(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式:
(((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3)n-Ab        (I)
[式中、Dは、オーリスタチン部分を表し;
qは、1〜10の整数を表し;
Lk1は、リンカーを表し;
mは、1〜10の整数を表し;
Pは、結合またはz価の基-P1-NH(ここでzは2〜11であり、P1は少なくとも1つのエチレン単位-CH2-CH2-またはエチレングリコール単位-O-CH2-CH2-を含む基である)を表し;
pは、1〜10の整数を表し;
Lk2は、結合またはy価のリンカー(ここでyは2〜11であり、1〜9のアスパルテートおよび/もしくはグルタメート残基からなる)を表し;
Lk3は、一般式:
-CO-Ph-X-Y-        (II)
{式中、Phは場合により置換されたフェニル基であり;XはCO基またはCH.OH基を表し;Yは式:
【化１】
0006328648.tif 000112
(式中、AおよびBはそれぞれC1〜4アルキレンまたはアルケニレン基を表す)の基を表す}
のリンカーを表し;
Abは、標的上の結合パートナーに結合することができる結合タンパク質またはペプチドを表し、前記結合タンパク質またはペプチドは、結合タンパク質またはペプチドにおけるジスルフィド結合由来の2つの硫黄原子を介してLk3に結合されており;
nは、1〜sの整数(ここでsは、Lk3にコンジュゲートする前に結合タンパク質またはペプチドに存在しているジスルフィド結合の数である)を表し;
m、n、p、q、yおよびzの値は、コンジュゲートに1〜10個のD基が含まれるように選択される]
のオーリスタチン含有コンジュゲート。
【請求項２】
オーリスタチンは、その末端の窒素原子を介して結合されたモノメチルオーリスタチンEまたはモノメチルオーリスタチンFである、請求項1に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
オーリスタチンは、その末端の窒素原子を介して結合されたモノメチルオーリスタチンEである、請求項1または請求項2に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
Lk1は、分解性リンカーである、請求項1から3のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
Lk1は、以下の基:
【化２】
0006328648.tif 000113
[式中、R、R'、R''およびR'''はそれぞれ水素原子またはアルキル基を表し、AAはプロテアーゼ特異的アミノ酸配列を表す]
の1つを含む、請求項4に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
Lk1は、
【化３】
0006328648.tif 000114
を含む、請求項5に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
qは、2〜10の整数であり、Lk1は、1つもしくは複数のアスパルテートまたはグルタメート残基が組み込まれた多価のリンカーである、請求項1から3のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
Pは結合を表すか、またはPは-P1-NH-(ここでP1は2〜10のエチレングリコール単位を含む)を表す、請求項1から7のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
Pは、ポリエチレングリコールを表す、請求項1から7のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
Lk3のフェニル基Phは置換されていない、請求項1から9のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
Yは、式:
【化４】
0006328648.tif 000115
を有する、請求項1から10のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
Abは、完全長抗体または完全長抗体の抗原結合領域を含む抗体フラグメントを表す、請求項1から11のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
Abは、IgG1もしくはIgG4またはIgG1もしくはIgG4のフラグメントを表す、請求項12に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
請求項1から13のいずれか一項に記載のコンジュゲートの調製方法であって、結合タンパク質における1つまたは複数のジスルフィド結合を還元する工程と、続けて一般式:
((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3a        (VIII)
[式中、D、Lk1、P、Lk2ならびにm、pおよびqは請求項1に規定の意味を有し;
Lk3aは式:
-CO-Ph-Xa-Ya        (IX)
{式中、Phは請求項1に規定の意味を有し、XaはCO基を表し、Yaは基:
【化５】
0006328648.tif 000116
(式中、AおよびBは請求項1に規定の意味を有し、Lはそれぞれ独立して脱離基を表し、xは1〜4の整数を表す)を表す}
の基を表す]のコンジュゲート化試薬と反応させて、XがCOを表す式Iのコンジュゲートを生成する工程と、場合により前記最初に形成されたCO基Xを還元してCH.OH基Xを有するコンジュゲートを得る工程とを含む、方法。
【請求項１５】
Yaは、
【化６】
0006328648.tif 000117
を表す、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
一般式:
((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3a         (VIII)
[式中、Dは、請求項1から3のいずれか一項に規定の意味を有し;Lk1は、請求項1および4から7のいずれか一項に規定の意味を有し;Pは、請求項1、8および9のいずれか一項に規定の意味を有し;Lk2、m、pおよびqは請求項1に規定の意味を有し、Lk3aは、式:
-CO-Ph-Xa-Ya        (IX)
{式中、Phは請求項1または請求項10に規定の意味を有し、XaはCO基を表し、Yaは基:
【化７】
0006328648.tif 000118
(式中、AおよびBは請求項1に規定の意味を有し、各Lは独立して脱離基を表し、xは1〜4の整数を表す)を表す}
の基を表す]
の化合物。
【請求項１７】
Yaは、
【化８】
0006328648.tif 000119
を表す、請求項16に記載の化合物。
【請求項１８】
請求項1から13のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、医薬的に許容される担体と、場合によりさらなる治療剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１９】
治療において使用するための、請求項1から13のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは請求項18に記載の組成物。
【請求項２０】
増殖性疾患の治療のための医薬の製造における、請求項1から13のいずれか一項に記載のコンジュゲートの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規薬物-タンパク質コンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
結合タンパク質は、標的細胞および分子の表面上の特定のマーカーに対する特異性により、様々な診断剤および治療剤のためのキャリアとして広範囲に使用されている。例えば、標識およびレポーター基、例えば、蛍光団、放射性同位元素および酵素にコンジュゲートしたそのようなタンパク質は、標識化およびイメージングの用途で使用されている。一方、細胞毒性剤および化学療法剤へのコンジュゲーションによって、特定の組織または構造、例えば特定の細胞種または増殖因子へのそのような薬剤の標的化送達が可能となり、正常で健常な組織への影響を最小限に抑え、化学療法の処置に伴う副作用を大幅に低減することが可能になっている。そのようなコンジュゲートは、いくつかの疾患分野、特にがんにおいて、多大な治療適用可能性を有している。
【０００３】
水溶性合成ポリマー、特にポリアルキレングリコールは、治療的に活性な分子、例えば、抗体などのペプチドまたはタンパク質リガンドをコンジュゲートするために広く使用されている。これらの治療コンジュゲートにより、薬物動態が好ましく変化し、循環時間が延長し、クリアランス率が減少し、全身毒性が減少し、いくつかの場合には臨床効果が増加することが示されている。タンパク質にポリエチレングリコール、すなわちPEGを共有結合的にコンジュゲートさせる方法は「PEG化」として一般に知られている。
【０００４】
有効性を最適化し、用量ごとの一貫性を確実にするために、結合タンパク質あたりのコンジュゲート化部分の数が同じであり、各部分が各結合タンパク質の同じアミノ酸残基に特異的にコンジュゲートしていることが重要である。したがって、いくつかの方法が、そのようなコンジュゲートの均質性を改善するために開発されてきた。Liberatoreら、Bioconj. Chem 1990、1、36〜50頁およびdel Rosarioら、Bioconj. Chem. 1990、1、51〜59頁には、抗体などのタンパク質におけるジスルフィド結合を交差して架橋するために使用可能な試薬の使用が記載されている。WO2005/007197には、ポリマーをタンパク質にコンジュゲートさせる方法が記載され、タンパク質のジスルフィド結合に由来する両方の硫黄原子をコンジュゲートさせて新規チオエテールコンジュゲートを生成する能力を有する新規コンジュゲーション試薬が使用されている。
【０００５】
オーリスタチンは、抗新生物剤であり、非常に強力な殺細胞薬に分類されている。この分類に入る様々な薬物、例えば天然産物ドラスタチン10[タツナミガイ(Dolabella auricularia)から単離]、モノメチルオーリスタチンE、モノメチルオーリスタチンF、モノメチルオーリスタチンD、オーリスタチンPYEおよびオーリスタチンPHEが、がんを含む様々な疾患の治療での使用にむけて開発中である。それらは非常に有毒であり、オーリスタチンを含むコンジュゲートの開発にむけて多くの研究が現在行われている。WO2009/117531には、C末端を介してリンカーに、次いで抗体に連結されたオーリスタチンを有する薬物コンジュゲートが示されている。これらのコンジュゲートは、薬物を放出するために自壊性基を必要とすることなく効果を示すと述べられている。WO2009/052431は、CD19結合剤に関し、オーリスタチンコンジュゲートが開示されている。
【０００６】
2つの抗体薬物コンジュゲートが、規制当局の承認を受けており、1つは薬物としてオーリスタチンを含むブレンツキシマブベドチン、もう1つは薬物としてメイタンシンを含むトラスツズマブエムタンシンである。これら双方の市販コンジュゲートにおいて、薬物と抗体との連結にマレイミドをベースとするリンカーが使用されている。マレイミドは、コンジュゲート化試薬で広く使用されている。しかしながら、他の多くのコンジュゲート化試薬と同様に、マレイミドの使用には、コンジュゲート反応の制御が困難であったり、均質性の低い産物が得られたり、得られたコンジュゲートの安定性が問題となる場合があったりといういくつかの難点が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2005/007197
【特許文献２】WO2009/117531
【特許文献３】WO2009/052431
【特許文献４】WO2010/100430
【特許文献５】WO2005/081711
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Liberatoreら、Bioconj. Chem 1990、1、36〜50頁
【非特許文献２】del Rosarioら、Bioconj. Chem. 1990、1、51〜59頁
【非特許文献３】Carter P.ら、Endocr. Relat. Cancer. 2004年12月; 11(4):659〜87頁
【非特許文献４】Liuら、Anal. Chem. 2010、82、5219〜5226頁
【非特許文献５】Nature Protocols、2006、1(54)、2241〜2252頁
【非特許文献６】Carter P.ら、Proc. Natl Acad. Sci. USA、89、4285〜4289頁(1992)
【非特許文献７】Hoら、Gene、77(1989)51〜59頁
【非特許文献８】「Transient Expression in HEK293-EBNA1 Cells」Chapter 12、in Expression Systems(DysonおよびDurocher編)。  Scion Publishing Ltd.、Oxfordshire、UK、2007
【非特許文献９】Promega社、技術公報TB288;Lewis Phillips G.D, Cancer Res 2008;68:9280〜9290頁
【非特許文献１０】Culture of Animal Cells:A manual of Basic Technique、R. Ian Freshney著、第3版、Alan R. Liss発行、N.Y. 1994
【非特許文献１１】Culture of Animal Cells:A manual of Basic Technique、R. Ian Freshney著、第5版、Wiley-Liss発行、N.Y.2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
それゆえ改善された安定性および均質性を有し、効率的に調製でき、必要な効能を示す改善オーリスタチン-抗体コンジュゲートが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、本発明は、一般式:
(((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3)n-Ab       (I)
[式中、Dは、オーリスタチン部分を表し;
qは、1〜10の整数を表し;
Lk1は、リンカーを表し;
mは、1〜10の整数を表し;
Pは、結合またはz価の基-P1-NH(ここでzは2〜11であり、P1は少なくとも1つのエチレン単位-CH2-CH2またはエチレングリコール単位-O-CH2-CH2-を含む基である)を表し;
pは、1〜10の整数を表し;
Lk2は、結合またはy価のリンカー(ここでyは2〜11であり、1〜9のアスパルテートおよび/もしくはグルタメート残基からなる)を表し;
Lk3は、一般式:
-CO-Ph-X-Y-       (II)
{式中、Phは場合により置換されたフェニル基であり;XはCO基またはCH.OH基を表し;Yは式:
【００１１】
【化１】
0006328648.tif 000002
【００１２】
(式中、AおよびBはそれぞれC1〜4アルキレンまたはアルケニレン基を表す)の基を表す}
のリンカーを表し;
Abは、標的上の結合パートナーに結合することができる結合タンパク質またはペプチドを表し、前記結合タンパク質またはペプチドは、結合タンパク質またはペプチドにおけるジスルフィド結合由来の2つの硫黄原子を介してLk3に結合されており;
nは、1〜sの整数(ここでsは、Lk3にコンジュゲートする前に結合タンパク質またはペプチドに存在しているジスルフィド結合の数である)を表し;
m、n、p、q、yおよびzの値は、コンジュゲートに1〜10個のD基が含まれるように選択される]
のオーリスタチン含有コンジュゲートを提供する。
【００１３】
Dは、オーリスタチン部分を表す(すなわち、Lk1基はオーリスタチンの残基に結合されている)。用語オーリスタチンには、オーリスタチンD、オーリスタチンE、オーリスタチンF、モノメチルオーリスタチンD、モノメチルオーリスタチンE、モノメチルオーリスタチンF、オーリスタチンPYE、オーリスタチンPHE、関連天然産物ドラスタチン10およびその誘導体などの化合物が含まれる。
【００１４】
好ましくは、オーリスタチンは部分構造(A)
【００１５】
【化２】
0006328648.tif 000003
【００１６】
