(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる（ポリ）ペプチドに連結された水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）をコードする核酸配列を含むか又はからなる核酸分子であって、
前記核酸配列は、５’から３’の方向に、
（ｉ）小胞体（ＥＲ）シグナル配列をコードする第１の配列セグメント；
（ii）細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる前記の（ポリ）ペプチドをコードする第２の配列セグメント；
（iii）リンカーをコードする第３の配列セグメント；及び
（iv）前記のＶＳＶ−Ｇをコードする第４の配列セグメント
を含む、核酸分子によってコードされる細胞膜結合ドメインを含む及び／又はからなる（ポリ）ペプチドに連結されたＶＳＶ−Ｇ；及び
（ｂ）細胞膜結合ドメインを含む及び／又はからなる（ポリ）ペプチドに連結されていないＶＳＶ−Ｇ
で偽型化されたレンチウイルスベクター粒子。
【請求項２】
前記の第２の配列セグメントでコードされる細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる前記の（ポリ）ペプチドが、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ抗体フラグメント、ＶＮＡＲ一本鎖抗体及びタンパク質足場からなる群から選択される、請求項１に記載のレンチウイルスベクター粒子。
【請求項３】
細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる前記の（ポリ）ペプチドが、糖脂質、リン脂質、オリゴ糖、Ｇタンパク質共役細胞受容体（ＧＰＣＲ）、分化のクラスター（ＣＤ）細胞表面タンパク質、細胞表面受容体、細胞表面共受容体及びタンパク質からなる群から選択される１つ又はそれ以上の細胞膜成分に特異的に結合する、請求項１又は２に記載のレンチウイルスベクター粒子。
【請求項４】
（ａ）前記ＥＲシグナル配列をコードする前記第１の配列セグメントが、配列番号１に示される核酸配列を含むか又はからなり；
（ｂ）リンカーをコードする前記第３の配列セグメントが、配列番号３に示される核酸配列を含むか又はからなり；及び／又は
（ｃ）前記ＶＳＶ−Ｇをコードする前記第４の配列セグメントが、配列番号５に示される核酸配列を含むか又はからなる、
請求項１〜３のいずれかに記載のレンチウイルスベクター粒子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子を製造する方法であって、
前記方法は、宿主細胞に
（ｉ）ウイルス粒子タンパク質をコードする１つ又はそれ以上のパッケージングプラスミド；
（ii）請求項１〜４のいずれかに定義された核酸分子を含むベクター；及び
（iii）細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる（ポリ）ペプチドに連結されていないＶＳＶ−Ｇをコードする核酸分子を含むベクター
をトランスフェクトすることを含む方法。
【請求項６】
細胞に形質導入する方法であって、
前記方法は、形質導入に適した条件下、形質導入される細胞を請求項１〜４のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子と接触させて、前記細胞に形質導入する工程を含む方法。
【請求項７】
前記細胞を、アジュバントと接触させることをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞を、１２．８ｋＤａ〜約１５ｋＤａの分子量を有するポロキサマーと接触させることをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
標的細胞の前記アジュバントとの接触の前に、接触と同時に、又は接触の後に、偽型レンチウイルスベクター粒子を前記細胞とスピノキュレーションさせる工程をさらに含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
形質導入される細胞が、腫瘍細胞、リンパ系細胞、上皮細胞、神経細胞及び幹細胞からなる群から選択される、請求項６〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
形質導入される細胞が、異種細胞集団の一部である、請求項６〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）請求項１〜４のいずれかに定義された核酸分子、及び細胞膜結合ドメインを含む若しくはからなる（ポリ）ペプチドに連結されていないＶＳＶ−Ｇをコードする核酸配列を含む若しくはからなる核酸分子；
並びに／又は
（ｂ）請求項１〜４のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子
を含むキット。
【請求項１３】
（ａ）請求項１〜４のいずれかに定義された核酸分子、及び細胞膜結合ドメインを含む若しくはからなる（ポリ）ペプチドに連結されていないＶＳＶ−Ｇをコードする核酸配列を含む若しくはからなる核酸分子；
並びに／又は
（ｂ）請求項１〜４のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子；
並びに、使用説明書
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる（ポリ）ペプチドに連結された水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）をコードする核酸配列を含むか又はからなる核酸分子であって、前記核酸配列は、５’から３’の方向に、（ａ）小胞体（endoplasmic reticulum：ＥＲ）シグナル配列をコードする第１の配列セグメント；（ｂ）細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる前記の（ポリ）ペプチドをコードする第２の配列セグメント；（ｃ）リンカーをコードする第３の配列セグメント；及び（ｄ）前記のＶＳＶ−Ｇをコードする第４の配列セグメントを含む、核酸分子に関する。さらに、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクター、前記ベクター又は前記核酸分子を含む宿主細胞、前記核酸分子によってコードされるポリペプチド、及び前記核酸分子によってコードされるポリペプチドを製造する方法に関する。加えて、本発明は、偽型レンチウイルスベクター粒子、細胞に形質導入する方法、並びに本発明の前記の核酸分子、ベクター、ポリペプチド及び宿主細胞の様々な組み合わせを含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書には、特許出願及び製造メーカーのマニュアルを含む多数の文献が引用されている。これらの文献の開示は、本発明の特許性に関連しないと考えているが、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。より具体的には、各々個々の文献が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、すべての参照される文献が参照により組み込まれる。
【０００３】
レンチウイルス発現ベクターは、安定した遺伝子発現を提供し、研究及び遺伝子治療の適用のための重要なツールとなっている。それらによって、広範囲の分裂胞及び非分裂の標的細胞のゲノムに、目的の遺伝子を組み込むことを可能にする［１］。ガンマレトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターは、いくつかの遺伝子治療臨床試験で成功して使用されている。重症複合免疫不全症状（ＳＣＩＤ）の遺伝子治療、及びキメラＴ細胞受容体の転写のための腫瘍治療について報告された最近の成功［２〜５］に伴って、安全性プロファイルが高められた第３世代の自己不活性化レンチウイルスの臨床応用の件数が増加すると予想されている。
【０００４】
レンチウイルスベクターは、遍在的に発現されるＬＤＬ受容体に結合する水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）でしばしば偽型化される［６］。ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスベクターは優れた機械的安定性を有し、それによってスピノキュレーション及び高力価のベクターストックの製造が可能となる［７］。ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、シグナル配列（ＳＳ）によって小胞体に向けられ、その小胞体でグリコシル化されて三量体が生成され、続いてその三量体は細胞膜に組み込まれる。ＶＳＶ−Ｇのタンパク質構造の変化によって、一般的に不適切なプロセシングや不安定なレンチウイルスが導かれる［８］。細胞の形質導入方法が進歩したにも関わらず、例えば初代Ｔ細胞及びリンパ腫細胞を含むリンパ系細胞、いくつかの上皮細胞株等のいくつかの細胞型で、低い形質導入率が報告されている［４，９］。この低い形質導入率は、それによって高い感染多重度（multiplicity of infection：ＭＯＩ）を用いる必要が生じるとの欠点がある。接触時間及びレンチウイルスの取り込み率を高めるために、特異的抗原結合のためのレンチウイルスＶＳＶ−Ｇエンベロープの遺伝子改変が報告されている［１０〜１３］。完全な抗体又は抗体フラグメントは、ウイルス膜と細胞膜の間の高親和性コネクターとして機能することができ、それによって形質導入率を増加させる可能性がある。しかし、ｓｃＦｖのＮ末端融合物をＶＳＶ−Ｇに融合させる以前の試みは、［１４］に記載の通り、その形質導入活性を失った欠陥レンチウイルスベクターをもたらした。従って、ＶＳＶ−Ｇに融合されたブドウ球菌プロテインＡ由来のより小さな抗体結合ＺＺドメインでレンチウイルスベクターの表面を改変することを目的とする別のアプローチ［１２］が開発された。このアプローチはインビトロでの成功が示されたにも関わらず、改変レンチウイルスベクターと各々の抗体の２つの試薬が、承認され、臨床グレードで提供され、結合されて活性治療剤を生成させる必要があるため、臨床プロトコールの開発としてあまり有利ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、代替手段及び／又は改善手段を確立する方法並びに細胞の形質導入方法に多くの労力が費やされているという事実があるが、このような方法を提供する必要性が依然として存在する。
この必要性は、請求項で特徴付けられる態様の提供によって対処される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従って、本発明は、細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる（ポリ）ペプチドに連結された水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）をコードする核酸配列を含むか又はからなる核酸分子であって、前記核酸配列は、５’から３’の方向に、（ａ）小胞体（ＥＲ）シグナル配列をコードする第１の配列セグメント；（ｂ）細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる前記の（ポリ）ペプチドをコードする第２の配列セグメント；（ｃ）リンカーをコードする第３の配列セグメント；及び（ｄ）前記のＶＳＶ−Ｇをコードする第４の配列セグメントを含む、核酸分子に関する。
【０００７】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語の１つ又は複数（すなわち、少なくとも１つ）を参照するように本明細書で用いられている。
【０００８】
本発明によれば、本明細書においてポリヌクレオチド又は核酸配列とも呼ばれる核酸分子には、例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ等のＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。本明細書で用いられる用語「ＲＮＡ」は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｒＲＮＡ、並びにＲＮＡウイルスのＲＮＡの場合などのゲノムＲＮＡを含むすべての形態のＲＮＡを含むことが理解される。「ＲＮＡ」を記述する実施態様は、好ましくはｍＲＮＡが挙げられる。さらに、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成若しくは半合成誘導体、混合ポリマー、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方などの当技術分野で知られている核酸模倣分子も含まれる。当業者に容易に理解されるように、核酸分子には、追加の非天然の又は誘導体化されたヌクレオチド塩基が含まれうる。本発明におけるこのような核酸模倣分子又は核酸誘導体には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエート核酸、ホスホルアミデート核酸、２’−Ｏ−メトキシエチルリボ核酸、モルホリノ核酸、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、及びリボース環が２’−酸素と４’−炭素の間でメチレン結合によって束縛されているＲＮＡ誘導体（参照、例えば、Braasch and Corey, Chemistry & Biology, 8, 1-7(2001)）が含まれる。ＰＮＡは、Nielsen et al, Science, 254: 1497(1991)；及び、Egholm et al, Nature 365: 666(1993)に記載されているように、ＤＮＡ又はＲＮＡの糖−リン酸骨格の代わりにアミド骨格を有する合成ＤＮＡ模倣物である。
好ましい実施態様において、少なくともオプション（ａ）〜（ｄ）に具体的に記載された核酸配列はＤＮＡである。さらにより好ましい実施態様において、本発明のすべての核酸分子はＤＮＡである。
【０００９】
本発明の核酸分子は、天然起源のもの、又は合成若しくは半合成起源のものであってもよい。従って、核酸分子は、例えば有機化学の通常のプロトコールに従って合成された核酸分子であってもよい。そのような核酸分子の調製と使用に、当業者は精通している（参照、例えば、Sambrook and Russel "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.(2001)）。
【００１０】
本明細書中で用いられる用語「含む」は、さらなる配列、成分及び／又は方法工程が、具体的に記載された配列、成分及び／又は方法工程に加えて含むことができることを意味する。しかし、この用語はまた、請求項の発明対象が、まさに記載された配列、成分及び／又は方法工程からなることも包含する。
【００１１】
核酸分子が記載の配列（からなるよりもむしろ）を含む実施態様において、その特定の配列上を５’末端若しくは３’末端のいずれか又は両方で付加的なヌクレオチドが延びている。これらの付加的なヌクレオチドは、異種又は同種のものであってよい。同種の配列の場合、これらの配列は、５’末端及び／又は３’末端で１５００個以下のヌクレオチドを含んでいてもよく、５’末端及び／又は３’末端で、例えば１０００個以下のヌクレオチドを、例えば９００個以下のヌクレオチドを、より好ましくは８００個以下のヌクレオチドを、例えば７００個以下のヌクレオチドを、例えば６００個以下のヌクレオチドを、例えば５００個以下のヌクレオチドを、さらにより好ましくは４００個以下のヌクレオチドを、例えば３００個以下のヌクレオチドを、例えば２００個以下のヌクレオチドを、例えば１００個以下のヌクレオチドを、より好ましくは５０個以下のヌクレオチドを、例えば４０個以下のヌクレオチドを、例えば３０個以下のヌクレオチドを、例えば２０個以下のヌクレオチドを、より好ましくは１０個以下のヌクレオチドを、最も好ましくは５個以下のヌクレオチドを含んでいてもよい。本明細書で用いられる用語「・・・個以下のヌクレオチド」とは、それ以下の任意の整数を含むヌクレオチドの数に関し、具体的に記載された数を含む。例えば、用語「５個以下のヌクレオチド」は、１、２、３、４及び５個のヌクレオチドのいずれかをさす。さらに、同種の配列の場合、これらの実施態様には、全ゲノム又は全染色体は含まれない。
付加的な異種の配列は、例えば、本発明のコード配列に作動的に連結された異種のプロモーター、及びさらに当技術分野で周知であり、本明細書により詳細に記載されている調節核酸配列を含んでもよい。
【００１２】
本発明の核酸分子中に含まれ、又は同核酸分子を構成する核酸配列は、細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる（ポリ）ペプチドに連結された水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質をコードする。このように、本核酸配列と、従って本発明の核酸分子は、融合タンパク質をコードする。本明細書では、この融合タンパク質は「本発明の融合タンパク質」とも呼ばれる。
【００１３】
本発明によれば、本核酸分子は、オプション（ａ）〜（ｄ）で規定される少なくとも４つの配列で構成され、ここでこれらの４つの核酸配列の順番は、５’から３’に示せば、すなわち、第１の核酸配列は（ａ）の配列であり、（ｂ）が続き、（ｃ）が続き、同様に（ｄ）が続く。
【００１４】
オプション（ａ）に記載の第１の配列は、小胞体（ＥＲ）シグナル配列をコードする核酸配列である。ＥＲシグナル配列は、新たに合成されたタンパク質のＮ末端に存在する短いペプチド配列である。ｍＲＮＡ翻訳の開始の際、この配列は翻訳されるべき第１の配列であり、新生タンパク質の新たなシグナル配列はシグナル識別粒子（signal recognition particles：ＳＲＰｓ）に結合する。ＳＲＰｓがＥＲシグナル配列に結合することで、翻訳が一時的に中止され、ＳＲＰ−シグナル配列−ｍＲＮＡ−リボソームの複合体がＥＲに移行し、ＳＲＰがＥＲ膜上の受容体（ＲＥＲ）を認識し、結合する。続いて、そのシグナル配列がＲＥＲの中に挿入され、その膜を横断し、その結果、新たなポリペプチド鎖がＥＲ内腔に引き込まれながら翻訳が継続される。
