(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫＸ６.３(ＮＫ６ ｈｏｍｅｏｂｏｘ３)タンパク質またはＮＫＸ６.３タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含む、抗がん用組成物であって、前記がんが胃がんであることを特徴とする、抗がん用組成物。
【請求項２】
前記ＮＫＸ６.３タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の抗がん用組成物。
【請求項３】
前記ＮＫＸ６.３タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の抗がん用組成物。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドは、発現ベクター内に含まれていることを特徴とする、請求項１に記載の抗がん用組成物。
【請求項５】
被検体から採取された生物学的試料にあるＮＫＸ６.３タンパク質の発現量、ＮＫＸ６.３タンパク質をコーディングするｍＲＮＡの発現量、またはＮＫＸ６.３遺伝子のＤＮＡコピー数を確認して胃がん発生の予測、胃がんの診断、または予後分析に必要な情報を提供する、方法。
【請求項６】
前記がん発生の予測のための生物学的試料は、非がん性(前癌性)組織であり、前記がんの診断、または予後分析のための生物学的試料は、がん組織であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記非がん性(前癌性)組織が、その周辺部の正常組織に比べてＮＫＸ６.３タンパク質の発現量が減少するか、ＮＫＸ６.３タンパク質をコーディングするｍＲＮＡの発現量が減少するか、またはＮＫＸ６.３遺伝子のＤＮＡコピー数が減少する場合、がんの発生リスクが高いと判断することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
胃の粘膜で前記非がん性(前癌性)組織が、その周辺部の正常組織に比べてＮＫＸ６.３タンパク質、Ｓｏｘ２タンパク質、及びＭｕｃ５ａｃタンパク質の発現が消失し、Ｃｄｘ２及びＭｕｃ２の発現が増加される場合、腸形化生が進行されているため、がんの発生が高いものと判断することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記がん組織が、その周辺部の正常組織に比べてＮＫＸ６.３タンパク質の発現量が減少するか、ＮＫＸ６.３タンパク質をコーディングするｍＲＮＡの発現量が減少するか、またはＮＫＸ６.３遺伝子のＤＮＡコピー数が減少する場合、がんと診断したり、がんの悪性度が高いものと判断することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
抗がん剤の候補物質を細胞に処理してＮＫＸ６.３タンパク質の活性、または細胞内発現レベルの増加に及ぼす効果を測定する段階を含む、抗がん剤スクリーニング方法であって、前記がんが胃がんであることを特徴とする、抗がん剤スクリーニング方法。
【請求項１１】
前記候補物質がＮＫＸ６.３タンパク質の活性を増加させたり、細胞内でＮＫＸ６.３遺伝子の発現レベルを増加させる場合、抗がん活性を有する抗がん剤と判断する段階を追加することを特徴とする、請求項１０に記載の抗がん剤スクリーニング方法。
【請求項１２】
前記ＮＫＸ６.３タンパク質の活性または細胞内発現レベルは、免疫沈降法(ｃｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ)、放射能免疫分析法(ＲＩＡ)、酵素免疫分析法(ＥＬＩＳＡ)、免疫組織化学、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、ウェスタンブロッティング(Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ)、及びフローサイトメトリー分析法(ＦＡＣＳ)からなる群から選択されるいずれか一つの方法で行うことを特徴とする、請求項１０に記載の抗がん剤スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん発症の予測、早期診断、及び治療剤としてのＮＫＸ６.３の用途に関し、より詳細には、ＮＫＸ６.３のタンパク質発現量、ｍＲＮＡ発現量、ＤＮＡコピー数を介してがんを早期に診断し、ＮＫＸ６.３タンパク質や遺伝子を投与してがんを治療するためのＮＫＸ６.３の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃上皮は、管状の分岐された胃腺(ｇａｓｔｒｉｃ ｇlａｎｄｓ)を形成し、胃腺は、様々な細胞を含む複雑な構造を有している。一般的に、胃上皮細胞は、非常に速い細胞回転率を有する細胞であって、毎３〜５日に上皮の再生を誘導するが、速い回転率にもかかわらず、細胞死滅を介して胃腺の上皮細胞は、恒常性を維持する。多能性幹細胞は、胃腺の首や脇部に位置しており、幹細胞は、有糸分裂後に胃腺の上または下部に移動し、さまざまな類型の細胞に分化される。最近の研究結果によると、胃粘膜の炎症は、主にヘリコバクター・ピロリ菌に感染されて発生し、萎縮性胃炎、腸上皮化生(腸形化生)や異形成のいくつかの段階を経て、胃がん発症に関与していることが知られている。このうち、腸形化生は、胃粘膜上皮細胞が腸粘膜上皮細胞に分化されるもので、胃がんの前癌病変と知られている。たとえ胃がんを克服するために多くの研究が行われて進められているが、胃がんの発生、及び進行に対する正確な分子的機序は、まだよく分からない実情であり、胃がんは、世界で最も高い発病率と死亡率を示す悪性腫瘍のいずれかに該当する。
【０００３】
多くのホメオドメイン(ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ)の転写因子が細胞分化及び発達の過程で重要な役割を担っている。このようなホメオボックス遺伝子の中でＮＫＸファミリーメンバーは、中枢神経系、消化管、及び膵臓で細胞の運命を決めるなどの発達及び分化の過程で重要な役割を担うことが知られている。この中で、ＮＫＸ遺伝子のサブファミリーであるＮＫＸ６の三番目のメンバーであるＮＫＸ６.３は、マウスの実験において、胃末端部の上皮細胞のうち、下部／ベース領域で主に発現される。人体でＮＫＸ６.３は、染色体８ｐ１１.２１に位置し、２６６個のアミノ酸のタンパク質をエンコーディングするが、ＮＫＸ６.３は、胃単位(ｇａｓｔｒｉｃ ｕｎｉｔ)の有糸分裂後に、上下に移動しながら分化する移動性細胞に発現され、胃がんでＮＫＸ６.３遺伝子が存在する染色体８ｐ１１部位の異型接合性消失が頻繁に観察されるところ、本発明者らは、ＮＫＸ６.３遺伝子の不活性化が胃粘膜上皮細胞の非正常的な分化と恒常性の不均衡をもたらすことができ、その結果、慢性的な胃炎とがん発症の原因となることができるものと予想した。
【０００４】
そこで、本発明者らは、ＮＫＸ６.３遺伝子が胃がんの発症に関連するのかを確認するため、５５個の胃がんのサンプルを用いて、ＮＫＸ６.３遺伝子の遺伝学的、厚生学的、及び発現分析を進めて、ＡＧＳとＭＮＫ１胃がん細胞株を用いて機能分析を行った。その結果、ＮＫＸ６.３の発現が正常の胃粘膜組織に比べて胃がん組織で大幅に減少し、ＮＫＸ６.３が胃粘膜上皮細胞の分化、細胞増殖、及び細胞死滅を調節する腫瘍抑制遺伝子として作用するということを確認することにより、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ＮＫＸ６.３(ＮＫ６ ｈｏｍｅｏｂｏｘ３)タンパク質、またはＮＫＸ６.３タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含む抗がん用組成物を提供することである。
【０００６】
本発明の他の目的は、被検体から採取された生物学的試料にあるＮＫＸ６.３タンパク質の発現量、ＮＫＸ６.３タンパク質をコーディングするｍＲＮＡの発現量、またはＮＫＸ６.３遺伝子のＤＮＡコピー数を確認してがん発生の予測、診断、または予後分析に必要な情報を提供することである。
【０００７】
本発明のもう一つの目的は、抗がん剤候補物質を細胞に処理してＮＫＸ６.３タンパク質の活性、または細胞内発現レベルの増加に及ぼす効果を測定する段階を含む抗がん剤スクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するため、本発明は、ＮＫＸ６.３(ＮＫ６ ｈｏｍｅｏｂｏｘ３)タンパク質またはＮＫＸ６.３タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含む抗がん用組成物を提供する。
【０００９】
本発明の一実施例において、前記ＮＫＸ６.３タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００１０】
本発明の一実施例において、前記ＮＫＸ６.３タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列からなるものであってもよい。
【００１１】
本発明の一実施例において、前記ポリヌクレオチドは、発現ベクター内に含まれているものであってもよい。
【００１２】
本発明の一実施例において、前記がんは、乳がん(ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ)、肝がん(ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ)、膀胱がん(ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ)、脳がん(ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ)、子宮頸がん(ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ)、大腸がん(ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ)、食道がん(ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ)、胆嚢がん(ｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ)、頭頸部がん(ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ)、腎臓がん(ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ)、肺がん(小細胞及び／または非−小細胞)(ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ(ｓｍａｌｌ ａｎｄ／ｏｒ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ))、黒色腫(ｍｅｌａｎｏｍａ)、卵巣がん(ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ)、生殖細胞がん(ｏｖａｒｙ(ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ)ｃａｎｃｅｒ)、前立腺がん(ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ)、膵臓がん(ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ)、陰茎がん(ｐｅｎｉｌｅ ｃａｎｃｅｒ)、皮膚がん(ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ)、軟組織肉腫(ｓｏｆｔ−ｔｉｓｓｕｅ ｓａｒｃｏｍａ)、扁平上皮細胞がん(ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ)、胃がん(ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ)、精巣がん(ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ)、甲状腺がん(ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ)、及び子宮がん(ｕｔｅｒｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ)からなる群から選択された一つ以上のがんであってもよい。
