(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象の生物のゲノムにおける増幅対象領域を標識されたプライマーを用いて増幅させ、得られた増幅産物の標識を検出することにより、該ゲノムを有する生物を検出するために用いられる生物検出用担体であって、
前記増幅産物にハイブリダイズする増幅産物検出用プローブが固定化された増幅産物検出用スポットと、
前記標識されたプライマーにハイブリダイズするプライマー検出用プローブが固定化されたプライマー検出用スポットと、を備えた
ことを特徴とする生物検出用担体。
【請求項２】
前記プライマー検出用スポットに、
前記標識されたプライマーを構成するフォワードプライマーにハイブリダイズするプローブ、及び／又は、
前記標識されたプライマーを構成するリバースプライマーにハイブリダイズするプローブが固定化された
ことを特徴とする請求項１記載の生物検出用担体。
【請求項３】
前記標識が、蛍光物質又は発色物質による標識であることを特徴とする請求項１又は２記載の生物検出用担体。
【請求項４】
前記増幅に用いられた反応液における前記標識されたプライマーの有無が、前記プライマー検出用スポットにおける標識の検出にもとづき判定されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の生物検出用担体。
【請求項５】
前記増幅に用いられた反応液における前記増幅産物の有無と前記標識されたプライマーの有無が、前記増幅産物検出用スポットと前記プライマー検出用スポットにおける標識の検出にもとづき同時に判定されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の生物検出用担体。
【請求項６】
検出対象の生物のゲノムにおける増幅対象領域を標識されたプライマーを用いて増幅させ、得られた増幅産物の標識を検出することにより、該ゲノムを有する生物を検出する生物の検出方法であって、
前記増幅産物にハイブリダイズする増幅産物検出用プローブが固定化された増幅産物検出用スポットと、前記標識されたプライマーにハイブリダイズするプライマー検出用プローブが固定化されたプライマー検出用スポットと、を備えた担体を用い、
前記増幅産物検出用プローブに前記増幅産物をハイブリダイズさせると共に、前記プライマー検出用プローブに前記標識されたプライマーをハイブリダイズさせ、
前記増幅産物検出用スポットと前記プライマー検出用スポットにおける標識の検出にもとづいて、前記増幅に用いられた反応液における前記増幅産物の有無と前記標識されたプライマーの有無を同時に判定する
ことを特徴とする生物の検出方法。
【請求項７】
前記プライマー検出用スポットにおいて標識が検出された場合、
前記増幅に用いられた反応液に前記標識されたプライマーが含有されていたと判定することを特徴とする請求項６記載の生物の検出方法。
【請求項８】
前記プライマー検出用スポットにおいて標識が検出され、かつ前記増幅産物検出用スポットにおいて標識が検出されなかった場合、
前記増幅産物検出用スポットにおいて標識が検出されなかった理由が、前記増幅に用いられた反応液への前記標識されたプライマーの入れ忘れではないと判定する
ことを特徴とする請求項７記載の生物の検出方法。
【請求項９】
前記プライマー検出用スポットにおいて標識が検出されなかった場合、
前記増幅に用いられた反応液に前記標識されたプライマーが含有されていなかったと判定することを特徴とする請求項６記載の生物の検出方法。
【請求項１０】
前記プライマー検出用スポットにおいて標識が検出されず、かつ前記増幅産物検出用スポットにおいて標識が検出されなかった場合、
前記増幅産物検出用スポットにおいて標識が検出されなかった理由が、前記増幅に用いられた反応液への前記標識されたプライマーの入れ忘れであると判定することを特徴とする請求項９記載の生物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子検査技術に関し、特に遺伝子増幅を行って得られた増幅産物の標識を検出することにより、該遺伝子を有する生物を特定する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、遺伝子検査では、環境や食品中から生物の細胞等を採取してＤＮＡを抽出し、特定の遺伝子を増幅させる反応を行って、得られた増幅産物のサイズを電気泳動で確認することにより、検査対象の生物の存否の判定が行われている。このようにして増幅産物を得るためには、増幅に用いられる反応液中にプライマーと呼ばれる短いサイズの一本鎖核酸を添加する必要がある。
