(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューグリーン（学名：Brassicaoleracea var. botrytis aut italiana, L.）の抽出物を有効成分として含む解毒用食品組成物。
【請求項２】
ニューグリーン（学名：Brassicaoleracea var. botrytis aut italiana, L.）とアザミとの複合抽出物を有効成分として含む解毒用食品組成物。
【請求項３】
ニューグリーン（学名：Brassicaoleracea var. botrytis aut italiana, L.）の抽出物を有効成分として含む、解毒作用のうちのフェーズＩＩ及びフェーズＩＩＩ活性用食品組成物であって、
前記フェーズＩＩ活性は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、キノン還元酵素、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼの増加による活性であり、
前記フェーズＩＩＩ活性は、体内で毒性物質の増加時に血清から検出される物質の体外への排出を促す活性である、
フェーズＩＩ及びフェーズＩＩＩ活性用食品組成物。
【請求項４】
ニューグリーン（学名：Brassicaoleracea var. botrytis aut italiana, L.）とアザミとの複合抽出物を有効成分として含む、解毒作用のうちのフェーズＩＩ及びフェーズＩＩＩ活性用食品組成物であって、
前記フェーズＩＩ活性は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、キノン還元酵素、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼの増加による活性であり、
前記フェーズＩＩＩ活性は、体内で毒性物質の増加時に血清から検出される物質の体外への排出を促す活性である、
フェーズＩＩ及びフェーズＩＩＩ活性用食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、解毒用組成物に関し、より詳しくは、ニューグリーン抽出物を有効成分として含有して解毒を活性化させる解毒用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
毒素には、代謝の過程によって発生する老廃物や活性酸素またはストレス等によって発生する様々な副産物だけでなく、細菌の浸透によって発生する外毒素（exotoxin）や内毒素（endotoxin）、植物または動物が有する毒性物質も、これに該当する。
【０００３】
近来、このような毒素を除去する解毒（DETOXIFICATION）に対する関心が増大している。解毒とは、有害物質が体内に流入するのを防止し、肝臓や腎臓、肺、皮膚等を通して老廃物の排出を促進することを指す包括的な意味を持ち、具体的には、アルコール解毒（ALCOHOL DETOXIFICATION）、薬物解毒（DRUGDETOXIFICATION）、代謝性解毒（METABOLIC DETOXIFICATION）等がある。このような解毒のための食事療法や運動療法、食品等が開発されており、中でも食品による解毒が盛んに研究されているのが現状である。
【０００４】
本発明者らは、このような解毒のための食品の原料となる薬剤を研究している最中、ニューグリーン抽出物が解毒作用を活性化させるということを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
ニューグリーン（Newgreen）はアブラナ科の植物であって、トスカーノ（Toscano）とも言う。ニューグリーンは主に葉が食用として用いられ、ビタミンＣ、ベータカロテン、カリウム、カルシウム、リン等が含まれており、その含量は一般野菜の２倍に達して栄養価の高い植物として知られている。
【０００６】
一方、このようなニューグリーンが解毒作用に効果があるか否かに対する研究は行われたことがない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記のような問題点を解決するために導き出されたものであり、本発明が解決しようとする課題は、人体内で解毒作用の際に必要な酵素を活性化させることが可能なニューグリーン抽出物を有効成分として含有する解毒用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記のような課題を解決するための本発明は、ニューグリーン（学名：Brassicaoleracea var. botrytis aut italiana, L.）の抽出物を有効成分として含有する解毒用食品組成物を提供することを技術的な特徴とする。
【０００９】
また、上記のような課題を解決するための本発明は、ニューグリーン（学名：Brassicaoleracea var. botrytis aut italiana, L.）とアザミとの複合抽出物を有効成分として含有する解毒用食品組成物を提供することを技術的な特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係るニューグリーン抽出物を有効成分として含有する解毒用組成物は、解毒作用を活性化させて、人体内の毒素を副作用もなく効率的に除去することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞におけるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの相対活性度を示すグラフである。