[式中、Raは、C1〜8アルキルを表し;Rbは、H、C1〜8アルキル、C3〜8シクロアルキルもしくはシクロアルケニル、アリール、-X-アリール、-X-C3〜8シクロアルキルもしくはシクロアルケニル、C3〜8ヘテロシクリルまたは-X-C3〜8ヘテロシクリルを表し;Rcは、Hまたはメチルを表し;Rdは、H、C1〜8アルキル、C3〜8シクロアルキルもしくはシクロアルケニル、アリール、-X-アリール、-X-C3〜8ヘテロシクリル、-C3〜8ヘテロシクリル、-X-C3〜8ヘテロシクリル、-X-S-C1〜8アルキルを表し;またはRcとRdが一緒になって、式-(CRaRb)r-の炭素環を形成し、ここでRaとRbは独立してHまたはC1〜8アルキルを表し、rは、2〜6の整数であり;Reは、HまたはC1〜8アルキルを表し;Rfは、H、C1〜8アルキル、C3〜8シクロアルキルもしくはシクロアルケニル、アリール、-X-アリール、-X-C3〜8シクロアルキルもしくはシクロアルケニル、C3〜8ヘテロシクリルまたは-X-C3〜8ヘテロシクリルを表し;Rgは、H、-OH、-C1〜8アルキル、C3〜8シクロアルキルもしくはシクロアルケニル、または-O-(C1〜8アルキル)を表し;Rhは、H、-OH、-C1〜8アルキル、C3〜8シクロアルキルもしくはシクロアルケニル、または-O-(C1〜8アルキル)を表し;各Xは、独立してC1〜10アルキレンである]
を含有する化合物である。
【００１７】
好ましくは、RaはC1〜4アルキル、特にメチルを表す。好ましくは、RbはC1〜4アルキル、特にイソプロピルを表す。好ましくは、RcはHを表す。好ましくは、RdはC1〜4アルキルまたは-CH2CH2SCH3、より好ましくは、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)2または-CH2CH2SCH3、最も好ましくは-CH(CH3)2を表す。好ましくは、ReはHまたはC1〜4アルキルを表し;最も好ましくは、Reはメチルを表す。好ましくは、RfはC1〜4アルキル、特に1-メチルプロピルを表す。好ましくは、Rgは-OHまたは-O-(C1〜4アルキル)を表し;最も好ましくは、Rgはメトキシを表す。好ましくは、Rhは-OHまたは-O-(C1〜4アルキル)を表し;最も好ましくは、Rhはメトキシを表す。
【００１８】
より好ましくは、オーリスタチンは部分構造(B)
【００１９】
【化３】
0006328648.tif 000004
【００２０】
[式中、Ra-Rhは上記で規定した意味を有する]
を含む。
【００２１】
さらにより好ましくは、オーリスタチンは部分構造(C)
【００２２】
【化４】
0006328648.tif 000005
【００２３】
[式中、Rdは-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2または-CH2CH2SCH3を表す]
を含む。
【００２４】
いくつかの好ましい実施形態において、オーリスタチンのN末端基は水素またはC1〜8アルキルであり、より好ましくは水素またはメチルである。例えば、オーリスタチンは部分構造(D)または(E):
【００２５】
【化５】
0006328648.tif 000006
【００２６】
を含む化合物であり得る。
【００２７】
いくつかの好ましい実施形態において、オーリスタチンのC末端基は、
【００２８】
【化６】
0006328648.tif 000007
【００２９】
[式中、Riは水素またはC1〜8アルキルを表し;RjはC6〜10アリールまたはC5〜10ヘテロアリールを表し、前記アリールまたはヘテロアリールはハロゲン、場合により最大3個のハロゲンで置換されているC1〜4アルキル、ヒドロキシ、C1〜4アルコキシおよびシアノからなる群からそれぞれ独立して選択される最大3個の置換基で場合により置換されており;Rkは水素またはC1〜8アルキルを表し;Rlは水素またはヒドロキシを表し;Rmは-CO2H、-CO2C1〜8アルキル、-CONH-C6〜10アリール、-CONH-C5〜10ヘテロアリールおよびC5〜10ヘテロアリールを表し、前記アリールまたはヘテロアリール基はハロゲン、場合により最大3個のハロゲンで置換されているC1〜4アルキル、ヒドロキシ、C1〜4アルコキシおよびシアノからなる群からそれぞれ独立して選択される最大3個の置換基で場合により置換されている]
である。
【００３０】
いくつかの好ましい実施形態において、オーリスタチンのC末端基は、
【００３１】
【化７】
0006328648.tif 000008
【００３２】
より好ましくは
【００３３】
【化８】
0006328648.tif 000009
【００３４】
[式中、Riは水素を表し;RjはフェニルまたはC5〜10ヘテロアリールを表し、前記フェニルまたはヘテロアリールはハロゲン、最大3個のハロゲンで場合により置換されているC1〜4アルキル、ヒドロキシ、C1〜4アルコキシおよびシアノからなる群からそれぞれ独立して選択される最大3個の置換基で場合により置換されており;RkおよびRlは両方とも水素であるか、またはRkがメチルでRjがヒドロキシである]
である。
【００３５】
いくつかの好ましい実施形態において、オーリスタチンのC末端基は、
【００３６】
【化９】
0006328648.tif 000010
【００３７】
より好ましくは
【００３８】
【化１０】
0006328648.tif 000011
【００３９】
[式中、Riは水素を表し;RjはフェニルまたはC5〜10ヘテロアリールを表し、前記フェニルまたはヘテロアリールはハロゲン、場合により最大3個のハロゲンで置換されているC1〜4アルキル、ヒドロキシ、C1〜4アルコキシおよびシアノからなる群からそれぞれ独立して選択される最大3個の置換基で場合により置換されており;Rmは-CO2H、-CO2C1〜8アルキル、またはC5〜10ヘテロアリールを表し、前記ヘテロアリールはハロゲン、最大3個のハロゲンで場合により置換されているC1〜4アルキル、ヒドロキシ、C1〜4アルコキシおよびシアノからなる群からそれぞれ独立して選択される最大3個の置換基で場合により置換されている]
である。
【００４０】
例えば、オーリスタチンは部分構造(F)または(G):
【００４１】
【化１１】
0006328648.tif 000012
【００４２】
を含んでもよい。
【００４３】
好ましい特定のオーリスタチンの例としては、
【００４４】
【化１２】
0006328648.tif 000013
【００４５】
【化１３】
0006328648.tif 000014
【００４６】
【化１４】
0006328648.tif 000015
【００４７】
【化１５】
0006328648.tif 000016
【００４８】
【化１６】
0006328648.tif 000017
【００４９】
【化１７】
0006328648.tif 000018
【００５０】
【化１８】
0006328648.tif 000019
【００５１】
【化１９】
0006328648.tif 000020
【００５２】
【化２０】
0006328648.tif 000021
【００５３】
【化２１】
0006328648.tif 000022
【００５４】
を含む。
【００５５】
オーリスタチンは、その構造に応じ、遊離の塩基もしくは遊離の酸の形態、または医薬的に許容される塩の形態、および/または溶媒和物として存在してもよい。式Iのコンジュゲートも、これらの形態で存在していてもよい。
【００５６】
Lk1は、オーリスタチン部分に任意の適切な位置で結合することができる。オーリスタチン部分がN末端に水素を有するオーリスタチンに相当する場合、Lk1は好ましくはN末端の窒素に結合し、例えば
【００５７】
【化２２】
0006328648.tif 000023
【００５８】
である。
【００５９】
オーリスタチン部分が、Rmが-CO2Hを表すオーリスタチンに相当する場合、Lk1は、例えばC末端の炭素に結合していてもよく、例えば
【００６０】
【化２３】
0006328648.tif 000024
【００６１】
である。
【００６２】
Lk1は、オーリスタチン部分DをP基に接続させるリンカー、結合、または基である。Lk1は、1〜10個のD基を保有できる。Lk1は分解性基を含んでいることが好ましく、すなわちLk1は、生理学的条件下で切断されてDをAbから分離するリンカーであることが好ましい。その代わりに、Lk1は生理学的条件下で切断されないリンカーであってもよい。Lk1が生理学的条件下で切断されるリンカーである場合、細胞内条件下で切断可能であることが好ましい。標的が細胞内にある場合、Lk1は細胞外条件に実質的に影響を受けない(すなわち、十分な用量の治療薬剤を細胞内標的に送達することが妨げられない)ことが好ましい。
【００６３】
Lk1は、分解性リンカーである場合、加水分解条件に感受性を有する基を含んでいてもよい。Lk1は、特定のpH値(例えば、酸性条件)で分解する基を含んでいてもよい。加水分解/酸性条件は、例えばエンドソーム内またはリソソーム内で見出せる条件であり得る。酸性条件下の加水分解を受けやすい基の例としては、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、cis-アコニット酸アミド、オルトエステルおよびアセタール/ケタールが挙げられる。加水分解条件に感受性を有する基の例としては、
【００６４】
【化２４】
0006328648.tif 000025
【００６５】
が挙げられる。
【００６６】
Lk1は、還元条件下で分解を受けやすい基であってもよい。例えば、Lk1は生物学的還元剤、例えばチオールに接触して切断され得るジスルフィド基を含有してもよい。ジスルフィド基の例としては、
【００６７】
【化２５】
0006328648.tif 000026
【００６８】
[式中、R、R'、R''およびR'''は、それぞれ独立して水素またはC1〜4アルキルである]、
および
【００６９】
【化２６】
0006328648.tif 000027
【００７０】
が挙げられる。
【００７１】
Lk1は酵素分解の影響を受けやすい基、例えば、プロテアーゼ(例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼ)またはペプチダーゼによる切断を受けやすい基を含んでもよい。例えば、Lk1は少なくとも1つ、例えば少なくとも2つ、または少なくとも3つのアミノ酸残基(例えば、Phe-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Val-Cit、Phe-Lys)を含むペプチジル基を含んでもよい。例えば、Lk1は1〜5個、例えば2〜4個のアミノ酸を有するアミノ酸鎖であってもよい。酵素分解を受けやすい基の別の例は、
【００７２】
【化２７】
0006328648.tif 000028
【００７３】
[式中、AAはプロテアーゼ特異的アミノ酸配列、例えばVal-Citを表す]
である。
【００７４】
好ましい実施形態において、Lk1は、
【００７５】
【化２８】
0006328648.tif 000029
【００７６】
であるか、またはこれを含む。
【００７７】
例えば、Lk1は、
【００７８】
【化２９】
0006328648.tif 000030
【００７９】
であってもよく、この場合、下記のようにDおよびP基に結合していることが好ましい:
【００８０】
【化３０】
0006328648.tif 000031
【００８１】
この実施形態において、オーリスタチン部分DはN末端の窒素を介して結合されていることが好ましい。
【００８２】
一実施形態において、Lk1は1個のオーリスタチン部分Dを有する(すなわち、q=1)。上記に示す特定のリンカーVはこの型のリンカーである。別の実施形態において、qは1より大きく、例えば2、3または4であり、Lk1は2以上のオーリスタチン部分を本発明のコンジュゲートに組み込む手段として使用される。一実施形態では、これは分岐リンカーLk1の使用によって達成することができ、例えばアスパルテートもしくはグルタメートまたは類似の残基が組み込まれていてもよい。これにより、式:
【００８３】
【化３１】
0006328648.tif 000032
【００８４】
[式中、bは1、2または3であり、b=1はアスパルテートであり、b=2はグルタメートであり、b=3は一つの好ましい実施形態を表す]の分岐要素が導入される。式VIにおけるアシル部分はそれぞれ適切なリンカーLk1aを介してD基に結合することができ、ここでLk1aは任意の適切なリンカーであり、例えば上記Lk1について述べた連結の一つが組み込まれた分解性リンカーである。一つの好ましい実施形態において、Lk1aは上記に示すV基を表す。アスパルテートもしくはグルタメートまたは類似の残基のアミノ基は、任意の適切な手段によってPに結合することができ、例えば連結はアミド結合を介することができ、例えば上記分岐基は、
【００８５】
【化３２】
0006328648.tif 000033
【００８６】
のように、-CO.CH2-基を介してPに結合してもよい。
【００８７】
必要に応じて、アスパルテートもしくはグルタメートまたは類似の残基を、さらなるアスパルテートおよび/もしくはグルタメートならびに/または類似の残基、例えば:
【００８８】
【化３３】
0006328648.tif 000034
【００８９】
に連結してもよく、以降同様にさらに最大9個のそのような残基に連結してもよく、それにより最大で10個のD基の組み込みが可能となる。上記のように、Dはそれぞれ任意の適切なリンカーLk1aを介してアスパルテート/グルタメートまたは類似の残基に接続されてもよい。
【００９０】
Pが-P1-NH-基を表す場合、P1は少なくとも1つのエチレンまたはエチレングリコール単位(-CH2-CH2-もしくは-O-CH2-CH2-)を含有する。多くのそのような単位が存在する場合、P1は、ポリエチレン、PEまたはポリエチレングリコール、PEGを表す。これらのポリマーは、1つの直鎖を含有しているものでもよく、または多くの小さいもしくは大きい鎖で構成される分岐形態を有しているものでもよく、その場合、ポリマーは分岐基、典型的には>CH-を、例えば-(CH2-CH2)2-CH-または-(O-CH2-)2CH-として含有する。それらは、場合により、任意の所望の方法で誘導体化または官能化されていてもよい。それらは例えばさらなる治療剤または標識化剤を保有するものでもよい。2分子以上の治療剤、例えば、2分子以上のオーリスタチン、または1分子のオーリスタチンに加えて1分子の治療剤を含有する多量体型コンジュゲートにより、相乗的および相加的利点がもたらされ得る。
【００９１】
P1がPEまたはPEGを表す場合、ポリマーの最適分子量は当然のことながら意図する用途に依存する。一般にP1がPEを表す場合、数平均分子量は、好ましくは最大2kDaであり、好ましくは最大1kDaである。P1がPEGを表す場合、より高分子量を使用することができ、例えば数平均分子量は最大75kDa、例えば最大60kDaであり得、最小数平均分子量は、例えば少なくとも0.5kDa、例えば少なくとも1kDa、例えば2kDaである。1つの好ましい実施形態において、数平均分子量が0.5から2kDaのPEGが使用され得る。しかしながら、いくつかの好ましい実施形態において、Pは結合であるか、またはPは-P1-NH-を表すものであり得、P1は少数の不連続性のエチレンまたはエチレングリコール単位を含有し、例えば2〜10個、例えば2もしくは3個のエチレンまたは好ましくはエチレングリコール単位を含有する。
【００９２】
式Iのコンジュゲートに2以上の-(CH2-CH2)a-または-(O-CH2-CH2)a-鎖[式中、aは任意の直鎖におけるエチレンまたはエチレングリコール単位の数である]を含有させること、例えば結果としてそのような鎖にそれぞれDq-Lk1基を保有させることが望ましい場合、2以上(すなわち2〜10)のそのような鎖をLk2に結合させるか、または分岐PEもしくはPEGを使用してLk2に接続させるP基を1つのみ使用するが2以上の分岐、例えば1〜9の分岐を含有(D-Lk1基に2〜10の結合点を提供)させることによって、これを達成することができる。
【００９３】
Pが-P1-NH-である場合、そのまたはそれぞれのP基は、アミド結合を介して隣接のLk1基および/またはLk2基に結合していることが理解される。例えば、PEG(通常、-OH基で終っている)を-NH2基で終止する対応PEGアミンに変換して、Lk2における-CO2基とアミド結合を形成させてもよく、またはOH基をLk1と上記のように連結-NH.CO.CH2.O-を形成するように反応させてもよい。
【００９４】
本発明の好ましい一実施形態において、P1はPEG水溶性合成ポリマーを表し、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本明細書全体を通してP1についての任意の一般的な言及は、PEGについての具体的な言及を含むと理解されるべきである。
【００９５】
