(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連性配列Ａ（ＭＩＣＡ）に免疫特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体は、
配列番号：１５４に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲ１、
配列番号：１５６に示すアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および
配列番号：１５８に示すアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、ならびに
配列番号：１６１に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、
配列番号：１６３に示すアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および
配列番号：１６５に示すアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３、
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記ＶＨ領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４領域が、配列番号：１５０に示されるＶＨの対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４領域に対し、
（ａ）少なくとも８０％同一性、
（ｂ）８５％同一性、
（ｃ）９０％同一性、
（ｄ）９５％同一性、
（ｅ）９６％同一性、
（ｆ）９７％同一性、
（ｇ）９８％同一性、
（ｈ）９９％同一性または
（ｉ）１００％同一性
を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記ＶＬ領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４領域が、配列番号：１５２に示されるＶＬの対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４領域に対し、
（ａ）少なくとも８０％同一性、
（ｂ）８５％同一性、
（ｃ）９０％同一性、
（ｄ）９５％同一性、
（ｅ）９６％同一性、
（ｆ）９７％同一性、
（ｇ）９８％同一性、
（ｈ）９９％同一性または
（ｉ）１００％同一性
を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記ＶＨ領域が、ＣＤＲ内ではない残基において５以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号：１５０に示すアミノ酸配列またはその変異体を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記ＶＬ領域が、ＣＤＲ内ではない残基において５以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号：１５２に示すアミノ酸配列またはその変異体を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項６】
配列番号：１５０に示すアミノ酸配列を有するＶＨ領域および配列番号：１５２に示すアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記抗体または抗原結合フラグメントがヒト、ヒト化またはキメラである、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメントを含む医薬組成物。
【請求項９】
１つ以上のさらなる薬剤を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
化学療法、放射線療法、サイトカイン、ケモカインおよび他の生体シグナル伝達分子、腫瘍特異的ワクチン、細胞癌ワクチン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ形質導入癌細胞）、腫瘍特異的モノクローナル抗体、自己および同種異系の幹細胞レスキュー（例えば、移植片対腫瘍効果を増強させる）、分子標的療法、抗脈管形成療法、および遺伝子治療からなる群から選択される癌の処置のために使用される１つ以上のさらなる薬剤を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記１つ以上のさらなる薬剤が、ヒドロキサム酸、ボリノスタット、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＬＡＱ８２４、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ＩＴＦ２３５７  ｉｔａｌｆａｒｍａｃｏ  ＳｐＡ、環状テトラペプチド、デプシペプチド（ロミデプシン、ＦＫ２２８）、ベンズアミド；ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ（ＳＮＤＸ−２７５／ＭＳ−２７５）、ＭＧＣＤ０１０３、短鎖脂肪酸、バルプロ酸、フェニル酪酸、ＡＮ−９、ｐｉｖａｎｅｘ、ＣＨＲ−３９９６、およびＣＨＲ−２８４５からなる群から選択されるヒストンデアセチラーゼインヒビター（ＨＤＡＣ）；ボルテゾミブ、ＮＰＩ−００５２、カーフィルゾミブ（ＰＲ−１７１）、ＣＥＰ  １８７７０、およびＭＬＮ９７０８からなる群から選択されるプロテアソーム阻害剤；抗−ＣＴＬＡ−４抗体またはペプチド；抗−ＰＤ−１抗体またはペプチド；抗−ＰＤＬ−１抗体またはペプチド；抗−ＯＸ４０抗体またはペプチド；抗−ＧＩＴＲ抗体またはペプチド；抗−ＬＡＧ−３抗体またはペプチド；および抗−ＴＩＭ−３抗体またはペプチドを含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
対象において癌の処置における使用のための、請求項８〜１１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸。
【請求項１４】
配列番号：１４９に対し
（ａ）少なくとも７５％配列同一性、
（ｂ）８０％配列同一性、
（ｃ）９０％配列同一性、
（ｄ）９５％配列同一性、
（ｅ）９９％配列同一性または
（ｆ）１００％配列同一性
を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の単離された核酸。
【請求項１５】
配列番号：１５１に対し
（ａ）少なくとも７５％配列同一性、
（ｂ）８０％配列同一性、
（ｃ）９０％配列同一性、
（ｄ）９５％配列同一性、
（ｅ）９９％配列同一性または
（ｆ）１００％配列同一性
を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１３または１４に記載の単離された核酸。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれかに記載の核酸を含むベクター。
【請求項１７】
前記ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである、請求項１６に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許仮出願番号第６１／７９２，０３４号（２０１３年３月１５日出願）および米国特許仮出願番号第６１／９１３，１９８号（２０１３年１２月６日出願）の利益を主張するものであり、これらの出願のそれぞれのすべては、それら全体において参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
政府の支援
本発明は、米国国立衛生研究所助成金番号第Ｐ０１  ＡＩ０４５７５７号および第Ｐ０１  ＣＡ７８３７８号の下、政府により支援を受けた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、ヒトを対象とする治療用組成物（例えば、ペプチド）に関する。
【背景技術】
【０００４】
ヒトは、状態または疾患に曝露されることにより、治療能を持つ抗体源を産生する。当該技術分野においては、このような抗体を得る際に一般的な手法が知られている。しかしながら、治療能を持つ抗体を特異的に得るための方法は、一般に、低頻度、緩慢な増殖速度、および抗体を産生するＢ細胞の抗体分泌濃度の低さにより制限を受ける。例えば、特定の特異性を有する記憶Ｂ細胞が占める割合は、典型的には、末梢血の単核細胞１００万個につき、または血液約１ｍＬにつき、わずか１個のみである（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１：２９８〜３０４（２００９）：Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２３７：１１７〜１３９（２０１０））。治療能を持つ抗体の頻度は、癌患者においてはさらに低くなるものと考えられ、細胞を高感度および高効率に単離することのできる新規アプローチを開発する必要がある。
【０００５】
従来の方法は、概して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養による記憶Ｂ細胞の抗体分泌細胞への分化、および／または免疫したモデル動物（例えば、マウス）の使用に依存するものである（Ｃｒｏｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：４９６９〜４９７３（２００３）：Ｆｅｃｔｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２８：ｅ３５３〜ｅ３６５（２００９）：Ｂｕｉｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２８：１７９〜１８６（２００９）：Ｃｏｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，５：ｅ８８０５（２０１０））。例えば、最大で一週間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養後、培養上清中に含まれる抗体を測定し、酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイにより抗体分泌細胞の頻度を調べることができる。このような方法には制限があることが報告されている（Ｈｅｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８３：３１７７７〜３１８７（２００９）：Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５８：５６〜６５（２０１０））。例えば、記憶Ｂ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養すると、記憶Ｂ細胞の表現型は変化し、異なる機能特性を有する形質細胞と似た表現型を有するようになる（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７：２２０５〜２２１３（２００７）：Ｈｕｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０９：１６１１〜１６１９（２００７）：Ｊｏｕｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１４：５１７３〜５１８１（２００９））。蛍光抗原に基づく方法にまつわる制限も報告されている（Ｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２１１：２９５〜３０２（２００６）：Ｏｄｅｎｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０５：１６１４〜１６２１（２００５）；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：８２２〜８２９（２００３）：Ｓｃｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４５８：６３６〜６４０（２００９）：Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２９：８５６〜８６１（２０１０））。
【０００６】
治療能を持つ抗体を特異的に得るまたは標的とする改良法が必要とされている。
【０００７】
ＭＩＣＡは、ほとんどのヒトＮＫ細胞、γδ  Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現しているＣ型レクチン様ＩＩ型膜貫通受容体ＮＫＧ２Ｄのリガンドである。ＮＫＧ２Ｄは、リガンドの結合により、アダプタータンパク質のＤＡＰ１０を介してシグナル伝達を行い、パーフォリン依存性の細胞溶解を惹起し、同時刺激をもたらす。ヒトにおいては、ＮＫＧ２Ｄリガンドには、ＭＨＣクラスＩ型鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、これと密接に関連するＭＩＣＢ、ＵＬ−１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）１〜４およびＲＡＥ−１Ｇが包含される。通常、正常組織ではＮＫＧ２Ｄリガンドは観察されないものの、ＤＮＡ損傷などの各種細胞ストレスにより発現が上方制御され、黒色腫などの様々な固形悪性腫瘍および血液系腫瘍において高頻度に検出されるようになる。ＮＫＧ２Ｄ欠損型マウスおよび抗ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体により処理した野生型マウスでは、腫瘍易罹患性が著しく上昇することから、リガンドの発現が陽性の形質転換細胞によるＮＫＧ２Ｄの活性化は、腫瘍抑制に外因的に寄与する。しかしながら、患者においては、腫瘍細胞から脱離したＮＫＧ２Ｄリガンドが、表面ＮＫＧ２Ｄの内部移行と、細胞傷害性リンパ球の機能を損なわせるトリガーとなり、免疫逃避が成立する恐れがある。可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドは、Ｆａｓリガンド、ＩＬ−１０、およびＴＧＦ−βを介し、抗腫瘍細胞傷害性に拮抗し得る、ＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−制御性Ｔ細胞の増殖も刺激し得る。ＭＩＣＡは、腫瘍細胞から脱離した、すなわち、細胞表面から周囲の媒質に放出されたＮＫＧ２Ｄリガンドであり、癌患者由来の血清は、典型的には可溶型（ｓＭＩＣＡ）を高濃度で含有している。ＭＩＣＡの脱離は、部分的にタンパク質ジスルフィド異性化酵素ＥＲｐ５との相互作用を通じてなされ、すなわち、ＥＲｐ５がＭＩＣＡの重要なシステインとジスルフィド結合を形成し、結果としてα３ドメインをアンフォールディングさせ、ＡＤＡＭ−１０／１７およびＭＭＰ１４によるタンパク質分解を受けやすくさせることを通じてなされる。
【０００８】
現在、免疫癌療法として癌標的を特異的に認識および結合する新規薬剤を同定することが求められている。このような薬剤は、腫瘍の進行と関連付けられる病態に関する診断用スクリーニングおよび治療介入に有用である。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、治療能を持つ抗体に関係する組成物および方法を提供する。
【００１０】
一部の実施形態では、本開示は、ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、またはそれらのエピトープに免疫特異的に結合するペプチドを含む組成物を提供する。一部の態様では、組成物のペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有する相補性決定領域（ＣＤＲ）３と、表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ３と、を含む。一部の態様では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）３と、表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＬのＣＤＲ３と、を含む。一部の態様では、ペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ２、あるいは表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ２、あるいはこれらの両方をさらに含む。一部の態様では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＨの相補性決定領域ＣＤＲ２、あるいは表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＬのＣＤＲ２、あるいはこれらの両方を含む。一部の態様では、ペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、あるいは表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、あるいはこれらの両方をさらに含む。一部の態様では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＨの相補性決定領域ＣＤＲ１、あるいは表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＬのＣＤＲ１、あるいはこれらの両方を含む。
【００１１】
一部の態様では、ペプチドは、配列番号１５０と同一性を有するＶＨ鎖、および配列番号１５２と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号１５０内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号１５２内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号１５０を含むＶＨ鎖および配列番号１５２を含むＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。
【００１２】
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されている特定の抗体により認識されるエピトープのすべてまたは一部を含むＭＩＣＡ内のエピトープに結合する抗体または抗体断片であるペプチドを提供する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、ＭＩＣＡ＊００９参照配列（配列番号：１６７）のアミノ酸１８１から２７４に相当するＭＩＣＡ  α３ドメイン内の領域を認識する。一部の実施形態では、抗体または抗体断片は、配列番号：１３１を含むＶＨ鎖および配列番号：１３３を含むＶＬ鎖を含む抗体と同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗体断片は、アミノ酸配列ＧＤＶＬＰＤＧＮＧＴＹＱＴＷＶＡＴＲＩＣ（配列番号：１６８）を含むか、または当該配列と重複する少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸のＭＩＣＡの少なくとも１つの部分を含むエピトープを認識する。一部の実施形態では、抗体または抗体断片は、配列番号：１１３を含むＶＨ鎖および配列番号：１１５を含むＶＬ鎖を含む抗体と同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗体断片は、アミノ酸配列ＮＶＥＴＥＥＷＴＶＰ（配列番号：１６９）を含むか、または当該配列と重複する少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸のＭＩＣＡの少なくとも１つの部分を含むエピトープを認識する。一部の実施形態では、抗体または抗体断片は、配列番号：１５０を含むＶＨ鎖および配列番号：１５２を含むＶＬ鎖を含む抗体と同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗体断片は、アミノ酸配列ＴＶＰＰＭＶＮＶＴＲ（配列番号：１７０）を含むか、または当該配列と重複する少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸のＭＩＣＡの少なくとも１つの部分を含むエピトープを認識する。一部の実施形態では、抗体または抗体断片は、配列番号：７７を含むＶＨ鎖および配列番号：７９を含むＶＬ鎖を含む抗体と同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗体断片は、配列番号：２を含むＶＨ鎖および配列番号：１１を含むＶＬ鎖を含む抗体と同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗体断片は、配列番号：９６を含むＶＨ鎖および配列番号：９８を含むＶＬ鎖を含む抗体と同じエピトープに結合する。
【００１３】
一部の態様では、ペプチドに加え、組成物には、さらに１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または２０未満）抗癌治療を含有させる。一部の態様では、組成物は医薬組成物（例えば、対象に投与するためのもの）として処方される。
【００１４】
一部の実施形態では、本開示は、ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連性配列Ａ（ＭＩＣＡ）またはそれらのエピトープに免疫特異的に結合するペプチドをコードする核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、組成物の核酸は、５以下の保存的アミノ酸置換を有する、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１１のＶＨをコードする。一部の態様では、組成物の核酸は、５以下の保存的アミノ酸置換を有する、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１１のＶＬをコードする。
【００１５】
１つの局面において、本開示は、配列番号：１に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：２に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の局面において、本開示は、配列番号：１０に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：１１に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【００１６】
１つの局面において、本開示は、配列番号：７６に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：７７に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の局面において、本開示は、配列番号：７８に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：７９に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【００１７】
１つの局面において、本開示は、配列番号：９５に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：９６に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の局面において、本開示は、配列番号：９７に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：９８に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【００１８】
１つの局面において、本開示は、配列番号：１１２に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：１１３に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の局面において、本開示は、配列番号：１１４に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：１１５に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【００１９】
１つの局面において、本開示は、配列番号：１３０に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：１３１に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の局面において、本開示は、配列番号：１３２に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：１３３に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【００２０】
１つの局面において、本開示は、配列番号：１４９に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：１５０に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の局面において、本開示は、配列番号：１５１に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：１５２に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【００２１】
一部の実施形態では、本開示は、ＭＩＣＡおよび細胞内Ｔ細胞ドメインに免疫特異的に結合するペプチドを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。１つの局面において、ＣＡＲに含まれるペプチドは、配列番号：２と同一性を有するＶＨ鎖、または配列番号：１１と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１のＶＨの、５以下の保存的アミノ酸置換を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号：２内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、または前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１のＶＬの、５以下の保存的アミノ酸置換を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号：１１内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号：２を含むＶＨ鎖および配列番号：１１を含むＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片を含む。
【００２２】
１つの局面において、ＣＡＲに含まれるペプチドは、配列番号：７７と同一性を有するＶＨ鎖、または配列番号：７９と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ６のＶＨの、５以下の保存的アミノ酸置換を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号：７７内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ６のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、または前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ６のＶＬの、５以下の保存的アミノ酸置換を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号：７９内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ６のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号：７７を含むＶＨ鎖および配列番号：７９を含むＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片を含む。
【００２３】
１つの局面において、ＣＡＲに含まれるＭＩＣＡに免疫特異的に結合するペプチドは、配列番号：９６と同一性を有するＶＨ鎖、または配列番号：９８と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ７のＶＨの、５以下の保存的アミノ酸置換を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号：９６内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ７のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、または前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ７のＶＬの、５以下の保存的アミノ酸置換を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号：９８内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ７のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号：９６を含むＶＨ鎖および配列番号：９８を含むＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片を含む。
【００２４】
１つの局面において、ＣＡＲに含まれるＭＩＣＡに免疫特異的に結合するペプチドは、配列番号：１１３と同一性を有するＶＨ鎖、または配列番号：１１５と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ８のＶＨの、５以下の保存的アミノ酸置換を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号：１１３内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ８のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、または前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ８のＶＬの、５以下の保存的アミノ酸置換を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号：１１５内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ８のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号：１１３を含むＶＨ鎖および配列番号：１１５を含むＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片を含む。
【００２５】
１つの局面において、ＣＡＲに含まれるＭＩＣＡに免疫特異的に結合するペプチドは、配列番号：１３１と同一性を有するＶＨ鎖、または配列番号：１３３と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ９のＶＨの、５以下の保存的アミノ酸置換を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号：１３１内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ９のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、または前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ９のＶＬの、５以下の保存的アミノ酸置換を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号：１３３内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ９のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号：１３１を含むＶＨ鎖および配列番号：１３３を含むＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片を含む。
【００２６】
１つの局面において、ＣＡＲに含まれるＭＩＣＡに免疫特異的に結合するペプチドは、配列番号：１５０と同一性を有するＶＨ鎖、または配列番号：１５２と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＨの、５以下の保存的アミノ酸置換を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号：１５０内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、または前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＬの、５以下の保存的アミノ酸置換を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号：１５２内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号：１５０を含むＶＨ鎖および配列番号：１５２を含むＶＬ鎖を含む抗体または抗体断片を含む。
【００２７】
他の態様において、本開示は、ＭＩＣＡに免疫特異的に結合するペプチドをコードする核酸を含むベクター（例えば、発現ベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはポックスウイルスベクター）を提供する。１つの局面において、ベクターは、配列番号：１０、７８、９７、１１４、１３２または１５１に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：１１、７９、９８、１１５、１３３または１５２に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【００２８】
他の局面において、ベクターは、配列番号：１、７６、９５、１１２、１３０または１４９に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：２、７７、９６、１１３、１３１、または１５０に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【００２９】
１つの局面において、ベクターは、配列番号：１に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：２に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の局面において、本開示は、配列番号：１０に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：１１に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【００３０】
１つの局面において、ベクターは、配列番号：７６に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：７７に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の局面において、本開示は、配列番号：７８に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：７９に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【００３１】
１つの局面において、ベクターは、配列番号：９５に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：９６に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の局面において、本開示は、配列番号：９７に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：９８に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【００３２】
１つの局面において、ベクターは、配列番号：１１２に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：１１３に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の局面において、本開示は、配列番号：１１４に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：１１５に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【００３３】
１つの局面において、ベクターは、配列番号：１３０に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：１３１に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の局面において、本開示は、配列番号：１３２に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：１３３に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【００３４】
１つの局面において、ベクターは、配列番号：１４９に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：１５０に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の局面において、本開示は、配列番号：１５１に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：１５２に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【００３５】
一部の実施形態では、本開示は、対象において癌を処置する方法を包含する。一部の態様では、方法は、本明細書に記載されている１つ以上のペプチドおよび／または核酸を含む組成物を対象に投与することを包含する。
【００３６】
本開示は、免疫療法後に癌患者からヒト抗体を単離する方法も提供する。
【００３７】
一部の実施形態では、本開示は、対象由来の自己抗原に対する免疫細胞を得る方法を包含し、方法は、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象を特定すること、自己抗原の多量体を提供すること、自己抗原の多量体を、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象由来のサンプルと接触させること、および自己抗原の多量体と結合する免疫細胞を得ること、を包含する。
【００３８】
一部の実施形態では、本開示は、自己抗原に対する癌患者由来の免疫細胞を得る方法を包含し、方法は、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象を特定すること；自己抗原の多量体を提供すること；自己抗原の多量体を、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象由来のサンプルと接触させること；および自己抗原の多量体と結合する免疫細胞を得ること、を包含する。
【００３９】
本明細書において定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。本発明に使用する方法および材料は本明細書に記載されるものの、当該技術分野において既知である、その他の好適な方法および材料も使用できる。材料、方法、および例は、例示目的のためのみのものであり、制限を意図するものではない。すべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース登録物、並びに本明細書において言及されるその他の参照は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。相反する場合には、定義などの、本発明における記載を参照する。
【００４０】
本発明のその他の特徴および利点は、以降の発明を実施するための形態および図面、並びに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】抗体ＩＤ１（抗ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）抗体）の重鎖可変領域（ＶＨ）の核酸配列（配列番号１）。
【図２】抗体ＩＤ１（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号２）。
【図３】抗体ＩＤ１（抗ＭＩＣＡ抗体）の軽鎖可変領域（ＶＬ）の核酸配列（配列番号１０）。
【図４】抗体ＩＤ１（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号１１）。
【図５Ａ】Ｂ細胞から抗体を製造する際の方法例を示す図。部位特異的にビオチン化させ、蛍光標識したストレプトアビジンと四量体を形成させるため、ＢｉｒＡ（ビオチンリガーゼ）タグを付して、抗原を発現させる。
【図５Ｂ】Ｂ細胞から抗体を製造する際の方法例を示す図。四量体および一連のモノクローナル抗体によりＢ細胞を染色する。クラススイッチした四量体＋の記憶Ｂ細胞を単一細胞でソーティングして、ＰＣＲ用ストリップチューブに回収する。
【図５Ｃ】Ｂ細胞から抗体を製造する際の方法例を示す図。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡの増幅を行う。
【図５Ｄ】Ｂ細胞から抗体を製造する際の方法例を示す図。ＰＣＲ産物の配列決定は、３００〜４００ｂｐのＰＣＲ産物を用い実施する。
【図５Ｅ】Ｂ細胞から抗体を製造する際の方法例を示す図。別個のベクターにクローニングされた、完全長のＩｇＧ１重鎖配列およびκ／λ軽鎖配列を構築するために、オーバーラップＰＣＲを行う。完全なヒト型組換え抗体を発現させるにあたり、ベクターはＣＨＯ−Ｓ細胞に一過性遺伝子導入する。
【図５Ｆ】Ｂ細胞から抗体を製造する際の方法例を示す図。抗原結合について抗体を試験し、有望な治療特性について評価する。
【００４２】
