(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造
【化１】
0006427789.tif 000014
の化合物ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を生成する方法であって、以下
【化２】
0006427789.tif 000015
（式中、
ＰＡＢＯＨはｐ−アミノベンジルアルコールを示し、
ＥＥＤＱは２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリンを示し、
ＰＥＧ−Ｎ３はＯ−（２−アジドエチル）−Ｏ’−（Ｎ−ジグリコリル−２−アミノエチル）ヘプタエチレングリコールを示し、
ＤＩＥＡはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを示し、
ＴＢＤＭＳ−Ｃｌはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドを示し、
ＤＭＡＰは４−ジメチルアミノピリジンを示し、
ＴＢＡＦはテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリドを示し、
ＡｃＯＨは酢酸を示し、
ＰＨ３Ｐはトリフェニルホスフィンを示し、
ＤＣＡはジクロロ酢酸を示し、
Ｆｍｏｃはフルオレニルメチルオキシカルボニル基を示し、
Ｌｙｓはリジン残基を示し、
ＭＭＴはモノメトキシトリチル基を示し、
ＴＢＤＭＳはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基を示し、
中間体４（１０−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８）は、１０位の水酸基がＴＢＤＭＳで保護されたＳＮ−３８である）
に示すような反応スキームを実行することを含み、
前記反応スキームは、Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ（中間体２）をヘプタンで沈殿させる工程をさらに含み、
１０−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８（中間体４）をトリホスゲン及びＤＭＡＰと反応させて１０−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８−２０−Ｏ−クロロギ酸（反応中間体５）を生成させる反応は、中間体４を含有するジクロロメタン反応混合物へトリホスゲンを添加することによって実行され、かつ前記トリホスゲンは少量ずつ添加されて、大規模製造中の発熱反応を低下させかつ高い反応収量を維持し、
銅触媒で触媒した付加環化反応によってアジド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯ−ＣＯ−２０−Ｏ−ＳＮ−３８（中間体７）をＭＣＣ−Ｙｎｅ（中間体８）と反応させて、ＭＣＣ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯ−ＣＯ−２０−Ｏ−ＳＮ−３８（中間体９）を生成する反応は、１４時間実施されて生成収量を改善し、
中間体９は、まずシリカゲルクロマトグラフィーによって精製され、次いでＥＤＴＡを用いて抽出されて銅が除去される、方法。
【請求項２】
ＣＬ２Ａ−ＳＮ３８のマレイミド部分を抗体または抗原結合抗体フラグメントと反応させて、ＳＮ３８−結合抗体または抗体フラグメントを生成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体及びＩｇＧ４抗体の半分子からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体または抗体フラグメントは、１分子〜１２分子のＣＬ２Ａ−ＳＮ３８と結合している、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体は、ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ＲＳ７（抗ＥＧＰ−１）、ＰＡＭ４（抗ＭＵＣ５ＡＣ）、ＫＣ４（抗ムチン）、Ａ１９（抗ＣＤ１９）、Ａ２０（抗ＣＤ２０）、ＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）、ＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、ＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、Ｒ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ）、Ｍｕ−９（抗ＣＳＡｐ）、Ｉｍｍｕ３１（抗ＡＦＰ）、ＣＣ４９（抗ＴＡＧ−７２）、Ｊ５９１（抗ＰＳＭＡ）、ＨｕＪ５９１（抗ＰＳＭＡ）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（抗ＰＳＭＡ二量体）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ）、Ｇ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ）及びｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体または抗体フラグメントは、炭酸脱水酵素ＩＸ、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α−アクチニン４、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂａ７３３、ＢＡＧＥ、ＢｒＥ３−抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ〜ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１α、結腸特異的抗原ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ−β、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＡＧ−３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１受容体、胎盤増殖因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、トムソン・フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死性抗原（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、Ｋｒａｓ、ならびに癌遺伝子産物からなる群から選択される抗原へ結合する、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２０１３年７月２３日出願の米国特許出願第１３／９４８，７３２号に対する優先権を主張する。
【０００２】
（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含有しており、その全体が参照により本明細書により組み込まれる。２０１４年４月４日作成の当該ＡＳＣＩＩコピーは、ＩＭＭ３４０ＷＯ２＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、大きさは６０，５９７バイトである。
【０００３】
本発明は、種々の癌細胞、感染性病原体を標的にするための改良された能力を有する、及び／または自己免疫疾患を治療するための治療用免疫複合体に関するものであり、当該複合体は、抗体部分と薬剤のカンプトテシン群から選択された薬剤部分とを含有する。抗体部分及び薬剤部分は、治療的効能を高める細胞内切断可能結合を介して結合している。最も好ましくは、以下に説明するとおり、カンプトテシンはＳＮ−３８であり、抗体部分及び薬剤部分を結合するリンカーはＣＬ２Ａである。特定の実施形態において、免疫複合体は、効能を最適にして毒性を最小限にする特異的な薬用量及び／または投与スケジュールで投与され得る。本明細書に開示するヒトでの治療用途のためのＳＮ−３８複合型抗体の投与に関する最適な薬用量及びスケジュールは、動物モデル試験から予測することのできなかった予期せぬ優れた効能を示しており、親化合物であるイリノテカン（ＣＰＴ−１１）を含む標準的な抗癌療法に対して抵抗性のある癌の有効な治療を可能にする。
【背景技術】
【０００４】
何年もの間、ヒトの癌への毒性薬剤の特異的な送達のためのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を使用することが、特異的に標的化する薬剤療法の分野において科学者の目標であった。腫瘍結合型ＭＡｂの複合体及び適切な毒性薬が開発されてきたが、癌の療法における成功は部分的なものであり、実質的には感染性疾患及び自己免疫疾患などの他の疾患においては何ら適用がなかった。毒性薬は、最も一般的には化学療法薬であるが、粒子放出性放射線核種、または細菌性もしくは植物性の毒素も特に癌療法のためにＭＡｂに結合しており（Ｓｈａｒｋｅｙ及びＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．２００６  ７〜８月号：５６（４）：２２６〜２４３）、より最近では、ある特定の感染性疾患の前臨床療法のための放射性免疫複合体が用いられている（Ｄａｄａｃｈｏｖａ及びＣａｓａｄｅｖａｌｌ，Ｑ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２００６；５０（３）：１９３〜２０４）。
【０００５】
ＭＡｂ−化学療法薬複合体を用いる利点は、（ａ）化学療法薬自体が構造上十分に定義されている、（ｂ）化学療法薬が非常に十分に定義された結合化学法を用いて、しばしばＭＡｂ抗原結合領域から遠隔の特異的な部位でＭＡｂタンパク質に結合している、（ｃ）ＭＡｂ−化学療法薬複合体がＭＡｂ及び細菌性もしくは植物性の毒素を包含する化学複合体よりも再現可能に作製することができ、このため、商業的開発及び規制認可をより受けることができる、ならびに（ｄ）ＭＡｂ−化学療法薬複合体が放射性核種ＭＡｂ複合体よりも毒性の程度が全身的にはるかに低いことである。
【０００６】
タンパク質−薬剤複合体に関する初期の研究は、薬剤が一旦標的細胞へと内在化すると、タンパク質−薬剤複合体が有用な治療薬であるように好ましくはその本来の形態で放出されることを示した。Ｔｒｏｕｅｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６２６〜６２９（１９８２））は、薬剤と抗体部分の間に、そのままの薬剤を遊離させるためにリソソームで切断される特異的なペプチドリンカーを用いる利点を示した。特に、ヒドラゾンを含有するものなど、弱酸で切断可能なリンカーを用いて調製したＭＡｂ−化学療法薬複合体が、腫瘍内部のｐＨが正常な生理学的ｐＨよりもしばしば低いという観察を基に開発された（Ｗｉｌｌｎｅｒら，米国特許第５，７０８，１４６号、Ｔｒａｉｌら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：２１２〜２１５（１９９３）））。第一の認可されたＭＡｂ−薬剤複合体であるゲムツズマブ・オゾガマイシンは、抗ＣＤ３３抗体であるヒト化Ｐ６７．６と強力なカリチアマイシン誘導体の間の酸不安定性ヒドラゾン結合を組み込んでいた（Ｓｉｅｖｅｒｓら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９：３２４４〜３２５４（２００１）、Ｈａｍａｎｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：４７〜５８（２００２））。いくつかの場合において、ＭＡｂ−化学療法薬複合体は、化学療法薬とＭＡｂの間の還元性に不安定の束縛されたジスルフィド結合を用いて作製された（Ｌｉｕら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：８６１８〜８６２３（１９９６））。
【０００７】
さらに別の切断可能なリンカーは、１〜４個のアミノ酸を含有するＴｒｏｕｅｔらのリソソームで不安定性のペプチドスペーサーと類似のＰｈｅ−ＬｙｓまたはＶａｌ−ＣｉｔなどのカテプシンＢ不安定性ジペプチドスペーサーを包含しており、薬剤とジペプチドの間の折りたたみ可能なスペーサーを追加的に組み込んだ（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：８５５〜８６９（２００２）、Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅら，米国特許第６，２１４，３４５  Ｂ１号、Ｄｏｒｏｎｉｎａら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７７８〜７８４（２００３））。後者のアプローチはまた、カンプトテシンの免疫複合体の調製において利用された（Ｗａｌｋｅｒら，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．１２：２１７〜２１９（２００２））。探索されてきた別の切断可能な部分は、抗体と化学療法薬の間のリンカーへと組み込んだエステル結合である。Ｇｉｌｌｉｍａｒｄ及びＳａｒａｇｏｖｉは、パクリタキセルのエステルを抗ラットｐ７５ＭＡｂ、ＭＣ１９２、または抗ヒトＴｒｋＡ  ＭＡｂである５Ｃ３と結合させた場合、複合体が標的特異的毒性を呈することを発見したことを認めた（Ｇｉｌｌｉｍａｒｄ及びＳａｒａｇｏｖｉ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：６９４〜６９９（２００１））。
【０００８】
抗体−薬剤複合体設計に関する現行の考え方は、細胞内でのみ切断する安定した結合を用いて抗体に結合させた超毒性薬の使用を強調している。このアプローチは、カリチアマイシン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、及びマイタンシノイドなどの超毒性薬の複合体を設計するのに使用されてきた。ＭＡｂに対する非常に安定した結合は結果的に、循環中の安定性を生じるが、複合体はまた、肝臓、脾臓、及び腎臓において処理され、それにより当該器官において毒性薬を放出し、疾患治療適用における治療ウィンドウを潜在的に低下させる。ホジキンリンパ腫のためのＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）、及び難治性乳癌のためのＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（アドトラスツズマブエムタンシン）の最近の規制認可は励みとなるが、非ホジキンリンパ腫におけるカリチアマイシン複合体の最大限の投与可能な薬用量における治療効能の欠如、及び当該複合体のその後の中止、ならびに急性骨髄性白血病のためのゲムツズマブ・オゾガマイシンの市場からの撤退は、抗体薬剤複合体（ＡＤＣ）において超毒性薬を用いる限界を示している。
【０００９】
本発明の複合体は、結合していないまたは「裸の」抗体または抗体フラグメントよりも大きな効能を有しているが、このような非結合型抗体部分は、特異的な状況において役に立ってきた。例えば、癌において、裸の抗体は、リンパ腫（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）及びＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、結腸直腸癌及び他の癌（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）及びＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、乳癌（ＨＥＲＥＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、ならびに現在臨床開発中の多数（例えば、エプラツズマブ、ベルツズマブ、ミラツズマブ）においてある役割を担ってきた。これらの場合のほとんどにおいて、臨床的使用は、これらの裸の抗体または非結合型抗体を化学療法または放射線療法などの他の療法と組み合わせることを包含してきた。
【００１０】
ＳＮ−３８などの治療薬を抗体部分に結合するためのＣＬ２Ａリンカーの使用はすでに開示されている（例えば、米国特許第７，９９９，０８３号及び第８，０８０，２５０号、実施例の節は参照により本明細書に組み込まれる）。しかしながら、最大の効能及び最少の毒性を結果的に生じる最適な投薬スケジュール、ならびにＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体及び抗体−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体の効率的な大規模製造を含む、ＣＬ２Ａ及びＭＡｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体を調製及び使用するより効率的な方法についての需要が存在する。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、カリチアマイシン、マイタンシノイドまたはＭＭＡＥのような超毒性化学療法薬のナノモル濃度未満からピコモル濃度までの毒性と比較して、インビトロでナノモル濃度の毒性を有するＳＮ−３８などのカンプトテシンの抗体複合体を使用する。超毒性ではない薬剤の使用によって、遊離薬の放出のために細胞内部移行を必要としない抗体−薬剤リンカーの使用が可能となるが、むしろ薬剤のいくつかの細胞外放出が可能となる。以下に説明するＣＬ２Ａリンカーを用いて、複合薬の５０％が２４時間放出され、それにより、細胞外及び細胞内の両方で当該薬を遊離させることによって、当該薬の生物学的利用能を増強させる。加えて、比較的非毒性の薬剤の使用によって、ＡＤＣのより多量の薬用量の投与が可能となり、より良好な治療効果をもたらす。
【００１２】
本発明は、ＣＰＴ−抗体免疫複合体を調製及び投与するための改良された方法及び組成物を提供することによって、当該技術分野における満たされていない必要性を解決する。好ましくは、カンプトテシンはＳＮ−３８である。開示した方法及び組成物は、他の形態の療法に対して難治性またはほとんど応答性がない種々の疾患及び容態、かつ選択的標的化に適した抗体または抗原結合抗体フラグメントが開発することのできる、または利用可能であるもしくは公知である疾患を含むことのできる種々の疾患及び容態の治療のために役に立つ。主題の免疫複合体を用いて治療され得る好ましい疾患または容態には例えば、癌、自己免疫疾患、免疫機能不全疾患または感染性生体が原因である疾患を含む。
【００１３】
抗体は、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であり、より好ましくは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域配列及び定常領域配列を含む、種々のアイソタイプであることができる。抗体またはそのフラグメントは、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７；３１７：１５５４〜１５５７）によって説明されるような半ＩｇＧ４抗体などの、キメラ、ヒト化、または完全ヒト抗体またはこれらの抗体結合フラグメント、あるいは、市販（例えば、ＡＢＬＹＮＸ（登録商標），ベルギー国ゲント市）のような単一ドメイン抗体（例えば、ナノボディ）であることができる。より好ましくは、抗体またはそのフラグメントは、特異的なアロタイプに属するヒト定常領域配列を含むよう設計または選択され得、このことは結果的に、免疫複合体がヒト対象へ投与される場合に低い免疫原性を生じ得る。投与に好ましいアロタイプには、Ｇ１ｍ３、Ｇ１ｍ３，１、Ｇ１ｍ３，２またはＧ１ｍ３，１，２などの非Ｇ１ｍ１アロタイプ（ｎＧ１ｍ１）を含む。より好ましくは、アロタイプは、ｎＧ１ｍ１、Ｇ１ｍ３、ｎＧ１ｍ１，２及びＫｍ３のアロタイプからなる群から選択される。
【００１４】
使用する抗体は、当該技術分野で公知のいずれかの疾患関連抗原に結合し得る。例えば、疾患の状態が癌である場合、腫瘍細胞によって発現するまたはそうでなければ腫瘍細胞と結合する多くの抗原は当該技術分野で公知であり、これには、炭酸脱水酵素ＩＸ、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α−アクチニン４、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂａ７３３、ＢＡＧＥ、ＢｒＥ３−抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ4、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ〜ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１α、結腸特異的抗原ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ−β、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）及びそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４抗原、ＫＳ−１抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＡＧ−３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ４抗原、膵癌ムチン、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１受容体、胎盤増殖因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、トムソン・フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死性抗原（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィ���ロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、Ｋｒａｓ、癌遺伝子マーカーならびに癌遺伝子産物を含むがそれらに限定しない（例えば、Ｓｅｎｓｉら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６，１２：５０２３〜５０３２、Ｐａｒｍｉａｎｉら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７，１７８：１９７５〜１９７９、Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００５，５４：１８７〜２０７を参照されたい）。好ましくは、当該抗体は、ＡＦＰ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＳＡｐ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＡＦＰ、ＭＵＣ５ａｃ、ＰＡＭ４抗原、ＣＤ７４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＨＬＡ−ＤＲに結合する。
【００１５】
利用してもよい例示的な抗体としては、ｈＲ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ、２０１０年３月１２日出願の米国特許出願第１２／７２２，６４５号)、ｈＰＡＭ４（抗ＭＵＣ５ａｃ、米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０、米国特許第７，２５１，１６４号）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９、米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ、米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４、米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２、米国特許第７，０７４，４０３号）、ｈＲＦＢ４（抗ＣＤ２２、２０１４年２月２５日出願の米国仮特許出願第６１／９４４，２９５号)、ｈＭｕ−９（抗ＣＳＡｐ、米国特許第７，３８７，７７３号）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ、米国特許第７，６１２，１８０号)、ｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５、米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６、米国特許第７，５４１，４４０号）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ−１、米国特許第７，２３８，７８５号）、ｈＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６、米国特許第７，５４１，４４０号）、Ａｂ１２４及びＡｂ１２５（抗ＣＸＣＲ４、米国特許第７，１３８，４９６号）が挙げられるが、これらに限定せず、引用された各特許または出願の実施例の節は参照により本明細書に組み込まれる。より好ましくは、抗体はＩＭＭＵ−３１（抗ＡＦＰ）、ｈＲＳ７（抗ＴＲＯＰ−２）、ｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）、ｈＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ｈＬ２４３またはＩＭＭＵ−１１４（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）あるいはｈＡ２０（抗ＣＤ２０）である。本明細書で使用する場合、エプラツズマブ及びｈＬＬ２という用語は相互交換可能であり、同様に、ベルツズマブとｈＡ２０、ｈＬ２４３ｇ４Ｐ、ｈＬ２４３ガンマ４Ｐ及びＩＭＭＵ−１１４という用語ともそうである。
【００１６】
使用する代替的な抗体としては、アブシキシマブ（抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブ（抗ＣＤ２０）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、トシツモマブ（抗ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗ＥｒｂＢ２）、ラムブロリズマブ（抗ＰＤ−１受容体）、ニボルマブ（抗ＰＤ−１受容体）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）、アバゴボマブ（抗ＣＡ−１２５）、アデカツムマブ（抗ＥｐＣＡＭ）、アトリズマブ（抗ＩＬ−６受容体）、ベンラリズマブ（抗ＣＤ１２５）、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１、抗ＣＤ２０）、ＣＣ４９（抗ＴＡＧ−７２）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（抗ＰＳＭＡ、米国特許出願第１１／９８３，３７２号、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４０５及びＰＴＡ−４４０６として寄託)、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ、ＷＯ２００９／１３０５７５）、トシリズマブ（抗ＩＬ−６受容体）、バシリキシマブ（抗ＣＤ２５）、ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）、エファリズマブ（抗ＣＤ１１ａ）、ＧＡ１０１（抗ＣＤ２０；Ｇｌｙｃａｒｔ  Ｒｏｃｈｅ)、ムロモナブ−ＣＤ３（抗ＣＤ３受容体）、ナタリズマブ（抗α４インテグリン）、オマリズマブ（抗ＩｇＥ）；ＣＤＰ５７１（Ｏｆｅｉら，２０１１，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４５：８８１〜８８５）、ＭＴＮＦＡＩ、Ｍ２ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＢＩ、Ｍ３０２Ｂ、Ｍ３０３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，イリノイ州ロックフォード市）、インフリキシマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，ペンシルバニア州マルバーン地区）、セルトリズマブペゴル（ＵＣＢ，ベルギー国ブリュッセル市）、抗ＣＤ４０Ｌ（ＵＣＢ，ベルギー国ブリュッセル市）、アダリムマブ（Ａｂｂｏｔｔ，イリノイ州アボットパーク）、ベンリスタ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの抗ＴＮＦ−α抗体；Ａｌｚ５０（Ｋｓｉｅｚａｋ−Ｒｅｄｉｎｇら，１９８７，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：７９４３〜７９４７）、ガンテネルマブ、ソラネズマブ及びインフリキシマブなどのアルツハイマー病の治療のための抗体；５９Ｄ８、Ｔ２Ｇ１ｓ、ＭＨ１のような抗フィブリン抗体；ＭＯＲ０３０８７（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＡＧ）、ＭＯＲ２０２（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、ＨｕＭａｘ−ＣＤ３８（Ｇｅｎｍａｂ）またはダラツムマブ（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）などの抗ＣＤ３８抗体；Ｐ４／Ｄ１０（米国特許第８，３３３，９７１号）、Ａｂ７５、Ａｂ７６、Ａｂ７７（Ｐａｕｌｉｋら，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５８：１７８１〜１７９０)などの抗ＨＩＶ抗体ならびにＰｏｌｙｍｕｎ（オーストリア国ウィーン市）によって説明及び販売されている、また米国特許第５，８３１，０３４号、米国特許第５，９１１，９８９号、ならびにＶｃｅｌａｒら，ＡＩＤＳ  ２００７；２１（１６）：２１６１〜２１７０及びＪｏｏｓら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００６；５０（５）：１７７３〜１７７９（すべて参照により本明細書に組み込まれる）において説明されている抗ＨＩＶ抗体；ならびにＣＲ６２６１（抗インフルエンザ）、エク��ビビルマブ（抗Ｂ型肝炎）、フェルビズマブ（抗ＲＳウイルス)、フォラビルマブ（抗狂犬病ウイルス）、モタビズマブ（抗ＲＳウイルス）、パリビズマブ（抗ＲＳウイルス）、パノバクマブ（抗シュードモナス属）、ラフィビルマブ（ｒａｆｉｖｉｒｕｍａｂ）（抗狂犬病ウイルス）、レガビルマブ（抗サイトメガロウイルス）、セビルマブ（抗サイトメガロウイルス）、チビルマブ（ｔｉｖｉｒｕｍａｂ）（抗Ｂ型肝炎）、及びウルトキサズマブ（抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））などの病原体に対する抗体が挙げられるが、これらに限定しない。
【００１７】
好ましくは、抗体部分は少なくとも１つの薬剤部分、より好ましくは、１〜約５の薬剤部分、あるいは約７〜１２の薬剤部分に結合している。種々の実施形態において、抗体部分は、４または６の薬剤部分あるいは５以下の薬剤部分に結合していてもよい。抗体部分あたりの薬剤部分の数は、１、２、３、４、５、６またはそれより多くあり得る。
【００１８】
水溶性ＣＰＴ誘導体の一例はＣＰＴ−１１である。広範な臨床データは、ＣＰＴ−１１の薬理学及び活性型ＳＮ−３８へのインビボでの変換に関して入手可能である（Ｉｙｅｒ及びＲａｔａｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４２：Ｓ３１〜４３（１９９８）、Ｍａｔｈｉｊｓｓｅｎら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：２１８２〜２１９４（２００２）、Ｒｉｖｏｒｙ，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．９２２：２０５〜２１５（２０００））。活性型ＳＮ−３８は、ＣＰＴ−１１よりも約２〜３桁の程度強力である。具体的な好ましい実施形態において、免疫複合体は、ｈＭＮ−１４−ＳＮ−３８、ｈＭＮ−３−ＳＮ−３８、ｈＭＮ−１５−ＳＮ−３８、ｈＩＭＭＵ−３１−ＳＮ−３８、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８、ｈＲ１−ＳＮ−３８、ｈＡ２０−ＳＮ−３８、ｈＰＡＭ４−ＳＮ−３８、ｈＬ２４３−ＳＮ−３８、ｈＬＬ１−ＳＮ−３８、ｈＲＦＢ４−ＳＮ−３８、ｈＭｕ−９−ＳＮ−３８またはｈＬＬ２−ＳＮ−３８複合体であり得る。より好ましくは、ＣＬ２Ａリンカーは、ＳＮ−３８を抗体部分に結合するために使用する。
【００１９】
種々の実施形態は、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性及び慢性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ腫及び白血病、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、癌腫、黒色腫、肉腫、神経膠腫、骨癌ならびに皮膚癌を含むがこれらに限定しない癌を治療するための主題の方法及び組成物の使用に関し得る。癌腫には口腔、食道、消化管、気管支（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｔｒａｃｔ）、肺、胃、結腸、乳房、卵巣、前立腺、子宮、子宮内膜、子宮頸部、膀胱、膵臓、骨、脳、結合組織、肝臓、胆嚢、膀胱、腎臓、皮膚、中枢神経系及び精巣の癌腫を含み得る。
【００２０】
主題の免疫複合体を用いて治療される可能性がある例示的な自己免疫疾患または免疫不全疾患には、急性免疫性血小板減少症、慢性免疫性血小板減少症、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、糖尿病（例えば、若年型糖尿病）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、抗好中球細胞質抗体関連血管炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形紅斑、ＩｇＡ腎炎、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞動脈炎／多発筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、線維化胞隔炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、臓器移植拒絶、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）及び炎症を含む。
【００２１】
加えて、主題の方法及び組成物は、感染性疾患、例えば、細菌、リケッチア、マイコプラズマ、原生動物、真菌類、ウイルス、寄生虫、または他の微生物性媒介物などの病原体による感染を包含する疾患を治療するために使用してもよい。例としては、エイズを生じるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、結核菌、ストレプトコッカス・アガラクチエ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、レジュネラ・ニューモフィラ菌、化膿性連鎖球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、Ｂ型インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ）、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、西ナイルウイルス、緑膿菌、らい菌、ウシ流産菌、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、単純ヘルペスウイルスＩＩ型、ヒト血清パルボ様ウイルス、ＲＳウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イボウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス４０型、マウス乳癌ウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ・ゴンディ、ランゲルトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅｉ）、ブルーストリパノソーマ、マンソン住血吸虫、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐａｎｉｃｕｍ）、ウシバベシア、ニワトリ盲腸コクシジウム（Ｅｌｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ）、回旋糸状虫、熱帯リーシュマニア、旋毛虫、タイレリア・パルバ、胞状条虫、ヒツジ条虫、無鉤条虫、単包条虫、メソセストイデス・コルティ、マイコプラズマ・アルスリチジス、マイコプラズマ・ヒオリニス、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・アルギニニ、アコレプラスマ・レイドロウィイ、マイコプラズマ・サリバリウム及び肺炎マイコプラズマが挙げられる。感染性生体に対する抗体（抗毒素抗体及び抗ウイルス抗体）及び他の標的に対する抗体を列挙している総説は、参照により本明細書に組み込まれるＣａｓａｄｅｖａｌｌ，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；９３（１）：５〜１５に含まれている。
【００２２】
癌の治療を包含するある特定の実施形態において、薬剤複合体は、手術、放射線療法、化学療法、裸の抗体を用いる免疫療法、放射線免疫療法、免疫調節薬、ワクチン、及びこれらに類するものと併用してもよい。類似の組み合わせは、自己免疫疾患など、抗体部分を受け入れられる他の疾患の治療において好ましい。例えば、カンプトテシン複合体は、ＴＮＦ阻害薬、Ｂ細胞抗体、インターフェロン、インターロイキン、ならびに関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、多発性硬化症、血管炎、及びＩ型糖尿病（若年型糖尿病）などの自己免疫疾患の治療に有効な他の薬剤と併用することができる。これらの併用療法によって、このような組み合わせで付与されることになっている各治療薬をより低用量にすることができ、したがって、ある特定の重度の副作用を低下させかつ、必要とされる治療期間を短縮することができる可能性がある。
【００２３】
感染性疾患において、薬剤免疫複合体は、他の治療薬、免疫調節薬、裸のモノクローナル抗体、またはワクチン（例えば、肝炎、ＨＩＶ、もしくはパピローマウイルスに対するモノクローナル抗体、またはＢ型肝炎などにおけるこれらのウイルスもしくはキナーゼ阻害薬の免疫原を基にしたワクチン）と併用することができる。これらの及び他のウイルス病原体に対する抗体及び抗原を基にしたワクチンは当該技術分野において公知であり、いくつかの場合において、すでに商業的に使用されている。抗感染性モノクローナル抗体の開発は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｉｃｈｅｒｔ及びＤｅｗｉｔｚ（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２００６；５：１９１〜１９５）によって近年総説にまとめられており、当該総説は裸の抗体による療法が遂行された優先病原体を要約しており、結果的に、抗体が第ＩＩＩ相治験にあるかまたは市販されているかのいずれかである２つの病原体（ＲＳウイルス及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌）が生じ、２５のその他の病原体は臨床研究にあり、臨床研究の間に２０の病原体が中止となった。併用療法については、感染性生体の治療のための放射線免疫療法の使用は例えば、米国特許第４，９２５，６４８号、第５，３３２，５６７号、第５，４３９，６６５号、第５，６０１，８２５号、第５，６０９，８４６号、第５，６１２，０１６号、第６，１２０，７６８号、第６，３１９，５００号、第６，４５８，９３３号、第６，５４８，２７５号ならびに米国特許出願公開第２００２０１３６６９０号及び第２００３０１０３９８２号に開示されており、それらの各々の実施例の節は参照により本明細書に組み込まれている。
【００２４】
免疫複合体の好ましい最適薬用量は、３ｍｇ／ｋｇと１８ｍｇ／ｋｇの間の薬用量が含まれ得、好ましくは、週１回、週２回、隔週または３週間に１回のいずれかで与えられ得る。最適な投薬スケジュールには、２週間連続療法の後に１、２、３または４週間の休薬の治療周期、あるいは療法及び休薬を週替わりで行う治療周期、あるいは１週間の療法の後に２、３または４週間の休薬の治療周期、あるいは３週間の療法の後に１、２、３または４週間の休薬の治療周期、あるいは４週間の療法の後に１、２、３または４週間の休薬の治療周期、あるいは５週間の療法の後に１、２、３、４または５週間の休薬の治療周期、あるいは２週間に１回、３週間に１回または１か月に１回の投与の治療周期を含み得る。治療はいずれかの周期数、好ましくは少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、または少なくとも１６の周期ほど延長してもよい。薬用量は、最高２４ｍｇ／ｋｇであってもよい。使用する例示的な薬用量には、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ及び２４ｍｇ／ｋｇを含み得る。好ましい薬用量は、４、６、８，９、１０、１２、１４、１６または１８ｍｇ／ｋｇである。当業者は、年齢、全身の健康状態、具体的な器官の機能または体重、及び特定の器官系（例えば、骨髄）に対する先行療法の効果など、種々の因子が免疫複合体の最適な薬用量を選択する上で考慮に入れられ得、薬用量及び／または投与頻度は、治療期間中に増減してもよいことを理解するであろう。薬用量は、必要な場合反復してもよく、腫瘍の縮小の証拠が少なくて４〜８用量の後に観察され得る。本明細書に開示する最適化した薬用量及び投薬スケジュールは、予期せぬ優れた効能及び低い毒性をヒト対象において示し、このことは、動物モデル研究からは予測することができなかった。驚くべきことに、優れた効能により、ＳＮ−３８がインビボで誘導される元である親化合物ＣＰＴ−１１を含む、１つ以上の標準的な抗癌療法に対して耐性があることがすでに分かっていた腫瘍の治療が可能となる。
【００２５】
請求する本組成物及び方法による驚くべき結果は、反復注入による場合でさえ、抗体−薬剤複合体の高用量の予期せぬ耐容性であり、悪心、嘔吐及び下痢ならびに皮疹、または管理可能な好中球減少症の比較的低い等級の毒性のみが観察された。さらなる驚くべき結果は、ＳＮ−３８をアルブミン、ＰＥＧまたは他の担体に結合させた他の生成物とは異なり、抗体−薬剤複合体の蓄積が欠如していることである。蓄積の欠如は、反復した投薬または増量した投薬の後でさえ、改善された耐容性及び重度の毒性の欠如と関連している。これらの驚くべき結果によって、予期せぬ高い効能及び低い毒性で投薬量及び送達スケジュールの最適化が可能となる。請求した方法は、すでに耐性のある癌を罹患している個体において腫瘍の大きさ（最長の直径によって測定する）の１５％以上、好ましくは２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上の縮小をもたらす。当業者は、腫瘍の大きさが、総腫瘍体積、いずれかの寸法における腫瘍の最大の大きさまたはいくつかの寸法における大きさの測定値の組み合わせなど、種々の異なる技術によって測定してもよいことを理解するであろう。このことは、コンピュータ断層撮影法、超音波検査法、及び／または陽電子放射断層撮影法など、標準的な放射線手順を用いてであり得る。大きさを測定する手段は、好ましくは結果的に腫瘍の除去を生じる免疫複合体治療を用いて腫瘍の大きさを減少させる傾向を観察することほど重要ではない。
【００２６】
免疫複合体は、周期的ボーラス注射として投与してもよいが、代替的な実施形態において、免疫複合体は、抗体−薬剤複合体の持続的な注入によって投与してもよい。血中の免疫複合体のＣｍａｘを高めかつＰＫを延ばすために、持続的な注入は、例えば留置カテーテルによって投与してもよい。このような装置は、ＨＩＣＫＭＡＮ（登録商標）、ＢＲＯＶＩＡＣ（登録商標）またはＰＯＲＴ−Ａ−ＣＡＴＨ（登録商標）カテーテルなど、当該技術分野において公知であり（例えば、Ｓｋｏｌｎｉｋら，Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｍｏｎｉｔ  ３２：７４１〜７４８，２０１０を参照されたい）、いずれかのこのような公知の留置カテーテルを使用してもよい。種々の持続的注入ポンプも当該技術分野において公知であり、いずれかのこのような公知の注入ポンプを使用してもよい。持続的な注入のための薬用量範囲は、１日当たり０．１ｍｇ／ｋｇと２．０ｍｇ／ｋｇの間であってもよい。より好ましくはこれらの免疫複合体は、２〜５時間、より好ましくは２〜３時間の比較的短期間にわたって静脈内注入によって投与することができる。
【００２７】
特に好ましい実施形態において、免疫複合体及び投薬スケジュールは、標準的な療法に対して耐性のある患者において有効であり得る。例えば、ｈＭＮ−１４−ＳＮ−３８免疫複合体は、ＳＮ−３８の親薬剤であるイリノテカンを用いた先行療法に応答しなかった患者へ投与してもよい。驚くべきことに、イリノテカン耐性患者は、ｈＭＮ−１４−ＳＮ−３８に対して部分的応答を示すことがある。腫瘍組織を特異的に標的とする免疫複合体の能力は、治療薬の改善された標的化及び向上した送達によって腫瘍耐性に打ち克ち得る。あるいは、ｈＭＮ−１４などの抗ＣＥＡＣＡＭ５免疫複合体は、ｈＭＮ−３またはｈＭＮ−１５などの抗ＣＥＡＣＡＭ６免疫複合体と併用投与してもよい。他の抗体−ＳＮ−３８免疫複合体は、代替的な標準的治療処置と比較して、類似の改善された効能及び／または低い毒性を示し得、放射性核種、毒素または他の薬剤と結合した抗体との組み合わせにおける異なるＳＮ−３８免疫複合体、またはＳＮ−３８−抗体複合体の組み合わせは、さらにより改善された効能及び／または低い毒性を提供し得る。具体的な好ましい対象は、転移性結腸癌患者、三重陰性乳癌患者、ＨＥＲ＋、ＥＲ＋、プロゲステロン＋乳癌患者、転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者、転移性膵癌患者、転移性腎細胞癌腫患者、転移性胃癌患者、転移性前立腺癌患者、または転移性小細胞肺癌患者であり得る。
【００２８】
ある特定の実施形態は、改善された収量及び／または効率でＣＬ２Ａ−ＳＮ３８複合体及び抗体−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８免疫複合体を大規模に調製するための改善された方法に関する。特に好ましい実施形態は、図１に示す合成スキームにおいて説明される。好ましくは、ＣＬ２Ａリンカーの末端にあるマレイミド基は、抗体部分または他の標的とするペプチドもしくはタンパク質における還元されたシステイン残基上のスルフヒドリル側鎖と反応するが、ＣＬ２Ａ部分を抗体部分に結合させる他の方法は公知であり、使用してもよい。さらなる好ましい実施形態において、ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８部分から調製した免疫複合体は、接線フロー濾過によって精製され、それにより、サイズ排除カラム及び疎水性相互作用カラム上での扱いにくいクロマトグラフィーを回避し、精製後の高いタンパク質回収を可能にする。
【００２９】
図１に説明する好ましい実施形態において、リジン側鎖上のＭＭＴ保護基を有するＦｍｏｃ−リジン（ＭＭＴ）−ＯＨ（中間体１、図１）は、ジクロロメタン中のＰＡＢＯＨ及びＥＥＤＱと反応して、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨを生じ、これがジエチルアミンと反応して、Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ（中間体２、図１）を形成する。Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨは、ＥＥＤＱ試薬含有ジクロロメタン中でＰＥＧ−アジドと反応して、アジド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ（中間体３、図１）を生じる。ＰＥＧ部分は、異なる数の単量体の混合物を含有する標準的なＰＥＧとは対照的に規定数の単量体を含有し、より均質な溶解度及び薬物動態特徴を最終生成物に提供する。別個の反応において、ＳＮ−３８は、ＴＢＤＭＳ−Ｃｌと反応して、１０−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８（中間体４、図１）を生じる。１０−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８は、トリホスゲン及びＤＭＡＰとの反応によって活性化され、反応中間体１０−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８−２０−Ｏ−クロロギ酸（中間体５、図１）を生成し、これがインサイツでアジド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨと反応して、アジド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯ−ＣＯ−２０−Ｏ−ＳＮ−３８−ＴＢＤＭＳ中間体（中間体６、図１）を生成する。中間体６は、ＴＢＡＦ／ＡｃＯＨ／ジクロロメタンで処理されて、ＴＢＤＭＳ保護基をＳＮ−３８部分から除去する。結果として生じるアジド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯ−ＣＯ−２０−Ｏ−ＳＮ−３８（中間体７、図１）は、ＭＣＣ−Ｙｎｅ（中間体８、図１）と反応して、抗体への結合のためのマレイミド反応基を含有するＭＣＣ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢ−Ｏ−ＳＮ−３８（中間体９、図１）を生じる。当該反応は、ＰＥＧ部分上のアジドとＭＣＣ−Ｙｎｅ中間体上のアルキンの間の銅仲介性付加環化反応によって生じる。最後に、ＭＭＴ保護基はリジン側鎖から除去され、抗体、抗体フラグメントまたは還元型スルフヒドリルを含有するいずれかの他のタンパク質もしくはペプチドに結合するために使用することのできる反応性マレイミド部分を有するＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８生成物を生成する。当業者は、システイン以外のアミノ酸側鎖への結合が所望の場合、マレイミド以外の反応基を導入してもよいことを理解するであろう。
【００３０】
好ましい実施形態において、リンカー−ＳＮ−３８複合体は、薬剤部分の活性化されたヒドロキシル基を含む炭酸塩である細胞内で切断可能な部分と、４−アミノベンジルアルコールまたはベンジル位にＣ１〜Ｃ１０アルキル基で置換された置換４−アミノベンジルアルコールを含み、後者はそのアミノ基を介してＬ型アミノ酸または最多４個のＬ型アミノ酸部分を含むポリペプチドに結合しており、ここで、Ｎ末端は、抗体部分結合基において終止するクロスリンカーに結合している。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の改善された大規模生成のための新規のスキーム。
【図２】ＭＡｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体を用いた、Ｃａｐａｎ１ヒト膵癌腫を保有する無胸腺ヌードマウスのインビボ療法。
【図３】ＭＡｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体を用いた、ＢｘＰＣ３ヒト膵癌腫を保有する無胸腺ヌードマウスのインビボ療法。
【図４】ｈＭＮ−１４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体を用いた、ＬＳ１７４Ｔヒト結腸癌腫を保有する無胸腺ヌードマウスのインビボ療法。
【図５Ａ】ヒト非小細胞肺腫瘍異種移植片を保有するマウスにおけるｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣの治療効能。Ｃａｌｕ−３腫瘍を保有するマウス（Ｎ＝５〜７）にｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８を４日ごとに合計４回の注射で注射した（ｑ４ｄｘ４）。ＡＤＣ及び対照はすべて、示した量で投与した（用量当たりのＳＮ−３８の量として表されている。長い矢印＝複合体注射、短い矢印＝イリノテカン注射）。
【図５Ｂ】ヒト結腸直腸腫瘍異種移植片を保有するマウスにおけるｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣの治療効能。ＣＯＬＯ２０５腫瘍保有マウス（Ｎ＝５）にＡＤＣを８回（ｑ４ｄｘ８）、またはイリノテカンの最大耐用量（ＭＴＤ）を２日ごとに（ｑ２ｄｘ５）合計５回注射した。ＡＤＣ及び対照はすべて、示した量で投与した（用量当たりのＳＮ−３８の量として表されている。長い矢印＝複合体注射、短い矢印＝イリノテカン注射）。
【図５Ｃ】ヒト膵癌異種移植片を保有するマウスにおけるｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣの治療効能。Ｃａｐａｎ−１（Ｎ＝１０）腫瘍保有マウス（Ｎ＝１０）を、示した薬剤で週２回、４週間治療した。ＡＤＣ及び対照はすべて、示した量で投与した（用量当たりのＳＮ−３８の量として表されている。長い矢印＝複合体注射、短い矢印＝イリノテカン注射）。
【図５Ｄ】ヒト膵癌異種移植片を保有するマウスにおけるｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣの治療効能。ＢｘＰＣ−３腫瘍保有マウス（Ｎ＝１０）を週２回、４週間、示した薬剤で治療した。ＡＤＣ及び対照はすべて、示した量で投与した（用量当たりのＳＮ−３８の量として表されている。長い矢印＝複合体注射、短い矢印＝イリノテカン注射）。
【図５Ｅ】ヒト肺扁平上皮細胞癌腫異種移植片を保有するマウスにおけるｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣの治療効能。ＡＤＣを週２回、４週間付与するのに加えて、ＳＫ−ＭＥＳ−１腫瘍保有（Ｎ＝８）マウスは、ＣＰＴ−１１のＭＴＤを受けた（ｑ２ｄｘ５）。ＡＤＣ及び対照はすべて、示した量で投与した（用量当たりのＳＮ−３８の量として表されている。長い矢印＝複合体注射、短い矢印＝イリノテカン注射）。
【図６】皮下ラモスモデルにおけるエプラツズマブ（Ｅｍａｂ）−ＳＮ−３８複合体及びベルツズマブ（Ｖｍａｂ）−ＳＮ−３８複合体の効能比較。腫瘍の平均がおよそ０．３５ｃｍ３（０．２０〜０．５５ｃｍ３）であるヌードマウス（１群当たりＮ＝１０）に各複合体０．２５ｍｇまたは０．５ｍｇを週２回、４週間投与した。
【図７】Ａ：皮下ラモス腫瘍を保有するヌードマウスにおけるＥｍａｂ抗ＣＤ２２−ＳＮ−３８複合体（実線）対無関係のラベツズマブ（Ｌｍａｂ）−ＳＮ−３８複合体（破線）の特異性。動物に各複合体を用量当たり７５μｇの用量で週２回、４週間腹腔内に与えた（２２ｇの平均体重を基にした５４．５μｇ／ｋｇのＳＮ−３８）。生存は、３．０ｃｍ３までの進行までの時間（ＴＴＰ）を基にしており、腫瘍は０．４ｃｍ３の平均の大きさで始まった。Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８複合体及びＬｍａｂ−ＳＮ−３８複合体についての生存中央値（示されている）を比較するＰ値は、各パネルに示す。Ｂ：皮下ラモス腫瘍を保有するヌードマウスにおけるＥｍａｂ抗ＣＤ２２−ＳＮ−３８複合体（実線）対無関係のラベツズマブ（Ｌｍａｂ）−ＳＮ−３８複合体（破線）の特異性。動物に各複合体を用量当たり１２５μｇの用量で週２回、４週間腹腔内に与えた（２２ｇの平均体重を基にした９１μｇ／ｋｇのＳＮ−３８）。生存は、３．０ｃｍ３までの進行時間（ＴＴＰ）を基にしており、腫瘍は０．４ｃｍ３の平均の大きさで始まった。Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８複合体及びＬｍａｂ−ＳＮ−３８複合体についての生存中央値（示されている）を比較するＰ値は、各パネルに示す。Ｃ：皮下ラモス腫瘍を保有するヌードマウスにおけるＥｍａｂ抗ＣＤ２２−ＳＮ−３８複合体（実線）対無関係のラベツズマブ（Ｌｍａｂ）−ＳＮ−３８複合体（破線）の特異性。動物に各複合体を用量当たり２５０μｇの用量で週２回、４週間腹腔内に与えた（２２ｇの平均体重を基にした１８２μｇ／ｋｇのＳＮ−３８）。生存は、３．０ｃｍ３までの進行までの時間（ＴＴＰ）を基にしており、腫瘍は０．４ｃｍ３の平均の大きさで始まった。Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８複合体及びＬｍａｂ−ＳＮ−３８複合体についての生存中央値（示されている）を比較するＰ値は、各パネルに示す。生存曲線（灰色の実線）も、イリノテカンの腹腔内注射を毎週与えた動物の別の群について示す（６．５μｇ／用量、ＳＮ−３８当量は２５０μｇの用量のＥｍａｂ−ＳＮ−３８複合体とほぼ同じである）。
【図８】ＩＭＭＵ−１３０（ラベツズマブ−ＮＳ−３８）を投与する前の患者の先行治療の履歴。先行治療には、第ＩＶ期ＣＲＣ結腸切除術／肝切除術（一部の小葉）、肝転移に関するラジオ波焼灼術、肝転移の楔状切除、ならびにイリノテカン／オキサリプラチン、Ｆｏｌｆｉｒｉｎｏｘ、Ｆｏｌｆｉｒｉｎｏｘ＋ベバシズマブ、ベバシズマブ＋５−ＦＵ／ロイコボリン、ＦｏｌＦｉｒｉ、Ｆｏｌｆｉｒｉ＋セツキシマブ、及びセツキシマブ単独を用いた化学療法を含んでいた。患者は、緩徐な静脈内注入によって隔週で１６ｍｇ／ｋｇの用量のＩＭＭＵ−１３２を合計１７治療用量受けた。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（定義）
以下に続く説明において、いくつかの用語を使用し、以下の定義は、請求する主題事項の理解を容易にするために提供する。本明細書で明確に定義されていない用語は、当該用語の平易かつ通常の意味に従って使用する。
【００３３】
別段の指定がない限り、「ａ」または「ａｎ」は「１つ以上の」を意味する。
【００３４】
「約」という用語は、値の±１０パーセント（１０％）を意味するものとして本明細書で使用する。例えば、「約１００」は、９０と１１０の間のいずれかの数を指す。
【００３５】
「抗体」は、本明細書で使用する場合、全長（すなわち、天然、または正常な免疫グロブリン遺伝子フラグメント組換え過程によって形成される）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または抗体フラグメントなど免疫グロブリン分子の抗原結合部分を指す。抗体または抗体フラグメントは、結合し得、またはさもなくば請求する主題事項の範囲内で誘導体化され得る。このような抗体には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４（及びＩｇＧ４の下位形態）、及びＩｇＡアイソタイプを含むが、これらに限定しない。
【００３６】
「抗体フラグメント」は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、単一ドメイン抗体（ＤＡＢまたはＶＨＨ）及びこれらに類するものなど抗体の一部であり、先に列挙したＩｇＧ４の半分子を含む（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７；３１７（９月１４日）：１５５４〜１５５７）。ナノボディ（ＡＢＬＹＮＸ（登録商標）、ベルギー国ゲント市）と呼ばれる単一ドメイン抗体の市販の形態は、以下にさらに詳細に考察する。構造にかかわらず、使用する抗体フラグメントは、完全抗体によって認識されるのと同じ抗原と結合する。「抗体フラグメント」という用語にはまた、特定の抗原へ結合して複合体を形成することによって抗体のように作用する合成タンパク質または遺伝的に操作されたタンパク質を含む。例えば、抗体フラグメントには、重鎖可変部及び軽鎖可変部からなる「Ｆｖ」フラグメントなどの可変部からなる単離されたフラグメント、軽鎖可変部及び重鎖可変部がペプチドリンカーによって結合している組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）、ならびにＣＤＲなど、高頻度可変部を模倣しているアミノ酸残基からなる最小認識単位を含む。Ｆｖフラグメントは、異なる方法で構築され、多価結合形態及び／または多重特異性結合形態を生じ得る。多価の場合、Ｆｖフラグメントは特定のエピトープに対する１つを超える結合部位を有するのに対し、多重特異性形態の場合、１つを超えるエピトープ（同じ抗原のものかまたは１つの抗原及び異なる抗原に対するものかのいずれか）が結合する。
【００３７】
