(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）からアポＡ−Ｉを得る方法であって：
（ａ）エタノール１５〜３０％（ｗ／ｗ）を含む緩衝溶液（Ｂ）にアポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）を懸濁させ、ここで、懸濁させたアポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）は６．４〜１０．０の範囲のｐＨを有する工程と、
（ｂ）アポＡ−Ｉタンパク質を可溶化したままに維持しながら、懸濁液から不純物を除去する工程と、
（ｃ）アポＡ−Ｉを懸濁液から沈殿させる工程と、
（ｄ）アポＡ−Ｉ沈殿物を回収する工程と
を含み、
ここで、アポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）は、血漿画分ＩＶである、前記方法。
【請求項２】
緩衝溶液（Ｂ）は、エタノール２０％（ｗ／ｗ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
懸濁させたアポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）は、７．２〜８．８の範囲のｐＨを有する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
懸濁させたアポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）は、８．１〜８．５の範囲のｐＨを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
懸濁させたアポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）は、７．０〜７．６の範囲のｐＨを有する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項６】
緩衝溶液（Ｂ）は、５ｍＭ〜３５ｍＭのＮａＨＣＯ3を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）で、アポＡ−Ｉタンパク質画分（Ａ）対緩衝溶液（Ｂ）の体積比は１：１〜１：５である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）で形成された懸濁液の伝導率は５ｍＳ／ｃｍ未満である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）で、エタノールをアルコール濃度５５〜６５％（ｗ／ｗ）まで添加することによって、不純物を沈殿させて除去する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｂ）で、懸濁液に添加するエタノールは、−５℃〜１５℃の温度を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｂ）で、沈殿に続く濾過、遠心分離、デカンテーション、限外濾過および／または沈降分離によって不純物を除去する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｃ）で、懸濁液のｐＨを４．６〜５．６の範囲に調整する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｃ）で、アポＡ−Ｉを沈殿させるために、懸濁液の温度を−２〜２０℃に調整する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
エタノールを４０〜９６％（ｗ／ｗ）の範囲で添加することによって、回収したアポＡ−Ｉ沈殿物を脱脂することを含む工程（ｅ）をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法に従ってアポＡ−Ｉを製造する工程と、
該アポＡ−Ｉを薬学的に許容される担体または賦形剤と組み合わせる工程と
を含む、医薬組成物の製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法に従ってアポＡ−Ｉを製造する工程と、
該アポＡ−Ｉを脂質と組み合わせて、それにより再構成ＨＤＬを製造する工程と
を含む、再構成ＨＤＬの製造方法。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法に従ってアポＡ−Ｉを製造する工程と；
該アポＡ−Ｉを脂質と組み合わせて、それにより再構成ＨＤＬを製造する工程と；
該再構成ＨＤＬを薬学的に許容される担体または賦形剤と組み合わせて、それにより医薬組成物を製造する工程と
を含む、医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分からアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉ）を回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉは、血液中の重要なリポタンパク質である（ＨＤＬ）の主要なタンパク質成分である。これは肝臓および腸によって合成され、血液中のＨＤＬの生理的機能；「コレステロール逆輸送」（ＲＣＴ）として知られる機序によって、末梢組織からコレステロールを除去し、肝臓または他のリポタンパク質にコレステロールを運搬して戻す機能を担っている。
【０００３】
疫学的および縦断的な研究に基づいて、血清コレステロールレベルの上昇と冠状動脈性心疾患の発症に明確な相関性があることが幾度も確証されてきた。
【０００４】
それ故、ＨＤＬ中のアポＡ−Ｉは抗炎症機能を有し、ＣＨＤの発生および発症を抑制すると考えられている。さらに、アポＡ−Ｉは血液中の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルを低減することがわかっており、また、内毒素に結合し、このためＨＤＬの抗内毒素機能において主要な役割を果たすことが知られている。
【０００５】
ＨＤＬおよびその主要な成分としてのアポＡ−Ｉの「保護的」役割が複数の研究において確認されており、アポＡ−Ｉは、アテローム性動脈硬化症の処置、急性冠症候群（ＡＣＳ）の処置、抗炎症処置、抗毒素処置、肝臓を標的とする薬物などに施用するための有望な候補（特に再構成ＨＤＬの一部として）になっている。
【０００６】
現在では、ヒト血漿は大量に採取され、個別の画分に処理され、その中にはアポリポタンパク質Ａ−Ｉを含有するものがある。画分は、元来米国で開発され、Ｃｏｈｎ法またはＣｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙ法として知られている手順［非特許文献１；非特許文献２］に従って、エタノール分画法により製造することができる。アポリポタンパク質を含有する血漿画分は、この方法の変型であるＫｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法［非特許文献３；非特許文献４］によって製造することもできる。いずれの方法も、アルコール中の沈殿差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）に基づいている。
【０００７】
アポリポタンパク質Ａ−Ｉをエタノールの沈殿画分から回収する様々な手法が文献に記載されている：
【０００８】
