(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂ（ＮＰＰＢ）、ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｂｅｔａ  ６（ＩＴＧＢ６）、ｃｏｐｉｎｅ  ＩＶ（ＣＰＮＥ４）、ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｋｅ  ５（ＥＭＬ５）、ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎ  １（ＩＴＳＮ１）及びｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＣＰＥＢ１）からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を増幅するプライマー対を含む、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷の判定用キット。
【請求項２】
ＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１及びＣＰＥＢ１からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質に対する抗体を含む、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷の判定用キット。
【請求項３】
創傷を有する被検体から採取された創傷滲出液中の細胞における、ＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１及びＣＰＥＢ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を検出する工程と、
前記少なくとも１種の遺伝子の発現が検出された場合に、前記創傷が、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷であると判定する工程と、
を含む、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷の判定方法。
【請求項４】
創傷を有する被検体から採取された創傷滲出液中の細胞における、ＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１及びＣＰＥＢ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を検出する工程と、
前記少なくとも１種の遺伝子の発現が検出された場合に、前記創傷滲出液が、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷に由来するものであると判定する工程と、
を含む、創傷滲出液の由来の判定方法。
【請求項５】
創傷を有する被検体から採取された創傷滲出液中の細胞における、ＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１及びＣＰＥＢ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を検出する工程と、
前記検出する工程の結果を、前記少なくとも１種の遺伝子の発現が検出された場合には、前記創傷が、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷であるという基準と比較する工程と、
を含む、前記創傷がクリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷であるか否かを試験する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷の判定キット、判定方法及び試験方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
創傷において、感染は、治癒遅延や敗血症等の重篤な合併症を引き起こす重大な問題である。創傷における細菌と宿主との関係は、細菌の創部への負荷の程度に応じて、汚染、定着、クリティカルコロナイゼーション、感染と連続的に捉えられる。従来、創傷の状態は、主に微生物学的検査や目視により評価されてきた（例えば、非特許文献１を参照）。
【０００３】
創傷は、正常に治癒する創傷、クリティカルコロナイゼーション創傷及び感染創傷に分類することができる。感染創傷とは、細菌が創傷部において増殖、浸潤した状態にある創傷をいう。感染創傷は、明らかな炎症徴候があり、治癒遅延する病態である。また、クリティカルコロナイゼーション創傷とは、クリティカルコロナイゼーション（臨界的定着）状態にある創傷をいう。クリティカルコロナイゼーション創傷は、明らかな炎症徴候がないにもかかわらず治癒遅延する病態である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Extending the TIME concept: what we have learned in the past 10 years?, Leaper DJ., et al., Int. Wound J. 9, 1-19, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
感染創傷もクリティカルコロナイゼーション創傷も、治癒に向かわせるためには臨床的介入が必要であることから、早期診断が求められる。これらのうち、感染創傷は、目視により明らかな炎症徴候が認められることから、比較的容易に診断できる。しかしながら、従来、クリティカルコロナイゼーション創傷は、「最適なケアにもかかわらず２週間以上治癒傾向が認められない」という基準により診断されてきた。このため、クリティカルコロナイゼーション創傷は、他の原因を排除するケアを行ったうえ、２週間以上待たなければ診断することができず、適切な介入が困難であるとともに、患者や医療者の負担や医療経済的負担が高まる場合があった。
【０００６】
そこで、本発明は、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷を正確かつ迅速に検出することができる判定キット、判定方法及び試験方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の通りである。
（１）Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂ（ＮＰＰＢ）、ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｂｅｔａ  ６（ＩＴＧＢ６）、ｃｏｐｉｎｅ  ＩＶ（ＣＰＮＥ４）、ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｋｅ  ５（ＥＭＬ５）、ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎ  １（ＩＴＳＮ１）及びｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＣＰＥＢ１）からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を増幅するプライマー対を含む、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷の判定キット。
