(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を内封してなる中性又はアニオン性リポソームであって、該核酸の内封量が中性又はアニオン性リポソームの総脂質量１００重量部に対して２重量部以上である、リポソームであって、前記中性又はアニオン性リポソームの相転移温度が、３５℃以上である、リポソーム。
【請求項２】
核酸の内封量が、中性又はアニオン性リポソームの総脂質量１００重量部に対して１５重量部以上である、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
中性又はアニオン性リポソームの平均粒子径が、５０〜１０００ｎｍである、請求項１又は２に記載のリポソーム。
【請求項４】
中性又はアニオン性リポソームのＺ電位が、−８０〜０ｍＶである、請求項１〜３の何れか１項に記載のリポソーム。
【請求項５】
核酸の塩基長が、２０ｎｔ以上である、請求項１〜４の何れか１項に記載のリポソーム。
【請求項６】
核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は核酸アナログである、請求項１〜５の何れか１項に記載のリポソーム。
【請求項７】
核酸アナログが、ＧＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡ、及びモルホリノからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項６に記載のリポソーム。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載のリポソームが、ポリアルキレングリコールにより表面修飾されてなるリポソーム。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載のリポソーム及びバイオナノカプセルを含む複合体。
【請求項１０】
バイオナノカプセルが、脂質及び自己組織化能を有するタンパク質を含む、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
バイオナノカプセルが、組織特異的結合分子を有する、請求項９又は１０に記載の複合体。
【請求項１２】
自己組織化能を有するタンパク質が、Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質である、請求項９〜１１の何れか１項に記載の複合体。
【請求項１３】
請求項１〜７の何れか１項に記載の中性又はアニオン性リポソーム、又は請求項９〜１２の何れか１項に記載の複合体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜７の何れか１項に記載の核酸を内封してなる中性又はアニオン性リポソームの製造方法であって、
（Ａ）中性又はアニオン性リポソームを構成する脂質
（Ｂ）核酸
（Ｃ）カルシウム塩、及び
（Ｄ）炭素数１〜４の低級アルコール
を含む水又は緩衝液
を同時に撹拌する工程を含む、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸を内封してなる中性又はアニオン性リポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療を行うために、生体内に特定の核酸を導入する際には、キャリアーとしてリポソームを採用した製剤が使用される。特に、カチオン性リポソームがキャリアーとして多用され、国内外の製薬会社が進めている核酸医薬のほとんどがこれに相当する。このようなカチオン性リポソームは体内に投与されると、免疫応答を惹起して炎症を引き起こす（非特許文献１、２）。
【０００３】
リポソームの形成方法は多岐にわたり、脂質膜水和法、逆相蒸発法、有機溶媒注入法等が存在し、リポソームに核酸を含む様々な物質を導入する方法として、パッシブローディング法、リモートローディング法等の手段がある（非特許文献３、４）。
【０００４】
また、一旦内封させた物質がリポソームから漏出しないようにするために、リポソームの相転移温度を高くする技術も知られている。
【０００５】
そして、リポソームに核酸を内封する際に、カルシウムイオン等を用いる手段も開発されている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＡＡＰＳ  Ｊ．７，Ｅ６１-７７（２００５）．
【非特許文献２】Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９，１５９９-６０５（２００２）．
【非特許文献３】Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９，６５-７７（１９９６）．
【非特許文献４】Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，３，２６７-２８２（１９８９）．
【非特許文献５】Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４６８，２３９-５２（２０００）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のようなカチオン性リポソームは核酸が有する負電荷と静電相互作用を生じやすいために、製剤化するには好都合ではある。ところが、生体内の細胞やオプソニンをはじめとする血中タンパク質とも非特異的に相互作用を起こしやすいことから、臓器特異的に核酸を送達することは困難である。
【０００８】
また、核酸を有効成分とし、カチオン性リポソームを用いて製剤化しても、核酸はリポソーム表面に結合した状態となり、生体内でのヌクレアーゼ等の酵素によって分解されやすいことも問題である。
【０００９】
そして、カチオン性リポソーム自体、免疫細胞に認識されやすいといった性質を有していることから、生体内に投与しても短時間で排出経路に導かれてしまい、核酸を所定の臓器に送達するといった目的を果たすのは困難である。
【００１０】