【０００３】
電気泳動の結果が陰性の場合は、通常、検査対象の生物が存在していなかったと判断される。しかしながら、反応液中にプライマーを入れ忘れるという人為的なミスが生じた場合にも電気泳動の結果は陰性となる。したがって、電気泳動の結果が陰性の場合、その原因が、検査対象の生物が存在していなかったことによるものか、あるいはプライマーの入れ忘れによるものかは、判別がつかないという問題があった。
特に、処理しなければならないサンプル数が多い場合や、検査対象の生物種が多いために多数のプライマーを反応液に添加する必要がある場合などには、このような人為的ミスが生じる可能性は増大する。このため、電気泳動の結果が陰性の場合の原因追及が、困難を極めることも少なくなかった。
【０００４】
一方、増幅産物の検出方法として、電気泳動のみならず、増幅産物にハイブリダイズするプローブが固定化されたスポットを備えたＤＮＡチップを用いた方法が広く行われている。例えば、特許文献１に記載の食中毒菌検出用担体を用いれば、７種類の食中毒菌をそれぞれ特異的に同時に検出することが可能になっている。
【０００５】
【特許文献１】国際公開２０１１−１４２１１９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、このようなＤＮＡチップを用いても、遺伝子の増幅工程において反応液中にプライマーを添加し忘れたために増幅産物が得られなかった場合には、ＤＮＡチップによる検査対象の検査結果は陰性となり、その原因が、検査対象の生物が存在していなかったことによるものか、あるいはプライマーの入れ忘れによるものかは、電気泳動の場合と同様に、やはり判別がつかなかった。
【０００７】
そこで、本発明者らは鋭意研究し、ＤＮＡチップに増幅産物を検出するためのプローブを固定化したスポットの他に、プライマーを検出するためのプローブを固定化したスポットを備えることによって、ＤＮＡチップにより増幅産物を検出すると共に、プライマーの入れ忘れも同時に検出可能にすることに成功し、本発明を完成させた。
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、遺伝子検査結果が陰性であった場合に、その原因が、核酸増幅に用いられた反応液中へのプライマーの入れ忘れに起因するものであるか否かを判定可能な生物検出用担体、及び生物の検出方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明の生物検出用担体は、検出対象の生物のゲノムにおける増幅対象領域を標識されたプライマーを用いて増幅させ、得られた増幅産物の標識を検出することにより、該ゲノムを有する生物を検出するために用いられる生物検出用担体であって、前記増幅産物にハイブリダイズする増幅産物検出用プローブが固定化された増幅産物検出用スポットと、前記標識されたプライマーにハイブリダイズするプライマー検出用プローブが固定化されたプライマー検出用スポットと、を備えた構成としてある。
【０００９】
また、本発明の生物の検出方法は、検出対象の生物のゲノムにおける増幅対象領域を標識されたプライマーを用いて増幅させ、得られた増幅産物の標識を検出することにより、該ゲノムを有する生物を検出する生物の検出方法であって、前記増幅産物にハイブリダイズする増幅産物検出用プローブが固定化された増幅産物検出用スポットと、前記標識されたプライマーにハイブリダイズするプライマー検出用プローブが固定化されたプライマー検出用スポットとを備えた担体を用い、前記増幅産物検出用プローブに前記増幅産物をハイブリダイズさせると共に、前記プライマー検出用プローブに前記標識されたプライマーをハイブリダイズさせ、前記増幅産物検出用スポットと前記プライマー検出用スポットにおける標識の検出にもとづいて、前記増幅に用いられた反応液における前記増幅産物の有無と前記標識されたプライマーの有無を同時に判定する方法としてある。