(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｗｎｔ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測する方法であって、
（ａ）患者からの腫瘍細胞の試料におけるバイオマーカーのレベルを検出する段階であって、前記バイオマーカーは、
（ｉ）ヘテロ接合性の消失を決定するための、ＲＮＦ４３染色体領域および／またはＺＮＲＦ３染色体領域におけるＤＮＡコピー数、
（ｉｉ）ＲＮＦ４３遺伝子および／またはＺＮＲＦ３遺伝子の不活性化変異を検出するために配列決定されたがん組織からのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ；
（ｉｉｉ）ＲＮＦ４３  ｍＲＮＡ発現および／またはＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡ発現；
（ｉｖ）ＲＮＦ４３タンパク質発現および／またはＺＮＲＦ３タンパク質発現；または
（ｖ）バイオマーカー（ｉ）〜（ｉｖ）の組み合わせ
からなる群から選択される、段階、
（ｂ）（ａ）で検出した、腫瘍細胞試料における前記バイオマーカーのレベルを
（ｉ）Ｗｎｔ阻害剤に対する感受性と相関している前記バイオマーカーの対照レベル；および
（ｉｉ）Ｗｎｔ阻害剤に対する耐性と相関している前記バイオマーカーの対照レベル
からなる群から選択される前記バイオマーカーの対照レベルと比較する段階；ならびに
（ｃ）患者の腫瘍がＲＮＦ４３もしくはＺＮＲＦ３の不活性化変異を有するか、患者の腫瘍がＲＮＦ４３もしくはＺＮＲＦ３のコピー数の減少を有するか、または患者の腫瘍がＲＮＦ４３  ｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現の減少またはＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現の減少を有し、それにより患者の腫瘍がＷｎｔ阻害剤に対して感受性である可能性が高いことが示される場合に、Ｗｎｔ阻害剤の治療的投与が有益であることが予測されるものとして患者を選択する段階
を含む方法。
【請求項２】
Ｗｎｔ阻害剤に対する腫瘍細胞の感受性を予測する方法であって、腫瘍細胞を少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤に接触させる段階および
（ａ）腫瘍細胞におけるバイオマーカーのレベルを検出する段階であって、前記バイオマーカーは、
（ｉ）ヘテロ接合性の消失を決定するための、ＲＮＦ４３染色体領域および／またはＺＮＲＦ３染色体領域におけるＤＮＡコピー数；
（ｉｉ）ＲＮＦ４３遺伝子および／またはＺＮＲＦ３遺伝子の不活性化変異を検出するための、腫瘍細胞からのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ；
（ｉｉｉ）ＲＮＦ４３  ｍＲＮＡ発現および／またはＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡ発現；
（ｉｖ）ＲＮＦ４３タンパク質発現および／またはＺＮＲＦ３タンパク質発現；並びに
（ｖ）バイオマーカー（ｉ）〜（ｉｖ）の組み合わせ
からなる群から選択される、段階；
（ｂ）（ａ）で検出した、腫瘍細胞における前記バイオマーカーのレベルを対照レベルと比較する段階；及び
（ｃ）腫瘍細胞がＲＮＦ４３もしくはＺＮＲＦ３の不活性化変異を有するか、腫瘍細胞がＲＮＦ４３もしくはＺＮＲＦ３のコピー数の減少を有するか、または腫瘍細胞がＲＮＦ４３  ｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現の減少またはＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現の減少を有する場合に、Ｗｎｔ阻害剤に対して腫瘍細胞が感受性である可能性が高いと決定する段階
を含む方法。
【請求項３】
ＲＮＦ４３染色体領域におけるＤＮＡコピー数の検出が、配列番号１の配列を有するヌクレオチドにハイブリダイズするプローブを用いたハイブリダイゼーションによるものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＺＮＲＦ３染色体領域におけるＤＮＡコピー数の検出が、配列番号２の配列を有するヌクレオチドにハイブリダイズするプローブを用いたハイブリダイゼーションによるものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＺＮＲＦ３染色体領域におけるＤＮＡコピー数の検出が、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によるものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＲＮＦ４３  ｍＲＮＡの発現が、配列番号１の配列を有するヌクレオチドにハイブリダイズするプローブを用いたハイブリダイゼーションにより測定されるものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
ＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡの発現が、配列番号２の配列を有するヌクレオチドにハイブリダイズするプローブを用いたハイブリダイゼーションにより測定されるものである、請求項１、２または６に記載の方法。
【請求項８】
ＲＮＦ４３タンパク質の発現が、免疫組織化学により測定されるものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
比較する段階が、腫瘍細胞における前記バイオマーカーレベルを、Ｗｎｔ阻害剤に対して耐性である１つまたは複数の対照細胞における前記バイオマーカーの対照レベルと比較することを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
比較する段階が、腫瘍細胞における前記バイオマーカーレベルを、Ｗｎｔ阻害剤に対して感受性である１つまたは複数の対照細胞における前記バイオマーカーの対照レベルと比較することを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｗｎｔ阻害剤に対する感受性と相関している前記バイオマーカーの対照レベルが予め決定されている、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｗｎｔ阻害剤に対する耐性と相関している前記バイオマーカーの対照レベルが予め決定されている、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｗｎｔ阻害剤が、２−［５−メチル−６−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリジン−３−イル］−Ｎ−［５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル］アセトアミドまたはその医薬的に許容される塩である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は２０１２年２月２８日に提出した米国仮特許出願番号６１／６０４２９０の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は概して、腫瘍細胞またはがん細胞の検出のための細胞膜結合抗原もしくは細胞膜結合受容体を含む、測定または試験方法および組成物またはそのテストストリップに関し、特に、Ｗｎｔ阻害剤療法が有益であることが予測されるがん患者の同定に関する。また、本発明は、特異的に選択された患者における使用のためのＷｎｔ阻害剤またはＷｎｔ阻害剤を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
生物学および医学において、古典的（canonical）Ｗｎｔ／β−カテニン経路は、分泌されたＷｎｔリガンド、細胞表面受容体および転写活性化補助因子β−カテニンが含まれるだけでなく、それらのコアタンパク質コンポーネントの他の多くのエフェクターやレギュレーターをも含む一連の細胞内シグナル伝達イベントである。Ｗｎｔリガンド非存在下において、β−カテニンはポリ−ユビキチン化とプロテアソーム分解を引き起こすマルチタンパク質複合体により定常的にリン酸化されている。Ｗｎｔタンパク質がその受容体に結合すると、細胞基質β−カテニンは分解複合体の阻害により安定化し、核へ移行してＷｎｔターゲット遺伝子の転写を活性化する。
【０００４】
Ｗｎｔの主な受容体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）ファミリーのタンパク質であり、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達に重要な共受容体としてのＬＲＰ５またはＬＲＰ６（ＬＤＬ受容体関連タンパク質５および６）を伴う。Nusse R (2005), Cell Research 15(1):28-32。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体は長いシステインに富むドメインを有する７回膜貫通分子である。ＬＲＰ５／６共受容体は単通過膜貫通タンパク質である。Huang H-C and Klein PS (2004) Genome Biol. 5(7):234。ＬＲＰ６は成人の骨恒常性に必要とされるのみであるＬＲＰ５に比べて優性である。McDonald BTら (2009) Developmental Cell 17(1):9-26。
【０００５】
非古典的（non-canonical）Ｗｎｔシグナル伝達は、β−カテニンに依存していない。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体は非古典的Ｗｎｔシグナル伝達に関連しているが、ＬＲＰ６共受容体は非古典的経路の活性のためには必須ではない。少なくとも２つの非古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路、平面内細胞極性（ＰＣＰ）経路およびＷｎｔカルシウム放出経路が存在する。
【０００６】
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、胚発生の間の細胞増殖および分化を調節するために重要である。成人においては、Ｗｎｔシグナル伝達は組織の恒常性を促進させ、その調節不全は様々なヒトの疾病、特にがんに関与している。Nusse R (2005), Cell Research 15(1):28-32。
【０００７】
Ｗｎｔ経路の異常な過剰活性化が結腸直腸がんの腫瘍形成に重要であることが多い。その他のタイプのがんについても、異常なＷｎｔシグナル伝達に関連付けられることが示されている。膵臓がん、肝臓がん、乳がんおよび皮膚がんが、これら他のタイプのがんに含まれる。Ｗｎｔ／ＰＣＰ非古典的経路における上昇した活性は腫瘍形成にも関与している。
【０００８】
Ｗｎｔシグナル伝達の拮抗薬が、Ｗｎｔ依存性腫瘍の治療のために開発されてきている。ポーキュパイン（Porcupine）阻害剤、タンキラーゼ（tankyrase）阻害剤、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ抗体、ＬＲＰ６抗体などの多くのＷｎｔ阻害剤が、がんの治療のために開発されている。しかし、これらのほとんどのＷｎｔ阻害剤は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の上流タンパク質成分を標的としている。これらのＷｎｔ阻害剤は、Ｗｎｔ経路の下流の遺伝子に変異を有する腫瘍においてＷｎｔシグナル伝達を阻害しないと思われるので、ＡＰＣ（大腸腺腫症）、ＡＸＩＮ１／２、およびβ−カテニンなどのような下流Ｗｎｔ経路遺伝子における発癌性変異を有する腫瘍に対しては効果的ではないことが多い。
【０００９】
このＷｎｔ経路の上流の遺伝子に変異を持つものとして同定された腫瘍の欠如がＷｎｔ阻害剤の臨床開発を妨げている。したがって、Ｗｎｔ経路の上流コンポーネントである遺伝子または遺伝子産物におけるがん関連Ｗｎｔ経路の変異を同定するための方法が、当技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、いずれもＷｎｔ受容体複合体Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ６のレベルをＦｒｉｚｚｌｅｄユビキチン化により負に調節する、２つの相同性膜貫通型Ｅ３ユビキチンリガーゼ（ＲＮＦ４３およびＺＮＲＦ３）の診断用途を提供する。一態様において、本発明は、Ｗｎｔ経路の阻害剤によって増殖が低下されることに感受性である腫瘍細胞の選択のためのバイオマーカーとしてのＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子の不活性化変異の使用を提供する。別の態様において、本発明は、ＲＮＦ４３またはＺＮＲＦ３遺伝子における不活性化変異をＷｎｔ阻害剤治療に対する腫瘍感受性のバイオマーカーとして使用することによる、Ｗｎｔ阻害剤での治療のためのがん患者の選択法を提供する。特定の態様において、本発明は、ミスセンスやフレームシフト変異などのＲＮＦ４３不活性化変異が、原発腫瘍および膵管腺がん（ＰＤＡＣ）の細胞株に存在することを提供する。内因性の野生型ＲＮＦ４３はＰＤＡＣ細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を調節し、内因性ＲＮＦ４３をＰＤＡＣにおいて阻害するとＦｒｉｚｚｌｅｄレベルおよびＷｎｔシグナル伝達を上昇させるため、本発明はがんにおいて変異している上流Ｗｎｔ経路成分（ＲＮＦ４３）の同定を提供する。
【００１１】
本発明はまた、ＲＮＦ４３遺伝子変異を有するがん細胞はＷｎｔ経路の阻害に対してより感受性であることを示す。がん細胞におけるＲＮＦ４３の阻害は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質の細胞表面レベルの増加をもたらす。したがって、上昇したＷｎｔシグナル伝達および変異ＲＮＦ４３を有するがん細胞、特に膵臓がん細胞は、Ｗｎｔ拮抗薬に対してより感受性である。したがって、本発明は、ＲＮＦ４３変異ステータスは、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤の治療的投与のためのがん患者選択戦略として用いることができることを提供する。
【００１２】
Ｗｎｔ阻害剤は、Ｗｎｔ経路の阻害が示される場合、例えば、腫瘍または異常な細胞増殖の治療において、ヒトにおけるまたは獣医学的な使用のための医薬用組成物として有用である。本発明は、Ｗｎｔ阻害剤に対する感受性を示すバイオマーカーを有することが測定された患者へＷｎｔ阻害剤またはＷｎｔ阻害剤を含む医薬組成物を投与することを含む、Ｗｎｔ阻害剤を用いてがん患者を治療する方法を提供する。例えば、患者試料は、Ｗｎｔ阻害剤に対する感受性を示すＲＮＦ４３変異またはＺＮＲＦ３変異の存在についてＤＮＡ配列決定法によって試験することができる。あるいは、患者試料は、ＲＮＦ４３遺伝子発現、ＲＮＦ４３タンパク質発現、ＺＮＲＦ３遺伝子発現、ＺＮＲＦ３タンパク質発現または他のバイオマーカーのレベルについて試験することができ、バイオマーカーの患者のレベルは、Ｗｎｔ阻害剤に対する感受性と相関しているバイオマーカーの対照レベルに統計学的に類似しているかまたはそれよりも低く、または、患者の腫瘍細胞におけるバイオマーカーのレベルは、Ｗｎｔ阻害剤に対する感受性と相関しているバイオマーカーのレベルに統計学的に類似している。対照レベルは、バイオマーカーの正常またはベースラインレベルであるか、健康な細胞または組織試料におけるバイオマーカーのレベルであるか、またはＷｎｔ阻害剤に対する耐性と相関しているバイオマーカーの対照レベルであってもよい。
【００１３】
Ｗｎｔ阻害剤またはＷｎｔ阻害剤を含む医薬組成物は、患者の治療に使用することができるが、ここでバイオマーカーの患者のレベルはＷｎｔ阻害剤に対する感受性と相関している。特定の実施形態では、Ｗｎｔ阻害剤またはＷｎｔ阻害剤を含む組成物は、患者ががんを有している際の使用のために意図されている。
【００１４】
ＺＮＲＦ３とＲＮＦ４３は機能的ホモログであり、ＺＮＲＦ３はまた、特定のタイプの腫瘍において変異している。したがって、ＺＮＲＦ３の変異ステータスもまた、Ｗｎｔ拮抗薬の治療的投与のためのがん患者を選択するために有益である。
【００１５】
一実施形態において、本発明は、Ｗｎｔ阻害剤の治療的投与が有益であるかまたは有益でないことが予測されるがん患者を選択するための方法を提供する。この方法は、
（ａ）患者からの腫瘍細胞の試料におけるバイオマーカーのレベルを検出する段階であって、バイオマーカーは、（ｉ）ヘテロ接合性の消失を決定するために、ＲＮＦ４３染色体領域もしくはＺＮＲＦ３染色体領域において検出されたＤＮＡコピー数、（ｉｉ）ＲＮＦ４３遺伝子もしくはＺＮＲＦ３遺伝子の不活性化変異を検出するために配列決定されたがん組織からのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくはＲＮＡ；（ｉｉｉ）ＲＮＦ４３  ｍＲＮＡ発現もしくはＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡ発現を測定するためのアッセイの結果；（ｉｖ）ＲＮＦ４３タンパク質発現もしくはＺＮＲＦ３タンパク質発現を測定するためのアッセイの結果；（ｖ）ＲＮＦ４３遺伝子欠失もしくはＺＮＲＦ３遺伝子欠失の機能的効果；または（ｖｉ）またはバイオマーカー（ｉ）〜（ｖ）の組み合わせであってもよい、段階；
（ｂ）腫瘍細胞試料におけるバイオマーカーのレベルを、（ｉ）Ｗｎｔ阻害剤に対する感受性と相関しているバイオマーカーの対照レベル；および（ｉｉ）Ｗｎｔ阻害剤に対する耐性と相関しているバイオマーカーの対照レベルからなる群から選択されるバイオマーカーの対照レベルと比較する段階；ならびに
（ｃ）患者の腫瘍がＲＮＦ４３もしくはＺＮＲＦ３変異を有するか、または患者の腫瘍がＲＮＦ４３  ｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現の減少またはＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現の減少を有し、それにより患者の腫瘍がＷｎｔ阻害剤に対して感受性である可能性が高いことが示される場合に、Ｗｎｔ阻害剤の治療的投与が有益であることが予測されるものとして患者を選択する段階
を含む。
【００１６】
腫瘍細胞におけるＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子の変異ステータスは、次のいずれかの方法、または方法の組み合わせによってアッセイされてもよい。
（ｉ）ＲＮＦ４３遺伝子の一方または両者のコピーが欠失しているか否かを確認するための１７番染色体におけるゲノム遺伝子座１７ｑ２２のＲＮＦ４３領域のＤＮＡコピー数解析。あるいは、ＺＮＲＦ３遺伝子の一方または両者のコピーが欠失しているか否かを確認するための２２番染色体におけるゲノム遺伝子座２２ｑ１２．１のＺＮＲＦ３領域のＤＮＡコピー数解析。ＲＮＦ４３またはＺＮＲＦ３のヘテロ接合性の消失は、Ｗｎｔ阻害剤を用いた治療による腫瘍増殖率の低減について選択される腫瘍のためのバイオマーカーである。
（ｉｉ）ＲＮＦ４３遺伝子における不活性化変異を検出するための、がん組織からのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡの配列決定。ＲＮＦ４３またはＺＮＲＦ３の不活性化変異は、Ｗｎｔ阻害剤を用いた治療による腫瘍増殖率の低減について選択される腫瘍のためのバイオマーカーである。不活性化変異は、ナンセンス変異、フレームシフト変異、スプライシングバリアント、または保存された残基のアミノ酸変化をもたらすミスセンス変異であってもよい。
（ｉｉｉ）タックマン（Taqman）または他の同様の技術を用いたＲＮＦ４３  ｍＲＮＡ発現アッセイまたはＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡ発現アッセイ。ｍＲＮＡのナンセンスまたはフレームシフト変異は、多くの場合、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解をもたらす。したがって、がん細胞におけるＲＮＦ４３  ｍＲＮＡ発現の喪失は、ＲＮＦ４３ナンセンスまたはフレームシフト変異のための二次または代替アッセイとして使用することができる。ＲＮＦ４３  ｍＲＮＡの欠如は、エピジェネティックなサイレンシングが原因である可能性もあり、その場合は、ゲノムＤＮＡには変異が存在しない。
（ｉｖ）ＲＮＦ４３遺伝子欠失またはＺＮＲＦ３遺伝子欠失の機能的効果のアッセイ、例えば腫瘍試料における、Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質レベルの増加、ＬＲＰ６タンパク質レベルの増加、ＬＲＰ６リン酸化の増加、およびＤｉｓｈｅｖｅｌｅｄリン酸化の増加などについて、正常対照と比較してアッセイおよび検出することによる。
【００１７】
Ｗｎｔ阻害剤で治療することによる腫瘍増殖率の低減について選択される腫瘍のバイオマーカーとして、ＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子変異ステータスを使用する利点は、薬剤開発の期間の良好な結果である。
【００１８】
