(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高純度塩酸バンコマイシンの分離精製方法であって、
（１）バンコマイシン粗製品をイオン交換クロマトグラフィー法によって塩酸バンコマイシン溶液を製造し、更にナノ濾過によって脱塩濃縮して、第１塩酸バンコマイシン濃縮液を得るステップであって、イオン交換クロマトグラフィーカラムの充填剤はカチオン交換グルカンゲル（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）又はアガロースゲル（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）であり、流動相はＮＨ４ＨＣＯ３水溶液である、ステップと、
（２）塩酸溶液で第１塩酸バンコマイシン濃縮液のｐＨを３．５−４．５に調整し、次に調整した第１塩酸バンコマイシン濃縮液を、ポリスチレン重合体を固定相とし、エタノール水溶液を流動相とし、溶離時の流動相中のエタノールの比率を１０％（Ｖ／Ｖ）とする、逆相クロマトグラフィーカラムに通液してカラムクロマトグラフィーを行うステップと、
（３）バンコマイシンＢの含有量が９８．５％より大きいクロマトグラフィー液を収集するステップと、
（４）塩酸で上記クロマトグラフィー液のｐＨを２．５−３．５に調整し、更にナノ濾過で濃縮させて溶媒と塩を除去して、第２塩酸バンコマイシン濃縮液を得るステップと、
（５）ステップ（４）の第２塩酸バンコマイシン濃縮液を精製し、脱水してクロマトグラフィー純度が９９％に達し、外観純白の塩酸バンコマイシン粉末を得るステップとを含む高純度塩酸バンコマイシンの分離精製方法。
【請求項２】
ステップ（１）の前記塩酸バンコマイシン溶液はイオン交換クロマトグラフィー法によって得たバンコマイシンのクロマトグラフィー純度が９５％より大きい塩酸バンコマイシン溶液である請求項１に記載の分離精製方法。
【請求項３】
ステップ（１）の塩酸バンコマイシン濃縮液は濃度が１００ｍｇ／ｍｌ−２００ｍｇ／ｍｌである請求項１に記載の分離精製方法。
【請求項４】
ステップ（２）の前記ポリスチレン重合体の粒子径が２０−４０μｍである請求項１に記載の分離精製方法。
【請求項５】
ステップ（２）の前記流動相は塩酸又は酢酸でｐＨを３．５−５．５に調整する請求項１に記載の分離精製方法。
【請求項６】
ステップ（４）では分子量１００−８００Ｄａのナノ濾過膜でナノ濾過を行う請求項１に記載の分離精製方法。
【請求項７】
ステップ（５）で製造された塩酸バンコマイシン粉末は濃度１０ｗｔ．％で、波長４５０ｎｍで、吸光度が０．０２より小さく、白度が８８％より大きく、クロマトグラフィー純度が９９％以上に達する請求項１に記載の分離精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は高純度塩酸バンコマイシンの分離精製方法に関する。該方法はクロマトグラフィー純度が９０％程度のバンコマイシン粗製品を原料として、まず塩−水を流動相として含むグルカンゲルカラムでクロマトグラフィーを行い、クロマトグラフィー純度が９５％より大きい塩酸バンコマイシンを収集し、ナノ濾過で脱塩して１００ｍｇ／ｍｌ−２００ｍｇ／ｍｌに濃縮させ、次に逆相Ｃ１８シリカゲルクロマトグラフィーカラム又は逆相重合体クロマトグラフィーカラムに通液して、アンモニウム塩を含むメタノール水溶液又はエタノール水溶液を流動相として溶離し、クロマトグラフィー純度が９８．５％より大きい塩酸バンコマイシンを収集し、更にナノ濾過で溶媒を除去し、次に１５０ｍｇ／ｍｌ−２５０ｍｇ／ｍｌに濃縮させて凍結乾燥させて、クロマトグラフィー純度が９９％に達し、外観純白の塩酸バンコマイシンを得ることである。
【背景技術】
【０００２】
塩酸バンコマイシンは放線菌属のアミコラトプシス・オリエンタリスが制御発酵条件下で生産する両性グリコペプチド類抗生物質であり、化学式がＣ６６Ｈ７５Ｃｌ２Ｎ９Ｏ２４・ＨＣｌ、分子量が１４８６である。既知の塩酸バンコマイシンはペプチドグリカン前駆体の末端Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａと結合して、細菌細胞壁の合成を抑制する。また、塩酸バンコマイシンは細胞膜の透過性とＲＮＡの合成を変化することもできる。塩酸バンコマイシンは特にβ−ラクトアミン抗生物質耐性を有するブドウ球菌による深刻な感染又は重症感染の初期治療にも、ペニシリンアレルギー又はペニシリンやセファロスポリンを使用して効果がない患者にも用いられる。早期にある文献に塩酸バンコマイシンは深刻な腎臓毒性、耳毒性を有することが報告されているため、臨床での幅広い使用が制限されるが、近年では、抗生物質的の大量使用が原因で、臨床上、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＡＳＡ）感染の病例が増加し、そのため塩酸バンコマイシンの使用量が年々増加する。従って、塩酸バンコマイシンの使用毒性を低下させ、薬品の安全性を向上させることは極めて重要になり、薬用塩酸バンコマイシンの純度向上は効果的な手段の一種である。近年では、科学技術の発展につれて、研究者は塩酸バンコマイシンの純度向上に取り込んだため、従来塩酸バンコマイシンが持つものと考えられる深刻な腎臓毒性や、耳毒性が軽減してきた。以上の原因によって、純度が更に高く、実現しやすく、工業的生産に適する塩酸バンコマイシンの精製プロセスの開発は非常に重要な意義がある。
【０００３】
バンコマイシンの分子は２つの基本構造、即ちグリコシル基部分としてのα−ｏ−ｖａｎｃｏｓａｍｉｎｅ−β−ｏ−ｇｌｕｃｏｓｙｌとペプチジル基部分としての中心ヘプタペプチド核で構成され、該構造は安定性が悪いことを決め、バンコマイシン分子は酸やアルカリ又は高温条件下で分解して分解生成物を生成する同時に、更に構造に複数の遊離フェノール性水酸基を持つため、酸化されてキノイド構造になることが発生しやすい。バンコマイシンは酸性条件と高温条件では加水分解して、一つのグリコシル基又は二つのグリコシル基を除去してデスバンコサミニルバンコマイシン又はアグルコバンコマイシン（ｄｅｓｖａｎｃｏｓａｍｉｎｙｌ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ  ａｎｄ  ａｇｌｕｃｏｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）を生成し、弱酸性環境下でも、一つのアミド基を除去して分解して２つの異性体を有するアミノバンコマイシンになる可能性もあることを報告する文献がある。バンコマイシンの化学構造のこれら特徴に基づき、高純度塩酸バンコマイシンの製造がある程度の困難である。
【０００４】