更にカチオン性リポソームは細胞毒性を有するため、細胞内に核酸が送達できたとしても斯かる細胞は損傷してしまうか死滅してしまう可能性もある。また、非特許文献２に記載のようにカチオン性リポソームは体内に投与されると、免疫応答を惹起して炎症を引き起こし、副作用となる事も問題である。
【００１１】
一方で非カチオン性リポソームは核酸と静電相互作用しにくいため、斯かるリポソームをキャリアーとして核酸を製剤化する際には、リポソームと核酸をカチオン性の物質を介して複合体化するか、もしくは核酸をリポソーム内に内封する必要がある。前者の場合には核酸がリポソーム表面に曝露された状態となるためヌクレアーゼからの分解を完全に防ぐことができず、また後者の場合は封入率の低さが問題となり、非特許文献１、２に記載されるカチオン性リポソームを用いた核酸の送達技術は、実用化できるレベルに至っていない。また、リモートローディング法にて核酸の内封を試みても、リポソーム製剤としての使用に耐えられる程度の内封量とはならない。
【００１２】
そこで、非特許文献５に記載のように、リモートローディング法にカルシウム塩及びアルコールを採用した変法方法によって核酸を非カチオン性リポソーム内に封入する技術が開発されたが、相転移温度を高く設定したリポソームには一切物質が内包されないという問題点も生じている。
【００１３】
本発明の課題は、核酸を内封する非カチオン性リポソームを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、リポソーム製造方法の一つであるエタノール希釈法に改変を加えることによって、核酸を非カチオン性リポソーム、すなわち中性又はアニオン性リポソームに高効率に内封させることができることを見出した。また、相転移温度の高い非カチオン性リポソームへの核酸の内封にも成功した。
【００１５】
本発明は斯かる知見に基づいて完成されたものであり、以下に示す広い態様の発明を包含する。
【００１６】
項１  核酸を内封してなる中性又はアニオン性リポソームであって、該核酸の内封量が中性又はアニオン性リポソームの総脂質量１００重量部に対して２重量部以上である、リポソーム。
【００１７】
項２  核酸の内封量が、中性又はアニオン性リポソームの総脂質量１００重量部に対して１５重量部以上である、上記項１に記載のリポソーム。
【００１８】
項３  中性又はアニオン性リポソームの相転移温度が、３５℃以上である、上記項１又は上記項２に記載のリポソーム。
【００１９】
項４  中性又はアニオン性リポソームの平均粒子径が、５０〜１０００ｎｍである、上記項１〜項３の何れか１項に記載のリポソーム。
【００２０】
項５  中性又はアニオン性リポソームのＺ電位が、−８０〜０ｍＶである、上記項１〜項４の何れか１項に記載のリポソーム。
【００２１】
項６  核酸の塩基長が、２０ｎｔ以上である、上記項１〜項５の何れか１項に記載のリポソーム。
【００２２】
項７  核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は核酸アナログである、上記項１〜項６の何れか１項に記載のリポソーム。
【００２３】
項８  核酸アナログが、ＧＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡ、及びモルホリノからなる群より選択される少なくとも１種である、上記項７に記載のリポソーム。
【００２４】
項９  構成脂質としてホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジルエタノールアミンからなる群より選択される少なくとも一つを含む、上記項１〜項８の何れか１項に記載のリポソーム。
【００２５】
項１０  構成脂質としてコレステロール類を含む、上記項１〜９の何れか１項に記載のリポソーム。
【００２６】
項１１  上記項１〜項１０の何れか１項に記載のリポソームが、ポリアルキレングリコールにより表面修飾されてなるリポソーム。
【００２７】
項１２  上記項１〜項１１の何れか１項に記載のリポソームとバイオナノカプセルを含む複合体。
【００２８】
項１３  バイオナノカプセルが、脂質及び自己組織化能を有するタンパク質を含む、上記項１２に記載の複合体。
【００２９】
項１４  バイオナノカプセルが、組織特異的結合分子を有する、上記項１２又は項１３に記載の複合体。
【００３０】
項１５  自己組織化能を有するタンパク質が、Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質である、上記項１２〜項１４の何れか１項に記載の複合体。
【００３１】
項１６  上記項１〜項１１の何れか１項に記載の中性又はアニオン性リポソーム、又は上記項１２〜項１４の何れか１項に記載の複合体を含む医薬組成物。
【００３２】
項１７  上記項１〜１１の何れか１項に記載の核酸を内封してなる中性又はアニオン性リポソームの製造方法であって、
（Ａ）中性又はアニオン性リポソームを構成する脂質
（Ｂ）核酸
（Ｃ）カルシウム塩、及び
（Ｄ）炭素数１〜４の低級アルコール
を含む水又は緩衝液を撹拌する工程を含む、製造方法。
【発明の効果】
【００３３】
本発明に係るリポソームは、リポソーム製剤とした際に核酸の送達に関して、実用するのに十分な効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】比較試験例１（界面活性剤処理）に示す実験結果を示すアガロース電気泳動の写真像。
【図２】比較試験例２（血清処理）に示す実験結果を示すアガロース電気泳動の写真像。
【図３】試験例（界面活性剤処理）に示す実験結果を示すアガロース電気泳動の写真像。
【図４】試験例（血清処理）に示す実験結果を示すアガロース電気泳動の写真像。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
＜中性又はアニオン性リポソーム＞
本発明に係る中性又はアニオン性リポソームは、核酸を内封する。内封とは、リポソーム内部に核酸分子の一部さえ存在していればよく、核酸分子全体がリポソーム内部に存在していなくともよい。すなわち、核酸分子がリポソームを構成する脂質二重膜に貫通した態様も、本発明に係る中性又はアニオン性リポソームに包含される。ただし、静電相互作用等によってリポソーム表面において核酸が結合している態様は、本発明に係る中性又はアニオン性リポソームには包含されない。