【００１５】
ＥＲシグナル配列の配列モチーフは、当技術分野で周知であり、例えば、LembergとMartoglio、又はSchwartz［４５，４６］に記載されている。従って、当業者は、適切な天然に存在するＥＲシグナル配列を知っているか、又は前記の機能を示し、本発明に用いることができる人工の、すなわち天然に存在しないＥＲシグナル配列を生成できる立場にある。
本発明の核酸分子によってコードされる融合タンパク質を製造するために、好ましくは天然に存在するＥＲシグナル配列が用いられ、より好ましくはウイルス性ＥＲシグナル配列又は細胞系に内在するＥＲシグナル配列が用いられる。ウイルス性ＥＲシグナル配列の場合は、ラブドウイルス科由来であることが好ましく、ベシクロウイルス属に由来することがより好ましい。最も好ましくは、ＥＲシグナル配列は、オプション（ｄ）で用いられるＶＳＶ−ＧのＥＲへの移動を内因的に媒介するＥＲシグナル配列である。
【００１６】
オプション（ｂ）に記載の第２の配列セグメントは、細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる（ポリ）ペプチドをコードする核酸配列である。
【００１７】
本発明に記載の用語「（ポリ）ペプチド」は、ポリペプチド及びペプチドに関する。本明細書で用語「タンパク質」と互換的に用いられる用語「ポリペプチド」は、一本鎖タンパク質又は３０個を超えるアミノ酸を含有するそのフラグメントを含むアミノ酸の直鎖状分子鎖を表し、他方、本明細書で用いられる用語「ペプチド」は、３０個以下のアミノ酸からなる分子群を表す。（ポリ）ペプチドは、少なくとも２つの同一又は異なる分子からなるオリゴマーをさらに形成してもよい。このような多量体の対応する高次構造は、それに相応して、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモトリマー又はヘテロトリマー等と呼ばれる。このような多量体はまた、用語「（ポリ）ペプチド」の定義に含まれる。用語「ポリペプチド」及び「ペプチド」はまた、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、及び当技術分野で周知の同様の改変等によって達成される、天然において改変されたポリペプチド／ペプチドをもさす。
【００１８】
本発明によれば、核酸分子は、「細胞膜結合ドメイン含む又はからなる（ポリ）ペプチド」をコードする。用語「細胞膜」並びに構造及び機能に関連するその科学的な意味は、当技術分野でよく知られており［４７，4８］、それに応じて本発明の文脈の中で用いられる。本発明における用語「細胞膜結合ドメイン」は、直接細胞膜に結合することができる任意のアミノ酸配列であり得る。中間分子を介して細胞膜に間接的にのみ結合する結合ドメインは、明確に除外される。
【００１９】
本発明の融合タンパク質内の細胞膜結合ドメインの機能は、本発明の融合タンパク質を発現するウイルス粒子と前記ウイルス粒子によって形質導入される標的細胞との間のコネクターとして作用することである。従って、目的の標的細胞の細胞膜に結合することが可能な細胞膜結合ドメインを選択すべきであることが理解される。好ましくは、細胞膜結合ドメインは、哺乳動物の標的細胞膜に結合することができる。より好ましくは、細胞膜結合ドメインは、例えば、前駆細胞、疾患細胞、初代細胞株、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、リンパ系細胞、幹細胞又は腫瘍細胞等のヒト標的細胞の細胞膜に結合することができる。
【００２０】
用語「結合」は、本明細書の文脈において、例えば共有結合性又は非共有結合性相互作用を介して、細胞膜と結合するドメインの能力をさす。「共有結合性」相互作用は、原子間の、又は原子と他の共有結合との間の電子対の共有によって特徴付けられる化学結合の形態である。共有結合には、例えばσ結合、π結合、金属−非金属結合、アゴスティック相互作用及び三中心二電子結合等の当技術分野でよく知られている多種類の相互作用が含まれる。「非共有」結合は、電子対の共有を伴わない化学結合である。非共有結合は、タンパク質や核酸等の巨大分子の三次元構造を維持する上で重要であり、そして分子が互いに特異的に、しかし一過的に結合する多くの生物学的プロセスに関与している。水素結合、イオン相互作用、ファンデルワールス相互作用、電荷−電荷結合、電荷−双極子結合、双極子−双極子結合及び疎水結合等のいくつかの種類の非共有結合がある。非共有結合性相互作用には、例えば、細胞膜上の標的結合部位の位置にリガンドを維持するために、いくつかの異なる種類の協働する非共有結合がよく含まれる。相互作用は、細胞膜の表面に何回も生じうる電荷又は双極子等の基を含んで起こりうる。
好ましくは、相互作用（すなわち結合）は、細胞膜の定められた部位（特定の細胞膜成分／エピトープを含む）で起こり、少なくとも１つの相互作用の形成、好ましくはいくつかの特定の相互作用のネットワークの形成を伴って進む。さらにより好ましくは、結合は標的細胞に特異的である。すなわち、結合は、標的細胞の細胞膜で起こり、非標的細胞の細胞膜では起こらず、又は有意には起こらない。
【００２１】
ドメインの構造は、ドメインが細胞膜への結合の機能、好ましくは特異的な結合の機能を具備する限り、限定されるものではない。様々な細胞膜結合ドメインが当技術分野で知られており、抗体及びそのフラグメント、タンパク質足場、並びに、例えばフィブロネクチン由来の（ポリ）ペプチド［４９］及びヘパリン結合活性を有する（ポリ）ペプチド等の細胞結合特性を有するタンパク質ドメインが含まれ、これらに限定されない。
【００２２】
本発明に従って用いられる用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びそれらの結合特異性をなお保持するそれらの誘導体又はフラグメントを含む。抗体フラグメント又は誘導体は、とりわけ、単一ドメイン抗体、ナノボディ、ラクダＶＨＨフラグメント、及び軟骨魚類Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメント由来のＶＮＡＲフラグメント、並びにＦｄ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はｓｃＦｖフラグメントを含む（参照、例えば、Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988；Harlow and Lane “Using Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999）。用語「抗体」は、キメラ抗体（ヒト定常ドメイン、非ヒト可変ドメイン）、一本鎖抗体、及びヒト化抗体（非ヒトＣＤＲｓの例外を有するヒト抗体）等の実施態様も含む。好ましくは、抗体はヒト化抗体である。
【００２３】
抗体の製造のための様々な技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Altshulerら，2010（Altshuler EP, Serebryanaya DV, Katrukha AG, 2010, Biochemistry (Mosc), Vol.75(13), 1584）に記載されている。従って、ポリクローナル抗体は、添加剤及びアジュバントと混合した抗原を用いた免疫後の動物の血液から得ることができ、モノクローナル抗体は、連続細胞系培養により製造される抗体を提供する任意の技術によって製造することができる。この技術の例は、例えば、Harlow EとLane D, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988；Harlow EとLane D, “Using Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999に記載されており、KohlerとMilstein，1975に記載されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（参照、例えば、Kozbor D, 1983, Immunology Today, vol.4, 7; Li J, Sai T, Berger M, Chao Q, Davidson D, Deshmukh G, Drozdowski B, Ebel W, Harley S, Henry M, Jacob S, Kline B, Lazo E, Rotella F, Routhier E, Rudolph K, Sage J, Simon P, Yao J, Zhou Y, Kavuru M, Bonfield T, Thomassen MJ, Sass PM, Nicolaides NC, Grasso L., 2006, PNAS, vol. 103(10), 3557）、及びヒトモノクローナル抗体を製造するＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al, 1985, Alan R. Liss, Inc, 77-96）が含まれる。さらに、組換抗体は、モノクローナル抗体から得ることができ、又はファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、若しくは細胞ディスプレイ等の種々のディスプレイ方法を用いて新規に調製することもできる。組換（ヒト化）抗体の発現のための適切なシステムは、例えば、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物の細胞株、又はトランスジェニック動物若しくは植物から選択することができる（参照、例えば、米国特許6,080,560；Holliger P, Hudson PJ. 2005, Nat Biotechnol., vol. 23(9), 11265）。さらに、一本鎖抗体の製造のために記載された技術（参照、特に、米国特許4,946,778）は、本発明の標的に特異的な一本鎖抗体を製造するために適合させることができる。ＢＩＡｃｏｒｅシステムで用いられている表面プラズモン共鳴を用いることで、ファージ抗体の効率を増加させることができる。好ましくは、抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体又は抗ＣＤ４４抗体からなる群から選択される。より好ましくは、抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体又は抗ＣＤ３０抗体である。上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は上皮上に主に発現され、ＣＤ３０はリンパ腫細胞上で発現されることがそれぞれ知られている［１５〜１８］。ＥＧＦＲ及びＣＤ３０に対して高い親和性を有する様々な抗体フラグメントが利用可能であり、以前にインビトロ及びインビボで使用された［１９〜２１］。好ましくは、少なくとも１つの親和性試薬は、実施例で用いられた抗ＥＧＦＲ又は抗ＣＤ３０抗体の１つであってよい。ＣＤ３０とＥＧＦＲに対する適切なｓｃＦｖ抗体は、当該分野で知られており、例えば、Klimkaら［６３］及びKettleboroughら［６４］に記載されている。
【００２４】
用語「タンパク質足場」は、当技術分野で知られており、コンビナトリアルタンパク質の設計方法を用いて所定の結合機能を備えることができた小型で堅牢な非免疫グロブリン「足場」から誘導される新型の受容体タンパク質（Gebauer and Skerra (2009) Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol, 13, 245-255）に関する。設計されたタンパク質足場の非限定的な好ましい例は、治療又はインビボでの診断のための医薬品候補の開発のためのタンパク質足場であり、以下にさらに詳述されるアドネクチン、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ及び設計されたＫｕｎｉｔｚ型阻害剤が含まれる。
【００２５】
オプション（ｂ）の核酸分子は、前記細胞膜結合ドメインを含む（ポリ）ペプチドをコードするか、又は前記細胞膜結合ドメインからなる（ポリ）ペプチドをコードすることができる。最初のオプションでは、細胞膜結合ドメインは、例えば抗体等のより大きな分子の一部である。後者のオプションでは、（ポリ）ペプチドは、それ自体が細胞膜結合ドメインである。このオプションの例としては、本明細書で上述したタンパク質足場が含まれ、これらに限定されない。細胞膜結合ドメインがより大きな分子の一部であるか、又は細胞膜結合ドメイン自体であるかに関わらず、いずれの場合にも、オプション（ｂ）の核酸分子は、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質の一部、すなわちか少なくとも付加的なセグメント（ａ）、（ｃ）及び（ｄ）を含むものであることが理解される。
【００２６】
オプション（ｃ）における第３の配列セグメントは、「リンカー」をコードする。本発明において用いられる用語「リンカー」は、続きのアミノ酸（すなわち、ペプチドリンカー）に関する。本発明に従って、リンカーは、第２の配列セグメントによってコードされるアミノ酸配列と第４の配列セグメントによってコードされるアミノ酸配列との間に配置され、それによって翻訳されたタンパク質中でこれら２つの配列を接続（リンク）させる。
【００２７】
本発明によって想定されるリンカーは、長さが少なくとも３個のアミノ酸の（ポリ）ペプチドリンカーである。好ましい実施態様では、リンカーの長さが３〜１００個のアミノ酸であり、より好ましくはリンカーの長さが５〜５０個のアミノ酸であり、さらにより好ましくはリンカーの長さが１０〜２０アミノ酸である。最も好ましくは、リンカーの長さが１３個のアミノ酸である。代替的又は付加的な実施態様では、リンカーは、レンチウイルスベクターの表面から細胞膜結合ドメインの距離を、約５〜１００Åに、より好ましくは約５〜７５Åに、そしてさらにより好ましくは約５〜５０Åに延長する。最も好ましくは、リンカーは細胞膜結合ドメインの距離を約３０Åに延長する。レンチウイルスベクターの表面から細胞膜結合ドメインの距離を決定するための手段及び方法は、当技術分野において知られており、融合タンパク質の三次元構造、二次／三次構造の予測、相同性モデリング、及び配列アラインメントの分析が含まれ、これらに限定されない。
【００２８】
リンカーは、物理的に分かれた核酸セグメント、例えば本発明の核酸分子のセグメント（ｂ）及び（ｄ）に役立つことが理解されるであろう。当技術分野で知られているように、リンカーの性質、すなわち長さ及び／又はアミノ酸配列は、発現された融合タンパク質に影響を与えうる。例えばリンカーの性質は、発現された融合タンパク質の安定性及び／又は溶解性を変更し、高めることができ、又は他の分子との相互作用若しくは多量体化に影響を与える立体的な効果を有しうる。よって、本発明のポリペプチドが標的細胞に結合する能力を維持することが必要条件であるから、好ましいリンカーは、コードされたポリペプチドの正しい発現とフォールディング、及びＶＳＶ−Ｇと細胞膜結合ドメインの生物学的機能を妨害してはならない。従って、リンカーは、これらの性質を今まで通り可能にするために、十分に長く、及び／又は柔軟でなければならない。よって、リンカーの長さ及び配列は、実際の組成、すなわち本発明の分子の配列セグメントの選択に基づいて変化させることができる。さらに、好ましいリンカーは、柔軟な構造を取らなければならず、機能的なタンパク質ドメイン及び／又は溶媒との相互作用を避けるために疎水性の特性又は荷電特性を最小限にしなければならない。好ましくは、リンカーは、免疫系による検出を避けることができる部分であるように選択される。当業者は、その一般的な知識に基づいて、適切なリンカー分子を設計する方法を知っている。例えば、ペプチドリンカーは、商業的に入手可能なＬＩＰ（Loop in Proteins：タンパク質中のループ）データベース（Michalskyら，2003［５０］）から選択することができる（参照、例えば、Glen Research（22825 Davis Drive, Sterling, Virginia, 20164 USA）のカタログ）。
【００２９】
当業者は、異なるリンカーの適合性をテストする方法をよく知っている。例えば、リンカーの適合性は、本明細書（参照、実施例４）に記載の通り、本発明のレンチウイルスベクターのウイルス収率及び／又は形質導入率を比較することによって、容易に試験することができる。
【００３０】
好ましくは、リンカーは、例えば、アミノ酸のグリシン、アスパラギン及び／又はセリンを含む柔軟なリンカーであり、好ましくは、リンカーは、アミノ酸のグリシン及びセリン、又はアラニン及びセリンを含む。より好ましくは、リンカーは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むか又はからなる。さらにより好ましくは、リンカーは、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる。
【００３１】
オプション（ｄ）における第４の配列セグメントは、水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質をコードする。水疱性口内炎ウイルス（本明細書ではＶＳＶと略す）は、水疱性口内炎インディアナウイルス（ＶＳＩＶ）とも呼ばれ、グループＶのラブドウイルス科（すなわち、ネガティブセンス一本鎖ＲＮＡ）のウイルスである。ウイルス、そのホスト、及びそのウイルスの感染によって誘発される疾患は、当技術分野でよく知られている［５１〜５３］。ＶＳＶ−Ｇは、膜貫通糖タンパク質であり［６，５２］であり、インビトロでの細胞を含まない条件で感染性偽型ウイルスを産生するパッケージング細胞によって構築された未成熟で非感染性のエンベロープ欠損レトロウイルス様粒子と効率的に結合することが知られている。このように、ＶＳＶエンベロープ糖タンパク質の配列は、当技術分野でよく知られており、本発明に従って、細胞質側末端、膜貫通ドメイン、及び効率的なウイルス出芽を媒介する膜近位細胞外ステム領域（外部ドメイン又は細胞外ドメイン）を含む。ＶＳＶ−Ｇの配列は、当技術分野、例えば［５４］に記載されており、天然のＶＳＶ−ＧのＮＣＢＩ参照番号は、NP_955548.1（ＮＣＢＩゲノムプロジェクト，2000）である。
【００３２】
