(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
原料としてスイゼンジノリ多糖体およびコラーゲンが用いられてなる複合体であって、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが化学結合によって結合されていることを特徴とするスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体。
【請求項２】
請求項１に記載のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体からなる細胞培養シート。
【請求項３】
スイゼンジノリ多糖体水溶液とコラーゲン水溶液とを混合し、得られた混合溶液を０〜４０℃の温度で乾燥させることを特徴とする請求項１に記載のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の製造方法。
【請求項４】
前記混合溶液が無機塩を含有する請求項３に記載のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体に関する。さらに詳しくは、本発明は、例えば、細胞培養シートをはじめ、手術の際の臓器などが癒着することを防止するための臓器癒着防止膜、創傷治療用絆創膏、創傷被覆膜、冷却用シート、臓器保存用クッションシート、体液吸い取りシートなどの用途に使用することが期待されるスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
水性ゲルは、水膨潤性を有し、柔軟であることから、生体関連材料として注目されている。水性ゲルのなかでも体液を吸収しながら膨潤する性質を有する水性ゲルは、手術痕癒着防止膜、創傷を被覆するための膜として使用することが検討されている。
【０００３】
接着性および生体適合性に優れ、多量の水溶液を吸収する親水性ゲルのシートとして、線状水溶性ポリエチレンオキシドからなる液体フィルムに高エネルギー線を照射することによって得られる親水性ゲルのシートが提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
しかし、前記親水性ゲルのシートは、引張強度が低いため、例えば、創傷被覆膜などの用途に適しているとはいえない。
【０００５】
前記親水性ゲルのシートの欠点を解消し、引張強度に優れたゲルシートとして、ポリエチレンオキシドおよびポリビニルアルコールを含有する水溶液に電離性放射線を照射することによって得られる医用材料用ゲルシートが提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭６３−２９６４９号公報
【特許文献２】特開２０００−２１０３７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、近年、細胞を培養させる際の培地として使用したときに細胞に対する接着性に優れ、細胞が伸展しやすい水膨潤性材料の開発が望まれている。
【０００８】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、細胞を培養させる際の培地として使用したときに細胞に対する接着性に優れ、細胞が伸展しやすく、細胞培養シートをはじめ、例えば、手術の際の臓器などが癒着することを防止するための臓器癒着防止膜、創傷治療用絆創膏、創傷被覆膜、冷却用シート、臓器保存用クッションシート、体液吸い取りシートなどの用途に使用することが期待されるスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体およびその製造方法ならびに当該スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体からなる細胞培養シートを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、
（１）  原料としてスイゼンジノリ多糖体およびコラーゲンが用いられてなる複合体であって、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが化学結合によって結合されていることを特徴とするスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体、
（２）  前記（１）に記載のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体からなる細胞培養シート、
（３）  スイゼンジノリ多糖体水溶液とコラーゲン水溶液とを混合し、得られた混合溶液を０〜４０℃の温度で乾燥させることを特徴とする前記（１）に記載のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の製造方法、および
（４）  前記混合溶液が無機塩を含有する前記（３）に記載のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の製造方法
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、細胞を培養させる際の培地として使用したときに細胞に対する接着性に優れ、細胞が伸展しやすく、細胞培養シートをはじめ、例えば、手術の際の臓器などが癒着することを防止するための臓器癒着防止膜、創傷治療用絆創膏、創傷被覆膜、冷却用シート、臓器保存用クッションシート、体液吸い取りシートなどの用途に使用することが期待されるスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体およびその製造方法ならびに当該スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体からなる細胞培養シートが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実験例１において、実施例２で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体、実施例３で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体、比較例１で用いられたスイゼンジノリ多糖体、比較例２で用いられたアテロコラーゲン、および比較例３で用いられたネイティブコラーゲンの各赤外吸収（ＩＲ）スペクトルの赤外吸収スペクトルを示すグラフである。