一実施形態において、本発明は、ＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子変異ステータスを試験するためのアッセイまたはキットを提供する。アッセイまたはキットは、関連するＷｎｔ阻害剤の新薬承認後の使用のためのコンパニオン診断アッセイであってよい。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、患者におけるがんの治療において使用するためのＷｎｔ阻害剤を含む医薬組成物を提供するが、（本明細書で定義の）バイオマーカーの患者のレベルはバイオマーカーの対照レベルと統計学的に同様であるかまたはそれよりも低く、対照バイオマーカーレベルは、Ｗｎｔ阻害剤に対する感受性と相関している。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＬＧＫ９７４処理によるコロニー形成アッセイを示す写真である。図１（ａ）は、２つの濃度（３００ｎＭおよび１μＭ）のＬＧＫ９７４の存在下における、ＨＰＡＦＩＩ細胞コロニー形成アッセイを示す図である。１３００細胞を記載した処理により培地に播種し、培地を１４日目のクリスタルバイオレット染色まで、５日ごとに交換した。ＬＧＫ９７４はＲＮＦ４３遺伝子にナンセンス変異を有するＨＰＡＦＩＩ細胞のコロニー形成を阻害する。図１（ｂ）は１μＭのＬＧＫ９７４単独の存在下または１０％のＷｎｔ３ａならし培地（ＣＭ）をともに毎日添加した条件での（機能性ＲＮＦ４３タンパク質を有する）ＰＫ１および（非機能性ＲＮＦ４３タンパク質を有する）ＨＰＡＦＩＩ細胞コロニー形成アッセイを示す図である。ＲＮＦ４３野生型ＰＫ１細胞は、１０日間のアッセイの間、ＬＧＫ９７４への感受性を示さなかった。ＲＮＦ４３変異ＨＰＡＦＩＩ細胞はＬＧＫ９７４によって阻害された。この阻害は、外因性のＷｎｔ３ａの添加によって部分的に救出されたので、ＬＧＫ９７４による増殖阻害は、Ｗｎｔシグナル伝達に依存したものである。
【図２−１】保存された残基を示すためのＲＮＦ４３タンパク質とＺＮＲＦ３タンパク質のアラインメントを示す図である。この情報は、不活性化変異されたミスセンス変異を予測することに利用することができる。ヒトＲＮＦ４３タンパク質の配列は、配列番号３においても提供され、ヒトＺＮＲＦ３の配列はまた、配列番号４において提供される。
【図２−２】保存された残基を示すためのＲＮＦ４３タンパク質とＺＮＲＦ３タンパク質のアラインメントを示す図である。この情報は、不活性化変異されたミスセンス変異を予測することに利用することができる。ヒトＲＮＦ４３タンパク質の配列は、配列番号３においても提供され、ヒトＺＮＲＦ３の配列はまた、配列番号４において提供される。
【図３−ａ】野生型ＲＮＦ４３を発現する、膵臓がん細胞ＹＡＰＣにおけるＲＮＦ４３によるＷｎｔシグナル伝達の負の調節を示す棒グラフのセットを示す図である。図３（ａ）は、ＲＮＦ４３の枯渇がＹＡＰＣ膵臓がん細胞株においてスーパーＴＯＰＦＬＡＳＨ（ＳＴＦ）活性を増加させることを示す図である。ＹＡＰＣ−ＳＴＦ細胞を、Ｗｎｔ３ａならし培地（ＣＭ）の非存在下または存在下で、示されたｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、ＳＴＦルシフェラーゼレポーター活性を測定した。ｐＧＬ２  ｓｉＲＮＡは、負の対照として作用する。
【図３−ｂ】野生型ＲＮＦ４３を発現する、膵臓がん細胞ＹＡＰＣにおけるＲＮＦ４３によるＷｎｔシグナル伝達の負の調節を示す棒グラフのセットを示す図である。図３（ｂ）は、ＳＴＦ活性のＲＮＦ４３  ｓｉＲＮＡによる活性化が、内因性のＷｎｔに依存することを示す図である。ＹＡＰＣ−ＳＴＦ細胞を、示したｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、次いでＤＭＳＯまたはポーキュパイン阻害剤ＬＧＫ９７４で処理した。その後、ＳＴＦレポーター活性を測定した。
【図３−ｃ】野生型ＲＮＦ４３を発現する、膵臓がん細胞ＹＡＰＣにおけるＲＮＦ４３によるＷｎｔシグナル伝達の負の調節を示す棒グラフのセットを示す図である。図３（ｃ）は、ＲＮＦ４３の枯渇がＡＸＩＮ２、β−カテニン標的遺伝子の発現を増加させることを示す図である。空ベクター（ＥＶ）またはｓｉＲＮＡ抵抗性ＲＮＦ４３を発現するＹＡＰＣ細胞は、示されたｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＡＸＩＮ２およびＲＮＦ４３の相対的ｍＲＮＡレベル。
【図４−ａ】いくつかのＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達関連遺伝子のｍＲＮＡレベルの変化を示す棒グラフのセットを示す図である。図４（ａ）は、β−カテニンの枯渇がＡＸＩＮ２とＲＮＦ４３のｍＲＮＡレベルを減少させることを示す図である。細胞を、ｓｉＲＮＡで処理し、示された遺伝子の相対的ｍＲＮＡレベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。
【図４−ｂ】いくつかのＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達関連遺伝子のｍＲＮＡレベルの変化を示す棒グラフのセットを示す図である。図４（ｂ）は、ポーキュパイン阻害剤がＲＮＦ４３  ｍＲＮＡおよびＡＸＩＮ２  ｍＲＮＡの発現を減少させたことを示す図である。ＹＡＰＣ細胞は３μＭのＩＷＰ２または１μＭのＬＧＫ９７４で処理し、定量的ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現分析に供した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
イントロダクション
本発明者らは、Ｗｎｔシグナル伝達の２つの負の調節因子、Ｚｉｎｃ／ＲＩＮＧフィンガータンパク質３（ＺＮＲＦ３、スイスプロットＱ９ＵＬＴ６、配列番号４）およびリングフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３、スイスプロットＱ６８ＤＶ７、配列番号３）、の機能を発見した。Hao HXら(2012) Nature 485(7397):195-200。ＲＮＦ４３、がん関連ＲＩＮＧフィンガータンパク質は、核タンパク質、ＨＡＰ９５と相互作用するユビキチンリガーゼである。Sugiura Tら (2008) Exp. Cell Res. 314(7):1519-28。ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３はどちらもＷｎｔ受容体Ｆｒｉｚｚｌｅｄのための相同細胞表面膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼである。両者のタンパク質はＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰ６を含むＷｎｔ受容体複合体の細胞表面レベルを阻害する。
【００２２】
本発明者らはまた、ＺＮＲＦ３がＷｎｔ経路活性化によって転写的に誘導されることを示した。ＺＮＲＦ３  ｓｉＲＮＡまたはドミナントネガティブＺＮＲＦ３が強力にＷｎｔシグナル伝達を増加する一方で、ＺＮＲＦ３の過剰発現は、Ｗｎｔシグナル伝達を減少させた。ＬＲＰ６リン酸化はＺＮＲＦ３阻害により増加した。このことは、ＺＮＲＦ３は、Ｗｎｔ経路の上流で作用することを示す。したがって、ＺＮＲＦ３は、Ｗｎｔリガンド刺激に対する細胞応答性を調節する。本発明者らは、ゼブラフィッシュやノックアウトマウスの両者を用いた生体内実験によって、この所見を細胞系において確認した。また、本発明者らは、ＲＮＦ４３がＺＮＲＦ３の機能的ホモログであり、Ｗｎｔシグナル伝達を調節することを示した。
【００２３】
ＲＮＦ４３および膵腫瘍
膵管腺がん（ＰＤＡＣ）は、膵臓がんの最も一般的な形態である。ＰＤＡＣは、非常に攻撃的で予後不良に関連している。Matthaei Hら (2011) Ann. Surg. Oncol. 18(12):3493-9; Luebke AMら (2012) Pancreatology 12(1):16-22; Hezel AF (2006) Genes Dev. 20(10)。膵上皮内腫瘍性病変（ＰａｎＩＮ；Pancreatic intraepithelial endoplasia）、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ；intraductal papillary mucinous neoplasm）と粘液性嚢胞腫瘍（ＭＣＮ；mucinous cystic neoplasm）はＰＤＡＣについての前駆体として考えられている。その管特性にもかかわらず、ＰＤＡＣは必ずしも腺管コンパートメントから生じない。
【００２４】
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路は膵臓の発生中に動的に調節され、外分泌膵臓の発生に必要である。Wells JM (2007) BMC Dev. Biol. 7:4。Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達の阻害は、膵臓の腺房発生を妨害するが、膵島発生を妨害しない。成体マウスの膵臓における安定なβ−カテニンの誘導発現は、膵島細胞に最小限の影響で成熟した外分泌細胞の増殖を増加させる。Heiser PWら (2006) Development 133(10):2023-32。Ｗｎｔ経路の活性化はＰＤＡＣの維持および／または進行に寄与し得ることを示す証拠が増えている。Morris JPら (2010) Nat. Rev. Cancer 10(10):683-95。β−カテニンの核または細胞質の蓄積がＰＤＡＣのサブセットで観察される（Pasca di Magliano Mら (2007) PLoS One 2(11):e1155）が、これは経路が活性化されていることを示している。細胞基質および核β−カテニンのレベルは、ＰａｎＩＮグレードおよびＰＤＡＣ(Wang Lら (2009) Cancer Sci. 101(3):700-6)の発生と正に相関しているので、β−カテニンシグナル伝達はＰＤＡＣの進行を促進させる。β−カテニンの枯渇は、ＰＤＡＣ細胞の増殖を減少させたが、これは表現型の形質転換の維持におけるβ−カテニンの重要性を示している。
【００２５】
ＩＭＰＮおよびＭＣＮにおいて、ＲＮＦ４３は頻繁に変異している（Furukawa Tら(2011) Sci. Rep. 1:161; Wu Jら (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(52):21188-93）。ＩＰＭＮおよびＭＣＮは、浸潤性膵管腺がん（ＰＤＡＣ）の前駆体である。
【００２６】
ヒトＲＮＦ４３の配列は当技術分野で知られている。全長ヒトＲＮＦ４３  ｃＤＮＡ（ＮＭ＿０１７７６３．４）は、商業的供給源（例えば、オープンバイオシステムズ（Open Biosystems）, Glastonbury, CT, USA 06033）から購入することができる。ＲＮＦ４３の詳細については、米国特許第７４２５６１２号を参照されたい。ＴＡＴ１７９ポリペプチドは、シグナルペプチドの後のＲＮＦ４３細胞外領域と同一である。ヨーロッパにおいてＥＰ１４８７８７７Ｂ１として認可された、国際特許出願ＷＯ２００３／０２４３９２を参照されたい。
【００２７】
近年、ＲＮＦ４３は、嚢胞性膵腫瘍における腫瘍サプレッサーであると提案された。Wu Jら (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. 108:2188。全エキソーム解析の研究において、８例の膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮｓ）のうちの６例、および８例の粘液性嚢胞腫瘍（ＭＣＮｓ）のうち３例は、ＲＮＦ４３の不活性化変異を保有することが示された。ＲＮＦ４３での不活性化変異が優越していることとその遺伝子座のヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）は、ＩＰＭＮｓとＭＣＮｓの両者における腫瘍抑制因子としてのＲＮＦ４３を確立する。その報告において、Ｗｕらは、ＲＮＦ４３の機能的な研究を提供していない。
【００２８】
より最近では、Ｚｎｒｆ３およびＲｎｆ４３の両者の腸特異的欠失は、腸陰窩の過剰増殖と腸腺腫形成を誘導することがマウスにおいて示された。Koo BKら (2012) Nature 488(7413):665-9。また、ＲＮＦ４３の変異は、嚢胞性膵腫瘍など、様々な腫瘍で同定されている。これらの研究は、ＲＮＦ４３はＺＮＲＦ３のようにＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の負の調節因子として作用することを示している。
【００２９】
しかし、ＲＮＦ４３が重要である細胞系は同定されておらず、およびＲＮＦ４３の試験管内での機能喪失研究は可能ではなかった。このように、がんにおけるＲＮＦ４３変異の生理的関連性は、以前は知られていなかった。
【００３０】
Ｗｎｔ／βカテニン経路
進化的に保存されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路は胚発生および成体組織の恒常性に重要である。Logan CY and Nusse R (2004) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 20:781-810; Clevers H (2006) Cell 127(3):469-80。Ｗｎｔシグナル伝達は、転写因子β−カテニンの代謝回転を調節し、重要な発生遺伝子の発現プログラムを制御する。MacDonald BTら (2009) Dev. Cell. 17(1):9-26。Ｗｎｔ経路の活性化がない場合は、細胞基質β−カテニンは、大腸腺腫症（adeomatous polyposis coli (APC)）、ＡＸＩＮおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼ３α／β（ＧＳＫ３α／β）などの複数のタンパク質を含有するβ−カテニン分解複合体に関連する。この複合体において、β−カテニンはＧＳＫ３によって恒常的にリン酸化されており、リン酸化β−カテニンはユビキチン・プロテアソーム経路によって分解される。２つの受容体、ＦｒｉｚｚｌｅｄとＬＲＰ５／６、によってＷｎｔシグナルが受け取られ、β−カテニン分解複合体の解離をもたらす。安定化β−カテニンは、核に移行し、ＴＣＦファミリーの転写因子に結合し、転写を開始させる。
【００３１】
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の異常な活性化は、腫瘍形成に関与しており、がんにおいてＷｎｔ経路の多くの下流コンポーネントは変異している。ＡＰＣのトランケーション変異は結腸直腸がんの８０％で発見される。β−カテニンの安定化変異とＡＸＩＮ１／２の機能喪失変異もまた様々ながんにおいて見出されている。精力的な研究にもかかわらず、下流経路変異を有するがんにおけるβ−カテニンシグナル伝達の標的化は、扱いやすい標的が不在のために難しい状況となっている。その一方で、Ｗｎｔシグナル伝達経路の上流には扱いやすい標的がいくつか存在する。Ｗｎｔシグナル伝達の上流を標的化する薬剤として、ＬＲＰ６抗体(Ettenberg Sら (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107(35):15473-8)、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ抗体(Gurney Aら (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(29):11717-22)、およびポーキュパイン阻害剤(Chen Bら (2009) Nat. Chem. Biol. 5(2):100-7)を含む、様々な薬剤が開発されてきている。しかし、これらの分子は下流の変異を有する腫瘍においてβ−カテニンのシグナル伝達を阻害しないと思われるため、これらの薬剤の臨床開発はこれまで困難であった。また、リガンド誘導性Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達に依存しているヒトの腫瘍を同定することは、なおも解決の難しい仕事である。
【００３２】
定義
「がん」とは、米国特許番号第８０９３０１１と米国特許番号第８０９３０１１（両者とも参照によりその全体が取り込まれる）に記載されるように、制御されていない増殖、分化能の欠如および局部組織に侵入して転移する能力によって特徴付けられる広い範囲の細胞悪性腫瘍の一般名称である。これらの新生物による悪性腫瘍は、様々な程度の有病率で体内のあらゆる組織および器官に影響を与える。したがって、本明細書で使用される用語「がん」は、無制限増殖、不死、転移能、急速な成長と増殖率およびある特定の形態学的特徴など、がんを引き起こす細胞に典型的な特徴を有する細胞の存在のことを示す。多くの場合、がん細胞は腫瘍の形態となるが、そのような細胞は単独で存在しうるか、または白血病細胞などの独立した細胞として血流を循環しうる。
【００３３】
「異常な細胞増殖」は通常の調節機構（例えば、接触阻害の損失）とは無関係の細胞増殖を指す。これには下記の異常増殖が含まれる：（１）細胞におけるＷｎｔ経路の過剰活動により増殖する腫瘍細胞（腫瘍）；（２）細胞においてＷｎｔ経路の異常な過剰活動が生じている、他の増殖性疾患の良性および悪性の細胞；（４）細胞におけるＷｎｔ経路の過剰活動により増殖する任意の腫瘍；（５）細胞におけるＷｎｔ経路の過剰活動により増殖する任意の腫瘍；ならびに（６）Ｗｎｔ経路の異常な過剰活動が生じている、他の増殖性疾患の良性および悪性の細胞。
【００３４】
「バイオマーカー」は、人間などの生物の特定の病気の状態や、他のいくつかの生理学的状態の指標として使用することができる任意のものである。バイオマーカーは、遺伝子の存在、対立する遺伝子、遺伝子発現の測定、タンパク質、測定することができ、生理学的状態と関連させることができるタンパク質活性の機能効果であってよい。バイオマーカーは、医師が診断と治療コースを選択する意思決定支援に使用できる検査値変数として医学において使用される。
【００３５】
「ヘテロ接合性の消失」（ＬＯＨ）は、正常細胞と比較してほぼすべて種類のがんが受ける遺伝物質（ＤＮＡ）の削除である。米国特許番号第７７１８３６４を参照のこと（参照によりその全体が組み込まれる）。がん細胞からの遺伝物質の消失は、染色体上の特定の遺伝子座における、細胞の増殖に影響を与える可能性がある遺伝子の対立遺伝子について、２つ以上あるうちの１つの選択的消失をもたらすことがある。遺伝的多様性やＤＮＡ多型により、対立遺伝子の組の多くが互いに異なっている。２つの対立遺伝子が同一である場合、その個体はその特定の遺伝子座での対立遺伝子の組がホモ接合体であると言われる。あるいは、２つの対立遺伝子が異なる場合、その個体はその遺伝子座でヘテロ接合体である。通常は、両者の対立遺伝子が転写され、ホモ接合体の場合、同一のタンパク質に、ヘテロ接合体の場合は、異なったタンパク質に最終的に翻訳される。ヘテロ接合型の対立遺伝子の組の１つが、ペアの染色体の１つからＤＮＡが削除されることにより失われた場合、残りの対立遺伝子が発現され、影響を受けた細胞は機能的にホモ接合型となる。このような状況は「ヘテロ接合性の消失」（ＬＯＨ）またはホモ接合性の減少と呼ばれる。ＤＮＡプローブを使用することにより、個体の正常な細胞からのＤＮＡを同じ個体の腫瘍細胞から抽出したＤＮＡと比較することができ、技術分野でよく知られている実験技術を使用してＬＯＨを同定できる。あるいは、ＬＯＨは、正常のヘテロ接合体細胞においては２つの多形性の形態のタンパク質であって、対立遺伝子の削除が発生したがん細胞においては１つだけの形態であることを示すことによってアッセイすることができる。例えば、Laskoら (1991) Annu. Rev. Genet. 25:281-314を参照されたい。特定の染色体領域上における高頻度ＬＯＨが、多くの種類の悪性腫瘍において報告されているが、これはこれらの遺伝子座上またはその近くに推定上の腫瘍抑制遺伝子または腫瘍関連遺伝子が存在していることを示している。したがって、ＬＯＨ分析は、推定遺伝子が存在する領域を狭め、同定することによる腫瘍抑制遺伝子を検索するための強力なツールである。Vogelsteinら (1988) New Engl. J. Med. 319(9):525-532; Fearonら (1990) Cell 61:759-767; およびFriendら, Nature 323:643-646 (1986)を参照のこと。多くの種類の腫瘍抑制因子候補または腫瘍関連遺伝子が分析により同定された。Callら (1990) Cell 60:509-520; Kinzlerら (1991) Science 253:661-665; およびBakerら (1989) Science 244:217-221を参照のこと。
【００３６】
「機能喪失」（ＬＯＦ）変異は、遺伝子の変異または対立遺伝子であり、その結果、細胞または生物（ヒト細胞またはヒトを含む）において遺伝子産物（例えば、コードされたタンパク質など）が正常未満または機能しないようになる。対立遺伝子が完全な機能喪失（ヌル対立遺伝子）を有しているとき、それは多くの場合、無形質の変異と呼ばれる。機能喪失変異に関連した表現型は、多くの場合、劣性である。
【００３７】
「置換」とは、１つの塩基を他に交換する変異（すなわち、ＡをＧに替えるような単一の「化学的文字」の変化）である。このような置換は、（１）異なるアミノ酸をコードするものにコドンを変更して、生産されるタンパク質に小さな変化を引き起こすもの（例えば、鎌状赤血球貧血は、β−ヘモグロビン遺伝子の置換によって引き起こされるが、これは産生されるタンパク質中の単一のアミノ酸が改変されるものである）；（２）同じアミノ酸をコードするものにコドンを変更して、産生されるタンパク質に変化が生じないもの（「サイレント変異」）、または（３）単一の「停止」コドンにアミノ酸をコードするコドンを変更して、不完全なタンパク質を生じさせるもの（不完全なタンパク質は、通常は機能をもたない）、でありうる。
【００３８】
「挿入」とは、追加の塩基対が、ＤＮＡ内の場所に挿入された変異である。
【００３９】
