(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
補体成分Ｃ４ｄと特異的に反応し、補体成分Ｃ４ｂまたはＣ４と反応しない抗体であって、アミノ酸配列ＮＶＴＬＳＳＴＧＲ−ＣＯＯＨからなるエピトープを含むペプチドに反応し、アミノ酸配列ＮＶＴＬＳＳＴＧＲＮＧＦＫ−ＣＯＯＨを含むペプチドに反応しないことを特徴とする抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
マウス抗体、ラット抗体、またはウサギ抗体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
動物（ヒトを除く）が、実質的にアミノ酸配列ＳＳＴＧＲ−ＣＯＯＨからなるペプチドによって免疫されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体を産生する方法。
【請求項６】
請求項５に従った方法によって取得可能であることを特徴とする抗体。
【請求項７】
試料中の補体成分Ｃ４ｄの検出のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、当該試料を、請求項１〜４または６のいずれか１項に従った抗体に接触させ、当該抗体とＣ４ｄとの間の結合が検出されることを特徴とする方法。
【請求項８】
前記試料は、血液試料、血清試料、血漿試料、滑液試料、または液状試料であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記試料は、熱不活性化されることを特徴とする請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ、および免疫組織化学からなる群から選択されることを特徴とする請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＳＬＥ、抗体媒介移植片拒絶、関節リウマチ、強皮病、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、血管炎、腎炎、抗リン脂質症候群、シェーグレン症候群、筋炎、肺がん、および血液腫瘍からなる群から選択される疾患の、診断または予後のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、請求項１〜４または６のいずれか１項に従った抗体を、個体に由来する試料に接触させ、当該試料が、所定の参照値に比較して、高いレベルの補体成分Ｃ４ｄを含む場合、前記個体が、前記疾患を罹患するか、または発達させる高いリスクを有すると結論付けることを特徴とする方法。
【請求項１２】
個体における疾患活動性を監視するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、前記疾患は、ＳＬＥ、血管炎、および抗体媒介移植片拒絶からなる群から選択され、請求項１〜４または６のいずれか１項に係る抗体を、前記個体に由来する試料に接触させ、当該試料中に存在するＣ４ｄのレベルが経時的に監視されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
個体における疾患の処置の効率を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、前記疾患が、肺がん、ＳＬＥ、血管炎、および抗体媒介移植片拒絶からなる群から選択され、請求項１〜４または６のいずれか１項に従った抗体を、処置の前後に個体から取得された試料に接触させ、処置後に取得された試料が、処置前に取得された試料中のＣ４ｄレベルに比べて、減少または低下したＣ４ｄレベルを有する場合、前記個体が、前記処置に反応すると結論付けることを特徴とする方法。
【請求項１４】
固体支持体に固定化された請求項１〜４または６のいずれか１項に従った抗体と、免疫複合体の検出のための試薬とを含むことを特徴とする補体成分Ｃ４ｄの検出のためのキット。
【請求項１５】
全身エリテマトーデスの個体における疾患活動性の再燃を予測または診断するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、請求項１〜４または６のいずれか１項に従った抗体が、前記個体に由来する試料と接触させられることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療診断法、および他の医療器具、ならびにそれらの使用の分野に属する。より詳細には、本発明は、補体系の成分に特異的に向けられた抗体であって、古典的補体経路の活性化の改良測定を可能にする抗体を提供する。さらに詳細には、本発明は、古典的補体経路の活性化を検出するための、手段および方法を提供する。さらに、本発明は、生物学的試料における補体成分Ｃ４ｄの存在を測定するための、手段および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
補体系は、病原体を生物体から排除するために、抗体、および食細胞の能力を補助、または「補完」する。補体系は、適応可能ではなく、個体の生存期間にわたって変化しない自然免疫系（１）と称される免疫系の一部である。しかしながら、補体系は、適応免疫系によって、迅速に形成され、作動することができる。
【０００３】
補体系は、血中に見出される多くのタンパク質であって、一般的に肝臓によって合成され、通常、不活性な前駆体（前駆タンパク質）として循環するタンパク質からなる。いくつかのトリガーの１つによって刺激されたとき、前記系におけるプロテアーゼは、特定のタンパク質を切断し、アナフィラトキシンを放出し、さらなる切断カスケードの増幅を惹起する。この活性カスケードの最終結果は、反応の大量増幅、および細胞を死滅させる膜攻撃複合体の活性化である。３０以上のタンパク質、およびタンパク質フラグメントが、血中において高濃度で見出される可溶タンパク質、および細胞膜受容体を含む補体系を構成する。それらは、血清のグロブリン画分の約５％を占め、オプソニンとして機能可能である。
【０００４】
補体系を構成するタンパク質は、主に肝細胞によって合成される。また、組織マクロファージ、血中単球、ならびに尿生殖器管、および消化管の上皮細胞によって相当量が製造される。補体系は、古典的経路、副経路、およびレクチン経路の、３つの生化学的経路によって惹起可能である（２）。
【０００５】
活性化の３つの経路は全て、タンパク質性Ｃ３コンバターゼ類似体と、膜攻撃形態をもたらす一般的な終末経路とを生じる。古典的補体経路は、典型的に、活性化のために抗原抗体複合体（免疫複合体）を必要とするが、副経路、およびマンノース結合レクチン経路は、抗体の存在なしに、それぞれ自然なＣ３加水分解、または炭水化物によって活性化することができる。全ての３つの経路において、Ｃ３コンバターゼは、補体Ｃ３を切断、および活性化し、Ｃ３ａおよびＣ３ｂを生じ、さらなる切断、および活性化事象のカスケードをもたらす。
【０００６】