【００３６】
上述のように核酸がリポソーム内に内封されているかを確認する手段としては、後述する実施例に示すように、リポソームを構成する脂質二重膜を溶解させ得る界面活性剤、ヌクレアーゼ等の核酸分解剤を組み合わせて確認できる。
【００３７】
なお本明細書では、用語「内封」と同義で「内包」との文言を用いることがある。
【００３８】
本発明に係る中性又はアニオン性リポソームに内包される核酸の量は、リポソームを構成するの総脂質量１００重量部に対して、２重量部以上である。より好ましくは５重量部以上、さらに好ましくは１０重量部以上、さらに好ましくは１５重量部以上であり、２０重量部以上が最も好ましい。
【００３９】
後述するように、本発明に係る中性又はアニオン性リポソームをＤＤＳ等の製剤とした際に、核酸の内封量が上昇するにつれて、投与する単位リポソーム量あたりの核酸による効果が増強されより優れた効果を発揮すると同時に、所要量の核酸を体内に投与する際に必要なリポソームの量、すなわち製剤として投与する量を低減させることが出来るため、リポソーム投与に伴う副作用が軽減される。
【００４０】
本発明に係る中性又はアニオン性リポソームの相転移温度は、特に限定はされないが、通常は３５℃程度以上とすればよく、より好ましくは４５℃以上、さらに好ましくは５５℃以上、さらに好ましくは６０℃以上、更に好ましくは６５℃以上、更に好ましくは７０℃以上であり、７５℃以上が最も好ましい。
【００４１】
後述するように、本発明に係る中性又はアニオン性リポソームをＤＤＳ等の製剤とした際に、リポソームの相転移温度が上昇するにつれて、生体投与時に体内の温度条件における安定性が増加し、内封した核酸の漏出が低減する事によって生体内での半減期の延長効果が得られる。
【００４２】
また、保存時においてはリポソーム内からの核酸の漏出が長期間にわたって抑制され、生体内投与時においても核酸の漏出が抑制されることから、結果として血中滞留性の面でより優れた効果を発揮する。
【００４３】
リポソームの相転移温度の測定方法は、特に限定はされないが、例えば示差走査熱量測定（ＤＳＣ）等を用いて測定すればよい。より具体的に、ＤＳＣを用いた測定であれば、ＤＳＣ  ２０４  Ｆ１  Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標；ＮＥＴＺＳＣＨ社）又はその同等品を使用し、超純水で希釈したリポソーム溶液に対して、超純水を標準試料とし、室温・常圧下で温度勾配１℃／分等の条件で測定すればよい。
【００４４】
本発明に係る中性又はアニオン性リポソームの平均粒子径は、特に限定はされないが、通常は５０〜１０００ｎｍ程度とすればよい。より好ましくは５０〜２００ｎｍ程度であり、５０〜１００ｎｍ程度が最も好ましい。
【００４５】
平均粒子径が５０〜１０００ｎｍ程度であれば体内の多くの血管を通過できるサイズであるため血管からの全身投与が可能となり、全身の各種組織へ移行できるといった効果を発揮し得る。また、５０〜２００ｎｍ程度であれば細網内皮系等の生体の異物排除機構に認識されにくくなり、血中滞留性が長くなるといった効果を発揮し得る。更に、５０〜１００ｎｍ程度であれば特に血管透過性の増加した腫瘍・炎症組織への移行や蓄積が顕著となり、内封核酸の腫瘍・炎症部位への送達がより効果的となるといった効果を発揮し得る。
【００４６】
リポソームの平均粒子径の測定方法は、特に限定はされないが、例えば動的光散乱法の原理等に基づいた機器を用いて測定し、Ｚ−平均粒子径を算出すればよい。より具体的に、動的光散乱法を用いた測定であれば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ又はその同等品を用い、溶媒としてＰＢＳ等の緩衝液又は超純水を用い、室温・常圧下の条件で測定し得られた光散乱強度の分布からキュムラント解析によって算出すればよい。
【００４７】
本発明に係る中性又はアニオン性リポソームのＺ電位は、特に限定はされないが、通常は−８０〜０ｍＶ程度とすればよく−８０〜−２０ｍＶ程度が好ましい。
【００４８】
Ｚ電位が−８０〜０ｍＶ程度であれば生体内に投与した際に非特異的な細胞やその他の生体成分と吸着しにくいため、生体内で長期間安定な状態で保持されるといった効果を発揮し得る。また、−８０〜−２０ｍＶ程度であればリポソーム同士の電荷的な反発によって、保存時の溶液中での分散状態が良好となり、長期間における保存性の向上といった効果を発揮し得る。
【００４９】
リポソームのＺ電位の測定方法は、特に限定はされないが、例えばレーザードップラー式電気泳動法の原理等に基づいた機器を用いて測定し、Ｈｅｎｒｙの式によりゼータ電位を算出すればよい。より具体的に、レーザードップラー式電気泳動法の原理を用いた測定であれば、実施例に示すように、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ又はその同等品を用い、純水中で、室温・常圧下の条件で測定し、算出すればよい。
【００５０】
本発明に係るリポソームに内封される核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよい。また核酸のサイズは、特に限定はされないが通常は２０ｎｔ程度以上（１０ｂｐ程度以上）であればよい。なお、上限値として６０００以下の核酸となるサイズが好ましい。
【００５１】
上記核酸とは、具体的にはＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸アナログ等が挙げられ、特に限定はされない。
【００５２】
核酸アナログは、特に限定はされないが、例えばＧＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡ、モルホリノ等が挙げられる。
【００５３】
