（２４％）、および１４０個（９％）存在した。ウェル間のポアソン分布を
仮定すると、１．３コピー／ウェル、０．２７コピー／ウェルおよび０．０９４コピー／
ウェルという計算された濃度は、名目上の濃度に合理的に近接し、試料調製中のサブマイ
クロリットルの体積でのピペッティングエラーを許容する。システムは急速な熱サイクリ
ングに最適化されていないとはいえ、２０分未満でＤＮＡの単一コピーの検出が達成され
ることに注目すべきである。短いサイクル時間は、様々なパラメータの一層の最適化で達
成されてもよい。
【００５９】
［高いサンプリング効率および高いビーズウェル占有率のための磁石を使用したビーズロ
ーディングの実証］
いくつかのチップ設計は、試料および試薬を単離された反応ウェルへと区分するのにガ
ラスおよびシリコン構成部分を使用してもよいが、これらの要素は、類似の構造および界
面化学をもってプラスチックで複製でき、例えば大量生産可能なモノリシックポリマーデ
バイスである。
【００６０】
重力に基づくローディングが観察され、シリコンおよびガラスチップ設計のための直径
３．２８μｍの磁気プライマー被覆ビーズの＞５５％の占有率をもたらしたとはいえ、総
ビーズ数からのサンプリング効率は悪かった（＜１％）。ビーズ上のプライマーへのハイ
ブリダイゼーションにより希少な標的配列のサンプリングを実行するため、本明細書では
、ビーズウェル内にロードされたビーズの総数を、試料とインキュベートされたスラリー
中のビーズの総数で割ったものを意味するものとして定義されるサンプリング効率は、可
能な限り高いものであるべきである。ビーズウェルの形状の改変および好適なブロッキン
グ緩衝液の使用により、磁気ローディングを使用しての占有率およびビーズサンプリング
効率を顕著に改善することが示された。ビーズの磁気操作は、ビーズウェルへのビーズの
送達の速度を大きく上げることができるが、磁場に沿ったビーズの整列は、磁気ローディ
ングでは達成されないという最近の論文で言及されているように、非最適化形状での多重
ローディングを引き起こす鎖状に並ぶという問題を抱え得る。［Ｋａｎ，Ｃ．Ｗ．ら  Ｌ
ａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ、２０１２、１２、５、９７７〜９８５頁］。
【００６１】
直径２．５μｍから５．４μｍの範囲のサイズで、４．５μｍ、５．７μｍ、および７
．０μｍの深さのビーズウェルのアレイをＳｉウェハー内に製作するために、ＤＲＩＥを
使用した。ウェハーをそれぞれ３〜４アレイのセクションに切り分けた。アレイをブロッ
キングし、ビーズ吸着を防止するために、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ  ＰＢＳ緩衝液
（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した（現在は、オンチップで観察される
ＰＣＲ阻害問題のため、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋの代わりに０．５％ＢＳＡを使用
する）。ビーズのアリコート（約１５０００個）をアレイの一方の側に置き、磁石をシリ
コンの裏側に沿って平行移動させ、ビーズをビーズウェルのアレイをまたいで引きずり、
その間ビーズを顕微鏡で観察した。相当数のウェルをまたいでビーズを引きずった後、ア
レイを脱イオン水で穏やかに洗浄し、約５ｎｍのＡｕ／Ｐｄでスパッター被覆し、ＳＥＭ
で画像化した。４．４μｍの深さでエッチングされたアレイのほとんどは、入念に洗浄し
た後のビーズの維持が悪い程度から中程度を示したが、より穏やかな洗浄での維持は許容
可能であると考えられる。７．０μｍの深さでエッチングされたアレイでは、ＳＥＭによ
り検査したとき、二重ビーズローディングの多くの事例が示された。直径３．５μｍのビ
ーズウェルでは、良好な維持が見られる一方で、相当程度のローディングが達成されるま
でに、アレイを複数回またいで通過させる必要があった。４．１μｍの直径を有する５．
７μｍの深さでエッチングされたアレイ（図１７Ａ〜図１７Ｂ）は、迅速にロードされ、
良好なビーズ維持を示した。この形状のビーズウェルで製作されたチップは、＜１５ｋの
