(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非侵襲的に採取した皮膚角層中のＦＡＢＰ−５を測定し、あらかじめ又は同時に測定した正常な皮膚角層のＦＡＢＰ−５の測定値と対比し、発現の上昇をニキビ悪性化の指標とするニキビ肌の検査方法。
【請求項２】
皮膚角層が、ヒト皮膚より剥離操作によって得たものである請求項１に記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニキビ肌の症状の評価と、治療効果の判定に使用するための指標とその検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニキビは、脂腺性毛包に生じる炎症性の皮膚疾患であって、医学的には尋常性ざ瘡を指し、ざ瘡、アクネともよばれる。思春期に多く発生して成長とともに自然に治る場合が多いが、その症状には個人差が大きいことが知られている。ニキビの発生に関係する主要な因子としては、内分泌因子（ホルモン）、毛包管の角化、毛包管内の細菌、遺伝的要因などがある。
皮膚にある毛包は、軟毛性毛包，脂腺性毛包および終毛性毛包の3種類に分類される。これらのうち脂腺性毛包は顔面においてもっとも密度が高く、胸、背の中央部がこれに次いでいる。ニキビは顔、胸、背に発生しやすいとされている。また、これらのニキビ発症部位には面皰（めんぽう）、丘疹、膿疱などの皮疹が混在して見られる。
【０００３】
いわゆるニキビの発生部位には、皮疹症状である面皰が形成されることがきっかけで悪性化してゆく。面皰形成の主な成因として、毛包管の異常角化、皮脂分泌の亢進、皮脂成分の変化、毛包管の細菌叢があげられている。面皰の中には角層片、皮脂、軟毛が充満しており、アクネ菌（Propionibacterium acnes）も増殖している。面皰は、内容物の貯留が増えて大きくなると、トリグリセリドの分解産物である遊離脂肪酸や、面皰中で増殖した細菌由来の酵素によって炎症が発生し、炎症を起こしたものを赤色丘疹と呼ぶ。赤色丘疹は、炎症と細菌の増殖によっての膿疱を形成し、さらに進行すると皮膚組織を犯して嚢腫となり、その後の組織修復過程で痘痕が形成される。炎症がなおっても痘痕や色素沈着が残る。
【０００４】
面皰や皮疹を予防し、悪化を防ぐための化粧品や医薬部外品で、アクネ用化粧品ともよばれる製品が市販されている。これらの製品は、過剰な皮脂を取り除くものや皮脂腺の過剰な働きを抑制するものが一般的であり、これに抗炎症剤や抗菌剤を配合することが多い。また、製品の種類は洗顔料や化粧水を中心に、最近ではメークアップ化粧品まで多岐にわたる。さらに、“にきびを防ぐ”という効果を訴求する医薬部外品の製品は、薬用石けん、洗顔料、化粧水、パック、クリーム、乳液などが市販されている。
しかしこのような予防措置をおこなっても、ニキビは発生する場合があり、発生したあとの症状の進行状況は個人差が大きく、ニキビによる肌のトラブルの発生を予見しながら、適切な治療を行うことが重要である。
【０００５】
特許文献１には、このような目的達成のためにニキビ患者の血中の骨型ＡＬＰ(ＢＡＰ)濃度を測定することにより、ニキビの状態を評価し、さらに好中球の割合を測定して、その割合が高い場合には、ニキビの素因をストレスであると特定し、ニキビ改善のためのアドバイスを行うことが提案されている。
特許文献２には、血液中のＦｒｅＴ４、８−ＯＨｄＧ生成速度、鉄濃度、フェリチン量、ヘモグロビン量、ヘマトクリット量、コリンエステラーゼ活性、遊離脂肪酸量から選択される１〜２種類以上の測定値を指標としてニキビにより発生する肌リスクを評価する方法が記載されている。
本出願人は、皮膚の状態を評価するためのバイオマーカーについて多数の特許出願をおこなっている。特に特許文献３には、アトピー性皮膚炎発症リスクのバイオマーカーとしてＧａｌｅｃｔｉｎ−７、ＦＡＢＰ−５、Ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ１、Ｅｎｏｌａｓｅ １及びｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ−２（ＳＣＣＡ２）など複数のタンパク質が有用であることを明らかにしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−１９９０２７号公報
【特許文献２】特開２００８−１０７２７５号公報
【特許文献３】特許第５２８２２２８号公報