例えば、特許文献１は、ｐＨ範囲３〜５または６〜９の緩衝水溶液中にヒト血漿またはヒト血清の画分を再懸濁させることによってこれらの画分からアポリポタンパク質を製造することに関する。望ましくない混入物は、短鎖脂肪族アルコールの添加によって沈殿させる。混入物を沈殿させるために、高濃度のエタノール（６８〜９６％エタノール）を含有する緩衝液が使用される。リポタンパク質が凝集する可能性は、高温、わずかにアルカリ性のｐＨによって、またはカオトロピック剤もしくは表面活性物質を添加することによって阻止され、これらはその後ゲル濾過によって除去される。陰イオン交換クロマトグラフィー工程を取り入れて、混入物をまとめ、一方で、アポリポタンパク質を通過させる。
【０００９】
非特許文献５は、尿素を濃度６Ｍで含有する抽出緩衝液の使用を開示している。
【００１０】
特許文献２には、アポリポタンパク質Ａ（アポＡ−Ｉ）またはアポリポタンパク質Ｅ（アポＥ）をヒト血漿から回収するための上記２つの方法の組合せが記載されている。前記文献は、８Ｍの尿素を含有する抽出緩衝液の使用による少なくとも１つの予備精製工程と、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用するさらなる精製工程とを含む方法を開示している。この特許文献２において、２０％エタノールを含む抽出緩衝液を使用する実験からアポＡ−Ｉの１％の回収が実現した。特許文献３は、アポＡ−Ｉを沈殿させるために低めの濃度のエタノール（８〜１４％）を使用することを含む、α−１アンチトリプシンからアポＡ−Ｉを分離する方法を教示している。
【００１１】
超高速遠心および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のような他の方法も、アポＡ−Ｉを回収するために使用される。しかし、これらの方法ではアポＡ−Ｉの製造にきわめて時間がかかり、微量のアポＡ−Ｉしか製造できない。したがって、これらの方法はアポＡ−Ｉの工業生産には不適である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＵＳ５，０８９，６０２
【特許文献２】ＷＯ９８／０７７５１
【特許文献３】ＷＯ２００９／０２５７５４
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｅ．Ｊ．Ｃｏｈｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６８、４５９〜４７５頁、１９４６
【非特許文献２】Ｊ．Ｌ．Ｏｎｃｌｅｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７１、５４１〜５５０頁、１９４９
【非特許文献３】Ｈ．Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ３７、８６６〜８７３頁、１９５４
【非特許文献４】Ｐ．ＫｉｓｔｌｅｒおよびＨ．Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  ７、４１４〜４２４頁、１９６２
【非特許文献５】Ｋｉｍら、Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈｅｌｆ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １６、７８５〜７９２頁（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、アポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分からアポＡ−Ｉを抽出および回収する方法であって、大規模生産に適し、アポＡ−Ｉを高収率で得ることを可能にする方法が依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本明細書において、アポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）からアポＡ−Ｉを得る方法であって、（ａ）直鎖状または分枝鎖状Ｃ１〜Ｃ４アルコール１５〜３０％（ｗ／ｗ）を含む緩衝溶液にアポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分を懸濁させて懸濁液を形成し、ここで、懸濁させたアポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）は６．４〜１０．０の範囲のｐＨを有する工程と、（ｂ）アポＡ−Ｉタンパク質を可溶化したままに維持しながら、懸濁液から不純物を除去する工程と、（ｃ）アポＡ−Ｉを懸濁液から沈殿させる工程と、（ｄ）アポＡ−Ｉ沈殿物を回収する工程とを含む方法を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、緩衝溶液は、直鎖状または分枝鎖状Ｃ１〜Ｃ４アルコール２０％（ｗ／ｗ）を含む。いくつかの実施形態では、懸濁させたアポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）は、８．１〜８．５の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、懸濁させたアポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）は、７．０〜７．６の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、緩衝溶液は、５ｍＭ〜３５ｍＭのＮａＨＣＯ３を含む。いくつかの実施形態では、直鎖状または分枝鎖状Ｃ１〜Ｃ４アルコールはエタノールである。
【００１７】
いくつかの実施形態では、工程（ａ）で、アポＡ−Ｉタンパク質画分対緩衝溶液の体積比は１：１〜１：５である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、工程（ａ）で形成された懸濁液は５ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、工程（ｂ）で、直鎖状または分枝鎖状Ｃ１〜Ｃ４アルコールをアルコール濃度４５〜６５％（ｗ／ｗ）まで添加することによって、不純物を沈殿させて除去する。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）で添加する直鎖状または分枝鎖状Ｃ１〜Ｃ４アルコールは、約−５℃〜１５℃の温度を有する。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）で沈殿させた不純物を、濾過、遠心分離、デカンテーション、限外濾過および／または沈降分離によって懸濁液から除去する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、工程（ｃ）で、懸濁液のｐＨを４．６〜５．６の範囲に調整する。いくつかの実施形態では、工程（ｃ）で、懸濁液は、アポＡ−Ｉを沈殿させるために−２〜２０℃の温度を有する。
【００２１】
いずれかの実施形態によれば、本方法は、例えば、アルコール、例えばエタノールを約４０％〜約９６％エタノール（ｗ／ｗ）の範囲内の濃度で添加することによって、回収したアポＡ−Ｉ沈殿物を脱脂する工程（ｅ）をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、エタノールを約４０％または約５０％の濃度まで添加することによって、回収したアポＡ−Ｉ沈殿物を脱脂する。エタノールは任意の医薬品等級エタノールとすることができる。本発明の特定の実施形態では、エタノールは９５％医薬品等級エタノール（５％メタノールを含有する３Ａ）である。
【００２２】
いくつかの実施形態によれば、本方法は、精製アポＡ−Ｉを少なくとも０．５０ｇ／Ｌ血漿の収率で回収する。
【００２３】
本発明の別の態様において、（ａ）アポＡ−Ｉ  １グラム当たりＩｇＡ  ０．３ｍｇ未満を含む精製アポＡ−Ｉを提供する。
【００２４】