本発明に係る中性又はアニオン性リポソームは、その表面がアルキレングリコールによって表面修飾されていてもよい。アルキレングリコールは特に限定はされないが、例えば、エチレングリコール、メチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール；エチレンオキシド、プロピレンオキシド、ブチレンオキシド等のアルキレンオキシドをモノマー単位として重合したポリアルキレングリコール等が挙げられる。
【００５４】
ポリアルキレングリコールはランダム重合体であってもブロック重合体であってもよく、分子量としては通常は１０００〜８０００程度であればよい。ポリアルキレングリコールの具体例としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール等が挙げられる。
【００５５】
本発明に係る中性又はアニオン性リポソームとアルキレングリコールの結合態様は特に限定はされないが、リポソームを構成する脂質とアルキレングリコールが化学結合されてなる態様が好ましい。中でも、後述する具体的なリポソームを構成する脂質の中でも親水性基を有する脂質の親水性基とアルキレングリコールが結合していることが好ましい。
【００５６】
なお、斯かる結合はＮＨＳエステルと上記親水性基に含まれるアミド基の結合、マレイイミド基と上記親水性基に含まれるスルフヒドリル基（チオール基）の結合等を介していることが好ましく、更に架橋剤によって結合が強固となるような処理が施されていてもよい。
【００５７】
本発明に係る中性又はアニオン性リポソームは、その内部に水又は緩衝液を含んでいてもよく、これらで満たされていてもよい。
【００５８】
本発明に係る中性又はアニオン性リポソーム構成脂質は、特に限定はされないが、リン脂質、コレステロール類、脂肪酸等が挙げられる。
【００５９】
リン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン、これらを常法によって水素添加したもの等の天然リン脂質；ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジチオピリジン−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＴＰ−ＤＰＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、エレオステアロイルホスファチジルコリン、エレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン、エレオステアロイルホスファチジルセリン等の合成リン脂質；又はこれらの塩等が挙げられる。
【００６０】
これらのリン脂質の中でも、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン等を構成脂質として多く含むリポソームは、そのＺ電位が低くなる傾向となり、上述のような中性、アニオン性の性質を発揮しやすくなる。
【００６１】
コレステロール類としては、例えばコレステロール、フィトステロール（シトステロール、スチグマステロール、フコステロール、スピナステロール、ブラシカステロール）、ラノステロール、エルゴステロール、これらの脂肪酸エステル等が挙げられる。このようなコレステロール類を構成脂質として多く含むリポソームは、その相転移温度が上述のように高くなる傾向となる。
【００６２】
脂肪酸としては、オレイン酸、パルミトレイン酸、リノール酸、或いはこれら不飽和脂肪酸を含む脂肪酸混合物等が挙げられる。中でも、側鎖の小さい不飽和脂肪酸を構成脂質として多く含むリポソームは、曲率の関係から粒子径が小さくなる傾向となる。
【００６３】
本発明に係る中性又はアニオン性リポソームの中でも、ＤＰＰＣ、ＤＰＰＥ、ＤＰＰＧ、及びコレステロールを構成脂質として含むリポソームが、そのＺ電位及び相転移温度の観点から好ましい。なお、ＤＰＰＣ、ＤＰＰＥ、及びＤＰＰＧはその塩であってもよい。
【００６４】
また、上述のように本発明に係るリポソームの表面がアルキレングリコールによって表面修飾される場合、上述の構成脂質として予めポリアルキレングリコールを有する化合物を用いてもよい。
【００６５】
＜本発明に係るリポソームの製造方法＞
上述の本発明に係る中性又はカチオン性リポソームの製造方法は、
（Ａ）中性又はアニオン性リポソームを構成する脂質
（Ｂ）核酸
（Ｃ）カルシウム塩、及び
（Ｄ）炭素数１〜４の低級アルコール
を含む水又は緩衝液を撹拌する工程を含む。
【００６６】
（Ａ）中性又はアニオン性リポソームを構成する脂質、及び（Ｂ）核酸は、＜中性又はアニオン性リポソーム＞に記載したものと同様とすることができる。
【００６７】
（Ｃ）カルシウム塩は、特に限定はされないが、例えば塩化カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム等が挙げられる。
【００６８】
（Ｄ）炭素数１〜４の低級アルコールは、特に限定はされないが、例えばエタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等が挙げられ、特に限定はされない。
【００６９】
緩衝液は、特に限定はされないが、通常は医学・生物学的手段にて用いられる中性領域で緩衝能を発揮する緩衝液であればよく、例えばＰＢＳ、ＴＢＳ、ＨＥＰＥＳ等が挙げられる。
【００７０】
水又は緩衝液中のカルシウム塩の最終濃度は、特に限定はされないが、通常は１〜１００ｍＭ程度とすればよい。
【００７１】
水又は緩衝液中の炭素数１〜４の低級アルコールの量は、特に限定はされないが、水又は緩衝液に炭素数１〜４の低級アルコールを合わせた全量を１００容量部とした際、通常は１０〜５０容量部程度とすればよい。
【００７２】
水又は緩衝液に、（Ａ）〜（Ｄ）の成分を混合する際の順序は、特に限定はされないが、例えば、（Ｄ）炭素数１〜４の低級アルコールに（Ａ）中性又はアニオン性リポソームを構成する脂質を混合し、これと共に（Ｃ）カルシウム塩及び（Ｂ）核酸を水又は緩衝液に混合する手段が挙げられる。
【００７３】
なお、水又は緩衝液への（Ｃ）カルシウム塩及び／又は（Ｂ）核酸の混合は、（Ａ）中性又はアニオン性リポソームを構成する脂質を混合した（Ｄ）炭素数１〜４の低級アルコールの混合の前に予め終了していてもよい。