【図２】実験例２において、実施例３で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体、実施例５で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体および比較例２で用いられたアテロコラーゲンの各赤外吸収（ＩＲ）スペクトルを示すグラフである。
【図３】実験例３において、実施例２で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体、実施例４で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体および比較例３で用いられたネイティブコラーゲンの各赤外吸収（ＩＲ）スペクトルを示すグラフである。
【図４】実験例５において、実施例２で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムを用いて細胞を２４時間培養させた結果を示す図面代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体は、原料としてスイゼンジノリ多糖体およびコラーゲンが用いられており、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが化学結合によって結合されていることを特徴とする。
【００１３】
本発明者らは、前記技術的課題に鑑みて、細胞培養シートなどとして好適に使用することができる材料を開発するべく鋭意研究を重ねたところ、原料としてスイゼンジノリ多糖体およびコラーゲンを用い、両者を水溶液の状態で混合し、得られた混合物を乾燥させたとき、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとの静電相互作用が効率よく起こり、両者が化学結合によって結合し、得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体は、細胞に対する接着性に優れ、しかも細胞が伸展しやすいという優れた効果を奏することが見出された。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
【００１４】
本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体は、前記したように、原料としてスイゼンジノリ多糖体およびコラーゲンが用いられた複合体であり、スイゼンジノリ多糖体水溶液とコラーゲン水溶液とを混合し、得られた混合溶液を０〜４０℃の温度で乾燥させることによって得ることができる。
【００１５】
スイゼンジノリ多糖体は、例えば、スイゼンジノリから抽出することによって得られる。スイゼンジノリからスイゼンジノリ多糖体を抽出する方法としては、例えば、国際公開第２００８／０６２５７４号パンフレットに記載の方法などが挙げられる。より具体的には、スイゼンジノリ多糖体は、例えば、８０℃程度の温度の０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にスイゼンジノリを添加し、数時間程度攪拌することにより、スイゼンジノリから抽出する方法、スイゼンジノリの水分散液を１２１℃程度の温度で3時間程度加熱することにより、スイゼンジノリから抽出する方法などにより、得ることができる。抽出されたスイゼンジノリ多糖体は、例えば、遠心分離、濾過、アルコール洗浄などによって精製してもよい。また、スイゼンジノリからスイゼンジノリ多糖体を抽出する前に、スイゼンジノリを凍結させた後に融解させ、さらに色素を除去することによって精製してもよい。
【００１６】
スイゼンジノリ多糖体は、硫酸化ムラミン酸、ヘキソース、ウロン酸などの単糖を構成単位として含む多糖類である。スイゼンジノリ多糖体を構成する単糖の割合および平均分子量は、スイゼンジノリの採取時期、採取場所などによって異なるが、通常、スイゼンジノリ多糖体は、通常、硫酸化ムラミン酸１〜３０モル％、ヘキソース３０〜８０モル％およびウロン酸を１〜５０モル％を含有し、４００万〜６０００万の重量平均分子量を有する。
【００１７】
本発明において、スイゼンジノリ多糖体は、コラーゲンとの均一分散性を向上させる観点から、通常、水溶液の状態で用いることが好ましい。
【００１８】
スイゼンジノリ多糖体水溶液におけるスイゼンジノリ多糖体の濃度は、コラーゲンと効率よく反応させる観点から、好ましくは０．００１（質量／体積）％以上、より好ましくは０．０５（質量／体積）％以上、さらに好ましくは０．１（質量／体積）％以上、さらに一層好ましくは０．３（質量／体積）％以上であり、スイゼンジノリ多糖体の分散性を向上させる観点から、好ましくは１０（質量／体積）％以下、より好ましくは８（質量／体積）％以下、さらに好ましくは５（質量／体積）％以下である。
【００１９】
スイゼンジノリ多糖体水溶液の溶媒は水であるが、本発明の目的が阻害されない範囲内で、水溶性有機溶媒が含まれていてもよい。
【００２０】
水溶性有機溶媒としては、例えば、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコールなどの脂肪族１価アルコール；エチレングリコール、ジエチレングリコール、グリセリンなどの脂肪族多価アルコール；メチルセロソルブ、エチルセロソルブ、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジグライム、ジエチルエーテルなどのエーテル；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトンなどのケトン；ホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、Ｎ-メチルピロリドンなどのアミド；テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル；ジメチルスルホキシド、炭酸プロピレンなどのカーボネート、酢酸などのカルボン酸などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの水溶性有機溶媒は、それぞれ単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。