古典的経路は、Ｃ１複合体の活性化によって惹起される。Ｃ１複合体は、１分子のＣ１ｑ、２分子のＣ１ｒおよび２分子のＣ１ｓからなるか、またはＣ１ｑｒ２ｓ２からなる。Ｃ１複合体は、Ｃ１ｑが、抗原に複合化した、ＩｇＭまたはＩｇＧに結合したときに活性化される。単一のＩｇＭは、前記経路を惹起することができるが、ＩｇＧは、複数必要である。このことは、Ｃ１ｑが病原体の表面に直接に結合したときに生じる。そのような結合は、Ｃ１ｑ分子における立体構造変化をもたらし、２つのＣ１ｒ分子の活性化をもたらす。Ｃ１ｒは、セリンプロテアーゼである。活性化されたＣ１ｒは、Ｃ１ｓを切断する（別のセリンプロテアーゼ）。Ｃ１ｒ２ｓ２成分は、Ｃ４と、Ｃ２とに分かれ、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ２ａ、およびＣ２ｂを生じる。Ｃ４ｂ、およびＣ２ａは、結合し、Ｃ３をＣ３ａおよびＣ３ｂに切断することを促進する古典的経路Ｃ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ａ複合体）を形成する。Ｃ３ｂは、後にＣ４ｂ２ａ（Ｃ３コンバターゼ）に加わり、Ｃ５コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ａ３ｂ複合体）を形成する。
【０００７】
古典的経路の活性化の間に形成されたＣ４ｂは、続いてセリンプロテアーゼ因子Ｉによって迅速に分解され、当該セリンプロテアーゼ因子Ｉは、Ｃ４ｂ結合タンパク質などの共因子の存在下において、古典的補体経路の活性化によってのみ現れる、Ｃ４ｂ分解の最終生成物であるＣ４ｄを生じる。Ｃ４ｄは、したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏ、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける古典的補体活性化のための優れたマーカである。近年、全身血液中のＣ４ｄは、肺がんの診断および予後マーカとして記載された（３）。Ｃ４ｄは、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）（４）、および抗体媒介移植片拒絶（５）のマーカとして広く使用されている。Ｃ４ｄの大部分は、古典的補体経路を最初に活性化した細胞の表面に結合したままであるが、ある部分は、放出され、血中において検出可能である。Ｃ４ｄ形成のスキームは、図１に示される。
【０００８】
いくつかの疾患の原因となる、Ｃ４ｄの役割、および古典的経路活性化を調査、および理解するために、Ｃ４ｄに対して特異的な試薬、特に抗体が求められている。本願は、その要求について取り組むものである。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、補体成分Ｃ４ｄに特異的に反応するが、補体成分Ｃ４ｂまたはＣ４には反応しない抗体であって、アミノ酸配列ＮＶＴＬＳＳＴＧＲ−ＣＯＯＨからなるエピトープを含むペプチドに反応し、アミノ酸配列ＮＶＴＬＳＳＴＧＲＮＧＦＫ−ＣＯＯＨを含むペプチドに反応しないエピトープに関する。
【００１０】
本発明は、そのような抗体を作製する方法であって、実質的にアミノ酸配列ＳＳＴＧＲ−ＣＯＯＨからなるペプチドが、抗原として使用される方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、試料中の補体成分Ｃ４ｄの検出方法であって、当該試料を本明細書に記載されたように抗体に接触させ、抗体とＣ４ｄとの間の結合が検出される検出方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、肺がん、ＳＬＥ、血管炎、および抗体媒介性移植片拒絶からなる群から選択される疾患の、診断または予後のための方法であって、本明細書に記載されたような抗体を、個体に由来する試料に接触させ、当該試料が、コントロール対象の試料と比較して、補体成分Ｃ４ｄの高いレベルを含む場合、前記個体が、前記疾患を、罹患または発症する高いリスクを有すると結論付ける方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、疾患活動性を監視するための方法であって、疾患が、疾患活性の再燃によって特徴付けられる方法を提供する。そのような疾患は、ＳＬＥ、血管炎、および抗体媒介性移植片拒絶からなる群から選択されてもよく、本明細書に記載されたような抗体を、個体に由来する試料に接触させ、当該試料中に存在するＣ４ｄレベルが経時的に監視される。
【００１４】
また、本発明は、疾患の処置の効率を決定するための方法を提供する。特に、疾患は、肺がん、ＳＬＥ、血管炎、および抗体媒介性移植片拒絶からなる群から選択される。そのような方法において、本明細書に記載されたような抗体を、処置の前後に個体から取得された試料に接触させ、処置後に取得された試料が、処置前に取得された試料におけるＣ４ｄレベルと比べて減少または低下したＣ４ｄレベルを有する場合、個体が処置に対して反応すると結論付けられる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
Ｃ４ｄに反応する抗体は、当該分野において公知であり、市販されている。しかしながら、Ｃ４ｄの存在についての診断試薬として有用であるためには、抗体が、補体活性化の結果として生じた遊離のＣ４ｄに特異的であることが不可避であり、このことは、当該抗体が、Ｃ４ｄのみを認識するが、Ｃ４ｂまたはＣ４を認識しないことを意味する。Ｃ４ｄは、Ｃ４ｂおよびＣ４の断片であるので、このことは、簡単な問題ではない。
【００１６】
活性化された補体タンパク質が、それらの親分子に存在しない特定の構造的エピトープを示すことが結論付けられた（６〜８）。そのようなエピトープは、多くの場合、ネオエピトープと表わされる。Ａ２５１抗体などの、Ｃ４ｄにおけるネオエピトープに対する抗体は、Quidel社（12544  High Bluff Drive, Suite 200、サンディエゴ、カルフォルニア、米国）から市販されており、Quidel Specialty Products社によって販売されている市販のMicroVue（商標）C4d EIAキットの基礎である。Quidel C4d MicroVue ELISAは、血清または血漿におけるＣ４ｄ断片の測定のための試験として、国際補体学会によって推奨されるアッセイである（９）。このアッセイは、捕捉抗体として抗Ｃ４ｄモノクローナル抗体A251に基づくものであり、検出抗体としてヤギポリクローナル抗体Ｃ４ｄを採用している。我々は、Ｃ４ｄに特異的に反応するA251抗体を試験し、当該抗体がＣ４およびＣ４ｂを認識することを見出した（実施例７、図２）。
【００１７】
Ｃ４ｄに対する抗体の他の代表的な例は、ヒト血漿から精製されたＣ４ｄに対して産生されたAb167093抗体（クローンLP69）である。この抗体は、Abcam社から市販されている（330 Cambridge Science Park、ケンブリッジ、CB4 0FL、英国）。我々は、Ｃ４ｄに特異的に向けられた抗体を試験し、当該抗体がＣ４およびＣ４ｂに交差反応することを明らかにした（実施例７、図３）。したがって、ヒト血漿から精製されたＣ４ｄは、Ｃ４ｄ特異的抗体を生成するために適したソースではないと考えられる。
【００１８】
Ｃ４ｄ特異的抗体を産生する他の手法は、抗原としてＣ４ｄの内部配列に由来する合成ペプチドの使用に依拠する。このグループの代表的な例は、ウサギモノクローナル抗体Ab136921、クローンA24-Tであり、Abcam社から市販されている。我々は、Ｃ４ｄに特異的に向けられたAb136921抗体を試験した。この抗体も、Ｃ４およびＣ４ｂに交差反応するようである（実施例７、図４）。