【図６Ａ】記憶Ｂ細胞の同定に関し、抗原の単量体および四量体を比較するグラフ。モノビオチン化ＴＴＣＦまたはＣＤ８０抗原を、Ａｌｅｘａ−４８８フルオロフォアにより直接標識した；四量体は未標識のストレプトアビジンを用い生成した。各ドナー由来の濃縮Ｂ細胞を３画分に分け、総抗原濃度を０．１２５μｇ／ｍＬに揃え、対照ＣＤ８０四量体、ＴＴＣＦモノマーまたはＴＴＣＦ四量体により染色した。ＦＡＣＳプロットはＣＤ１９＋  ＣＤ２７＋  ＩｇＭ−クラススイッチした記憶Ｂ細胞を示し、ゲート付近の数は、親ゲート（parental gate）の割合を表す。
【図６Ｂ】記憶Ｂ細胞の同定に関し、抗原の単量体および四量体を比較するグラフ。３つの異なるドナーで検出された四量体＋記憶Ｂ細胞の頻度。個数は、四量体＋細胞／１×１０６個ＣＤ１９＋記憶Ｂ細胞として算出した。
【図７Ａ】形質芽球および記憶Ｂ細胞から産生された抗体が、ＴＴＣＦに対し高親和性に結合したことを示す線グラフ。組換え抗体の親和性を求めるため、飽和結合試験を実施した。ＴＴＣＦ抗原は、キレート剤とインキュベートすることで６１５ｎｍにて強力な蛍光シグナルを発するユーロピウムで標識した。抗体を９６ウェルプレートに固定化し、ＴＴＣＦユーロピウム（１００ｎＭ〜４ｐＭ）とともに３７℃で２時間インキュベートした。６１５ｎｍにて蛍光カウントを記録し、非線形回帰分析によりＫＤを算出した。ＣＨＯ−Ｓ細胞で産生された対照抗体（クローン８．１８．Ｃ５）もすべての実験に包含させた。組換え抗体ＴＴＣＦ  １および２は、ＴＴＣＦ四量体＋形質芽球（ドナー１）により産生された。
【図７Ｂ】形質芽球および記憶Ｂ細胞から産生された抗体が、ＴＴＣＦに対し高親和性に結合したことを示す線グラフ。組換え抗体の親和性を求めるため、飽和結合試験を実施した。ＴＴＣＦ抗原は、キレート剤とインキュベートすることで６１５ｎｍにて強力な蛍光シグナルを発するユーロピウムで標識した。抗体を９６ウェルプレートに固定化し、ＴＴＣＦユーロピウム（１００ｎＭ〜４ｐＭ）とともに３７℃で２時間インキュベートした。６１５ｎｍにて蛍光カウントを記録し、非線形回帰分析によりＫＤを算出した。ＣＨＯ−Ｓ細胞で産生された対照抗体（クローン８．１８．Ｃ５）もすべての実験に包含させた。ＴＴＣＦ抗体３、４、および５は、３つの異なるドナーのＴＴＣＦ四量体＋記憶Ｂ細胞に由来する。
【図８】ＭＩＣＡコーティングしたルミネックスビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す棒グラフ。
【図９Ａ】ＭＩＣＡコーティングビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す線グラフ。
【図９Ｂ】ＭＩＣＡコーティングビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す線グラフ。
【図９Ｃ】ＭＩＣＡコーティングビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す線グラフ。
【図９Ｄ】ＭＩＣＡコーティングビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す線グラフ。
【図９Ｅ】ＭＩＣＡコーティングビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す線グラフ。
【図９Ｆ】ＭＩＣＡコーティングビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す線グラフ。
【図９Ｇ】ＭＩＣＡコーティングビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す線グラフ。
【図９Ｈ】ＭＩＣＡコーティングビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す線グラフ。
【図９Ｉ】ＭＩＣＡコーティングビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す線グラフ。
【図９Ｊ】ＭＩＣＡコーティングビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す線グラフ。
【図９Ｋ】ＭＩＣＡコーティングビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す線グラフ。
【図９Ｌ】ＭＩＣＡコーティングビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す線グラフ。
【図９Ｍ】ＭＩＣＡコーティングビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す線グラフ。
【図９Ｎ】ＭＩＣＡコーティングビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す線グラフ。
【図９Ｏ】ＭＩＣＡコーティングビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す線グラフ。
【図１０】抗体ＩＤ６（抗ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）抗体）の重鎖可変領域（ＶＨ）の核酸配列（配列番号７６）。
【００４３】
【図１１】抗体６（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号７７）。
【図１２】抗体ＩＤ６（抗ＭＩＣＡ抗体）の軽鎖可変領域（ＶＬ）の核酸配列（配列番号７８）。
【図１３】抗体ＩＤ６（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号７９）。
【図１４】抗体ＩＤ７（抗ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）抗体）の重鎖可変領域（ＶＨ）の核酸配列（配列番号９５）。
【図１５】抗体ＩＤ７（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号９６）。
【００４４】
【図１６】抗体ＩＤ７（抗ＭＩＣＡ抗体）の軽鎖可変領域（ＶＬ）の核酸配列（配列番号９７）。
【図１７】抗体ＩＤ７（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号９８）。
【図１８】抗体ＩＤ８（抗ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）抗体）の重鎖可変領域（ＶＨ）の核酸配列（配列番号１１２）。
【図１９】抗体ＩＤ８（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号１１３）。
【図２０】抗体ＩＤ８（抗ＭＩＣＡ抗体）の軽鎖可変領域（ＶＬ）の核酸配列（配列番号１１４）。
【００４５】
【図２１】抗体ＩＤ８（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号１１５）。
【図２２】抗体ＩＤ９（抗ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）抗体）の重鎖可変領域（ＶＨ）の核酸配列（配列番号１３０）。
【図２３】抗体ＩＤ９（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号１３１）。
【図２４】抗体ＩＤ９（抗ＭＩＣＡ抗体）の軽鎖可変領域（ＶＬ）の核酸配列（配列番号１３２）。
【図２５】抗体ＩＤ９（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号１３３）。
【００４６】
【図２６Ａ】組換え型抗ＭＩＣＡ抗体によるＭＩＣＡ対立遺伝子産物に特異的な結合の評価を示す線グラフ。
【図２６Ｂ】組換え型抗ＭＩＣＡ抗体によるＭＩＣＡ対立遺伝子産物に特異的な結合の評価を示す線グラフ。
【図２６Ｃ】組換え型抗ＭＩＣＡ抗体によるＭＩＣＡ対立遺伝子産物に特異的な結合の評価を示す線グラフ。
【図２６Ｄ】組換え型抗ＭＩＣＡ抗体によるＭＩＣＡ対立遺伝子産物に特異的な結合の評価を示す線グラフ。
【図２６Ｅ】組換え型抗ＭＩＣＡ抗体によるＭＩＣＡ対立遺伝子産物に特異的な結合の評価を示す線グラフ。
【図２６Ｆ】組換え型抗ＭＩＣＡ抗体によるＭＩＣＡ対立遺伝子産物に特異的な結合の評価を示す線グラフ。
【図２６Ｇ】組換え型抗ＭＩＣＡ抗体によるＭＩＣＡ対立遺伝子産物に特異的な結合の評価を示す線グラフ。
【図２７】抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２  Ａｂ２による、自己腫瘍細胞の標識を示す線グラフ。
【図２８】一連のＦＡＣＳプロットは、血清ＭＩＣＡによるＮＫＧ２Ｄの調節を示す。ヒトＮＫ細胞を患者ＣＭ２４００２由来の対照血清により１：１０希釈し、４８時間インキュベートした。記載の抗体を、インキュベートの開始時に１０μｇ／ｍＬ濃度で加えた。フローサイトメトリーにより、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄの発現を評価した。
【図２９】一連のＦＡＣＳプロットは、組換えＭＩＣＡによるＮＫＧ２Ｄの調節を示す。ヒトＮＫ細胞を、２ｎｇ／ｍＬ濃度のＭＩＣＡとともに４８時間インキュベートした。記載の抗体を、インキュベートの開始時に１０μｇ／ｍＬ濃度で加えた。４８時間後、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ発現をフローサイトメトリーにより評価した。
【図３０】抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２  Ａｂ２による細胞介在性細胞傷害の増大を示す線グラフ。１０μｇ／ｍＬの記載の抗体の存在下で、組換え型ＭＩＣＡ（２ｎｇ／ｍＬ）とともに、ヒトＮＫ細胞を４８時間インキュベートした。記載の比率で４時間インキュベートした後で、ＮＫ細胞（エフェクター細胞）がＫ５６２標的細胞を殺傷する能力を、ＬＤＨの放出を測定することにより評価した。
【００４７】
【図３１】抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９による細胞介在性細胞傷害を示す棒グラフ。１０μｇ／ｍＬの記載の抗体の存在下で、組換え型ＭＩＣＡ（２ｎｇ／ｍＬ）とともに、ヒトＮＫ細胞を４８時間インキュベートした。４時間インキュベートした後で、ＮＫ細胞（エフェクター細胞）がＫ５６２標的細胞を殺傷する能力を、ＬＤＨの放出を測定することにより評価した。エフェクター細胞および標的細胞を４時間インキュベートする際、ＮＫＧ２Ｄブロッキング抗体またはＦｃブロッキング抗体を加え、細胞介在性細胞傷害に対するＦｃ受容体およびＮＫＧ２Ｄの関与を評価した。
【図３２】組換え型抗ＭＩＣＡ抗体によるＭＩＣＡ  α３ドメインの結合を示す一連の線グラフ。組換え型ＭＩＣＡ  α３ドメインをビオチン化し、ストレプトアビジンコーティングしたビーズ表面で捕捉した。記載の抗体１０μｇ／ｍＬを、それぞれ組換えタンパク質によりコーティングしたビーズとともに１時間インキュベートした。続いてビーズを洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体とともにインキュベートした。フローサイトメトリーによりＦＩＴＣ蛍光を定量化した。
【図３３】抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９による腫瘍細胞の標識を示す線グラフ。フローサイトメトリーにより蛍光を測定した。
【図３４】抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９の、ＭＩＣＡ対立遺伝子産物特異性をＬｕｍｉｎｅｘアッセイにより定量し、示す棒グラフ。
【図３５】抗体ＩＤ１１（抗ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連性配列Ａ（ＭＩＣＡ）抗体）の重鎖可変領域（ＶＨ）鎖の核酸配列（配列番号：１４９）。
【００４８】
【図３６】抗体１１のＶＨ鎖のアミノ酸配列（抗ＭＩＣＡ抗体）（配列番号：１５０）。
【図３７】抗体ＩＤ１１（抗ＭＩＣＡ抗体）の軽鎖可変領域（ＶＬ）鎖の核酸配列（配列番号：１５１）。
【図３８】抗体ＩＤ１１（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号：１５２）。
【図３９】進行性黒色腫を有する患者における血清ＭＩＣＡ濃度の棒グラフ証明。血清ＭＩＣＡは、市販されているサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して検出した。血清を１：１０希釈で試験した。
【図４０】抗ＭＩＣＡ抗体が黒色腫患者血清とインキュベートされたＮＫ細胞についてのＮＫＧ２Ｄ下方制御をブロックすることを示す表。ＰＢＭＣを、コントロール血清または可溶性ＭＩＣＡを単独または１００ｕｇ／ｍｌでの指示された抗体の存在下で含む黒色腫患者サンプルと４８時間インキュベートした。４８時に、ＮＫＧ２Ｄ発現をＮＫ細胞（ＣＤ３−、ＣＤ８−、ＣＤ５６＋）についてフローサイトメトリーにより決定した。データはＮＫＧ２Ｄ陽性であるＮＫ細胞の％として示される。
【００４９】
【図４１】抗ＭＩＣＡ抗体が黒色腫患者血清とインキュベートされたＮＫ細胞によってＫ５６２標的細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介細胞毒性を増強することを示す一連のグラフ。ＰＢＭＣを、コントロール血清または可溶性ＭＩＣＡを単独または１００ｕｇ／ｍｌでの指示された抗体の存在下で含む黒色腫患者サンプルと４８時間インキュベートした。４８時に、細胞を洗浄し、２０：１のエフェクター対標的比で５１Ｃｒ標識Ｋ５６２標的細胞とインキュベートした。特異的溶解は、４時間後にシンチレーション計測により評価された。
【図４２】抗ＭＩＣＡ抗体が黒色腫患者血清とインキュベートされたＮＫ細胞によってＫ５６２標的細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介細胞毒性を増強することを示す一連のグラフ。ＰＢＭＣを、コントロール血清または可溶性ＭＩＣＡを単独または１００ｕｇ／ｍｌでの指示された抗体の存在下で含む黒色腫患者サンプルと４８時間インキュベートした。４８時に、細胞を洗浄し、２０：１のエフェクター対標的比で５１Ｃｒ標識Ｋ５６２標的細胞とインキュベートした。特異的溶解は、４時間後にシンチレーション計測により評価された。
【図４３】抗ＭＩＣＡ抗体が黒色腫患者血清とインキュベートされたＮＫ細胞によってＫ５６２標的細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介細胞毒性を増強することを示す一連のグラフ。ＰＢＭＣを、コントロール血清または可溶性ＭＩＣＡを単独または１００ｕｇ／ｍｌでの指示された抗体の存在下で含む黒色腫患者サンプルと４８時間インキュベートした。４８時に、細胞を洗浄し、２０：１のエフェクター対標的比で５１Ｃｒ標識Ｋ５６２標的細胞とインキュベートした。特異的溶解は、４時間後にシンチレーション計測により評価された。
【図４４】ヒトＭＩＣＡを発現するように形質導入されたＢ１６黒色腫細胞への抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９の結合を示すグラフ。指示された抗体を、Ｂ１６黒色腫細胞および１０ｕｇ／ｍｌでヒトＭＩＣＡを発現するように形質導入されたＢ１６黒色腫細胞とインキュベートし、染色をフローサイトメトリーにより分析した。
【図４５】Ｂ１６−ＭＩＣＡ腫瘍が脾臓のＮＫ細胞および腫瘍浸潤ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ発現を下方調節することを証明する一連のグラフ。ＮＫＧ２Ｄ発現は、非腫瘍マウスの脾臓または腫瘍を有する動物の脾臓および腫瘍から単離されたＮＫ細胞（ＣＤ３−、ＣＤ８−、ＣＤ３３５＋）においてフローサイトメトリーにより決定された。
【００５０】
【図４６】抗ＭＩＣＡ抗体処置がＢ１６−ＭＩＣＡ腫瘍を有するマウスにおいて血清−ＭＩＣＡレベルを減少させることを証明する一連のグラフ。Ｂ１６−ＭＩＣＡ腫瘍を有するＢ６マウスを、１週間に３回尾静脈注射によって１００ｕｇまたは２００ｕｇ／用量のＣＭ３３３２２  Ａｂ２９で処置した。最初の処置から１週間後、血液を回収し、血清ＭＩＣＡはＥＬＩＳＡにより測定された。
【図４７】抗ＭＩＣＡ抗体の投与がサンドイッチＥＬＩＳＡによるＭＩＣＡ検出を妨げないことを示すグラフ。組換えＭＩＣＡを１０００倍過剰の抗体と１８時間回転しながらインキュベートした。ＭＩＣＡ濃度は、サンドイッチＥＬＩＳＡにより決定された。
【図４８】抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９でのＢ１６−ＭＩＣＡ腫瘍を有するマウスの処置が腫瘍増殖を停止することを証明するグラフ。Ｂ１６−ＭＩＣＡ腫瘍を有するマウスを、腫瘍が直径５ｍｍに達したときに始まる、２００ｕｇ／用量のマウスＩｇＧ２ａ／κアイソタイプコントロールまたは抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９で静脈内に処置した。用量を週に３回投与し、腫瘍容量を毎日記録した。矢印は投与を示す。
【図４９】腫瘍細胞から分離するＭＩＣＡを減少させる抗ＭＩＣＡ抗体の能力を証明する一連のグラフ。ＲＰＭＩ−８２２６細胞を、１０ｕｇ／ｍｌのアイソタイプコントロール抗体、ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９、またはＣＭ２４００２  Ａｂ２の存在下で培養した。４８時間後、細胞を洗浄し、ＭＩＣＡ表面発現をフローサイトメトリーにより決定し、馴化培地における分離されるＭＩＣＡをサンドイッチＥＬＩＳＡにより評価した。
【図５０】抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２  Ａｂ２、ＣＭ３３３２２  Ａｂ４、およびＣＭ３３３２２  Ａｂ１１による細胞媒介毒性を証明する棒グラフ。５１Ｃｒ標識Ｋ５６２細胞を指示された抗体の存在下で３０分間インキュベートした。３０分で、全ＰＢＭＣを２０：１のエフェクター対標的比で加えた。特異的溶解は、４時間後にシンチレーション計測により評価された。
【００５１】
【図５１】腫瘍細胞から分離するＭＩＣＡを減少させる抗ＭＩＣＡ抗体の能力を証明する一連のグラフ。ＲＰＭＩ−８２２６細胞を、アイソタイプコントロール抗体、ＣＭ２４００２  Ａｂ２、ＣＭ３３３２２  Ａｂ４またはＣＭ３３３２２  Ａｂ１１の存在下で培養した。４８時間後、細胞を洗浄し、ＭＩＣＡ表面発現をフローサイトメトリーにより決定し、馴化培地における分離されるＭＩＣＡをサンドイッチＥＬＩＳＡにより評価した。
【図５２】抗ＭＩＣＡ抗体が黒色腫患者血清とインキュベートされたＮＫ細胞によってＫ５６２標的細胞のＮＫＧ２Ｄ−媒介細胞毒性を増強することを示す折れ線グラフ。ＰＢＭＣを、コントロール血清または可溶性ＭＩＣＡを単独または指示された抗体の存在下で含む黒色腫患者サンプルと４８時間インキュベートした。４８時に、細胞を洗浄し、０：１、１０：１および５：１のエフェクター対標的比で５１Ｃｒ標識Ｋ５６２標的細胞とインキュベートした。特異的溶解は、４時間後にシンチレーション計測により評価された。
【図５３】血清ＭＩＣＡによるＮＫＧ２Ｄの制御を示す一連のＦＡＣＳプロット。全ＰＢＭＣを、コントロール血清とまたは黒色腫血清を単独とまたは指示された抗体の存在下でと４８時間インキュベートした。４８時間後、細胞を洗浄し、ＮＫＧ２Ｄ表面発現をフローサイトメトリーにより評価した。
【図５４】抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２  Ａｂ２、ＣＭ３３３２２  Ａｂ４、およびＣＭ３３３２２  Ａｂ１１による細胞媒介毒性を示す折れ線グラフ。全ＰＢＭＣを、指示された抗体、ネガティブコントロール抗体（ＴＴＣＦ特異的）またはポジティブコントロール抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の存在下で組換えＭＩＣＡ（ｒＭＩＣＡ）と４８時間インキュベートした。特異的溶解は、４時間後に５１Ｃｒ放出により評価された。
【図５５】組換えＭＩＣＡによるＮＫＧ２Ｄの制御を示す一連のＦＡＣＳプロット。全ＰＢＭＣを、コントロール血清とまたはｒＭＩＣＡを単独でまたは指示された抗体の存在下で混合された血清と４８時間インキュベートした。４８時間後、細胞を洗浄し、ＮＫＧ２Ｄ表面発現をフローサイトメトリーにより評価した。
【００５２】
【図５６Ａ】ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９のエピトープは、ＭＩＣＡ＊００９のアミノ酸配列（配列番号：１６７）内に示される。
【図５６Ｂ】ＣＭ３３３２２  Ａｂ４のエピトープは、ＭＩＣＡ＊００９のアミノ酸配列（配列番号：１６７）内に示される。
【図５６Ｃ】ＣＭ３３３２２  Ａｂ１１のエピトープは、ＭＩＣＡ＊００９のアミノ酸配列（配列番号：１６７）内に示される。
【図５７】ＭＩＣＡ＊００９参照構造上のＣＭ３３３２２  Ａｂ２９およびＣＭ３３２２  ＡｂＢ４に対するエピトープのマッピング。エピトープマッピングは重複ペプチドアレイを使用して行われた。それぞれのペプチドは、それぞれのペプチドに対して１０アミノ酸分岐を有する２０アミノ酸直線状配列であった。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本開示は、対象とする抗原の四量体を用いＢ細胞を標識することで、疾患に罹患したヒト対象から、疾患において重要な治療標的を直接対象にする抗体を得ることができるという観察に一部基づく。上記背景技術の項で記載した通り、従来法には、少なくとも、ヒト対象において適切なＢ細胞を同定するのは非効率的であり、および／すなわち捕捉した任意のＢ細胞の表現型が変化し、ひいては有用性が低減されてしまうという制限がある。対照的に、本明細書に記載の方法は、疾患に関連する抗原を特異的に対象とする希少な記憶Ｂ細胞を捕捉することが可能である。以下に記載する通り、この方法は疾患に関連する抗原の四量体化を要するものであり、以下の実施例に記載する通りの工程により、適切な記憶Ｂ細胞の同定が強化される。詳細には、本明細書に記載の方法により、抗原に対する対象の初回曝露後、より長期間にわたって、適切な記憶Ｂ細胞をより効率的に捕捉できるようになる。本明細書に記載の方法は、本明細書で開示される方法を使用し捕捉した記憶Ｂ細胞から得られた遺伝子材料を使用して生成した抗体（およびこのような抗体の配列から生成されたペプチド）も包含する。
【００５４】
本明細書には、ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連性配列Ａ（ＭＩＣＡ）に対するヒト抗体が記載される。ＭＩＣＡに対するこれらのヒト抗体は、四量体抗原の使用を伴う方法により、細胞性癌ワクチン（ＧＭ−ＣＳＦを形質導入した自己腫瘍細胞）を接種した患者から同定された。
【００５５】
一部の例では、本開示は、選別されたヒト対象、および対象から得られる治療用組成物から、治療能を持つ抗体を特異的に得るまたは標的とする方法を提供する。これらの方法には、ヒト対象において免疫細胞を得るまたは標的とすること（ここで、免疫細胞には、限定するものではないが例えば、Ｂ細胞および／または記憶Ｂ細胞が含まれる）、得られたまたは標的とした免疫細胞から遺伝子材料（例えば、ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）を単離または精製すること、単離または精製された遺伝子材料を使用して治療用組成物、例えば、本明細書に開示される治療用組成物を製造すること、を包含させることができる。この方法についての詳細は、以下「方法」の項に提供する。
【００５６】
一部の例では、本開示は、状態または疾患を有するまたは有していた、および状態または疾患に対する正の免疫応答を示した対象において存在する抗体に関係する、治療用組成物（例えば、抗体、抗体断片、抗体誘導体、および／または抗体複合体などの治療用ペプチドを含む）を提供する。
【００５７】
治療用組成物
一部の例では、本明細書に記載の治療用組成物は、疾患または状態に関連する結合パートナー（例えば、免疫原（複数可）、抗原（複数可）、および／またはエピトープ（複数可））と相互作用（例えば、結合、特異的結合、および／または免疫特異的結合）することができ、治療用組成物および結合パートナー間の相互作用により、状態または疾患に対し正の免疫応答が生じる（例えば、対象において疾患または症状の程度が軽減する）。
【００５８】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１１の重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、および／または６）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む（例えば、含む、これから本質的になる、またはこれからなる）ペプチドを含有し得る。
【００５９】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示すＩＤ１、６、７、８、９または１１の重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、および／または６）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み（例えば、含み、これから本質的になり、またはこれからなり）、かつこれらのエピトープを含むＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連性配列Ａ（ＭＩＣＡ（例えば、ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．１３０８３８））（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ））と相互作用（例えば、結合、特異的結合、および／または免疫特異的結合）する、ペプチドを含有し得る。
【００６０】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１１のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合、および／または免疫特異的結合）する。一部の例では、ペプチドは少なくとも２つのＣＤＲを含んでよく、少なくとも２つのＣＤＲは、表１に示される異なる抗体のＣＤＲである。換言すれば、抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１１に関し表１に示す、ＣＤＲ（並びにＦＲおよび／またはＡＡ配列）は互換可能であり、かつペプチドがＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に対し結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）するのであれば、組み合わせてペプチドを生成することができる。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、９および／または１１のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤＩＤ１、６、７、８、９または１１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１１のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４のうち少なくとも１つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号２、７７、９６、１１３、１３１若しくは１５０のうちの１つ、および／または配列番号１１、７９、９８、１１５、１３３若しくは１５２のうちの１つを含む。各例において、ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）し得る。一部の例では、ペプチドおよびＭＩＣＡ間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭ、約５０ｎＭ〜２００ｎＭ、または１ｎＭ〜２０ｎＭ、例えば、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、または０．１０ｎＭ以下であってよい。
【００６１】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ１のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合、および／または免疫特異的結合）する。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ１のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ＩＤ１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４のうち少なくとも１つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号：２および／または配列番号：１１を含む。各例において、ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）し得る。一部の例では、ペプチドおよびＭＩＣＡ間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭ、約５０ｎＭ〜２００ｎＭ、または１ｎＭ〜２０ｎＭ、例えば、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、または０．１０ｎＭ以下であってよい。
【００６２】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ６のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合、および／または免疫特異的結合）する。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ６のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ６のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ６のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ＩＤ６のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ６のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ６のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４のうち少なくとも１つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号：７７および／または配列番号：７９を含む。各例において、ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）し得る。一部の例では、ペプチドおよびＭＩＣＡ間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭ、約５０ｎＭ〜２００ｎＭ、または１ｎＭ〜２０ｎＭ、例えば、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、または０．１０ｎＭ以下であってよい。
【００６３】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ７のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合、および／または免疫特異的結合）する。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ７のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ７のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ７のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ＩＤ７のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ７のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ７のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４のうち少なくとも１つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号：９６および／または配列番号：９８を含む。各例において、ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）し得る。一部の例では、ペプチドおよびＭＩＣＡ間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭ、約５０ｎＭ〜２００ｎＭ、または１ｎＭ〜２０ｎＭ、例えば、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、または０．１０ｎＭ以下であってよい。
【００６４】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ８のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合、および／または免疫特異的結合）する。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ８のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ８のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ８のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ＩＤ８のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ８のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ８のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４のうち少なくとも１つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号：１１３および／または配列番号：１１５を含む。各例において、ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）し得る。一部の例では、ペプチドおよびＭＩＣＡ間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭ、約５０ｎＭ〜２００ｎＭ、または１ｎＭ〜２０ｎＭ、例えば、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、または０．１０ｎＭ以下であってよい。
【００６５】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ９のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合、および／または免疫特異的結合）する。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ９のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ９のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ９のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ＩＤ９のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ９のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ９のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４のうち少なくとも１つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号：１３１および／または配列番号：１３３を含む。各例において、ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）し得る。一部の例では、ペプチドおよびＭＩＣＡ間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭ、約５０ｎＭ〜２００ｎＭ、または１ｎＭ〜２０ｎＭ、例えば、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、または０．１０ｎＭ以下であってよい。
【００６６】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合、および／または免疫特異的結合）する。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ１１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ１１のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ＩＤ１１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ１１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１１のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４のうち少なくとも１つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号：１５０および／または配列番号：１５２を含む。各例において、ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）し得る。一部の例では、ペプチドおよびＭＩＣＡ間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭ、約５０ｎＭ〜２００ｎＭ、または１ｎＭ〜２０ｎＭ、例えば、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、または０．１０ｎＭ以下であってよい。
【００６７】
一部の例では、、治療用組成物は、配列番号：２および／または配列番号：１１；配列番号：７７および／または配列番号：７９；配列番号：９６および／または配列番号：９８；配列番号：１１３および／または配列番号：１１５；配列番号：１３１および／または配列番号：１３３；および／または配列番号：１５０および／または配列番号：１５２を含むペプチドを含有するものであり得る。
表１
【表１−１】
0006397886.tif 000002
【表１−２】
0006397886.tif 000003
【表１−３】
0006397886.tif 000004
【表１−４】
0006397886.tif 000005
【表１−５】
0006397886.tif 000006
＊  配列は、記載の配列に対し（例えば、少なくとも）８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％配列同一性を有する配列または変異体を含む。
＊＊  配列は、１、２、３、４、５、５未満、または１０未満で保存的なアミノ酸の改変を含有し得る。
＃  配列は、記載の配列、例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４の相当する領域内に対し（例えば、少なくとも）８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％配列同一性を有し、並びに／あるいはＣＤＲ  １、２、および／または３の相当する領域内に１、２、３、４、５、５未満、または１０未満で保存的なアミノ酸の改変を有する、配列または変異体を含む。
＃＃  配列は、記載の配列に対し（例えば、少なくとも）８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％配列同一性を有する配列または変異体を含み、配列は対応するアミノ酸（ＡＡ）をコードする。
ＡＡ＃は、ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列を示す。
核酸＃＃は、ＶＨまたはＶＬ核酸配列を示す。
【００６８】
ＣＤＲおよびＦＲ領域を上記に示したが、このような領域はカバットの手法に従って定義することもできる（「免疫対象となるタンパク質配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７および１９９１年））。同様に、抗体または抗原結合断片に対するアミノ酸付番も、カバットの手法に従う。
【００６９】
「ペプチド」は、鎖の長さにおいて上限なしで、少なくとも２つの連続的に連結されたアミノ酸残基を含む鎖を示す。タンパク質における１つ以上のアミノ酸残基は、限定はしないが、例えばグリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合形成のような修飾を含み得る。用語「ペプチド」は、本願明細書において「ポリペプチド」および「タンパク質」と相互互換である。
【００７０】
一部の例では、治療用組成物には、例えば、完全長の抗体および／若しくはインタクトな抗体、または抗体断片などといった抗体を含むペプチドが含有され得る。「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介し、糖、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合することのできる、免疫グロブリン分子である。本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけではなく、任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）またはそれらの一本鎖、抗体を含む融合タンパク質、および任意のその他の改変を受けた、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の構成成分も包含する。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはこれらのサブクラス）などの任意のクラスの抗体を包含し、特定のクラスの抗体である必要はない。抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに分類することができる。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちの幾種類かは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分けることもできる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。各クラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元構造は公知である。