「欠失」とは、ＤＮＡのセクションが欠失した、または削除された変異である。
【００４０】
「フレームシフト」とは、ＤＮＡ配列から３で割り切れない数のヌクレオチドの挿入または欠失）によって引き起こされる変異である。コドンによる遺伝子発現のトリプレットの特質により、挿入または欠失は、リーディングフレーム（コドンのグループ）を変更することができ、オリジナルとは全く異なる翻訳結果をもたらす。これは多くの場合、機能喪失をもたらすトランケートしたタンパク質を生成する。
【００４１】
（その発明者フレデリック・サンガーにちなんで名付けられた）「サンガー配列決定法」とは、ポリヌクレオチドの配列決定の鎖伸長停止法（chain-terminator method）である。サンガー配列決定法の特徴は、ＤＮＡの鎖伸長ターミネーターとしてのジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）の使用である。サンガー配列決定法は、多くの場合、自動化された方法である。
【００４２】
「次世代シーケンシング」法は、シーケンシング処理を並列化し、一度に数千から数百万の配列を生成する、最近開発されたハイスループット配列決定法のグループである。この技術は、生成されたデータの増加、ならびにこれらのデータを生成するために必要なコストの低下により、扱いやすい、汎用ツールとして当業者によって認識されてきている。
【００４３】
特に明記しない限り、本明細書で使用される用語「治療する」は、患者における、腫瘍の増殖、腫瘍転移または他の発癌または新生物細胞を部分的にまたは完全に、逆進、緩和、その進行を阻害、または予防することを意味する。用語「治療」とは、本明細書では、特に明記しない限り、治療する行為を指す。
【００４４】
語句「治療する方法」またはその等価の語句は、がん治療に適用された場合、がん細胞の数を減少もしくは消滅するように、またはがんの症状を緩和するように設計された手順または行動方針を指す。がんまたは他の増殖性疾患を「治療する方法」は、必ずしもがん細胞または他の疾患の細胞が実際に消滅すること、細胞の数または疾患が実際に減少すること、またはがんまたは他の疾患の症状が実際に緩和されることを意味しない。しばしば、がんを治療する方法は成功のみこみが低くとも行われるが、それにもかかわらず、その病歴および推定余命の条件によっては、全体的に有益な行動方針とみなされる。
【００４５】
「治療的に有効な薬剤」とは、研究者、獣医、医師または他の臨床医によって求められている、組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する組成物である。
【００４６】
「治療有効量」または「有効量」とは、研究者、獣医師、医師または他の臨床医によって求められている、組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する、対象化合物または組み合わせの量である。
【００４７】
「阻害剤」（inhibitor）とは、上述したような天然に存在するまたは参照化合物の効果を阻害する（例えば、拮抗する、低減させる、減少させる、遮断する、逆進させる、または変化させる）化合物である。そのような阻害剤は、任意の化合物、タンパク質、ペプチド、もしくは（リボザイムおよびアンチセンスを含む）核酸、または拮抗的効果を提供する薬物／化合物／ペプチドの設計物または選択物の製品を含むことができる。
【００４８】
「単離された」ポリヌクレオチド、または単離された核酸分子は、その天然の環境から取り出された（すなわち、ヒトの操作に供せされた）核酸分子のことであり、その天然の環境は核酸分子が天然に見出されるゲノムまたは染色体である。このように、語句「単離された」は核酸分子が精製された程度を必ずしも反映しないが、核酸分子が天然に見出されるゲノム全体または染色体全体を、この分子が含まないことを示している。遺伝子を検出するために（例えば、遺伝子へのハイブリダイゼーションによって）本発明の方法で使用されるようなポリヌクレオチドは、典型的には与えられた試料（例えば、細胞試料）中の全長遺伝子（またはその一部）の同定のためのハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用するのに適した標的遺伝子の一部である。単離された核酸分子は、遺伝子または遺伝子の一部（例えば、調節領域またはプロモーター）を含むことができる。遺伝子を含む単離された核酸分子は、そのような遺伝子を含む染色体の断片ではなく、むしろその遺伝子に関連するが同じ染色体上に天然に見出される追加の遺伝子とは関連しないコード領域および調節領域を含む。単離された核酸分子はまた、天然においては特定の核酸配列に通常隣接されない付加的な核酸（すなわち、異種配列）により隣接（すなわち、配列の５’末端または３’末端に、またはその両方に）された特定の核酸配列を含むことができる。単離された核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）のいずれかの誘導体を含むことができる。語句「核酸分子」は、主として物理的な核酸分子を示し、語句「核酸配列」は、主として核酸分子上のヌクレオチドの配列を示すが、２つの語句は、特にタンパク質をコードする能力を有する核酸分子、または核酸配列に関して、交換可能に使用することができる。単離された核酸分子は、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）または化学合成を用いて作製することができる。
【００４９】
「プローブ」（オリゴヌクレオチドプローブ）とは、典型的には長さ約５０から１００ヌクレオチドから数百ヌクレオチド、数千ヌクレオチドのサイズの範囲である核酸分子である。したがって、プローブは、整数の増分で、５０から数千ヌクレオチドの範囲内の任意の長さを含む、本明細書に記載のアッセイでの使用に適した任意の長さであることができる。このような分子は、典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸配列にハイブリダイズすることにより、試料中の標的核酸配列を同定するために使用される。ハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において公知である。例えば、Sambrookら(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labs Pressを参照されたい。
【００５０】
「プライマー」もまた、核酸配列のことである。ＰＣＲプライマーは、典型的には、ポリメラーゼ連鎖反応において使用されるかなり短い長さのオリゴヌクレオチド（例えば、８から３０ヌクレオチド）である。ＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブは、標的配列からの配列情報を使用して、当業者によって容易に開発および製造することができる。Sambrookら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labs Pressを参照されたい。
【００５１】
用語「試験試料」または「患者試料」は、本発明の方法によって評価される細胞から分泌された細胞または製品を含有する任意のタイプの試料を指すために一般的に用いることができ、単離された細胞の試料、組織試料または体液試料を含むがこれらに限定されない。単離された細胞の試料は、典型的には、懸濁液中または生体内の組織内で細胞を結合させた結合組織から分離した細胞の標本であり、それは本発明の方法による評価のために適切な数の細胞を収集できるような任意の適切な方法によって、臓器、組織または流体から収集されたものである。細胞試料中の細胞は、同じタイプである必要はない一方で、精製方法は、好ましくは評価される細胞のタイプを濃縮するように用いることができる。細胞は、例えば、組織をこすることによって、個々の細胞を分離するように組織試料を処理することによって、または体液から単離することによって、取得することができる。
【００５２】
「組織試料」は、単離された細胞の試料に類似しているが、身体の臓器または組織の一部として本明細書において定義され、典型的には、いくつかの細胞タイプを含み、場合によって、細胞を保持する細胞骨格構造をともに含む。用語「組織試料」は、「細胞試料」と、いくつかの例において、互換的に使用されてもよい一方で、用語「組織試料」は、細胞試料よりもより複雑な構造を指定するためにより多く使用され得る。組織試料は生検によって得ることができ、例えば、切断、スライシング、またはパンチによって得ることができるものを含む。
【００５３】
「体液試料」は、組織試料のように、評価する細胞を含有し、サンプリングされる特定の体液に適した任意の方法によって得られた液体である。サンプリングのための適切な体液としては、血液、粘液、精液、唾液、痰、気管支洗浄液、母乳、胆汁および尿を含むがこれらに限定されない。
【００５４】
「対照レベル」は、Ｗｎｔ阻害剤に対する感受性と相関するレベルまたはＷｎｔ阻害剤に対する耐性と相関するレベルを含むことができる、ヘテロ接合の対照レベルである。したがって、ヘテロ接合性の消失の対照またはベースラインレベルと比較して、患者試料がＷｎｔ阻害剤療法への感受性または耐性である可能性が高いかどうか、（例えば、良好な応答者または応答者（治療が有益である患者）であるか、あるいは、貧弱な応答者または非応答者（療法が有益でない患者かまたはあまり有益でない患者）であるか）を決定することができる。より具体的には、「対照レベル」はヘテロ接合性の対照レベル；野生型、正常またはベースラインステータスを示すＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ配列；ＲＮＦ４３  ｍＲＮＡの対照レベルまたは活性；ＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡの対照レベルまたは活性、ＲＮＦ４３遺伝子欠失やＺＮＲＦ３遺伝子欠失の機能的効果を表すことができ、Ｗｎｔ阻害剤への感受性と相関しているレベル、配列もしくは効果またはＷｎｔ阻害剤に対する耐性と相関しているレベルを含めることができる。したがって、患者試料、がん細胞または細胞がＷｎｔ阻害剤に対して感受性または耐性である可能性が高いかどうかについて、対照ヘテロ接合；野生型、正常もしくはベースラインステータスを示すＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくはＲＮＡ配列；正常もしくはベースラインＲＮＦ４３  ｍＲＮＡもしくは活性；正常もしくはベースラインＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡもしくは活性、またはＲＮＦ４３もしくはＺＮＲＦ３遺伝子の正常もしくはベースライン機能的効果と比較して、決定することができる。「対照レベル」とは、非がん性、健康、野生型の組織または細胞、あるいは特定の実施形態においては、プラセボ処理した腫瘍細胞における比較のために測定された配列、パラメーターまたはレベルを指すことができる。
【００５５】
用語「一致した個体」は、評価されるべき細胞または腫瘍増殖のタイプに適した１つまたは複数の特性に基づいた、対照個体の一致を示す。対照個体は、性別、年齢、人種、または対照個体と患者のベースラインに影響を与える可能性のある関連の生物学的もしくは社会学的要因に基づいて、評価される患者に一致させることができる（例えば、既存の条件、特定の物質の消費、他の生物学的または生理学的因子のレベル）。
【００５６】
「医薬組成物」は、活性剤と他の担体、例えば、化合物または組成物、不活性物質（例えば、検出可能な薬剤または標識）またはアジュバント、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバント等の活性物質の組み合わせである。担体はまた、例えば；タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、および炭水化物（例えば、単糖およびオリゴ糖を含む糖；アルジトール、アルドン酸、エステル化糖などの誘導体化糖；および多糖または糖ポリマー等）のような薬学的賦形剤および添加剤を含み、単独または組み合わせで１から９９．９９パーセント重量または容量を含む、単独または組み合わせで存在することができる。炭水化物賦形剤には、例えば；フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどの単糖類；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどの多糖類；ならびに、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）およびミオイノシトールなどのアルジトールが挙げられる。これは、固体または液体形態であり得る。
【００５７】
方法
一実施形態において、本発明は、Ｗｎｔ阻害剤の治療的投与が有益であるかまたは有益でないことが予測されるがん患者を選択する方法を提供する。この方法は、
（ａ）患者からの腫瘍細胞の試料におけるバイオマーカーのレベルを検出する段階であって、バイオマーカーは、（ｉ）ヘテロ接合性の消失を決定するために、ＲＮＦ４３の染色体領域もしくはＺＮＲＦ３染色体領域において検出されたＤＮＡコピー数、（ｉｉ）ＲＮＦ４３遺伝子もしくはＺＮＲＦ３遺伝子の不活性化変異を検出するために配列決定されたがん組織からのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくはＲＮＡ；（ｉｉｉ）ＲＮＦ４３  ｍＲＮＡ発現もしくはＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡ発現を測定するためのアッセイの結果；（ｉｖ）ＲＮＦ４３  ｍＲＮＡ発現もしくはＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡ発現を測定するためのアッセイの結果；（ｖ）ＲＮＦ４３遺伝子欠失もしくはＺＮＲＦ３遺伝子欠失の機能的効果；または（ｖｉ）またはバイオマーカー（ｉ）〜（ｖ）の組み合わせであってもよい、段階；
（ｂ）腫瘍細胞試料におけるバイオマーカーのレベルを、（ｉ）Ｗｎｔ阻害剤に対する感受性と相関しているバイオマーカーの対照レベル；および（ｉｉ）Ｗｎｔ阻害剤に対する耐性と相関しているバイオマーカーの対照レベルからなる群から選択されるバイオマーカーの対照レベルと比較する段階；ならびに
（ｃ）患者の腫瘍がＲＮＦ４３もしくはＺＮＲＦ３変異を有するか、または患者の腫瘍がＲＮＦ４３  ｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現の減少またはＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現の減少を有し、それにより患者の腫瘍がＷｎｔ阻害剤に対して感受性である可能性が高いことが示される場合に、Ｗｎｔ阻害剤の治療的投与が有益であることが予測されるものとして患者を選択する段階
を含む。
【００５８】
腫瘍細胞におけるＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子の変異ステータスは、次のいずれかの方法、または方法の組み合わせによりアッセイされることができる。
（ｉ）ＲＮＦ４３遺伝子の一方または両者のコピーが欠失しているか否かを確認するための１７番染色体におけるゲノム遺伝子座１７ｑ２２のＲＮＦ４３領域のＤＮＡコピー数解析。あるいは、ＺＮＲＦ３遺伝子の一方または両者のコピーが欠失しているか否かを確認するための２２番染色体におけるゲノム遺伝子座２２ｑ１２．１のＺＮＲＦ３領域のＤＮＡコピー数解析。ＲＮＦ４３またはＺＮＲＦ３のヘテロ接合性の消失は、Ｗｎｔ阻害剤を用いた治療による腫瘍増殖率の低減について選択される腫瘍のためのバイオマーカーである。
（ｉｉ）ＲＮＦ４３遺伝子における不活性化変異を検出するための、がん組織からのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡの配列決定。ＲＮＦ４３またはＺＮＲＦ３の不活性化変異は、Ｗｎｔ阻害剤を用いた治療による腫瘍増殖率の低減について選択される腫瘍のためのバイオマーカーである。不活性化変異は、ナンセンス変異、フレームシフト変異、スプライシングバリアント、または保存された残基のアミノ酸変化をもたらすミスセンス変異であり得る。
（ｉｉｉ）タックマン（Taqman）または他の同様の技術を用いたＲＮＦ４３  ｍＲＮＡ発現アッセイまたはＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡ発現アッセイ。ｍＲＮＡのナンセンスまたはフレームシフト変異は、多くの場合、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解をもたらす。したがって、がん細胞におけるＲＮＦ４３  ｍＲＮＡ発現の喪失は、ＲＮＦ４３ナンセンスまたはフレームシフト変異のための二次または代替アッセイとして使用することができる。ＲＮＦ４３  ｍＲＮＡの欠如は、エピジェネティックなサイレンシングが原因である可能性もあり、その場合は、ゲノムＤＮＡには変異が存在しない。
（ｉｖ）ＲＮＦ４３遺伝子欠失またはＺＮＲＦ３遺伝子欠失の機能的効果のアッセイ、例えば腫瘍試料における、Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質レベルの増加、ＬＲＰ６タンパク質レベルの増加、ＬＲＰ６リン酸化の増加、およびＤｉｓｈｅｖｅｌｅｄリン酸化の増加などについて、正常対照と比較してアッセイおよび検出することなどによる（この場合、腫瘍試料におけるＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質レベルの増加、ＬＲＰ６タンパク質レベルの増加、ＬＲＰ６リン酸化の増加、およびＤｉｓｈｅｖｅｌｅｄリン酸化の増加が、ＲＮＦ４３遺伝子バイオマーカーまたはＺＮＲＦ３遺伝子バイオマーカーの対照レベルよりも低いことが指標である）。
【００５９】
検出段階は、（ＲＮＦ４３について）配列番号１または（ＺＮＲＦ３について）配列番号２で提供される配列にハイブリダイズするヌクレオチドプローブを使用することによってなされる。
【００６０】
不活性化変異は、ナンセンス変異（表１および表２を参照）、フレームシフト変異（表１および表２を参照）、スプライス部位変異または保存された残基でのアミノ酸変化をもたらすミスセンス変異であり得る。図２は、タンパク質中のどのアミノ酸が保存されているかについての指針を提供する、ヒトＲＮＦ４３とＺＮＲＦ３タンパク質のアラインメントを示す。
【００６１】
スプライス部位変異は、前駆体メッセンジャーＲＮＡが成熟したメッセンジャーＲＮＡへプロセッシングされる段階で、イントロンのスプライシングが行われる特定の部位に、いくつかのヌクレオチドを挿入または削除する遺伝的変異である。スプライシング部位の消滅は、１つまたは複数のイントロンが成熟ｍＲＮＡ中に残ることとなり、異常なタンパク質の産生をもたらし得る。
【００６２】
ｍＲＮＡにおけるナンセンスまたはフレームシフト変異は、多くの場合、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解をもたらす。したがって、がん細胞におけるＲＮＦ４３  ｍＲＮＡ発現の喪失は、ＲＮＦ４３ナンセンスまたはフレームシフト変異のための二次または代替アッセイとして使用することができる。ＲＮＦ４３  ｍＲＮＡの欠如はまた、エピジェネティックなサイレンシングが原因である可能性があり、その場合は、ゲノムＤＮＡには変異が存在しない。
【００６３】
比較する段階は、Ｗｎｔ阻害剤に対して耐性である１つまたは複数の対照細胞またはＷｎｔ阻害剤に対して感受性である１つまたは複数の対照細胞、またはその両者におけるバイオマーカーの対照レベルと腫瘍細胞におけるバイオマーカーのレベルを比較することによって行うことができる。一態様において、Ｗｎｔ阻害剤に対する感受性または耐性と相関しているバイオマーカーの対照レベルは、予め決定されている。
【００６４】
Ｗｎｔ阻害剤療法が有益であるかまたは有益でないと予測される患者を選択する段階のために、試験される大多数の患者について、ほとんどの患者はＷｎｔ阻害剤による治療に耐性である腫瘍を有することが企図される。これは、Ｗｎｔシグナル伝達に対する腫瘍の依存性は、増殖因子シグナル伝達に対する腫瘍の依存ほど高頻度ではないことが予想される。さらに、Ｗｎｔ依存性腫瘍がＷｎｔ経路における下流遺伝子変異を有する場合、その腫瘍は最新のＷｎｔ阻害剤に応答しないであろう。したがって、当技術分野において、治療のためにＷｎｔ阻害剤治療に対して良好な応答者であるがん患者群を選択する必要がある。良好な応答者を予測する能力は、がん患者からの腫瘍におけるＲＮＦ４３変異ステータスまたはＺＮＲＦ３変異ステータスを決定する主な有用性である。
【００６５】
上に記載した本発明の方法の実施形態はいずれも、任意のタイプのがんを有する患者に使用することができる。一実施形態において、患者は、乳管癌、腺癌またはメラノーマを有する（表１を参照のこと）。別の実施形態において、患者は、膵臓がん、結腸がん、食道がんまたは皮膚がんを有する（表１、表２、表３、表４、および表５を参照のこと）。本発明のさらに別の方法において、患者は、ＲＮＦ４３変異を有する胃腫瘍を有している。
【００６６】
上に記載した本発明の実施形態のいずれにおいても、任意のＷｎｔ阻害剤に対する応答性を評価することができる。試験管内においては、Ｗｎｔ阻害剤の応答性は、標準的な細胞増殖、分化、およびアポトーシスアッセイにおいて決定することができる。腫瘍細胞におけるＷｎｔシグナル伝達の状態に関するＷｎｔ阻害剤の効果は、β−カテニン、β−カテニン標的遺伝子ＡＸＩＮ２のｍＲＮＡ発現、およびＬＲＰ６のリン酸化のレベルを調べることにより評価することができる。診療所において、固形腫瘍または腫瘍ステータスのバイオマーカーの評価は、イメージング、例えば、ＰＥＴスキャンによる腫瘍の縮小量に基づいている。
【００６７】