【図２】Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞におけるキノン還元酵素（quinone reductase）の相対活性度を示すグラフである。
【図３】Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞におけるＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼの相対活性度を示すグラフである。
【図４】Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞におけるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼｍＲＮＡの相対発現量を示すグラフである。
【図５】Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞におけるキノン還元酵素ｍＲＮＡの相対発現量を示すグラフである。
【図６】Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞におけるＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼｍＲＮＡの相対発現量を示すグラフである。
【図７】Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞におけるグルタチオンの相対活性度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明を説明するにあたって、本発明で用いられる用語の意味を説明する。
【００１３】
本明細書において、「抽出物」は当業界で粗抽出物（Crude extract）と通用する意味であるが、広義的には抽出物をさらに分画（Fractionation）した分画物の意味も含む。すなわち、ニューグリーン抽出物は、上述した抽出溶媒を用いて得たものだけでなく、これに精製過程をさらに適用して得たものも含む。例えば、前記抽出物を一定の分画分子量値を有する限外濾過膜を通して得られた分画、様々なクロマトグラフィー（大きさ、電荷、疏水性または親和性に応じた分離のために調製されたもの）による分離等の、追加的に実施された様々な精製方法により得られた分画も本発明のニューグリーン抽出物に含まれるものである。
【００１４】
本明細書において、「有効成分として含む」とは、ニューグリーン抽出物の効能や活性を達成するのに十分な量を含むことを意味する。本発明は、天然植物材であるニューグリーンから抽出した組成物であって、過量投与しても人体に副作用がないため、ニューグリーン抽出物が本発明の組成物に含まれた量的な上限は、通常の技術者が適切な範囲内で選択して実施することができる。
【００１５】
本明細書において、「薬学的な有効量」はニューグリーン抽出物の効能または活性を達成するのに十分な量を意味する。
【００１６】
以下では、本発明の組成物について詳細に説明する。
【００１７】
本発明に係るニューグリーン抽出物は有機溶媒を用いて抽出し、抽出溶媒として用いられるものは以下のとおりである。
【００１８】
先ず、極性溶媒として好適なものは、（ｉ）水、（ｉｉ）炭素数１〜６のアルコール（好ましくは、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、１−ペンタノール、２−ブトキシエタノールまたはエチレングリコール）、（ｉｉｉ）酢酸、（ｉｖ）ＤＭＦ（N,N-Dimethylformamide）及び（ｖ）ＤＭＳＯ（Dimethylsulfoxide）等がある。
【００１９】
そして、非極性溶媒として好適なものは、アセトン、アセトニトリル、エチルアセテート、メチルアセテート、フルオロアルカン、ペンタン、ヘキサン、２，２，４−トリメチルペンタン、デカン、シクロヘキサン、シクロペンタン、ジイソブチレン、１−ペンテン、１−クロロブタン、１−クロロペンタン、ｏ−キシレン、ジイソプロピルエーテル、２−クロロプロパン、トルエン、１−クロロプロパン、クロロベンゼン、ベンゼン、ジエチルエーテル、ジエチルスルフィド、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、アニリン、ジエチルアミン、エーテル、四塩化炭素、メチレンクロリド、石油エーテル及びＴＨＦ等がある。
【００２０】
本発明は、抽出溶媒として、（ａ）水、（ｂ）炭素数１〜４の無水または低級アルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等）、（ｃ）前記低級アルコールと水との混合溶媒、（ｄ）アセトン、（ｅ）エチルアセテート、（ｆ）クロロホルム、（ｇ）ブチルアセテート、（ｈ）１，３−ブチレングリコール、（ｉ）ヘキサン及び（ｊ）ジエチルエーテル等を用いることが好ましく、容易な抽出のために、水、エタノールまたは水とエタノールとの混合物をニューグリーンに処理して抽出することがより好ましい。
【００２１】
また、本発明で用いられるニューグリーン抽出物は、減圧蒸留及び凍結乾燥または噴霧乾燥等のような追加の過程によって粉末状に調製することができる。
【００２２】
したがって、本発明は上記のような抽出溶媒を用いて抽出物を調製することができ、以下ではニューグリーン抽出物を調製する方法について説明する。
【００２３】
１）ニューグリーン抽出物の調製
