(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ及びＣＴの部分を含む組換え融合タンパク質であって、
融合タンパク質は、クモ糸タンパク質の反復断片に由来する任意の部分を含んでいないという条件で、
該組換え融合タンパク質はポリマーを形成することが可能であり；
Ｂは有機ターゲットとの選択的相互作用の能力を提供する非スピドロイン部分であり、該Ｂ部分が、配列番号６から１０のアミノ酸配列の何れかに３０％未満の同一性を有し；及び
ＣＴは７０から１２０アミノ酸残基からなる部分で、クモ糸タンパク質のＣ末端断片に由来し、該ＣＴ部分が、配列番号７及び配列番号１４〜４４の何れか一のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一性を有し、該ＣＴ部分が、ポリマー形成の能力を提供する、組換え融合タンパク質。
【請求項２】
ＣＴ部分が、配列番号７に少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一性を有する、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３】
Ｂ部分が、配列番号６から１０の何れかに２０％、又は１０％未満の同一性を有する、請求項１又は２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項４】
有機ターゲットが、免疫グロブリン及び免疫グロブリン又はその誘導体を含む分子からなる群から選択される、請求項１から３の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項５】
Ｂ部分が、ブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメイン、及びそのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメイン、連鎖球菌プロテインＧ、及びそのＣ１、Ｃ２及びＣ３ドメイン；及びこれらのアミノ酸配列の何れかに少なくとも９０％同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される、請求項４に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６】
Ｂ部分が、ブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメイン、ブドウ球菌プロテインＡのＢドメイン、及び連鎖球菌プロテインＧのＣ２ドメイン；及びこれらのアミノ酸配列の何れかに少なくとも９０％同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される、請求項５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項７】
Ｂ部分が、ブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメイン、及び連鎖球菌プロテインＧのＣ２ドメインからなる群から選択される、請求項６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項８】
有機ターゲットが、アルブミン及びアルブミン又はその誘導体を含む分子からなる群から選択される、請求項１から３の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９】
有機ターゲットが、ビオチン及びビオチン又はその誘導体若しくは類似体を含む分子からなる群から選択される、請求項１から３の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１から９の何れか一項に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項１１】
有機ターゲットと選択的相互作用が可能なポリマーであって、請求項１から９の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質を反復構造単位として含有し、Ｂ部分が有機ターゲットとの選択的相互作用の能力を提供する、ポリマー。
【請求項１２】
サンプルからの有機ターゲットの分離における、請求項１１に記載のポリマーの使用。
【請求項１３】
細胞の培養における、請求項１１に記載のポリマーの使用。
【請求項１４】
有機ターゲットを含むサンプルを提供し；
親和性培地は有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である、親和性培地を提供し；
前記親和性培地を、親和性培地と有機ターゲット間の結合を達成するために適した条件下で前記サンプルと接触させ；及び
非結合サンプルを除去する工程を含む、
サンプルからの有機ターゲットの分離のための方法であって、
親和性培地が、（ｉ）請求項１から９の何れか一項に記載の融合タンパク質を含む有機ターゲットの固定化のための親和性培地であって、Ｂ部分が有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である親和性培地、（ｉｉ）請求項１１に記載のポリマーを含み、該ポリマーが組換え融合タンパク質を含む（ｉ）の親和性培地、（ｉｉｉ）有機ターゲットを更に含み、Ｂ部分が前記有機ターゲットと選択的相互作用が可能であり該有機ターゲットに結合される（ｉ）又は（ｉｉ）の親和性培地、及び（ｉｖ）有機ターゲットが第二有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である（ｉｉｉ）の親和性培地、からなる群から選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は組換え融合タンパク質の分野、より具体的にはクモ糸タンパク質（スピドロイン）に由来する部分を含む新規融合タンパク質に関する。本発明は、スピドロインに由来する部分を含む組換え融合タンパク質を含むポリマーであるタンパク質構造を提供する方法を与える。また、有機ターゲットに結合するための新規なタンパク質構造を与える。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
応用タンパク質化学において、活性、典型的には生物活性ペプチドを、活性に関連する部位、典型的には有機ターゲット、例えば、核酸、タンパク質、タンパク質の複合体、タンパク質及び／又は脂質及び／又は糖質及び／又は核酸などに対していかに調製又は提示するかは一般的な問題である。最も簡単な解決策は、生物活性ペプチド又はタンパク質の水溶液を提供することである。しかしながら、多くの適用が所望の目標を達成するために幾つかの更なる手段を要求する。例えば、ペプチド／タンパク質は、脂質混合物と会合するか又は支持構造体に化学的に固定化されてもよい。
【０００３】
支持構造体に固定化されたペプチド／タンパク質の適用は、バイオプロセス、クロマトグラフィー、細胞捕獲及び培養、アクティブ・フィルタ、及び診断などの調製用及び分析的分離操作が含まれる。細胞外マトリックスタンパク質に基づく構造体、例えばコラーゲンは、欧州特許第７０４５３２号及び欧州特許第９８５７３２号に開示されている。
【０００４】
また、支持する構造体にクモ糸タンパク質を使用することが提案されている。クモ糸タンパク質は、強度と弾性の組み合わせにより、並外れた靭性と伸展性を獲得している天然の高性能ポリマーである。クモは異なる機械的性質と機能を有する様々なタイプの糸を産生する最大７つの異なる腺を持っている。大瓶状腺（major ampullate gland）により生産されるしおり糸は最も強靱な繊維である。それは２つの主要なポリペプチドからなり、これらはほとんどの場合大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）１及び２と称され、例えばニワオニグモ（Araneus diadematus）においてはＡＤＦ−３及びＡＤＦ−４と称される。これらのタンパク質は、２００から７２０ｋＤａの範囲の分子量を有する。クモのしおり糸タンパク質、又はＭａＳｐは３つの成分を有する；非反復Ｎ末端ドメイン、多くの反復型ポリ−Ａｌａ／Ｇｌｙセグメントからなる中央反復領域、及び非反復Ｃ末端ドメイン。一般に、反復領域は糸の繊維で分子間接触を形成すると考えられているが、末端ドメインの正確な機能は良く分かっていない。繊維形成を伴う会合において、反復領域はランダムコイルとαヘリックス構造からβシート構造への構造変換を受ける。スピドロインのＣ末端領域はクモの種類と糸のタイプ間において一般的に保存されている。
【０００５】
国際公開第０７／０７８２３９号とStark, M. et al., Biomacromolecules 8: 1695-1701, (2007) は、ＡｌａとＧｌｙの高含量を持つ反復性断片とタンパク質のＣ末端断片、並びにクモ糸タンパク質を含む可溶性融合タンパク質からなる微小クモ糸タンパク質を開示している。クモ糸タンパク質の繊維はその融合パートナーからのクモ糸タンパク質の遊離の際に自発的に得られる。
【０００６】
Rising, A. et al., CMLS 68(2): 169-184 (2010) はクモ糸タンパク質の生産における進展を総説している。繊維は、クモ糸タンパク質の繰り返し領域及び非反復Ｃ末端ドメインに由来するセグメントの４反復からなる小型化されたスピドロイン構築物から作成される。
【０００７】
米国特許出願公開第２００９／０２６３４３０号は酵素β−ガラクトシダーゼの微小クモ糸タンパク質の膜に対する化学的結合を開示している。しかし、化学的結合はタンパク質の安定性及び／又は機能において好ましくない条件を必要とし得る。クモ糸タンパク質の反復領域に由来するセグメントの複数の反復は、ＲＧＤ細胞結合セグメント(Bini, E et al., Biomacromolecules 7:3139-3145 (2006)); Morgan et al., Biomaterials 29(16): 2556-2563 (2008)) 及び／又はＲ５ペプチド (Wong Po Foo, C et al., Proc Natl Acad Sci 103 (25): 9428-9433 (2006))又はミネラル化(mineralization)に関与する別のタンパク質セグメント (Huang, J et al., Biomaterials 28: 2358-2367 (2007)；国際公開第２００６／０７６７１１号）を含むように設計されている。これらの先行技術文献では、膜は、変性有機溶媒ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）中に融合タンパク質を可溶化し、乾燥することにより形成される。
【０００８】
米国特許出願公開第２００５／２６１４７９号（Ａ１）は、糸タンパク質繊維又は他のポリマー構造を形成することなく、複合体混合物からの個々の糸タンパク質の磁気親和性分離を含む、反復断片及び親和性タグからなる組換え糸タンパク質の精製のための方法を開示している。
【０００９】
既知の支持構造と関連技術は、例えば経済性、効率性、安定性、再生能力、生物活性及び生体適合性に関していくつかの欠点を持っている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的は、新規な組換え融合タンパク質を提供することである。特に、有機ターゲットとの選択的相互作用が可能な新規融合タンパク質を提供することを本発明の目的とする。
【００１１】
有機ターゲットとの選択的相互作用が可能な新規なタンパク質構造を提供することを本発明の目的とする。
【００１２】
有機ターゲットとの選択的相互作用が可能なタンパク質構造を提供することも本発明の目的であって、その構造は、タンパク質の２次構造又は活性への予測できない影響をもち及び／又はそのタンパク質構造に残り得るであろう過酷な溶媒（harsh solvents）を用いることなく形成されることを特徴とする。
【００１３】
有機ターゲットとの選択的相互作用が可能な安定なタンパク質構造を提供することは本発明の一つの目的であって、そのタンパク質構造は、例えば化学的処理により、使用後に容易に再生可能である。
【００１４】
生体適合性で細胞培養及び移植組織として適している安定なタンパク質構造を提供することは本発明の別の目的である。
【００１５】
有機ターゲットとの選択的相互作用が可能な高密度の等間隔の機能性を持つタンパク質構造を提供することは本発明のさらに別の目的である。
【００１６】
何ヶ月間も４℃又は室温での貯蔵の際にその選択的結合能を維持するタンパク質構造を提供することは本発明の更なる目的である。
【００１７】
オートクレーブ可能、即ち加熱処理後にその選択的結合能を維持するタンパク質構造を提供することも本発明の目的である。
【００１８】
これらの目的及び以下の開示から自明であろう他の目的のために、本発明は第一態様に従って、融合タンパク質と、反復構造単位として本請求項に記載の融合タンパク質を含むポリマーからなるタンパク質構造を提供する。
【００１９】
関連する態様に従って、本発明は、本請求項に記載される融合タンパク質をコードする単離された核酸及び融合タンパク質を生産する方法を提供する。
【００２０】
別の態様に従って、本発明は本請求項に記載のタンパク質構造を提供するための方法を提供する。
【００２１】
更なる態様に従って、本発明は本請求項に記載の親和性培地を提供する。
【００２２】
一態様に従って、本発明は本請求項に記載の細胞足場材料を提供する。関連する態様に従って、本発明はまた細胞と本請求項に記載の細胞足場材料の組み合わせを提供する。
【００２３】
一態様に従って、本発明は本請求項に記載のタンパク質構造及び融合タンパク質の新規な使用を提供する。
【００２４】
別の態様に従って、本発明は本請求項に記載のサンプルからの有機ターゲットの分離の方法を提供する。
【００２５】
更なる態様に従って、本発明は本請求項に記載の細胞の固定化及び任意で培養の方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１−１】図１−１は、スピドロインＣ末端ドメインの配列アラインメントを示す。
【図１−２】図１−２は、スピドロインＣ末端ドメインの配列アラインメントを示す。
【図２】図２は、スピドロインＮ末端ドメインの配列アラインメントを示す。
【図３】図３は、繊維形態の糸融合型ＡＢＤの顕微鏡写真を示す。
【図４】図４は、ＡＢＤ−ＮＴＣＴ膜及びＡＢＤ−ＣＴ膜から溶出したヒト血漿の画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図５】図５は、繊維及び発泡体形態の糸融合型Ｍ４断片の顕微鏡写真を示す。
【図６】図６は、Ｍ４−ＮＴＣＴ膜及びＭ４−ＣＴ膜に結合したＡｔｔｏ−５６５ビオチンの蛍光顕微鏡写真を示す。
【図７】図７は、発泡体形態の糸融合型抗体断片の顕微鏡写真を示す。
【図８】図８は、純粋な糸融合型抗体断片の抗原結合解析を示す。
【図９】図９は、糸融合型キシラナーゼの巨視的発泡体を示す。
【００２７】
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【００２８】
発明の詳細な記述
本発明は、有機ターゲットとの選択的相互作用が可能な固体タンパク質構造が、反復構造単位として組換え融合タンパク質のポリマーの形態で調製できるとする見識に一般的に基づいている。融合タンパク質は、有機ターゲットと選択的に相互作用することが可能である、好ましくは３０以上のアミノ酸残基の、少なくとも一の非スピドロイン部分と、及び融合タンパク質はクモ糸タンパク質の反復断片に由来する任意の部分を含んでいないという条件でクモ糸タンパク質の少なくともＣ末端断片に対応する部分とを含有している。
【００２９】
驚くべきことに、クモ糸タンパク質に由来する部分は、構造的に再配置するために誘導することができ、その結果、ポリマー性の固体構造を形成するが、非スピドロイン部分は構造的に再配置されず、その所望の構造と機能、即ち、有機ターゲットと選択的相互作用する能力を維持する。タンパク質構造は、化学的結合工程又は変性法による工程無しで得ることができ、これは、特に機能がその部分の２次構造に依存しているときに、その部分の維持された機能性を持つ融合タンパク質を得る手順を促進し、及びその可能性を向上する。これらの融合タンパク質ポリマーの形成は厳しく制御され、この見識は、更なる新規タンパク質構造、タンパク質構造を作り出す方法、及び様々な応用と方法におけるタンパク質構造の用途へと発展している。
【００３０】
従って、本発明による融合タンパク質は、所望の選択的相互作用活性と、生理学的条件下でタンパク質構造に用いられる内部の固体支持体活性の両方を内部に持っている。スピドロイン部分がポリマー性の固体構造を形成するために構造的に再配置されるときに、非スピドロイン部分はスピドロイン部分に共有結合しているが、融合タンパク質の結合活性が維持されていることは驚くべきこととして考慮されねばならない。実際、選択的相互作用活性を与えるその部分の熱及び／又は化学的安定性及び／又は結合活性は、本発明の融合タンパク質構造に組み込まれるときに増大し得る。タンパク質構造はまた、有機ターゲットに対する選択的相互作用活性の予測可能な高い密度を提供する。全ての発現タンパク質部分は固体支持体に結合しているため、選択的相互作用活性を持つ有用なタンパク質部分の損失は最小化される。
【００３１】
本発明による融合タンパク質から形成されるポリマーは固体構造であり、それらの物理特性において、特に高強度、弾力性と軽量の有用な組み合わせにおいて有用である。特に有用な特徴は、融合タンパク質のスピドロイン由来部分は、生化学的に堅牢であり、例えば酸、塩基又はカオトロピック剤による再生に適しており、及び加熱滅菌、例えば１２０℃で２０分のオートクレーブに適している。ポリマーはまた、細胞接着及び増殖を支援するその能力において有用である。ドラグラインシルク(dragline silk)に由来する特性は、医療又は技術的目的のための新しい材料の開発において魅力的である。特に、本発明によるタンパク質構造は、クロマトグラフィー、細胞捕獲、選択及び培養、アクティブ・フィルタ、及び診断などの調整的及び分析的分離操作において有用である。本発明によるタンパク質構造はまた、移植片などの医療機器、及び、創傷閉鎖システム、バンドエイド、縫合糸、創傷包帯などの医療用品、及び細胞固定化のための足場、細胞培養、組織工学及び誘導細胞の再生において有用である。
【００３２】
本発明は、有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である組換え融合タンパク質を提供し、その融合タンパク質はＢ部分及びＣＴ部分、及び任意でＮＴ部分を含んでいる。本発明はまた、有機ターゲットとの選択的相互作用が可能であるタンパク質構造を提供し、該タンパク質構造は、本発明による組換え融合タンパク質を含み、及び任意で該タンパク質からなり、即ち、Ｂ部分及びＣＴ部分、及び任意でＮＴ部分を含み、及び任意で該部分からなる。本発明による融合タンパク質は、クモ糸タンパク質の反復（ＲＥＰ）断片に由来する任意の部分を含んでいない。