本発明における第１の配列セグメントが既にＥＲシグナル配列をコードしていることが理解される。従って、第４の配列セグメントによってコードされるＶＳＶ−Ｇは、好ましくはさらなるＥＲシグナル配列を含まない。本発明の目的のために、天然のＶＳＶ−Ｇ配列又は改変ＶＳＶ−Ｇ配列［５５，５６］のいずれかを用いることができる。例えば、ＶＳＶ−Ｇの許容エピトープ挿入部位（参照、［５５及び５６］参照）への、ＲＧＤ等の標的ペプチドの導入、又は正に荷電したペプチド（例えば、ポリリジンペプチド（Ｋ７〜Ｋ２０））の導入を、効果の向上を達成するために用いることができる［５７〜６０］。改変されたＶＳＶ−Ｇ配列を用いる場合には、改変されたＶＳＶ−ＧがＬＤＬ受容体に結合する能力、及び／又は前記改変ＶＳＶ−Ｇ配列で偽型化された安定で正しく調製されたレンチウイルスベクターを与える能力を損なわないことが重要である。好ましくは、改変は、膜貫通ドメイン（例えば、配列番号６で示されるＶＳＶ−Ｇタンパク質の４２６位〜４６６位の範囲）又は細胞質ドメイン（例えば、配列番号６で示されるＶＳＶ−Ｇタンパク質の４６７位〜４９５位の範囲）の中にはない。また、改変は、配列番号６で示されるＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質のアミノ酸３８５と４４４の間の領域にはないことが好ましい。というのも、この領域はαヘリックスを形成する傾向を有し、この領域が膜と直接相互作用することを可能にしうることが示唆されているからである［６２］。好ましくは、ＶＳＶ−Ｇの配列は改変されない。加えて、本明細書で上記した通り、ＶＳＶ−ＧのＮ末端ドメインがリンカーに直接、結合されることが特に好ましい。
【００３３】
本発明に従って、配列セグメントは、５’から３’の方向に配置される。各々の配列セグメントを、中間の配列を有さず又は有して、前の配列セグメントに続けることができる。本明細書で上記した通り、末端配列を、代わりに又は付加的に５’末端及び／又は３’末端に加えることができる。例えば、検出可能な標識をコードする第５の配列セグメント（すなわち、第４のセグメントの３’末端）が本発明の核酸分子中に含まれることは、本明細書で明白に把握される。典型的な検出可能な標識、及び典型的な断続的な配列は、例えば、本発明の核酸分子又はそれでコードされるポリペプチドのいずれかの精製又は検出を後に行うためのタグであることができる。タグの非限定的な例としては、ストレップタグ（Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇｓ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、ポリ（Ｈｉｓ）タグ、及びそれらの誘導体、又は例えばＶ５タグ、Ｃ−ｍｙｃタグ及びＨＡタグ等のエピトープタグが含まれる。これらのすべてのタグ及びその誘導体は、当技術分野でよく知られており、例えばLichty JJら Comparison of affinity tags for protein purification Protein Expr Purif. 2005 May; 41 (1): 98-105に記載されている。好ましくは、タグが融合タンパク質に含まれている場合、タグは図１に示すＨｉｓタグである。検出可能な標識は、例えば、３Ｈ又は３２Ｐ等の放射性標識、蛍光標識、及びレポータータンパク質をさらに含むが、これらに限定されない。核酸の標識は当技術分野でよく理解されており、例えばSambrookとRussel "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001)に、記載されている。
【００３４】
中間の配列及び／又は末端配列が存在する場合、これらは、本発明のＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質の完全性と機能性、特に細胞、好ましくはトランスフェクトが困難な細胞へのトランスフェクション効率の増加を導くレンチウイルスベクターの一部としてのその用途を損なわないように選択される。当業者は、その科学的知見に基づいて、細胞膜結合ドメインを含む融合タンパク質の完全性と機能性に悪影響を与えうる改変を認識しており、それによって、必要に応じて、適切な断続的配列及び／又は末端配列を同定することができる。さらに、当業者は、前記の完全性と機能性が断続的配列及び／又は末端配列の付加によって損なわれるかどうかを、実験的に、例えば本明細書に記載された実験に基づいて確認することができる。
好ましくは、中間の配列は、第２、第３及び第４の配列セグメントの間に存在しない。すなわち、これらの配列セグメントは、第２、第３及び第４の配列セグメントに対応する融合タンパク質が第２〜第４の配列セグメントに属するヌクレオチドのみで構成されるように、お互い直接に続く。
【００３５】
本発明に従って、新規のＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質は、腫瘍抗原ＥＧＦＲ又はＣＤ３０のいずれかに対するＮ末端一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含み、ＶＳＶ−Ｇ及びｓｃＦｖが柔軟なリンカーによって分離されて、準備される。添付の実施例に示されるように、高力価のレンチウイルスベクター（ＬＶ）調製物が、ｗｔ−ＶＳＶ−Ｇと特定の比率で本発明のｓｃＦｖで改変されたＶＳＶ−Ｇを用いて得ることができた。また、添付の実施例に示されるように、リンカーを有さずＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質を有するレンチウイルス粒子を製造したところ、ウイルス収率が強く減少し、これらのウイルス粒子は、Ｔ４７Ｄ細胞の形質導入率を増加させることができなかった。従って、本発明者は、細胞膜結合ドメインとＶＳＶ−Ｇとの間のリンカー配列は、ＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質で再標的化されたレンチウイルス粒子の機能に必須であると結論する。
【００３６】
今まで、ｓｃＦｖのＮ末端をＶＳＶ−Ｇに結合させる試みが成功したことは、当技術分野で全く報告されていない。代わりに、当技術分野で遂行された代替アプローチとして、例えばＶＳＶ−Ｇに融合されたブドウ球菌プロテインＡに由来する小さな抗体結合ＺＺドメインで、レンチウイルスベクターの表面を改変するものがある［１２］。しかしながら、このアプローチは、改変レンチウイルスベクターと各々の抗体の２つの試薬が、臨床用途のために承認され、臨床グレードの純度で提供され、結合されて活性治療剤を生成させる必要がある。従って、本発明の新規なＶＳＶ−Ｇの融合タンパク質は、低いＭＯＩで改善された形質導入率を有し、例えばリンパ系細胞又は腫瘍細胞等の形質導入が困難な細胞の形質導入に適しているレンチウイルス粒子を調製するためのＬＶの偽型化のための改良手段を提供する。
【００３７】
本発明の核酸分子の好ましい実施態様において、前記第２の配列セグメントでコードされる細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる（ポリ）ペプチドは、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ抗体フラグメント、ＶＮＡＲ一本鎖抗体及びタンパク質足場からなる群から選択される。
【００３８】
本明細書で上記した通り、前記の抗体の種類には、キメラ抗体（ヒト定常ドメイン、非ヒト可変ドメイン）及びヒト化抗体（非ヒトＣＤＲｓの例外を有するヒト抗体）等の実施態様が含まれる。
【００３９】
本明細書中で用語「設計されたタンパク質足場」と互換的に用いられる用語「タンパク質足場」は、当技術分野でよく知られており、コンビナトリアルタンパク質設計方法を用いる規定の結合機能を有し、小型で堅牢な非免疫グロブリン「足場」に由来する新世代の受容体タンパク質に関する（Gebauer and Skerra (2009) Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol, 13, 245-255）。好ましく非限定的な設計されたタンパク質足場の例としては、アドネクチン、アフィボディ、アンチカリン及びＤＡＲＰｉｎが含まれる。
【００４０】
本発明において、「アドネクチン」（モノボディーとも呼ばれる）は、２〜３個の露出したループを有し、中央のジスルフィド架橋を欠いた９４残基のＩｇ様のβ−サンドイッチの折り畳み構造を取るヒトフィブロネクチンIIIの１０番目の細胞外ドメイン（１０Ｆｎ３）に基づいている。
【００４１】
本発明において、「アフィボディ」は、ブドウ球菌プロテインＡのＺドメイン、すなわち３個のヘリックスが結束し、２個のα−ヘリックス上にインターフェースを提供する約５８残基に基づく。
【００４２】
本明細書で用いられる用語「アンチカリン」は、リポカリンに由来する設計されたタンパク質をさす（Beste, G., Schmidt, F.S., Stibora, T., Skerra, A. (1999) Small antibody-like proteins with prescribed ligand specificities derived from the lipocalin fold. PNAS, 96, 1898-903）。アンチカリンは、リポカリンの中で高度に保存されたコア部を形成し、開放端に４つの構造的に可変なループを用いてリガンドへの結合部位を自然に形成する８本鎖のβ−バレルを有する。アンチカリンは、ＩｇＧスーパーファミリーと相同的ではないが、これまで抗体の結合部位に一般的と考えられていた特徴：（i）配列変異の結果としての構造上の高い適応性、及び（ii）異なる形状のターゲットへの適合を誘導するコンフォメーション上の高められた柔軟性を示す。
【００４３】
本発明において、用語「ＤＡＲＰｉｎ」は、典型的には３回の繰り返しβターンに起因する剛性のインターフェースを提供するよう設計されたアンキリン反復ドメイン（１６６残基）をさす。ＤＡＲＰｉｎは、通常、繰り返しごとに６つの位置がランダム化される人工的コンセンサス配列に対応する３つの反復を保有する。その結果、ＤＡＲＰｉｎは構造上の柔軟性を失う。
【００４４】
「クニッツドメインペプチド」は、例えば、ウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）又は組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）等のクニッツ型プロテアーゼ阻害剤のクニッツドメインに由来する。クニッツドメインは約６ｋＤａの分子量を有し、必要な標的特異性を持つドメインはファージディスプレイ等のディスプレイ技術によって選択することができる（Gebauer and Skerra (2009) Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol, 13, 245-255）。
【００４５】
本発明の核酸分子の特に好ましい実施態様において、前記第２の配列セグメントでコードされる細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる（ポリ）ペプチドが、一本鎖抗体である。
免疫グロブリンドメインにおけるＶＬドメイン及びＶＨドメインの配置に関しては、ＶＬドメインは、ＶＨドメインのＮ末端又はＣ末端に配置することができる。従って、本発明の核酸分子において、ＶＬドメインをコードする核酸は、ＶＨドメインをコードする核酸の５’又は３’に配置することができる。当業者は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインのいかなる配置が特異的ｓｃＦｖにより適しているかを決定することができる。
【００４６】
本発明の核酸分子のさらに好ましい実施態様において、細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる（ポリ）ペプチドは、糖脂質、リン脂質、オリゴ糖及びタンパク質からなる群から選択される１つ又はそれ以上の細胞膜成分に特異的に結合する。
【００４７】
糖脂質は、細胞膜上に存在する炭水化物が結合した脂質であり、その細胞膜上で他の成分の中で細胞認識に役立つ。糖脂質の非限定的な例としては、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質及びグリコシルホスファチジルイノシトールが含まれる。
【００４８】
リン脂質は、リン酸基を含む両親媒性の脂質である。細胞膜の中で最も一般に見られるリン脂質は、ホスファチジルコリン（レシチン、略称ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン、略称ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）及びスフィンゴミエリンである。それらの化学的構成に基づけば、これらは、基本構造としてグリセリンを有するグリセロリン脂質と、スフィンゴシン由来するリン酸塩を含有するスフィンゴ脂質であるスフィンゴミエリンとの２つのグループに分類される。
【００４９】
オリゴ糖は、少数の単純な糖（単糖）を含む糖類ポリマーである。これらは一般に動物細胞の原形質膜上で見出され、その原形質膜上で他の成分の中で細胞−細胞認識の役割を果たす。
【００５０】
本明細書で上記した通り、タンパク質は３０個以上のアミノ酸を含む直線状のアミノ酸の分子鎖である。この実施態様における好適なタンパク質は、Ｇタンパク質共役細胞受容体（ＧＰＣＲ）、分化のクラスター（cluster of differentiation（ＣＤ）；当技術分野ではcluster of designationとも呼ばれる）細胞表面タンパク質、細胞表面受容体又は細胞表面共受容体である。
【００５１】
本発明の核酸分子のさらに好ましい実施態様において、（ａ）前記ＥＲシグナル配列をコードする第１の配列セグメントが、配列番号１に示される核酸配列若しくは配列番号１と少なくとも６０％の相同性を有する核酸配列を含むか又はからなり；（ｂ）リンカーをコードする第３の配列セグメントが、配列番号３に示される核酸配列若しくは配列番号３と少なくとも６０％の相同性を有する核酸配列を含むか又はからなり；及び／又は（ｃ）前記ＶＳＶ−Ｇをコードする第４の配列セグメントが、配列番号５に示される核酸配列若しくは配列番号５と少なくとも６０％の相同性を有する核酸配列を含むか又はからなる。
【００５２】
従って、本発明に含まれるのは、記載された配列番号で示される核酸分子と少なくとも６０％の相同性を有する核酸分子、核酸配列又は配列セグメントである（少なくとも６０％の相同性としては、例えば少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性、さらに好ましくは少なくとも９５％の相同性、例えば少なくとも９８％の相同性、最も好ましくは少なくとも９９％の相同性が挙げられる）。
このような変異体分子は、他の種に由来するスプライスフォーム又は相同の分子であってもよい。これらの変異体核酸分子は、それにもかかわらず、示された機能を有するアミノ酸配列をコードしなければならないことが理解されるであろう。すなわち、配列番号１の変異体によってコードされる配列はＥＲシグナル配列でなければならず；配列番号３の変異体によってコードされる配列は、リンカーでなければならず；及び、配列番号５の変異体によってコードされる配列は、本明細書に上記したＶＳＶ−Ｇの機能を有する糖タンパク質をコードしていなければならない。
【００５３】
本発明において、核酸分子に関連した用語「と少なくとも％で相同である」は、アミノ酸配列の全長（又は比較されるその一部のすべて）を構成する核酸残基の数と比較して、２個又はそれ以上の一列に整列させた核酸配列における同一の核酸の一致（「ヒット」）の数を表す。２つ又はそれ以上の配列又はサブ配列のための一列の整列を用いる他の条件において、当技術分野で公知の配列比較アルゴリズムを用いて測定して、又は手動で整列させて目視で検査して、（サブ）配列を比較し、比較する窓上、若しくは指定された領域上、対応が最大になるように整列させた際、同一である核酸残基のパーセント（例えば、少なくとも６０％の相同性）を決定してもよい。本発明における好ましい核酸は、長さが少なくとも１００〜１５０個のヌクレオチドである領域にわたって、より好ましくは長さが少なくとも２００〜４００個のヌクレオチドである領域にわたって、記載された相同性が存在するものである。本発明におけるより好ましい核酸は、上記の（ａ）及び（ｂ）に記載した核酸分子の全長にわたって記載された配列の相同性を有するものである。
１つの実施態様においては、２つの配列が、一列に整列させた際、同一の長さ、すなわち３’末端又は５’末端で他の配列上に延びるいずれの配列も存在せずに、少なくとも６０％の相同性を示す。あるいは、そのような延長が起こる場合は、他の配列のいずれかの末端上に３０個以上のヌクレオチドが延長しないことが好ましく、より好ましくは１５個以上のヌクレオチドが延長しない。
【００５４】
配列間のパーセント配列相同性の決定方法、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム（Thompson, Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680）又はＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., 1988, 85; 2444）に基づくものなどのアルゴリズムを用いる方法は、当技術分野でよく知られている。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、典型的には配列中の内部の不一致の欠失又は付加、換言すれば欠落を、その計算で考慮しないが、これは、％配列相同性の過大評価を回避するために、手動で補正することができる。しかし、ＣＬＵＳＴＡＬＷは、その相同性の計算で配列欠落を考慮に入れる。当技術分野の当業者には、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムも利用可能である（Altschul, Nucl. Acids Res., 1977, 25: 3389）。核酸配列のためのＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列のためには、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、及び期待値（Ｅ）１０を用いる。ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci., 1989, 89: 10915）は、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両方の鎖の比較を用いる。これらのすべてのプログラムは、本発明の目的のために用いてよい。しかし、好ましくはＢＬＡＳＴプログラムが用いられる。
