(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１ないし配列番号６のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるデコイペプチドまたはポリペプチドであって、
前記デコイペプチドまたはポリペプチドは、競争的阻害によってＰＬＢ（ホスホランバン）のＰＰ１（プロテインホスファターゼ１）媒介の脱リン酸化を抑制するデコイペプチドまたはポリペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号１ないし配列番号６のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と、細胞膜透過性ペプチドとからなるデコイペプチドまたはポリペプチドであって、
前記配列表の配列番号１ないし配列番号６のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と、前記細胞膜透過性ペプチドとが結合されており、
前記デコイペプチドまたはポリペプチドは、競争的阻害によってＰＬＢ（ホスホランバン）のＰＰ１（プロテインホスファターゼ１）媒介の脱リン酸化を抑制するデコイペプチドまたはポリペプチド。
【請求項３】
前記配列表の配列番号１ないし配列番号６のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列は、ジスルフィド結合によって前記細胞膜透過性ペプチドに結合されていることを特徴とする請求項２に記載のデコイペプチドまたはポリペプチド。
【請求項４】
下記一般式Ｉで表されるペプチド配列からなるデコイペプチドまたはポリペプチド：
Ｘ１−Ａｌａ−Ｘ２−Ｘ３−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ４ （Ｉ）
前記Ｘ１は、存在しないまたはＡｒｇを示し、前記Ｘ２は、Ｓｅｒ、ＧｌｕまたはＡｓｐを示し、前記Ｘ３は、ＴｈｒまたはＧｌｕを示し、前記Ｘ４は、存在しない、Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−ＰｒｏまたはＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎを示し、前記Ｘ３がＴｈｒの場合、Ｘ２はＳｅｒではなく；
前記デコイペプチドまたはポリペプチドは、競争的阻害によってＰＬＢ（ホスホランバン）のＰＰ１（プロテインホスファターゼ１）媒介の脱リン酸化を抑制する。
【請求項５】
下記一般式Ｉで表されるペプチド配列と、細胞膜透過性ペプチドとからなるデコイペプチドまたはポリペプチド：
Ｘ１−Ａｌａ−Ｘ２−Ｘ３−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ４ （Ｉ）
前記Ｘ１は、存在しないまたはＡｒｇを示し、前記Ｘ２は、Ｓｅｒ、ＧｌｕまたはＡｓｐを示し、前記Ｘ３は、ＴｈｒまたはＧｌｕを示し、前記Ｘ４は、存在しない、Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−ＰｒｏまたはＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎを示し、前記Ｘ３がＴｈｒの場合、Ｘ２はＳｅｒではなく；
前記一般式Ｉで表されるペプチド配列と、前記細胞膜透過性ペプチドとが結合されており、
前記デコイペプチドまたはポリペプチドは、競争的阻害によってＰＬＢ（ホスホランバン）のＰＰ１（プロテインホスファターゼ１）媒介の脱リン酸化を抑制する。
【請求項６】
（ａ）請求項１から５のいずれかに記載のデコイペプチドまたはポリペプチドの薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含むＰＬＢ関連疾病の予防または治療用の薬剤学的組成物。
【請求項７】
前記ＰＬＢ関連疾病は、心臓疾患であることを特徴とする請求項６に記載の薬剤学的組成物。
【請求項８】
前記心臓疾患は、心不全、虚血、不整脈、心筋梗塞、うっ血性心不全、移植拒絶、異常な心臓収縮または異常なＣａ２＋代謝であることを特徴とする請求項７に記載の薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照文献
本出願は、２０１２年７月５日に出願された米国仮特許出願ＵＳ  ６１／６６８，０３４から優先権主張を伴い、上記仮特許出願に開示された内容は、本明細書に参照により組み込まれる。
公共基金研究に関する陳述
本発明は、大韓民国政府（ＭＥＳＴ）によって出資されたグローバル研究室プログラム（Ｍ６−０６０５−００−０００１）、ＧＩＳＴのＳｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  Ｇｒａｎｔ、及びＮＩＨ（ＨＬ−０８０４９８−１）の後援を受けた。
本発明は、プロテインホスファターゼ１媒介のホスホランバンの脱リン酸化を抑制することができるホスホランバンのデコイペプチドまたはポリペプチド、その用途及び製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心不全（Ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）は、全世界的に死亡率及び罹病率の主な原因として残っている［１−３］。心不全の特徴は、心臓の心室腔サイズの増加及び心臓収縮機能の減少である。従来の研究は、心臓収縮の異常が心不全の開始及び進行を引き起こすという考えを裏付ける［４−６］。細胞内のＣａ２＋サイクリング（ｃｙｌｃｌｉｎｇ）は、心筋細胞の収縮性を直接に調節する［７、８］。少量の細胞外Ｃａ２＋が電圧依存的なＬ型のＣａ２＋チャネルを通じて心筋細胞に流入され、その後リアノジン受容体（ＲｙＲ：ｒｙａｎｏｄｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を通じて筋小胞体（ＳＲ：ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）からＣａ２＋が大量放出される［９］。細胞内Ｃａ２＋の増加は筋フィラメント（ｍｙｏｆｉｌａｍｅｎｔ）の収縮を触発する。筋線維膜（ｓａｒｃｏｌｅｍｍａ）でのＳＲ  Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）２ａ及びＮａ＋／Ｃａ２＋交換体（ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）を通じたＳＲへのＣａ２＋の再流入は、その後筋フィラメントの弛緩を開始する。
【０００３】
従来の研究は、ＳＥＲＣＡ２ａの発現及び活性の減少がヒト及び動物モデルで心不全に関連することを示す［１０−１２］。したがって、遺伝子量の増加によるＳＥＲＣＡ２ａレベルの回復が、心不全治療に対する合理的な接近であると判断され、これはラット［１３−１５］及びブタ［１６］の心不全モデルを用いた事例で証明された。さらに、ＳＥＲＣＡ２ａのアデノ随伴ウイルス媒介の伝達は、最近、心不全患者で心機能の向上に対する安全で効果的な様相を示した［１７、１８］。
【０００４】
内因性阻害剤であるホスホランバン（ＰＬＢ：ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ）は、ＳＥＲＣＡ２ａ活性を負に調節し、これはプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ：ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ）、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ：Ｃａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＩＩ）及びプロテインホスファターゼ１（ＰＰ１：ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １）によって順次に調節される。ＰＫＡ及びＣａＭＫＩＩは、それぞれＰＬＢのＳｅｒ１６及びＴｈｒ１７をリン酸化し、これはＳＥＲＣＡ２ａからＰＬＢの分離をもたらし、ＳＥＲＣＡ２ａのＣａ２＋−ＡＴＰアーゼ活性がほぼ最大になるようにする［１９−２１］。一方、ＰＰ１によるＰＬＢのＳｅｒ１６及びＴｈｒ１７での脱リン酸化は、ＰＬＢとＳＥＲＣＡ２ａとの結合及びＰＬＢによるＳＥＲＣＡ２ａの抑制を向上する［２２、２３］。興味深いことに、動物モデル及び末期ヒト心不全モデルで、ＰＰ１の活性増加［２７、２８］に伴われるＰＬＢリン酸化の減少［２４−２６］を観察した。したがって、ＰＰ１活性及びＰＬＢリン酸化の正常化は、心機能の向上及び心不全進行を抑制するための妥当な接近である。
【０００５】
標的タンパク質を模倣した小さなペプチドのような分子デコイ（ｄｅｃｏｙ）は、タンパク質間相互作用の妨害［２９］、プロテインキナーゼによる標的タンパク質のリン酸化の妨害［３０］、及びホスファターゼによるリン酸化されたタンパク質の脱リン酸化を妨害［３１、３２］するのに成功的に用いられて来た。
【０００６】
本明細書の全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体が本明細書に参照により組み込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、ＰＬＢ関連疾病、特にＰＬＢの脱リン酸化レベルによって減少されたＳＥＲＣＡ２ａ活性によって誘発された疾病の治療のためのデコイペプチドまたはポリペプチドを開発すべく、鋭意研究努力した。その結果、本発明者らは、ＰＬＢのリン酸化レベルを顕著に増加させるデコイペプチドを合成した。また、本発明者らは、上記デコイペプチドがインビトロで収縮性パラメータを増加させ、エクスビボで左心室の弛緩期圧力を向上することを見出した。すなわち、本発明者らは、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドが、ＳＥＲＣＡ２ａ活性の回復による心臓保護効果及び心筋収縮性向上の強心効果を提供し、したがって、これをＰＬＢの脱リン酸化抑制によるＰＬＢ関連疾病の治療に用いることができることを確認して、本発明を完成するに至った。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、競争的阻害によってＰＬＢのＰＰ１媒介の脱リン酸化を抑制するデコイペプチドまたはポリペプチドを提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、ＰＬＢ関連疾病の予防または治療用の薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、競争的阻害によってＰＬＢのＰＰ１媒介の脱リン酸化を抑制するデコイペプチドまたはポリペプチドの製造方法を提供することにある。
【００１１】
本の発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によってより明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一様態によれば、本発明は、下記一般式Ｉで表されるペプチド配列で構成されるデコイペプチドまたはポリペプチドを提供する：
Ｘ１−Ａｌａ−Ｘ２−Ｘ３−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ４  （Ｉ）
上記Ｘ１は、０〜５０個のアミノ酸残基、上記Ｘ２は、Ｓｅｒ、ＧｌｕまたはＡｓｐ、上記Ｘ３は、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＡｓｐ、上記Ｘ４は、０〜５０個のアミノ酸残基を示し、上記Ｘ３がＴｈｒの場合、Ｘ２はＳｅｒではなく；上記デコイペプチドまたはポリペプチドは、競争的阻害によってＰＬＢ（ホスホランバン）のＰＰ１（プロテインホスファターゼ１）媒介の脱リン酸化を抑制する。
【００１３】
本発明者らは、ＰＬＢ関連疾病、特にＰＬＢの脱リン酸化レベルによって減少されたＳＥＲＣＡ２ａ活性によって誘発された疾病の治療のためのデコイペプチドまたはポリペプチドを開発すべく、鋭意研究努力した。その結果、本発明者らは、ＰＬＢのリン酸化レベルを顕著に増加させるデコイペプチドを合成した。また、本発明者らは、上記デコイペプチドがインビトロで収縮性パラメータを増加させ、エクスビボで左心室の弛緩期圧力を向上することを見出した。すなわち、本発明者らは、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドが、ＳＥＲＣＡ２ａ活性の回復による心臓保護効果及び心筋収縮性向上の強心効果を提供し、したがって、これをＰＬＢの脱リン酸化抑制によるＰＬＢ関連疾病の治療に用いることができることを確認した。
【００１４】