「裸の抗体」とは概して、治療薬へ結合していない完全な抗体である。これは、抗体分子のＦｃ部分が補体固定及びＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）など、エフェクター機能または免疫学的機能を提供し、これが細胞溶解を結果として生じ得る作用へと機序を設定するからである。しかしながら、Ｆｃ部分は、抗体の治療機能に必要でなくてもよいが、むしろアポトーシス、抗血管新生作用、抗転移活性、ヘテロタイプまたはホモタイプの接着の阻害など抗接着活性、及びシグナル伝達経路における干渉などの他の機序は、活動をし始め得、及び疾患の進行を妨げ得る。裸の抗体には、ネズミ抗体ならびに、キメラ抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗体及びこれらのフラグメントなどのある特定の組換え抗体を含む、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方、ならびにこれらのフラグメントがある。本明細書で使用する場合、「裸の」は、「結合していない」と同義であり、治療薬へ連結も結合もしていないことを意味する。
【００３８】
「キメラ抗体」とは、１つの種由来の抗体、好ましくは齧歯類抗体、より好ましくはネズミ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、重鎖及び軽鎖の両抗体鎖の可変部を含有するが、抗体分子の定常部はヒト抗体の定常部に由来する、組換えタンパク質である。獣医学的応用のために、キメラ抗体の定常部は、霊長類、ネコまたはイヌなどの他の種の定常部に由来してもよい。
【００３９】
「ヒト化抗体」とは、１つの種に由来する抗体、例えばネズミ抗体に由来するＣＤＲがネズミ抗体の重鎖及び軽鎖可変部からヒト重鎖及び軽鎖可変部（フレームワーク領域）へと移植された組換えタンパク質である。抗体分子の定常部は、ヒト抗体の定常部に由来する。いくつかの場合、ヒト化抗体のフレームワーク領域の特定の残基、特にＣＤＲ配列に接触しているまたは近い残基は、修飾されていてもよく、例えば、元のネズミ抗体、齧歯類抗体、ヒトより下位の霊長類の抗体、または他の抗体由来の対応する残基と置換されてもよい。
【００４０】
「ヒト抗体」とは、例えば抗原負荷に応答してヒト抗体を産生するよう「操作」されたトランスジェニックマウスから得られる抗体である。この技術において、ヒト重鎖及び軽鎖の遺伝子座のエレメントは、内在性重鎖及び軽鎖の遺伝子座の標的化した崩壊を含有する胚性幹細胞株に由来するマウスの系統へと導入される。トランスジェニックマウスは、種々の抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、当該マウスは、ヒト抗体分泌性ハイブリドーマを産生するために使用することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Ｇｒｅｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）、及びＴａｙｌｏｒら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）によって説明されている。完全ヒト抗体はまた、遺伝子もしくは染色体のトランスフェクション法、及びファージディスプレイ技術によって構築することができ、これらはすべて当該技術分野で公知である。例えば、免疫化していないドナー由来の免疫グロブリン可変部遺伝子レパートリーに由来するヒト抗体及びそのフラグメントのインビトロでの作製については、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５３（１９９０）を参照されたい。この技術において、抗体可変部遺伝子は、糸状バクテリオファージの大小いずれかのコートタンパク質遺伝子へとフレーム内でクローン化され、ファージ粒子の表面上に機能的抗体フラグメントとして表示される。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能的特性に基づいた選択はまた、当該特性を呈する抗体をコードする遺伝子の選択を結果として生じる。この方法で、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは、種々のフォーマットで実施することができ、これらの総説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５５６４〜５５７１（１９９３）を参照されたい。ヒト抗体はまた、インビトロで活性化されたＢ細胞によって産生されてもよい。米国特許第５，５６７，６１０号及び第５，２２９，２７５号を参照されたく、これらの各々の実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４１】
本明細書で使用する「感染性疾患」とは、細菌、リケッチア、マイコプラズマ、原生動物、真菌類、ウイルス、寄生虫、または他の微生物性媒介物などの病原体による感染を包含する疾患である。例としては、エイズを生じるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、結核菌、ストレプトコッカス・アガラクチエ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、レジュネラ・ニューモフィラ菌、化膿性連鎖球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、Ｂ型インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ）、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、西ナイルウイルス、緑膿菌、らい菌、ウシ流産菌、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、単純ヘルペスウイルスＩＩ型、ヒト血清パルボ様ウイルス、ＲＳウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イボウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス４０型、マウス乳癌ウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ・ゴンディ、ランゲルトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅｉ）、ブルーストリパノソーマ、マンソン住血吸虫、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐａｎｉｃｕｍ）、ウシバベシア、ニワトリ盲腸コクシジウム（Ｅｌｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ）、回旋糸状虫、熱帯リーシュマニア、旋毛虫、タイレリア・パルバ、胞状条虫、ヒツジ条虫、無鉤条虫、単包条虫、メソセストイデス・コルティ、マイコプラズマ・アルスリチジス、マイコプラズマ・ヒオリニス、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・アルギニニ、アコレプラスマ・レイドロウィイ、マイコプラズマ・サリバリウム及び肺炎マイコプラズマが挙げられる。感染性生体（抗毒素抗体及び抗ウイルス抗体）及び他の標的に対する抗体を列挙している総説は、参照により本明細書に組み込まれるＣａｓａｄｅｖａｌｌ，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；９３（１）：５〜１５に含まれている。
【００４２】
「治療薬」とは、結合部分、例えば抗体または抗体フラグメントとは別個に、同時にまたは連続して投与される分子または原子であり、疾患の治療に有用である。治療薬の例としては、抗体、抗体フラグメント、複合体、薬剤、細胞毒性薬、アポトーシス促進薬、毒素、ヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡｓｅを含む）、ホルモン、免疫調節薬、キレート薬、ホウ素化合物、光活性薬もしくは色素、放射性同位体もしくは放射性核種、オリゴヌクレオチド、干渉性ＲＮＡ、ペプチド、抗血管新生薬、化学療法薬、サイトカイン（ｃｙｏｋｉｎｅ）、ケモカイン、プロドラッグ、酵素、結合タンパク質もしくはペプチド、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定しない。
【００４３】
「免疫複合体」とは、治療薬へ結合した抗体、抗体フラグメントまたは他の抗体部分である。本明細書で使用する場合、「複合体」及び「免疫複合体」という用語は相互交換可能に使用される。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「抗体融合タンパク質」という用語とは、１つ以上の天然抗体、一本鎖抗体または抗体フラグメントが、タンパク質もしくはペプチド、毒素、サイトカイン、ホルモンなど、別の部分へ連結した組換え産生される抗原結合分子である。ある特定の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、同じ抗原または異なる抗原上の同じエピトープ、異なるエピトープへ結合し得る互いに融合した同じまたは異なる抗体、抗体フラグメントまたは一本鎖抗体のうちの２つ以上を含んでもよい。
【００４５】
「免疫調節薬」とは、存在する場合、身体の免疫系を変化、抑制または刺激する治療薬である。典型的には、使用する免疫調節薬は、免疫細胞を刺激して、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞及び／またはＴ細胞など免疫応答カスケードにおいて増殖または活性化する。しかしながら、いくつかの場合、免疫調節薬は、自己免疫疾患の治療的処置などにおけるように、免疫細胞の増殖または活性化を抑制し得る。本明細書で説明する免疫調節薬の例はサイトカインであり、特定の抗原との接触において１つの細胞集団（例えば、刺激されたＴリンパ球）によって放出されるおよそ５〜２０ｋＤａの可溶性小分子タンパク質であり、細胞間で細胞間メディエーターとして作用する。当業者が理解するように、サイトカインの例としては、リンホカイン、モノカイン、インターロイキン、ならびに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びインターフェロンなどのいくつかの関連シグナル伝達分子が挙げられる。ケモカインは、サイトカインのサブセットである。ある特定のインターロイキン及びインターフェロンは、Ｔ細胞または他の免疫細胞の増殖を刺激するサイトカインの例である。
【００４６】
「ＣＰＴ」とは、カンプトテシンについての略語である。本出願で使用する場合、ＣＰＴは、カンプトテシンそれ自体またはカンプトテシンの類似体もしくは誘導体を表す。カンプトテシン及びその類似体のうちの一部の構造は、示されている付番及び文字Ａ〜Ｅで標識された環とともに、以下のチャート１の式１に付与されている。
【００４７】
（チャート１）
【化１】
0006427789.tif 000002
【００４８】
（化学的略語）
ＤＣＡ：ジクロロ酢酸（Ｄｉｃｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）
Ｆｍｏｃ：フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド
ＥＥＤＱ：２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン
ＭＣＣ−ｙｎｅ：４−（Ｎ−マレイミドメチル）−Ｎ−（２−プロピニル）シクロヘキサン−１−カルボキサミド
ＭＭＴ：モノメトキシトリチル
ＰＡＢＯＨ：ｐ−アミノベンジルアルコール
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール
ＴＢＡＦ：テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド
ＴＢＤＭＳ：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
【００４９】
（カンプトテシン複合体）
抗体または抗原結合性抗体フラグメントへ結合したカンプトテシン治療薬を含む免疫複合体を調製するための非限定的な方法及び組成物を以下に説明する。好ましい実施形態において、薬剤の溶解度は、規定されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分（すなわち、規定数の単量体単位を含有するＰＥＧ）を薬剤と抗体の間に配置することによって高められ、ここで規定されたＰＥＧとは、好ましくは１〜３０単量体単位を含有する、より好ましくは１〜１２の単量体単位を含有する低分子量ＰＥＧである。
【００５０】
好ましくは、第一のリンカーは、一端で薬剤を結合しており、もう一端でアセチレン基またはアジド基で終始し得る。この第一のリンカーは、一端にアジド基またはアセチレン基を、もう一端にカルボン酸基またはヒドロキシル基などの異なる反応基を有する規定されたＰＥＧ部分を含み得る。当該二官能性の規定されたＰＥＧは、アミノアルコールのアミン基へ結合し得、後者のヒドロキシル基は、カルボン酸塩の形態で薬剤上のヒドロキシル基へ結合し得る。あるいは、当該規定された二官能性ＰＥＧの非アジド（またはアセチレン）部分は、Ｌ型アミノ酸またはポリペプチドのＮ末端へ結合するとともに、Ｃ末端はアミノアルコールのアミノ基へ結合し得、後者のヒドロキシ基は、炭酸塩またはカルバミン酸塩の形態でそれぞれ薬剤のヒドロキシル基へ結合し得る。
【００５１】
第一のリンカーのアジド（またはアセチレン）基に対して相補性の抗体カップリング基及び反応基を含む第二のリンカー、すなわちアセチレン（またはアジド）は、アセチレン−アジド付加環化反応を介して薬剤−（第一のリンカー）複合体と反応して、疾患標的抗体への結合に有用な最終的な二官能性薬剤産物を供給し得る。抗体カップリング基は好ましくは、チオール基またはチオール反応基のいずれかである。
【００５２】
ＳＮ−３８などのＣＰＴ類似体を包含する薬剤−リンカー前駆体の調製におけるＣ−２０炭酸塩の存在下での１０−ヒドロキシル基の選択的再生のための方法を以下に提供する。ＳＮ−３８におけるフェノール性ヒドロキシルなどの薬剤における反応性ヒドロキシル基についての他の保護基、例えば、ｔ−ブチルジメチルシリルまたはｔ−ブチルジフェニルシリルも使用してもよく、これらは、抗体カップリング部分への誘導体化された薬剤の連結の前にフッ化テトラブチルアンモニウムによって脱保護してもよい。ＣＰＴ類似体の１０−ヒドロキシル基はあるいは、「ＢＯＣ」以外のエステルまたは炭酸塩として保護され、それにより二官能性ＣＰＴはこの保護基の先行する脱保護なしで抗体へ結合する。保護基は、当該生体複合体が投与された後に生理学的ｐＨ条件下で容易に脱保護され得る。
【００５３】
「クリック化学現象」と呼ばれるアセチレン−アジドカップリングにおいて、アジド部分は、Ｌ３上のアセチレン部分とともにＬ２上にあってもよい。あるいは、Ｌ２はアセチレンを含有するとともにＬ３がアジドを含有してもよい。「クリック化学現象」は、アセチレン部分とアジド部分の間の銅（＋１）触媒性付加環化反応を指す（Ｋｏｌｂ  ＨＣ及びＳｈａｒｐｌｅｓｓ  ＫＢ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  ２００３；８：１１２８〜１１３７）が、クリック化学現象の代替的な形態は公知であり、使用してもよい。当該反応は、臭化銅及びトリフェニルホスフィンからなる混合物を使用して、ジクロロメタンなどの非極性有機溶媒における非常に効率的なカップリングを可能にする。クリック化学現象の利点は、それが化学選択的でありかつ、チオール−マレイミド反応などの他の周知の結合化学反応を補完することである。以下の考察において、複合体が抗体または抗体フラグメントを含む場合、標的化ペプチドなどの別の種類の結合部分が置換されてもよい。
【００５４】
例示的な好ましい実施形態は、薬剤誘導体及び一般式２
ＭＡｂ−［Ｌ２］−［Ｌ１］−［ＡＡ］ｍ−［Ａ’］−薬剤  （２）
の抗体からなる複合体に関するものであり、式中、ＭＡｂは疾患標的化抗体であり、Ｌ２は抗体カップリング部分及びアセチレン（またはアジド）基のうちの１つ以上を含む架橋剤の一成分であり、Ｌ１は、Ｌ２におけるアセチレン（またはアジド）部分に対して相補的な、アジド（またはアセチレン）を一端で有し、及びもう一端でカルボン酸またはヒドロキシル基などの反応基を有する規定されたＰＥＧを含み、ＡＡはＬ型アミノ酸であり、ｍは０、１、２、３、または４の値を有する整数であり、かつＡ’は、エタノールアミン、４−ヒドロキシベンジルアルコール、４−アミノベンジルアルコール、または置換もしくは非置換エチレンジアミンからなる群から選択される追加的なスペーサーである。「ＡＡ」のＬ型アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンから選択される。Ａ’基がヒドロキシル基を含有する場合、当該Ａ’基は、カルボン酸塩またはカルバミン酸塩の形態でそれぞれ薬剤のヒドロキシル基またはアミノ基へ連結される。
【００５５】
式２の好ましい実施形態において、一般式２の「Ａ」はＡ−ＯＨであり、それによりＡ−ＯＨは４−アミノベンジルアルコールまたはベンジル位でＣ１〜Ｃ１０アルキル基で置換された置換４−アミノベンジルアルコールなどの折り畳み可能な部分であり、後者はそのアミノ基を介して、Ｌ型アミノ酸または最多４個のＬ型アミノ酸部分を含むポリペプチドへ結合し、ここで、Ｎ末端は抗体部分結合基において終止する架橋剤へ結合する。
【００５６】
好ましい実施形態の一例は以下に付与されており、ここで、一般式（２）のＡ’のＡ−ＯＨ実施形態は、置換４−アミノベンジルアルコールに由来し、かつ「ＡＡ」は、一般式（２）におけるｍ＝１を有する単一のＬ型アミノ酸から構成され、かつ薬剤はＳＮ−３８で例示される。構造は以下に表されている（式３、ＭＡｂ−ＣＬＸ−ＳＮ−３８と呼ぶ）。ＡＡの単一のアミノ酸は、以下のＬ型アミノ酸、すなわちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンのうちのいずれか１つから選択される。４−アミノベンジルアルコール部分（Ａ’のＡ−ＯＨ実施形態）上の置換基Ｒは水素または、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基から選択されるアルキル基である。
【化３】
0006427789.tif 000003
【００５７】
単一のアミノ酸ＡＡがＬ型リジンでありかつＲ＝Ｈであり、かつ薬剤がＳＮ−３８によって例示される式３のＭＡｂ−ＣＬＸ−ＳＮ−３８の実施形態（式４、ＭＡｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と呼ぶ）。
【化４】
0006427789.tif 000004
【００５８】
別の好ましい実施形態において、複合体のＬ１成分は、１〜３０個の反復する単量体単位を有する規定されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーを含有する。さらなる好ましい実施形態において、ＰＥＧとは、１〜１２個の反復する単量体単位を有する規定されたＰＥＧである。ＰＥＧの導入は、市販されているヘテロ二官能化ＰＥＧ誘導体を用いることを包含し得る。ヘテロ二官能性ＰＥＧは、アジド基またはアセチレン基を含有し得る。「ＮＨＳ」がスクシンイミジルである、８個の反復する単量体単位を含有するヘテロ二官能性の規定されたＰＥＧの一例を、以下の式５に示す。
【化５】
0006427789.tif 000005
【００５９】
好ましい実施形態において、ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を生成する過程は、図１に示すとおりである。この実施形態において、ある特定の有意な過程の変化が、免疫複合体ＭＡｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を生成するのに使用するＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の調製においてなされた。例えば、当業者に明白ではない米国特許第７，９９９，０８３号において開示される手順へのこれらの変化は、以下の変化を含む。
１）ヘキサンはＬｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ（図１における中間体２）を沈殿させるのに以前使用されていたが、より安全な代替物質として、ヘキサンをヘプタンと置き換えた。残留している除去されていないジエチルアミンは、ＮＭＲ分光法によってアッセイした。ジエチルアミンの存在が検出される場合、材料をさらに精製して、ジエチルアミンを除去し、中間体２におけるジエチルアミンの存在によって生じる収量の減少を回避した。
２）ＳＮ−３８からの１０−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８（図１における中間体４）の調製において、反応のために溶媒として以前使用されていたジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）をジクロロメタン（ＤＣＭ）と置き換え、それにより、反応後の溶媒の除去をさらに容易にした。ＤＭＦからＤＣＭへの切り替えは、規模拡大を簡便にするために、及びＤＭＦ中での反応で時折観察される幾分減少した生成物収量の改善のために実施した。ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドを用いたヒドロキシル基の保護は通常、ＤＭＦを溶媒として用いて実施するが、他の溶媒は使用されている（Ｇｒｅｅｎｅ  ＴＷ及びＷｕｔｓ  ＰＧＭ，有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社，１９９９；１２７〜１３２頁）。ＳＮ−３８の脈絡において、ＤＭＦの使用は、当該材料がＤＣＭにおいて難溶性であるため、好ましかった。ＤＣＭ媒体中での生成物の形成の高い収量は予期せぬことであり、予想することはできなかった。
３）図１における１０−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８からそのクロロギ酸塩反応中間体５への変換において、トリホスゲンを１つのロットの代わりに少量ずつジクロロメタン溶液へ添加した。このことは、大規模製造において反応温度が潜在的に危険に上昇するのを回避しつつ、収量を保った。
４）最後から２番目の中間体であるＭＣＣ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＣＯ−２０−Ｏ−ＳＮ−３８（図１における中間体９）を結果として生じるための、アジド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯ−ＣＯ−２０−Ｏ−ＳＮ−３８（図１における中間体７）とＭＣＣ−Ｙｎｅ（図１における中間体８）の間の付加環化反応において、当該生成物は、反応混合物がまず銅塩を除去するためにＥＤＴＡ抽出で後処理し、収量の減少をもたらす場合、不安定であることが発見された。驚くべきことに、当該反応混合物のクロマトグラフィーを最初に実施した後にＥＤＴＡを用いた抽出を行って、シリカゲルカラムに完全には捉えられていない残留している銅塩を除去した場合、当該生成物は安定していることも発見された。この過程の変化はまた、望ましくない副産物の形成を回避することによって収量の改善をもたらした。操作の順序を単純に逆転させることによって、すなわち、最初にクロマトグラフィーを行った後にＥＤＴＡを用いて抽出することによって、精製の前に中間体９の安定性を改善することは予期しなかった。
５）先の項目４において説明したのと同じ反応において、改善された収量は、反応時間が１８〜２４時間の代わりに１４時間まで短縮した場合に得られた。
【００６０】
ある特定の実施形態において、二官能性薬剤が抗体結合基としてチオール反応部分を含有している場合、標識されることになっている抗体上のチオールは、還元型システイン残基の代わりに、チオール化試薬を用いることによって、抗体のリジン基の側鎖上に生じ得る。ＭＡｂのリジン基の修飾によって抗体へとチオール基を導入するための方法は、当該技術分野で周知である（Ｗｏｎｇ，タンパク質の結合及び架橋に関する化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ社，フロリダ州ボカラトン市（１９９１），２０〜２２頁）。あるいは、還元剤トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いた抗体上での鎖間ジスルフィド結合の軽度の還元は、抗体上に７〜１０個のチオールを生じることができ、このことは、抗原結合領域から離れたＭＡｂの鎖間領域に複数の薬剤部分を組み込む利点を有している。その上、ＴＣＥＰを用いた還元の後、還元型抗体の前精製が必要ではなく、ジスルフィドで還元された抗体は、チオール反応性ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８へインサイツで結合する。
【００６１】
別の好ましい実施形態において、抗体及びＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８からなる複合体は、当該複合体数百グラムを精製するために２５〜３０透析濾過容積の複合体形成緩衝液を用いて５０，０００Ｄａの分子量のカットオフメンブレンを用いる接線フロー濾過（ＴＦＦ）法によって精製する。この方法は、サイズ排除クロマトグラフィーカラム及び疎水性クロマトグラフィーカラム上での高価なかつ扱いにくいクロマトグラフィー精製を採用する必要性を除去する。
【００６２】
さらに別の実施形態において、当該複合体は、６〜７．０のｐＨのグッドの生物学的緩衝液中で製剤化され、保存のために凍結乾燥する。好ましくは、グッドの緩衝液は、６〜７のｐＨ範囲の、好ましくは６．５〜７のｐＨ範囲の、及び１０〜１００ｍＭの、好ましくは２５ｍＭの緩衝液濃度の２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、及び１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）からなる群から選択される。最も好ましい製剤緩衝液は、ｐＨ６．５の２５ｍＭのＭＥＳである。
【００６３】
さらなる実施形態において、精製された複合体は、トレハロース及びポリソルベート８０などの賦形剤と組み合わされ、凍結乾燥され、及び−２０〜８℃の温度範囲で凍結乾燥体として保存される。
【００６４】
（一般的な抗体技術）
実質的にいずれかの標的抗原に対するモノクローナル抗体を調製するための技術は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）、ならびにＣｏｌｉｇａｎら（編），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第１巻，２．５．１〜２．６．７頁（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９１）を参照されたい。簡潔には、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物をマウスへ注射すること、脾臓を取り出してＢリンパ球を得ること、Ｂリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作製すること、ハイブリドーマをクローン化すること、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選別すること、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養すること、及び抗体をハイブリドーマ培養物から単離することによって得ることができる。
【００６５】
キメラ抗体またはヒト化抗体の製造などの種々の技術は、抗体のクローン化及び構築の手順を包含し得る。関心対象の抗体についての抗原結合Ｖκ（可変軽鎖）配列及びＶＨ（可変重鎖）配列は、ＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥ、及びｃＤＮＡライブラリスクリーニングなど、種々の分子クローン化手順によって得られ得る。ネズミ抗体を発現する細胞由来の抗体のＶ遺伝子は、ＰＣＲ増幅によってクローン化して配列決定することができる。当該Ｖ遺伝子の確実性を確認するために、クローン化したＶＬ遺伝子及びＶＨ遺伝子はＯｒｌａｎｄｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６：３８３３（１９８９））によって説明されるように、キメラＡｂとして細胞培養物中に発現することができる。Ｖ遺伝子配列をもとに、ヒト化抗体は次に、Ｌｅｕｎｇら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：１４１３（１９９５））によって説明されるように設計及び構築することができる。
【００６６】
ｃＤＮＡは、一般的な分子クローン化技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，分子クローン化，実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ），第２版（１９８９））によってネズミ抗体を産生するいずれかの公知のハイブリドーマ株またはトランスフェクトした細胞株から調製することができる。抗体についてのＶκ配列は、プライマーＶＫ１ＢＡＣＫ及びＶＫ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉら，１９８９）またはＬｅｕｎｇら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１５：２８６（１９９３））によって説明される拡充したプライマーセットを用いて増幅され得る。ＶＨ配列は、プライマー対ＶＨ１ＢＡＣＫ／ＶＨ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉら，１９８９）、またはＬｅｕｎｇら（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９（１９９４））によって説明されるネズミＩｇＧの定常部へアニーリングするプライマーを用いて増幅することができる。ヒト化Ｖ遺伝子は、Ｌｅｕｎｇら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：１４１３（１９９５））によって説明されるような長鎖オリゴヌクレオチドテンプレート合成及びＰＣＲ増幅の組み合わせによって構築することができる。
【００６７】
ＶκについてのＰＣＲ産物は、ｐＢＲ３２７をもとにしたステージングベクターである、ＶＫｐＢＲなどの、Ｉｇプロモーター、シグナルペプチド配列及び簡便な制限部位を含有するステージングベクターへとサブクローン化することができる。ＶＨについてのＰＣＲ産物は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔをもとにしたＶＨｐＢＳなど、類似のステージングベクターへとサブクローン化することができる。プロモーター及びシグナルペプチド配列とともにＶκ配列及びＶＨ配列を含有する発現カセットは、ＶＫｐＢＲ及びＶＨｐＢＳから切り出して、それぞれｐＫｈ及びｐＧｌｇなど、適切な発現ベクターへとライゲートすることができる（Ｌｅｕｎｇら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９（１９９４））。発現ベクターは、適切な細胞へと同時トランスフェクトして、上澄み液をキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の産生についてモニターすることができる。あるいは、Ｖκ及びＶＨ発現カセットは、切り出して、Ｇｉｌｌｉｅｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１（１９８９））によって説明されるような及びＬｏｓｍａｎら，Ｃａｎｃｅｒ，８０：２６６０（１９９７）においても示されている、ｐｄＨＬ２などの単一発現ベクターへとサブクローン化することができる。
【００６８】
代替的な実施形態において、発現ベクターは、無血清培地中でのトランスフェクション、増殖及び発現にあらかじめ適応した宿主細胞へとトランスフェクトしてもよい。使用してもよい例示的な細胞株としては、Ｓｐ／ＥＥＥ、Ｓｐ／ＥＳＦ及びＳｐ／ＥＳＦ−Ｘ細胞株が挙げられる（例えば、米国特許第７，５３１，３２７号、第７，５３７，９３０号及び第７，６０８，４２５号を参照されたく、これらの各々の実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる）。これらの例示的な細胞株は、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞株に基づいており、突然変異体Ｂｃｌ−ＥＥＥ遺伝子でトランスフェクトされ、メトトレキサートへ曝露されてトランスフェクトした遺伝子配列を増幅し、及びタンパク質発現のために無血清細胞株へあらかじめ適応している。
【００６９】
（キメラ抗体及びヒト化抗体）
キメラ抗体とは、ヒト抗体の可変部が例えば、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むマウス抗体の可変部によって置き換えられた組換えタンパク質である。キメラ抗体は、対象へ投与した場合、低い免疫原性及び高い安定性を呈する。キメラ抗体を構築するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｌｅｕｎｇら，１９９４，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９）。
【００７０】
キメラモノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重鎖可変部及び軽鎖可変部からヒト抗体の対応する可変部へとマウスＣＤＲを移植することによってヒト化し得る。キメラモノクローナル抗体におけるマウスフレームワーク領域（ＦＲ）も、ヒトＦＲ配列と置き換えられる。ヒト化したモノクローナル抗体の安定性及び抗原特異性を保つために、１つ以上のヒトＦＲ残基がマウス対応物残基によって置き換わり得る。ヒト化したモノクローナル抗体は、対象の治療的処置のために使用され得る。ヒト化したモノクローナル抗体の製造のための技術は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓら，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２：３２３、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４、Ｃａｒｔｅｒら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５、Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９２，１２：４３７、Ｔｅｍｐｅｓｔら，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６、Ｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１９９３，１５０：２８４４を参照されたい）。
【００７１】
他の実施形態は、非ヒト霊長類抗体に関し得る。ヒヒにおける治療上有用な抗体を生じるための一般的な技術は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら，ＷＯ９１／１１４６５（１９９１）において、及びＬｏｓｍａｎら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：３１０（１９９０）において見出され得る。別の実施形態において、抗体は、ヒトモノクローナル抗体であり得る。このような抗体は、以下に考察するように、抗原負荷に応じて特定のヒト抗体を産生するよう操作されたトランスジェニックマウスから得られ得る。
【００７２】
（ヒト抗体）
組み合わせアプローチまたはヒト免疫グロブリン遺伝子座を用いて形質転換したトランスジェニック動物のいずれかを用いて完全ヒト抗体を作製するための方法は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｍａｎｃｉｎｉら，２００４，Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：３１５〜３２８、Ｃｏｎｒａｄ及びＳｃｈｅｌｌｅｒ，２００５，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．８：１１７〜１２６、Ｂｒｅｋｋｅ及びＬｏｓｅｔ，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．３：５４４〜５５０であり、各々参照により本明細書に組み込まれる）。このような完全ヒト抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体よりもさらに少数の副作用を呈しかつ本質的に内在性のヒト抗体としてインビボで機能すると期待される。ある特定の実施形態において、請求する方法及び手順は、このような技術によって作製されるヒト抗体を利用し得る。
【００７３】
ある代替例において、ファージディスプレイ技術を使用して、ヒト抗体を作製してもよい（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＤａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら，２００５，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．４：１２６〜１４０）。ヒト抗体は、正常なヒトからまたは癌など特定の疾患状態を呈するヒトから作製され得る（Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら，２００５）。罹患した個体からヒト抗体を構築する利点は、循環中の抗体レパートリーが疾患関連抗原に対する抗体へと偏り得ることである。
【００７４】
本方法論の１つの非限定例において、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら（２００５）は、骨肉腫患者からヒトＦａｂ抗体フラグメントのファージディスプレイライブラリを構築した。概して、全ＲＮＡを循環血リンパ球から得た（同書）。組換えＦａｂをμ鎖、γ鎖及びκ鎖の抗体レパートリーからクローン化し、ファージディスプレイライブラリへと挿入した（同書）。ＲＮＡをｃＤＮＡへ変換し、重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列に対して特異的なプライマーを用いてＦａｂ  ｃＤＮＡライブラリを作成するために使用した（参照により本明細書に組み込まれるＭａｒｋｓら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７）。ライブラリ構築は、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆら（２０００，ファージディスプレイ実験室マニュアル（Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｂａｒｂａｓら（編），初版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー地区，９．１〜９．２２頁，参照により本明細書に組み込まれる）に従って実施した。最終的なＦａｂフラグメントは、制限エンドヌクレアーゼを用いて切断し、バクテリオファージゲノムへと挿入して、ファージディスプレイライブラリを作成した。このようなライブラリは、標準的なファージディスプレイ法によってスクリーニングしてもよい。当業者は、この技術が例示的であるに過ぎず、ファージディスプレイによるヒト抗体または抗体フラグメントを作製及びスクリーニングするためのいずれかの公知の方法を利用してもよいことを理解するであろう。
【００７５】
別の代替例において、ヒト抗体を産生するために遺伝子操作されたトランスジェニック動物を使用して、先に考察した標準的な免疫化プロトコルを用いて、本質的にいずれかの免疫原性標的に対する抗体を作製してもよい。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Ｇｒｅｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）、及びＴａｙｌｏｒら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）によって説明されている。このような系の非限定例は、Ａｂｇｅｎｉｘ（カリフォルニア州フリーモント市）製のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧｒｅｅｎら，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１〜２３）である。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）及び類似の動物において、マウス抗体遺伝子は、非活性化されており、機能的ヒト抗体遺伝子によって置き換えられているが、マウス免疫系の残りは未処置のままである。
【００７６】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、アクセサリー遺伝子及び調節エレメントとともに可変部配列の大部分を含むヒトＩｇＨ及びＩｇκ遺伝子座の複数の部分を含有する生殖系列により構成されたＹＡＣ（酵母人工染色体）を用いて形質転換した。ヒト可変部レパートリーを使用して、抗体産生性Ｂ細胞を作製してもよく、これを公知の技術によってはイブリドーマへと加工してもよい。標的抗原で免疫化したＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、正常な免疫応答によってヒト抗体を産生し、これは、先に考察した標準的な技術によって収集及び／または製造され得る。種々の系統のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は入手可能であり、これらの各々は、異なるクラスの抗体を産生することができる。遺伝子操作で産生されたヒト抗体は、正常なヒト抗体の薬物動態特性を保有していながら、治療能力を有することが示されている（Ｇｒｅｅｎら，１９９９）。当業者は、請求する組成物及び方法が、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）の使用に限定されるのではなく、ヒト抗体を産生するよう遺伝子操作されたいずれかのトランスジェニック動物を利用し得ることを理解するであろう。
【００７７】
（抗体フラグメントの製造）
抗体フラグメントは、例えば、従来法によって抗体全体のペプシンまたはパパインによる切断によって得られ得る。例えば、抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２と示される５Ｓフラグメントを提供するためのペプシンによる抗体の酵素による切断によって製造され得る。このフラグメントはさらにチオール還元剤を及び任意で、ジスルフィド結合の切断から結果的に生じるスルフヒドリル基についての遮断基を用いて切断して、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価フラグメントを製造してもよい。あるいは、ペプシンを用いた酵素による切断は、２つの一価Ｆａｂフラグメント及びＦｃフラグメントを製造する。抗体フラグメントを製造するための例示的な方法は、米国特許第４，０３６，９４５号、米国特許第４，３３１，６４７号、Ｎｉｓｏｎｏｆｆら，１９６０，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，８９：２３０、Ｐｏｒｔｅｒ，１９５９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，７３：１１９、Ｅｄｅｌｍａｎら，１９６７，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，４２２頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、及びＣｏｌｉｇａｎら（編），１９９１，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）において開示されている。
【００７８】
重鎖の分離など、抗体を切断して、一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成する他の方法、フラグメントのさらなる切断または他の酵素的、化学的もしくは遺伝的技術も、完全抗体によって認識される抗原へフラグメントが結合する限り、使用してもよい。例えば、Ｆｖフラグメントは、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の結合を含む。この結合は、Ｉｎｂａｒら，１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２６５９において説明される通り、非共有結合であることができる。あるいは、可変部は、分子間ジスルフィド結合によって結合していてもよく、またはグルたるアルデヒドなどの化学物質によって架橋していてもよい。Ｓａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７を参照されたい。
【００７９】
好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによって結合したＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓｃＦｖ）は、オリゴヌクレオチドリンカー配列によって結合するＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は、発現ベクターへと挿入され、これがその後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの宿主細胞へと導入される。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを用いて一本鎖ポリペプチドを合成する。ｓｃＦｖを製造するための方法は、当該技術分野で周知である。Ｗｈｉｔｌｏｗら，１９９１，方法：酵素学における方法に対する必携（Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）２：９７、Ｂｉｒｄら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｐａｃｋら，１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１２７１、及びＳａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７を参照されたい。
【００８０】
抗体フラグメントの別の形態は、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）であり、時に一本鎖抗体と呼ばれる。単一ドメイン抗体を製造するための技術は当該技術分野で周知である（例えば、Ｃｏｓｓｉｎｓら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２００７，５１：２５３〜２５９、Ｓｈｕｎｔａｏら，Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ０６，  ４３：１９１２〜１９１９、Ｔａｎｈａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６：２４７７４〜２４７８０を参照されたい）。他の種類の抗体フラグメントは、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、関心対象の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。このような遺伝子は例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体産生細胞のＲＮＡから可変部を合成することによって得ることができる。Ｌａｒｒｉｃｋら，１９９１，方法：酵素学における方法に対する必携（Ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）２：１０６、Ｒｉｔｔｅｒら（編），１９９５，モノクローナル抗体：製造、遺伝子操作及び臨床への応用（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ），１６６〜１７９頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｂｉｒｃｈら（編），１９９５，モノクローナル抗体：原理及び応用（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ），１３７〜１８５頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ社）を参照されたい。
【００８１】
（抗体の変化）
ある特定の実施形態において、抗体のＦｃ部分などの抗体の配列は、血清中の半減期など、複合体の生理学的特徴を最適化するために変化してもよい。部位特異的突然変異誘発などによるタンパク質におけるアミノ酸配列を置換する方法は、当該技術分野で広く公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，分子クローン化，実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，第２版，１９８９）。好ましい実施形態において、変化はＦｃ配列における１つ以上のグリコシル化部位の付加または除去を包含し得る（例えば、その実施例の節が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２５４，８６８号）。他の好ましい実施形態において、Ｆｃ配列における特定のアミノ酸置換がなされ得る（例えば、Ｈｏｒｎｉｃｋら，２０００，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４１：３５５〜３６２、Ｈｉｎｔｏｎら，２００６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６：３４６〜３５６、Ｐｅｔｋｏｖａら  ２００６，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：１７５９〜１７６９、米国特許第７，２１７，７９７号であり、各々参照により本明細書に組み込まれる）
【００８２】
（抗体アロタイプ）
治療用抗体の免疫原性は、注入反応の高い危険性及び治療応答の短い持続時間と関係している（Ｂａｅｒｔら，２００３，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４８：６０２〜６０８）。治療用抗体が宿主において免疫応答を誘導する程度は、抗体のアロタイプによって一部決定され得る（Ｓｔｉｃｋｌｅｒら，２０１１，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：２１３〜２２１）。抗体アロタイプは、抗体の定常部配列における特定の位置にあるアミノ酸配列の変化と関連する。重鎖γ型定常部を含有するＩｇＧ抗体のアロタイプは、Ｇｍアロタイプと命名されている（１９７６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１７：１０５６〜１０５９）。
【００８３】
一般的なＩｇＧ１ヒト抗体について、最も普及しているアロタイプは、Ｇ１ｍ１である（Ｓｔｉｃｋｌｅｒら，２０１１，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：２１３〜２２１）。しかしながら、Ｇ１ｍ３アロタイプもコーカサス人種において頻繁に生じている（Ｓｔｉｃｋｌｅｒら，２０１１）。Ｇ１ｍ３患者など、非Ｇ１ｍ１（ｎＧ１ｍ１）へ投与した場合に免疫応答を誘導する傾向があるアロタイプ配列をＧ１ｍ１抗体が含有することは報告されている（Ｓｔｉｃｋｌｅｒら，２０１１）。非Ｇ１ｍ１アロタイプ抗体は、Ｇ１ｍ１患者へ投与した場合、それほど免疫原性ではない（Ｓｔｉｃｋｌｅｒら，２０１１）。
【００８４】
ヒトＧ１ｍ１アロタイプは、重鎖ＩｇＧ１のＣＨ３配列におけるカバット位置３５６におけるアスパラギン酸及びカバット位置３５８におけるロイシンのアミノ酸を含む。ｎＧ１ｍ１アロタイプは、カバット位置３５６におけるグルタミン酸及びカバット位置３５８におけるメチオニンのアミノ酸を含む。Ｇ１ｍ１及びｎＧ１ｍ１の両アロタイプは、カバット位置３５７におけるグルタミン酸残基を含み、当該アロタイプは時にＤＥＬアロタイプ及びＥＥＭアロタイプと呼ばれる。Ｇ１ｍ１及びｎＧ１ｍ１アロタイプ抗体についての重鎖定常部配列の非限定例は、例示的な抗体リツキシマブ（配列番号８５）及びベルツズマブ（配列番号８６）について以下に示す。
リツキシマブ重鎖可変部配列（配列番号８５）（原文では［］内は太字）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫ［ＫＡ］ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ［Ｄ］Ｅ［Ｌ］ＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ベルツズマブ重鎖可変部（配列番号８６）（原文では［］内は太字）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫ［ＲＶ］ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ［Ｅ］Ｅ［Ｍ］ＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【００８５】
Ｊｅｆｆｅｒｉｓ及びＬｅｆｒａｎｃ（２００９，ｍＡｂｓ  １：１〜７）は、ＩｇＧアロタイプに特徴的な配列変化及び免疫原性に及ぼす当該配列変化の効果を総説している。Ｊｅｆｆｅｒｉｓ及びＬｅｆｒａｎｃは、Ｇ１ｍ３アロタイプがＧ１ｍ１７アロタイプにおけるカバット２１４におけるリジン残基と比較して、カバット位置２１４におけるアルギニン残基を特徴とすると報告した。ｎＧ１ｍ１，２アロタイプは、カバット位置３５６におけるグルタミン酸、カバット位置３５８におけるメチオニン及びカバット位置４３１におけるアラニンを特徴としていた。Ｇ１ｍ１，２アロタイプは、カバット位置３５６におけるアスパラギン酸、カバット位置３５８におけるロイシン及びカバット位置４３１におけるグリシンを特徴としていた。重鎖定常部配列変異体に加えて、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ及びＬｅｆｒａｎｃ（２００９）は、カバット位置１５３におけるバリン及びカバット位置１９１におけるロイシンを特徴とするＫｍ１アロタイプ、カバット位置１５３におけるアラニン及びカバット位置１９１におけるロイシンによるＫｍ１，２アロタイプ、ならびにカバット位置１５３におけるアラニン及びカバット位置１９１におけるバリンを特徴とするＫｍ３アロタイプを有するカッバ軽鎖定常部におけるアロタイプ変異体を報告した。
【００８６】
治療用抗体に関して、ベルツズマブ及びリツキシマブはそれぞれ、広範な血液学的悪性腫瘍及び／または自己免疫疾患の治療のために使用する、ＣＤ２０に対するヒト化ＩｇＧ１抗体及びキメラＩｇＧ１抗体である。表１は、リツキシマブ対ベルツズマブのアロタイプ配列を比較している。表１に示すように、リツキシマブ（Ｇ１ｍ１７，１）は、ＤＥＬアロタイプＩｇＧ１であり、リツキシマブにおけるリジン対ベルツズマブにおけるアルギニンのカバット位置２１４（重鎖ＣＨ１）における追加的な配列変化を有している。対象における免疫原性がベルツズマブはリツキシマブよりも低いこと、つまりヒト化抗体とキメラ抗体の間の差に起因する効果が報告されている（例えば、Ｍｏｒｃｈｈａｕｓｅｒら，２００９，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：３３４６〜３３５３、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら，２００９，Ｂｌｏｏｄ  １１３：１０６２〜１０７０、Ｒｏｂａｋ及びＲｏｂａｋ，２０１１，ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２５：１３〜２５を参照されたい）。しかしながら、ＥＥＭアロタイプとＤＥＬアロタイプの間のアロタイプにおける差はまた、ベルツズマブの比較的低い免疫原性の原因となる可能性が高い。
表１．リツキシマブ対ベルツズマブのアロタイプ
【表１】
0006427789.tif 000006
【００８７】
ｎＧ１ｍ１遺伝子型の個体における治療用抗体の免疫原性を低下させるために、カバット２１４におけるアルギニンを特徴とするＧ１ｍ３アロタイプならびにカバット位置３５６におけるグルタミン酸、カバット位置３５８におけるメチオニン及びカバット位置４３１におけるアラニンを特徴とするｎＧ１ｍ１，２ヌルアロタイプに対応するよう抗体のアロタイプを選択することが望ましい。驚くべきことに、長期間にわたるＧ１ｍ３抗体の反復した皮下投与が有意な免疫応答を結果として生じないことが発見された。代替的な実施形態において、Ｇ１ｍ３アロタイプと同様にヒトＩｇＧ４重鎖は、カバット位置２１４におけるアルギニン、カバット位置における３５６におけるグルタミン酸、カバット位置３５９におけるメチオニン及びカバット位置４３１におけるアラニンを有している。免疫原性は、当該位置における残基に少なくとも一部関連しているように見えるので、治療用抗体のためのヒトＩｇＧ４重鎖定常部配列の使用も好ましい実施形態である。Ｇ１ｍ３  ＩｇＧ１抗体とＩｇＧ４抗体の併用も、治療用投与のために有用であり得る。
【００８８】
（公知の抗体）
種々の実施形態において、請求する方法及び組成物は、当該技術分野で公知の種々の抗体のうちのいずれかを利用してもよい。使用する抗体は、いくつかの公知の源から商業的に得てもよい。例えば、種々の抗体分泌性ハイブリドーマ株は、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス市）から入手可能である。腫瘍関連抗原を含むがこれに限定しない種々の疾患標的に対する多数の抗体は、ＡＴＣＣに寄託されており、ならびに／または可変部配列を公開しており、請求する方法及び組成物における使用に利用可能である。例えば、米国特許第７，３１２，３１８号、第７，２８２，５６７号、第７，１５１，１６４号、第７，０７４，４０３号、第７，０６０，８０２号、第７，０５６，５０９号、第７，０４９，０６０号、第７，０４５，１３２号、第７，０４１，８０３号、第７，０４１，８０２号、第７，０４１，２９３号、第７，０３８，０１８号、第７，０３７，４９８号、第７，０１２，１３３号、第７，００１，５９８号、第６，９９８，４６８号、第６，９９４，９７６号、第６，９９４，８５２号、第６，９８９，２４１号、第６，９７４，８６３号、第６，９６５，０１８号、第６，９６４，８５４号、第６，９６２，９８１号、第６，９６２，８１３号、第６，９５６，１０７号、第６，９５１，９２４号、第６，９４９，２４４号、第６，９４６，１２９号、第６，９４３，０２０号、第６，９３９，５４７号、第６，９２１，６４５号、第６，９２１，６４５号、第６，９２１，５３３号、第６，９１９，４３３号、第６，９１９，０７８号、第６，９１６，４７５号、第６，９０５，６８１号、第６，８９９，８７９号、第６，８９３，６２５号、第６，８８７，４６８号、第６，８８７，４６６号、第６，８８４，５９４号、第６，８８１，４０５号、第６，８７８，８１２号、第６，８７５，５８０号、第６，８７２，５６８号、第６，８６７，００６号、第６，８６４，０６２号、第６，８６１，５１１号、第６，８６１，２２７号、第６，８６１，２２６号、第６，８３８，２８２号、第６，８３５，５４９号、第６，８３５，３７０号、第６，８２４，７８０号、第６，８２４，７７８号、第６，８１２，２０６号、第６，７９３，９２４号、第６，７８３，７５８号、第６，７７０，４５０号、第６，７６７，７１１号、第６，７６４，６８８号、第６，７６４，６８１号、第６，７６４，６７９号、第６，７４３，８９８号、第６，７３３，９８１号、第６，７３０，３０７号、第６，７２０，１５５号、第６，７１６，９６６号、第６，７０９，６５３号、第６，６９３，１７６号、第６，６９２，９０８号、第６，６８９，６０７号、第６，６８９，３６２号、第６，６８９，３５５号、第６，６８２，７３７号、第６，６８２，７３６号、第６，６８２，７３４号、第６，６７３，３４４号、第６，６５３，１０４号、第６，６５２，８５２号、第６，６３５，４８２号、第６，６３０，１４４号、第６，６１０，８３３号、第６，６１０，２９４号、第６，６０５，４４１号、第６，６０５，２７９号、第６，５９６，８５２号、第６，５９２，８６８号、第６，５７６，７４５号、第６，５７２；８５６号、第６，５６６，０７６号、第６，５６２，６１８号、第６，５４５，１３０号、第６，５４４，７４９号、第６，５３４，０５８号、第６，５２８，６２５号、第６，５２８，２６９号、第６，５２１，２２７号、第６，５１８，４０４号、第６，５１１，６６５号、第６，４９１，９１５号、第６，４８８，９３０号、第６，４８２，５９８号、第６，４８２，４０８号、第６，４７９，２４７号、第６，４６８，５３１号、第６，４６８，５２９号、第６，４６５，１７３号、第６，４６１，８２３号、第６，４５８，３５６号、第６，４５５，０４４号、第６，４５５，０４０号、第６，４５１，３１０号、第６，４４４，２０６号、第６，４４１，１４３号、第６，４３２，４０４号、第６，４３２，４０２号、第６，４１９，９２８号、第６，４１３，７２６号、第６，４０６，６９４号、第６，４０３，７７０号、第６，４０３，０９１号、第６，３９５，２７６号、第６，３９５，２７４号、第６，３８７，３５０号、第６，３８３，７５９号、第６，３８３，４８４号、第６，３７６，６５４号、第６，３７２，２１５号、第６，３５９，１２６号、第６，３５５，４８１号、第６，３５５，４４４号、第６，３５５，２４５号、第６，３５５，２４４号、第６，３４６，２４６号、第６，３４４，１９８号、第６，３４０，５７１号、第６，３４０，４５９号、第６，３３１，１７５号、第６，３０６，３９３号、第６，２５４，８６８号、第６，１８７，２８７号、第６，１８３，７４４号、第６，１２９，９１４号、第６，１２０，７６７号、第６，０９６，２８９号、第６，０７７，４９９号、第５，９２２，３０２号、第５，８７４，５４０号、第５，８１４，４４０号、第５，７９８，２２９号、第５，７８９，５５４号、第５，７７６，４５６号、第５，７３６，１１９号、第５，７１６，５９５号、第５，６７７，１３６号、第５，５８７，４５９号、第５，４４３，９５３号、第５，５２５，３３８号を参照されたく、これらの各々の実施例の節は参照により本明細書に組み込まれる。これらは、例示的であるに過ぎず、広範な種々の他の抗体及び当該抗体のハイブリドーマは当該技術分野で公知である。当業者は、ほぼいずれかの疾患関連抗原に対する抗体配列または抗体分泌性ハイブリドーマが、関心対象の選択された疾患関連標的に対する抗体についての、ＡＴＣＣ、ＮＣＢＩ及び／またはＵＳＰＴＯのデータベースの単純な検索によって得られ得ることを理解するであろう。クローン化した抗体の抗原結合ドメインは、当該技術分野で周知の標準的な技術を用いて増幅し得、切り出され得、発現ベクターへライゲートされ得、適応した宿主細胞へとトランスフェクトされ得、タンパク質産生のために使用され得る（例えば、米国特許第７，５３１，３２７号、第７，５３７，９３０号、第７，６０８，４２５号及び第７，７８５，８８０号を参照されたく、これらの各々の実施例の節は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８９】
