(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：８のアミノ酸配列の一部を含む３０アミノ酸以下の単離されたペプチドであって、
（ａ）配列番号：２または１のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；および
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１または２個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞を誘導する能力を有するペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが少なくとも２種類のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有する、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子が、ＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＲ８およびＨＬＡ−ＤＱの１つから成る群より選択される、請求項２に記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
ＬＹ６Ｋ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する配列番号：２のアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
（ａ）配列番号：２および１から成る群より選択されるアミノ酸配列；および
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１または２個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドが配列番号：６のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
配列番号：２、１および６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
（ｉ）Ｔｈ１細胞、
（ｉｉ）ＣＴＬ、
（ｉｉｉ）Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）、および
（ｉｖ）ＣＴＬを誘導する能力を有するＡＰＣ
から成る群より選択される細胞の少なくとも１つを誘導するための組成物であって、請求項１から７のいずれか一項に記載の１つもしくは複数のペプチド、またはそれらをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項１０】
（ａ）請求項１から７のいずれか一項に記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）請求項８に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１から７のいずれか一項に記載のペプチドを自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）請求項１から７のいずれか一項に記載のペプチドを自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）前記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも１つの有効成分を含有し、ならびに
（ｉ）がんの治療、
（ｉｉ）がんの予防、
（ｉｉｉ）がんにおける術後再発の予防、および
（ｉｖ）前記（ｉ）から（ｉｉｉ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される目的のために製剤化されている、医薬組成物。
【請求項１１】
ＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＲ８から成る群より選択される少なくとも１つを有する対象への投与用に製剤化されている、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ＣＴＬ誘導能を有する１つまたは複数のペプチドをさらに含有する、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答を増強するための組成物であって、
（ａ）請求項１から７のいずれか一項に記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）請求項８に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１から７のいずれか一項に記載のペプチドを自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）請求項１から７のいずれか一項に記載のペプチドを自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）前記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも１つの有効成分を含有する組成物。
【請求項１４】
Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有するＡＰＣを誘導するための方法であって、ＡＰＣを請求項１から７のいずれか一項に記載のペプチドとインビトロで接触させる段階を含む方法。
【請求項１５】
Ｔｈ１細胞をインビトロで誘導するための方法であって、
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、ＭＨＣクラスＩＩ分子と請求項１から７のいずれか一項に記載のペプチドとの複合体を自らの表面に提示するＡＰＣと共培養する段階；および
（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、またはＴＣＲサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入する段階であって、ここでＴＣＲが、細胞表面に提示されるＭＨＣクラスＩＩ分子と請求項１から７のいずれか一項に記載のペプチドとの複合体に結合することができる、段階
から成る群より選択される段階を含む方法。
【請求項１６】
ＣＴＬをインビトロで誘導するための方法であって、
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の両方を、請求項４から７のいずれか一項に記載のペプチドと接触させたＡＰＣと共培養する段階；ならびに
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、請求項４から７のいずれか一項に記載のペプチドと接触させたＡＰＣと共培養する段階
から成る群より選択される段階を含む方法。
【請求項１７】
ＭＨＣクラスＩＩ分子と請求項１から７のいずれか一項に記載のペプチドとの複合体を自らの表面に提示する、単離されたＡＰＣ。
【請求項１８】
ＡＰＣの表面に提示された請求項１から７のいずれか一項に記載のペプチドを認識する、単離されたＴｈ１細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物科学の分野、より詳細にはがん療法の分野に関する。特に、本発明は、がんワクチンとして極めて有効な新規ペプチド、ならびに腫瘍の治療および予防のいずれかまたは両方のための薬剤に関する。
優先権
本出願は、２０１２年７月１０日出願の米国特許仮出願第６１／６６９，９９５号の恩典を主張し、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上で見いだされる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するエピトープペプチドを認識し、その後腫瘍細胞を死滅させることが示されている。ＴＡＡの最初の例として黒色腫抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーが発見されて以来、多くの他のＴＡＡが、主として免疫学的アプローチを通して、発見されてきた（非特許文献１、２）。これらのＴＡＡのいくつかは、現在、免疫療法の標的として臨床開発が進められている。
【０００３】
がん細胞の増殖および生存に不可欠なＴＡＡは、免疫療法のための標的として有用であり、というのは、そのようなＴＡＡの使用は、治療的に行われる免疫選択の結果としてのＴＡＡの欠失、突然変異または下方制御に起因するがん細胞の免疫回避の広く記述されている危険性を最小限に抑え得るからである。
したがって、強力で特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導することができる新しいＴＡＡの同定はさらなる発展が保証される。そこで、様々なタイプのがんに対するペプチドワクチン戦略の臨床適用が進行中である（非特許文献３〜１０）。現在までに、これらの腫瘍関連抗原由来ペプチドを使用した臨床試験のいくつかの報告がある。残念ながら、これまでのところ、これらのがんワクチンの治験は、今までにこれらのがんワクチン治験で認められてきた低い客観的応答率しかもたらしていない（非特許文献１１〜１３）。したがって、免疫療法標的としての使用に適する新しいＴＡＡが当分野において依然として必要である。
【０００４】
ＬＹ６Ｋは、最初は、注釈づけられていない転写産物としていくつかのグループによって同定された（アクセッション番号ＮＭ＿０１７５２７；配列番号：７によってコードされる配列番号：８）。バイオインフォマティクスによる最近の解析は、ＬＹ６Ｋを、低分子量ＧＰＩアンカー型分子に高い相同性を有するＬＹ６ファミリーに属するメンバーとして分類した（非特許文献１４）。ＬＹ６ファミリーの他のメンバーと同様に、ＬＹ６Ｋは、保存された位置に１０個のシステイン残基を有し、理論的には、ＧＰＩアンカリングを決定する配列構造を保有する。ＬＹ６ファミリーのメンバーは、細胞シグナル伝達および／または細胞接着に関連する機能を有すると考えられたが（非特許文献１５）、肺発癌におけるＬＹ６Ｋの正確な役割または正常細胞におけるその生理的機能は現在のところ不明である。ＬＹ６Ｋ遺伝子は、肺がんの半数以上におけるアリル獲得の領域である、染色体８ｑ２４に位置するので（非特許文献１６）、その過剰発現はこの遺伝子座における増幅または染色体異常から生じ得る。
【０００５】
２３，０４０遺伝子を含むゲノムワイドｃＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現プロフィール解析を通して、ＬＹ６Ｋは、膀胱がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、食道がん、胃がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、骨肉腫、膵がんおよび軟組織腫瘍などのいくつかのがんにおいて上方制御されることが最近示された（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。
【０００６】
合わせて考慮すると、このデータは、ＬＹ６Ｋが新規の潜在的な普遍的がん抗原であることを示唆する。したがって、ＬＹ６Ｋ由来のエピトープペプチドは、幅広いがんの治療のためのがん免疫療法として適用可能であり得る。
最近、健常ボランティアのＰＢＭＣから腫瘍反応性かつＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２：０１）拘束性の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導することができる高度免疫原性のＬＹ６Ｋ由来のＣＴＬエピトープ（特許文献１）が同定された。さらに、ＬＹ６Ｋ由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬエピトープも同定されている（非特許文献１７、特許文献４）。それゆえ、ＬＹ６Ｋは、がん免疫療法に適用できる依然として魅力的な標的分子である。
【０００７】
腫瘍特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞、特にＴヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞は、ＣＴＬ媒介性抗腫瘍免疫の効率的な誘導に重要な役割を果たす（非特許文献１８）。Ｔｈ１細胞によって主として産生されるＩＦＮ−γは、長く持続するＣＴＬ応答の誘導と維持のために必須であり、免疫記憶の維持において重要な多数の相互作用を通して支援を提供する（非特許文献１９、２０）。Ｔｈ１細胞によって分泌されるＩＦＮ−γは、直接の抗腫瘍作用または抗血管新生作用も媒介する（非特許文献２１）。さらに、Ｔｈ細胞は、腫瘍部位におけるＣＴＬの侵入のために道を開かなければならないことが示されている（非特許文献２２）。それゆえ、特異的Ｔｈ１細胞を活性化することができる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来Ｔｈ細胞エピトープの同定は、腫瘍担持宿主における有効な腫瘍免疫の誘導のために重要である；理想的には、有効なワクチンの設計は、ＣＴＬとＴｈ１細胞の両方を刺激する複数のエピトープを含むべきである（非特許文献２３）。しかしながら、ＬＹ６Ｋに由来するそのようなエピトープは未だ同定されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００８／１０２５５７号
【特許文献２】国際公開第２００９／０１６６９１号
【特許文献３】国際公開第２００４／０３１４１３号
【特許文献４】国際公開第２００６／０９０８１０号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｏｏｎ  Ｔ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９３  Ｍａｙ  ８，５４（２）：１７７−８０
【非特許文献２】Ｂｏｏｎ  Ｔ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ  Ｐ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９６  Ｍａｒ  １，１８３（３）：７２５−９
【非特許文献３】Ｈａｒｒｉｓ  ＣＣ，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １９９６  Ｏｃｔ  １６，８８（２０）：１４４２−５５
【非特許文献４】Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ  ＬＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９  Ｊｕｌ  １，５９（１３）：３１３４−４２
【非特許文献５】Ｖｉｓｓｅｒｓ  ＪＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９  Ｎｏｖ  １，５９（２１）：５５５４−９
【非特許文献６】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ  ＳＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９６  Ｍａｙ  １，１５６（９）：３３０８−１４
【非特許文献７】Ｔａｎａｋａ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９７  Ｏｃｔ  １５，５７（２０）：４４６５−８
【非特許文献８】Ｆｕｊｉｅ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９９  Ｊａｎ  １８，８０（２）：１６９−７２
【非特許文献９】Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９９  Ｍａｙ  ５，８１（３）：４５９−６６
【非特許文献１０】Ｏｉｓｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９９  Ｍａｙ  ５，８１（３）：３８７−９４
【非特許文献１１】Ｂｅｌｌｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００２  Ｏｃｔ  １５，２０（２０）：４１６９−８０
【非特許文献１２】Ｃｏｕｌｉｅ  ＰＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２００２  Ｏｃｔ，１８８：３３−４２
【非特許文献１３】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００４  Ｓｅｐ，１０（９）：９０９−１５
【非特許文献１４】ｄｅ  Ｎｏｏｉｊ−ｖａｎ  Ｄａｌｅｎ  ＡＧ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００３  Ｍａｒ  １；１０３（６）：７６８−７４
【非特許文献１５】Ｂａｍｅｚａｉ  Ａ  ＆  Ｒｏｃｋ  ＫＬ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９５  Ｍａｙ  ９；９２（１０）：４２９４−８
【非特許文献１６】Ｂａｌｓａｒａ  ＢＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９７  Ｊｕｎ  １；５７（１１）：２１１６−２０
【非特許文献１７】Ｓｕｄａ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．２００７  Ｎｏｖ；９８（１１）：１８０３−８
【非特許文献１８】Ｃｈａｍｏｔｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４；６４：３８６−９０
【非特許文献１９】Ｂｅｖａｎ  ＭＪ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４；４：５９５−６０２
【非特許文献２０】Ｓｈｅｄｌｏｃｋ  ＤＪ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎ  Ｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００３；３００：３３７−９
【非特許文献２１】Ｓｔｒｅｅｔ  ＳＥ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２００１；９７：１９２−７
【非特許文献２２】Ｂｏｓ  Ｒ，ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ  ＬＡ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；７０：８３６８−７７
【非特許文献２３】Ｍｅｌｉｅｆ  ＣＪ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００８；８：３５１−６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明に関連して、本発明者らは、がん免疫療法のための理想的なペプチドワクチンは、両者が互いに天然で近位である、ＣＴＬとＴｈ１細胞の両方のエピトープを含む単一ポリペプチドを含むものであると考えた（Ｋｅｎｔｅｒ  ＧＧ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００９；３６１：１８３８−４７）。
【００１１】
そのために、本発明者らは、プロミスキャスな（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ＨＬＡクラスＩＩ分子との関連で認識され、ＣＴＬエピトープを含む、新規ＬＹ６Ｋ由来Ｔｈ１細胞エピトープを同定する戦略を設計し、そのようにして特徴づけられたエピトープがより効率的なＴ細胞媒介性腫瘍免疫を誘導するという仮定の下で研究を進めた。ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを予測するコンピュータアルゴリズムおよびＨＬＡ−Ａ２４（Ａ＊２４：０２）拘束性ＣＴＬによって認識される公知のＣＴＬエピトープ配列を使用して、候補となる、ＣＴＬエピトープを含有するプロミスキャスなＨＬＡクラスＩＩ拘束性Ｔｈ１細胞エピトープを選択した。
【００１２】
本発明は、少なくとも一部には、Ｔｈ１細胞応答を誘導するための免疫療法の標的として役立つ適切なエピトープペプチドの発見に基づく。ＬＹ６Ｋ遺伝子は、膀胱がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、食道がん、胃がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、骨肉腫、膵がんおよび軟組織腫瘍および頭頸部悪性腫瘍（ＨＮＭＴ）を含む多くのがん型で上方制御されることが認められているので、本発明は、リンパ球抗原６複合体、Ｋ遺伝子座（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ６  ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＬＹ６Ｋ）遺伝子の遺伝子産物、より詳細にはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１７５２７（配列番号：７）の遺伝子によってコードされる配列番号：８に示すポリペプチドをさらなる分析のための標的とする。対応する分子に特異的なＴｈ１細胞を誘発するエピトープペプチドを含むＬＹ６Ｋ遺伝子産物をさらなる試験のために特に選択した。例えば、健常ドナーまたはＨＮＭＴ患者から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヒトＬＹ６Ｋに由来するプロミスキャスなＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰおよび／またはＤＱ結合ペプチドを用いて刺激した。それぞれの候補ペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰまたはＤＱ陽性標的細胞を認識するＴｈ１細胞を樹立し、ＬＹ６Ｋに対する強力で特異的な免疫応答を誘導することができるＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰおよび／またはＤＱ拘束性エピトープペプチドを同定した。これらの結果は、ＬＹ６Ｋが強力な免疫原性をもち、そのエピトープはＴｈ１細胞応答を通して媒介される腫瘍免疫療法のために有効であることを明らかにする。付加的な試験は、少なくとも１つのＣＴＬエピトープを含むプロミスキャスなＨＬＡ−ＤＲおよび／またはＤＱ結合ペプチドが、同じドナーにおいてＬＹ６Ｋ特異的にＣＴＬ応答を刺激できることも明らかにした。これらの結果は、ＬＹ６Ｋが強く免疫原性であること、ならびにＴｈ１細胞およびＣＴＬエピトープの両方を含むそのエピトープが、Ｔｈ１細胞およびＣＴＬ応答の両方を通して媒介される腫瘍免疫療法のために有効であることを確認する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
それゆえ、Ｔｈ１細胞誘導能ならびに配列番号：１および２の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供することが本発明の１つの目的である。本発明は、改変されたペプチド、すなわち最大３０アミノ酸までの長さであり、配列番号：８（ＬＹ６Ｋ）のアミノ酸配列から選択される連続するアミノ酸配列を有する、Ｔｈ１細胞誘導能を備えたペプチド、ならびにその機能的等価物を企図する。あるいは、本発明はまた、Ｔｈ１細胞およびＣＴＬ誘導能の両方を有するペプチドも提供する。いくつかの態様において、本発明のペプチドは、配列番号：１または２のアミノ酸配列または、Ｔｈ１細胞を誘導する能力を維持しつつ、１、２もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／もしくは付加されている、その改変型に対応する。
【００１４】
対象に投与された場合、本発明のペプチドは、好ましくは１つまたは複数の抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に提示され、次にこれがＴｈ１細胞を誘導する。本発明のペプチドが少なくとも１つのＣＴＬエピトープをさらに含む場合、そのようなＡＰＣはまた、本発明のペプチドから生成されるＣＴＬエピトープを提示し、したがってそれぞれのペプチドを標的とするＣＴＬを誘導するようにペプチドをプロセシングする。それゆえ、本発明のペプチドのいずれかまたはその断片を提示する抗原提示細胞、ならびに抗原提示細胞を誘導するための方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
【００１５】
本発明の１つまたは複数のペプチドもしくはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはそのようなペプチドもしくはその断片を提示する抗原提示細胞の投与は、強力な抗腫瘍免疫応答の誘導をもたらす。したがって、以下の１つまたは複数を有効成分として含有する薬剤または医薬組成物を提供することが本発明のさらにもう１つの目的である：（ａ）本発明の１つまたは複数のペプチド、（ｂ）そのようなペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド、および（ｃ）本発明の１つまたは複数の抗原提示細胞。そのような本発明の薬剤または医薬組成物は、ワクチンとして特に有用である。
【００１６】
がん（すなわち腫瘍）の治療および／もしくは予防（すなわち防止）、ならびに／またはその術後再発の予防のための方法を提供することが本発明のなおさらなる目的である。本発明の１つまたは複数のペプチド、ポリヌクレオチド、抗原提示細胞または薬剤もしくは医薬組成物を投与する段階を含む、Ｔｈ１細胞を誘導するまたは抗腫瘍免疫を誘導するための方法も企図される。さらに、本発明のＴｈ１細胞はがんに対するワクチンとしても使用され、がんの例には、膀胱がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、食道がん、胃がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、骨肉腫、膵がん、軟組織腫瘍および頭頸部悪性腫瘍（ＨＮＭＴ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００１７】
本発明の特に企図される目的の例には以下が含まれる：
［１］１０〜３０アミノ酸長を有し、配列番号：８のアミノ酸配列の一部を含む単離されたペプチドであって：
（ａ）配列番号：１または２のアミノ酸配列から選択される９を超えるアミノ酸長を有する連続するアミノ酸配列；および
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞を誘導する能力を有するペプチド。
［２］前記ペプチドまたはその断片が少なくとも２種類のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有する、［１］に記載の単離されたペプチド。
［３］前記ＭＨＣクラスＩＩ分子がＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＲ８およびＨＬＡ−ＤＱの１つから成る群より選択される、［２］に記載の単離されたペプチド。
［４］前記ペプチドが、ＬＹ６Ｋ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有するペプチドのアミノ酸配列を含む、［１］から［３］のいずれか１つに記載の単離されたペプチド。
［５］前記ペプチドが、
（ａ）配列番号：１および２から成る群より選択されるアミノ酸配列；および
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、［４］に記載の単離されたペプチド。
［６］前記ペプチドが配列番号：６のアミノ酸配列を含む、［５］に記載の単離されたペプチド。
［７］［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
［８］
（ｉ）Ｔｈ１細胞、
（ｉｉ）ＣＴＬ、
（ｉｉｉ）Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）、および
（ｉｖ）ＣＴＬを誘導する能力を有するＡＰＣ
から成る群より選択される細胞の少なくとも１つを誘導するための組成物であって、［１］から［６］のいずれか１つに記載の１つもしくは複数のペプチド、またはそれらをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、組成物、または
（ｉ）Ｔｈ１細胞、
（ｉｉ）ＣＴＬ、
（ｉｉｉ）Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）、および
（ｉｖ）ＣＴＬを誘導する能力を有するＡＰＣ
から成る群より選択される少なくとも１種類の細胞を誘導するための組成物であって、［１］から［５］のいずれか１つに記載の１つもしくは複数のペプチド、またはそれらをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、組成物。
［９］
（ａ）［１］から［６］のいずれか１つに記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）［７］の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）上記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも１つの有効成分を含有し、ならびに
（ｉ）がんの治療、
（ｉｉ）がんの予防、
（ｉｉｉ）がんにおける術後再発の予防、および
（ｉｖ）上記（ｉ）から（ｉｉｉ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される目的のために製剤化されている、医薬組成物。
［１０］前記組成物が、ＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＲ８から成る群より選択される少なくとも１つを有する対象への投与のために製剤化されている［９］に記載の医薬組成物、または前記組成物が、ＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＲ８から成る群より選択される少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象への投与のために製剤化されている［９］に記載の医薬組成物。
［１１］前記組成物が、ＣＴＬ誘導能を有する１つまたは複数のペプチドをさらに含有する、［９］または［１０］に記載の医薬組成物。
［１２］ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答を増強するための組成物であって、
（ａ）［１］から［６］のいずれか１つに記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）［７］に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）上記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも１つの有効成分を含有する組成物。
［１３］Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有するＡＰＣを誘導するための方法であって、ＡＰＣを［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階を含む方法。
［１４］ＣＴＬを誘導する能力を有するＡＰＣを誘導するための方法であって、
（ａ）ＡＰＣを［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階
から成る群より選択される段階を含む方法。
［１５］Ｔｈ１細胞を誘導するための方法であって、
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、ＭＨＣクラスＩＩ分子と［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示するＡＰＣと共培養する段階；および
（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、またはＴＣＲサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入する段階であって、ここでＴＣＲが、細胞表面に提示されるＭＨＣクラスＩＩ分子と［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片との複合体に結合することができる、段階
から成る群より選択される段階を含む方法、またはＴｈ１細胞を誘導するための方法であって、
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、ＭＨＣクラスＩＩ分子と［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示するＡＰＣと共培養する段階；および
（ｂ）両方のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットをコードする単一ポリヌクレオチド、または各々別々のＴＣＲサブユニットをコードする複数のポリヌクレオチドをＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入する段階であって、ここでＴＣＲが、ＡＰＣの細胞表面に提示されるＭＨＣクラスＩＩ分子と［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片との複合体に結合することができる、段階
から成る群より選択される段階を含む方法。
［１６］ＣＴＬを誘導するための方法であって、
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の両方を、［４］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドと接触させたＡＰＣと共培養する段階；ならびに
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、［４］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドと接触させたＡＰＣと共培養する段階
から成る群より選択される段階を含む方法。
［１７］ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答を増強するための方法であって、
（ａ）［１］から［６］のいずれか１つに記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）［７］に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）上記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも１つの有効成分を対象に投与する段階を含む方法。
［１８］ＭＨＣクラスＩＩ分子と［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示する、単離されたＡＰＣ。
［１９］［１３］または［１４］に記載の方法によって誘導されるＡＰＣ。
［２０］ＡＰＣの表面に提示された［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を認識する、単離されたＴｈ１細胞。
［２１］［１５］に記載の方法によって誘導されるＴｈ１細胞。
［２２］がんに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法であって、
（ａ）［１］から［６］のいずれか１つに記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）［７］に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）上記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも１つの有効成分を含有する組成物を対象に投与する段階を含む方法。
［２３］［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドに対する抗体またはその免疫学的に活性な断片。
［２４］［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
［２５］［２４］に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
［２６］［１］から［６］のいずれか１つに記載のペプチド、［７］に記載のポリヌクレオチドまたは［２３］に記載の抗体を含む、診断キット。
【００１８】
上記に加えて、本発明の他の目的および特徴は、以下の詳細な説明を付属の図面および実施例と併せて読めばより十分に明らかになる。しかしながら、本発明の前記概要および以下の詳細な説明はどちらも例示的な態様であり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。特に、ここでいくつかの特定の態様を参照して本発明を説明するが、説明は本発明を例証するものであり、本発明の限定とは解釈されないことが認識される。様々な変更および適用が、付属の特許請求の範囲に記載されている本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者に想起され得る。同様に、本発明の他の目的、特徴、利益および利点は、本概要および以下に記載する特定の態様から明らかであり、また当業者には容易に明白である。そのような目的、特徴、利益および利点は、単独でまたは本明細書に組み込まれる参考文献を考慮して、付属の実施例、データ、図面およびそれらから引き出されるすべての妥当な推論と併せて上記から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本発明の様々な局面および適用は、以下の図面の簡単な説明および本発明の詳細な説明とその好ましい態様を考慮した上で当業者に明らかになるであろう。
【００２０】
【図１Ａ】図１は、コンピュータアルゴリズム（ＩＥＤＢ推奨方法）によって予測されるプロミスキャスなＨＬＡクラスＩＩ結合ＬＹ６Ｋ由来ペプチドを示す。パートＡは、コンピュータアルゴリズム（ＩＥＢＤ解析リソース、コンセンサス法、ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ａｎａｌｙｚｅ／ｈｔｍｌ／ｍｈｃ＿ＩＩ＿ｂｉｎｄｉｎｇ．ｈｔｍｌ）を用いたヒトＬＹ６Ｋタンパク質のアミノ酸配列の解析の結果を示す。横軸の数字は、ＬＹ６Ｋ由来の１５ｍｅｒペプチドのＮ末端のアミノ酸残基位置を示す。より高いコンセンサスパーセンタイル順位は、ＨＬＡクラスＩＩ分子へのより強い結合親和性を示す。
【００２１】
【図１Ｂ】パートＢは、複数のＨＬＡクラスＩＩアリル産物（ＤＰＢ１＊０５：０１、ＤＲＢ１＊０８：０３、ＤＲＢ１＊９：０１およびＤＲＢ１＊１５：０２）についてオーバーラップする高いコンセンサスパーセンタイル順位を有する２つのオーバーラップする２４ｍｅｒおよび２０ｍｅｒ長鎖ペプチド（ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）およびＬＹ６Ｋ（１７２−１９１））を、パネルＡにおいて１および２の番号を付した黒いバーによって示されるように選択し、プロミスキャスなＨＬＡクラスＩＩ拘束性Ｔｈ細胞エピトープを同定するために合成したことを示す。ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）は、ＣＴＬによってＨＬＡ−Ａ２４に関連して認識される１０ｍｅｒペプチドを含む。
【００２２】