【００７４】
更に、水又は緩衝液への（Ａ）中性又はアニオン性リポソームを構成する脂質を混合した（Ｄ）炭素数１〜４の低級アルコール、（Ｂ）核酸、及び（Ｃ）カルシウム塩の混合と同時に、撹拌処理を行ってもよい。
【００７５】
撹拌処理は、特に限定はされないが、例えばボルテックスミキサー、マグネティックスターラー等の公知の方法、機器等を用いて行うことができる。
【００７６】
本発明の製造方法には、撹拌工程の後に、透析工程に供して、カルシウム塩又は炭素数１〜４の低級アルコールを除去する工程が含まれていてもよい。
【００７７】
＜複合体＞
本発明に係る複合体は、上述の本発明に係る中性又はアニオン性リポソームとバイオナノカプセルを含む。
【００７８】
本発明に係る複合体におけるリポソームとバイオナノカプセルの重量比は、特に限定はされないが、通常はリポソーム１００重量部に対してバイオナノカプセルが５〜１００程度とすることができる。粒子数比では、リポソーム１０粒子あたり、バイオナノカプセルが４〜５０程度とすればよい。
【００７９】
バイオナノカプセルの構成成分は特に限定はされないが、例えば脂質及び自己組織化能を有するタンパク質を含んでいればよい。
【００８０】
自己組織化能を有するタンパク質は、生体内、特に細胞内で小胞体ルーメン、細胞膜、核膜等の脂質二重膜を巻き込んでウイルス様粒子を形成し得るタンパク質である範囲において特に限定はされないが、例えば、エンベローブを有するウイルスの出芽機能に関連するタンパク質、エンベローブタンパク質、又はこれらの変異体等が挙げられる。
【００８１】
エンベローブを有するウイルスは、特に限定はされないが、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）等のヘパドナウイルス科に属するウイルス；センダイウイルス（ＨＶＪ）等のパラミクソウイルス科に属するウイルス；単純ヘルペスウイルス等のヘルペスウイルス科に属するウイルス；インフルエンザウイルス等のオルトミクソウイルス科に属するウイルス；ヒト免疫不全ウイルス等のレトロウイルス科に属するウイルス等が挙げられる。
【００８２】
自己組織化能を有するタンパク質は特に限定はされないが、例えば、ＨＶＢの出芽機能に関連するタンパク質であるＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質；ＨＶＪの出芽機能に関連するタンパク質であるＦプロテイン、ヘマグルチニンーノイラミニダーゼタンパク質、又はこれらの変異体が挙げられる。中でもＨＢｓＡｇタンパク質、ＨＢｓＡｇタンパク質の変異体等が好ましい。
【００８３】
上記変異体とは、上述のようなウイルス様粒子を形成し得る作用を発揮する範囲に限りにおいて特に限定はされることはなく、具体的な変異導入数も同様の範囲において特に限定はされないが、通常は変異導入前のアミノ酸配列と８５％程度以上、好ましくは９０％程度以上、より好ましくは９５％程度以上、最も好ましくは９９％程度以上の同一性を有する変異体となるような変異導入数とすればよい。
【００８４】
なお、ここでいう変異導入とは、置換、欠失、挿入等を包含する。具体的な変異導入方法は、公知の方法を用いて実施することができ、特に限定はされないが、例えば置換であれば保存的な置換技術を採用すればよい。
【００８５】
用語「保存的な置換技術」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。
【００８６】
例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン等といった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることは保存的な置換技術にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸等といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基同士；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン等といった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基同士；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン等といった非極性側鎖を有するアミノ酸残基同士；スレオニン、バリン、イソロイシン等といったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基同士、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン等といった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に保存的な置換にあたる。
【００８７】
用語「同一性」とは、２以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対する同一のアミノ酸配列の程度をいう。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を参照すればよい。
【００８８】
ＨＢｓＡｇタンパク質は、特に限定はされないが、例えば特許第４０８５２３１号に示すアミノ酸配列を含むタンパク質等が挙げられ、そのＨＢｓＡｇの変異体とは、例えば特許４０８５２３１号に記載の低抗原性粒子に含まれるＨＢｓＡｇ変異体、特開２００４−０８１２１０号公報に記載のシステイン残基を改変したＨＢｓＡｇタンパク質、特開２０１３−０２１９９９号公報に記載の大腸菌発現用ＨＢｓＡｇタンパク質等が挙げられる。
【００８９】
上記自己組織化能を有するタンパク質には、組織特異的結合分子が含まれていてもよい。組織特異的結合分子とは、特に限定はされないが、タンパク質、ペプチド、糖鎖等が挙げられる。タンパク質又はペプチドとしては、例えば抗体、レクチン、これらの断片等が挙げられる。
【００９０】