ビーズでロードされ、典型的には洗浄後に８０％から＞９０％のビーズ占有率を示し、＞
８〜１０％のサンプリング効率をもたらし得る。図１８Ａ〜図１８Ｄは、ローディングプ
ロセス中に撮影された一連の画像を示す。ビーズは、蛍光ビーズの明るい凝集塊がアレイ
をまたいで動かされるにつれて、凝集塊からウェル内に堆積される。ローディング後の緩
衝液での洗浄により、ほとんどの遊離ビーズを除去し、ほとんどのウェルが単一のビーズ
でロードされた状態になる。まれに生じる二重ローディングは、４．５μｍから５．７μ
ｍの間の値までウェルの深さを減少させることにより、さらに減少されてもよい。＞１０
ｋのビーズ数が、より少数のビーズよりもはるかに速く配置できることが観察され、した
がって、サンプリング効率はビーズウェルの数が増加するにつれて改善し得る。磁石の形
状の一層の最適化および磁石移動の自動化は、占有率をさらに改善し、ローディング時間
を最短化し得る。いくつかの実施形態において、ビーズのウェルまたは収容領域に対する
様々な比を、ビーズ収容を改善するために使用してもよい。例えば、ビーズが直径ｄを有
する場合、固体支持体収容領域は、１．０５ｄから１．５５ｄの直径および１．２ｄから
１．８ｄの深さを有する円柱形状を有すると現在は考えられている。この比は、本明細書
に記載の磁気ビーズローディングを使用するときに特に有益であり得る。加えて、この比
は、任意の好適なビーズアレイローディング用途またはデバイス、例えばＳｉＭｏＡにお
いて使用されてもよい。
【００６２】
［反応体積を減少させることによりダイマー形成を減少させる］
３つの標的についてのビオチン化プライマーセットの試験を完了し、マスターミックス
の総体積をより小さい、単離された反応へと分割したときのプライマーダイマー形成に対
する効果を探究した。大量に並行する空間的マルチプレクシング（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉ
ｎｇ−ｉｎ−ｓｐａｃｅ）は、すべてのプライマーセットに適合する熱サイクルプログラ
ムを要し得る。ｎｕｃ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、およびｍｅｃＡプライマーセットについて顕
著なプライマーダイマー形成が、ポリプロピレンＰＣＲチューブ内で従来の体積（５〜１
０μＬ）で、低アニーリング温度でＰＣＲを実施するときに典型的には認められる一方で
、より小さい体積でのオンチップでのプライマーダイマー形成の減少もまた観察された。
これらの観察が表面相互作用の差異による可能性がある一方で、代替的説明の１つは、プ
ライマーの濃度が同じままであるとはいえ、所定の反応におけるプライマー分子の総数（
それゆえ、非特異的相互作用を増幅する可能性）が、総プライマー数の減少とともに減少
するというものであり得る。加えて、精製中に除去されない、合成中に形成する微量の形
成不全のプライマーもまた、非特異的増幅を引き起こし得る。任意の所定の反応において
これらの不純物の発生率を非常に低いものとする反応の分節化は、これらの非特異的反応
の事例を減少させると考えられる。単一のビーズ反応に使用される体積を大きく（標準的
な１０μＬ反応物よりも数百万から数千倍低く）減少させることは、低アニーリング温度
でのいくつかのセットにおけるプライマーダイマー形成ゆえに、従来の体積の反応におい
て現在は適合しないプライマーセットの使用を可能にすることが予測される。プライマー
設計の制約を緩和するこの能力は、この手法のアクセシビリティを大きく改善し、新たな
疾患の検出のための新規標的配列を含める再構成を大きく加速すると考えられる。多くの
場合、ダイマー形成はまれな現象であるが、それが生じると、増幅され、反応体積全体に
わたって広がる。ＰＣＲマスターミックスの所定の体積を、多くの単離されたウェルに分
割するとき、まれに生じるダイマー形成（またはわずかな不純物）は、多くの小反応体積
の１つに効果的に隔離され、反応の大多数は影響を受けないままである。
【００６３】
【表１】
0006420431.tif 000002
【００６４】
ＰＣＲチューブ中の５μＬ反応物におけるダイマー形成の程度を、３００ｎＬオンチッ
プ反応において観察されるものと比較するため、予備的試験を実施した。３つのストック
