(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病に罹患した患者の治療における使用のための組成物であって、
前記治療は、該組成物を予め定められた位置で患者の体内に移植することを含み、
前記組成物は、マンヌロン酸含有量が少なくとも５０％であり、粘度が１００ｍＰａ・ｓ以下であるアルギン酸塩粒子中に被包された、胎生期、新生児期、または周産期における膵臓細胞の凝集体を含み、
前記凝集体は、１００マイクロメートルよりも小さいことを特徴とする組成物。
【請求項２】
５０％を超える前記凝集体が、５０マイクロメートル未満であることを特徴とする請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
前記アルギン酸塩は、粘度が２０ｍＰａ・ｓを超えることを特徴とする請求項１または２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
前記細胞は、ＶＥＧＦ産生細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
前記細胞は、インスリン産生細胞であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
前記細胞は、ベータ細胞であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
前記細胞は、ブタに由来するものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
前記患者は、ヒトであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
前記予め定められた位置は、皮下であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
前記糖尿病は、１型糖尿病であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
前記粒子は、１００〜８０００マイクロメートルの寸法を有することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
前記粒子は、２００〜８００マイクロメートルの平均寸法を有することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
前記移植は、注入、または外科的な埋め込みによって実施されることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
前記高Ｍアルギン酸塩は、少なくとも５０％、もしくは６０％、もしくは６５％、もしくはそれ以上のマンヌロン酸を含むことを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物治療の分野に属し、特に細胞治療におけるカプセル化細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日では、細胞に基づく治療は、適切な細胞を入手しにくいことが原因で、実際の臨床ではほとんど行われていない。細胞を治療に適用するためには、それらは、いかなる免疫応答も引き起してはならない。このような理由から、主として自己細胞が今日まで使用されてきている［Freimark et al., Transfus. Med. Hemother. 2010, 37: 66-73］。しかしながら、患者における生存細胞の数は限られており、高度に変質した組織などの特定の条件下においては、生存細胞は残っていない。さらに、これらの細胞の抽出は、追加手術につながり、また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増殖も、困難である。
【０００３】
他の手法は、同種異系、または異種細胞を用いることによってこれらの問題を回避している。これらの細胞は、それらの治療学的挙動に関してより安定であり、在庫として産生することも可能である。この手法は、しかしながら、宿主の免疫系が、同種異系、または異種細胞を異物として認識し得るという不利益がある。これらの細胞によって生じる免疫応答を防ぐために、細胞の被包が提案され、うまく採用されている。ある研究は、被包された、同種異系および異種細胞が、数種類の疾患の治療において有望な結果をもたらすことを示した。
【０００４】
上述の研究では、被包化細胞が短い生存期間であるという欠点に悩まされており、多くの研究において、この短い生存期間は、被包化細胞に対する酸素欠乏および栄養素供給の不足の結果であるとされている。
【０００５】
最近の論文［Veriter et al., Tissue engineering 16:1503 - 1513 (2010)］において、成体ブタ膵島は、肉眼で見える被包化構造体であり、高いマンヌロン酸含有量および高い粘度を有するアルギン酸塩から構成されており、糖尿病ラットにおいて、皮下移植された際に、１２週間にわたって生存可能であり、血中グルコースレベルを６０日間にわたって下方制御可能であったことが記載されている。
【０００６】
これらの有望な結果にもかかわらず、さらに非侵襲的でより長期間持続する手段および方法が望まれている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、被包化細胞を含む組成物の第２医薬用途に関する。より具体的には、本発明は、予め定められた位置における患者への移植のための異物の使用に関し、異物は、マンヌロン酸を多く含有するアルギン酸塩（高Ｍアルギン酸塩、またはＨＭアルギン酸塩）中に被包された、胎生期、新生児期、または周産期の膵臓細胞を含む。そのような組成物は、血管新生を誘導または刺激することが見出された。
【０００８】
より一般的な用語で表現すると、本発明は、特定化合物の不足または欠乏によって特徴付けられる、医学的症状または疾患を患っている患者を治療する方法であって、被包化細胞が、その化合物を産生するか、または前記患者によって産生されるべきその化合物を誘導し、前記被包化細胞が、前記患者に移植される方法に関する。本発明に係る方法において、細胞は、長時間にわたって機能的に保たれる。
【０００９】
より具体的な実施形態において、本発明は、糖尿病患者の治療における使用のための組成物であって、該治療が、予め定められた位置において患者の体内に前記組成物を移植することを含み、前記組成物が、少なくとも５０％のマンヌロン酸含有量と１００ｍＰａ・ｓ以下の粘度とを有するアルギン酸塩粒子中に被包された、胎生期、新生児期、または周産期の膵臓細胞の凝集体を含み、該凝集体が、１００マイクロメートルよりも小さい、組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】コントロール（点線）に対して、高Ｍアルギン酸塩で被包された胎児ブタベータ細胞を皮下に移植されたマウス（実線）における血中グルコースレベル（ｍｇ  グルコース／１００ｍｌ）を示すグラフである。移植されたマウス（ｎ＝１５）およびコントロールである非移植マウス（ｎ＝５）は、３グラム／ｋｇ  生存体重で腹腔内にグルコースを注入され、それらの血中グルコースレベルが観察された。
【図２】ブタ胎児ベータ細胞の皮下移植後、２０週間にわたるブタ血漿Ｃペプチドレベルを示すグラフである。実線は、移植されたマウスであり、点線は、非移植コントロールである。
【図３】ブタ胎児ベータ細胞の皮下移植後２０週間にわたる血中グルコースレベル（ｍｇ  グルコース／１００ｍｌ  血液）を示すグラフである。実線は、移植されたマウスであり、点線は、非移植コントロールである。 *ｐ＜０．０５; **ｐ＜０．０１; ***ｐ＜０．００５  スチューデントｔ検定、両側、対応なし。
【図４】皮下移植の２０週後における、高Ｍ移植片の血管新生を示す光学顕微鏡画像である。
【図５】移植後２０週間にわたる、グルコース誘導ブタ血漿Ｃペプチド（ｎｇ／ｍｌ）を示すグラフである。
【図６】移植後２０週間にわたる空腹時血中グルコース（ｍｇ％）を示すグラフである。実線は、高Ｍ移植片であり、点線は、高Ｇ移植片である。アスタリスクは、２つの群の間の有意差レベルを示す。 *ｐ＜０．０５; **ｐ＜０．０１; ***ｐ＜０．００５  スチューデントｔ検定、両側、対応なし。
【図７】移植後２０週間にわたる、グルコース誘導血漿ブタＣペプチド（ｎｇ／ｍｌ）を示すグラフである。実線は、皮下の高Ｍ移植片であり、点線は、腹膜内の高Ｍ移植片である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、細胞治療における被包化細胞の使用に関する。用語「細胞治療」とは、本明細書において、疾患を治療するために、または組織の機能を回復するために人体などの体内において新規に細胞を誘導する処理を意味する。