【図２Ａ】図２は、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ペプチドでの末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激によるＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞株の誘導および抗原提示ＨＬＡクラスＩＩ分子の同定を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞株を、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）での末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも３回の刺激後に様々なＨＬＡクラスＩＩ遺伝子型を有する３名の健常ドナーから生成し、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した。パートＡでは、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）に対する応答を３名の健常ドナーについて示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、自己ＰＢＭＣ単独（ペプチドなし）、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）（１０μｇ／ｍｌ）でパルスしたＰＢＭＣ、またはＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰもしくはＨＬＡ−ＤＱに特異的な５μｇ／ｍｌのｍＡｂの存在下にＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）でパルスしたＰＢＭＣで刺激した。
【００２３】
【図２Ｂ１】パートＢでは、様々なＨＬＡクラスＩＩ分子によって拘束されるＴｈ細胞によるＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ペプチドの認識を示す。３名の健常ドナーから樹立したＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞株を、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）でパルスしたもしくはパルスしていない指示されているＨＬＡクラスＩＩ分子（ＤＰ５、ＤＲ４、ＤＲ８またはＤＲ１５）を発現するＬ細胞、抗ＨＬＡ−ＤＲ、抗ＨＬＡ−ＤＰもしくは抗ＨＬＡクラスＩブロッキングｍＡｂの存在下にＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）でパルスしたＬ細胞、またはＥＢＮＡ−ＤＰ５でパルスしたＬ−ＤＰ５と共培養した。ＩＦＮ−γ産生Ｔｈ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した。ドナーのＨＬＡ型を各パネルの上部に表示した。データは、２回または３回のアッセイの平均±ＳＤとして提示している。同様の結果を得た少なくとも３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。
【００２４】
【図２Ｂ２】図２Ｂ２は図２Ｂ１の続きである。
【００２５】
【図３Ａ】図３は、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ペプチドでの末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激によるＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞株の誘導および抗原提示ＨＬＡクラスＩＩ分子の同定を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞株を、様々なＨＬＡクラスＩＩ遺伝子型を有する３名の健常ドナーから生成した。ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）での末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも３回の刺激後、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した。パートＡにおいて、上の部分；左側のパネル；ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）に対する応答をＨＬＡ−ＤＲ８陽性かつＨＬＡ−ＤＲ１５陽性の健常ドナーについて示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、自己ＰＢＭＣ単独（−）、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）（１０μｇ／ｍｌ）でパルスしたＰＢＭＣ、またはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰもしくはＤＱに特異的な５μｇ／ｍｌのｍＡｂの存在下にＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）でパルスしたＰＢＭＣで刺激した。右側のパネル；ＨＬＡ−ＤＲ１５分子によって拘束されるＴｈ細胞によるＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ペプチドの認識。健常ドナーＨＤＬ３から樹立したＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞株を、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）でパルスしたもしくはパルスしていないＬ−ＤＲ８もしくはＬ−ＤＲ１５、または抗ＨＬＡ−ＤＲもしくは抗ＨＬＡクラスＩブロッキングｍＡｂの存在下にＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）でパルスしたＬ−ＤＲ１５細胞と共培養した。パートＡにおいて、下の部分；ＨＬＡ−ＤＲ１５拘束性ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ特異的Ｔｈ細胞をＨＤＬ２から生成した。
【００２６】
【図３Ｂ】パートＢでは、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）に対する応答を健常ドナーＨＤＬ４について示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、自己ＰＢＭＣ単独（ペプチドなし）、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）（１０μｇ／ｍｌ）でパルスしたＰＢＭＣ、またはＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰもしくはＨＬＡ−ＤＱに特異的な５μｇ／ｍｌのｍＡｂの存在下にＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）でパルスしたＰＢＭＣで刺激した。ＩＦＮ−γ産生Ｔｈ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した。ドナーのＨＬＡ型を各パネルの上部に表示した。データは、２回または３回のアッセイの平均±ＳＤとして提示している。同様の結果を得た少なくとも３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。
【００２７】
【図４】図４は、ＬＹ６Ｋ（１６８−１９２）ペプチドでの末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激によるＬＹ６Ｋ（１６８−１９２）特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導および抗原提示ＨＬＡクラスＩＩ分子の同定を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞株を健常ドナーＨＤＬ４から生成した。ＬＹ６Ｋ（１６８−１９２）での末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも３回の刺激後、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した。ＬＹ６Ｋ（１６８−１９２）に対する応答をＨＬＡ−ＤＲ８（ＤＲＢ１＊０８：０３）およびＨＬＡ−ＤＲ１４（ＤＲＢ１＊１４：０５）陽性健常ドナーについて示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、自己ＰＢＭＣ単独（ペプチドなし）、ＬＹ６Ｋ（１６８−１９２）（１０μｇ／ｍｌ）でパルスしたＰＢＭＣ、またはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰもしくはＤＱに特異的な５μｇ／ｍｌのｍＡｂの存在下にＬＹ６Ｋ（１６８−１９２）でパルスしたＰＢＭＣで刺激した。
【００２８】
【図５Ａ１】図５は、バルクＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）特異的ＣＤ４＋Ｔｈ細胞株またはＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ特異的Ｔｈクローンの機能的特性を示す。パートＡでは、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）でパルスしたＬ−ＤＰ５（５×１０４）と共培養したＴ細胞（１×１０４）の２０時間のインキュベーション期間後、培養上清を回収し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアッセイシステムを用いてサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−７）の濃度を測定した。データは３回のアッセイの平均±ＳＤとして提示している。
【００２９】
【図５Ａ２】図５Ａ２は図５Ａ１の続きである。
【００３０】
【図５Ｂ】パートＢでは、コグネイトペプチドの存在下での自己ＰＢＭＣ（ＨＬＡ−ＤＱ拘束性ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ特異的Ｔｈクローンに関して）の２４時間のインキュベーション後、培養上清を回収し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアッセイシステムを用いてサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭＩＰ１β）の濃度を測定した。データは３回のアッセイの平均±ＳＤとして提示している。
【００３１】
【図５Ｃ】パートＣは、抗原刺激後にＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞表面に露出されたＣＤ１０７ａの検出を表示する。上のパネルでは、細胞をＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰまたは無関係なペプチドで再刺激した。プロットの内部の数字は、象限の特徴を有する細胞集団（ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞）のパーセンテージを示す。下のパネルでは、細胞をＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰまたは無関係なペプチドで再刺激した。プロットの内部の数字は、象限の特徴を有する細胞集団（ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞）のパーセンテージを示す。
【００３２】
【図６Ａ】図６は、インビトロおよびインビボでＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導するＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰを示す。パートＡでは、ＰＢＭＣ（２×１０６／ウェル）を、いずれのサイトカインも添加せずにＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ（７μＭ）と共に２週間インキュベートした。０日目と７日目にＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰを添加し、次にＬＰペプチドでのインビトロ刺激の１４日目に細胞を回収して、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８  ｍＡｂと組み合わせてＨＬＡ−Ａ２４（Ａ＊２４：０２）／ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ペプチド複合体のＰＥ標識テトラマーで染色し、フローサイトメトリによって分析した。右上象限のドットはＣＤ８＋テトラマー＋Ｔ細胞を表す。示されている事象はＣＤ８＋Ｔ細胞にゲートをかけている。プロットの内部の数字は、右上象限の特徴を有する細胞集団（ＣＤ８＋テトラマー＋Ｔ細胞）のパーセンテージを示す。データは、ＨＬＡ−Ａ２４陽性健常ドナーから同様の結果を得た２つの独立した実験を代表する。
【図６Ｂ】パートＢは、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰが、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰでワクチン接種した頭頸部がん患者に由来する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のインビトロ増殖を誘導することを示す。ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰで能動免疫した患者から単離したＰＢＭＣ中のＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬを、エクスビボでＨＬＡ−Ａ２４（Ａ＊２４：０２）／ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）複合体のＰＥ標識テトラマーによって検出した。ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰでのＰＢＭＣの短期（１週間）刺激後、ＰＢＭＣを回収し、その後ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬもテトラマーによって検出した。
【００３３】
【図６Ｃ】パートＣは、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰで免疫したＨＬＡ−Ａ２４  ＴｇｍにおけるＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬの増殖を表示する。ＨＬＡ−Ａ２４  Ｔｇｍを、尾の基部で、ＩＦＡ中に乳化したＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰを用いて免疫した。ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰでの２回目のワクチン接種の７日後、鼠径リンパ節中のＣＤ８＋Ｔ細胞をポジティブ単離し、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰまたは無関係なペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞と共培養して、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の数をエクスビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した。同様の結果を得た３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。
【００３４】
【図７】図７は、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）短鎖ペプチドでワクチン接種した頭頸部がん患者から単離したＰＢＭＣにおけるＬＹ６Ｋ長鎖ペプチド特異的Ｔ細胞の存在を示す。パートＡでは、ＬＹ６Ｋ特異的Ｔ細胞応答を、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）短鎖ペプチドでワクチン接種した６名の頭頸部がん患者、対照としてワクチン接種していない患者および３名の健常ドナーにおいて評価した。ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰとＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰの混合物での短期刺激（１週間）後、個々のＬＹ６Ｋ特異的Ｔ細胞の頻度をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて検出した。結果は、バックグラウンドを差し引いた後の特異的ＩＦＮ−γスポットを表した。ＩＦＮ−γスポットが１０より多くかつバックグラウンドの２倍を上回る場合は、応答を陽性とみなした。プロットの各群内の線は中央値を示す。パートＢは、ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞のＨＬＡ拘束を明らかにする。ＬＰで１週間刺激したＰＢＭＣを、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰまたはＨＬＡクラスＩに特異的な５μｇ／ｍｌのｍＡｂの存在下に各々のペプチド（１０μｇ／ｍｌ）で再刺激した。ＩＦＮ−γ産生Ｔｈ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した。結果は、バックグラウンドを差し引いた後の特異的ＩＦＮ−γスポットを表した。同様の結果を得た３名のがん患者からの３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。
【００３５】
【図８Ａ】ＨＮＭＴ患者から得たＰＢＭＣにおけるＬＹ６Ｋ−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞の存在を示す。パートＡでは、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰとＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰの混合物でのＰＢＭＣの１週間のインビトロ刺激後、ＬＹ６Ｋ−ＬＰ特異的Ｔ細胞の頻度をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検出した。
【００３６】
【図８Ｂ１】パートＢは、ＬＹ６Ｋ−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞のＨＬＡクラスＩＩ拘束を示す。ＬＹ６Ｋ−ＬＰで１週間刺激した新鮮ＰＢＭＣを、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱまたはＨＬＡクラスＩに特異的なｍＡｂの存在下に各々のＬＹ６Ｋ−ＬＰで再刺激した。Ｔｈ細胞によるＬＹ６Ｋ−ＬＰ特異的ＩＦＮ−γ産生は、７名のＨＮＭＴ患者において抗ＨＬＡクラスＩＩ  ｍＡｂの添加によって有意に阻害されたが、抗ＨＬＡクラスＩ  ｍＡｂでは阻害されなかった（ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰ、ＨＮＭＴ３１、４１、１０７；ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ、ＨＮＭＴ２６、３１、４１、４２、１０３、１０７、１０８）。
【００３７】
【図８Ｂ２】図８Ｂ２は図８Ｂ１の続きである。
【００３８】
【図８Ｃ】パートＣでは、ＨＮＭＴ患者は、正常で健康な個人と比較してＬＹ６Ｋ−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞免疫の上昇を示す。ＬＹ６Ｋ−ＬＰ（１１９−１４２）ＬＰまたはＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰに応答した患者および健常ドナー（対照）の割合を示す棒グラフである。ｐ値はフィッシャーの正確確率検定を用いて算出した。
【図８Ｄ】パートＤでは、ＬＹ６Ｋ−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞応答を２３名のＨＮＭＴ患者において評価した。ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰでワクチン接種した２０名のＨＮＭＴ患者（ワクチン接種後）、１１名のＨＮＭＴ患者（ワクチン接種前）、および９名の健常ドナー（対照）を試験した。結果は、バックグラウンドを差し引いた後の特異的ＩＦＮ−γスポットを示す。各々のドットは個々のドナーを表す。水平の線は中央値を示し、ｐ値はノンパラメトリックのマン−ホイットニーＵ検定からの統計結果を表す。ｎ．ｓ．、有意でない。
【００３９】
【図８Ｅ】パートＥ〜Ｇは、ワクチン接種前および接種後のＨＮＭＴ患者から得たＰＢＭＣにおけるＬＹ６Ｋ−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞の存在を示す。ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰとＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰの混合物でのＰＢＭＣの１週間のインビトロ刺激後、ＬＹ６Ｋ−ＬＰ特異的Ｔ細胞の頻度をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検出した。パートＥにおいて、ワクチン接種後のＨＮＭＴ患者は、正常で健康な個人と比較してＬＹ６Ｋ−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞免疫の上昇を示した。ワクチン接種後のＨＮＭＴ患者におけるＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ特異的免疫応答の頻度は、ワクチン接種前のＨＮＭＴ患者におけるよりも有意に高かった。ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰまたはＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰに応答した患者および健常ドナー（対照）の割合を示す棒グラフである。ｐ値はフィッシャーの正確確率検定を用いて算出した。
【００４０】
【図８Ｆ】パートＦにおいて、ＣＴＬエピトープペプチドワクチンの反復接種は、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰ（黒い棒）およびＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ（白い棒）特異的Ｔｈ細胞応答を増大させるかまたは誘発した。
【００４１】
【図８Ｇ】パートＧは、進行したがんを有するワクチン接種したＨＮＭＴ患者（ＣＴＲ−８３７９、進行、ｎ＝１３）と術後アジュバント免疫療法を受けているワクチン接種したＨＮＭＴ患者（ＣＴＲ−８３８０、術後、ｎ＝８）の間でのＬＹ６Ｋ−ＬＰ特異的ＩＦＮ−γスポットの数の比較を表示する。ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰとＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰの混合物でのＰＢＭＣの１週間のインビトロ刺激後、個々のＬＹ６Ｋ−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞の頻度をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検出した。結果は、バックグラウンドを差し引いた後の特異的ＩＦＮ−γスポットを示す。各々のドットは個々のドナーを表す。水平の線は中央値を示し、ｐ値はノンパラメトリックのマン−ホイットニーＵ検定からの統計結果を表す。ｎ．ｓ．、有意でない。
【００４２】
【図９】図９は、ＬＹ６Ｋ−ＬＰが天然にプロセシングされるＴｈ細胞エピトープを包含することを示す。パートＡは、ＨＤＬ１から樹立したＨＬＡ−ＤＰ５拘束性ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰ特異的バルクＴｈ細胞が、組換えＬＹ６Ｋタンパク質をロードした自己ＤＣを特異的に認識したことを明らかにする。同様の結果を得た３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。パートＢは、ＨＬＡ−ＤＲ１５（左側、ＨＤＬ２）またはＨＬＡ−ＤＱ（右側、ＨＤＬ４）拘束性ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ特異的Ｔｈクローンが、組換えＬＹ６Ｋタンパク質をロードした自己ＤＣを認識したことを明らかにする。同様の結果を得た５つの独立した実験からの代表的なデータを示す。コグネイトＬＹ６Ｋ−ＬＰをＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける陽性対照として使用した。
【００４３】
【図１０Ａ】図１０は、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰがインビトロおよびインビボでＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の効率的な増殖を誘導することを示す。パートＡは、ＤＣによるＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰの取込みと交差提示を表示する。固定していないまたは固定したＤＣをＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰまたはＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰで３時間パルスした。ＨＤＬ３から生成したバルクＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬを６時間共培養して、応答をＩＦＮ−γ標識によって測定した。同様の結果を得た３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。
【図１０Ｂ】パートＢは、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰがインビトロでＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の効率的な増殖を誘導することを明らかにする。ＨＤＬ３（ＨＬＡ−Ａ２４＋およびＤＲ１５＋）から樹立したＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的バルクＣＴＬを、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ（中央のパネル）または無関係なＬＰ（右側のパネル）でパルスした自己ＤＣを用いてインビトロで刺激した。ＬＰ刺激前（０日目；左側のパネル）およびＬＰ刺激後７日目に、培養した細胞のアリコート（１×１０５細胞）を、抗ヒトＣＤ８  ｍＡｂと組み合わせたＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的テトラマーで染色した。同様の結果を得た３つの独立した実験からの０日目と７日目の代表的なデータを示す。事象はＣＤ８＋Ｔ細胞にゲートをかけている。
【００４４】
【図１０Ｃ】パートＣは、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰがＨＮＭＴ患者においてＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬのインビトロ増殖を誘導することを明らかにする。ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰでワクチン接種したＨＮＭＴ患者（ＨＮＭＴ１０８）からの新鮮なＰＢＭＣをＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰと共に培養した。０日目（エクスビボ）および７日目に、ＰＢＭＣをテトラマーＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）複合体または対照テトラマーで染色した。（ＣＤ８＋Ｔ細胞にゲートをかけている；ドットプロット）。７日目に、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬの頻度もＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検出した（棒グラフ）。同様の結果を有する４名のワクチン接種したＨＮＭＴ患者（表１、ＨＮＭＴ４３、１０５、１０８および１１０）からの代表的なデータを示す。
【００４５】
【図１０Ｄ】パートＤでは、ＣＤ８＋テトラマー＋細胞の割合の増加（増加倍数）を示す。
【００４６】
【図１０Ｅ】パートＥ〜Ｇは、ＬＹ６Ｋ−ＬＰがＨＮＭＴ患者においてＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬのインビトロ増殖を誘導することを明らかにする。パートＥでは、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰでワクチン接種したＨＮＭＴ患者（ＨＮＭＴ２９）からの新鮮なＰＢＭＣを、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰとＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰの混合物と共に培養した。０日目（エクスビボ）および７日目（ＬＹ６Ｋ−ＬＰでのインビトロ刺激後）に、ＰＢＭＣをテトラマーＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）複合体で染色した（ＣＤ８＋Ｔ細胞にゲートをかけている）。７日目に、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）特異的ＣＴＬの頻度もＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検出した（棒グラフ）。詳細な方法は「補足材料および方法」に示されている。同様の結果を有する９名のワクチン接種したＨＮＭＴ患者（ＨＮＭＴ２０、２６、２９、３１、３４、３９、４１、１０２および１０８）からの代表的なデータを示す。
【００４７】
【図１０Ｆ】パートＦでは、ＣＤ８＋テトラマー＋細胞の割合の増加（倍数増加）を示す。
【００４８】
【図１０Ｇ】パートＧでは、ワクチン接種前のＨＮＭＴ患者（ＨＮＭＴ４２）からの新鮮なＰＢＭＣをＬＹ６Ｋ−ＬＰの混合物で刺激した。
【図１０Ｈ】パートＨは、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰがインビトロでＣＴＬの効率的なクロスプライミングを誘導することを明らかにする。ＨＤＬ３から得たＰＢＭＣをＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰと共に２週間インキュベートした。０日目と７日目にＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰを添加し、次に１４日目に細胞を回収して、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的テトラマーで染色した。同様の結果を得た３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。ＨＤＬ１およびＨＤＬ４からも同様の結果を得た。
【００４９】
【図１０Ｉ】パートＩは、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰで免疫したマウスにおけるＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬの誘導を示す。ＨＬＡ−Ａ２４  ＴｇｍをＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰで免疫した。ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰでの３回目のワクチン接種後、鼠径リンパ節中のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰでパルスしたＢＭ−ＤＣ（骨髄由来ＤＣ）で刺激した。ＩＦＮ−γ産生マウスＣＤ８＋Ｔ細胞の数をエクスビボＥＬＩＳＰＯＴによって分析した。同様の結果を得た８つの独立した実験からの代表的なデータを示す。
【００５０】
【図１１Ａ】図１１は、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬの誘導へのＬＹ６Ｋ−ＬＰの相乗作用を示す。パートＡは、活性化バルクＬＹ６Ｋ−ＬＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬの誘導増強を明らかにする。ＨＬＡ−Ａ２４＋／ＤＲ１５＋のＨＤＬ３に由来するＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰ特異的またはＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ特異的バルクＣＤ４＋Ｔ細胞およびＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的バルクＣＤ８＋Ｔ細胞を、いずれのサイトカインも添加せずにＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ（ＳＰ）単独、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ＋対照ＬＰ（対照ＬＰ＋ＳＰ）、またはＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ＋ＬＹ６Ｋ−ＬＰ（ＬＹ６Ｋ−ＬＰ＋ＳＰ）の存在下で自己ＤＣと共に培養した。ペプチドとの１週間のインビトロ培養後、培養した細胞を、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）複合体のＰＥ標識テトラマーおよびＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８  ｍＡｂで染色した。いずれのペプチドも加えずに培養した細胞の結果も示した（ペプチドなし）。刺激前の棒は、この実験で使用したＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的バルクＣＤ８＋Ｔ細胞株のテトラマー＋ＣＤ８＋Ｔ細胞／ウェルの絶対数を示す。データは３回のアッセイの平均±ＳＤとして提示している（棒グラフ）。同様の結果を得た３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。
【００５１】
【図１１Ｂ】パートＢは、ＬＹ６Ｋ特異的ＣＴＬの誘導へのＬＹ６Ｋ−ＬＰの相乗作用を明らかにする。ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰでワクチン接種したＨＮＭＴ４３から得た新鮮ＰＢＭＣを９６ウェルの丸底培養プレートに播種し（１×１０５細胞／ウェル）、次いでいずれのサイトカインも添加せずにＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ単独（１０μｇ／ｍＬ）、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ＋対照ＬＰ（１０μｇ／ｍＬ）、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ＋ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰ（１０μｇ／ｍＬ）、またはＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ＋ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ（１０μｇ／ｍＬ）を加えた。培養の７日目に、細胞をＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）特異的テトラマーで染色した。代表的なＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的テトラマー染色を示す（ＣＤ８＋Ｔ細胞にゲートをかけている；ドットプロット）。
【００５２】
【図１１Ｃ】パートＣは、テトラマー＋ＣＤ８＋細胞／ウェルの絶対数を示す棒グラフを表示する。データは３回のアッセイの平均±ＳＤとして提示している。同様の結果を得た３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。
【００５３】
【図１１Ｄ】パートＤでは、２名のワクチン接種したＨＮＭＴ患者（上のパネル、ＨＭＮＴ４２；下のパネル、ＨＮＭＴ３１）から得た新鮮ＰＢＭＣを、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ（ＳＰ）またはＳＰ＋ＬＹ６Ｋ−ＬＰ（ＳＰ＋ＬＰ）と共に７日間培養した。同様の結果を有する２連のウェルから得た代表的なＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的テトラマー染色（ＣＤ８＋Ｔ細胞にゲートをかけている）を示す。
【００５４】
【図１２】図１２はＨＮＭＴ患者の臨床特徴を示す。「材料および方法」の章で詳述するＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定したＬＹ６Ｋ特異的Ｔ細胞応答を示す。陽性および陰性応答をそれぞれ（＋）および（−）によって表す。Ｎｏ．、回数；ＣＴＲ、臨床試験登録；ｖａｃ．、ワクチン接種；ＨＮＭＴ、頭頸部悪性腫瘍；Ｍ／Ｆ、男性／女性；ＬＰ、長鎖ペプチド；ｎ．ｔ．、試験せず。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
態様の説明
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似または等価の任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法、装置および材料をここに記述する。しかしながら、本発明の材料および方法について記載する前に、本発明が本明細書で述べる特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコル等は慣例的な実験法および最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。また、本記載で用いる用語は、特定のバージョンまたは態様を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図されず、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。
【００５６】
本明細書で言及する各々の公報、特許または特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。しかしながら、本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明によるそのような開示に先行する権利がないことの承認と解釈されるべきではない。
【００５７】
Ｉ．定義
特に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。しかしながら、矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。
本明細書で使用する「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という語は、特に明確に示されない限り「少なくとも１つの」を意味する。
【００５８】