本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、下記一般式Ｉで表されるペプチド配列で構成される：
Ｘ１−Ａｌａ−Ｘ２−Ｘ３−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ４  （Ｉ）
リン酸化されたＰＬＢを模倣して設計された本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、ＰＬＢのＰＰ１媒介の脱リン酸化を抑制し、ＰＬＢのリン酸化レベルを顕著に増加させ、収縮性パラメータを増加させることで、左心室の弛緩期圧力を顕著に向上する。本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、不全性心臓（ｆａｉｌｉｎｇ  ｈｅａｒｔ）でのＳＥＲＣＡ２ａ活性の回復のための代替様式を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次のとおりである：
（ａ）本発明は、競争的阻害によってＰＬＢのＰＰ１媒介の脱リン酸化を抑制することができるデコイペプチドまたはポリペプチド、その製造方法、及び本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドを有効成分として含むＰＬＢ関連疾病の予防または治療用の薬剤学的組成物を提供する。
（ｂ）本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドがＰＰ１媒介の脱リン酸化の抑制によって、ＰＬＢのリン酸化レベルを顕著に増加させることは注目に値する。また、上記デコイペプチドまたはポリペプチドは、ＳＥＲＣＡ２ａ活性の回復による心臓保護効果及び心筋収縮性向上の強心効果を提供する。
（ｃ）本発明は、ＰＬＢ関連疾病の予防または治療に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１ａ】単量体ＰＬＢ（左側）の構造及びデコイペプチドのアミノ酸配列（右側）を示す。上記単量体ＰＬＢの「Ｌ型」構造は、細胞質ヘリックス、連結短ループ及び膜貫通ヘリックスを含む。上記連結短ループを構成する９個のアミノ酸からペプチドを誘導した。上記デコイペプチドにおいて、リン酸化を模倣するためにＳｅｒ（Ｓ、セリン）またはＴｈｒ（Ｔ、スレオニン）残基をＧｌｕ（Ｅ、グルタミン酸）で置換した。上記置換されたグルタミン酸残基を下線で表示した。
【図１ｂ】心筋細胞でデコイペプチドの細胞内吸収を示す。上記分離された心筋細胞を３７℃で１時間１μＭのペプチド溶液でインキュベートした。Ｃｏｎは処理していない細胞、ψＰＬＢ−ＳＥはＦＩＴＣで標識されたデコイペプチド、ＤＩＣは微分干渉対比（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ）イメージ；ＦＩＴＣはＦＩＴＣ蛍光イメージを示す。
【図１ｃ】デコイペプチドによるＰＬＢリン酸化の増加を示す。分離された成体心筋細胞を４５分間１μＭのデコイペプチドで処理し、その後１５分間１μＭのＰＭＡで処理した。リン酸化ＰＬＢ（Ｓ１６）、リン酸化ＰＬＢ（Ｔ１７）、総ＰＬＢまたはＧＡＰＤＨに対する抗体をプローブとして細胞溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）をウェスタンブロッティングした。上記デコイペプチドの配列は次のとおりである：ψＰＬＢ−ＳＥ，  ＲＡＥＴＩＥＭＰＱ（配列表の配列番号１）；  ψＰＬＢ−ＳＤ，  ＲＡＤＴＩＥＭＰＱ（配列表の配列番号３）；ψＰＬＢ−ＴＥ，ＲＡＳＥＩＥＭＰＱ（配列表の配列番号２）。ＰＭＡは、ホルボール１２−ミリスタート  １３−アセタート（ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ）を示す。
【図１ｄ】短縮されたデコイペプチドによるＰＬＢリン酸化の増加を示す。分離された成体心筋細胞を４５分間１μＭのデコイペプチドで処理し、その後１５分間１μＭのＰＭＡで処理した。リン酸化ＰＬＢ（Ｓ１６）、リン酸化ＰＬＢ（Ｔ１７）、総ＰＬＢまたはＧＡＰＤＨに対する抗体をプローブとして細胞溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）をウェスタンブロッティングした。上記短縮されたデコイドペプチドの配列は次のとおりである：ψＰＬＢ−８−ｍｅｒ，  ＡＥＴＩＥＭＰＱ（配列表の配列番号４）；ψＰＬＢ−７−ｍｅｒ，  ＲＡＥＴＩＥＭ（配列表の配列番号５）；ψＰＬＢ−６−ｍｅｒ，ＲＡＥＴＩＥ（配列表の配列番号６）；ψＰＬＢ−５−ｍｅｒ：  ＲＡＥＴＩ（配列表の配列番号７）。ＰＭＡは、ホルボール１２−ミリスタート  １３−アセタート（ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ）を示す。
【図２ａ】デコイペプチドによる心臓収縮性の増加を示す。分離された成体心筋細胞を４５分間１μＭのデコイペプチドで処理し、その後１５分間１μＭのＰＭＡで処理した。その後、収縮性パラメータを測定した。図２ａは、収縮性パラメータを示す。細胞短縮ピーク（Ｐｅａｋ  ｃｅｌｌ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）は、短縮された細胞長さの百分率、−ｄＬ／ｄｔは細胞短縮の最大速度；＋ｄＬ／ｄｔは細胞再延長（ｒｅｌｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇ）の最大速度を示す。＃は対照群と比較してＰ＜０．０５、＊は対照群と比較してＰ＜０．０１、エラーバー（ｅｒｒｏｒ  ｂａｒ）はＳＤを示す。
【図２ｂ】デコイペプチドによる心臓収縮性の増加を示す。分離された成体心筋細胞を４５分間１μＭのデコイペプチドで処理し、その後１５分間１μＭのＰＭＡで処理した。その後、収縮性パラメータを測定した。図２ｂは、収縮性パラメータを示す。細胞短縮ピーク（Ｐｅａｋ  ｃｅｌｌ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）は、短縮された細胞長さの百分率、−ｄＬ／ｄｔは細胞短縮の最大速度；＋ｄＬ／ｄｔは細胞再延長（ｒｅｌｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇ）の最大速度を示す。＃は対照群と比較してＰ＜０．０５、＊は対照群と比較してＰ＜０．０１、エラーバー（ｅｒｒｏｒ  ｂａｒ）はＳＤを示す。
【図２ｃ】デコイペプチドによる心臓収縮性の増加を示す。分離された成体心筋細胞を４５分間１μＭのデコイペプチドで処理し、その後１５分間１μＭのＰＭＡで処理した。その後、収縮性パラメータを測定した。図２ｃは、Ｆｕｒａ２／ＡＭで測定した一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）Ｃａ２＋特性の平均パラメータを示す。ベースライン（Ｂａｓｅｌｉｎｅ）［Ｃａ２＋  ］ｉは、弛緩時の細胞内Ｃａ２＋濃度、  △［Ｃａ２＋  ］ｉ（３４０／３８０）は、収縮時の細胞内増加されたＣａ２＋濃度、τ（ｍｓ）は、Ｃａ２＋の一過性減少速度を示す。８個の個別心臓から約５００個の細胞を選別して、Ｃａ２＋の一過性測定を行った。＃は対照群と比較してＰ＜０．０５、＊は対照群と比較してＰ＜０．０１、エラーバー（ｅｒｒｏｒ  ｂａｒ）はＳＤを示す。
【図２ｄ】デコイペプチドによる心臓収縮性の増加を示す。分離された成体心筋細胞を４５分間１μＭのデコイペプチドで処理し、その後１５分間１μＭのＰＭＡで処理した。その後、収縮性パラメータを測定した。図２ｄは、Ｆｕｒａ２／ＡＭで測定した一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）Ｃａ２＋特性の平均パラメータを示す。ベースライン（Ｂａｓｅｌｉｎｅ）［Ｃａ２＋  ］ｉは、弛緩時の細胞内Ｃａ２＋濃度、  △［Ｃａ２＋  ］ｉ（３４０／３８０）は、収縮時の細胞内増加されたＣａ２＋濃度、τ（ｍｓ）は、Ｃａ２＋の一過性減少速度を示す。８個の個別心臓から約５００個の細胞を選別して、Ｃａ２＋の一過性測定を行った。＃は対照群と比較してＰ＜０．０５、＊は対照群と比較してＰ＜０．０１、エラーバー（ｅｒｒｏｒ  ｂａｒ）はＳＤを示す。
【図３ａ】エクスビボでの虚血後の心機能を示す。図３ａは、ランゲンドルフ潅流したラットの心臓を示す。全般的な虚血誘導のために２０分間潅流を中止した後、１μＭのＴＡＴまたはψＰＬＢ−ＳＥを同時投与して３０分間再潅流し、左心室の弛緩期圧力（ＬＶＤＰ）の変化を観察した。ｎ＝４であり、＊はＴＡＴと比較してＰ＜０．０１、エラーバーはＳＥＭを示す。
【図３ｂ】エクスビボでの虚血後の心機能を示す。図３ｂは、再潅流後に製造した心臓溶解物を示す。リン酸化ＰＬＢ（Ｓ１６）、リン酸化ＰＬＢ（Ｔ１７）、総ＰＬＢ、カスパーゼ３、またはＧＡＰＤＨに対する抗体をプローブとしてウェスタンブロッティングを行った。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドにおいて、本発明の配列「Ａｌａ−Ｘ２−Ｘ３−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ」は、上記デコイペプチドまたはポリペプチドの作用及び機能に必須である。上記Ｘ１及びＸ４残基は、多様に変形されることができる。このような点で、本発明は、ＰＰ１に対するデコイとしての機能または活性を維持する限り、「Ａｌａ−Ｘ２−Ｘ３−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ」配列を含むいずれのペプチドまたはポリペプチドも含む。
【００１８】
本明細書の用語「ペプチド」とは、ペプチド結合によってアミノ酸残基が互いに結合されて形成された直線状の分子を意味する。本明細書の用語「ポリペプチド」とは、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸（同一または異なる）の重合体（ｐｏｌｙｍｅｒ）を意味する。
【００１９】
本明細書でＰＬＢと共に使用される用語「デコイペプチドまたはポリペプチド」は、リン酸化されたＰＬＢの連結短ループを模倣したペプチド配列を含むように設計されたペプチドまたはポリペプチドであって、これは競争的方式によってＰＰ１に結合できることで、ＰＰ１の作用を遮断することができる。
【００２０】
本明細書の用語「ＰＰ１媒介の脱リン酸化」とは、ＰＰ１によるＰＬＢの脱リン酸化を意味する。
【００２１】
デコイペプチド（またはポリペプチド）に関する本明細書の用語「競争的阻害」とは、デコイペプチドまたはポリペプチド−ＰＰ１複合体の形成のために、ＰＰ１に対する競争的結合によって脱リン酸化が抑制されることを意味する。上記デコイペプチドまたはポリペプチドは、ＰＰ１に結合するＰＬＢのリン酸化位置と競争する方式でＰＰ１と結合する。
【００２２】
本発明の一実現例によれば、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、細胞質ペプチドまたはポリペプチドである。すなわち、一般式Ｉにおいて、Ｘ１及びＸ４は、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドが細胞質に存在することを妨害することができるアミノ酸ドメインを含まない。例えば、上記アミノ酸ドメインは、膜貫通ドメイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）及びオルガネラ標的ドメイン（ｏｒｇａｎｅｌｌｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）を含むが、これに限定されない。このような観点で、Ｘ１及びＸ４は、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドが細胞質に存在できるようにする範囲内のいずれのアミノ酸残基も含むことができる。
【００２３】
本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、ＰＬＢのＰＰ１媒介の脱リン酸化を抑制する範囲内であれば、いずれの長さのデコイペプチドまたはポリペプチドも含む。例えば、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、アミノ酸５〜１００個、５〜８０個、５〜６０個、５〜４０個、５〜３０個、５〜２０個、５〜１５個、５〜９個または６〜９個の長さであってもよい。
【００２４】
本発明の一実現例によれば、本発明の一般式ＩのＸ１は、０〜４０個、０〜３０個、０〜２０個、０〜１０個、０〜３個または０〜１個のアミノ酸残基である。
【００２５】