【００１２】
細胞の供給源および所望の機能が、どの細胞種が各疾患に最も有用であるかを示すようにするには、単一細胞または一般的なドナーを、全ての疾患の治療に使用することはできない［Gage FH: Cell therapy. Nature 1998; 392 (6679 suppl):18-24］。いくつかの種類の細胞治療が存在する。ｉ）自己、または同種の幹細胞の移植、ｉｉ）成熟した機能的細胞の移植、ｉｉｉ）必要な物質を生産する修飾ヒト細胞の移植、ｉｖ）トランス分化細胞の移植、および）異種移植である。
【００１３】
自己細胞は、免疫応答を引き起さないという利点を有するので細胞治療に好ましいが、十分な量の適切な細胞を回収することは困難である。いくつかの疾患は、先天的であるので、治療すべき疾患を発症する遺伝的素因が、自己細胞に残存したままである。さらに、追加の外科的手術が必要である。これらの理由から、同種異系、または異種細胞は、再生医療のための細胞供給源として魅力的である。これらの細胞を免疫応答から保護し、細胞を生存させておくために、そのような細胞の被包が実現可能な方法である。
【００１４】
細胞の被包は、当該分野で受け入れられている用語であり、本明細書において、細胞の固定化であって、小さな分子（治療用タンパク質、栄養素、酸素など）を拡散可能であるが、宿主の免疫系および機械的ストレスから当該細胞を保護する半透膜内における細胞の固定化を意味する［Morris PJ: Immunoprotection of therapeutic cell, transplants by encapsulation. Trends Biotechnol. 1996;14(5):163-167, and Rihova B: Immunocompatibility and biocompatibility of cell delivery systems. Adv Drug Deliv Rev. 2000; 42 (1-2): 65-80］。
【００１５】
寒天、アルギン酸塩、カラゲナン、セルロースおよびその誘導体、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、エポキシ樹脂、光化架橋性樹脂、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリスチレンおよびポリウレタン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ならびに被包に使用される他の重合体などの多くの生体材料が存在する。現存の材料は、理想的な、生体適合性、分解性、および物理的特性をもたらすために設計および修飾される。細胞被包のための好ましい材料の１つは、多価カチオンとの反応後に３次元構造体を形成するアルギン酸塩である。
【００１６】
利用可能な生体材料と同様に、形成方法も多面的である。好ましい方法の１つは、外層によって覆われるコアカプセルの形成である。この技術は、Uludag H, De Vos P, Tresco PA: Technology of mammalian cell encapsulation、Advanced Drug Delivery Rev 2000;42(1-2):29-64, Shoichet MS, Li RH, White ML, Winn SR: Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose、Biotechnol Bioeng 1996; 50(4): 374-381, Zimmermann H, Shirley SG, Zimmermann U: Alginate- based encapsulation of cells: past, present, and future、およびCurr Diab Rep 2007;7 (4):314-320 and Rabanel JM, Banquy X, Zouaoui H, Mokhtar M, Hildgen P: Progress technology in microencapsulation methods for cell therapy. Biotechnol Prog 2009;25(4): 946-963に広く記載され、これらの教示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００１７】
多くの疾患、特に慢性疾患は、特定の細胞種の機能不全に基づくものである。細胞内プロセスは、容易にｉｎ  ｖｉｔｒｏで模倣することができない多くの調節およびシグナル経路によって非常に複雑である。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究に基づいて、そのような疾患の治療のための薬剤または治療法を開発することは非常に困難である。なぜなら、これらの研究結果は、多くの場合ｉｎ  ｖｉｖｏにおける薬剤効果を投影することができないからである。より良好な結果をもたらすものは、治療的タンパク質を産生するか、または組織の機能を保持する細胞の移植である。なぜなら、これは、天然の挙動により類似しており、意図しない副反応を最小化することが可能であるからである。
【００１８】
代替療法に比べて、細胞被包の利点として、ドナー組織の限られた供給に対する代替供給源としての同種異系（非ヒト）細胞が使用できる、持続性の免疫抑制が回避できる、および所望であれば、長期間にわたる治療用製品が供給できるという点がある。また、遺伝的に修飾された細胞は、親のゲノムを変えることなく、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて任意のタンパク質の製造を誘導することができる。治療タンパク質単独の被包に比べて、細胞の固定化は、新規に合成されたタンパク質を一定の割合で、持続的かつ制御して放出することを可能にし、より生理的な状態をもたらす。さらに、カプセル損傷の場合、毒性をもたらす高タンパク質濃度の迅速な放出を、回避することが可能である。これらの理由によって、被包化細胞を用いる細胞治療は、多くの臨床用途のための有望な手法であると考えられる。
【００１９】
被包された一次細胞は、生体器官、または生体混生体としても知られている。最も一般的なものは、糖尿病の治療のために膵臓を擬態する被包されたランゲルハンス島の移植である。この疾患について、同種異系、および異種移植手法において動物の研究から有望な結果が得られた［Gianello P, Dufrane D: Correction of a diabetes mellitus type 1 on primate with encapsulated islet of pig pancreatic transplant. Bull Mem Acad R Med Belg 2007;162(10-12):439-450, Thanos CG, Elliott RB: Encapsulated porcine islet transplantation: an evolving therapy for the treatment of type I diabetes. Expert Opion Biol Ther 2009;9(1):29-44, Black SP, Constantinidis I, Cui H, Tucker-Burden C, Weber CJ, Safley SA: Immune responses to an encapsulated allogeneic islet beta-cell line in diabetic NOD mice. Biochem Biophys Res Commun 2006;340(1):236-243 and Altman JJ, Houlbert D, Chollier A, Leduc A, Mc- Millan P, Galletti PM: Encapsulated human islet transplants in diabetic rats. Trans Am Soc Artif Intern Organs 1984;30:382-386.］。
【００２０】