（２）ＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１及びＣＰＥＢ１からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質に対する抗体を含む、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷の判定キット。
（３）創傷を有する被検体から採取された創傷滲出液中の細胞における、ＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１及びＣＰＥＢ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を検出する工程と、前記少なくとも１種の遺伝子の発現が検出された場合に、前記創傷が、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷であると判定する工程と、を含む、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷の判定方法。
（４）創傷を有する被検体から採取された創傷滲出液中の細胞における、ＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１及びＣＰＥＢ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を検出する工程と、前記少なくとも１種の遺伝子の発現が検出された場合に、前記創傷滲出液が、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷に由来するものであると判定する工程と、を含む、創傷滲出液の由来の判定方法。
（５）創傷を有する被検体から採取された創傷滲出液中の細胞における、ＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１及びＣＰＥＢ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を検出する工程と、前記検出する工程の結果を、前記少なくとも１種の遺伝子の発現が検出された場合には、前記創傷が、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷であるという基準と比較する工程と、を含む、前記創傷がクリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷であるか否かを試験する方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷を正確かつ迅速に検出することができる判定キット、判定方法及び試験方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】対照群、定着群、クリティカルコロナイゼーション群、感染群のラットの創傷の肉眼的所見の変化を示す写真である。
【図２】対照群、定着群、クリティカルコロナイゼーション群、感染群のラットの創傷の創面積の変化を示すグラフである。
【図３】（ａ）は、対照群、定着群、クリティカルコロナイゼーション群、感染群のラットの創傷の、創作製６日後における発赤量を示すグラフである。（ｂ）は、対照群、定着群、クリティカルコロナイゼーション群、感染群のラットの創傷の、創作製６日後における腫脹量を示すグラフである。
【図４】対照群、定着群、クリティカルコロナイゼーション群、感染群のラットの創傷の、創作製６日後における創底の組織１ｇ当たりの細菌数を示すグラフである。
【図５】対照群、定着群、クリティカルコロナイゼーション群、感染群のラットの創傷の、創作製６日後における肉眼的所見を上段に示す。また、各群の創傷の写真内のＡ〜Ｄの枠で示す部位から作製した切片の写真をそれぞれＡ〜Ｄに示す。Ａ〜Ｄの写真内の矢頭は、創縁の位置を示す。更に、Ａ〜Ｄの写真内のＥ〜Ｌの枠で示す部位の拡大写真をそれぞれＥ〜Ｌに示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１実施形態において、本発明は、Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂ（ＮＰＰＢ）、ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｂｅｔａ  ６（ＩＴＧＢ６）、ｃｏｐｉｎｅ  ＩＶ（ＣＰＮＥ４）、ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｋｅ  ５（ＥＭＬ５）、ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎ  １（ＩＴＳＮ１）及びｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＣＰＥＢ１）からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を増幅するプライマー対を含む、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷の判定キットを提供する。
【００１１】
創傷滲出液中には、主に血管から創部へと遊走してきた免疫担当細胞等の、宿主の細胞が多く含まれている。後述するように、発明者らは、創傷滲出液中の細胞において、ＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１、ＣＰＥＢ１のいずれかの遺伝子の発現が検出された場合、当該創傷がクリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷であると判断できることを見出した。すなわち、ＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１、ＣＰＥＢ１遺伝子は、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷のマーカーとして有用である。本実施形態のキットは、創傷を有する被検体から採取された創傷滲出液中の細胞における上記のマーカー遺伝子の発現を検出するのに好適である。
【００１２】
本実施形態のキットによって、従来は判定に２週間以上必要であった、クリティカルコロナイゼーション創傷を正確かつ迅速に検出することができる。これにより、創傷が、正常に治癒する創傷であるか、クリティカルコロナイゼーション創傷若しくは感染創傷であるかを迅速に判定し、適切な治療方針を決定する判断材料を提供することができる。
