(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列に対してアライメントしたとき、
前記塩基配列の第５４位〜第５９位の部分塩基配列ＡＧＴＴＣＧに対応する部分塩基配列を備え、さらに、
以下の（ａ）〜（ｃ）；
（ａ）前記塩基配列の第２７位から第３５位の部分塩基配列ＴＴＴＴＧＴＴＣＴがＴＴＴＴＴＣＴとなっている第１の変異、
（ｂ）前記塩基配列の第６９位から第７７位の部分塩基配列ＴＣＴＣＡＴＴＴＴがＴＣＴＴＴＴとなっている第２の変異、及び
（ｃ）前記塩基配列の第５１位のＧがＡとなっている第３の変異
からなる群から選択される１又は２以上の変異を備える、酵母のDIT1ターミネーター由来の酵母ターミネーター。
【請求項２】
前記第１の変異を備える、請求項１に記載の酵母ターミネーター。
【請求項３】
前記第２の変異を備える、請求項１又は２に記載の酵母ターミネーター。
【請求項４】
前記第３の変異を備える、請求項１〜３のいずれかに記載の酵母ターミネーター。
【請求項５】
前記第１の変異及び前記第２の変異を備える、請求項１に記載の酵母ターミネーター。
【請求項６】
前記第１の変異、第２の変異及び３の変異を備える、請求項１に記載の酵母ターミネーター。
【請求項７】
配列番号１で表される塩基配列に対してアライメントしたとき、前記塩基配列の第１位〜第２６位の部分塩基配列に対応する塩基配列を備える、請求項１〜６のいずれかに記載の酵母ターミネーター。
【請求項８】
配列番号１で表される塩基配列に対してアライメントしたとき、前記塩基配列の第４２位〜第５０位の部分塩基配列ＴＡＡＡＣＡＴＴＡに対応する塩基配列を備える、請求項１〜７のいずれかに記載の酵母ターミネーター。
【請求項９】
配列番号１で表される塩基配列に対してアライメントしたとき、前記塩基配列の第６０位〜第６８位の部分塩基配列ＴＴＴＴＣＴＴＴＴに対応する塩基配列を備える、請求項１〜８のいずれかに記載の酵母ターミネーター。
【請求項１０】
配列番号１で表される塩基配列に対してアライメントしたとき、前記塩基配列の第７８位〜第２０５位の部分塩基配列対応する塩基配列が前記部分配列に対して９０％以上の同一性を有する、請求項１〜９のいずれかに記載の酵母ターミネーター。
【請求項１１】
酵母における遺伝子発現カセットであって、
プロモーター領域と、目的遺伝子のコード領域を導入するためのクローニングサイト又は前記目的遺伝子のコード領域と、請求項１〜１０のいずれかに記載の酵母ターミネーターを含むターミネーター領域と、を備える、カセット。
【請求項１２】
酵母での遺伝子発現用ベクターであって、
プロモーター領域と、目的遺伝子のコード領域を導入するためのクローニングサイト又は前記目的遺伝子のコード領域と、請求項１〜１０のいずれかに記載の酵母ターミネーターを含むターミネーター領域と、を備える、ベクター。
【請求項１３】
遺伝子組換え酵母であって、
プロモーター領域と、目的遺伝子のコード領域と、請求項１〜１０のいずれかに記載の酵母ターミネーターを含むターミネーター領域を保持する、酵母。
【請求項１４】
酵母を用いた物質の生産方法であって、
請求項１３に記載の遺伝子組換え酵母を培養する工程、
を備える、生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、目的遺伝子の発現量を向上させる酵母ターミネーター及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
出芽酵母において、目的タンパク質をコードする目的遺伝子等の下流には、通常、PGK1ターミネーターやCYC1ターミネーターが用いられている。こうした汎用されるターミネーターの2倍以上に増大させるターミネーター領域が同定され、目的遺伝子のコード領域の下流に高活性ターミネーターを配置することにより、目的遺伝子のタンパク質生産量を向上させる技術が報告されている（特許文献１、非特許文献１）。
【０００３】
報告されている上位５種類の高活性ターミネーターの特性が詳しく検討された結果、DIT1ターミネーターが最も高い活性を有することが判明してきている（非特許文献２）。ターミネーターとプロモーターとは相乗効果を発揮するため、最高活性を持つDIT1ターミネーターは高発現のTDH3プロモーターなどと同様に、出芽酵母の代謝工学に幅広く活用されると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−３９５３３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Yamanishi M, Ito Y, Kintaka R, Imamura C, Katahira S, Ikeuchi A, Moriya H,  Matsuyama T. A genome-wide activity assessment of terminator regions in Saccharomyces cerevisiae provides a “terminatome” toolbox. ACS Synth Biol, 2, 337-347.