【特許文献４】ＷＯ２００７／０４６４６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、ニキビの予防と治療について研究を行っている。その過程で、ニキビの主たる皮疹症状である面皰に着目して観察したところ、面皰が悪性化して嚢腫にいたる場合と面皰の状態あるいは赤色丘疹や膿疱にとどまる場合など、様々な症状変化があることを観察によって確認した。そしてニキビの増加や、ニキビの悪性度を科学的に数値化することを見いだした。
本発明の目的は、ニキビの診断や経過を正確に評価するための指標と検査法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、前記のアトピー性皮膚炎のマーカーであるＦＡＢＰ−５ (Fatty acid binding protein-5)に注目し、ニキビのない健常人の皮膚、及びニキビを有する患者皮膚の疾患部、非疾患部におけるＦＡＢＰ−５の発現量を測定したところ、健常人と比較してニキビの悪性化に対応してＦＡＢＰ−５の発現量が高いことを見出した。この知見に基づき、皮膚試料中のＦＡＢＰ−５を測定すればニキビの悪性度の診断や治療経過等の診断が可能となることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明の構成は、以下のとおりである。
（１）非侵襲的に採取した皮膚角層中のＦＡＢＰ−５を測定し、あらかじめ又は同時に測定した正常な皮膚角層のＦＡＢＰ−５の測定値と対比し、発現の上昇をニキビ悪性化の指標とするニキビ肌の検査方法。
（２）皮膚角層が、ヒト皮膚より剥離操作によって得たものである（１）に記載の検査方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の検査法によれば、嚢腫、赤色丘疹や膿疱面皰などの各種段階の面皰を有するニキビ肌の治療経過、治療効果等が正確に判定できる。ニキビの出現していない肌や部位でのニキビの発症の予測が可能となる。さらにまた、検査対象の皮膚試料採取が容易であり、患者の負担が少なく簡便に検査することができる。
以上に加えて、培養細胞を用いて、培養細胞中に発現するＦＡＢＰ−５を抑制する作用を有する物質をスクリーニングすることができる。スクリーニングされた物質は、ニキビの予防治療剤として期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】正常ヒト頬、ニキビ肌の頬の皮膚剥離角層中のＦＡＢＰ−５の量を、ニキビの有無によって表示したグラフである。ニキビが出現することによりＦＡＢＰ−５が増加していることが明らかである。
【図２】正常ヒト額、ニキビ肌の額の皮膚剥離角層中のＦＡＢＰ−５の量を、ニキビの有無によって表示したグラフである。ニキビが出現することによりＦＡＢＰ−５が増加していることが明らかである。
【図３】正常ヒト頬、ニキビ肌の頬の皮膚剥離角層中のＦＡＢＰ−５の量を、ニキビの悪性度に対応して表示したグラフである。ニキビの悪性度が進行するにつれてＦＡＢＰ−５が増加していることが明らかである。
【図４】正常ヒト額、ニキビ肌の額の皮膚剥離角層中のＦＡＢＰ−５の量を、ニキビの悪性度に対応して表示したグラフである。ニキビの悪性度が進行するにつれてＦＡＢＰ−５が増加していることが明らかである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、非侵襲的に採集した皮膚試料中のＦＡＢＰ−５を測定し、あらかじめ又は同時に測定した正常な皮膚試料のＦＡＢＰ−５の測定値と対比し、発現の上昇をニキビ悪性化の指標とするニキビ肌の検査方法に係る発明である。
本発明において、ニキビ肌とは、医学的に尋常性ざ瘡と診断される皮疹であって、嚢腫、赤色丘疹や膿疱、面皰などの各種段階のいずれかの面皰を有する肌をいう。
【００１３】
ＦＡＢＰ−５ (Fatty acid binding protein-5)は、分子質量１５，０３３Ｄａの細胞内タンパク質である。主に表皮に存在するタンパク質で乾癬（表皮の規則的な肥厚と不全角化を特徴とする）の組織で発現が上昇することから同定された。脂肪酸（オレイン酸）や疎水性のリガンドと結合する細胞内タンパク質で、脂肪酸の取り込み、輸送、代謝、さらに細胞の増殖や分化などに関与する。増殖中の表皮角化細胞ではFABP-5の発現は少ないが、分化誘導により約２倍に増加する。乾癬で高発現しているS100A7(カルシウム依存性のシグナリングプロテイン)とも結合し、表皮角化細胞の分化段階では接着斑（focal adhesion）様構造に局在する。遺伝子配列情報は、Fatty acid binding protin 5, J. Invest. Dermatol. 99:299-305(1992)に開示されている。またアミノ酸配列情報は、Fatty acid-binding protein, epidermal, Biochem. J. 302:363-371(1994)に開示されている。またＦＡＢＰ−５がアトピー性皮膚炎のマーカーとなりうることが特許文献４に開示されている。