請求する方法及び組成物の範囲内で有用であり得る特定の抗体としては、ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ＬＬ２もしくはＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ベルツズマブ（ｈＡ２０、抗ＣＤ２０）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｕｍａｂ）（抗ＣＤ２０）、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１、抗ＣＤ２０）、ランブロリズマブ（抗ＰＤ−１受容体）、ニボルマブ（抗ＰＤ−１受容体）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）、ＲＳ７（抗上皮性糖タンパク質１（ＥＧＰ−１、ＴＲＯＰ−２としても公知））、ＰＡＭ４もしくはＫＣ４（両方とも抗ムチン）、ＭＮ−１４（抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＤ６６ｅもしくはＣＥＡＣＡＭ５としても公知）、ＭＮ−１５もしくはＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、Ｍｕ−９（抗結腸特異的抗原ｐ）、Ｉｍｍｕ  ３１（抗アルファ−フェトプロテイン）、Ｒ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ）、Ａ１９（抗ＣＤ１９）、ＩＭＭＵ−Ｈ２Ｂ（抗Ｈ２Ｂ）、ＩＭＭＵ−Ｈ３（抗Ｈ３）、ＩＭＭＵ−Ｈ４（抗Ｈ４）、ＴＡＧ−７２（例えば、ＣＣ４９）、Ｔｎ、Ｊ５９１もしくはＨｕＪ５９１（抗ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原））、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（抗ＰＳＭＡ二量体）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ）、Ｇ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ  ＭＡｂ）、Ｌ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲンツズマブ（抗ＣＤ３３）、イビリツモマブ・チウキセタン（抗ＣＤ２０）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、トシツモマブ（抗ＣＤ２０）、ＰＡＭ４（別名クリバツズマブ、抗ムチン）及びトラスツズマブ（抗ＥｒｂＢ２）が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体は当該技術分野で公知である（例えば、米国特許第５，６８６，０７２号、第５，８７４，５４０号、第６，１０７，０９０号、第６，１８３，７４４号、第６，３０６，３９３号、第６，６５３，１０４号、第６，７３０．３００号、第６，８９９，８６４号、第６，９２６，８９３号、第６，９６２，７０２号、第７，０７４，４０３号、第７，２３０，０８４号、第７，２３８，７８５号、第７，２３８，７８６号、第７，２５６，００４号、第７，２８２，５６７号、第７，３００，６５５号、第７，３１２，３１８号、第７，５８５，４９１号、第７，６１２，１８０号、第７，６４２，２３９号及び米国特許出願公開第２００５０２７１６７１号、第２００６０１９３８６５号、第２００６０２１０４７５号、第２００７００８７００１号、米国特許出願第１４／１８０，６４６号であり、各々の実施例の節は参照により本明細書に組み込まれる）。使用する具体的な公知の抗体としては、ｈＰＡＭ４（米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（米国特許第７，２５１，１６４号）、ｈＡ１９（米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ−３１（米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（米国特許第７，０７４，４０３号）、ｈＭｕ−９（米国特許第７，３８７，７７３号）、ｈＬ２４３（米国特許第７，６１２，１８０号）、ｈＭＮ−１４（米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ−１５（米国特許第７，５４１，４４０号）、ｈＲ１（米国特許出願第１２／７７２，６４５号）、ｈＲＳ��（米国特許第７，２３８，７８５号）、ｈＭＮ−３（米国特許第７，５４１，４４０号）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（米国特許出願第１１／９８３，３７２号、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４０５及びＰＴＡ−４４０６として寄託）及びＤ２／Ｂ（ＷＯ２００９／１３０５７５）が挙げられ、列挙した各特許または出願の文書は、図及び実施例の節に関して参照により本明細書に組み込まれる。
【００９０】
説明した複合体を用いて標的化され得る他の有用な抗原としては、炭酸脱水酵素ＩＸ、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α−アクチニン４、Ａ３、Ａ３３抗体に対して特異的な抗原、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂａ７３３、ＢＡＧＥ、ＢｒＥ３抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ〜ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１α、結腸特異的抗原ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ−β、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）及びそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導性因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４抗原、ＫＳ−１抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＡＧ−３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ４抗原、膵癌ムチン、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１受容体、胎盤増殖因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、トムソン・フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、Ｋｒａｓ、癌遺伝子マーカーならびに癌遺伝子産物が挙げられる（例え��、Ｓｅｎｓｉら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６，１２：５０２３〜５０３２、Ｐａｒｍｉａｎｉら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７，１７８：１９７５〜１９７９、Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏら．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００５，５４：１８７〜２０７を参照されたい）。
【００９１】
適切な抗原に関する包括的な分析（クラスター指定またはＣＤ）は、フローサイトメトリーによって示すように、血液系腫瘍細胞を標的としており、薬剤結合型免疫療法に適した抗体を選択するためのガイドであることができるＣＤとは、Ｃｒａｉｇ及びＦｏｏｎ，Ｂｌｏｏｄ  ２００８年１月１５日にオンラインで事前公開；ＤＯＬ  １０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００７−１１−１２０５３５である。
【００９２】
ＣＤ６６抗原は、類似の構造を有する５つの異なる糖タンパク質からなり（ＣＤ６６ａ〜ｅ）、それぞれ癌胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子ファミリーメンバーＢＣＧ、ＣＧＭ６、ＮＣＡ、ＣＧＭ１及びＣＥＡによってコードされる。これらのＣＤ６６抗原（例えば、ＣＥＡＣＡＭ６）は主として、顆粒球、消化管の正常上皮細胞及び種々の組織の腫瘍細胞において発現する。また、癌に適した標的として含まれているのは、ＮＹ−ＥＳＯ−１などの癌精巣抗原（Ｔｈｅｕｒｉｌｌａｔら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００７；１２０（１１）：２４１１〜２４１７）、ならびに骨髄性白血病（Ｋｏｚｌｏｖら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ．  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．２００５；１６３（１）：６２〜６７）及びＢ細胞疾患にもおけるＣＤ７９ａ、ならびに非ホジキンリンパ腫についてのＣＤ７９ｂ（Ｐｏｉｓｏｎら，Ｂｌｏｏｄ  １１０（２）：６１６〜６２３）である。上記の抗原の多くは、２００２年１１月１５日出願の「治療薬の標的への送達のための多重特異的非共有結合性複合体の使用（Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｆｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」という表題の米国仮特許出願第６０／４２６，３７９号に開示されている。より治療抵抗性の高い前駆体腫瘍細胞集団であることが原因であるとされている癌幹細胞（Ｈｉｌｌ及びＰｅｒｒｉｓ，Ｊ  Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２００７；９９：１４３５〜１４４０）は、前立腺癌（Ｍａｉｔｌａｎｄら，Ｅｒｎｓｔ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐｏｓ．Ｐｒｏｃ. ２００６； ５：１５５〜１７９）、非小細胞肺癌（Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇら，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００７；１２２（３）：３８５〜３９１）、ならびに神経膠芽腫（Ｂｅｉｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７（９）：４０１０〜４０１５）におけるＣＤ１３３、ならびに結腸直腸癌（Ｄａｌｅｒｂａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００７；１０４（２４）１０１５８〜１０１６３）、膵癌（Ｌｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７（３）：１０３０〜１０３７）、ならびに頭頸部扁平細胞癌腫（Ｐｒｉｎｃｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００７；１０４（３）９７３〜９７８）におけるＣＤ４４などのある特定の癌種において標的とすることができる抗原を有する。乳癌療法のための別の有用な標的は、Ｔａｙｌｏｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００３；３７５：５１〜５９）によって説明されるＬＩＶ−１抗原である。
【００９３】
多発性骨髄腫療法のために、適切な標的化抗体が例えば、ＣＤ３８及びＣＤ１３８（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００６；１２（１１〜１２）：３４５〜３４６、Ｔａｓｓｏｎｅら，Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０４（１２）：３６８８〜３６９６）、ＣＤ７４（Ｓｔｅｉｎら，同書）、ＣＳ１（Ｔａｉら，Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１２（４）：１３２９〜１３３７）、ならびにＣＤ４０（Ｔａｉら，２００５；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５（１３）：５８９８〜５９０６）に対して説明されてきた。
【００９４】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、先天性及び適応性の免疫性及びアポトーシスの重要な調節因子である。ＣＤ７４は、ＭＩＦについての内在性受容体であることが報告されている（Ｌｅｎｇら，２００３，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７：１４６７〜１４７６）。ＭＩＦ仲介性細胞内経路に及ぼすアンタゴニスト性抗ＣＤ７４抗体の治療効果は、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌及び慢性リンパ球性白血病（例えば、Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒら，２００４，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：３４、Ｓｈａｃｈａｒ及びＨａｒａｎ，２０１１，Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ５２：１４４６〜１４５４）、関節リウマチ及び全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患（Ｍｏｒａｎｄ及びＬｅｅｃｈ，２００５，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  １０：１２〜２２、Ｓｈａｃｈａｒ及びＨａｒａｎ，２０１１，Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ５２：１４４６〜１４５４）、腎異種移植片拒絶反応などの腎疾患（Ｌａｎ，２００８，Ｎｅｐｈｒｏｎ  Ｅｘｐ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０９：ｅ７９〜ｅ８３）、ならびに多くの炎症性疾患（Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒら，２００９，Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ  ２００９年３月２２日電子公開、Ｔａｋａｈａｓｈｉら，２００９，Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｓ  １０：３３）などの広範な範囲の疾患状態の治療のために有用であり得る。ミラツズマブ（ｈＬＬ１）は、ＭＩＦ仲介性疾患の処置のための治療的使用に関する例示的な抗ＣＤ７４抗体である。
【００９５】
抗ＴＮＦ−α抗体は、当該技術分野で公知であり、自己免疫疾患、免疫機能不全（例えば、移植片対宿主病、臓器移植片拒絶反応）または糖尿病などの免疫疾患を治療するために有用であり得る。ＴＮＦ−αに対する公知の抗体としては、ヒト抗体ＣＤＰ５７１（Ｏｆｅｉら，２０１１，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４５：８８１〜８８５)、ネズミ抗体ＭＴＮＦＡＩ、Ｍ２ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＢＩ、Ｍ３０２Ｂ及びＭ３０３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，イリノイ州ロックフォード市)、インフリキシマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，ペンシルバニア州マルバーン市）、セルトリズマブ・ペゴール（ＵＣＢ，ベルギー国ブリュッセル市）、ならびにアダリムマブ（Ａｂｂｏｔｔ，イリノイ州アボットパーク地区）が挙げられる。これら及び他の多くの公知の抗ＴＮＦ−α抗体は、請求する方法及び組成物において使用され得る。免疫調節不全疾患または自己免疫疾患の療法のための使用に関する他の抗体としては、ベルツズマブ、エプラツズマブ、ミラツズマブまたはｈＬ２４３などの抗Ｂ細胞抗体、トシリズマブ（抗ＩＬ−６受容体）、バシリキシマブ（抗ＣＤ２５）、ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）、エファリズマブ（抗ＣＤ１１ａ）、ムロモナブ−ＣＤ３（抗ＣＤ３受容体）、抗ＣＤ４０Ｌ（ＵＣＢ、ベルギー国、ブリュッセル市）、ナタリズマブ（抗α４インテグリン）及びオマリズマブ（抗ＩｇＥ）が挙げられるが、これらに限定しない。
【００９６】
チェックポイント阻害薬抗体は、主に癌療法において使用されてきた。免疫チェックポイントは、自己免疫寛容を維持しかつ、末梢組織損傷を最小限にするよう免疫系応答の程度を調節する原因である免疫系における阻害経路を指す。しかしながら、腫瘍細胞はまた、腫瘍組織に対する免疫応答の有効性を低下させるよう、免疫系チェックポイントを活性化させることができる。細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５２としても公知）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１、ＣＤ２７９としても公知）及びプログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４としても公知）に対する例示的なチェックポイント阻害薬抗体は、疾患細胞、組織または病原体に対する免疫応答の有効性を高めるために、１つ以上の他の薬剤と併用され得る。例示的な抗ＰＤ１抗体としては、ランブロリズマブ（ＭＫ−３４７５、ＭＥＲＣＫ）、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ＡＭＰ−２２４（ＭＥＲＣＫ）、及びピジリズマブ（ＣＴ−０１１、ＣＵＲＥＴＥＣＨ社）が挙げられる。抗ＰＤ１抗体は、例えばＡＢＣＡＭ（登録商標）（ＡＢ１３７１３２）、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標）（ＥＨ１２．２Ｈ７、ＲＭＰ１−１４）及びａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（Ｊ１０５、Ｊ１１６、ＭＩＨ４）から市販されている。例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体としては、ＭＤＸ−１１０５（ＭＥＤＡＲＥＸ）、ＭＥＤＩ４７３６（ＭＥＤＩＭＭＵＮＥ）ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）及びＢＭＳ−９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）が挙げられる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体も例えば、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（ＭＩＨ１）から市販されている。例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体としては、イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）及びトレメリムマブ（ＰＦＩＺＥＲ）が挙げられる。抗ＰＤ１抗体は、例えばＡＢＣＡＭ（登録商標）（ＡＢ１３４０９０）、ＳＩＮＯ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ（１１１５９−Ｈ０３Ｈ、１１１５９−Ｈ０８Ｈ）、及びｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＰＩＥＲＣＥ（ＰＡ５−２９５７２、ＰＡ５−２３９６７、ＰＡ５−２６４６５、ＭＡ１−１２２０５、ＭＡ１−３５９１４）から市販されている。イピリムマブは近年、転移性黒色腫の治療のためのＦＤＡ認可を受けた（Ｗａｄａら，２０１３，Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  １１：８９）。
【００９７】
別の好ましい実施形態において、迅速に内部移行した後に再発現し、加工され及び細胞表面上に提示される抗体が使用され、細胞による持続的な取り込み及び循環複合体の付着を可能にする。最も好ましい抗体／抗原対の例は、抗ＣＤ７４ＭＡｂ（インバリアント鎖、クラスＩＩ特異的シャペロン、Ｉｉ）であるＬＬ１である（例えば、米国特許第６，６５３，１０４号、第７，３１２，３１８号を参照されたく、各々の実施例の節は参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＤ７４抗原は、Ｂ細胞リンパ腫（多発性骨髄腫を含む）及び白血病、ある特定のＴ細胞リンパ腫、黒色腫、結腸癌、肺癌、及び腎癌、神経膠芽腫、ならびにある特定の他の癌に関して高度に発現する（Ｏｎｇら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９８：２９６〜３０２（１９９９））。癌におけるＣＤ７４抗体の使用に関する総説は、参照により本明細書に組み込まれるＳｔｅｉｎら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７  ９月１５日号；１３（１８  第２部）：５５５６ｓ〜５５６３ｓに含まれている。
【００９８】
抗ＣＤ７４抗体を用いて好ましく治療される疾患としては、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、黒色腫、肺癌、腎癌、結腸癌、多形膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）、組織球腫、骨髄性白血病、及び多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定しない。標的細胞の表面上での短期間のＣＤ７４抗原の持続的な発現に続く抗原の内部移行、及び抗原の再発現によって、標的に向かうＬＬ１抗体が運ぶいずれかの化学療法部分とともに、当該抗体は内部移行することができる。このことは、高いかつ治療用の濃度のＬＬ１−化学療法薬複合体がこのような細胞の内側に蓄積されることを許容する。内部移行したＬＬ１−化学療法薬複合体は、リソソーム及びエンドソームを循環し、化学療法部分は、標的細胞内で活性のある形態で放出される。
【００９９】
別の好ましい実施形態において、病原体に対する抗体が公知であるので、治療用複合体は、病原体に対して使用することができる。例えば、細菌、リケッチア、マイコプラズマ、原生動物、真菌類及びウイルスなどの病原体ならびにこのような微生物と結合している抗原及び生成物によって生じる例えばウイルス感染、細菌感染、真菌感染及び寄生虫感染を含む感染性病変によって生じるまたは当該感染性病変と結合したマーカーを特異的に結合する抗体及び抗体フラグメントはとりわけ、各々の実施例の節が参照により本明細書に組み込まれるＨａｎｓｅｎら，米国特許第３，９２７，１９３号ならびにＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  米国特許第４，３３１，６４７号、第４，３４８，３７６号、第４，３６１，５４４号、第４，４６８，４５７号、第４，４４４，７４４号、第４，８１８，７０９号及び第４，６２４，８４６号、ならびに先に引用したＲｅｉｃｈｅｒｔ及びＤｅｗｉｔｚにおいて開示されている。感染性生体及び他の標的に対する抗体（抗毒素抗体および抗ウイルス抗体）を列挙している総説は、参照により本明細書に組み込まれるＣａｓａｄｅｖａｌｌ，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；９３（１）：５〜１５に含まれている。
【０１００】
好ましい実施形態において、当該病原体は、その実施例の節が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４４０，４１６号において開示されるようなＨＩＶウイルス、結核菌、ストレプトコッカス・アガラクチエ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、レジュネラ・ニューモフィラ菌、化膿性連鎖球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、Ｂ型インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ）、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、緑膿菌、らい菌、ウシ流産菌、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、単純ヘルペスウイルスＩＩ型、ヒト血清パルボ様ウイルス、ＲＳウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イボウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス４０型、マウス乳癌ウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、西ナイルウイルス、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ・ゴンディ、ランゲルトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅｉ）、ブルーストリパノソーマ、マンソン住血吸虫、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐａｎｉｃｕｍ）、ウシバベシア、ニワトリ盲腸コクシジウム（Ｅｌｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ）、回旋糸状虫、熱帯リーシュマニア、旋毛虫、タイレリア・パルバ、胞状条虫、ヒツジ条虫、無鉤条虫、単包条虫、メソセストイデス・コルティ、マイコプラズマ・アルスリチジス、マイコプラズマ・ヒオリニス、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・アルギニニ、アコレプラスマ・レイドロウィイ、マイコプラズマ・サリバリウム及び肺炎マイコプラズマからなる群から選択される。
【０１０１】
より好ましい実施形態において、抗ｇｐ１２０及び他のこのような抗ＨＩＶ抗体を含む本発明の薬剤複合体は、エイズ患者におけるＨＩＶのための治療薬として使用することができ、結核菌に対する抗体の薬剤複合体は、薬剤屈折性結核のための治療薬として適している。抗ｇｐ１２０ＭＡｂ（抗ＨＩＶ  ＭＡｂ）及びシュードモナス外毒素などの毒素からなる融合タンパク質は、抗ウイルス特性について調査されてきた（Ｖａｎ  Ｏｉｇｅｎら，Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，５：７５〜９１，１９９８）。エイズ患者におけるＨＩＶ感染を治療する試みは、おそらく不十分な効能または許容され得ない宿主毒性により失敗した。本発明のＣＰＴ薬剤複合体は、タンパク質毒素のこのような毒性副作用を有利に欠失し、それゆえ、エイズ患者におけるＨＩＶ感染を治療する上で有利に使用される。これらの薬剤複合体は、単独で付与することができ、または単独で付与された時にこのような患者において有効な他の抗体または治療薬と組み合わせで与えることができる。候補抗ＨＩＶ抗体には、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら（ＡＩＤＳ．２００６年１０月３日号；２０（１５）：１９１１〜１９１５）によって説明されるＰ４／Ｄ１０抗エンベロープ抗体ならびにＰｏｌｙｍｕｎ（オーストリア国ウィーン市）によって説明及び販売され、また米国特許第５，８３１，０３４号、米国特許第５，９１１，９８９号及びＶｃｅｌａｒら，ＡＩＤＳ  ２００７；２１（１６）：２１６１〜２１７０及びＪｏｏｓら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００６；５０（５）：１７７３〜１７７９（参照によりすべて本明細書に組み込まれる）においても説明される抗ＨＩＶ抗体が含まれる。ＨＩＶについての好ましい標的化薬とは、耐性を克服するための、これらの抗体の種々の組み合わせである。
【０１０２】
自己免疫疾患または免疫系機能不全（例えば、移植片対宿主病、臓器移植拒絶反応）を治療するために使用する抗体は、当該技術分野で公知であり、開示した方法及び組成物を用いてＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８へ結合し得る。自己免疫疾患／免疫機能不全疾患を治療するために使用する抗体は、ＢＣＬ−１、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−６、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ５５、ＴＮＦ−α、インターフェロン、ＩＬ−６及びＨＬＡ−ＤＲを含むがこれらに限定しない例示的な抗原へ結合し得る。先に考察したこれらの及び他の標的抗原へ結合する抗体を使用して、自己免疫疾患または免疫機能不全疾患を治療してもよい。免疫複合体を用いて治療され得る自己免疫疾患には、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、抗好中球細胞質抗体関連血管炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形紅斑、ＩｇＡ腎炎、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞動脈炎／多発筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬または線維化胞隔炎が含まれ得る。
【０１０３】
先に考察した抗体及び疾患関連抗原に対する他の公知の抗体は、請求する方法及び組成物の実施において、ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８免疫複合体として使用され得る。
【０１０４】
（二重特異性抗体及び多重特異性抗体）
二重特異性抗体は、多くの生体医学での応用において有用である。例えば、腫瘍細胞表面抗原に対する及びＴ細胞表面受容体に対する結合部位を有する二重特異性抗体は、Ｔ細胞によって特定腫瘍細胞の溶解を導くことができる。神経膠腫及びＴ細胞上のＣＤ３エピトープを認識する二重特異性抗体は、ヒト患者における脳腫瘍を治療する上で成功裡に使用されてきた（Ｎｉｔｔａら，Ｌａｎｃｅｔ，１９９０；３５５：３６８〜３７１）。ある特定の実施形態において、本明細書に開示した治療薬複合体のための技術及び組成物は、抗体部分としての二重特異性抗体または多重特異性抗体とともに使用してもよい。
【０１０５】
二重特異性抗体または多重特異性抗体を製造するための数多くの方法は、例えば、米国特許第７，４０５，３２０号において開示されているように公知であり、この実施例の節は参照により本明細書に組み込まれる。二重特異性抗体は、異なる抗原性部位を認識するモノクローナル抗体を各々産生する２つの異なるハイブリドーマの融合を包含するクアドローマ法によって製造することができる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８３；３０５：５３７〜５４０）。
【０１０６】
二重特異性抗体を製造するための別の方法は、２つの異なるモノクローナル抗体を化学的につなげるためのヘテロ二官能性架橋剤を使用する（Ｓｔａｅｒｚ，ら．Ｎａｔｕｒｅ．１９８５；３１４：６２８〜６３１、Ｐｅｒｅｚら．Ｎａｔｕｒｅ．１９８５；３１６：３５４〜３５６）。二重特異性抗体はまた、２つの親モノクローナル抗体の各々をそれぞれ半分の分子へと減らした後に、混合して再度酸化させ、複合構造を得ることによって製造することができる（Ｓｔａｅｒｚ及びＢｅｖａｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８６；８３：１４５３〜１４５７）。別の代替例は、２つまたは３つの個別に精製したＦａｂ’フラグメントを、適切なリンカーを用いて化学的に架橋することを包含する（例えば、欧州特許出願第０４５３０８２号を参照されたい）。
【０１０７】
他の方法には、レトロウイルス由来のシャトルベクターを介して異なる選択可能なマーカーを個々の親ハイブリドーマへと遺伝子移入した後、当該親ハイブリドーマを融合させること（ＤｅＭｏｎｔｅら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９０，８７：２９４１〜２９４５）、または異なる抗体の重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子を含有する発現プラスミドを用いたハイブリドーマ細胞株をトランスフェクションによって、ハイブリドーマを作製する効率性を改善することを含む。
【０１０８】
同族のＶＨドメイン及びＶＬドメインは、適切な組成と長さのペプチドリンカー（通常、１２個超のアミノ酸残基からなる）を用いて接合させることができ、結合活性を有する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成する。ｓｃＦｖを製造する方法は、米国特許第４，９４６，７７８号及び米国特許第５，１３２，４０５号に開示されており、それらの各々の実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる。１２個未満のアミノ酸残基までペプチドリンカー長を短縮することは、同じ鎖にあるＶＨドメイン及びＶＬドメインの対形成を防止し、ＶＨドメイン及びＶＬドメインと他の鎖にある相補的なドメインとの対形成を強制し、結果的に、機能的多量体の形成を生じる。３アミノ酸残基と１２アミノ酸残基の間のリンカーと接合するＶＨドメイン及びＶＬドメインのポリペプチド鎖は主として、二量体（二特異性抗体と呼ばれる）を形成する。０アミノ酸残基と２アミノ酸残基の間のリンカーを用いる場合、三量体（三特異性抗体と呼ばれる）及び四量体（四特異性抗体と呼ばれる）が好ましいが、オリゴマー化の実際のパターンは、リンカー長に加えてＶドメインの組成及び向き（ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ）に左右されるように見える。
【０１０９】
多重特異性抗体または二重特異性抗体を製造するためのこれらの技術は、当該技術の低い収量、精製の必要性、低い安定性または多大な労力の点で、種々の困難を呈している。より近年では、「ＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）」（ＤＮＬ（商標））として公知の二重特異性コンストラクトを使用して、実質的にいずれかの所望の抗体、抗体フラグメント及び他のエフェクター分子の組み合わせを製造してきた（例えば、米国特許第７，５５０，１４３号、第７，５２１，０５６号、第７，５３４，８６６号、第７，５２７，７８７号、及びＵＳＳＮ第１１／９２５，４０８号を参照されたく、これらの各々の実施例の節は参照により本明細書に組み込まれる）。当該技術は、固定ドメイン（ＡＤ）ならびに二量体化及びドッキングドメイン（ＤＤＤ）と呼ばれる相補性タンパク質結合ドメインを利用し、これが互いに結合して二量体、三量体、四量体、五量体及び六量体に及ぶ複雑な構造の組み立てを可能にする。これらは、広範な精製を必要とすることなく、高い収量で安定した複合体を形成する。当該技術は、単一特異性、二重特異性または多重特異性抗体の組み立てを可能にする。二重特異性抗体または多重特異性抗体を作製するための、当該技術分野で公知の技術のうちのいずれかは、現に請求する方法の実施において利用してもよい。
【０１１０】
癌療法に好ましいなどの使用の組み合わせには、ＣＤ２０＋ＣＤ２２抗体、ＣＤ７４＋ＣＤ２０抗体、ＣＤ７４＋ＣＤ２２抗体、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）＋ＣＥＡＣＡＭ６（ＮＣＡ）抗体、インスリン様増殖因子（ＩＬＧＦ）＋ＣＥＡＣＡＭ５抗体、ＥＧＰ−１（例えば、ＲＳ−７）＋ＩＬＧＦ抗体、ＣＥＡＣＡＭ５＋ＥＧＦＲ抗体が含まれる。このような抗体は、各々の実施例の節が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，０８３，４７７号、第６，１８３，７４４号及び第６，９６２，７０２号、ならびに米国特許出願公開第２００３０１２４０５８号、第２００３０２１９４３３号、第２００４０００１８２５号、第２００４０２０２６６６号、第２００４０２１９１５６号、第２００４０２１９２０３号、第２００４０２３５０６５号、第２００５０００２９４５号、第２００５００１４２０７号、第２００５００２５７０９号、第２００５００７９１８４号、第２００５０１６９９２６号、第２００５０１７５５８２号、第２００５０２４９７３８号、第２００６００１４２４５号及び第２００６００３４７５９号に説明されるように、併用する必要があるだけでなく、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ及びこれらに類するものなど種々の形態の融合タンパク質としても組み合わせることができる。
【０１１１】
（プレターゲティング）
二重特異性抗体または多重特異性抗体はまた、プレターゲティング技術において利用され得る。プレターゲティングとは、骨髄などの正常組織への望ましくない毒性に寄与する直接標的に向かう抗体の緩徐な血中クリアランスを解決するよう本来開発された多工程過程である。プレターゲティングを用いる場合、放射性核種または他の治療薬は、血液から数分以内に除去される小さな送達分子（標的へ向かうことのできるコンストラクト）へ結合する。標的へ向かうことのできるコンストラクトのための結合部位及び標的抗原を有するプレターゲティング二重特異性抗体または多重特異性抗体がまず投与され、遊離抗体は、循環から除去することが可能となり、次に標的へ向かうことのできるコンストラクトが投与される。
【０１１２】
プレターゲティング法は、例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎら，米国特許第４，８６３，７１３号、Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：２２６，１９８８、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：１２９４，１９８７、Ｏｅｈｒら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：７２８，１９８８、Ｋｌｉｂａｎｏｖら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：１９５１，１９８８、Ｓｉｎｉｔｓｙｎら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３０：６６，１９８９、Ｋａｌｏｆｏｎｏｓら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１：１７９１，１９９０、Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４８：１６７，１９９１、Ｐａｇａｎｅｌｌｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５９６０，１９９１、Ｐａｇａｎｅｌｌｉら，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２：２１１，１９９１、米国特許第５，２５６，３９５号、Ｓｔｉｃｋｎｅｙら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：６６５０，１９９１、Ｙｕａｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：３１１９，１９９１、米国特許第６，０７７，４９９号、第７，０１１，８１２号、第７，３００，６４４号、第７，０７４，４０５号、第６，９６２，７０２号、第７，３８７，７７２号、第７，０５２，８７２号、第７，１３８，１０３号、第６，０９０，３８１号、第６，４７２，５１１号、第６，９６２，７０２号、及び第６，９６２，７０２号に開示されており、各々参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
対象における疾患または障害を治療または診断するプレターゲティング法は、（１）二重特異性抗体または抗体フラグメントを対象へ投与すること、（２）任意に洗浄組成物を対象へ投与し、組成物に循環から抗体を除去させること、及び（３）ＳＮ−３８など、１つ以上のキレートしたまたは化学的に結合した治療薬または診断薬を含有する、標的へ向かうことのできるコンストラクトを対象へ投与することによって提供され得る。
【０１１４】
（標的へ向かうことのできるコンストラクト）
ある特定の実施形態において、プレターゲティングにおいて使用するための１つ以上の治療薬または診断薬を用いて標識された標的へ向かうことのできるコンストラクトペプチドは、標的へ向かうことのできるコンストラクトペプチドについての１つ以上の結合部位及び疾患または容態と関連した標的抗原についての１つ以上の結合部位を有する二重特異性抗体へ結合するよう選択され得る。二重特異性抗体は、当該抗体が対象へまず投与され得るプレターゲティング技術において使用され得る。二重特異性抗体が標的抗原へ結合するための、及び未結合の抗体が循環から除去されるのに十分な時間が許容され得る。次に、標識したペプチドなど、標的へ向かうことのできるコンストラクトが対象へ投与され得、二重特異性抗体へ結合して、罹患した細胞または組織に局在することが許容され得る。
【０１１５】
このような標的へ向かうことのできるコンストラクトは、多様な構造であることができ、標的へ向かうことのできるコンストラクトに対する高い親和性で結合する抗体またはフラグメントの利用能についてだけでなく、プレターゲティング法ならびに二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）または多重特異性抗体内で使用した場合の迅速なインビボでの除去についても選択される。疎水性薬は、強力な免疫応答を誘発する上で最良であるのに対し、親水性薬は、迅速なインビボでの除去に好ましい。したがって、疎水性特徴と親水性特徴の間の平衡が確立される。このことは、親水性キレート薬を用いて多くの有機部分の固有の疎水性を相殺することによって一部達成され得る。また、正反対の溶液特性を有する標的へ向かうことのできるコンストラクトのサブユニット、例えば、一部は疎水性でありかつ一部は親水性であるアミノ酸を含有するペプチドが選択され得る。
【０１１６】
２個という少数のアミノ酸残基、好ましくは２〜１０個の残基を有するペプチドが使用され得、またキレート剤など他の部分へ連結され得る。リンカーは、好ましくは５０，０００ダルトン未満の、及び有利には約２０，０００ダルトン未満、１０，０００ダルトン未満または５，０００ダルトン未満の分子量を有する低分子量の複合体であるべきである。より通常として、標的へ向かうことのできるコンストラクトペプチドは、例えば二重特異性抗体への結合のための４つ以上の残基及び１つ以上のハプテンを有する。例示的なハプテンとしては、Ｉｎ−ＤＴＰＡ（インジウム−ジエチレントリアミン五酢酸）またはＨＳＧ（ヒスタミンスクシニルグリシン）が挙げられ得る。標的へ向かうことのできるコンストラクトはまた、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン１，４，７，１０−四酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−１，４，７−三酢酸）、ＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）、ＮＥＴＡ（［２−（４，７−ビスカルボキシメチル［１，４，７］トリアザシクロノナン−１−イル−エチル）−２−カルボニルメチル−アミノ］酢酸）または他の公知のキレート部分など、１つ以上のキレート部分を含み得る。キレート部分は例えば、治療用及びまたは診断用核種、常磁性イオンあるいは造影剤へ結合させるために使用され得る。
【０１１７】
標的へ向かうことのできるコンストラクトはまた、主鎖構造における非天然アミノ酸、例えばＤ型アミノ酸を含んで、インビボでのペプチドの安定性を高め得る。代替的な実施形態において、非天然アミノ酸またはペプトイドから構築されるものなどの他の主鎖構造が使用され得る。
【０１１８】
標的へ向かうことのできるコンストラクトとして使用されるペプチドは、固相支持体ならびに反復直交脱保護及びカップリングの標準的な技術を用いて自動ペプチド合成装置において簡便に合成される。キレート部分または他の薬剤の結合のために後に使用することになっているペプチド中の遊離アミノ基は、Ｂｏｃ基などの標準的な保護基で有利に遮断されるのに対し、Ｎ末端残基はアセチル化されて血清安定性を高め得る。このような保護基は当業者に周知である。Ｇｒｅｅｎｅ及びＷｕｔｓ  有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），１９９９（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク）を参照されたい。ペプチドが二重特異性抗体系内で後の使用のために調製される場合、当該ペプチドは、樹脂から有利に切断して、対応するＣ末端アミドを生じ、インビボでのカルボキシペプチダーゼ活性を阻害する。
【０１１９】
二重特異性抗体を用いたプレターゲティングを使用する場合、抗体は、標的組織によって産生されるまたは標的組織と結合している抗原に対する第一の結合部位、及び標的へ向かうことのできるコンストラクト上のハプテンに対する第二の結合部位を含有する。例示的なハプテンとしては、ＨＳＧ及びＩｎ−ＤＴＰＡが挙げられるが、これらに限定しない。ＨＳＧハプテンに対して生じる抗体は公知であり（例えば、６７９抗体）、適切な二重特異性抗体内へと容易に組み込むことができる（例えば、実施例の節が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９６２，７０２号、第７，１３８，１０３号及び第７，３００，６４４号を参照されたい）。しかしながら、Ｉｎ−ＤＴＰＡ及び７３４抗体など、他のハプテン及び当該ハプテンへ結合する抗体は当該技術分野で公知であり、使用され得る（例えば、実施例の節が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，５３４，４３１号）。
【０１２０】
（ＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）（ＤＮＬ（商標）））
好ましい実施形態において、二価または多価の抗体は、ＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）（ＤＮＬ（商標））複合体として形成される（例えば、米国特許第７，５２１，０５６号、第７，５２７，７８７号、第７，５３４，８６６号、第７，５５０，１４３号及び第７，６６６，４００号を参照されたく、これらの各々の実施例の節は参照により本明細書に組み込まれる）。概して、当該技術は、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）の調節（Ｒ）サブユニットの二量体化及びドッキングドメイン（ＤＤＤ）配列と種々のＡＫＡＰタンパク質のうちのいずれかに由来するアンカードメイン（ＡＤ）配列の間で生じる特異的かつ高親和性の結合相互作用を利用する（Ｂａｉｌｌｉｅら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００５；５７９：３２６４、Ｗｏｎｇ及びＳｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＤＤＤペプチド及びＡＤペプチドは、いずれかのタンパク質、ペプチドまたは他の分子へ結合し得る。ＤＤＤ配列が自然に二量体化して、ＡＤ配列へ結合するので、当該技術は、ＤＤＤ配列またはＡＤ配列へ結合し得るいずれかの選択された分子間での複合体形成を許容する。
【０１２１】
標準的なＤＮＬ（商標）複合体は、１つのＡＤ結合分子へ結合した２つのＤＤＤ結合分子を有する三量体を含むが、複合体構造における変化は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体及び他の他量体の形成を許容する。いくつかの実施形態において、ＤＮＬ（商標）複合体は、同じ抗原性決定因子または２つ以上の異なる抗原へ結合する２つ以上の抗体、抗体フラグメントまたは融合タンパク質を含み得る。ＤＮＬ（商標）複合体はまた、タンパク質、ペプチド、免疫調節薬、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、結合タンパク質、ペプチドリガンド、担体タンパク質、毒素、オンコナーゼなどのリボヌクレアーゼ、ｓｉＲＮＡなどの阻害性オリゴヌクレオチド、抗原または異種抗原、ＰＥＧなどの重合体、酵素、治療薬、ホルモン、細胞毒性薬、抗血管新生薬、アポトーシス促進薬、あるいはいずれかの他の分子または凝集体など、１つ以上の他のエフェクターを含み得る。
【０１２２】
セカンドメッセンジャーであるｃＡＭＰのＲサブユニットへの結合によって惹起される最良に研究されたシグナル伝達経路のうちの１つにおいて中心的な役割を担っているＰＫＡは、１９６８年にウサギ骨格筋から初めて単離された（Ｗａｌｓｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６８；２４３：３７６３）。ホロ酵素の構造は、Ｒサブユニットによって不活性形態に保持される２つの触媒サブユニットからなる（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：８４４３）。ＰＫＡのイソ酵素は、２種類のＲサブユニット（ＲＩ及びＲＩＩ）が見つかっており、各種類はαアイソフォーム及びβアイソフォームを有する（Ｓｃｏｔｔ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９９１；５０：１２３）。したがって、ＰＫＡ調節サブユニットの４つのアイソフォームは、ＲＩα、ＲＩβ、ＲＩＩα及びＲＩＩβである。Ｒサブユニットは、安定した二量体としてのみ単離されており、二量体化ドメインは、ＲＩＩαの最初の４４個のアミノ酸末端残基からなるよう示されている（Ｎｅｗｌｏｎら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２）。以下に考察するように、他の調節サブユニットのアミノ酸配列の類似の部分は、二量体化及びドッキングに関与しており、各々、調節サブユニットのＮ末端近くに位置する。ｃＡＭＰのＲサブユニットへの結合は、広範なセリン／トレオニンキナーゼ活性についての活発な触媒サブユニットの放出をもたらし、当該サブユニットが、ＡＫＡＰとのドッキングを介したＰＫＡの区画化を通じて選択された基質へと向かう（Ｓｃｏｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０；２６５；２１５６１）。
【０１２３】
最初のＡＫＡＰである微小管結合タンパク質２が１９８４年に特徴づけられて以来（Ｌｏｈｍａｎｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８４；８１：６７２３）。細胞膜、アクチン細胞骨格、核、ミトコンドリア、及び小胞体を含む種々の細胞内部位へと局在する５０個を超えるＡＫＡＰが、酵母からヒトにまで及ぶ種において多様な構造で同定された（Ｗｏｎｇ及びＳｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＰＫＡについてのＡＫＡＰのＡＤは、１４〜１８個の残基からなる両親媒性の螺旋である（Ｃａｒｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１；２６６：１４１８８）。ＡＤのアミノ酸配列は、個々のＡＫＡＰの間でかなりに変化し、それとともにＲＩＩ二量体について報告された結合親和性は２〜９０ｎＭに及ぶ（Ａｌｔｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００３；１００：４４４５）。ＡＫＡＰは、二量体Ｒサブユニットへ結合するのみである。ヒトＲＩＩαについては、ＡＤは、２３個のアミノ末端残基によって形成される疎水性表面へ結合する（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ及びＳｃｏｔｔ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２１６）。したがって、ヒトＲＩＩαの二量体化ドメイン及びＡＫＡＰ結合ドメインは両方とも、同じＮ末端の４４アミノ酸配列内に位置し（Ｎｅｗｌｏｎら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２、Ｎｅｗｌｏｎら，ＥＭＢＯ  Ｊ．２００１；２０：１６５１）、本明細書ではＤＤＤと名付けている。
【０１２４】
本発明者らは、プラットフォーム技術を開発して、ヒトＰＫＡ調節サブユニットのＤＤＤ及びＡＫＡＰのＡＤを、以後Ａ及びＢと呼ばれるいずれかの２つの実体を非共有結合複合体へとドッキングさせるための優れた対のリンカーモジュールとして利用し、当該複合体はさらに、戦略的な位置におけるＤＤＤ及びＡＤの両方へのシステイン残基の導入を通じてＤＮＬ（商標）複合体へとロックして、ジスルフィド結合の形成を容易にした。当該アプローチの一般的な方法論は次のとおりである。実体Ａは、Ａの前駆体へＤＤＤ配列を連結することによって構築され、結果的に、以後ａと呼ばれる第一の成分を生じる。ＤＤＤ配列は、二量体の自然な形成をもたらすので、Ａはしたがって、ａ２から構成される。実体Ｂは、Ｂの前駆体へＡＤ配列を連結させることによって構築され、結果的に以後ｂと呼ばれる第二の成分を生じる。ａ２に含まれるＤＤＤの二量体モチーフは、ｂに含まれるＡＤ配列への結合のためのドッキング部位を作り、したがってａ２及びｂの迅速な会合を容易にし、ａ２ｂから構成される二元三量体複合体を形成する。この結合事象は、非可逆的にされ、その後の反応でジスルフィド架橋を介して２つの実体を共有結合させ、これが、有効な局所濃縮の原理をもとに非常に効率的に生じ、その理由は、初期の結合相互作用がＤＤＤ及びＡＤの両方へと配置される反応性チオール基を近接位にもたらして（Ｃｈｍｕｒａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００１；９８：８４８０）、部位特異的にライゲートするからである。リンカー、アダプターモジュール及び前駆体の種々の組み合わせを用いて、異なる化学量論の広範な種々のＤＮＬ（商標）コンストラクトを製造および使用し得る（例えば、米国特許第７，５５０，１４３号、第７，５２１，０５６号、第７，５３４，８６６号、第７，５２７，７８７号及び第７，６６６，４００号を参照されたい）。
【０１２５】
当該２つの前駆体の官能基から離れてＤＤＤ及びＡＤを結合させることによって、このような部位特異的ライゲーションはまた、当該２つの前駆体の元の活性を保つと期待される。このアプローチは、天然ではモジュール式であり、広範な活性を有するペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、及び他のエフェクター部分を含む広範な物質を部位特異的にかつ共有結合で連結させるよう適用することができる可能性がある。以下の実施例に説明するＡＤ及びＤＤＤ結合型エフェクターを構築する融合タンパク質法を利用して、本質的にいずれかのタンパク質またはペプチドは、ＤＮＬ（商標）コンストラクトへと組み込まれ得る。しかしながら、当該技術は限定的ではなく、他の結合方法を利用してもよい。
【０１２６】
関心対象の融合タンパク質をコードする合成二本鎖核酸を製造するための核酸合成、ハイブリッド形成及び／または増幅を含む融合タンパク質を作製するための種々の方法は公知である。このような二本鎖核酸は、標準的な分子生物学技術によって融合タンパク質製造のための発現ベクターへと挿入され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，分子クローニング，実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ），第２版，１９８９を参照されたい）。このような好ましい実施形態において、ＡＤ部分及び／またはＤＤＤ部分は、エフェクタータンパク質またはペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかへ結合し得る。しかしながら、当業者は、エフェクター部分へのＡＤ部分またはＤＤＤ部分の結合部位が、エフェクター部分及びエフェクター部分のその生理学的活性に関与する部分の化学的性質に応じて変化し得ることを理解するであろう。種々のエフェクター部分の部位特異的結合は、二価架橋試薬及び／または他の化学結合技術の使用など、当該技術分野で公知の技術を用いて実施され得る。
【０１２７】
（ＡＤ部分及びＤＤＤ部分における構造−機能関連性）
異なる種類のＤＮＬ（商標）コンストラクトについて、異なるＡＤ配列またはＤＤＤ配列を利用してもよい。例示的なＤＤＤ配列及びＡＤ配列は以下に提供する。
ＤＤＤ１
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１）
ＤＤＤ２
ＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２）
ＡＤ１
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３）
ＡＤ２
ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（配列番号４）
【０１２８】
当業者は、ＤＤＤ１及びＤＤＤ２がタンパク質キナーゼＡのヒトＲＩＩαアイソフォームのＤＤＤ配列に基づいていることを理解するであろう。しかしながら、代替的な実施形態において、ＤＤＤ部分及びＡＤ部分は、以下のＤＤＤ３、ＤＤＤ３Ｃ及びＡＤ３において例示されているように、タンパク質キナーゼＡのヒトＲＩα形態のＤＤＤ配列及び対応するＡＫＡＰ配列に基づいていてもよい。
ＤＤＤ３
ＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＲＬＥＫＥＥＡＫ（配列番号５）
ＤＤＤ３Ｃ
ＭＳＣＧＧＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＲＬＥＫＥＥＡＫ（配列番号６）
ＡＤ３
ＣＧＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＧＣ（配列番号７）
【０１２９】