【００３３】
実施例の融合タンパク質のＣＴ部分及び任意でＮＴ部分は必然的に特定のタンパク質、例えばユープロステノプス オーストラリス(Euprosthenops australis)に由来する主要スピドロイン１（ＭａＳｐ１）に関するが、本開示は本発明による融合タンパク質構造を生産する目的において任意の構造的に類似する部分に対して適用可能であると考えられる。更に、実施例の融合タンパク質の選択的相互作用活性を提供するＢ部分は必然的に特定のタンパク質部分、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ及びストレプトアビジンに由来する部分に関するが、本開示は本発明による融合タンパク質構造を生産する目的において、有機ターゲットと選択的相互作用可能である、任意の構造的及び／又は機能的に類似するＢ部分に対して適用可能であると考えられる。
【００３４】
本発明による特定の融合タンパク質は、式Ｂｘ−ＣＴ−Ｂｚによって定義され、ここでｘ及びｚは０から５の整数；及びｘ＋ｚ≧１であり、任意で一以上のＮＴ部分、例えば、融合タンパク質の何れか末端で、又は任意の２つの融合タンパク質間で、１−２のＮＴ部分、例えば、ＮＴ−Ｂｘ−ＣＴ−Ｂｚ、Ｂｘ−ＮＴ−ＣＴ−Ｂｚ、Ｂｘ−ＣＴ−ＮＴ−Ｂｚ、Ｂｘ−ＣＴ−Ｂｚ−ＮＴ、ＮＴ−ＮＴ−Ｂｘ−ＣＴ−Ｂｚ又はＢｘ−ＣＴ−Ｂｚ−ＮＴ−ＮＴを更に含んでいる。もし、ｘ＋ｚ＞１である場合、即ち、もし２つ以上のＢ部分がある場合、それらは同一であるか又は異なっても良い。２つ以上のＢ部分が同じ有機ターゲット又は異なる有機ターゲットとの選択的相互作用の能力を有し得る。２つ以上のＢ部分が実質的に同一であり、各々が同一の有機ターゲットとの選択的相互作用の能力を有するのが好ましい。あるいは、２つ以上のＢ部分が同一でなく、それらが有機ターゲットとの選択的相互作用の能力を一緒に提供するのが好ましい。
【００３５】
本発明による好ましい融合タンパク質において、ｘ及びｚは０から２の整数、好ましくは０から１の整数である。本発明による特定の好ましい融合タンパク質において、ｘ又はｚのどちらかは０であり、即ち、融合タンパク質は式Ｂｘ−ＣＴ、及びＣＴ−Ｂｚにより定義され、ここでｘ又はｚのどちらかは１から５の整数であり、任意で１−２のＮＴ部分を含有する。本発明による好ましい融合タンパク質において、ｘ及びｚは０から１の整数であり；及びｘ＋ｚ＝１である。従って、本発明による特定の好ましい融合タンパク質は、式Ｂ−ＣＴ及びＣＴ−Ｂにより定義され、任意で１−２のＮＴ部分を含有する。本発明による特定の好ましい融合タンパク質は、任意的なＮＴ部分を欠損している。
【００３６】
用語「融合タンパク質」は、ここでは、組換え核酸、即ち、通常は一緒に生じるであろう二つ以上の核酸を組み合わせることにより人工的に創られる、ＤＮＡ又はＲＮＡからの発現により作成されるタンパク質を意味する（遺伝子操作）。本発明による融合タンパク質は、組換えタンパク質であり、従って、天然に生じるタンパク質に同一ではない。特に、野生型スピドロインは、上記に定めた組換え核酸から発現されないため、本発明による融合タンパク質ではない。結合された核酸配列は、特定の機能的特性を持つ異なるタンパク質、部分的なタンパク質又はポリペプチドをコードしている。得られる融合タンパク質、又は組換え融合タンパク質は、もとのタンパク質、部分的タンパク質又はポリペプチドの各々から生じた機能特性を持つ単一タンパク質である。更に、本発明及び対応する遺伝子による融合タンパク質は、キメラであり、即ち、タンパク質／遺伝子部分は、少なくとも２つの異なる種に由来する。ＣＴ部分及び任意でＮＴ部分は、クモ糸タンパク質に由来する。誤解を避けるために、本発明によるＢ部分は非スピドロインタンパク質又はポリペプチドであり、即ちクモ糸タンパク質から生じない。特に、本発明によるＢ部分は、クモ糸タンパク質のＣ末端断片、反復性断片、又はＮ末端断片から生じない。
【００３７】
融合タンパク質は、典型的には１７０から２０００アミノ酸残基、例えば１７０から１０００アミノ酸残基、例えば１７０から６００アミノ酸残基、好ましくは１７０から５００アミノ酸残基、例えば１７０から４００アミノ酸残基からなる。クモ糸タンパク質断片を含む長いタンパク質が、可溶化及び重合のための過酷な溶剤の使用を必要とする非晶質の凝集体を形成する傾向があるので、小さいサイズが有利である。組換え融合タンパク質は、特にクモ糸タンパク質が一以上のＢ部分である場合において及び／又はそれがＮＴ部分、例えば１−２のＮＴ部分を含むとき、２０００残基以上を含み得る。
【００３８】
用語「スピドロイン」及び「クモ糸タンパク質」は、本記述を通して同義に用いられ、全ての既知のクモ糸タンパク質を包含し、典型的には「ＭａＳｐ」、ニワオニグモ（Araneus diadematus）の場合「ＡＤＦ」と略される大瓶状腺クモ糸タンパク質を含む。これらの大瓶状腺クモ糸タンパク質は一般に１と２の２つのタイプがある。これらの用語は、既知のクモ糸タンパク質に対して高度の同一性及び／又は類似性を持つ非天然タンパク質を包含する。
【００３９】
その結果、用語「非スピドロイン」はクモ糸タンパク質から由来しないタンパク質、即ちクモ糸タンパク質に対して同一性及び／又は類似性の程度が低い（又は全くない）タンパク質を意味する。
【００４０】
本発明によるタンパク質構造は、有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である。この能力は本発明による融合タンパク質にあり、より具体的には融合タンパク質のＢ部分にある。ＣＴ部分及び任意でＮＴ部分の、有機分子との任意の相互作用は、「有機ターゲットとの選択的相互作用が可能」なる語句により包含されない。誤解を避けるために、「有機ターゲットとの選択的相互作用が可能」なる語句は、ＣＴ部分及び／又は任意でＮＴ部分の関与する相互作用に依存する本発明による融合タンパク質の二量体化、オリゴマー化又は重合を包含していない。
【００４１】
「有機ターゲット」なる用語は、当業者により無機分子と伝統的に考えられるもの、例えばカーボネート、炭素の単純酸化物、シアン化物、ダイヤモンド及びグラファイトの例外を除いて、炭素を含む全化学分子を包含する。誤解を避けるために、例えば、シリカ及び塩化カルシウムのような無機分子、塩及びイオンは、有機ではない。有機ターゲットは、有機分子、例えば細胞表面上の受容体複合体を含むか又はからなる複合体であり得る。有機ターゲットは、共有結合又は他の型の会合により結合され得る、一つ以上の有機分子の種類のモノマー、ダイマー、オリゴマー又はポリマーであり得る。もちろん単に単一有機分子であっても良い。本発明による好ましい有機ターゲットは、限定されないが、核酸、タンパク質及びポリペプチド、脂質及び炭水化物、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。本発明による好ましい有機ターゲットは、限定されないが、免疫グロブリン、免疫グロブリン分子又はその誘導体を含む分子、アルブミン、アルブミン又はその誘導体含む分子、ビオチン、ビオチン又はその誘導体若しくは類似体を含む分子、及び生物学的な疾患マーカー、例えば体組織からの血液、血清、尿、唾液又は他の試料を包含する。
【００４２】
本発明の関連において、例えば本発明による融合タンパク質のＢ部分などのリガンドとそのターゲットとの「特異的」又は「選択的」相互作用とは、特異的及び非特異的相互作用間又は選択的及び非選択的相互作用間の違いが有意義になるようなものである相互作用を意味する。２つのタンパク質間の相互作用はときには解離定数により測定される。解離定数は２つの分子間の結合（又は親和性）の強度を記述する。典型的には、抗体とその抗原の間の解離定数は１０−７から１０−１１Ｍである。しかし、高い特異性は必ずしも高い親和性を必要としない。そのカウンターパートに対して低親和性（モルの範囲内で）を持つ分子は、はるかに高い親和性を有する分子と同程度に特異的であることが示されている。本発明の場合、特異的又は選択的相互作用とは、天然に生じるか又は処理された生物学的又は生化学的液体のサンプル中で他のタンパク質が存在する所定の条件下で、特定の方法が、特定のタンパク質、標的タンパク質又はその断片の存在及び／又は量を決定するために用いることができる範囲を指す。言い換えれば、特異性又は選択性は、関連するタンパク質を区別する能力である。特異的及び選択的とは時には本記述において同義的に用いられる。
【００４３】
本発明による融合タンパク質はまた、一以上のリンカーペプチドを含む。リンカーペプチドは、融合タンパク質の任意の部分間、例えばＣＴ部分とＮＴ部分間、２つのＢ部分間、Ｂ部分とＣＴ部分間に配置され得るか又は融合タンパク質の何れかの末端に配置され得る。融合タンパク質が２つ以上のＢ部分を含有する場合、リンカーペプチドはまた２つのＢ部分との間に配置され得る。リンカーは、融合タンパク質の機能単位の間にスペーサーを提供することができるが、融合タンパク質の同定及び精製のためのハンドル、例えばＨｉｓ及び／又はＴｒｘタグを構成することもできる。融合タンパク質が、融合タンパク質の同定と精製のために２つ以上のリンカーペプチドを含む場合、それらはスペーサー配列、例えば、Ｈｉｓ６−スペーサー−Ｈｉｓ６−、などのスペーサー配列により隔てられているのが望まれる。リンカーはまた、シグナル認識粒子などのシグナルペプチドをも構成することができ、それは融合タンパク質を膜へと導き、及び／又は宿主細胞から周囲の培地への融合タンパク質の分泌を引き起こす。融合タンパク質はまた、そのアミノ酸配列中に、リンカー及び／又は他の関連部分、典型的にはＢ部分又は部分（複数）の切断及び除去を可能にする、開裂部位を含み得る。様々な開裂部位が、例えば、化学試薬、例えばＣＮＢｒによるＭｅｔ残基の後ろの開裂部位、及びヒドロキシルアミンによるＡｓｎ−Ｇｌｙ残基間の開裂部位、トロンビン又はプロテアーゼ３Ｃなどのプロテアーゼの開裂部位、及びインテイン自己スプライシング配列などの自己スプライシング配列が、当業者に知られている。
【００４４】
ＣＴ及びＢ部分は、互いに直接又は間接的に連結されている。直接的結合は、リンカーなどの介在配列の無い、部分間の直接共有結合を意味する。間接的な結合はまた、部分が共有結合で結合されているが、リンカー及び／又は一以上の更なる部分、例えば１−２のＮＴ部分などの介在配列があることを意味する。
【００４５】
Ｂ部分又は部分（複数）は、融合タンパク質の内部に又は何れかの末端に配置され得、即ちＣ末端に配置されるか又はＮ末端に配置される。Ｂ部分又は部分（複数）は、融合タンパク質のＮ末端に配置されることが好まれる。仮に融合タンパク質が、融合タンパク質の同定と精製のために一つ以上のリンカー、例えばＨｉｓ又はＴｒｘタグを含む場合、融合タンパク質のＮ末端に配置されることが好まれる。
【００４６】
好ましい融合タンパク質は、Ｎ末端にＢ部分が配置された形態を有し、１から３０アミノ酸残基、例えば１から１０アミノ酸残基のリンカーペプチドによって、Ｃ末端に配置されたＣＴ部分へ結合している。リンカーペプチドは開裂部位を含み得る。任意で、融合タンパク質はＮ末端又はＣ末端に、Ｈｉｓタグ、及び開裂部位などの精製タグを含み得るリンカーペプチドを有する。
【００４７】
その他の好ましい融合タンパク質は、Ｃ末端に配置されたＣＴ部分へ直接結合したＢ部分をＮ末端に配置した形態を有する。任意で、融合タンパク質はＮ末端又はＣ末端に、Ｈｉｓタグ、及び開裂部位などの精製タグを含み得るリンカーペプチドを有する。
【００４８】
本発明によるタンパク質構造は、本発明による組換え融合タンパク質を反復構造単位として含むポリマーであり、それは整列した複数の融合タンパク質、典型的には１００融合タンパク質単位を軽く超える、例えば１０００融合タンパク質単位又はそれ以上を含むことを意味する。任意で、ポリマーは更なる反復構造単位として、Ｂ部分の無い相補性タンパク質、好ましくはクモ糸に由来するタンパク質を含み得る。このことは、融合タンパク質のＢ部分が、大きい及び／又は嵩高い場合に有利であり得る。これらの相補性タンパク質は、ＣＴ部分、及び任意で更にＮＴ部分、例えば１−２のＮＴ部分を典型的に含み、及びからなり得る。本発明による好ましい相補性タンパク質は、Ｂ部分が欠失した本明細書に記載の構造の何れかを有することができる。相補性融合タンパク質は、Ｂ部分が欠失した融合タンパク質に実質的に同一であることが望ましい。しかしながら、本発明によるタンパク質構造は、反復構造単位として本発明による組換え融合タンパク質からなるポリマーであること、即ち本発明によるタンパク質構造は本発明による組換え融合タンパク質のポリマーであることが望ましい。
【００４９】
ポリマーの融合単位の規模は、タンパク質構造が有意な大きさを得たことを意味する。好ましい実施態様にて、タンパク質構造は少なくとも２次元で少なくとも０．１μｍの大きさを有する。従って、本明細書で使用する「タンパク質構造」なる用語は、少なくとも０．１μｍの厚さを持つ融合タンパク質ポリマー、好ましくはヒトの目に見える、即ち少なくとも１μｍの厚さを持つ巨視的ポリマーを指す。「タンパク質構造」なる用語は、構造をとらない凝集体又は沈殿を包含しない。融合タンパク質のモノマーは水溶性であるが、本発明に係るタンパク質構造は、固体構造、即ち水に溶けない。タンパク質構造は、本発明に係る組換え融合タンパク質のモノマーを反復構造単位として含有するポリマーである。
【００５０】
本発明に係るタンパク質構造は、繊維、薄膜、発泡体、網、メッシュ、球及びカプセルからなる群から選択される物理的形態であることが望ましい。
【００５１】
本発明に係るタンパク質構造は、少なくとも１ｎｍ又は少なくとも０．１μｍ、好ましくは少なくとも１μｍの厚さの繊維又は薄膜であることが望ましい。繊維又は薄膜は、１ｎｍ−４００ｍ、例えば１−４００μｍ、及び好ましくは６０−１２０μｍの範囲の厚さを持つことが望ましい。繊維は、０．５−３００ｃｍ、好ましくは１−１００ｃｍの範囲の長さを有することが望ましい。他の好ましい範囲は０．５−３０ｃｍ及び１−２０ｃｍである。繊維は物理的操作中に無傷のままである能力を有し、即ち、紡績、製織、撚糸、かぎ針編み及び同様の手順で用いることができる。薄膜は、可干渉性で、固体構造、例えばマイクロタイタープレートのプラスチックへ付着するという点で有利である。薄膜のこの特性は、洗浄と再生手順を容易にし、分離の目的に非常に有用である。特に有用なタンパク質構造は、薄膜又は繊維であり、Ｂ部分はブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメイン又はそれに対して少なくとも７０％同一性を有するタンパク質断片である。
【００５２】
また、本発明に係るタンパク質構造は、１ＭＰａを超えた、好ましくは２ＭＰａを超えた、より好ましくは１０ＭＰａ以上の引張強度を有することが好ましい。本発明に係るタンパク質構造は、１００ＭＰａを超えた、より好ましくは２００ＭＰａ以上の引張強度を有することが好ましい。
【００５３】
用語「％同一性」は、本明細書と添付された特許請求の範囲の全体を通して使用されるように、以下のように計算される。クエリ配列は、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムを使用して、標的配列にアラインされる(Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994))。比較は、整列された配列の最短に対応するウィンドウを介して行われる。各位置でアミノ酸配列が比較され、標的配列において同一対応を有するクエリ配列における位置の割合が、％同一性として報告される。
【００５４】
「％類似性」は、本明細書と添付された特許請求の範囲の全体を通して使用されるように、疎水性残基のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ及びＣｙｓは類似し；塩基残基のＬｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓは類似し、；酸性残基のＧｌｕとＡｓｐは類似し；親水性残基、無電荷残基のＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒは類似していることを例外として、「％同一性」について説明されるように計算される。残りの天然アミノ酸のＧｌｙはこれに関連する他の何れのアミノ酸に対して類似していない。
【００５５】
この説明全体を通して、本発明による他の代わりの実施態様は、明記された同一性の割合の代わりに、対応する類似の割合を実行する。別の代わりの実施態様は、明記された同一性の割合並びに、各配列について好ましい同一性の割合の群から選択された、その他のより高い割合の類似性を実行する。例えば、配列はその他の配列に７０％類似している可能性があり；又はそれはその他の配列に７０％同一であり得；又はそれはその他の配列に７０％同一で９０％類似であり得る。
【００５６】
ＣＴ部分は７０から１２０アミノ酸残基を含むタンパク質断片で、クモ糸タンパク質のＣ末端断片から由来する。「に由来する」なる表現は、本発明によるＣＴ部分の関連において、クモ糸タンパク質のＣ末端アミノ酸配列に高度の類似性を有することを意味する。図１に示されるように、このアミノ酸配列はＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２を含む、様々な種及びクモ糸タンパク質の間で良く保存されている。ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２のＣ末端領域のコンセンサス配列は、配列番号９として提供される。図１において、以下のＭａＳｐタンパク質がアラインされ、必要に応じＧｅｎＢａｎｋの受託エントリーで表示される（配列番号１４−４４）。
【００５７】
0006412866.tif 000006
0006412866.tif 000007
【００５８】
ＣＴ部分が完全には欠失していない限り、本発明によるクモ糸タンパク質において、どの特異的ＣＴ部分が存在するかは重大ではない。従って、本発明によるＣＴ部分は、図１及び表１に示されたアミノ酸配列（配列番号１４−４４）又は高度な類似性を持つ配列の何れかから選択することができる。様々なＣ末端配列が、本発明によるクモ糸タンパク質に使用することができる。
【００５９】
本発明によるＣＴ断片の配列は、図１のアミノ酸配列（配列番号１４−４４）に基づいて、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号９に対して、少なくとも５０％同一性、好ましくは少なくとも６０％同一性、より好ましくは少なくとも６５％同一性、又は実に少なくとも７０％同一性を有する。
【００６０】