【００１３】
また、本発明は、被検体から採取された生物学的試料にあるＮＫＸ６.３タンパク質の発現量、ＮＫＸ６.３タンパク質をコーディングするｍＲＮＡの発現量、またはＮＫＸ６.３遺伝子のＤＮＡコピー数を確認してがん発生の予測、がん診断、または予後分析に必要な情報を提供する方法を提供する。
【００１４】
本発明の一実施例において、前記がん発生の予測のための生物学的試料は、非がん性(前癌性)組織であり、前記がんの診断、または予後分析のための生物学的試料は、がん組織であってもよい。
【００１５】
本発明の一実施例において、前記非がん性(前癌性)組織が、その周辺部の正常組織に比べてＮＫＸ６.３タンパク質の発現量が減少するか、ＮＫＸ６.３タンパク質をコーディングするｍＲＮＡの発現量が減少するか、またはＮＫＸ６.３遺伝子のＤＮＡコピー数が減少する場合、がんの発生リスクが高いと判断することができる。
【００１６】
本発明の一実施例において、特に、胃(ｓｔｏｍａｃｈ)において、前記非がん性(前癌性)組織が、その周辺部の正常組織に比べてＮＫＸ６.３タンパク質、Ｓｏｘ２タンパク質、及びＭｕｃ５ａｃタンパク質の発現が消失し、Ｃｄｘ２及びＭｕｃ２の発現が増加する場合、腸形化生が進められており、がんの発生が高いと判断することができる。
【００１７】
本発明の一実施例において、前記がん組織が、その周辺部の正常組織に比べてＮＫＸ６.３タンパク質の発現量が減少するか、ＮＫＸ６.３タンパク質をコーディングするｍＲＮＡの発現量が減少するか、またはＮＫＸ６.３遺伝子のＤＮＡコピー数が減少する場合、がんと診断したり、がんの悪性度が高いと判断することができる。
【００１８】
本発明の一実施例において、前記がんは、乳がん(ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ)、肝がん(ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ)、膀胱がん(ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ)、脳がん(ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ)、子宮頸がん(ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ)、大腸がん(ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ)、食道がん(ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ)、胆嚢がん(ｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ)、頭頸部がん(ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ)、腎臓がん(ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ)、肺がん(小細胞及び／または非−小細胞)(ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ(ｓｍａｌｌ ａｎｄ／ｏｒ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ))、黒色腫(ｍｅｌａｎｏｍａ)、卵巣がん(ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ)、生殖細胞がん(ｏｖａｒｙ(ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ)ｃａｎｃｅｒ)、前立腺がん(ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ)、膵臓がん(ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ)、陰茎がん(ｐｅｎｉｌｅ ｃａｎｃｅｒ)、皮膚がん(ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ)、軟組織肉腫(ｓｏｆｔ−ｔｉｓｓｕｅ ｓａｒｃｏｍａ)、扁平上皮細胞がん(ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ)、胃がん(ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ)、精巣がん(ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ)、甲状腺がん(ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ)、及び子宮がん(ｕｔｅｒｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ)からなる群から選択された一つ以上のがんであってもよい。
【００１９】
また、本発明は、抗がん剤候補物質を細胞に処理してＮＫＸ６.３タンパク質の活性、または細胞内の発現レベルの増加に及ぼす効果を測定する段階を含む抗がん剤スクリーニング方法を提供する。
【００２０】
本発明の一実施例において、前記候補物質がＮＫＸ６.３タンパク質の活性を増加させたり、細胞内でＮＫＸ６.３遺伝子の発現レベルを増加させる場合、抗がん活性を有する抗がん剤と判断する段階を追加することができる。
【００２１】
本発明の一実施例において、前記ＮＫＸ６.３タンパク質の活性または細胞内の発現レベルは、免疫沈降法(ｃｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ)、放射能免疫分析法(ＲＩＡ)、酵素免疫分析法(ＥＬＩＳＡ)、免疫組織化学、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、ウェスタンブロッティング(Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ)、及びフローサイトメトリー分析法(ＦＡＣＳ)からなる群から選択されるいずれか一つの方法で行ってもよい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に係るＮＫＸ６.３は、がん細胞で活性または発現が抑制されており、がんを早期に診断することができる診断用組成物として活用できるだけでなく、ＮＫＸ６.３の発現を誘導してがん細胞の生存を抑制し、細胞死滅を誘導する機能を発揮するところ、抗がん治療用組成物としても有用に使用することができ、胃粘膜細胞の分化を誘導して前癌病変である腸形化生を抑制する効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】胃がん細胞株と胃がん組織におけるＮＫＸ６.３の発現を示したもので、Ａ) ＡＧＳ、ＭＫＮ１、ＭＫＮ２８、及びＭＫＮ４５胃がん細胞株は、ＮＫＸ６.３タンパク質の発現を示していないが、ＮＫＸ６.３を一時的にトランスファクションしたＡＧＳ細胞株、または安定的にトランスフェクションしたＡＧＳNKX6.3及びＭＮＫ１NKX6.3細胞株では、ＮＫＸ６.３タンパク質の発現が確認され、Ｂ) 殆どの胃がん組織では、ＮＫＸ６.３タンパク質の発現が消失したり、減少し、Ｃ) 胃がん組織と各例に相応する非−がん性胃粘膜組織でＮＫＸ６.３遺伝子プロモーター部位のメチル化及び非メチル化されたＤＮＡが全て観察された。(Ｕ，ｕｐｐｅｒ ｓｔｏｍａｃｈ; Ｍ，ｍｉｄｄｌｅ ｓｔｏｍａｃｈ，Ｌ，ｌｏｗｅｒ ｓｔｏｍａｃｈ; Ｎ，ｎｏｒｍａｌ; Ｔ，ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ; Ｍ，ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ; Ｕ，ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ)
【図２】非−がん性胃粘膜と胃がん組織でＮＫＸ６.３ＤＮＡコピー数とＮＫＸ６.３ｍＲＮＡ発現の様相変化を観察したもので、Ａ) ５５個の胃がん及びこれに対応する胃粘膜組織でＮＫＸ６.３ ＤＮＡ数値をＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎを用いたｒｅａｌ ｔｉｍｅ−ＱＰＣＲで分析した後、ＧＡＰＤＨで正常化し、Ｂ) ＮＫＸ６.３ ｍＲＮＡ発現をＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎを用いたＱＲＴ−ＰＣＲで分析した後、ＧＡＰＤＨで正常化し、Ｃ＆Ｄ) ３５個の正常胃粘膜組織及び胃がん組織サンプルでＮＫＸ６.３ＤＮＡコピー数とｍＲＮＡ発現との量的相関関係を確認した結果である(Ｐ＜０.０００１)。
【図３】胃粘膜組織の萎縮性胃炎と腸形化生でＮＫＸ６.３の発現を観察したもので、Ａ) ５５個の胃粘膜組織でｍＲＮＡ発現量の変化のｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ分析、Ｂ) 単核細胞浸潤、萎縮性胃炎、腸形化生でＮＫＸ６.３ｍＲＮＡ発現の散布図分析、Ｃ) 胃粘膜組織と萎縮性胃炎、または腸形化生を区分するためのＮＫＸ６.３を用いたＲＯＣ曲線の分析、Ｄ) 単核細胞浸潤、萎縮性胃炎、腸形化生でＣｄｘ２ ｍＲＮＡ発現の散布図分析、Ｅ) 胃粘膜組織と萎縮性胃炎、または腸形化生を区分するためのＣｄｘ２を用いたＲＯＣ曲線の分析結果である。
