(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコサミノグリカンおよび活性化合物由来の結合体からなる化合物であって、前記活性化合物が官能基を介して前記グリコサミノグリカン、またはそれらの塩のカルボン酸基に結合されて共有性結合を形成し、ならびに、前記活性化合物がレナリドマイド、ゲムシタビン、セレコキシブ、およびニメスリド中のニトロ基がアミノ基に還元された化合物からなる群より選択され、前記グリコサミノグリカンがヒアルロン酸であり、前記共有性結合がアミド結合による直接的結合である、化合物。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸が、１０ｋＤａ〜２０００ｋＤａの範囲内に含まれる平均分子量を有する、請求項１に記載のグリコサミノグリカンおよび活性化合物由来の結合体からなる化合物。
【請求項３】
がんの治療に使用するための、請求項１または２に記載のグリコサミノグリカンおよび活性化合物由来の結合体からなる化合物。
【請求項４】
前記がんが、肝がん、肝細胞がん、胆管がん、胆管細胞がん、大腸がん、腺がん、リンパ腫と扁平上皮がん、乳がん、腺管がん、小葉がん、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、腎細胞がん、尿路上皮細胞がん、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、または膵臓がんである、請求項３に記載のグリコサミノグリカンおよび活性化合物由来の結合体からなる化合物。
【請求項５】
がんの治療用の医薬組成物を調製するための、請求項１または２に記載のグリコサミノグリカンおよび活性化合物由来の結合体からなる化合物の使用。
【請求項６】
前記がんが、肝がん、肝細胞がん、胆管がん、胆管細胞がん、大腸がん、腺がん、リンパ腫と扁平上皮がん、乳がん、腺管がん、小葉がん、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、腎細胞がん、尿路上皮細胞がん、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、または膵臓がんである、請求項５に記載のグリコサミノグリカンおよび活性化合物由来の結合体からなる化合物の使用。
【請求項７】
請求項１または２に記載のグリコサミノグリカンおよび活性化合物由来の少なくとも一つの結合体を、少なくとも一つの賦形剤および／または希釈剤と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項８】
前記組成物ががんを治療するためのものである、請求項７に記載のグリコサミノグリカンおよび活性化合物由来の少なくとも一つの結合体を含む医薬組成物。
【請求項９】
前記がんが、肝がん、肝細胞がん、胆管がん、胆管細胞がん、大腸がん、腺がん、リンパ腫と扁平上皮がん、乳がん、腺管がん、小葉がん、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、腎細胞がん、尿路上皮細胞がん、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、または膵臓がんである、請求項８に記載のグリコサミノグリカンおよび活性化合物由来の少なくとも一つの結合体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載のグリコサミノグリカンおよび活性化合物由来の結合体からなる化合物を調製する方法であって、
Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシサクシンイミドと共に、ヒアルロン酸であるグリコサミノグリカンの水溶液を調製する工程と、
レナリドマイド、ゲムシタビン、セレコキシブ、またはニメスリド中のニトロ基がアミノ基に還元された化合物の有機溶媒を調製する工程と、
前記溶液の両方を、室温で、少なくとも１０時間混合撹拌して、混合溶液を得る工程と、  前記混合溶液を数日間透析する工程と、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療剤と結合したグリコサミノグリカンからなる化合物ならびにその調製方法および使用にも関連する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、細胞機能および相互作用を刺激に応答して制御する相互作用分子の動的集合体である。細胞外マトリックス高分子のクラスの１つであるグリコサミノグリカンは、広い範囲の正常および異常両方の生体プロセス（細胞移動、分化、増殖、免疫応答、および細胞骨格形成を含むもの）に関与することが知られた分子である。
【０００３】
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、分岐の無い鎖状ポリマーであって、二糖反復単位から構成されている。これらの二糖単位は常に、アミノ糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）（ほとんどの場合では、硫酸化されているもの）を、第二の糖（通常は、ウロン酸（グルクロン酸、イズロン酸）であるもの）と共に含む。ＧＡＧが高度に負に帯電しているのは、それらの糖残基のほとんどにカルボキシル基または硫酸基が存在し、したがって、ＧＡＧの親水性が強いからである。ＧＡＧは、高度に伸長した立体構造をとり、空間を埋めて圧縮力に抵抗性のマトリックスを形成する傾向がある。ＧＡＧの４種類の主要グループは、それらの糖残基、これらの残基間の連結タイプ、および、硫酸基の数と位置により識別されてきた。それらのグループには、（１）ヒアルロナン、（２）コンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸、（３）ヘパラン硫酸およびヘパリン、並びに（４）ケラタン硫酸が含まれる。
【０００４】
ヒアルロナン（ヒアルロン酸、ヒアルロネート、またはＨＡとも呼ばれる）は、ＧＡＧの中で最も単純である。ヒアルロナンは、硫酸化されていない二糖単位（特に、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸）の規則的反復配列からなる。その分子量は、４００ダルトン（二糖）から数百万ダルトン以上の範囲にある場合がある。ヒアルロナンは、あらゆる組織（例、皮膚、軟骨、および眼、ならびに全てでなくてもほとんどの場合、動物成体中の体液）中に種々の量で見出され得る。ヒアルロナンは、初期胚に特に多く存在する。関節軟骨中では、ＨＡは、軟骨機能に重要な大きな集合体を形成することができる。さらにまた、細胞運動と免疫細胞接着は、細胞表面受容体ＲＨＡＭＭ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ（ヒアルロナンにより媒介される運動のための受容体））およびＣＤ４４により媒介される。
【０００５】
ＨＡは、その合成途上で、伸長するポリマーが細胞表面内膜を貫通して細胞の外へと押し出されながら、その膜において直接合成される。その合成は、単一のタンパク質酵素ヒアルロナン合成酵素（ＨＡＳ）により媒介される。対照的に、他のＧＡＧは、細胞の内部にあるゴルジ体中で、おそらく何らかのコアタンパク質と結合して合成され、そして、その後エキソサイトーシスにより放出される。脊椎動物の生体組織内におけるＨＡ分解は、ヒアルロニダーゼおよび順次糖を除去するエキソグリコシダーゼ類により媒介される。哺乳類型ヒアルロニダーゼは、加水分解活性およびトランスグリコシダーゼ活性の両者を有し、ＨＡおよびコンドロイチンを分解することができる。結合組織では、ＨＡと結合する水和水は、組織間の空間を作り、従って、細胞の動きと増殖を媒介する能力のある環境を創出する。ＨＡは細胞運動性と関連する生命現象（迅速な発生、再生、修復、胚形成、胚発生、創傷治癒、血管新生、および腫瘍形成を含むもの）において重要な役割を果たす。
【０００６】
ＣＤ４４（Ｐｇｐ−１、Ｈｅｒｍｅｓ−３、ＨＣＡＭ、ＥＣＭＲＩＩＩとしても知られる）は、広範囲に発現される糖タンパク質であって、その分子量は、８５〜９０ｋＤａである。ＣＤ４４は、グリコサミノグリカンであるヒアルロン酸（ＨＡ）の主要細胞表面受容体である。ＣＤ４４は、特異的にＨＡに結合するが、コンドロイチン硫酸含有プロテオグリカンも認識可能である。ＣＤ４４は、種々の細胞機能および生理学的機能（ＨＡへの接着とＨＡ上の移動、ＨＡ分解、および腫瘍転移を含むもの）において役割を果たす。ＣＤ４４はまた、細胞外マトリックスの結合、細胞移動、リンパ球活性化、リンパ球ホーミング、および気管支平滑筋細胞の増殖にも役割を果たすことが示されている（非特許文献１）。受容体であるＣＤ４４は、その細胞外ドメインの可変領域において、複雑なパターンの選択的スプライシングを示す。ＣＤ４４は、ＨＡに対する特に重要な白血球受容体であるようで、従って、喘息の発病に役割がある可能性がある。さらに、ＨＡのレベル（対照群のマウスにおける実験的喘息の間に増加したもの）は、抗体で治療したマウス中では顕著に減少した。このことは、ＨＡ代謝（特に、高分子量ＨＡを炎症性を促進する低分子量型に分解すること）におけるＣＤ４４の役割を支持する。このことが特に重要なのは、ＨＡ由来のオリゴ糖がＴｏｌｌ様受容体に結合およびそれを活性化することができるからである。明らかなことは、この結果の最も重要な点が、抗ＣＤ４４治療の有する薬効が顕著に大きいことである。
【０００７】