Lk2は、y価のリンカー[yは2〜11である]を表す。そのように1〜10個のPまたはLk1基を結合させることが可能である。その最も単純な形態において、Lk2は結合であり、この場合、Lk1は-P1-NH-基に直接結合するか、またはPが結合である場合はD-Lk1基に結合している。しかしながら、Lk2は、本発明のコンジュゲートに2以上のD基(オーリスタチン部分)を組み込む手段として使用してもよい。これはアスパルテートまたはグルタメート残基をLk3の-CO-基にアミド連結を介して結合させること(例えば、アスパルテートまたはグルタメートアミン基をLk3に対応する適切なカルボン酸誘導体に反応させること)によって達成される。これにより上記に示す式VIの分岐要素が導入される。その場合、アシル部分のそれぞれがアミド連結を介して-P1-NH-基に結合してもよく、またはPが結合であるとき、D-Lk1基に結合してもよい。その代わりに、アスパルテートまたはグルタメート残基を上記に示す式VIIaおよびVIIbにおいて示されるようなさらなるアスパルテートおよび/またはグルタメート残基、最大9個のそのようなアスパルテートおよび/またはグルタメートなどの残基に結合させてもよく、複数のD-Lk1-P基の結合を介してLk2の様々な結合点に最大10個のD基を組み込むことができる。Lk2の価数は、存在するD-Lk1-P基の数と関連していることが理解される。例えば、D-Lk1-P基のそれぞれについてPが-P1-NH-であるとき、Lk2の価数は、存在する-P1-NH-基の数と関連し、すなわちpはy-1と等しくなる。D-Lk1-P基のそれぞれについてPが結合であるとき、Lk2の価数は、存在するD-Lk1基の数と関連し、すなわちmはy-1に等しくなる。
【００９６】
Lk3は結合タンパク質におけるジスルフィド結合に由来する2つの硫黄基を介して結合タンパク質に結合することができる特別なリンカーである。Lk3において、フェニル基Phは置換されていなくても置換されていてもよい。フェニル基Phに場合により存在し得る置換基は、例えば、アルキル(好ましくは、場合によりOHまたはCO2Hで置換されているC1〜4アルキル、特にメチル)、-CN、NO2、-CO2R4、-COH、-CH2OH、-COR4、-OR4、-OCOR4、-OCO2R4、-SR4、-SOR4、-SO2R4、-NHCOR4、-NR4COR4、NHCO2R4、-NR4.CO2R4、-NO、-NHOH、-NR4.OH、-C=N-NHCOR4、-C=N-NR4.COR4、-N+R43、-N+H3、-N+HR42、-N+H2R4、ハロゲン、例えばフッ素または塩素、-C≡CR4、-C=CR42および-C=CHR4(式中、R4はそれぞれ独立して水素原子またはアルキル(好ましくはC1〜6アルキル)、アリール(好ましくはフェニル)、またはアルキル-アリール(好ましくはC1〜6アルキル-フェニル)基から選択される1つまたは複数の同じまたは異なる置換基が挙げられる。電子求引性置換基の存在が特に好ましい。好ましい置換基としては、例えば、CN、-NO2、-OR4、-OCOR4、-SR4、-NHCOR4、-NR.COR4、-NHOHおよび-NR4.COR4が挙げられる。但し、フェニル基Phは置換されていないことが好ましい。
【００９７】
YがIII基を表すときは、炭素1個の架橋がリンカーLk3と結合タンパク質Abのジスルフィド結合に由来する2つの硫黄原子との間に形成され、YがIV基を表すときは、A基とB基の性質により、リンカーLk3と結合タンパク質Abのジスルフィド結合に由来する2つの硫黄原子との間に形成される架橋の長さが決まる。好ましくは、炭素3個の架橋が形成されること、すなわちYが式:
【００９８】
【化３４】
0006328648.tif 000035
【００９９】
を有することが好ましい。
【０１００】
上述のように、2以上のオーリスタチン部分を含むコンジュゲートが有利な可能性がある。2以上のオーリスタチン部分を存在させることは、いくつかの異なる方法で達成することができ、例えば、上記のような分岐PEGの使用によって、多価の基Lk2の使用によって、または多価の基Lk1の使用によって達成することができる。しかしながら、2以上のリンカーLk3を結合タンパク質Abに接続させて達成してもよい。一般に、正常な完全長抗体は4つの鎖間ジスルフィド結合(全IgG1抗体について重鎖-重鎖または重鎖-軽鎖)を有しており、これらのいずれかまたは全てを本発明によるリンカーLk3により架橋することができる。抗体の1つまたは複数の鎖間ジスルフィド結合をリンカーLk3によって架橋する場合も包含される。2つ以上のコンジュゲート基が存在する場合、nは1より大きい。nは、例えば、2、3、または4であり得る。
【０１０１】
その代わりに、またはそれに加えて、1個または複数個のさらなるオーリスタチン部分を、リンカーLk1を介してPに連結させて、またはPが結合である場合は、Lk2に直接連結させて、存在させることができる。この場合、mは1より大きく、例えば2、3または4であり、最大10である。2以上のリンカーLk1が存在する場合、これらは互いに同じであっても異なっていてもよい。
【０１０２】
その代わりに、またはそれに加えて、1つまたは複数のさらなるオーリスタチン部分を多価のリンカーLk1に連結させて存在させることができる。この場合、qは1より大きく、例えば2、3または4であり、最大10である。
【０１０３】
本発明のコンジュゲートは最大10個のD基(オーリスタチン部分)を保有する場合が企図されている。式Iのコンジュゲートに2以上のD基(すなわち2以上のオーリスタチン部分)を含むことが所望される場合、いくつかの方法のいずれか1つでこれを達成することができる。例えば複数の(((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3)-基が単一の抗体に結合していてもよい(すなわち、nは2〜s)。この接続様式は、2以上のD基を含むコンジュゲートを提供する1つの好ましい方法を形成する。2以上のD基を含むコンジュゲートを提供するための第2の好ましい方法は、多価のリンカーLk1を使用するものであり、例えば上記のように1つもしくは複数のアスパルテートおよび/もしくはグルタメートまたは類似の残基を含有するリンカーLk1(例えば、式VI、式VIIaおよび式VIIb)を使用して、複数のD基を存在させること(すなわち、qは2〜10)が可能になる。Lk1が多価のリンカーであるコンジュゲート、特に上記式VIを含み、p=1、q=2、m=1およびLk2が結合であるコンジュゲートが特に効果的であり、そのようなコンジュゲートは本発明の好ましい実施形態を形成すると考えられる。
【０１０４】
その代わりに、またはそれに加えて、Lk2が1〜9個のアスパルテートおよび/またはグルタメート残基からなる基である場合、複数の(Dq-Lk1)m-P)-基は、Lk2基の様々な位置(すなわち、p=2〜10)に、Lk2基のアスパルテートまたはグルタメート残基のカルボキシ基と一緒になったアミン部分の各基のアミド結合によって結合させることができる。P1が少なくとも1つのエチレンまたはエチレングリコール単位を含有し、少なくとも1つの分岐単位も含有する場合、複数の(Dq-Lk1)-基が追加的にまたは代替的にP1基の異なる位置に結合することができる(すなわち、mは2〜10)。
【０１０５】
上記の組合せを有するコンジュゲートも本発明に包含される。例として、コンジュゲートは、2つの((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-基に結合しているAb基を含有してもよく、ここで、それら((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-基のそれぞれに対して、Lk2は2つの(D-Lk1)m-P基に結合しているアスパルテートまたはグルタメート残基であり、それら(D-Lk1)m-P基のそれぞれに対してPは-P1-NH-であり、P1は少なくとも1つのエチレンまたはエチレングリコール単位を含有し、少なくとも1つの分岐単位も含有し、全部で8個のD-Lk1基がコンジュゲートに存在するようにする。さらなる例として、コンジュゲートは2つの((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-基に結合しているAb基を含有してもよく、ここでそれら((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-基のそれぞれに対して、Lk2は結合であり、Pは-P1-NH-であり、P1は少なくとも1つのエチレンまたはエチレングリコール単位を含有し、少なくとも1つの分岐単位も含有し、各Lk1は、2つのD基に結合しているアスパルテートもしくはグルタメートまたは類似の残基も含有し、全部で8個のD-Lk1基がコンジュゲートに存在するようにする。
【０１０６】
異なるLk3、Lk2、P、Lk1およびD基が同じコンジュゲートに存在してもよく、例えば、コンジュゲートは、2つの((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3基に結合しているAb基を含有し、それらの((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-基の一方において、Lk2は結合であり得、それら((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-基の他方において、Lk2はアスパルテートまたはグルタメート残基であり得る。同様にコンジュゲートがLk2基に結合している複数の(D-Lk1)m-P基を含有している場合において、これらのP基のうち1つは結合であり得、これらのP基のもう1つは-P1-NH-であり得る。
【０１０７】
最も単純な実施形態において、本発明は、1個のオーリスタチン部分(n=m=q=p=1)を含有するコンジュゲートに関する。コンジュゲートは最大10個のオーリスタチン部分、例えば8個までのオーリスタチン部分を含有し得る。コンジュゲートは、例えば、最大4個、例えば、1、2、3または4個のオーリスタチン部分を有し得る。2個のD基が存在する場合、これらは例えば、式:
【０１０８】
【化３５】
0006328648.tif 000036
【０１０９】
[式中、Lk1は、好ましくは、上記の式(Va)の基を含む]
のコンジュゲートであり得る。
【０１１０】
その代わりに、2個のD基が存在する場合、これらは例えば、式:
【０１１１】
【化３６】
0006328648.tif 000037
【０１１２】
[式中、Lk1aは、好ましくは、上記の式(V)の基を含む]
のコンジュゲートであり得る。
【０１１３】
上記式は、Abに存在する1つのジスルフィド結合をつなぐXの結合を示す。抗体は最大4個の鎖間ジスルフィド結合を有することができ、これらの結合それぞれが1個のオーリスタチン分子を保有する試薬によって架橋された場合、得られるコンジュゲートの薬物:抗体比(DAR)は4になる。2個のオーリスタチン分子を保有する試薬を使用して、4つ全てのジスルフィド結合を架橋する場合、例えば、2個のPEもしくはPEG鎖を保有する試薬または分岐PEもしくはPEG鎖を有するもしくは分岐リンカーLk1を有する試薬を使用する場合、DARは8になる。そのような高いDARを有するコンジュゲートは臨床的に極めて有利である可能性がある。Abが〜X-基の2、3または特に4コピーを保有する上記Ia〜Ieのコンジュゲートは、本発明の好ましい実施形態の一つを形成する。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】親抗体、IgGC226SおよびIgGC229SのDAR分布(40℃でコンジュゲーション)を示す図である。
【図２】親抗体、IgGC226SおよびIgGC229SのDAR分布(22℃でコンジュゲーション)を示す図である。
【図３】ビス-スルホン試薬1を用いて調製したDAR-2およびDAR-4コンジュゲートならびに比較可能なマレイミド系試薬を用いて調製したDAR-2およびDAR-4コンジュゲートの平均薬物抗体比率をインキュベーション時間に対してプロットしたグラフである。
【図４】IgG枯渇血清でインキュベートしたビス-スルホンコンジュゲートおよびマレイミドコンジュゲートについてのHICクロマトグラムである。
【図５】薬物と抗体のUV最大吸光度の比とピーク溶出の順序によって同定される分離したDAR変異体それぞれについての面積を棒グラフでプロットした図である。
【図６】SKBR-3またはBT-474細胞内における抗体-試薬1コンジュゲートのいずれかを用いた処置に対する細胞生存性応答を示す図である。
【図７】SKBR-3またはBT-474細胞内における試薬6コンジュゲートまたは試薬9コンジュゲートのいずれかを用いた処置に対する細胞生存性を示す図である。
【図８】ビス-スルホン-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE試薬1を使用して生産された抗体薬物コンジュゲートについてのインビボ異種移植試験の結果を示す図である。
【図９】SDS-PAGEの結果を示す図である。Mで標識したレーンはNovex Protein標準(Invitrogen社)を示す。レーン1および2はそれぞれコンジュゲーション反応前および後のIgGC226Sの移動プロファイルを示す。レーン3および4は親抗体についての等価な反応を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１５】
便宜上、用語「結合タンパク質」は、結合タンパク質およびペプチドの両方を含むものとして本明細書を通して使用され、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、ペプチドもタンパク質も含まれると理解されるべきである。本発明のコンジュゲートにおいて使用し得る結合タンパク質としては、標的の結合パートナーに対する結合剤として作用し得る任意のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが挙げられる。標的は、例えば微生物、ウイルスまたは細胞、例えばがん細胞もしくは免疫細胞であり得る。このように、結合タンパク質はオーリスタチンを特定の標的に標的化させるように作用する。そのような結合タンパク質の例としては、完全長抗体、抗体フラグメント、免疫グロブリン(Ig)、合理的もしくは組換えタンパク質工学技術により得られる非Igタンパク質骨格、およびレクチンが挙げられる。タンパク質-薬物コンジュゲートで使用される最も一般的な結合タンパク質は抗体であり、結合タンパク質またはAb基と述べられる場合はいつでも、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、抗体についての具体的な言及を含むと理解されるべきである。
【０１１６】
この明細書を通じて、用語「抗体」は、標的抗原、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、またはそれらの組合せを、その免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原認識部位を通じて認識し、特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味すると解すべきである。用語「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、および抗体が所望の生物活性を示す限りあらゆる抗原識別部位を含む他の改変免疫グロブリン分子が包含される。抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと称される重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、免疫グロブリンの5つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgM、またはその下位分類(アイソタイプ)(例えば、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAlおよびIgA2)のいずれかに分類することが可能である。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造と3次元構造を有する。IgG1またはIgG4の使用が特に好ましい。
【０１１７】
さらに、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、用語「抗体」は、完全長抗体、および完全長抗体の抗原結合領域を含む抗体フラグメントを包含すると理解されるべきである。抗体フラグメントは、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、ダイアボディ、ミニボディ、または抗体フラグメントから形成される多重特異的抗体であり、例えば、scFvフラグメントまたはダイアボディの異なる順列および場合によりscFv-Fc、scFv-Fc-scFv、Fab-scFv、(Fab'ScFv)2、scダイアボディ、scダイアボディ-Fc、scダイアボディ-CH3、scFv-CH3、scFv-CH2-CH3融合タンパク質などのFcフラグメントまたはCHドメインで構成されるミニボディなどであり得る。抗体フラグメントは、酵素的切断、合成または組換え技術によって生産し得る。