従って、所定の機能を有し、さらに上記のプログラム又は当業者に利用可能なプログラムのいずれか、好ましくはＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定される少なくとも６０％の配列相同性を有する全ての核酸分子は、本発明の範囲に含まれる。
【００５５】
本発明の核酸分子のより好ましい実施態様において、（ａ）前記ＥＲシグナル配列をコードする第１の配列セグメントが、配列番号１に示される核酸配列を含むか又はからなり；（ｂ）リンカーをコードする第３の配列セグメントが、配列番号３に示される核酸配列を含むか又はからなり；及び／又は（ｃ）前記ＶＳＶ−Ｇをコードする第４の配列セグメントが、配列番号５に示される核酸配列を含むか又はからなる。
本発明の核酸分子のさらにより好ましい実施態様において、核酸分子は、配列番号７又は配列番号９の全長の核酸配列を有する。
【００５６】
本発明はさらに、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。
好ましくは、ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、又は例えば、従来から遺伝子工学的に用いられている他のベクターである。本発明の核酸分子は、真核生物のタンパク質の発現に適したいくつかの市販のベクターに挿入してもよい。非限定的な例としては、原核生物のプラスミドベクターが含まれ、具体的にはｐＵＣシリーズ，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Stratagene社）、ｐＥＴシリーズの発現ベクター（Novagen社）又はｐＣＲＴＯＰＯ（Invitrogen社）、並びにｐＲＥＰ（Invitrogen社）、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen社）、ｐＣＥＰ４（Invitrogen社）、ｐＭＣＩｎｅｏ（Stratagene社）、ｐＸＴ１（Stratagene社）、ｐＳＧ５（Stratagene社）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＢＰＶ−１、ｐｄＢＰＶＭＭＴｎｅｏ、ｐＲＳＶｇｐｔ、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐｌＺＤ３５、ｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ（Clontech社）、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Clontech社）、ｐＥＡＫ−１０（Edge Biosystems社）、ｐＴｒｉＥｘ−Ｈｙｇｒｏ（Novagen社）及びｐＣＩＮｅｏ（Promega社）等の哺乳動物細胞における発現に適合するベクターが含まれる。
【００５７】
上記の本発明の核酸分子はまた、他のポリヌクレオチドとの翻訳融合物が生成されるようにベクターに挿入してもよい。その他のポリヌクレオチドは、例えば、溶解度を増加させ、及び／又は融合タンパク質の精製を容易にすることができるタンパク質をコードしてもよい。非限定的な例として、ｐＥＴ３２、ｐＥＴ４１、ｐＥＴ４３が含まれる。
ベクター改変技術については、SambrookとRussell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001)が参照される。一般に、ベクターは、１つ又はそれ以上の複製開始点（ｏｒｉ）及びクローニング又は発現のための遺伝システム、１つ又はそれ以上の宿主における選択のためのマーカー、例えば抗生物質耐性、並びに１つ又はそれ以上の発現カセットを含むことができる。適切な複製開始点（ｏｒｉ）は、例えばＣｏｌＥ１、ＳＶ４０ウイルス及びＭ１３の複製開始点を含む。
【００５８】
ベクターに挿入されるコード配列は、例えば標準的な方法によって合成されるか、又は天然物から単離することができる。転写調節エレメント及び／又は他のアミノ酸コード配列へのコード配列のライゲーションは、確立された方法を用いて行うことができる。コード配列の発現を保証する転写調節エレメント（発現カセットの一部）は、当業者によく知られている。これらのエレメントは、転写の開始を保証する調節配列（例えば、翻訳開始コドン、プロモーター、エンハンサー、及び／又はインスレーター）、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）（Owens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001), 1471-1476）、並びに必要に応じて転写の終了及び転写物の安定化を確保するポリＡシグナルを含む。追加の調節エレメントとして、転写及び翻訳エンハンサー、及び／又は自然に随伴されるプロモーター領域又は異種プロモーター領域を含んでもよい。好ましくは、本発明の核酸分子は、その発現を可能にする発現制御配列に作動的に連結されている。ベクターは、さらなる調節エレメントとして分泌シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。そのような配列は当業者によく知られている。さらに、用いられる発現システムに依存して、細胞内の区画に発現したポリペプチドを指向し得るリーダー配列を、本発明のポリヌクレオチドのコード配列に加えてもよい。そのようなリーダー配列は、当技術分野でよく知られている。
【００５９】
転写の開始を確実にする調節エレメントの可能な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ｌａｃＺプロモーター、ｇａｉ１０プロモーター、ヒト伸長因子１α−プロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＣａＭキナーゼプロモーター、オートグラファカリフォルニア核多角体病ウイルス（Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus：ＡｃＭＮＰＶ）ポリヘドリンプロモーター又はＳＶ４０エンハンサーが含まれる。原核生物における発現のために、例えばｔａｃ−ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５又はｔｒｐプロモーターを含む多数のプロモーターが記載されている。原核細胞及び真核細胞におけるさらなる調節エレメントの例としては、ＳＶ４０−ポリＡ部位又はｔｋ−ポリＡ部位、又はＳＶ４０、ｌａｃＺ及びＡｃＭＮＰＶポリヘドリンポリアデニル化シグナル等のポリヌクレオチドの下流にある転写終結シグナルが含まれる。
【００６０】
さらに、本発明のベクターは、選択マーカーを含むことが好ましい。選択マーカーの例としては、ネオマイシン耐性、アンピシリン耐性及びハイグロマイシン耐性等が含まれる。特別に設計されたベクターは、細菌−真菌細胞又は細菌−動物細胞などの異なる宿主間のＤＮＡの往復を可能にする。
本発明の発現ベクターは、本発明の核酸分子及びコードされた融合タンパク質の複製及び発現を導くことができる。記載の調節エレメントを含む適切な発現ベクターは当技術分野で知られており、例えば、ｐＧｒｅｅｎＰｕｒｏ（System Biosciences社，米国，カリフォルニア，マウンテンビュー）、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogene社，特に添付の実施例で用いられる）、ｐＳＰＯＲＴ１（GIBCO BRL社）又はｐＧＥＭＨＥ（Promega社）、又はラムダｇｔ１１、ｐＪＯＥ、ｐＢＲ１−ＭＣＳシリーズなどの原核生物発現ベクターが挙げられる。
本明細書で上記した本発明の核酸分子は、細胞内に、直接導入するように、又はリポソーム、ファージベクター若しくはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介して導入するように設計しても良い。さらに、本発明の核酸分子のための真核生物発現システムとして、バキュロウイルス系、又はワクシニアウイルス若しくはセムリキ森林ウイルスに基づくシステムを用いることができる。
【００６１】
本発明はさらに、本発明の核酸分子又はベクターを含む宿主細胞に関する。
適切な原核生物宿主は、例えば、大腸菌、ストレプトミセス、サルモネラ又はバチルス属の細菌などを含む。適切な真核生物宿主細胞は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パストリス、シゾサッカロミセス・ポンベ等の酵母、又はＤＴ４０細胞等のニワトリ細胞である。発現に適した昆虫細胞は、例えば、ショウジョウバエＳ２細胞、ショウジョウバエＫｃ細胞、又はスポドプテラＳｆ９細胞及びＳｆ２１細胞である。適当なゼブラフィッシュ細胞株は、ＺＦＬ、ＳＪＤ又はＺＦ４を含むが、これらに限定されない。
用いられ得る哺乳動物宿主細胞は、ヒトＨｅｌａ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｈ９及びＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３及びＣ１２７細胞、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７及びＣＶ１、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、マウス肉腫細胞、ボウズメラノーマ細胞、ヒトＣＡＰ又はＣＡＰ−Ｔ細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。また、本発明の範囲には、初代哺乳動物細胞又は細胞株が含まれる。初代細胞は、生物から直接得られる細胞である。適切な初代細胞は、例えば、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス初代肝細胞、心筋細胞、神経細胞、及びマウス筋肉幹細胞（サテライト細胞）、ヒト皮膚線維芽細胞及びヒト肺線維芽細胞、ヒト上皮細胞（鼻、気管、腎臓、胎盤、腸、気管支上皮細胞）、ヒト分泌細胞（唾液腺、皮脂腺、汗腺に由来）、ヒト内分泌細胞（甲状腺細胞）、ヒト脂肪細胞、ヒト平滑筋細胞、ヒト骨格筋細胞、及びこれらに由来する安定な不死化細胞株（例えば、ｈＴＥＲＴ又は癌遺伝子不死化細胞）である。
【００６２】
前記の宿主細胞のための適切な培養培地及び条件は当技術分野で知られている。
本実施態様における宿主細胞は、本明細書で後に詳述する通り、例えば、本発明のベクターの増幅のための方法、本発明の融合タンパク質の製造のための方法、又はレンチウイルス粒子の直接製造のための方法で用いることができる。
【００６３】
本発明はさらに、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドに関する。
本発明のポリペプチドは、例えば配列番号８又は配列番号１０で示される配列から選択されるアミノ酸配列の全体を有してもよい。
【００６４】
本発明はさらに、本発明のＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質を製造する方法であって、前記方法は、本発明の宿主細胞を適切な条件下で培養し、製造されたＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質を単離することを含む方法に関する。
原核生物又は真核生物の宿主を培養するのに適した条件は、当業者によく知られている。例えば、細菌を培養するのに適した条件は、Luria Bertani（ＬＢ）培地中で通気下に培養することである。発現生成物の収率及び溶解度を高めるために、培地は、収率及び溶解度を向上させ又は促進させることが知られている適当な添加剤を用いて緩衝化させ又は補充することができる。大腸菌は４℃〜約３７℃で培養することができ、その正確な温度又は連続の温度は過剰発現される分子に依存する。一般的に、当業者は、これらの条件が宿主の要求及び発現タンパク質の要件に適合しなければならないことがあることも認識している。誘導性プロモーターが宿主細胞中に存在するベクター中の本発明の核酸を制御する場合は、ポリペプチドの発現は、適切な誘導剤の添加によって誘導することができる。適切な発現プロトコール及び戦略は、当業者に知られている。
【００６５】
細胞の種類及びその特別な要求によるが、哺乳動物細胞の培養は、例えば、１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを含有する、ＲＰＭＩ培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地又はＤＭＥＭ培地で行うことができる。細胞を、例えば、５％ＣＯ２、水飽和雰囲気下、３７℃で、又はＤＴ４０ニワトリ細胞には４１℃で保管することができる。昆虫細胞培養に適した培地は、例えば、ＴＮＭ＋１０％ＦＣＳ又はＳＦ９００培地である。昆虫細胞は、通常、付着培養又は懸濁培養として２７℃で培養される。真核細胞又は脊椎動物細胞のための好適な発現プロトコールは、当業者によく知られており、例えば、上記引用のSambrookとRusselから引き出すことができる。
【００６６】
用語「単離」は、宿主細胞から、又は宿主細胞が培養されていた培地から製造されたＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質を除去することによる、製造されたＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質の選択的な収集をさす。好ましくは、単離されたＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質は、１００％純粋、すなわち本発明のＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質ではない如何なる他の成分を含んでいない。製造された融合タンパク質の単離方法は、当技術分野でよく知られており、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）、アフィニティークロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、ディスクゲル電気泳動又は免疫沈降等の方法工程が含まれ、例えば、上記引用のSambrookとRusselが参照されるが、これらに限定されない。
用語「製造された融合タンパク質の単離」は、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質の単離をさすことが当業者には理解されるであろう。
【００６７】
本発明はさらに、（ａ）本発明の核酸分子によってコードされるＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質ドメイン；及び（ｂ）細胞膜結合ドメインを含む及び／又はからなる（ポリ）ペプチドに連結されていないＶＳＶ−Ｇで偽型化されたレンチウイルスベクター粒子に関する。
【００６８】
本明細書において「レンチウイルスベクター」とも称される「レンチウイルスベクター粒子」は、レンチウイルス粒子、すなわち非分裂標的細胞のゲノムに組み込むことができるレトロウイルスのサブクラスに基づくベクターである。レンチウイルスのユニークな特徴は、他のレトロウイルスベクターとは対照的に、複製の自己不活性化（ＳＩＮ）領域を有することである。レンチウイルスは、当技術分野でよく知られており、例えば、Retroviruses, Coffin JM, Hughes SH, Varmus HE, Cold Spring Harbor (NY): Cold Sprinh Harbour Laboratory Press; 1997; ISBN-10:0-87969-571-4; O'Connell RM, Balazs AB, Rao DS, Kivork C, Yang L, Baltimore D. Lentiviral vector delivery of human interleukin-7 (hIL-7) to human immune system (HIS) mice expands T lymphocyte populations. PLoS One. 2010 Aug 6; 5(8):e12009; Matrai J, Chuah MK, VandenDriessche T. Recent advances in lentiviral vector development and applications. Mol Ther. 2010 Mar;18(3):477-90に詳細に記載されている。
【００６９】
レンチウイルスベクター粒子は、例えば、ウシ、ウマ、ネコ、ヒツジ／ヤギ、又は霊長類のレンチウイルスの群のレンチウイルスに基づく。好ましくは、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２又はＳＩＶウイルスなどの霊長類レンチウイルスに基づく。最も好ましくは、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ１のレンチウイルスに基づく。当業者が知っているように、大部分の（市販の）レンチウイルスベクターは、異なるウイルスに由来するウイルス成分の混合物に相当し、従ってある程度「ハイブリッド」ベクターである。例えば、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ１、ＶＳＶｇ、ＣＭＶ、ＷＰＲＥウイルスに由来する成分を含んでいてもよい。このようなハイブリッドベクターは、本発明には明白に認識されている。
【００７０】