腫瘍体積の測定方法は、当技術分野において公知である。Therasse P.ら (2000) J. Natl. Cancer Inst. 92(3): 205-216を参照されたい。追跡期間の間に各々同定され、報告されたベースラインの病変を特徴付けるために、同じ評価法と同じ技術を利用するべきである。治療の抗腫瘍効果を評価するために使用される場合、臨床検査による評価よりもイメージングに基づいた評価のほうが好ましい。
【００６８】
臨床検査。臨床的に検出された病変は、表面的である場合（例えば、皮膚結節および触知リンパ節）にのみ測定可能であるとみなされる。皮膚病変の場合には、カラー写真−病変のサイズを見積もるための定規を含めて−による文書化が推奨される。
【００６９】
胸部Ｘ線。胸部Ｘ線での病変は、明確に区別され、含気肺によって囲まれている場合に、測定可能な病変として許容される。しかし、ＣＴが好ましい。客観的な腫瘍応答の評価のための、この評価方法の使用に関するさらなる詳細については、Therasse Pら (2000) J. Natl. Cancer Inst. 92 (3): 205-216によって提供される。
【００７０】
ＣＴおよびＭＲＩ。Ｘ線コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）は、応答評価のために選択された標的病変を測定するための、現在利用可能な最良の、最も再現性のある方法である。従来法によるＣＴおよびＭＲＩは、スライス厚が１０ｍｍ以下の連続した切片で行われるべきである。スパイラルＣＴは、５ｍｍの連続的な再構成アルゴリズムを用いて行うべきである；この仕様は、胸部、腹部、骨盤の腫瘍に適用される。一方、頭頸部腫瘍および四肢の腫瘍は通常、特定のプロトコルを必要とする。Therasse Pら (2000) J. Natl. Cancer Inst. 92 (3): 205-216を参照されたい。
【００７１】
超音波。検査の主要エンドポイントが客観的な応答評価である場合、臨床的に簡単にアクセスすることができない腫瘍病変を測定するために超音波を使用すべきではない。それは、表在触知可能なリンパ節、皮下病変および甲状腺結節の臨床測定についての、可能な代替方法として使用することができる。超音波はまた、通常、臨床検査によって評価される表在性病変の完全消失を確認するときにも有用であるかもしれない。客観的応答評価の目的で腫瘍病変を測定するために超音波を使用しないことを正当化する理由は、付録Ｉ（Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｉ）において提供される。
【００７２】
内視鏡検査や腹腔鏡。客観的な腫瘍評価のためにこれらの技術を利用することは、まだ完全にまたは広く確証されていない。この特定の状況においてそれらを使用する場合には、一部の施設でのみ利用可能である精巧な装置や高度な専門知識を必要とする。したがって、客観的な腫瘍応答のためのそのような技術の利用は、専門施設での検証目的に制限する必要がある。しかし、このような技術は、生検標本が得られる場合、完全な組織病理学的応答を確認するのに有用であり得る。
【００７３】
腫瘍マーカー。腫瘍体積の測定との相関に使用される腫瘍マーカー（すなわち、本発明のマーカーではない）のみでは、応答を評価するために使用することができない。しかし、マーカーが最初に正常上限を超えている場合は、完全臨床応答したと考えられる患者については、すべての腫瘍病変が消失した際に、それらは通常のレベルに戻らなければならない。臨床試験を支援するための前立腺特異抗原およびＣＡ（がん抗原）１２５応答の標準用法について、特定の付加的基準が検証されている。
【００７４】
細胞診と組織学。細胞学的および組織学的技法は、部分的応答と完全応答を区別するために、まれなケースにおいて使用することができる（例えば、治療後に、胚細胞腫瘍のような腫瘍タイプにおいて残存良性病変と残存悪性病変とを区別するために）。測定可能な腫瘍が応答または安定疾患の基準を満たしている場合に、治療中に現れるか、悪化した任意の浸出液について腫瘍的性質の細胞学的確認が必要となる。このような状況下では、収集した液体を細胞診することにより、応答または安定な疾患（浸出液が治療の副作用かもしれない）と進行性疾患（流体が新生物起源であることが確認された場合）とを区別することが可能である。客観的な腫瘍応答をよりよく確立するための新しい技術は、それらが腫瘍応答評価の状況において使用されるように十分に確証された場合に、これらの基準に統合される。
【００７５】
ヘテロ接合性の消失
本発明の一実施形態では、ＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子のヘテロ接合性の消失を有する腫瘍は、応答する可能性がより高い（すなわち、Ｗｎｔ阻害剤によって増殖が、遅くなっている。したがって、ＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子のヘテロ接合性の消失を有する腫瘍を持つがん患者は、Ｗｎｔ阻害剤療法に対して応答速度がより高く、進行性疾患の速度がより低く、進行への時間がより長く、長期生存率がより高い可能性が高い。一実施形態では、ＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子のコピーを持つ腫瘍試料を有する患者は、Ｗｎｔ阻害剤による治療に対する良好な応答者であると予測される。
【００７６】
ヘテロ接合性の消失の対照レベルを設定するための方法は、試料タイプ、試料が得られた組織または器官、および評価される患者のステータスに基づいて選択される。方法は、患者の試料を評価するために使用されるものと同じ方法であることができる。一実施形態において、対照レベルは、細胞が評価されるのと同じ細胞タイプを使用して設定される。別の実施形態において、対照レベルは、Ｗｎｔ阻害剤に対して耐性または感受性であることが知られている患者または細胞株に由来する対照試料から設定される。一態様において、対照試料は、一致した個体の集団から得られた。
【００７７】
対照レベルを設定するために、一致した個体数から試料が得られ、試験試料と同様の方法で評価される。一致した個体の数は当業者によって決定することができるが、対照試料はそこから適切な対照レベル（例えば、集団）を設定するために取得しなければならず、評価される患者（すなわち、試験患者）と比較するための適切なベースラインを設定するために統計学的に適切であるべきである。対照試料から得られた値は、そのような値を設定するために当技術分野において標準的な方法を用いて、適切なベースラインレベルを設定するように統計分析の任意の適切な方法を用いて統計学的に処理される。
【００７８】
腫瘍細胞あたりのＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子のコピー数は、蛍光インサイツハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）により検出することができる。ＦＩＳＨはＤＮＡベースの技術であり、新鮮なまたは保存したパラフィン包埋腫瘍試料において首尾よく行うことができる。この技術は十分に確立されており、プローブは、臨床細胞遺伝学および分子病理学の研究室において短いターンアラウンドで、容易に構築することができる。マウスＲＮＦ４３のためのＦＩＳＨプローブは市販されているので、当業者は、容易にヒトＲＮＦ４３のための対応するＦＩＳＨプローブを構築することができるであろう。Rogan Pら(2001) Genome Res. 11(6): 1086-1094を参照されたい。あるいは、ヒトＲＮＦ４３またはヒトＺＮＲＦ３などのヒト遺伝子に対するＦＩＳＨプローブのカスタム設計のサービスは、Empire Genomics, Buffalo, NY, USAからのＦＩＳＨプローブによるものなど、市販されている。
【００７９】
ハイブリダイゼーション
遺伝子の検出は、ハイブリダイゼーションアッセイを使用して達成することができる。核酸ハイブリダイゼーションは、（例えば、オリゴヌクレオチドまたはより大きなポリヌクレオチド）プローブと標的核酸を、プローブとその相補的標的が相補的塩基対形成を介して安定したハイブリッド二重鎖を形成できる条件下で接触させることを単純に含む。本明細書で使用する場合、ハイブリダイゼーション条件は、核酸分子が類似の核酸分子を同定するために用いられる標準的なハイブリダイゼーション条件のことを言う。そのような標準的な条件は、例えば、Sambrookら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labs Press（その全体が参照により組み入れられる、特に9.31〜9.62ページを参照）に開示されている。さらに、ヌクレオチドのミスマッチの程度を変えることを可能にするハイブリダイゼーションを達成するための適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を計算する式は、例えば、Meinkothら (1984) Anal. Biochem. 138, 267-284（その全体が参照により取り込まれる）に開示されている。ハイブリッド二重鎖を形成しない核酸は、ハイブリダイズした核酸から洗い流され、ハイブリダイズした核酸はその後、典型的には、結合させた検出可能な標識の検出により検出することができる。核酸は、温度の上昇または核酸を含有する緩衝液の塩濃度を減少させることによって変性される。低ストリンジェンシー条件下（例えば、低温または高塩濃度またはその両者）においては、アニールした配列が完全に相補的でない場合であってもハイブリッド二重鎖（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、またはＲＮＡ：ＤＮＡ）を形成するであろう。したがって、ハイブリダイゼーションの特異性は、より低いストリンジェンシーで低減する。逆に、より高いストリンジェンシー（例えば、より高い温度またはより低い塩濃度）においては、ハイブリダイゼーションを成功させるにはより少ないミスマッチが必要である。
【００８０】
高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、本明細書で言及されるように、ハイブリダイゼーション反応において探索するために使用される核酸分子と少なくとも約９０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にする条件（すなわち、約１０％以下のヌクレオチドのミスマッチを許容する条件）のことを言う。当業者は、特定のレベルのヌクレオチドミスマッチを達成する適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を計算するためにMeinkothら (1984) Anal. Biochem. 138, 267-284の式を使用することができる。そのような条件は、ＤＮＡ：ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが形成されているか否かに依存して変化する。あるいは、ＴｍはSambrookら(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labs Press., 9.31から9.62ページに記載されるように、経験的に計算することができる。
【００８１】
ハイブリダイズした核酸は、核酸試料に結合した１つまたは複数の標識を検出することによって検出される。当業者に周知の多数の手段のいずれかによって、標識を組み込むことができる。本発明で使用するのに適した検出可能な標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の組成物を含む。本発明において有用な標識は、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、アレクサフルオル（Alexa fluor）、スペクトラムダイ（Spectrum dyes）など）、量子ドット、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、および比色標識を含む。そのような標識を検出する手段は当業者によく知られている。したがって、例えば、放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出することができ、蛍光マーカーは、放出された光と蛍光顕微鏡を検出するための光検出器を用いて検出することができる。比色標識は、単に着色標識を可視化することによって検出される。好ましくは、ハイブリダイズする核酸は、蛍光標識によって、最も好ましくは蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイの条件によって検出される。ＦＩＳＨアッセイは、当該技術分野においてよく知られている。
【００８２】
本発明の方法において、腫瘍細胞試料中のＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子ヘテロ接合性の消失のレベルは、（ｉ）Ｗｎｔ阻害剤に対する感受性と相関している対照レベル；および（ｉｉ）Ｗｎｔ阻害剤に対する耐性と相関している対照レベルから選択されるＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子ヘテロ接合性の消失の対照レベルと比較される。患者の腫瘍細胞におけるＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子ヘテロ接合性の消失のレベルが、Ｗｎｔ阻害剤に対する感受性と相関しているＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子ヘテロ接合性の消失の対照レベルに統計学的に類似しているかまたはそれよりも高い場合、または、患者の腫瘍細胞におけるＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子ヘテロ接合性の消失のレベルが、Ｗｎｔ阻害剤に対する耐性と相関しているＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子ヘテロ接合性の消失のレベルよりも統計学的に高い場合、患者は、Ｗｎｔ阻害剤、そのアゴニスト、またはＷｎｔ阻害剤と実質的に同様の生物学的活性を有する薬物の治療的投与が有益であることが予測されるものとして選択される。患者の腫瘍細胞におけるＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子ヘテロ接合性の消失のレベルが、Ｗｎｔ阻害剤に対する感受性と相関しているＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子ヘテロ接合性の消失の対照レベルよりも統計学的に低い場合、または、患者の腫瘍細胞におけるＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子ヘテロ接合性の消失のレベルが、Ｗｎｔ阻害剤に対する耐性と相関しているＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子ヘテロ接合性の消失のレベルに統計学的に類似しているかまたはそれよりも低い場合、患者は、Ｗｎｔ阻害剤、そのアゴニスト、またはＷｎｔ阻害剤と実質的に同様の生物学的活性を有する薬物の治療的投与が有益でないことが予測されるものとして選択される。
【００８３】
不活性化変異
本発明の一実施形態では、ＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子における不活性化変異を有する腫瘍は、Ｗｎｔ阻害剤に応答性（つまり、その増殖が遅くなること）である可能性が高い。ＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子の１つまたは複数の変異が検出されると、Ｗｎｔ阻害剤を用いた治療が患者に有益であることが予測される。ＲＮＦ４３遺伝子における１つまたは複数の変異の検出のための指針は、実施例に提供される。
【００８４】
ＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子の１つまたは複数の変異が検出されると、Ｗｎｔ阻害剤療法に患者が応答するかまたはＷｎｔ阻害剤療法が患者に有益である可能性が高いと予測される。変異が検出されない場合は、Ｗｎｔ阻害剤療法に患者が応答する可能性が低いかまたはそれが患者に有益である可能性が低いと予測される。遺伝子変異をスクリーニングするための方法は、当技術分野で周知であり、Sambrookら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labs Pressに記載されており、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応、ポリアクリルアミドゲル解析、クロマトグラフィー、または分光法を含む。「次世代シークエンシング」でなされている最近の進歩により、ポリヌクレオチドの直接塩基配列決定は、ＲＮＦ４３遺伝子の変異ステータスまたはＺＮＲＦ３遺伝子の変異ステータスをアッセイするための最も安価で信頼性のある方法になりつつあると期待される。
【００８５】
遺伝子変異をスクリーニングするための方法には、遺伝子によってコードされる改変タンパク質産物のスクリーニングをさらに含むことができる（例えば、免疫ブロット法（例えば、ウエスタンブロット）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫沈降、免疫組織化学、免疫蛍光法、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）および免疫蛍光顕微鏡を介して）。
【００８６】
腫瘍試料は腫瘍細胞から均一に構成されていないため、ＲＮＦ４３  ｍＲＮＡの消失またはＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡの消失について、ｍＲＮＡ中の少なくとも５０％の低下は、機能喪失を表すと考えることができる。
【００８７】
患者試料
患者試料を得る適切な方法は当業者に知られている。患者試料は、患者からの任意の体液または組織を含むことができ、それには腫瘍細胞または腫瘍細胞のタンパク質が含有されていてもよい。
【００８８】
一般に、試料のタイプ（すなわち、細胞、組織または体液）は、腫瘍細胞増殖について評価される器官または組織への接近性および構造に基づいて、あるいはどのようながんのタイプが評価されるかに基づいて選択される。本発明は、腺管がん、腺がんまたはメラノーマ（表１参照）などの腫瘍または膵臓がん、結腸がん、食道または皮膚がんを有する患者からの腫瘍（表１、表２、表３、表４および表５を参照）を評価するために特に有用である。これらの場合、典型的な試料は、それぞれ、腫瘍試料または患者からの膵臓組織試料からの切片である。
【００８９】
試料が患者から得られた後、試料は本明細書に記載のいずれかのバイオマーカーの１つまたは複数の検出について評価される。本発明のいくつかの態様において、組織、細胞またはその一部（例えば、組織の切片、核酸などの細胞の成分など）は、１つまたは複数の核酸と接触させる。そのようなプロトコルは、例えば、遺伝子発現またはヘテロ接合性の消失を検出するために使用される。そのような方法は、細胞ベースのアッセイまたは非細胞ベースのアッセイを含むことができる。標的遺伝子を発現する組織または細胞は、典型的には、混合、ハイブリダイゼーション、または適切な技術により標的遺伝子の検出を可能にするように組み合わせることによるような、任意の適切な方法によって、検出試薬（例えば、プローブ、プライマー、または他の検出可能なマーカー）と接触させる。
【００９０】
患者試料は、利用される検出技術のための任意の適切な方法によって調製される。一実施形態において、患者試料は、新鮮なまま、凍結して、固定してまたはその他の保存状態で使用することができる。例えば、患者腫瘍細胞はパラフィン中に患者の組織を固定化することによって調製することができる。固定化された組織は、切片化し、次いで、プローブが標的遺伝子（例えば、ＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子）へハイブリダイゼーションすることを検出するために、プローブと接触させることができる。
【００９１】
対照群
対照レベルは、アッセイが行われるたびに、各アッセイのために設定される必要はない。むしろ、ベースラインまたは対照は、感受性および耐性の患者（応答者および非応答者）について以前に決定された対照レベルに関して蓄積された情報のフォームを参照することによって設定することができる。対応する検出法を用いた場合、対照レベルは、上に記載したいずれかの検出方法のために設定することができる。このような蓄積された情報のフォームは、感受性および耐性の腫瘍／患者の集団または個別のデータの基準チャート、リストまたは電子ファイル、あるいは評価する患者にとって有用な対照レベル遺伝子ヘテロ接合性の消失に関する任意の他のデータ源を含むことができる。
【００９２】
比較のための対照レベルは、情報のフォームとして提供される予め確立された対照を含む、任意のタイプの対照であってよい。他のスコアリングシステムは、対照との比較に基づいて考案することができ、カットオフの近くにある患者は、診断を確定するために、他の基準、バイオマーカー、または技術により評価することができる。また、カットオフは、臨床医または研究者が望むように、患者集団に応じて変化させることができる。
【００９３】
Ｗｎｔ阻害剤に対する耐性と相関する対照については、バイオマーカーがＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子の不活性化変異である場合には、対照はＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子の野生型配列であってもよい。このような配列は公的に入手可能であり、明確に定義されている。一実施形態では、ＲＮＦ４３遺伝子の配列は配列番号１によって提供される。別の実施形態において、ＺＮＲＦ３遺伝子の配列は配列番号２によって提供される。
