(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＧタンパク質に特異的に結合することができ、かつＲＳＶ  Ａ株およびＢ株を中和することができるヒト抗体であって、前記抗体が、前記ＲＳＶ  Ｇタンパク質の中央保存ドメイン内のエピトープに結合し、前記エピトープが、ＲＳＶ  Ａ２株のＲＳＶ  Ｇタンパク質のアミノ酸１６１〜１６９の１つ以上のアミノ酸または他の株における対応するアミノ酸の１つ以上のアミノ酸を含み、
前記抗体が、
ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号３の重鎖ＣＤＲ３領域、配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む抗体、
ｂ）配列番号４の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号６の重鎖ＣＤＲ３領域、配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１７の重鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む抗体、
ｃ）配列番号７の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号９の重鎖ＣＤＲ３領域、配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む抗体、
ｄ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号１２の重鎖ＣＤＲ３領域、配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む抗体、
ｅ）配列番号２５の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号２７の重鎖ＣＤＲ３領域、配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む抗体、ならびに
ｆ）配列番号３１の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号３３の重鎖ＣＤＲ３領域、配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号３５の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む抗体
からなる群から選択されるものである、抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体の抗原結合断片。
【請求項３】
請求項１に記載の抗体および／または請求項２に記載の抗原結合断片を含み、少なくとも１つの治療剤および／または検出可能な作用物質をさらに含む、免疫複合体。
【請求項４】
請求項１に記載の抗体および／または請求項２に記載の抗原結合断片をコードする核酸分子。
【請求項５】
請求項４に記載の少なくとも１つの核酸分子を含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の少なくとも１つのベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
請求項１に記載の抗体および／または請求項２に記載の抗原結合断片を産生する方法であって、
ａ）前記抗体の発現を促す条件下で請求項６に記載の宿主細胞を培養するステップと、任意選択で、
ｂ）前記発現された抗体および／または抗原結合断片を回収するステップと
を含む方法。
【請求項８】
請求項１に記載の抗体および／または請求項２に記載の抗原結合断片を含み、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、医薬組成物。
【請求項９】
医薬としての使用のための、請求項１に記載の抗体および／または請求項５に記載の抗原結合断片または請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ＲＳＶ感染症の予防または処置またはその組み合わせにおける使用のための、請求項１に記載の抗体、請求項２に記載の抗原結合断片、または請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
少なくとも１つの請求項１に記載の抗体、請求項２に記載の抗原結合断片、もしくは請求項８に記載の医薬組成物またはその組み合わせを含むキット。
【請求項１２】
ＲＳＶ感染症を検出する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の抗体、請求項２に記載の抗原結合断片および／または請求項３に記載の免疫複合体を使用してサンプル中のＲＳＶ抗原のレベルをアッセイするステップと、
（ｂ）ＲＳＶ抗原のアッセイレベルをコントロールレベルと比較するステップであって、それによって、前記コントロールレベルと比較した前記ＲＳＶ抗原のアッセイレベルの増加がＲＳＶ感染症を示す、ステップと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学に関する。本発明は、特に、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の付着糖タンパク質（Ｇタンパク質）に特異的に結合し、かつＲＳＶを中和する抗体および抗原結合断片に関する。本発明はまた、抗ＲＳＶ抗体を使用する診断方法、予防方法、および治療方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、麻疹およびムンプスを引き起こすものなどの一般的な呼吸器ウイルスも含む、パラミクソウイルス科のマイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスである。２つの主なＲＳＶサブタイプ：サブタイプＡおよびサブタイプＢがある。ＲＳＶは、上気道において複製し、次いで、より下の気道に広がり、細気管支炎または肺炎に至る。ウイルスは、炎症、気道の浮腫、粘液産生の増加、および呼吸上皮の衰弱を引き起こす。
【０００３】
世界中の呼吸器疾患の推定６４００万の症例および１６０，０００人の死亡は、ＲＳＶ誘発性の疾患に起因する。重度のＲＳＶ感染症は、子供および乳児において、とりわけ早産児において、最も頻繁に生じる。慢性肺疾患または先天性心疾患などの根底にある健康問題は、重病の危険性を著しく増加させ得る。ＲＳＶ感染症はまた、高齢者、慢性肺病を有する個人、および骨髄移植レシピエントなどの免疫無防備状態の成人においても、重病を引き起こし得る。
【０００４】
ＲＳＶ感染症の予防および処置に対するいくつかのアプローチが調査されてきた。ドナーから単離される静脈内免疫グロブリン（ＲＳＶ−ＩＧＩＶ；ＲｅｓｐｉＧａｍ（登録商標））およびモノクローナル抗体パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））は、ハイリスク早産児におけるＲＳＶ予防法に承認された。しかしながら、ＲＳＶに対するワクチンまたは市販で入手可能な処置は、依然として利用可能ではない。ＲＮＡ阻害剤であるリバビリンのみが、ＲＳＶ感染症の処置に承認されている。ＲＳＶ感染症の処置に有効となるために、有効性が低いことに起因して高用量、繰り返し投与、および／または多量のパリビズマブなどの抗体産物が必要とされる。
【０００５】
ＲＳＶは、２つの主な表面糖タンパク質、ＦおよびＧを有する。Ｆタンパク質は、融合を媒介し、インビトロにおいて、細胞の細胞質へのウイルスの侵入を可能にし、合胞体の形成を促進する。Ｆタンパク質配列は、ＲＳＶ株の間でかなり（約９０％）保存されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：２６２３−２６２８）。唯一の販売されているモノクローナル抗体パリビズマブは、ＲＳＶのＦタンパク質に対して向けられる。
【０００６】
ＲＳＶのＧタンパク質は、非常にグリコシル化されており、付着タンパク質として機能する表面タンパク質である。Ｆタンパク質とは対照的に、Ｇタンパク質は、ＲＳＶ  Ａ２株のＧタンパク質のアミノ酸残基１５３〜１８４または他の株における対応するアミノ酸残基を含む中央保存ドメイン（ＣＣＤ）を除いて、株にわたってかなり変異性である。中央保存ドメインおよび隣接領域（残基１４５〜１９３）の両方は、強固で重いＯ−グリコシル化ムチン様領域に接している。中央保存ドメインのＮ−末端の半分は、７００を超える株の間で保存されている小さな領域を含有する。Ｃ−末端の半分は、１−４，２−３配置でつながれた４つの保存システインを含有し、フォールドして、シスチンの輪なわ（ｃｙｓｔｉｎｅ  ｎｏｏｓｅ）になる。
【０００７】
Ｇタンパク質に向けられる抗体を使用する受動免疫は、株にわたる配列保存の欠如により実用的でないと一般に考えられてきたが、ＲＳＶ  Ｇタンパク質に結合するモノクローナル抗体の中和が知られている。Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６２：４２３２−４２３８）は、ＦおよびＧマウスモノクローナル抗体の混合物の中和能力を記載し、これらのうちの１つは、ＲＳＶ  Ｇタンパク質に結合する（つまり１３１−２Ｇ）。この抗体の抗原部位は、その後、Ｓｕｌｌｅｎｄｅｒ（Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）２０９：７０−７９）によって定められた。この抗体は、ＲＳＶの主な株に相当するＲＳＶグループＡおよびＢの両方に結合することが分かった。そのうえ、国際公開第２００９／０５５７１１号パンフレットは、ＲＳＶ  Ａ２のＧタンパク質内の保存モチーフと免疫反応性であり、ＲＳＶ  ＡおよびＢサブタイプに対する中和活性を有する、３Ｄ３および３Ｇ１２などの抗体を開示する。これらの抗体は、中央保存ドメインの線状エピトープを認識することが示されたが、ＲＳＶ抗体およびワクチンを評価するために好ましい動物モデル（つまりコットンラット）において試験されなかった。
【０００８】
特に幼い子供においておよび高齢者において、ＲＳＶによって引き起こされる呼吸器疾患の重症度を考慮して、ＲＳＶ感染症を予防し、処置するための有効な手段の必要性が引き続き存在している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質に特異的に結合し、かつＲＳＶを中和することができる単離抗体およびその抗原結合断片を提供する。抗体および抗原結合断片は、好ましくは、サブタイプＡおよびＢの両方のＲＳＶに特異的に結合し、中和することができる。好ましくは、抗体は、ヒト抗体である。抗体は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の中央保存非グリコシル化領域（中央保存ドメイン、ＣＣＤとも呼ばれる）のエピトープに結合する。
【００１０】
抗体および抗原結合断片は、Ｇタンパク質に対して高い親和性を有し、強力な中和能力を有する。本発明の抗体および抗原結合断片は、単独でならびに他の診断剤、予防剤、および／または治療剤と組み合わせての両方で、診断剤、予防剤、および／または治療剤として有用である。
【００１１】
本発明は、１つ以上の本発明の抗体および／またはその抗原結合性断片を含む組成物をさらに提供する。本発明はまた、抗ＲＳＶ抗体を用いる診断方法、予防方法、および治療方法も提供する。予防方法および治療方法は、ＲＳＶ感染症およびＲＳＶ媒介性の疾患もしくは状態の予防もしくは処置ならびに／またはＲＳＶ感染症の１つ以上の症状の回復のために、抗ＲＳＶ抗体および／またはその抗原結合断片をヒト対象に投与するステップを含む。複数の異なる抗ＲＳＶ抗体および／もしくはその抗原結合断片のならびに／または他の抗ＲＳＶ抗体との組み合わせは、併用療法に使用することができる。他の予防剤または治療剤と組み合わせて抗ＲＳＶ抗体および／またはその抗原結合断片を含む組成物も提供される。本発明はまた、抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子も提供する。
【００１２】
本発明の抗体は、抗体が、少なくともインビトロ中和アッセイにおいて、あらゆる既知の抗ＲＳＶ  Ｇ抗体よりも、特に、既知の抗ＲＳＶ  Ｇモノクローナル抗体３Ｄ３よりも、ＲＳＶ  Ａ型およびＢ型に対して強力であるという点で独特である。
【００１３】
本発明の抗体は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質上の独特のエピトープに結合する。
【００１４】
ある実施形態では、抗体が、そのアミノ酸配列において、ＣＸＸＸＸＣモチーフを含む重鎖ＣＤＲ３を含む。
【００１５】
ある実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、それらが抗ＲＳＶ  Ｆ抗体と相加的および／または相乗的に作用するという点で独特である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＲＳＶ  ＧａおよびＲＳＶ  Ｇｂタンパク質に対する結合プロファイルを示す図である。ＩｇＧは、組換えＲＳＶ  ＧａおよびＧｂタンパク質の外部ドメインに結合するそれらの能力についてＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。白丸（破線）は、Ｇａ（ＲＳＶ  Ａ／Ｌｏｎｇ）への結合を表し、黒丸（実線）は、Ｇｂ（ＲＳＶ  Ｂ／Ｂ１）への結合を表す。
【図２】図２は、ＲＳＶ−ＡおよびＲＳＶ−Ｂ株に対する中和プロファイルを示す図である。ＩｇＧは、ＲＳＶ−ＡおよびＲＳＶ−Ｂ株を中和するそれらの能力について中和アッセイにおいて試験した。白丸（点線）は、ＲＳＶ−Ａ（ＲＳＶ  Ａ／Ａ２）の中和を表し、黒丸（実線）は、ＲＳＶ−Ｂ（ＲＳＶ  Ｂ／１８５３７）の中和を表す。
【図３】図３は、ＲＳＶ  ＧペプチドへのＲＳＶ  Ｇ特異的モノクローナル抗体の結合を示す図である（ＥＬＩＳＡ）。中央保存ドメインにまたがる短いおよび長いＲＳＶ  Ｇペプチド（表１５）を、様々な濃度のＲＳＶ  Ｇ特異的ｍＡｂ：ＣＢ００３．１（黒色の丸、実線）、ＣＢ０１０．７（白抜きの黒色の丸、破線）、またはモノクローナル抗体なし（明るい灰色の丸）と共に、ＥＬＩＳＡにおける結合実験に使用した。