【００２１】
コラーゲンは、例えば、ウシ、ブタ、サメなどの組織から抽出することによって得ることができるものであり、例えば、（株）高研製、製品番号：ＭＩＣ−００（ウシ真皮由来アテロコラーゲン）などとして商業的に容易に入手することができる。コラーゲンとしては、例えば、Ｉ型コラーゲン、ネイティブコラーゲン、アテロコラーゲンなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらのコラーゲンは、それぞれ単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。
【００２２】
本発明において、コラーゲンは、スイゼンジノリ多糖体との均一分散性を向上させる観点から、通常、水溶液の状態で用いることが好ましい。
【００２３】
コラーゲン水溶液におけるコラーゲンの濃度は、スイゼンジノリ多糖体と効率よく反応させる観点から、好ましくは０．００１（質量／体積）％以上、より好ましくは０．０５（質量／体積）％以上、さらに好ましくは０．１（質量／体積）％以上、さらに一層好ましくは０．３（質量／体積）％以上であり、コラーゲンの分散性を向上させる観点から、好ましくは３０（質量／体積）％以下、より好ましくは２５（質量／体積）％以下、さらに好ましくは２０（質量／体積）％以下である。
【００２４】
コラーゲン水溶液の溶媒は水であるが、本発明の目的が阻害されない範囲内で、水溶性有機溶媒が含まれていてもよい。水溶性有機溶媒は、前記スイゼンジノリ多糖体水溶液に用いることができる水溶性有機溶媒と同様のものを例示することができる。
【００２５】
スイゼンジノリ多糖体１００質量部あたりのコラーゲンの量は、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとを効率よく複合させる観点から、好ましくは５〜５００質量部、より好ましくは１０〜４００質量部、さらに好ましくは３０〜３００質量部、さらに一層好ましくは５０〜２００質量部である。
【００２６】
スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとの混合は、あらかじめ両者を均一な組成となるように混合した後、得られた混合物と水とを混合することによって行なってもよいが、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとを均一に分散させる観点から、スイゼンジノリ多糖体水溶液とコラーゲン水溶液とを混合することによって行なうことが好ましい。
【００２７】
スイゼンジノリ多糖体水溶液とコラーゲン水溶液とを混合する際、スイゼンジノリ多糖体水溶液の液温およびコラーゲン水溶液の液温は、いずれも、水溶液の凍結を防止し、コラーゲンの変性を抑制する観点から、好ましくは０〜４０℃、より好ましくは５〜３５℃である。
【００２８】
なお、スイゼンジノリ多糖体水溶液とコラーゲン水溶液とを混合することによって得られた混合溶液には、無機塩が溶解していてもよい。無機塩を前記混合溶液に溶解させることにより、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の膨潤度および機械的強度を適宜調整することができる。
【００２９】
無機塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどのアルカリ金属ハロゲン化物；塩化マグネシウム、塩化カルシウム、臭化マグネシウム、臭化カルシウム、ヨウ化マグネシウム、ヨウ化カルシウムなどのアルカリ土類金属ハロゲン化物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの無機塩は、それぞれ単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。これらの無機塩のなかでは、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カルシウムが好ましく、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムが好ましく、塩化ナトリウムがさらに好ましい。
【００３０】
前記混合溶液における無機塩の濃度は、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の機械的強度を向上させる観点から、好ましくは０．０１Ｍ以上、より好ましくは０．０５Ｍ以上、さらに好ましくは０．１Ｍ以上であり、前記と同様にスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の機械的強度を向上させる観点から、好ましくは０．４Ｍ以下、より好ましくは０．３Ｍ以下、さらに好ましくは０．２Ｍ以下である。
【００３１】
次に、前記で得られた混合溶液を０〜４０℃の温度で乾燥させる。前記混合溶液の乾燥は、例えば、前記混合溶液を基材に塗布することにより、被膜を形成させ、形成された被膜から水分を除去することによって行なうことができる。
【００３２】
前記混合溶液を基材に塗布する際に用いられる基材としては、例えば、ステンレス鋼板などの金属板、ガラス板、ポリプロピレン、ポリエチレンなどのポリオレフィン；ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル；ナイロン６６などに代表されるポリアミド；ポリメチル（メタ）アクリレートなどに代表されるアクリル樹脂などの樹脂からなる樹脂板、繊維強化樹脂（ＦＲＰ）板、炭素板などの無機板などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３３】
前記混合溶液を基材に塗布する方法としては、例えば、スプレーコート法、ロールコート法、はけ塗り法、グラビアコート法、リバースコート法、ロールブラッシュ法、エアーナイフコート法、浸漬（ディッピング）法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３４】