（１）ニューグリーンを選別して粉砕した後、（２）粉砕物重量（ｗ）の約１〜２５倍の体積量（ｖ）、好ましくは７〜２０倍の体積量（ｖ）の精製水を含む水、メタノール、エタノール、ブタノール等の炭素数１〜４の低級アルコールまたはこれらの混合溶媒から選択された溶媒、より好ましくは水、エタノールまたはこれらの混合溶媒を用いて、（３）０〜１２０℃、好ましくは５０〜１００℃の抽出温度で、（４）約１時間〜１０日間、好ましくは約２時間〜８時間、（５）冷浸抽出、熱水抽出、超音波抽出、還流冷却抽出または加熱抽出法等の抽出方法により、好ましくは熱水抽出または還流冷却抽出法により、（６）約１〜１０回、好ましくは２〜８回繰り返し抽出する。そして、（７）前記抽出物を濾過布により濾過し、（８）濾過液を真空濃縮した後、（９−１）凍結乾燥するか、（９−２）配合比率に応じてデキストリンを混合し噴霧乾燥してニューグリーン抽出物を取得する。
【００２４】
２）アザミ抽出物の調製
（１）アザミを選別して粉砕した後、（２）粉砕物重量（ｗ）の約１〜２５倍の体積量（ｖ）、好ましくは７〜２０倍の体積量（ｖ）の精製水を含む水、メタノール、エタノール、ブタノール等の炭素数１〜４の低級アルコールまたはこれらの混合溶媒から選択された溶媒、より好ましくは水、エタノールまたはこれらの混合溶媒を用いて、（３）０〜１２０℃、好ましくは５０〜１００℃の抽出温度で、（４）約１時間〜１０日間、好ましくは約２時間〜８時間、（５）冷浸抽出、熱水抽出、超音波抽出、還流冷却抽出または加熱抽出法等の抽出方法により、好ましくは熱水抽出または還流冷却抽出法により、（６）約１〜１０回、好ましくは２〜８回繰り返し抽出する。そして、（７）前記抽出物を濾過布により濾過し、（８）濾過液を真空濃縮した後、（９−１）凍結乾燥するか、（９−２）配合比率に応じてデキストリンを混合し噴霧乾燥してアザミ抽出物を取得する。
【００２５】
３）ニューグリーンとアザミとの複合抽出物の調製
１）で調製されたニューグリーン抽出物と、２）で調製されたアザミ抽出物とを混合する。
【００２６】
そして、後述する実験で用いられるニューグリーン抽出物及びニューグリーンとアザミとの複合抽出物は、ニューグリーン及びアザミの粉砕物重量の８倍の体積量の精製水を溶媒にして、４時間で熱水抽出法により１次抽出し、４倍の体積量の精製水を加えて２次抽出した後、抽出物を濾過布により濾過し、真空濃縮した後、抽出物とデキストリンとを１：１で混合して噴霧乾燥することによって調製する。
【００２７】
一方、ニューグリーン抽出物及びニューグリーンとアザミとの複合抽出物は、亜臨界流体を用いて抽出する亜臨界抽出法や超臨界流体を用いて抽出する超臨界抽出法により抽出物を調製してもよい。
【００２８】
以下では、本発明に係るニューグリーン抽出物及びニューグリーンとアザミとの複合抽出物による効果を試験例によって詳細に説明する。
【００２９】
参考として、試験例１で測定されるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、キノン還元酵素、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼは解毒過程におけるフェーズＩＩに関与する酵素である。
【００３０】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼは、外部異物の代謝過程中に生成された親電子性毒性物質を、還元されたグルタチオン（glutathione-SH；ＧＳＨ）と結合させて、溶解し易い水溶性物質にして排泄させる酵素であって、細胞質に多量に存在し、様々な種類のアイソザイム（isozyme）が明らかになっている。また、この酵素は、生体内の還元されたグルタチオン（ＧＳＨ）を基質として用いて発癌の直接的な原因となる活性中間代謝産物を除去することは勿論、坑酸化活性の役割もする。
【００３１】
還元されたグルタチオンは、外部の毒性物質が細胞内に侵入した時に直接反応するか、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ及びグルタチオンペルオキシダーゼ（Glutathione peroxidase）の基質として作用し、毒性物質と結合して無毒にする機能を有している（Mitchell、J.R.,J.A.Hinson and S.D.Nelson.1976.Glutathioneand drug induced tissue lesion:metabolism and function、pp.357-367、In I.M.Arias and W.B.Jakoby (eds.)、Glutathione.Ravenpress、New York、NY.）。大部分の外部の化学物質は、シトクロムＰ４５０−依存性モノオキシゲナーゼシステム（Cytochrome P450-dependent monooxygenase system）において代謝され、親電子的な物質（Electrophilic product）、エポキシド（Epoxides）または非常に毒性の強い物質に変化する。この物質は、還元されたグルタチオンと直接的に結合するか、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼによって抱合される抱合反応を経て排泄されたりもする（Molder、P.and B.Jernestiom.1983.Interactionof glutathione with reactive intermediates.pp.99-108、InA.Larson、S.Orrenius、A.Holgrenand B.Mannervik (eds.)