本発明の一般式Ｉにおいて、上記Ｘ１にはいずれのアミノ酸も位置することができる。本発明の一実現例によれば、上記Ｘ１は、ＰＬＢのアミノ酸配列（配列番号１０）の１５番目のアミノ酸のＮ末端方向に０〜５０個、０〜４０個、０〜３０個、０〜２０個、０〜１０個、０〜３個または０〜１個のアミノ酸残基がつながったアミノ酸配列で構成される。本発明の特定の実現例によれば、上記Ｘ１は、ＰＬＢのアミノ酸配列（配列番号１０）の１５番目のアミノ酸のＮ末端方向に１個のアミノ酸残基で構成される。
【００２６】
本発明の一実現例によれば、本発明の一般式ＩのＸ４は、０〜４０個、０〜３０個、０〜２０個、０〜１０個または０〜３個のアミノ酸残基である。
【００２７】
本発明の一般式Ｉにおいて、Ｘ４にはいずれのアミノ酸も位置することができる。本発明の一実現例によれば、上記Ｘ４は、ＰＬＢのアミノ酸配列（配列番号１０）の１９番目のアミノ酸のＣ末端方向に０〜５０個、０〜４０個、０〜３０個、０〜２０個、０〜１０個または０〜３個のアミノ酸残基がつながったアミノ酸配列で構成される。本発明のある実現例によれば、上記Ｘ４は、ＰＬＢのアミノ酸配列（配列番号１０）の１９番目のアミノ酸のＮ末端方向に０または３個のアミノ酸残基で構成される。本発明の特定の実現例によれば、上記Ｘ４は、ＰＬＢのアミノ酸配列（配列番号１０）の１９番目のアミノ酸のＮ末端方向に３個のアミノ酸残基で構成される。
【００２８】
本発明の一実現例によれば、本発明のＸ１はＡｒｇである。
【００２９】
本発明の一実現例によれば、本発明のＸ４は、Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−ＰｒｏまたはＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎである。
【００３０】
本発明のＰＬＢのアミノ酸配列（配列表の配列番号１０）の１６番目のアミノ酸であるＳｅｒ残基（Ｓｅｒ１６）及び１７番目のアミノ酸であるＴｈｒ残基（Ｔｈｒ１７）は、ＰＬＢの流動的なループ地域（ＰＬＢのアミノ酸配列（配列表の配列番号１０）の１４〜２２番目のアミノ酸）に位置するリン酸化部位である。一般式Ｉにおいて、Ｘ２及びＸ３は、それぞれＰＬＢ内のＳｅｒ１６及びＴｈｒ１７が位置しているアミノ酸の位置を示す。
【００３１】
本発明において、Ｓｅｒ１６及び／またはＴｈｒ１７をＧｌｕまたはＡｓｐで置換して、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドを設計する。本発明の一般式ＩのＸ２及び／またはＸ３にＧｌｕまたはＡｓｐを含むデコイペプチドまたはポリペプチドは、リン酸化されたＰＬＢと類似して、ＰＰ１に結合するＰＬＢのリン酸化位置と競争する。
【００３２】
本発明の一実現例によれば、本発明のＸ２は、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、Ｘ３は、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＡｓｐである。本発明の他の実現例によれば、本発明のＸ２は、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、Ｘ３は、Ｔｈｒである。
【００３３】
本発明の一実現例によれば、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、配列表の配列番号１ないし配列番号６のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列で構成される。本発明の他の実現例によれば、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、配列表の配列番号１及び配列番号３ないし配列番号６のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列で構成される。本発明の特定の実現例によれば、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、配列表の配列番号１、配列番号３及び配列番号６のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列で構成される。
【００３４】
本発明の配列表の配列番号１ないし配列番号６は次のとおりである：
配列表の配列番号１は、Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎである。
配列表の配列番号２は、Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎである。
配列表の配列番号３は、Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎである。
配列表の配列番号４は、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎである。
配列表の配列番号５は、Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔである。
配列表の配列番号６は、Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕである。
【００３５】
本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、修飾側鎖を有する一つ以上のアミノ酸があるペプチドまたはポリペプチドを含むことができる。側鎖修飾の例は、還元アルキル化反応；メチルアセトイミデートによるアミジン化；無水酢酸によるアシル化；シアネートによるアミノ基のカルバモイル化；２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ酸のトリニトロベンジル化；無水コハク酸及びテトラヒドロフタル酸無水物によるアミノ基のアシル化；及びピリドキサール−５−リン酸の処理後、ＮａＢＨ４で還元されたピリドキシル化のようなアミノ基の修飾を含む。
【００３６】
アルギニン残基のグアニジン基は、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサール及びグリオキサールのような試薬による複素環縮合物の形成で修飾されることができる。カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソ尿素の形成によってカルボジイミド活性をし、次に誘導体化、例えば、アミド化で誘導体化して修飾させることができる。
【００３７】
スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシルメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物による混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドによる反応；４−クロロメルクリ安息香酸、４−クロロメルクリフェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール及び他の水銀剤を使用した水銀誘導体の形成；塩基ｐＨでシアネートによるカルバモイル化のような方法によって修飾されることができる。システイン残基のいずれの修飾も、ペプチドが要するジスルフィド結合を形成するのに影響を与えてはいけない。また、システインのスルフヒドリル基は、セレニウム等価物で代替することができ、これによってペプチドには一つ以上のジスルフィド結合位置にジセレニウム結合が形成されることができる。
【００３８】
トリプトファン残基は、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミドによる酸化または２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミドまたはスルホニルハライドによるインドール環のアルキル化によって修飾されることができる。一方、チロシン残基は、テトラニトロメタンを用いたニトロ化によって修飾されて３−ニトロチロシン誘導体を形成させることができる。
【００３９】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化またはジエチルピロカーボネートによるＮ−カルボエトキシル化によって行われることができる。
【００４０】
プロリン残基は、例えば、４位置でのヒドロキシル化によって修飾されることができる。
【００４１】
本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、これのアミノ酸残基を修飾させることで、より安定性を向上することができる。例えば、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸は、アセチル基、フルオレニルメトキカルボニル基、ホルミル基、パルミトール基、ミリスチル基、ステアリル基またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を持つ。本発明の一実現例によれば、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、アセチル基の保護基が結合されている。
【００４２】
本明細書で用語「安定性」とは、インビボでの安定性だけでなく、貯蔵安定性（例えば、常温貯蔵安定性）も意味する。上述した保護基は、インビボでプロテアーゼの攻撃から本発明のペプチドを保護する作用をする。
【００４３】
本発明の一実現例によれば、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチドがさらに結合されている。本発明の他の実現例によれば、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、Ｎ末端及び／またはＣ末端に細胞膜透過性ペプチドがさらに結合されている。
【００４４】
本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドを心筋細胞内に運ぶためには、上記デコイペプチドまたはポリペプチドが細胞膜透過性ペプチドを含んでいなければならない。本明細書の用語「細胞膜透過性ペプチド」は、特定のペプチド（またはタンパク質）を細胞内に運ぶために必須なペプチドであって、通常、５〜５０個またはそれ以上のアミノ酸配列で構成されている。
【００４５】
細胞膜透過性ペプチドは、それ自体でリン脂質二重層の細胞膜を通過することができるアミノ酸配列を持つペプチドであって、例えば、Ｔａｔ由来ペプチド、シグナルペプチド（例えば、細胞透過性ペプチド）、アルギニンリッチペプチド、トランスポータンまたは両親媒性ペプチドキャリアなどを含むが、これに限定されない（Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｍ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９：１１７３−１１７６  （２００１）；  Ｄｕｐｏｎｔ，  Ａ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ，  Ａ．，  ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ｌａｎｇｅｌ，  Ｅｄｉｔｏｒ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  （２００２）；  Ｃｈａｌｏｉｎ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６（３７）：１１１７９−８７  （１９９７）；  及びＬｕｎｄｂｅｒｇ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｌ，  Ｕ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  １６（５）：２２７−２３３  （２００３））。また、上記のような天然配列と共に、レトロインベルソ（ｒｅｔｒｏｉｎｖｅｒｓｏ）及びＤ−アイソマーペプチドを含む、細胞膜透過性質を有する多様なアンテナペディア（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）基礎ペプチドが知られている（Ｂｒｕｇｉｄｏｕ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２１４（２）：６８５−９３  （１９９５）；Ｄｅｒｏｓｓｉ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ８：８４−８７  （１９９８））。
【００４６】
本発明の他の実現例によれば、本発明の細胞膜透過性ペプチドは、ＴＡＴペプチド（Ｔａｔ由来ペプチド）である。