本発明による代表的なＣＴ部分は、ユープロステノプス オーストラリス(Euprosthenops australis)配列の配列番号７である。従って、本発明による好ましい態様によれば、ＣＴ部分は、配列番号７又は図１及び表１の個々の何れかのアミノ酸配列（配列番号１４−４４）に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％同一性を有する。本発明の好ましい実施態様において、ＣＴ部分は配列番号７又は図１及び表１の個々の何れかのアミノ酸配列に対して同一である。
【００６１】
ＣＴ部分は典型的には７０から１２０アミノ酸残基からなる。ＣＴ部分は、少なくとも７０、又は８０を上回る、好ましくは９０を上回るアミノ酸残基を含むことが望まれる。また、ＣＴ部分は、多くても１２０、又は１１０未満のアミノ酸残基を含むことが望まれる。典型的なＣＴ部分は約１００アミノ酸残基を含む。
【００６２】
任意のＮＴ部分は１００から１６０アミノ酸残基を含むタンパク質断片で、クモ糸タンパク質のＮ末端断片に由来する。「に由来する」なる表現は、本発明によるＮＴ部分の関連において、クモ糸タンパク質のＮ末端アミノ酸配列に高度の類似性を有することを意味する。図２に示されるように、このアミノ酸配列はＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２を含む、様々な種及びクモ糸タンパク質の間で良く保存されている。図２において、該当するＧｅｎＢａｎｋの受託エントリーが表示された以下のスピドロインＮＴ部分がアラインされる（配列番号４５−５８）。
【００６３】
0006412866.tif 000008
【００６４】
Ｎ末端部分に対応する部分のみが、シグナルペプチドを除いて、各配列について示されている。ＮｃフラッグとＮｌｍフラッグが、Rising A. et al. Biomacromolecules 7, 3120-3124 (2006)に従って翻訳され編集された。
【００６５】
本発明によるクモ糸タンパク質において、どの特定のＮＴ部分が存在しているかは重大ではない。従って、本発明によるＮＴ部分は、図２及び表２に示されたアミノ酸配列（配列番号４５−５８）又は高度な類似性を持つ配列の何れかから選択することができる。多種多様のＮ末端配列を、本発明によるクモ糸タンパク質に使用することができる。図２の相同配列に基づいて、以下の配列が、コンセンサスＮＴアミノ酸配列を構成する：ＱＡＮＴＰＷＳＳＰＮＬＡＤＡＦＩＮＳＦ（Ｍ／Ｌ）ＳＡ（Ａ／Ｉ）ＳＳＳＧＡＦＳＡＤＱＬＤＤＭＳＴＩＧ（Ｄ／Ｎ／Ｑ）ＴＬＭＳＡＭＤ（Ｎ／Ｓ／Ｋ）ＭＧＲＳＧ（Ｋ／Ｒ）ＳＴＫＳＫＬＱＡＬＮＭＡＦＡＳＳＭＡＥＩＡＡＡＥＳＧＧ（Ｇ／Ｑ）ＳＶＧＶＫＴＮＡＩＳＤＡＬＳＳＡＦＹＱＴＴＧＳＶＮＰＱＦＶ（Ｎ／Ｓ）ＥＩＲＳＬＩ（Ｇ／Ｎ）Ｍ（Ｆ／Ｌ）（Ａ／Ｓ）ＱＡＳＡＮＥＶ（配列番号８）。
【００６６】
本発明によるＮＴ部分の配列は、図２のアミノ酸配列に基づいて、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号８に対して、少なくとも５０％同一性、好ましくは少なくとも６０％同一性を有する。好ましい実施態様において、本発明によるＮＴ部分の配列は、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号８に対して、少なくとも６５％同一性、好ましくは少なくとも７０％同一性を有する。好ましい実施態様において、本発明によるＮＴ部分は、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号８に対して、更に７０％、好ましくは８０％の類似性を有する。
【００６７】
本発明による代表的なＮＴ部分は、ユープロステノプス オーストラリス(Euprosthenops australis)配列の配列番号６である。本発明の好ましい実施態様によれば、ＮＴ部分は、配列番号６又は図２の個々の何れかのアミノ酸配列（配列番号４５−５８）に対して、少なくとも８０％同一性を有する。本発明の好ましい実施態様において、ＮＴ部分は、配列番号６又は図２の個々の何れかのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％同一性を有する。本発明の好ましい実施態様において、ＮＴ部分は配列番号６又は図２の個々の何れかのアミノ酸配列に対して、特にＥａ ＭａＳｐ１（配列番号４５）に対して同一である。
【００６８】
ＮＴ部分は１００から１６０アミノ酸残基を含む。ＮＴ部分は、少なくとも１００，又は１１０を上回る、好ましくは１２０を上回るアミノ酸残基を含むことが望まれる。また、ＮＴ部分は、多くても１６０、又は１４０未満のアミノ酸残基を含むことが望まれる。典型的なＮＴ部分は約１３０から１４０アミノ酸残基を含む。
【００６９】
融合タンパク質は、クモ糸タンパク質の反復断片に由来する任意の部分を含んでいない。クモ糸タンパク質の反復断片に由来し、従って本融合タンパク質に欠けている典型的な部分はＲＥＰ部分、即ち、クモ糸タンパク質の反復断片に由来する７０から３００アミノ酸残基を含んでなるタンパク質断片である。ＲＥＰ部分を欠いた融合タンパク質において、Ｂ部分の、その抗原ターゲットよりも他の分子に対する非特異的結合は、有利なことに更にもっと減少することが観察されている。また固体構造がＲＥＰ部分を欠く融合タンパク質から自発的に形成されることは特に驚くべきことである。
【００７０】
ＲＥＰ部分は、アラニンリッチストレッチとグリシンリッチストレッチの間で交互に反復特性を有する。ＲＥＰ部分は、一般に、７０を上回る、例えば１４０を上回り、及び３００未満、好ましくは２４０未満、例えば２００未満のアミノ酸残基を含み、下記により詳細に説明されるように、それ自身を幾つかのＬ（リンカー）セグメント、Ａ（アラニンリッチ）セグメント及びＧ（グリシンリッチ）セグメントに分割することができる。典型的には、前記リンカーセグメントは任意であって、ＲＥＰ部分の末端に位置しており、一方残りのセグメントは順にアラニンリッチ及びグリシンリッチである。従って、ＲＥＰ部分は一般的に以下の構造のどちらかを有することができ、ここでｎは整数である。
Ｌ（ＡＧ）ｎＬ、例えばＬＡ１Ｇ１Ａ２Ｇ２Ａ３Ｇ３Ａ４Ｇ４Ａ５Ｇ５Ｌ；
Ｌ（ＡＧ）ｎＡＬ、例えばＬＡ１Ｇ１Ａ２Ｇ２Ａ３Ｇ３Ａ４Ｇ４Ａ５Ｇ５Ａ６Ｌ；
Ｌ（ＧＡ）ｎＬ、例えばＬＧ１Ａ１Ｇ２Ａ２Ｇ３Ａ３Ｇ４Ａ４Ｇ５Ａ５Ｌ；又は
Ｌ（ＧＡ）ｎＧＬ、例えばＬＧ１Ａ１Ｇ２Ａ２Ｇ３Ａ３Ｇ４Ａ４Ｇ５Ａ５Ｇ６Ｌ。
アラニンリッチセグメント又はグリシンリッチセグメントは、Ｎ末端又はＣ末端のリンカーセグメントに隣接しているかどうかは重要ではないということになる。ｎは２から１０の整数、好ましくは２から８、好ましくは４から８、より好まれるのは４から６であり、即ち、ｎ＝４、ｎ＝５、又はｎ＝６である。
【００７１】
ＲＥＰ部分のアラニン含有量は、典型的には２０％を超え、好ましくは２５％を超え、より好ましくは３０％を超え、及び５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３５％未満である。
【００７２】
次に、ＲＥＰ部分を構成するセグメントに目を向けると、各々のセグメントは個別であり、即ち、特定のＲＥＰ部分の任意の２つのＡセグメント、任意の２つのＧセグメント、又は任意の２つのＬセグメントは同一であるか又は同一でない場合がある。従って、セグメントの各タイプが特定のＲＥＰ部分内で同一であることは一般的特徴ではない。むしろ、以下の開示は、ＲＥＰ部分をどのように同定するかのガイドラインを当業者に提供し、そのことにより、それはクモ糸タンパク質の反復断片に由来すると考えられ、かつ、それは本発明に係る機能性融合タンパク質の一部を構成しない。
【００７３】
各個々のＡ断片は、８から１８アミノ酸残基を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸残基の大部分はアラニン残基である。より具体的には、アミノ酸残基の０から３はアラニン残基ではなく、残りのアミノ酸残基がアラニン残基である。従って、各個別のＡセグメントの全てのアミノ酸残基は、例外なく、又は１つ、２つ又は３つのアミノ酸残基が任意のアミノ酸であって良い例外を除き、アラニン残基である。アラニン置換アミノ酸は天然のアミノ酸であり、好ましくは、セリン、グルタミン酸、システイン、及びグリシン、より好ましくはセリンから個別に選択される。もちろん、一以上のＡセグメントが全てアラニンセグメントであり、一方、残りのＡセグメントが１から３の非アラニン残基、例えばセリン、グルタミン酸、システイン又はグリシンなどを含有することは可能である。
【００７４】
各個々のＡセグメントは、典型的には、配列番号１０のアミノ酸残基７−１９、４３−５６、７１−８３、１０７−１２０、１３５−１４７、１７１−１８３、１９８−２１１、２３５−２４８、２６６−２７９、２９４−３０６、３３０−３４２、３５７−３７０、３９４−４０６、４２１−４３４、４５８−４７０、４８９−５０２、５１７−５２９、５５３−５６６、５８１−５９４、６１８−６３０、６４８−６６１、６７６−６８８、７１２−７２５、７４０−７５２、７７６−７８９、８０４−８１６、８４０−８５３、８６８−８８０、９０４−９１７、９３２−９４５、９６９−９８１、９９９−１０１３、１０２８−１０４２及び１０６０−１０７３の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％同一性を有する。この群の各配列は、ユープロステノプス オーストラリス(Euprosthenops australis)ＭａＳｐ１タンパク質の天然に生じる配列のセグメントに対応し、これは対応するｃＤＮＡのクローニングから推定される。国際公開第２００７／０７８２３９号を参照。あるいは、各個々のＡセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基１４３−１５２、１７４−１８６、２０４−２１８、２３３−２４７及び２６５−２７８の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％同一性を有する。
【００７５】
更に、実験データから、各個々のＧセグメントは１２から３０アミノ酸残基のアミノ酸配列であることが結論付けられている。個々のＧセグメントは１４から２３アミノ酸残基から成ることが好ましい。各Ｇセグメントの少なくとも４０％のアミノ酸残基はグリシン残基である。典型的には、各個々のＧセグメントのグリシン含量は、４０から６０％の範囲にある。
【００７６】
各個々のＧセグメントは、典型的には、配列番号１０のアミノ酸残基２０−４２、５７−７０、８４−１０６、１２１−１３４、１４８−１７０、１８４−１９７、２１２−２３４、２４９−２６５、２８０−２９３、３０７−３２９、３４３−３５６、３７１−３９３、４０７−４２０、４３５−４５７、４７１−４８８、５０３−５１６、５３０−５５２、５６７−５８０、５９５−６１７、６３１−６４７、６６２−６７５、６８９−７１１、７２６−７３９、７５３−７７５、７９０−８０３、８１７−８３９、８５４−８６７、８８１−９０３、９１８−９３１、９４６−９６８、９８２−９９８、１０１４−１０２７、１０４３−１０５９及び１０７４−１０９２の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％同一性を有する。この群の各配列は、ユープロステノプス オーストラリス(Euprosthenops australis）ＭａＳｐ１タンパク質の天然に生じる配列のセグメントに対応し、これは対応するｃＤＮＡのクローニングから推定される。国際公開第２００７／０７８２３９号を参照。あるいは、各個々のＧセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基１５３−１７３、１８７−２０３、２１９−２３２、２４８−２６４及び２７９−２９６の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％同一性を有する。この群の各配列は、発現された、非天然クモ糸タンパク質のセグメントに対応し、そのタンパク質は適切な条件下で糸構造を形成する能力を有する。従って、各個々のＧセグメントは、上述のアミノ酸セグメントから選択されたアミノ酸配列に対して同一とすることができる。
【００７７】
本発明によれば、Ｇセグメントの３つのサブタイプがある。この分類は、ユープロステノプス オーストラリス(Euprosthenops australis)ＭａＳｐ１タンパク質配列（国際公開第２００７／０７８２３９号）の注意深い解析に基づいており、その情報は、新規な非天然クモ糸タンパク質の構築において用いられ検証されている。
【００７８】
Ｇセグメントの第一のサブタイプは、アミノ酸の一文字コンセンサス配列ＧＱＧ（Ｇ／Ｓ）ＱＧＧ（Ｑ／Ｙ）ＧＧ（Ｌ／Ｑ）ＧＱＧＧＹＧＱＧＡ  ＧＳＳ（配列番号１１）により表わされる。この第一の、そして一般的に最長のＧセグメントサブタイプは、典型的には、２３アミノ酸残基を含むが、わずか１７アミノ酸残基しか含まない場合もあり、荷電残基を欠損するか又は一つの荷電残基を含む。従って、この第一のＧセグメントサブタイプは、典型的には１７から２３アミノ酸残基を含むが、わずか１２又は３０ものアミノ酸残基を含み得ることが意図されている。この第一のサブタイプの代表的なＧセグメントは、アミノ酸配列１０のアミノ酸残基２０−４２、８４−１０６、１４８−１７０、２１２−２３４、３０７−３２９、３７１−３９３、４３５−４５７、５３０−５５２、５９５−６１７、６８９−７１１、７５３−７７５、８１７−８３９、８８１−９０３、９４６−９６８、１０４３−１０５９及び１０７４−１０９２である。所定の実施態様において、この第一のサブタイプの各Ｇセグメントの最初の２つのアミノ酸残基は、−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ではない。
【００７９】
本発明によるＧセグメントの第ニのサブタイプは、アミノ酸の一文字コンセンサス配列ＧＱＧＧＱＧＱＧ（Ｇ／Ｒ）ＹＧＱＧ（Ａ／Ｓ）Ｇ（Ｓ／Ｇ）Ｓ（配列番号１２）により表わされる。この第二の、一般には中規模の、Ｇセグメントサブタイプは、典型的には１７アミノ酸残基を含み、荷電残基を欠損するか又は一つの荷電残基を含む。この第二のＧセグメントサブタイプは、典型的には１４から２０アミノ酸残基を含むが、わずか１２又は３０ものアミノ酸残基を含み得ることが意図されている。この第二のサブタイプの代表的なＧセグメントは、配列番号１０のアミノ酸残基２４９−２６５、４７１−４８８、６３１−６４７及び９８２−９９８、及び配列番号３のアミノ酸残基１８７−２０３である。
【００８０】
Ｇセグメントの第三のサブタイプは、アミノ酸の一文字コンセンサス配列Ｇ（Ｒ／Ｑ）ＧＱＧ（Ｇ／Ｒ）ＹＧＱＧ（Ａ／Ｓ／Ｖ）ＧＧＮ（配列番号１３）により表わされる。この第三のＧセグメントサブタイプは、典型的には１４アミノ酸残基を含み、一般的にはＧセグメントサブタイプの最短である。この第三のＧセグメントサブタイプは、典型的には１２から１７アミノ酸残基を含むが、２３ものアミノ酸残基を含み得ることが意図されている。この第一のサブタイプの代表的なＧセグメントは、アミノ酸配列１０のアミノ酸残基５７−７０、１２１−１３４、１８４−１９７、２８０−２９３、３４３−３５６、４０７−４２０、５０３−５１６、５６７−５８０、６６２−６７５、７２６−７３９、７９０−８０３、８５４−８６７、９１８−９３１、１０１４−１０２７；及び配列番号３のアミノ酸残基２１９−２３２である。 
【００８１】
従って、好ましい実施態様において、各個々のＧセグメントは、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％同一性を有する。
【００８２】
ＲＥＰ部分のＡセグメントとＧセグメントの交互配列の好ましい実施態様において、全ての第二のＧセグメントは第一のサブタイプのものであり、一方残りのＧセグメントは第三のサブタイプ、例えば、．．．Ａ１Ｇ短いＡ２Ｇ長いＡ３Ｇ短いＡ４Ｇ長いＡ５Ｇ短い．．．である。ＲＥＰ部分のその他の好ましい実施態様において、第二のサブタイプの一つのＧセグメントが、挿入、例えば．．．Ａ１Ｇ短いＡ２Ｇ長いＡ３Ｇ中程度Ａ４Ｇ短いＡ５Ｇ長い．．．を介して規則的にＧセグメントを中断する。
【００８３】
各個々のＬセグメントは、任意のリンカーアミノ酸配列を表わし、０から２０アミノ酸残基、例えば０から１０アミノ酸残基を包含しうる。また、ユープロステノプス オーストラリス(Euprosthenops australis)由来のＭａＳｐ１タンパク質の推定アミノ酸配列の反復部分（配列番号１０）に存在するリンカーアミノ酸配列もある。特に、リンカーセグメントのアミノ酸配列は、記載されたＡセグメント又はＧセグメントの何れかに似ている可能性があるが、一般的には、本明細書で定義されるような基準を満たすには十分でない。
【００８４】
代表的なＬセグメントは、配列番号１０のアミノ酸残基１−６及び１０９３−１１１０；配列番号３のアミノ酸残基１３８−１４２であるが、当業者は、これらのセグメントについて多くの適切な代替アミノ酸配列があることを容易に認識するであろう。ＲＥＰ部分の一実施態様において、Ｌセグメントの一つは０アミノ酸を含む、即ち、Ｌセグメントの一つを欠いている。ＲＥＰ部分のその他の実施態様において、両方のＬセグメントが０アミノ酸を含む、即ち、両方のＬセグメントを欠いている。従って、ＲＥＰ部分のこれらの実施態様は、以下のように模式的に表わすことができる；（ＡＧ）ｎＬ、（ＡＧ）ｎＡＬ、（ＧＡ）ｎＬ、（ＧＡ）ｎＧＬ；Ｌ（ＡＧ）ｎ、Ｌ（ＡＧ）ｎＡ、Ｌ（ＧＡ）ｎ、Ｌ（ＧＡ）ｎＧ；及び（ＡＧ）ｎ、（ＡＧ）ｎＡ、（ＧＡ）ｎ、（ＧＡ）ｎＧ。
【００８５】
融合タンパク質は、クモ糸タンパク質の反復断片に由来する任意の部分を含んでいない、即ち、それは反復クモ糸タンパク質に対して低程度の同一性及び／又は類似性を持つか、或いは全く同一性及び／又は類似性を持たない。本発明による融合タンパク質の配列は、ここで開示された反復スピドロインアミノ酸配列の何れか、特に配列番号１０から１３の何れかに対して、３０％未満の同一性、例えば２０％未満の同一性、好ましくは１０％未満の同一性を有する。
【００８６】
Ｂ部分は、３０アミノ酸残基以上を含むタンパク質又はポリペプチド断片である。Ｂ部分は、好ましくは５０アミノ酸残基以上、例えば１００アミノ酸残基以上を含んでいる。Ｂ部分は、好ましくは１０００アミノ酸残基未満、例えば４００アミノ酸残基未満、より好ましくは３００アミノ酸残基未満を含んでいる。それは有機ターゲットと選択的相互作用することができ、有機ターゲットと選択的相互作用する能力を与えるのは融合タンパク質のＢ部分である。
【００８７】
Ｂ部分は非スピドロイン部分である。このことは、それがクモ糸タンパク質から由来しない、即ちクモ糸タンパク質に対して低程度の同一性及び／又は類似性を持つか、或いは全く同一性及び／又は類似性を持たないことを意味する。本発明によるＢ部分の配列は、ここで開示されたスピドロインアミノ酸配列の何れか、特に配列番号６から１０の何れかに対して、３０％未満の同一性、例えば２０％未満の同一性、好ましくは１０％未満の同一性を有する。
