(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルのレーザ・アブレーション用のアブレーション・セル（１）を作動させる方法であって、
前記アブレーション・セル（１）は、
キャリア・ガス（Ｇ１）をフロー・チャネル（１１）に供給するための入口（１２）と、出口（１３）とを有するフロー・チャネル（１１）と、
該フロー・チャネル（１１）の第１の壁部（１５）における横向き開口（１４）と、
該フロー・チャネルの第２の壁部（１７）に配置され、該横向き開口（１４）と対向する横向きウィンドウ（１６）と、
該横向き開口（１４）に隣接するサンプル・チャンバ（２１）であって、レーザ・ビーム（４１）が該横向きウィンドウ（１６）と該横向き開口（１４）とを通過して該サンプル・チャンバ（２１）に入りサンプル（２３）の表面（２４）に衝突することが可能である様式で該サンプル（２３）を受け取るように構成されており、シース・ガス（Ｇ２）を該サンプル・チャンバに供給するための入口（２２）を有するサンプル・チャンバ（２１）と、を備え、
前記方法は、
サンプル（２３）を、該サンプルの表面（２４）が前記横向き開口（１４）を向くように、前記サンプル・チャンバ（２１）に配置するステップと、
前記フロー・チャネル（１１）の前記入口（１２）に、キャリア・ガス（Ｇ１）を供給するステップと、
前記サンプル・チャンバ（２１）の前記入口（２２）に、シース・ガス（Ｇ２）を供給するステップと、
前記横向きウィンドウ（１６）と前記横向き開口（１４）とを通過させて、該表面（２４）の上に、パルス・レーザ・ビーム（４１）を照射することによって、該表面（２４）から物質をアブレートするステップと、
前記表面（２４）上で前記レーザ・ビーム（４１）を走査するステップと、
前記表面（２４）の化学的イメージを取得するために、得られたエアロゾルを分析するステップと、
を、必ずしも上記順序とは限らずに含み、
前記サンプル（２３）が、生体サンプルである、方法。
【請求項２】
前記サンプルが、人間もしくは動物の組織の組織サンプル、固定化細胞の単分子層、またはバイオフィルムである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記パルス・レーザ・ビーム（４１）の各パルスが、擬似瞬間的なレーザ生成エアロゾルの質量分布（２５）を生じさせ、前記サンプル（２３）が、前記フロー・チャネル（１１）から、前記レーザ生成質量分布（２５）が前記フロー・チャネル（１１）の内部において前記横向き開口（１４）と前記横向きウィンドウ（１６）との間にその中心を有するような距離に配置される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプル（２３）が、前記サンプル（２３）の前記表面（２４）が前記フロー・チャネル（１１）の前記中心から０．５ミリメートル〜４．５ミリメートルの範囲の距離を有するように配置される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記キャリア・ガス（Ｇ１）が第１の粘度を有し、前記シース・ガス（Ｇ２）が前記第１の粘度よりも低い第２の粘度を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記一次的なキャリア・ガス（Ｇ１）がアルゴンであり、前記二次的なキャリア・ガス（Ｇ２）が少なくとも５０％のヘリウムを含むガスである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記一次的なガス（Ｇ１）は、前記フロー・チャネル（１１）の前記入口（１２）に、第１の体積流量で供給され、
前記二次的なガス（Ｇ２）は、前記サンプル・チャンバ（２１）の前記入口（２２）に、第２の体積流量で供給され、
前記第２の体積流量は前記第１の体積流量の０．３〜１．０倍である、
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
サンプル物質のレーザ・アブレーション用のアブレーション・セル（１）であって、
キャリア・ガス（Ｇ１）をフロー・チャネル（１１）に供給するための入口（１２）と、出口（１３）とを有するフロー・チャネル（１１）と、
該フロー・チャネル（１１）の第１の壁部（１５）における横向き開口（１４）と、
該フロー・チャネルの第２の壁部（１７）に配置され、該横向き開口（１４）と対向する横向きウィンドウ（１６）と、
該横向き開口（１４）に隣接するサンプル・チャンバ（２１）であって、レーザ・ビーム（４１）が該横向きウィンドウ（１６）と該横向き開口（１４）とを通過して該サンプル・チャンバ（２１）に入りサンプル（２３）の表面（２４）に衝突することが可能である様式で該サンプル（２３）を受け取るように構成されており、シース・ガス（Ｇ２）を該サンプル・チャンバに供給するための入口（２２）を有し、該横向き開口の断面積は約２０ｍｍ２以下である、サンプル・チャンバ（２１）と、
を備えるアブレーション・セル（１）。
【請求項９】
キャリア・ガス（Ｇ１）をフロー・チャネル（１１）に供給するための入口（１２）と、出口（１３）とを有するフロー・チャネル（１１）と、
該フロー・チャネル（１１）の第１の壁部（１５）における横向き開口（１４）と、
該フロー・チャネルの第２の壁部（１７）に配置され、該横向き開口（１４）と対向する横向きウィンドウ（１６）と、
該横向き開口（１４）に隣接するサンプル・チャンバ（２１）であって、レーザ・ビーム（４１）が該横向きウィンドウ（１６）と該横向き開口（１４）とを通過して該サンプル・チャンバ（２１）に入りサンプル（２３）の表面（２４）に衝突することが可能である様式で該サンプル（２３）を受け取るように構成されており、シース・ガス（Ｇ２）を該サンプル・チャンバに供給するための入口（２２）を有するサンプル・チャンバ（２１）と、
を備えるアブレーション・セル（１）と、
ＩＣＰトーチ（６）と、
該アブレーション・セルを該ＩＣＰトーチ（６）に接続する管（６１）であって、該アブレーション・セル（１）の前記フロー・チャネル（１１）の断面積とほぼ等しい断面積、または、該アブレーション・セル（１）の前記フロー・チャネル（１１）の該断面積に対し、断面のどのような変動も該フロー・チャネルと該管とを通過する層流を著しく妨げることがない程度にのみ僅かに変化する断面積を有する管（６１）と、
を備えるＩＣＰイオン源。
【請求項１０】
前記フロー・チャネルが、本質的に一定である断面積、または、断面のどのような変動も前記フロー・チャネルを通過する層流を有意に妨げることがない程度にのみ僅かに変動する断面積を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法、請求項８に記載のアブレーション・セル、または請求項９に記載のＩＣＰイオン源。
【請求項１１】
前記フロー・チャネルの前記入口（１２）と前記出口（１３）とが、１６０度から２００度までの角度を含むように方向付けられている、請求項１から７または１０に記載の方法、請求項８または１０に記載のアブレーション・セル、または請求項９または１０に記載のＩＣＰイオン源。
【請求項１２】
前記フロー・チャネル（１１）と前記サンプル・チャンバ（２１）とは分離壁によって分離されており、該分離壁が、該フロー・チャネル（１１）の前記第１の壁部（１５）を形成し、５００マイクロメートル未満、好ましくは２００マイクロメートル未満の最小厚（ｗ）を有する、請求項１から７、１０、または１１のいずれか一項に記載の方法、請求項８、１０、または１１に記載のアブレーション・セル、または請求項９から１１のいずれか一項に記載のＩＣＰイオン源。
【請求項１３】
前記フロー・チャネル（１１）を収容するセル・トップ（１０）と、前記サンプル・チャンバ（２１）を形成するセル・ボトム（２０）とを備えており、該セル・ボトム（２０）が、前記サンプル（２３）を交換するために、該セル・トップ（１０）から取り外し可能である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法、請求項８、または１０から１２のいずれか一項に記載のアブレーション・セル、または請求項９から１２のいずれか一項に記載のＩＣＰイオン源。
【請求項１４】
請求項８または１０から１３のいずれか一項に記載のアブレーション・セル（１）と、
レーザ・ビーム（４１）を、前記横向きウィンドウ（１６）と前記横向き開口（１４）とを通過させて、前記サンプル（２３）に放射するレーザ（４）と、
該サンプル（２３）と該レーザ・ビーム（４１）との間の相対位置を変更するための位置決めデバイス（５）と、
を備えるアブレーション装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、たとえば生体物質のイメージングのための、レーザ・アブレーション・セルと、アブレーション装置およびそのようなレーザ・アブレーション・セルを用いた誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）イオン源と、そのようなレーザ・アブレーション・セルを用いる方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰＭＳ）は、産業的、地質学的、環境的、および生体的サンプルの多量、少量、微量、および超微量元素に関する正確な定量的情報を提供する。ＩＣＰＭＳでは、エアロゾル・サンプルが、キャリア・ガス・ストリームによって、いわゆるＩＣＰトーチに運ばれる。このトーチにおいて、ガスが強く高周波の電磁場にさらされ、結果的に、誘導によってプラズマが形成される。イオンが、プラズマから質量分析計の中に抽出され、そこで、イオンの質量対電荷比に基づいて、分離される。
【０００３】
ＩＣＰＭＳは、固体サンプルから物質をアブレートして（ａｂｌａｔｅ）ＩＣＰに要求されるエアロゾルを生成するために、レーザ・アブレーション（ＬＡ）と連結させることが可能である。アブレーションはＩＣＰトーチにおいて直接的に実行されることがあり得るし、または、サンプルをＩＣＰトーチの上流にある外部のレーザ・アブレーション・セルに配置することもあり得、レーザ・アブレーションによって生成されたエアロゾルは、キャリア・ガス・ストリームによってＩＣＰトーチに輸送される。たとえば、参考文献１は、エアロゾル排出方向がキャリア・ガスの排出方向と平行であるレーザ・アブレーション・セル（いわゆるＨＥＡＤセル）について説明していた。参考文献２では、類似の原理に基づく別のレーザ・アブレーション・セル・デザインについて、説明されている。
【０００４】
１９９０年代の前半以来、サンプルの表面上でレーザ・スポットを走査することによって、レーザ・アブレーションＩＣＰＭＳ（ＬＡ−ＩＣＰＭＳ）を化学的イメージング・ツールとして用いる試みがなされてきた。多くの研究が、相当に多様な硬質および軟質のサンプルに基づいて、ＬＡ−ＩＣＰＭＳの潜在的なイメージング能力について、説明してきている。これらの研究のほとんどは、約５〜１００μｍの有効空間解像度を示した。ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳは、単細胞における抗原発現の高度に多重化された定量分析を提供するが、現時点では、組織サンプル内部の単細胞のイメージングに必要な解像度に不足している。
【０００５】
しかし、組織切片の診断分析などのいくつかの応用例は、たとえば細胞間の可変性を視覚化するために、さらに高い空間解像度を要求する。有効空間解像度は、レーザ・スポット・サイズとシステム分散とのたたみ込みによって決定される。システム分散は、一方で、多くの場合、各レーザ・ショットの後のエアロゾル・ウォッシュアウト時間と走査速度との妥協によって、支配される。ウォッシュアウト時間が長くなれば、それだけますます、走査速度が一定に保たれる場合には、隣接するサンプル・スポットから生じる信号の間で、より多くの重複が生じる。したがって、エアロゾル・ウォッシュアウト時間は、多くの場合、全体的な走査時間を増加させることなく解像度を改善するための、キーとなる制限因子の１つである。