前記混合溶液を基材に塗布することによって形成される被膜の厚さは、特に限定されないが、本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の機械的強度を向上させるとともに塗工性を向上させる観点から、好ましくは３０〜３００μｍ、より好ましくは５０〜２００μｍである。なお、形成された被膜を乾燥させた後、形成された被膜上にさらに前記混合溶液を重ね塗りすることにより、被膜の厚さを大きくすることができる。
【００３５】
次に、以上のようにして前記混合溶液から形成された被膜を０〜４０℃の温度で乾燥させる。一般に、形成された被膜を乾燥させる方法として、加熱乾燥法、赤外線などの電子線照射による乾燥法などが知られている。これに対して、本発明では、これらの乾燥法と相違し、積極的に高温に加熱するのではなく、前記温度で乾燥させるという操作が採られているので、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが化学結合によって結合しているスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体を得ることができる。
【００３６】
本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体では、このようにスイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが化学結合によって結合している理由は、確かではないが、おそらく前記混合溶液を乾燥させているときに、被膜の厚さが徐々に減少するにしたがい、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが徐々に錯体を形成することに基づくものと考えられる。したがって、本発明において、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが化学結合によって結合していることは、実質的にスイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが錯体を形成していることを意味する。
【００３７】
前記混合溶液を乾燥させる際の当該混合溶液の液温は、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとを化学結合によって結合させるとともに、当該混合溶液の凍結を防止し、コラーゲンの変性を抑制する観点から、０〜４０℃、好ましくは３〜４０℃、より好ましくは５〜４０℃、さらに好ましくは５〜３５℃に調整する。前記混合溶液を乾燥させる際の雰囲気は、特に限定されないが、通常、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の製造効率の向上の観点から、大気であることが好ましい。また、前記雰囲気は、常圧であってもよく、必要により、減圧または加圧されていてもよい。また、混合溶液を乾燥させるときの雰囲気の相対湿度についても特に限定がなく、通常の相対湿度、例えば、３０〜８０％程度であればよい。
【００３８】
前記混合溶液を乾燥させるのに要する時間は、当該混合溶液の液量、乾燥温度などによって異なるので一概には決定することができないことから、前記混合溶液の乾燥は、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが十分に化学結合によって結合するまで行なうことが好ましい。前記混合溶液を乾燥させるのに要する時間は、通常、コラーゲンの析出を防止し、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとを十分に化学結合によって結合させる観点から、好ましくは１５時間以上、より好ましくは２０時間以上、さらに好ましくは２５時間以上、さらに一層好ましくは３０時間以上であり、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の製造効率を向上させる観点から、好ましくは１００時間以下、より好ましくは８０時間以下、さらに好ましくは６０時間以下である。
【００３９】
前記混合溶液を基材に塗布し、乾燥させることによって本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体を製造した場合には、本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体は、基材から剥離することにより、使用に供することができる。
【００４０】
本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の乾燥後の厚さは、当該スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の用途などによって異なるので一概には決定することができないが、通常、１０〜１００μｍ程度である。
【００４１】
また、本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の大きさは、任意であり、本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の用途に応じて適宜調整することが好ましい。
【００４２】
以上のようにしてスイゼンジノリ多糖体水溶液とコラーゲン水溶液とを混合し、得られた混合溶液を０〜４０℃の温度で乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが化学結合によって結合したスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体を得ることができる。スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体において、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが化学結合によって結合していることは、例えば、赤外吸光分析（ＩＲ）において、コラーゲンが有するアミド基に由来するピークが波数の大きいほうにシフトしていることによって確認することができる。