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、遺伝子検査結果が陰性であった場合に、その原因が、核酸増幅に用いられた反応液中へのプライマーの入れ忘れに起因するものであるか否かを判定可能な生物検出用担体、及び生物の検出方法の提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施形態に係る生物検出用担体及び生物の検出方法の実施例で用いたＰＣＲ反応液の組成を示す図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る生物検出用担体及び生物の検出方法の実施例で用いたプライマーの塩基配列を示す図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る生物検出用担体及び生物の検出方法の実施例で用いたプローブの塩基配列を示す図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る生物検出用担体及び生物の検出方法の実施例で用いたＤＮＡチップにおけるＳ／Ｎ比値（配列番号５〜７）を示す図である。
【図５】本発明の一実施形態に係る生物検出用担体及び生物の検出方法の実施例で用いたＤＮＡチップにおけるＳ／Ｎ比値（配列番号８〜１０）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態に係る生物検出用担体及び生物の検出方法について、詳細に説明する。
本実施形態の生物検出用担体は、検出対象の生物のゲノムにおける増幅対象領域を標識されたプライマーを用いて増幅させ、得られた増幅産物の標識を検出することにより、該ゲノムを有する生物を検出するために用いられる生物検出用担体であって、増幅産物にハイブリダイズする増幅産物検出用プローブが固定化された増幅産物検出用スポットと、標識されたプライマーにハイブリダイズするプライマー検出用プローブが固定化されたプライマー検出用スポットとを備えたことを特徴とする。
【００１３】
本実施形態の生物検出用担体として、マイクロアレイやＤＮＡチップを好適に用いることができる。また、本実施形態の生物検出用担体として、ニトロセルロースなどの膜を使用しても良い。
【００１４】
本実施形態の生物検出用担体の使用に先立って、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などの核酸増幅反応によって、検査対象の生物のゲノムにおける増幅対象領域（標的領域）が標識されたプライマーを用いて増幅される。すなわち、検査対象の生物の細胞から抽出されたＤＮＡ（テンプレート）における遺伝子から選択された標的領域が増幅され、これにより得られた増幅産物は、ＤＮＡなどの核酸であり、標識を有している。なお、核酸増幅反応はＰＣＲに限定されず、例えば、ＬＡＭＰ、ＳＤＡ、ＬＣＡ等を用いることもできる。また、核酸は核酸アナログであっても良く、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＢＮＡ）／Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ，登録商標）などであっても良い。
【００１５】
本実施形態の生物検出用担体には、増幅産物にハイブリダイズする増幅産物検出用プローブがスポッティングされて、当該プローブが固定化された増幅産物検出用スポットを備えている。そして、本実施形態の生物検出用担体に核酸増幅に用いられた反応液を滴下して、増幅産物を増幅産物検出用プローブにハイブリダイズさせ、増幅産物の標識を検出することによって、反応液中における増幅産物の有無を検出することができる。
【００１６】
また、本実施形態の生物検出用担体には、標識されたプライマーにハイブリダイズするプライマー検出用プローブがスポッティングされて、当該プローブが固定化されたプライマー検出用スポットを備えている。そして、本実施形態の生物検出用担体に核酸増幅に用いられた反応液を滴下して、プライマーをプライマー検出用プローブにハイブリダイズさせ、プライマーの標識を検出することによって、反応液中におけるプライマーの有無を検出することができる。
【００１７】
すなわち、本実施形態の生物検出用担体によれば、増幅産物の有無の検出と同時に、核酸増幅に用いられた反応液中にプライマーが添加されていたか否かを検出することができる。
このため、例えば、反応液中にプライマーが添加されていたことが検出され、かつ増幅産物が検出されなかった場合には、その原因が、反応液中へのプライマーの入れ忘れではなく、検査対象の生物が存在していなかったことによるものと判断することが可能となる。
【００１８】
