(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルテン分解用のマイクロカプセル化細菌集団であって、
ａ）ラクトバチルスプランタルムＡＴＣＣ８０１４、ラクトバチルスサンフランシセンシスＡＴＣＣ２７６５２、及びラクトバチルスブレビスＡＴＣＣ１４８６９と、ｂ）カプセル化剤と、ｃ）プレバイオティクスと、ｄ）トレハロースとを含み、  細菌由来のタンパク質分解酵素及び真菌由来のタンパク質分解酵素と組み合わせられることを特徴とするグルテン分解用のマイクロカプセル化細菌集団。
【請求項２】
前記カプセル化剤が、タンパク質を９０％含む乳清から分離したタンパク質、デキストロース当量が１０のマルトデキストリン、アラビアゴム、メスキートゴム、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、大豆から分離したタンパク質、カゼイン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載のマイクロカプセル化細菌集団。
【請求項３】
前記カプセル化剤が、タンパク質を９０％含む乳清から分離したタンパク質、デキストロース当量が１０のマルトデキストリン、アラビアゴム、及びこれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項２に記載のマイクロカプセル化細菌集団。
【請求項４】
前記プレバイオティクスが、ポリデキストロース、イヌリン、アガベシロップからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載のマイクロカプセル化細菌集団。
【請求項５】
前記プレバイオティクスが、アガベシロップであることを特徴とする、請求項４に記載のマイクロカプセル化細菌集団。
【請求項６】
前記細菌由来のタンパク質分解酵素及び前記真菌由来のタンパク質分解酵素が、通常パン焼きに使われる酵素より選択されることを特徴とする、請求項１に記載のマイクロカプセル化細菌集団。
【請求項７】
ａ）ラクトバチルスプランタルムＡＴＣＣ８０１４と、ｂ）ラクトバチルスサンフランシセンシスＡＴＣＣ２７６５２と、ｃ）ラクトバチルスブレビスＡＴＣＣ１４８６９と、ｄ）タンパク質を９０％含む乳清から分離したタンパク質と、ｅ）デキストロース当量が１０のマルトデキストリンと、ｆ）アラビアゴムと、ｇ）アガベシロップと、ｈ）トレハロースとを含み、
細菌由来のタンパク質分解酵素及び真菌由来のタンパク質分解酵素と組み合わせられることを特徴とする、請求項１に記載のマイクロカプセル化細菌集団。
【請求項８】
ａ）ラクトバチルスプランタルムＡＴＣＣ８０１４と、ｂ）ラクトバチルスサンフランシセンシスＡＴＣＣ２７６５２と、ｃ）ラクトバチルスブレビスＡＴＣＣ１４８６９と、ｄ）タンパク質を９０％含む乳清から分離したタンパク質を４０〜６０％と、ｅ）デキストロース当量が１０のマルトデキストリンを１０〜２０％と、ｆ）アラビアゴムを２０〜８０％と、ｇ）アガベシロップを１〜１０％と、ｈ）トレハロースとを含み、
細菌由来のタンパク質分解酵素０．００５〜０．０３％及び真菌由来のタンパク質分解酵素０．００１〜０．０２％と組み合わせられることを特徴とする、請求項７に記載のマイクロカプセル化細菌集団。
【請求項９】
請求項１に記載のグルテン分解用のマイクロカプセル化細菌集団を得る方法であって、
ａ）各乳酸菌株を別々に再活性化するステップと、
ｂ）活性化された各菌株を、各菌株が所望の濃度となるまで別々に液体培地で培養するステップと、
ｃ）各菌株に対して、余分の培地を除去し、微生物を集めて、ペレットを得るステップと、
ｄ）各菌株に対して得られたペレットを別々に再懸濁させて生食懸濁液とし、所要の体積に調整するステップと、
ｅ）所要量の各菌株を混合し、最終体積に仕上げるステップと、
ｆ）カプセル化剤を適切な割合で水に溶かして、溶解固形物を２０〜３０％とするステップと、
ｇ）プレバイオティクスとトレハロースを添加するステップと、
ｈ）前記３つの乳酸菌株の混合物を接種して、前記３つの乳酸菌株の混合物を１グラムの粉末のマイクロカプセル当り１０１０ＣＦＵ程度とするステップと、
ｉ）入口温度が１１０〜１６０℃、出口温度が６０〜８０℃、送り速度が２０〜５０ｍＬ／ｍｉｎで、噴霧乾燥するステップとを含むことを特徴とする、方法。
【請求項１０】
前記噴霧乾燥が、入口温度が１５０℃、出口温度が８０℃、送り速度が２２ｍＬ／ｍｉｎで、噴霧乾燥器で行われることを特徴とする、請求項９に記載のマイクロカプセル化細菌集団を得る方法。
【請求項１１】
グルテン濃度が２０ｐｐｍ未満であるサワードウを得るための、請求項１に記載のマイクロカプセル化細菌集団と、細菌由来のタンパク質分解酵素及び真菌由来のタンパク質分解酵素との組み合わせの使用。
