(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質であって、
―  フラグメントが、配列番号９０で示されるｈＴＲＡＩＬの９５から１２１までの範囲（両端を含む）のアミノ酸から始まり、ｈＴＲＡＩＬの２８１の位置のアミノ酸で終わる、可溶性ｈＴＲＡＩＬタンパク質配列の機能的フラグメントであるか、
哺乳動物細胞において、細胞の表面上のその受容体への結合の際に、アポトーシスシグナルを誘導することができ、かつ、ｈＴＲＡＩＬの１３１、１４９、１５９、１９３、１９９、２０１、２０４、２１２、２１５、２１８および２５１からなる群またはｈＴＲＡＩＬの１９５、２６９および２１４からなる群から選択される位置における１つまたは２つ以上の突然変異を有する、前記機能的フラグメントのホモログであるか、
または、
Ｄ２１８Ｈ突然変異体またはＹ１８９Ｎ−Ｒ１９１Ｋ−Ｑ１９３Ｒ−Ｈ２６４Ｒ−Ｉ２６６Ｒ−Ｄ２６９Ｈ突然変異体から選択される、前記機能的フラグメントのホモログである、ドメイン（ａ）、および
―  両親媒性αヘリックスコンフォメーションを有する、細胞膜に小孔を形成する細胞溶解性エフェクターペプチドの配列である、少なくとも１つのドメイン（ｂ）、
を含み、
ここでドメイン（ｂ）の配列が、ドメイン（ａ）のＣ末端および／またはＮ末端に付着している、前記融合タンパク質。
【請求項２】
ドメイン（ａ）が、ｈＴＲＡＩＬの９５−２８１、ｈＴＲＡＩＬの１１４−２８１、ｈＴＲＡＩＬの１１５−２８１、ｈＴＲＡＩＬの１１６−２８１、ｈＴＲＡＩＬの１１９−２８１、およびｈＴＲＡＩＬの１２１−２８１の範囲（両端を含む）のアミノ酸からなる群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ドメイン（ｂ）が、
―  配列番号３６のピロスリン１、
―  配列番号３７のピロスリン５、
―  配列番号４１の１４アミノ酸合成溶解性ペプチド、
―  配列番号４３の２７アミノ酸ペプチドＦＦｈＣＡＰ１８、
―  配列番号４４のＢＡＭＰ−２８ペプチド、
―  配列番号４５の、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームＣのアナログ、
―  配列番号４６の、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームＡのアナログ、
―  配列番号４７の、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームＢのアナログ、
―  配列番号４８の、インフルエンザウイルスヘマグルチニンのＨＡ２ドメインのフラグメント、
―  配列番号５４のヒトパーフォリンの活性フラグメント、
―  配列番号５５のBacillus thuringensisのパラスポリン２、
―  配列番号１２５の、ＫＬＬＫモチーフを有する合成溶解性ペプチドとＰＤＧＦ受容体のアンタゴニストであるペプチドを含む、融合タンパク質、
―  配列番号１２６のプレウロシジンアナログ、
―  配列番号１２７のプレウロシジンアナログ、および
―  配列番号１２８の合成溶解性ペプチド、
からなる群から選択されるペプチドである、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間、または複数のドメイン（ｂ）の間に、メタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される配列、ウロキナーゼｕＰＡにより認識される配列、およびフューリンにより認識される配列、およびネイティブフューリンにより認識される配列から選択される、プロテアーゼ切断部位を含有するドメイン（ｃ）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
メタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される配列が、Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｙであり、ウロキナーゼｕＰＡにより認識される配列が、Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ａｒｇであり、フューリンにより認識される配列が、Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｒｇであり、およびネイティブフューリンにより認識される配列が、Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  ＬｅｕまたはＨｉｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎである、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ドメイン（ｃ）が、互いに隣接して位置する、メタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される配列と、ウロキナーゼｕＰＡにより認識される配列の組み合わせである、請求項４または５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質であって、ドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドが、輸送ドメイン（ｄ）にさらに結合されており、該輸送ドメイン（ｄ）が、以下：
―（ｄ１）６、７、８、９、１０または１１個のＨｉｓ残基を含む、細胞膜を通って輸送するポリヒスチジン配列、および
―（ｄ２）６、７、８、９、１０または１１個のＡｒｇ残基からなる、細胞膜を通って輸送するポリアルギニン配列、
―（ｄ３）ＰＤ４輸送ドメイン（タンパク質形質導入ドメイン４）Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｌａ、
―（ｄ４）トランスフェリン受容体結合配列Ｔｈｒ  Ｈｉｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｍｅｔ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｐｒｏからなる輸送配列、および
―（ｄ５）ＰＤ５輸送ドメイン（タンパク質形質導入ドメイン５、ＴＡＴタンパク質）Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ、
およびそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、前記融合タンパク質。
【請求項８】
配列（ｄ）が、エフェクターペプチドドメイン（ｂ）のＣ末端またはＮ末端に位置する、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
輸送ドメイン（ｄ）が、ドメイン（ｂ）とドメイン（ｃ）の間、またはドメイン（ａ）とドメイン（ｃ）の間、または２つのドメイン（ｃ）の間に位置する、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
配列（ｄ）が、融合タンパク質のＣ末端に位置する、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
２つの（ｃ）ドメインの間に、Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  ＧｌｙおよびＡｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕから選択される、ＰＥＧ分子の付着のためのリンカーであるドメイン（ｅ）を含む、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
フレキシブルな立体リンカーをドメイン（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）の間にさらに含む、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
立体リンカーが、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ、Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ、Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ、Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｃｙｓ、Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｃｙｓ、Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ、単一のグリシン残基Ｇｌｙ、および単一のシステイン残基Ｃｙｓ、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質：配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号９１；配列番号９２；配列番号９３；配列番号９４；配列番号９５；配列番号９６；配列番号９７；配列番号９８；および配列番号１０２。
【請求項１５】
組み換えタンパク質である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
E. coliにおける遺伝子発現について最適化された、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
以下からなる群から選択される、請求項１７に記載のポリヌクレオチド：配列番号６０；配列番号６１；配列番号６２；配列番号６７；配列番号６８；配列番号６９；配列番号７０；配列番号７１；配列番号７２；配列番号７４；配列番号７５；配列番号７６；配列番号７７；配列番号７８；配列番号７９；配列番号８６；配列番号８７；配列番号８８；配列番号１０８；配列番号１０９；配列番号１１０；配列番号１１１；配列番号１１２；配列番号１１３；配列番号１１４；配列番号１１５；および配列番号１１９。
【請求項１９】
活性成分としての請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質を、薬学的に許容し得る担体と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項２０】
非経口投与用の形態である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ヒトを含む哺乳動物における腫瘍性疾患の処置に用いるための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療的な融合タンパク質、特に組み換え融合タンパク質の分野に関する。より具体的には、本発明は、可溶性ヒトＴＲＡＩＬタンパク質の配列と細胞内またはミトコンドリア膜に小孔を形成するペプチドの配列のフラグメントを含む融合タンパク質、それらを含有する医薬組成物、治療における、特に抗がん剤としてのそれらの使用、ならびに、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、該ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、および、これらの発現ベクターを含有する宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインファミリーのメンバーであるＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド(Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis Inducing Ligand)）タンパク質は、Ａｐｏ２Ｌ（Ａｐｏ２−リガンド）としても知られ、腫瘍細胞およびウイルスに感染した細胞におけるアポトーシスの強力なアクチベーターである。ＴＲＡＩＬは、体内に天然に存在するリガンドである。ＴＲＡＩＬタンパク質、そのアミノ酸配列、コードするＤＮＡ配列の配列番号、および、タンパク質発現系は、EP0835305A1に初めて開示された。
【０００３】
ＴＲＡＩＬタンパク質は、アポトーシス促進性の表面ＴＲＡＩＬ受容体１および２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１／Ｒ２）に結合し、続いてこれら受容体の活性化により、その抗がん活性を発揮する。これらの受容体はＤＲ４およびＤＲ５（デスレセプター(death receptor)４およびデスレセプター５）としても知られ、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーであり、様々なタイプのがん細胞に過剰発現されている。これらの受容体の活性化は、サプレッサー遺伝子ｐ５３に非依存的なアポトーシスの外部シグナリング経路を誘導することができ、これは、活性化されたカスパーゼ８により、実行型(executive)カスパーゼの活性化と、それによる核酸の分解をもたらす。ＴＲＡＩＬの活性化の間に放出されるカスパーゼ８はまた、切断型Ｂｉｄタンパク質の放出を引き起こすこともでき、Ｂｉｄタンパク質はミトコンドリアへ移行されて、ここでチトクロムｃの放出を刺激し、よってデスレセプターからのアポトーシスのシグナルが間接的に増幅される。
ＴＲＡＩＬは、このタンパク質に抵抗性を示す健常細胞においてはアポトーシスを本質的に誘導することなく、腫瘍細胞に対して選択的に作用する。したがって、血液悪性腫瘍および固形腫瘍を含む様々なタイプの広範ながんには作用するが、正常細胞には危害を加えず、潜在的に比較的わずかな副作用しか及ぼさない抗がん剤として、ＴＲＡＩＬの極めて大きな可能性が認識された。
【０００４】
ＴＲＡＩＬタンパク質は、２８１アミノ酸の長さを有するＩＩ型膜タンパク質である。アミノ酸残基１１４−２８１を含むその細胞外領域は、プロテアーゼによる切断により２０ｋＤａサイズの可溶性ｓＴＲＡＩＬ分子を形成し、これも生物学的に活性である。ＴＲＡＩＬおよびｓＴＲＡＩＬの両方の形態は、標的細胞上に存在するＴＲＡＩＬ受容体との相互作用を介して、アポトーシスの引き金を引く能力がある。ＴＲＡＩＬ分子の可溶性部分の強い抗腫瘍活性と、極めて低い全身毒性とが、細胞株テストを使用して実証された。また、ｈＴＲＡＩＬのアミノ酸１１４−２８１に相当するアミノ酸配列を有し、ＩＮＮの下デュラナミン(dulanermin)で知られる、組み換えヒト可溶性ＴＲＡＩＬ（ｒｈＴＲＡＩＬ）を用いた予備的なヒト臨床研究も、その良好な耐性と用量制限毒性がないことを示した。
【０００５】
例えばEP 1 688 498において、ｈＴＲＡＩＬ１２２−２８１の組み換え円順列変異体に対して近年報告されたように、１１４−２８１より短いＴＲＡＩＬのフラグメントもまた、膜のデスレセプターと結合し、これらの受容体を介してアポトーシスを誘導することができる。
【０００６】
しかしながら、患者に対する臨床試験において、単独療法としてのＴＲＡＩＬの実際の有効性は低いことが証明された。また問題となるのは、多くのがん細胞が示す、ＴＲＡＩＬに対する本来の抵抗性または獲得抵抗性であった（例えばWO2007/022214を参照）。抵抗性は様々な機序による可能性があり、がんのタイプに特異的であるか、または患者に依存性である（Thorburn A, Behbakht K, Ford H. TRAIL receptor-targeted therapeutics: resistance mechanisms and strategies to avoid them. Drug Resist Updat 2008; 11: 17-24）。この抵抗性が、ＴＲＡＩＬの抗がん剤としての有用性を制限する。ＴＲＡＩＬに対する抵抗性の機序は完全には理解されていないが、これは、細胞表面受容体レベルからシグナリング経路内の実行型カスパーゼに及ぶＴＲＡＩＬ誘導アポトーシス経路の様々なレベルで現れ得ると考えられる。
【０００７】
この低効率性とＴＲＡＩＬに対する腫瘍の抵抗性とを克服するために、放射線治療剤および化学治療剤を用いた様々な併用療法が考案され、それによってアポトーシスの相乗効果が得られた（WO2009/002947；A. Almasan and A. Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviews 14 (2003) 337-348；RK Srivastava, Neoplasis, Vol 3, No 6, 2001, 535-546、Soria JC et al., J. Clin. Oncology, Vol 28, No 9 (2010), p. 1527-1533）。選択された従来の化学治療剤（パクリタキセル、カルボプラチン）とモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体との組み合わせにおける、がん処置のためのｒｈＴＲＡＩＬの使用は、WO2009/140469に記載されている。しかしながら、かかる組み合わせは必然的に、従来の化学治療または放射線治療の周知の欠陥を暗示する。しかし従来の技術は、ＴＲＡＩＬタンパク質を他のタンパク質またはそのフラグメントと融合させることにより得た、ＴＲＡＩＬに対する細胞の抵抗性を消滅させることを示唆するいかなるデータについても沈黙している。
【０００８】
さらに、ＴＲＡＩＬ治療に関連する問題は、その低い安定性および投与後の体内からの急速な排出であるように見える。
細胞膜またはミトコンドリア膜の崩壊（不連続）の結果としての、がん細胞の破壊および腫瘍増殖の阻害の効果が知られている。膜崩壊することができる細胞溶解作用を有する物質を、抗がん治療と補助抗がん治療の両方として用いる試みがなされている。
細胞溶解活性を有する多くの天然および合成のペプチドおよびタンパク質が知られている。細胞溶解性ペプチドは、小孔形成ペプチドまたは細胞溶解素として記載されている。小孔形成ペプチドの膜表面との相互作用は、正に荷電したペプチドと、負に荷電した細胞膜の表面との非特異的静電相互作用に基づき得る。
【０００９】
これらのペプチドは一般にカチオン性のものであり、したがって主に負に荷電した粒子の表面との静電相互作用が可能である。細胞溶解性ペプチドが、細胞表面上の脂質と、および細胞内に浸透後はミトコンドリア膜表面上の脂質と接触および相互作用すると、細胞膜の連続性の中断が生じ、続いて小サイズの膜貫通小孔が形成され、これにより、イオンを含む細胞質の内容の、細胞外への漏洩が起こり、細胞内での急速かつ不可逆的な電解質不均衡、細胞溶解および細胞死がもたらされる。
【００１０】
小孔形成ペプチドと膜表面との相互作用は、表面上に存在する特定受容体との相互作用も含み得る。
細胞膜に小孔を形成することができる、細菌、植物または哺乳動物由来の天然に存在する周知の細胞溶解性ペプチドは、それらが赤血球および他の真核細胞の溶解を引き起こすために、多くの場合溶血素とも呼ばれる。これらの毒素としては、セクロピンＡおよびＢ、オーレイン（aurein）１．２、シトロピン（citropin）１．１、ディフェンシン（ＨＮＰ−２）、ラクトフェリシンＢ、タキプレシン、ＰＲ−３９、Enterococcus faecalisの細胞溶解素、デルタ溶血素、ジフテリア毒素、Vibrio choleraeの細胞溶解素、Actinia equinaからの毒素、Streptococcus intermediusからの溶解性ペプチド、レンチウイルス溶解性ペプチド、Actinobacillus actinomycetemcomitansの白血球毒素、マガイニン、メリチン、リンフォトキシン、エンケファリン、パラダキシン（paradaxin）、パーフォリン（特にそのＮ末端フラグメント）、Clostridium perfringensからのパーフリンゴリジンＯ（ＰＦＯ／シータ毒素）、およびストレプトリジンが挙げられる。医薬としてのそれらの有用性は、溶血を引き起こすその能力によって制限される。
天然の細胞溶解性ペプチドは、例えばR. Smolarczyk et al., Postepy Hig. Med. Dosw., 2009; 63: 360-368に記載されている。
【００１１】
また、既知の合成細胞溶解性小孔形成ペプチドも存在する。これらは、溶血特性を欠くように、免疫原性がより低いように、または、例えばＶＥＧＦＲ（血管内皮成長因子受容体）ファミリーの受容体およびＥＧＦＲ（上皮成長因子の受容体）ファミリーの受容体などの細胞標的に対して、高い結合特異性を可能にする表面を有するように、設計されている。これらは多くの場合、天然の細胞溶解性ペプチドフラグメントのハイブリッドであり、例えば、セクロピンＡフラグメントとマガイニン２フラグメントのハイブリッドＣＡ（１−８）ＭＡ（１−１２）、またはセクロピンＡフラグメントとメリチンＣＡＭＥＬフラグメントのハイブリッド（ＣＡ（１−７）ＭＲＬ（２−９））である。また、その一部がＤ−アミノ酸の形態であるアミノ酸のリシン、アルギニンおよびロイシンからなる、既知の合成細胞溶解性ペプチドＤ−Ｋ４−Ｌ２−Ｒ９およびＤ−Ｋ６−Ｌ９も存在する。さらに、インテグリンαν−β３と結合したＲＧＤモチーフとＤ−アミノ酸ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫで構成されるエフェクタードメインとを含む、既知の合成キメラペプチドＲＧＤ−４ＣＤ（ＫＬＡＫＬＡＫ）２も存在し、また、細胞への侵入を可能にするＰＴＤ−５モチーフとＤ−アミノ酸ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫで構成されるエフェクタードメインとを含む、既知の合成キメラペプチドＰＴＤ−５Ｄ（ＫＬＡＫＬＡＫ）２も存在する（例えばR. Smolarczyk et al., Postepy Hig. Med. Dosw., 2009; 63: 360-368を参照）。その他のよく知られた合成の細胞溶解性ペプチドは、例えばRegen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159: 566-571, 1989に記載されている。
【００１２】
ペプチドの膜への付着後に生じる膜の破壊は、「バレルステーブ」（バレルステーブモデル）のメカニズム、「ドーナツ型形状」（トロイダル小孔モデル）のメカニズム、または「カーペット」メカニズムによって起こり得る（例えば、R. Smolarczyk et al., Postepy Hig. Med. Dosw., 2009; 63: 360-368を参照）。
「バレルステーブ」のメカニズムは、少なくとも２３アミノ酸の長さを有するα−ヘリックスコンフォメーションの両親媒性ペプチドについて観察される。例えば、「バレルステーブ」のメカニズムにより膜の破壊を引き起こすペプチドは、グラミシジンＡ、アラメチシン（alameticin）、パーフォリン、ピロスリン（pilosulin）、反復ＫＬＡＫモチーフを有する合成ペプチド、カセリシジン、Entamoeba histolyticaから単離されたペプチド、パラスポリン、およびセクロピンである。「トロイダル小孔モデル」のメカニズムにより膜の破壊を引き起こすペプチドには、例えばメリチンおよびマガイニンが含まれる。例えば、「カーペット」モデルにより膜の破壊を引き起こすペプチドは、セクロピンＡおよびＢである。
【００１３】
小孔の形成による細胞膜の崩壊は、高い正電荷のペプチドと負に荷電した膜成分との相互作用によっても引き起こされ得る。このような特性は、特に、グラニュライシン、メリチンのアナログおよび誘導体、Ｋ（Ｌ）ｘＲモチーフを含むペプチド、タキプレシン、ボンベシン、マガイニンおよびビスコトキシンを示す。
標的細胞の膜における小孔の形成はまた、ペプチドの酵素活性とも関連し得る。ホスホリパーゼＡの酵素活性は、例えば、ホスファチジルコリンおよびスフィンゴミエリンに対する特異的ホスホジエステラーゼ活性を有するホスホリパーゼ、非特異的な細胞溶解活性を有する溶血素および細胞溶解素、または例えばコレステロールなどを含有する生体膜に対する細胞溶解活性を有する溶血素および細胞溶解素により、示される。細胞またはミトコンドリア膜に小孔の形成をもたらすこ種類の酵素活性は、リステリオリシン、イクイナトキシン（equinatoxin）、ホスホリパーゼＰＣ−ＰＬＣおよびClostridium perfringensからのα毒素によって示される。
【００１４】
腫瘍細胞を標的とすることができるドメインを有する小孔形成ペプチドの、周知のコンジュゲートおよびキメラも存在する。標的化のために、腫瘍細胞の表面上で過剰発現される抗原、炭水化物部分、または成長因子受容体が使用される。標的化送達は、細胞溶解活性に必要とされる高レベルの小孔形成ペプチドを、細胞表面上に提供する。
標的化された小孔形成アクチノポリン(actinoporin)の使用は、Panchal RG. et al., Poreforming proteins and their application in biotechnology. Curr Pharm Biotechnol 2002, 3:99-115；Panchal RG: Novel therapeutic strategies to selectively kill cancer cells. Biochem Pharmacol 1998, 55:247-252、およびHoskin DW, Ramamoorthy A: Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides. Biochim Biophys Acta-Biomembr 2008, 1778:357-87に記載されている。
【００１５】
また、小孔形成ペプチドおよびタンパク質には、適切な遺伝子改変によって、ならびに適切なリガンドまたは抗体への化学的接合によって、腫瘍関連抗原および受容体に指向する能力を付与できることが知られている。かかる改変は、Bacillus thuringiensisのｄ−エンドトキシン、Actinia equinaからのイクイナトキシンＩＩ、Stichodactyla helianthusのスチコリシンＩ（sticholysin I）、およびCorynebacterium diphtheriaeのジフテリア毒素に対して記載されている（Soletti RC., Potentiation of anticancer-drug cytotoxicity by sea anemone pore-forming proteins in human glioblastoma cells. Anti-Cancer Drugs 2008, 19:517-525；Pederzolli C,: Biochemical and cytotoxic properties of conjugates of transferrin with equinatoxin-II, a cytolysin from a sea anemone. Bioconjugate Chem 1995, 6:166-173；van der Spek JC.: Fusion protein toxins based on diphtheria toxin: Selective targeting of growth factor receptors of eukaryotic cells. Appl Chimeric Genes Hybrid Proteins Pt B 2000, 327:239-249）。
【００１６】
また記載されているのは、小孔形成スチコリシン毒素Ｉと腫瘍特異的抗原Ｃ２に対するモノクローナル抗体とからなる融合タンパク質、および結腸がん細胞株モデルでの処置におけるその有用性である（Tejuca M. et al., Construction of an immunotoxin with the pore forming protein St1 and/or C5, a monoclonal antibody against a colon cancer cell line, Int. Immunopharmacol. 2004, 4:731-744）。ジフテリア毒素およびインターロイキン２またはＥＧＦを含む多数の融合タンパク質、および標的受容体を過剰発現する細胞を破壊するそれらの潜在能力も記載されている（Murphy JR, van der Spek JC, Targeting diphtheria-toxin to growth-factor receptors, Semin Cancer Biol 1995, 6:259-267）。
また、腫瘍環境におけるエフェクタータンパク質の放出と、その結果として、腫瘍細胞への内在化を可能にするために、細胞溶解性ペプチドを含む融合タンパク質分子内の特定のプロテアーゼによって認識される切断部位の使用も知られている。例えば、Panchal Rら（Nat Biotechnol 1996, 14:852-856）は、腫瘍環境中に存在するプロテアーゼによって活性化されるカテプシンＢによって認識される切断部位をそれらの配列中に含む、α溶血素を開示した。
【００１７】
前立腺がん細胞（ＰＳＡ）のプロテアーゼによって切断された場合に活性化される、細菌性細胞溶解性小孔形成タンパク質の不活性な前駆体である、周知の改変プロアエロリシン（ＰＡ）も存在する（Williams S.A. et al., JNCI J. Natl. Cancer Inst. (2007) 99 (5): 376-385）。
US5817771B1には、腫瘍細胞に選択的に結合する要素としての抗体または抗原を有する小孔形成細胞溶解性ペプチドと、腫瘍環境において細胞溶解性ペプチドの選択的活性化を可能にするリンカー、特に腫瘍環境において特異的に過剰発現される例えばプロテアーゼなどの酵素によって認識される切断部位とのコンジュゲート（融合タンパク質を含む）が開示されている。
Baruaら（Cancer Letters 293 (2010) 240-253）は、ＴＲＡＩＬに対して抵抗性であり、デスレセプターアゴニスト抗体ＤＲ４とＤＲ５を用いた処置に非感受性の前立腺がん細胞株が、ＫＬＡＫ配列を含む合成カチオン性両親媒溶解性ペプチドＫＬＡによるこれらの細胞の処置後に、これらの抗体に対して感受性となることが報告されている。
【００１８】
本発明は、ＴＲＡＩＬに由来するドメインと、哺乳動物細胞の細胞および／またはミトコンドリア膜に対する小孔形成特性を有する細胞溶解性エフェクターペプチドのドメインを含有する、抗がん特性を有する融合タンパク質を提供する。
本発明のタンパク質の２つのドメインのそれぞれは、異なる機能を有している。ｈＴＲＡＩＬ由来のドメインの存在により、本発明のタンパク質はがん細胞に選択的に指向され、ここでタンパク質の要素はそれらの効果を発揮する。特に、ＴＲＡＩＬドメインは細胞と結合した後、アポトーシスを誘発するその活性を発揮することができ、およびエフェクターペプチドは、細胞および／またはミトコンドリア膜に小孔を形成し、がん細胞の溶解を引き起こす活性を発揮することができる。
【００１９】
本発明のタンパク質の腫瘍環境への送達は、身体の健常な細胞に対する毒性および副作用を最小限に抑えることができ、医薬の投与頻度の低下を可能とする。さらに、本発明によるタンパク質の使用による標的化療法は、前から知られている、高い毒性および高用量投与の必要性に起因した、非特異的療法の効率が低いという問題を、植物または細菌毒素を用いた細胞またはミトコンドリア膜での小孔形成に基づいて、回避することが可能となる。
【００２０】
本発明の融合タンパク質は、多くの場合、可溶性ｈＴＲＡＩＬおよびその配列のフラグメントを含むその変異体よりも効き目があることが判明した。これまで、本発明の融合タンパク質に使用されるエフェクターペプチドは、好ましくない動態、非特異的プロテアーゼによる急速な分解、および経路の活性化の正しい順序（標的部位におけるエフェクターペプチドの適切な作用を可能にするのに必要である）の欠如により引き起こされる体内への蓄積のために、医学の分野ではほとんど使用されていなかった。融合タンパク質へのエフェクターペプチドの取り込みは、それらの作用が所望される部位への、それらの選択的な送達を可能にする。さらに、エフェクターペプチドの付着は、タンパク質の質量を増やし、その結果半減期が延長し、腫瘍中のタンパク質貯留が増加し、その効率が増進する。
新規な融合タンパク質は、それらの個々の天然細胞溶解性ペプチドと比較して、少なくとも低減されたか限定された、または実質的に排除された溶血活性を有する。
【００２１】
加えて、新規の融合タンパク質はまた、多くの場合、ＴＲＡＩＬに対する自然の抵抗性または誘導抵抗性にも打ち勝つ。ほとんどの場合、抵抗性を克服することは、融合タンパク質の細胞またはミトコンドリア膜の脂質への結合および小孔の形成が、細胞外への二価イオンの漏出を引き起こし、その結果として細胞膜電位が不安定となることによる。ミトコンドリア膜脂質への結合の結果として、シトクロムＣ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏタンパク質およびＡＩＦ因子の細胞質への放出が起こり、影響を受けた細胞内のアポトーシス促進性カスパーゼの活性化を引き起こす。ミトコンドリア膜の分解はカスパーゼ９の活性化も引き起こし、アポトーシスの誘導をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
図の説明