【０１１８】
結合タンパク質は、標的、例えば、増殖性疾患、自己免疫疾患または感染性疾患に関連する細胞またはウイルスの表面上の受容体、抗原または他の部分に対する結合剤として作用し得る。例えば、結合タンパク質は、がん細胞上の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体であり得る。がん細胞の抗体標的化のための細胞表面抗原の同定および確認方法は既知であって、例えばCarter P.ら、Endocr. Relat. Cancer. 2004年12月;11(4):659〜87頁で知られており、がんを処置するためのいくつかの抗体-薬物コンジュゲートが現在、臨床的に開発中である。がんの処置に利用可能な抗体の例および特定のがんの腫瘍マーカーも当該分野で周知であり、使用可能である。その代わりに、標的は免疫細胞、例えば自己免疫抗体の産生を担う細胞であってもよく、または自己免疫疾患に関与する活性化リンパ球であってもよい。他の実施形態において、標的は微生物またはウイルスの感染または疾患に関連する微生物またはウイルスであり得る。
【０１１９】
本発明のコンジュゲートは、結合タンパク質における1つまたは複数のジスルフィド結合を還元し、続けて一般式:
((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3a        (VIII)
[式中、D、Lk1、P、Lk2ならびにm、pおよびqは一般式Iで示した意味を有し;
Lk3aは式:
-CO-Ph-Xa-Ya        (IX)
{式中、Phは上記で示された意味を有し;XaはCO基を表し;Yaは基:
【０１２０】
【化３７】
0006328648.tif 000038
【０１２１】
(式中、AおよびBは上記で規定した意味を有し;各Lは独立して脱離基を表し;xは1〜4の整数を表す)を表す}
の基を表す]
のコンジュゲート化試薬と反応させることによって調製することができる。
【０１２２】
上記式X、XI、XIIおよびXIIIの基は互いに化学的に等価であり、式XおよびXIの基は抗体のジスルフィド結合をつなぐ炭素1個の架橋をもたらし、式XIIおよびXIIIの基は下記にn=1の場合:
【０１２３】
【化３８】
0006328648.tif 000039
【０１２４】
について示されるように、より長い炭素架橋をもたらす。
【０１２５】
XまたはXII基を含有するコンジュゲート化試薬を抗体と反応させると、反応経路の迅速な工程として1つの脱離基Lの喪失が起こり、これによりXIまたはXIII基を含むコンジュゲート化試薬がそれぞれ生成される。したがって式XIまたはXIIIのコンジュゲート化試薬は、その場で調製されるか、または最初から使用される。X、XI、XIIまたはXIII基のいずれかを含有するコンジュゲーション試薬の使用における重要な特徴は、α-メチレン脱離基および二重結合が、マイケル活性化部分として作用する電子求引性官能部分と交差コンジュゲートすることである。脱離基が多官能性試薬における脱離を直接置換よりも受けやすく、電子求引性基がマイケル反応に適切な活性化部分である場合、一連の分子内ビスアルキル化を連続的マイケル反応および逆マイケル反応によって起こすことが可能である。脱離部分は、第一のアルキル化が起こるまで露出しない潜在的コンジュゲート二重結合をマスクする役割を果たし、二重アルキル化は、一連の相互マイケル反応および逆マイケル反応によって起こる。電子求引性基および脱離基は、一連のマイケル反応および逆マイケル反応によって二重アルキル化が起こるように最適に選択される。さらに、二重結合または脱離基と電子求引性基との間にコンジュゲートした付加的多重結合を有する多官能性アルキル化剤を調製することも可能である。
【０１２６】
脱離基Lは、例えば、-SR4、-SO2R4、-OSO2R4、-N+R43、-N+HR42、-N+H2R4、ハロゲンまたは-Oφを表し、ここでR4は上記に規定した意味を有し、φは少なくとも1つの電子求引性置換基、例えば、-CN、-NO2、-CO2R4、-COH、-CH2OH、-COR4、-OR4、-OCOR4、-OCO2R4、-SR4,-SOR4、-SO2R4、-NHCOR4、-NR4COR4、-NHCO2R4、-NR4CO2R4、-NO、-NHOH、-NR4OH、-C=N-NHCOR4、-C=N-NR4COR4、-N+R43、-N+HR42、-N+H2R4、ハロゲン、特に塩素または特にフッ素、-C≡CR4、-C=CR42および-C=CHR4を含有する置換されたアリール基、特にフェニル基を表し、R4はそれぞれ独立して上記に規定した意味の一つを有する。特に好ましい脱離基Lは、-SR4または-SO2R4、特に-SO2R4であり、ここでR4は、フェニル、または特にトシル基を表す。したがって、特に好ましいYa基は、
【０１２７】
【化３９】
0006328648.tif 000040
【０１２８】
である。
【０１２９】
好ましいコンジュゲート化試薬の例としては、
【０１３０】
【化４０】
0006328648.tif 000041
【０１３１】
[式中、Lk1は好ましくは上記の式(Va)の基を含み、Yaは好ましくは式(XII)の基であり、特にAおよびBはそれぞれ-CH2-である]
が挙げられる。
【０１３２】
さらなるコンジュゲート化剤の好適な例としては、
【０１３３】
【化４１】
0006328648.tif 000042
【０１３４】
[式中、Lk1は好ましくは上記式(V)の基を含み、Yaは好ましくは式(XII)の基であり、特にAおよびBはそれぞれ-CH2-である]
が挙げられる。
【０１３５】
またさらなるコンジュゲート化試薬の好適な例としては、
【０１３６】
【化４２】
0006328648.tif 000043
【０１３７】
[式中、bは1、2または3である。Yaは好ましくは式(XII)の基であり、特にAおよびBはそれぞれ-CH2-の基である。P1は好ましくはPEG、特に上述の基の1つであり、好ましくは15〜35のO-CH2-CH2-反復単位を有する基である]
が挙げられる。
【０１３８】
上記試薬の1つを使用するコンジュゲーション方法の直接的な生成物は、XがケトCO基を表すオーリスタチン-抗体コンジュゲートである。しかしながら、本発明の方法は適切な条件下で可逆的である。これは、いくつかの用途、例えば抗体からのオーリスタチンの急速な分離が必要な用途で望ましい場合があるが、他の用途では急速な分離が望ましくない場合もある。したがってCO基Xを還元してCH.OH基Xとすることによってコンジュゲートを安定化することが望ましい場合がある。したがって、上記の方法は、最初に形成されたLk3のCO基Xを還元してLk3にCH.OH基Xを有するコンジュゲートを得る追加的な場合に応じた工程を含んでもよい。還元剤としてホウ素の水素化合物、例えば水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウム、またはトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを使用することが特に好ましい。使用し得る他の還元剤としては、例えば、塩化スズ(II)、アルコキシド、例えばアルミニウムアルコキシド、および水素化アルミニウムリチウムが挙げられる。
【０１３９】
上記の方法の適切な反応条件はWO2005/007197およびWO2010/100430に示されており、それらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。方法は、例えば、全ての反応物が溶解可能な溶媒または溶媒混合物中で実施してもよい。抗体は、水性反応媒体中で、コンジュゲーション試薬と直接反応させてもよい。この反応媒体は、求核剤のpH要件に応じて、緩衝液で処理してもよい。反応の最適pHは、一般的には少なくとも4.5、典型的には約5.0〜約8.5の間、好ましくは約6.0〜8.2である。最適反応条件は、当然のことながら、使用する特定の反応物に依存する。
【０１４０】
反応温度3〜37℃の間が一般に適切である。有機媒体(例えばTHF、酢酸エチル、アセトン)中で行われる反応は、典型的に周囲温度までの温度で行われる。
【０１４１】
結合タンパク質は、化学量論的に等量または過剰の試薬を使用して、所望の試薬と効果的にコンジュゲートすることができる。過剰の試薬と生成物は、通常の精製技術、例えば標準的クロマトグラフィー技法、例えばイオン交換クロマトグラフィーもしくはサイズ排除クロマトグラフィー、透析濾過によって、または、ポリヒスチジンタグが存在するときは例えばニッケルまたは亜鉛に基づく金属アフィニティークロマトグラフィーを使用した分離によって、容易に分離することができる。結合タンパク質における特定のジスルフィド結合の標的化は、既知の方法、例えば、タンパク質の部分還元、例えば、Liuら、Anal. Chem. 2010、82、5219〜5226頁により参照される方法によって実施し得る。
【０１４２】
上記一般式VIIIのコンジュゲーション試薬は、オーリスタチンと、一般式:
((Lk1b)m-P)p-Lk2-Lk3a
[式中、m、P、L、p、Lk2およびLk3aは一般式VIIIに示される意味を有し、Lk1bはオーリスタチンに存在する基と反応する基を含むように式Lk1を改変させた基である]
の化合物とを反応させることによって調製し得る。典型的には、Lk1bはモノメチルオーリスタチンの末端の窒素原子と反応する。典型的な基および適切な反応は当業者にとって周知である。
【０１４３】
一般式VIIIのコンジュゲーション試薬は新規であり、したがって本発明はこれらの試薬自体を提供する。これらの新規試薬において、Lk1、P、Lk2、m、pおよびqの値は、一般式Iについて上記に規定したものが好ましい。さらに本発明は、本発明によるオーリスタチン-タンパク質コンジュゲートと、医薬的に許容される担体と、場合によりさらなる治療剤とを含む、治療で使用するための、特に増殖性疾患、自己免疫性疾患または感染性疾患、例えばがんを処置する医薬として使用するための医薬組成物を提供する。また本発明は、医薬的有効量のそのようなコンジュゲートまたは医薬組成物を患者に投与する工程を含む、患者の処置方法を提供する。本発明が有効である特定の状態としては、例えば、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、リンパ球白血病および慢性骨髄性白血病を含む白血病、胃がん、乳がん、卵巣がん、肝臓がん、消化器がん、結腸がん、腎臓がん、例えば腎細胞癌、肺がん、例えば小細胞肺がん、黒色腫、膀胱がんおよび肉腫が挙げられる。
【０１４４】
上記のように本発明の一つの好ましい実施形態は2以上のオーリスタチン分子を含有する特定のコンジュゲートに関する。特定の分岐構造を有し、広範囲の薬物を含む一定の薬物コンジュゲートは新規であり、別個の実施形態において本発明はこれらのコンジュゲート自体も提供する。したがって、本発明は一般式:
(((D'q'-Lk1')m-P)p-Lk2-Lk3)n-Ab        (I')
[式中、D'は薬物部分を表し;
q'は、2〜10の整数を表し;
Lk1'は、リンカーを表し;
mは、1〜10の整数を表し;
Pは、結合またはz価の基-P1-NH-(ここでzは2〜11であり、P1は少なくとも1つのエチレン単位-CH2-CH2-またはエチレングリコール単位-O-CH2-CH2-を含む基である)を表し;
pは、1〜10の整数を表し;
Lk2は、結合またはy価のリンカー(ここでyは2〜11であり、1〜9のアスパルテートおよび/もしくはグルタメート残基からなる)を表し;
Lk3は、一般式:
-CO-Ph-X-Y-        (II)
{式中、Phは場合により置換されたフェニル基であり;XはCO基またはCH.OH基であり;Yは式:
【０１４５】
【化４３】
0006328648.tif 000044
【０１４６】
(式中、AおよびBはそれぞれC1〜4アルキレンまたはアルケニレン基を表す)の基を表す}
のリンカーを表し;
Abは、標的上の結合パートナーに結合することができる結合タンパク質またはペプチドを表し、前記結合タンパク質は、結合タンパク質またはペプチドにおけるジスルフィド結合由来の2つの硫黄原子を介してLk3に結合されており;ならびに
nは、1〜sの整数(ここでsは、Lk3にコンジュゲートする前に結合タンパク質またはペプチドに存在しているジスルフィド結合の数である)を表し;
m、n、p、q'、yおよびzの値は、コンジュゲートに1〜10個のD'基が含まれるように選択される]
を有するコンジュゲートも提供する。
【０１４７】
本発明のこの態様において、m、P、p、Lk2、Lk3、nおよびAbは、Dがオーリスタチン部分を表す本発明の態様について上記に規定された意味および好ましいと規定された意味を有する。
【０１４８】
D'は、結合タンパク質またはペプチドにコンジュゲートさせることが所望される任意の薬物を表すことができ、例えば、細胞毒性薬であり得、例えば上記のオーリスタチンであり得、またはメイタンシンであり得る。用語メイタンシンには、メイタンシン自体、15-メトキシアンサミトシンP-3などのメイタンシノイドおよびそれらの誘導体などの化合物が含まれる。
【０１４９】
好ましくは、メイタンシンは部分構造(A)
【０１５０】
【化４４】
0006328648.tif 000045
【０１５１】
[式中、Xは、OまたはSを表し;Raは、水素またはC1〜4アルキルを表し;Rbは、水素、ヒドロキシ、C1〜4アルコキシまたはC1〜4アルキルC(O)O-を表し;Rcは、水素、ヒドロキシ、C1〜4アルコキシまたはC1〜4アルキルC(O)O-を表し;Rdは、水素またはC1〜4アルキルを表し;Reは、ハロゲンまたは水素を表し;Rfは、水素またはC1〜4アルキルを表す]
を含む化合物である。
【０１５２】
好ましくは、XはOを表す。好ましくは、RaはC1〜4アルキル、特にメチルを表す。好ましくは、Rbは水素を表す。好ましくは、Rcは水素またはメトキシを表し、より好ましくは水素を表す。好ましくは、RdはC1〜4アルキル、特にメチルを表す。好ましくは、Reは塩素または水素、特に塩素を表す。好ましくは、RfはC1〜4アルキル、特にメチルを表す。
【０１５３】
より好ましくは、メイタンシンは部分構造(B)
【０１５４】
【化４５】
0006328648.tif 000046
【０１５５】
[式中、XおよびRa-Rfは上記で規定した意味を有する]
を含む。
【０１５６】
さらにより好ましくは、メイタンシンは部分構造(C)または(D)
【０１５７】
【化４６】
0006328648.tif 000047
【０１５８】
を含み、最も好ましくは(C)を含む。
【０１５９】
メイタンシンは、部分構造(A)、(B)、(C)または(D)のエステルカルボニル炭素原子に結合した以下の(E)基:
【０１６０】
【化４７】
0006328648.tif 000048
【０１６１】
を含み得る。
【０１６２】
例えば、メイタンシンは、部分構造(F):
【０１６３】
【化４８】
0006328648.tif 000049
【０１６４】
を含み得る。
【０１６５】
いくつかの好ましい実施形態において、メイタンシンは部分構造(A)、(B)、(C)または(D)のエステルカルボニル炭素原子に結合した以下の基:
【０１６６】
【化４９】
0006328648.tif 000050
【０１６７】
の1つを含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、メイタンシンは部分構造(A)、(B)、(C)または(D)のエステルカルボニル炭素原子に結合した(L)基:
【０１６９】
【化５０】
0006328648.tif 000051
【０１７０】
を含む。
【０１７１】
特定のメイタンシンの例としては、以下:
【０１７２】
【化５１】
0006328648.tif 000052
【化５２】
0006328648.tif 000053
【化５３】
0006328648.tif 000054
【０１７３】
が挙げられる。
【０１７４】
Lk1'は、薬物部分に、任意の適切な位置で結合することができる。例えば、上記でリンカーLk1について示したように、オーリスタチンに結合し得る。D'が(E)基を含むメイタンシンに相当するメイタンシン部分である場合、Lk1'は、例えば(E)基の窒素原子、例えば
【０１７５】
【化５４】
0006328648.tif 000055
【０１７６】
に結合し得る。
【０１７７】
