(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染のインビトロ検出方法であって、生物学的試料中に存在するＨＣＶキャプシドタンパク質および前記キャプシドタンパク質に対する抗体の同時検出を特徴とし、ａ）生物学的試料を、前記キャプシドタンパク質に対する捕捉抗体および前記試料中に存在する抗キャプシドタンパク質抗体を捕捉することができる捕捉抗原と接触させ；ｂ）前記混合物を、抗原抗体複合体の形成を可能にする条件でインキュベートし；ｃ）形成された抗原抗体複合体を検出し（捕捉されたキャプシドタンパク質に結合することができる標識された検出抗体を適宜用いてもよく、および／または捕捉されたキャプシドに対する抗体に結合することができる標識された検出抗原を適宜用いてもよい）；前記捕捉抗原は、多くても配列番号：１のアミノ酸１からアミノ酸４４からなるＨＣＶキャプシドに由来する抗原フラグメントからなり、前記抗原フラグメントは、ｉ）ＨＣＶキャプシドタンパク質のアミノ酸６から３７であって、３３〜３６位における少なくとも１つのアミノ酸の点変異を有するものを含み、またはからなることを特徴とする方法。
【請求項２】
捕捉抗原が、アミノ酸３４の点変異を有するペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
捕捉抗原が、ＨＣＶキャプシドタンパク質の配列番号：１の１〜４４位からなり、３４位におけるアミノ酸の点変異を有するペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
３４位におけるアミノ酸が、グリシン残基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記捕捉抗体および前記捕捉抗原が、固相上に固定されているものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記固相が、キャプシドではないＨＣＶタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原をさらに含むものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記固相が、ＮＳ３またはＮＳ４に由来する少なくとも１つの抗原をさらに含むものである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
検出抗体が、抗原抗体複合体が形成した後に混合物に加えられるものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
検出抗体および／または検出抗原が、捕捉抗体および捕捉抗原と同時に生物学的試料と接触されるものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
多くても配列番号：１のアミノ酸１〜アミノ酸４４からなるＨＣＶキャプシドに由来する抗原フラグメントからなるペプチドであって、前記抗原フラグメントが、ＨＣＶキャプシドタンパク質のアミノ酸６から３７であって、３３〜３６位における少なくとも１つのアミノ酸の点変異を有するものを含み、またはからなる、ペプチド。
【請求項１１】
アミノ酸３４の点変異を有する、請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
ＨＣＶキャプシドタンパク質の配列番号：１の１〜４４位からなり、３４位におけるアミノ酸の点変異を有する、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
３４位におけるアミノ酸が、グリシン残基である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１４】
Ｎ末端でスペーサーに共有結合された請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のペプチドを含む、抱合されたペプチド。
【請求項１５】
前記スペーサーが、Ｃ−Ｈｘ（式中、Ｃは、システインであり、Ｈｘは、６−アミノヘキサン酸である）である、請求項１４に記載の抱合されたペプチド。
【請求項１６】
請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のペプチドが、それ自体に共有結合しているか、またはスペーサーを介して運搬分子を有している、請求項１４または１５に記載の抱合されたペプチド。
【請求項１７】
抗ＨＣＶキャプシド抗体の捕捉抗原として、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のペプチドを含む、生物学的試料中のＨＣＶウイルスによる感染を検出するために有用なキット。
【請求項１８】
捕捉抗原の他に、生物学的試料中に存在し、前記捕捉抗原と複合体を形成する前記抗ＨＣＶ抗体を検出する手段を含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記検出手段が、標識された抗免疫グロブリンまたは抗アイソタイプ抗体である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
ａ１）請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のペプチドである抗ＨＣＶキャプシド抗体の捕捉抗原；
ｂ）ＨＣＶキャプシドタンパク質に対する捕捉抗体（前記捕捉抗原および前記捕捉抗体は、固相上に固定されている）；ならびに
ｃ１）標識された検出抗体、
ｃ２）請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のペプチドである抗免疫グロブリン抗体または適宜標識されていてもよい検出抗原
を含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１】
ａ１）請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のペプチドである抗ＨＣＶキャプシド抗体の捕捉抗原；
ａ２）非構造タンパク質ＮＳ３、ＮＳ４、および／またはＮＳ５のいずれかまたは全てを含む抗非構造タンパク質抗体の捕捉抗原、
ｂ）ＨＣＶキャプシドタンパク質に対する捕捉抗体（前記捕捉抗原および前記捕捉抗体は、固相上に固定されている）；ならびに
ｃ１）標識された検出抗体、
ｃ２）請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のペプチドである抗免疫グロブリン抗体または適宜標識されていてもよい検出抗原
を含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