本明細書でウイルスベクターの文脈で用いられる用語「偽型」は、外来ウイルスのエンベロープタンパク質の組込みによるウイルスベクターの細胞型特異性の調節をさす。このアプローチは、当技術分野でよく知られており、例えば、Bischfら（Flexibility in cell targeting by pseudotyping lentiviral vectors. Methods Mol Biol. 2010; 614: 53-68）に記載されている。このアプローチを用いて、宿主のトロピズムを変更することができ、及び／又はウイルスの安定性を減少若しくは増加させることができる。例えば、レンチウイルスの偽型化のためのＶＳＶ−Ｇの使用は、例えば、Burnsら（Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90(17): 8033-8037）に記載されている。
【００７１】
用語「細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる（ポリ）ペプチドに連結されていないＶＳＶ−Ｇ」は、本明細書において野生型ＶＳＶ−Ｇとも呼ぶ。この文脈において、用語「野生型」は、用いられたＶＳＶ−Ｇに細胞膜結合ドメインが融合されていない事実のみをさす。しかし、非天然（すなわち、改変された）ＶＳＶ−Ｇ分子が細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる（ポリ）ペプチドに連結されていない限り、非天然ＶＳＶ−Ｇ分子の使用は除外されない。
【００７２】
本明細書で用いられるように、用語「ＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質」及び「・・・に連結されていないＶＳＶ−Ｇ」は、記載された分子の「１つ」に限定されない。代わりに、これらの用語は、数における特別な制限はなく、存在する分子の種類を定義する。言い換えれば、用語「ＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質」は１つ又はそれ以上のＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質を明白に包含し、用語「・・・に連結されていないＶＳＶ−Ｇ」は細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる（ポリ）ペプチドに連結されていない１つ又はそれ以上のＶＳＶ−Ｇを明白に包含する。
【００７３】
本発明に従って、２つの異なる種類のＶＳＶ−Ｇタンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクター粒子、すなわち本明細書で上記した本発明の融合タンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクター粒子（オプション（ａ））と、細胞膜結合ドメインに融合されていないＶＳＶ−Ｇ、すなわち野生型（ｗｔ）ＶＳＶ−Ｇで偽型化されたレンチウイルスベクター粒子（オプション（ｂ））が提供される。言い換えれば、各々の個別のレンチウイルスベクター粒子は、その表面に、改変されたＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質と野生型ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質の両方を発現する。
【００７４】
本発明に従って、驚くべきことに、これらの両方のＶＳＶ−Ｇでの偽型化が、これらのタンパク質のいずれか一方のみを用いるよりも有利であることが見出された。第１に、本発明のＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質の１００％の使用は、例えば実施例４に示されるように、サイトメトリーアッセイで細胞に感染することができず、従って、意図された形質導入を達成しなかった。第２に、添付の実施例に示されるように、本発明の分子と野生型分子との混合物とすることによって、野生型単独の場合と比較して感染率の向上が導かれた。
【００７５】
本発明のレンチウイルスベクター粒子の好適な実施態様において、ウイルスエンベロープの前記の偽型化されたレンチウイルスベクター粒子で示される（ａ）:（ｂ）の比率は、１０％：９０％と５０％：５０％の間である。
言い換えれば、この好ましい実施態様に従って、本発明のＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質とｗｔ−ＶＳＶ−Ｇとの比率は、約１０％の本発明のＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質対約９０％のｗｔ−ＶＳＶ−Ｇと、約５０％の本発明のＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質対約５０重量％のｗｔ−ＶＳＶ−Ｇとの間の範囲にある。好ましくは、その比率は、約３３％の本発明のＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質と約６７重量％のｗｔ−ＶＳＶ−Ｇである。
【００７６】
本明細書で用いられる用語「約」は、明示的に示された値と、そこからの小さな誤差を含む。言い換えれば、「約３３％」のパーセントは、記載された量の３３％を含むが、正確にその通りである必要はなく、数％異なってもよく、従って、例えば３１％、３２％、３４％又は３５％が含まれる。このような値は、ほぼ記載された値に対応している限り、完全な精度を必要としない相対的な値であることを、当業者は認識している。従って、記載された値から、例えば１５％の誤差、より好ましくは１０％の誤差、及び最も好ましくは５％の誤差が、用語「約」に含まれる。
【００７７】
本発明はさらに、本発明の偽型レンチウイルスベクター粒子を製造する方法であって、前記方法は、宿主細胞に、（ｉ）ウイルス粒子タンパク質、及びＬＴＲを含む核酸の効率的な製造とパッケージングに必要なアクセサリータンパク質をコードする１つ又はそれ以上のパッケージングプラスミド；（ii）本発明の核酸分子を含むベクター；並びに（iii）細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる（ポリ）ペプチドに連結されていないＶＳＶ−Ｇをコードする核酸分子を含むベクターをトランスフェトすることを含む方法に関する。
【００７８】
このような偽型レンチウイルスベクターを製造する方法は、当技術分野でよく知られており、例えば、Naldini, L.(1998）［６１］に記載されている。宿主細胞、好ましくはＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＡＰ又はＣＡＰ−Ｔ細胞が用いられる。例えばカプシド、逆転写酵素等のウイルスタンパク質をコードするパッケージングベクター、及び偽型レンチウイルスベクター粒子に追加的に導入された核酸分子を担持するベクターを含む多数のベクターが、これらの細胞にトランスフェクトされ、又はエレクトロポレーションされる。又は、前記ベクターの導入のためにヌクレオフェクションが用いられる。加えて、偽型レンチウイルスベクター粒子によって届けられる遺伝物質を含むさらなるベクターを、トランスフェクトしてもよい。
【００７９】
これらのベクターは、直接導入によって、又はエレクトロポレーション（例えば、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Eppendorf社）、Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ（BioRad社）、ＭａｘＣｙｔｅトランスフェクションシステム（Maxcyte社）を用いる）、ＰＥＩ（Polysciences社，Warrington，Eppelheim）、Ｃａ２＋媒介トランスフェクション、リポソーム（例えば、「リポフェクタミン」（Invitrogen社））、若しくは非リポソーム化合物（例えば、「Ｆｕｇｅｎｅ」（Roche社）又はヌクレオフェクション（Lonza社））を介する導入によって、宿主細胞に導入することができる。
【００８０】
本発明の偽型レンチウイルスベクター粒子に関して本明細書で上記した定義及び好ましい実施態様のすべては、本発明の偽型レンチウイルスベクター粒子を製造する方法に準用される。例えば、本発明のＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質と細胞膜結合ドメインに融合されていないＶＳＶ−Ｇとの好ましい比率は、本発明の偽型レンチウイルスベクター粒子の製造方法に用いられる比率に等しく適用される。従って、例えば、約６７％の細胞膜結合ドメインを含む又はからなる（ポリ）ペプチドに連結されていないＶＳＶ−Ｇと約３３％の本発明のＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質との好ましい比率を得るために、オプション（ii）のベクターと比較して２倍のオプション（iii）のベクターを宿主細胞に加えることで、約２：１の比率、すなわち６７％対３３％となる。
【００８１】
本発明はさらに、細胞に形質導入する方法であって、前記方法は、形質導入に適した条件下、形質導入される細胞を本発明の偽型レンチウイルスベクター粒子と接触させて、前記細胞に形質導入する工程を含む方法に関する。従って、本発明はまた、標的細胞の形質導入のための本発明のレンチウイルスベクター粒子の使用にも関する。
【００８２】
本明細書中で用いられる用語「形質導入（transducing）」は、本技術分野でよく知られており、遺伝物質を細胞内に導入するプロセス、及び必要に応じて続いてウイルスベクター粒子を介して前記細胞のゲノム中に組込むプロセスをさす。前記遺伝物質は、標的細胞のゲノムへの組込みのために意図された前記ウイルスベクター粒子に含まれる１つ又はそれ以上の標的ＲＮＡ配列（以下、標的配列と言う）と組み合わせたウイルスＲＮＡを含むか、又はからなる。
【００８３】
本発明の本方法の文脈において本明細書中で用いられる用語「接触」は、形質導入事象が発生できるように、形質導入される細胞（以下、「標的細胞」とも言う）をレトロウイルスベクターと接触するようにすることをさす。形質導入事象を生じさせる接触条件は、当技術分野でよく知られており、形質導入される細胞にある程度依存し得る。例えば、いくつかの標的細胞は他の細胞よりもトランスフェクトが困難であり、ウイルスベクターによる形質導入が達成される前に、特定の培地中に移す必要があり得る。対応する方法及び条件は、例えばJacomeら（Lentiviral-mediated Genetic Correction of Hematopoietic and Mesenchymal Progenitor Cells From Fanconi Anemia Patients. Mol Ther. 2009 June; 17(6): 1083-1092）、Chuら（Efficient and Stable Gene Expression into Human Osteoclasts Using an HIV-1-Based Lentiviral Vector. DNA Cell Biol. 2008 June; 27(6): 315-320）、又はPoczobuttら（Benign mammary epithelial cells enhance the transformed phenotype of human breast cancer cells. BMC Cancer. 2010; 10: 373）に記載されている。典型的な条件は、実施例に記載されている。
【００８４】
本発明に従って、形質導入される細胞は、ウイルスベクターによる形質導入のために標的とされる、目的の任意の細胞であり得る。本発明において用いられる用語「細胞（cell／cells）」は、単一細胞及び／若しくは単離された細胞、又は組織、生物又は細胞培養等の多細胞エンティティの一部である細胞をさす。言い換えれば、本方法は、インビボ、エクスビボ又はインビトロで行うことができる。好ましくは、形質導入される細胞は、多細胞真核生物のいずれかの細胞を含む真核細胞であり、好ましくは脊椎動物などの動物に由来する細胞である。より好ましくは、形質導入される細胞は、哺乳動物細胞である。本発明の方法に従って、哺乳動物細胞のゲノムを形質導入することによる改変を通じて達成されるべき特定の目的に応じて、原獣類又は獣亜綱などの異なる哺乳動物のサブクラスの細胞を用いてもよい。例えば、獣亜綱のサブクラス内で、好ましくは下綱の真獣亜綱の動物の細胞が、より好ましくは他の霊長類、偶蹄目、奇蹄目、齧歯目及びウサギ目の動物の細胞が、本発明の方法で用いられる。さらに、本発明の方法に従う標的細胞への形質導入を介してゲノムを改変することで達成される目的に応じて、組織の種類及び／又は分化する能力に基づいて、１つの種の中で、本発明の方法で用いられる細胞を同様に選択することができる。３つの基本的な細胞のカテゴリー：生殖細胞、体細胞及び幹細胞は、原則として本発明の方法で形質導入することができるが、これらが哺乳動物の体を構成する。生殖細胞は、配偶子をもたらす細胞であり、従って世代を通して継続する。幹細胞は分裂し、様々な特殊化した細胞型に分化するだけでなく、自身で再生して、より多くの幹細胞を産生することができる。哺乳動物には、２つの主要な種類の幹細胞：胚性幹細胞及び成体幹細胞がある。体細胞は、配偶子、生殖母細胞及び未分化幹細胞ではないすべての細胞が含まれる。哺乳動物の細胞は、分化する能力によって分類することができる。分化全能性（全能性としても知られる）細胞は、接合体（受精卵）及びその後の卵割球等の胎盤組織を含む、成体生物のすべての細胞型に分化することができる細胞である。一方、胚性幹細胞等の多能性細胞は、胎盤等の胚体外組織に貢献することはできず、３つの胚葉：内胚葉、中胚葉及び外胚葉のいずれかに分化する能力を有する。多能性前駆細胞は、細胞系の数が限られた複数の細胞をもたらす能力を有する。さらに、少数の細胞型にのみ発展できる少能性細胞、及び１つの細胞型にしか発展できない単能性細胞（時に前駆細胞と呼ばれる）がある。４つの組織の基本型：筋肉組織、神経組織、結合組織及び上皮組織があり、それらから、例えばリンパ系細胞又は神経幹細胞のような本発明の方法に用いられる細胞が誘導されうる。ヒト細胞が本発明の方法に用いるのために想定される限度において、ヒト細胞がヒト胚から、特にヒト胚の破壊を伴う方法によって得られていないことが好ましい。他方、ヒト胚性幹細胞は、商業的に入手可能であるか、又はヒト胚の破壊を必要としない方法で得られた既存の胚性幹細胞株から採取されるように、当業者が自由に処分できる。代替的に、又はヒト胚性幹細胞の代わりに、例えば誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞等の胚性幹細胞に類似する多能性細胞を用いることができ、その生成は当技術分野の水準にある（Hargus G et al., 2010, Proc Natl Acad Sci U S A, 107: 15921-15926；Jaenisch R. and Young R., 2008, Cell 132: 567-582；Saha K, and Jaenisch R., 2009, Cell Stem Cell 5: 584-595）。
【００８５】
本明細書に上記し、添付の実施例に示すように、リンパ腫細胞株又は腫瘍細胞株等の形質導入が困難な細胞であっても、本発明のレンチウイルスベクター粒子を用いる方法によって形質導入することができることが、本発明に従って見出された。
本発明の細胞に形質導入する方法の好ましい実施態様において、前記方法は、前記細胞を、アジュバント、好ましくは１２．８ｋＤａ〜約１５ｋＤａの分子量を有するポロキサマーと接触させることをさらに含む。
本明細書で用いられる用語「アジュバント」は、レンチウイルス形質導入の効率を高める化合物に関する。アジュバントの非限定的な例には、例えば１２．８ｋＤａ〜約１５ｋＤａの分子量を有するポロキサマー、及びポリブレンが含まれる。
好ましくは、本発明の細胞に形質導入する方法は、前記細胞を１２．８ｋＤａ〜約１５ｋＤａの分子量を有するポロキサマーと接触させることをさらに含む。
【００８６】
用語「ポロキサマー」は、当技術分野でよく知られており、２つのポリオキシエチレンの親水性鎖が両側に置かれた中央のポリオキシプロピレンの疎水性鎖で構成される非イオン性トリブロック共重合体をさす。ブロックコポリマーは、下式で表すことができる。
ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｘ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｚ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｙＨ
（式中、ｚは、（Ｃ３Ｈ６Ｏ）で表される疎水性基部が少なくとも２２５０Ｄａの分子量を有するような整数である。ｘ又はｙは、約８から１８０又はそれ以上の整数である。）