【０００６】
最速のウォッシュアウト時間は、数ミリ秒のシングルショット信号継続時間を結果的に生じさせるイントーチ・アブレーションによって達成され得る。しかし、イントーチ・アブレーションは非常に小さなサンプルに限定され、レーザ・スポットの走査は、イントーチ・アブレーションを用いる場合には、実現が非常に困難である。したがって、イメージングへの応用のためには、外部レーザ・アブレーション・セルが用いられるのが一般的である。しかし、最もよく知られたセル・デザインを用いたとしても、ウォッシュアウト時間は、多くの場合、秒のスケールであり、１００ミリ秒未満の短いウォッシュアウト時間は達成するのが難しい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、組織サンプル、細胞の単一層およびバイオフィルムなどの生体物質のイメージングのための技術における用途を有する、さらなる改善されたレーザ・アブレーション・セルと（たとえば、ＩＣＰ−ＭＳにリンクされた）そのようなセルを組み入れているアブレーション装置とを提供すること、特に、単一細胞イメージング技術として用いるようにＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳを適合させることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様では、本発明は、短いエアロゾル・ウォッシュアウト時間を達成する潜在性を有するレーザ・アブレーション・セルを提供する。そのようなレーザ・アブレーション・セルは、請求項１において特定されている。本発明のさらなる実施形態は、従属請求項において規定されている。
【０００９】
したがって、キャリア・ガスをこのフロー・チャネルに供給するための入口、および出口を有するフロー・チャネルを備えるレーザ・アブレーション・セルが、提供される。横向き開口が、フロー・チャネルの第１の壁部に提供され、横向きウィンドウが、フロー・チャネルの第２の壁部に、横向き開口と対向するように配置されている。サンプル・チャンバが、横向き開口に隣接して、提供される。サンプル・チャンバは、レーザ・ビームが横向きウィンドウと横向き開口とを通過してサンプル・チャンバに入りサンプルの表面に衝突することが可能である様式でサンプルを受け取るように構成されており、それにより、サンプル表面から物質をアブレートしてエアロゾルを生じさせる。サンプル・チャンバは、シース・ガスをサンプル・チャンバに供給するための入口を有する。
【００１０】
フロー・チャネルの入口と出口とは、フロー・チャネル自体と本質的に同じ断面積を有する管（ｔｕｂｉｎｇ）に接続され得る。このようにして、フロー・チャネルは、本質的に、単一の管として作用する。本発明のアブレーション・セルは、したがって、「チューブ・セル」のデザインを有すると考えられ得る。フロー・チャネルの断面積の変動を（好ましくは、断面の形状の変動も）最小化することにより、この「チューブ・セル」のデザインがフロー・チャネルにおける本質的に層流パターンを維持することを可能にして、可能な限り乱流を回避する。さらに、このデザインが、サンプルのフロー・チャネルに充分に近い配置を可能にすることにより、レーザによって誘導されるエアロゾルのプルームの大半の割合が、キャリア・ガスの流れの中に直接的に導かれる。これらの方策により、分散を著しく低減される。実際には、本発明によるセル・デザインにより、ウォッシュアウト時間を３０ミリ秒（１％の最大値での全幅）未満に縮小することが可能になり、サンプルのウォッシュアウトのテーリングを最小化することが可能になる。この改善は、原子質量の全範囲にわたる元素について観測される。
【００１１】
フロー・チャネルは、好ましくは、ほぼ一定である断面積を有する、または、高々僅かに変動する断面積を有する。特に、好ましくは、フロー・チャネルの断面積は、横向き開口の近傍において、ほぼ一定である。フロー・チャネルの断面積は、断面のどのような変動も層流を著しく妨げることがない場合に、最大でも僅かに変動すると見なされ得る。特に、この断面積は、フロー・チャネルに沿った任意の断面について、フロー・チャネルの平均の直径の変動が管軸に沿った１ｍｍの長さ当たり１．５ｍｍよりも小さい場合に、最大でも僅かに変動すると考えられ得るのであるが、これは、好ましくは、管軸に沿った１ｍｍの長さ当たり０．５ｍｍ未満である場合にそうであり、より好ましくは、管軸に沿った１ｍｍの長さ当たり０．２ｍｍ未満である場合にそうである。フロー・チャネルは、ベンチュリ管におけるように、明白な吸引効果を回避するため、横向き開口における明白な収縮を形成しないこと、そして、結果的に生じる正の圧力差によってキャリア・ガスがサンプル・チャンバの中に押し込まれることを回避するため、横向き開口の近傍において著しく幅が拡大しないことが、好ましい。
【００１２】
絶対数では、断面積は、レーザ・スポット・サイズとレーザ・エネルギとに応じて、広い範囲の値を取り得る。フロー・チャネルの平均の直径（Ａを断面積として、ｄ＝２（Ａ／π）１／２として計算される）は、たとえば、５０マイクロメートルから５ミリメートルまで、好ましくは、２００マイクロメートルから５ミリメートルまでの範囲を有し得る。
【００１３】
フロー・チャネルの入口と出口との間の角度は、好ましくは少なくとも１６０度（正確には、１６０度から２００度までの間）であり、より好ましくは少なくとも１７０度（正確には、１７０度から１９０度までの間）である。換言すると、フロー・チャネルは、好ましくは、ほぼ直線的であるか、または、２０度を超えない角度で、もしくは、よりよくは１０度を超えない角度で、いずれかの方向に曲げられている。シース・ガスの入口は、フロー・チャネルの方向に対して、任意の方向に選択され得る。好ましくは、シース・ガスの入口は、横方向に対して垂直に延長する。
【００１４】
フロー・チャネルとサンプル・チャンバとは分離壁によって分離されており、この分離壁が、横向き開口が配置されているフロー・チャネルの第１の壁部を形成する。サンプルがフロー・チャネルの充分近くに配置されることを可能にするために、分離壁は、好ましくは最小の厚さ（最小厚）が５００マイクロメートル未満であり、より好ましくは最小厚が２００マイクロメートル未満である。分離壁の厚さはフロー・チャネルの円周に沿って変動し得ることに注意すべきであるが、分離壁は、通常、その最小厚を管とサンプル・チャンバとの間の開口に直ちに隣接して有し、その最小厚は、管軸に垂直な平面において開口から遠ざかる方向で増加する。その最小厚は、フロー・チャネルの長さに沿って、さらに変動し得る。
【００１５】
横向き開口によって誘導されるフローの乱れを最小化するために、この開口の断面積は小さく維持されるべきである。他方で、開口と相対的にサンプルを移動させることなくレーザ・ビームがサンプル表面で走査されることを可能にするのに充分である程度に開口を大きくことが、望まれ得る。妥協として、横向き開口の断面積は、好ましくは約２０ｍｍ２以下、より好ましくは約７ｍｍ２以下である。フロー・チャネルの断面積との関係で表されると、開口とフロー・チャネルとの断面積の比率は、好ましくは約５以下、より好ましくは約３以下、最も好ましくは約１以下である。レーザ・ビームが横向き開口を通過することを可能にするためには、横向き開口は、好ましくは少なくとも約０．０１ｍｍ２の断面積を有する。フロー・チャネルに対して横断方向の横向き開口の幅は、好ましくはフロー・チャネルの平均直径の８０％未満、より好ましくはフロー・チャネルの平均直径の５０％未満である。フロー・チャネルの方向の横向き開口の長さは、好ましくはフロー・チャネルの平均直径の５倍以下、より好ましくはフロー・チャネルの直径の３倍以下または１．５倍以下でもある。
【００１６】
容易なサンプル交換を可能にするために、レーザ・アブレーション・セルは、好ましくは、フロー・チャネルを収納する第１のセル部分（以下では、「セル・トップ」と称される）と、サンプル・チャンバを形成する第２のセル部分（以下では、「セル・ボトム」と称される）とを備える２つの部分から構成されるデザインを有する。セル・ボトムは、好ましくは、サンプルを交換するために、セル・トップから取り外し可能である。セル・ボトムは、好ましくは、セル・トップに向けて開放されており、すなわち、サンプル・チャンバとフロー・チャネルとの間の分離壁は、好ましくは、セル・ボトムによってではなく、むしろセル・トップによって形成される。「トップ」および「ボトム」という用語は、これらの部分の絶対的な向きを定義しないものとして、理解されるべきであり、これらの用語は、単に、異なるセル部分の間をよりよく区別するために用いられているのであり、レーザ・アブレーション・セルを、セル・トップが床の方向を指しておりセル・ボトムが天井の方向を指しているような反転された向きでも同様に用いられ得る。
【００１７】
本発明は、さらに、上述したアブレーション・セルを備えた完全なアブレーション装置に関する。このアブレーション装置は、さらに、レーザ・ビームを、横向きウィンドウと横向き開口とを通過させて、サンプル表面上に放射するレーザ、特にＵＶレーザと、サンプルとレーザ・ビームとの間の相対位置を変更するための位置決めデバイスとを備える。この位置決めデバイスは、たとえば、レーザ・アブレーション・セル全体をレーザに対して移動させるためのｘ−ｙまたはｘ−ｙ−ｚステージ、アブレーション・セルとレーザとの間の相対的位置を固定された状態に維持しながら、レーザ・アブレーション・セル内部でサンプルを移動させるためのｘ−ｙまたはｘ−ｙ−ｚステージ、アブレーション・セルとレーザとの間の相対的位置を固定された状態に維持しながら、レーザ・ビームを偏向させるビーム偏向器などのいずれかを備え得る。この位置決めデバイスは、サンプル表面上でレーザ・ビームを走査するのに用いられ得る。結果的に生じるエアロゾルは、たとえばＩＣＰＭＳによって、その元素的または同位体的な組成に関して、後で分析され得る。このようにして、サンプル表面は、その元素的または同位体的組成にしたがって、画像化され得る。しかし、本発明は、ＩＣＰＭＳイメージングに関係するアブレーション・セルの使用に限定されることはなく、短いエアロゾル・パルスが要求される他の方法においても用いられ得る。
【００１８】
本発明は、さらに、上述したアブレーション・セルを備えたＩＣＰイオン源を提供する。このＩＣＰ源は、さらに、アブレーション・セルの出口に接続されたＩＣＰトーチと、前記アブレーション・セルをＩＣＰトーチに接続する管とを備える。好ましくは、この管は、アブレーション・セルのフロー・チャネルの断面積とほぼ等しい断面積を有する、または、フロー・チャネルの断面積と比較すると、ごく僅かに変化するだけであり、よって、管の長さ全体にわたって最小の分散で層流を維持するようになっている。
【００１９】
本発明は、また、そのようなＩＣＰイオン源とそのイオン源に結合された質量分析計とを備えたＩＣＰＭＳシステムも包含する。質量分析計は、たとえば、四重極質量分析計、飛行時間（ＴＯＰ）質量分析計、または磁場セクタ質量分析計、特に、マッタウフ・ヘルツォーク質量分析計であり得る。しかし、本発明は、どの特定のタイプの質量分析計にも限定されない。
【００２０】
本発明は、さらに、上述したアブレーション・セルを動作させる方法を提供する。この方法は、
サンプルを、サンプルの表面が横向き開口を向くように、サンプル・チャンバに配置するステップと、
フロー・チャネルの入口に、キャリア・ガスを供給するステップと、
サンプル・チャンバの入口に、シース・ガスを供給するステップと、
横向きウィンドウと横向き開口とを通過させて、前記表面の上に、パルス・レーザ・ビームを照射することによって、表面から物質をアブレートするステップと、
を、必ずしも上記順序とは限らずに含む。
【００２１】
レーザ・ビームの方向、横向きウィンドウおよび横向き開口の向き、結果的にサンプルの向きは、空間的に任意であり得る。たとえば、レーザ・ビームは、上向き、下向き、横向きなどであり得るし、サンプル表面は、レーザ・ビームがサンプル表面に到達することを可能にするいずれかの向きに方向付けられ得る。