【００１９】
Ｃ４ｄに特異的に反応する他の抗体は、参考文献Ｎｏ．２０（Ａｌｉら）に記載されたウサギポリクローナル抗体１２〜５０００である。この抗体は、American Research products社から得られ、Ｃ４ｄに特異的に向けて試験された。この抗体も、Ｃ４およびＣ４ｂに交差反応するようである（実施例７、図１６）。
【００２０】
したがって、Ｃ４ｄに由来する内部ペプチドも、Ｃ４ｄ特異的抗体を得るために好適な抗原として使用することができないと考えられる。
【００２１】
疑わしいＣ４ｄ特異的抗体のさらなる種類は、Ｃ４ｄのＣ末端半分に由来するペプチドに対して産生された抗体である。我々は、そのような抗体の３つの代表例を試験した。Abcam社から市販のウサギモノクローナル抗体183311、クローンSP91も、Ｃ４ｄ対して特異的でないことが見出された。なぜなら、この抗体は、Ｃ４とＣ４ｂとに反応するからである（図５）。
【００２２】
我々は、Ｃ４ｄに由来するＣ末端ペプチドで免疫されたウサギに由来するポリクローナル抗体を試験した。この抗体（Abcam社から市販のAb58781）は、Ｃ４ｄに特異的ではない。なぜなら、この抗体は、Ｃ４とＣ４ｂとに反応するからである（図１７）。
【００２３】
また、我々は、Ｃ４ｄに由来するＣ末端ペプチドで免疫されたウサギに由来する別のポリクローナル抗体を試験した。この抗体（CPAMD2、カタログ番号AP15376PU-S、Acris社から市販）は、Ｃ４ｄに特異的ではない。なぜなら、この抗体は、Ｃ４とＣ４ｂとに反応するからである（図１８）。これらの結果は、Ｃ４ｄに由来するＣ末端ペプチドによる免疫化が、Ｃ４ｂおよび／またはＣ４に交差反応しない、Ｃ４ｄに特異的な抗体を得るための効果的な戦略ではないことも示している。
【００２４】
Ｃ４ｄに対して真に特異的な抗体を得るために、我々は、グリシン／システインスペーサに付着された、Ｃ４ｄのＮ末端、およびＣ末端配列に由来する５アミノ酸に対応するペプチドでウサギを免疫した（ペプチドあたりウサギ２匹）。このことは、実施例４に詳述される。免疫化に使用された２つのペプチドの配列は、
Ｎ末端  Ｃ４ｄ部分：ＮＨ２−ＴＬＥＩＰＧ−ＧＧＣ（配列番号１）
Ｃ末端  Ｃ４ｄ部分：ＣＧＧ−ＳＳＴＧＲ−ＣＯＯＨ（配列番号２）であった。
【００２５】
太い字体で示されたアミノ酸は、Ｃ４ｄアミノ酸配列の一部であり、グリシン残基、およびシステイン残基は、スペーサとして使用される。ウサギ♯１および♯２は、配列番号１に係るペプチドで免疫された。ウサギ♯３および♯４は、配列番号２に係るペプチドで免疫された。免疫化および採血は、Agrisera AB社（スウェーデン）によって行われ、集められた抗血清は、上記で使用されたような同一のアッセイにおいて、Ｃ４、Ｃ４ｂ、およびＣ４ｄに対する反応性についてＥＬＩＳＡで試験された。
【００２６】
配列ＳＳＴＧＲ−ＣＯＯＨを含むＣ末端ペプチドによって免疫された、ウサギ♯３および♯４の両方は、Ｃ４ｄに特異的な抗体を産生した。それらは、Ｃ４ｄに等しく良好に反応し、Ｃ４またはＣ４ｂに反応しなかった（ウサギ♯３に由来する抗体のみが図６に示されている）。Ｃ末端ペプチドＣＧＧＳＳＴＧＲ−ＣＯＯＨ（配列番号２）で免疫された、ウサギ♯３および♯４に由来する２つの血清は、同一の特異性を有するようであった。本明細書に記載された実験は、ウサギ♯３に由来する抗体で全て行われた。ウサギ♯４に由来する抗体が使用されたとき、それらは、同一の結果をもたらした。ウサギ♯３に由来する抗体は、さらに、本明細書において、ＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体として表わされた。配列ＮＨ２−ＴＬＥＩＰＧを含むＮ末端ペプチドで免疫された２匹のウサギ（♯１および♯２）に由来する抗体は、Ｃ４、Ｃ４ｂ、またはＣ４ｄに反応せず、廃棄された。
【００２７】
ＢＬＯＫ  Ｃ４ｄによって認識されるエピトープは、Ｃｙｓ−ＮＶＴＬＳＳＴＧＲ−ＣＯＯＨペプチド（配列番号３）に対するＢＬＯＫ  Ｃ４ｄの反応性と、Ｃｙｓ−ＮＶＴＬＳＳＴＧＲＮＧＦＫ−ＣＯＯＨペプチド（配列番号４）に対する反応性の欠如とによって示されるように、Ｃ４ｄの最終Ｃ末端に置かれた。
【００２８】
配列番号３は、遊離のカルボキシル基を有するＣ４ｄの最終Ｃ末端を表し、一方、配列番号４は、Ｃ４ｄおよびＣ４ｃのＣ末端の間の結合を表す（図１を参照）。したがって、ＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体は、Ｃ４ｄに特異的なエピトープであって、その前駆体Ｃ４ｂまたはＣ４に存在しない、Ｃ４ｄの最終Ｃ末端に存在するエピトープを認識すると結論付けられる。
【００２９】
上述された市販の抗Ｃ４ｄ抗体は、配列番号３および配列番号４に係るペプチドについてそれらの反応性を試験された。市販の抗体はいずれも、配列番号３または配列番号４に係るペプチドに反応しなかった。このことは、図７に図示される。
【００３０】
本発明は、したがって、アミノ酸配列ＮＶＴＬＳＳＴＧＲ−ＣＯＯＨからなるエピトープを含むペプチドに特異的に反応するが、アミノ酸配列ＮＶＴＬＳＳＴＧＲＮＧＦＫ−ＣＯＯＨを含むペプチドに反応しない抗体についての一態様に関する。そのような抗体は、Ｃ４ｄに特異的に反応し、Ｃ４またはＣ４ｂに反応しない。
【００３１】
表現「アミノ酸配列ＮＶＴＬＳＳＴＧＲ−ＣＯＯＨからなるエピトープを含むペプチドに特異的に反応するが、アミノ酸配列ＮＶＴＬＳＳＴＧＲＮＧＦＫ−ＣＯＯＨを含むペプチドに反応しない」は、抗体が、アミノ酸ＳＳＴＧＲと遊離のＣ末端アルギニン残基（Ｒ−ＣＯＯＨとして示された）とを含むＣ４ｄのＣ末端におけるエピトープに特異的に反応することを示すために、本明細書において使用される。さらに、アミノ酸配列ＮＶＴＬＳＳＴＧＲ−ＣＯＯＨからなるエピトープを含むペプチドに特異的に反応するが、４つのＣ末端アミノ酸（ＮＧＦＫ）の余分のストレッチによってのみ異なる同一のペプチド、すなわち、アミノ酸配列ＮＶＴＬＳＳＴＧＲＮＧＦＫ−ＣＯＯＨを含む同一のペプチドに反応しない。
【００３２】
さらに異なる用語において、本発明に係る抗体は、ペプチドＮＶＴＬＳＳＴＧＲ−ＣＯＯＨに含まれるエピトープに反応するが、ＮＶＴＬＳＳＧＲＮＧＦＫ−ＣＯＯＨに反応しない抗体として記載されてもよい。
【００３３】
別の態様において、本発明は、補体成分Ｃ４ｄに特異的に反応し、補体成分Ｃ４ｂに反応しない抗体であって、アミノ酸配列ＮＶＴＬＳＳＴＧＲ−ＣＯＯＨからなるエピトープを含むペプチドに反応し、アミノ酸配列ＮＶＴＬＳＳＴＧＲＮＧＦＫ−ＣＯＯＨを含むペプチドに反応しない抗体に関する。
【００３４】
そのような抗体は、当該技術分野において知られた従来の免疫化法を用いて作製されてもよい。好ましい実施形態において、そのような抗体は、ポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、それらの標的抗原に結合する高いアビジティおよび高いアフィニティについて知られている。別の好ましい実施形態において、本発明に係る抗体は、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、またはウサギモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体であってもよい。そのようなモノクローナル抗体は、無制限の供給で製造することができるのに、抗体の品質を保つという利点を有する。
