(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）カフェインと、（ｂ）クリルオイルとを含有する筋肉細胞におけるＰＧＣ１α発現促進剤。
【請求項２】
（ａ）カフェインと（ｂ）クリルオイルの含有質量比（ａ／ｂ）が、１／５〜５／１である請求項１記載の筋肉細胞におけるＰＧＣ１α発現促進剤。
【請求項３】
筋肉細胞におけるＰＧＣ１α発現促進剤が、筋肉細胞におけるＰＧＣ１α発現促進用の医薬品、医薬部外品、化粧品又は機能性食品組成物である請求項１又は２記載の筋肉細胞におけるＰＧＣ１α発現促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＧＣ１α発現促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界的に肥満者数は増加傾向にあり、肥満は心臓への負担増加、膝・腰等の関節に対する負担増加、生活習慣病の原因等、様々な悪影響を及ぼす。また、肥満の原因は中性脂肪であり、中性脂肪が過剰に蓄積し、脂肪細胞が増加・肥大することで理想体型を超えて体が大きくなり、外見的にも問題となる。
その肥満を改善させるためには、中性脂肪を分解し、分解して生じた遊離脂肪酸をエネルギーとして消費(燃焼)させる必要がある。しかしながら、効果的に遊離脂肪酸を消費(燃焼)させるためには、ある程度継続的に有酸素運動を実施する必要があり(例えばウォーキングであれば１０分以上等)、遊離脂肪酸を消費(燃焼)させられなければ、遊離脂肪酸が中性脂肪に再合成され、再び脂肪細胞に蓄積するため、痩せないこととなる。一般的に痩せるためには運動が必要である。
しかし、遊離脂肪酸や糖を燃焼してエネルギーを産生する役割を持つミトコンドリアの増加・活性化させることにより、運動を必要とせず、肥満を改善させられる可能性がある。そのミトコンドリアの増加・活性化に影響を与えるのが遺伝子転写を制御するタンパク質であるＰＧＣ−１α(Peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-１α)であり、ＰＧＣ−１αの発現を促進することにより、ミトコンドリアが増加することが知られている（非特許文献１）。
【０００３】
中性脂肪、特に体脂肪の蓄積を抑制したり、分解する作用を有する成分（例えば、カフェイン）が種々報告されており（非特許文献２〜５）、分岐アミノ酸等のアミノ酸類、各種の植物抽出物を配合したサプリメントや飲食品が販売されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Nature, 464, 1313-1319(2010)
【非特許文献２】Biochimica et Biophysica Acta, General Subjects, 496(2), 458-74 (1977)
【非特許文献３】日本薬理学雑誌, 74, 459-466 (1978)
【非特許文献４】J Appl Physiol 115, 260-267 (2013)
【非特許文献５】Toxicology In Vitro, 27(6), 1830-1837 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来の体脂肪燃焼促進剤等は、その効果が十分でない等の問題がある。
従って、本発明は、ミトコンドリアの増加・活性化に着目した新たな体脂肪燃焼促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、種々の動物由来の成分のＰＧＣ１α発現に対する作用を検討してきたところ、カフェインと構成脂肪酸としてω３不飽和脂肪酸を含むリン脂質との組み合わせが、これらの成分をそれぞれ単独で作用させた場合に比べて相乗的に優れた内臓脂肪細胞及び筋肉細胞におけるＰＧＣ１α発現促進作用を有し、ミトコンドリアの増加・活性化を介してエネルギー消費を促進させる剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔３〕を提供するものである。
〔１〕（ａ）カフェインと、（ｂ）構成脂肪酸としてω３不飽和脂肪酸を含むリン脂質とを含有するＰＧＣ１α発現促進剤。
〔２〕内臓脂肪細胞及び／又は筋肉細胞におけるＰＧＣ１αの発現促進剤である〔１〕記載のＰＧＣ１α発現促進剤。
〔３〕（ｂ）構成脂肪酸としてω３不飽和脂肪酸を含むリン脂質が、クリルオイル由来である〔１〕又は〔２〕記載のＰＧＣ１α発現促進剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＰＧＣ１α発現促進剤によれば、内臓細胞及び／又は筋肉細胞におけるＰＧＣ１αの発現が顕著に促進されるため、ミトコンドリアの増加・活性化を介してエネルギー消費が促進される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】内臓脂肪におけるＰＧＣ１α発現促進作用を示す図である。***＜０．００１。