【００８８】
Ｂ部分を選択することは当業者の能力の範囲内と見なされる。にもかかわらず、Ｂ部分として有用であると証明され得る親和性リガンドの例、並びに検出及び／又は定量化のための形態と条件の例が説明の目的で下に与えられる。
【００８９】
親和性リガンドの選択に必要とされる生物分子の多様性は、複数の可能性のある足場分子の一つの組み合わせ操作により生成することができ、次いで、特異的及び／又は選択的親和性リガンドが適切な選択プラットフォームを用いて選択される。有機ターゲットに対する親和性リガンドを生成するために有用なそのような構造の非限定的な例として、ブドウ球菌タンパク質及びそれらのドメイン及びＺドメイン等のこれらのドメインの誘導体（Nord K et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:772-777)；リポカリン (Beste G et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:1898-1903)；アンキリンリピートドメイン（Binz HK et al. (2003) J. Mol. Biol. 332:489-503)；セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）(Smith GP et al. (1998) J. Mol. Biol. 277:317-332; Lehtioe J et al. (2000) Proteins 41:316-322)；γクリスタリン(Fiedler U and Rudolph R、国際公開第０１／０４１４４号）；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）(Peelle B et al. (2001) Chem. Biol. 8:521-534)；ヒトの細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４） (Hufton SE et al. (2000) FEBS Lett. 475:225-231; Irving RA et al. (2001) J. Immunol. Meth. 248:31-45)；ノッティン（ｋｎｏｔｔｉｎ）タンパク質などのプロテアーゼ阻害剤、 (Wentzel A et al. (2001) J. Bacteriol. 183:7273-7284; Baggio R et al. (2002) J. Mol. Recognit. 15:126-134) 及びクニッツドメイン(Roberts BL et al. (1992) Gene 121:9-15; Dennis MS and Lazarus RA (1994) J. Biol. Chem. 269:22137-22144)；ＰＤＺドメイン(Schneider S et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:170-175)；オレドキシンなどペプチドアプタマー(Lu Z et al. (1995) Biotechnology 13:366-372; Klevenz B et al. (2002) Cell. Mol. Life Sci. 59:1993-1998)；ブドウ球菌ヌクレアーゼ(Norman TC et al. (1999) Science 285:591-595)；テンダミスタット(tendamistats)(McConell SJ and Hoess RH (1995) J. Mol. Biol. 250:460-479; Li R et al. (2003) Protein Eng. 16:65-72)；フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに基づくトリネクチン(Koide A et al. (1998) J. Mol. Biol. 284:1141-1151; Xu L et al. (2002) Chem. Biol. 9:933-942)；及び亜鉛フィンガー(Bianchi E et al. (1995) J. Mol. Biol. 247:154-160; Klug A (1999) J. Mol. Biol. 293:215-218; Segal DJ et al. (2003) Biochemistry 42:2137-2148)；アドネクチン(adnectin)；アンチカリン(anticalin)；ＤＡＲＰｉｎ；アフィリン(affilin)及びアビマー(avimer)があげられる。
【００９０】
上記の例は、新規の結合特異性の生成に使用される単一のランダム化されたループを提示する足場タンパク質、タンパク質表面から突出する側鎖が、新規の結合特異性を生成するためにランダム化されている強固な二次構造を有するタンパク質の足場、及び新規結合特異性の生成のために使用される非連続的な超可変ループ領域を示す足場を含む。
オリゴヌクレオチドはまた親和性リガンドとして使用することができる。アプタマーもしくはデコイと呼ばれる一本鎖核酸は、明確に定義された三次元構造にフォールドし、高い親和性と特異性でそれらのターゲットに結合する(Ellington AD and Szostak JW (1990) Nature 346:818-822; Brody EN and Gold L (2000) J. Biotechnol. 74:5-13; Mayer G and Jenne A (2004) BioDrugs 18:351-359)。オリゴヌクレオチドリガンドは、ＲＮＡ又はＤＮＡの何れかとすることができ、ターゲット分子のクラスの広い範囲に結合することができる。
【００９１】
上述の足場構造体の任意の変異体のプールからの所望の親和性リガンドの選択において、多くの選択プラットフォームが、選択した標的タンパク質に対する特異的新規リガンドの単離のために利用することができる。選択プラットフォームは、限定されないが、ファージディスプレイ(Smith GP (1985) Science 228:1315-1317)、リボソームディスプレイ (Hanes J and Plueckthun A(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4937-4942)、酵母２−ハイブリッド系(Fields S and Song O (1989) Nature 340:245-246)、酵母ディスプレイ(Gai SA and Wittrup KD (2007) Curr Opin Struct Biol 17:467-473)、ｍＲＮＡディスプレイ(Roberts RW and Szostak JW (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:12297-12302)、細菌ディスプレイ(Daugherty PS (2007) Curr Opin Struct Biol 17:474-480, Kronqvist N et al. (2008) Protein Eng Des Sel 1-9, Harvey BR et al. (2004) PNAS 101(25):913-9198)、マイクロビーズディスプレイ(Nord O et al. (2003) J Biotechnol 106:1-13、国際公開第０１／０５８０８号）、ＳＥＬＥＸ(System Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) (Tuerk C and Gold L (1990) Science 249:505-510) 及びタンパク質断片相補アッセイ（ＰＣＡ）(Remy I and Michnick SW (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:5394-5399)を含む。免疫グロブリン、アルブミン、又は他の有機ターゲットに対する親和性を持つＢ部分の好ましい群は、細菌レセプチンドメイン又はその誘導体である。
【００９２】
Ｂ部分の好ましい群は、免疫グロブリン及び免疫グロブリン又はその誘導体、例えばＩｇＧの結晶化可能断片（Ｆｃ）領域を含む分子と選択的相互作用することができる。免疫グロブリンサブクラスの好ましい群は、ブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメインによって認識されるサブクラスである。即ち、ヒト由来のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＭ、ウサギ及びウシ由来の全Ｉｇサブクラス、モルモット由来のＩｇＧ１とＩｇＧ２、及びマウス由来のＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及びＩｇＭ（Hober, S. et al., J. Chromatogr B. 848:40-47 (2007)を参照）、より好ましくはヒト由来の免疫グロブリンサブクラスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＭである。Ｚドメインは、ブドウ球菌タンパク質の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）結合ドメインＢの改変版であり、ＩｇＧの結晶化（Ｆｃ）領域断片に結合する５８アミノ酸長の三重らせんモチーフである。免疫グロブリンサブクラスの別の好ましい群は、Ｃ２ドメイン連鎖球菌プロテインＧによって認識されるサブクラス、即ち、ＩｇＧ３を含む全ヒトサブクラス、及びマウス、ウサギ及びヒツジを含む数種の動物由来のＩｇＧである。
【００９３】
好ましいＢ部分の一群は、ブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメイン、ブドウ球菌タンパク質及びそのドメイン、好ましくはＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメイン、連鎖球菌プロテインＧ及びそのドメイン、好ましくはＣ１、Ｃ２及びＣ３ドメイン；及びこれらのアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも７０％同一性、例えば少なくとも８０％同一性、又は少なくとも９０％同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される。好ましくは、Ｂ部分は、ブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメイン、ブドウ球菌タンパク質のＢドメイン、及び連鎖球菌プロテインＧのＣ２ドメイン；及びこれらのアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも７０％同一性、例えば少なくとも８０％同一性、又は少なくとも９０％同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される。好ましくは、Ｂ部分は、ブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメイン、及びこのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％同一性、例えば少なくとも８０％同一性、又は少なくとも９０％同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される。Ｂ部分はブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメイン及び連鎖球菌プロテインＧのＣ２ドメインからなる群から選択されるのが望ましい。免疫グロブリンに対する親和性を持つＢ部分の好ましい群は、細菌レセプチンドメイン又はその誘導体である。
【００９４】
好ましいＢ部分の別の群は、アルブミン及びアルブミン又はその誘導体を含む分子と選択的相互作用することができる。アルブミンに対する親和性を持つＢ部分の好ましい群は、細菌レセプチンドメイン又はその誘導体である。好ましいＢ部分は、連鎖球菌プロテインＧ、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメイン、Finegoldia magna由来のＧＡモジュール；及びこれらのアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも７０％同一性、例えば少なくとも８０％同一性、又は少なくとも９０％同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される。好ましくは、Ｂ部分は、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメイン、及びこのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％同一性、例えば少なくとも８０％同一性、又は少なくとも９０％同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される。Ｂ部分は連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインであることが望ましい。
【００９５】
好ましいＢ部分の更なる群は、ビオチン及びビオチン又はその誘導体若しくは類似体を含む分子と選択的相互作用が可能である。好ましいＢ部分は、ストレプトアビジン、単量体ストレプトアビジン（Ｍ４）；及びこれらのアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも７０％同一性、例えば少なくとも８０％同一性、又は少なくとも９０％同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される。Ｂ部分は単量体ストレプトアビジン（Ｍ４）であることが望ましい。
【００９６】
好ましいＢ部分の別の群は、酵素的触媒される反応において基質と選択的に相互作用することができる酵素である。好ましい酵素Ｂ部分は、キシラナーゼ及びリゾチームが含まれる。
【００９７】
好ましいＢ部分の別の群は、細胞増殖を刺激し得る増殖因子である。好ましい増殖因子のＢ部分は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、特にヒトＥＧＦ、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、神経成長因子１（ＮＧＦ１）及び間質細胞由来因子１（ＳＤＦ１）が含まれる。
【００９８】
本発明に係る具体的な融合タンパク質及びタンパク質構造は実施例に与えられる。これらの好ましい融合タンパク質は、配列番号６１−６６、６８、７０、７２、７４、７６、８０、８２、８４及び８６からなる群を形成する。更なる好ましい融合タンパク質は、これらのアミノ酸配列の何れかに対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一性を有している。
【００９９】
本発明は、本発明による融合タンパク質をコードする単離された核酸を更に提供する。具体的には、特定の核酸は、実施例及び添付配列表で提供される。更に好ましい核酸は、配列番号６１−６６、６８、７０、７２、７４、７６、８０、８２、８４及び８６の何れかに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一性を有する融合タンパク質をコードする。
【０１００】
本発明に係る核酸は、本発明の融合タンパク質を産生するのに有用である。本発明は、融合タンパク質の生産方法を提供する。第一の工程は、本発明に係る融合タンパク質を適切な宿主で発現することを含む。適切な宿主は、当業者に周知であり、例えば、細菌細胞及び真核細胞、例えば、酵母、昆虫細胞株及び哺乳動物細胞株などを含む。典型的には、この工程は、大腸菌中で融合タンパク質をコードする核酸分子の発現を含む。
【０１０１】
第二の方法の工程では、融合タンパク質を含有する混合物を得ることを含む。混合物は、例えば、宿主細胞を溶解又は機械的に破壊することによって得ることができる。融合タンパク質が宿主細胞によって分泌される場合に、混合物はまた、細胞培養培地を収集することによって得ることができる。このようにして得られたタンパク質は、標準的な手順を用いて単離することができる。必要であれば、この混合物を遠心分離にかけて、適切な画分（沈殿物又は上清）を収集することができる。融合タンパク質を含有する混合物はまた、分離させるために、ゲルろ過クロマトグラフィー、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、透析法、相分離又は濾過に供することができる。任意で、リポ多糖及び他の発熱物質がこの段階で積極的に除去される。必要ならば、リンカーペプチドは、この工程で切断することによって除去することができる。
【０１０２】
本発明によるタンパク質構造又は形態は、適切な条件下で、本発明に係る融合タンパク質から自発的に構築され、ポリマーへの構築は剪断力の存在、及び／又は２つの異なる相の間、例えば固体と液体相との間、空気と液相との間の界面、又は疎水性／親水性界面、例えば、鉱物油−水界面によって促進される。得られた界面の存在は、界面において又は界面周囲の領域において重合を刺激し、その領域は前記重合が前記界面又は前記界面領域で開始するように、液体培地に広がっている。種々のタンパク質構造が、構築の最中に条件を適合させることにより生成することができる。例えば、その構築を軽く左右に振られる容器中で生じさせる場合、繊維が、空気−水界面に形成される。混合物を静置する場合、薄膜が空気−水界面に形成される。混合物を蒸発させる場合、薄膜は容器の底部に形成される。油が水性混合物に添加される場合、静置した場合又は振った場合に、薄膜が、油−水界面に形成される。この混合物を例えば空気のバブリング又は泡立てにより発泡させる場合、発泡体は安定し、乾燥させた場合に固化する。
【０１０３】
従って、本発明は、有機ターゲットに対する結合親和性を示すタンパク質構造を与えるための方法を提供する。第一の方法工程にて、本発明による組換え融合タンパク質が与えられる。融合タンパク質は、本発明による核酸から、適切な宿主中でそれを発現させることにより与えられ得る。第二の方法工程にて、融合タンパク質は組換え融合タンパク質を含むポリマーの形成を達成するための条件にさらされる。特に、自発的に構築されたタンパク質構造はヘキサフルオロイソプロパノールに可溶化することができるが、可溶化された融合タンパク質は、その後自発的に、例えば繊維に、再構築できない。
【０１０４】