Lk1'は2以上の薬物部分D'をP基に接続するリンカーであり、2〜10個のD'基を保有できる。Lk1'は好ましくは分解性基を含有しており、すなわち、Lk1'は好ましくは生理学的条件下で切断されてD'をAbから分離するリンカーである。その代わりに、Lk1'は生理学的条件下で切断されないリンカーであってもよい。Lk1'が生理学的条件下で切断されるリンカーである場合、細胞内条件下で切断可能であることが好ましい。標的が細胞内にある場合、Lk1'は細胞外条件に実質的に影響を受けない(すなわち、十分な用量の治療薬剤を細胞内標的に送達することが妨げられない)ことが好ましい。
【０１７８】
Lk1'が分解性リンカーである場合、加水分解条件に感受性を有する基を含んでいてもよい。Lk1'は特定のpH値(例えば、酸性条件)で分解する基を含んでいてもよい。加水分解/酸性条件は、例えば、エンドソーム内またはリソソーム内で見出すことができる。酸性条件下で加水分解を受けやすい基の例としては、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、cis-アコニット酸アミド、オルトエステルおよびアセタール/ケタールが挙げられる。加水分解条件に感受性を有する基の例としては、
【０１７９】
【化５５】
0006328648.tif 000056
【０１８０】
が挙げられる。
【０１８１】
Lk1'は還元条件下で分解を受けやすい基であってもよい。例えば、Lk1'は生物学的還元剤、例えばチオールに接触して切断され得るジスルフィド基を含有し得る。ジスルフィド基の例としては、
【０１８２】
【化５６】
0006328648.tif 000057
【０１８３】
[式中、R、R'、R''およびR'''は、それぞれ独立して、水素またはC1〜4アルキルである]
および
【０１８４】
【化５７】
0006328648.tif 000058
【０１８５】
が挙げられる。
【０１８６】
Lk1'は酵素分解の影響を受けやすい基、例えば、プロテアーゼ(例えば、リソソームプロテアーゼもしくはエンドソームプロテアーゼ)またはペプチダーゼによる切断を受けやすい基を含んでもよい。例えば、Lk1'は少なくとも1個、例えば少なくとも2個、または少なくとも3個のアミノ酸残基(例えば、Phe-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Val-Cit、Phe-Lys)を含むペプチジル基を含有し得る。例えば、Lk1'は1〜5個、例えば2〜4個のアミノ酸を有するアミノ酸鎖であり得る。酵素分解を受けやすい基の別の例は、
【０１８７】
【化５８】
0006328648.tif 000059
【０１８８】
[式中、AAはプロテアーゼ特異的アミノ酸配列、例えばVal-Citを表す]
である。
【０１８９】
Lk1'は、
【０１９０】
【化５９】
0006328648.tif 000060
【０１９１】
を含み得る。
【０１９２】
例えば、Lk1'は、
【０１９３】
【化６０】
0006328648.tif 000061
【０１９４】
を含み得る。
【０１９５】
式I'によって示される本発明の実施形態において、q'は1より大きく、例えば2、3または4であり、Lk1'は2以上の薬物部分を本発明のコンジュゲートに組み込む手段として使用される。Lk1'は、分岐リンカーであり、例えば、アスパルテートもしくはグルタメートまたは類似の残基を組み込むことができ、これにより、式:
【０１９６】
【化６１】
0006328648.tif 000062
【０１９７】
[式中、bは1、2または3であり、b=1はアスパルテートであり、b=2はグルタメートであり、b=3は本発明の一つの好ましい実施形態を形成する]
の分岐要素が導入される。式VIにおけるアシル部分のそれぞれが、適切なリンカーLk1aを介してD'基に結合していてもよい。Lk1aは任意の適切なリンカーであって、例えばLk1'について上記に示した連結の一つを組み込んだ分解性リンカーである。好ましい一実施形態において、Lk1aは上記に示すV基を表す。アスパルテートもしくはグルタメートまたは類似の残基のアミノ基は、任意の適切な手段によってPに結合することができ、例えば連結はアミド結合を介することができ、例えば上記の分岐基は-CO.CH2-基を介してPに結合し、
【０１９８】
【化６２】
0006328648.tif 000063
【０１９９】
となり得る。
【０２００】
必要に応じて、アスパルテートもしくはグルタメートまたは類似の残基を、さらなるアスパルテートおよび/もしくはグルタメートならびに/または類似の残基、例えば
【０２０１】
【化６３】
0006328648.tif 000064
【０２０２】
に連結してもよく、以降同様にさらに最大9個のそのような残基に連結してもよく、それにより最大で10個のD基の組み込みが可能となる。上記のように、D'はそれぞれ、任意の適切なリンカーLk1aを介してアスパルテート/グルタメートまたは類似の残基に接続されてもよい。
【０２０３】
式I'の好ましいコンジュゲートは、式:
【０２０４】
【化６４】
0006328648.tif 000065
【０２０５】
[式中、a、bおよびAbは上記に示した意味を有する]
を有する。D'は、例えば、上述のようにメイタンシン、特にオーリスタチンであり得る。
【０２０６】
式I'のコンジュゲートは、上記式Iのコンジュゲートについての記載に準じて、但しLk1をLk1'に置換し、DをD'に置換し、qを1より大きくして、調製することができる。
【０２０７】
式:
((D'q'-Lk1')m-P)p-Lk2-Lk3a       (VIII')
[式中、D'、q'、Lk1'、m、P、p、Lk2およびLk3は、上記に規定および好ましいと規定された意味を有する]
のコンジュゲート化試薬は新規であり、本発明の一部を形成する。それらは、式VIIIの試薬について上記した方法に準じて調製することができる。本発明のこの態様による特に好ましいコンジュゲート化試薬は、式:
【０２０８】
【化６５】
0006328648.tif 000066
【０２０９】
[式中、bは1、2または3である]を有する。Yaは好ましくは式(XII)の基であり、特にAおよびBがそれぞれ-CH2-である基である。P1は好ましくはPEG、特に上述の基の1つであり、好ましくは15〜35の-O-CH2-CH2-反復単位を有する基である。また、上記式においてAbが〜X-基の2、3または好ましくは4コピーを保有する等価構造も好ましい。
【０２１０】
本発明は、さらに、本発明による式I'のコンジュゲートと、医薬的に許容される担体と、場合によりさらなる治療薬とを含む、治療で使用するための、特に増殖性疾患、自己免疫性疾患もしく感染性疾患、例えばがんを処置する医薬として使用するための、医薬組成物を提供する。また本発明は医薬的有効量のそのようなコンジュゲートまたは医薬組成物を患者に投与する工程を含む、患者の処置方法を提供する。そのようなコンジュゲートを使用し得る特定の条件としては、上記の条件が挙げられる。
【０２１１】
驚いたことに、式I'の化合物は、Lk1'が分岐リンカーでなく、q'が1であるが、分岐が分岐リンカーLk2の使用によって分子に導入されている同じ数の薬物分子D'を含有する対応コンジュゲートと比較して、活性が向上していることが見出された。
【０２１２】
式I'のコンジュゲートに関する本発明の態様の具体的な特徴は、以下のとおりである。
1. 上記式I'のコンジュゲート。
2. D'は、細胞毒性薬である、項1に記載のコンジュゲート。
3. D'は、オーリスタチンまたはメイタンシンである、項1に記載のコンジュゲート。
4. D'は、その末端の窒素原子を介して結合されたモノメチルオーリスタチンEまたはモノメチルオーリスタチンFである、項3に記載のコンジュゲート。
5. オーリスタチンは、その末端の窒素原子を介して結合されたモノメチルオーリスタチンEである、項4に記載のコンジュゲート。
6. Lk1'は、分解性リンカーである、項1〜5のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
7. Lk1'は、以下の基:
【０２１３】
【化６６】
0006328648.tif 000067
【０２１４】
[式中、R、R'、R''およびR'''はそれぞれ水素原子またはアルキル基を表し、AAはプロテアーゼ特異的アミノ酸配列を表す]
の1つを含む、項6に記載のコンジュゲート。
8. 1Lk1'は、
【０２１５】
【化６７】
0006328648.tif 000068
【０２１６】
を含む、項7に記載のコンジュゲート。
9. Lk1'は、式:
【０２１７】
【化６８】
0006328648.tif 000069
【０２１８】
[式中、bは1、2または3である]
の要素を含む、項1〜8のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
10. 式:
【０２１９】
【化６９】
0006328648.tif 000070
【０２２０】
[式中、bは1、2または3である]
を有する項1〜5のいずれか一項に記載のコンジュゲート;およびAbが〜X-基の2、3または4コピーを保有する等価構造。
11. Pは結合を表すか、またはPは-P1-NH-(ここでP1は2〜10のエチレングリコール単位を含む)を表す、項1〜10のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
12. Pは、ポリエチレングリコールを表す、項1〜11のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
13. Lk3のフェニル基Phは置換されていない、項1〜12のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
14. Yは、式:
【０２２１】
【化７０】
0006328648.tif 000071
【０２２２】
を有する、項1〜13のいずれか一項に記載のコンジュゲート:
15. Abは、完全長抗体または完全長抗体の抗原結合領域を含む抗体フラグメントを表す、項1〜14のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
16. Abは、IgG1もしくはIgG4またはIgG1もしくはIgG4のフラグメントを表す、項1〜15のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
17. 項1〜16のいずれか一項に記載のコンジュゲートの調製方法であって、結合タンパク質における1つまたは複数のジスルフィド結合を還元する工程と、続けて一般式:
((D'q'-Lk1')m-P)p-Lk2-Lk3a       (VIII')
[式中、D'、Lk1'、P、Lk2ならびにm、pおよびq'は項1に規定した意味を有し、
Lk3aは式:
-CO-Ph-Xa-Ya             (IX)
{式中、Phは請求項1で規定した意味を有し、XaはCO基を表し、Yaは基:
【０２２３】
【化７１】
0006328648.tif 000072
【０２２４】
(式中、AおよびBは、項1で規定した意味を有し、Lはそれぞれ独立して脱離基を表し、xは、式Iのコンジュゲートを生成するための1〜4の整数を表し、XはCOを表す)を表す}
の基を表す]
のコンジュゲート化試薬と反応させる工程と、場合により前記最初に形成されたCO基Xを還元してCH.OH基Xを有するコンジュゲートを得る工程とを含む、方法。
18. Yaは、
【０２２５】
【化７２】
0006328648.tif 000073
【０２２６】
を表す、項17に規定の方法。
19. 一般式:
((D'q'-Lk1')m-P)p-Lk2-Lk3a        (VIII')
[式中、D'は項1〜5のいずれか一項で示された意味を有し、Lk1'は項1および6〜9のいずれか一項に規定の意味を有し、Pは項1、10および11のいずれか一項に規定の意味を有し、Lk2、m、pおよびqは項1に規定の意味を有し、Lk3aは式:
-CO-Ph-Xa-Ya        (IX)
{式中、Phは項1または項10で規定した意味を有し、XaはCO基を表し、Yaは基:
【０２２７】
【化７３】
0006328648.tif 000074
【０２２８】
(式中、AおよびBは項1で規定した意味を有し、各Lは独立して脱離基を表し、xは1〜4の整数を表す)を表す}
の基を表す]
の化合物。
19. Yaは、
【０２２９】
【化７４】
0006328648.tif 000075
【０２３０】
を表す、項18に規定の化合物。
20. 項1〜15のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、医薬的に許容される担体と、場合によりさらなる治療薬とを含む、医薬組成物。
21. 治療で使用するための、項1〜15のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは項20に記載の組成物。
22. 医薬的有効量の項1〜15のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは項20に記載の組成物を患者に投与する工程を含む、患者の処置方法。
【０２３１】
本発明のコンジュゲートはいくつかの重要な利点を実際に示すが、そのような利点の存在は予測し得なかったことである。本発明のコンジュゲートは、市販のコンジュゲートで現在使用されているマレイミド試薬を使用して調製された等価な薬物-抗体コンジュゲートと比較して、顕著な安定性の増加を実証する。さらにこれらの合成方法は、マレイミドを使用する方法と比較して、薬物-抗体比率に関する均質性が顕著に改善された生成物をもたらす。均質性は、製薬原料の生産規則性のための製薬原料の利点である。単一のDAR種をより高い収率で生じさせる方法は、効率性の増加を通して費用もより軽減する。不均質な混合物からDAR種を精製して製造された単一のDAR種の医薬品は、大量生産するには極めて高価であると予想される。
【０２３２】
さらに、異なってもしくは異なる比率で代謝されるためにより不均質性の大きい分解生成物が生じる可能性がある混合DAR物質とは対照的に、全ての薬物が同じように代謝されて類似の産物を生じることから、単一のDAR種は、薬物動態、安全性、毒性および忍容性のより高い予測可能性を示すと予想される。
【０２３３】
以下、実施例により本発明を説明する。
【実施例１】
【０２３４】
末端ビス-スルホン官能基を有し24反復単位PEGを有するバリン-シトルリン-パラアミノベンジル-モノメチルオーリスタチンE(val-cit-PAB-MMAE)試薬1の合成
【０２３５】
【化７５】
0006328648.tif 000076
【０２３６】
工程1:4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(ビス-スルホン)のH2N-dPEG(24)-CO-OtBuへのコンジュゲーション
【０２３７】
【化７６】
0006328648.tif 000077
【０２３８】
H2N-dPEG(24)-CO-OtBu(1.057g、Iris Biotech社)のトルエン(3mL)溶液を蒸発乾燥し、残留物をジクロロメタン(25mL)に再溶解した。撹拌下、4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(1.0g;Nature Protocols、2006、1(54) 2241〜2252頁)を添加し、得られた溶液をさらに72時間、室温でアルゴン雰囲気下撹拌した。揮発物を真空下で除去し、固体残留物を温アセトン(30mL)に溶解し、非吸着性脱脂綿によって濾過した。濾物を-80℃に冷却して固体を沈澱させ、-9℃で30分、4000rpmで遠心分離を行って固体を分離した。上清を取り除き、沈澱/分離方法をさらに2回繰り返した。最終的に上清を取り除いて得られた固体を真空乾燥し、保護されたビス-スルホン酸2Pを、無色の非晶質固体(976mg、68%)として得た。
【０２３９】
【数１】
0006328648.tif 000078
【０２４０】
工程2:tert-ブチル保護基の除去:
【０２４１】
【化７７】
0006328648.tif 000079
【０２４２】
工程1の生成物(976mg)のジクロロメタン(4mL)中の撹拌溶液に、トリフルオロ酢酸(4mL)を添加し、得られた溶液をさらに2時間撹拌した。その後、揮発物を真空下で除去し、残留物を温アセトン(30mL)に溶解した。生成物を、工程1に記載のようにアセトンから析出することによって分離し、生成物2を白色の粉末(816mg、85%)として得た。
【０２４３】
【数２】
0006328648.tif 000080
【０２４４】
工程3:酸末端PEG化ビス-スルホン2へのH2N-val-cit-PAB-MMAEのコンジュゲーション
【０２４５】