【図１】図１は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１１ａの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんＡ５４９を負ったCby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【図２】図２は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１１ａの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんＡ５４９を負ったCby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【図３】図３は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１１ａの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんＡ５４９を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【図４】図４は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１１ａの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんＡ５４９を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【図５】図５は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１１ａの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【図６】図６は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１１ａの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【図７】図７は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１１ａの本発明の融合タンパク質で処置された、前立腺がんＰＣ３を負ったCby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【図８】図８は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１１ａの本発明の融合タンパク質で処置された、前立腺がんＰＣ３を負ったCby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【図９】図９は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１１ａの本発明の融合タンパク質で処置された、膵臓がんＰＡＮＣ−１を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【００２３】
【図１０】図１０は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１１ａの本発明の融合タンパク質で処置された、膵臓がんＰＡＮＣ−１を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【図１１】図１１は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１１ａの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【図１２】図１２は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１１ａの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【図１３】図１３は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１６ａの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＳＷ６２０を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【図１４】図１４は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１６ａの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＳＷ６２０を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【図１５】図１５は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１６ａの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＣｏｌｏ２０５を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【図１６】図１６は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１６ａの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＣｏｌｏ２０５を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【図１７】図１７は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１１ａの本発明の融合タンパク質で処置された、子宮肉腫ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【図１８】図１８は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１１ａの本発明の融合タンパク質で処置された、子宮肉腫ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【図１９】図１９は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１６ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、膵臓がんＭＩＡ  Ｐａｃａ−２を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【００２４】
【図２０】図２０は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１６ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、膵臓がんＭＩＡ  Ｐａｃａ−２を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【図２１】図２１は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１６ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【図２２】図２２は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１６ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【図２３】図２３は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１６ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、肝細胞がんＨｅｐＧ２を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【図２４】図２４は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１６ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、肝細胞がんＨｅｐＧ２を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【図２５】図２５は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１６ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、肝がんＰＬＣ／ＰＲＦ／５を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【図２６】図２６は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１６ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、肝がんＰＬＣ／ＰＲＦ／５を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の詳細な説明
本発明は、融合タンパク質であって、
―  フラグメントがｈＴＲＡＩＬ９５より小さくない位置のアミノ酸から始まり、ｈＴＲＡＩＬ２８１の位置のアミノ酸で終わる、可溶性ｈＴＲＡＩＬタンパク質配列の機能的フラグメントであるか、または、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは８５％の同一性を有する、前記機能的フラグメントのホモログである、ドメイン（ａ）、および
―  細胞膜に小孔を形成する細胞溶解性エフェクターペプチドの配列である、少なくとも１つのドメイン（ｂ）、
を含み、
ここでドメイン（ｂ）の配列が、ドメイン（ａ）のＣ末端および／またはＮ末端に付着している、前記融合タンパク質に関する。
本発明に従う「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって共に繋がった複数のアミノ酸から作られる分子として理解されるべきである。それゆえに、本発明による「ペプチド」という用語は、オリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を含む。
本発明において、ペプチドのアミノ酸配列は、当該技術分野で採用されている従来の方式で、ペプチドのＮ末端（Ｎ末）からそのＣ末端（Ｃ末）へ向かう方向に提示されるだろう。それゆえに、いかなる配列も、その線状で提示されたものの左側にＮ末端を、右側にＣ末端を有する。
【００２６】
用語「可溶性ｈＴＲＡＩＬタンパク質の配列の機能的な可溶性フラグメント」とは、哺乳動物細胞において、細胞の表面上のその受容体への結合の際に、アポトーシスシグナルを誘導することができる可溶性ｈＴＲＡＩＬタンパク質の任意のかかるフラグメントを表すと理解されるべきである。
また当業者には、ＴＲＡＩＬ配列の少なくとも７０％または８５％の相同性の存在が当技術分野で知られていることが、理解されるであろう。
本発明の融合タンパク質中のエフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ｈＴＲＡＩＬタンパク質でもｈＴＲＡＩＬタンパク質の一部またはフラグメントでもないことを、理解すべきである。
本発明の融合タンパク質は、ドメイン（ａ）のＣ末端および／またはＮ末端に付着した、エフェクターペプチドの少なくとも１つのドメイン（ｂ）を組み込んでいる。
配列ｈＴＲＡＩＬにより、GenBankデータベースのアクセッション番号P505591およびEP0835305A1に公開されたｈＴＲＡＩＬの既知の配列および、本発明の配列表に配列番号９０として提示されたものと理解される。
【００２７】
特定の態様において、ドメイン（ａ）は、ｈＴＲＡＩＬ９５からｈＴＲＡＩＬ１２１までの範囲（両端を含む）のアミノ酸で始まり、アミノ酸ＴＲＡＩＬ２８１で終わる、ＴＲＡＩＬ配列のフラグメントである。
具体的には、ドメイン（ａ）は、ｈＴＲＡＩＬ９５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１９−２８１、およびｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１に対応する配列からなる群から選択してもよい。当業者にとって、ｈＴＲＡＩＬ９５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１６−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１９−２８１、およびｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１は、ＴＲＡＩＬの既知の配列においてそれぞれ９５番、１１４番、１１５番、１１６番、１１９番、および１２１番で表されたアミノ酸で始まり、最後のアミノ酸２８１で終わるヒトＴＲＡＩＬタンパク質のフラグメントを表すことは、明白であろう。
他の具体的態様において、ドメイン（ａ）は、ｈＴＲＡＩＬ９５より小さくない位置のアミノ酸で始まり、アミノ酸ｈＴＲＡＩＬ２８１で終わる可溶性ＴＲＡＩＬタンパク質配列の機能的フラグメントのホモログであって、その配列は、少なくとも７０％、好ましくは８５％、オリジナル配列と一致する。
この態様の具体的な変形において、ドメイン（ａ）は、ｈＴＲＡＩＬ９５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１６−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１９−２８１、およびｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１に対応する配列からなる群から選択されるフラグメントのホモログである。
ＴＲＡＩＬフラグメントのホモログは、このフラグメントのアミノ酸配列の変更／改変であると理解されるべきであり、ここで、１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、およびアミノ酸の１５％以下を含む、少なくとも１個のアミノ酸が変化しており、ここで、改変された配列のフラグメントは、ＴＲＡＩＬ配列の機能性すなわち、哺乳動物細胞において細胞表面のデスレセプターに結合してアポトーシスを誘導する能力を保存している。アミノ酸配列の改変は、例えば、アミノ酸の置換、欠失および／または付加を含んでもよい。
好ましくは、改変された配列を有するＴＲＡＩＬフラグメントのホモログは、ＴＲＡＩＬのネイティブな(native)フラグメントと比較して、デスレセプターＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）またはＤＲ５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）との改変された親和性を示す。
【００２８】
「改変された親和性」という用語は、上昇された親和性および／または受容体の選択性が変更された親和性を指す。
好ましくは、改変された配列を有するＴＲＡＩＬフラグメントのホモログは、ＴＲＡＩＬのネイティブなフラグメントと比較して、デスレセプターＤＲ４およびＤＲ５に対して上昇した親和性を示す。
特に好ましくは、改変された配列を有するＴＲＡＩＬフラグメントのホモログは、デスレセプターＤＲ４と比較して、デスレセプターＤＲ５に対して上昇した親和性を示し、すなわちＤＲ５／ＤＲ４選択性の上昇を示す。
また好ましくは、改変された配列を有するＴＲＡＩＬフラグメントのホモログは、デスレセプターＤＲ１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３）および／またはＤＲ２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ４）に対する親和性に関連して、該受容体ＤＲ４および／またはＤＲ５に対する選択性の上昇も示す。
【００２９】
デスレセプターＤＲ４およびＤＲ５対する親和性ならびに／または選択性の上昇をもたらすＴＲＡＩＬの改変は、当業者に知られている。例えば、Tur V, van der Sloot AM, Reis CR, Szegezdi E, Cool RH, Samali A, Serrano L, Quax WJ. DR4-selective tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) variants obtained by structure-based design. J. Biol. Chem. 2008 Jul 18;283(29):20560-8には、ＤＲ４に対して上昇した選択性を有するＤ２１８Ｈ突然変異が記載され、また、Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP.Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis.2009 Jun;14(6):778-87には、ＤＲ４に対して低下した親和性を有する、Ｄ２６９Ｈ突然変異が記載されている。ＤＲ１およびＤＲ２受容体と比較した、ＤＲ４およびＤＲ５から選択された１つの受容体に対する親和性の上昇、およびＤＲ４と比較した受容体ＤＲ５に対する親和性の上昇をもたらすｈＴＲＡＩＬ突然変異体は、WO2009077857およびWO2009066174にも記載されている。
【００３０】
好適な突然変異は、ネイティブなｈＴＲＡＬの位置における１３１、１４９、１５９、１９３、１９９、２０１、２０４、２０４、２１２、２１５、２１８および２５１からなる群から選択される１つまたは２つ以上の突然変異であり、特に、突然変異は、リシン、ヒスチジンもしくはアルギニンなどの塩基性アミノ酸、またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸などの酸性アミノ酸とのアミノ酸置換を含む。特に、WO2009066174に記載のように、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｋ、Ｒ１４９Ｉ、Ｒ１４９Ｍ、Ｒ１４９Ｎ、Ｒ１４９Ｋ、Ｓ１５９Ｒ、Ｑ１９３Ｈ、Ｑ１９３Ｋ、Ｎ１９９Ｈ、Ｎ１９９Ｒ、Ｋ２０１Ｈ、Ｋ２０１Ｒ、Ｋ２０４Ｅ、Ｋ２０４Ｄ、Ｋ２０４Ｌ、Ｋ２０４Ｙ、Ｋ２１２Ｒ、Ｓ２１５Ｅ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｄ、Ｄ２１８Ｙ、Ｄ２１８Ｈ、Ｋ２５１Ｄ、Ｋ２５１ＥおよびＫ２５１Ｑからなる群から選択される１つまたは２つ以上の突然変異を挙げることができる。
【００３１】
好適な突然変異はまた、アミノ酸１９５、２６９および２１４からなる群から選択されるネイティブなｈＴＲＡＩＬの位置における１つまたは２つ以上の突然変異でもあり、特に突然変異は、リシン、ヒスチジンまたはアルギニンなどの塩基性アミノ酸とのアミノ酸置換を含む。特に、WO2009077857に記載のように、Ｄ２６９Ｈ、Ｅ１９５ＲおよびＴ２１４Ｒからなる群から選択される、１つまたは２つ以上の突然変異を挙げることができる。
具体的な態様において、ｈＴＲＡＩＬのフラグメントのホモログであるドメイン（ａ）は、WO2009066174に記載のような、ネイティブなＴＲＡＩＬ配列のＤ２１８Ｈ突然変異体、または、Gasparian ME et al. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. 2009 Jun; 14(6): 778-87に記載のような、ネイティブなＴＲＡＩＬ配列のＹ１８９Ｎ−Ｒ１９１Ｋ−Ｑ１９３Ｒ−Ｈ２６４Ｒ−Ｉ２６６Ｒ−Ｄ２６９Ｈ突然変異体から選択される。
【００３２】
ドメイン（ａ）、すなわちＴＲＡＩＬのフラグメントは、融合タンパク質の構築物の、細胞表面上のデスレセプターへの結合を担うドメインである。さらに、結合の際にドメイン（ａ）は、その既知のアゴニスト活性、すなわちアポトーシスの外因性経路の活性化を発揮するであろう。
本発明の融合タンパク質のドメイン（ｂ）は、真核細胞に対する細胞溶解活性を有するエフェクターペプチドのドメインである。
本発明の融合タンパク質の特定の態様において、融合タンパク質のドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、配列番号３４、配列番号５６、および配列番号１２５〜配列番号１３２からなる群から選択される、がん細胞に対する小孔形成活性を有するペプチドである。
【００３３】
細胞溶解活性を有するペプチドについては、細胞膜において、および細胞への浸透後にはミトコンドリア膜において、小孔を形成する能力を有し、これにより膜の連続性を破壊するペプチドを意味する。膜の破壊により、イオンを含む細胞質の内容物の、細胞外への漏出が起こり、これにより細胞内で急速かつ不可逆的な電解質不均衡と、その破壊（細胞溶解）が引き起こされる。
細胞またはミトコンドリア膜に小孔を形成し、したがって細胞溶解を引き起こすペプチドの能力は、当業者に知られている細胞膜の透過化を試験する方法によって決定することができ、例えば、以前に細胞に適用された細胞内物質、例えばＡＴＰまたは放射性標識マーカーなどの、細胞からの放出を測定することにより、または、細胞が無傷であれば生じないトリパンブルーなどの色素の取り込みを測定することによって、決定することができる。
【００３４】
本発明の細胞溶解性エフェクターペプチドは、天然ペプチドまたは合成ペプチドのいずれであってもよい。
天然の細胞溶解性小孔形成ペプチドは、細菌外毒素であってよく、例えばα−ＨＬ、アエロリシン、パーフリンゴリシン、ニューモリシン、ストレプトリジンＯ、リステリオリシン、Bacillus thuringensis毒素、Bacillus thuringensisのパラスポリン、溶血素またはコリシンなどのE.coliからの溶菌分子などである。
天然の細胞溶解性小孔形成ペプチドは真核ペプチドであってもよく、例えば、ヒトグラニュライシン、オーストラリアのアリMyrmecia Pilosulaの毒液からのピロスリン１およびピロスリン５を含むピロスリンファミリー、アフリカのカエルXenopus laevisの皮膚からのマガイニン２などのマガイニン、アフリカのカエルLitoria raniformisの皮膚からのオーレイン１．２、アマガエルLitoria citropaの皮膚からのシトロピン１．１、ミツバチApis melliferaの毒液からメリチン、ヒト細胞から単離されたαディフェンシンおよびβディフェンシンなどのディフェンシン、牛乳からのラクトフェリンＢなどのラクトフェリン、カニTachypleus tridentatusの白血球からのタキプレシン、セクロピンＡおよびＢ、またはPleuronectes americanusから単離されたプレウロシジン（pleurocidin）である。
【００３５】
合成の細胞溶解性小孔形成ペプチドは、以下のような既知の細胞溶解性ペプチドであってもよい：セクロピンＡフラグメントとマガイニン２フラグメントのハイブリッドＣＡ（１−８）ＭＡ（１−１２）、セクロピンＡフラグメントとメリチンＣＡＭＥＬのフラグメントのハイブリッド（ＣＡ（１−７）ＭＲＬ（２−９））、正に荷電したアミノ酸であってその一部がＤ−アミノ酸の形態であるリシン、アルギニンおよびロイシンからなる、合成細胞溶解性ペプチド、例えばＤ−Ｋ４−Ｌ２−Ｒ９およびＤ−Ｋ６−Ｌ９、および、Ｄ−アミノ酸モチーフＫＬＡＫＬＡＫまたはその反復から構成されるドメインを含有するペプチド、例えば（ＫＬＡＫＬＡＫ）２、２つの溶解性ペプチドの合成ハイブリッドペプチド、例えばハイブリッドマガイニン−ボンベシンおよびセクロピン−メリチンなど、合成細胞溶解性ペプチドと、ＴＲＡＩＬ受容体以外の細胞表面上に存在する受容体に結合するドメイン、または細胞への浸透を可能にするドメインとを含有する合成融合ペプチド、または、ＫＬＬＬＫおよびＫＬＬＫ系列からなる両親媒性ヘリックスモデルに基づく溶解性ペプチド、および／または哺乳動物由来の改変型もしくは切断型ペプチド（好ましくは形質導入または標的ドメインとの融合形態）。
【００３６】
本発明の融合タンパク質のドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、高い正電荷を有するペプチドと負に荷電した膜との直接的な相互作用によって、細胞またはミトコンドリア膜に小孔を形成するペプチドであってもよい。
この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、配列番号３４（ヒトグラニュライシンの活性型）、配列番号３５（１５アミノ酸合成溶解性ペプチド）、配列番号３８（タキプレシンからのペプチド）、配列番号３９（融合ペプチドボンベシン−マガイニン２）、配列番号４０（マガイニン２）、配列番号４２（２６アミノ酸ハイブリッドペプチドセクロピン−メリチン）、配列番号５３（ビスコトキシンＡ３（ＶｔＡ３））、および配列番号５６（ＥＧＦインヒビターと合成溶解性ペプチドを含む、融合ペプチド）、配列番号１３２（メリチン）、配列番号１２９および配列番号１３１（ボンベシンと、ＢＭＡＰ２７（Ｂ２７）またはＢＭＡＰ２８（Ｂ２８）の切断型を含む、融合ペプチド）、配列番号１３０（１７アミノ酸合成ペプチド）として指定される。
本発明の融合タンパク質のドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、生体膜との相互作用を可能にする両親媒性αヘリックスコンフォメーションを有する、小孔形成ペプチドであってもよい。
【００３７】
この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、配列番号３６（ピロスリン１）、配列番号３７（ピロスリン５）、配列番号４１（１４アミノ酸合成溶解性ペプチド）、配列番号４３（２７アミノ酸ペプチドＦＦ／ＣＡＰ−１８）、配列番号４４（ＢＡＭＰ−２８ペプチド）、配列番号４５（Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームＣのアナログ）、配列番号４６（Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームＡのアナログ）、配列番号４７（Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームＢのアナログ）、配列番号４８（インフルエンザウイルスヘマグルチニンのＨＡ２ドメインのフラグメント）、配列番号５４（ヒトパーフォリンの活性フラグメント）、配列番号５５（Bacillus thuringensisからのパラスポリン２）、配列番号１２５（ＫＬＬＫモチーフを有する合成融合ペプチド）、配列番号１２６および配列番号１２７（プレウロシジンアナログ）、配列番号１２８（ＫＬＬＫモチーフを有する合成ペプチド）として指定される。
本発明の融合タンパク質のドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、ホスホリパーゼ、溶血素または細胞溶解素の群から選択される、酵素活性を有する小孔形成ペプチドであってもよい。この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、配列番号４９（ホスホリパーゼＣ活性を有するClostridium perfringensからのα毒素のＮ末端ドメイン）、配列番号５０（リステリオリシンＯ）、配列番号５１（ホスホリパーゼＰＣ−ＰＬＣ）、および配列番号５２（イクイナトキシン（equinatoxin）ＥｑＴｘ−ＩＩ）として指定される。
【００３８】
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、サポニン様ファミリーに属する、ヒトグラニュライシンの活性型であるペプチドであってもよく、これは、膜の脂質に強い結合能力を示す（P. M. Lydyard, A. Whelan, M. W. Fanger, "Krotkie wyklady: Immunologia", Wydawnictwo Naukowe PWN 2001）。膜に結合する能力により、グラニュライシンは、ミトコンドリア膜を分解することができる。このプロセスは、シトクロムＣ、タンパク質ＳＭＡＣ／ＤｉａｂｌｏおよびＡＩＦ因子の細胞質への放出をもたらし、これはアポトーシスカスケードの活性化およびカスパーゼ９の活性化を引き起こし、アポトーシスの誘導ももたらす。グラニュライシンは、Ｂｉｄタンパク質も活性化してｔＢｉｄを形成し、これはミトコンドリアの膜における小孔形成に直接関与する（Zhang et al, The Journal of Immunology, 182: 6993-7000, 2009）。
【００３９】
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号３４で示される、８３アミノ酸ペプチドである。
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、ロイシン（Ｌ）およびリシン（Ｋ）からなる合成細胞溶解性ペプチド、およびハチ毒液からの天然の溶解性ペプチドまたはAmeba histoliticaからのペプチドに構造的に類似したものであってもよい（Makovitzki, A., Suppression of Human Solid Tumor Growth in Mice by Intratumor and Systemic Inoculation of Histidine-Rich and pH-Dependent Host Defense-like Lytic Peptides, cancer Research, 2009）。前記アミノ酸の含量が高いために、このペプチドは強い正電荷を有し、腫瘍形質転換細胞の膜との選択的相互作用と、「バレルステーブ」メカニズムによる小孔形成により、これら構造内への浸透が可能である。
【００４０】
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号３５で示される、１５アミノ酸ペプチドである。
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、ペプチド・ピロスリン１であってよく、これは、オーストラリアのアリMyrmecia Pilosulaの毒液に由来するカチオン性分子である。ピロスリン１は、配列中に定期的に反復される高含量のリシンおよびアルギニンを有するペプチドである。これらのアミノ酸の含量が高いために、このペプチドは強い正電荷を有し、がん細胞の膜との選択的相互作用と、「バレルステーブ」メカニズムを介した小孔形成が可能である（Kourie et al., Am J Physiol Cell Physiol, 278: 1063-1087, 2000）。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号３６で示される、５６アミノ酸ペプチドである。
【００４１】
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、ペプチド・ピロスリン５であってよく、これは細胞膜とのイオン相互作用の原因であり、小孔形成をもたらし、その結果として腫瘍増殖の阻害をもたらす。ピロスリン５は、オーストラリアのアリMyrmecia Pilosulaの毒液に由来するピロスリンファミリーに属するペプチドである。このペプチドはその構造中にアミノ酸であるリシン、アラニン、およびアスパラギン酸の周期的な反復パターンを有し、正の電荷を付与して、これにより腫瘍細胞表面との相互作用を増強することができる。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号３７で示される、１００アミノ酸ペプチドである。
【００４２】
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、カニTachypleus tridentatusの白血球から単離されたカチオン性ペプチドのタキプレシンであってもよい。真核細胞内に浸透すると、タキプレシンはミトコンドリア膜に高い親和性を示し、「バレルステーブ」メカニズムを介したそれらの不安定化と、シトクロムＣ、タンパク質ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯおよびＡＩＦ因子などの因子の細胞質への放出を引き起こし、これは細胞死につながる（Chen, Y., et al., RGD-Tachyplezin inhibits tumor growth. Cancer Res, 2001. 61(6): p. 2434-8；Ouyang, G.L., et al., Effects of tachyplesin on proliferation and differentiation of human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells. World J Gastroenterol, 2002. 8(6): p. 1053-8）。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号３８で示される、１７アミノ酸ペプチドである。
【００４３】
ドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、真核細胞に対する細胞溶解活性を有する融合ペプチド・ボンベシン−マガイニンであってもよい。