【非特許文献２】Ito Y, Yamanishi M, Ikeuchi A, Imamura C, Tokuhiro K, Kitagawa T, Matsuyama T. Characterization of five terminator regions that increase the protein yield of a transgene in Saccharomyces cerevisiae. J Biotechnol, 168, 486-492.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
目的物質を生産する遺伝子組換え酵母を代謝工学的な手法を用いて開発する際に、目的遺伝子のタンパク質を強く発現することが求められる。ターミネーターがタンパク質生産量を増加させる活性を高めることができれば、目的遺伝子1コピーあたりの目的タンパク質の生産量が増大するため、目的遺伝子の導入回数の減少による開発コストの大幅な低減が期待できる。また、mRNA一分子あたりのタンパク質生産量が増加すれば、mRNA合成と分解に用いられるエネルギーが目的の代謝経路に振り分けられて、最終生産物の収率や収量の向上も期待できる。
【０００７】
ところで、出芽酵母のDIT1ターミネーターは、上流に配置された遺伝子コード領域のタンパク質を生産する活性が最も高いため、上記の目的を達成するのに有効な手段と考えられる。しかしながら、野生型DIT1ターミネーターは、自然の進化によって生じた塩基配列を備えており、必ずしも導入された上流遺伝子のタンパク質生産量を最大限にするために最適化されてはいない。
【０００８】
本明細書は、野生型DIT1ターミネーターを上回る性能を有する酵母ターミネーター及びその利用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、本発明者らが同定したDIT1ターミネーター領域の塩基配列とその内に含まれる推定されるシス配列及びその前後において変異を導入して、改変型DIT1ターミネーターの活性を、本発明者らが開発した評価方法により評価した。その結果、DIT1ターミネーターよりも高活性の酵母ターミネーターを取得することができた。こうした知見に基づき、本明細書は、以下の手段を提供する。
【００１０】
（１）配列番号１で表される塩基配列に対してアライメントしたとき、
前記塩基配列の第５４位〜第５９位の部分塩基配列ＡＧＴＴＣＧに対応する部分塩基配列を備え、さらに、
以下の（ａ）〜（ｃ）；
（ａ）前記塩基配列の第２７位から第３５位の部分塩基配列ＴＴＴＴＧＴＴＣＴがＴＴＴＴＴＣＴとなっている第１の変異、
（ｂ）前記塩基配列の第６９位から第７７位の部分塩基配列ＴＣＴＣＡＴＴＴＴがＴＣＴＴＴＴとなっている第２の変異、及び
（ｃ）前記塩基配列の第５１位のＧがＡとなっている第３の変異
からなる群から選択される１又は２以上の変異を備える、酵母のDIT1ターミネーター由来の酵母ターミネーター。
（２）前記第１の変異を備える、（１）に記載の酵母ターミネーター。
（３）前記第２の変異を備える、（１）又は（２）に記載の酵母ターミネーター。
（４）前記第３の変異を備える、（１）〜（３）のいずれかに記載の酵母ターミネーター。
（５）前記第１の変異及び前記第２の変異を備える、（１）に記載の酵母ターミネーター。
（６）前記第１の変異、第２の変異及び３の変異を備える、（１）に記載の酵母ターミネーター。
（７）配列番号１で表される塩基配列に対してアライメントしたとき、前記塩基配列の第１位〜第２６位の部分塩基配列に対応する塩基配列を備える、（１）〜（６）のいずれかに記載の酵母ターミネーター。
（８）配列番号１で表される塩基配列に対してアライメントしたとき、前記塩基配列の第４２位〜第５０位の部分塩基配列ＴＡＡＡＣＡＴＴＡに対応する塩基配列を備える、 （１）〜（７）のいずれかに記載の酵母ターミネーター。
（９）配列番号１で表される塩基配列に対してアライメントしたとき、前記塩基配列の第６０位〜第６８位の部分塩基配列ＴＴＴＴＣＴＴＴＴに対応する塩基配列を備える、（１）〜（８）のいずれかに記載の酵母ターミネーター。
（１０）配列番号１で表される塩基配列に対してアライメントしたとき、前記塩基配列の第７８位〜第２０５位の部分塩基配列対応する塩基配列が前記部分配列に対して９０％以上の同一性を有する、（１）〜（９）のいずれかに記載の酵母ターミネーター。
（１１）酵母における遺伝子発現カセットであって、
プロモーター領域と、目的遺伝子のコード領域を導入するためのクローニングサイト又は前記目的遺伝子のコード領域と、（１）〜（１０）のいずれかに記載の酵母ターミネーターを含むターミネーター領域と、備える、カセット。
（１２）酵母での遺伝子発現用ベクターであって、
プロモーター領域と、目的遺伝子のコード領域を導入するためのクローニングサイト又は前記目的遺伝子のコード領域と、（１）〜（１０）のいずれかに記載の酵母ターミネーターを含むターミネーター領域と、を備える、ベクター。
（１３）遺伝子組換え酵母であって、
プロモーター領域と、目的遺伝子のコード領域と、（１）〜（１０）のいずれかに記載の酵母ターミネーターを含むターミネーター領域を保持する、酵母。
（１４）酵母を用いた物質の生産方法であって、
（１３）に記載の遺伝子組換え酵母を培養する工程、
を備える、生産方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】変異型DIT1ターミネーターのゲノム挿入用コンストラクトの構成。制限酵素部位を上に示す図である。
【図２】NAB6-PAP1アッセイの概略図を示す図である。
【図３】15種類の3bp欠失変異型DIT1tの活性評価結果を示す図である。縦軸は、野生型DIT1tコントロール株を基準とした相対GFP蛍光強度、下段Cは野生型、d2は10bp欠失変異型d2、白棒はコントロール株、グレー棒はNAB6過剰発現株、黒棒はPAP1過剰発現株、誤差は標準偏差を示す。それぞれ、３〜４実験の平均値である。
【図４】30種類の1塩基変異の変異型DIT1t株m1〜m30株のNAB6+PAP1アッセイ結果を示す図である。縦軸は、野生型DIT1tコントロール株のGFP蛍光強度を基準とした時の相対蛍光強度、横軸の上段Wは野生型、Cは3bp欠失変異型d15株を示すとともに、下段は点変異を導入した10bp塩基配列で、その上段は変異させた塩基を示す。cis配列をコードしているターミネーター領域「AGTTCG」に破線を付してしめす。また、白棒はコントロール株、薄いグレー棒はNAB6過剰発現株、濃いグレー棒はPAP1過剰発現株、黒棒はNAB6とPAP1同時過剰発現株をそれぞれ示す。それぞれ、３〜４実験の平均値。誤差は示していない。
【図５】NAB6+PAP1アッセイによって、野生型よりも高い活性を示した変異型DIT1t株の遺伝子発現増強活性を示す図である。縦軸は、野生型DIT1tコントロール株のGFP蛍光強度を基準とした時の相対蛍光強度を示し、横軸は、変異型DIT1t株を示し、それぞれ、コントロールのpGP564（灰色）、pGP564-NAB6（白色）、pGP564-PAP1（斜線）、pGP564-PAP1-NAB6（黒色）のバーを示す。各４回の実験の平均値を示し、誤差は標準偏差を示した。を示す図である。
【図６】野生型DIT1ターミネーターと変異型DIT1ターミネーターの活性の比較結果を示す図である。縦軸は、PGK1ターミネーター活性を１とした時の相対活性の値を示し、横軸は、OD600=0.1で植え継いだ後の時間を示し、野生型（○）、変異型d7（▲）、d21（◆）、m22（■）、d23（△）、d22（●）を示す。値は４回の独立した実験の平均値。