数十年にもわたり塩酸バンコマイシンの製品の開発が行われており、初期の製造プロセスでは、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン等の溶媒を使用して結晶化させることが一般的であるが、塩化アンモニウム又は塩化ナトリウムを添加して塩析法で沈殿させる手段で完成品を製造することもあり、しかし、バンコマイシン発酵液に多くの不純物が存在し、特にバンコマイシンの構造類似体が多いので、純度が低く、クロマトグラフィー純度が９３％より大きいという欧州薬局方の規格を満たすのがある程度の困難である。
【０００５】
最近、各種媒体によるクロマトグラフィー分離技術が発展するにつれて、該技術は塩酸バンコマイシンの分離精製に幅広く用いられるようになる。ＣＮ２００７１０１８７３００．５では、イオン交換充填材のグルカンゲルＳｅｐｈａｄｅｘ  ＣＭ−２５、アガロースＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ又はアガロースＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを使用してクロマトグラフィーを行い、４−６％の重炭酸アンモニウムを流動相として、クロマトグラフィー純度が９５％より大きく、９８％より小さい塩酸バンコマイシンを製造し、更に塩化ナトリウム溶液を添加して塩析沈殿を行うことで分離し、エタノールで加圧洗浄し、乾燥させて塩酸バンコマイシンの完成品を得る。該プロセスは高純度塩酸バンコマイシンが得られるが、収率が低く、更に、イオン交換クロマトグラフィー方法の色素除去効果が低く、そのため、該プロセスによる製品は外観の色や溶液吸光度において十分ではない。
【０００６】
特許ＷＯ２００６０６１１６６における実例は粒子径５ｕｍの逆相シリカゲル（Ｏｃｔａｄｅｃｙｌ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ）をクロマトグラフィー媒体として、５ｍＭ酢酸アンモニウムを含んでｐＨが４．０に調整した３％メタノール溶液を流動相として、流動相に２％のペンタノールを脱着剤として添加し、クロマトグラフィー純度が９７．５％より大きい塩酸バンコマイシンを収集し、次に真空濃縮によって収集液の濃度を１４０ｍｇ／ｍｌにし、メタノールを添加して、アンモニア水でｐＨを８．５−９．０に調整し、原料液の温度を０℃に冷却して、沈殿物を分離し、更にメタノールで加圧洗浄して、分離物を水で溶解してｐＨを３．２に調整し、次にイソプロパノールで結晶化させ、真空乾燥させて、純度９７−９９．３％の塩酸バンコマイシン完成品を得る。該特許にかかるプロセスに欠陥が存在し、特にスケールアップがある程度の困難であり、該方法では、流動相と溶離剤は異なる溶媒を使用するため、溶媒の回収難度がある程度に大きくなり、また、該プロセスは逆相精製を利用するため、一回の処理でクロマトグラフィー純度が９９％以上に達することができないので、二回の溶媒結晶化操作を行って、最後に真空乾燥することで完成品を得ることが必要であり、溶媒結晶化には、残留溶媒が効果的に除去できず、ＩＣＨによる溶媒残留量への要求を満たすことができないという問題があることが一般的であり、更に、該方法はステップが複雑であり、製品の収率も良いとはない。
【０００７】
従って、従来の文献資料から、様々な欠点が存在するので、商業生産に適する高純度（クロマトグラフィー純度が９９％以上に達する）塩酸バンコマイシンの生産方法がまたなく、塩酸バンコマイシンの使用安全性を確保するために、高純度塩酸バンコマイシンの製造方法が求められる。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は純度（クロマトグラフィー純度９９％以上）が高く、不純物が少ない塩酸バンコマイシンの商業生産用の高効率分離精製方法を提供し、前記分離精製方法は、（１）バンコマイシン粗製品をイオン交換クロマトグラフィー法によって塩酸バンコマイシン溶液を製造し、更にナノ濾過によって脱塩濃縮して、第１塩酸バンコマイシン濃縮液を得るステップと、（２）塩酸溶液で第１塩酸バンコマイシンの濃縮液のｐＨを３．５−４．５に調整し、次に調整した第１塩酸バンコマイシンの濃縮液を、Ｃ１８シリカゲル又はポリスチレン重合体を固定相とし、アンモニウム塩を含むメタノール水溶液又はエタノール水溶液を流動相とする逆相クロマトグラフィーカラムに通液してカラムクロマトグラフィーを行うステップと、（３）バンコマイシンＢの含有量が９８．５％より大きいクロマトグラフィー液を収集するステップと、（４）塩酸で上記クロマトグラフィー液のｐＨを２．５−３．５に調整し、次にナノ濾過で濃縮させることで溶媒と塩を除去して、第２塩酸バンコマイシン濃縮液を得るステップと、（５）ステップ（４）の第２塩酸バンコマイシン濃縮液を精製し、脱水してクロマトグラフィー純度が９９％に達し、外観純白の塩酸バンコマイシン粉末を得るステップとを含む。
【０００９】
好ましくは、ステップ（１）の前記塩酸バンコマイシン溶液はイオン交換クロマトグラフィー法によって得たバンコマイシンのクロマトグラフィー純度が９５％より大きい塩酸バンコマイシン溶液である。上記バンコマイシンのクロマトグラフィー純度が９５％以上の塩酸バンコマイシン溶液は下記従来技術における方法で製造される。（１）まず、中国特許ＣＮ０１１３２０４８．６に記載の方法によって、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  Ｏｒｉｅｒｔａｌｉｓ）ＳＩＰＩ４３４９１を発酵菌種とし、接種物を培養して、一次シードタンクに接種し、二次シード拡大培養を行った後、発酵缶に入れて、温度２４−３４℃、培養圧力０．０１−０．０８ＭＰａで培養し、過程において溶存酸素とｐＨを制御し、発酵周期を４−６日間にし、バンコマイシン発酵液を得る。（２）次に、中国特許ＣＮ２００７１０１９８５９９．４の記載に基づき、バンコマイシン発酵液をマクロ孔質樹脂に通液して、エタノールを含む酸性水溶液でバンコマイシンを溶離した後、溶離液に活性炭を加えて脱色し、脱色液に重炭酸アンモニウムを添加し、更にアンモニア水でｐＨを７．５−８．５に調整し、撹拌して静置した後に分離してクロマトグラフィー純度が８０％以上のバンコマイシン粗製品（該バンコマイシン粗製品とはステップ（１）におけるバンコマイシン粗製品である）を得る。（３）バンコマイシン粗製品を精製水に溶解した後に、孔径０．０１〜０．５μｍのセラミック膜で濾過して、澄んだバンコマイシン濾液を得る。澄んだバンコマイシン濾液をイオン交換クロマトグラフィーカラムで精製して、バンコマイシンＢの含有量が９５％以上の有効クロマトグラフィー液（即ち、バンコマイシンクロマトグラフィー純度が９５％以上の塩酸バンコマイシン溶液）を得る。ここでは、いわゆるイオン交換クロマトグラフィーカラムは充填材としてカチオン交換グルカンゲル（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）又はアガロースゲル（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を使用する。カラムに充填するバンコマイシン濾液について酸性条件下でクロマトグラフィーカラムに充填し、アルカリ性条件においてアルカリ金属塩又はアンモニウム塩を添加してクロマトグラフィーをすることが必要であり、一般的には、ＮＨ４＋塩やＮａ＋塩、例えばＮａＣｌ、ＮＨ４ＨＣＯ３、（ＮＨ４）２ＣＯ３等が使用される。クロマトグラフィーする時にバンコマイシンＢの含有量が９３％以上の画分を収集することによって混合した有効クロマトグラフィー液中のバンコマイシンＢの含有量を９５％以上にする。