タンパク質構造は、有機ターゲットの固定化用の親和性培地の一部として有用であり、ここでＢ部分は有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である。サンプル、例えば生物学的サンプルは、生物学的サンプルに存在する有機ターゲットに結合することができる本発明による融合タンパク質又はタンパク質構造に適用することができ、その融合タンパク質又はタンパク質構造はその後サンプルからの有機ターゲットの分離に有用である。生物学的サンプル、例えば被験体から除去された血液、血清又は血漿などは、有機ターゲットの検出、分離及び／又は定量化を受ける。
【０１０５】
従って本発明はサンプルからの有機ターゲットの分離のための方法を与える。サンプル、例えば、有機ターゲットを含む血液、血清又は血漿が与えられる。生物学的サンプルは、前に得られた試料である場合がある。もし以前に得たサンプルを方法で用いる場合、本方法の工程はヒト又は動物の体で実施されない。
【０１０６】
本発明による親和性培地は、本発明による融合タンパク質又はタンパク質構造を含んで与えられる。所定の実施態様にて、親和性培地は、本発明による融合タンパク質又はタンパク質構造を含有している。親和性培地は、本発明による融合タンパク質のＢ部分を用いて、有機ターゲットと選択的相互作用することができる。親和性培地は、親和性培地と有機ターゲット間の結合を達成するために適した条件下でサンプルと接触される。結合しないサンプルは、親和性培地と有機ターゲット間の選択的結合を維持するために適した条件下で除去される。本方法は親和性培地、特に本発明による融合タンパク質に固定化した有機ターゲットを生じる。
【０１０７】
本発明による好ましい方法にて、親和性培地中の融合タンパク質は、親和性培地と有機ターゲット間の結合を達成するために親和性培地とサンプルを接触させると、本発明によるタンパク質構造として存在する。
【０１０８】
この点において特に有用なタンパク質構造は、薄膜又は繊維であり、Ｂ部分はブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメイン又はそれに対して少なくとも７０％同一性、例えば少なくとも８０％同一性、又は少なくとも９０％同一性を有するタンパク質断片である。薄膜は、固体支持体、例えばマイクロタイタープレートのプラスチックへ付着するという点で有利である。薄膜のこの特性は、洗浄と再生手順を容易にし、分離の目的に非常に有用である。
【０１０９】
Ｚドメインのアルカリ安定性は、本発明によるタンパク質構造中で本発明による融合タンパク質の部分であるときに更に拡張することができることが驚くべきことに観察されている。この特性は洗浄及び再生目的に非常に有用であり得、例えば高濃度のＮａＯＨ、例えば０．１Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ又は１Ｍ以上、例えば２Ｍを許容し、及び／又は高濃度の尿素、例えば６〜８Ｍを許容する。この化学的安定性はまた、アフィニティー精製のためのＺドメインの使用の反復サイクルを可能にするために有用であり得る。このアルカリ安定性は、Ｚドメインの安定化変異体を利用することによって更に増加させることができる。更に、Ｚドメインを含む本発明による融合タンパク質は熱に安定であることが有利に示されている。これは固体タンパク質形態／構造並びに結合能を維持しながら、熱による殺菌を可能にする。
【０１１０】
Ｚドメインを含む従来の親和性マトリックスの既知の問題は、親和性マトリックスからのＺドメインの漏出である。ペプチド結合によるＺドメインの本発明の融合タンパク質への安定した導入のため、本発明のタンパク質構造からのＺドメインの望ましくない漏出は低いか又は存在しないことが考慮される。本発明による融合タンパク質の別の利点は、得られたタンパク質構造が高密度のＺドメイン（又は他のＢ部分）を有することである。この高密度が高い結合能を与えることが熟慮される。要するに、融合タンパク質のこれらの特性は様々なＢ部分に対して、特に生産に無駄のないタンパク質Ｚを用いるアフィニティー精製に非常に魅力的である。またこれらの特性は、従来のゲルビーズアフィニティーカラム、例えば濾過様形式よりも他の形式において有用である。
【０１１１】
固定化有機ターゲットは第二有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である。本方法は次いで、第一有機ターゲットと第二有機ターゲット間の選択的相互作用を達成するために適した条件下で、第一有機ターゲットとの選択的相互作用を可能とする、前記親和性培地と固定化有機ターゲットを第二有機ターゲットと接触させる工程を更に含む。
【０１１２】
固定化有機ターゲットは検出可能であるか及び／又は定量可能である。有機ターゲットの検出及び／又は定量化は、様々な生物学的又は非生物学的相互作用に基づくアッセイにおける結合試薬の検出及び／又は定量のための当業者に既知の任意の方法で達成され得る。有機ターゲットは様々なマーカーでそれ自身が標識され得るか、或いは、検出、可視化及び／又は定量化を可能にる２次標識親和性リガンドにより同様に検出され得る。これは、当業者に既知の多くの技術の任意の一以上を使用して、任意の過度の実験を包含せずに、有機ターゲット又は任意の２次親和性リガンドに結合され得る多数の標識の任意の一以上を用いて達成することができる。有機ターゲット及び／又は二次親和性リガンドに結合させることができる標識の非限定的な例は、蛍光色素又は金属（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレスカミン）、発色色素（例えば、ロドプシン）、化学発光化合物（例えば、管腔、イミダゾール）及び生物発光タンパク質（例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ）、ハプテン（例えば、ビオチン）が挙げられる。様々な他の有用なフルオロフォアと発色が、Stryer L (1968) Science 162:526-533及びBrand L and Gohlke JR (1972) Annu. Rev. Biochem. 41:843-868に記載されている。有機ターゲット及び／又は二次親和性リガンドはまた、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ラクタマーゼ）、放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ）及び粒子（例えば金）で標識することができる。本開示の関連において、「粒子」とは分子の標識に適した金属粒子などの粒子を指す。更に、親和性リガンドは、蛍光半導体ナノ結晶（量子ドット）で標識することができる。量子ドットは、優れた量子収率を有し、有機蛍光色素に比べて光安定であり、従って、より容易に検出される (Chan et al. (2002) Curr Opi Biotech. 13: 40-46)。異なるタイプの標識が、様々な化学、例えばアミン反応又はチオール反応を用いて有機ターゲット又は２次親和性リガンドに結合することができる。しかし、アミンとチオール以外の他の反応基、例えば、アルデヒド、カルボン酸及びグルタミンを用いることができる。
【０１１３】
検出及び／又は定量化が２次有機ターゲット又は２次親和性リガンドへの曝露を含む場合には、親和性培地は非結合親和性リガンドを除去するためにバッファーでもう一度洗浄される。例として、２次親和性リガンドは抗体又は断片又はその誘導体であり得る。その後、有機ターゲットは従来の方法で検出及び／又は定量化することができる。２次親和性リガンドに対する結合特性は変わることがあるが、当業者は日常の実験による各々の決定について、操作的で最適なアッセイ条件を決定することができるべきである。
【０１１４】
標識分子の検出、局在化及び／又は定量は、例えば光学顕微鏡又は免疫蛍光顕微鏡などの可視化技術を含んでも良い。他の方法は、フローサイトメトリー又は発光測定を介した検出を含むことができる。標識の可視化の方法としては、限定されるものではないが、蛍光、発光測定及び／又は酵素的技術を含むことができる。蛍光は、特定の波長の光に蛍光標識を露光し、その後、特定の波長領域で放射された光を検出及び／又は定量化することによって検出及び／又は定量化される。発光タグ付けされた分子の存在は、化学反応の最中に生じた発光により検出及び／又は定量化され得る。酵素反応の検出は、化学反応から生じるサンプル中の色ずれによるものである。当業者は、様々な異なるプロトコルが適切な検出及び／又は定量化するために変更可能であることを認識している。
【０１１５】
有機ターゲットの検出及び／又は定量化のための一つの利用可能な方法は、それ或いは２次親和性リガンドを、後に酵素免疫測定法（例えば、ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡなど）で検出及び／又は定量化可能である酵素に結合させることによる。そうした技術は十分に確立されており、その実現には当業者に不当な困難を提示しない。そうした方法において、生物学的サンプルは、有機標的に結合する本発明に係るタンパク質構造と接触させられ、その後酵素的に標識された二次親和性リガンドで検出及び／又は定量化される。この後、適切な基質を適切な緩衝液中で酵素標識と反応させ化学的部分を生成し、それは例えば分光光度計、蛍光光度計、ルミノメーターを使用するか又は視覚的な手段により検出及び／又は定量化される。
【０１１６】
有機ターゲット又は二次親和性リガンドは、検出及び／又は定量化を可能にするために放射性同位体で標識することができる。本開示の適切な放射性標識の非限定的な例は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉである。標識した親和性リガンドの特異的活性は、放射性標識の半減期、同位体の純度、及びどのように標識が親和性リガンドに組み込まれているのかに依存する。親和性リガンドは、好ましくは、周知の技術を用いて標識される（Wensel TG and Meares CF (1983) in: Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy (Burchiel SW and Rhodes BA eds.) Elsevier, New York, pp 185-196）。このように放射性標識された親和性リガンドは、放射能の検出による有機ターゲットを視覚化するために使用することができる。放射性核種のスキャニングは、例えばガンマカメラ、磁気共鳴分光法、放射トモグラフィー、ガンマ／ベータカウンター、シンチレーションカウンター及びラジオグラフ(radiographies)で行うことができる。
【０１１７】
従って、サンプルは、有機ターゲットの検出、分離及び／又は定量化のためのタンパク質構造に適用することができる。この手順は有機ターゲットの検出を可能にするだけでなく、その分布とその発現の相対的水準を更に示し得る。任意で、有機ターゲットは親和性培地から遊離され回収することができる。従って、本用途は有機ターゲットが固定化されている親和性培地上でのアフィニティー精製を含んでも良い。タンパク質構造は、カラム又はウェルプレート（例えば、９６ウェルプレートなど）中又は磁気ビーズ、アガロースビーズ又はセファロースビーズに例えば配置されても良い。更に、本用途は、例えばデキストランマトリックスを用いる水溶性マトリックス上でのタンパク質構造の使用、又は、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ機器などの表面プラズモン共鳴装置での使用を含んでも良く、その分析は、例えば固定化された有機ターゲット又は数多くの潜在的な親和性リガンド対する親和性をモニタリングすることを含んでもよい。
【０１１８】
本発明に係るタンパク質構造は、酸、塩基及びカオトロピック剤を含む様々な洗浄剤で洗浄し、再生することができる。特に有用な洗浄剤は、例えば、０．１、０．５又は１ＭのＮａＯＨのような水酸化ナトリウム又は例えば６−８Ｍ尿素などの尿素を含む。本発明に係るタンパク質構造は、驚くべきことに、化学処理及び／又は滅菌加熱処理に対して耐性であるため、本タンパク質構造の使用を伴う本発明による方法は、タンパク質構造の再生の最終工程を含み得る。本方法は、好ましくは、化学的処理及び／又は滅菌熱処理による親和性培地の再生の最終工程を含む。化学的処理は例えば、０．１、０．５又は１ＭのＮａＯＨのような水酸化ナトリウム又は例えば６−８Ｍ尿素などの尿素による処理を含む。
【０１１９】
本発明に係る融合タンパク質はまた、融合タンパク質を重合させ、例えば、薄膜、発泡体又は繊維などのタンパク質構造を形成することができるようにする前に、溶液中の有機ターゲットに結合させることができる。そのようなスピドロイン由来部分（例えばＣＴ）及びＢ部分を組み込んだ対応する融合タンパク質は両方とも、夾雑タンパク質の存在下においてさえも、材料中に感知できるほどの夾雑物が取り込まれることなく、固体構造に重合し、その機能性（Ｂ）部位はそれらの期待される結合特性を保持する。従って、Ｂ部分の結合特性は周囲の溶液由来の化合物又は細胞を捕捉し、その捕捉された化合物又は細胞を本発明によるタンパク質構造の中に組み込むために用いることができる。
【０１２０】
従って、本発明による別の好ましい方法にて、親和性培地中の融合タンパク質は、親和性培地と有機ターゲット間の結合を達成するために親和性培地とサンプルを接触させると溶液中に存在する。有機ターゲットに結合した融合タンパク質の複合体は、その後、本発明による融合タンパク質を形成させられる。
【０１２１】
この方法は、その目的が、溶液から特定の分子や細胞を「取り出す」こと、例えば標的タンパク質が分泌されるときに、大規模な真核細胞生産系の培地から標的分子を得ることであるときに特に有用である。スピドロイン由来部分による標的分子の結合と固体構造の形成を生理学的条件下で行うことができるため、及びスピドロイン由来部分が細胞適合性(cytocompatible)であるゆえ、本方法は、継続的な生産工程に対して繰り返し適用することができる。
【０１２２】
本発明によるタンパク質構造はまた細胞の分離、固定化、及び／又は培養に有用である。この点で特に有用なタンパク質構造は、薄膜、繊維又は発泡体である。薄膜は、固体構造、例えばマイクロタイタープレートのプラスチックへ付着するという点で有利である。薄膜のこの特性は、洗浄と再生手順を容易にし、選択的検出と分離の目的に非常に有用である。
【０１２３】
従って、本発明は、細胞表面上に存在する有機ターゲットを有する細胞の培養のための細胞足場材料を提供する。細胞足場材料は、本発明に係るタンパク質構造を含んでいる。所定の実施態様にて、細胞足場材料は、本発明によるタンパク質構造からなる。
【０１２４】
本発明の融合タンパク質を含む、及び任意で該タンパク質からなるポリマーを含む細胞足場材料は、様々な異なる環境設定下で、細胞、好ましくは真核細胞のの培養のために有益な環境を提供することが本発明者らによって見いだされている。更に、この環境は、それ以外の場合には非常に難しい、実験室で培養するには非常に費用がかかるか又は不可能でさえある細胞の培養の確立及び、組織工学及び／又は移植に有用な材料を含有する細胞の樹立について可能としている。
【０１２５】
本発明はまた、細胞、好ましくは真核細胞と本発明による細胞足場材料の組み合わせを提供する。本発明によるそうした組み合わせは、様々な異なる形態において提示され、及び特定の状況の必要性に合わせて調整され得る。例えば、本発明の組み合わせは、損傷又は疾患組織での細胞の置換のための細胞含有移植片として有用であり得ることを意図している。
【０１２６】
細胞足場材料は、直接的又は間接的に細胞を捕捉するために利用することができる。直接捕捉において、Ｂ部分は、細胞表面上に存在する有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である。あるいは、Ｂ部分は、中間体有機ターゲットと選択的相互作用が可能で、中間体有機ターゲットに結合し、その中間体有機ターゲットは、細胞表面上に存在する有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である。従って、間接的な捕捉において、細胞足場材料は、中間体有機ターゲットを更に含んでおり、Ｂ部分は、選択的相互作用が可能であり、該中間体有機ターゲットに結合される。中間体有機ターゲットは、同様に、細胞表面上に存在する有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である。
【０１２７】
本明細書に開示される細胞足場材料の一実施態様において、融合タンパク質は、さらに、オリゴペプチド細胞結合モチーフを含んでいる。特定の状況で特定の細胞の培養に関連して、オリゴペプチド細胞結合モチーフの存在は、細胞生存率を改善するか又は維持することが観察されており、クモ糸タンパク質の一部として、細胞足場材料へのそのようなモチーフの包含は更なる利点を提供すると考えられる。細胞結合モチーフは、少なくとも１つのペプチド結合を介して融合タンパク質の残りの部分に結合されたオリゴペプチドである。例えば、融合タンパク質の残りのＮ末端又はＣ末端、又はクモ糸タンパク質の残りの部分のアミノ酸配列内の任意の位置に結合され得る。オリゴペプチド細胞結合モチーフの選択に関して、当業者は、いくつかの選択肢を知っている。クモ糸タンパク質の残りの部分へのオリゴペプチド細胞結合モチーフの結合は、標準的遺伝子工学又は化学結合技術を用いて当業者によって容易に達成される。従って、幾つかの実施態様において、細胞結合モチーフは、遺伝子工学、即ち、融合タンパク質をコードする核酸と細胞結合モチーフとの間の遺伝子融合の一部を形成することを介して導入される。そうした実施態様のさらなる有益な特徴として、細胞結合モチーフは、細胞足場材料を構成するポリマー中で融合タンパク質の単量体に対して１：１の比率で存在するであろう。
【０１２８】
本明細書に記載の方法又は組合せで使用される細胞足場材料中のポリマーは、様々な物理的形態をとることができ、特定の物理的形態の用途は、異なる特定の状況において更なる利点を供与することができる。例えば、本方法又は組合せの実施態様において、細胞足場材料は、薄膜、発泡体、カプセル、繊維及び繊維メッシュからなる群から選択される物理的形態である。
【０１２９】
従って、本発明は、細胞の固定化のための方法を提供する。サンプル、例えば関心のある含む細胞を含有する血液などの生体試料が提供される。生物学的サンプルは、前に得られた試料である場合がある。もし以前に得たサンプルを方法で用いる場合、本方法の工程はヒト又は動物の体で実施されない。
【０１３０】
サンプルは、細胞足場材料及び目的の細胞の表面に存在する有機ターゲットとの間の選択的相互作用を可能にする適切な条件下で、本発明に係る細胞足場材料に対して適用される。細胞は、細胞表面の有機ターゲットと前記細胞足場材料との間の結合により、前記細胞足場材料に対して固定化される。結合しないサンプルは、細胞足場材料と有機ターゲット間の選択的結合を維持するために適した条件下で除去される。本方法は細胞足場材料、特に本発明によるタンパク質の構造に固定化されるた有機ターゲットを提示する細胞を生じる。
【０１３１】