【００４３】
本発明では、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の原料として、自然界に存在しており、食用として利用されているスイゼンジノリから抽出することによって得られるスイゼンジノリ多糖体および食用として利用されているコラーゲンが用いられているので、本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体は、ヒトをはじめとする動物に対する安全性が高いことから、例えば、細胞培養シート、手術の際の臓器などが癒着することを防止するための臓器癒着防止膜、創傷治療用絆創膏、創傷被覆膜、冷却用シート、臓器保存用クッションシート、体液吸い取りシートなどの用途に使用することが期待されるものである。
【実施例】
【００４４】
次に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。
【００４５】
調製例
スイゼンジノリ(Aphanothece sacrum)の原試料を凍結させた後、解凍することにより、スイゼンジノリ細胞体を破壊し、当該スイゼンジノリ細胞体に含まれている蛍光性色素であるフィコビリプロテインなどを溶出させ、水洗することによって除去した。
【００４６】
次に、前記で水洗したスイゼンジノリ原試料をイソプロパノールで洗浄することにより、当該スイゼンジノリ原試料に含まれている脂溶性色素、クロロフィル、カロテノイド系色素などを除去した。前記でイソプロパノールを用いて洗浄したスイゼンジノリ試料を０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液中に浸漬し、当該溶液の液温を８０℃に保ちながら５時間撹拌することにより、スイゼンジノリ細胞体を完全に破壊し、かつスイゼンジノリ試料に含まれているタンパク質やＤＮＡなどの生体高分子を分解させ、これらの破壊残渣、解残渣およびスイゼンジノリ多糖体を含む溶液を得た。
【００４７】
前記で得られた溶液をガーゼで濾過し、不純物を除去した後、当該溶液のｐＨがおよそ７〜８程度となるまで塩酸で中和した。その後、この溶液にイソプロパノールと水の混合溶媒（イソプロパノールと水の容量比：７０：３０）を添加し、撹拌することにより、スイゼンジノリ多糖体を精製し、回収した。
【００４８】
前記で回収されたスイゼンジノリ多糖体を再度、水中溶解させ、得られたスイゼンジノリ多糖体水溶液をイソプロピルアルコールに添加することによってスイゼンジノリ多糖体を脱水させ、繊維化させた。繊維化されたスイゼンジノリ多糖体の収率は、スイゼンジノリ原試料乾燥重量に対し約５０〜８０質量％であった。
【００４９】
以上のようにして精製されたスイゼンジノリ多糖体の重量平均分子量を多角度静的光散乱法（ＭＡＬＬＳ）にて以下の測定条件で測定した。その結果、当該スイゼンジノリ多糖体の重量平均分子量は、２０００万であることが確認された。前記で精製されたスイゼンジノリ多糖体を以下の実施例で用いた。
【００５０】
〔測定条件〕
・装置：Wyatt Technology社製、商品名：Dawn Heleos II
・注入時の濃度：０．０１質量％
・注入量：１００μＬ
・流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
・溶媒：０．１Ｍ硝酸ナトリウム水溶液
・カラム：昭和電工（株）製、商品名：Shodex OHpak SB-807 HQおよび商品名：Shodex OHpak SB-804 HQ
・カラムの温度：４０℃
・測定温度：２５℃
・レーザーの波長：６６５．２ｎｍ
・測定角：１３．０°、２０．７°、２９．６°、３７．５°、４４．８°、５３．１°、６１．１°
・セルのタイプ：溶融シリカ
・ＲＩ検出器：Wyatt Technology社製、商品名：Optilab T-rEX、レーザーの波長：６５８．０ｎｍ
【００５１】
実施例１
スイゼンジノリ多糖体０．５（質量／体積）％水溶液１７ｍＬおよびネイティブコラーゲン〔（株）高研製〕の０．５（質量／体積）％水溶液３３ｍＬを十分に撹拌することにより、スイゼンジノリ多糖体およびコラーゲンを含む混合溶液を調製した。前記で得られた混合溶液を表面が平坦なポリプロピレン製のプレート上にスプレーコートした。前記プレートを３５℃の雰囲気中で２日間乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを得た。前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートをプレートから剥がし、その厚さを測定したところ、当該スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートの厚さは、約４０μｍであった。
【００５２】
次に、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを縦５ｍｍ、横５ｍｍの正方形状に裁断し、得られた試験片を約１５℃の純水中に２４時間浸漬した後、浸漬前の質量および浸漬後の質量から式：
〔膨潤度（−）〕＝〔（浸漬後の質量−浸漬前の質量）÷（浸漬前の質量）〕
に基づいて膨潤度を求めた。その結果、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートの膨潤度は、６．０であった。
【００５３】
また、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを１５℃の純水中に１時間した後、水中から取り出し、偏光顕微鏡で観察したところ、スイゼンジノリ多糖体分子およびコラーゲン分子が微細な配向ドメインがランダムに存在していることが確認された。
【００５４】
実施例２
