(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
代表的なサンプルが受託番号ＤＳＭ２４８２９として寄託されているＶｅ４２７ＲＢとして指定されるトマト黄化壊疽ウイルス（ＴＳＷＶ）のＴｓｗ−耐性破壊株に対して耐性であるカプシクム・アニュームの非トランスジェニック栽培トウガラシ植物であって、
前記トウガラシ植物が、代表的な種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４１９３６として寄託されている野生トウガラシ系統株ＰＡ２６３８由来の遺伝子移入フラグメントを含み、
前記遺伝子移入フラグメントが、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性を付与する形質を含み、
Ｖｅ４２７ＲＢにより感染または接種された前記トウガラシ植物の少なくとも６０％が、全体的兆候を発症しない、前記トウガラシ植物。
【請求項２】
代表的な種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４１９３６として寄託されている野生系統株ＰＡ２６３８の植物を交配することにより得られうるか、または種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４１８１７またはＮＣＩＭＢ４１８１８として寄託された植物を、別のトウガラシ植物と交配することにより得られうる、請求項１記載のトウガラシ植物。
【請求項３】
以下の型：ブロッキー・ベル型（ｂｌｏｃｋｙ  ｂｅｌｌ  ｔｙｐｅ）、カイエンヌ型（Ｃａｙｅｎｎｅ  ｔｙｐｅ）、ラムヨー型（Ｌａｍｕｙｏ）、ドルチェ・イタリアーノ（Ｄｕｌｃｅ  Ｉｔａｌｉａｎｏ）、コニカル（ｃｏｎｉｃａｌ）、カピア（Ｃａｐｉａ）、スィート・チャールストン（Ｓｗｅｅｔ  Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ）、ドルマ（Ｄｏｌｍａ）、チェリー（Ｃｈｅｒｒｙ）、ハラペニョ型（Ｊａｌａｐｅｎｏ  ｔｙｐｅ）、シャキラ（Ｓｈａｋｉｒａ）、ペンシル（Ｐｅｎｃｉｌ）またはホット・チャールストン（Ｈｏｔ  Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ）、シヴリ（Ｓｉｖｒｉ）、ハンガリアン・ワックス（Ｈｕｎｇａｒｉａｎ  Ｗａｘ）、カプヤ（Ｋａｐｙａ）、バナナ（ｂａｎａｎａ）、アンチョ（ａｎｃｈｏ）、フレズノ（Ｆｒｅｓｎｏ）、セラーノ（Ｓｅｒｒａｎｏ）、アナハイム（Ａｎａｈｅｉｍ）、パシラ（Ｐａｓｉｌｌａ）、サンタ・フェ（Ｓａｎｔａ  Ｆｅ）、スコッチ・ボンネット（Ｓｃｏｔｃｈ  ｂｏｎｎｅｔ）、ハバネロ（Ｈａｂａｎｅｒｏ）から選択される果実をつける、請求項１または２記載のトウガラシ植物。
【請求項４】
前記果実がベル型またはラムヨー型である、請求項３記載のトウガラシ植物。
【請求項５】
近交系またはＦ１ハイブリッドである、請求項１〜４のいずれか１項記載のトウガラシ植物。
【請求項６】
ゲノム内にＴｓｗ耐性遺伝子をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項記載のトウガラシ植物。
【請求項７】
野性型ＴＳＷＶ株による感染または接種後に全体的兆候を示さない、請求項６記載のトウガラシ植物。
【請求項８】
前記野性型ＴＳＷＶ株が、Ｂｒ０１ＷＴ、ｐ１０５ＷＴ、Ｖｅ４３０ＷＴ、Ｂｒ２０ＷＴおよびｐ１７０ＷＴから選択される、請求項７記載のトウガラシ植物。
【請求項９】
Ｔｓｗ−耐性遺伝子の存在がＤＮＡマーカーを用いて検出できる、請求項６〜８のいずれか一項記載のトウガラシ植物。
【請求項１０】
Ｔｓｗ−耐性遺伝子を含み、かつ代表的なサンプルが受託番号ＤＳＭ２４８２９として寄託されているＶｅ４２７ＲＢに対して耐性であるカプシクム・アニューム種の栽培トウガラシ植物であり、
Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性アッセイにおいて、試験した植物の少なくとも６０％が、株Ｖｅ４２７ＲＢを用いた第一回目の接種の約２８日後に上部の非接種葉に対して全体的兆候を示さない系統である、請求項１〜９のいずれか１項記載のトウガラシ植物。
【請求項１１】
種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４１８１７、ＮＣＩＭＢ４１８１８およびＮＣＩＭＢ４１９３６として寄託された植物を、別のトウガラシ植物と交配することにより、耐性が得られる、請求項１〜１０のいずれか１項記載のトウガラシ植物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項記載のトウガラシ植物が生育されうる種子。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項記載のトウガラシ植物の果実またはその部分。
【請求項１４】
前記部分が果実の果肉である、請求項１３記載の果実またはその部分。
【請求項１５】
果実が、少なくとも７ｃｍ長および／または少なくとも２ｃｍ幅である、請求項１３または１４記載の果実またはその部分。
【請求項１６】
甘トウガラシの果実である、請求項１３〜１５のいずれか一項記載の果実またはその部分。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか１項記載のトウガラシ植物のイン・ビトロの細胞または組織培養物。
【請求項１８】
Ｖｅ４２７ＲＢとして指定されるトマト黄化壊疽ウイルス（ＴＳＷＶ）の株に対して耐性であるカプシクム植物を作出する方法であって、
（ａ）Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性アッセイを行なうことにより、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のカプシクム植物または系統または品種を、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性についてスクリーニングする工程、
（ｂ）Ｖｅ４２７ＲＢ感染後に全体的兆候を発症しないカプシクム植物または系統または品種を同定する工程、
（ｃ）同定した植物または系統または品種を、別の栽培カプシクム植物と交配して、Ｆ１植物を作出する工程、および、
（ｄ）Ｆ１植物を１回以上自殖または交配して、Ｖｅ４２７ＲＢ耐性を有する後代カプシクム植物を作出する工程
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、植物育種および植物改良、特にＴｓｗ−耐性破壊株Ｖｅ４２７ＲＢに対して耐性であるカプシクム・アニューム・エル種（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ Ｌ．）の植物体に関する。
【背景技術】
【０００２】
(本発明の背景)
カプシクム・アニューム・エル植物体は、ナス科の草木植物である。この植物体は、約０．５〜１．５メートル（２０〜６０インチ）に達する。一つの白色の花は、トウガラシの果実を実らせる。この果実は、未熟時には緑色であり、幾つかの品種は茶色または紫色へと熟すが、基本的には赤色に変化する。この種は、殆どの気候に耐えることができるが、特に温暖かつ乾燥した気候において生産性が高い。カプシクム・アニューム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）品種の栽培トウガラシ植物体には、トウガラシの様々なタイプ、例えば、ピーマン、カイエンペッパー、パプリカおよびハラペニョが挙げられる。
【０００３】
トスポウイルスは、多くの植物種に対して重大な病理学的脅威であり、甚大なダメージを与え、世界中で損害をもたらしている(German et al. 1992, Ann Rev Phytopath V30: 315−348)。従って、トスポウイルス耐性を付与または増強する遺伝子は、耐性栽培品種を開発するためには、植物育種家にとっての継続的な標的である。Ｓｗ−５遺伝子は、リコペルシコン・ペルヴィアヌム(Lycopersicon peruvianum)から栽培トマトへと形質移入され、トスポウイルス血清群Ｉ（例えば、ＴＳＷＶ、トマト黄化壊疽ウイルス）および血清群ＩＩ（例えば、ＧＲＳＶおよびＴＣＳＶ、落花生リングスポット・ウイルスおよびトマト退緑スポットウイルス各々)に対する耐性を与える。
【０００４】
市販の甘および辛トウガラシ栽培品種は、近年高い頻度で、ＴＳＷＶ（他のトスポウイルス類、例えばＧＲＳＶまたはＴＣＳＶに対してではない）に対して超感度耐性を付与する優性の耐性遺伝子Ｔｓｗを含んでいる。Ｔｓｗ遺伝子は、カプシクム・キネンセ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ）種の系統であるＰＩ１５２２２５、ＰＩ１５９２３６から移入された(Black et al. 1991, Plant Disease. 75: 863; Boiteux et al 1995, Theor. Appl. Genet. 90: 146−149; Costa et al. 1995, First Int. Symposium on Solanaceae for the New Market, March 28−31 1995, Malaga, Spain, Acta Hortic. 412: 523−532)。Ｔｓｗを同定および／または選抜するための分子マーカーもまた開発されており(Moury et al. 2000, Genome 43: 137−142)、Ｊａｈｎらはトウガラシの染色体１０にＴｓｗ遺伝子をマッピングしている(2000, MPMI Vol 13: 673−682)。
【０００５】
１つの難点は、Ｔｓｗ遺伝子により与えられたＴＳＷＶ耐性が高温により破壊され、また植物の年数によって変わることである（若植物はより感受性が高い）。化学的証拠から、Ｔｓｗ−耐性遺伝子がＴＳＷＶの遠距離の移行を障害することにより機能し得るということを示唆していると考えられた(Rogero et al, Thrips and Tospoviruses：Proceedings of the 7th Int Symposium on Thysanoptera, pp105−110を参照されたい)。
【０００６】
Ｔｓｗ遺伝子に関するさらなる問題は、ＴＳＷＶのＴｓｗ−耐性破壊株が報告されていることである。このＴｓｗ−耐性破壊株は、優性なＴｓｗ耐性遺伝子を担持する植物に全体的に感染することができる。Ｃ．ｃｈｉｎｅｎｓｅの耐性を破壊する耐性破壊株に関する最初の報告は１９９３年にされた(Boiteaux et al. Plant Disease 77：210)。後に、Ｍｏｕｒｙらは、Ｔｓｗ耐性を克服するウイルス株も見出したが(1997, Euphytica 1994：45−52)、ＧＲＳＶまたはＴＣＳＶ単離物ではなく、むしろ本当にＴＳＷＶ単離物であったかどうかを評価するためにウイルス単離物を分類しなかった。
【０００７】
Ｒｏｇｇｅｒｏら(1999, Plant Disease Vol 83：p965)は、イタリアで、ＰＩ１５２２５由来のＴｓｗ遺伝子を担持するトウガラシハイブリッドにおけるＴｓｗ−耐性を克服する２つＴＳＷＶの野生単離株を見出した。血清学的アッセイにより、このウイルス単離株はＴＳＷＶ株であって、スリップベクターであるミカンキイロアザミウマ(Frankliniella occidentalis)により伝染することが確認された。２００２年には、Ｒｏｇｇｅｒｏらは、イタリアで別のＴｓｗ−耐性破壊株を報告した(Plant Disease Vol 86: 950−954)。試験した市販のトウガラシ全品種に対し、実験条件下においてこれらの耐性破壊ＴＳＷＶ株は全体的に感染した。しかし、Ｓｗ−５遺伝子を担持するＴＳＷＶ耐性トマトの品種は、トウガラシ由来のＴｓｗ−耐性破壊株に感受性ではなく、Ｓｗ−５およびＴｓｗは異なる特徴を有することを示した(Roggero et al. 2002,上掲)。この点は、Ｊａｈｎら(2000,上掲)によっても確認された。
【０００８】
２００４年に、Ｍａｒｇａｒｉａらは、スペイン（アルメリア）の農場でＴｓｗ−耐性破壊株を同定したことを報告した(Plant Pathology Vol 53：p794)。
【０００９】
Ｍａｒｇａｒｉａらは、優性なＴｓｗ耐性遺伝子を担持するトウガラシ植物体および様々な天然のＴＳＷＶ株（野生株およびＴｓｗ−耐性を破壊することができた株の両方）との相互作用を試験した［2007(MPMI Vol 20: 547−558)］。Ｔｓｗ−耐性破壊ＴＳＷＶ株は、その試験では上付きの「ＲＢ」により表示される。これらの耐性破壊株の一つは、２００３年にスペインのアルメリアのトウガラシ農場から単離されたＶｅ４２７ＲＢである。Ｔｓｗ−遺伝子を担持するトウガラシの接種葉上にのみ局所ダメージをもたらす野性型ＴＳＷＶ株とは異なり、耐性破壊ＴＳＷＶ株は、全体的な感染、例えば感染植物全体の至る場所で葉の退緑および黄化斑紋を引き起こす。野性型（株Ｂｒ０１ｗｔ）およびＲＢ株のゲノム間の再集合物を有する株を用いることにより、Ｍａｒｇａｒｉａらは、Ｔｓｗ−耐性破壊株の非病原性決定基が、低分子ＲＮＡ（Ｓ ＲＮＡ）で見出されたＮＳタンパク質（非構造タンパク質）であることを示すことができた(2007, MPMI Vol 20: 547−558)。この試験の耐性破壊株において、ＮＳタンパク質は、野性型ＮＳタンパク質と比べて、１または２つの変異または欠失を含んでいた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