【図７】野生型DIT1ターミネーターと変異型DIT1（d22）ターミネーターの活性の比較結果を示す図である。縦軸は、PGK1ターミネーター活性を１とした時の相対活性の値を示し、横軸は、OD600=0.1で植え継いだ後の時間を示し、野生型（○）、変異型d22（■）を示す。値は３回の独立した実験の平均値。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書の開示は、酵母ターミネーター及びその利用に関する。本明細書に開示される酵母ターミネーターによれば、ＰＧＫ１ターミネーターに対して２倍以上の発現増強活性を有するDIT1ターミネーターよりもさらに高い発現増強活性で外来遺伝子など所望の目的遺伝子を酵母において発現させることができる。
【００１３】
（酵母ターミネーター）
本明細書に開示される酵母ターミネーター（以下、本酵母ターミネーターという。）は、酵母のDIT1ターミネーターに由来する酵母ターミネーターであって、配列番号１で表される塩基配列に対してアライメントしたとき、以下の（ａ）〜（ｃ）；
（ａ）前記塩基配列の第２７位から第３５位の部分塩基配列ＴＴＴＴＧＴＴＣＴがＴＴＴＴＴＣＴとなっている第１の変異、
（ｂ）前記塩基配列の第６９位から第７７位の部分塩基配列ＴＣＴＣＡＴＴＴＴがＴＣＴＴＴＴとなっている第２の変異、及び
（ｃ）前記塩基配列の第５１位のＧがＡとなっている第３の変異
からなる群から選択される１又は２以上の変異を備えることができる。
【００１４】
本酵母ターミネーターは、酵母のDIT1遺伝子のターミネーターに由来している。ここで、「酵母のDIT1遺伝子のターミネーターに由来する」とは、天然に存在している酵母のDIT1遺伝子のターミネーター、すなわち、DIT1遺伝子のタンパク質のコード領域の終止コドンの次の塩基から好ましくは１５０塩基長、より好ましくは１８０塩基長、さらに好ましくは２００塩基長、なお好ましくは２１０塩基長、一層好ましくは２３０塩基長、より一層好ましくは２５０塩基長程度の領域又は当該領域を改変したものを意味している。したがって、配列番号１で表される塩基配列に対して上記変異を有している限り、天然に存在するDIT1遺伝子の天然のターミネーターであっても、天然のDIT1遺伝子のターミネーターを人工的に改変した非天然のターミネーターであってもよい。
【００１５】
また、本酵母ターミネーターは、以下に説明する塩基配列上の特徴を１又は２以上を有しており、酵母のDIT1遺伝子のターミネーターに由来するものである限り、天然から取得したＤＮＡであってもよいし、天然のＤＮＡを利用して調製したものであってもよいし、完全に人工的に遺伝子工学的に又は化学的に合成したものであってもよい。
【００１６】
本酵母ターミネーターは、配列番号１で表される塩基配列からなる野生型DIT1ターミネーターよりも高い遺伝子発現増強活性を有していることが好ましい。好ましくは、上記野生型ターミネーターの遺伝子発現活性に対する相対活性が１．１倍以上であり、より好ましくは１．２倍以上であり、さらに好ましくは１．３倍以上であり、なお好ましくは１．４倍以上であり、一層好ましくは１．５倍以上である。
【００１７】
野生型DIT1ターミネーターに対する相対活性は、例えば、後段にて説明する方法により評価することができる。
【００１８】
（コア配列）
本酵母ターミネーターは、配列番号１で表される塩基配列に対してアライメントしたとき、配列番号１で表される塩基配列の第５４位〜第５９位の部分塩基配列ＡＧＴＴＣＧ（本明細書において、コア配列ともいう。）に対応する塩基配列を備えることが好ましい。このコア配列を維持することで、ＮＡＢ６−ＰＡＰ１による活性化に基づく発現増強活性を維持することができる。また、コア配列に加えて、同第５２位〜５３位の部分塩基配列を併せて維持していてもよい。
【００１９】
以下、本酵母ターミネーターが、配列番号１で表される塩基配列に対して備えることができる変異等について説明する。
【００２０】
（第１の変異）
本酵母ターミネーターが備えることができる第１の変異は、本酵母ターミネーターの塩基配列を、配列番号１で表される塩基配列に対してアライメントしたとき、配列番号１で表される塩基配列の第２７位から第３５位の部分塩基配列ＴＴＴＴＧＴＴＣＴがＴＴＴＴＣＴとなっている変異である。
【００２１】
本明細書において、塩基配列のアライメントは、各種公知のプログラムにて実施することができる。この種のプログラムとしては、例えば、BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）、COBALT(http://www.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi)、Clustal W（http://www.genome.jp/tools/clustalw/）、Clustal Omega（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）及びMUSCLE（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）等のほか、商業的に入手可能なプログラムが挙げられる。当業者であれば、アライメントのためのプログラムを、NCBI、NIH、DDBJ、EBIなど公開ウェブサイトから適宜取得し、あるいはウェブサイト上で適宜利用し、あるいは商業的に入手可能なアライメントプログラムを用いて、配列番号１で表される塩基配列に対して比較対象とする塩基配列をアライメントさせることができる。アライメントにより、配列番号１で表される塩基配列上の１つの塩基又は２以上の塩基からなる部分塩基配列に対応して、比較対象となる塩基配列がどのような塩基又は部分塩基配列を有しているかを特定することができる。
【００２２】
本酵母ターミネーターが有する第１の変異は、配列番号１で表される塩基配列において、第２７位〜第３５位において、結果として３つの塩基が欠失するかのごとくの変異である。配列番号１で表される塩基配列と酵母ターミネーターの塩基配列とをアライメントした結果、第１の変異として規定する態様を有していれば、アライメントプログラムによって表現される変異の形態は特に限定されない。アライメントにおいては、プログラム、配列、パラメータ等により、アライメント結果が異なって表現されることがあるからである。
【００２３】
（第２の変異）
本酵母ターミネーターが備えることができる第２の変異は、本酵母ターミネーターの塩基配列を、配列番号１で表される塩基配列に対してアライメントしたとき、配列番号１で表される塩基配列の第６９位から第７７位の部分塩基配列ＴＣＴＣＡＴＴＴＴがＴＣＴＴＴＴとなっている変異である。
【００２４】
本酵母ターミネーターにおける第２の変異は、配列番号１で表される塩基配列において、第６９位〜第７７位において、結果として３つの塩基が欠失するかのごとくの変異である。第１の変異と同様、配列番号１で表される塩基配列と酵母ターミネーターの塩基配列とをアライメントした結果、第２の変異として規定する態様を有していれば、アライメントプログラムによって表現される変異の形態は特に限定されない。
【００２５】
（第３の変異）
本酵母ターミネーターが備えることができる第３の変異は、本酵母ターミネーターの塩基配列を、配列番号１で表される塩基配列に対してアライメントしたとき、配列番号１で表される塩基配列の第５１位のＧがＡとなっている置換変異である。