【００３５】
本発明に係る抗体は、当該技術分野において知られた従来法によって得ることができ、実質的にアミノ酸配列ＳＳＴＧＲ−ＣＯＯＨからなるペプチドが免疫原として使用される。言い換えれば、本発明は、上述されたような抗体を産生する方法であって、実質的にアミノ酸配列ＳＳＴＧＲ−ＣＯＯＨからなるペプチドが免疫原として使用される方法に関する。本発明の他の態様は、したがって、そのような方法によって得ることができる抗体に関する。
【００３６】
産生された抗体は、したがって、従来技術の抗体に対して顕著な利点を有し、本明細書に記載されたような予期せぬ特性を示す。
【００３７】
Ａ２５１抗体が捕捉抗体として使用されているQuidelMicroVue（商標） C4d EIAキット(カタログ番号  Ａ００８)は、血清または血漿におけるＣ４ｄ断片の測定用の試験として国際補体学会によって推奨されている（６）。我々は、このアッセイが、多くの欠点および欠陥を抱えることを見出した。第１に、何度も凍結融解された試料で行われたとき、一貫性のない結果をもたらす。我々は、本明細書において、１２回凍結融解された２つの試料（♯１および♯８）を用いて得られた結果を示す。これらの試料は、凍結融解サイクルの数が増加するとともに増加するＣ４ｄレベルを示した（図８）。これらと同じ試料が、ＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体が捕捉抗体として使用されたサンドイッチアッセイにおいて分析されたとき、結果は、一貫しており、凍結融解サイクル数の増加とともに変化することはなかった（図９）。
【００３８】
市販のQuidelMicroVue（商標）C4d EIAキットの別の欠陥は、熱不活性化された血清を使用することができないことである。正常ヒト血清（ＮＨＳ）が熱不活性化の前後で試験されたとき、Quidelアッセイは、非常に多くの偽陽性反応を生じたが、一方、ＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体を用いるサンドイッチアッセイでは、生じなかった（図１０）。
【００３９】
また、図１０に示されるデータは、ＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体を採用するアッセイが、非常に高い、従って良好な信号対雑音比を有するが、一方、QuidelMicroVue（商標）アッセイは、信号対雑音比１０をもたらし（高標準物質／低標準物質）、捕捉抗体としてＢＬＯＫ  Ｃ４ｄを採用するサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイは、同一の高標準物質および低標準物質が使用されたとき、信号対雑音比３００をもたらした。
【００４０】
本発明に係る抗体は、したがって、Ｃ４ｄの検出のための改良アッセイの製造を可能にする。また、本発明は、したがって、試料中の補体成分Ｃ４ｄのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法であって、当該試料を、上述のように抗体に接触させ、抗体とＣ４ｄとの間の結合が検出される検出方法に関する。
【００４１】
有利な実施形態において、本発明は、上述のような方法であって、試料が、血液試料、血清試料、血漿試料、滑液試料、または液体試料である方法に関する。本発明に従った方法は、臨床研究に由来する保存試料を用いる場合にはよくあることであるが、試料を、複数回にわたって熱不活性化または融解するとき、特に良好な結果をもたらすことができる。
【００４２】
本発明に従った抗体は、多くの免疫学的アッセイフォーマットにおいて使用可能である。ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ、および免疫組織化学におけるその使用が特に好ましい。
【００４３】
さらに、我々は、リツキシマブを用いる処置を行われた白血病患者における古典的補体経路の活性化の評価を試みた。リツキシマブは、ＣＤ２０を保有するがん細胞に結合したとき、Ｃ１複合体に結合し、古典的経路を直接に活性化する。
【００４４】
我々は、リツキシマブの注入の前後に得られた試料中のＣ４ｄのレベルを測定した。また、我々は、古典的経路の活性化のさらなる下流マーカである終末補体複合体（ＴＣＣ）のレベルを測定した。
【００４５】
ＴＣＣは、以下のように生じる。Ｃ３コンバターゼは、Ｃ３ｂを生じるＣ３を活性化し、Ｃ３ｂは、続いて、その特異性を変化するＣ３コンバターゼに結合し、Ｃ５コンバターゼとなる。この酵素複合体は、Ｃ５をＣ５ｂに活性化し、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、およびＣ９と相互作用して、細胞膜に入り、細胞死をもたらすＴＣＣを形成する。Ｃ５ｂ−９複合体のいくらかは、溶液中に残り、ＥＬＩＳＡによって測定可能である（１０）。
【００４６】
リツキシマブなどの分子が古典的経路を活性化するとき、当業者は、生成された、Ｃ４ｄ（経路の初期）およびＴＣＣ（経路の最後）の間の相関を予期することができるであろう。
【００４７】
血漿試料は、ストックホルムのカロリンスカ大学病院からの、抗ＣＤ２０ｍＡｂ（リツキシマブ（商標））で処置された、非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者から得られた。試料は、リツキシマブ未処置の患者からのみ集められた。我々は、リツキシマブ注入の直前および直後に集められた１１人の患者に由来する試料を得、ＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体を採用する本発明に従ったＣ４ｄ  ＥＬＩＳＡにおいて、およびQuidel社のC4dMicroVue（商標）アッセイにおいてそれらを試験した。リツキシマブ処置の前後における、試料中のＣ４ｄレベルの増加は、両方のアッセイについて測定され、終末補体複合体（ＴＣＣ）のレベルと比較された。
【００４８】
図１１および図１２は、それぞれ２つのＣ４ｄ  ＥＬＩＳＡにおいて測定されたようにＣ４ｄの増加が示され、ＴＣＣ  ＥＬＩＳＡを用いて得られた結果に対してプロットされた。  我々は、本発明に従ったＣ４ｄ  ＥＬＩＳＡにおいて得られたデータが、ＴＣＣアッセイとよく相関し（スペアマン  ｒ＝０．８８，ｐ＝０．０００７，図１１）、一方、Quidelアッセイを用いて得られたＣ４ｄデータは、ＴＣＣデータと相関しなかった（スペアマン  ｒ＝−０．２９，ｐ＝０．３８，図１２）。
【００４９】
我々は、本発明に従った抗体および方法は、従来技術の抗体および方法よりも生物学的な試料においてＣ４ｄを検出するために適していると結論付ける。
【００５０】
補体成分Ｃ４ｄは、最近、ＳＬＥ、抗体媒介移植片拒絶、関節リウマチ、血管炎、腎炎、抗リン脂質症候群、強皮症、シェーグレン症候群、筋炎、肺がん、および血液腫瘍などの多くの疾患の診断および予後マーカとして記載された。
【００５１】