【００７１】
代表的な抗体および抗体断片としては、限定するものではないが、モノクローナル抗体（完全長のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合断片から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ラクダ化（camelised）抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、所望の生物活性（例えば、抗原結合部分）を示す抗体断片、ジスルフィド結合させたＦｖｓ（ｄｓＦｖ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体など）、細胞内抗体、並びに上記の任意のエピトープ結合断片が挙げられる。抗体または抗体断片はヒト型またはヒト化抗体であってよい。
【００７２】
抗体は、一般的に、１０５から１０１１Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）により反映される高親和性にて同種抗原に特異的に結合する。約１０４Ｍより大きい任意のＫＤは、一般的に非特異的結合を示すと考えられる。本明細書において使用されるとき、抗原に「特異的に結合する」抗体は、１０７Ｍ以下、好ましくは１０８Ｍ以下、よりさらに好ましくは５ｘ１０９Ｍ以下、およびより好ましくは１０８Ｍから１０１０Ｍ以下のＫＤを有することを意味する高親和性にて非関連抗原に結合しないが、高親和性にて抗原および実質的に同一の抗原に結合する抗体を示す。抗原は、所定の抗原に対し高度の配列同一性を示すとき、例えば、所定の抗原の配列に対し少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％、またはよりさらに好ましくは少なくとも９９％配列同一性を示すとき、所定の抗原と「実質的に同一」である。一例として、ヒトＭＩＣＡに特異的に結合する抗体はまた、ある霊長種由来のＭＩＣＡ抗原（例えば、カニクイザルＭＩＣＡ）と交差反応性を有し得るが、他の種由来のＭＩＣＡ抗原またはＭＩＣＡ以外の抗原と交差反応し得ない。
【００７３】
抗体のフラグメントは、完全長抗体の抗原結合部分を含み、完全長抗体の所望のアフィニティーおよび特異性を保持する限り、提供される方法において使用するために適当である。本明細書において使用されるとき、抗体の用語「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）は、抗原（例えば、ヒトＭＩＣＡ）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを指す。このような「フラグメント」は、例えば約８から約１５００アミノ酸長、適当には約８から約７４５アミノ酸長、適当には約８から約３００、例えば約８から約２００アミノ酸、または約１０から約５０または１００アミノ酸長である。したがって、抗ＭＩＣＡ抗体のフラグメントは、Ｆｖ部分においてＭＩＣＡに結合する能力、およびＦｖ部分において樹状細胞、マクロファージ、好中球、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞におけるＦｃ受容体に結合する能力を保持する。このようなフラグメントは、対応する完全長抗ＭＩＣＡ抗体と同様の特性により特徴付けられる、すなわち、該フラグメントは、ヒト細胞の表面に発現されるヒトＭＩＣＡ抗原、または培地に分離されている対応するｓＭＩＣＡ抗原に特異的に結合する。
【００７４】
抗体の抗原結合機能は全長抗体のフラグメントによって行うことができることが示されている。抗体の用語「抗原結合部分」内に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）または（ｖｉｉ）所望により合成リンカーによって連結され得る２つまたはそれ以上の単離されたＣＤＲの組合せを含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対を成し一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖として作られることが可能である合成リンカーによって、連結され得る（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３）。このような一本鎖抗体はまた、抗体の用語「抗原結合部分」内に包含されることが意図される。これらの抗体断片は当業者に知られる慣用の技術を使用して得られ、該断片は無傷な抗体と同じ方法において有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷な免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的開裂によって、生産され得る。
【００７５】
Ｆｖ断片は完全な抗原認識部位および結合部位を含有している抗体断片である。これらの領域は、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインが緊密に会合した２量体から構成され、これらのドメインは、天然では、例えばｓｃＦｖにて共有結合し得る。このドメインの立体構造中で、各可変ドメインの３箇所のＣＤＲが相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体表面の抗原結合部位を形成する。総じて、抗体には、６つのＣＤＲまたはこれらのサブセットにより、抗原に対する結合特異性が付与される。単一の可変ドメイン（すなわち、Ｆｖのうち、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含む片鎖）であっても、抗原に対する認識能および結合能を有する場合もあるものの、通常は、完全な結合部位と比較して親和性が低くなる。
【００７６】
一本鎖Ｆｖまたは（ｓｃＦｖ）抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般的に、ＦｖポリペプチドはＶＨおよびＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓｃＦｖは抗原を結合するのに望ましい構造を形成することができる。
【００７７】
Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の可変および定常ドメイン、並びに重鎖の可変ドメインおよび第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、断片分子同士が、一般的に、カルボキシ末端近傍においてシステイン残基からなるヒンジ部位により共有結合している、一対のＦａｂフラグメントを含む。抗体断片のその他の化学的カップリング法も当該技術分野において既知である。
【００７８】
「二重特異性」または「二機能性抗体」は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含む種々の方法によって生産され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ＆  Ｌａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７９：３１５−３２１  （１９９０）；  Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８、１５４７−１５５３  （１９９２）参照。
【００７９】
二重特異性抗体は、抗原結合部位を２つ有する小型の抗体断片であり、この断片は、同様のポリペプチド鎖（ＶＨおよびＶＬ）中でＶＨがＶＬに連結している。同一鎖上の２つのドメインを対形成させるのには短すぎるリンカーを使用すると、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対形成し、抗原結合部位を２つ生成する。
【００８０】
線状抗体は、一対の抗原結合領域を形成する、タンデムに連結したＦｄ断片対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）と相補的な軽鎖ポリペプチドとをともに含む。線状抗体は、二重特異的または単一特異的なものであり得る。
【００８１】
本開示の抗体および抗体断片には、所望のエフェクター機能または血清半減期を得るためＦｃ領域において改変を加えることができる。一部の例では、Ｆｃ領域は、血清半減期を延長するためにＰＥＧまたはアルブミンと結合させることができ、あるいは所望の効果が得られる何らかのその他の複合体とすることができる。あるいは、副作用または治療による合併症を最小限に抑えるためにエフェクター機能を除去または抑制するのが望ましい場合には、何らかの他のＦｃ領域を使用することもできる。
【００８２】
ヒトおよびヒト化抗体には、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する（すなわちこれらの由来するものと同じアミノ酸配列を有する）抗体が含まれる。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列にはコードされていないアミノ酸残基を、例えば、ＣＤＲ中、特にＣＤＲ３中に含有し得る（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてランダム変異または部位特異的変異により、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて体細胞変異により、変異が導入され得る）。本明細書において使用されるとき、用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって調製、発現、作製または単離される全てのヒト抗体、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたは導入染色体(transchromosomal)の動物（例えば、マウス）またはそこから調製されるハイブリドーマから単離される抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、（ｃ）組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、および（ｄ）他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含むあらゆる他の手段によって調製、発現、作製または単離される抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、例えば抗体成熟中に起こる後の再配列および突然変異を含むが、生殖細胞系列遺伝子によってコードされる特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列を利用する可変および定常領域を含む。当分野で知られているとおり（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  （２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２３（９）：１１１７−１１２５参照）、可変領域は、抗原結合ドメインを含み、外来抗原に特異的な抗体を形成するように再配置する種々の遺伝子によってコードされる。再配列に加えて、可変領域は、外来抗原に対する抗体のアフィニティーを増加させるように、多数の単一のアミノ酸変化（体細胞突然変異または超突然変異(hypermutation)と称される）によってさらに修飾され得る。定常領域は、抗原にさらに応答して変化する（すなわち、アイソタイプスイッチ）。したがって、抗原に応答して軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする再配置された、および体細胞変異された核酸分子は、元の核酸分子と配列同一性を有さないが、代わりに実質的に同一または類似であり得る（すなわち、少なくとも８０％同一性を有する）。
【００８３】
「ヒト」抗体（ＨｕＭＡｂ）は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を示す。さらに、抗体が定常領域を含むとき、定常領域もまたヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。本願発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）。しかしながら、本明細書において使用されるとき、用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種、例えばマウスの生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフトされている抗体を含むことを意図しない。用語「ヒト」抗体および「完全ヒト」抗体は同義的に使用される。
【００８４】
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲドメイン外のいくつかの、多くの、または全てのアミノ酸がヒト免疫グロブリン由来の対応するアミノ酸で置換されている抗体を示す。抗体のヒト化形態の１つの態様において、１つ以上のＣＤＲ領域内のいくつかの、多くの、または全てのアミノ酸が変化していないのに対して、ＣＤＲドメイン外のいくつかの、多くの、または全てのアミノ酸がヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸で置換されている。特定の抗原に結合する抗体の能力を破壊しない限り、アミノ酸の小さい付加、欠失、挿入、置換または修飾が許される。「ヒト化」抗体は、元の抗体と同様の抗原特異性を保持する。
【００８５】
「キメラ抗体」は、可変領域がある種に由来し、定常領域が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域がマウス抗体に由来し、定常領域がヒト抗体に由来する抗体を示す。
【００８６】
本明細書で使用するとき、用語「エピトープ」は、抗体が結合し得るタンパク質決定因子を指す。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基から構成され、かつ通常、特異的な立体構造特性、並びに特異的な電荷特性を有する。エピトープは、タンパク質の三次折り畳みに並べられている隣接していないアミノ酸（例えば、立体構造エピトープ）または隣接するアミノ酸（例えば、非立体構造エピトープ）の両方で形成され得る。立体構造および非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下において、前者に対する結合は失われるのに対し、後者に対する結合は失われないという点で区別される。エピトープは、一般的に、ユニークな空間配座において少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。何のエピトープが所定の抗体に結合されるかを決定するための方法（すなわち、エピトープマッピング）は、当分野でよく知られており、（例えば、ＭＩＣＡからの）重複または隣接するペプチドを所定の抗体（例えば、抗ＭＩＣＡ抗体）との反応性について試験する、例えば免疫ブロット法および免疫沈降アッセイを含む。エピトープの空間配座を決定する方法は、当分野の技術および本明細書に記載されているもの、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴を含む（例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)参照）。
【００８７】
用語「エピトープマッピング」は、抗体抗原認識のための分子決定因子の同定のプロセスを示す。
【００８８】
抗体または抗体断片に対する用語「エピトープに結合する」または「エピトープを認識する」は、抗原内でのアミノ酸の連続的または不連続的なセグメントを示す。当業者は、該用語は、抗体または抗体断片がエピトープ配列内のあらゆるアミノ酸と直接接触していることを必ずしも意味しないことを理解している。
【００８９】
２つ以上の抗体に対する用語「同じエピトープに結合する」は、抗体がアミノ酸の同じ、重複または包括的な、連続的または不連続的なセグメントに結合することを意味する。当業者は、フレーズ「同じエピトープに結合する」が抗体が同じアミノ酸に正確に結合または接触することを必ずしも意味しないことを理解している。抗体が接触する正確なアミノ酸は異なっていてもよい。例えば、第１の抗体は、第２の抗体によって結合されるアミノ酸のセグメントによって完全に包含されるアミノ酸のセグメントに結合することができる。他の例において、第１の抗体は、第２の抗体によって結合される１つ以上のセグメントと有意に重複するアミノ酸の１つ以上のセグメントに結合する。この目的のために、このような抗体は、「同じエピトープ」に結合すると考える。
【００９０】
したがって、本明細書に記載されている特定の抗体により認識されるエピトープ（例えば、同じまたは重複領域またはその領域間のまたはその領域にわたる領域）のすべてまたは一部（例えば、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸、連続的または不連続的）を含むＭＩＣＡ上のエピトープに結合する抗体も、本願発明に包含される。
【００９１】
本明細書に記載されている抗体と「ＭＩＣＡ上の同じエピトープ」に結合する抗体を決定するための技術は、例えば、エピトープマッピング方法、例えば、エピトープの原子分解を提供する抗原：抗体複合体の結晶のｘ線分析を含む。他の方法は、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾によって結合の喪失がエピトープ構成要素の指標(indication)としばしば考えられる、抗原フラグメントまたは抗原の突然変異への抗体の結合をモニタリングする。加えて、エピトープマッピングのためのコンピューターによるコンビナトリアル方法も使用することができる。これらの方法は、特異的な短ペプチドをコンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから単離する興味ある抗体の能力に頼る。次に、このペプチドは、ペプチドライブラリーをスクリーニングするために使用される抗体に相当するエピトープの定義のための手がかりと見なされる。エピトープマッピングについて、立体構造の不連続的なエピトープをマッピングするように示されるコンピューターによるアルゴリズムも開発されている。
【００９２】
ＭＩＣＡへの結合について本明細書に記載されている抗体と競合する抗体も本願発明に包含される。同じエピトープを認識する、または結合について競合する抗体は、日常的な技術を使用して同定することができる。このような技術は、例えば、ある抗体の、標的抗原への別の抗体の結合をブロックする能力を示す免疫測定法、すなわち、競合的結合アッセイを含む。競合的結合は、試験下で免疫グロブリンが共通の抗原への参照抗体の特異的結合を阻害するアッセイ、例えばＭＩＣＡにおいて決定される。多くのタイプの競合的結合アッセイが知られている、例えば：固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９：２４２  （１９８３）参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３７：３６１４  （１９８６）参照）；固相直接標識化アッセイ、固相直接標識化サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８８）参照）；Ｉ−１２５ラベルを使用する固相直接ラベルＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２５（１）：７  （１９８８）参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６  （１９９０））；および直接標識化ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３２：７７  （１９９０））。一般的に、かかるアッセイは、非標識試験免疫グロブリンおよび標識化参照免疫グロブリンのいずれかを有する細胞または固体表面に結合される精製された抗原の使用を含む。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で細胞または固体表面に結合される標識の量を決定することにより測定される。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。通常、競合する抗体が過剰に存在するとき、それは参照抗体の共通の抗原への特異的結合を少なくとも５０−５５％、５５−６０％、６０−６５％、６５−７０％、７０−７５％またはそれ以上阻害する。
【００９３】
本明細書において使用される用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合」および「特異的に結合」は、あらかじめ決定された抗原上のエピトープへの抗体結合を示す。一般的に、抗体は、分析物として組換えＭＩＣＡおよびリガンドとして抗体を使用してＢＩＡＣＯＲＥ  ２０００器具において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により決定されるとき、約１０−７Ｍ未満、たとえば約１０８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満または１０−１０Ｍまたはそれ未満の平衡解離定数（ＫＤ）で結合し、あらかじめ決定された抗原または密接に関連した抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対する親和性よりも少なくとも２倍良いアフィニティーであらかじめ決定された抗原に結合する。したがって、「ヒトＭＩＣＡに特異的に結合する」抗体は、１０−７Ｍ以下、たとえば約１０８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満または１０−１０Ｍ未満またはそれ未満のＫＤでヒトＭＩＣＡに結合する抗体を示す。「カニクイザルＭＩＣＡと交差反応する」抗体は、１０−７Ｍ以下、たとえば約１０８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満または１０−１０Ｍ未満またはそれ未満のＫＤでカニクイザルＭＩＣＡに結合する抗体を示す。１つの態様において、非ヒト種由来のＭＩＣＡと交差反応しないこのような抗体は、標準結合アッセイにおいてこれらのタンパク質に対して本質的に検出不可能な結合を示す。
【００９４】
本明細書において使用されるとき、用語「ｋａｓｓｏｃ」または「ｋａ」は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を示すように意図されている一方、本明細書において使用されるとき、用語「ｋｄｉｓ」または「ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を示すように意図されている。本明細書において使用されるとき、用語「ＫＤ」は、解離定数を示すように意図されており、それはｋｄ対ｋａの比（すなわちｋｄ／ｋａ）から得られ、かつモル濃度（Ｍ）として表現されるものである。抗体に対するＫＤ値は、当該技術分野で十分に確立された方法を用いて決定可能である。抗体のＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムの利用によるものである。
【００９５】
本明細書において使用されるとき、ＩｇＧ抗体に対する用語「高親和性」は、標的抗原に対して１０−８Ｍ以下、さらに好ましくは１０−９Ｍ以下、よりさらに好ましくは１０−１０Ｍ以下のＫＤを有する抗体を示す。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに応じて変化しうる。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合は１０−７Ｍ以下、さらに好ましくは１０−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を示す。
【００９６】
本明細書において使用される用語「ＥＣ５０」は、インビトロまたはインビボアッセイのいずれかにおいて応答を誘導し、最大応答の５０％、すなわち、最大応答およびベースラインの中間である抗体またはその抗原結合部分の濃度を示す。
【００９７】
用語「固定されたＭＩＣＡに結合」は、例えば、細胞の表面上に発現された、または固体支持体に付着されている、ＭＩＣＡに結合する本願発明の抗体の能力を示す。
【００９８】
本明細書において使用される用語「交差反応」は、本願発明の抗体が異なる種からのＭＩＣＡに結合する能力を示す。例えば、ヒトＭＩＣＡに結合する本願発明の抗体はまた、別の種のＭＩＣＡ（例えば、カニクイザルＭＩＣＡ）に結合し得る。本明細書において使用される交差反応性は、結合アッセイ（例えば、ＳＰＲ、ＥＬＩＳＡ）において精製された抗原との特異的反応性またはＭＩＣＡを生理学的に発現する細胞への結合または当該細胞と機能的相互作用を検出することにより測定される。交差反応性を決定するための方法は、本明細書に記載されている標準結合アッセイ、例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ  ２０００  ＳＰＲ器具（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用するＢｉａｃｏｒｅＴＭ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析、またはフローサイトメトリー技術を含む。
【００９９】
可変ドメインの「ＣＤＲ」は、超可変領域内のアミノ酸残基であり、カバット（Kabat）、コチア（Chothia）の定義に従って同定される。カバットおよびコチアの両方の蓄積、ＡｂＭ、接触性、および／または立体構造の定義、またはＣＤＲ決定に関わる何らかの手法は、当該技術分野で公知である。抗体ＣＤＲは、もともとはカバットらにより定義された超可変領域として同定することもできる。例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，「免疫対象となるタンパク質配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．を参照されたい。ＣＤＲの位置は、元々コチアおよびその他の著者らにより報告されているループ構造としても同定することができる。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７〜８８３を参照されたい。ＣＤＲを同定するその他の手法としては、「ＡｂＭの定義」が挙げられる。ＡｂＭは、カバットおよびコチアの定義に含まれ、かつＯｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリング用ソフトウェア（現Ａｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））、または抗原の接触性についての観察に基づくＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２〜７４５に記載のＣＤＲの「接触性の定義（contact definition）」を使用して導くことができる。本明細書においてＣＤＲの「立体構造の定義」として参照される、別のアプローチでは、ＣＤＲの配置は、抗原を結合するようエンタルピーを作用させる残基配置として同定することができる。例えば、Ｍａｋａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８３：１１５６〜１１６６を参照されたい。さらに別の、ＣＤＲの境界についての定義は、上記の手法のいずれかに固執するものではないがカバットのＣＤＲと少なくとも一部重なるものの、特定の残基、若しくは残基群、またはさらには完全なＣＤＲが、抗原の結合性に著しく影響を与えないという予測または実験による所見を考慮して、短縮または延長することができる。本明細書で使用するとき、ＣＤＲは、当該技術分野において既知の任意の手法（手法の組み合わせを包含する）により定義されたＣＤＲを指す。本明細書で使用する方法では、これらのアプローチのうちのいずれかに従って規定されたＣＤＲを利用することができる。１つ以上のＣＤＲを含有する任意の所与の実施形態に際し、ＣＤＲは、カバット、コチア、伸長、ＡｂＭ、接触法、および／または立体構造の定義のうちのいずれかに従って規定することができる。
【０１００】
一部の例では、例えば、未改変のペプチドと比較して、ペプチド変異体の抗原結合特性が維持されるかまたは改善されるのであれば、本明細書で開示されるペプチドのアミノ酸配列に改変および変更を加え、ペプチド変異体（例えば、本明細書で開示されるペプチドに対し規定の配列相同性を有するペプチド）を作製してもよい（任意の改変ペプチドの抗原結合特性は、本明細書に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ並びに／あるいは当該技術分野において既知の手法を使用して評価することができる）。
【０１０１】
一般的に、ペプチド変異体はアミノ酸レベルで観察されかつ考察される一方で、実際の改変は、典型的には核酸レベルで導入されまたは実施される。例えば、表１に示すペプチドに対し８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、または９９％アミノ酸配列同一性を有する変異体は、配列番号１、１０、７６、７８、９５、９７、１１２、１１４、１３０、１３２、１４９、および／または１５１をコードしている核酸、またはこれらの部分／断片を、当該技術分野において既知の手法（例えば、クローニング法）、および／または本明細書で開示される手法を用い改変することにより作成できる。
【０１０２】
アミノ酸配列の改変は、典型的には、置換、挿入、または欠失による改変の３種類のうちの１つ以上に当てはまる。挿入には、アミノおよび／または末端の融合、並びに配列中への単一または複数のアミノ酸残基の挿入が含まれる。通常、挿入は、アミノまたはカルボキシ末端の融合と比較して、より小さな挿入であり、例えば、約１〜４残基ほどである。欠失は、タンパク質配列からの１つ以上のアミノ酸残基の除去により特徴づけられる。典型的には、タンパク質分子内のいずれか一箇所にて約２〜６未満の残基が欠失している。アミノ酸置換は、典型的には単一残基のものであるが、一度に複数の異なる位置に生じる場合もある；挿入は、通常、約１〜１０個のアミノ酸残基である；欠失は、約１〜３０残基の範囲である。欠失または挿入は隣接する対になすことができ、すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入をなすことができる。置換、欠失、挿入、またはこれらの任意の組み合わせを合わせて、最終的なコンストラクトを得ることもできる。変異は、読み枠外の配列に配置すべきではなく、および好ましくは、ｍＲＮＡの二次構造を生成し得る相補性決定領域に作成すべきではない。置換による改変は、少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその部位に挿入されるというものである。一部の例では、置換は、保存的アミノ酸置換であり得る。一部の例では、本明細書に記載のペプチドには、表１に示すペプチドに対する１つ以上の保存的アミノ酸置換を含有させることができる。例えば、変異体は、表１に示すペプチドに対し、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２０〜３０、３０〜４０、または４０〜５０個の保存的アミノ酸置換を含有し得る。あるいは、変異体は、表１に示すペプチドに対する５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下の保存的アミノ酸置換を含有し得る。このような置換は、概して以降の表２に従ってなされ、かつ保存的置換と呼ばれる。タンパク質の改変に対する許容性を予測する方法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１０１（２５）：９２０５〜９２１０（２００４）を参照されたい）。
【０１０３】
【表２】
0006397886.tif 000007
【０１０４】
一部の例では、置換は非保存的なものである。例えば、表１に示すペプチド中のアミノ酸は、ペプチドの何らかの特性または態様を変更し得るアミノ酸により置換することができる。一部の例では、非保存的アミノ酸置換は、例えば、ペプチドの構造を変化させ、ペプチドの結合特性を変化する（例えば、抗原に対するペプチドの結合親和性を増加または減少させる、並びに／あるいは、抗原に対するペプチドの結合特異性を増加または減少させる）ためになすことができる。
【０１０５】
一部の例では、ペプチドおよび／またはペプチド変異体には、表１に示すペプチドの断片を含有させることができ、あるいは断片であってよい。このような断片には、例えば、断片が、完全長のペプチドの結合特性を少なくとも一部保有するのであれば、例えば、表１に示すＣＤＲ、ＦＲ、および／またはＡＡと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０〜１００、１０１〜１５０個少ないアミノ酸を含有させ得る（例えば、完全長のペプチドの結合特性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％）。切断はアミノ末端、カルボキシ末端、および／または本明細書に記載のペプチド内に行うことができる。
【０１０６】
一部の例では、ペプチド変異体の相互作用面は、例えば、未改変のペプチドに対するペプチド変異体の結合特性を、変更（例えば、増強または減弱）、保存、または維持するための改変を受けていないペプチドのものと同様（例えば、ほぼ同様）であり得る。ペプチドの相互作用面を同定する手法は当該技術分野において既知である（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ：Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，６：１４７１〜２１０５（２００７）；Ａｎｄｒａｄｅ  ａｎｄ  Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，６４（１１）：１７７７〜１７８１（１９９２）；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，７７（１）：１４〜２５（２００９）；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ：並びにＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１０：１４７１〜２１０５（２００９）。
【０１０７】
当業者であれば、２つのポリペプチド（例えば、未改変のペプチドおよびペプチド変異体）の同一性を評価する方法については容易に判断する。例えば、同一性は、同一度が最も高くなるように２つの配列を整列させた後に算出することができる。同一性を算出する別の方法は、公開されているアルゴリズムにより実施することができる。配列比較の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ，２：４８２（１９８１）の局所同一性アルゴリズム（local identity algorithm）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）と同様の検索方法、コンピュータへのこれらのアルゴリズムの実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェア・パッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または観察により実施することができる。
【０１０８】
同様の種類の同定は、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８〜５２（１９８９）；Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６〜１０（１９８９）；Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１〜３０６（１９８９）に開示されるアルゴリズムにより、核酸についても得ることができ、これらの文献は、少なくとも、核酸アラインメントに関係する要素を参照することにより、本明細書に組み込まれる。典型的には任意の方法を使用できること、並びに特定の例においてはこれらの各種方法により得られる結果が異なっていることは理解されるが、当業者であれば、これらの方法のうち少なくとも１つにより同一性が認められた場合、配列は記載の同一性を有するものとされ、かつ本明細書で開示される配列であるとみなされることは理解するであろう。
【０１０９】
２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列で共有される同一位置の数の関数（すなわち％相同性＝同一位置の＃／位置の全体＃×１００）であり、２つの配列の最適なアラインメントにおいて導入される必要がある。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、下記の非限定例にて記載のように数学的アルゴリズムを用いて行われうる。
【０１１０】
２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０または８０のギャップ重量および１、２、３、４、５もしくは６の長さ重量を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.com入手可能）内のＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｅ．  ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．  Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ、４：１１−１７  （１９８９））を用いて決定可能であり、同アルゴリズムはＰＡＭ１２０重み残基テーブル(weight residue table)、１２のギャップ長ペナルティ(Gap length penalty)および４のギャップペナルティを用いてＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に導入されている。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （４８）：４４４−４５３  （１９７０））アルゴリズムを用いて決定可能であり、同アルゴリズムはＢｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかと、１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４のギャップ重量および１、２、３、４、５もしくは６の長さ重量を用いてＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）内のＧＡＰプログラム中に包含されている。
【０１１１】
本願発明の核酸およびタンパク質配列をさらに「クエリー配列」として用い、公的データベースで探索を行い、例えば、例えば関連配列を同定することが可能である。かかる探索は、Altschul、et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行可能である。ＢＬＡＳＴヌクレオチドの探索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行うことで、本願発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質の探索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことで、本願発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップドアラインメント（ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）を得るため、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴは、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されているように利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、各プログラムのデフォルトパラメータ（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照のこと。
【０１１２】
一部の例では、以降の方法の項においてより詳細に記載される通り、本明細書で開示される治療用組成物は、本明細書で開示される方法を使用して得られた免疫細胞（例えば、記憶Ｂ細胞などのＢ細胞）から単離および／または精製された遺伝子材料（例えば、ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）を使用して作製することができる。このような遺伝子材料が得られた場合に、本明細書で開示される治療用組成物をこのような遺伝子材料を使用して作製する方法は当該技術分野において既知であり、および／または以下に要約される。
【０１１３】
一部の例では、ペプチドには検出可能な標識を含有させ得る。本明細書で使用するとき、「標識」は、標識を取り付けられるペプチドの検出を可能にする部位に組み込まれた、少なくとも１つのエレメント、同位体、または官能基を指す。標識は直接取り付けることができ（すなわち、結合を介して）、またはリンカー（例えば、環状または非環状、分岐状または非分岐状、置換または非置換アルキレン；環状または非環状、分岐状または非分岐状、置換または非置換アルケニレン；環状または非環状、分岐状または非分岐状、置換または非置換アルキニレン；環状または非環状、分岐状または非分岐状、置換または非置換ヘテロアルキレン；環状または非環状、分岐状または非分岐状、置換または非置換ヘテロアルケニレン；環状または非環状、分岐状または非分岐状、置換または非置換ヘテロアルキニレン；置換または非置換アリーレン；置換または非置換ヘテロアリーレン；あるいは置換または非置換アシレン（acylene）、あるいはこれらのうちの、リンカーを構成させることのできる任意の組み合わせ）により取り付けることができる。標識は、生物活性または検出される本発明のポリペプチドの特性に干渉しない任意の位置にて、ペプチドに取り付けることができる。