【図４】ＮＫＸ６.３が、胃の分化マーカーＳｏｘ２と腸の分化マーカーＣｄｘ２の発現調節因子であることを確認したもので、Ａ) ＮＫＸ６.３は、Ｓｏｘ２遺伝子の場合、３〜４ｋｂプロモーター部位を結合して転写因子として作用し、Ｂ) ＮＫＸ６.３は、Ｃｄｘ２遺伝子の５ｋｂプロモーター部位で転写因子としての結合能が増加し、Ｃ) ＮＫＸ６.３は、時間依存性でＳｏｘ２遺伝子の発現を誘導し、Ｄ) Ｃｄｘ２遺伝子の発現を抑制したことを確認した結果である。
【図５】人体の胃粘膜組織で正常の胃腺(ｇａｓｔｒｉｃ ｇlａｎｄ)は、ＮＫＸ６.３、Ｓｏｘ２、及びＭｕｃ５ａｃを発現しているが、腸形化生のある胃腺は、これらの発現が消失しており、腸の分化マーカーであるＣｄｘ２とＭｕｃ２を発現しているため、前記細胞株の研究結果を人体の胃粘膜組織で検証した。
【図６】細胞の生存及び細胞の死滅に及ぼすＮＫＸ６.３の影響を確認したもので、Ａ) ＡＧＳmock、ＭＫＮ１mock、ＡＧＳNKX6.3、ＭＮＫ１NKX6.3細胞株で細胞の生存をＭＴＴ ａｓｓａｙで確認し、Ｂ) ＡＧＳmock、ＭＫＮ１mock、ＡＧＳNKX6.3、ＭＮＫ１NKX6.3細胞株で細胞増殖抑制能をＢｒｄＵ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙで確認し、Ｃ) ＡＧＳNKX6.3、ＭＮＫ１NKX6.3細胞株でコロニー形成抑制能を確認し、Ｄ) ＡＧＳNKX6.3、ＭＮＫ１NKX6.3細胞株で細胞周期進行抑制能を確認した。
【図７】ＡＧＳNKX6.3とＭＮＫ１NKX6.3細胞株でＮＫＸ６.３の細胞自滅死誘導能をａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙで確認した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明者らは、細胞分化の過程において異常が生じると、がんが発生しうるという点に着目し、胃がん組織でＮＫＸ６.３のタンパク質の発現を調べてみたところ、本発明者らが予想したように、胃がん組織では、ＮＫＸ６.３の発現が消失したり、著しく減少することが確認できた。
【００２５】
つまり、ＡＧＳ、ＭＫＮ１、ＭＫＮ２８、及びＭＫＮ４５のような胃がん細胞株でＮＫＸ６.３の発現が確認されず、非がん性粘膜組織でＮＫＸ６.３が発現された３５個の胃がん組織のうち、３３個の組織(９４.３％)でもＮＫＸ６.３の発現が正常組織に比べて著しく減少したり、消失することが確認された(図１Ａ及び図１Ｂ参照)。
【００２６】
このようなＮＫＸ６.３発現の減少がＮＫＸ６.３遺伝子の体細胞内での後成的変化によって引き起こされるかを確認するため、胃がん組織でＮＫＸ６.３遺伝子の突然変異を確認した。しかし、胃がん組織で 特異しそうなＮＫＸ６.３遺伝子の体細胞突然変異は、確認されなかった(データ未図示)。
【００２７】
そこで、本発明者らは、ＮＫＸ６.３遺伝子プロモーター部位のメチル化の変化によって胃がん組織でＮＫＸ６.３の発現様相が変化するかを確認するため、メチル化の有無を分析したが、胃がん組織と正常粘膜組織でＮＫＸ６.３遺伝子のメチル化は、大きな差異がないものと確認されて(図１Ｃ参照)、胃がんの発生過程でＮＸＫ６.３の体細胞突然変異やプロモーターの過メチル化は、胃がんの発生に大きな影響を及ぼさないと結論を下した。
【００２８】
以後、本発明者らは、胃がんでＮＫＸ６.３発現が減少する機序をさらに確認するため、ＤＮＡコピー数とｍＲＮＡ転写レベルをｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＱＰＣＲ、及びｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲで分析したところ、非−がん性胃粘膜組織に比べて胃がん組織でそれぞれＤＮＡコピー数とｍＲＮＡ転写発現が５５個のサンプルのうち、１８(３２.７％)及び３４(６１.８％)個のサンプルで減少することが示された(図２Ａ及び図２Ｂ参照)。一方、本発明者らは、ＮＫＸ６.３ ＤＮＡコピー数とｍＲＮＡ転写体発現との関係を比較したが、非−がん性粘膜組織と胃がん組織で全てＤＮＡコピー数とｍＲＮＡ転写体との間に有意な相関関係を示すことが分かった(Ｐ＜０.０００１)(図２Ｄ参照)。前記のような結果から本発明者らは、胃がんで減少したＮＫＸ６.３遺伝子のＤＮＡコピー数とｍＲＮＡ転写レベルが、ＮＫＸ６.３タンパク質の発現の減少に主な原因であると判断した。
【００２９】
ＮＫＸ６.３は、新規な転写因子として胃粘膜上皮細胞の分化過程に作用することが知られている。そこで、本発明者らは、細胞分化過程の異常の一つである腸形化生が胃がんの前癌病変であり、腸形化生を抑制すると、がんを予防できるという点に着目し、萎縮性胃炎と腸形化生病変を示す組織でＮＫＸ６.３の発現量の変化を調査したが、萎縮性胃炎と腸形化生病変を示す組織で全てＮＫＸ６.３の発現が著しく減少し、Ｃｄｘ２の発現が増加することを確認することができた(図３参照)。
【００３０】
これに加えて、ＮＫＸ６.３が細胞分化に関連する蛋白発現に及ぼす影響をさらに調査したが、ＮＫＸ６.３は、胃粘膜細胞への分化を誘導するＳｏｘ２遺伝子と腸の粘膜細胞への分化を誘導するＣｄｘ２遺伝子の発現を調節して腸形化生を抑制することを確認することができた。
【００３１】
つまり、ＮＫＸ６.３は、Ｓｏｘ２とＣｄｘ２遺伝子のプロモーター部位に結合する転写因子として、胃の分化マーカーであるＳｏｘ２の発現を誘導する反面、腸の分化マーカーであるＣｄｘ２の発現を抑制した(図４参照)。
【００３２】
また、人体胃粘膜組織において正常の胃腺(ｇａｓｔｒｉｃ ｇlａｎｄ)は、ＮＫＸ６.３、Ｓｏｘ２、及びＭｕｃ５ａｃを発現しているが、腸形化生のある胃腺は、これらの発現が消失し、腸の分化マーカーであるＣｄｘ２とＭｕｃ２が発現していた(図５参照)。
【００３３】
この他にも、本発明者らは、ＮＫＸ６.３が胃がん細胞の成長と死滅にどのような影響を及ぼすかを確認するため、ＮＫＸ６.３を安定的に発現するＡＧＳNKX6.3及びＭＮＫ１NKX6.3細胞株を作製して細胞の生存率を観察したが、ＮＫＸ６.３の発現は、これらの胃がん細胞株の生存、細胞増殖、及びコロニー形成を時間依存的に抑制することが分かった(図６Ａ、５Ｂ、５Ｃ及び５Ｄ参照)。また、ＡＧＳNKX6.3、ＭＮＫ１NKX6.3細胞株で時間依存的にこれらの胃がん細胞株の細胞死滅を誘導することが分かった(図７参照)。これらの結果から、本発明者らは、ＮＫＸ６.３が胃がん細胞の正常な分化を誘導し、細胞増殖を抑制し、細胞死滅を調節する腫瘍抑制者として機能することが分かった。
【００３４】
したがって、本発明は、ＮＫＸ６.３タンパク質またはＮＫＸ６.３タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含む抗がん用組成物を提供することができる。
【００３５】
好ましくは、前記ＮＫＸ６.３タンパク質は、配列番号１で記載されるアミノ酸配列を有するものであってもよく、前記ＮＫＸ６.３タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドは、配列番号２で記載される塩基配列を有するものであってもよい。
【００３６】
また、本発明に係る前記ＮＫＸ６.３タンパク質は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して機能的同等物であってもよい。前記「機能的同等物」とは、アミノ酸の付加、置換または欠失の結果、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは、７０％、より好ましくは、８０％以上の配列相同性を有するものであって、本発明のＮＫＸ６.３と実質的に同質の活性を示すポリペプチドをいう。ここで、「実質的に同質の活性」とは、前記で記載したＮＫＸ６.３の活性を意味する。前記機能的同等物には、例えば、本発明に係るＮＫＸ６.３のアミノ酸配列のアミノ酸の一部が置換されるか、欠失または付加されたアミノ酸配列変形体が含まれてもよい。アミノ酸の置換は、好ましくは、保存的置換であってもよく、天然に存在するアミノ酸の保存的置換の例は、以下の通りである。脂肪族アミノ酸(Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ)、疎水性アミノ酸(Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ)、芳香族アミノ酸(Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ)、酸性アミノ酸(Ａｓｐ、Ｇｌｕ)、塩基性アミノ酸(Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ)及び硫黄含有アミノ酸(Ｃｙｓ、Ｍｅｔ)。アミノ酸の欠失は、好ましくは、本発明のＮＫＸ６.３の活性に直接関与していない部分に位置してもよい。また、前記機能的同等物の範囲には、ＮＫＸ６.３の基本骨格及びこれの生理活性を保持しながら、ポリペプチドの一部の化学構造が変形されたポリペプチド誘導体も含まれてもよい。例えば、本発明のポリペプチドの安定性、保存性、揮発性又は溶解度等を変更させるための構造変更及び生理活性を保持しながら、他のタンパク質との融合により作られた融合タンパク質などがこれに含まれてもよい。
【００３７】
また、前記ＮＫＸ６.３タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドは、プラスミドまたはウイルスベクターのような発現ベクター内に公知の方法によって導入させた後、前記発現ベクターを、当業界に公知された様々な方法で形質導入(ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ)または形質移入(ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ)によって発現型で標的細胞内に導入させることができる。
【００３８】
プラスミド発現ベクターは、人に使用できるＦＤＡの承認された遺伝子伝達方法であり、人の細胞に直接的にプラスミドＤＮＡを伝達する方法であって(Ｎａｂｅｌ，Ｅ.Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１２８５−１２８８，１９９０)、プラスミドＤＮＡは、ウイルスベクターとは異なり、均質に精製することができるという長所がある。本発明で使用できるプラスミド発現ベクターとしては、当業界に公知された哺乳動物の発現プラスミドを使用することができ、本発明の一実施例では、ｐｃＤＮＡ３.１(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)プラスミドを使用してＮＫＸ６.３遺伝子が挿入された図１２の開裂地図を有する再調合発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３.１−ＮＫＸ６.３を製造した。