ある物質（例えばペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等）に関して使用する「単離された」および「精製された」という用語は、その物質が、さもなければ天然源中に含まれ得る少なくとも１つの物質を実質的に含まないことを指示する。したがって、単離されたまたは精製されたペプチドは、そのペプチドが由来する細胞もしくは組織源からの糖質、脂質もしくは他の混入タンパク質などの細胞材料を実質的に含まない、または化学合成される場合は化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないペプチドを指す。「細胞物質を実質的に含まない」という用語は、ペプチドが、そのペプチドが単離されたまたは組換え生産された細胞の細胞成分から切り離されている、ペプチドの調製物を包含する。したがって、細胞物質を実質的に含まないペプチドは、約３０％、２０％、１０％または５％（乾燥重量）未満の異種タンパク質（本明細書では「混入タンパク質」とも称する）を有するポリペプチドの調製物を包含する。ペプチドが組換え生産される場合は、ペプチドは、好ましくは培地も実質的に含まず、ペプチド調製物の容積の約２０％、１０％または５％未満の培地を含むペプチドの調製物を包含する。ペプチドが化学合成によって生産される場合は、ペプチドは、好ましくは化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、そのペプチドの合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質をペプチド調製物の容積の約３０％、２０％、１０％または５％（乾燥重量）未満含むペプチドの調製物を包含する。特定のペプチド調製物が単離または精製されたペプチドを含むことは、例えばタンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後の単一バンドの出現およびゲルのクマシーブリリアントブルー染色等によって示され得る。好ましい態様では、本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは単離または精製されている。
【００５９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書ではアミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。本用語は、天然のアミノ酸ポリマーに加えて、１つもしくは複数のアミノ酸残基が改変された残基であるアミノ酸ポリマー、または対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基にも適用される。
【００６０】
本明細書で使用する「アミノ酸」という用語は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびに細胞内で翻訳後に修飾されたもの（例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾されたＲ基または修飾された骨格（例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチルメチオニンスルホニウム）を有する化合物を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様に機能する化合物を指す。
アミノ酸は、本明細書ではＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される、一般に公知の３文字表記、または１文字表記によって言及され得る。
【００６１】
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、本明細書では互換的に使用され、特に明確に示されない限り、一般に受け入れられている１文字コードによって言及される。「剤」および「組成物」という用語は、本明細書では、特定量の特定成分を含む生成物、ならびに特定量の特定成分の組合せから直接または間接的に生じる任意の生成物を指すために互換的に使用される。医薬組成物に関するそのような用語は、有効成分、および担体を構成する不活性成分を含む生成物、ならびに成分の任意の２つもしくはそれ以上の組合せ、錯体形成もしくは凝集から、または成分の１つもしくは複数の解離から、または成分の１つもしくは複数の他の種類の反応もしくは相互作用から直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図されている。したがって、本発明の医薬組成物は、本発明の化合物と医薬的または生理学的に許容される担体とを混合することによって作製される任意の組成物を包含する。
【００６２】
「有効成分」という用語は、本明細書では生物学的または生理学的に活性な組成物中の物質を指す。特に、医薬組成物に関連して、「有効成分」という用語は、目的の薬理学効果を示す成分物質を指す。例えば、がんの治療または予防における使用のための医薬組成物の場合、組成物中の有効成分は、直接または間接的にがん細胞および／または組織に対する少なくとも１つの生物学的または生理学的作用をもたらし得る。好ましくは、そのような作用は、がん細胞増殖を低減するまたは阻害すること、がん細胞および／または組織を損傷するまたは死滅させること等を含み得る。典型的には、有効成分の間接的な作用は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答の誘導である。製剤化される前は、「有効成分」は「バルク」、「原薬」または「原体」とも称され得る。本明細書で使用する「医薬的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という語句は、液体もしくは固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料を含むがこれらに限定されない、医薬的または生理学的に許容される材料、組成物、物質またはビヒクルを意味する。
【００６３】
特に定義されない限り、「がん」という用語は、例えば膀胱がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、食道がん、胃がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、骨肉腫、膵がん、軟組織腫瘍および頭頸部悪性腫瘍（ＨＮＭＴ）を含む、ＬＹ６Ｋ遺伝子を過剰発現するがんを指す。特に定義されない限り、「頭頸部悪性腫瘍（ＨＮＭＴ）」および「頭頸部がん」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
特に定義されない限り、「Ｔリンパ球」および「Ｔ細胞」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【００６４】
特に定義されない限り、「細胞傷害性Ｔリンパ球」、「細胞傷害性Ｔ細胞」および「ＣＴＬ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、特に明確に指示されない限り、非自己細胞（例えば腫瘍細胞、ウイルス感染細胞）を認識し、そのような細胞の死滅を誘導することができるＴリンパ球のサブグループを指す。ＣＴＬは、ＣＤ８＋Ｔリンパ球と区別され、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるペプチドを認識することができる。
特に定義されない限り、「ＨＬＡ−Ａ２４」という用語は、サブタイプを含むＨＬＡ−Ａ２４型を指し、その例には、ＨＬＡ−Ａ＊２４０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ＊２４０３、ＨＬＡ−Ａ＊２４０４、ＨＬＡ−Ａ＊２４０７、ＨＬＡ−Ａ＊２４０８、ＨＬＡ−Ａ＊２４２０、ＨＬＡ−Ａ＊２４２５およびＨＬＡ−Ａ＊２４８８が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
特に定義されない限り、本明細書で使用する「ＨＬＡ−Ａ２」という用語は、典型的にはサブタイプを指し、その例には、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２０４、ＨＬＡ−Ａ＊０２０５、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６、ＨＬＡ−Ａ＊０２０７、ＨＬＡ−Ａ＊０２１０、ＨＬＡ−Ａ＊０２１１、ＨＬＡ−Ａ＊０２１３、ＨＬＡ−Ａ＊０２１６、ＨＬＡ−Ａ＊０２１８、ＨＬＡ−Ａ＊０２１９、ＨＬＡ−Ａ＊０２２８およびＨＬＡ−Ａ＊０２５０が含まれるが、これらに限定されない。
特に定義されない限り、「Ｔヘルパー１型細胞」および「Ｔｈ１細胞」という用語は、本明細書では互換的に使用され、特に明確に示されない限り、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるペプチドを認識することができ、細胞性免疫に関連するＣＤ４＋Ｔリンパ球のサブグループを指す。特に定義されない限り、「Ｔｈ細胞」、「ＣＤ４＋Ｔ細胞」および「ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞」という用語も本明細書では互換的に使用される。Ｔｈ１細胞は、細胞性免疫に関する他の免疫細胞（例えばＣＴＬ、マクロファージ）の活性化および／または刺激を助けるために様々なサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α等）を分泌する。
【００６６】
特に定義されない限り、「ＨＬＡ−ＤＲ４」という用語はサブタイプを指し、その例には、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０３、ＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０６、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０８、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０９、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：１０およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：１１が含まれるが、これらに限定されない。
特に定義されない限り、「ＨＬＡ−ＤＲ８」という用語はサブタイプを指し、その例には、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８：０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８：０３、ＬＡ−ＤＲＢ１＊０８：０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８：０５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８：０６、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８：０７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８：１０、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８：１１およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８：１２が含まれるが、これらに限定されない。
特に定義されない限り、「ＨＬＡ−ＤＲ９」という用語はサブタイプを指し、その例には、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９：０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９：０３、ＬＡ−ＤＲＢ１＊０９：０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９：０５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９：０６、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９：０７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９：０８およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９：０９が含まれるが、これらに限定されない。
特に定義されない限り、「ＨＬＡ−ＤＲ１５」という用語はサブタイプを指し、その例には、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０３、ＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０６、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０８、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０９、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：１０およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：１１が含まれるが、これらに限定されない。
特に定義されない限り、「ＨＬＡ−ＤＰ２」という用語はサブタイプを指し、その例にはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０２０１およびＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０２：０２が含まれるが、これらに限定されない。
特に定義されない限り、「ＨＬＡ−ＤＰ５」という用語はサブタイプを指し、その例にはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１が含まれるが、これに限定されない。
【００６７】
特に定義されない限り、「ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答」という語句は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によるペプチドの提示によって誘導される免疫応答を指す。本明細書では、「ＭＨＣクラスＩＩ抗原によって媒介される免疫応答」は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、特にＴｈ１細胞によって誘導される免疫応答を含む。そのような免疫応答の例には、サイトカイン（例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α等）の産生ならびに他の免疫細胞（例えばＣＴＬ、マクロファージ等）の活性化および／または刺激が含まれるが、これらに限定されない。
特に定義されない限り、「ＬＹ６Ｋに特異的なＴｈ１細胞」という語句は、ＬＹ６Ｋに由来するペプチドを提示する抗原提示細胞によって特異的に活性化されるが、他の抗原提示細胞では特異的に活性化されないＴｈ１細胞を指す。
特に定義されない限り、「ＬＹ６Ｋ特異的ＣＴＬ」という語句は、ＬＹ６Ｋを発現する標的細胞に対して特異的に細胞傷害性を示すＣＴＬを指す。
【００６８】
特に定義されない限り、ペプチドに関連して使用される場合、「ＣＴＬ誘導能」という語句は、抗原提示細胞上に提示された場合ＣＴＬを誘導するペプチドの能力を指す。
特に定義されない限り、本明細書で使用する「キット」という用語は、試薬と他の材料の組合せに関して用いられる。キットは、マイクロアレイ、チップ、マーカー等を含み得ることが本明細書で企図される。「キット」という用語は、試薬および／または材料の特定の組合せに限定されることを意図しない。
【００６９】
本発明に関連して、「抗体」という用語は、指定されるタンパク質またはそのペプチドに特異的に反応性である免疫グロブリンおよびその断片を指す。抗体は、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質または放射性標識に融合した抗体、および抗体断片を含み得る。さらに、本明細書における抗体はその最も広い意味で使用され、特に無傷モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷抗体から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体］は、すべてのクラス（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）を指示する。
特に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００７０】
ＩＩ．ペプチド
以下で詳細に説明する本発明のペプチドは、「ＬＹ６Ｋペプチド」または「ＬＹ６Ｋポリペプチド」と称され得る。
ＬＹ６Ｋに由来するペプチドがＴヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞によって認識される抗原として機能することを明らかにするため、ＬＹ６Ｋに由来するペプチド（配列番号：８）を、これらがＭＨＣクラスＩＩ分子によってプロミスキャスに拘束される抗原エピトープであるかどうかを判定するために分析した。ＬＹ６Ｋに由来するプロミスキャスなＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＲ８および１つまたはいくつかのＨＬＡ−ＤＱへの結合親和性に基づいて同定した。これらのペプチドをロードした樹状細胞（ＤＣ）によるＣＤ４＋Ｔ細胞のインビトロ刺激後、以下のペプチドの各々を用いてＴｈ１細胞を成功裏に樹立した：
ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）／ＫＷＴＥＰＹＣＶＩＡＡＶＫＩＦＰＲＦＦＭＶＡＫＱ（配列番号：１）、および
ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）／ＫＣＣＫＩＲＹＣＮＬＥＧＰＰＩＮＳＳＶＦ（配列番号：２）。
【００７１】
上述したこれらの樹立されたＴｈ１細胞は、それぞれのペプチドでパルスした抗原提示細胞の刺激に応答して強力な特異的Ｔｈ１細胞活性を示した。さらに、前記ペプチドは、日本人において高頻度に認められるいくつかのＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰおよびＨＬＡ−ＤＱ分子（例えばＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＲ８）によって拘束されるＴｈ１細胞を刺激することができた。これらの結果は、ＬＹ６ＫがＴｈ１細胞によって認識される抗原であること、およびペプチドが、いくつかのＨＬＡクラスＩＩ分子（例えばＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＲ８、および１つまたはいくつかのＨＬＡ−ＤＱなど）によってプロミスキャスに拘束されるＬＹ６Ｋのエピトープペプチドであることを明らかにする；したがって、そのようなペプチドは、ＣＴＬによる細胞傷害作用の標的抗原として有効であり得る。
上記で同定したペプチドは、ＬＹ６Ｋに特異的なＣＴＬを誘導する能力を有するＣＴＬエピトープのアミノ酸配列を付加的に含み、本明細書で明らかにするように、そのようなペプチドは、Ｔｈ１細胞に加えてＬＹ６Ｋに特異的なＣＴＬも誘導することができる。したがって、これらのペプチドは、ＬＹ６Ｋを発現するがんに対する免疫応答の誘導のための適切なペプチドであり得る。ＬＹ６Ｋ遺伝子は、例えば膀胱がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、食道がん、胃がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、骨肉腫、膵がん、軟組織腫瘍および頭頸部悪性腫瘍（ＨＮＭＴ）を含む大部分のがん組織で過剰発現されるので、免疫療法のための良好な標的である。
【００７２】
したがって、本発明は、ＬＹ６Ｋに特異的なＴｈ１細胞を誘導する能力を有するペプチドを提供する。本発明のペプチドは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができ、抗原提示細胞上に提示され得る。あるいは、本発明のペプチドの断片は、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができ、抗原提示細胞上に提示され得る。ペプチドのこれらの断片は、抗原提示細胞内でのプロセシングによって生成され得る。好ましい態様では、本発明のペプチドまたはその断片は、２またはそれ以上の種類のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えばＨＬＡ−ＤＰ５およびＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＲ８およびＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＰ５およびＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＱの１つ、またはＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＲ８）に結合する能力を有する。言い換えると、本発明のペプチドは、２またはそれ以上の種類のＭＨＣクラスＩＩ分子によって拘束されるＴｈ１細胞を誘導する能力を有し得る。別の態様では、本発明のペプチドは、ＬＹ６Ｋ特異的ＣＴＬ誘導能を有するペプチドのアミノ酸配列を含む。ＬＹ６Ｋ特異的ＣＴＬ誘導能を有するそのようなペプチドの典型的な例には、配列番号：３のアミノ酸配列を有するペプチドが含まれる。
【００７３】
ＭＨＣクラスＩＩ分子における結合溝は両端で開いているので、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドはその長さに柔軟性を有し得る。ＭＨＣクラスＩＩ分子についてのコア結合モチーフは９個のアミノ酸残基から成り、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは一般に、コア結合モチーフと隣接する他のアミノ酸残基を有する。隣接アミノ酸残基の数は限定されない。したがって、配列番号：１または２のすべてのアミノ酸残基がＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するために必ずしも必要ではない。したがって、本発明のペプチドは、Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有するペプチドであり得、そのようなペプチドは以下から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む：
（ａ）配列番号：１または２のアミノ酸配列からの９個より多い連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列；および
（ｂ）１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されている（ａ）のアミノ酸配列。
【００７４】
ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの長さは一般に１０〜３０アミノ酸である。配列番号：１および２のアミノ酸配列はＬＹ６Ｋのアミノ酸配列（配列番号：８）の一部から成るので、本発明のペプチドは以下の［１］〜［６］に記載のペプチドであり得る：
［１］１０〜３０アミノ酸長を有し、配列番号：８のアミノ酸配列の一部を含む単離されたペプチドであって、
（ａ）配列番号：１または２のアミノ酸配列から選択される９を超えるアミノ酸長を有する連続するアミノ酸配列；および
（ｂ）１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されている（ａ）のアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有するペプチド；
［２］前記ペプチドまたはその断片が少なくとも２種類のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有する、［１］に記載の単離されたペプチド；
［３］前記ＭＨＣクラスＩＩ分子がＨＬＡ−ＤＰ５、ＤＲ１５、ＤＲ８およびＨＬＡ−ＤＱの１つから成る群より選択される、［２］に記載の単離されたペプチド；
［４］前記ペプチドが、ＬＹ６Ｋ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有するペプチドのアミノ酸配列を含む、［１］から［３］のいずれか１つに記載の単離されたペプチド；ならびに
［５］前記ペプチドが、
（ａ）配列番号：１および２から成る群より選択されるアミノ酸配列；ならびに
（ｂ）１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されている（ａ）のアミノ酸配列；および
［６］前記ペプチドが配列番号：６のアミノ酸配列を含む、［５］に記載の単離されたペプチド。
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、［４］に記載の単離されたペプチド。
【００７５】
本発明のペプチドによって誘導されるＴｈ１細胞はＬＹ６Ｋに特異的である。それゆえ、いくつかの態様において、本発明は、配列番号：８のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列から成る３０アミノ酸残基未満のペプチドであって、配列番号：１または２のアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。
【００７６】
一般に、インターネット上で現在利用可能なソフトウェアプログラム、例えばＷａｎｇ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．２００８．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．４（４）：ｅ１００００４８．１１：５６８；およびＷａｎｇ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．に記載されているソフトウェアプログラムを使用して、様々なペプチドとＨＬＡ抗原との間の結合親和性をインシリコで算出することができる。ＨＬＡ抗原との結合親和性は、例えばＮｉｅｌｓｅｎ  Ｍ  ａｎｄ  Ｌｕｎｄ  Ｏ．２００９．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１０：２９６．；Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．２００７．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．８：２３８．Ｂｕｉ  ＨＨ，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．５７：３０４−３１４．Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（６）：５５５−５６１およびＮｉｅｌｓｅｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．２００８．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．４（７）ｅ１０００１０７に記載されているように測定することができる。したがって、本発明は、そのような公知のプログラムを用いて同定されたＨＬＡ抗原と結合すると決定されたＬＹ６Ｋのペプチドを包含する。
【００７７】
上述したように、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドはその長さに柔軟性があるので、配列番号：１または２のアミノ酸配列は、生じるペプチドが必須のＴｈ１細胞誘導能を保持する限り、場合により付加的なアミノ酸残基と隣接していてもよい。Ｔｈ１細胞誘導能を有するそのようなペプチドは、典型的には約３０アミノ酸未満、しばしば約２９アミノ酸未満、通常は約２８または２７アミノ酸未満である。配列番号：１および２の中から選択されるアミノ酸配列に隣接する特定のアミノ酸配列は、そのような隣接アミノ酸配列がもとのペプチドのＴｈ１細胞誘導能を損なわない限り、限定されず、任意の種類のアミノ酸で構成され得る。典型的な態様では、そのような隣接アミノ酸配列は、配列番号：１または２のアミノ酸配列に隣接する配列番号：８のアミノ酸配列の中から選択され得る；しかし、本発明はそれに限定されない。そこで、本発明はまた、Ｔｈ１細胞誘導能ならびに配列番号：１および２の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。
他方で、ＭＨＣクラスＩＩ分子についてのコア結合モチーフは９個のアミノ酸残基から成るので、配列番号：１または２のアミノ酸配列の全長がＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するためおよびＴｈ１細胞の誘導のために必ずしも必要ではない。したがって、本発明のペプチドは、必須のＴｈ１細胞誘導能を保持することを条件として、配列番号：１または２の９個より多い連続するアミノ酸を有するアミノ酸の形態をとることができる。Ｔｈ１細胞誘導能を有するペプチドは、典型的には約１０より多いアミノ酸、しばしば１１または１２より多いアミノ酸、通常は１３または１４より多いアミノ酸である。したがって、本発明のペプチドは、Ｔｈ１細胞誘導能を有し、かつ配列番号：１または２のアミノ酸配列からの９、１０、１１、１２、１３または１４個より多い連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、ペプチドであり得る。
【００７８】
タンパク質中の１、２またはそれ以上のアミノ酸の改変はタンパク質の機能に影響を及ぼさず、一部の場合にはもとのタンパク質の所望の機能を増強することさえあることは一般に公知である。実際に、改変されたペプチド（すなわちもとの参照配列と比較して１、２または数個のアミノ酸残基が改変されている（すなわち置換、付加、欠失または挿入されている）アミノ酸配列から成るペプチド）が、もとのペプチドの生物学的活性を保持することは知られている（Ｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８４，８１：５６６２−６；Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９８２，１０：６４８７−５００；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８２，７９：６４０９−１３）。したがって、１つの態様では、本発明のペプチドは、Ｔｈ１細胞誘導能ならびに配列番号：１および２の中から選択されるアミノ酸配列の両方を有し得、１、２またはさらにそれ以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失および／または置換されている。あるいは、本発明のペプチドは、Ｔｈ１細胞誘導能ならびに配列番号：１または２のアミノ酸配列において１、２または数個のアミノ酸が付加、挿入、欠失および／または置換されているアミノ酸配列の両方を有し得る。
【００７９】
当業者は、単一アミノ酸または小さな割合のアミノ酸を改変するアミノ酸配列への個々の付加または置換は、もとのアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらす傾向があることを認識する。そこで、それらはしばしば「保存的置換」または「保存的改変」と称され、タンパク質の改変は、もとのタンパク質と類似の機能を有する改変されたペプチドを生じさせる。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は当技術分野において周知である。アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、および以下の共通する官能基または特徴を有する側鎖：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）である。加えて、以下の８群は各々相互に保存的置換であるアミノ酸を含む：  
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および  
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９８４参照）。
【００８０】
そのような保存的に改変されたペプチドも本発明のペプチドとみなされる。しかし、本発明のペプチドはそれらに限定されず、改変されたペプチドがもとのペプチドのＴｈ１細胞誘導能を保持する限り、非保存的改変も含み得る。さらに、改変されたペプチドは、ＬＹ６Ｋの多型変異体、種間相同体およびアリルのＴｈ１細胞誘導性ペプチドを除外すべきではない。
【００８１】
必須のＴｈ１細胞誘導能を保持するために、少数の（例えば１、２もしくは数個）または低い割合のアミノ酸を改変する（挿入、付加、欠失および／または置換する）ことができる。本明細書では、「数個」という用語は、５またはそれ以下のアミノ酸、例えば４または３またはそれ以下のアミノ酸を意味する。改変するアミノ酸の割合は、好ましくは２０％もしくはそれ以下、より好ましくは１５％もしくはそれ以下、さらに一層好ましくは１０％もしくは８％もしくはそれ以下、または１〜５％である。
【００８２】
本発明の好ましいペプチド、すなわち配列番号：１および２（ＬＹ６Ｋ  １１９−１４２、１７２−１９１）のホモロジー解析は、これらのペプチドが他の公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドと有意の相同性を有さないことを確認する。したがって、免疫療法に使用した場合、これらのペプチドが未知のまたは望ましくない免疫応答を生じる可能性は有意に低い。したがって、これらのペプチドは、がん患者においてＬＹ６Ｋに対する免疫を誘発するために極めて有用であると期待される。
【００８３】
免疫療法に関連して使用する場合、本発明のペプチドまたはその断片は、抗原提示細胞の表面に、好ましくはＨＬＡクラスＩＩ抗原との複合体として、提示されなければならない。それゆえ、Ｔｈ１細胞を誘導するだけでなく、ＨＬＡクラスＩＩ抗原に高い結合親和性も有するペプチドを選択することが好ましい。そのために、ペプチドをアミノ酸残基の置換、挿入、欠失および／または付加によって改変し、改善された結合親和性を有する改変されたペプチドを生成することができる。
【００８４】
本発明はまた、上述したペプチドのＮ末端および／またはＣ末端への１〜２個のアミノ酸の付加を企図する。高いＨＬＡ抗原結合親和性を有し、Ｔｈ１細胞誘導能を保持するそのような改変ペプチドも本発明に含まれる。
例えば、本発明は、ＨＬＡクラスＩＩ抗原に結合し、Ｔｈ１細胞誘導能を有し、配列番号：１および２から成る群より選択されるアミノ酸配列において１、２または数個のアミノ酸が改変されているアミノ酸配列を含む、３１、３０、２９、２８、２７または２６未満のアミノ酸長の単離されたペプチドを提供する。
これらのペプチドはまた、ＡＰＣと接触するかまたはＡＰＣに導入された場合、ＡＰＣ中でプロセシングされて、プロセシングされた断片をその上に提示し得る。例えば、本発明のペプチドは、ＡＰＣの表面に提示される通常１１〜２６（典型的には１５〜２５）アミノ酸残基から成る断片にプロセシングされ得る。
【００８５】
しかしながら、ペプチド配列が、異なる機能を有する内因性または外因性タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、自己免疫疾患および／または特定の物質に対するアレルギー症状などの負の副作用を誘導し得る。それゆえ、ペプチドの配列が別のタンパク質のアミノ酸配列とマッチする状況を回避するために、利用可能なデータベースを用いて最初にホモロジー検索を実施することが望ましいと考えられる。目的のペプチドと比較して同一のペプチドまたは１もしくは２個のアミノ酸相違を有するペプチドが自然界に存在しないことがホモロジー検索から明らかになった場合は、そのような副作用の危険性を伴わずにＨＬＡ抗原とのその結合親和性を高めるためならびに／またはそのＴｈ１細胞および／もしくはＣＴＬ誘導能を高めるために目的のペプチドを改変することができる。
【００８６】
上述したＨＬＡクラスＩＩ抗原に高い結合親和性を有するペプチドは極めて有効であると期待されるが、指標として高い結合親和性の存在に従って選択した候補ペプチドを、Ｔｈ１細胞誘導能の存在に関してさらに検討する。本明細書では、「Ｔｈ１細胞誘導能」という語句は、ＡＰＣと接触した場合、ＡＰＣ上でＴｈ１細胞を誘導する能力を付与するペプチドの能力を示す。さらに、「Ｔｈ１細胞誘導能」は、Ｔｈ１細胞の活性化および／またはＴｈ１細胞の増殖を誘導する、ＩＦＮ−γ産生を含むＴｈ１細胞媒介性サイトカイン産生を促進して他の細胞（例えばＣＴＬ、マクロファージ）を助けるおよび／または刺激する、ペプチドの能力を含む。
【００８７】
Ｔｈ１細胞誘導能の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を担持する抗原提示細胞（例えばＢリンパ球、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ））、またはより詳細にはヒト末梢血単核白血球由来のＤＣを誘導し、ペプチドで刺激した後、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）と混合して、次にＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生され、放出されたＩＦＮ−γを測定することによって達成できる。あるいは、ペプチドのＴｈ１細胞誘導能は、Ｔｈ１細胞によるＣＴＬ活性化に基づいて評価することができる。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞を試験ペプチドで刺激したＤＣと共培養し、次にＣＴＬおよびＣＴＬの標的細胞と混合する。標的細胞は、５１Ｃｒなどで放射性標識することができ、Ｔｈ１細胞から分泌されるサイトカインによって活性化されたＣＴＬの細胞傷害活性を、標的細胞から放出された放射能から算出することができる。あるいは、Ｔｈ１細胞誘導能は、試験ペプチドで刺激した抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下でＴｈ１細胞によって産生され、放出されたＩＦＮ−γを測定し、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いて培地上の阻害領域を可視化することによって評価できる。
【００８８】
上述した改変に加えて、本発明のペプチドはまた、生じる結合ペプチドがもとのペプチドのＴｈ１細胞誘導能を保持する限り、他の物質に結合することもできる。適切な物質の例には、例えばペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成ポリマー等が含まれる。本発明のペプチドは、修飾がもとのペプチドの生物学的活性を損なわない限る、グリコシル化、側鎖酸化またはリン酸化等のような修飾を含み得る。これらの種類の修飾は、付加的な機能（例えば標的化機能および送達機能）を付与するまたはペプチドを安定化するために実施できる。
【００８９】
例えば、ペプチドのインビボでの安定性を高めるために、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸模倣体または非天然アミノ酸を導入することは当技術分野において公知である；この概念は本発明のペプチドにも適合させ得る。ペプチドの安定性は多くの方法で評価することができる。例えば、ペプチダーゼならびにヒト血漿および血清などの様々な生物学的媒質を用いて安定性を試験することができる（例えばＶｅｒｈｏｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ  １９８６，１１：２９１−３０２参照）。
【００９０】
本発明のペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ抗原と組み合わせた複合体としてＡＰＣの表面に提示され、その後Ｔｈ１細胞を誘導し得る。それゆえ、ＡＰＣの表面でＨＬＡクラスＩＩ抗原と複合体を形成するペプチドも本発明に含まれる。本発明のペプチドを提示するＡＰＣをワクチンとして接種することができる。
【００９１】