【０１１４】
標識としては、限定するものではないが、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、６７Ｇａ、９９ｍＴｃ（Ｔｃ−９９ｍ）、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１６９Ｙｂ、および１８６Ｒｅといった放射性同位体または重同位体などであり得る同位体部位を含有する標識；酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）と結合し得る抗体または抗原であり得る免疫性部分または免疫反応性部分を含有する標識；着色、冷光、リン光などの標識、または蛍光部分（例えば、蛍光標識ＦＩＴＣなど）を含有する標識；１つ以上の光親和性部分を有する標識；１つ以上の既知の結合パートナー（ビオチン−ストレプトアビジン、ＦＫ５０６−ＦＫＢＰなど）を有するリガンド部分を有する標識を挙げることができる。
【０１１５】
一部の例では、標識には、生物システムにおいて分子間相互作用を直接的に解明するために、１つ以上の光親和性部分を含有させることができる。各種既知の発光分子を使用することができ、殆どの場合、ジアゾ化合物類、アジド類、ジアジリニン類のナイトレン類またはカルベン類への光分解（photoconversion）を利用する（例えば、Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．，Ｐｈｏｔｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８３），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍを参照されたい。この非特許文献は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）。本発明の特定の実施形態では、光親和性の標識としては、限定するものではないが、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸などといった、１つ以上のハロゲン部分により置換されたｏ−、ｍ−、およびｐ−アジゾベンゾイル類が使用される。
【０１１６】
標識は撮像剤であってもよく、または撮像剤として利用することもできる。撮像剤の例としては、限定するものではないが、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピューター断層撮影法（ＣＡＴ）、単一光子放射断層撮影法、Ｘ線法、蛍光透視法、および磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）；制吐薬；並びに造影剤に使用されるものが挙げられる。診断薬の例としては、限定するものではないが、蛍光分子、冷光分子、磁気分子；ガドリニウム系キレート剤（例えば、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、ＤＯＴＡ、およびＨＰ−ＤＯ３Ａを併用したガドリニウム系キレート剤）、鉄キレート剤、マグネシウムキレート剤、マンガンキレート剤、銅キレート剤、クロムキレート剤、ＣＡＴおよびＸ線撮像に有用なヨウ素系化合物、並びに放射性核種が挙げられる。好適な放射性核種としては、限定するものではないが、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３０Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｉ、１３５Ｉ、４７Ｓｃ、７２Ａｓ、７２Ｓｅ、９０Ｙ、８８Ｙ、９７Ｒｕ、１００Ｐｄ、１０１ｍＲｈ、１１９Ｓｂ、１２８Ｂａ、１９７Ｈｇ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、１０９Ｐｄ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、６７Ｃｕ、７５Ｂｒ、７７Ｂｒ、９９ｍＴｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５０、３２Ｐ、３３Ｐ、および１８Ｆが挙げられる。
【０１１７】
蛍光および冷光分子としては、限定するものではないが、「染料」、「標識」、または「指示薬」として一般に呼ばれる異なる各種有機または無機小分子が挙げられる。例としては、限定するものではないが、フルオレセイン、ローダミン、アクリジン染料、Ａｌｅｘａ、シアニン染料などが挙げられる。蛍光および冷光分子としては、天然に生じる各種タンパク質およびその誘導体、例えば、遺伝子組換えされた変異体を挙げることができる。例えば、蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ、赤色、青色、黄色、シアン色、およびサファイア色蛍光タンパク質、造礁サンゴ蛍光タンパク質などが挙げられる。冷光タンパク質としては、ルシフェラーゼ、エクオリン、およびこれらの誘導体が挙げられる。当該技術分野においては、数多くの蛍光および冷光染料並びにタンパク質が知られている（例えば、米国特許出願公開第２００４／００６７５０３号；Ｖａｌｅｕｒ，Ｂ．，「分子蛍光：原理および応用（Molecular Fluorescence: Principles and Applications），」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，２００２；並びに「蛍光プローブおよび探索分子、分子プローブハンドブック（Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Molecular Probes）」，第９版，２００２）。
【０１１８】
本明細書で使用するとき、用語「精製された」または「単離された」は、他の分子、例えば、ポリペプチド、核酸分子が、その天然の環境成分から識別されかつ分離されおよび／または回収されていることを指す。したがって、一実施形態では、本発明の抗体は精製抗体であり、自然環境の１つ以上の成分から分離されている。
【０１１９】
核酸組成物
一部の例では、本開示は、本開示のペプチド（例えば、表１に開示される）に相当する（例えば、本開示のペプチドをコードする）ヌクレオチド配列を提供する。これらの配列には、本開示のペプチドに関係するすべての縮重配列を包含し、すなわち、特定のペプチドおよび変異体並びにその誘導体を１つコードする配列を有するすべての核酸を包含する。したがって、具体的な各核酸配列は記載されないものの、各配列およびすべての配列は、実際のところ本開示のポリペプチド配列により本明細書に開示されかつ記載される。
【０１２０】
一部の例では、本開示の核酸には、発現ベクターを含む。適切なベクターの例としては、限定するものではないが、プラスミド、人工染色体、例えば、ＢＡＣ、ＹＡＣ、またはＰＡＣ、並びにウイルスベクターが挙げられる。
【０１２１】
提供されるベクターには、例えば、複製起点および／またはマーカーを含有させることもできる。マーカー遺伝子は、選択可能な表現型、例えば、抗生物質耐性を細胞に付与し得る。マーカー産物は、ベクターが細胞に入り、かつ入った後に発現しているかを判断するために使用する。哺乳類細胞用の選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、およびブラストサイジンである。このような選択可能なマーカーが哺乳類の宿主細胞に首尾よく移行された場合、形質転換した哺乳類宿主細胞は、選択圧下に置いた場合に生存し得る。他のマーカーの例としては、例えば、大腸菌（E. coli）ｌａｃＺ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびルシフェラーゼが挙げられる。加えて、発現ベクターには、発現したポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または局在化）を促進するよう設計したタグ配列を含有させることができる。ＧＦＰ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集、またはＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ；Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）配列などのタグ配列は、典型的には、コードされているポリペプチドを有する融合体として発現させることができる。このようなタグは、カルボキシまたはアミノ末端のいずれかを含む、ポリペプチド内のどこにでも挿入することができる。
【０１２２】
一部の例では、本開示は、本明細書で開示される核酸（例えば、ベクター）および／またはペプチドを含む細胞を包含する。細胞には、例えば、真核生物および／または原核細胞が包含され得る。一般的に、本明細書において使用され得る細胞は、例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８から市販のものである。同様に、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，「分子生物学標準プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，（１９９８）も参照されたい。本明細書で開示される細胞の生成に有用な形質転換および遺伝子導入方法は、例えば、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，「分子生物学標準プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，（１９９８）に記載されている。
【０１２３】
ベクター媒介遺伝子導入は、抗体の標的化送達を操作するために示されている（Ｂａｌａｚｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ．  ２０１１  Ｎｏｖ  ３０；４８１（７３７９）：８１−４）。したがって、１つの局面において、本開示は、興味あるＭＩＣＡに免疫特異的に結合するペプチドをコードするポリヌクレオチドをウイルスを使用して標的細胞に送達するための方法および組成物を提供する。遺伝子治療の文脈において、ＭＩＣＡに免疫特異的に結合するペプチドをコードする核酸配列は、ベクター（例えば、限定はしないがアデノウイルス、ワクシニアウイルスまたはアデノ随伴ウイルスを含むウイルスベクター）を介して細胞に送達され得る。例えば、特定の細胞表面分子に対する特異性を有するタンパク質、例えば抗体または抗体断片を、ウイルスの表面に付着させ、ウイルスを特異的な細胞に標的化させることができる。さらに、ウイルスを核酸配列、例えばプロモーターを含むように操作し、ウイルスが特定の細胞、例えば癌細胞のみに機能させることができる。
【０１２４】
一部の例では、記載されている治療用組成物は、ＭＩＣＡに免疫特異的に結合するペプチドをコードする核酸を含むベクター（例えば、発現ベクター、ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター）を含むことができる。１つの局面において、ＭＩＣＡに免疫特異的に結合するペプチドは、ＭＩＣＡに免疫特異的に結合する抗体または抗体断片である。本明細書に記載されているとおり、抗体および抗体断片は、限定はしないが、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合フラグメントから形成される多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、ラクダ抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、所望の生物学的活性を示す抗体断片（例えば抗原結合部分）、ジスルフィド連結Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本願発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、細胞内抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを含む。
【０１２５】
したがって、１つの局面において、本開示は、配列番号：１、７６、９５、１１２、１３０または１４９に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むベクターおよび細胞を提供する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：２、７７、９６、１１３、１３１または１５０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【０１２６】
１つの局面において、ベクターは、配列番号：１０、７８、９７、１１４、１３２または１５１に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。一部の態様では、核酸配列は、配列番号：２、１１、７９、９８、１１５、１３３または１５２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【０１２７】
一部の実施形態では、本開示は、ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連性配列Ａ（ＭＩＣＡ）またはそれらのエピトープに免疫特異的に結合するペプチドをコードする核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、組成物の核酸は、５以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１１のＶＨをコードする。一部の態様では、組成物の核酸は、５以下の保存的アミノ酸置換を有する表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１１のＶＬをコードする。
【０１２８】
１つの局面において、本開示は、配列番号：１に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性ヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。一部の態様では、単離された核酸配列は、配列番号：２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の局面において、本開示は、配列番号：１０に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性ヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。一部の態様では、単離された核酸配列は、配列番号：１１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【０１２９】
１つの局面において、本開示は、配列番号：７６に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性ヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。一部の態様では、単離された核酸配列は、配列番号：７７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の局面において、本開示は、配列番号：７８に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性ヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。一部の態様では、単離された核酸配列は、配列番号：７９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【０１３０】
１つの局面において、本開示は、配列番号：９５に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性ヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。一部の態様では、単離された核酸配列は、配列番号：９６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の局面において、本開示は、配列番号：９７に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性ヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。一部の態様では、単離された核酸配列は、配列番号：９８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【０１３１】
１つの局面において、本開示は、配列番号：１１２に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性ヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。一部の態様では、単離された核酸配列は、配列番号：１１３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の局面において、本開示は、配列番号：１１４に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性ヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。一部の態様では、単離された核酸配列は、配列番号：１１５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【０１３２】
１つの局面において、本開示は、配列番号：１３０に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性ヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。一部の態様では、単離された核酸配列は、配列番号：１３１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の局面において、本開示は、配列番号：１３２に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性ヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。一部の態様では、単離された核酸配列は、配列番号：１３３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【０１３３】
１つの局面において、本開示は、配列番号：１４９に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性ヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。一部の態様では、単離された核酸配列は、配列番号：１５０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。他の局面において、本開示は、配列番号：１５１に対し少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の、または完全（１００％）配列同一性ヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。一部の態様では、単離された核酸配列は、配列番号：１５２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【０１３４】
本明細書において使用される用語「核酸」または「核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖または二本鎖であってよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【０１３５】
単離された核酸は、例えば、天然ゲノムにおけるＤＮＡ分子が除外され、または不存在である直接に隣接して通常見られる核酸配列の１つを提供するＤＮＡ分子であり得る。したがって、単離された核酸は、限定はしないが、他の配列から独立している別々の分子として存在するＤＮＡ分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理により生産される化学的に合成された核酸、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡフラグメント）ならびにベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）に、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに導入されるＤＮＡを含む。加えて、単離された核酸は、操作された核酸、例えばハイブリッドまたは融合核酸の一部である組換えＤＮＡ分子を含むことができる。例えばｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー内の、数百から数百万の他の核酸中に存在する核酸、またはゲノムＤＮＡ制限消化を含むゲル切片中に存在する核酸は、単離された核酸として考えない。
【０１３６】
パーセント配列同一性の計算において、２つの配列をアラインし、２つの配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一一致の数を決定する。同一一致の数をアラインされる領域の長さ（すなわち、アラインされるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数）で割り、１００を掛けて、パーセント配列同一性値に達する。アラインされる領域の長さがもっとも短い配列の全長サイズ次第で１つまたは両方の配列の一部であり得ることが理解される。単一の配列は２つ以上の他の配列とアラインされ、それぞれのアラインされる領域と異なるパーセント配列同一性値を有することがあることも理解される。同一性パーセント値は通常、最も近い整数に概算されることに注意すること。例えば、７８．１％、７８．２％、７８．３％および７８．４％は７８％に繰り下がり、７８．５％、７８．６％、７８．７％、７８．８％および７８．９％は７９％に繰り上がる。また、アラインされる領域の長さは常に整数であることに注意すること。
【０１３７】
本明細書において使用される用語「パーセント配列同一性」は、任意の所定のクエリー配列と対象配列間の同一性の程度を示す。別の対象核酸またはアミノ酸配列と比較しての任意のクエリー核酸またはアミノ酸配列、例えば転写因子についての同一性パーセントは、以下のように決定することができる。
【０１３８】
核酸は、全細胞内に、細胞溶解液中にまたは部分精製形態もしくは実質的に純粋な形態で存在しうる。核酸は、当該技術分野で周知のアルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動およびその他を含む標準技術により、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば他の細胞核酸もしくはタンパク質から除去精製される場合、「単離される」かまたは「実質的に純粋な状態にされる」。Ｓｅｅ、Ｆ．  Ａｕｓｕｂｅｌ、ｅｔ  ａｌ．、ｅｄ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８７）参照。
【０１３９】
しばしば天然配列（修飾された制限酵素認識部位などを除けば）においてであるが、ｃＤＮＡ、ゲノムまたはそれらの混合物のいずれかからの本願発明の核酸組成物は、遺伝子配列を提供する標準技術にしたがって変異させてもよい。コード配列について、これらの変異は、要望通りアミノ酸配列に影響を及ぼし得る。特に、天然Ｖ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチおよび本明細書に記載されている他のこのような配列に実質的に相同であるか、またはそれらから派生するＤＮＡ配列が考えられる（ここで「派生」はある配列が別の配列と同一であるか、または別の配列から修飾されていることを示す）。
【０１４０】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれているとき、「作動可能に連結」されている。例えば、配列の転写に影響を与えるとき、プロモーターまたはエンハンサーはコード配列と作動可能に連結されている。転写調節配列について、作動可能に連結は、連結されるＤＮＡ配列が隣接しており、必要であれば２つのタンパク質コード領域を、隣接して、リーディングフレームにおいて結びつけることを意味する。スイッチ配列について、作動可能に連結は、該配列がスイッチ組換え(recombination)を生じることができることを示す。
【０１４１】
本明細書において使用される用語「ベクター」は、核酸配列を宿主細胞に移動させるために使用される任意の分子を示す。一部の態様では、発現ベクターを利用する。発現ベクターは、宿主細胞の形質転換のために適当な核酸分子であり、移動される核酸配列の発現指向および／またはコントロールする核酸配列を含む。発現は、イントロンが存在するとき、限定はしないが転写、翻訳およびスプライシングのようなプロセスを含む。一部の態様では、ウイルスベクターを利用する（例えば、特に、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルス）。多数のこのようなウイルスベクターを利用できることが当分野で理解されている。さらに他の局面において、非ウイルスプラスミドベクターもまた、本願発明を実施することにおいて適当であり得る。本願発明のベクターは、当業者に広く利用できる標準組換え技術を使用して構築され得る。このような技術は、一般的な分子生物学文献、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８９）において見ることができる。
【０１４２】
本明細書において使用される用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を示すことを意図する。該用語は特定の対象細胞のみだけでなくかかる細胞の子孫もまた示すことを意図すると理解されるべきである。或る修飾が突然変異または環境の影響のいずれかによって後世において起こり得るため、かかる子孫は、実際には、親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書において使用される用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【０１４３】
キメラ抗原受容体
一部の例では、本願発明は、ＭＩＣＡに免疫特異的に結合するペプチドおよび細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。（Ｋａｌｏｓ  Ｍ、ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．  ２０１１  Ａｕｇ  １０；３（９５））。一部の態様では、ＣＡＲは、ＭＩＣＡに免疫特異的に結合するペプチド、細胞外ヒンジドメイン、Ｔ細胞受容体膜貫通ドメイン、および細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインを含む。本願発明のさらなる態様は、本願発明のＣＡＲに関連する、関連核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、抗体またはその抗原結合部分、および医薬組成物を提供する。
【０１４４】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ−細胞シグナル伝達ドメインに連結した抗体の抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）を含む人工的に構築されるハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである。（Ｋａｌｏｓ  Ｍ、ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．  ２０１１  Ａｕｇ  １０；３（９５））。Ｋａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．は、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ  Ｔ細胞の産生を記載しており、慢性リンパ性白血病患者におけるＣＡＲ修飾Ｔ−細胞が介在する強力な抗腫瘍効果を証明している。ＣＡＲの操作されたＴ−細胞特性は、非ＭＨＣ−非拘束性様式において選択される標的へＴ細胞特異性および反応性を変更する能力を含み、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用する。ＣＡＲ修飾Ｔ−細胞はインビボで複製する可能性を有し、長期持続は持続的腫瘍コントロールを可能にし、抗体の繰り返し注入の必要性を防ぐ。（Ｋａｌｏｓ  Ｍ、ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．  ２０１１  Ａｕｇ  １０；３（９５））。非ＭＨＣ−非拘束性抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に抗原処理から独立している抗原を認識する能力を与え、したがって腫瘍回避の主なメカニズムを回避する。さらに、Ｔ−細胞において発現されるとき、ＣＡＲは、有利には、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファおよびベータ鎖と二量化しない。ＣＡＲ修飾Ｔ細胞は、ＵＳ２００３／０２２４５０およびＵＳ２０１０／０２６１２６９およびＭｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．    ２００９  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １７：１４５３において詳細に記載されている。
【０１４５】
医薬組成物
一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物には、癌の処置に使用される他の化合物、薬剤、および／または剤を含有させることができる。このような化合物、薬剤、および／または剤としては、例えば、化学療法剤、低分子抗癌剤または所定の癌に対する免疫応答を刺激する抗体を挙げることができる。一部の例では、治療用組成物には、例えば、本明細書で開示される１つ以上のペプチド、および１つ以上の抗ＣＴＬＡ−４抗体若しくはペプチド、抗ＰＤ−１抗体若しくはペプチド、抗ＰＤＬ−１抗体若しくはペプチド、抗ＯＸ４０（ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５および／またはＴＸＧＰ１Ｌとしても知られている）抗体若しくはペプチド、抗ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８、ＡＩＴＲおよび／またはＣＤ３５７としても知られている）抗体若しくはペプチド、抗ＬＡＧ−３抗体若しくはペプチド、および／または抗ＴＩＭ−３抗体若しくはペプチドが挙げられる。例えば、一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物は、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、または１０未満）の化合物と組み合わせることができる。
【０１４６】
一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物には、ヒストン脱アセチル化酵素（「ＨＤＡＣ」）阻害剤などの他の化合物を含有させ得る。ＨＤＡＣ阻害剤の例としては、例えば、ヒドロキサム酸、ボリノスタット（Ｚｏｌｉｎｚａ）；スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）（Ｍｅｒｃｋ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＬＡＱ８２４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）（ＣｕｒａＧｅｎ）、ＩＴＦ２３５７  Ｉｔａｌｆａｒｍａｃｏ  ＳｐＡ（Ｃｉｎｉｓｅｌｌｏ）、環状テトラペプチド；デプシペプチド（ロミデプシン、ＦＫ２２８）（Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ベンズアミド；Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ（ＳＮＤＸ−２７５／ＭＳ−２７５）（Ｓｙｎｄａｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＭＧＣＤ０１０３（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、短鎖脂肪酸、バルプロ酸、フェニル酪酸、ＡＮ−９、ｐｉｖａｎｅｘ（Ｔｉｔａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ＣＨＲ−３９９６（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、およびＣＨＲ−２８４５（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられる。
【０１４７】
一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物には、例えば、ボルテゾミブ（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＮＰＩ−００５２（Ｎｅｒｅｕｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、カーフィルゾミブ（ＰＲ−１７１）（Ｏｎｙｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＣＥＰ  １８７７０、およびＭＬＮ９７０８といったプロテアソーム阻害剤などの、その他の化合物を含有させることができる。
【０１４８】
一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物には、これまでに、抗ＭＩＣＡモノクローナル抗体の有効性を増強させ得るＭＩＣＡの発現を増大させることが示されている、メルファランなどのアルキル化剤、およびアドリアマイシン（ドキソルビシン）などのトポイソメラーゼ阻害薬を含有させることができる。
【０１４９】
一部の例では、、治療用組成物は、例えば、本明細書に記載されている１つ以上のペプチドおよび１つ以上の他の薬剤、例えば、化学療法、放射線療法、サイトカイン、ケモカインおよび他の生体シグナル伝達分子、腫瘍特異的ワクチン、細胞癌ワクチン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ形質導入癌細胞）、腫瘍特異的モノクローナル抗体、自己および同種異系の幹細胞レスキュー（例えば、移植片対腫瘍効果を増強させるため）、他の治療抗体、分子標的療法、抗脈管形成療法、治療目的での感染因子（例えば、腫瘍局在化細菌）および遺伝子治療を含むことができる。
【０１５０】
一部の例では、治療用組成物は、製薬上許容可能な担体と共に製剤化された、本明細書に記載されている抗ＭＩＣＡ抗体またはその抗原結合部分の１つまたは組合せを含むことができる。このような組成物は、ＭＩＣＡに結合する（例えば、２つ以上の異なる）ペプチド、抗体、抗原結合部分、免疫複合体または二重特異性分子の１つまたは組合せを含み得る。
【０１５１】
例えば、医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または補体作用を有する抗体の組合せ（または免疫複合体または二重特異性）を含むことができる。一部の例では、このような組成物は、ＭＩＣＡ＊００９配列（配列番号：１６７）内のアミノ酸２２９から２４８と関与または重複するエピトープと相互作用する抗体または抗体断片、ＭＩＣＡ＊００９アミノ酸配列（配列番号：１６７）内のアミノ酸１７９から１８８と関与または重複するエピトープと相互作用する抗体または抗体断片、および／またはＭＩＣＡ＊００９アミノ酸配列（配列番号：１６７）内のアミノ酸１１９から１２８と関与または重複するエピトープと相互作用する抗体または抗体断片の１つ以上を含み得る。例えば、治療用組成物は、ＭＩＣＡに結合し、ＣＭ３３３２２  ｍＡｂ４のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／またはＣＭ３３３２２  ｍＡｂ４のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むペプチド、抗体または抗体断片を、抗体ＩＤ１、６、７、８または９のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ１、６、７、８または９のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む１つ以上のペプチド、抗体または抗原結合フラグメントと共に含むことができる。
【０１５２】
一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物は、医薬組成物として、または医薬組成物に使用するために処方することができる。このような組成物は、任意の経路、例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に認可された任意の経路により対象に投与するために処方または調節することができる。方法例は、ＦＤＡのＣＤＥＲデータ標準マニュアル（CDER Data Standards Manual），ｖｅｒ．００４（ｆｄａ．ｇｉｖｅ／ｃｄｅｒ／ｄｓｍ／ＤＲＧ／ｄｒｇ００３０１．ｈｔｍから入手可能）に記載されている。
【０１５３】
担体材料と組み合わせることで単一の剤形を生成可能な活性成分の量は、処置される対象および特定の投与方法に依存して変化することになる。単一の剤形を生成するための担体材料と併用可能な活性成分の量は、一般に治療効果をもたらす組成物の量となる。一般に、この量は、製薬上許容可能な担体との併用で、１００％のうち、活性成分の約０．０１％〜約９９％、好ましくは活性成分の約０．１％〜約７０％、最も好ましくは活性成分の約１％〜約３０％の範囲となる。
【０１５４】
一部の例では、医薬組成物には、有効な量の１つ以上のペプチドを含有させることができる。本明細書で使用するとき、用語「有効な量」および「処置に有効な」は、所望される効果または生理学的結果を得る際の投与という文脈において、一定時間（急性または慢性投与および定期または継続投与など）にわたって有効である本明細書に記載されている１つ以上のペプチド（例えば、ＭＩＣＡに結合する抗体または抗体断片）の量または濃度を指す。
【０１５５】
一部の例では、医薬組成物には、１つ以上のペプチド並びに任意の製薬上許容可能な担体、補助剤および／または賦形剤を含有させることができる。一部の例では、医薬組成物には、さらに１つ以上の追加の治療剤を、疾患または病徴の調節を達成するのに有効な量で含有させることができる。
【０１５６】
用語「製薬上許容可能な担体または補助剤」は、本発明のペプチドとともに患者に投与することができ、かつ本発明のペプチドの薬理活性を損なわず、かつ治療量の化合物を送達するのに十分な投与量で投与した場合に非毒性である基剤または助剤を指す。
【０１５７】
本発明の医薬組成物に使用することのできる製薬上許容可能な基材、補助剤および賦形剤としては、限定するものではないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸塩などの自己乳化薬物送達システム（ＳＥＤＤＳ）、Ｔｗｅｅｎ若しくは他の同様の高分子系送達マトリックスなどの薬物剤形において使用される界面活性剤、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、緩衝成分、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸と、水と、塩類とまたは電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩との、部分グリセリド混合物、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系材料、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、並びに羊毛脂が挙げられる。本明細書に記載の処方の化合物の送達性を増強させるために、α−、β−、およびγ−シクロデキストリンなどのシクロデキストリンを有利に使用することもできる。
【０１５８】
本発明の医薬組成物には、製薬上許容できる任意の一般的な非毒性基材、補助剤、または賦形剤を含有させることができる。場合によっては、処方のｐＨは、製薬上許容可能な酸、塩基、または緩衝剤により調整して、処方された化合物またはその送達形態の安定性を向上させることができる。本明細書で使用するとき、用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病巣内、および頭蓋内注射または輸液による手法を包含する。
【０１５９】
医薬組成物は、吸入および／または経鼻投与用の溶液または粉末の形態であり得る。このような組成物は、好適な分散剤または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０など）および懸濁剤を使用して、当該技術分野において既知の手法に従って処方することもできる。無菌注射製剤は、非毒性非経口投与可能な希釈剤または溶媒を用いた無菌注射製剤または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール溶液）であってもよい。利用することのできる投与可能な賦形剤および溶媒としては、マンニトール、水、リンガー液および生理食塩水が挙げられる。加えて、無菌硬化油は、一般的に、溶媒または懸濁媒質として利用される。この目的に関し、合成モノまたはジグリセリドなどの任意の低刺激性硬化油が利用され得る。例えば、オリーブ油またはヒマシ油、特に、これらのポリオキシエチル化化合物などといった、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、製薬上許容できる天然油として、注射剤の調製に有用である。これらの油溶液または懸濁液には、乳濁液およびまたは懸濁液など、製薬上許容可能な剤形の処方に一般的に使用される、長鎖アルコール希釈剤若しくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロース若しくは同様の分散剤を含有させることができる。その他の一般的に使用されるＴｗｅｅｎ若しくはＳｐａｎなどの界面活性剤、および／または他の類似の乳化剤、または製薬上許容可能な固体、液体若しくは他の剤形の製造に一般に使用される生物学的利用能増強剤なども、製剤目的で使用することができる。