【００４７】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）由来のＴａｔタンパク質は８６個のアミノ酸で構成されており、システインリッチ、塩基性及びインテグリン結合部分の主タンパク質ドメインを有している。たとえ、ＴａｔペプチドはＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列表の配列番号１１）（すなわち、Ｔａｔタンパク質の４８〜６０番目のアミノ酸配列）配列だけでタンパク質の細胞膜透過性質を有するとしても、付加的にＴａｔ配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲの多くのコピーを含む分岐構造がある場合、細胞膜をより効果的に通過できるものと知られている（Ｔｕｎｇ，  Ｃ．  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １０：３６０９−３６１４（２００２））。細胞膜透過性質を有するＴａｔペプチドの多様性については、Ｓｃｈｗａｒｚｅ，  Ｓ．  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５６９−１５７２（１９９９）に記載されている。本発明のある実現例によれば、本発明のＴＡＴペプチドは、配列表の配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
【００４８】
また、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、精製を容易にするために、他の融合タンパク質を含むことができ、これはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、米国）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ社、米国）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ社、米国）及び６ｘＨｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ社、米国）を含むが、これに限定されない。本発明の一実現例によれば、本発明の融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製される、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼが融合された場合には、この酵素の基質であるグルタチオンを用いることができ、６ｘＨｉｓが用いられた場合には、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｈｉｓ結合樹脂カラム（Ｎｏｖａｇｅｎ社、米国）を用いて、所望の融合タンパク質を迅速かつ容易に得ることができる。
【００４９】
本発明の一実現例によれば、本発明のＰＬＢはヒトに由来し、これのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に開示されている。ＮＣＢＩ内のヒトＰＬＢアミノ酸配列のアクセッション番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ）は、ＡＡＡ６０１０９．１、ＡＡＡ６００８３．１及びＡＡＤ５５９５０．１である。
【００５０】
本発明によれば、本明細書の用語「デコイペプチドまたはポリペプチド」は、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドの機能的な均等物を含むものと解釈される。本明細書の用語「機能的な均等物」は、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドに比べると類似または向上した生物学的活性を持つと共に、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドの一部アミノ酸配列でのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を持つアミノ酸配列の変異（例えば、必須配列であるＡｌａ−Ｘ２−Ｘ３−Ｉｌｅ−Ｇｌｕの周囲アミノ酸残基の変異）を意味する。上記アミノ酸置換は、保存的置換であってもよい。自然的にアミノ酸に発生する上記保存的置換の例は、脂肪族アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ及びＰｒｏ）、疎水性アミノ酸（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＶａｌ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ及びＧｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ及びＡｓｎ）及び含硫アミノ酸（Ｃｙｓ及びＭｅｔ）を含む。上記アミノ酸欠失は、本発明のデコイペプチド及びポリペプチド活性に直接に関連しない部分に位置する。
【００５１】
本発明によれば、本発明で利用可能な本発明のデコイペプチド及びポリペプチドのアミノ酸配列は、本発明のデコイペプチド配列に実質的に同一性を有するペプチド配列を含むものと解釈される。本明細書の用語「実質的同一性」とは、二つのアミノ酸配列を最大限対応するようにアラインし、ＢＬＡＳＴ、ＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴのような当業界で通常用いられるアルゴリズムまたは肉眼検査を用いてアラインされた配列を分析した場合に、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列相同性を共有することを意味する。配列比較のためのアライメント方法は、当業界に公知されている。アライメントに対する多様な方法及びアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２（１９８１）；  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  ４８：４４３（１９７０）；  Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４：  ３０７−３１（１９８８）；  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−４４（１９８８）；  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３（１９８９）；  Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：１０８８１−９０（１９８８）；  Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐ．  Ａｐｐｌ．  ＢｉｏＳｃｉ．  ８：１５５−６５（１９９２）  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４：３０７−３１（１９９４）に開示されている。
【００５２】
ＮＣＢＩベーシック・ローカルアライメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ：  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０（１９９０））は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などで接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ  ａｎｄ  ｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動して用いることができる。ＢＬＳＡＴは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／でアクセス可能である。このプログラムを用いた配列相同性比較方法は、  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌから確認することができる。
【００５３】
本発明の他の様態によれば、本発明は、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドのうちいずれか一つのデコイペプチドまたはポリペプチドの薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含むＰＬＢ関連疾病の予防または治療用の薬剤学的組成物を提供する。
【００５４】
ＰＬＢ関連疾病について使用される本明細書の用語「予防」とは、ＰＬＢ関連疾病の完全な予防、上記疾病を有する対象体での症状発生の予防または上記疾病を有する対象体での症状再発の予防を意味する。
【００５５】
ＰＬＢ関連疾病について使用される本明細書の用語「治療」は、対象体でＰＬＢ関連疾病症状の一部または全部の除去または症状強度の減少を示す。
【００５６】
ＰＬＢ関連疾病について使用される本明細書の用語「薬剤学的有効量」とは、対象体に投与される、ＰＬＢ関連症状、状態または疾病の予防または治療に十分な量を意味する。
【００５７】
本明細書の用語「対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」とは、ヒト、ヒトではない哺乳類または動物を含む。上記ヒトではない哺乳類は、牛、羊、ヤギ、馬、豚、犬及び猫のような家畜及び伴侶動物を意味する。
【００５８】
本発明によれば、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドを有効成分として含む薬剤学的組成物は、ＰＬＢ関連疾患の予防または治療に使用されることができる。
【００５９】
心筋細胞の収縮性は、細胞内のＣａ２＋サイクリングによって直接調節され、ＳＥＲＣＡ２ａは心筋細胞内の上記Ｃａ２＋サイクリングで重要な役割をする。ＰＬＢは、ＳＥＲＣＡ２ａの内因性阻害剤であって、ＰＰ１による脱リン酸化を通じてこれの抑制活性が向上する。
【００６０】
本発明において、本発明のデコイペプチドは、ＰＬＢのリン酸化レベルを顕著に増加させる（図１ｃ及び１ｄ）。また、本発明のデコイペプチドは、インビトロで収縮性パラメータを増加させ（図２ａ〜２ｄ）、エクスビボで左心室の弛緩期血圧を向上する（図３ａ及び３ｂ）。すなわち、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドがＳＥＲＣＡ２ａ活性の回復による心臓保護効果及び心筋収縮性向上の強心効果を提供し、したがって、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドをＰＬＢのＰＰ１媒介の脱リン酸化抑制によるＰＬＢ関連疾病の予防または治療に用いることができる。
【００６１】
本発明の一実現例によれば、本発明のＰＬＢ関連疾病は、心臓疾患である。本発明の他の実現例によれば、本発明の心臓疾患は、心不全、虚血、不整脈、心筋梗塞、うっ血性心不全、移植拒絶、異常な心臓収縮または異常なＣａ２＋代謝である。本発明のある実現例によれば、本発明の心臓疾患は、心不全または虚血である。本発明の特定の実現例によれば、本発明の心臓疾患は、心不全である。
【００６２】
本明細書の用語「心不全」は、心臓の拍出量が正常以下に落ちることによって、心臓の機能が末梢組職の代謝要求量を満たすことができない臨床症状を意味する。すなわち、心不全は、多くの原因によって心臓が血液をポンピングする能力が減少するか、正常に拍動をしても十分な量の血液を全身に送ることができない状態を意味する。
【００６３】
本発明のまた他の実現例によれば、本発明の心不全は、心臓肥大症、冠状動脈硬化症、心筋梗塞、心臓弁膜症、高血圧または心筋症によって誘発される。
【００６４】
本発明の一実現例によれば、本発明の薬剤学的組成物は、強心用組成物である。
【００６５】
本発明によれば、本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含むことができる。本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、炭水化物類化合物（例：ラクトース、アミロース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、セルロースなど）、アラビアゴム、リン酸カリウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カリウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、塩溶液、アルコール、植物油（例：トウモロコシ油、綿種油、大豆油、オリーブ油、ヤシ油）、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油などを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、上記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。好適な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，  １９９５）に詳細に記載されている。