さらに、初期の試験的な臨床研究が行われ、膵臓の機能をいくらか回復することができたが、インスリンを用いる薬物療法を完全に停止することができないと結論付けられた［Elliott RB, Escobar L, Tan PL, Muzina M, Zwain S, Buchanan C: Live encapsulated porcine islets from a type 1 diabetic patient 9.5 yr after xenotransplantation. Xenotransplantation 2007;14(2):157-161, Scheen AJ: Clinical study of the month. Prolonged insulin independence after transplantation of islets of Langerhans in a patient with type 1 diabetes: achievement of a dream? Rev Med Liege 2000; 55(8):803-805 and Calafiore R, Basta G, Luca G, Lemmi A, Montanucci MP, Calabrese G, Racanicchi L, Mancuso F, Brunetti P: Microencapsulated pancreatic islet allografts into non-immunosuppressed patients with type 1 diabetes: first two cases. Diabetes Care 2006; 29(1):137-138.］。
【００２１】
また、一次細胞は、ハンチントン病などの神経変性疾患の治療において使用される。この疾患は、脳の特定領域の損傷をもたらすハンチンチンタンパク質の変異によって発症する。脈絡叢（ＣＰｓ）は、脳脊髄液（ＣＳＦ）を産生し、代謝廃棄物、外来物質、およびＣＳＦからの過剰な神経伝達物質を除去する濾過システムとして機能する脳の領域である。このような方法で、ＣＰは、最適な脳機能を必要とする細胞外環境を維持することを補助する［Emerich DF, Vasconcellos AV, Elliott RB, Skinner SJ, Borlongan CV: The choroid plexus: function, pathology and therapeutic potential of its transplantation. Expert Opin Biol Ther 2004; 4(8):1191-1201.］。
【００２２】
ハンチントン病に関するいくつかの研究において、ＣＰは、被包され、実験動物の脳に移植された。ハンチントン病の霊長類モデルにおいて、被包されたＣＰは、神経が変性するのを防ぐ神経栄養増殖因子を送達する。さらに、被包されたウシクロマフィン細胞による神経活性化物質の分泌は、別の神経性疾患である慢性神経障害性疼痛の治療におけるラットモデルにおいて有望な結果をもたらした［Jeon Y, Kwak K, Kim S, Kim Y, Lim J, Baek W: Intrathecal implants of microencapsulated xenogenic chromaffin cells provide a long-term source of analgesic substances. Transplant Proc 2006; 38(9):3061-3065］。また、遺伝子改変された成熟細胞は、細胞治療に使用される。一次細胞の数は、限られているので、他の細胞供給源が必要とされる。ある代替法は、所望の治療タンパク質を送達するための成熟細胞の遺伝子改変である。どの細胞種が使用されるかは、用途、ならびに処理、保存、利用可能性、および費用によって決まる。通常の薬物で治療することが困難である大脳および循環器系疾患などのいくつかの用途のために、被包され遺伝的に改良された細胞は、普通薬として治療により好適である。遺伝子改変された繊維芽細胞（リコンビナントグリア細胞株由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）産生）は、被包され、パーキンソン病の治療におけるそれらの能力に関して調べられた。ラットモデルにおいて、ＧＤＮＦ送達は、神経機能の回復を向上させた［Yasuhara T, Date I: Intracerebral transplantation of genetically engineered cells for Parkinson’s disease: toward clinical application. Cell Transplant 2007;16(2):125-132. 21 Sajadi A, Bensadoun JC, Schneider BL, Lo Bianco C, Aebischer P: Transient striatal delivery of GDNF via encapsulated cells leads to sustained behavioral improvement in a bilateral model of Parkinson disease. Neurobiol Dis 2006;22(1):119-129］。
【００２３】
改変されたマウス筋芽細胞からなる被包細胞系システムは、アリルスルファターゼＡを異染色性白質ジストロフィー患者のＣＮＳに送達するために開発された［Consiglio A, Martino S, Dolcetta D, Cusella G, Conese M, Marchesini S, Benaglia G, Wrabetz L, Orlacchio A, Deglon N, Aebischer P, Severini GM, Bordignon C: Metabolic correction in oligodendrocytes derived from metachromatic leukodystrophy mouse model by using encapsulated recombinant myoblasts. J Neurol Sci 2007;255(1-2):7-16］。
【００２４】
細胞を含むインプラントに一般的に付随する問題は、細胞が、酸素および栄養素欠乏になるので、最適な方法で発生または代謝することができないということである。したがって、血管内皮細胞増殖因子などの、血管の増殖を促進する物質を産生する外来移植片を含めることが試みられた。
【００２５】
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管発生および血管新生を刺激する細胞によって産生されるシグナルタンパク質である。これは、血液循環が不適当であるとき、組織への酸素供給を回復するシステムの一部である。ＶＥＧＦの血清中濃度は、気管支喘息において高く、糖尿病において低い。ＶＥＧＦの通常機能は、胚発生の間に新規の血管、障害後に新規の血管、運動後に筋肉、バイパスを妨げられた血管に新規の血管（側副血行路）を生じることである。
【００２６】
ＶＥＧＦが過剰発現すると、疾患に寄与し得る。固形癌は、十分な血液供給がなければ制限された寸法を超えて成長することができない。ＶＥＧＦを発現可能な癌は、成長および転移可能である。ＶＥＧＦの過剰発現は、目の網膜および体の他の部分における血管疾患を生じ得る。ベバシズマブなどの薬剤は、ＶＥＧＦを抑制することができ、それらの疾患を制御または遅延することができる。
【００２７】
ＶＥＧＦは、成長因子のサブファミリー、具体的にはシスチン−ノット成長因子の血小板由来成長因子ファミリーである。それらは、血管発生（胚循環器系の新規形成）、および血管新生（既存の脈管構造からの血管成長）の両方に関する重要なシグナルタンパク質である。
【００２８】
最も重要なメンバーは、ＶＥＧＦ−Ａである。他のメンバーは、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＶＥＧＦ−Ｄである。後者は、ＶＥＧＦ−Ａよりも後に発見され、それらの発見前、ＶＥＧＦ−Ａは、単にＶＥＧＦと称された。
【００２９】
ＶＥＧＦ−Ａの活性は、血管内皮細胞において主に調べられたが、それは、他の細胞種（たとえば、刺激単球／マクロファージ遊走、神経、癌細胞、腎臓上皮細胞）の数に影響を与える。
【００３０】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＶＥＧＦ−Ａは、内皮細胞の有糸分裂誘発および細胞遊走を刺激することが示された。また、ＶＥＧＦ−Ａは、血管拡張薬であり、毛細血管透過性を増加し、本来、血管透過性因子と称された。
【００３１】
心筋炎を治療するために、血管上皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現する、被包化異種チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が、ラットに移植された。被包されたＣＨＯ細胞に対する免疫応答は、低いものであった。ＶＥＧＦを発現するＣＨＯ細胞は、心機能の向上をもたらす血管新生を顕著に増加させた［Zhang H, Zhu SJ, Wang W, Wei YJ, Hu SS: Transplantation of microencapsulated genetically modified xenogeneic cells augments angiogenesis and improves heart function. Gene Ther 2008;15(1):40-48］。