他の代替的な実施形態において、ＡＤ部分及び／またはＤＤＤ部分の他の配列バリアントは、ＤＮＬ（商標）複合体の構築に利用され得る。例えば、ＰＫＡ、ＲＩα、ＲＩＩα、ＲＩβ及びＲＩＩβのＤＤＤ部分に対応するヒトＰＫＡ  ＤＤＤ配列の４つのバリアントのみがある。ＲＩＩα  ＤＤＤ配列は、先に開示したＤＤＤ１及びＤＤＤ２の基礎である。４つのヒトＰＫＡ  ＤＤＤ配列は以下に示す。ＤＤＤ配列は、ＲＩＩαの残基１〜４４、ＲＩＩβの１〜４４、ＲＩαの１２〜６１及びＲＩβの１３〜６６を表す（ＤＤＤ１の配列がヒトＰＫＡ  ＲＩＩα  ＤＤＤ部分からわずかに修飾されていることに留意されたい）。
ＰＫＡ  ＲＩα
ＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＶＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＫＬＥＫＥＥＡＫ（配列番号８）
ＰＫＡ  ＲＩβ
ＳＬＫＧＣＥＬＹＶＱＬＨＧＩＱＱＶＬＫＤＣＩＶＨＬＣＩＳＫＰＥＲＰＭＫＦＬＲＥＨＦＥＫＬＥＫＥＥＮＲＱＩＬＡ（配列番号９）
ＰＫＡ  ＲＩＩα
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＧＱＱＰＰＤＬＶＤＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＲＱ（配列番号１０）
ＰＫＡ  ＲＩＩβ
ＳＩＥＩＰＡＧＬＴＥＬＬＱＧＦＴＶＥＶＬＲＨＱＰＡＤＬＬＥＦＡＬＱＨＦＴＲＬＱＱＥＮＥＲ（配列番号１１）
【０１３０】
ＡＤドメイン及びＤＤＤドメインの構造−機能関連性は、研究対象であった（例えば、Ｂｕｒｎｓ−Ｈａｍｕｒｏら，２００５，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：２９８２〜２９９２、Ｃａｒｒら，２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１７３３２〜１７３３８、Ａｌｔｏら，２００３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：４４４５〜４４５０、Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３９６：２９７〜３０６、Ｓｔｏｋｋａら，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４００：４９３〜４９９、Ｇｏｌｄら，２００６，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３８３〜３９５、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら，２００６，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３９７〜４０８を参照されたく、これらの各々の全文は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１３１】
例えば、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３９７〜４０８）は、ＡＤ−ＤＤＤ結合相互作用の結晶構造を調査し、ヒトＤＤＤ配列が二量体形成またはＡＫＡＰ結合（以下の配列番号１において下線を付した）のいずれかにおいて重要であるいくつかの保存されたアミノ酸残基を含有していると結論付けた（参照により本明細書に組み込まれるＫｉｎｄｅｒｍａｎら，２００６の図１を参照されたい）。当業者は、ＤＤＤ配列の配列バリアントを設計する上で、下線を付した残基のうちのいずれかを変化させることを望ましく回避し、その一方で保存的アミノ酸置換が、二量体化及びＡＫＡＰ結合にあまり決定的ではない残基についてなされ得ることを理解するであろう。
ＳＨ［Ｉ］Ｑ［Ｉ］ＰＰＧ［Ｌ］ＴＥ［ＬＬ］ＱＧ［Ｙ］Ｔ［Ｖ］Ｅ［ＶＬ］ＲＱＱＰＰＤ［ＬＶ］Ｅ［Ｆ］Ａ［Ｖ］Ｅ［ＹＦ］ＴＲ［Ｌ］ＲＥＡＲＡ（配列番号１）（カッコ内は原文で下線が付されている）
【０１３２】
以下により詳細に考察するように、保存的アミノ酸置換は、２０個の共通のＬ型アミノ酸の各々について特徴づけられてきた。したがって、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６）のデータ及び保存的アミノ酸置換をもとに、配列番号１をもとにした潜在的な代替的ＤＤＤ配列を表２に示す。表２を考案する上で、高度に保存的なアミノ酸置換のみを考慮した。例えば、帯電した残基は、同じ電荷の残基と置換されるのみであり、小さな側鎖を有する残基は、類似の大きさの残基で置換され、ヒドロキシル側鎖は、他のヒドロキシルで置換されるのみであるなどである。アミノ酸二次構造におけるプロリンの独特な効果のため、他の残基はプロリンに対して置換されなかった。限定数のこのような潜在的な代替的ＤＤＤ部分配列は、以下の配列番号１２〜配列番号３１に示す。当業者は、ＤＤＤ部分の属内の多数の代替的な種が、標準的な技術によって、例えば、市販のペプチド合成装置または周知の部位特異的変異誘発技術を用いて構築することができることを理解するであろう。ＡＤ部分結合に及ぼすアミノ酸置換の効果はまた、例えばＡｌｔｏら（２００３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：４４４５〜４４５０）において開示されるような標準的な結合アッセイによって容易に判定され得る。
表２．ＤＤＤ１（配列番号１）における保存的アミノ酸置換。配列番号８７として開示する共通配列。
【表２】
0006427789.tif 000007
ＴＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１２）
ＳＫＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１３）
ＳＲＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１４）
ＳＨＩＮＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１５）
ＳＨＩＱＩＰＰＡＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１６）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＳＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１７）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＤＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１８）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＮＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１９）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＡＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２０）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＳＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２１）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＤＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２２）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＫＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２３）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＮＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２４）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＮＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２５）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＥＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２６）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＤＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２７）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＬＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２８）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＩＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２９）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＶＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３０）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＤＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３１）
【０１３３】
Ａｌｔｏら（２００３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：４４４５〜４４５０）は、種々のＡＫＡＰタンパク質のＡＤ配列のバイオインフォマティクス分析を実施して、ＤＤＤについての結合定数が０．４ｎＭであるＡＫＡＰ−ＩＳと呼ばれるＲＩＩ選択的ＡＤ配列（配列番号３）を設計した。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列は、ＰＫＡへのＡＫＡＰ結合のペプチドアンタゴニストとして設計された。置換がＤＤＤへの結合を低下させる傾向にあるＡＫＡＰ−ＩＳ配列における残基は、以下の配列番号３で下線を付している。当業者は、ＡＤ配列の配列バリアントを設計する上で、下線を付した残基のうちのいずれかを変化させることを望ましく回避し、その一方で、保存的アミノ酸置換がＤＤＤ結合についてあまり決定的ではない残基についてなされ得ることを理解するであろう。表３は、先の表２におけるＤＤＤ１（配列番号１）について示したのと同様のＡＫＡＰ−ＩＳ（ＡＤ１、配列番号３）の配列における潜在的な保存的アミノ酸置換を示す。
【０１３４】
限定数のこのような潜在的な代替的ＡＤ部分配列は、以下の配列番号３２〜配列番号４９に示す。さらに、起こり得るＡＤ部分配列の属内の非常に多数の種は、Ａｌｔｏら（２００３）のデータをもとに当業者によって作製、検査及び使用され得る。Ａｌｔｏ（２００３）の図２が、実際の結合実験をもとに、ＤＤＤ部分への結合活性を保有しつつ、なされ得るさらにより多数の潜在的アミノ酸置換を示していることは留意される。
ＡＫＡＰ−ＩＳ
ＱＩＥＹＬ［Ａ］ＫＱ［ＩＶ］ＤＮ［ＡＩ］ＱＱＡ（配列番号３）（カッコ内は原文で下線を付されている）
表３．ＡＤ１（配列番号３）における保存的アミノ酸置換。配列番号８８として開示する共通配列。
【表３】
0006427789.tif 000008
ＮＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３２）
ＱＬＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３３）
ＱＶＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３４）
ＱＩＤＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３５）
ＱＩＥＦＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３６）
ＱＩＥＴＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３７）
ＱＩＥＳＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３８）
ＱＩＥＹＩＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３９）
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号４０）
ＱＩＥＹＬＡＲＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号４１）
ＱＩＥＹＬＡＫＮＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号４２）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＥＮＡＩＱＱＡ（配列番号４３）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＱＡＩＱＱＡ（配列番号４４）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＮＱＡ（配列番号４５）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＮＡ（配列番号４６）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＬ（配列番号４７）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＩ（配列番号４８）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＶ（配列番号４９）
【０１３５】
Ｇｏｌｄら（２００６，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３８３〜３９５）は、結晶学及びペプチドスクリーニングを利用して、ＲＩアイソフォームと比較してＰＫＡのＲＩＩアイソフォームについて５桁の程度ほど高い選択性を呈するＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列（配列番号５０）を開発した。下線を付した残基は、ＡＫＡＰ−ＩＳ配列に対するアミノ酸置換の位置を示しており、ＲＩＩαのＤＤＤ部分への結合を高めた。この配列において、Ｎ末端Ｑ残基は、残基番号４と付番され、Ｃ末端Ａ残基は残基番号２０である。置換がＲＩＩαに対する親和性に影響するようなすことのできる残基は、残基８、１１、１５、１６、１８、１９及び２０であった（Ｇｏｌｄら，２００６）。ある特定の代替的な実施形態において、ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列は、ＤＮＬ（商標）コンストラクトを調製するためにＡＫＡＰ−ＩＳ  ＡＤ部分配列と置換され得ることが企図される。ＡＫＡＰ−ＩＳ  ＡＤ配列と置換され得る他の代替的な配列は、配列番号５１〜５３に示す。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列に対する置換は下線を付してある。配列番号４に示すＡＤ２配列のように、ＡＤ部分が追加的なＮ末端残基システイン及びグリシンならびにＣ末端残基グリシン及びシステインも含み得ることが予期される。
ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ（カッコ内は原文で下線を付してある）
ＱＩＥＹ［Ｖ］ＡＫＱＩＶＤ［Ｙ］ＡＩ［Ｈ］ＱＡ（配列番号５０）
代替的なＡＫＡＰ配列（カッコ内は原文で下線を付してある）
ＱＩＥＹ［Ｋ］ＡＫＱＩＶＤ［Ｈ］ＡＩ［Ｈ］ＱＡ（配列番号５１）
ＱＩＥＹ［Ｈ］ＡＫＱＩＶＤ［Ｈ］ＡＩ［Ｈ］ＱＡ（配列番号５２）
ＱＩＥＹ［Ｖ］ＡＫＱＩＶＤ［Ｈ］ＡＩ［Ｈ］ＱＡ（配列番号５３）
【０１３６】
Ｇｏｌｄらの図２は、以下に示す種々のＡＫＡＰタンパク質由来の追加的なＤＤＤ結合配列を開示した。
（ＲＩＩ特異的ＡＫＡＰ）
ＡＫＡＰ−ＫＬ
ＰＬＥＹＱＡＧＬＬＶＱＮＡＩＱＱＡＩ（配列番号５４）
ＡＫＡＰ７９
ＬＬＩＥＴＡＳＳＬＶＫＮＡＩＱＬＳＩ（配列番号５５）
ＡＫＡＰ−Ｌｂｃ
ＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫ（配列番号５６）
（ＲＩ特異的ＡＫＡＰ）
ＡＫＡＰｃｅ
ＡＬＹＱＦＡＤＲＦＳＥＬＶＩＳＥＡＬ（配列番号５７）
ＲＩＡＤ
ＬＥＱＶＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴ（配列番号５８）
ＰＶ３８
ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦ（配列番号５９）
（二重特異性ＡＫＡＰ）
ＡＫＡＰ７
ＥＬＶＲＬＳＫＲＬＶＥＮＡＶＬＫＡＶ（配列番号６０）
ＭＡＰ２Ｄ
ＴＡＥＥＶＳＡＲＩＶＱＶＶＴＡＥＡＶ（配列番号６１）
ＤＡＫＡＰ１
ＱＩＫＱＡＡＦＱＬＩＳＱＶＩＬＥＡＴ（配列番号６２）
ＤＡＫＡＰ２
ＬＡＷＫＩＡＫＭＩＶＳＤＶＭＱＱ（配列番号６３）
【０１３７】
Ｓｔｏｋｋａら（２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４００：４９３〜４９９）はまた、配列番号６４〜６６に示すＰＫＡへのＡＫＡＰ結合のペプチド競合薬を開発した。ペプチドアンタゴニストは、Ｈｔ３１（配列番号６４）、ＲＩＡＤ（配列番号６５）及びＰＶ−３８（配列番号６６）と命名された。Ｈｔ−３１ペプチドは、ＰＫＡのＲＩＩアイソフォームに対する比較的大きな親和性を呈したのに対し、ＲＩＡＤ及びＰＶ−３８はＲＩに対する比較的高い親和性を示した。
Ｈｔ３１
ＤＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫＡＡＧＡＹ（配列番号６４）
ＲＩＡＤ
ＬＥＱＹＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴＥ（配列番号６５）
ＰＶ−３８
ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＣ（配列番号６６）
【０１３８】
Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３９６：２９７〜３０６）は、ＰＫＡのＲＩＩ形態のＤＤＤに対する０．４ｎＭと低い結合定数を有するＰＫＡへのＡＫＡＰ結合についてのさらに他のペプチド競合薬をさらに開発した。種々のＡＫＡＰアンタゴニスト性ペプチドの配列は、Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒらの表１に提供され、以下の表４に再現されている。ＡＫＡＰＩＳは、合成ＲＩＩサブユニット結合ペプチドを表す。すべての他のペプチドは、示されたＡＫＡＰのＲＩＩ結合ドメインに由来する。
表４．ＡＫＡＰペプチド配列
ペプチド配列
ＡＫＡＰＩＳ          ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３）
ＡＫＡＰＩＳ−Ｐ      ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＰＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号６７）
Ｈｔ３１              ＫＧＡＤＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫＡＡＧ（配列番号６８）
Ｈｔ３１−Ｐ          ＫＧＡＤＬＩＥＥＡＡＳＲＩＰＤＡＰＩＥＱＶＫＡＡＧ（配列番号６９）
ＡＫＡＰ７δ−ｗｔ−ｐｅｐ          ＰＥＤＡＥＬＶＲＬＳＫＲＬＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号７０）
ＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０４Ｔ−ｐｅｐ    ＰＥＤＡＥＬＶＲＴＳＫＲＬＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号７１）
ＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０８Ｄ−ｐｅｐ    ＰＥＤＡＥＬＶＲＬＳＫＲＤＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号７２）
ＡＫＡＰ７δ−Ｐ−ｐｅｐ            ＰＥＤＡＥＬＶＲＬＳＫＲＬＰＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号７３）
ＡＫＡＰ７δ−ＰＰ−ｐｅｐ          ＰＥＤＡＥＬＶＲＬＳＫＲＬＰＥＮＡＰＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号７４）
ＡＫＡＰ７δ−Ｌ３１４Ｅ−ｐｅｐ    ＰＥＤＡＥＬＶＲＬＳＫＲＬＶＥＮＡＶＥＫＡＶＱＱＹ（配列番号７５）
ＡＫＡＰ１−ｐｅｐ                  ＥＥＧＬＤＲＮＥＥＩＫＲＡＡＦＱＩＩＳＱＶＩＳＥＡ（配列番号７６）
ＡＫＡＰ２−ｐｅｐ                  ＬＶＤＤＰＬＥＹＱＡＧＬＬＶＱＮＡＩＱＱＡＩＡＥＱ（配列番号７７）
ＡＫＡＰ５−ｐｅｐ                  ＱＹＥＴＬＬＩＥＴＡＳＳＬＶＫＮＡＩＱＬＳＩＥＱＬ（配列番号７８）
ＡＫＡＰ９−ｐｅｐ                  ＬＥＫＱＹＱＥＱＬＥＥＥＶＡＫＶＩＶＳＭＳＩＡＦＡ（配列番号７９）
ＡＫＡＰ１０−ｐｅｐ                ＮＴＤＥＡＱＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＶＳＤＩＭＱＱＡ（配列番号８０）
ＡＫＡＰ１１−ｐｅｐ                ＶＮＬＤＫＫＡＶＬＡＥＫＩＶＡＥＡＩＥＫＡＥＲＥＬ（配列番号８１）
ＡＫＡＰ１２−ｐｅｐ                ＮＧＩＬＥＬＥＴＫＳＳＫＬＶＱＮＩＩＱＴＡＶＤＱＦ（配列番号８２）
ＡＫＡＰ１４−ｐｅｐ                ＴＱＤＫＮＹＥＤＥＬＴＱＶＡＬＡＬＶＥＤＶＩＮＹＡ（配列番号８３）
Ｒａｂ３２−ｐｅｐ                  ＥＴＳＡＫＤＮＩＮＩＥＥＡＡＲＦＬＶＥＫＩＬＶＮＨ（配列番号８４）
【０１３９】
異なるＡＫＡＰタンパク質のＡＤドメイン間で高度に保存された残基は、ＡＫＡＰ  ＩＳ配列（配列番号３）に関して下線を付すことによって以下に示す。当該残基は、Ａｌｔｏら（２００３）によって観察されたのと同じであり、Ｃ末端アラニン残基の付加を伴う（参照により本明細書に組み込まれるＨｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（２００６）の図４を参照されたい）。ＲＩＩ  ＤＤＤ配列に対する特に高い親和性を有するペプチドアンタゴニストの配列は、ＡＫＡＰ−ＩＳ、ＡＫＡＰ７δ−ｗｔ−ｐｅｐ、ＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０４Ｔ−ｐｅｐ及びＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０８Ｄ−ｐｅｐの配列であった。
ＡＫＡＰ−ＩＳ（カッコ内は原文で下線を付してある）
ＱＩＥＹＬ［Ａ］ＫＱ［ＩＶ］ＤＮ［ＡＩ］ＱＱ［Ａ］（配列番号３）
【０１４０】
Ｃａｒｒら（２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１７３３２〜１７３３８）は、ヒト及び非ヒトタンパク質由来の異なるＡＫＡＰ結合ＤＤＤ配列間の配列相同性の程度を調査し、異なるＤＤＤ部分間で最も高度に保存されているように見えるＤＤＤ配列において残基を同定した。これらは、配列番号１のヒトＰＫＡ  ＲＩＩα  ＤＤＤ配列に関して下線を付すことによって以下に示す。特に保存された残基は斜字体によってさらに示す。当該残基は、ＡＫＡＰタンパク質への結合に重要であるとＫｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６）によって示唆された残基と重複しているが同一ではない。当業者は、ＤＤＤの配列バリアントを設計する上で、最も保存された残基（斜字体）を変化させることを回避することが最も好ましく、保存された残基（下線）を変化させることを回避することも好ましい一方で、保存的アミノ酸置換が、下線を付しておらず斜字体でもない残基について検討され得ることを理解するであろう。
Ｓ［ＨＩ］Ｑ［（ＩＰ）］Ｐ［（ＧＬ）］Ｔ［Ｅ（ＬＬ）Ｑ（Ｇ）Ｙ（Ｔ）］Ｖ［（ＥＶＬＲ）］Ｑ［（ＱＰ）］Ｐ［（ＤＬ）ＶＥ（ＦＡ）］ＶＥ［（ＹＦ）］ＴＲ［（Ｌ）］Ｒ［Ｅ］Ａ［（Ｒ）］Ａ（配列番号１）（［］内は原文で下線を付してあり、（）内は斜字体である）
【０１４１】
Ｃａｒｒら（２００１）のデータをもとにしたＤＤＤ１（配列番号１）配列についての保存的アミノ酸置換の修飾されたセットは、表５に示す。当業者は、表１及び表２について先に開示した代替的なＤＤＤアミノ酸配列を容易に派生させ得る。
表５．ＤＤＤ１（配列番号１）における保存的アミノ酸置換。配列番号８９として開示する共通配列。
【表５】
0006427789.tif 000009
【０１４２】
当業者は、ＤＤＤアミノ酸配列またはＡＤアミノ酸配列におけるこれらの及び他のアミノ酸置換を利用して、ＡＤ部分またはＤＤＤ部分の属内での代替的な種を、当該分野において標準的な技術及び単に日常的な実験法を用いて製造し得ることを理解するであろう。
【０１４３】
（代替的なＤＮＬ（商標）構造）
ある特定の代替的な実施形態において、ＤＮＬ（商標）コンストラクトは、代替的に構築された抗体または抗体フラグメントを用いて形成され得、ここで、ＡＤ部分は重鎖におけるＦｃのＣ末端の代わりにκ軽鎖（Ｃκ）のＣ末端に結合し得る。代替的に形成されたＤＮＬ（商標）コンストラクトは、各々の全文が参照により本明細書に組み込まれる２０１２年６月１日出願の米国仮特許出願第６１／６５４，３１０号、２０１２年６月２０日出願の第６１／６６２，０８６号、２０１２年７月１９日出願の第６１／６７３，５５３号、及び２０１２年８月１３日出願の第６１／６８２，５３１号において開示される通り調製され得る。軽鎖結合型ＤＮＬ(商標)コンストラクトは、インビトロでの高いＦｃエフェクター機能活性ならびにインビボでの改善された薬物動態、安定性及び抗リンパ腫活性を呈する（Ｒｏｓｓｉら，２０１３，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２４：６３〜７１）。
【０１４４】
Ｃκ結合型ＤＮＬ（商標）コンストラクトは、米国仮特許出願第６１／６５４，３１０号、第６１／６６２，０８６号、第６１／６７３，５５３号及び第６１／６８２，５３１号に開示される通り調製され得る。簡潔には、Ｃκ−ＡＤ２−ＩｇＧは、組換え工学によって作製され、それによりＡＤ２ペプチドは、κ軽鎖のＣ末端へ融合した。Ｃκの天然のＣ末端はシステイン残基であり、これはＣＨ１へのジスルフィド架橋を形成するので、１６アミノ酸残基「ヒンジ」リンカーを用いて、Ｃκ−ＶＨ１ジスルフィド架橋からＡＤ２の距離を置いた。Ｃκ−ＡＤ２−ＩｇＧ−ベルツズマブ及びＣκ−ＡＤ２−ＩｇＧ−エプラツズマブのための哺乳類動物発現ベクターは、ｐｄＨＬ２ベクターを用いて構築され、これは、相同的ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧモジュールの発現にすでに用いた。Ｖκ／Ｃκイントロン内のＢａｍＨＩ制限部位からＣκイントロンのＸｈｏＩ制限部位３’までに及ぶｐｄＨＬ２ベクター配列を含む２２０８ｂｐのヌクレオチド配列が、Ｃκについてのコード配列の３’末端でフレーム中でヒンジリンカーのコード配列（ＥＦＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰ、配列番号１６２）及びＡＤ２の挿入を伴って合成された。この合成配列は、ＢａｍＨＩ制限部位及びＸｈｏＩ制限部位を介してベルツズマブ及びエプラツズマブのためのＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクターへと挿入した。ＳｐＥＳＦＸ−１０を用いた産生クローンの作製は、ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧモジュールについて説明した通り実施した。Ｃκ−ＡＤ２−ＩｇＧ−ベルツズマブ及びＣκ−ＡＤ２−ＩｇＧ−エプラツズマブは、バッチローラーボトル培養において安定してトランスフェクトした産生クローンによって産生し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを用いた単一工程において上澄み液から精製した。
【０１４５】
２２−（２０）−（２０）についてすでに説明された同じＤＮＬ（商標）法（Ｒｏｓｓｉら，２００９，Ｂｌｏｏｄ  １１３：６１６１〜６１７１）の後、Ｃκ−ＡＤ２−ＩｇＧ−エプラツズマブを、ベルツズマブ由来のＦａｂ系モジュールであるＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ベルツズマブと結合させ、ｂｓＨｅｘＡｂ２２＊−（２０）−（２０）を生じ、式中、２２＊は、エプラツズマブのＣκ−ＡＤ２モジュールを示し、かつ各（２０）はベルツズマブＦａｂの安定化した二量体を象徴する。２２＊−（２０）−（２０）の特性を２２−（２０）−（２０）の特性と比較し、相同的Ｆｃ−ｂｓＨｅｘＡｂは、類似の組成及び分子の大きさを有するが異なるアーキテクチャを有するＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧエプラツズマブを含む。
【０１４６】
２０−２ｂについてすでに説明した同じＤＮＬ（商標）法（Ｒｏｓｓｉら，２００９，Ｂｌｏｏｄ  １１４：３８６４〜３８７１）の後、Ｃκ−ＡＤ２−ＩｇＧ−ベルツズマブを、Ｃ末端でＤＤＤ２ペプチドが融合したＩＦＮα２ｂのモジュールであるＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２と結合させ、各軽鎖へ融合した二量体ＩＦＮα２ｂを有するベルツズマブを含む２０＊−２ｂを作製した。２０＊−２ｂの特性を、相同的Ｆｃ−ＩｇＧ−ＩＦＮαである２０−２ｂの特性と比較した。
【０１４７】
ｂｓＨｅｘＡｂ及びＩｇＧ−ＩＦＮαの各々をＭａｂＳｅｌｅｃｔアフィニティクロマトグラフィーによってＤＮＬ（商標）反応混合物から単離した。２つのＣκ由来のプロトタイプ、すなわち、エプラツズマブ（抗ＣＤ２２）とベルツズマブ（抗ＣＤ２０）の４つのＦａｂとを含む抗ＣＤ２２／ＣＤ２０二重特異性六価抗体、ならびにベルツズマブとインターフェロンα２ｂの４つの分子とを含むＣＤ２０標的化免疫サイトカインは、Ｆｃ由来の対応物と比較して、インビトロでの高いＦｃエフェクター機能、ならびにインビボでの改善された薬物動態、安定性及び抗リンパ腫活性を示した。
【０１４８】
（アミノ酸置換）
代替的な実施形態において、開示した方法及び組成物は、１つ以上の置換されたアミノ酸残基を有するタンパク質またはペプチドの製造及び使用を包含し得る。例えば、ＤＮＬ（商標）コンストラクトを作製するために使用するＤＤＤ配列及び／またはＡＤ配列は、先に論じたように修飾され得る。
【０１４９】
当業者は、概して、アミノ酸置換が典型的には、あるアミノ酸と比較的類似の特性の別のアミノ酸との置き換えを包含すること（すなわち、保存的アミノ酸置換）に気付くであろう。種々のアミノ酸の特性ならびにタンパク質の構造及び機能に及ぼすアミノ酸置換の効果はこれまで、当該技術分野における広範な研究の対象および知識となっている。
【０１５０】
例えば、アミノ酸のヒドロパシー係数が考慮され得る（Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５〜１３２）。アミノ酸の相対的なヒドロパシー特徴は、結果として生じるタンパク質の二次構造に寄与し、そのことが結果として、当該タンパク質と他の分子との相互作用を規定する。各アミノ酸は、その疎水性及び帯電特徴をもとにヒドロパシー係数を割り当てられており（Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）、これらは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、及びアルギニン（−４．５）である。保存的置換をする上で、ヒドロパシー係数が±２以内であるアミノ酸の使用が好ましく、±１以内がより好ましく、±０．５以内がさらにより好ましい。
【０１５１】
アミノ酸置換はまた、アミノ酸残基の親水性を考慮に入れ得る（例えば、米国特許第４，５５４，１０１号）。親水性値は、アミノ酸残基へ割り当てられており、アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０）、グルタミン酸（＋３．０）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５．＋−．１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）である。アミノ酸の、類似の親水性の他のアミノ酸との置き換えが好ましい。
【０１５２】
他の考慮には、アミノ酸側鎖の大きさが含まれる。例えば、概して、グリシンまたはセリンなどコンパクトな側鎖を有するアミノ酸を、かさばる側鎖を有するアミノ酸、例えばトリプトファンまたはチロシンと置き換えることは好ましくないであろう。タンパク質の二次構造に及ぼす種々のアミノ酸残基の効果も考慮される。実験研究を通じて、αへリックス、βシートまたは逆ターン二次構造を採用するタンパク質ドメインの傾向に及ぼす異なるアミノ酸残基の効果は判定されており、当該技術分野で公知である（例えば、Ｃｈｏｕ及びＦａｓｍａｎ，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：２２２〜２４５；１９７８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１〜２７６；１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７〜３８４を参照されたい）。
【０１５３】
このような考慮及び広範な実験研究をもとに、保存的アミノ酸置換の表が構築されており、当該技術分野で公知である。例えば、アルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸、セリンとトレオニン、グルタミンとアスパラギン、及びバリンとロイシンとイソロイシンである。あるいは、Ａｌａ（Ａ）ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｖａｌ；Ａｒｇ（Ｒ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ｌｙｓ；Ａｓｎ（Ｎ）ｈｉｓ、ａｓｐ、ｌｙｓ、ａｒｇ、ｇｌｎ；Ａｓｐ（Ｄ）ａｓｎ、ｇｌｕ；Ｃｙｓ（Ｃ）ａｌａ、ｓｅｒ；Ｇｌｎ（Ｑ）ｇｌｕ、ａｓｎ；Ｇｌｕ（Ｅ）ｇｌｎ、ａｓｐ；Ｇｌｙ（Ｇ）ａｌａ；Ｈｉｓ（Ｈ）ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ａｒｇ；Ｉｌｅ（Ｉ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｌｅｕ；Ｌｅｕ（Ｌ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｉｌｅ；Ｌｙｓ（Ｋ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ａｒｇ；Ｍｅｔ（Ｍ）ｐｈｅ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；Ｐｈｅ（Ｆ）ｌｅｕ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ａｌａ、ｔｙｒ；Ｐｒｏ（Ｐ）ａｌａ；Ｓｅｒ（Ｓ）ｔｈｒ；Ｔｈｒ（Ｔ）ｓｅｒ；Ｔｒｐ（Ｗ）ｐｈｅ、ｔｙｒ；Ｔｙｒ（Ｙ）ｔｒｐ、ｐｈｅ、ｔｈｒ、ｓｅｒ；Ｖａｌ（Ｖ）ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ａｌａである。
【０１５４】
アミノ酸置換についての他の考慮には、当該残基がタンパク質の内部に位置するかどうかまたは溶媒曝露されているかどうかが含まれる。内部残基については、保存的置換には、Ａｓｐ及びＡｓｎ、Ｓｅｒ及びＴｈｒ、Ｓｅｒ及びＡｌａ、Ｔｈｒ及びＡｌａ、Ａｌａ及びＧｌｙ、Ｉｌｅ及びＶａｌ、Ｖａｌ及びＬｅｕ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ、Ｌｅｕ及びＭｅｔ、Ｐｈｅ及びＴｙｒ、Ｔｙｒ及びＴｒｐが含まれるであろう（例えば、ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕにあるＰＲＯＷＬウェブサイトを参照されたい）。溶媒曝露されている残基については、保存的置換には、Ａｓｐ及びＡｓｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａ、Ｇｌｙ及びＡｓｎ、Ａｌａ及びＰｒｏ、Ａｌａ及びＧｌｙ、Ａｌａ及びＳｅｒ、Ａｌａ及びＬｙｓ、Ｓｅｒ及びＴｈｒ、Ｌｙｓ及びＡｒｇ、Ｖａｌ及びＬｅｕ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ、Ｉｌｅ及びＶａｌ、Ｐｈｅ及びＴｙｒが含まれるであろう（同上）。ＰＡＭ２５０スコア化マトリックス、Ｄａｙｈｏｆｆマトリックス、Ｇｒａｎｔｈａｍマトリックス、ＭｃＬａｃｈｌａｎマトリックス、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅマトリックス、Ｈｅｎｉｋｏｆｆマトリックス、宮田マトリックス、Ｆｉｔｃｈマトリックス、Ｊｏｎｅｓマトリックス、Ｒａｏマトリックス、Ｌｅｖｉｎマトリックス及びＲｉｓｌｅｒマトリックスなど、種々のマトリックスがアミノ酸置換の選択を支援するために構築されてきた（同上）。
【０１５５】
アミノ酸置換を判定する上で、正に帯電した残基（例えば、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）と負に帯電した残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）の間のイオン結合（塩架橋）の形成または隣接するシステイン残基間のジスルフィド結合の形成など、分子間結合または分子内結合の存在も考慮され得る。
【０１５６】
コードされたタンパク質配列におけるいずれかのアミノ酸といずれかの他のアミノ酸とを置換する方法は周知であり、例えば部位特異的変異誘発の技術によってまたはアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドの合成及び組み立てならびに発現ベクターコンストラクトへのスプライシングによるといった、当業者にとっては日常的な実験のことである。
【０１５７】
（ファージディスプレイ）
請求する組成物及び／または方法のある特定の実施形態は、種々の標的分子、細胞または組織の結合するペプチド及び／またはペプチド模倣薬に関し得る。結合するペプチドは、ファージディスプレイ技術を含むがこれに限定しない当該技術分野で公知のいずれかの方法によって同定され得る。ファージディスプレイの種々の方法及びペプチドの多様な集団を製造するための技術は、当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、第５，６２２，６９９号及び第６，０６８，８２９号は、ファージライブラリを調製するための方法を開示している。ファージディスプレイ技術は、小さなペプチドがバクテリオファージの表面上で発現できるよう、当該バクテリオファージを遺伝子操作することを包含する（Ｓｍｉｔｈ及びＳｃｏｔｔ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５〜１３１７、Ｓｍｉｔｈ及びＳｃｏｔｔ，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１：２２８〜２５７）。ペプチドに加えて、一本鎖抗体などの比較的大きなタンパク質ドメインも、ファージ粒子の表面上に提示され得る（Ａｒａｐら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：３７７〜３８０）。
【０１５８】
所与の器官、組織、細胞型または標的分子に対して選択的な標的化アミノ酸配列は、パニングによって単離され得る（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ及びＲｕｏｓｌａｈｔｉ，  １９９６，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：３６４〜３６６、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，１９９９，Ｔｈｅ  Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４３：１５９〜１６２）。簡潔には、推定上の標的化ペプチドを含有するファージのライブラリを未処置の生体へまたは単離した器官、組織、細胞型もしくは標的分子へ投与して、結合したファージを含有する試料を収集する。標的へ結合したファージは、標的器官、組織、細胞型または標的分子から溶出した後、宿主細菌において当該ファージを増殖させることによって増幅され得る。
【０１５９】
ある特定の実施形態において、ファージは、何回かのパニング間で宿主細胞中で増殖し得る。ファージによって溶解されるよりもむしろ、細菌は、代わりに、特異的インサートを提示する複数コピーのファージを分泌し得る。所望の場合、増幅したファージは、標的器官、組織、細胞型または標的分子へさらに曝露され、追加的な回数のパニングについて収集され得る。複数回のパニングは、選択的または特異的バインダの集団が得られるまで実施され得る。ペプチドのアミノ酸配列は、ファージゲノムにおける標的化ペプチドインサートに対応するＤＮＡを配列決定することによって判定され得る。同定された標的化ペプチドは次に、標準的なタンパク質化学技術によって合成ペプチドとして製造され得る（Ａｒａｐら，１９９８、Ｓｍｉｔｈら，１９８５）。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、サブトラクションプロトコルを使用して、背景ファージ結合をさらに低下させてもよい。サブトラクションの目的は、関心対象の標的以外の標的へ結合するライブラリからファージを除去することである。代替的な実施形態において、ファージライブラリは、対照細胞、組織または器官に対してプレスクリーニングされ得る。例えば、腫瘍結合ペプチドは、対照の正常細胞株に対してライブラリをプレスクリーニングした後に同定され得る。サブトラクション後、ライブラリを関心対象の分子、細胞、組織または器官に対してスクリーニングし得る。サブトラクションプロトコルに関する他の方法は公知であり、例えば、米国特許第５，８４０，８４１号、第５，７０５，６１０号、第５，６７０，３１２号及び第５，４９２，８０７号において開示されるように、請求する方法の実施において使用され得る。
【０１６１】
（ナノボディ）
ナノボディは、大きさ約１２〜１５ｋＤａの単一ドメイン抗体である（長さ約１１０アミノ酸）。ナノボディは、完全な大きさの抗体のように標的抗原へ選択的に結合することができ、抗原に対する類似の親和性を有する。しかしながら、ナノボディの比較的非常に小さな大きさのため、ナノボディは固形腫瘍へとより良好に浸透することができる可能性がある。より小さな大きさはまた、ナノボディの安定性に寄与し、完全な大きさの抗体と比べてｐＨ及び温度の両極端に対する耐性がある（Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎら，１９９９，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔ  １４３１：３７〜４６）。単一ドメインの抗体は本来、ラクダ科動物（ラクダ、アルパカ、ラマ）が軽鎖を有さない完全に機能的な抗体を有するという発見に従って開発された（例えば、Ｈａｍｓｅｎら，２００７，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７７：１３〜２２）。重鎖抗体は、単一の可変部（ＶＨＨ）及び２つの定常部（ＣＨ２及びＣＨ３）からなる。抗体のように、ナノボディは、多価及び二重特異性のコンストラクトとして開発及び使用され得る。ＩＬ−６Ｒ、ｖＷＦ、ＴＮＦ、ＲＳＶ、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ−１７Ａ及びＦならびにＩｇＥ（例えば、ＡＢＬＹＮＸ（登録商標）、ベルギー国ゲント市）など、癌、炎症、感染性疾患、アルツハイマー病、急性冠症候群及び他の障害における潜在的な臨床用途で種々の標的抗原を標的化するヒト化形態のナノボディは、商業的に開発中である（例えば、Ｓａｅｒｅｎｓら，２００８，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ８：６００〜６０８、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２０１３，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８２：７７５〜７９７、Ｉｂａｎｅｚら，２０１１，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０３：１０６３〜１０７２）。
【０１６２】
ナノボディの血漿半減期は、完全な大きさの抗体の血漿半減期よりも短く、主として腎経路によって排出される。ナノボディはＦｃ領域を欠失しているので、補体依存性細胞毒性を呈さない。
【０１６３】
ナノボディは、標的抗原を用いたラクダ、ラマ、アルパカまたはサメの免疫化の後に、ｍＲＮＡの単離、ライブラリへのクローニング及び抗原結合についてのスクリーニングによって製造され得る。ナノボディ配列は、標準的な技術によってヒト化され得る（例えば、Ｊｏｎｅｓら，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４、Ｃａｒｔｅｒら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５、Ｓａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７、Ｓｉｎｇｅｒら，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４）。ヒト化は、ラクダ科動物とヒトのＦＲ配列間での高い相同性のため、比較的簡単である。
【０１６４】
種々の実施形態において、主題のＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体は、細胞、組織、器官または病原体への複合薬の標的化した送達のためのナノボディを含み得る。使用するナノボディは、例えば、米国特許第７，８０７，１６２号、第７，９３９，２７７号、第８，１８８，２２３号、第８，２１７，１４０号、第８，３７２，３９８号、第８，５５７，９６５号、第８，６２３，３６１号及び第８，６２９，２４４号に開示されており、各々の実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
（結合プロトコル）
好ましい結合プロトコルは、中性または酸性のｐＨで容易に得られるチオール−マレイミド反応、チオール−ビニルスルホン反応、チオール−ブロモアセトアミド反応、またはチオール−ヨードアセトアミド反応に基づいている。このことは、例えば、活性のあるエステルを用いる場合に必要とされるであろうような結合のためのより高いｐＨ条件についての必要性を除去する。例示的な結合プロトコルに関するさらなる詳細は、以下の実施例の節において説明する。
【０１６６】
（治療的処置）
別の態様において、本発明は、本明細書に説明するような治療有効量の治療用複合体を対象へ投与することを含む、対象を治療する方法に関する。本明細書に説明する治療用複合体を用いて治療され得る疾患には、例えば、別のＣＤ２２エピトープ（ｈＲＦＢ４）に対するｈＬＬ２ＭＡｂ（エプラツズマブ、米国特許第６，１８３，７４４号を参照されたい）などの抗ＣＤ２２抗体またはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＣＤ８０もしくはＨＬＡ−ＤＲなどの他のＢ細胞抗原に対する抗体を用いるＢ細胞悪性腫瘍（例えば、非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病）が含まれるが、これらに限定されない。他の疾患には、内胚葉由来の消化器系上皮の腺癌、乳癌及び非小細胞肺癌などの癌、ならびに他の癌腫、肉腫、神経膠芽腫、骨髄性白血病などが含まれるが、これらに限定しない。特に、抗原、例えば、悪性固形腫瘍または造血器新生物、例えば、消化管、胃、結腸、食道、肝臓、肺、乳房、膵臓、肝臓、前立腺、卵巣、精巣、脳、骨またはリンパの腫瘍、肉腫あるいは黒色腫によって産生されるまたはこれらと結合する例えば癌胎児性抗原に対する抗体が有利に使用される。このような治療薬は、疾患状態及び複合体の耐容性に応じて単回または反復して付与することができ、また、任意に手術、体外放射線、放射免疫療法、免疫療法、化学療法、アンチセンス療法、干渉性ＲＮＡ療法、遺伝子治療、及びこれらに類するものと併用することもできる。各組み合わせは、腫瘍の種類、病期、患者の容態及び先行療法、ならびに担当医が考慮する他の因子に対して適応させられる。
【０１６７】
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、ヒトを含む哺乳類動物を含むがこれに限定しないいずれかの動物（すなわち、脊椎動物及び非脊椎動物）を指す。当該用語が特定の齢または性別に限定されるべきであることは意図されない。したがって、成体及び新生児の対象、ならびに胎児は、雄性であろうと雌性であろうと、当該用語によって包含される。本明細書で示される用量はヒト用であるが、他の哺乳類動物及び子供の大きさに対して、重量または平方メートルの大きさに従って調整することができる。
【０１６８】
好ましい実施形態において、ｈＲＳ７  ＭＡｂなどの抗ＥＧＰ−１（抗ＴＲＯＰ−２）抗体を含む治療用複合体は、その実施例の節が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２３８，７８５号、第７，５１７，９６４号及び第８，０８４，５８３号において開示されるように、食道、膵臓、肺、胃、結腸及び直腸、膀胱、乳房、卵巣、子宮、腎臓ならびに前立腺の癌腫などの癌腫を治療するために使用することができる。ｈＲＳ７抗体は、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号９０）、ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号９１）、及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号９２）ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号９３）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号９４）及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号９５）を含むヒト化抗体である。
【０１６９】
別の好ましい実施形態において、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体（例えば、ｈＭＮ−１４、ラブレツズマブ）及び／または抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体（例えば、ｈＭＮ−３またはｈＭＮ−１５）を含む治療用複合体は、各々の実施例の節が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，５４１，４４０号、第７，９５１，３６９号、第５，８７４，５４０号、第６，６７６，９２４号及び第８，２６７，８６５号において開示されるように、ＣＥＡＣＡＭ５及び／またはＣＥＡＣＡＭ６を発現する種々の癌のうちのいずれかを治療するために使用され得る。抗ＣＥＡＣＡＭ５、抗ＣＥＡＣＡＭ６、またはこれら２つの組み合わせを用いて治療され得る固形腫瘍には、乳房、肺、膵臓、食道、甲状腺髄様、卵巣、結腸、直腸、膀胱、口腔及び胃の癌が含まれるが、これらに限定しない。胃腸、呼吸器、尿生殖器及び乳房の癌を含む大部分の癌腫は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現し、主題の免疫複合体を用いて治療され得る。ｈＭＮ−１４抗体は、軽鎖可変部ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＧＴＳＶＡ；配列番号９６）、ＣＤＲ２（ＷＴＳＴＲＨＴ；配列番号９７）、及びＣＤＲ３（ＱＱＹＳＬＹＲＳ；配列番号９８）ならびに重鎖可変部ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＴＹＷＭＳ；配列番号９９）、ＣＤＲ２（ＥＩＨＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤ；配列番号１００）及びＣＤＲ３（ＬＹＦＧＦＰＷＦＡＹ；配列番号１０１)を含むヒト化抗体である。
【０１７０】
ｈＭＮ−３抗体は、軽鎖可変部ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ、配列番号１０２）、ＣＤＲ２（ＫＶＳＮＲＦＳ、配列番号１０３）及びＣＤＲ３（ＦＱＧＳＨＶＰＰＴ、配列番号１０４）ならびに重鎖可変部ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号１０５）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ、配列番号１０６）及びＣＤＲ３（ＫＧＷＭＤＦＮＳＳＬＤＹ、配列番号１０７）を含むヒト化抗体である。
【０１７１】
ｈＭＮ−１５抗体は、軽鎖可変部ＣＤＲ配列ＳＡＳＳＲＶＳＹＩＨ（配列番号１０８）、ＧＴＳＴＬＡＳ（配列番号１０９）、及びＱＱＷＳＹＮＰＰＴ（配列番号１１０）ならびに重鎖可変部ＣＤＲ配列ＤＹＹＭＳ（配列番号１１１）、ＦＩＡＮＫＡＮＧＨＴＴＤＹＳＰＳＶＫＧ（配列番号１１２）、及びＤＭＧＩＲＷＮＦＤＶ（配列番号１１３）を含むヒト化抗体である。
【０１７２】
別の好ましい実施形態において、抗ＣＤ７４抗体（例えば、ｈＬＬ１、ミラツズマブ、各々の実施例の節が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，０７４，４０３号、第７，３１２，３１８号、第７，７７２，３７３号、第７，９１９，０８７号及び第７，９３１，９０３号に開示）を含む治療用複合体は、腎臓、肺、小腸、胃、乳房、前立腺または卵巣の癌、ならびに多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、及びホジキンリンパ腫などのいくつかの血液学的な癌を含むがこれらに限定しない、ＣＤ７４を発現する種々の癌のうちのいずれかを治療するために使用され得る。ｈＬＬ１抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨ；配列番号１１４）、ＣＤＲ２（ＴＶＳＮＲＦＳ；配列番号１１５）、及びＣＤＲ３（ＳＱＳＳＨＶＰＰＴ；配列番号１１６）ならびに重鎖可変部ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＶＮ；配列番号１１７）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＰＮＴＧＥＰＴＦＤＤＤＦＫＧ；配列番号１１８）、及びＣＤＲ３（ＳＲＧＫＮＥＡＷＦＡＹ；配列番号１１９）を含むヒト化抗体である。
【０１７３】
別の好ましい実施形態において、抗ＣＤ２２抗体（例えば、ｈＬＬ２、エプラツズマブ、各々の実施例の節が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７８９，５５４号、第６，１８３，７４４号、第６，１８７，２８７号、第６，３０６，３９３号第７，０７４，４０３号及び第７，６４１，９０１号に開示、またはキメラもしくはヒト化ＲＦＢ４抗体）を含む治療用複合体は、無痛性形態のＢ細胞リンパ腫、進行性形態のＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫またはびまん性Ｂ細胞型リンパ腫を含むがこれらに限定しない、ＣＤ２２を発現する種々の癌のうちのいずれかを治療するために使用され得る。抗ＣＤ２２複合体はまた、急性免疫性血小板減少症、慢性免疫性血小板減少症、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、糖尿病（例えば、若年型糖尿病）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、抗好中球細胞質抗体関連血管炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形紅斑、ＩｇＡ腎炎、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞動脈炎／多発筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、線維化胞隔炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、臓器移植拒絶、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）及び炎症などの自己免疫疾患を治療するために使用される。ｈＬＬ２抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＡＮＨＫＹＬＡ、配列番号１２０）、ＣＤＲ２（ＷＡＳＴＲＥＳ、配列番号１２１）、及びＣＤＲ３（ＨＱＹＬＳＳＷＴＦ、配列番号１２２）ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＳＹＷＬＨ、配列番号１２３）、ＣＤＲ２（ＹＩＮＰＲＮＤＹＴＥＹＮＱＮＦＫＤ、配列番号１２４）、及びＣＤＲ３（ＲＤＩＴＴＦＹ、配列番号１２５）を含むヒト化抗体である。
【０１７４】
好ましい実施形態において、ｈＭｕ−９  ＭＡｂなどの抗ＣＳＡｐ抗体を含む治療用複合体は、各々の実施例の節が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９６２，７０２号、第７，３８７，７７２号、第７，４１４，１２１号、第７，５５３，９５３号、第７，６４１，８９１号及び第７，６７０，８０４号において開示されるような結腸直腸癌ならびに膵癌及び卵巣癌を治療するために使用することができる。ｈＭｕ−９抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ、配列番号１２６）、ＣＤＲ２（ＫＶＳＮＲＦＳ、配列番号１２７）、及びＣＤＲ３（ＦＱＧＳＲＶＰＹＴ、配列番号１２８）ならびに重鎖可変ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＥＹＶＩＴ、配列番号１２９）、ＣＤＲ２（ＥＩＹＰＧＳＧＳＴＳＹＮＥＫＦＫ、配列番号１３０）、及びＣＤＲ３（ＥＤＬ、配列番号１３１）を含むヒト化抗体である。
【０１７５】
ｈＰＡＭ４  ＭＡｂを含む治療用複合体は、各々の実施例の節が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２３８，７８６号及び第７，２８２，５６７号において開示されるような膵癌または他の固形腫瘍を治療するために使用することができる。ｈＰＡＭ４抗体は、軽鎖可変部ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＳＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＹ、配列番号１３２）、ＣＤＲ２（ＳＴＳＮＬＡＳ、配列番号１３３）、及びＣＤＲ３（ＨＱＷＮＲＹＰＹＴ、配列番号１３４）ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＳＹＶＬＨ、配列番号１３５）、ＣＤＲ２（ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＱＹＮＥＫＦＫＧ、配列番号１３６）及びＣＤＲ３（ＧＦＧＧＳＹＧＦＡＹ、配列番号１３７）を含むヒト化抗体である。
【０１７６】