【請求項１２】
前記サワードウのグルテン濃度が１０ｐｐｍ未満であることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
２０ｐｐｍ未満の前記グルテン濃度が、少なくとも３時間の発酵後に得られることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
請求項１に記載のグルテン分解用のマイクロカプセル化細菌集団と、細菌由来のタンパク質分解酵素及び真菌由来のタンパク質分解酵素との組み合わせからサワードウを製造する方法であって、
ｉ）３０〜６０％の粉に４０〜８０％の水を混合し、パン生地の収量が１５０〜４７５のパン生地を得るステップと、
ｉｉ）事前に混練水に溶かした、細菌由来のタンパク質分解酵素０．００５〜０．０３％及び真菌由来のタンパク質分解酵素０．００１〜０．０２％を添加するステップと、
ｉｉｉ）該マイクロカプセル化細菌集団を１グラムの粉当り１０１０ＣＦＵ程度となるように添加するステップと、
ｉｖ）混合するステップと、
ｖ）３０〜３７℃の温度と７０〜９２％の相対湿度で、３〜４８時間発酵させるステップとを含むことを特徴とする、方法。
【請求項１５】
ステップi）で使用される前記粉が、小麦粉、ライ麦粉、及びオーツ麦粉から選択されることを特徴とする、請求項１４に記載のサワードウの製造方法。
【請求項１６】
前記粉が、小麦粉であることを特徴とする、請求項１５に記載のサワードウの製造方法。
【請求項１７】
ステップi）において、前記得られたパン生地が、１５０〜１６０のパン生地の収量（ＤＹ）を有することを特徴とする、請求項１４に記載のサワードウの製造方法。
【請求項１８】
前記発酵が、２８〜３５時間行われることを特徴とする、請求項１４に記載のサワードウの製造方法。
【請求項１９】
前記発酵が、７５〜８０％の相対湿度で行われることを特徴とする、請求項１４に記載のサワードウの製造方法。
【請求項２０】
前記発酵が、３５℃の温度及び７６％の相対湿度で３１時間行われることを特徴とする、請求項１４に記載のサワードウの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はパン及びパン派生食料品の食品産業に関する。特に、サワードウへのグルテン分解用のマイクロカプセル化細菌集団とその製造方法、及びグルテンが入っていないサワードウを用いたパン製品の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
セリアック病は免疫系の遺伝的な障害であって、小麦やライ麦、大麦に含まれるタンパク質の一種であるグルテンの摂取によって引き起こされる。人間の上部消化管では、グルテンの消化が悪い。グルテンはグリアジンとグルテニンとの二つの成分からなる。グリアジンはアルコール可溶性であり、セリアック病患者にとって有毒成分を一番多く含んでいる（非特許文献１）。
【０００３】
グルテンを含む食べ物を食べると、セリアック病患者の免疫システムが腸絨毛を損傷又は破壊するように反応し、食品中の栄養素が吸収されないため、栄養状態が悪化する。セリアック病の病状が患者の年齢によって異なるが、子供は下痢、腹部膨満、嘔吐と体重減少、大人は鉄欠乏性貧血、疲労、骨痛、関節炎、骨粗しょう症などが最も一般的な病状である（非特許文献２）。
【０００４】
近年まではセリアック病がまれだと思われていたが、今は世界で新生児１５０人に１人が患うという最も一般的な過敏症の一つになっている。また、診断されたのは全患者の９％でしかないと推測されている。メキシコのサルバドル・スビラン国立医科学栄養研究所（Instituto Nacional de Ciencias Medicas y Nutricion）の統計によると、セリアック病患者の潜在患者数は約２６０万人に上る（非特許文献３）。
【０００５】
現在、セリアック病の唯一の認められている治療法は、一生グルテンフリーの食事制限である。国際食品規格によると、食品のグルテン濃度が２０ｐｐｍ以下だとグルテンフリーとされる。しかし多糖類の摂取減によるエネルギー摂取量の減少や健康に有益な腸内細菌叢の低減、日和見病原体（opportunistic pathogens）の増加といった栄養面でのマイナス要素につながる。また、グルテンフリーの食事制限による有益な細菌叢の低減が免疫刺激活性に悪影響を及ぼし、抗炎症性化合物の生成量を低下させる。
【０００６】
従って、セリアック病患者が摂取できる食品であって、手近な食品の種類を増やすことで食生活を改善できるグルテンフリーの食品が必要である。
【０００７】
主に小麦粉から作られるパンは、人間の食生活に欠かせない食品の一つでる。