【００２２】
各レーザ・パルスは、擬似瞬間的なレーザ生成エアロゾルの質量分布（プルーム）を生じさせる。本明細書では、「擬似瞬間的」とは、キャリア・ガス・ストリームおよびシース・ガス・ストリームによる質量輸送の時間スケールよりもはるかに短い時間スケールを意味する。レーザ生成エアロゾル質量分布は、レーザ・パルスの作用のみによって生じるのであって、キャリアおよびシース・ガスの通常のガス流は無視される。この質量分布は、レーザ・パルスとサンプルとの最初の相互作用から１ミリ秒未満の間に確立される。サンプルは、好ましくは、フロー・チャネルから、レーザ生成質量分布がフロー・チャネルの内部において横向き開口と横向きウィンドウとの間にその中心を有するような距離に配置される。質量分布の中心は、剛体の重心と同じように、エアロゾル・プルーム全体にわたって積分を行う通常の態様で定義される。このように、エアロゾル・プルームの大半は、キャリア・ガスのストリームの中に直接に注入され、キャリア・ガスのストリームによって、最小の分散で、輸送され得る。
【００２３】
サンプル表面とフロー・チャネルの中心軸との最適な距離は、レーザのタイプ、レーザ・ビームのエネルギ、キャリアおよびシース・ガスのタイプ、ならびにこれらのガスの流量に依存する。たとえば、ナノ秒の範囲にあるパルスを用いる標準的なＡｒＦエキシマ・レーザ、キャリア・ガスとして流量が１．１Ｌ／分であるアルゴン、およびシース・ガスとして流量が０．６Ｌ／分であるヘリウムの場合には、約２ｍｍの距離が最適ということが判明している。より一般的な用語では、サンプルは、好ましくは、５０フェムト秒から５０ナノ秒の範囲にあるレーザ・パルスに対し、サンプルの表面のフロー・チャネルの中心軸からの距離が０．５ミリメートルから４．５ミリメートルの範囲にあるように、配置されるべきである。
【００２４】
結果的には、サンプル表面と、サンプル・チャンバをフロー・チャネルから分離する分離壁との最適な距離は、様々なパラメータに依存することになる。この距離は、５０マイクロメートル未満から１ミリメートル以上までの範囲であり得る。この距離は、シース・ガスが、サンプルの表面に沿って流れ、横向き開口を通過してフロー・チャネルの中に至ることを可能にするのに充分な程度に大きくあるべきである。
【００２５】
シース・ガスは、次の少なくとも３つのタスクを満たす。すなわち、シース・ガスは、エアロゾルの注入方向と一致する方向にエアロゾルを流すことにより、エアロゾル粒子のキャリア・ガスへの取り込みを助けること、シース・ガスは、サンプル表面の上方に「保護領域」を形成し、制御された雰囲気の下でアブレーションが実行されることを保証すること、およびシース・ガスは、フロー・チャネルのフロー速度を増加させることである。好ましくは、シース・ガスの粘度は、一次的なキャリア・ガスの粘度よりも低い。これは、エアロゾルがフロー・チャネルの中心に制限され、アブレーション・セルよりも下流におけるエアロゾルの分散が最小化されることに役立つ。特に、キャリア・ガスは、好ましくはアルゴン（Ａｒ）である。アルゴンは、エアロゾルがフロー・チャネルの壁に到達する前にエアロゾルの膨張を停止させるのに特に適しているのであるが、このことは、Ａｒガス・ベースのＩＣＰのほとんどにおいて、器具の感度を向上させるために、要求される。シース・ガスは、好ましくはヘリウム（Ｈｅ）である。しかし、シース・ガスは、たとえば水素、窒素または水蒸気などの他のガスによって置き換えられ得る、または、それらの他のガスを含み得る。好ましくは、シース・ガスの主要な割合、たとえば、体積の少なくとも５０％はヘリウムである。摂氏２５度では、Ａｒは２２．６μＰａｓの粘度を有し、他方で、Ｈｅは１９．８μＰａｓの粘度を有する。
【００２６】
キャリア・ガスとシース・ガスとの最適な流量は、様々な因子に依存することになるのであるが、まず第１に幾何学的要素、特にフロー・チャネルの断面積に依存する。第２に、最適な流量は、横向き開口の幾何学的要素に依存することになる。しかし、シース・ガスの体積流量はキャリア・ガスの体積流量よりも小さいこと、特に、キャリア・ガスの体積流量の０．３〜１．０倍であることが好ましい。シース・ガスの流量は、エアロゾル・プルームの中心をフロー・チャネルの中心に近く注入するのに役立つように調整され得る。
【００２７】
本発明の方法は、特に、化学的イメージングに適している。この目的のために、本発明の方法は、表面上でレーザ・ビームを走査するステップと、サンプル表面の化学的イメージを取得するために結果的に生じるエアロゾルを分析するステップとを含み得る。分析は、質量分析、特にＩＣＰＭＳによって実行され得るが、どのような他の適切な方法によって実行されることもあり得る。
【００２８】
この方法は、生体サンプル、特に、人間または動物の組織の組織サンプルの調査に、非常に適している。しかし、この方法は、生体サンプルに限定されることはなく、他の種類のサンプルにも同様に適用され得る。生体サンプルに関して実行されるときには、本発明の方法は、亜細胞レベル、細胞レベル、または、ある組織内部の個別の細胞が個別的には解像されない、より低い解像度で、実行され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
本発明の好適な実施形態が、図面を参照して、以下で説明されるのであるが、図面は、本発明の現在の好適な実施形態を図解する目的を有しているのであって、本発明を限定する目的は有していない。図面は、次の通りである。
【図１】本発明によるレーザ・アブレーション・セルの全体像を示す概略図（縮尺通りではない）である。
【図２】図１のレーザ・アブレーション・セルの長軸方向の中心断面を示す概略図（縮尺通りではない）である。
【図３】レーザ・アブレーション・セルにおけるレーザによって生成されたプルームを示す概略図（縮尺通りではない）である。
【図４】レーザ・アブレーション・セルのフロー・チャネルにおけるガス流に対するシミュレート結果の概略的な図解であり、部分（ａ）はＨｅとＡｒとの間の混合分布パターンを示し、アブレートされたエアロゾルが横向き開口の上方の混合インターフェースに存在し、混合の程度が、白が最高の混合度を表すグレー・スケールで示されており、部分（ｂ）は、シミュレートされたガス流の速度パターンを示し、流速がグレー・スケールで示されており、白が最高の流速を表す。
【図５】図１のレーザ・アブレーション・セルを用いたＬＡ−ＩＣＰＭＳシステムの全体の非常に概略的な図解である。
【図６】（ａ）は、サンプル表面と横向き開口との間のギャップ間隔を変動させることによる、（ｂ）は、キャリア・ガス（Ａｒ）の流量を変動させることによる、（ｃ）は、シース・ガス（Ｈｅ）の流量を変動させることによる、レーザ・アブレーション・セルのパフォーマンスの最適化の結果の図解であって、ピーク幅は、１％の最大基準における幅全体に基づくピーク面積に正規化されている。
【図７】質量分析計における様々な反復率での２７Ａｌ強度によって示される、レーザ・アブレーション・セルのパフォーマンスの図解であり、（ａ）は、約１Ｈｚの反復率に対する過渡信号を、（ｂ）は、部分（ａ）のカッコが付された部分の拡大図であり、（ｃ）は、約１０Ｈｚの反復率に対する過渡信号を示し、（ｄ）は、約３０Ｈｚの反復率に対する過渡信号を示す。
【図８】様々な同位体に対するレーザ・アブレーション・セルの特徴付けの図解であり、（ａ）はピーク幅を示し、（ｂ）はピーク面積から計算された、正規化されたアバンダンス感度を示している。
【図９】「ＥＴＨ」という文字の形状を有するＡｕフィルムと「ＰＳＩ」という文字の形状を有する積層されたＡｇフィルムとを有するＰｔコーティングされたテスト・パターンに対して取得された画像であって、（ａ）は光学顕微鏡によって、（ｂ）は走査式電子顕微鏡によって、（ｃ）および（ｄ）は、図１のレーザ・アブレーション・セルを用いたＬＡ−ＩＣＰ−四重極−ＭＳによってイメージングが実行された画像である。
【図１０】ＬＡ−ＩＣＰ−単一検出器磁場セクタ−ＭＳによって取得された、乳癌組織の薄切片内のヒト表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）の画像を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
レーザ・アブレーション・セル
図１および図２は、本発明の例示的な実施形態によるレーザ・アブレーション・セル１を概略的に図解しており、レーザ・アブレーション・セル１は、以下では、「チューブ・セル」とも称される。アブレーション・セル１は、第１の部分であるセル・トップ１０と第２の部分であるセル・ボトム２０との２つの部分を備える。管状のフロー・チャネル１１は、セル・トップ１０に形成され、キャリア・ガス入口１２から混合ガス出口１３まで延長する。セル・トップ１０の底側の壁部１５には、横向き開口１４が形成されている。セル・トップ１０の上側の壁部１７には、横断方向の穴が形成されており、ＵＶ透過性のシリコン・ウィンドウ１６によって閉鎖されている。セル・ボトム２０には、サンプル・チャンバ２１が提供される。シース・ガス入口２２は、サンプル・チャンバ２１に通じている。シース・ガス入口２２はフロー・チャネル１１とは（逆）平行に延長するように示されているが、シース・ガス入口の方向は、任意に選択され得る。好ましくは、シース・ガス入口は、横断方向に対して垂直に延長する。サンプル２３はサンプル・チャンバ２１に配置され、サンプル２３の上側表面２４が横向き開口１４よりも下に位置するように、セル・ボトム２０がセル・トップ１０に取り付けられる。
【００３１】
アブレーション・セルを動作させるためには、キャリア・ガスＧ１がフロー・チャネル１１の入口１２に供給され、シース・ガスＧ２がサンプル・チャンバ２１の入口２２に供給される。ＵＶレーザ・ビーム４１が、ウィンドウ１６に入り、フロー・チャネル１１を横断し、横向き開口１４を通過してフロー・チャネル１１から出て、サンプル２３の上側表面２４に衝突する。
【００３２】
各レーザ・パルスが、図３に概略的に図解されているように、エアロゾル・プルーム２５を生成する。このプルームは、レーザ・パルスの作用の直接的結果であり、レーザ・パルスの終端の直後のプルームにおける初期質量分布は、キャリア・ガスＧ１及びシース・ガスＧ２の流れによって、非常に僅かにだけ影響される。レーザ・アブレーション・セル１のデザインにより、レーザによって生成されたエアロゾルの質量分布の中心が、シース・ガス・ストリームによってエアロゾルを最初にフロー・チャネルまで運ぶことを必要とせずに、ちょうどフロー・チャネルの中に配置されることが可能になる。キャリア・ガスＧ１とシース・ガスＧ２とは、次に、エアロゾルを出口１３に向けて運び、出口１３において、これらのガスは、混合ガス・ストリームＧ３として、アブレーション・セルを出る。
【００３３】
キャリア・ガスＧ１としては、アルゴン（Ａｒ）が好ましい。シース・ガスとしては、好ましくは、ヘリウム（Ｈｅ）が選択される。Ａｒは、純粋なＨｅ雰囲気において典型的に生じるエアロゾルの膨張を停止させるのに有益である。サンプル容器からＨｅを加えることは、３つの利点を有する。すなわち、ａ）この設定により、エアロゾルがエアロゾル注入方向の軸方向に流れるために、粒子の取り込みに役立ち、ｂ）Ｈｅガスは、サンプル表面の上方に「保護」領域を形成し、Ｈｅ雰囲気の下でアブレーションが行われることが保証され、ｃ）チューブ・セルにおいて既にＡｒとＨｅとを混合することにより、分散性のガス・アダプタ（Ａｒ／Ｈｅ混合バルブ）が不要になるだけでなく、キャリア・ガスとしてＨｅだけを用いる通常の設定と比較して流速とガス粘度とを増大させ、したがって、エアロゾルの分散を低下させる。
【００３４】