【００６６】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口で投与することができ、非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入などで投与することができる。
【００６７】
本発明の薬剤学的組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性といった要因によって様々であり、通常の熟練した医師は所望の治療または予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の好ましい実現例によれば、好適な１日投与量は、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。投与は一日に一回投与することもでき、数回に分けて投与することができる。
【００６８】
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することで単位用量形態に製造されるか、または多用量容器内に内入させて製造されることができる。このとき、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤、粉剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
【００６９】
本発明のまた他の様態によれば、本発明は、（ａ）ＰＬＢアミノ酸配列（配列番号１０）の１６番目のアミノ酸であるＳｅｒ残基及び／または１７番目のアミノ酸であるＴｈｒ残基をＧｌｕまたはＡｓｐで置換し、上記ＰＬＢアミノ酸配列（配列番号１０）の１５〜１９番目のアミノ酸周辺の周囲アミノ酸残基を０〜９５個選択することによって、ＰＬＢのデコイペプチドまたはポリペプチドを設計するステップであって、上記設計されたデコイペプチドまたはポリペプチドは、下記一般式Ｉで表されるペプチド配列で構成され、
Ｘ１−Ａｌａ−Ｘ２−Ｘ３−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ４  （Ｉ）
上記Ｘ１は、０〜５０個のアミノ酸残基、上記Ｘ２は、Ｓｅｒ、ＧｌｕまたはＡｓｐ、上記Ｘ３は、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＡｓｐ、上記Ｘ４は、０〜５０個のアミノ酸残基を示し、上記Ｘ３がＴｈｒの場合、Ｘ２はＳｅｒではないステップ；及び（ｂ）上記ステップ（ａ）で設計されたデコイペプチドまたはポリペプチドを製造するステップを含む競争的阻害によって、ＰＬＢのＰＰ１媒介の脱リン酸化を抑制する本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドを製造する方法を提供する。
【００７０】
本発明の方法をそれぞれのステップ別に詳細に説明すれば、次のとおりである：
ステップ（ａ）：デコイペプチドまたはポリペプチドの設計
本発明によれば、まず、ＰＬＢアミノ酸配列（配列番号１０）の１６番目のアミノ酸であるＳｅｒ残基及び／または１７番目のアミノ酸であるＴｈｒ残基をＧｌｕまたはＡｓｐで置換し、上記ＰＬＢアミノ酸配列（配列番号１０）の１５〜１９番目のアミノ酸周辺の周囲アミノ酸残基を０〜９５個選択することによって、ＰＬＢのデコイペプチドまたはポリペプチドを設計する。上記設計されたデコイペプチドまたはポリペプチドは、一般式Ｉ（Ｘ１−Ａｌａ−Ｘ２−Ｘ３−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ４）で表されるペプチド配列で構成され、上記Ｘ１は、０〜５０個のアミノ酸残基、上記Ｘ２は、Ｓｅｒ、ＧｌｕまたはＡｓｐ、上記Ｘ３は、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＡｓｐ、上記Ｘ４は、０〜５０個のアミノ酸残基を示し、上記Ｘ３がＴｈｒの場合、Ｘ２はＳｅｒではない。
【００７１】
本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドにおいて、上記ＰＬＢアミノ酸配列の１５、１８及び１９番目のアミノ酸残基は、Ａｓｐ、Ｉｌｅ及びＧｌｕである（配列番号１０を参照）。
【００７２】
本発明によれば、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチド配列の「Ａｌａ−Ｘ２−Ｘ３−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ」は、上記デコイペプチドまたはポリペプチドの作用及び機能に必須である。上記周囲アミノ酸残基は、多様に変異されることができる。このような観点で、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、ＰＰ１に対する誘引体（ｄｅｃｏｙ）としての機能または活性を維持する範囲内であれば、いずれの周囲アミノ酸残基も含む。
【００７３】
本発明の周囲アミノ酸残基は、ＰＬＢのＰＰ１媒介の脱リン酸化を抑制する範囲内であれば、いずれの長さのアミノ酸残基も含む。例えば、本発明の周囲アミノ酸残基は、アミノ酸０〜９５個、０〜７５個、０〜５５個、０〜３５個、０〜１５個、０〜１０個、０〜４個または１〜４個の長さである。
【００７４】
本発明の一実現例によれば、本発明の周囲アミノ酸残基は、（ｉ）ＰＬＢのアミノ酸配列（配列番号１０）の１５番目のアミノ酸のＮ末端方向に０〜５０個、０〜４０個、０〜３０個、０〜２０個、０〜１０個、０〜３個または０〜１個のアミノ酸残基がつながったアミノ酸配列、及び（ｉｉ）ＰＬＢのアミノ酸配列（配列番号１０）の１９番目のアミノ酸のＣ末端方向に０〜５０個、０〜４０個、０〜３０個、０〜２０個、０〜１０個または０〜３個のアミノ酸残基がつながったアミノ酸配列で構成される。本発明の特定の実現例によれば、上記１５番目のアミノ酸のＮ末端方向のアミノ酸配列は、１個のアミノ酸残基がつながったものであり、上記１９番目のアミノ酸のＣ末端方向のアミノ酸配列は、０または３個のアミノ酸残基がつながったものである。
【００７５】
本発明の他の実現例によれば、上記１５番目のアミノ酸のＮ末端方向のアミノ酸残基は、Ａｒｇである。
【００７６】
本発明の他の実現例によれば、上記１９番目のアミノ酸のＣ末端方向のアミノ酸残基は、Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−ＰｒｏまたはＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎである。
【００７７】
本発明において、上記Ｓｅｒ１６残基またはＴｈｒ１７残基をＧｌｕまたはＡｓｐ残基で置換した本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、ＰＬＢのリン酸化を増加させる（図１ｃ及び１ｄ）。したがって、Ｓｅｒ１６残基またはＴｈｒ１７残基のうちいずれか一つのアミノ酸残基だけがＧｌｕまたはＡｓｐ残基で置換された場合でも、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、ＰＬＢのＰＰ１媒介の脱リン酸化を抑制することができる。
【００７８】
本発明の一実現例によれば、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、Ｓｅｒ残基またはＳｅｒとＴｈｒ残基全部をＧｌｕまたはＡｓｐ残基で置換して設計する。本発明の他の実現例によれば、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、Ｓｅｒ残基のみをＧｌｕまたはＡｓｐ残基で置換して設計する。
【００７９】
本発明の特定の実現例によれば、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、配列表の配列番号１ないし配列番号６のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列で構成されるように設計する。本発明の他の特定の実現例によれば、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、配列表の配列番号１及び配列番号３ないし配列番号６のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列で構成されるように設計する。本発明のまた他の特定の実現例によれば、本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、配列表の配列番号１、配列番号３及び配列番号６のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列で構成されるように設計する。
【００８０】
ステップ（ｂ）：デコイペプチドまたはポリペプチドの製造
ステップ（ａ）の実施後、設計された本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドを製造する。
【００８１】
本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、当業界で一般的に実施する組換えＤＮＡ技術（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）で製造することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｒ．  Ｂ．，  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，  ８５：２１４９−２１５４（１９６３），  Ｋａｉｓｅｒ，  Ｅ．，  Ｃｏｌｅｓｃｏｔ，  Ｒ．Ｌ．，  Ｂｏｓｓｉｎｇｅｒ，  Ｃ．Ｄ．，  Ｃｏｏｋ，  Ｐ．Ｉ．，  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ３４：５９５−５９８（１９７０））。α−アミノ基と側鎖基を持つ保護されたアミノ酸は樹脂に付着している。次に、α−アミノ保護基を除去した後、中間体を得るためにアミノ酸を順次に結合させる。
【００８２】
本発明のまた他の様態によれば、本発明は、（ａ）本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドのうちいずれか一つのデコイペプチドまたはポリペプチドの薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与するステップを含むＰＬＢ関連疾病の予防または治療方法を提供する。
【００８３】
本発明の一実現例によれば、本発明のＰＬＢ関連疾病は、心臓疾患である。本発明の他の実現例によれば、本発明の心臓疾患は、心不全、虚血、不整脈、心筋梗塞、うっ血性心不全、移植拒絶、異常な心臓収縮または異常なＣａ２＋代謝である。本発明のある実現例によれば、本発明の心臓疾患は、心不全または虚血である。本発明の特定の実現例によれば、本発明の心臓疾患は、心不全である。
【００８４】
本発明の他の実現例によれば、本発明の心不全は、心臓肥大症、冠状動脈硬化症、心筋梗塞、心臓弁膜症、高血圧または心筋症によって誘発される。
【００８５】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【実施例】
【００８６】
１．実験器具及び方法
デコイペプチド
本発明のデコイペプチドは、リン酸化部位であるＳｅｒ１６及びＴｈｒ１７周辺のＰＬＢタンパク質配列（配列表の配列番号１０）から誘導した：ＲＡＳ１６Ｔ１７ＩＥＭＰＱ。上記ペプチドは、細胞内への流入促進のためにシステイン−システイン結合によって細胞透過ペプチドＴＡＴ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ：配列表の配列番号１１）をＮ末端にコンジュゲートした。本発明で使用したペプチドは次のとおりである：ＰＬＢ−ｗｔ，ＲＡＳＴＩＥＭＰＱ（配列表の配列番号８）；ψＰＬＢ−ＳＥ，  ＲＡＥＴＩＥＭＰＱ（配列表の配列番号１）；ψＰＬＢ−ＴＥ，ＲＡＳＥＩＥＭＰＱ（配列表の配列番号２）；  ψＰＬＢ−ＳＤ，ＲＡＤＴＩＥＭＰＱ（配列表の配列番号３）。また、下記の短縮されたψＰＬＢ−ＳＥペプチドも実験した：８−ｍｅｒ，ＡＥＴＩＥＭＰＱ（配列表の配列番号４）；７−ｍｅｒ，ＲＡＥＴＩＥＭ（配列表の配列番号５）；６−ｍｅｒ，ＲＡＥＴＩＥ（配列表の配列番号６）；５−ｍｅｒ，ＲＡＥＴＩ（配列表の配列番号７）。上記のすべてのペプチドをエニゼン社（大韓民国）で合成及び修飾し、１ｍＭのストック濃度で蒸留水に溶解した。ペプチドは  ＞９５％純粋だった。上記デコイペプチドを最終濃度１μＭで１時間処理した。細胞生存率及び形態はペプチドに重大な影響を及ぼさなかった。