マガイニンファミリーは、アフリカのカエルXenopus laevisの皮膚から単離された２１−２７アミノ酸ポリペプチドからなる。ペプチドの両親媒性αヘリックス構造は、「バレルステーブ」メカニズムを介してそれらが細胞膜に小孔を形成することを可能とする（Matsuzaki et al, Biochim Biophys Acta, 1327:119-130, 1997）。ボンベシンは、カエルの皮膚から単離された高い正電荷を有する１４アミノ酸のペプチドであり、腫瘍ホーミングペプチドの群に属し、したがって、いくつかのタイプの固形腫瘍および血液がんの表面に高い親和性を示し、これは細胞膜の強い負電荷によって特徴付けられる（Moody et al, Peptides, 1983; volume 4: 683-686）。ボンベシンは、ニューロメジンＢの細胞受容体に結合することができ、ニューロメジンＢは人体内に存在するボンベシンの近接したホモログであって、腫瘍細胞の表面に高度に発現される。これはボンベシンの特異性と腫瘍に占領された組織における蓄積のレベルとを著しく増大させ、一方で全身毒性を最小化する。毒性ペプチドとボンベシンのコンジュゲートは、個々のタンパク質と比較して増強された抗腫瘍活性を示す（Huawei et al, Mol. Pharmaceutics, 2010; 2:586-596）。マガイニンは、腫瘍細胞の受容体への制限された結合特性を特徴とし、その結果、その細胞毒性は、高濃度でのみ現れる。マガイニンとボンベシンを含む融合ペプチドが、腫瘍細胞に対する特異性および細胞毒性の増強を可能とすることが示されている（Liu S. et al., Enhancement of cytotoxicity of antimicrobial peptide magainin II in tumor cells by bombesin-targeted delivery. Acta Pharmacol Sin. 2011 Jan;32(1):79-88）。
【００４４】
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号３９で示される、４０アミノ酸ペプチドである。
ドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドはまた、真核細胞に対する細胞溶解活性を有する、ボンベシンとＢＭＡＰ２７（Ｂ２７）またはＢＭＡＰ２８（Ｂ２８）の切断型バージョンとを含む融合ペプチドであってもよい。かかるキメラペプチドは、細胞毒性活性および低減された全身毒性を示す（Cai H. et al., Selective apoptotic killing of solid and hematologic tumor cells by bombesin-targeted delivery of mitochondria-disrupting peptides, Mol. Pharmaceutics, 2010, 7(2), pp. 586-596）。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号１２９で示される３１アミノ酸ペプチド、および添付の配列表に配列番号１３１で示される２９アミノ酸ペプチドである。
【００４５】
ドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、真核細胞に対する細胞溶解活性を有し、細胞およびミトコンドリア膜に小孔を形成するマガイニン２ペプチドであってもよい。特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号４０で示される、２３アミノ酸ペプチドである。
真核細胞に対する活性を有するドメイン（ｂ）の別の細胞溶解性エフェクターペプチドは、合成溶解性ペプチドであってもよい。両親媒性αヘリックスタンパク質としての、式（ＫＬＡＫＫＬＡ）ｎ（式中、ｎはモチーフの反復数である）の合成ペプチドは、細胞への侵入後に、負に荷電したミトコンドリア膜内に蓄積され、小孔の形成とミトコンドリアの静電位の不安定化を引き起こし、これにより選択されたがん細胞株の細胞を選択的に排除する（Javadpour et al, J Med Chem, 39:3107-13, 1996）。
【００４６】
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号４１で示される、１４アミノ酸ペプチドである。
真核細胞に対する細胞溶解活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、界面活性剤のような様式で細胞膜を崩壊させる、他の合成溶解性ペプチドであってもよい。（Papo N, Shai Y. New lytic peptides based on the D,L-amphipathic helix motif preferentially kill tumor cells compared to normal cells. Biochemistry. 2003 Aug 12;42(31):9346-54）。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号１２８で示される、１７アミノ酸ペプチドである。
【００４７】
真核細胞に対する細胞溶解活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、細胞膜における小孔の形成を引き起こし、その結果腫瘍成長の阻害をもたらす、セクロピン−メリチンハイブリッドペプチドであってもよい。セクロピンＡは、その構造中に、リシン、ロイシン、およびアラニンなどの正に荷電した多数のアミノ酸を含み（Quellette, A., J., and Selsted, M., E., 1996, FASEB. J., 10(11), 1280-9）、これにより、真核細胞の膜に小孔を形成する。さらに、セクロピンＡは毒性活性を有し、微小管の構造を不安定化することによって、細胞骨格構造を破壊する（Jaynes, J. et al., 1989, Peptide Res., 2 (2), 157-60）。
【００４８】
メリチンは、２５アミノ酸から構成され、高い正電荷およびαヘリックス構造を有するペプチドであり、したがって、「バレルステーブ」メカニズムによって腫瘍細胞の膜と強く相互作用し、小孔を形成する（Smolarczyk, R. et al Peptydy -nowa klasa lekow przeciwnowotworowych, Postepy Hig and Med. Doswiadczalnej, 2009, 63: 360-368）。さらにメリチンは、細胞膜の脂質二重層の成分である脂肪酸の放出をもたらす膜リン脂質の分解に関与する、膜酵素ホスホリパーゼＡ２を刺激する。セクロピンペプチドの正に荷電したＮ末端とメリチンペプチドの疎水性Ｎ末端との遺伝子融合から得た合成キメラペプチドのセクロピンＡ／メチリンは、標的細胞に対してより高い細胞毒性活性を示し、セクロピンおよびメリチンに特徴的な溶血活性を欠いている（Boman, H., G. et al (1989) FEBS Lett 259, 103-106; Andreu, D. et al (1992) FEBS Lett. 296, 190-194）。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号４２で示される、２６アミノ酸ペプチドである。
【００４９】
小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、Isogai Eにより“Antimicrobial and Lipopolysaccharide-Binding Activities of C-Terminal Domain of Human CAP18 Peptides to Genus Leptospira”, The Journal of Applied Research, Vol. 4, No. 1, 2004, 180-185に記載されたペプチドＦＦ／ＣＡＰ１８である。ＦＦ／ＣＡＰ１８は、２個のアミノ酸残基のフェニルアラニンによる置換により改変された、ヒトカテリシジンｈＣＡＰ１８１０９−１３５の２７アミノ酸Ｃ末端配列のアナログである。ＦＦ／ＣＡＰ１８は、組み込まれた改変に起因して、天然配列より増加した強いカチオン特性を有し、真核細胞膜に強く結合する。一旦膜の表面に結合すると、ＦＦ／ＣＡＰ１８はチャネルおよびイオン小孔を形成し、細胞の静電バランスの不安定化をもたらす。また、細胞内に侵入した後に、アナログはミトコンドリア膜内に組み込まれてイオンチャネルを形成し、従って、ミトコンドリアの静電ポテンシャルを不安定化し、ミトコンドリアからシトクロムＣ、ＳＭＡＣ／ＤｉａｂｌｏまたはＡＩＦ因子などのサイトソル因子への放出をもたらし、これがアポトーシスのプロセスを開始させる。
【００５０】
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号４３で示される、２７アミノ酸ペプチドである。
小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、カテリシジンファミリーに属する強い正の電荷を持つペプチドＢＡＭＰ−２８である。このペプチドはまた、唾液腺細胞によって産生された４ｋＤａ未満の質量の１２個のペプチドの群であり、抗菌および抗真菌特性を発揮する、ヒトヒスタチンの構造的アナログである（W. Kamysz et al., Histatyny - bialka liniowe bogate w histydyne, Nowa Stomatologia 2004）。ＢＡＭＰ−２８ペプチドのＮ末端ドメインは強く正に荷電し、細胞膜へのドッキングに関与し、一方Ｃ末端部分は、細胞毒性活性の原因である。（Hugosson, M., D. et al., 1994). Antibacterial peptides and mitochondrial presequences affect mitochondrial coupling, repiration and protein import. Eur. J. Biochem. 223:1027-1033）。ＢＡＭＰ−２８ペプチド活性のメカニズムは、主に細胞およびミトコンドリア膜における小孔の形成に基づく（A. Risso et al., BMAP-28, an Antibiotic Peptide of Innate Immunity, Induces Cell Death through Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore, MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Mar. 2002, p. 1926-1935）。
【００５１】
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号４４で示される、２７アミノ酸ペプチドである。
小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームＡのアナログであり、これは細胞表面上の蓄積に関与して小孔形成がもたらされ、その結果腫瘍成長が阻害される。赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）のペプチドの３つのアイソフォームＡ、ＢおよびＣが同定され、これらは寄生虫の顆粒状細胞質に位置していた。これらは、３つのスルフィド架橋によって安定化された、二次構造に４つの両親媒性ヘリックスを含む、７７アミノ酸ポリペプチドである（Leippe, M et al EMBO J. 11, 3501-3506, 1992）。これらのペプチドは、真核細胞に対する溶解特性を有する（Leippe, M. and Muller-Eberhard, H.J. Toxicology 87, 5-18, 1994）。これらのペプチドの構造の第３ヘリックスは、細胞膜の浸透と小孔の形成に適した長さを有する。３つ全てのアイソフォームの第３ヘリックスのみを含むアミノ酸配列に基づき、一連のアナログ合成ペプチド（Ａ３、Ｂ３およびＣ３）が、ヒトのがん細胞株に対して小孔形成および細胞毒性活性を有するように構成され、低い溶血活性を特徴としている（Andra et al., FEBS Letters 385: 96-100,1996）。
【００５２】
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号４５で示される、２４アミノ酸ペプチドである。
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームＢのアナログである。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号４６で示される、２４アミノ酸ペプチドである。
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームＣのアナログである。
【００５３】
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号４７で示される、２４アミノ酸ペプチドである。
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、インフルエンザウイルスヘマグルチニンのＨＡ２ドメインの、２０アミノ酸Ｎ末端フラグメントのホモログ、いわゆる「融合ペプチド」であり、ウイルスキャプシドと宿主細胞膜との相互作用に関与し（挿入）、宿主の細胞膜における小孔形成をもたらす。インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）は、ウイルスキャプシドと宿主細胞膜の融合に関与する、ホモ三量体糖タンパク質である。タンパク質の構造において、２つのドメインが識別され、ＨＡ１は受容体結合に関与し、およびＨ２は細胞膜との相互作用に関与する。ＨＡ２ドメインの構造において、「融合ペプチド」と呼ばれるＮ末端部分（２０アミノ酸）のみが、細胞膜の構造に直接挿入される（Durrer P et al., J Biol Chem 271:13417-13421, 1996）。融合ペプチドホモログの構造解析は、その活性が、エンドソーム膜を穿孔可能な両親媒性αヘリックスの形成をもたらすコンフォメーションの変化に関連していることを示した（Takahashi S., Biochemistry 29: 6257-6264, 1990）。したがって、「融合ペプチド」の誘導体は、エンドソームからの効率的かつ迅速な「エスケープ」を提供する生物学的に活性な物質の効果的な担体として、使用することができる。
【００５４】
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号４８で示される、１２アミノ酸ペプチドである。
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、Clostridium perfringensからのα毒素のＮ末端ドメインであり、これは細胞膜からのホスファチジルコリンおよびスフィンゴミエリンに対するホスホリパーゼＣ活性を有し、小孔の形成を可能にする。Clostridium perfringensのα毒素のＮ末端ドメインは、ホスホリパーゼＣの活性中心を含んでいる。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号４９で示される、２４７アミノ酸ペプチドである。
【００５５】
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、リステリオリシンＯのフラグメントであり、これは、病原体により分泌され、エンドソーム環境の酸性化の後に活性化される溶血素の群に属する、コレステロール依存性小孔形成ペプチドである（Schnupf P, Portnoy DA. Listeriolysin O: a phagosome-specific lysin. Microbes Infect. 2007 Aug; 9(10): 1176-87. Epub 2007 May 7）。標的タンパク質を有する融合タンパク質の形態のリステリオリシンＯは、腫瘍細胞を特異的に排除できることが示されている（Bergelt S, Frost S, Lilie H. Listeriolysin O as cytotoxic component of an immunotoxin. Protein Sci. 2009 Jun;18(6):1210-20）。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号５０で示される、４６８アミノ酸ペプチドである。
【００５６】
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、ホスホリパーゼＰＣ−ＰＬＣの活性フラグメントである。ホスホリパーゼＰＣ−ＰＬＣは、一次内皮細胞における液胞の効率的な溶解に関与し、一次および二次液胞の溶解において、リステリオリシンと相乗的に作用する。ＰＣ−ＰＬＣの基質は、ホスファチジルコリンである（Smith GA, Marquis H, Jones S, Johnston NC, Portnoy DA, Goldfine H. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 1995 Nov;63(11):4231-7）。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号５１で示される、２８８アミノ酸ペプチドである。
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、イクイナトキシンタンパク質である。イクイナトキシンＥｑＴｘーＩＩは、Actinia equinaアネモネから単離された、小孔形成細胞溶解素であり、哺乳動物細胞に対する高い非特異的毒性を特徴とする。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号５２で示される、１７９アミノ酸ペプチドである。
【００５７】
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、ビスコトキシンＡ３（ＶｔＡ３）である。ビスコトキシンＡ３は、ヤドリギ（Viscum album）からのチオニンの１つである。構造的には、このファミリーに典型的な３つのジスルフィド架橋を有する、４６アミノ酸の鎖からなる（Coulon A. et al., Comparative membrane interaction study of viscotoxins A3, A2 and B from mistletoe (Viscum album) and connections with their structures. Biochem J. 2003 Aug 15;374(Pt 1):71-8）。ビスコトキシンのがん細胞株に対する毒性特性は知られている（Tabiasco J. et al Mistletoe viscotoxins increase natural killer cell-mediated cytotoxicity. Eur J Biochem. 2002 May;269(10):2591-600）。ＶｔＡ３について、作用の正確な分子メカニズムは記載されていない。しかし、イオンチャネルの形成および透過化による膜構造の損傷が関与することが知られている。分子の強い正の電荷は、核酸とリン脂質両方への結合に有利である（Giudici M, Pascual R, de la Canal L, Pfuller K, Pfuller U, Villalain J. Interaction of viscotoxins A3 and B with membrane model systems: implications to their mechanism of action. Biophys J. 2003 Aug;85 (2):971-81）。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号５３で示される、４６アミノ酸ペプチドである。
【００５８】
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、ヒトパーフォリンの活性フラグメントであるペプチドである。ヒトパーフォリンを含む、免疫系に「見えない」ヒト由来のタンパク質の使用は、生成される強力な免疫原性により、細菌、動物または植物起源の毒素を含有するタンパク質キメラの限られた臨床的有用性の問題を解決することができる（Frankel AE. Reducing the immune response to immunotoxin. Clin Cancer Res. 2004 Jan 1;10(1 Pt 1):13-5）。細胞膜に非特異的に小孔を形成するヒトパーフォリンのＮ末端３４アミノ酸フラグメントは、全タンパク質の選択的細胞毒性活性を保持している（Liu CC, Walsh CM, Young JD. Perforin: structure and function. Immunol Today.1995 Apr;16(4):194-201）。がん細胞を標的とする抗体に融合したパーフォリンフラグメントは、全タンパク質の選択的細胞毒性活性を保持している（Wan L. Expression, purification, and refolding of a novel immunotoxin containing humanized single-chain fragment variable antibody against CTLA4 and the N-terminal fragment of human perforin. Protein Expr. Purif. 2006 Aug;48(2):307-13. Epub 2006 Mar 9）。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号５４で示される、３３アミノ酸ペプチドである。  
【００５９】
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、Bacillus thuringensisからのパラスポリン２である。パラスポリンファミリーは、サブグループＰＳ１、ＰＳ２−ＰＳ３、ＰＳ４に属する１３種類の毒素を含む（Ohba M. Parasporin, a new anticancer protein group from Bacillus thuringiensis. Anticancer Res. 2009 Jan;29(1):427-33）。パラスポリン２はがん細胞（ＭＯＬＴ−４、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＬ６０、ＨｅｐＧ２、ＣＡＣＯ−２）に対して特異性を発揮し、プロテイナーゼＫによってそれぞれ５１および３６アミノ酸のＮおよびＣ末端フラグメントの部分を切断することにより活性化された、３７ｋＤａのプロトキシンの形態で存在する。パラスポリン２の主な作用は細胞膜内でのオリゴマー化からなり、これは約３ｎｍの直径を有する小孔を形成し、透過性の増加をもたらす。パラスポリン２の活性の効果は試験した細胞株の種類に依存し、細胞から細胞質の流出およびそれらの溶解によって引き起こされる、いわゆる「ブレブ（blebb）」またはバルジの形成（ＨｅｐＧ２およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞）、または、細胞のバーストをもたらす空胞様構造の形成（ＭＯＬＴ−４）を含む（Kitada S. Cytocidal actions of parasporin-2, an anti-tumor crystal toxin from Bacillus thuringiensis. J. Biol. Chem. 2006 Sep 8;281(36):26350-60）。また、パラスポリン２の活性は微小管の構造の破壊、アクチンフィラメントの絡み合い、ミトコンドリアおよび小胞体のフラグメント化をもたらす（Akiba T. Crystal structure of the parasporin-2 Bacillus thuringiensis toxin that recognizes cancer cells. J. Mol. Biol. 2009 Feb 13;386(1):121-33）。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号５５で示される、２５１アミノ酸ペプチドである。
【００６０】
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、合成溶解性ペプチドと細胞表面上のＥＧＦ受容体のペプチドインヒビターを含む、融合タンパク質である。細胞表面上のＥＧＦＲインヒビターの結合は、溶解性ペプチドの細胞表面への配置を可能にし、さらに、細胞内に局在する受容体チロシンキナーゼを阻害する。キナーゼ活性の阻害は、生化学的シグナルのカスケードの欠如をもたらし、細胞質のＣａ２＋イオンの放出およびＲＡＳシグナル伝達経路の活性化を導き、解糖経路活性の増加およびタンパク質合成の増加をもたらし、従って細胞増殖の低減および腫瘍の制限された進行を引き起こす（Carpenter G, Cohen S., (May 1990). "Epidermal growth factor". The Journal of Biological Chemistry 265 (14): 7709-12）。両親媒性およびらせん状タンパク質として反復されるロイシンおよびリシン残基を含む合成ペプチドは、選択されたがん細胞株を選択的に排除する（Javadpour et al., J. Med. Chem., 39:3107-13, 1996）。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号５６で示される、３２アミノ酸ペプチドである。
【００６１】
添付の配列表に配列番号５６で示される、ＥＧＦインヒビターおよび合成溶解性ペプチドを含む融合ペプチドは新規であり、これまでに記載されていない。
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、ＫＬＬＫモチーフを有する合成溶解性ペプチドと、細胞表面上のＰＤＧＦ受容体のアンタゴニストであるペプチドとを含む融合タンパク質である。ＰＤＧＦのインヒビターの細胞表面上の結合は、溶解性ペプチドの細胞表面への配置を可能にし、さらに結合は、細胞増殖および血管新生に影響を与える（Ostman A. et al., PDGF Receptors as Targets in Tumor Treatment, Adv. Cancer Res., 2007;97:247-74）。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号１２５で示される、３９アミノ酸ペプチドである。
【００６２】
添付の配列表に配列番号１２５で示される融合ペプチド、および、配列番号１２５の、ＰＤＧＦアンタゴニストと合成溶解性ペプチドの融合変異体は新規であり、これまでに記載されていない。
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、プレウロシジンのアナログであるタンパク質である。プレウロシジンは、細胞膜と相互作用するカチオン性αヘリックス構造のタンパク質である（Cole AM et al., Isolation and characterization of pleurocidin, an antimicrobial peptide in the skin secretions of winter flounder. J Biol Chem.1997 May 2;272(18):12008-13）。プレウロシジン様ペプチドは、薬剤耐性で成長の遅い乳がん細胞を含む、乳がん細胞に対して活性である。（Hilchie AL et al., Pleurocidin-family cationic antimicrobial peptides are cytolytic for breast carcinoma cells and prevent growth of tumor xenografts. Breast Cancer Res. 2011 Oct 24;13(5):R102）。
【００６３】
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号１２６で示される２５アミノ酸ペプチド、および添付の配列表に配列番号１２７で示される２６アミノ酸ペプチドである。
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン（ｂ）の別のエフェクターペプチドは、Ｂ２７ペプチド、すなわちカテリシジンファミリーに属するウシ骨髄細胞から単離されたＢＭＡＰ２７タンパク質の切断型である。（Donati M. et al., Activity of Cathelicidin Peptides against Chlamydia spp., Antimicrob Agents Chemother. 2005 March; 49(3): 1201-1202）。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号１３０で示される、２５アミノ酸ペプチドである。
【００６４】
がん細胞の表面に存在するＴＲＡＩＬ受容体に結合すると、融合タンパク質は、二重の効果を発揮する。ドメイン（ａ）、すなわちＴＲＡＩＬの機能的フラグメントまたは保存された機能性を有するそのホモログは、その既知のアゴニスト活性を発揮する、すわなち、細胞表面のデスレセプターに結合して、アポトーシスの外因性経路を活性化するであろう。融合タンパク質のドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、ＴＲＡＩＬドメインの活性と並行して、その作用を細胞外または細胞内で潜在的に発揮することができるであろう。
本発明の融合タンパク質において、ＴＲＡＩＬの抗腫瘍活性は以下により増強される：細胞またはミトコンドリア膜における小孔の形成が、細胞の静電荷の乱れ、細胞質からのイオンの漏出、またはミトコンドリアの静電ポテンシャルの不安定化、およびシトクロムＣ、ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯおよびＡＩＦ因子などの因子の細胞質への放出を引き起こし、これは次に、ＴＲＡＩＬのＤＲ系の機能的受容体への付着からのシグナルと相乗的に、内因的に誘導されたアポトーシスを活性化する。
【００６５】
新しい融合タンパク質はまた、個々の天然の細胞溶解性ペプチドについて少なくとも低減もしくは制限されたか、または実質的に排除された、溶血活性の特性を示す。
本発明の一態様においては、ドメイン（ａ）およびドメイン（ｂ）は、細胞環境に、特に腫瘍細胞環境に存在する例えばメタロプロテアーゼ、ウロキナーゼまたはフューリンなどのプロテアーゼによって認識される切断部位の配列を含む、少なくとも１つのドメイン（ｃ）によって連結されている。
プロテアーゼにより認識される配列は、以下から選択することができる：
−  メタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される配列Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ／ＰＬＧＬＡＧＥＰ、または、それが付着した配列の最後のアミノ酸と共にメタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される配列を形成するそのフラグメント、
【００６６】
−  ウロキナーゼｕＰＡにより認識される配列Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ａｒｇ／ＲＶＶＲ、または、それが付着した配列の最後のアミノ酸と共にウロキナーゼにより認識される配列を形成するそのフラグメント、
およびそれらの組み合わせ、または 
−  フューリンにより認識される配列Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ／ＲＱＰＲ、Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ／ＲＱＰＲＧ、Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ／ＲＫＫＲ）、またはフューリンにより認識されるその他の非定型配列であって、M. Gordon et all. In Inf. and Immun, 1995, 63, No. 1, p. 82-87により開示されたもの、またはフューリンにより認識されるネイティブ配列Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ／ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬもしくはＨｉｓＡｒｇＧｌｎＰｒｏＡｒｇＧｌｙＴｒｐＧｌｕＧｌｎ／ＨＲＱＰＲＧＷＥＱ）、または、それが付着した配列の最後のアミノ酸と共にフューリンにより認識される配列を形成するそのフラグメント。