【００１０】
該バンコマイシンのクロマトグラフィー純度が９５％以上の有効クロマトグラフィー液通をナノ濾過して塩酸バンコマイシンを１０−２０％含む濃縮液（濃度１００ｍｇ／ｍｌ−２００ｍｇ／ｍｌ）を得て、該濃縮液を好ましく２−８℃で保存する。ナノ濾過は分子量が１００−８００Ｄａのナノ濾過膜で行われる。前記濃縮温度は≦２０℃以下とする。
上記濃縮液を４Ｎ塩酸溶液によってｐＨを３．５−４．５に調整し、好ましくは、粒子径が好ましく５μｍ−６０μｍのＣ１８シリカゲル、又は、重合体例えばポリスチレンの粒子径が好ましく２０μｍ−４０μｍの逆相重合体充填材を含む逆相クロマトグラフィーカラムに通液する。メタノール又はエタノールを流動相としてアンモニウム塩をｐＨ調整用緩衝剤として添加し、好ましくは塩酸又は酢酸でｐＨを３．５−５．５に調整し、ここにおいて、アンモニウム塩として主に塩化アンモニウム又は酢酸アンモニウムを使用してイソクラティック溶離と勾配溶離を行うことが好ましく、この中に、アンモニウム塩を含むメタノール水溶液又はエタノール水溶液において、前記アンモニウム塩の濃度が０．１％−１ｗｔ％である。バンコマイシンＢの含有量が９８．５％以上の画分を収集して、混合溶離液中のバンコマイシンＢ成分の含有量を９９％以上にする。
【００１１】
混合溶離液を４Ｎの塩酸で酸性化してｐＨを２．５−３．５に調整し、次にナノ濾過で溶媒と塩を除去し、好ましくは、ナノ濾過は分子量１００−８００Ｄａのナノ濾過膜で行われる。更に、前記濃縮の温度≦２０℃である。再濃縮させて塩酸バンコマイシンを１５−２５％含む濃縮液を得て、凍結乾燥機又は噴霧乾燥機に入れて精製し、脱水し（精製脱水方法は公知従来技術としての凍結乾燥、又は噴霧乾燥法、塩析結晶法又は溶媒結晶化法である）乾燥させ、クロマトグラフィー純度が９９％より大きい塩酸バンコマイシン粉末を得る。該塩酸バンコマイシン粉末は濃度１０％で、波長４５０ｎｍ下で、吸光度が０．０２より小さく、白度が８８％より大きい。
【００１２】
従来の特許に比べて、本発明の製造方法は、イオン交換クロマトグラフィーと逆相シリコンクロマトグラフィーの使用によって、最終の塩酸バンコマイシンの純度を９９％より大きくし、製品の色を外観的に大幅に改善し、また、本方法ではイオン交換と逆相の二回のクロマトグラフィーだけでバンコマイシンの含有量を９９％より大きくするので、方法がシンプルであり、更に、本方法ではアンモニウム塩、エタノール又はメタノールを逆相クロマトグラフィーの流動相とするから、従来特許に比べて、後続処理や溶媒回収が操作しやすくなり、ナノ濾過膜で簡単に濃縮処理を行うことができるため、操作しやすくなるという利点を有し、従って、該プロセスは製品の品質を向上させるだけでなく、大規模な産業生産に適する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１のバンコマイシンＢの含有量が９０．２％のバンコマイシン粗製品のクロマトグラムを示す。
【図２】実施例１のバンコマイシンＢの含有量が９５．３％の塩酸バンコマイシン濃縮液のクロマトグラムを示す。
【図３】実施例２のバンコマイシンＢの含有量が９９．１％の塩酸バンコマイシン完成品のクロマトグラムを示す。
【図４】実施例４−６のバンコマイシンＢの含有量が９５．８％の塩酸バンコマイシン濃縮液のクロマトグラムを示す。
【図５】実施例４のバンコマイシンＢの含有量が９９．０％の塩酸バンコマイシン完成品のクロマトグラムを示す。
【図６】実施例５のバンコマイシンＢの含有量が９９．２％の塩酸バンコマイシン完成品のクロマトグラムを示す。
【図７】実施例６のバンコマイシンＢの含有量が９９．０％の塩酸バンコマイシン完成品のクロマトグラムを示す。
【図８】実施例７−９のバンコマイシンＢの含有量が９５．９％の塩酸バンコマイシン濃縮液のクロマトグラムを示す。
【図９】実施例７のバンコマイシンＢの含有量が９９．０％の塩酸バンコマイシン完成品のクロマトグラムを示す。
【図１０】実施例８のバンコマイシンＢの含有量が９９．２％の塩酸バンコマイシン完成品のクロマトグラムを示す。
【図１１】実施例９のバンコマイシンＢの含有量が９９．３％の塩酸バンコマイシン完成品のクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下は実施例によって本発明を更に説明するが、本発明は前記実施例範囲に制限されるものではない。下記実施例では、具体的な条件を明示しない実験方法は、一般的な方法と条件、又は商品の取り扱い説明書に応じることになる。
【００１５】
以下の実施例を使用して本発明を更に具体的に説明するが、以下の実施例と実施例中のプロセスのパラメータ範囲に制限されない。
【００１６】
実施例１：バンコマイシンＢの含有量が９５％以上の塩酸バンコマイシン溶液の製造
ビーカーにおいてバンコマイシン粗製品２５０ｇを２．０Ｌの精製水に溶解して、十分に撹拌し、完全に溶解した後に孔径０．２ｕｍの濾過膜で濾過し、次に水を添加して希釈し、図１に示されるように、濃度４３．６ｍｇ／ｍｌ、クロマトグラフィー純度９０．２％の塩酸バンコマイシン粗製品溶解液３．０Ｌを得る。
【００１７】
上記塩酸バンコマイシン粗製品溶解液３０００ｍｌを、クロマトグラフィーカラム体積に対して４％程度の充填量で、グルカンＳｅｐｈａｄｅｘ  ＣＭ−２５を装入した８ｃｍ＊６０ｃｍガラスクロマトグラフィーカラムに通液し、吸着方法として充填液と１／５のクロマトグラフィー充填材を混合し、次に混合液を直接充填し、更に精製水を使用して１．５倍カラム体積／時間の流速で洗浄し、６倍カラム体積洗浄後、０．３％（ｗ／ｖ）のＮＨ４ＨＣＯ３水溶液を使用して１倍カラム体積／時間の流速で１５−２０倍カラム体積を前洗浄し、前洗浄が終了する時に溶離液中のバンコマイシンＢの含有量が９０％より大きくなり、次に５％（ｗ／ｖ）ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液でバンコマイシンを溶離して、段階的に収集して、ＨＰＬＣで測定したバンコマイシンＢの含有量が９５％より大きい画分を混合した後、４Ｎの塩酸でｐＨを３．１に調整して、図２に示されるように、濃度１８．６ｍｇ／ｍｌ、クロマトグラフィー純度９６．５％の有効溶離液５６００ｍｌを得る。
【００１８】