【図２】筋肉細胞におけるＰＧＣ１α発現促進作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のＰＧＣ１α発現促進剤の有効成分は、（ａ）カフェインと、（ｂ）構成脂肪酸としてω３不飽和脂肪酸を含むリン脂質との２成分である。
【００１１】
（ａ）カフェインは、化学名１，３，７−トリメチルキサンチンであり、コーヒー等に含まれる成分である。コーヒー豆から抽出することもできるが、公知の合成法により製造することもできる。カフェインは、中枢神経興奮作用、強心作用などを有し、脂肪燃焼効果を有することが知られているが、ＰＧＣ１α発現に対する作用については知られていない。
【００１２】
（ｂ）構成脂肪酸としてω３不飽和脂肪酸を含むリン脂質としては、ω３高度不飽和脂肪酸であるドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、リノレン酸、α−リノレン酸を構成脂肪酸とするリン脂質が挙げられる。
当該（ｂ）リン脂質は、純粋なものを使用してもよいし、当該（ｂ）リン脂質を含有する天然脂質を用いてもよい。（ｂ）リン脂質を含有する天然脂質としては、例えばオキアミ由来油、特に南極オキアミ由来油（クリルオイル）が好ましい。オキアミ由来油には、ω３高度不飽和脂肪酸含有リン脂質が３５〜７０質量％含まれるので、これを用いるのが好ましい。これらのオキアミ由来油は市販品を使用することができる。
【００１３】
本発明のＰＧＣ１α発現促進剤は、ＰＧＣ１α発現促進効果の点から、（ａ）成分と（ｂ）成分の含有質量比（ａ／ｂ）が１／１００〜１００／１であるのが好ましく、１／５０〜５０／１であるのがより好ましく、１／２０〜２０／１であるのがさらに好ましく、１／１０〜１０／１であるのがさらに好ましく、１／５〜５／１であるのがさらに好ましい。
【００１４】
（ａ）カフェインと（ｂ）リン脂質とを含有する組成物は、後記実施例に示すように、優れた内臓脂肪細胞及び筋肉細胞におけるＰＧＣ１α発現促進作用を有することから、エネルギー消費促進剤として有用である。本発明のＰＧＣ１α発現促進剤を摂取すれば、内臓脂肪細胞及び筋肉細胞におけるミトコンドリアの増加・活性化を介し、エネルギー消費が促進され、肥満が予防又は改善され、痩身効果が得られる。
【００１５】
本発明のＰＧＣ１α発現促進剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品及び機能性食品に配合して使用することができる。また、その投与形態は、経口投与又は経皮投与が好ましい。
【００１６】
本発明のＰＧＣ１α発現促進剤を、医薬品、医薬部外品、化粧品、機能性食品として使用する場合には、（ａ）成分及び（ｂ）成分の混合物をそのまま使用することができるが、効果を損なわない範囲において、例えば、セルロース及びその誘導体、デンプン及びその誘導体、天然及び合成高分子等の乳糖、賦形剤、ステアリン酸及びその塩類、天然及び合成ワックス等の滑沢剤、糖類、酸味剤、香料等の種々の担体を配合することができる。また、本発明の医薬品、医薬部外品、化粧品又は機能性食品は、投与方法、投与経路に応じて散剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤等の剤型とすることができる。
【００１７】
また、本発明のＰＧＣ１α発現促進剤には、体脂肪減少に寄与する他の成分、例えばガルシニアエキス、ギムネマ、カプサイシン、コロハ種子エキス、難消化性デキストリン、その他食物繊維等を配合することができる。
【００１８】
本発明のＰＧＣ１α発現促進剤中には（ａ）成分及び（ｂ）成分を合計で１〜１００質量％、さらに５〜８０質量％、さらに１０〜７０質量％含有するのが好ましい。また、本発明のＰＧＣ１α発現促進剤の摂取量は、（ａ）成分及び（ｂ）成分合計で１日当たり、１０〜５０，０００mgが好ましく、さらに１００〜５，０００mgが好ましい。
【実施例】
【００１９】
次に実施例を挙げてさらに本発明を詳細に説明する。
【００２０】
実施例１
（１）ヒト筋芽細胞の培養
ヒト筋芽細胞は、凍結細胞を融解して１０mLの２％ＨＳ（Ｈｏｒｓｅ  Ｓｅｒｕｍ）／ＤＭＥＭ培地（以下試験培地と称する）に添加し、１８０ｇで５分間遠心した後上清を除去し、６．２５mLの試験培地に細胞を再懸濁した。これを９６ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに２００μＬずつ播種し、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）で７２時間培養して筋管細胞に分化させた。培養後、各サンプルを添加した試験培地に交換し、ＣＯ２インキュベーターで培養してＲＮＡ抽出に用いた。
（２）内臓脂肪細胞の培養