ポロキサマーは、「プルロニック（登録商標）」又は「Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）」（ＢＡＳＦ）の商標名でも知られている。ポリマーブロックの長さはカスタマイズすることができ、その結果、多くの異なるポロキサマーが存在する。本発明の方法に従って用いられるポロキサマーは、少なくとも１２．８ｋＤａ〜約１５ｋＤａの分子量を有するポロキサマーである。上記の一般式から明らかなように、対応する分子量を有するポロキサマーは、ポロキサマーを構成する重合体ブロックの長さを変えて構成することができる。例えば、２つのポロキサマーが、ほぼ同じ分子量を有するが構造的に異なることがある。というのも、一方のポロキサマーがより多くの疎水性ブロックポリマーの繰り返しと、より少ない親水性ブロックポリマーの繰り返しとを有し、他のポロキサマーがより多い親水性ブロックポリマーの繰り返しと、より少ない疎水性ブロックポリマーの繰り返しを有することがあるからである。例えば、ｚは、少なくとも（各値として）４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０又は少なくとも５２のように、４２〜５２の範囲にすることができ、そしてｘ＋ｙは、少なくとも（各値として）２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０又は少なくとも３５０のように、２２０〜３６０の範囲にすることができる。好ましくは、ｚは４４〜５０の範囲であり、ｘ＋ｙは２３５〜２６６の範囲である。ブロックコポリマーの合成は精密ではないから、上記の値は正確には合成によって達成できないかもしれず、その平均値は（本明細書に記載のように）ある程度異なるであろう。好ましくは、ポロキサマーは、１２．８〜約１４．９ｋＤａの分子量、約１３．２〜約１４．９ｋＤａの分子量、約１３．４〜約１４．９ｋＤａの分子量、より好ましくは約１４．０〜約１４．９ｋＤａの分子量、約１４．３〜約１４．８ｋＤａの分子量、約１４．５〜約１４．７ｋＤａの分子量、及び最も好ましくは約１４．６ｋＤａの分子量を有する。当業者に理解されるように、本方法は、多数のポロキサマーを用いて行うことができる。従って、特に異なって明記しない場合は、本明細書で用いられる用語「ポロキサマー」は、用語「ポロキサマーズ」（いくつかのポロキサマーの集まりを表し、ポロキサマー混合物とも呼ばれる）と互換的に用いることができる。本明細書で概説したように、ポロキサマーの合成は精密ではなく、様々な分子量のポロキサマー混合物を生じる。従って、本明細書中で使用されるポロキサマー（ズ）の分子量に関連する用語「平均」は、全て同一の組成を有するポロキサマーを、従って同一の分子量を有するポロキサマーを製造する技術能力がない結果として用いられる。従って、当技術分野の方法に従って製造されるポロキサマーは、各々がその分子量に関して多様性を有するポロキサマーの混合物として存在し、しかしその混合物は全体として本明細書で特定された平均された分子量を有する。当業者は、本発明の方法で用いることができるポロキサマーを得る立場にいる。例えば、ＢＡＳＦ社とシグマアルドリッチ社は、本明細書で記載されるように、ポロキサマーを提供している。分子量を測定する方法は、当技術分野でよく知られており、化学の標準的な教科書に記載されている。実験的に高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）をポロキサマーの分子量を測定するために用いることができる。
【００８７】
レンチウイルスベクター粒子及びアジュバント、好ましくはポロキサマーは、両方の化合物が形質導入を可能にするように同時に標的細胞と接触する限り、同時に、例えば混合物として、又は連続的に、標的細胞に加えることができる。好ましくは、標的細胞、レンチウイルスベクター粒子及びアジュバント（ポロキサマー）は、少なくとも５時間、例えば少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、より好ましくは９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、最も好ましくは少なくとも１２時間、接触させる。また、想定されるのは、より長い時間、例えば少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、又は少なくとも２４時間である。好ましいのは、レンチウイルスベクター粒子及びアジュバント、好ましくはポロキサマーの同時添加である。
【００８８】
本明細書において上記されたポロキサマーの使用は、本質的に標的細胞の生存能力に影響を与えることなく、付着した懸濁した標的細胞におけるレトロウイルスベクターの形質導入率を顕著に高めることが、以前（ＷＯ２０１３／１２７９６４）、見出されている。簡単に言えば、レンチウイルスベクターを用いた場合、「Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８」（ＨＯ−［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｘ−［ＣＨ２Ｃ２Ｈ４Ｏ］ｚ−［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｙ（ｘ＋ｙ＝２６５．４５及びｚ＝５０．３４（Kabanov, A., Zhu, J. & Alakhov, V. Adv. Genet. 53, 231-261(2005)）;平均分子量：１４．６ｋＤａ）と呼ばれるポロキサマーが、当技術分野の水準の形質導入増強剤ポリブレン（１，５−ジメチル−１，５−ジアザウンデカメチルポリメトブロミド）より１００倍高い濃度であっても、ポリブレンより低い細胞毒性を示し、高い形質転換効率を示した（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）。最も驚くべきことには、使用したポロキサマーの形質導入向上効果は、特定の細胞型に限定されなかった。多くの確立された腫瘍細胞株は感染させるのが困難であったが、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８（２６５の親水性エチレンオキシド（ＥＯ）単位と５０の疎水性プロピレンオキシド（ＰＯ）単位からなる１４．６ｋＤａの平均分子量；さらには以下で定義される）を用いることで、トランスフェクトが困難であったリンパ腫細胞株の感染率を大幅に増加させたことが、ＷＯ２０１３／１２７９６４に示されている。
【００８９】
本発明の方法の好ましい実施態様において、ポロキサマーは、式：
ＨＯ−［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｘ−［ＣＨ２Ｃ２Ｈ４Ｏ］ｚ−［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｙ
（式中、ｘ＋ｙ＝２６５．４５、及びｚ＝５０．３４（平均値（Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８）））
を有するか、又はポロキサマーは、式：
ＨＯ−［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｘ−［ＣＨ２Ｃ２Ｈ４Ｏ］ｚ−［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｙ
（式中、ｘ＋ｙ＝２３６．３６、及びｚ＝４４．８３（平均値（Ｆ９８）））
を有する。
【００９０】
１つ目の式のポロキサマーは、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８として当技術分野で知られており、約２６５の親水性エチレンオキシド（ＥＯ）単位と約５０の疎水性プロピレンオキシド（ＰＯ）単位からなる１４．６ｋＤａの平均分子量を有する白色顆粒として合成される。ブロックコポリマーは、アルカリ性触媒の存在下、ＰＯモノマーとＥＯモノマーを連続して添加することで合成される。この合成は、ＰＯブロックの重合で開始され、続いてＰＯブロックの両端にＥＯ鎖が延ばされる。ブロックコポリマーの合成は精密ではないために、ｘ＋ｙとｚの繰り返しは平均値として示される。従って、及び用語「平均値」に関して、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の上記の定義は、前記の中央値からはずれるポロキサマーをも含み、すなわち平均（平均値）から標準偏差内に入るポロキサマーを含む。この比率によって、水又はリン酸緩衝液中で特に問題のない溶解性が与えられる（Kabanov, A., Zhu, J. & Alakhov, V. Adv. Genet. 53, 231-261(2005)）。水溶液中では、ユニマーと呼ばれる単一のポロキサマー分子が、ＰＯコアとＥＯシェルを有するミセルとして自己集合することが記載されている。本明細書で定義された範囲内の分子量を有する例示的なポロキサマーとしてのＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８は、標的細胞での、特にトランスフェクトが困難であることが知られている標的細胞での形質導入効果の強力な増加剤として作用することがＷＯ２０１３／１２７９６４に示されている。
【００９１】
２つ目の式のポロキサマーは、Ｆ９８（Kabanov, A et al. Advances in Genetics. 2005; 53: 231-261）として当技術分野で知られており、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８として、本発明に従って好ましく用いられる。Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８に与えられた用語「平均値」に関する定義は、Ｆ９８にも適用される。
本発明の方法の好ましい実施態様において、前記ポロキサマーは、約５０〜５０００μｇ／ｍｌの濃度で提供される。
本明細書で規定された用語「約」は、必要な変更を加えて実施態様に適用される。
【００９２】
特に好ましいのは、約１００〜４０００μｇ／ｍｌの濃度であり、より好ましくは約２００〜３０００μｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは約３００〜２０００μｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは約４００〜１５００μｇ／ｍｌ、及び最も好ましくは約４５０〜１２５０μｇ／ｍｌの濃度である。また、好ましいのは、約６００〜１０００μｇ／ｍｌ、７００〜１０００μｇ／ｍｌ、８００〜１０００μｇ／ｍｌ、９００〜１０００μｇ／ｍｌの濃度である。後者の濃度では、本明細書で規定されるポロキサマーは、水又はリン酸緩衝液中で希釈した場合、液体状態である。当業者に理解されるように、液体ポロキサマーで細胞に形質導入することは、例えば、より簡便なピペッティング等の便利な取り扱いが可能になるため、実用的により便利になりうる。
本発明のこの方法に従って、ポロキサマーは、好ましくは、水、リン酸緩衝液、又は直接、細胞培養培地に溶解される。ポロキサマーは、例えば、水又はリン酸緩衝液中に溶解させて、所定の使用濃度に希釈することができる１００ｍｇ／ｍｌのストック溶液を得ることができる。２００ｍｇ／ｍｌ以上の濃度のポロキサマー溶液はゲル状である。２００ｍｇ／ｍｌ以下の濃度ではポロキサマー溶液は、液体状態である。好ましくは、濃度は、ポロキサマーが液体状態で提供される程度のものである。
【００９３】
本発明の方法のさらに好ましい実施態様において、標的細胞は、さらにポリカチオン性ポリマー又はポリカチオン性ペプチドの群から選択される１つ又はそれ以上のポリカチオン性物質と接触させる。
本発明において、「ポリカチオン性ポリマー」は、繰り返し単位が正電荷を有し、前記繰り返し単位の正電荷がプロトン化された窒素部分に起因する荷電したポリマーをさす。例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で正に帯電した基は、イミン基である。ポリカチオン性ポリマーの他の非限定的な例は、ポリブレン物質（１，５−ジメチル−１，５−ジアザウンデカメチレンポリメトブロミド、ヘキサジメトリンブロミド）である。
用語「ポリカチオン性ペプチド」は、正に荷電したペプチドをさす。例えば、ポリ−Ｌ−リジンは、（Ｃ６Ｈ１２Ｎ２Ｏ）ｎ（式中、本発明に従って、ｎは少なくとも２、例えば少なくとも２０、好ましくは２００と５００の間、より好ましくは５００と２５００の間であってよいが、これらに限定されない。）の分子式を有するホモポリマーポリカチオン性ペプチドである。
【００９４】
本発明の細胞に形質導入する方法のさらに好ましい実施態様において、前記方法は、標的細胞の前記アジュバントとの接触の前に、接触と同時に、又は接触の後に、偽型レンチウイルスベクター粒子を前記細胞とスピノキュレーションさせるさらなる工程を含む。
本発明の細胞を形質導入する方法のさらにより好ましい実施態様において、前記方法は、標的細胞の前記ポロキサマーとの接触の前に、接触と同時に、又は接触の後に、偽型レンチウイルスベクター粒子を前記細胞とスピノキュレーションさせるさらなる工程を含む。
用語「スピノキュレーション」は、当技術分野でよく知られており、ウイルス粒子の細胞への取り込みのためにごく近く接触することを確実にするための、レンチウイルスベクター粒子との標的細胞の遠心力利用接種に関する。スピノキュレーションのプロトコールは当技術分野でよく知られており、例えば、Millingtonら, 2009［４４］にレンチウイルスベクターについて記載されている。スピノキュレーション工程は、標的細胞の前記アジュバント、好ましくは前記ポロキサマーとの接触の前に、接触と同時に、又は接触の後に行われる。好ましくは、スピノキュレーション工程は、標的細胞をアジュバント、好ましくはポロキサマーと接触させた後に行われる。
スピノキュレーション工程は、実施例５に示されるように、本発明の方法で達成される形質導入率を、特にトランスフェクトが困難な細胞で、さらに増加させる。
【００９５】
本発明の細胞に形質導入する方法のさらに好ましい実施態様において、形質導入される細胞が、腫瘍細胞、リンパ系細胞、上皮細胞、神経細胞及び幹細胞からなる群から選択されるか、並びに／又は、好ましくは、形質導入される細胞が、異種細胞集団の一部である。
本発明における用語「腫瘍細胞」は、当技術分野でよく知られており、良性、前悪性又は悪性の腫瘍の形成に関与する腫瘍細胞をさす。悪性である腫瘍細胞は、一般に癌細胞と呼ばれ、転移し、又は隣接組織に拡散する能力を有しうる。好ましい腫瘍細胞は、例えば、膵臓腫瘍細胞（例えば、ＡｓＰＣ−１及びＰＡＮＣ−１細胞等）、リンパ腫細胞株（例えば、ＫＡＲＰＡＳ−２９９、ＳＵＤＨＬ−１、ＳＵＰ−Ｍ２及びＳＲ−７８６細胞等）、及び乳癌細胞（例えば、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１及びＴ４７ｄ細胞等）である。
用語「リンパ系細胞」は、リンパ球の生成に関与している細胞及びリンパ球自体をさす。用語「リンパ球」は、当技術分野でよく知られているように、小リンパ球（Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、形質細胞）及びナチュラルキラー細胞をさす。リンパ球系細胞はさらに、例えば、リンパ球系樹状細胞、及びプロリンパ球、リンパ芽球、リンパ球系共通前駆細胞等のリンパ球前駆細胞を含む。
【００９６】
用語「上皮細胞」は、当技術分野でよく知られている。上皮細胞は、体全体に空洞や構造体の表面の一面をおおい、また多くの腺を形成する。上皮組織は、単純な上皮（１細胞の厚さ）と重層化された上皮（いくつかの細胞層）に分類することができる。上皮細胞はさらに、それらの形態によって、扁平上皮細胞、立方上皮細胞、柱状上皮細胞及び多列上皮細胞に分類される。例えば、ヒトの胃と腸は上皮細胞で一面をおおわれている。さらに、上皮細胞株は、乳癌細胞（例えば、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１及びＴ４７Ｄ細胞等）又は細胞株ＨＥＫ２９３Ｔの細胞も含む。
「神経細胞」は、当技術分野でよく知られており、電気的に興奮性であり、電気的及び化学的なシグナリングによって情報を送信する細胞である。例えば、感覚ニューロン、運動ニューロン等の様々な特殊化した神経細胞が存在する。例えば、バスケット細胞、ベッツ細胞、中型有棘神経細胞、プルキンエ細胞、錐体細胞、レンショウ細胞、顆粒細胞、又は前角細胞は、本発明に従って標的細胞として用いることができる。「神経腫瘍細胞」は、神経起源の腫瘍細胞であり、例えば神経膠腫、髄芽腫、星細胞腫、及び神経系統由来の他の癌がある。神経膠腫細胞株（例えば、Ｕ８７及びＬＮ１８等）は、本発明の方法に用いることができる。
【００９７】
用語「幹細胞」は、当技術分野でよく知られており、本明細書に詳述されている。本発明の方法に従って用いられる好ましい幹細胞は、例えば、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞、がん幹細胞である。
これらの細胞型の全ては、典型的にトランスフェクト又は形質導入することが困難と考えられているが、今や、本発明の方法に基づいて、より効率的に形質導入することができる。
付加的な、又は好ましい実施態様において、形質導入される細胞は、不均質な細胞集団、すなわち異なる種類の細胞を含む細胞集団（本明細書では「混合集団」とも呼ぶ）の一部である。添付の実施例に示されるように、特に実施例４及び６において、形質導入が、細胞膜結合ドメインが結合し得る標的分子を有する細胞で、明確に高められる。そのような標的分子を有する細胞と有さない細胞を含む混合細胞集団では、形質導入の平衡が前記標的分子を有する細胞に向けてシフトされる。従って、競合する非標的細胞の存在下ですら、それらの標的細胞に対する再標的化されたレンチウイルス粒子の相対的な特異性が得られることが、本明細書に示されている。
【００９８】
さらに、本発明は、さらに
（ａ）（ｉ）本発明の核酸分子；若しくは
（ａ）（ii）本発明の核酸分子、及び細胞膜結合ドメインを含む若しくはからなる（ポリ）ペプチドに連結されていないＶＳＶ−Ｇをコードする核酸配列を含む若しくはからなる核酸分子；
並びに／又は
（ｂ）（ｉ）本発明のベクター；若しくは
（ｂ）（ii）本発明のベクター、及び細胞膜結合ドメインを含む若しくはからなる（ポリ）ペプチドに連結されていないＶＳＶ−Ｇをコードする核酸配列を含む若しくはからなる核酸分子を含むベクター；
並びに／又は
（ｃ）（ｉ）本発明の宿主細胞；若しくは
（ｃ）（ii）本発明の宿主細胞、及び細胞膜結合ドメインを含む若しくはからなる（ポリ）ペプチドに連結されていないＶＳＶ−Ｇをコードする核酸配列を含む若しくはからなる核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞；
並びに／又は
（ｄ）（ｉ）本発明のポリペプチド；若しくは
（ｄ）（ii）本発明のポリペプチド、及び細胞膜結合ドメインを含む若しくはからなる（ポリ）ペプチドに連結されていないＶＳＶ−Ｇ；
並びに／又は
（ｅ）本発明の偽型レンチウイルスベクター粒子；
並びに、必要に応じて、使用説明書
を含むキットに関する。
【００９９】
キットの様々な成分は、１つ又はそれ以上のバイアル等の１つ又はそれ以上の容器中に包装されてもよい。バイアルは、前記成分に加えて、保存のために防腐剤又は緩衝剤を、維持及び保管のために媒体、例えば、特にＥＳ細胞培地、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、ゲンタマイシンを含んでもよい。有利には、キットは、当業者が例えば、本発明の種々の実施態様を簡便に実施できるようにする、前記成分の使用についての説明書を含む。前記成分のいずれかは、実験のセッティングで用いてもよい。
【０１００】