上記複合体に含まれるＨＬＡ抗原の型は、治療および／または予防を必要とする対象の型とマッチしなければならない。例えば、日本人においては、ＨＬＡ−ＤＰ５、ＤＲ８およびＤＲ１５が一般的であり、それゆえ日本人患者の治療に適する。典型的には、臨床において、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型を前もって検査し、これにより特定のＨＬＡクラスＩＩ抗原への結合能力を有するペプチドの適切な選択が可能になる。好ましい態様では、本発明のペプチドはＴｈ１細胞をプロミスキャスに誘導することができる。本明細書では、ペプチドが少なくとも２つの異なる種類のＭＨＣクラスＩＩ分子によって拘束されるＴｈ１細胞を誘導することができる場合、このペプチドのＴｈ１細胞誘導能は「プロミスキャス」である。言い換えると、ペプチドが少なくとも２つの異なる種類のＭＨＣクラスＩＩ分子によって認識される場合、そのような抗原認識は「プロミスキャス」とみなされる。ペプチドに関連して使用する場合、「少なくとも２つの異なる種類のＭＨＣクラスＩＩ分子によって認識される」という語句は、ペプチドまたはその断片が少なくとも２つの異なる種類のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できることを示す。例えば、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）（配列番号：１）およびＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）（配列番号：２）は、それぞれＨＬＡ−ＤＰ５、ＤＲ１５およびＤＲ８、ならびにＨＬＡ−ＤＲ１５および１つまたはいくつかのＨＬＡ−ＤＱによって認識される。それゆえ、これらのペプチドは「プロミスキャス」なエピトープの典型的な例である。
【００９２】
ＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５またはＨＬＡ−ＤＲ８陽性ＡＰＣを使用する場合は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するペプチドが好ましく使用される。他方で、ＨＬＡ−ＤＲ１５陽性ＡＰＣを使用する場合は、好ましいペプチドは配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチドである。
したがって、好ましい態様では、配列番号：１のアミノ酸配列を有するペプチドを、誘導の前にＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５またはＨＬＡ−ＤＲ８を有すると同定された対象においてＴｈ１細胞の誘導のために使用し得る。同様に、配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチドを、誘導の前にＨＬＡ−ＤＲ１５を有すると同定された対象においてＴｈ１細胞の誘導のために使用し得る。
【００９３】
ＩＩＩ．ＬＹ６Ｋペプチドの調製
本発明のペプチドは周知の技術を用いて調製することができる。例えば、本発明のペプチドは、組換えＤＮＡ技術または化学合成を用いて、合成によって調製することができる。本発明のペプチドは、個別にまたは２もしくはそれ以上のペプチドから成るより長いポリペプチドとして合成することができる。本発明のペプチドを、次に、他の天然の宿主細胞タンパク質およびその断片、または他の何らかの化学物質を実質的に含まないようにするために、単離する、すなわち精製することができる。
本発明のペプチドは、修飾がもとの参照ペプチドの生物学的活性を損なわない限り、グリコシル化、側鎖酸化またはリン酸化などの修飾を含み得る。他の例示的な修飾には、例えばペプチドの血清半減期を延長させるために使用できる、Ｄ−アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の組み込みが含まれる。
【００９４】
本発明のペプチドは、選択したアミノ酸配列に基づく化学合成を通して得ることができる。この合成に適合させ得る従来のペプチド合成法の例には以下が含まれる：
（ｉ）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６６；
（ｉｉ）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６；
（ｉｉｉ）「ペプチド合成」（日本語）、丸善、１９７５；
（ｉｖ）「ペプチド合成の基礎と実験」（日本語）、丸善、１９８５；
（ｖ）「医薬品の開発」（日本語）、続第１４巻（ペプチド合成）、広川書店、；
（ｖｉ）国際公開第９９／６７２８８号；および
（ｖｉｉ）Ｂａｒａｎｙ  Ｇ．＆  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｒ．Ｂ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｖｏｌ．２，「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０，１００−１１８。
【００９５】
あるいは、本発明のペプチドは、ペプチドを作製するための任意の公知の遺伝子工学的方法を適合させて得ることができる（例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ  Ｊ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １９７７，１３２：３４９−５１；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＆  Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ）１９８３，１０１：３４７−６２）。例えば、最初に、発現可能な形態で（例えばプロモーター配列に対応する調節配列の下流に）目的のペプチドをコードするポリヌクレオチドを保有する適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に形質転換する。次に宿主細胞を培養して関心対象のペプチドを生産させる。本発明のペプチドはまた、インビトロ翻訳系を採用してインビトロで作製することもできる。
【００９６】
ＩＶ．ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の前記ペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドも提供する。これらには、天然のＬＹ６Ｋ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１７５２７（配列番号：７））に由来するポリヌクレオチド、ならびにその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。本明細書では、「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重に起因して、数多くの機能的に同一の核酸が所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定されるあらゆる位置で、コドンを、コードされるポリペプチドを変化させることなく前述した対応するコドンのいずれかに変化させることができる。そのような核酸変異は、保存的に改変された変異の一種である、「サイレント変異」である。ペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列は、核酸のあらゆる可能なサイレント変異も表す。当業者は、核酸中の各々のコドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を、機能的に同一の分子を生じるように改変できることを認識する。したがって、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、各々の開示される配列において暗黙のうちに表現される。
【００９７】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの誘導体で構成され得る。当技術分野において周知のように、ＤＮＡはＡ、Ｔ、ＣおよびＧなどの塩基で適切に構成され、Ｔは、ＲＮＡではＵに置き換えられる。当業者は、非天然の塩基もポリヌクレオチドに含まれ得ることを認識する。
【００９８】
本発明のポリヌクレオチドは、その間に介在アミノ酸配列を含んでまたは含まずに、本発明の複数のペプチドをコードし得る。例えば、介在アミノ酸配列は、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位（例えば酵素認識配列）を提供することができる。さらに、ポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするコード配列に加えて任意の付加的な配列を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、ペプチドの発現に必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであり得るか、またはマーカー遺伝子などを含む発現ベクター（プラスミド）であり得る。一般に、そのような組換えポリヌクレオチドは、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを使用する従来の組換え技術を通したポリヌクレオチドの操作によって調製することができる。
【００９９】
組換えおよび化学合成の両方の技術が、本発明のポリヌクレオチドを作製するために使用できる。例えば、ポリヌクレオチドは適切なベクターへの挿入によって作製でき、これをコンピテント細胞にトランスフェクトした場合に発現させ得る。あるいは、ＰＣＲ技術または適切な宿主における発現を用いてポリヌクレオチドを増幅することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９参照）。あるいは、ポリヌクレオチドは、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＳＬ  ＆  Ｉｙｅｒ  ＲＰ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９２，４８：２２２３−３１１；Ｍａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １９８４，３：８０１−５に記載されているように、固相技術を用いて合成することができる。
【０１００】
Ｖ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）
本発明はまた、ＨＬＡクラスＩＩ抗原と本発明のペプチドまたはその断片との間で形成される複合体を自らの表面に提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）も提供する。本発明のペプチドと接触させることによって得られるＡＰＣは、治療および／または予防の対象である患者に由来することができ、それだけでまたは本発明のペプチド、Ｔｈ１細胞またはＣＴＬを含む他の薬剤と組み合わせてワクチンとして投与することができる。
【０１０１】
ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞を含み、これらは、リンパ球によって認識されるためにタンパク質性抗原をその細胞表面に提示することが公知である。ＤＣはＡＰＣの中で最も強力なＴｈ１細胞誘導活性を有する代表的なＡＰＣであるので、ＤＣは本発明のＡＰＣとして有用である。
【０１０２】
さらに、好ましい態様では、本発明のペプチドはまた、ＭＨＣクラスＩ抗原によって媒介されるＣＴＬ応答ならびにＴｈ１（クラスＩＩ）を誘導することもできる。一般に、ＭＨＣクラスＩ抗原によって認識されるエピトープの長さは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原のもの（１５またはそれ以上のアミノ酸残基）より短い（例えば８〜１０アミノ酸残基）ことが周知である。それゆえ、本発明のペプチドのプロセシングされた産物はＣＴＬの誘導をもたらす。実際に、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１；配列番号：２）から誘導されるＣＴＬは、ＣＴＬ認識エピトープとして既に同定されている断片（ＲＹＣＮＬＥＧＰＰＩ；配列番号：３）を認識する。したがって、本発明のペプチドは、Ｔｈ１を誘導するだけでなく、ＡＰＣ内でのプロセシング後にＣＴＬも誘導する。言い換えると、本発明のペプチドと接触したＡＰＣは、本発明のペプチドをプロセシングして、ＭＨＣクラスＩ抗原と共にそれらの断片を提示し、ならびにＭＨＣクラスＩＩ抗原と共にそれらの全体を提示する。その結果として、ＭＨＣクラスＩＩ抗原と共にＡＰＣに提示される本発明のペプチドを認識するＴｈ１、およびペプチドのプロセシングされた断片を介して誘導されるＣＴＬの両方が、本発明のペプチドを使用して誘導され得る。
【０１０３】
例えば、ＡＰＣは、末梢血単球からＤＣを誘導し、次にそれらをインビトロ、エクスビボまたはインビボで本発明のペプチドと接触させる（刺激する）ことによって得られる。本発明のペプチドを対象に投与した場合、本発明のペプチドまたはその断片を提示するＡＰＣが対象の体内で誘導される。本明細書では、「ＡＰＣを誘導する」という語句は、ＡＰＣを本発明のペプチドと接触させて（で刺激して）、ＨＬＡクラスＩＩ抗原と本発明のペプチドまたはその断片との間で形成される複合体をＡＰＣの表面に提示させることを含む。あるいは、本発明のペプチドをＡＰＣに導入して、本発明のペプチドまたはその断片をＡＰＣに提示させた後、ＡＰＣをワクチンとして対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は、
ａ：最初の対象からＡＰＣを回収する段階、
ｂ：段階ａのＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階、および
ｃ：ペプチドをロードしたＡＰＣを２番目の対象に投与する段階
を含み得る。
【０１０４】
最初の対象と２番目の対象は同じ個体であってもよく、または異なる個体でもよい。あるいは、本発明によれば、抗原提示細胞を誘導する医薬組成物を製造するための本発明のペプチドの使用が提供される。加えて、本発明は、抗原提示細胞を誘導する医薬組成物を製造するための方法または工程を提供し、前記方法は、本発明のペプチドを医薬的に許容される担体と混合するまたは製剤化するための段階を含む。さらに、本発明はまた、抗原提示細胞を誘導するための本発明のペプチドも提供する。段階（ｂ）によって得たＡＰＣをワクチンとして対象に投与することができる。
【０１０５】
本発明の１つの側面として、本発明のＡＰＣは高レベルのＴｈ１細胞誘導能を有する。本明細書では、「高レベルのＴｈ１細胞誘導能」という語句において、高レベルとは、ペプチドと接触していないＡＰＣ、またはＴｈ１細胞を誘導することができないペプチドと接触したＡＰＣによるＴｈ１細胞誘導能のレベルと比較したものである。本明細書では、ＡＰＣに関連して使用する場合、「Ｔｈ１細胞誘導能」という語句は、ＣＤ４＋Ｔ細胞と接触した場合にＴｈ１細胞を誘導するＡＰＣの能力を示す。高レベルのＴｈ１細胞誘導能を有するそのようなＡＰＣは、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をインビトロでＡＰＣに移入する段階を含む方法によって調製することができる。導入する遺伝子はＤＮＡまたはＲＮＡの形態であり得る。導入のための方法の例には、特に限定されることなく、この分野で従来実施されている様々な方法が含まれ、例えばリポフェクション、エレクトロポレーションおよびリン酸カルシウム法などが使用できる。より詳細には、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９６，５６：５６７２−７；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８，１６１：５６０７−１３；Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９６，１８４：４６５−７２；公表特許公報第２０００−５０９２８１号に記載されているように実施することができる。遺伝子をＡＰＣに移入することにより、遺伝子は細胞内で転写、翻訳などを受け、その後得られたタンパク質はＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩによってプロセシングされて、提示経路を通してペプチドの提示へと進む。あるいは、本発明のＡＰＣは、ＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階を誘導する方法によって調製することができる。
【０１０６】
好ましい態様では、本発明のＡＰＣは、ＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＲ８の群から選択されるＭＨＣクラスＩＩ分子と本発明のペプチド（配列番号：１から選択されるアミノ酸配列を含む）の複合体を自らの表面に提示するＡＰＣであり得る。別の態様では、本発明のＡＰＣは、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＱの１つの群から選択されるＭＨＣクラスＩＩ分子と本発明のペプチド（配列番号：２のアミノ酸配列を含む）の複合体を自らの表面に提示するＡＰＣであり得る。好ましくは、ＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＲ８は、それぞれＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０２およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８：０３であり得る。
【０１０７】
ＶＩ．Ｔヘルパー１型細胞（Ｔｈ１細胞）
本発明のペプチドのいずれかに対して誘導されるＴｈ１細胞は、インビボでがん細胞を標的とするＣＴＬを含むエフェクター細胞のいずれかの免疫応答を強化し、したがってペプチド自体と同様の方法で、ワクチンとして役立つ。そこで、本発明はまた、本発明のペプチドのいずれかによって特異的に誘導されるまたは活性化される単離されたＴｈ１細胞も提供する。
【０１０８】
そのようなＴｈ１細胞は、（１）１つまたは複数の本発明のペプチドを対象に投与し、対象からＴｈ１細胞を回収すること、（２）ＡＰＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させ（で刺激し）、その後Ｔｈ１細胞を単離すること、（３）ＣＤ４＋Ｔ細胞もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のＡＰＣと接触させること、または（４）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドもしくはＴＣＲサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをＣＤ４＋Ｔ細胞に導入することによって得られ、ここで、ＴＣＲはＭＨＣクラスＩＩ分子と本発明のペプチドの複合体に結合することができる。（３）の方法のためのそのようなＡＰＣは上述した方法によって調製することができる。（４）の方法の詳細は、以下の「ＶＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章で述べる。
【０１０９】
本発明のＡＰＣでの刺激によって誘導されたＴｈ１細胞は、治療および／または予防の対象である患者に由来してもよく、作用を調節するために単独でまたは本発明のペプチドを含む他の薬剤と組み合わせて投与することができる。得られたＴｈ１細胞は、細胞性免疫に関与する免疫細胞（例えばＣＴＬ、マクロファージ）を活性化するおよび／または刺激することができる。本発明のＴｈ１細胞によって活性化され得るそのような免疫細胞には、がん細胞などの標的細胞に対して細胞傷害性を示すＣＴＬが含まれる。例えば、そのようなＣＴＬの標的細胞は、内因性にＬＹ６Ｋを発現する細胞（例えばがん細胞）、またはＬＹ６Ｋ遺伝子をトランスフェクトされた細胞であり得る。好ましい態様では、本発明のペプチドは、ＣＴＬエピトープペプチドの少なくとも１つのアミノ酸配列を含むことができ、Ｔｈ１細胞に加えて、がん細胞などのＬＹ６Ｋ発現細胞に対するＣＴＬも誘導することができる。この場合、本発明のペプチドは、Ｔｈ１細胞およびＣＴＬをインビボで同時にまたは連続的に誘導することができ、誘導されたＴｈ１細胞は、誘導されたＣＴＬを有効に活性化することができる。したがって、ＣＴＬエピトープペプチドの少なくとも１つのアミノ酸配列を含むそのようなペプチドは、がん免疫療法のための適切なペプチドである。
【０１１０】
さらに、本発明のＴｈ１細胞は、他の標的細胞に対する何らかのＣＴＬを抗原非依存的に活性化するおよび／または刺激する様々なサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）を分泌する。したがって、本発明のＴｈ１細胞は、ＬＹ６Ｋ以外の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する細胞を標的とするＣＴＬ活性を増強することにも寄与し得る。したがって、本発明のＴｈ１細胞は、本発明のペプチドおよびＡＰＣと同様に、ＬＹ６Ｋを発現する腫瘍だけでなく、他のＴＡＡを発現する腫瘍のための免疫療法にも有用である。
【０１１１】
いくつかの態様において、本発明のＴｈ１細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰまたはＨＬＡ−ＤＱ抗原と本発明のペプチドの複合体を提示する細胞を認識するＴｈ１細胞である。Ｔｈ１細胞に関連して、「細胞を認識する」という語句は、そのＴＣＲを介した細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子と本発明のペプチドの複合体の結合および抗原特異的に活性化されることを指す。本明細書では、「抗原特異的に活性化される」という語句は、特定のＭＨＣクラスＩＩ分子とペプチドに応答して活性化されることを指し、活性化されたＴｈ１細胞からのサイトカイン産生が誘導される。好ましい態様では、ＨＬＡ−ＤＲは、ＨＬＡ−ＤＲ８およびＨＬＡ−ＤＲ１５から成る群より選択され得る。好ましくは、ＨＬＡ−ＤＲ８およびＨＬＡ−ＤＲ１５は、それぞれＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８：０３およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０２であり得る。他方で、ＨＬＡ−ＤＰ５はＨＬＡ−ＤＰ抗原の好ましい例である。より好ましくは、ＨＬＡ−ＤＰ５はＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１であり得る。
【０１１２】
ＶＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを形成することができる１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含有する組成物、およびこれを使用する方法を提供する。そのようなＴＣＲサブユニットは、ＬＹ６Ｋペプチドを提示するＡＰＣに対する特異性をＣＤ４＋Ｔ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を有する。当技術分野において公知の方法を用いることにより、本発明のペプチドによって誘導されるＴｈ１細胞のＴＣＲサブユニットとしてα鎖およびβ鎖の核酸を同定することができる（国際公開第２００７／０３２２５５号およびＭｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７１，３２８８（２００３））。誘導体ＴＣＲは、ＬＹ６Ｋペプチドを提示するＡＰＣに高い結合力で結合することができ、場合により効率的なサイトカイン産生を媒介することができる。
【０１１３】
ＴＣＲサブユニットをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド（すなわちＴＣＲサブユニットの両方をコードする単一ポリヌクレオチドまたは各々別々のＴＣＲサブユニットをコードする複数のポリヌクレオチド）を適切なベクター、例えばレトロウイルスベクターに組み込むことができる。これらのベクターは当技術分野において周知である。ポリヌクレオチドまたはそれらを含むベクターは、ＣＤ４＋Ｔ細胞、例えば患者由来のＣＤ４＋Ｔ細胞に有用に移入することができる。好都合には、本発明は、患者自身のＴ細胞（または別の哺乳動物のＴ細胞）の速やかな改変を可能にし、優れたがん細胞死滅特性を有する改変されたＴ細胞を迅速かつ容易に生産する、すぐに入手可能な組成物を提供する。
【０１１４】
本発明はさらに、ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドまたはＴＣＲサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドでの形質導入によって調製されるＴｈ１細胞を提供し、ここで、ＴＣＲサブユニットはＬＹ６Ｋペプチド（例えばＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５もしくはＨＬＡ−ＤＲ８に関しては配列番号：１、およびＨＬＡ−ＤＲ１５もしくはＨＬＡ−ＤＱの１つに関しては配列番号：２）に結合することができる。形質導入されたＴｈ１細胞は、インビボでがん細胞にホーミングすることができ、インビトロで周知の培養方法によって増殖させることができる（例えばＫａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２，３４５２−３４６１（１９８９））。上述したように調製したＴｈ１細胞は、治療または保護を必要とする患者においてがんを治療するまたは予防する上で有用な免疫原性組成物を形成するために使用できる。
【０１１５】
ＶＩＩＩ．薬剤または医薬組成物
本発明の方法および組成物ががんの「治療」に関連して有用性を有する限り、治療が臨床上の利益、例えばＬＹ６Ｋ遺伝子の発現の低下、または対象におけるがんの大きさ、有病率または転移能の低減を導く場合、治療は「有効」とみなされる。治療が予防的に適用される場合、「有効」は、がんの形成を遅延させるもしくは予防するまたはがんの臨床症状を予防するもしくは軽減することを意味する。有効性は、特定の腫瘍型を診断するまたは治療するための任意の公知の方法に関連して決定される。
【０１１６】
本発明の方法および組成物ががんの「予防」（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）に関連して有用性を有する限り、そのような用語は、本明細書では、疾患による死亡率または罹患率の負荷を低減させる任意の行為を指すために互換的に使用される。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「一次、二次および三次予防レベルで」行われ得る。一次予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は疾患の発生を回避し、一方二次および三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）、ならびに機能を回復させ、疾患に関連する合併症を減少させることによって既存の疾患の負の影響を低減することを目指す活動を包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を軽減すること、例えば腫瘍の増殖および転移を低減すること、血管新生を減少させることを目指す広範囲の予防的治療を含む。
【０１１７】
本発明に関連して、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／またはその術後再発の防止は、以下の段階、例えばがん細胞の外科的除去、がん性細胞の成長の阻害、腫瘍の退縮または後退、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍退行、ならびに転移の低減または阻害などの段階のいずれかを含む。がんの有効な治療および／または予防は、がんを有する個体の死亡率を低下させ、予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、がんに伴う検出可能な症状を軽減する。例えば、有効な治療および／または予防を構成する症状の低減または改善は、１０％、２０％、３０％もしくはそれ以上の低減または安定な疾患を含む。
【０１１８】
上述したように、本発明のペプチドによって誘導されるＴｈ１細胞は、細胞性免疫に関与する免疫細胞を助けることができる。Ｔｈ１細胞によって分泌されるサイトカインは抗原非依存的にＣＴＬに影響を及ぼし得るので、そのような免疫細胞には、ＬＹ６Ｋを発現するがん細胞に対するＣＴＬだけでなく、他のＴＡＡを発現するがん細胞に対するＣＴＬも含まれる。したがって、本発明は、少なくとも１つの本発明のペプチドを含有する薬剤または医薬組成物を提供する。薬剤または医薬組成物において、そのようなペプチドは治療的または医薬的に有効な量で存在する。本発明の薬剤または組成物によって誘導されるＴｈ１細胞は、細胞性免疫に関与する任意の免疫細胞に影響を及ぼすサイトカインを分泌することができるので、本発明の薬剤または医薬組成物は、細胞性免疫に関与する任意の免疫細胞（例えばＣＴＬ、マクロファージ）を助ける、刺激するおよび／または増強するために有用である。それゆえ、本発明の薬剤または組成物は、ＣＴＬを含むそのような免疫細胞によって媒介される免疫応答を増強するまたは促進するあらゆる目的に有用である。例えば、本発明の薬剤または組成物は、そのような免疫細胞によって媒介されるがんまたは腫瘍に対する免疫応答を増強するまたは促進することができるので、本発明は、がんの治療および／または予防における使用のための、本発明のペプチドの少なくとも１つを含有する薬剤または組成物を提供する。そのような薬剤または組成物中のペプチドの量は、ＬＹ６Ｋを発現するがんを担持する対象において免疫応答を有意に増強するまたは刺激するのに有効な量であり得る。
【０１１９】
さらに、図６に示すように、本発明の過程で同定されたＬＹ６Ｋ由来ペプチドは、ＣＴＬエピトープ単独での刺激と比較してＣＴＬ誘導を増強することが確認されている。それゆえ、本発明はまた、ＨＬＡ−Ａ２４などのＭＨＣクラスＩ抗原によって媒介される免疫応答を増強するまたは刺激するための薬剤または組成物も提供する。別の態様では、本発明はさらに、ＭＨＣクラスＩ抗原によって媒介される免疫応答を増強するまたは刺激するための薬剤または組成物を製造するための本発明のペプチドの使用を提供する。
【０１２０】
好ましい態様において、本発明の過程で同定されたＬＹ６Ｋ由来ペプチドは、Ｔｈ１細胞ならびにＬＹ６Ｋ発現細胞に対するＣＴＬを含み得る。したがって、本発明はまた、ＬＹ６Ｋを発現するがんまたは腫瘍に対するＣＴＬの誘導における使用のための、本発明のペプチドの少なくとも１つを含有する薬剤または組成物も提供する。
【０１２１】
さらに、本発明のペプチドの少なくとも１つを含有する薬剤または組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答を増強するまたは促進するのに使用することができる。
ＬＹ６Ｋの発現は、正常組織と比較して、膀胱がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、食道がん、胃がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、骨肉腫、膵がんおよび軟組織腫瘍を含むいくつかのがん型において特異的に上昇するので（国際公開第２００８／１０２５５７号、国際公開第２００９／０１６６９１号および国際公開第２００４／０３１４１３号）、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、がんもしくは腫瘍の治療および／もしくは予防のため、ならびに／またはその術後再発の防止のために使用することができる。したがって、本発明は、本発明のペプチドの１つまたは複数または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、がんもしくは腫瘍の治療および／もしくは予防のため、ならびに／またはその術後再発の防止のための薬剤または医薬組成物を提供する。あるいは、本発明のペプチドを、薬剤または医薬組成物としての使用のために、ＡＰＣなどの前記細胞のいずれかの表面で発現させることができる。加えて、前記Ｔｈ１細胞も、本発明の薬剤または医薬組成物の有効成分として使用することができる。
【０１２２】
別の態様では、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療するための医薬組成物または薬剤の製造における、
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書で開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）本発明のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣ、および
（ｄ）本発明のＴｈ１細胞
の中から選択される有効成分の使用を提供する。
【０１２３】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍を治療するのに使用するための、
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書で開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）本発明のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣ、および
（ｄ）本発明のＴｈ１細胞
の中から選択される有効成分を提供する。
【０１２４】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍を治療するための医薬組成物または薬剤を製造するための方法または工程であって、有効成分として、
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書で開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）本発明のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣ、および
（ｄ）本発明のＴｈ１細胞
の中から選択される有効成分と医薬的または生理学的に許容される担体を製剤化する段階を含む方法または工程を提供する。
【０１２５】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療するための医薬組成物または薬剤を製造するための方法または工程であって、
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書で開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）本発明のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣ、および
（ｄ）本発明のＴｈ１細胞
の中から選択される有効成分を医薬的または生理学的に許容される担体と混合する段階を含む方法または工程も提供する。
【０１２６】
あるいは、本発明の医薬組成物または薬剤は、がんまたは腫瘍の予防およびその術後再発の防止のいずれかまたは両方のために使用し得る。
【０１２７】
本発明の薬剤または医薬組成物はワクチンとして使用される。本発明に関連して、「ワクチン」（免疫原性組成物とも称される）という語句は、動物に接種した場合抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する組成物を指す。
【０１２８】
本発明の薬剤または医薬組成物は、対象または患者においてがんもしくは腫瘍を治療するおよび／もしくは予防する、ならびに／またはその術後再発もしくは転移性再発を防止するために使用できる。そのような対象の例には、ヒトならびに、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒおよびチンパンジー、特に商業的に重要な動物または家畜を含むがこれらに限定されない他の哺乳動物が含まれる。
【０１２９】
本発明の過程で、配列番号：１および２の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、いくつかのＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＰおよび／またはＨＬＡ−ＤＱ分子（すなわちＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ１５、１つまたはいくつかのＨＬＡ−ＤＱ）によって拘束されるプロミスキャスなＴｈ１細胞エピトープであることが見出され、これらは、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答に起因する、がんに対する強力で特異的な免疫応答を誘導することができる候補であり得る。それゆえ、配列番号：１または２のアミノ酸配列を有するこれらのペプチドのいずれかを含む本発明の薬剤または医薬組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＲ８の中から選択される少なくとも１つを有する対象への投与に特に適する。さらに、本明細書で明らかにするように、配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチド（配列番号：６のアミノ酸配列を有するペプチドを含む）は、未知のＨＬＡ−ＤＱ分子に結合することが確認された（図３）。それゆえ、配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチドを含む薬剤または医薬組成物は、ＨＬＡ−ＤＲ１５を有さない対象への投与に適し得る。同じことが、これらのペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む薬剤または医薬組成物にも当てはまる。
【０１３０】
あるいは、好ましい態様では、本発明の過程で同定されたペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４を有する対象に適用された場合、ＬＹ６Ｋに特異的なＣＴＬを誘導することもできる。したがって、本発明のペプチドの投与を通して、Ｔｈ１細胞の誘導に加えてＬＹ６Ｋを発現するがんに対するＣＴＬ応答が誘導され得ることがさらに期待される。さらに、本発明のペプチドは、ＬＹ６Ｋ発現細胞に対するＣＴＬ応答を、そのプロセシングを介して誘導することができるだけでなく、それによって媒介されるＴｈ１細胞誘導により、ＣＴＬ応答を増強することもできる。したがって、同じ対象においてＴｈ１細胞およびＬＹ６Ｋ特異的ＣＴＬの両方の誘導を達成するために、例えば、治療される対象は、配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチドを投与する場合は、好ましくはＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ１５を有し、およびＭＨＣクラスＩ分子としてＨＬＡ−Ａ２４を有する。さらに、配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチド（配列番号：６のアミノ酸配列を有するペプチドを含む）は、１つまたはいくつかのＨＬＡ−ＤＱ分子に結合することができるので、そのようなペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子としてＨＬＡ−Ａ２４を有し、およびＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ１５を有さない対象においてＴｈ１細胞およびＣＴＬを誘導し得る。
【０１３１】
別の態様では、本発明は、Ｔｈ１細胞誘導に依存するがん免疫療法を提供する。本発明によって提供される治療戦略は、Ｔｈ１細胞から分泌されるサイトカインによって活性化される免疫細胞が目的のがん細胞を標的とする限り、ＬＹ６Ｋ発現とは無関係に任意のがんに適用でき、有効である。
本発明の薬剤または医薬組成物によって治療されるべきがんまたは腫瘍には、膀胱がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、食道がん、胃がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、骨肉腫、膵がん、軟組織腫瘍および頭頸部悪性腫瘍（ＨＮＭＴ）が含まれるがこれらに限定されず、そのようながんの好ましい例には、例えば膀胱がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、食道がん、胃がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、骨肉腫、膵がん、軟組織腫瘍および頭頸部悪性腫瘍（ＨＮＭＴ）を含む、ＬＹ６Ｋを発現する任意の種類のがんまたは腫瘍が含まれる。