【００３９】
本発明に係る核酸を含むプラスミド発現ベクター(ｐｌａｓｍｉｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ)は、当業界に公知された方法、例えば、これに限定されるものではないが、一時的形質移入(ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ)、微細注射、形質導入(ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ)、細胞融合、カルシウムホスフェート沈殿法、リポソーム媒介された形質移入(ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ)、ＤＥＡＥデキストラン−媒介された形質移入(ＤＥＡＥ Ｄｅｘｔｒａｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ)、ポリブレン−媒介された形質移入(ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ)、電気穿孔法(ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ)、遺伝子ガン(ｇｅｎｅ ｇｕｎ)、及び細胞内にＤＮＡを流入させるための他の公知の方法により、腫瘍細胞内に導入することができる(Ｗｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ.Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２６７：９６３−９６７、１９９２; Ｗｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１４６２１−１４６２４，１９８８)。好ましくは、一時的形質移入方法を使用することができる。
【００４０】
また、前記ＮＫＸ６.３を発現させることができるベクターは、公知の方法により、細胞、組織、または体内に投与されてもよいが、例えば、局所的に、非経口、経口、鼻腔、静脈、筋肉内、皮下内または他の適切な手段によって投与されてもよい。特に、前記ベクターは、標的組織の腫瘍細胞を治療するための有効量で標的がん、または腫瘍細胞内に直接注射することができる。特に、目、胃腸管、尿生殖器管、肺及び気管支システムなどの体腔(ｂｏｄｙ ｃａｖｉｔｙ)のがんまたは腫瘍の場合には、本発明の薬学的組成物をがんまたは腫瘍によって影響を受ける有腔器官(ｈｏｌｌｏｗ ｏｒｇａｎ)内に針、導管(ｃａｔｈｅｔｅｒ)、または他の種類の輸送チューブを用いて直接注入することができる。
【００４１】
また、本発明に係る抗がん組成物は、がんを予防及び治療することができる薬学的組成物として使用することができ、前記薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。前記「薬学的に許容される」とは、生理学的に許容され、人間に投与されるとき、通常的に胃腸障害、めまいなどのアレルギー反応、またはこれと類似した反応を起こさない組成物をいう。薬学的に許容される担体としては、例えば、ラクトース、デンプン、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などのような経口投与用担体及び水、油適宜、食塩水、水性グルコース、及びグリコールなどの非経口投与用担体などがあり、安定化剤及び保存剤をさらに含むことができる。適切な安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、またはアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適切な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、メチル−またはプロフィール−パラベン、及びクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体としては、次の文献に記載されていることを参考にすることができる(Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ's Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５)。本発明に係る薬学的組成物は、上述したような薬学的に許容される担体とともに、当業界に公知された方法により適切な形態で剤形化されうる。つまり、本発明の薬学的組成物は、公知の方法に応じて様々な非経口または経口投与用の形態で製造することができ、非経口投与用剤形の代表的なものとしては、注射用剤形に等張性水溶液または懸濁液が好ましい。注射用剤形は、適切な分散剤または湿潤剤及び懸濁化剤を使用して、当業界に公知された技術によって製造することができる。例えば、各成分を食塩水または緩衝液に溶解させて注射用として剤形化することができる。また、経口投与用剤形としては、これに限定されるものではないが、粉末、顆粒、錠剤、丸薬、及びカプセルなどがある。
【００４２】
前記のような方法で剤形化された薬学的組成物は、有効量で経口、経皮、皮下、静脈または筋肉を含むいくつかの経路を介して投与することができる。前記で「有効量」とは、患者に投与したとき、予防または治療効果を示す量をいう。本発明に係る薬学的組成物の投与量は、投与経路、投与対象、年齢、性別、体重、個人差及び疾病状態に応じて適宜選択することができる。好ましくは、本発明の薬学的組成物は、疾患の程度に応じて、有効成分の含量を異にすることができるが、好ましくは、１μｇ〜１００００μｇｍｇ／体重ｋｇ／ｄａｙ、より好ましくは１０〜１０００μｇ／体重ｋｇ／ｄａｙの有効容量で一日に数回繰り返し投与することができる。また、本発明の抗がん用組成物は、がんを予防、改善または治療する効果を持つ公知の化合物と並行して投与することもできる。
【００４３】
また、本発明は、がんの予防、診断、または予後分析に必要な情報を提供するために被検体から採取された生物学的試料のＮＫＸ６.３タンパク質の発現量、ＮＫＸ６.３タンパク質をコーディングするｍＲＮＡの発現量、またはＮＫＸ６.３遺伝子のＤＮＡコピー数を確認してがんを診断する方法を提供することができる。
【００４４】
本発明の明細書において、用語の「予防」は、がんの前癌性病変におけるがん発生の予防を含む。好ましくは、本発明の予防は、がんの発生を根本的に抑制する可能性を意味する。
【００４５】
本発明の明細書において、用語の「診断」は、特定の疾病または疾患に対する一つのオブジェクトの感受性(ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ)を判定すること、一つのオブジェクトが特定の疾病または疾患を現在有しているかどうかを判定すること、特定の疾病または疾患にかかった一つのオブジェクトの予後(ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ)(例えば、前−転移性、または転移性がん状態の同定、がんの段階決定、または治療に対するがんの反応性決定)を判定すること、またはテラメトリックス(ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ)(例えば、治療効能に対する情報を提供するため、オブジェクトの状態をモニタリングすること)を含む。
【００４６】
本発明の明細書において、用語の「予後」は、疾病の進行可能性の過程、特に、疾病の快方、疾病の再生、腫瘍再発、転移、及び死の可能性の側面での予測を含む。好ましくは、本発明の予後は、がん患者の疾病が完治する可能性を意味する。一方、本発明において、がんの悪性度が高いということは、がんの侵襲及び転移の可能性が高く、再発の危険性が高い状態を含む。
【００４７】
本発明の好ましい具現例によると、本発明は、免疫分析(ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ)方式、すなわち、抗原−抗体反応方式で行うことができる。この場合、上述した本発明のがんマーカーに特異的に結合する抗体またはアプタマーを用いて行われる。
【００４８】
本発明で用いられる抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり、好ましくは、モノクローナル抗体である。抗体は、当業界で通常的に行われる方法、例えば、融合方法(Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６：５１１−５１９(１９７６))、再調合ＤＮＡ方法(米国特許第４,８１６,５６号)、またはファージ抗体ライブラリ方法(Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８(１９９１)及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ. Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８，１−５９７(１９９１))によって製造することができる。抗体の製造に対する一般的なプロセスは、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ. ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９;Ｚｏｌａ，Ｈ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ＩＮＣ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９８４;及びＣｏｌｉｇａｎ，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ，１９９１に詳細に記載されており、前記文献は、本明細書において参照として挿入される。例えば、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞の製造は、不死滅化細胞株を抗体−生産リンパ球と融合させて行われ、このプロセスに必要な技術は、当業者によく知られており、容易に行うことができる。ポリクローナル抗体は、タンパク質抗原を適合した動物に注射し、この動物から抗血清を収集した後、公知の親和性(ａｆｆｉｎｉｔｙ)技術を用いて、抗血清から抗体を分離して得ることができる。
【００４９】