プライマー検出用プローブとしては、標識されたプライマーを構成するフォワードプライマーにハイブリダイズするプローブ、又は、標識されたプライマーを構成するリバースプライマーにハイブリダイズするプローブのいずれか一方を用いることができる。この場合、プライマー検出用スポットには、標識されたプライマーを構成するフォワードプライマーにハイブリダイズするプローブ、又は、標識されたプライマーを構成するリバースプライマーにハイブリダイズするプローブが固定化される。これにより、核酸増幅に用いられた反応液中にプライマーが添加されていたか否かを検出することが可能である。
【００１９】
また、プライマー検出用プローブとして、標識されたプライマーを構成するフォワードプライマーにハイブリダイズするプローブ、及び、標識されたプライマーを構成するリバースプライマーにハイブリダイズするプローブの両方を用いることができる。この場合、プライマー検出用スポットには、標識されたプライマーを構成するフォワードプライマーにハイブリダイズするプローブ、及び、標識されたプライマーを構成するリバースプライマーにハイブリダイズするプローブが固定化される。これにより、核酸増幅に用いられた反応液中にプライマーが添加されていたか否かをより確実に検出することが可能となる。
【００２０】
本実施形態の生物検出用担体において、標識の方法は特に限定されないが、蛍光標識又は発色物質による標識を好適に用いることができる。
ＰＣＲにより蛍光標識を行う場合は、蛍光標識されたプライマーを用いて、末端のみが蛍光標識された増幅産物を得ることができる。
蛍光標識成分としては、Ｃｙ５やＣｙ３などを好適に用いることができる。さらに、標識として、ジコキシゲニン、ビオチン、放射性同位体などのその他のものを用いることも可能である。
【００２１】
標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができる。蛍光標識を検出する場合は、例えば、東洋鋼鈑株式会社のＢＩＯＳＨＯＴ（Ｒ）を用いて、増幅産物の蛍光強度値を測定することにより行うことができる。
また、測定結果として、蛍光強度値の他、Ｓ／Ｎ比値（Signal  to  Noise  ratio，（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）を算出することも好ましい。Ｓ／Ｎ比値にもとづいて、測定結果が陽性であるか陰性であるかを、精度高く判定することができるためであり、一般にＳ／Ｎ比値が３〜４以上の場合、陽性と判定することができる。なお、以下の実施例では、Ｓ／Ｎ比値が４以上の場合を陽性と判定している。
【００２２】
次に、本実施形態の生物の検出方法について説明する。
本実施形態の生物の検出方法は、検出対象の生物のゲノムにおける増幅対象領域を標識されたプライマーを用いて増幅させ、得られた増幅産物の標識を検出することにより、該ゲノムを有する生物を検出する生物の検出方法であって、増幅産物にハイブリダイズする増幅産物検出用プローブが固定化された増幅産物検出用スポットと、標識されたプライマーにハイブリダイズするプライマー検出用プローブが固定化されたプライマー検出用スポットとを備えた担体を用い、増幅産物検出用プローブに増幅産物をハイブリダイズさせると共に、プライマー検出用プローブに標識されたプライマーをハイブリダイズさせ、増幅産物検出用スポットとプライマー検出用スポットにおける標識の検出にもとづいて、増幅に用いられた反応液における増幅産物の有無と標識されたプライマーの有無を同時に判定することを特徴とする。
【００２３】
すなわち、本実施形態の生物の検出方法では、検査対象の生物の細胞からＤＮＡが抽出された後、そのＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅するための標識されたプライマーを用いてＰＣＲなどの核酸増幅反応を実施し、標識された増幅産物を生成する（増幅工程）。
なお、検査対象の生物として、カビや食中毒菌などの微生物を選択する場合、増幅工程に先立って、環境や食品中から微生物のサンプリングを行い、複数の微生物を同時に増菌培養した後、得られた培養液からＤＮＡを同時に抽出することが好ましい。
【００２４】
次に、本実施形態の生物検出用担体に、増幅に用いられた反応液を接触させて、増幅産物を増幅産物検出用プローブにハイブリダイズさせると共に、プライマーをプライマー検出用プローブにハイブリダイズさせる（ハイブリダイズ工程）。