【００１３】
上記のマーカー遺伝子の発現は、正常に治癒する創傷の創傷滲出液中の細胞では認められず、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷の創傷滲出液中の細胞において認められる。
【００１４】
創傷滲出液中の細胞において、上記のマーカー遺伝子のいずれか１つ以上の発現が検出された場合、当該創傷滲出液が由来する創傷は、クリティカルコロナイゼーション創傷若しくは感染創傷であると判定することができる。
【００１５】
また、後述するように、クリティカルコロナイゼーション創傷の創傷滲出液中の細胞よりも感染創傷の創傷滲出液中の細胞において、上記のマーカー遺伝子の発現量が高い。したがって、本実施形態のキットは、対象とする創傷が、クリティカルコロナイゼーション創傷であるか、感染創傷であるかを判断する判断材料を提供することもできる。また、マーカーの定量的数値が創傷の臨床的経過を鋭敏に反映するため、創傷の臨床的経過を判断する判断材料を提供することもできる。
【００１６】
本実施形態のキットに含まれるプライマー対は、上記のいずれかのマーカー遺伝子の発現を検出するプライマー対である。本実施形態のキットに含まれるプライマー対を用いて、創傷滲出液中の細胞の全ＲＮＡ又はｍＲＮＡをサンプルとしたＲＴ−ＰＣＲ等を行うことにより、上記のマーカー遺伝子の発現を検出することができる。遺伝子の発現の検出は、例えば定性的なＰＣＲにより行ってもよいし、例えばリアルタイム定量ＰＣＲ等の定量性のある遺伝子増幅法により行ってもよいし、ＬＡＭＰ法等の定温で反応が進行する遺伝子増幅法により行ってもよい。あるいは、ノーザンブロッティング等により行ってもよい。
【００１７】
創傷滲出液は、例えば、患者の治療に用いられたガーゼ等から回収することができる。創傷滲出液中の細胞は、例えば、創傷滲出液を含むガーゼをリン酸緩衝液に浸した後、このリン酸緩衝液を遠心することにより沈殿させて回収することができる。例えば、沈殿した細胞を破砕して全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素及びオリゴｄＴプライマー又はランダムプライマーを用いて逆転写することによってｃＤＮＡを調製し、このｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより上記のマーカー遺伝子の発現を検出することができる。
【００１８】
ＮＰＰＢ遺伝子を増幅するプライマー対としては、ＮＰＰＢ遺伝子のｃＤＮＡを増幅できるものであれば特に限定されないが、例えば、配列番号１に示す塩基配列を有するフォワードプライマー（センスプライマー）及び配列番号２に示す塩基配列を有するリバースプライマー（アンチセンスプライマー）からなるプライマー対が挙げられる。
【００１９】
ＩＴＧＢ６遺伝子を増幅するプライマー対としては、ＩＴＧＢ６遺伝子のｃＤＮＡを増幅できるものであれば特に限定されないが、例えば、配列番号３に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号４に示す塩基配列を有するリバースプライマーからなるプライマー対が挙げられる。
【００２０】
ＣＰＮＥ４遺伝子を増幅するプライマー対としては、ＣＰＮＥ４遺伝子のｃＤＮＡを増幅できるものであれば特に限定されないが、例えば、配列番号５に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号６に示す塩基配列を有するリバースプライマーからなるプライマー対が挙げられる。
【００２１】
ＥＭＬ５遺伝子を増幅するプライマー対としては、ＥＭＬ５遺伝子のｃＤＮＡを増幅できるものであれば特に限定されないが、例えば、配列番号７に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号８に示す塩基配列を有するリバースプライマーからなるプライマー対が挙げられる。
【００２２】
ＩＴＳＮ１遺伝子を増幅するプライマー対としては、ＩＴＳＮ１遺伝子のｃＤＮＡを増幅できるものであれば特に限定されないが、例えば、配列番号９に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号１０に示す塩基配列を有するリバースプライマーからなるプライマー対が挙げられる。
【００２３】
ＣＰＥＢ１遺伝子を増幅するプライマー対としては、ＣＰＥＢ１遺伝子のｃＤＮＡを増幅できるものであれば特に限定されないが、例えば、配列番号１１に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号１２に示す塩基配列を有するリバースプライマーからなるプライマー対が挙げられる。
【００２４】
上記の遺伝子の発現は、タンパク質レベルで検出してもよい。すなわち、１実施形態において、本発明は、ＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１及びＣＰＥＢ１からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質に対する抗体を含む、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷の判定キットを提供する。
【００２５】
本明細書において、ＮＰＰＢ遺伝子がコードするタンパク質をＮＰＰＢタンパク質という。同様に、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１、ＣＰＥＢ１遺伝子がコードするタンパク質を、それぞれ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１、ＣＰＥＢ１タンパク質という。
【００２６】
抗体としては、ヒトのＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１、ＣＰＥＢ１タンパク質を検出できるものであれば特に制限はなく、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また、ファージ抗体やアプタマー等であってもよい。
【００２７】
本実施形態のキットは、創傷を有する被検体から採取された創傷滲出液中の細胞における上記のマーカータンパク質の発現を検出するのに好適である。
【００２８】
創傷滲出液中に含まれる、宿主の細胞における上記のタンパク質の発現を検出することにより、創傷が、正常に治癒する創傷であるか、クリティカルコロナイゼーション創傷若しくは感染創傷であるかを判定することができる。
【００２９】
上記のマーカータンパク質の発現は、正常に治癒する創傷の創傷滲出液中の細胞では認められず、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷の創傷滲出液中の細胞において認められる。
【００３０】