次に上記有効溶離液を、孔径４００分子量のナノ濾過膜に通液することで脱塩して濃縮させ、透析液導電率が１２５５μｓ／ｃｍとなるようにそれに精製水を５回添加し、次に原料液を濃縮させ、濃度１５６ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ＝３．８、クロマトグラフィー純度９５．３％、体積６８０ｍｌの塩酸バンコマイシン濃縮液（図２参照）を得て、前記濃縮液を２−８℃で保存して使用に備える。
【００１９】
実施例２：高純度塩酸バンコマイシンの完成品の製造
例１で製造された濃縮液６８０ｍｌを、粒子径３０μｍのＣ１８シリカゲル充填材を装入した分取カラム（１５ｃｍ＊３０ｃｍ）に通液し、塩酸でｐＨを４．０に調整して、０．２％のＮＨ４Ｃｌ（Ｗ／Ｖ）と８％のメタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）を含むものを流動相として、５ＢＶ／ｈの流速で１００ｍｉｍ前洗浄し、次に流動相中のメタノールの比率を１２％に上げて、５ＢＶ／ｈの流速で溶離し、オンライン測定によって波長λ＝２８０であり、吸光度が迅速に上昇し始める時に、溶離液を収集し、２．５Ｌを１本として、合計で約１０本収集し、各本のバンコマイシンＢ含有量を測定し、クロマトグラフィー純度が９８．５％より大きいものを混合し、合計で濃度６．８ｍｇ／ｍｌの混合クロマトグラフィー液１２．５Ｌを得て、４Ｎ塩酸でｐＨを２．８に調整する。
【００２０】
上記クロマトグラフィー液を、孔径４００分子量のナノ濾過膜に通液して脱溶媒し、透析液に溶媒が無くなるとともに濃縮し始めると、混合液を濃度２４０ｍｇ／ｍｌ、体積３３８ｍｌに濃縮させ、次に濃縮液を０．４５μｍ濾過膜で濾過し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥させ、塩酸バンコマイシンの凍結乾燥粉末の完成品６８．５ｇを得て、収率は６４．６％、クロマトグラフィー純度は９９．１％（図３参照）、１０％溶液吸光度Ａ４５０ｎｍ＝０．０１２であった。
【００２１】
実施例３：孔径が異なるナノ濾過膜の濃縮効果の比較
孔径がそれぞれ１００Ｄａ、２００Ｄａ、４００Ｄａ及び８００Ｄａ、濾過面積がいずれも０．３２ｍ２の管状ナノ濾過膜を、順に実験室の小型ナノ濾過膜装置（型番ＬＮＧ−ＮＦ−１０１）に取り付け、塩酸バンコマイシンを１０％含む濃縮液８０００ｍｌを、４つの部分に分け、先ず一つの部分をナノ濾過して濃縮させ、循環ポンプの圧力を１０ｂａｒに制御し、濃縮開始時に透析サンプルを取って力価を測定し、更に透出流速を記録し、サイクル液の体積が１０００ｍｌになるまで濃縮させると終了し、透析サンプルを取って力価を測定し、更に透出流速を記録し、使用するたびに洗浄装置を洗浄して別の管状ナノ濾過膜に変換し、別の濃縮液を使用して試験を行う。試験結果は以下のとおりである：
【００２２】
【表１】
0006438966.tif 000002
【００２３】
上記表から分かるように、ナノ濾過膜の孔径による透析液力価への影響が低く、従って濃縮塩酸バンコマイシンであれば適用できるが、管状膜の孔径が流速に影響を与え、流速から見ると、孔径が２００Ｄａより大きい管状膜が好ましい。
【００２４】
実施例４：粒子径が異なるＣ１８シリカゲルの比較
濃度１５０ｍｇ／ｍｌ、クロマトグラフィー純度９５．８％（図４参照）の濃縮液３３０ｍｌを、塩酸又は水酸化ナトリウム溶液でｐＨを４．０に調整し、粒子径５μｍのＣ１８シリカゲル充填材を装入した分取カラム（１５ｃｍ＊３０ｃｍ）に通液し、塩酸でｐＨを４．０に調整して、０．１％のＮＨ４Ｃｌ（Ｗ／Ｖ）と８％のメタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）を含むものを流動相として、５ＢＶ／ｈの流速で１００ｍｉｍ前洗浄し、次に流動相中のメタノールの比率を１２％に上げて、５ＢＶ／ｈの流速で溶離し、オンライン測定によって波長λ＝２８０であり、吸光度が迅速に上昇し始める時に、溶離液を収集し、２．５Ｌを１本として、合計で約８本収集し、各本のバンコマイシンＢの含有量を測定し、クロマトグラフィー純度が９８．５％より大きいものを混合して、合計で濃度３．８ｍｇ／ｍｌの混合クロマトグラフィー液１０Ｌを得て、４Ｎ塩酸でｐＨを２．８に調整する。
【００２５】
上記クロマトグラフィー液を、孔径４００分子量のナノ濾過膜に通液して脱溶媒し、透析液に溶媒が無くなるとともに濃縮し始めると、混合液を濃度１５０ｍｇ／ｍｌ、体積２４８ｍｌに濃縮させ、次に濃縮液を０．４５μｍ濾過膜で濾過し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥させ、塩酸バンコマイシンの凍結乾燥粉末の完成品３０．８ｇを得て、収率は６２．２％、クロマトグラフィー純度は９９．０％（図５参照）、１０％溶液吸光度Ａ＝０．０１４であった。
【００２６】
実施例５：粒子径が異なるＣ１８シリカゲルの比較
濃度１５０ｍｇ／ｍｌ、クロマトグラフィー純度９５．８％の濃縮液３３０ｍｌを、塩酸又は水酸化ナトリウム溶液でｐＨを４．０に調整し、粒子径３０μｍのＣ１８シリカゲル充填材を装入した分取カラム（１５ｃｍ＊３０ｃｍ）に通液し、塩酸でｐＨを４．０に調整して、０．１％のＮＨ４Ｃｌ（Ｗ／Ｖ）と８％のメタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）を含むものを流動相として、５ＢＶ／ｈの流速で１００ｍｉｍ前洗浄し、次に流動相中のメタノールの比率を１２％に上げて、５ＢＶ／ｈの流速で溶離し、オンライン測定によって波長λ＝２８０であり、吸光度が迅速に上昇し始める時に、溶離液を収集し、２．５Ｌを１本として、合計で約８本収集し、各本のバンコマイシンＢの含有量を測定し、クロマトグラフィー純度が９８．５％より大きいものを混合して、合計で濃度４．１ｍｇ／ｍｌの混合クロマトグラフィー液１０Ｌを得て、４Ｎ塩酸でｐＨを２．８に調整する。
【００２７】
上記クロマトグラフィー液を、孔径４００分子量のナノ濾過膜に通液して脱溶媒し、透析液に溶媒が無くなるとともに濃縮し始めると、混合液を濃度１５０ｍｇ／ｍｌ、体積２６５ｍｌに濃縮させ、次に濃縮液を０．４５μｍ濾過膜で濾過し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥させ、塩酸バンコマイシンの凍結乾燥粉末の完成品３２．５ｇを得て、クロマトグラフィー純度は９９．２％（図６参照）、収率は６５．６％、１０％溶液吸光度Ａ＝０．０１５であった。
【００２８】
実施例６：粒子径が異なるＣ１８シリカゲルの比較