ニキビ肌との関係では、本発明に係るＦＡＢＰ−５が関与することはまったく知られていない。
【００１４】
本発明の検査方法では、皮膚試料中のＦＡＢＰ−５の遺伝子量または蛋白質量を測定する。ここで、皮膚試料としては、ヒトの表皮角層を含む皮膚試料が好ましく、ヒト皮膚からバイオプシーにより採取できる。通常はテープストリッピング法と呼ばれる、皮膚に粘着性のテープを貼付し、これを剥離する際に、テープに付着してくる角層を試料とすることが患者の負担の少ない方法である。
【００１５】
皮膚試料中のＦＡＢＰ−５を遺伝子試料として測定する場合には例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法等が挙げられる。また、ＦＡＢＰ−５遺伝子の定量はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより行うことができる。ＦＡＢＰ−５蛋白質の測定手段としては、例えば免疫染色等が採用できる。測定に用いる抗ＦＡＢＰ−５抗体及びその標識体は市販品を用いることができる。
【００１６】
免疫染色の場合には、例えば蛍光免疫染色により測定可能である。ＦＡＢＰ−５の定量は、例えば蛍光強度を、市販の測定装置とソフトウェアで定量することにより行うことができる。
【００１７】
また、本発明を診断薬とする場合には、上記の抗ＦＡＢＰ−５抗体、その標識体、第２抗体、標識第２抗体などを含有するＥＬＩＳＡキットとすることが好ましい。さらに、分析のための緩衝液等と組み合せた検査キットとすることもできる。また市販のキットを使用することもできる。このようなキットとしては、上皮脂肪酸結合タンパク質(FABP5)化学発光免疫測定キット（ＵＳＣＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＩＮＣ．）、ＣｉｒｃｕＬｅｘ Ｍｏｕｓｅ ＦＡＢＰ５/Ｅ−ＦＡＢＰ/ｍａｌ１ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（株式会社医学生物学研究所）などを例示できる。
【００１８】
本発明者が健常人の皮膚におけるＦＡＢＰ−５を測定したところ、全ての健常人の皮膚は低値であった。一方、ニキビ肌と診断された患者の患部及びその周辺部位の皮膚からは、健常人と比してＦＡＢＰ−５が著しく増加していることが確認された。同じ患者の、面皰などの皮疹を呈していない部位の皮膚は、ＦＡＢＰ−５が、患部よりは低いものの、健常人に比して高いことが確認された。従って、皮膚、特にニキビ周辺のＦＡＢＰ−５の変化量を観察すれば、ニキビの経過、治療効果、治療経過等の診断が可能である。
ＦＡＢＰ−５はニキビ肌の増悪に応じて増加することから、ＦＡＢＰ−５はニキビの増悪に何らかの形で関与して増加すると考えられる。したがって、公知のヒト培養皮膚細胞（ヒト三次元表皮モデル）を用いた、ＦＡＢＰ−５抑制又は促進物質のスクリーニングが従来技術を用いて実施できる。試験に当たっては、培養系にスクリーニング対象の物質を添加し、表皮モデル中に産生されるＦＡＢＰ−５量を測定し、対照の非添加の表皮モデル中のＦＡＢＰ−５量と比較して減少した場合を、ＦＡＢＰ−５抑制作用を有すると評価し、増加した場合を、ＦＡＢＰ−５促進作用を有すると評価する。
【実施例】
【００１９】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００２０】
１．ニキビ肌のＦＡＢＰ−５測定試験
Ａ．方法
（１）試験対象
健常者（１２名）：
顔面／身体に炎症性皮疹、アトピー性皮膚炎症状等の皮膚疾患が観察されない者を医師の診断により選別した。
ニキビ肌の患者：
医師の診断により尋常性ざ瘡と診断された患者（軽症１４名、中等症・重症１１名）を対象とした。
なお診断基準は下記に示す日本皮膚科学会尋常性ざ瘡治療ガイドライン2008年の判定基準に準じて行い、中等症以上の症状を示す患者を本出願においては中等症・重症群として分類した。
【００２１】
日本皮膚科学会診断基準
軽症  ：片顔に炎症性皮疹が5個以下
中等症：片顔に炎症性皮疹が6個以上20個以下
重症  ：片顔に炎症性皮疹が21個以上50個以下
最重症：片顔に炎症性皮疹が51個以上
年齢18歳以上、男女不問
【００２２】
（２）皮膚角層採取方法