【００３２】
被包された遺伝子改変細胞を用いる他の手法は、７型ムコ多糖症を治療するための、上皮細胞におけるベータグルクロニダーゼの発現［Nakama H, Ohsugi K, Otsuki T, Date I, Kosuga M, Okuyama T, Sakuragawa N: Encapsulation cell therapy for mucopolysaccharidosis type VII using genetically engineered immortalized human amniotic epithelial cells. Tohoku J Exp Med 2006; 209(1):23-32.］、筋芽細胞におけるエリスロポエチンの発現［Murua A, de Castro M, Orive G, Hernandez RM, Pedraz JL: In vitro characterization and in vivo functionality of erythropoietin-secreting cells immobilized in alginate-poly-L-lysine-alginate microcapsules. Biomacromolecules 2007;8(11):3302-3307 and Murua A, Orive G, Hernandez RM, Pedraz JL: Xenogeneic transplantation of erythropoietin-secreting cells immobilized in microcapsules using transient immunosuppression. J Control Release 2009; 137(3):174-178］、または腫瘍増殖を抑制する、ＣＨＯ細胞におけるＩＬ−６発現［Moran DM, Koniaris LG, Jablonski EM, Cahill PA, Halberstadt CR, McKillop IH: Microencapsulation of engineered cells to deliver sustained high circulating levels of interleukin-6 to study hepatocellular carcinoma progression. Cell Transplant 2006;15(8-9):785-798.］である。
【００３３】
また、被包されたＶＥＧＦ産生細胞は、局所脳虚血において神経保護および血管新生効果をもたらすことが見出された。それに関して、ＶＥＧＦを産生するリコンビナントＢＨＫ細胞がラット線条体に移植された。この移植片は、実験的に閉塞を誘導した後、神経保護および血管新生効果をもたらした［Yano et al., J. Neurosurg. 2005 103: 104-114］。
【００３４】
また、糖尿病マウスは、ＶＥＧＦとともにＡＮ６９膜に被包されたラット膵島で治療された。マウスの腹膜におけるこれらの移植片の埋め込みによって、膵島のインスリン分泌が増加し、糖血症レベルが低下し、２８日間にわたって安定であった。
【００３５】
これに対して、いくつかの研究は、ＶＥＧＦ産生移植片が、移植部分周辺において、巨細胞および好酸球の蓄積を誘導し、完全な移植片被包化を導き得ることを示す。増殖因子の使用は、有害な副反応を生じ得ることが述べられている［Heidenhain et al., Artif. Organs, 2011 35 E1-10］。
【００３６】
上述から、同種異系または異種成熟細胞を容易に利用可能であるので、このことは、重大な問題の一因となるものではないと結論付けることができる。しかしながら、被包された、同種異系、または異種細胞に基づく細胞治療は、依然としていくつかの制限を有する。現在までに、この細胞が短い時間だけ治療用タンパク質を分泌することと、細胞の被包にも関わらず、多くの場合、宿主の免疫応答が生じることが見出された
【００３７】
本発明につながる研究において、我々は、アルギン酸塩移植片、およびアルギン酸塩移植片に取り囲まれる細胞によって誘導される血管新生に着目し、我々は、特にＶＥＧＦ産生細胞に着目した。我々の目標は、細胞が、数週間、または数カ月、特に１０、１５、または２０週間を超えるような長期間にわたって代謝し、多くの疾患の治療のための化合物を産生し続ける環境をもたらすことである。
【００３８】
血管新生は、既に存在する血管から新たな血管が形成される生理的過程である。このことは、中胚葉細胞前駆体からの上皮細胞の新規形成である血管発生とは区別される。発生中の胚における最初の血管は、血管発生によって形成され、その後、血管新生が、発生の間、および疾患における血管の増殖の、全部ではないが、大部分を占める。
【００３９】
血管新生は、成長および発生、ならびに創傷治癒における、および肉芽組織の形成における正常な生命維持過程である。しかしながら、良性状態から悪性のものへの腫瘍の移行における基礎的工程でもあり、癌の治療における血管新生抑制剤の使用に通じる。血管新生の刺激は、多様な血管新生タンパク質によって実施されてもよく、ＶＥＧＦなどのいくつかの成長因子を含む。
【００４０】
インスリンは、血中グルコース濃度を減少させる効果をもたらすホルモンである。ベータ細胞は、同時により多く産生する間に、いくつかのその保存されたインスリンを分泌することによって血中グルコース濃度を急上昇させるために迅速に反応することができる。
【００４１】
細胞外のグルコース濃度が高いとき、グルコース分子は、ＧＬＵＴ２トランスポータによるその濃度勾配によって駆動される促進された分散によって細胞内に移動する。ベータ細胞は、糖分解の第１工程を触媒するグルコキナーゼを使用するので、代謝は、生理的な血中グルコースレベル以上にのみ生じる。グルコースの代謝は、ＡＴＰを産生し、ＡＤＰに対するＡＴＰの比率を増加する。
【００４２】
この比率が上昇するとき、ＡＴＰ感受性カリウムイオンチャネルは、閉じる。このことは、もはやカリウムイオンが細胞の外に拡散することができないことを意味する。その結果、膜を横断する電位の相違は、より正になる（カリウムイオンが細胞内に蓄積するからである）。この電位変化は、電位開口型カルシウムチャネルを開き、カルシウムイオンを細胞外から内部に浸透させ、それらの濃度勾配を減少させる。カルシウムイオンが細胞に入るとき、それらは、インスリンを含む小胞を、移動させ、細胞表面の膜に融合させ、エキソサイトーシスによってインスリンを放出する。
【００４３】
モデル系として、我々は、アルギン酸塩マトリックスに被包されたブタ周産期ベータ細胞を採用した。ベータ細胞は、ランゲルハンス島に位置する膵臓内の細胞の一種である。それらは、島における細胞の６５〜８０％を構成する。ベータ細胞の主要な機能は、インスリンの産生、保存、および放出である。
【００４４】
また、ベータ細胞は、プロインスリンをＣペプチドおよびインスリンに切断する結果としてＣペプチドを産生し、インスリンに対して等モル量で血流に分泌する。Ｃペプチドは、糖尿病の症状に関連する神経障害および他の血管変質を防ぐことを補助する。インスリンは、血清中においてＣペプチドよりも非常に短い半減期を有し、当業者は、生産されたインスリンの量とベータ細胞塊との量についての概算を得るためにＣペプチドのレベルを測定する。
【００４５】
我々のモデル系において、ベータ細胞は、アルギン酸塩の特定の種類および量で被包され、アルギン酸塩粒子を形成し、該粒子は、マイクロカプセルとも称される。アルギン酸塩は、１〜４結合したβ−Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）と、そのＣ−５エピマーのα−Ｌ−グルロン酸との直鎖状２成分コポリマーの異種性基を含む。モノマーは、連続的Ｇ残基（Ｇブロック）、連続的Ｍ残基（Ｍブロック）、交互ＭＧ残基（ＭＧブロック）、またはランダムに組織されたブロックのホモポリマー状ブロックに見出すことができる。
【００４６】
アルギン酸塩は、生理学的な治療用途の幅広い範囲において、生体材料として研究されてきた。生体適合性材料としてのその将来性は、血漿量を人工的に増やす外科的役割において、１９６４年に最初に調査された（Murphy et al., Surgery. 56: 1099-108, 1964)。最近２０年にわたって、糖尿病などの疾患の治療のためのアルギン酸塩細胞マイクロカプセル化における目覚ましい発展があった。
【００４７】