全身エリテマトーデスは、複雑な病因を有し、多臓器が関与する慢性の自己免疫疾患である。補体の清掃機能は、感染しやすいので、ＳＬＥの病状が補体系における欠陥に関係するとの証拠が存在する。（Pickering et al., 2000）。他方、本体が、ＳＬＥの経過の間に処分されない自己抗原は、補体活性化の潜在能力を保持しており、それによって疾患を悪化させる（Leffler et al., 2012）。
【００５２】
ＳＬＥは、再燃と名付けられた悪化した臨床症状の繰り返し期間と、寛解と称される疾患度が低下した期間とによって特徴付けられる。ＳＬＥについての根治的治療は存在しないので、治療的介入の目的は、再燃症状を和らげることによって臓器損傷を最小化することである。補体Ｃ３タンパク質および補体Ｃ４タンパク質の総レベルの測定を含む、バイオマーカの大規模なアレイは、ＳＬＥを診断し、監視するために使用されるが、それらは、再燃の予測において信頼性がない。
【００５３】
我々は、したがって、本発明に従った抗体および方法がＳＬＥの再燃を予測可能であるか否かを検討し、ＳＬＥ患者が前記疾患の再燃を経験したか否かを、実際に予測し、正確に決定することが可能であることを見出した。これらの実験は、実施例１２に記載されている。
【００５４】
本発明は、したがって、請求項１〜４、または６のいずれか１項に従った抗体が、個体に由来する試料に接触させられる、全身エリテマトーデスの個体の臨床状態を監視するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。そのような監視は、疾患活動性における再燃を、予測または診断することを含んでもよい。
【００５５】
本発明者らは、本発明に従った抗体が、Ｃ４ｄについて、より正確で、特異的なアッセイを可能にし、本発明に従った抗体は、ＳＬＥ、抗体媒介移植片拒絶、関節リウマチ、強皮病、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、血管炎、腎炎、抗リン脂質症候群、シェーグレン症候群、筋炎、肺がん、および血液腫瘍からなる群から選択された疾患の、診断または予後のための方法において有利に使用されてもよく、本発明に従った抗体を、個体に由来する試料に接触させ、当該試料が、所定の参照値と比較して、補体成分Ｃ４ｄの高いレベルを含む場合、個体が、前記疾患に罹患するか、または発症する高いリスクを有すると結論付けることを確立した。当業者は、たとえば、コントロール対象の試料に由来する参照値を得るための様々な方法を十分に把握している。
【００５６】
また、本発明は、疾患活動性を監視するための方法であって、疾患が疾患活動性の再燃によって特徴付けられる方法を提供する。そのような疾患は、ＳＬＥ、血管炎、および抗体媒介性移植片拒絶からなる群から選択されてもよく、本明細書に記載されたような抗体を、個体に由来する試料に接触させ、試料中に存在するＣ４ｄのレベルが、経時的に監視される。
【００５７】
また、本発明は、疾患の処置の効率を決定するための方法を提供する。特に、疾患は、肺がん、血液腫瘍、ＳＬＥ、血管炎、および抗体媒介性移植片拒絶からなる群から選択される。処置の効率の決定は、様々な方法で行われてもよい。たとえば、血液腫瘍のための処置は、腫瘍細胞が、補体によって死滅するように、作動機構として補体を使用する。したがって、薬剤に対する臨床応答は、補体活性化と、結果的により高いＣ４ｄとに付随する。上述されたような、多くの他の疾患において、高レベルのＣ４ｄは、病気、自発的な補体活性化の印であり、処置は、標的における補体活性化の除去を後にもたらす、病原性因子の除去を目的とする。そのような方法においては、本明細書に記載されたような抗体を、処置の前後に個体から取得された試料に接触させ、処置後に取得された試料が、処置前に取得された試料におけるＣ４ｄレベルに比べて、Ｃ４ｄの減少または低下したレベルを有する場合、個体が処置に反応すると結論付けられる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】Ｃ４ｃおよびＣ４ｄへの補体成分Ｃ４ｂの処理。
【図２】固定化された補体成分Ｃ４、Ｃ４ｂ、およびＣ４ｄに対するマウスモノクローナル抗体A251（Quidel社）の反応性。
【図３】固定化された補体成分Ｃ４、Ｃ４ｂ、およびＣ４ｄに対するマウスモノクローナル抗体LP69（Abcam社）の反応性。
【図４】固定化された補体成分Ｃ４、Ｃ４ｂ、およびＣ４ｄに対するウサギモノクローナル抗体A24-T（Abcam社）の反応性。
【図５】固定化された補体成分Ｃ４、Ｃ４ｂ、およびＣ４ｄに対するウサギモノクローナル抗体SP91（Abcam社）の反応性。
【図６】固定化された補体成分Ｃ４、Ｃ４ｂ、およびＣ４ｄに対する、Ｃ４ｄのＣ末端エピトープＳＳＴＧＲ−ＣＯＯＨを含むペプチドを用いて免疫されたウサギ♯３に由来する血漿の反応性。ウサギ♯４に由来する血清は、同一の結果をもたらし、血清♯３および♯４は、抗体ＢＬＯＫ  Ｃ４ｄを形成するために組み合わせられた。
【図７】Ｃ４ｄに含まれるペプチドＮＶＴＳＳＴＧＲ−ＣＯＯＨに対するＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体の特異的反応と、Ｃ４ｂにおいてのみ生じるペプチドＮＶＴＳＳＴＧＲＮＧＦＫに対する反応性の欠如とを示すグラフである。
【図８】凍結／融解サイクル数の増加とともにQuidelMicroVue（商標）C4d ELISAの反応性を示すグラフである。
【図９】凍結／融解サイクル数の増加とともに、ＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体を採用するサンドイッチＥＬＩＳＡの反応性を示すグラフである。
【図１０】QuidelMicroVue（商標）アッセイと、ＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体を採用するサンドイッチＥＬＩＳＡとの結果の比較を示すグラフである。低標準物質、および高標準物質（それぞれ０および２４２ｎｇ／ｍｌ）と、正常ヒト血清（ＮＨＳ）と、熱不活性化された正常ヒト血清とが試験された。
【図１１】リツキシマブ（商標）で処置された１１人の白血病患者における、ＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ  ＥＬＩＳＡの結果と、ＴＣＣ  ＥＬＩＳＡの結果との相関を示すグラフである。
【図１２】リツキシマブ（商標）で処置された１１人の白血病患者における、QuidelMicroVue（商標）C4d ELISAの結果と、ＴＣＣ  ＥＬＩＳＡの結果との相関を示すグラフである。
【図１３】Ｉ因子阻害抗体の量の増加（０、０．５、１、および２マイクロリットル）にともなう、ＩｇＧ活性化された正常ヒト血清に対するＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体の反応性を示すグラフである。
【図１４】ＳＬＥの患者に由来する血清におけるＣ４ｄレベルが、疾患の寛解および再燃時において取得された。同一の血清におけるＣ３およびＣ４のレベルが、比較のために示される。
【図１５】同一の患者から得られる再燃−寛解の組み合わせによる、ＳＬＥの患者に由来する血清におけるＣ４ｄレベルの比較。