本発明の方法を抗体またはアプタマーを用いて行う場合、本発明は、通常の免疫分析方法によって行って、がんを診断するために用いられることができる。このような免疫分析は、従来に開発された様々な定量的または定性的免疫分析プロトコルに基づいて行うことができる。前記免疫分析フォーマットは、放射能免疫分析、放射能免疫沈殿、免疫沈殿、免疫組織化学染色、ＥＬＩＳＡ(ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ ａｓｓａｙ)、キャプチャ−ＥＬＩＳＡ、抑制または競合の分析、サンドイッチ分析、フローサイトメトリー分析(ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ)、免疫蛍光染色及び免疫親和性精製を含むが、これらに限定されるものではない。前記免疫分析または免疫染色の方法は、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｅ. Ｔ．Ｍａｇｇｉｏ，ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９８０;Ｇａａｓｔｒａ，Ｗ．，Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ(ＥＬＩＳＡ)，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ． １，Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ． ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，１９８４;及びＥｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９に記載されており、前記文献は、本明細書に参照として挿入される。
【００５０】
例えば、本発明の方法は、放射能免疫分析方法によって行われる場合、放射能同位元素(例えば、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２、及びＳ３５)でラベル付けされた抗体が、本発明のマーカー分子を検出するために用いられることができる。
【００５１】
本発明の方法は、ＥＬＩＳＡ方式で行われる場合、本発明の特定の実施例は、（１）分析しようとする未知の細胞試料分解物を固体基質の表面にコーティングする段階と、（２）一次抗体としてのマーカーに対する抗体と前記細胞分解物を反応させる段階と、（３）前記段階（２）の結果物を酵素が結合された二次抗体と反応させる段階と、（４）前記酵素の活性を測定する段階と、を含む。
【００５２】
前記固体基質に適したものは、炭化水素ポリマー(例えば、ポリスチレン、及びポリプロピレン)、ガラス、金属、またはゲルであり、最も好ましくは、マイクロタイタープレートである。前記二次抗体に結合された酵素は、発色反応、蛍光反応、発光反応、または赤外線反応を触媒する酵素を含むが、これに限定されず、例えば、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、及びシトクロムＰ４５０を含む。前記二次抗体に結合する酵素としてアルカリフォスファターゼが用いられる場合には、基質としてブロモクロロインドリルフォスフェート(ＢＣＩＰ)、ニトロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ)、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−フォスフェート(ｎａｐｈｔｈｏｌ−ＡＳ−Ｂ１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ)、及びＥＣＦ(ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ)のような発色反応基質が用いられ、ホースラディッシュペルオキシダーゼが用いられる場合には、クロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ−ルシフェリン、ルシゲニン(ビス−Ｎ−メチルアクリジニウムニトラート)、レゾルフィンベンジルエーテル、ルミノール、がんプレックスレッド試薬(１０−アセチル−３,７−ジヒドロキシフェノキサジン)、ＨＹＲ(ｐ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ ａｎｄ ｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ)、ＴＭＢ(ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ)、ＡＢＴＳ(２,２−Ａｚｉｎｅ−ｄｉ[３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ])、ｏ−フェニレンジアミン(ＯＰＤ)及びナフトール／ピロニン、グルコースオキシダーゼとｔ−ＮＢＴ(ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ)及びｍ−ＰＭＳ(ｐｈｅｎｚａｉｎｅ ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ)のような基質が用いられることができる。
【００５３】
本発明の方法が、キャプチャ−ＥＬＩＳＡ方式で行われる場合、本発明の特定の実施例は、（１）捕捉抗体(ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ)として、本発明のマーカーに対する抗体を固体基質の表面にコーティングする段階と、（２）捕捉抗体と試料を反応させる段階と、（３）前記段階（２）の結果物をシグナルを発生させるラベルが結合されており、ＮＫＸ６.３タンパク質に特異的に反応する検出抗体(ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ)と反応させる段階と、（４）前記ラベルから発生するシグナルを測定する段階と、を含む。
【００５４】
前記検出抗体は、検出可能なシグナルを発生させるラベルを有している。前記ラベルは、化学物質(例えば、ビオチン)、酵素(アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、及びシトクロムＰ４５０)、放射性物質(例えば、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２、及びＳ３５)、蛍光物質(例えば、フルオレセイン)、発光物質、化学発光物質(ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ)、及びＦＲＥＴ(ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ)を含むが、これに限定されるものではない。様々なラベルとラベリング方法は、Ｅｄ． Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。
【００５５】
前記ＥＬＩＳＡ方法及びキャプチャ−ＥＬＩＳＡ方法において最終的な酵素の活性測定またはシグナルの測定は、当業界に公知された様々な方法によって行うことができる。このようなシグナルの検出は、本発明のマーカーの定性的、または定量的分析を可能にする。もし、ラベルとしてビオチンが用いられた場合には、ストレプトアビジンで、ルシフェラーゼが用いられた場合には、ルシフェリンでシグナルを容易に検出することができる。
【００５６】
本発明の他の変形例によれば、抗体の代わりに、本発明のマーカーに特異的に結合するアプタマーを用いることができる。アプタマーは、オリゴ核酸、またはペプチド分子であり、アプタマーの一般的な内容は、Ｂｏｃｋ ＬＣ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５５(６３６０)：５６４６(１９９２);Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ Ｆ，Ｂｕｔｚ Ｋ「Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｐｔａｍｅｒｓ：ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｎｅｗ ｔｏｏｌｓ fｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ」．Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．７８(８)：４２６３０(２０００);Ｃｏｈｅｎ ＢＡ，Ｃｏｌａｓ Ｐ，Ｂｒｅｎｔ Ｒ．「Ａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ a ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ」．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５(２４)：１４２７２７(１９９８)に詳細に開示されている。
【００５７】
上述した免疫分析プロセスによる最終的なシグナルの強さを分析することにより、がんを診断することができる。つまり、生物学的試料から本発明のマーカーのタンパク質が低発現されてシグナルが正常の生物学的試料(例えば、正常胃組織、血液、血漿、または血清)より著しく弱く出る場合には、がんと診断することができる。
【００５８】
また、本発明は、ＮＫＸ６.３タンパク質をコーディングするｍＲＮＡの発現量、またはＮＫＸ６.３遺伝子のＤＮＡコピー数を確認してがんを診断することができる。
【００５９】
ｍＲＮＡ発現量、またはＮＫＸ６.３遺伝子のＤＮＡコピー数は、ＰＣＲ増幅過程を通じて確認することができ、マイクロアレイを介して確認することができる。
【００６０】