、Functions ofglutathione:biochemical、physiological、toxicological、and clinical aspects.RavenPress、New York、NY.）。体内還元されたグルタチオンの含量低下は、肝細胞の蛋白質分泌の損傷と、脂肪肝、肝壊死、線維芽細胞の増殖と言った肝疾患を引き起こす。また、細胞内還元されたグルタチオンが枯渇すると、毒性の強い代謝産物が生成され、細胞内損傷と癌の発生をもたらす。硫黄（Ｓ）を含む化合物は、体内還元されたグルタチオンの含量を増加させて、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼやキノン還元酵素のような毒性抑制酵素の活性を増加させ、発癌物質の生成を抑制するものとして、Ｂｅｎｓｏｎら（Benson、A.M.and P.B.Barretto.1985.Effects ofdisulfiram、diethydithiocarbamate、bisethylxanthogen、and benzyl isothiocyanate onglutathine activites in mouse organs. Cancer Res.45、4219-4223）によって報告された。
【００３２】
キノン還元酵素は、キノンとキノンイミン（quinoneimine）を還元させて新陳代謝の前駆体の細胞毒性（Cytotoxicity）から細胞を保護し、主にその活性が肝臓で最も高く、腎臓や脳においても比較的に高く現れるものとして知られている。また、毒性効果、突然変異の誘発、そして発癌物質による発癌過程の開始を抑制する効果がある。
【００３３】
また、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを電子供与体として用い、２個の電子を移動させてセミキノン（semiquinone）を形成せず、キノン類そのものに対する保護効果だけでなく、他の癌予防酵素系と共通に誘導される特徴により、無毒化酵素の中で代表的な酵素であると言える。
【００３４】
そして、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、乳酸脱水素酵素、尿素窒素、尿酸、クレアチン、総ビリルビン、鉄等は体内で毒性物質の増加時に血清から検出される物質であって、フェーズＩＩＩで体外に排出される。
【００３５】
（試験例１：動物細胞対象試験）
＜１−１：試験対象＞
１０％のウシ胎児血清（GIBCO社）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Invitrogen社）が含まれたダルベッコ改変イーグル培地（GIBCO社）に、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞（ATCC CRL-2026）を４×１０５個／ｍｌになるように懸濁し、前記細胞懸濁液を９６−ｗｅｌｌプレートの各ウェルに０．２ｍｌずつ添加した後、５％のＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２４時間培養した。次いで、新しいダルベッコ改変イーグル培地に交換した後、１セットの対照群には蒸留水を、１セットの第１実験群にはニューグリーン（５０μｇ／ｍｌ）を、１セットの第２実験群にはニューグリーン（２５μｇ／ｍｌ）及びアザミ（２５μｇ／ｍｌ）の複合抽出物を添加して、２４時間培養した。培養終了後、培地を除去し、リン酸緩衝塩溶液で細胞を洗浄し、０．１ｍｌの細胞溶解液を添加した後、３７℃で１０分間インキュベーションした。
【００３６】
＜１−２：グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」という）の活性測定＞
＜１−１＞で調製された各群の細胞液２５μｌに１５５μｌの反応溶液（リン酸カリウム緩衝液の１．３ｍＭグルタチオン）を添加し、測定前に２０μｌの反応基質１０ｍＭ  ＣＤＮＢ（２，４−ジニトロクロロベンゼン、Sigma-aldrich社）を添加し、３４０ｎｍ波長での吸光度の変化を測定した。各活成分析は３回繰り返し測定し、蛋白量は、サンプル溶液をリン酸緩衝塩溶液で５０倍希釈し、ＭｉｃｒｏＢＣＡ蛋白質分析キットを用いて測定した。
【００３７】
各ＧＳＴ活性は、対照群のＧＳＴ活性に対する相対値として下記の式によって算出した。ＧＳＴの相対活性の結果を図１に示す。
【００３８】
ＧＳＴ活性＝（試験物質添加セクションの最大レート係数÷試験物質添加セクションの蛋白量）÷（水添加セクションの最大レート係数÷水添加セクションの蛋白量）
【００３９】
図１に示すように、ＧＳＴの活性について、第１実験群が対照群に比べて約１．６倍に増加するといった統計的に有意な活性向上が観察された。また、第２実験群のＧＳＴ活性は対照群に比べて約２．２倍に増加した。そして、同一濃度下では、ニューグリーン単独よりもニューグリーン及びアザミの複合抽出物が、活性増加効果がより大きいことが分かる。
【００４０】
＜１−３：キノン還元酵素（以下、「ＱＲ」という）の活性測定＞
＜１−１＞で調製された各群の細胞液２５μｌに１００μｌの反応溶液（Sigma-aldrich社）を添加した。この時、基質の存在及び不在を設定し、基質存在には、反応溶液に、最終濃度５０μＭになるようにメナジオン（Sigma-aldrich社）を添加した。活成の分析は各々３回繰り返し実施した。また、各ＱＲ活性は、対照群のＱＲ活性に対する相対値として下記の式によって算出した。ＱＲの相対活性の結果を図２に示す。