【図４】図４は、ＰｅｐＳｃａｎによる最小エピトープマッピングを示す図である。中央領域（ＲＳＶ−Ｇ  Ａ型およびＢ型の残基１４５〜２０１）のすべての完全に重複する５アミノ酸長、８アミノ酸長、１０アミノ酸長、１４アミノ酸長、１８アミノ酸長、２５アミノ酸長、および３２アミノ酸長ペプチドのＲＳＶ  Ｇタンパク質特異的抗体の結合活性。ペプチドとの結合活性は、ＰｅｐＳｃａｎ  ＥＬＩＳＡシグナルに比例する垂直線として示す。
【図５】図５は、ＰｅｐＳｃａｎによるＣＢ００３．１およびＣＢ０１０．７エピトープの完全置換分析を示す図である。ペプチドとの、それぞれ１００および３０ｎｇ／ｍＬのモノクローナル抗体ＣＢ００３．１およびＣＢ０１０．７の結合活性は、Ｐｅｐｓｃａｎ  ＥＬＩＳＡシグナルに比例した垂直線として示す。２０本の線のそれぞれのグループは、もとの１４アミノ酸長ペプチド（ＦＨＦＥＶＦＮＦＶＰＣＳＩＣ）におけるそれぞれのアミノ酸位置に対する完全置き換えセットに相当する。２０本の線のそれぞれのグループ内で、置換は、１文字アミノ酸コード（ＡＣＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹ）に基づくアルファベット順になっており、もとの１４アミノ酸長ペプチドの反応性は、灰色のバーとして示す。
【図６】図６は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質中央領域のアラニンスキャニング（ＰｅｐＳｃａｎ）を示す図である。Ａ型（左パネル）およびＢ型（右パネル）のＲＳＶ−Ｇ中央ドメインの残基１６１〜１９２に対応するペプチドのすべての位置でのアラニン置換。Ａ型の１８０位のアラニンをグリシンと置換した。もとのペプチドの反応性は、灰色のバーとして示す。
【図７】図７は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質中央領域の天然に存在する変異体へのモノクローナル抗体の結合を示す図である。入手可能なＡ型（上パネル）およびＢ型（下パネル）変異体に対応する様々なペプチドとのｍＡｂ  ＣＢ００３．１およびＣＢ０１０．７の結合。野生型ペプチドの反応性は、灰色のバーとして示す。
【図８】図８は、チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）の４日後の肺および鼻甲介ウイルス負荷に対するコットンラットＲＳＶ−Ａ／Ｌｏｎｇモデルにおける抗ＲＳＶ  Ｇ  ｍＡｂの予防効能を示す図である。
【図９】図９は、チャレンジの４日後の肺および鼻甲介ウイルス負荷に対するコットンラットＲＳＶ−Ａ／Ｌｏｎｇモデルにおける抗ＲＳＶ  Ｇ  ｍＡｂの治療効能を示す図である。
【図１０】図１０は、チャレンジの６日後の病理組織診断スコアに対するコットンラットＲＳＶ−Ａ／Ｌｏｎｇモデルにおける抗ＲＳＶ  Ｇ  ｍＡｂの治療効能を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
本発明において使用される用語の定義を下記に示す。
【００１８】
本明細書において使用される用語「含まれる」または「含む」は、語「限定を伴うことなく」が続くと見なされる。
【００１９】
本明細書において使用されるように、用語「抗体」は、キメラ、ヒト化、またはヒトモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体を含む免疫グロブリン分子を指す。用語「抗体」は、当技術分野において知られている免疫グロブリンクラスおよびサブクラスをすべて含む。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、抗体は、５つの主なクラスのインタクトな抗体：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに分けることができ、これらのいくつかのものは、サブクラス（アイソタイプ）、たとえばＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４にさらに分けられてもよい。
【００２０】
抗原結合断片という用語は、免疫グロブリンの結合パートナー、つまりＲＳＶ  Ｇタンパク質への特異的な結合について、インタクトな免疫グロブリンと競合する、免疫グロブリンの断片を含む抗原結合ドメインおよび／または可変ドメインを指す。構造にかかわらず、抗原結合断片は、インタクトな免疫グロブリンによって認識されるものと同じ抗原と結合する。抗原結合断片は、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二価単鎖抗体、（単一）ドメイン抗体、二特異性抗体、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、（ポリ）ペプチドへの特異的な抗原結合を与えるのに十分な免疫グロブリンの少なくとも断片を含有する（ポリ）ペプチド、などを含む。抗原結合断片は、抗体のアミノ酸配列の少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、または２５０近接アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを含んでいてもよい。抗原結合断片は、合成してまたはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって産生されてもよく、またはそれらは、組換えＤＮＡ技術によって遺伝子的に操作されてもよい。産生の方法は、当技術分野においてよく知られており、たとえば参照によって本明細書において組み込まれるＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ，Ｌａｎｅ（１９８８），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにおいて記載される。抗体またはその抗原結合断片は、１つ以上の結合部位を有していてもよい。２つ以上の結合部位がある場合、結合部位は互いに同一であってもよく、またはそれらは異なっていてもよい。
【００２１】
本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、単一の特異性の抗体分子を指す。モノクローナル抗体は、特定のエピトープへの単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来するもしくはそれに基づくまたは完全合成配列に由来する可変および定常領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を指す。モノクローナル抗体を調製する方法は、結合特異性にとって重要ではない。
【００２２】
本明細書において使用される用語「機能的変異体」は、参照抗体と結合パートナー、つまりＲＳＶへの特異的結合について競合することができる、参照抗体のヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸が改変されたヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列を含む抗体を指す。言いかえれば、参照抗体のアミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列における修飾は、ヌクレオチド配列によってコードされるまたはそのアミノ酸配列を含有する抗体の結合特質に有意に影響を与えず、改変もしない、つまり、抗体はなお、その標的を特異的に認識し、それに結合することができる。機能的変異体は、ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、追加、および欠失を含む保存的配列修飾を有していてもよい。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発およびランダムなＰＣＲ媒介性突然変異誘発など、当技術分野において知られている標準的な技術によって導入することができ、天然および非天然ヌクレオチドおよびアミノ酸を含んでいてもよい。
【００２３】
本発明の抗体に関して本明細書において使用される用語「中和する」は、中和が実現されるメカニズムに関係なく、その生物学的効果を中和するもしくは阻害することおよび／またはＲＳＶの感染力価を低下させることによって、ウイルスによる細胞の感染を予防するまたは阻害することができる抗体を指す。中和は、たとえば、細胞表面へのウイルスの付着もしくは接着を阻害することによってまたは標的細胞へのウイルスの付着後のウイルスおよび細胞の膜の融合を阻害することによって、などで実現することができる。
【００２４】
抗体およびその結合パートナー、たとえば抗原の相互作用に関して、本明細書において使用される用語「特異的に結合する」は、相互作用が、特定の構造、たとえば結合パートナー上の抗原決定基またはエピトープの存在に依存することを意味する。言いかえれば、抗体は、結合パートナーが他の分子または有機体の混合物中に存在する場合でさえ、結合パートナーに優先的に結合するまたはそれを認識する。結合は、共有結合もしくは非共有結合の相互作用またはその両方の組み合わせによって媒介されてもよい。さらに言いかえれば、用語「特異的に結合する」は、抗体が、抗原決定基またはエピトープと特異的に免疫反応性であり、他の抗原決定基またはエピトープと免疫反応性ではないということを意味する。抗原に（免疫）特異的に結合する抗体は、たとえばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ＢＩＡＣＯＲＥ、または当技術分野において知られている他のアッセイによって決定されるように、より低い親和性で他のペプチドまたはポリペプチドに結合してもよい。抗原に特異的に結合する抗体またはその断片は、同じエピトープを運ぶ、関係する抗原と交差反応してもよい。好ましくは、抗原に特異的に結合する抗体またはその断片は、他の抗原と交差反応しない。
【００２５】
本発明の詳細な説明
第１の態様では、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＧタンパク質に特異的に結合することができ、かつＲＳＶを中和することができる抗体および抗原結合断片を提供する。抗体は、好ましくは、サブタイプＡおよびＢの両方のＲＳＶに特異的に結合し、中和することができる。好ましくは、抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。
【００２６】
本発明によれば、抗体および抗原結合断片は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の中央保存ドメイン（ＣＣＤ）のエピトープに結合する。中央保存ドメインは、ＲＳＶ  Ａ２株のＧタンパク質のアミノ酸１５３〜１８４（または他の株における対応するアミノ酸残基）を含むアミノ酸配列にまたがる。ある実施形態では、抗体および抗原結合断片が、アミノ酸残基１６１〜１６９を含むアミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸残基、特に、ＲＳＶ  Ａ２株のＧタンパク質のアミノ酸残基１６２〜１６８（ＲＳＶ株Ａ２株に従うナンバリング）を含むアミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸を含むエピトープに結合する。
【００２７】
したがって、シスチンの輪なわのＮ−末端である部位に位置するＧタンパク質中のエピトープに結合する抗体および抗原結合断片が、提供される。本発明によれば、本発明の中和抗体のうちの少なくともいくつかが、たとえば以前に記載されたモノクローナル抗体３Ｄ３（国際公開第２００９／０５５７１１号パンフレット）のように、類似するが同一ではない線状エピトープに結合するという事実にもかかわらず、本発明の抗体は、インビトロ中和アッセイにおいて測定されるように、より高い中和効力を有することが示された。本発明によれば、本発明の抗体が独特な方法でこの線状エピトープに結合することが示された。したがって、本発明によれば、これらの抗体は、ＲＳＶ  Ａ型およびＢ型の１６１〜１６９エピトープ（ＲＳＶ株Ａ２に従うナンバリング）に対して異なる側鎖特異性を有することが示された。これは、たとえば、本発明の抗体のエピトープが、たとえば３Ｄ３と比較して、異なる本質的な残基を有することを示す置換分析によって表される（実施例１１を参照されたい）。
【００２８】
本発明の抗体および抗原結合断片は、インビトロ中和アッセイ、特に、実施例７において記載されるインビトロアッセイにおいて、既知の抗ＲＳＶ  Ｇ抗体のいずれよりもＲＳＶ  Ａ型およびＢ型に対して強力である、特に、既知の抗ＲＳＶ  Ｇモノクローナル抗体３Ｄ３よりも強力であることが示された。
【００２９】
ある実施形態では、ＲＳＶ株Ａ／Ａ２（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＶＲ−１５４０）に対する抗体および抗原結合断片のＩＣ５０（プラーク形成の５０％の中和に有効な希釈）が、４０ｎｇ／ｍｌ未満であったおよび／またはＲＳＶ株Ｂ／１８５３７（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＶＲ−１５８９）に対するＩＣ５０が、３０ｎｇ／ｍｌ未満であった。
【００３０】
一実施形態では、抗体が、１Ｆ１２、３Ｇ１２、１Ａ５、３Ｄ３、１Ｇ１、２Ｂ１１、５Ｄ８、２Ｄ１０、３Ｆ９、１Ｄ４、１Ｇ８、６Ａ１２、１０Ｃ６（国際公開第２００９／０５５７１１号パンフレットに記載される）からなる群から選択される抗体ではない。
【００３１】
ある実施形態では、本発明の抗体または抗体断片が、１Ｆ１２、３Ｇ１２、１Ａ５、３Ｄ３、１Ｇ１、２Ｂ１１、５Ｄ８、２Ｄ１０、３Ｆ９、１Ｄ４、１Ｇ８、６Ａ１２、および１０Ｃ６（国際公開第２００９／０５５７１１号パンフレットに記載される）からなる群から選択される抗体とＲＳＶ  Ｇタンパク質への結合について競合する。
【００３２】
ある実施形態では、抗体が、そのアミノ酸配列において、ＣＸＸＸＸＣモチーフを含む重鎖ＣＤＲ３を含む。
【００３３】
ある実施形態では、抗体が、
ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号３の重鎖ＣＤＲ３領域、
ｂ）配列番号４の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号６の重鎖ＣＤＲ３領域、