本明細書において使用されるように、用語アルギン酸塩共役体は、限定されるものではないが、アルギン酸塩−コラーゲン、アルギン酸塩−キチン、アルギン酸塩−セルロース、アルギン酸塩−ラミニン、アルギン酸塩−エラスチン、アルギン酸塩−フィブロネクチン、アルギン酸塩−コラーゲン−ラミニン、およびコラーゲン、キチン、セルロース、ラミニン、エラスチン、コラーゲン−ラミニン、またはヒアルロン酸がアルギン酸塩に共有結合した（または結合していない）アルギン酸塩−ヒアルロン酸を含み得る。
【００４８】
本明細書において使用されるような「Ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、明確に示されない限り、単独および複数の指示対象の両方を表す。例として、「ａ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ」は、１つ以上の区画（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）を表してもよい。
【００４９】
本明細書において使用される「約（ａｂｏｕｔ）」は、パラメータ、量、経時的期間などの測定可能な値を表し、特定値から、＋／−２０％以下、好ましくは＋／−１０％以下、より好ましくは＋／−５％以下、さらに好ましくは＋／−１％以下、一層好ましくは＋／−０．１％以下の変化を、そのような変化が、開示された発明における実施に好適である限り、含むことを意味する。しかしながら、修飾語「約（ａｂｏｕｔ）」が表す値は、それ自体でも具体的に開示されたと理解されるべきである。
【００５０】
エンドポイントによる数値範囲の記載は、範囲内に含まれる全ての数および有理数と、記載されたエンドポイントとを含む。
【００５１】
表現「パーセンテージ」、「％」、または「重量％」（重量パーセント）は、本明細書全体にわたって特に規定されない限り、製剤全体の重量に基づくそれぞれの成分の相対的重量を表す。
【００５２】
本明細書に記載された実験において、我々は、マンヌロン酸に富む（高Ｍ）のアルギン酸塩を含む被包システムを用いた。特に良好な結果は、低粘度を有する高Ｍアルギン酸塩を用いて得られた。アルギン酸塩の純度は、アルギン酸塩系粒子の生体適合性を測定するために示された。装置埋め込みのＦＤＡ要件によれば、エンドトキシンの含有量は、患者一人あたり３５０ＥＵ未満（ＣＮＳ用途について１５ＥＵ未満）でなければならない。エンドトキシンの生理化学的用途は、アルギン酸塩に非常に似ているので、それらの除去は困難な問題であったが、１００ＥＵ／ｇ未満の特定のエンドトキシン含有量を有する精製アルギン酸塩は、現在市販されている。バッチのｃＧＭＰ規格は、アルギン酸塩が、ＡＳＴＭガイド２０６４に従って認証された方法によって特徴付けられることを必要とする。バッチごとに証明書が引き渡されるべきである。
【００５３】
多くの従来研究は、高Ｇアルギン酸塩の使用に焦点を絞っていた。なぜなら、特に、高Ｇアルギン酸塩は、高Ｍアルギン酸塩よりも強固で頑丈な被包化用マトリックスを提供するからである。本発明は、高マンヌロン酸アルギン酸塩（高Ｍ）を含む組成物を利用する。
【００５４】
本明細書において使用される用語、高Ｍは、少なくとも５０％、好ましくは５０％を超えるマンヌロン酸含有量を有するアルギン酸塩を表す。好ましい実施形態において、マンヌロン酸含有量は、少なくとも６０％など、少なくとも６５％など、もしくは６８％、７０％などの少なくとも６７％など、または少なくとも７５％などの少なくとも５５％である。マンヌロン酸含有量は、化学修飾によって、および／または異なるマンヌロン酸含有量を有する異なるアルギン酸塩−バッチの混合によって、天然に生じるアルギン酸塩から得ることができる。
【００５５】
本明細書において使用されるような用語、低粘度は、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、または２０ｍＰａ・ｓ未満などのような１００ｍＰａ・ｓ未満の粘度を有するアルギン酸塩組成物を表すことを意味する。特に良好な結果が得られたが、高Ｍアルギン酸塩が２０ｍＰａ・ｓを超える粘度を有するときであった。
【００５６】
当業者は、アルギン酸塩の粘度を測定する技術を良好に認識する。そのような方法の代表的な例は、生物医学的な組織工学医薬品用途における使用を対象とした出発物質としてのアルギン酸塩の特徴付け、および試験のためのＡＳＴＭ  Ｆ２０６４−００（２００６）スタンダードガイドに記載されている（ＡＳＴＭ  Ｄ２１９６セット２０セルシウス度、および２重量％の高Ｍアルギン酸塩を用いる）。アルギン酸塩の粘度を測定するための他の任意の方法は、しかしながら、同様に良好に適しており、本明細書の実施例２において使用されたＰｒｏｎｏｖａに由来する材料は、その点で基準値として使用されてもよい。
【００５７】
最近の論文［Veriter et al., Tissue engineering 16:1503 - 1513 (2010)］において、分離された成体ブタ膵島は、高マンヌロン酸（高Ｍ）含有量および高粘度を有するアルギン酸塩から形成される巨視的構造体内に被包され、１２週間にわたって生存可能であり、皮下に埋め込まれたとき６０日にわたって糖尿病ラットにおいて血中グルコースレベルを下方制御することができたことが記載された。
【００５８】
この技術は、巨視的構造体が外科的方法によって埋め込まれなければならない不都合を回避するが、より小さな構造体が注入による埋め込みにとって好ましい。残念ながら、高粘度を有する高Ｍアルギン酸塩は、２００〜８００マイクロメートルの直径を有する粒子などの、小さく、注入可能な粒子の製造について本来的に適していない。
【００５９】
さらに、Veriter (上記)によって記載された技術において、血管新生は、埋め込み後４週間で既に減少する。このことは、この方法を臨床治療について好適でないものにする。なぜなら、組成物は、非常に頻繁に投与されなければならないからである。
【００６０】
我々は、２００〜８００マイクロメートルの直径を有する低粘度（１００ｍＰａ・ｓ未満）高Ｍ（少なくとも５０％マンヌロン酸）アルギン酸塩微粒子を用いるVeriterの方法を繰り返した。Veriterの知見と一致して、我々は、血管新生を全く観察しなかった。
【００６１】
驚くべきことに、しかしながら、我々が、１００マイクロメートル未満の凝集体寸法を有する、胎生期、新生児期、または周産期の膵臓細胞とともにこれらの低粘度高Ｍアルギン酸塩微粒子を入れたとき、これは、血管新生の長期に持続する誘導をもたらした。さらに、細胞は、２０週間にわたって、生存可能であり、インスリンを再生産、および産生可能であった。これらの結果は、５０％を超える凝集体が５０マイクロメートル未満である細胞製剤において一層明らかであった。
【００６２】
一態様において、本発明は、したがって、糖尿病に罹患した患者の治療における使用のための組成物であって、治療は、予め定められた位置における患者の体内に組成物を埋め込むことを含み、当該組成物は、少なくとも５０％のマンヌロン酸含有量と１００ｍＰａ・ｓ以下の粘度とを有するアルギン酸塩中に被包された、胎生期、新生児期、または周産期の膵臓細胞の凝集体を含み、当該凝集体は、１００マイクロメートルよりも小さい組成物に関する。
【００６３】
より具体的には、本発明は、上述されたような使用のための組成物であって、５０％を超える凝集体が５０マイクロメートル未満である組成物に関する。この点において５０％を超えるとは、９０％または１００％などの、７０％を超える、またはさらに８０％を超えるなどの、６０％を超える値を含む。そのような小さな凝集体が好ましい。なぜなら、それらは、細胞の生存と細胞の増殖とをもたらすからである（以下を参照）。
【００６４】
上述のように、高Ｍアルギン酸塩が１００ｍＰａ・ｓ未満の粘度を有するとき、驚くべき良好な結果が得られた。好ましい実施形態において、本発明は、したがって、上述のような組成物の使用であって、高Ｍアルギン酸塩が、８０、７０、６０、５０、４０、３０、または２０未満などの９０ｍＰａ・ｓ以下のような１００ｍＰａ・ｓ以下の粘度を有する組成物の使用に関する。
【００６５】
特に良好な結果は、しかしながら、高Ｍアルギン酸塩が２０ｍＰａ・ｓを超える粘度を有するときに得られた。好ましい実施形態において、本発明は、したがって、上述のような使用に関し、高Ｍアルギン酸塩が、３０、４０、５０、６０、または７０ｍＰａ・ｓなどの２０ｍＰａ・ｓを超える粘度を有する。
【００６６】
また、我々は、細胞、特に高Ｍアルギン酸塩粒子に被包されたＶＥＧＦ産生細胞が、血管新生および／または血管発生を誘導または改良するために非常に適したものであることを見出した。本発明は、したがって、上述のような使用のための組成物であって、細胞がＶＥＧＦ産生細胞である組成物に関する。
【００６７】
また、本明細書における開示は、予め定められた位置において患者への移植に適した異物であって、血管新生の誘導または刺激における使用のための低粘度の高Ｍアルギン酸塩に被包された細胞を含む異物である。