別の好ましい実施形態において、ＩＭＭＵ３１などの抗ＡＦＰ  ＭＡｂを含む治療用複合体は、その実施例の節が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，３００，６５５号において開示されるような、ヒト化、キメラ及びヒトの抗体形態を用いて。肝細胞癌、胚細胞腫瘍、及び他のＡＦＰ産生腫瘍を治療するために使用することができる。ＩＭＭＵ３１抗体は、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＳＹＶＩＨ、配列番号１３８）、ＣＤＲ２（ＹＩＨＰＹＮＧＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ、配列番号１３９）及びＣＤＲ３（ＳＧＧＧＤＰＦＡＹ、配列番号１４０）ならびに軽鎖ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＧ、配列番号１４１）、ＣＤＲ２（ＹＴＳＡＬＬＰ、配列番号１４２）及びＣＤＲ３（ＬＱＹＤＤＬＷＴ、配列番号１４３）を含むヒト化抗体である。
【０１７７】
別の好ましい実施形態において、ｈＬ２４３などの抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＭＡｂを含む治療用複合体は、その実施例の節が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６１２，１８０号において開示されるように、リンパ腫、白血病、皮膚、食道、胃、結腸、直腸、膵臓、肺、乳房、卵巣、膀胱、子宮内膜、子宮頸部、精巣、腎臓、肝臓の癌、黒色腫または他のＨＬＡ−ＤＲ産生腫瘍を治療するために使用することができる。ｈＬ２４３抗体は、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号１４４）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＲＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ、配列番号１４５）、及びＣＤＲ３（ＤＩＴＡＶＶＰＴＧＦＤＹ、配列番号１４６）ならびに軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＲＡＳＥＮＩＹＳＮＬＡ、配列番号１４７）、ＣＤＲ２（ＡＡＳＮＬＡＤ、配列番号１４８）、及びＣＤＲ３（ＱＨＦＷＴＴＰＷＡ、配列番号１４９）を含むヒト化抗体である。
【０１７８】
別の好ましい実施形態において、ベルツズマブ（ｈＡ２０）、１Ｆ５、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１）、またはリツキシマブなどの抗ＣＤ２０ＭＡｂを含む治療用複合体は、各々の実施例の節が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４３５，８０３号または第８，２８７，８６４号において開示されるように、リンパ腫、白血病、免疫性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、エバンス症候群、関節炎、動脈炎、尋常性天疱瘡、腎移植拒絶反応、心臓移植拒絶反応、関節リウマチ、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、びまん性Ｂ細胞型リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、Ｉ型糖尿病、ＧＶＨＤ、多発性硬化症または多発性骨髄腫を治療するために使用することができる。ｈＡ２０（ベルツズマブ）抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲＬ１（ＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ、配列番号１５０）、ＣＤＲＬ２（ＡＴＳＮＬＡＳ、配列番号１５１）及びＣＤＲＬ３（ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ、配列番号１５２）ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲＨ１（ＳＹＮＭＨ、配列番号１５３）、ＣＤＲＨ２（ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ、配列番号１５４）及びＣＤＲＨ３（ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＤＶ、配列番号１５５）を含むヒト化抗体である。
【０１７９】
別の好ましい実施形態において、ｈＡ１９などの抗ＣＤ１９  ＭＡｂを含む治療用複合体は、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病または急性リンパ芽球性白血病などのＢ細胞関連リンパ腫及び白血病を治療するために使用することができる。治療され得る他の疾患状態には、各々の実施例の節が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，１０９，３０４号、第７，４６２，３５２号、第７，９０２，３３８号、第８，１４７，８３１号及び第８，３３７，８４０号において開示されるように、急性または慢性免疫性血小板減少症、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、抗好中球細胞質抗体関連血管炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形紅斑、ＩｇＡ腎炎、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞動脈炎／多発筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、及び線維化胞隔炎などの自己免疫疾患が含まれる。ｈＡ１９抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１  ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮ（配列番号１５６）、ＣＤＲ２  ＤＡＳＮＬＶＳ（配列番号１５７）、及びＣＤＲ３  ＱＱＳＴＥＤＰＷＴ（配列番号１５８）ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１  ＳＹＷＭＮ（配列番号１５９）、ＣＤＲ２  ＱＩＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ（配列番号１６０）及びＣＤＲ３  ＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号１６１）を含むヒト化抗体である。
【０１８０】
抗テネイシン抗体を含む治療用複合体は、造血器腫瘍及び固形腫瘍を治療するために使用することができ、テネイシンに対する抗体を含む複合体は、固形腫瘍、好ましくは神経膠芽腫のような脳の癌を治療するために使用することができる。
【０１８１】
好ましくは、ヒトの疾患の治療において使用する抗体は、抗体のヒト版またはヒト化（ＣＤＲ移植）版であるが、抗体のネズミ版及びキメラ版を使用することができる。送達薬と同じ種のＩｇＧ分子は、免疫応答を最小限にするためにたいてい好ましい。このことは、反復治療を考慮する場合に特に重要である。ヒトについては、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体は、抗ＩｇＧ免疫応答を患者から生じる可能性が低い。ｈＬＬ１及びｈＬＬ２などの抗体は、標的細胞上の内部移行する抗原への結合後に迅速に内部移行し、このことは、運搬中の化学療法薬が、同様に細胞へと迅速に内部移行されていることを意味する。しかしながら、より低速の内部移行を有する抗体も、選択的療法を果たすために使用することができる。
【０１８２】
病原体に対する抗体が公知であるので、治療用複合体は病原体に対して使用することができる。例えば、細菌、リケッチア、マイコプラズマ、原生動物、真菌類、及びウイルスなどの病原体ならびにこのような微生物と結合している抗原及び生成物によって例えば生じるウイルス感染、細菌感染、真菌感染及び寄生虫感染を含む感染性病変によって生じるまたはこれに結合しているマーカーを特異的に結合する抗体及び抗体フラグメントは、とりわけ、各々の実施例の節が参照により本明細書に組み込まれるＨａｎｓｅｎら，米国特許第３，９２７，１９３号ならびにＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  米国特許第４，３３１，６４７号、第４，３４８，３７６号、第４，３６１，５４４号、第４，４６８，４５７号、第４，４４４，７４４号、第４，８１８，７０９号及び第４，６２４，８４６号、ならびに先に引用したＲｅｉｃｈｅｒｔ及びＤｅｗｉｔｚにおいて開示されている。好ましい実施形態において、当該病原体は、その実施例の節が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４４０，４１６号において開示されるように、ＨＩＶウイルス、結核菌、ストレプトコッカス・アガラクチエ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、レジュネラ・ニューモフィラ菌、化膿性連鎖球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、Ｂ型インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ）、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、緑膿菌、らい菌、ウシ流産菌、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、単純ヘルペスウイルスＩＩ型、ヒト血清パルボ様ウイルス、ＲＳウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イボウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス４０型、マウス乳癌ウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、西ナイルウイルス、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ・ゴンディ、ランゲルトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅｉ）、ブルーストリパノソーマ、マンソン住血吸虫、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐａｎｉｃｕｍ）、ウシバベシア、ニワトリ盲腸コクシジウム（Ｅｌｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ）、回旋糸状虫、熱帯リーシュマニア、旋毛虫、タイレリア・パルバ、胞状条虫、ヒツジ条虫、無鉤条虫、単包条虫、メソセストイデス・コルティ、マイコプラズマ・アルスリチジス、マイコプラズマ・ヒオリニス、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・アルギニニ、アコレプラスマ・レイドロウィイ、マイコプラズマ・サリバリウム及び肺炎マイコプラズマからなる群から選択される。
【０１８３】
抗ｇｐ１２０及び他のこのような抗ＨＩＶ抗体を含む本発明の薬剤複合体は、エイズ患者におけるＨＩＶのための治療薬として使用することができ、結核菌に対する抗体の薬剤複合体は、薬剤屈折性結核のための治療薬として適している。抗ｇｐ１２０ＭＡｂ（抗ＨＩＶ  ＭＡｂ）及びシュードモナス外毒素などの毒素からなる融合タンパク質は、抗ウイルス特性について調査されている（Ｖａｎ  Ｏｉｇｅｎら，Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，５：７５〜９１，１９９８）。エイズ患者におけるＨＩＶ感染を治療する試みは、おそらく不十分な効能または許容し得ない宿主毒性により失敗した。本発明の薬剤複合体は、タンパク質毒素のこのような毒素副作用を有利に欠失しており、それゆえエイズ患者におけるＨＩＶ感染を治療する上で有利に使用される。これらの薬剤複合体は、単独で付与することができ、または単独で付与された時にこのような患者において有効な他の抗生物質もしくは治療薬と組み合わせて付与することができる。候補抗ＨＩＶ抗体には、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら（ＡＩＤＳ．２００６年１０月３日号；２０（１５）：１９１１〜１９１５）によって説明されるＰ４／Ｄ１０抗エンベロープ抗体、ならびにＰｏｌｙｍｕｎ（オーストリア国ウィーン市）によって説明及び販売され、また米国特許第５，８３１，０３４号、米国特許第５，９１１，９８９号およびＶｃｅｌａｒら，ＡＩＤＳ  ２００７；２１（１６）：２１６１〜２１７０及びＪｏｏｓら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００６；５０（５）：１７７３〜１７７９（すべてが参照により本明細書に組み込まれる）においても説明される抗ＨＩＶ抗体が含まれる。ＨＩＶについての好ましい標的化薬は、耐性を克服するためのこれらの抗体の種々の組み合わせである。
【０１８４】
細胞及び病原体へのより有効な組み込みは、多価多重特異性抗体または多価単一特異性抗体を用いることによって達成することができる。このような二価抗体及び二重特異性抗体の例は、それらの各々の実施例の節が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，３８７，７７２号、第７，３００，６５５号、第７，２３８，７８５号及び第７，２８２，５６７号において認められる。これらの多価抗体または多重特異性抗体は、複数の抗原標的及び同じ抗原標的の複数のエピトープさえも発現するが、細胞または病原体上での単一抗原標的の不十分な発現または利用可能性のため、免疫療法のための抗体標的化及び十分な結合をしばしば回避する癌及び感染性生体（病原体）の標的化において特に好ましい。複数の抗原またはエピトープを標的化することによって、当該抗体は、標的上でのより高い結合及び在留時間を示し、したがって、本発明において目的とする薬剤のより高い飽和を生じる。
【０１８５】
治療用複合体はまた、自己免疫疾患及び免疫系機能不全（例えば、移植片対宿主病、臓器移植拒絶反応）を治療するために使用され得る。自己免疫疾患／免疫機能不全疾患を治療するために使用する抗体は、ＢＣＬ−１、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−６、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１３８、ＦＭＣ−７、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ及びＭＩＦを含むがこれらに限定しない例示的な抗原へ結合し得る。先に論じた、これらの及び他の標的抗原へ結合する抗体は、自己免疫疾患または免疫機能不全疾患を治療するために使用され得る。免疫複合体を用いて治療され得る自己免疫疾患には、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、抗好中球細胞質抗体関連血管炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形紅斑、ＩｇＡ腎炎、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞動脈炎／多発筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬または線維化胞隔炎が含まれ得る。
【０１８６】
当業者は、抗体または抗体フラグメントへ結合したカンプトテシンを含む主題の免疫複合体が単独で、または二次抗体、二次抗体フラグメント、二次免疫複合体、放射性核種、毒素、薬剤、化学療法薬、放射線療法、ケモカイン、サイトカイン、免疫調節薬、酵素、ホルモン、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡなどの１つ以上の他の治療薬との組み合わせで使用され得ることを理解するであろう。このような追加的な治療薬は、別個に、主題の抗体−薬剤免疫複合体との組み合わせで、または当該複合体へ結合させて投与され得る。
【０１８７】
ある特定の実施形態において、本発明のカンプトテシン複合体と併用される治療薬は、１つ以上の同位体を含み得る。罹患した組織を治療するのに有用な放射性同位体には、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２２７Ｔｈ及び２１１Ｐｂが含まれるが、これらに限定しない。治療用放射性核種は好ましくは、２０〜６０００ｋｅＶの範囲で、好ましくはオージェ放射体については６０〜２００ｋｅＶ、β放射体については１００〜２５００ｋｅＶ、及びα放射体については４０００〜６０００ｋｅＶの範囲で壊変エネルギーを有する。有用なβ粒子放射型核種の最大壊変エネルギーは好ましくは２０〜５０００ｋｅＶ、より好ましくは１００〜４０００ｋｅＶ、及び最も好ましくは５００〜２５００ｋｅＶである。オージェ放射粒子で実質的に壊変する放射性核種も好ましい。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、Ｉ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍ及びＩｒ−１９２である。有用なβ粒子放射型核種の壊変エネルギーは好ましくは、１０００ｋｅＶ未満、より好ましくは１００ｋｅＶ未満、及び最も好ましくは７０ｋｅＶ未満である。α粒子の生成で実質的に壊変する放射性核種も好ましい。このような放射性核種にはＤｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３、Ｔｈ−２２７及びＦｍ−２５５が含まれるが、これらに限定しない。有用なα粒子放射型放射性核種の壊変エネルギーは好ましくは２０００〜１００００ｋｅＶ、より好ましくは３０００〜８０００ｋｅＶ、及び最も好ましくは４０００〜７０００ｋｅＶである。可能性のある有用な追加的な放射性核種には、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、１６９Ｙｂ及びこれらに類するものが含まれる。
【０１８８】
放射性核種及び他の金属は、例えば抗体または複合体へ結合したキレート基を用いて送達され得る。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、及びＴＥＴＡなどの大環状キレート剤は、種々の金属及び放射性金属、最も特別にはガリウム、イットリウム及び銅の放射性核種とそれぞれ使用される。このような金属−キレート剤複合体は、関心対象の金属へ環の大きさを合わせることによって非常に安定にすることができる。複合体形成する２２３Ｒａのための大環状ポリエーテルなどの他の環型キレート剤を使用してもよい。
【０１８９】
本明細書で説明するカンプトテシン複合体と併用する治療薬にはまた、例えば、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロトキシン、タキサン、代謝拮抗薬、チロシンキナーゼ阻害薬、アルキル化薬、抗生物質、Ｃｏｘ−２阻害薬、有糸分裂阻害薬、血管新生阻害薬及びアポトーシス促進薬などの化学療法薬、特にドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、他のカンプトテシン、ならびにこれら及び他のクラスの抗癌薬に由来する他の物質、ならびにそれらに類するものが含まれる。他の癌化学療法薬には、窒素マスタード、アルキルスルホン酸塩、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位錯体、ホルモン、及びこれらに類するものが含まれる。適切な化学療法薬は、レミントンの医薬の科学（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ），第１９版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９５）において、及びグッドマン及びギルマンの治療薬の薬理学的基礎（ＧＯＯＤＭＡＮ  ＡＮＤ  ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ），第７版（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９８５）において、ならびにこれらの刊行物の改訂版において説明されている。実験薬など、他の適切な化学療法薬は、当業者に公知である。
【０１９０】
使用する例示的な薬剤には、５−フルオロウラシル、アファチニブ、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、アキシチニブ、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリチアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ−２阻害薬、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダサチニブ、ジナシクリブ、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノ−モルフォリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エルロチニブ、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エルロチニブ、エンチノスタット、エストロゲン受容体結合薬、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、エトポシドホスファート、エキセメスタン、フィンゴリモド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質転移酵素阻害薬、フラボピリドール、ホスタマチニブ、ガネテスピブ、ＧＤＣ−０８３４、ＧＳ−１１０１、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イブルチニブ、イダルビシン、イデラリシブ、イフォスファミド、イマチニブ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラパチニブ、レノリダミド、ロイコボリン、ＬＦＭ−Ａ１３、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、オラパリブ、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ＰＣＩ−３２７６５、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、タモキシフェン、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態）、トランスプラチナム（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、バタラニブ、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド及びＺＤ１８３９が含まれるが、これらに限定しない。このような薬剤は、本明細書で説明する複合体の一部で有り得、またはそれに代わるものとして、説明した複合体との組み合わせで、複合体の前に、同時にまたは後にのいずれかで投与され得る。あるいは、当該技術分野で公知のような１つ以上の治療用の裸の抗体は、説明した複合体と併用され得る。例示的な治療用の裸の抗体は、先に説明している。
【０１９１】
カンプトテシン複合体とともに使用され得る治療薬はまた、標的化部分へ結合した毒素を含み得る。この点において使用され得る毒素には、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、及びシュードモナス内毒素が含まれる（例えば、Ｐａｓｔａｎら，Ｃｅｌｌ（１９８６），４７：６４１，ならびにＳｈａｒｋｅｙ及びＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．２００６年７〜８月号；５６（４)：２２６〜２４３を参照されたい）。本明細書で使用に適した追加的な毒素は、当業者に公知であり、及び米国特許第６，０７７，４９９号に開示されている。
【０１９２】
さらに別のクラスの治療薬は、１つ以上の免疫調節薬を含み得る。使用する免疫調節薬は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン及びこれらの組み合わせから選択され得る。特に有用なのは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのリンホトキシン、インターロイキン（ＩＬ）などの造血因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子、インターフェロンα、β、γまたはλなどのインターフェロン、及び「Ｓ１因子」と呼ばれるものなどの幹細胞増殖因子である。サイトカインに含まれるのは、ヒト増殖ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト増殖ホルモン、及びウシ増殖ホルモンなどの増殖ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン、肝増殖因子、プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、腫瘍壊死因子α及びβ、ミュラー管抑制因子、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＮＧＦ−βなどの神経増殖因子、血小板増殖因子、ＴＧＦα及びＴＧＦβなどのトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、インスリン様増殖因子Ｉ型及びＩＩ型、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロンα、β、γ及びλなどのインターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）など）、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＬＩＦ、キット−リガンドまたはＦＬＴ−３などのＩＬ、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子ならびにリンホトキシン（ＬＴ）である。本明細書で使用する場合、サイトカインという用語には、天然源由来のタンパク質、または組換え細胞培養物及び天然配列のサイトカインの生物活性のある等価物由来のタンパク質が含まれる。
【０１９３】
使用するケモカインには、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−β及びＩＰ−１０が含まれる。
【０１９４】
（製剤及び投与）
複合体の適切な投与経路には、経口投与、非経口投与、直腸投与、経粘膜投与、小腸投与、髄内注射、髄腔内注射、直接的脳室内注射、静脈内注射または腹腔内注射が含まれるが、これらに限定しない。好ましい投与経路は非経口である。あるいは、当該化合物を全身性様式よりもむしろ局所性様式で、例えば、当該化合物の固形腫瘍への直接的な注射することを介して投与してもよい。
【０１９５】
免疫複合体は、医薬として有用な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤することができ、それにより免疫複合体は、医薬として適切な賦形剤との混合で組み合わされる。滅菌リン酸緩衝塩類溶液は、医薬として適した賦形剤の一例である。他の適切な賦形剤は、当業者に周知である。例えば、Ａｎｓｅｌら，医薬剤形及び薬剤送達システム（ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，第５版（Ｌｅａ及びＦｅｂｉｇｅｒ  １９９０）ならびにＧｅｎｎａｒｏ（編），レミントンの医薬科学（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，第１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）ならびにこれらの改訂版を参照されたい。
【０１９６】
好ましい実施形態において、免疫複合体は、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、３−（Ｎ−モルフォリニル）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、及びピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）［Ｐｉｐｅｓ］からなる群から選択される緩衝液を用いて、グッドの生物学的緩衝液（ｐＨ６〜７）中に製剤化される。より好ましい緩衝液は、ＭＥＳまたはＭＯＰＳであり、好ましくは２０〜１００ｍＭの濃度範囲、より好ましくは約２５ｍＭである。最も好ましいのは、ｐＨ６．５の２５ｍＭ  ＭＥＳである。製剤はさらに、２５ｍＭトレハロース及び賦形剤として０．０１％（ｖ／ｖ）ポリソルベート８０を含んでもよく、添加される賦形剤の結果として、最終的な緩衝液濃度は２２．２５ｍＭへ修正される。好ましい保存方法は、複合体の凍結乾燥した製剤として、−２０℃〜２℃の温度範囲で、最も好ましくは２℃〜８℃で保存される。
【０１９７】
免疫複合体は、例えばボーラス注射、緩徐な注入または持続的な注入を介した静脈内投与のために製剤化することができる。好ましくは、本発明の抗体は、約４時間未満の期間にわたって、より好ましくは約３時間未満の期間にわたって注入される。例えば、最初の２５〜５０ｍｇは３０分以内で、好ましくは１５分でさえ注入され得、残余は、次の２〜３時間にわたって注入される。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、アンプルでまたは複数回用量の容器で、保存料を添加して提供することができる。組成物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションのような形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤及び／または分散剤のような製剤に関する薬剤を含有することができる。あるいは、有効成分は、適切なビヒクル、例えば、発熱物質非含有滅菌水を用いた使用前の構成のために粉末状であることができる。
【０１９８】
追加的な医薬法は、治療用複合体の作用の持続時間を制御するために採用され得る。徐放性調製物は、免疫複合体を形成または吸収するための重合体の使用を通じて調製することができる。例えば、生体適合性重合体には、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）のマトリックスならびにステアリン酸二量体及びセバシン酸からなるポリ無水物共重合体のマトリックスが含まれる（Ｓｈｅｒｗｏｏｄら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４４６（１９９２））。このようなマトリックスからの免疫複合体の放出速度は、免疫複合体の分子量、マトリックス内での免疫複合体の量、及び分散した粒子の大きさによる（Ｓａｌｔｚｍａｎら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５５：１６３（１９８９）、Ｓｈｅｒｗｏｏｄら，上述）。他の固体剤形は、Ａｎｓｅｌら，医薬剤形及び薬剤送達システム（ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ），第５版（Ｌｅａ及びＦｅｂｉｇｅｒ  １９９０）、及びＧｅｎｎａｒｏ（編），レミントンの医薬科学（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ），第１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）、ならびにこれらの改訂版において説明される。
【０１９９】
概して、ヒトに投与する免疫複合体の薬用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身の健康状態及び先行する病歴のような因子に応じて変化する。単回静脈内注入として約１ｍｇ／ｋｇ〜２４ｍｇ／ｋｇの範囲にある薬用量の免疫複合体を受け手に提供することが望ましくあり得るが、より少量またはより多量の薬用量も、状況が必要とするように投与してもよい。例えば、７０ｋｇの患者に対する１〜２０ｍｇ／ｋｇの薬用量は、１．７ｍの患者に対して７０〜１４００ｍｇまたは４１〜８２４ｍｇ／ｍ２である。薬用量は、必要に応じて、例えば、週１回を４〜１０週間、週１回を８週間、または週１回を４週間反復してもよい。また、維持療法において必要に応じて、隔週で数か月間、または毎月もしくは毎４半期で多くの月数など、比較的低頻度で付与してもよい。好ましい薬用量には、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ及び２４ｍｇ／ｋｇが含まれ得るが、これらに限定しない。１〜２４ｍｇ／ｋｇの範囲のいずれかの量を使用してもよい。薬用量は好ましくは、週１回または週２回で複数回投与される。４週間、より好ましくは８週間、より好ましくは１６週間またはそれより長い最短投薬計画を使用してもよい。投与計画は、（ｉ）毎週、（ｉｉ）隔週、（ｉｉｉ）１週間の療法後の２、３または４週間の休薬、（ｉｖ）２週間の療法後の１、２、３または４週間の休薬、（ｖ）３週間の療法後の１、２、３、４または５週間の休薬、（ｖｉ）４週間の療法後の１、２、３、４または５週間の休薬、（ｖｉｉ）５週間の療法後の１、２、３、４または５週間の休薬、及び（ｖｉｉｉ）毎月からなる群から選択される周期で、週１回または２回の投与を含んでもよい。当該周期は、４、６、８、１０、１２、１６または２０回あるいはそれより多く反復してもよい。
【０２００】
あるいは、免疫複合体は、２週間ごとまたは３週間ごとに１回として投与して、合計少なくとも３回反復してもよい。または、週２回を４〜６週間である。薬用量をおよそ２００〜３００ｍｇ／ｍ２まで下げる場合（１．７ｍの患者に対して１回あたり３４０ｍｇまたは７０ｋｇの患者に対して４．９ｍｇ／ｋｇ）、週１回またはさらには週２回を４〜１０週間投与してもよい。あるいは、投薬計画は減らしてもよく、すなわち、２週間ごとまたは３週間ごとを２〜３か月間としてもよい。しかしながら、１２ｍｇ／ｋｇを毎週または２〜３週間ごとに１回のようなさらにより多量の用量は、反復した投薬周期で緩徐な静脈内注入によって投与することができることはすでに決定されている。投薬計画は場合により、他の間隔で反復することができ、投薬は、種々の非経口経路を通じて、用量及び計画の適切な調整を用いて付与され得る。
【０２０１】
好ましい実施形態において、免疫複合体は、癌の療法に有用である。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、神経膠芽腫、黒色腫、肉腫、及び白血病、骨髄腫、またはリンパ系腫瘍が挙げられるが、これらに限定しない。このような癌のより詳細な例は以下に記載しており、扁平細胞癌（例えば、扁平上皮細胞癌）、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、星状細胞腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺扁平癌腫を含む肺癌、腹膜癌、消化管癌を含む胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、膵癌、多形膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌、肝細胞癌腫、神経内分泌腫瘍、甲状腺髄様癌、分化型甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎（ｋｉｄｎｅｙ）癌または腎（ｒｅｎａｌ）癌、前立腺癌、外陰癌、肛門癌、陰茎癌、及び頭頸部癌が含まれる。「癌」という用語には、一次悪性細胞または一次悪性腫瘍（例えば、元の悪性部位または腫瘍部位以外の対象者の身体における部位へ細胞が移動していない腫瘍）及び二次悪性細胞または二次悪性腫瘍（例えば、元の腫瘍の部位とは異なる二次的な部位への悪性細胞または腫瘍細胞の移動である転移から生じる腫瘍）が含まれる。
【０２０２】
癌または悪性腫瘍の他の例としては、急性小児リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝癌、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝癌、成人軟組織肉腫、エイズ関連リンパ腫、エイズ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂尿管癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、小児（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝癌、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部視路膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体テント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児原発性肝癌、小児横紋筋肉腫、小児軟組織肉腫、小児視路視床下部膠腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、膵内分泌腺島細胞癌、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫及び関連腫瘍、膵外分泌腺癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド、消化管腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、有毛細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼内黒色腫、島細胞癌、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎癌、喉頭癌、口唇癌及び口腔癌、肝癌、肺癌、リンパ増殖性疾患、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性潜伏性原発性頸部扁平上皮癌（Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｏｃｃｕｌｔ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｎｅｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ）、転移性原発性頸部扁平上皮癌（Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｎｅｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ）、転移性頸部扁平上皮癌（Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｎｅｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ）、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／血漿細胞新生物、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄性白血病、骨髄増殖性疾患、鼻腔癌及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、潜伏性原発性転移性頸部扁平上皮癌（Ｏｃｃｕｌｔ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｎｅｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ）、中咽頭癌、骨線維性／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵癌、パラプロテイン血症、真性多血症、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉腫、頸部扁平上皮癌（Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｎｅｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ）、胃癌、テント上原始神経外胚葉性松��体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂尿管移行上皮癌、移行性腎盂尿管癌、絨毛性腫瘍、尿管腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視路視床下部神経膠腫、外陰癌、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、ならびに先に列挙した器官系に位置する、新生物に加えていずれかの他の過剰増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定しない。
【０２０３】
本明細書で説明及び請求する方法及び組成物は、悪性容態または前悪性容態を治療するために、及び先に説明した障害を含むがこれらに限定しない新生物状態または悪性状態への進行を予防するために使用され得る。このような使用は、特に、過形成、化生、または最も詳細には異形成からなる非新生物性細胞増殖が生じた新生物または癌への進行に先行することがわかっているまたは疑われる容態において示されている（このような異常な増殖容態に関する総説については、Ｒｏｂｂｉｎｓ及びＡｎｇｅｌｌ，基礎病理学（Ｂａｓｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ），第２版，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，フィラデルフィア市，６８〜７９頁（１９７６）を参照されたい）。
【０２０４】
異形成は、しばしば癌の前兆であり、主として上皮に認められる。異形成は、個々の細胞の均一性の喪失及び細胞の構築配向の喪失を包含する非新生物細胞増殖の最も無秩序な形態である。異形成の特徴としては、慢性的な刺激作用または炎症が存在する箇所で生じる。治療することのできる異形成障害には、無汗性外胚葉形成不全症、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房・指異形成（ａｔｒｉｏｄｉｇｉｔａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、気管支肺異形成、大脳異形成、子宮頸部異形成、軟骨外胚葉異形成、鎖骨頭蓋形成不全、先天性外胚葉形成不全、頭蓋骨幹異形成、頭蓋手根足根骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉形成不全、エナメル質形成不全、脳眼形成不全、片肢性骨端骨異形成、多発性骨端異形成、点状骨端異形成、上皮性異形成、顔面指趾生殖器異形成、家族性線維性顎異形成、家族性白色襞性異形成、線維筋異形成、線維性骨異形成症、開花性骨異形成（ｆｌｏｒｉｄ  ｏｓｓｅｏｕｓ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、遺伝性腎網膜異形成、発汗性外胚葉異形成、無汗性外胚葉異形成、リンパ性減少性胸腺異形成、乳房形成異常、下顎顔面異形成、骨幹端異形成、モンディーニ型内耳異形成、単骨性線維性骨異形成症、粘膜上皮異形成、多発性骨端異形成症、眼耳脊椎異形成症、眼歯指異形成症、眼脊椎異形成、歯牙異形成、眼下顎異形成（ｏｐｔｈａｌｍｏｍａｎｄｉｂｕｌｏｍｅｌｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、根尖性セメント質異形成、多骨性線維性骨異形成、偽軟骨発育不全性脊椎骨端異形成（ｐｓｅｕｄｏａｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｔｉｃ  ｓｐｏｎｄｙｌｏｅｐｉｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、網膜形成不全、中隔視神経異形成、脊椎骨端異形成症（ｓｐｏｎｄｙｌｏｅｐｉｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、及び心室橈骨異形成が含まれるが、これらに限定しない。
【０２０５】
治療することのできる追加的な新生物発生前障害には、良性増殖不全障害（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性容態、組織肥大、腸ポリープまたは腺腫、及び食道異形成）、白斑病、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、太陽性口唇炎、及び太陽性角化症が含まれるが、これらに限定しない。
【０２０６】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、癌、特に先に列挙した癌の発達、進行及び／または転移を抑制するために使用する。
【０２０７】
追加的な過剰増殖性疾患、障害及び／または容態には、悪性腫瘍ならびに、白血病（急性白血病、例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病を含む）及び慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ性白血病）を含む）、真性多血症、リンパ腫（例えば、ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、重鎖病、ならびに線維性肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫（ｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、聴神経腫瘍、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、及び網膜芽細胞腫のような肉腫及び癌腫を含むがこれらに限定しない固形腫瘍のような関連障害の進行及び／または転移を含むが、それらに限定しない。
【０２０８】
免疫複合体を用いて治療され得る自己免疫疾患には、急性及び慢性免疫性血小板減少症、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、抗好中球細胞質抗体関連血管炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形紅斑、ＩｇＡ腎炎、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞動脈炎／多発筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬または線維化胞隔炎が含まれ得る。
【０２０９】
（キット）
種々の実施形態は、患者における罹患した組織を治療するのに適した成分を含有するキットに関し得る。例示的なキットは、本明細書に説明する少なくとも１つの結合した抗体または他の標的化部分を含有し得る。投与のための成分を含有する組成物が経口送達などによる消化管を介した送達のために製剤化していない場合、何らかの他の経路を通じてキットの構成要素を送達できる装置が含まれ得る。非経口送達などの適用のためのある種類の装置は、対象の体内へ組成物を注射するために使用する注射器である。吸入装置も使用され得る。
【０２１０】
キットの構成要素は、一緒に包装され得、または２つ以上の容器へと分離され得る。いくつかの実施形態において、容器は、再構成に適した組成物の滅菌済みの凍結乾燥した製剤を含有するバイアルであり得る。キットはまた、他の試薬の再構成及び／または希釈に適した１つ以上の緩衝液を含有し得る。使用され得る他の容器には、パウチ、トレイ、ボックス、チューブ、またはこれらに類するものが含まれるが、それらに限定しない。キットの成分は、容器内で滅菌的に包装及び維持され得る。含むことのできる別の構成要素は、キットの使用のためにキットを用いる者への説明書である。
【実施例】
【０２１１】
本発明の種々の実施形態は、本発明の範囲を制限することなく、以下の実施例によって説明される。
【０２１２】
（概要）
以下に使用する略語は、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）、ＥＥＤＱ（２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン）、ＭＭＴ（モノメトキシトリチル）、ＰＡＢＯＨ（ｐ−アミノベンジルアルコール）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＳＭＣＣ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル）、ＴＢＡＦ（フッ化テトラブチルアンモニウム）、ＴＢＤＭＳ（塩化ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）である。
【０２１３】
以下の実施例におけるヒドロキシ化合物のクロロギ酸塩は、参照により組み込まれるＭｏｏｎら（Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．５１：６９１６〜６９２６，２００８）において説明される手順に従って、トリホスゲン及びＤＭＡＰを用いて調製した。抽出作業は、クロロホルム、ジクロロメタンまたは酢酸エチルを用いた抽出ならびに任意で飽和重炭酸塩、水を用いた、及び飽和塩化ナトリウムを用いた洗浄を指す。フラッシュクロマトグラフィーは、別段の記載がない限り、最高１５％（ｖ／ｖ）メタノール−ジクロロメタンを用いる、２３０〜４００メッシュシリカゲル及びメタノール−ジクロロメタン勾配を用いて実施した。逆相ＨＰＬＣは、プレカラムフィルタを装着した７．８×３００ｍｍのＣ１８  ＨＰＬＣカラムを用い、かつ１分間当たり３ｍｌの流量で１００％溶媒Ａから１００％溶媒Ｂへの１０分間の溶媒勾配を用い、かつ１分間当たり４．５ｍｌの流量で１００％溶媒Ｂを５分間または１０分間維持する方法Ａによって、あるいはプレカラムフィルタを装着した４．６×３０ｍｍのＸｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８、２．５μｍカラムを用い、１分間当たり１．５ｍｌの流量で１００％の溶媒Ａから１００％の溶媒Ｂへの４分間の溶媒勾配及び１分間当たり２ｍｌの流量で１分間の１００％の溶媒Ｂを用いる方法Ｂによって実施した。溶媒Ａは０．３％酢酸アンモニウム水溶液、ｐＨ４．４６であるのに対し、溶媒Ｂは９：１のアセトニトリル−酢酸アンモニウム水溶液（０．３％）、ｐＨ４．４６であった。ＨＰＬＣは、３６０ｎｍ及び２５４ｎｍで設定した二重インライン吸光度検出器によってモニターした。
【０２１４】
（実施例１：ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の調製）
大規模製造のための改良された方法に関する、以下の工程を含むＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の合成について好ましい反応スキームを図１に示す。
【０２１５】
（Ｏ−（２−アジドエチル）−Ｏ’−［（Ｎ−ジグリコリル−２−アミノエチル）−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ］ヘプタエチレングリコール（中間体３、図１）の調製）
５００ｍｌの単口フラスコに市販のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＯＨ（１６ｇ）、ｐ−アミノベンジルアルコール（３．２６ｇ）及びＥＥＤＱ（６．５２ｇ）を入れた後、無水ジクロロメタン（８０ｍｌ）を添加した。一晩攪拌した後に、ジエチルアミン（２５ｍｌ）を添加し、さらに６時間の後、反応混合物を約５０ｍｌの容積まで濃縮した。これをヘプタンで希釈し、溶液を５０ｍｌまで再度濃縮した。ヘプタン（各５０ｍｌ）を用いた２回の追加的なチェイスは、底部にガム状の物質を含有する二相性の混合物を提供した。ガム状の物質をジクロロメタン（２４ｍｌ）に取り、攪拌し、ヘプタン（８０ｍｌ）の緩徐な添加へと処理した。１時間の攪拌後、スラリーを濾過して１３．０２ｇ（９９．６％収率）のＬｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ（図１の中間体２）を得た。残留ジエチルアミンが存在することが判った場合、この物質をさらにクロマトグラフィーによって任意精製した。Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ（１１．５１ｇ）を無水ジクロロメタン（９０ｍｌ）中のＯ−（２−アジドエチル）−Ｏ’−（Ｎ−ジグリコリル−２−アミノエチル）ヘプタエチレングリコール（ＰＥＧ−Ｎ３、１２．１０７ｇ）の溶液と混合した。この攪拌した溶液へ、ＥＥＤＱ（５．５４ｇ）を添加した。約１８時間の後、反応混合物を濃縮して、酢酸エチル−メタノール勾配溶出を用いたシリカゲル上でのクロマトグラフィーによって精製し、純粋な表題生成物（図１の中間体３）を得た。
【０２１６】
（ＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８（図１の中間体４）の調製）
調製は、溶媒としてジメチルホルムアミドの代わりにジクロロメタンの使用により改変され、より容易な後処理が可能となった。無水ジクロロメタン（１６０ｍｌ）中のジイソプロピルエチルアミン（３６．６ｇ）の溶液をＳＮ−３８（３３ｇ）へ添加した。懸濁液を氷水浴中で冷却し（ｃｏｌｌｅｄ）、攪拌した。この攪拌した溶液へ、ジクロロメタン（１２５ｍｌ）中の塩化ｔｅｒ−ブチルジメチルシリル（３１．７２ｇ）の溶液を添加した。冷浴を除去し、反応混合物を４時間攪拌した。透明な反応混合物を３８０ｍｌの１０％塩化ナトリウム溶液中の０．２Ｍ  ＨＣｌを３８０ｍｌ、及び１０％塩化ナトリウム溶液を３００ｍｌ用いて洗浄した。乾燥及び溶媒除去後の生成物を酢酸エチル−ヘプタンから沈殿させて、３８．７５ｇ（９１％収率）のＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８を得た。
【０２１７】
（１０−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８−２０−Ｏ−クロロギ酸（図１の反応中間体５）の生成及びＯ−（２−アジドエチル）−Ｏ’−［（Ｎ−ジグリコリル−２−アミノエチル）−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＣＯ−２０−Ｏ−ＳＮ−３８］ヘプタエチレングリコール（図１の中間体７）の調製）
必要量のトリホスゲンのボーラス添加からの大量の発熱を避けるため、改良した方法を、無水ジクロロメタン（４ｍｌ）中のトリホスゲン（０．２４ｇ）の溶液を３０分間にわたって、ジクロロメタン（１７ｍｌ）における０．９４ｇのＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８及びＤＭＡＰ（０．７６ｇ）の攪拌した混合物へ添加することによって発明した。このことは結果的に、無水エタノールで急冷した、急冷した一定分量の反応混合物のＨＰＬＣ分析によって測定されるように、反応中間体（図１の５）への９８．５％の変換を生じた。未反応のＳＮ−３８を用いた初期に形成されたクロロギ酸の急冷による二量体物質の形成の証拠がないまま、必要な生成物の透明な形成がしたがって保証された。ボーラス添加が結果的に５．８℃から１７．６℃への多量の発熱を生じたが、反応の質を損なうことのないまま、緩徐な添加は内部温度を常時１０℃未満に維持した。同じアプローチは、２５０ｍｌの無水ジクロロメタン中の１１．２５ｇ（２２．２ｍｍｏｌ）のＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８を用いて、及び先に小規模反応について説明した通りに比例して他の試薬を用いて反復した。１５分後、ジクロロメタン（１２５ｍｌ）中の２５．０１ｇのＯ−（２−アジドエチル）−Ｏ’−［（Ｎ−ジグリコリル−２−アミノエチル）−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ］ヘプタエチレングリコール（図１の中間体３）の溶液を８分間にわたって添加した。７５分後、反応混合物を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．３）、水、及び鹹水を用いて連続して洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。次に、生成物の溶液を、テトラヒドロフラン（３１ｍｌ）、無水ジクロロメタン（３４ｍｌ）及び酢酸（３ｍｌ）中の１Ｍフッ化テトラブチルアンモニウムの混合物とともに攪拌した。２時間後、反応混合物を０．２５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６）、水、及び鹹水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。メタノール−塩化メチレン混合物による勾配溶出を用いるシリカゲル上でのクロマトグラフィーは、１７．３ｇ（５２％収率）の表題生成物（図１の中間体７）を供給した。
【０２１８】
（ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（図１）の調製）
無水ジクロロメタン（１３０ｍｌ）中のＯ−（２−アジドエチル）−Ｏ’−［（Ｎ−ジグリコリル−２−アミノエチル）−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＣＯ−２０−Ｏ−ＳＮ−３８］ヘプタエチレングリコール（図１の中間体７、１０．２ｇ）を４−（Ｎ−マレイミドメチル）−Ｎ−（２−プロピニル）シクロヘキサン−１−カルボキサミド（図１の中間体８（「ＭＣＣ−ｙｎｅ」）、３．７８ｇ）と混合した。これに、ジクロロメタン（１００ｍｌ）中のトリフェニルホスフィン（０．３８ｇ）、臭化銅（０．２４ｇ）、及びジイソプロピルエチルアミン（０．２５ｍｌ）の混合物を添加した。反応混合物を大気室温で１４時間攪拌した。この材料をクロマトグラフィーによって濃縮及び精製し、純粋な生成物溶液をＥＤＴＡ、水、及び鹹水で洗浄した。生成物Ｏ−｛２−［（１，２，３−トリアゾリル）−４−［４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキサミドメチル］］エチル｝−Ｏ’−［（Ｎ−ジグリコリル−２−アミノエチル）−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＣＯ−２０−Ｏ−ＳＮ−３８］ヘプタエチレングリコール（図１の中間体９）は、１０．８ｇ（８９％収率）の量で得、これは、先に得た６７％の最大収率よりも良好であった。この修正された手順は、反応時間の短縮（１４時間対１８〜４１時間）のため、収率を改善し、また、最初にクロマトグラフィーを、その後ＥＤＴＡ抽出を実施することによって、中間体９を用いたすでに遭遇していた安定性問題を回避した。ジクロロメタン中の生成物溶液をアニソール（２．８ｇ）と混合し、５℃未満まで冷却し、ジクロロ酢酸（５．８ｇ）と２時間反応させた。最終生成物ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、８１％の（２工程における）全体収率で、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルから沈殿した。
【０２１９】
（実施例２．ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の抗体への結合）
抗ＣＥＡＣＡＭ５ヒト化ＭＡｂであるｈＭＮ−１４、抗ＣＤ２２ヒト化ＭＡｂであるｈＬＬ２、抗ＣＤ２０ヒト化ＭＡｂであるｈＡ２０、抗ＥＧＰ−１ヒト化ＭＡｂである、ｈＲＳ７、及び抗ムチンヒト化ＭＡｂであるｈＰＡＭ４をこれらの研究に使用した。各抗体を７〜７．４の範囲のｐＨのリン酸緩衝液中のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いて緩徐に還元し、このｐＨを６．５へ調整し、共溶媒として５〜１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを用いて大気温度で２０分間インキュベートして、約１０倍モル過剰量のＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と反応させた。いかなる過剰量のチオールも抗体に関して１０倍モル過剰量で水溶液として使用するＮ−エチルマレイミドを用いてキャッピングした。
【０２２０】
複合体は、２０〜３０透析濾過容積の最終的な形成緩衝液（２５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．５）を用いた、接線フロー濾過（ＴＦＦ）によって精製した。この方法は、サイズ排除カラム及び疎水性カラムにおける厄介な連続精製を回避し、それにより、何百グラムもの複合体を容易な様式で精製することができる。この生成物をＳＮ−３８について、３６６ｎｍでの吸光度及び標準値との相関づけによってアッセイした。タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸光度から推定し、この波長でのＳＮ−３８の過剰量の吸光度を補正した。これらから、ＳＭ−３８／ＭＡｂ置換比（ＤＡＲ）を決定した。精製した複合体は、ガラスバイアル中で凍結乾燥した製剤として保存し、真空下で栓をし、−２０℃の冷凍庫で保管した。典型的には５〜７の範囲にあったこれらの複合体のうちのいくつかについて得られたＤＡＲは表６に示す。