上記のマーカータンパク質は、創傷滲出液中の宿主細胞により発現され、一部が創傷滲出液中に分泌されると考えられる。したがって、上記のマーカータンパク質の発現の検出は、創傷滲出液をサンプルとして行ってもよい。また、上記のマーカータンパク質の発現の検出は、創傷滲出液中の宿主細胞を回収し、回収した宿主細胞の破砕液等をサンプルとして行ってもよい。
【００３１】
マーカータンパク質の発現の検出は、例えば、イムノブロッティング、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）、ｗｏｕｎｄ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ等によって行うことができる。
【００３２】
ここで、ｗｏｕｎｄ  ｂｌｏｔｔｉｎｇとは、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜等の膜を創部に直接接触させ、例えば１０秒〜１分間放置後回収し、回収された膜に転写されたタンパク質を免疫染色等により解析する方法である。
【００３３】
１実施形態において、本発明は、創傷を有する被検体から採取された創傷滲出液中の細胞における、ＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１及びＣＰＥＢ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を検出する工程と、前記少なくとも１種の遺伝子の発現が検出された場合に、前記創傷が、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷であると判定する工程と、を含む、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷の判定方法を提供する。
【００３４】
（遺伝子の発現を検出する工程）
本実施形態の判定方法において、上記のマーカー遺伝子の発現の検出は、ｍＲＮＡレベルで行ってもよく、タンパク質レベルで行ってもよい。
【００３５】
ｍＲＮＡレベルでマーカー遺伝子の発現を検出する場合には、まず、例えば、治療に使用したガーゼ等に含まれる創傷滲出液から、宿主の細胞を回収する。続いて、この細胞から全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを調製する。例えば、ノーザンブロッティングを行う場合には、これらのＲＮＡをサンプルとしてマーカー遺伝子の発現を検出することができる。また、ＰＣＲ等によりマーカー遺伝子の発現を検出する場合には、上記の全ＲＮＡ又はｍＲＮＡをもとに、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製し、調製したｃＤＮＡをサンプルに用いればよい。マーカー遺伝子の発現の検出は、例えば定性的なＰＣＲにより行ってもよいし、例えばリアルタイム定量ＰＣＲ等の定量性のある遺伝子増幅法により行ってもよいし、ＬＡＭＰ法等の定温で反応が進行する遺伝子増幅法により行ってもよい。
【００３６】
タンパク質レベルでマーカー遺伝子の発現を検出する場合には、例えば、治療に使用したガーゼ等に含まれる創傷滲出液をサンプルとしたイムノブロッティング、ＥＬＩＳＡ等により、創傷滲出液に含まれるマーカータンパク質の存在を検出することができる。
【００３７】
あるいは、治療に使用したガーゼ等に含まれる創傷滲出液から、宿主の細胞を回収し、この細胞の破砕液をサンプルとしてイムノブロッティング、ＥＬＩＳＡ等により、宿主の細胞によるマーカータンパク質の発現を検出することができる。あるいは、患者の創部にニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜等の膜を直接接触させ、例えば１０秒〜１分間放置後回収し、回収された膜を免疫染色等により解析する、ｗｏｕｎｄ  ｂｌｏｔｔｉｎｇにより、創傷滲出液中に分泌されたマーカータンパク質の存在を検出することもできる。
【００３８】
（判定する工程）
マーカー遺伝子の発現を検出した結果、ＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１及びＣＰＥＢ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が検出された場合に、上記の創傷が、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷であると判定することができる。
【００３９】
本実施形態の判定方法によって、従来は判定に２週間以上必要であった、クリティカルコロナイゼーション創傷を正確かつ迅速に検出することができる。これにより、創傷が、正常に治癒する創傷であるか、クリティカルコロナイゼーション創傷若しくは感染創傷であるかを迅速に判定し、適切な治療方針を決定する判断材料を提供することができる。
【００４０】
１実施形態において、本発明は、創傷を有する被検体から採取された創傷滲出液中の細胞における、ＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１及びＣＰＥＢ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を検出する工程と、前記少なくとも１種の遺伝子の発現が検出された場合に、前記創傷滲出液が、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷に由来するものであると判定する工程と、を含む、創傷滲出液の由来の判定方法を提供する。
【００４１】
（遺伝子の発現を検出する工程）
本実施形態の判定方法において、上記のマーカー遺伝子の発現の検出は、ｍＲＮＡレベルで行ってもよく、タンパク質レベルで行ってもよい。本工程は、上述したクリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷の判定方法における、マーカー遺伝子の発現を検出する工程と同様の方法によりに行うことができる。
【００４２】
（判定する工程）
マーカー遺伝子の発現を検出した結果、ＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１及びＣＰＥＢ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が検出された場合に、上記の創傷滲出液が、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷に由来するものであると判定することができる。
【００４３】
本実施形態の判定方法によって、従来は判定に２週間以上必要であった、クリティカルコロナイゼーション創傷を正確かつ迅速に検出することができる。これにより、創傷が、正常に治癒する創傷であるか、クリティカルコロナイゼーション創傷若しくは感染創傷であるかを迅速に判定し、適切な治療方針を決定する判断材料を提供することができる。
【００４４】