【００２６】
本酵母ターミネーターは、配列番号１で表される塩基配列とアライメントしたとき、こうした第１の変異、第２の変異及び第３の変異のいずれか１つ、２つ又は全てを備えることで、配列番号１で表される塩基配列を有する野生型DIT1ターミネーターよりも高い発現増強活性を備えることができる。
【００２７】
例えば、本酵母ターミネーターが、第１の変異を備えることで、野生型ターミネーターに対して１．１倍以上、PGK1ターミネーターに対して２．８倍以上の発現増強活性を備えることができる。また、例えば、本酵母ターミネーターが、第２の変異を備えることで、野生型ターミネーターに対して１．２倍以上、PGK1ターミネーターに対して３．０倍以上の発現増強活性を備えることができる。例えば、本酵母ターミネーターが第１の変異と第２の変異とを備えることで、野生型ターミネーターに対して約１．５倍以上、PGK1ターミネーターに対して約４．０倍以上の発現増強活性を得ることができる。また、本酵母ターミネーターが、第１の変異と、第２の変異と、第３の変異とを備えることで、野生型のターミネーターに対して約１．５倍以上、PGK1ターミネーターに対して４．０倍以上の発現増強活性を得ることができる。また、本酵母ターミネーターが、例えば、第２の変異を備えることで、野生型ターミネーターに対して１．４倍以上、PGK1ターミネーターに対して４．０倍以上の発現増強活性を得ることができる。
【００２８】
なお、発現増強活性は、酵母において、TDH3プロモーターの制御下にGFPをコードする遺伝子を導入し、その下流に野生型ターミネーター、PGK1ターミネーター、野生型ターミネーター及び本酵母ターミネーターのいずれかを接続したコンストラクトを、例えば、W303−1aなどの野生型酵母（Saccharomyces cerevisiae）のPDC6遺伝子座に導入した形質転換体を取得した。これらの各種酵母を対数増殖期を経て定常期まで増殖させてGFPの蛍光を測定して、野生型ターミネーター及びPGK1ターミネーターに対する各種酵母ターミネーターの発現増強活性を取得することができる。発現増強活性は、定常期において観察される最大発現増強活性とする。
【００２９】
発現増強活性は、PGK1ターミネーターによって得られた発現増強活性を１としたときの相対活性として取得することが好ましい。
【００３０】
本酵母ターミネーターは、上記したコア配列、第１〜第３の変異のほか、以下の部分配列を備えることもできる。本酵母民は、例えば、配列番号１で表される塩基配列に対してアライメントしたとき、配列番号１で表される塩基配列の第１位〜第２６位の部分塩基配列AGT  AAG  AGC  GCT  ACA  TTG  GTC  TAC  CT（以下、第１の部分配列ともいう。）を備えることが好ましい。この部分塩基配列を維持することで、発現増強活性を維持することができる。また、配列番号１で表される塩基配列からなるターミネーターよりも高いターミネーター活性が得られる範囲で、この部分塩基配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、より一層好ましくは９７％以上、さらに一層好ましくは１００％の同一性を有する塩基配列を備えていてもよい。
【００３１】
本酵母ターミネーターは、また、例えば、配列番号１で表される塩基配列に対してアライメントしたとき、配列番号１で表される塩基配列の第４２位〜第５０位の部分塩基配列ＴＡＡＡＣＡＴＴＡに対応する塩基配列（以下、第２の部分配列という。）を備えることが好ましい。この部分塩基配列を維持することで、発現増強活性を維持することができる。さらに、配列番号１で表される塩基配列の第３６位〜第４１位の部分塩基配列に対応する塩基配列を備えていてもよい。
【００３２】
本酵母ターミネーターは、また、例えば、配列番号１で表される塩基配列に対してアライメントしたとき、配列番号１で表される塩基配列の第６０位〜第６８位の部分塩基配列ＴＴＴＴＣＴＴＴＴに対応する塩基配列（以下、第３の部分配列ともいう。）を備えることが好ましい。この部分塩基配列を維持することで、発現増強活性を維持することができる。
【００３３】
また、本酵母ターミネーターは、配列番号１で表される塩基配列に対してアライメントしたとき、配列番号１で表される塩基配列の第７８位〜第２０５位の部分塩基配列（以下、第４の部分配列ともいう。）を備えることができる。かかる部分塩基配列を維持することで、発現増強活性を維持することができる。また、配列番号１で表される塩基配列からなるターミネーターよりも高いターミネーター活性が得られる範囲で、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、なお好ましくは９６％以上、より一層好ましくは９７％以上、さらに一層好ましくは９８％以上、なお一層好ましくは９９％以上、一層好ましくは１００％の同一性を有する塩基配列を備える。
【００３４】
本酵母ターミネーターは、配列番号１で表される塩基配列の５’末端に酵母において機能する終止コドンを付加されて備えていることが好ましい。終止コドンとしては、ＴＡＡ、ＴＡＧ及びＴＧＡが挙げられる。例えば、ＴＡＡとすることができる。
【００３５】
本酵母ターミネーターは、野生型ターミネーターの塩基配列において、第１の変異、第２の変異及び第３の変異から選択される１又は２以上のみ備えていてもよいが、配列番号１で表される塩基配列とアライメントしたとき、ターミネーター活性を低下させない限りさらに他の変異を備えていてもよい。
【００３６】
例えば、本酵母ターミネーターは、配列番号１で表される塩基配列とアラインメントしたとき、少なくとも、コア配列、第１、第２及び第３の変異に対応する部分塩基配列を含まない塩基配列において、配列番号１で表される塩基配列に対して、好ましくは８５％以上、さらに一層好ましくは９０％以上、なお一層好ましくは９５％以上の同一性を有しており、野生型ターミネーターよりも高い発現増強活性を有しているものであってもよい。また、例えば、本酵母ターミネーターは、より好ましくは同９６％以上、さらに好ましくは同９７％以上、なお好ましくは同９８％以上、一層好ましくは同９９％以上の同一性を有していることが好ましい。
【００３７】
また、本酵母ターミネーターは、配列番号１で表される塩基配列とアラインメントしたとき、コア配列、第１、第２及び第３の変異並びに第１、第２、第３及び第４の部分配列から選択される１又は２以上の部分塩基配列に対応する塩基配列を含まない塩基配列において、配列番号１で表される塩基配列に対して、好ましくは８５％以上、さらに一層好ましくは９０％以上、なお一層好ましくは９５％以上の同一性を有しており、野生型ターミネーターよりも高い発現増強活性を有しているものであってもよい。また、例えば、本酵母ターミネーターは、より好ましくは同９６％以上、さらに好ましくは同９７％以上、なお好ましくは同９８％以上、一層好ましくは同９９％以上の同一性を有していることが好ましい。
【００３８】
本明細書において、同一性又は類似性とは、当業者にいて知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術分野で“同一性 ”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する好ましい方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される。同一性及び類似性を決定するための方法は、公に利用可能なプログラムにコードされている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。BLASTのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