表６：いくつかの複合体におけるＳＮ−３８／ＭＡｂ薬／ＭＡｂ比（ＤＡＲ）
【表６】
0006427789.tif 000010
【０２２１】
（実施例３．ヒト膵癌または結腸癌の前臨床モデルにおけるインビボでの治療効能）
ヒト膵腫瘍または結腸腫瘍異種移植片を皮下に有する免疫欠損無胸腺雌ヌードマウスを特異的ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体または対照複合体のいずれかで処置し、あるいは未処置のままにしておいた。特異的複合体の治療効能が観察された。図２は、Ｃａｐａｎ１膵腫瘍モデルを示しており、ここで、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ−１）抗体、ｈＰＡＭ４（抗ムチン）抗体、及びｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）抗体の特異的ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体は、対照ｈＡ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体（抗ＣＤ２０）及び未処置の対照と比較して良好な効能を示した。同様に、ヒト膵癌のＢＸＰＣ３モデルにおいて、特異的ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、対照処置よりも良好な治療効能を示した（図３）。同様に、ヒト結腸癌の侵攻性ＬＳ１７４Ｔモデルにおいて、特異的ｈＭＮ−１４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いた処置は、未処置と比べてより有効であった（図４）。
【０２２２】
（実施例４．多様な上皮癌の有効な治療のためのヒト化抗ＴＲＯＰ−２ＩｇＧ−ＳＮ−３８複合体の使用）
本研究の目的は、いくつかのヒト固形腫瘍の種類に対するＳＮ−３８−抗ＴＲＯＰ−２抗体−薬剤複合体（ＡＤＣ）の効能を査定し、マウス及びサルにおける当該ＡＤＣの耐用性を評価することであり、サルは、ヒトと同様のｈＲＳ７に対する組織交差反応性を有していた。２つのＳＮ−３８誘導体であるＣＬ２−ＳＮ−３８（米国特許第７，５９１，９９４号を参照されたい）及びＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を抗ＴＲＯＰ−２ヒト化抗体ｈＲＳ７へ結合させた。この免疫複合体を安定性、結合性及び細胞毒性についてインビトロで特徴づけた。効能は、ＴＲＯＰ−２抗原を発現する５つの異なるヒト固形腫瘍異種移植片モデルにおいて検査した。毒性は、マウスにおいて及びカニクイザルにおいて評価した。
【０２２３】
２つのＳＮ−３８誘導体のｈＲＳ７複合体は、薬剤置換（約６）、細胞結合性（Ｋｄ約１．２ｎｍｏｌ／ｌ）、細胞毒性（ＩＣ５０約２．２ｎｍｏｌ／ｌ）、インビトロでの血清安定性（ｔ／１／２約２０時間）において等価であった。ＡＤＣへの細胞の曝露は、ＰＡＲＰ切断に至るシグナル伝達経路を実証したが、ｐ５３及びｐ２１の上方制御における遊離ＳＮ−３８に対する差がみられた。有意な抗腫瘍効果は、非標的化の対照ＡＤＣと比較して、Ｃａｌｕ−３（Ｐ≦０．０５）、Ｃａｐａｎ−１（Ｐ＜０．０１８）、ＢｘＰＣ−３（Ｐ＜０．００５）、及びＣＯＬＯ２０５（Ｐ＜０．０３３）の腫瘍を有するマウスにおいて非毒性用量のｈＲＳ７−ＳＮ−３８によって生じた。マウスは、２×１２ｍｇ／ｋｇ（ＳＮ−３８当量）の用量を許容したが、ＡＬＴ及びＡＳＴの肝臓酵素レベルの一時的な上昇しか伴わなかった。２×０．９６ｍｇ／ｋｇを注入したカニクイザルは、血球計数における一過性の減少しか呈さなかったが、重要なことに、この値は、正常範囲未満に低下しなかった。
【０２２４】
本発明者らは、抗ＴＲＯＰ−２ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８  ＡＤＣが、様々なヒト固形腫瘍種類に対して有意かつ特異的な抗腫瘍効果を提供したと結論付ける。抗ＴＲＯＰ−２ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８  ＡＤＣは、ヒトと類似の組織ＴＲＯＰ−２発現を有するサルにおいて十分に許容された（Ｃａｒｄｉｌｌｏら，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７〜３１６９）。
【０２２５】
固形腫瘍を罹患している患者に関して好結果のイリノテカン治療は、ＣＰＴ−１１プロドラッグから活性のあるＳＮ−３８代謝産物への低い変換率に大きく起因して、これまで制限されてきた。この変換についての必要性を回避し、及びＳＮ−３８を腫瘍へ受動的に送達する手段として、標的に向かわない形態のＳＮ−３８が調査されてきた。本発明者らは、ＳＮ−３８をヒト化抗ＴＲＯＰ−２抗体ｈＲＳ７へ共有結合させた。この抗体−薬剤複合体は、非小細胞肺癌、膵癌、結腸直腸癌、及び肺扁平上皮癌を含む様々な皮下のヒト癌異種移植片モデルにおいて、特異的な抗腫瘍効果を有している（例えば、≦３．２ｍｇ／ｋｇの累積的なＳＮ−３８当量）。
【０２２６】
ＴＲＯＰ−２は、多くの上皮癌において広範に発現するが、いくつかの正常組織においても発現し、それゆえ、カニクイザルにおける用量漸増研究を実施し、本複合体の臨床上の安全性を評価した。サルは、わずかな可逆的毒性しか持たずに２４ｍｇのＳＮ−３８当量／ｋｇを許容した。その腫瘍標的化及び安全性特性を考慮すると、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、イリノテカンに応答する固形腫瘍の管理における改善を提供し得る。
【０２２７】
ＧＡ７３３−１（胃抗原７３３−１）、ＥＧＰ−１（上皮糖タンパク質１型）、及びＴＡＣＳＴＤ２（腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質）としても公知のヒト栄養膜細胞表面抗原（ＴＲＯＰ−２）は、種々のヒト癌において発現し、より侵攻性の疾患と関連しているいくつかにおいては予後の有意性を有している（例えば、Ａｌｂｅｒｔｉら，１９９２，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １１：５３９〜５４５、Ｓｔｅｉｎら，１９９３，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５５：９３８〜９４６、Ｓｔｅｉｎら，１９９４，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．８：９８〜１０２を参照されたい）。ネズミＴＲＯＰ−２を用いてトランスフェクトしたマウス膵癌細胞株におけるＴＲＯＰ−２の機能的役割に関する研究は、低血清条件における高い増殖、多くの移動、及びインビトロでの高い固定非依存性増殖、ならびにインビボでの高いＫｉ−６７発現及び比較的高い転移の尤度の証拠を伴う高い増殖率を明らかにした（Ｃｕｂａｓら，２０１０，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ９：２５３）。
【０２２８】
多くの上皮癌におけるＴＲＯＰ−２抗原の分布によって、当該抗原は魅力的な治療標的とされる。Ｓｔｅｉｎおよび共同研究者ら（１９９３，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５５：９３８〜９４６）は、ＥＧＰ−１へ結合するＲＳ７−３Ｇ１１（ＲＳ７）と命名された抗体を特徴づけ、当該抗体は、多くの固形腫瘍において存在するが、当該抗原はまた、いくつかの正常組織において、より低強度でまたは制限された領域で発現していた。標的化効能及び治療効能は、放射性標識したＲＳ７を用いた多くのヒト腫瘍異種移植片において記載された（Ｓｈｉｈら，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：５８５７ｓ〜５８６３ｓ、Ｓｔｅｉｎら，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  ８０：２６３６〜２６４１、Ｇｏｖｉｎｄａｎら，２００４，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ８４：１７３〜１８２）が、この内部移行性抗体は、非結合形態では治療活性を示さなかった（Ｓｈｉｈら，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：５８５７ｓ〜５８６３ｓ）。しかしながら、インビトロでは、当該抗体はＴＲＯＰ−２陽性癌に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を実証した。
【０２２９】
本発明者らは、ＳＮ−３８のいくつかの誘導体、すなわちイリノテカンの有効成分であるトポイソメラーゼＩ型阻害薬またはＣＰＴ１１連結した抗ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＤ６６ｅ）ＩｇＧを用いた抗体−薬剤複合体（ＡＤＣ）の調製を報告した（Ｍｏｏｎら，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６〜６９２６、Ｇｏｖｉｎｄａｎら，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２〜６０６１）。当該誘導体は、インビトロでの血清安定性特性が変化し、インビボでの研究は、１つの形態（ＣＬ２と命名）が、いくぶん安定性のある他の系統よりもヒト結腸癌及び膵癌異種移植片の発達を予防または抑止する上でより有効であることが分かった。
【０２３０】
重要なことに、これらの効果は非毒性用量で生じ、初期の検査は、用量限定毒性を測定することに失敗した（Ｇｏｖｉｎｄａｎら，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２〜６０６１）。これらの結果は勇気づけられるが、また驚くべきでもあり、その理由は、ＣＥＡＣＡＭ５抗体がＡＤＣの成功に対して決定的であると考えられる特性である内部移行をしていないからである。本発明者らは、抗ＣＥＡＣＡＭ５−ＳＮ−３８複合体の治療活性が、抗体の局在後に腫瘍内でのＳＮ−３８の緩徐な放出と関連し得ると推測した。イリノテカンは、細胞がその増殖周期のＳ期の間に暴露される場合に最良に挙動するので、徐放性は応答を改善すると期待されている。実際、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはミセルのような非標的化血漿延長薬へ連結したＳＮ−３８は、イリノテカン単独またはＳＮ−３８単独を上回る改善された効能を示しており（例えば、Ｋｏｉｚｕｍｉら，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：１００４８〜１００５６）、この機序へ追加的な支持を与えている。
【０２３１】
ＲＳ７抗体の上皮癌との広範な反応性及び当該抗体の内部移行能を考慮すると、本発明者らは、ＲＳ７−ＳＮ−３８複合体が、当該薬剤の徐放性からだけでなく、直接的な細胞内送達からも利益を受け得ると仮説を立てた。それゆえ、本発明者らは、ネズミＲＳ７抗体のヒト化版（ｈＲＳ７）を用いてＳＮ−３８複合体の効能を調製及び検査した。ＳＮ−３８誘導体に対する改変がなされ（Ｇｏｖｉｎｄａｎら，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２〜６０６１）、インビトロでの安定性もインビボでの効能も変化させることなく、当該複合体の品質を改善した。この新たな誘導体（ＣＬ２Ａと命名）は現在、抗体へのＳＮ−３８のカップリングに好ましい薬剤である。本明細書では、本発明者らは、非毒性薬用量でヌードマウスに植え込んだいくつかの上皮癌細胞株におけるｈＲＳ７−ＳＮ−３８複合体の効能を示し、他の研究は、実質的により多量の用量を許容し得ることを明らかにした。より重要なことに、ヒトと類似の組織におけるＴＲＯＰ−２も発現するサルにおける毒性研究は、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８が、マウスにおける治療有効量よりも明らかに多量で許容されることを示し、本複合体が、広範な上皮癌を罹患している患者を治療するための有望な薬剤であるという証拠を提供した。
【０２３２】
（材料及び方法）
（細胞株、抗体、及び化学療法薬）
本研究において使用したヒト癌細胞株はすべて、米国培養細胞系統保存機関から購入した。これらには、Ｃａｌｕ−３（非小細胞肺癌）、ＳＫ−ＭＥＳ−１（肺扁平上皮癌）、ＣＯＬＯ２０５（結腸腺癌）、Ｃａｐａｎ−１及びＢｘＰＣ−３（膵腺癌）、ならびにＰＣ−３（前立腺癌）が含まれる。ヒト化ＲＳ７  ＩｇＧ及び対照のヒト化抗ＣＤ２０（ｈＡ２０  ＩｇＧ、ベルツズマブ）ならびに抗ＣＤ２２（ｈＬＬ２  ＩｇＧ、エプラツズマブ）の抗体は、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ社で調製した。イリノテカン（２０ｍｇ／ｍｌ）はＨｏｓｐｉｒａ社から得た。
【０２３３】
（ＳＮ−３８免疫複合体及びインビトロでの態様）
ＣＬ２−ＳＮ−３８の合成はすでに説明されている（Ｍｏｏｎら，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６〜６９２６；米国特許第７，５９１，９９４号も参照されたい）。ＣＬ２−ＳＮ−３８のｈＲＳ７  ＩｇＧへの結合及び血清安定性は、説明されている通り実施した（Ｍｏｏｎら，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６〜６９２６、Ｇｏｖｉｎｄａｎら，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２〜６０６１）。ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（分子量１４８０）及びそのｈＲＳ７複合体の調製、ならびに安定性、結合性、及び細胞毒性の研究は、すでに説明されている通りに実施した（Ｍｏｏｎら，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６〜６９２６）。細胞溶解液を調製し、ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ、ｐ５３、及びＰＡＲＰ（ポリ−ＡＤＰ−リボースポリメラーゼ）に対するイムノブロッティングを実施した。
【０２３４】
（インビボでの治療研究）
動物試験全体について、ＳＮ−３８免疫複合体及びイリノテカンの用量はＳＮ−３８当量において示す。６の平均ＳＮ−３８／ＩｇＧ置換比をもとに、２０ｇマウスへの５００μｇＡＤＣの用量（２５ｍｇ／ｋｇ）は、０．４ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８を含有している。イリノテカンの用量は同様に、ＳＮ−３８当量として示す（すなわち、４０ｍｇイリノテカン／ｋｇは、２４ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８と等価である）。４〜８週齢のＮＣｒ雌無胸腺ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス、及び１０週齢の雄スイス−ウェブスター系マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓから購入した。許容性試験は、ＳＮＢＬ  ＵＳＡ社によるカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）（２．５〜４ｋｇの雌雄のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））において実施した。動物に異なるヒト癌細胞株を皮下移植した。腫瘍体積（ＴＶ）は、カリパスを用いて２次元で測定することによって決定し、体積はＬ×ｗ２／２として定義し、式中Ｌは腫瘍の最長寸法であり、かつｗは最短である。腫瘍は、療法が開始したときには０．１０ｃｍ３と０．４７ｃｍ３の間の大きさに及んでいた。各実験における処置計画、薬用量、及び動物の個体数は、結果に説明する。凍結乾燥したｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８及び対照ＡＤＣを滅菌塩類溶液中で再構成し、必要に応じて希釈した。試薬はすべて腹腔内投与した（０．１ｍｌ）が、例外はイリノテカンであり、静脈内投与した。投薬計画は、本発明者らの先行研究に影響され、当該先行研究において、ＡＤＣは、４日ごとにまたは週２回、変動する時間長で与えた（Ｍｏｏｎら，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６〜６９２６、Ｇｏｖｉｎｄａｎら，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２〜６０６１）。この投薬頻度は、インビトロでの複合体の血清半減期の考慮を反映しており、ＡＤＣへのより持続的な曝露を許容した。
【０２３５】
（統計）
発達曲線は、初期ＴＶの継時的な％変化として決定した。腫瘍の発達に関する統計分析は、曲線下面積（ＡＵＣ）をもとにした。個々の腫瘍の発達の特性は、直線−曲線モデル化を通じて得た。ｆ検定を採用して、発達曲線の統計分析前の群間の分散の均一度を決定した。両側のｔ検定を用いて、種々の処置群と対照の間の統計的な有意性を評価したが、例外は塩類溶液対照であり、片側のｔ検定を用いた（ｐ≦０．０５での有意性）。ＡＵＣの統計比較は、群内の最初の動物が進行により安楽死する時までしか実施しなかった。
【０２３６】
（薬物動態及び体内分布）
１１１Ｉｎで放射性標識したｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８及びｈＲＳ７  ＩｇＧを、皮下にＳＫ−ＭＥＳ−１腫瘍（約０．３ｃｍ３）を有するヌードマウスへ注射した。１つの群には２０μＣｉ（２５０μｇタンパク質）の１１１Ｉｎ−ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を静脈内注射したのに対し、別の群は、２０μＣｉ（２５０μｇタンパク質）の１１１Ｉｎ−ｈＲＳ７  ＩｇＧを受容した。種々の時点で、マウス（時点当たり５匹）を麻酔し、心穿刺を介して採血し、次いで安楽死させた。腫瘍及び種々の組織を摘出し、秤量し、γシンチレーションによって計数して、組織１ｇあたりの％注射用量（％ＩＤ／ｇ）を測定した。第三の群は、２５０μｇの未標識ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を注射した３日後に１１１Ｉｎ−ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を投与し、同様に剖検した。ｆ検定を用いた分散の均一度を決定した後に、両側ｔ検定を用いてｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８及びｈＲＳ７  ＩｇＧの取り込みを比較した。血中クリアランスに関する薬物動態分析は、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェア（Ｐａｒｓｉｇｈｔ社）を用いて実施した。
【０２３７】
（スイス−ウェブスター系マウス及びカニクイザルにおける許容性）
簡潔には、マウスは、４群へ選別され、各々２ｍｌの酢酸ナトリウム緩衝液対照の腹腔内注射、または３つ異なる用量のｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（４、８、または１２ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８）を０日後及び３日後に受けた後、結果に説明する通り、血液及び血清を収集した。カニクイザル（２．５〜４．０ｋｇの３匹の雄及び３匹の雌）には、２つの異なる用量のｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を投与した。起こり得る血液学的毒性及び血清化学物質の評価のために採血したサルの薬用量、回数、及び個体数は結果に説明している。
【０２３８】
（結果）
（ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の安定性及び効力）
２つの異なる系統を用いて、ＳＮ−３８をｈＲＳ７  ＩｇＧへ結合させた。第一のものはＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と名付け、すでに説明されている（Ｍｏｏｎら，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６〜６９２６、Ｇｏｖｉｎｄａｎら，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２〜６０６１）。フェニルアラニン部分を除去するという点で、ＣＬ２リンカーの合成に対する変更がなされた。この変更で変更が簡素化されたが、結合結果に影響しなかった（例えば、ＣＬ２−ＳＮ−３８及びＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８には両方とも、ＩｇＧ分子当たり約６個のＳＮ−３８を組み込んだ）。配列比較で、血清安定性、抗原結合性またはインビトロでの細胞毒性における有意差は認められなかった（非表示）。
【０２３９】
ＣＬ２からＣＬ２ＡへのＳＮ−３８リンカーの変更は、インビボでの効力に影響しないことを確認するために、それぞれ０．４ｍｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８を週２回×４週間用いて、開始時の腫瘍は両試験において０．２５ｃｍ３の大きさで、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ及びｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８を、ＣＯＬＯ２０５腫瘍またはＣａｐａｎ−１腫瘍を有するマウスにおいて比較した（非表示）。ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ複合体及びＣＬ２−ＳＮ−３８複合体は両方とも、未処置（ＡＵＣ１４日間：ＣＯＬＯ２０５モデルにおける塩類溶液に対するＰ＜０．００２、ＡＵＣ２１日間：Ｃａｐａｎ−１モデルにおける塩類溶液に対するＰ＜０．００１）及び非標的化の抗ＣＤ２０対照ＡＤＣであるｈＡ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（ＡＵＣ１４日間：ＣＯＬＯ−２０５モデルにおけるＰ＜０．００３、ＡＵＣ３５日間：Ｃａｐａｎ−１モデルにおけるＰ＜０．００２）と比較して腫瘍の発達を有意に抑制した。Ｃａｐａｎ−１モデルにおける試験終了時（１４０日後）に、マウスの５０％はｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８で処置し、ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８のマウスの４０％は腫瘍がなかったのに対し、ｈＡ２０−ＡＤＣ処置した動物の２０％だけが、疾患に関する可視的徴候を有していなかった。重要なことに、両腫瘍モデルにおける２つの特異的複合体の間の効能の差はなかった。
【０２４０】
（作用機序）
インビトロでの細胞毒性試験は、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８が、いくつかの異なる固形腫瘍系統に対してｎｍｏｌ／Ｌの範囲にＩＣ５０値を有していることを実証した（表８）。遊離ＳＮ−３８によるＩＣ５０は、細胞株全部において複合体よりも低かった。ＴＲＯＰ−２発現とｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８に対する感度の間に相関はなかったが、ＡＤＣと遊離ＳＮ−３８のＩＣ５０比は、より高いＴＲＯＰ−２を発現する細胞においてより低く、より多くの抗原が存在する場合に薬剤を内部移行する高い能力を反映している可能性が最も高い。
表８．いくつかの固形腫瘍系統におけるＴＲＯＰ−２の発現ならびにＳＮ−３８及びｈＲＳ７−ＳＮ−３８のインビトロでの細胞毒性
【表８】
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ａ  ＩＣ５０値は、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８のＳＮ−３８当量として示す。
【０２４１】
ＳＮ−３８は、細胞におけるいくつかのシグナル伝達経路を活性化して、アポトーシスをもたらすことが公知である。本発明者らの最初の研究では、インビトロでの早期シグナル伝達事象に関与する２つのタンパク質（ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１及びｐ５３）の発現及び１つの後期アポトーシス事象［ポリ−ＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断］を調査した（非表示）。ＢｘＰＣ−３において、ＳＮ−３８は、Ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１発現における２０倍の亢進をもたらしたのに対し、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は結果的に１０倍の亢進しか生じず、この細胞株における遊離ＳＮ−３８を用いた比較的高い活性と一致する知見であった（表８）。しかしながら、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、遊離ＳＮ−３８よりも２倍超高くＣａｌｕ−３におけるｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１の発現を高めた（非表示）。
【０２４２】
ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と遊離ＳＮ−３８仲介性シグナル伝達事象の間のより大きな相違は、ｐ５３発現において観察された。ＢｘＰＣ−３及びＣａｌｕ−３の両方において、遊離ＳＮ−３８を用いたｐ５３の上方制御は、４８時間まで明らかではなかったのに対し、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８はｐ５３を２４時間以内に上方制御した（非表示）。加えて、ＡＤＣへ曝露した細胞におけるｐ５３発現は、ＳＮ−３８と比較して両細胞株において高かった（非表示）。興味深いことに、ｈＲＳ７  ＩｇＧは、ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１発現に対して明らかな効果は有していなかったが、ＢｘＰＣ−３及びＣａｌｕ−３の両方におけるｐ５３の上方制御を誘導したものの、４８時間曝露の後にしか生じなかった。より後期のアポトーシス事象の点で、ＰＡＲＰの切断は、ＳＮ−３８または当該複合体のいずれかとともにインキュベートした場合、両細胞株において明白であった（非表示）。切断したＰＡＲＰの存在は、ＢｘＰＣ−３において２４時間でより高かったが、このことは、ｐ２１の高い発現及びその比較的低いＩＣ５０と相関している。ＡＤＣを上回る遊離ＳＮ−３８を用いた切断の比較的高い程度は、細胞毒性の知見と一致していた。
【０２４３】
（ｈＲＳ−ＳＮ−３８の効能）
ＴＲＯＰ−２がいくつかのヒトの癌腫において広く発現するので、いくつかの異なるヒト癌モデルにおいての研究を実施し、ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８系統の評価で始まったが、後にＣＬ２Ａ系統との複合体を用いた。０．０４ｍｇＳＮ−３８／ｋｇのｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８を４日間ごと×４回与えたＣａｌｕ−３保有ヌードマウスは、等価の量のｈＬＬ２−ＣＬ２−ＳＮ−３８を投与した動物と比較して有意に改善された応答を有していた（ＴＶはそれぞれ、０．１４±０．２２ｃｍ３対０．８０±０．９１ｃｍ３、ＡＵＣ４２日後Ｐ＜０．０２６、図５Ａ）。用量応答は、用量が０．４ｍｇ／ｋｇ  ＳＮ−３８まで高まった場合に観察された。この比較的高い用量レベルで、特異的ｈＲＳ７複合体を与えたマウスはすべて、２８日間以内に「治癒」し、１４７日後の研究終了時まで腫瘍がないままであったのに対し、無関係のＡＤＣを用いて処置した動物においては腫瘍が再発達した（特異的ＡＵＣ９８日後対無関係のＡＵＣ９８日後、Ｐ＝０．０５）。ｈＲＳ７  ＩｇＧ及びＳＮ−３８の混合物を受容するマウスにおいて、腫瘍は５６日後までに４．５倍超ほど増大した（ＴＶ＝１．１０±０．８８ｃｍ３、ｈＳＲ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８に対するＡＵＣ５６日後Ｐ＜０．００６）。
【０２４４】
効能はまた、ヒト結腸腫瘍異種移植片（ＣＯＬＯ２０５）及び膵腫瘍異種移植片（Ｃａｐａｎ−１）において調査した。ＣＯＬＯ２０５腫瘍保有動物（図５Ｂ）において、ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８（０．４ｍｇ／ｋｇ、４日ごと×８回）は、２８日間の処置期間にわたって腫瘍の発達を予防し、対照の抗ＣＤ２０ＡＤＣ（ｈＡ２０−ＣＬ２−ＳＮ−３８）、またはｈＲＳ７  ＩｇＧと比較して、有意により小さな腫瘍であった（それぞれ、ＴＶ＝０．１６±０．０９ｃｍ３、１．１９±０．５９ｃｍ３、及び１．７７±０．９３ｃｍ３、ＡＵＣ２８日後Ｐ＜０．０１６）。マウス血清がヒト血清よりもイリノテカンをＳＮ−３８へより効率的に変換することができるので、イリノテカンの最大耐用量（２４ｍｇのＳＮ−３８／ｋｇ、２日ごと×５回）はｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８と同程度に有効ではあるが、イリノテカンにおけるＳＮ−３８用量（２４００μｇの累積量）は、当該複合体を用いた場合（合計６４μｇ）よりも３７．５倍大きかった。
【０２４５】
Ｃａｐａｎ−１を保有する動物は、ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８複合体と等価のＳＮ−３８用量で付与した場合にイリノテカン単独に対して有意な応答を何ら示さなかった（例えば、３５日後に、平均腫瘍サイズは、０．４ｍｇのＳＮ−３８／ｋｇ  ｈＲＳ７−ＳＮ−３８を付与された動物においては０．０４±０．０５ｃｍ３であったのに対し、０．４ｍｇ／ｋｇ  ＳＮ−３８を付与されたイリノテカン処置動物においては１．７８±０．６２ｃｍ３であり、ＡＵＣ３５日後Ｐ＜０．００１であった。図５Ｃ）。イリノテカン用量が４ｍｇ／ｋｇ  ＳＮ−３８へと１０倍増加した場合、応答は改善されたが、０．４ｍｇ／ｋｇ  ＳＮ−３８用量レベルでの複合体と同程度に有意ではなかった（ＴＶ＝０．１７±０．１８ｃｍ３対１．６９±０．４７ｃｍ３、ＡＵＣ４９日後Ｐ＜０．００１）。等用量の非標的化ｈＡ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８はまた、イリノテカン処置動物と比較して有意な抗腫瘍効果を有していたが特異的ｈＲＳ７複合体は、無関連のＡＤＣよりも有意に良好であった（ＴＶ＝０．１７±０．１８ｃｍ３対０．８０±０．６８ｃｍ３、ＡＵＣ４９日後Ｐ＜０．０１８）。
【０２４６】
次に、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８のＡＤＣを用いた研究を、ヒト上皮癌に関する２つの他のモデルへ発展させた。ＢｘＰＣ−３ヒト膵腫瘍を保有するマウス（図５Ｄ）において、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は再度、塩類溶液または等量の非標的化ｈＡ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いて処置した対照マウスと比較して腫瘍の発達を有意に抑制し（それぞれ、ＴＶ＝０．２４±０．１１ｃｍ３対１．１７±０．４５ｃｍ３及び１．０５±０．７３ｃｍ３、ＡＵＣ２１日後Ｐ＜０．００１）、または１０倍以上のＳＮ−３８当量で付与されたイリノテカンとの比較でもそうであった（それぞれＴＶ＝０．２７±０．１８ｃｍ３対０．９０±０．６２ｃｍ３、ＡＵＣ２５日後Ｐ＜０．００４）。興味深いことに、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＤＣを用いて処置したＳＫ−ＭＥＳ−１ヒト肺扁平上皮腫瘍を保有するマウス（図５Ｅ）において、腫瘍の発達抑制は、塩類溶液または非結合型ｈＲＳ７  ＩｇＧよりも優れていた（それぞれＴＶ＝０．３６±０．２５ｃｍ３対１．０２±０．７０ｃｍ３及び１．３０±１．０８ｃｍ３、ＡＵＣ２８日後Ｐ＜０．０４３）が、非標的化ｈＡ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８またはイリノテカンのＭＴＤは、特異的ｈＲＳ７−ＳＮ−３８複合体と同じ抗腫瘍効果を提供した。ネズミ試験全体において、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣは、体重減少の点で充分耐容性があった（非表示）。
【０２４７】
（ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の体内分布）
ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８または非結合型ｈＲＳ７  ＩｇＧの体内分布を、個々の１１１Ｉｎ標識した基質を用いて、ＳＫ−ＭＥＳ−１ヒト肺扁平上皮癌異種移植片を保有するマウスにおいて比較した（非表示）。薬物動態分析を実施して、非結合型ｈＲＳ７に対するｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８のクリアランスを決定した（非表示）。ＡＤＣは、等量の非結合型ｈＲＳ７とよりも迅速に除去し、ＡＤＣは、約４０％のより短い半減期及び平均残存時間を呈した。それにもかかわらず、このことは、腫瘍の取り込みに及ぼす最小の影響を有していた（非表示）。２４時間及び４８時間の時点での有意差はあったが、７２時間（取り込みのピーク）までに腫瘍における両薬剤の量は同様であった。正常組織のうち、肝臓及び脾臓の差は最も顕著であった（非表示）。注射２４時間後のうち、肝臓においてｈＲＳ７  ＩｇＧと比べて２倍強のｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８があった。逆に脾臓では、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と比べて取り込みのピーク（４８時間の時点）では３倍高い親ｈＲＳ７  ＩｇＧが存在していた。残りの組織の取り込み及びクリアランスは概して、血中濃度の差を反映していた。
【０２４８】
週２回用量を療法用に付与したので、０．２ｍｇ／ｋｇ（２５０μｇタンパク質）のｈＲＳ７  ＡＤＣの投与前用量をまず受容した３日後に１１１Ｉｎ標識した抗体を注射した１群の動物における腫瘍の取り込みを調査した。投与前用量を投与したマウスにおける１１１Ｉｎ−ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の腫瘍取り込みは、投与前用量を受けなかった動物との比較であらゆる時点で実質的に低下した（例えば、７２時間時、投与前用量を受けた場合の腫瘍の取り込みは、１２．５％±３．８％ＩＤ／ｇであるのに対し、投与前用量を与えていない動物においては２５．４±８．１％ＩＤであった；Ｐ＝０．０１２３）。投与前用量の投与は、血中クリアランスにも組織の取り込みにも明確な影響を有していなかった（非表示）。これらの研究は、いくつかの腫瘍モデルにおいて、特異的抗体の腫瘍付着が、先行する投与によって低下する可能性があることを示唆しており、このことはおそらく、治療応答の特異的が、ＡＤＣ用量を増加させるとともに低下し得る理由、及びさらなる用量の漸増が必要ではない理由を説明している。
【０２４９】
（スイス−ウェブスター系マウス及びカニクイザルにおけるｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の耐容性）
スイス−ウェブスター系マウスは、４、８、及び１２ｍｇのＳＮ−３８／ｋｇ  ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の各々、３日間にわたって２用量を耐容し、最小限の一過性の体重減少を伴った（非表示）。造血性毒性が生じ、血清化学物質のみが、高いアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）及びアラニントランスアミナーゼを明らかにした（非表示）。処置の７日後、ＡＳＴは、３つの処置群すべてにおいて正常レベル（２９８Ｕ／Ｌ超）を上回って上昇し（非表示）、マウスの最大の比率は、２×８ｍｇ／ｋｇ群においてであった。しかしながら、処置後１５日間までに、ほとんどの動物が正常範囲内であった。ＡＬＴレベルも処置７日間以内で正常範囲（７７Ｕ／Ｌ超）を上回り（非表示）、１５日後までに標準化の証拠を伴った。これらの全マウス由来の肝臓は、組織損傷に関する組織学的証拠を示さなかった（非表示）。腎機能の点で、グルコースレベル及び塩化物レベルのみが処置群において幾分高かった。２×８ｍｇ／ｋｇにおいて、７匹のうちの５匹のマウスは幾分高いグルコースレベルを有しており（２７３〜３２０ｍｇ／ｄＬの範囲、正常値上限２６３ｍｇ／ｄＬ）、これは注射後１５日間までに正常に戻った。同様に、塩化物レベルはわずかに高く、２つの最高薬用量群（２×８ｍｇ／ｋｇ群における５７％及び２×１２ｍｇ／ｋｇ群におけるマウスの１００％）において１１６〜１２７ｍｍｏｌ／Ｌに及んでおり（正常範囲の上限値１１５ｍｍｏｌ／Ｌ）、注射後１５日間高いままであった。このことはまた、胃腸毒性の徴候を示し得、その理由は、ほとんどの塩化物が腸による吸収を通じて得られるからであり、しかしながら、終了時には、調査したいずれの器官系においても組織損傷の組織学的証拠はなかった（非表示）。
【０２５０】
マウスはｈＲＳ７が結合したＴＲＯＰ−２を発現しないので、臨床用途のためのｈＲＳ７複合体の能力を判定するためには、より適切なモデルが必要であった。免疫組織学研究は、ヒト及びカニクイザルの両方において複数の組織における結合を明らかにした（乳房、眼、消化管、腎臓、肺、卵巣、卵管、膵臓、副甲状腺、前立腺、唾液腺、皮膚、胸腺、甲状腺、扁桃腺、尿管、膀胱、及び子宮）（非表示）。この交差反応性をもとに、耐容性研究をサルにおいて実施した。
【０２５１】
２×０．９６ｍｇ  ＳＮ−３８／ｋｇのｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を受ける群は、注入後及び本研究の終了まで、有意な臨床事象を何ら有していなかった。体重減少は７．３％を超過せず、１５日後まで順化体重へ戻った。一過性の減少は、血球計数データのほとんどにおいて示された（非表示）が、値は、正常範囲未満に低下しなかった。異常な値は血清化学物質において認められなかった。１１日後に剖検した動物の組織病理学的検査（最後の注射８日後）は、造血性器官（胸腺、下顎骨及び腸間膜リンパ節、脾臓ならびに骨髄）、消化器官（胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、及び直腸）、雌性生殖器官（卵巣、子宮、及び膣）、及び注射部位での顕微鏡レベルの変化を示した。これらの変化は、最小から中程度まで及び、すべての組織において回復期の終了時（３２日後）に完全に逆転したが、胸腺及び消化管は例外で、これよりのちの時点で完全な回復へ向かう傾向にあった。
【０２５２】
当該複合体の２×１．９２ｍｇ  ＳＮ−３８／ｋｇ用量レベルで、消化管合併症及び骨髄抑制から１匹の死亡が生じ、この群内の他の動物は、同様だが２×０．９６ｍｇ／ｋｇ群よりも重症度の高い副作用性事象を示した。これらのデータは、用量制限毒性が、すなわち腸及び血液学的にイリノテカンの用量制限毒性と同一であったことを示す。したがって、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８についてのＭＴＤは、２×０．９６ｍｇ  ＳＮ−３８／ｋｇと１．９２ｍｇ  ＳＮ−３８／ｋｇの間にあり、これは、２×０．３〜０．６ｍｇ／ｋｇ  ＳＮ−３８のヒト当量を表す。
【０２５３】
（考察）
ＴＲＯＰ−２は、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵癌、前立腺癌、及び卵巣癌を含む多くの上皮腫瘍において発現するタンパク質であり、細胞毒性薬を送達するための潜在的に重要な標的となっている。ＲＳ７抗体は、ＴＲＯＰ−２へ結合すると内部移行し（Ｓｈｉｈら，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：５８５７ｓ〜５８６３ｓ）、このことによって細胞毒の直接的な細胞内送達が可能となる。
【０２５４】
化学療法薬の抗体への結合は、３０年間を超える間に探索されてきた。ＡＤＣの大部分は腫瘍によって処理されないが、正常組織によっては処理されるので、これらの薬剤が腫瘍の治療レベルに到達する前に正常器官系に対してあまりにも毒性がある危険がある。いずれの治療薬を用いる場合でも、治療ウィンドウはＡＤＣの可能性を決定する鍵因子であり、したがって、「超毒性」薬を調査するよりもむしろ、本発明者らは、ＴＲＯＰ−２標的化ＡＤＣの薬剤成分としてＳＮ−３８を選択した。
【０２５５】
ＳＮ−３８は、強力なトポイソメラーゼＩ型阻害薬であり、ＩＣ５０値は、いくつかの細胞株においてはナノモル濃度範囲である。結腸直腸がんの治療に使用されるのは、プロドラッグであるイリノテカンの活性形態であり、これはまた、肺癌、乳癌、及び脳癌において活性を有する。本発明者らは、ＣＰＴ−１１の低いかつ患者によって変化する活性型ＳＮ−３８への体内変換を克服することによって、ＡＤＣの形態で直接標的に向かうＳＮ−３８がＣＰＴ−１１よりも有意に改善された治療薬であろうと推論した。
【０２５６】
元のＣＬ２誘導体に挿入されたＰｈｅ−Ｌｙｓペプチドは、カテプシンＢを介した起こり得る切断を許容した。合成方法を簡素化するための尽力において、ＣＬ２Ａではフェニルアラニンが除去され、したがって、カテプシンＢの切断部位が除かれた。興味深いことに、この生成物は、ＣＬ２を用いて得られた広範な特性と比較して、良好に規定されたクロマトグラフィー特性を有していた（非表示）が、より重要なことに、この変化は、並列検査において複合体の結合性、安定性、及び効力に及ぼす影響はなかった。これらのデータは、ＣＬ２におけるＳＮ−３８が主として、カテプシンＢ切断部位ではなく、ＳＮ−３８のラクトン環に対するｐＨ感受性炭酸ベンジル結合における切断によって複合体から放出されたことを示唆している。
【０２５７】
様々な固形腫瘍細胞株に対するｈＲＳ７  ＡＤＣのインビトロでの細胞毒性は一致して、ｎｍｏｌ／Ｌ範囲のＩＣ５０値を有していた。しかしながら、遊離ＳＮ−３８へ曝露した細胞は、ＡＤＣと比較して低いＩＣ５０値を示した。遊離型ＳＮ−３８と結合型ＳＮ−３８の間のこの相違はまた、ＥＮＺ−２２０８（Ｓａｐｒａら，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：１８８８〜１８９６）及びＮＫ０１２（Ｋｏｉｚｕｍｉら，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：１００４８〜１００５６）について報告されていた。ＥＮＺ−２２０８は、分枝ＰＥＧを利用して、ＰＥＧ当たり約３．５〜４分子のＳＮ−３８を連結するのに対し、ＮＫ０１２は、２０重量％のＳＮ−３８を含有するミセルナノ粒子である。本発明者らのＡＤＣを用いた場合、この相違（すなわち、遊離型ＳＮ−３８と結合型ＳＮ−３８による効力の比）は、ＴＲＯＰ−２発現レベルが腫瘍細胞において高まるにつれて低下し、当該薬剤の標的への送達に対する利点を示唆している。インビトロでの血清安定性の点で、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８のＣＬ２及びＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の両形態は、約２０時間のｔ／１／２を生じ、これは、ＥＮＺ−２２０８について報告された１２．３分という短いｔ／１／２とは対照的である（Ｚｈａｏら，２００８，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １９：８４９〜８５９）が、２４時間後の生理学的条件下でのＮＫ０１２からのＳＮ−３８の５７％の放出と類似している（Ｋｏｉｚｕｍｉら，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：１００４８〜１００５６）。
【０２５８】
ｈＲＳ７−ＳＮ−３８を用いた（ＣＬ２−ＳＮ−３８またはＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８のいずれかを用いた）腫瘍保有マウスの処置は、５つの異なる腫瘍モデルにおいて腫瘍の発達を有意に抑制した。当該モデルのうちの４つにおいて、腫瘍の退行が観察され、Ｃａｌｕ−３の場合、最高用量のｈＲＳ７−ＳＮ−３８を受けたマウスはすべて、本研究の終了時に腫瘍がなかった。ヒトとは異なり、イリノテカンは、マウスにおける血漿エステラーゼによってＳＮ−３８へ５０％を超える変換率で非常に効率的に変換され、ヒトにおいてよりもマウスにおいて高い効能を生じる。イリノテカンを１０倍高いまたは等価のＳＮ−３８レベルで投与した場合、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８は、腫瘍の発達を制御する上で有意により良好であった。イリノテカンを２４ｍｇ／ｋｇのＭＴＤで２日ごと×５で投与した場合（３７倍多いＳＮ−３８）にのみ、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８の有効性と等しかった。患者において、本発明者らは、この利点を期待して、イリノテカンの体内変換が実質的により低いであろうことから、さらによりｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を奨励するであろう。
【０２５９】
本発明者らはまた、ＳＫ−ＭＥＳ−１のようないくつかの抗原発現細胞株において、抗原結合型ＡＤＣの使用が、非結合型の無関連の複合体よりも良好な治療応答を保証しないことを示した。このことは、珍しいまたは予期せぬ発見ではない。実際、言及した非結合型ＳＮ−３８複合体は、イリノテカンと比較した場合、早期に治療活性を高めるので、無関連のＩｇＧ−ＳＮ−３８複合体は、何らかの活性を有していると期待される。このことは、腫瘍が未成熟で漏れやすく、正常組織よりも巨大分子をよく通過させる血管を有しているという事実に関連する。本発明者らの複合体を用いた場合、ＳＮ−３８の５０％は、ｐＨがリソソームレベルを模倣するレベル（例えば、３７℃でｐＨ５．３）まで低下した場合に約１３時間で放出される（データ非表示）のに対し、中性ｐＨの血清では、放出速度はほぼ２倍低下する。無関連の複合体が酸性の腫瘍微小環境に入ると、いくばくかのＳＮ−３８を局所的に放出すると期待される。腫瘍の生理学及び薬剤に対する生得的感度のような他の因子も、この「基準」活性を規定する上である役割を担っている。しかしながら、より長い残存時間を有する特異的複合体は、特異的抗体を捕捉するための十分な抗原がある限り、この基準応答よりも高い効力を有するべきである。ＳＫ−ＭＥＳ−１モデルにおける体内分布研究はまた、腫瘍抗原が連続的な投与の結果として飽和した場合、特異的複合体の腫瘍取り込みが低下し、そのことが無関連の複合体を用いて認められるのと類似の治療結果を生じることを示した。
【０２６０】
本発明者らのＡＤＣと他のＳＮ−３８送達薬に関して公開された報告の間の直接的な比較をすることは挑戦的ではあるが、いくつかの一般的な見解を得ることができる。本発明者らの療法研究において、最高の個々の用量は０．４ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８であった。Ｃａｌｕ−３モデルにおいて、２０ｇマウスにおいて１．６ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８または３２μｇのＳＮ−３８の合計累積用量のために、４回の注射のみを与えた。ＥＮＺ−２２０８を用いた複数の研究は、１０ｍｇ／ｋｇのＭＴＤ×５回を用いて実施され、ＮＫ０１２を用いた前臨床研究は、３０ｍｇ／ｋｇのＭＴＤ×３回を包含していた。したがって、有意な抗腫瘍効果は、ＥＮＺ−２２０８及びＮＫ０１２において報告された用量よりもそれぞれ３０倍及び５５倍低いＳＮ−３８当量でｈＲＳ７−ＳＮ−３８を用いて得た。１０倍低いｈＲＳ７  ＡＤＣ（０．０４ｍｇ／ｋｇ）を用いた場合でさえ、有意な抗腫瘍効果が観察されたのに対し、より低い用量のＥＮＺ−２２０８は呈さず、ＮＫ０１２用量が７．５ｍｇ／ｋｇまで４倍低下した場合、効能は失われた（Ｋｏｉｚｕｍｉら，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：１００４８〜１００５６）。正常マウスは、１週間にわたる累積的な用量の２４ｍｇ／ｋｇ  ＳＮ−３８（１５００ｍｇ／ｋｇ  複合体）を用いた場合、急性毒性を示さず、ＭＴＤがより高いことを示した。したがって、腫瘍保有動物は、７．５〜１５倍低い量のＳＮ−３８等価物を用いて有効に処置された。
【０２６１】
トポイソメラーゼＩ型阻害薬として、ＳＮ−３８は、細胞のＤＮＡに対する有意な損傷を誘導し、ｐ５３及びｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の上方制御は結果的に、カスパーゼの活性化及びＰＡＲＰの切断を生じる。本発明者らがＢｘＰＣ−３及びＣａｌｕ−３を本発明者らのＡＤＣへ曝露した場合、ｐ５３及びｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１は両方とも、基準レベルを上回って上方調節された。加えて、ＰＡＲＰ切断はまた、両細胞株において明白であり、これらの細胞におけるアポトーシス性事象を確認した。興味深いのは、遊離ＳＮ−３８及び本発明者らのｈＲＳ７−ＳＮ−３８の両方による、ｐ５３と比較してＢｘＰＣ−３及びＣａｌｕ−３におけるｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の高い上方調節であった。このことはこれら２つの細胞株におけるｐ５３の突然変異状態及びｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１仲介性アポトーシスのｐ５３非依存性経路の使用を示し得る。
【０２６２】
興味深い観察は、遊離ＳＮ−３８に対するｈＲＳ７−ＡＤＣによって仲介されるＢｘＰＣ−３及びＣａｌｕ−３の両方における２４時間時のｐ５３の早期上方調節であった。裸のｈＲＳ７  ＩｇＧでさえこれらの細胞株においてｐ５３を上方調節することができたが、４８時間曝露の後のみであった。抗体によるＴＲＯＰ−２過剰発現及び交差架橋は、いくつかのＭＡＰＫ関連シグナル伝達事象及び細胞内カルシウム放出と連関している。ｈＲＳ７の結合は、ＰＡＲＰ切断の欠如によって立証されるように、ＢｘＰＣ−３及びＣａｌｕ−３においてアポトーシスを誘導するのに十分ではなかったが、一細胞を刺激するには十分であり得、それによりｈＲＳ７へ結合したＳＮ−３８の包含が、腫瘍の発達抑制に及ぼすより大きな効果をもたらし得る。どの経路がＳＮ−３８のｈＲＳ７送達に関与し、及び当該経路が遊離型ＳＮ−３８とどのように異なり得、及び何の効果のｐ５３状態がこのシグナル伝達において担い得るのかを理解するために、研究が現に進行中である。
【０２６３】
体内分布研究は、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８が親ｈＲＳ７  ＩｇＧと類似の腫瘍取り込みを有するが、ＳＮ−３８の疎水性に起因する可能性がある２倍高い肝取り込みで、実質的により迅速に除去することを明らかにした。ＡＤＣが肝臓を通じて除去される場合、肝臓及び消化管の毒性は用量制限的であると期待された。マウスは、高い肝トランスアミナーゼの証拠を有していたが、消化管毒性はせいぜい軽度であり、体重の一過性減少のみがあり、異常性は組織病理学的調査の際に認められなかった。興味深いことに、血液学的毒性は認められなかった。しかしながら、サルは、イリノテカンについて期待されたように同一の毒性特性を示し、消化管毒性及び血液学的毒性は用量制限的であった。
【０２６４】
ｈＲＳ７によって認識されるＴＲＯＰ−２はマウスにおいて発現していないので、ヒトと類似のＴＲＯＰ−２の組織発現を有するサルにおける毒性研究を実施することは決定的に重要であった。サルは、軽度かつ可逆的な毒性の０．９６ｍｇ／ｋｇ／用量（約１２ｍｇ／ｍ２）を許容したが、これは、約０．３ｍｇ／ｋｇ／用量（約１１ｍｇ／ｍ２）のヒト用量と推定する。ＮＫ０１２の第Ｉ相臨床治験において、固形腫瘍を罹患している患者は、用量制限毒性として第４期好中球減少症で、３週間ごとの２８ｍｇ／ｍ２のＳＮ−３８を耐容した（Ｈａｍａｇｕｃｈｉら，２０１０，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６：５０５８〜５０６６）。同様に、ＥＮＺ−２２０８を用いた第Ｉ相臨床治験は、用量制限的な熱性好中球減少症を明らかにし、推奨は、３週間ごとに１０ｍｇ／ｍ２、または患者がＧ−ＣＳＦを投与される場合、１６ｍｇ／ｍ２を投与することであった。サルは、２２ｍｇ／ｍ２の累積的なヒト当量を耐容したので、ｈＲＳ７がいくつかの正常組織へ結合するが、ｈＲＳ７  ＡＤＣの単一処置のためのＭＴＤが、他の非標的化ＳＮ−３８薬のＭＴＤと類似し得ることは可能である。実際、抗ＴＲＯＰ−２の特異性は、ＤＬＴを規定する上である役割を担っていそうには見えず、その理由は、毒性特性が、イリノテカンの毒性特性と類似していたからであった。より重要なことに、抗腫瘍活性が、ちょうど０．０３ｍｇのＳＮ−３８当量／ｋｇ／用量のヒト当量で応答したマウスにおけるような、ヒトにおける抗腫瘍活性が達成できる場合、有意な抗腫瘍応答が臨床的に実現され得る。
【０２６５】
結論として、マウスにおけるインビボでのヒト癌異種移植片モデルと組み合わせた、サルにおける毒性研究は、このＴＲＯＰ−２を標的化するＡＤＣが異なる上皮由来のいくつかの腫瘍において効果的な治療薬であることを示した。
【０２６６】
（実施例５．血液学的悪性の治療のための抗ＣＤ２２（エプラツズマブ）結合型ＳＮ−３８）
本発明者らは、ＩｇＧ結合型ＳＮ−３８のおよそ５０％が血清中で２４時間ごとに解離できるＣＬ２Ａリンカーを用いて調製した場合、ＳＮ−３８と結合した緩徐に内部移行する抗体が成功裡に使用されることができることをすでに発見した。本研究において、エプラツズマブ（迅速に内部移行する）及びベルツズマブ（緩徐に内部移行する）を用いて調製したＳＮ−３８複合体、ヒト化抗ＣＤ２２及び抗ＣＤ２０  ＩｇＧの効能をそれぞれ、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療について調査した。抗体−薬剤複合体はいずれも、種々のヒトリンパ腫／白血病細胞株に対して類似のナノモル活性を有していたが、ＳＮ−３８の緩徐な放出は、無関連の複合体に対してでさえインビトロでの効力判別を損なった。ＳＮ−３８を抗ＣＤ２２複合体へ安定して連結した場合、その効力は、４０〜５５倍低下した。それゆえ、比較的安定していない緩徐に解離するＣＬ２Ａリンカーを用いてのみ、さらなる研究を実施した。インビボの類似の抗腫瘍活性は、Ｒａｍｏｓ異種移植片を保有するマウスにおいてＣＤ２２とＣＤ２０抗体−薬剤複合体の間で認められたが、Ｒａｍｏｓは，ＣＤ２２よりも１５倍多くＣＤ２０を発現しており、エプラツズマブ−ＳＮ−３８複合体（Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８）の内部移行がその活性を高めることを示唆した。Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８は、インビボでの非結合型の無関連ＩｇＧ−ＳＮ−３８複合体よりも有効であり、十分に確立したＲａｍｏｓ異種移植片の大部分を非毒性用量で除去した。インビトロ及びインビボでの研究は、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８が、より有効な治療のために非結合型ベルツズマブと組み合わせることができることを示した。したがって、Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８は、毒性レベルを十分に下回る用量でリンパ腫及び白血病において活性があり、それゆえ、単独でまたは抗ＣＤ２０抗体療法と組み合わせて治療能を有する新たな有望な薬剤を表している（Ｓｈａｒｋｅｙら，２０１１，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：２２４〜２３４）。
【０２６７】
（序論）
多大な尽力により白血病及びリンパ腫の生物学的療法に関して焦点を絞られており、当該療法において、非結合型抗体（例えば、リツキシマブ、アレムツズマブ、オファツムマブ）、放射性免疫複合体（９０Ｙ−イブリツモマブ・チウキセタン、１３１Ｉ−トシツモマブ）、及び薬剤複合体（ゲムツズマブ・オゾガマイシン）は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の認可を受けた。別の抗体−薬剤複合体（ＡＤＣ）であるブレンツキシマブベドチン（ＳＧＮ−３５、抗ＣＤ３０−オーリスタチンＥ）は近年、ホジキンリンパ腫及び未分化大細胞リンパ腫のためにＦＤＡによる迅速な認可を受けた。ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ７４、及びＣＤ７９ｂを標的とする前臨床開発及び臨床開発にはいくつかの他のＡＤＣもある。
【０２６８】
これらの標的すべてに対する抗体は、薬剤の担体のための論理的選択であり、その理由は当該抗体が内部移行するからである。ＣＤ２２の内部移行及び特異性は、ＣＤ２２を白血病及びリンパ腫に特に重要な標的とし、臨床研究においては少なくとも３つの異なる抗ＣＤ２２複合体があり、これにはＣＭＣ−５４４（酸不安定性結合型カリチアマイシン）、抗ＣＤ２２−マイタンシン複合体（安定して連結されたＭＣＣ−ＤＭ１）、及びＣＡＴ−３８８８（旧ＢＬ２２、シュードモナス外毒素一本鎖融合タンパク質）が含まれる。これらの複合体すべてにおける活性薬はナノモル未満の効力を有する（すなわち、いわゆる超有毒性）。
【０２６９】
本発明者らは近年、抗体を、プロドラッグであるイリノテカンに由来する低いナノモル濃度の効力を有するトポイソメラーゼＩ阻害薬であるＳＮ−３８と結合させる方法を開発した（Ｇｏｖｉｎｄａｎら，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２〜６０６２、Ｍｏｏｎら，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６〜６９２６）。４つのＳＮ−３８連結化学物質をまず、緩徐に内部移行する抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体を用いて調製した複合体を用いて調査した（Ｇｏｖｉｎｄａｎら，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２〜６０６２、Ｍｏｏｎら，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６〜６９２６）。当該複合体は、ＣＥＡＣＡＭ５結合を保有していたが、ヒト活性中でＳＮ−３８の解離速度において異なっており、半減期は、およそ１０時間から６７時間まで変動した（Ｇｏｖｉｎｄａｎら，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２〜６０６２）。最終的に、中間的な安定性（２４〜３５時間で約５０％解離）を有するＣＬ２と命名したリンカーをさらなる開発のために選択した。ＣＬ２は、近年改変されており、簡素化して製造収量を改善するためにカテプシンＢ切断可能型ジペプチドにおけるフェニルアラニンを除去した。ＣＬ２Ａと命名されたこの新たな誘導体は、ＳＮ−３８に対するｐＨ感受性炭酸連結を保有しているが、もはやカテプシンＢによって選択的に切断されない。それにもかかわらず、ＣＬ２Ａは元のＣＬ２リンカーと同一の血清安定性及びインビボでの活性を有している（Ｃａｒｄｉｌｌｏら，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７〜３１６９）。毒性を有さない有意な効能が、緩徐に内部移行する抗ＣＥＡＣＡＭ５−ＳＮ−３８で認められたので、本発明者らは、抗ＣＥＡＣＡＭ５−ＳＮ−３８の活性が、当該抗体が腫瘍中に局在した後の当該抗体からのＳＮ−３８の緩徐な放出によって支援されると仮定した。したがって、本報告の主たる目的は、Ｂ細胞癌に非常に特異的であるが、抗原発現特性及び内部移行特性の異なる２つの抗体とともにＣＬ２Ａリンカーを用いて調製した複合体の治療上の見込みを評価することとした。
【０２７０】