【０００８】
小麦粉生地の特徴は、主にグルテン蛋白に依存する。最近、この蛋白の品質を高めるため、あるいはガス貯留処理を改善してより通気したパンを製造するために、様々な処理がなされている（非特許文献４）。その処理の一つは、サワードウ使用のパン製造である。
【０００９】
この処理の主な役割は、生地を発酵させることでガス含有量を高め、パンくずがより柔らかいふわふわしたパンを得ることである。
【００１０】
サワードウは、（小麦やオーツ麦、米などの）粉と水、酵母菌、そして通常ラクトバチルス属に属する乳酸菌の混合物を発酵したものによって得られる（非特許文献５）。パン焼き技術において、サワードウの使用は発酵におけるpH低下、より良いガス貯留、グルテン網のより高い抵抗力、小麦粉アミラーゼの抑制、水のグルテンとでんぷん粒との結合、ペントースの膨張、フィチン酸塩錯体の可溶化、発酵不良の防止などの優れた効果をあげる（非特許文献６）。パン作りにおいて、これらのサワードウは新しい生地と混合される。
【００１１】
また、サワードウの発酵に使用される乳酸菌は、パン作りにおけるグルテン改良を可能にするため、セリアック病患者に有毒なタンパク質成分を除去できる。ただし、すべての乳酸菌がグルテン残留濃度をグルテン過敏症の人（セリアック病患者）が耐えられる量に減らすことができないので、グルテンの加水分解に貢献するプロテアーゼを利用して乳酸菌の種類を選択し、適切な組み合わせを見つけなければならない。
【００１２】
発酵の際、乳酸菌のタンパク質分解系（proteolytic system）が微生物の代謝活動を促す低分子量ペプチドとアミノ酸を放出することで、味を良くしアレルギー性ペプチドの量を減らすことに貢献する（非特許文献７）。従って、グリアジン成分に過敏なためにグルテンを少量でも含む食品を消費できなかったセリアック病患者に大きな希望をもたらしている（非特許文献８、非特許文献６）。サワードウで作られたパンについての調査では、特定の処理条件下（長時間の発酵と半液体）、乳酸菌が小麦グリアジン成分を加水分解する能力を持つ（非特許文献９、非特許文献７）。
【００１３】
非特許文献１０では（事前にグリアジンを加水分解する能力に基づいて選択された）市販されていない乳酸桿菌株の混合物と真菌由来のプロテアーゼの様々な組み合わせをサワードウに用いて、比較的長い発酵において小麦粉の毒性を除去した。乳酸桿菌による加水分解速度が非常に効率的だったのに加え、サワードウから抽出されたタンパク質がインターフェロンγの活性化を誘導したと認められた。また、アルブミンとグロブリン、グリアジンが完全に加水分解されたのに対し、サワードウにおいてのグルテン残量が２０％だった。
【００１４】
同じように、特許文献１に少なくとも６つの市販の乳酸菌種及び／又はビフィズス菌種の混合物が示されている。この混合物はサワードウの製造に利用できる。同様に、これらの配合物に、パン焼きに普段使用される微生物のプロテアーゼを適量に加えると、発酵したサワードウは２００ｐｐｍ未満のグルテン濃度となり、セリアック病患者の消費に相応しくない虞がある。また、乳酸菌種が多いほど、グリアジンの分解が進むため、多くの種を使用する必要がある。よって、この分解を実現するための混合物が複雑になる。
【００１５】
一方、特許文献２に２種の乳酸菌と、１以上の真菌由来のプロテアーゼを含む混合物が示されている。１２時間の発酵後、グリアジンとグルテニンの残量が認められなかった。更に、グルテンの残量濃度が２０ｐｐｍ未満となった。
【００１６】
このように、従来技術によるグルテン分解用の細菌培養物にいくつかのデメリットがある。例えば、市販の菌株の場合、（少なくとも６種の）乳酸菌の複雑な混合物が使用される一方、特別に選択された菌株の場合、培養物を活性化し、増殖と洗浄してから浮遊状態で培養物（接種源）を生地に添加しなければならない。よって、培養物を毎日用意する必要があり、また感染を防ぐための特殊管理において同じ成長段階で活発に保ち、それぞれの乳酸菌を適切な割合と量に保たなければならないが、感染の潜在的なリスクも生じる。
【００１７】
そのつど接種源を生産することの難しさを緩和するための代案として、十分な量を生産するようにマイクロカプセル化することが知られている。これによって培養物の処理を減らして、乳酸の培養物の感染や生存能力に関するリスクを低くし小麦粉生地分解の効率化を図ることができる。
【００１８】
乳酸菌の生存能力と活性は培養物の増殖率、乳酸と酢酸の生産能力、全固形分、培養温度と時間、接種源の使用量、及び抗生物質や殺菌剤あるいは洗浄剤の残留物などの要素で決まる（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０）。