また、本明細書に記載するいずれかの方法により得られるアポＡ−Ｉ、かかるアポＡ−Ｉと薬学的に許容される担体または賦形剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）とを含む医薬組成物、および／またはかかる組成物の製造方法も提供する。
【００２５】
また、本明細書に記載するいずれかの方法により得られるアポＡ−Ｉから製造される再構成ＨＤＬ、かかる再構成ＨＤＬと薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物、および／もしくは再構成ＨＤＬの製造方法ならびに／または再構成ＨＤＬを含む組成物も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】アポＡ−Ｉの収率に対する、緩衝液の体積、緩衝液の濃度、エタノールの濃度、温度、ｐＨおよび混合時間の影響。図１は、血漿から得られるアポＡ−Ｉの収率が、低めの濃度のエタノールを含む緩衝溶液（Ｂ）を使用したときに最大になることを示す。
【図２】アポＡ−Ｉの収率に対するエタノールの濃度およびｐＨの影響。図２は、血漿から得られるアポＡ−Ｉの収率が、エタノールを１５〜３０％の範囲内の濃度で含む緩衝溶液（Ｂ）を使用したときに最大になることを示す。
【図３】アポＡ−Ｉの収率に対するエタノールの濃度およびｐＨの影響を表す等高線図。図３は、２０〜５０％の範囲内のエタノールの濃度を使用したときの、アポＡ−Ｉの収率に対するｐＨの影響をさらに示す。収率は、エタノールを１５〜３０％の範囲内の濃度で含む緩衝溶液（Ｂ）にアポＡ−Ｉを懸濁し、懸濁液のｐＨが６．４〜１０．０の範囲内であるときに最大になる。
【図４】アポＡ−Ｉの収率に対するエタノールの濃度の影響を示す適合線プロット（Ｆｉｔｔｅｄ  ｌｉｎｅ  ｐｌｏｔ）。図４は、血漿から得られるアポＡ−Ｉの収率が、エタノールを１５〜３０％の範囲内の濃度で含む緩衝溶液（Ｂ）を使用したときに最大になることを示す。
【図５】実施例６に記載する方法によって精製したアポＡ−Ｉ沈殿物（工程ｄ）におけるタンパク質分解活性（Ａ）および非活性化部分トロンボプラスチン時間（ＮａＰＴＴ）凝固時間（Ｂ）。図５は、画分ＩＶ材料を再可溶化中に冷却時間を最小限にすると、精製アポＡ−Ｉ生成物においてタンパク質分解活性および凝固因子活性化が低減されることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
アポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）からアポＡ−Ｉを得る方法であって：（ａ）直鎖状または分枝鎖状Ｃ１〜Ｃ４アルコール１５〜３０％（ｗ／ｗ）を含む緩衝溶液（Ｂ）にアポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）を懸濁させ、ここで、懸濁させたアポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）は６．４〜１０．０の範囲のｐＨを有する工程と、（ｂ）アポＡ−Ｉタンパク質を可溶化したままに維持しながら、懸濁液から不純物を除去する工程とを含む方法を、本明細書に記載する。特定の実施形態では、工程（ｂ）の次に、（ｃ）アポＡ−Ｉを懸濁液から沈殿させる工程と、場合により、（ｄ）アポＡ−Ｉ沈殿物を回収する工程とが続く。
【００２８】
本明細書に記載する方法に関連して、「アポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分を懸濁させる」という表現は、アポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分を可溶化し、これによりタンパク質画分の少なくとも大部分を溶液中に組み入れることを意味する。
【００２９】
驚くべきことに、直鎖状または分枝鎖状Ｃ１〜Ｃ４アルコール１５〜３０％（ｗ／ｗ）を含むある体積の緩衝溶液（Ｂ）中に、アポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）を可溶化し、ここで、懸濁させたアポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）が、６．４〜７．５または８．１〜８．５を含む６．４〜１０．０の範囲のｐＨを有する場合、尿素のようなカオトロピック物質を添加しなくても、従来知られている方法よりずっと多量のアポＡ−Ｉタンパク質を一定の緩衝液体積中に懸濁させることができることが判明した。したがって、出発画分（Ａ）から得られるアポＡ−Ｉの量は、従来知られている方法と比較して大幅に増加させることができる。
【００３０】
この発見は特に注目に値する。なぜなら、技術の現状に従うと、１５〜３０％（ｗ／ｗ）の範囲のアルコール濃度はアポＡ−Ｉタンパク質を可溶化するのに不十分であり、収率がきわめて低いものになるからである。
【００３１】
この予測とは対照的に、いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法によるｐＨとアルコール濃度との独自の組合せにより、少なくともアポＡ−Ｉ  ０．５０グラム／リットル血漿（ｇ／Ｌ血漿）の収率での精製アポＡ−Ｉを実現する。いくつかの実施形態では、少なくともアポＡ−Ｉ  ０．６０ｇ／Ｌ血漿が、本明細書に記載する方法（工程ｂで）によって得られる。逆に、エタノールの量が３０％ｗ／ｗを超えると、その場合、アポＡ−Ｉの回収量は低減する。例えば４５％ｗ／ｗでは、アポＡ−Ｉの回収量はおよそ０．１２ｇ／Ｌ血漿であり、本明細書に記載する方法がアポＡ−Ｉ回収量を少なくとも３００％増加させることが可能であることを示している。
【００３２】
本明細書に記載する方法は、関連技術に示唆されている方法より簡易で安価な、アポＡ−Ｉを可溶化する方法を提供する。また、低めの濃度の直鎖状または分枝鎖状Ｃ１〜Ｃ４アルコールを使用することにより、爆発の危険が低減され、沈殿工程の製造ユニットの建設に関してコストが下がるという利点をもたらす。
【００３３】
さらに、懸濁させたアポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）のｐＨ範囲が６．４〜９．０である実施形態では、このｐＨレベルがタンパク質の脱アミドを防止すると考えられ、これにより、得られるバイオ医薬品（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｒｕｇ）が免疫原性となるリスクを低減する。いくつかの実施形態では、懸濁させたアポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）は、７．２〜８．８または８．０〜８．６または８．１〜８．５または８．２〜８．４または６．４〜７．４を含む６．４〜９．０の範囲のｐＨを有する。
【００３４】
本明細書に記載する方法は、迅速、ロバスト、特異的および安全であり、処理時間中の、目的の生成物の収率および純度が改善されたものになる。したがって、本明細書に記載する方法は、アポＡ−Ｉの大規模な精製に使用するのに特に好適である。本開示に関連して、大規模な精製に好適とは、ヒト血漿画分のような出発材料数十キログラムから出発する精製、例えばアポＡ−Ｉタンパク質を含有する出発画分５０キログラム以上（５００キログラムのような）から出発する精製を意味する。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「血漿」とは、液状の血液成分を指し、血漿誘導体および血漿を含有する組成物を含む。
【００３６】
本方法は、これにより、従来使用されている方法と比較して、生成物の収率とこれに絡む経済性とのバランスを、改善し、容認できるものにすることを容易にする。
【００３７】