中でも、組織特異的結合分子が抗体である場合、上記自己組織化能を有するタンパク質中に抗体結合ドメインを保持していてもよい。抗体結合ドメインとしては、抗体のＦｃドメインに結合するドメインであることが好ましい。具体的な抗体結合ドメインは、特に限定はされないが、例えばプロテインＡに含まれる抗体結合ドメイン、プロテインＧに含まれる抗体結合ドメイン、プロテインＬに含まれる抗体結合ドメイン等が挙げられる。
【００９１】
例えば、自己組織化能を有するタンパク質がＨＢｓＡｇタンパク質であり、プロテインＡに含まれる抗体結合ドメインであるＺドメインをタンデムで、これをＨＢｓＡｇタンパク質のＮ末端に有する態様として、特許第４２１２９２１号に記載されたＨＢｓＡｇタンパク質の変異体が挙げられる。
【００９２】
上述のようなバイオナノカプセルの製造方法は、特に限定されることはなく、公知の方法を採用して得ることができる。具体的には、酵母などの真核細胞に、自己組織化能を有するタンパク質又はその変異体のアミノ酸配列をコードする遺伝子を導入し、斯かる細胞を培養の後細胞内からバイオナノカプセルを精製することができる。精製工程には適当なカラムクロマトグラフィー採用すればよいが、更に、熱処理工程が含まれていると精製効率が上昇するので好ましい。
【００９３】
本発明に係る複合体は、上述の本発明に係る中性又はアニオン性リポソームと上述のバイオナノカプセルとを混合しさえすればよい。混合時の条件は公知の方法を採用すればよいが、例えば特開２０１２−６７０４０号公報に記載のように、通常、医学・生物学的実験等にて多用される中性領域のｐＨ環境下ではなく、ｐＨ５以下又は１０以上の環境下で混合することが好ましい。
【００９４】
本発明の中性又はアニオン性リポソームには、上記核酸に代えて又は同時に薬剤も封入することもできる。とは特に限定はされないが、例えば公知の医薬組成物の有効成分であればよく、特にカチオン性を有する有効成分であることが好ましい。
【００９５】
＜医薬組成物＞
本発明に係る医薬組成物は、上述の中性若しくはアニオン性リポソーム、又は上述の複合体を含む。医薬組成物中の中性又はアニオン性リポソームの含有量は、特に限定はされないが、通常は医薬組成物１００重量部あたり、０．００１〜１００重量部程度とすればよい。すなわち、本発明に係る中性又はアニオン性リポソームそのものを本発明に係る医薬組成物としてもよい。
【００９６】
同様に医薬組成物中の複合体の含有量も、特に限定はされることはなく、通常は医薬組成物１００重量部あたり、０．００１〜１００重量部程度とすればよい。すなわち、本発明に係る複合体そのものを本発明に係る医薬組成物としてもよい。
【００９７】
本発明に係る医薬組成物には、上述の中性若しくはアニオン性リポソーム又は上述の複合体を含むが、中でも中性又はアニオン性リポソームに内包される核酸が有効成分として働く。従って、本発明に斯かる医薬組成物は、核酸が発揮する機能に従って、種々の患者に投与することが可能である。例えば、核酸が肝細胞にて疾患の作用機序として働く遺伝子の発現を抑制する効果を発揮するものであれば、斯かる作用機序によって発症する肝疾患の治療に有用と考えられる。
【００９８】
用語『治療』とは、所望の薬理学的効果及び／又は生理学的効果を得ることを意味する。この効果は、疾病及び／又は疾病に起因する悪影響（病態、症状等）を、部分的又は完全に治癒することを含む。また、上記効果には、疾病及び／又は疾病に起因する悪影響（病態、症状等）の進行を阻止又は遅延する効果、病態や症状を緩和する（疾病、症状等の後退、又は進行の逆転を引き起こす）効果、再発を阻止する効果等が含まれる。
【００９９】
また、上記効果には、疾病及び／又は疾病に起因する悪影響（病態、症状等）の素因を持ち得るが、まだ持っていると診断されていない個体において、疾病及び／又は疾病に起因する悪影響（病態、症状等）が起こることを部分的又は完全に防止する効果が含まれる。従って、『治療』なる用語には、『緩解』、『再発防止』、『予防』等の意味も含まれる。
【０１００】
本発明に係る医薬組成物の投与方法は、投与対象、後述する医薬組成物の剤形等に応じて適宜選択すればよいが、例えば経口投与、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、くも膜下腔内投与、皮内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、肺内投与、眼内投与、腟内投与、頸部内投与、直腸内投与、皮下投与等が挙げられる。
【０１０１】
本発明に係る医薬組成物の投与量は、上述のように有効成分となる核酸の量に換算し、その効果を発揮し得る範囲において適宜設定すればよい。
【０１０２】
本発明に係る医薬組成物の剤形は、特に限定はされないが、例えばＤＤＳ製剤、輸液剤、埋め込み注射剤、持続性注射剤等の注射剤；腹膜透析用剤、血液透析用剤等を含む透析用剤；口腔内崩壊錠、チュアブル錠、発泡錠、分散錠、溶解錠等等の錠剤；硬カプセル錠、軟カプセル錠等のカプセル剤；発泡顆粒剤、徐放性顆粒剤、腸溶性顆粒剤等を含む顆粒剤；散剤；エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、リモナーデ剤等の経口液剤；シロップ用剤等のシロップ剤；経口ゼリー剤；トローチ剤、舌下錠、バッカル錠、付着錠、ガム剤等の口腔用錠剤；口腔用スプレー剤；口腔用半固形剤；含嗽剤；吸入粉末剤、吸入液剤、吸入エアゾール剤等の吸入剤；眼軟膏剤等の点眼剤；点耳剤；点鼻粉末剤、点鼻液剤等の点鼻剤；坐剤；直腸用半固形剤；注腸剤；膣錠；膣用坐剤；外用散剤等の外用固形剤；リニメント剤、ローション剤等の外用液剤；外用エアゾール剤、ポンプスプレー剤等のスプレー剤；軟膏剤；クリーム剤；ゲル剤；テープ剤、パップ剤等の貼付剤等が挙げられる。
【０１０３】
本発明に係る医薬組成物には、本発明に係る中性又はアニオン性リポソーム又は本発明に係る複合体と共に、これらの効果を損なわない範囲に限り、薬学的に許容可能な公知の担体又は添加物を配合し、公知の方法を採用して上述の剤形とすることができる。
【０１０４】