【００６８】
言い換えれば、本発明は、血管新生を誘導または刺激する方法であって、上述のような高Ｍアルギン酸塩中に被包された細胞を含む異物などの組成物が予め定められた位置において血管新生を誘導または刺激する必要のある患者に移植される方法に関する。そのような患者は、糖尿病に罹患していてもよい。本明細書において糖尿病は、１型または２型糖尿病を含む。
【００６９】
言い換えれば、本発明は、糖尿病に罹患した患者、または１型糖尿病に罹患した患者などの患者の治療における使用のための組成物であって、当該組成物が、予め定められた位置において患者の体内に移植され、当該組成物が、高Ｍアルギン酸塩に被包された、胎生期、新生児期、または周産期のブタ膵臓細胞の凝集体を含み、５０％を超える当該凝集体が５０マイクロメートル未満である組成物を提供する。このことは、凝集体の直径がより大きい（＞１００マイクロメートル）ことを意味する完全な成体膵島の必要性を記載している多くの従来技術刊行物（Dufrane et al 2006）とは対照的である。
【００７０】
本明細書において使用されるように、用語「異物」は、異物が移植される患者に由来しない、少なくとも１つの成分、または物質を含む組成物を表すことを意図される。前記用語は、したがって、患者自身に由来する細胞、または組織からなる組成物を排除するが、異物が移植される患者の体に対して、異質または外来の化合物を含む組成物を包含する。たとえば、高Ｍアルギン酸塩を含む組成物は、体に対して外来のものである。移植されるべき患者の体に由来する細胞または組織は、患者に対して外来または異質のものではない。
【００７１】
好ましい実施形態において、異物は、患者の体に対して外来または異質の化合物を排他的に構成さえる。一例として、我々は、本明細書において、高Ｍアルギン酸塩および膵臓細胞を含む異物を提供する。異物が移植されるべき患者とは異なる患者の体に由来するヒト細胞は、細胞が由来する患者が、異物が移植されるべき患者と同一種に属するときでさえ、異物が移植されるべき患者に対して外来性であるとみなされる。
【００７２】
本明細書に示される実験において、我々は、高Ｍアルギン酸塩中に被包され、皮下に移植される周産期細胞が、増殖し、分化し、ならびに第４週から開始し、少なくとも１６〜２０週間、実験が終了した後にわたって、最小の生理的レベルをはるかに上回るレベルのインスリンおよびＣペプチドを産生および分泌することによって、上昇したグルコースレベルに対する反応のそれらの通常の機能を発揮することを示した。
【００７３】
移植のために適切な他の部位は、網、脂肪組織などの脂肪沈着、または筋肉内を含む。
【００７４】
ＶＥＧＦ産生ブタベータ細胞が高Ｍアルギン酸塩のカプセル中に使用されたとき、それらは、本明細書に示された図および表に示されたように、１６〜２０週間の全期間にわたって機能的インスリンを産生した。
【００７５】
理論に縛られることを望むものではないが、我々は、１６または２０週間にわたるインスリンの継続的産生が、高Ｍ被包化移植片への向上した血液供給によってもたらされると仮定した。実際に、我々は、皮下に移植された高Ｍ移植片の大規模な血管新生を観察したが、高Ｇ移植片は、血管新生の顕著なパターンを示さなかった（図４）。また、高Ｇ移植片は、本明細書に提供された実施例に詳述されるように、２０週間の追跡観察期間の間に顕著な量のインスリンを産生しなかった。
【００７６】
我々は、胎生期、新生児期、または周産期のブタ細胞が、移植後に追加のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖が可能であったことを観察した。このことは、文献（Growth and functional maturation of beta-cells in implants of endocrine cells purified from prenatal porcine pancreas. Bogdani M, Suenens K, Bock T, Pipeleers-Marichal M, In 't Veld P, Pipeleers D. Diabetes. 2005 Dec;54(12):3387-94.）においても認識されている。しかしながら、我々は、このことが、特に、高Ｍアルギン酸塩被包化移植片を用いる場合、ベータ細胞数は、移植後２０週間で３〜６倍に増加したことを観察した。移植片の寸法における同様の増殖は、高Ｇ被包化細胞には存在せず、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて２０週間後、細胞の絶対数が５０％減少した（表１）。
【表１】
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【００７７】
また、本発明は、上述されたような使用であって、細胞がＶＥＧＦ産生細胞である使用に関する。細胞の量は、臨界的であるとは思われない。我々は、０．５×１０６、１×１０６、および２×１０６個の細胞を含む移植片を用いて、本明細書に記載された実験を再現し、３×１０６個の細胞を含む移植片を用いて得られた結果と同じ結果を見出した。
【００７８】
そのような細胞は、多くの異なる疾患の治療において有利に使用され得る。本明細書に開示された方法および化合物を用いて治療される特に好適な疾患は、糖尿病であってもよい。この場合、細胞は、有利には、インスリン産生細胞であってもよい。そのような細胞は、多様な供給源に由来するベータ細胞であってもよい。ベータ細胞は、有利には、たとえば新生児または胎児の膵臓に由来してもよい。さらに好ましい実施形態において、膵臓は、ブタから得られてもよい。また、我々は、上述された実験、およびヒト膵島細胞を用いる実施例を実施した。その結果は、ブタ細胞を用いて得られた結果と同一ではない場合、同等であった。したがって、本発明は、上述された、使用、方法、組成物、または使用のための組成物であって、細胞がヒト細胞である、使用、方法、組成物、または使用のための組成物にも関する。
【００７９】
また、本明細書において、高Ｍアルギン酸塩移植片が、有利に皮下移植されてもよいことが示された。このことは、多くの顕著な利点を有し、まず第１に当然、取扱いが容易である。皮下移植は、注入によって、または他の最小限に浸襲性の埋め込みによって、容易に実施されてもよい。また、異物は、経皮的留置、キーホールサージェリー、切開、またはカテーテル／トラッカー留置によって患者に埋め込まれてもよい。
【００８０】
本明細書において、用語「注入」は、任意にニードルを通して、シリンジによって、粘稠液を患者の体内に入れ、それによって組成物を患者の体内に留置する、作用、または処理として理解されるべきである。
【００８１】
皮下移植は、必要な場合、移植後における移植片の容易な観察および除去のために特に好ましい。
【００８２】
さらに、我々は、高Ｍ移植片が、追跡観察期間の２０週間にわたって増加した量の機能的なインスリンを産生するが、一方、高Ｍ被包化細胞の腹腔内移植片は、顕著な量のインスリンを産生しなかった。
【００８３】
移植のための移植片または異物は、意図する用途に好適な任意の形態であってもよい。皮下に適用されるとき、移植片は、有利には、ゲル、または９００、８００、もしくは７００マイクロメートルなど、１０００マイクロメートルなどの８０００マイクロメートルの最大寸法を有する粒子であって、該粒子の最少直径が、５０、１００、２００、もしくは４００マイクロメートルなど、３０マイクロメートルなどの１０マイクロメートルを超え得る粒子の形態であってもよい。粒子は、有利には、上述の最少寸法と、最大寸法との間における任意の値の直径を有してもよい。特に好ましい粒子、またはカプセルは、基本的に球形であり、３０〜１０００マイクロメートルなど、５０〜９００マイクロメートルなど、１００〜８００マイクロメートルなど、２００〜８００マイクロメートルなどの１０〜８０００マイクロメートルの最大寸法を有する。粒子の寸法は、液体製剤の粘度および流量によって、および液滴を形成するために液滴形成機序を設定することによって主に測定され、内包されることが意図される細胞の数と相関関係にある。当業者は、カプセル、または粒子の好適な寸法をどのように選択するのか知っている。
【００８４】
また、移植片、または異物は、細胞を内包するアルギン酸塩を含むメッシュの形態であってもよい。また、それは、カセット（TheraCyte（商標））、またはポリマー足場などの任意の他の生体適合性半透性被包装置であってもよい。
【００８５】
さらに好ましい実施形態において、高Ｍアルギン酸塩は、５０％を超えるマンヌロン酸含有量を有する。
【実施例】
【００８６】