【００１９】
不利な条件へのプレバイオティクス菌の抵抗力を高めるために色々な方法が知られている。例えば、プレバイオティクス機能を持つ微量栄養素をマイクロカプセル化し組み入れる方法がある（非特許文献１１、非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献２０）。
【００２０】
高酸素濃度や製造、保管、冷凍、胃腸管を通る時の酸やアルカリ性条件に敏感なプレバイオティクスを守ることができるので、プレバイオティクスの生存能力を高めるためにマイクロカプセル化が提案されてる（非特許文献１４、非特許文献１１、非特許文献２１、非特許文献１８、非特許文献２３、非特許文献２０）。
【００２１】
乳酸菌のマイクロカプセル化が従来技術だとしても、サワードウの発酵の際にグルテンを分解するのに利用される材料をマイクロカプセル化することでよく保護するために、乾燥条件やカプセル化の媒体を精選しなければならないことが従来技術では明記されていない。なぜなら、マイクロカプセル壁の設計が、保護する材料の特定のタイプやマイクロカプセルが使用される環境、それに保護される活物質の解放機構によって決まる重要点だからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】米国出願第2008/0131556号
【特許文献２】国際公開第2010//073283号
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Green, P. H. R. and Cellier, C. 2007. Celiac disease. N. Engl. J. Med.; 357:1731-1743
【非特許文献２】National Digestive Diseases Information Clearinghouse, NIH Publication No. 08-4269, 2008
【非特許文献３】http://celiacosdemexico.org.mx/manifiesto-celiaco
【非特許文献４】Arendt et al., 2007. Impact of sourdough on the texture of bread. Food Microbiology 24:165-174
【非特許文献５】De Vuyst, L. and Vancanneyt, M. 2007. Biodiversity and identification of sourdough lactic acid bacteria. Food Microbiology 24.120-127
【非特許文献６】Di Cagno, R. et al. 2002. Proteolysis by sourdough lactic acid bacteria: Effects on wheat Flour protein fractions and gliadin peptides involved in human cereal intolerante. Applied and Environmental Microbiology 68: 623-633
【非特許文献７】De Angelis, M. et al. 2005. VSL#3 probiotic preparation has the capacity to hydrolyze gliadin polypeptides responsable for Celiac Sprue probiotics and gluten intolerante. Biochimica et Biophysica Acta 1762(1): 80-93
【非特許文献８】Wieser, H. 2007. Chemistry of Gluten proteins. Food Microbiology 24: 115-119
【非特許文献９】Di Cagno, R. et al. 2004. Sourdough bread made from wheat and nontoxic flours and started with selected lactobacilli is tolerated in celiac sprue patients. Applied and Environmental Microbiology 70(2):1088-1096
【非特許文献１０】Rizzello et al., 2007. Highly efficient gluten degradation by lactobacilli and fungal proteases during food processing: new perspectives for celiac disease. Applied and Environmental Microbiology 73 (14): 4499-4507