【００６７】
本発明の一態様において、プロテアーゼ切断部位は、任意の順番で互いに隣接して位置する、メタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される配列、および／またはウロキナーゼｕＰＡにより認識される配列、および／またはフューリンにより認識される配列の組み合わせである。
好ましくは、一態様において、ドメイン（ｃ）は、Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｙ／ＲＶＶＲＰＬＧＬＡＧおよびＰｒｏ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ａｒｇ／ＰＬＧＬＡＧＲＶＶＲから選択される、フューリンにより認識される配列である。
プロテアーゼである、メタロプロテアーゼＭＭＰ、ウロキナーゼｕＰＡおよびフューリンは、腫瘍環境において過剰発現される。プロテアーゼにより認識される配列の存在は、ドメイン（ａ）のドメイン（ｂ）からの切断を可能にし、すなわち、機能的ドメイン（ｂ）の放出、したがって活性化の促進を可能とする。
【００６８】
融合タンパク質の細胞内への内部移行後の、エフェクターペプチド−機能的ドメイン（ｂ）の活性化は、本発明の融合タンパク質のドメイン（ａ）を、ドメイン（ｂ）からリソソーム（lisosomal）酵素（非特異的プロテアーゼ）で切断することにより、非特異的に生じ得る。
プロテアーゼ切断部位の存在は、エフェクターペプチドの迅速な放出を可能にすることによって、ペプチドをその作用場所に輸送する機会を増加させるが、これは、融合タンパク質の非特異的プロテアーゼによるランダムな分解が起こる前に腫瘍環境において過剰発現されるプロテアーゼによる、ｈＴＲＡＩＬフラグメントからの切断の結果である。
さらに、輸送ドメイン（ｄ）は、本発明の融合タンパク質のエフェクターペプチドのドメイン（ｂ）に付着してもよい。
【００６９】
ドメイン（ｄ）は、以下からなる群から選択することができる：
（ｄ１）細胞膜を通って輸送し、６、７、８、９、１０または１１個のヒスチジン残基（Ｈｉｓ／Ｈ）からなる、ポリヒスチジン配列；
（ｄ２）細胞膜を通って輸送し、６、７、８、９、１０または１１個のアルギニン残基（Ａｒｇ／Ｒ）からなる、ポリアルギニン配列、
（ｄ３）ＰＤ４輸送配列（タンパク質形質導入ドメイン４）Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｌａ／ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ、
（ｄ４）トランスフェリン受容体結合配列からなる輸送配列Ｔｈｒ  Ｈｉｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｍｅｔ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｐｒｏ／ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ、
（ｄ５）ＰＤ５輸送配列（タンパク質形質導入ドメイン５、ＴＡＴタンパク質）Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ／ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、
または、それが付着した配列の最後のアミノ酸と共に、輸送ドメインの配列（ｄ１）または（ｄ２）を形成するこれらのフラグメント、
および
−これらの組み合わせ。
【００７０】
例えば（ｄ１）と（ｄ２）などのドメインの組み合わせは、特に、（ｄ１）／（ｄ２）および（ｄ２）／（ｄ１）の組み合わせを含んでよい。
さらに、例えば（ｄ１）と（ｄ２）などのドメインの組み合わせは、互いに隣接して位置し、ドメイン（ｂ）の一端に接続されているドメイン、および／またはドメイン（ｂ）の異なる末端に連結されたドメインを含んでよい。
融合タンパク質が、ドメイン（ｂ）に付着したドメイン（ｄ）と、ドメイン（ａ）と（ｂ）の間の切断部位のドメイン（ｃ）の両方を有する場合には、ドメイン（ｃ）は、構築物の切断後に、輸送ドメイン（ｄ）がドメイン（ｂ）に付着したままであるように配置されることが、理解されるべきである。換言すれば、融合タンパク質が、輸送ドメイン（ｄ）および切断部位ドメイン（ｃ）の両方を有する場合、ドメイン（ｄ）はドメイン（ｂ）と（ｃ）の間に配置されるか、またはドメイン（ｄ）の付着場所の反対側となるドメイン（ｂ）の端部に配置される。
【００７１】
本発明はまた、ドメイン（ｄ）が２つの（ｃ）ドメインの間に位置する変異体、すなわち、構築物の切断後に、輸送ドメイン、好ましくは移行ドメインが、ＴＲＡＩＬドメインにも、エフェクターペプチドドメインにも付着していない変異体も含む。
本発明は、ドメイン（ｄ）がドメイン（ｃ）とドメイン（ａ）の間に位置する変異体、すなわち、構築物の切断後に、輸送ドメインがＴＲＡＩＬドメインに付着したままである変異体は、含まない。
【００７２】
別の態様において、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、さらに、ＰＥＧ分子の融合タンパク質への付着に好適な配列を含むドメイン（ｅ）が配置される（ＰＥＧ化リンカー）。かかるリンカーは、既知の配列Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ／ＡＳＧＣＧＰＥＧ、または、それが付着した配列の最後のアミノ酸と共に、ＰＥＧ分子の付着に好適な配列を形成するそのフラグメントであってよい。ＰＥＧ化リンカーはまた、以下の群から選択することができる：
Ａｌａ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ／ＡＡＣＡＡ、
Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ／ＳＧＧＣＧＧＳ、および
Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ／ＳＧＣＧＳ、
または、それが付着した配列の最後のアミノ酸と共に、ＰＥＧ分子の付着に好適な配列を形成するそのフラグメント。
好ましくはＰＥＧ化リンカーの配列は、Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ／ＡＳＧＣＧＰＥＧである。
【００７３】
融合タンパク質の主要な機能的要素および切断部位ドメイン（単数または複数）とは別に、本発明の融合タンパク質は、フレキシブルな立体リンカーの１または２以上の中性配列を含んでもよい。このような立体リンカーは周知であり、文献に記載されている。融合タンパク質配列へのこれらの組み込みは、宿主細胞においてその過剰発現のプロセスによって産生されるタンパク質の正しいフォールディングを提供することを目的とする。具体的には、立体リンカーは、グリシン、グリシン−セリン、またはグリシン−システイン−アラニンリンカーであってよい。
具体的には、立体リンカーは、グリシンとセリン残基の組み合わせ、例えばＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ／ＧＧＧＧＳまたは立体リンカーに作用するそれらの任意のフラグメントであってよく、例えば、フラグメントＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ／ＧＧＧＳ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ／ＧＧＧまたはＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ／ＧＧＧＧ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ／ＧＧＳＧ、Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ／ＧＳＧまたはＳｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ／ＳＧＧ、またはその組み合わせである。
【００７４】
別の態様において、立体リンカーはグリシン、セリン、およびアラニン残基の任意の組み合わせであってよく、例えばＡｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ／ＡＳＧＧ、または立体リンカーとして作用するその任意のフラグメント、例えばＡｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ／ＡＳＧである。立体リンカーの組み合わせを使用することも可能であり、例えば配列Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ／ＧＧＧＧＳまたは立体リンカーとして作用するその任意のフラグメント（例えばＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ／ＧＧＧ）と、立体リンカーとして作用する別のフラグメントである。このような場合において、立体リンカーは、グリシン、セリン、およびアラニン残基の組み合わせであってよく、例えばＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ／ＧＧＧＳＡＳＧＧ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ／ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ／ＧＧＳＧＧＧＧＧＳまたはＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ／ＧＧＧＧＧＧＳである。さらに別の態様において、立体リンカーは、セリンとヒスチジン残基の組み合わせ：Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ／ＳＨＨＳまたはＳｅｒ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｓｅｒ／ＳＨＨＡＳであってもよい。
【００７５】
さらに別の態様において、立体リンカーは、単一のグリシンまたはシステイン残基などの単一のアミノ酸残基から、特に１もしくは２から最大４個までのグリシンまたはシステイン残基から、選択することができる。
別の態様において、リンカーは、上述の立体リンカーのフラグメントから形成してもよく、フラグメントは、付着している配列の末端アミノ酸と共に立体リンカー配列を形成する。
別の態様において、立体リンカーは、本発明の融合タンパク質の三量体構造の形成および安定化を促進することができ、従って血液循環系におけるその半減期を延長し、血液循環系への投与後のタンパク質の活性に影響を与え得る、脱会合（deasociation）を予防する。この場合、リンカーはシステインとアラニンの組み合わせであり、例えば、フラグメントのＣｙｓ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｃｙｓ／ＣＡＡＡＣＡＡＣまたはＣｙｓ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｃｙｓ／ＣＡＡＣＡＡＡＣ、または、それが付着した末端アミノ酸配列であり、かつ三量体構造を安定化する立体リンカーを形成する、それらのフラグメントである。
【００７６】
さらに、立体リンカーはまた、非特異的な様式で生じる、機能ドメイン（ｂ）の活性化のためにも有用となり得る。非特異的な様式でのドメイン（ｂ）の活性化は、立体リンカーのｐＨ依存性加水分解によって、本発明の融合タンパク質のドメイン（ａ）をドメイン（ｂ）から切断することにより行ってもよい。
本発明の融合タンパク質の具体的な態様は、小孔形成ペプチドを含む融合タンパク質であって、次に指定されたペプチドの群から選択されるものである：
配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、および配列番号１３２。
【００７７】
上述した代表的な融合タンパク質の構造の詳細な説明は、以下に提示の実施例に示されている。
本発明によると、融合タンパク質とは、２つもしくは３つ以上のタンパク質またはそのフラグメントを含む単一のタンパク質分子が、化学的リンカーを追加せずに、それら各ペプチド鎖内のペプチド結合を介して共有結合されることを意味する。
融合タンパク質はまた、代わりに、タンパク質構築物またはキメラタンパク質としても記載することができる。本発明によると、「構築物」または「キメラタンパク質」という用語は、使用される場合、上で定義された融合タンパク質を指すものとして理解されるべきである。
当業者にとって、このように定義された融合タンパク質が、ペプチドとタンパク質の化学合成の既知の方法によって合成され得ることは明らかであろう。
【００７８】
融合タンパク質は、化学的ペプチド合成の方法、特に、好適な樹脂を担体として使用する固相におけるペプチド合成の技術を使用して、合成することができる。かかる技術は従来型であり、当技術分野において知られ、とりわけ、例えばBodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer- Verlag, New York、Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Companyのような研究論文に記載されている。
融合タンパク質は、ペプチドの化学合成の方法により、連続したタンパク質として合成することができる。あるいは、タンパク質の個々のフラグメント（ドメイン）を別々に合成し、次に、一方のペプチドフラグメントのアミノ末端を、もう一方のペプチドのカルボキシル末端から縮合させることによって、ペプチド結合を介して１つの連続したペプチドに化学結合させてもよい。かかる技術は従来周知である。
しかしながら、好ましくは、本発明の融合タンパク質は、宿主細胞において融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の遺伝子発現の方法によって生成された、組み換えタンパク質である。
【００７９】
結果として生じたペプチドの構造を検証するために、ペプチドの分子量を決定するための高分解能質量分析技術などの、ペプチドのアミノ酸組成を分析する既知の方法を使用してもよい。ペプチド配列を確認するために、ペプチドを連続的に分解してアミノ酸の配列を同定するタンパク質シーケンサーもまた使用することができる。
本発明のさらなる側面は、ポリヌクレオチド配列、特に、上で定義された融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列である。
好ましくは、ポリヌクレオチド配列、特に、本発明に従う、上で定義された融合タンパク質をコードするＤＮＡは、E. coliにおける発現に最適化された配列である。
【００８０】
本発明の他の側面はまた、ポリヌクレオチド配列、特に上で定義された本発明のＤＮＡ配列を含む発現ベクターでもある。
本発明の他の側面はまた、上で定義された発現ベクターを含む宿主細胞でもある。
本発明の融合タンパク質の発現にとって好ましい宿主細胞は、E. coli細胞である。
【００８１】
融合タンパク質などの、組み換えタンパク質の生成のための方法は、周知である。簡潔には、この技術は、ポリヌクレオチド分子、例えば標的タンパク質のアミノ酸配列をコードし、宿主における標的タンパク質の発現に向かわせるＤＮＡ分子、の生成にある。ポリヌクレオチド分子をコードする標的タンパク質を、次に、該ポリペプチドの有効な発現を確保する適切な発現ベクターに取り込む。次に、組み換え発現ベクターを、形質移入／形質転換用の宿主細胞に導入し、結果として、形質転換された宿主細胞が産生される。この後に標的タンパク質を過剰発現させるために形質転換した細胞を培養し、得られたタンパク質を精製し、タンパク質の発現または精製に使用されたタグ配列を切断により任意に切り取る。
発現と精製に好適な技術は、例えば、研究論文Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), and A. Staron et al., Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995に記載されている。
【００８２】
コスミド、プラスミドまたは改変されたウイルスは、宿主細胞におけるＤＮＡ配列の導入および複製のための発現ベクターとして使用することができる。典型的には、プラスミドが、発現ベクターとして使用される。好適なプラスミドは周知であり、市販されている。
本発明の発現ベクターは、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、および、好適な宿主細胞に取り込まれた該コード配列の転写と翻訳とに必要な調節配列を含む。調節配列の選択は、宿主細胞のタイプに依存し、当業者によって容易に実施することができる。かかる調節配列の例は、転写のプロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列であり、コード配列の前に挿入される転写開始シグナル、およびコード配列の後に挿入される転写終結配列を含む。また、使用する宿主細胞およびベクターに依るが、複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサーおよび転写の誘導を可能にする配列などの他の配列を発現ベクターに導入してもよい。
【００８３】
発現ベクターはまた、マーカー遺伝子配列も含むことができ、これは、形質転換細胞に明確な表現型を与え、形質転換細胞の特異的な選択を可能にする。さらに、該ベクターはまた、挿入された標的タンパク質のコード配列を含む組み換えプラスミドにより形質転換された細胞と、挿入のないプラスミドを取り込んだ細胞を区別すること可能にする、第２のマーカー配列も含んでもよい。ほとんどの場合、典型的な抗生物質抵抗性マーカーを使用するが、当該分野で知られている任意の他のレポーター遺伝子を使用してもよく、細胞の中のその存在(in vivo)によって、オートラジオグラフィー技術、分光光度法または生物発光および化学発光を使用して容易に判定することができる。例えば、宿主細胞に依るが、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子を使用してもよい。
【００８４】
さらに、発現ベクターは、適切な細胞区画、例えば折り畳みが促進される周辺質、にタンパク質を輸送するシグナル配列を含んでもよい。加えて、Ｎ末端に付着されるＨｉｓＴａｇまたはＣ末端に付着されるＧＳＴなどのラベル／タグをコードする配列が存在してもよく、それは、続く、ニッケルカラムでの親和性クロマトグラフィーによる、親和性の原理を使用して産生されるタンパク質の精製を促進する。その溶解性を増大させる配列だけでなく、宿主細胞におけるタンパク質分解からタンパク質を保護する追加の配列もまた、存在してもよい。
【００８５】
標的タンパク質の配列に付着された補助的な要素は、その活性をブロックするか、または、例えば毒性などの別の理由で有害となり得る。かかる要素は除去されなければならず、酵素的または化学的な切断によって達成され得る。具体的には、６−ヒスチジンタグのＨｉｓＴａｇまたは親和性クロマトグラフィーによるタンパク質精製を可能にするために付着されたこのタイプの他のマーカーは、可溶性ＴＲＡＩＬタンパク質の肝毒性に対して記載されたその効果のために、除去されるべきである。原核細胞：Escherichia coliまたはBacillus subtilisなどの細菌性細胞、Saccharomyces cervisiaeまたはPichia pastorisなどの酵母、および真核細胞株（昆虫、哺乳動物、植物）を含む、様々な周知の宿主細胞に基づく異種発現系を使用してよい。
【００８６】
好ましくは、培養および遺伝子操作が容易であることと、得られる産生物が大量であることのために、E. coli発現系を使用する。したがって、本発明の融合タンパク質をコードする標的配列を含むポリヌクレオチド配列は、E. coliにおける発現に最適化されるであろう。すなわち、それは、コード配列の中に、先端技術において知られている配列の可能な変異体から選択される、E. coliにおける発現に最適なコドンを含むであろう。さらに、発現ベクターは、コード配列に付着された、E. coliに好適な前記要素を含むであろう。
【００８７】
したがって、本発明の好ましい態様において、本発明の融合タンパク質をコードする配列を含み、かつE. coliにおける発現に最適化されたポリヌクレオチド配列は、以下： 
配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号７７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、および配列番号１２４、
からなるポリヌクレオチド配列の群から選択され、
これらはそれぞれ、以下のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードする：
【００８８】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、および配列番号１０７。
【００８９】
好ましい態様において、本発明はまた、上で示された配列番号５７から配列番号８７および配列番号１０８から配列番号１２４のポリヌクレオチド配列の群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、E. coliの形質転換に好適な発現ベクター、ならびにかかる発現ベクターで形質転換されたE. coli細胞を提供する。
形質転換、すなわち、細菌性宿主細胞、具体的にはE. coliへの、ＤＮＡ配列の導入は、例えば、低温（４℃）でのカルシウムイオンによる処置の後、熱ショック（３７−４２℃で）に供するか、または電気穿孔によって、ＤＮＡを取り込ませるよう調製されたコンピテント細胞に対して通常実施される。かかる技術は周知であり、通常、発現系の製造業者によって決定されるか、または文献および実験室での作業のためのマニュアル、例えばManiatis et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982などに記載されている。
【００９０】
E. coli発現系における本発明の融合タンパク質の過剰発現の手順は、以下にさらに記載されるであろう。
本発明はまた、活性成分としての、上で定義された本発明の融合タンパク質、ならびに好適な、薬学的に許容し得る担体、希釈剤および従来型の補助成分を含む医薬組成物も提供する。医薬組成物は、担体もしくは希釈剤の中に溶解されるかまたは分散された、本発明の融合タンパク質と薬学的に許容し得る補助的な成分との有効量を含み、好ましくは、単位剤形で処方された医薬組成物、または、複数回の用量を含む処方物の形態であろう。他の成分、担体および希釈剤だけでなく、医薬品形態およびそれらの処方の方法も、当業者に知られており、文献に記載されている。例えば、それらは、研究論文Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USAに記載されている。
【００９１】
用語「薬学的に許容し得る担体、希釈剤および補助成分」は、当該技術分野で知られている、任意の溶媒、分散媒、界面活性剤、抗酸化剤、安定剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤を含む。本発明の医薬組成物は、経口、非経口、吸入、局所のための液状の、固形のおよびエアロゾルの形態などの、選択される投与経路および所望の剤形、ならびに、選択される形態が、注入によるように投与経路のために殺菌されたものである必要があるべきかどうかに依存して、様々なタイプの担体、希釈剤および賦形剤を含んでもよい。本発明に従い、医薬組成物の投与の好ましい経路は、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、腫瘍内などの注入経路を含む非経口であるか、または、単発または連続的な静脈内点滴による。
【００９２】
一態様において、本発明の医薬組成物は、直接腫瘍に注入することによって投与してもよい。他の態様において、本発明の医薬組成物は、静脈内に投与してもよい。さらに他の態様において、本発明の医薬組成物は、皮下または腹腔内に投与することができる。非経口投与のための医薬組成物は、必要ならば、適切なｐＨに緩衝された体液と等浸透圧の、薬学的に許容し得る水性または非水性培地における水溶液または分散液であってよく、抗酸化剤、緩衝剤、静菌性剤、および該組成物をレシピエントの組織または血液に適合させる可溶性物質もまた含んでもよい。当該組成物に含まれてもよい他の成分は、例えば、水、エタノールなどのアルコール、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなどのポリオール、トリグリセリド、植物油、リポソームなどの脂質である。妥当な流動性および該物質の粒子サイズは、レシチンなどのコーティング物質、ならびに、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリソルベートおよび同類のものなどの界面活性剤により提供されてよい。
【００９３】
液体非経口組成物に好適な等張化剤は、例えば、グルコースなどの糖および塩化ナトリウムならびにそれらの組み合わせである。
あるいは、注入または点滴による投与のための医薬組成物は、例えば、パイロジェンフリー滅菌水などの好適な担体中に使用直前に再構成するための、凍結乾燥粉末などの粉末形態であり得る。
非経口投与のための本発明の医薬組成物はまた、溶液、スプレーまたはエアロゾルを含む経鼻投与の形態を有してもよい。好ましくは、鼻腔内投与のための形態は、水性溶液であり、鼻の分泌物と類似の特徴を維持するように、約５．５から約６．５までのｐＨに維持するために、等張であるか、または緩衝化されているであろう。さらに、それは、周知の鼻腔内用調製物におけるような保存剤または安定化剤を含むことができる。
【００９４】
本組成物は、１種または２種以上の成分の酸化を遅らせる、様々な抗酸化剤を含んでもよい。さらに、微生物の作用を防止するために、本組成物は、例えば非限定的に、パラベン類、クロロブタノール、チメロサール、ソルビン酸、およびこのタイプの類似の知られている物質を含む様々な抗菌剤および抗真菌剤を含んでもよい。一般に、本発明の医薬組成物は、例えば少なくとも約０．０１ｗｔ％の活性成分を含むことができる。より具体的に、本組成物は、活性成分を、本組成物単位の１重量％から７５重量％まで、または例えば２５重量％から６０重量％までの量において含んでもよいが、示された値に限定されるものではない。人間を含む患者に投与される本発明による組成物の用量の実際の量は、体重、病気の重篤度、処置される疾患のタイプ、先のまたは同時の治療的介入、患者および投与経路などの、物理的および生理学的な要因により決定することができる。好適な単位用量、全用量および本組成物中の活性成分の濃度は、処置する医師により決定されるべきである。
【００９５】
本組成物は、例えば、患者の体重１ｋｇあたり約１マイクログラム〜約１０００ｍｇの用量において、例えば体重１ｋｇあたり５ｍｇ〜１００ｍｇの範囲において、または体重１ｋｇあたり５ｍｇ〜５００ｍｇの範囲において、投与してもよい。融合タンパク質およびそれを含む組成物は、抗がん性または抗腫瘍性を呈し、がん疾患の処置のために使用することができる。本発明はまた、上で定義される本発明の融合タンパク質の、ヒトを含む哺乳動物におけるがん疾患を処置するための使用をも提供する。本発明はまた、ヒトを含む哺乳動物における新生物／がん疾患を処置する方法を提供し、該方法は、かかる処置を必要とする対象に、上で定義されたような本発明の融合タンパク質の、抗新生物／抗がんに有効な量を、任意に適切な医薬組成物の形態において、投与することを含む。
【００９６】
本発明の融合タンパク質は、白血病、肉芽種症、ミエローマなどの血液悪性腫瘍および他の血液悪性腫瘍の処置のために使用することができる。融合タンパク質はまた、乳がん、非小細胞肺がんを含む肺がん、結腸がん、膵がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、腎臓がん、脳腫瘍および同類のものなどの固形腫瘍の処置のためにも使用されことができる。がんの処置における融合タンパク質の適切な投与経路は、具体的に、本発明の融合タンパク質を注入または点滴の形態において、この投与経路に適切な組成および形態において、投与することからなる、非経口経路である。本発明は、以下の基本手順および具体的な融合タンパク質の例において、より詳細に記載されるであろう。
【００９７】
融合タンパク質の過剰発現のための基本手順
プラスミドの調製
標的融合タンパク質のアミノ酸配列を、それをコードし、かつEscherichia coliにおける発現に最適化されたコドンを含む、ＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用した。かかる手順により、Escherichia coliにおける標的タンパク質の合成のさらなるステップの効率を増大させることができる。その結果得られたヌクレオチド配列を、次いで、自動合成した。加えて、制限酵素ＮｄｅＩの切断部位（リーディング鎖の５’末端において）およびＸｈｏＩの切断部位（リーディング鎖の３’末端において）を、標的タンパク質をコードする、得られた該遺伝子に加えた。これらを、ベクターｐＥＴ２８ａ（Novagen）の中に該遺伝子をクローニングするために使用した。それらはまた、該タンパク質をコードする遺伝子を他のベクターにクローニングするためにも使用してもよい。この構築物から発現される標的タンパク質は、Ｎ末端において、トロンビンに認識される部位の手前に置かれ、続く親和性クロマトグラフィーによるその精製に役立つ、ポリヒスチジンタグ（６ヒスチジン）を任意に備え得る。いくつかの標的は、いかなるタグもなく、特にヒスチジンタグもなく発現され、続いてそれらをＳＰセファロースで精製した。
【００９８】
得られた構築物の正確さを、先ず、酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを使用する単離プラスミドの制限分析により確認し、その後、標的タンパク質の全リーディングフレームを自動シークエンシングすることにより確認した。シークエンシングのために使用したプライマーは、ベクター中に存在するＴ７プロモーター（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’）およびＴ７ターミネーター（５’−ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ−３’）の配列に相補的であった。得られたプラスミドを、製造業者の推奨に従って形質転換された市販のE. coli株において、標的融合タンパク質を過剰発現させるために使用した。選択培地（ＬＢ寒天、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、１％グルコース）上で得られたコロニーを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）および１％グルコースが補充されたＬＢ液体培地中で終夜培養物を調製するために使用した。振盪培養器における約１５ｈの成長の後、その培養物を、適切な培養に植菌するために使用した。
【００９９】
融合タンパク質の過剰発現および精製―基本手順Ａ
カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）および１００μＭの硫酸亜鉛を有するＬＢ培地に、終夜培養物を植菌した。その培養物を、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が０．６０−０．８０に達するまで、３７℃でインキュベートした。その後、ＩＰＴＧを、０．２５−１ｍＭの範囲の最終濃度まで添加した。２５℃で振盪しながらのインキュベーション（３．５−２０ｈ）の後、培養物を２５ｍｉｎ、６，０００ｇで遠心分離した。細菌ペレットを、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾールを含むｐＨ７．４の緩衝液中で再懸濁した。懸濁液を、氷上で８分間超音波処理した（４０％の振幅、１５秒パルス、１０ｓのインターバル）。得られた抽出物を、４０分間、２００００ｇ、４℃における遠心分離により清澄化した。Ｎｉ−セファロース（GE Healthcare）樹脂を、緩衝液での平衡化により前処置し、これを、細菌性細胞抽出物の調製のために使用した。その樹脂を、次いで、抽出物の遠心分離後に得られた上清と共に４℃で終夜インキュベートした。
【０１００】