実施例１：被包化のための細胞の調製ブタ胎児膵臓細胞は、本質的にＥＰ１１４６１１７に記載されたように得られた。特に、以下の手順が採用された。妊娠１０８〜１１４日の妊娠雌ブタを麻酔し、手術室において無菌条件下で外科的に胎児を取り出し、胎児（頭殿長  ２８＋／−５ｃｍ（平均＋／−ＳＤ））が断頭され、無菌下で解剖して膵臓を取り出し、無菌培養培地（Pipeleers et al, Endocrinology 117:806-816, 1985）に集められた。組織は、約１ｍｍ３の寸法の小さな断片にハサミで切断された。
【００８７】
分離培地を用いて組織断片を洗浄した後、断片は、０．３ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ−Ｐ（Roche社）を有する分離培地２００ｍｌに懸濁され（室温）、続いて１５分間振とうされた。組織消化物は、５００ミクロンフィルタを通して濾過され、濾過物は、１．０４０の密度を有する溶液を通して遠心（１５００ｒｐｍにおいて６秒）され、その後ペレットが保存された。５００ミクロンフィルタ上に残った材料は、さらに１５分間にわたってコラゲナーゼとともに再度培養され、続いて以前と同様に濾過され、遠心され、それによってペレットは、再度保存された。２回目にフィルタ上に残った材料は、上述のように、濾過および遠心前に、カルシウムを含まない解離培地に再懸濁され(Pipeleers and Pipeleers-Marichal, Diabetologia 20:654-663, 1981)、室温で１５分間培養する間に分散された。この分散手順は、フィルタ上に残った材料に繰り返された。
【００８８】
４つのペレット画分は、２％の新生児ウシ血清（ＮＣＳ）を含む分離培地に懸濁され、１００ミクロンフィルタを通して濾過され、大きな細胞クラスタを除去し、濾液は、単一細胞と、小さな（＜１００ミクロン直径）細胞凝集体とから構成された。この細胞懸濁液は、ＪＥ−１０Ｘ対向流エルトリエーションロータ(Beckman instruments社  パロアルト  カルフォルニア)のチャンバにポンプで注入され、１５００ｒｐｍで遠心され、ポンプは１９０ｍｌ／分の設定であった。これらの条件下において、１５ミクロン未満の直径を有する粒子は、チャンバの外に流され、したがって、大きな寸法（１５〜１００ミクロン）を有する粒子を保持した。エルトリエート画分は、遠心され、ペレットは１．０４０の密度を有する培地に再懸濁され、１．０７５の密度を有する培地の上部に層状化された。２５００ｒｐｍで２０分間の遠心後、１．０４０と１．０７５との間の中間物は、シリコナイズされたパスツールピペットで除去され、２％ＮＣＳを含む分離培地で洗浄された。細胞は、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ  ＴＣ１００  Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ，９００−０３００において自動で計数された。エルトリエートされた１５ミクロン未満の画分から、３〜５千万個の細胞がそれぞれの胎児膵臓について得られた。この画分に含まれる細胞の６０％超は、単一の細胞であった。
【００８９】
細胞は、１ｍｌの培地あたり５０万〜１００万個の細胞で、６ｍＭグルコース、ペニシリン０．０７５ｍｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン０．１ｍｇ／ｍｌ、２ｍＭグルタミン、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｕＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、１μＭヒドロコルチゾン、５ｍＭニコチンアミド、および０．５％ウシ血清アルブミンを有するハムＦ−１０培地を含む１４ｃｍの無菌ペトリ皿に静置された。３７セルシウス度、および空気中の５％ＣＯ２で１６時間培養後、細胞は洗浄され、低いカルシウム濃度（０．２ｍＭ）を除いて、上述のように培地は同じ種類のハムＦ１０培地によって置換された。これらの条件下において、細胞は、７日間にわたって懸濁培養物において保持され、０．９％ＮａＣｌを用いて洗浄され、続いて遠心によって回収された。
【００９０】
細胞懸濁液が、したがって、得られ、１００マイクロメートル以下の細胞凝集体を本質的に含んでいた。５０％を超える単一細胞を含む細胞凝集体画分と、５０マイクロメートル未満の細胞凝集体とは、血管新生誘導において特に良好な結果をもたらした。
【００９１】
実施例２：細胞の被包
マイクロカプセル化は、高マンヌロン酸含有量（高Ｍ、少なくとも５０％のＭ）を有する、Ｐｒｏｎｏｖａ  ＵＰ  ＬＶＭ、ノルウェー、製品番号４２００２０６から得られた高度に精製されたアルギン酸塩を用いて実施された。
【００９２】
ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＬＶＭは、低粘度（２０〜２００ｍＰａ・ｓ）のアルギン酸ナトリウムであり、５０％を超えるモノマー単位は、マンヌロネートである。所与のバッチ記録に基づいて、バッチが選択され、１００ｍＰａ・ｓ未満の粘度で使用された。
【００９３】
本明細書に記載されたコントロール実験において、高Ｇアルギン酸塩が使用される。本願明細書において、高Ｇは、高いグルロン酸（高Ｇ、＞５０％のグルロン酸またはグルロネート）を意味する。
【００９４】
アルギン酸塩の２％溶液は、５０ｍｌファルコンチューブにおいてアルギン酸塩の１ｍｌあたり２０×１０６個の細胞の最終濃度まで、実施例１において得られた細胞ペレットに混合された。
【００９５】
細胞懸濁液は、その後、以下の設定を用いて同軸気体流装置を通された。
−  流速ポンプ：  １．８ｍｌ／分
−  空気流メータ：  ２．５〜３Ｌ／分
−  圧力弁１：  ０．２ＭＰａ
−  圧力弁２：  ０．１ＭＰａ
【００９６】
ペリスタポンプを用いて、細胞−アルギン酸塩混合物は、金属ハブニードル（ゲージ１６）を用いて５０ｍｌのファルコンチューブ外に吸引され、２２ゲージのエアジェットニードルに向けてチューブを通された。アルギン酸塩中に細胞を含む液滴は、２２ゲージのエアジェットニードル（空気流２．５〜３ｌ／分）を通す押出（０．５〜１．５ｍｌ／分）によって産生された。
【００９７】
液滴は、ゲル化溶液として、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ、０．１４Ｍマンニトール、ｐＨ７．２〜７．４において、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２と、１ｍＭ  ＢａＣｌ２とのゲル状溶液を含む２０ｍｌビーカに２ｃｍ落とされた。この緩衝液との接触下で、微小滴は、ゼリー化される。液滴寸法は、ポンプ流速と使用される空気流とに依存して２００〜８００μｍにわたって変化する。高Ｍカプセルは、平均６２５ｕｍ（＋／−  ７０）の直径であり、一方、高Ｇカプセルは、５００ｕｍ（＋／−  ７５）であった。
【００９８】
液滴は、ゲル状溶液において７分にわたって残存した。その後、カプセルは、ゲル化溶液から除去され、０．９％ＮａＣｌを用いて穏やかに撹拌された。この工程は、３回繰り返しされ、その度に、洗浄溶液を完全に新たにされた。
【００９９】
ＱＣについて試料を取得後、被包化細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で無血清培地中で移植まで培養された。
【０１００】
実施例３  カプセルの品質管理、および被包化細胞の細胞数
被包化細胞の細胞数および生存率は、取扱説明書に従って、ヌクレオカウント（Nucleocounter YC-100, Chemometec社)によって測定された。簡潔には、実施例２において得られた被包細胞懸濁液から３通りの３０個のカプセルが得られた。カプセルは、Sigma Aldrich社から得られたフラボバクテリウムマルチボラ（Flavobacterium multivorum）に由来するアルギン酸リアーゼを用いて処理された。粉末、≧ユニット／ｇ固体を、取扱説明書に従って使用した。
【０１０１】
リアーゼ処理後、遊離の細胞を計数した。典型的な実験において高Ｍカプセルは、カプセル１つあたり約１５００個の細胞（＋／−  ３６０）を含んでいたが、高Ｇカプセルは、カプセル１つあたり９９０個の細胞（＋／−  ５００）を含んでいた。これらの細胞の、約４０％は、インスリン産生細胞であり、約２５％は、グルカゴン産生細胞であった。７０〜９０％の細胞が、生存しているようであった。
【０１０２】
実施例４：移植実験
本明細書において記載された移植実験において、３×１０６個の被包化細胞が、腹腔内（ＩＰ）または皮下（ＳＣ）のいずれかで８週齢の雄NOD/SCID Jaxmice（登録商標）（Charles River Laboratories社）に移植された。ＩＰ移植のために、白線に沿って動物の腹壁および腹膜にわずかな切開がなされた。Charles River Laboratories社の被包化細胞は、その後、４ｍｌの緩衝溶液で満たされた５ｍｌピペットを用いて腹膜腔に導入された。