ｃ）配列番号７の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号９の重鎖ＣＤＲ３領域、
ｄ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号１２の重鎖ＣＤＲ３領域、
ｅ）配列番号２５の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号２７の重鎖ＣＤＲ３領域、または
ｆ）配列番号３１の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号３３の重鎖ＣＤＲ３領域
を含む重鎖を含む。
【００３４】
ある実施形態では、抗体が、
ａ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ３領域、
ｂ）配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３領域、
ｃ）配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ３領域、
ｄ）配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３領域、
ｅ）配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ３領域、または
ｆ）配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号３５の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ３領域
を含む軽鎖を含む。
【００３５】
ある実施形態では、抗体が、
ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３領域、および配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む抗体、
ｂ）配列番号４の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号６の重鎖ＣＤＲ３領域、配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３領域、
ｃ）配列番号７の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号９の重鎖ＣＤＲ３領域、配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む抗体、
ｄ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号１２の重鎖ＣＤＲ３領域、配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む抗体、
ｅ）配列番号２５の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号２７の重鎖ＣＤＲ３領域、配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む抗体、ならびに
ｆ）配列番号３１の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号３３の重鎖ＣＤＲ３領域、配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号３５の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む抗体
からなる群から選択される。
【００３６】
ある実施形態では、抗体が、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００３７】
ある実施形態では、抗体が、配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３８】
ある実施形態では、抗体が、
ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
ｄ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
ｅ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体、ならびに
ｆ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体からなる群から選択される。
【００３９】
ある実施形態では、上記に記載される抗体の抗原結合断片が、提供される。抗原結合断片は、好ましくは、同じエピトープに結合する。
【００４０】
本発明の抗体および抗原結合断片は、たとえば、これもＲＳＶ  Ｇタンパク質の中央保存ドメインのエピトープに結合することが示された抗ＲＳＶ  Ｇ抗体３Ｄ３などの既知の抗ＲＳＶ  Ｇタンパク質のエピトープと比較して、異なるエピトープに結合する。異なるエピトープに結合することにより、抗体が、３Ｄ３などの既知の抗体と比較して、異なる決定的なアミノ酸残基に結合することが意味される。本発明の抗体は、インビトロ中和アッセイ、特に実施例７において記載されるインビトロ中和アッセイにおいて測定された場合に、既知のＲＳＶ  Ｇタンパク質結合抗体のいずれよりも強力であることがさらに示された。
【００４１】
ある実施形態では、抗体が、ＲＶＳ  Ｆタンパク質に結合する抗体と組み合わせて使用された場合、相乗的に作用する。本明細書において使用されるように、用語「相乗的な」は、組み合わせて使用された場合の抗体または抗原結合断片の組み合わせられた効果が、個々に使用された場合のそれらの相加効果よりも大きいことを意味する。相乗作用を計算する方法は、組み合わせインデックス（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）によるものである。組み合わせインデックス（ＣＩ）の概念は、Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｔａｌａｌａｙ（Ａｄｖ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ．，２２：２７−５５，１９８４）によって記載された。
【００４２】
ある実施形態では、抗体および抗原結合断片が、医薬としての使用のためのもの、好ましくは、ＲＳＶ  Ａおよび／またはＢサブタイプによって引き起こされるＲＳＶ感染症の診断処置、治療処置、および／または予防処置における使用のためのものである。本明細書において使用されるように、用語「処置する」または「処置」は、ＲＳＶに既に感染している対象のウイルス負荷を低下させることおよび／またはそのような対象における疾患の症状を回復させることを指す。そのような症状は、たとえば細気管支炎、気道炎症、肺におけるうっ血、および呼吸困難を含む。「予防」または「予防法」は、ＲＳＶの広がりを阻害するもしくは低下させることまたはＲＳＶによる感染症に関連する１つ以上の症状の発症、発達、もしくは進行を阻害するもしくは低下させることを包含する。
【００４３】
本発明はまた、本発明の少なくとも１つの抗体または抗原結合断片を含む組成物にも関する。ある実施形態では、組成物が、本発明による少なくとも１つの抗体または抗原結合断片および少なくとも薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。「薬学的に許容される賦形剤」によって、好都合な投薬形態を調製するための、抗体などの活性分子と組み合わせられる任意の不活性物質を意味する。「薬学的に許容される賦形剤」は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに無毒性であり、かつ薬剤、作用物質、または抗体を含む製剤の他の成分と適合性である賦形剤である。薬学的に許容される賦形剤は、当技術分野に広く適用され、知られている。
【００４４】
他の実施形態では、本発明は、ＲＳＶ感染症の診断、予防法、および／または処置のための医薬の調製における本発明の抗体または抗原結合断片の使用に関する。本発明はまた、その必要がある対象に治療有効量の本発明による抗体を投与することによる、ＲＳＶ感染症の予防または処置の方法にも関する。用語「治療有効量」は、ＲＳＶによる感染症から結果として生じる状態を予防する、回復させる、および／または処置するのに有効である、本明細書において定義される抗体の量を指す。本明細書において使用される回復は、目に見えるまたは感知できる疾患症状、ウイルス血症、またはＲＳＶ感染症の任意の他の測定可能な症状発現の低下を指してもよい。
【００４５】
療法における使用のために、抗体またはその断片は、適した賦形剤を使用して医薬組成物に製剤され、標準的なプロトコールに従って投与される。医薬組成物は、本発明による１つ以上の抗体または抗原結合断片を含んでいてもよい。ＲＳＶのＦタンパク質と免疫反応性である１つ以上の抗体またはＲＳＶもしくは炎症に対して有効な他の治療剤を含むさらなる治療剤が、存在してもよい。したがって、ステロイド性および非ステロイド性抗炎症化合物の両方などの抗炎症剤が、組成物中に含まれてもよい。
【００４６】
ある実施形態において、完全抗体、つまり補体含有Ｆｃ領域を含有する抗体が、使用される。
【００４７】
ある実施形態では、たとえば、肺における炎症応答を低下させるために、抗体の抗原結合断片のみが、使用される。免疫特異性断片および全抗体の混合物の投与も本発明の範囲内に含まれる。
【００４８】
処置は、ＲＳＶ感染症に感受性の患者グループを標的にしてもよい。そのような患者グループは、たとえば高齢者（たとえば≧５０歳、≧６０歳、好ましくは≧６５歳）、子ども（たとえば≦５歳、≦１歳）、入院患者、免疫無防備の患者、および抗ウイルス化合物により処置されたが、不十分な抗ウイルス応答を示した患者を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
本発明の抗体組成物の投与は、典型的に注射によるもの、一般に筋肉内または静脈内注射によるものである。製剤は、抗体組成物を投与するための当技術分野において一般に知られている方法で調製される。適した製剤は、参照によって本明細書において組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡなどの標準的な処方集において見つけられてもよい。製剤は、典型的に、非経口投与にふさわしいものであり、バッファー、酸化防止剤、およびその他同種のものを含む等張液ならびにリポソーム、ミセル、およびナノ粒子などの送達ビヒクルを含むエマルションを含む。所望のプロトコールおよび製剤は、主治医の判断および対象の特定の状態に依存する。投薬レベルは、適切な場合、対象の年齢、全身の健康状態、および感染症の重症度に依存するであろう。
【００５０】
本発明の他の態様は、本明細書において定義される抗体の機能的変異体を含む。分子は、変異体が、「親」または「参照」抗体と、ＲＳＶまたはその断片に特異的に結合することについて競合し得る場合、本発明による抗体の機能的変異体であると考えられる。言いかえれば、分子は、機能的変異体が、ＲＳＶまたはその断片の同じまたは重複するエピトープになお結合することができる場合、本発明による抗体の機能的変異体であると考えられる。機能的変異体は、一次構造の配列において実質的に類似する誘導体を含むが、これらに限定されず、Ｆｃ受容体領域もしくはエフェクター機能に関与する他の領域において修飾を有するおよび／またはたとえば、親抗体において見つけられない化学的および／もしくは生化学的なインビトロもしくはインビボ修飾を含有するものを含む。そのような修飾は、とりわけ、アセチル化、アシル化、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、架橋、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、酸化、ペグ化、タンパク分解性プロセシング、リン酸化、およびその他同種のものを含む。
【００５１】
その代わりに、機能的変異体は、親抗体のアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失、またはその組み合わせを含有するアミノ酸配列を含む、本発明において定義される抗体とすることができる。さらに、機能的変異体は、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかまたは両方にアミノ酸配列の切断を含むことができる。本発明による機能的変異体は、親抗体と比較して、同じまたは異なる、高いまたは低い結合親和性を有していてもよいが、ＲＳＶまたはその断片になお結合することができる。たとえば、本発明による機能的変異体は、親抗体と比較して、ＲＳＶまたはその断片に対する結合親和性が増加していてもよく、または減少していてもよい。本発明の範囲内にあることが意図される機能的変異体は、本明細書において定義される親抗体と、少なくとも約５０％〜約９９％、好ましくは少なくとも約６０％〜約９９％、より好ましくは少なくとも約７０％〜約９９％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％〜約９９％、最も好ましくは少なくとも約９０％〜約９９％、特に少なくとも約９５％〜約９９％、特に少なくとも約９７％〜約９９％のアミノ酸配列同一性および／または相同性を有する。当業者に知られているとりわけＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔなどのコンピューターアルゴリズムは、比較し、類似するまたは同一のアミノ酸残基を定めるために、アミノ酸配列を最適にアライメントするために使用することができる。機能的変異体は、エラープローンＰＣＲ、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、ならびに重鎖および／または軽鎖シャフリングを含むが、これらに限定されない、当技術分野において知られている一般的な分子生物学の方法によって、親抗体またはその一部を改変することによって、得ることができる。
【００５２】