固相上に固定されたキャプシドタンパク質の天然エピトープ３３−３６に対する抗ＨＣＶキャプシド抗体の捕捉抗体、ならびに前記ＨＣＶキャプシドタンパク質の部分３３−３６に存在する天然エピトープとは異なるエピトープに対する直接または間接的に標識された検出抗体を含む、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３】
固相上に固定されたキャプシドタンパク質の天然エピトープ３３−３６に対する抗ＨＣＶキャプシド抗体の捕捉抗体、ならびに前記ＨＣＶキャプシドタンパク質の部分６−３７に存在する天然エピトープとは異なるエピトープに対する直接または間接的に標識された検出抗体を含む、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２４】
前記ＨＣＶキャプシドタンパク質の部分３３−３６に存在する天然エピトープとは異なるエピトープに対する固相上に固定された抗ＨＣＶキャプシド抗体の捕捉抗体、ならびに前記ＨＣＶキャプシドタンパク質の天然エピトープ３３−３６に対する直接または間接的に標識された検出抗体を含む、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２５】
前記ＨＣＶキャプシドタンパク質の部分６−３７に存在する天然エピトープとは異なるエピトープに対する固相上に固定された抗ＨＣＶキャプシド抗体の捕捉抗体、ならびに前記ＨＣＶキャプシドタンパク質の天然エピトープ３３−３６に対する直接または間接的に標識された検出抗体を含む、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染のインビトロ検出、ならびにこのための前記ウイルスのキャプシドタンパク質に由来する抗原ペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景技術：
Ｃ型肝炎ウイルスによる感染は、特に、輸血時において、長い間認識されてきた厄介な健康問題である。
【０００３】
輸血後のリスクを減らすためには、抗体が出現する前の汚染直後に、ウイルス自体の存在を検出することが必要である。汚染とセロコンバージョン（すなわち、抗体の出現）との間のこの期間は、「血清空白時間（serological window）」と呼ばれる。
【０００４】
使用が簡略で、検出感度が高く、特異的で、再現可能で、高価ではなく容易である方法を目的として、まず、血清空白時間中にＨＣＶ抗原を検出し、次いでセロコンバージョン後の患者の血清学的な進展をモニターし、ＨＣＶ抗原の検出とともに抗ＨＣＶ抗体を検出するための大量スクリーニング用に自動化することができる方法が提案されてきた。
【０００５】
しかしながら、この方法は、血清中に存在する抗ＨＣＶ抗体と標識された抗ＨＣＶ抗体との間の干渉という大きな問題を抱えている。すなわち、抗原の同時サンドウィッチ検出に用いられる標識された抗体によって認識されるエピトープと同一のエピトープを有する標的抗原の所定の抗体を検出するために固相を導入することは、固相上に標識された抗体を不可逆的に固定し、それゆえ試験の擬陽性反応を生じてしまうであろう。
【０００６】
これは、特に、抗ＨＣＶキャプシド抗体およびＨＣＶキャプシド抗原の同一固相上の同時検出用の系に当てはまる。よって、キャプシド抗原を検出するために用いられる標識された抗ＨＣＶキャプシド抗体によって認識されるエピトープと同一のエピトープを有するキャプシド抗原の、抗ＨＣＶキャプシド抗体を検出するための固相上における蓄積は、固相上に標識された抗体の固定を招き、試験の擬陽性反応を生じる。
【０００７】
干渉の問題に対処するため、特許文献１は、ＨＣＶキャプシド抗原および抗ＨＣＶキャプシド抗体の同時測定方法（「組み合わせ（combo）」タイプの試験）であって、前記抗原は、抗キャプシド抗体の捕捉および検出を同時に供給するキャプシドエピトープとは異なるキャプシドエピトープに対する抗体によって捕捉され、標識される方法を提案する。代表的な例として、間接アッセイにおける抗原および抗体のサンドウィッチ検出のための同時アッセイにおいて、抗原を検出するために、ＨＣＶキャプシドのアミノ酸（ＡＡ）１００からアミノ酸１３０までの配列のエピトープに対する第１（捕捉）抗体および配列ＡＡ４０−５０のエピトープに対する第２（検出）抗体が用いられ、前記抗体を検出するために、用いられる捕捉抗原は、その一部に配列ＡＡ１−４２およびＡＡ６６−８０を含有するものが挙げられる。
【０００８】
特許文献２は、特に、界面活性剤としてＮ−ラウロイルザルコシンを用いた、キャプシドならびに抗ＮＳ３およびＮＳ４抗体の同時検出のためのアッセイを記載する。当該文献は、（サンドウィッチで）キャプシド抗原、および抗キャプシドおよび抗非構造ＨＣＶタンパク質抗体（サンドウィッチ、二重抗原）の同時検出のためのアッセイに言及する。抗原を捕捉するために、ＨＣＶキャプシドのＮ末端伸長部分（ＡＡ１０−５３）を認識するとされるｃ１１−３およびｃ１１−７の２つの抗体が用いられ、検出のために、第３の抗体であるｃ１１−１４が、ＨＣＶキャプシドのＣ末端部分（ＡＡ１２０−１３０）を認識するとされる。前記抗体を検出するために、用いられる捕捉抗原は、スーパーオキサイドジスムターゼ（「ＳＯＤ」）のフラグメントに融合させた、抗原ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５および数種類のＨＣＶに由来する一連のキャプシド配列：ＡＡ９−５３（Ｒ４７Ｌ突然変異を有する）、ＡＡ６４−８８およびＡＡ６７−８４を含有する複数のエピトープを有する融合抗原である。
【０００９】
特許文献３は、同一の抗体を用いて、それらの起源またはエピトープ特異性を示すことなくキャプシドを検出するための「組み合わせ競合（Combo complete）」アッセイを記載する。抗キャプシド抗体は、（変異源によって）改変されているキャプシド抗原：Ｃ２２ＫＳＮＶ４７、４８（キャプシド配列ＡＡ１０−９９のアミノ酸４７および４８の欠如を含むＳＯＤとの融合タンパク質）またはＣ２２ＫＳＲ４７Ｌ（４７位のロイシンがアルギニンに置換されたキャプシド配列ＡＡ１０−９９を含むＳＯＤとの融合タンパク質）によって検出される。
【００１０】
特許文献４は、ＨＣＶキャプシド抗原を検出するための多くの抗原およびアッセイを記載する。「リアルコンビ（Real Combo）」の名で記載される「組み合わせ競合（Combo complete）」アッセイのみが、抗キャプシド抗体を検出するために固相に固定化されたキャプシドのアミノ酸１１−２８に相当するビオチン化ペプチドを用いる。これは、キャプシドを検出するために、固相中のＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの抗体Ｃ１１−１４（キャプシド配列ＡＡ４５−５０を認識する）およびアクリジンで標識されたＣ１１−１０（キャプシド配列ＡＡ３２−３６を認識する）との組み合わせを採用している。よって、特許文献４は、明確に区別され、すなわち、重ね合わない２つのキャプシド部位（前記抗体を検出するためのＡＡ１１−２８、ならびに前記抗原を検出するための抗ＡＡ３２−３６抗体およびＡＡ４５−５０）を介して、キャプシド抗原の捕捉および抗キャプシド抗体の捕捉を行う。