本発明の核酸分子、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のポリペプチド、又は本発明の偽型レンチウイルスベクター粒子に関する、本明細書で記載した定義及び好ましい実施態様は、本発明のキットの成分に準用される。例えば、本発明の偽型レンチウイルスベクター粒子は、本明細書で記載したように、ポロキサマーと組み合わせることができる。別の例を挙げれば、本発明のＶＳＶ−Ｇの融合タンパク質と細胞膜結合性ドメインに連結されていないＶＳＶ−Ｇとの好ましい比率は、オプション（ａ）（ii）に従って、キットの成分の比率に等しく適用される。従って、特に好ましくは、前記キットに、ＶＳＶ−Ｇの合計量の３３％の量の本発明の核酸物質、及びＶＳＶ−Ｇの合計量の６７％の量の細胞膜結合ドメインを含む又はからなる（ポリ）ペプチドに連結されていないＶＳＶ−Ｇをコードする核酸配列が含まれる。
【０１０１】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術における当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含んでいる特許明細書が優先する。
本明細書中、特に請求項中で特徴付けられた実施態様に関しては、従属請求項に記述された各々の実施態様は、その従属クレームが従属している（独立又は従属している）各々の請求項の各々の実施態様と組み合わされることが意図されている。例えば、独立請求項１が３つの選択肢Ａ、ＢとＣを列挙し、従属請求項２が選択肢Ｄ、ＥとＦを列挙し、請求項１及び請求項２に従属する請求項３が選択肢Ｇ、ＨとＩを列挙している場合、特に異なって記述されていなければ、本明細書には、Ａ，Ｄ，Ｇ；Ａ，Ｄ，Ｈ；Ａ，Ｄ，Ｉ；Ａ，Ｅ，Ｇ；Ａ，Ｅ，Ｈ；Ａ，Ｅ，Ｉ；Ａ，Ｆ，Ｇ；Ａ，Ｆ，Ｈ；Ａ，Ｆ，Ｉ；Ｂ，Ｄ，Ｇ；Ｂ，Ｄ，Ｈ；Ｂ，Ｄ，Ｉ；Ｂ，Ｅ，Ｇ；Ｂ，Ｅ，Ｈ；Ｂ，Ｅ，Ｉ；Ｂ，Ｆ，Ｇ；Ｂ，Ｆ，Ｈ；Ｂ，Ｆ，Ｉ；Ｃ，Ｄ，Ｇ；Ｃ，Ｄ，Ｈ；Ｃ，Ｄ，Ｉ；Ｃ，Ｅ，Ｇ；Ｃ，Ｅ，Ｈ；Ｃ，Ｅ，Ｉ；Ｃ，Ｆ，Ｇ；Ｃ，Ｆ，Ｈ；Ｃ，Ｆ，Ｉの組み合わせに対応する実施態様が開示されていると理解されるべきである。
【０１０２】
同様に、独立請求項及び／又は従属請求項が選択肢を列挙していない場合でも、従属請求項が先行する複数の請求項に従属していれば、それによって保護される主題の任意の組み合わせが明示的に開示されていると考えられることが理解される。例えば、独立請求項１があり、従属請求項２が請求項１に従属し、従属請求項３が請求項１と２の両方に従属している場合、請求項３と請求項１の主題の組み合わせは、請求項３、請求項２及び請求項１の主題の組み合わせと同様に、明確かつ明白に開示されていることになる。さらに、従属請求項４が請求項１〜３のいずれかに従属して存在している場合、請求項４と請求項１の主題の組み合わせ、請求項４、請求項２及び請求項１の主題の組み合わせ、請求項４、請求項３及び請求項１の主題の組み合わせ、並びに請求項４、請求項３、請求項２及び請求項１の主題の組み合わせが明確かつ明白に開示されていることになる。
上記の考慮すべき事項は、添付されているすべての請求項に準用される。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】ｓｃＦｖ−ＶＳＶ−Ｇ融合体を含むレンチウイルス粒子の設計及び製造を示す図である。ＶＳＶ−Ｇプラスミドが、野生型（ｗｔ）及びｓｃＦｖを添加したレンチウイルスの製造のために使用された。ＣＤ３０又はＥＧＦＲの特異性を得るために、いずれかの抗原に対するｓｃＦｖ抗体フラグメントは、シグナル配列（ＳＳ）とＶＳＶ−Ｇのタンパク質配列の間でクローニングされた。検出の目的のために、ＨｉｓタグをＮ末端に融合させた。［略語］ＶＳＶ−Ｇ：水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質Ｇ。Ｈｉｓ６：６個のヒスチジン残基からなＨｉｓタグ。ＶＨ／ＶＬ：可変重鎖／可変軽鎖。
【図２−１】異なる比率のｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ添加レンチウイルス粒子を有するＥＧＦＲ＋ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の形質導入を示す図である。（ａ）異なる比率のｗｔ−ＶＳＶ−Ｇ及びｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ−ＶＳＶ−Ｇをコードするパッケージングプラスミドを用いて製造された、６個の異なるｃｏｐＧＦＰコードレンチウイルス粒子の収率。（ｂ）Ｈｉｓタグ（８４ｋＤａ）による、抗体で再標的化されたレンチウイルス粒子（３３％ｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ−ＶＳＶ−Ｇ，右レーン）の免疫ブロットアッセイ。参考として１００％ｗｔ−ＶＳＶ−Ｇレンチウイルス粒子（左レーン）とレンチウイルスｐ２４コアタンパク質（２４ｋＤａ）が提供された。（ｃ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面上のＥＧＦＲ発現のＦＡＣＳ分析。
【図２−２】異なる比率のｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ添加レンチウイルス粒子を有するＥＧＦＲ＋ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の形質導入を示す図である。（ｄ）ＭＯＩ１（ＭＦＩ：平均蛍光強度）で（（ａ）のような）異なる比率のｓｃＦｖ添加レンチウイルス粒子で形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析。（ｅ）（ｄ）で記載された、実行されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における形質導入実験の統計的定量化（３回の異なる実験，平均±ＳＤ，＊ ｔ検定でｐ＜０．０５）。
【図３】抗体で再標的化されたレンチウイルスの形質導入に影響を与えるファクターを示す図である。（ａ）Ｔ４７Ｄ（ＥＧＦＲ＋）とＺＲ７５（ＥＧＦＲ−）細胞の表面上のＥＧＦＲ発現のＦＡＣＳ分析。（ｂ＋ｃ）異なる比率タイプのｃｏｐＧＦＰコードｓｃＦｖ付加レンチウイルス粒子でのＭＯＩ１でのＴ４７Ｄ（ｂ）とＺＲ７５（ｃ）細胞の形質導入後のＧＦＰ発現の定量。（ｄ）ｓｃＦｖ抗体フラグメントとＶＳＶ−Ｇの間の融合リンカーを保有するか、又はそのような融合リンカーを保有していないｗｔ及びｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ付加レンチウイルス粒子（ＭＯＩ１）で培養したＴ４７Ｄ細胞における形質導入実験の定量（３回の異なる実験，平均±ＳＤ，＊ ｔ検定でｐ＜０．０５）。
【図４−１】ｓｃＦｖ−αＣＤ３０付加レンチウイルス粒子によるＣＤ３０＋リンパ腫細胞の形質導入を示す図である。（ａ）ＫＡＲＰＡＳ−２９９、ＳＵＰ−Ｍ２、ＳＵＤＨＬ１及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面上のＣＤ３０発現のＦＡＣＳ分析。
【図４−２】ｓｃＦｖ−αＣＤ３０付加レンチウイルス粒子によるＣＤ３０＋リンパ腫細胞の形質導入を示す図である。（ｂ＋ｃ）スピノキュレーションと共に、又は無しに、ＭＯＩ１０若しくは１のｃｏｐＧＦＰコードレンチウイルス粒子、ポロキサマーに基づくアジュバント及びｓｃＦｖ−αＣＤ３０付加ＶＳＶ−Ｇで培養された記載された細胞における形質導入実験の統計的定量化（３回の異なる実験，平均±ＳＤ，＊ ｔ検定でｐ＜０．０５，＊＊ ｔ検定でｐ＜０．０１）。
【図４−３】ｓｃＦｖ−αＣＤ３０付加レンチウイルス粒子によるＣＤ３０＋リンパ腫細胞の形質導入を示す図である。（ｄ＋ｅ）スピノキュレーションと共に、又は無しに、ＭＯＩ１０若しくは１のｃｏｐＧＦＰコードレンチウイルス粒子、ポロキサマーに基づくアジュバント及びｓｃＦｖ−αＣＤ３０付加ＶＳＶ−Ｇで培養された記載された細胞における形質導入実験の統計的定量化（３回の異なる実験，平均±ＳＤ，＊ ｔ検定でｐ＜０．０５，＊＊ ｔ検定でｐ＜０．０１）。
【図５】非標的細胞の存在下での競合的形質導入アッセイにおけるＳｃＦｖ−ＶＳＶ−Ｇ付加標的細胞の形質導入を示す図である。（ａ）ＨＬ６０白血病細胞の表面上のＣＤ３０発現のＦＡＣＳ分析。（ｂ）ＫＡＲＰＡＳ−２９９とＨＬ６０細胞、又は（ｃ）ＺＲ７５とＴ４７Ｄ細胞を、同じ細胞数で混合し、（左側）ｗｔレンチウイルス粒子で、（右側）ＭＯＩ１で３３％のｓｃＦｖ−ＶＳＶ−Ｇ付加レンチウイルス粒子で、形質導入した。細胞蛍光ドットブロット（ＦＳＣ対ＣＤ３０又はＥＧＦＲ発現）では、２つの集団を区別することができた：（ｂ）におけるＣＤ３０−ＨＬ６０細胞とＣＤ３０＋ＫＡＲＰＡＳ−２９９細胞、又は（ｃ）におけるＥＧＦＲ−ＺＲ７５細胞とＥＧＦＲ＋Ｔ４７Ｄ細胞。下側のドットブロット（ＧＦＰ発現対ＦＳＣ）において、ゲートされた細胞集団は、ｃｏｐＧＦＰ発現について分析した。グラフは、実施された３つの複製についての１つの実験を表す。
【発明を実施するための形態】
【０１０４】
実施例によって、本発明が説明される。
【実施例】
【０１０５】
実施例１：材料と方法
細胞株
ヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，Pan Biotech，ドイツ，アイデンバッハ）及び２ｍＭグルタミンを補充したＤＭＥＭ培地中で培養した。未分化大細胞リンパ腫細胞株ＫＡＲＰＡＳ−２９９、ＳＵＤＨＬ−１及びＳＵＰ−Ｍ２、及び前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ６０は、１０％ＦＣＳ及び２ｍＭグルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。上皮乳房腫瘍細胞株ＺＲ７５及びＴ４７Ｄは、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン及び０．２Ｕ／ｍｌウシインシュリン（Cell Application Inc.，カリフォルニア，サンディエゴ）を含むＲＰＭＩ培地中で培養した。
【０１０６】
ｓｃＦｖ−αＣＤ３０−／ｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ−ＶＳＶ−Ｇプラスミドのエンジニアリング
ＭｆｅＩ制限部位は、パッケージングベクターｐＭＤ２．Ｇ（例えば、Addgene.orgから入手可能）中で利用可能なＶＳＶ−Ｇ（インディアナ血清型）のＳＳにエラープローンＰＣＲを介して加えた。Ｎ末端にＨｉｓタグを導入するために、ｓｃＦｖ−αＣＤ３０及びｓｃＦｖ−αＥＧＦＲのｃＤＮＡ（これらの配列は、例えばGeneArt（登録商標）等の供給業者から注文可能である）は、ＭｆｅＩ−Ｈｉｓタグセンスプライマー（5'-GCGACCAATTGCCATCATCATCATCATCATGCCCAGGTCAAGCTGCAGGAGTGGACTGAACTGGCAAAG；配列番号１１）、及びＸｈｏＩ部位（5'-GTAATCTCGAGCCACCTCCTGAACCGCCTCCCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCACACCGAACGTGGCG；配列番号１２）を係留（harbouring）し、リンカー配列の半分（柔軟なリンカー：GGGSGGGSSGGGS）を含むアンチセンスプライマーを用いて増幅した。加えた際、リンカーの他の半分は、ＰＣＲ（5'-GTTATCTCGAGCGGAGGCGGTTCAAAGTTCACCATAGTTTTTCCACACAACAAAAGAAACTG（配列番号１３）及び5'-GTATTACCGGTTCCTGGGTTTTTAGGAGCAAGATAGCTGAGATCCACTG（配列番号１４）ＶＳＶ−Ｇ内のＡｇｅｌ制限部位を使用する）で、ＶＳＶ−ＧのＮ末端に結合した。両生成物は、ＭｆｅＩ／ＸｈｏＩ又はＸｈｏＩ／Ａｇｅｌのいずれかで二重に消化して、（ＭｆｅＩ／Ａｇｅｌ消化で線状化された）ｐＭＤ２．Ｇに再挿入した。ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ制限酵素は、Fermentas（リトアニア，ビリニュス）から購入した。オリゴヌクレオチドは、Eurofins MWG Operon（ドイツ，エベルスベルク）から入手した。
【０１０７】
レンチウイルスの製造
レンチウイルス形質導入ベクターｐＧｒｅｅｎＰｕｒｏ（System Biosciences，米国，カリフォルニア，マウンテンビュー）は、内部ＣＭＶプロモーターで制されるｃｏｐＧＦＰの発現を可能にする。複製欠損レンチウイルス粒子は、８μｇのｐＧｒｅｅｎＰｕｒｏ、１６μｇ又は８μｇのパッケージングプラスミドｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥとｐＲＳＶ．Ｒｅｖ（例えばAddgene.orgから入手可能）、４μｇの様々な比のｐＭＤ２．Ｇ、ｐＭＤ２．Ｇ ｓｃＦｖ−αＣＤ３０又はαＥＧＦＲを有する１０ｃｍのペトリ皿中でＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性コトランスフェクションによって製造した。トランスフェクションには、リポフェクタミン２０００（Life Technologies，米国，カリフォルニア，カールズバッド）を製造業者の指示書に従って使用した。ウイルス粒子は、トランスフェクションから４８時間後に回収し、低速遠心分離で細胞破片を取り除き、０．４５μｍステリカップフィルターを用いて濾過した。レンチウイルス上清を、前述［２４］の通り、アミコン−２０カラム（Millipore，米国，マサチューセッツ，ビレリカ）を用いた限外濾過によって濃縮した。濃縮レンチウイルスのアリコートを−８０℃で保存した。ウイルス力価（濃縮アリコート１ｍｌ当たりのウイルス粒子）は、連続的に希釈したレンチウイルスのアリコートを用いて、QuickTiter（商標）レンチウイルス定量ｐ２４ＥＬＩＳＡ（BioCat，ドイツ，ハイデルベルク）によって同社のプロトコールに従って、決定した。
【０１０８】
免疫ブロット分析
ウイルスタンパク質の調製のために、２μｌの濃縮レンチウイルス溶液を、尿素サンプル緩衝液（５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、８Ｍ尿素、２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．０３％ブロモフェノールブルー、２．５％ジチオスレイトール、ｐＨ８．０）中で９５℃で１０分間インキュベートすることで変性させた［２５］。サンプルは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（１４％）で分画し、ニトロセルロース膜（GE Healthcare，英国，リトルチャルフォント）に移した。Ｈｉｓタグ付きのｓｃＦｖ−αＣＤ３０−ＶＳＶ−Ｇ又はｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ−ＶＳＶ−Ｇは、マウス抗Ｈｉｓ抗体（クローン１３／４５／３１，Dianova，ドイツ，ハンブルク）、及び続いて、抗マウス抗体が結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ（Santa Cruz Biotechnology，米国，カリフォルニア，サンタクルス）を用いて検出した。マウス抗体（BioCat，ドイツ，ハイデルベルク）で検出されるレンチウイルスコアタンパク質ｐ２４を、レンチウイルスタンパク質の内部標準として使用した。ブロットした膜は、供給業者が推奨するように、ＥＣＬアドバンスウエスタンブロット検出システム（GE Healthcare）で展開した。
【０１０９】
レンチウイルスの形質導入
ＨＥＫ２９３Ｔ、ＺＲ７５及びＴ４７Ｄ細胞（２×１０５細胞／ウェル）が、１０μｌのポロキサマーに基づく化学アジュバント（LentiBoost（商標），シリオンバイオテック社，ドイツ，マルティンス）［２３］を有するか又は有さない１ｍｌのレンチウィルス含有培地で、異なるＭＯＩ（レンチウイルス粒子／細胞）で覆われた。３７℃で５％ＣＯ２で２４時間培養した後、上清を新鮮な培地に交換し、さらに２４時間培養した。
ＫＡＲＰＡＳ−２９９、ＳＵＤＨＬ−１又はＳＵＰ−Ｍ２懸濁細胞（１０６細胞／ウェル）は、１ｍｌのレンチウイルス含有培地に再懸濁した。プレートを８００ｇで９０分間、遠心分離（スピノキュレーション）した。スピノキュレーション後、直接、ＳＵＤＨＬ−１細胞を洗浄し、新鮮な培地に再懸濁させ、４８時間培養した。遠心分離後、ＫＡＲＰＡＳ−２９９、ＳＵＰ−Ｍ２及びＨＬ６０細胞を、１ｍｌのレンチウイルス含有培地中で一晩培養し、その後、洗浄し、新鮮な培地に再懸濁し、さらに２４時間培養した。競合アッセイのために、５×１０５のＫＡＲＰＡＳ−２９９及び５×１０５のＨＬ６０細胞又は１０５のＴ４７Ｄ及び１０５のＺＲ７５細胞の混合物を、ポロキサマーに基づくアジュバントLentiBoost（商標）を有する１ｍｌのレンチウイルス含有培地に再懸濁した。懸濁細胞を８００ｇで９０分間、遠心分離し、一晩培養し、その後、洗浄し、再度２４時間培養した。
【０１１０】
細胞蛍光分析
レンチウイルスの形質導入後、細胞を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。ＦＡＣＳＤｉｖａ（BD Biosciences，ドイツ，ハイデルベルク）を用いて、前方及び側方散乱特性及び５３０ｎｍの緑色蛍光発光について、３万イベントが分析された。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は形質導入された細胞の蛍光強度の変化を定量化する。
ＣＤ３０又はＥＧＦＲの表面発現を検出するために、２％ＦＣＳを補充したＰＢＳで、１０６細胞を２回洗浄し、１００μｌの抗体希釈液（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ中１：２０；ＦＩＴＣ結合αＣＤ３０又はαＥＧＦＲ抗体及びアイソタイプ対照，Dako，デンマーク；ＰＥ結合αＣＤ３０又はαＥＧＦＲ抗体，BioLegend，米国，カリフォルニア，サンディエゴ）中で、氷上で１時間、培養した。サイトメトリー検出（ＦＩＴＣ：５３０ｎｍ；ＰＥ：６１０ｎｍ）の前に、細胞を２回洗浄し、ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ中に再懸濁した。