ＨＡ−ＣＤ４４相互作用は、分化、炎症、Ｔ細胞リクルートメントおよび活性化、肺炎、ならびに腫瘍増殖および転移に重要な役割を果たす場合がある。選択的にスプライシングされたＣＤ４４転写産物の発現が変化することが、胃がんを含む多くのがんで見出される（非特許文献２）。
【０００８】
受容体ＣＤ４４の過剰発現により、悪性腫瘍細胞が、正常な結合組織または間葉系細胞よりも、比率として多くのバイオコンジュゲート（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を選択的に取り込む場合もある。いくつかの研究では、ＨＡ合成および取り込みが増加することと、がん進行および転移能とを関係づけている。ある種の腫瘍（肺に見られる多くのものを含む）は、ＣＤ４４細胞表面マーカーを過剰発現する。乳がん細胞は、正常組織よりもＨＡ取り込みが多いことが知られ、多剤耐性に寄与する主要な因子であるＰ−糖タンパク質高発現にＨＡを必要とする。さらにまた、浸潤性乳がん細胞は、ＣＤ４４（ＨＡに対する主要な受容体）を過剰発現し、そしてその増殖に関しては、ＣＤ４４により内部に移行したＨＡの濃度が高いことに依存する。従って、ＨＡと化学療法剤とのナノ結合体は、リンパ性転移に対して効力がある可能性がある（非特許文献３）。
【０００９】
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）およびシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−２選択的阻害剤は、疼痛、炎症、および発熱に一般的に使用される治療剤群である。最近、いくつかのＮＳＡＩＤおよび選択的ＣＯＸ−２阻害剤が、腫瘍形成プロセス全体を通して複数の生物学的事象に関与することにより抗がん活性を有する場合もあることが、多くの実験で示唆されてきている。例えば、疫学的研究は、アスピリンを定期的に使用することが、がん、特に大腸がんの発症リスクを軽減することを示している（非特許文献４）。また別に、ＣＯＸ−２アンタゴニスト（例、セレコキシブ（Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）、ロフェコキシブ（Ｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）、ニメスリド（Ｎｉｍｅｓｕｌｉｄｅ）、メロキシカム（Ｍｅｌｏｘｉｃａｍ）およびエトドラク（Ｅｔｏｄｏｌａｃ））は、抗がん活性も有する場合もあることも判明している（非特許文献５）。さらに、ＣＯＸ−２は、多くの前悪性、悪性、及び転移性ヒトがんにおいて慢性的に過剰発現され、そして、過剰発現のレベルは、いくつかのがんにおける浸潤性、予後、および生存率に有意に相関することが示されている（非特許文献６）。最大効力は、典型的には、ＣＯＸ−１関連毒性により、用量的に限定される。しかしながら、ＣＯＸ−２阻害剤は、大腸がん、皮膚がん、肺がん、膀胱がん、および乳がんの動物モデルのいくつかで腫瘍抑制効果を有することが示されている（非特許文献７）。
【００１０】
特許文献１は、炎症の治療またはがん転移の検出におけるＣＤ４４の使用を記載する。その著者たちは、ＣＤ４４が炎症症状においてアップレギュレーションされ、ＣＤ４４ペプチドがＴ細胞活性化を阻害することができることを示す。ＣＤ４４による転移の阻害に関するデータまたは請求項は提示されておらず、腫瘍増殖または血管新生を阻害するためのＣＤ４４の使用に対する請求項も作成されていない。特許文献２は、がんおよび血管新生依存性疾患を阻害するための（ＣＤ４４を含む）ＨＡ結合タンパク質およびペプチドの使用を開示する。この特許出願は、メタスタチン（軟骨連結タンパク質の３８ｋＤａ断片）およびこの断片由来のＨＡ結合ペプチドを使用して、Ｂ１６マウスメラノーマの肺転移およびルイス肺癌を阻害する。ＨＡ結合ペプチドの場合、ニワトリＣＡＭ上のＢ１６メラノーマの増殖およびＨＡ上の内皮細胞移動が阻害された。両方の特許出願においては、ＨＡ結合ペプチドの使用は、ヒアルロン酸に結合する能力と直接的に関連付けされている。
【００１１】
特許文献３は、可溶性組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメイン（ＣＤ４４ＨＡＢＤ）が、ニワトリとマウスにおいてインビボで血管新生を阻害し、従って、様々な起源のヒト腫瘍増殖を阻害することを示す。この発明は、可溶性で糖鎖付加がないＣＤ４４組換えタンパク質を、血管系細胞表面受容体の標的化に基づいた血管新生阻害剤の新規クラスとして開示する。
【００１２】
従って、上記で引用した先行技術は、ＣＤ４４の潜在的使用を開示し、任意の効果がＨＡ−ＣＤ４４相互作用に依存する場合があることを示唆する。結果、ＣＤ４４−ＨＡ結合体に現在までに帰する全ての効用は、ヒアルロン酸に結合する能力に直接依存する。
【００１３】
しかしながら、いくつかの治療剤は、いまだ、ＨＡに結合することに成功しておらず、さらなる実験を実施して、活性化合物を患部に運ぶ担体としてのＨＡの潜在的有用性を確認する必要がある。特に、先行技術は、細胞表面受容体ＣＤ４４と、活性化合物とＨＡとの結合体との相互作用が、ＣＤ４４の過剰発現を特徴とする疾患においてそのような活性化合物を標的に運搬して、同化合物の効果的治療上の改善を得るために有利に利用可能であることを示している。
【００１４】
例えば、がん等の病理に関しては、事実、腫瘍性細胞に対する効果的な細胞傷害性効果と、より安全なプロフィールを有する正常細胞における細胞傷害性効果とをバランスする入手可能な治療ツールを所持したいと感じる必要性が未だ存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第９４／０９８１１号
【特許文献２】国際公開第９９／４５９４２号
【特許文献３】米国特許第８，１９２，７４４号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｇｕｎｔｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａ  ｎｅｗ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＣＤ４４  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｏ  ｒａｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ，Ｃｅｌｌ，５；６５（１）：１３−２４
【非特許文献２】Ｆ  Ｒｅｉｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４４  Ｖａｒｉａｎｔ  Ｅｘｏｎｓ  ｉｎ  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｔｉｓｓｕｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１４：１１−１６
【非特許文献３】Ｅｌｉａｚ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ＣＤ４４：ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  ｋｉｌｌ  ＣＤ４４−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１（６）：２５９２−６０１
【非特許文献４】Ｓａｎｄｌｅｒ  ＲＳ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ａｓｐｉｒｉｎ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｍａｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｖｉｏｕｓ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄ．，３４８：８８３−８９０
【非特許文献５】Ｙａｍａｚａｋｉ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｓｈｏｗ  ａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５３１（２）：２７８−８４
【非特許文献６】Ｄａｎｎｅｎｂｅｒｇ  ＡＪ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ：ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｉｓｅ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，４（６）：４３１−６
【非特許文献７】Ａｌａｎｅ  Ｔ．Ｋｏｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ：Ａ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＯＸ−２  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，９（２  Ｓｕｐｐｌ）：２８−３５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、活性化合物とＨＡとを結合することに基づく新規化合物であって、細胞表面受容体ＣＤ４４を過剰発現する疾患においてそのような活性化合物を患部に運搬するのに適するものを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、従って、治療剤とグリコサミノグリカンとが結合している化合物であって、前記治療剤がＣＤ４４の発現と高度に関連するがん疾患を治療するために用いられる化合物を提供する。