【００１１】
特許文献５は、ＨＣＶ特異的なマウスモノクローナル抗体に結合する可能性を排除した、ＨＣＶ感染を検出する試験で用いられる変異キャプシド配列を含有するペプチドの使用を記載する。
【００１２】
特許文献６に記載の発明者は、構造的な改変により、人為的に異なる抗体を捕捉するために用いられる標的抗原の特定のエピトープを作り出した。よって、改変されたエピトープは破壊される。同時に、抗原を捕捉し、および／または検出するために用いられる抗体は、患者の抗原に存在する全く改変されていないエピトープを認識し、それにより、これらの同一のエピトープをもはや有していない改変された抗原に結合することができないように選択された部分に対するものである。エピトープは同一ではないため、ＨＣＶ抗原および患者の抗体を捕捉し、および／または検出するために用いられる抗体間に競合はない。特許文献６は、少なくとも２つの別個のエピトープ部位に変異を有するＨＣＶキャプシドペプチド、特に、ペプチド１−７５（Ｇ３４−Ｇ４４−Ｇ４７）をより明確に記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】ＥＰ１０２０７２７（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）
【特許文献２】特許出願ＷＯ０１／９６８７５（ＣＨＩＲＯＮ）
【特許文献３】特許出願ＥＰ１２５１３５３（Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）
【特許文献４】特許出願ＷＯ２００３／００２７４９（Ａｂｂｏｔｔ）
【特許文献５】特許出願ＥＰ１３１０５１２（Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）
【特許文献６】特許出願ＷＯ２００３／０９５９６８
【発明の概要】
【００１４】
発明の概要：
本発明者らは、ＨＣＶ感染を検出するためのさらにより有益な方法を提案する。
【００１５】
本発明の方法は、干渉についての課題を解決しつつ優れた感度を有し、より迅速な検出を可能にし、セロコンバージョン後の患者の血清学的進展をモニターできるようにする。
【００１６】
より正確には、本発明は、生物学的試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染のインビトロ検出方法であって、ＨＣＶキャプシドタンパク質および前記キャプシドタンパク質に対する抗体を同時に検出することを特徴とし、抗キャプシド抗体を捕捉するために、短縮されたＨＣＶキャプシドに由来する抗原フラグメントを含むペプチドを用いる方法を提供する。
【００１７】
よって、本発明の１つの対象は、生物学的試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染のインビトロ検出方法であって、生物学的試料中に存在するＨＣＶキャプシドタンパク質および前記キャプシドタンパク質に対する抗体の同時検出を特徴とし、ａ）前記生物学的試料を、前記キャプシドタンパク質に対する捕捉抗体および前記試料中に存在する抗キャプシドタンパク質抗体を捕捉できる捕捉抗原と接触させ；ｂ）前記混合物を、抗原抗体複合体の形成を可能にする条件でインキュベートし；ｃ）形成された抗原抗体複合体を検出することを特徴とし（捕捉されたキャプシドタンパク質に結合することができる標識された検出抗体を適宜用いてもよく、および／または捕捉されたキャプシドに対する抗体に結合することができる標識された検出抗原を適宜用いてもよい）；前記捕捉抗原は、アミノ酸１からアミノ酸４４のＨＣＶキャプシドに由来する抗原フラグメントを含み、またはからなるペプチドであり、前記抗原フラグメントは、ｉ）ＨＣＶキャプシドタンパク質のアミノ酸６から３７であって、３３〜３６位における少なくとも１つのアミノ酸、好ましくは、３４位におけるアミノ酸の少なくとも１つの点変異を有するもの、またはｉｉ）これらの相同配列を含み、またはからなることを特徴とする方法である。
【００１８】
本発明の別の対象は、抗原フラグメントを含むペプチドである。
【００１９】
本発明の別の対象は、抗ＨＣＶキャプシド抗体の捕捉抗原として前記ペプチドを含む、生物学的試料中のＨＣＶウイルスによる感染を検出するために用いられるキットである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明：
定義
本明細書では、用語「Ｃ型肝炎ウイルス」または「ＨＣＶ」は、Ｃ型肝炎に関するウイルスの全ての株、全てのタイプ、サブタイプおよび遺伝子型を包含する。本発明の方法は、実際に、その起源およびその遺伝子型に関わらず、いずれのＨＣＶ感染をも検出することを目的とする。これには、特に、ヨーロッパ、米国、日本などに蔓延しているウイルスの周知のタイプおよびサブタイプ（すなわち、６種類の主要な遺伝子型：１、２、３、４、５、６およびそれらのサブタイプ１ａ、１ｂ、３ａなど）が含まれる。Ｓｔｕｙｖｅｒら（１９９４）；Ｂｕｋｈ（１９９５）。ＨＣＶキャプシドタンパク質は、配列番号：１：
１ mstnpkpqrk tkrntnrrpq dvkfpgggqi vggvyllprr gprlgvratr ktsersqpr
６１ rrqpipkarq pegrawaqpg ypwplygneg mgwagwllsp rgsrpswgps dprrrsrnlg
１２１ kvidtltcgf adlmgyiplv gaplggaara lahgvrvled gvnyatgnlp gcsfsiflla
１８１ llscltipas a
の１９１個のアミノ酸のタンパク質である。
【００２１】
特に断りがない限り、前記アミノ酸は、遺伝子型１（サブタイプ１ａ、１ｂ、１ｃ）の共通配列である配列番号：１に関するキャプシドタンパク質に位置する。
【００２２】
キャプシドタンパク質の数種類のエピトープが同定されてきた。とりわけ、アミノ酸１６およびアミノ酸４０の間に位置するエピトープが公知である。
【００２３】
用語「多くてもアミノ酸１〜アミノ酸４４」は、多くても４４個のアミノ酸であるペプチドが、配列番号：１のアミノ酸４４を超えて伸長しないが、配列６−３７（配列番号：１を基準とする）を含有することを条件として、適宜短くなってもよいことを意味する。
【００２４】
本発明との関連において、「生物学的試料」は、好ましくは、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液などの生物学的液体からなる。
【００２５】