エプラツズマブ（Ｅｍａｂ）は、非結合型または結合型でリンパ腫及び白血病において広範に評価されてきた、迅速に内部移行する（例えば、１時間以内に５０％以上）ヒト化抗ＣＤ２２  ＩｇＧ１である。ベルツズマブ（Ｖｍａｂ）も臨床的に研究中だが緩徐に内部移行する（例えば、１時間で約１０％）ヒト化抗ＣＤ２０抗体である。ＣＤ２０は通常、非ホジキンリンパ腫においてＣＤ２２よりも非常に高いレベルで発現するのに対し、ＣＤ２２は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）において優先的に発現するが、多発性骨髄腫においては発現しない。両抗体とも、非結合型薬剤として患者において有効だが、ベルツズマブのみがネズミ異種移植片モデルにおいて活性がある（Ｓｔｅｉｎら，２００４，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：２８６８〜２８７６）。非結合型ベルツズマブと組み合わせた９０Ｙ−ＥｍａｂがＮＨＬモデルにおいて高い効能を有することを示した先行研究（Ｍａｔｔｅｓら，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：６１５４〜６１６０）をもとに、本発明者らは、Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８＋Ｖｍａｂの組み合わせも調査し、その理由は、これが、同じ標的抗原と競合することなく及び追加的な毒性を有することなく、追加的な利益を提供することができる可能性があったからである。
【０２７１】
（材料及び方法）
（細胞株）
Ｒａｍｏｓ、Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ（バーキットリンパ腫）、及びＪｅＫｏ−１（マントル細胞リンパ腫）を米国培養細胞系統保存機関から購入した。ＲＥＨ、ＲＳ４；１１、ＭＮ−６０、及び６９７（全部）は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎから購入した。ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ（濾胞性ＮＨＬ）は、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｒ．Ｓｍｉｔｈ博士（Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，ペンシルバニア州フィラデルフィア市）からの贈呈品であった。細胞株はすべて、１０〜２０％ウシ胎児血清を含有する推奨された補足培地中で３７℃の加湿したＣＯ２インキュベーター（５％）中で培養し、マイコプラズマについて周期的にチェックした。
【０２７２】
（抗体及び結合方法）
エプラツズマブ及びベルツズマブはそれぞれ、ヒト化した抗ＣＤ２２及び抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５  ＩｇＧ１であるラベツズマブ（Ｌｍａｂ）、及びヒト化抗ＴＲＯＰ−２抗体であるＲＳ７（両方ともＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ社製）を非結合型の無関連対照として使用した。本明細書では、Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８、Ｖｍａｂ−ＳＮ−３８、及びＬｍａｂ−ＳＮ−３８は、先に説明したＣＬ２Ａリンカーを用いて調製した複合体を指す。ヒト血清におけるインビトロでの研究は、活性のあるＳＮ−３８部分のおよそ５０％がＩｇＧから毎日放出される（Ｃａｒｄｉｌｌｏら，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７〜３１６９）。ＣＬ２Ｅと命名した別のリンカー（米国特許第７，９９９，０８３号及び第８，０８０，２５０号を参照されたい）は、ヒト血清中で１４日間にわたって安定であるが、当該リンカーは、リソソーム中で処理される場合にＳＮ−３８の放出を容易にするためのカテプシンＢ切断部位を含有している。ＣＬ２Ｅを調製する方法ならびにＣＬ２Ａリンカー及びＣＬ２Ｅリンカーの構造は、米国特許第７，９９９，０８３号及び第８，０８０，２５０号に示されている。当該複合体は、ＩｇＧあたりおよそ６個のＳＮ−３８単位を含有していた（例えば、１．０ｍｇのＩｇＧ−ＳＮ−３８複合体は、約１６μｇのＳＮ−３８を含有している）。
【０２７３】
（インビトロでの細胞結合性及び細胞毒性）
４℃で１時間インキュベートした非結合型特異的抗体及び無関連抗体を用いて、フローサイトメトリーを実施し、結合性は、これもまた４℃で１時間インキュベートしたフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）−Ｆｃγフラグメント特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて明らかにした。蛍光中央値は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアパッケージを用いたＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ（登録商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において測定した。
【０２７４】
細胞毒性は、ＭＴＳ色素還元アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。用量応答曲線（ヤギ抗ヒトＦｃγＦ（ａｂ’）２あり／なし、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）は、三つ組の測定の平均から生じ、ＩＣ５０値は、ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（第５版）を用いて計算し、統計比較はデータについての最良当てはめ曲線についてＦ検定を用いた。有意性はＰ＜０．０５に設定した。
【０２７５】
（イムノブロッティング）
検査薬への２４時間または４８時間の曝露の後、初期アポトーシス（ｐ２１発現）及び後期アポトーシス（ＰＡＲＰ切断）のマーカーをウェスタンブロッティングによって明らかにした。
【０２７６】
（インビボでの研究）
皮下Ｒａｍｏｓモデルは、培養物（９５％超の生存率）から４〜６週齢の雌ヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）へと１×１０７個の細胞（０．２ｍｌ）を植え込むことによって開始した。植え込み３週間で、０．４〜０．８ｃｍ３（カリパスによって測定、長さ×幅×厚さ）に及ぶ腫瘍を有する動物を複数群の動物へと分け、各々同じ範囲の腫瘍サイズを有していた。腫瘍サイズ及び体重を週少なくとも１回測定し、腫瘍が３．０ｃｍ３に発達した場合、または当該動物が２０％以上の体重減少を経験した場合、本研究から外した。静脈内ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬモデル及び６９７モデルをそれぞれ、雌重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）における２．５×１０６個及び１×１０７個の細胞の静脈内注射によって開始した。処置は、ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ細胞の投与５日後、及び６９７接種の７日後に開始した。後肢麻痺または代理の生存終了点としての罹患の他の徴候を用いて、動物を毎日観察した。すべての処置は、０．２ｍｌ以下で腹腔内に付与した。具体的な薬用量と頻度は結果の節において説明している。マウスはイリノテカンをＳＮ−３８へ効率よく変換するので、イリノテカン投与は、ＳＮ−３８当量をもとに調整し、ＳＮ−３８モル当量は、ＡＤＣ質量の１．６％及びイリノテカン質量の６０％をもとにする。
【０２７７】
効能は、先に示した通り、代理の生存終了点としての進行までの時間（ＴＴＰ）を用いて、カプラン・マイヤー曲線において表した。統計分析は、ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いた対数順位検定によって実施した（有意性、Ｐ＜０．０５）。
【０２７８】
（結果）
（抗原発現及びインビトロでの細胞毒性）
細胞株はすべて、ＳＮ−３８に対して高い感受性があり、ＥＣ５０値はＤａｕｄｉについての０．１３ｎｍｏｌ／ＬからＲＳ４；１１についての２．２８ｎｍｏｌ／Ｌまで及んだ（表９）。６９７及びＲＳ４；１１を除いては、Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８抗ＣＤ２２複合体は、ＳＮ−３８よりも２〜７倍有効ではなかった。このことは、本発明者らの標的指向型及び他の非標的指向型のＳＮ−３８複合体を用いた共通の発見である。抗原発現の差にもかかわらず、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８及びＶｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、非結合型Ｌｍａｂ−ＣＬ２−ＳＮ−３８抗ＣＥＡＣＡＭ５複合体と類似の効力を有しており、これは、４日間のＭＴＳアッセイの間のＳＮ−３８のおよそ９０％の解離に起因する可能性があった。より短い曝露時間を用いた他のインビトロでの手順はまた、複合体の効力の差を識別する上で有効ではなかった。例えば、１日曝露後のアネキシンＶ染色は、未処置細胞と処置細胞の間の差を見出し損ねた（非表示）。ｐ２１及びＰＡＲＰ切断の上方調節もそれぞれ、アポトーシスの初期マーカー及び後期マーカーとして調査した。Ｒａｍｏｓはｐ２１を発現しなかった。しかしながら、ＰＡＲＰ切断は検出されたが、４８時間曝露の後でしかなく、ＳＮ−３８処置細胞においてより強く発現した（非表示）。ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ細胞株はｐ２１を発現したが、ｐ２１の情報調節もＰＡＲＰ切断もＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８曝露の４８時間後まで明らかではなかった。しかしながら、両方とも、遊離型ＳＮ−３８による２４時間曝露の後で観察された（非表示）。遊離型ＳＮ−３８によるアポトーシス事象の高い強度及びより早期の活性化は、ＩｇＧ結合型と比べて遊離型ＳＮ−３８の低いＥＣ５０と一致しており、本結果は、少なくとも４８時間の曝露時間が必要であるが、この時点でおよそ７５％のＳＮ−３８が当該複合体から放出されたであろうことを示した。
表９．ＦＡＣＳｃａｎによるＣＤ２０及びＣＤ２２の発現ならびにいくつかの造血性腫瘍細胞株に対するＳＮ−３８ならびに特異的Ｅｍａｂ抗ＣＤ２２−ＳＮ３８、Ｖｍａｂ抗ＣＤ２０−ＳＮ−３８、及びＬｍａｂ抗ＣＥＡＣＡＭ５−ＳＮ−３８複合体のＭＴＳアッセイによるインビトロでの細胞毒性
【表９】
0006427789.tif 000012
略語：ＣＩ＝信頼区間、ＮＤ＝非測定。ａ  ＥＣ５０は、Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８におけるＳＮ−３８のモル当量として表した。
【０２７９】
本発明者らは、今回は、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８＋Ｖｍａｂを用いて処置した細胞におけるＰＡＲＰ切断及びｐ２１発現をさらに調査した。Ｒａｍｏｓにおけるより以前の研究を確認するように、ＰＡＲＰ切断はまず、当該複合体への４８時間曝露のみ生じ、架橋性抗体の存在においては発現に変化がない（非表示）。４８時間超のベルツズマブへの曝露は、ＰＡＲＰ切断に及ぼす効果を何ら有さなかったが、切断は、架橋性抗体を添加した２４時間以内で強力であった（非表示）。しかしながら、ベルツズマブ単独（架橋剤なし）をＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と組み合わせると、ＰＡＲＰ切断は２４時間曝露後に生じ（非表示）、ベルツズマブが架橋の非存在下でさえ、アポトーシスのより迅速な開始を誘導することが可能であることを示した。ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ細胞株における唯一の顕著な差は、当該組み合わせが４８時間でｐ２１の発現を大いに亢進したことであり（非表示）、ここでも、ベルツズマブをＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体と組み合わせた場合、アポトーシス誘導の加速をさらに示唆した。Ｒａｍｏｓと比較した場合のＷＳＵ−ＦＳＣＣＬにおけるアポトーシス誘導の遅延は、ＣＤ２２及びＣＤ２０のより低い発現によって説明されそうである。
【０２８０】
超毒性薬はその成熟前放出が毒性を高めるので、しばしば、血清中で非常に安定であるリンカーを用いるが、これらの複合体は、薬剤が最適に送達されるよう内部移行しなければならない。エプラツズマブは迅速に内部移行するので、本発明者らは、ＣＬ２Ａ連結したＥｍａｂ−ＳＮ−３８複合体のインビトロでの細胞毒性を血清安定性ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８複合体と比較して、より安定して連結したＳＮ−３８から利益が得られ得るかどうかを調査した。両複合体は、類似の結合親和性を有していた（非表示）が、より安定したＥｍａｂ−ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８は、３つの細胞株においてＣＬ２Ａ複合体よりもおよそ４０〜５５倍弱かった（非表示）。特異性がＣＬ２Ａ複合体を用いた場合欠失していたが、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８は一貫して、非結合型Ｌｍａｂ−抗ＣＥＡＣＡＭ５−ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８複合体よりもおよそ２倍強力であった（非表示）。本発明者らは、より安定して連結された複合体が、緩徐に内部移行するベルツズマブ複合体に適している可能性は低いと結論付け、それゆえ、ＣＬ２Ａ連結型ＳＮ−３８複合体を用いてのみ、本発明を続行した。
【０２８１】
インビトロでのアッセイの限界のため、効能は、異種移植片モデルにおいて評価した。表９に示すように、リンパ腫細胞株はすべて、ＣＤ２２よりもＣＤ２０の非常により高い発現を有している。Ｄａｕｄｉは、ＣＤ２２及びＣＤ２０の最高の発現を有していたが、非結合型ベルツズマブに対してインビボで非常に感受性があり、インビトロでの検査は、ＳＮ−３８に対する最大の感受性を明らかにした（表９）。これらの特性は、特に非結合型エプラツズマブが動物において有効な治療薬ではない場合、ＳＮ−３８複合体と非結合型抗体とに起因する活性の差を評価することは困難になるであろう。Ｒａｍｏｓは、９０Ｙ−Ｅｍａｂをベルツズマブと組み合わせるための利点を示すために既に使用されており（Ｍａｔｔｅｓら，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：６１５４〜６１６０）、本発明者らは、Ｒａｍｏｓヒトバーキット細胞株におけるＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体及びＶｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体の比較で開始することを決定した。フローサイトメトリーは、ＣＤ２２を上回るＣＤ２０の１５倍高い発現を示したにもかかわらず、Ｒａｍｏｓ異種移植片の免疫組織学的検査は、多量のＣＤ２２及びＣＤ２０を示すとともに、ＣＤ２２は、ＣＤ２０よりも均一に発現しているように見えた（非表示）。
【０２８２】
未処置の動物におけるＲａｍｏｓ異種移植片は、迅速に進行し、０．４ｃｍ３というその開始サイズから６日間以内に３．０ｃｍ３の終了時サイズに到達し（非表示）、既に報告されているように、ベルツズマブもエプラツズマブも十分に確立されたＲａｍｏｓ異種移植片の進行に明らかに影響を及ぼさなかった（Ｓｈａｒｋｅｙら，２００９，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ５０：４４４〜４５３）。他のＳＮ−３８複合体を用いた先行知見と一致して、４週間以内に週２回、０．５ｍｇ／用量処置計画で処置した動物はいずれも、明らかな体重減少がなかった。両複合体は、腫瘍の発達を制御する上で非常に有効であり、動物の８０％以上が、４週間の処置の終了時までに腫瘍に関する証拠がなかった（図６）。０．２５ｍｇのＶｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８用量は、最初の４週間にわたって発達を制御する上でより良好であったが、０．５ｍｇでは、同様に初期の発達制御が両複合体について観察された。したがって、ＣＤ２２よりもＣＤ２０の１５倍高い発現にもかかわらず、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、Ｖｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と比べても遜色がなかった。それゆえ、残りの研究は、Ｅｍａｂ−Ｓ  ＣＬ２Ａ−Ｎ−３８単独に、または非結合型ベルツズマブとの併用に焦点を当てた。
【０２８３】
（Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８用量応答及び特異性）
用量応答関係は、特異的Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体及び無関連のＬｍａｂ−ＣＬ２−ＳＮ−３８複合体について見られたが、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、検査した３つのレベルのうちの２つで有意により良好な発達制御を有しており、中間的な用量の特異的複合体が好ましい強い傾向を有していた（図７）。ここでも、０．２５ｍｇのＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、腫瘍の大部分を減少させ、ここで１０匹の動物のうちの７匹は１２週間のモニタリング期間の終了時に腫瘍がなく、体重の変化がなかった。イリノテカン単独を付与した動物（６．５μｇ／用量、０．２５ｍｇの複合体とほぼ同じＳＮ−３８当量）は、１．９週間の生存中間値を有しており、本研究の終了時には１１匹の動物のうちの３匹は腫瘍がなく、このことは、無関連のＬｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体について３．４５週間の生存中間値とは有意に異ならなかった（Ｐ＝０．４５２、図７Ｃ）。
【０２８４】
６９７接種白血病モデルにおいて、塩類溶液処置した動物の生存中央値は、腫瘍接種からちょうど１７日間であった。非結合型エプラツズマブ＋イリノテカンを付与した動物（０．５ｍｇの当該複合体と同じモル当量のＳＮ−３８）は、同じ生存中央値を有していたのに対し、０．５ｍｇのＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を付与した動物は、腫瘍接種開始７日後に開始の週２回、０．５ｍｇのＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を付与した動物は２４．５日間まで生存し、未処置の動物よりも（Ｐ＜０．０００１）またはイリノテカンとともに付与した非結合型エプラツズマブ（Ｐ＝０．０１６）について有意により長かった。しかしながら、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、無関連の複合体よりも有意に良好ではなく（生存中央値＝２２日間、Ｐ＝０．３０４）、この細胞株におけるＣＤ２２の低い発現を反映していた可能性が最も高い。
【０２８５】
（非結合型Ｖｍａｂ抗ＣＤ２０と組み合わせたＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）
本発明者らは、９０Ｙ−Ｅｍａｂが皮下Ｒａｍｏｓモデルにおいて非結合型ベルツズマブと組み合わせた場合、改良された応答をすでに報告しており（Ｍａｔｔｅｓら，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：６１５４〜６１６０）、したがってこの可能性をＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いて調査した。パイロット研究において、平均およそ０．３ｃｍ３の皮下Ｒａｍｏｓ腫瘍を保有する５匹の動物にベルツズマブ（０．１ｍｇ）、０．１ｍｇのＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８、またはＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８＋Ｖｍａｂを与えた（薬剤はすべて週２回、４週間与えた）。２．０ｃｍ３までのＴＴＰ中央値はそれぞれ２２日、１４日、及び７７日超であり（ベルツズマブ対Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８単独、Ｐ＝０．５９、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８＋Ｖｍａｂ対Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８、Ｐ＝０．０１４５）、ベルツズマブとＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の併用が、全体的な治療応答を改善するという初期徴候を提供した。週２回４週間の治療計画も使用した追跡研究では、０．１ｍｇのＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８＋０．１ｍｇのベルツズマブを与えた１１匹の動物のうちの６匹が治療開始から１６週間、腫瘍に関する証拠がなかったのに対し、ベルツズマブ単独を受容した、または０．１ｍｇの対照Ｌｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いた動物についての生存中央値はそれぞれ、１．９週間及び３．３週間であり、１１匹の動物のうちの３匹が、これらの群の各々において１６週間後に腫瘍がなかった（非表示）。より長いＴＴＰ中央値及びより多くの生存個体にもかかわらず、群間に有意差は認められなかった。したがって、豊富なＣＤ２０及び中程度のレベルのＣＤ２２を有するＲａｍｏｓモデルにおいて、非毒性用量レベルで付与したＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体は、非結合型抗ＣＤ２０療法よりも有意に良好ではなかったが、非結合型抗ＣＤ２０療法へのＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の追加は、毒性なしで応答を改善するように見えた。当該ＳＮ−３８複合体が最高耐容用量よりもかなり低いレベルで付与されることを強調することは重要であり、それゆえ、これらの結果は、非結合型抗ＣＤ２０療法が、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体のものと等しいと解釈されるべきではない。
【０２８６】
ＣＤ２０及びＣＤ２２の低い発現を有するＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ濾胞性ＮＨＬ細胞株を用いた静脈内植え込みモデルにおいて、２つの追加的な研究を実施した（非表示）。塩類溶液処置した動物についての生存時間の中央値は、腫瘍植え込みから４０〜４２日間であった。０．３ｍｇのＡＤＣと同じＳＮ−３８当量を含有する用量で付与したイリノテカン単独（非表示）は、生存中央値を延長した（それぞれ４９日間対４０日間、Ｐ＝０．０４２）が、１５匹の動物のうちの１４匹は、４９日後に疾患の進行に屈し、同日、塩類溶液群における１５匹の動物のうちの最後の４匹を外した（非表示）。当該動物の比較的低いＣＤ２０発現にもかかわらず、ベルツズマブ単独（３５μｇを週２回×４週間）は、本モデルにおいて有効であった。生存中央値は、第一の研究において９１日間まで延び、２個体が治癒し（１６１日後）、第二の研究では７７日間まで延びたが、８９日後に生存個体はなかった（ベルツズマブ単独対塩類溶液処置、両研究においてＰ＜０．００１）。イリノテカン及びベルツズマブと併用した非結合型エプラツズマブ（０．３ｍｇ／用量）は、ベルツズマブ単独と同じ生存中央値を有しており、エプラツズマブもイリノテカンも実質的な応答に貢献していないことを示唆した。
【０２８７】
ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬによる低いＣＤ２２発現のため、予期したように、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８単独は、Ｒａｍｏｓにおいてほど有効ではなかった。０．１５ｍｇ用量で、塩類溶液群を上回る有意な利点は見られなかったが、０．３ｍｇでは、生存中央値は６３日間まで延び、塩類溶液処置動物と比較して有意な改善を提供した（Ｐ＝０．００６）。０．３ｍｇのＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いた第二の研究は、塩類溶液群と比較して高い生存を確認した（７５日間対４０日間、Ｐ＜０．０００１）。この応答の特異性は、第一の研究において明らかではなく、当該研究において、無関連のＬｍａｂ−ＣＬ２−ＳＮ−３８複合体及びＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の生存中央値は、０．１５ｍｇ用量レベルでも０．３ｍｇ用量レベルでも異ならなかった（それぞれ２用量レベルでのＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８対抗ＣＥＡＣＡＭ５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８について４２日間対４９日間及び６３日間対６３日間）。しかしながら、第二の研究において、０．３ｍ用量のＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、無関連の複合体を上回る有意に改善された生存を提供した（７５日間対４９日間、Ｐ＜０．０００１）。ここでも、本モデルにおける特異性を示すのが困難なことは、低いＣＤ２２発現と関連してる可能性が最も高い。
【０２８８】
特異的Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８をベルツズマブと組み合わせると、実質的に生存が延び、対照Ｌｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８よりも応答が頑強であるという証拠がある。例えば、第一の研究において、ベルツズマブ＋０．１５ｍｇまたは０．３ｍｇの対照複合体を用いて処置した動物の生存中央値はそれぞれ、９８日間及び９１日間であり、ベルツズマブ単独の生存中央値と類似していた（９１日、非表示）。しかしながら、ベルツズマブ＋０．１５ｍｇの特異的Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体は、生存中央値を１４０日間まで延ばした。この改善は、ベルツズマブ単独よりも有意に高いことはなかった（Ｐ＝０．２５７）が、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８用量がベルツズマブを用いて０．３ｍｇまで上げた場合、１０匹の動物のうちの６匹は、本研究の終了時に生きたままであり、対照複合体＋ベルツズマブを上回る有意な生存利点を提供した（Ｐ＝０．０００２）。第二の研究において、ベルツズマブ単独の生存中央値は、第一におけるよりも短かった（７７日間対９１日間）が、ベルツズマブを用いた対照複合体についての生存中央値は、再度９１日間であり、これは今や、ベルツズマブ単独を上回る有意な生存利点を生じた（Ｐ＜０．０００１）。特異的Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体をベルツズマブと組み合わせると、生存中央値は１２６日間まで延び、これは、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８及びベルツズマブ単独それぞれについての７５日間及び７７日間の生存中央値よりも有意に長かった（各々についてＰ＜０．０００１）。しかしながら、このことは、本研究において、対照の抗ＣＥＡＣＡＭ５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体との組み合わせを上回る統計的な改善についての必要条件をあまり満たさなかった（Ｐ＝０．０７８）。
【０２８９】
（考察）
過去１０年間にわたって、ＡＤＣは、癌療法における実質的な前進をなしてきたが、またいくつかの後退もあった。この前進は、研究者が、単独で使用するには毒性が高過ぎるが、抗体へ連結した場合にこれらのいわゆる超毒性薬が前臨床検査において実質的に改善された応答を生じる薬剤を調査するために選択した場合に大いに生じた。ホジキンリンパ腫におけるオーリスタチン複合体であるブレンツキシマブベドチンの近年の認可、及び非結合型トラスツズマブに対して屈する乳癌における単一薬剤としてのトラスツズマブ−ＤＭ１抗ＨＥＲ２−マイタンシン複合体を用いた臨床的な成功は、これらの超毒性薬を保有するＡＤＣが、認められた治療様式となりつつあることを示唆している。しかしながら、ピコモル濃度範囲でそれら自体が強力である薬剤を用いて調製した複合体は、抗ＣＤ３３−カリチアマイシン複合体であるゲムツズマブ・オゾガマイシンの市場からの撤去をする近年の決定が示唆するように、毒性についての高い危険性を有する可能性がある（Ｒａｖａｎｄｉ，２０１１，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２９：３４９〜３５１）。したがって、ＡＤＣの成功は、薬剤及び抗体を互いに結合する適切な化学物質を識別すること、ならびに細胞毒性薬の適切かつ選択的送達を許容するために十分に発現した適切な標的を規定することに依存し得る。
【０２９０】
本発明者らは、ＳＮ−３８が血清中の複合体から緩徐に放出できる（１日当たり約５０％）、ＳＮ−３８をＩｇＧへ連結するためのＣＬ２Ａリンカーを開発した。このリンカーを用いて、緩徐に内部移行する抗体は、有効な治療薬であり得、おそらくその理由は、内部移行することがなくても、腫瘍へ局在する抗体が十分量の薬剤を局所的に放出するからである。ＣＬ２Ａリンカーはまた近年、迅速に内部移行することが報告されているＴＲＯＰ−２に対する抗体とともに使用された（Ｃａｒｄｉｌｌｏら，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７〜３１６９）。したがって、緩徐な放出機序が内部移行性及び非内部移行性の抗体に有益であると思われる。
【０２９１】
本報では、本発明者らは、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療のために、迅速に内部移行する抗ＣＤ２２  ＩｇＧであるエプラツズマブ、及び緩徐に内部移行する抗ＣＤ２０  ＩｇＧであるベルツズマブを用いて調製したＳＮ−３８複合体を比較することによって、ＣＬ２Ａリンカーに関する本発明者らの評価を拡張した。エプラツズマブのネズミ親を用いた先行研究は、１時間以内に抗体のほとんどが内部移行し、ＣＤ２２の５０％が５時間以内に細胞表面上に再度発現することを示した（Ｓｈｉｈら，１９９４，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５６：５３８〜５４５）。この内部移行及び再発現の過程は、ＣＤ２２のより低い表面発現を補償し得る細胞内送達を可能にするであろう。Ｂ細胞悪性腫瘍の多くがＣＤ２２よりもＣＤ２０を非常に多く発現するので、ＣＤ２０を標的にする複合体は、その毒性負荷を腫瘍の中に局在した後に放出することによってより多くのモル量の薬剤を送達し得る。
【０２９２】
インビトロでの細胞毒性は、培地中への複合体からのＳＮ−３８の放出のため、特異的複合体または無関連の複合体でさえその効力を識別することができなかった。実際、ＳＮ−３８単独は、複合体よりも幾分強力であったが、このことは、細胞に進入してトポイソメラーゼＩ型と結合する加速した能力を反映しているのかもしれない。他の研究は、当該複合体が４８時間の曝露を必要とした後にアポトーシスの初期の徴候を見ることができることを明らかにしているので、本発明者らは、インビトロでの検査が、これら２つの複合体の効力を識別することはできないと結論付け、それゆえインビボでの研究に頼った。
【０２９３】
異種移植片モデルにおいて、両複合体は、Ｒａｍｏｓ腫瘍に対して類似の抗腫瘍活性を有していたが、そのフローサイトメトリーは、ＣＤ２２よりもほぼ１５倍高く発現したＣＤ２０を示した。このことは、特にいずれかの薬剤が他の薬剤の結合に干渉するであろうという懸念なく、非結合型Ｖｍａｂ抗ＣＤ２０療法と組み合わせることができるので、Ｅｍａｂ抗ＣＤ２２−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体を選択することに対しる支持を与えた。実際、用量制限毒性はＳＮ−３８含有量によって駆動されるであろうことから、抗ＣＤ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体を使用した場合、与えられたＩｇＧタンパク質用量の合計は、有効な非結合型抗ＣＤ２０抗体治療に典型的に必要なレベルを下回るであろう。より多くの未標識抗ＣＤ２０を抗ＣＤ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体へ加えることは、あえて当該複合体の取り込みを低下させかつその効能を潜在的に低下させる危険があるであろう。しかしながら、本発明者らは、放射性標識したエプラツズマブを非結合型ベルツズマブとともに用いる併用研究において既に示したように、利点は、両薬剤の最大の有効かつ安全な薬用量で与えられた当該薬剤に由来することができる。インビトロでの研究は、ベルツズマブが、シグナル伝達を高めるのに使用する架橋の非存在下でさえ、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８により開始するアポトーシス事象を加速させることを示した。したがって、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体が、抗ＣＤ２０複合体と同程度に有効であった限り、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体を選択することは論理的な選択であり、なぜなら、より有効な併用療法を、抗原のうちの片方または両方の発現が低い腫瘍においてでさえ可能とするからである。
【０２９４】
超毒性薬を用いるたいていのＡＤＣは、安定して連結されているので、本発明者らはまた、血清中で安定だが細胞内切断可能な抗ＣＤ２２−ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８複合体を検査したが、ＣＬ２Ａリンカーを用いた場合よりも４０〜５５倍弱かった。他者らは、抗ＣＤ２０抗体または抗ＣＤ２２抗体へ結合した種々の超毒性薬を調査し、内部移行する複合体が概してより活性があることを発見しただけでなく、緩徐に内部移行する抗体でさえ、放出した薬剤が細胞膜を貫通する場合に有効となり得ることを観察した。ＣＬ２Ａ型のリンカーは、ＳＮ−３８に適し得るが、血清中でのわずかな持効性放出でさえ毒性を高めかつ治療ウィンドウを損なうであろうさらに毒性のある薬剤には適していないかもしれない。
【０２９５】
Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、Ｒａｍｏｓ保有マウスにおいて０．６ｍｇの累積用量で活性があり（７５μｇを週２回、４週間）、これは、ちょうど２．５ｍｇ／ｋｇのヒト用量と推定される。したがって、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、患者における広い治療ウィンドウを有するべきである。さらに、有効かつ安全用量の抗ＴＲＯＰ−２−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体は、毒性の明確な亢進はないが効能の改善された最大耐用量の９０Ｙ標識抗体と組み合わせた（Ｓｈａｒｋｅｙら，２０１１，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １０：１０７２〜１０８１）。したがって、これらのＳＮ−３８抗体複合体の安全性及び効能特性は、他の併用療法にとって非常に好ましい。
【０２９６】
イリノテカンは、造血器癌の治療に決まり切って使用されないが、ＳＮ−３８は、固形腫瘍と同じようにリンパ腫及び白血病細胞株において強力であった（Ｃａｒｄｉｌｌｏら，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７〜３１６９）。ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ細胞株において、特異的ＩｇＧ複合体及び無関連のＩｇＧ複合体は、イリノテカンよりも有意に良好であったのに対し、Ｒａｍｏｓでは、無関連の複合体を用いたＴＴＰ中央値は、イリノテカンよりも長かったが有意に良好ではなかった。これらの結果は、非特異的ＩｇＧが薬剤についての優れた担体であり、遊離薬剤またはアルブミンもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−Ｆｃを用いて調製した複合体よりもインビボで強力であることを示した他の研究と一致している。ＰＥＧ−ＳＮ−３８複合体は、有意な抗腫瘍効果を有していたが、１０〜３０ｍｇ／ｋｇ  ＳＮ−３８当量に及ぶその最大耐用量で付与されていた（Ｓａｐｒａら，２００９，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９４：１４５６〜１４５９）。対照的に、Ｒａｍｏｓを保有する動物へ４週間にわたって与えられたＳＮ−３８の最大累積用量は、１．６ｍｇ／ｋｇに過ぎず（すなわち、０．２５ｍｇのＥｍａｂ−ＳＮ−３８が週２回、４週間にわたって与えられた）、これは非毒性であった。
【０２９７】
Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の特異的治療活性は、より高いＣＤ２２発現で細胞株において改善するように見えた。例えば、Ｒａｍｏｓにおいて、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８単独の特異的治療効果は、調査した３つの異なる用量レベルのうちの２つで記録し、かなりの数の腫瘍が完全になくなった。対照的に、ＣＤ２２の発現が約２．５倍低いＷＳＵ−ＦＳＣＣＬにおいて、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、２つの研究のうちの１つにおいて無関連の抗ＣＥＡＣＡＭ５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体と比較して有意に生存を改善した。しかしながら、非結合型抗ＣＤ２０療法と併用した場合、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３が治療応答を増幅することを強調することは重要である。したがって、これら２つの治療の組み合わせは、ＣＤ２２が高度に発現していない状況においてでさえ、応答を高め得る。
【０２９８】
結論として、あまり安定ではないＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８リンカーを用いた場合、Ｅｍａｂ抗ＣＤ２２−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体は、ＣＤ２０発現がＣＤ２２よりも対数倍高くして余りあるという事実にもかかわらず、類似の抗ＣＤ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体のようにインビボで非毒性用量で等しく活性があった。治療応答は、ＣＤ２２発現が低い場合でさえ、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と非結合型Ｖｍａｂ抗ＣＤ２０療法との併用によって利益を受け、両抗原が存在する場合に、当該併用療法がいくつかのＢ細胞悪性腫瘍における応答を改善し得ることを示唆した。本研究は、この組み合わせが多様なリンパ腫及び白血病前臨床モデルにおいて非常に強力であり、さらに、宿主毒性を比較的持たないように見えることを示唆している。
【０２９９】
（実施例６．ＣＤ７４＋ヒト癌の治療のための抗ＣＤ７４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体）
【０３００】
ＣＤ７４は、抗体結合後に内部移行及び再利用されるので、抗体−薬剤複合体（ＡＤＣ）のための魅力的な標的である。ＣＤ７４はたいてい、血液の癌と関係しているが、固形の癌においても発現する。それゆえ、ＣＤ７４発現固形腫瘍療法のためのヒト化抗ＣＤ７４抗体であるミラツズマブを用いて調製したＡＤＣの有用性を調査した。ミラツズマブ・ドキソルビシン及び２つのミラツズマブ−ＳＮ−３８複合体は、血清中での安定性及びリソソーム中でのＳＮ−３８をどのように放出するかが異なる切断可能なリンカー（ＣＬ２Ａ及びＣＬ２Ｅ）を用いて調製した。ＣＤ７４発現は、フローサイトメトリー及び免疫組織化学的検査によって測定した。インビトロでの細胞毒性及びインビボでの治療薬研究は、ヒト癌細胞株Ａ−３７５（黒色腫）、ＨｕＨ−７及びＨｅｐ−Ｇ２（肝細胞癌）、Ｃａｐａｎ−１（膵癌）、ならびにＮＣＩ−Ｎ８７（胃癌）、ならびにＲａｊｉバーキットリンパ腫において実施した。ミラツズマブ−ＳＮ−３８  ＡＤＣは、標的抗原を発現する異種移植片において抗ＴＲＯＰ−２抗体及び抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体を用いて調製したＳＮ−３８  ＡＤＣと比較した。
【０３０１】
ミラツズマブ・ドキソルビシンは、リンパ腫モデルにおいて最も有効であったのに対し、Ａ−３７５及びＣａｐａｎ−１では、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８のみが治療上の有益性を示した。ＴＲＯＰ−２またはＣＥＡＣＡＭ６と比べてＣＤ７４の非常の低い表面発現にもかかわらず、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、抗ＴＲＯＰ−２−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と類似の効能をＣａｐａｎ−１において有していたが、ＮＣＩ−Ｎ８７では、抗ＣＥＡＣＡＭ６複合体及び抗ＴＲＯＰ−２複合体が優れていた。単回用量レベルでの２つの肝細胞癌細胞株における研究は、塩類溶液処置した動物よりも有意な利点を示したが、無関連のＩｇＧ複合体に対してはそうではなかった。ＣＤ７４は、いくつかの固形腫瘍異種移植片においてＡＤＣに適した標的であり、効能はＣＤ７４発現の均一性によって大きく影響を受け、ＣＬ２Ａ連結型ＳＮ−３８複合体は、最良の治療応答を提供した。
【０３０２】
（序論）
不変鎖またはＩｉと呼ばれるＣＤ７４は、ＨＬＡ−ＤＲと結合してクラスＩＩ抗原提示構造に対する抗原性ペプチドの結合を阻害するＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ７４は、不変鎖複合体をエンドソーム及びリソソームへ配向するシャペロン分子として機能し、ＮＦ−κＢによって仲介される経路を用いて、及びＣＤ４４との相互作用を介したＴ細胞応答においてはＢ細胞の成熟におけるアクセサリー分子として機能し（Ｎａｕｊｏｋａｓら，１９９３，Ｃｅｌｌ  ７４：２５７〜２６８）、ならびにＣＤ７４は、炎症促進性サイトカインのための受容体である、細胞増殖経路及び生存経路を活性化することに関与するマクロファージ遊走阻止因子である（Ｌｅｎｇら，２００３，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７：１４６７〜１４７６）。
【０３０３】
正常ヒト組織において、ＣＤ７４は主としてＢ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、活性化Ｔ細胞のサブセット、及び胸腺上皮に発現し（非表示）、Ｂ細胞腫瘍の９０％超に発現する（Ｂｕｒｔｏｎら，２００４，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：６６０６〜６６１１、Ｓｔｅｉｎら，２００４，Ｂｌｏｏｄ  １０４：３７０５〜３７１１）。初期の研究では、ＣＤ７４が膜に存在するかどうかに関する矛盾したデータがあり、その理由の一部は、不変鎖に対する抗体が、当該分子の細胞質部分に特異的であったからだけでなく、表面上にコピーが比較的ほとんどなく、細胞表面上でのＣＤ７４の半減期が非常に短いからである。細胞表面上のＣＤ７４のおよそ８０％は、ＭＨＣＩＩ抗原ＨＬＡ−ＤＲと結合している（Ｒｏｃｈｅら，１９９３，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：８５８１〜８５８５）。ネズミ抗ＣＤ７４抗体ＬＬ１を用いて、Ｒａｊｉバーキットリンパ腫細胞株は、４．８×１０４コピー／個を有していると概算されたが、迅速な細胞内移行のため、１日当たり約８×１０６個の抗体分子が内部移行及び異化した（Ｈａｎｓｅｎら，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３２０：２９３〜３００）。したがって、ＣＤ７４の内部移行は非常に動的であり、当該抗体は表面から迅速に移動して細胞の内側へ下ろした後、表面上にＣＤ７４が再度発現する。Ｆａｂ’の内部移行は、ＩｇＧ結合とちょうど同程度に迅速に生じ、二価結合が必要ではないことを示している。ネズミＬＬ１のＣＤＲグラフト版であるミラツズマブ（ｈＬＬ１）を用いたより後期の研究は、抗体がＢ細胞増殖、遊走、及び接着分子発現を変化させることができることを発見した（Ｓｔｅｉｎら，２００４，Ｂｌｏｏｄ  １０４：３７０５〜３７１１、Ｑｕら，２００２，Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ａｓｓｏｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４３：２５５、Ｆｒｏｌｉｃｈら，２０１２，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  １４：Ｒ５４）が、抗ＣＤ７４抗体の例外的な内部移行特性によって、癌治療薬の細胞内送達のための効率的な担体となった（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，２００３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９：６５６７〜６５７１）。前臨床効能及び毒性学的検査の結果をもとに、多発性骨髄腫（Ｋａｕｆｍａｎら，２００８，ＡＳＨ年次学会要約集，１１２：３６９７）、ならびに非ホジキンリンパ腫及び慢性リンパ球性白血病におけるミラツズマブ・ドキソルビシンを用いた第Ｉ相臨床治験が開始された。
【０３０４】
興味深いことに、ＣＤ７４はまた、癌、腎癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、ある特定の肉腫、及び膠芽腫のような非造血器癌において発現し（例えば、Ｇｏｌｄら，２０１０，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ  ４：１〜１２）、それゆえ、この抗原を発現する固形腫瘍のための治療標的であり得る。ミラツズマブ・ドキソルビシン複合体は、血液癌のモデルにおいて非常に活性があるので、この評価のための論理的な選択となった。しかしながら、本発明者らは近年、非常に強力なトポイソメラーゼＩ型阻害薬ＳＮ−３８を抗体へ連結するための手順を開発した。ＳＮ−３８は、イリノテカンの活性型であり、その薬理学的特徴及び代謝は周知である。これらの複合体は、固形腫瘍細胞株においてナノモル濃度の効力を有しており、活発に内部移行していない抗体を用いて活性があることがわかった。先行研究は、血清中でより安定したまたはあまり安定していないかのいずれかである他のリンカーよりもむしろ、血清中の複合体から約１日の半減期でＳＮ−３８が解離することができるリンカー（ＣＬ２Ａ）についての優先性を示した。しかしながら、ミラツズマブの例外的な内部移行能を考慮して、血清中で非常に安定だが、リソソーム中に取り込まれるとＳＮ−３８を放出することができる新たなリンカー（ＣＬ２Ｅ）が開発された。
【０３０５】
本研究は、主として固形腫瘍に対する有効な療法のための、これらの３つのミラツズマブ抗ＣＤ７４複合体、すなわち、ドキソルビシンとの１つの複合体、及び２つのＳＮ−３８複合体を用いるための見通しを調査する。
【０３０６】
（材料及び方法）
（ヒト腫瘍細胞株）
Ｒａｊｉバーキットリンパ腫Ａ３７５（黒色腫）、Ｃａｐａｎ−１（膵腺癌）、ＮＣＩ−Ｎ８７（胃癌）、Ｈｅｐ−Ｇ２肝細胞癌及びＭＣ／ＣＡＲ骨髄腫細胞株は、米国培養細胞系統保存機関（バージニア州マナサス市）から購入した。ＨｕＨ−７肝細胞癌細胞株はヒューマンサイエンス研究資源バンク（日本国大阪府）から購入した。細胞株はすべて、加湿した３７℃のＣＯ２インキュベーター（５％）の中で、１０％〜２０％のウシ胎児血清及び補足物質を含有する推奨培地中で培養した。細胞を５０回未満継代し、マイコプラズマについて規則的にチェックした。
【０３０７】
（抗体及び結合方法）
ミラツズマブ（抗ＣＤ７４ＭＡｂ）、エプラツズマブ（抗ＣＤ２２）、ベルツズマブ（抗ＣＤ２０）、ラベツズマブ（抗ＣＥＡＣＡＭ５）、ｈＭＮ１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、及びｈＲＳ７（抗ＴＲＯＰ−２）は、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。先の実施例において説明した通り、ＣＬ２Ａリンカー及びＣＬ２ＥリンカーならびにこれらのＳＮ−３８誘導体を調製して、抗体へ結合させた。ミラツズマブ・ドキソルビシン複合体は、先に説明されている通り調製した（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，２００３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９：６５６７〜６５７１）。複合体はすべて、ＩｇＧのジスルフィド還元の後に、これらのリンカーの対応するマレイミド誘導体との反応によって調製した。分光測光分析は、薬剤：ＩｇＧモル置換比が５〜７であると概算した（１．０ｍｇのタンパク質は、約１６μｇのＳＮ−３８または２５μｇのドキソルビシン当量を含有する）。
【０３０８】
（インビトロでの細胞結合性及び細胞毒性）
非結合型及び結合型のミラツズマブの細胞結合性を抗原陽性細胞及び細胞毒性検査と比較するアッセイは、ＭＴＳ色素還元法（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マジソン市）を用いた。
【０３０９】
（フローサイトメトリー及び免疫組織化学的検査）
フローサイトメトリーは、膜結合型抗原または膜及び細胞質抗原のみの評価を提供する様式で実施した。免疫組織化学的検査は、皮下腫瘍異種移植片のホルマリン固定し、パラフィン包埋した切片において実施し、抗現追跡法を用いずに染色し、抗ヒトＩｇＧ複合体を用いて明らかにされる１０μｇ／ｍｌで抗体を用いた。
【０３１０】
（インビボ試験）
雌ヌードマウス（４〜８週齢）または雌ＳＣＩＤマウス（７週齢）はＴａｃｏｎｉｃ（ニューヨーク州ジャーマンタウン地区）から購入し、１週間の検疫の後で使用した。試薬はすべて、塩類溶液対照を含め、週２回、４週間腹腔内投与した。指定用量は結果に示している。毒性は、毎週の体重測定によって評価した。Ｒａｊｉバーキットリンパ腫モデルについては、ＳＣＩＤマウスに、０．１ｍｌ培地中の２．５×１０６個のＲａｊｉ細胞を静脈内注射した。５日後、動物は複合体または塩類溶液の単回静脈内注射（０．１ｍｌ）を受けた（Ｎ＝１０匹／群）。マウスは、苦痛及び麻痺についての徴候について毎日観察し、後肢麻痺が発症したか、初期体重の１５％超の減少か、またはそうでなければ瀕死（代用生存終了点）の場合のいずれかで安楽死させた。
【０３１１】
皮下腫瘍は、２次元でカリパスによって測定し、腫瘍の体積（ＴＶ）はＬ×ｗ２／２として算出し、式中Ｌは最長の直径であり、かつｗは最短の直径である。測定は週に少なくとも１回行い、動物は腫瘍が１．０ｃｍ３まで発達したときに屠殺された（すなわち、代用生存終了点）。Ａ−３７５黒色腫細胞株（０．２ｍｌ中の６×１０６個）をヌードマウスに植え込み、療法は腫瘍の平均が０．２３±０．０６ｃｍ３になったときに開始した（Ｎ＝８匹／群）。Ｃａｐａｎ−１は、ヌードマウスにおいて、組織培養物由来の８×１０６個の細胞と組み合わせた連続継代腫瘍由来の腫瘍懸濁液（１５％（ｗ／ｖ）腫瘍懸濁液０．３ｍｌ）の組み合わせを用いて皮下に植え込んだ。治療は、ＴＶの平均が０．２７±０．０５ｃｍ３になったときに開始した（Ｎ＝１０匹／群）。ＮＣＩ−Ｎ８７胃腫瘍異種移植片は、マトリゲルと末期培養物由来の１×１０７個の細胞からなる１：１（ｖ／ｖ）の混合物を０．２ｍｌ皮下注射することによって開始した。療法は、ＴＶの平均が０．２４９±０．０４５ｃｍ３になったときに開始した（Ｎ＝７匹／群）。同じ手順は、ヌードマウスにおけるＨｅｐ−Ｇ２及びＨｕＨ−７肝細胞癌異種移植片を発達させるために従った。療法は、Ｈｅｐ−Ｇ２の平均が０．３６４±０．０６２ｃｍ３になったとき（Ｎ＝５匹／群）及びＨｕＨ−７の平均が０．２９８±０．０５５ｃｍ３となったとき（Ｎ＝５匹／群）に開始した。
【０３１２】
効能は、生存時間中央値を決定するために、上記の代用終了点を用いて、カプラン・マイヤー生存曲線において表す。分析は、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（カリフォルニア州ラホヤ地区）を用いた対数順位（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定によって実施し、有意性はＰ＜０．０５とした。
【０３１３】
（結果）
（ヒト腫瘍細胞株及び異種移植片におけるＣＤ７４発現）
４つの異なる固形腫瘍種類由来の６系統の細胞株を、主として透過処理した細胞の分析に基づいてＣＤ７４陽性と識別し（表１０）、その理由は、固形腫瘍細胞株における膜のみのＣＤ７４のＭＦＩが背景ＭＦＩよりも２倍未満高かったからである（Ａ−３７５黒色腫細胞株を除く）。Ｒａｊｉにおける表面ＣＤ７４発現は、固形腫瘍細胞株よりも５倍超高かったが、透過処理したＲａｊｉ細胞における総ＣＤ７４は、固形腫瘍細胞株のほとんどと類似していた。
表１０．ミラツズマブ陽性ゲーティング処理細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表したフローサイトメトリーによるＣＤ７４の発現
【表１０】
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【０３１４】
免疫組織学的検査は、Ｒａｊｉ皮下異種移植片が非常に均一なかつ強度の高い染色を有しており、顕著な細胞表面標識を伴っていた（非表示）。Ｈｅｐ−Ｇ２肝細胞癌細胞株は、固形腫瘍の最も均一な取り込みを有しており、中程度の強さであったが主として細胞質を染色し（非表示）、次いでＡ−３７５黒色腫細胞株は、幾分均一さの低い染色を有しており、より強度は高いがほぼ細胞質に発現した（非表示）。Ｃａｐａｎ−１膵癌細胞株（非表示）及びＮＣＩ−Ｎ８７（非表示）胃癌細胞株は、中程度（Ｃａｐａｎ−１）から高強度（ＮＣＩ−Ｎ８７）のＣＤ７４染色を有していたが、均一に分布してはいなかった。ＨｕＨ−７肝細胞癌細胞株（非表示）は、最も均一度が低く、最も弱い染色を有していた。
【０３１５】
（複合体の免疫反応性）
非結合型ミラツズマブ、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ３８複合体及びミラツズマブ−ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８複合体についてのＫｄ値は、有意に異なっておらず、それぞれ平均で０．７７ｎＭ、０．５９ｎＭ、及び０．８０ｎＭであった。ＭＣ／ＣＡＲ多発性骨髄腫細胞株において測定した非結合型ミラツズマブ及びドキソルビシン結合型ミラツズマブについてのＫｄ値はそれぞれ、０．５±０．０２ｎＭ及び０．８±０．２ｎＭであった（Ｓａｐｒａら，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：１８８８〜１８９６）。
【０３１６】
（複合体のインビトロでの薬剤放出及び血清安定性）
メルカプトエタノールでキャッピングしたＣＬ２Ａリンカー及びＣＬ２ＥリンカーからのＳＮ−３８の放出機序は、リソソーム条件を部分的に模倣する環境、すなわち、低ｐＨ（ｐＨ５．０）において、及びカテプシンＢの存在下または非存在下で決定した。ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８基質は、酵素の非存在下でｐＨ５で不活性であった（非表示）が、カテプシンＢ存在下では、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ部位での切断は迅速に進行し、半減期は３４分であった（非表示）。活性型ＳＮ−３８の形成は、ＳＮ−３８の１０番目の位置におけるカルバミン酸結合の分子内環化を必要とし、このことは、より緩徐に生じ、半減期は１０．７時間であった（非表示）。
【０３１７】
期待したように、カテプシンＢは、ＣＬ２Ａリンカーにおける活性型ＳＮ−３８の放出に及ぼす効果はなかった。しかしながら、ＣＬ２Ａは、切断可能な炭酸ベンジル結合を有しており、ｐＨ５．０でのＣＬ２Ｅリンカーと類似の速度で活性型ＳＮ−３８を放出し、半減期は約１０．２時間であった（非表示）。ｐＨ感受性のあるアシルヒドラゾン結合を有するミラツズマブ・ドキソルビシン複合体は、半減期がｐＨ５．０で７〜８時間であった（非表示）。
【０３１８】
これらのリンカーは全部、リソソーム関連条件下で相対的に類似の速度で薬剤を放出するが、血清中での非常に異なる安定性を有している。ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、２１．５５±０．１７時間で遊離ＳＮ−３８の５０％を放出し（非表示）、他のＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と一致した。しかしながら、ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８複合体は非常に不活性であり、半減期は約２１００時間に至ると推定した。ミラツズマブ・ドキソルビシン複合体は、ドキソルビシンの５０％を９８時間で放出し、これは、２つの他の抗体−ドキソルビシン複合体と同様であった（非表示）
【０３１９】
（細胞毒性）
これらの複合体の評価に関する重要な点は、造血器腫瘍細胞株及び固形腫瘍細胞株における遊離型ドキソルビシン及びＳＮ−３８の相対的な効力であった。本発明者らのグループは、ＳＮ−３８がいくつかのＢ細胞リンパ腫細胞株及び急性白血病細胞株において活性があり、効力は０．１３ｎＭから２．２８ｎＭに及ぶことをすでに報告した（Ｓｈａｒｋｅｙら，２０１１，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：２２４〜２３４）。インビボ療法研究のために後で使用する固形腫瘍細胞株のうちの４系統におけるＳＮ−３８効力は、２．０ｎＭから６ｎＭに及んだ（非表示）。ドキソルビシンは、まちまちの応答を有しており、Ｒａｊｉリンパ腫細胞株及びＡ−３７５黒色腫細胞株においては３〜４ｎＭの効力であったが、Ｃａｐａｎ−１細胞株、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞株、及びＨｅｐ−Ｇ２細胞株に対してはほぼ１０倍低かった。ＳＮ−３８の効力をドキソルビシンと比較する他の研究は、ＬＳ１７４Ｔ結腸癌では１８：１８（それぞれ、ＳＮ−３８対ドキソルビシンのｎＭ効力）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌では２：２ｎＭ、ＳＫ−ＯＶ−４卵巣癌では１８：９０ｎＭ、Ｃａｌｕ−３肺腺癌では３２：５８２ｎＭ、Ｃａｐａｎ−２膵癌では、３７：２２１ｎＭ、及びＮＣＩ−Ｈ４６６小細胞肺癌では０．１：２ｎＭであることを発見した。したがって、ＳＮ−３８は、これらの細胞株のうちの４系統においてドキソルビシンよりも５〜２０倍高い効力であり、ＬＳ１７４Ｔ及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１において同様の効力であった。集約的に、これらのデータは、ドキソルビシンがＳＮ−３８よりも固形腫瘍に対してあまり有効ではないのに対し、ＳＮ−３８が固形腫瘍及び造血器腫瘍において等しく有効であるように見えることを示している。
【０３２０】
期待したように、３つの複合体形態はしばしば、インビトロでの遊離薬よりもいくばくか低い効力の程度であったが、その理由は、薬剤複合体は、細胞内に薬剤を輸送するための抗体結合を必要としていながら、両薬剤が、細胞へ容易に輸送されると期待されるためである（非表示）。ＣＬ２Ａ連結したＳＮ−３８複合体は例外であり、その理由は、ＳＮ−３８の９０％超が４日間のアッセイ期間にわたって複合体から培地へと放出されるからである（Ｃａｒｄｉｌｌｏら，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７〜３１６９、Ｓｈａｒｋｅｙら，２０１１，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：２２４〜２３４）。したがって、複合体を迅速に内部移行する場合でさえ、遊離薬とＣＬ２Ａ連結薬の間の差を識別することは困難であろう。
【０３２１】