前述に定められたように、細胞足場材料は、直接的又は間接的に細胞を捕捉するために利用することができる。直接捕捉において、Ｂ部分は、細胞表面上に存在する有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である。あるいは、Ｂ部分は、中間体有機ターゲットと選択的相互作用が可能で、中間体有機ターゲットに結合し、その中間体有機ターゲットは、細胞表面上に存在する有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である。従って、間接的な捕捉において、細胞足場材料は、中間体有機ターゲットを更に含んでおり、Ｂ部分は、選択的相互作用が可能であり、該中間体有機ターゲットに結合される。中間体有機ターゲットは、同様に、細胞表面上に存在する有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である。
【０１３２】
捕捉方法に関わらず、捕捉された細胞は、細胞足場材料から細胞捕獲に関与する部分を解放するために、融合タンパク質の切断により融合タンパク質から放出されてもよい。上述のように、融合タンパク質は、そのアミノ酸配列中に、関連部分、典型的にはＢ部分又は細胞結合モチーフの切断及び除去を可能にする、開裂部位を含み得る。様々な開裂部位が、例えば、化学試薬、例えばＣＮＢｒによるＭｅｔ残基の後ろの開裂部位、及びヒドロキシルアミンによるＡｓｎ−Ｇｌｙ残基間の開裂部位、トロンビン又はプロテアーゼ３Ｃなどのプロテアーゼの開裂部位、及びインテイン自己スプライシング配列などの自己スプライシング配列が、当業者に知られている。
【０１３３】
また、本発明は、細胞の培養の方法を提供する。目的の細胞は、上記に開示された方法を用いて細胞骨格材料に固定されている。細胞足場材料及び固定化細胞の組合せは、細胞培養に適した条件下で維持される。
【０１３４】
本発明の関連において、細胞の「培養」、「細胞培養」等の用語は、例えば、それらが、細胞が分裂及び／又は増殖した状況、細胞が、その自然環境に存在する場合、細胞型によって提示される少なくとも一つの機能特性を保持した分化状態に維持される状況、及び幹細胞が未分化状態で維持される状況を包含するように、広義に解釈されるべきである。
【０１３５】
別の態様によれば、本発明は、タンパク質はクモ糸タンパク質の反復断片から由来する任意の部分を含んではいないという条件で、ＣＴ部分及び少なくとも一のＮＴ部分を含む新規な組換えタンパク質を提供する。好ましい実施態様において、タンパク質は１−２のＮＴ部分を含んでいる。
【０１３６】
好ましい実施態様において、組換えタンパク質は、ＣＴ部分及び少なくとも一のＮＴ部分、例えば１−２のＮＴ部分からなる。タンパク質は、模式的に、ＮＴ−ＣＴ、ＣＴ−ＮＴ、ＮＴＮＴ−ＣＴ、ＣＴ−ＮＴＮＴ又はＮＴ−ＣＴ−ＮＴ、及び好ましくはＮＴ−ＣＴ又はＮＴＮＴ−ＣＴとして記載され得る。
【０１３７】
本発明による好ましい実施態様は、融合タンパク質は、配列番号５９−６０、及びこれらの配列の何れかに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一性を有するタンパク質からなる群から選択される。本発明は、本発明による組換えタンパク質をコードする単離された核酸を更に提供する。
【０１３８】
このタンパク質は、クモ糸タンパク質の反復断片を欠いており、従って、それが依然として、固体タンパク質構造、例えば繊維及び薄膜を形成することができることは驚くべきことである。本組換えタンパク質による利点は、それが、ＣＴ単独あるいはＮＴ部分を欠くがＲＥＰを含有する対応するタンパク質よりも高収率で生産することができることである。例えば、実施例１−２を参照。
【０１３９】
本発明は、この態様による反復構造単位として、組換えタンパク質を含むポリマーであるタンパク質構造を提供する。タンパク質構造は好ましくは少なくとも２次元で少なくとも０．１μｍの大きさを有する。タンパク質構造は、好ましくは、繊維、薄膜、発泡体、網、メッシュ、球及びカプセルからなる群から選択される物理的形態である。
【０１４０】
この組換えタンパク質は、クモ糸タンパク質の反復断片に由来する任意の部分を含んでいないので、それは反復クモ糸タンパク質に対して低程度の同一性及び／又は類似性を持つか、或いは全く同一性及び／又は類似性を持たない。本発明によるタンパク質の配列は、ここで開示された反復スピドロインアミノ酸配列の何れか、特に配列番号１０から１３の何れかに対して、３０％未満の同一性、例えば２０％未満の同一性、好ましくは１０％未満の同一性を有する。
【０１４１】
本発明は、以下の非限定的実施例により、以下に更に説明されるであろう。
【実施例】
【０１４２】
実施例１  ＮＴ−ＣＴのクローニング、発現及び繊維形成
ＮＴに共有結合したＣＴが繊維を形成することができるかを調べるため、ＮＴ−ＣＴ融合タンパク質（ＮＴ部分とＣＴ部分）を生成し、精製した。
クローニング
Ｈｉｓ６ＮＴ−ＣＴ融合タンパク質（配列番号５９）をコードする遺伝子を構築した。ベクターは、カナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を補充した寒天プレート上で増殖させたケモコンピテント(chemocompetent)大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。コロニーをその後採取し、正しい挿入のためにＰＣＲ検査をし、その後またＤＮＡ配列を確認するために配列決定した。
【０１４３】
産生
ｐＴ７Ｈｉｓ６ＮＴＣＴベクターを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、カナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を補充したルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（全６リットル）で、３０℃で１−１．５のＯＤ６００値まで増殖させ、次に、３００μＭのＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で発現を誘導し、約２時間、２０℃でさらにインキュベートした。次に、細胞を４７００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により回収し、得られた細胞ペレットを、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に溶解した。
【０１４４】
精製
２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に溶解させた細胞ペレットは、細菌細胞を溶解するために、リゾチーム及びＤＮアーゼＩが補充され、細胞溶解物を３０分間１５０００回転の遠心後に回収した。次に、回収した細胞溶解物を分割し、合計４つのキレートセファロースファーストフローＺｎ２＋カラムにロードし、タンパク質がＨｉｓ６タグを介してカラムマトリックスに結合するように保った。洗浄後、結合したタンパク質を２０ｍＭのトリス／３００ｍＭのイミダゾール（ｐＨ８．０）で溶出した。ＮＴＣＴの収率は、ＣＴ又はＲｅｐ４ＣＴよりも典型的に高かった。次に、プールされた溶出液を一晩、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）の５リットルに対して透析し、１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、最終的に繊維又は薄膜を形成させた。ｐＨが６．４未満に減少した場合には、繊維はより速く形成された。
【０１４５】
Ｈｉｓ６ＮＴＣＴの巨視的な繊維を得ることができたという事実は、ＣＴはＮＴに融合されたときに繊維形成特性を保持することを実証する。
【０１４６】
実施例２  ＮＴＮＴ−ＣＴのクローニング、発現及び繊維形成
ＮＴＮＴに共有結合されるものの、ＣＴが繊維を形成することができるかを調べるため、ＮＴＮＴ−ＣＴ融合タンパク質（ＮＴＮＴ部分とＣＴ部分）を生成し、精製した。
クローニング
Ｈｉｓ６ＮＴＮＴ−ＣＴ融合タンパク質（配列番号６０）をコードする遺伝子を構築した。ベクターは、カナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を補充した寒天プレート上で増殖させたケモコンピテント（chemocompetent）大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。コロニーをその後採取し、正しい挿入のためにＰＣＲ検査をし、その後またＤＮＡ配列を確認するために配列決定した。
【０１４７】
産生
ｐＴ７Ｈｉｓ６ＮＴＮＴＣＴベクターを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、カナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を補充したルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（全６リットル）で、３０℃で１−１．５のＯＤ６００値まで増殖させ、次に、３００μＭのＩＰＴＧで発現を誘導し、約２時間、２０℃でさらにインキュベートした。次に、細胞を４７００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により回収し、得られた細胞ペレットを、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に溶解した。
【０１４８】
精製
２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に溶解させた細胞ペレットは、細菌細胞を溶解するために、リゾチーム及びＤＮアーゼＩが補充され、細胞溶解物を３０分間１５０００回転の遠心後に回収した。次に、回収した細胞溶解物を分割し、合計４つのキレートセファロースファーストフローＺｎ２＋カラムにロードし、タンパク質がＨｉｓ６タグを介してカラムマトリックスに結合するように保った。洗浄後、結合したタンパク質を２０ｍＭのトリス／３００ｍＭのイミダゾール（ｐＨ８．０）で溶出した。ＮＴＮＴＣＴの収率は、ＣＴ又はＲｅｐ４ＣＴよりも典型的に高かった。次に、プールされた溶出液を一晩、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）の５リットルに対して透析し、１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、最終的に繊維又は薄膜を形成させた。ｐＨが６．４未満に減少した場合には、繊維はより速く形成された。
【０１４９】
Ｈｉｓ６ＮＴＮＴＣＴの巨視的な繊維を得ることができたという事実は、ＣＴはＮＴＮＴに融合されたときに繊維形成特性を保持することを実証する。
【０１５０】
実施例３  ＩｇＧ結合ＣＴ融合タンパク質のクローニング、発現及び繊維形成
融合タンパク質の概念を証明するために、ＣＴタンパク質（ＣＴ部分）はＺタンパク質ドメイン（Ｂ部分）と融合して生成される。Ｚドメインは、ブドウ球菌タンパク質の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）結合ドメインＢの改変版であり、ＩｇＧの結晶化（Ｆｃ）領域断片に結合する５８アミノ酸長の三重らせんモチーフである。目標は、ＣＴに融合したＺドメインからなる融合タンパク質から、例えば、繊維、薄膜及び膜などの構造体を生成し、及びドメインＺのＩｇＧ結合能力、並びにＣＴの構造形成特性をなお保持することが可能であるかどうかを探索することである。そのために、ＣＴのＮ末端又はＣ末端のＺドメインからなる融合タンパク質をクローニングする。
【０１５１】
クローニング
Ｈｉｓ６ＺＣＴ及びＨｉｓ６ＣＴＺ融合タンパク質（配列番号６１−６２）をコードする遺伝子が構築され、カナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を補充した寒天プレート上で増殖させたケモコンピテント（chemocompetent）大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換する。コロニーをその後採取し、正しい挿入のためにＰＣＲ検査をし、その後また正しいＤＮＡ配列を確認するために配列決定する。
【０１５２】
産生
ｐＴ７Ｈｉｓ６ＺＣＴ又はｐＴ７Ｈｉｓ６ＣＴＺベクターを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、カナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を補充したルリア−ベルターニ培地（全６リットル）で、３０℃で１−１．５のＯＤ６００値まで増殖させ、次に、３００μＭのＩＰＴＧでＨｉｓ６ＺＣＴ又はＨｉｓ６ＣＴＺ発現を誘導し、約２時間、２０℃でさらにインキュベートする。次に、細胞を４７００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により回収し、得られた細胞ペレットを、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に溶解する。
【０１５３】
精製
２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に溶解させた細胞ペレットは、細菌細胞を溶解するために、リゾチーム及びＤＮアーゼＩが補充され、すぐに細胞溶解物を３０分間１５０００回転の遠心後に回収する。次に、回収した細胞溶解物を分割し、合計４つのキレートセファロースファーストフローＺｎ２＋カラムにロードし、Ｈｉｓ６ＺＣＴタンパク質がＨｉｓ６タグを介してカラムマトリックスに結合するように保つ。洗浄後、結合したタンパク質を２０ｍＭのトリス／３００ｍＭのイミダゾール（ｐＨ８．０）で溶出した。プールされた溶出画分を一晩、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）の５リットルに対して透析し、１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、最終的に繊維を形成させた。
【０１５４】
分析
融合タンパク質構造のＢ部分の、有機ターゲットとの選択的相互作用の能力を探索するために、融合タンパク質のＺドメインのＩｇＧに結合する能力を試験した。この融合タンパク質の繊維と薄膜を、精製したＩｇＧ及び血清からのＩｇＧの結合のために用い、その後溶出し続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ここでＩｇＧは非還元条件下で〜１４６ｋＤａのバンドとして現れる。
【０１５５】
実施例４  ＩｇＧ結合ＮＴＣＴ融合タンパク質のクローニング、発現及び繊維形成
融合タンパク質の概念を証明するために、ＮＴ−ＣＴタンパク質（ＮＴ部分とＣＴ部分）はＺタンパク質ドメイン（Ｂ部分）と融合して生成される。目標は、ＮＴＣＴに融合したＺドメインからなる融合タンパク質から、例えば、繊維、薄膜及び膜などの構造体を生成し、及びドメインＺのＩｇＧ結合能力、並びにＣＴの構造形成特性をなお保持することが可能であるかどうかを探索することである。そのために、ＮＴＣＴのＮ末端及びＣ末端のＺドメインからなる融合タンパク質をクローニングする。
【０１５６】
クローニング
Ｈｉｓ６ＺＮＴＣＴ及びＨｉｓ６ＮＴＣＴＺ融合タンパク質（配列番号６３−６４）をコードする遺伝子が構築され、カナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を補充した寒天プレート上で増殖させたケモコンピテント（chemocompetent）大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換する。コロニーをその後採取し、正しい挿入のためにＰＣＲ検査をし、その後またＤＮＡ配列を確認するために配列決定する。
【０１５７】
産生
ｐＴ７Ｈｉｓ６ＺＮＴＣＴ及びｐＴ７Ｈｉｓ６ＮＴＣＴＺベクターを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、カナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を補充したルリア−ベルターニ（Luria-Bertani）培地（全６リットル）で、３０℃で１−１．５のＯＤ６００値まで増殖させ、次に、３００μＭのＩＰＴＧで発現を誘導し、約２時間、２０℃でさらにインキュベートする。次に、細胞を４７００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により回収し、得られた細胞ペレットを、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に溶解する。
【０１５８】
精製
２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に溶解させた細胞ペレットは、細菌細胞を溶解するために、リゾチーム及びＤＮアーゼＩが補充され、すぐに細胞溶解物を３０分間１５０００回転の遠心後に回収する。次に、回収した細胞溶解物を分割し、合計４つのキレートセファロースファーストフローＺｎ２＋カラムにロードし、Ｈｉｓ６ＺＮＴＣＴ又はＨｉｓ６ＮＴＣＴＺタンパク質がＨｉｓ６タグを介してカラムマトリックスに結合するように保つ。洗浄後、結合したタンパク質を２０ｍＭのトリス／３００ｍＭのイミダゾール（ｐＨ８．０）で溶出した。プールされた溶出画分を一晩、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）の５リットルに対して透析し、１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、最終的に繊維を形成させた。
【０１５９】
分析
融合タンパク質構造のＢ部分の、有機ターゲットとの選択的相互作用の能力を探索するために、融合タンパク質のＺドメインのＩｇＧに結合する能力を試験した。この融合タンパク質の繊維と薄膜を、精製したＩｇＧ及び血清からのＩｇＧの結合のために用い、その後溶出し続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ここでＩｇＧは非還元条件下で〜１４６ｋＤａのバンドとして現れる。
【０１６０】
実施例５  ＩｇＧ結合ＮＴＮＴＣＴ融合タンパク質のクローニング、発現及び繊維形成
融合タンパク質の概念を証明するために、ＮＴＮＴ−ＣＴタンパク質（ＮＴＮＴ及びＣＴ部分）はＺタンパク質ドメイン（Ｂ部分）と融合して生成される。目標は、ＮＴＮＴＣＴに融合したＺドメインからなる融合タンパク質から、例えば、繊維、薄膜及び膜などの構造体を生成し、及びドメインＺのＩｇＧ結合能力、並びにＣＴの構造形成特性をなお保持することが可能であるかどうかを探索することである。そのために、ＮＴＮＴＣＴのＮ末端及びＣ末端のＺドメインからなる融合タンパク質をクローニングする。