図４は、ＡＮＳＹＳ  ＣＦＸ１２ソフトウェア・パッケージ（ドイツのベルリン所在のＡＮＳＹＳ社）を用いて実行された計算流体力学的なシミュレーションの結果を示している。乱流のための剪断応力輸送モデルが考察された。シミュレーションは、次のパラメータに対して実行された。すなわち、横向き開口の長さ：Ｌ＝４．５ｍｍ、横向き開口の幅：１．５ｍｍ、底側の壁部の最小厚：ｗ＝５０マイクロメートル、フロー・チャネルの全長：５０ｍｍ、円筒形のサンプル・チャンバの直径：２３ｍｍ、サンプル２３の上側表面２４から底側壁部１５までの距離：ｄ＝３５０マイクロメートルである。入口におけるＡｒの流れは２．６ｍ／ｓ（１．１Ｌ／分）という一定速度に設定され、他方で、Ｈｅは１．４ｍ／ｓ（０．６Ｌ／分）を用いてシミュレートなされた。
【００３５】
２つの入口ガスの混合分布が、図４（ａ）に示されている。２つのガスの混合は、グレー・スケールで示されており、白が最高の混合度である。横向き開口１４において、ＨｅのフローがＡｒのフローの中に入ることにより、明確なインターフェースが形成される。ヘリウムが、開口領域を顕著に支配して、アルゴンと共に、境界層を形成する。横向き開口１４においては、２つのガスの混合度が最小であるために、そして、レーザによってアブレートされたエアロゾルはＨｅを容易に貫通するがＡｒについてはそうではないことを示す上述の結果により、エアロゾルはアルゴン雰囲気の中には拡散していないこと、したがって、フロー・チャネルの断面全体には到達しておらず、非常に稠密なままに留まっていることが推定され得る。当初は非常に明確であったインターフェースが、開口から数ミリメートル下流の間に、拡大する。注入されるガス流の組合せを変動させることによって、境界層の高さを、したがって、アブレートされたエアロゾルの高さを、制御することが可能である。
【００３６】
シミュレートされたガス流の速度分布が、図４（ｂ）に示されている。横向き開口１４の上流にあるＡｒが注入されたフローは、フロー・チャネルにおける典型的な層流分布を表しており、管の中心において最速のフローであり、管壁に向かって徐々に減速する。２つのガスの出現をシミュレートしても、著しい乱流は示されなかった。しかし、計算されたレイノルズ数（約２０００）は、層流から乱流への移行（２３００〜４０００）に近接している。しかし、乱流モデルを用いることにより、厳格な層流を示された。したがって、乱流の不存在により、そして、最高ガス速度に一致するチューブ・セルの中心に近接してレーザ・エアロゾルのための停止距離が定義されることにより、低いエアロゾルの分散が達成されるはずである、と結論付けることが可能である。
【００３７】
図５は、ＬＡ−ＩＣＰＭＳシステムの全体を概略的に図解している。レーザ・ビームは、レーザ４０によって生成される。レーザ・アブレーション・セル１は、レーザ・ビームに対するサンプルの位置を変更することを可能にするために、Ｘ−Ｙ−Ｚステージ５の上に配置される。レーザ・アブレーション・セル１の出口１３は、管６１によって、ＩＣＰトーチ６に接続されている。管６１は、排出されるガスＧ３の層流を保証するために、レーザ・アブレーション・セル１のフロー・チャネル１１とほぼ同じ内径を有する。ＩＣＰトーチは、ＲＦコイル６２の動作により、プラズマ源を生成するのであるが、これは、通常の態様で構築される。ＩＣＰトーチは、この技術分野で広く知られており、さらなる説明を必要としない。ＩＣＰトーチは、ＩＣＰ源７１を経由して、質量分析計７に接続される。質量分析計は、四重極質量分析計、飛行時間（ＴＯＦ）質量分析計、セクタ質量分析計などであり得る。
【００３８】
もちろん、レーザ・アブレーション・セルとＬＡ−ＩＣＰＭＳの設定とについては、本発明の範囲から逸脱することなく、多くの改変が可能である。特に、本発明は、レーザ・アブレーション・セルのための材料の特定の選択、サンプル・チャンバの特定の幾何学的要素またはサイズ、アブレーション・セルにおけるフロー・チャネルの特定の幾何学的要素、長さ、および直径、アブレーション・セルにおける横向き開口の特定の幾何学的要素およびサイズ、特定のウィンドウ・サイズまたは材料、アブレーションのためのレーザの特定のタイプ、アブレーション・セルに導入される特定のガスのタイプなどには限定されない。
【００３９】
ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳおよび質量サイトメトリ
本発明は、誘導結合プラズマ質量分析（ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳ）に結合可能なレーザ・アブレーション・セルに関するが、誘導結合プラズマ分析は、生体サンプルを画像化する場合に応用例を有する。よって、本発明は、（ｉ）本発明によるレーザ・アブレーション・セルと、（ｉｉ）質量分析計とを備えるＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳを提供する。ある応用例では、サンプルにおける異なる標的分子を、異なる標識原子を用いて標識することが可能であり、次に、ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳが、標識生体サンプルの複数の細胞にわたって用いられる。検出された信号をそれらの信号を生じさせたレーザ・アブレーション・セルにおけるレーザ・アブレーションの既知である位置とリンクさせることにより、この方法は、標識標的分子をサンプル上の特定の位置に局所化することを可能にし、よって、サンプルの画像の構築を可能にする。
【００４０】
ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳが、組織サンプルを、サンプルからアブレートされた物質のプルームを生成させるレーザ・パルスに当てることを含み、これらのプルームは、エアロゾルとして、分析のためにＩＣＰ−ＭＳ装置に輸送される。サンプルにおける標識原子は、ＭＳによって区別可能であり、したがって、それらを検出することによって、プルームにおける複数の標的の存在または不存在が明らかになる。
【００４１】
このようにして生成される信号の空間解像度は、（ｉ）信号はアブレートされる面積全体にわたって積分されるため、レーザのスポット・サイズ、および、（ｉｉ）連続するプルームからの信号の重なり合いを回避するために、プルームが生成される速度に対して、プルームを分析可能な速度という２つの主要な因子に依存する。
【００４２】
よって、個々の細胞を分析するために、これらの細胞よりも大きくないレーザ・スポット・サイズが用いられるべきであり、さらに詳しくは、亜細胞的な解像度を用いて物質をアブレートすることができるレーザ・スポット・サイズが用いられるべきである。このサイズは、サンプルにおける特定の細胞に依存することになるが、一般的には、レーザ・スポットは、たとえば、０．２〜４μｍ、０．２５〜３μｍ、または０．４〜２μｍの範囲内にある４μｍ未満の直径を有する。よって、レーザ・スポットは、約３μｍ、２μｍ、１μｍ、または０．５μｍの直径を有し得る。好適な実施形態では、レーザ・スポットの直径は、０．５〜１．５μｍの範囲内、または約１μｍである。小さなスポット・サイズは、より幅の広いレーザ・ビームの縮小と近視野光学装置とを用いることによって、達成され得る。１μｍのレーザ・スポットの直径は１μｍのレーザ焦点に対応するが、レーザ焦点は、レーザ・ビームをサンプル表面上に転送する対物レンズの数値アパーチャに起因して±２０％変動し得る。
【００４３】
組織サンプルの迅速な分析のためには、たとえば１０Ｈｚ以上（すなわち、毎秒１０回のアブレーションであり、これは、毎秒１０個のプルームを生じる）である高周波のアブレーションが必要とされる。好適な実施形態では、アブレーションの周波数は、１０〜２００Ｈｚの範囲内、１５〜１００Ｈｚの範囲内、または２０〜５０Ｈｚの範囲内にある。少なくとも２０Ｈｚのアブレーション周波数により、典型的な組織サンプルのイメージングを合理的な時間で達成することが可能になる。上述したように、これらの周波数では、装置は、連続的なアブレーションの間での実質的な信号の重なり合いを回避するのに充分な速度で、アブレートされた物質を分析できなければならない。連続的なプルームから生じる信号の間の重なり合いは、強度において１０％未満、より好ましくは５％未満、理想的には１％未満であることが好ましい。プルームの分析に要求される時間は、アブレーション・セルのウォッシュアウト時間、ＩＣＰへのおよびＩＣＰを通過するプルーム・エアロゾルの移動時間、およびイオン化された物質を分析するのに要する時間、に依存する。
【００４４】
長いウォッシュアウト時間を伴うセルは、画像が生成され得る速度を制限するか、または、連続的なサンプル・スポットから生じる信号間の重なり合いに至る（たとえば、１０秒超の信号継続時間を有した参考文献３を参照）。したがって、エアロゾルのウォッシュアウト時間は、走査時間全体を増加させることなく高い解像度を達成するための主要な制限因子である。本発明を用いると、最終画像において、空間的に解像された１ピクセル当たりで１００ｍｓ未満という時間を達成することが可能である。
【００４５】
プルーム・エアロゾルがＩＣＰに至りＩＣＰを通過する移動時間は、単にアブレーション・セルをＩＣＰの近傍に配置することによって、そして、エアロゾルを適切な速度で直接的にＩＣＰまで運ぶために充分なガス流を保証することによって、容易に達成される。アルゴンおよびヘリウムを用いて輸送することで、よい結果が提供される。
【００４６】
イオン化された物質を解析するのに要する時間は、イオンの検出のために用いられる質量分析計のタイプに依存することになる。たとえば、ファラデー・カップを用いた装置では、迅速な信号を分析するには遅すぎるのが一般的である。全体として、所望のイメージング速度（したがって、アブレーション周波数）、解像度（したがって、レーザ・スポット・サイズおよびアブレーション・セル）および多重化の程度が、用いられるべき質量分析計のタイプを決定することになる（または、逆に、質量分析計の選択が、達成可能な速度、解像度および多重化を決定することになる）。
【００４７】
たとえばポイント・イオン検出器を用いて一度にただ１つの質量対電荷比率（ｍ／Ｑであり、ＭＳでは、一般的にｍ／ｚと称される）を検出する質量分析装置は、複数の標識を用いた単細胞イメージングにおいて、劣悪な結果を生じる。第１に、複数の質量対電荷比率の間での切り換えに要する時間が、複数の信号が判断され得る速度を制限し、第２に、イオンが低量である場合には、その装置が他の質量対電荷比率に焦点を合わせるときに信号を逃してしまう可能性があり得るのである。このために、たとえ感度が高くても、四重極ベースの検出器は、複数の標識を用いたイメージングには適しておらず、その理由は、デザインによって、異なる複数の質量対電荷比率のイオンが連続的に通過するために複数の標識のためのデータ取得が遅いからである。同様に、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＥｌｅｍｅｎｔＸＲやＥｌｅｍｅｎｔ２など、他のコメント装置は、一度にただ１つのｍ／Ｑを分析するのであって、静電場ジャンプの範囲を超える範囲にわたって複数のｍ／Ｑ値を測定するときには、磁気ジャンプのための安定化時間が長くなる。
【００４８】
よって、複数の異なるｍ／Ｑ値を有するイオンについて、実質的に同時の検出を提供する技術を用いることが好ましい。たとえば、ポイント・イオン検出器を用いる代わりに、アレイ検出器を用いることが可能である（たとえば、参考文献４の第２９章を参照のこと）。マルチコレクタ型のセクタ電磁場ＩＣＰ−ＭＳ装置を用いることが可能であり（たとえば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎｅｐｔｕｎｅ  Ｐｌｕｓ、Ｎｕ  Ｐｌａｓｍａ  ＩＩ、およびＮｕ  Ｐｌａｓｍａ  １７００システムなど）、そして特に、マッタウフ・ヘルツォーク幾何学的要素を有するもの（たとえば、ＳＰＥＣＴＲＯ  ＭＳであり、これは、半導体直接電荷検出器を用いた１回の測定において、リチウムからウラニウムまでのすべての元素を、同時に記録することが可能である）が用いられ得る。これらの装置は、複数のｍ／Ｑ信号を、実質的に同時に測定することが可能である。それらの感度は、検出器に電子増倍管を含めることにより、上昇させることが可能である。しかし、アレイ・セクタ装置が理想ではない。その理由は、そのような装置は、増加する信号を検出するのには有用であっても、信号レベルが下降しているときには有用度が下がり、したがって、高度に可変的な濃度で複数の標識が存在するような状況には充分に適していないからである。