【００１９】
第一の観点では、本発明の目的は、グリコサミノグリカンおよび活性化合物由来の結合体からなる化合物であって、前記活性化合物が官能基を介して前記グリコサミノグリカン、その誘導体、またはそれらの塩のカルボン酸基に結合されて共有性結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を形成し、ならびに、前記活性化合物がレナリドマイド（Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、およびＣＯＸ−２アンタゴニストからなる群より選択される、化合物である。
【００２０】
本発明に係る結合体の前記グリコサミノグリカンは、好ましくは、ヒアルロン酸である。
【００２１】
さらにまた、本発明に係るグリコサミノグリカン結合体は、好ましくは、がん疾患を治療するための使用に関する。
【００２２】
従って、第二の観点では、本発明のさらなる目的は、グリコサミノグリカンおよび活性化合物由来の結合体からなる化合物の使用であって、前記活性化合物が官能基を介して前記グリコサミノグリカン、その誘導体、またはそれらの塩のカルボン酸基に結合されて共有性結合を形成し、ならびに、がんの治療のため及び前記医薬治療用の医薬組成物の調製のために、前記活性化合物がレナリドマイド、ゲムシタビン、およびＣＯＸ−２アンタゴニストからなる群より選択される、使用である。
【００２３】
さらに別の観点では、本発明の目的は、グリコサミノグリカンおよび活性化合物由来の結合体からなる化合物を調製する方法であって、前記活性化合物が官能基を介して前記グリコサミノグリカン、その誘導体、またはそれらの塩のカルボン酸基に結合されて共有性結合を形成し、ならびに、前記活性化合物がレナリドマイド、ゲムシタビン、およびＣＯＸ−２アンタゴニストからなる群より選択される、方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
本発明を十分説明するために、その実施形態への参照を、添付した図面中で解説する。本明細書に付属するこれらの図面は、本明細書の一部を成す。しかしながら、添付した図面は、本発明の範囲を限定するものとして考慮されない。
【図１】図１は、正常および傷害大腸組織における蛍光インデックスによりＨＡの親和力を示す。
【図２Ａ】図２は、異なる時間経過における、ＨＣＴ１５細胞株およびＨＴ２９細胞株上に作用するＨＡ−色素化合物の蛍光の結果を示す。図２Ａは、６時間でのＨＣＴ１５細胞株を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、１２時間でのＨＣＴ１５細胞株を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、６時間でのＨＴ２９細胞株を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、１２時間でのＨＴ２９細胞株を示す。
【図３】図３は、ＨＡ−レナリドマイド結合体の構造を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、遊離レナリドマイド、ＨＡ、およびＨＡ−レナリドマイド結合体のＨＴ２９細胞株への細胞傷害性効果を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、遊離レナリドマイド、ＨＡ、およびＨＡ−レナリドマイド結合体のＨＣＴ１５細胞株への細胞傷害性効果を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、真正ニメスリド（−ＮＯ２基を有するもの；ＮｉＮＯ２）の構造および水素添加修飾産物（−ＮＨ２基を有するもの；ＮｉＮＨ２）を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＨＡ−ＮｉＮＨ２結合体の構造を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ＨＴ２９またはＨＣＴ１５のいずれかにおける、ＮｉＮＯ２およびＮｉＮＨ２の細胞傷害性効果を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＨＴ２９におけるＮｉＮＯ２、ＮｉＮＨ２、ＨＡ、およびＨＡ−ＮｉＮＨ２結合体の細胞傷害性効果を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、３種類のグループの各々のマウスの２４日間の総体重を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、コントロール、ＮｉＮＯ２、およびＨＡ−ＮｉＮＨ２のグループによる腫瘍抑制効果を示す。
【図８】図８は、ＨＡ−セレコキシブの合成手順およびその構造を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ＨＡ、セレコキシブ、およびＨＡ−セレコキシブ結合体のＨＴ２９細胞株への細胞傷害性効果を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＨＡ、セレコキシブ、およびＨＡ−セレコキシブ結合体のＧＢＭ８４０１細胞株への細胞傷害性効果を示す。
【図１０】図１０は、ＨＡ−ゲムシタビンの合成手順およびその構造を示す。
【図１１】図１１は、ＨＡ−ゲムシタビン結合体のＡ５４９細胞株への細胞傷害性効果を示す。
【図１２】図１２は、ＨＡ−ゲムシタビン結合体のＧＢＭ８４０１細胞株への細胞傷害性効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の目的、利点、および新規特徴は、付随する図面と組合わせた場合に、以下の詳細な説明からより明らかとなるであろう。
【００２６】
一般的に、経口投与または循環系に注射された治療剤は、標的治療部位に直接到達しなければならず、したがって、標的疾患および正常器官への薬効が非常に似ているのは、その濃度と特異性がその標的部位でそれほど高くないからである。よって、有効量の活性化合物の投与は、多くの症例では、効果的でなくなり、そして、同活性化合物の安全性プロフィールにより制限される。
【００２７】
良好な安全性プロフィールを有する同活性化合物を併用して治療効力を改善するために、戦略の１つは、治療剤を担体と共有結合することを通して、疾患部位により選択的に標的化するようその治療剤を改変することである。このことは、以前から期待されているのであるが、抗腫瘍療法の分野で特に感じる必要性である。
【００２８】
この目的で、本発明者は、活性物質を標的化して運搬するために、ヒアルロン酸（ＨＡ）とその受容体ＣＤ４４との間の相互作用を活用する考えに想到した。
【００２９】
正常組織または器官に比して標的部位上に治療剤を比較的高濃度で維持するという考えは、ＨＡに関する長期間の研究と実験の後に、本発明者が確立したものである。
【００３０】
本発明を生み出した結果を、実施例に詳細に記載し、以下に簡単に要約する。
【００３１】
事実、様々な平均分子量（ＭＷ）のヒアルロン酸は、正常組織よりも傷害組織において接着インデックスが高く、そして、低分子量のＨＡは高分子量のＨＡよりも性能がよいことを示す結果の支持が、本発明に見出される。特に、傷害大腸組織に接着する３種類の平均分子量のＨＡ間の差異を比べる図１に示されるように、３５０ＫＤａのＨＡの傷害大腸組織への接着の蛍光インデックスは、他の２種類の平均分子量（２０００ＫＤａ＝２ＭＤａおよび１０００ＫＤａ＝１ＭＤａ）のＨＡよりも高かった。さらに、１ＭＤａのＨＡの傷害またはさらに正常大腸組織への接着の蛍光インデックスは、２ＭＤａのＨＡよりも高かった。ＨＡが炎症部位により特異的に接着することができることをこの結果は確認した。そして、そのことにより、本発明者は本発明をさらに発明し、おそらくＨＡとその細胞表面受容体ＣＤ４４とが相互作用することによるとされる、ヒアルロン酸の組織への接着というこの特有の特徴が、このグリコサミノグリカンが他の化合物と結合される場合に維持可能であるかどうかを検証する。
【００３２】
従って、ＨＡを標的化運搬ビヒクルとして使用して、治療剤をＣＤ４４が多く存在する部位に届けることができるかどうかを検証するために、本発明者はその治療剤とＨＡをさらに結合する。前記したように、炎症、感染、またはがんが存在する状況でＣＤ４４が過剰発現される場合、関連治療剤は、リガンドであるＨＡが受容体であるＣＤ４４に付着することに起因して、標的部位に容易に到達し、そして、標的部位で比較的高濃度に保持可能である。炎症部位またはＣＤ４４が多く存在する部位へのＨＡの接着効果と共に、治療剤結合体は、標的部分上で特に凝集し、その部位上で治療剤が比較的高濃度であることに起因して治療効力を増強することが期待される。従って、治療剤結合体は、利用される治療剤の量を適宜減少させて、より良好な安全性プロフィールを持つようになる。
【００３３】