【００４１】
ＱＲ活性＝｛［（試験物質添加セクションの基質存在の吸光度）−（試験物質添加セクションの基質不在の吸光度）］÷（試験物質添加センションの蛋白量）｝÷｛［（水添加セクションの基質存在の吸光度）−（水添加セクションの基質不在の吸光度）］÷（水添加セクションの蛋白量）｝
【００４２】
図２に示すように、ＱＲ酵素の活性について、第１実験群が対照群に比べて約１．８倍といった統計的に有意な活性向上が観察された。また、第２実験群は対照群に比べて約２．８倍の活性増加が確認された。そして、同一濃度下では、ニューグリーン単独よりもニューグリーン及びアザミの複合抽出物が、活性増加効果がより大きいことが分かる。
【００４３】
＜１−４：ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（以下、「ＵＧＴ」という）の活性測定＞
ＵＧＴ活性は、B.Burchell、P.Weatherillら(Methods in Enzymology 77、p169(1981))の方法を一部改良して行った。＜１−１＞の過程中、リン酸緩衝塩溶液で細胞を洗浄した後に凍結融解をして細胞液を調製した。この細胞液に０．２ｍｌの反応液｛０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１５ｍＭ  ｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ、Invitrogen社）｝を添加してよく撹拌し、氷の中で３０分間インキュベーションした。この酵素溶液８０μｌを９６−ｗｅｌｌプレートに移動し、２０μｌの２０ｍＭグルクロン酸（Sigma-aldrich社）を添加する分画と添加しない分画とを設定し、３７℃で１時間インキュベーションした。
【００４４】
また、基質濃度の反応液ＰＮＰを用いて検量線を作成し、その後、２Ｍグリシンバッファ（ｐＨ１０．４）１００μｌを添加し、４０５ｎｍ波長での吸光度を測定して活性を分析した。活性分析は各々３回実施した。また、各ＵＧＴ活性は、対照群のＰＮＰ量に対する含有ＰＮＰ量として下記の式によって算出した。その結果を図３に示す。
【００４５】
ＵＧＴ活性＝［（グルクロン酸不在の試験物質添加セクションのＰＮＰ量）−（グルクロン酸存在の試験物質添加セクションのＰＮＰ量）］÷［（グルクロン酸不在の水添加セクションのＰＮＰ量）−（グルクロン酸存在の水添加セクションのＰＮＰ量）］
【００４６】
図３に示すように、ニューグリーンはＵＧＴ活性が１．１倍に増加して相対的に小さい幅の上昇があったが、ニューグリーンとアザミとの複合抽出物はＵＧＴ活性が約１．９倍と有意に増加するのを確認することができた。
【００４７】
＜１−５：代謝毒素分解酵素ｍＲＮＡの発現に対する誘導作用の測定＞
＜１−５−１：細胞におけるｍＲＮＡの抽出及び分析＞
＜１−１＞で調製された各群の細胞液にＲＮＡｉｓｏ（TAKARA社）０．５ｍｌを添加し、室温で５分間インキュベーションした後、クロロホルム０．１ｍｌを添加した後、乳白色になるまでよく混ぜた。そして、室温で５分間インキュベーションし、４℃、１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上層液のみ集めて０．２５ｍｌのイソプロパノールを添加してよく混合し、室温で１０分間インキュベーションした。そして、４℃、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた沈殿物を０．５ｍｌ溶解した後、全体ＲＮＡ水溶液を得た。逆転写反応及びリアルタイムＰＣＲはＥｘｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲキット（TAKARA社）を用いて行った。全てのＰＣＲの対照群として、トランスフェリンレセプター（Ｔｆｒｃ）に特異的プライマーを用いた。そして、測定はＲｏｃｈｅシステムを用いて行い、活性の分析は各２回実施し、各実施値におけるｍＲＮＡ発現量は、対照群に対して測定しようとするｍＲＮＡの相対量として算出した。
【００４８】
＜１−５−２：ＧＳＴ  ｍＲＮＡの発現量の測定＞
ニューグリーン及びニューグリーンとアザミとの複合抽出物によるＧＳＴ  ｍＲＮＡの発現量を測定するために、ＧＳＴに特異的なプライマーを用いて逆転写ＰＣＲとリアルタイムＰＣＲとを実施し、ｍＲＮＡ発現量を下記の式によって算出した。その結果を図４に示す。
【００４９】
ＧＳＴ  ｍＲＮＡ発現量＝［（試験物質添加セクションのＧＳＴ  ｍＲＮＡ発現量）÷（試験物質添加セクションのＴｆｒｃ  ｍＲＮＡ発現量）］÷［（水添加セクションのＧＳＴ  ｍＲＮＡ発現量）÷（水添加セクションのＴｆｒｃ  ｍＲＮＡ発現量）］
【００５０】
図４に示すように、ＧＳＴ  ｍＲＮＡ発現量は、ニューグリーンを処理した時、対照群に比べて約２．６倍に増加した。また、ニューグリーンとアザミとの複合抽出物の場合、対照群に比べて約４．７倍の発現量の増加を確認することにより、単独処理よりも優れたＧＳＴ  ｍＲＮＡの発現誘導効果を確認した。
【００５１】
＜１−５−３：ＱＲ  ｍＲＮＡの発現量の測定＞
ニューグリーン及びニューグリーンとアザミとの複合抽出物によるＱＲ  ｍＲＮＡの発現量を測定するために、ＧＳＴに特異的なプライマーを用いて逆転写ＰＣＲとリアルタイムＰＣＲとを実施し、ｍＲＮＡ発現量を下記の式によって算出した。その結果を図５に示す。
【００５２】
ＱＲ  ｍＲＮＡ発現量＝［（試験物質添加セクションのＱＲ  ｍＲＮＡ発現量）÷（試験物質添加セクションのＴｆｒｃ  ｍＲＮＡ発現量）］÷［（水添加セクションのＱＲ  ｍＲＮＡ発現量）÷（水添加セクションのＴｆｒｃ  ｍＲＮＡ発現量）］