具体的な担体又は添加物は、特に限定はされないが、例えば希釈剤、賦形剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、媒体、送達システム、乳化剤、錠剤分解物質、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、香料、甘味料等等が挙げられる。
【０１０５】
本発明に係る医薬組成物は、上述のような核酸を内封した中性又はアニオン性リポソーム（非カチオン性リポソーム）を含有する。このような非カチオン性リポソームは、生体内に投与しても、免疫システムに感知され難く、排出経路に導かれない傾向となる。更に、生体内の臓器に非特異的に捕捉されにくい。
【０１０６】
以上、本発明に係る医薬組成物は優れた臓器ターゲティング効果を発揮するのでＤＤＳ製剤とすることが好ましい。
【０１０７】
また、本発明に係る中性又はアニオン性リポソームには有効成分となり得る核酸を内封しているため、生体に投与してもヌクレアーゼ等の酵素からの攻撃に耐えうるため、特定の臓器に有効成分を安全に送達できるといった効果も発揮する。このことからも、本発明に係る医薬組成物はＤＤＳ製剤とすることが好ましい。
【０１０８】
そして、本発明に係る医薬組成物が複合体を含むものである場合であって、例えばバイオナノカプセルに含まれる自己組織化能を有するタンパク質としてＨＢｓＡｇタンパク質を含むものである場合、斯かるタンパク質のＮ末端領域（バイオナノカプセル表層提示領域）に存在するアミノ酸配列による肝細胞認識機能に基づいて、肝臓組織へ有効成分である核酸を安全に、且つ特異的に送達することが可能である。
【０１０９】
更に、上述のように自己組織化能を有するタンパク質が組織特異的結合分子を有する場合、斯かる結合分子の働きによって生体内の所望の部位に有効成分である核酸を安全に、且つ特異的に送達することが可能となる。
【０１１０】
以上のことからも、本発明に係る医薬組成物には、ＤＤＳ製剤として特に有効に用いることができる態様の発明も包含する。
【実施例】
【０１１１】
以下に本発明をより詳細に説明するための実施例を示す。ただし、本発明が以下に示す実施例に限定されないのは言うまでもない。
【０１１２】
＜比較例＞
核酸を内封するリポソーム作製の従来法
〔リポソームの調製〕
ナスフラスコ内で以下に示す任意の脂質を所望のモル比で混合し、クロロホルム：メタノール＝２：１の混合溶媒に溶解させた。次いでこれを真空減圧して溶媒を除去し、脂質フィルムを形成させた。ここに、超純水又は１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファーを加えてバッファー中にてリポソームを形成させた。得られたリポソームは適宜エクストルーダーを用いて所定の粒子径となるように調製した。
【０１１３】
〔核酸の内封〕
内封する核酸として、配列番号１〜４の何れかに示す塩基配列からなるｓｉＲＮＡを必要に応じて組み合わせて用いた。なお、配列番号１及び２に示す塩基配列からなるｓｉＲＮＡはホタル由来のルシフェラーゼの遺伝子の発現を抑制することを目的に設計された塩基配列を有するものであり、配列番号３及び４に示す塩基配列からなるｓｉＲＮＡは、細胞への導入実験時にコントロールとして多用されるスクランブル配列を有するものである。
【０１１４】
上述のように調製したリポソームを含む溶液に、重量比でｓｉＲＮＡ：リポソーム＝１〜１０：１００となるようにｓｉＲＮＡを加えた。また、斯かる溶液に塩化カルシウムを加えた。斯かる溶液をヴォルテックスで撹拌しながら、溶液全体に対する終濃度が４０％（ｖ／ｖ）エタノールとなるように添加した。なお、エタノール添加後の塩化カルシウムの濃度は１〜１０ｍＭ程度であった。
【０１１５】
次いで、斯かる溶液をＰＢＳで透析し、エタノールとカルシウムイオンを除いてｓｉＲＮＡを内封するリポソームを作製した。
【０１１６】
（比較製造例１）
下記表１に示す脂質組成（組成比；ｍｏｌ比）及びＩｎｐｕｔ（重量比；ｓｉＲＮＡ／リポソーム）でｓｉＲＮＡ内封リポソームを製造した。各種測定結果も表１に示す。
【０１１７】
表中の内封率（％）は、（リポソームに内封されているｓｉＲＮＡ量）／（未封入ｓｉＲＮＡを含む溶液全体に含まれるｓｉＲＮＡ量）×１００（％）で算出した。
【０１１８】
未封入ｓｉＲＮＡを含む溶液全体に含まれるｓｉＲＮＡ量は、Ｑｕａｎｔ―ｉＴ（登録商標）  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００溶液をリポソーム溶液に終濃度１６．７％で添加する事でリポソームを破壊し、内封ｓｉＲＮＡを漏出させて測定した。また、リポソームに内封されていないｓｉＲＮＡ量は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を使用せずリポソームを破壊しない条件で同様の測定を行った。
【０１１９】
また、リポソームに内封されているｓｉＲＮＡ量は、（未封入ｓｉＲＮＡを含む溶液全体に含まれるｓｉＲＮＡ量）-（リポソームに内封されていないｓｉＲＮＡ量）より算出した。
【０１２０】
表中の対脂質核酸量（核酸はｓｉＲＮＡ；重量％）は、（リポソームに内封されたｓｉＲＮＡ量）／（リポソーム量）×１００（％）で算出した。溶液中のリポソーム量は、コレステロールＥ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）、もしくはリン脂質Ｃ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）によって測定した。
【０１２１】
表中の粒子径（Ｚ−ａｖｅｒａｇｅ；ｎｍ）は、動的光散乱法の原理に基づいた装置であるＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳを用いて測定した。
【０１２２】
表中の電荷（Ｚ−ｐｏｔｅｎｔｉａｌ；ｍＶ）は、レーザードップラー式電気泳動法に基づいた装置であるＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳを用いて測定した。なお、測定したリポソームは超純水を溶媒とするものであるため、測定値はマイナス側にシフトする傾向となる。
【０１２３】
【表１】
0006404034.tif 000002