用語「抗体」は、抗体を少なくとも１つの抗原化合物の抗原決定因子に結合することを可能にする少なくとも１つの抗原認識部位を含むか、またはからなる全体の抗体または抗体の機能フラグメントのいずれかを意味する。抗体フラグメントの例として、出願人は、フラグメントＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２ならびに鎖ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）、ｄｓＦｖ（二本鎖可変断片）などを挙げうる。これらの機能フラグメントは、特に、遺伝学的技術によって取得することができる。
【００２６】
本発明に関して有用であるモノクローナル抗体または単一特異性ポリクローナル血清の産生は、従来技術に基づくものであり、その詳細は下記に記載される。
【００２７】
「捕捉抗体」は、好ましくは、親和性結合（affine binding）により、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗原を保持することができる、好ましくは、固相に固定された、抗体または抗体の一部を意味する。
【００２８】
生物学的試料中の抗体および抗原の存在は、特異的なマーカーによって明らかにされる。抗原の検出に関して、本発明は、特に、少なくとも１つの「検出抗体」による検出を想定する。前記の標識された「検出抗体」は、親和性結合によって、捕捉抗体によって認識されるエピトープとは異なるエピトープ部位を認識する捕捉抗原に結合することができる。抗体の検出に関して、標識された抗免疫グロブリン、または抗アイソタイプ抗体、例えば、間接ＥＬＩＳＡにおける抗免疫グロブリンＧまたはサンドウィッチ型における標識された抗原は、特に用いることができる。
【００２９】
捕捉抗体および／または検出抗体は、ＨＣＶキャプシドタンパク質の部分３３−３６の天然エピトープを認識する。
【００３０】
用語「標識された」は、直接標識（酵素、放射性同位元素、蛍光色素、発光化合物などによる）および間接標識（例えば、直接または標識された「親和性ペア」の試薬（以下に限定されないが、標識されたアビジン−ビオチンペア）により標識された抗体自体などによる）の両方を意味する。
【００３１】
「捕捉抗原」は、抗ＨＣＶ抗体によって認識することができ、抗ＨＣＶ抗体との親和性結合を可能にする、好ましくは、固相上に固定された単離された抗原フラグメントを意味する。
【００３２】
「検出抗原」は、標識された抗原を意味する。競合により捕捉された抗原を検出し、または従来の抗原−抗体−抗原サンドウィッチ技術（「二重抗原サンドウィッチ」方法（Ｍａｉｏｌｉｎｉら（１９７８））とも呼ばれる）により抗体を検出することを可能にする。
【００３３】
用語「特異性」または「特異的」は、抗体の抗原に対する認識または特異的結合を示す場合、またはエピトープとの「特異的な」認識について記載する場合、このエピトープの擬排他的（quasi-exclusive）な認識により、他の抗原と実質的に相互作用することなく抗原と相互作用することを意味する。１０８Ｌ．ｍｏｌ−１以上の解離定数が好ましい。
【００３４】
用語「ホモログ」は、多くても４４アミノ酸のＨＣＶキャプシドに由来する抗原フラグメントを含むペプチドを意味する。この抗原フラグメントには、１つまたはそれ以上のアミノ酸の保存的置換、あるいはＮ末端（アミノ酸１〜５）および／またはＣ末端（アミノ酸３８〜４４）における１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失による、ＨＣＶキャプシドタンパク質の多くてもアミノ酸１から４４の範囲にある配列とは異なる配列が含まれる。
【００３５】
捕捉および検出抗体および抗原
本発明で用いられる抗体は、抗原の特異的な抗体であり、このため、モノクローナル抗体または単一特異性ポリクローナル抗体であり、すなわち、１つのエピトープのみを特異的に認識するものである。
【００３６】
本発明の方法は、より具体的には、抗キャプシド抗体の検出に関するものであり、生物学的試料中に存在する抗キャプシド抗体を固定する捕捉抗原を用いるものである。
【００３７】
抗キャプシド抗体を捕捉するためとされるペプチドには、多くてもアミノ酸１から４４の範囲であるＨＣＶキャプシドに由来する抗原フラグメントが含まれ、前記抗原フラグメントには、ＨＣＶキャプシドタンパク質のアミノ酸６から３７の配列またはこの相同配列が含まれる。よって、本発明による捕捉抗原は、（通常、ＨＣＶキャプシドタンパク質に存在する）アミノ酸４５から１９１を欠失していることが理解される。ある実施態様によれば、本発明による捕捉抗原として有用なペプチドのアミノ酸配列は、３２から４４個のアミノ酸を含み、またはからなり、例えば、４４個のアミノ酸の配列からなる。
【００３８】
前記ペプチドは、配列３３−３６における少なくとも１つのアミノ酸、好ましくは、３４位におけるアミノ酸の少なくとも１つの点変異を有する。これは、非保存的アミノ酸のいずれかで置換されうる。アミノ酸３４については、好ましくは、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニンまたはアラニン残基とは異なるアミノ酸が用いられる。好ましくは、非荷電アミノ酸が選択される。好ましくは、３４位におけるアミノ酸バリンがグリシンに置換される。
【００３９】
捕捉抗原ペプチドの変異により、試料中の固定された抗原−抗キャプシド抗体反応と、試料中の固定された抗体−キャプシド抗原反応との間で干渉し合うことはない。
【００４０】
好ましい実施態様によれば、固相上に固定化された捕捉抗体は、キャプシドタンパク質の天然エピトープ３３−３６に対する抗体であり、一方で、直接または間接的に標識されたｃ１）における検出抗体は、前記ＨＣＶキャプシドタンパク質の部分３３〜３６、より一般的には、６〜３７に存在する天然エピトープとは異なるエピトープに対するものである。例えば、これは、前記キャプシドのエピトープ４４−４７に対する抗体でありうる。
【００４１】
別の好ましい実施態様によれば、固相上に固定された捕捉抗体は、前記ＨＣＶキャプシドタンパク質の３３から３６位、より一般的には、６〜３７位に存在する天然エピトープとは異なるエピトープに対する抗体であり−例えば、これは、キャプシドのエピトープ４４−４７に対する抗体であり得、直接または間接的に標識されたｃ１）における検出抗体は、キャプシドタンパク質の天然エピトープ３３−３６に対する抗体である。
【００４２】
ある実施態様によれば、捕捉抗原は、ＨＣＶキャプシドタンパク質の配列１〜４４からなり、３４位におけるアミノ酸の点変異、好ましくはグリシンへの置換を有するペプチドである。
【００４３】
よって、好ましい例は、配列番号：２：
１MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGG３４YLLPRRGPRL
のペプチドである。
【００４４】