【００５３】
図５に示すように、ＱＲ  ｍＲＮＡ発現量は、ニューグリーンを処理した時、対照群に比べて約２．４倍に増加した。また、ニューグリーンとアザミとの複合抽出物の場合は、対照群に比べて約４．４倍の発現量の増加を確認することにより、単独処理よりも優れたＱＲ  ｍＲＮＡの発現誘導効果を確認した。
【００５４】
＜１−５−４：ＵＧＴ  ｍＲＮＡの発現に対する誘導作用の評価＞
ニューグリーン及びニューグリーンとアザミとの複合抽出物によるＵＧＴ  ｍＲＮＡ発現量を測定するために、ＵＧＴに特異的なプライマーを用いて逆転写ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲを実施し、ｍＲＮＡ発現量を下記の式によって算出した。その結果を図６に示す。
【００５５】
ＵＧＴ  ｍＲＮＡ発現量＝［（試験物質添加セクションのＵＧＴ  ｍＲＮＡ発現量）÷（試験物質添加セクションのＴｆｒｃ  ｍＲＮＡ発現量）］÷［（水添加セクションのＵＧＴ  ｍＲＮＡ発現量）÷（水添加セクションのＴｆｒｃ  ｍＲＮＡ発現量）］
【００５６】
図６に示すように、ＵＧＴ  ｍＲＮＡ発現量は、ニューグリーンを処理した時、対照群に比べて約４倍の増加を示した。また、ニューグリーンとアザミとの複合抽出物の場合、対照群に比べて約５．２倍の発現量の増加を確認することにより、ニューグリーンの単独処理よりも優れたＵＧＴ  ｍＲＮＡの発現誘導効果を確認した。
【００５７】
＜１−６：細胞内グルタチオン（以下、「ＧＳＨ」という）量の増加作用の評価＞
ニューグリーン及びニューグリーンとアザミとの複合抽出物による肝細胞内ＧＳＨ量の増加を評価するために、Clarissa Gerhauserら{Cancer Research 57、271-278(1997)}の方法を一部改良して実施した。＜１−１＞の過程中、リン酸緩衝塩溶液で細胞を洗浄した後、凍結融解を３回繰り返し行った後、０．１ｍｌのバッファＡ｛１２５μＭリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．５）、６．３ｍＭ  ＥＤＴＡ｝を添加した。このように調製された細胞溶解液２５μｌに１００μｌの反応溶液｛２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  Ｇ６Ｐ、３０μｍＮＡＤＰ、２Ｕ／ｍｌＧ６ＰＤＨ、０．２５Ｕ／ｍｌグルタチオン還元酵素（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社）、０．６ｍＭ  ＤＴＮＢ）｝を添加した。室温で５分間インキュベーションした後、４０５ｎｍ波長での吸光度を測定した。活性の分析は各々３回実施した。標準として細胞溶解液の代わりに２〜２００μｌのＧＳＨを連続して２倍希釈した溶液を同時に測定した。
【００５８】
また、蛋白量は細胞溶解液をリン酸緩衝塩溶液で５０倍希釈し、ＭｉｃｒｏＢＣＡ蛋白質分析キットを用いて測定した。また、ＧＳＨ量は対照群に対するＧＳＨ相対量として下記の式によって算出した。その結果を図７に示す。
【００５９】
ＧＳＨ活性量＝［（試験物質添加セクションのＧＳＨ量）÷（試験物質添加セクションの蛋白量）］÷［（水添加セクションのＧＳＨ量）÷（水添加セクションの蛋白量）］
【００６０】
図７に示すように、ＧＳＨ活性は、ニューグリーンを処理した時、対照群に比べて約１．８倍に増加することが分かる。また、ニューグリーンとアザミとの複合抽出物を処理した場合は、対照群に比べて約２．５６倍のＧＳＨ活性増加を確認することにより、単独処理よりもさらに高いＧＳＨ活性誘導効果を確認した。
【００６１】
このように、本発明に係るニューグリーン抽出物及びニューグリーンとアザミとの複合抽出物は、解毒作用中のＰｈａｓｅ  ＩＩに関与する酵素の作用を促進して解毒作用を活性化させることが分かる。
【００６２】
（試験例２：動物対象試験）
＜２−１：研究対象及び期間＞
Sprague-Dawley系の約１５０ｇの雄ネズミを（株）デハンバイオから分譲を受けた飼育場で恒温恒湿を維持しながら飼育して研究を進めた。実験期間中、水及び飼料は自由に供給し、この際用いた水差し、飼料容器及び飼育場等の全ての器具は重金属の汚染を防止するために０．４％  ＥＤＴＡ溶液で洗浄した後に脱イオン水でさらに洗浄し、乾燥させた後に使用した。
【００６３】
１週間の適応期間を経た後、試験対象のネズミを無作為に、正常対照群、陰性対照群、第１実験群、及び第２実験群にそれぞれ１０匹ずつ分類した。試験対象のネズミには、毒性誘発のために鉛（Ｐｂ）及びカドミウム（Ｃｄ）を用いた。酢酸鉛及び硫化カドミウムとしてＪｕｎｓｅｉ社製の特級試薬を用い、各々の試薬を希釈して、鉛は５０ｐｐｍ、カドミウムは２５ｐｐｍに調整して、陰性対照群、第１実験群、及び第２実験群に毎日午後５時に１ｍｌずつ１７日間腹腔投与した。正常対照群は、重金属投与の代わりに生理食塩水１ｍｌを毎日午後５時に腹腔投与した。重金属投与の前後に血液を採取して、重金属露出の有無と肝毒素分解酵素とを定量化した。
【００６４】
同時に、第１実験群には実施例のニューグリーン抽出物を、第２実験群にはニューグリーンとアザミと（７：３比率）の複合抽出物を各々５２ｍｇ／日・ｋｇで毎日午後５時に経口投与し、正常対照群及び陰性対照群には生理食塩水を同一体積で同時刻に経口投与した。前記ニューグリーン及びニューグリーンとアザミとの複合抽出物の濃度は６０ｋｇの成人基準の５００ｍｇ／日・ｋｇ摂取量と同一量である。