【０１０３】
ＳＣ移植片は、左背側皮下腔に位置された。このために、皮膚は、下層にある筋肉から穏やかに取り外され、移植片は、得られた空間に移植された。全ての外科的手術は、全身麻酔下で実施された。
【０１０４】
コントロール動物は、移植を受けなかった。その後、動物は、２０週間にわたって観察された。
【０１０５】
実施例５：血中グルコースレベルの測定
血中グルコースレベルは、取扱説明書に従って、グルコカードストリップ（Glucocard X-sensor; Menarini Diagnostics社、フィレンツェ、イタリア）を用いて、尾部血液において測定された。グルコース測定は、移植後２週間ごとに実施された。
【０１０６】
実施例６：移植片および宿主によって産生されたＣペプチドの測定
グルコース（３グラム／ｋｇ  生体重量）が腹腔内に注入され、ブタＣペプチドが、市販されているＲＩＡキット（PCP-22K、Linco Research社、セントチャールズ、ＭＯ、米国）を用いて、２５０μｌＥＤＴＡ−アプロチニン血漿中で注入の１５分後に測定された。このことは、本明細書において、グルコース誘導血漿ブタＣペプチドレベルと記載される。
【０１０７】
実施例７：移植片は、機能的インスリンを産生する。
移植された移植片が機能的ブタインスリンを実際に産生することを確認するために、グルコースレベルは、グルコース溶液の腹腔内注入後２時間にわたって観察された。試料は、０、１５、３０、６０、９０、および１２０分後に取得された。図１は、低粘度（＜１００ｍＰａ・ｓ）で被包化されたブタ胎児ベータ細胞および高Ｍカプセルを皮下に受け入れたマウスは、コントロール（非移植）マウスよりも迅速に有意に低いエンドポイントまでグルコースを除去したことを示す。図１は、１５匹の移植マウスと５匹のコントロールマウスとを用いて、移植の２０週間後に得られた結果を示す。エラーバーは、標準偏差を示し、結果は、高度の有意差（ｐ＜０．００１）を示した。
【０１０８】
実施例８：被包化細胞は、２０週間にわたって生存し、機能的である。
グルコース誘導血漿ブタＣペプチドレベルは、移植後２週間ごとに測定された。産生されたブタＣペプチドの量は、移植片によって産生された機能的インスリン産生の指標として取得された。図２は、低粘度−高Ｍアルギン酸塩中のブタ胎児ベータ細胞を皮下に移植されたマウスが、２０週間の全期間にわたって、増加したレベルのブタＣペプチドを産生したことを示す。このことは、図３から分かるように、２０週後における血中グルコースレベルの減少によって証明されるような機能的インスリン産生を反映している。
【０１０９】
実施例９：低粘度−高Ｍアルギン酸塩中の皮下移植片は、血管新生を誘導する。
動物は、移植の２０週間後に屠殺され、移植片は、病理組織学的実験のために取り出された。移植片の血管新生は、光学顕微鏡下で測定された。
【０１１０】
低粘度で被包化された、ブタ胎児ベータ細胞の高Ｍアルギン酸塩は、皮下に移植されたとき、非常に効率的に血管新生を誘導した。ほとんど全ての低粘度の高Ｍカプセルが、毛細血管ネットワークによって取り囲まれていることが見出された（図４）。このことは、毛細血管と移植片との間の機能的な結合を示す。これに対して、高Ｇカプセルは、毛細血管によって取り囲まれておらず、偶発的な毛細血管が移植片内に入ったが、機能的結合をもたらしてはいなかった。高Ｇ移植片における毛細血管は、カプセルに血液を供給するというよりも、それらを迂回しているようであった。細胞で処方されていない低粘度の高Ｍカプセルは、２０週間にわたって生存したが、Ｎｏｄ−Ｓｃｉｄマウスでも、ＢａｌｂＣマウスでも顕著な毛細血管ネットワークを示さなかった。
【０１１１】
実施例１０  被包化後の細胞生存率
外植片は、コラゲナーゼを用いて消化され、カプセルは、回収率を測定するために、精選され、計数された。カプセルは、上述のようにリアーゼを用いて消化された。細胞の生存率は、ヘキスト／ヨウ化プロピジウム染色によって測定された。核の数および生存率は、ヌクレオカウンターを用いて確認された。細胞性組成物は、ホルムアルデヒド固定されたサイトスライドの免疫蛍光染色（サイトスピンで４分間、１０００ｒｐｍ（Thermo Fisher Scientific社）後に測定された。
【０１１２】
実施例１１：低粘度で被包化された高Ｍアルギン酸塩ベータ細胞に対する高Ｇで被包化された細胞
低粘度の高Ｍアルギン酸塩中に被包化され、皮下移植された胎児ブタベータ細胞は、２０週間にわたってＣペプチドの着実な増加を示したが、一方、高Ｇ粒子中に移植された細胞は、顕著なレベルのＣペプチドを産生しなかった。このことは、図５に示される。高Ｇアルギン酸塩中に被包化された細胞を移植された動物におけるグルコースレベルは、２０週間にわたって顕著に変化しなかったが、一方、低粘度の高Ｍ被包化細胞を受け入れた動物におけるグルコースレベルは、顕著に減少した（図６）。ベータ細胞数は、ＨＭアルギン酸塩移植片における移植後２０週間で４〜６倍に増加したが、一方、ＨＧ移植片において、それは５０％減少した。
【０１１３】
実施例１２：腹腔内移植に対する皮下移植
低粘度の高Ｍアルギン酸塩中に被包化され、皮下に移植されたブタ胎児ベータ細胞は、腹腔内に移植されたとき、同じカプセルよりも、２０週間の追跡観察期間にわたってＣペプチドの顕著に高い産生を示した。結果として、皮下移植された動物のグルコースレベルは減少したが、一方、腹腔内に移植された動物は、グルコースレベルの顕著な減少を示さなかった。
【０１１４】
実施例１３  細胞調製の比較分析
我々は、本実験において使用された細胞調製物と、従来技術において使用された細胞との間の相違を調べた。成体膵島は、Dufrane et al（Xenotransplantation 2006: 13; 204-214）に記載された実験などの従来の移植実験において一般的に使用されている。本明細書において記載された実験において使用されるような細胞調製物は、それらが１００マイクロメートル未満の凝集体からなり、６０％、７０％または８０％を超えるような、５０％を超える凝集体が、５０マイクロメートルよりも小さいという事実によって特徴付けられる。凝集体の下限（単一細胞）は、細胞の寸法によって決定される。良好な結果は、１５マイクロメートルよりも大きな凝集体を用いて得られ得る。これに対して、Dufrane et al（上記）は、良好な結果が、１００マイクロメートルをはるかに超える成体膵島の４２％超から構成される単離体を用いて得られたことを記載した。他の出所（Ching et al., Arch. Surg. 136; (2001); 276-279）は、膵島の寸法が６４４マイクロメートルであることを記載している。
【０１１５】
膵島は通常、約６５％インスリン陽性細胞を含み、インスリン陽性細胞は、インスリンを産生することができる細胞を意味する。本願において使用される細胞調製物は、被包化の時点において３０〜４０％のインスリン陽性細胞を含む。本明細書に記載されたように、細胞の凝集体が高Ｍアルギン酸塩中に移植されたとき、それらは、１２〜２０週間の程度の期間にわたって、高Ｍ粒子内部における８０％の細胞塊がインスリン陽性細胞となるまで増殖し、再生する。被包化の時点において存在する他の細胞種は、グルカゴン陽性細胞（２７％＋／−４）、ソマトスタチン陽性細胞（１６％＋／−２）、膵臓ポリペプチド陽性細胞（５％）、およびＣＫ７細胞（１５％＋／−１４）であった。
【０１１６】
最も重要なことは、我々は、ファクタ３〜６の移植後、インスリン産生細胞塊が増殖するが、全細胞塊はファクタ１．５〜２．５によって増加することを見出した。インスリン陽性細胞の増加は、移植された膵島において観察されなかったが、一方、細胞塊は、数週間後には全て失われた。
【０１１７】
また、我々の細胞調製は、インスリン産生細胞に分化し成熟する前駆細胞のプールを含むと考えられ、当該プールは、細胞塊の増殖に寄与し得る。膵島は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて実質的に前駆細胞活性を実質的に含まないことが知られている。
【０１１８】
また、我々は、本明細書に記載されたような細胞凝集塊が、第４週目から開始する好適なインスリン分泌を有することを観察したが、一方、単離された膵島は、移植開始からインスリンを産生した(上記のVeriter et al および 上記のDufrane et al)。さらに、膵島の迅速な応答は、４週間しか持続しないが、我々の細胞凝集塊は、産生および応答性を低下することなく、移植後２０週間までインスリンを産生した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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