【非特許文献１１】Picot and Lacroix, 2003
【非特許文献１２】Briceno, 2005
【非特許文献１３】Desmond et al., 2002
【非特許文献１４】Favaro-Trinidad and Grosso, 2002
【非特許文献１５】Lian et al., 2003
【非特許文献１６】Akalin et al., 2004
【非特許文献１７】Cerdeira et al., 2005
【非特許文献１８】Iyer and Kailasapathy, 2005
【非特許文献１９】Ozer et al., 2005
【非特許文献２０】Ann et al., 2007
【非特許文献２１】Chandramouli et al., 2004
【非特許文献２２】Talwalkar and Kailasapathy, 2004
【非特許文献２３】Crittenden et al., 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
従来技術の問題点に鑑みてなされた本発明の目的は、乳酸菌株のマイクロカプセル化微生物集団を提供することである。このマイクロカプセル化微生物集団は、細菌由来のタンパク質分解酵素と真菌由来のタンパク質分解酵素と組み合わせることにより、サワードウの製造に適切で、セリアック病患者に有毒な成分を含むグルテンを分解するために小麦粉生地に直接添加され、安定した、活性化が速く扱いやすいものである。
【００２５】
本発明の別の目的は、簡単で工業規模でも使用可能な方法で上記のマイクロカプセル化微生物集団を用いてグルテンが分解されたサワードウを得ることである。
【００２６】
更に本発明の別の目的は、サワードウから、グルテンフリーでセリアック病患者の消費に適切な、パン製品を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
そこで、ａ）３つの異なる市販の乳酸菌株と、ｂ）カプセル化剤と、ｃ）プレバイオティクスと、ｄ）トレハロースを含み、細菌由来のタンパク質分解酵素及び真菌由来のタンパク質分解酵素と組み合わせられる、グルテン分解用のマイクロカプセル化細菌集団が開発された。
【００２８】
本発明の他の側面によれば、グルテン分解用のマイクロカプセル化細菌集団の製造方法；その細菌集団と、細菌由来のプロテアーゼと真菌由来のプロテアーゼとの組み合わせから製造されたサワードウであって、グルテン濃度が２０ｐｐｍ未満のサワードウ；及びそのサワードウの製造方法とそのサワードウから得たグルテンフリーのパン製品が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の開発において、３つの異なる市販の乳酸菌株と、細菌集団を高水準で保護し、活動を速やかに開始できるように小麦粉生地への早い溶解を促すカプセル化剤と、細菌集団の生存率を高めるためのプレバイオティクスと、含まれる細菌の特定栄養成分としてのトレハロースとを含むマイクロカプセル化細菌集団が、市販の細菌由来のタンパク質分解酵素及び市販の真菌由来のタンパク質分解酵素と組み合わせて使用されると、サワードウの発酵過程においてのグルテン分解に役立つことを予期せず発見した。
【００３０】
乳酸菌株は、好ましくはラクトバチルスプランタルムＡＴＣＣ８０１４、ラクトバチルスサンフランシセンシスＡＴＣＣ２７６５２、及びラクトバチルスブレビスＡＴＣＣ１４８６９である。
【００３１】
カプセル化剤は、タンパク質を９０％含む乳清から分離したタンパク質、デキストロース当量が１０のマルトデキストリン、アラビアゴム、メスキートゴム、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、大豆から分離したタンパク質、カゼイン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択され、好ましくはタンパク質を９０％含む乳清から分離したタンパク質、デキストロース当量が１０のマルトデキストリン、アラビアゴム、及びこれらの組み合わせである。
【００３２】
一方、プレバイオティクスは、ポリデキストロース、イヌリン、アガベシロップからなる群より選択され、好ましくはアガベシロップである。
【００３３】
細菌由来のタンパク質分解酵素及び真菌由来のタンパク質分解酵素は、通常パン焼きに使われる酵素より選択される。
【００３４】