【００６５】
＜２−２：血清の臨床化学検査を通じた重金属及び毒素分解及び排出の検査＞
血液は投与が終わった翌日の午後５時に、＜２−１＞の試験対象ネズミの大腿静脈（femoral vein）から採取した後、ヘパリン（Heparin）が処理されたチューブに移し替え、遠心分離機（２５００ｒｐｍ、４℃）で１５分間遠心分離して血漿を分離した。
【００６６】
そして、分離した血漿から下記の成分を各々の臨床化学検査によって確認した。
【００６７】
・グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（Glutamic oxaloacetate transaminase、以下、「ＧＯＴ」という）
血清中のＧＯＴ作用により、アスパラギン酸とα−ケトグルタル酸はオキサロ酢酸とＬ−グルタミン酸に変化し、さらにオキサロ酢酸は、還元型コエンザイムＮＡＤＨの存在下でＭＤＨ作用によりマレートを生成する。したがって、ＮＡＤＨがＮＡＤ＋に酸化する時、３４０ｎｍ波長で吸光度の減少を測定する原理を利用したキット（Boehringer Mannheim社）を用いて自動分析機（Moleculardevice社）でＧＯＴを測定した。
【００６８】
・グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（Glutamic pyruvate transaminase、以下、「ＧＰＴ」という）
血清中のＧＰＴ作用により、Ｌ−アラニンとα−ケトグルタミン酸はピルベートとＬ−グルタミン酸に変化し、生成されたピルベートは、還元型コエンザイムＮＡＤＨの存在下でＬＤＨ作用により乳酸を生成する。したがって、ＮＡＤＨがＮＡＤ＋に酸化する時、３４０ｎｍ波長で吸光度の減少を測定する原理を利用したキット（Boehringer Mannheim社）を用いて自動分析機（Moleculardevice社）でＧＰＴを測定した。
【００６９】
・アルカリ性ホスファターゼ（Alkaline phosphatase、以下、「ＡＬＰ」という）
Ｐ−ニトロフェニルホスフェートを基質として用い、Ｐ−ニトロフェノールとＮａＯＨを作用させる時に黄色を帯びるＩＦＣＣ原理を利用したキット（ＡＬＰ、Boehringer Mannheim社）を用いて発色させ、自動分析機（Moleculardevice社）でＡＬＰを測定した。
【００７０】
・乳酸脱水素酵素（Lactatedehydrogenase；ＬＤＨ）
バッファされたピルベート基質とＮＡＤＨ２に血清を加えてインキュベーションさせれば、血清内のＬＤＨによってピルビン酸が減少し、乳酸とＮＡＤ＋が生成される原理を利用したＬＤＨキット（Boehringer Mannheim社）を用いて発色させ、自動分析機（Moleculardevice社）でＬＤＨを測定した。
【００７１】
・尿素窒素（Bloodurea nitrogen、以下、「ＢＵＮ」という）
尿素キット（Urea、Boehringer Mannheim社）を用いて自動分析機で血清内の尿素窒素の濃度を測定した。
【００７２】
・尿酸（Uricaicd）
キット（BoehringerMannheim社）を用いて発色させ、自動分析機（Molecular device社）で測定して血清内の尿酸の濃度を測定した。
【００７３】
・クレアチン（Creatine）
クレアチンはアルカリ溶液でピクリン酸（Picric acid）と有色化合物を形成するため、形成速度を測定して濃度を求める原理のキット（Boehringer Mannheim社）を用いて発色させ、自動分析機（Moleculardevice社）でクレアチンを測定した。
【００７４】
・総ビリルビン（TotalBilirubin）
ＤＰＤ  ｍｅｔｈｏｄ原理により、キット（Ｂｉｌ−Ｔ、Botheringer mannheim、ドイツ）を用いて発色させた後、自動分析機（Moleculardevice社）で濃度を求めた。
【００７５】
・鉄
血清を湿式分解してＡ．Ａ．Ｓ．で測定した。
【００７６】
結果は平均と標準偏差で示し、有意性を検証するために、統計処理はStudent’s t-testを利用し、ｐ＜０．０５の時に有意であるとみなして表示した。その結果を表１に示す。
【００７７】
【表１】
0006412645.tif 000002
【００７８】
血中正常ＧＯＴと正常ＧＰＴ活性度は、各々３９〜１１１ｕｎｉｔ／ｌ、２０〜６１ｕｎｉｔ／ｌであり、ＧＰＴは肝特異性として慢性肝炎、急性肝炎、脂肪肝、アルコール性肝炎、肝臓がんで増加し、ＧＯＴは心臓、肝臓、骨格、腎臓、膵臓疾患等で増加する。本実験結果では、表１のように、正常対照群のＧＯＴ、ＧＰＴ濃度は、各々６２．１２ｕｎｉｔ／ｌ、４８．４３ｕｎｉｔ／ｌとして正常範囲であった。これに対し、重金属を注入した陰性対照群の場合は、統計的に有意な濃度変化を示すことにより、正常範囲から外れることが確認できた。その反面、第１実験群の場合は、ＧＯＴとＧＰＴの濃度が各々統計的に有意な増加幅を示した。そして、第２実験群の場合、ＧＯＴは多少増加したものの正常範囲に近接しており、ＧＰＴは正常濃度範囲内に測定された。
【００７９】
これにより、重金属投与が肝臓等の臓器に中毒性の損傷を与え、本発明に係る組成物の摂取が、重金属のような毒素に曝されたネズミの臓器で中毒現象を緩和乃至軽減させることによって臓器を毒素から保護することが分かる。特に、ニューグリーンとアザミとの複合抽出物を摂取した時に、ニューグリーン単独で摂取した時よりもさらに良い効果を示した。
【００８０】