濃度１５０ｍｇ／ｍｌ、クロマトグラフィー純度９５．８％の濃縮液３３０ｍｌを、塩酸又は水酸化ナトリウム溶液でｐＨを４．０に調整し、粒子径６０μｍのＣ１８シリカゲル充填材を装入した分取カラム（１５ｃｍ＊３０ｃｍ）に通液し、塩酸でｐＨを４．０に調整して、０．１％のＮＨ４Ｃｌ（Ｗ／Ｖ）と８％のメタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）を含むものを流動相として、５ＢＶ／ｈの流速で１００ｍｉｍ前洗浄し、次に流動相中のメタノールの比率を１２％に上げて、５ＢＶ／ｈの流速で溶離し、オンライン測定によって波長λ＝２８０であり、吸光度が迅速に上昇し始める時に、溶離液を収集し、２．５Ｌを１本として、合計で約８本収集し、各本のバンコマイシンＢの含有量を測定し、クロマトグラフィー純度が９８．５％より大きいものを混合して、合計で濃度３．８ｍｇ／ｍｌの混合クロマトグラフィー液１０Ｌを得て、４Ｎ塩酸でｐＨを２．８に調整する。
【００２９】
上記クロマトグラフィー液を、孔径４００分子量のナノ濾過膜に通液して脱溶媒し、透析液に溶媒が無くなるとともに濃縮し始めると、混合液を濃度１５０ｍｇ／ｍｌ、体積２４５ｍｌに濃縮させ、次に濃縮液を０．４５μｍ濾過膜で濾過し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥させ、塩酸バンコマイシンの凍結乾燥粉末の完成品２９．８ｇを得て、クロマトグラフィー純度は９９．０％（図７参照）、収率は６０．２％、１０％溶液吸光度Ａ＝０．０１２であった。
【００３０】
実施例４、実施例５及び実施例６を比較することによって明らかなように、粒子径が異なるＣ１８シリカゲル充填材を持つ逆相クロマトグラフィーは、効果についてクロマトグラフィー純度、製品の収率及び製品の吸光度への影響が低いが、操作圧力について、粒子径が小さいほど圧力が大きくなり、従って量産の場合は３０μｍ−６０μｍのＣ１８シリカゲルが好ましい。
【００３１】
実施例７：流動相中のＣＨ３ＣＯＯＮＨ４とＮＨ４Ｃｌの比較
濃度１５２ｍｇ／ｍｌ、クロマトグラフィー純度９５．９％（図８参照）の濃縮液３３０ｍｌを、塩酸でｐＨを４．０に調整して、粒子径３０μｍのＣ１８シリカゲル充填材を装入した分取カラム（１５ｃｍ＊３０ｃｍ）に通液し、酢酸でｐＨを４．０に調整し、０．１％のＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（Ｗ／Ｖ）と８％のメタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）を含むものを流動相として、５ＢＶ／ｈの流速で１００ｍｉｍ前洗浄し、次に流動相中のメタノールの比率を１２％に上げて、５ＢＶ／ｈの流速で溶離し、オンライン測定によって波長λ＝２８０であり、吸光度が迅速に上昇し始める時に、溶離液を収集し、２．５Ｌを１本として、合計で約８本収集し、各本のバンコマイシンＢの含有量を測定し、クロマトグラフィー純度が９８．５％より大きいものを混合して、合計で濃度４．０ｍｇ／ｍｌの混合クロマトグラフィー液１０Ｌを得て、４Ｎ塩酸でｐＨを２．８に調整する。
【００３２】
上記クロマトグラフィー液を、孔径４００分子量のナノ濾過膜に通液して脱溶媒し、透析液に溶媒が無くなるとともに濃縮し始めると、混合液を濃度１５０ｍｇ／ｍｌ、体積２５２ｍｌに濃縮させ、次に濃縮液を０．４５μｍ濾過膜で濾過し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥させ、塩酸バンコマイシンの凍結乾燥粉末の完成品３１．１ｇを得て、クロマトグラフィー純度は９９．０％（図９参照）、１０％溶液吸光度Ａ＝０．０１７であった。
【００３３】
実施例５と比較することによって明らかなように、ＮＨ４Ｃｌを含む流動相を使用する場合は成分と収率はＣＨ３ＣＯＯＮＨ４を含む流動相を使用する場合との差異が小さい。
【００３４】
実施例８：流動相中の比率が異なるＮＨ４Ｃｌの比較
濃度１５２ｍｇ／ｍｌ、クロマトグラフィー純度９５．９％の濃縮液３３０ｍｌを、塩酸でｐＨを４．０に調整して、粒子径３０μｍのＣ１８シリカゲル充填材を装入した分取カラム（１５ｃｍ＊３０ｃｍ）に通液し、塩酸でｐＨを４．０に調整して、０．５％のＮＨ４Ｃｌ（Ｗ／Ｖ）と８％のメタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）を含むものを流動相として、５ＢＶ／ｈの流速で１００ｍｉｍ前洗浄し、次に流動相中のメタノールの比率を１２％に上げて、５ＢＶ／ｈの流速で溶離し、オンライン測定によって波長λ＝２８０であり、吸光度が迅速に上昇し始める時に、溶離液を収集し、２．５Ｌを１本として、合計で約９本収集し、各本のバンコマイシンＢの含有量を測定し、クロマトグラフィー純度が９８．５％より大きいものを混合して、合計で濃度３．２ｍｇ／ｍｌの混合クロマトグラフィー液１２．５Ｌを得て、４Ｎ塩酸でｐＨを２．８に調整する。
【００３５】
上記クロマトグラフィー液を、孔径４００分子量のナノ濾過膜に通液して脱溶媒し、透析液に溶媒が無くなるとともに濃縮し始めると、混合液を濃度１５０ｍｇ／ｍｌ、体積２６０ｍｌに濃縮させ、次に濃縮液を０．４５μｍ濾過膜で濾過し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥させ、塩酸バンコマイシンの凍結乾燥粉末の完成品３２．１ｇを得て、収率は６４．０％、クロマトグラフィー純度は９９．２％（図１０参照）、１０％溶液吸光度Ａ＝０．０１６であった。
【００３６】
実施例９：流動相中の比率が異なるＮＨ４Ｃｌの比較
濃度１５２ｍｇ／ｍｌ、クロマトグラフィー純度９５．９％の濃縮液３３０ｍｌを、塩酸でｐＨを４．０に調整して、粒子径３０μｍのＣ１８シリカゲル充填材を装入した分取カラム（１５ｃｍ＊３０ｃｍ）に通液し、塩酸でｐＨを４．０に調整して、１％のＮＨ４Ｃｌ（Ｗ／Ｖ）と８％のメタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）を含むものを流動相として、５ＢＶ／ｈの流速で１００ｍｉｍ前洗浄し、次に流動相中のメタノールの比率を１２％に上げて、５ＢＶ／ｈの流速で溶離し、オンライン測定によって波長λ＝２８０であり、吸光度が迅速に上昇し始める時に、溶離液を収集し、２．５Ｌを１本として、合計で約９本収集し、各本のバンコマイシンＢの含有量を測定し、クロマトグラフィー純度が９８．５％より大きいものを混合して、合計で濃度３．１ｍｇ／ｍｌの混合クロマトグラフィー液１２．５Ｌを得て、４Ｎ塩酸でｐＨを２．８に調整する。
【００３７】
上記クロマトグラフィー液を、孔径４００分子量のナノ濾過膜に通液して脱溶媒し、透析液に溶媒が無くなるとともに濃縮し始めると、混合液を濃度１５０ｍｇ／ｍｌ、体積２５８ｍｌに濃縮させ、次に濃縮液を０．４５μｍ濾過膜で濾過し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥させ、塩酸バンコマイシンの凍結乾燥粉末の完成品３２．０ｇを得て、収率は６３．８％、クロマトグラフィー純度は９９．３％（図１１参照）、１０％溶液吸光度Ａ＝０．０１４であった。
【００３８】