マスターミックスを調製し、それぞれが５００ｎＭの異なるプライマーセット（表２）、
１％Ｂｌｏｃｋｅｒ  ＢＳＡ、１×Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣ
Ｒ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ、１×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、および０．０６２５単
位／μＬの追加のＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する。次に、９
つのアリコート（５μＬ）をプロピレンＰＣＲチューブに分注し、６０℃のアニーリング
温度で６０サイクルの熱サイクルにかけた。熱サイクル後、ＤＮＡ  １０００チップでＡ
ｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００上でキャピラリーゲル電気泳動を使用
してＰＣＲミックスを分析した。これらの反応の１１〜２２％でダイマー形成が観察され
た。上のとおり配合したマスターミックスから、５０個のオンチップ反応（それぞれ３０
０ｎＬ）を調製し、ｒｔ−ＰＣＲを使用してオンチップで熱サイクルにかけた。オンチッ
プ反応のうち１つのみが、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ蛍光シグナルにおいてプライマーダ
イマーを示した。Ｓ．ｍｕｔａｎｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡおよびｍｅｃＡ配列の陽性対照は
、それぞれ１１／１１の反応について増幅の成功を示した。
【００６５】
［プライマー官能化ビーズとのハイブリダイゼーション］
バルクビーズおよびスタンダードＰＣＲを使用した、希釈液中の試料ＤＮＡに対するプ
ライマー標識化ビーズの能力に関する予備的調査を実施した。標的ｇＤＮＡ（約３５０コ
ピー／μＬ）を、１５分間３７℃で、制限酵素（例えばＥｃｏＲＶ、Ｂｐｕ１０Ｉ、およ
びＳｆａＮＩ）で消化し、標的化領域の近くのＤＮＡを切断した。次に、消化物を９５℃
まで５分間加熱し、ＤＮＡを変性させた。次に、１０μＬのこの消化物（約３５００コピ
ー）を１０〜１５分間、５μＬのビーズスラリー（約２５μｇのビーズ）とともにインキ
ュベートした。ＰＣＲ緩衝液（ポリメラーゼなし）で３回の１５μＬ洗浄工程を実施した
。次に、１．５μＬアリコートをＰＣＲマスターミックスに添加し、５μＬ反応物を形成
し、６０回の熱サイクルにかけた。ゲルにプロットされた典型的な電気泳動図を、図２０
に示す。洗浄工程間での０．５μＬのキャリーオーバーを仮定する場合、約０．０１３コ
ピーの標的ＤＮＡのみが液相中に移行した。したがって、これらの予備的結果は、ビーズ
が何らかの仕方でＤＮＡを捕捉していることを示す。ビーズへのＤＮＡ付着のメカニズム
は、特異的ハイブリダイゼーションまたは非特異的吸着であってもよい。ハイブリダイゼ
ーションが効率的サンプリングおよび可能な最低検出限界にとって好ましい一方で、ある
程度の非特異的吸着は、標的の同一性がＰＣＲ増幅により決定されるので、アッセイに有
害である可能性は低い。
【００６６】
［実施例３］
図２１Ａ〜図２１Ｃは、複数の遺伝子マーカー（ｎｕｃおよびｍｅｃＡ、陰性対照とし
てＳ．ｍｕｔａｎｓ）によるＭＲＳＡの検出のための典型的なコード化ビーズベースアッ
セイからの代表セクションを示す。
【００６７】
ストレプトアビジン被覆ビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、
製品ナンバーＰＭＳ３Ｎ／１００９８）の３つのアリコートを、別々の２００μＬ  ＰＣ
Ｒグレードポリプロピレンチューブ内に置いた。フォワードおよびリバース５’−ビオチ
ン化プライマーの異なるセットを、それぞれのアリコートとともにインキュベートし、そ
の結果、１つのアリコートはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｇＤＮＡに
見出されるｎｕｃ遺伝子のためのプライマーを含有し、別のものはメチシリン耐性Ｓ．ａ
ｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）に見出されるｍｅｃＡ遺伝子のためのプライマーを含有し、第３
のものはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ｇＤＮＡのためのプライマーを含
有した。インキュベーション後、ビーズ表面に結合していないプライマーを除去するため
、ビーズを緩衝液で洗浄した。次に、コード化を目的として、ｍｅｃＡ遺伝子のためのプ
ライマーを有するビーズを、ビオチン標識化Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５ナノ結晶（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とともにインキュベートし、Ｓ．ｍｕｔａ
ｎｓ  ｇＤＮＡのためのプライマーを有するビーズを、ビオチン標識化Ｑｄｏｔ（登録商
標）６５５ナノ結晶（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにインキュベートした。Ｓ．ａｕｒ
ｅｕｓに見出されるｎｕｃ遺伝子のためのプライマーを有するビーズを、緩衝液のみでイ
ンキュベートした。インキュベーション後、結合していないビオチン標識化Ｑｄｏｔナノ
結晶を除去するため、ビーズセットを緩衝液で洗浄した。このようにして、基本的なコー
ド化スキームを実行したが、コード化はこの方法に限定されず、本明細書に記載の様々な
他の方法を使用してもなされ得る。次に、それぞれのセットからのビーズのアリコートを
混合し、３つのビーズタイプすべてを含有するスラリーを形成した。ビーズタイプは、蛍
光顕微鏡を使用して、Ｑｄｏｔ６０５、Ｑｄｏｔ６５５、または非標識ビーズの自己蛍光
からの発光をモニターすることにより容易に識別可能だった（図１９Ａ〜図１９Ｃ）。
【００６８】
個々のビーズを別々の反応ウェル（それぞれ約２２．５ｐＬ）に単離するため、マイク
ロ流体チップ、例えば図９〜図１１におけるデバイス２００を使用した。簡潔に述べると
、シリコンウェハーを、マグネトロンスパッタリングを使用して、５ｎｍのチタンおよび
１００ｎｍの金で被覆した。ガラス基材もまた、５ｎｍのチタンおよび２０ｎｍの金で被
覆した。１５００個の反応領域のアレイを形成するため、シリコンウェハーおよびガラス
基材の両方でフォトリソグラフィパターニングを使用し、それぞれの領域は一辺が５０μ
ｍの大きさの四角部分として画定し、金を除去して親水性酸化物表面を残した。フォトリ
ソグラフィおよび深掘り反応性イオンエッチングを使用して、それぞれの反応領域の中央
に、直径約４．１μｍおよび深さ５．７μｍの大きさの単一のビーズウェルをエッチング
した。ネガ型フォトレジスト（ＫＭＰＲ１０１０、ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．、Ｎ
ｅｗｔｏｎ、ＭＡ）の層を、シリコンウェハーの表面上にパターニングし、チャンネルお
よび高さ約９μｍの壁のパターンを形成した。ガラス基材における試薬添加のための穴の
製作後、それをシリコンウェハー上に整列させ、その結果、親水性酸化物パターンがシリ
コンウェハー上のそれと合わさった。次に、エポキシを使用してこれら２つを結合し、そ
の結果、約９μｍのギャップによりガラス基材がシリコンウェハーから隔てられた。デバ
イスを、純エタノール中の１−オクタデカンチオールの飽和溶液で満たし、＞１２時間放
置し、その結果、アルキルチオールの自己組織化単分子層がガラスおよびシリコン基材の
金表面上に形成された。
【００６９】
マイクロ流体デバイスを緩衝液で満たし、次に、３つの異なるビーズタイプを含有する
少量の混合物をデバイス内にロードした。デバイスの外側に磁石を適用し、その結果、シ
リコン基材にエッチングされたビーズウェルのアレイをまたいで磁気ビーズを引きずった
。単一のビーズが約８０％から９０％超のビーズウェルにロードしたことが観察された。
アレイを緩衝液で洗浄し、遊離ビーズを除去した。次に、蛍光顕微鏡によりアレイを画像
化し、それぞれのロードされたビーズのタイプおよび位置を決定した。
【００７０】
１×Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ｑＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘ−ＵＤＧおよび０．１１単位／μＬ