【００４９】
本発明と共に用いるために最も好ましいＭＳ方法は、飛行時間（ＴＯＦ）検出に基づいており、これは、単一のサンプルにおける複数の質量を擬似同時的に登録できる。理論的には、ＴＯＦ技術は、その空間電荷特性のために、ＩＣＰイオン源には理想的に適していることはないのであるが、本発明者たちは、ＴＯＦ装置が、実現可能な単細胞イメージングを可能にするのに充分に高速に且つ充分な感度で、ＩＣＰイオン・エアロゾルを分析できることを示した。ＴＯＦ質量分析計は、ＴＯＦ加速度計および飛行管において空間電荷の効果を処理するのに要求される妥協のために、原子分析には人気がないのが通常であるのだが、本発明の組織イメージング方法は、標識原子だけを検出することによって効果的になり得るのであって、他の原子（たとえば、１００未満の原子質量を有するもの）を取り除くことができるのである。この結果として、（たとえば）１００〜２５０ダルトン領域における質量が豊富であり、稠密度がより低いイオン・ビームが生じ、これは、より効率的に操作および合焦が可能であり、したがって、ＴＯＦ検出が容易になり、ＴＯＦの高いスペクトル走査速度を利用することができる。このように、ＴＯＦ検出と、サンプルにおいては一般的ではないが未標識サンプルで見られる質量を超える質量を有する標識原子の選択とを、たとえば、より高い質量の遷移元素を用いることによって組み合わせることにより、迅速なイメージングが達成され得る。狭い範囲の標識質量を用いることは、したがって、ＴＯＦ検出が効果的なイメージングに用いられるべきことを意味する。
【００５０】
適切なＴＯＦ装置は、Ｔｏｆｗｅｒｋ、ＧＢＣサイエンティフィック・イクイップメント（たとえば、Ｏｐｔｉｍａｓｓ  ９５００  ＩＣＰ−ＴＯＦＭＳ）、およびＦｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃａｎａｄａ（たとえば、ＣｙＴＯＦ（登録商標）およびＣｙＴＯＦ（登録商標）２などの装置）から入手可能である。これらのＣｙＴＯＦ（登録商標）装置は、ＴｏｆｗｅｒｋおよびＧＢＣ装置よりも高い感度を有しており、質量サイトメトリでの使用が知られているが、その理由は、これらが、希土類金属の質量範囲において（特に、１００〜２００のｍ／Ｑ範囲において）、迅速によい感度でイオンを検出できるからである。参考文献５を参照のこと。よって、これらは、本発明と共に用いるための好適な装置であり、この技術分野で既に知られている装置設定を用いて、イメージングに用いられ得る。これらの装置の質量分析計は、高周波のレーザ・アブレーションの時間スケールにおいて、高い質量・スペクトル取得周波数で、擬似同時的に多数のマーカを検出することができる。これらの装置は、１細胞当たり約１００という検出限度で、大量の標識原子を測定することができるので、組織サンプルの画像の感度のよい構築が可能になる。これらの特徴のために、今や、質量サイトメトリを、細胞下分解能での組織イメージングのための感度および多重度の必要性を満たすために、用いることができるのである。従来は、質量サイトメトリは、懸濁液中の細胞を分析するためにだけ用いられてきたのであって、したがって、組織または腫瘍の微小環境内部における細胞間の相互作用に関する情報は、失われてきた。質量サイトメトリ装置と、高解像度のレーザ・アブレーション・システムおよび高速移動低分散アブレーション・チャンバとを組み合わせることによって、実用的な時間スケールでの高い多重性を有する組織サンプルの画像構築を許容することが可能となったのである。質量サイトメトリに関するさらなる詳細は、参考文献６において見いだすことが可能である。
【００５１】
サンプルのアブレーションに用いられる波長及びレーザ・パワーの選択は、ＩＣＰ−ＭＳによる細胞分析における通常の用法に従うことができる。レーザは、支持のためのサンプル・ホルダを実質的にアブレートすることなく、所望の深さまでアブレーションを生じさせるために充分なフルエンスを有していなければならない。２０Ｈｚにおいて２〜５Ｊ／ｃｍ２の間のレーザ・フルエンスが典型的に適切であり、たとえば、３〜４Ｊ／ｃｍ２または約３．５Ｊ／ｃｍ２である。理想的には、分析のために細胞物質をアブレートするためには、単一のレーザ・パルスで充分であり、よって、レーザ・パルスの周波数は、アブレーション・プルームが生成される周波数と一致する。レーザは、通常、エキシマまたはエキシプレックス・レーザである。適切な結果は、フッ化アルゴン・レーザ（λ＝１９３ｎｍ）を用いて、得ることができる。２５μｍの開口を用いると、このレーザは、２５分の１の縮小によって、組織サンプル上に画像化可能であり、１μｍの直径を有するスポット・サイズを与える。これらのレーザを用いた１０〜１５ｎｓのパルス継続時間が、適切なアブレーションを達成することができる。フェムト秒レーザ（すなわち、パルス継続時間が１ｐｓ未満）もまた用いられることがあり、サンプルへの熱移動が少ないことは優れているのであるが、非常に高価であり、これがなくても、よいイメージングの結果を達成することが可能である。
【００５２】
全体としては、レーザ・パルス周波数および強度は、個別的なレーザ・アブレーション・プルームの区別を許容するために、ＭＳ検出器の応答特性との組合せで選択される。小さなレーザ・スポットと、短いウォッシュアウト時間を有するアブレーション・セルとの組合せにおいて、高速かつ高解像度のイメージングが、今日、実現可能である。
【００５３】
画像の構築
ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳは、プルームにおける複数の標識原子のための信号を提供することができる。本発明のレーザ・アブレーション・セルによって生成されるプルームにおける標識の検出は、アブレーション位置における同種の標的の存在を明らかにする。サンプル表面上の既知の空間位置において一連のプルームを生成することによって、ＭＳ信号は、サンプル上の標識の位置を明らかにし、よって、信号が、サンプルの画像を構築するのに用いられ得る。区別可能な標識を用いて複数の標的を標識することにより、標識原子の位置と同種の標的の位置とを関連付けして、複雑な画像を構築することが可能であり、既存の技術を用いて達成可能なものをはるかに凌駕する多重化のレベルに到達する。本発明者たちは、生成された画像が、ＩＦＭによって決定されている与えられたマーカを表す染色パターンと細胞の割合とを再生できることを示し、それにより、イメージングへの本発明の適切性を確認した。
【００５４】
理想的には、画像は、組織サンプル上でレーザのラスタ走査を実行することによって、構築されることになる。ラスタ走査（ステップ・サイズ）における連続するアブレーションの間隔、およびラスタ走査における隣接する直線の間の間隔は、理想的には、関心対象領域の完全なカバーを達成するためには、用いられているレーザ・スポット・サイズと同じである（たとえば、１μｍのレーザ・スポットに対して１μｍの間隔）。いくつかの実施形態では、しかし、方法が、レーザ・スポット・サイズよりも小さな（たとえば、少なくとも２倍、４倍、または５倍小さい）ステップ・サイズを用いることもあるが、その理由は、これによってより小さなアブレーション面積が得られ、よって、イメージングの解像度を向上させるからである。走査を達成するには、レーザを移動させることが可能であるが、アブレーション・セルを（または、セルのコンテンツを）移動させることの方が、通常は、より便利である。移動速度は、アブレーション周波数とラスタ間隔とに依存し、たとえば、１μｍのラスタ間隔と２０Ｈｚのアブレーションとの場合には、アブレーション・セルは、２０μｍ／ｓの並進速度を有することになる。１μｍ未満のステップ・サイズを達成することができるサポートステージが入手可能であり、たとえば、５００ｎｍまたは２００ｎｍのステップ・サイズ（または、さらに小さい）を備えている。
【００５５】
一般的には、アブレートされた表面層のコンテンツに基づいて、サンプルの２次元（２Ｄ）画像が生成される。組織の３Ｄ画像は、単一サンプルのｚ軸において隣接する複数の断面からの２Ｄ画像（ｘｙ平面における）スタックを集合させることによって作成され得る。しかし、このようにして２Ｄ画像を集合させることに対する代替策として、直接的な３Ｄイメージングも実行可能である。これは、様々な方法で達成可能である。たとえば、アブレーションが実質的に一定の深さで蒸発を生じさせる場合には、単一のｘｙ平面上の点における反復的なアブレーションにより、ｚ軸方向において、より深い情報が順々に明らかになる。アブレーションが実質的に一定の深さを有していない場合には、アブレートされた物質の体積を測定することが可能であり（たとえば、既知の体積の標準との関係で）、この体積は、ｚ軸方向の深さに容易に変換され得る。３Ｄイメージングが実行される場合には、ｘｙ平面上の位置が維持されている間に、複数回のｚ軸方向のアブレーションを実行すること（「ドリリング」）、そして、サンプルを層ごとにアブレートすること（たとえば、より深いｚ軸層に移動する前に、ｘｙ平面上のある面積のアブレーションを実行すること）が可能である。層ごとのアブレーションが好ましい。３Ｄイメージングの精度は、アブレートされた物質の再度の堆積、一定のアブレーション深度を維持する能力、および標識がサンプルの中へ貫通する能力などの因子によって制限されるが、これらの制約の限度内でも、依然として有用な結果が達成され得る。
【００５６】
信号を画像に集合させるにはコンピュータを用い、既知の技術とソフトウェア・パーセンテージとを用いて達成され得る。たとえば、カイリバンク・ソフトウェア（Ｋｙｌｅｂａｎｋ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）によるＧＲＡＰＨＩＳパッケージを用いることが可能であるが、ＴＥＲＡＰＬＯＴなど他のパッケージを用いることも可能である。ＭＡＬＤＩ−ＭＳＩなどの技術からのＭＳデータを用いたイメージングが、この技術分野で知られており、たとえば、参照文献７は、Ｍａｔｌａｂプラットフォーム上でＭＳイメージング・ファイルを見て分析するための「ＭＳｉＲｅａｄｅｒ」インターフェースを開示しているし、参考文献８は、たとえば、「Ｄａｔａｃｕｂｅ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ」プログラムなど、完全な空間およびスペクトル解像度での２Ｄおよび３Ｄ両方のＭＳＩデータセットの高速なデータ探索および視覚化のための２つのソフトウェア計測器を開示している。
【００５７】
本発明を用いて得られた画像は、たとえば、ＩＨＣの結果が分析されるのと同じ態様で、さらに、分析され得る。たとえば、画像は、サンプルにおける細胞の部分母集団を表現するのに用いられることが可能であり、臨床的な診断に有用な情報を提供することができる。同様に、本発明が提供する高次元のサイトメトリ・データから細胞の階層を抽出するのに、ＳＰＡＤＥ分析を用いることができる。参考文献９を参照のこと。
【００５８】
組織サンプルの標識
画像は、単一の標識原子または複数の異なる標識原子を用いて標識されたサンプルから取得可能であり、ここで、標識原子は、ＩＣＰ−ＭＳによってレーザ・アブレーションのなされたプルームにおいて検出される。複数の異なる原子を参照することは、複数の原子核種がサンプルの標識に用いられることを意味する。これらの原子核種は、ＩＣＰ−ＭＳを用いて区別することができ（たとえば、それらは異なるｍ／Ｑの比率を有する）、結果的に、１つのプルーム内に２つの異なる標識原子が存在することにより、２つの異なるＭＳ信号が生じる。
【００５９】