そして、増幅産物とプライマーの標識を検出することにより、反応液中における増幅産物の有無と、プライマーの有無を同時に判定する（検出工程）。
【００２５】
このような本実施形態の生物の検出方法において、プライマー検出用スポットで標識が検出された場合、増幅に用いられた反応液中に標識されたプライマーが含有されていたと判定することができる。
また、プライマー検出用スポットで標識が検出され、かつ増幅産物検出用スポットで標識が検出されなかった場合、増幅産物検出用スポットにおいて標識が検出されなかった理由が、増幅に用いられた反応液へのプライマーの入れ忘れではなく、検査対象の生物が存在していなかったことによるものと判断することが可能となる。
【００２６】
さらに、プライマー検出用スポットにおいて標識が検出されなかった場合、増幅に用いられた反応液にプライマーが含有されていなかったと判定することができる。
また、プライマー検出用スポットにおいて標識が検出されず、かつ増幅産物検出用スポットにおいて標識が検出されなかった場合、増幅産物検出用スポットにおいて標識が検出されなかった理由が、増幅に用いられた反応液への標識されたプライマーの入れ忘れであると判定することができる。すなわち、増幅産物検出用スポットにおいて標識が検出されなかった直接的な原因が、反応液中へのプライマーの入れ忘れであることが確認できるため、反応液中にプライマーを入れて再度試験を行い、検査対象の生物の有無を再確認することが可能となる。
【００２７】
本実施形態の生物検出用担体及び生物の検出方法において、標識されたプライマーは、当該プライマーにより得られる増幅産物を検出するための増幅産物検出用プローブとはハイブリダイズしないように設計される。また、プライマー検出用プローブは、ハイブリダイズの対象である標識されたプライマーにより得られた増幅産物とは適切にハイブリダイズすることができない。
【００２８】
以上説明したように、本実施形態の生物検出用担体及び生物の検出方法によれば、遺伝子検査結果が陰性であった場合に、その原因が、核酸増幅に用いられた反応液中へのプライマーの入れ忘れに起因するものであるか否かを判定することができる。
すなわち、プライマー検出用スポットで標識が検出され、かつ増幅産物検出用スポットで標識が検出されなかった場合には、その原因が、反応液中へのプライマーの入れ忘れではなく、検査対象の生物が存在していなかったことによるものと判断することが可能となる。
また、プライマー検出用スポットにおいて標識が検出されず、かつ増幅産物検出用スポットにおいて標識が検出されなかった場合には、その原因が、反応液中へのプライマーの入れ忘れであることを容易に確認することが可能となる。
【実施例】
【００２９】
本実施形態の生物検出用担体及び生物の検出方法の効果を確認するために、プライマーと試料の有無が異なる８種類の反応液を用いてＰＣＲを実施し、増幅産物検出用スポットとプライマー検出用スポットを備えた担体を用いて、増幅産物とプライマーの検出試験を行った。
【００３０】
検出対象の生物としては、アスペルギルス  フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ，菌株番号：ＪＣＭ１０２５２株）を使用した。この菌株のゲノムは、ｒＲＮＡ遺伝子におけるＩＴＳ領域及びβチューブリン遺伝子を有している。この菌株をＭ４０Ｙ寒天培地を用いて２５℃暗所下で７日間静置培養し、得られた菌糸体を検体とした。次いで、菌糸体の一部を採取し、直径０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたチューブに入れ、浸盪装置を用いてカビの細胞を破砕した。そして、ＤＮＡ抽出装置によりカビのゲノムＤＮＡを抽出した。このＤＮＡ抽出液をＰＣＲにおいて使用する試料（テンプレート）とした。
【００３１】
次に、８種類のＰＣＲ反応液（サンプル１〜８）を図１に記載の組成で調整した。すなわち、緩衝液（Ampdirect  G/Crich）４．０μｌ、緩衝液（Ampdirect  addition4）４．０μｌ、核酸合成基質（dNTP  Mixture）１．０μｌ、ＩＴＳ用フォワードプライマー(2.5μM)（配列番号１）１．０μｌ、ＩＴＳ用リバースプライマー(2.5μM)（配列番号２）１．０μｌ、βチューブリン用フォワードプライマー(10μM)（配列番号３）１．０μｌ、βチューブリン用リバースプライマー(10μM)（配列番号４）１．０μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ（Nova  Taq  Hot  Start）０．２μｌ、試料（Asp.flavus  ＤＮＡ濃度:372ng）１．０μｌ、滅菌水（全量を２０μｌとする残量分）とし、プライマーと試料について、含めたものと含めないものを準備した。配列番号１〜４の塩基配列を図２に示す。また、サンプル毎に４つの同一の反応液を準備して、それぞれにつき試験を行った。