優性なＴｓｗ遺伝子は、世界中の多くの地域において、ＴＳＷＶに対する耐性をトウガラシ品種へ付与する場合には依然として有用であるが、新規ＴＳＷＶ株、特にＴｓｗ−耐性破壊株によりもたらされるダメージを最小とするためには、ＴＳＷＶ耐性の新規起源株が、可能な限り迅速に必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の目的は、Ｔｓｗ−耐性破壊株に対して耐性を付与するＴｓｗ−遺伝子とは異なる新規耐性遺伝子を含むトウガラシ植物体、例えば、ＮＳタンパク質において変異および／または欠失を含む株を提供することである。一実施態様において、この新規耐性遺伝子は、Ｔｓｗ−耐性破壊株Ｖｅ４２７ＲＢに対して少なくとも耐性を付与する。本発明のさらなる目的は、新規耐性遺伝子およびＴｓｗ遺伝子の両方を含むトウガラシ植物体を提供すること、すなわち野性型ＴＳＷＶ株（病原型Ｐ０）およびＴｓｗ−耐性破壊株（病原型Ｐ１）（少なくともＶｅ４２７ＲＢ）、さらに好ましくは他のＴｓｗ−耐性破壊株（例えば、ＮＳタンパク質において１以上の欠失および／または変異を有する株および／またはＴｓｗ−遺伝子を担持するトウガラシ植物の全体的感染が可能である株）に対して耐性がある植物体を提供することである。
【発明の詳細な説明】
【００１２】
本明細書において使用されるように、用語「含む」およびその関連語は、この用語に後続する事項を包含するが、具体的に言及されていない事項は排除されないということを意味するために非限定的な意図で使用される。しかし、当業者は、用語「含む」はまた、用語「からなる」も包含する。すなわち、本発明の実施態様において、下位要素を含む要素、例えばＱＴＬは、当該下位要素からなってもよい。さらに、冠詞の引用による要素への言及は、内容から明らかに、要素が１つであるか、１つのみであるということが要求されなければ、１以上の要素が存在するという可能性を排除するものではない。従って、冠詞は、通常「少なくとも１つ」または「１以上の」を意味し、例えば、「細胞」とは、細胞培養物、組織、生物全体などの形態における複数の細胞もまた意味する。同様に、「植物」はまた複数の植物をいう。
【００１３】
「表現型」とは、その遺伝子型およびその環境の間の相互作用の結果として、植物の観察可能な外観および／または生理学的出現である。それは、観察できる形態学的特徴および／または生理学的特徴を包含する。
【００１４】
「遺伝子型」とは、環境因子により部分的に影響をうけた植物の元々持っている遺伝子情報の全てであり、これは表現型にて表される。
【００１５】
本明細書において使用されるとおり、「トウガラシ植物」または「トウガラシ」とは、カプシクム属の植物体またはその一部分(例えば、果実)である。トウガラシには、トウガラシ全種類、例えば、辛/刺激性トウガラシおよび非刺激性トウガラシ(甘トウガラシ)が挙げられる。この用語には、野生系統（wild accession）および栽培トウガラシが包含される。
【００１６】
「栽培トウガラシ」とは、カプシクム・アニューム・エル、カプシクム・キネンセ・ジャック（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ Ｊａｃｑ．）、カプシクム・フルテスセンス・エル（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ Ｌ．）、カプシクム・バッカツム・エル（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｂａｃｃａｔｕｍ Ｌ．）、およびカプシクム・プベッセンス・ルイーズ＆パヴ(Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ Ｒｕｉｚ＆Ｐａｖ．)の品種である。
【００１７】
本明細書において使用される用語「栽培品種」(または「栽培された」植物体)とは、「野生」状態以外の生物学的状態にある植物を示し、この「野生」状態とは、元々は栽培されてない、非栽培種または自然状態の植物または系統を示し、用語「栽培された」は、そのような野生または雑草の植物を含まない。用語「栽培品種」は、良好な農業的特徴、例えば、育種材、研究材、育種系統、優良な育種系列、合成集団、ハイブリッド、創始株(founder stock)/基本の集団、近交系、栽培品種(ハイブリッド栽培品種の放任授粉)、分離集団、変異/遺伝子ストック、および進化した/改良された栽培品種を有する物質を含まない。一実施態様において、用語「栽培品種」はまた、在来種、すなわち長年にわたり人によって地域的に選抜かつ栽培され、地域特有の環境に適応した、共通の遺伝子プールを共有するトウガラシ植物体(または集団)である。一般的には、「栽培トウガラシ」は、果実栽培のために、農場または保護環境(例えば、温室またはハウス露地)において、人により栽培される育種系統および多様な栽培トウガラシを指す。栽培品種は、野生系統と比較して、良好な農業的特徴、例えば、高収量、より大きな果実サイズ、高い繁殖性、植物および／または果実の高均一性などを有する。栽培品種の例示には、カプシクム・アニューム、カプシクム・キネンセ、カプシクム・フルテスセンス、カプシクム・バッカツム、およびカプシクム・プベッセンス種に属する栽培種が挙げられる。
【００１８】
本明細書において使用されるように、用語「植物」とは、植物全体またはその任意の一部または派生物、例えば、植物器官(例えば、栽培または非栽培果本葉、種、花など)、植物細胞、植物プロトプラスト、植物全体を再生できる植物細胞または組織培養物、植物カルス、植物細胞塊、および植物中または植物の一部におけるインタクトな植物細胞、例えば、胚、花粉、胚珠、卵巣、果実(例えば、収穫した組織または器官、例えば、収穫したトウガラシ果実またはその一部)、花、葉、種子、クローン化伝播植物、根、根茎、茎、根端などである。また、あらゆる発生段階には、例えば、実生、幼若および成熟などが含まれる。
【００１９】
本明細書で使用されるように、用語「果実」は、Ｔｓｗ−耐性破壊株に対する耐性を付与するトウガラシ植物、例えば株Ｖｅ４２７ＲＢにて成長したトウガラシの果実を示す。一実施態様において、果実とは、収穫される果実である。一実施態様において、かかる果実は、種が無い、すなわち果実は、種子を全く含まないか、または生育可能ではない種子を含むか、あるいは成熟期を含めたその発生の全段階において成熟種子を含まない（すなわち、それらは種子を介する伝播に好適ではない）。
【００２０】
トウガラシ果実の「水分の多い果肉（pulp）」、「鞘（pod）」または「果肉（flesh）」なる用語は、種子ではなく果実の一部をいう。一般的には、果実の果肉は種子を覆っており、そのため果肉および種子が本発明の意味における果実を形成する。
【００２１】
「植物品種」とは、既知の最下位の同じ植物分類のなかの植物の一群であって、これは(植物種育成者権の承認のための条件が満たされているかどうかに拘わらず)、特定の遺伝子型または遺伝子型の組合せから生じる特徴の発現を根拠として規定でき、少なくとも１つのそれらの特徴の発現によりその他の植物群と区別することができ、また何ら変化せずに増殖され得るので実在物として見なされる。従って、植物の一群が、１つの遺伝子座または遺伝子の存在(または、この一つの遺伝子座または遺伝子を理由とする一連の表現型の特徴)によって全て特徴づけられるが、それ以外では別の遺伝子座または遺伝子に関しては互いに大きく異なり得るならば、植物が同じ種類であっても、用語「植物品種」を用いて、植物の一群を示すことはできない。
【００２２】
「植物系統」または「育種系統」とは、植物およびその後代をいう。本明細書に使用されるとおり、用語「近交系」とは、繰り返して自殖する植物系統をいう。
【００２３】
「Ｆ１、Ｆ２など」は、２つの親植物または親系統の間の交配後に連続して血縁関係となる世代をいう。２つの植物または系統を交配することにより作出された種子から成長した植物は、Ｆ１世代と呼ばれる。このＦ１植物を自殖することにより、Ｆ２世代などになる。「Ｆ１ハイブリッド」植物（または、Ｆ１ハイブリッド種子)は、２つの親近交系を交配して得た世代である。
【００２４】
「ハイブリッド」または「ハイブリッド植物」とは、少なくとも２つの異なる植物または異なる親系統植物を交雑（異種交配：cross−fertilization）して作出した植物である。そのような交雑物の種子(ハイブリッド種子)は、本明細書に包含され、同様にそれらの種子から成長したハイブリッド植物およびこの成長した植物から得られる植物の部分も包含されると理解される。
【００２５】
用語「形質（trait）」とは、交配および選抜などにより、一つの植物から別の植物に伝達可能である遺伝特徴、例えばＴＳＷＶ耐性をいう。
【００２６】
「ＴＳＷＶ」、「ＴＳＷＶ株」または「ＴＳＷＶ単離物」または「ＴＳＷＶ病原型」は、トマト黄化壊疽ウイルスの株をいい、これは血清学的に（例えば、ＴＳＷＶヌクレオキャプシドまたは糖タンパク質に対して生じた抗体を用いることにより、Roggero and Masenga, 2002, Plant Dis. Vol86, 950−953を参照されたい)決定され得るか、または配列比較［例えば、ある株を完全なゲノム配列が決定されたブラジル単離株Ｂｒ０１ｗｔ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０５０、ＮＣ＿００２０５１およびＮＣ＿００２０５２）と比較すること］により決定され得る。
【００２７】
「野性型（ＷＴ）ＴＳＷＶ株」または「病原型Ｐ０」は、当分野で既知の優性なＴｓｗ−耐性遺伝子が耐性を付与するＴＳＷＶ株をいう。例えば、Ｔｓｗ−耐性遺伝子を有する耐性植物は、例えば、感染後または人為的接種（植菌）（例えば、本明細書に記載したような病原型Ｐ０を用いる耐性アッセイにおいて実施され得る接種）後に、上部の非接種葉において黄化斑紋などの全体的兆候を実質的に示さない。ＷＴ ＴＳＷＶ株の例示は、例えばｐ１０５ＷＴまたはＶｅ４３０ＷＴであり、これらは、両方Ｍａｒｇａｒｉａらにより記述されている（2007, MPMI Vol 20: 547−558に記述されている)。各々受託番号ＤＱ３７６１７８およびＤＱ３７６１８４としてＧｅｎＢａｎｋに寄託された両株は、そのＳセグメント配列により識別され得る。
【００２８】
「ＴＳＷＶ耐性遺伝子」または「ＴＳＷＶ耐性アレル」は、植物ゲノム中に存在する場合に、該遺伝子または該アレルまたは該ＤＮＡ領域を欠いた植物と比較して１以上のＴＳＷＶ株に対する耐性を付与または増強させる遺伝子またはアレルを含む遺伝子またはアレルまたはＤＮＡ領域をいう。
【００２９】
「Ｔｓｗ遺伝子」または「Ｔｓｗ耐性遺伝子」は、当分野では既知の優性な耐性遺伝子、例えば、Ｃ．ｃｈｉｎｅｎｓｅ ＰＩ１５２２２５、ＰＩ１５９２３６またはＴｓｗ遺伝子を含む市販のトウガラシ品種、例えばＣ．ａｎｎｕｕｍ ｃｖ．Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（市販のハイブリッドピーマン品種)から得られるものをいう。Ｔｓｗ遺伝子の存在または非存在を、実施例に記載したような耐性アッセイおよび／または当分野で提供される分子マーカーアッセイを用いて決定できる(例えば、Moury et al. 2000, Genome 43: 137−142 and Jahn et al. 2000, MPMI Vol 13: 673−682)。
【００３０】
「Ｔｓｗ−耐性破壊株」（ＲＢ）または「病原型Ｐ１」は、機能的なＴｓｗ−耐性遺伝子を含む植物、例えば、Ｃ．ｃｈｉｎｅｎｓｅ ＰＩ１５２２２５、ＰＩ１５９２３６またはＣ．ａｎｎｕｕｍ 栽培品種「エクスプロアー（Ｅｘｐｌｏｒｅｒ）」の植物体に対して全体的な疾患兆候（上部の非接種葉における黄化斑紋）を引き起こすことができるＴＳＷＶ株をいう。一実施態様において、局所壊死障害は接種葉で形成される。一実施態様において、Ｔｓｗ−耐性破壊株は、非構造タンパク質（ＮＳ）中に１以上の変異および／または欠失を含む［Margaria et al. (2007, MPMI Vol 20: 547−558) and de Haan et al. (1990, J. Gen. Virol. 71: 1001−1007)を参照されたい］。
【００３１】
「Ｖｅ４２７ＲＢ」は、Ｍａｒｇａｒｉａら(2004, 2007, 上掲)に記載したようなスペイン（アルメリア）の農場から単離されたＲＢ−株をいい、この代表的なサンプルは受託番号ＤＳＭ２４８２９としてＤＳＺＭに寄託されている。
【００３２】
「Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性」を有するか、または含むか、あるいは「Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性」であるトウガラシ植物は、Ｖｅ４２７ＲＢによる接種または感染後に全体的兆候を発症しないトウガラシ植物をいう。これを、様々な方法を用いて試験することができるが、一つの例は、人為的接種アッセイ、例えば本明細書に記載したＶｅ４２７ＲＢ−耐性アッセイなど（例えば、５〜６枚の完全に成長した葉をつけたトウガラシ植物体の最も若い幼葉２枚にＶｅ４２７ＲＢを接種することにより、上部の非接種葉は接種後の約２８日目に黄化斑紋の兆候を示さない）を用いるものである。一実施態様において、植物系統または品種は、全体的兆候を実質的に示さなければ、Ｖｅ４２７ＲＢに対して耐性であるといえ、それは感染植物または接種植物の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれ以上（例えば、９２％、９３％、９４％、９５％、９８％、９９％または１００％）が全体的兆候を示さないこと（すなわち、上部の非接種葉上での黄化斑紋形成がないこと）を意味する。
【００３３】
「Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性付与ＱＴＬまたはそのＶｅ４２７ＲＢ耐性付与部分を含む遺伝子要素」または「Ｖｅ４２７ＲＢ耐性付与ＱＴＬ」は、遺伝子要素、例えばＴｓｗ−耐性破壊株Ｖｅ４２７ＲＢに対するトウガラシ植物体耐性を付与または増強させる核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）をいう。一実施態様において、該遺伝子要素は、野生系統株ＰＡ２６３８のカプシクム植物から派生／獲得できる。従って、一実施態様において、遺伝子要素は、系統株ＰＡ２６３８の植物を、別のトウガラシ植物体と交配することにより得ることができる（獲得できる）。本明細書で使用されるような「野生系統株ＰＡ２６３８」は、イタリアのマーケットから得た野生系統株をいう。ＰＡ２６３８の代表的な種子サンプルは、２０１２年２月２３日に受託番号ＮＣＩＭＢ ４１９３６としてヌンヘムス・ベスローテン・フェンノートシャップにより寄託されている。一実施態様において、植物体中のＶｅ４２７ＲＢ耐性付与ＱＴＬを含む遺伝子要素の存在または非存在は、例えばアッセイ本明細書に記載した「Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性アッセイ」および／または分子マーカーアッセイなどの耐性アッセイを用いて決定され得る。一実施態様において、Ｖｅ４２７ＲＢ耐性付与ＱＴＬ起源物を含む遺伝子要素とは、受託番号ＮＣＩＭＢ ４１８１７、ＮＣＩＭＢ ４１８１８またはＮＣＩＭＢ ４１９３６として寄託された種子ならびにこれらの種子から成長した植物および／またはその後代から、得られるか、派生されるか、取得できるか、または存在するものである。すなわち、一実施態様において、Ｖｅ４２７ＲＢ耐性付与ＱＴＬ起源物を含む遺伝子要素は、種子が受託番号ＮＣＩＭＢ ４１８１７、ＮＣＩＭＢ ４１８１８またはＮＣＩＭＢ ４１９３６として寄託された植物を別のトウガラシ植物体と交配することにより、得られるか、獲得できるか、派生されるか、派生させ得るものである。
【００３４】
「Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性アッセイ」は、Ｔｓｗ−耐性破壊株に対するトウガラシ植物体の耐性および／またはＶｅ４２７ＲＢ耐性付与ＱＴＬを含む遺伝子要素の存在を決定するために好適なアッセイである。アッセイは、さらに以下に例示的に記述される。かかるアッセイを用いて、植物、植物系統または品種を、Ｔｓｗ−耐性破壊株、例えばＶｅ４２７ＲＢに対して「耐性」であると分類できる。
【００３５】
「耐性」とは、有効な（または機能的な）耐性遺伝子がない植物と比較して、有効な（または機能的な）耐性遺伝子を含む植物において、特定病原（例えば、１以上のＴＳＷＶ株）の成長よび／または発生における統計学的に有意な制限および／または特定病原（例えば、１以上のＴＳＷＶ株）による感染後の疾患兆候における統計学的に有意な低下をいう。耐性は、定性的に決定されてもよく（特定系列または品種の植物を「耐性」または「感受性」として分類すること）、および／または耐性は定量化されてもよく、例えば耐性アッセイにおいては、例えば、ウイルス株による感染を生き延びるか（生存％）、または植物の一部分のみが感染された場合に実質的に全体的兆候を示さない特定の系統または品種の植物の％として測定することにより定量されてもよい。一実施態様において、植物系統または品種は、兆候、特にＴｓｗ−耐性破壊株による感染または接種後に発症しない全体的兆候に従い、「耐性」として特定されれば、Ｔｓｗ−耐性破壊株に対して耐性であるといえ、これはＴＳＷＶ耐性アッセイにおいて、例えば本明細書に記載したようなアッセイにおいて試験され得る。一実施態様において、植物系統または品種は、植物系統または種類が実質的に全体的兆候を示さなければ、すなわち、植物の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれ以上（例えば、９２％、９３％、９４％、９５％、９８％、９９％または１００％）が、Ｔｓｗ−耐性破壊株による感染または接種後に全体的兆候を示さなければ（すなわち、上部の非接種葉上に黄化斑紋形成がなければ）、Ｔｓｗ−耐性破壊株に対して耐性であるといえる。当業者は、系統または品種あたりの、少なくとも１０、１２、１５または２０またはそれ以上の植物体が、ある系統または種類が耐性であるかどうかを評価するために同じ試験条件下で試験されるべきであり、かつ好適な対照植物を含むべきであることが理解されよう。
【００３６】
用語「アレル」は、特定遺伝子座での遺伝子の１以上の別の形態を意味し、これらアレルの全ては、特定遺伝子座での１つの形質または特徴に関与する。有機体の二倍体細胞において、所定遺伝子のアレルは、染色体上の特定の位置または遺伝子座（複数の遺伝子座)に存在する。一つのアレルは、一対の均一な相同染色体の各染色体上に存在する。例えばトウガラシなどの二倍体植物種は、特定遺伝子座で多数の異なるアレルを含み得る。これらは、遺伝子の同一アレル(ホモ接合型)または２つの異なるアレル(ヘテロ接合型)であってもよい。
【００３７】
「植え付け」または「植え付けた」とは、機械または手により農場へ播種(直接播種)すること、または実生(苗)を植え替えることを意味する。
【００３８】
「栄養繁殖（Vegetative propagation）」は、栄養組織からの植物の繁殖、例えばイン・ビトロ繁殖によるものをいい。イン・ビトロ繁殖とは、イン・ビトロの細胞培養または組織培養、ならびにそのイン・ビトロ培養からの全植物体の再生に関する。元々の植物のクローン類(すなわち、遺伝子的に同一の栄養繁殖)は、イン・ビトロ培養および再生方法により作成され得る。
【００３９】
用語「遺伝子座」（遺伝子座の複数形）は、例えば、遺伝子またはＱＴＬまたは分子マーカーが存在する染色体上の特定の場所または複数の場所あるいは部位または領域を意味する。同一染色体上の遺伝子座間の距離は、交差の頻度により評価される。さらに離れた２つの遺伝子座は、交差がそれらの間でさらに起こり易い。反対に、２つの遺伝子座が共に近接している場合には、交差はそれらの間で起こりにくい。通例、１センチモルガン（ｃＭ）とは、遺伝子座間で１％の組み換えと等価である（例えば、マーカー）。
【００４０】
本明細書において用語「ＱＴＬ」および「量的形質遺伝子座」は、当分野で認識される意味で使用される。この用語は、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性または少なくとも調節領域をコードする少なくとも１つの遺伝子（またはアレル）と関連があるカプシクムの特定の染色体上に位置する領域、すなわちＶｅ４２７ＲＢ−耐性に関与する１以上の遺伝子の発現を制御する染色体の領域をいう。その遺伝子の表現型発現は、例えば、ウイルス複製の速度低減として、および／または植物を介するウイルスの移動速度の低減として、および／またはその表現型の効果（例えば、実質的に全体的兆候が発症しない）として観察され得る。ＱＴＬは、例えば１以上の遺伝子を含むことができ、この生成物が遺伝子耐性を付与する。あるいは、ＱＴＬは、例えば、調節遺伝子を含み得るか、またはこの生成物の配列が、植物のゲノム中の他の遺伝子座上の遺伝子発現に影響を与えることにより、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性を付与する。
【００４１】
用語「天然の遺伝子バックグラウンド」とは、本明細書においてＱＴＬの元々の遺伝子バックグラウンド、すなわちＱＴＬが元々存在するゲノムおよび染色体を示すために使用される。従って、ＰＡ２６３８のゲノム（受託番号ＮＣＩＭＢ ４１９６３）は、本発明のＶｅ４２７ＲＢ−耐性付与ＱＴＬを含む遺伝子要素の天然の遺伝子バックグラウンドを示す。逆に言えば、ＰＡ２６３８の元々の遺伝子バックグラウンドから、別のカプシクム植物または種の別の遺伝子バックグラウンド（例えば、別のゲノムの染色体上）への、ＱＴＬまたはその耐性付与部分を含むＤＮＡ領域（または、遺伝子移入フラグメント）の移行（または、遺伝子移入）を包含する方法により、その天然の遺伝子バックグラウンド中には存在しないＱＴＬまたはその耐性付与部分がもたらされる。本明細書において使用されたとおり、用語「連鎖群」とは、(染色体の物理的実体物)染色体と同義である。
【００４２】
用語「分子マーカー」、「遺伝子マーカー」または「ＤＮＡマーカー」とは、本明細書において、核酸配列中の差異を可視化するために様々な方法により検出された多型核酸配列をいう。かかる方法の例示は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカー、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入体、突然変異、マイクロサテライトマーカー（ＳＳＲ）、配列特徴増幅領域（ＳＣＡＲ）、切断増幅多型配列(ＣＡＰＳ)マーカーまたはアイソザイムマーカー、あるいはそれらマーカーの組み合わせであって、これは特定遺伝子の位置および染色体の位置を規定するものである。「ＱＴＬあるいは遺伝子または遺伝子座に連鎖した分子マーカー」はすなわち、ＱＴＬ、遺伝子または遺伝子座を含むゲノムＤＮＡ領域と物理的に連鎖したマーカーをいい、ＱＴＬ、遺伝子または遺伝子座を含むＤＮＡ領域と共分離する。このようにして、マーカーは遺伝子移入領域を規定できる。
【００４３】
「組み換え事象」とは、減数分裂の交差事象をいう。
【００４４】
用語「遺伝子移入領域」または「遺伝子移入されたＤＮＡ領域」、「遺伝子移入された形質」または「遺伝子移入された遺伝子」または「遺伝子移入フラグメント」は、戻し交配などの育種方法により、１つの植物ゲノムから別の植物ゲノムのそのゲノムに移行された染色体セグメントをいう。
【００４５】
本明細書において「遺伝子移入」は、種間ハイブリダイゼーションにより、一つの植物ゲノムから、同種または近縁種の別の植物ゲノムへと、特定の形質または表現型（例えば、ＴＳＷＶ株ＶＥ４２７ＲＢに対する耐性）を付与するＤＮＡ領域の移行（遺伝子移入領域）をいう。具体的には、非栽培植物または野性型植物（良好な農業特性を欠く）から、栽培植物（良好な農業特性を有する）のゲノムへの、このＤＮＡ領域の移行をいう。従って、一実施態様において、得られるトウガラシ植物は、栽培トウガラシ植物のゲノムを含んでおり、このゲノムには、別の植物ゲノム、特にＰＡ２６３８由来のゲノムの遺伝子移入フラグメントが遺伝子移入されている。遺伝子移入は、一般的には、育種工程、例えば、１以上の交雑、自殖および／または戻し交配を包含するが、マーカー利用選抜、表現型選抜（例えば、耐性アッセイ）、倍加半数体産生、胚なども包含し得る。
【００４６】
「戻し交配」とは、２つの親間の交配から得た植物が、その親のうちの一つと（戻し）交配される育種方法をいう。戻し交配で使用した親を、反復親という。戻し交配を繰返すことで、該ゲノムがさらにホモ接合型となり、反復親のゲノムにより一層類似するようになる。戻し交配を使用して、ドナー植物(例えば、野生系統株)からの形質を、別の植物(例えば、栽培される植物または育種系列)に導入できる。
【００４７】
用語「自殖する」とは、自家受粉の過程をいい、この過程において個体は、自己の花粉と、風媒受粉または受精される。植物は繰り返して「自殖され」(自家受精され）てきた。
【００４８】
用語「タンパク質」とは、作用様式、サイズ、３次元構造または起源を有するポリペプチドをいう。「野性型」タンパク質とは、野性型、例えば野性型ＴＳＷＶウイルス株に存在しているような完全な機能タンパク質である。本明細書において「突然変異タンパク質」は、野性型タンパク質と比較して、置換、削除または挿入されている１以上のアミノ酸となるタンパク質をコードしている核酸配列において、１以上の突然変異を含んでいるタンパク質である。すなわち、タンパク質の「フラグメント」または「部分」はさらに、「タンパク質」ということもできる。「単離タンパク質」は、もはやその自然環境において存在しないタンパク質を示すために使用される。
【００４９】
ＴＳＷＶの「野性型ＮＳタンパク質」または「野性型非構造タンパク質」とは、野性株に存在するＮＳタンパク質であり、例えば株ＶＥ４３０ＷＴのＮＳタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＤ３８７００．１（図１ａ）の配列を有し、一方でＴｓｗ−耐性破壊株ＶＥ４２７ＲＢのＮＳタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＤ３８７０２．１（図１ｂ）の配列を有しており、野性型タンパク質とは１つのアミノ酸のみが異なり（すなわち「突然変異ＮＳタンパク質」である）、かつ野性型タンパク質と９９％配列同一性を有する。
【００５０】
タンパク質をコードする核酸分子における「突然変異」とは、野性型配列と比較して、１以上のヌクレオチドの変化、例えば１以上のヌクレオチドの置換、削除または挿入である。「点変異」とは、１つのヌクレオチドの置換、挿入または欠失である。「非センス」突然変異は、タンパク質をコードしている核酸配列における(点)変異であって、この変異により、あるコドンが停止コドンに変わる。切除型タンパク質は、機能低減または機能喪失となり得る。「ミスセンス」の変異は、タンパク質をコードしている核酸配列における(点)変異であり、これによりコドンが変化して、異なるアミノ酸をコードする。得られるタンパク質は、機能低下または機能喪失または機能変化となり得る。
【００５１】