スイゼンジノリ多糖体０．５（質量／体積）％および０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有する水溶液２５ｍＬおよびネイティブコラーゲン〔（株）高研製〕の０．５（質量／体積）％および０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有する水溶液２５ｍＬを十分に撹拌することにより、スイゼンジノリ多糖体およびコラーゲンを含む混合溶液を調製した。前記で得られた混合溶液を表面が平坦なポリプロピレン製のプレート上にスプレーコートした。前記プレートを３５℃の雰囲気中で２日間乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを得た。前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートをプレートから剥がし、その厚さを測定したところ、当該スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートの厚さは、約４０μｍであった。
【００５５】
その後、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを大過剰の水中に１日間浸漬することにより、当該乾燥体に含まれている未反応のスイゼンジノリ多糖体、未反応のコラーゲン、ナトリウムイオンおよび塩素イオンを除去し、３５℃の雰囲気中で２日間乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムを得た。
【００５６】
次に、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの膨潤度を実施例１と同様にして求めた。その結果、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの膨潤度は、１０であった。
【００５７】
また、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムを１５℃の純水中に１時間した後、水中から取り出し、得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の水膨潤物を偏光顕微鏡で観察したところ、色調の変化からスイゼンジノリ多糖体分子およびコラーゲン分子が配向していることが確認された。
【００５８】
実施例３
スイゼンジノリ多糖体０．５（質量／体積）％および０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有する水溶液２５ｍＬおよびアテロコラーゲン〔（株）高研製〕の０．５（質量／体積）％および０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有する水溶液２５ｍＬを十分に撹拌することにより、スイゼンジノリ多糖体およびコラーゲンを含む混合溶液を調製した。前記で得られた混合溶液を表面が平坦なポリプロピレン製のプレート上にスプレーコートした。前記プレートを３５℃の雰囲気中で２日間乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを得た。前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートをプレートから剥がし、その厚さを測定したところ、当該スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートの厚さは、約４０μｍであった。
【００５９】
その後、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを大過剰の水中に１日間浸漬することにより、当該乾燥体に含まれている未反応のスイゼンジノリ多糖体、未反応のコラーゲン、ナトリウムイオンおよび塩素イオンを除去し、３５℃の雰囲気中で２日間乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムを得た。
【００６０】
次に、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの膨潤度を実施例１と同様にして求めた。その結果、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの膨潤度は６１であった。
【００６１】
実施例４
スイゼンジノリ多糖体０．５（質量／体積）％および０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有する水溶液３３ｍＬおよびネイティブコラーゲン〔（株）高研製〕の０．５（質量／体積）％および０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有する水溶液１７ｍＬを十分に撹拌することにより、スイゼンジノリ多糖体およびコラーゲンを含む混合溶液を調製した。前記で得られた混合溶液を表面が平坦なポリプロピレン製のプレート上にスプレーコートした。前記プレートを３５℃の雰囲気中で２日間乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを得た。前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートをプレートから剥がし、その厚さを測定したところ、当該スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートの厚さは、約４０μｍであった。
【００６２】
その後、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを大過剰の水中に１日間浸漬することにより、当該乾燥体に含まれている未反応のスイゼンジノリ多糖体、未反応のコラーゲン、ナトリウムイオンおよび塩素イオンを除去し、３５℃の雰囲気中で２日間乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムを得た。
【００６３】
次に、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの膨潤度を実施例１と同様にして求めた。その結果、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの膨潤度は、３.１×１０2であった。
【００６４】
また、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムを１５℃の純水中に１時間した後、水中から取り出し、偏光顕微鏡で観察したところ、色調の変化からスイゼンジノリ多糖体分子およびコラーゲン分子が配向していることが確認された。