１実施形態において、本発明は、創傷を有する被検体から採取された創傷滲出液中の細胞における、ＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１及びＣＰＥＢ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を検出する工程と、前記検出する工程の結果を、前記少なくとも１種の遺伝子の発現が検出された場合には、前記創傷が、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷であるという基準と比較する工程と、を含む、前記創傷がクリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷であるか否かを試験する方法を提供する。
【００４５】
（遺伝子の発現を検出する工程）
本実施形態の試験方法において、上記のマーカー遺伝子の発現の検出は、ｍＲＮＡレベルで行ってもよく、タンパク質レベルで行ってもよい。本工程は、上述したクリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷の判定方法における、マーカー遺伝子の発現を検出する工程と同様の方法によりに行うことができる。
【００４６】
（判定する工程）
本工程において、マーカー遺伝子の発現を検出した結果を、以下の基準、すなわち、ＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１及びＣＰＥＢ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が検出された場合には、上記の創傷が、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷であるという基準と比較する。本工程により、上記の創傷が、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷であるか否かを試験することができる。
【００４７】
本実施形態の試験方法によって、従来は判定に２週間以上必要であった、クリティカルコロナイゼーション創傷を正確かつ迅速に検出することができる。これにより、創傷が、正常に治癒する創傷であるか、クリティカルコロナイゼーション創傷若しくは感染創傷であるかを迅速に判定し、適切な治療方針を決定する判断材料を提供することができる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
発明者らは、まず、クリティカルコロナイゼーション創傷動物モデルを作製した。続いて、動物モデルの創傷滲出液中の細胞における遺伝子発現の網羅的解析により、クリティカルコロナイゼーション創傷及び感染創傷で特異的に高発現する遺伝子を抽出し、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷のマーカー遺伝子候補を抽出した。続いて、候補遺伝子のヒトホモログ遺伝子の発現レベルをヒト臨床サンプルで確認し、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷を正確かつ迅速に検出することができるマーカー遺伝子を決定した。以下、各実験の具体的な内容を説明する。
【００５０】
〔実験例１〕
［クリティカルコロナイゼーション創傷動物モデルの作製及び妥当性の検討］
まず、クリティカルコロナイゼーション創傷動物モデルを作製した。本動物モデルが満たすべき条件として、汚染、定着、クリティカルコロナイゼーション、感染に対応する一連のモデルであること、１種類の実験操作の条件の違いによって、定着、クリティカルコロナイゼーション、感染の創傷モデルが再現できることが考えられた。また、創傷治癒に影響を与えることなく創傷滲出液を採取することができ、創傷滲出液中の細胞における遺伝子発現の網羅的解析が可能なだけの質、量ともに十分な創傷滲出液が得られるモデルであることが必要であると考えた。
【００５１】
従来、マウス、ラット、ブタ等を用いた創傷動物モデルが多数存在していたが、上記の条件を満たす動物モデルは存在しなかった。
【００５２】
様々な検討を行った結果、ラットの両側腹部に全層欠損創を作製し、創作製１日後に濃度を変えて細菌懸濁液を接種し、フィルムドレッシングで覆い、２４時間毎にドレッシング交換するモデルにより、定着、クリティカルコロナイゼーション、感染に対応する創傷動物モデルを作製できることが明らかとなった。このモデルでは、フィルムドレッシング内に創傷滲出液が溜まるため、創内に異物を入れることなく創傷滲出液を回収することができる。
【００５３】
より具体的には、ラットとしてＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄性ラット（約６ヶ月齢、５００ｇ）を使用した。また、細菌として緑膿菌ＰＡＯ１株を使用した。ラットの両側腹部に全層欠損創を作製し、創作製１日後に濃度を変えて細菌懸濁液を接種した。ここで、接種する細菌懸濁液の濃度を変えることにより、対照群、定着群、クリティカルコロナイゼーション群、感染群の創傷動物モデルを作製した。細菌懸濁液の濃度は、対照群は、ＯＤ６００＝０．０（リン酸緩衝液のみ）；定着群は、ＯＤ６００＝０．５（２．０６×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）；クリティカルコロナイゼーション群は、ＯＤ６００＝０．７５（３．２４×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）；感染群は、ＯＤ６００＝１．０（４．１２×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）とした。
【００５４】
対照群は、正常治癒の基準である。また、定着創傷の基準は、複製する細菌が存在するが、宿主に障害なく治癒することである。また、クリティカルコロナイゼーション創傷の基準は、炎症徴候を伴わない治癒遅延を起こすことである。また、感染創傷の基準は、増殖する細菌を創部に認め、炎症徴候を伴う宿主の障害が明らかであることである。
【００５５】
全層欠損創は次のようにして作製した。まず、ラットに２５〜３０ｍｇ／ｋｇ体重のソムノペンチル（共立製薬社製）を腹腔内投与して麻酔した。続いて、バリカンを用いて麻酔したラットの胴体の毛を剃り、更に除毛クリームを使用して、毛の根元まで完全に除去した。剃毛は、後述するフィルムドレッシングからの創傷滲出液の漏れを防止するために行った。剃毛した翌日、再びラットを麻酔し、滅菌されたメスを用いて、直径２ｃｍの円形の全層欠損創を作製した。創傷は、透明なフィルムドレッシング（３Ｍ（商標）テガダーム（商標）トランスペアレントドレッシング、住友スリーエム株式会社）で覆い、不織布ガーゼを、フィルムドレッシングを覆うようにラットの胴体に緩く巻き、テープで固定した。
【００５６】
また、細菌懸濁液の接種は、全層欠損創を作製した翌日、次のようにして行った。上述した各濃度の細菌懸濁液を調製し、２７ゲージのニードルを装着した使い捨て１ｍＬシリンジを用いて、創傷１つあたり０．１ｍＬの細菌懸濁液を、創傷の円内の頭尾方向の２カ所にそれぞれ、深さ５ｍｍの筋肉層に垂直に注射した。更に、創傷を覆う滅菌ガーゼにも、創傷１つあたり０．２ｍＬの細菌懸濁液を滴下した。