「配列同一性」および「配列類似性」とは、グローバルまたは局所アラインメントアルゴリズムを用いて、２つのペプチドまたは２つのヌクレオチド配列のアラインメントにより決定できる。次いで、配列は「実質的に同一」または「実質的に類似」として示されてもよく、それらは（例えば、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴまたはＥｍｂｏｓｓ プログラム「ニードル(Ｎｅｅｄｌｅ)」（デフォルトパラメーターを用いる、下記を参照されたい）により好適に並べられた場合には）、少なくとも特定の配列同一性の最小％を共有する（以下にさらに規定される）。これらのプログラムは、ニードルマン−ウンシュ法グローバルアラインメントアルゴリズムを使用して、それら全長にわたり、２つの配列を並べて一致する数を最大にし、ギャップの数を最小にする。一般的に、デフォルトパラメーターを、ギャップ挿入ペナルティ＝１０およびギャップ伸張ペナルティ＝０．５（ヌクレオチドおよびタンパク質アラインメントについて双方）と共に使用する。ヌクレオチドについて、使用したデフォルトスコアリングマトリックスは、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質については、このデフォルトスコアリングマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２である(Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915−919)。％配列同一性についての配列アライメントおよびスコアは、例えばAccelrys Inc.（9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121−3752 USA）またはＥＭＢＯＳＳ(http://www.ebi.ac.uk/Tools/webservices/services/emboss)から入手できるコンピュータープログラム、例えばＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．３を用いて決定できる。あるいは、％類似性または同一性を、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのデータベースを検索して決定してもよいが、ヒットは、ペアワイズを検索して並べ、配列同一性を比較するべきである。
【００５２】
「平均」とは、本明細書においては算術平均をいう。
【００５３】
「カプサイシン」は、カプシクム属に属する植物であるチリトウガラシの有効成分である。それはヒトを含む哺乳動物に対して刺激性であって、焼け付く感覚を生じる。カプサイシン：
【化１】
0006328569.tif 000002
の量は、カプシクム・アニュームを含めた様々なカプシクム品種間で大きく異なる。
【００５４】
「スコヴィル値」は、トウガラシの刺激性の辛味（または、ピリピリ感／辛味）に関する尺度である。スコヴィル辛味単位（ＳＨＵ）の数値は、存在するカプサイシンの量を示す：一定量の乾燥トウガラシからのカプサイシン油のアルコール抽出物を、「辛味」が数人の被験者（通常５名）にて感知されるまで、水中の糖溶液に徐々に添加する；希釈の程度が、スコヴィル値に対するその尺度を示す。別法として、刺激性の辛味を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定できる。この方法は、アメリカの香辛料事業者団体(American Spice Trade Association)(ＡＳＴＡ)辛味単位の結果を提供する。ＨＰＬＣ方法は、当分野では公知である（例えば、ＤＩＯＮＥＸの記述を参照されたい）。イソクラティック分析系は、ポンプ、オートサンプラー、恒温槽、４方式ＣｏｕｌＡｒｒａｙ（登録商標）検出器およびアレイ前に位置するＵＶ／ｖｉｓ検出器から構成する。ＬＣ条件：カラム：MD−150(3 x 150mm; 3μm)、移動相：50mM 酢酸アンモニウム, pH 4.4, 酢酸を用いる；45% アセトニトリル, 流速：0.8 mL/min, 温度：周囲温度, 注入量：20 μｌ, 検出器及び条件：電気化学検出器：Model 5600A, CoulArray, Model 5010 Analytical Cellを有する, 加電圧：＋１５０, ＋４５０ｍＶ vs. Pd, ＵＶ検出器：標準ＵＶ検出器, 波長：２３５および２８０ｎｍ。１部分のカプサイシン/milの測定が、約１５のスコルビル単位に対応する。しかし、トウガラシのピリピリ感／辛味を決定する場合にはスコヴィル方法が好ましい。
【００５５】
当業者は、用語「およそ」は、好ましくは、ある値と組み合わせて厳密値を示すと理解される。しかし、一般的に、用語「およそ」は、測定技術または生物学的分布の範囲内で認識かつ許容される測定誤差を理由とする数値変動もまた包含する。一般的には、かかる誤差は、測定技術に依拠して１０％以下、８％以下、６％以下、４％以下、２％以下、１％以下、０．１％以下、０．０１％以下である。一般的な技術常識に基づいて、当業者は、既知の測定技術または生物学的プロセス（例えば、メンデルの法則を適用する場合の後代の分布範囲）において許容できる誤差を、過度の負担なく同定するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１ａ】図１ａは株ＶＥ４３０ＷＴのＮＳタンパク質を示す。
【図１ｂ】図１ｂはＴｓｗ−耐性破壊株ＶＥ４２７ＲＢのＮＳタンパク質を示す。
【図２】図２はＰＡ２６３８（ＮＣＩＭＢ４１９３６）の果実を示す。５つの緑色果実（右）および５つの赤色／成熟果実（左）。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
（発明の詳細な説明）
Ｔｓｗ−耐性破壊株Ｖｅ４２７ＲＢは、その他の株間で特に、Ｔｓｗ−耐性遺伝子を担持するトウガラシ植物の耐性を克服することができることが判った(Margario et al. 2004, 2007、上掲）。スペインの農場から単離したこの株を用いた人為的接種を用いると、驚くべきことに、ＰＡ２６３８として指定された野性型カプシクム系統株は、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性であること、すなわちＰＡ２６３８の植物を人為的に接種した場合に実質的に全体的兆候が見られないことが判った。Ｖｅ４２７ＲＢは、Ｔｓｗ−遺伝子を含むトウガラシ植物において全体的感染を引き起こし得る株である。驚くべきことに、この新規耐性起源株ＰＡ２６３８は野性型ＴＳＷＶ株に対して耐性ではなく、このことは、この新規耐性起源株ＰＡ２６３８は理想的には優性なＴｓｗ遺伝子などの他の耐性遺伝子を組込まれるべきであることを示す。
【００５８】
野生型トウガラシ系統株は、ＰＣＲ分析により既知のＴｓｗ−耐性遺伝子がないことを確認された。
【００５９】
Ｖｅ４２７ＲＢ耐性付与ＱＴＬを含む新規遺伝子要素は、選択されたＶｅ４２７ＲＢ−耐性Ｆ２植物の連続戻し交配により、ＰＡ２６３８から栽培トウガラシへと遺伝子移入される。ＰＡ２６３８は、辛いトウガラシ植物である、すなわちＰＡ２６３８の果実は、カプサイシンを生成／含有する。言い換えると、ＰＡ２６３８の成熟果実は、少なくとも６００ＳＨＵまたは少なくとも４０ＡＳＴＡ辛味単位の辛味を含有する。
【００６０】
植物系統
本発明の一局面は、Ｖｅ４２７ＲＢとして示されるトマト黄化壊疽ウイルス（ＴＳＷＶ）のＴｓｗ−耐性破壊株に対して耐性であるカプシクム属のトウガラシ植物、好ましくは栽培されるトウガラシ植物をいう。この代表的なサンプルは、受託番号ＤＳＭ ２４８２９として寄託されており、該トウガラシ植物は、その天然の遺伝子バックグラウンドには存在しないＶｅ４２７ＲＢ−耐性付与ＱＴＬまたはそのＶｅ４２７ＲＢ−耐性付与部分を含む遺伝子要素を含む。例えば、該遺伝子要素の天然の遺伝子バックグラウンドがＰＡ２６３８であるならば、本発明の植物はＰＡ２６３８植物ではない。このように、本発明の植物は、栽培トウガラシのゲノムを有するトウガラシ植物を含み、該ゲノムは非栽培トウガラシ植物、例えばＰＡ２６３８からのＶｅ４２７ＲＢ耐性を付与する遺伝子移入フラグメントを含んでいる。
【００６１】
本発明の別の態様は、ＰＡ２６３８の植物から派生する／得られる／得ることができるゲノム遺伝子要素をそのゲノム中に含んでおり、該遺伝子要素が、Ｔｓｗ−耐性破壊ＴＳＷＶ−耐性付与ＱＴＬまたはそのＴｓｗ−耐性破壊ＴＳＷＶ耐性付与部分を含むが、但しカプシクム属の植物がＰＡ２６３８ではない、カプシクム属のトウガラシ植物の提供をいう。
【００６２】
本発明の一態様は、Ｔｓw−遺伝子を含むトウガラシ植物における全体的感染を引き起こし得るＴｓｗ−耐性破壊ＴＳＷＶ株に対する耐性付与ＱＴＬを、そのゲノム内に含むカプシクム属のトウガラシ植物の提供をいう。
【００６３】
一局面において、本発明は、そのゲノム内に遺伝子要素を含んでおり、該遺伝子要素は、Ｔｓｗ−耐性破壊ＴＳＷＶ−耐性付与ＱＴＬまたはそのＴｓｗ−耐性破壊ＴＳＷＶ−耐性を付与する部分を含み、該遺伝子要素またはその耐性付与部分はその天然の遺伝子のバックグラウンドには存在しないカプシクム属のトウガラシ植物を提供する。好ましくは、この耐性は、ＰＡ２６３８から派生する／得られる／得ることができる。すなわちＰＡ２６３８は、該遺伝子要素の天然遺伝子のバックグラウンドである。
【００６４】
本明細書において「から派生する」、「から得られる」および「から得ることができる」とは、１以上の受託番号として寄託された植物の種子を交配して得らえる/得ることができる形質(および、その形質を含む植物)をいう。これは、第一交配、その後の数回の自家受粉および／または戻し交配を含み得る。従って、この形質を付与する遺伝子要素は、別の遺伝子のバックグラウンドに、遺伝子移入または移行され得る。
【００６５】
本発明の一態様は、そのゲノム内に遺伝子要素を含んでおり、該遺伝子要素がＴｓｗ−耐性破壊ＴＳＷＶ−耐性付与ＱＴＬまたはそのＴｓｗ−耐性破壊ＴＳＷＶ−耐性付与部分を含むカプシクム属のトウガラシ植物をいい、これは最も広い幅で少なくとも２ｃｍの幅を有する成熟果実をつける、すなわち成熟果実は、少なくとも約２ｃｍまたはそれ以上、例えば、少なくとも約３ｃｍ、４ｃｍ、５ｃｍ、６ｃｍ、７ｃｍ、８ｃｍ、９ｃｍ、１０ｃｍ、１１ｃｍまたはそれ以上の幅であり、および／または少なくとも５ｃｍ、６ｃｍ、７ｃｍ、８ｃｍ、９ｃｍ、１０ｃｍ、１１ｃｍ、１２ｃｍ、１３ｃｍ、１４ｃｍ、１５ｃｍ、１６ｃｍ、１７ｃｍ、１８ｃｍ、１９ｃｍまたはそれ以上の果実の長さを有する。例えば、かかる植物はベル型またはラムヨー型の果実を作出する。
【００６６】
一実施態様において、Ｔｓｗ−耐性破壊ＴＳＷＶ株は、突然変異体ＮＳタンパク質を特徴としており、このＴｓｗ−耐性破壊株のＮＳタンパク質修飾は、関連ＷＴ株の野性型タンパク質と比較して、該Ｔｓｗ−耐性破壊株が単離されるその領域内で一つのアミノ酸交換、アミノ酸の欠失からなる群から選択される１、２、３またはそれ以上の修飾から選択され、これにより優性なＴｓｗ−遺伝子により付与される耐性を克服できるＴｓｗ−耐性破壊株となる。一実施態様において、野性株のＮＳタンパク質の配列は、Ｍａｒｇａｒｉａら(2007,MPMI Vol20:547-558)の図３に開示されたようなｐ１７０ｗｔ、Ｍａｒｇａｒｉａら(2007,MPMI Vol20:547-558)の図３に開示したようなｐ１０５ｗｔ、または受託番号ＡＢＤ３８７００.１を有するＶｅ４３０ＷＴのＮＳタンパク質の配列である。一つの好ましい実施態様において、ＴＳＷＶの野性株は、ｐ１０５ＷＴまたはＶｅ４３０ＷＴであって、これは受託番号ＤＱ３７６１７８およびＤＱ３７６１８４として各々ＧｅｎＢａｎｋに寄託されたそのＳセグメント配列により同定され得る。一実施態様において、ＴＳＷＶのＴｓｗ−耐性破壊株は、野性型ＮＳタンパク質配列、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＤ３８７００．１を有する野性株のＮＳタンパク質と比較して、そのＮＳタンパク質配列内にアミノ酸の交換およびアミノ酸の欠失からなる群から選択される１または２の変異を含むか、または含有する。Ｔｓｗ−耐性破壊株のＮＳタンパク質配列は８５の位置でアミノ酸交換を有する。一実施態様において、Ｔｓｗ−耐性破壊株のＮＳタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＤ３８７０２．１（Ｖｅ４２７ＲＢを指す）配列を有する。一実施態様において、野性株のＮＳタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＤ３８７００．１（図１を参照する）を有する。別の実施態様において、野性株ＮＳタンパク質は、ｐ１０５ＷＴのＮＳタンパク質（受託番号ＤＱ３７６１７８を参照されたい）である。
【００６７】
好ましくは、Ｔｓｗ−耐性破壊ＴＳＷＶ株はＶｅ４２７ＲＢであり、代表的なＶｅ４２７ＲＢのサンプルは、受託番号ＤＳＭ ２４８２９として寄託されている。当業者は、Ｖｅ４２７ＲＢに対する耐性が、もちろん他のＴｓｗ−耐性破壊株に対する耐性を排除するものではないことを理解している。しかし、本明細書で使用されるＶｅ４２７ＲＢに対する耐性は、ＴＳＷＶの野性株（すなわち、Ｔｓｗ−遺伝子が耐性を付与する株）に対する耐性を包含しない。
【００６８】
一実施態様において、本発明のトウガラシ植物は、Ｔｓｗ−耐性破壊株Ｖｅ４２７ＲＢに対して耐性であって、ＰＡ２６３８（ＮＣＩＭＢ ４１９３６）ではないトウガラシ植物である。
【００６９】
一実施態様において、多くて３、好ましくは多くて２の長さ対幅の比を有し、かつ２ｃｍ以上の最大幅を有する成熟果実を有するトウガラシ植物は、代表的な種子が受託番号ＮＣＩＭＢ ４１９３６として寄託されている野生系統株から派生され／得られる／得ることができるＶｅ４２７ＲＢ−耐性付与ＱＴＬまたはそのＶｅ４２７ＲＢ−耐性付与部分を含む遺伝子要素を含んでいる。
【００７０】
本発明のトウガラシ植物は、栽培トウガラシ植物(栽培品種)が好ましい。さらに、本発明の栽培トウガラシ植物は、カプシクム・アニューム、カプシクム・キネンセ、カプシクム・バッカツム、カプシクム・フルテッセンス、カプシクム・プベッセンス、好ましくはカプシクム・アニュームからなる群から選択される品種であってもよい。一実施態様において、本発明のトウガラシ植物は近交系である。特定の実施態様において、本発明のトウガラシ植物は、ハイブリッド、特にＦ１ハイブリッドである。Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性付与ＱＴＬを含む遺伝子移入フラグメントは、トウガラシ植物、近交系またはＦ１ハイブリッドにおいてヘテロ接合型またはホモ接合型で存在していてもよい。
【００７１】