【００６５】
実施例５
スイゼンジノリ多糖体０．５（質量／体積）％および０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有する水溶液３３ｍＬおよびアテロコラーゲン〔（株）高研製〕の０．５（質量／体積）％および０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有する水溶液１７ｍＬを十分に撹拌することにより、スイゼンジノリ多糖体およびコラーゲンを含む混合溶液を調製した。前記で得られた混合溶液を表面が平坦なポリプロピレン製のプレート上にスプレーコートした。前記プレートを３５℃の雰囲気中で２日間乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを得た。前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートをプレートから剥がし、その厚さを測定したところ、当該スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートの厚さは、約４０μｍであった。
【００６６】
その後、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを大過剰の水中に１日間浸漬することにより、当該乾燥体に含まれている未反応のスイゼンジノリ多糖体、未反応のコラーゲン、ナトリウムイオンおよび塩素イオンを除去し、３５℃の雰囲気中で２日間乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムを得た。
【００６７】
次に、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの膨潤度を実施例１と同様にして求めた。その結果、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの膨潤度は、３.０×１０2であった。
【００６８】
比較例１
スイゼンジノリ多糖体０．５（質量／体積）％を含有する水溶液５０ｍＬを表面が平坦なポリプロピレン製のプレート上にスプレーコートした。前記プレートを３５℃の雰囲気中で２日間乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体フィルムを得た。
【００６９】
比較例２
アテロコラーゲン〔（株）高研製〕の０．５（質量／体積）％を含有する水溶液５０ｍＬを表面が平坦なポリプロピレン製のプレート上にスプレーコートした。前記プレートを３５℃の雰囲気中で２日間乾燥させることにより、アテロコラーゲンフィルムを得た。
【００７０】
比較例３
ネイティブコラーゲン〔（株）高研製〕の０．５（質量／体積）％を含有する水溶液５０ｍＬを表面が平坦なポリプロピレン製のプレート上にスプレーコートした。前記プレートを３５℃の雰囲気中で２日間乾燥させることにより、ネイティブコラーゲンフィルムを得た。
【００７１】
実験例１
実施例２で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体、実施例３で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体、比較例１で用いられたスイゼンジノリ多糖体、比較例２で用いられたアテロコラーゲン、および比較例３で用いられたネイティブコラーゲンの赤外吸収（ＩＲ）スペクトルを赤外吸収スペクトル装置（パーキンエルマー社製、商品名：Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｎｅ）を用いて調べた。その結果を図１に示す。
【００７２】
図１に示された結果から、実施例２および３で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体は、比較例１で用いられたスイゼンジノリ多糖体、比較例２で用いられたアテロコラーゲンおよび比較例３で用いられたネイティブコラーゲンと対比して、アミドIIIに由来する１２３７ｃｍ-１のピークが減少および消失していないことから、コラーゲンが変性していないことが確認された。
【００７３】
実験例２
実施例３で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体、実施例５で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体および比較例２で用いられたアテロコラーゲンの赤外吸収（ＩＲ）スペクトルを赤外吸収スペクトル装置（パーキンエルマー社製、商品名：Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｎｅ）を用いて調べた。その結果を図２に示す。
【００７４】
図２に示された結果から、比較例１で用いられたスイゼンジノリ多糖体のアミノ基に由来する波数１５３７ｃｍ-1のピークが、実施例３で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体および実施例５で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体では、いずれも波数１５４６ｃｍ-1にシフトしていることから、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが錯体（化学的結合）を形成していることが推察される。
【００７５】
実験例３
実施例２で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体、実施例４で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体および比較例３で用いられたネイティブコラーゲンの赤外吸収（ＩＲ）スペクトルを赤外吸収スペクトル装置（パーキンエルマー社製、商品名：Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｎｅ）を用いて調べた。その結果を図３に示す。
【００７６】