上記に定義される配列からなるが、さらにＮ末端またはＣ末端側の１〜５個のアミノ酸が短縮された相同ペプチドもまた用いることができる。よって、配列３３−３６における少なくとも１つのアミノ酸、好ましくは３４位におけるアミノ酸の点変異を有するペプチド６−３７を用いることができる。好ましくは、これは、配列番号：３：
６KPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGG３４YLL３７
のペプチドである。
【００４５】
上記ペプチドとは保存的置換による相違のみのペプチドもまた、本発明に含まれる。
【００４６】
用語「保存的置換」は、ペプチドの一般構造または抗原性を変えることなく、あるアミノ酸残基を別のものに置換することを表す。保存的置換には、以下に限定されないが、同様の特性を有するアミノ酸との置換（例えば、形態、極性、水素結合能、酸性度、塩基性度、疎水性など）が含まれる。同様の特性を有するアミノ酸は、当業者に周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンは、塩基性の親水性アミノ酸であり、相互に交換可能であり得る。同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニンまたはバリンで置換することができる。互いに置換することができる天然の親水性アミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリンおよびスレオニンが含まれる。「置換された」および「修飾された」は、本発明によれば、自然界で見出されるアミノ酸と比較して変更されているか、または修飾されているアミノ酸を意味する。
【００４７】
よって、本発明に関連して、保存的置換は、あるアミノ酸の同様の特性を有する別のアミノ酸への置換である。保存的置換の例は、下記の表１に記載される：
表１．保存的置換Ｉ
【表１】
0006312600.tif 000002
【００４８】
Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（１９７５）によれば、保存的アミノ酸はまた、下記の表２に示されるようにグループ化されうる：
表２．保存的置換ＩＩ
【表２】
0006312600.tif 000003
【００４９】
さらに別の代わりの保存的置換は、下記の表３に示される：
表３．保存的置換ＩＩＩ
【表３】
0006312600.tif 000004
【００５０】
本発明によるペプチドは、ペプチド合成の全ての従来技術によって、すなわち、特に、化学的合成または遺伝学的組み換えによって調製することができる。好ましい態様において、ペプチドは、化学的合成によって取得される。より好ましくは、ペプチドは、縮合中にペプチド結合に挿入されるアミンおよびカルボキシル基を除いて、予め、アミノ酸残基によって行われた全ての反応性官能基を保護することに留意しながら、特に、純度、抗原特異性の理由、望ましくない副作用の非存在およびその実施容易性に利点のある固相合成のメリフィールズの技術により、必要な順序でのアミノ酸残基の連続的な縮合によって、あるいは適当な順序で過去に形成され、数個のアミノ酸をすでに含有するフラグメントにおける残基の縮合によって、あるいは過去に調製した数個のフラグメントの縮合によって取得される（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）；Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ（１９７１）；Ａｔｈｅｒｔｏｎら（１９８９））。自動合成機として、ミリポア製の「９０５０  Ｐｌｕｓ  Ｐｅｐ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ」、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ製の「Ｐｉｏｎｅｅｒ」合成機、ＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）製の「４３３Ａ」合成機またはＲａｉｎｉｎ製の「Ｓｙｍｐｈｏｎｙ」合成機を用いることができる。ペプチドはまた、均一相合成によって取得することができる。
【００５１】
抗キャプシド抗体を捕捉するものとされる抗原ペプチドは、そのＮ末端側でスペーサーにより伸長することができる。
【００５２】
本発明はまた、Ｎ末端側でスペーサーに共有結合した抗原ペプチドを含む、前記抱合されたペプチドに関する。
【００５３】
「スペーサー」は、好ましくは、官能性を有する、すなわち、例えば、チオール、ヒドラジド、アルデヒド基またはビオチンを有する、好ましくは、ペプチド、好ましくは、１〜８個のアミノ酸である分子を意味する。一般的に、ω−アミノ酸などの非天然アミノ酸を含むことができる１〜８個のアミノ酸のペプチドである。好ましくは、前記スペーサーには、少なくとも１つのシステイン残基が含まれる。好ましい実施態様によれば、スペーサーは、Ｃ−Ｈｘ（式中、Ｃは、システインであり、Ｈｘは、６−アミノヘキサン酸である）である。別の実施態様によれば、スペーサーは、配列ＣＧＧのペプチドである。
【００５４】
捕捉ペプチドは、それ自体で共有結合することができるか、またはスペーサーを介して運搬分子にカップリングすることができる。よって、スペーサーは、固体表面上、タンパク質または可溶性官能性ポリマー上での抗原ペプチドの結合を最適化することを可能にし、および／または数種類の抗原分子を抱合することを可能にする。好ましくは、運搬分子は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはオバルブミンなどのタンパク質である。別の実施態様によれば、ペプチドは、アミノデキストランにスペーサーを介して結合している。
【００５５】
よって、一定の実施態様によれば、前記ペプチド抱合体には、同一または異なっていてもよい数種類の抗原ペプチドに共有結合したスペーサーが含まれる。よって、好ましくは、ホモダイマーが形成される。
【００５６】
特に好ましくは、抗キャプシド抗体の捕捉抗原は、上記に定義される１つの抗原ペプチドのみである（例えば、配列番号：２のペプチド）。
【００５７】
しかしながら、一定の実施態様において、上記に定義される本発明による捕捉抗原（例えば、配列番号：２のペプチド）は、別の捕捉抗原（好ましくは、本発明による捕捉抗原と同一の固相上に存在する）と組み合わせて用いることができ、この別の捕捉抗原のアミノ酸配列は、アミノ酸４５または４６からアミノ酸６０〜８０、好ましくは、６５〜７５または６８〜７５（配列番号：１を参照）のうちの１つの範囲内であるＨＣＶキャプシドタンパク質のフラグメントを含み、またはからなる。より具体的な実施態様において、さらなる捕捉抗原は、配列４５−６５、４５−６６、４５−６７、４５−６８、４５−６９、４５−７０、４５−７１、４５−７２、４５−７３、４５−７４もしくは４５−７５、または配列４６−６５、４６−６６、４６−６７、４６−６８、４６−６９、４６−７０、４６−７１、４６−７２、４６−７３、４６−７４もしくは４６−７５からなる。例として、ペプチド４５−６５、ペプチド４５−６８、あるいは、より好ましくは、ペプチド４５−７５でありうる。