一実施態様において、本発明のトウガラシ植物は、甘トウガラシ植物である。本発明の「甘トウガラシ」とは、トウガラシ植物の果実がスコヴィル値にて０ＳＨＵ〜５００ＳＨＵ、好ましくは０ＳＨＵ〜２００ＳＨＵ、より好ましくは０ＳＨＵ〜５０ＳＨＵの平均スコアを有するトウガラシ植物である。一つの好ましい実施態様において、甘いトウガラシのその辛味は、およそ０ＳＨＵである。別の実施態様において、トウガラシ果実のカプサイシンの量は、０〜およそ３０ＡＳＴＡ辛味単位、好ましくは０〜１３ＡＳＴＡ辛味単位、またはさらに好ましくは０〜２ＡＳＴＡ辛味単位である。異なる実施態様において、本発明のトウガラシ植物の果実は、０〜１００ＳＨＵ、０〜５００、００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００、２５００〜５０００またはそれ以上を有する。さらなる実施態様において、本発明のトウガラシ植物の果実は、およそ５．０００ＳＨＵ〜およそ２０．０００ＳＨＵ、またはおよそ２５．０００ＳＨＵ以上のスコア、例えば３０．０００〜５０．０００、５０．０００〜１００．０００、１００．０００〜２００．０００、１００．０００〜３５０．０００ＳＨＵ、または３５０．０００ＳＨＵを超えるスコアである。
【００７２】
別の実施態様において、本発明のトウガラシ植物は、ベル型のトウガラシ植物である。一般的に、ピーマンは、成熟果実が、約１．５〜およそ０．７の長さ／幅の比を有し、かつ少なくとも約７．５ｃｍ、８ｃｍ、９ｃｍ、１０ｃｍまたはそれ以上、例えばおよそ７．５ｃｍ〜およそ１７．５ｃｍの平均果実の長さを有する植物である。好ましくは、成熟果実は、およそ１．３〜およそ０．９の長さ／幅の比を有し、かつ少なくとも約７．５ｃｍ、８ｃｍ、９ｃｍ、１０ｃｍまたはそれ以上の長さ、例えばおよそ７．５〜およそ１５ｃｍの長さの平均果実長を有する。果実の色は、例えば、緑色、赤色、黄色、オレンジ色、白色、虹色（熟しつつある段階）および紫色でありうる。北米のピーマンは、約１０ｃｍの長さで、約１０ｃｍの幅を有する果実であり、一方、欧州のピーマンは、濃淡が少なく、細長い形状である。ピーマンは、カプシクム属のなかの一群であって、カプシクム・アニューム・エル種のものである。一実施態様において、ベル型のトウガラシ植物は、カプサイシンを生成しないか、または５００ＳＨＵまたは３０ＡＳＴＡ辛味単位までのカプサイシンをわずかに生成する。一つの好ましい実施態様において、ピーマンはカプサイシンを生成しない。さらなる別の実施態様において、このベル型の果実の形状は、実質的に「Capsicum Pepper Varieties and Classification」(New Mexico State University, Circular 530, College of Agriculture and Home Economics, http://www.reocities.com/wstarron/circ530.pdf)に記述されたようなピーマンの形状と同一である。
【００７３】
別の実施態様において、本発明の植物のトウガラシの成熟果実の長さ／幅の比は、せいぜい約４、せいぜい約３．０、せいぜい約２．５、せいぜい約２．０、せいぜい約１．５である。
【００７４】
別の実施態様において、本発明の植物のトウガラシの成熟果実の幅は、その最大幅で少なくとも約１．５ｃｍ、少なくとも約２．０ｃｍ、少なくとも約３．０ｃｍ、少なくとも約４．０ｃｍ、少なくとも約６ｃｍ、少なくとも約７ｃｍ、少なくとも約８ｃｍ、少なくとも約９ｃｍ、少なくとも約１０ｃｍ、またはそれ以上である。
【００７５】
別の実施態様において、本発明の植物のトウガラシの成熟果実の幅は、その最大幅で、少なくとも４．０ｃｍ、例えば６．０ｃｍまたはそれ以上、７ｃｍまたはそれ以上、８ｃｍまたはそれ以上であり、長さ／幅の比は、多くて３、好ましくは多くて２．５、好ましくは多くて２．０、または多くて１．５である。
【００７６】
別の実施態様において、本発明のトウガラシ植物は、受託番号ＮＣＩＭＢ ４１８１７またはＮＣＩＭＢ ４１８１８として寄託されている代表的な種子サンプルのトウガラシ植物であるか、または種子の寄託物ＮＣＩＭＢ４１８１７またはＮＣＩＭＢ４１８１８から派生する／派生できる／得られる／得ることができるトウガラシ植物、例えばその得られるＦ１−ハイブリッドおよびＶＥ４２７ＲＢ−耐性を保持しているトウガラシ植物である。そのため、一態様において、ＶＥ４２７ＲＢ−耐性を含む本発明のトウガラシ植物は、受託番号ＮＣＩＭＢ ４１８１７またはＮＣＩＭＢ ４１８１８として寄託された種子の植物を、別のトウガラシ植物と交配することにより、得ることができる/得られる。
【００７７】
好ましい実施態様において、ＶＥ４２７ＲＢに対する耐性を提供する遺伝子移入フラグメントは、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性などのＴｓｗ−耐性破壊ＴＳＷＶ株−耐性を保持するがＮＣＩＭＢ４１８１７および／またはＮＣＩＭＢ４１８１８に見出されるフラグメントよりも短いフラグメントであってもよい。より短い遺伝子移入フラグメントを含んでいるトウガラシ植物は、ＮＣＩＭＢ４１８１７またはＮＣＩＭＢ４１８１８と共に生育させること、そしてＶｅ４２７ＲＢ−耐性を保持する組換え後代を選抜することにより作出できる。例えば、ＮＣＩＭＢ ４１８１７またはＮＣＩＭＢ ４１８１８を、遺伝子移入フラグメントを欠くトウガラシ植物と交配させて、Ｆ１植物を作出し、このＦ１を自殖させて、Ｆ２世代（または、さらなる世代）を作出して、Ｆ２世代を、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性である植物について、例えば本明細書に記載した耐性アッセイを用いて、スクリーニングできる。その後、短い遺伝子移入フラグメントを含む組換え植物を、標準方法、例えば分子マーカーまたはＦＩＳＨ(蛍光インサイチュ・ハイブリダイゼーション)を用いて同定できる。
【００７８】
さらに本発明の別の態様は、本発明のトウガラシ植物の果実をいうか、またはかかるトウガラシ果実の果肉、すなわち果実の非繁殖部分をいう。一実施態様において、本発明のトウガラシ植物のトウガラシ果実は、生存可能な種子を有するが、別の実施態様においては、該果実は、生存出来ない種子のみを含むか、または種がない(単為結実)ものである。
【００７９】
本発明の一実施態様は、細胞組織培養条件下でさえ繁殖に好適ではない収穫される果実の組織または植物細胞をいう。本発明の植物のトウガラシ果実は、当分野では既知の様々な種の幅広い範囲から選択されることができる。例えば、トウガラシ果実は、以下のタイプを有し得る：ベル型（Ｂｅｌｌ）（ブロッキー型：Ｂｌｏｃｋｙ）、カイエンヌ、ラムヨー型（長いブロッキー型）、ドルチェ・イタリアーノ（ｄｕｌｃｅ ｉｔａｌｉａｎｏ）、円錐型（ｃｏｎｉｃａｌ）、カピア（ｃａｐｉａ）、スィート・チャールストン（ｓｗｅｅｔ ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ）、ドルマ（ｄｏｌｍａ）、チェリー（ｃｈｅｒｒｙ）、ハラペニョ、シャキラ（ｓｈａｋｉｒａ）、ペンシル（ｐｅｎｃｉｌ）またはホット・チャールストン、シブリ類（Ｓｉｖｒｉ）［例えば、デムレ・シブリ（Ｄｅｍｒｅ Ｓｉｖｒｉ）またはカザンリ・シブリ（Ｋａｚａｎｌｉ Ｓｉｖｒｉ）］、ハンガリアン・ワックス、カプヤ（Ｋａｐｙａ）／フロリニス（Ｆｌｏｒｉｎｉｓ）、バナナ、フレズノ（Ｆｒｅｓｎｏ）、セラーノ（Ｓｅｒｒａｎｏ）、アンチョ（Ａｎｃｈｏ）、アナハイム、パシラ、サンタ・フェ、スコッチ・ボネット、ハバネロ。様々なトウガラシのタイプの写真の幾つかの例は、限定するものではないがＢｏｓｌａｎｄら（１９９６）に開示されている。これらの果実は、いかなる色調であってもよい。
【００８０】
また本発明の別の態様は、本明細書に記載したＶＥ４２７ＲＢ−耐性植物の種子または本明細書に記載したＶＥ４２７ＲＢ−耐性植物が生育できる種子をいう。
【００８１】
さらなる実施態様は、別のカプシクム植物との交配における、親としての本発明のカプシクム植物の使用に関する。また、ＶＥ４２７ＲＢ−耐性を含む他のカプシクム植物を作出する方法が提供される、すなわち本発明の植物（例えば、本明細書において寄託された種またはその後代から）由来のＶＥ４２７ＲＢ−耐性を付与する遺伝子移入フラグメントを、別のカプシクム植物に移行させるか、またはＰＡ２６３８由来のＶＥ４２７ＲＢ−耐性を付与するＱＴＬを含むゲノムＤＮＡフラグメントを、栽培カプシクム植物に移行させることである。
【００８２】
また別の態様は、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性付与ＱＴＬまたはそのＶｅ４２７ＲＢ−耐性付与部分を含む遺伝子要素を含む本発明の植物の植物細胞をいう。一実施態様において、かかる植物細胞は、再生可能な細胞である、すなわち、それらはＶＥ４２７ＲＢ−耐性である全トウガラシ植物中で再生され得る。別の実施態様において、かかる細胞は、再生できない。別の態様において、本発明の植物細胞を含むか、または本発明の植物細胞から構成されるイン・ビトロ細胞培養物またはイン・ビトロ組織培養物が提供される。細胞および組織は、ＶＥ４２７ＲＢ−耐性を付与する遺伝子要素を含んでいる、花粉、子房、胚、葉、軸、胚軸、子葉、果実部、分裂組織または他の細胞／組織である。また、再生された植物も提供される。
【００８３】
Ｔｓｗ−耐性破壊株、例えばＶＥ４２７ＲＢに対する植物の耐性は、様々な方法により、例えば本明細書に開示されたＶＥ４２７ＲＢ−耐性アッセイにより試験され得る。本明細書に記載したＶＥ４２７ＲＢ−耐性アッセイは、野性型（ＷＴ；Ｐ０）および耐性破壊（ＲＢ）病原型（Ｐ１）などに対する耐性を決定するために好適であり、即ち、該アッセイは、ＶＥ４２７ＲＢに対する耐性を決定することに限定されず、他のＴｓｗ−耐性破壊株を同定するため、および他のＰ１病原型に対する新規耐性起源物を同定するために使用され得る。従って、本明細書に記載した様々な実施態様において、ＶＥ４２７ＲＢは、Ｔｓｗ−遺伝子を含むカプシクム植物に対して全体的症候を引き起こす他のＴｓｗ−耐性破壊株に置き換えられてもよい。かかる実施態様は、本発明の実施態様と等価であると理解される。
【００８４】
耐性アッセイ
本発明のＶＥ４２７ＲＢ耐性を付与する遺伝子移入フラグメントを含むカプシクム植物を同定および／または選択するために、以下の耐性アッセイまたは別のアッセイを使用できる。以下に、実施例において使用されたアッセイ、およびある植物系統または品種が本発明のＶＥ４２７ＲＢ耐性を付与する遺伝子要素を含むかどうかを決定できるアッセイについて記述する。当業者は、開示されたアッセイを同じように改変できるか、または様々なアッセイを開発できる、例えばＰ１病原型（好ましくは、ＶＥ４２７ＲＢ）による農場感染に基づいて、Ｐ１を媒介するウイルス感染昆虫に基づいて、または、様々な人為的接種アッセイに基づいて開発できる。使用したアッセイは、好ましくは、例えば、感受性のあるコントロール植物は全体的兆候を発症するが一方で、下部の葉などの感染または接種後の全体的兆候（または、ウイルス粒子の全体的存在）が（実質的に）存在しないことにより、耐性付与遺伝子要素（例えば、遺伝子移入フラグメント）を含むカプシクム植物を同定できるはずである。もちろん、様々なアッセイは、植物が耐性であるか、または感受性であるかどうかを決定する様々な方法を使用できるが、アッセイがどのようなものであっても、もし該植物が、本明細書に記載したＶＥ４２７ＲＢ耐性アッセイにおいて（再度）試験され、それらが本アッセイのＶＥ４２７ＲＢ耐性を含むと決定されれば、それらは本発明のＶＥ４２７ＲＢ耐性を付与する遺伝子要素を含んでいる。
【００８５】
病原型接種源の調製
病原型、例えばＰ０またはＰ１を、感染したニコチアナ・ベンタミアナ(Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ)の葉または葉液として液体窒素中で長期間保存できる。
【００８６】
それをトウガラシ系統の人為的接種試験のために使用する前に、ＴＳＷＶ耐性遺伝子をいずれも担持していない感受性植物（例えば、ニコチアナ・ベンタミアナまたはカプシクム植物）を、この病原型により感染させて、該病原型の活性を確認することができる（例えば、５またはそれ以上の植物を感染させ得る）。ネガティブコントロールとして、耐性植物を、適宜同じように感染できる（例えば、Ｐ１に対して寄託物ＮＣＩＭＢ １８１７およびＮＣＩＭＢ １８１８およびＮＣＩＭＢ １９３６のカプシクム・アニューム植物、およびＰ０に対してＴｓｗ遺伝子を有するカプシクム植物）。
【００８７】
接種物の活性は、感受性植物が全体的兆候を発症するかどうかにより確認される。これらの植物の症候を示す葉(葉上の黄化斑紋により同定される)を、試験されるトウガラシ系統の接種に用いることができる。電子顕微鏡を用いて、その他のウイルスの存在を排除できる。
【００８８】
本発明のＴＳＷＶ−耐性アッセイ
本発明のＴＳＷＶ−耐性アッセイ（例えば、ＶＥ４２７ＲＢまたはＰ０−耐性アッセイ、または別のＰ１耐性アッセイ）において、１以上のＴＳＷＶ病原型に対する耐性について試験される植物系統または品種の多くの植物を、多くのコントロール植物と同じ条件下で播種または生育させる。病原型は、例えばＰ１（ＶＥ４２７ＲＢ、この代表的なサンプルは、受託番号ＤＳＭ２４８２９としてＤＳＺＭにて寄託されている）またはＰ０（野性型ＴＳＷＶ株、例えば、Ｔｓｗ−遺伝子を有する植物、例えばＣ．ｃｈｉｎｅｎｓｅ ＰＩ１５２２２５に対して耐性であるＴＳＷＶ株）である；かかる野性株は、例えばそのＳセグメント配列（ＧｅｎＢａｎｋ 受託番号：ＤＱ３７６１７８）により同定され得るｐ１０５ＷＴである。一般的には、少なくとも５以上、少なくとも１０以上、少なくとも１２以上、少なくとも１５以上、少なくとも２０以上の植物（試験植物)/病原型を、播種して、それらが２枚の子葉および５枚〜６枚の本葉をつけるまで生育させる。この生育条件は、例えば温室内で、十分に水が供給される、約１４時間の日照時間を含めた２６℃／１８℃の日／夜である。光源は、例えばＰｈｉｌｉｐｓ ＳＯＮ−Ｔ ４００ ナトリウムランプ、光合成有効放射線１２０μｍｏｌ＊ｓｅｃ−１＊ｍ−２μ［ＰＡＲ］である。生育培地は、例えば、半分が芝土で半分が窪みのような土壌(soil such as half turf and half pit)である。同じ条件を、実施例におけるＶＥ４２７ＲＢ−耐性アッセイ中に使用した。当業者は、トウガラシ植物についての生育条件に関して熟知している。同じ生育条件を用いて、コントロール植物を育てた。一般的には、コントロール植物を、２つのカテゴリーに分けてもよい：特異的病原型、例えば病原型Ｐ０またはＰ１に対して耐性である植物、そして該特異的病原型に感受性があると知られている植物。好ましくは、コントロール植物の両方のカテゴリーが、耐性アッセイの一部分として存在しなければならないことは、当業者には理解できよう。各アッセイにおいて、コントロール植物の一部を、緩衝液および目的とする病原型の混合物により処理し、コントロール植物の一部を緩衝液単独により処理した。緩衝液単独により処理した植物は、アッセイ終了時に無症状を維持するはずである、すなわちこれらの植物は、ウイルス感染の局所または全体的兆候のいずれも示さないはずである。