本方法を、具体的な実施形態に関してここに例示することにする。本発明は、以下に例示する様々な工程、構成要素およびパラメーターの、様々な実施形態のすべての順列および組合せを含むことが、以下の説明から理解されるべきである。
【００３８】
本明細書に記載する方法には、アポＡ−Ｉを含む任意の出発材料、例えば相当量のアポＡ−Ｉを含有する任意の出発材料、例えば相当量のアポＡ−Ｉを含有するタンパク質の、任意の未精製の混合物を使用することができる。
【００３９】
「アポＡ−Ｉ」という用語は、アポＡ−Ｉタンパク質およびその画分を指す。通常、アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、血漿由来のアポリポタンパク質Ａ−Ｉまたは組換えアポリポタンパク質Ａ−Ｉ、例えばアポＡ−Ｉ、プロアポＡ１、もしくはアポＡ−Ｉミラノのような変異体、もしくは４ＷＦのようないわゆる酸化耐性形態である。いくつかの実施形態では、アポリポタンパク質Ａ−Ｉは血漿由来のアポＡ−Ｉである。アポリポタンパク質Ａ−Ｉの生物活性画分も想定される。画分は、天然でも化学合成でも組換えでもよい。
【００４０】
特定の実施形態によれば、出発材料は、アポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）、例えばヒト血漿の画分から選択されるもの、例えば、Ｃｏｈｎ分画法もしくはＫｉｓｔｌｅｒおよびＮｉｔｓｃｈｍａｎｎ法または類似の他の方法に従って、ヒト血漿の冷エタノール分画によって得られる血漿画分ＩＶ−ＩまたはＩＶ（沈殿物ＩＶまたはそれと同様に呼ばれることもある）などである。他の例として、アポＡ−Ｉを含有する硫酸アンモニウム沈殿物を挙げることができる。血漿画分ＩＶをその原料として使用する場合、本明細書に記載する方法は、血漿源を十分に利用するという利点をもたらす。特定の実施形態では、出発材料は、画分ＩＶもしくはＣｏｈｎ画分ＩＶ１もしくはＣｏｈｎ画分ＩＶ４または類似の画分である。さらなる特定の実施形態では、出発材料は、画分ＩＶ沈殿物に由来する。他のアポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）には、別にＺｅｍａｉｒａ（商標）のようなＡＡＴ治療薬に製造するためにα−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）が予め除去されているものを含めることができる。かかるアポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分の例は、ＷＯ２００９／０２５７５４に記載されている。ＡＡＴは、ｉ）アポＡ−Ｉを含有する画分を、ＡＡＴを含有する画分から分離するために、アポＡ−ＩおよびＡＡＴを含む出発ヒト血漿画分を処理することにより、アポＡ−Ｉから分離することができ、この処理には、ａ）場合により、出発材料として使用される出発ヒト血漿画分を、アポＡ−ＩとＡＡＴの両方を可溶化するように処理することと；ｂ）アポＡ−Ｉが沈殿し、ＡＡＴが溶解したままとなるように、エタノールを８〜１４％ｖ／ｖの濃度まで添加し、ｐＨを約５〜約６に調整することによって、可溶化したアポＡ−Ｉを沈殿させることと；ｃ）沈殿したアポＡ−Ｉを、ＡＡＴを含有する溶液から分離することとが含まれる。この沈殿したアポＡ−Ｉは、本発明の特定の実施形態では、アポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）である。ＡＡＴおよびアポＡ−Ｉを含む出発ヒト血漿画分は、Ｃｏｈｎ分画法もしくはＫｉｓｔｌｅｒおよびＮｉｔｓｃｈｍａｎｎ法または類似の他の方法に従って、ヒト血漿の冷エタノール分画によって得られる１つまたはそれ以上の画分ＩＶ−ＩまたはＩＶ（沈殿物ＩＶまたはそれと同様に呼ばれることもある）から選択することができる。場合により、これらの画分は、Ｃｏｈｎ画分ＩＶ、Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ上清ＡおよびＡ＋１からの沈殿物（例えば沈殿物Ａ＋ＩＶ）と呼ばれる場合がある。他の例として、ＡＡＴおよびアポＡ−Ｉを含有する硫酸アンモニウム沈殿物を挙げることができる。いくつかの実施形態では、アポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分は、Ａｅｒｏｓｉｌ（商標）のような微粉化二酸化ケイ素を含む。
【００４１】
アポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）を、直鎖状または分枝鎖状Ｃ１〜Ｃ４アルコール１５〜３０％（ｗ／ｗ）を含む緩衝溶液（Ｂ）に懸濁させ、当該懸濁させたアポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）は、６．４〜１０．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、アポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）を緩衝溶液（Ｂ）に懸濁させてから、懸濁させたアポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）のｐＨを６．４〜１０．０の範囲に調整する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、アポＡ−Ｉタンパク質画分（Ａ）を可溶化するための緩衝溶液（Ｂ）は、直鎖状または分枝鎖状Ｃ１〜Ｃ４アルコール１６〜２８％または１７〜２６％または１８〜２４％または１９〜２２％（ｗ／ｗ）を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、アポＡ−Ｉタンパク質画分（Ａ）を可溶化するための緩衝溶液（Ｂ）は、直鎖状または分枝鎖状Ｃ１〜Ｃ４アルコール２０％（ｗ／ｗ）を含む。従来技術の方法と比較してこのようにアルコール濃度が低いと、経済的な観点から有益であるだけでなく、多量のアポＡ−Ｉタンパク質画分（Ａ）を可溶化することも可能になり、ある一定量の出発材料からの精製アポＡ−Ｉの全収率が増加する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、緩衝溶液（Ｂ）は、６．４〜９．０または７．２〜８．８または８．０〜８．６または６．４〜７．４を含む、６．４〜１０．０の範囲のｐＨを有する。一層特定した実施形態では、緩衝溶液（Ｂ）のｐＨは、８．３のような、８．１〜８．５の範囲内である。これらのｐＨ範囲は、アポＡ−Ｉタンパク質の脱アミノおよび変性を最小限に抑えると考えられる。
【００４５】
一層特定した他の実施形態では、緩衝溶液（Ｂ）のｐＨは、７．３のような、７．０〜７．４の範囲内である。このｐＨ範囲は、アポＡ−Ｉタンパク質の脱アミノおよび変性を最小限に抑えると考えられる。
【００４６】
緩衝溶液（Ｂ）は、任意の適切な塩で調製することができる。緩衝溶液（Ｂ）を調製するのに適切な１種の塩はＮａＨＣＯ３である。ＮａＨＣＯ３は、安価で、市販により多量に入手可能であり、このため工業規模で適用するのに好適である。いくつかの実施形態では、緩衝溶液（Ｂ）は、１５ｍＭまたは２５ｍＭのＮａＨＣＯ３のような、５ｍＭ〜３５ｍＭのＮａＨＣＯ３を含む。この緩衝液の条件は、アポＡ−Ｉタンパク質画分（Ａ）を可溶化するのに特に有効であることがわかっている。さらに、ＮａＨＣＯ３は、毒性が低く、使用し易いため、特に有利である。しかし、他の適切な緩衝剤もまた、使用してもよい。緩衝剤を選ぶ際に、特定の作用剤については、生物学的に適合すること、水／アルコール溶液中での溶解性が良好であることの両方が必要であることを考慮に入れるべきである。
【００４７】