その後、それをクロマトグラフィーカラム中にロードし、１５〜５０容積の緩衝液（５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）で洗浄した。得られたタンパク質を、０．５ＭのＮａＣｌを有する５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．４）中のイミダゾール勾配を使用してカラムから溶出させた。得られた画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。適切な画分を組み合わせて、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのＬ−アルギニン、０．１ｍＭのＺｎＳＯ４、０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０に対して、４℃で終夜透析し、同時に、Ｈｉｓｔａｇが存在している場合は、Ｈｉｓｔａｇをトロンビン（１：５０）で切断した。切断の後、トロンビンを、ベンズアミジンセファロース（登録商標）樹脂を使用する精製により、Ｈｉｓｔａｇを伴って発現した標的融合タンパク質から分離した。Ｈｉｓｔａｇなしで発現した標的融合タンパク質の精製は、ＳＰセファロースで実施した。その産物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分析した（Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982）。
【０１０１】
融合タンパク質の過剰発現および精製―基本手順Ｂ
カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）および１００μＭの硫酸亜鉛を有するＬＢ培地に、終夜培養物を植菌した。培養物を、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が０．６０−０．８０に達するまで、３７℃でインキュベートした。その後、ＩＰＴＧを、最終濃度が０．５−１ｍＭの範囲になるまで添加した。２５℃で振盪しながらの２０ｈのインキュベーション後に、培養物を２５ｍｉｎ、６，０００ｇで遠心分離した。過剰発現後の細菌性細胞を、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、０．５ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）を含む緩衝液（ｐＨ７．８）中、フレンチプレスにて破壊した。得られた抽出物を、５０分間、８０００ｇでの遠心分離により清澄化した。Ｎｉ−セファロース樹脂を、得られた上清と共に終夜インキュベートした。次いで、タンパク質が結合した樹脂を、クロマトグラフィーカラム中に充填した。
【０１０２】
未結合のタンパク質を含む画分を洗い流すために、カラムを、１５〜５０容積の緩衝液（５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、０．５ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）（ｐＨ７．８））で洗浄した。その後、ベッドに特異的に結合しているタンパク質の大部分を洗い流すために、カラムを、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、０．５ｍＭのＰＭＳＦを含む緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。得られた画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982）。標的タンパク質を含む画分を組み合わせ、タンパク質がヒスチジンタグを伴って発現された場合は、トロンビン（タンパク質４ｍｇあたり１Ｕ、８ｈ、１６℃で）で切断し、ポリヒスチジンタグを除去した。次いでその画分を、処方緩衝液（５００ｍＭのＬ−アルギニン、５０ｍＭのＴｒｉｓ、２．５ｍＭのＺｎＳＯ４（ｐＨ７．４））に対して透析した。
【０１０３】
この説明において、ヒスチジンタグと共に当初発現され、続いて該タグを除去されたタンパク質は、実施例番号に続いて上付きのａ）で表される。ヒスチジンタグなしで当初から発現されたタンパク質は、実施例番号に続いて上付きのｂ）で表される。
２−Ｄ電気泳動による融合タンパク質の特徴付け
得られたタンパク質をさらに特徴付けて、クロマトグラフィ条件を正確に選択するために、タンパク質の等電点を決定した。この目的のために、二次元電気泳動（２−Ｄ）方法を以下のスケジュールに従って二段階で使用した。
ステップ１．ｐＨ勾配におけるタンパク質の等電点電気泳動法および変性条件
【０１０４】
濃度１−２ｍｇ／ｍｌのタンパク質調製物を、アセトン中に１０％のトリクロロ酢酸および０．０７％のβ−メルカプトエタノールを含有する沈殿溶液と１：１の割合で混合することにより、沈殿させた。混合物を−２０℃で３０分間インキュベートし、次いで１５，０００ｇおよび４℃で２５分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを冷アセトンと０．０７％β−メルカプトエタノールで２回洗浄した。次にアセトンの残留物を、臭いが検出されなくなるまで蒸発させた。タンパク質ペレットを、２５０ｍｌの再水和緩衝液、８Ｍの尿素、１％のＣＨＡＰＳ、１５ｍＭのＤＴＴ、０．５％の両性電解質（GE Healthcare）に、その後に用いるストリップに依存して、３−１１または６−１１のｐＨのプロファイルで懸濁した。タンパク質溶液を等電点電気泳動用のセラミックチャンバーに入れ、次いで適切なｐＨプロファイル（３−１１または６−１１）で１３ｃｍのDrysStrip（GE Healthcare）に供した。全体を鉱油の層で覆った。チャンバーはEttan IPGphor III装置に入れ、ここで、等電点電気泳動を、ストリップの寸法およびｐＨプロファイルに割り当てられた次のプログラムに従って行った。
【０１０５】
２０℃で１６時間脱水。
固定されたｐＨ勾配で電界にフォーカス
【表Ａ】
0006324905.tif 000002
その後、焦点のタンパク質を含有するストリップを脱イオン水で１分間洗浄し、クーマシーブリリアントで染色し、ついで脱色し、タンパク質の位置をマークする画像としてアーカイブに保管した。脱色したストリップは、次の組成の緩衝液で１５分間、２回平衡化した：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６Ｍの尿素、１％ＤＴＴ、２％ＳＤＳ、３０％グリセロール。
【０１０６】
ステップ２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる第２方向への分離。
ストリップは、標準サイズ毎に単一のウェルを含有する１２．５％ポリアクリルアミドゲル上に置き、次に分離を、２００Ｖの電圧で３時間、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用装置で実施した。ゲルはクーマシーブリリアントで染色し、適用されたスケールでアーカイブに保管した。タンパク質は、サイズの標準に基づいてその重量を決定することにより同定され、そのＩＰＩは、製造業者（GE Healthcare）が提供する曲線に基づき６−１１の尺度で（アノードとしてマークされた端からのストリップの長さの％に対するｐＨの比率）、または等電点電気泳動校正キット（GE Healthcare）により実験的に決定された曲線に基づいて３−１１の尺度で、読み取った。
【０１０７】
例
本発明の融合タンパク質の代表例を、以下の例に示す。
例において、融合タンパク質のアミノ酸配列は、タンパク質のＮ末端からＣ末端への順序で記述する。例において、ＴＲＡＩＬは常にｈＴＲＡＩＬを意味する。
以下のアミノ酸配列成分の記号を使用する；ここでは３文字の記号に続き、等価の１文字の記号を示す。
ＬＩＮＫＥＲ１：立体リンカーＧｌｙ  Ｇｌｙ／ＧＧ
ＬＩＮＫＥＲ２：立体リンカーＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ／ＧＧＧ
【０１０８】
ＬＩＮＫＥＲ３：立体リンカーＧｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ／ＧＳＧ
ＬＩＮＫＥＲ４：立体リンカーＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ／ＧＧＧＧＳ
ＬＩＮＫＥＲ５：立体リンカーＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ／ＧＧＧＧＧＳ
ＬＩＮＫＥＲ６：立体リンカーＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ／ＧＧＳＧＧ
ＬＩＮＫＥＲ７：立体リンカーＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ／ＧＧＧＳＧＧＧ
ＬＩＮＫＥＲ８：立体リンカーＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ／ＧＧＧＧＳＧ
ＬＩＮＫＥＲ９：立体リンカーＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ／ＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ
ＬＩＮＫＥＲ１０：立体リンカーＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ／ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ
ＬＩＮＫＥＲ１１：立体リンカーＧｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ／ＧＳＧＧＧＳＧＧＧ
ＬＩＮＫＥＲ１２：立体リンカーＣｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｃｙｓ／ＣＡＡＣＡＡＣ
ＬＩＮＫＥＲ１３：立体リンカーＣｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｃｙｓ／ＣＡＡＡＣＡＡＣ
ＬＩＮＫＥＲ１４：立体リンカーＣｙｓ／Ｃ
ＬＩＮＫＥＲ１５：立体リンカーＧｌｙ／Ｇ
ＬＩＮＫＥＲ１６：立体リンカーＳｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ／ＳＧＧ
【０１０９】
ＦＵＲＩＮ：フューリンにより切断される配列Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ／ＲＫＫＲ
ＦＵＲＩＮ．ＮＡＴ：フューリンにより切断されるネイティブ配列Ｈｉｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ／ＨＲＱＰＲＧＷＥＱ
ＵＲＯＫＩＮ：ウロキナーゼにより切断される配列Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ａｒｇ／ＲＶＶＲ
ＭＭＰ：メタロプロテアーゼにより切断される配列Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｙ／ＰＬＧＬＡＧ
ＰＥＧ１：ＰＥＧ化リンカーＡｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ／ＡＳＧＣＧＰＥ
ＰＥＧ２：ＰＥＧ化リンカーＡｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ／ＡＳＧＣＧＰＥＧ
ＴＲＡＮＳ１：輸送配列Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ／ＨＨＨＨＨＨ
ＴＲＡＮＳ２：輸送配列Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ／ＲＲＲＲＲＲＲ
ＴＲＡＮＳ３：輸送配列Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ／ＲＲＲＲＲＲＲＲ
ＴＲＡＮＳ４：輸送配列Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｌａ／ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ
ＴＲＡＮＳ５：輸送配列Ｔｈｒ  Ｈｉｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｍｅｔ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｐｒｏ／ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ
ＴＲＡＮＳ６：輸送配列Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ／ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ
【０１１０】
例１．配列番号１の融合タンパク質
配列番号１のタンパク質は、２５８アミノ酸の長さおよび２９．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、ヒトグラニュライシンの８３アミノ酸活性型（配列番号３４）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカーＧ、立体リンカー（ＧＳＧ）、メタロプロテアーゼＭＭＰ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、およびウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１５−ＬＩＮＫＥＲ３−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−（配列番号３４）
【０１１１】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１および配列番号５７である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号５７）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１１２】
例２．配列番号２の融合タンパク質
配列番号２のタンパク質は、２６１アミノ酸の長さおよび３０．０９ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１９−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着した、ヒトグラニュライシンの８３アミノ酸活性型（配列番号３４）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、および立体リンカー（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号３４）−ＵＲＯＫＩＮ−ＭＭＰ−ＬＩＮＫＥＲ４−（ＴＲＡＩＬ１１９−２８１）
【０１１３】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２および配列番号５８である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号５８）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例２ａ）およびヒスチジンタグなし（例２ｂ）の両方で発現された。
【０１１４】
例３．配列番号３の融合タンパク質
配列番号３のタンパク質は、１８６アミノ酸の長さおよび２１．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、合成１５アミノ酸溶解性ペプチド（配列番号３５）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）およびウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−（配列番号３５）
【０１１５】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号３および配列番号５９である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号３）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号５９）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１１６】
例４．配列番号４の融合タンパク質
配列番号４のタンパク質は、２２７アミノ酸の長さおよび２５．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着した、５６アミノ酸ピロスリン１（配列番号３６）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）およびメタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号３６）−ＵＲＯＫＩＮ−ＭＭＰ−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
【０１１７】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号４および配列番号６０である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号４）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号６０）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１１８】
例５．配列番号５の融合タンパク質
配列番号５のタンパク質は、２６４アミノ酸の長さおよび２９．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ９５−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は５６アミノ酸ピロスリン１（配列番号３６）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＣＡＡＣＡＡＣ）、立体リンカー（ＧＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、およびウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ９５−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１２−ＬＩＮＫＥＲ２−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−（配列番号３６）
【０１１９】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号５および配列番号６１である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号５）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号６１）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１２０】
例６．配列番号６の融合タンパク質
配列番号６のタンパク質は、２９９アミノ酸の長さおよび３３．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ９５−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した９０アミノ酸ペプチドピロスリン５（配列番号３７）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＳＧ）、立体リンカー（ＣＡＡＣＡＡＡＣ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、および立体リンカーＧが組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ９５−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ３−ＬＩＮＫＥＲ１２−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１５−（配列番号３７）
【０１２１】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号６および配列番号６２である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号６）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号６２）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例６ａ）およびヒスチジンタグなし（例６ｂ）の両方で発現された。
【０１２２】
例７．配列番号７の融合タンパク質
配列番号７のタンパク質は、２２４アミノ酸の長さおよび２５．６ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ９５−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、タキプレシンからの１７アミノ酸活性ペプチド（配列番号３８）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＣＡＡＣＡＡＡＣ）、立体リンカー（ＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、およびウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ９５−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１２−ＬＩＮＫＥＲ１−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−（配列番号３８）
【０１２３】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号７および配列番号６３である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号７）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号６３）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例７ａ）およびヒスチジンタグなし（例７ｂ）の両方で発現された。
【０１２４】
例８．配列番号８の融合タンパク質
配列番号８のタンパク質は、２０２アミノ酸の長さおよび２３．８ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１４−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、タキプレシンからの１７アミノ酸活性ペプチド（配列番号３８）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、および７つのアルギニンの輸送配列（ＲＲＲＲＲＲＲ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１１４−２８１）−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−ＴＲＡＮＳ２−（配列番号３８）
【０１２５】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号８および配列番号６４である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号８）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号６４）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例８ａ）およびヒスチジンタグなし（例８ｂ）の両方で発現された。
【０１２６】
例９．配列番号９の融合タンパク質
配列番号９のタンパク質は、２４３アミノ酸の長さおよび２７．６ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ９５−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着した、３８アミノ酸の融合ペプチドボンベシン−マガイニン（配列番号３９）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、および立体リンカー（ＣＡＡＡＣＡＡＣ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号３９）−ＵＲＯＫＩＮ−ＭＭＰ−ＬＩＮＫＥＲ１３−（ＴＲＡＩＬ９５−２８１）
【０１２７】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号９および配列番号６５である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号９）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号６５）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１２８】
例１０．配列番号１０の融合タンパク質
配列番号１０のタンパク質は、１９６アミノ酸の長さおよび２２．４ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１９−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着した、２３アミノ酸マガイニン２（配列番号４０）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）およびメタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号４０）−ＵＲＯＫＩＮ−ＭＭＰ−（ＴＲＡＩＬ１１９−２８１）
【０１２９】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１０および配列番号６６である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１０）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号６６）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１３０】
例１１．配列番号１１の融合タンパク質
配列番号１１のタンパク質は、２０２アミノ酸の長さおよび２３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、合成１４アミノ酸溶解性ペプチド（配列番号４１）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ）、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、および８つのアルギニンの輸送配列（ＲＲＲＲＲＲＲＲ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１０−ＵＲＯＫＩＮ−ＭＭＰ−ＴＲＡＮＳ３−（配列番号４１）
【０１３１】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１１および配列番号６７である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１１）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号６７）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例１１ａ）およびヒスチジンタグなし（例１１ｂ）の両方で発現された。
【０１３２】
例１２．配列番号１２の融合タンパク質
配列番号１２のタンパク質は、２０５アミノ酸の長さおよび２３．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、合成１４アミノ酸溶解性ペプチド（配列番号４１）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥＧ）、立体リンカー配列（ＧＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、およびポリアルギニン輸送配列（ＲＲＲＲＲＲＲ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＰＥＧ２−ＬＩＮＫＥＲ２−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−ＴＲＡＮＳ２−（配列番号４１）
【０１３３】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１２および配列番号６８である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１２）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号６８）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１３４】
例１３．配列番号１３の融合タンパク質
配列番号１３のタンパク質は、２２８アミノ酸の長さおよび２５．９ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ９５−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、１４アミノ酸溶解性ペプチド（配列番号４１）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ）、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、および８つのアルギニンの輸送配列（ＲＲＲＲＲＲＲＲ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ９５−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１０−ＵＲＯＫＩＮ−ＭＭＰ−ＴＲＡＮＳ３−（配列番号４１）
【０１３５】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１３および配列番号６９である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１３）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号６９）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例１３ａ）およびヒスチジンタグなし（例１３ｂ）の両方で発現された。
【０１３６】
例１４．配列番号１４の融合タンパク質
配列番号１４のタンパク質は、１９２アミノ酸の長さおよび２２．１ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着した、１４アミノ酸溶解性ペプチド（配列番号４１）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー（Ｃ）、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、およびメタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）が組み込まれている。さらに、エフェクターペプチドのＮ末端には、ポリヒスチジン輸送配列（ＨＨＨＨＨＨ）が付着している。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
ＴＲＡＮＳ１−（配列番号４１）−ＬＩＮＫＥＲ１４−ＵＲＯＫＩＮ−ＭＭＰ−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
【０１３７】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１４および配列番号７０である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１４）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号７０）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１３８】
例１５．配列番号１５の融合タンパク質
配列番号１５のタンパク質は、２００アミノ酸の長さおよび２３．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着した、１４アミノ酸溶解性ペプチド（配列番号４１）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー（Ｃ）、８つのアルギニンの輸送配列（ＲＲＲＲＲＲＲＲ）、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、およびメタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）が組み込まれている。さらに、ヒスチジン輸送配列（ＨＨＨＨＨＨ）が、エフェクターペプチドのＮ末端に付着している。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