N-メチルモルホリン(7.5mg)を、ビス-スルホン-PEG-COOH(45mg)およびHATU(13mg)のジクロロメタン-ジメチルホルムアミド(85:15v/v、6mL)の撹拌溶液に添加した。室温で30分撹拌した後、H2N-val-cit-PAB-MMAE(38mg、Concortis社、WO2005/081711に従って調製)を添加し、混合物をさらに24時間、室温で撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、1MのHCl、水性NaHCO3 10%w/v、ブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥させた。粗物質を、カラムクロマトグラフィーによりジクロロメタン-メタノール(90:10v/v)で溶出してさらに精製し、溶媒を真空下で除去して、ビス-スルホン-PEG(24)-MMAE生成物1を、透明無色の固体(31mg、41%)として単離した。m/z M+Na 2758.5;  診断シグナル
【０２４６】
【数３】
0006328648.tif 000081
【実施例２】
【０２４７】
末端にビス-スルホン官能基を有する5kDaのPEGを有するモノメチルオーリスタチンE(MMAE)試薬3の合成
【０２４８】
【化７８】
0006328648.tif 000082
【０２４９】
工程1:5kDaのHCl.H2N-PEG-COOH4への4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(ビス-スルホン)のコンジュゲーション
【０２５０】
【化７９】
0006328648.tif 000083
【０２５１】
N-メチルモルホリン(0.004mL)を、5kDaのHCl.H2N-PEG-COOH(100mg、Iris Biotech社)および4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(49mg)のジクロロメタン(5mL)の撹拌溶液に添加し、アルゴン雰囲気下、室温で48時間撹拌した。揮発物を真空下で除去し、固体残留物を温アセトン(7mL)に溶解し、非吸着性脱脂綿に通して濾過した。濾物を-80℃に冷却して固体を析出させ、-9℃で30分、4000rpmで遠心分離を行って固体を分離した。上清を取り除き、沈澱/分離方法をさらに2回繰り返した。最終的に上清を取り除いて得られた固体を真空乾燥し、5kDaのPEG試薬4を白色の粉末(90mg、80%)として得た。
【０２５２】
【数４】
0006328648.tif 000084
【０２５３】
工程2:工程1で得た5kDaの酸末端PEG化ビス-スルホンへのH2N-val-cit-PAB-MMAEのコンジュゲーション
HATU(5mg)を、Na2CO3(3mg)と、H2N-val-cit-PAB-MMAE(11mg)と、ジクロロメタンおよびDMF(1mL)の無水混合物中の工程1生成物(35mg)との撹拌懸濁液に添加し、アルゴン雰囲気下で2日間撹拌した。ジクロロメタンを真空下で除去し、反応混合物を、工程1に記載の方法と同様の方法で冷アセトン(3×5mL)からの沈澱により精製した。固体を真空乾燥させて、ビス-スルホン-PEG(5kDa)-MMAE3を無色の非晶質固体(42mg、95%)として得た。診断シグナル
【０２５４】
【数５】
0006328648.tif 000085
【実施例３】
【０２５５】
末端ビス-スルホン官能基に直接連結したモノメチルオーリスタチンE(MMAE)試薬5の合成
【０２５６】
【化８０】
0006328648.tif 000086
【０２５７】
工程1:4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(ビス-スルホン)のNH2-val-cit-PAB-MMAEへのコンジュゲーション
4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(35mg)を、炭酸ナトリウム(3mg)およびNH2-val-cit-PAB-MMAE(35mg)のDCM-DMF無水混合物(3:1、1mL)の撹拌懸濁液に添加し、アルゴン雰囲気下で24時間撹拌した。生成物を、カラムクロマトグラフィーによりジクロロメタン-メタノール(95:5、v/v)で溶出して精製し、ビス-スルホン-MMAE5を無色の非晶質固体(22mg、33%)として得た。m/z M+Na 1629.5:  診断シグナル
【０２５８】
【数６】
0006328648.tif 000087
【実施例４】
【０２５９】
種々の抗体-薬物コンジュゲートの調製
抗体コンジュゲートが高レベルの均質性と低い平均DARで製造され得ることを実証するために、それぞれ1つの重鎖間ジスルフィド結合を有する2つの改変抗体変異体を、親抗体配列のPCRをベースとする部位特異的変異誘発によって作製した。これらの抗体変異体および親抗体を、ジスルフィド結合由来の2つのシステイン残基間に架橋を形成する実施例1で調製したコンジュゲート化試薬(ビス-スルホン-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE1)と反応させた。
【０２６０】
親抗体および抗体変異体(IgGC226SおよびIgGC229S)の調製
ヒトIgG1(κ)フレームワークに基づき生成したヒト化抗Her2受容体モノクローナル抗体変異体(トラスツズマブ)をコードする親抗体DNA配列の構築は、以前にCarter P.ら、Proc. Natl Acad. Sci. USA、89、4285〜4289頁(1992)に記載されており、この文献で抗体はhumAb4D5-8として言及されている。本実験の目的のために、重鎖アミノ酸配列の359位と361位のアミノ酸をAspとLeuでそれぞれ置換した(E359DおよびM361L)。また本実験で使用される親抗体の軽鎖および重鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号1および2によって本明細書に示される。親抗体のヒンジ領域における2つのシステイン(ヒンジ領域配列:PKSCDKTHTCPPCP)は、抗体の2つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合を形成する。これらのシステイン残基は、EUインデックス番号方式によるIgG1の226位および229位に相当し、配列番号2の229残基および232残基である。
【０２６１】
2つの遺伝子改変抗体変異体(IgGC226SおよびIgGC229S)を、親抗体重鎖配列のPCRに基づく部位特異的変異誘発によってヒンジ領域の重鎖間システイン残基の1つをアミノ酸Serで置換することによって作製した。使用したPCR方法は、Hoら、Gene、77(1989) 51〜59頁に記載されているようなヒンジ領域配列に修飾を生成するプライマー重複伸長であった。PCRプライマーオリゴヌクレオチドを設計して、対象抗体のコーディング配列にヌクレオチド変化を組み込んだ。Cys226Ser変異体において、コドン変換はTGC(Cys)からAGC(Ser)であった。Cys229Ser変異体において、コドン変換はTGC(Cys)からAGT(Ser)であった。新配列を重鎖の他の部分を含む重鎖発現ベクターに戻してクローニングした。最終構築物(突然変異誘発後)は挿入物の完全長配列決定によって確認した。
【０２６２】
新しく生成した重鎖構築物を、ポリエチレンイミン(PEI)を使用して対応する軽鎖構築物と共にHEK293細胞にコトランスフェクトし、6日間の一過性培養で発現させ、プロテインAとサイズ排除クロマトグラフィーの組合せによって、「Transient Expression in HEK293-EBNA1 Cells」Chapter 12、in Expression Systems(DysonおよびDurocher編)。Scion Publishing Ltd.、Oxfordshire、UK、2007におけるプロトコルに基づいて精製した。
【０２６３】
ビス-スルホン-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE1の親抗体および抗体変異体へのコンジュゲーション
抗体変異体と、鎖間ジスルフィド結合あたり1、1.5または2当量の高分子コンジュゲーション試薬ビス-スルホン-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE1とのコンジュゲーションを、抗体還元後に実施した。還元反応を、4.7mg/mL抗体濃度で、10mM DTTを使用して1時間、22℃または40℃で実施した。各抗体変異体に対してバッファー交換を行い、過剰の還元剤を除去した。高分子コンジュゲーション試薬を、コンジュゲーションの直前に50%アセトニトリル水溶液(pH8)で調製した。コンジュゲーション中の抗体濃度は3mg/mLであり、反応を一晩(16時間)、40℃または22℃で行った。コンジュゲーション反応の反応条件を以下のTable 1(表1)に示す。
【０２６４】
【表１】
0006328648.tif 000088
【０２６５】
「IgGC226S」変異体は226位にCysからSerへの置換を有し、したがって1個の重鎖内ジスルフィド結合を229位に有する。「IgGC229S」変異体は229位にCysからSerへの置換を有し、したがって1個の重鎖内ジスルフィド結合を226位に有する。
【０２６６】
バッファー交換後に、それぞれの反応を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によって分析し、前述のように、280nmでのピーク面積%を使用して薬物付加の化学量論を決定した。平均薬物抗体比率(DAR)および生成された抗体-薬物コンジュゲートの薬物コンジュゲート種分布(DAR1-3)をTable 2(表2)に示す。
【０２６７】
【表２】
0006328648.tif 000089
【０２６８】
Table 2(表2)にデータによって示されるように、抗体は高レベルの均質性および低い平均DARで効率的にコンジュゲートすることができる。低い平均DARを有する抗体-薬物コンジュゲートは、より高い平均DARを有するコンジュゲートと比較して、いくつかの有益な特性を有しており、例えばクリアランス率が低減し、治療指数がより高く、毒性が減少している。
【実施例５】
【０２６９】
DAR分布の分析
実施例4において、単一のヒンジ-ジスルフィド変異体の最も低い平均DARは、40℃の場合(反応1および7)ならびに22℃の場合(反応4および10)の両方で、鎖間ジスルフィド結合あたり1当量の高分子コンジュゲーション試薬を使用するときに得られた。これらの結果と親抗体を使用して取得可能な抗体の結果とを比較するために、親抗体をジスルフィド結合あたり1当量の高分子コンジュゲーション試薬を使用して実施例4に設定された条件でコンジュゲートした。
【０２７０】
親抗体、IgGC226SおよびIgGC229Sの平均DARをTable 3(表3)に示す。
【０２７１】
【表３】
0006328648.tif 000090
【０２７２】
Table 3(表3)のデータに示されるように、親抗体の平均DARは、40℃または22℃のいずれでも、単一ヒンジのジスルフィド変異体IgGC226SおよびIgGC229Sより顕著に高かった。
【０２７３】
コンジュゲーション反応によって生成された抗体-薬物コンジュゲート種の分布曲線を分析してDAR分布も測定した。平均DARがより低いことに加えて、図1(40℃でコンジュゲーション)および図2(22℃でコンジュゲーション)からは、本方法によって得られる抗体-薬物コンジュゲート(IgGC226SおよびIgGC229S)が、親抗体を用いて製造したコンジュゲートよりも、不均質性が低減し、収率が向上していることが理解できる。改善された均質性を有する抗体-薬物コンジュゲートは、様々な化学量論の混合物よりも精製の必要性が少なく、毒性が低減および/または薬物動態が向上しており、高薬物付加種が存在しなくなることにより有効性が向上している。
【実施例６】
【０２７４】
ビス-スルホン-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE1から生成した抗体薬物コンジュゲートと、比較可能なマレイミド系試薬から生成した抗体薬物コンジュゲートとの、人工血清安定性の比較
4種のトラスツズマブ-MMAEコンジュゲートを調製した。2種のコンジュゲートは、ビス-スルホン-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE1(実施例1)からトラスツズマブ抗体[ハーセプチン(登録商標)]を使用して調製し、精製後、DAR-2およびDAR44コンジュゲートを得た。残りの2種のコンジュゲートは、比較可能なマレイミド系試薬(H2N-val-cit-PAB-MMAEから1と同様の方法で調製したmal-val-cit-PAB-MMAE)から調製し、精製DAR-2およびDAR-4コンジュゲートを得た。
【０２７５】
4種のコンジュゲートそれぞれを20mg/mLの濃度のヒト血清アルブミンを含むリン酸塩緩衝食塩水(pH7.4)中の1mg/mL溶液として調製した。アジ化ナトリウムを添加し(最終濃度1mM)、次いで混合物を4つの等量のアリコートに分割した。1つのアリコートは直ぐに-80℃で凍結した。残りのアリコートは37℃で維持した。37℃のアリコートは24、48および120時間後に取り出し、-80℃の冷凍庫に移した。最終時間点後、混合物をProPac(登録商標)2.1mm×100mmのHIC-10カラム(Fisher Scientific社)を使用して分析的疎水性相互作用クロマトグラフィーにより分析した。方法は50分で100%バッファーA(pH7.0の50mMリン酸ナトリウム、1.5M硫酸アンモニウム)から100%バッファーB(pH7.0の50mMリン酸ナトリウム、20%イソプロパノール)への直線勾配で構成した。流量は1mL/分であり、温度は30℃に設定した。検出は248および280nmでのUV吸収に従って実施した。各サンプルについて平均薬物抗体比率を測定し、インキュベーション時間に対してプロットした。結果を図3に示す。図3において、薬物-抗体比率へ顕著な低下は、ビス-スルホン試薬1を用いて調製したDAR-2およびDAR-4コンジュゲートでは観察されず、これらのコンジュゲートが人工血清中でのインキュベーションにおいて安定であることが示される。しかしながら、マレイミドをベースとするコンジュゲートでは、経時的なDAR分布の低下が観察された。
【実施例７】
【０２７６】
IgG枯渇血清中の安定性
トラスツズマブ-MMAEコンジュゲートを、ビススルホン試薬1または比較可能なマレイミド試薬(実施例6)のいずれかから調製し、両方のコンジュゲートを精製して、抗体あたり4つの薬物分子を付加させた(DAR4)。コンジュゲートをIgG枯渇血清(BBI溶液、SF142-2)と混合し、コンジュゲートの最終濃度を1mg/mLにした。アジ化ナトリウムを添加し(最終濃度1mM)、次いで混合物をアリコートに分割した。2つのアリコートは直ぐに-80℃で凍結した。残りのアリコートは37℃で維持し、120時間後に2つのアリコートを取り出して-80℃の冷凍庫に移した後、解析した。冷凍アリコートを、ProPac(登録商標)2.1mm×100mmのHIC-10カラム(Fisher Scientific社)に関して実施例6に記載された方法を使用して分析的疎水性相互作用クロマトグラフィーによって分析した。
【０２７７】
IgG枯渇血清でインキュベートしたコンジュゲートについてのHICクロマトグラムを、図4に示す。ビス-スルホンコンジュゲートおよびマレイミドコンジュゲートの両方について、一連の主要なピークは30分から55分の間の溶出に見られる。時間ゼロで、ビス-スルホンコンジュゲートは52.2分に溶出するピーク(ピーク1)として観察される。このピークは120時間後も顕著な変化はなく、コンジュゲートが試験中に分解されなかったことを示す。一方、マレイミドDAR4コンジュゲートは、時間ゼロで、49.1分に溶出するピーク(ピーク1)として観察されるが、120時間後にはこのピークサイズが著しく低下することから、コンジュゲートが分解されたことを示す。マレイミドコンジュゲートに対する120時間のクロマトグラムでは、44.8分(ピーク2)、40.9分(ピーク3)および34.0分(ピーク4)に新しいピークが観察され、それぞれ、DAR-3、DAR22および遊離mAbの標準物質と同じ保持時間で溶出しており、マレイミドコンジュゲートは経時的に薬物損失が進行していることが示される。
【実施例８】
【０２７８】
高いDAR4収率でのビス-スルホン-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE1の抗体へのコンジュゲーション