頬部及び額部の皮膚より角質チェッカー（２．５ｃｍ×２．５ｃｍ：アサヒバイオメッド製)を用い、ニキビの出現している部位の近傍であって、皮疹や面皰のない部位から１枚テープストリッピングを行い、角層を採取した。
【００２３】
（３）皮膚角層からの抽出
ガラスビーズとRIPAバッファー（#89901/Thermo SCIETIFIC）500μｌの入ったチューブに角層を採取した角層チェッカーを入れ、２５分間ボルテックスミキサーにて振とうし、角層タンパクを抽出した。
【００２４】
（４）ＦＡＢＰ−５量の測定
９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ(ＣＯＳＴＡＲ/#3590)に、ＰＢＳ(−)(ＷＡＫＯ/#16219321)で０．５μｇ/ｍｌに希釈した固層化抗体 (Ｂｉｏ Ｖｅｎｄｅｒ/#RD181060100)を１００μｌ/ｗｅｌｌ分注し、２０℃で一晩インキュベートし固定化した。
ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（０．０５%Ｔｗｅｅｎ２含有 ＰＢＳ）３００μｌで３回洗浄後、 Ｒｅａｇｅｎｔ Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｒ&Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ/#890803）を２００μｌ/ｗｅｌｌを添加し、２５℃で1時間ブロッキング操作を行った。
再度洗浄後、角層抽出サンプル１００μｌ/ｗｅｌｌを添加し、３７℃で１．５時間反応させた。また、検量線作製用のＦＡＢＰ−５ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（コスモバイオ#FAB0805）を０〜５０ｎｇ/ｍｌの濃度で添加して反応させ、検量線とした。
次いで洗浄後、検出用抗体 (Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ／#AF3077) を0.5μg/ｍｌになるようにＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで希釈した溶液を100μl/well添加し、３７℃で１時間反応させた。
反応終了後ｗｅｌｌを洗浄し、次いで、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ／#890803）をｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで２００倍に希釈し、これを１００μｌ/ｗｅｌｌ添加し、２５℃で３０分反応させた。
反応終了後ｗｅｌｌを洗浄し、ＴＭＢ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ／#G7431）100μl/wellにて発色させ（２５℃、１５分）、１Ｎ硫酸により反応を停止させた後、ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ １９０(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ)を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
前記の作成済み検量線から、各試料のＦＡＢＰ−５量を算出した。なお角層中のＦＡＢＰ−５量は、角層抽出液中の総タンパク量で補正し、単位タンパク量あたりのＦＡＢＰ−５量で表した。  
【００２５】
（５）測定結果と解析
１）ニキビの有無による解析
被験者を健常者１２名、ニキビ肌の患者２５名の２群に分けて、ニキビの有無によるＦＡＢＰ−５の測定値を解析した。図１に頬部、図２に額部の測定結果を示す。
ニキビの有無によって皮膚角層のＦＡＢＰ−５が顕著に増加することが明らかとなった。
【００２６】
２）ニキビの症状の重篤度による解析
上記の被験者のデータをさらに、健常者１２名、軽症者１４名、中等症・重症者１１名の３群に分類して、ＦＡＢＰ−５の測定結果を再解析した。解析結果を同様に、頬部の測定結果（図３）、額部の測定結果（図４）として示した。
頬部・額部とも、ニキビの重症化に伴ってＦＡＢＰ−５は増加した。
以上の解析から、ＦＡＢＰ−５を測定することでニキビの悪性化の程度を評価できることが判明した。また本発明の方法は、ニキビの悪性化度に対応してＦＡＢＰ−５が増加することから、ニキビの治療効果の判定や回復度の評価に使用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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