ＴＲＡＮＳ１−（配列番号４１）−ＬＩＮＫＥＲ１４−ＴＲＡＮＳ３−ＵＲＯＫＩＮ−ＭＭＰ−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
【０１３９】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１５および配列番号７１である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１５）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号７１）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１４０】
例１６．配列番号１６の融合タンパク質
配列番号１６のタンパク質は、２０２アミノ酸の長さおよび２３．１ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、１４アミノ酸溶解性ペプチド（配列番号４１）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、および８つのアルギニンの輸送配列（ＲＲＲＲＲＲＲＲ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１０−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−ＴＲＡＮＳ３−（配列番号４１）
【０１４１】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１６および配列番号７２である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１６）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号７２）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例１６ａ）およびヒスチジンタグなし（例１６ｂ）の両方で発現された。
【０１４２】
例１７．配列番号１７の融合タンパク質
配列番号１７のタンパク質は、２０８アミノ酸の長さおよび２３．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１６−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着した、２６アミノ酸ハイブリッドペプチドセクロピンＡ−メリチン（配列番号４２）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）およびメタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号４２）−ＵＲＯＫＩＮ−ＭＭＰ−（ＴＲＡＩＬ１１６−２８１）
【０１４３】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１７および配列番号７３である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１７）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号７３）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１４４】
例１８．配列番号１８の融合タンパク質
配列番号１８のタンパク質は、２０３アミノ酸の長さおよび２３．６ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１６−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着した、２７アミノ酸ペプチドｈＣＡＰ−１８／ＬＬ−３７（配列番号４３）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）およびメタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号４３）−ＵＲＯＫＩＮ−ＭＭＰ−（ＴＲＡＩＬ１１６−２８１）
【０１４５】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１８および配列番号７４である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１８）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号７４）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１４６】
例１９．配列番号１９の融合タンパク質
配列番号１９のタンパク質は、２０３アミノ酸の長さおよび２３．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１６−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着した、２７アミノ酸ペプチドＢＡＭＰ−２８（配列番号４４）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）およびメタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号４４）−ＵＲＯＫＩＮ−ＭＭＰ−（ＴＲＡＩＬ１１６−２８１）
【０１４７】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１９および配列番号７５である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１９）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号７５）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１４８】
例２０．配列番号２０の融合タンパク質
配列番号２０のタンパク質は、２００アミノ酸の長さおよび２２．８ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームＣの２４アミノ酸アナログ（配列番号４５）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＳＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）およびウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ６−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−（配列番号４５）
【０１４９】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２０および配列番号７６である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２０）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号７６）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１５０】
例２１．配列番号２０の融合タンパク質
配列番号２０のタンパク質は、２００アミノ酸の長さおよび２２．８ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームＡの２４アミノ酸アナログ（配列番号４６）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＳＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）およびウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ６−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−（配列番号４６）
【０１５１】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２１および配列番号７７である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２１）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号７７）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１５２】
例２２．配列番号２２の融合タンパク質
配列番号２２のタンパク質は、２００アミノ酸の長さおよび２２．８ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームＢの２４アミノ酸アナログ（配列番号４７）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＳＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）およびウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ６−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−（配列番号４７）
【０１５３】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２２および配列番号７８である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２２）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号７８）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１５４】
例２３．配列番号２３の融合タンパク質
配列番号２３のタンパク質は、１９０アミノ酸の長さおよび２２．１ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着した、インフルエンザウイルスヘマグルチニンのＨＡ２ドメインの１２アミノ酸フラグメント（配列番号４８）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、７つのアルギニンの輸送配列（ＲＲＲＲＲＲＲ）、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）およびメタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号４８）−ＴＲＡＮＳ２−ＵＲＯＫＩＮ−ＭＭＰ−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
【０１５５】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２３および配列番号７９である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２３）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号７９）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例２３ａ）およびヒスチジンタグなし（例２３ｂ）の両方で発現された。
【０１５６】
例２４．配列番号２４の融合タンパク質
配列番号２４のタンパク質は、４２９アミノ酸の長さおよび４８．６ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着した、ホスホリパーゼＣ活性を有するClostridium perfringensからのα毒素のＮ末端ドメインの２４７アミノ酸フラグメント（配列番号４９）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー（Ｇ）、立体リンカー（ＧＧＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化リンカー（ＡＳＧＣＧＰＥ）、および立体リンカー（ＧＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号４９）−ＬＩＮＫＥＲ１５−ＬＩＮＫＥＲ５−ＰＥＧ２−ＬＩＮＫＥＲ５−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
【０１５７】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２４および配列番号８０である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２４）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号８０）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１５８】
例２５．配列番号２５の融合タンパク質
配列番号２５のタンパク質は、６５８アミノ酸の長さおよび７３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着した、４６８アミノ酸ペプチドリステリオリシンＯ（配列番号５０）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー（Ｇ）、立体リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ）、フューリン切断部位（ＲＫＫＲ）、ＰＥＧ化リンカー（ＡＳＧＣＧＰＥＧ）、および立体リンカー（ＧＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号５０）−ＬＩＮＫＥＲ１５−ＬＩＮＫＥＲ９−ＦＵＲＩＮ−ＰＥＧ２−ＬＩＮＫＥＲ５−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
【０１５９】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２５および配列番号８１である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２５）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号８１）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１６０】
例２６．配列番号２６の融合タンパク質
配列番号２６のタンパク質は、４７８アミノ酸の長さおよび５４ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着した、２８９アミノ酸ホスホリパーゼＰＣ−ＰＬＣ（配列番号５１）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ）、フューリン切断部位（ＲＫＫＲ）、ＰＥＧ化リンカー（ＡＳＧＣＧＰＥＧ）、および立体リンカー（ＧＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号５１）−ＬＩＮＫＥＲ９−ＦＵＲＩＮ−ＰＥＧ２−ＬＩＮＫＥＲ５−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
【０１６１】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２６および配列番号８２である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２６）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号８２）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１６２】
例２７．配列番号２７の融合タンパク質
配列番号２７のタンパク質は、３６１アミノ酸の長さおよび４０．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着した、１７９アミノ酸イクイナトキシンＥｑＴｘ−ＩＩ（配列番号５２）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＧＳ）、フューリン切断部位（ＲＫＫＲ）、ＰＥＧ化リンカー（ＡＳＧＣＧＰＥ）、および立体リンカー（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号５２）−ＬＩＮＫＥＲ４−ＦＵＲＩＮ−ＰＥＧ１−ＬＩＮＫＥＲ４−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
【０１６３】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２７および配列番号８３である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２７）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号８３）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１６４】
例２８．配列番号２８の融合タンパク質
配列番号２８のタンパク質は、２２７アミノ酸の長さおよび２５．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１６−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着した、４６アミノ酸ペプチドビスコトキシンＡ３（ＶｔＡ３）（配列番号５３）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、および立体リンカー（ＧＧＳＧＧ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号５３）−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ６−（ＴＲＡＩＬ１１６−２８１）
【０１６５】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２８および配列番号８４である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２８）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号８４）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１６６】
例２９．配列番号２９の融合タンパク質
配列番号２９のタンパク質は、２２４アミノ酸の長さおよび２４．９ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、４６アミノ酸ペプチドビスコトキシンＡ３（ＶｔＡ３）（配列番号５３）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）およびウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ７−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−（配列番号５３）
【０１６７】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２９および配列番号８５である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２９）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号８５）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１６８】
例３０．配列番号３０の融合タンパク質
配列番号３０のタンパク質は、２００アミノ酸の長さおよび２２．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、ヒトパーフォリンの３３アミノ酸活性フラグメント（配列番号５４）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳＧ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ８−（配列番号５４）
【０１６９】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号３０および配列番号８６である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号３０）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号８６）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１７０】
例３１．配列番号３１の融合タンパク質
配列番号３１のタンパク質は、２１０アミノ酸の長さおよび２３．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、ヒトパーフォリンの３３アミノ酸活性フラグメント（配列番号５４）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＧＳＧ）、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、およびメタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ８−ＵＲＯＫＩＮ−ＭＭＰ−（配列番号５４）
【０１７１】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号３１および配列番号８７である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号３１）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号８７）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１７２】
例３２．配列番号３２の融合タンパク質
配列番号３２のタンパク質は、４３６アミノ酸の長さおよび４８ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１６−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着した、Bacillus thuringensisからの２５１アミノ酸パラスポリン２（配列番号５５）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、および立体リンカー（ＧＳＧＧＧＳＧＧＧ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号５５）−ＵＲＯＫＩＮ−ＭＭＰ−ＬＩＮＫＥＲ１１−（ＴＲＡＩＬ１１６−２８１）
【０１７３】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号３２および配列番号８８である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号３２）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号８８）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１７４】
例３３．配列番号３３の融合タンパク質
配列番号３３のタンパク質は、２１５アミノ酸の長さおよび２４．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、ＥＧＦインヒビターと合成溶解性ペプチドを含む、３２アミノ酸融合ペプチド（配列番号５６）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（Ｇ）、立体リンカー（ＣＡＡＣＡＡＡＣ）、立体リンカー（ＧＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、およびウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１５−ＬＩＮＫＥＲ１２−ＬＩＮＫＥＲ２−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−（配列番号５６）
【０１７５】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号３３および配列番号８９である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号３３）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号８９）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
【０１７６】
例３４．配列番号９１の融合タンパク質
配列番号９１のタンパク質は、２２３アミノ酸の長さおよび２５．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着した、ＰＤＧＦＲインヒビターと合成溶解性ペプチドを含む、３９アミノ酸融合ペプチド（配列番号１２５）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）およびメタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、立体リンカー（ＧＧ）、立体リンカー（ＣＡＡＡＣＡＡＣ）、および立体リンカー（ＳＧＧ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号１２５）−ＵＲＯＫＩＮ−ＭＭＰ−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１３−ＬＩＮＫＥＲ１６−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
【０１７７】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号９１および配列番号１０８である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号９１）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１０８）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
【０１７８】
例３５．配列番号９２の融合タンパク質
配列番号９２のタンパク質は、２２３アミノ酸の長さおよび２５．６ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ９５−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着した、１４アミノ酸融合合成溶解性ペプチド（配列番号４１）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、ポリアルギニン輸送ドメイン（ＲＲＲＲＲＲＲ）、フューリン切断部位（ＲＫＫＲ）、立体リンカー（ＧＧＧ）、および立体リンカー（ＣＡＡＡＣＡＡＣ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号４１）−ＴＲＡＮＳ２−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ２−ＬＩＮＫＥＲ１３−（ＴＲＡＩＬ９５−２８１）
【０１７９】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号９２および配列番号１０９である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号９２）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１０９）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
【０１８０】
例３６．配列番号９３の融合タンパク質
配列番号９３のタンパク質は、２３２アミノ酸の長さおよび２６．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ９５−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着した、１４アミノ酸融合合成溶解性ペプチド（配列番号４１）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、ポリアルギニン輸送ドメイン（ＲＲＲＲＲＲＲ）、フューリン切断部位（ＲＫＫＲ）、ネイティブフューリン切断部位（ＨＲＱＰＲＧＷＥＱ）、立体リンカー（ＧＧＧ）、および立体リンカー（ＣＡＡＡＣＡＡＣ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号４１）−ＴＲＡＮＳ２−ＦＵＲＩＮ−ＦＵＲＩＮ．ＮＡＴ−ＬＩＮＫＥＲ２−ＬＩＮＫＥＲ１３−（ＴＲＡＩＬ９５−２８１）
【０１８１】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号９３および配列番号１１０である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号９３）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１１０）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
【０１８２】
例３７．配列番号９４の融合タンパク質
配列番号９４のタンパク質は、２０７アミノ酸の長さおよび２３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、１４アミノ酸融合合成溶解性ペプチド（配列番号４１）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、輸送ドメイン（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ）、および立体リンカー（ＧＧ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１０−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−ＴＲＡＮＳ４−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号４１）
【０１８３】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号９４および配列番号１１１である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号９４）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１１１）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
【０１８４】
例３８．配列番号９５の融合タンパク質
配列番号９５のタンパク質は、２１８アミノ酸の長さおよび２４．４ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、２５アミノ酸プレウロシジンアナログ（配列番号１２６）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、輸送ドメイン（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ）、および立体リンカー（ＧＧ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１０−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−ＴＲＡＮＳ４−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号１２６）
【０１８５】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号９５および配列番号１１２である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号９５）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１１２）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