トラスツズマブ(pH7.5の20mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、20mM EDTA中5.2mg/mLで0.768mL)溶液に、5mM TCEP溶液(0.032mL)を添加し、得られた混合物を40℃で1時間インキュベートした。TCEP処理抗体を室温に冷却し、pH7.5の20mMリン酸ナトリウム、150mM NaClおよび20mM EDTAを使用して4.44mg/mLに希釈した。次いで、ビス-スルホン-dPEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE溶液(0.100mL、4.4mg/mL)の50%(v/v)MeCNおよび50%(v/v)20mMリン酸ナトリウム溶液(pH7.5)、150mM NaClならびに20mM EDTAを抗体溶液に添加した。得られたコンジュゲーション反応混合物を混合し、22℃で22時間インキュベートした。22時間後、50mM N-アセチル-L-システイン(0.064mL、3.0mM)を添加し、得られた混合物をさらに1時間、22℃でインキュベートした。反応サンプルを、分析HICにより、TOSOH TSK-ゲル  ブチル-NPR 35×4.6mmカラムを使用して分析した。薬物と抗体のUV最大吸光度の比とピーク溶出の順序によって同定される分離したDAR変異体それぞれについての面積を棒グラフでプロットした。結果を図5に示す。図5において、主生成物(>73%)はDAR-4コンジュゲートである。
【実施例９】
【０２７９】
ビス-スルホン-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE試薬1から調製したトラスツズマブMMAEコンジュゲートのインビトロ分析
トラスツズマブMMAEコンジュゲートを、実施例8と同様にして、但しスケールを5mgのトラスツズマブに増加させ、N-アセチルL-システインインキュベーション工程を含めずに作製した。反応混合物をAKTAプライムシステムに結合させたToyoPearl Phenyl 650S樹脂充填1mLカラムを用いて、バッファーA:50mMリン酸ナトリウム、2.0M NaCl pH7.0およびバッファーB:80% 50mMリン酸ナトリウム、pH7.0の20%イソプロパノールで平衡化させて分取HICにより精製した。コンジュゲーション混合物を等量の4.0M NaClの50mMリン酸ナトリウム(pH7.0)と混合し、カラム上に1mL/分のバッファーAで注入した。次いで、DAR4サンプルを0-100%のバッファーB勾配を使用して溶出した。DAR4種が溶出し始めた時、勾配を保持し、UVトレースが、勾配が続くベースラインに戻るまで保持した。溶出ピークの画分を回収し、選択し、TOSOH TSKゲルButhyl-NPR 35×4.6mmのカラムを使用して分析的HICにより分析した。DAR4を含有する画分(純度>90%)を合わせ、HiPrep(商標)26/10脱塩カラムを使用してPBS pH7.4にバッファー交換し、VivaSpin 20(10kDa MWCO PES膜)濃縮機で4000×g、室温で濃縮した。濃縮DAR4サンプルを次いで滅菌条件下で濾過し、-80℃の冷凍庫で急速冷凍した。最終サンプルをブラッドフォード分析によって定量し、非還元SDS-PAGEおよび分析的HICによって分析し、インビトロ評価に用いた。
【０２８０】
mAb-試薬1コンジュゲートのインビトロ効果をHER-2受容体過剰発現がん細胞株の細胞増殖に対する阻害効果を測定することによって求めた。
【０２８１】
インビトロでの細胞毒性薬またはADCを用いた処置後の腫瘍細胞生存性の損失は、薬物またはADCの濃度を増加させながら細胞株を増殖させ、CellTiter Glo(登録商標)発光試薬を使用して増殖または代謝活性の損失を定量することによって測定することができる(Promega社、技術公報TB288; Lewis Phillips G.D、  Cancer Res 2008; 68:9280〜9290頁)。このプロトコルには、細胞播種、薬物処理、およびウェル中に存在する細胞数に直接関連するATP合成に基づいた未処理細胞に対する細胞生存性の決定が記載されている。
【０２８２】
HER2-陽性SK-BR-3およびBT-474細胞を3mLのトリプシンEDTAで5〜15分間トリプシン処理した。トリプシン処理を10mLの完全培地を添加することによって停止し、細胞を50mLのFalconチューブに移した。細胞を、Neubauer血球計算器を使用して計数し、BT-474に対して1×105/mL、SK-BR-3に対して5×104/mLの細胞密度にそれぞれ調節した。細胞を、ポリ-D-リジンで被覆した不透明ウェルを有する96ウェルプレートに播種し(100μL/ウェル)、37℃および5%CO2で24時間インキュベートした。腫瘍細胞株SK-BR-3(ATCC-HTB-30)およびBT-474(ATCC-HTB-20)は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから購入した。SK-BR-3細胞をマッコイ5A培地[Life Technologies(登録商標)]、10%ウシ胎児血清、100μ/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン中で増殖させた。BT-474細胞をDMEM/F-12培地[Life Technologies(登録商標)]、10%ウシ胎児血清、100u/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン中で増殖させた。
【０２８３】
細胞培養のための方法は、ATCCの生成物情報シートおよびその引用文献、例えば、Culture of Animal Cells:A manual of Basic Technique、R. Ian Freshney著、第3版、Alan R. Liss発行、N.Y. 1994または第5版、Wiley-Liss発行、N.Y.2005から導いた。ADCまたは遊離薬物(MMAE)の系列希釈は、96ウェルプレートに渡ってピペッティングし、関連細胞培地を希釈液として使用してカラム3から10へと2倍希釈することによって三連で作製した。HER2-陽性細胞株、BT-474およびSK-BR-3をTable 4(表4)に示す薬物濃度で処置した。次いで、細胞を薬物(総体積200μL/ウェル)と共に37℃、5%CO2でさらに96時間インキュベートした。
【０２８４】
【表４】
0006328648.tif 000091
【０２８５】
細胞生存アッセイは、Cell-Titer Glo(登録商標)発光試薬を使用して、製造業者の指示書(Promega社、技術公報TB288;Lewis Phillips G.D、Cancer Res 2008;68:9280〜9290頁)に記載されるように実施した。インキュベーション時間、例えば細胞溶解および発光試薬とのインキュベーションは、最適発光シグナルのために、それぞれ3分および20分延長した。発光はプレートリーダー(例えば、MD Spectramax M3プレートリーダー)を使用して記録し、データは4パラメーターの非線形回帰モデルを使用して連続的に分析した。
【０２８６】
結果は図6に示しており、これからSKBR-3またはBT-474細胞内における抗体-試薬1コンジュゲートのいずれかを用いた処置に対する細胞生存性応答が示される。生存性は、処置していない細胞に対する%として表す。生存性%(Y軸)を薬物濃度(nM)の対数(x軸)に対してプロットして全てのコンジュゲートと遊離薬物についてのIC50値を決定する。IC50値を、Table 5(表5)に示す。
【０２８７】
【表５】
0006328648.tif 000092
【０２８８】
図6およびTable 5(表5)に示されるように、抗体-試薬1コンジュゲートはHER2-陽性細胞株において活性である。
【実施例１０】
【０２８９】
末端ビススルホン官能基を有しモノ24反復単位PEGを有するビス-(バリン-シトルリン-パラアミノベンジル-モノメチルオーリスタチンE)(val-cit-PAB-MMAE)2試薬6の合成
【０２９０】
【化８１】
0006328648.tif 000093
【０２９１】
工程1:H2N-val-cit-PAB-MMAEのFmoc-L-α-アミノアジピン酸へのコンジュゲーション。
【０２９２】
【化８２】
0006328648.tif 000094
【０２９３】
H2N-val-cit-PAB-MMAE.TFA塩(120mg、Concortis社)、Fmoc-L-α-アミノアジピン酸(16.9mg)および1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスフェート(HATU)(34.2mg)の無水ジメチルホルムアミド(1.5mL)の撹拌溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(51mL)を0℃で添加し、反応混合物を2時間撹拌して、室温まで16時間温めた。次いで反応混合物を逆相C18-カラムクロマトグラフィーによりバッファーA(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1% TFAおよびバッファーB(v/v):0.1%TFA含有アセトニトリル(100:0v/vから0:100)で溶出して直接精製した。有機溶媒を真空下で除去し、水性溶媒を凍結乾燥により除去した。Fmoc-L-α-アミノアジピン酸-ビス-[val-cit-PAB-MMAE]7を白色の固体(99.0mg)として単離した。m/z[M+H]+ 2593。
【０２９４】
工程2:Fmoc-L-α-アミノアジピン酸-ビス-[val-cit-PAB-MMAE]7の脱保護
【０２９５】
【化８３】
0006328648.tif 000095
【０２９６】
Fmoc-L-α-アミノアジピン酸-ビス-[val-cit-PAB-MMAE]7(15mg)を、無水ジメチルホルムアミド(1mL)に溶解し、ピペリジンを添加した(0.1mL)。室温で16時間撹拌した後、反応混合物を酢酸(0.2mL)の添加によって酸性化し、次いで逆相C18-カラムクロマトグラフィーによりバッファーA(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1% TFAおよびバッファーB(v/v):0.1% TFA含有アセトニトリル(100:0v/vから0:100)で溶出して直接精製し、有機溶媒を真空下で除去し、水性溶媒を凍結乾燥により除去し、H2N-L-α-アミノアジピン酸-ビス-[val-cit-PAB-MMAE]8を白色の固体(7.0mg)として単離した。m/z[M+H]+ 2374。
【０２９７】
工程3: L-α-アミノアジピン酸-ビス-[val-cit-PAB-MMAE]8の酸末端PEG化ビス-スルホン2へのコンジュゲーション
H2N-L-α-アミノアジピン酸-ビス-[val-cit-PAB-MMAE]5c(7mg)および公知の4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]安息香酸(6mg)を含有する無水ジメチルホルムアミド(0.5mL)中の撹拌溶液に、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスフェート(HATU)(1.4mg、14mgを含有させた100μLのDMFストック溶液10μL)を添加し、溶液を5分間、0℃で撹拌した。次いでN-メチルモルホリン(NMM)[0.37μL、(37μLを含有する963μLのDMFストック溶液10μL)]に添加し、溶液を撹拌した。1時間の時間間隔ではHATU[1.4mg(ストック溶液10μL)]およびNMM[0.37μl(ストック溶液10μL)]の追加分を、合計で3回の添加となるまで加えた。次いで材料を逆相C18-カラムクロマトグラフィーによりバッファーA(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1% TFAおよびバッファーB(v/v):0.1% TFA含有アセトニトリル(100:0v/vから0:100)で溶出して直接精製し、有機溶媒を真空下で除去し、水性溶媒を凍結乾燥により除去し、ビス-スルホン-PEG(24)-H2N-ビス-[val-cit-PAB-MMAE]6を無色の膜(3.3mg、31%)として単離した。m/z[M+H]2+ 1992。
【実施例１１】
【０２９８】
末端ビススルホン官能基を有するビス-(モノ24反復単位PEG-バリン-シトルリン-パラアミノベンジル-モノメチルオーリスタチンE)(PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE)2試薬9の合成
【０２９９】
【化８４】
0006328648.tif 000096
【０３００】
工程1:アセチル安息香酸へのアスパラギン酸のコンジュゲーション
【０３０１】
【化８５】
0006328648.tif 000097
【０３０２】
L-アスパラギン酸β-t.-ブチルα-t.-ブチルエステル塩酸塩(3.43g)および無水ジクロロメタン(30mL)の撹拌溶液に、4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)(1.786g)を添加した。2時間後、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDCI)(2.80g)および4-アセチル安息香酸(2.00g)を添加し、反応物を室温で撹拌した。28時間後、溶液を水(100mL)で分配し、水相をジクロロメタン(2×10mL)で抽出した。合わせた有機相を、水(2×50mL)、ブライン(100mL)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。固体残留物をカラムクロマトグラフィーによりジクロロメタン-メタノール(99.5:0.5v/v)で溶出して精製し、溶媒を真空下で除去してジ-tert-ブチル2-[(4-アセチルベンゾイル)アミノ]ブタンジオエート10をオフホワイト色の固体(3.856g、81%)として単離した。
【０３０３】
【数７】
0006328648.tif 000098
【０３０４】
工程2:ビス-トリルスルファニルブタンジオエート11の形成
【０３０５】
【化８６】
0006328648.tif 000099
【０３０６】
ジ-tert-ブチル2-[(4-アセチルベンゾイル)アミノ]ブタンジオエート10(1.00g)の無水エタノール(20mL)の撹拌懸濁液に、4-メチルベンゼンチオール(635mg)を添加した。反応混合物に、ホルムアルデヒド(37%水溶液)(0.3mL)Nature Protocols、2006、1(54)、2241〜2252頁)を添加し、次いで加熱還流した。2時間および8時間後に、追加分のホルムアルデヒド(37%水溶液、0.3mL)を添加した。さらに16時間後、反応混合物を室温に冷却し、真空下で濃縮し、ジクロロメタン(50mL)で希釈し、水(3×25mL)で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。粗物質を、カラムクロマトグラフィーによりジクロロメタン-メタノール(99.5:0.5v/vから98:2v/v)で溶出して精製し、溶媒を真空下で除去してジ-tert-ブチル2-[[4-[3-(p-トリルスルファニル)-2-(p-トリルスルファニルメチル)プロパノイル]ベンゾイル]アミノ]ブタンジオエート11を薄黄色の固体(0.594g、35%)として単離した。
【０３０７】
【数８】
0006328648.tif 000100
【０３０８】
工程3:tert-ブチル保護基の除去
【０３０９】
【化８７】
0006328648.tif 000101
【０３１０】
ジ-tert-ブチル2-[[4-[3-(p-トリルスルファニル)-2-(p-トリルスルファニルメチル)プロパノイル]ベンゾイル]アミノ]ブタンジオエート11(527mg)の無水ジクロロメタン(2.5mL)の撹拌溶液に、トリフルオロ酢酸(2.5mL)を室温で不活性雰囲気下、注意深く添加した。16.5時間後、反応物を真空下で濃縮させ、残留したトリフルオロ酢酸をトルエン(2×3mL)との共沸蒸留によって除去した。粗生成物を真空下で濃縮して2-(4-(3-(p-トリルチオ)-2-((p-トリルチオ)メチル)プロパノイル)ベンズアミド)コハク酸12を薄黄色の油(490mg、推定定量的収率)として得て、これをさらに精製することなく使用した。
【０３１１】
【数９】
0006328648.tif 000102
【０３１２】
工程4:ビス-トリルチオ-Asp-酸のH2N.dPEG(24)-CO-OtBuへのコンジュゲーション
【０３１３】
【化８８】
0006328648.tif 000103
【０３１４】