【００５７】
続いて、創傷をフィルムドレッシング（住友スリーエム株式会社）で覆った。２４時間後に、フィルムドレッシング及び創傷を覆う滅菌ガーゼを除去し、創傷及び創傷の周囲を生理食塩水で洗浄し、再びフィルムドレッシング（住友スリーエム株式会社）で覆った。フィルムドレッシングは２４時間ごとに除去し、創傷及び創傷の周囲を生理食塩水で洗浄し、再びフィルムドレッシング（住友スリーエム株式会社）で覆った。
【００５８】
本創傷動物モデルを用いて、創作製６日後に、クリティカルコロナイゼーション創傷モデルの妥当性を評価した。クリティカルコロナイゼーション創傷モデルの妥当性は、創面積、発赤量、腫脹量に基づいて、「炎症徴候を伴わない治癒遅延を起こす」か否かにより評価した。各評価の方法及び結果を以下に示す。創面積の変化から治癒遅延を評価し、発赤量・腫脹量から炎症徴候を伴うか否かを評価した。また、組織細菌数の測定及び創部の組織学的解析も行った。
【００５９】
図１は、各群の創傷の肉眼的所見の変化を示す写真である。スケールバーは１０ｍｍを示す。正常治癒の基準となる対照群では、創作製２〜３日後に、創作製による急性炎症と思われる発赤が創周囲に見られたが、徐々に消失し、創作製６日後には肉芽も上がり、肉眼的に発赤は消失した。定着群では、細菌接種にも関わらず対照群と同様の所見が認められた。クリティカルコロナイゼーション群では、創作製６日後の所見において、明らかな炎症徴候は認められなかった。感染群では、創作製６日後には周囲皮膚の発赤と白色壊死組織の拡大が観察された。
【００６０】
（創面積）
創部のデジタルカメラ画像から、画像解析ソフトである、ＩｍａｇｅＪ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて創面積を定量した。
【００６１】
図２は、各群のラットの創傷の平均創面積の変化を示すグラフである。エラーバーは標準偏差を示す。図中、「＊」は、５％未満の危険率で有意差があることを示す。感染群では、死亡したマウスも認められた。クリティカルコロナイゼーション群では、対照群に対して有意に治癒遅延が認められた。
【００６２】
（発赤量及び腫脹量）
創部のデジタルカメラ画像からＩｍａｇｅＪで創縁外周２ｍｍの創周囲の皮膚の発赤量を測定した。また、ヘマトキシリン−エオジン染色した組織の創縁１０ｍｍ以内の腫脹部と正常部の厚さの比を算出し、腫脹量を測定した。
【００６３】
図３（ａ）は、各群のラットの創傷の、創作製６日後における平均発赤量を示すグラフである。エラーバーは標準偏差を示す。図中、「＊」は、５％未満の危険率で有意差があることを示す。図３（ｂ）は、各群のラットの創傷の、創作製６日後における平均腫脹量を示すグラフである。エラーバーは標準偏差を示す。図中、「＊」は、５％未満の危険率で有意差があることを示す。
【００６４】
発赤量、腫脹量とも、感染群のみで有意に高く、クリティカルコロナイゼーション群では、発赤量・腫脹量の上昇は認められなかった。この結果は、クリティカルコロナイゼーション群のラットの創傷が炎症徴候を伴わないことを示す。
【００６５】
以上の結果から、本クリティカルコロナイゼーション創傷動物モデルの創傷が、炎症徴候を伴わない治癒遅延を起こしていることが明らかとなり、本モデルの妥当性が確認された。
【００６６】
（組織細菌数）
創底の組織をホモジェナイズし、段階希釈したものを、ＬＢ寒天培地で４８時間培養後、全コロニー数をカウントし、組織１ｇ当たりの細菌数を算出した。
【００６７】
図４は、各群のラットの創傷の、創作製６日後における創底の組織１ｇ当たりの細菌数（組織細菌数）を示すグラフである。図中、「＊」は、５％未満の危険率で有意差があることを示す。組織細菌数は、クリティカルコロナイゼーション群及び感染群で、対照群と比較して有意に高かった。
【００６８】
（組織学的解析）
創部のパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン−エオジン染色した。光学顕微鏡で観察し、形態学的特徴と炎症性細胞の局在を観察した。
【００６９】
図５は、対照群、定着群、クリティカルコロナイゼーション群、感染群のラットの創傷の、創作製６日後における肉眼的所見を上段に示す。また、各群の創傷の写真内のＡ〜Ｄの枠で示す部位から作製した切片の写真をそれぞれＡ〜Ｄに示す。Ａ〜Ｄの写真内の矢頭は、創縁の位置を示す。更に、Ａ〜Ｄの写真内のＥ〜Ｌの枠で示す部位の拡大写真をそれぞれＥ〜Ｌに示す。Ａ〜Ｄの写真におけるスケールバーは２ｍｍを示す。Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋの写真におけるスケールバーは２００μｍを示す。Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌの写真におけるスケールバーは１００μｍを示す。
【００７０】
その結果、全ての群で創底表層に炎症性細胞浸潤が認められた。また、対照群、定着群の筋層には炎症性細胞浸潤が全く認められなかった。クリティカルコロナイゼーション群では、皮下組織に強い炎症性細胞の凝集が認められ、筋層の炎症性細胞浸潤は極軽度であった。感染群では、皮下組織は壊死してポケットを形成しており、筋層までの多数の炎症性細胞浸潤と細胞障害による筋細胞の形態的変化（細胞の膨化と内容物の流出：ネクローシス）が顕著に認められた。
【００７１】
続いて、創作製６日後の組織において、クリティカルコロナイゼーション群で特異的な所見であった、皮下組織の炎症性細胞の凝集を、創作製５〜７日後の組織を用いて詳細に観察した。その結果、創作製５〜７日後の全ての組織において、同様の特徴が観察された（図示せず）。
【００７２】
クリティカルコロナイゼーションは表層の細菌負荷の増加と捉えられている。組織細菌数と組織学的解析の結果から、本クリティカルコロナイゼーション創傷動物モデルにおいても、表層の細菌負荷の増加の病態が確認され、従来の知見と矛盾がないことが確認された。
【００７３】
〔実験例２〕
［クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷のマーカー遺伝子の探索］
上述した対照群、定着群、クリティカルコロナイゼーション群、感染群のラットの、創作製６日後の創傷滲出液中の宿主細胞を１×１０６個／サンプルずつ回収し、全ＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡを各群毎に混合し、対照群（ｎ＝４）、定着群（ｎ＝５）、クリティカルコロナイゼーション群（ｎ＝６）、感染群（ｎ＝５）の４群４サンプルの全ＲＮＡを得た。
【００７４】
得られた４群４サンプルの全ＲＮＡを、それぞれＷｈｏｌｅ  Ｒａｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｌｉｇｏ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ４ｘ４４Ｋ  ｖ３（４４，２５４プローブ、３０，４２３遺伝子、アジレントテクノロジー社）にハイブリダイズさせ、各群の創傷滲出液中の細胞における遺伝子の発現を解析した。マイクロアレイのラベル効率、ハイブリダイゼーション効率、ＱＣの結果には問題がないことを確認した。