【００８７】
成体ラットの心室心筋細胞の分離
従来の文献［３３］に開示されたところから最小限変形をして、これによってＳＤラットの心臓から心室心筋細胞を分離した。上記ラットは８〜１２週齢の雄性ラットを使用した。簡略に説明すれば、５分間イソフルラン（０．５％）を吸入させてラットを痲酔した。上記心臓を胸部から速やかに取り除いて、１００％のＯ２ガス下、３７℃で３分間無カルシウムタイロード緩衝液（ｃａｌｃｉｕｍ−ｆｒｅｅ  Ｔｙｒｏｄｅ  ｂｕｆｆｅｒ：１３７ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１０ｍＭの２，３−ブタンジオンモノオキシム、５ｍＭのタウリン）を大動脈に逆に潅流した。その後、潅流溶液にコラゲナーゼタイプＢ（０．３５Ｕ／ｍｌ；Ｒｏｃｈｅ社）及びヒアルロニダーゼ（０．１ｍｇ／ｍｌ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社）を添加して酵素分解を開始した。分解１０分後、上記心臓が膨脹を始めるとき、左心室を速やかに取り除いて、数個のかたまりに分けた後、上記と同一の酵素溶液内で３７℃で１０分間６０〜７０ｒｐｍで撹拌してさらに分解させた。分散された心筋細胞を含む上澄み液を細胞ろ過器（細孔径  １００μｍ、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社）でろ過して、５００ｒｐｍで１分間穏やかに遠心分離した。Ｃａ２＋逆行を避けるために、細胞外のＣａ２＋を３０分間１．２５ｍＭの濃度で逆に添加した。このような過程によって普通８０％以上の収率で明確な筋節模様を有するロッド型心室心筋細胞を得た。明確な筋線維膜水疱を有するか、自発的に収縮する心筋細胞は廃棄した。
【００８８】
蛍光顕微鏡で観察
ペプチドの細胞内流入（ｕｐｔａｋｅ）を確認するために、ＦＩＴＣでψＰＬＢ−ＳＥを標識した。上記分離した心筋細胞をラミニンコーティングされたガラスプレートに塗抹し、２ｍＭのＬ−カルニチン、５ｍＭのクレアチン、５ｍＭのタウリン及び１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンが補充されたＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が含有されたＭＥＭ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地で培養した。上記細胞を１μＭのＦＩＴＣ標識されたψＰＬＢ−ＳＥに１時間露出させた後、タイロード溶液で二回洗浄した。６３ｘ（１．４ＮＡ）油浸対物レンズ及びフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）ＦＩＴＣ最適化フィルタセット（ＯｍｅｇａＲ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，  米国）が装着されたＬｅｉｃａ  ＤＭＲＢＥ顕微鏡（ＬａｂＣｏｍｍｅｒｃｅ社、米国）を用いて蛍光イメージを視覚化した。ＣｏｏｌＳＮＡＰ  ＴＭｆｘ  ＣＣＤ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ社、米国）カメラを用いてイメージを得て、メタモルフイメージングソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ社、米国）で分析した。
【００８９】
ウェスタンブロット分析
ＳＤＳ試料緩衝液内の心臓溶解物（５０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに展開させた後、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、米国）に移した。上記膜を５％脱脂乳（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）溶液で遮断し、その後ＰＬＢ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ社、米国）、リン酸化ＰＬＢ（Ｓｅｒ１６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、米国）、リン酸化ＰＬＢ（Ｔｈｒ１７、Ｂａｄｒｉｌｌａ社、イギリス）、ＳＥＲＣＡ２ａ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社、米国）、カスパーゼ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、米国）、またはＧＡＰＤＨ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社、米国）に対する抗体で一晩インキュベートした。その後、上記膜をホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、米国）がコンジュゲーションされた２次抗体でインキュベートし、ウェスタンライティングケミルミネセンス試薬（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、米国）を用いて現像した。
【００９０】
細胞収縮性及び細胞内Ｃａ２＋の一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）の測定
心室心筋細胞の機械的な特性は、従来の文献［３４］に記載された通りにビデオ基盤のエッジ感知システム（ＩｏｎＯｐｔｉｘ社、米国）を用いて評価した。簡略に説明すれば、倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ−１００Ｆ、Ｎｉｋｏｎ社、日本）の載物台に載せられたチャンバ内に細胞を付着したラミニンコーティングされたカバースリップを位置させ、３７℃で約１ｍｌ／ｍｉｎの速度でタイロード緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］）を潅流した。ＨＬＤ−ＣＳ培養チャンバ／ｓｔｉｍホルダー上に位置したＳＴＩＭ−ＡＴ刺激装置／サーモスタット（Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ社、米国）を用いて３Ｈｚ（３０Ｖ）の頻度で上記細胞をフィールド刺激した。ＩｏｎＯｐｔｉｘ  ＭｙｏＣａｍカメラ（ＩｏｎＯｐｔｉｘ社、米国）を用いて上記目的の心筋細胞をコンピュータモニタ上に表示し、毎８．３ｍｓごとに速やかにイメージ区域をスキャンした結果、短縮または再延長の振幅及び速度が忠実に記録された。短縮または再延長する間の細胞長さの変化を捕捉し、ソフトエッジソフトウェア（ＩｏｎＯｐｔｉｘ社、米国）を用いて分析した。上記心筋細胞をＣａ２＋敏感性指示計（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）である０．５μΜのＦｕｒａ２−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、米国）３７℃で１５分間置いた。蛍光放出を筋細胞カルシウム及び収縮性記録システム（Ｍｙｏｃｙｔｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ、ＩｏｎＯｐｔｉｘ社、米国）を用いて収縮性の測定と同時に記録した。上述したように、フィールド刺激する間、３４０または３８０ｎｍフィルターを通じた７５Ｗハロゲンランプによって放出される光に心筋細胞を露出した。３４０ｎｍで０．５秒間初期照光した後、フォトマルチプライヤーチューブによって４８０及び５２０ｍで蛍光放出を探知した後、３８０ｎｍで記録プロトコルの持続期間の間、蛍光放出を探知した。プロトコルの終了時点で上記３４０ｎｍ励起スキャンを繰り返し、二つの波長でのＦｕｒａ蛍光強度の割合から細胞内Ｃａ２＋濃度の質的変化を推論した。
【００９１】
分離心臓の潅流装置実験
イソフルラン（０．５％）を５分間吸入させてラットを痲酔した。心臓を速やかに取り除いた後、冷却過酸化タイロード溶液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルコース、１ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１００％のＯ２）に位置させた。大動脈にキャニュラーを挿入し、一定の圧力（６５ｍｍＨｇ、３７±０．２℃）でランゲンドルフ法によって過酸化タイロード溶液を潅流した。心臓機能の継続的な測定のために水で満たされたラテックスバルーンを左心室チャンバに挿入し、圧力トランスデューサー（ＡＤ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、米国）を連結した。パワーラブチャートシステムズ（ＡＤ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、米国）を用いて心拍動、左心室の弛緩期圧力（ＬＶＤＰ）及び左心室圧の一次導関数（最大ＬＶ＋ｄＰ／ｄｔ及び最大ＬＶ−ｄＰ／ｄｔ）を全部記録した。測定された最後の弛緩期圧力が６〜１０ｍｍＨｇの範囲になるように上記バルーンの体積を約２５０〜３００μｌに調節した。３０分の安定期後、全般的な虚血誘導のために２０分間上記心臓の潅流を中止し、その後３０分間再潅流させた。最終濃度１μΜでデコイペプチドを潅流させた。
【００９２】
統計
適切な評価のために平均±ＳＤでデータを表示した。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔまたはボンフェローニ補正（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）を装着した一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、Ｓｔｓｔｖｉｅｗ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０、ＳＡＳ社、米国）を用いて各群の平均を比較した。Ｐ−ｖａｌｕｅ＜０．０５を統計学的に有意なものと見なした。
【００９３】
実験結果
デコイペプチド
ＰＬＢはＮ末端に細胞質ヘリックス、Ｃ末端に膜貫通ヘリックス、そして上記二つのヘリックスを連結する流動的なループを含む（図１、左側）。リン酸化部位は上記連結ループ部分内のＳｅｒ１６及びＴｈｒ１７残基である。本発明者らは、ループ地域の９個のアミノ酸と正確にマッチングされる配列である９−ｍｅｒペプチド（ＲＡＳＴＩＥＭＰＱ、配列表の配列番号８）を合成し、ジスルフィド結合によって細胞透過ペプチドＴＡＴと結合させて、ψＰＬＢ−ｗｔを製造した。また、本発明者らは、ＴＡＴ結合された類似ペプチドを製造したが、これはＰＬＢのＳｅｒ１６またはＴｈｒ１７と相応するＳｅｒまたはＴｈｒ残基それぞれをＧｌｕで代替したψＰＬＢ−ＳＥまたはψＰＬＢ−ＴＥである（図１ａ、右側）。上記ペプチドをＦＩＴＣで標識して、ラット左心室から分離して培養した心筋細胞に添加した。蛍光顕微鏡下で観察した結果、ほとんどすべての心筋細胞内に上記ペプチドが効果的に流入されたことが分かった（図１ｂ）。上記実験によって、上記心筋細胞が効果的に本発明のペプチドを吸収することを確認し、標識していないペプチドは、その後の実験で使用した。
【００９４】
心筋細胞にホルボール１２−ミリスタート  １３−アセタート（ＰＭＡ：  ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ）を処理する場合、ＰＫＣａ活性化によってＰＬＢのリン酸化が顕著に減少することは既に知られている。ψＰＬＢ−ＳＥを前処理した場合、ψＰＬＢ−ｗｔを処理した場合と違って、Ｓｅｒ１６及びＴｈｒ１７  両方でＰＬＢのＰＭＡ誘導された脱リン酸化をかなり遮断した。ψＰＬＢ−ＴＥの処理もＰＬＢの脱リン酸化を遮断したが、ψＰＬＢ−ＳＥの処理より効果的ではなかった（図１ｃ）。ＰＬＢのリン酸化レベルはψＰＬＢ−ＳＥ処理以後少し増加したが、基準レベルよりは顕著に高かった。ＰＰ１がＰＬＢを脱リン酸化させるものと知られている唯一のプロテインホスファターゼであるのを考慮すると、上記データは、ψＰＬＢ−ＳＥがＰＰ１媒介の脱リン酸化を完璧に抑制するデコイペプチドとして作用することを立証する。
【００９５】
Ｓｅｒ１６をＡｓｐで代替したψＰＬＢ−ＳＤは、ψＰＬＢ−ＳＥほどＰＬＢのリン酸化レベルの増加に効果的だった（図１ｃ）。本発明者らは、ＡＥＴＩＥＭＰＱ（ψＰＬＢ−８−ｍｅｒ、配列表の配列番号４）、ＲＡＥＴＩＥＭ（ψＰＬＢ−７−ｍｅｒ、配列表の配列番号５）、ＲＡＥＴＩＥ（ψＰＬＢ−６−ｍｅｒ、配列表の配列番号６）及びＲＡＥＴＩ（ψＰＬＢ−５−ｍｅｒ、配列表の配列番号７）で構成された短縮されたψＰＬＢ−ＳＥペプチドを合成した。上記ペプチドの中で唯一にψＰＬＢ−５−ｍｅｒのみがＰＬＢのリン酸化レベルの増加に効果がなかった（図１ｄ）。したがって、上記結果は、ＡＳＴＩＥ（配列表の配列番号９）が必要な最小限のアミノ酸配列であり、Ｓｅｒ残基をＧｌｕまたはＡｓｐで代替する場合、ＰＰ１に対して効果的なデコイペプチドを製造できることを示すものである。