【０１３２】
本発明の薬剤または医薬組成物は、前記有効成分に加えて、Ｔｈ１細胞またはＣＴＬを誘導する能力を有する他のペプチド、前記他のペプチドをコードする他のポリヌクレオチド、前記他のペプチドまたはその断片を提示する他の細胞等を含有し得る。Ｔｈ１細胞またはＣＴＬを誘導する能力を有するそのような「他の」ペプチドの例には、がん特異抗原（例えば同定されたＴＡＡ）に由来するペプチドが含まれるが、これに限定されない。
【０１３３】
必要に応じて、本発明の薬剤または医薬組成物は、有効成分、例えば本発明のペプチドのいずれかの抗腫瘍作用を他の治療物質が阻害しない限り、場合により他の治療物質を付加的な有効成分として含んでもよい。例えば、製剤は、抗炎症薬、鎮痛剤、化学療法剤等を含み得る。医薬自体に他の治療物質を含めることに加えて、本発明の医薬を１つまたは複数の他の薬理的剤と連続的にまたは同時に投与することもできる。医薬および薬理的作用物質の量は、例えば、使用される薬理的剤の種類、治療される疾患、ならびに投与のスケジュールおよび投与経路に依存する。
【０１３４】
当業者は、本明細書で特に言及する成分に加えて、本発明の薬剤または医薬組成物が、対象となる製剤の種類を考慮して当技術分野において慣例的な他の剤（例えば増量剤、結合剤、希釈剤、賦形剤等）も含み得ることを認識する。
【０１３５】
本発明の１つの態様では、本発明の薬剤または医薬組成物を、治療する疾患、例えばがんの病的状態を治療するために有用な材料を含む製品およびキットに含めることができる。前記製品は、ラベルを付した本発明の薬剤または医薬組成物のいずれかの容器を含み得る。適切な容器には、ボトル、バイアルおよび試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器上のラベルは、剤が疾患の１つまたは複数の状態の治療または予防に使用されることが示されるべきである。ラベルはまた、投与等に関する指示も示し得る。
【０１３６】
上述した容器に加えて、本発明の薬剤または医薬組成物を含むキットは、場合により医薬的に許容される希釈剤を収容する第二の容器をさらに含んでもよい。第二の容器は、使用のための指示書と共に、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジおよび添付文書を含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
【０１３７】
薬剤または医薬組成物は、所望する場合は、有効成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置中に包装することができる。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与のための指示書が添付され得る。
【０１３８】
（１）ペプチドを有効成分として含有する薬剤または医薬組成物：
本発明のペプチドは、薬剤もしくは医薬組成物として直接投与することができるか、または必要な場合は、従来の製剤方法によって製剤化される。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬剤に通常使用される担体、賦形剤などが、特に制限されることなく適宜含まれ得る。そのような担体の例には、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液などが含まれるが、これらに限定されない。さらに、薬剤または医薬組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、防腐剤、界面活性剤などを含有し得る。本発明の薬剤または医薬組成物は抗がん目的に用いることができる。
【０１３９】
本発明のペプチドは、インビボでＴｈ１細胞を誘導する本発明のペプチドの２つまたはそれ以上で構成される、組合せとして調製することができる。ペプチドの組合せはカクテルの形態をとってもよく、または標準的な技術を用いて互いに複合化し得る。例えば、ペプチドを化学的に連結するかまたは単一融合ポリペプチド配列として発現させることができる。組合せ中のペプチドは、同じであってもよくまたは異なっていてもよい。
【０１４０】
本発明のペプチドを投与することにより、ペプチドまたはその断片がＡＰＣ上のＨＬＡクラスＩＩ抗原によって高密度で提示され、次に提示されたペプチドとＨＬＡクラスＩＩ抗原との間で形成された複合体に対して特異的に反応するＴｈ１細胞が誘導される。あるいは、対象からＡＰＣ（例えばＤＣ）を取り出し、次に本発明のペプチドによって刺激して、本発明のペプチドまたはその断片のいずれかを自らの表面に提示するＡＰＣを得る。これらのＡＰＣを対象に再投与して、対象においてＴｈ１細胞を誘導することができ、結果として、腫瘍関連内皮に対する攻撃性を増大させることができる。
【０１４１】
本発明のペプチドを有効成分として含む、がんまたは腫瘍の治療および／または予防のための薬剤または医薬組成物は、細胞性免疫を有効に樹立することが公知のアジュバントも含み得る。あるいは、薬剤または医薬組成物は、他の有効成分と共に投与することができ、または顆粒に製剤化することによって投与できる。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と共に（または連続的に）投与した場合、タンパク質に対する免疫応答を増強する化合物を指す。本明細書で企図されるアジュバントには、文献（Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  １９９４，７：２７７−８９）に記載されているものが含まれる。適切なアジュバントの例には、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、ＩＳＣＯＭａｔｒｉｘ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣｐＧ、水中油型エマルション等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４２】
さらに、リポソーム製剤、ペプチドが直径数マイクロメートルのビーズに結合している顆粒製剤、および脂質がペプチドに結合している製剤を好都合に使用し得る。
【０１４３】
本発明の別の態様では、本発明のペプチドはまた、医薬的に許容される塩の形態で投与し得る。好ましい塩の例には、アルカリ金属との塩、金属との塩、有機塩基との塩、有機酸（例えば酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸等）との塩、および無機酸（例えば塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等）との塩が含まれる。本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される塩」という語句は、化合物の生物学的有効性および特性を保持し、無機酸または無機塩基、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等との反応によって得られる塩を指す。
【０１４４】
いくつかの態様において、本発明の薬剤または医薬組成物は、Ｔｈ１細胞および場合によりＣＴＬをプライミングする成分をさらに含み得る。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＴｈ１細胞および場合によりＣＴＬをプライミングすることができる剤として同定されている。例えば、パルミチン酸残基をリシン残基のε−アミノ基およびα−アミノ基に結合し、次に本発明のペプチドに連結することができる。その後、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子中で直接投与する、リポソーム中に組み込む、またはアジュバント中に乳化することができる。Ｔｈ１細胞および場合によりＣＴＬ応答の脂質プライミングの別の例として、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質が、適切なペプチドに共有結合した場合、Ｔｈ１細胞および場合によりＣＴＬをプライミングするために使用できる（例えばＤｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８９，３４２：５６１−４参照）。
【０１４５】
適切な投与方法の例には、経口、皮内、皮下、筋肉内、骨内、腹腔内および静脈内注射など、ならびに全身投与または標的部位の近傍への局所投与（すなわち直接注入）が含まれるが、これらに限定されない。投与は、単回投与によって実施でき、または反復投与によって強化することもできる。医薬的または治療的に有効な量のペプチドを、ＬＹ６Ｋを発現するがんの治療を必要とする対象に投与することができる。あるいは、Ｔｈ１細胞によって媒介される免疫応答を増強もしくは刺激する、および／またはＬＹ６Ｋを発現するがんもしくは腫瘍に対するＣＴＬを誘導するのに十分な量の本発明のペプチドを、ＬＹ６Ｋを発現するがんを担持する対象に投与することができる。本発明のペプチドの用量は、治療する疾患、患者の年齢、体重、投与方法などに従って適切に調整することができ、通常は０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、例えば０．５ｍｇ〜５ｍｇであり、数日から数ヶ月に１回投与することができる。当業者は、適切で最適な用量を容易に決定することができる。
【０１４６】
（２）ポリヌクレオチドを有効成分として含有する薬剤または医薬組成物：
本発明の薬剤または医薬組成物はまた、本明細書で開示するペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な形態で含有し得る。本明細書では、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞内に導入された場合、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現されることを意味する。例示的な態様では、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノムへの安定な組み込みを達成するのに必要なものを備え得る（相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばＴｈｏｍａｓ  ＫＲ  ＆  Ｃａｐｅｃｃｈｉ  ＭＲ，Ｃｅｌｌ  １９８７，５１：５０３−１２参照）。例えば、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９０，２４７：１４６５−８；米国特許第５，５８０，８５９号；同第５，５８９，４６６号；同第５，８０４，５６６号；同第５，７３９，１１８号；同第５，７３６，５２４号；同第５，６７９，６４７号；および国際公開第９８／０４７２０号参照。ＤＮＡに基づく送達技術の例には、「裸のＤＮＡ」、促進（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性送達が含まれる（例えば米国特許第５，９２２，６８７号参照）。
【０１４７】
本発明のペプチドは、ウイルスベクターまたは細菌ベクターによっても発現され得る。発現ベクターの例には、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる。このアプローチは、例えば本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとしての、ワクシニアウイルスの使用を含む。宿主への導入後、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を惹起する。免疫プロトコルに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９１，３５１：４５６−６０に記載されている。治療的投与または免疫のために有用である多種多様な他のベクター、例えばアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が明らかである。例えばＳｈａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ  ２０００，６：６６−７１；Ｓｈｅｄｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ２０００，６８：７９３−８０６；Ｈｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ２０００，１４：５７１−８５参照。
【０１４８】
対象へのポリヌクレオチドの送達は、直接的であってもよく、この場合対象はポリヌクレオチドを担持するベクターに直接暴露され、または間接的であってもよく、この場合は最初にインビトロで細胞を関心対象のポリヌクレオチドで形質転換し、次に細胞を対象に移植する。これら２つのアプローチは、それぞれインビボおよびエクスビボ遺伝子治療として公知である。
【０１４９】
遺伝子治療の方法の一般的な総説に関しては、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １９９３，１２：４８８−５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  １９９１，３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  １９９３，３３：５７３−９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３，２６０：９２６−３２；Ｍｏｒｇａｎ  ＆  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９３，６２：１９１−２１７；Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９３，１１（５）：１５５−２１５参照）。本発明にも使用できる、組換えＤＮＡ技術の分野で一般に公知の方法は、ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９３；およびＫｒｉｅｇｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９０に記載されている。
【０１５０】
ペプチドの投与と同様に、ポリヌクレオチドの投与は、経口、皮内、皮下、静脈内、筋肉内、骨内および／または腹腔内注射などによって実施してよく、全身投与もしくは標的部位の近傍への局所投与も使用される。投与は、単回投与によって実施でき、または複数回投与によって強化することもできる。医薬的または治療的に有効な量のポリヌクレオチドを、ＬＹ６Ｋを発現するがんの治療を必要とする対象に投与することができる。あるいは、Ｔｈ１細胞によって媒介される免疫応答を増強もしくは刺激する、および／またはＬＹ６Ｋを発現するがんもしくは腫瘍に対するＣＴＬを誘導するのに十分な量の本発明のポリヌクレオチドを、ＬＹ６Ｋを発現するがんを担持する対象に投与することができる。適切な担体または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞中のポリヌクレオチドの用量は、治療する疾患、患者の年齢、体重、投与方法などに従って適切に調整することができ、通常は０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、例えば０．５ｍｇ〜５ｍｇであり、数日ごとに１回から数ヶ月ごとに１回投与することができる。当業者は、適切で最適な投与量を容易に決定することができる。
【０１５１】
ＩＸ．ペプチド、ＡＰＣまたはＴｈ１細胞を使用する方法
本発明のペプチドおよびそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明のＡＰＣおよびＴｈ１細胞を誘導するために使用できる。本発明のＡＰＣはまた、本発明のＴｈ１細胞を誘導するためにも使用できる。ペプチド、ポリヌクレオチドおよびＡＰＣは、任意の他の化合物がこれらのＴｈ１細胞誘導能を阻害しない限り、任意の他の化合物と組み合わせて使用することができる。したがって、本発明の前記薬剤または医薬組成物のいずれかを、Ｔｈ１細胞を誘導するために使用でき、それに加えて、ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものも、以下で論じるようにＡＰＣを誘導するために使用できる。
【０１５２】
（１）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法：
本発明は、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用してＡＰＣを誘導する方法を提供する。ＡＰＣの誘導は、「Ｖ．抗原提示細胞」の章で上述したように実施することができる。本発明はまた、Ｔｈ１細胞誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法も提供し、前記ＡＰＣの誘導は、「Ｖ．抗原提示細胞」、前出の項目でも言及されている。
あるいは、本発明は、Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製するための方法であって、以下の段階：
（ａ）ＡＰＣを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階
の１つを含み得る方法を提供する。
【０１５３】
あるいは、本発明は、Ｔｈ１細胞誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法であって、
（ａ）ＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階；および
（ｂ）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階
から成る群より選択される段階を含む方法を提供する。
本発明の方法は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで実施することができる。
好ましくは、本発明の方法はインビトロまたはエクスビボで実施できる。好ましい態様では、Ｔｈ１細胞誘導能を有するＡＰＣの誘導のために使用するＡＰＣは、好ましくはＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＲ８およびＨＬＡ−ＤＱの１つの中から選択される少なくとも１つを発現するＡＰＣであり得る。そのようなＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＲ８およびＨＬＡ−ＤＱの１つの中から選択される少なくとも１つを有する対象から得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、当技術分野において周知の方法によって調製することができる。本発明の方法によって誘導されるＡＰＣは、本発明のペプチドまたはその断片とＨＬＡクラスＩＩ抗原（例えばＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＱの１つ）の複合体を自らの表面に提示するＡＰＣであり得る。対象においてがんに対する免疫応答を誘導するために、本発明の方法によって誘導されたＡＰＣを対象に投与する場合、対象は、好ましくはＡＰＣが由来するのと同じ対象である。しかし、対象がＡＰＣドナーと同じＨＬＡ型を有する限り、対象はＡＰＣドナーとは異なる対象であってもよい。
【０１５４】
別の態様では、本発明は、Ｔｈ１細胞誘導能を有するＡＰＣを誘導するのに使用するための剤または組成物を提供し、そのような剤または組成物は、本発明の１つまたは複数のペプチドまたはポリヌクレオチドを含む。
別の態様では、本発明は、ＡＰＣを誘導するために製剤化される剤または組成物の製造における、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
【０１５５】
あるいは、本発明はさらに、Ｔｈ１細胞誘導能を有するＡＰＣを誘導するのに使用するための本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするポリペプチドを提供する。
好ましい態様では、本発明のペプチドは、Ｔｈ１応答を誘導するだけでなく、それらをプロセシングした後にＣＴＬ応答も誘導する。したがって、好ましい態様では、本発明の方法によって調製されるＡＰＣは、がん細胞を含む、ＬＹ６Ｋ発現細胞に対するＣＴＬを誘導するためにも有用であり得る。例えば、配列番号：３のアミノ酸配列を含むペプチドによって誘導する場合は、ＨＬＡ−Ａ２４を発現するＡＰＣがＬＹ６Ｋ特異的ＣＴＬを誘導するのに適する。
【０１５６】
（２）Ｔｈ１細胞を誘導する方法：
さらに、本発明は、本発明のペプチド、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは本発明のペプチドもしくはその断片を提示するＡＰＣを用いてＴｈ１細胞を誘導するための方法を提供する。本発明はまた、本発明のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ抗原の複合体を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを形成することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用してＴｈ１細胞を誘導するための方法も提供する。好ましくは、Ｔｈ１細胞を誘導するための方法は、
ａ：ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡクラスＩＩ抗原と本発明のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示する抗原提示細胞と接触させる段階、および
ｂ：ＴＣＲが本発明のペプチドまたはその断片とＨＬＡクラスＩＩ抗原の複合体を認識するまたは複合体に結合することができる、ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドまたはＴＣＲサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入する段階
から成る群より選択される少なくとも１つの段階を含む。
【０１５７】
本発明のペプチドを対象に投与した場合、対象の体内でＴｈ１細胞が誘導され、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答（例えばがん細胞を標的とする免疫応答）が増強される。あるいは、本発明のペプチドおよび本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをエクスビボ治療法に使用することができ、この治療法では、対象由来のＡＰＣおよびＣＤ４陽性細胞、または末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させ（本発明のペプチドで刺激し）、Ｔｈ１細胞を誘導した後、活性化したＴｈ１細胞を対象に戻す。例えば、前記方法は、
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；
ｂ：段階ａのＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階；
ｃ：段階ｂのＡＰＣをＣＤ４＋Ｔ細胞と混合し、Ｔｈ１細胞を誘導するために共培養する段階；および
ｄ：段階ｃの共培養物からＣＤ４＋Ｔ細胞を回収する段階
を含み得る。
さらに、Ｔｈ１細胞は、ＴＣＲが本発明のペプチドまたはその断片とＨＬＡクラスＩＩ抗原の複合体に結合することができる、ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドまたはＴＣＲサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入することによって誘導できる。そのような形質導入は、「ＶＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章で上述したように実施することができる。
【０１５８】
本発明の方法は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで実施することができる。好ましくは、本発明の方法はインビトロまたはエクスビボで実施できる。Ｔｈ１細胞の誘導のために使用するＣＤ４陽性Ｔ細胞は、対象から得たＰＢＭＣから当技術分野において周知の方法によって調製することができる。好ましい態様では、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のドナーは、ＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＲ８の中から選択される少なくとも１つを有する対象であり得る。配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチドは１つまたはいくつかのＨＬＡ−ＤＱに結合することができるので、配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチドを使用する場合は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のドナーは必ずしも上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を有していなくてもよい。本発明の方法によって誘導されるＴｈ１細胞は、本発明のペプチドまたはその断片とＨＬＡクラスＩＩ抗原の複合体を自らの表面に提示するＡＰＣを認識することができるＴｈ１細胞であり得る。対象においてがんに対する免疫応答（またはＭＨＣクラスＩ分子によって媒介される免疫応答）を誘導するために、本発明の方法によって誘導されたＴｈ１細胞を対象に投与する場合、対象は、好ましくはＣＤ４陽性Ｔ細胞が由来するのと同じ対象である。しかし、対象がＣＤ４陽性Ｔ細胞ドナーと同じＨＬＡ型を有する限り、対象はＣＤ４陽性Ｔ細胞ドナーとは異なる対象であってもよい。
【０１５９】
好ましい態様では、本発明のペプチドは、ＬＹ６Ｋ発現細胞に対するＣＴＬならびにＴｈ１細胞を誘導することができる。それゆえ、本発明はさらに、ＣＴＬを誘導するための方法であって、
ａ：ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の両方を、本発明のペプチドと接触させたＡＰＣと共培養する段階；ならびに
ｂ：ＣＤ８陽性Ｔ細胞を本発明のペプチドと接触させたＡＰＣと共培養する段階
から成る群より選択される少なくとも１つの段階を含む方法を提供する。
ＣＴＬを誘導するそのような方法では、本発明のペプチドはＡＰＣ内でプロセシングされてＣＴＬエピトープペプチドを生成し、生成されたＣＴＬエピトープペプチドはＡＰＣの表面に提示される。
【０１６０】
あるいは、本発明によれば、Ｔｈ１細胞を誘導する薬剤または医薬組成物を製造するための本発明のペプチドの使用が提供される。加えて、本発明は、Ｔｈ１細胞を誘導する薬剤または医薬組成物を製造するための方法または工程を提供し、方法は、本発明のペプチドを医薬的に許容される担体と混合するまたは製剤化するための段階を含む。さらに、本発明はまた、Ｔｈ１細胞を誘導するための本発明のペプチドも提供する。
【０１６１】
本発明の方法によって誘導されるＣＤ４＋Ｔ細胞は、ワクチンとして対象に投与することができる。
本発明に関連して、ＬＹ６Ｋを過剰発現するがんをこれらの有効成分で治療することができる。そのようながんの例には、膀胱がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、食道がん、胃がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、骨肉腫、膵がん、軟組織腫瘍および頭頸部悪性腫瘍（ＨＮＭＴ）が含まれるが、これらに限定されない。したがって、有効成分を含有するワクチンまたは医薬組成物の投与の前に、治療されるがん細胞または組織におけるＬＹ６Ｋの発現レベルが同じ器官の正常細胞と比較して増大しているかどうかを確認することが好ましい。したがって、１つの態様では、本発明は、ＬＹ６Ｋを（過剰）発現するがんを治療するための方法であって、
ｉ）治療されるべきがんを有する対象から得たがん細胞または組織におけるＬＹ６Ｋの発現レベルを測定する段階；
ｉｉ）ＬＹ６Ｋの発現レベルを正常対照と比較する段階；および
ｉｉｉ）上記（ａ）〜（ｄ）から成る群より選択される少なくとも１つの成分を、正常対照と比較してＬＹ６Ｋを過剰発現するがんを有する対象に投与する段階
を含み得る方法を提供する。あるいは、本発明は、ＬＹ６Ｋを過剰発現するがんを有する対象に投与するのに使用するための、上記（ａ）〜（ｄ）から成る群より選択される少なくとも１つの成分を含有するワクチンまたは医薬組成物を提供し得る。言い換えると、本発明はさらに、本発明のＬＹ６Ｋポリペプチドで治療されるべき対象を同定するための方法であって、対象由来のがん細胞または組織におけるＬＹ６Ｋの発現レベルを測定する段階を含み、遺伝子の正常対照レベルと比較したレベル上昇が、対象が本発明のＬＹ６Ｋポリペプチドで治療し得るがんを有することを指示する方法を提供する。本発明のがんを治療する方法を以下でより詳細に説明する。
【０１６２】
さらに、好ましい態様では、本発明のペプチドを投与する前に対象のＨＬＡ型を同定し得る。例えば、配列番号：１のアミノ酸配列を有するペプチドは、好ましくはＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５またはＨＬＡ−ＤＲ８を有すると同定された対象に投与する。あるいは、配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチドは、好ましくはＨＬＡ−ＤＲ１５を有すると同定された対象に投与する。
目的のＬＹ６Ｋの転写または翻訳産物を含む限り、任意の対象由来の細胞または組織をＬＹ６Ｋ発現の測定に使用することができる。適切な試料の例には、血液、唾液および尿などの体組織および体液が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、対象由来の細胞または組織試料は、上皮細胞、より好ましくはがん性上皮細胞またはがん性であることが疑われる組織由来の上皮細胞を含む細胞集団を含有する。さらに、必要な場合は、得られた体組織および体液から細胞を精製し、その後対象由来試料として使用してもよい。
【０１６３】
本発明の方法によって治療される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが含まれるが、これらに限定されない。
本発明によれば、対象から得たがん細胞または組織におけるＬＹ６Ｋの発現レベルを測定する。発現レベルは、当技術分野において公知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルで測定することができる。例えば、ＬＹ６ＫのｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション法（例えばノーザンハイブリダイゼーション）によりプローブを用いて定量化し得る。検出はチップまたはアレイ上で実施し得る。ＬＹ６Ｋの発現レベルを検出するにはアレイの使用が好ましい。当業者は、ＬＹ６Ｋの配列情報を利用してそのようなプローブを調製することができる。例えば、ＬＹ６ＫのｃＤＮＡをプローブとして使用し得る。必要な場合は、プローブを色素、蛍光物質および同位体などの適切な標識で標識化してもよく、遺伝子の発現レベルをハイブリダイズした標識の強度として検出し得る。
【０１６４】
さらに、ＬＹ６Ｋの転写産物（例えば配列番号：７）は、増幅に基づく検出方法（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によってプライマーを使用して定量化し得る。そのようなプライマーは、利用可能な遺伝子の配列情報に基づいて調製し得る。
詳細には、本発明の方法に使用するプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中等度にストリンジェントな条件下または低ストリンジェントな条件下でＬＹ６ＫのｍＲＮＡにハイブリダイズする。本明細書で使用する場合、「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高温で認められる。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、規定のイオン強度およびｐＨで特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。標的配列は一般に過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有される。典型的には、ストリンジェントな条件とは、塩濃度がｐＨ  ７．０〜８．３で約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）であり、および温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、より長いプローブまたはプライマーの場合は少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成し得る。
【０１６５】
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出してもよい。例えば、ＬＹ６Ｋタンパク質（配列番号：８）の量を測定し得る。翻訳産物としてのタンパク質の量を測定するための方法には、タンパク質を特異的に認識する抗体を使用する免疫測定法が含まれる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。さらに、抗体の断片または改変抗体がＬＹ６Ｋタンパク質への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変型（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に使用し得る。タンパク質の検出のためのこれらの種類の抗体を調製する方法は当技術分野において周知であり、本発明ではそのような抗体およびその等価物を調製するために任意の方法を使用し得る。
翻訳産物に基づきＬＹ６Ｋ遺伝子の発現レベルを検出する別の方法として、ＬＹ６Ｋタンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学分析を介して染色の強度を測定し得る。すなわち、この測定では、強い染色は、タンパク質の存在／レベルの増大、および同時に、ＬＹ６Ｋ遺伝子の高い発現レベルを指す。
がん細胞における標的遺伝子、例えばＬＹ６Ｋ遺伝子の発現レベルは、標的遺伝子の対照レベル（例えば正常細胞におけるレベル）から、例えば１０％、２５％もしくは５０％増大している場合、または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超もしくはそれ以上に増大している場合、増大していると決定され得る。
【０１６６】
対照レベルは、疾患状態（がん性または非がん性）が既知である対象から以前に採取され、保存されていた試料を使用することによって、がん細胞と同時に測定し得る。加えて、治療されるべきがんを有する器官の非がん性領域から得た正常細胞を正常対照として使用してもよい。あるいは、疾患状態が既知である対象由来の試料において以前に測定されたＬＹ６Ｋ遺伝子の発現レベルを分析することによって得られた結果に基づき、統計学的方法によって対照レベルを決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験した細胞からの発現パターンのデータベースから導き出すことができる。さらに、本発明の１つの態様によれば、生物学的試料におけるＬＹ６Ｋ遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定した複数の対照レベルと比較し得る。対象由来の生物学的試料のものと類似の組織型に由来する参照試料から決定した対照レベルを使用することが好ましい。さらに、疾患状態が既知である集団におけるＬＹ６Ｋ遺伝子の発現レベルの標準値を使用することが好ましい。標準値は当技術分野において公知の任意の方法によって入手し得る。例えば、平均±２Ｓ．Ｄ．または平均±３Ｓ．Ｄ．の範囲を標準値として使用し得る。
【０１６７】
本発明に関連して、非がん性であることが既知の生物学的試料から決定した対照レベルを「正常対照レベル」と称する。他方で、対照レベルをがん性生物学的試料から決定した場合は、それを「がん性対照レベル」と称する。試料の発現レベルと対照レベルの差は、発現レベルが細胞のがん性または非がん性状態に依存して異ならないことが公知の対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して基準化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼおよびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６８】
ＬＹ６Ｋ遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比べて増大しているか、またはがん性対照レベルと類似／同等である場合、対象は、治療されるべきがんを有すると診断され得る。
より詳細には、本発明は、（ｉ）対象が治療されるべきがんを有するか否かを診断する、および／または（ｉｉ）がん治療のための対象を選択する方法であって、
ａ）治療されるべきがんを有することが疑われる対象から得たがん細胞または組織におけるＬＹ６Ｋの発現レベルを測定する段階；
ｂ）ＬＹ６Ｋの発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；
ｃ）ＬＹ６Ｋの発現レベルが正常対照レベルと比較して増大している場合、対象を、治療されるべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において、対象が治療されるべきがんを有すると診断された場合、その対象をがん治療のために選択する段階
を含む方法を提供する。
【０１６９】
あるいは、そのような方法は、
ａ）治療されるべきがんを有することが疑われる対象から得たがん細胞または組織におけるＬＹ６Ｋの発現レベルを測定する段階；
ｂ）ＬＹ６Ｋの発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階；
ｃ）ＬＹ６Ｋの発現レベルががん性対照レベルと類似または同等である場合、対象を、治療されるべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において、対象が治療されるべきがんを有すると診断された場合、その対象をがん治療のために選択する段階
を含む。
【０１７０】
いくつかの態様において、そのような方法は、上記で定義した段階ａ）〜ｄ）の後または前に、ＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＲ８から成る群より選択されるＨＬＡを有する対象を同定する段階をさらに含み得る。本発明によるがん療法は、ＬＹ６Ｋを過剰発現するがんに罹患しており、ならびにＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＲ８のいずれか１つを有する対象にとって好ましい。ＨＬＡタイピングの方法は当技術分野において周知である。例えば、ＨＬＡアリルをタイピングするためのＰＣＲに基づく方法は周知である。各々のＨＬＡ分子に特異的な抗体も、対象のＨＬＡ型を同定するための適切なツールである。
本発明はまた、本発明のＬＹ６Ｋポリペプチドで治療することができるがんに罹患している対象を決定するためのキットも提供し、そのようなキットは、特定のがん療法、より詳細には、がん免疫療法の効果を評価するおよび／またはモニタリングするのにも有用であり得る。適切ながんの説明例には、膀胱がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、食道がん、胃がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、骨肉腫、膵がん、軟組織腫瘍および頭頸部悪性腫瘍（ＨＮＭＴ）が含まれるが、これらに限定されない。より詳細には、キットは、好ましくは対象由来のがん細胞におけるＬＹ６Ｋ遺伝子の発現を検出するための少なくとも１つの試薬を含み、そのような試薬は、
（ａ）ＬＹ６Ｋ遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＬＹ６Ｋタンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＬＹ６Ｋタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