実施例５、実施例８及び実施例９を比較することによって明らかなように、流動相においてＮＨ４Ｃｌ（Ｗ／Ｖ）と８％のメタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）の含有量は製品の収率、クロマトグラフィー成分及び吸光度への影響が低いが、収集体積に影響を及ぼす。
【００３９】
実施例１０：ｐＨが異なる充填液と流動相の比較
濃度１４６ｍｇ／ｍｌ、クロマトグラフィー純度９６．４％の濃縮液６７０ｍｌを、塩酸でｐＨを３．５に調整して、粒子径３０μｍのＣ１８シリカゲル充填材を装入した分取カラム（１５ｃｍ＊３０ｃｍ）に通液し、塩酸でｐＨを３．５に調整して、０．５％のＮＨ４Ｃｌ（Ｗ／Ｖ）と８％のメタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）を含むものを流動相として、５ＢＶ／ｈの流速で１００ｍｉｍ前洗浄し、次に流動相中のメタノールの比率を１２％に上げて、５ＢＶ／ｈの流速で溶離し、オンライン測定によって波長λ＝２８０であり、吸光度が迅速に上昇し始める時に、溶離液を収集し、２．５Ｌを１本として、合計で約１０本収集し、各本のバンコマイシンＢの含有量を測定し、クロマトグラフィー純度が９８．５％より大きいものを混合して、合計で濃度６．３ｍｇ／ｍｌの混合クロマトグラフィー液１２．５Ｌを得て、４Ｎ塩酸でｐＨを２．８に調整する。
【００４０】
上記クロマトグラフィー液を、孔径４００分子量のナノ濾過膜に通液して脱溶媒し、透析液に溶媒が無くなるとともに濃縮し始めると、混合液を濃度２００ｍｇ／ｍｌ、体積３８０ｍｌに濃縮し、次に濃縮液を０．４５μｍ濾過膜で濾過し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥させ、塩酸バンコマイシンの凍結乾燥粉末の完成品６３．１ｇを得て、収率は６４．５％、クロマトグラフィー純度は９９．２％、１０％溶液吸光度Ａ＝０．０１５であった。
【００４１】
実施例１１：ｐＨが異なる充填液と流動相の比較
濃度１４６ｍｇ／ｍｌ、クロマトグラフィー純度９６．４％の濃縮液６７０ｍｌを、塩酸でｐＨを４．５に調整し、粒子径３０μｍのＣ１８シリカゲル充填材を装入した分取カラム（１５ｃｍ＊３０ｃｍ）に通液し、塩酸でｐＨを４．５に調整し、０．５％のＮＨ４Ｃｌ（Ｗ／Ｖ）と８％のメタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）を含むものを流動相として、５ＢＶ／ｈの流速で１００ｍｉｍ前洗浄し、次に流動相中のメタノールの比率を１２％に上げて、５ＢＶ／ｈの流速で溶離し、オンライン測定によって波長λ＝２８０であり、吸光度が迅速に上昇し始める時に、溶離液を収集し、２．５Ｌを１本として、合計で約１０本収集し、各本のバンコマイシンＢの含有量を測定し、クロマトグラフィー純度が９８．５％より大きいものを混合して、合計で濃度５．１ｍｇ／ｍｌの混合クロマトグラフィー液１５Ｌを得て、４Ｎ塩酸でｐＨを２．８に調整する。
【００４２】
上記クロマトグラフィー液を、孔径４００分子量のナノ濾過膜に通液して脱溶媒し、透析液に溶媒が無くなるとともに濃縮し始めると、混合液を濃度２００ｍｇ／ｍｌ、体積３６０ｍｌに濃縮させ、次に濃縮液を０．４５μｍ濾過膜で濾過し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥させ、塩酸バンコマイシンの凍結乾燥粉末の完成品５８．２ｇを得て、収率は５９．５％、クロマトグラフィー純度は９９．０％、１０％溶液吸光度Ａ＝０．０１８であった。
【００４３】
実施例７、実施例１０及び実施例１１を比較することによって明らかなように、充填液と流動相のｐＨが３．５であるか４．０であるかは製品の収率と成分への影響が低いが、充填液のｐＨが４．５であれば、収集体積を増大し、収率と成分へやや影響を及ぼす。
【００４４】
実施例１２：流動相中の各濃度のＣＨ３ＣＯＯＮＨ４の比較
濃度１５４ｍｇ／ｍｌ、クロマトグラフィー純度９５．９％の濃縮液３３０ｍｌを、塩酸又は水酸化ナトリウムでｐＨを４．０に調整し、粒子径３０μｍのＣ１８シリカゲル充填材を装入した分取カラム（１５ｃｍ＊３０ｃｍ）に通液し、酢酸でｐＨを４．０に調整し、０．５％のＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（Ｗ／Ｖ）と８％のメタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）を含むものを流動相として、５ＢＶ／ｈの流速で１００ｍｉｍ前洗浄し、次に流動相中のメタノールの比率を１２％に上げて、５ＢＶ／ｈの流速で溶離し、オンライン測定によって波長λ＝２８０であり、吸光度が迅速に上昇し始める時に、溶離液を収集し、２．５Ｌを１本として、合計で約８本収集し、各本のバンコマイシンＢの含有量を測定し、クロマトグラフィー純度が９８．５％より大きいものを混合して、合計で濃度４．１ｍｇ／ｍｌの混合クロマトグラフィー液１０Ｌを得て、４Ｎ塩酸でｐＨを２．８に調整する。
【００４５】
上記クロマトグラフィー液を、孔径４００分子量のナノ濾過膜に通液して脱溶媒し、透析液に溶媒が無くなるとともに濃縮し始めると、混合液を濃度１５０ｍｇ／ｍｌ、体積２６０ｍｌに濃縮させ、次に濃縮液を０．４５μｍ濾過膜で濾過し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥させ、塩酸バンコマイシンの凍結乾燥粉末の完成品３２．５ｇを得て、収率は６４．０％、クロマトグラフィー純度は９９．１％、１０％溶液吸光度Ａ＝０．０１３であった。
【００４６】
実施例１３：流動相中の各濃度のＣＨ３ＣＯＯＮＨ４の比較
濃度１５４ｍｇ／ｍｌの濃縮液３３０ｍｌを、塩酸又は水酸化ナトリウムでｐＨを４．０に調整し、粒子径３０μｍのＣ１８シリカゲル充填材を装入した分取カラム（１５ｃｍ＊３０ｃｍ）に通液し、酢酸でｐＨを４．０に調整し、１％のＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（Ｗ／Ｖ）と８％のメタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）を含むものを流動相として、５ＢＶ／ｈの流速で１００ｍｉｍ前洗浄し、次に流動相中のメタノールの比率を１２％に上げて、５ＢＶ／ｈの流速で溶離し、オンライン測定によって波長λ＝２８０であり、吸光度が迅速に上昇し始める時に、溶離液を収集し、２．５Ｌを１本として、合計で約９本収集し、各本のバンコマイシンＢの含有量を測定し、クロマトグラフィー純度が９８．５％より大きいものを混合して、合計で濃度３．２ｍｇ／ｍｌの混合クロマトグラフィー液１２．５Ｌを得て、４Ｎ塩酸でｐＨを２．８に調整する。
【００４７】