の追加Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒ
ｌｓｂａｄ、ＣＡ）、０．５５％Ｂｌｏｃｋｅｒ  ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、および１×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、および２５ｐＬ反応物当たりおよそ１５コピ
ーのＭＲＳＡ  ｇＤＮＡ（ＡＴＣＣ＃  ７００６９９Ｄ−５）で、ＰＣＲマスターミック
スを調製した。次に、マスターミックスをマイクロ流体デバイス内にロードし、その結果
、それは完全にガラスとシリコンとの間のギャップを満たした。次に、鉱油をデバイスに
添加し、減圧によりウェルアレイをまたいで移動させた。鉱油は優先的には、アルキルチ
オール処理された金表面を湿らせ、露出した親水性酸化物表面の間に挟まれた単離された
約２５ｐＬの水性液滴を残す。
【００７１】
チップを熱サイクルステージ上に置き、そこでそれを５０℃まで１２秒間、９０℃で１
２０秒間、次に９０℃で５秒間および６０℃で３０秒間を３０サイクルで加熱した。毎サ
イクル後にアレイを画像化し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉインターカレーティング色素か
らの蛍光発光をモニターした。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ｇＤＮＡに見出されるｎｕｃ遺伝子の
ためのプライマーを担持するものとして同定されるビーズを含有する反応ウェルのおよそ
９４％が、ＰＣＲ増幅の証拠を示し、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）に見
出されるｍｅｃＡ遺伝子のためのプライマーを担持するビーズを含有する反応ウェルの約
９４％と同様だった。Ｓ．ｍｕｔａｎｓ  ｇＤＮＡのためのプライマーを含有するものと
して同定されるウェルの約６％のみが、陽性の結果を示した。ビーズウェルのおよそ２％
が、１つのＭＲＳＡプライマービーズおよび１つのｍｕｔａｎｓプライマービーズの両方
を含有するものとして同定された。ｎｕｃ遺伝子のためのプライマーを担持するビーズの
二重ローディングがいくつか生じ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓプライマーセットに見られる偽陽性
を引き起こした可能性が高いが、これは容易には、ビーズのポリスチレンシェルからの弱
い自己蛍光シグナルと識別できなかった（なぜなら、このセットではコード化色素が使用
されなかったからである）。ビーズウェル形状のさらなる最適化およびより高度に洗練さ
れたコード化方法が、偽陽性シグナルを減少させるために容易に実行できることが予測で
きる。
【００７２】
図１９Ａ〜図１９Ｄに示されるように、約２５ｐＬの体積を有する１２個の反応ウェル
の蛍光顕微鏡画像において、チップの小さな一領域が示される。図１９Ａは、３６５／１
０ｎｍ  ｅｘ．および６０５／５５ｎｍ  ｅｍ．でのコード化画像である。Ｑｄｏｔ  ６
０５で標識化された３つのビーズおよびＭＲＳＡ  ｇＤＮＡに見出されるｍｅｃＡ遺伝子
のためのプライマーが、白い四角でハイライトされている。図１９Ｂは、４４５／５０ｎ
ｍ  ｅｘ．および６６５／３０ｎｍ  ｅｍ．でのコード化画像を示す。Ｑｄｏｔ  ６５５
で標識化された４つのビーズおよびＳ．ｍｕｔａｎｓ  ｇＤＮＡのためのプライマーが、
白い四角でハイライトされている。図１９Ｃは、５５６／２０ｎｍ  ｅｘ．および６２０
／６０ｎｍ  ｅｍ．での第３のコード化画像を示す。すべてのビーズセットがこれらの波
長で弱く自己蛍光を発し、Ｑｄｏｔ  ６０５およびＱｄｏｔ  ６５５の両方で標識化され
たビーズは明るく蛍光を発する。Ｑｄｏｔ標識なしのビーズ（白い四角でハイライトされ
ている）は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ｇＤＮＡに見出されるｎｕｃ遺伝子のためのプライマー
を担持する。空ビーズウェルが白い六角形でハイライトされている。図１９Ｄは、熱サイ