本発明はまた、免疫複合体、つまり少なくとも１つの抗体、抗原結合断片、または機能的変異体を含み、とりわけ検出可能な成分／作用物質などの少なくとも１つのタグをさらに含む分子を提供する。本発明による免疫複合体の混合物または本発明による少なくとも１つの免疫複合体および治療剤または他の抗体もしくは免疫複合体などの他の分子の混合物も本発明において企図される。さらなる実施形態では、本発明の免疫複合体が、２つ以上のタグを含んでいてもよい。これらのタグは、互いに同じまたは別個とすることができ、抗体に非共有結合でつなぐ／コンジュゲートすることができる。タグはまた、共有結合を通してヒト抗体に直接つなぐ／コンジュゲートすることができる。その代わりに、タグは、１つ以上の連結化合物によって抗体につなぐ／コンジュゲートすることができる。抗体にタグをコンジュゲートするための技術は、当業者によく知られている。本発明の免疫複合体のタグは、治療剤であってもよいが、それらはまた、検出可能な成分／作用物質とすることもできる。療法および／または予防において適したタグは、毒素またはその機能的部分、抗生物質、酵素、食作用または免疫刺激を増強する他の抗体であってもよい。検出可能な作用物質を含む免疫複合体は、たとえば、対象がＲＳＶに感染しているかどうかを評価するためにまたは臨床試験手順の一部としてＲＳＶ感染症の発達もしくは進行をモニターするために、たとえば、所定の処置レジメンの効能を決定するために、診断的に使用することができる。しかしながら、それらはまた、他の検出および／または分析および／または診断の目的に使用されてもよい。検出可能な成分／作用物質は、酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、ポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属イオンを含むが、これらに限定されない。検出および／または分析および／または診断の目的のために抗体を標識するために使用されるタグは、とりわけ（組織）サンプルの免疫組織化学的染色、フローサイトメトリー検出、走査レーザーサイトメトリー検出、蛍光イムノアッセイ、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、バイオアッセイ（たとえば食作用アッセイ）、ウエスタンブロッティングの適用など、使用される特定の検出／分析／診断技術および／または方法に依存する。当技術分野において知られている検出／分析／診断技術および／または方法に適した標識は、当業者の範囲内に十分にある。
【００５３】
さらに、本発明のヒト抗体または免疫複合体はまた、固体支持体に付着させることもでき、これらは、ＲＳＶまたはその断片のインビトロイムノアッセイまたは精製に特に有用である。本発明の抗体は、精製を促進するためのペプチドなどのマーカー配列に融合することができる。例として、ヘキサ−ヒスチジンタグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、ｍｙｃタグ、またはフラグタグを含むが、これらに限定されない。その代わりに、抗体は、抗体ヘテロコンジュゲートを形成するために第２の抗体にコンジュゲートすることができる。他の態様では、本発明の抗体が、１つ以上の抗原にコンジュゲートされてもよい／付着されてもよい。好ましくは、これらの抗原は、抗体−抗原コンジュゲートが投与される対象の免疫系によって認識される抗原である。抗原は、同一であってもよいが、また互いに異なっていてもよい。抗原および抗体を付着させるコンジュゲーション方法は、当技術分野においてよく知られており、架橋剤の使用を含むが、これらに限定されない。
【００５４】
たとえばリンカーを介して直接または間接的にコンジュゲートすることによって免疫複合体を化学的に産生することに次いで、免疫複合体は、本発明の抗体および適したタグを含む融合タンパク質として産生することができる。融合タンパク質は、たとえば、組換えで、適したタグをコードするヌクレオチド配列とインフレームで抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を構築し、次いで、核酸分子を発現させることなどによって、当技術分野において知られている方法によって産生することができる。
【００５５】
本発明は、本発明による抗体、抗原結合断片、または機能的変異体をコードする核酸分子をさらに提供する。そのような核酸分子は、上記に記載されるように、たとえば親和性成熟のプロセスにおいて、クローニングの目的のための中間体として使用することができる。好ましい実施形態では、核酸分子が、単離されるまたは精製される。当業者は、これらの核酸分子の機能的変異体も本発明の一部となることが意図されることを十分に理解するであろう。機能的変異体は、親核酸分子から翻訳されるものと同一のアミノ酸配列を提供するために、標準的な遺伝子コードを使用して直接翻訳することができる核酸配列である。好ましくは、核酸分子は、上記に記載されるＣＤＲ領域を含む抗体をコードする。さらなる実施形態では、核酸分子が、本発明の抗体の２、３、４、５、またはさらに６つすべてのＣＤＲ領域を含む抗体をコードする。
【００５６】
ベクター、つまり、本発明による１つ以上の核酸分子を含む核酸構築物を提供することは、本発明の他の態様である。ベクターは、とりわけＦ、Ｒ１、ＲＰ１、Ｃｏｌ、ｐＢＲ３２２、ＴＯＬ、Ｔｉなどのプラスミド；コスミド；ラムダ、ラムドイド、Ｍ１３、Ｍｕ、Ｐ１、Ｐ２２、Ｑβ、Ｔ−ｅｖｅｎ、Ｔ−ｏｄｄ、Ｔ２、Ｔ４、Ｔ７などのファージ；植物ウイルスに由来することができる。ベクターは、本発明の抗体のクローニングのためにおよび／または発現のために使用することができ、遺伝子療法の目的にさらに使用されてもよい。１つ以上の発現調節核酸分子に作動可能に連結された本発明による１つ以上の核酸分子を含むベクターも本発明によって包含される。ベクターの選択は、従う組換え手順および使用される宿主に依存する。宿主細胞におけるベクターの導入は、とりわけリン酸カルシウムトランスフェクション、ウイルス感染、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性のトランスフェクション、リポフェクタミントランスフェクション、またはエレクトロポレーションによって達成することができる。ベクターは、自己複製性であってもよく、またはそれらが統合される染色体と一緒に複製してもよい。好ましくは、ベクターは、１つ以上の選択マーカーを含有する。マーカーの選択は、当業者によく知られているように、これは本発明にとって重大ではないが、選択した宿主細胞に依存してもよい。それらは、カナマイシン、ネオマイシン、プロマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）、マウス由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ）を含むが、これらに限定されない。ヒト抗体を単離するために使用することができるタンパク質またはペプチドをコードする１つ以上の核酸分子に作動可能に連結された、上記に記載されるヒト抗体をコードする１つ以上の核酸分子を含むベクターも本発明によって包含される。これらのタンパク質またはペプチドは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、金属結合ポリヒスチジン、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、およびベータ−ガラクトシダーゼを含むが、これらに限定されない。
【００５７】
本発明はまた、上記に言及されるベクターの１つ以上のコピーを含有する宿主細胞も提供する。宿主細胞は、哺乳類、植物、昆虫、真菌、または細菌起源の細胞を含むが、これらに限定されない。細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属のいくつかの種およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などのグラム陽性菌またはグラム陰性菌由来の細胞を含むが、これらに限定されない。真菌細胞のグループでは、好ましくは、酵母細胞が、使用される。酵母における発現は、とりわけピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびメタノール資化酵母（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）などの酵母株を使用することにより実現することができる。さらに、ショウジョウバエおよびＳｆ９由来の細胞などの昆虫細胞は、宿主細胞として使用することができる。それに加えて、宿主細胞は、とりわけ、森林植物などの作物植物由来の細胞または穀物植物もしくは薬用植物などの食物および原材料を提供する植物由来の細胞または鑑賞植物由来の細胞または球根作物（ｆｌｏｗｅｒ  ｂｕｌｂ  ｃｒｏｐ）由来の細胞などの植物細胞とすることができる。たとえば、形質転換（トランスジェニック）植物または植物細胞は、既知の方法、たとえばアグロバクテリウム媒介性の遺伝子導入、葉片の形質転換、ポリエチレングリコール誘発性のＤＮＡ移入によるプロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、超音波処理、マイクロインジェクション、または射撃遺伝子導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）によって産生される。そのうえ、適した発現系は、バキュロウイルス系とすることができる。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、またはＢｏｗｅｓメラノーマ細胞などの哺乳類細胞を使用する発現系は、本発明において好ましい。哺乳類細胞は、哺乳類起源の天然の分子に非常に類似する翻訳後修飾を有する発現タンパク質を提供する。本発明は、ヒトに投与されなければならないことがあり得る分子を扱うため、完全にヒトの発現系が、特に好ましいと思われる。そのため、さらにより好ましくは、宿主細胞は、ヒト細胞である。ヒト細胞の例は、とりわけ、ＨｅＬａ、９１１、ＡＴ１０８０、Ａ５４９、２９３、およびＨＥＫ２９３細胞である。好ましい実施形態では、ヒトプロデューサー細胞が、発現可能な構成をしたアデノウイルスＥ１領域をコードする核酸配列の少なくとも機能的部分を含む。さらに好ましい実施形態では、前記宿主細胞が、ヒト網膜に由来し、９１１細胞または番号９６０２２９４０の下で１９９６年２月２９日にＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、ＣＡＭＲ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰ４  ＯＪＧ、Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎに委託され、商標ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（ＰＥＲ．Ｃ６はＣｒｕｃｅｌｌ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｂ．Ｖ．の登録商標である）の下で販売されている細胞株などのように、アデノウイルスＥ１配列を含む核酸により不死化される。本出願の目的のために、「ＰＥＲ．Ｃ６細���」は、番号９６０２２９４０の下で委託された細胞または祖先、上流もしくは下流の継代、および委託された細胞の祖先由来の子孫ならびに前述のもののいずれかの誘導体を指す。宿主細胞における組換えタンパク質の産生は、当技術分野においてよく知られている方法によって実行することができる。関心のあるタンパク質のための産生プラットフォームとして商標ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）の下で販売されている細胞の使用は、国際公開第００／６３４０３号パンフレットに記載され、この開示は、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる。
【００５８】
本発明の抗体は、様々な手段によって調製することができる。本発明によって抗体を産生する方法は、本発明のさらなる一部である。方法は、ａ）抗体の発現を促す条件下で本発明による宿主細胞を培養するステップおよびｂ）任意選択で、発現された抗体を回収するステップを含む。発現された抗体は、無細胞抽出物から回収することができるが、好ましくは、それらは培養培地から回収される。産生するための上記の方法はまた、本発明の抗体および／または免疫複合体の機能的変異体を作製するために使用することもできる。無細胞抽出物または培養培地から抗体などのタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られている。
【００５９】
その代わりに、宿主細胞などの宿主における発現に次いで、本発明の抗体および免疫複合体は、従来のペプチドシンセサイザーによって合成してまたは本発明によるＤＮＡ分子に由来するＲＮＡ核酸を使用する無細胞翻訳系において産生することができる。本発明による抗体はまた、たとえば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスまたはウサギなどのトランスジェニック非ヒト哺乳類によって生成されてもよい。好ましくは、トランスジェニック非ヒト哺乳類は、上記に記載されるヒト抗体のすべてまたは一部分をコードするヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する。トランスジェニック非ヒト哺乳類は、ＲＳＶまたはその断片の精製調製物または濃縮調製物により免疫化することができる。非ヒト哺乳類を免疫化するためのプロトコールは、当技術分野において十分に確立されている。開示が参照によって本明細書において組み込まれるＵｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ（１９９８），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  ＹｏｒｋおよびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ（２００１），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。免疫化プロトコールは、フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバントなどのアジュバントありまたはなしの、複数回の免疫化を含むことが多いが、また、裸のＤＮＡによる免疫化を含んでいてもよい。他の実施形態では、ヒト抗体が、トランスジェニック動物に由来するＢ細胞、形質細胞、および／または記憶細胞によって産生される。他の実施形態では、ヒト抗体が、上記トランスジェニック非ヒト哺乳類から得られたＢ細胞の不死化細胞への融合によって調製されるハイブリドーマによって産生される。上記トランスジェニック非ヒト哺乳類から得られるＢ細胞、形質細胞、およびハイブリドーマならびに上記トランスジェニック非ヒト哺乳類、Ｂ細胞、形質細胞、および／または記憶細胞ならびにハイブリドーマから得られるヒト抗体も本発明の一部である。