価格、毒性および産業上の利用可能性の理由から、通常、直鎖状または分枝鎖状Ｃ１〜Ｃ４アルコールはエタノールである。エタノールには、扱いやすく、産業上の利用に適してもいるというさらなる利点がある。しかし、エタノール以外では、メタノール、ｎ−プロパノールもしくはイソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、イソブタノールまたはｔｅｒｔ−ブタノールのような他のアルコールが、ここに記載する方法に使用するのに適切である。
【００４８】
エタノールを使用する場合、通常、エタノールは任意の医薬品等級エタノールとする。本発明の特定の実施形態では、エタノールは９６％医薬品等級エタノール（例えば９４％エタノールおよび２％メチルエチルケトン（ＭＥＫ））である。本発明の特定の実施形態では、エタノールは９５％医薬品等級エタノール（５％メタノールを含有する３Ａ）である。
【００４９】
凝固因子およびプロテアーゼ活性化を最小限に抑えるために、アポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）に緩衝液（Ｂ）を接触させて約９０分以内に、アポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）（例えば画分ＩＶのような）の緩衝液（Ｂ）中懸濁液の温度を１．０±０．５℃まで冷却する。特定の実施形態では、アポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）（例えば画分ＩＶ）に緩衝液Ｂを接触させて約６０分以内に、懸濁液を１．０±０．５℃まで冷却する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、アポＡ−Ｉ画分（Ａ）を緩衝液（Ｂ）に懸濁させてから、懸濁液のｐＨを、必要に応じて、６．４〜１０．０の範囲内、例えば７．３のような７．０〜７．４の範囲内、または例えば８．３のような８．１〜８．５の範囲内に調整する。
【００５１】
アポＡ−Ｉの緩衝液（Ｂ）中の懸濁を容易にするために、緩衝液（Ｂ）は、アポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）と接触するとき、約１３℃のような約１０℃〜１６℃を含む約１０℃〜２６℃の温度を有することが可能である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、タンパク質画分（Ａ）対緩衝溶液（Ｂ）の体積比は１：２のような１：１〜１：５である。アポＡ−Ｉ画分（Ａ）対緩衝溶液（Ｂ）の体積比の低いものを使用すると、工業規模生産において、材料費および緩衝溶液の保管経費の低減に特に有益である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、懸濁液の伝導率は、０．５〜１．０ｍＳ／ｃｍの範囲内のような５ｍＳ／ｃｍ未満である。
【００５４】
上に概説したように、アポＡ−Ｉを含有するタンパク質画分（Ａ）を緩衝溶液（Ｂ）中に可溶化した後で、アポＡ−Ｉタンパク質を溶解したままに維持しながら、アポＡ−Ｉタンパク質画分（Ａ）中に存在する他の不所望のタンパク質または他の成分のような不純物を懸濁液から除去する（工程（ｂ））。いくつかの実施形態では、直鎖状または分枝鎖状Ｃ１〜Ｃ４アルコールをアルコール濃度４５〜６５％（ｗ／ｗ）まで、例えば５０％（ｗ／ｗ）または６０％（ｗ／ｗ）まで添加することによって、不純物を沈殿させる。この範囲はアポＡ−Ｉ以外の多くのタンパク質成分を可溶化するのに有効であると考えられる。したがって、この精製工程は、アポＡ−Ｉを他の不所望の成分から分離するきわめて特異的で有効な方法を提供する。
【００５５】
不純物の沈殿を容易にするために、懸濁液に添加する直鎖状または分枝鎖状Ｃ１〜Ｃ４アルコールは、約５℃のような、約−５℃〜３０℃の温度を有していてもよい。
【００５６】
いくつかの実施形態では、直鎖状または分枝鎖状Ｃ１〜Ｃ４アルコールはエタノールである。特定の実施形態では、エタノールの濃度は５５％〜６５％（ｗ／ｗ）の範囲内である。
【００５７】
ｐＨを６．４〜１０の範囲内に維持する。いくつかの実施形態では、ｐＨは、７．２〜８．８または８．０〜８．６または８．１〜８．５または８．２〜８．４または６．４〜７．４を含む、６．４〜９．０の範囲内である。
【００５８】
いくつかの実施形態では、沈殿した不純物を、濾過、遠心分離、デカンテーション、限外濾過および／または沈降分離のような任意の既知の方法によって懸濁液から除去する。いくつかの実施形態では、不純物を濾過によって除去する。これらの実施形態によれば、フィルターは、特定して、沈殿した不純物を保持するが、所望の生成物、例えば所望のアポＡ−Ｉタンパク質を保持しないように選ぶことができる。かかる方法に有用なフィルターには、ポリプロピレンフィルターシートおよびＣＨ９セルロースフィルターシートなどがある。
【００５９】
いくつかの実施形態では、不純物を除去してから、アポＡ−Ｉを懸濁液から沈殿させる（工程（ｃ））。このアポＡ−Ｉ沈殿は、懸濁液のｐＨを、５．４のような、４．６〜５．６の範囲のｐＨに調整することによって実行することができる。このｐＨ範囲では、アポＡ−Ｉの沈殿が高度に選択的であると考えられ、それにより、他の不所望のタンパク質は溶解したままに維持される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、アポＡ−Ｉを沈殿させるために、懸濁液の温度を（必要に応じて）−２〜２０℃の範囲に調整する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、アポＡ−Ｉ沈殿物を回収する（工程（ｄ））。これらの実施形態によれば、アポＡ−Ｉを沈殿させてから、液体のフィルター通過を容易にする濾過助剤を懸濁液に添加してもよい。濾過助剤は、濾過性能を高めるために濾過器材と組み合わせて使用される無機鉱物粉末または有機繊維状材料である。よく見られる濾過助剤には、珪藻岩、パーライトおよびセルロースなどがある。適切な濾過助剤は当技術分野において公知であり、Ｃｅｌｉｔｅ（商標）５７４濾過助剤などがある。
【００６２】
いくつかの実施形態では、アポＡ−Ｉ沈殿物を、不純物の濾過について上述した方法のような任意の適切な方法によって回収する。いくつかの実施形態では、アポＡ−Ｉ沈殿物を濾過によって回収する。これらの実施形態によれば、フィルターは、所望のアポＡ−Ｉタンパク質を保持し、一方で、これより小さい他の成分がフィルター孔を通過するように選ぶことができる。
【００６３】
特定の実施形態では、本方法は、沈殿したアポＡ−Ｉから不純物を除去するために洗浄溶液を使用する工程をさらに含む。洗浄溶液は、水でも適切な洗浄緩衝液でもよい。洗浄工程を使用する場合、アポＡ−Ｉタンパク質はフィルター上に留まり、一方、不純物は溶解し、洗い流されるように洗浄が行われる。
【００６４】
さらなる特定の実施形態によれば、本方法は、例えば、アルコール、例えばエタノールを約４０％〜約９６％エタノール（ｗ／ｗ）の範囲内の濃度で添加することによって、回収したアポＡ−Ｉ沈殿物を脱脂するさらなる工程（ｅ）を含む。ここに記載する方法に関連して、「脱脂した」とは脂質の除去を意味し、このようにしてアポＡ−Ｉ生成物の脂質含有量を低減する。
【００６５】
脱脂したアポＡ−Ｉ沈殿物（精製アポＡ−Ｉ）は、−２０℃以下で、タンパク質の機能を失わずに１年までの間保管することができる。
【００６６】