治療剤または色素が、うまくＨＡと結合したかどうかを確認し、そして、ＨＡ付着効果をさらに確認するために、本発明の発明者は、実験（色素をＨＡに結合（ＨＡ−色素）し、細胞株およびマウスを別々に処理することを含むもの）を実施した。図２Ａおよび２Ｂは、様々有効時間での細胞株ＨＣＴ１５（ＣＤ４４の量が少ない結腸直腸腺がん）に関する実験を示す。そして、図２Ｃおよび２Ｄは、様々有効時間での細胞株ＨＴ２９（ＣＤ４４の量が多い結腸直腸腺がん）に関する実験を示す。ＨＴ２９の結果（図２Ｃおよび図２Ｄ）は、ＨＡ−色素の結合に成功し、そして、それが、ＨＴ２９におけるＣＤ４４が多く存在する領域に付着し（図２Ｃ）、ＨＴ２９細胞中へもさらに侵入した（図２Ｄ）ことを示す。このことは、本発明の思想が適正かつ効果的であることを意味し、また、治療剤または色素がＨＡに結合可能であり、そのＨＡがＣＤ４４に結合する能力を保持していることをも意味する。
【００３４】
ＨＴ２９およびＨＣＴ１５細胞株に遊離色素およびＨＡ−色素を付着させる条件をマウスに４週間実施した。遊離色素を、マウスの尾静脈に注射した。その結果は、二種類の異なるＣＤ４４発現がん細胞は、付着結果に差異が全くないことを示した。ＨＴ２９の付着領域の比は５０．１５％である一方、ＨＣＴ１５は４９．８６％である。しかしながら、ＨＡ結合色素をマウスの尾静脈に注射した場合は、よりＣＤ４４を発現するがん細胞ＨＴ２９は、ＨＡ結合色素の濃度が有意に高いことを示す一方で、よりＣＤ４４の発現が低いＨＣＴ１５は非常に限定された結果を示した。ＨＴ２９の付着領域の比は７４．１５％である一方、ＨＣＴ１５は２５．８５％である。その結果が示し得るのは、ＨＡと色素を結合させた場合、ＨＡがＣＤ４４が多く存在する部位に付着するために、色素濃度が上昇したことである。
【００３５】
ＣＤ４４とよく関連する疾患には、がん、感染症、および炎症が含まれる。本発明の好ましい実施形態では、例えば、がんには、大腸がん、線維肉腫、乳がん、腺がん、および脳悪性グリオーマが含まれる。
【００３６】
本明細書と特許請求の範囲では、本発明で使用される用語「治療剤」、「活性化合物」、または「薬剤」は、抗がん剤を含んでもよい。抗がん剤の大多数は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、および他の抗がん剤に区分可能である。
【００３７】
好ましい実施形態は、レナリドマイド、ゲムシタビン、セレコキシブ、およびニメスリドを含む抗がん剤との結合である。
【００３８】
ニメスリドは、広く用いられる選択的ＣＯＸ−２アンタゴニストであって、他のＮＳＡＩＤと比較すると胃腸での安全性が優れているものの１つである。最近では、ニメスリドは、ｐ２１（がん抑制遺伝子）の発現を誘導し、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）関連経路（がん細胞の細胞成長、細胞増殖、細胞運動、細胞生存、タンパク質合成に必須の経路）を阻害することによって、抗がん剤として働くと想定されている（Ｚｈａｎｇ  ＹＪ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ｍＴＯＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ  ａｎｄ  Ｎｉｍｅｓｕｌｉｄｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｖｉａ  ａ  ＣＯＸ−２  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ．Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ．，１８（２）：５８０−８）。
【００３９】
レナリドマイド（サリドマイドの４−アミノ−グルタミル類似体）は、その能力を改善しその催奇形性および神経学的副作用を減少させるようにサリドマイドの化学構造を改変して派生させた合成化合物である（Ｖ．Ｋｏｔｌａ，ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２：３６）。レナリドマイドは、抗血管新生活性、抗腫瘍形成活性、および免疫調節活性があることが示されている。それら活性は、癩性結節性紅斑（ＥＮＬ）（Ｊ．Ｓｈｅｓｋｉｎ，１９８０，Ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｅｐｒａ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｅｐｒｏｍａｔｏｕｓ  ｌｅｐｒｏｓｙ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，６：３１８−３２２）中および自己免疫疾患（Ｅ．Ａｔｒａ  ａｎｄ  Ｅ．Ｉ．Ｓａｔｏ，１９９３，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，１１（５）：４８７−９３）中の個々の事例に基づく免疫調節活性により理解されてきた。レナリドマイドは、抗血管新生特性を有することが判明し、各種血液悪性腫瘍および固形悪性腫瘍（例、脊髄形成異常症、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、原発性全身性アミロイドーシス、非ホジキンリンパ腫、骨髄様化生を伴う骨髄線維症、およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症）に対する活性を有する治療剤として見られるようになった（Ｖｅｎｕｍａｄｈａｖ  Ｋｏｔｌａ，ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２：３６）。各種悪性症状におけるレナリドマイドの治療剤としての潜在能力に関する臨床的証拠は、様々な血液悪性腫瘍における各種メカニズムを通して、インビトロおよび動物モデルで示されてきた薬動力学的効果の大きさと一貫性がある。レナリドマイドは、がん抑制遺伝子ｐ２１をアップレギュレートし、従って、がん細胞のアポトーシスを誘導することができる（Ｖｅｒｈｅｌｌｅ  Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ  ａｎｄ  ＣＣ−４０４７  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｗｈｉｌｅ  ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｎｏｒｍａｌ  ＣＤ３４＋  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６７（２）：７４６−５５）。レナリドマイドは、多発性骨髄腫において血管新生因子ＶＥＧＦおよびインターロイキン−６（ＩＬ−６）の発現を有意に減少させ、したがって、血管新生を少なくして、それゆえ多発性骨髄腫における臨床的治療作用に寄与することも示された（Ｇｕｐｔａ  Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌ��ｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１５（１２）：１９５０−６１）。
【００４０】
本発明の目的は、ＨＡのカルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアミノ基にリンカーもしくはスペーサーを用いるかまたは用いずに、前記治療剤とＨＡを結合または抱合して、特異的場所および特異的時間で作用効果を実現することである。従って、ＣＤ４４が多く存在する特異的部位に治療剤を運ぶ標的化運搬ビヒクルとしてのＨＡは、より良好な治療効力および安全性を生み出すことができる。
【００４１】
本明細書中で一般的に使用される用語「リンカー」または「スペーサー」は、化合物の二つの要素を連結する有機部分を意味する。リンカーは、典型的には、直接的結合、原子（例、酸素もしくは硫黄）、またはユニット（例、ＳＳ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨもしくは原子鎖（例、置換もしくは非置換アルキルであって、一若しくは複数のメチレンがＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、ＮＨ、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）を間に有するか、もしくはそれらを末端に有するもの）を含む。本発明の用語「リンカー」または「スペーサー」は、存在しない場合もあるが、治療剤とＨＡとの間に存在する任意の化学化合物であって、化学的、酵素学的に除去される場合もあるし、または、自発的に分解する場合もあるものを示す。この用語は、また、治療剤を連結するために有用な少なくとも一つの他の基（例、アミノ基、チオール基、さらに、カルボキシ基）を含む。リンカーまたはスペーサーは、ポリペプチド、ペプチド、または脂質であってもよい。
【００４２】
適するリンカーまたはスペーサーは、例えば、直鎖もしくは分岐した脂肪族、芳香族、または芳香脂肪族のＣ２〜Ｃ２０ジカルボン酸、アミノ酸、ペプチドである。
【００４３】
リンカーの役割は、存在する場合はいつでも、ヒアルロン酸と治療剤との間のアームまたはスペーサーを作り出すことにある。リンカーは、一方の側で、アミド、カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアミノ基による連結を介してＨＡに繋がれ、他の側では、任意の可能な共有型結合を介して治療剤に繋がれる。
【００４４】