【００３９】
同一性（％）は、同一残基の数を残基の総数で割り算し１００を掛けたものとして定義される。アライメントにおける配列が（ギャップまたは伸長により）異なる長さのものである場合、最長配列の長さが計算において用いられる。
【００４０】
また、本酵母ターミネーターは、高ストリンジェント条件下で、配列番号１で表される塩基配列からなる核酸プローブにハイブリダイゼーションすることができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは当業者により容易に決定され、一般に、プローブ長、洗浄温度および塩濃度に左右される経験的計算である。一般に、適切なアニーリングのためには、より長いプローブはより高い温度を要し、一方、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖がそれらの融解温度未満の環境中に存在する場合に、変性ＤＮＡが再アニールしうることに基づいている。プローブとハイブリダイズ可能配列との間の所望の相同性の度合が高くなればなるほど、用いられうる相対温度は高くなる。その結果、より高い相対温度は反応条件をより高いストリンジェンシートにし、より低い温度はより低いストリンジェンシーする傾向にあるということになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細および説明に関しては、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照されたい。
【００４１】
なお、本明細書中で用いる「高いストリンジェンシー」なる語は、（１）洗浄のために、低いイオン強度および高温を用いる条件、例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳを５０℃で用いる条件、（２）ハイブリダイゼーション中に、変性剤、例えばホルムアミドを用いる条件、例えば、４２℃の７５０ｍＭ塩化ナトリウム／５０ｍＭクエン酸ナトリウムを伴う、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール、０．１％ＢＳＡを伴う５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを用いる条件、または（３）０．２×ＳＳＣ中で４２℃および５０％ホルムアミド中で５５℃での洗浄、ならびにそれに続く、５５℃におけるＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高いストリンジェンシーの洗浄と共に、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト液、超音波処理サケ精子（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％硫酸デキストラン（４２℃）を用いる条件を意味する。
【００４２】
また、本酵母ターミネーターは、配列番号１で表される塩基配列において、第１の変異、第２の変異及び第３の変異以外の部分において、１又は２以上の塩基の、置換、欠失及び／又は挿入を備えることができる。こうした塩基の置換、欠失及び挿入の総数は、好ましくは３０個以下であり、より好ましくは２５個以下であり、さらに好ましくは２２個以下であり、なお好ましくは２０個以下であり、一層好ましくは１７個以下であり、より一層好ましくは１５個以下であり、さらに一層好ましくは１２個以下であり、なお一層好ましくは１０個以下であり、また好ましくは７個以下で、より好ましくは５個以下であり、なお好ましくは３個以下であり、一層好ましくは２個以下であり、より一層好ましくは１個以下である。
【００４３】
こうした本酵母ターミネーターとしては、例えば、配列番号２（第１の変異を備える）、配列番号３（第２の変異を備える）、配列番号４（第３の変異を備える）、配列番号５（第１の変異及び第２の変異を備える）、配列番号６（第１の変異、第２の変異及び第３の変異を備える）のそれぞれで表される塩基配列が挙げられる。
【００４４】
以上説明したように、本酵母ターミネーターは、酵母において優れた発現増強活性を有するDIT1ターミネーターに対してより一層高い発現増強活性を備えている。このため、酵母における有用遺伝子の発現をより強く、また、より広いスケール範囲で有用遺伝子の発現を調節できるようになる。
【００４５】
（遺伝子発現カセット）
本明細書に開示される遺伝子発現カセット（以下、本遺伝子発現カセットという。）は、酵母で作動するプロモーター領域、目的遺伝子のコード領域を導入するためのクローニングサイト又は目的遺伝子のコード領域と、本酵母ターミネーターを含むターミネーター領域とを備えることができる。こうした遺伝子発現カセットによれば、酵母において目的遺伝子の発現を高度に増強することができる。
【００４６】
酵母で作動するプロモーター領域としては特に限定しない。各種公知の酵母プロモーターを適宜含めることができる。酵母のプロモーターとしては、一般的に高発現プロモーターであるTDH1プロモーター他、ADH1プロモーター、TPI1プロモーター、HXT7プロモーター、PGK1プロモーター等、適宜選択して用いることができる。
【００４７】
目的遺伝子のコード領域を導入するためのクローニングサイトは、例えば、１又は２以上の制限酵素サイトを備えることができる。こうしたクローニングサイトは、必要に応じて１又は２以上の所望の制限酵素サイトを含むように構成することができるほか、市販のプラスミドやベクターを適宜転用することができる。
【００４８】
目的遺伝子のコード領域における目的遺伝子は、酵母で発現させることを意図するものであれば、どの生物種に由来していてもよい。目的遺伝子は、天然に存在するタンパク質をコードする天然の遺伝子のほか、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列が人工的に改変されたタンパク質をコードする遺伝子であってもよいし、例えば、異種のタンパク質を融合した融合タンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、目的遺伝子は、酵母でのコドン用法に改変されていてもよい。目的遺伝子の態様については、さらに後述する。
【００４９】
ターミネーター領域は、本酵母ターミネーターを含んでいる。本酵母ターミネーターは、目的遺伝子のコード領域の終止コドンの下流に備えることができる。例えば、終止コドンに直接連結される。
【００５０】
本遺伝子発現カセットは、また、そのプロモーター領域の３’側及びターミネーター領域の５’側に、遺伝子発現カセット自体を、修飾可能にそれぞれ１又は２以上の制限酵素サイトを備えることができる。
【００５１】
さらにまた、本遺伝子発現カセットは、本遺伝子発現カセットを、酵母染色体に組み込むための１又は２以上の酵母遺伝子に対する相同組換え領域を備えることができる。相同組換え領域は、酵母染色体上の遺伝子破壊の影響が少ない酵母遺伝子や領域が選択される、こうした領域としては、特に限定しないが、例えば、PDC6遺伝子等が挙げられる。例えば、相同組換え領域は、酵母染色体上の遺伝子領域のコード領域よりも上流側とコード領域よりも下流側に相同な領域であって、特に限定しないが、通常、数百塩基程度とすることができる。