ＡＬＰは、肝機能不全、骨疾患、黄疸等において病状に応じて上昇し、毒物中毒や慢性腎臓炎で低下する。試験対象ネズミの正常ＡＬＰ濃度は１４〜４８ｕｎｉｔ／ｌである。表１に示すように、陰性対照群の場合、ＡＬＰ濃度が正常対照群に比べて有意に上昇した。これに対し、第１実験群は、ＡＬＰ濃度が正常範囲に近接した幅に増加し、第２実験群は、多少は増加したものの正常範囲内に測定された。
【００８１】
ＬＤＨは肝臓、心臓、骨格筋、腎臓等に分布しており、心臓病、肝疾患、腎臓疾患で増加する。試験対象ネズミの正常ＬＤＨ濃度は１６７〜１４２８ｕｎｉｔ／ｌである。陰性対照群の場合、ＬＤＨの活性が正常範囲ではあるが、正常対照群に比べて約２倍程度にＬＤＨ活性が増加したことが分かる。これに対し、第１実験群の場合は、ＬＤＨ活性が有意に小幅に増加し、第２実験群の場合は、より正常対照群に近接に小幅にＬＤＨ活性が増加することが分かる。
【００８２】
ＢＵＮは、腎臓機能障害で上昇する腎臓機能診断の指標となり、試験対象ネズミの正常ＢＵＮ濃度は１５〜２１ｍｇ／ｄｌである。陰性対照群の場合、重金属投与によってＢＵＮ濃度は正常対照群に比べて約３倍程度増加した。これに対し、第１実験群の場合は、陰性対照群より７．２ｍｇ／ｄｌ程度と有意に低く測定され、第２実験群の場合は、陰性対照群に比べて約１６．４ｍｇ／ｄｌ程度と低く測定された。
【００８３】
尿酸は痛風、腎臓毒性の中の、特に水銀、鉛中毒等において幾何級数的に増加する代表的な指標として知られている。陰性対照群の場合は、尿酸の濃度が正常対照群に比べて約０．５２ｍｇ／ｄｌ以上増加した。これに対し、第１実験群の場合は、増加幅が相対的に少なく、第２実験群は、正常対照群に近接した。
【００８４】
クレアチンも尿酸と同様に腎臓機能障害時に増加する指標であって、試験対象ネズミの正常クレアチン濃度は０．４〜１．５ｍｇ／ｄｌである。陰性対照群の場合は、クレアチン濃度が２．７６ｍｇ／ｄｌまで増加したのに対し、第１実験群の場合は、増加幅が相対的に少なく、第２実験群の場合も、正常範囲を超過したものの、陰性対照群に比べて統計的に有意に少ない増加幅を示した。
【００８５】
ビリルビンは、中毒性肝臓障害、溶血性黄疸、四塩化炭素、カドミウム中毒、断食等において有意に増加する診断指標であって、試験対象ネズミの正常ビリルビン濃度は０．１２〜０．４０ｍｇ／ｄｌである。陰性対照群は、ビリルビン濃度が正常対照群に比べて約２倍以上上昇したが、第１実験群の場合は、陰性対照群に比べて相対的に少ない増加幅を示した。そして、第２実験群の場合は、正常レベルのビリルビン濃度が測定された。
【００８６】
血清の生化学的検査により本発明に係る抽出物の解毒効果を確認した結果、重金属による様々な生化学指標の異常変化を正常化できることを確認することができた。これは、ニューグリーン及びニューグリーンとアザミとの複合抽出物が毒素の吸収を阻害し、且つ、毒素の分解を助けるフラボノイド等の様々な有効成分を含有して毒素分解Ｐｈａｓｅ  ＩＩ酵素の活性によって起こったものであると予想することができる。
【００８７】
＜２−３：糞、血清、肝臓及び腎臓の重金属含量の確認＞
投与が終わった翌日の午後５時以前に、＜２−１＞の試験対象ネズミの糞を採取し、５時に血清、肝臓、腎臓から、鉛及びカドミウムの含量を確認した。鉛の場合を表２に示し、カドミウムの場合を表３に示す。
【００８８】
【表２】
0006412645.tif 000003
【００８９】
【表３】
0006412645.tif 000004
【００９０】
鉛は、人体に吸収、蓄積されると、体重減少、貧血、肝臓と腎臓等の臓器の生化学的及び形態学的変化、免疫機能低下のような中毒現象を引き起こし得る。表２に示すように、鉛は腎臓において高いレベルで蓄積されるのを確認することができ、肝臓にも多少蓄積されるのが確認できた。
【００９１】
第１実験群の場合は、糞から少ない濃度ではあるが鉛が排出されるのを確認し、第２実験群の糞からは、高い濃度の鉛の排出を確認することができた。そして、第１実験群の場合、鉛含量が肝臓及び腎臓において統計的に有意なレベルで減少することが確認できる。また、第２実験群の場合、第１実験群に比べて腎臓及び肝臓において２倍以上の鉛含量の減少効果を確認し、血清では鉛が観察されなかった。
【００９２】
カドミウムは、生体で肝臓及び腎臓に毒素を示す代表的な重金属であって、鉛よりもさらに高い濃度で肝臓及び腎臓に蓄積されるのを確認することができた。第１実験群の場合、血清、肝臓、腎臓に蓄積されていたカドミウムの濃度が、陰性対照群に比べて約５０％程度少なく蓄積されることが確認でき、第２実験群の場合、腎臓では陰性対照群に比べて約８５％のカドミウム含量が、肝臓では８０％のカドミウム含量が、少なく蓄積されるのを確認することができる。また、第１実験群及び第２実験群の場合、陰性対照群に比べて高いレベルでカドミウムが糞として排出されることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明に係るニューグリーン抽出物を有効成分として含有する解毒用組成物を用いる場合、解毒作用を活性化させて、人体内の毒素を副作用なく効率的に除去することができる。したがって、前記組成物は、解毒作用等の効果を奏する機能性食品または医薬品等に活用することができる。
【図１】
0006412645.tif 000005
【図２】
0006412645.tif 000006
【図３】
0006412645.tif 000007
【図４】
0006412645.tif 000008
【図５】
0006412645.tif 000009
【図６】
0006412645.tif 000010
【図７】
0006412645.tif 000011