本発明の方法に由来するアポＡ−Ｉに、専用のウイルス低減工程（ウイルス不活化および／またはウイルス除去）を追加で施して、ウイルス病原体を確実に除去することができる。一般的なウイルス不活化技術には、伝統的な低温殺菌手順（６０℃で１０時間加熱）、短波長紫外線照射またはガンマ線照射のような物理的方法、および有機溶媒／界面活性剤（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）または低ｐＨインキュベーションのような化学的方法などがある。ウイルス除去技術には、ナノ濾過と呼ばれることも多いウイルス濾過のようなサイズ排除法などがある。これらのウイルス濾過方法は、タンパク質溶液からウイルスを除去するのに有効な方法であることがわかっている。いくつかの実施形態では、本発明の精製アポＡ−ＩにはＥＰ１３１７９７５５．７に記載の熱不活化および／またはウイルス濾過のようなウイルス低減手順が施される。
【００６７】
本発明は、以下の特性：
（ａ）アポＡ−Ｉ  １グラム当たりＩｇＡ  ０．３ｍｇ未満；
（ｂ）アポＡ−Ｉ  １グラム当たりＩｇＧ  ０．７ｍｇ未満；
（ｃ）アポＡ−Ｉ  １グラム当たりＩｇＭ  ０．０５ｍｇ未満；
（ｄ）アポＡ−Ｉ  １グラム当たりハプトグロビン４．９ｍｇ未満；
（ｅ）アポＡ−Ｉ  １グラム当たりヘモペキシン２．７ｍｇ未満；
（ｆ）アポＡ−Ｉ  １グラム当たりフィブリノゲン６．４ｍｇ未満；
（ｇ）アポＡ−Ｉ  １グラム当たりセルロプラスミン０．９ｍｇ未満；
（ｈ）アポＡ−Ｉ  １グラム当たりアルブミン１４．６ｍｇ未満；
（ｉ）アポＡ−Ｉ  １グラム当たりα−２−マクログロブリン２．３ｍｇ未満；
（ｊ）アポＡ−Ｉ  １グラム当たりα−１−アンチトリプシン１２ｍｇ未満；および
（ｋ）アポＡ−Ｉ  １グラム当たりトランスフェリン３．９ｍｇ未満
を特徴とする精製アポＡ−Ｉを提供する。
【００６８】
タンパク質の含有量は比濁分析によって測定することができる。アポＡ−Ｉ含有量は、高性能キャピラリー電気泳動法を使用して測定することもできる。
【００６９】
本発明の別の態様において、（ａ）アポＡ−Ｉ  １グラム当たりＩｇＡ  ０．３ｍｇ未満を含む精製アポＡ−Ｉを提供する。特定の実施形態では、アポＡ−Ｉ生成物は、アポＡ−Ｉ  １グラム当たりＩｇＡ  ０．２ｍｇ未満；またはアポＡ−Ｉ  １グラム当たりＩｇＡ  ０．１ｍｇ未満；またはアポＡ−Ｉ  １グラム当たりＩｇＡ  ０．０７５ｍｇ未満；またはアポＡ−Ｉ  １グラム当たりＩｇＡ  ０．０５ｍｇ未満；またはアポＡ−Ｉ  １グラム当たりＩｇＡ  ０．０２ｍｇ未満を含む。ＩｇＡ純度レベルは、アポＡ−Ｉ生成物を含む医薬製剤の安全性プロファイルに、ことによると影響する可能性があるため、ＩｇＡ欠乏症の患者における抗ＩｇＡ抗体の形成リスクを最小限に抑えるのに望ましい低めのレベルにこれを低くするのが有利である。このＩｇＡ欠乏症という状態は、約１：１３３の人々を冒している最もよくある原発性抗体欠乏症であり、その状態は比較的穏やかであるため、冒されている人々に認識されないでいることが多い。
【００７０】
上記の精製アポＡ−Ｉは、治療に使用するための再構成ＨＤＬのような医薬組成物に配合することができる。かかる医薬組成物には、薬学的に許容される担体または賦形剤を含めてもよい。薬学的に許容される担体または賦形剤の非限定的な例として、水、乳化剤、結合剤、充填剤、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）、緩衝液、安定化剤、塩、アルコールおよびポリオール、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）、タンパク質およびペプチド、脂質、ガム、糖ならびに他の炭水化物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７１】
再構成ＨＤＬは、アポ−ＡＩに加えて、１種またはそれ以上の脂質、界面活性剤および安定化剤を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。脂質の非限定的な例として、リン脂質、コレステロール、コレステロール−エステル、脂肪酸および／またはトリグリセリド類が挙げられる。脂質はリン脂質であるのが好ましい。リン脂質の非限定的な例として、ホスファチジルコリン（ＰＣ）（レシチン）、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）（セファリン）、ホスファチジルグリセリン（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）またはこれらの天然もしくは合成の誘導体が挙げられる。安定化剤は、糖（例えばスクロース）または糖アルコール（例えばマンニトールまたはソルビトール）のような炭水化物とすることができるが、これらに限定されるものではない。界面活性剤は、存在する場合、任意のイオン性（例えば、陽イオン性、陰イオン性、双性イオン性）界面活性剤でも非イオン性界面活性剤でもよく、胆汁酸、およびコール酸ナトリウムのような胆汁酸塩を含めてもよい。
【００７２】
アポＡ−１および／または再構成ＨＤＬ配合剤の治療用使用には、心血管系疾患（例えば急性冠症候群（ＡＣＳ、アテローム性動脈硬化症および心筋梗塞））、またはＡＣＳに罹患しやすくなる糖尿病、脳卒中もしくは心筋梗塞のような、疾患、障害もしくは状態、高コレステロール血症（例えば高血清コレステロールまたは高ＬＤＬコレステロール）、およびタンジール病の症候であるような高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のレベルの低下が引き起こす低コレステロール血症の、処置または予防が含まれる。
【実施例】
【００７３】
上記のように、相当量のアポＡ−Ｉを含有するタンパク質の任意の未精製の混合物を、本明細書に記載する精製方法の出発材料として使用することができる。
【００７４】
以下の実施例において、アポＡ−Ｉを、Ｃｏｈｎ分画法またはＫｉｓｔｌｅｒおよびＮｉｔｓｃｈｍａｎｎ法に従って、冷エタノール分画を使用してヒト血漿から抽出し、血漿画分ＩＶ−ＩまたはＩＶを出発材料として得た。工程（ａ）で、画分ＩＶを緩衝溶液（Ｂ）に懸濁させ、次いでｐＨを調整してから、工程（ｂ）で高めのエタノール濃度に曝露して種々の不純物を沈殿させた。不純物を、深層濾過により、濾過助剤の存在下で除去し、次いで、工程（ｃ）として、ｐＨをアポＡ−Ｉの等電点の近くに動かしてアポＡ−Ｉを沈殿させた。工程（ｄ）で、濾過助剤を添加し、アポＡ−Ｉ沈殿物を濾過により回収した。場合により、工程（ｅ）として、アポＡ−Ｉ沈殿物を再懸濁させ、エタノール（例えば４０〜９６％ｗ／ｗ）を添加して残留脂質を除去することができた。
【００７５】
アポＡ−Ｉの含有量を、様々な試料採取点で、キャピラリー電気泳動法を使用して測定した。
【００７６】
キャピラリー電気泳動法を使用して測定した純度をパーセンテージとして表し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで目視評価も行った。
【実施例１】
【００７７】
画分ＩＶ沈殿物の製造
ヒト血漿を約０℃まで冷却し、ｐＨ約７．２に調整した。冷エタノールを濃度約８％（ｗ／ｗ）まで添加し、温度をおよそ−２℃まで低下させた。（画分Ｉ）を形成した沈殿物を遠心分離または濾過により除去した。
【００７８】
上記手順の濾液または上清をｐＨ約６．９に調整し、冷エタノールを濃度約２０％（ｗ／ｗ）まで添加した。次いで、温度を−５℃まで低下させ、混合物に再度遠心分離または濾過を行った。（画分ＩＩ＋ＩＩＩ）を形成した沈殿物を他の目的のために取り置いた。
【００７９】
上記手順の濾液または上清をｐＨおよそ５に調整し、エタノールの濃度を約２０％（ｗ／ｗ）に調整した。温度を約−５℃に調整した。（画分ＩＶ）を形成した沈殿物を遠心分離または濾過により除去し、ペーストの形状にして必要になるまで保管した。この画分ＩＶペーストは、アポＡ−Ｉならびに混在タンパク質および脂質を含有する。
【実施例２】
【００８０】
沈殿物ＩＶからのアポＡ−Ｉの回収に影響する因子