【００５２】
また、本遺伝子発現カセットは、本遺伝子発現カセットが導入された形質転換酵母を選択するための選択マーカー遺伝子を備えることができる。選択マーカー遺伝子は、栄養要求性遺伝子、薬剤耐性遺伝子等が挙げられる。こうした選択マーカー遺伝子は、それ自体発現可能に構成されている。
【００５３】
（発現ベクター）
本明細書に開示される酵母での遺伝子発現用ベクター（以下、本ベクターともいう。）は、プロモーター領域と、目的遺伝子のコード領域を導入するためのクローニングサイト又は前記目的遺伝子のコード領域と、本酵母ターミネーターを含むターミネーター領域を備えることができる。プロモーター、クローニングサイト及び目的遺伝子のコード領域及びターミネーター領域は、本遺伝子発現カセットにおいて既に説明した各種態様のほか、本酵母ターミネーターについて既に説明した各種態様を適宜適用することができる。さらに、本ベクターは、本遺伝子発現カセットが備えることができる。したがって、本ベクターは、必要に応じて相同組換え領域や、選択マーカー遺伝子等も備えることができる。
【００５４】
（遺伝子組換え酵母）
本明細書に開示される酵母は、プロモーター領域と、目的遺伝子のコード領域と、本酵母ターミネーターを含むターミネーター領域を保持することができる。本酵母によれば、所望の目的遺伝子の発現を増強することができる。
【００５５】
本酵母は、既に説明した本遺伝子発現カセット又は本ベクターを酵母に導入して酵母を形質転換することによって得ることができる。
【００５６】
酵母としては、公知の各種酵母を利用できるが、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属の酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属の酵母、キャンディダ・シェハーテ（Candida shehatae）等のキャンディダ属の酵母、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）等のピキア属の酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属の酵母、クロッケラ属（Klocckera）の酵母、スワニオマイセス属（Schwanniomyces）の酵母及びヤロイア属（Yarrowia）の酵母、トリコスポロン（Trichosporon）属の酵母、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属の酵母、パチソレン（Pachysolen）属の酵母、ヤマダジマ（Yamadazyma）属の酵母、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）等のクルイベロマイセス属の酵母、イサトケンキア・オリエンタリス（Issatchenkia orientalis）等のイサトケンキア属の酵母が挙げられる。例えば、工業的生産を考慮すると、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ポンベ、カンジダ・アルビカンス、ピキア・パストリス、クルイベロミセス・ラクティスが好ましいものとして挙げられる。より好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロミセス・ラクティスが挙げられる。
【００５７】
本酵母は、本酵母ターミネーターによって所望の目的遺伝子を発現制御することが可能になっているほか、所望の目的遺伝子の発現をさらに増強するために、本酵母ターミネーターを一層活性化する増強システムを備えていてもよい。かかるシステムとしては、例えば、特開2015-136303号公報等に開示される発現システムであって、DIT1ターミネーターを活性化できる酵母由来のPAP1遺伝子、酵母由来のNAB6遺伝子、酵母由来のCCC1遺伝子及び酵母由来のMOS2遺伝子からなる群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現を増強するように構成されていてもよい。こうした活性化遺伝子及び酵母への適用方法は、当該公報の段落００４０〜００６３及び同００７４〜０１０３に詳細に記載されている。
【００５８】
本遺伝子発現カセット及び本ベクターの作製方法並びにこれらを酵母に導入する方法、本酵母を作製する方法に関して必要な一般的な操作は、当業者間で通常行われているものであり、たとえば、T．Maniatis，J. Sambrookらの実験書（Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1982,1989、2001)等を適宜参照することにより当業者であれば実施することができる。
【００５９】
（酵母を用いた物質の生産方法）
本明細書に開示される酵母を用いた物質の生産方法は、本酵母を培養する工程を備えることができる。本生産方法によれば、所望の目的遺伝子を、本酵母ターミネーターによってその発現強度を増強することができる。本来的に目的遺伝子の発現を調節するプロモーターによる制御に加えて本酵母ターミネーターによってその発現を調節（増強）することができるため、より一層目的遺伝子の発現を増強又は広範囲に制御できる。
【００６０】
目的遺伝子としては、概して有用な物質な生産に関連する内因性遺伝子及び／又は外因性遺伝子が挙げられる。外因性遺伝子は、酵母以外の生物種における天然遺伝子であってもよいし、酵母を含む生物の天然遺伝子を改変した人工遺伝子であってもよいし、より人工的な遺伝子であってもよい。
【００６１】
また、目的遺伝子は、直接物質生産に関わる遺伝子であってもよいし、資化するエネルギーとしてグルコース以外のキシロースなどのヘミセルロースなどの利用性を向上又は付与するための遺伝子であってもよい。セルロースやヘミセルロースを分解して酵母が資化可能な単糖等とするための酵素を発現させることもできる。こうした酵素としては、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼが代表的であるほか、ヘミセルロースの種類に応じて、キシランを分解するキシラナーゼ、β-キシロシダーゼ、キシラン側鎖を分解するα-アラビノフラノシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、マンナンを分解するマンナナーゼ、ガラクトース側鎖を切断するα-ガラクトシダーゼ、ペクチンを切断するペクトリアーゼ、ペクチナーゼ、キシログルカンを分解するキシログルカナーゼ、キシランとリグニンとの結合を切断するフェルラ酸エステラーゼ等が挙げられる。
【００６２】
生産する物質としては、特に限定しないが、例えば、酵母が通常を利用して生産可能な化合物であってもよい。また、例えば、酵母における代謝系の１種又は２種以上の酵素を遺伝子組換えにより置換、追加等して本来の代謝物でない化合物であってもよい。具体的には、エタノールなどの低級アルコール、乳酸、酢酸などの有機酸の他、１，３−プロパン−ジオール、プロパノール、ブタノール、コハク酸、エチレン及びグリセロールのほか、イソプレノド合成経路の追加によるテルペノイド系のファルネソール、ゲラニルゲラニオール、スクアレン、さらには、ファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、解糖系の改変によるグリセリン、プラスチック・化成品原料など、バイオリファイナリー技術が対象とする材料が挙げられる。