【図１６】固定化された補体成分Ｃ４、Ｃ４ｂ、およびＣ４ｄに対するAmerican research products社のウサギポリクローナル抗体１２〜５０００の反応性。
【図１７】固定化された補体成分Ｃ４、Ｃ４ｂ、およびＣ４ｄに対するAbcam社のウサギポリクローナル抗体58781の反応性。
【図１８】固定化された補体成分Ｃ４、Ｃ４ｂ、およびＣ４ｄに対するAcris社のウサギポリクローナル抗体15376  カタログ番号AP15376PU-Sの反応性。
【図１９】選択された患者の血清に対するＢＬＯＫＣ４ｄ抗体の反応性。
【実施例】
【００５９】
実施例１：Ｃ４ｄタンパク質の作製
２００マイクログラム／ｍｌのＣ４ｂ溶液（Complement Technology社4801 Troup Hwy, Suite 701、タイラー、テキサス、75703  米国、カタログ番号A108、ロット#5C）を、２０マイクログラム／ｍｌの血漿精製Ｉ因子と混合し（１１）、ｐＨ８．０  Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水で５０マイクロリットルの最終体積の、４００マイクログラム／ｍｌの血漿精製Ｃ４ＢＰ（１２）は、３７℃で５時間にわたってインキュベートされた。
【００６０】
実施例２：Ｃ４と、その断片Ｃ４ｂおよびＣ４ｄとを用いるＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレート（Maxisorp、Nunc社）を室温（ＲＴ）で一晩コートした。実施例１に記載されたように取得した、ＰＢＳ中の５マイクログラム／ｍｌのＣ４溶液（Complement technology社、カタログ番号A105、ロット#22a）、またはＣ４ｂ（Complement Technology社、カタログ番号A108、ロット#5C）、もしくはＣ４ｄ調製物の５０マイクロリットルを各ウェルに添加した。マイクロタイタープレートは、続いて洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で洗浄され、ＲＴで２時間にわたって、２００マイクロリットルのブロッキング緩衝液（洗浄緩衝液中の１％ＢＳＡ）を用いてブロッキングされた。５０マイクロリットルのブロッキング緩衝液中に１：１０００で希釈された、血清または精製された抗体を、１時間にわたって添加し、ＲＴでインキュベートし、続いて洗浄し、同じブロッキング緩衝液中に希釈された５０マイクロリットルのヤギ抗ウサギ−ＨＲＰ抗体（Dako社）を用いてインキュベートした。最終的な洗浄後、５０マイクロリットルの標準ＯＰＤタブレット溶液（Dako社、製造者の指示書に従って作製した）をウェルに添加し、十分な色が得られると直ちに０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を用いて発色反応を停止した。吸光度は、マイクロプレートリーダ（Varian社）において４９０ｎｍで測定された。
【００６１】
実施例３：ウサギの免疫
我々は、グリシン／システインスペーサで伸長されたＣ４ｄのＮ末端およびＣ末端配列からの５アミノ酸に対応するペプチドを用いてウサギ（ペプチドあたりウサギ２匹）を免疫した。免疫に使用された２つのペプチドの配列は、Ｎ末端Ｃ４ｄ部分：ＮＨ２−ＴＬＥＩＰＧＧＧＣ（配列番号１）、およびＣ末端Ｃ４ｄ部分：ＣＧＧＳＳＴＧＲ−ＣＯＯＨ（配列番号２）であった。
【００６２】
ペプチドは、Innovagen AB社（スウェーデン）によって、標準のＦ−ｍｏｃ化学を用いて合成された。ペプチドは、続いてキーホールリンペットヘモシアニンに結合された。免疫は、Agrisera AB社の標準的なプロトコールに従って行われた。簡潔には、ウサギは、ｔ＝０において、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）中の２００マイクログラムのペプチドを用いて免疫され、続いて、ｔ＝２７日目において、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）中の２００マイクログラムのペプチドの２回の追加免疫を注入され、ｔ＝５４およびｔ＝８１日目において、ＦＩＡ中の１００マイクログラムのペプチドの２回の追加免疫を注入された。動物は、ｔ＝９２日において、採血され、屠殺された。Ｃ末端ペプチドを用いて免疫された２匹のウサギに由来する血清は、特異性の点で同様であり、ＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体として明細書において言及される。
【００６３】
実施例４  ＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体の特異性
我々は、Ｃ４ｄの形成が、Ｉ因子（ヒトＩ因子（♯１）に対するマウスモノクローナル抗体  Quidel Corp社  米国）に対する抗体によって阻害された試料に対するその反応性を決定することによってＢＬＯＫ  Ｃ４ｄの特異性を確かめた。補体因子Ｉ（ｆＩ）は、補体系のタンパク質であり、モルモット血清において１９６６年に最初に単離され（１４）、細胞に結合した、または液相のＣ３ｂおよびＣ４ｂを切断することによって補体活性化を制御する（１５）。Ｉ因子が阻害されたとき、Ｃ４ｂに由来するＣ４ｄの形成は、阻害される。
【００６４】
２マイクロリットルの正常ヒト血清は、０、０．５、１、および２マイクロリットルのＩ因子抗体（１、２ｍｇ／ｍｌ）と混合され、５分間氷上でインキュベートされた。２マイクロリットルの熱凝集ＩｇＧ（１０ｍｇ／ｍｌ）は、１ｍＭ  ＣａおよびＭｇを含む２５マイクロリットルのＰＢＳと混合され、３７℃で４５分間にわたってインキュベートされた。混合物は、続いて４０ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＧＶＢ緩衝液を用いて３００マイクロリットルまで希釈された。５０マイクロリットルのこの調製物は、実施例６に従って作製されたマイクロＥＬＩＳＡプレートのウェル毎に使用された。
【００６５】
試料のＣ４ｄレベルは、抗体を阻害するＩ因子の量の増加とともに減少することが観察された（図１３）。
【００６６】
我々は、ＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体が、Ｃ４ｄに特異的であると結論付けた。なぜなら、ＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体は、Ｃ４ｄを除く、古典的補体経路の全ての成分を含む試料に対して全く反応性を示さなかったからである。
【００６７】
熱不活性化されたヒト血清を用いて行われたコントロール実験は、全くシグナルを示さなかったが、Ｉ因子に対する抗体が、等量のコントロール抗体（タンパク質Ｓに対するＭＫ５４）によって置き換えられた試料において１００％のシグナルが得られた。
【００６８】
実施例５  試薬の作製
熱不活性化された正常ヒト血清（ＮＨＳ）は、成分を不活性化するために５６℃で６０分間にわたってＮＨＳをインキュベートすることによって作製された。
【００６９】
熱凝集ＩｇＧは、ＰＢＳ中の１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ溶液（Immuno社、オーストリア）を６３℃で３０分間にわたって加熱することによって作製された。１５．０００×Ｇで５分間の遠心分離後、ペレットは、廃棄された。