の群より選択される。
【０１７１】
ＬＹ６Ｋ遺伝子のｍＲＮＡを検出するのに適した試薬の例には、ＬＹ６Ｋ  ｍＲＮＡに特異的に結合するまたはＬＹ６Ｋ  ｍＲＮＡを同定する核酸、例えばＬＹ６Ｋ  ｍＲＮＡの一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、ＬＹ６Ｋ  ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブによって例示される。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製し得る。必要な場合は、ＬＹ６Ｋ  ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体マトリックス上に固定化し得る。さらに、ＬＹ６Ｋ  ｍＲＮＡを検出するための複数の試薬をキットに含めてもよい。
【０１７２】
他方で、ＬＹ６Ｋタンパク質を検出するのに適した試薬の例には、ＬＹ６Ｋタンパク質に対する抗体が含まれる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。さらに、抗体の断片または改変された抗体がＬＹ６Ｋタンパク質への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変型（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を試薬として使用し得る。タンパク質の検出のためのこれらの種類の抗体を調製する方法は当技術分野において周知であり、本発明ではそのような抗体およびその等価物を調製するために任意の方法を使用し得る。さらに、直接結合または間接標識技術により、抗体をシグナル生成分子で標識してもよい。標識、ならびに抗体を標識し、その標的への抗体の結合を検出するための方法は当分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明のために利用し得る。さらに、ＬＹ６Ｋタンパク質を検出するための複数の試薬をキットに含めてもよい。
【０１７３】
キットは、前記試薬の複数を含んでもよい。例えば、がんを有さないまたはがんに罹患している対象から得た組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、使用のための指示書と共に、緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジおよび添付文書（例えば書面、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。これらの試薬などは、ラベルを付した容器中に保持され得る。適切な容器には、ボトル、バイアルおよび試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。
【０１７４】
本発明の１つの態様として、試薬がＬＹ６Ｋ  ｍＲＮＡに対するプローブである場合、少なくとも１つの検出部位を形成するために試薬を多孔性ストリップなどの固体マトリックス上に固定化し得る。多孔性ストリップの測定領域または検出領域は、各々が核酸（プローブ）を含む複数の部位を含み得る。試験ストリップはまた、陰性対照および／または陽性対照のための部位を含んでもよい。あるいは、対照部位は、試験ストリップから隔てられたストリップ上に配置し得る。場合により、異なる検出部位は異なる量の固定化核酸を含んでもよく、すなわち、第一検出部位ではより高い量を含み、それに続く部位ではより少ない量を含んでもよい。試験試料の添加後、検出可能なシグナルを提示する部位の数により、試料中に存在するＬＹ６Ｋ  ｍＲＮＡの量の定量的指標が提供される。検出部位は、任意の適切な検出可能形状に構成することができ、典型的には、試験ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。
【０１７５】
本発明のキットは、陽性対照試料またはＬＹ６Ｋ標準試料をさらに含み得る。本発明の陽性対照試料は、ＬＹ６Ｋ陽性試料を採取し、次にそのＬＹ６Ｋレベルを検定することによって調製し得る。あるいは、精製されたＬＹ６Ｋタンパク質またはポリヌクレオチドを、ＬＹ６Ｋを発現しない細胞に添加して、陽性試料またはＬＹ６Ｋ標準試料を形成してもよい。本発明では、精製ＬＹ６Ｋは組換えタンパク質であり得る。陽性対照試料のＬＹ６Ｋレベルは、例えばカットオフ値を上回る。
【０１７６】
Ｘ．抗体：
本発明はさらに、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は、本発明のペプチドに特異的に結合し、他のペプチドには結合しない（または弱く結合する）。あるいは、抗体は、本発明のペプチドならびにそのホモログに結合する。本発明のペプチドに対する抗体は、がんの診断アッセイおよび予後判定アッセイならびに画像化法において使用され得る。同様に、そのような抗体は、ＬＹ６Ｋががん患者において発現されるまたは過剰発現される限り、他のがんの治療、診断および／または予後判定において使用され得る。さらに、細胞内で発現される抗体（例えば一本鎖抗体）は、ＬＹ６Ｋの発現が関与するがんを処置する際に治療的に使用され得、その例には、膀胱がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、食道がん、胃がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、骨肉腫、膵がん、軟組織腫瘍および頭頸部悪性腫瘍（ＨＮＭＴ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７７】
本発明はまた、配列番号：１および２の中から選択されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを含むＬＹ６Ｋタンパク質（配列番号：８）またはその断片の検出および／または定量化のための様々な免疫学的アッセイも提供する。そのようなアッセイは、適宜に、ＬＹ６Ｋタンパク質またはその断片を認識し、結合することができる１つまたは複数の抗ＬＹ６Ｋ抗体を含み得る。本発明において、ＬＹ６Ｋポリペプチドに結合する抗ＬＹ６Ｋ抗体は、好ましくは他のペプチドを排除して、好ましくは配列番号：１および２の中から選択されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを認識する。抗体の結合特異性は阻害試験で確認することができる。すなわち、分析する抗体と全長ＬＹ６Ｋポリペプチドの間の結合が配列番号：１および２の中から選択されるアミノ酸配列を有する任意の断片ポリペプチドの存在下で阻害される場合、抗体は断片に「特異的に結合する」とみなされる。本発明に関連して、そのような免疫学的アッセイは、様々なタイプの放射免疫測定法、免疫クロマトグラフィ技術、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光検定法（ＥＬＩＦＡ）等を含むがこれらに限定されない、当技術分野において周知の様々な免疫学的アッセイ形式内で実施される。
【０１７８】
本発明の関連する免疫学的であるが抗体を使用しないアッセイには、Ｔ細胞免疫原性アッセイ（阻害性または刺激性）ならびにＭＨＣ結合アッセイも含まれ得る。加えて、本発明の標識抗体を用いたラジオシンチグラフィ画像化法を含むがこれに限定されない、ＬＹ６Ｋを発現するがんを検出することができる免疫学的画像化法も本発明によって提供される。そのようなアッセイは、ＬＹ６Ｋを発現するがんの検出、モニタリングおよび予後判定において臨床的に使用することができ、そのようながんの例には、膀胱がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、食道がん、胃がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、骨肉腫、膵がん、軟組織腫瘍および頭頸部悪性腫瘍（ＨＮＭＴ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７９】
本発明はまた、本発明のペプチドに結合する抗体も提供する。本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの任意の形態で使用することができ、ウサギなどの動物を本発明のペプチドで免疫することによって得られる抗血清、すべてのクラスのポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ヒト抗体ならびに遺伝的組換えによって作製されるヒト化抗体を包含する。
【０１８０】
抗体を得るための抗原として使用する本発明のペプチドは、任意の動物種に由来し得るが、好ましくはヒト、マウスまたはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。ヒト由来のペプチドは、本明細書で開示するヌクレオチドまたはアミノ酸配列から入手し得る。
本発明によれば、本発明のポリペプチドの完全なペプチドおよび部分ペプチドは免疫化抗原として役立ち得る。適切な部分ペプチドの例には、例えば本発明のペプチドのアミノ（Ｎ）末端断片またはカルボキシ（Ｃ）末端断片が含まれる。
【０１８１】
本明細書では、抗体は、全長ＬＹ６ＫペプチドまたはＬＹ６Ｋペプチドの断片のいずれかと反応するタンパク質と定義される。好ましい態様では、本発明の抗体は、配列番号：１および２の中から選択されるアミノ酸配列を有するＬＹ６Ｋの断片ペプチドを認識することができる。オリゴペプチドを合成する方法は当技術分野において周知である。合成後、ペプチドを、場合により免疫原として使用する前に精製してもよい。本発明では、オリゴペプチド（例えば２４ｍｅｒまたは２６ｍｅｒ）を、免疫原性を増強するために担体と複合化または連結してもよい。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）は担体として周知である。ＫＬＨとペプチドを複合化する方法も当技術分野において周知である。
【０１８２】
あるいは、本発明のペプチドまたはその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクターに挿入してもよく、次にそれを使用して本明細書で述べるような宿主細胞を形質転換する。所望のペプチドまたはその断片を任意の標準的な方法によって宿主細胞の外部または内部から回収することができ、その後抗原として使用し得る。あるいは、ペプチドを発現する細胞全体またはその溶解物または化学合成したペプチドを抗原として使用してもよい。
【０１８３】
任意の哺乳動物を抗原で免疫し得るが、好ましくは細胞融合のために使用する親細胞との適合性を考慮に入れる。一般に、げっ歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）または霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅ）科の動物を使用し得る。げっ歯目科の動物には、例えばマウス、ラットおよびハムスターが含まれる。ウサギ目科の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長目科の動物には、例えばカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル、マントヒヒおよびチンパンジーなどの狭鼻下目（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）のサル（旧世界ザル）が含まれる。
【０１８４】
抗原で動物を免疫する方法は当技術分野において公知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射が哺乳動物の免疫のための標準的な方法である。より詳細には、抗原を適切な量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水等に希釈し、懸濁し得る。所望する場合は、抗原懸濁液を適切な量の標準的なアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントと混合し、乳化して、その後哺乳動物に投与してもよい。好ましくは、それに続いて、適切な量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を４〜２１日ごとに数回投与する。適切な担体も免疫のために使用し得る。上記のように免疫した後、血清を、所望抗体の量の増加に関して標準的な方法によって検査し得る。
【０１８５】
本発明のペプチドに対するポリクローナル抗体は、血清中の所望抗体の増加に関して検査した免疫哺乳動物から血液を採取し、任意の従来の方法で血液から血清を分離することによって調製し得る。ポリクローナル抗体には、ポリクローナル抗体を含有する血清、ならびに血清から単離し得るポリクローナル抗体を含有する画分が含まれる。免疫グロブリンＧまたはＭは、例えば本発明のペプチドと結合したアフィニティカラムを用いて本発明のペプチドだけを認識する画分から調製することができ、プロテインＡまたはプロテインＧカラムを用いてこの画分をさらに精製し得る。
【０１８６】
本発明に関する使用のためのモノクローナル抗体を調製するには、抗原で免疫した哺乳動物から免疫細胞を採取し、上述したように血清中の所望抗体のレベル上昇を検査して、細胞融合に供する。細胞融合に使用する免疫細胞は、好ましくは脾臓から得られる。上記免疫細胞と融合させる他の好ましい親細胞には、例えば哺乳動物の骨髄腫細胞、より好ましくは薬剤による融合細胞の選択のための獲得特性を有する骨髄腫細胞が含まれる。上記免疫細胞と骨髄腫細胞を公知の方法に従って、例えばＭｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．の方法（Ｇａｌｆｒｅ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ７３：３−４６（１９８１））に従って融合させることができる。
【０１８７】
生じる細胞融合によって得られたハイブリドーマは、それらを標準的な選択培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン含有培地）で培養することによって選択し得る。細胞培養を、典型的には数日間から数週間、すなわち所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞（非融合細胞）を死滅させるのに十分な時間、ＨＡＴ培地中で継続する。その後、標準的な限界希釈を実施して、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、クローン化し得る。
【０１８８】
ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫する上記方法に加えて、ヒトリンパ球、例えばＥＢウイルスに感染したものをインビトロでペプチド、ペプチド発現細胞またはそれらの溶解物で免疫し得る。次に、免疫したリンパ球を、Ｕ２６６などの無限に分裂することができるヒト由来骨髄腫細胞と融合させて、ペプチドに結合することができる所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを生成し得る（特開昭６３−１７６８８号）。
【０１８９】
得られたハイブリドーマを、その後マウスの腹腔に移植し、腹水を抽出し得る。得られたモノクローナル抗体を、例えば硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡもしくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィまたは本発明のペプチドを結合させたアフィニティカラムによって精製することができる。本発明の抗体は、本発明のペプチドの精製および検出に使用できるだけでなく、本発明のペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補としても用いることができる。あるいは、抗体を産生する、免疫リンパ球などの免疫細胞をがん遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体を調製するために使用してもよい。
【０１９０】
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子工学技術を用いて組換えによって調製することもできる（例えばＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  ＬＴＤ（１９９０）参照）。例えば、抗体をコードするＤＮＡを免疫細胞、例えば抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫リンパ球などからクローン化し、適切なベクターに挿入して、宿主細胞に導入し、組換え抗体を調製し得る。本発明はまた、上述したように調製される組換え抗体も提供する。
【０１９１】
本発明の抗体は、抗体の断片または改変された抗体が本発明のペプチドの１つまたは複数に結合する限り、抗体の断片または改変された抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、またはＨ鎖とＬ鎖からのＦｖ断片が適切なリンカーによって連結されている一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であり得る（Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−８３（１９８８））。より詳細には、抗体断片は、抗体をパパインまたはペプシンなどの酵素で処理することによって生成し得る。あるいは、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入して、適切な宿主細胞において発現させてもよい（例えばＣｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５２：２９６８−７６（１９９４）；Ｂｅｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １７８：４７６−９６（１９８９）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １７８：４９７−５１５（１９８９）；Ｌａｍｏｙｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １２１：６５２−６３（１９８６）；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １２１：６６３−９（１９８６）；Ｂｉｒｄ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９：１３２−７（１９９１）参照）。
【０１９２】
抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々な分子との結合によって修飾し得る。本発明はそのような修飾された抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得られ得る。これらの修飾方法は当技術分野において慣例的である。
【０１９３】
あるいは、本発明の抗体は、非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域との間のキメラ抗体として、または非ヒト抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域を含むヒト化抗体として入手し得る。そのような抗体は公知の技術に従って調製することができる。ヒト化は、げっ歯動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置き換えることによって実施できる（例えばＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））。したがって、そのようなヒト化抗体は、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少ない部分が非ヒト種からの対応する配列によって置換されているキメラ抗体である。
【０１９４】
ヒトフレームワーク領域および定常領域に加えてヒト可変領域を含む完全ヒト抗体も使用できる。そのような抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を用いて作製することができる。例えば、インビトロ法は、バクテリオファージ上に提示されるヒト抗体断片の組換えライブラリの使用を含む（例えばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）参照）。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウスに導入することによって作製できる。このアプローチは、例えば米国特許第６，１５０，５８４号；同第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号に記載されている。
【０１９５】
上述したようにして得られた抗体を均一に精製し得る。例えば、抗体の分離および精製は、一般的なタンパク質に用いられる分離および精製方法に従って実施できる。例えば、抗体を、アフィニティクロマトグラフィ、フィルター、限外ろ過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動および等電点電気泳動などの、しかしこれらに限定されないカラムクロマトグラフィの適切に選択し、組み合わせた使用によって分離および単離し得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））。プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムをアフィニティカラムとして使用することができる。使用される例示的なプロテインＡカラムには、例えばＨｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳおよびＳｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。
【０１９６】
適切なクロマトグラフィ技術の例には、アフィニティクロマトグラフィを除いて、例えばイオン交換クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、ゲルろ過、逆相クロマトグラフィ、吸着クロマトグラフィ等が含まれる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６））。クロマトグラフィ手順は、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィによって実施することができる。
【０１９７】
例えば、吸光度の測定、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）および／または免疫蛍光法を用いて本発明の抗体の抗原結合活性を測定し得る。ＥＬＩＳＡでは、本発明の抗体をプレートに固定化し、本発明のペプチドをプレートに塗布して、次に所望の抗体を含有する試料、例えば抗体産生細胞の培養上清または精製抗体を適用する。その後、一次抗体を認識する、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識した二次抗体を適用し、プレートをインキュベートする。次に、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニルリン酸などの酵素基質をプレートに添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。Ｃ末端またはＮ末端断片などのペプチドの断片を、抗体の結合活性を評価するための抗原として使用し得る。ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、本発明による抗体の活性を評価するために使用してもよい。
【０１９８】
上記方法は、本発明の抗体を、本発明のペプチドを含むと推測される試料に曝露し、抗体とペプチドによって形成される免疫複合体を検出または測定することにより、本発明のペプチドの検出または測定を可能にする。本発明によるペプチドの検出または測定の方法は、ペプチドを特異的に検出または測定することができるため、この方法はペプチドを用いる様々な実験で使用することができる。
【０１９９】
ＸＩ．ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドを導入するベクターおよび宿主細胞も提供する。本発明のベクターは、本発明のペプチドを発現するためまたは遺伝子治療のために本発明のヌクレオチドを投与するための、宿主細胞における本発明のヌクレオチド、特にＤＮＡの担体として有用である。
【０２００】
大腸菌を宿主細胞として選択し、ベクターを大腸菌（例えばＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１またはＸＬ１Ｂｌｕｅ）において大量に増幅し、生産する場合、ベクターは、大腸菌における増幅に適した「複製起点（ｏｒｉ）」および形質転換した大腸菌を選択するのに適したマーカー遺伝子（例えばアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等のような薬剤によって選択される薬剤耐性遺伝子）を有するべきである。例えば、Ｍ１３シリーズのベクター、ｐＵＣシリーズのベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等が使用できる。加えて、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴおよびｐＴ７も、上述したベクターと同様に、ｃＤＮＡをサブクローニングし、抽出するために使用できる。本発明のタンパク質を生産するためにベクターを使用する場合は、発現ベクターが使用できる。例えば、大腸菌で発現される発現ベクターは、大腸菌において増幅される上記特徴を有するべきである。ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１またはＸＬ１  Ｂｌｕｅなどの大腸菌を宿主細胞として使用する場合、ベクターは、大腸菌において所望の遺伝子を効率的に発現することができるプロモーター、例えばｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−６（１９８９）；ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ６：２４２２−７（１９９２））、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−３（１９８８））、Ｔ７プロモーター等を有するべきである。その点に関して、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＥＧＦＰおよびｐＥＴ（この場合、宿主は、好ましくはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＬ２１である）が、例えば、上記ベクターの代わりに使用できる。加えて、ベクターはまた、ペプチド分泌のためのシグナル配列も含み得る。ペプチドが大腸菌のペリプラズムに分泌されるように指令する例示的なシグナル配列は、ｐｅｌＢシグナル配列である（Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １６９：４３７９（１９８７））。ベクターを標的宿主細胞に導入するための手段には、例えば塩化カルシウム法およびエレクトロポレーション法が含まれる。
【０２０１】
大腸菌に加えて、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えばｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８（１７）：５３２２（１９９０））、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系」（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えばｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えばｐＺＩｐｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）ならびに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の発現ベクター（例えばｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が、本発明のポリペプチドを生産するために使用できる。
【０２０２】
ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＮＩＨ３Ｔ３細胞などの動物細胞においてベクターを発現するために、ベクターは、そのような細胞における発現に必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：１０８（１９７９））、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８：５３２２（１９９０））、ＣＭＶプロモーター等、および好ましくは形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、薬剤（例えばネオマイシン、Ｇ４１８）によって選択される薬剤耐性遺伝子）を担持すべきである。これらの特徴を有する公知のベクターの例には、例えばｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶおよびｐＯＰ１３が含まれる。
【０２０３】
以下では、特定の実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。しかし、以下の実験材料、方法および実施例は、当業者が本発明の特定の態様を作製し、使用することを助けるのに役立ち得るが、本発明の態様を例示することだけを意図し、したがっていかなる意味でも本発明の範囲を限定するものではない。当業者は容易に認識するように、本明細書で述べるものと類似または等価の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができる。
【実施例】
【０２０４】
材料および方法
患者および臨床試験
ペプチドに基づくがん免疫療法の２つの第Ｉ相臨床試験は、熊本大学（熊本、日本）の治験審査委員会によって審査され、承認された（承認番号８４１および１１２４）。頭頸部がんに罹患している患者はすべて、書面によるインフォームドコンセントを得た後、ＨＬＡ−Ａ２４の保有に基づいて選択した。腫瘍の病期および悪性度は、国際対がん連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）（ＵＩＣＣ）の分類に従って決定した。標準的な治療に抵抗性であった、再発性または転移性腫瘍を有する手術不可能な進行した頭頸部がんに罹患している患者を一方の治験（８４１）に登録した。手術可能な進行した頭頸部がんに罹患している患者を別の治験（１１２４）に登録した。この治験（１１２４）におけるこれらの患者は、術後ペプチドワクチン免疫療法で治療されたことがあった。患者は、再発性または転移性腫瘍を有する手術不可能な進行したＨＮＭＴに罹患しており、標準的な治療に抵抗性であった；これらの患者を大学病院医療情報ネットワーク臨床試験登録システム（ＵＭＩＮ−ＣＴＲ）番号０００００８３７９（ＣＴＲ−８３７９）の下で治験に登録した。根治的切除術を受けたＨＮＭＴ患者は、ＵＭＩＮ−ＣＴＲ番号０００００８３８０（ＣＴＲ−８３８０）の下で治験に登録した。後者の治験では、ＨＮＭＴ患者を、Ｓ−１、イフォスファミドまたはドキソルビシンと組み合わせた術後ペプチドワクチンで治療した。ワクチン接種のカクテルは、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬによって認識されかつＣＤＣＡ１（ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４））、ＫＯＣ１（ＫＯＣ１−Ａ２４（５０８−５１６））およびＬＹ６Ｋ（ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）に由来する、３つの合成短鎖ペプチド（ＳＰ）から成る（Ｓｕｄａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ２００７）。ペプチド（各々１ｍｇ）をＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５１  ５００μＬ中に乳化し、０、７、１４、２８、４２、５６、６３および７０日目、ならびにその後は腫瘍の進行または毒性が観察されるまで月に１回、皮下（ｓ．ｃ．）注射する。これらの臨床試験および試験の解析は現在も進行中である。これらの治験に参加した２３名の患者から血液試料を採取し、ＬＹ６Ｋ由来ペプチドに反応性のＴｈ細胞の免疫応答を検討した。
【０２０５】
細胞株および抗体
微量の内因性ＨＬＡクラスＩ分子を発現するヒトＢリンパ芽球様細胞株Ｃ１ＲのＨＬＡ−Ａ２４形質転換体であるＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞（Ｋａｒａｋｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９３；３７：１３９−４２）は、滝口雅文博士（熊本大学、熊本、日本）の厚意により贈られた。抗原提示細胞（ＡＰＣ）として、ＤＲ４（ＤＲＢ１＊０４：０５）、ＤＲ８（ＤＲＢ１＊０８：０３）、ＤＲ１５（ＤＲＢ１＊１５：０２）、またはＤＰ５（ＤＰＢ１＊０５：０１）のいずれかを発現するように遺伝的に操作されたマウス線維芽細胞株であるＬ細胞；Ｌ−ＤＲ４、Ｌ−ＤＲ８、Ｌ−ＤＲ１５、またはＬ−ＤＰ５を使用した。
【０２０６】
ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドのアルゴリズムによる予測
潜在的なプロミスキャスＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＰに結合するヒトＬＹ６Ｋ由来ペプチドを予測するため、コンピュータアルゴリズム（ＩＥＢＤ解析リソース、コンセンサス法、ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ａｎａｌｙｚｅ／ｈｔｍｌ／ｍｈｃ＿ＩＩ＿ｂｉｎｄｉｎｇ．ｈｔｍｌ）を用いてヒトＬＹ６Ｋタンパク質のアミノ酸配列を解析した（Ｗａｎｇ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；１１：５６８．Ｗａｎｇ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  ２００８；４：ｅ１００００４８）。プログラムは、タンパク質全体を包含する１５アミノ酸長配列のオフセットを解析した。ＤＲＢ１＊０９：０１またはＤＲＢ１＊１５：０２アリルによってコードされる複数のＨＬＡクラスＩＩ分子についてオーバーラップする高いコンセンサスパーセンタイル順位を有し、かつＬＹ６Ｋ由来の１０ｍｅｒＣＴＬエピトープを天然に含む２０アミノ酸長ペプチドを選択し、合成して、ＣＴＬエピトープを含むプロミスキャスなヘルパーＴ細胞エピトープを同定した（Ｈａｒａｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００８；１２３：２６１６−２５）。ＤＰＢ１＊０５：０１、ＤＲＢ１＊０８：０３、ＤＲＢ１＊０９：０１またはＤＲＢ１＊１５：０２によってコードされる複数のＨＬＡクラスＩＩ分子についてオーバーラップする高いコンセンサスパーセンタイル順位を有するが、ＣＴＬエピトープを含まない、別の２４アミノ酸長のＬＹ６Ｋ由来ＬＰも合成した。
【０２０７】
合成ペプチドおよび組換えタンパク質
ＨＬＡ−Ａ２４に結合するヒトＬＹ６Ｋ由来の短鎖ペプチド（ＳＰ）である、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）、ＲＹＣＮＬＥＧＰＰＩ（配列番号：３）を合成した（純度＞９５％、Ｂｉｏｍａｔｉｋ，Ｃａｎａｄａ）。２つのＬＰである、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）、ＫＷＴＥＰＹＣＶＩＡＡＶＫＩＦＰＲＦＦＭＶＡＫＱ（配列番号：１）；ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）、ＫＣＣＫＩＲＹＣＮＬＥＧＰＰＩＮＳＳＶＦ（配列番号：２）を合成し（純度＞９０％）、ＬＹ６Ｋ特異的ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激する能力に関して試験した。ＨＬＡ−Ａ２４（ＨＩＶ−Ａ２４、ＲＹＬＲＤＱＱＬＬ）（配列番号：４）に結合するＨＩＶペプチドを陰性対照ＳＰとして使用した（Ｔｏｍｉｔａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ；１０２：６９７−７０５．Ｔｏｍｉｔａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ；１０２：７１−８）。ＤＰ５に結合するＥＢＮＡ（エプスタイン−バーウイルス核抗原）由来のＬＰであるＥＢＮＡ−ＤＰ５（ＦＬＱＴＨＩＦＡＥＶＬＫＤＡＩＫＤＬ）（配列番号：５）およびプロミスキャスなＨＩＶ由来のＬＰを陰性対照ＬＰとして使用した（Ｆｕｊｉｋｉ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００７；３０：２８２−９３）。ペプチドを１０μｇ／μＬの濃度でジメチルスルホキシドに溶解した。組換え全ＬＹ６ＫおよびＣＤＣＡ１タンパク質を、ｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１によって発現させた。ＣＤＣＡ１タンパク質を対照として用いた。各々の組換えタンパク質を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。
【０２０８】
健常ドナーからのＴＡＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞株の生成
健常ドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取し、使用するための研究プロトコルは、熊本大学の治験審査委員会によって承認された。９名の健常ドナーから、書面によるインフォームドコンセントを得た後で血液試料を得た。この試験で検討した健常ドナーのＨＬＡ−Ａ、ＤＲＢ１およびＤＰＢ１アリルを、ポリメラーゼ連鎖反応およびアリル特異的プローブハイブリダイゼーションを用いてＨＬＡ遺伝子変異のＤＮＡタイピングによって決定し、表１に示す。健常ボランティアおよび患者からのＰＢＭＣを以前に述べられているように（Ｉｎｏｕｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ；１２７：１３９３−４０３）単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ４モノクローナル抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）と結合した磁気マイクロビーズを用いて陽性選択によってＰＢＭＣから精製した。単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を、以前に述べられているように（Ｈａｒａｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００８；１２３：２６１６−２５）インビトロ培養によってＣＤ１４＋細胞から生成し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用して、ＴＡＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導した。ＤＣ（１×１０４／ウェル）を１０μｇ／ｍｌのＬＰで３時間パルスし、照射して（４５Ｇｙ）、その後９６ウェル平底培養プレートの各ウェルにおいて５％ヒト補体除去血漿を添加したＡＩＭ−Ｖ  ２００μＬ中の自己ＣＤ４＋Ｔ細胞（３×１０４／ウェル）と混合した。７日後、培地の半分を各培養物から取り出し、次に、ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）および５ｎｇ／ｍｌのヒト組換え（ｈｒ）ＩＬ−７でパルスした、照射した（５０Ｇｙ）自己ＰＢＭＣ（１×１０５）を含む新鮮培地（１００μＬ／ウェル）を培養物に添加した。ペプチドでの２回目の刺激の２日後に、ｈｒ  ＩＬ−２を１０ＩＵ／ｍｌの最終濃度で各ウェルに添加した。１週間後、各ウェル中の刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞を、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイにおいて特異性について分析した。コグネイトペプチドに特異的応答を示すＴ細胞を２４ウェルプレートに移し、１０ＩＵ／ｍｌのｈｒ  ＩＬ−２および５ｎｇ／ｍｌのｈｒ  ＩＬ−７を添加した培地中、ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）でパルスした照射自己ＰＢＭＣ（１×１０６／ウェル）を用いて週１回の間隔で再刺激した。