本発明は、２よりも多くの標識原子の同時的な検出のために用いることができ、たとえば、少なくとも３、４、５、１０、２０、３０、３２、４０、５０またはさらには１００の異なる標識原子など、多重的な標識検出を許容する。標識原子は、また、組合せ的な態様でも用いられ、区別可能な標識の個数をさらに増加させることもできる。例では、あるイメージング方法における３２の異なる標識原子の使用を示しているが、ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳは、本来、たとえば１００を超える異なる原子核種など、より多くの数の異なる原子の並列的な検出に適している（これについては、参考文献５を参照のこと）。異なる標識原子を用いて異なる標的を標識することによって、単一の画像における複数の標的の細胞位置を決定することが可能である（たとえば、参考文献１０を参照のこと）。
【００６０】
本発明と共に用いられ得る標識原子は、ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳによって検出可能であり標識されていない組織サンプルには実質的に存在しないいずれかの核種を含む。よって、たとえば、１２Ｃの原子は、標識原子としては適切ではない可能性があるが、その理由は、この原子は自然界に豊富に存在するからであり、他方で、１１Ｃは理論的には用いられ得るのであるが、その理由は、これが、自然界には存在しない人工的な同位体であるからである。好適な実施形態では、しかし、標識原子は、希土金属（１５のランタニドと、スカンジウムおよびイットリウム）などの遷移金属である。これら１７の元素は、ＩＣＰ−ＭＳによって容易に区別され得る多くの異なる同位体を提供する。広範囲のこれらの元素は、濃縮同位体の形態として入手可能であり、たとえば、サマリウムは６つの安定同位体を有し、ネオジウムは７つの安定同位体を有するが、これらはすべて濃縮された形態で入手可能である。１５のランタニド元素は、非冗長的に一意的な質量を有する同位体を、少なくとも３７個提供する。標識原子として用いられるのに適切な元素の例には、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジウム（Ｎｄ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、タリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテシウム（Ｌｕ）、スカンジウム（Ｓｃ）、およびイットリウム（Ｙ）が含まれる。希土金属に加えて、他の金属原子も、ＩＣＰ−ＭＳによる検出に適しており、たとえば、金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）、イリジウム（Ｉｒ）、ロジウム（Ｒｈ）、ビスマス（Ｂｉ）などがある。放射性同位体の使用は好ましくないのであり、その理由は、それらは取り扱いが便利ではなく不安定であるからであって、たとえば、Ｐｍはランタニドの中でも好ましい標識原子ではない。
【００６１】
ＴＯＦ分析（上述したことを参照のこと）を容易化するためには、原子質量が８０〜２５０の範囲内、たとえば、８０〜２１０の範囲内、または、１００〜２００の範囲内などにある標識原子を用いることが役立つ。この範囲は、ＳｃおよびＹを除くすべてのランタニドが含まれる。１００〜２００という範囲により、異なる標識原子を用いることによって理論的には１０１重の分析が許容され、他方で、本発明は、ＴＯＦ  ＭＳの高スペクトルの走査速度を利用することができる。上述したように、その質量が標識されていないサンプルにおいて見られる場合よりも上にあるウィンドウにある標識原子を選択することによって（たとえば、１００〜２００の範囲内）、ＴＯＦ検出は、生体的に意味のあるレベルにおける高速イメージングを提供するのに用いられ得る。
【００６２】
組織サンプルを標識するには、一般的には、標識原子が特異的結合対（ｓｂｐ）の一メンバーに結合されていることが要求される。この標識されているｓｂｐは、それが存在する場合にはｓｂｐの他のメンバー（標的ｓｂｐメンバー）と相互作用を生じることができるように、組織サンプルと接触されており、よって、標識原子を、サンプルにおける特定の位置に局所化する。標識を標的分子に運ぶｓｂｐは、また、本明細書では、特異的標識構築物とも称される。この特異な位置の標識原子の存在は検出されることができ、この情報は標的ｓｂｐメンバーがその位置に存在する画像に移される。希土金属及び他の標識原子を、既知の技術によってｓｂｐメンバーにコンジュゲートすることができ、たとえば、参考文献１１は、ＩＣＰ−ＭＳ検出のための、ランタニド原子のオリゴヌクレオチドプローブへの付着について説明しており、参考文献１２は、オリゴヌクレオチドを標識するためにルテニウムを用いることについて説明しており、フルイダイム・カナダ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃａｎａｄａ）社は、３０超の異なる標識原子をタンパク質（抗体を含む）にコンジュゲートするのに用いることができるＭａｘＰａｒ（登録商標）金属標識キットを販売している。
【００６３】
様々な数の標識原子を、単一のｓｂｐメンバーに付着することが可能であり、より多くの標識原子がいずれかのｓｂｐメンバーに付着されているときに、より高い感度が達成され得る。たとえば、ｓｂｐメンバーには、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００よりも多くの標識原子が、ｓｂｐメンバーに付着され得る。たとえば、それぞれがＤＴＰＡなどのキレート剤を含む複数のモノマー単位を含む単分散ポリマーを、用いることができる。たとえば、ＤＴＰＡは、たとえば、約１０−６Ｍの解離定数を有する３＋のランタニドイオンと結合する。これらのポリマーは、ｓｂｐメンバーに付着するのに用いられ得るチオール反応基（たとえば、マレイミド）で終端することができる。たとえば、チオール反応基は、抗体のＦｃ領域に結合し得る。これらのポリマーのコンジュゲーションのためには、他の官能基もまた用いられ得るが、たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのアミン反応基、または、カルボキシルに対するもしくは抗体のグリコシル化に対する反応性の基などである。任意の個数のポリマーが、各ｓｂｐメンバーに結合し得る。用いられ得るポリマーの特定の例には、直鎖（「Ｘ８」）ポリマーまたは第３世代樹枝状（「ＤＮ３」）ポリマーが含まれるが、これらは共に、ＭａｘＰａｒ（登録商標）試薬として入手可能である。標識における原子の個数を増加させるために、金属ナノ粒子の使用も行われ得る。
【００６４】
上述したように、標識原子をｓｂｐメンバーに付着させ、この標識ｓｂｐメンバーが、（存在する場合には）標的ｓｂｐメンバーを見つけることができる場所で、組織サンプルと接触し、標識ｓｂｐが形成される。標識ｓｂｐメンバーは、標識原子に付着するのに適しており、さらに本発明を用いてイメージングを行うのに適したいずれかの化学構造を備え得る。
【００６５】
一般的な用語では、本発明は、組織サンプル（たとえば、ＩＨＣにおいて用いられているような、または、インサイチュハイブリダイゼーションＦＩＳＨにおける蛍光のような）における標的分子の位置を決定する際に用いるため、既に知られているいずれかのｓｂｐと共に用いられ得るが、サンプルに接触するｓｂｐメンバーは、ＩＣＰ−ＭＳによって検出される標識原子を担持することになる。よって、本発明は、入手可能なＩＨＣおよびＦＩＳＨ試薬を用いることによって、たとえば、レーザ・アブレーションがなされＩＣＰ−ＭＳによって検出され得る標識をＦＩＳＨプローブが運ぶように改変するために、既に用いられている標識を単に改変することによって、容易に実施することができる。
【００６６】
ｓｂｐは、核酸二重鎖、抗体／抗原複合体、受容体／リガンド対、またはアプタマー／標的対のいずれかを含み得る。このように、標識原子は核酸プローブに付着可能であり、次いで、核酸プローブは組織サンプルと接触することによって、当該核酸プローブがそこで相補的な核酸とハイブリダイズすることができ、たとえばＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖、またはＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖を形成する。同様に、標識原子は抗体に付着可能であり、次に、抗体は組織サンプルと接触することによりその抗原と結合することができる。標識原子はリガンドに付着可能であり、次に、リガンドは組織サンプルと接触することによりその受容体と結合することができる。標識原子はアプタマーリガンドに付着可能であり、次に、アプタマーリガンドは組織サンプルと接触することによりその標的と結合することができる。このようにして、標識されたｓｂｐメンバーは、サンプルにおける多様な標的を検出するのに用いられ得るのであるが、これには、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、タンパク質、糖、脂質、または代謝産物が含まれる。
【００６７】
本発明の典型的な使用では、標識されたｓｂｐメンバーは、抗体である。抗体の標識は、たとえば、上述したＭａｘＰａｒ（登録商標）コンジュゲーションキットを用いて、１つまたは複数の標識原子を結合する分子を抗体にコンジュゲートすることを通じて、達成され得る。イメージングに有用な細胞タンパク質を認識する抗体は、ＩＨＣのために既に広く利用可能であり、現在の標識技術（たとえば、蛍光）の代わりに標識原子を用いることにより、これらの既知の抗体を、本発明での使用に容易に適合させることができるが、多重化能力を増加させるという利点を伴う。本発明と共に用いられる抗体は、細胞表面上の標的または細胞内の標的を認識することができる。抗体は、多様な標的を認識することができるのであって、たとえば、抗体は、個々のタンパク質を特異的に認識することができ、共通のエピトープを共有する複数の関連するタンパク質を認識することができ、またはタンパク質上の特定の翻訳後修飾を認識することができる（たとえば、ユビキチン化を検出するために、興味対象のタンパク質上のチロシンとホスホチロシンとを区別すること、リジンとアセチルリジンとを区別すること、など）。その標的と結合した後に、抗体にコンジュゲートした標識原子を、サンプルにおけるその標的の位置を明らかにするために、検出することができる。
【００６８】
標識ｓｂｐメンバーは、通常、サンプルにおける標的ｓｂｐメンバーと直接的に相互作用を行うことになる。しかし、いくつかの実施形態では、標識ｓｂｐメンバーが標的ｓｂｐメンバーと間接的に相互作用を行うことが可能であり、たとえば、一次抗体が標的ｓｂｐメンバーに結合し、次いで二次標識抗体がサンドイッチアッセイの形式で一次抗体と結合し得る。しかし、通常は、直接的な相互作用に依存し、その理由は、直接的な相互作用が、より容易に達成可能であり、より高度な多重化を可能にするからである。しかし、両方の場合において、サンプルは、サンプル中で標的ｓｂｐメンバーに結合することができるｓｂｐメンバーと接触しており、より後の段階で、標的ｓｂｐメンバーに付着した標識が検出される。
【００６９】
本発明の１つの特徴は、サンプルにおける複数の（たとえば、１０以上、そして、さらには、１００以上さえも）異なる標的ｓｂｐメンバーを検出できる能力であり、たとえば、複数の異なるタンパク質および／または複数の異なる核酸配列を検出することができる能力である。これらの標的ｓｂｐメンバーの示差的な検出を可能にするためには、それらの各ｓｂｐメンバーは、それらの信号がＩＣＰ−ＭＳによって区別され得るように、異なる標識原子を担持するべきである。たとえば、１０の異なるタンパク質を検出する場合には、１０の異なる抗体（それぞれが、異なる標的タンパク質に対して特異的である）を用いることができ、これらの抗体のそれぞれがユニークな標識を担持することによって、異なる抗体からの信号が区別できる。いくつかの実施形態では、単一の標的に対して、たとえば、同一タンパク質上の異なるエピトープを認識する複数の異なる抗体を用いることが望ましい。よって、ある方法では、このタイプの冗長性のため、標的よりも多くの抗体を用いることがあり得る。しかし、一般的には、本発明は、複数の異なる標識原子を用いて、複数の異なる標的を検出するであろう。