【００５８】
さらに、抗キャプシド抗体の検出は、別のＨＣＶタンパク質に対する抗体の検出と組み合わせることができる。様々な捕捉または検出抗原は、一緒に組み合わせることができる。数種類の異なる捕捉および／または検出抗原を用いるこの実施態様は、抗キャプシド抗体および抗非構造タンパク質抗体、例えば、ＨＣＶのＮＳ３および／またはＮＳ４またはＮＳ５の同時検出を可能にする。抗キャプシド抗体および抗ＮＳ３抗体の同時検出が特に好ましい。本発明はまた、ＨＣＶ抗体のキャプシド抗原、抗キャプシド抗体、抗外被構造タンパク質Ｅ１および／またはＥ２抗体、外被Ｅ１および／またはＥ２抗原、ならびに／あるいは抗非構造タンパク質ＮＳ３および／またはＮＳ４またはＮＳ５の同時検出を含む。他の考え得る組み合わせもまた、本発明の一部を構成する。
【００５９】
検出方法
本発明の方法は、生物学的試料中に存在するＨＣＶキャプシドタンパク質および前記キャプシドタンパク質に対する抗体の同時検出を特徴とし、前記方法は、ａ）前記生物学的試料を、前記キャプシドタンパク質に対する捕捉抗体、および前記試料中に存在する抗キャプシドタンパク質抗体を捕捉することができる捕捉抗原と接触させ；ｂ）前記混合物を、抗原抗体複合体の形成を可能にする条件でインキュベートし；ｃ）適宜、捕捉されたキャプシドタンパク質に結合することができる標識された検出抗体を用いて、および／または適宜、捕捉されたキャプシドに対する抗体に結合することができる標識された検出抗原を用いて、形成された抗原抗体複合体を検出することを特徴とする。
【００６０】
一般に、特に断りがなければ、捕捉抗原は、上記に記載されるように、多くてもアミノ酸１〜アミノ酸４４のＨＣＶキャプシドに由来する抗原フラグメントおよび前記フラグメントを含む抱合されたペプチドの両方を意味する。
【００６１】
生物学的試料は、予備段階で適宜処理することができ、あるいは検出されるべき抗原の露出を促進する条件で捕捉抗原および捕捉抗体と接触させることができる。
【００６２】
有利なことに、試料は、検出前、好ましくは、用いられる抗体と接触させる前に変性剤で処理される。この変性剤は、特に、例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ４０）（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ６３０とも呼ばれるｔｅｒｔ−オクチルフェノキシポリ（オキシエチレン）エタノール）、ｎ−オクチルベータ−Ｄ−グルコピラノシドまたは酸性溶液などの非イオン型のうちの１つまたはそれ以上の界面活性剤からなりうる。
【００６３】
この組み合わせ免疫アッセイは、当業者に周知である様々な形：非限定的な例として、固相中でまたは均一相中で；１回または２回；二重サンドウィッチ法（抗原および抗体の両方の検出のためのサンドウィッチ）；あるいは（抗原検出のための）サンドウィッチ方法と組み合わせた（抗体検出のための）間接方法で実施することができる。
【００６４】
好ましい実施態様によれば、捕捉抗体および捕捉抗原は、固相上に固定される。固相の非限定的な例として、デンマークのＮｕｎｃ社から販売されているマイクロプレートなどのマイクロプレート、特に、ポリスチレンマイクロプレートを用いることができる。固体粒子またはビーズ、ＤｙｎａｌまたはＭｅｒｃｋ−Ｅｕｒｏｌａｂ（仏国）から供給される常磁性ビーズ（商品名Ｅｓｔａｐｏｒ）などの常磁性ビーズ、またはポリスチレンまたはポリプロピレンの試験管、あるいはニトロセルロースメンブレンなども用いることができる。
【００６５】
（捕捉および検出のための）２つの抗体間のサンドウィッチ型の免疫アッセイ形式は、生物学的試料中に存在する抗原を検出するのに特に有利である一方、抗体は、捕捉抗原および（一般に「間接型」と呼ばれる形式により）抗体（例えば、標識されたタンパク質Ａまたは標識された抗免疫グロブリン、あるいは抗アイソタイプ抗体）上に固定される標識された抱合体を用いて検出することができる。（「抗原−抗体−抗原サンドウィッチ」または「二重抗原サンドウィッチ）と表記される形式によれば）抗体上に固定されている捕捉抗原および標識された抗原を有利に用いることによって抗体を検出することもできる。
【００６６】
競合による抗原の検出のための免疫アッセイ形式もまた可能である。免疫アッセイの他のタイプはまた、予想され得、当業者に周知である。
【００６７】
本発明によるＨＣＶ抗原および抗ＨＣＶ抗体の同時検出は、捕捉抗体および捕捉抗原と同時に、特に、検出抗体などの検出手段で生物学的試料を同時に接触させることによって一度に実施することができる。この場合、抗原を検出するための免疫アッセイおよび抗体を検出するための免疫アッセイの両方は、好ましくは、サンドウィッチで行われる。あるいは、特に、検出抗体などの検出手段は、すなわち、最初の抗原抗体複合体が形成された後に混合物に次いで加えることができる。これは、二段階（two-step）アッセイと呼ばれる。
【００６８】
本発明の好ましい実施態様によれば、生物学的試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染の検出方法は、ａ）前記試料を、固相上に固定されたＨＣＶキャプシドタンパク質の捕捉抗体および抗ＨＣＶキャプシド抗体の捕捉抗原と接触させ；ｂ）前記混合物を、抗原抗体複合体の形成を可能にする条件でインキュベートし；ｃ）固相および液相を分離し；ｄ）前記固相を、捕捉されたＨＣＶ抗原に結合することができる標識された検出抗体、および捕捉された抗ＨＣＶ抗体に結合することができる１つまたはそれ以上の標識された抗免疫グロブリンまたは抗アイソタイプ抗体と接触させることを特徴とする。
【００６９】
ＥＬＩＳＡアッセイ、放射免疫アッセイまたはいずれか他の検出技術は、形成された抗原抗体複合体の存在を明らかにするために用いることができる。
【００７０】
生物学的試料中の抗原または抗体の存在の検出は、当業者に周知の標準技術により、マーカーによって放出されるシグナル（色、発光、放射活性など）の測定によって定量化で補完することができる。
【００７１】
キット
本発明の方法による生物学的試料中のＨＣＶ感染の検出に有用であるキットおよび試薬は、多くの生物学的試料に適用可能な本発明の簡便な実際の適用を提供しうる。
【００７２】
よって、本発明は、生物学的試料中のＨＣＶウイルスによる感染を検出するために用いることができるキットであって、抗ＨＣＶキャプシド抗体を捕捉することができる抗原ペプチドを含むキットを提供する。キットは、生物学的試料中に存在し、前記捕捉抗原と複合体を形成する前記抗ＨＣＶ抗体を検出するための手段であって、好ましくは、標識された抗免疫グロブリンまたは抗アイソタイプ抗体であるものをさらに含みうる。