上記クロマトグラフィー液を、孔径４００分子量のナノ濾過膜に通液して脱溶媒し、透析液に溶媒が無くなるとともに濃縮し始めると、混合液を濃度１５０ｍｇ／ｍｌ、体積２６５ｍｌに濃縮させ、次に濃縮液を０．４５μｍ濾過膜で濾過し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥させ、塩酸バンコマイシンの凍結乾燥粉末の完成品３３．０ｇを得て、収率は６５．０％、クロマトグラフィー純度は９９．０％、１０％溶液吸光度Ａ＝０．０１５であった。
【００４８】
実施例７、実施例１２及び実施例１３を比較することによって明らかなように、流動相においてＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（Ｗ／Ｖ）と８％のメタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）の濃度は完成品の含有量、収率及び吸光度への影響が低く、高濃度ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４は収集体積に影響を及ぼす。
【００４９】
実施例１４：ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４系を流動相とする場合の各ｐＨの比較
濃度１４５ｍｇ／ｍｌ、クロマトグラフィー純度９６．６％の濃縮液６７０ｍｌを、塩酸でｐＨを３．５に調整して、粒子径３０μｍのＣ１８シリカゲル充填材を装入した分取カラム（１５ｃｍ＊３０ｃｍ）に通液し、酢酸でｐＨ＝３．５に調整し、０．５％のＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（Ｗ／Ｖ）と８％のメタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）を含むものを流動相として、５ＢＶ／ｈの流速で１００ｍｉｍ前洗浄し、次に流動相中のメタノールの比率を１２％に上げて、５ＢＶ／ｈの流速で溶離し、オンライン測定によって波長λ＝２８０であり、吸光度が迅速に上昇し始める時に、溶離液を収集し、２．５Ｌを１本として、合計で約１０本収集し、各本のバンコマイシンＢの含有量を測定し、クロマトグラフィー純度が９８．５％より大きいものを混合して、合計で濃度６．２ｍｇ／ｍｌの混合クロマトグラフィー液１２．５Ｌを得て、４Ｎ塩酸でｐＨを２．８に調整する。
【００５０】
上記クロマトグラフィー液を、孔径４００分子量のナノ濾過膜に通液して脱溶媒し、透析液に溶媒が無くなるとともに濃縮し始めると、混合液を濃度２００ｍｇ／ｍｌ、体積３７０ｍｌに濃縮させ、次に濃縮液を０．４５μｍ濾過膜で濾過し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥させ、塩酸バンコマイシンの凍結乾燥粉末の完成品６０．６ｇを得て、収率は６２．４％、クロマトグラフィー純度は９９．２％、１０％溶液吸光度Ａ＝０．０１６であった。
【００５１】
実施例１５：ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４系を流動相とする場合の各ｐＨの比較
濃度１５６ｍｇ／ｍｌ、クロマトグラフィー純度９５．７％の濃縮液６５０ｍｌを、塩酸又は水酸化ナトリウムでｐＨを４．０に調整し、粒子径３０μｍのＣ１８シリカゲル充填材を装入した分取カラム（１５ｃｍ＊３０ｃｍ）に通液し、酢酸でｐＨを４．０に調整し、０．５％のＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（Ｗ／Ｖ）と８％のメタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）を含むものを流動相として、５ＢＶ／ｈの流速で１００ｍｉｍ前洗浄し、次に流動相中のメタノールの比率を１２％に上げて、５ＢＶ／ｈの流速で溶離し、オンライン測定によって波長λ＝２８０であり、吸光度が迅速に上昇し始める時に、溶離液を収集し、２．５Ｌを１本として、合計で約１０本収集し、各本のバンコマイシンＢの含有量を測定し、クロマトグラフィー純度が９８．５％より大きいものを混合して、合計で濃度６．４ｍｇ／ｍｌの混合クロマトグラフィー液１２．５Ｌを得て、４Ｎ塩酸でｐＨを２．８に調整する。
【００５２】
上記クロマトグラフィー液を、孔径４００分子量のナノ濾過膜に通液して脱溶媒し、透析液に溶媒が無くなるとともに濃縮し始めると、混合液を濃度２００ｍｇ／ｍｌ、体積３８５ｍｌに濃縮させ、次に濃縮液を０．４５μｍ濾過膜で濾過し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥させ、塩酸バンコマイシンの凍結乾燥粉末の完成品６３．９ｇを得て、収率は６３．０％、クロマトグラフィー純度は９９．０％、１０％溶液吸光度Ａ＝０．０１４であった。
【００５３】
実施例１６：ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４系を流動相する場合の各ｐＨの比較
濃度１４５ｍｇ／ｍｌ、クロマトグラフィー純度９６．６％の濃縮液６７０ｍｌを、水酸化ナトリウムでｐＨを４．５に調整し、粒子径３０μｍのＣ１８シリカゲル充填材を装入した分取カラム（１５ｃｍ＊３０ｃｍ）に通液し、酢酸でｐＨを４．５に調整し、０．５％のＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（Ｗ／Ｖ）と８％のメタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）を含むものを流動相として、５ＢＶ／ｈの流速で１００ｍｉｍ前洗浄し、次に流動相中のメタノールの比率を１２％に上げて、５ＢＶ／ｈの流速で溶離し、オンライン測定によって波長λ＝２８０であり、吸光度が迅速に上昇し始める時に、溶離液を収集し、２．５Ｌを１本として、合計で約１０本収集し、各本のバンコマイシンＢの含有量を測定し、クロマトグラフィー純度が９８．５％より大きいものを混合して、合計で濃度６．１ｍｇ／ｍｌの混合クロマトグラフィー液１２．５Ｌを得て、４Ｎ塩酸でｐＨを２．８に調整する。
【００５４】
上記クロマトグラフィー液を、孔径４００分子量のナノ濾過膜に通液して脱溶媒し、透析液に溶媒が無くなるとともに濃縮し始めると、混合液を濃度２００ｍｇ／ｍｌ、体積３７０ｍｌに濃縮させ、次に濃縮液を０．４５μｍ濾過膜で濾過し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥させ、塩酸バンコマイシンの凍結乾燥粉末の完成品６１．０ｇを得て、収率は６２．８％、クロマトグラフィー純度は９９．１％、１０％溶液吸光度Ａ＝０．０１８であった。
実施例１４、実施例１５及び実施例１６を比較することによって明らかなように、充填液と流動相のｐＨを３．５−４．５に制御すれば、製造された製品の収率や品質への影響が低い。
【００５５】
実施例１７：ＰＳ樹脂を重合体充填材とする逆相による製造実施例