リンカーまたはスペーサーがジカルボン酸である場合、治療剤とエステル結合を形成するカルボン酸基は、化合物のヒドロキシル基に対してであってもよい。リンカーまたはスペーサーがジヒドラジドである場合、ＨＡとアミド結合を形成するアミノ基は、ＨＡの使用していないカルボン酸基に対してであってもよい。好ましいリンカーまたはスペーサーは、治療剤に対してはコハク酸、ＨＡに対してはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）である。
【００４５】
好ましい実施形態において、本発明は、グリコサミノグリカン（好ましくはヒアルロン酸）および活性化合物由来の結合体からなる化合物であって、前記活性化合物が官能基を介して前記グリコサミノグリカン、その誘導体、またはそれらの塩のカルボン酸基に結合されて共有性結合を形成し、ならびに、前記活性化合物がレナリドマイド、ゲムシタビン、およびＣＯＸ−２アンタゴニストからなる群より選択される、化合物である。
【００４６】
活性化合物であるレナリドマイド、ゲムシタビン、または好ましいＣＯＸ−２アンタゴニストであるニメスリドもしくはセレコキシブは、好ましくは直接的に、ＨＡの機能的カルボン酸基と活性化合物のＮＨ２基を介して結合可能である。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態では、ＨＡの機能的カルボキシル基の１つと活性化合物の基の１つとの間にリンカーが直接または間接的のいずれかで存在する共有性結合は、アミド性結合またはエステル結合のいずれかである場合がある。
【００４８】
リンカーを介した間接的結合の場合、前記リンカーは、ポリペプチド、ペプチド、脂質、アミノ酸、あるいは、直鎖もしくは分岐した脂肪族、芳香族、または芳香脂肪族Ｃ２〜Ｃ２０ジカルボン酸から選択される。
【００４９】
結合用の好ましいＨＡの平均分子量の範囲は１０ｋＤａ〜２０００ｋＤａを含み、その結合はＨＡのカルボキシル基の少なくとも４０％に関与する。
【００５０】
本発明に係るグリコサミノグリカン結合体は、好ましくは、がん疾患を治療するための使用に関する。そして、本発明の最も好ましい実施形態において、そのがん疾患は、肝がん、肝細胞がん、胆管がん、胆管細胞がん、大腸がん、腺がん、リンパ腫と扁平上皮がん、乳がん、腺管がん、小葉がん、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、腎細胞がん、尿路上皮細胞がん、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、または膵臓がんから選択される。
【００５１】
従って、本発明は、抗がん剤結合体（ＨＡ−レナリドマイド、ＨＡ−ゲムシタビン、ＨＡ−ニメスリド、およびＨＡ−セレコキシブ）であって、前記レナリドマイド、ゲムシタビン、およびセレコキシブが、それぞれレナリドマイドの−ＮＨ２基とＨＡの−ＣＯＯＨ基との間にアミド結合を形成してＨＡと結合されるもの、さらに、ニメスリドに関しては、−ＮＯ２基が−ＮＨ２基に改変されて、したがって、ニメスリドがアミド結合を介してＨＡの−ＣＯＯＨ基に共有結合されて、ＨＡ−ＮｉＮＨ２結合体を形成するものを提供する。ＨＡ−レナリドマイド結合体の構造を図３に示す。真正ニメスリド（ＮｉＮＯ２）および水素添加産物ＮｉＮＨ２の構造を図５Ａに示し、ＨＡ−ＮｉＮＨ２結合体の構造を図５Ｂに示す。ＨＡ−セレコキシブ結合体の構造を図８に示す。ＨＡ−ゲムシタビン結合体の構造を図１０に示す。
【００５２】
ある実施形態では、本発明の結果は、ＣＤ４４が豊富な細胞株（ＨＴ２９）では、ＨＡ−レナリドマイド結合体がレナリドマイドまたはＨＡがそれぞれ示すよりも有意に高い細胞傷害性効果を示し（図４Ａ）、しかしながら、この相乗効果の傾向が細胞株ＨＣＴ１５ではそれほど顕著ではない（図４Ｂ）ことを示した。本発明の結果は、ＨＡ−レナリドマイド処理下で、ＣＤ４４の量がより少ないＨＣＴ１５における細胞生存率が、ＣＤ４４が多く存在するＨＴ２９よりも高い傾向にあることを示し、それは、ＣＤ４４が豊富に存在する細胞株ＨＴ２９がＨＡ−レナリドマイド処理にずっと感受性があることを意味する。しかしながら、細胞生存率へのレナリドマイドの効果は両細胞株においてほぼ同一である。この結果が示すのは、レナリドマイドはＣＤ４４と相互作用せず、同等の治療剤量において比較すると、ＨＡがまさに、共に結合させるとレナリドマイドの治療効力を増強することができることである。
【００５３】
別の実施形態では、本発明の結果は、真正ニメスリド（ニトロ官能基−ＮＯ２を有するもの）の細胞傷害性効果は、水素添加修飾産物（アミン官能基−ＮＨ２を有するもの）の効果よりも、ＨＴ２９またはＨＣＴ１５のいずれにおいても、特に高用量において、一般的に良好であることを示す（図６Ａ）。しかしながら、ＮｉＮＨ２をＨＡと結合させる場合、ＨＡ−ＮｉＮＨ２の細胞傷害性は、ＮｉＮＨ２またはＮｉＮＯ２単独のいずれのものよりも有意に高い（図６Ｂ）。この結果は、レナリドマイドと結合したＨＡの実施形態と全て同じである。従って、抗がん剤の細胞傷害性効果は、ＨＡと結合させることにより増強可能である。
【００５４】
さらにまた、動物試験の実施形態では、本発明の結果は、ＨＡ−ＮｉＮＨ２の腫瘍抑制効果はＮｉＮＯ２またはコントロール群のものよりも強力であることを示す（図７Ｂ）。この結果は、３種類のグループのマウスの各々の平均体重は、２４日の範囲ではほとんど同じであり（図７Ａ）、体重減少のような有意な副作用がないことを示すことを示した。しかしながら、コントロール、ＮｉＮＯ２、およびＨＡ−ＮｉＮＨ２の各グループ間で比較すると、腫瘍体積は有意に異なっていた。ＨＡ−ＮｉＮＨ２グループは、ニメスリドまたはコントロール群のいずれもが有するよりも優れた腫瘍抑制効果を有している（図７Ｂ）。この結果は、本発明のＨＡ−ＮｉＮＨ２結合体がＮｉＮＯ２単独よりも優れた治療効果を有することを示す。
【００５５】
ＨＡ−セレコキシブの細胞傷害性効果は、ＨＴ２９細胞およびＧＢＭ８４０１細胞においてＨＡおよびセレコキシブ単独よりも良い傾向であることを、結果は示した（図９Ａおよび９Ｂ）。そして、ＨＡ−ゲムシタビンの細胞傷害性効果がＡ５４９細胞（図１１）およびＧＢＭ８４０１細胞（図１２）において増加するという傾向を、結果は示した。
【００５６】
まとめると、ＨＡと結合したレナリドマイドおよびニメスリドの抗腫瘍効力は、レナリドマイドおよびニメスリド単独のものと比較すると、それぞれ、細胞傷害性効果および腫瘍抑制効力が有意に向上した。前記結果が示すのは、本発明が（レナリドマイドおよびニメスリドを含む）がん治療薬の治療効果を増強するのに多大に貢献するということである。
【００５７】
疾患を治療するため、本発明の好ましい実施形態の処方剤または投与形態は、眼、耳、口、鼻、気道、胃腸管、循環系、局所への使用のために投与する投与形態を処方するために、賦形剤を含む。より好ましい実施形態の経口投与形態は、固形投与形態、（限定はされないが懸濁剤を含む）溶液、（限定はされないが、放出制御錠剤を含む）錠剤、および（限定はされないが腸溶コーティングカプセルを含む）カプセル剤からなる群より選択される。より好ましい実施形態の胃腸管投与形態は、固形投与形態、灌流、浣腸剤、坐薬、および（限定はされないが懸濁剤を含む）溶液からなる群より選択される。より好ましい実施形態の循環系または全身性投与形態は、静脈内（ＩＶ）、筋中（ＩＭ）および皮下（ＳＣ）からなる群より選択される。より好ましい実施形態の局所投与形態は、灌流、浣腸剤、坐薬、スプレー剤、吸入剤、およびドロップ剤からなる群より選択される。
【００５８】
本発明の目的である、グリコサミノグリカンおよび活性医薬化合物由来の結合体からなる化合物を調製する方法は、
グリコサミノグリカン、好ましくはヒアルロン酸の水溶液を調製する工程と、
Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシサクシンイミドと共に、レナリドマイド、ゲムシタビンまたはＣＯＸ−２アンタゴニストの水溶液を調製する工程と、
前記両溶液を、室温で、少なくとも１０時間混合撹拌して、混合溶液を得る工程と、ならびに
前記混合溶液を数日間透析する工程と、を含む。
【００５９】
以下の実施例を、本発明の各種実施形態を説明する目的で付与するが、いかなる様式においても本発明を限定することを意味しない。
【実施例】
【００６０】
実施例１：大腸組織におけるＨＡの接着（ＩＶＩＳ画像システム−ビジョン３）
手順：
１．  ０．２５ｇの高分子量ヒアルロン酸ナトリウム粉末（ＨＨＡ；Ｍｗ：２ＭＤａ；Ｆｒｅｄａ）および０．２５ｇの低分子量ヒアルロン酸ナトリウム粉末（ＬＨＡ；Ｍｗ：０．３５ＭＤａ；Ｆｒｅｄａ）を、それぞれ５０ｍｌのＰＢＳバッファー（リン酸緩衝生理食塩水）に加えて、０．５％溶液を作成した。次に、粉末が全て溶解するまで６時間撹拌した。０．２５ｇの中程度の分子量のヒアルロン酸ナトリウム粉末（ＭＨＡ；Ｍｗ：１ＭＤａ；Ｆｒｅｄａ）を、５０ｍｌのＰＢＳバッファー中に加えた。その後、粉末が全て溶解するまで６時間撹拌し、次の工程で使用できる準備ができた。
【００６１】