【００８９】
一般的には、２枚の子葉および５〜６枚の本葉をつけた植物の完全に生育しているが最も若い幼葉２枚を、１回目として機械的に接種した（例えば、接種物、すなわち緩衝液および病原型の混合物を、葉の上に噴霧することによって）。その後、例えば５日後に、接種葉に第２回目の機械的接種を行なった。
【００９０】
試験植物の２枚の最も若い幼葉の接種のために、感染したニコチアナ・ベンタミアナの葉を、液体窒素で凍結して、粉末に挽く、例えば葉の粉末（１ｇ）を、５ｍｌポール緩衝液（リン酸緩衝液０．０５Ｍ ｐＨ７、ＤＩＥＣＡ（ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物）０．００５Ｍ、ＥＤＴＡ−Ｎａ２０．００１Ｍ、チオグリコール酸ナトリウム０．００５Ｍ)と混合した。所望により、非接種葉と比較して、活性炭素片により生じるより暗い色調によって接種葉を標識するために、緩衝液は、着色剤、例えば活性炭素粉末を含有してもよい。該混合物を、噴霧などにより葉の上に接種してもよい。
【００９１】
ネガティブコントロールとして、２枚の子葉および５〜６枚の本葉をつけたコントロール植物の完全に生育したが最も若い幼葉２枚を、緩衝液単独により機械的に接種できる/した。
【００９２】
ウイルスの症候−第１回目の特定のウイルス株による接種２８日後に誘導された兆候（黄化斑紋形成）が、実質的に植物の上部の非接種葉に無ければ、植物を耐性と見なした；すなわち、これらの植物は実質的に全体的兆候を示さない。接種葉上の症候ならびに試験植物およびコントロール植物の上部の非接種葉の全体的兆候に関する第一回目の観察は、各植物について、例えば、５、６または７日後に評価され得る。第２回目の観察は、例えば、１２、１３または１４日後に評価され得る。第３回目の観察は、例えば、２８、２９、または３０日後に評価され得る。上部の非接種葉は、第１回目の接種時点よりも後の段階で、はじめてこの植物から十分に発達するということに留意する。
【００９３】
一実施態様において、各カテゴリー（例えば、病原型または緩衝液の単独により処理された感受性コントロール植物、および／または病原型または緩衝液の単独により処理された耐性コントロール植物）におけるコントロール植物の数は、耐性アッセイにおける試験植物の量と比較して、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％であるが、耐性アッセイにおけるコントロール植物の各カテゴリーにおける植物の数は、少なくとも１、好ましくは少なくとも５、または少なくとも１０である；あるいは、コントロール植物の数は、耐性アッセイにおける試験植物の量に等しい。一実施態様において、試験あたりに、少なくとも２回以上の反復を実施した。一実施態様において、同一系統／品種の試験植物の量は、カテゴリーあたりに、少なくとも５、６、１０、１２、１５または２０の試験植物である（病原型または緩衝液単独により処理した試験植物)。
【００９４】
分析
ＶＥ４２７ＲＢ耐性アッセイにおいて、ＶＥ４２７ＲＢを病原型として使用した。同様に、Ｐ０耐性アッセイにおいて、Ｐ０、例えばｐ１０５ＷＴまたはＶｅ４３０ＷＴを病原型として使用した。
【００９５】
もし実質的に全体的兆候が（各々ＶＥ４２７ＲＢまたはＰ０による葉の接種後に）、上部の非接種葉に表れないが、感受性コントロール植物においては全体的兆候がその上部の非接種葉に、例えば、本明細書に記載したアッセイ条件または等価のアッセイ条件下で表れる場合、試験植物を、各々「ＶＥ４２７ＲＢに対して耐性」または「Ｐ０に対して耐性」と分類できる。
【００９６】
「全体的兆候」とは、ＴＳＷＶ症候、特に黄化斑紋形成をいい、これはＴＳＷＶを接種されなかった葉に、好ましくは上部の葉に発症する。
【００９７】
「局所症候」とは、ＴＳＷＶ症候、特に壊死障害をいい、これはＴＳＷＶを接種された（所望により、例えば炭素粉末によりマークされた）葉上で発症する。
【００９８】
本明細書に記載したアッセイにおいて、植物系統または品種の「実質的に全体的兆候がない」とは、植物系統または植物品種の大多数の試験植物、すなわち少なくとも６０％が、(ウイルス誘導性の)全体的な黄化斑紋形成(白化)のいかなる兆候をも、上部の非接種葉上に示さないが、全ての感受性コントロール植物は全体的兆候を示すということを意味する。一実施態様において、試験植物の少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９８％またはさらに１００％は、上部の非接種葉上で（ウイルス誘導性の）全体的黄化斑紋形成（白化）のいずれの兆候も示さない。
【００９９】
「黄化斑紋形成」とは、当業者には知られているトウガラシに対するＴＳＷＶの全体的感染に関する典型的な兆候である。「黄化斑紋形成」は、黄色斑紋/スポット/領域の面積をいう。
【０１００】
本明細書で使用されるとおり「壊死障害」とは、壊死が接種葉でおきた小さな暗色の領域である。
【０１０１】
従って、一実施態様において、実質的に全体的兆候を示さない（すなわち、接種しなかった上部葉上に黄化斑紋形成がない)試験植物は、緩衝液単独により接種されたコントロール植物と比較して、接種葉に壊死障害を実質的に示す。これは、病原型に対する耐性植物の局所反応である。植物「実質的に、局所壊死障害を示す/発症する」とは、人為的接種の約２８日後に、壊死障害を接種葉上に示す少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９２％、９３％、９５％、９８％、９９％または１００％をいう。
【０１０２】
しかし、当業者は、本明細書に記載の耐性アッセイ条件下での、緩衝液単独を接種したコントロール植物または特異的病原型に対して耐性であると知られるコントロール植物、例えばＶｅ４２７ＲＢと比較した上部の非接種葉におけるウイルスの存在／非存在は、例えば本明細書に記載したＶＥ４２７ＲＢ−耐性アッセイまたはＰ０−耐性アッセイの対象である植物の上部の非接種葉におけるウイルスのＮＳタンパク質の存在（または非存在）に基づくＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を用いて決定できることを熟知している。従って、全体的兆候の存在／非存在（および耐性の存在／非存在）を評価するための別法または追加の方法とは、ＴＳＷＶウイルス粒子が上部の非接種葉に見出されるかどうかを試験することである。
【０１０３】
Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性カプシクム植物の作出
野性型カプシクムに由来する（例えば、ＰＡ２６３８または他のＶｅ４２７ＲＢ−耐性の野生型カプシクム植物から得られる）遺伝子移入フラグメントにより付与されたＶｅ４２７ＲＢ−耐性を含むカプシクム植物、特に栽培カプシクムは、多くの方法により作り出され得る。好ましい実施態様において、カプシクム植物は、非トランスジェニック方法、好ましくは、交配、自殖、戻し交配、倍加半数体産生、胚レスキュー、マーカー支援育種、プロトプラスト融合など、またはその組み合わせから選択される１以上の方法を包含する育種方法により作出される。
【０１０４】
本発明はまた、上記した本発明のドナートウガラシ植物においてＶｅ４２７ＲＢに対する耐性を付与する量的耐性遺伝子座（ＱＴＬ）の存在を検出するための方法、ならびに少なくとも１つのＱＴＬまたはそのＶｅ４２７ＲＢ−耐性付与部分を含む遺伝子要素／核酸配列を、該ドナー植物からＶｅ４２７ＲＢ−感受性レピシエントのカプシクム植物に移行するための方法を実施する工程を含む、Ｖｅ４２７ＲＢ耐性カプシクム植物の作出方法に関する。該核酸配列の移行を、本明細書に以前に記載した方法のいずれかにより実施できる。
【０１０５】
一実施態様において、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性カプシクム植物を同定するための方法は、以下の工程を含む：
ａ）例えば、本明細書に記載したようなＶｅ４２７ＲＢ−耐性アッセイを実施することにより、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性について、カプシクム植物の系統または品種をスクリーニングする工程、
ｂ）Ｖｅ４２７ＲＢ感染後の全体的兆候を発症しないカプシクム植物または系統または品種を同定する工程。
【０１０６】
同定した植物系統または品種を、その後にさらに戻し交配スキームまたは他の従来の育種スキームにおいて使用して、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性カプシクム植物（好ましくはＣ．ａｎｎｕｕｍ）、好ましくは、良好な農業特性を有し、かつＶｅ４２７ＲＢ−耐性ＱＴＬを含む栽培品種または品種を作出できる。
【０１０７】
一実施態様において、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性カプシクム植物を作出するための方法は、以下の工程を含む：
ａ）例えば、本明細書に記載したようなＶｅ４２７ＲＢ−耐性アッセイを行なうことにより、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性についてカプシクム植物または系統または品種をスリーニングする工程、
ｂ）Ｖｅ４２７ＲＢ感染後に全体的兆候を発症しないカプシクム植物または系統または品種を同定する工程、
ｃ）該同定した植物または系統または品種を、別のカプシクム植物、例えばＶｅ４２７ＲＢ−耐性を欠く植物と交配して、Ｆ１植物を作出すること、
ｄ）Ｆ１植物を１回以上、自殖および／または交配して（例えば、戻し交配）、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性を含むカプシクム植物後代を作出する工程。
【０１０８】
工程ａ）において、カプシクム植物系統または品種は、一実施態様において、野性型カプシクム植物または栽培カプシクム植物であってもよい。一実施態様において、工程ａ）において、該植物は、ＮＣＩＭＢ ４１８１７、ＮＣＩＭＢ ４１８１８およびＮＣＩＭＢ ４１９３６として寄託された植物から選択された植物またはその後代であり、これによりこの後代植物はＶｅ４２７ＲＢ−耐性を含む。
【０１０９】
工程ｂ）において、Ｖｅ４２７ＲＢ感染植物の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９２％、９３％、９５％、９８％、９９％または１００％が全体的兆候を発症しなければ、該植物を、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性であると同定することができる。工程ｃ）において、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性が導入される植物は、好ましくは栽培カプシクム植物、好ましくはＶｅ４２７ＲＢ−耐性を欠く優良な育種系統または品種である。この植物は、所望によりＴｓｗ−耐性を含み、そのため工程ｄ）において生じた後代植物は、優性なＴｓｗ耐性遺伝子およびＶｅ４２７ＲＢ−耐性を付与する遺伝子要素の両方を含む。Ｔｓｗ耐性を含んでいる植物は、例えば本明細書に記載したような分子マーカー分析および／または耐性アッセイまたは任意の他のアッセイにより同定することができ、これによりカプシクム植物は、野性型ＴＳＷＶ株（病原型Ｐ０）、例えばｐ１０５ＷＴまたは他の株に対して耐性である（すなわち、例えば、実施例に記載したようなＴＳＷＶ耐性アッセイにおいて全体的兆候を発症しない）。
【０１１０】
工程ｄ）において、後代植物においてＶｅ４２７ＲＢ−耐性を付与する遺伝子要素の存在は、様々な方法（例えば、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性アッセイまたは類似のアッセイ、Ｖｅ４２７ＲＢ株が発見された地域における野外試験など）により確認され得る。適宜、Ｔｓｗ遺伝子の存在を、マーカーおよび／またはＴＳＷＶ耐性アッセイにより確認することができる。
【０１１１】
別の実施態様により、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性を１つのカプシクム植物から、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性を欠く別のカプシクム植物に移行するための方法により提供される。この方法は、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性ドナーカプシクム植物から、Ｖｅ４２７ＲＢ−感受性レピシエントのカプシクム植物への、該植物を交配することによる遺伝子移入フラグメントの移行を含む。こうして、この移行は、従来の育種技術を用いて適切に達成され得る。Ｖｅ４２７ＲＢ耐性付与ＱＴＬを含む遺伝子移入フラグメントは、マーカー利用選抜（ＭＡＳ）を用いることにより、市販のカプシクム系統または品種へと好適に遺伝子移入され得る。マーカー利用育種またはマーカー利用選抜は、所望の形質をコードする１以上の遺伝子を含有するそれら後代植物を同定および選抜するための１以上の分子マーカーの使用を含む。本例示において、かかる同定および選抜は、本発明のＱＴＬまたはそれと関連のあるマーカーまたは遺伝子移入フラグメントと関連のあるマーカー(すなわち、遺伝子移入フラグメントに特異的なマーカー)を選抜することに基づく。