【０１２４】
上述のように、ＤＯＰＣやこれとＤＯＰＥを構成脂質とする中性リポソームへの核酸の内封量は、インプットとして核酸量を増やすほど、内封率及び対脂質核酸量が増えることが明らかとなったが、同時に得られる核酸が内封されたリポソームの粒子径が増大する傾向となることが明らかとなり、インプットを２０／１００とした場合には、５００〜１０００ｎｍとなった（データ示さず）。従って、比較例に示す方法にてリポソームに核酸を内封するためのインプットは、１０／１００が限度であると考えられる。
【０１２５】
また、カルシウムイオン及び／又はエタノールが本製法によるリポソームへの核酸の内封が必須であることも明らかとなった（データ示さず。）
【０１２６】
（比較試験例１）
得られた核酸内封リポソームをアガロースゲル電気泳動法に供し、リポソーム内に核酸が封じ込められているかどうかを確認する実験を行った。
【０１２７】
比較製造例１にて得られた、核酸を内封させた２種の脂質組成からなるリポソームをそのままか、又は１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理して脂質膜の破壊処理を施したサンプル調製し、アガロースゲル電気泳動法に供した。また、コントロールとして、核酸そのもの（上述の配列番号１〜４の何れかに示す塩基配列からなるｓｉＲＮＡ）を用いた。結果を図１に示す。
【０１２８】
図１から明らかなように、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００処理を施すことによって、核酸（ｓｉＲＮＡ）のバンドが検出された。従って、上述の方法によって得られるリポソームには、核酸が内包されていることが明らかとなった。
【０１２９】
（比較試験例２）
比較製造例１にて得られた、核酸を内封させた２種の脂質組成からなるリポソームを上述の（比較試験例１）におけるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００処理に代えて、血清（ＦＢＳ）処理に供し、血清中のヌクレアーゼによる核酸の分解に耐えるかどうかを確認する実験を行った。血清処理は、５０％ＦＢＳ中で３０分、３７℃での処理とした。斯かる処理後のサンプルを（比較試験例１）と同様にアガロースゲル電気移動法に供した。また、コントロールとして、核酸そのもの（封入に用いたｓｉＲＮＡそのもの）を用いた。結果を図２に示す。
【０１３０】
図２に示す結果から、コントロールとして用いた核酸そのものをＦＢＳ処理に供した場合、核酸が完全に分解されているのに対して、核酸を封入したリポソームをＦＢＳ処理に供しても、分解されにくくなっていることが明らかとなった。以上のことから、（比較製造例１）にて作製した２種類のリポソーム中には、核酸が内封されていることが明らかになった。
【０１３１】
（比較製造例２）
上述の比較製造例１と同様の方法で、各種脂質組成のリポソームに核酸を内包させる実験を行った。Ｉｎｐｕｔは、全て重量比でｓｉＲＮＡ／リポソーム＝１０／１００とした。下記表２に表１と同様に脂質組成（組成比はモル比）、対脂質核酸量、粒子径、及び電荷と共に、相転移温度（℃）を示す。なお、相転移温度が高いと、リポソームの性状が硬くなる傾向であることが知られている。なお、ｓｉＲＮＡは比較製造例１と同じものを用いた。
【０１３２】
【表２】
0006404034.tif 000003
【０１３３】
表２に示すように、比較製造例１及び２に示す方法では、相転移温度が高く、固い性状を有するリポソームに対して核酸を封入させることは非常に困難であることが明らかとなった。そして、相転移温度が６０℃を超えるＤＰＰＣ：ＤＰＰＥ：ＤＰＰＧ−Ｎａ：Ｃｈｏｌ＝１５：１５：３０：４０となる脂質組成からなるリポソームに対して、核酸を内封させることすらできなかった。
【０１３４】
＜実施例＞
本発明の核酸を内封するリポソームの製造方法
本発明では、上述の＜比較例＞にて示す２段階の製造例とは異なる方法で、核酸を内封するリポソームを製造した。
【０１３５】
エタノール中で任意の脂質を所望のモル比で混合した。ここに、上述のｓｉＲＮＡを脂質との質量比が、ｓｉＲＮＡ：脂質＝１０：１００又は２０：１００となるように、超純水又はバッファーと共にヴォルテックスで撹拌しながら混合し、溶液全体に対するエタノールの量が、４０％（ｖ／ｖ）となるように調製した。なお、エタノールへの各種成分の添加後の塩化カルシウムの濃度は１〜１０ｍＭ程度であった。
【０１３６】
次いで、斯かる溶液をＰＢＳで透析し、エタノールとカルシウムイオンを除いてｓｉＲＮＡを内封するリポソームを作製した。
【０１３７】
＜製造例１＞
下記表３に示す脂質組成（組成比はｍｏｌ比）及びＩｎｐｕｔ（重量比；ｓｉＲＮＡ／リポソーム）でｓｉＲＮＡ内封リポソームを製造した。各種測定結果も表３に示す。
【０１３８】
表中の内封率、対脂質核酸量、及び粒子径は、上記（比較製造例１）の表１にて説明したとおりである。
【０１３９】
【表３】
0006404034.tif 000004
【０１４０】
上述のように、ＤＯＰＣやこれとＤＯＰＥを構成脂質とする中性リポソームへの核酸の内封量は、インプットとして核酸量を増やすほど、内封率及び対脂質核酸量が増えることが明らかとなった。
【０１４１】
上記表３に示すＤＰＰＣ／ＤＰＰＥ／ＤＰＰＧ−Ｎａ／Ｃｈｏｌ（１５／１５／３０／４０）の核酸（ｓｉＲＮＡ）を内封する非カチオン性リポソームを、比較実験例１及び２と同様の処理に供し、核酸がリポソーム内に内封されているかどうかを確認する実験を行った。図３に比較実験例１と同様に、界面活性剤処理に供した実験結果、図４に血清処理に供した実験結果を示す。
【０１４２】
図３及び４から明らかなように、界面活性剤処理に供した実験結果から核酸が分解されることは無く、、血清処理に供しても核酸が分解されることはなかったことから、ＤＰＰＣ／ＤＰＰＥ／ＤＰＰＧ−Ｎａ／Ｃｈｏｌ内には確かに核酸が内封されていることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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