【００６０】
本発明は、少なくとも本発明による抗体、抗原結合断片、免疫複合体、機能的変異体、および／または少なくとも核酸を含むキットをさらに提供する。任意選択で、本発明のキットの上記構成成分は、適した容器に包装され、示される状態の診断、予防法、および／または処置について標識される。前述の構成成分は、水性、好ましくは滅菌溶液としてまたは還元用の凍結乾燥、好ましくは滅菌製剤として、単一または複数回用量の容器中に保管されてもよい。キットは、薬学的に許容されるバッファーを含むより多くの容器をさらに含んでいてもよい。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、１つ以上の適した宿主のための培養培地、およびおそらく少なくとも１つの他の治療剤、予防剤、または診断剤を含む、営利的なおよび利用者の立場から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。たとえば、そのような治療薬、予防薬、または診断薬の使用に関する徴候、使用頻度、投薬量、製造、投与、禁忌、および／または警告についての情報を含有する、治療薬、予防薬、または診断薬の市販のパッケージに慣例上含まれる説明書をキットに付随させることができる。
【００６１】
本発明による抗体はまた、ＲＳＶの検出のためのインビトロ方法における診断剤として好都合に使用することもできる。本発明は、したがって、サンプル中のＲＳＶを検出する方法であって、（ａ）たとえば、診断的に有効な量の本発明による抗体（もしくはその断片）または免疫複合体とサンプルを接触させることによって、サンプル中のＲＳＶ抗原のレベルをアッセイするステップと、（ｂ）ＲＳＶ抗原のアッセイレベルをコントロールレベルと比較するステップであって、それによって、コントロールレベルと比較したＲＳＶ抗原のアッセイレベルの増加がＲＳＶ感染症を示す、ステップとを含む方法をさらに提供する。サンプルは、（可能性として）感染した対象由来の血液、血清、排便、痰、鼻咽頭吸引液、気管支洗浄液、尿、組織、もしくは他の生体物質を含むが、これらに限定されない生物学的サンプルまたは水、飲料などの非生物学的サンプルなどであってもよい。サンプルは、それを検出の方法により適したものにするために、最初に操作されてもよい。操作は、とりわけ、ウイルスがタンパク質、（ポリ）ペプチド、または他の抗原断片などの抗原成分に分解するような方法で、ウイルスを含有することが疑われるおよび／またはそれを含有するサンプルを処置することを意味する。好ましくは、本発明の抗体または免疫複合体は、抗体およびサンプル中に存在し得るウイルスまたは抗原成分の間で免疫学的複合体の形成を可能にする条件下でサンプルと接触させられる。免疫学的複合体の形成は、もしあれば、サンプル中のウイルスの存在を示し、次いで、適した手段によって検出され、測定される。そのような方法は、とりわけ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、免疫組織化学的検査、ＦＡＣＳ、ＢＩＡＣＯＲＥ、およびウエスタンブロット分析などの均質および不均質結合イムノアッセイを含む。とりわけ患者血清および血液および血液由来産物についての大規模臨床スクリーニングのための好ましいアッセイ技術は、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット技術である。ＥＬＩＳＡ試験は、特に好ましい。
【００６２】
本発明は、本発明を限定するようには意図されない以下の実施例においてさらに例証される。
【実施例】
【００６３】
実施例１
抗原産生および標識
ウイルスの膜の表面上に発現される融合タンパク質（ＲＳＶ  Ｆ）とは異なり、付着タンパク質（ＲＳＶ  Ｇ）は、非常に変異性であり、したがって、ＲＳＶの２つの広域サブタイプ（つまりサブタイプＡおよびＢ）が定められている。配列変異性にもかかわらず、ＲＳＶ  Ｇは、中央の高度に保存された領域を含有する。広域中和モノクローナル抗体を得ようとして、代表的なサブグループＡ（ＲＳＶ  Ａ／Ｌｏｎｇ）およびサブグループＢ株（ＲＳＶ  Ｂ／Ｂ１）に対応するＲＳＶ  Ｇを２９３フリースタイル細胞において組換えで発現させ、精製し、１細胞ソーティング実験における使用のために標識した。
【００６４】
ＲＳＶ  ＧａおよびＧｂの発現
本明細書においてＲＳＶ  ＧａおよびＧｂと呼ばれる、ＲＳＶ  Ａ／Ｌｏｎｇ（受入番号Ｐ２０８９５）およびＲＳＶ  Ｂ／Ｂ１（受入番号ＮＰ＿０５６８６２）に対応する組換えＲＳＶ付着タンパク質（Ｇタンパク質）を、Ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）および６×ヒスチジンタグの両方と共に、ＣＭＶベースプロモーター哺乳類発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、ｐｃＤＮＡ３．１）から発現させた（表１）。ヒトＶカッパＩシグナルペプチドに対応するリーダー配列は、分泌を促進するためにアミノ末端に導入した。ＲＳＶ  ＧａおよびＧｂの両方は、膜貫通ドメインを欠いて発現させ、それぞれＲＳＶ  ＧａおよびＧｂのアミノ酸６５〜２８８および６５〜２９９を含んだ。
【００６５】
ＲＳＶ  ＧａおよびＧｂは、メーカーのガイドラインに従ってトランスフェクトした。組換え発現ＲＳＶ  ＧａおよびＧｂタンパク質は、ニッケルＮＴＡクロマトグラフィーを使用して精製した。トランスフェクションの７２時間後、上清を採取し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ８および３００ｍＭ  ＮａＣｌに対して一晩透析した。翌日、透析を新鮮なバッファーにより、さらに６時間、繰り返した。次いで、透析した上清に、５％グリセロールおよび１０ｍＭイミダゾール（ＶＷＲ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＥＭ−５７２０）を補足し、２ｍＬのＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３０３１０）を詰めたカラムに装填した。結合したタンパク質は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、および２０ｍＭイミダゾールからなる２カラム容量の洗浄バッファーにより続いて洗浄した。次いで、タンパク質は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、および５０ｍＭイミダゾールを含有する５ｍＬの溶出バッファーにより溶出した。最後に、溶出物を、一晩、４℃で４リットルのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。次いで、透析したタンパク質を、３０Ｋ  ＭＷＣＯ濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ濃縮装置）において０．５〜１．０ｍＬに濃縮し、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡアッセイ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、メーカーの説明書に従って）によって定量化した。そのうえ、精製タンパク質は、それぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシーによって品質を調整した。
【００６６】
ＲＳＶ  Ｇａは、メーカーの説明書に従って、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７マイクロスケールタンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ３０００９）を使用して、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（ＡＦ  ６４７）により蛍光標識した。精製後、標識の程度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＵＶ分光光度計（メーカー）を使用して、１モルのタンパク質当たり１．２モルのＡＦ  ６４７となることが決定された。同様に、ＲＳＶ  Ｇｂタンパク質は、メーカーの説明書に従って、マイクロスケールタンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ３０００６）を使用して、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＡＦ  ４８８）により標識し、最終精製後、標識の程度は、１モルのタンパク質当たり約２モルのＡＦ  ４８８となることがＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を使用して決定された。
【００６７】
【表１】
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【００６８】
実施例２
抗ＲＳＶ  Ｇ特異的抗体の同定
ＲＳＶ  Ｇタンパク質に対する広域中和モノクローナル抗体は、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋを通して得られた末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離された記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＩｇＧ＋）から回収した。手短に言えば、ＣＤ２２＋濃縮Ｂ細胞を、記憶Ｂ細胞表面マーカーに対する蛍光標識抗体により染色し、ＲＳＶ  Ｇａ、Ｇｂ（実施例１において記載されるように、それぞれＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７および４８８により標識）またはＲＳＶ  Ｇ中央保存ドメイン（ＣＣＤ）ビオチンコンジュゲートペプチド（ＳＹＭ−１７０６）と共にインキュベートした。ＣＤ１９／ＣＤ２７／ＩｇＧ／ＲＳＶＧａ／ＲＳＶＧｂまたはＣＤ１９／ＣＤ２７／ＩｇＧ／ＳＹＭ−１７０６（信頼できるソーティング実験において使用）。ポジティブな細胞をソートし、単一の細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＭｏＦｌｏ  ＸＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、９６ウェルプレートの個々のウェルの中に置いた。プレートは、プロセシングまで、−８０℃で保管した。平均で、ドナー当たりおよそ１０〜２５×１０６Ｂ細胞を調査した。
【００６９】
実施例３
ＲＳＶ  ＧａおよびＧｂに対して特異的な単一Ｂ細胞からの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の回収
実施例２において記載されるように、ＲＳＶに対する広域中和モノクローナル抗体を、ＲＳＶ  Ｇａタンパク質およびＧｂタンパク質またはＲＳＶ  Ｇ中央保存ドメイン（ＣＣＤ）ビオチンコンジュゲートペプチド（ＳＹＭ−１７０６）に対して反応性を有する記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＩｇＧ＋）から単離した。次いで、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子は、ツーステップＰＣＲアプローチによって個々のＢ細胞から回収し、クローニングし、Ｆａｂ抗体としてインビトロにおいて発現させた。
【００７０】
第１鎖ｃＤＮＡ合成
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｋｉｔ、Ｃａｔ  Ｎｏ．１８０８０−０５１）を使用して、個々にソートした細胞から生成した。
【００７１】
ネステッドＰＣＲによるＩｇＧ重鎖および軽鎖増幅
ＩｇＧ重鎖および軽鎖可変領域（カッパ鎖およびラムダ鎖の両方）は、ツーステップネステッドＰＣＲアプローチを使用して、新たに調製したｃＤＮＡから増幅した。続いて、重鎖および軽鎖ＰＣＲ断片を、オーバーラップ伸長ＰＣＲを使用し、下流のクローニングを容易にするために、単一のカセットに集めた。
【００７２】
ステップＩ  増幅
ステップＩについて、上記に言及されるように生成した２．５μＬの新たに調製したｃＤＮＡを、重鎖、カッパ軽鎖、およびラムダ軽鎖を増幅するための鋳型として使用した。抗体重鎖（ＣＢ−５’ＬＶＨプライマー）、カッパ軽鎖（ＣＢ−５’ＬＶｋプライマー）、およびラムダ軽鎖（ＣＢ−５’ＬＶｌａｍプライマー）のリーダー領域に対して特異的にデザインしたプライマーのプールを使用した（表２〜４）。それぞれ、重鎖、カッパ軽鎖、およびラムダ軽鎖のＣＨ１領域、Ｃｋ、およびＣＬ領域に対して特異的にデザインした単一のリバースプライマーを、ステップＩ  ＰＣＲ反応において使用した。
【００７３】
【表２】
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【００７４】
【表３】
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【００７５】
【表４】
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【００７６】
ステップＩＩ  増幅