明細書に記載された用語の「増幅」は、核酸分子を増幅する反応を意味する。様々な増幅反応が当業界に報告されており、これはポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)(米国特許第４,６８３,１９５、４,６８３,２０２、及び４,８００,１５９号)、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲ)(Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ(２００１))，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈ．Ｉ．(ＷＯ８９／０６７００)及びＤａｖｅｙ，Ｃ.等(Ｅｐ３２９,８２２)の方法、リガーゼ連鎖反応(ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ; ＬＣR)(１７，１８)、Ｇａｐ−ＬＣR(ＷＯ９０／０１０６９)、回復連鎖反応(ｒｅｐａｉｒ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ; ＥＰ４３９,１８２)、転写−媒介増幅(ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ; ＴＭＡ，ＷＯ８８／１０３１５)、自己保持塩基配列の複製(ｓｅｌｆ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ＷＯ９０／０６９９５)、ターゲットポリヌクレオチドの塩基配列の選択的増幅(ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、米国特許第６,４１０,２７６号)、コンセンサス配列のプライミングポリメラーゼ連鎖反応(ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｒｉｍｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ(ＣＰ−ＰＣＲ)、米国特許第４,４３７,９７５号)、任意的プライミングポリメラーゼ連鎖反応(ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ ｐｒｉｍｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ(ＡＰ−ＰＣＲ)、米国特許第５,４１３,９０９号及び第５,８６１,２４５号)、核酸塩基配列基盤増幅(ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ(ＮＡＳＢＡ)、米国特許第５,１３０,２３８号、第５,４０９,８１８号、第５,５５４,５１７号、及び第６,０６３,６０３号)、ストランド置換増幅(ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ)２１、２２及びループ−介在等温増幅(ｌｏｏｐｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ;ＬＡＭＰ)２３を含むが、これに限定されるものではない。使用可能な他の増幅方法は、米国特許第５,２４２,７９４、５,４９４,８１０、４,９８８,６１７号、及び米国特許第０９／８５４,３１７号に記載されている。
【００６１】
ＰＣＲは、最もよく知られている核酸増幅方法であって、それの多くの変形と応用が開発されている。例えば、ＰＣＲの特異性、または敏感性を向上させるため、従来のＰＣＲ手順を変形させてタッチダウン(ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ)ＰＣＲ、ホットスタート(ｈｏｔ ｓｔａｒｔ)ＰＣＲ、ネスト(ｎｅｓｔｅｄ)ＰＣＲ、及びブースター(ｂｏｏｓｔｅｒ)ＰＣＲが開発された。また、リアルタイム(ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ)ＰＣＲ、分別ディスプレイＰＣＲ(ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ ＰＣＲ：ＤＤ−ＰＣＲ)、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅(ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ：ＲＡＣＥ)、マルチプレックスＰＣＲ、インバースポリメラーゼ連鎖反応(ｉｎｖｅｒｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＩＰＣＲ)、ベクトレット(ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅ)ＰＣＲ、及びＴＡＩＬ−ＰＣＲ(ｔｈｅｒｍａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ ＰＣＲ)が、特定の応用のために開発された。ＰＣＲの詳細な内容は、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，及びＭｏｌｌｅｒ，Ｓ.Ｇ.ＰＣＲ．ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｎ.Ｙ.(２０００)に記載されており、それの教示事項は、本明細書に参照として挿入される。
【００６２】
本発明において、診断に使用されるプローブまたはプライマーは、ＮＫＸ６.３ヌクレオチド配列に対して相補的な配列を有する。本明細書において、用語の「相補的(ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ)」は、ある特定の混成化(ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ)またはアニーリング条件の下で、上述したヌクレオチド配列に選択的に混成化することができる程度の相補性を有することを意味する。したがって、用語の相補的は、用語の完全相補的(ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ)とは異なる意味を持ち、本発明のプライマーまたはプローブは、上述したヌクレオチド配列に選択的に混成化することができる程度であれば、一つまたはそれ以上のミスマッチ(ｍｉｓｍａｔｃｈ)塩基配列を持つことができる。
【００６３】
本明細書で使用される用語の「プライマー」は、適切な温度で適切な緩衝液内で、適切な条件(すなわち、４種の異なるヌクレオシドトリホスフェート及び重合反応酵素)の下で鋳型−指示ＤＮＡ合成の開始点として作用することができる一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの適切な長さは、様々な要素、例えば、温度とプライマーの用途に応じて変化するが、典型的に１５−３０ヌクレオチドである。短いプライマー分子は、鋳型と十分に安定した混成複合体を形成するため、一般的に、より低い温度を必要とする。
【００６４】
プライマーの配列は、鋳型の一部配列と完全に相補的な配列を有している必要はなく、鋳型と混成化されてプライマー固有の作用をすることができる範囲内での十分な相補性を持っていれば十分である。したがって、本発明でのプライマーは、鋳型の上述したヌクレオチド配列に完全に相補的な配列を有している必要はなく、この遺伝子配列に混成化されてプライマー作用をすることができる範囲内で十分な相補性を持っていれば十分である。これらのプライマーのデザインは、上述したヌクレオチド配列を参照して当業者によって容易に行うことができ、例えば、プライマーのデザイン用プログラム(例えば、ＰＲＩＭＥＲ３プログラム)を用いて行うことができる。
【００６５】
本明細書で使用される用語の「プローブ」は、自然の、または変形されたモノマーまたは連鎖(ｌｉｎｋａｇｅｓ)の線形オリゴマーを意味し、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含み、ターゲットヌクレオチド配列に特異的に混成化することができ、自然に存在するか、または人為的に合成されたものである。本発明のプローブは、好ましくは、単一鎖であり、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。
【００６６】
プローブの標識は、混成化の可否を検出させるシグナルを提供することができ、これは、オリゴヌクレオチドに連結されうる。適切な標識は、蛍光団(例えば、フルオレセイン(ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ)、フィコエリスリン(ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ)、ローダミン、リサミン(ｌｉｓｓａｍｉｎｅ)、そして、Ｃｙ３とＣｙ５(Ｐｈａｒｍａｃｉａ))、発色団、化学発光団、磁気粒子、放射性同位元素(Ｐ３２及びＳ３５)、質量標識電子密集粒子、酵素(アルカリフォスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼ)、補因子、酵素の基質、重金属(例えば、金)、抗体、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニンとキレート基などの特定の結合パートナーを有するヘプテンを含むが、これに限定されるものではない。標識は、当業界で通常的に行われる様々な方法、例えば、ニックトランスレーション(ｎｉｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ)方法、ランダムプライミング方法(Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍs ｂｏｏｋｌｅｔ，「Ａｍｅｒｓｈａｍ」(１９８９年))、及びカイネーション方法(Ｍａｘａｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：４９９(１９８６))を介して行うことができる。標識は、蛍光、放射能、発色測定、重量測定、Ｘ−線回折または吸収、磁気、酵素的活性、マス分析、結合親和度、混成化高周波、ナノ結晶によって検出することができるシグナルを提供する。
【００６７】
分析対象となる核酸試料は、様々な生物学的試料(ｂｉｏｓａｍｐｌｅｓ)から得たｍＲＮＡを用いて製造することができ、好ましくは、胃(ｓｔｏｍａｃｈ)組織細胞から得たｍＲＮＡを用いて製造することができる。プローブの代わりに分析対象となるｃＤＮＡを標識して混成化反応−基礎分析を行うこともできる。
【００６８】
一方、本発明のＮＫＸ６.３は、がん細胞の増殖を抑制し、細胞死滅を促進させる活性があるので、本発明は、前記遺伝子を用いた抗がん剤スクリーニング方法を提供することができる。
【００６９】
つまり、本発明に係る抗がん剤スクリーニング方法は、抗がん剤候補物質を細胞に処理してＮＫＸ６.３タンパク質の活性または細胞内の発現レベルの増加に及ぼす効果を測定する段階を含むことができる。また、前記候補物質がＮＫＸ６.３タンパク質の活性を増加させたり、細胞内でＮＫＸ６.３遺伝子の発現レベルを増加させる場合、抗がん活性を有する抗がん剤として判断する段階をさらに含むことができる。
【００７０】
前記ＮＫＸ６.３タンパク質の活性または細胞内の発現レベルが増加するという意味は、ＮＫＸ６.３遺伝子の発現が増加したり、またはＮＫＸ６.３タンパク質の分解が抑制されてＮＫＸ６.３タンパク質の濃度が増加することをいう。前記ＮＫＸ６.３遺伝子発現は、ＮＫＸ６.３遺伝子の転写及び蛋白質への翻訳過程を含む。
【００７１】
また、ＮＫＸ６.３タンパク質の活性または細胞内の発現レベルは、免疫沈降法(ｃｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ)、放射能免疫分析法(ＲＩＡ)、酵素免疫分析法(ＥＬＩＳＡ)、免疫組織化学、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、ウェスタンブロッティング(Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ)及びフローサイトメトリー分析法(ＦＡＣＳ)からなる群から選択されるいずれか一つの方法で行うことができる。
【００７２】