実験計画法（ＤＯＥ）論を使用した初期実験は、より多量のアポＡ−Ｉを可溶化することを目的に、沈殿物ＩＶ（例えば画分ＩＶを含有する）を炭酸水素ナトリウム緩衝液に溶解することに焦点を当てた。表１は、中心点の実行（ｃｅｎｔｒｅ  ｐｏｉｎｔ  ｒｕｎ）を伴うＰｌａｃｋｅｔｔ−Ｂｕｒｍａｎ計画に使用した６つの処理パラメーターの条件の概要である。試験したパラメーターには、緩衝液の体積、エタノールの濃度、温度、ｐＨおよび混合時間を含めた。沈殿物ＩＶを可溶化する工程の初期スクリーニングで１３の実験（Ｔｈｉｒｔｅｅｎ  ｒｕｎｓ）を行った。
【００８１】
沈殿物ＩＶペーストの一定分量を、ＤＯＥ計画に明記したとおりの体積の緩衝液に溶解した。次いで、ｐＨをＤＯＥ計画に従って調整し、その後、その実験（ｔｈａｔ  ｒｕｎ）に割り当てた温度で懸濁液を混合した。懸濁液のサンプルを採取し、４，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。得られた上清を分析にかけた。試験の結果を標準化し、ｇアポＡ−Ｉ／Ｌ血漿として表した。
【００８２】
【表１】
0006404333.tif 000002
【００８３】
表２は、初期Ｐｌａｃｋｅｔｔ−ＢｕｒｍａｎスクリーニングＤＯＥで得られた結果の概要であり、アポＡ−Ｉの収率を標準化し、ｇアポＡ−Ｉ／Ｌ血漿として表した。
【００８４】
Ｍｉｎｉｔａｂ１６  ＤＯＥ分析から、エタノールの濃度のみが収率についてｐ＜０．０５を有するという結論が導かれ、再懸濁緩衝液中のエタノールの濃度が低いほど、アポＡ−Ｉがより多く可溶化した（図１）。
【００８５】
【表２】
0006404333.tif 000003
【実施例３】
【００８６】
沈殿物ＩＶからのアポＡ−Ｉの回収に対するエタノールの濃度およびｐＨの効果
試験には、エタノールの濃度を２０〜５０％の間で変化させ、ｐＨを６．４〜７．２の間で変化させた１０の実験を含めた。中心点の実行を伴う２組の２２完全実施要因ＤＯＥ計画（ｆｕｌｌ  ｆａｃｔｏｒｉａｌ  ＤＯＥ  ｄｅｓｉｇｎ）として試験を行った（表３）。その方法は、沈殿物ＩＶペーストの一定分量を、ＤＯＥに従ったエタノールの濃度を有する１５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３緩衝液２部に溶解するものとした。次いで、ｐＨをＤＯＥ計画に従って調整し、その後、懸濁液を０±１℃の温度に調整し、１時間混合した。懸濁液のサンプルを採取し、４，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。得られた上清を分析にかけた。試験の結果を標準化し、ｇアポＡ−Ｉ／Ｌ血漿として表した。
【００８７】
【表３】
0006404333.tif 000004
【００８８】
Ｍｉｎｉｔａｂ１６  ＤＯＥ分析から、収率についてｐ＜０．０５を有する唯一の因子はエタノールの濃度であるという結論が導かれた（表４）。この結果は、再懸濁緩衝液中のエタノールの濃度が低いほど、より多く可溶化したアポＡ−Ｉが最大の収率で観察され、その場合のエタノールの濃度は２０〜３０％の間であったことを示している（図２）。再懸濁溶液のｐＨは、ｐＨを６．４から７．２まで上げると、アポＡ−Ｉの回収量が増加する軽微な影響を示した。しかし、これは有意であるとは認められなかった（ｐ＝０．１１３）。
【００８９】
【表４】
0006404333.tif 000005
【００９０】
図３は、エタノールの濃度を２０〜５０％の範囲内で使用したときのアポＡ−Ｉの収率に対するｐＨの影響をさらに示す。エタノールを１５〜３０％の範囲内の濃度で含み、ｐＨが６．４〜７．２の範囲内である、本明細書に記載するとおりの緩衝溶液（Ｂ）にアポＡ−Ｉを懸濁させたとき、収率が最大になった。
【実施例４】
【００９１】
沈殿物ＩＶからのアポＡ−Ｉの回収に対するエタノールの濃度の効果。
可溶化する工程中にエタノールがどの濃度のときにアポＡ−Ｉの収率が最大になるかを判定するために、線形実験を行った。エタノールの濃度０％、１５％および３０％を、上記のとおり、２組ずつ試験した。表５はエタノールの濃度の線形実験から得られた結果の概要であり、アポＡ−Ｉの収率を標準化し、ｇアポＡ−Ｉ／Ｌ血漿として表し、純度をパーセンテージとして表した。
【００９２】
【表５】
0006404333.tif 000006
【００９３】
図４に示すように、血漿から得られるアポＡ−Ｉの収率は、エタノールを１５〜３０％の範囲内の濃度で含む緩衝溶液（Ｂ）を使用したときに最大となった。
【実施例５】
【００９４】
沈殿物ＩＶからのアポＡ−Ｉの回収に対するエタノールの濃度およびｐＨの効果
１５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡで作製し、表６に従ってエタノールの濃度を様々にした懸濁緩衝液２部に、沈殿物ＩＶを溶解し、その後、ＨＣｌ  ０．５ＭまたはＮａＯＨ  ０．５Ｍを使用し、表６に従ってｐＨを調整した。
【００９５】
ｐＨを設定してから、懸濁液のサンプルを採取し、４，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。得られた上清を分析にかけた。結果を標準化し、アポＡ−Ｉのグラム／Ｌ血漿として表した。
【００９６】
先の試験で、沈殿物ＩＶの再懸濁工程中に、エタノールの濃度１５％〜３０％を懸濁緩衝液中に使用したときにアポＡ−Ｉの収率が最大になったことがわかった。再懸濁液のｐＨは軽微な効果しかもたらさないと見られたが、試験した範囲は狭く、ｐＨ６．４〜ｐＨ７．２であった。これより広いｐＨ範囲がアポＡ−Ｉの収率に影響するかどうかを判定するために、表６に従って実験を行い、アポＡ−Ｉの収率を計算した。
【００９７】
【表６】
0006404333.tif 000007
【００９８】
これらの実験の結果を表７に示す。ｐＨ５．０では、エタノールの濃度に関係なく、アポＡ−Ｉの収率は検出不能であった。２０％エタノール、ｐＨ７．４と、１５％エタノールまたは３０％エタノールの存在下でのｐＨ１０．０とに溶解すると、類似レベルのアポＡ−Ｉの回収率が得られた（工程ｂ）（表７）。
【００９９】
【表７】
0006404333.tif 000008
【実施例６】
【０１００】
回収したアポＡ−Ｉ中のプロテアーゼ活性および活性化凝固因子
アポＡ−Ｉの沈殿を内容とするアポＡ−Ｉの精製ならびに工程（ｄ）のアポＡ−Ｉ沈殿物中のタンパク質分解活性および活性化凝固因子の存在の判定。
【０１０１】
沈殿物ＩＶペーストの一定分量を、懸濁緩衝液（Ｂ）（１５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３／２０％エタノール緩衝液）２部に溶解した。懸濁液を０±１℃の温度に調整した。懸濁液が１０分、６５分または１２０分で目標温度１℃に達するように冷却装置をプログラムした。次いで、懸濁液をその温度（約０±１℃）で約１時間混合した。混合した後、懸濁液のｐＨを、ＮａＯＨ  ０．５ＭまたはＨＣｌ  ０．５Ｍ溶液を使用して調整し、ｐＨ約７．３を得た。
【０１０２】
懸濁液の温度を−１〜２℃に維持しながら、−４℃に予冷したエタノールを最終濃度６０％まで添加した。エタノール添加後に、懸濁液を約３０分間混合した。
【０１０３】
インキュベーションした後、濾過助剤を懸濁液に添加した。１５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３／６０％エタノールで予洗しておいた深層フィルターを通す濾過によって、可溶性のアポＡ−Ｉ材料（アポＡ−Ｉ濾液）を不溶性の不純物から分離した。濾過ケーキを１５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３／６０％エタノールで洗浄した。
【０１０４】
ある量のＨＣｌ  ０．５Ｍ溶液をアポＡ−Ｉ濾液に添加して、ｐＨ５．４±０．１を有する懸濁液を得た。懸濁液の温度を約０℃に調整し、ｐＨ／温度条件を約２時間維持した。