【０１６１】
クローニング
Ｈｉｓ６ＺＮＴＣＴ及びＨｉｓ６ＮＴＣＴＺ融合タンパク質（配列番号６５−６６）をコードする遺伝子が構築され、カナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を補充した寒天プレート上で増殖させたケモコンピテント（chemocompetent）大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換する。コロニーをその後採取し、正しい挿入のためにＰＣＲ検査をし、その後またＤＮＡ配列を確認するために配列決定する。
【０１６２】
産生
ｐＴ７Ｈｉｓ６ＺＮＴＮＴＣＴ及びｐＴ７Ｈｉｓ６ＮＴＮＴＣＴＺベクターを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、カナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を補充したルリア−ベルターニ（Luria-Bertani）培地（全６リットル）で、３０℃で１−１．５のＯＤ６００値まで増殖させ、次に、３００μＭのＩＰＴＧで発現を誘導し、約２時間、２０℃でさらにインキュベートする。次に、細胞を４７００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により回収し、得られた細胞ペレットを、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に溶解する。
【０１６３】
精製
２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に溶解させた細胞ペレットは、細菌細胞を溶解するために、リゾチーム及びＤＮアーゼＩが補充され、すぐに細胞溶解物を３０分間１５０００回転の遠心後に回収する。次に、回収した細胞溶解物を分割し、合計４つのキレートセファロースファーストフローＺｎ２＋カラムにロードし、Ｈｉｓ６ＺＮＴＮＴＣＴ又はＨｉｓ６ＮＴＮＴＣＴＺタンパク質がＨｉｓ６タグを介してカラムマトリックスに結合するように保つ。洗浄後、結合したタンパク質を２０ｍＭのトリス／３００ｍＭのイミダゾール（ｐＨ８．０）で溶出した。プールされた溶出画分を一晩、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）の５リットルに対して透析し、１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、最終的に繊維を形成させた。
【０１６４】
分析
融合タンパク質構造のＢ部分の、有機ターゲットとの選択的相互作用の能力を探索するために、融合タンパク質のＺドメインのＩｇＧに結合する能力を試験した。この融合タンパク質の繊維と薄膜を、精製したＩｇＧ及び血清からのＩｇＧの結合のために用い、その後溶出し続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ここでＩｇＧは非還元条件下で〜１４６ｋＤａのバンドとして現れる。
【０１６５】
実施例６  ＡＢＤ−ＮＴＣＴ及びＡＢＤ−ＣＴ融合タンパク質のクローニング、発現及び固体構造の形成
ＮＴＣＴ及びＣＴは、連鎖球菌プロテインＧ由来のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）との融合で生成された。ＡＢＤはアルブミンと結合する５ｋＤａの三重らせんモチーフである。目標は、ＮＴＣＴに融合したＡＢＤドメイン（Ｈｉｓ６−ＡＢＤ−ＮＴＣＴと表記；配列番号６８）及びＣＴに融合したＡＢＤドメイン（Ｈｉｓ６−ＡＢＤ−ＣＴと表記；配列番号７０）からそれぞれなる融合タンパク質から、例えば、繊維及び薄膜などの構造体を生成し、及びＡＢＤドメインのアルブミン結合能力、並びにＮＴＣＴ及びＣＴの構造形成特性をなお保持することが可能であるかどうかを探索することであった。そのために、ＮＴＣＴ及びＣＴのＮ末端に融合したＡＢＤドメインからなる２つの融合タンパク質がクローニングされた。
【０１６６】
クローニング
Ｈｉｓ６−ＡＢＤ−ＣＴ融合タンパク質（配列番号７０）をコードする遺伝子（配列番号６９）は以下のように構築した。プライマーは、そのようなＡＢＤ配列を含むベクターからドメインＡＢＤのＰＣＲ断片を生成するために設計された。また、プライマーは、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩの認識部位を含有していた。得られたＰＣＲ生成物は、その後、標的ベクター（カナマイシン耐性遺伝子を有するｐＡｆｆ８Ｈｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６ＣＴを示す）のように、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで処理した。ターゲットベクターの制限切断に際し、Ｈｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６部分が切断された。切断されたＰＣＲ断片と目標ベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて互いに連結し、そして、得られた正しく連結されたベクター（ｐＴ７Ｈｉｓ６−ＡＢＤ−ＣＴ）は、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充した寒天プレート上に増殖させたケモコンピテント(chemocompetent)大腸菌(E. coli) ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換された。コロニーをその後採取し、正しい挿入のためにスクリーニングし、続いて、標的ベクター中にＡＢＤが挿入されたＤＮＡ配列を確認するために配列決定した。
【０１６７】
Ｈｉｓ６−ＡＢＤ−ＮＴＣＴ融合タンパク質（配列番号６８）をコードする遺伝子（配列番号６７）のクローニングは、Ｈｉｓ６−ＡＢＤ−ＣＴについて説明されるのと同様に構築されたが、標的ベクターは、ｐＴ７Ｈｉｓ６ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴと示され、ｐＴ７Ｈｉｓ６ｓｃＦｖ１部分はＮｄｅＩとＥｃｏＲＩでの処理により切断された。正確に連結されたベクターは、ｐＴ７Ｈｉｓ６ＡＢＤ−ＮＴＣＴと示される。
【０１６８】
産生
ｐＴ７Ｈｉｓ６−ＡＢＤ−ＣＴベクターを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したルリア−ベルターニ（Luria-Bertani）培地（全３リットル）で、３０℃で１−１．５のＯＤ６００値まで増殖させ、次に、３００μＭのＩＰＴＧでｐＴ７Ｈｉｓ６−ＡＢＤ−ＣＴの発現を誘導し、約１７時間、１４℃でさらにインキュベートした。次に、細胞を４７００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により回収し、得られた細胞ペレットを、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に溶解した。
【０１６９】
Ｈｉｓ６ＡＢＤ−ＮＴＣＴの産生は、Ｈｉｓ６ＡＢＤ−ＣＴについて記載したのと同様に行われた。
【０１７０】
精製
２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）中に溶解した細胞ペレットは、細菌細胞を溶解するために、リゾチーム及びＤＮアーゼＩを補充され、その後、ＮａＣｌとイミダゾールをそれぞれ２００ｍＭ及び１０ｍＭの最終濃度まで添加した。３０分間の遠心分離（１５０００ｒｐｍ）後、細胞溶解物を回収した。次に、回収した細胞溶解物をキレートセファロースファストフローＺＮ２＋カラムにロードし、Ｈｉｓ６タグを介してＨｉｓ６−ＡＢＤ−ＣＴタンパク質がマトリックスに結合するように保った。洗浄後、結合したタンパク質を２０ｍＭのトリス／２００ｍＭのイミダゾール（ｐＨ８．０）／３００ｍＭのＮａＣｌで溶出した。溶出物は、Ａ２８０の測定によると２８．８ｍｇのＨｉｓ６−ＡＢＤ−ＣＴタンパク質を含んでいた。次に、溶出したタンパク質を、一晩、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）を３リットルに対して透析し、その後、１．４８ｍｇ／ｍｌに濃縮し、６．２１６ｍｇのＨｉｓ６−ＡＢＤ−ＣＴ融合タンパク質の最終量を得た。
【０１７１】
同じ精製手順を、Ｈｉｓ６−ＡＢＤ−ＮＴＣＴについて行った。Ｈｉｓ６−ＡＢＤ−ＮＴＣＴの溶出濃度は１．７６ｍｇ／ｍｌで、融合タンパク質の３５．２ｍｇの最終量を得た。
【０１７２】
薄膜及び繊維の形成
Ｈｉｓ６−ＡＢＤ−ＣＴの薄膜は、薄膜あたり１ｍｇ／ｍｌの可溶性融合タンパク質の１５μｌから、９６ウェルプレート（組織培養プレート、浮遊細胞、８３．１８３５．５００、ザルスタット）中で成型された。次いで、薄膜を一晩凝固させた（２０℃、３５％相対湿度）。１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液の１５μｌからＨｉｓ６−ＡＢＤ−ＮＴＣＴの薄膜を成型するために同じ手順が続けられた。
【０１７３】
繊維はまた、Ｈｉｓ６ＡＢＤ−ＣＴ及びＨｉｓ６ＡＢＤ−ＮＴＣＴの両方に関して、可溶性融合タンパク質の１．７６及び１．０６ｍｇ／ｍｌからそれぞれ作られた。図３ａは、Ｈｉｓ６−ＡＢＤ−ＮＴＣＴ融合タンパク質（配列番号６８）の顕微鏡繊維写真を示し、図３ｂは、Ｈｉｓ６−ＡＢＤ−ＣＴ融合タンパク質（配列番号７０）の顕微鏡繊維写真を示す。ＣＴ又はＮＴＣＴは別のタンパク質、即ち４６アミノ酸長のＡＢＤドメインに融合されているが、Ｈｉｓ６ＡＢＤ−ＣＴ及びＨｉｓ６ＡＢＤ−ＮＴＣＴの両方の巨視的な繊維を得ることができたという事実は、ＣＴ及びＮＴＣＴはＡＢＤドメインに融合されているにもかかわらず、それらの構造形成特性を保持していることを示している。
【０１７４】
分析
アルブミンに結合するＡＢＤ−ＮＴＣＴの薄膜の能力を評価するために、アルブミンの源としてヒト血漿を使用した。ＡＢＤ−ＮＴＣＴ及びＡＢＤ−ＣＴの４つの薄膜は、１×ＰＢＳの１５０μｌで予め湿らせ、続いて室温で３０分間、ヒト血漿（１：５希釈）の１００μｌでのインキュベーションを行った。２００μｌの１×ＰＢＳで３回洗浄した後、結合したアルブミンを、溶出緩衝液（即ち、０．５Ｍ酢酸、１Ｍ尿素、１００ｍＭのＮａＣｌ）によりｐＨを約２．７まで下げることによって５０μｌで溶出し、その後溶出画分を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＮＴＣＴ及びＣＴの薄膜がコントロール材料として使用され、同じ方法で処理された。
【０１７５】
図４は、ヒト血漿からのアルブミンのＡＢＤ−ＮＴＣＴ薄膜及びＡＢＤ−ＣＴ薄膜への結合後に溶出した画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。ゲルは以下に従ってロードされた：
（１−４）ＡＢＤ−ＮＴＣＴ薄膜の四連、１４μｌロードされた；
（５−８）ＡＢＤ−ＣＴ薄膜の四連、１４μｌロードされた；
（９）タンパク質のラダー；
（１０−１３）ＮＴＣＴ（コントロール）薄膜の四連；
（１４−１６）ＣＴ（コントロール）薄膜の三連；
（１７）ヒト血漿（１：５０）、８μｌロードされた。
【０１７６】
ＡＢＤ−ＮＴＣＴ及びＡＢＤ−ＣＴの全ての薄膜はヒト血漿からのアルブミンに結合している（図４、レーン１−８）。ＡＢＤ−ＮＴＣＴ薄膜及びＡＢＤ−ＣＴ薄膜の溶出画分においては単一のアルブミンのバンド（〜６５ｋＤａ）のみが現れるため、それらはヒト血漿からの他のいかなるものにも非特異的には結合しないように見える。ＮＴＣＴ及びＣＴのコントロール薄膜は、溶出画分で少しもアルブミンを示していない（図４、レーン１０−１６）。このことは、ＡＢＤドメインはＮＴＣＴとＣＴとの融合タンパク質の巨視的固体構造で機能的であると結論される。
【０１７７】
実施例７  Ｍ４−ＮＴＣＴ及びＭ４−ＣＴ融合タンパク質のクローニング、発現及び固体構造の形成
単量体ストレプトアビジン（Ｍ４）ドメインは、ＮＴＣＴ及びＣＴタンパク質との融合でそれぞれ産生された。Ｍ４ドメインは、四量体ストレプトアビジンの変異型バージョンであり、ビオチンに非共有結合する１５９アミノ酸長のタンパク質ドメインである。我々の目標は、ＮＴＣＴに融合したＭ４ドメイン（Ｈｉｓ６−Ｍ４−ＮＴＣＴと表記；配列番号７２）及びＣＴに融合したＭ４ドメイン（Ｈｉｓ６−Ｍ４−ＣＴと表記；配列番号７４）からそれぞれなる融合タンパク質から、例えば、薄膜、発泡体及び繊維などの構造体を生成し、及びＭ４ドメインのビオチン結合能力、並びにＮＴＣＴ及びＣＴの構造形成特性をなお保持することが可能であるかどうかを探索することであった。そのために、ＮＴＣＴ及びＣＴのＮ末端に融合したＭ４ドメインからなる２つの融合タンパク質がクローニングされた。
【０１７８】
クローニング
Ｈｉｓ６−Ｍ４−ＣＴ融合タンパク質（配列番号７４）をコードする遺伝子（配列番号７３）が実施例６に記載されるように構築されたが、プライマーは、Ｍ４配列などを含むベクターからドメインＭ４のＰＣＲ断片を生成するために設計された。標的ベクターは、ｐＡｆｆ８Ｈｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６ＣＴと記され、Ｈｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６部分はＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩによる処理により切断された。正確に連結されたベクターは、ｐＴ７Ｈｉｓ６Ｍ４−ＣＴと示される。
【０１７９】
Ｈｉｓ６−Ｍ４−ＮＴＣＴ融合タンパク質（配列番号７２）をコードする遺伝子（配列番号７１）のクローニングは、Ｈｉｓ６−Ｍ４−ＣＴについて説明されるのと同様に構築されたが、標的ベクターは、ｐＴ７Ｈｉｓ６ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴと示され、ｐＴ７Ｈｉｓ６ｓｃＦｖ１部分はＮｄｅＩとＥｃｏＲＩでの処理により切断された。正確に連結されたベクターは、ｐＴ７Ｈｉｓ６Ｍ４−ＮＴＣＴと示される。
【０１８０】
産生
Ｈｉｓ６Ｍ４−ＣＴ及びＨｉｓ６Ｍ４−ＮＴＣＴの産生は、実施例６に記載したのと同様に行われた。
【０１８１】
精製
Ｈｉｓ６Ｍ４−ＣＴ及びＨｉｓ６Ｍ４−ＮＴＣＴの精製は、実施例６に記載したのと同様に行われた。
【０１８２】
溶出物は、３．６ｍｇのＨｉｓ６Ｍ４−ＣＴタンパク質を含んでいた。タンパク質の濃度が１．３９ｍｇ／ｍｌに到達後、０．８３４ｍｇのＨｉｓ６Ｍ４−ＣＴ融合タンパク質の最終量が得られた。
【０１８３】
Ｈｉｓ６Ｍ４−ＮＴＣＴの溶出物含量は３．２ｍｇであった。タンパク質の濃度が１．１４ｍｇ／ｍｌに到達後、１．３６８ｍｇのＨｉｓ６Ｍ４−ＮＴＣＴ融合タンパク質の最終量が得られた。
【０１８４】
薄膜、発泡体及び繊維の形成
Ｈｉｓ６Ｍ４−ＣＴ及びＨｉｓ６Ｍ４−ＮＴＣＴの薄膜は、実施例６に記載したように成型された。繊維は、可溶性融合タンパク質の１．１４ｍｇ／ｍｌからＨｉｓ６−Ｍ４−ＮＴＣＴで作られた（図５ａ）。発泡体は、１．３９ｍｇ／ｍｌの可溶性融合タンパク質の３０μｌからＨｉｓ６−Ｍ４−ＣＴで作られた（図５ｂ）。ＮＴＣＴ又はＣＴは別のタンパク質、即ち１５９アミノ酸長のＭ４ドメインに融合されているが、Ｈｉｓ６−Ｍ４−ＮＴＣＴ及びＨｉｓ６−Ｍ４−ＣＴの薄膜、繊維、及び発泡体を得ることができたという事実は、ＮＴＣＴ及びＣＴはＭ４ドメインに融合されているにもかかわらず、それらの構造形成特性を保持していることを示している。
【０１８５】
分析
スポットされたＨｉｓ６−Ｍ４−ＮＴＣＴ及びＨｉｓ６−Ｍ４−ＣＴの薄膜は、標的タンパク質分子をそれぞれ０．３４ナノモル及び０．５ナノモル含有する。２つの糸が融合したＭ４構築物のビオチン結合能を評価するために、各構築物において２つの薄膜を選択し、Ａｔｔｏ−５６５ビオチンの等量でインキュベートすることにより、薄膜中に存在する標的タンパク質分子の量と比較して分析した。その後、標識されたビオチンを除去し、薄膜を１×ＰＢＳ１００μｌで３回洗浄した。最終的に、１００μｌの１×ＰＢＳが薄膜に添加され、その後倒立ニコンエクリプスＴｉ機器（５６３ｎｍで励起、５９２ｎｍで発光）を用いて蛍光顕微鏡分析を行った。ＮＴＣＴ（０．５５ナノモル）及びＣＴ（１．２８ナノモル）の薄膜がコントロール材料として使用され、同じ方法で処理された。
【０１８６】
Ｍ４−ＮＴＣＴ及びＭ４−ＣＴの薄膜は、ビオチンに結合する固有の親和性を有する単量体ストレプトアビジン（Ｍ４）を含む。標識されたビオチンが分析に使用されるため、薄膜へのビオチンの結合は、上記で示した波長で蛍光顕微鏡によって検出することができた。図６は、Ｍ４−ＮＴＣＴ膜及びＭ４−ＣＴ膜に結合したＡｔｔｏ−５６５ビオチンの、検出のための２倍の倍率の蛍光顕微鏡写真を示す。Ａ：Ｍ４−ＮＴＣＴ；Ｂ：ＮＴＣＴ；Ｃ：Ｍ４−ＣＴ及びＤ：ＣＴ。図６（Ａ、Ｃ）において、蛍光はＭ４−ＮＴＣＴ及びＭ４−ＣＴの薄膜からのみ見ることができるが、コントロールの薄膜（Ｂ、Ｄ）からは見えない。このことは、Ｍ４のビオチン結合能はＮＴＣＴとＣＴに融合されているにもかかわらず保持されていることを確認する。
【０１８７】
実施例８  ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴ及びｓｃＦｖ１−ＣＴ融合タンパク質のクローニング、発現及び固体構造の形成
ＮＴＣＴ及びＣＴは、単一鎖断片変異体（ｓｃＦｖ１）と命名される操作された抗体断片との融合体として産生された。ｓｃＦｖ１は、自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に特異的な抗原を認識する、２７ｋＤａの一価、操作された抗体断片である。我々の目標は、ＮＴＣＴに融合したｓｃＦｖ１タンパク質ドメイン（Ｈｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴと表記；配列番号７６）及びＣＴに融合したｓｃＦｖ１タンパク質ドメイン（Ｈｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＣＴと表記；配列番号７８）からそれぞれなる融合タンパク質から、例えば、繊維、発泡体及び薄膜などの構造体を生成し、及びｓｃＦｖ１タンパク質ドメインの抗原結合能力、並びにＮＴＣＴ及びＣＴの構造形成特性をなお保持することが可能であるかどうかを探索することであった。そのために、ＮＴＣＴ及びＣＴのＮ末端に融合したｓｃＦｖ１ドメインからなる２つの融合タンパク質がクローニングされた。
【０１８８】
クローニング
Ｈｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＣＴ融合タンパク質（配列番号７８）をコードする遺伝子（配列番号７７）が実施例６に記載されるように構築されたが、プライマーは、ｓｃＦｖ１配列などを含むベクターからドメインｓｃＦｖ１のＰＣＲ断片を生成するために設計された。標的ベクターは、ｐＡｆｆ８Ｈｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６ＣＴと記され、Ｈｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６部分はＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩによる処理により切断された。正確に連結されたベクターは、ｐＴ７Ｈｉｓ６ｓｃＦｖ１−ＣＴと示される。
【０１８９】
Ｈｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴ融合タンパク質（配列番号７６）をコードする遺伝子（配列番号７５）のクローニングはＨｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＣＴのために記載されているのと同様に構築されたが、ＮＴＣＴの増幅に用いたプライマーは、制限エンドヌクレアーゼのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの部位を含んでおり、ここでの標的ベクターはＴ７Ｈｉｓ６ｓｃＦｖ１−ＲｅｐＣＴで示され、このＲｅｐＣＴ部分はＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩでの処理により切断された。正確に連結されたベクターは、ｐＴ７Ｈｉｓ６ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴと示される。
【０１９０】
産生
Ｈｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＣＴ及びＨｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴの産生は、ｐＴ７Ｈｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴの産生が、６リットルの培養培地の総容量で行ったことを除いて、実施例６に記載したのと同様に行われた。
【０１９１】
精製
Ｈｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＣＴ及びｐＨｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴの精製は、実施例６に記載したのと同様に行われた。
【０１９２】
溶出物は、０．９３ｍｇのＨｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＣＴタンパク質を含んでいた。タンパク質の濃度が０．８７ｍｇ／ｍｌに到達後、０．３４８ｍｇのＨｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＣＴ融合タンパク質の最終量が得られた。
Ｈｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴの溶出物含量は４．８６ｍｇであった。タンパク質の濃度が２．１４ｍｇ／ｍｌに到達後、２．５７ｍｇのＨｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴ融合タンパク質の最終量が得られた。
【０１９３】
薄膜、発泡体及び繊維の形成
Ｈｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＣＴの薄膜は、薄膜あたり５μＭの可溶性融合タンパク質の１μｌからマイクロアレイスライド（プラスチックＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）上にスポットされた。次いで、温度と湿度が調節された部屋で、薄膜を一晩凝固させた。５μＭのタンパク質溶液の１μｌからＨｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴの薄膜を成型するために同じ手順が続けられた。
【０１９４】
繊維は、可溶性融合タンパク質の０．４９ｍｇ／ｍｌからＨｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴで作成され（データ非表示）、及び発泡体は、可溶性融合タンパク質の０．２２ｍｇ／ｍｌ及び０．３８ｍｇ／ｍｌの３０μｌからそれぞれＨｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴ及びＨｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＣＴの両方で作成された（図７ａ及び７ｂ）。ＮＴＣＴ又はＣＴは別のタンパク質、即ち２６３アミノ酸長のｓｃＦｖ１ドメインに融合されているが、Ｈｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴ及びＨｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＣＴの巨視的な繊維及び発泡体を得ることができたという事実は、ＮＴＣＴ及びＣＴはｓｃＦｖ１ドメインに融合されているにもかかわらず、そこで構造形成特性をなお保持していることを示している。
【０１９５】
分析
純粋な抗体（ｓｃＦｖ１、コントロール）及び糸が融合した抗体（ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴ）は、透明及び黒のポリマーマキシソープマイクロアレイスライド（ＮＵＮＣ、２５ｘ７６ｍｍ）上に５μＭのタンパク質溶液の１μＬを手動で添加することでマイクロアレイ形式にスポットされ、１３５ピコモルの純粋な抗体（ｓｃＦｖ１）及が２７４ピコモルの融合した抗体（ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴ）をそのスポットされた薄膜中に得た。薄膜形態中にタンパク質をスポットした後、薄膜を、温度と湿度が調節された部屋で一晩乾燥させた。次いで、アレイは、２００μｌのサンプルバッファー（ＰＢＳ中に１％（ｗ／ｖ）の無脂肪粉乳及び１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を含む）を９０分間適用することによりブロックし、その後、２００〜３００μｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中に０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を含む）を適用することによって３回洗浄した。全てのインキュベーションは、室温で穏やかに撹拌して行った。次に、１００−２００μｌのサンプルバッファー中で希釈されたビオチン化抗原サンプル（１０ｎＭ）が適用され、１時間インキュベートした。アレイは、その後、２００〜３００μｌの洗浄緩衝液を適用することによって３回洗浄し、結合した抗原を検出するために、試料緩衝液中に希釈されたアレクサ６４７標識ストレプトアビジン（１μｇ／ｍｌ）の１００〜２００μｌを、アレイ上に適用し、１時間インキュベートした。最後に、アレイを２００〜３００μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、窒素気流下で乾燥した。アレイは、共焦点マイクロアレイ蛍光スキャナー（ScanArray Express, Perkin-Elmer Life & Analytical Sciences)を用いてスキャンした。スキャンアレイエクスプレス(ScanArray Express)ソフトウェアＶ２．０（Perkin-Elmer Life & Analytical Sciences）を用いて各スポットの強度を定量した。同じ分析手順を、Ｈｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＣＴ融合タンパク質を分析するために行った。
【０１９６】
潜在的なバイオマーカーとなり得る低含量の血清タンパク質を検出するために、ｓｃＦｖ１はＮＴＣＴ又はＣＴのＮ末端に融合され、それぞれ、Ｈｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴ及びＨｉｓ６−ｓｃＦｖ１−Ｃを生じさせた。純粋な抗体（コントロール）及び糸融合型抗体断片をマイクロアレイスライド上にスポットし、それらの抗原結合能力をビオチン化抗原サンプルを用いて分析した。次いで、アレクサ６４７標識ストレプトアビジンが結合した抗原を検出するために使用された。図８は、純粋な（コントロール）糸融合型抗体断片の抗原結合解析を示す。スポットの強度は、５０９０検出強度で測定した。分析では、糸融合型抗体（Ｈｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴ）断片の抗原認識は、ｓｃＦｖ１コントロール単独と比較して２５倍に増加し、他の抗原との交差反応の兆候はＨｉｓ６−ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴにおいては認められないことを示した。
【０１９７】
実施例９  キシラナーゼ−ＮＴＣＴ及びキシラナーゼ−ＣＴ融合タンパク質のクローニング、発現及び固体構造の形成
酵素活性を有するタンパク質をＮＴＣＴ及びＣＴと融合させる概念を証明するために、枯草菌由来の酵素のキシラナーゼＡはＮＴＣＴ及びＣＴのそれぞれとの融合体で産生された。キシラナーゼＡ（エンド−１，４−β−キシラナーゼＡ）は１８５アミノ酸長であり（シグナルペプチドなし）、グリコシルヒドロラーゼ１１（セルロースＧ）ファミリーに属する。キシラナーゼＡの酵素機能は、植物細胞壁中のヘミセルロースの主要成分であるキシランのβ−１，４グリコシド結合を切断することである。我々の目標は、ＮＴＣＴに融合したキシラナーゼＡ（Ｘｙｌ−ＮＴＣＴと表記；配列番号８０）及びＣＴに融合したキシラナーゼＡ（Ｘｙｌ−ＣＴと表記；配列番号８２）からそれぞれなる融合タンパク質から、例えば、繊維、発泡体及び薄膜などの構造体を生成し、及びキシラナーゼの酵素活性、並びにＣＴの構造形成特性をなお保持することが可能であるかどうかを探索することであった。そうするために、１）ＮＴＣＴ及び２）ＣＴのＮ末端側のキシラナーゼからなる２つの融合タンパク質がクローニングされた。
【０１９８】
クローニング
Ｈｉｓ６Ｘｙｌ−ＣＴ融合タンパク質（配列番号８２）をコードする遺伝子（配列番号８１）が実施例６に記載されるように構築されたが、プライマーは、キシラナーゼ配列などを含むベクターからキシラナーゼドメインのＰＣＲ断片を生成するために設計された。標的ベクターは、ｐＡｆｆ８Ｈｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６ＣＴと記され、Ｈｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６部分はＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩによる処理により切断された。正確に連結されたベクターは、ｐＴ７Ｈｉｓ６Ｘｙｌ−ＣＴと示される。
【０１９９】
Ｈｉｓ６Ｘｙｌ−ＮＴＣＴ融合タンパク質（配列番号８０）をコードする遺伝子（配列番号７９）のクローニングは、Ｈｉｓ６Ｘｙｌ−ＣＴについて説明されるのと同様に構築されたが、標的ベクターは、ｐＴ７Ｈｉｓ６ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴと示され、ｐＴ７Ｈｉｓ６ｓｃＦｖ１部分はＮｄｅＩとＥｃｏＲＩでの処理により切断された。正確に連結されたベクターは、ｐＴ７Ｈｉｓ６Ｘｙｌ−ＮＴＣＴと示される。
【０２００】
産生
Ｈｉｓ６Ｘｙｌ−ＣＴ及びＨｉｓ６Ｘｙｌ−ＮＴＣＴの産生は、実施例６に記載したのと同様に行われた。
【０２０１】
精製
Ｈｉｓ６Ｘｙｌ−ＣＴ及びＨｉｓ６Ｘｙｌ−ＮＴＣＴの精製は、実施例６に記載したのと同様に行われた。
【０２０２】
溶出物は、３．６ｍｇのＨｉｓ６Ｘｙｌ−ＣＴタンパク質を含んでいた。タンパク質の濃度が２．１ｍｇ／ｍｌに到達後、２ｍｇのＨｉｓ６Ｘｙｌ−ＣＴ融合タンパク質の最終量が得られた。
【０２０３】
Ｈｉｓ６Ｘｙｌ−ＮＴＣＴタンパク質の溶出物含量は４．３ｍｇであった。タンパク質の濃度が０．６５ｍｇ／ｍｌに到達後、０．３ｍｇのＨｉｓ６Ｘｙｌ−ＮＴＣＴ融合タンパク質の最終量が得られた。
【０２０４】
薄膜、発泡体及び繊維の形成
Ｈｉｓ６Ｘｙｌ−ＣＴの薄膜は９６ウェルプレート（組織培養プレート、浮遊細胞、８３．１８３５．５００、ザルスタット）中で成型された。各薄膜は、１．０ｍｇ／ｍｌの可溶性のＨｉｓ６Ｘｙｌ−ＣＴの１５μｌから、ｐＨ８とｐＨ６の両方で作成された。次いで、薄膜を一晩凝固させた（２０℃、３５％相対湿度）。同じ手順がＨｉｓ６Ｘｙｌ−ＮＴＣＴの薄膜の成型のために行われ、各薄膜は０．４１ｍｇ／ｍｌの可溶性Ｈｉｓ６Ｘｙｌ−ＮＴＣＴの１５μｌから（ｐＨ８とｐＨ６の両方で）成型された。
【０２０５】
発泡体は、可溶性Ｈｉｓ６Ｘｙｌ−ＣＴ（１−２ｍｇ／ｍｌ）から、タンパク質溶液４０μｌに（ピペッティングすることによって）空気を導入することにより作成され、室温で一晩乾燥した。Ｈｉｓ６Ｘｙｌ−ＣＴの成型された発泡体（図９）の出現は、ＣＴはＸｙｌドメインに融合されているにもかかわらず、その構造形成特性を保持していることを示している。
【０２０６】
図９は、可溶性融合タンパク質から作られた、融合タンパク質Ｈｉｓ６Ｘｙｌ−ＣＴ（配列番号８２）の巨視的な発泡体を示している。発泡体の出現は、クモ糸のＣＴドメインは、酵素キシラナーゼ（Ｘｙｌ）との融合で生産されたにもかかわらず、その構造形成特性を保持していることを示している。
【０２０７】
ＮＴＣＴ又はＣＴに融合したキシラナーゼの酵素活性の分析
キシラナーゼは、２つのキシロース残基の間のβ−１，４グリコシド結合を切断する酵素である。ＮＴＣＴ又はＣＴに融合したキシラナーゼ（Ｘｙｌ）の酵素の能力を試験するため、Ｈｉｓ６Ｘｙｌ−ＣＴ及びＨｉｓ６Ｘｙｌ−ＮＴＣＴの各薄膜は、９０μｌのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ６．０）によりインキュベートする。全ての薄膜について５０℃で１０分間のプレインキュベーション後、４０ｍＭのＰＮＸ（ｐ−ニトロフェニルキシロピラノシド）基質１０μｌが添加され、少なくとも１０分間、５０℃でさらにインキュベートした。次いで、停止溶液（０．５ＭのＮａ２ＣＯ３）１００μｌが各薄膜に添加され、酵素反応からの生成物を同定するために４１０ｎｍで吸光度測定を行った。前述したのと同じ手順により成型されたＮＴＣＴ及びＣＴの薄膜がコントロールとしてインキュベートされた。
【０２０８】
実施例１０  キシラナーゼ−ＮＴＣＴ及びキシラナーゼ−ＣＴ融合タンパク質のクローニング、発現及び固体構造の形成
細胞刺激作用を有するペプチドをＮＴＣＴ及びＣＴと融合させる概念を証明するために、ヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）がＮＴＣＴ及びＣＴのそれぞれとの融合体で産生された。ＥＧＦは、多くの細胞型、例えばケラチノサイトの細胞表面に見られる上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して高い親和性を有する５３アミノ酸残基長の成長因子である。ＥＧＦＲに結合すると、タンパク質−チロシンキナーゼ活性が刺激され、細胞内で様々な生化学的変化を生じ、細胞成長及び増殖を誘発する。我々の目標は、ＮＴＣＴに融合したＥＧＦ（ＥＧＦ−ＮＴＣＴと表記；配列番号８４）及びＣＴに融合したＥＧＦ（ＥＧＦ−ＣＴと表記；配列番号８６）からそれぞれなる融合タンパク質から、例えば、繊維及び薄膜などの構造体を生成し、及びＥＧＦの細胞刺激作用、並びにＣＴの構造形成特性をなお保持することが可能であるかどうかを探索することであった。そうするために、１）ＮＴＣＴ及び２）ＣＴのＮ末端側のＥＧＦからなる２つの融合タンパク質がクローニングされた。
【０２０９】
クローニング
Ｈｉｓ６ＥＧＦ−ＣＴ（配列番号８６）融合タンパク質をコードする遺伝子（配列番号８５）が実施例６に記載されるように構築されたが、プライマーは、ＥＧＦ配列などを含むベクターからＥＧＦのＰＣＲ断片を生成するために設計された。標的ベクターは、ｐＡｆｆ８Ｈｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６ＣＴと記され、Ｈｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６部分はＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩによる処理により切断された。正確に連結されたベクターは、ｐＴ７Ｈｉｓ６ＥＧＦ−ＣＴと示される。
【０２１０】
Ｈｉｓ６−Ｍ４−ＮＴＣＴ融合タンパク質（配列番号８４）をコードする遺伝子（配列番号８３）のクローニングは、Ｈｉｓ６ＥＧＦ−ＣＴについて説明されるのと同様に構築されたが、標的ベクターはここではｐＴ７Ｈｉｓ６ｓｃＦｖ１−ＮＴＣＴと示され、ｐＴ７Ｈｉｓ６ｓｃＦｖ１部分はＮｄｅＩとＥｃｏＲＩでの処理により切断された。正確に連結されたベクターは、ｐＴ７Ｈｉｓ６ＥＧＦ−ＮＴＣＴと示される。
【０２１１】
産生
Ｈｉｓ６ＥＧＦ−ＣＴ及びＨｉｓ６ＥＧＦ−ＮＴＣＴの産生は、実施例６に記載したのと同様に行われた。
【０２１２】
精製
Ｈｉｓ６ＥＧＦ−ＣＴ及びＨｉｓ６ＥＧＦ−ＮＴＣＴの精製は、実施例６に記載したのと同様に行われた。
【０２１３】
薄膜及び繊維の形成
薄膜及び繊維は、Ｈｉｓ６ＥＧＦ−ＣＴ及びＨｉｓ６ＥＧＦ−ＮＴＣＴの両方から、実施例６に記載したように作成される。
【０２１４】
ＮＴＣＴ又はＣＴに融合したＥＧＦの細胞刺激能力の分析
ＣＴに融合した場合（Ｈｉｓ６ＥＧＦ−ＣＴと表記）又はＮＴＣＴに融合した場合（Ｈｉｓ６ＥＧＦ−ＮＴＣＴと表記）、ＥＧＦのケラチノサイトに対する細胞刺激能力が調べられた。この目的のために、融合タンパク質Ｈｉｓ６ＥＧＦ−ＣＴ及びＨｉｓ６ＥＧＦ−ＮＴＣＴの薄膜がそれぞれ使用される。正常ヒト表皮ケラチノサイト（初代細胞）は、細胞培養培地（ＫＧＭ−ＧＯＬＤ、Ｌｏｎｚａ）中に３５００又は７０００細胞／ｃｍ２の密度でマトリックス上に組換えヒトＥＧＦ含み又は含まずに播種される。培地は一日おきに交換される。生存細胞及び死細胞を、２４、４８、７２及び９６時間後に生／死アッセイ（Molecular Probes）で染色する。顕微鏡写真は１０倍の倍率で倒立蛍光顕微鏡（ニコンエクリプスＴｉ）の中で行われる。
【図１−１】
0006412866.tif 000009
【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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