【００６３】
本酵母の培養工程においては、本酵母を、酵母の種類、目的遺伝子の種類、生産しようとする物質の種類に応じて適切な培養条件下で培養することができる。すなわち、例えば、スクロースなどの適当な炭素源、アミノ酸、無機質等を含む培地を用いて、静置培養、振とう培養等を用いることができる。通気条件は、例えば、嫌気条件下、微好気条件下及び好気条件等、適宜選択することができる。培養温度も、特に限定しないが、例えば、２０℃〜４０℃等の範囲とすることができる。また、培養時間も必要に応じて設定されるが、例えば、数時間〜１５０時間程度とすることができる。また、ｐＨの調整は、例えば、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。
【００６４】
こうした培養工程の実施により、本酵母が有している物質生産能力に応じて物質を生産することができる。培養工程後、培養液から有用物質含有画分を回収する工程、さらにこれを精製又は濃縮する工程を実施することもできる。回収工程や精製等の工程は生産する物質の種類等に応じて適宜選択される。
【実施例】
【００６５】
以下、本明細書の開示を実施例を挙げて具体的に説明するが、これらの実施例は、本明細書の開示を限定するものではない。
【実施例１】
【００６６】
（タンパク質生産活性を向上させる変異型DIT1ターミネーターの探索）
以下の手順で、野生型DIT1tと比較して、高い活性を有する変異型DIT1tを探索し、同定した。
【００６７】
１．DIT1遺伝子のストップコドンの直後の塩基から数えて3１塩基下流のGを始点として、３塩基づつ順次欠失させた16種類の3塩基欠失の変異型DIT1ターミネーターDNA断片を合成した。野生型（d０）及び１５種類の変異型ターミネーター（d7〜d21）の塩基配列の配列番号は以下の表に示すとおりである。
【００６８】
【表１】
0006260627.tif 000002
【００６９】
続いて、30種類DIT1遺伝子のストップコドンの次の塩基から5０塩基下流のAを始点としたAGTTAGTTCGの部分に飽和変異（例えば、野生型の配列がAなら、C、G、Tのそれぞれの配列に置換）を導入した変異型DIT1ターミネーターDNA断片を合成した。合計３０種類の変異型ターミネーター（m1〜m30）の塩基配列の配列番号は表１に併せて示すとおりである。
【００７０】
さらに、d7とd21の欠失を合わせ持つ変異型ターミネーターd22、及びm22の変異とd22の欠失を合わせ持つ変異型ターミネーターd23の2種類の変異型DIT1ターミネーターDNA断片を合成した。これらの変異型ターミネーター（d22、d23）の塩基配列の配列番号は表１に併せて示すとおりである。
【００７１】
これらのDNA断片には全て、クローニングのために5¢側にKpnI部位を、3¢側にBamHI部位を合成した。
【００７２】
２．次に、各変異型DIT1ターミネーターの活性を比較するためのコンストラクトを構築した。コンストラクトの概要を図１に示す。まず、pSP73ベクター（Promega社）のClaI、XhoI部位の間に、図１に示すように、PDC6上流領域（ＧＦＰのコード領域の開始コドンから-822〜-177）、TDH3プロモーター（前記開始コドンから-796〜-1）、コドン最適化GFP（Yamanishi, M., Matsuyama, T. (2012) A modified Cre-lox genetic switch to dynamically control metabolic flow in transgenic  Saccharomyces cerevisiae. ACS Synth. Biol. 1, 172?180.を参照）、各変異型DIT1ターミネーター（DIT1t）、TRP1栄養要求性マーカー遺伝子、PDC6下流領域（終了コドンから+4〜+599）、ApaI部位。なお、以上の構成のコンストラクトは、以下の文献にも記載されている（Yamanishi M, Ito Y, Kintaka R, Imamura C, Katahira S, Ikeuchi A, Moriya H,  Matsuyama T. A genome-wide activity assessment of terminator regions in Saccharomyces cerevisiae provides a “terminatome” toolbox. ACS Synth Biol, 2, 337-347、Ito Y, Yamanishi M, Ikeuchi A, Imamura C, Tokuhiro K, Kitagawa T, Matsuyama T. Characterization of five terminator regions that increase the protein yield of a transgene in Saccharomyces cerevisiae. J Biotechnol, 168, 486-492、Yamanishi, M., Katahira, S., Matsuyama, T. (2011) TPS1 terminator increases mRNA and protein yield in a Saccharomyces cerevisiae expression system. Biosci. Biotechnol. Biochem. 75, 2234-2236）。
【００７３】
３．各変異型DIT1ターミネーターのコンストラクトを野生型酵母W303-1aのゲノムに以下の手順でPDC6遺伝子座に挿入した。株の名前は、導入した変異型DIT1ターミネーターの種類に応じて名づけた。
【００７４】
３−１．宿主となる野生型酵母をYPD液体培地を用いて、30℃で対数増殖期（OD660=0.4〜0.6）まで培養し、Frozen-EZ Yeast Transformation IIキット（ZYMO RESEARCH社）で処理してコンピテントセルを調整した。
３−２．制限酵素ClaI、及びApaIを用いて、37℃で3時間以上反応して、断片化した。
３−３．コンピテントセル50uLに、断片化した各コンストラクトを50μg加え、PEGバッファーで希釈した。これを45分間加温し、形質転換した。
３−４．これらの形質転換酵母を洗浄後、滅菌水に懸濁して、トリプトファン選抜培地に塗布した。培地成分は、2% agar; 2% glucose; 0.67% Yeast Nitrogen Base without amino acids (YNB) (Difco, Detroit, MI); 0.082% Complete Supplement Mixture (CSM)-TRP （ForMedium, Norfolk, UK） and adenine (40 mg/L)。30℃で1昼夜静置培養して形質転換体のコロニーを得た。
３−５．得られたコロニーをそれぞれの選択培地で培養し、生育能を安定に保持している株を選択して、コロニーPCRを行い、目的遺伝子の導入を確認した。
【００７５】