２．  蛍光ＨＡ（ＨＡ−ｆ）を以下のように調製した。（１）０．３９ｇのＭＥＳ遊離酸（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を、１００ｍｌのｄｄ水中に溶解した。（２）溶液Ａ：６５ｍｇのフルオレセインアミン（ｆｌｕｒｏｒｅｓｃｅｉｎａｍｉｎｅ）粉末（異性体Ｉ、Ｆｌｕｋａ社）を、９ｍｌの９５％エタノール（ＥｔＯＨ）溶液中に溶解し、その後、暗所で１０分間撹拌した。（３）溶液Ｂ：３５９ｍｇのＥＤＣ粉末（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩、シグマ社）を９ｍｌのＭＥＳバッファーに溶解し、その後、１０分間撹拌した。（４）溶液Ｃ：２１６ｍｇのＮＨＳ粉末（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド、シグマ社）を９ｍｌのＭＥＳバッファーに溶解し、その後、１０分間撹拌した。（５）３ｍｌの溶液Ａを、５０ｍｌの０．５％ＨＡ溶液中にゆっくりと滴下し、その後、光が遮断された条件下で１０分間撹拌した。（６）３ｍｌの溶液Ｂと５ｍｌの溶液Ｃを、工程（５）の溶液中に別々に滴下し、その後、光が遮断された条件下で１０分間撹拌した。（７）０．０２ＭのＭＥＳバッファーを、容積が１００ｍｌに達するまで、工程（６）の溶液中にゆっくりと加え、その後、光が遮断された条件下、室温で２４時間撹拌した。（８）反応後産物を、透析溶液としての５Ｌの脱イオン水中の透析チューブ（ＭＷ：１２０００〜１４０００）中に注入し、その後、透析溶液の蛍光がなくなるまで、透析溶液を１２時間ごとに交換しながら、５日間、４℃、暗所にて撹拌した。（９）透析後の液体を５０ｃｃのプラスチック製遠心管に分注し、次に、一晩−２０℃の冷凍庫で保管し、その後、暗所で凍結乾燥器中で乾燥した。（１０）乾燥したＨＡ−ｆ粉末を−２０℃の冷凍庫で保管した。（１１）５０ｍｇのＨＡ−ｆ粉末を、ゆっくりと１０ｍｌのＰＢＳバッファー中に加え、その後、粉末が完全に溶解するまで６時間撹拌した。
【００６２】
３．  ７〜８週齢のＳＤラット（スプラーグドーリーラット）の大腸組織をメスで切除し、次に、ＰＢＳバッファーで洗浄し、その後、３〜４ｃｍ長に切断して、最終的にＰＢＳバッファー中に含浸した。
【００６３】
４．  傷害大腸組織を、縦方向に２０回、歯ブラシでブラッシングして、その後、ＰＢＳバッファー中に含浸させて調製した。
【００６４】
５．  正常および傷害大腸組織を、１２穴プレートに入れて、その後、１ｍｌの０．５％ＨＡ−ｆ溶液を各ウエルに加えて、そして、室温で２時間振とうした。過剰なＨＡ−ｆ溶液を、２時間後にチップで吸引した。次に、１０分間ＰＢＳバッファー中に浸して、その後、ＰＢＳバッファーを除去する工程を３回繰り返した。
【００６５】
６．  洗浄した大腸組織を、内壁組織を上側にして１２穴プレートに静置し、その後、ＩＶＩＳ（インビボ画像システム：ＸＥＮＯＧＥＮ）の台（ｄｏｃｋ）の上に設置した。初期設定パラメータを、励起が４６５ｎｍおよび発光が５００ｎｍとするＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）としてセットアップした。その後、画像をソフトウェアにより記録した。
【００６６】
７．  全ての値は、観察したものの平均として計算した。組織学的インデックスをＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定により解析した。
【００６７】
結果：蛍光インデックスを定量し、図１に示されるように配置した。正常大腸組織の蛍光インデックスを１として規定した。他の大腸組織試験は、規定値により補正した。結果は、同じ平均分子量Ｍｗを有するＨＡは、正常大腸組織よりも明らかに高い蛍光インデックスで傷害大腸組織に接着したことを示した（Ｐ＜０．０１）。傷害大腸組織に接着する３種類の異なる平均分子量のＨＡ間の差異を比べると、３５０ＫＤａのＨＡの傷害大腸組織への接着の蛍光インデックスは、他の２種類の平均分子量（２ＭＤａおよび１ＭＤａ）のＨＡよりも高かった。さらに、１ＭＤａのＨＡの傷害またはさらに正常大腸組織への接着の蛍光インデックスは、２ＭＤａのＨＡよりも高かった。
【００６８】
実施例２：ＨＡ−色素結合プロセスおよびＨＡ−色素のインビトロ画像
手順
以下のＨＡ−色素結合プロセス全体を暗所で維持しなければならない。
【００６９】
ＨＡ−ＡＤＨの合成
１．  ＨＡ（０．３４ＭＤａ；５０ｍｇ）を水中に溶解して、４ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。
２．  ５倍過剰量（１１４．８ｍｇ）のＡＤＨ（アジピン酸ジヒドラジド）をその溶液に加えた。
３．  反応混合物のｐＨを、０．１ＮのＨＣｌを添加して４．７５に調整した。
４．  次に、１当量（２５．１ｍｇ）のＥＤＣを、固形形態で加えた。反応混合物のｐＨを、０．１ＮのＨＣｌを添加して４．７５に維持した。
５．  １５分間反応後、反応混合物のｐＨを７．０に調整するように０．１ＮのＮａＯＨを添加して、反応をクエンチした。
６．  その反応混合物を、その後、前処理した透析チューブ（Ｍｗのカットオフ：３５００）に移して、そして、１００ｍＭのＮａＣｌ、次に、２５％ＥｔＯＨ／水を４サイクル、最後に水に対して徹底的に透析した。その溶液を、その後、０．２μｍのセルロースアセテート膜を通してろ過し、瞬間冷凍し、凍結乾燥した。
７．  ＡＤＨの置換度を、１Ｈ  ＮＭＲにより測定した。
【００７０】
ＨＡ−ＡＤＨ−ＦＩＴＣの合成
１．  ８８ｍｇのＨＡ−ＡＤＨ（ＤＳ＝３６％）を３５ｍｌの水中に溶解した。
２．  ９．５ｍｇのＦＩＴＣを１０ｍｌのＤＭＳＯに溶解した。
３．  ＨＡ−ＡＤＨ溶液とＦＩＴＣ溶液とを混合する。
４．  室温で４８時間撹拌後、ＭＷＣＯが１２０００〜１４０００の透析バッグを使用して、０．３ＭのＮａＣｌと純水を交互に用いて、溶液を３日間透析した。
５．  その溶液を、その後、２日間凍結乾燥した。
６．  最後に、置換度をＵＶスペクトルにより決定した。
【００７１】
ＨＡ−色素のインビトロ画像
（１）１×１０５のＨＴ２９細胞およびＨＣＴ１５細胞（ヒト大腸がん、ＣＤ４４陽性細胞）を、３．５ｃｍディッシュの中にある顕微鏡用スライド上に播種した。
（２）指示された色素濃度である１μＭのＨＡ−色素（ＨＡ：０．３４ＭＤａ）を、指示された時間でそれぞれの細胞に加えた。
（３）インキュベーション後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、その後、３．７％のホルムアルデヒドで固定した。
（４）ＨＡ−色素と細胞との間の相互作用を、共焦点顕微鏡で観察した。
【００７２】
結果：蛍光観察により、ＨＣＴ１５（図２Ａおよび図２Ｂ）並びにＨＴ２９（図２Ｃおよび図２Ｄ）上の付着部位と色素量を知ることができる。結果が明らかにするのは、色素とＨＡの結合に成功したこと、および、ＨＡがＨＴ２９上のＣＤ４４が多く存在する部位におけるＨＡ−色素濃度を上昇させることである。そこでは、ＨＴ２９は、ＨＣＴ１５が有するよりも強い蛍光を有していて、その蛍光はＣＤ４４がより多く存在することと一致する。また、ＨＡ−色素は、細胞内へも侵入することができることさえをも証明した（図２Ｄ）。ＨＡ−色素は、（よりＣＤ４４が豊富な）ＨＴ２９において、６時間の処理後に蓄積し、そして、１２時間の処理後に内部に取り込まれた。このような現象は、ＨＡ−色素の６時間または１２時間の処理後に、（よりＣＤ４４の少ない）ＨＣＴ１５においては観察されなかった。
【００７３】
実施例３：細胞株および異種移植腫瘍モデル
手順
１．細胞培養条件および継代
（１）細胞培養条件：
・ＨＴ２９：高グルコースＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシン
・ＨＣＴ１５：ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％ＦＢＳ、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシン
（２）継代：
（Ｉ）培養培地を除去し、捨てる。
（ＩＩ）１×ＰＢＳで細胞層を軽くゆすいで、トリプシン阻害剤を含む血清を全て除去する。
（ＩＩＩ）１ｍＬの０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液をフラスコに加え、そして、細胞層が散逸するまで（通常５〜１５分間）、顕微鏡下で細胞を観察する。その後、９ｍＬの完全増殖培地を加え、穏やかにパイペッティングして細胞を吸引する。
（ＩＶ）適量の細胞懸濁物を新しい培養ディッシュに加える（継代比は１：３〜１：８）。
（Ｖ）培養物を３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ２）にインキュベートする。
【００７４】
２．異種移植腫瘍モデル
（１）ＨＴ２９およびＨＣＴ１５細胞（２×１０７細胞／マウス）を、８週齢の雄ヌードマウスの左右臀部（左右後脚の上側）に別々に皮下注射した。
（２）ＩＶＩＳ実験は、異種移植腫瘍のサイズが３〜４週間後に４００〜５００ｍｍ３の範囲内になった際に実施開始可能であった。
【００７５】
３．ＩＶＩＳ実験
（１）イソフルランにより麻酔した後、異種移植ヌードマウスの画像を、以下のパラメータ（ｆ／ｓｔｏｐ：８、露出時間３秒、励起波長６３３または６３５ｎｍ、および測定発光波長６６８ｎｍ）で、ブランクとして撮影した。使用した機器は、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  ２００であった。
（２）２００μｌの１２．５μＭの遊離色素または２００μｌの（ＨＡ−色素の内、１２．５μＭの色素と０．１ｍｇのＨＡ（ＨＡ：１．１２ＭＤａ）を有する）ＨＡ−色素溶液をそれぞれ、尾静脈から静脈注射した。
（３）ＩＶＩＳ画像の写真を所定の時間（５、１０、３０分、および１、２時間）後に撮影した。観察とその機器のパラメータを工程１に簡潔に記載した。マウスは、注射２時間後に屠殺解剖し、内臓における蛍光分布を解析した。