【００７０】
複数の標識抗体が用いられる場合には、これら抗体がそれぞれの抗原に対して類似の親和性を有していることが好ましいのであるが、その理由は、そのことが、ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳによって検出される標識原子の量と組織サンプルにおける標的抗原の豊富さとの間の関係が、異なるｓｂｐの全体でより一貫性を有する（特に、高い走査周波数において）ことを保証することを助けるからである。
【００７１】
標的ｓｂｐメンバーが細胞内部に位置する場合には、サンプルが標識と接触する前または接触の間に、細胞膜の透過処理が必要になるのが典型的である。たとえば、標的がＤＮＡ配列であるが、標識ｓｂｐメンバーが生きている細胞の膜を通過できないときには、組織サンプルの細胞を固定化し透過処理することができる。標識ｓｂｐメンバーは、次いで、細胞に侵入して、標的ｓｂｐメンバーとｓｂｐを形成することができる。これに関して、ＩＨＣおよびＦＩＳＨで用いる既知のプロトコルが用いることができる。
【００７２】
通常は、本発明の方法は、少なくとも１つの細胞内標的及び少なくとも１つの細胞表面標的を検出することになる。しかし、いくつかの実施形態では、本発明を、細胞内標的を無視しながら、複数の細胞表面標的を検出するのに用いることができる。本発明が、サンプル中の選択された標的の位置の画像を提供するため、全体的にみれば、標的の選択は、本発明の方法から所望される情報によって決定されることになる。
【００７３】
生体サンプル
本発明は、生体サンプルのイメージングの方法を提供する。いくつかの場合には、このサンプルは組織サンプルである。組織サンプルは、複数の相互作用を行う細胞を含んでおり、この方法は、組織サンプルにおけるこれらの細胞の画像を提供するために、これら複数の細胞を、レーザ・アブレーションに供する。一般的に、本発明を、現在はＩＨＣ技術によって研究されている組織サンプルを分析するのに用いることができるが、ただし、ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳによる検出に適した標識の使用を伴う。
【００７４】
任意の適切な組織サンプルが、本明細書で説明されているレーザ・アブレーション・セル、イオン源、ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳシステムを用いて、分析され得る。たとえば、組織は、上皮組織、筋肉組織、神経組織など、およびこれらの組合せであり得る。診断または予後目的のためには、この組織は腫瘍由来であり得る。いくつかの実施形態では、サンプルが既知の組織由来であり得るが、そのサンプルが腫瘍細胞を含むかどうかは、未知であり得る。イメージングは、腫瘍の存在を示す標的の存在を明らかにすることができ、よって診断を容易にする。組織サンプルは、たとえば、ヒトの乳癌組織またはヒトの乳腺上皮細胞（ＨＭＬＥ）など、乳癌組織を含み得る。組織サンプルは、ホルマリン固定パラフィン包理（ＦＦＰＥ）された組織を含み得る。組織は、任意の生きている多細胞生物から、通常はヒトから、取得することができる。
【００７５】
組織サンプルは、通常、たとえば４〜６μｍなど２〜１０μｍの範囲内にある厚さを有する、切片である。そのような切片を調製する技術は、ＩＨＣの分野から広く知られており、たとえば、ミクロトームの使用、脱水ステップを含み、包埋などを含む。このように、組織は、化学的に固定され、次いで、切片が所望の平面に調製され得る。また、凍結切片法またはレーザ・キャプチャ微細解剖も、組織サンプルの調製に用いられ得る。サンプルは、たとえば、細胞内標的の標識のための試薬を許容するために、透過処理がなされ得る（上述を参照のこと）。
【００７６】
最大サイズはレーザ・アブレーション装置によって、特に、アブレーション・セルの中に適合し得るサンプルのサイズによって決定されることになるのであるが、分析される組織サンプルのサイズは、現在のＩＨＣ法と類似する。５ｍｍ×５ｍｍまでのサイズが典型的であるが、より小さなサンプル（たとえば、１ｍｍ×１ｍｍ）もまた有益である（これらの寸法は、断片のサイズを指しており、その厚さは指していない）。
【００７７】
組織サンプルのイメージングに有用であることに加えて、本発明は、その代わりに、接着性の細胞の単分子層または（従来の免疫細胞化学におけるような）固体表面上で固定化されている細胞の単分子層などの細胞サンプルのイメージングに用いられ得る。これらの実施形態は、細胞懸濁質量サイトメトリ用に容易に可溶化できない接着性細胞の分析に、特に有用である。このように、現在の免疫組織化学的分析を強化するのに有用であることに加え、本発明は、免疫細胞化学現象を強化するのにも用いられ得る。本発明は、また、バイオフィルムのイメージングにも用いられ得る。バイオフィルムの分析は、医療の場において重要であって、その理由は、感染性試薬のバイオフィルムが、身体の粘膜上に、または、たとえば、留置カテーテル上に形成するからである。
【００７８】
サンプルは、調製されてから、レーザ・アブレーション・セルの中に配置され、次いで本発明による分析に供される。
【実施例】
【００７９】
Ａ．実験
レーザ・アブレーション・セルの製作
セル・トップ１０を、アクリル・ガラス（ポリ（メチルメタクリレート）、ＰＭＭＡ）の直方体から製造した。内径が３ｍｍである長手方向の孔を長軸に沿って直方体に穿孔して、フロー・チャネル１１を形成した。セル・トップ１０の上側壁部１７に、横断方向であり僅かに楕円形の孔を、長さＬ＝４．５ｍｍおよび幅１．５ｍｍを有するように形成し、ＵＶ透過性のシリカ・ウィンドウ１６によって閉鎖した。上側の孔と同様の寸法の横向き開口１４を、セル・トップ１０の下側壁部１５に形成した。次に、下側壁部１５を機械加工し、フロー・チャネル１１の領域における該下側壁部の最小厚ｗを約５０マイクロメートルまで低減した。フロー・チャネル１１の全長は、約５０ｍｍであった。
【００８０】
セル・ボトム１０は、別のＰＭＭＡ直方体から製作した。直径が約２３ｍｍの円筒形のサンプル・チャンバ２１を直方体に切削した。半径方向に延長する孔をセル・ボトムに穿孔して、シース・ガス入口２２を形成した。シース・ガス入口は、フロー・チャネル１１に対して１０度の角度で延在した。サンプル２３をサンプル・チャンバ２１の中に配置した。セル・ボトム２０は、４つのネジ（図示せず）により、セル・トップ１０に取り付けた。スペーサまたはシールは必須ではないが、セル・トップ１０とセル・ボトム２０との間の接触領域をよりよく密閉するために、任意でスペーサまたはシールを設けてもよい。サンプル２３の上側表面２４は、横向き開口１４に面していた。サンプル２３の上側表面２４と下側の壁部１５との間の距離ｄは、約３５０マイクロメートルであった。よって、サンプル表面２４とフロー・チャネル１１の中心軸との間の距離は、全体では約１．９ミリメートル（フロー・チャネルの半径が１．５０ｍｍ、壁の厚さｗが０．０５ｍｍ、距離ｄが０．３５ｍｍ）であった。
【００８１】
チューブ・セルのパフォーマンス、最適化および特徴付けのための実験的設定
均一なレーザ・ビーム・プロファイルを備えたＡｒＦエキシマ・レーザ・システム（ドイツのゲッチンゲン所在、ラムダ・フィジーク（Ｌａｍｂｄａ  Ｐｈｙｓｉｋ）社による）を、アジレント７５００ｃｓ  ＩＣＰ−四重極−ＭＳ装置（ドイツのヴァルトブロン所在のアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）社によるＩＣＰ−Ｑ−ＭＳ）に連結した。レーザのフルエンスは、１７．３Ｊ／ｃｍ２であった。信頼性レベルを向上させるために、すべてのデータ点は、（特にそうではないとの記載がない限り）３×３のシングルショットマトリックススキャンから導かれ、レーザ・スポット・サイズは１０μｍであり、隣接するショットの間の間隔は１５μｍである。ＩＣＰトーチへの移動管を、混合ガス出口１３に接続された内径が３ｍｍであるＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）管で構成した。同様の管を、Ａｒ入口１２への供給管としても用いた。Ａｒキャリア・ガス流を、１．１Ｌ／分に調整した。長さが５０ｃｍである移動管を、直径を変更することなく、直接的にＩＣＰトーチに接続した。サンプル・チャンバを通過して提供されるＨｅシース・ガス流を、０．６Ｌ／分に調整した。チューブ・セルのパフォーマンス測定は、１０ｍｓのドエル時間で、実行した。セルのウォッシュアウトを描写するために、ＮＩＳＴ６１０の基準ガラス上の１Ｈｚ、１０Ｈｚおよび３０Ｈｚのレーザ・アブレーションの間に単一の同位体である２７Ａｌの取得を実行した。ＩＣＰを１４７０Ｗで動作させ、四重極ＭＳを、ピーク・ホッピング・モードにおいて１ピーク当たり１点に設定した。
【００８２】
キャリア・チューブ開口とサンプル表面との間のギャップ距離、Ａｒであるキャリア・ガスの流量、およびＨｅであるシース・ガスの流量を含む、様々な動作パラメータの最適化を実行した。ある１つのパラメータを最適化しているときには、残りの２つは、予備的最適化に基づいて、「最適化前」の状態、たとえばギャップ距離を３５０μｍ、Ａｒの流量を１．１Ｌ／分、Ｈｅの流量を０．６Ｌ／分に設定した。データは、正規化されたピーク幅に基づいて評価したが、この正規化されたピーク幅とは、各ピーク内で収集されたカウントの総数（ピーク面積）によってピーク幅を割ったものである。各ピークに対して、１％の最大値における幅全体（ＦＷ０．０１Ｍ）を、ピーク幅を決定するのに用いた。１％の最大値位置がどのデータ点とも一致しなかった場合には、最も近接する２つの点の線形補間を適用した。ピーク面積については、ピーク幅の内部のすべてのデータ点を積分したが、ピーク・テーリングがカウント全体の１％未満だけにしか貢献しなかったため、補間は必要ではなかった。
【００８３】
ルーチン分析のためのセルの特徴付けを、上述したものと同じパラメータを用いて実行した。しかし、ｍ／Ｑが低い、中間的、さらには高い場合からの複数の同位体を、異なった複数の実行において記録した。ピーク面積の感度には、アバンダンス補正を行った。
【００８４】
「硬質」物のイメージングのためのサンプル作製
イメージング能力を示すためのサンプルを、レーザ誘起前方転写法によって作製した。ドナー基板の作製のためには、高品質の溶融シリカガラスを、犠牲動的放出層（ＤＲＬ）としてのＵＶ吸収性のトリアゼンポリマー（ＴＰ）層で被覆し、その上に別の薄膜物質を堆積させた。転写手順においては、３０８ｎｍのＸｅＣｌエキシマ・レーザ・ビームを、「ＥＴＨ」（または「ＰＳＩ」）という中空マスク上で画像化し、ドナー基板の背面側にインパクトを与える前に、１／４に縮小した。ＴＰ−ＤＲＬをアブレートし、生成された衝撃波が、ＰＥＤＯＴ：ＰＳＳ（ポリ（スチレンスルホナート）とブレンドしたポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン））でコーティングしたガラス製の受取側基板に向かって該薄膜を推進させた。サンプルは、６０ｎｍの厚さの金の「ＥＴＨ」という薄い層が底部に、８０ｎｍの銀の「ＰＳＦ」が上部に配置されているように（Ａｕ／Ａｇ）作製した。走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって２つのロゴの堆積を制御するために、パターン堆積の後に、５ｎｍの白金の薄膜を受取側基板の上に均一にコーティングした。
【００８５】
組織サンプルの調製