４．NAB6-PAP1アッセイを行い、変異型DIT1ターミネーター株の活性を評価した。NAB6とPAP1は、DIT1ターミネーター活性化因子として以前に同定されており、これら２つの遺伝子が同経路でDIT1ターミネーターを活性化していることがわかっている（特許文献１）。活性化機構としては、NAB6もしくは他の因子がDIT1の3¢-UTRに含まれるcis配列AGＵＵCGと結合し、何らかの複合体を形成して、DIT1の3¢-UTRの上流の遺伝子コード領域のタンパク質の生産量を向上させると考えられる。したがって、NAB6及びPAP1をそれぞれ過剰発現させて、変異型DIT1ターミネーターを評価することにより、NAB6及びPAP1による活性化能を有する変異型DIT1ターミネーターを効率的に取得することができる。そこで、変異型DIT1t株において、NAB6及びPAP1の各遺伝子を過剰発現する遺伝子組換え体を作製し、GFP蛍光を指標として、変異型DIT1tの発現増強活性の変化を野生型の活性とを比較するNAB6-PAP1アッセイを行った。なお、NAB6-PAP1アッセイは、上記特許文献の段落００７４〜０１０３の記載に準じて行った。
【００７６】
４−１．LEU2栄養要求性マーカーとして持つ、多コピー型ベクターpGP564（Thermo Fisher Scientific Inc）のBamHI、XhoI部位の間に、NAB6 (開始コドン-391から+3952)、PAP1（開始コドン-509から+2149）を挿入したプラスミドpGP564-NAB6とpGP564-PAP1、及びpGP564-NAB6のSpeI部位の間にPAP1（開始コドン-509から+2149）を挿入したプラスミドpGP564-NAB6-PAP1を作製した。
【００７７】
４−２．宿主となる変異型DIT1t株をYPD液体培地を用いて、30℃で対数増殖期（OD660=0.4〜0.6）まで培養し、Frozen-EZ Yeast Transformation IIキット（ZYMO RESEARCH社）で処理してコンピテントセルを調製した。
【００７８】
４−３．変異型DIT1t株のコンピテントセル50uLに、4種類のプラスミド（コントロール株：pGP564、NAB6株：pGP564-NAB6、PAP1株：pGP564-PAP1、NAB6+PAP1株：pGP564-NAB6-PAP1）を100ｎg加え、PEGバッファーで希釈した。これらを45分間加温し、形質転換した。3塩基欠失の変異型DIT1t株のd7〜d21株に関しては、3種類のプラスミド（コントロール株：pGP564、NAB6株：pGP564-NAB6、PAP1株：pGP564-PAP1）を導入し、1塩基変異の変異型DIT1t株m1〜m30及び複合変異型DIT1t株d22、d23株に関しては、4種類のプラスミドを導入した株を、それぞれ作製した。
【００７９】
４−４．これらの形質転換酵母を洗浄後、滅菌水に懸濁して、ロイシン選抜培地に塗布した。培地成分は、2% agar; 2% glucose; 0.67% Yeast Nitrogen Base without amino acids (YNB) (Difco, Detroit, MI); 0.082% Complete Supplement Mixture (CSM)-LEU （ForMedium, Norfolk, UK） and adenine (40 mg/L)。30℃で1昼夜静置培養して形質転換体のコロニーを得た。
【００８０】
４−５．V字底の96穴ディープウェル・プレート（Corning社、3960）の各ウェルにロイシン選抜液体培地（上記培地成分から2% agarを抜いたもの）を500μl分注し、変異型DIT1tコントロール株、変異型DIT1t NAB6株、変異型DIT1t PAP1株、変異型DIT1t NAB6+PAP1株のそれぞれを各４連で植菌した。各ディープウェル・プレートには、基準となる野生型DIT1tのコントロール株、NAB6株、PAP1株、NAB6+PAP1株のそれぞれを各４連で植菌した。
【００８１】
４−６．プレートに通気性シール（BIO-BIK社 BF-400）を貼り、振とう培養器（タイテック社 MBR-022UP）を用いて、30℃、180rpmで終夜培養し、前培養とした。
【００８２】
４−７．新しい96穴ディープウェル・プレートの各ウェルにロイシン選抜液体培地を500μlずつ分注し、前培養液10μlを植菌し、通気性シールを貼って、同様の条件で6時間培養した。
【００８３】
４−８．フローサイトメーター（FCM、Beckman Coulter社CELL LAB QUANTA SC）を用いて、510/10のフィルターセットを用い、波長488nmのレーザーで酵母菌体内のGFPタンパク質の蛍光を励起し、その蛍光強度を測定した。データは、Igor Pro（WaveMetrix社）で解析した。3塩基欠失の変異型DIT1t株についての結果を図３に示し、飽和変異による変異型DIT1t株についての結果を図４に示し、有効な３塩基欠失変異及び飽和変異によるほか、２種類の複合変異による変異型DIT1t株とを含む変異型DIT1t株についての結果を図５に示す。
【００８４】
４−９．図３に示すように、d7株とd21株が野生型よりも活性が若干高かった。また、図４に示すように、1塩基変異の変異型DIT1t株についてはm22株の活性が若干高い値を示した。また、図５に示すように、d7株、d21株、ｍ22株、d22株及びd23株を野生型DIT1tよりも高い活性を有する変異型DIT1tの候補とした。
【実施例２】
【００８５】
本実施例では、変異型DIT1tの活性を評価した。すなわち、実施例１で選抜された変異型DIT1tの候補について、以下の手順で対数増殖期から定常期までの活性（ＧＦＰ蛍光強度）の変化を実施例１と同様にして経時的に調べた。なお、対数増殖期から定常期までの培養については常法にて行った。また、対照として野生型DIT1t株のほか、PGK1t株を用いた。結果を図６に示す。なお、図６においては、PGK1t株の活性を１とした相対活性で各変異型株の活性を表す。
【００８６】
図６に示すように、調べた各時点において、候補となった全ての変異型DIT1t株は、野生型と比較して、高い活性を示すことが判明した。特に、d22株及びd23株は、定常期において、通常用いられているPGK1ターミネーターやCYC1ターミネーターの最大4倍以上、既存の技術で最高活性を有する野生型DIT1ターミネーターの最大1.5倍の活性を有することが判明した。また、定常期にd23株はd22株と比較して、若干、活性が落ちることが観察された。いずれの時点においても、d22株が最も高い活性を示した。
【実施例３】
【００８７】
本実施例では、実施例１で作製した変異型DIT1t−d22株のためのコンストラクトを実施例１及び２とは異なる親株に導入して、親株の違いによる影響を確認した。本実施例では、親株として、一倍体酵母であるYPH499株を用い、実施例１と同様の手順で遺伝子組換えを行い、YPH499株について野生型DIT1t株と変異型DIT1t-d22株とを作製して、実施例１と同様の手順でターミネーター活性を評価した。結果を図７に示す。
【００８８】
図７に示すように、ＹＰＨ株においても、DIT1t-d22株（YPH）は、野生型DIT1t株に対して高いターミネーター活性を呈した。以上のことから、変異型DIT1tは、親株にかかわらず高いターミネーター活性を発現することがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【００８９】
配列番号２〜５４：変異型DIT1ターミネーター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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