【００７５】
クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷のマーカー遺伝子候補を次のようにして抽出した。まず、リスト１として、対照群に比較して定着群で発現が上昇せず、クリティカルコロナイゼーション群及び感染群で発現が上昇する遺伝子を、対照群と比較した感染群の発現比が高い順に、降順に３００遺伝子リストアップした。リスト１の一部を表１に示す。
【００７６】
また、リスト２として、対照群に比較して定着群での多少の発現上昇を許容し、クリティカルコロナイゼーション群及び感染群で更に発現が上昇する遺伝子を、対照群と比較した感染群の発現比が高い順に、降順に２５０遺伝子リストアップした。リスト２の１部を表２に示す。
【００７７】
【表１】
0006413163.tif 000002
【００７８】
【表２】
0006413163.tif 000003
【００７９】
以上の結果から、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷のマーカー遺伝子の候補が数百個得られた。
【００８０】
〔実験例３〕
［ヒトのクリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷のマーカー遺伝子の探索］
実際の臨床における、創傷滲出液サンプルを用いて、ヒトのクリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷のマーカー遺伝子を探索した。
【００８１】
具体的には、実際の創傷保有患者の創傷滲出液を含むガーゼから宿主細胞を回収し、全ＲＮＡを抽出し、実験例２で得られたマーカー遺伝子候補のリストに挙げられた遺伝子に対応するヒトホモログ遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、ヒトのクリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷のマーカー遺伝子を探索した。
【００８２】
石川県内の３医療施設における慢性創傷保有患者のうち、褥瘡経過評価基準である、ＤＥＳＩＧＮ−Ｒ（日本褥瘡学会学術教育委員会、２００８年）による評価で、ｄ２〜Ｄ５及びＤＵの褥瘡を有し、滲出液があり、通常のケアにガーゼ又はガーゼ付絆創膏が用いられている患者を対象として検討を行った。なお、本実験は、東京大学医学系研究科・医学部倫理委員会、金沢大学医学倫理委員会の承認を得た（承認番号第１００２８号及び第４２３号）。
【００８３】
（患者の分類）
まず、患者を、次の基準により、定着群、クリティカルコロナイゼーション群、感染群に分類した。創傷の肉眼的所見は、１人の皮膚・排泄ケア認定看護師により判断した。まず、創面積が週３０％以上縮小し、肉眼的に感染徴候を認めない患者を正常治癒群（定着群）とした。また、創面積が不変又は拡大し、肉眼的に明らかな感染徴候を認めないが治癒遅延した患者をクリティカルコロナイゼーション群とした。また、創面積が拡大し、肉眼的に明らかな感染徴候が認められ、Ｌｅｖｉｎｅ法で細菌数が１０５ＣＦＵ／ｃｍ２以上であった患者を感染群とした。定着群の患者４名、クリティカルコロナイゼーション群の患者３名、感染群の患者４名を対象として検討を行った。
【００８４】
（創傷滲出液の回収）
各患者の通常のケアに使用された使用済みガーゼから創傷滲出液を採取した。具体的には、まず、使用済みガーゼのうち創傷滲出液を含む領域を、滅菌したメスとはさみを用いて切り出した。周囲環境からのコンタミネーションを防止するため、ガーゼの内部の領域のみをＲＮＡ抽出に使用した。切断したガーゼは、５０ｍＬ遠沈管に入れた２０ｍＬのＲＮａｓｅフリーリン酸緩衝液に浸し、氷上で実験室まで運搬した。運搬に要した時間は最大で２時間であった。
【００８５】
実験室において、遠沈管の内容物をポアサイズ６０μｍのフィルター（メルクミリポア社）に通し、ろ液を新しい遠沈管に回収した。続いて、回収されたろ液を、１２００×ｇ、４℃で８分間遠心し、上清を捨て、創傷滲出液中の細胞のペレットを回収した。回収された細胞から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて全ＲＮＡを調製した。調製したＲＮＡは、使用するまで−８０℃で保存した。
【００８６】
（候補遺伝子及びプライマー）
実験例２のリスト１の上から順に、アノテーション及びヒトホモログ遺伝子が存在し、ターゲット遺伝子特異的なプライマー設計が可能であった遺伝子を、候補遺伝子として１２個選択し、そのヒトホモログ遺伝子を増幅するプライマーを設計した。表３に、選択した候補遺伝子及び当該遺伝子増幅用プライマーの配列番号を示す。
【００８７】
【表３】
0006413163.tif 000004
【００８８】
また、実験例２のリスト２の上から順に、アノテーション及びヒトホモログ遺伝子が存在し、ターゲット遺伝子特異的なプライマー設計が可能であった遺伝子を、候補遺伝子として８個選択し、そのヒトホモログ遺伝子を増幅するプライマーを設計した。表４に、選択した候補遺伝子及び当該遺伝子増幅用プライマーの配列番号を示す。
【００８９】
【表４】
0006413163.tif 000005
【００９０】
予備検討の結果、１８Ｓ  ｒＲＮＡ及びＨＰＲＴ１遺伝子を内部標準に用い、Ｃｔ値の幾何平均値を、「内部標準の平均Ｃｔ値」として、後述するΔＣｔ値の算出に使用した。１８Ｓ  ｒＲＮＡ増幅用プライマーとしては、配列番号４１（フォワードプライマー）及び配列番号４２（リバースプライマー）に示すプライマーを使用した。ＨＰＲＴ１遺伝子増幅用プライマーとしては、配列番号４３（フォワードプライマー）及び配列番号４４（リバースプライマー）に示すプライマーを使用した。
【００９１】
（定量ＰＣＲ）
逆転写酵素及びランダムプライマーを使用して、調製した全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。続いて、調製したｃＤＮＡを鋳型として、Ｍｘ３０００Ｐ  ｑＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、アジレントテクノロジー社）を使用して、定量ＰＣＲを行った。
【００９２】
定量ＰＣＲでは、初期鋳型量が多いほど、増幅産物が早く検出可能な量に達する。この結果、横軸にＰＣＲ反応のサイクル数を示し、縦軸に増幅産物の量を示すグラフ（増幅曲線）を作成すると、初期鋳型量が多いほど、早いＰＣＲサイクルで増幅曲線が立ち上がる。したがって、段階希釈したスタンダードサンプルを用いて定量ＰＣＲを行うと、鋳型ＤＮＡ量が多い順番に並んだ増幅曲線が得られる。ここで、適当なところに閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を設定すると、閾値と増幅曲線が交わる点（Ｃｔ値、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）が算出される。Ｃｔ値と初期鋳型量の対数値の間には直線関係がある。あるいは、Ｃｔ値と初期鋳型量の間には相関関係があるともいえる。