【０２０９】
【表１】
0006255594.tif 000002
【０２１０】
ペプチドに対するＴ細胞応答の評価
ペプチドでパルスしたＡＰＣに対するＴｈ細胞の免疫応答を、以前に述べられているように（Ｔｏｍｉｔａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ；１０２：６９７−７０５）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴキット、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって評価した。簡単に述べると、ペプチドでパルスしたＰＢＭＣ（３×１０４細胞／ウェル）での刺激後の３×１０４のバルクＣＤ４＋Ｔ細胞、またはペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲまたはＤＰを発現するＬ細胞（５×１０４／ウェル）での刺激後の１×１０４のバルクＣＤ４＋Ｔ細胞当たりの、ＩＦＮ−γを産生するペプチド特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を分析した。抗原提示に関与する拘束ＨＬＡ分子を決定するため、抗原誘導性ＩＦＮ−γ産生のブロッキングを、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ｍＡｂ（Ｌ２４３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＨＬＡ−ＤＰ  ｍＡｂ（Ｂ７／２１、ａｂｃａｍ）、抗ヒトＨＬＡ−ＤＱ  ｍＡｂ（ＳＰＶ−Ｌ３、ａｂｃａｍ）または抗ＨＬＡクラスＩ  ｍＡｂ（Ｗ６／３２、ａｂｃａｍ）を添加することによって検査した。すべてのｍＡｂを５μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。ＨＩＶ由来のペプチドと共に培養した細胞を陰性対照として使用した。ＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に培養した細胞を陽性対照として使用した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのすべての評価は２連または３連に実施し、結果は平均値に対応した。
【０２１１】
サイトカインアッセイ
Ｔ細胞（１×１０４／ウェル）を、９６ウェル培養プレートにおいてＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）の存在下でＬ−ＤＰ５（５×１０４／ウェル）と共に培養した。２０時間後、培養上清を採取し、サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１７）レベルを、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を製造者の使用説明書に従って使用して測定した。
【０２１２】
ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰ特異的バルクＴｈ細胞（３×１０４細胞／ウェル）およびＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ特異的Ｔｈ細胞クローン（Ｔｈクローン、１×１０４細胞／ウェル）を、９６ウェル培養プレートにおいてコグネイトペプチドの存在下で自己ＰＢＭＣ（３×１０４細胞／ウェル）と共に培養した。２４時間後、培養上清を回収し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を製造者の使用説明書に従って使用して、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αおよびＭＩＰ１β）レベルを測定した。
【０２１３】
ＣＤ１０７ａ動員アッセイ
ＬＰで刺激された脱顆粒ＣＤ４＋Ｔリンパ球を同定するため、細胞表面に露出されたＣＤ１０７ａをフローサイトメトリによって分析した。（Ｒｕｂｉｏ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００３；９：１３７７−８２．Ｂｅｔｔｓ  ＭＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００３；２８１：６５−７８）簡単に述べると、ＣＤ１０７ａ動員アッセイを以前に述べられているように実施した。（Ｔｏｍｉｔａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ２０１１；１０２（１）：７１−８）ＬＹ６Ｋ由来ペプチドまたは対照ペプチド（１μｇ／ｍｌ）を刺激剤として添加し、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ１０７ａ  ｍＡｂまたはＦＩＴＣ標識アイソタイプ対照マウスＩｇＧ１およびモネンシンを各ウェルに添加した。細胞を３７℃で５時間培養した。培養後、ペプチドで刺激したＴｈ細胞またはＣＴＬをＰＥ結合抗ヒトＣＤ４抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色し、フローサイトメトリ（ＦＡＣＳｃａｎ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析した。
【０２１４】
ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）長鎖ペプチドでのＰＢＭＣの刺激
インビトロでのＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰでの刺激によるＨＬＡ−Ａ２４陽性ドナーからのＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬの誘導を評価するため、ＰＢＭＣ（２４ウェルプレートで２×１０６／ウェル）を、いずれのサイトカインも添加せずにＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ（７μＭ）と共に２週間インキュベートした。０日目と７日目にＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ（７μＭ）を添加し、次にＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰでのインビトロ刺激の１４日目に細胞を回収して、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８  ｍＡｂと組み合わせたＨＬＡ−Ａ２４（Ａ＊２４：０２）／ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）複合体のＰＥ標識テトラマーで染色し、フローサイトメトリによって分析した。
【０２１５】
ＨＮＭＴ患者におけるＬＹ６Ｋ−ＬＰでの刺激によるＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬの増殖
ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰでワクチン接種した１１名のＨＮＭＴ患者からのＰＢＭＣを、２４ウェルプレート（２×１０６／ウェル）においてＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰとＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ（各々１０μｇ／ｍＬ）の混合物と共に培養した；ｒｈＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍＬ）およびｒｈＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）を０日目と２日目に添加した。０日目（エクスビボ）および７日目に、ＰＢＭＣを、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８  ｍＡｂとＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）複合体とのＰＥ標識テトラマー（ＭＢＬ、名古屋、日本）で染色した。
【０２１６】
インビボクロスプライミングアッセイ
ＨＬＡ−Ａ２４  Ｔｇｍは、Ｆ．Ａ．Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ博士の厚意により提供された（Ｊｕｎｇ  ＫＯ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８６：７６１６−２４）。ペプチドワクチン接種のため、マウスに、７日の間隔で、ＩＦＡ中に乳化したＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ（１００μｇ／マウス）溶液を尾の基部で皮内注射した。ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰでの２回目のワクチン接種の７日後に、マウスを犠死させて鼠径リンパ球を得、ＣＤ８＋Ｔ細胞を磁気マイクロビーズでポジティブ単離した。ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰまたはＨＩＶ−Ａ２４  ＳＰでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞（２×１０４／ウェル）での刺激後にＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞（３×１０５／ウェル）の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって計数した。
【０２１７】
ＨＬＡ−Ａ２４（ＨＨＨ）トランスジェニックマウス（Ｔｇｍ）は、Ｆ．Ａ．Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ博士の厚意により提供された（Ｊｕｎｇ  ＫＯ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；８６：７６１６−２４）。マウスに、７日の間隔で３回、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中に乳化したＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ溶液（１００μｇ／マウス）を尾の基部で皮内注射した。ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰでの３回目のワクチン接種の７日後に、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）での陽性選択によって鼠径リンパ節から単離した。ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰでパルスしたＢＭ−ＤＣ（２×１０４細胞／ウェル）での刺激に応答したＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞（１×１０５細胞／ウェル）の数をエクスビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって計数した（Ｉｎｏｕｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ２００９；１２６：６７−７２；Ｈａｒａｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００８；１２３：２６１６−２５）。
【０２１８】
ＬＹ６Ｋ由来のＳＰで能動免疫した頭頸部がん患者におけるＬＹ６Ｋ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の評価
がん患者または健常ドナーからのＰＢＭＣを、５％ヒト補体除去血漿を添加したＡＩＭ−Ｖ中、２４ウェルプレート（２×１０６／ウェル）において１０μｇ／ｍＬのＬＹ６Ｋ由来ＬＰの混合物と共に培養し、ＩＬ−７およびＩＬ−２を０日目と２日目に添加した。１週間の細胞培養後、ＰＢＭＣを回収し、ＬＹ６Ｋ特異的Ｔ細胞の存在をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定した。短期培養したＰＢＭＣ（１×１０５／ウェル）を洗浄し、抗ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体で前被覆したＥＬＩＳＰＯＴプレートにおいて培地中のＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）またはＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰと共に１８時間培養した。ＨＩＶ−Ａ２４と共に培養した細胞を陰性対照として使用した。スポット形成細胞／１０５細胞として表した特異的Ｔ細胞の数を、陰性対照値（バックグラウンド）を差し引いた後に算出した。ＨＬＡクラスＩＩ拘束の判定のため、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰまたはＨＬＡクラスＩに特異的な以下のブロッキング抗体を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの間に細胞培養物に添加した。ＩＦＮ−γが１０より多くかつバックグラウンドの２倍を上回る場合は、応答を陽性と評価した。がん患者におけるすべての実験は、単一ウェルまたは２連のウェルで実施した。患者の細胞に関するＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、使用可能な細胞の数が限られていたため、１連、２連または３連のウェルで実施した。ＩＦＮ−γが１５より多くかつバックグラウンドの２倍を上回る場合は、応答を陽性と評価した。この試験は、探索的研究の原則（ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ）の下で活動する研究室で行い、研究プロトコルを用いて実施した。本発明者らは、ヒトＴ細胞アッセイに関する枠組みを報告した「Ｔ細胞アッセイについての最小限情報（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ａｂｏｕｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ａｓｓａｙ）」（ＭＩＡＴＡ）の推奨（Ｂｒｉｔｔｅｎ  ＣＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０１２；３７：１−２）に同意する。
【０２１９】
テトラマー染色
ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現を、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ複合体のＰＥ標識テトラマー（ＭＢＬ、名古屋、日本）を使用して製造者の使用説明書に従ってＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検査した。ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＨＩＶ−Ａ２４（ＲＹＬＲＤＱＱＬＬ：配列番号：４）複合体のＰＥ標識テトラマーを陰性対照として使用した。
【０２２０】
インビトロ交差提示アッセイ
ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰでの刺激によるＨＬＡ−Ａ２４＋かつＨＬＡ−ＤＲ１５＋ＨＤＬ３からのＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ反応性ＣＴＬの誘導を、記述されているように（Ｔｏｍｉｔａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ２０１１；１０２：７１−８．，Ｉｍａｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８；１４：６４８７−９５）実施した。以前に述べられているように（Ｈａｒａｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００８；１２３：２６１６−２５）、単球由来のＤＣをインビトロ培養によってＣＤ１４＋細胞から生成した。自己未熟ＤＣを、生存状態に保持するかまたは０．１％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で３分間固定し、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）−ＬＰまたは対照ＬＰ（各々１６μＭ）で３時間パルスして、３回洗浄した。ペプチドパルスの間およびパルス後にＯＫ４３２（０．１ＫＥ／ｍＬ）を添加し、ＤＣの成熟を誘導した。公知のＣＴＬエピトープを含まないＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰを対照ＬＰとして使用した。ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ反応性バルクＣＴＬを、１０μｇ／ｍＬのブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む培地中に２：１の比率で６時間添加した。ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生を細胞内標識によって測定した。細胞を、ＰｅｒＣＰ標識抗ヒトＣＤ８  ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＰＥ標識ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的テトラマーと組み合わせたＦＩＴＣ標識抗ヒトＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。
【０２２１】
ＨＮＭＴ患者におけるＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）−ＬＰでの刺激によるＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬの増殖
ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰでワクチン接種した５名のＨＮＭＴ患者からのＰＢＭＣを、９６ウェルプレートにおいて（１×１０５／ウェル）ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ（各々１０μｇ／ｍＬ）と共に培養した；ｒｈＩＬ２（２０ＩＵ／ｍＬ）およびｒｈＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）を０日目と２日目に添加した。０日目（エクスビボ）および７日目に、ＰＢＭＣを、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８  ｍＡｂとＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）複合体とのＰＥ標識テトラマーで染色した。
【０２２２】
ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）−ＬＰでのＰＢＭＣの刺激によるＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬのインビトロ誘導
インビトロでのＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰでの刺激によるＨＬＡ−Ａ２４＋ドナー（ＨＤＬ１、ＨＤＬ３およびＨＤＬ４）からのＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬの誘導を評価するため、ＰＢＭＣ（２４ウェルプレートで２×１０６細胞／ウェル）を、いずれのサイトカインも添加せずにＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ（７μＭ）と共に２週間インキュベートした。７日目にＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ（７μＭ）を添加し、次にＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰでのインビトロ刺激の１４日目に細胞を回収して、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８  ｍＡｂとのＰＥ標識ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的テトラマーで染色した。
【０２２３】
ＬＹ６Ｋ特異的ＣＴＬの誘導に対するＬＹ６Ｋ−ＬＰの相乗作用
ＬＹ６Ｋ−ＬＰがＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬの誘導を増強することができるかどうかを試験するため、ＨＤＬ３由来のＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰ特異的またはＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ特異的バルクＣＤ４＋Ｔ細胞（１×１０５細胞／ウェル、４８ウェルプレート）およびＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的バルクＣＤ８＋Ｔ細胞（１×１０５細胞／ウェル）を、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ（１０μｇ／ｍＬ）、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ＋対照ＬＰ（１０μｇ／ｍＬ）、またはＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ＋ＬＹ６Ｋ−ＬＰ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下で自己ＤＣ（２×１０４細胞／ウェル）と共に培養した。ペプチドとの１週間のインビトロ培養後、培養した細胞をＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的テトラマーで染色した。
ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰでワクチン接種したＨＮＭＴ患者から得た新鮮ＰＢＭＣを、９６ウェル丸底培養プレートに播種し（１×１０５細胞／ウェル）、次いで、サイトカインを添加せずに５％ヒト補体除去血漿を添加した最終容量２００μＬのＡＩＭ−Ｖ中のＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ単独（１０μｇ／ｍＬ）、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ＋対照ＬＰ（１０μｇ／ｍＬ）、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ＋ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰ（１０μｇ／ｍＬ）、またはＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ＋ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ（１０μｇ／ｍＬ）を添加した。培養の７日目に、細胞をＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）特異的テトラマーで染色した。
【０２２４】
統計解析
データを、両側スチューデントｔ検定（棒グラフ）、フィッシャーの正確確率検定、またはノンパラメトリックのマン−ホイットニーＵ検定によって比較した。すべての検定に関してＰ値＜０．０５の差を統計的に有意とみなした。
【０２２５】
結果
潜在的なプロミスキャスＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの予測および選択
ＬＹ６Ｋの潜在的かつプロミスキャスなＨＬＡクラスＩＩ結合Ｔｈ細胞エピトープを同定するため、本発明者らは、最初に、図１Ａおよび表２に示すようにコンピュータアルゴリズムを用いて（Ｗａｎｇ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；１１：５６８．Ｗａｎｇ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  ２００８；４：ｅ１００００４８）ＬＹ６Ｋのアミノ酸配列を検討した。興味深いことに、本発明者らは、コンピュータアルゴリズムによって強力なプロミスキャスＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドと予測された１つのＬＹ６Ｋ由来ペプチドＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）が、ＣＴＬエピトープであるＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）に非常に近位であることを見出した（図１Ｂ）。それゆえ、本発明者らは、複数のＨＬＡクラスＩＩ分子ＨＬＡ−ＤＲ９（ＤＲＢ１＊０９：０１）およびＨＬＡ−ＤＲ１５についてオーバーラップする高いコンセンサスパーセンタイル順位を有し、かつＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬによって認識される天然の１０ｍｅｒペプチドを含む、候補ＬＰであるＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）（図１Ａおよび表２）を、その後の分析のために選択し、合成した。ＣＴＬエピトープを含まないが、複数のＨＬＡクラスＩＩ分子についてオーバーラップする高いコンセンサスパーセンタイル順位を有する、別のＬＰであるＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）も合成し、このＬＰがＬＹ６Ｋ特異的Ｔｈ細胞を生成することができるかどうかを評価した。
【０２２６】
【表２】
0006255594.tif 000003
【０２２７】
ＣＴＬエピトープを天然に含むＬＹ６Ｋ由来のプロミスキャスなＨＬＡクラスＩＩ結合Ｔｈ細胞エピトープの同定
本発明者らは、これら２つの選択した合成ＬＰがＬＹ６Ｋ特異的Ｔｈ細胞を生成することができるかどうかを評価した。３名の健常ドナーのＰＢＭＣから単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を、週１回の間隔で、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ペプチドでパルスした自己ＤＣおよびＰＢＭＣで刺激した。少なくとも３回の刺激後、培養したＣＤ４＋Ｔｈ細胞のＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）特異的応答をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検査した。ＨＬＡ−ＤＰ５陽性かつＤＲ４陽性の健常ドナーにおいて、生成されたＴｈ細胞株は、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）に応答して有意の量のＩＦＮ−γを産生した（図２Ａ）。Ｔｈ細胞株のＨＬＡ拘束を明らかにするため、ＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＰに特異的なｍＡｂを使用した。ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）に応答したＴｈ細胞株のＩＦＮ−γ産生は、ＨＬＡ−ＤＰ特異的ｍＡｂを添加した場合有意に減少したが、ＨＬＡ−ＤＲ特異的ｍＡｂは影響を示さなかった（図２Ａ）。
【０２２８】
ＨＬＡ拘束をさらに分析するため、本発明者らは、ペプチドでパルスしたＬ−ＤＰ５またはＬ−ＤＲ４細胞に対するＴｈ細胞の反応性を試験した。ＤＰ５陽性健常ドナーから生成したバルクＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）特異的Ｔｈ細胞株は、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）でパルスしたＬ−ＤＰ５細胞を特異的に認識したが、Ｌ−ＤＲ４細胞、無関係なペプチド（ＥＢＮＡ−ＤＰ５）でパルスしたＬ−ＤＰ５細胞、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ペプチドでパルスしたＬ−ＤＲ４細胞は認識しなかった。ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）でパルスしたＬ−ＤＰ５細胞の認識におけるＴｈ細胞株のＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡ−ＤＰ  ｍＡｂの添加によって有意に阻害されたが、抗ＨＬＡクラスＩ  ｍＡｂでは阻害されなかった（図２Ｂ）。これらの結果は、これらのＴｈ細胞株においてＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）がＨＬＡ−ＤＰ５によって提示されることを明らかに示した。
【０２２９】
ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）が他のＨＬＡクラスＩＩ分子に結合して、Ｔｈ細胞応答を誘導することができるかどうかを調べるため、２名の他の健常ドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）でパルスした自己ＤＣおよびＰＢＭＣで刺激した。ＨＬＡ−ＤＲ８陽性ドナーＨＤＬ２から生成したＴｈ細胞株は、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）でパルスしたＰＢＭＣおよびＬ−ＤＲ８細胞に応答して有意の量のＩＦＮ−γを特異的に産生したが、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）でパルスしたＬ−ＤＲ１５細胞では有意の量のＩＦＮ−γは産生されなかった。ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）でパルスしたＰＢＭＣまたはＬ−ＤＲ８細胞に応答したＴｈ細胞株のＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ｍＡｂの添加によって有意に阻害されたが、ＨＬＡ−ＤＰまたはＨＬＡ−クラスＩ特異的ｍＡｂでは阻害されなかった（図２ＡおよびＢ）。これらの結果は、このＴ細胞株においてＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）がＨＬＡ−ＤＲ８によって提示されることを明らかに示した。
【０２３０】
ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）での刺激によってＨＬＡ−ＤＲ１５陽性ドナーＨＤＬ３から生成したＴｈ細胞株も、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）でパルスしたＰＢＭＣおよびＬ−ＤＲ１５細胞に応答して有意の量のＩＦＮ−γを特異的に産生したが、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）でパルスしたまたはパルスしていないＬ−ＤＲ８細胞では有意の量のＩＦＮ−γは産生されなかった。ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）でパルスしたＰＢＭＣまたはＬ−ＤＲ１５細胞に対するＴｈ細胞株のＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ｍＡｂの添加によって有意に阻害されたが、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱまたはＨＬＡクラスＩ特異的ｍＡｂでは阻害されなかった（図２ＡおよびＢ）。これらの結果は、このＴ細胞株においてＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）がＨＬＡ−ＤＲ１５によって提示されたことを明らかに示す。
したがって、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）は、ＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ８およびＨＬＡ−ＤＲ１５分子に結合する能力を有しており、このことは、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）が日本人群におけるプロミスキャスで高頻度のＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示されるＴｈ細胞エピトープであることを示す。
【０２３１】
次に、本発明者らは、別のペプチドである、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬによって認識されるエピトープを含むＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）が、特異的Ｔｈ１細胞を生成することができるかどうかを評価した。２名の健常ドナーからのＰＢＭＣのＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）でパルスした自己ＤＣおよびＰＢＭＣで刺激した。
ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）での刺激によってＨＬＡ−ＤＲ１５陽性ドナーＨＤＬ３から生成したＴｈ細胞株は、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）でパルスしたＰＢＭＣおよびＬ−ＤＲ１５細胞に応答して有意の量のＩＦＮ−γを特異的に産生したが、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）でパルスしたまたはパルスしていないＬ−ＤＲ８細胞では有意の量のＩＦＮ−γは産生されなかった。ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）でパルスしたＰＢＭＣまたはＬ−ＤＲ１５細胞に対するＴｈ細胞株のＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ｍＡｂの添加によって有意に阻害されたが、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱまたはＨＬＡ−クラスＩ特異的ｍＡｂでは阻害されなかった（図３Ａの上のパネル）。ＨＬＡ−ＤＲ１５＋ドナー（ＨＤＬ２）から生成したＴｈ細胞は、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰでパルスしたＰＢＭＣに応答して、ＨＬＡ−ＤＲ依存的に有意の量のＩＦＮ−γを産生した。バルクＴｈ細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ依存的に、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰでパルスしたＬ−ＤＲ１５細胞を特異的に認識した（図３Ａの下のパネル）。これらの結果は、このＴ細胞株においてＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）がＨＬＡ−ＤＲ１５によって提示されたことを明らかに示す。
【０２３２】
ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）が別のＨＬＡクラスＩＩ分子に結合し、Ｔｈ細胞応答を誘導することができるかどうかを調べるため、ＨＬＡ−ＤＲ１５陰性健常ドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）でパルスした自己ＤＣおよびＰＢＭＣで刺激した。生成されたＴｈ細胞は、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）でパルスした自己ＰＢＭＣに応答して有意の量のＩＦＮ−γを産生したが、パルスしていないＰＢＭＣでは有意の量のＩＦＮ−γは産生されなかった（図３Ｂ）。Ｔｈ細胞株のこのＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡ−ＤＱ  ｍＡｂの添加によって有意に阻害されたが、抗ＨＬＡ−ＤＲまたは抗ＨＬＡ−ＤＰでは阻害されなかった。これらの結果は、このＴｈ細胞がＨＬＡ−ＤＱ分子によって拘束されることを示した。
【０２３３】
天然の対応するタンパク質のＮ末端およびＣ末端の両方で伸長させた２５アミノ酸（ａａ）長の合成ペプチドＬＹ６Ｋ（１６８−１９２）、ＦＦＹＬＫＣＣＫＩＲＹＣＮＬＥＧＰＰＩＮＳＳＶＦＫ（配列番号：６）を合成し、同じくＬＹ６Ｋ特異的ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激する能力に関して試験した。興味深いことに、この伸長したＬＰは、同じドナーにおいてペプチド特異的ＤＱ拘束性Ｔｈ細胞だけでなく、ＤＲ拘束性Ｔｈ細胞も誘導することができた（図４）。したがって、より長いペプチドＬＹ６Ｋ（１６８−１９２）は、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）よりもプロミスキャスにＴｈ細胞を誘導することができると考えられる。
合わせて考慮すると、ここで提示したこれらの結果は、２つのペプチドＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）およびＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）が、ＨＬＡ−ＤＰ５、ＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＱ拘束性Ｔｈ細胞を刺激する能力を有することを明らかに示し、これらのペプチドが、プロミスキャスなＨＬＡクラスＩＩ分子によってＴｈ細胞に提示され得ることおよび多くの患者のがん免疫療法に使用可能であり得ることを示唆する。
【０２３４】
ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ペプチドはＴｈ１型ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激する
ＬＹ６Ｋペプチド誘導性Ｔｈ細胞をさらに特徴づけるため、本発明者らは、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘシステムにより、コグネイトペプチドでのＬＹ６Ｋ特異的バルクＣＤ４＋Ｔｈ細胞株の刺激に応答したいくつかのサイトカインを測定した。ドナーＨＤＬ１から生成したＬＹ６Ｋ特異的バルクＴｈ株は、コグネイトペプチドでパルスしたＬ−ＤＰ５での再刺激により、大量のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭＩＰ−１βを産生し、ＩＬ−２を有意に産生したが、ＩＬ−４およびＩＬ−１７の産生はより少なく、このことは、ＬＹ６Ｋペプチドによって誘導されるＴｈ細胞のＴｈ１分極特性を示した（図５Ａ）。