また、本発明のＮＫＸ６.３を標的としたスクリーニング方法は、高効率スクリーニング(ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ; ＨＴＳ)を適用することができる。ＨＴＳは、多数の候補物質を並行試験して、多数の候補物質の生物学的活性に対して同時に、又はほぼ同時にスクリーニングする方法である。特定の様態として、９６−ウェル微細力価プレート、または１９２−ウェル微細力価プレートで細胞株を培養し、ここで多数の候補物質を処理した後、免疫化学的方法によりＮＫＸ６.３の発現程度を測定することができる。前記ウェルは、典型的に５０μｌないし５００μｌに至る検定の容積を必要とし、プレートの以外に、９６−ウェルフォーマットを広範囲な均一系及び不均一系検定に適合にするために、多数の計器、機構、ピペッタ、ロボット、プレート洗浄機、及びプレートリーダーが商業的に利用可能である。
【００７３】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【実施例】
【００７４】
〈実施例１〉
１−１.胃がんのサンプル収得
計５５個の凍結された胃がん組織とがん周囲の非がん性粘膜組織を保健福祉家族部が支援している韓国国立バイオバンクの分院である全南大学校和順病院から得た。告知に立脚した同意は、ヘルシンキ宣言に基づいて提供され、これにより、すべての患者から書面同意書を得て、すべての実験は、カトリック大学校医科大学の機関監査委員会から承認を受けて行われた(ＭＣ１５ＳＩＳＩ００１５)。実験に参加した患者のうち、家族性がんを示す患者は、確認されなかった。
【００７５】
１−２．細胞培養及びＮＫＸ６.３のトランスフェクション
ＡＧＳ、ＭＫＮ１、ＭＫＮ２８、及びＭＮＫ４５胃がん細胞株は、熱で不活性化された１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて，５％ＣＯ2、３７℃の条件で培養した。全体のＮＫＸ６.３−ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３.１(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ)発現ベクターにクローニングした後、計５ｍｇの発現プラスミドを６０ｍｍディッシュに培養したＡＧＳとＭＫＮ１細胞株にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を用いて、製造者の方式に基づいて、一時的にトランスフェクションした。
【００７６】
また、人のＮＫＸ６.３を安定的に発現するＡＧＳとＭＫＮ１細胞株であるＡＧＳNKX6.3とＭＮＫ１NKX6.3細胞株を作製し、安定的なＮＫＸ６.３蛋白発現をウエスタンブロットで確認した。
【００７７】
１−３．統計分析
細胞の生存に対するＮＫＸ６.３の効果を分析するため、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いた。データは、少なくとも３回の独立した実験を経た後、平均±標準偏差で示した。線形回帰相関及びＣｈｉ−スクエアテストをＮＫＸ６.３のＤＮＡコピー数の変化によるｍＲＮＡ及び蛋白質発現との相関関係を分析するために使用した。ｐ〈０.０５の場合、統計的に有意なものと解釈した。
【００７８】
〈実施例２〉
胃がん細胞株と胃がん組織でのＮＫＸ６.３タンパク質の発現量の減少
ＮＫＸ６.３タンパク質の発現を、前記３５人の患者から採取した胃がん組織でウェスタンブロッティングの方法で調査し、各例に相応する非がん性−胃粘膜組織でのＮＫＸ６.３の発現量もともに調査した。ＡＧＳ、ＭＫＮ１、ＭＫＮ２８、ＭＮＫ４５のような胃がん細胞株からもＮＫＸ６.３の発現量を調査した。ウェスタンブロッティングのために細胞を溶解させ、２０％ポリアクリルアミドゲルに電気泳動した後、Ｈｙｂｏｎｄ−ＰＶＤＦメンブレン(Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ)にトランスファーし、抗−ＮＫＸ６.３モノクローナル抗体(Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ)で反応させた。タンパク質のバンドは、ＥＣＭウェスタンブラティング検出試薬(Ｂｉｄ−Ｒａｄ)で検出した。
【００７９】
その結果、ＡＧＳ、ＭＮＫ１、ＭＫＮ２８、及びＭＫＮ４５胃がん細胞株では、ＮＫＸ６.３タンパク質の発現が観察されていないため、これらの胃がん細胞株では、ＮＫＸ６.３が完全に不活性化されていることが確認できた(図１Ａ参照)。胃の上部[噴門(ｃａｒｄｉａ)]、中部[基底部(ｆｕｎｄｕｓ)、コーパス(ｃｏｒｐｕｓ)]、及び下部[空洞(ａｎｔｒｕｍ)と幽門部(ｐｙｌｏｒｕｓ)]を含む非−がん性胃粘膜組織のうち、３５個のサンプルでＮＫＸ６.３タンパク質の発現が確認され、これらの胃がん組織のうち、３３個(９４.３％)では、その発現が消失したり、減少されたことが確認された(図１Ｂ参照)。
【００８０】
〈実施例３〉
胃がん組織でＮＫＸ６.３の突然変異の分析
前記実施例２のＮＫＸ６.３の減少された発現が遺伝子の突然変異に関連付けられているかどうかを確認するため、配列分析を行った。このために、各腫瘍細胞及びこれに対応する非−がん性胃粘膜細胞からゲノムＤＮＡをＮＫＸ６.３遺伝子の全体のコーディング領域をカバーする６組のプライマーで増幅した。ＮＫＸ６.３の突然変異を検出するための具体的なプライマーは、Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.ＮＣ_０００００８.１１のゲノム配列に基づいてデザインし、具体的なプライマー配列は、下記表１の通りである。
【００８１】
【表１】
0006312861.tif 000002
【００８２】
それぞれのポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)の手順は、標準条件下で行った。これを簡略に説明すると、反応混合物を１２分間９４℃で変性させた後、４０秒間、９４℃で変性、４０秒間５６〜６０℃でアニーリングし、４０秒間７２℃で延長する段階を３５サイクルの間に反応させた。７２℃で最終の延長段階は、５分間行った。ＰＣＲ産物の配列分析は、製造者のプロトコルに従ってサイクルシーケンシングキット(パーキンエルマー、フォスターシティ、ＣＡ、ＵＳＡ)を用いて行った。
【００８３】
その結果、胃がん細胞でＮＫＸ６.３の突然変異は、確認されなかった。信頼性を確保するため、ＰＣＲ及び配列解析をそれぞれ２回行ったが、結果は、同じことが分かった。
【００８４】
〈実施例４〉
胃がん組織でＮＫＸ６.３のメチル化状態の分析
前記実施例２のＮＫＸ６.３の減少された発現が、ＮＸＫ６.３遺伝子のプロモーター領域のメチル化によるものか確認した。このために、ＮＫＸ６.３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態は、ＤＮＡに亜硫酸水素ナトリウムの処理後、メチル化特異的ＰＣＲ(ＭＳＰ)によって測定した。二硫化酸変形されたＤＮＡ５μｌをメチル化または非メチル化されたＮＫＸ６.３を分析するためのＮＫＸ６.３プライマー２組を使用してＭＳＰした。このときに使用したプライマーは、前記表１に示した。 ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ５μｌ、各プライマー０.５μＭ，各ｄＮＴＰ０.２μＭ，１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2，０.４ ｕｎｉｔのＡｍｐｌｉ Ｔａｑ ｇｏｌｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ)、３μｌ１０×バッファーを用いて、総３０μｌ体積で反応した。反応溶液は、初期に９５℃で１分間変性させた。増幅は、９５℃で３０秒、５９℃で３０秒、７２℃で３０秒間、４０サイクルを行い、７２℃で、最後に５分間追加延長反応した。ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲル上に直接ロードして電気泳動し、ＥｔＢｒ染色した後、ＵＶ光で確認した。
【００８５】
その結果、すべての正常組織と胃がん組織でＮＫＸ６.３遺伝子にメチル化及び非メチル化された部分を示して(図１Ｃ参照)、ＮＫＸ６.３の特定のメチル化が胃がん組織でのＮＫＸ６.３発現に影響を及ぼさないことを確認できた。
【００８６】
〈実施例５〉
胃がん組織でＮＫＸ６.３のＤＮＡコピー数の変化とｍＲＮＡ発現様相変化の分析
胃がん組織でＮＫＸ６.３の発現量の減少がＮＫＸ６.３のＤＮＡコピー数の変化及びｍＲＮＡ発現様相の変化と関係があるのか確認した。このため、胃がん組織とこれに相応する非−がん性胃粘膜組織からゲノムＤＮＡとｍＲＮＡを抽出して定量した後、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ ３０００Ｐ ＱＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍを用いて、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＱＰＣＲを行った。 ＮＫＸ６.３ ＤＮＡコピー数を確認するための特異的プライマーは、Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＮＣ_０００００８.１１のゲノム配列を用いてデザインした。すべてのサンプルは、ＧＡＰＤＨ特異的プライマーでＰＣＲ増幅して正常化した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ分析のためのプライマーは、遺伝子特異的遺伝子−特異的非−相同性ＤＮＡ配列に基づいてデザインし、プライマー配列は、前記表１に記載した通りである。
【００８７】
ｍＲＮＡ発現を確認するため、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍ(Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ)で製造された逆転写キットを用いて、製造者の方式によってｃＤＮＡを合成した。 ＱＰＣＲのために５０ｎｇのｃＤＮＡをＦｕｌｌｖｅｌｏｃｉｔｙ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ)と２０ｐｍｏｌ／μｌの順方向及び逆方向のプライマーを用いて、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ ３０００Ｐ ＱＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍで増幅した。
【００８８】