【００７６】
結果：蛍光画像は、遊離色素がＨＴ２９（左）およびＨＣＴ１５（右）で、ほぼ均等に分布していることを示した。ＨＴ２９の付着領域の比は、５０．１５％である一方、ＨＣＴ１５は４９．８６％である。しかしながら、ＨＡ−色素は、（ＨＴ２９よりもＣＤ４４が少ない）ＨＣＴ１５よりも、ＨＴ２９のＣＤ４４が多く存在する部位に特により多く付着することができる。ＨＴ２９の付着領域の比は、７４．１５％である一方、ＨＣＴ１５は２５．８５％である。この結果は、ＨＡは、ＣＤ４４が多く存在する部位に色素が集まることに貢献できることを証明した。
【００７７】
実施例４：ＨＡ−レナリドマイド結合体の合成
手順
１．  ５０ｍｇのＨＡ（１０Ｋ〜７００ＫＤａ）を、２５ｍｌのＤＤ水に溶解した。
２．  ２５．１ｍｇのＥＤＣおよび１５．１ｍｇのＮＨＳを２ｍｌのＤＤ水中で混合し、５分間室温で撹拌した。
３．  ＨＡ溶液を、１．３１ｍｌのＮａＯＨを加えることにより中和した。
４．  ３．４ｍｇのレナリドマイドを、２ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液中で溶解した。
５．  この混合物（ＨＡ、ＥＤＣ、ＮＨＳ、およびレナリドマイド）を、１２時間室温で撹拌した。
６．  混合物を、透析バッグ（ＭＷＣＯ：３５００）を使用して、過剰なＤＤ水に対して２〜３日間透析した。
７．  ＨＡ−レナリドマイド粉末を、ＨＡ−レナリドマイド溶液を凍結乾燥器を通して脱水して得た。
【００７８】
結果：図３は、ＨＡレナリドマイド結合体の構造を示す。
【００７９】
実施例５：レナリドマイドのインビトロ細胞傷害性
手順
１．  ９６穴プレートの各ウエルごとに、培地（高グルコースＤＭＥＭで、１０％ＦＢＳ、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを含むもの）中に１×１０４細胞の低密度で、ＨＴ２９細胞を播種した。
２．  ９６穴プレートの各ウエルごとに、培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２で、１０％ＦＢＳ、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを含むもの）中に１×１０４細胞の低密度で、ＨＣＴ１５細胞を播種した。
３．  播種一日（２４時間）後、以下の治療剤の指示された用量（レナリドマイド：４００μＭ、２００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１２．５μＭ、６．２５μＭ、３．１２５μＭおよび０；ＨＡ：４ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．０６２５ｍｇ／ｍｌ、０．３１２５ｍｇ／ｍｌ、および０；ＨＡ−レナリドマイド：４００μＭ、２００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１２．５μＭ、６．２５μＭ、３．１２５μＭおよび０）を含む培地中に、細胞を２４時間インキュベートした。
４．  細胞生存率への治療剤の効果を、黄色色素３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）がミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性により切断されて紫色ホルマザン結晶になることに基づくアッセイを使用して、評価した。
５．  ２４時間の治療剤処理後、培地を除去し、細胞層を、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ２）で４時間、培地中に（０．５ｍｇ／ｍｌに）希釈したＭＴＴで処理後、培地でゆすいだ。
６．  その細胞に、その後、１００μｌ／ウエルのＤＭＳＯを加えて、細胞ホモジネートの吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して５７０ｎｍで測定した。
７．  生細胞の割合を、処理細胞から得られた平均吸光度を、非処理コントロール細胞の平均吸光度で割って計算した。
【００８０】
結果：結果は、ＣＤ４４が豊富な細胞株（ＨＴ２９）では、ＨＡ−レナリドマイド結合体が、レナリドマイドまたはＨＡ単独よりも細胞殺傷効果があることを示した（図４Ａ）。同様に、この相乗効果傾向は、細胞株ＨＣＴ１５（図４Ｂ）でも見られた。
【００８１】
実施例６：ＨＡ−ＮｉＮＨ２結合体の合成
ＮｉＮＯ２への水素添加
１．  ５００ｍｇのニメスリド（ＮｉＮＯ２）を、２０ｍｌの酢酸エチルに完全に溶かし、その後、２００ｍｇの５％Ｐｄ／Ｃ（炭素上のパラジウム）を触媒として、その溶液中に加えた。継続的な撹拌下でボトルをガス抜きして、２４時間撹拌後、１ａｔｍにまでなるようにＨ２ガスで、空気を置換した。
２．  薄層クロマトグラフ法（ＴＬＣシリカゲルスライド６０  Ｆ２５４）を、移動相がヘキサン：酢酸エチル＝２：１で行い、波長２５４ｎｍで水素添加産物の純度を同定した。
３．  産物の同定後、ろ過によりＰｄ／Ｃを除去し、引き続きロータリーエバポレーターで残った溶媒を除去した。
４．  水素添加産物を、さらなる精製のために、ヘキサン：酢酸エチル＝１：１溶液中に溶解した。
５．  シリカゲルカラムをその精製に使用して、溶出液（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で溶出した。
６．  色付き画分を回収し、濃度と構造をそれぞれＵＶとＮＭＲで決定して、水素添加産物ＮｉＮＨ２の収率を確認した。
７．  ＮｉＮＨ２粉末を凍結乾燥器を使って得た。
【００８２】
ＨＡ−ＮｉＮＨ２結合体の合成
１．  ５０ｍｇのＨＡ（１０〜７００ＫＤａ）を、２５ｍｌのＤＤ水に溶解した。
２．  ２５．１ｍｇのＥＤＣおよび１５．１ｍｇのＮＨＳを１ｍｌのＤＤ水中で混合し、５分間室温で撹拌した。
３．  ３．６５ｍｇのＮｉＮＯ２を１ｍｌのＤＭＳＯ溶液に溶解し、その後、３分以内に、注射器でＨＡ／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液中にゆっくり滴下した。
４．  この混合物（ＨＡ、ＥＤＣ、ＮＨＳ、およびＮｉＮＨ２）を、暗所にて、１２時間室温で撹拌した。
５．  混合物を、透析バッグ（ＭＷＣＯ：３５００）を使用して、過剰なＤＤ水に対して２〜３日間透析した。
６．  ＨＡ−ＮｉＮＨ２粉末を、ＨＡ−ＮｉＮＨ２溶液を凍結乾燥器を通して脱水して得た。
【００８３】
結果：図５Ａは、真正ニメスリド（ＮｉＮＯ２）の構造と産物ＮｉＮＨ２を示す。図５Ｂは、ＨＡ−ＮｉＮＨ２結合体の構造を示す。
【００８４】
実施例７：ＮｉＮＯ２のインビトロ細胞傷害性
手順
１．  ９６穴プレートの各ウエルごとに、培地（高グルコースＤＭＥＭで、１０％ＦＢＳ、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを含むもの）中に１×１０４細胞の低密度で、ＨＴ２９細胞を播種した。
２．  ９６穴プレートの各ウエルごとに、培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２で、１０％ＦＢＳ、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを含むもの）中に１×１０４細胞の低密度で、ＨＣＴ１５細胞を播種した。
３．  播種一日（２４時間）後、以下の治療剤の指示された用量（ＮｉＮＯ２（ＮＯ２基を有する真正ニメスリドを表す）：２００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１２．５μＭ、６．２５μＭ、３．１２５μＭおよび０；ＮｉＮＨ２（ＮＨ２基を有するニメスリドを表す）：２００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１２．５μＭ、６．２５μＭ、３．１２５μＭおよび０；ＨＡ：４ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．０６２５ｍｇ／ｍｌ、０．３１２５ｍｇ／ｍｌ、および０；ＨＡ−ＮｉＮＨ２：２００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１２．５μＭ、６．２５μＭ、３．１２５μＭおよび０）を含む培地中に、細胞を２４時間インキュベートした。
４．  細胞生存率への治療剤の効果を、黄色色素３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）がミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性により切断されて紫色ホルマザン結晶になることに基づくアッセイを使用して、評価した。
５．  ２４時間の治療剤処理後、培地を除去し、細胞層を、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ２）で４時間、培地中に（０．５ｍｇ／ｍｌに）希釈したＭＴＴで処理後、培地でゆすいだ。
６．  その細胞に、その後、１００μｌ／ウエルのＤＭＳＯを加えて、細胞ホモジネートの吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して５７０ｎｍで測定した。
７．  生細胞の割合を、処理細胞から得られた平均吸光度を、非処理コントロール細胞の平均吸光度で割って計算した。
【００８５】