【００９４】
ＲＮＦ４３  ｍＲＮＡの喪失については、腫瘍試料中のｍＲＮＡ発現の少なくとも５０％の減少が観察される。
【００９５】
Ｗｎｔ阻害剤に対する耐性のための別の対照は、同じ患者からの非腫瘍試料であろう。このような非腫瘍試料が入手できない場合には、ほとんどの患者は、Ｗｎｔ阻害剤に応答しないため、他の患者または健康な被験者からの平均値を比較することができる。
【００９６】
統計分析
上に記載したように、本発明に記載のバイオマーカーの検出の段階は、異なる組み合わせで組み合わせることができる。この段階は、任意の順序で実行されるか、実質的に同時に実行されることができる。対照と患者試料との間の差を決定する統計分析は、質的変数についてのピアソンのカイ二乗検定のフィッシャーの直接確率法を含む当該技術分野で公知の任意の方法を用いて、および連続変数についてのスチューデントのｔ検定または分散分析を用いて、行うことができる。統計学的有意性は、典型的にはｐ＜０．０５として定義される。
【００９７】
Ｗｎｔ阻害剤
本発明の方法は、Ｗｎｔ阻害剤またはＷｎｔ阻害剤と実質的に同様の生物学的活性を有する薬物を使用した治療に応答する（例えば、治療上有益であること）可能性が非常に高い患者を決定または予測するために有用であるだけでなく、Ｗｎｔ阻害剤を用いた治療に応答しない可能性が非常に高い患者を決定または予測するためにも有用である。本発明はまた、ＲＮＦ４３遺伝子変異を有するがん細胞は、Ｗｎｔ経路の阻害に対してより感受性であることを提供する。がん細胞においてＲＮＦ４３を阻害すると、細胞表面Ｆｒｉｚｚｌｅｄレベルの増加をもたらす。したがって、変異ＲＮＦ４３を有する増強されたＷｎｔシグナル伝達とがん細胞、特に膵臓がん細胞は、Ｗｎｔ拮抗薬に対してより感受性である。非機能性ＲＮＦ４３タンパク質を有する細胞株であるＨＰＡＦＩＩに関する図３および図４を参照されたい。本発明者らはまた、同じく非機能性ＲＮＦ４３タンパク質を有する、細胞株Ｐａｎｃ１０．０５もポーキュパイン阻害剤に感受性であることを観察した。
【００９８】
一実施形態では、Ｗｎｔ阻害剤はヒトでの使用に適したポーキュパイン阻害剤である。Ｗｎｔ阻害剤は、ＩＷＰ−２、ＩＷＰ−３またはＩＷＰ−４など公知のポーキュパイン阻害剤と同様の機能を有するポーキュパイン阻害剤であってよく、それらはChen Bら (2009) Nature Chem. Biol. 5: 100-107によって記載され、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈからステモレキュール（Stemolecule；商標）Ｗｎｔ阻害剤ＩＷＰ−２  （＃１３０−０９５−５８４）、ステモレキュール（商標）Ｗｎｔ阻害剤ＩＷＰ−３（＃１３０−０９５−５８５）およびステモレキュール（商標）Ｗｎｔ阻害剤ＩＷＰ−４として市販されている。ステモレキュール（商標）ＩＷＰ−２、ステモレキュール（商標）ＩＷＰ−３およびステモレキュール（商標）ＩＷＰ−４は、ポーキュパイン（ＰＯＲＣＮ）、膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼによってＷｎｔタンパク質のパルミチル化を防ぐ。
【００９９】
また、Ｗｎｔ阻害剤はドラッグデザインの生産物であってよく、当該技術分野で知られている様々な方法で生産することができる。２０１０年９月１０日に公開された国際特許出願ＷＯ２０１０／１０１８４９を参照のこと。模倣薬または本発明に有用な他の化合物を設計するために有用なドラッグデザインの様々な方法は、Maulikら (1997) Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies. Wiley-Liss, Inc.に記載されている（その全体が参照により取り込まれる）。Ｗｎｔ阻害剤は、分子多様性ストラテジー（大規模で化学的に多様な分子ライブラリを迅速に構築することを可能にする関連するストラテジーの組み合わせ）、天然または合成化合物のライブラリ、特に化学またはコンビナトリアルライブラリ（すなわち、配列またはサイズが異なるが類似のビルディングブロックを有する化合物のライブラリ）、あるいは合理的、指向的または無作為のドラッグデザインによるものから入手できる。例えば、Maulikら (1997) Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies. Wiley-Liss, Inc.を参照のこと。分子多様性ストラテジーにおいて、大規模な化合物ライブラリは、例えば、ペプチド、オリゴヌクレオチド、天然または合成ステロイド化合物、炭水化物または天然または合成有機と非ステロイド系分子から、生物学的、酵素または化学的アプローチを利用して合成される。分子多様性ストラテジーの開発に重要なパラメーターとしては、サブユニット多様性、分子サイズ、ライブラリの多様性などが含まれる。このようなライブラリのスクリーニングの一般的な目標は、組み合わせの選択の逐次適用を利用することにより所望の標的の高親和性リガンドを取得し、無作為または指向的な設計ストラテジーによりリード分子を最適化することである。分子多様性の方法はMaulikら(1997) Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies. Wiley-Liss, Inc.に詳しく記載されている。
【０１００】
好ましい実施形態において、Ｗｎｔ阻害剤は、式（１）：
【０１０１】
【化１】
0006397335.tif 000002
の化合物または、生理学的に許容される塩である（式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はＮおよびＣＲ７から選択され；
Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ８の１つはＮであり、他はＣＨであり；
Ｘ９は、ＮおよびＣＨから選択され；
Ｚはフェニル、ピラジニル、ピリジニル、ピリダジニルおよびピペラジニルから選択され、ここで各々のＺのフェニル、ピラジニル、ピリジニル、ピリダジニルまたはピペラジニルは場合によってＲ６基で置換されており；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は水素であり；
ｍは１であり；
Ｒ４は水素、ハロ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチルおよびメチルから選択され；
Ｒ６は水素、ハロおよび−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０であり；ここで、Ｒ１０はメチルであり；
Ｒ７は水素、ハロ、シアノ、メチルおよびトリフルオロメチルから選択される）。
【０１０２】
Ｗｎｔ阻害剤は、
Ｎ−［５−（３−フルオロフェニル）ピリジン−２−イル］−２−［５−メチル−６−（ピリダジン−４−イル）ピリジン−３−イル］アセトアミド；
２−［５−メチル−６−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリジン−３−イル］−Ｎ−［５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル］アセトアミド（ＬＧＫ９７４）；
Ｎ−（２，３’−ビピリジン−６’−イル）−２−（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；
Ｎ−（５−（４−アセチルピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）−２−（２’−メチル−３−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；
Ｎ−（５−（４−アセチルピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）−２−（２’−フルオロ−３−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；および
２−（２’−フルオロ−３−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）−Ｎ−（５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル）アセトアミド；
の群から選択される化合物またはその医薬的に許容される塩であることができる。
【０１０３】
最も好ましくは、Ｗｎｔ阻害剤は、２−［５−メチル−６−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリジン−３−イル］−Ｎ−［５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル］アセトアミド  （ＬＧＫ９７４）である。
【０１０４】
Ｗｎｔ阻害剤と実質的に同様の生物学的活性を有する薬剤は、参照化合物により実質的に同じ機能を示すかまたは発揮する薬剤を指し、生体内または試験管内において測定されるかまたは観測される参照化合物に帰する。例えば、ポーキュパイン阻害剤と実質的に同様の生物学的活性を有する薬剤は、ＩＷＰ−２、ＩＷＰ−３またはＩＷＰ−４のような参照化合物により示されるか発揮されるものと実質的に同じ機能を有する薬剤を指す。
【０１０５】
別の実施形態では、Ｗｎｔ阻害剤は、Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USAおよび他の市販元から入手できるタンキラーゼ阻害剤ＸＡＶ９３９（Ｃ９２８９）である。Huang SMら (2009) Nature 461(7264):614-20を参照されたい。
【０１０６】
その他のタイプのＷｎｔ阻害剤としては、アプタマー、ＲＮＡｉ、リボザイムが含まれるが、それらに限定されない。アプタマーは、高い親和性と特異性で所定の特定ターゲット分子に結合する能力に基づいて無作為コンビナトリアル核酸ライブラリから選択される短鎖の合成核酸（通常はＲＮＡであるがＤＮＡでもよい）である。アプタマーは定義された三次元構造を想定して、構造に非常にわずかな相違を持つ化合物を区別することができる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡが、哺乳類システムにおいては短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、相補的な遺伝子の発現阻害または抑制に使用されるプロセスである。リボザイムは生体触媒（例えば、共有結合の切断または形成によって）を実行することができるＲＮＡセグメントである。より具体的には、リボザイムは、標的ＲＮＡ部分に結合して、リン酸ジエステルバックボーンを特定の切断部位で切断して不活性化することにより機能するアンチセンスＲＮＡ分子である。
【０１０７】
その他のタイプの阻害剤は、天然のＷｎｔ阻害剤と類似性があってもよい。Ｗｎｔシグナル伝達の既知の天然の拮抗薬には、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質、分泌されたＦｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ｓＦＲＰ）、Ｗｎｔ阻害因子１（ＷＩＦ−１）、およびＳｏｇｇｙが含まれる。Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質ファミリー（Ｄｋｋ−１から−４）のメンバーは、リンカー領域で区切られた２つのシステインリッチなドメインを有する分泌タンパク質である。Ｄｋｋファミリーには、Ｄｋｋ−３に相同であるが他のファミリーメンバーとは相同ではない、Ｓｏｇｇｙも含まれる。
【０１０８】
ｓＦＲＰは、膜結合型Ｆｒｉｚｚｌｅｄに類似した５つのＷｎｔ結合糖タンパク質のファミリーである。Ｗｎｔ阻害剤の最大のファミリーには、ｓＦＲＰ−１、２、および５からなる第１グループと、ｓＦＲＰ−３および４を含む第２グループの２つのグループが含有されている。
【０１０９】
一実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の拮抗薬は、生体内において、テラトカルシノーマの増殖を阻害したと報告されるＦｒｉｚｚｌｅｄ８ＣＲＤ−ｈＦｃなどの、可溶Ｗｎｔ受容体であってよい。DeAlmeida VIら (2007) Cancer Res. 67(11):5371-9。
【０１１０】
Ｗｎｔシグナル伝達の他の天然の拮抗薬には、ＷＩＦ−１（Ｗｎｔ阻害因子１）、Ｗｎｔタンパク質に結合してその活性を阻害する分泌タンパク質が含まれる。
【０１１１】
Ｗｎｔ阻害剤のさらに別のタイプとしては、抗体、その抗原結合フラグメント、または抗原結合ペプチドもしくは「結合パートナー」であってもよい。抗体は、免疫グロブリンドメインを含むことにより特徴付けられ、したがって、抗体は免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質のメンバーである。抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、２価と１価の抗体、二重または多重特異性抗体、そのような抗体を含有する血清、様々な程度に精製されている抗体、ならびに全抗体の任意の機能的等価物を含めることができる。Ｗｎｔ阻害剤として有用な単離した抗体としては、そのような抗体を含有する血清、または様々な程度に精製されている抗体を含めることができる。本発明の全抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよい。あるいは、１つまたは複数の抗体ドメインがトランケートしているまたは欠損している抗原結合フラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ）２フラグメント）などの全抗体の機能的等価物、さらには一本鎖抗体または複数のエピトープに結合できる抗体（例えば、二重特異性抗体）を含む遺伝子組み換え抗体またはその抗原結合フラグメント、または、１つまたは複数の異なる抗原に結合できる抗体（例えば、二重または多重特異性抗体）は、Ｗｎｔ阻害剤として用いることもできる。
【０１１２】
ＬＲＰ６抗体(Ettenberg Sら (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107(35):15473-8)およびＦｒｉｚｚｌｅｄ抗体(Gurney Aら (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(29):11717-22)を含む、上流のＷｎｔシグナル伝達を標的とした様々な抗体が開発されている。
【０１１３】
アッセイおよびキット
アッセイキットおよび本発明の方法は、特定のＷｎｔ阻害剤に応答すると予測された患者、細胞、または組織を同定するために使用してもよい。このようなコンパニオン診断キットの使用は、承認薬との使用として政府の薬剤登録機関によって承認された他のコンパニオン診断試験と同様であろう。例えば、ＡＬＫ４変異した肺がんの治療のためのクリゾチニブ（crizotinib）およびＢＲＡＦ変異したメラノーマのためのベムラフェニブ（vemurafenib）の２０１１年における食品医薬局による承認を参照されたい。
【０１１４】
アッセイキットおよび本発明の方法は、Ｗｎｔ阻害剤に耐性であるがん細胞の応答性を向上することができる治療を同定するため、およびＷｎｔ阻害剤の応答を高める補助治療法を開発するために有用であるかもしれない。
【０１１５】
アッセイキットおよび本発明の方法は、膵臓がん（表２を参照）など、Ｗｎｔ阻害剤で治療できる任意のがん、あるいは腺管がん、腺がんまたはメラノーマ（表１を参照）などのＷｎｔ阻害剤により増殖を減速することができる任意の腫瘍を有する患者に有用である。このような患者は、ＲＮＦ４３またはＺＮＲＦ３遺伝子発現の減少を有していない場合には、本明細書で提供される方法の結果として、非効果的な療法による副作用と金銭的費用から免れるかもしれない。アッセイキットおよび本発明の方法は、特定の患者に対して腫瘍の分子特性に関する情報に基づいてＷｎｔ阻害剤療法を勧めることができるかできない医師に有用である。アッセイキットおよび本発明の方法は、効率的なヒトＲＮＦ４３  ＦＩＳＨアッセイの開発のための需要も有用に増加させ、未開発のヌクレオチドプローブを使用可能にする。
【０１１６】
一実施形態では、本発明は、Ｗｎｔ阻害剤の治療的投与が有益であるか有益でないと予測されるがん患者を選択するためのアッセイキットを提供する。アッセイキットとしては以下のものが含まれる：
（ａ）腫瘍細胞の試料において（ｉ）ＲＮＦ４３遺伝子もしくはＺＮＲＦ３遺伝子の増幅レベル；または（ｉｉ）ＲＮＦ４３遺伝子もしくはＺＮＲＦ３遺伝子のヘテロ接合性の消失のレベルから選択されたバイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせのレベルを検出するための手段。
（ｂ）（ｉ）Ｗｎｔ阻害剤への感受性を検出するための対照試料；（ｉｉ）Ｗｎｔ阻害剤への耐性を検出するための対照試料；（ｉｉｉ）Ｗｎｔ阻害剤への感受性と相関しているバイオマーカーの前もって決定された対照レベルを含有する情報；または（ｉｖ）Ｗｎｔ阻害剤耐性と相関しているバイオマーカーの前もって決定された対照レベルを含有する情報から選択される対照。
【０１１７】
一実施形態では、キットはさらに、ＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子における変異を検出するための手段を含むことができる。
【０１１８】
一実施形態では、変異を検出するための手段は、ＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子の一部にハイブリダイズするヌクレオチドプローブである。特定の実施形態では、検出するための手段は、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プローブである。検出のための手段はいずれも、検出可能な標識を含有することができる。検出のための手段のいずれも、基板上に固定することができる。
【０１１９】
一実施形態では、ＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子ヘテロ接合性の消失を検出する手段は、一般に、本発明の方法に使用できる任意のタイプの試薬であってよい。このような検出のための手段は、ＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブまたはプライマーを含む。ＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３のための核酸配列は、当技術分野で知られており、このような検出用試薬を製造するために使用することができる。そのような検出手段を用いたアッセイを実施するのに有用な付加的な試薬もまた、インサイツハイブリダイゼーションを実施するための試薬、蛍光マーカーを検出するための試薬、ポリメラーゼ連鎖反応を実施するための試薬などとして、含むことができる。
【０１２０】
本発明のアッセイキットを検出するための手段は、検出可能なタグまたは検出可能な標識にコンジュゲートさせることができる。そのようなタグは、目的の遺伝子またはタンパク質を検出するために使用される試薬の検出を可能にする、任意の適切なタグであり得るものであり、分光学的、光化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の組成物または標識が含まれるが、これらに限定されない。本発明において有用な標識としては：標識されたストレプトアビジンコンジュゲートで染色するためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、ダイナビーズ（Dynabeads；商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用される他のもの）、およびコロイド金または着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズのような比色標識、が含まれる。
【０１２１】
さらに、本発明のアッセイキットの検出手段は、基板上に固定化することができる。このような基板は、以前、記載した検出方法のいずれかにおいて使用されるような検出試薬の固定化のための任意の適切な基板を含むことができる。簡単に述べると、検出手段の固定化に適した基板は、所望の標的分子を検出するため検出手段の活性または能力に著しく影響を与えることなく検出手段と結合を形成することができる任意の固体有機、生体高分子または無機支持体のような任意の固体支持体を含む。例示的な有機固体支持体は、ポリスチレン、ナイロン、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂、およびアクリルコポリマー（例えば、ポリアクリルアミド）のようなポリマーが挙げられる。キットは、試薬の検出のために、または陽性または陰性対照、洗浄溶液、希釈緩衝液などの標識のために適した試薬を含んでもよい。キットは、キットを使用して、結果を解釈するための取扱説明書のセットを含んでもよい。
【０１２２】
アッセイキットはまた、１つまたは複数の対照を含むことができる。対照としては：（ｉ）患者における使用のために評価されたＷｎｔ阻害剤に対する感受性を検出するための対照試料；（ｉｉ）Ｗｎｔ阻害剤に対する耐性を検出するための対照試料；（ｉｉｉ）Ｗｎｔ阻害剤感受性または耐性に関して測定される特定のバイオマーカーの予め決定された対照レベルを含有する情報（例えば、Ｗｎｔ阻害剤に対する感受性またはＷｎｔ阻害剤に対する耐性と相関しているＲＮＦ４３遺伝子またはＺＮＲＦ３遺伝子ヘテロ接合性の消失の予め決定された対照レベル）を含むことができる。
【０１２３】