１）ステップＩＩについて、上記の反応から生成された２．５μＬのステップＩ  ＰＣＲ産物を、重鎖、カッパ軽鎖、およびラムダ軽鎖遺伝子を増幅するための鋳型として使用した。抗体重鎖、カッパ軽鎖、およびラムダ軽鎖のフレームワーク１領域に対して特異的にデザインしたフォワードプライマーのプールを使用した（表５〜７）。重鎖ジャンクション（３’ＳａｌＩＪＨプライマー）、カッパ軽鎖ジャンクション（３’Ｊｋプライマー）に対して特異的にデザインしたリバースプライマーおよびラムダ軽鎖に対応する５’領域特異的プライマー（ＣＢ−ＶＬプライマー）のプールを使用した。さらに、ステップＩＩフォワードプライマーは、ＳｆｉＩ制限部位を導入するために操作し、一方、ステップＩＩ重鎖リバースプライマーは、ＳａｌＩ制限部位を導入するようにデザインした。
【００７７】
【表５】
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【００７８】
【表６】
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【００７９】
【表７】
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【００８０】
ステップＩＩＩ  増幅：オーバーラップ伸長ＰＣＲ
ステップＩＩＩについて、重鎖および軽鎖ＤＮＡ断片（ステップＩＩ産物）は、１）軽鎖ステップＩＩ断片の３’エンドおよび重鎖ステップＩＩ断片の５’エンドにアニールし、カッパまたはラムダ定常領域を含有する、下記に概説されるように増幅されるＦａｂリンカー（カッパまたはラムダ；表８）、２）軽鎖の５’エンドにアニールするＳｆｉＩ制限部位を有するフォワードオーバーラッププライマー、ならびに３）重鎖ステップＩＩ断片の３’エンドにアニールするＳａｌＩ制限部位を有するリバースプライマー（表９）を使用し、オーバーラップ伸長ＰＣＲを介して単一のカセットに連結した。この反応により、軽鎖−リンカー−重鎖からなる１２００ｂｐ断片（つまりカセット）がもたらされる。増幅後、ＰＣＲリンカー反応産物またはオーバーラップ伸長ＰＣＲ反応産物を、１％アガロースゲル上で分離し、メーカーの説明書に従ってゲル抽出した（Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６）。
【００８１】
【表８】
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【００８２】
【表９】
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【００８３】
消化および細菌発現ベクターの中へのクローニング
オーバーラップ伸長ＰＣＲのＰＣＲ精製（Ｑｉａｇｅｎ）後に、断片を消化し、次いで、消化したオーバーラップ産物を１％アガロースゲル上で分離した。オーバーラップカセットに対応するバンド（約１．１ｋｂ）を、ゲル抽出（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。最後に、消化したオーバーラップ伸長産物をライゲーションし、ｐＣＢ−Ｆａｂ細菌発現ベクターの中にクローニングした。形質転換はすべて、ＤＨ５ａ  Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．１８２５８−０１２）を使用して実行した。およそ１００μｌの回収した細胞を、２０ｍＭグルコースを補足した１００μｇ／ｍＬカルベニシリンプレート上に平板培養した。プレートは、コロニー増殖を可能にするように３７℃で一晩インキュベートした。
【００８４】
実施例４
ＲＳＶ  Ｇに結合するＦａｂおよびモノクローナル抗体救出
実施例３においてクローニングしたＦａｂ抗体を細菌中で発現させ、ＲＳＶ  Ｇａ、ＲＳＶ  Ｇｂ、またはＲＳＶ  Ｇ中央保存ドメイン（ＣＣＤ）ペプチド（ＳＹＭ−１７０６：アミノ酸配列：ビオチン−ＫＱＲＱＮＫＰＰＮＫＰＮＮＤＦＨＦＥＶＦＮＦＶＰＣＳＩＣＳＮＮＰＴＣＷＡＩＣＫＲ；配列番号１２５）に結合するそれらの能力についてもう一度試験した。
【００８５】
細菌上清を、ＲＳＶ  Ｇａ、Ｇｂ、ＣＣＤペプチド、ネガティブコントロールアクチン、および抗ヒトＦ（ａｂ）２コーティングプレートに追加し、３７℃で２時間インキュベートした（ストレプトアビジンコーティングプレート上でインキュベートし、室温で２時間インキュベートしたＣＣＤペプチドを除く）。ＣＲ９５１４（３Ｄ３をベースとする、つまり、国際公開第２００９／０５５７１１号パンフレットにおいて開示される３Ｄ３の重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体）を、０．４％ＮＦＤＭ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中０．１μｇ／ｍＬの希釈でＲＳＶ  Ｇａ、Ｇｂ、ＣＣＤペプチド、および抗ヒトＦ（ａｂ）２コーティングプレートに対するポジティブコントロールとして使用した。マウス抗アクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ３８５３）は、ウシアクチンコーティングプレートに対するポジティブコントロールとして１．２５μｇ／ｍＬで使用した。抗ＨＡ  ＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２０１３８１９００１）は、細菌上清に対して二次抗体として使用した。抗ヒトＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０９−０３６−０９７）は、ＣＲ９５１４（３Ｄ３の可変領域を含む）コントロールウェルに対して使用した。最後に、ヤギ抗マウスＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１５−０３５−０７２）は、アクチンポジティブコントロールに対して使用した。インキュベーション後、プレートは、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で４回洗浄し、およそ５分間、５０μＬ  １：１  ｖ／ｖ  ＴＭＢ：過酸化物溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ  Ｎｏ．３４０２１）により現像した。反応は、５０μＬ  ２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４の追加によって直ちに停止させ、４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡプレート読み取り装置を使用して測定した。ポジティブな結合は、０．５以上のＯＤ４５０（０．５〜０．９は中程度の結合であり、＞１は強力な結合である）およびバックグラウンドの３倍の応答によって示された。
【００８６】
ＥＬＩＳＡの結果に基づいて、抗原を標的にする反応性を有する平均約６つのクローンを選択した。それぞれのＦａｂ抗体は、フレームワーク１特異的およびジャンクション特異的プライマーのプールを使用して最初にクローニングしたため、交差プライミング（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ）の可能性は、とりわけ非常に関係するプライマーについて、高かった。このため、それぞれのオーバーラップ産物に相当するいくつかの細菌クローンをシークエンシングするために選択した。プラスミドミニプレップＤＮＡは、メーカーのガイドライン（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ  Ｃａｔ．Ｎｏ．２７１０６）に従って調製した。選択したそれぞれのクローンに対応する重鎖および軽鎖は、表１０においてハイライトしたプライマーによりシークエンシングした。配列を分析し、最も近い生殖細胞系列を同定し、ＣＤＲおよびフレームワーク領域を決定した。この情報は、候補抗体をクローニングし、ＩｇＧに変換するためのプライマーをデザインするために続いて使用した。
【００８７】
【表１０】
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【００８８】
実施例５
ＩｇＧのクローニング、シークエンシング、および精製
実施例４において概説される細菌ＥＬＩＳＡにおいて同定されたＲＳＶ  Ｇａ、Ｇｂ、およびＣＣＤペプチドに反応性のＦａｂ抗体を、ヒト胚腎臓細胞（２９３−Ｆ細胞）中でクローニングし、ＩｇＧとして発現させた。ＩｇＧは、続いて、濃度の決定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによっておよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、品質を調整した。
【００８９】
Ａ．ＩｇＧクローニングおよびシークエンシング情報
細菌ＥＬＩＳＡ（実施例４において概説）において同定したＦａｂ抗体は、続いて、ｐＣＰ９−カッパ（配列番号１２７）およびｐＣＰ９−ラムダ（配列番号１２８）発現ベクターの中に、制限消化によって可変重ならびに軽ドメイン（カッパおよびラムダ）をクローニングすることによって、ＩｇＧに変換した。交差プライミング（実施例４において前述）の可能性を想定して、ＩｇＧへの変換のために選択したそれぞれの細菌クローンのＦＲ１の最初のアミノ酸およびジャンクション領域の最後のアミノ酸は、その対応する生殖細胞系列配列のものと頻繁に異なるものとした。このため、それぞれの抗体に特異的なプライマーは、選択したそれぞれの細菌クローンの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方についてＦＲ１およびジャンクション領域を再建するようにデザインした。重鎖および軽鎖は、対応する細菌クローン（実施例４においてｐＣＢ−Ｆａｂベクターから発現）を使用して増幅し、ｐＣＰ９発現ベクターの中に連続的な方法でクローニングした。
【００９０】
重鎖の増幅は、３７０ｂｐの平均サイズの断片をもたらし、これを１％アガロース上で分離し、メーカーの説明書（Ｑｉａｇｅｎ）に従ってゲル抽出した。次いで、重鎖断片は、オーバーラップ伸長ＰＣＲによって、ＨＡＶＴ２０リーダー配列（５’−ＡＴＧＧＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＴＴＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＴＴＧＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＴＣＴＴＧＡＡＴＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴ−３’；ＭＡＣＰＧＦＬＷＡＬＶＩＳＴＣＬＥＦＳＭＡ）を付着させるために使用した。
【００９１】
対応するオーバーラップＨＡＶＴ２０−重鎖産物は、続いて、メーカーの説明書（Ｑｉａｇｅｎ）に従ってＰＣＲ精製した。ラーゲ−ションを連続して実行した；すなわち、軽鎖を最初に消化し、ライゲーションしたまたは対応する重鎖を消化し、挿入した。一旦、軽鎖または重鎖挿入をシークエンシングし、確認したら、代表的な細菌クローンを選択し、ミニプレップを調製し、第２の鎖をクローニングするために使用した（つまり軽鎖または重鎖、どちらが最初にクローニングされたかに依存）。重鎖断片のクローニングのために、ｐＣＰ９ベクターおよびＰＣＲ精製重鎖オーバーラップ産物を、制限酵素ＢａｍＨＩ  ＨＦ（ＮＥＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ３１３６Ｌ）およびＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ０１４６Ｌ）により消化した。消化したｐＣＰ９ベクターおよび重鎖オーバーラップ産物は、次いで、１％アガロースゲル上で分離し、ゲル抽出した（ｐＣＰ９ベクターについて上の方の約９．５ｋＢ）。ラーゲ−ションは、１：３ベクター挿入比で実行し、ＤＨ５ａ  Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．１８２５８−０１２）の中に形質転換した。配列確認と同時に、第２の鎖（たとえば軽鎖）をクローニングした。軽鎖断片のクローニングのために、対応する重鎖および軽鎖ＰＣＲ産物を含有するｐＣＰ９クローンを、ＮｏｔＩ  ＨＦ（ＮＥＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ３１８９Ｌ）およびＸｂａＩ（ＮＥＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ０１４５Ｌ）により消化した。次いで、軽鎖は、対応する重鎖遺伝子を含有するｐＣＰ９ベクターの中にライゲーションし、ＤＨ５ａ  Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｃｅｌｌの中に形質転換した。いくつかのコロニーをシークエンシングのために選択し、分析した。表１１および１２は、抗体重鎖および軽鎖ＣＤＲ領域の配列を示す。
【００９２】
【表１１】
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【００９３】
【表１２】
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【００９４】
Ｂ．ＩｇＧ発現および精製
それぞれのＩｇＧを発現させるために、関心のある重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方を含有するｐＣＰ９ベクターのミディプレップを調製し（Ｑｉａｇｅｎ）、メーカーの説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５１−００３１）に従って、２９３ｆｅｃｔｉｎを使用して、２９３−Ｆ細胞をトランスフェクトするために使用した。トランスフェクション後、細胞は、十分なＩｇＧ産生を可能にするために７２時間インキュベートした。次いで、細胞培地を採取し、細胞を取り出すために遠心分離した。精製は、プロテインＡカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｂｅａｄｓ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０９６３−０３）を使用して、カラムクロマトグラフィーによって達成した。次いで、溶出物は、４リットルの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して２回透析した。最後に、透析したサンプルは、１０ｋＤａ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により約１ｍＬまで濃縮した。