しかし、低いＣｔ値のため、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ ＰＣＲは、４５サイクル行い、ｍＲＮＡの抽出と逆転写の信頼性を確保するため、すべてのサンプルは、ＧＡＰＤＨ特異的プライマーでＰＣＲ増幅して正常化した。標準曲線法を用いて、遺伝子発現の相対的な量を定量化したが、この方法は、他のサンプルで標的ＤＮＡとｍＲＮＡの相対的な量の直接比較に使用することができる単位以下の正規化式の値を提供する。すべてのサンプルは、二重に実験して平均値を使用し、ＤＮＡコピー数とｍＲＮＡ発現量がｍｅａｎ ｔｅｓｔ(がん)／ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ(粘膜)の割合が０.５倍以下のとき、減少したものと定義した。
【００８９】
その結果、ＮＫＸ６.３のＤＮＡコピー数は、１８個の胃がんＤＮＡで、その周辺部の胃粘膜ＤＮＡに比べて減少したことが確認された(図２Ａ参照)。ＮＫＸ６.３遺伝子の転写体は、すべての例に相応する非−がん性胃粘膜組織に発現されていた(図２Ｂ参照)。ｍＲＮＡ転写体の発現消失、または減少は、分析された５５個の胃がん組織のうち、３４個(６１.８％)で観察された。非−がん性胃粘膜組織と胃がん組織で全て、ＮＫＸ６.３のＤＮＡコピー数とｍＲＮＡ転写体の発現との間の有意な相関関係を示した(Ｐ＜０.０００１)(図２Ｃ及び２Ｄ参照)。
【００９０】
〈実施例６〉
ＮＫＸ６.３発現がＣｄｘ２発現及び腸形化生に及ぼす影響
ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ分析に介して５５個の胃組織でＮＫＸ６.３のｍＲＮＡ発現量を調査した。 Ｈ.ｐｙｒｏｌｉ.の感染、萎縮性胃炎、腸形化生のない胃粘膜でのｍＲＮＡ発現の平均値を対照群として使用した。各場合のｍＲＮＡ発現の変化は、対照群胃粘膜の平均値で正常化し、０.５倍以下に減少した場合、ｍＲＮＡ発現量が減少したものと定義した。
【００９１】
その結果、２８個の組織(５０.９％)でＮＫＸ６.３のｍＲＮＡ発現量が減少した。腸形化生を有している２０個の胃組織サンプルのうち、１９個(９５.０％)でＮＫＸ６.３ ｍＲＮＡ発現の減少が観察された(図３Ａ参照)。
【００９２】
一方、散布図の分析においてＮＫＸ６.３ ｍＲＮＡ発現は、単核細胞浸潤(Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−ｔｅｓｔ，Ｐ＜０.０００１)、萎縮性胃炎(Ｐ＝０.０２７４)、腸形化生(Ｐ＜０.０００１)と密接に関連していたが、顆粒性白血球浸透(Ｐ＝０.３５５０)とは相関関係がないことが示された(図３Ｂ参照)。
【００９３】
人間の胃粘膜組織から萎縮性胃炎、または腸形化生を区別するため、ＮＫＸ６.３を使用してＲＯＣ曲線分析を行った。その結果、ＮＫＸ６.３発現の程度は、萎縮性胃炎と腸形化生組織でそれぞれＡＵＣ値が、０.６８９２(９５％ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ [ＣＩ]，０５４６３−０.８３２１; Ｐ＝０.０２３８６)と０.９４１４(９５％ＣＩ，０８８４７−０.９９８１; Ｐ＜０.０００１)であることが示された(図３Ｃ参照)。
Ｃｄｘ２ ｍＲＮＡ発現は、散布図の分析結果、単核細胞浸潤(Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−ｔｅｓｔ，Ｐ＝０.００３６)、萎縮(Ｐ＝０.００３８)、腸形化生(Ｐ＜０.０００１)と密接に関連していることが分かった(図３Ｄ参照)。
【００９４】
人間の胃粘膜組織から萎縮性胃炎、または腸形化生を区分するため、Ｃｄｘ２を使用してＲＯＣ曲線分析を行った。その結果、Ｃｄｘ ２発現の程度は、萎縮性胃炎と腸形化生の組織で、それぞれＡＵＣ値が０.７６１３(９５％ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ [ＣＩ]、０.６２５０−０.８９７６; Ｐ＝０.００１８１２)と０.９９７１(９５％ＣＩ，０.９８９５−１.００５; Ｐ＜０.０００１)であった(図３Ｅ参照)。
【００９５】
前記のような結果を総合して見ると、がんに発展する前の段階である萎縮性胃炎や腸形化生の段階でＮＫＸ６.３の発現は減少し、Ｃｄｘ２の発現は、増加していることが示され、がんに発展する前の病変である萎縮性胃炎及び腸形化生の段階でＮＫＸ６.３の発現を増加させたり、Ｃｄｘ２の発現を減少させる場合、がんの発生を予防できることが分かった。
【００９６】
〈実施例７〉
ＮＫＸ６.３発現が胃粘膜上皮細胞の分化に及ぼす効果の分析
胃上皮細胞でＮＫＸ６.３の機能を確認するため、ＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞株にＮＫＸ６.３を安定的に発現させることができるようにした。このためにＡＧＳとＭＮＫ１細胞株にＮＫＸ６.３を安定的に発現する細胞株であるＡＧＳNKX6.3とＭＮＫ１NKX6.3細胞株を作製し、これに対する対照群であるＡＧＳmockとＭＮＫ１mock細胞株を作製し、ＮＫＸ６.３の安定的な発現は、ウェスタンブロッティングで確認した。
【００９７】
そこで、本発明者らは、ＮＫＸ６.３が細胞の分化に及ぼす影響を分析するため、ＮＫＸ６.３が、胃の分化マーカーであるＳｏｘ２と腸の分化マーカーであるＣｄｘ２の転写因子として作用して発現を調節するかどうかをＣｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ−ＰＣＲ法で調査した。
【００９８】
その結果、ＮＫＸ６.３は、Ｓｏｘ２とＣｄｘ２遺伝子のプロモーター部位に結合する転写因子として胃の分化マーカーであるＳｏｘ２の発現を誘導し、腸の分化マーカーであるＣｄｘ２の発現を抑制することを確認した(図４参照)。また、人体胃粘膜組織で正常の胃腺(ｇａｓｔｒｉｃ ｇlａｎｄ)は、ＮＫＸ６.３、Ｓｏｘ２、及びＭｕｃ５ａｃを発現しているが、腸形化生のある胃腺は、これらの発現が消失し、腸の分化マーカーであるＣｄｘ２とＭｕｃ２が発現しており、細胞株の研究結果を検証した(図５参照)。
【００９９】
〈実施例８〉
ＮＫＸ６.３による胃がん細胞株の細胞増殖抑制効果の分析
胃上皮細胞でＮＫＸ６.３の機能を確認するため、ＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞株にＮＫＸ６.３を安定的に発現させることができるようにした。このために、ＡＧＳとＭＮＫ１細胞株にＮＫＸ６.３を安定的に発現する細胞株であるＡＧＳNKX6.3とＭＮＫ１NKX6.3細胞株を作製し、これに対する対照群であるＡＧＳmockとＭＮＫ１mock細胞株を作製した。ＡＧＳNKX6.3NKX6.3とＭＮＫ１NKX6.3細胞株でＮＫＸ６.３の安定的な発現は、ウェスタンブロッティングで確認した。
【０１００】
その結果、図１から分かるように、ＡＧＳNKX6.3とＭＮＫ１NKX6.3細胞株は、対照群に比べてＮＫＸ６.３タンパク質を安定的に発現することが確認された。
【０１０１】
そこで、本発明者らは、ＮＫＸ６.３が細胞の生存に及ぼす影響を分析するため、ＭＴＴ[３−(４,５ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ−２,５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ]分析法によってＡＧＳmock、ＭＮＫ１mock、ＡＧＳNKX6.3とＭＮＫ１NKX6.3細胞株で２４、４８、７２時間目の細胞生存率を分析した。吸光度は、５４０ｎｍで分光光度計を用いて測定し、細胞生存率は、ｍｏｃｋ(空ベクター＋リポペクタミン)に対して相対的に観察した。
【０１０２】
その結果、対照群に比べてＡＧＳNKX6.3とＭＮＫ１NKX6.3細胞株では、時間が経過するにつれてＮＫＸ６.３が、前記胃がん細胞の生存を著しく抑制させることが分かった(図６Ａ参照)。また、細胞増殖に及ぼす影響をＢｒｄＵ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ法で調査した結果、対照群に比べてＮＫＸ６.３が胃がん細胞の増殖を時間が経過するにつれて著しく抑制し、コロニー形成も抑制した(図６Ｂと５Ｃ参照)。これと共にＡＧＳNKX6.3とＭＮＫ１NKX6.3細胞株でＮＫＸ６.３は、細胞周期の進行を抑制した(図６Ｄ参照)。
【０１０３】
〈実施例９〉
ＮＫＸ６.３による胃がん細胞株の細胞死滅分析
ＮＫＸ６.３を外部から導入した場合、胃がん細胞株の細胞死滅が誘導されるかを確認するため、ＮＫＸ６.３を安定的に発現するＡＧＳNKX6.3とＭＮＫ１NKX6.3細胞株でＦＩＴＣ−標識されたａｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色を介して細胞染色して細胞死滅を分析した。そのために、製造者の方式によってＡＧＳNKX6.3とＭＮＫ１NKX6.3細胞株で培養した後、２４、４８、及び７２時間でＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙを行った。このために、ＡＧＳNKX6.3とＭＮＫ１NKX6.3細胞株は、冷ＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌバインディングバッファーを用いて再懸濁した後、１００μｌの上澄み液を４００μｌのブロッキング溶液と混合し、各混合液に５μｌ(１μｇ／ｍｌ)のａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣと５μｌのＰＩ(２μｇ／ｍｌ)を添加して、暗室で１５分間反応させた。以後、細胞をフローサイトメトリー(ＦＡＣＳ、ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ)で分析し、ＰＩ染色のない蛍光−陽性細胞のみを死滅される細胞と見なした。
【０１０４】
その結果、ＮＫＸ６.３を発現するＡＧＳNKX6.3とＭＮＫ１NKX6.3細胞株で時間が経過するにつれて細胞死滅する細胞数が増加することが分かった(図７参照)。
【０１０５】
前記のような結果を通じてＮＫＸ６.３は、胃がん細胞で特異的に発現が減少されることが示され、このような胃がん細胞株にＮＫＸ６.３を導入すれば、胃がん細胞株特異的に細胞増殖を抑制し、細胞死滅を誘導できるため、ＮＫＸ６.３は、胃がんの治療剤で治療できることが分かった。
【０１０６】
これまで本発明について、その好ましい実施例を中心として察し見た。本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者は、本発明が、本発明の本質的な特性から逸脱しない範囲で変形された形態で具現されることができることを理解できるだろう。したがって、開示された実施例は、限定的な観点ではなく、説明的な観点から考慮されるべきである。本発明の範囲は、前述した説明ではなく、特許請求の範囲に示されており、それと同等の範囲内にあるすべての相違点は、本発明に含まれるものと解釈されるべきであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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