【００７３】
有利なことに、前記キットは、数種類の抗原および数種類の捕捉抗体を含有することができる。
【００７４】
前記キットは、ＮＳ３および／またはＮＳ４、および／またはＮＳ５などのウイルスの他のタンパク質の抗原をさらに含むことができ、これらの抗原は、抗ＮＳ３および／または抗ＮＳ４、および／またはＮＳ５抗体を捕捉するものとされる。好ましくは、これらの抗原は、キャプシドに由来する捕捉抗原と混合される。
【００７５】
上記に記載されるように、捕捉抗体および捕捉抗原は、マイクロプレートなどの固相上で固定された形で有利に提示することができる。
【００７６】
好ましいキットには、
ａ１）多くてもアミノ酸１〜アミノ酸４４のＨＣＶキャプシドに由来する抗原フラグメントを含むか、またはからなるペプチドである捕捉抗原（前記抗原フラグメントは、ｉ）３４位におけるアミノ酸の少なくとも１つの点変異を有するＨＣＶキャプシドタンパク質のアミノ酸６〜３７の配列、またはｉｉ）これらの相同配列を含み、またはからなる）；
ａ２）好ましくは、タンパク質ＮＳ３、ＮＳ４、および／またはＮＳ５のいずれかまたは全てを含む抗非構造タンパク質抗体の捕捉抗原、
ｂ）ＨＣＶキャプシドタンパク質に対する捕捉抗体（前記捕捉抗原および前記捕捉抗体は、固相上に固定されている）；ならびに
ｃ１）標識された検出抗体、
ｃ２）多くてもアミノ酸１からアミノ酸４４のＨＣＶキャプシドに由来する抗原フラグメントを含み、またはからなるペプチドである抗原フラグメントを含み、またはである抗免疫グロブリン抗体が含まれ、あるいは、適宜、標識された検出抗原が含まれていてもよい（前記抗原フラグメントは、ｉ）３３〜３６位における少なくとも１つのアミノ酸の点変異を有するＨＣＶキャプシドタンパク質のアミノ酸６〜３７の配列またはｉｉ）前記配列の相同配列を含み、またはからなる）。
【００７７】
捕捉抗体および／または検出抗体は、ＨＣＶキャプシドタンパク質の部分３３−３６の天然エピトープを認識する。
【００７８】
好ましい実施態様によれば、固相上に固定された捕捉抗体は、キャプシドタンパク質の天然エピトープ３３−３６に対する抗体であり、一方、直接または間接的に標識されたｃ１）における検出抗体は、前記ＨＣＶキャプシドタンパク質の部分３３〜３６、より一般的には、６〜３７に存在する天然エピトープとは異なるエピトープである。例えば、これは、キャプシドのエピトープ４４−４７に対する抗体でありうる。
【００７９】
別の好ましい実施態様によれば、固相上に固定された捕捉抗体は、前記ＨＣＶキャプシドタンパク質の部分３３〜３６、より一般的には、６〜３７に存在する天然エピトープとは異なるエピトープに対する抗体である−例えば、これは、キャプシドのエピトープ４４−４７に対する抗体であり得、一方、直接または間接的に標識されたｃ１）における検出抗体は、キャプシドタンパク質の天然エピトープ３３−３６に対する抗体である。
【００８０】
キットは、界面活性剤、より具体的には、当業者に公知である非イオン性界面活性剤をさらに含むことができる。
【００８１】
下記の実施例は、本発明をその範囲を限定することなく例示するものである。
【実施例】
【００８２】
実施例：Ｃ型肝炎ウイルスによる感染の検出
アッセイプロトコールの材料：
１）選択した固相：Ｎｕｎｃ（デンマーク）のＭａｘｉｓｏｒｐマイクロプレート。
２）抗キャプシドモノクローナル抗体−ビオチン抱合体（「ａｃｍ−ＰＯＤ」）：ペルオキシダーゼで標識した抗キャプシドモノクローナル抗体の抱合体、Ａｃｍ２は、特許出願ＥＰ０７５２１０２に記載のプロトコールに従って調製する。別の抗キャプシドモノクローナル抗体であるＡｃｍ１もまた用いる。
３）マウス抗ＩｇＧ（Ｆｃ）ヒトポリクローナル抗体−ＰＯＤ抱合体：この抱合体は、米国のＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｅｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから取得する（間接ＥＬＩＳＡ型）。ビオチン標識キャプシドペプチド抱合体（サンドウィッチ型）。
４）本発明によるプロトコールの第１および第２ステップのための希釈剤：
第１ステップのための希釈剤：０．２５％でＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ  ６３０（Ｓｉｇｍａ）を加えたｐＨ６．７のＴｒｉｓ緩衝液、ＮａＣｌ  ０．０５Ｍ。
第２ステップのための希釈剤：２０％のグリセロール中のｐＨ６．７のクエン酸緩衝液（５０ｍＭ）。
５）発色溶液：発色溶液は、
５ａ）基質緩衝液：０．０１５％でＨ２Ｏ２および４％でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ＰＲＯＬＡＢＯ）を含有するｐＨ４．０のクエン酸（０．０７５Ｍ）および酢酸ナトリウム（０．１Ｍ）の溶液、および
５ｂ）色素原：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（８ｍＭ）を含有する溶液（Ｓｉｇｍａ）
からなった。
【００８３】
方法：
試料（血清または血漿）中のＣ型肝炎ウイルスのキャプシド抗原および抗体（抗キャプシドおよび抗ＮＳ３、ＮＳ４）の同時検出のためのプロトコール
【００８４】
このアッセイの原理は、抗原を検出するためのサンドウィッチ型および抗体を検出するための間接型の免疫酵素法に基づくものである。
【００８５】
これは以下のステップに基づく：
感作溶液を最初に：
緩衝液Ｔｒｉｓ０．５Ｍ、ｐＨ７．４中で
・ＨＣＶ抗原の混合物：配列番号：２を含む変異の入ったペプチドＣＨｘ−１−４４（Ｇ３４）（キャプシド）、ならびに非構造領域ＮＳ３（ＡＡ１１９２−１６５７）およびＮＳ４（ＡＡ１６９４−１７３５）から選択されるクローンから大腸菌によって産生された２種類の組み換えタンパク質、ならびに
・抗キャプシドモノクローナル抗体（Ａｃｍ１）
を用いて調製する。
【００８６】
次いで、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，Ｍａｘｉｓｏｒｐ）のウェルを１ウェルあたり１１０μｌの割合で上記溶液を用いて感作する。
【００８７】
マイクロタイタープレートを室温（１８−２４℃）で終夜インキュベートする。
【００８８】
感作溶液を取り除き、該プレートを、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含有するリン酸緩衝液（０．０１Ｍ，ｐＨ７．４）で洗浄し、続いて５％のショ糖、２５％のスキムミルク（仏国のＣａｎｄｉａ（登録商標）またはいずれか他の同等な市販されているスキムミルク）および１０ｍＭのＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝液（０．０１Ｍ，ｐＨ７）を加えて飽和する。