図３に示された結果から、実施例２で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体および実施例４で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体では、いずれも、比較例３で用いられたスイゼンジノリ多糖体のアミノ基に由来する波数１５３７ｃｍ-1のピークが波数１５４５ｃｍ-1にシフトしていることから、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが錯体（化学的結合）を形成していることが推察される。
【００７７】
実験例４
実施例２で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムおよび実施例５で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの物性として、異方性、圧縮弾性率および架橋点間分子量を以下の方法に基づいて調べた。その結果、実施例２で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの異方性は９．３であり、圧縮弾性率は１０８ｋＰａであり、架橋点間分子量は７．５ｇ／ｍｏｌであり、実施例４で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの異方性は４６であり、圧縮弾性率は５ｋＰａであり、架橋点間分子量は２９．０ｇ／ｍｏｌであった。
【００７８】
〔異方性の測定方法〕
正立型生物顕微鏡〔オリンパス（株）製〕の光路に２枚の偏光子を互いに偏光方向が直交するようにして挿入し、その間にサンプル（スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の水膨潤物）をエッジ部分が光路に平行になるように設置した後、さらに波長５３０ｎｍの偏光カラーフィルターを鋭敏色板としてサンプルの上方に挿入した。
【００７９】
次に、鋭敏色板の偏光方向を前記偏光子に対して４５°の方向になるように調整した後、白色光を下方から照射することにより、上方からサンプルの色を観察した。
【００８０】
〔圧縮弾性率の測定方法〕
各フィルムを縦約５ｍｍ、横約５ｍｍの正方形状に裁断することにより、試験片を作製した。得られた試験片を約１５℃の純水中に２４時間浸漬した後、試験片の圧縮強度を圧縮試験機(ＩＮＳＴＲＯＮ社製、型番：３３６５)で測定し、変位を縦軸に圧縮応力を横軸にとることによって描かれたグラフの傾きを求めることにより圧縮弾性率を算出した。
【００８１】
〔架橋点間分子量の計算方法〕
架橋点間分子量は、式：
［架橋点間分子量（ｇ／ｍｏｌ）］
＝３×［水の密度（１０3ｋｇ/ｍ3）／膨潤度)］
×［気体定数（８．３１ｍ2ｋｇ・ｓ-2・Ｋ-1・ｍｏｌ-1）］
×［水温（３００Ｋ）／圧縮弾性率(ｋＰａ)］
に基づいて求めた。
【００８２】
実験例５
実施例２で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムを７０％エタノール水溶液に２４時間浸漬することにより、滅菌処理を行なった。その後、当該フィルムを滅菌リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、１０％ウシ胎児県政含有ダルベッコ改変イーグル基礎培地(ＤＭＥＭ)に２４時間浸漬し、膨潤ゲルとした。
【００８３】
前記で得られた膨潤ゲルを１５ｍｍポンチで打ち抜き、２４ｗｅｌｌカルチャープレート〔旭硝子（株）製、ＩＷＡＫＩブランドマイクロプレート、品種コード：３８２０−０２４〕に静置し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）５００μＬを添加した。
【００８４】
細胞接着試験に使用した細胞は、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞(ＭＳＣ)(独立行政法人理化学研究所、理化学研究所バイオリソースセンターから入手)を用いた。なお、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞(ＭＳＣ)は、継代数３のものを用いた。
【００８５】
次に、５００００／ｍＬの密度に調製した骨髄由来ヒト間葉系幹細胞(ＭＳＣ)懸濁液１ｍＬを各ｗｅｌｌに整地されたゲル上に播種し、２４時間経過後、細胞の接着および伸展を観察した。なお、陽性対象として、２４ｗｅｌｌプレートの未処理ｗｅｌｌに同数の骨髄由来ヒト間葉系幹細胞(ＭＳＣ)を播種し、観察した。
【００８６】
細胞の接着および伸展は、位相差顕微鏡および染色用色素〔（株）同仁化学研究所製、商品名：Ｃａｌｃｅｉ−ＡＭ〕で染色された生細胞の蛍光像を蛍光顕微鏡で観察することによって評価した。その結果を図４に示す。
【００８７】
前記で培養された細胞は、いずれも生きており、しかも良好に培地の膨潤ゲルに接着していた。また、ｄｉｓｈ １およびｄｉｓｈ ２で培養された細胞の写真を図４に示すが、図４の白色で示されているように、細胞が培地の膨潤ゲルで伸展していることがわかる。さらに、細胞は、膨潤ゲルの表面に沿って均一に接着していることが確認された。
【００８８】
以上の結果から、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体は、細胞に対する親和性に優れているのみならず、細胞に対する接着性にも優れ、さらに細胞が伸展しやすいという優れた性質を有するものであることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体は、細胞を培養させる際の培地として使用したときに細胞に対する接着性に優れ、細胞が伸展しやすいことから、細胞培養シートをはじめ、例えば、手術の際の臓器などが癒着することを防止するための臓器癒着防止膜、創傷治療用絆創膏、創傷被覆膜、冷却用シート、臓器保存用クッションシート、体液吸い取りシートなどの種々の用途に使用することが期待されるものである。
【図１】
0006412414.tif 000002
【図２】
0006412414.tif 000003
【図３】
0006412414.tif 000004
【図４】
0006412414.tif 000005