本発明の一実施形態によれば、マイクロカプセル化細菌集団は、ａ）ラクトバチルスプランタルムＡＴＣＣ８０１４と、ｂ）ラクトバチルスサンフランシセンシスＡＴＣＣ２７６５２と、ｃ）ラクトバチルスブレビスＡＴＣＣ１４８６９と、ｄ）タンパク質を９０％含む乳清から分離したタンパク質と、ｅ）デキストロース当量が１０のマルトデキストリンと、ｆ）アラビアゴムと、ｇ）アガベシロップと、ｈ）トレハロースとを含み、細菌由来のタンパク質分解酵素及び真菌由来のタンパク質分解酵素と組み合わせられる。
【００３５】
より好ましくは、このマイクロカプセル化細菌集団は、ａ）ラクトバチルスプランタルムＡＴＣＣ８０１４と、ｂ）ラクトバチルスサンフランシセンシスＡＴＣＣ２７６５２と、ｃ）ラクトバチルスブレビスＡＴＣＣ１４８６９と、ｄ）タンパク質を９０％含む乳清から分離したタンパク質を４０〜６０％と、ｅ）デキストロース当量が１０のマルトデキストリンを１０〜２０％と、ｆ）アラビアゴムを２０〜８０％と、ｇ）アガベシロップを１〜１０％と、ｈ）トレハロースとを含み、細菌由来のタンパク質分解酵素０．００５〜０．０３％及び真菌由来のタンパク質分解酵素０．００１〜０．０２％と組み合わせられる。
【００３６】
マイクロカプセル化は噴霧乾燥等の公知の方法で行われる。例えば、マイクロカプセル化細菌集団を得る方法は、
ａ）各乳酸菌株を別々に再活性化するステップと、
ｂ）活性化された各菌株を、各菌株が所望の濃度となるまで別々に液体培地で培養するステップと、
ｃ）各菌株に対して、微生物を集めるために余分の培地を好ましくは遠心分離で除去し、ペレットを得るステップと、
ｄ）各菌株に対して得られたペレットを別々に再懸濁させて、生食懸濁液とし、所要の体積に調整するステップと、
ｅ）所要量の各菌株を混合し、最終体積に仕上げるステップと、
ｆ）２０〜３０％の溶解固形物となるようにカプセル化剤を適切な割合で水に溶かすステップと、
ｇ）プレバイオティクスとトレハロースを添加するステップと、
ｈ）３つの乳酸菌株の混合物が１グラムの粉末のマイクロカプセル当り１０１０ＣＦＵ程度となるよう、３つの乳酸菌株の混合物を接種するステップと、
ｉ）入口温度が１１０〜１６０℃、出口温度が６０〜８０℃、送り速度が２０〜５０ｍＬ／ｍｉｎで、好ましくは噴霧乾燥器で乾燥するステップとを含む。
【００３７】
好ましくは、ステップｅ）では、ラクトバチルスプランタルムＡＴＣＣ８０１４を１０〜５０％の比率、ラクトバチルスサンフランシセンシスＡＴＣＣ２７６５２を４０％の比率、ラクトバチルスブレビスＡＴＣＣ１４８６９を１０〜５０％の比率で混合する。
【００３８】
好ましくは、乾燥は噴霧乾燥器を用いて、入口温度が１５０℃、出口温度が８０℃、送り速度が２２ｍＬ／ｍｉｎで行われる。
【００３９】
本発明の他の側面によれば、本発明のマイクロカプセル化細菌集団と、細菌由来のタンパク質分解酵素及び真菌由来のタンパク質分解酵素との組み合わせから製造されたサワードウであって、グルテン濃度が２０ｐｐｍ未満、好ましくは１０ｐｐｍ未満で、グルテンフリーのパン製品の製造に相応しいサワードウが提供される。
【００４０】
好ましくは、このサワードウのグルテン濃度は少なくとも３時間の発酵、好ましくは３１時間の発酵後に得られる。
【００４１】
本発明のサワードウを製造する方法は、
ｉ）３０〜６０％の粉に４０〜８０％の水を混合し、パン生地の収量が１５０〜４７５、好ましくは１５０〜１６０のパン生地を得るステップと、
ｉｉ）混練水に事前に溶かした、細菌由来のタンパク質分解酵素０．００５〜０．０３％及び真菌由来のタンパク質分解酵素０．００１〜０．０２％を添加するステップと、
ｉｉｉ）３つの乳酸菌株の混合物が１グラムの粉当り１０１０ＣＦＵ程度となるよう、マイクロカプセル化細菌集団を添加するステップと、
ｉｖ）混合するステップと、
ｖ）３０〜３７℃の温度と７０〜９２％、好ましくは７５〜８０％の相対湿度で、３〜４８時間、好ましくは２８〜３５時間発酵させるステップとを含む。
【００４２】
ステップｉ）で使用される粉は、小麦粉、ライ麦粉、及びオーツ麦粉から選択され、好ましく小麦粉である。
【００４３】
発酵は好ましくは３５℃の温度及び７６％の相対湿度で３１時間行われる。
【００４４】
上述のように、上記の方法で得られる本発明のサワードウはグルテン濃度が２０ｐｐｍ未満であって、好ましくは１０ｐｐｍ未満である。好ましくは、このサワードウのグルテン濃度は３時間の発酵後に得られる。
【００４５】
これらのサワードウから、グルテンフリーでセリアック病患者の消費に適切なパン製品、好ましくは菓子パンを得ることができる。
【００４６】
以下の実施例によって本発明はより明確になるが、以下の実施例は本発明の好ましい実施形態を正しく理解するために例示されるのであって、上記の詳細な説明に基づいて実施できる、例示されていない実施形態の存在を否定するものではない。
【実施例】