【００９６】
ψＰＬＢ−ＳＥは心筋細胞の収縮性を増加させる。
本発明者らは、次にψＰＬＢ−ＳＥが心筋細胞の収縮性に影響を及ぼすか否かを試験した。分離した成体心筋細胞をペプチドで前処理して、ＰＭＡで処理した。ピーク短縮を含む収縮性パラメータの減少及び収縮と弛緩速度で示すように、ＰＭＡは収縮性をかなり減少させた。ψＰＬＢ−ｗｔ及びψＰＬＢ−ＴＥが収縮性においてないか軽微な効果を示すのに対し、ψＰＬＢ−ＳＥは、収縮性のＰＭＡ誘導された減少を完璧に防止した（図２ａ）。ＰＭＡはまた、Ｃａ２＋一過性増幅の顕著な減少及びＣａ２＋一過性減少の時定数（τ）の顕著な増加を誘発した。ψＰＬＢ−ｗｔ及びψＰＬＢ−ＴＥの細胞内Ｃａ２＋調節に対する効果が、無視しても良い程度または僅かな程度であるのに対し、ψＰＬＢ−ＳＥ前処理は、上記ＰＭＡ誘導された欠陷を完全に転換させた（図２ｂ）。このようなデータは、ψＰＬＢ−ＳＥの前処理によって内因性ＰＬＢの復元されたリン酸化レベルが収縮性を正常化させることを示す。ψＰＬＢ−ＳＤ及びψＰＬＢ−６−ｍｅｒは、いずれも収縮性維持及びカルシウムイオンの調節にψＰＬＢ−ＳＥと同様に効果的だった（図２ｃ及び２ｄ）。
【００９７】
ψＰＬＢ−ＳＥはエクスビボで虚血／再潅流後の機能的回復を向上する。
本発明者らは、さらに、エクスビボで虚血／再潅流（Ｉ／Ｒ：  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）中のψＰＬＢ−ＳＥの利点を実験した。ラットの心臓をランゲンドルフ潅流し、全般的な虚血誘導のために２０分間潅流を中止した後、３０分間再潅流した。Ｉ／Ｒは左心室の弛緩期圧力を顕著に低下させた（３７〜４４ｍｍＨｇ  ｖｓ．虚血前  ８０〜１００ｍｍＨｇ）。再潅流時点で、ψＰＬＢ−ＳＥまたは対照群ペプチドＴＡＴを再潅流溶液に添加した。ＴＡＴは効果がなかったのに対し、ψＰＬＢ−ＳＥは弛緩期圧力を顕著に増加させた（７３〜７８ｍｍＨｇ）（図３ａ）。実験の終了時点で、心臓溶解物を製造してウェスタンブロッティングを行った。Ｉ／ＲはＳｅｒ１６及びＴｈｒ１７いずれにおいてもＰＬＢのリン酸化をかなり減少させ、ψＰＬＢ−ＳＥはＳｅｒ１６でのリン酸化を顕著に回復させた。また、Ｉ／Ｒは細胞死滅に関連するカスパーゼ３を活性化させ、ψＰＬＢ−ＳＥはこのような結果を完璧に逆行させた（図３ｂ）。総括的に、このようなデータはψＰＬＢ−ＳＥがＳｅｒ１６でＰＬＢのリン酸化レベルを増加させることによって、少なくとも部分的でもＩ／Ｒ後の機能的な回復を向上することを示す。
【００９８】
考察
ＳＥＲＣＡ２ａは心筋細胞で細胞内Ｃａ２＋調節の決定的な調節子であり、心不全及びＩ／Ｒ損傷での上記ＳＥＲＣＡ２ａの役割はよく確立されている［６］。したがって、ＳＥＲＣＡ２ａレベル及び／または活性の正常化様相は、重要な治療的潜在要素になることができる。不全性心臓で抑制されたＳＥＲＣＡ２ａレベルの遺伝子移動媒介の回復が一つの接近になることができる。このような接近は、心不全動物モデルで効果的であり［１３−１６］、最近末期ヒト心不全患者において安全で効果的であることが明らかになった［１７、１８］。
【００９９】
ＰＬＢはＳＥＲＣＡ２ａの内因性阻害剤であり、したがって、ＰＬＢはＳＥＲＣＡ２ａの活性化調節のための潜在的な標的である。アンチセンスＲＮＡ［３５］またはｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）［３６］によるＰＬＢの下向き調節は、ＳＥＲＣＡ２ａの活性化及び心筋細胞の収縮性を部分的に回復させた。内因性ＰＬＢの構造を崩壊するために設計されたＰＬＢのドミナントネガティブ型であるＫ３Ｅ／Ｒ１４Ｅは、新生児及び成体心筋細胞でＳＥＲＣＡ２ａ活性を向上した［３５］。
【０１００】
本発明において、本発明者らは、ψＰＬＢ−ＳＥがＰＰ１に対するデコイペプチドとして作用することによって、ＰＬＢの脱リン酸化を防止することを示した。興味深いことに、本発明者らは、ψＰＬＢ−ＴＥがψＰＬＢ−ＳＥほど効果的ではないことを発見した（図１ｃ）。たとえ、構造上、現在認識が不可能であるとしても、Ｓｅｒ１６にリン酸化されたＰＬＢがＴｈｒ１７にリン酸化されたＰＬＢよりもＰＰ１に対してより良い基質であるのを把握することができる。Ｔｈｒ１７部位のリン酸化は、β−アドレナジック刺激中に唯一にＳｅｒ１６にリン酸化に続いて起きることは注目に値する［３６］。したがって、Ｔｈｒ１７にのみリン酸化されたＰＬＢはインビボで存在しないだろう。結論として、本発明者らは、ＳＥＲＣＡ２ａ活性の回復によって、ψＰＬＢ−ＳＥが心臓保護効果を奏するのを示した。短いペプチドのように、ψＰＬＢ−ＳＥはｓｉＲＮＡまたは突然変異ＰＬＢタンパク質よりも種々の治療的な利点を有する。今後の実験は、ψＰＬＢ−ＳＥが心不全の多様な手術的及び遺伝的なモデルに効果的であるか否かを決定するようになるだろう。
【０１０１】
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されないことは明からである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれの等価物によって定義されると言える。
【０１０２】
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８．  Ｓｃｈａｕｂ  ＭＣ，  Ｈｅｆｔｉ  ＭＡ，  Ｚａｕｇｇ  Ｍ．  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ２００６  Ａｕｇ；  ４１（２）：  １８３−２１４．
９．  ＭａｃＬｅｎｎａｎ  ＤＨ，  Ｋｒａｎｉａｓ  ＥＧ．  Ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ：  ａ  ｃｒｕｃｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００３  Ｊｕｌ；  ４（７）：  ５６６−７７．
１０．  Ａｒａｉ  Ｍ，  Ｍａｔｓｕｉ  Ｈ，  Ｐｅｒｉａｓａｍｙ  Ｍ．  Ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ａｎｄ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．  １９９４  Ａｐｒ；  ７４（４）：  ５５５−６４．
１１．  Ｈａｓｅｎｆｕｓｓ  Ｇ，  Ｒｅｉｎｅｃｋｅ  Ｈ，  Ｓｔｕｄｅｒ  Ｒ，  Ｍｅｙｅｒ  Ｍ，  Ｐｉｅｓｋｅ  Ｂ，  Ｈｏｌｔｚ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  Ｃａ（２＋）−ＡＴＰａｓｅ  ｉｎ  ｆａｉｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｏｎｆａｉｌｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．  １９９４  Ｓｅｐ；  ７５（３）：  ４３４−４２．
１２．  Ｍｅｙｅｒ  Ｍ，  Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇｅｒ  Ｗ，  Ｐｉｅｓｋｅ  Ｂ，  Ｈｏｌｕｂａｒｓｃｈ  Ｃ，  Ｈｅｉｌｍａｎｎ  Ｃ，  Ｐｏｓｉｖａｌ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｆａｉｌｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  １９９５  Ａｕｇ  １５；  ９２（４）：  ７７８−８４．
１３．  Ｍｉｙａｍｏｔｏ  ＭＩ，  ｄｅｌ  Ｍｏｎｔｅ  Ｆ，  Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｕ，  ＤｉＳａｌｖｏ  ＴＳ，  Ｋａｎｇ  ＺＢ，  Ｍａｔｓｕｉ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ＳＥＲＣＡ２ａ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｌｅｆｔ−ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｏｒｔｉｃ−ｂａｎｄｅｄ  ｒａｔｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２０００  Ｊａｎ  １８；  ９７（２）：  ７９３−８．
１４．  ｄｅｌ  Ｍｏｎｔｅ  Ｆ，  Ｈａｊｊａｒ  ＲＪ，  Ｈａｒｄｉｎｇ  ＳＥ．  Ｏｖｅｒｗｈｅｌｍｉｎｇ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＳＥＲＣＡ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．  ２００１  Ｊｕｎ  ８；  ８８（１１）：  Ｅ６６−７．
１５．  Ｓａｋａｔａ  Ｓ，  Ｌｅｂｅｃｈｅ  Ｄ，  Ｓａｋａｔａ  Ｙ，  Ｓａｋａｔａ  Ｎ，  Ｃｈｅｍａｌｙ  ＥＲ，  Ｌｉａｎｇ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｃｏｒｏｎａｒｙ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ＳＥＲＣＡ２ａ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ  ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｓｉｚｅ  ｉｎ  ａ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００７  Ｆｅｂ；  ２９２（２）：  Ｈ１２０４−７．
１６．  Ｋａｗａｓｅ  Ｙ，  Ｌｙ  ＨＱ，  Ｐｒｕｎｉｅｒ  Ｆ，  Ｌｅｂｅｃｈｅ  Ｄ，  Ｓｈｉ  Ｙ，  Ｊｉｎ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＳＥＲＣＡ２ａ    ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ａ  ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ２００８  Ｍａｒ  １８；  ５１（１１）：  １１１２−９．
１７．  Ｊａｓｋｉ  ＢＥ，  Ｊｅｓｓｕｐ  ＭＬ，  Ｍａｎｃｉｎｉ  ＤＭ，  Ｃａｐｐｏｌａ  ＴＰ，  Ｐａｕｌｙ  ＤＦ，  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｌｃｉｕｍ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  （ＣＵＰＩＤ  Ｔｒｉａｌ），  ａ  ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｈａｓｅ  １／２  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ．  Ｊ  Ｃａｒｄ  Ｆａｉｌ．  ２００９  Ａｐｒ；  １５（３）：  １７１−８１．
１８．  Ｊｅｓｓｕｐ  Ｍ，  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ｂ，  Ｍａｎｃｉｎｉ  Ｄ，  Ｃａｐｐｏｌａ  Ｔ，  Ｐａｕｌｙ  ＤＦ，  Ｊａｓｋｉ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ  （ＣＵＰＩＤ）：  ａ  ｐｈａｓｅ  ２  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ２０１１  Ｊｕｌ  １９；  １２４（３）：  ３０４−１３．
１９．  Ｌｅ  Ｐｅｕｃｈ  ＣＪ，  Ｈａｉｅｃｈ  Ｊ，  Ｄｅｍａｉｌｌｅ  ＪＧ．  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｂｙ  ｃｙｃｌｉｃ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｃａｌｃｉｕｍ−−ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  １９７９  Ｎｏｖ  １３；  １８（２３）：  ５１５０−７．