【０１６０】
医薬組成物は、限定するものではないが、カプセル剤、錠剤、乳濁液および水性懸濁液、分散液および溶液などといった、経口投与可能な任意の投与形態で経口投与することができる。経口用途用の錠剤の場合、一般に使用される基材としては乳糖およびトウモロコシデンプンが挙げられる。典型的には、ステアリン酸マグネシウムなどの粘滑剤も添加される。カプセル形態での経口投与の際に有用な希釈剤としては、乳糖および乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。水性懸濁液および／または乳濁液を経口投与する場合、有効成分は、乳化剤および／または懸濁剤と組み合わせた油相に懸濁または溶解させることもできる。必要に応じて、特定の甘味料および／または香料および／または着色料を添加することもできる。
【０１６１】
あるいは、またはこれに加え、医薬組成物は、点鼻剤（エアゾール）または経鼻吸入により投与することができる。このような組成物は、製剤処方の技術分野で公知の手法に従って調製され、かつベンジルアルコールまたは他の好適な保存料、生物学的利用能を増強させる吸収促進剤、フッ化炭素、および／または当該技術分野において既知の他の溶解剤若しくは分散剤を利用して、生理食塩水溶液として調製することができる。
【０１６２】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される任意の１つ以上のペプチドまたは医薬組成物（以降「Ｘ」として記載）を、以降の方法において使用するための方法を提供する。
【０１６３】
本明細書で開示される１つ以上の疾患または状態（例えば、「Ｙ」として以降の実施例において参照される癌）の処置において薬剤として使用するための物質Ｘ。Ｙの処置用薬剤を製造する際の物質Ｘの使用；およびＹの処置において使用するための物質Ｘ。
【０１６４】
一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物は、米国での販売、米国への輸入、および／または米国からの輸出用に製剤することができる。
【０１６５】
方法
一部の例では、方法には、状態または疾患を有するまたは有したヒト対象、および状態または疾患に対し正の免疫応答を示すまたは示したヒト対象を選別することが包含され得る。一部の例では、好適な対象には、例えば、状態または疾患を有するまたは有していたものの、疾患またはそれらの病態から回復している対象、現在では疾患の症状が（例えば、同様の状態または疾患を有する他の対象（例えば、大多数の対象）と比較して）軽減している対象、並びに／あるいは、例えば、無症候期（例えば、同様の状態または疾患を有する他の対象（例えば、大多数の対象）と比較して）において、状態または疾患を有するまたは有していたものの、状態または疾患を有しつつ（例えば、同様の状態または疾患を有する他の対象（例えば、大多数の対象）と比較して）より長期間生存している対象、が包含される。一部の例では、状態または疾患に対してワクチンを接種している（例えば、ワクチン接種歴があるおよび／またはワクチンを接種されたことがあるおよびワクチンを再接種されている（例えば、免疫補助剤入りワクチンを接種されている））対象を選別することができる。
【０１６６】
本明細書で使用するとき、用語「対象」は、任意の動物を指す。一部の例では、対象は哺乳類である。本明細書で使用するとき、一部の例では、用語「対象」はヒト（例えば、男性、女性、または子供）を指す。本方法に使用する試料には、血清試料が包含され、例えば、選別された対象から得られた血清試料が包含される。
【０１６７】
一部の例では、対象の選別には、対象から試料を得ること（例えば、候補となる対象）、および対象が選択に適するかを示す指標について試料を試験することを包含させることができる。一部の例では、対象は、状態または疾患を有していたかまたは有しているものとして、例えば、医療従事者により、確認または特定することができる。一部の例では、状態または疾患に対する正の免疫応答の提示は、病歴、家族歴、および／または正の免疫応答に関する指標の検出からなされる。場合によっては、患者の選別には複数名の患者を包含させることができる。例えば、第１施設により候補となる対象から試料を得て、第２施設により試料を試験することができる。一部の例では、対象は、医師（例えば、一般開業医）により選別および／または参照することができる。一部の例では、対象の選別には、選別した対象から試料を得ること、および試料を保管すること、および／または本明細書で開示される方法を使用すること、を包含させることができる。試料は、例えば、細胞または細胞集団を含有し得る。
【０１６８】
一部の例では、免疫細胞を得ることまたは標的とすることには、例えば、標的とする免疫細胞に結合（例えば、特異的に結合）することができる免疫原四量体を得ること、または提供すること；免疫原四量体と試料とを接触させること；免疫原四量体を検出すること；免疫原四量体が標的免疫細胞に結合するか否か判定すること；並びに、標的とする免疫細胞に免疫原四量体が結合する場合には、標的とする免疫細胞を得ること、のうちの１つ以上および／または組み合わせを包含させることができる。
【０１６９】
免疫原四量体には、状態または疾患に関連する、および／または標的とする免疫細胞に結合（例えば、特異的に結合）する免疫原を含有させることができ、例えば、標的免疫細胞は、選択された状態または疾患に関連するものである。状態または疾患に関連する免疫原および標的免疫細胞としては、例えば、特定の状態または疾患を有する対象には存在するが、この状態または疾患を有さない対象には存在しない、免疫原または免疫細胞；並びに／あるいは特定の状態または疾患を有する対象と、この状態または疾患を有さない対象とで程度が異なる（例えば、増加している）免疫原または免疫細胞が挙げられる。一部の例では、免疫原または免疫細胞は癌特異的なものであり得る。免疫原は可溶性であり得る。免疫原四量体には、四量体（例えば、免疫原性抗原（例えば、抗原および／またはエピトープ）の単量体、二量体、および／または三量体を含む）が含有され得る。一部の例では、免疫原四量体は、同様の条件下での、細胞に対する非四量体型の免疫原の結合性と比較して、細胞に対する結合性が増大している。一部の例では、四量体抗原は、検出可能な部分、例えば、ストレプトアビジン部分を含有する。四量体化の方法は、当該技術分野において既知でありかつ本明細書で開示される。
【０１７０】
免疫原四量体を検出すること、および／または免疫原四量体が標的細胞に結合するか否かを判定することは、当該技術分野において既知のおよび／または本明細書で開示される方法を使用して実施することができる。例えば、方法はフローサイトメトリーを包含し得る。フローサイトメトリー（ソーティングおよびゲーティング法を含む）を最適化する方法は、当該技術分野において既知であり、および／または本明細書で開示される。一部の例では、方法には、標的とする免疫細胞に結合する抗原四量体間の結合性、結合親和性、および／または結合特異性の度合いの解析が包含され得る。例えば、免疫原四量体と標的免疫細胞と間に、規定の結合度が測定された場合に（例えば、このような場合に限り）、標的とする免疫細胞を得ることができる。規定の結合度は、特定の度合いであってよく、および／または相対的な度合いであってよい。標的とする免疫細胞を得ることには、標的とする免疫細胞を得ること、提供すること、同定すること、選別すること、精製すること、および／または単離すること、を包含させることができる。このような方法には、例えば、セルソーティング法、細胞濃縮法、および／またはバックグラウンド減少法を含有させることができる。
【０１７１】
一部の例では、自己抗原に対する免疫細胞を得ることは、例えば、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象を特定すること；自己抗原の多量体を得ることまたは提供すること；自己抗原の多量体を、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象由来のサンプルと接触させること；自己抗原の多量体と結合する免疫細胞を得ることのうちの１つ以上および／またはこれらの組み合わせを包含し得る。
【０１７２】
一部の例では、方法には、癌患者由来の自己抗原に対する免疫細胞を得ることを包含させることができ、例えば、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象を特定すること；自己抗原の多量体を提供すること；自己抗原の多量体を、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象由来のサンプルと接触させること；並びに自己抗原の多量体と結合する免疫細胞を得ることのうちの１つ以上および／またはこれらの組み合わせを包含させ得る。
【０１７３】
多量体型の自己抗原には、状態または疾患に関連する、および／または標的とする免疫細胞に結合（例えば、特異的に結合）する自己抗原を含有させることができ、例えば、標的免疫細胞は、選択された状態または疾患に関連するものである。状態または疾患に関連する自己抗原および標的免疫細胞としては、例えば、特定の状態または疾患を有する対象には存在するが、この状態または疾患を有さない対象には存在しない、抗原または免疫細胞；および／あるいは特定の状態または疾患を有する対象と、この状態または疾患を有さない対象とで程度が異なる（例えば、増加している）免疫原または免疫細胞が挙げられる。一部の例では、状態または疾患は癌であり得る。一部の実施形態では、癌は、黒色腫、肺癌、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、グリア芽腫、肝臓癌、並びに結腸癌、リンパ腫または白血病である。一部の例では、自己抗原または免疫細胞は、癌特異的なものであり得る。自己抗原は可溶性であり得る。多量体型の自己抗原には、自己抗原（例えば、抗原および／またはエピトープ）の四量体（例えば、単量体、二量体、および／または三量体型抗原を四量体化させたものなど）が包含され得る。一部の例では、自己抗原の多量体は、検出可能な部位、例えば、ストレプトアビジン部位を含有する。多量体化の方法は、当該技術分野において既知でありかつ本明細書で開示される。
【０１７４】
得られた標的免疫細胞からの遺伝子材料（例えば、ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）の単離または精製方法は、当該技術分野において既知であり、かつ本明細書において例示される。このような遺伝子材料が得られた場合に、本明細書で開示される治療用組成物をこのような遺伝子材料を使用して作製する方法は当該技術分野において既知であり、および／または以下に要約される。上述のように、当該技術分野において既知の手法を用いて遺伝子材料に変更を加え、本明細書で開示されるペプチド変異体を作製することができる。
【０１７５】
標的細胞内に含有されるまたは標的細胞から得られる核酸（例えば、ｃＤＮＡ）からペプチドを作製することは、例えば、解析法、例えば、標的とする免疫細胞（例えば、単一のまたは単離され、同定された標的免疫細胞）由来の重鎖および軽鎖可変ドメインの配列決定をすることを包含し得る。一部の例では、方法には、完全型ヒト抗体、またはそれらの断片（例えば、上記の通りのもの）を生成すること、並びに非ヒト抗体をヒト化することが包含され得る。ＤＮＡは、得られた免疫細胞から、一般的な手法を用い（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを使用することで）容易に単離および／または配列決定することができる。
【０１７６】
単離したＤＮＡは、発現ベクター中に配置し、次に、本来であれば抗体タンパク質を産生しない大腸菌（Escherichia coli）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞に遺伝子導入し、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体を合成させることができる。抗体をコードしているＤＮＡの、細菌における組換え発現についての総説としては、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６〜２６２（１９９３）およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．，１３０：１５１〜１８８（１９９２）が挙げられる。
【０１７７】
抗体またはそれらの変異体の組換え発現には、一般的に、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有している発現ベクターの構築が必要とされる。したがって、本発明は、抗体分子、抗体重鎖または軽鎖、抗体またはこれらの部分の重鎖または軽鎖可変ドメイン、あるいは重鎖または軽鎖ＣＤＲ、操作可能に連結したプロモーター、をコードしているヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。このようなベクターには、抗体分子の定常部をコードしているヌクレオチド配列（例えば、米国特許第５，９８１，２１６号；同第５，５９１，６３９号；同第５，６５８，７５９号および同第５，１２２，４６４号を参照されたい）を含有させることができ、並びに完全な重鎖、完全な軽鎖、または完全な重鎖および軽鎖の両方を発現させるために、抗体の可変ドメインをこのようなベクターにクローニングすることもできる。一般的な手法により、発現ベクターを宿主細胞に移行させたならば、次に、遺伝子導入した細胞を一般的な手法により培養し、抗体を産生させる。したがって、本発明は、操作可能に異種プロモーターに連結された、本発明の抗体若しくはそれらの断片、またはそれらの重鎖若しくは軽鎖、またはそれらの部分、または本発明の単鎖抗体、をコードしているポリヌクレオチドを含有している、宿主細胞を含む。特定の実施形態では、二本鎖抗体の発現にあたり、以降に記載の通りに、完全な免疫グロブリン分子を発現させるための重鎖および軽鎖の両方をコードしているベクターを宿主細胞において同時発現させることもできる。
【０１７８】
組換え抗体の発現の際に宿主として入手可能な哺乳類細胞株は、当該技術分野において公知であり、かつアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能な、限定するものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、ヒト腎臓上皮細胞２９３、および数多くのその他の細胞株などの数多くの不死化細胞株を包含する。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後のプロセシングおよび修飾に関し、特徴的でかつ特異的な機序を有する。適切な細胞株または宿主系を選択することで、発現させた抗体またはそれらの部分の正しい修飾およびプロセシングが保証されることになる。この目的を達成するために、一次転写産物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機序を保有している真核生物を宿主細胞として使用することができる。このような哺乳類宿主細胞としては、限定するものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄ、ＮＳ０（なんらかの機能性免疫グロブリン鎖を内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＳＰ２０、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ並びにＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられる。一実施形態では、ヒトリンパ球を不死化させることにより展開されるヒト細胞株を使用して、遺伝子組換え法によりモノクローナル抗体を産生させることができる。一実施形態では、遺伝子組換え法によるモノクローナル抗体の産生には、ヒト細胞株ＰＥＲ．Ｃ６．（Ｃｒｕｃｅｌｌ，オランダ）を使用することができる。
【０１７９】
一部の例では、本明細書で開示されるペプチドは合成により生成することができる。本明細書に記載のペプチドの合成に有用な、合成による化学的な変換および保護基による方法論（保護および脱保護）は、当該技術分野において既知であり、このようなものとしては、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，包括的有機分子変換法（Comprehensive Organic Transformations），ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，「有機合成における保護基（Protective Groups in Organic Synthesis）」，第３版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９９）；Ｌ．ＦｉｅｓｅｒおよびＭ．Ｆｉｅｓｅｒ，「有機合成用フィッシャーおよびフィッシャー試薬（Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis）」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）；並びにＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，「有機合成用試薬辞典（Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis）」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５）、並びにこれらの改訂版に記載のものなどが挙げられる。
【０１８０】
ペプチドは、当業者により公知の化学合成法により製造することもできる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，「合成ペプチド（Synthetic Peptides）」第３章：ユーザーズガイド（User's Guide），ｅｄ．Ｇｒａｎｔ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，（ニューヨーク市，Ｎ．Ｙ．），１９９２，ｐ．７７を参照されたい。したがって、ペプチドは、自動化したメリーフィールド固相合成法を使用して、例えば、アプライドバイオシステムズのモデル４３０Ａまたは４３１のペプチド合成装置において、側鎖保護されたアミノ酸を使用し、ｔ−Ｂｏｃ若しくはＦｍｏｃ化学法のいずれかにより保護したα−ＮＨ２により合成することができる。
【０１８１】
本明細書に記載のペプチドを製造する際の一つの手法には、ペプチド固相合成法（ＳＰＰＳ）が使用される。リンカー分子を用い酸に不安定な結合を介し、Ｃ末端アミノ酸をポリスチレン樹脂と結合させる。この樹脂は、合成に使用される溶媒に不溶性であることから、過剰な試薬および副産物は比較的簡単かつ迅速に洗い流される。Ｎ末端は、酸には安定であるものの塩基により除去することのできるＦｍｏｃ基により保護される。任意の側鎖官能基は、塩基に安定で酸には不安定な基により保護される。
【０１８２】
天然の化学連結法を使用し、個々の合成ペプチドを結合させることにより、より長鎖のペプチド鎖を合成することができる。別の方法としては、より長鎖の合成ペプチドは、公知の組換えＤＮＡ法により合成することができる。このような手法は、詳細なプロトコルを備える公知の一般的な手法により提供される。本発明のペプチドをコードしている遺伝子を構築するため、アミノ酸配列を逆翻訳して、アミノ酸配列をコードしている核酸配列、好ましくは、遺伝子を発現させる生物に関し最適化されたコドンを有する核酸配列を得る。次に、合成遺伝子を、典型的にはペプチドおよび必要に応じて任意の制御エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することにより作製する。合成遺伝子を適切なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞に形質移入させる。次に、選択された発現系および宿主に合った、好適な条件下でペプチドを発現させる。このペプチドを、一般的な手法により精製し、および特徴づける。
【０１８３】
ペプチドは、ハイスループットでコンビナトリアルな方法、例えば、アドバンスドケムテックから入手可能な、ハイスループットなマルチチャンネルシンセサイザーで合成することができる。
【０１８４】
ペプチド結合は、例えば、ペプチドの生理学的安定性を向上させるために、レトロ・インベルソ（retro-inverso）結合（Ｃ（Ｏ）−ＮＨ）；還元型アミド結合（ＮＨ−ＣＨ２）；チオメイレン結合（Ｓ−ＣＨ２またはＣＨ２−Ｓ）；オキソメチレン結合（Ｏ−ＣＨ２またはＣＨ２−Ｏ）；エチレン結合（ＣＨ２−ＣＨ２）；チオアミド結合（Ｃ（Ｓ）−ＮＨ）；トランス型オレフィン結合（ＣＨ＝ＣＨ）；フッ素置換されたトランス型オレフィン結合（ＣＦ＝ＣＨ）；ケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）−ＣＨＲ）またはＣＨＲ−Ｃ（Ｏ）（式中、ＲはＨまたはＣＨ３である）；およびフッ素−ケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）−ＣＦＲまたはＣＦＲ−Ｃ（Ｏ）（式中、ＲはＨまたはＦまたはＣＨ３である）により置き換えることができる。
【０１８５】
ペプチドは、アセチル化、アミド化、ビオチン化、シンナモイル化、ファルネシル化、フルオレセイン化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化（Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｈｒ）、ステアロイル化、スクシニル化およびスルフリル化によりさらに修飾することができる。上記の通り、ペプチドを例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アルキル基（例えば、Ｃ１〜Ｃ２０線状または分岐状アルキル基）；脂肪酸ラジカル；およびこれらの組み合わせと結合させることができる。
【０１８６】
一部の例では、ペプチドは、免疫グロブリン分子の精製に関し、当該技術分野において既知の任意の方法、例えば、クロマトグラフ（例えば、イオン交換、アフィニティー（特にプロテインＡまたはプロテインＧ特異的抗原に対する親和性をもとにしたもの）、およびサイズ排除クロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の違い、あるいはタンパク質の精製に関する任意のその他の一般的な手法により精製することができる。さらに、本発明の抗体またはそれらの断片は、精製を容易にするため、上記のまたは当該技術分野において既知の異種ポリペプチド配列（本明細書において「タグ」と参照される）と融合させることもできる。
【０１８７】
代表的な、非限定的な方法の概略を図５Ａ−５Ｆに示す。この概略は、順序を指定するものではない。
【０１８８】
一部の例では、本開示はまた、所望の機能性ＭＩＣＡ結合特性を保持する本明細書に記載されている抗体のアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含む重鎖可変および／または軽鎖領域を有する抗体または抗体断片を提供する。例えば、いくつかの態様において、抗体または抗体断片は、上記配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列を含むことができる。配列番号：２、７７、９６、１１３、１３１または１５０および７９、９８、１１５、１３３または１５２のＶＨおよびＶＬ領域と高い（すなわち、８０％またはそれ以上）相同性を有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体または抗体断片は、配列番号：７７、９６、１１３、１３１または１５０および／または１１、７９、９８、１１５、１３３または１５２をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介性突然変異誘発）、次に、本明細書に記載されている機能アッセイを使用して、保持された機能（すなわち、１つ以上の機能、例えば、ＭＩＣＡのアルファ３ドメインへの結合；ＭＩＣＡ分離のブロック；ＭＩＣＡへのＮＧＫＤ結合を阻害しない；可溶性ＭＩＣＡ誘導ＮＧＫＤ下方調節およびＮＫ細胞細胞毒性低下のブロック）についてコードされる改変された抗体の試験により得ることができる。
【０１８９】
ＭＩＣＡへの本明細書に記載されている特定の抗ＭＩＣＡ抗体（例えば、抗体ＩＤ１、６、７、８、９および１１）の結合に対して競合する（例えば、交差競合する）抗体および抗体断片も提供する。かかる競合する抗体は、標準ＭＩＣＡ結合アッセイにおいて該抗体へのＭＩＣＡの結合を競合的に阻害する能力に基づいて特定することができる。例えば、組換えヒトＭＩＣＡタンパク質がプレート上に固定され、抗体の１つが蛍光標識され、標識された抗体の結合と競合オフ(compete off)する標識されていない抗体の能力を評価する標準ＥＬＩＳＡアッセイを使用することができる。さらに、またはあるいは、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を、抗体の交差競合する能力を評価するために使用することができる。ＭＩＣＡへの抗ＭＩＣＡ抗体の結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がＭＩＣＡへの結合に対して該抗体と競合することができることを証明する。
【０１９０】
したがって、１つの態様において、本開示は、ＦＡＣＳにより測定されるとき、活性化Ｔ細胞上のＭＩＣＡへの本明細書に記載されている抗ＭＩＣＡ抗体の結合を少なくとも５０％、例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％阻害する抗ＭＩＣＡ抗体を提供する。例えば、競合する抗ＭＩＣＡ抗体候補物による抗ＭＩＣＡ抗体の結合の阻害は、実施例に記載されている条件下で評価することができる。
【０１９１】
一部の例では、本開示は、本明細書に記載されている抗ＭＩＣＡ抗体（例えば、抗体ＩＤ８、９および１１）と同じエピトープに結合する抗ＭＩＣＡ抗体を提供する。実施例１４にさらに議論されているとおり、抗体ＩＤ８（ＣＭ３３３２２  ｍＡｂ１１）は、ＭＩＣＡ＊００９  アミノ酸配列（配列番号：１６７）内の残基１１９から１２８と関与するエピトープに結合する；抗体ＩＤ９（ＣＭ３３３２２  ｍＡｂ２９）は、ＭＩＣＡ＊００９アミノ酸配列（配列番号：１６７）内の残基２２９から２４８と関与するエピトープに結合する；抗体ＩＤ１１（ＣＭ３３３２２  ｍＡｂ４）は、ＭＩＣＡ＊００９アミノ酸配列（配列番号：１６７）内の残基１７９から１８８と関与するエピトープに結合する。したがって、一部の実施形態では、本開示は、ＭＩＣＡ＊００９のアミノ酸１８１から２７４に相当するα３領域内のアミノ酸残基に結合する抗ＭＩＣＡ抗体または抗体断片を提供する。
【０１９２】
本明細書に記載されている抗体と「ＭＩＣＡ上の同じエピトープ」に結合する抗体を決定するための技術は、例えば、エピトープマッピング方法、例えば、エピトープの原子分解を提供する抗原：抗体複合体の結晶のｘ線分析を含む。他の方法は、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾によって結合の喪失がエピトープ構成要素の指標(indication)としばしば考えられる、抗原フラグメントまたは抗原の突然変異への抗体の結合をモニタリングする。加えて、エピトープマッピングのためのコンピューターによるコンビナトリアル方法も使用することができる。これらの方法は、特異的な短ペプチドをコンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから単離する興味ある抗体の能力に頼る。次に、このペプチドは、ペプチドライブラリーをスクリーニングするために使用される抗体に相当するエピトープの定義のための手がかりと見なされる。エピトープマッピングについて、立体構造の不連続的なエピトープをマッピングするように示されるコンピューターによるアルゴリズムも開発されている。
【０１９３】
例えば、マウスは、本明細書に記載されているヒトＭＩＣＡ、生産されるハイブリドーマ、およびＭＩＣＡへの結合についてｍＡｂ４と競合する能力についてスクリーニングされて得られるモノクローナル抗体で免疫化され得る。マウスはまた、ｍＡｂ４モノクローナル抗体が結合するエピトープを含むＭＩＣＡのより小さいフラグメントで免疫化することもできる。例えば、Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９，  １９９４の方法が、同じエピトープ、したがって典型的なモノクローナル抗体と同様の特性を有するモノクローナル抗体の選択を導くために使用され得る。ファージディスプレイを使用して、最初に、典型的な抗体の重鎖をＭＩＣＡ結合モノクローナル抗体を選択するように（好ましくはヒト）軽鎖のレパートリーと対にし、次に、新規軽鎖を典型的なモノクローナル抗体と同じエピトープを有する（好ましくはヒト）ＭＩＣＡ結合モノクローナル抗体を選択するように（好ましくはヒト）重鎖のレパートリーと対にする。あるいは、典型的なモノクローナル抗体の変異体（例えば、ｍＡｂ４、ＩＤ１１）は、抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡの突然変異誘発により得ることができる。
【０１９４】
例えば、Ｃｈａｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：１３８８−１３９４に記載されているエピトープマッピングは、抗体が興味あるエピトープに結合するか否かを決定するために行うことができる。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  （１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：  １０８１−１０８５によって記載されている「Ａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、またはＭＩＣＡまたはＭＩＣＢにおけるアミノ酸残基の点突然変異誘発のいくつかの他の形態もまた、本願発明の抗−ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢ抗体に対する機能的エピトープを決定するために使用され得る。しかしながら、突然変異誘発試験はまた、ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢの全体的三次元構造に極めて重要であるが、抗体−抗原接触に直接的に関与しないアミノ酸残基を表し得、したがって、他の方法が、この方法を使用して決定される機能的エピトープを確認するために必要とされ得る。
【０１９５】
本明細書に記載されている抗体競合アッセイはまた、抗体が別の抗体と「同じエピトープに結合する」か否かを決定するために使用することができる。一般的に、第２の抗体が過剰であり、第１の抗体が全ての部位で飽和である条件下で、第２の抗体によってエピトープと相互作用することが知られている抗体の５０％またはそれ以上、６０％またはそれ以上、７０％またはそれ以上、例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の競合は、これらの抗体が「同じエピトープに結合する」ことを示す。２つの抗体間の競合レベルを評価する貯めに、例えば、放射免疫測定法または抗体に対して他の標識を使用するアッセイを使用することができる。例えば、ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢ抗原を、同じ量の第２の標識されていない抗ＭＩＣＡ抗体の存在下で、標識化化合物（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、ビオチン、またはルビジウム）にコンジュゲートされた飽和量の第１の抗ＭＩＣＡ抗体またはその抗原結合フラグメントとインキュベートすることができる。次に、標識されていないブロッキング抗体の存在化で抗原に結合する標識された抗体の量を評価し、標識されていないブロッキング抗体の非存在下での結合と比較する。競合は、ブロッキング抗体の非存在下と比較しての、標識されていないブロッキング抗体の存在下での結合シグナルの変化パーセントによって決定される。したがって、ブロッキング抗体の非存在下での標識された抗体の結合と比較して、ブロッキング抗体の存在下での標識された抗体の結合の５０％阻害があるとき、５０％の２つの抗体間での競合がある。したがって、５０％またはそれ以上、６０％またはそれ以上、７０％またはそれ以上、例えば７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の第１および第２の抗体間の競合についての言及は、第１の抗体が抗原への第２の抗体の結合（または逆もまた同様）を（第１の抗体の非存在下で第２の抗体による抗原の結合と比較して）５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上を阻害することを意味する。したがって、第２の抗体による抗原への第１の抗体の結合の５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の阻害は、２つの抗体が同じエピトープに結合することを示す。
【０１９６】
（１）本明細書に記載されているＶＨ  ＣＤＲ領域の１つ以上を含むＶＨ配列および本明細書に記載されているＶＬ  ＣＤＲ領域の１つ以上を含むＶＬ配列、および（２）異種フレームワーク領域を含む操作された組換え抗体も提供する。異種フレームワーク領域は、ＣＤＲ領域の天然供給源ではない抗体、細胞、またはヒトに由来し得る。例えば、一部の実施形態では、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１１のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および同じＣＤＲを含む抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１１に由来しないフレームワーク領域を含み得る。一部の実施形態では、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ１のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および抗体ＩＤ１に由来しないフレームワーク領域を含み得る。一部の実施形態では、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ６のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ６のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および抗体ＩＤ６に由来しないフレームワーク領域を含み得る。一部の実施形態では、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ７のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ７のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および抗体ＩＤ７に由来しないフレームワーク領域を含み得る。一部の実施形態では、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ８のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ８のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および抗体ＩＤ８に由来しないフレームワーク領域を含み得る。一部の実施形態では、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ９のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ９のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および抗体ＩＤ９に由来しないフレームワーク領域を含み得る。一部の実施形態では、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ１１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ１１のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および抗体ＩＤ１１に由来しないフレームワーク領域を含み得る。
【０１９７】
（１）本明細書に記載されているＶＨ  ＣＤＲ領域の１つ以上を含むＶＨ配列および本明細書に記載されているＶＬ  ＣＤＲ領域の１つ以上を含むＶＬ配列、および（２）異種定常領域を含む操作された組換え抗体も提供する。異種定常領域は、ＣＤＲ領域の天然供給源ではない抗体、細胞、またはヒトに由来し得る。例えば、一部の実施形態では、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１１のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、およびＣＤＲが得られたヒトではないヒトの定常領域を含み得る。一部の実施形態では、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ１のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および抗体ＩＤ１に由来しない定常領域を含み得る。一部の実施形態では、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ６のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ６のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および抗体ＩＤ６に由来しない定常領域を含み得る。一部の実施形態では、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ７のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ７のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および抗体ＩＤ７に由来しない定常領域を含み得る。一部の実施形態では、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ８のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ８のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および抗体ＩＤ８に由来しない定常領域を含み得る。一部の実施形態では、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ９のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ９のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および抗体ＩＤ９に由来しない定常領域を含み得る。一部の実施形態では、抗体は、表１に示される抗体ＩＤ１１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または抗体ＩＤ１１のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および抗体ＩＤ１１に由来しない定常領域を含み得る。
【０１９８】
（１）本明細書に記載されているＶＨ  ＣＤＲ領域の１つ以上を含むＶＨ配列および本明細書に記載されているＶＬ  ＣＤＲ領域の１つ以上を含むＶＬ配列、および（２）異種Ｆｃ領域を含む操作された組換え抗体も提供する。異種Ｆｃ領域は、ＣＤＲ領域の天然供給源ではない抗体、細胞、またはヒトに由来し得る。
【０１９９】
出発原料から改変された特性を有し得る修飾抗体を設計されるように、出発原料として本明細書中に開示されるＶＨおよび／またはＶＬ配列のうちの１つ以上を有する抗体を使用して、作製された改変および修飾された抗体も提供する。ここで修飾抗体は最初の抗体からの改変された特性を有しうる。抗体は、一方もしくは両方の可変領域（すなわちＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば１つ以上のＣＤＲ領域内および／または１つ以上のフレームワーク領域内での１つ以上の残基の修飾によって改変可能である。さらにまたはその他として、抗体は、定常領域内で残基を修飾し、例えば抗体のエフェクター機能を改変することによって改変可能である。
【０２００】
実施することができる可変領域の改変の１つのタイプはＣＤＲ移殖である。抗体は、６つの重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基全体に支配的な標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、各抗体間でＣＤＲ外部の配列よりも多様である。ＣＤＲ配列が大部分の抗体−抗原相互作用に関与することから、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列上に移植された特定の天然抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターの作成により発現することは可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ、Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；  Ｊｏｎｅｓ、Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；  Ｑｕｅｅｎ、Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｅｅ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８６：１００２９−１００３３；Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５，２２５，５３９号、およびＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０号参照）。
【０２０１】