【０１１２】
ＭＡＳは、各ＱＴＬ効果に関するより詳細な試験を可能にする目的のＱＴＬを担持する準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）を作出するために使用することができ、戻し交配近交系（ＢＩＬ）集団の開発に有効な方法でもある。この実施態様に従って開発されたカプシクム植物は、多数の形質をレピシエント植物から有利に派生させ、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性をドナー植物から得ることができる。上記に簡単に説明したとおり、従来の育種技術を使用して、Ｖｅ４２７ＲＢ耐性をコードしている核酸配列を、Ｖｅ４２７ＲＢ−感受性のレピシエントカプシクム植物に遺伝子移入できる。一つの方法においては、これを血統育種といい、Ｖｅ４２７ＲＢに対して耐性を示し、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性をコードしている核酸配列を含むドナーカプシクム植物は、好ましくは工業的に望ましい特徴、例えば以下のものに限らないが疾患耐性、昆虫耐性、価値のある果実特徴などを示すＶｅ４２７ＲＢ感受性レピシエントのカプシクム植物と交配される。得られる植物集団（Ｆ１ハイブリッドを表す）は、次いで自家受粉して、種子（Ｆ２種子）をもうける。Ｆ２種子から生育したＦ２植物を、次いでＶｅ４２７ＲＢに対する耐性についてスクリーニングする。代替的または追加的に、１以上のさらなる世代、例えばＦ３、Ｆ４またはＢＣ１またはＢＣ２世代を、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性についてスクリーニングしてもよい。個体群を、例えば本明細書に記載した耐性アッセイまたは別の耐性アッセイに従ってスクリーニングすることができ、および／またはマーカー利用選抜を用いて、例えば耐性アッセイから得た結果を確認することができる。このように、幾つかの方法を組み合わせて使用することもできる。
【０１１３】
近交系Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性カプシクム植物系統を、親の系統を作出するために使用した循環選抜および戻し交配、自殖および／または二ゲノム性半数体(di-haploid)の技術、あるいはその他の技術を用いて開発できる。循環選抜および戻し交配の方法において、反復親を、本明細書において「非反復親」として表される反復親とは異なる第一のドナー植物と交配することにより、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性を、標的レピシエント植物（反復親）に遺伝子移入することができる。該反復親は、耐性ではないか、またはＶｅ４２７ＲＢに対して低いレベルの耐性（例えば、本発明のアッセイにおいて少なくとも１０の植物の少なくともおよそ６０％、少なくともおよそ７０％、少なくともおよそ８０％が、Ｖｅ４２７ＲＢによる接種後に全体的兆候を示す）を有する植物であり、商業的に所望の特徴、例えばこれに限定しないが(別の)疾病耐性、昆虫耐性、有益な果実特徴などを有する植物である。非反復親は、反復親と交雑受精された任意の植物品種または近交系であり得る。反復親と非反復親との交配により得られる後代が、反復親に戻し交配される。その後、得られる植物集団を、所望の特徴についてスクリーニングする、このスクリーニングは多くの異なる方法にて生じ得る。例えば、この集団を、表現型の病理学スクリーニング、例えば、本明細書に記載した耐性アッセイ、Ｖｅ４２７ＲＢを用いる当分野では既知の定量的アッセイおよび／またはマーカー利用選抜（ＭＡＳ）を用いてスクリーニングできる。
【０１１４】
例えば、劣性の遺伝子座を遺伝子移入する場合に、その遺伝子座により付与される表現型は、遺伝子座についてホモ接合型の植物が形成される条件下でのみ、後代植物に発現されることに留意されたい。
【０１１５】
一般的には、所望の形質、例えばＶｅ４２７ＲＢ−耐性をハイブリッドカプシクム品種に導入する方法は、以下の工程を含む：
（ａ）近交系のカプシクム親を、１以上の所望の形質を含む別のカプシクム植物と交配して、Ｆｌ後代植物を作出する工程、ここで１つの所望の形質はＶｅ４２７ＲＢ−耐性であって、該Ｆｌ後代植物は、Ｆ２、またはＦ３、または次の世代を作出するために１回以上自殖される工程、
（ｃ）該Ｆ２またはＦ３または次の世代の後代植物から、所望の形質を有するそれらの植物を、例えば本明細書に規定したとおりのＴＳＷＶ耐性アッセイを用いて選択する工程；
（ｄ）所望により、選択された後代植物を、該近交系のカプシクム親植物と戻し交配して、戻し交配後代植物を作出する工程；
（ｅ）所望により、該近交系のカプシクム親植物の所望の形質ならびに形態学的および生理学的特徴を有する戻し交配後代植物を選択する工程、ここで該選抜は、例えば本明細書に記載したとおりの耐性アッセイを含む；
（ｆ）所望により、工程（ｄ）および（ｅ）を、２回またはそれ以上連続して繰り返して、選択された３代またはそれ以上の戻し交配後代植物を作出する工程；
（ｇ）所望により、ホモ接合植物を同定するために、選択された戻し交配後代を自殖する工程；
（ｈ）所望により、少なくとも１つの該戻し交配後代または自殖植物を、別の近交系のカプシクム親植物と交配して、同じ環境条件下で生育した場合に、所望の形質ならびにハイブリッドカプシクム品種の全ての形態学的および生理学的特徴を有するハイブリッドカプシクム品種を作出する工程。
【０１１６】
提示したとおり、ホモ接合形態にてＶｅ４２７ＲＢ−耐性を含む純粋な育種（近交系）後代を提供するために、最も近い戻し交配世代を自殖してもよい。従って、循環選抜、戻し交配および自殖の結果とは、Ｖｅ４２７ＲＢ耐性と関連する遺伝子ならびに商業的に興味深い形質と関連がある他の遺伝子について遺伝的に均一な（homogenous）系統の作出である。
【０１１７】
得られるＦ１ハイブリッドカプシクム植物は、ホモ接合またはヘテロ接合型形態においてＶｅ４２７ＲＢ−耐性を付与する遺伝子要素を含み得る。従って、一実施態様において、各々良好な農業的特徴を有し、各々ホモ接合形態においてＶｅ４２７ＲＢ−耐性を付与する遺伝子要素を含む２つの近交系の親の系統が提供される、そのため該Ｆ１ハイブリッドは、ホモ接合形態においてＶｅ４２７ＲＢ−耐性を付与する遺伝子要素を含む。別の実施態様において、２つの近交系の親系統は、各々良好な農業特徴を有するが、一つの近交系の親系統は、ホモ接合形態においてＶｅ４２７ＲＢ−耐性を付与する遺伝子要素を含んでいるが、もう一方のものは、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性を付与する遺伝子要素を欠いている、そのため該Ｆ１ハイブリッドはヘテロ接合型形態においてＶｅ４２７ＲＢ−耐性を付与する遺伝子要素を含む。好ましくは、近交系の親系統（およびＦ１ハイブリッド）は、カプシクム・アニューム．種の系統であって、高品質のトウガラシ果実を産生する。一実施態様において、トウガラシ果実は、ピーマンであるが、あらゆる他の果実の形状／型およびあらゆる色が提供され得る。
【０１１８】
従って、Ｆ１ハイブリッドトウガラシ産生における親として、カプシクム植物、好ましくはトウガラシ植物を使用する（ここで、該Ｆ１ハイブリッド親は、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性を付与する遺伝子要素を含む）。一実施態様において、遺伝子要素は、ＮＣＩＭＢ ４１８１７、ＮＣＩＭＢ ４１８１８およびＮＣＩＭＢ４１９３６から選択された受託番号として寄託された種子またはその後代から得られ、これにより後代植物はＶｅ４２７ＲＢ−耐性を含む。本明細書に記載した植物の種子、特に、本明細書に記載したＦ１ハイブリッドが生育可能な種子および／またはＶｅ４２７ＲＢ−耐性を含む同系交配のＣ．ａｎｎｕｕｍから生育可能な種子もまた提供され、これにより該耐性とは、受託番号ＮＣＩＭＢ ４１８１７、ＮＣＩＭＢ ４１８１８および／またはＮＣＩＭＢ４１９３６として寄託された種子に存在するような耐性である；すなわち、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性は、該種子から得られうる／から得ることができる。
【０１１９】
植物育種の最終地点は、１品種に様々な所望の形質を組み合わせることである。商業用の穀物のためには、これらの形質は、疾患および昆虫に対する耐性、熱および乾燥に対する耐性、穀物成熟までの時間の短縮、高い収量、ならびに良好な農業品質、果実の均一性などを含み得る。植物特徴の均一性、例えば、発芽力および群生確立(stand establishment)、生育速度、成熟度ならびに植物高の均一性もまた重要であり得る。
【０１２０】
商業用穀物は、植物の受粉方法に関して有利な技術を通じて生育される。１つの花からの花粉が、同じ植物の同じ花または別の花に伝播されれば、植物は自家受粉される。同族または同系統内の個体が受粉に使用される場合、植物は兄弟受粉される。花粉が異なる族または系統由来の異なる植物の花に由来するものならば、植物は他家受粉される。自家受粉され、かつ多くの世代型について選抜されてきた植物は、殆ど全ての遺伝子の遺伝子座でホモ接合となり、真の育種後代の均一集団を生成する。２つの異なるホモ接合系統間での交配は、多くの遺伝子座についてヘテロ接合型であり得るハイブリッド植物の均一集団を作出する。多くの遺伝子座で各々ヘテロ接合型の２つの植物の交配は、遺伝的に異なり、かつ均一ではない異種植物の集団を作出する。
【０１２１】
カプシクム植物育種プログラムにおけるハイブリッドトウガラシ品種の開発は、次の３工程を含む：（１）最初の育種交配のために、多様な遺伝子起源プールから植物を選抜する工程；（２）数世代の間に育種交配から選抜された植物を自殖して、個々に純種を生育させ、かつ均一性が高い一連の近交系を作出する工程；および（３）選択された近交系を非関連近交系と交配して、ハイブリッド後代（Ｆｌ）を作出する工程。十分な連続した同系交配後に、雑種世代は、開発された近交系の種子を増やすよう役立つにすぎない。好ましくは、近交系は、ホモ接合型アレルをその遺伝子座の約９５％またはそれ以上含むべきである。
【０１２２】
同系接合性および近交系の均一性に関する重要な結論は、近交系の規定された対を交配することにより創出されたハイブリッドは常に同じものであるということである。一旦優れたハイブリッドを作出するハイブリッドが同定されると、ハイブリッド種子の継続供給は、これらの同系交配親を用いて創出でき、その後該ハイブリッドカプシクム植物を、このハイブリッド種子の供給により作出できる。
【０１２３】
本発明のある態様は、本発明の方法により得られるＶｅ４２７ＲＢ−耐性トウガラシ植物またはその一部をいう。本発明の別の態様は、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性を付与するＱＴＬを含むＶｅ４２７ＲＢ−耐性カプシクム植物またはその一部に関し、ここで該ＱＴＬは、その天然の遺伝子のバックグラウンドには存在しない。本発明のＶｅ４２７ＲＢ−耐性トウガラシ植物は、任意の遺伝子タイプ、例えば近交系、ハイブリッド、半数体、二ゲノム性半数体またはトランスジェニックであってよい。さらに、本発明の植物は、Ｖｅ４２７ＲＢ耐性形質についてヘテロ接合型またはホモ接合型であってもよく、好ましくはホモ接合型である。本発明のＱＴＬならびにその耐性付与部分を、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性カプシクム植物に提供するために、任意のカプシクム植物へ移行させることができるが、本発明の方法および植物は、好ましくはカプシクム・アニューム種の植物に関連する。本明細書に記載したＶｅ４２７ＲＢ−耐性の近交系のカプシクム系統を、さらなる交配に使用して、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性ハイブリッド植物を作出する。例えば、本発明の初代のＶｅ４２７ＲＢ−耐性近交系カプシクム植物を、商業用の所望の形質、例えばこれに限定しないが、疾患耐性、昆虫耐性、所望の果実特徴、所望の果実形状および果実サイズなどを有する第２代の近交系カプシクム植物と交配できる。この第２代近交系のカプシクム系統は、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性であっても、またはなくてもよい。好ましくは、この第２代近交系のカプシクム系統はＶｅ４２７ＲＢ−耐性である。
【０１２４】
本発明の別の態様は、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性トウガラシ植物へと生育できる種子を作出する方法に関する。一実施態様において、該方法は、本発明のＶｅ４２７ＲＢ−耐性カプシクム植物を提供し、該Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性植物を別のカプシクム植物と交配し、そしてこの交配から得られる種子（これを植え付けた場合に、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性カプシクム植物を産生する）を回収する工程を含む。あるいは、該方法は、本発明のＶｅ４２７ＲＢ−耐性カプシクム植物を提供し、植物を自殖し、そして自殖して得られる種子を回収する工程を含む。
【０１２５】