２０．  Ｊａｍｅｓ  Ｐ，  Ｉｎｕｉ  Ｍ，  Ｔａｄａ  Ｍ，  Ｃｈｉｅｓｉ  Ｍ，  Ｃａｒａｆｏｌｉ  Ｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａ２＋  ｐｕｍｐ  ｏｆ  ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．  Ｎａｔｕｒｅ．  １９８９  Ｎｏｖ  ２；  ３４２（６２４５）：  ９０−２．
２１．  Ｍａｔｔｉａｚｚｉ  Ａ，  Ｍｕｎｄｉｎａ−Ｗｅｉｌｅｎｍａｎｎ  Ｃ，  Ｇｕｏｘｉａｎｇ  Ｃ，  Ｖｉｔｔｏｎｅ  Ｌ，  Ｋｒａｎｉａｓ  Ｅ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｔｈｒ１７  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．  ２００５  Ｄｅｃ  １；  ６８（３）：  ３６６−７５．
２２．  ＭａｃＤｏｕｇａｌｌ  ＬＫ，  Ｊｏｎｅｓ  ＬＲ，  Ｃｏｈｅｎ  Ｐ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ｗｈｉｃｈ  ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９１  Ｍａｒ  ２８；  １９６（３）：  ７２５−３４．
２３．  Ｓｔｅｅｎａａｒｔ  ＮＡ，  Ｇａｎｉｍ  ＪＲ，  Ｄｉ  Ｓａｌｖｏ  Ｊ，  Ｋｒａｎｉａｓ  ＥＧ．  Ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｄｉａｃ  ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｉｓ  ａ  ｔｙｐｅ  １  ｅｎｚｙｍｅ．  Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  １９９２  Ｆｅｂ  １４；  ２９３（１）：  １７−２４．
２４．  Ｓｃｈｗｉｎｇｅｒ  ＲＨ，  Ｍｕｎｃｈ  Ｇ，  Ｂｏｌｃｋ  Ｂ，  Ｋａｒｃｚｅｗｓｋｉ  Ｐ，  Ｋｒａｕｓｅ  ＥＧ，  Ｅｒｄｍａｎｎ  Ｅ．  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｃａ（２＋）−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＳＥＲＣＡ  ２ａ  ｉｎ  ｆａｉｌｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｅｒｉｎ−１６  ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．  １９９９  Ｍａｒ；  ３１（３）：  ４７９−９１．
２５．  Ｍｉｓｈｒａ  Ｓ，  Ｇｕｐｔａ  ＲＣ，  Ｔｉｗａｒｉ  Ｎ，  Ｓｈａｒｏｖ  ＶＧ，  Ｓａｂｂａｈ  ＨＮ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  Ｃａ（２＋）  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｆａｉｌｉｎｇ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ．  Ｊ  Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ２００２  Ｍａｒ；  ２１（３）：  ３６６−７３．
２６．  Ｓａｎｄｅ  ＪＢ，  Ｓｊａａｓｔａｄ  Ｉ，  Ｈｏｅｎ  ＩＢ，  Ｂｏｋｅｎｅｓ  Ｊ，  Ｔｏｎｎｅｓｓｅｎ  Ｔ，  Ｈｏｌｔ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｓｅｒｉｎｅ（１６）  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆａｉｌｉｎｇ  ｒａｔ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ：  ａ  ｍａｊｏｒ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒ  ｔｏ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ＳＥＲＣＡ２  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．  ２００２  Ｆｅｂ  １；  ５３（２）：  ３８２−９１．
２７．  Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｊ，  Ｅｓｃｈｅｎｈａｇｅｎ  Ｔ，  Ｊｏｎｅｓ  ＬＲ，  Ｌｉｎｃｋ  Ｂ，  Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｗ，  Ｓｃｈｏｌｚ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．  １９９７  Ｊａｎ；  ２９（１）：  ２６５−７２．
２８．  Ｈｕａｎｇ  Ｂ，  Ｗａｎｇ  Ｓ，  Ｑｉｎ  Ｄ，  Ｂｏｕｔｊｄｉｒ  Ｍ，  Ｅｌ−Ｓｈｅｒｉｆ  Ｎ．  Ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｄ  ｂａｓａｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｏｓｔｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｒｅｍｏｄｅｌｅｄ  ｒａｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ：  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ，  Ｇ（ｉ）  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ，  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．  １９９９  Ｏｃｔ  ２９；  ８５（９）：  ８４８−５５．
２９．  Ｔａ  ＨＭ，  Ｎｇｕｙｅｎ  ＧＴ，  Ｊｉｎ  ＨＭ，  Ｃｈｏｉ  Ｊ，  Ｐａｒｋ  Ｈ，  Ｋｉｍ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ  ｌｉｇａｎｄ  （ＲＡＮＫＬ）  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｏｓｔｅｏｐｅｔｒｏｓｉｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２０１０  Ｎｏｖ  ２３；  １０７（４７）：  ２０２８１−６．
３０．  Ｌａｗ  ＪＨ，  Ｌｉ  Ｙ，  Ｔｏ  Ｋ，  Ｗａｎｇ  Ｍ，  Ａｓｔａｎｅｈｅ  Ａ，  Ｌａｍｂｉｅ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｃｏｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｙ−ｂｏｘ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｈｉｌｓｔ  ｓｐａｒｉｎｇ  ｎｏｒｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１０；  ５（９）．
３１．  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｈ，  Ｄｕｒｅｌｌ  ＳＲ，  Ｆｅｎｇ  Ｈ，  Ｂａｉ  Ｙ，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＣＷ，  Ａｐｐｅｌｌａ  Ｅ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ２Ｃｄｅｌｔａ，  Ｗｉｐ１．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ２００６  Ｎｏｖ  ７；  ４５（４４）：  １３１９３−２０２．
３２．  Ｈａｙａｓｈｉ  Ｒ，  Ｔａｎｏｕｅ  Ｋ，  Ｄｕｒｅｌｌ  ＳＲ，  Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ＤＫ，  Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＬＭ，  Ａｐｐｅｌｌａ  ＤＨ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｙｃｌｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｓｅｒ／Ｔｈｒ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＰＰＭ１Ｄ  （Ｗｉｐ１）．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ２０１１  Ｍａｙ  ３１；  ５０（２１）：  ４５３７−４９．
３３．  Ｒｅｎ  Ｊ，  Ｗｏｌｄ  ＬＥ．  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｒａｔｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｅ  ｂｙ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  Ｖｉｄｅｏ−Ｂａｓｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ．  Ｂｉｏｌ  Ｐｒｏｃｅｄ  Ｏｎｌｉｎｅ．  ２００１  Ｄｅｃ  １１；  ３：  ４３−５３．
３４．  Ｚｈｏｕ  ＹＹ，  Ｗａｎｇ  ＳＱ，  Ｚｈｕ  ＷＺ，  Ｃｈｒｕｓｃｉｎｓｋｉ  Ａ，  Ｋｏｂｉｌｋａ  ＢＫ，  Ｚｉｍａｎ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｍｏｕｓｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ：  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２０００  Ｊｕｌ；  ２７９（１）：  Ｈ４２９−３６．
３５．  Ｈｅ  Ｈ，  Ｍｅｙｅｒ  Ｍ，  Ｍａｒｔｉｎ  ＪＬ，  ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ  ＰＭ，  Ｈｏ  Ｐ，  Ｌｏｕ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ａｎｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ  ｏｎ  ＳＲ  Ｃａ（２＋）−ＡＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９９  Ａｕｇ  ３１；  １００（９）：  ９７４−８０．
３６．  Ｌｕｏ  Ｗ，  Ｃｈｕ  Ｇ，  Ｓａｔｏ  Ｙ，  Ｚｈｏｕ  Ｚ，  Ｋａｄａｍｂｉ  ＶＪ，  Ｋｒａｎｉａｓ  ＥＧ．  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｄｅｆｉｎｅ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｄｕａｌ  ｓｉｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９８  Ｆｅｂ  ２０；  ２７３（８）：  ４７３４−９．
【図１ａ】
0006404213.tif 000002
【図１ｂ】
0006404213.tif 000003
【図１ｃ】
0006404213.tif 000004
【図１ｄ】
0006404213.tif 000005
【図２ａ】
0006404213.tif 000006
【図２ｂ】
0006404213.tif 000007
【図２ｃ】
0006404213.tif 000008
【図２ｄ】
0006404213.tif 000009
【図３ａ】
0006404213.tif 000010
【図３ｂ】
0006404213.tif 000011
【配列表】
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