したがって、本開示の別の実施形態は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列（各々、配列番号４、８１、１００、１１７、１３５および１５４、配列番号８４、１０２、１１９、１３７および１５６、ならびに配列番号８、８６、１０３、１２１、１３９および１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む）を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列（各々、配列番号１３、８８、１０６、１２４、１４２および１６１、配列番号１５、９０、１０８、１２６、１４４および１６３、ならびに配列番号１７、９２、１１０、１２８、１４６および１６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む）を含む軽鎖可変領域とを含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。したがって、かかる抗体は、表１に示されるモノクローナル抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１１のＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ配列を有し、これらはさらにこれらの抗体由来の異なるフレームワーク配列を含みうる。
【０２０２】
かかるフレームワーク配列は、生殖細胞系の抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベースまたは出版された参考文献から得られうる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子における生殖細胞系ＤＮＡ配列は、（インターネット上のwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで入手可能な）「Ｖベース（ＶＢａｓｅ）」ヒト生殖細胞系配列データベースや、ならびにＫａｂａｔ、Ｅ．  Ａ．、ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２；  Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ、Ｉ．  Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  “Ｔｈｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａｂｏｕｔ  Ｆｉｆｔｙ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  Ｖ−Ｈ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｌｏｏｐｓ”  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：７７６−７９８；ならびにＣｏｘ、Ｊ．  Ｐ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  “Ａ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ    Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｂｉａｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓａｇｅ”  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：８２７−８３６（これら各々の内容は参照により本明細書中に明示的に援用される）において見出されうる。
【０２０３】
本開示の抗体で用いられる例示されるフレームワーク配列は、本開示の抗体により用いられるフレームワーク配列と構造的に類似する配列を含む。ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列、ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列はフレームワーク配列の元となる生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子内に見出される配列と同一の配列を有するフレームワーク領域上に移植されうるか、あるいはＣＤＲ配列は生殖細胞系配列と比べて１つ以上の突然変異を含むフレームワーク領域上に移植されうる。例えば、特定の例ではフレームワーク領域内の残基を突然変異させ、抗体の抗原への結合能を維持または増強することが有益であることが見出されている（例えば、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌによる米国特許第５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０号参照）。
【０２０４】
可変領域修飾の別のタイプは、アミノ酸残基をＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内で変異させ、それにより目的の抗体の１つ以上の結合特性（例えば親和性）を改善するものである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介性突然変異誘発を行い、突然変異を導入可能であり、かつ、目的の抗体の結合または他の機能特性に対する効果が、本明細書中に記載されかつ実施例に提供されるインビトロまたはインビボアッセイにおいて評価されうる。好ましくは、（上で考察の）保存的修飾が導入される。突然変異は、アミノ酸の置換、付加または欠失でありうるが、好ましくは置換である。さらに典型的には、ＣＤＲ領域内の１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ以下の残基が改変される。
【０２０５】
したがって、別の実施形態では、本開示は、（ａ）配列番号４、８１、１００、１１７、１３５および１５４からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号４、８１、１００、１１７、１３５および１５４と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号６、８４、１０２、１１９、１３７および１５６からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号６、８４、１０２、１１９、１３７および１５６と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｃ）配列番号８、８６、１０３、１２１、１３９および１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号８、８６、１０３、１２１、１３９および１５８と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域；（ｄ）配列番号１３、８８、１０６、１２４、１４２および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号１３、８８、１０６、１２４、１４２および１６１と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｅ）配列番号１５、９０、１０８、１２６、１４４および１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号１５、９０、１０８、１２６、１４４および１６３と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域；ならびに（ｆ）配列番号１７、９２、１１０、１２８、１４６および１６５からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号１７、９２、１１０、１２８、１４６および１６５と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含む単離抗ＭＩＣＡモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０２０６】
抗体のＣＤＲにおけるメチオニン残基は酸化され、可能な化学分解および抗体の効力における結果としての減少を引き起こし得る。したがって、本願発明はまた、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲにおける１つ以上のメチオニン残基が酸化的分解を受けないアミノ酸残基と置き換えられている抗ＭＩＣＡ抗体を提供する。１つの態様において、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１１のＣＤＲにおけるメチオニン残基は、酸化的分解を受けないアミノ酸残基と置き換えられる。
【０２０７】
本開示の改変抗体は、例えば抗体の特性を改善するためにＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾が施されている場合の抗体を含む。典型的には、かかるフレームワーク修飾を施すことで抗体の免疫原性が低下する。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系配列に「復帰突然変異する（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅ）」ことである。より詳細には、体細胞突然変異を経ている抗体は、抗体が誘導される生殖細胞系配列とは異なるフレームワーク残基を含みうる。かかる残基は、抗体フレームワーク配列を抗体が誘導される生殖細胞系配列と比較することにより同定されうる。フレームワーク領域配列を生殖細胞系列立体配置に戻すために、体細胞突然変異を、例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介性突然変異誘発によって、生殖細胞系列配列に「復帰突然変異させる」ことができる。かかる「復帰突然変異された」抗体もまた、本願発明により包含されることを意図する。
【０２０８】
フレームワーク修飾の別のタイプは、フレームワーク領域内またはさらに１つ以上のＣＤＲ領域内で１つ以上の残基を変異させ、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。このアプローチは、「脱免疫（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」としても称され、Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌによる米国特許公開第２００３０１５３０４３号にさらに詳述されている。
【０２０９】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内でなされる修飾に加えまたはその他として、本開示の抗体は、Ｆｃ領域内で修飾を含み、典型的には抗体の１つ以上の機能特性、例えば血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合性および／または抗原依存性の細胞毒性を変化させるように改変されうる。さらに、本開示の抗体は、化学的に修飾されうる（例えば１つ以上の化学的部分が抗体に付着されうる）か、または修飾によりそのグリコシル化が改変されさらに抗体の１つ以上の機能特性が改変されうる。これらの各実施形態は下記にさらに詳述されている。Ｆｃ領域内の残基の番号付与はＫａｂａｔのＥＵ指数のものである。
【０２１０】
Ｆｃは、免疫グロブリン、好ましくはヒト免疫グロブリンの定常領域（該定常領域のフラグメント、アナログ、変異体、突然変異体または誘導体を含む）に由来するドメインを含む。適当な免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、および他のクラス、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭを含む。免疫グロブリンの定常領域は、天然または合成ポリペプチドであり得、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはＣＨ４ドメインを、別々にまたは組み合わせて含み得る。
【０２１１】
免疫グロブリンの定常領域は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合および補体結合を含む多くの重要な抗体機能に関与する。アイソタイプによって指定される特有のエフェクター機能をそれぞれ有するＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭに分類される、重鎖定常領域の５つの主なクラスがある。例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４として知られる４つのサブクラスに分離される。本明細書で言及されるＦｃは、重鎖定常領域の任意のクラスまたはサブクラスを含み得る。
【０２１２】
Ｉｇ分子は、多数のクラスの細胞受容体と相互作用する。例えば、ＩｇＧ分子は、抗体のＩｇＧクラスに特異的なＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）の３つのクラス、すなわちＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩと相互作用する。ＦｃγＲ受容体へのＩｇＧの結合のための重要な配列は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに位置されることが報告されている。抗体の血清半減期は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する抗体の能力によって影響される。同様に、ＩｇＦｃの血清半減期もまた、かかる受容体に結合する能力によって影響される（Ｇｉｌｌｉｅｓ  Ｓ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５９：２１５９−６６）。本明細書で言及されるＦｃは、これらの受容体の１つ以上に結合し得る。
【０２１３】
本明細書に記載されている抗体は、免疫グロブリン重鎖のカルボキシ末端の少なくとも一部を含むＦｃを含み得る。例えば、Ｆｃは、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２−ＣＨ４ドメイン、ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４ドメイン、ヒンジ−ＣＨ２ドメイン、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ４ドメイン、またはヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４ドメインを含み得る。Ｆｃドメインは、任意の免疫グロブリンクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭまたは任意のＩｇＧ抗体サブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に属する抗体に由来し得る。Ｆｃドメインは、天然の対立遺伝子またはスプライス変異体を含む天然Ｆｃ配列であり得る。Ｆｃドメインは、２つまたはそれ以上の異なるＩｇアイソタイプからのＦｃドメインの一部を含むハイブリッドドメイン、例えば、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４ハイブリッドＦｃドメインであり得る。典型的な態様において、Ｆｃドメインはヒト免疫グロブリン分子に由来する。Ｆｃドメインは、限定はしないがマウス、ラット、ウサギ、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダおよびサルを含む非ヒト動物からのＦｃドメインのヒト化または脱免疫化バージョンであり得る。
【０２１４】
１つの態様において、Ｆｃドメインは、変異Ｆｃ配列、例えば、望ましい構造的特徴および／または生物学的活性を提供するように、親Ｆｃ配列（例えば、変異体を産生するために後で修飾される非修飾Ｆｃポリペプチド）と比較して（例えばアミノ酸置換、欠失および／または挿入によって）修飾されているＦｃ配列である。
【０２１５】
例えば、１つには、親Ｆｃと比較して、（ａ）増加または減少した抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）、（ｂ）増加または減少した補体依存性の細胞毒性（ＣＤＣ）、（ｃ）増加または減少したＣ１ｑに対する親和性および／または（ｄ）増加または減少したＦｃ受容体に対する親和性を有するＦｃ変異体を産生させるためにＦｃ領域において修飾を作ってもよい。かかるＦｃ領域変異体は一般的に、Ｆｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾の組み合わせが特に望ましいであると考えられる。例えば、変異Ｆｃ領域は、例えば本明細書（図面を含む）で同定される特定のＦｃ領域位置に２、３、４、５などの置換を含み得る。
【０２１６】
変異Ｆｃドメインは、ジスルフィド結合形成に関与する部位が除去される配列変化を含み得る。かかる除去は、本願発明の分子を生産するために使用される宿主細胞に存在する他のシステイン含有タンパク質との反応を回避し得る。この目的のために、Ｎ−末端でのシステイン含有セグメントは切断されてもよい、またはシステイン残基は欠失させてもよい、もしくは他のアミノ酸（例えば、アラニル、セリル）で置換してもよい。システイン残基が除去されるときでさえ、一本鎖Ｆｃドメインは、非共有的に結合している二量体Ｆｃドメインをまだ形成することができる。他の態様において、天然Ｆｃドメインは、選択される宿主細胞とより適合性とさせるように修飾させ得る。例えば、１つには、大腸菌における消化酵素、例えばプロリンイミノペプチダーゼにより認識され得る、典型的な天然ＦｃのＮ−末端近くのＰＡ配列を除去し得る。他の態様において、Ｆｃドメイン内の１つ以上のグリコシル化部位を除去してもよい。一般的にグリコシル化される残基（例えば、アスパラギン）は細胞溶解反応を与え得る。このような残基は、欠失され得るか、またはグリコシルされない残基（例えば、アラニン）で置換され得る。他の態様において、相補体との相互作用に関与する部位、例えばＣ１ｑ結合部位はＦｃドメインから除去され得る。例えば、１つにはヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失してよく、または置換してよい。１つの態様において、Ｆｃ受容体への結合に影響する部位、好ましくはｓａｌｖａｇｅ受容体結合部位以外の部位、を除去してもよい。他の態様において、Ｆｃドメインは、ＡＤＣＣ部位を除去するように修飾され得る。ＡＤＣＣ部位は当分野で知られている；例えば、ＩｇＧ１におけるＡＤＣＣ部位に関してＭｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９  （５）：  ６３３−９  （１９９２）参照。変異Ｆｃドメインの特定の例は、例えば、ＷＯ  ９７／３４６３１およびＷＯ  ９６／３２４７８に記載されている。
【０２１７】
１つの態様において、ＣＨ１のヒンジ領域が、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化する、例えば増加または減少するように修飾される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌによる米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化することで、例えば軽鎖および重鎖の構築が促進されるかあるいは抗体の安定性が増大または低下する。
【０２１８】
他の態様において、抗体のＦｃヒンジ領域の突然変異により抗体の生物学的半減期が減少する。より詳細には、抗体により天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合に対するブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合が低下している程度に、１つ以上のアミノ酸変異がＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入される。このアプローチは、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌによる米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳述されている。
【０２１９】
他の態様において、抗体の修飾によりその生物学的半減期が増加する。様々なアプローチが可能である。例えば、ワード（Ｗａｒｄ）に交付された米国特許第６，２７７，３７５号明細書に記載のように、１つ以上の以下の変異、すなわちＴ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆが導入可能である。あるいは、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌによる米国特許第５，８６９，０４６号および米国特許第６，１２１，０２２号に記載のように、生物学的半減期を増加させるため、抗体はＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）受容体結合エピトープを有するようにＣＨ１またはＣＬ領域内で改変されうる。
【０２２０】
１つの態様において、Ｆｃは、以下に示されるヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む：ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号：１７１）。最後のグリシンおよびリジンは任意であると理解すべきである。１つの態様において、Ｆｃは、（配列番号：１７１）と少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。１つの態様において、Ｆｃは、（配列番号：１７１）の少なくとも５０、１００または１５０個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。１つの態様において、Ｆｃは、（配列番号：１７１）の５０−１００、５０−１５０、または１００−１５０個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。１つの態様において、Ｆｃは、１−５、１−１０、１−１５、１−２０、または１−２５の置換または保存的置換を有する（配列番号：１７１）を含むアミノ酸配列を含む。ヒト野生型γ１定常領域配列は、最初にＥｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １０：４０７１  （１９８２）におけるＬｅｒｏｙ  Ｈｏｏｄ’ｓ  ｇｒｏｕｐによって記載された。ＥＵ指数位置３５６、３５８および４３１はＧ１ｍγ１ハプロタイプを定義する。
【０２２１】
さらなるＦｃ変異体は以下に記載される。開示のＦｃ領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、Ｖａ．）による、ＥＵ指数による番号付与配置を含むと理解される。
【０２２２】
本願発明は、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換し、抗体のエフェクター機能を改変することによって改変されるＦｃ領域を有するペプチドを含む。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸が、抗体がエフェクターリガンドに対して改変された親和性を有しても親抗体の抗原への結合能を保持する程度に異なるアミノ酸残基と置換されうる。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えばＦｃ受容体または補体のＣ１成分でありうる。このアプローチは、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌによる米国特許第５，６２４，８２１および５，６４８，２６０号にさらに詳述されている。
【０２２３】
別の例では、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸が、抗体がＣ１ｑ結合を改変しおよび／または補体依存性の細胞毒性（ＣＤＣ）を低減または根絶している程度に異なるアミノ酸残基と置換されうる。このアプローチは、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌによる米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳述されている。
【０２２４】
別の例では、アミノ酸位置２３１および２３９内の１つ以上のアミノ酸残基が改変されることにより、抗体の補体を固定する能力が改変される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌによるＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１にさらに記載されている。
【０２２５】
さらに別の例では、以下の位置、すなわち２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８もしくは４３９での１つ以上のアミノ酸の修飾によるＦｃ領域の修飾により、抗体の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力が増大しおよび／または抗体のＦｃγ受容体に対する親和性が増大する。このアプローチは、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開ＷＯ００／４２０７２にさらに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上のＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対する結合部位がマッピングされており、かつ結合が改善された変異体についての記載がなされている（Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｒ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：６５９１−６６０４参照）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９での特異的変異がＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善することが示された。さらに、以下の変異体の組み合わせ、すなわちＴ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４ＡがＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善することが示された。典型的な置換は、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄ、および３３２Ｅを含む。典型的な変異体は、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ａ／２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｆ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ、２６７Ｅ／３２４Ｔ、ａｎｄ  ２６７Ｅ／２６８Ｆ／３２４Ｔを含む。ＦｃｙＲおよび補体相互作用を増強させるための他の修飾は、限定はしないが置換２９８Ａ、３３３Ａ、３３４Ａ、３２６Ａ、２４７１、３３９Ｄ、３３９Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、３９６Ｌ、３０５１、および３９６Ｌを含む。これらの他の修飾は、Ｓｔｒｏｈｌ，  ２００９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：６８５−６９１に概説される。
【０２２６】
Ｆｃガンマ受容体への結合を増加させるＦｃ修飾は、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７９、２８０、２８３、２８５、２９８、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３１２、３１５、３２４、３２７、３２９、３３０、３３５、３３７、３３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７９、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９の任意の１つ以上でアミノ酸修飾を含み、Ｆｃ領域内の残基の番号付与はＫａｂａｔのＥＵ指数のものである（ＷＯ００／４２０７２）。
【０２２７】
Ｆｃに作ることができる他のＦｃ修飾は、ＦｃｙＲおよび／または補体タンパク質への結合を低下または除去し、それによりＦｃ介在エフェクター機能、例えばＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣを低下または除去するためのものである。典型的な修飾は、限定はしないが、位置２３４、２３５、２３６、２３７、２６７、２６９、３２５、および３２８での置換、挿入、および欠失を含み、番号付与はＥＵ指数のものである。典型的な置換は、限定はしないが２３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌ、および３２８Ｒを含み、番号付与はＥＵ指数のものである。Ｆｃ変異体は２３６Ｒ／３２８Ｒを含み得る。ＦｃｙＲおよび補体相互作用を減少させるための他の修飾は、置換２９７Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３７Ａ、３１８Ａ、２２８Ｐ、２３６Ｅ、２６８Ｑ、３０９Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２９Ｓ、２３８Ｓ、２３３Ｐ、および２３４Ｖ、ならびに突然変異手段または酵素的手段によって、またはタンパク質をグリコシル化しない細菌のような生物体における生産によって位置２９７でのグリコシル化の除去を含む。これらの他の修飾はは、Ｓｔｒｏｈｌ、２００９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：６８５−６９１に概説される。
【０２２８】
所望により、Ｆｃ領域は、当業者に知られているさらなる、および／または代替の位置で非天然アミノ酸残基を含み得る（例えば、米国特許第５，６２４，８２１；６，２７７，３７５；６，７３７，０５６；６，１９４，５５１；７，３１７，０９１；８，１０１，７２０号；ＰＣＴ特許公報ＷＯ  ００／４２０７２；ＷＯ  ０１／５８９５７；ＷＯ  ０２／０６９１９；ＷＯ  ０４／０１６７５０；ＷＯ  ０４／０２９２０７；ＷＯ  ０４／０３５７５２；ＷＯ  ０４／０７４４５５；ＷＯ  ０４／０９９２４９；ＷＯ  ０４／０６３３５１；ＷＯ  ０５／０７０９６３；ＷＯ  ０５／０４０２１７、ＷＯ  ０５／０９２９２５およびＷＯ  ０６／０２０１１４）。
【０２２９】
抑制性受容体ＦｃｙＲｌｌｂに対する親和性を増強させるＦｃ変異体もまた使用され得る。このような変異体は、例えばＢ細胞および単球を含む、ＦｃｙＲｌ  ｌｂ＋細胞と関連している免疫調節活性を有するＦｃを提供し得る。１つの態様において、Ｆｃ変異体は、１つ以上の活性化受容体と比較して、ＦｃｙＲｌｌｂに対する選択的に増強されたアフィニティーを提供する。ＦｃｙＲｌ  ｌｂへの結合を変化させるための修飾は、ＥＵ指数による、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８、および３３２からなる群から選択される位置での１つ以上の修飾を含む。ＦｃｙＲｌ  ｌｂ  アフィニティーを増強させるための典型的な置換は、限定はしないが、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙ、および３３２Ｅを含む。典型的な置換は、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、および３２８Ｙを含む。ＦｃｙＲｌ  ｌｂへの結合を増強させるための他のＦｃ変異体は、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅ、および２６７Ｅ／３２８Ｆを含む。
【０２３０】
Ｆｃ領域のそのリガンドに対する親和性および結合特性は、限定はしないが、平衡方法（例えば、酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、または放射免疫測定法（ＲＩＡ））、または動力学（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ分析）、および他の方法、例えば間接結合アッセイ、競合結合アッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）を含む、当分野で知られている種々のインビトロアッセイ方法（生化学的または免疫学的ベースのアッセイ）により決定され得る。これらおよび他の方法においては、検査されている１以上の成分上の標識を利用することが可能であり、および／または、限定はしないが色素原標識、蛍光標識、発光標識または同位体標識を含む種々の検出方法を利用することが可能である。結合親和性および動力学の詳細な説明は、抗体−免疫原相互作用を中心に説明しているＰａｕｌ、Ｗ．  Ｅ．、ｅｄ．、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４ｔｈ  Ｅｄ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  （１９９９）において見出され得る。
【０２３１】
Ｆｃはまた、抗体の血清半減期を増強させ得る。例えば、これは、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合親和性を増加させることによって行われ得る。例えば、１つ以上の以下の残基を変異させることができる：米国特許第６，２７７，３７５号に記載されている２５２、２５４、２５６、４３３、４３５、４３６。
【０２３２】
ＦｃＲｎへの結合を増加させ、および／または薬物動態学的特性を改善する他の典型的なＦｃ変異体は、位置２５９、３０８、４２８、および４３４での置換、例えば２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、および４３４Ｍを含む。ＦｃＲｎへの結合Ｆｃを増加させる他の変異体は、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００４、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９（８）：  ６２１３−６２１６、Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７６：３４６−３５６）、２５６Ａ、２７２Ａ、２８６Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３０７Ｑ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７６Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１  、２７６（９）：６５９１−６６０４）、２５２Ｆ、２５２Ｔ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｓ、２５６Ｒ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、２５６Ｔ、３０９Ｐ、３１１Ｓ、４３３Ｒ、４３３Ｓ、４３３Ｉ、４３３Ｐ、４３３Ｑ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ、３０８Ｔ／３０９Ｐ／３１１Ｓ（Ｄａｌｌ  Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００２、１６９：５１７１−５１８０、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．、２００６、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８１  ：２３５１４−２３５２４）を含む。ＦｃＲｎ結合を調節するための他の修飾は、Ｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８２：７６６３−７６７１に記載されている。
【０２３３】
１つの態様において、特定の生物学的特性を有するハイブリッドＩｇＧアイソタイプが、使用され得る。例えば、ｌｇＧ１／ｌｇＧ３ハイブリッド変異体は、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるｌｇＧ１位置を２つのアイソタイプが異なる位置でのｌｇＧ３からのアミノ酸で置換することによって構築され得る。したがって、１つ以上の置換、例えば、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２Ｉ、４３５Ｒ、および４３６Ｆを含むハイブリッド変異体ＩｇＧ抗体が構築され得る。本願発明の他の態様において、ｌｇＧ１／ｌｇＧ２ハイブリッド変異体は、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるｌｇＧ２位置を２つのアイソタイプが異なる位置でのｌｇＧ１からのアミノ酸で置換することによって構築され得る。したがって、１つ以上の置換、例えば、１つ以上の以下のアミノ酸置換：２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ（位置２３６でのグリシンの挿入に関して）、および３２７Ａを含むハイブリッド変異体ＩｇＧ抗体が構築され得る。
【０２３４】
さらに別の態様において、抗体のグリコシル化は修飾される。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、抗体がグリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、抗体の抗原に対するアフィニティーを増強するために改変することができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内でグリコシル化の１つ以上の部位を改変することにより達成することができる。例えば、１つ以上のアミノ酸置換は、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらし、それによってその部位のグリコシル化を排除するように行うことができる。このような非グリコシル化は抗体の抗原に対するアフィニティーを増強し得る。かかるアプローチは、Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，７１４，３５０および６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載されている。あるいは、Ｆｃ領域に共有的に付着させるオリゴ糖は、例えば種々の生物体または細胞系、操作されたものまたは別で（例えば、Ｌｅｃ−１３  ＣＨＯ細胞またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）においてＩｇＧを発現させることによって、グリコシル化経路に関与する酵素（例えば、ＦＵＴ８［ａ１，６−フコシルトランスフェラーゼ］および／またはβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］）を調節することによって、ＩｇＧが発現された後に炭水化物を修飾することによって、または酵素的阻害剤としてフコースアナログの存在下でＦｃ融合タンパク質を発現させることによって、変化させることができる。Ｆｃの糖型を修飾させるための他の方法は、酵母（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４（２）：２１０−２１５）、コケ（ｍｏｓｓ）（Ｎｅｃｈａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００７、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｊｏｌ  ４４（７）：  １８２６−８）、および植物（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．、２００６、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４（１２）：１５９１  −７）の糖操作された(glycoengineered)系統を使用することを含む。
【０２３５】
１つの態様において、Ｆｃ融合は、シアル化(sialylation)のレベルを変化させるように糖操作される。Ｆｃ分子におけるシアル化されたＦｃグリカンのより高いレベルは、機能性に有害に影響を与え得る（Ｓｃａｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００７、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４４（７）：  １５２４−３４）、およびＦｃシアル化のレベルにおける違いは修飾された抗炎症活性をもたらすことができる（Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：６７０−６７３）。
【０２３６】
Ｆｃ分子のグリコシル化のレベルはまた特定の突然変異によって修飾され得る。例えば、アミノ酸位置２９７または２９９での突然変異は、位置２９７でのグリコシル化を取り除く。使用され得る他のＦｃ修飾は、ＷＯ８８／０７０５４、ＷＯ８８／０７０８９、ＵＳ  ６，２７７，３７５、ＷＯ９９／０５１６４２、ＷＯ０１／０５８９５７、ＷＯ２００３／０７４６７９、ＷＯ２００４／０２９２０７、ＵＳ  ７，３１７，０９１およびＷＯ２００４／０９９２４９に記載されているものを含む。
【０２３７】