【００３２】
サンプル１〜８におけるプライマーと試料の有無は、以下の通りである。
サンプル１：ＩＴＳ用、βチューブリン用の各プライマーと、試料の全てを含む。
サンプル２：βチューブリン用のプライマーと、試料のみを含む。
サンプル３：ＩＴＳ用のプライマーと、試料のみを含む。
サンプル４：試料のみを含む。
サンプル５：ＩＴＳ用、βチューブリン用の各プライマーのみを含む。
サンプル６：βチューブリン用のプライマーのみを含む。
サンプル７：ＩＴＳ用のプライマーのみを含む。
サンプル８：プライマー及び試料を含まない。
【００３３】
ＰＣＲによる遺伝子の増幅には、サーマルサイクラーｅｐグラジエント（エッペンドルフ株式会社）を使用した。反応条件は、以下の通りである。
（１）９５℃  １０分
（２）９５℃  ３０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）５６℃  ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃  ６０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃  １０分
（２）〜（４）を４０サイクル
【００３４】
生物検出用担体として、図３に示すプローブを固定化したものを準備した。
すなわち、プライマー検出用スポットとして、配列番号５の塩基配列（ＩＴＳ用フォワードプライマーの相補鎖）からなるプローブが固定化されたものと、配列番号６の塩基配列（ＩＴＳ用リバースプライマーの相補鎖）からなるプローブが固定化されたものと、配列番号７の塩基配列（βチューブリン用フォワードプライマーの相補鎖）からなるプローブが固定化されたものと、配列番号８の塩基配列（βチューブリン用リバースプライマーの相補鎖）からなるプローブが固定化されたものの４種類を備え、増幅産物検出用スポットとして、配列番号９の塩基配列（ＩＴＳ領域検出用）からなるプローブが固定化されたものと、配列番号１０の塩基配列（βチューブリン遺伝子検出用）からなるプローブが固定化されたものの２種類を備えたものを準備した。
【００３５】
次に、ＰＣＲ反応液４μＬとハイブリダイゼーション用の緩衝液２μＬ（3×SSC／0.3%SDS  クエン酸−生理食塩水−ドデシル硫酸ナトリウム）を混合したものを、上記生物検出用担体に滴下して、４５℃で１時間反応させた。
反応後、生物検出用担体を室温下で洗浄液（2×SSC／0.2%SDS溶液、2×SSC溶液の順に）に浸して洗浄を行い、カバーガラスを載せて蛍光検出器Ｂｉｏｓｈｏｔ(東洋鋼鈑株式会社製)により各プローブのスポットの蛍光を検出した。
【００３６】
具体的には、プローブにハイブリダイズした増幅産物の標識成分（Ｃｙ５）をレーザー光により励起して発光させ、その光量を検出器内に取り付けたＣＣＤカメラにより検出した。また、光量を電気信号に置換して数値化し、蛍光強度値を得た。この蛍光強度値は、当該装置での強度指標であり、単位はない。また、Ｓ／Ｎ比値を算出した。その結果を図４，５に示す。
【００３７】
サンプル１（ＩＴＳ用、βチューブリン用の各プライマーと、試料の全てを含む）では、配列番号５〜１０に対応するスポットは、全て陽性となっている。すなわち、２種類の増幅産物が検出されると共に、４つのプライマーが全て検出されている。
【００３８】
サンプル２（βチューブリン用のプライマーと、試料のみを含む）では、配列番号７，８，１０に対応するスポットのみが、陽性となっている。すなわち、βチューブリン遺伝子の増幅産物が検出されると共に、βチューブリン用の２つのプライマーが検出されている。
一方、ＩＴＳ領域の増幅産物と、ＩＴＳ用のプライマーは検出されていない。したがって、ＩＴＳ領域の増幅産物が検出されない理由が、反応液中にＩＴＳ用のプライマーが含まれていないためであることが分かる。
【００３９】
サンプル３（ＩＴＳ用のプライマーと、試料のみを含む）では、配列番号５，６，９に対応するスポットが、陽性となっている。すなわち、ＩＴＳ領域の増幅産物が検出されると共に、ＩＴＳ用の２つのプライマーが検出されている。