ペルオキシダーゼで標識した抗キャプシドモノクローナル抗体Ａｃｍ２を含有する１００μｌの第１ステップのための希釈剤、続いて５０μｌの前記試料（血清または血漿）を各ウェルに連続して分配する。
【００８９】
反応混合液を３７℃で１．５時間インキュベートする。存在しうるＨＣＶキャプシド抗原は、固相モノクローナル抗体Ａｃｍ１に結合し、ペルオキシダーゼで標識した抗キャプシドモノクローナル抗体Ａｃｍ２と複合体を形成する。さらに、抗ＨＣＶ抗体が存在する場合、それらは、固相上に固定された抗原に結合する。
【００９０】
次いで、前記プレートを洗浄溶液（０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０を加えた緩衝液Ｔｒｉｓ  ＮａＣｌ  ０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）で洗浄する（３回）。
【００９１】
ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体またはビオチン標識キャプシドペプチドを含有する１００μｌの第２ステップのための希釈剤を各ウェルに分配する。反応混合液を室温（１８−２４℃）で３０分間インキュベートする。標識抗ヒトＩｇＧ抗体またはビオチン標識キャプシドペプチドは、順番に固相上に残っている特異的な抗体に固定される。
【００９２】
次いで、プレートを洗浄溶液（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％で加えた緩衝液Ｔｒｉｓ  ＮａＣｌ  ０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）で洗浄する（５回）。これにより結合していない抗ヒトＩｇＧ抱合体が取り除かれる。
【００９３】
１００μｌの発色溶液（基質バッファー＋色素原）を各ウェルに分配する。反応は、暗室にて室温（１８〜２４℃）で３０分間行う。
【００９４】
次いで、１００μｌの停止溶液（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を各ウェルに分配する。
【００９５】
反応を止め、光学濃度を４５０／６２０ｎｍにて分光光度計で読み取る。
【００９６】
閾値の定義：
閾値は、ＲＯＣ（受信者動作特性）曲線（ＢｅｒｃｋおよびＳｃｈｕｌｔｚ（１９８６））を用いて、特異性および感度についてのデータの統計学的解析後に決定した。
【００９７】
特異性試験は、健常な対象からの５０００個の試料に基づき、感度試験は、市販のパネル：ＢＢＩ（米国のＢｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｉｍｐａｔｈ（米国）、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ（米国）、Ｎａｂｉ（米国）、ＰｒｏＭｅｄＤｘ（米国））からのＨＣＶ陽性試料（特に、セロコンバージョンの開始）に基づく。
【００９８】
閾値は、実験に特異的な一定係数Ｘで割ることによって、陽性コントールについて得たシグナルから各プレートについて算出する。間接法で示される実施例では、約０．４５ユニットのＯＤ（光学濃度）である。
【実施例１】
【００９９】
実施例１：ＨＣＶ抗原について陰性である試料（血清または血漿）における抗キャプシド抗体の検出
市販品として入手可能なセロコンバージョン試料の３つのパネルＰＨＶ９０５、９０７および９１４（すなわち、ＨＣＶ感染後またはセロコンバージョン中の２人の患者から取得した血清または血漿の２種類の連続試料）（Ｓｅｒａｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／ＢＢＩ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，米国）を、サンドウィッチプロトコールに従って試験した。次いで、キャプシドペプチド１−４４Ｇ３４（配列番号：２）をビオチンで標識し、該複合体をストレプトアビジン−ペルオキシダーゼで視覚化した。よって、単一の抗キャプシド検出である。
【０１００】
これらの試料は、３個の陰性試料と６個の標準偏差の平均値から算出した閾値で陽性であることが見出された（ＯＤ：０．０７７）。
表１：
【表４】
0006312600.tif 000005
【０１０１】
よって、本発明は、ＨＣＶに感染した対象において、抗キャプシド抗体について陽性である試料を検出することができる。
【０１０２】
実施例２：抗体および／または抗原に対して陽性であるセロコンバージョン血清における様々な技術の性能および分類の比較
異なる特異性を有する９個の商業的に利用可能なセロコンバージョンパネル（米国のＳｅｒａｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／ＢＢＩ；米国のＩｍｐａｔｈ）は、指示プロトコールによる本発明に従うアッセイを用いて試験し、その結果を一連の商業的に利用可能な試験で比較した。この比較は、ＲＮＡ検出（ＰＣＲアッセイ）と比較した検出における遅延日数を説明する。よって、最小の合計を示すキットは、早期検出について最高の効能を付与するものである。これらのパネルは、ＨＣＶウイルスのＮＳ３タンパク質およびキャプシドに対する抗原および／または抗体に陽性であることが見出される（Ｏｒｔｈｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社によって市販されるＲＩＢＡ試験によって行われる特徴付け）。
表２：
【表５】
0006312600.tif 000006
【０１０３】
本発明は、抗体アッセイより迅速に抗体および抗原に陽性な試料を検出することを可能にする。
【０１０４】
参考文献
- Atherton et al. (1989) "Solid phase peptide synthesis, a practical approach", IRL Press,, Oxford University Press, pp. 25-34
- Bukh, Semin. Liver Dis. (1995) 15: 41-63;
- Maiolini et al., (1978) Journal of Immunological Methods, 20, pp. 25-34
- Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc,, 85, pp. 2149-2154
- Sheppard, in "Peptides 1971", Nesvadba H (ed.) North Holland, Amsterdam, p. 111
- Stuyver et al. (1994), P. N. A. S. USA, 91, pp. 10134-10138
【配列表】
0006312600000001.app