さらにまたはその他として、グリコシル化の改変タイプを有する抗体、例えば減量されたフコシル残基を有する低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体または増強されたＧｌｃＮａｃ二分構造を有する抗体が作製されうる。かかる改変されたグリコシル化パターンにより、抗体のＡＤＣＣ能力が増大することが示されている。かかる炭水化物修飾は、例えばグリコシル化機構が改変された宿主細胞内で抗体を発現することにより行われうる。グリコシル化機構が改変された細胞については当該技術分野で記載がなされており、本開示の組換え抗体を発現することにより改変されたグリコシル化を有する抗体が産生される宿主細胞として用いられうる。例えば、Ｈａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．によるＥＰ１，１７６，１９５は、機能的に破壊されたフコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系について記載している。かかる細胞系内で発現される抗体は低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を示す。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５には、フコースをＡｓｎ（２９７）に連結された炭水化物に付着させる能力が低下した（その宿主細胞内で発現される抗体の低フコシル化ももたらす）変異ＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃ１３細胞について記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｒ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：２６７３３−２６７４０も参照）。Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．によるＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２には、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えばβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を、改変された細胞系内で発現される抗体が抗体のＡＤＣＣ活性の増大をもたらすＧｌｃＮａｃ二分構造の増大を示すように発現するように改変された細胞系について記載されている（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １７：１７６−１８０も参照）。
【０２３８】
さらに、特定のＦｃ変異体は、Ａｒｇ２１８がクローニングを容易にするためにＢｇ１ＩＩ制限酵素認識配列を含むようにヒンジ領域に導入されているがγ１ヒンジ領域を含み、対になっていないスルフヒドリル基の可能性のある存在によって悪影響を防止するようにＣｙｓ残基置換のためにＳｅｒを含むＦｃ４変異体を含む。Ｆｃ４のＣＨ２領域はγ１  ＣＨ２に基づき、Ｆｃ  γ受容体Ｉ（ＦｃγＲＩ）結合を低下させる３つのアミノ酸置換を含む。これらは、ＥＵ指数位置２３４、２３５、および２３７での置換である。これらの置換は、Ｇｒｅｇ  Ｗｉｎｔｅｒ’ｓ  ｇｒｏｕｐによるＤｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：５６３  （１９８８）において記載され、Ｆｃ  γ  ＲＩへの結合を低下させるについてこの文献に示された。加えて、補体Ｃ１ｑ結合部位における２つのアミノ酸置換は、補体結合を低下させるように導入された。これらは、ＥＵ指数位置３３０および３３１での置換である。補体Ｃ１ｑ結合（または補体結合または活性化の欠乏）における位置３３０および３３１の重要性、または関連性は、Ｓｈｅｒｉｅ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ’ｓ  ｇｒｏｕｐによるＴａｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７８：６６１  （１９９３）およびＣａｎｆｉｅｌｄおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７３：１４８３  （１９９１）において記載されている。Ｆｃ４変異体におけるＣＨ３領域は、野生型γ１  Ｆｃと同一のままである。
【０２３９】
Ｆｃ５は、ヒンジ領域におけるＡｒｇ２１８置換が野生型Ｌｙｓ２１８残基に戻されたＦｃ４の変異体である。Ｆｃ５はまた、Ｆｃ４と同じＣｙｓ２２０Ｓｅｒ置換ならびに野生型γ１Ｆｃと同一であるＣＨ２領域を有する同じＣＨ２置換を含む。Ｆｃ６変異体は、Ｆｃ５と同じヒンジ領域置換を含み、Ｆｃ４と同じＣＨ２置換を含む。Ｆｃ６  ＣＨ３領域は、カルボキシル末端リジン残基を含まない。この特定のＬｙｓ残基は、付与されたＥＵ指数番号を有さない。このリジンは、成熟免疫グロブリンから種々の程度に除去され、したがって循環する抗体上に大部分は見られない。組換えＦｃ上のこの残基の非存在はより均質な産物をもたらし得る。Ｆｃ７変異体は、ヒンジ領域において野生型γ１  Ｆｃと同一である。そのＣＨ２領域はγ１  ＣＨ２に基づくが、残基Ａｓｎ−２９７でのＮ−連結炭水化物付着部位が、脱グリコシル化Ｆｃを生産するように、Ｇｌｎに変化される（例えば、Ｔａｏ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  （１９８９）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４３：２５９５−２６０１参照）。ＣＨ３領域は、野生型γ１  Ｆｃと同一である。Ｆｃ８変異体は、Ｆｃ４と同一であるヒンジ領域を有し、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の両方が対応する野生型γ１  Ｆｃ領域と同一である。Ｆｃ９変異体は、ちょうどカルボキシ末端のＡｓｐ残基で開始し、軽鎖へのジスルフィド結合に関与するＣｙｓ残基までの短縮γ１ヒンジを含む。残っているヒンジ配列は野生型γ１ヒンジと同一である。ＣＨ２領域配列およびＣＨ３領域配列の両方は、野生型γ１  Ｆｃに対して対応する領域と同一である。Ｆｃ１０変異体は、Ｆｃ５と同じヒンジ領域置換を含む。ＣＨ２領域配列およびＣＨ３領域配列の両方は、野生型γ１  Ｆｃに対して対応する領域と同一である。Ｆｃ１１変異体は、Ｆｃ５と同じヒンジ領域置換を含む。そのＣＨ２ドメインは、γ１  ＣＨ２に基づくが、Ｆｃγ受容体結合を減少させる置換（ＥＵ指数位置２３４、２３５、および２３７での置換）を含む。Ｆｃ１１は、Ｃ１ｑ結合および補体結合について野生型である。Ｆｃ１１のＣＨ３ドメインは、野生型γ１  ＣＨ３と同一である。Ｆｃ１２変異体は、Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒ、Ｃｙｓ２２６Ｓｅｒ、およびＣｙｓ２２９Ｓｅｒ置換を有するγ１ヒンジを含み、Ｆｃ５と同一であるＣＨ２ドメインを有し、野生型γ１  ＣＨ３ドメインを有する。Ｆｃ１３変異体は、Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒ、Ｃｙｓ２２６Ｓｅｒ、およびＣｙｓ２２９Ｓｅｒ置換を有するγ１ヒンジを含み、Ｆｃ５と同一であるＣＨ２ドメインを有し、Ｔｙｒ４０７Ｇｌｙ置換を有する野生型γ１  ＣＨ３を有する。Ｆｃ１４変異体は、Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒ、Ｃｙｓ２２６Ｓｅｒ、およびＣｙｓ２２９Ｓｅｒ置換を有するγ１ヒンジを含み、野生型γ１  ＣＨ２を有し、Ｔｙｒ４０７Ｇｌｙ置換を有する野生型γ１  ＣＨ３を有する。Ｆｃ１５変異体は、ＩｇＧ４「Ｆａｂ交換」を減少させるようにＳｅｒ２２８Ｐｒｏ置換を有するγ４ヒンジを含み、野生型γ４  ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する。Ｆｃ１６変異体は、Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒ置換を含むγ１ヒンジを含み、γ１  ＣＨ２と同一であるＣＨ２ドメインを有し、野生型γ４  ＣＨ３と同一であるＣＨ３ドメインを有する。Ｆｃ１７変異体は、Ｃｙｓ２２０Ｓｅ���置換を有するγ１ヒンジを含み、Ｐｈｅ２４３Ａｌａ置換を有するγ１  ＣＨ２ドメインを有し、野生型γ１  ＣＨ３と同一であるＣＨ３ドメインを有する。Ｆｃ１８変異体は、Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒ置換を有するγ１ヒンジを含み、野生型γ１  ＣＨ２と同一であるγ１  ＣＨ２ドメインを有し、Ｈｉｓ４３５Ａｌａ置換を有するγ１  ＣＨ３を含む。Ｆｃ１９変異体は、Ｆｃ５と同一であるヒンジを含み、残基Ａｓｎ−２９７でのＮ−連結炭水化物付着部位が脱グリコシル化Ｆｃを生産するようにＧｌｎに変化されていることを除きＦｃ５と同一であるＣＨ２ドメインを有し、野生型γ１  ＣＨ３と同一であるＣＨ３ドメインを有する。Ｆｃ２１変異体は、Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒ、Ｃｙｓ２２６Ｓｅｒ、およびＣｙｓ２２９Ｓｅｒ置換を有するγ１ヒンジを含み、Ｆｃ５と同一であるＣＨ２ドメインを有し、Ｐｈｅ４０５ＡｌａおよびＴｙｒ４０７Ｇｌｙ置換を有するγ１  ＣＨ３を有する。Ｆｃ２２変異体は、Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒ、Ｃｙｓ２２６Ｓｅｒ、およびＣｙｓ２２９Ｓｅｒ置換を有するγ１ヒンジを含み、Ｆｃ１と同一であるＣＨ２ドメインを有し、Ｐｈｅ４０５ＡｌａおよびＴｙｒ４０７Ｇｌｙ置換を有するγ１  ＣＨ３を有する。Ｆｃ２３変異体は、Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒ置換を有するγ１ヒンジを含み、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ、Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ置換を有するγ１  ＣＨ２ドメインを有し、野生型γ１  Ｆｃと同一であるＣＨ３ドメインを有する。
【０２４０】
本願発明で検討される本明細書中の抗体の別の修飾はペグ化(pegylation)である。抗体をペグ化することで、例えば抗体の生物学的（例えば血清）半減期が増加されうる。抗体をペグ化するため、抗体またはその断片は、典型的にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１つ以上のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着した状態になるという条件下で反応する。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行われる。本明細書において使用されるとき用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質、例えばモノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを誘導体化するのに用いられているＰＥＧの形態のいずれかを包含することを意図されている。１つの態様において、ペグ化されるべき抗体はアグリコシル化(aglycosylated)抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当該技術分野で既知であり、本願発明の抗体に適用可能である。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．によるＥＰ  ０  １５４  ３１６およびＩｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．によるＥＰ  ０  ４０１  ３８４参照。
【０２４１】
使用方法
一部の例では、本開示は、本明細書で開示される組成物を対象に投与することを包含する処置方法を提供する。
【０２４２】
本明細書においては、対象における癌または癌の症状の処置および／または予防方法も提供され、方法は、ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連性配列Ａ（ＭＩＣＡ）に免疫特異的に結合する、治療に有効な量のペプチドを、前記対象に投与することを包含し、前記ペプチドは、５以下の保存的アミノ酸置換を有する、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１１のＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）３と、５以下の保存的アミノ酸置換を有する、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、９または１１のＶＬのＣＤＲ３と、を含む。一部の実施例では、癌は、ＭＩＣＡの過剰発現を伴う癌である。一部の実施形態では、癌は、黒色腫、肺癌、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、並びに結腸癌、リンパ腫または白血病である。一部の実施形態では、癌は黒色腫である。一部の実施形態では、癌は、形質細胞の悪性腫瘍であり、例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）または形質細胞の前癌性状態である。一部の実施例では、対象は、それまでに癌を有するものとして診断されているか、または癌になりやすいものとして診断されている。
【０２４３】
一部の例では、本開示は、対象における癌または癌の症状の処置および／または予防方法を提供し、方法は、ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連性配列Ａ（ＭＩＣＡ）に特異的に結合する単離抗体を含む治療に有効な量の組成物を、前記対象に投与することを包含し、前記抗体は、配列番号２、７７、９６、１１３、１３１または１５０のＶＨ配列として示される、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１１、７９、９８、１１３、１３３または１５２の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列と、を含む。
【０２４４】
当業者により公知の癌の症状としては、限定するものではないが、異常な分子特徴、非対称性、境界、色、および／または直径など分子外見の変化、新規色素沈着を生じた皮膚面積、異常なほくろ、爪下暗色化領域、乳房腫瘤、乳頭変化、乳房嚢胞、乳房痛、死亡、体重減少、脱力感、過剰な倦怠感、食欲低下、食欲不振、慢性咳嗽、息切れの悪化、喀血、血尿、血便、悪心、嘔吐、肝転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、鼓腸、腹腔内液体貯留、膣出血、便秘、腹部膨隆、結腸の穿孔、急性腹膜炎（感染、発熱、疼痛）、疼痛、吐血、大量の発汗、発熱、高血圧、貧血症、下痢、黄疸、目眩、悪寒、筋痙攣、大腸癌転移、肺転移、膀胱転移、肝転移、骨転移、腎転移、および膵転移、嚥下障害、および同様の症状が挙げられる。
【０２４５】
本明細書で開示される方法は、広範な種、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、シカ、エルク、ヤギ、イヌ、ネコ、イタチ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラット、およびマウスに適用することができる。
【０２４６】
本明細書で使用するとき、用語「処置」または「処置する」は、対象が罹患している疾患または状態の少なくとも１つの症状または生物学的徴候の発現、進行または再発を軽減、阻害、寛解、および／または軽減することを指す。一部の例では、処置により、患者が罹患している疾患または状態が持続的に消失し得る。
【０２４７】
用語「有効用量」または「有効量」は、所望の効果をなし遂げる十分な量または所望の効果を少なくとも部分的になし遂げる量として定義される。用語「治療有効用量」は、疾患にすでに罹患している患者における疾患およびその合併症を治癒する、または少なくとも部分的に阻止するために十分な量として定義される。この使用に対して有効な量は、処置される障害の重症度および患者自身の免疫系の全身状態に依存する。
【０２４８】
薬物または治療剤、例えば本願発明のＦｃ融合タンパク質の「治療有効な量」または「治療有効用量」は、単独または別の治療剤と組み合わせて使用して、病徴の重症度の低下、無症状期間の頻度および持続時間の増加、または病気の苦痛に起因する欠陥または障害の阻止により証明される疾患退行を促進する薬物の任意の量である。薬物の治療有効な量または用量は、単独または別の治療剤と組み合わせて疾患を発症する危険性がある、または疾患の再発に苦しむ対象に投与されると、疾患の発症または再発を阻害する薬物の任意の量である「予防的有効量」または「予防有効用量」を含む。疾患退行を促進する、または疾患の発症または再発を阻害する治療剤の能力は、当業者に既知の種々の方法を使用して、例えば臨床試験中のヒト対象において、ヒトにおける有効性の動物モデルシステム予測において、またはインビトロアッセイにおいて薬剤の活性をアッセイすることにおいて評価することができる。
【０２４９】
一例として、抗癌剤は対象における癌退行を促進する。好ましい態様において、治療有効な量の薬物は、癌を除去する点で癌退行を促進する。「癌退行を促進」は、有効な量の薬物を単独または抗腫瘍剤と組み合わせての投与が、腫瘍増殖またはサイズの減少、腫瘍の壊死、少なくとも１つの病徴の重症度の減少、無症状期間の頻度および持続時間の増加、病気の苦痛に起因する欠陥または障害の阻止、または患者における病徴の改善を引き起こすことを意味する。加えて、処置に関して用語「有効」および「有効性」は、薬理学的有効性および生理学的安全性の両方を含む。薬理学的有効性は、患者における癌退行を促進する薬物の能力を示す。生理学的安全性は、毒性、または薬物の投与によって引き起こされる細胞、臓器および／または生物体レベルでの他の有害生理学的効果（副作用）のレベルを示す。
【０２５０】
腫瘍の処置のための一例として、薬物の治療有効な量または用量は好ましくは、未処置対象と比較して、細胞増殖または腫瘍増殖を少なくとも約２０％、さらに好ましくは少なくとも約４０％、よりさらに好ましくは少なくとも約６０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％を阻害する。最も好ましい態様において、薬物の治療有効な量または用量は、細胞増殖または腫瘍増殖を完全に阻害する、すなわち、好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を１００％阻害する。腫瘍増殖を阻害する化合物の能力は、以下に記載されているアッセイを使用して評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は細胞増殖を阻害する化合物の能力を試験することにより評価することができる、かかる阻害は当業者に既知のアッセイによりインビトロで測定することができる。本願発明の他の好ましい態様において、腫瘍退縮は、少なくとも約２０日間、さらに好ましくは少なくとも約４０日間、また  よりさらに好ましくは少なくとも約６０日間観察または持続され得る。
【０２５１】
一般的に、方法は、状態または疾患に関連するリスクを有する、あるいは状態または疾患を有する対象を選別することを包含する。一部の例では、対象の状態または疾患は、本明細書で開示される医薬組成物により処置することができる。例えば、一部の例では、方法には、癌を有する対象を選別することが包含され、例えば、対象の癌は、ＭＩＣＡおよび／またはアンジオポエチン−２のいずれかまたは両方を標的とすることにより処置することができる。
【０２５２】
一部の例では、処置方法には、必要に応じて、患者が罹患している疾患または病状を予防または処置するための、単回投与、複数回投与、および反復投与が包含される。場合によっては、処置方法には、処置前、処置中、および／または処置後に対象において疾患の程度を評価することを包含させることができる。一部の例では、処置は、対象において検出される疾患の度合いが低減するまで継続することができる。
【０２５３】
本明細書で使用するとき、用語「投与する」、「投与すること」、または「投与」は、形態にかかわらず本発明のペプチドを、埋め込むこと、吸収させること、摂取させること、注入すること、または吸入させることを指す。一部の例では、本明細書で開示される１つ以上のペプチドは、対象に局所的に（例えば、経鼻的に）、および／または経口的に投与することができる。例えば、本明細書に記載の方法には、有効な量の化合物または化合物の組成物を投与して、所望のまたは記載の効果を得ることが包含される。任意の特定の患者に対する具体的な投与法および処置レジメンは、使用する具体的な化合物の活性、年齢、体重、通常の健康状態、性別、体重、投与時間、排泄速度、合剤、疾患、状態、または症状の重症度および経過、疾患、状態、または症状に対する患者の性質、並びに処置を行う医師の判断などといった多様な因子に応じ変化し得る。
【０２５４】
例えば、投与レジメンを調節することで最適な所望の応答（例えば治療応答）がもたらされる。単回ボーラスが投与され得るか、数回の分割用量が時間とともに投与され得るか、または同用量が治療状況の要件で示されるように比例的に減少または増加され得る。投与の容易さおよび用量の均一性を意図し、非経口組成物を投与単位形態で調製することが特に有利である。本明細書において使用されるとき「投与単位形態」は、処置されるべき対象に対する単一の用量として適合する物理的に別々の単位であり、各単位は必要とされる医薬担体と一緒に所望の治療効果をもたらすように計算された既定量の活性化合物を有する。本願発明の投与単位形態における仕様は、（ａ）活性化合物固有の特性および達成されるべき特定の治療効果と、（ｂ）個体における感受性を治療するためにかかる活性化合物を化合する当該技術分野に内在する制限により決定づけられ、かつそれらに直接依存している。
【０２５５】
抗ＭＩＣＡ抗体または抗体断片の投与においては、用量は、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、およびより一般的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば用量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重または１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。典型的な処置レジメンでは、毎週１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、１か月に１回、３か月ごとに１回または３〜６か月ごとに１回の投与が必要とされる。本願発明の抗ＭＩＣＡ抗体に対する好ましい投与レジメンは、静脈内投与を介した１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、ここで抗体は（ｉ）６回投与を４週ごと、次いで３か月ごと；（ｉｉ）３週ごと；（ｉｉｉ）１回の３ｍｇ／ｋｇ体重、次いで３週ごとに１ｍｇ／ｋｇ体重といった投与スケジュールのうちの１つを用いて投与される。
【０２５６】
いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が同時投与され、いずれの場合でも投与される各抗体の用量は指定範囲内に含まれる。多くの場合、抗体が通常投与される。単回投与間の間隔は、例えば、週単位、月単位、３か月単位または年単位であってもよい。患者における抗体の標的抗原に対する血中濃度の測定により示されるとき、間隔は不規則であってもよい。用量は、ある方法では約１〜１０００μｇ／ｍｌ、またある方法では約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度をなし遂げるように調節される。
【０２５７】
あるいは、医薬組成物は徐放製剤として投与可能であり、いずれの場合でも低頻度の投与が必要とされる。用量および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変化する。一般に、ヒト抗体は最長の半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体がそれに続く。投与の用量および頻度は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかに依存して変化しうる。予防的適用においては、比較的低用量が長期にわたり比較的低頻度の間隔で投与される。一部の患者が、余生にわたって治療を受け続ける。治療的適用においては、疾患の進行が低下または終結されるまで、好ましくは患者が疾患の徴候の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量が必要とされる場合がある。その後、患者は予防レジメンで投与されうる。
【０２５８】
本願発明の医薬組成物中での活性成分の実際の用量レベルは、患者に毒性をもたらすことなく、特定の患者、組成物および投与様式について所望の治療応答を得るのに有効な活性成分の量を得るように変化しうる。選択される用量レベルは、用いられる本願発明の特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、用いられる特定の化合物の投与経路、投与時間、排出速度、用いられる特定の組成物と併用される治療薬、他の薬物、化合物および／または材料の処置時間、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般健康および過去の病歴、ならびに医術において周知の要素のようなものを含む種々の薬物動態学的因子に依存する。
【０２５９】
投与後に、対象を、疾患の程度を検出、診断、または判定するために評価することができる。一部の例では、処置を、対象において検出される疾患の程度が変化（例えば、低減）するまで継続することができる。
【０２６０】
患者の状態の改善に応じ（例えば、対象における疾患の程度の変化（例えば、低減））、必要に応じて、本発明の化合物、組成物または組み合わせの維持量を投与することができる。続いて、症状の変化に応じ、改善された状態が維持される程度にまで、投与量または投与頻度あるいはこの両方を減少させることもできる。しかしながら、患者は、何らかの疾患の症状の再発に応じて、長期にわたって断続的に処置する必要がある場合もある。
【０２６１】
一部の例では、本開示は、ヒト対象由来の、免疫細胞、例えば、Ｂ細胞および／または記憶Ｂ細胞を検出する方法を提供する。例えば、このような方法を使用して、ヒト対象において、免疫細胞、例えば、Ｂ細胞および／または記憶Ｂ細胞の程度を、例えばイベントを追跡して、モニターすることができる。イベント例としては、限定するものではないが、疾患、感染症の検出；本明細書で開示される治療用組成物の投与、治療薬または処置レジメンの投与、ワクチンの投与、免疫応答の誘導が挙げられる。このような方法は、臨床的におよび／または研究用に使用することができる。
【実施例】
【０２６２】
本発明は、以降の実施例でさらに説明される。これらの実施例は、請求項に記載される本発明の範囲を制限するものではない。
【０２６３】
本明細書に記載される方法は、所定の抗原に対し特異性を有する希少な記憶Ｂ細胞を、限られた量の末梢血から、高感度に、特異的におよび高信頼度で検出可能なものである。本方法は、抗原の排除後数カ月から数年間にわたり記憶Ｂ細胞の可視化および単離を可能にする。
【０２６４】
本明細書で開示される方法の原理の証明は、Ｆｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ，１１８（２）：３４８〜３５７（２０１１））に詳細に報告される通り、破傷風毒素のＣ末断片（ＴＴＣＦ）の四量体を使用してなされている。この参考文献は、参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【０２６５】
ほとんどの個体は破傷風トキソイドによりワクチン接種を受け、ワクチンによりＩｇＧ抗体の持続性力価を誘導されることから、ＴＴＣＦ（すなわち、ＴＴＣＦの、５２ｋＤａ、非毒性のＣ末断片）をモデル抗原として選択した（Ａｍａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５７：１９０３〜１９１５，２００７）。したがって、本明細書で開示される方法において、ＴＴＣＦを使用し、対象の大規模なプールを検証することができた。しかしながら、当業者であれば、一般的な手法を用い、任意の疾患に関連する抗原を包含するよう、本方法を改変することができることは理解するであろう。以降に例示される通り、このような改変は、癌関連抗原であるＭＩＣＡおよびアンジオポエチン−２を抗原とする抗体を獲得することにより示される。
【０２６６】
実施例１：抗原の発現および四量体の形成
以下にさらに詳細に記載される通り、ＴＴＣＦは大腸菌（Eschericia coli）において発現させ、ＢｉｒＡ酵素による部位特異的モノビオチン化のためＢｉｒＡ部位をＮ末端に取り付けた。タンパク質とビオチン化部位の間に可動性リンカーを配置し、抗体の結合に関係する立体障害を回避した。ＴＴＣＦは、アニオン交換クロマトグラフィーにより精製し、ＢｉｒＡによりビオチン化し、ゲル濾過クロマトグラフィーにより、未結合のビオチンおよびＢｉｒＡから分離した。蛍光標識したストレプトアビジンを、モル比１：４でビオチン化ＴＴＣＦ抗原とインキュベートし、ＴＴＣＦ四量体を生成した。これらの四量体を、次に一連のｍＡｂとともに使用して、破傷風トキソイドに特異的な記憶Ｂ細胞を同定した。
【０２６７】
ＴＴＣＦをｐＥＴ−１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Eschericia coli）において、１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により２８℃で４時間タンパク質発現を誘導した。細胞を洗浄し、溶解し、得られる上清を回収した。ＨＩＳ−選択親和性カラム（Ｓｉｇｍａ）を使用して、ＴＴＣＦを精製した。タンパク質分解によりＨｉｓタグを除去した。同様の方法を用い、マウスＣＤ８０膜近位ドメインを産生した。タンパク質をモノビオチン化した。特定の実験に際し、Ａｌｅｘａ−４８８染料分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、ビオチン化ＴＴＣＦまたはＣＤ８０の一級アミンに連結した。
【０２６８】
ビオチン化抗原を、モル比４：１で特級ＰＥ標識ストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と少なくとも２０分間氷上でインキュベートし、抗原四量体を調製した。使用に先立ち、四量体抗原を遠心分離し、凝集体を除去した。一部の実施例では、四量体は、４：１比のＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ−４８８標識抗原と非蛍光ストレプトアビジンとにより形成させた。
【０２６９】
実施例２：特定方法
Ｆｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１８（２）：３４８〜３５７（２０１１）に記載の通りに方法を実施した。細胞は、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ細胞選別機で分取した。細胞は単一細胞として分取した。サンプルからは、最初に、一連の除外マーカー（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、７ＡＡＤ）が陰性のＣＤ１９＋細胞をゲーティングし、次に、ＣＤ２７を高発現しかつＣＤ１９を即時的に（immediate level）発現していると同定された形質芽球をゲーティングし、最後に四量体＋  ＣＤ１９＋細胞をゲーティングした。
【０２７０】
記憶Ｂ細胞は低頻度であることから、注意深く、可能な限りバックグラウンドを減少させる必要があった。Ｂ細胞は、最初はネガティブ選別により濃縮し（ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ５６およびグリコホリンＡに対する抗体カクテル）、四量体に非特異的に結合し得る大部分の細胞を除去した。濃縮細胞を均一に分注し、ＴＴＣＦまたは対照四量体により染色した後、ＣＤ１９、ＣＤ２７およびＩｇＭにより標識して、クラススイッチした記憶Ｂ細胞を特異的に選択した。ゲーティング戦略では、ＣＤ１９を発現し、一連の除外マーカー（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、７ＡＡＤ）による標識を欠き、メモリーマーカーＣＤ２７を発現し、かつＩｇＭの発現を欠くことをクラススイッチのエビデンスとしてみなした。対象とする抗原に特異的な記憶Ｂ細胞を可視化するため、四量体の染色をＣＤ２７染色に対しプロットした。ｍＲＮＡ抽出緩衝液３μＬを入れたＰＣＲ用ストリップチューブに、四量体陽性のＢ細胞を直接分取した。
【０２７１】
分取の間チューブは冷温に維持し、分取した細胞は凍結し、−８０℃で保管した。ＣＤ１９＋  ＣＤ２７＋  ＩｇＭ−Ｂ細胞を陽性対照として使用した。
【０２７２】
既存のネステッドＰＣＲプロトコルを使用して、重鎖および軽鎖可変領域を増幅した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，２４４：２１７〜２２５，２０００）。混入を最小限に抑えるのに適切な条件下でｍＲＮＡの増幅を行った。使用したプライマーは次のものを含む：
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧ（配列番号：１９）；
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＧＡＡＧＴＴＡＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＣ（配列番号：２０）；
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＡＧＲＴＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＣ（配列番号：２１）。
【０２７３】
Ｆｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１８（２）：３４８〜３５７（２０１１）に記載の通りにネステッドＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【０２７４】
混入をモニターし、予防するため、陰性対照を包含させた。ＴＴＣＦ四量体により標識した計３５の単一細胞から、３２の重鎖および３０の軽鎖断片を増幅させ、ＰＣＲ産物をゲルから精製し直接配列決定したところ、最終的なＰＣＲ効率は８９％に相当した。配列解析により、ＴＴＣＦ四量体＋細胞では、特定の遺伝子配列が優先されることはなく、異なる多様なＶＨＤ−ＪＨ遺伝子配列が選択されていたことが明らかになった。観察された配列により、クローンにおいて、体細胞突然変異により細胞が多様化していることが支持された。
【０２７５】
抗体産生および精製には、重鎖および軽鎖可変ドメインのＤＮＡを、ウシプロラクチンシグナルペプチド配列並びに完全長のＩｇＧ１またはκ軽鎖定常ドメインを含有している別個のｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターにクローニングすることを包含させた。抗体は、３７℃、８％  ＣＯ２下で、１００ｍＬ培養フラスコを用い、８ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＣＨＯ−Ｓ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で発現させた。遺伝子導入の一日前に、細胞は６×１０５個／ｍＬとして分取した。遺伝子導入の当日に、必要があれば細胞は１×１０６個／ｍＬに調整した。ＭＡＸ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２５μｇの重鎖および軽鎖プラスミドＤＮＡを同時導入し、遺伝子導入した細胞を６〜８日間培養した。プロテインＧセファロースビーズを用いてタンパク質を得て、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．５）を使用して抗体を溶出し、Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心チューブを使用してビーズから分離した。マイクロバイオスピンカラム（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、精製抗体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に移した。タンパク質濃度は吸光度（２８０ｎｍ）により評価した。
【０２７６】
飽和結合アッセイに関し、非ビオチン化、ＭｏｎｏＱ精製ＴＴＣＦをユーロピウムにより標識し、未結合のユーロピウムを除去した。９６ウェル平底プレートの各ウェルを、２０ｎｇの抗体を含む１００ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．６）により一晩コーティングした。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびウシγグロブリンを添加したアッセイ緩衝液を用い、ブロッキングを行った。アッセイ緩衝液によりＴＴＣＦ−ユーロピウムを希釈し（１００ｎＭ〜４ｐＭ）、３ウェル１組で各ウェルに２００μＬずつ分注した。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、２００μＬの洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０μＭのＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した。各ウェルに１００μＬの増感液を加え、Ｖｉｃｔｏｒ３プレートリーダーを６１５ｎｍで使用して、蛍光をカウントした。
【０２７７】
ソフトウェアＩＭＧＴ／Ｖ−ＱｕｅｓｔおよびＪＩＯＮＳＯＬＶＥＲを使用し、重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を解析した。ＦｌｏｗＪｏ解析ソフトウェアを使用し、フローサイトメトリーデータを評価した。ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を使用し、独立ｔ検定により統計解析を実施した。抗体のＫＤ値を測定するため、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を使用して、非線形回帰分析により飽和結合データを当てはめた。
【０２７８】
実施例３：多量体化により記憶Ｂ細胞の識別が促進される
ＴＴＣＦ四量体および単量体を比較した。Ａｌｅｘａ−４８８によりＴＴＣＦを蛍光標識し、次に単量体形態で使用するか、あるいは未標識のストレプトアビジンを使用して四量体に変換した（上記を参照されたい）。次に、濃縮Ｂ細胞を、同濃度のＴＴＣＦ−Ａｌｅｘａ−４８８四量体または単量体とインキュベートした。対照タンパク質（ＣＤ８０膜近位ドメイン）を同様の方法で標識し、同様に四量体として使用した。
【０２７９】
図６Ａおよび６Ｂに示す通り、３つのドナー由来の細胞を使用したところ、ＴＴＣＦ単量体では一部の記憶Ｂ細胞が標識されていたのに対し、四量体では識別頻度は大幅に増大した（１．６〜７．３倍）。３つのＴＴＣＦ特異的記憶Ｂ細胞のドナーのうちの１つは四量体により検出されたが、単量体では検出されなかった。
【０２８０】
これらの結果から、末梢血に存在する記憶Ｂ細胞は非常にわずかであるにもかかわらず、抗原四量体により、ＢＣＲの抗原特異性に基づき、記憶Ｂ細胞を高感度に検出することが可能になることが示される。ＴＴＣＦ特異的にクラススイッチした記憶Ｂ細胞は、適切なＴＴＣＦ抗原四量体により高感度に標識されたのに対し、四量体型の対照により標識されたバックグラウンドは一貫して低かった。
【０２８１】
実施例４：方法／抗体の確認
オーバーラップＰＣＲにより、ＩｇＧ重鎖およびκ鎖の定常部を、単離された可変配列と連結して、完全ヒト型抗体を生成した。ＣＨＯ−Ｓ細胞を使用し、無血清哺乳類発現系により、６〜８日間にわたって抗体を一過性に発現させた。プロテインＧおよびゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、抗体を精製した。
【０２８２】
図７Ａ−７Ｂに示す通り、ＴＴＣＦ特異的形質芽球から単離された抗体は、ＴＴＣＦ抗原に対し、ＫＤ＝２．２ｎＭ（ＴＴＣＦ  Ａｂ  １）および３２３ｐＭ（ＴＴＣＦ  Ａｂ  ２）の高結合親和性を示した（図７Ｂ）。記憶Ｂ細胞から単離した抗体は、他の抗体に対しても、ＫＤ＝３８２ｐＭ、２２８ｐＭ、および１．４ｎＭの高結合親和性を示した（ＴＴＣＦ  Ａｂｓ  ３、４および５）（図７Ｂ）。
【０２８３】
これらのデータにより、本明細書で開示される方法の特異性が支持される。さらには、本明細書に記載の方法の特異性は、３の異なるドナーから５種の抗ＴＴＣＦ抗体を構築することによっても実証され、これらのすべての抗体は高親和性でＴＴＣＦと結合した。
【０２８４】
本明細書に示すデータは、宿主由来の抗原が排除されてから長時間が経過した後でも、抗原四量体により、記憶Ｂ細胞を高感度に検出することができることも実証する。
【０２８５】
実施例５：抗ＭＩＣＡ抗体の取得
本明細書に記載の方法を使用して、ＭＩＣＡに対し免疫特異的に結合する抗体を作製した。
【０２８６】
簡潔に述べると、抗原のモノビオチン化を可能にするＣ末端ＢｉｒＡタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号１４８））とともに、ＭＩＣＡ抗原（ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．１３０８３８）を発現させた。Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）で標識したストレプトアビジン（ＳＡ）により、抗原を四量体化した（ＭＩＣＡ：ＳＡのモル比４：１）。ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクター（ＧＶＡＸ）（ＰＮＡＳ  １０３：９１９０、２００６）により遺伝子導入した自己腫瘍細胞をワクチン接種した進行期黒色腫患者から末梢血単核細胞を得て、次に抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂから入手可能））により処理した。末梢血単核細胞を迅速に解凍し、洗浄し、２％のウシ胎児血清を添加したリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）により５×１０６にて再懸濁し、約０．１ｕｇ／ｍＬの四量体により氷上で３０分間染色した。クラススイッチした記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋、かつＩｇＭ−）を識別するため、抗体を加えた。Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、および死細胞を標識する一連の排除抗体をインキュベートして、四量体によるバックグラウンドの染色を軽減させた（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、７−ＡＡＤ）。ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩを使用し、ＭＩＣＡ四量体と結合する単一のＢ細胞をＰＣＲ用８連ストリップチューブに分取した。以下に記載の遺伝子特異的なプライマーを使用して、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販のキット（カタログ番号ＭＢＣＬ９０３１０）により、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）のｍＲＮＡを増幅した。