【００９５】
一連の品質調整ステップは、濃度および純度を決定し、かつサイズを評価するためにそれぞれのＩｇＧについて実行した。ＩｇＧ濃度は、２１０，０００Ｍ−１  ｃｍ−１のＩｇＧについてのモル吸光係数を使用して、ＮａｎｏＤｒｏｐリーディングを介して初めに決定した。そのうえ、ＩｇＧ濃度は、サプライヤーの説明書に従ってＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）によっておよびＯｃｔｅｔ  Ｒｅｄ３８４（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）でプロテインＡセンサーチップを使用する測定によって確認した。さらなる品質調整ステップとして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを非還元および還元条件（つまり±ＤＴＴ）下で実行し、インタクトＩｇＧまたは還元重および軽ポリペプチド鎖を視覚化するためにＢｉｏ−Ｓａｆｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｓｔａｉｎ（Ｂｉｏｒａｄ）を続けた。最後に、ＩｇＧは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ  ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でサイズ排除クロマトグラフィーによって品質調整した。
【００９６】
実施例６
ＩｇＧ結合アッセイ
上記の実施例５において記載されるように生成し、品質調整したＩｇＧおよび抗ＲＳＶ  Ｇ抗体ＣＲ９５１４（３Ｄ３の可変領域を含む）を、組換えＲＳＶ  ＧａおよびＧｂタンパク質に結合するそれらの能力についてＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。手短に言えば、９６ハーフウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、一晩１×ＰＢＳ中５０μＬの抗原によりコーティングした［ＲＳＶ  Ｇａ：０．５μｇ／ｍＬ；ＲＳＶ  Ｇｂ：０．５μｇ／ｍＬ；ウシアクチン：１μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ）；ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）２：２μｇ／ｍＬ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）。プレートを４℃で一晩インキュベートし、翌日、ＰＢＳ中１３５μＬの４％無脂肪粉乳（ＮＦＤＭ、Ｂｉｏｒａｄ）により遮断し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、ｍＡｂは、１００ｎｇ／ｍＬから開始して、０．４％ＮＦＤＭ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で希釈し、５倍希釈液で滴定し、３７℃で２時間プレートに追加した。ＣＲ９５１４（３Ｄ３）ｍＡｂは、ＲＳＶ  ＧａおよびＧｂに対するポジティブコントロールとして使用し、同様の方法で滴定した。そのうえ、マウス抗アクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ３８５３）は、ウシアクチンコーティングプレートに対するポジティブコントロールとして１．２５μｇ／ｍＬで使用した。インキュベーション後、プレートを、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０により４回洗浄した。二次抗体を、それぞれ、０．４％ＮＦＤＭ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中１：１０００で追加し、３７℃で４０分間インキュベートした。抗Ｆｃ  ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０９−０３５−００８）は、ｍＡｂに対する二次抗体として使用した。最後に、ヤギ抗マウスＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１５−０３５−０７２）は、アクチンポジティブコントロールに対して使用した。インキュベーション後、プレートは、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で４回洗浄し、およそ５分間、５０μＬ  １：１  ｖ／ｖ  ＴＭＢ：過酸化物溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ  Ｎｏ．３４０２１）により現像した。反応は、５０μＬ  ２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４の追加によって直ちに停止させ、４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡプレート読み取り装置を使用して測定した。本発明に従う抗体についての結合の推定ＥＣ５０値（それぞれのＩｇＧを滴定することによって決定）は、ＲＳＶ株Ａ／Ｌｏｎｇについて１．０〜２．０ｎｇ／ｍｌ、株Ｂ／Ｂ１について０．５〜２．５ｎｇ／ｍｌの範囲にわたった。
【００９７】
実施例７
ＩｇＧ中和アッセイ
抗ＲＳＶ抗体は、プラーク低下アッセイによって評価されるように溶液中のＲＳＶに結合し、中和するそれらの能力について分析した。この実験において、ウイルスおよび抗体は、標的細胞の非存在下においてあらかじめインキュベートした。次いで、混合物を細胞に追加し、ウイルス感染を、本明細書において記載される標準的なプラーク低下アッセイによって測定した。抗ＲＳＶ抗体は、ＲＳＶ  Ａ／Ａ２（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＶＲ−１５４０）、ＲＳＶ  Ｂ／１８５３７（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＶＲ−１５８０）、およびＲＳＶ  Ａ／Ｌｏｎｇ（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＶＲ−２６）を含むＲＳＶのいくつかの株を中和するそれらの能力について分析した。抗体ＣＲ９５１４（３Ｄ３）およびＣＲ９５０５（１３１−２Ｇをベースとする、つまり、国際公開第２００９／０５５７１１号パンフレットにおいて開示されるように１３１−２Ｇの重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体）を基準として使用した。
【００９８】
Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ、ｃａｔ  ｎｏ：ＣＣＬ−８１；Ｍａｎａｓｓａｓ）を宿主細胞感染のために使用した。Ｖｅｒｏ細胞を、１％Ｌ−グルタミン（ＨｙＣｌｏｎｅ、ｃａｔ  ｎｏ：ＳＨ３００３４．０１）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（ＨｙＣｌｏｎｅ、ｃａｔ  ｎｏ：ＳＶ３００１０）を補足した、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ、ｃａｔ  ｎｏ：ＳＨ３００７０．０３）を有するＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ｃａｔ  ｎｏ：ＳＨ  ３０２８５．０１）中で成長させた。Ｖｅｒｏ細胞を、５％ＣＯ２を有する３７℃のインキュベーター中で維持し、１週間当たり２回継代した。
【００９９】
実験の１日目に、Ｖｅｒｏ細胞を２４ウェル細胞培養プレート中で培養した。細胞は、２日目までに細胞単層の形成（＞８０％コンフルエンス）を可能にする密度（ウェル当たりおよそ９×１０４細胞）で平板培養した。２日目に、それぞれの抗体を、１０％ベビーウサギ補体（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、ｃａｔ  ｎｏ．Ｃ１２ＣＡＸ）を含有したそのままのイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ、ＡＴＣＣ、ｃａｔ  ｎｏ：３０−２００３）中で段階希釈した。試験した最終抗体濃度は、１０μｇ／ｍＬ、１．３μｇ／ｍＬ、１５６ｎｇ／ｍＬ、１９．５ｎｇ／ｍＬ、２．４ｎｇ／ｍＬ、および０．３ｎｇ／ｍＬであった（抗体濃度：２．５μｇ／ｍＬ、３１２．５ｎｇ／ｍＬ、３９．１ｎｇ／ｍＬ、４．９ｎｇ／ｍＬ、０．６１ｎｇ／ｍＬ、および０．０８ｎｇ／ｍＬを使用したＣＢ０１０．７を除く）。ウイルスはまた、２０００〜３０００ｐｆｕ／ｍＬ（１００〜１５０ｐｆｕ／５０μＬ）の濃度までそのままのＥＭＥＭ中で希釈し、８５μＬの希釈ＲＳＶを８５μＬのそれぞれの希釈抗体溶液に追加し、ピペッティングにより混合した。ウイルスコントロールサンプルについては、８５μＬの希釈ウイルスを８５μＬのそのままのＥＭＥＭに追加した。抗体−ウイルスまたはウイルスコントロール混合物は、２時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、培養培地を、Ｖｅｒｏ宿主細胞を含有する２４ウェル細胞培養プレートからデカントし、次いで、あらかじめインキュベートした１５０μＬのウイルス抗体またはウイルスコントロール混合物を、それぞれのウェルに移した。それぞれの試験およびコントロールサンプルを３通り調製した。次いで、細胞を、１５分ごとに混合しながら１時間３７℃でインキュベートした。
【０１００】
インキュベーション期間後、１ｍＬの重層培地（ｏｖｅｒｌａｙ  ｍｅｄｉｕｍ）を、それぞれのウェル（重層培地はＥＭＥＭ、２％ＦＢＳ、１％Ｌ−グルタミン、０．７５％メチルセルロースを含有した）に追加した。次いで、２４ウェル細胞培養プレートを、およそ９６〜１２０時間、３７℃（５％ＣＯ２を有する）でインキュベートした。細胞プレートは、室温で１時間、１０％ホルマリンにより固定し、ｄｄＨ２０により１０回洗浄し、１時間、３７℃でＰＢＳ中５％無脂肪粉ミルク（ＮＦＤＭ）により遮断した。インキュベーション後、遮断溶液をデカントし、２００μＬのＨＲＰコンジュゲートマウス抗ＲＳＶ抗体（ａｂ２０６８６、Ａｂｃａｍ、１％ＮＦＤＭにおいて１：７５０希釈）をそれぞれのウェルに追加した。プレートを２時間３７℃でインキュベートし、ｄｄＨ２０により１０回洗浄した。洗浄後、２００μＬのＴｒｕｅＢｌｕｅ（登録商標）ペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ  Ｃａｔ．Ｎｏ．５０−７８−０２）をそれぞれのウェルに追加した。プレートを室温で１０分間現像した。プレートは、ｄｄＨ２０により２回洗浄し、ペーパータオル上で乾燥させ、青色のプラークの数を数えた。
【０１０１】
ＩＣ５０（プラーク形成の５０％の中和に有効な希釈）は、ＳＰＳＳ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓを利用して計算した。プラーク低下率は、以下の式に従って計算した：
プラーク低下率（百分位数）＝１−［（それぞれの抗体希釈液中の平均プラーク数）／（ウイルスコントロールウェル中の平均プラーク数）］＊１００。
【０１０２】
表１３は、ＲＳＶ株Ａ／Ａ２（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＶＲ−１５４０）およびＲＳＶ  Ｂ／１８５３７（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ．ｎｏ．ＶＲ−１５８０）に対する抗体のパネルについてのＩＣ５０を列挙する。
【０１０３】
【表１３】
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【０１０４】
表１３は、ＲＳＶ株Ａ／Ａ２（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＶＲ−１５４０）に対する抗体および抗原結合断片のＩＣ５０（プラーク形成の５０％の中和に有効な希釈）が、４０ｎｇ／ｍｌ未満であったことおよび／またはＲＳＶ株Ｂ／１８５３７（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＶＲ−１５８９）に対するＩＣ５０が、３０ｎｇ／ｍｌ未満であったことを示す。
【０１０５】
そのうえ、ＲＳＶ株Ａ／Ｌｏｎｇ（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＶＲ−２６）に対する抗体ＣＢ００３．１、ＣＢ０１０．７、ならびにコントロール抗体ＣＲ９５０５（１３１−２Ｇ）およびＣＲ９５１４（３Ｄ３）についてのＩＣ５０は、それぞれ１６、１２、１８、および１７ｎｇ／ｍＬであった。
【０１０６】
実施例８
コドン最適化を含む完全ヒト免疫グロブリン分子（ヒトモノクローナル抗体）の構築およびリスク回避（ｄｅ−ｒｉｓｋｉｎｇ）分析
上記実施例５において単離されたそれぞれの抗体クローンの重鎖および軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）を、遊離システインならびにグリコシル化、脱アミド、および酸化部位を含む潜在的な翻訳後修飾部位の存在について検査した。これらの部位を除去するために、構造保存的なおよび／または生殖細胞系列ベースの置換からなるアミノ酸突然変異を使用する（表１４）。可変領域中の非保存システインは、セリンに突然変異させた。グリコシル化部位については、アスパラギンの保存的グルタミンとの交換または生殖細胞系列突然変異を含むいくつかの突然変異を使用することができる。脱アミド部位に対する修飾は、アスパラギン酸のアスパラギンとのおよびセリンまたはアラニンのグリシンとの交換を含む。潜在的な酸化の部位は修飾しない。次いで、抗体クローンのそれぞれのＶＨおよびＶＬから得られたヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎでヒト細胞における発現のためにコドン最適化した。これらの機能的変異体の可変領域は、続いて、ＩｇＧ発現ベクターｐＣＰ９−カッパ（配列番号１２７を参照）およびｐＣＰ９−ガンマ（配列番号１２８を参照）における発現のために制限消化によって直接クローニングした。ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、および／またはＳｒｆＩは、可変重鎖をクローニングするために使用し、ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩは、可変軽鎖をクローニングするために使用した。すべての構築物についてのヌクレオチド配列は、当業者に知られている標準的な技術に従って検証した。