一方、βチューブリン遺伝子の増幅産物は検出されていないが、本サンプルではβチューブリン用プライマーを含まないにも拘わらず、βチューブリン用フォワードプライマーを検出するための配列番号７に対応するスポットも陽性となっている。その理由としては、ＩＴＳ領域の増幅産物が、当該スポットに固定化されたプライマー検出用プローブとハイブリダイズしたことが考えられる。
しかしながら、βチューブリン用リバースプライマーを検出するための配列番号８に対応するスポットは陰性であることから、反応液中にβチューブリン用プライマーが適切に含まれていないことが確認できる。したがって、βチューブリン遺伝子の増幅産物が検出されない理由が、反応液中にβチューブリン用プライマーが適切に含まれていないためであることが分かる。
【００４０】
サンプル４（試料のみを含む）では、全てのスポットが、陰性となっている。すなわち、増幅産物は検出されず、プライマーも検出されていない。したがって、増幅産物が検出されない理由が、反応液中にプライマーが含まれていないためであることが分かる。この場合、反応液中にプライマーを添加することでサンプル１と同条件の試験を行い、反応液中に試料が含まれていることを適切に確認することが可能となる。
【００４１】
サンプル５（ＩＴＳ用、βチューブリン用の各プライマーのみを含む）では、配列番号５〜８に対応するスポットのみが、陽性となっている。すなわち、増幅産物は検出されず、４つのプライマーのみが検出されている。したがって、増幅産物が検出されない理由が、反応液中に試料が含まれていないためであると判断できる。
【００４２】
サンプル６（βチューブリン用のプライマーのみを含む）では、配列番号７，８に対応するスポットのみが、陽性となっている。すなわち、増幅産物は検出されず、βチューブリン用の２つのプライマーのみが検出されている。このとき、βチューブリン用のプライマーが検出されているにも拘わらず、βチューブリン遺伝子の増幅産物が検出されていないことから、反応液中に試料が含まれていないと判断することができる。
【００４３】
サンプル７（ＩＴＳ用のプライマーのみを含む）では、配列番号５，６に対応するスポットのみが、陽性となっている。すなわち、増幅産物は検出されず、ＩＴＳ用の２つのプライマーのみが検出されている。このとき、ＩＴＳ用のプライマーが検出されているにも拘わらず、ＩＴＳ領域の増幅産物が検出されていないことから、反応液中に試料が含まれていないと判断することができる。
【００４４】
サンプル８（プライマー及び試料を含まない）では、全てのスポットが、陰性となっている。すなわち、増幅産物は検出されず、プライマーも検出されていない。この場合、増幅産物が検出されない理由は、反応液中にプライマーが含まれていないためであると判断できる。そして、反応液中にプライマーを添加することでサンプル５と同条件の試験を行い、反応液中に試料が含まれていないことを適切に確認することが可能となる。
【００４５】
以上の通り、本実施形態の生物検出用担体及び生物の検出方法によれば、反応液中における増幅産物とプライマーの有無を同時に検出することできる。このため、増幅産物が検出されない場合、反応液中にプライマーを添加して再度試験を行うことができ、反応液中における試料の有無を適切に確認することが可能となる。
【００４６】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能である。例えば、本実施形態の生物検出用担体及び生物の検出方法において、プライマー及びプローブの配列は、生物種に応じて適宜選択することが可能である。また、実施例では微生物を対象として実験を行っているが、本発明は、対象とする生物の種類を限ることなく適用することが可能である。さらに、実施例では反応液に複数のプライマーセットを添加しているが、一組のプライマーセットのみを添加して実施することも勿論可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明は、食品検査、疫学的環境検査、環境検査、臨床試験、及び家畜衛生等において、生物検出用担体を用いて各種標的を検出する場合などに好適に利用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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