【００４７】
（実施例１）
接種源の生産
ラクトバチルスプランタルムＡＴＣＣ８０１４、ラクトバチルスサンフランシセンシスＡＴＣＣ１４８６９、及びラクトバチルスブレビスＡＴＣＣ２７６５２の菌株をＡＴＣＣから業者を通して入手した。ラクトバチルスプランタルムＡＴＣＣ８０１４とラクトバチルスサンフランシセンシスＡＴＣＣ１４８６９は固体培地にて保存され、ラクトバチルスブレビスＡＴＣＣ２７６５２は凍結乾燥された。
【００４８】
菌株を再活性化するために、ネジキャップの試験管において液体のＭＲＳ（Man Rogosa Sharpe）培地（米国のDifcoTM）に播種し、２４〜４８時間、又は濁度の増加によって成長が見られるまで、３５〜３７℃にて培養した。
【００４９】
培養物がこの特徴を備えたら、ＭＲＳの固体培地が入ったシャーレーに移し、また２４〜４８時間、同じ温度で培養した。
【００５０】
成長した微生物を、５０ｍＬのＭＲＳ培地が添加された１２５ｍＬの三角フラスコに別々に移動され、８〜１２時間、３７℃にて５０〜１００ｒｐｍで撹乱しながら培養し、接種源の前駆体（pre-inoculum）が得られた。
【００５１】
前記培養時間の経過後、培養物を５００〜１０００ｍＬのＭＲＳ培地が添加された２８００ｍＬのフェルンバッハフラスコに、無菌状況下で再度移動させ、１０〜１６時間、３７℃にて５０〜１５０ｒｐｍで撹乱しながら培養した。培地の吸光度（濁度）を測るため、各フラスコからサンプルを採取した。
【００５２】
残った培地を除去し、微生物を集めるために、培養物を、エタノールで消毒された２５０ｍＬの遠心分離管に入れて、２０分間、２０００〜５０００ｒｐｍで遠心分離した。
【００５３】
得られたペレットを無菌食塩水（９ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）に再懸濁させた。微生物を再懸濁させて、所要の体積に調整してから、同様に無菌状態で所要量の各菌株を混合し、最終体積に仕上げることでマイクロカプセル化しようとする接種源を用意した。
【００５４】
（実施例２）
細菌集団のマイクロカプセル化
酸素に対する遮断性のために、タンパク質を９０％含む乳清から分離したタンパク質と、デキストロース当量が１０のマルトデキストリンと、アラビアゴムとを、それぞれの割合でカプセル化剤として選択した。
【００５５】
細菌集団の中での細菌の再活性化を図るため、ポリデキストロース、イヌリン、及びアガベシロップの三種類のプレバイオティクスの添加を分析した。また、トレハロースを、細菌集団を構成する細菌の特定栄養成分として使用した。
【００５６】
２０〜３０％の溶解固形物となるように、カプセル化剤を適切な割合で水に溶かした。プレバイオティクスとトレハロースを添加し、この分散物に、１グラムの粉末マイクロカプセル当り１０１０ＣＦＵとなるよう細菌集団を接種した。
【００５７】
この混合物は入口温度が１５０℃、出口温度が８０℃、送り速度が２２ｍＬ／ｍｉｎで、噴霧乾燥器で乾燥させた。
【００５８】
それにより、粉末のマイクロカプセル化微生物集団が得られた。
【００５９】
（実施例３）
乳酸菌の発達に好ましいプレバイオティクス比率の決定
上述のように、マイクロカプセル化集団へのポリデキストロース（Ｐ）、イヌリン（Ｉ）、及びアガベシロップ（Ｍ）の添加を評価した。そこで、表１で示すように、本実験ではシンプレックス・セントロイド混合計画法を用いた。
【００６０】
表１  評価された、微生物集団のマイクロカプセル化用のプレバイオティクス配合
【表１】
0006312688.tif 000002
【００６１】
対応する乳酸菌の分散物と壁材料に各混合物を加え、上述の通り噴霧乾燥させた。
【００６２】
マイクロカプセル化されたら、粉末を１ｇ取り出し、攪乱しながら３０℃の滅菌水で再水和した。１ｍＬのアリコートを取り出し、段階希釈し、プレートに播種することで一番可能性の高い番号を判別した。細菌の生存率についての結果が表２に示される。
【００６３】
表２  プレバイオティクスの組み合わせ別の乳酸菌の生存率
【表２】
0006312688.tif 000003
【００６４】
この結果によって、アガベシロップをプレバイオティクスとして用いた場合、生存率が一番高く（９８％）なったことが分かる。
【００６５】
（実施例４）
サワードウの試作
手作りのパン焼きに適した、市販の白い小麦粉と、１０１０ＣＦＵ／ｇの濃度で実施例２によって得られたマイクロカプセル化細菌集団のほかに、カプセル化剤と、トレハロースと、プレバイオティクスとしてのアガベシロップとを用いた。
【００６６】
タンパク質分解酵素として、細菌由来のもの（商品名HT proteolitic 200、Enmex S.A. de C.V.、メキシコ）と、真菌由来のもの（商品名Harizyme G、Enmex S.A. de C.V.、メキシコ）とを使用した。