【０１０５】
引き続いて、濾過助剤を懸濁液に添加し、アポＡ−Ｉ沈殿物を深層濾過によって回収した。深層フィルターを６０％エタノールで予洗した。９６％エタノールで最初の後洗浄を行ってから、２０％エタノールで後洗浄を行った。
【０１０６】
精製アポＡ−Ｉ沈殿物をタンパク質分解活性について分析し、非活性化部分トロンボプラスチン時間（ＮａＰＴＴ）凝固時間を測定した。これらの試験から、工程（ｄ）のアポＡ−Ｉ沈殿物中の残留プロテアーゼの量に関する指標が得られた。
【０１０７】
試験用に工程（ｄ）からアポＡ−Ｉ沈殿物を製造するために、沈殿物１部を２％ＳＤＳ／１００ｍＭトリスｐＨ８．５緩衝液３部に添加することによってこれを溶解した。次いで、アポＡ−Ｉを含有する懸濁液を４５分〜１時間の間混合した。次いで、懸濁液を遠心分離し、上清を使用してタンパク質分解活性およびＮａＰＴＴを測定した。
【０１０８】
タンパク質分解活性アッセイは比色法であり、アポＡ−Ｉを含有する上清を緩衝溶液（ｐＨ８．０）と１：３で混合した。次いで、この溶液（２００μＬ）を、ｐＮＡを含有する基質２０μＬと共にマイクロタイタープレートウェルに添加した。次いで、プレートを３７℃で１０分間インキュベートしてから、４０５ｎｍで初回読み取りを行った。同じ条件下でインキュベーションを継続し、３０分、６０分および９０分時点でさらに読み取り（４０５ｎｍ）を行った。インキュベーションの終了時に、０〜９０分の間に形成されたｐＮＡの量を測定することによって、タンパク質分解活性（ｎｋａｔ／Ｌ）を計算した。
【０１０９】
アポＡ−Ｉ沈殿物のロット（工程（ｄ）由来）中の活性化凝固因子の存在を、欧州薬局方各条２．６．２２に従った一般的な非活性化部分トロンボプラスチン時間（ＮａＰＴＴ）アッセイによって試験した。
【０１１０】
その結果は、工程（ａ）で、画分ＩＶを再可溶化中に、温度を１℃まで低下させるための所要時間を短縮することによって、アポＡ−Ｉ沈殿物（工程（ｄ）にて）中のプロテアーゼ活性および活性化凝固因子のレベルを最小限に抑えることができることを示している（図５）。
【実施例７】
【０１１１】
アポＡ−Ｉの大規模回収
沈殿物ＩＶペースト（５００〜５５０ｋｇ）を１５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３／２０％エタノール緩衝液２部に溶解することによって、規模を大きくしたバッチ（ｎ＝１７）を製造した。次いで、懸濁液を０±１℃の温度に調整し、約１時間混合した。混合した後で、ＮａＯＨ  ０．５ＭまたはＨＣｌ  ０．５Ｍを使用して、ｐＨを７．３に調整した。
【０１１２】
エタノールを最終濃度６０％になるまで添加し、懸濁液を約１５分間混合した。次いで、懸濁液を、１５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３／６０％エタノールで予洗しておいたフィルタープレスで濾過した。得られた濾過ケーキも１５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３／６０％エタノールで洗浄した。
【０１１３】
試験の結果を標準化し、血漿１Ｌ当たりのｇアポＡ−Ｉとして表した。１７バッチの平均回収率は０．６ｇ／Ｌ（工程（ｂ）にて）であった。
【実施例８】
【０１１４】
Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ画分ＩＶからのアポＡ−Ｉの精製−再懸濁中のｐＨの効果
沈殿物ＩＶからの再懸濁アポＡ−Ｉ中のｐＨが精製アポＡ−Ｉの全収率に及ぼす効果を、ｐＨを７．２〜１２．０の範囲に変化させることによって評価した。
【０１１５】
精製アポＡ−Ｉを得る方法は、１５ｍＭの炭酸ナトリウムを含有する２０％ＥｔＯＨの沈殿物ＩＶの溶解緩衝液２部（２２±２℃）に沈殿物ＩＶを溶解するというものとした。緩衝液を沈殿物ＩＶに添加してから、懸濁液の温度を約１５分間で２℃（２±１℃）まで低下させた。およそ１５分間混合した後で、懸濁液のｐＨを７．２〜１２．０の範囲の目標ｐＨに調整してから、９６％エタノールを添加して最終濃度６０％に到達させた。
【０１１６】
得られた懸濁液をＣｅｌｉｔｅ５７４の存在下で濾過した。次いで、濾液のｐＨを約ｐＨ５．３に低下させ、約０℃で約２時間インキュベートした。次いで濾過助剤を添加し、懸濁液を約３０分間混合してから濾過し、アポＡ−Ｉ沈殿物を回収した。次いで、アポＡ−Ｉ沈殿物を９６％エタノールで脱脂した。
【０１１７】
脱脂したアポＡ−Ｉ沈殿物のアポＡ−Ｉ含有量および他の特徴を測定するために、２％ＳＤＳを含有する１００ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．５の３部に、沈殿物を室温で４５分間溶解した。サンプルを遠心分離してから分析した。
【０１１８】
沈殿物ＩＶの再懸濁工程のｐＨが、脱脂したアポＡ−Ｉ沈殿物中のアポＡ−Ｉの全収率に及ぼす影響を、ｐＨをより高くした抽出条件を使用した際に得られる、より高い回収レベルを用いて調査した（表８）。アポＡ−Ｉの量は、高性能キャピラリー電気泳動法（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ３Ｄ  ＣＥ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して測定した。測定は、変性条件下、すなわちＳＤＳの存在下で行う。次に、アポＡ−Ｉ含有量は、水性サンプルと脂質を含有するサンプル（例えば再構成ＨＤＬ）との両方において測定することができる。簡潔に述べると、アポＡ−Ｉおよそ２〜３ｍｇ／ｍＬを含有するサンプル（必要に応じて水で希釈）（１５０μＬ）を、１６％ＳＤＳ（２５μＬ）およびフェニルアラニン（２５μＬ、２または４ｍｇ／ｍＬ）で製造した。次いで、サンプルを沸騰水浴中で３分間インキュベートしてから、電気泳動緩衝液（５０ｍＭのホウ酸ナトリウム、０．２％ＳＤＳ、ｐＨ９．１、３００μＬ）中に１：２．５に希釈し、濾過した（０．４５μｍ）。次いで、サンプルを溶融シリカキャピラリー（５６ｃｍ、内径５０μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１６００−６１２３２）に導入した。電気泳動を２５ｋＶで行った。使用した基準は、国際アポＡ−Ｉ基準（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡｐｏＡ−Ｉ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）（ＢＣＲ−３９３）であり、標準曲線は２０〜９５０μｇ／ｍＬで確立した。内部標準（フェニルアラニン）と比較した際の相対的ピーク面積に基づいて定量化した。
【０１１９】
【表８】
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【０１２０】
精製アポＡ−Ｉ生成物中の他の血漿タンパク質のレベル（アポＡ−Ｉ  １グラム当たり血漿タンパク質ｍｇ）を、比濁分析（ＢＮ  ＰｒｏＳｐｅｃ、Ｓｉｅｍｅｎｓ）により、Ｓｉｅｍｅｎｓから得た基準、対照および抗血清を用いて測定した。ＩｇＡ含有量については、Ｓｉｅｍｅｎｓ製のＮラテックスＩｇＡキットを、製造元の使用説明書に従って使用した。
【０１２１】
精製アポＡ−Ｉ生成物中の他の血漿タンパク質のレベルは画分ＩＶ抽出工程のｐＨがｐＨ８．５に達するまで安定したままであった。これより高いｐＨ８．７のようなｐＨでの抽出条件では、血漿タンパク質レベルは増加した（表９）。
【０１２２】
【表９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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