【００７０】
標準物質は、２マイクロリットルのＮＨＳと２マイクロリットルの熱凝集ＩｇＧ（１０ｍｇ／ｍｌ）とを混合することによって作製され、１ｍＭ  ＣａおよびＭｇを含むＰＢＳ緩衝液を用いて２５マイクロリットルまで希釈され、３７℃で１時間にわたってインキュベートされた。混合物は、続いて４０ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＧＶＢ（２．０７５ｍＭ  ベロナール緩衝液  ｐＨ７．３、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０８３％  ゼラチン、１１６ｍＭ  グルコース、６０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて２００マイクロリットルまで希釈された。５０マイクロリットルのそのような試料は、ＥＬＩＳＡウェル毎に入れられ、Ｃ４ｄの１任意単位（ＡＵ）を含むと規定されたが、この標準物質の連続希釈液は、標準曲線を満たした。緩衝液のみ（４０ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＧＶＢ）を、０値とした。
【００７１】
実施例６  Ｃ４ｄ捕捉アッセイ
Maxisorp９６ウェルプレート（Nunc社）は、０．０２％アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍ  炭酸塩緩衝液  ｐＨ９．６中に１０倍希釈された５０マイクロリットルのＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体を用いて一晩コートされた。マイクロタイタープレートは、３７℃で１時間にわたって２００マイクロリットルのブロッキング緩衝液（洗浄緩衝液中の３％  フィッシュゼラチン（Nordic社））を用いてブロッキングされた。洗浄後、５０マイクロリットルの試料が入れられ、３７℃で１時間にわたってインキュベートされた。洗浄後、５０マイクロリットルの検出抗体（抗Ｃ４ｄマウスモノクローナル、Quidel社、#A213、ブロッキング緩衝液中に１：１５００で希釈された）は、後続の別の洗浄サイクルを適用され、５０マイクロリットルのヤギ抗マウスＨＲＰ（Dako社）は、ブロッキング緩衝液中に１：１０００で希釈された。５０マイクロリットルの標準ＯＰＤタブレット溶液（Dako社、製造者の指示書に従って作製された）は、ウェルに添加され、発色反応は、十分な色が得られると、０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を用いて停止された。吸光度は、マイクロプレートリーダにおいて４９０ｎｍで測定された。コントロール実験は、実施例１１に記載されたようにアフィニティ精製された抗体を用いて行われ、３．５マイクログラム／ｍｌ  ＩｇＧの最終濃度まで希釈された。アフィニティ精製された抗体は、ＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体と同一の結果をもたらした。
【００７２】
実施例７  市販の抗Ｃ４ｄ抗体およびＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体の反応性
本明細書において使用された市販の抗体は、Quidel社のA251、ロット番号910499、Abcam社のクローンLP69、製造番号ab167093、ロット番号GR126509-6、Abcam社のクローンA24-T、製造番号ab136921、ロット番号GR161597-2、Abcam社のクローンSP91、製造番号ab183311、ロット番号GR181800-1、American Research Products社のウサギポリクローナル抗C4d12-5000、ロット番号41200、Abcam社のウサギポリクローナル抗C4d 58781、ロット番号GR173176-3、およびAcris社のウサギポリクローナル抗C4d Ab CPAMD2、カタログ番号AP15376PU-S、ロット番号130618MCであった。
【００７３】
ＥＬＩＳＡアッセイは、実施例２に詳述されたように準備され、実施された。全ての抗体は、１：５０に希釈された抗体SP91と、製造者によって予め希釈された既製のAbcam社のウサギポリクローナル抗C4d  抗C4d  58781とを除いて、１０マイクログラム／ｍｌで試験された。
【００７４】
ブロッキング緩衝液中に好適に希釈された抗体（５０マイクロリットル）は、３７℃で１時間にわたってインキュベートされ、洗浄後、５０マイクロリットルの二次抗体（A24-T、SP91、およびＢＬＯＫ  Ｃ４ｄに対する１：１０００に希釈されたDako社のヤギ抗ウサギＨＲＰ、またはLP69およびA251に対する１：１０００に希釈されたDako社のヤギ抗マウスＨＲＰ）を用いて１時間にわたってインキュベートされた。最後の洗浄後、５０マイクロリットルの標準ＯＰＤタブレット溶液（Dako社、製造者の指示書に従って作製された）は、ウェルに添加され、発色反応は、十分な色が得られると、０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を用いて停止された。吸光度は、マイクロプレートリーダで４９０ｎｍにおいて測定された。最終結果は、ネガティブコントロールの読み取り値（一次Ａｂが添加されないとき、４９０ｎｍにおける測定値）を減算することによって計算された。結果は、図２〜図６、および図１６〜図１８に示される。
【００７５】
実施例８  ペプチドＥＬＩＳＡ
Ｃ末端Ｃ４ｄ部分についてのＥＬＩＳＡは、配列Ｃｙｓ−ＮＶＴＬＳＳＴＧＲ−ＣＯＯＨ（配列番号３）、またはＣｙｓ−ＮＶＴＬＳＳＴＧＲＮＧＦＫ（配列番号４）を有するペプチドを５０マイクログラム／ｍｌ含む５０マイクロリットルのＰＢＳを用いて、Maxisorpプレート（Nunc社）を３７℃で１時間にわたってコーティングすることによって作製された。
【００７６】
マイクロタイタープレートは、続いて洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ ２０）を用いて洗浄され、２００マイクロリットルのブロッキング緩衝液（洗浄緩衝液中に１％ＢＳＡ）を用いてＲＴで２時間にわたってブロックキングされた。ブロッキング緩衝液中に希釈された抗体（５０マイクロリットル）は、３７℃で１時間にわたってインキュベートされ、続いて洗浄され、５０マイクロリットルの二次抗体（A24-T、SP91、およびＢＬＯＫ  Ｃ４ｄに対するDako社の１：１０００希釈されたヤギ抗ウサギ−ＨＲＰ、またはLP69およびA251に対する１：１０００希釈されたDako社のヤギ抗マウスＨＲＰ）を用いて１時間インキュベートされた。最後の洗浄後、５０マイクロリットルの標準ＯＰＤタブレット溶液（Dako社、製造者の指示書に従って作製された）は、ウェルに添加され、発色反応は、十分な色が得られれば、０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を用いて停止された。吸光度は、マイクロプレートリーダにおいて４９０ｎｍで測定された。最終結果は、ネガティブコントロール（一次Ａｂが添加されないとき、４９０ｎｍにおける測定値）についての読み取り値の減算によって計算された。