ｍＲＮＡの増幅
ＩｇＧ−Ｔ７：ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧ（配列番号：２２）
κ−Ｔ７：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＧＡＡＧＴＴＡＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＣ（配列番号：２３）
λ−Ｔ７：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＡＧＲＴＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＣ（配列番号：２４）
【０２８７】
第１回目のＰＣＲ
ＶＨＬ−１：ＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧ（Ｃ／Ｇ）ＡＣＣＴＧＧＡ（配列番号：２５）
ＶＨＬ−２：ＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＡＣＴＴＴＧ（Ｃ／Ｔ）ＴＣＣＡＣ（配列番号：２６）
ＶＨＬ−３：ＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣ（配列番号：２７）
ＶＨＬ−４：ＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＡＣＡ（Ｃ／Ｔ）ＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴ（配列番号：２８）
ＶＨＬ−５：ＡＴＧＧＧＧＴＣＡＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＴ（配列番号：２９）
ＶＨＬ−６：ＡＣＡＡＴＧＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＡＴ（配列番号：３０）
ＶｋＬ−１：ＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧ（配列番号：３１）
ＶｋＬ−２：ＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＡＡＴＧＣＴＣＴＧＧ（配列番号：３２）
ＶｋＬ−３：ＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＴＣＴＧＧＣＴＣ（配列番号：３３）
ＶｋＬ−４：ＣＡＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＴＴＣＴ（配列番号：３４）
ＶｌＬ−１：ＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＴＣＣＴ（配列番号：３５）
ＶｌＬ−２：ＣＴＣＣＴＣＡＣＴＣＡＧＧＧＣＡＣＡ（配列番号：３６）
ＶｌＬ−３：ＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡ（Ｔ／Ｃ）Ｃ（Ｃ／Ｇ）ＣＴＣＴＣＣ（配列番号：３７）
ＣｇＩＩ：ＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＧＡＣ（Ｃ／Ｇ）ＧＡＴＧ（配列番号：３８）
ＣｋＩＩ：ＴＴＴＣＡＡＣＴＧＣＴＣＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＧ（配列番号：３９）
ＣｌＩＩ：ＡＧＣＴＣＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＧ（Ｃ／Ｔ）ＧＧ（配列番号：４０）
【０２８８】
第２回目のＰＣＲ
ＶＨ−１：ＣＡＧＧＴ（Ｇ／Ｃ）ＣＡＧＣＴＧＧＴ（Ｇ／Ａ）ＣＡＧＴＣ（配列番号：４１）
ＶＨ−２：ＣＡＧ（Ａ／Ｇ）ＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号：４２）
ＶＨ−３：（Ｇ／Ｃ）ＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣ（配列番号：４３）
ＶＨ−４：ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号：４４）
ＶＨ−５：ＧＡ（Ｇ／Ａ）ＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣ（配列番号：４５）
ＶＨ−６：ＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣ（配列番号：４６）
Ｖｋ−１：ＣＧ（Ａ／Ｃ）ＣＡＴＣＣ（Ａ／Ｇ）Ｇ（Ａ／Ｔ）ＴＧＡＣＣＣＡＧＴ（配列番号：４７）
Ｖｋ−２：ＣＧＡＴ（Ａ／Ｇ）ＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣ（Ｃ／Ｔ）ＣＡＧ（配列番号：４８）
Ｖｋ−３：ＣＧＡＡＡＴ（Ｔ／Ａ）ＧＴＧ（Ｔ／Ａ）ＴＧＡＣ（Ｇ／Ａ）ＣＡＧＴＣＴ（配列番号：４９）
Ｖｋ−４：ＣＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴ（配列番号：５０）
Ｖｌ−１：ＣＣＡＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣ（配列番号：５１）
Ｖｌ−２：ＣＣＡＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣ（配列番号：５２）
Ｖｌ−３：ＣＴＣＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣ（Ｔ／Ａ）ＣＡＧＣ（配列番号：５３）
ＣｇＩＩＩ：ＧＡＣ（Ｃ／Ｇ）ＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡ（配列番号：５４）
ＣｋＩＩＩ：ＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣ（配列番号：５５）
ＣｌＩＩＩ：ＧＧＧＡＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＧ（配列番号：５６）
【０２８９】
第１のＰＣＲおよび第２のＰＣＲに使用したプライマーおよびＰＣＲのサイクル条件は、Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｏｌｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ、２０００）に記載の方法をもとに最適化した。
【０２９０】
上記のプライマーセットにより十分に網羅されていない可能性のあった重鎖可変領域配列を網羅するよう、代替となる重鎖可変領域の順方向プライマーのセットを開発した。以降の代替的なプライマーを作成した：
第１回目のＰＣＲ
ＶＨＬ１−５８：ＴＣＡＣＴＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＴＧＧＡ（配列番号：５７）
ＶＨＬ２−５：ＣＣＡＴＧＧＡＣＡ（Ｃ／Ｔ）ＡＣＴＴＴＧ（Ｃ／Ｔ）ＴＣＣＡＣ（配列番号：５８）
ＶＨＬ３−７：ＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＡＡＴＡＧＧＧＣＣ（配列番号：５９）
ＶＨＬ３−１１：ＡＡＣＡＡＡＧＣＴＡＴＧＡＣＡＴＡＴＡＧＡＴＣ（配列番号：６０）
ＶＨＬ３−１３．１：ＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴ（配列番号：６１）
ＶＨＬ３−１３．２：ＡＧＴＴＧＴＴＡＡＡＴＧＴＴＴＡＴＣＧＣＡＧＡ（配列番号：６２）
ＶＨＬ３−２３：ＡＧＧＴＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＴＡＧＡＡ（配列番号：６３）
ＶＨＬ４−３９：ＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡ（Ｃ／Ｔ）ＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴ（配列番号：６４）
ＶＨＬ４−６１：ＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＴＣ（配列番号：６５）
ＶＨＬ−９：ＣＣＴＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＡＣＣＡＧＣＣＣ（配列番号：６６）
【０２９１】
第２回目のＰＣＲ
ＶＨ１−３／１８：ＣＡＧＧＴ（Ｃ／Ｔ）ＣＡＧＣＴ（Ｔ／Ｇ）ＧＴＧＣＡＧＴＣ（配列番号：６７）
ＶＨ１−４５／５８：ＣＡ（Ａ／Ｇ）ＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣ（配列番号：６８）
ＶＨ２−５：ＣＡＧ（Ａ／Ｇ）ＴＣＡＣＣＴＴＧＡ（Ａ／Ｇ）ＧＧＡＧＴＣＴＧＧＴ（配列番号：６９）
ＶＨ３−９／２３／４３：ＧＡ（Ａ／Ｇ）ＧＴＧＣＡＧＣＴＧ（Ｔ／Ｇ）ＴＧＧＡＧＴＣ（配列番号：７０）
ＶＨ３−１６：ＧＡＧＧＴＡＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣ（配列番号：７１）
ＶＨ３−４７：ＧＡＧＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣ（配列番号：７２）
Ｖ４−３４：ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＡＧＴＧ（配列番号：７３）
Ｖ４−３０−２／３９：ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号：７４）
ＶＨ７−４−１：ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＣ（配列番号：７５）
【０２９２】
簡潔に述べると、初回のＰＣＲには、ｍＲＮＡ増幅により生成したｃＤＮＡ  ２ｕＬをテンプレートとして使用し、次のサイクル条件を用いた：前増幅３サイクル（９４℃／４５秒、４５℃／４５秒、７２℃／１０５秒）；増幅３０サイクル（９４℃／４５秒、５０℃／４５秒、７２℃／１０５秒）；最終的な伸長、７２℃／１０分。
【０２９３】
初回のＰＣＲ産物３ｕＬを、第２回目のネステッドＰＣＲのテンプレートとして使用した。３サイクルの前増幅を省略したことを除き、初回のＰＣＲと同様のサイクル条件を使用した。いずれのＰＣＲ工程も、クローン化したＰｆｕポリメラーゼＡＤ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで分離し、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ  ＤＮＡゲル回収キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、大きさにして３００〜４００ヌクレオチドを単離した。第２回目のネステッドＰＣＲ用の順方向および逆方向プライマーを使用して、配列決定を実施した。２段階ネステッドＰＣＲにより、重鎖および軽鎖のＢＣＲ可変ドメインを増幅する（上記を参照のこと）。ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクター（ＧＶＡＸ）により遺伝子導入した自己腫瘍細胞をワクチン接種した進行期黒色腫患者から、末梢血単核細胞を得た（ＰＮＡＳ  １０３：９１９０，２００６）。完全長のＩｇＧ１抗体として、ＣＨＯ−Ｓ発現系において抗体を発現させた。
【０２９４】
２つの独立したビーズ系アッセイにより、ＭＩＣＡに結合する抗ＭＩＣＡ抗体を検証した。初回アッセイには、各種ＭＩＣＡ対立遺伝子産物（Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ、カタログ番号ＬＳＭＩＣＡ００１）に対し、抗ＭＩＣＡ抗体の検出用に設計された市販の溶液系ビーズアッセイキットを使用した。各種濃度のＭＩＣＡ抗体をビーズとともにインキュベートし、次に洗浄し、フィコエリトリンと結合させた抗ヒトＩｇＧ抗体とともにインキュベートした。２次洗浄工程後に、装置Ｌｕｍｉｎｅｘでビーズを解析した。陰性対照は、フィコエリトリンのみ（抗ＭＩＣＡ抗体は含まない）と結合させた抗ヒトＩｇＧ抗体を備えるビーズをインキュベートしたものから構成された。陽性対照は、フィコエリトリンと直接結合させた市販の抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢモノクローナル抗体（クローン６Ｄ４）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号３２０９０６）とビーズとをインキュベートしたものから構成された。第２のアッセイは、ストレプトアビジンと結合させたポリスチレンビーズを使用して、社内で開発した。ビーズはモノビオチン化ＭＩＣＡタンパク質によりコーティングし、各種濃度の抗ＭＩＣＡ抗体、抗ＴＴＣＦ抗体（アイソタイプ陰性対照）、またはフィコエリトリンと直接結合させたＢｉｏＬｅｇｅｎｄ抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体（陽性対照）とともにインキュベートした。抗ＭＩＣＡ抗体または抗ＴＴＣＦ抗体とインキュベートしたビーズを洗浄し、次にＡｌｅｘａ４８８を結合させた抗ヒトＩｇＧ抗体とともにインキュベートした。ビーズに結合するバックグラウンドを測定するため、比較のためＭＩＣＡタンパク質によりコーティングしていないストレプトアビジン結合ビーズを使用して、同様のインキュベートを実施した。抗体に対する結合について、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒフローサイトメーターによりビーズを解析した。
【０２９５】
図８および９Ａ−９Ｏに示す通り、抗ＭＩＣＡ抗体（ＭＩＣＡ−Ａｂ１２およびＭＩＣＡ−Ａｂ２０）は高親和性でＭＩＣＡと結合する。ＭＩＣＡ−Ａｂ２０は、表１に記載の抗ＭＩＣＡ抗体ＩＤ−１に相当する。
【０２９６】
実施例６：抗ＭＩＣＡ抗体
本明細書に記載の方法を使用して、生物学的特性と臨床的な相関を有するさらなる抗ＭＩＣＡ抗体を開発した。癌の細胞ワクチン（ＧＭ−ＣＳＦ形質導入された癌細胞、ＧＶＡＸとして参照）と、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ−４受容体に対するイピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂから入手可能））による阻害を遮断する抗体との接種を受けた患者において、共通の対立遺伝子産物と反応するＭＩＣＡ特異的抗体を同定した。次に、ＭＩＣＡ四量体を使用して、血清ＭＩＣＡの反応が最も高かった患者の末梢血単核細胞からＢ細胞を単離した。実施例５において概説する通り、単一細胞ＰＣＲにより、これらのＢ細胞から、重鎖および軽鎖配列を決定した。この試行により、北アメリカの人口集団において共通する対立遺伝子産物を認識する抗体を同定した。
【０２９７】
ＣＭ２４００２  Ａｂ２（表１に記載される抗ＭＩＣＡ抗体ＩＤ−６）は、ＧＶＡＸ＋イピリムマブ併用療法に対し臨床的に有意な応答を示し、かつ血漿がＭＩＣＡと強力に反応した、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者から単離された抗体である。ＣＭ２４００２  Ａｂ２軽鎖（図１２および１３）および重鎖（図１０および１１）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列に下線を引き、示す。同様の患者から、強力な結合性を有するさらなる抗体を得て、ＣＭ２４００２  Ａｂ４（表１に記載の抗ＭＩＣＡ抗体ＩＤ−７）と標識した。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列に下線を引き、ＣＭ２４００２  Ａｂ４軽鎖（図１６および１７）および重鎖（図１５および１４）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【０２９８】
ＣＭ３３３２２  Ａｂ１１（表１に記載の抗ＭＩＣＡ抗体ＩＤ−８）、ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９（表１に記載の抗ＭＩＣＡ抗体ＩＤ−９）およびＣＭ３３３２２  Ａｂ４（表１に記載の抗ＭＩＣＡ抗体ＩＤ−１１）は、ＧＶＡＸ＋イピリムマブ併用療法に対し長期にわたって応答を示す、転移性黒色腫患者から単離された抗体である。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列に下線を引き、ＣＭ３３３２２  Ａｂ１１軽鎖（（図２０および２１）および重鎖（図１８および１９）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列に下線を引き、ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９軽鎖（図２４および２５）および重鎖（図２２および２３）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列に下線を引き、ＣＭ３３３２２  Ａｂ４軽鎖（図３７および３８）および重鎖（図３５および３６）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。この患者が長期にわたって臨床応答を示したため、これらの抗体を特に対象とする。
【０２９９】
最初に、対象とする抗体を同定、クローニング、および発現させた後、異なるＭＩＣＡ対立遺伝子産物に対するこれらの抗体の特異性を、細胞数測定ビーズアッセイにより評価した。簡潔に述べると、可溶性の組換えＭＩＣＡ対立遺伝子産物００２、００８、００９と、単一のＢｉｒＡビオチン化部位を有するＭＩＣＢとを発現させ、精製し、およびストレプトアビジンビーズで捕捉した。次に、記載の抗ＭＩＣＡ抗体を、組換えＭＩＣＡによりコーティングした異なる濃度のビーズとともに１時間インキュベートし、次に洗浄し、ＦＩＴＣで標識した抗ヒトＩｇＧ二次抗体とともにインキュベートした。２回目の洗浄工程後、フローサイトメトリーにより、ビーズの結合したＦＩＴＣの蛍光の定量を完了した。北アメリカの人口集団における有病率に基づき、ＭＩＣＡ対立遺伝子産物００２、００８、００９並びに関連するＭＩＣＢタンパク質を選択した（図２６Ａ−Ｇ）。重要なことに、ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９は、すべてのＭＩＣＡ対立遺伝子産物並びにＭＩＣＢに強力に結合した。他に２つの抗体が対立遺伝子産物のサブセットに結合した：ＣＭ２４００２  Ａｂ４はＭＩＣＡ＊００９およびＭＩＣＢに強力に結合し、ＣＭ３３３２２  Ａｂ１１はＭＩＣＡ＊００２、ＭＩＣＡ＊００８、およびＭＩＣＢに強力に結合した（図２６Ａ−Ｇ）。同様の手法により生成したヒト陰性対象抗体（破傷風トキソイドＣ末端断片、すなわちＴＴＣＦ特異的抗体）、並びに抗ＭＩＣＡ陽性対照抗体（ＭＩＣＡを抗原とする、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから市販のマウス抗体）を使用し、特異性を実証した。これらの試験により、ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９を、臨床応用に有望な候補として同定した。
【０３００】
実施例７：自己腫瘍細胞に対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合
フローサイトメトリーにより、単離した抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２  Ａｂ２の自己腫瘍細胞への結合能を評価した（図２７）。患者ＣＭ２４００２から骨髄を得て、ＣＭ２４００２  Ａｂ２により、腫瘍細胞への結合を試験した。次に、骨髄試料から、ＣＤ３３＋  ＣＤ３４＋細胞として腫瘍細胞を同定した。次に、腫瘍細胞を、１０μｇ／ｍＬの、抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２  Ａｂ２、陽性対照の市販のＭＩＣＡ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、または陰性対照抗体（ＴＴＣＦ特異性）により染色した。図２７に示す通り、ＣＭ２４００２  Ａｂ２はこれらの細胞に強力に結合した。ＣＭ２４００２  Ａｂ２は非腫瘍細胞（ＣＤ１６＋およびＣＤ３＋細胞）に対し結合を示さず、バックグラウンドの結合のみがＣＤ１４＋細胞にみられたことから、抗腫瘍特異性が実証された（データ不掲載）。
【０３０１】
実施例８．抗ＭＩＣＡ抗体によるＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体の阻害
単離された抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２  Ａｂ２が、同族受容体であるＮＫＧ２Ｄによる可溶性ＭＩＣＡ介在性の下方制御を妨げる能力を評価した。患者由来の血清ＣＭ２４００２を１：１０希釈して使用して、ヒトＮＫ細胞とともに４８時間インキュベートした。これらの培養物に、ＣＭ２４００２  Ａｂ２（濃度１０μｇ／ｍＬ）、市販の陽性対照ＭＩＣＡ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）または陰性対照抗体（ＴＴＣＦ特異的）を加えた。４８時間の時点で、ＮＫＧ２Ｄの発現をフローサイトメトリーにより評価した（図２８）。患者由来の血清ＣＭ２４００２は、ＮＫＧ２Ｄの発現を強力に下方制御した（したがって、この受容体の機能を不能にした）。ＣＭ２４００２  Ａｂ２および陽性対照ＭＩＣＡ抗体は、ＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ｄの細胞表面での発現を部分的に回復した。特異性を実証するために、患者の血清の代わりに組換えＭＩＣＡ  ２ｎｇ／ｍＬとともに細胞をインキュベートして、上記の実験を繰り返した（図２９）。ＣＭ２４００２  Ａｂ２はＮＫＧ２Ｄ発現のＭＩＣＡ介在性の下方制御を完全に妨げたのに対し、陰性対照抗体（ＴＴＣＦ特異的）は効果を有さなかった（図２９）。これらのデータは、ヒトＮＫ細胞上の重要なＮＫＧ２Ｄ受容体の阻害は、ヒトＭＩＣＡ抗体により妨げられることを実証する。
【０３０２】
単離された抗ＭＩＣＡ抗体がＮＫＧ２Ｄの可溶性ＭＩＣＡ介在下方制御を防止する能力をさらに試験するために、上記実験は複数の血清サンプルおよびさらなる単離された抗ＭＩＣＡ抗体を使用して繰り返した。図２９に示されるとおり、進行性黒色腫を有する患者からの２０個の血清サンプルのうち１５は、有意なレベルの分離されるＭＩＣＡを含む。ＰＢＭＣを、コントロール血清または可溶性ＭＩＣＡ単独または１００ｕｇ／ｍｌで指示された抗体の存在下で含む選択された黒色腫患者サンプルと４８時間インキュベートした。４８時に、ＮＫＧ２Ｄ発現を、フローサイトメトリーによってＮＫ細胞（ＣＤ３−、ＣＤ８−、ＣＤ５６＋）において決定した（図４０；データはＮＫＧ２Ｄ陽性であるＮＫ細胞の％として示される）。これらのデータは、ヒトＭＩＣＡ抗体が、血清サンプルにおいてＮＫＧ２Ｄ下方制御をブロックし、試験された全ての血清サンプルにおいてＮＫＧ２Ｄ−媒介細胞毒性を回復させ、ヒトＮＫ細胞上の重要なＮＫＧ２Ｄ受容体の阻害を防止することができることをさらに証明する。
【０３０３】
単離された抗ＭＩＣＡ抗体がＮＫＧ２Ｄの可溶性ＭＩＣＡ介在下方制御を防止する能力をさらに試験するために、上記実験はさらなる単離された抗ＭＩＣＡ抗体（例えば、ＣＭ２４００２  Ａｂ２、ＣＭ３３３２２  Ａｂ４またはＣＭ３３３２２  Ａｂ１１）を使用して繰り返した。４８時間後、細胞を洗浄し、ＮＫＧ２Ｄ表面発現をフローサイトメトリーにより評価した。図５５に示されるとおり、いくつかの抗ＭＩＣＡ抗体はｒＭＩＣＡ誘導ＮＫＧ２Ｄ下方制御をブロックする。
【０３０４】
単離された抗ＭＩＣＡ抗体がＮＫＧ２Ｄの黒色腫血清誘導下方制御を防止する能力を試験するために、上記実験は複数の血清サンプルおよびさらなる単離された抗ＭＩＣＡ抗体を使用して繰り返した。全ＰＢＭＣをコントロール血清または黒色腫血清単独または指示された抗体の存在下でと４８時間インキュベートした。４８時間後、細胞を洗浄し、ＮＫＧ２Ｄ表面発現をフローサイトメトリーにより評価した。図５３に示されるとおり、いくつかの抗ＭＩＣＡ抗体は黒色腫血清誘導ＮＫＧ２Ｄ下方制御をブロックする。
【０３０５】
実施例９：抗ＭＩＣＡ抗体の細胞介在性細胞傷害
ＣＭ２４００２  Ａｂ２が細胞介在性細胞傷害を可能にするか評価するため、１０μｇ／ｍＬのＣＭ２４００２  Ａｂ２、陰性対照抗体（ＴＴＣＦ特異的）、または陽性対照抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の存在下で、ヒトＮＫ細胞（エフェクター細胞）を、組換えＭＩＣＡ（２ｎｇ／ｍＬ）とともに４８時間インキュベートした。４８時間後、細胞を洗浄し、エフェクター：標的比２０：１、１０：１、および５：１で、Ｋ５６２腫瘍細胞とともに４時間インキュベートした。ＮＫ細胞による標的細胞の特異的な溶解は、Ｋ５６２腫瘍細胞からの細胞質タンパク質（ＬＤＨ）の放出により測定した。ＭＩＣＡ抗体の非存在下においては、ＮＫ細胞によるＫ５６２腫瘍細胞の殺傷は観察されなかった。しかしながら、ＣＭ２４００２  Ａｂ２は、ＮＫ細胞介在性のＫ５６２腫瘍細胞の溶解を非常に促進させ、かつすべてのエフェクター：標的比において、マウスＭＩＣＡの陽性対照抗体よりも効果的であった（図３０）。（Ｆｃ受容体によりというよりは）ＮＫＧ２Ｄ経路によりＫ５６２腫瘍細胞の殺傷が実際に介在されることがさらに実証された。さらに２つの実験群（ＮＫＧ２ＤおよびヒトＦｃブロック用の遮断抗体による）を加え、上記の実験を繰り返した。加えて、ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９も試験した。データから、ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９を加えることで、ＮＫ細胞介在性細胞傷害が可能になることが示される。ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体を加えた場合にはＫ５６２細胞の殺傷は生じなかったのに対し、Ｆｃ遮断試薬の場合にはわずかに効果が示された（図３１）。これらのデータは、ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９がＮＫＧ２Ｄ経路の抗腫瘍機能を回復させることを示す。
【０３０６】
さらなる単離された抗−ＭＩＣＡが細胞媒介細胞毒性であるか否かを決定するために、全ＰＢＭＣを、ＣＭ２４００２  Ａｂ２、ＣＭ３３３２２  Ａｂ４、ＣＭ３３３２２  Ａｂ１１、ネガティブコントロール抗体（ＴＴＣＦ特異的）またはポジティブコントロール抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の存在下で、組換えＭＩＣＡ（ｒＭＩＣＡ）と４８時間インキュベートした。４８時間後、細胞を洗浄し、２０：１、１０：１、および５：１  エフェクター：標的比で５１Ｃｒ標識Ｋ５６２標的細胞と４時間インキュベートした。特異的溶解を４時間後の５１Ｃｒ放出により評価した。図５４において証明されるとおり、ＮＫ細胞を殺す活性は、組換えｓＭＩＣＡの存在下で抗ＭＩＣＡ抗体により増強される。
【０３０７】
単離された抗ＭＩＣＡ抗体が細胞媒介細胞毒性であるか否かをさらに決定するために、ヒトＮＫ細胞（エフェクター細胞）を黒色腫患者血清と４８時間インキュベートした。ＰＢＭＣを、コントロール血清または可溶性ＭＩＣＡ単独または１００ｕｇ／ｍｌで指示された抗体の存在下で含む黒色腫患者サンプルと４８時間インキュベートした（ネガティブアイソタイプコントロール抗体（ＴＴＣＦ特異的）またはポジティブコントロール抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。４８時に、細胞を洗浄し、２０：１のエフェクター対標的比で５１Ｃｒ標識Ｋ５６２標的細胞とインキュベートした。特異的溶解を４時間後のシンチレーション計測により評価した（図４１−４３）。これらのデータは、ＣＭ２４００２  Ａｂ２、ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９およびＣＭ３３３２２  Ａｂ４がＮＫＧ２Ｄ経路の抗腫瘍機能を回復させることをさらに示す。
【０３０８】
全ＰＢＭＣを、コントロール血清または黒色腫血清単独またはＣＭ２４００２  Ａｂ２、ＣＭ３３３２２  Ａｂ４またはＣＭ３３３２２  Ａｂ１１の存在下でと４８時間インキュベートした（図５２）。４８時間後、細胞を洗浄し、指示されたエフェクター対標的比で５１Ｃｒ標識Ｋ５６２標的細胞とインキュベートした。特異的溶解を４時間後の５１Ｃｒ放出により評価した。図５６において証明されるとおり、ＮＫ細胞を殺す活性は、黒色腫血清の存在下で抗ＭＩＣＡ抗体により増強される。
【０３０９】
さらなる例において、ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２は、Ｋ５６２腫瘍細胞のＮＫ細胞媒介溶解を非常に増強させ、全てのエフェクター：標的比でポジティブコントロールマウスＭＩＣＡ抗体よりもより有効であった（図５０）。
【０３１０】
実施例１０：ＭＩＣＡドメインα３に対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合
ＮＫＧ２Ｄ受容体は、ＭＩＣＡのα１およびα２ドメイン頂部に結合するため、同じ部位に結合する抗体は、ＮＫＧ２Ｄ受容体と競合し、ＮＫ細胞による腫瘍細胞の殺傷を妨げる可能性がある。α３ドメインに結合する抗体は、ＮＫＧ２Ｄ受容体の結合を遮断できないため、特に対象となる。同時に、このような抗体は、タンパク質分解による腫瘍細胞表面からのＭＩＣＡの切断に干渉し得る。ＭＩＣＡ  α３ドメインに対する抗ＭＩＣＡ抗体の性能を、前述の細胞数測定ビーズアッセイにより評価した。ビオチン化組換えタンパク質をストレプトアビジンビーズ上に捕捉した。次に、ビーズを、１０μｇ／ｍＬの抗体ＣＭ２４００２  Ａｂ２、ＣＭ２４００２  Ａｂ４、ＣＭ３３３２２  Ａｂ１１、ＣＭ３３３２２  ＡＢ２９、陰性対照の抗体（ＴＴＣＦ特異的）、または陽性対照の抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）とともにインキュベートし、続いてＦＩＴＣにより標識した抗ヒトＩｇＧ二次抗体とともにインキュベートし、ビーズに結合したＦＩＴＣ蛍光をフローサイトメトリーにより定量した（図３２）。図３２に示す通り、ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９はＭＩＣＡ  α３ドメインに結合するため、治療応用に関し非常に興味を引く。
【０３１１】
実施例１１：腫瘍細胞に対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合
広範な癌を標的とした際のＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９の使用可能性を評価した。ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９による標識性について、多発性骨髄腫（ＲＰＭＩ  ８２２６およびＸｇ−１）、卵巣癌（ＯＶＣＡＲ３）、急性骨髄性白血病（Ｕ９３７）、黒色腫（Ｋ０２８）、肺癌（１７９２および８２７）、および乳癌（ＭＣＦ７）細胞をひと通り試験した。１％  ＢＳＡを添加したＰＢＳに、腫瘍細胞を１×１０６個／ｍＬの濃度で再懸濁し、１０μｇ／ｍＬの、ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９、並びに陽性および陰性対照（それぞれマウスＭＩＣＡ抗体およびＴＴＣＦ−特異的抗体）（直接的に結合させたもの）により４℃で１時間染色した。フローサイトメトリーにより標識を評価した（図３３）。試験した細胞株の大部分に関し、ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９は、いずれも、市販の陽性対照により標識した場合と比較してより良好に各腫瘍細胞型に結合した。
【０３１２】
実施例１１：抗ＭＩＣＡ抗体のＭＩＣＡ対立遺伝子産物特異性
市販のＬｕｍｉｎｅｘアッセイを用い、ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９の対立遺伝子産物特異性を評価した。市販の試験キットは、単一のサンプルにおいて結合性を評価することを可能にする、それぞれ固有の蛍光特性を有するＬｕｍｉｎｅｘビーズに直接結合した組換えＭＩＣＡ対立遺伝子産物（ＭＩＣＡ＊００１、＊００２、＊００７、＊０１２、＊０１７、＊０１８、＊０２７、＊００４、＊００９、および＊０１５）を含有する。記載のＭＩＣＡ対立遺伝子産物によりコーティングしたＬｕｍｉｎｅｘビーズを、１０μｇ／ｍＬの、ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ陽性対照、および陰性対照（ＴＴＣＦ）とともに１時間インキュベートし、続いて、ＰＥを結合させた抗ヒトＩｇＧ二次抗体とともにインキュベートした。記載の抗体とともに６０分間インキュベートし、続いてＰＥ結合抗ヒト二次抗体とともにインキュベートした後、装置Ｌｕｍｉｎｅｘ  ２００を用い蛍光を測定した（図３４）。ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９が市販のアッセイに存在するすべての対立遺伝子産物に結合し得たことから、この抗体はＭＩＣＡの遺伝子型とは関係なく患者に使用できることが示唆された。
【０３１３】
これらのデータにより、ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９の高生物活性と、これらの抗体の、ＮＫ細胞介在性の腫瘍細胞溶解能とが実証される。これらのデータは、免疫療法に応答性の癌患者が、ＮＫ細胞の抗腫瘍活性を回復したＭＩＣＡ抗体を産生したことを実証する。あわせて、これらの結果により、癌患者において免疫抑制を克服する際に、および腫瘍崩壊を促進する際に、抗ＭＩＣＡ抗体が持ち得る治療能が強調された。
【０３１４】
実施例１２．抗ＭＩＣＡ抗体のインビトロおよびインビボ生物学的活性
腫瘍増殖に対する抗ＭＩＣＡ抗体の影響を直接的に試験するために、マウスＢ１６を使用して抗ＭＩＣＡ抗体のインビトロおよびインビボ生物学的活性を評価した。この試験のために、Ｂ１６マウス黒色腫細胞を、ヒトＭＩＣＡを発現するように形質導入した。フローサイトメトリーを、ＭＩＣＡの細胞Ｂ１６表面発現を検出するために使用した（図４４）。
【０３１５】
図４５は、Ｂ１６−ＭＩＣＡ腫瘍が脾臓のＮＫ細胞および腫瘍浸潤ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ発現を下方調節することを証明する一連のグラフを提供する。ＮＫＧ２Ｄ発現は、非腫瘍マウスの脾臓または腫瘍を有する動物の脾臓および腫瘍から単離されたＮＫ細胞（ＣＤ３−、ＣＤ８−、ＣＤ３３５＋）においてフローサイトメトリーにより決定された。
【０３１６】
図４６は、抗ＭＩＣＡ抗体処置がＢ１６−ＭＩＣＡ腫瘍を有するマウスにおいて血清−ＭＩＣＡレベルを減少させることを示す。Ｂ１６−ＭＩＣＡ腫瘍を有するＢ６マウスを、１週間に３回尾静脈注射によって１００ｕｇまたは２００ｕｇ／用量のＣＭ３３３２２  Ａｂ２９で処置した。最初の処置から１週間後、血液を回収し、血清ＭＩＣＡはＥＬＩＳＡにより測定された。図４７は、抗ＭＩＣＡ抗体の投与がサンドイッチＥＬＩＳＡによるＭＩＣＡ検出を妨げないことを示す。組換えＭＩＣＡを１０００倍過剰の抗体と１８時間回転しながらインキュベートした。ＭＩＣＡ濃度は、サンドイッチＥＬＩＳＡにより決定された。
【０３１７】
腫瘍増殖に対する抗ＭＩＣＡ抗体の影響を直接的に試験するために、抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９をＢ１６−ＭＩＣＡ腫瘍を有するマウスに投与した。マウスを、腫瘍が直径５ｍｍに達したときに始まる、２００ｕｇ／用量のマウスＩｇＧ２ａ／κアイソタイプコントロールまたは抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９で静脈内に処置した。用量を週に３回投与し、腫瘍容量を毎日記録した。図４８に示されるとおり、抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ３３３２２  ＡＢ２９でのＢ１６−ＭＩＣＡ腫瘍を有するマウスの処置が腫瘍増殖を停止する。これらのデータはインビトロおよびインビボの両方で黒色腫細胞の増殖阻害を示し、抗ＭＩＣＡ抗体処置が宿主抗腫瘍応答および腫瘍細胞の直接的殺傷の調節の結果として可能な治療戦略であり得ることを示す。
【０３１８】
実施例１３．抗ＭＩＣＡ抗体は腫瘍細胞から分離するＭＩＣＡを減少させる
腫瘍細胞から分離するＭＩＣＡを減少させるＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９の可能性を試験した。ＲＰＭＩ−８２２６細胞を１０ｕｇ／ｍｌ  アイソタイプコントロール抗体（ＴＴＣＦ−Ｓ１Ｃ１）、ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９、またはＣＭ２４００２  Ａｂ２の存在下で培養した。４８時間後、細胞を洗浄し、ＭＩＣＡ表面発現をフローサイトメトリーにより決定した。図４９において証明されるとおり、ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９は、ＲＰＭＩ−８２２６細胞から分離するＭＩＣＡを減少させる
【０３１９】
さらなる例において、腫瘍細胞から分離するＭＩＣＡを減少させるＣＭ２４００２  Ａｂ２、ＣＭ３３３２２  Ａｂ４、およびＣＭ３３３２２  Ａｂ１１の可能性を試験した。ＲＰＭＩ−８２２６細胞を、アイソタイプコントロール抗体（ＴＴＣＦ−Ｓ１Ｃ１）およびＣＭ２４００２  Ａｂ２、ＣＭ３３３２２  Ａｂ４またはＣＭ３３３２２  Ａｂ１１の存在下で培養した。４８時間後、細胞を洗浄し、ＭＩＣＡ表面発現をフローサイトメトリーにより決定した。図５１において証明されるとおり、ＣＭ２４００２  Ａｂ２、ＣＭ３３３２２  Ａｂ４およびＣＭ３３３２２  Ａｂ１１は、ＲＰＭＩ−８２２６細胞から分離するＭＩＣＡを減少させる。
【０３２０】
実施例１４．抗ＭＩＣＡ抗体のエピトープマッピング
ＣＭ３３３２２  ｍＡｂ  ２９、ＣＭ３３３２２  １１およびＣＭ３３３２２  ｍＡｂ４に対するエピトープ配列を決定するために、実験を行った。簡潔には、エピトープマッピングを、ＭＩＣＡ＊００９細胞外ドメインの全長にわたる一連の重複ペプチドを含むペプチドアレイによって行った。アレイにおけるそれぞれのペプチドは、以前の配列と１０アミノ酸によって重複してそれぞれ後の配列を有する、ＭＩＣＡ＊００９参照配列（配列番号：１６７）からの２０アミノ酸直線状配列の長さであった（１０ａａオフセット（ｏｆｆｓｅｔ）で２０ａａペプチド）。これらのペプチドは、フレキシブルな（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）リンカーの使用を介してスライドガラスに結合させた。Ｃｙ５コンジュゲートされた抗ヒトＩｇＧ抗体で検出されるペプチドフラグメントに結合される抗体と共に、抗体をスライドとインキュベートした。アレイスポットへの結合は、ＧｅｎｅＰｉｘマイクロアレイスキャナーで評価した。結果は、ｍＡｂｓ  ＣＭ３３３２２  Ａｂ４およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９がヒトＭＩＣＡまたはＭＩＣＢのアルファ−３領域に結合したことを示した。
【０３２１】
結果は、全３つの抗体が明らかに異なる連続的なアミノ酸配列を含むヒトＭＩＣＡのα３領域内のエピトープと相互作用したことを示した。ＭＩＣＡ＊００９内のＣＭ３３３２２  ｍＡｂ  ２９、ＣＭ３３３２２  １１およびＣＭ３３３２２  ｍＡｂ４に対するエピトープのアミノ酸配列は、図５６Ａ−５６Ｃに示される。ＭＩＣＡの三次元構造内でＣＭ３３３２２  ｍＡｂ  ２９およびＣＭ３３３２２  ｍＡｂ４に対するエピトープの位置はまた、図５７に示される。
【０３２２】
結果は、抗体ＣＭ３３３２２  ｍＡｂ２９により認識されるエピトープが、ヒトＭＩＣＡ配列番号：１６７のアミノ酸残基２２９から２４８に相当する、隣接アミノ酸配列：ＧＤＶＬＰＤＧＮＧＴＹＱＴＷＶＡＴＲＩＣ（配列番号：１６８）を含むことを示した。（図５６Ａ）。抗体ＣＭ３３３２２  ｍＡｂ１１により認識されるエピトープは、ヒトＭＩＣＡ配列番号：１６７のアミノ酸残基１１９から１２８に相当する、隣接アミノ酸配列：ＮＶＥＴＥＥＷＴＰ（配列番号：１６９）を含む（図５６Ｂ）。抗体ＣＭ３３３２２  ｍＡｂ  ４により認識されるエピトープは、ヒトＭＩＣＡ配列番号：１６７のアミノ酸残基１７９から１８８に相当する、隣接アミノ酸配列：ＴＶＰＰＭＶＮＶＴＲ（配列番号：１７０）を含む（図５６Ｃ）。
【０３２３】
ウェスタンブロットにおける天然または変性ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢへのｍＡｂｓ  ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９の結合もまた決定した。簡潔には、実験は以下のとおりに行った。ヒトＭＩＣＡまたはＭＩＣＢを、変性または非変性のＰＡＧＥ電気泳動法のいずれかに付した。結果は、ｍＡｂ  ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９が天然ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢならびに変性タンパク質に結合することを示し、当該抗体が少なくとも部分的に連続的であるエピトープに結合することを示した。
【０３２４】
その他の実施の形態
本発明は、発明を実施するための形態と組み合わせて記載したが、前述の記載は、例示目的のものであり、本発明の範囲を制限するものではないことは理解されるであろう。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義される。以降の特許請求の範囲内に含まれるその他の態様、利点、および改変も存在する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６−１】
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【図５６−２】
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【図５７】
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【配列表】
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