結果：結果は、ＨＴ２９またはＨＣＴ１５のいずれにおいても、（ＮＯ２基を有する）真正ニメスリドが、（ＮＨ２基を有する）改変産物よりも細胞傷害性効果が一般的に良いことを示した（図６Ａ）。しかしながら、ＮｉＮＯ２をＨＡと結合させる場合、ＨＡ−ＮｉＮＨ２の細胞傷害性は、ＮｉＮＨ２またはＮｉＮＯ２単独のものよりも有意に高い（図６Ｂ）。
【００８６】
実施例８：異種移植ヌードマウスモデルにおける腫瘍増殖阻害
手順
１．  ＨＴ２９（２×１０７細胞／マウス）を、８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃで胸腺の無い（ｎｕ＋／ｎｕ＋）マウスの右臀部（右脚の上側）に皮下注射した。
２．  腫瘍増殖阻害実験は、異種移植腫瘍のサイズが、０日と規定される、１００ｍｍ３より小さい時点で、実施開始可能となった。
３．  腫瘍サイズと体重を、実験期間中、３または５日ごとに測定した。
４．  腫瘍体積を、１／２（４π／３）（Ｌ／２）（Ｗ／２）Ｈ（Ｌは腫瘍の長さ、Ｗは腫瘍の幅、およびＨは腫瘍の高さ）として計算した。
５．  複数のマウスを、ＰＢＳ−コントロール、ＮｉＮＯ２、またはＨＡ−ＮｉＮＨ２処置のために互いに異なるグループに分けた。
６．  マウスに、４８または７２時間の間隔をおいて、ＮｉＮＯ２（１．５ｍｇ／ｋｇ）、ＨＡ−ＮｉＮＨ２（１．５ｍｇ／ｋｇのＮｉＮＯ２に相当）、またはＰＢＳを各投与量で、尾静脈から注射して投与した。
７．  各マウスの腫瘍サイズと体重変化を記録した。
【００８７】
結果：結果は、各マウスの平均体重は、ほぼ同じであったことを示した（図７Ａ）。しかしながら、コントロール、ＮｉＮＯ２、およびＨＡ−ＮｉＮＨ２の各グループを比較すると、腫瘍体積は有意に異なることが示された。ＨＡ−ＮｉＮＨ２グループは、ＮｉＮＯ２グループおよびコントロールよりも優れた腫瘍抑制効果を有している（図７Ｂ）。この結果は、本発明のＨＡ−ＮｉＮＨ２結合体がＮｉＮＯ２単独よりも優れた治療効果を有することを示す。
【００８８】
実施例９：ＨＡ−セレコキシブ結合体の合成
手順
１．  １００ｍｇのＨＡ（１０Ｋ〜７００ＫＤａ）を、２５ｍｌのＤＤ水に溶解した。
２．  テトラブチルアンモニウム水酸化物（ＴＢＡ−ＯＨ）０．８当量を、ＨＡ溶液に加え、１６時間撹拌した。
３．  溶液を乾燥させて、ＨＡ−ＴＢＡ白色固形物を得た。
４．  ４０ｍｇのＨＡ−ＴＢＡを、１ｍｌのＤＤ水に溶解し、その後、３０ｍｇのＥＤＣと１８ｍｇのＮＨＳ粉末を、その溶液中に加え、そして５分間室温で撹拌した。
５．  ４ｍｇのセレコキシブを、２ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液中に溶解した。
６．  この混合物（ＨＡ−ＴＢＡ、ＥＤＣ、ＮＨＳ、およびセレコキシブ）を、７２時間室温で撹拌した。
７．  混合物を、透析バッグ（ＭＷＣＯ：１２００〜１４００）を使用して、ＤＭＳＯとＤＤ水の比率が２対１である溶液に対して、溶液を３回交換して１日間透析した。
８．  その後、混合物を、透析バッグ（ＭＷＣＯ：１２００〜１４００）を使用して、０．３ＭのＮａＣｌに対して、その溶液を一日に２回交換して、２日間透析した。
９．  ＨＡ−セレコキシブ粉末を、ＨＡ−セレコキシブ溶液を凍結乾燥器を通して脱水して得た。
【００８９】
結果：図８は、ＨＡ−セレコキシブの合成手順およびその構造を示す。
【００９０】
実施例１０：セレコキシブのインビトロ細胞傷害性
手順
１．  ９６穴プレートの各ウエルごとに、培地（高グルコースＤＭＥＭで、１０％ＦＢＳ、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを含むもの）中に１×１０４細胞の低密度で、ＨＴ２９細胞を播種した。
２．  ９６穴プレートの各ウエルごとに、培地（ＤＭＥＭで、１０％ＦＢＳ、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを含むもの）中に１×１０４細胞の低密度で、ＧＢＭ８４０１細胞を播種した。
３．  播種一日（２４時間）後、以下の治療剤の指示された用量（ＨＡ−セレコキシブ：１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１２．５μＭ、６．２５μＭ、３．１２５μＭおよび０）を含む培地中に、細胞を２４時間インキュベートした。
４．  細胞生存率への治療剤の効果を、黄色色素３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）がミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性により切断されて紫色ホルマザン結晶になることに基づくアッセイを使用して、評価した。
５．  ２４時間の治療剤処理後、培地を除去し、細胞層を、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ２）で４時間、培地中に（０．５ｍｇ／ｍｌに）希釈したＭＴＴで処理後、培地でゆすいだ。
６．  その細胞に、その後、１００μｌ／ウエルのＤＭＳＯを加えて、細胞ホモジネートの吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して５７０ｎｍで測定した。
７．  生細胞の割合を、処理細胞から得られた平均吸光度を、非処理コントロール細胞の平均吸光度で割って計算した。
【００９１】
結果：ＨＡ−セレコキシブの細胞傷害性効果は、ＨＴ２９細胞およびＧＢＭ８４０１細胞においてＨＡおよびセレコキシブ単独よりも良い傾向であることを、結果は示した（図９Ａおよび図９Ｂ）。
【００９２】
実施例１１：ＨＡ−ゲムシタビン結合体の合成
手順
１．  ５０ｍｇのＨＡ（１０〜７００ＫＤａ）を、２５ｍｌのＤＤ水に溶解した。
２．  ２５．１ｍｇのＥＤＣおよび１５．１ｍｇのＮＨＳを１ｍｌのＤＤ水中で混合し、５分間室温で撹拌した。
３．  ＨＡ溶液を、１．４４ｍｌのＮａＯＨを加えることにより中和した。
４．  ３．９ｍｇのゲムシタビンを、１ｍｌのＤＭＳＯ溶液を用いて、１ｍｌのＤＤ水に溶解し、その後、３分以内に、注射器でＨＡ／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液中にゆっくり滴下した。
５．  この混合物（ＨＡ、ＥＤＣ、ＮＨＳ、およびゲムシタビン）を、暗所にて、１２時間室温で撹拌した。
６．  混合物を、透析バッグ（ＭＷＣＯ：１２０００〜１４０００）を使用して、過剰なＤＤ水に対して２〜３日間透析した。
７．  ＨＡ−ゲムシタビン粉末を、ＨＡ−ゲムシタビン溶液を凍結乾燥器を通して脱水して得た。
【００９３】
結果：図１０は、ＨＡ−ゲムシタビン結合体の合成手順およびその構造を示す。
【００９４】
実施例１２：ゲムシタビンのインビトロ細胞傷害性
手順
１．  ９６穴プレートの各ウエルごとに、培地（高グルコースＤＭＥＭで、１０％ＦＢＳ、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを含むもの）中に１×１０４細胞の低密度で、Ａ５４９細胞を播種した。
２．  ９６穴プレートの各ウエルごとに、培地（ＤＭＥＭで、１０％ＦＢＳ、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを含むもの）中に１×１０４細胞の低密度で、ＧＢＭ８４０１細胞を播種した。
３．  播種一日（２４時間）後、以下の治療剤の指示された用量（ＨＡ−ｇｅｍ：４００μＭ、２００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１２．５μＭ、６．２５μＭ、３．１２５μＭおよび０）を含む培地中に、細胞を４８時間インキュベートした。
４．  播種一日（２４時間）後、以下の治療剤の指示された用量（ＨＡ−セレコキシブ：２００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１２．５μＭ、６．２５μＭ、３．１２５μＭおよび０）を含む培地中に、細胞を２４時間インキュベートした。
５．  細胞生存率への治療剤の効果を、黄色色素３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）がミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性により切断されて紫色ホルマザン結晶になることに基づくアッセイを使用して、評価した。
６．  ２４時間の治療剤処理後、培地を除去し、細胞層を、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ２）で４時間、培地中に（０．５ｍｇ／ｍｌに）希釈したＭＴＴで処理後、培地でゆすいだ。
７．  その細胞に、その後、１００μｌ／ウエルのＤＭＳＯを加えて、細胞ホモジネートの吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して５７０ｎｍで測定した。
８．  生細胞の割合を、処理細胞から得られた平均吸光度を、非処理コントロール細胞の平均吸光度で割って計算した。
【００９５】
結果：結果は、ＨＡ−ゲムシタビンの細胞傷害性効果がＡ５４９細胞（図１１）およびＧＢＭ８４０１細胞（図１２）において増加するという傾向を示した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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