【００９３】
高いＣｔ値は、増幅産物が検出可能な量に達するためにより多くの増幅が必要であることを示す。したがって、初期鋳型量がより少なかったことを意味する。表５及び表６に、内部標準及び検討した２０個の候補遺伝子の平均Ｃｔ値を示す。表中、「ＮＤ」は、遺伝子の発現が検出されなかったことを示す。また、表７及び表８に、検討した２０個の候補遺伝子のΔＣｔ値を示す。表中、「ＮＤ」は、遺伝子の発現が検出されなかったことを示す。ΔＣｔ値は、下記式（１）により計算した。なお、上述したように、内部標準として、１８Ｓ  ｒＲＮＡ及びＨＰＲＴ１遺伝子を使用し、Ｃｔ値の幾何平均値を、「内部標準の平均Ｃｔ値」とした。
ΔＣｔ値＝対照遺伝子の平均Ｃｔ値−内部標準の平均Ｃｔ値  …（１）
【００９４】
【表５】
0006413163.tif 000006
【００９５】
【表６】
0006413163.tif 000007
【００９６】
【表７】
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【００９７】
【表８】
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【００９８】
（ヒトのクリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷のマーカー遺伝子の同定）
定量ＰＣＲの結果、多くの候補遺伝子は、発現が検出されなかった。しかしながら、発現が検出された候補遺伝子は、定着群、クリティカルコロナイゼーション群、感染群において、異なる発現プロファイルを示す傾向にあった。定着群と、クリティカルコロナイゼーション群又は感染群との間で、ΔＣｔ値が明確に異なる遺伝子として、ＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＣＰＥＢ１、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１を選定した。表９に、これらのマーカー遺伝子のΔＣｔ値の結果を示す。表中、「ＮＤ」は、遺伝子の発現が検出されなかったことを示す。
【００９９】
【表９】
0006413163.tif 000010
【０１００】
表９に示すように、２０個の候補遺伝子のうち、ＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１は、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷において高い発現量を示した（７サンプル中７サンプル）。一方、正常治癒する定着群の創傷においては発現が認められなかった（４サンプル中０サンプル）。
【０１０１】
また、ＣＰＥＢ１は、正常治癒する定着群の創傷においては発現が認められず（４サンプル中０サンプル）、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷において、高い発現量を示した（７サンプル中６サンプル）。
【０１０２】
すなわち、ＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１は、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷の検出において、１００％の感度及び１００％の特異度を示した。また、ＣＰＥＢ１は、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷の検出において、８５％の感度及び１００％の特異度を示した。
【０１０３】
なお、感度及び特異度は、下記表１０におけるＡ〜Ｄの値を用いて、下記式（２）又は下記式（３）により算出される。
感度（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）×１００  …（２）
特異度（％）＝Ｄ／（Ｃ＋Ｄ）×１００  …（３）
【０１０４】
【表１０】
0006413163.tif 000011
【０１０５】
また、表９における、クリティカルコロナイゼーション群と感染群におけるＮＰＰＢ、ＩＴＧＢ６、ＣＰＮＥ４、ＥＭＬ５、ＩＴＳＮ１、ＣＰＥＢ１遺伝子のΔＣｔ値の比較から、これらのマーカー遺伝子の発現量がより高いと感染創傷であり、より低いとクリティカルコロナイゼーション創傷であると判定できることが示された。つまり、これらのマーカー遺伝子の発現量に基づいて、クリティカルコロナイゼーション創傷と感染創傷を区別することも可能である。
【０１０６】
〔実験例４〕
［クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷のマーカー遺伝子の発現量の経時的な変化］
感染群の患者（患者ＩＤ：感染群４）の症例において、創傷の治療の経過と、実験例３で同定された、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷のマーカー遺伝子の発現量の変化について検討した。
【０１０７】
この患者は、緊急搬入された患者であった。初診時において、発赤、腫脹、悪臭、膿性分泌物、発熱（３７．８℃）等の明確な感染の徴候を示していた。スワブ法による細菌数の測定結果は１０５ＣＦＵ／ｃｍ２以上であり、明確に感染群に分類された。創傷滲出液サンプルの回収の後、直ちにデブリドーマン、洗浄、抗菌薬の全身投与、局所消毒、銀含有ドレッシングの適用が開始された。これらの治療の結果、当日中に患者の体温は３７．２℃に低下し、細菌数も１０２ＣＦＵ／ｃｍ２に低下した。
【０１０８】
表１１に、この患者の創傷の臨床的判断と各マーカー遺伝子のΔＣｔ値の測定結果を示す。表中、「ＮＤ」は、遺伝子の発現が検出されなかったことを示す。また、Ａは初診時を示し、ＢはＡから３時間後（治療介入後）の時点を示し、ＣはＡから１週間後の時点を示し、ＤはＡから２週間後の時点を示す。
【０１０９】
表１１に示すように、マーカー遺伝子の発現量の解析結果は、創傷の臨床的判断と矛盾のないものであった。Ｂの時点において、細菌数と同様に、各マーカー遺伝子の発現は低下又は消失した。これらの新規のマーカー遺伝子は、治療に対する創傷の応答を十分に敏感に反映することが確認された。
【０１１０】
【表１１】
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【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明によれば、クリティカルコロナイゼーション創傷又は感染創傷を正確かつ迅速に検出することができる判定キット、判定方法及び試験方法を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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