クル３０回後の、４７０／４０ｎｍ  ｅｘ．および５２５／５０ｎｍ  ｅｍ．でのアッセ
イ画像を示す。相当量の二本鎖ＤＮＡの存在下でのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ蛍光は容易
に検出でき、分析物の検出を示す。四角で囲んだ反応ウェルは、シグナルの大きな増加を
示した一方で、他の反応ウェルは自己蛍光またはインターカレートされていないＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ  Ｉからの弱いシグナルしか示さず、プライマーを含有しないウェル（白い
六角形）により示されるものと同様だった。
【００７３】
【表２】
0006420431.tif 000003
【００７４】
したがって、ＰＣＲプローブ（例えば、とりわけＴａｑｍａｎおよび分子標識プローブ
）はＰＣＲの特異性を改善でき、プローブが固相への付着のためにビオチン化されている
か、あるいは官能化されている場合、それらは容易にプライマーとともにビーズに付着す
る。ビーズが反応ウェル内に決定性ローディングされるとき、単一の検出フルオロフォア
がすべてのプローブセットについて使用されてもよい。プローブが組み込まれる場合、追
加の最適化が実施されてもよい。両方のタイプの反応について類似の熱サイクルおよびマ
スターミックス条件を使用する場合、プローブを使用する反応と同一のチップ上で、プロ
ーブを要しないＰＣＲ反応を使用できる。いくつかの場合、ユニバーサルプライマーを自
由溶液中でマスターミックスに添加でき、特異的プローブを特異的プライマーセットの代
わりにビーズに付着できる。
【００７５】
本発明のいくつかの実施形態が、ＰＣＲ前にＤＮＡを精製するために固相抽出膜６８（
図２〜図３）を使用する一方で、デバイスを他の仕方で実施して、標的ＤＮＡの、マイク
ロビーズに結合したその配列特異的プライマーへの直接ハイブリダイゼーションを使用で
きる。ビーズ混合物が分析物ＤＮＡまたはｃＤＮＡとともにインキュベートされるとき、
ビーズに付着したプライマーは、ハイブリダイゼーションプローブとして作用し、そのビ
ーズに特異的な配列を捕捉して精製すると考えられる。プライマーの長さおよび配列を制
御することまたは新規核酸塩基の追加によりこれらのハイブリダイゼーション現象を最適
化するよう、プライマーを設計できる。試料マトリクスの干渉成分（外来ｇＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、細胞膜成分等）を洗い流し、精製された標的ＤＮＡをビーズに結合したプライマーに
ハイブリダイズさせることができる。
【００７６】
多くの反応ウェルが、プライマーで標識化された同じセットの１つまたは複数のビーズ
または表面を含有し得る、デジタルＰＣＲフォーマットのいくつかの実施形態もまた実行
してもよい。次に、定量は終点検出に基づいていてもよい。等温増幅を使用した標的の定
量もまた、デジタルＰＣＲアプローチと同様に達成され得る。
【００７７】
前述されたことは、本発明を例示するのであって、それを限定するものとして解釈され
るべきではない。少数の典型的な本発明の実施形態が説明されたとはいえ、実質的に本発
明の新規な教示および利点から逸脱することなしに、典型的実施例において多くの変更が
可能であることを、当業者は容易に認めると考えられる。したがって、かかる変更のすべ
てを、請求項に定義される本発明の範囲内に含めることが意図されている。したがって、
前述されたことは本発明を例示するのであって、開示された特定の実施形態に限定するも
のとして解釈されるべきでなく、開示された実施形態ならびに他の実施形態に対する変更
は、添付の請求項の範囲内に含まれることが意図されていることが理解されるべきである
。本発明を以下の請求項により定義し、請求項と均等なものはその中に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
0006420431.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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