別の実施態様において、この方法は、本発明のＶｅ４２７ＲＢ−耐性カプシクム植物を提供する工程、該Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性植物をカプシクム植物と交配する工程、この交配から得られる種子を回収する工程、該種子を植物へと生育させる工程、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性植物を本明細書に記載したいずれかの方法により選抜する工程、該十分数の世代について選抜された植物を自家受粉して、植物におけるＶｅ４２７ＲＢ−耐性を付与するアレルについて固定された植物を得る工程、こうして得られた植物を、十分数の世代に所望の表現型形質を有するカプシクム植物と戻し交配して、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性であり、かつ所望の表現型形質を有するカプシクム植物を得る工程、そして最新の戻し交配から得られる植物から作出された種子（これを植え付けた場合に、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性であるカプシクム植物を産生する）を回収する工程を含む。
【０１２６】
Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性カプシクム植物を生成するための別の実施態様において、プロトプラスト融合を、ドナーカプシクム植物からレピシエント植物へと核酸を移行させるために使用できる。プロトプラスト融合は、２以上のプロトプラスト（細胞壁が酵素処置により除去された細胞）間の誘導性または自発的結合、例えば体細胞ハイブリダイゼーションであり、１つ、２または複数の核細胞を生成させる。自然には異種交配できない植物種を用いて得られ得る融合細胞は、イン・ビトロで培養され、所望の形質の組み合わせを示すハイブリッド植物中で再生される。より具体的には、第一のプロトプラストを、Ｖｅ４２７ＲＢによる感染に対する耐性を示すカプシクム植物または他の植物系統から得ることができる。第二のプロトプラストを、商業的価値のある特徴、例えば次のものに限定しないが、疾患耐性、昆虫耐性、有益な果実特徴などを含む、第二のカプシクムまたは他の植物系統、好ましくはカプシクム系統から得ることができる。次いで、プロトプラストは、当業者には既知の従来のプロトプラスト融合方法を用いて融合される。
【０１２７】
別法として、胚救済（embryo rescue）を、ドナー植物からレピシエント植物へと本発明のＱＴＬまたはそのＶｅ４２７ＲＢ−耐性付与部分を含む核酸の移行において用いてもよい。胚救済を、交配物由来の胚を単離する方法として使用できる（ここで、植物は生育可能な種子を生成できない）。この方法において、植物の受精子房または未熟種子を、イン・ビトロで培養して、新規植物を作出するよう再生される。
【０１２８】
さらに、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性を付与する遺伝子要素を各細胞にて含む、単離細胞、イン・ビトロ細胞培養物および組織培養物、プロトプラスト培養物、植物部位、収穫された材料（例えば、収穫されたトウガラシ果実）、花粉、子房、花、種子、雄蕊、花部などが提供される。そのため、該細胞または組織が再生されるか、または全体のカプシクム植物に生育される場合に、この植物はＶｅ４２７ＲＢ−耐性を含む。
【０１２９】
すなわち、本発明の植物の細胞または組織のイン・ビトロ細胞培養物および／または組織培養物もまた提供される。細胞または組織培養物を、シュート形成培地(shooting media)および／または発根用培地(rooting media)で処理して、カプシクム植物を再生させる。
【０１３０】
また、本発明の植物の栄養繁殖またはクローン繁殖もまた本明細書に包含される。数多くの様々な栄養繁殖技術が存在する。切り出された部分（節、茎頂、茎など）は、例えば、上記したようなイン・ビトロ培養物に使用され得る。また、その他の栄養繁殖技術が存在し、接ぎ木または高取り法などを用いることができる。高取り法においては、幹の一端から発根させることができるが、それは依然として親植物と連結しているため、一旦十分に根が成長してから、該クローン植物を親から分離する。
【０１３１】
従って、一態様において、以下の工程を含む方法が提供される：
ａ）本発明の植物の一部（例えば、細胞または組織、例えば切除物）を得る工程、
ｂ）該植物の一部を栄養繁殖させて、該植物の一部分から、同一植物を作出する工程。
【０１３２】
従って、クローン/栄養繁殖のために本発明の植物の植物生長部分を使用することもまた、本発明の実施態様である。
また、Ｖｅ４２７ＲＢ−耐性を付与する遺伝子要素を含む複数の収穫されたトウガラシの果実は、かかるトウガラシ果実の部分を含む食品または飼料製品としても提供される。
一態様において、果実は種無し果実である。
【０１３３】
寄託情報
Ｔｓｗ−耐性破壊ＴＳＷＶ株Ｖｅ４２７ＲＢの代表的なサンプルは、ＤＳＭＺ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffstrasse 7B, 38124 Braunschweig, Germany)にて、受託番号ＤＳＭ ２４８２９として、２０１１年４月１９日にヌンヘムス・ベスローテン・フェンノートシャップ（Ｎｕｎｈｅｍｓ Ｂ．Ｖ．）により寄託された。
【０１３４】
Ｖｅ４２７ＲＢ耐性遺伝子遺伝子移入物を含むカプシカム・アニュームの種子の代表的なサンプルは、ＮＣＩＭＢ(NCIMB Limited, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA Scotland, UK)にて、受託番号ＮＣＩＭＢ ４１８１７およびＮＣＩＭＢ ４１８１８として、２０１１年３月１４日にヌンヘムス・ベスローテン・フェンノートシャップにより寄託された。
【０１３５】
ＰＡ２６３８の代表的なサンプルは、ＮＣＩＭＢ（NCIMB Limited, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA Scotland, UK)にて、受託番号ＮＣＩＭＢ４１９３６として２０１２年２月２３日にヌンヘムス・ベスローテン・フェンノートシャップにより寄託された。
【０１３６】
出願人は、生物学的物質およびそれらから得られる任意の物質のサンプルが、規則３２（１）ＥＰＣまたは類似の規則および規制を持つ国々または条約国の関連法に従って、この出願が拒絶、取下げ、または取下げたと見なされれば、特許付与公知または出願日から２０年間まで、指定の専門家にのみ引き渡すことを要求するものである。
【０１３７】
寄託物へのアクセスは、この出願の継続期間中、申請により寄託物に対して権限のある米国特許庁責任者により決定された人物が利用できる。３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８０８（ｂ）に従い、寄託物を公的に利用できるように寄託者に課された全ての制限は、特許権付与の時点で完全に排除される。寄託物は、３０年間、または最新の申請の後の５年間、または特許期間を延長できる期間維持され、もしそれらの期間に利用できなくなれば、置き換えられる。出願人は、この出願に対する特許権または植物品種保護法(7 USC 2321 et seq.)の下に認められたあらゆる権利を放棄しない。
【０１３８】
以下の非限定的実施例は、本発明のトウガラシ植物、種子および果実の作出を説明する。本明細書に記載した全ての引用文献は、出典明示により本明細書に組み込まれる。
【０１３９】
実施例
Ｖｅ４２７ＲＢに対して有効な耐性起源の同定
耐性スクリーニングを、耐性破壊株Ｖｅ４２７ＲＢおよびその対応する野性型Ｖｅ４３０ＷＴが初めて単離されたスペインのアルメニアの自然感染条件下で行なった［Margaria et al.(Plant Pathology Vol 53: p794)］。驚くべきことに、野生系統株ＰＡ２６３８は、耐性破壊株Ｖｅ４２７ＲＢに対して耐性を示した。
【０１４０】
耐性破壊株Ｖｅ４２７ＲＢに対する耐性を、イタリアのトゥーリンで単離されたＴｓｗ耐性破壊株Ｖｅ４２７ＲＢによる人為的接種を用いて確認した。
【０１４１】
接種方法および耐性評価を、上記および下記のとおりに実施した。局所および全体的兆候の例示的な写真を、例えばＭａｒｇａｒｉａら(2007, MPMI Vol 20: 547−558)にて見ることができる。
【０１４２】
耐性破壊株Ｖｅ４２７ＲＢおよび野性型（ＷＴ）株ｐ１０５ＷＴを、一対の宿主株に対する症候の発症について評価した。遺伝子型あたり１２の植物体を、Ｖｅ４２７ＲＢまたは野性株いずれかを用いて接種した。接種後に、局所症候を、７、１５および２８日後の接種葉において評価し、全体的兆候を、１５および２８日後の上部の非接種葉において評価した。
【０１４３】
試験植物およびコントロール植物を、同じ条件下で播種して、２枚の子葉および５〜６枚の本葉をつけるまで生育させた。生育条件は：温室、十分な水の供給、温度：約１４時間の日照時間を含めたおよそ２６℃／１８℃の日／夜、光強度：およそ１２０μｍｏｌ＊ｓｅｃ−１＊ｍ−２μ［ＰＡＲ］、生育場所：土壌(半分が芝土で半分が窪みのような土壌)。
【０１４４】
２枚の子葉および５〜６枚の本葉をつけた植物の完全に成長しているが最も若い幼葉２枚を、活性炭素粉末を含む緩衝液およびＶｅ４２７ＲＢの混合物を該葉上に噴霧することにより機械的に接種した。５日後に、第２回目の機械による接種を行なった。接種のために、感染したニコチアナ・ベンタミアナの葉の粉末（１ｇ）を、ポール緩衝液（リン酸緩衝液０．０５Ｍ，ｐＨ７，ＤＩＥＣＡ（ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物）（５ｍｌ）０．００５Ｍ、ＥＤＴＡ−Ｎａ２ ０．００１Ｍ、チオグリコール酸ナトリウム ０．００５Ｍ）と共に混合した。接種した葉を、該葉の表面の上部が湿るまで噴霧した。この緩衝液の量が噴霧した表面に依存することは当業者には理解されるであろう。そのため、例えば、緩衝液のおよそ０．１ｍｌ、およそ０．２ｍｌ、およそ０．５ｍｌ、およそ０．７ｍｌ、およそ１．０ｍｌ、およそ１．５ｍｌ、およそ２．０ｍｌ、およそ２．５ｍｌ、およそ４．０ｍｌを使用して葉の表面上部を湿らせてもよい。
【０１４５】
各々病原型の活性を、感受性ニコチアナ・ベンタミアナ植物の葉に接種することにより確認した。全ての接種されたニコチアナ・ベンタミアナ植物は、２８日後に全体的兆候を示した。ネガティブコントロールとして、２枚の子葉および５〜６枚の本葉をつけた植物の完全に成長しているが最も若い幼葉２枚を、機械的に緩衝液単独で接種した。２８日後に全体的（または局所性）症候は検出されなかった。
【０１４６】
Ｔｓｗ遺伝子を担持し、かつ野性型ｐ１０５ＷＴ（およびＶｅ４２７ＲＢに対して感受性である）に対して耐性であるコントロール品種のカプシクム・キネンセ ＰＩ１５２２２５（ＣＶ１と示す）、ならびにＴｓｗ遺伝子を担持しない（すなわち、ｐ１０５ＷＴに対して感受性であり、かつＶｅ４２７ＲＢに対して感受性である）コントロール品種Ｑｕａｄｒａｔｏ Ｄ’Ａｓｔｉ(市販、例えばhttp://www.macrolibrarsi.it/prodotti/ peperone-quadrato-dasti-5-gr-b525.phpを参照されたい）（ＣＶ２と示す）を、コントロール系統として使用する。しかし、野性型ＴＳＷＶなどに対して耐性／感受性であるとして知られ/同定され得る他のコントロール系統も使用できる。結果を、以下の表１に示す。病原型Ｐ０（ｐ１０５ＷＴ）接種植物、ＣＶ２およびＰＡ２６３８は、第１回目の接種後２８日目に全体的兆候を示したが、ＣＶ１植物（Ｔｓｗ耐性遺伝子を含む）は全体的兆候を示さなかった、すなわち予測したとおり野性株に対して耐性であった。
【０１４７】
対照的に、病原型Ｐ１（Ｖｅ４２７ＲＢ）を接種されたＣＶ１植物は全体的症候を示し、ＴｓｗがＰ１に対して有効ではないことが確認されたが、しかし、ＰＡ２６３８は全体的兆候を示さなかった。従って、この野生系統株は、Ｐ１に対して実際に耐性であり、かつ接種部位での局所壊死反応は全体のウイルス拡散を防止するようである。
【０１４８】
表１−上記した耐性アッセイの章に記載したような接種後の、人為的接種２８日後の表現型
【表１】
0006328569.tif 000003
【０１４９】
実施例２−優良なトウガラシ育種系統へのＰ１（Ｖｅ４２７ＲＢ）に対する耐性の遺伝子移入
ＴＳＷＶ病原型Ｐ０およびＰ１を効果的にコントロールするために、戻し交配プログラムを、ＰＡ２６３８誘導性耐性およびＴｓｗ−遺伝子付与耐性が組込まれた優性なＴｓｗ遺伝子を含む優良なトウガラシ育種系統を用いて開始した。
【０１５０】
野生系統株ＰＡ２６３８を、ブロッキー・ベル型（カプシクム・アニューム・エル）に属する、カプシクム・キネンセ ＰＩ１５２２２５から得るＴｓｗ遺伝子を担持する親系統と交配した。Ｆ１後代を、少なくとも２回自殖させた。
【０１５１】
Ｔｓｗについて公開された分子マーカーを用いるマーカー分析により、ＰＡ２６３８は優性なＴｓｗ遺伝子を含有しないが、優良なブロッキー・ベル型トウガラシ育種系統はＴｓｗ遺伝子を含んでいることを確認した。
ＰＡ２６３８からの遺伝子移入フラグメントを含む後代系統を、実施例１に記載したとおりにＶｅ４２７ＲＢ接種後の全体的症候の発症について試験して、この結果を表２に示した。１系統あたり１２の植物体を試験した。全体的兆候（上部の非接種葉での黄化斑紋形成）を、第一回目の接種後２８日目に評価した。
【０１５２】
表２−第一回目の接種後２８日目の様々な系統に関するＶｅ４２７ＲＢ耐性アッセイの結果
【表２】
0006328569.tif 000004
Ｔｓｗ−耐性破壊株Ｖｅ４２７ＲＢ（そのゲノム中に、野生型カプシクム系統ＰＡ２６３８からの耐性付与遺伝子移入フラグメントを含む）に対して実質的に同レベルの耐性を有するトウガラシ植物を選抜した。これらの系統の種子を、受託番号ＮＣＩＭＢ ４１８１７およびＮＣＩＭＢ ４１８１８として寄託した。野生型カプシクム ＰＡ２６３８の種子を、受託番号ＮＣＩＭＢ ４１９３６として寄託した。
【図１ａ】
0006328569.tif 000005
【図１ｂ】
0006328569.tif 000006
【図２】
0006328569.tif 000007
【配列表】
0006328569000001.app