【０１０７】
【表１４】
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【０１０８】
実施例９
ＥＬＩＳＡおよびＯｃｔｅｔによるペプチド結合研究
詳細なエピトープマッピングを、ＣＢ０１０．７およびＣＢ０３０．１などの同定されたＲＳＶ  Ｇタンパク質特異的ｍＡｂについて実行した。ペプチドは、Ｆｍｏｃ化学によって合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。ペプチド−ペプチド相互作用研究のために、いくつかのペプチドは、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）スペーサーを介してＮ−末端でビオチン化した。ペプチドは、エレクトロスプレー質量分析法によって特徴について分析した。サンプルは、Ｃ１８逆相カラムを有する超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ、Ａｌｌｉａｎｃｅ、Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）によって分析し、フォトダイオードアレイ検出器および質量高感度検出器により検出した。溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ＋０．０５％トリフルオロ酢酸［ＴＦＡ］）および溶媒Ｂ（ＡＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ）と共に２５〜１００％のアセトニトリル（ＡＣＮ）についての２５％／分の勾配を使用した。試薬は、すべて少なくともＨＰＬＣグレードとした。
【０１０９】
ｍＡｂは、ＲＳＶ−Ｇ  Ａ型およびＢ型の中央保存領域を含有するビオチン化ペプチドへの結合について試験した（表１５）。アビジンコーティング９６ウェルマイクロタイタープレートを洗浄し、室温で１時間、ＥＬＩＳＡバッファー（ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中１００μＬビオチン化ペプチド（２．３７×１０−７Ｍ）と共にインキュベートした。次に、洗浄後、ウェル当たり１８０μＬの遮断バッファー（ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳ）を、ウェルに移し、室温で１時間インキュベートした。続いて、プレートを洗浄し、室温で１時間、抗ヒトＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共にインキュベートした。洗浄後、１００μＬのｏ−フェニレンジアミンホースラディッシュペルオキシダーゼ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をそれぞれのウェルに追加した。反応を１００μＬ  １Ｍ  Ｈ２ＳＯ４により１０分後に停止させた。吸収を４９０ｎｍで読み取った。
【０１１０】
【表１５】
0006412107.tif 000016
【０１１１】
上記に記載されるｍＡｂはすべて、ＲＳＶ  ＧａおよびＧｂタンパク質（実施例６）ならびに中央領域Ａ型およびＢ型ペプチドに結合した（データを示さず）。抗体ＣＢ００３．１およびＣＢ０１０．７の滴定は、これらのｍＡｂが４つすべてのペプチドに対して約２０ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０を有することを示した（図３）。ＲＳＶ  ＧペプチドへのｍＡｂの結合はまた、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ３８４（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）でストレプトアビジンセンサーチップを使用して決定した。さらに、ｍＡｂは、Ａ型およびＢ型ペプチドの両方に対して交差反応性を示した（表１６）。ＣＢ００３．１は、Ａ型およびＢ型ペプチドの両方に対して最も高い応答を示した。ＣＢ０１０．７は、Ａ型ペプチドと比較して、Ｂ型に対してわずかに高い結合を示した。
【０１１２】
【表１６】
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【０１１３】
実施例１０
最小エピトープのマッピング（ＰｅｐＳｃａｎ）
ｍＡｂによって認識される最小エピトープをマッピングするために、反応性を、ＰｅｐＳｃａｎ分析を使用し、ＲＳＶ−Ｇ  Ａ型およびＢ型の中央領域（残基１４５〜２０１）に対応する複数の長さ（５、８、１０、１４、１８、２５、または３２アミノ酸長）のペプチドについて試験した。ペプチドへの抗体の結合は、ＰｅｐＳｃａｎベースのＥＬＩＳＡにおいて評価した。それぞれのｍＡｂは、最適な結合が実現され、非特異的結合が回避されたことを確実にするように滴定した。それぞれのクレジットカード型ポリプロピレンプレートは、５％ウマ血清（ｖ／ｖ）、５％ＯＶＡ（ｗ／ｖ）、および１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するＰＢＳにおいてまたは４％ウマ血清（ｖ／ｖ）および１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するＰＢＳの代替の遮断バッファーにおいて、１〜１０ｎｇ／ｍＬのｍＡｂと共に４℃で一晩インキュベートした、共有結合したペプチドを含有した。洗浄後、プレートは、２５℃で１時間、ＨＲＰ連結ウサギ抗ｍＡｂ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）と共にインキュベートした。さらなる洗浄後、ペルオキシダーゼ活性は、ＡＢＴＳ基質を使用して評価し、発色現像は、電荷結合素子カメラおよび画像処理システムを使用して定量化した。
【０１１４】
分析は、エピトープの有力なコアに対応する、抗体に結合する最小ペプチドおよびこれも結合に寄与する追加の隣接残基を含有し、完全なエピトープを含有する最も高度な結合を有するペプチドを示す。ペプチドへの抗体の反応性を表１７に要約する（大文字として示す残基）。すべての抗体が中央保存ドメインに結合するが、それらの結合についての決定的な残基は異なる。２つの抗体（ＣＢ００３．１およびＣＢ０１０．７）については、最小エピトープが、Ｎ−末端ＣＣＤ領域に制限される（国際公開第２００９／０５５７１１号パンフレットにおいて開示される３Ｄ３に類似する）。
【０１１５】
実施例１１
完全置換分析（ＰｅｐＳｃａｎ）
結合にとって決定的な側鎖を同定し、既知のＲＳＶ株に対する認識の幅を研究するために、ペプチドの専用のセットを合成した。抗体ＣＢ００３．１およびＣＢ０１０．７によって認識される配列ＦＨＦＥＶＦＮＦＶＰＣＳＩＣ（配列番号１３２）のそれぞれの位置についての２８０の単一置換変異体ペプチドの専用のペプチド配列による完全置換分析を実行し、これらの抗体への結合にとって重要な残基を明らかにした（図５）。これらの抗体のエピトープは、３Ｄ３エピトープに類似するが、全く異なる方法で認識される。これは、発明者らの抗体のエピトープが、３Ｄ３と比較して、全く異なる本質的な残基を有することを示す置換分析によって反映される。そのため、認識および結合のモードは非常に異なる。実施例７において示されるように、本発明の抗体は、３Ｄ３よりも高度な中和能力を有する。
【化１】
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【０１１６】
結合にとって重要な保存残基も表１７に要約する（太字で示される決定的な残基）。
【０１１７】
実施例１２
アラニンスキャニング（ＰｅｐＳｃａｎ）
それぞれの位置をアラニン残基によって置換したペプチドのセットを試験した（図６）。抗体への結合にとって決定的な側鎖を表１７に要約する（太字の黒色で示す）。
【０１１８】
実施例１３
天然の変異体ペプチドへの結合（ＰｅｐＳｃａｎ）
次に、抗体は、ＲＳＶ−Ｇ中央ドメインの完全な多様性を包含する３１のペプチドのパネルに対して、それが２０１２年１月１日にＧｅｎＢａｎｋにおいて見出されたため、試験した。図７において示されるように、ほとんどすべてのＡ型およびＢ型の天然に存在する変異体ペプチドが認識される。ＣＢ００３．１は、Ｂ型ペプチドよりもＡ型に対してより低い結合を示す。ＣＢ０１０．７は、同様に十分に、Ａ型およびＢ型ペプチドの両方に結合する。Ａ型変異体ペプチドにおける１８０位の突然変異は抗体にとって決定的となる。Ｓｅｒ１７０Ｃｙｓの突然変異は、ＣＢ０１０．７にとって決定的ではなかった。Ｉｌｅ１７１Ｔｈｒ突然変異はＣＢ００３．１結合にとって決定的であり、Ｇｌｎ１７５Ａｒｇ突然変異はＣＢ００３．１にとって決定的であった。二重突然変異Ｉｌｅ１８１Ｐｈｅ；Ｉｌｅ１８４ＡｌａもＣＢ００３．１にとって決定的であった。４つの抗体への結合にとって決定的な天然に存在する変異体を表１７に要約する（下線によって示す）。
【０１１９】
【表１７】
0006412107.tif 000019
【０１２０】
実施例１４
抗Ｇ  ｍＡｂの予防効能
抗Ｇ  ｍＡｂがインビボ予防効能を示すかどうかを決定するために、ｍＡｂ  ＣＢ０００３．１およびＣＢ０１０．７をＲＳＶ−Ａ／Ｌｏｎｇコットンラットモデルにおいて試験した。チャレンジの２４時間前に、体重の範囲が１日目  ６０〜８０ｇ、６〜８週齢、パラミクソウイルスに対して血清陰性の近交系オスコットンラットに、上部後脚（四頭筋）に５ｍｇ／ｋｇのＣＢ００３．１、ＣＢ０１０．７、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）、またはビヒクル（グループ当たりｎ＝５）を筋肉内注射した。０日目に、コットンラットは、１００μＬ（それぞれの鼻孔に５０μＬ）で鼻内滴下によって１０５．４ｐｆｕ  ＲＳＶ−Ａ／Ｌｏｎｇによりチャレンジした。９６時間後、肺および鼻甲介：ｑＰＣＲによる全ウイルスＲＮＡ負荷決定のための全ＲＮＡの単離のための舌区（ｌｉｎｇｕａｌ  ｌｏｂｅ）、ｐｆｕ試験による感染ウイルス負荷決定のための残りの肺および鼻甲介を収集するために動物を屠殺した。血液サンプルは、適切な投薬について確認するために、チャレンジ前の０日目（ｍＡｂ投与の２４時間後）におよび研究終了（チャレンジの９６時間後）時に収集した。Ｇ  ｍＡｂは、ビヒクルと比較して、肺および鼻甲介の感染ウイルス力価ならびに肺ＲＮＡウイルス負荷を低下させた（図８）。肺感染ウイルス力価（ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｇ）は、抗体ＣＢ００３．１およびＣＢ０１０．７によって２．４５６および１．５５９  ｌｏｇ１０、それぞれ低下したが、ＣＲ９５１４（３Ｄ３）による予防処置は、０．８０１  ｌｏｇ１０の減少しかもたらさなかった。
【０１２１】
実施例１５
抗Ｇ  ｍＡｂの治療効能
抗Ｇ  ｍＡｂがインビボ治療効能を示すかどうかを決定するために、ｍＡｂ  ＣＢ００３．１およびＣＢ０１０．７をＲＳＶ−Ａ／Ｌｏｎｇコットンラットモデルにおいて試験した。０日目に、体重の範囲が１日目  ６０〜８０ｇ、６〜８週齢、パラミクソウイルスに対して血清陰性の近交系オスコットンラットに、１００μＬ（それぞれの鼻孔に５０μＬ）で鼻内滴下によって１０６．１ｐｆｕ  ＲＳＶ−Ａ／Ｌｏｎｇによりチャレンジした。チャレンジの１日後に、５０ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ００３．１、ＣＢ０１０．７、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）（グループ当たりｎ＝１４）、またはビヒクル（グループ当たりｎ＝２３）を、心臓内注射によって投与した。４日目に、無作為に選んだグループ当たり５匹の動物を肺および鼻甲介：ｑＰＣＲによる全ウイルスＲＮＡ負荷決定のための全ＲＮＡの単離のための舌区、ｐｆｕ試験による感染ウイルス負荷決定のための残りの肺および鼻甲介を収集するために屠殺した。６日目に、すべての残りの動物（グループ当たりｎ＝９または１８）を、肺の病理組織診断のための肺を収集するために屠殺した。血液サンプルは、適切な投薬について確認するために、チャレンジの２日後（ｍＡｂ投与の２４時間後）におよび研究終了（チャレンジの４または６日後）時に収集した。Ｇ  ｍＡｂは、ビヒクルと比較して、肺および鼻甲介の感染ウイルス力価を低下させたが、肺ＲＮＡウイルス負荷は低下させなかった（図９）。肺感染ウイルス力価（ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｇ）は、抗体ＣＢ００３．１およびＣＢ０１０．７によって２．３４８および１．７３６  ｌｏｇ１０、それぞれ低下したが、ＣＲ９５１４（３Ｄ３）による治療処置は、１．３６９  ｌｏｇ１０の減少しかもたらさなかった。さらに、新しいＧ  ｍＡｂは、細気管支周囲炎、血管周囲炎、間質肺炎、および肺胞炎についての病理組織診断スコアを低下させた（図１０）が、ＣＲ９５１４（３Ｄ３）は間質肺炎を低下させたのみであった。
【０１２２】
配列
【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
0006412107.tif 000027
【化１０】
0006412107.tif 000028
【図１】
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【図２】
0006412107.tif 000030
【図３】
0006412107.tif 000031
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0006412107.tif 000037
【図１０−１】
0006412107.tif 000038
【図１０−２】
0006412107.tif 000039
【配列表】
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