ヒト前駆脂肪細胞（内臓脂肪）は、増殖培地を用いてＴ−７５フラスコに起眠し、８０％ コンフルエントになるまで培養した。培地交換は２日おきに行い０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡを用いて細胞を剥離し、細胞を回収して本試験に用いた。試験には購入後継代数２の細胞を用いた。
前駆脂肪細胞を、増殖培地を用いて１０，０００ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種し、ＣＯ２インキュベーター（５％ ＣＯ２、３７℃）内で２４時間培養した。培養後、１００％コンフルエントになっていることを確認し、２００μＬの分化培地と交換し、ＣＯ２インキュベーターで10日間培養して脂肪細胞へ分化誘導した。分化誘導後１０日目にサンプル含有分化培地に交換し、ＣＯ２インキュベーターで培養してサンプル処理した。サンプル処理時間３時間の細胞を、ＲＮＡ抽出に用いた。
【００２１】
（２）サンプル調製
試験培地を用いて、カフェイン１０００μｇ／mL、カフェイン２０００μｇ／mL、クリルオイル１０００μｇ／mL、カフェイン＋クリルオイル各１０００μｇ／mLとなるよう調製した。カフェイン添加試験培地は０．４５μｍのフィルターで滅菌して試験に用いた。クリルオイル含有培地はフィルターを透過しなかったため、クリーンベンチで無菌的に調製し、フィルター滅菌せずに試験に用いた。陰性対照にはカフェイン及びクリルオイル無添加の試験培地を用いた。
【００２２】
（３）トータルＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ化
細胞からのトータルＲＮＡの回収およびｃＤＮＡ化はＦａｓｔＬａｎｅ  Ｃｅｌｌ  ＲＴ−ＰＣＲキットの手順に従い行った。
【００２３】
（４）リアルタイムＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲはＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いたインターカレーター法で行った。具体的にはＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ専用プレートに表１のように反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
ＰＣＲ反応は９５℃・３０ｓｅｃ−（９５℃・１０ｓｅｃ−６０℃・３０ｓｅｃ）×４５ｃｙｃｌｅｓ−９５℃・１５ｓｅｃ−５５℃・１５ｓｅｃ−９５℃・１５ｓｅｃの条件で行い、ＰＣＲ反応終了後にＰＣＲ産物の解離曲線を求めた。
相対発現量はΔΔＣｔ法により、コントロールの発現量を１．０となるよう算出した。内部標準遺伝子としてＡＣＴＢ（β−Ａｃｔｉｎ）遺伝子を用いた。試験に使用したプライマー配列を表２に示した。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
（５）統計解析
比較試験区間（無添加区ｖｓサンプル添加区）では有意差検定を行った。検定はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔで両側検定を行いＰ＜０．０５（帰無仮説が５％未満）のものを図中に示した。グラフデータは平均値±標準誤差として示し、有意水準を記載する場合は*＜０．０５、**＜０．０１、***＜０．００１とした。
【００２８】
（６）被験物質
・カフェイン（抽出物）（白鳥製薬株式会社）
・クリルオイル（清光薬品工業株式会社、ω３高度不飽和脂肪酸リン脂質４１質量％含有）
【００２９】
（７）細胞
・ヒト骨格筋筋芽細胞（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．  Ｎｏ．ＰＴ−５０２０，Ｌｏｔ．Ｎｏ．００００２７９７４６，３８歳、アジア人種、女性、ＢＭＩ＝２６）
・ヒト前駆脂肪細胞（内臓脂肪）（Ｌｏｎｚａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＰＴ−５００５，Ｌｏｔ．Ｎｏ．８Ｆ３４８２，４６歳、白色人種、男性、ＢＭＩ＝２６）
【００３０】
（８）結果
ｉ）内臓脂肪細胞におけるＰＧＣ１αの発現促進作用を図１に示す。
図１より、カフェイン及びクリルオイルの併用により、内臓脂肪細胞におけるＰＧＣ１α発現促進作用は、相乗的に増強された。
ii）筋肉細胞におけるＰＧＣ１α発現促進作用を図２に示す。
図２より、カフェイン及びクリルオイルの併用により、筋肉細胞におけるＰＧＣ１α発現促進作用は、相乗的に増強された。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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