【０１１１】
統計分析
全ての実験は、技術的には二重試験で、生物学的には三重試験で行った。平均±標準偏差（ＳＤ）の値は、特に明記しない限り、示された。得られた結果を、統計ソフトウェアSigmaPlot（Systat Software，カリフォルニア，サンノゼ）を用いて、ｔ検定で統計的に評価した。統計的有意性は、＊ｐ＜０．０５レベルで考慮した。
【０１１２】
実施例２：ｓｃＦｖ−ＶＳＶ−Ｇ融合体を含むレンチウイルス粒子の設計及び製造
ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルス粒子の製造のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｃｏｐＧＦＰ発現レンチウイルス発現ベクターと３つのパッケージングプラスミド（それらの１つがＶＳＶ−Ｇ（ｐＭＤ２．Ｇ）をコードする）とを含む４つのプラスミドの混合物で一過的にトランスフェクトした。それぞれＣＤ３０又はＥＧＦＲを認識する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ−αＣＤ３０又はｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ）を組み込むために、シグナル配列（ＳＳ）及び全長ＶＳＶ−ＧのＮ末端との間に挿入された、Ｎ末端Ｈｉｓタグと、それに続いてｓｃＦｖ抗体フラグメント、柔軟なリンカー（GGGSGGGSSGGGS）を含む新規ＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質が設計された（図１）。最適なレンチウイルスベクターの構成を決定するために、野生型（ｗｔ）ＶＳＶ−Ｇ又はｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ付加ＶＳＶ−ＧのいずれかをコードするｐＭＤ２．Ｇプラスミドを異なる比率で有するＧＦＰコードｓｃＦｖで再標的化されたレンチウイルス粒子が生成された。１０％、２０％、３３％及び６７％のｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ−ＶＳＶ−Ｇを有する抗体で再標的化された粒子が、同等の収率（レンチウイルスコアタンパク質ｐ２４を検出するＥＬＩＳＡアッセイで定量化）で製造することができた（図２ａ）。製造混合物中のｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ−ＶＳＶ−Ｇコードプラスミドの高い比率によって、ｗｔ−ＶＳＶ−Ｇレンチウイルスの製造と比較して低い収率がもたらされた。レンチウイルス粒子へのｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ−ＶＳＶ−Ｇの取り込みは、ｓｃＦｖ−ＶＳＶ−Ｇ偽型粒子のイムノブロットで示された。膜結合型ＶＳＶ−Ｇの可能な蓄積が認められたが（白い雲）、ＨｉｓタグｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ−ＶＳＶ−Ｇの明確なバンドが検出された（図２ｂ）。
【０１１３】
実施例３：異なる比率のｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ添加レンチウイルス粒子を有するＥＧＦＲ＋ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の形質導入
ＧＦＰコード抗体で再標的化された粒子は、ＭＯＩ１でサイトメトリー分析（図２ｃ〜ｅ）でＥＧＦＲ＋ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に感染する能力を試験した。ｗｔ−ＶＳＶ−Ｇレンチウイルス粒子は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の２４．１％に感染できるが、ｓｃＦｖ−ＶＳＶ−Ｇ追加レンチウイルス粒子は、感染率を大幅に２．５倍（３３％ｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ−ＶＳＶ−Ｇを有する粒子で６２．３％）に向上させることができた。６７％のｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ−ＶＳＶ−Ｇを担持する抗体で再標的化されたレンチウイルス粒子は、感染率がｗｔ−ＶＳＶ−Ｇレンチウイルス粒子の半分（１３．４％）のみであり、ホモタイプ（１００％）のｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ−ＶＳＶ−Ｇレンチウイルス粒子は感染性ではなかった（図２ｄ，ｅ）。
【０１１４】
実施例４：抗体で再標的化されたレンチウイルスの形質導入に影響を与えるファクター
ｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ−ＶＳＶ−Ｇを提示するレンチウイルス粒子は、ＥＧＦＲ＋ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に感染することができた。向上された形質導入率の特異性を確認するために、抗原発現Ｔ４７Ｄ乳癌細胞及び抗原陰性ＺＲ７５細胞の両方を、細胞モデルとして用いた（図３ａ）。Ｔ４７Ｄ細胞では、３３％ｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ−ＶＳＶ−Ｇレンチウイルス粒子は、ｗｔ−ＶＳＶ−Ｇレンチウイルス粒子（３３．７％）と比較して感染率が２倍（６７．５％）に高まり、最高の性能を示した。上記の通り、より高いプラスミド量のｓｃＦｖ添加ＶＳＶ−Ｇ（１００％）を含有するウイルスの製造は、サイトメトリ−アッセイにおいてＥＧＦＲ＋細胞の感染に失敗した（図３ｂ）。３３％ｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ−ＶＳＶ−Ｇレンチウイルス粒子でのＥＧＦＲ−ＺＲ７５細胞の形質導入では、形質導入率が増加せず（図３ｃ）、このことから、ｓｃＦｖ標的化されたレンチウイルス粒子の増強効果がタ−ゲット細胞表面上の抗原の存在と相関していることが証明された。
融合タンパク質のドメインの大きさ及び付着メカニズムの両方が、組換融合タンパク質の正しい折り畳み及び機能のために重要である。融合リンカ−（１３アミノ酸：GGGSGGGSSGGGS）の役割を評価するために、我々は、ｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ抗体フラグメントの可変軽鎖配列とＶＳＶ−Ｇ遺伝子配列を分離するリンカー配列が無いｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ−ＶＳＶ−Ｇを設計した（参照：図１ａ）。融合リンカーが無い３３％ｓｃＦｖ−αEＧＦＲ−ＶＳＶ−Ｇレンチウイルス粒子の製造は、３３％ｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ−ＶＳＶ−Ｇレンチウイルス粒子の製造と比較して、ウイルス収率が強く減少した（２．５×１０８対９．１×１０８ウイルス粒子／ｍｌ）。融合リンカーの無い抗体で再標的化された粒子は、Ｔ４７Ｄ細胞の形質導入率を増加させることができなかった（図３ｄ）。我々は、抗体とＶＳＶ−Ｇとの間のリンカー配列は、ｓｃＦｖ−ＶＳＶ−Ｇで再標的化されたレンチウイルス粒子の改善された機能に影響するとの結論を下した。
【０１１５】
実施例５：ＣＤ３０＋リンパ腫細胞のための最適化された形質導入プロトコール
低いレンチウイルス感染力価（ＭＯＩ２以下）は、最も接着性の上皮細胞に形質導入するのに十分である。しかし、懸濁のリンパ腫細胞等の造血細胞では、高いレンチウイルス力価（ＭＯＩ１０）であっても、一部の細胞集団しか形質導入できない。従って、スピノキュレーション、ポロキサマーに基づく化学アジュバント、及びｓｃＦｖで再標的化されたＶＳＶ−Ｇエンベロープを組み合わせることによって、最適化された感染プロトコールが開発された。ＫＡＲＰＡＳ−２９９、ＳＵＰ−Ｍ２及びＳＵＤＨＬ−１リンパ腫細胞は、ＣＤ３０−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較して、高いＣＤ３０表面発現レベルを示す（図４ａ）。ＭＯＩ１０でのリンパ腫細胞の標準的な形質導入によって、２０〜４０％の形質導入率がもたらされた（図４ｂ〜ｄ）。スピノキュレーション及び化学アジュバントを追加することで、レンチウイルス感染が増加した。さらに、レンチウイルスの表面の３３％をｓｃＦｖ−αＣＤ３０−ＶＳＶ−Ｇで改変したところ、ＭＯＩ１０での形質導入率が９０％を超えるレベルに向上した（ＳＵＤＨＬ−１細胞でｗｔ−ＶＳＶ−Ｇよりも４倍の改善）。レンチウイルス粒子の力価がＭＯＩ１に減少したとしても、本形質導入プロトコールを用いることで５０％のリンパ腫細胞が形質導入できた。従って、本最適化されたシステムを用いることで、以前の当技術分野のプロトコールと比較すると１０倍以上の形質導入効率の増加が得られた。対照的に、ＣＤ３０−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、レンチウイルス表面の改変によって利益を得ることができず、特定の抗原の存在が必要であることがはっきりと示された。これらのデータは、ｓｃＦｖ−αＥＧＦＲ−ＶＳＶ−Ｇ付加レンチウイルスが用いられたときのＥＧＦＲ−ＺＲ７５細胞への効果（図３ｃ）と相関する。すべての試験した細胞型で、３３％のｓｃＦｖ−ＶＳＶ−Ｇで偽型化されたレンチウイルスベクターの使用によって、最高の形質導入の結果が得られた。
【０１１６】
実施例６：非標的細胞の存在下でのＳｃＦｖ−ＶＳＶ−Ｇ付加による標的細胞の形質導入
単一細胞型の培養において、ｓｃＦｖで再標的化されたレンチウイルス粒子は、ｗｔ−ＶＳＶ−Ｇ偽型ベクターよりもより効果的にリンパ腫と上皮腫瘍細胞を形質導入することができた。さらに、その特異性を２つの競合的な細胞形質導入実験で試験した。第１の実験では、接着性のＥＧＦＲ＋Ｔ４７Ｄ細胞及びＥＧＦＲ−ＺＲ７５細胞を共培養した（図５ａ）。第２の実験では、ＣＤ３０＋ＫＡＲＰＡＳ−２９９細胞を、ＣＤ３０−ＨＬ６０前骨髄球性リンパ腫細胞と混合し、両細胞を懸濁液中で培養した（図５ｂ，ｃ）。両方の混合物を、１００％ｗｔ−ＶＳＶ−Ｇレンチウイルス粒子又は３３％ｓｃＦｖ−αＣＤ３０−ＶＳＶ−Ｇレンチウイルス粒子で、ＭＯＩ１で最適化条件（＋スピノキュレーション、＋ポロキサマー系アジュバント）下で感染させた。１００％ｗｔ−ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルス粒子を使用した細胞混合物の各々は、ＦＡＣＳ分析によって類似した形質導入率を示した（第１の実験では、２４．８％形質導入されたＺＲ７５細胞及び２７．３％形質導入されたＴ４７Ｄ細胞；第２の実験では、３７．１％形質導入されたＨＬ−６０細胞及び３６．３％形質導入されたＫＡＲＰＡＳ−２９９細胞）。接着性のＴ４７Ｄ細胞及びＺＲ７５細胞の形質導入と比較して、リンパ腫細胞及びＨＬ６０細胞の懸濁液を用いた実験では、全体としてＧＦＰ発現のＭＦＩ（平均蛍光強度）値がより低かった。
どちらの場合も、ｓｃＦｖで再標的化されたレンチウイルス粒子を使用したときは、形質導入の平衡が、混合物中の抗原陽性細胞型にシフトした（６１．９％のＥＧＦＲ＋Ｔ４７Ｄ細胞、対１７．１％の形質導入されたＥＧＦＲ−ＺＲ７５細胞、及び７２．２％のＣＤ３０＋ＫＡＲＰＡＳ−２９９細胞、対１６．５％の形質導入されたＣＤ３０−ＨＬ６０細胞）。これらの知見は、競合する非標的細胞の存在下であっても、抗体で再標的化されたレンチウイルス粒子がそれらの標的細胞に対する相対的特異性を有することを示している。
【０１１７】
実施例７：検討
リンパ腫腫瘍抗原ＣＤ３０又は広範な上皮腫瘍抗原ＥＧＦＲに対するリンカー融合一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を提示するｓｃＦｖ再標的化ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質を担持する、新たなタイプのレンチウイルス粒子が開発された。スピノキュレーション及びポロキサマーに基づくアジュバントと組み合わせると、抗原陽性細胞における高い形質導入率が低いＭＯＩでも達成された。
様々な化学アジュバントを、レンチウイルス遺伝子導入を高めるために用いることができ、化学アジュバントには膜電荷を中和するカチオン性ポリマー又は脂質に基づく化学物質が含まれる［２６〜２８］。臨床応用のために、レンチウイルス形質導入プロトコールは、しばしばレトロウイルス形質導入増強剤のレトロネクチン、フィブロネクチン由来フラグメントの使用に基づく［２９］。レトロネクチンは、ＧＡＬＶ偽型ベクター及びＲＤ１１４偽型ベクターの活性を促進するが、ＶＳＶ−Ｇ偽型ベクターの形質導入は低いことが報告された［２２，３０，３１］。さらに、懸濁細胞へのレトロネクチンの添加量は、その表面に基づく活性によるため難解である。
【０１１８】
レンチウイルスベクターの形質導入の臨床プロトコールに適した新規なアジュバントを探索した結果、ＣＤ３４＋造血細胞及び初代Ｔ細胞への改善された遺伝子送達を示す、カチオン性ペプチドＶｅｃｔｏｆｕｓｉｎ−１（登録商標）及び両親媒性ポロキサマーＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−１０８（約１４，６００の平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（プロピレングリコール）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（Sigma Aldrich））が最近発見された［３２，２３］。ポロキサマーＦ１０８は、高濃度（＞５ｍｇ／ｍｌ）でも毒性レベルが低く、ＢＡＳＦから入手可能な化学組成物（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ３３８（登録商標））と同一のポロキサマー３３８（登録商標）についてＦＤＡのドラッグマスターファイルがある。
【０１１９】
過去には、抗体−再標的化の研究は、他の糖タンパク質に融合した抗体を提示するレトロウイルスを用いて、又は接合に基づくアプローチによって、行われていた［３３〜３６］。ＶＳＶ−Ｇに基づく研究によって、ＶＳＶ−ＧのＮ末端に新たなタンパク質ドメインを挿入した後に維持することができる粒子会合体の安定化及び膜融合能力［３７］の観点から強力な糖タンパク質として、ＶＳＶ−Ｇの利点が示されている［３８，３９］。ＶＳＶ−ＧのＮ末端に、コラーゲン結合ドメイン［１１］、抗原結合ＺＺドメイン［１２］又はフィブリノーゲン結合部位［１３］を追加することによって、改変されたレンチウイルス粒子（ｗｔ−ＶＳＶ−Ｇとのいくつかの混合物）が、コラーゲン／抗体でコーティングされたマトリックス又はフィブリンヒドロゲルに固定化することができた。その後、ウイルス粒子が付着されたマトリックス上に培養した細胞は、５回までより効率的に形質導入された。１つの研究［１１］で、粒子の製造の間に改変ＶＳＶ−Ｇを温度感受性膜で輸送することによって、許容可能な力価が３０℃でのみ達成できた。これらの方法によって、ウイルス粒子の固定化が向上し、それによって接着性の細胞が固定化したウイルス粒子とポリブレンにごく近く接触させた際、空間的に制御されたウイルスの取り込みを増加させ、レンチウイルス粒子自体の特異性を変化させないことを示した。
【０１２０】
レンチウイルス粒子の選択性を高めるために、Kaikkonenら［４０］は、ｇｐ６４偽型エンベロープ上でＶＳＶ−Ｇの膜貫通ドメインにストレプトアビジンを融合させ、αＥＧＦＲ−アビジン−抗体とαＣＤ４６−アビジン−抗体の接合に基づく結合を誘導させた。これによって、ポリブレンの存在下、ＭＯＩ０．２〜１．２で接着性の肺腫瘍細胞株、肝臓腫瘍細胞株及び卵巣癌細胞株における形質導入率が２倍以上高くなった。しかし、ビオチン化抗体−アダプターが、血清中のビオチニダーゼ活性によって解離する傾向がある［４１］ために、このような非共有結合性の結合アプローチは、制限を持たせることができる。
DrejaとPiechaczyk［１４］は、遍在的に発現するヒトＭＨＣ−Ｉに対して指向されたｓｃＦｖ抗体フラグメントに融合された外来シグナル配列を、全長ＶＳＶ−ＧのＮ末端（リンカーなし）に付加した。彼らは、抗体で再標的化されたレンチウイルス粒子の形成及び細胞との結合が示したが、低い力価と、ヒト細胞への低い感染性しか達成しなかった。
【０１２１】
彼らは、ポリブレンの存在下での非結合性ｓｃＦｖ抗体フラグメントを担持するＶＳＶ−Ｇレンチウイルス粒子と比較して、ヒト細胞の形質導入（ＭＯＩは示されていない）が５倍高い選択性を達成した。我々の結果は、ホモタイプ（１００％）のｓｃＦｖ添加ＶＳＶ−Ｇ粒子がＭＯＩ１で標的細胞を形質導入しなかったので、これらの知見を支持する。抗体フラグメントがＶＳＶ−Ｇの受容体結合部位をマスクしているか、又は空間的妨害がＶＳＶ−Ｇの融合能力を阻害しているかもしれない［４２，４３］。
本研究では、ｗｔ−ＶＳＶ−ＧとｓｃＦｖ添加ＶＳＶ−Ｇの混合物を提示するレンチウイルス粒子を製造することによって、高い形質導入率で特異性を増加させることができた。全ての実験で、ｓｃＦｖ添加ＶＳＶ−Ｇの３３％の比率で最良の結果が得られた。スピノキュレーションとポロキサマーに基づく化学アジュバントを組み合わせることで、抗原陽性リンパ腫細胞の４倍高い形質導入が、非標的ＨＬ６０細胞の存在下であっても、得られた。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
結論
本明細書に記載された組換えｓｃＦｖ−ＶＳＶ−Ｇ融合の戦略は、及び特に上記実施例中の好ましい戦略は、ｓｃＦｖ抗体フラグメントの親和性を変えることで、異なる細胞性抗原に容易に適応できる。挑戦的な非接着性細胞モデルでスピノキュレーション及び化学アジュバントを組み合わせることによって、遺伝子送達速度の顕著な増加が達成された。これらは、工業及び医薬におけるレンチウイルスの適用に有益である。
【０１２３】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【配列表】
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