【０１８６】
例３９．配列番号９６の融合タンパク質
配列番号９６のタンパク質は、２１９アミノ酸の長さおよび２４．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、２６アミノ酸プレウロシジンアナログ（配列番号１２７）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、輸送ドメイン（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ）、および立体リンカー（ＧＧ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１０−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−ＴＲＡＮＳ４−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号１２７）
【０１８７】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号９６および配列番号１１３である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号９６）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１１３）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
【０１８８】
例４０．配列番号９７の融合タンパク質
配列番号９７のタンパク質は、２１２アミノ酸の長さおよび２３．９ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、１７アミノ酸合成溶解性ペプチド（配列番号１２８）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、輸送ドメイン（ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ）、および立体リンカー（ＧＧ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１０−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−ＴＲＡＮＳ５−ＬＩＮＫＥＲ２−（配列番号１２７）
【０１８９】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号９７および配列番号１１４である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号９７）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１１４）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
【０１９０】
例４１．配列番号９８の融合タンパク質
配列番号９８のタンパク質は、２０７アミノ酸の長さおよび２３．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、１４アミノ酸合成溶解性ペプチド（配列番号４１）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、輸送ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）、および立体リンカー（ＧＧ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１０−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−ＴＲＡＮＳ６−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号４１）
【０１９１】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号９８および配列番号１１５である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号９８）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１１５）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
【０１９２】
例４２．配列番号９９の融合タンパク質
配列番号９９のタンパク質は、２０７アミノ酸の長さおよび２４ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、３１アミノ酸合成ペプチド（配列番号１２９）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、およびウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１０−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−（配列番号１２９）
【０１９３】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号９９および配列番号１１６である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号９９）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１１６）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
【０１９４】
例４３．配列番号１００の融合タンパク質
配列番号１００のタンパク質は、２１０アミノ酸の長さおよび２４．１ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、１７アミノ酸合成ペプチド（配列番号１３０）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、およびウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、輸送ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）、および立体リンカー（ＧＧ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１０−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−ＴＲＡＮＳ６−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号１３０）
【０１９５】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１００および配列番号１１７である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１００）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１１７）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
【０１９６】
例４４．配列番号１０１の融合タンパク質
配列番号１０１のタンパク質は、２１１アミノ酸の長さおよび２３．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、２９アミノ酸合成溶解性ペプチド（配列番号１３１）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、およびウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、および立体リンカー（ＧＧ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１０−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号１３１）
【０１９７】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１０１および配列番号１１８である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１０１）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１１８）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
【０１９８】
例４５．配列番号１０２の融合タンパク質
配列番号１０２のタンパク質は、２３４アミノ酸の長さおよび２６．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドの２つのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に順番に付着した、２５アミノ酸メリチンペプチド（配列番号１３２）および１４アミノ酸合成溶解性ペプチド（配列番号４１）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、およびウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、および立体リンカー（ＧＧ）が組み込まれている。さらに、立体リンカー（ＧＧＧＧＳ）が２つのエフェクターペプチドのドメインの間に組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１０−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号１３２）−ＬＩＮＫＥＲ４−（配列番号４１）
【０１９９】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１０２および配列番号１１９である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１０２）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１１９）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
【０２００】
例４６．配列番号１０３の融合タンパク質
配列番号１０３のタンパク質は、２０５アミノ酸の長さおよび２３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、２５アミノ酸メリチンペプチド（配列番号１３２）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、およびウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１０−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−（配列番号１３２）
【０２０１】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１０３および配列番号１２０である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１０３）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１２０）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
【０２０２】
例４７．配列番号１０４の融合タンパク質
配列番号１０４のタンパク質は、２１４アミノ酸の長さおよび２４．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、２５アミノ酸メリチンペプチド（配列番号１３２）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、ポリアルギニン輸送ドメイン（ＲＲＲＲＲＲＲ）、および立体リンカー（ＧＧ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１０−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−ＴＲＡＮＳ３−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号１３２）
【０２０３】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１０４および配列番号１２１である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１０４）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１２１）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
【０２０４】
例４８．配列番号１０５の融合タンパク質
配列番号１０５のタンパク質は、２１５アミノ酸の長さおよび２４．４ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、２５アミノ酸メリチンペプチド（配列番号１３２）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、および立体リンカー（ＧＧ）が組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端にはポリアルギニン輸送ドメイン（ＲＲＲＲＲＲＲＲ）が付着されて、全構築物のＣ末端フラグメントを形成している。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１０−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号１３２）−ＴＲＡＮＳ３
【０２０５】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１０５および配列番号１２２である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１０５）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１２２）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
【０２０６】
例４９．配列番号１０６の融合タンパク質
配列番号１０６のタンパク質は、２０３アミノ酸の長さおよび２３．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、１５アミノ酸合成溶解性ペプチド（配列番号３５）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、およびポリアルギニン輸送ドメイン（ＲＲＲＲＲＲＲＲ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１０−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−ＴＲＡＮＳ３−（配列番号３５）
【０２０７】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１０６および配列番号１２３である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１０６）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１２３）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
【０２０８】
例５０．配列番号１０７の融合タンパク質
配列番号１０７のタンパク質は、２０８アミノ酸の長さおよび２３．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着した、１５アミノ酸合成溶解性ペプチド（配列番号３５）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ）、メタロプロテアーゼ切断部位（ＰＬＧＬＡＧ）、ウロキナーゼ切断部位（ＲＶＶＲ）、輸送ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）、および立体リンカー（ＧＧ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１０−ＭＭＰ−ＵＲＯＫＩＮ−ＴＲＡＮＳ６−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号３５）
【０２０９】
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１０７および配列番号１２４である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１０７）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１２４）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
【０２１０】
例５１．融合タンパク質の抗腫瘍活性の試験
融合タンパク質の抗腫瘍活性の試験は、in vitroで腫瘍細胞株に対する細胞毒性アッセイにて、およびin vivoでマウスにおいて実施した。比較として、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１タンパク質およびプラセボを使用した。
１．円偏光二色性の測定：得られたタンパク質の二次構造組成の決定
融合タンパク質の調製物の性質を、それらの構造の観点から、例２３、例１１、および例１３の融合タンパク質について、円偏光二色性により決定した。
円偏光二色性は、タンパク質の二次構造および立体配座の決定のために使用する。ＣＤ法は、光の偏光面の回転および楕円偏光の出現により示される、タンパク質構造の光学活性を利用する。遠紫外（ＵＶ）におけるタンパク質のＣＤスペクトルにより、ポリペプチド主鎖の立体配座に関する正確なデータが得られる。
【０２１１】
透析
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、８０ｍＭのサッカロース、５ｍＭのＤＴＴからなる緩衝液へ処方した後の、分析されるタンパク質の試料は、１２ｋＤａカットオフの透析バッグ（Sigma-Aldrich）中で透析した。透析を、タンパク質調製物について１００倍量（ｖ／ｖ）過剰の緩衝液中４℃で数時間撹拌しながら実施した。透析の完了後、各調製物を遠心分離し（２５０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）、上清を回収した。こうして得られた試料中のタンパク質濃度は、ブラッドフォード法により決定した。
【０２１２】
濃度範囲が０．１−２．７ｍｇ／ｍｌのタンパク質の円偏光二色性の測定を、光路長０．２ｍｍまたは１ｍｍの石英キュベット中、Jasco J-710分光偏光計で実施した。窒素を７ｌ／ｍｉｎで流しながら測定を行ったため、波長範囲１９５ｎｍから２５０ｎｍまでの測定が可能であった。測定のパラメーター：−１ｎｍのスペクトル分解能；光線の半値幅１ｎｍ；感度２０ｍｄｅｇ、１つの波長での平均時間−８ｓ、スキャン速度１０ｎｍ／ｍｉｎ。
得られたスペクトルを、CDProソフトウェアを使用して１９３−２５０ｎｍの範囲で数値分析した。光電子倍増管での電圧が７００Ｖを超える点を、この波長範囲でのシグナル対ノイズ比が小さすぎるために除外した。
【０２１３】
得られたデータを使用して、分析したタンパク質における特定の二次構造の含量を、CDProソフトウェアにより計算した（表１）。
表１．分析したタンパク質における二次構造の含量
【表１】
0006324905.tif 000003
＊結晶構造１Ｄ４Ｖに基づいて得られた値
＊＊結晶構造１ＩＫＱ、１Ｒ４Ｑ、１ＡＢＲ、３ＰＸ８に基づいて得られた値
【０２１４】
対照分子（ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１）は、大多数がβシート構造型（波長２２０ｎｍでの楕円率が明らかに最小となる）であるタンパク質に特有のＣＤスペクトルを示す。これは、二次構造成分の計算と一致しており、αへリックス要素が極めて少ないことを示唆している。
得られた結果はまた、ｈＴＲＡＩＬタンパク質の結晶構造からのデータとも一致し、本発明の融合タンパク質（例２３）に特徴的であり、β要素は、それらの構造の４２％を構成する。例１１および例１３のタンパク質について、高いαへリックス含量が観察された（波長２０８ｎｍにて、追加の最小スペクトル）。これは、構築物における、強い両親媒性の性質を有しαへリックス様構造を形成するＫＬＡＫＬＡＫモチーフの存在のためである。残念ながら、例２３、例１１および例１３からのタンパク質のＣＤ測定用の緩衝液中での低い安定性と、分析された調製物の低濃度のために、これらのスペクトルは高いノイズレベルと低い解像度が特徴的である。したがって、これらは実際の状況を完全に反映していない可能性があり、結果を示唆するのみである。
【０２１５】
２．In vitroにおける細胞株テスト
細胞株
細胞株はＡＴＣＣとＣＬＳから入手し、その後繁殖させてAdamed’s Laboratory of Biology Cell Line Bankに寄託した。実験の間、細胞は、マイコプラズマの存在についてＰＣＲ法によりキットVenorRGeM Mycoplasma PCR Detection Kit（Minerva Biolabs, Berlin, Germany）を用いて日常的にチェックした。培養物は標準条件下に維持した：３７℃、５％ＣＯ２（ＤＭＥＭの場合は１０％ＣＯ２）、および８５％の相対湿度。特定の細胞株は、ＡＴＣＣの推奨に従って適切な培地中で培養した。
【０２１６】
表２．接着性細胞株
【表２−１】
0006324905.tif 000004
【０２１７】
【表２−２】
0006324905.tif 000005
【０２１８】
【表２−３】
0006324905.tif 000006
【０２１９】
【表３】
0006324905.tif 000007
【０２２０】
ＭＴＴ細胞毒性テスト
ＭＴＴアッセイは、細胞の増殖、生存率および細胞毒性を測定するために使用される比色アッセイである。これは、ミトコンドリア酵素のスクシナート−テトラゾリウムレダクターゼ１による、黄色のテトラゾリウム塩ＭＴＴ（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）の、非水溶性紫染料ホルマザンへの分解にある。ＭＴＴの還元は、生細胞にしか生じない。データ分析は、対照細胞と比較して処置された集団の細胞数の５０％で還元が生じる濃度である、タンパク質のＩＣ５０濃度（単位ｎｇ／ｍＬ）の決定からなる。結果は、GraphPad Prism 5.0ソフトウェアを使用して分析した。テストは、文献の記載（Celis, JE, (1998). Cell Biology, a Laboratory Handbook, second edition, Academic Press, San Diego; Yang, Y., Koh, LW, Tsai, JH., (2004); Involvement of viral and chemical factors with oral cancer in Taiwan, Jpn J Clin Oncol, 34 (4), 176-183）に従って実施した。
【０２２１】
細胞培養培地を、所定の密度（１００μＬあたり１０４−１０５細胞）に希釈した。その後、適切に希釈された１００μｌの細胞懸濁液を、９６ウェルプレートに３ウェルずつ適用した。このように調製した細胞を、使用した培地に応じて５％または１０％のＣＯ２中、３７℃で２４ｈインキュベートし、その後、細胞（１００μｌの培地中）に、様々な濃度のテストされるタンパク質を含む１００μｌの培地をさらに添加した。３−４回の細胞分裂に相当する次の７２時間にわたって、標的タンパク質と共に細胞をインキュベーションした後、標的タンパク質を有する培地に、２０ｍｌのＭＴＴ希釈標準溶液［５ｍｇ／ｍｌ］を添加し、５％ＣＯ２中３７℃で３ｈインキュベーションを続けた。その後、ＭＴＴ溶液を有する培地を除去し、１００μｌのＤＭＳＯを添加してホルマザン結晶を溶解した。撹拌後、５７０ｎｍでの吸光度を測定した（参照フィルター６９０ｎｍ）。
【０２２２】
ＥＺ４Ｕ細胞毒性テスト
ＥＺ４Ｕ（Biomedica）テストを使用して、非接着性細胞株におけるタンパク質の細胞毒性活性をテストした。このテストは、テトラゾリウム塩の還元で形成されるホルマザンが水に可溶であるように、ＭＴＴ法を改変したものである。細胞生存率試験は、タンパク質（タンパク質を７つの濃度で各３ウェルずつ）と共に細胞を連続７２時間インキュベーションした後に行った。これに基づいて、GraphPad Prism 5ソフトウェアを使用してＩＣ５０値を（２回の独立した実験の平均値として）決定した。対照細胞は、溶媒のみでインキュベートした。
【０２２３】
in vitro細胞毒性テストの結果は、溶媒のみで処置した対照細胞に対して融合タンパク質の細胞毒性効果が５０％のレベルで観察されたタンパク質濃度に相当するＩＣ５０値（ｎｇ／ｍｌ）として、まとめて示す。各実験は、３ウェルずつで実施した少なくとも２つの独立した実験の平均値を表す。タンパク質調製物に活性が無いと判断する基準としては、ＩＣ５０限度値２０００ｎｇ／ｍｌを採用した。ＩＣ５０値が２０００を超える融合タンパク質は不活性とみなした。
このテストのために選択した細胞は、ＴＲＡＩＬタンパク質に対して自然抵抗性のある腫瘍細胞株（ＴＲＡＩＬに対する自然抵抗性の基準：ＴＲＡＩＬタンパク質のＩＣ５０＞２０００）のみならず、ＴＲＡＩＬタンパク質に感受性のある腫瘍細胞株や、従来の抗がん薬剤抵抗性がん株としてドキソルビシンに抵抗性のある株ＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５も含んだ。
【０２２４】
未分化ＨＵＶＥＣ細胞株を、非がん細胞における融合タンパク質の効果／毒性の査定用の、健常な対照細胞株として使用した。
得られた結果により、本発明の特定の融合タンパク質を、ＴＲＡＩＬに自然抵抗性のある細胞に投与することにより、細胞株のＴＲＡＩＬに対する抵抗性を克服できる可能性が確認された。本発明の融合タンパク質を、ＴＲＡＩＬに感受性のある細胞に投与した場合、いくつかのケースでは、ＴＲＡＩＬのみの場合のＩＣ５０値と比べて融合タンパク質のＩＣ５０値が減少したことが示され、活性能力の明らかで強い相乗作用が観察された。さらに、標準的な抗がん薬剤のドキソルビシンに抵抗性のある細胞においても、本発明の融合タンパク質の細胞毒性活性が得られており、いくつかのケースでは、ＴＲＡＩＬのみの活性よりも高かった。
非がん細胞株で得られた２０００を超えるＩＣ５０値は、健常細胞に対して、本発明のタンパク質の使用に関連する毒性効果が無いことを示しており、本タンパク質の全身毒性の可能性が低いことを示唆している。
【０２２５】
広範な腫瘍細胞株の一団に対する、選択されたタンパク質調製物の細胞毒性活性の決定
表４は、広範囲で最も頻度の高いがんに対応する種々の臓器由来の広範な腫瘍細胞の一団に対する、選択された本発明の融合タンパク質のin vitroでの細胞毒性活性テストの結果を表す。
実験結果を、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表す。全ての計算およびグラフは、GraphPad Prism 5.0ソフトウェアを使用して作成した。
得られたＩＣ５０値により、融合タンパク質の高い細胞毒性活性が確認され、したがって、がんの処置における潜在的有用性が確認された。
【０２２６】
【表４−１】
0006324905.tif 000008
【０２２７】
【表４−２】
0006324905.tif 000009
【０２２８】
【表４−３】
0006324905.tif 000010
【０２２９】
【表４−４】
0006324905.tif 000011
【０２３０】
【表４−５】
0006324905.tif 000012
【０２３１】
３．異種移植におけるin vivoの融合タンパク質の抗腫瘍有効性
タンパク質調製物の抗腫瘍活性を、ヒト結腸がんＣｏｌｏ２０５およびＨＣＴ−１１６、ヒト肺がんＡ５４９およびＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ、ヒト前立腺がんＰＣ−３、ヒト膵臓がんＰａｎｃ−１およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２、ヒト肝がんＰＣＬ／ＰＲＦ／５およびＨｅｐＧ２、およびヒト多剤耐性子宮肉腫ＭＥＳ−ＳＡ．Ｄｘ５のマウスモデルにおいてテストした。
【０２３２】
細胞
ヒト肺がんＡ５４９およびＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ、ヒト前立腺がんＰＣ−３の細胞は、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Hyclone, Logan, UT, USA）中に維持した。
ヒト結腸がんＣｏｌｏ２０５の細胞は、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Hyclone, Logan, UT, USA）（任意にＯｐｔｏ−ＭＥＭ（Invitrogen, Cat.22600-134）と１：１の比率で混合）中に維持した。
ヒト膵臓がんＰＡＮＣ−１、ヒト肝がんＰＣＬ／ＰＲＦ／５、膵臓がんＭＩＡ  ＰａＣａ−２、およびヒト結腸がんＳＷ−６２０の細胞は、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを補充したＤＭＥＭ培地（Hyclone, Logan, UT, USA）中に維持した。
ヒト結腸がんＨＣＴ−１１６の細胞は、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを補充したＭｃＣｏｙ培地（Hyclone, Logan, UT, USA）中に維持した。
【０２３３】
多剤耐性ヒト子宮肉腫ＭＥＳ−ＳＡ．Ｄｘ５の細胞は、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミン、および１μＭの塩酸ドキソルビシン（Sigma, Cat. No. D1515-10MG）を補充したＭｃＣｏｙ培地（Hyclone, Logan, UT, USA）中に維持した。
ヒト肝がんＨｅｐＧ２の細胞は、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを補充したＭＥＭ培地（Hyclone, Logan, UT, USA）中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン（Invitrogen）で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ、４℃で８ｍｉｎ遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁した。
【０２３４】
マウス
本発明のタンパク質の抗腫瘍活性の試験は、Centrum Medycyny Doswiadczalnej in Bialystokから入手した４−６週齢（肺がんモデル）のCby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスまたは９−１０週齢（前立腺がんモデル）、Charles River Germanyから入手した４−５週齢の雌Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスを用いて実施した。マウスは、食糧および脱塩水を（適宜）自由摂取として、特定病原体感染防止条件下で保持した。動物を使用した全ての実験は、ガイドライン：「Interdisciplinary Principles and Guidelines for the Use of Animals in Research, Marketing and Education」（New York Academy of Sciences' Ad Hoc Committee on Animal Researchにより発行）に従って行い、実験はIV Local Ethics Committee on Animal Experimentation in Warsaw (No. 71/2009)により認可された。
【０２３５】
実験の過程および評価
腫瘍サイズは電子キャリパーを用いて測定し、腫瘍体積は、式：（ａ２×ｂ）／２を用いて算出した；式中、ａ＝腫瘍の短い対角線（ｍｍ）およびｂ＝腫瘍の長い対角線（ｍｍ）である。腫瘍成長阻害は、次の式を用いて算出した：