キットはまた、サンプリングされた細胞タイプに特徴的である対照マーカーを検出するための手段を含むことができ、本明細書において以前記載したバイオマーカーの存在を検出するための方法によるような、試料における公知のマーカーの存在を検出する（核酸またはタンパク質レベルにおいて）方法において使用することができる任意のタイプの試薬であって、一般的にはよい。具体的には、手段は、ポジティブに細胞タイプを同定する、分析される細胞タイプの特異的マーカーを同定することを特徴とする。例えば、肺腫瘍アッセイにおいては、バイオマーカー発現または生物活性のレベルについて肺上皮細胞をスクリーニングすることが望ましい。したがって、対照マーカーを検出する手段は、細胞が結合組織または炎症細胞などの他の細胞型と区別されるように、上皮細胞および好ましくは、肺上皮細胞に特徴的であるマーカーを同定する。このような手段は、本発明のアッセイの正確度と特異性を上昇させる。このような対照マーカーの検出手段としては：ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でタンパク質マーカーをコードする核酸分子にハイブリダイズするプローブ；そのような核酸分子を増幅するＰＣＲプライマー；標的分子上のコンホメーション的に異なる部位に特異的に結合するアプタマー；または抗体、その抗原結合断片、または試料中の対照マーカーに選択的に結合する抗原結合ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。多くの細胞マーカーについての核酸配列およびアミノ酸配列は、当技術分野で知られており、このような検出用試薬を製造するために使用することができる。
【０１２４】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態、およびそれらの各種用途の例示である。これらは説明の目的のみに記載されるものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例
【実施例１】
【０１２５】
表１に示されるように、ＲＮＦ４３遺伝子は、原発性膵管腺がんおよび他の腫瘍において変異している。膵臓、大腸、食道および皮膚の原発性腫瘍からの９つのゲノムＤＮＡにおけるナンセンスおよびフレームシフト変異。それらのうち、５つは膵腫瘍であり、検査した膵腫瘍の合計数は１９である（ダメージによるミスセンス変異の可能性のあるものを除き、試料の２５％超における変異）。
【０１２６】
【表１】
0006397335.tif 000003
【実施例２】
【０１２７】
表２に示すように、ＲＮＦ４３遺伝子は複数の膵臓がん細胞株における変異である。コピー数解析に基づいて、サンガー配列決定法で同定される１０例の膵臓がん細胞株におけるゲノム変異は、潜在的にＲＮＦ４３遺伝子の１つだけのコピーが残った。ＲＮＦ４３不活性化変異を有する３つの特有な細胞株が同定された：ＨＰＡＦＩＩ（ナンセンス変異）、Ｐａｎｃ  １０．０５（フレームシフト変異、ＰＬ４５細胞と関連）、ＰａＴｕ−８９８８Ｓ（有害突然変異、ＰａＴｕ−８９８８Ｔ細胞と関連）。
【０１２８】
【表２】
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【０１２９】
ＲＮＦ４３不活性化変異を有する他の細胞株（例えば、Ｃａｐａｎ−２）と共に、ＨＰＡＦＩＩ、Ｐａｎｃ  １０．０５、ＰａＴｕ−８９８８Ｓ細胞株に関する追加情報が下記の実施例３および実施例４において提供される。
【実施例３】
【０１３０】
ＬＧＫ９７４による古典的Ｗｎｔ経路阻害
膵臓細胞のＬＧＫ９７４処理に対する感受性を試験管内における細胞増殖アッセイで試験した。２４例のヒト膵臓がん細胞株をＬＧＫ９７４にて処理または未処理とした。
【０１３１】
細胞増殖データは３８４ウェルフォーマットで生成した。細胞を採取し、１．５Ｘ１０４細胞／ｍＬの密度でその適切な増殖培地中に再懸濁させた。その後、細胞は３８４ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ＢｉｏＯｎｅ  ７８９１６３）に、最終容量１ウェルあたり５０μＬにてプレーティングし、バイオテックマイクロフィル（BioTek μFill）ディスペンサー（シリアル番号０００−３５８６）を使用して、ウェルあたりの密度を７５０細胞／ウェルとした。その後、プレートは、ＡＣＰ−１システム（３７℃、５％  ＣＯ２）上のインキュベーターに移し、細胞をオーバーナイトで取り付けたままとした。ＬＧＫ９７４についての１２ポイント用量反応曲線は、３８４ウェルＥＣＨＯ互換性ソースプレート（Ｌａｂｃｙｔｅ  Ｐ−０５５２５）中、２ｍＭの最高濃度および１．１３ｘ１０−５ｍＭの最低濃度で整えた。プレーティングの約１８時間後、Ｌａｂｃｙｔｅ  ＥＣＨＯ５５５を用い、５０ｎＬのＬＧＫ９７４を細胞に投与した。プレート内にＩＣ５０曲線を複製し、細胞株ごとにプレートを複製した。化合物の添加に続いて、プレートは１２０時間、インキュベーターに返却した。アッセイプレートは、製造業者の取扱説明書に従い、１０μＬの１ｘＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ７５７３）を添加して読み取った。次いで、プレートを１０分間室温でインキュベートし、組み込まれたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｖｉｅｗｌｕｘ（２秒露光、２×ｂｉｎ、高感度）で読み取った。生データは、プレートごとにＤＭＳＯ対照ウェルを用いて正規化し、ＩＣ５０決定のためにカーブフィッティングを行った。
【０１３２】
細胞増殖は、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて５日後に測定した。表３に示されるように、ＬＧＫ９７４は、Ｃａｐａｎ−２、ＰＡ−ＴＵ−８９８８ＳおよびＨＰＡＦＩＩを含む膵臓がん細胞株のサブセットにおいて、ｎＭ  ＩＣ５０’ｓでの細胞増殖を阻害した。表４および実施例４に示すように、４つの細胞株すべてはＲＮＦ４３の機能喪失（ＬＯＦ）変異を保有している。
【０１３３】
【表３】
0006397335.tif 000005
【０１３４】
表４は、膵臓細胞株のリスト、細胞株におけるＲＮＦ４３変異およびＬＧＫ９７４による経路阻害を示す表である。
【０１３５】
【表４】
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【実施例４】
【０１３６】
ＲＮＦ４３の不活性化変異は、膵臓がんにおけるＷｎｔ依存性を付与する
この実施例においては、ＲＮＦ４３はＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達を阻害し、負のフィードバック機構として膵臓がん細胞におけるＦｒｉｚｚｌｅｄの膜レベルを減少させることを示す。内因性Ｗｎｔシグナル伝達の阻害は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄの細胞表面レベルを増加させた。
【０１３７】
ＬＧＫ９７４、Ｗｎｔ分泌を遮断するポーキュパイン阻害剤を用い、複数の膵臓がん細胞株をＷｎｔ依存性について試験した。膵臓がん細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＡＴＣＣによって推奨される培地中で増殖させた。
【０１３８】
著しいことに、すべてのポーキュパイン阻害剤に感受性な株は、ＲＮＦ４３の不活性化変異を保持している。Ｗｎｔ分泌の阻害またはβ−カテニンの枯渇は、ＲＮＦ４３  ＷＴ膵腫瘍細胞ではなく、ＲＮＦ４３変異体の増殖を阻害する。野生型ＲＮＦ４３をＲＮＦ４３変異株へ再導入しても、それらの増殖を阻害する。ＬＧＫ９７４は、生体内でＲＮＦ４３変異膵腫瘍の増殖を阻害する。本発明者らのデータは、膵臓がんにおけるＲＮＦ４３の変異は、Ｗｎｔシグナル依存性を付与し、ＲＮＦ４３変異は、Ｗｎｔ阻害剤の開発のための患者の選択のためのバイオマーカーとして使用すべきであることを示している。
【０１３９】
３つのＷｎｔ依存性の膵臓がん細胞株は、ポーキュパイン阻害剤ＬＧＫ９７４を使用して同定され、著しいことに、これらすべての細胞株は、ＲＮＦ４３の機能喪失変異を保有する。これらのＲＮＦ４３変異細胞株の増殖は、β−カテニンの枯渇またはＲＮＦ４３の再発現により阻害され、そしてそれらの増殖はＬＧＫ９７４によって阻害される。本発明者らのデータは、膵臓がんにおいて腫瘍抑制因子としてのＲＮＦ４３を確立し、ＲＮＦ４３変異は、Ｗｎｔシグナル伝達経路を標的とする薬剤の有効性を予測するためのバイオマーカーとして使用できることを示している。
【０１４０】
本発明者らは、ＬＧＫ９７４、現在診療所で検査されているポーキュパイン阻害剤を用いたＷｎｔ依存性のための３９の膵臓がん細胞株のパネルを試験した。著しいことに、すべてのＬＧＫ９７４感受性株がＲＮＦ４３の不活性化変異を有している。Ｗｎｔ分泌の阻害、β−カテニンの枯渇、または野生型ＲＮＦ４３の発現は、ＲＮＦ４３変異体の増殖を遮断したが、ＲＮＦ４３野生型膵臓がん細胞は遮断しなかった。ＬＧＫ９７４は、マウス異種移植モデルにおけるＲＮＦ４３変異した膵腫瘍の増殖を阻害した。
【０１４１】
【表５】
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【０１４２】
病巣形成をアッセイするため、示された細胞株の６０００〜１２０００細胞を２ｍｌの増殖培地中、６ウェル組織培養プレートに播種した。細胞付着のためのオーバーナイト培養後、培地を組換えＷｎｔ３ａの存在下および非存在下で１μＭ  ＬＧＫ９７４を含有する新鮮な増殖培地と交換した。ＤＯＸ誘導性β−カテニンのｓｈＲＮＡ実験のために、細胞を５ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンにて処理した。細胞コロニーが所望のサイズに達したとき、ＰＢＳ中の４％ホルマリンで細胞を固定し、クリスタルバイオレット溶液で染色した。数回洗浄の後、プレートを乾燥し、画像化した。
【０１４３】
逆転写および定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のために、ＲＮｅａｓｙプラスミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞または腫瘍から全ＲＮＡを抽出した。タックマン逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造業者の取扱説明書に従って１μｇのＲＮＡを逆転写した。定量的ＰＣＲは、０．６μｌの２０×タックマンプローブおよびＰＣＲプライマーミックス、６μｌの２Ｘ  タックマンファーストアドバンスドマスターミックス（Taqman FAST Advanced Master Mix；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および５．４μｌの希釈されたｃＤＮＡテンプレートからなる１２μｌの反応液において実施した。用いたサーモサイクリング条件は、９５℃で２０秒、続いて９５℃で１秒、６０℃で２０秒間を４０サイクルであった。すべての実験を４重に行った。遺伝子発現分析は、比較ΔΔＣＴ法を用いて実施し、ハウスキーピング遺伝子ＧＵＳＢまたは１８Ｓで正規化した。タックマンプローブはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。
【０１４４】
膵臓がん細胞におけるＲＮＦ４３によるＷｎｔシグナル伝達の負の調節。
ＲＮＦ４３の枯渇は、Ｗｎｔ誘導性のＳＴＦを向上させる。ＲＮＦ４３は頻繁に嚢胞性膵腫瘍において変異している(Furukawa Tら(2011) Sci. Rep. 1:161; Wu Jら (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(52):21188-93)ため、ＲＮＦ４３は膵臓がん細胞におけるＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達の重要な調節因子である可能性がある。したがって、発明者らはＹＡＰＣ、膵臓がん細胞株における機能喪失実験を行った。別個のｓｉＲＮＡを用いて、ＲＮＦ４３を枯渇させると、外因性Ｗｎｔ３ａならし培地の非存在下または存在下のいずれかで、スーパーＴＯＰＦｌａｓｈ（ＳＴＦ）Ｗｎｔレポーター活性が、著しく増加した。図３（ａ）を参照のこと。
【０１４５】
ルシフェラーゼレポーターアッセイについては、ＹＡＰＣ−ＳＴＦレポーター細胞を、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、Ｗｎｔ３ａならし培地または適用可能な場合、化合物で処理した。ＳＴＦルシフェラーゼアッセイは、製造業者の取扱説明書に従ってＢｒｉｇｈｔＧｌｏルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。
【０１４６】
ＳＴＦレポーターを発現する膵臓細胞株を構築するために、ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＡＴＣＣによって推奨される培地中で増殖させた。レトロウイルスまたはレンチウイルスは、ＦｕＧＥＮＥ  ６（Ｒｏｃｈｅ）トランスフェクション試薬を用いた標準的なウイルスパッケージング手順により、ＨＥＫ２９３細胞から作製した。ＳＴＦレポーター、ＲＮＦ４３構築物、またはＤＯＸ誘導性β−カテニンｓｈＲＮＡを発現する膵臓細胞株は、ウイルス感染および薬剤選択により生成した。
【０１４７】
ｓｉＲＮＡトランスフェクションは、製造業者の取扱説明書に従ってＤｈａｒｍａｆｅｃｔ  １トランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を用いて行った。ｓｉＲＮＡの配列は下記に記載されたものである：ｐＧＬ２（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｄ−００１１００−０１），標的配列，５’−ＣＧＴＡＣＧＣＧＧＡＡＴＡＣＴＴＣＧＡ−３’；ＲＮＦ４３−１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｊ−００７００４−１２），標的配列，５’−ＧＧＵＧＧＡＧＵＣＵＧＡＡＡＧＡＵＣＡ−３’；ＲＮＦ４３−２（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｊ−００７００４−１１），標的配列，５’−ＧＧＡＧＡＡＡＧＣＵＡＵＵＧＣＡＣＡＧ−３’；ＣＴＮＮＢ１−１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｊ−００３４８２−１０），標的配列，５’−ＵＡＡＵＧＡＧＧＡＣＣＵＡＵＡＣＵＵＡ−３’；および  ＣＴＮＮＢ１−２（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｊ−００３４８２−１２），標的配列，５’−ＧＧＵＡＣＧＡＧＣＵＧＣＵＡＵＧＵＵＣ−３’。
【０１４８】
ＲＮＦ４３の枯渇はＤｖｌのリン酸化およびβ−カテニンの安定化を誘導する。ＬＧＫ９７４は、Ｗｎｔ分泌を強力に阻害するポーキュパイン阻害剤であり、現在、臨床評価中である。外因性Ｗｎｔ３ａの非存在下でのＲＮＦ４３  ｓｉＲＮＡによって誘導されたＳＴＦ活性は、ＬＧＫ９７４および以前から知られているポーキュパイン阻害剤ＩＷＰ−２によって阻害される。Chen Bら (2009) Nat. Chem. Biol. 5(2):100-7。この活性が内因性Ｗｎｔタンパク質の発現に依存することを示す、図３（ｂ）を参照されたい。これらの結果は、ＲＮＦ４３がＹＡＰＣ細胞における自己分泌Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達を積極的に抑制することを示している。
【０１４９】
ＲＮＦ４３の枯渇はＦＡＣＳによりＦＺＤレベルを増加する。本発明者らは、次に、ＹＡＰＣ細胞におけるＲＮＦ４３の機能を特徴付けるために生化学アッセイを行った。ＲＮＦ４３の枯渇はＳＴＦレポーター活性の上昇と一致して、細胞基質β−カテニンのレベルを増加させた。
【０１５０】
Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（ＤＶＬ）は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄの下流の細胞内シグナル伝達タンパク質であり、そのリン酸化はＦｒｉｚｚｌｅｄによって刺激される。ＲＮＦ４３の枯渇は、免疫組織化学アッセイにおいて、ＤＶＬ２のリン酸化を増加させた。抗ＤＶＬ抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡから入手した。
【０１５１】
ｐａｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ抗体１８Ｒ５を用いたフローサイトメトリーによりアッセイされたように、実際、ＲＮＦ４３の枯渇が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄの細胞表面レベルを大幅に増加させた。表６は、ＲＮＦ４３の枯渇がＦｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）の細胞表面レベルを増加させることを示している。ＹＡＰＣ細胞は、示されたｓｉＲＮＡでトランスフェクションし、Ｆｒｉｚｚｌｅｄの膜レベルは、ｐａｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ抗体１８Ｒ５を用いたフローサイトメトリーによって分析した。
【０１５２】
【表６】
0006397335.tif 000008
【０１５３】
フローサイトメトリー分析のために、トリプシンを含まない細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細胞を採取し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）に再懸濁した。ブロッキング後、細胞を抗ｐａｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（１８Ｒ５）抗体と共に４℃で１時間インキュベートし、続いて、アロフィコシアニン（Allophycocyanin；ＡＰＣ）をコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体とインキュベーションした。ＦＡＣＳ緩衝液を用いて十分に洗浄した後、細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターを用いたマルチチャネル分析に供した。ＰＩ陰性細胞からの蛍光シグナルは、ヒストグラムプロットにおいて表示した。
【０１５４】
野生型ＲＮＦ４３の過剰発現は、膜ＦＺＤを減少させる。ＲＮＦ４３  ｓｉＲＮＡの効果はオフターゲット活性によって媒介されるという可能性を除外するために、ＹＡＰＣ細胞においてｓｉＲＮＡ耐性ＲＮＦ４３  ｃＤＮＡを安定的に発現させることによる、ｃＤＮＡのレスキュー実験を行った。
【０１５５】
ｓｉＲＮＡ耐性ＲＮＦ４３の発現は、ＲＮＦ４３  ｓｉＲＮＡのＦｒｉｚｚｌｅｄのレベルにおける効果を大きく消失させたので、ＲＮＦ４３  ｓｉＲＮＡの活性は、オンターゲットである。
【０１５６】
ＲＮＦ４３ΔＲＩＮＧの過剰発現は、膜ＦＺＤを向上させる。ＲＮＦ４３の枯渇は、ＡＸＩＮ２、β−カテニン標的遺伝子の発現も増加させ、この効果はまた、ｓｉＲＮＡ耐性ＲＮＦ４３の発現によって消失する。図３（ｃ）を参照されたい。
【０１５７】
ＲＮＦ４３  ｓｉＲＮＡに耐性のＲＮＦ４３  ｃＤＮＡ、ＲＮＦ４３ΔＲＩＮＧ（アミノ酸の２７２から３１２が欠損している）、およびＦ６９Ｃ変異体は、２段階の変異誘発ＰＣＲによって生成し、様々な哺乳動物発現ベクターにクローニングした。ｐＬｅｎｔｉ６−ＳＴＦレポータープラスミドおよびβ−カテニンｓｈＲＮＡウイルスプラスミドは、以前にHao H-Xら (2012) Nature 485(7397):195-200により記載されている。
【０１５８】
閾値サイクル（Ｃｔ）値に基づいて、本発明者らは、ＹＡＰＣ細胞においてＲＮＦ４３がＺＮＲＦ３と比較して優位に発現していることを、定量的ＰＣＲアッセイにおいて観察した。本発明者らの結果は、ＲＮＦ４３が、膵臓細胞内のＦｒｉｚｚｌｅｄの膜発現を減少させることによりＷｎｔシグナル伝達を負に調節していることを示している。
【０１５９】
ＲＮＦ４３は膵臓がんＹＡＰＣ中でＺＮＲＦ３よりもｑＰＣＲによる高いレベルで発現されており、Ｗｎｔシグナル伝達の調節におけるその重要性と一致している。Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達は、膵臓の外分泌コンパートメントの発生および腺房細胞の安定したβ−カテニン増殖の異所性発現を促進させる。Heiser PWら (2006) Development 133(10):2023-32。本発明者らは、以前、Ｒ−スポンジンタンパク質が、ＺＮＲＦ３とＲＮＦ４３を阻害し、Ｆｒｉｚｚｌｅｄを安定化させることにより、Ｗｎｔシグナル伝達を刺激することを示した。Hao HXら (2012) Nature 485(7397):195-200。
【０１６０】
Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄの膜発現を抑制する。
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達はＦＺＤ膜発現を負に調節する。ポーキュパイン阻害剤ＬＧＫ９７４はＦＺＤの膜レベルを上昇させる。ＲＮＦ４３とＺＮＲＦ３は、β−カテニン標的遺伝子であることが示されている。Hao HXら (2012) Nature 485(7397):195-200; Koo BKら (2012) Nature 488(7413):665-9。しかし、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ発現における内因性Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達の効果は試験されていない。