H2N-dPEG(24)-CO-OtBu(240mg、Iris Biotech社)のトルエン(3mL)溶液を蒸発乾燥し、残留物をジクロロメタン(15mL)に再溶解した。撹拌下で1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDCI)(17.4mg)および2-(4-(3-(p-トリルチオ)-2-((p-トリルチオ)メチル)プロパノイル)ベンズアミド)コハク酸12(50mg)を添加し、反応混合物を不活性雰囲気下、室温で撹拌した。16時間後、さらなる量のH2N.dPEG(24)-CO-OtBu(240mg)およびEDCI(17.4mg)を添加した。合計で96時間後、固体残留物を、カラムクロマトグラフィーによりジクロロメタン-メタノール(99:1v/vから90:10v/v)で溶出して直接精製し、溶媒を真空下で除去し、ビス-トリルービスPEG13をろう状の黄色の固体(179.5mg、68%)として単離した。
【０３１５】
【数１０】
0006328648.tif 000104
【０３１６】
工程5:tert-ブチル保護基の除去
【０３１７】
【化８９】
0006328648.tif 000105
【０３１８】
ビス-トルイル-ビスPEG-エステル13(179.5mg)の無水ジクロロメタン(3.0mL)の撹拌溶液に、トリフロオロ酢酸(3.0mL)を室温で不活性雰囲気下、注意深く添加した。2時間45分後、反応物を真空下で濃縮させ、残留したトリフルオロ酢酸をトルエン(2×7mL)との共沸蒸留によって除去した。粗生成物を真空下で濃縮し、次いでカラムクロマトグラフィーによりジクロロメタン-メタノール(98:2v/vから85:15v/v)で溶出して精製し、溶媒を真空下で除去し、ビス-トルイル-ビスPEG-酸14を薄黄色の油(102mg、59%)として単離した。
【０３１９】
【数１１】
0006328648.tif 000106
【０３２０】
工程6:ビス-トリルスルファニル-ビス-PEG-酸の酸化
【０３２１】
【化９０】
0006328648.tif 000107
【０３２２】
水(3mL)を、ビス-トルイル-ビスPEG-酸14(102mg)のメタノール(3mL)の撹拌溶液に添加し、次いでOxone(登録商標)(67.1mg)を少しずつ添加した。得られた懸濁液を、室温で撹拌し、18時間後、反応混合物を脱脂綿の栓を通して濾過し、MeOH/水1:1(2mL)で洗浄した。合わせた有機洗浄液を真空下で濃縮し、メタノールを除去し、水層をジクロロメタン(3×7mL)で抽出した。合わせた有機層を、水性HCl(1×5mL、pH3)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮し、ビス-スルホン-ビス-PEG-酸15を薄黄色の固体(79mg、76%)として得た。
【０３２３】
【数１２】
0006328648.tif 000108
【０３２４】
工程7:H2N-val-cit-PAB-MMAEのビス酸末端PEG化ビス-スルホンへのコンジュゲーション
不活性雰囲気下のビス-スルホン-ビス-PEG-酸15(24.0mg)の撹拌溶液に、H2N-val-cit-PAB-MMAE.TFA塩(37.2mg)および無水炭酸ナトリウム(2.7mg)の無水ジメチルホルムアミド(0.8mL)を添加した。次いで、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスフェート(HATU)(9.6mg)を添加し、反応混合物を室温で撹拌した。42時間後、反応混合物を、酢酸(50μL)で酸性化し、次いで逆相C18カラムクロマトグラフィーによりバッファーA(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1% TFAおよびバッファーB(v/v):0.1% TFA含有アセトニトリル(100:0v/vから0:100)で溶出して直接精製した。生成物画分については、有機溶媒を真空下で除去し、水性溶媒を凍結乾燥により除去した。さらに逆相シリカジオールカラムクロマトグラフィーを使用して酢酸エチル-イソプロパノール(100:0v/vから0:100v/v)で溶出して精製を行った。溶媒を真空下で除去し、ビス-スルホン-PEG(24)-ビス-[val-cit-PAB-MMAE]9を、無色の油(8.0mg、21%)として単離した。m/z M+Na 5104。
【実施例１２】
【０３２５】
二重付加したビス-スルホンMMAE試薬8および二重付加したビス-スルホンMMAE試薬9の抗体フラグメント(Fab)へのコンジュゲーション
トラスツズマブのパパイン消化から得られたFab(2.14mg/mL、PBS中)の2つの5mLアリコートを、DTT(50μLの1M DTT溶液を添加)を用いて22℃で1時間、還元した。2つのPD-10カラムを使用して還元されたFab溶液を20mMリン酸ナトリウム、pH7.4(150mM NaClおよび20mM EDTA)にバッファー交換し、過剰のDTTを除去した。バッファー交換後、サンプル濃度をUVによって測定した。バッファー交換Fab溶液を、1.1mg/mL(3.6mL最終容積)に、pH7.4の20mMリン酸ナトリウム(150mM NaClおよび20mM EDTA)を用いて希釈した。
【０３２６】
1つの還元Fabのアリコートに、ビス-スルホン-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE2(1.2mg/mL、0.4mL)の50:50v/vのアセトニトリルおよび20mMリン酸ナトリウム溶液(pH7.4)、150mM NaClならびに20mM EDTAを添加した。第2のFabのアリコートに、ビス-スルホン-[PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE]2(0.4mL、1.5mg/mL)を50:50v/vのアセトニトリルおよび20mMリン酸ナトリウムに含有させた溶液(pH7.4)、150mM NaClならびに20mM EDTAを添加した。両方の反応混合物を22℃で22時間インキュベートした。インキュベーションの完了後、反応混合物(4.0mL)を、10mLのZeba(商標)スピンカラムを使用してPBSにバッファー交換した。得られた両方のFab-MMAEコンジュゲートをToyopearl Phenyl HICカラム(1mL)を使用する分取HICにより精製し、純度を93%超とした。サンプルをそれぞれ2M NaCl、50mMリン酸ナトリウム、pH7.0に入れ、20%プロパン-2-オール、50mMリン酸ナトリウム、pH7.0の0〜100%勾配で溶出した。
【実施例１３】
【０３２７】
抗体薬物コンジュゲート(ADC)のインビトロ細胞生存アッセイによる分析
実施例12で調製された試薬6および試薬9抗体コンジュゲートのインビトロ有効性をHER-2受容体過剰発現がん細胞株の細胞増殖に対する阻害効果を実施例9の方法によって測定することによって決定した。
【０３２８】
HER2-陽性SK-BR-3およびBT-474細胞を3mLのトリプシンEDTAで5〜15分間トリプシン処理した。トリプシン処理は10mLの完全培地を添加させることによって停止し、細胞を50mLのFalconチューブに移した。細胞を、Neubauer血球計算器を使用して計数し、BT-474に対して1×105/mL、SK-BR-3に対して5×104/mLの細胞密度にそれぞれ調節した。細胞を、ポリ-D-リジンで被覆した不透明ウェルを有する96ウェルプレートに播種し(100μL/ウェル)、37℃および5%CO2で24時間インキュベートした。腫瘍細胞株SK-BR-3(ATCC-HTB-30)およびBT-474(ATCC-HTB-20)は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから購入した。SK-BR-3細胞を、マッコイ5A培地[Life Technologies(登録商標)]、10%ウシ胎児血清、100u/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン中で増殖させた。BT-474細胞をDMEM/F-12培地[Life Technologies(登録商標)]、10%ウシ胎児血清、100u/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン中で増殖させた。
【０３２９】
HER2-陽性細胞株、BT-474およびSK-BR-3を表6Table 6(表6)に示す薬物濃度で処置した。次いで細胞を薬物(総体積200μL/ウェル)と共に37℃、5%CO2でさらに96時間インキュベートした。
【０３３０】
【表６】
0006328648.tif 000109
【０３３１】
細胞生存アッセイは、Cell-Titer Glo(登録商標)発光試薬を使用して、製造業者の指示書(Promega社、技術公報TB288;Lewis Phillips G.D、Cancer Res 2008;68:9280〜9290頁)に記載されるように実施した。インキュベーション時間、例えば細胞溶解および発光試薬とのインキュベーションは、最適発光シグナルのために、それぞれ3分および20分延長した。発光はプレートリーダー(例えば、MD Spectramax M3プレートリーダー)を使用して記録し、データは4パラメーターの非線形回帰モデルを使用して連続的に分析した。
【０３３２】
結果を図7に示しており、これからSKBR-3またはBT-474細胞内における試薬6コンジュゲートまたは試薬9コンジュゲートのいずれかを用いた処置に対する細胞生存性が示される。生存性は、処置していない細胞に対する%として表される。全てのコンジュゲートならびに遊離薬物についてIC50値を決定するために、生存性%(Y軸)を薬物濃度(nM)の対数(x軸)に対してプロットした。IC50値をTable 7(表7)に示す。
【０３３３】
【表７】
0006328648.tif 000110
【０３３４】
図7および  Table 7(表7)に示されるように、どちらの抗体コンジュゲートもHER2-陽性細胞株において活性である。試薬6コンジュゲートの効力は試薬9コンジュゲートと比較して増加している。いずれのコンジュゲートも遊離薬物より効率的に増殖を低減させる。
【実施例１４】
【０３３５】
ビス-スルホン-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE試薬1を使用して生産された抗体薬物コンジュゲートについてのインビボ異種移植試験
DAR=1、DAR=2、DAR=3およびDAR=4を有する4つの抗体薬物コンジュゲート(ADC)を、ビス-スルホン-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE試薬1とトラスツズマブとのコンジュゲーションから製造し、HICにより精製して、それぞれDAR単独の純度を95%超とした。次いで、各コンジュゲートを、以下のように異種移植試験で使用した。
【０３３６】
雌の重症複合免疫不全症マウス(Fox Chase SCID(登録商標)、C.B-17/Icr-Prkdcscid、Charles River Laboratories社)は11週齢であり、体重(BW)範囲は試験1日目で18.0〜23.1グラムの範囲であった。動物に水(逆浸透、1ppm Cl)ならびに18.0%粗タンパク質、5.0%粗脂肪、および5.0%粗繊維からなるNIH 31 Modified and Irradiated Lab Diet(登録商標)を自由に摂取させた。静止したマイクロアイソレータ内の照射Enrich-o'cobs(商標)実験動物寝具上で12時間明サイクル、20〜22℃(68〜72°F)および40〜60%湿度で、マウスを収容した。
【０３３７】
異種移植は、SCIDマウスにおける連続皮下移植によって維持したBT474ヒト乳癌腫を用いて開始した。腫瘍移植の日には、それぞれの試験マウスに1mm3のBT474断片を右脇腹に皮下移植し、平均サイズが90〜120mm3の標的範囲に達するように腫瘍増殖をモニターした。カリパスを使用して腫瘍を二次元で測定し、次式を使用して体積を計算した:
【０３３８】
【数１３】
0006328648.tif 000111
【０３３９】
式中、w=腫瘍の幅、l=腫瘍の長さ(単位mm)。
【０３４０】
試験日を第1日目と設定した腫瘍移植後28日目に、それぞれ63〜126mm3の範囲の個々の腫瘍体積を有し、グループの平均腫瘍体積を99〜101mm3とした10匹のマウスからなるグループに動物を分類した。処置はマウスグループ(n=10)の全てで皮下BT474腫瘍(63〜126mm3)が確立された1日目に開始した。グループ1はビヒクル処置対照群であった。グループ2〜5にはそれぞれDAR=1、DAR=2、DAR=3およびDAR=4を有するADCを各20mg/kgで静脈内に1、8および15日目に与えた。試験が61日目に終了するまで、腫瘍を毎週2回、測定した。マウスを個別にモニターし、それぞれのマウスを腫瘍が1500mm3の最終体積に達したときまたは最終日のいずれか先に到達した時点で安楽死させた。終了までの時間(TTE)を各マウスについて計算した。処置結果は、対照マウスに対する処置マウスについてのTTE中央値の増加%として定義し、腫瘍成長遅延率(%TGD)から決定し、グループ間の差異がログランク生存分析を使用してP≦0.05の場合に統計学的に有意とみなした。マウスを完全回帰(CR)および部分回帰(PR)応答についてもモニターした。試験の最後にCRを有する動物は腫瘍無し生存体として追加的に分類した。処置の忍容性を体重測定および処置関連副作用臨床徴候の頻繁な観察によって評価した。
【０３４１】
ビヒクル処理した対照に対するTTE中央値は34.9日であり、61日の試験期間に最大の可能なTGDは26.1日(75%)であった。全ての投与計画は十分な忍容性があり、有効性の評価が可能であった。DAR=1およびDAR=2を有するADCは測定可能なTGDがそれぞれ14.4日(41%)および16.9日(48%)となったが、対照との顕著な生存率の差異はなかった(P>0.05)。DAR=1群には腫瘍のない生存体が1体あり、これは3つの群の中で記録された唯一の退縮であった。DAR=3およびDAR=4を有するADCは最大TGD(26.1日、75%)となり、対照に対する顕著な生存率の差異(P<0.001)が生じたが、2つのレジメンは回帰応答に基づいて区別された。DAR=3による処置では、3体のPRが生じたが、DAR=4による処置では10/10の腫瘍のない生存体が生じた。結果を図8に示す。
【実施例１５】
【０３４２】
ビス-スルホン-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE1の親抗体および抗体変異体IgGC226Sへのコンジュゲーション:IgGC226Sを用いた鎖間架橋のより高い保持
親抗体および実施例4に記載の単一のヒンジジスルフィド変異体IgGC226Sの、鎖間ジスルフィド結合あたり1モル当量のコンジュゲーション試薬ビス-スルホン-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE1を抗体還元後に実施した(TCEP、鎖間ジスルフィドあたり1モル当量、15分、40℃)。コンジュゲーション試薬は、コンジュゲーションの直前にDMSO[5%(v/v)DMSOの反応溶液となる]で調製した。コンジュゲーション中の抗体濃度は4mg/mLであった。反応は40℃で一晩実施し、その後、反応混合物を10mM DHAを用いて1時間室温で処理し、次いでSDS-PAGEによって分析した。SDS-PAGEゲルを、InstantBlue(商標)で染色し、IMAGEQUANT(商標)LAS 4010機器(GE Healthcare社)を用いて染色してレーン内に存在する各種の%を決定した。SDS-PAGEの結果を図9に示す。図9において、Mで標識したレーンはNovex Protein標準(Invitrogen社)を示す。レーン1および2はそれぞれコンジュゲーション反応前および後のIgGC226Sの移動プロファイルを示す。レーン3および4は親抗体についての等価な反応を示す。抗体の重-重鎖間ジスルフィドがコンジュゲーション後に、ジスルフィド結合の交錯によるなど、共有結合により架橋されないとき、SDS-PAGEによって重鎖-軽鎖二量体(H+L)の80kDaマーカーのすぐ下にバンドが見える。対照的に重-重鎖間ジスルフィドがコンジュゲーション後に架橋されるとき、抗体重鎖-軽鎖四量体(2H+2L)の160kDaマーカーのすぐ上にバンドが見える。レーン2および4を比較すると、単一の重鎖間ジスルフィドを有するIgGC226Sにコンジュゲートすることにより、2つの重鎖間ジスルフィドを有する親抗体の場合と比較して、2つの重鎖間架橋の程度がより高くなり(それぞれ抗体の重鎖-軽鎖四量体が67%であるのに対して80%)、重鎖-軽鎖二量体形成の程度がより低くなる(それぞれ31%に対して17%)ことが理解できる。本方法はこのように重鎖間ジスルフィド結合の効率的な架橋によって抗体コンジュゲートの安定性を改善する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006328648.tif 000127
【図９】
0006328648.tif 000128
【配列表】
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