【００７７】
実施例９  白血病／リンパ腫患者群
非ホジキンリンパ腫、または慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の患者は、スウェーデン、ストックホルムのカロリンスカ大学病院にて診断され、Anders Osterborg教授によって扱われた。リツキシマブ処置（単一薬治療として、または化学療法計画ととともに）に認定された患者に由来するＥＤＴＡ血漿試料は、標準的な薬用量（３７５ｍｇ／ｍ２）の薬剤の第１注入の直後および直前に採取された。
【００７８】
血漿試料のいくつかは、凍結融解サイクルを通じてＣ４ｄの読み取り値の安定性のために試験された。この目的のために、それらは、１０マイクロリットルに分割され、続いて−８０℃で凍結され、液体状態になるまでＲＴで融解された。凍結融解は、所望のサイクル数に従って繰り返された。
【００７９】
実施例１０  ＴＣＣアッセイ
ＴＣＣアッセイは、以前に記載されたように（１３）、捕捉抗体として、抗Ｃ９−ネオエピトープ抗体、クローンae11、検出抗体として、ビオチン化抗Ｃ６モノクローナル抗体、クローン9C4を用いて実施された。０．０２％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中に希釈されたウェルあたり１００マイクロリットルの捕捉抗体を、Maxisorpプレート（Nunc社）にＲＴで一晩固定化した。二次抗体の検出は、ウェルあたり１００マイクロリットルのストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（R&D社、米国）を用いて実施され、その後、アッセイは、ＯＰＤタブレット（Dako社）を用いて開発され、４９０ｎｍにおける吸光度が測定された。
【００８０】
実施例１１  ＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体のアフィニティ精製
特異性および感受性の点で優れた結果が提供されたという事実があるものの、抗体は、本明細書に開示されたように、ペプチドを用いるアフィニティ精製によってさらに精製されてもよい。特に有利な方法は、以下の通りである。
【００８１】
３ｍｌのウサギ♯３に由来するＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗血清は、アフィニティクロマトグラフィーを用いてＣ４ｄ特異的な抗体を精製するために使用された。Sulpholinkビーズ（１０ｍｌのビーズ、Thermo Scientific社）は、製造者のプロトコールに従って、１２ｍｇの配列番号３（GenScript社、米国）に従ったペプチドを用いてコンジュゲートされた。カラムは、ＰＢＳ緩衝液を用いて平衡化され、抗血清試料が入れられた。ＰＢＳを用いる洗浄後、ペプチド結合画分は、０．１Ｍ  グリシン  ｐＨ２．５を用いて溶出され、直ちに１／１０体積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を用いて中和された。溶出液の中和画分は、配列番号４に従ったペプチド（GenScript社、米国）にコンジュゲートされた別のSulpholinkカラムに入れられた。このカラムは、Ｃ４ｄ−Ｃ４ｃ境界エピトープ（もしあれば）に潜在的に結合可能であるので、Ｃ４ｄに特異的ではない抗体のネガティブ選別に使用される。未結合画分は、集められ、ＰＢＳ緩衝液に対して透析され、１０ｋＤａのカットオフ装置（Vivaspin、米国）を用いて濃縮された。
【００８２】
実施例１２  ＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体は、ＳＬＥの再燃を予測および診断する。
４つ以上のアメリカ関節リウマチ学会の分類基準（Tan et al., 1982）を満たす９８人のＳＬＥ患者は、本試験に含まれる。患者に由来する血漿は、１９８４年〜２００９年までスウェーデンのルンド大学のリウマチ科において集められた。２つの時点に由来する試料が選択された。１つの時点は、患者が最も高いＳＬＥ疾患活動性インデックス２０００（SLEDAI-2K, Gladmann, D., et al., J. Rheumatol (2002) 29: 288-291）を有するときであり、これは、「再燃」と定義され、別の時点は、患者が経験を積んだ熟練医によって評価される最も低い疾患活動性を有するときであり、「寛解」と定義される。
【００８３】
日常の実験室分析によるデータセット（Ｃ３およびＣ４の測定値など）は、全ての試料について利用可能であった。７７人の健常ドナーに由来する血漿試料は、コントロールとして含まれた。Ｃ４ｄレベルは、実施例６に記載されたようなＢＬＯＫ抗体に基づくＣ４ｄ  ＥＬＩＳＡを用いて、患者とコントロールとにおいて測定された。Quidel C4d MicroVueキットの精製されたＣ４ｄの希釈液は、標準物質として使用された。
【００８４】
全ての患者が分析に入れられたとき、総Ｃ３およびＣ４レベルにおける相違（ｐ＝０．０６３および０．２０６５、ｎ．ｓ．）とは対照的に、再燃および寛解のＣ４ｄレベルの間で高い有意差が検出可能であった（図１４、マンホイットニー検定ｔによって、ｐ＝０．０００５、***）。
【００８５】
ウィルコクソン符号順位検定（同一の患者から得られた再燃−寛解の対合が考慮された）が、同一のデータセットにおいて実施されたとき、再燃と寛解とのＣ４ｄレベルの間において高い有意差を検出可能であった（図１５、ｐ＝＜０．０００１  ***）。これに対して、Ｃ３レベルは、寛解に比べて再燃の間にわずかに減少し、非常に低いレベルにおいて顕著になった（ｐ＝０．０２７５  *）。Ｃ４レベルは、全く有意差を示さなかった（ｐ＝０．１０８５、ｎ．ｓ．）。
【００８６】
本発明者らは、分析が、全コホートについて、または個々の患者からの結果に組み合わせて実施されるとき、本発明に従ったＣ４ｄ抗体および方法が、ＳＬＥ再燃を寛解から顕著に（ｐ＜０．０５）識別可能である改良アッセイをもたらすと結論付けた。
【００８７】
実施例１３  ＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体は、関節リウマチ、強皮症、乾癬性関節炎、および強直性脊椎炎の患者を健常コントロールから識別する。
試料は、関節リウマチ、強皮症、乾癬性関節炎、または強直性脊椎炎に罹患した２０人の個体から得られた。２０人の健常な個人の集団は、コントロールとして機能する。これらの血清は、本明細書に記載されたようにＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ  ＥＬＩＳＡにおいて試験された。我々は、ＢＬＯＫ  Ｃ４ｄ抗体が、患者群を通常のコントロールから識別することができることを見出した（表１および図１９）。
【表１】
0006438573.tif 000002
【００８８】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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