【０１６１】
本発明者らは、独立的なβ−カテニンｓｉＲＮＡがＹＡＰＣ細胞においてＦｒｉｚｚｌｅｄの細胞表面レベルを著しく増加させることをフローサイトメトリーにより見出した。β−カテニンの枯渇はまた、β−カテニン標的遺伝子ＡＸＩＮ２およびＲＮＦ４３のｍＲＮＡレベルを減少させた。図４（ａ）を参照されたい。表７は、β−カテニンの枯渇がＦｒｉｚｚｌｅｄの細胞表面レベルを増加させることを示している。ＹＡＰＣ細胞は、示されたｓｉＲＮＡによりトランスフェクションし、Ｆｒｉｚｚｌｅｄの膜レベルは、フローサイトメトリーによって分析された。
【０１６２】
【表７】
0006397335.tif 000009
【０１６３】
この観察と一致して、ポーキュパイン阻害剤ＩＷＰ２またはＬＧＫ９７４の処理は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄの細胞表面レベルを増加し、ＡＸＩＮ２およびＲＮＦ４３のｍＲＮＡレベルを減少させた。図４（ｂ）を参照されたい。表８は、ポーキュパイン阻害剤がＦｒｉｚｚｌｅｄの細胞表面レベルを増加させることを示している。ＹＡＰＣ細胞は３μＭのＩＷＰ−２または１μＭのＬＧＫ９７４で処理し、膜Ｆｒｉｚｚｌｅｄ発現についてのフローサイトメトリー分析に供した。
【０１６４】
【表８】
0006397335.tif 000010
【０１６５】
これらの結果は、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達がＦｒｉｚｚｌｅｄの膜レベルを強く阻害することを示している。
【０１６６】
膵腫瘍におけるＲＮＦ４３の変異の特徴付け
ＲＮＦ４３の不活性化変異を含有する膵臓がん株の同定。ポーキュパインの強力な選択的阻害剤、ＬＧＫ９７４の発見は、がん細胞株の大規模パネルにおいてＷｎｔ依存性を全身的に検討する類のない化学物質ツールを我々に提供した。本発明者らは、ＬＧＫ９７４を膵臓がん細胞株の大規模パネルにおいて、病巣形成アッセイを使用して試験した。病巣形成アッセイを利用したのは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏのような通常の増殖アッセイよりも感受性であり、様々な細胞株の異なる増殖率により影響を受けにくいという理由のためである。３９膵臓細胞株をスクリーニングしたうち、ＬＧＫ９７４は３つの細胞株、ＰａＴｕ−８９８８Ｓ、ＨＰＡＦＩＩおよびＣａｐａｎ−２において、強い増殖阻害活性を示すのみであった。
【０１６７】
本発明者らは次にＷｎｔ依存関係を付与し得る遺伝的病変を決定することとした。ＲＮＦ４３はがんにおいて変異したＷｎｔ経路の上流において唯一の知られている負のレギュレーターである。この理由により、本発明者らはすべての膵臓がん細胞株において、ＲＮＦ４３エクソンの塩基配列決定を行った。著しいことに、すべての３つのＬＧＫ９７４感受性細胞株は、ＲＮＦ４３のホモ接合変異を有している（ＨＰＡＦＩＩ、Ｅ１７４Ｘ；ＰａＴｕ−８９８８Ｓ、Ｆ６９Ｃ；Ｃａｐａｎ−２、Ｒ３３０ｆｓ）。Ｅ１７４ＸおよびＲ３３０ｆｓ変異は、ＲＮＦ４３タンパク質の大半をトランケートし、最もおそらくはタンパク質を不活性化する。ＲＮＦ４３の細胞外ドメインに追加のシステインを導入するＦ６９Ｃ変異の結果はあまり明確になっていない。
【０１６８】
細胞株における変異は、ゲノム塩基配列決定分析により決定した。塩基配列決定分析のために概して、製造業者の取扱説明書に従って、ゲノムＤＮＡをＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。ＲＮＦ４３のエクソンはＰＣＲによって増幅し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のプラットフォームにて塩基配列決定した。
【０１６９】
Ｆ６９Ｃ変異の機能を定義するために、Ｃ末端ＨＡタグ化野生型ＲＮＦ４３、ＲＮＦ４３ΔＲＩＮＧ、およびＲＮＦ４３  Ｆ６９ＣをＹＡＰＣ細胞中で安定的に発現させた。
【０１７０】
全長ヒトＲＮＦ４３  ｃＤＮＡ（ＮＭ＿０１７７６３．４）は、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入し、ＰＣＲによりＣ末端ＨＡエピトープでタグ付けした。ＲＮＦ４３  ｃＤＮＡ耐性ＲＮＦ４３  ｓｉＲＮＡ、ＲＮＦ４３ΔＲＩＮＧ（アミノ酸２７２〜３１２の欠損）、およびＦ６９Ｃ変異体は、２段階の変異誘発ＰＣＲによって生成し、様々な哺乳動物発現ベクターにクローニングした。ｐＬｅｎｔｉ６−ＳＴＦレポータープラスミドおよびβ−カテニンｓｈＲＮＡウイルスプラスミドは、以前、Hao H-Xら (2012) Nature 485(7397):195-200において記載した。
【０１７１】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄターンオーバーの調節におけるＲＮＦ４３の機能と一致していることに、ＲＮＦ４３ΔＲＩＮＧの過剰発現はドミナントネガティブ活性を示し、Ｆｒｉｚｚｌｅｄの膜レベルを増加させる一方で、野生型ＲＮＦ４３の過剰発現は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄの膜レベルを低下させた。ＲＮＦ４３  Ｆ６９Ｃの過剰発現は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄの膜レベルを中程度に増加させたので、Ｆ６９Ｃは機能喪失変異体であり、過剰発現の際に部分的なドミナントネガティブ活性を有する。
【０１７２】
表９は、空のベクター（ＥＶ）、野生型（ＷＴ）ＲＮＦ４３、または変異（ΔＲＩＮＧまたはＦ６９Ｃ）ＲＮＦ４３を安定的に発現する、ＹＡＰＣ細胞における膜のＦｒｉｚｚｌｅｄのフローサイトメトリー分析を示す表である。
【０１７３】
【表９】
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【０１７４】
さらに、ＲＮＦ４３ΔＲＩＮＧの過剰発現は、ＤＶＬ２リン酸化を増加させ、Ｗｎｔ３ａ誘導性ＳＴＦレポーター活性を増強するが、ＲＮＦ４３  Ｆ６９Ｃについてはより少ない程度であった。これらのデータは、Ｆ６９ＣはＲＮＦ４３についての不活性化ミスセンス変異であることを示している。
【０１７５】
ＲＮＦ４３の枯渇は、野生型のＲＮＦ４３におけるＦＺＤ膜発現を増加させるが、ＲＮＦ４３の変異細胞においては増加させない。本発明者らは次に、これらの膵臓がん細胞株におけるＲＮＦ４３の機能を調べた。ＲＮＦ４３の枯渇はＹＡＰＣおよびＰＫ１において、ＤＶＬ２リン酸化を増加したが、野生型ＲＮＦ４３を有する２つの膵臓がん細胞株、ＨＰＡＦＩＩ、ＰａＴｕ−８９８８Ｓ、およびＣａｐａｎ−２細胞におけるＲＮＦ４３の枯渇は、ＤＶＬ２リン酸化を増加させなかった。同様に、ＲＮＦ４３の枯渇は、ＲＮＦ４３野生型（ＹＡＰＣとＰＫ１）におけるＦｒｉｚｚｌｅｄの細胞表面レベルを増加させたが、ＲＮＦ４３変異（ＨＰＡＦＩＩ、ＰａＴｕ−８９８８Ｓ、およびＣａｐａｎ−２）膵臓がん細胞株については、増加させなかった。まとめると、これらの結果は、ＲＮＦ４３変異を有する膵臓がん細胞株において、ＦｒｉｚｚｌｅｄレベルはもはやＲＮＦ４３によって阻害されないことを示している。
【０１７６】
表１０は、ＲＮＦ４３  ｓｉＲＮＡで処理した膵臓がん細胞株における膜Ｆｒｉｚｚｌｅｄのフローサイトメトリー分析を示す。
【０１７７】
【表１０】
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【０１７８】
ＲＮＦ４３変異は、膵腫瘍におけるＷｎｔ阻害に対する感受性を予測する。
ＬＧＫ９７４は、すべての細胞株において細胞基質β−カテニンを減少させる。本発明者らは、次に、膵臓がん細胞株におけるＷｎｔ依存性の特性を調べた。病巣形成アッセイでは、ＬＧＫ９７４はＰＫ１とＹＡＰＣに大きな影響を与えることなく（表６参照）、ＰａＴｕ−８９８８Ｓ、ＨＰＡＦＩＩ、およびＣａｐａｎ−２の増殖を強く阻害した。重要なことに、ＲＮＦ４３変異細胞におけるＬＧＫ９７４の増殖阻害効果は、外因性Ｗｎｔ３ａによって救出されるので、ＬＧＫ９７４の効果は、Ｗｎｔ分泌の遮断によって媒介される。（病巣形成アッセイにおいて、膵臓がん細胞株は、ＤＭＳＯ、１μＭのＬＧＫ９７４、または組換えＷｎｔ３ａを加えたＬＧＫ９７４で処理した。）イムノブロットおよびｑＰＣＲアッセイは、ＬＧＫ９７４がＭＹＣ、β−カテニン標的遺伝子の発現を減少させ、およびサイクリン依存性キナーゼ阻害剤ｐ２１の発現をＲＮＦ４３変異体においては増加させたが、ＲＮＦ４３野生型細胞株においては増加させないことを示した。ＬＧＫ９７４は細胞基質β−カテニンを減少させ、ＲＮＦ４３変異体およびＲＮＦ４３野生型細胞株の両者において、β−カテニン標的遺伝子ＡＸＩＮ２の発現を減少させたため、これらのすべての細胞株は、活性な自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を有している。
【０１７９】
さらに、ＬＧＫ９７４はＲＮＦ４３変異細胞における分化マーカーＭＵＣ２、ＭＵＣ５Ａ／Ｃの発現を誘導した。ＬＧＫ９７４は、ＲＮＦ４３変異細胞株においてＥＤＵの取り込みを遮断したため、これらの細胞におけるＷｎｔ阻害は細胞周期停止をもたらす。ＬＧＫ９７４誘導性増殖阻害およびＲＮＦ４３変異細胞の細胞分化はまた、Ｋｉ６７染色（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｖｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ  ９４０１０からの抗Ｋｉ６７（ＳＰ６））およびアルシアンブルー染色を用いることで明らかである。さらに、軟寒天アッセイにおいて、ＬＧＫ９７４はＰａＴｕ−８９８８ＳおよびＨＰＡＦＩＩの増殖を強く阻害したが、ＰＫ１は阻害しなかった。軟寒天アッセイでは増殖しないため、Ｃａｐａｎ−２は試験することができない。まとめると、これらの結果は、ＲＮＦ４３変異細胞における自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達の阻害が、増殖停止および細胞分化を誘導することを示している。
【０１８０】
軟寒天アッセイのため、細胞を１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中、０．３％の低融点アガロース（Ｌｏｎｚａ）２５０μｌ中に懸濁させ、ウェルあたり５０００から１００００細胞の密度で４８ウェル培養プレートに、ＤＭＥＭを含有する固化した０．８％アガロース２５０μｌの上にプレーティングした。プレートを室温で３０分間冷却した後、２５０μｌの増殖培地を細胞の上に添加した。次いで、プレートを、５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。細胞は、３〜４日毎に、ＤＭＳＯまたは１μＭのＬＧＫ９７４を含有する新鮮な増殖培地で処理した。コロニーが所望のサイズに達した時点で写真を撮影し、コロニーを製造業者の取扱説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ  １４０７２から）に従ってアラマーブルで染色した。これらの実験は３回繰り返し、少なくとも４つのウェルを各条件について毎回反復した。
【０１８１】
ＥｄＵの増殖アッセイのため、細胞をウェルあたり６０００〜１２０００細胞の密度で９６ウェルプレート中の増殖培地にプレーティングし、そしてＤＭＳＯまたは１μＭのＬＧＫ９７４で処理した。３日後、細胞をＣｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵアレクサフルオル４８８  ＨＣＳアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に含まれていた２０μＭ  ＥｄＵを含有する新鮮な増殖培地で処理し、プレートを５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気中３７℃で２時間インキュベートした。細胞は、最終４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、透過処理し、ＰＢＳ中０．７５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００および５０μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔで３０分間染色した。洗浄後、細胞をＣｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵのアッセイキットの取扱説明書に従って、ＥｄＵの検出に進めた。３連のウェルを各条件について行った。
【０１８２】
ムチンについてのアルシアンブルー染色の手順は次のように行った：膵臓がん細胞株は、様々な密度で２２５ｃｍ３組織培養フラスコ上にプレーティングし、ＤＭＳＯまたはＬＧＫ９７４（１００ｎＭ）を用いて７２時間処理した。培地を除去することにより細胞ペレットを採取し、１×ＰＢＳで洗浄し、１０ｍｌの１０％緩衝液ホルマリンを添加した。次いで、細胞をフラスコの底から掻き取り、５０ｍｌのコニカルチューブに入れ、１０％緩衝液ホルマリンで約５０ｍｌまで満たし、１〜２時間固定させた。次いで、固定した細胞を含有するコニカルチューブを５分間１２００ｒｐｍで遠心分離し、ペレット化した細胞をレンズペーパーに包み、組織診断カセットに入れ、処理し、パラフィンに包埋した。ＦＦＰＥ切片を５μｍに切断し、スライド上に載せ、少なくとも３０分間、６０℃で焼成し、脱パラフィン化した。次にスライドをＨ２Ｏで２回すすぎ、酢酸の３％水溶液に３分間、移し、直接、３％酢酸ｐＨ１中のアルシアンブルー１％に３０分間、移した。次いで、スライドを１０分間流水中に置き、その後、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ  ０．１％（Ｋｅｒｎｅｃｈｔｒｏｔ）に５分間置かれる前に蒸留したＨ２Ｏで、すすいだ。スライドは、再度流水で洗浄し、次いで脱水した。最後に、スライドは、パルマスリップ（Permaslip；登録商標）でカバーガラスを施した。
【０１８３】
イムノブロッティングのために、全細胞のライセートをプロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を補充したＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて細胞を溶解することによって調製し、その後、４℃において１０分間１４０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞基質β−カテニンの抽出のために、細胞ペレットを低張緩衝液（プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤を補充した１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１０ｍＭ  ＫＣｌ）中に再懸濁し、３回の凍結融解サイクルによって溶解した。等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に移し、そして一次抗体と共に４℃オーバーナイトでインキュベートした。ＨＲＰまたは赤外色素のいずれかとコンジュゲートした二次抗体を、それぞれ、ＥＣＬフィルムまたはＬＩ−ＣＯＲオデッセイスキャナを用いたシグナル可視化のために使用した。
【０１８４】
ＬＧＫ９７４はＭＹＣを阻害し、ｐ２１タンパク質の発現をＲＮＦ４３変異体において誘導したが、ＲＮＦ４３野生型膵臓がん株においては誘導しなかった。Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質は古典的Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達および非古典的Ｗｎｔシグナル伝達の両者を増強するため、ＲＮＦ４３の変異による不活性化は、おそらく、古典的および非古典的Ｗｎｔシグナル伝達の両者を増加させるであろう。研究している膵臓株の細胞増殖におけるＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達の寄与を決定するために、β−カテニンのｓｈＲＮＡを使用した。以前に検証したβ−カテニンのｓｈＲＮＡ(Scholer-Dahirel Aら (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(41):17135-40)の誘導発現は、ＲＮＦ４３変異体（ＰａＴｕ−８９８８Ｓ、ＨＰＡＦＩＩ、およびＣａｐａｎ−２）の増殖を強く阻害したが、ＲＮＦ４３野生型（ＰＫ１およびＹＡＰＣ）膵臓がん株は阻害しなかった。β−カテニンの枯渇はまた、β−カテニン標的遺伝子ＡＸＩＮ２およびＭＹＣ（抗ＭＹＣはＡｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ  ０２１３９から入手可能である）の発現を減少させ、ｐ２１（抗ｐ２１はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ  ０１７３０から入手可能である）、ＭＵＣ２、およびＭＵＣ５Ａ／Ｃｓの発現をＲＮＦ４３変異細胞株内で増加させた。これらの結果は、細胞増殖におけるＬＧＫ９７４の効果は古典的Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達によって媒介される可能性が高いことを示している。
【０１８５】
本発明者らは、次に、ＲＮＦ４３変異はＲＮＦ４３変異細胞の増殖に必要であるかどうかを調べた。本発明者らは、ＬａｃＺやＲＮＦ４３ΔＲＩＮＧではなく、野生型ＲＮＦ４３の発現が、ＲＮＦ４３変異したＰａＴｕ−８９８８ＳとＣａｐａｎ−２細胞の増殖を顕著に阻害する一方で、ＲＮＦ４３野生型ＹＡＰＣ細胞には影響がなかったことを見出した。野生型ＲＮＦ４３が過剰発現すると、おそらくＰａＴｕ−８９８８Ｓ細胞内で内因的に発現しているＲＮＦ４３  Ｆ６９Ｃの小規模なドミナント活性に打ち勝つのだろう。ＨＰＡＦＩＩ細胞株のウイルス感染効率は低すぎて、ＬａｃＺまたはＲＮＦ４３ΔＲＩＮＧを発現するレトロウイルスを用いて、安定的に感染した細胞を得ることができなかったため、ＨＰＡＦＩＩはこのアッセイで試験することができない。
【０１８６】
同じく、本発明者らの結果は、ＲＮＦ４３変異によって強化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達がＲＮＦ４３変異型膵臓がん細胞の増殖に必要とされることを示し、これらの細胞におけるＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達の抑制が、細胞周期の停止および分化マーカーの誘導を誘導することを示す。
【０１８７】
Ｗｎｔ分泌を遮断すると、生体内におけるＲＮＦ４３変異膵腫瘍の増殖が阻害される。生体内でのＲＮＦ４３変異膵腫瘍の維持におけるＷｎｔ経路の活性化の役割を分析するために、本発明者らは、２つのＰＤＡＣ異種移植モデル（ＨＰＡＦＩＩおよびＣａｐａｎ−２）を利用した。
【０１８８】
生体内での有効性および薬力学的研究のために、９５〜１１０％の培養密度で細胞を採取した。ＢＤマトリゲルマトリックス基底膜（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と５０：５０に混合した１０００万個の細胞（ＨＰＡＦＩＩ）または３００万個の細胞（Ｃａｐａｎ−２）をｎｕ／ｎｕ（Ｈａｒｌａｎ）（ＨＰＡＦＩＩ）またはｓｃｉｄ．ｂｇ（Ｈａｒｌａｎ）（Ｃａｐａｎ−２）マウスの上部右腋窩上の領域に皮下移植した。腫瘍は週２回、キャリパー測定によってモニターされ、腫瘍体積（ＴＶ）は楕円体の数式を使用して計算した：ＴＶ（ｍｍ３）＝（（ｌｘｗ２）ｘ３．１４１５９））／６。異種移植腫瘍を有するマウスは、腫瘍移植（Ｃａｐａｎ−２）の１４日後、平均腫瘍体積が２２３ｍｍ３に達したとき（範囲２００〜２５０ｍｍ３）または移植（ＨＰＡＦＩＩ）の１１日後、平均腫瘍容積３４１ｍｍ３に達したとき（範囲２７２〜４１８ｍｍ３）のいずれかに、治療群（グループあたりｎ＝８）に無作為に割り付けられた。マウスは、（０．５％メチルセルロース（ＭＣ）／０．５％  Ｔｗｅｅｎ８０）または０．５％  ＭＣ／０．５％Ｔｗｅｅｎ８０中のフマル酸塩の形態のＬＧＫ９７４（ＬＧＫ９７４−ＡＥ−４、遊離塩基分子量換算係数１．２９３）の０．６５ｍｇ／ｍＬ懸濁液のいずれかの媒体で、強制経口投与（ｐ．ｏ．）により１日２回（ＢＩＤ）、１０ｍＬ／ｋｇの投与量で治療された。生体内用量は遊離塩基当量として報告される。１４日間（ＨＰＡＦＩＩ）または３５日間（Ｃａｐａｎ−２）の治療後、抗腫瘍活性がパーセント治療／対照（％Ｔ／Ｃ）または％リグレッション（％ＲＥＧ）値として報告された。抗腫瘍活性は、次の数式を使用して算出された：ΔＴｔ≧０の場合には、％Ｔ／Ｃ＝１００  ΔΔＴｔ／ΔＣｔ；またはΔＴｔ＜０の場合には、％ＲＥＧ＝１００  ΔΔＴｔ／Ｔ０；ここで：Ｔ０＝無作為化の日における薬剤治療群の平均腫瘍体積（ＴＶ）；Ｔｔ＝調査終了時での薬剤治療群の平均ＴＶ；ΔＴｔ＝Ｔ０−Ｔｔ；Ｃｔ＝調査終了日時での対照群の平均ＴＶ；Ｃ０＝無作為化の日における対照群の平均ＴＶ；およびΔＣｔ＝Ｃ０−Ｃｔ  ＊  ％Ｔ／Ｃ値が１００から４２％の範囲の場合抗腫瘍活性が無いものと解釈される；％Ｔ／Ｃ値≦４２％および＞１０％は抗腫瘍活性が有るものと解釈し、％Ｔ／Ｃ値≦１０％または％ＲＥＧ≧−１０％は腫瘍停滞と解釈される。％Ｒｅｇ値＜−１０％はリグレッションと解釈される。動物の独立、並列コホート（治療および時間ポイントあたりｎ＝３）を媒体または上述のＬＧＫ９７４により治療し、薬力学マーカーの生体外解析のために腫瘍組織を取得した。
【０１８９】