ホルマリン固定パラフィン包理した、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に富む乳癌組織を、６μｍの薄片に切り分けた。このサンプルは、ＣＣｌｍエピトープ回復条件の下で、ディスカバリＸＴプラットフォーム（ヴェンタナ（Ｖｅｎｔａｎａ）・メディカル・システムズ社）の上で処理した。その後で、サンプルを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）／１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘを用いて３０分間ブロッキングし、５０分間２００μＬの１６５Ｈｏ標識抗ＨＥＲ２と共に５μｇ／ｍＬで培養した。サンプルは、ＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘで３回洗浄し、室温で乾燥させた。１６５Ｈｏとの抗体のコンジュゲーションのために、市販のＭＡＸＰＡＲ抗体標識キット（ＤＶＳサイエンシズ社）を用いた。
【００８６】
「硬質」物のイメージングのための計測および動作条件
チューブ・セルの特徴付けに関して上述したものと同様の構成を、この実験のためにも用いた。８５２×４０８μｍ２の面積を、１０Ｈｚの反復率のライン走査によってカバーした。連続的なレーザ・ショットの間の距離と、ライン走査の間の横方向の距離とは、４μｍのレーザ・クレータに基づくと、共に４μｍであった。実際のレーザ・ビームのサイズは、１〜２μｍであった。しかし、より大きな影響を受けた面積が観測され、これは、拡大された熱貫通体積（金属製の薄膜における高い熱拡散と、ｎｓの光−物質の相互作用時間）によって説明され得る。３つの同位体１０７Ａｇ、１９５Ｐｔおよび１９７Ａｕが、ピーク・ホッピング・モードで、各同位体について６００μｓのドエル時間で、測定された。しかし、各同位体について、装置の四重極設定時間が数ミリ秒であることにより、同位体の全体の組の読み取りが、１０ｍｓ未満では完了できなかった。明らかに、そのような大きなオーバヘッドの一部（低いデューティ・サイクル）が、高速で高解像度のイメージング実験の間に取得可能な信号の品質を制約する。データ分析は、各シングルショット信号の積分（台形積分方式）に基づいていた。
【００８７】
組織イメージングのための計測および動作条件
組織のイメージングは、約１μｍの空間解像度でＡｒＦエキシマ・レーザに結合されたＥｌｅｍｅｎｔ２（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社による）ＩＣＰＭＳ上で実行した。動作条件は、高速の過渡信号の最大感度に対して最適化していた。したがって、１６５Ｈｏだけが記録された。画像分析のために、サンプルをラインごとに、２０Ｈｚのレーザ周波数、１×１μｍ２の画像ピクセル・サイズで走査した。ＭＳのドエル時間は、適用されたレーザ・アブレーション速度に従って、５０ｍｓに設定した。
【００８８】
Ｂ．結果および検討
チューブ・セルの最適化
チューブ・セル底部とサンプル表面との間のギャップへの分散の依存が、図６（ａ）に示されている。プロットされたピーク幅は、ＦＷ０．０１Ｍにおいて収集された全カウントに正規化した。約３５０μｍのギャップ幅において最小ピーク幅が観察された。この最適化されたギャップ距離を用いて、ＡｒおよびＨｅガスの流量最適化を実行した。対応する結果は、正規化されたピーク幅に基づいて、図６（ｂ）および図６（ｃ）に示されている。３つの最適化すべてが、正規化されたピーク幅に対して、約１０−３ｍｓ／カウントという明らかな最小値を生じている。以下の節において報告されるすべての測定は、サンプル・ギャップ及びガス流量に対して最適化された値を用いて実行したものである。異なる設定に応じて、そのような最適値は、変動し得る。
【００８９】
チューブ・セルの実験的評価
チューブ・セルを約１Ｈｚのレーザ周波数を用いて特徴付けた。典型的な過渡信号（対数スケールで示されている）が、図７（ａ）にまとめられている。主要元素の単一のウォッシュアウト信号は、ＦＷ０．０１Ｍの場合には、約３０ｍｓ継続する。過渡ピークは、依然として僅かに非対称的な形状を有しており、エアロゾルの遅延したウォッシュアウトが原因で僅かにテールを生じている。ピーク最大値の後では、信号が２０ｍｓの間に２桁より多く低下したが、これは、積分された信号全体の９９．９８％より多くを表している。全信号の残存部分（積分された信号面積の０．０２％）は、４０〜５０ｍｓの後でバックグラウンドに至るピークのテールにおいて見いだされた。第２の信号減衰の勾配は、高速ウォッシュアウトの場合とは異なり、異なるプロセスを示しており、これは、表面からの再堆積された物質の取り込みに関係することが疑われる。これは、チューブ・セルの底部開口の中へのＨｅシース・ガスの流れに起因する可能性が高く、このシース・ガスの流れは、レーザ・プルーム注入と平行であり、レーザ・プルームの注入は、クレータの周囲の領域を最も効率的に洗い流す。シングルショットを１秒のブランクだけ間隔があいていることが、さらなるサンプルの除去が生じないことを示す。
【００９０】
図７（ｂ）は、１０Ｈｚのレーザ周波数で取得された過渡信号を示している。ピークの幅および形状は、１Ｈｚで測定された信号と類似していた。３０Ｈｚのライン走査を用いたレーザ周波数のさらなる増加は、図７（ｃ）に示されている。ピークの幅および形状は、１Ｈｚおよび１０Ｈｚで測定された信号に類似していた。信号構造は、２つの隣接するピークは、互いにバックグラウンドに分離できないということを示している。しかし、２つの連続するピークの間の重なり合いは、強度において１％未満である。したがって、３０Ｈｚであっても、画像の濃度が２桁ほど濃く異なることを許容し得るという結論に達することができ、このことは、本発明のアブレーション・セルを、レーザ・アブレーション・イメージングにとって非常に魅力的なものとする。全体的評価は、ウォッシュアウトが、３０〜５０ｍｓの時間範囲の中に、著しく改善されていることを証明している。
【００９１】
広い同位体の範囲に対するチューブ・セルの特徴付け
チューブ・セルのパフォーマンスのさらなる特徴付けが、図８に示されている。ピーク面積から計算されたピーク幅および感度が、低いｍ／Ｑ（７Ｌｉ）から高いｍ／Ｑ（２３８Ｕ）まで、様々な同位体について示されている。図８（ａ）から見られるように、すべての同位体測定の平均ピーク幅は、３０〜３５ｍｓという狭い範囲内に含まれる。報告された信号の継続時間は、ＦＷ０．０１Ｍに基づいて計算された。ｍ／Ｑの範囲にわたる標準偏差は、アブレートされた質量、エイリアス効果、およびガス流の動力学における差異に起因するゆらぎの結果である可能性が非常に高い。図８（ｂ）は、さらに、ピーク面積に対して正規化された感度を示しており、これは、単一のショット・アブレーション・モードで１０μｍのクレータを用いて決定された。シングルショット・モードにおいて一般的に用いられているアブレーション・セルの設定と比較すると、ピーク面積の感度は、１０倍改善された。これは、改善されたサンプル輸送効率や改善されたイオン化とは関係なく、純粋に、アブレーション部位からＩＣＰへサンプル密度が保存されていることに基づく。
【００９２】
連続的Ｑ−ＭＳによる高速イメージング
「硬質」サンプルを、様々なイメージング技術によって研究した。結果は、図９に図解されている。まず、パターンの特徴的な詳細を光学顕微鏡（図９（ａ））と走査電子顕微鏡（ＳＥＭ、図９（ｂ））とによって画像化した。これらの画像は、高感度且つ高空間解像度のＬＡ−ＩＣＰＭＳの品質を１９７Ａｕ（図９（ｃ））および１０７Ａｇ（図９（ｄ））について評価するのに用いた。光学およびＳＥＭの画像は、均一性、形状および幾何学的要素に関して、薄膜パターンは完全ではなかったことを示している。しかし、サンプルは、ＬＡ−ＩＣＰＭＳによって分析されるのに非常に適していると考えられた。ＬＡ−ＩＣＰＭＳは、明白なパターン境界を備えた高度に一貫性を有する画像を生成したのである。薄膜から背景（または裏側）への迅速な信号変化は、約１μｍの高い空間解像度のためのインジケータであると考えられた。一方の実験室から他方の実験室へのサンプル移動の間に、「Ｔ」の左側のアームに、スクラッチが導入され、このスクラッチさえもが、図９（ｃ）のＬＡ−ＩＣＰＭＳによって画像化されており、対照写真として撮られた図９（ａ）における光学顕微鏡の画像と整合している。
【００９３】
同時的マタウフ・ヘルツォーグ質量分析計による高速イメージング
標準的な四重極質量分析計の深刻な制約は、その連続的なｍ／Ｑ分析方式である。低分散のチューブ・セルの結果である短い信号パルス継続時間は、ＬＡ−ＩＣＰに擬似同時的または同時的な質量分析計が結合されていない限り、複数の同位体の記録を制限する。そのような進化したＭＳの例には、マタウフ・ヘルツォーグＭＳ（ＭＨ−ＭＳ）と飛行時間ＭＳ（ＴＯＦ−ＭＳ）とが含まれる。ＭＨ−ＭＳ装置の多要素イメージング能力を例証するために、四重極ＩＣＰＭＳについて上述したのと同じＬＡ−ＩＣＰシステムを連結した。このシステムを用いて取得された画像は、四重極ＭＳの場合と同様の品質および解像度を有していた。ＬＡ−ＩＣＰ−ＴＯＦ−ＭＳという連結は、そのような迅速な化学イメージングの用途に同様に適しているということが、ここで言及されるべきである。
【００９４】
組織イメージング
本明細書で開示する元素イメージングＬＡ−ＩＣＰＭＳシステムの多くの可能性がある応用例の中で、生体組織の薄い切片におけるバイオマーカの分布を調べることにより、その潜在性を証明することを決定した。当該分析は、第１に、最小の生体単位である細胞の内部におけるバイオマーカの形態を解像して、当該バイオマーカの位置を特定するために、低いμｍの解像度を要求する。この情報は、生物学的プロセスの研究において重要であるし、包括的な診断目的のために重要である。第２に、当該分析は、本明細書に開示するアブレーション・セルを用いて実現可能なものとして、ピクセル当たりの測定時間が短いことを要求し、生物学的および生体医学的分析においては統計的目的のため典型的に多数のサンプルと大きな組織面積（５００×５００μｍ２）を分析することが必要である。したがって、乳癌の組織切片を分析して、図６に図解されている個々の細胞のヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）の状態を調べた。この画像は、細胞膜上で高度に発現するＨＥＲ２のタンパク質を示した。ＨＥＲ２は、最初の乳癌診断の後の、再発のない生存時間、転移までの時間、および全体的な生存時間の主要な決定要素である。この分析では、約１μｍの空間解像度が達成された。このような高い空間解像度と化学物質感度とにより、乳癌組織における極めて正確なＨＥＲ２判定が可能になった。乳癌分析のための重要なバイオマーカの細胞下分解能は、病理学者たちを、彼らの様々な治療選択肢に導くことに適し得る。上で本発明はほんの一例として説明されており、本発明の範囲および精神に留まりながら改変を行うことが可能であることが。理解されるであろう。
【００９５】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４（ａ）】
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【図４（ｂ）】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９（ａ）】
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【図９（ｂ）】
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【図９（ｃ）】
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【図９（ｄ）】
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【図１０】
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