濃度１４８ｍｇ／ｍｌ、クロマトグラフィー純度９５．９％の濃縮液６８０ｍｌを、塩酸でｐＨを４．０に調整して、粒子径２０μｍのＰＳ吸着樹脂を装入した分取カラム（１５ｃｍ＊３０ｃｍ）に通液し、塩酸でｐＨを４．０に調整して、５％のエタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）を流動相として、２ＢＶ／ｈの流速で６０ｍｉｍ前洗浄し、次に流動相中のエタノールの比率を１０％に上げて、２ＢＶ／ｈの流速で溶離し、オンライン測定によって波長λ＝２８０であり、吸光度が迅速に上昇し始める時に、溶離液を収集し、２Ｌを１本とし、合計で約１０本収集し、各本のバンコマイシンＢの含有量を測定し、クロマトグラフィー純度が９８．５％より大きいものを混合して、合計で濃度６．４ｍｇ／ｍｌの混合クロマトグラフィー液１２Ｌを得て、４Ｎ塩酸でｐＨを２．８に調整する。
【００５６】
上記クロマトグラフィー液を、孔径４００分子量のナノ濾過膜に通液して脱溶媒し、透析液に溶媒が無くなるとともに濃縮し始めると、混合液を濃度２００ｍｇ／ｍｌ、体積３６５ｍｌに濃縮させ、次に濃縮液を０．４５μｍ濾過膜で濾過し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥させ、塩酸バンコマイシンの凍結乾燥粉末の完成品６０．６ｇを得て、収率は６０．２％、クロマトグラフィー純度は９９．３％、１０％溶液吸光度Ａ＝０．０１６であった。
【００５７】
実施例１８：ＰＳ樹脂を重合体充填材とする逆相による製造実施例
濃度１４８ｍｇ／ｍｌ、クロマトグラフィー純度９５．９％の濃縮液６８０ｍｌを、塩酸でｐＨを３．５に調整して、粒子径２０μｍのＰＳ吸着樹脂を装入した分取カラム（１５ｃｍ＊３０ｃｍ）に通液し、塩酸でｐＨを３．５に調整して、５％のエタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）を流動相として、２ＢＶ／ｈの流速で６０ｍｉｍ前洗浄し、次に流動相中のエタノールの比率を１０％に上げて、２ＢＶ／ｈの流速で溶離し、オンライン測定によって波長λ＝２８０であり、吸光度が迅速に上昇し始める時に、溶離液を収集し、２Ｌを１本とし、合計で約１０本収集し、各本のバンコマイシンＢの含有量を測定し、クロマトグラフィー純度が９８．５％より大きいものを混合して、合計で濃度６．２ｍｇ／ｍｌの混合クロマトグラフィー液１２Ｌを得て、４Ｎ塩酸でｐＨを２．８に調整する。
【００５８】
上記クロマトグラフィー液を、孔径４００分子量のナノ濾過膜に通液して脱溶媒し、透析液に溶媒が無くなるとともに濃縮し始めると、混合液を濃度２００ｍｇ／ｍｌ、体積３７０ｍｌに濃縮させ、次に濃縮液を０．４５μｍ濾過膜で濾過し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥させ、塩酸バンコマイシンの凍結乾燥粉末の完成品６１．２ｇを得て、収率は６０．８％、クロマトグラフィー純度は９９．０％、１０％溶液吸光度Ａ＝０．０１５であった。
【００５９】
実施例１９：ＰＳ樹脂を重合体充填材とする逆相による製造実施例
濃度１５８ｍｇ／ｍｌ、クロマトグラフィー純度９６．２％の濃縮液６５０ｍｌを、塩酸でｐＨを３．５に調整して、粒子径４０μｍのＰＳ吸着樹脂を装入した分取カラム（１５ｃｍ＊３０ｃｍ）に通液し、塩酸でｐＨを３．５に調整して、５％のエタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）を流動相として、２ＢＶ／ｈの流速で６０ｍｉｍ前洗浄し、次に流動相中のエタノールの比率を１０％に上げて、２ＢＶ／ｈの流速で溶離し、オンライン測定によって波長λ＝２８０であり、吸光度が迅速に上昇し始める時に、溶離液を収集し、２Ｌを１本とし、合計で約１０本収集し、各本のバンコマイシンＢの含有量を測定し、クロマトグラフィー純度が９８．５％より大きいものを混合して、合計で濃度７．１ｍｇ／ｍｌの混合クロマトグラフィー液１２Ｌを混合て、４Ｎ塩酸でｐＨを２．８に調整する。
【００６０】
上記クロマトグラフィー液を、孔径４００分子量のナノ濾過膜に通液して脱溶媒し、透析液に溶媒が無くなるとともに濃縮し始めると、混合液を濃度２００ｍｇ／ｍｌ、体積４００ｍｌに濃縮させ、次に濃縮液を０．４５μｍ濾過膜で濾過し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥させ、塩酸バンコマイシンの凍結乾燥粉末の完成品６４．７ｇを得て、収率は６３．０％、クロマトグラフィー純度は９９．０％、１０％溶液吸光度Ａ＝０．０１２であった。
【００６１】
実施例２０：ＰＳ樹脂を重合体充填材とする逆相による製造実施例
濃度１５８ｍｇ／ｍｌ、クロマトグラフィー純度９６．２％の濃縮液６５０ｍｌを、塩酸でｐＨを４．０に調整して、粒子径４０μｍのＰＳ吸着樹脂を装入した分取カラム（１５ｃｍ＊３０ｃｍ）に通液し、塩酸でｐＨを４．０に調整して、５％のエタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）を流動相として、２ＢＶ／ｈの流速で６０ｍｉｍ前洗浄し、次に流動相中のエタノールの比率を１０％に上げて、２ＢＶ／ｈの流速で溶離し、オンライン測定によって波長λ＝２８０であり、吸光度が迅速に上昇し始める時に、溶離液を収集し、２Ｌを１本とし、合計で約１０本収集し、各本のバンコマイシンＢの含有量を測定し、クロマトグラフィー純度が９８．５％より大きいものを混合して、合計で濃度６．８ｍｇ／ｍｌの混合クロマトグラフィー液１２Ｌを得て、４Ｎ塩酸でｐＨを２．８に調整する。
【００６２】
上記クロマトグラフィー液を、孔径４００分子量のナノ濾過膜に通液して脱溶媒し、透析液に溶媒が無くなるとともに濃縮し始めると、混合液を濃度２００ｍｇ／ｍｌ、体積３８０ｍｌに濃縮させ、次に濃縮液を０．４５μｍ濾過膜で濾過し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥させ、塩酸バンコマイシンの凍結乾燥粉末の完成品６３．５ｇを得て、収率は６１．８％、クロマトグラフィー純度は９９．１％、１０％溶液吸光度Ａ＝０．０１８であった。
【００６３】
実施例１７−２０では、仕様が異なる重合体逆相充填材ＰＳを使用して分取クロマトグラフィーを行い、更にそれぞれ異なるｐＨ条件で製造し、結果として、製造された完成品の成分、収率及び吸光度の差異が小さく、効果が高い。
【００６４】
なお、上記の発明内容及び具体的な実施形態は本発明が提供する技術案の実用を説明することを目指すもので、本発明の保護範囲の限定とすることができない。当業者は本発明の主旨や原理を脱逸せずに、様々な修正、同等置換、又は改良をすることができる。本発明の保護範囲は添付した請求項書類を基準にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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