【００６７】
サワードウを試作するために、パン生地の収量が１５０〜１６０となるよう、小麦粉４００ｇと水１５０ｍＬを混合し生地を用意した。細菌由来のタンパク質分解酵素を０．０８ｇ（商品名HT proteolitic 200、Enmex S.A. de C.V.、メキシコ）と真菌由来のタンパク質分解酵素を０．１２ｇ（商品名Harizyme G、Enmex S.A. de C.V.、メキシコ）を添加した。両方の酵素を混練水に事前に溶かしておいた。続いて、水に懸濁させた本発明のマイクロカプセル化微生物集団を１０１０ＣＦＵ／ｇとなるように添加した。
【００６８】
通常のミキサーで８分間混ぜた上、３５℃の温度と７６％の相対湿度で、３１時間発酵させた。電気泳動分析（ウエスタンブロット法）で、発酵中のｐＨ及び発酵が終わった際のグルテン分解の度合いを観測した。結果が表３に示される。
【００６９】
表３  マイクロカプセル化細菌集団で摂取されたサワードウの分解速度
【表３】
0006312688.tif 000004
【００７０】
表のデータによると、本発明のマイクロカプセル化細菌集団とタンパク質分解酵素の組み合わせの影響として、発酵の最初の３時間以内にグルテンのグリアジン成分の強い分解率が確認された。
【００７１】
（実施例５）
アストルガのカップケーキ型の菓子パンをサワードウから乳酸発酵によって製造
実施例４によって得られたサワードウを使用して、カップケーキ型のグルテンフリーの菓子パンを製造した。バターと、マーガリンと、飴ガラス（sugar glass）とを、ミキサーのパレットを使って混ぜた。まず、混ぜ合わさるまで低速で混ぜ、その後速度を上げ、混合物に空気をなるべく多く含めるように更に２０分混ぜた。
【００７２】
３つの卵黄を少しずつ加えて完全に混ぜ合わさってから、牛乳と、調味料（オレンジ、ライム、チョコレート）と、ソルビン酸カリウムを添加した。
【００７３】
実施例４の発酵したサワードウと、トウモロコシでんぷんと、ニシュタマリゼーション（石灰水処理）された粉末と、ベーキングソーダと、ベーキングパウダーとを事前にビニール袋で混合し、上述の混合物に組み入れた。水を添加し、高速で８分間混ぜた。
【００７４】
別々に、卵白を硬くなるまで混ぜてから、泡を壊さないように中速で生地に混ぜ合わせた。
【００７５】
液体状の生地をオーブン用のトレーに載せたカップケーキの紙コップに注いで、２００℃で１０分間焼いた。
【００７６】
（実施例６）
消費者によるアストルガのカップケーキの評価
従来の生地で作られた、いわゆる無添加のカップケーキに対して、実施例５（本発明のマイクロカプセル化微生物集団とタンパク質分解酵素の組み合わせによって得られたサワードウを使用）によって調理したオレンジと、ライムと、チョコレート味のカップケーキの認容性を調査するため、消費者による評価を行った。
【００７７】
そのために、イベロアメリカナ大学のメキシコシティーキャンパスで、アストルガのカップケーキの消費者７０人を対象に調査が行われた。参加者は５０％が男性、５０％が女性、年齢が１５〜４５歳で、市販の菓子パンを少なくとも１５日ごとに食べていた。この調査の有意水準と信頼水準はそれぞれ０．０５％と９５％であった。結果が表４に示される。
【００７８】
表４  マイクロカプセル化細菌集団とプロテアーゼとの組み合わせを含んだ、発酵されたサワードウから作られたカップケーキの消費者についての調査結果
【表４】
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【００７９】
表４の結果によって、９５％（０．０５）の水準で、評価を行った特徴（外見、触感、味）のすべてについて無添加のカップケーキに有意差はなく、またオレンジ味とチョコレート味のファインの総合評価に有意差はなかったことが分かる。
【００８０】
一方、ライムカップケーキは９５％の水準で、評価を行った特徴のすべてについて自然なカップケーキに対して有意差は認められ、無添加カップケーキの方が高く評価された。
【００８１】
上述のようにセリアック病患者が摂取できるグルテンフリーの食品を目的として、サワードウにおいてのグルテン分解用のマイクロカプセル化細菌集団及びそれの製造方法を考案した。本発明の趣旨を逸脱しない範囲で詳細について種々変更可能であるので、上記実施例は、サワードウにおいてのグルテン分解用のマイクロカプセル化細菌集団及びそれの製造方法の例にすぎず、本発明を限定するものではないことが当業者に明白であることに注意されたい。
【００８２】
従って、本発明は、先行技術と特許請求の範囲にしか制限されないと解すべきである。