図５Ｂに示すように、ＨＤＬ４からのＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ特異的Ｔｈクローンは、刺激後に大量のこれらのサイトカインを産生し、このことは、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰが多機能性Ｔｈ１細胞を誘導できることを示唆した。同様の結果を、ＨＤＬ３から樹立したＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ特異的Ｔｈ細胞から得た（データは示していない）。
【０２３５】
興味深いことに、抗ウイルス性ＣＤ４＋エフェクターおよび腫瘍浸潤性リンパ球について示されたのと同様に（Ｃａｓａｚｚａ  ＪＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００６；２０３：２８６５−７７．Ａｔｔｉｇ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９；６９：８４１２−９．Ｗｉｄｅｎｍｅｙｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ；１３１：１４０−９）、細胞傷害性マーカーＣＤ１０７ａも、コグネイトペプチドで刺激したＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）特異的バルクＴｈ細胞株上で検出することができた（図５Ｃ、上のパネル）。ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰに関しては、抗ウイルス性ＣＤ４＋エフェクターおよび腫瘍浸潤性リンパ球について以前に明らかにされたのと同様に（Ｃａｓａｚｚａ  ＪＰ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００６；２０３：２８６５−７７；Ａｔｔｉｇ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９；６９：８４１２−９；Ｗｉｄｅｎｍｅｙｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１２；１３１：１４０−９；Ｍａｒｔｏｒｅｌｌｉ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１０；２９：３７１−４０２）、ＣＤ１０７ａが、コグネイトペプチドで刺激したＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ特異的バルクＴｈ１細胞（ＨＤＬ４）上でも検出された（図５Ｃ、下のパネル、データは示していない）。全体として、これらのデータは、ＬＹ６Ｋ特異的Ｔｈ１細胞がヘルパー機能および直接の細胞傷害活性を及ぼすことができることを示唆し、これらはどちらもがん免疫療法のために有益である。
【０２３６】
ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰはインビトロおよびインビボでＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激する
次にＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激するＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰの能力を検討した。７μＭのＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰでのＰＢＭＣの２回の刺激は、無関係なペプチドでのＰＢＭＣの刺激と比較してＨＬＡ−Ａ２４拘束性かつＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導した（図６Ａ）。
【０２３７】
本発明者らはまた、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰが、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰを用いてインビボで能動免疫した頭頸部がん患者において生成されたＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のインビトロでの増殖を刺激することができるかどうかも試験した。この患者からエクスビボで単離したＰＢＭＣにおけるＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的かつＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬの存在を、ＨＬＡ−Ａ２４（Ａ＊２４：０２）／ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）複合体のＰＥ標識テトラマーで染色することによって検出した（図６Ｂ、左側）。これらのＰＢＭＣをＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰと共に短期間（１週間）培養し、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をテトラマーによって検出した。図６Ｂの右側に示すように、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬはＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰでの短期インビトロ刺激によって有意に増殖した。
【０２３８】
次に、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰの能力をインビボで検討した。ＨＬＡ−Ａ２４  Ｔｇｍを、７日の間隔で、ＩＦＡ中に乳化したＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰを用いて尾の基部で２回免疫した。ＬＰでの２回目のワクチン接種の７日後に、鼠径ＬＮ中のＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の数をエクスビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定した。図６Ｃに示すように、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰでのＨＬＡ−Ａ２４  Ｔｇｍの２回の免疫によって刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰでパルスしたＣ１Ｒ２４０２での再刺激に応答してＩＦＮ−γを特異的に産生したが、無関係なＨＩＶ−Ａ２４ペプチドでパルスしたＣ１Ｒ２４０２ではＩＦＮ−γを産生せず、このことは、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰが、おそらくＨＬＡ−Ａ２４  Ｔｇｍにおけるインビボでの交差提示によって、有意の割合のＩＦＮ−γ産生ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬを誘導したことを示唆した。
合わせて考慮すると、これらの結果は、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰがインビトロおよびインビボの両方でＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬをクロスプライミングすることができることを示唆する。
【０２３９】
ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）短鎖ペプチドでワクチン接種した頭頸部がん患者におけるＬＹ６Ｋ特異的Ｔ細胞の存在
最近、Ｇｏｄｅｔ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．は、肺がん患者における自発的な腫瘍特異的Ｔｈ細胞応答の存在および天然に生じるＴＡＡ特異的Ｔｈ免疫応答が臨床転帰に影響を及ぼすことを報告した（Ｇｏｄｅｔ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；１８：２９４３−５３）。そこで、本発明者らは、ＬＹ６Ｋ特異的Ｔｈ細胞応答が、ＬＹ６Ｋ由来のＣＴＬエピトープワクチンでのがん患者の能動免疫によって効率的に誘導され得ると考えた。患者における抗原特異的応答を検出するため、７名の頭頸部がん患者から単離したＰＢＭＣを回収し、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰ特異的Ｔｈ細胞をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検出した。３名の健常ボランティアから単離したＰＢＭＣを対照として使用した。ＩＦＮ−γ分泌細胞の数が陰性対照の少なくとも２倍である場合、応答を陽性とみなした。この実験計画により、ＬＹ６Ｋ特異的Ｔｈ細胞記憶応答を測定することが可能となる。図７Ａに示すように、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰ特異的記憶免疫応答が６名の患者のうち５名（８３％）で観察され、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ特異的記憶免疫応答はすべての患者（１００％）で観察されたが、３名の連続的な健常ドナーおよび１名のワクチン接種していないがん患者ではＬＹ６Ｋに対する特異的ＩＦＮ−γ応答は検出されなかった（図７Ａ）。Ｔｈ細胞株のこれらのＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ｍＡｂの添加によって有意に阻害されたが、抗ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱまたは抗ＨＬＡクラスＩでは阻害されなかった（図７Ｂ）。これらの結果は、これらの抗原特異的ＩＦＮ−γ産生がＨＬＡ−ＤＲ分子によって拘束されるＣＤ４＋細胞に由来することを明らかに指示した。これらの所見はまた、これら２つのＬＹ６Ｋ由来ＬＰが天然にプロセシングされ、がん患者においてインビボでＣＤ４＋Ｔ細胞に提示されることを示した。
【０２４０】
ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰでのワクチン接種前および接種後のＨＮＭＴ患者におけるＬＹ６Ｋ特異的Ｔｈ細胞の存在
本発明者らは、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰを用いた２つのペプチドワクチン治験に登録された２１名のＨＮＭＴ患者からの末梢血におけるＬＹ６Ｋ−ＬＰに特異的なＴｈ細胞応答を評価した。ドナーの特徴を図１２に要約する。ＬＹ６Ｋ−ＬＰでのＰＢＭＣのインビトロ刺激の１週間後、個々のＬＹ６Ｋ−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞の頻度をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検出した（図８Ａ）。ＩＦＮ−γ分泌細胞の数が陰性対照の少なくとも２倍である場合に応答を陽性とみなした。ＬＹ６Ｋ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答がＨＮＭＴ患者において存在することが認められた。図８Ｂに示すように、７名のＨＮＭＴ患者においてＴｈ細胞によるＬＹ６Ｋ−ＬＰ特異的ＩＦＮ−γ産生は抗ＨＬＡクラスＩＩ  ｍＡｂの添加によって有意に阻害されたが、抗ＨＬＡクラスＩ  ｍＡｂによっては阻害されなかった。興味深いことに、３名のＨＮＭＴ患者におけるＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰ特異的ＨＬＡ−ＤＲまたはＤＱ拘束性Ｔｈ細胞のＨＬＡクラスＩＩアリルは、ＨＬＡ−ＤＲ８およびＨＬＡ−ＤＲ１５によって共有されていなかった（図８Ｂ；ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰ；ＨＮＭＴ３１、４１および１０７）。５名のＨＮＭＴ患者におけるＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ特異的ＨＬＡ−ＤＲ拘束性Ｔｈ細胞のＨＬＡクラスＩＩアリルは、ＨＬＡ−ＤＲ１５によって共有されなかった（図８Ｂ；ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ；ＨＮＭＴ３１、４１、４２、１０７および１０８）。これらの結果は、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰおよびＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰが、この試験におけるインビトロ実験によって同定されなかったいくつかのＨＬＡクラスＩＩ拘束性Ｔｈ細胞エピトープを包含する可能性があり、多くのがん患者をカバーし得ることを示唆する。
【０２４１】
ＬＹ６Ｋ−ＬＰでの短期インビトロ刺激後、有意の頻度（ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰ、２３名のうち１０名、４４％；ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ、２３名のうち１６名、７０％）のＬＹ６Ｋ−ＬＰ特異的免疫応答がＨＮＭＴ患者で検出されたが、９名の健常ドナーではＬＹ６Ｋ−ＬＰに対する特異的ＩＦＮ−γ応答は検出されなかった（図８Ｃおよび図１２）。ワクチン接種した患者でのＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰおよびＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰに対する特異的スポットの数も、健常ドナーにおけるよりも有意に多かった（図８Ｄ）。ワクチン接種した患者におけるＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ特異的スポットの数は、ワクチン接種前のＨＮＭＴ患者におけるよりも有意に多かった（図８Ｄ、右側のパネル）が、ワクチン接種した患者におけるＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰ特異的スポットの数は、ワクチン接種前のＨＮＭＴ患者におけるものと比較して有意ではなかった（図８Ｄ、左側のパネル）。ワクチン接種後のＨＮＭＴ患者におけるＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ特異的免疫応答の頻度は、ワクチン接種前のＨＮＭＴ患者におけるものよりも有意に高かった（図８Ｅ）。ＬＹ６Ｌ−ＬＰ特異的応答がワクチン接種前の一部の患者で検出されたが、頻度は低かった（図１２；ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰ、１１名のうち２名、１８％；ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ、１１名のうち１名、９％）。興味深いことに、ＬＹ６Ｋ−ＬＰに特異的な応答は反復ワクチン接種によって誘発または増大された（図８Ｆ）。進行したがんを有するワクチン接種したＨＮＭＴ患者（ＣＴＲ−８３７９、ｎ＝１３）および術後アジュバント免疫療法を受けているワクチン接種したＨＮＭＴ患者（ＣＴＲ−８３８０、ｎ＝８）におけるＬＹ６Ｋ−ＬＰ特異的ＩＦＮ−γスポットの数の比較では、術後アジュバント免疫療法を受けているＨＮＭＴ患者におけるＬＹ６Ｋ−ＬＰ特異的ＩＦＮ−γスポットの数が、進行したがんを有するワクチン接種したＨＮＭＴ患者におけるよりも有意に多かった（図８Ｇ）。合わせて考慮すると、これらの所見は、ＨＮＭＴを有する患者がＬＹ６Ｋ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を開始させることができることを示唆する。
【０２４２】
ＬＹ６Ｋ−ＬＰは天然にプロセシングされるＴｈ細胞エピトープを包含する
本発明者らは続けて、ＤＣがＬＹ６Ｋタンパク質を取り込み、プロセシングして、ＬＹ６Ｋ−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞を刺激することができるかどうかを評価した。組換えＬＹ６Ｋタンパク質をロードした自己ＤＣを調製し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおけるＡＰＣとして使用した（Ｔｏｍｉｔａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ２０１１；１０２：７１−８；Ｈａｒａｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００８；１２３：２６１６−２５）。ＨＬＡ−ＤＰ５拘束性ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰ反応性バルクＴｈ細胞は、ＬＹ６Ｋタンパク質をロードしたＤＣをＨＬＡ−ＤＰ依存的に効率よく認識したが、対照タンパク質をロードしたＤＣは認識せず、このことは、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰが、天然にプロセシングされかつＨＬＡ−ＤＰ５分子によって提示されるエピトープを包含することを示している（図９Ａ）。ＨＬＡ−ＤＲ１５またはＨＬＡ−ＤＱ拘束性ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ特異的Ｔｈクローンも、ＬＹ６Ｋタンパク質をロードした自己ＤＣを認識し、このことは、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰが、天然にプロセシングされかつＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＱ分子によって提示されるエピトープを包含することを示している（図９Ｂ）。
【０２４３】
ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬは、インビトロでＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰの交差提示を通して刺激された
次に、本発明者らは、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰでパルスしたＤＣが、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰの交差提示を通してＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的バルクＣＴＬを刺激するかどうかを試験した。
ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生を細胞内標識によって測定した。Ｔ細胞応答におけるＬＰ分解産物の外因性提示の寄与を排除するまたは評価するために、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰを交差提示することはできないが生存ＤＣと同程度に効率的に提示することができる固定ＤＣ（図１０Ａ、固定ＤＣ＋ＳＰ）を使用した。ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰは、非固定ＤＣ（ＤＣ＋ＬＰ）によって交差提示された場合のみ、有意の割合のＩＦＮ−γ分泌性テトラマー＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導した。ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰでパルスした固定ＤＣは、対照ＬＰでパルスした非固定ＤＣと同様に、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）特異的ＣＴＬを刺激することができなかった（固定ＤＣ＋ＬＰおよびＤＣ＋対照ＬＰ）。
【０２４４】
本発明者らは、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰがＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的バルクＣＴＬの増殖を誘導することができるかどうかを評価した。ＨＬＡ−Ａ２４＋ＨＤＬ３の精製ＣＤ８＋Ｔ細胞から生成したＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的バルクＣＴＬを、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰでパルスした自己ＤＣで再刺激した。図１０Ｂに示すように、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的テトラマー＋ＣＤ８＋細胞の集団は、７日目にＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰでパルスしたＤＣでの刺激によって有意に増殖したが、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的バルクＣＴＬを対照ＬＰでパルスしたＤＣで刺激した場合は減少した。これらの結果は、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬの増殖がＤＣによるＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰの交差提示によって誘導されたことを示唆する。
【０２４５】
ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰはＨＮＭＴ患者においてＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬの効率的な増殖を誘導する
本発明者らは、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰが６名のＨＮＭＴ患者のＰＢＭＣにおけるＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬのインビトロでの増殖を誘導することができるかどうかを評価した。ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰでワクチン接種した５名のＨＮＭＴ患者からの新鮮なＰＢＭＣをＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ（１０μｇ／ｍＬ）と共に培養した。ｒｈＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍＬ）およびｒｈＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）を０日目と２日目に添加した。０日目（エクスビボ）および７日目に、ＰＢＭＣをＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的テトラマーで染色した。図１０Ｃに示すように、ＨＮＭＴ１０８から単離したＰＢＭＣを、インビトロ培養の前に（エクスビボで）ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的テトラマーで染色した場合、テトラマー＋細胞の頻度はＣＤ８＋Ｔ細胞の０．０５％に過ぎなかった。テトラマー＋細胞は、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰを添加せずにＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰでＰＢＭＣを１週間インビトロ刺激することによって有意に増殖した。ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）特異的ＣＴＬの頻度はＣＤ８＋Ｔ細胞の０．３５％に有意に増加した。該細胞を７日目にＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰで刺激した場合、抗原特異的ＩＦＮ−γ産生も検出された。２倍を上回るテトラマー＋ＣＤ８＋細胞の割合の増加は、ワクチン接種後の５名のＨＮＭＴ患者のうち４名で観察された（図１０Ｄ；ＨＮＭＴ４３、１０５、１０８および１１０）。これらの結果は、ＨＮＭＴ患者のＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬの増殖がＤＣによるＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰの交差提示によって誘導された可能性があることを示唆する。ＰＢＭＣをＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰとＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ（各々１０μｇ／ｍＬ；図１０Ｅ〜Ｆ）の混合物と共に培養した場合、ワクチン接種後の１１名のＨＮＭＴ患者のうち９名から同様の結果を得た。興味深いことに、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰでのワクチン接種前のＨＮＭＴ４２におけるＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的テトラマー＋細胞も、ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰとＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰの混合物での刺激によって有意に増殖した（図１０Ｇ）。
【０２４６】
ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰの交差提示はインビトロおよびインビボでＬＹ６Ｋ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を効率的にプライミングする
その後、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬを誘導するＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰの能力をテトラマー標識によって検査した。ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬは、３名のＨＬＡ−Ａ２４＋健常ドナー（ＨＤＬ１、ＨＤＬ３、ＨＤＬ４；図１０Ｈ、データは示していない）におけるＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰと共に２週間培養したＰＢＭＣ中で有意に誘導された。
ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬをプライミングするＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰの能力をエクスビボＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検査した。ＨＬＡ−Ａ２４  Ｔｇｍは、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰで３回免疫した。ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰでワクチン接種したＨＬＡ−Ａ２４  ＴｇｍのＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰでパルスしたＢＭ−ＤＣでの刺激に応答してＩＦＮ−γを産生した（図１０Ｉ）。これらの結果は、ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰの取込み後、ＡＰＣがインビトロおよびインビボでＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬをクロスプライミングすることができることを明らかにする。
【０２４７】
ＬＹ６Ｋ−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞によるＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）特異的ＣＴＬの誘導増強
本発明者らは、ＬＹ６Ｋ−ＬＰがＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬの誘導を増強することができるかどうかを試験した。ＨＤＬ３由来のＬＹ６Ｋ−ＬＰ特異的バルクＣＤ４＋Ｔ細胞およびＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的バルクＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ＋対照ＬＰ、またはＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ＋ＬＹ６Ｋ−ＬＰの存在下で自己ＤＣと共に培養した。ペプチドとの１週間のインビトロ培養後、培養した細胞をＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的テトラマーで染色した。図１１Ａに示すように、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ＋ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰまたはＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ＋ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰの添加は、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ単独またはＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ＋対照ＬＰの添加と比較して、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数を有意に増加させた。活性化ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰ特異的Ｔｈ細胞によるＨＬＡ−Ａ２４＋ＨＤＬ４でのＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的テトラマー＋Ｔ細胞の誘導増強が観察された（データは示していない）。
【０２４８】
次に、ワクチン接種後のＨＮＭＴ患者（ＨＮＭＴ３１、４２および４３）からのＰＢＭＣにおけるＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬの誘導に対するＬＹ６Ｋ−ＬＰの相乗効果を評価した。免疫後２か月目にＨＮＭＴ４３から採取したＰＢＭＣを、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ単独、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ＋対照ＬＰ、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ＋ＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰ、またはＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ＋ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰと共に７日間培養した。ペプチドとの１週間のインビトロ培養後、細胞をＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的テトラマーで染色した（図１１Ｂ）。ＰＢＭＣをＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ＋ＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰと共に培養した場合、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数は、ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ単独またはＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ＋対照ＬＰと共に培養した場合と比較して有意に増大した（図１１Ｃ）。ＨＮＭＴ４３におけるＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬの誘導に対するＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰの相乗作用は存在しなかった。本発明者らが免疫後１か月目に評価した場合も同様の結果を得た（データは示していない）。ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰへのＬＹ６Ｋ（１１９−１４２）ＬＰまたはＬＹ６Ｋ（１７２−１９１）ＬＰの添加により、ＨＮＭＴ３１およびＨＮＭＴ４２において同様の結果を得た（図１１Ｄ）。これらの結果は、ＬＹ６Ｋ−ＬＰがＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６）ＳＰ特異的ＣＴＬの相乗的誘導を生じさせ得ることを示唆する。
【０２４９】
考察
最も魅力的なワクチン化合物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の治療的免疫応答を誘導することができるＴＡＡの配列に対応する合成ＬＰであると考えられる（Ｋｅｎｔｅｒ  ＧＧ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００９；３６１：１８３８−４７．Ｍｅｌｉｅｆ  ＣＪ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ  ＳＨ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００８；８：３５１−６０）。これらのＬＰの注射後、患者のＤＣがＬＰを取り込み、プロセシングして、様々なＨＬＡクラスＩ分子およびＨＬＡクラスＩＩ分子に関連するすべての可能なＣＴＬエピトープおよびＴｈエピトープをそれぞれ提示すると考えられる。したがって、本発明者らは、がん免疫療法のための理想的なペプチドワクチンは、最も一般的に認められるＨＬＡによって拘束されるＣＴＬおよびＴｈ１細胞の両方を誘導することができる単一ポリペプチドであるべきだと考えた。
この試験において、本発明者らは、ＣＴＬエピトープを含むＬＹ６Ｋ由来のＬＰを同定し、このＬＹ６Ｋ由来のＬＰがプロミスキャスなＨＬＡクラスＩＩ拘束性Ｔｈ１細胞によって認識され得ることを見出した。さらに本発明者らは、２つのＬＹ６Ｋ由来ＬＰに対するＴ細胞応答が、ＬＹ６Ｋ由来のＣＴＬエピトープペプチドで能動的にワクチン接種した、進行した頭頸部がん患者において見出されることを認めた。これらの結果は、ワクチン接種で活性化されたＣＴＬによって誘導される腫瘍溶解が、抗原提示細胞による取込みおよびＬＹ６Ｋ由来ＬＰをＣＤ４＋Ｔ細胞に提示するためのＬＹ６Ｋタンパク質のプロセシングを促進すること、ならびにＬＹ６Ｋ特異的ＣＴＬ応答とＴｈ応答の間での相乗作用がインビボで起こったことを示唆する。
【０２５０】
結論として、本発明者らは、プロミスキャスなＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋Ｔｈ細胞によって認識される２つのＬＹ６Ｋ由来ペプチドを初めて同定し、これらの１つはＣＴＬエピトープを含んでおり、このことは、これらのＴｈ１エピトープが、ＬＹ６Ｋ特異的Ｔｈ１細胞だけでなく、起こり得る交差提示によってＬＹ６Ｋ特異的ＣＴＬの増殖のための良好なツールも提供することを示唆する。これらの所見は、今後、様々な種類のがんのためのＬＹ６Ｋペプチドに基づく免疫療法の臨床試験を促進するであろう。
【産業上の利用可能性】
【０２５１】
本発明は、強力な抗腫瘍免疫応答を誘導することができ、したがって多種多様ながん型に適用可能性を有する、ＬＹ６Ｋ由来のＴｈ１細胞エピトープペプチドを記述する。そのようなペプチドは、がん、特にＬＹ６Ｋを発現するがんに対するペプチドワクチンとしてのさらなる開発に値する。本発明のペプチドは、Ｔｈ１細胞応答を誘導することができ、したがって、Ｔｈ１細胞によって分泌されるサイトカインが、抗原依存的に細胞性免疫に関与する任意の免疫細胞を助けるかまたは活性化することができる。それゆえ、本発明によって提供される免疫治療戦略は、疾患がＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答によって改善され得る限り、がんを含む任意の疾患に適用することができる。特に、本発明のＴｈ１細胞は、ＣＴＬによって惹起される免疫応答を改善することができる。それゆえ、本発明のペプチドは、対象においてがんを含む疾患に対するＣＴＬ応答を増強するのに有益である。
さらに、好ましい態様では、本発明のペプチドはまた、Ｔｈ１細胞だけでなく、ＬＹ６Ｋ発現細胞に対するＣＴＬも誘導することができる。本発明のそのようなペプチドは、ＬＹ６Ｋに関連する疾患、例えばがん、より詳細には膀胱がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、食道がん、胃がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、骨肉腫、膵がん、軟組織腫瘍および頭頸部悪性腫瘍の治療のためにも有用であり得る。
【０２５２】
本発明を、詳細におよびその特定の態様を参照して本明細書で説明したが、前記説明は本質的に例示的および説明的であり、本発明とその好ましい態様を例証することを意図する。日常的な実験を通して、当業者は、その境域および境界が添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正がなされ得ることを容易に認識するであろう。
【図１Ａ】
0006255594.tif 000004
【図１Ｂ】
0006255594.tif 000005
【図２Ａ】
0006255594.tif 000006
【図２Ｂ１】
0006255594.tif 000007
【図２Ｂ２】
0006255594.tif 000008
【図３Ａ】
0006255594.tif 000009
【図３Ｂ】
0006255594.tif 000010
【図４】
0006255594.tif 000011
【図５Ａ１】
0006255594.tif 000012
【図５Ａ２】
0006255594.tif 000013
【図５Ｂ】
0006255594.tif 000014
【図５Ｃ】
0006255594.tif 000015
【図６Ａ】
0006255594.tif 000016
【図６Ｂ】
0006255594.tif 000017
【図６Ｃ】
0006255594.tif 000018
【図７】
0006255594.tif 000019
【図８Ａ】
0006255594.tif 000020
【図８Ｂ１】
0006255594.tif 000021
【図８Ｂ２】
0006255594.tif 000022
【図８Ｃ】
0006255594.tif 000023
【図８Ｄ】
0006255594.tif 000024
【図８Ｅ】
0006255594.tif 000025
【図８Ｆ】
0006255594.tif 000026
【図８Ｇ】
0006255594.tif 000027
【図９】
0006255594.tif 000028
【図１０Ａ】
0006255594.tif 000029
【図１０Ｂ】
0006255594.tif 000030
【図１０Ｃ】
0006255594.tif 000031
【図１０Ｄ】
0006255594.tif 000032
【図１０Ｅ】
0006255594.tif 000033
【図１０Ｆ】
0006255594.tif 000034
【図１０Ｇ】
0006255594.tif 000035
【図１０Ｈ】
0006255594.tif 000036
【図１０Ｉ】
0006255594.tif 000037
【図１１Ａ】
0006255594.tif 000038
【図１１Ｂ】
0006255594.tif 000039
【図１１Ｃ】
0006255594.tif 000040
【図１１Ｄ】
0006255594.tif 000041
【図１２】
0006255594.tif 000042
【配列表】
0006255594000001.app