ＨＰＡＦＩＩ異種移植片を有するマウスの５ｍｇ／ｋｇのＬＧＫ９７４の強制経口投与、１日２回、１４日間の投与での治療の結果、媒体治療と比較して腫瘍増殖が有意に阻害された（Ｔ／Ｃ＝３３％）。さらに、Ｃａｐａｎ−２異種移植片を有するマウスを５ｍｇ／ｋｇのＬＧＫ９７４で１日２回、３５日間の強制経口投与にて処置することにより、腫瘍停滞（Ｔ／Ｃ＝５％）を達成した。ＬＧＫ９７４の作用機構と符合して、β−カテニン標的遺伝子、ＡＸＩＮ２の発現は治療したＨＰＡＦＩＩおよびＣａｐａｎ−２異種移植片において減少した。ＲＮＦ４３変異ＰＤＡＣ細胞における試験管内の知見と同様に、ＬＧＫ９７４による治療により、異種移植腫瘍中での細胞周期の停止と分化が誘導される。
【０１９０】
免疫組織化学および画像解析のために、異種移植腫瘍試料は、６から２４時間、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、処理し、パラフィンに包埋した。免疫組織化学的染色は、ベンタナディスカバリーシステム（Ventana Discovery System）上で実施した。画像はアペリオスキャンスコープ（Aperio Scanscope）を使用して撮影した。マウスの膵臓および異種移植腫瘍の切片全体の画像は、ビジオファーム（Visiopharm）を用いて分析した。異種移植腫瘍において、間質組織はセクションアセンブラー（Section Assembler）モジュールを使用して自動的に除外した。壊死領域は解析ソフトウェアによって提供される描画ツールを使用して手動で除外した。組織をＴｉｓｓｕｅｍｏｒｐｈＤＰモジュールを使用してセグメント化し、ＤＡＢ強度を核タンパク質についてはパーセント正の核または核に限定されないタンパク質についてはパーセント正のピクセルのいずれかとして定量した。
【０１９１】
議論。
本実施例において、本発明者らは、ＲＮＦ４３がＦｒｉｚｚｌｅｄの膜発現を抑制することにより、膵臓細胞におけるＷｎｔ経路の負のフィードバック調節因子として機能することを実証した。本発明者らは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達が、おそらくＲＮＦ４３の誘導を介して、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ膜発現を強力に阻害することを示した。この知見は、膵臓がん細胞が、ＲＮＦ４３を変異させて、この強力な負のフィードバック調節から逃れ、高いレベルのＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を達成することを選択する理由の説明を提供する。本発明者らのデータは、膵臓がんにおける腫瘍抑制因子としてのＲＮＦ４３を確立し、ＲＮＦ４３変異が、Ｗｎｔシグナル伝達経路を標的とする薬剤の有効性を予測するためのバイオマーカーとして使用できることを示している。
【０１９２】
本発明者らは、ＬＧＫ９７４が２９例のうち２２例（７６％）の膵臓がん細胞株においてＡＸＩＮ２の発現を減少させることを見出した。したがって、高いパーセンテージの膵臓がん細胞株が自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を有する。しかしながら、これらの細胞株のほとんどの増殖は、病巣形成アッセイにおいてＬＧＫ９７４によって影響されない。著しいことに、増殖アッセイにおいてＬＧＫ９７４に対して明らかな感受性を示すすべての３つの膵臓がん株はＲＮＦ４３機能喪失変異を有する。これらの結果は、ＲＮＦ４３変異した腫瘍は、Ｗｎｔ依存的となる確率がＲＮＦ４３野生型腫瘍と比較してはるかに高いことを示している。
【０１９３】
興味深いことに、ＲＮＦ４３変異を有するすべての細胞株が、ＬＧＫ９７４に対して感受性であるわけではない。本発明者らは、ＲＮＦ４３、Ｐａｔｕ−８９８８Ｔ（Ｆ６９Ｃ）、Ｐａｎｃ１０．０５（Ｍ１８ｆｓ）、およびＰＬ４５（Ｍ１８ｆｓ）のホモ接合変異を持つ３つの膵臓がん株を発見したが、これらの細胞株の増殖はＬＧＫ９７４に対して感受性ではない。Ｐａｔｕ−８９８８ＳとＰａｔｕ−８９８８Ｔは、同じ患者に由来し、Ｐａｎｃ１０．０５およびＰＬ４５も同じ患者に由来していることに留意されたい。これらの結果は、他のメカニズムがＲＮＦ４３変異した腫瘍をＷｎｔシグナル伝達に無関係とすることができることを示している。
【０１９４】
薬剤の毒性と腫瘍の分子病変レベルでの不均一性のため、臨床試験において治療に応答する可能性が最も高い患者を高めることは、分子的標的がん治療薬の開発の成功のために有益である。しかしながら、Ｗｎｔ−依存性腫瘍を同定するための優れた戦略が利用できないため、これらの薬剤の臨床開発は困難である。Ｗｎｔタンパク質の過剰発現またはＷｎｔ阻害剤の過小発現に基づいた戦略は、患者選択のために十分に堅牢ではない。実際に、明らかに自己分泌Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達を有する多くのＰＤＡＣ株は、試験管内増殖についてＷｎｔに依存しない。さらに、β−カテニンシグナル伝達は、リガンド非依存的に活性化させることができるため、β−カテニンの核蓄積に基づいた戦略も信頼性がないであろう。
【０１９５】
本発明者らの研究は、膵臓がんにおける上流Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する腫瘍抑制因子としてのＲＮＦ４３を確立した。試験管内においてＷｎｔ阻害剤に対して感受性なすべてのＷｎｔ阻害剤膵臓がん細胞株がＲＮＦ４３変異を保持するという本発明者らの知見は、ＲＮＦ４３変異はＷｎｔ阻害剤の有効性を試験する臨床試験のために膵腫瘍を選択するための断定的なバイオマーカーとして使用することができることを示している。
【０１９６】
本明細書で引用した特許および刊行物のそれぞれの内容は、参照によりその全体が取り込まれる。
【０１９７】
本明細書において提供される詳細な説明は、本発明を例示するが、その範囲を限定するものではない。本発明の他の異なる形態は、当業者にとって容易に明らかであり、添付の特許請求の範囲によって包含される。
本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
Ｗｎｔ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測する方法であって、
（ａ）患者からの腫瘍細胞の試料におけるバイオマーカーのレベルを検出する段階であって、バイオマーカーは、
（ｉ）ヘテロ接合性の消失を決定するための、ＲＮＦ４３染色体領域および／またはＺＮＲＦ３染色体領域におけるＤＮＡコピー数、
（ｉｉ）ＲＮＦ４３遺伝子および／またはＺＮＲＦ３遺伝子の不活性化変異を検出するために配列決定されたがん組織からのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ；
（ｉｉｉ）ＲＮＦ４３  ｍＲＮＡ発現および／またはＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡ発現；
（ｉＶ）ＲＮＦ４３タンパク質発現および／またはＺＮＲＦ３タンパク質発現；
（ｖ）ＲＮＦ４３遺伝子欠失および／またはＺＮＲＦ３遺伝子欠失の機能的効果；または
（ｖｉ）バイオマーカー（ｉ）〜（ｖ）の組み合わせ
からなる群から選択される、段階、
（ｂ）腫瘍細胞試料におけるバイオマーカーのレベルを
（ｉ）Ｗｎｔ阻害剤に対する感受性と相関しているバイオマーカーの対照レベル；および
（ｉｉ）Ｗｎｔ阻害剤に対する耐性と相関しているバイオマーカーの対照レベル
からなる群から選択されるバイオマーカーの対照レベルと比較する段階；ならびに
（ｃ）患者の腫瘍が不活性化ＲＮＦ４３もしくはＺＮＲＦ３変異を有するか、患者の腫瘍がＲＮＦ４３もしくはＺＮＲＦ３のコピー数の減少を有するか、または患者の腫瘍がＲＮＦ４３  ｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現の減少またはＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現の減少を有し、それにより患者の腫瘍がＷｎｔ阻害剤に対して感受性である可能性が高いことが示される場合に、Ｗｎｔ阻害剤の治療的投与が有益であることが予測されるものとして患者を選択する段階
を含む方法。
［２］
Ｗｎｔ阻害剤に対する腫瘍細胞の感受性を予測する方法であって、腫瘍細胞を少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤に接触させる段階および
（ａ）腫瘍細胞におけるバイオマーカーのレベルを検出する段階であって、バイオマーカーは、
（ｉ）ヘテロ接合性の消失を決定するための、ＲＮＦ４３染色体領域および／またはＺＮＲＦ３３染色体領域におけるＤＮＡコピー数、
（ｉｉ）ＲＮＦ４３遺伝子および／またはＺＮＲＦ３遺伝子の不活性化変異を検出するための、腫瘍細胞からのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ；
（ｉｉｉ）ＲＮＦ４３  ｍＲＮＡ発現および／またはＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡ発現；
（ｉｖ）ＲＮＦ４３タンパク質発現および／またはＺＮＲＦ３タンパク質発現
（ｖ）ＲＮＦ４３遺伝子欠失および／またはＺＮＲＦ３遺伝子欠失の機能的効果；あるいは
（ｖｉ）バイオマーカー（ｉ）〜（ｖ）の組み合わせ
からなる群から選択される、段階：
（ｂ）腫瘍細胞におけるバイオマーカーのレベルを対照レベルと比較する段階；
（ｃ）腫瘍細胞におけるバイオマーカーレベルと対照レベルの差に基づいて、Ｗｎｔ阻害剤に対する腫瘍細胞の感受性を決定する段階
を含む方法。
［３］
ステップ１（ａ）（ｉ）のＲＮＦ４３染色体領域におけるＤＮＡコピー数の検出が、配列番号１の配列を有するヌクレオチドにハイブリダイズするプローブを用いたハイブリダイゼーションによるものである、請求項１または２に記載の方法。
［４］
ステップ１（ａ）（ｉ）のＺＮＲＦ３染色体領域におけるＤＮＡコピー数の検出が、配列番号２の配列を有するヌクレオチドにハイブリダイズするプローブを用いたハイブリダイゼーションによるものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
［５］
ステップ１（ａ）（ｉ）のＺＮＲＦ３染色体領域におけるＤＮＡコピー数の検出が、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によるものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
［６］
ステップ１（ａ）（ｉｉｉ）のＲＮＦ４３  ｍＲＮＡ発現を測定するアッセイが、配列番号１の配列を有するヌクレオチドにハイブリダイズするプローブを用いたハイブリダイゼーションによるものである、請求項１または２に記載の方法。
［７］
ステップ１（ａ）（ｉｉｉ）のＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡ発現を測定するアッセイが、配列番号２の配列を有するヌクレオチドにハイブリダイズするプローブを用いたハイブリダイゼーションによるものである、請求項１、２または６に記載の方法。
［８］
ステップ１（ａ）（ｉｖ）のＲＮＦ４３タンパク質発現を測定するアッセイが、免疫組織化学によるものである、請求項１または２に記載の方法。
［９］
ステップ１（ａ）（ｖ）の機能喪失を測定するアッセイが、抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ抗体を用いたＦＡＣＳアッセイを使用することによるものである、請求項１または２に記載の方法。
［１０］
ステップ１（ａ）（ｖ）の機能喪失を測定するアッセイが、Ｗｎｔレポーターアッセイを使用することによるものである、請求項１または２に記載の方法。
［１１］
Ｗｎｔレポーターアッセイが、Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質レベルの増加、ＬＲＰ６タンパク質レベルの増加、ＬＲＰ６リン酸化の増加、およびＤｉｓｈｅｖｅｌｅｄリン酸化の増加からなる群から選択されるタンパク質活性を測定するものである、請求項１０に記載の方法。
［１２］
比較する段階が、腫瘍細胞におけるバイオマーカーレベルを、Ｗｎｔ阻害剤に対して耐性である１つまたは複数の対照細胞におけるバイオマーカーの対照レベルと比較することを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
［１３］
比較する段階が、腫瘍細胞におけるバイオマーカーレベルを、Ｗｎｔ阻害剤に対して感受性である１つまたは複数の対照細胞におけるバイオマーカーの対照レベルと比較することを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
［１４］
Ｗｎｔ阻害剤に対する感受性と相関しているバイオマーカーの対照レベルが予め決定されている、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
［１５］
Ｗｎｔ阻害剤に対する耐性と相関しているバイオマーカーの対照レベルが予め決定されている、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
［１６］
Ｗｎｔ阻害剤の治療的投与が有益であるかまたは有益でないと予測されるがん患者を選択するためのアッセイキットであって、
（ａ）腫瘍細胞の試料において、
（ｉ）ＲＮＦ４３遺伝子および／またはＺＮＲＦ３遺伝子のヘテロ接合性の消失；
（ｉｉ）ＲＮＦ４３遺伝子および／またはＺＮＲＦ３遺伝子の機能喪失のレベル
（ｉｉｉ）ＲＮＦ４３  ｍＲＮＡおよび／またはＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡ発現のレベル；
（ｉｖ）ＲＮＦ４３タンパク質および／またはＺＮＲＦ３タンパク質発現のレベル；ならびに
（ｖ）ＲＮＦ４３遺伝子および／またはＺＮＲＦ３遺伝子欠失の機能的効果
からなる群から選択されるバイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせのレベルを検出するための手段；
（ｂ）対照
を含むアッセイキット。
［１７］
対照が、
（ｉ）Ｗｎｔ阻害剤に対する感受性を検出するための対照試料；
（ｉｉ）Ｗｎｔ阻害剤に対する耐性を検出するための対照試料；
（ｉｉｉ）Ｗｎｔ阻害剤に対する感受性と相関しているバイオマーカーの予め決定された対照レベルを含有する情報；および
（ｉｖ）Ｗｎｔ阻害剤に対する耐性と相関しているバイオマーカーの予め決定された対照レベルを含有する情報
からなる群から選択される、請求項１６に記載のアッセイキット。
［１８］
ステップ１５（ａ）（ｉ）および２１（ａ）（ｉ）のいずれかにおけるＲＮＦ４３遺伝子を検出するための手段が、配列番号１の配列を有するヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチドプローブを含む、請求項１６または１７に記載のアッセイキット。
［１９］
ステップ１５（ａ）（ｉ）および２１（ａ）（ｉ）のいずれかにおけるＺＮＲＦ３遺伝子を検出するための手段が、配列番号２の配列を有するヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチドプローブを含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載のアッセイキット。
［２０］
ステップ１５（ａ）（ｉ）におけるＲＮＦ４３遺伝子を検出するための手段が、ゲノム遺伝子座１７ｑ２２にハイブリダイズするヌクレオチドプローブを含む、請求項１６または１７に記載のアッセイキット。
［２１］
ステップ１６（ａ）（ｉ）におけるＺＮＲＦ３遺伝子を検出するための手段が、ゲノム遺伝子座２２ｑ１２．１にハイブリダイズするヌクレオチドプローブを含む、請求項１６、１７または２０に記載のアッセイキット。
［２２］
ステップ１６（ａ）（ｉｉｉ）におけるＲＮＦ４３タンパク質を検出するための手段が、配列番号３の配列を有するポリヌクレオチドに選択的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項１６、１７または２０に記載のアッセイキット。
［２３］
ステップ１６（ａ）（ｉｉｉ）におけるＺＮＲＦ３タンパク質を検出するための手段が、配列番号４の配列を有するポリヌクレオチドに選択的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項１６から２２のいずれか一項に記載のアッセイキット。
［２４］
検出のための手段が、検出可能な標識を含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載のアッセイキット。
［２５］
検出のための手段が基板上に固定化される、請求項１６から２４のいずれか一項に記載のアッセイキット。
［２６］
患者におけるがんの治療において使用するためのＷｎｔ阻害剤を含む医薬組成物であって、請求項１に記載のバイオマーカーの患者のレベルが、バイオマーカーの対照レベルに統計学的に類似しているかまたはそれよりも低く、対照バイオマーカーレベルは、Ｗｎｔ阻害剤に対する感受性と相関している、医薬組成物。
［２７］
対照レベルが、バイオマーカーの正常またはベースラインレベル、健康な細胞または組織試料におけるバイオマーカーのレベル、またはＷｎｔ阻害剤に対する耐性と相関しているバイオマーカーの対照レベルである、請求項２６に記載のＷｎｔ阻害剤を含む医薬組成物。
［２８］
がんが膵臓がんである、請求項２６または２７に記載のＷｎｔ阻害剤を含む医薬組成物。
［２９］
Ｗｎｔ阻害剤が、式（１）：
【化２】
0006397335.tif 000013
の化合物またはその生理学的に許容される塩（式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はＮおよびＣＲ７から選択され；
Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ８の１つはＮであり、他はＣＨであり；
Ｘ９はＮおよびＣＨから選択され；
Ｚはフェニル、ピラジニル、ピリジニル、ピリダジニルおよびピペラジニルから選択され、ここで各々のＺのフェニル、ピラジニル、ピリジニル、ピリダジニルまたはピペラジニルは場合によってＲ６基で置換されており；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は水素であり；
ｍは１であり；
Ｒ４は水素、ハロ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチルおよびメチルから選択され；
Ｒ６は水素、ハロおよび−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０から選択され；ここで、Ｒ１０はメチルであり；
Ｒ７は水素、ハロ、シアノ、メチルおよびトリフルオロメチルから選択される）である、
請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法、または請求項１６から２５のいずれか一項に記載のアッセイ、または請求項２６から２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［３０］
Ｗｎｔ阻害剤が、
Ｎ−［５−（３−フルオロフェニル）ピリジン−２−イル］−２−［５−メチル−６−（ピリダジン−４−イル）ピリジン−３−イル］アセトアミド；
２−［５−メチル−６−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリジン−３−イル］−Ｎ−［５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル］アセトアミド；
Ｎ−（２，３’−ビピリジン−６’−イル）−２−（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；
Ｎ−（５−（４−アセチルピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）−２−（２’−メチル−３−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；
Ｎ−（５−（４−アセチルピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）−２−（２’−フルオロ−３−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；および
２−（２’−フルオロ−３−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）−Ｎ−（５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル）アセトアミド；
の群から選択される化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法、または請求項１６から２５のいずれか一項に記載のアッセイ、または請求項２６から２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−ａ】
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【図３−ｂ】
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【図３−ｃ】
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【図４−ａ】
0006397335.tif 000020
【図４−ｂ】
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【配列表】
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