ＴＧＩ［％］（腫瘍成長阻害）＝（ＷＴ／ＷＣ）×１００−１００％
式中、ＷＴは、処置群の平均腫瘍体積であり、ＷＣは対照群の平均腫瘍体積である。 
実験結果は、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表す。すべての計算およびグラフは、GraphPad Prism 5.0プログラムを用いて作成した。
【０２３６】
肺がんモデルｃ
実験Ａ．
０日目に、Cby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ：マトリゲル（４：１）の混合物０．１ｍｌに懸濁した５×１０６のＡ５４９細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）を用いて移植した。実験１９日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜７５ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物：例１１ａの本発明の融合タンパク質（１５ｍｇ／ｋｇ）、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（２０ｍｇ／ｋｇ）、および対照として注射用水を投与した。調製物は１日１回、１日おきに６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。実験３５日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
【０２３７】
実験結果を図１および図２に、腫瘍体積の変化の図、ならびに、例１１ａの本発明の融合タンパク質および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置したマウスにおける、対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）として示す。
図１および図２に示す実験結果は、例１１ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験３５日目において対照と比較して、ＴＧＩ２８％でＡ５４９腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが０％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。このように、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
【０２３８】
実験Ｂ．０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ培地とマトリゲル（３：１）の混合物０．１ｍｌに懸濁した７×１０６のＡ５４９細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）を用いて移植した。実験１７日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜１００−１２０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物：例１１ａの本発明の融合タンパク質（４０ｍｇ／ｋｇ）、および対照としての処方緩衝液（１９ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、８１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、ｐＨ７．４）に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（２０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。調製物は１日１回、１日おきに６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。実験３４日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を図３および図４に、腫瘍体積の変化の図、ならびに、例１１ａの本発明の融合タンパク質および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置したマウスにおける、対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）として示す。
図３および図４に示す実験結果は、例１１ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験３４日目において対照と比較して、ＴＧＩ４５％でＡ５４９腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが２１．８％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。このように、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
【０２３９】
実験Ｃ．
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下（ｓｃ）に、０．１ｍｌのＨＢＳＳ緩衝液に懸濁した５×１０６のＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）を用いて移植した。実験１１日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜１００−１２０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物：例１１ａの本発明の融合タンパク質（４０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ）、および対照としての処方緩衝液（１９ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、８１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、ｐＨ７．４）に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（２０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。調製物は、１日１回、１日おきに６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した（例１１ａの本発明の融合タンパク質の場合、最初の投与は４０ｍｇ／ｋｇで、続いて３０ｍｇ／ｋｇで）。実験２９日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
【０２４０】
実験結果を図５および図６に、腫瘍体積の変化の図、ならびに、例１１ａの本発明の融合タンパク質および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置したマウスにおける、対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）として示す。
図５および図６に示す実験結果は、例１１ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験２９日目において対照と比較して、ＴＧＩ９３％でＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが７６％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。このように、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
【０２４１】
前立腺がんモデル
０日目に、Cby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスの右側皮下（ｓｃ）に、０．１８ｍｌのＨＢＳＳ培地と０．０２ｍｌのマトリゲルに懸濁した５×１０６のＰＣ３細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）を用いて移植した。実験２９日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜９０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物：例１１ａの本発明の融合タンパク質（１５ｍｇ／ｋｇ）、および対照として０．９％ＮａＣｌを投与した。調製物は１日１回６日間、静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。実験６０日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
【０２４２】
実験結果を図７および図８に、腫瘍体積の変化の図、ならびに、例１１ａの本発明の融合タンパク質で処置したマウスにおける、対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）として示す。
図７および図８に示す実験結果は、例１１ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験６０日目において対照と比較して、ＴＧＩ３３％でＰＣ３腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった（すなわち、体重基準値の１０％未満）。これは本発明のタンパク質の低い全身毒性を示す。
【０２４３】
膵臓がんモデル
実験Ａ：ＰＡＮＣ−１細胞
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ：マトリゲル（３：１）の混合物０．１ｍｌに懸濁した５×１０６のＰＡＮＣ−１細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）を用いて移植した。実験３１日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜１１０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物：例１１ａの本発明の融合タンパク質（４０ｍｇ／ｋｇ）、および対照としての処方緩衝液（１９ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、８１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、ｐＨ７．４）に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（２０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。調製物は１日１回、１日おきに６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。実験４２日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
【０２４４】
実験結果を図９および図１０に、腫瘍体積の変化の図、ならびに、例１１ａの本発明の融合タンパク質および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置したマウスにおける、対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）として示す。
図９および図１０に示す実験結果は、例１１ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験４２日目において対照と比較して、ＴＧＩ３２．６％でＰＡＮＣ−１腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが２６％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。このように、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった（すなわち、体重基準値の１０％未満）。これは本発明のタンパク質の低い全身毒性を示す。
【０２４５】
実験Ｂ：ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側腹部の皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ培地とマトリゲルの３：１の混合物０．１ｍｌに懸濁した５×１０６のＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）を用いて移植した。腫瘍のサイズが６０−３９８ｍｍ３になったとき（２０日目）、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜１７０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物：例１６ｂの本発明の融合タンパク質（５０ｍｇ／ｋｇ）、および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（５０ｍｇ／ｋｇ）、ならびに参照化合物のゲムシタビン（Gemzar, Eli Lilly）（５０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。調製物は１日おきに６回静脈内投与し（ｉ．ｖ．）、ゲムシタビンは同一のスケジュールで腹腔内（ｉ．ｐ．）に適用した。対照群には処方緩衝液を与えた。
【０２４６】
処置群の平均腫瘍サイズが〜１０００ｍｍ３となったときに、マウスを頸椎脱臼により屠殺した。
ＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓がんを負い、本発明の例１６ｂの融合タンパク質および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１とゲムシタビンで処置されたCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスで得た実験結果を、図１９に腫瘍体積の変化の図として、および図２０に、対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）として示す。
図１９および図２０に示す実験結果は、例１６ｂの本発明の融合タンパク質の投与が、実験６１日目において対照と比較して、ＴＧＩ９３％でＭＩＡ  ＰａＣａ−２腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１およびゲムシタビンについては、対照と比較して、ＴＧＩがそれぞれ６８％と４２．６％レベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。このように、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独および化学療法と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
【０２４７】
結腸がんモデル
実験Ａ：ＨＣＴ１１６細胞
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下（ｓｃ）に、０．１ｍｌのＨＢＳＳ培地に懸濁した５×１０６のＨＣＴ１１６細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）を用いて移植した。実験１８日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜４００ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物：例１１ａの本発明の融合タンパク質（３５ｍｇ／ｋｇ）、および対照としての処方緩衝液（５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、９５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、８０ｍＭのサッカロース、ｐＨ８．０）に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（２０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。調製物は１日１回、１日おきに６回静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。実験３２日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
【０２４８】
実験結果を図１１および図１２に、腫瘍体積の変化の図、ならびに、例１１ａの本発明の融合タンパク質および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置したマウスにおける、対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）として示す。
図１１および図１２に示す実験結果は、例１１ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験３２日目において対照と比較して、ＴＧＩ３３．５％でＨＣＴ１１６腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが５．６％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。このように、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった（すなわち、体重基準値の１０％未満）。これは本発明のタンパク質の低い全身毒性を示す。
【０２４９】
実験Ａ１：ＨＣＴ１１６細胞
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側腹部の皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ緩衝液：マトリゲル（３：１）の混合物０．１ｍｌに懸濁した５×１０６のＨＣＴ１１６細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）を用いて移植した。腫瘍のサイズが７１−４３２ｍｍ３になったとき（１３日目）、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜１８０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物：例１６ｂの本発明の融合タンパク質（９０ｍｇ／ｋｇ）、および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（６５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。調製物は１日おきに６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。対照群には処方緩衝液を与えた。
実験群の平均腫瘍サイズが〜１０００ｍｍ３になったとき、マウスを頸椎脱臼により屠殺した。
【０２５０】
ＨＣＴ１１６結腸がんを負い、本発明の例１６ｂの融合タンパク質および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置されたCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスで得た実験結果を、図２１に腫瘍体積の変化の図として、および図２２に、対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）として示す。
図２１および図２２に示す実験結果は、例１６ｂの本発明の融合タンパク質の投与が、実験２４日目において対照と比較して、ＴＧＩ６５．８％でＨＣＴ１１６腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが３７．９％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。このように、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
【０２５１】
実験Ｂ：ＳＷ６２０細胞
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ：マトリゲル（３：１）の混合物０．１ｍｌに懸濁した５×１０６のＳＷ６２０細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）を用いて移植した。実験１７日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜３２０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物：例１６ａの本発明の融合タンパク質（２０ｍｇ／ｋｇ）、および対照としての処方緩衝液（１９ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、８１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、ｐＨ７．４）に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（３０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。調製物は１日１回、１日おきに６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。実験３１日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
【０２５２】
ＳＷ６２０を負い、本発明の例１６ａの融合タンパク質および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置されたCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスで得た実験結果を、図１３および図１４に、腫瘍体積の変化の図、および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）として示す。
図１３および図１４に示す実験結果は、例１６ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験３１日目において対照と比較して、２５％のＴＧＩでＳＷ６２０腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが−９％のレベルで、腫瘍細胞成長に対する阻害効果は得られなかった。このように、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった（すなわち、体重基準値の１０％未満）。これは本発明のタンパク質の低い全身毒性を示す。
【０２５３】
実験Ｃ：Ｃｏｌｏ２０５細胞
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下（ｓｃ）に、０．１ｍｌのＨＢＳＳ緩衝液に懸濁した５×１０６のＣｏｌｏ２０５細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）を用いて移植した。実験１３日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜１１５ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。
処置群には、次の調製物：例１６ａの本発明の融合タンパク質（３０ｍｇ／ｋｇ）、および対照としての処方緩衝液（１９ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、８１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、ｐＨ７．４）に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（３０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。調製物は１日１回、１日おきに６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。実験３３日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
【０２５４】
実験結果を図１５および図１６に、腫瘍体積の変化の図、および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）として示す。
図１５および図１６に示す実験結果は、例１６ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験３３日目において対照と比較して、８０％のＴＧＩでＣｏｌｏ２０５腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが１８．８％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。このように、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
【０２５５】
多剤耐性子宮肉腫モデル
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ：マトリゲルの１０：１の混合物０．１ｍｌに懸濁した７×１０６のＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）を用いて移植した。実験１９日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜１８０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物：例１１ａの本発明の融合タンパク質（３０ｍｇ／ｋｇ）、および対照としての処方緩衝液（１９ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、８１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、ｐＨ７．４）に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。調製物は１日１回、１日おきに６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。実験３５日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
【０２５６】
実験結果を図１７および図１８に、腫瘍体積の変化の図、および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）として示す。
図１７および図１８に示す実験結果は、例１１ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験３５日目において対照と比較して、８１％のＴＧＩでＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが２９％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。このように、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった（すなわち、体重基準値の１０％未満）。これは本発明のタンパク質の低い全身毒性を示す。
【０２５７】
肝がんモデル
実験Ａ：ＨｅｐＧ２細胞
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側腹部の皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ緩衝液：マトリゲルの３：１の混合物０．１ｍｌに懸濁した７×１０６のＨｅｐＧ２細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）を用いて移植した。腫瘍のサイズが６４−５２９ｍｍ３になったとき（２５日目）、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜２３０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物：例１６ｂの本発明の融合タンパク質（８０ｍｇ／ｋｇ）、および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（５０ｍｇ／ｋｇ）、ならびに参照化合物５−ＦＵ（５−フルオロウラシル、Sigma-Aldrich）（２０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。調製物は１日おきに６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）し、５−ＦＵは腹腔内（ｉ．ｐ．）に適用した。対照群には処方緩衝液を与えた。
処置群の平均腫瘍サイズが〜１０００ｍｍ３となったときに、マウスを頸椎脱臼により屠殺した。
【０２５８】
得られた実験結果を、図２３に腫瘍体積の変化の図として、および図２４に、対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）として示す。
図２３および図２４に示す実験結果は、例１６ｂの本発明の融合タンパク質の投与が、実験４２日目において対照と比較して、９４．６％のＴＧＩでＨｅｐＧ２腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが２３．２％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。参照化合物の５−ＦＵは、ＨｅｐＧ２腫瘍に対していかなる有効性も示さなかった。このように、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独および標準化学療法と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
【０２５９】
実験Ｂ：ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側腹部の皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ緩衝液：マトリゲルの３：１の混合物０．１ｍｌに懸濁した７×１０６のＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）を用いて移植した。腫瘍のサイズが７２−５３６ｍｍ３になったとき（２９日目）、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜２０５ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物：例１６ｂの本発明の融合タンパク質（５０ｍｇ／ｋｇ）、および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（５０ｍｇ／ｋｇ）、ならびに参照化合物５−ＦＵ（５−フルオロウラシル、Sigma-Aldrich）（３０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。調製物は１日おきに６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）し、ただし５−ＦＵは、（ｑ１ｄ×５）×２のスケジュールで腹腔内（ｉ．ｐ．）に適用した。対照群には処方緩衝液を与えた。
処置群の平均腫瘍サイズが〜１０００ｍｍ３となったときに、マウスを頸椎脱臼により屠殺した。
【０２６０】
得られた実験結果を、図２５に腫瘍体積の変化の図として、および図２６に、対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）として示す。
図２５および図２６に示す実験結果は、例１６ｂの本発明の融合タンパク質の投与が、実験４３日目において対照と比較して、５３％のＴＧＩでＰＬＣ／ＰＲＦ／５腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１および５−ＦＵについては、対照と比較して、それぞれＴＧＩが２５．２％と３２．２％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。このように、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独および標準化学療法と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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