安定したＣＬ２Ｅ連結型ＳＮ−３８は、遊離型ＳＮ−３８と比較してＲａｊｉ細胞株において比較的充分に実施したが、４系統の固形腫瘍細胞株において実質的に（７〜１６倍）低い効力を有しており、Ｃｄ７４の比較的低い表面発現が、これらの固形腫瘍における薬剤輸送を最小限にする上である役割を担ってい得ることを示唆している。ミラツズマブ・ドキソルビシン複合体は、細胞株すべてにおいて遊離ドキソルビシンと比較した場合、効力の実質的な差があり、固形腫瘍細胞株において遊離型ＳＮ−３８に対するＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８複合体と同様の程度であった。
【０３２２】
上記の６系統の追加的な細胞株において、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体は、ミラツズマブ・ドキソルビシン複合体よりも９〜６０倍強力であったが（非表示）、さらにこの結果は、ＣＬ２Ａ連結型複合体が、４日間のインキュベーション期間にわたってＳＮ−３８のほとんどを培地中へ放出するのに対し、ドキソルビシン複合体は、この同じ期間にわたって当該複合体の薬剤のせいぜい５０％を放出するであろうという事実によって大いに影響された。ＣＬ２Ｅ連結型ミラツズマブは、これらの他の細胞株において調査しなかった。
【０３２３】
（ヒト腫瘍異種移植片のインビボでの療法）
種々の抗体を用いて調製したミラツズマブ・ドキソルビシン複合体またはＳＮ−３８合体を用いたインビボでの先行研究は、当該複合体が最高耐容量よりもはるかに低い用量で有効であることを示し（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，２００３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９：６５６７〜６５７１、Ｓａｐｒａら，２００５，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：５２５７〜５２６４、Ｇｏｖｉｎｄａｎら，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２〜６０６１、Ｃａｒｄｉｌｌｏら，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７〜３１６９、Ｓｈａｒｋｅｙら，２０１１，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：２２４〜２３４）、したがって、十分に耐容するレベルで各複合体の同様だが固定した量を比較することに焦点を絞ってインビボで検査した。
【０３２４】
ミラツズマブ・ドキソルビシン複合体が２つのＳＮ−３８複合体とどのように比較するかを判断するために、最初の研究はまず、播種したリンパ腫Ｒａｊｉモデルにおいてドキソルビシン複合体及びＳＮ−３８複合体を調査した（非表示）。特異的複合体はすべて、非標的化ラベツズマブ−ＳＮ−３８複合体または塩類溶液で処理した、生存中央値が２０日間でしかない動物よりも有意に良好であった（Ｐ＜０．０００１）。ＲａｊｉにおけるＳＮ−３８複合体についての８倍と同程度の利点を示すインビトロでの研究にも関わらず、最良の生存は、ミラツズマブ・ドキソルビシン複合体を用いて見られ、１７．５ｍｇ／ｋｇ（３５０μｇ）の単回用量を付与した動物全部及び２．０ｍｇ／ｋｇ（４０μｇ）を付与した１０匹の動物のうちの７匹は、本研究の終了時に生存していた（１１２日後）（例えば、１７．５ｍｇ／ｋｇ用量ミラツズマブ・ドキソルビシン対ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８、Ｐ＝０．００１２）。生存は、より安定なＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８複合体について有意により低かった（ＣＬ２Ａ対ＣＬ２Ｅについてそれぞれ、Ｐ＜０．０００１及びＰ＝０．０１９７、１７．５ｍｇ／ｋｇ用量及び２．０ｍｇ／ｋｇ用量）が、インビトロでの研究は、両複合体が内部移行する場合に同様の速度で活性型ＳＮ−３８を放出するであろうことを示唆した。
【０３２５】
５系統の固形腫瘍細胞株を調査し、Ａ−３７５黒色腫細胞株で開始し、その理由はドキソルビシン及びＳＮ−３８に対するインビトロの応答が最良であったからである。Ａ−３７５異種移植片は迅速に発達し、塩類溶液処置対照動物の生存中央値は１０．５日間に過ぎなかった（非表示）。１２．５ｍｇ／ｋｇ（１個体あたり０．２５ｍｇ）の週２回用量のミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体は、２８日間まで生存を延長させ（Ｐ＝０．０００６）、これは、１７．５日間の生存中央値を有する対照のエプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体よりも有意に良好であり（Ｐ＝０．００８９）、後者は、塩類処置動物とは有意に異ならなかった（Ｐ＝０．１９６７）。ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ複合体は、ミラツズマブ−ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８複合体よりも有意に長い生存を提供し（Ｐ＝０．００１４）、対照のエプラツズマブ−ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８複合体と同じ１４日間の生存中央値であった。ＳＮ−３８複合体よりも２倍多い用量のミラツズマブ・ドキソルビシン複合体を付与したにもかかわらず、生存中央値は、塩類処置動物よりも良好ではなかった（１０．５日間）。
【０３２６】
Ａ−３７５黒色腫モデルを用いた場合、Ｃａｐａｎ−１において、ＣＬ２Ａ連結型ＳＮ−３８複合体のみが有効であり、生存中央値は３５日間であり、より低用量（５ｍｇ／ｇ、１個体あたり１００μｇ）（Ｐ＜０．０２）でさえ、未処置の動物とは有意に異なっていた（Ｐ＜０．０３６）（非表示）。ミラツズマブ−ＣＬ２Ｅ複合体も非標的化エプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体も、または２倍多量の用量のミラツズマブ・ドキソルビシン複合体も、いずれの生存利点も提供しなかった（Ｐ＝０．４４対塩類溶液）。同じ用量の内部移行性抗ＴＲＯＰ−２−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体（ｈＲＳ７−ＳＮ−３８、ＩＭＭＵ−１３２）を付与した動物を用いた同じ研究において、生存中央値はミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と等しかった（非表示）ことは注目すべきである。ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体は、種々の固形腫瘍を治療するための関心対象のＡＤＣとして既に同定されていた（Ｃａｒｄｉｌｌｏら，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７〜３１６９）。Ｃａｐａｎ−１に及ぼす表面結合型ｈＲＳ７についてのＭＦＩは、ミラツズマブについての２２（表１０を参照されたい）と比較して２３７であった（非表示）。したがって、実質的により低い表面抗原発現を有するにもかかわらず、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体は、本モデルにおけるｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体と同様に挙動した。
【０３２７】
固形腫瘍異種移植片のうちの２系統における比較的劣悪な治療結果を有するミラツズマブ・ドキソルビシン複合体を用いる場合、ミラツズマブ−ＳＮ−３８複合体を、多くの固形腫瘍の表面により多量に発現するＴＲＯＰ−２（ｈＲＳ７）またはＣＥＡＣＡＭ６（ｈＭＮ−１５）（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら，２００７，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ７：２、Ｓｔｅｉｎら，１９９３，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５５：９３８〜９４６）に対する他のヒト化抗体を用いて調製したＳＮ−３８複合体と比較するよう焦点は移行した。３つの追加的な異種移植片モデルを調査した。
【０３２８】
胃腫瘍モデルＮＣＩ−８７において、１７．５ｍｇ／ｋｇ／用量（３５０μｇ）のミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を付与した動物は、生存において幾分改善を提供したが、塩類溶液処置動物（３１日間対１４日間、Ｐ＝０．０７６０）または非結合型ベルツズマブ抗ＣＤ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ３９複合体（２１日間、Ｐ＝０．３１２８）と比較して、統計的有意性を満たし損ねた（非表示）。しかしながら、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ複合体及びｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ複合体は、生存中央値をそれぞれ６６日間及び６３日間まで有意に改善した（Ｐ＝０．０００１）。表面発現型ＴＲＯＰ−２及びＣＥＡＣＡＭ６についてのＭＦＩはそれぞれ、７９５及び１１２３であり、５でしかなかったＣＤ７４よりも非常に高かった（表１０を参照されたい）。免疫組織化学的検査は、この細胞株の異種移植片におけるＣＤ７４の比較的高強度の細胞質発現を示したが、重要なことに、当該発現は散乱しており、当該腫瘍内の規定されたポケットにのみ現れた（非表示）。ＣＥＡＣＡＭ６及びＴＲＯＰ−２は、ＣＤ７４よりも均一に発現しており（非表示）、ＣＥＡＣＡＭ６は、細胞質及び膜上の両方により多量に存在し、ＴＲＯＰ−２は主として膜上に認められた。したがって、抗ＣＥＡＣＡＭ６複合体及び抗ＴＲＯＰ−２複合体を用いて改善された生存は、ＮＣＩ−Ｎ８７におけるより高い抗原密度及びより均一な発現の両方を有望に反映している可能性が最も高い。
【０３２９】
Ｈｅｐ−Ｇ２肝細胞癌細胞株において（非表示）、免疫組織化学的検査は、非常に均一な発現を示すとともに、ＣＤ７４の細胞質染色は中程度であり、かつフローサイトメトリーは比較的低い表面発現を示した（ＭＦＩ＝９）。ｈＭＮ−１５を用いたＭＦＩは１７５であり、免疫組織化学的検査は、かなり均一な膜及び細胞質でのＣＥＡＣＡＭ６の発現を示すとともに、非常に高強度の膜染色の分離したポケットがあった（非表示）。Ｈｅｐ−Ｇ２異種移植片を保有する動物における試験は、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８が、塩類処置群における２１日間と比較して４５日間まで生存を延ばした（Ｐ＝０．００４８）のに対し、ｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体は３５日間まで生存を改善した。ｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を上回るミラツズマブ複合体に有利な傾向があったが、統計的有意性には到達しなかった（４６日間対３５日間、Ｐ＝０．０８０２）。しかしながら、非結合型ベルツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体は、ミラツズマブ複合体と同様な生存有利性を提供した。本発明者らは、非結合型複合体を用いた治療結果が、特により高いタンパク質用量で特異的ＣＬ２Ａ連結型複合体と同様である可能性があることをすでに観察していたが、特異的複合体及び対照複合体の力価は通常、選択的に明らかとなった。したがって、特異的複合体のいずれも、この細胞株におけるこれらの用量で選択的な治療上の有利性を提供しなかった。
【０３３０】
Ｈｅｐ−Ｇ２と類似の表面発現を有するがわずかにより低い細胞質レベルを有するＨｕＨ−７肝細胞癌細胞株（表１０を参照されたい）を用いた別の試験（非表示）は、有意に異なることはないにもかかわらず、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ複合体よりも長い（３５日間対１８日間）という生存上の有利性を提供するｈＭＮ−１５−ＳＮ−３８複合体を発見した（Ｐ＝０．２９４４）。ｈＭＮ−１５複合体及びミラツズマブ複合体の両方が塩類処置動物よりも有意に良好であった（それぞれＰ＝０．００８及び０．００９）が、ここでも、複合体のいずれもが、この用量レベルで標的に向かわないベルツズマブ−ＳＮ−３８複合体とは有意に異ならなかった（それぞれ、Ｐ＝０．４６０２及び０．９０３３）。ＣＥＡＣＡＭ６表面発現は、この細胞株において比較的低く（ＭＦＩ＝８１）、免疫組織化学的検査は、ＣＤ７４（非表示）及びＣＥＡＣＡＭ６（非表示）の両方とも非常にわずかであり、かなり散乱していることを示した。
【０３３１】
（考察）
腫瘍選択的化学療法のための抗体−薬剤複合体（ＡＤＣ）のアプローチは、現在かなり関心の高い分野である（例えば、Ｇｏｖｉｎｄａｎら，２０１２，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １２：８７３〜８９０、Ｓａｐｒａら，２０１１，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０：１１３１〜１１４９）。近年の臨床上の成功（Ｐｒｏら，２０１２，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １２：１４１５〜１４２１、ＬｏＲｕｓｓｏら，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：４３７〜４４７）は、大部分、既に使用されてきた従来の化学療法薬の代わりに、超毒性薬の採用を用いて生じてきた。しかしながら、標的選択、抗体、及び薬剤リンカーはすべて、ＡＤＣの最適な性能に影響する因子である。例えば、トラスツズマブ−ＤＭ１の場合、ＨＥＲ２はこの抗原を発現する腫瘍において豊富であり、抗体は内部移行し、抗体自体は抗腫瘍活性を有し、これらがすべて治療結果を高めるよう組み合わさり得る。完全に対照的に、ＣＤ７４は、細胞表面上で非常により低いレベルで発現しているが、その独特な内部移行特性及び表面再発現特性によって、ミラツズマブ抗ＣＤ７４  ＡＤＣが、ドキソルビシンのような中程度の毒性薬を用いた場合でさえ、造血器癌異種移植片モデルにおいて有効であることができた（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，２００３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９：６５６７〜６５７１、Ｓａｐｒａら，２００５，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：５２５７〜５２６４）。ドキソルビシンは、造血器癌においてより頻繁に使用されるが、ＳＮ−３８及び他のカンプトテシン類が固形腫瘍患者へ投与されるのに対し、本発明者らは、固形腫瘍におけるドキソルビシン複合体及びミラツズマブのＳＮ−３８複合体の有用性を評価することを決断した。ミラツズマブ−ドキソルビシン複合体は、種々の造血器癌の異種移植片モデルにおいて有効であり、臨床試験に至った（ＮＣＴ０１１０１５９４及びＮＣＴ０１５８５６８８）のに対し、いくつかのＳＮ−３８複合体は、固形腫瘍モデル及び造血器腫瘍モデルにおいて有効であり、２つの新たなＳＮ−３８複合体が結腸直腸癌及び多様な上皮癌の第Ｉ相臨床治験において探求されるに至った（ＮＣＴ０１２７０６９８及びＮＣＴ０１６３１５５２）。
【０３３２】
インビトロでの非結合型ドキソルビシン及びＳＮ−３８は、Ｒａｊｉリンパ腫細胞株に対してドキソルビシンと同様の効力を有していたが、ＳＮ−３８は、いくつかの異なる固形腫瘍細胞株においてより強力であった。興味深いことに、インビボでのミラツズマブ−ドキソルビシン複合体は、ミラツズマブ−ＳＮ−３８複合体と比較して、Ｒａｊｉにおける最良の応答を提供した。しかしながら、Ｃａｐａｎ−１及びＡ−３７５において、ミラツズマブ−ドキソルビシンは、ＣＬ２Ａ連結型ＳＮ−３８ミラツズマブ複合体と比べてあまり有効ではなかったが、インビトロでの検査は、Ａ−３７５が遊離ＳＮ−３８に対するのと等しく、遊離ドキソルビシンに対して感受性があることを示した。２つの他の細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌及びＬＳ１７４Ｔ結腸癌も、遊離型ドキソルビシンを用いた場合、インビトロでのＳＮ−３８と同様の効力を有していたが、インビトロでの検査は、ＳＮ−３８が固形癌及び血液癌において等しく有効であることを示し、かつＳＮ−３８は評価したたいていの固形腫瘍細胞株においてドキソルビシンよりも５〜２０倍高い効力を有するので、本発明者らは、固形腫瘍療法のための２つのミラツズマブ−ＳＮ−３８複合体に焦点を絞ることを決断した。しかしながら、ミラツズマブ−ＳＮ−３８複合体の有用性をより良好に評価するために、本発明者らは、種々の固形腫瘍において存在する他の抗原に対する抗体を用いて調製したＳＮ−３８  ＡＤＣに対する比較評価を含んだ。
【０３３３】
本発明者らは、以前Ｃａｐａｎ−１細胞株における内部移行性ｈＲＳ７抗ＴＲＯＰ−２  ＣＬ２Ａ連結型ＳＮ−３８複合体を用いた治療応答を研究し（Ｃａｒｄｉｌｌｏら２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７〜３１６９）、それゆえ、ミラツズマブ複合体及びｈＲＳ７  ＳＮ−３８複合体の効能を比較した。本研究において、両複合体は、対照抗体と比較して生存を有意に改善し、各々のＣＬ２Ａ連結型ＳＮ−３８複合体は、ＣＬ２Ｅ連結型複合体よりも優れていた。フローサイトメトリーは、ＴＲＯＰ−２発現がＣａｐａｎ−１におけるＣＤ７４よりも高いことを示したので、本結果は、例外的であることが公知であるＣＤ７４の輸送能が、ＴＲＯＰ−２よりも効率的であることを示唆した。しかしながら、抗原到達性（すなわち、膜対細胞質の生理学的な及び「結合部位」の遮断）及び腫瘍内での細胞間の分布は、標的指向化療法のいずれの形態にも影響する決定的な因子であり、特に、個々の細胞への生成物の適切な細胞内送達に左右される因子であることは周知である（Ｔｈｕｒｂｅｒら，２００８，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ  Ｒｅｖ  ６０：１４２１〜１４３４）。抗原が腫瘍内の細胞すべてにおいて均一には発現しない状況において、ＣＬ２Ａ連結型複合体のような腫瘍中に局在した後にその搭載物を緩徐に放出する標的指向化薬を有することは、非標的指向化バイスタンダー細胞へ薬剤を分散させることができ、それにより当該薬剤の効能範囲を高めるであろう。実際、多量の抗原発現は、結合部位遮断効果により腫瘍侵入を潜在的に妨害するが、細胞外放出機序は、薬剤が腫瘍内へ拡散する機序を提供し得る。この機序はまた、本発明者らが本明細書で使用する抗ＣＥＡＣＡＭ５及び抗ＣＥＡＣＡＭ６のようなあまり内部移行しない抗体を用いて調査した他の複合体の効能を支援すると考えられる。ミラツズマブ系複合体は、腫瘍細胞との抗体の直接的な相互作用により著しく依存しており、ＣＤ７４の迅速な内部移行及び、細胞表面上でのより低い存在度を補償できる再発現を利用する。しかしながら、この利点は、ＣＤ７４が腫瘍内で非常に散乱している場合に軽減され、腫瘍内で当該複合体を保有する機序なしでは、薬剤の当該複合体からの緩徐な放出に関する有益性は失われるであろう。本発明者らのグループによるヒト消化管腫瘍に関する先行総説は、ヒト消化管腫瘍が、良好な均一性で高レベルの発現をしばしば有することを示唆している（Ｇｏｌｄら，２０１０，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ  ４：１〜１２）。
【０３３４】
ＳＮ−３８についての適切なリンカーに関する本発明者らの初期評価の間、ＣＬ２Ａリンカーと類似の、ＳＮ−３８の２０ヒドロキシル位で連結されるよう設計した「ＣＬ２Ｅ」様リンカーを含むいくつかの異なる誘導体を調査した。しかしながら、当該抗体複合体は、十分な抗腫瘍活性を欠失しており、探求されなかった。ミラツズマブの例外的な内部移行特性を考慮して、本発明者らは、ＳＮ−３８−リンカー化学物質を再考することを決断し、ＣＤ７４複合体の迅速な内部移行が、より安定である複合体の薬剤搭載を高めるであろうという仮説を用いた。本発明者らは、脱離基がフェノール性である場合、このことは環化を促進し、それゆえ、ＣＬ２Ｅ−リンカーは、ＳＮ−３８のフェノール性１０位で接合するよう設計されると推測した。
【０３３５】
開始時に、ＣＬ２Ｅ連結型ＳＮ−３８複合体は、Ｒａｊｉ細胞株におけるＣＬ２Ａ複合体と顕著に類似のＩＣ５０を有しており、このことは、迅速に内部移行した場合に両複合体がほぼ同じ速度でＳＮ−３８の活性型を放出するであろうという見解と一致した。しかしながら、すでに記載したように、ＣＬ２Ａ複合体のインビトロでの活性は、培地中へのＳＮ−３８の放出によって大きく影響され、未処置の複合体による取り込みを必ずしも反映していない。ＣＬ２Ｅ連結型複合体は、ＣＬ２Ａ複合体よりも固形腫瘍細胞株において非常に弱いことが分かっている場合、このことは、ＣＤ７４のより低い表面発現がミラツズマブ結合を介したＳＮ−３８の内部移行に影響することを示唆した。しかしながら、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８がＣＬ２Ｅ複合体よりも優れていることをＲａｊｉにおけるインビボでの研究が示したとき、ＣＬ２Ｅの効能に影響するであろういくつかの他の因子を検討しなければならなかった。考えられる説明の１つは、ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８のリンカー設計が薬剤の２０位を誘導体化していないままにしており、ラクトン基を開環に影響されやすいようにしているというものである。実際、イリノテカンを用いた研究は、ＳＮ−３８の効力がいくつかの因子によって低減するとともに、カルボン酸形態に対して開いているラクトン環は、未処置のラクトン形態の効力の１０％しか有していないことを示した。対照的に、ＣＬ２Ａ連結型ＳＮ−３８は、２０ヒドロキシル位で誘導体化されており、生理学的条件下でカンプトテシンにおけるラクトン基を安定化する過程である。それゆえ、ＳＮ−３８のラクトン環は、ＣＬ２Ａにおける切断から保護されているようだが、ＣＬ２Ｅ複合体においてはそうではない。したがって、ラクトン環の脱安定化は、インビボでのＣＬ２Ｅの低減した効能に寄与した可能性があり得る。インビトロでの安定性試験及び血清安定性の分析が酸性条件下で実施されたので、本発明者らは、これらの複合体のいずれかにおけるＳＮ−３８のカルボン酸形態の直接的な基準を有していない。
【０３３６】
結論として、インビトロ及びインビボでの結果は、ミラツズマブ−ドキソルビシン複合体がＲａｊｉリンパ腫細胞株においてＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体よりも優れていることを示し、このことはＣＬ２Ａ複合体と比較してドキソルビシン複合体の改善された安定性を反映しているのかもしれない。しかしながら、ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体が非常に安定であるＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８複合体よりも有効であったという発見は、薬剤の活性化または細胞株の感度に潜在的に関連する他の問題が役割を担っているのかもしれないことを示唆している。
【０３３７】
ＣＤ７４は、細胞生物学において複数の役割を有しており、抗原提示細胞においては、抗原性ペプチドを加工する上でより主たる役割を有している可能性があり、固形腫瘍の場合、その役割は生存に対してより関連し得る。これらの異なる役割は、細胞内輸送及びプロセシングに影響し得る。あるいは、ＣＬ２Ｅ連結型ＳＮ−３８のより低い効能は、ＳＮ−３８におけるラクトン開環反応による薬剤の失活を反映し、特異的リンカーの重要性と関係し得る。最後に、固形腫瘍モデルにおいて、抗原到達性は、他の内部移行性抗体（ｈＲＳ７）またはより到達性があり（表面発現型）かつ豊富である、あまり内部移行しない抗体（ｈＭＮ１５）を用いて調製した複合体に対して測定した場合、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の効力を規定する上で主たる役割を有しているように見える。本発明者らは、この発見が標的指向化療法に対して普遍的であると考えているが、これらの研究は、標的抗原の表面発現が最小限である場合でさえ、ＣＤ７４標的指向化薬の独特な内部移行特性が、有意な効能を提供することができることを少なくとも示した。
【０３３８】
（実施例７．療法屈折性転移性結腸癌（ｍＣＲＣ）を治療するためのｈＲＳ７−ＳＮ−３８（ＩＭＭＵ−１３２）の使用）
患者は、２０１２年１月に転移性疾患を元々提示していた、ｍＣＲＣを罹患している６２歳女性であった。当該患者は、診断２週間後に第一の療法として腹腔鏡下回腸横断結腸切除術を受けた後、ネオアジュバント設定における４周期のＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、５−フルオロウラシル、オキサリプラチン）化学療法を受けた後、肝臓の右葉における転移性病変の除去のために、２０１２年３月に右側肝切除術を受けた。この後、合計１２周期のＦＯＬＦＯＸのために、２０１２年６月にアジュバントＦＯＬＦＯＸ投与計画を再開した。８月に、神経毒性の悪化により、オオキサプラチンを投与計画から外した。当該患者の５−ＦＵの最後の周期は２０１２年９月２５日であった。
【０３３９】
２０１３年１月に実施したＣＴでは、肝臓への転移を示した。次に、当該患者を、ＩＭＭＵ−１３２（ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）研究試験へ登録するための良好な候補として評価した。当該患者の病歴における共存症には、喘息、糖尿病、高血圧、高コレステロール血症、心雑音、裂孔ヘルニア、甲状腺機能低下、手根管症候群（ｃａｒｐｅｌ  ｔｕｎｎｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、緑内障、鬱、むずむず脚症候群、及び神経障害が含まれる。当該患者の手術歴には、卵管結紮（ｔｕｂｏ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）（１９７５年）、甲状腺切除（１９８３年）、胆嚢摘出術（ｃｈｏｌｅｓｃｙｓｔｅｃｔｏｍｙ）（２００１年）、手根管減圧術（ｃａｒｐｅｌ  ｔｕｎｎｅｌ  ｒｅｌｅａｓｅ）（２００８年）、及び緑内障手術が含まれる。
【０３４０】
本治験へ入るとき、当該患者の標的病変は、肝臓左葉における３．１ｃｍの腫瘍であった。非標的病変には、肝臓におけるいくつかの低減衰塊が含まれた。当該患者の基準ＣＥＡは７８１ｎｇ／ｍであった。
【０３４１】
当該患者が説明を受け同意に署名した後、ＩＭＭＵ−１３２を週１回の予定で、２週連続の注入によって付与した後、１週間の休薬、これが一治療周期を構成した。これらの周期は耐容されると反復した。ＩＭＭＵ−１３２の第一の注入（８ｍｇ／ｋｇ）は、２０１３年２月１５日に開始し、顕著な事象なく完了した。当該患者は、第一の周期の経過の間、吐き気（段階２）及び疲労（段階２）を経験し、それ以来、主要な有害事象なしで治療を続行していった。当該患者は、２０１３年３月に脱毛症及び便秘を報告した。２０１３年４月８日実施の第一の応答評価（６回用量後）は、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）によって２９％まで標的病変の縮小を示した。当該患者のＣＥＡレベルは、２０１３年３月２５日に２３０ｎｇ／ｍｌまで低下した。２０１３年５月２３日の第二の応答評価（１０回用量後）では、標的病変は３９％まで縮小し、したがって、ＲＥＣＩＳＴ基準による部分的な応答に相当した。当該患者は、２０１３年６月１４日の時点で治療を続行しており、８ｍｇ／ｋｇで１２用量のｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（ＩＭＭＵ−１３２）を構成する６周期を受けた。当該患者の健康状態及び臨床的症状は、本研究処置を開始して以来、かなり改善した。
【０３４２】
（実施例８．療法屈折性転移性乳癌を治療するためのｈＲＳ７−ＳＮ−３８（ＩＭＭＵ−１３２）の使用）
患者は、２００５年に元々、第ＩＶ期三重陰性乳癌（ＥＲ／ＰＲ陰性、ＨＥＲ−ｎｅｕ陰性）と診断された５７歳女性であった。当該患者は２００５年に左側乳房の腫瘍切除を受けた後、２００５年９月にアジュバント設定における投与集中ＡＣＴを受けた。次に、当該患者は、放射線療法を受け、これは１１月に完了した。当該疾患の局所再発は、患者が、２０１２年初期に反対側（右側）の乳房におけるしこりを触診したときに識別した後、ＣＭＦ（シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル）化学療法を用いて治療した。当該患者の疾患は同年再発し、胸壁の皮膚に転移性病変があった。次に、当該患者は、カルボプラチン＋ＴＡＸＯＬ（登録商標）化学療法投与計画を受け、その間に血小板減少症が結果として生じた。当該患者の疾患は進行し、毎週のドキソルビシンを開始し、これは６回用量続いた。皮膚疾患も進行中であった。２０１２年９月２６日のＦＤＧ−ＰＥＴ走査は、胸壁における疾患の進行及び拡大した固形の腋窩リンパ節を示した。疼痛制御のために当該患者にオキシコドンを与えた。
【０３４３】
当該患者に、２０１２年１０月から２０１３年２月まで（２週間ごとに４か月間）、ＩＸＥＭＰＲＡ（登録商標）を与え、この時には胸壁病変が開いて出血した。次に、当該患者にＸＥＬＯＤＡ（登録商標）を服用させ、これは、手及び足の神経障害ならびに便秘により十分に耐容しなかった。皮膚病変は進行性であり、次に当該患者は、説明を受け同意を与えた後にＩＭＭＵ−１３２治験に登録された。当該患者はまた、甲状腺機能亢進症及び視覚障害の病歴を有しており、ＣＮＳ疾患の高い危険性を有していた（しかしながら、脳ＭＲＩはＣＮＳ疾患について陰性であった）。本治験への登録時には、当該患者の右側乳房における皮膚病変（標的）は、最大径で４．４ｃｍ及び２．０ｃｍを測定した。当該患者は、右側乳房に別の標的病変を有しており、左右の腋窩における各々のリンパ節を肥大させていた。
【０３４４】
第一のＩＭＭＵ−１３２注入（１２ｍｇ／ｋｇ）は、２０１３年３月１２日に開始し、これは十分に耐容した。当該患者の第二の注入は、１週間後の計画してあった注入当日に段階３の好中球絶対数（ＡＮＣ）の減少（０．９）のため、遅延した。１週間の遅延後及びＮＥＵＬＡＳＴＡ（登録商標）を受けた後、当該患者の第二のＩＭＭＵ−１３２を投与し、９ｍｇ／ｋｇで２５％用量減少させた。その後、当該患者は、週１回２週間後に１週間の休薬のプロトコルにより計画通りにＩＭＭＵ−１３２を受けていった。２０１３年５月１７日の当該患者の３周期の療法後の第一の応答評価は、標的病変の長軸半径の合計の４３％の減少を示し、ＲＥＣＩＳＴ基準による部分的な応答に相当していた。当該患者は、９ｍｇ／ｋｇ用量レベルで治療を続行中である。当該患者の健康状態及び臨床症状は、ＩＭＭＵ−１３２を用いた治療を開始して以来かなり改善した。
【０３４５】
（実施例９．難治性転移性非小細胞肺癌を治療するためのｈＲＳ７−ＳＮ−３８（ＩＭＭＵ−１３２）の使用）
これは、非小細胞肺癌と診断された６０歳男性である。当該患者に、カルボプラチン、ベバシズマブからなる化学療法投与計画を６か月間与え、当該患者は応答を示し、次に進行後に、翌２年間にわたってカルボプラチン、エトポシド、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、ゲムシタビンを用いる化学療法のさらなる経過を受け、偶発的な応答は２か月以内続く。次に、患者は、左側縦隔腫瘤が６．５×４ｃｍを測定しかつ胸水がある。
【０３４６】
説明を受け同意に署名した後、当該患者は、隔週に１８ｍｇ／ｋｇの用量でＩＭＭＵ−１３２を与える。第一の２回の注射の間、短時間の好中球減少症及び下痢を経験し、４時間以内に４回の便通があるが、これらは２日以内に解決し、または対症療法的投薬に応答する。合計６回のＩＭＭＵ−１３２の注入後、指標病変のＣＴ評価は２２％の減少を示し、部分的応答をちょうど下回るが、間違いなく腫瘍の縮小である。当該患者は、本療法をさらに２か月間続行し、この時、指数病変径の合計の４５％の腫瘍縮小の部分的応答がＣＴによって示され、したがって、ＲＥＣＩＳＴ基準による部分的な応答に相当する。
【０３４７】
（実施例１０．難治性転移性小細胞肺癌を治療するためのｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（ＩＭＭＵ−１３２）の使用）
これは、小細胞肺癌の診断を下された６５歳女性であり、左肺、腋窩リンパ節を、及び左脳頭頂葉への転移に関するＭＲＩの証拠を包含する。先行化学療法にはカルボプラチン、エトポシド、及びトポテカンが含まれるが、応答は示されない。放射線療法も当該患者の疾患を制御し損なう。次に、当該患者に１８ｍｇ／ｋｇの用量でＩＭＭＵ−１３２を３週間に１回、合計５回の注入を与える。第二の用量の後、当該患者は、低血圧及び段階２の好中球減少症を経験し、これらは次の注入の前に改善する。第五の注入の後、ＣＴ試験は、当該患者の標的左肺のしこりの１３％の縮小を示す。脳のＭＲＩもこの転移の１０％の減少を示す。当該患者は、ＩＭＭＵ−１３２投薬を３週間ごとにさらに３か月間続行し、容態の客観的及び主観的改善を示し続け、左肺のしこりの２５％の減少及び脳の転移の２１％の減少がある。
【０３４８】
（実施例１１．第ＩＶ期転移性疾患の胃癌患者のｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（ＩＭＭＵ−１３２）を用いた療法）
この患者は、喫煙及び４０年間にわたる長期間の過剰なアルコール摂取歴のある６０歳男性である。当該患者は、体重減少、摂食不快及び制酸薬によって緩和されない疼痛、頻繁な腹痛、腰痛、ならびに最近では両腋窩における触知可能なリンパ節を経験している。当該患者は、医学的アドバイスを求め、精密検査後、いくつかの扁平特徴を含む腺癌を胃食道接合部に有することを、胃内視鏡を介した生検をもとにして示される。放射線試験（ＣＴ及びＦＤＧ−ＰＥＴ）はまた、左右の腋窩、縦隔領域、腰椎、及び肝臓（右葉に２つの腫瘍及び左葉に１つの腫瘍、すべて直径２ｃｍと４ｃｍの間で測定）における転移性疾患を明らかにする。当該患者の胃腫瘍は切除され、次に当該患者はエピルビシン、シスプラチン、及び５−フルオロウラシルを用いた一連の化学療法を受ける。投薬４か月及び休薬６週間の後、当該患者はドセタキセル化学療法へと切り替わり、これも転移性腫瘍及びいくつかの全身的な悪化に関するＣＴ測定によって確認される進行をもとにすると、当該患者の疾患を制御し損なっている。
【０３４９】
次に、当該患者に、ＩＭＭＵ−１３２（ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）を１０ｍｇ／ｋｇの用量で用いる療法を隔週で注入し合計６回用量与えた後、ＣＴ試験を実施して、当該患者の状態を評価する。これらの注入は十分耐容性があり、何らかの軽度の吐き気及び下痢を伴っており、対症療法的投薬を用いて制御されている。ＣＴ試験は、当該患者の指標の転移性病変の合計が２８％まで低下したことを明らかにするので、当該患者はさらに５つのコースについて本療法を続行する。追跡ＣＴ試験は、当該疾患がＩＭＭＵ−１３２療法に先立つ当該患者の基準値測定に由来するＲＥＣＩＳＴ基準によって約３５％低下したままであることを示し、当該患者の全身の容態はまた、改善されたように見え、当該患者は、制御下にある自身の疾患への楽観的態度を取り戻している。
【０３５０】
（実施例１２．ＩＭＭＵ−１３０（ラベツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）のみを用いた、先行化学免疫療法に対して難治性の進行性結腸癌患者の療法）
当該患者は、第ＩＶ期転移性結腸癌の病歴を持つ５０歳男性であり、２００８年に最初に診断され、原発性結腸癌及び転移性結腸癌に対してそれぞれ結腸切除術及び部分的肝切除術を行った。次に、当該患者は図８に示すように、イリノテカン、オキサリプラチン、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ（５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｕｒａｃｉｌ）、ロイコボリン、イリノテカン、オキサリプラチン）、及びベバシズマブ、ならびに５−フルオロウラシル／ロイコボリンと併用したベバシズマブを含む化学療法をほぼ２年間受けた。その後、当該患者には、セツキシマブ単独またはＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、５−フルオロウラシル、イリノテカン）化学療法と併用したコースを翌年以降与えた。２００９年には、当該患者は、化学免疫療法を受けながらも肝臓への転移に対するラジオ波焼灼療法を受け、２０１０年後期には、当該患者は、肺への転移の楔形切除を受け、これは、数か月後の２０１１年初期に再度行われた。２０１１年の化学免疫療法を受けたにもかかわらず、新たな肺転移が２０１１年の終わりに現れ、２０１２年には肺及び肝臓への転移が可視化された。当該患者の基準血漿癌胎児性抗原（ＣＥＡ）力価は、ＩＭＭＵ−１３０を用いた抗体−薬剤療法を受けるちょうど前に１２．５ｎｇ／ｍｌであった。コンピュータ断層撮影法によって腫瘍サイズの変化を測定するために放射線科医によって選択された指標病変は、右側の肺の中葉及び肝臓への転移であり、両方とも、ＩＭＭＵ−１３０（抗ＣＥＡＣＡＭ５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）療法前の基準での最長直径の合計として総計９１ｍｍであった。
【０３５１】
この患者は、緩徐な静脈内注入によるＩＭＭＵ−１３０の１６ｍｇ／ｋｇの複数回用量を隔週で合計１７治療用量受けた。当該患者は、当該療法に十分耐容性があり、第一の治療の後、段階１の吐き気、下痢及び疲労しかなく、これらは治療４及び治療５の後に生じたがその後はなく、その理由はこれらの副作用についての投薬を受けたからである。治療３の後、当該患者は脱毛症（段階２）を示し、これはその後の両方の間存在した。吐き気、下痢、及び偶発的な嘔吐は２〜３日間しか持続せず、第一の注入後の疲労は２週間続いた。その他の点では、当該患者は当該療法に耐容性が十分あった。このＳＮ−３８と結合したヒト化（ＣＤＲグラフト化）抗体を受けている長期間のため、当該患者の血液は抗ラベツズマブ抗体について測定し、１６回用量の後でさえ検出されなかった。
【０３５２】
最初のコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）測定は４回の治療後に行い、指標病変においてこの両方に先立って基準値で実施した測定の合計から２８．６％の変化を示した。８回の治療の後、この低下は４０．６％になり、したがって、ＲＥＣＩＳＴ基準による部分的な寛解に相当した。この応答は、さらに２か月間維持し、この時、当該患者のＣＴ測定は、指標病変が基準値測定よりも３１．９％低いが、測定した４０．６％の先行低下よりも幾分高いことを示した。したがって、肺及び肝臓における指標病変の注意深いＣＴ測定をもとに、イリノテカン（ＳＮ−３８の親分子）を含む先行する化学療法及び免疫療法に失敗したこの患者は、抗ＣＥＡＣＡＭ５ヒト化抗体であるラベツズマブ（ｈＭＮ−１４）を介して標的指向化した場合、イリノテカン（またはカンプトテシン）の活性代謝産物であるＳＮ−３８に対する客観的な応答を示した。インビボでＳＮ−３８を放出することによってイリノテカン（ＣＰＴ−１１）が作用するが、患者が自身の最後のイリノテカン含有療法に対して早期に応答し損なった後に部分的な応答を誘導することによって、結腸直腸癌患者において、ＳＮ−３８結合型抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体が有効であることを立証したことは驚きであった。当該患者の血漿ＣＥＡ力価の低下はまた、ＣＴ知見を確証し、第三の療法用量の後、基準値レベルは１２．６ｎｇ／ｍｌから２．１ｎｇ／ｍｌへ落ち、８回目と１２回目の間は１．７ｎｇ／ｍｌと３．６ｎｇ／ｍｌの間であった。ＣＥＡの正常血漿力価は通常、２．５ｎｇ／ｍｌと５．０ｎｇ／ｍｌの間であるとみなされるので、本療法は、当該患者の血中ＣＥＡ力価の正常化を果たした。
【０３５３】
（実施例１３．ＩＭＭＵ−１３０を用いた進行性結腸癌患者の療法）
この患者は、転移性結腸癌（第ＩＶ期）と最初に診断された７５歳女性である。当該患者は、結腸右半切除術及び小腸切除をした後、ＦＯＬＦＯＸ療法、ＦＯＬＦＯＸ＋ベバシズマブ療法、ＦＯＬＦＩＲＩ＋ラムシルマブ療法、及びＦＯＬＦＩＲＩ＋セツキシマブ療法を１年半受け、この時当該患者は疾患の進行を示し、疾患が後部盲嚢、大網、へと広がり、当該患者の骨盤の中には腹水が、及び胸腔の右側には胸水がある。本療法の直前の当該患者の基準ＣＥＡ力価は１５ｎｇ／ｍｌである。当該患者は、６ｍｇ／ｋｇのＩＭＭＵ−１３０（抗ＣＥＡＣＡＭ５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）を週２回、２週間連続で与えられた後、１週間休薬し（３週間周期）、これを２０用量超について行い、これは非常に十分耐容性があり、いずれの主たる血液学的毒性及び非血液学的毒性も有していない。療法の２か月以内に、当該患者の血漿ＣＥＡ力価は１．３ｎｇ／ｍｌまで中程度に弱まるが、８週間の評価で当該患者は指標腫瘍病変の２１％の縮小を示し、これは、１３週間で２７％の縮小まで高まる。驚くべきことに、患者の腹水及び胸水は両方ともこの時点で減少し（後者は消失）、したがって、患者の全体的な状態を顕著に改善する。当該患者は研究用療法を続行する。
【０３５４】
（実施例１４．ＩＭＭＵ−１３０を用いて治療される第ＩＶ期転移性疾患を罹患している胃癌患者）
当該患者は、摂食に関する６年間の胃の不快及び疼痛のため、治療を求めていた５２歳男性であり、過去１２か月間で体重減少をしている。胃の領域の触診で固いしこりが明らかとなり、次に当該しこりは胃内視鏡で検査され、当該患者の胃の下部に潰瘍性腫瘤が明らかとなる。これを生検し、胃腺癌として診断する。実験室での検査で、具体的な異常な変化は明らかとならないが、例外は、肝機能検査、ＬＤＨ、及びＣＥＡが高いことであり、後者は１０．２ｎｇ／ｍｌである。次に、患者は、全身ＰＥＴ走査を受け、これは、胃腫瘍に加えて、左腋窩及び肝臓右葉において転移性疾患を明らかにする（２つの小さな転移）。当該患者は、胃腫瘍を切除した後、転移性腫瘍の基準ＣＴ測定を受ける。手術４週間後、当該患者はシスプラチン及び５−フルオロウラシル（ＣＦ）の投与計画からなる３コースの併用療法を受けるが、これに十分耐容性がなく、そのため、ドセタキセルを用いた治療へ切り替える。当該疾患はＣＴ走査をもとにすると、約４か月間安定化しているが、その後、当該患者のさらなる体重減少、腹痛、食欲喪失、極度の疲労という愁訴から、反復したＣＴ試験を行い、当該試験は、合計２０％まで転移の大きさの増加及び元の胃切除の部位の疑わしい病変を示す。
【０３５５】
次に、患者は８ｍｇ／ｋｇの週間計画をもとにしたＩＭＭＵ−１３０（抗ＣＥＡＣＡＭ５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）を用いた実験的な療法を付与される。当該患者はこれに十分耐容性があるが、３週間後に段階２の好中球減少症及び段階１の下痢を示す。当該患者の第４の注入は、１週間ほど延期された後、週間注入が再開され、次の４回の注射については下痢及び好中球減少症に関する証拠はない。当該患者は次に、この転移性腫瘍のサイズを測定して胃切除の元の領域を見るために、ＣＴ試験を受ける。放射線科医は、ＲＥＣＩＳＴ基準により、ＩＭＭＵ−１３０療法前の基準値と比較して２３％の転移性病変の合計の減少を測定する。元の胃切除の領域にはいずれの明らかな病変もあるようには見えない。この時の患者のＣＥＡ力価は７．２ｎｇ／ｍｌであり、これは１４．５ｎｇ／ｍｌのＩＭＭＵ−１３０前の基準値から非常に減少している。患者は、８．０ｇ／ｋｇの同じ用量で週間ＩＭＭＵ−１３０療法に関して続行し、合計１３回の注入の後、当該患者のＣＴ試験は、肝臓への１つの転移が消失しかつ転移性病変すべての合計が４１％減少することを示し、ＲＥＣＩＳＴによる部分的応答に相当している。当該患者の全身容態は改善し、当該患者は、３週間に１回の８ｍｇ／ｋｇのＩＭＭＵ−１３０の維持療法をさらに４回の注射について受け続けながら、自身の通常の活動を再開する。血中ＣＥＡの最後の測定で、値は４．８ｎｇ／ｍｌであり、これは喫煙者についての正常範囲内であり、当該患者について当てはまるものである。
【０３５６】
（実施例１５．再発性三重陰性転移性乳癌のｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いた療法）
ベバシズマブ＋パクリタキセルを用いて、応答なくすでに治療した三重陰性転移性乳癌を罹患している５８歳女性は、いくつかの肋骨、腰椎への転移を表しており、孤立性病変は左肺において直径３ｃｍを測定し、かなりの骨痛及び疲労がある。当該患者に、ＩｇＧあたり６分子のＳＮ−３８と結合した抗ＣＥＡＣＡＭ６ヒト化モノクローナル抗体ｈＭＮ−１５ＩｇＧを用いた実験的療法を与える。当該患者に３週間ごとに１２ｍｇ／ｋｇの注入を４回について一連の療法として反復する。一過性の段階２の好中球減少症及び数回の初期の下痢を除き、当該患者は当該療法に十分に耐容性があり、次に、当該療法を反復し、２か月間の休薬後、さらにもう一回のコースを受ける。放射線検査は、当該患者がＲＥＣＩＳＴ基準による部分的な応答を有することを示しており、その理由は、指標病変の径の合計が３９％減少するからである。骨痛を含む当該患者の全身容態も改善し、当該患者は、病気前とほぼ同レベルの活動に復帰する。
【０３５７】
（実施例１６．再発型の概して屈折性の転移性結腸癌のｈＭＮ−１５−ＳＮ−３８を用いた療法）
４６歳女性は第ＩＶ期転移性結腸癌を罹患しており、原発性病変の切除の先行歴があり、当該患者はまた、肝臓の両葉への同期した肝臓転移、及び右肺への拡散に関する単一の焦点を有しており、これらの転移はＣＴによって２ｃｍと５ｃｍの間の径と測定された。当該患者は、３年間の期間にわたって、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、オキサリプラチン、セツキシマブ、及びベバシズマブを含む種々のコースの化学療法を受けている。２つの場合において、疾患の安定化または短期間応答に関する証拠があるが、測定した病変の３０％以上の減少はない。当該患者の血漿ＣＥＡ力価は、ｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８療法前の基準値で４６ｎｇ／ｍｌであり、総指標病変は合計で９２ｍｍを測定する。
【０３５８】
ｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いた療法は、毎週１２ｍｇ／ｋｇで２週間で開始し、その後の１週間は休薬期間であり、２１日周期内である。この周期を３回反復し、単に一過性の好中球減少症及び消化管の副作用（吐き気、嘔吐、下痢）しかない。驚くべきことに、ＦＯＬＦＩＲＩ療法（イリノテカン、またはＣＰＴ−１１を含む）に応答し損ねているにもかかわらず、当該患者は、療法を完了した後にＲＥＣＩＳＴ基準による部分的な応答を示す。次に、当該患者は、本療法に関する１６ｍｇ／ｋｇの用量で月１回を次の６か月間という維持計画に置かれる。追跡走査は、当該患者の疾患が、部分的応答（ＰＲ）として制御下にあるままであり、かつ当該患者が９０％のカルノフスキー（Ｋａａａｒｎｏｆｓｋｙ）・パフォーマンス・ステータスにおいて概して良好な容態にあることを示している。
【０３５９】
（実施例１７．抗ＣＳＡｐ−ＳＮ−３８複合体を用いて治療される、第ＩＶ期転移性疾患を罹患している結腸癌患者）
本患者は肝臓の左葉への及び両肺への結腸癌転移を表し、９ｃｍのＳ字結腸腺癌の切除を受けた後、ＦＯＬＦＩＲＩ及びセツキシマブを用いた６か月間の化学免疫療法を受け、次にＦＯＬＦＯＸの後、ベバシズマブをさらに約９か月の期間受ける。初期切除に次ぐ療法の開始の１０か月後、安定したと思われていた疾患は、病変の発達及び左副腎においてみられる新たな転移によって進行を示す。この時点での当該患者の血漿ＣＥＡは５２ｎｇ／ｍｌであり、当該患者の全身容態は、腹痛、疲労、及び境界性貧血を罹患して悪化していたように見え、おそらく内出血を示唆している。
【０３６０】
当該患者は、今やｈＭｕ−９（抗ＣＳＡｐ）抗体のＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体を１２ｍｇ／ｋｇの用量で毎週を週２回与えられており、治療周期として１週間休薬した後、追加的な治療周期について反復し、血球計数を毎週測定し、消化管反応に対してアトロピン投薬を受ける。段階２の脱毛症は、第一の治療周期後にみられるが、段階１の好中球減少症のみである。３回の治療周期後、当該患者の血漿ＣＥＡ力価は１９ｎｇ／ｍｌまで低下し、このとき当該患者のＣＴ測定は、肝臓及び肺における指標病変の２４．１％の低下を示す。さらなる３回の治療後、ＣＴにおける３１．４％の指標腫瘍病変の減少、及び副腎腫瘤のサイズの約４０％の減少を示す。本患者は、抗ＣＳＡｐ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抗体−薬剤療法へ応答中であるとみなし、本療法を続行する。当該患者の全身容態は、改善されたように見え、疲労低下、腹痛及び不快のないこと、ならびに概してより活力がある。
【０３６１】
（実施例１８．抗ＣＥＡＣＡＭ６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８免疫複合体を用いた乳癌の治療）
本患者は、三重陰性（エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体及びＨｅｒ２／ｎｅｕを発現していない）の転移性乳癌を罹患しており、当該乳癌は、過去３年にわたるいくつかの異なる療法後に再発している。当該患者は、両肺に、ならびに当該患者のＣ４、Ｃ５、Ｔ２、及びＴ３椎骨への転移、ならびにいくつかの肋骨へ両側性にいくつかの小さな腫瘍を表している。当該患者は、溶骨性病変のための標準的な療法下にあり、今では１６ｍｇ／ｋｇの用量のｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を週１回、３週間用いた治療を開始し、１週間の休薬に続き、この３週間周期療法をさらに２回再開する。療法２週間後、ＣＴ走査を実施して応答を評価したところ、小さな肺転移のうちの２つが消失したのに対し、より大きな病変のうちの１つは、約４０％減少したように見えることが特記される。脊椎への転移はなおも存在するが、Ｃ４及びＣ５の病変は、約２５％小さいように見える。肋骨への転移のうち、６個の小さな病変のうちの２つは、サイズが大変非常に減少するように見え、可視的なまたは小さな領域の瘢痕または壊死があることに関しては確実ではない。当該患者の腫瘍マーカー及び当該患者のＬＤＨ力価は、安定したレベルまたは低いレベルのいずれかを示すように見え、疾患の進行が停止したこと及び疾患の退行に関するいくつかの証拠もあることを示している。主観的に、当該患者は非常により良好に感じており、疲労及び骨痛がより少なく、呼吸が改善されている。当該患者は各療法の後に何らかの最小限の吐き気及び嘔吐を経験したが、１週間以内に解決した。唯一の他の副作用は、一過性の血小板減少症であり、これも７日間以内に解決している。当該患者は観察下にあり、２か月間以内に療法周期を再開する予定である。
【０３６２】
（実施例１９．抗ＣＥＡＣＡＭ５及び抗ＣＥＡＣＡＭ６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８免疫複合体の組み合わせを用いた転移性結腸癌の治療）
本患者は転移性結腸癌を罹患しており、肝臓における疾患（右葉に５ｃｍの病変及び左葉に３ｃｍの病変）及び右肺への２つの転移（２ｃｍ及び３ｃｍのサイズ）に関するＣＴの証拠がある。結腸の原発性癌はすでに切除されており、当該患者は、肝臓及び肺への異時性転移癌のため、術後療法のコースを受けた。療法中、当該肝転移癌は発達し、当該１つの肺転移癌は２つになるので、患者は実験的化学免疫療法についての候補となる。当該患者は次に、二重抗体−薬剤複合体、すなわちラベツズマブ（ｈＭＮ−１４）−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８及びｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８のコースを開始し、各々交互の日で８ｍｇ／ｋｇの用量で週一回を２週間の後、毎月を４か月間反復する。療法の２週間後、患者の状態はＣＴ検査及び実験室での検査によって評価する。ＣＴ走査は、肝右葉における大きな腫瘍が５０％、左葉における腫瘍が約３３％、及び肺への転移が両腫瘍について累積的に約２０％減少することを明らかにする。当該患者の血中ＣＥＡ力価は、療法開始時の２２ｎｇ／ｍｌから本追跡試験における６ｎｇ／ｍｌへと低下する。主観的に、当該患者は、より強壮に感じていると述べており、また日常活動においてより精力的であるように見える。副作用は、療法後２週間以内に正常範囲へ回復する一過性の血小板減少症及び白血球減少症、ならびに制吐薬によって制御される数回の吐き気及び嘔吐である。当該患者は、約２か月後に、疾患状態についてのさらなる精密検査に続いて、これらの療法周期を再開する予定である。
【０３６３】
（実施例２０．抗体−薬剤複合体の持続的注入）
患者は、直腸癌をすでに切除しており、従来治療による術前及び術後の放射線化学療法を受けている。当該患者は、４年間腫瘍がなかったが、今では通例のＣＴ及び追跡血液ＣＥＡ値によって発見された３つの小さな転移性病変が肝右葉にあり、当該病変は初期療法後の３．０ｎｇ／ｍｌから６．３ｎｇ／ｍｌまで上がっている。当該患者は、留置カテーテル及び、２ｍｇ／ｋｇ用量でのラベツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の１７日間にわたる持続的注入を与えられている。当該患者は次に、５週間後に反復持続注入療法を受け、今度は１ｍｇ／ｋｇで３週間である。３週間後、ＣＴ走査及び血中ＣＥＡモニタリングは、肝臓への転移のうちの１つが消失し、その他２つが同じまたはわずかに小さいことを明らかにする。血中ＣＥＡ力価は今では２．４ｎｇ／ｍｌを測定する。当該患者は症候性ではなく、療法下にありながら段階２の吐き気及び嘔吐を、及び段階２の好中球減少症を罹患し、両方とも継時的に解決する。
【０３６４】
（実施例２１．抗ＣＥＡＣＡＭ５免疫複合体を用いた進行性転移性結腸癌の療法）
本患者は、転移性結腸癌について先行療法に失敗している５０歳男性である。第一の療法は、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ＋ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（段階的な様式で漸増）であり、第一の周期においてＩＲＯＸ（イリノテカン＋オキサリプラチン）とともに開始する。本治療を開始した後、当該患者はＣＴを受け、肝転移癌の大きさの減少を示す。これに次いで、腫瘍組織を除去するために手術する。アジュバント化学療法は、第一の投与計画（ＩＲＯＸ部分なし）の持続であり、一過性再発がない期間を生じた。約１年間の間隔の後、ＣＴは肝転移癌の再発を明らかにする。このことによって第二の投与計画（ＦＯＬＦＩＲＩ＋セツキシマブ）が開始される。別のＣＴは、肝転移癌における応答を示す。次に、肝転移癌のＲＦ切除を実施した後、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ＋セツキシマブを用いたアジュバント化学療法を続行した後、セツキシマブをおよそ１年間維持する。別のＣＴ走査は、疾患に関する証拠を示していない。さらなる走査は、起こり得る肺小結節を示しており、これは確認される。このことは、肺小結節の楔形切除に至る。その後、ＦＯＬＦＩＲＩ＋セツキシマブを再開及び続行する。これより後のＣＴ走査は、肺及び肝の両転移癌を示す。
【０３６５】
ｈＭＮ−１４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８免疫複合体の投与の時点で、当該患者は、進行性転移性結腸癌を罹患しており、肺及び肝臓の両方の転移があり、イリノテカン（カンプトテシン）に対して非応答性である。ｈＭＮ−１４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８免疫複合体は、１２ｍｇ／ｋｇの薬用量で投与され、これは隔週で反復される。当該患者は、ＲＥＣＩＳＴ基準による転移性腫瘍の減少を伴う部分的な応答を示す。
【０３６６】
特筆すべきは、この１２ｍｇ／ｋｇ（隔週で付与）のコホートにおける唯一の患者が段階２の血液学的特徴（好中球減少症）を示しており、たいていの患者が段階１または段階２の吐き気、嘔吐、または脱毛症を罹患している（これらは、抗体−薬剤複合体の活性の徴候である）が、十分に耐容性があることである。カンプトテシンの改善された標的化における抗体部分の効果は、非結合型イリノテカンに対して既に耐性があった癌におけるＳＮ−３８部分の効能を説明している。
【０３６７】
（実施例２２．抗ＭＵＣ５ａｃ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８免疫複合体を用いた転移性膵癌の治療）
この４４歳患者は、転移性膵癌の病歴があり、膵臓頭部において手術できない膵十二指腸腺癌があり、肝臓の左葉及び右葉に対する転移を示しており、前者は３×４ｃｍを測定し、後者は２×３ｃｍを測定する。当該患者はゲムシタビンのコースを付与されるが、客観的な応答を何ら示していない。４週間後、当該患者は、８ｍｇ／ｋｇの用量でｈＰＡＭ４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を週２回、２週間静脈内に付与され、１週間休薬の後、さらに２周期反復する。ＣＴ試験を１週間後に実施し、腫瘍腫瘤における３２％の総体的な減少（全部位）を示し（部分的な応答）、それとともに血中ＣＡ１９−９力価は基準値の２２０から放射線評価時の７５へと低下する。当該患者は、抗体−薬剤複合体を用いた各治療後における段階１の吐き気及び嘔吐、最後の治療周期の終了時の段階２の好中球減少症（４週間後に解決）しか示さない。注入反応を防止するための前投薬は付与されていない。
【０３６８】
（実施例２３．療法屈折性転移性結腸癌（ｍＣＲＣ）を治療するためのｈＬ２４３−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の使用）
本患者は、転移性結腸癌を罹患している６７歳男性である。診断直後に横行結腸切除術を受けた後、患者は、ネオアジュバント設定における４周期のＦＯＬＦＯＸ化学療法を受けた後、肝臓左葉における転移性病変の除去のために部分的な肝切除術を受ける。これに次いで、合計１０周期のＦＯＬＦＯＸについてアジュバントＦＯＬＦＯＸ投与計画を行う。
【０３６９】
ＣＴは肝臓への転移を示す。当該患者の標的病変は、肝臓左葉において３．０ｃｍの腫瘍である。非標的病変には、肝臓におけるいくつかの低減衰腫瘤を含んでいた。基準ＣＥＡは６８５ｎｇ／ｍｌである。
【０３７０】
当該患者が説明を受け同意に署名した後、ｈＬ２４３−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（１０ｍｇ／ｋｇ）を隔週で４か月間付与する。当該患者は、第一の治療の後、吐き気（段階２）及び疲労（段階２）を経験し、主要な有害事象なしで当該治療を続行する。実施した第一の応答評価（８用量後）は、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）による２６％の標的病変の縮小を示し、当該患者のＣＥＡレベルは２４５ｎｇ／ｍｌまで低下する。第二の応答評価（１２用量後）において、標的病変は３５％まで縮小した。当該患者の全身レベルの健康及び臨床的な症状はかなり改善する。
【０３７１】
（実施例２４．ＩＭＭＵ−１１４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＳＮ−３８）を用いた再発性濾胞性リンパ腫の治療）
種々の所属リンパ節（頸部、腋窩、縦隔、鼠径部、腹部）及び骨髄の関与における広範にわたる疾患を呈している濾胞性リンパ腫に対するＲ−ＣＨＯＰ化学療法を受けた後、この６８歳男性に、実験薬ＩＭＭＵ−１１４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）を１０ｍｇ／ｋｇの用量で毎週、３週間付与し、３週間休薬した後、第二のコースをさらに３週間与える。当該患者は次に、ＣＴによる指標腫瘍病変の変化について評価し、ＣＨＥＳＯＮ基準による２３％の低下を示す。本療法をさらに２コースについて反復し、これは次に、ＣＴによる腫瘍の５５％の低下を示し、これは部分的応答である。
【０３７２】
（実施例２５．ＩＭＭＵ−１１４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いた再発性慢性リンパ球性白血病の治療）
慢性リンパ球性白血病に関する国際ワークショップ及び世界保健機構の分類によって定義されるようなＣＬＬの病歴を持つ６７歳男性は、フルダラビン、デキサメタゾン、及びリツキシマブを用いた先行療法ならびにＣＶＰの投与計画後に再発性疾患を罹患している。当該患者は今では、全身のリンパ節の肥大と関連した発熱及び寝汗、ヘモグロビン及び血小板の低い産生、ならびに迅速に上昇する白血球数がある。当該患者のＬＤＨは高く、β−２−ミクログロブリンは正常のほぼ２倍である。当該患者に、８ｍｇ／ｋｇの投薬スキームでＩＭＭＵ−１１４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いる療法を毎週、４週間与えた後、２週間休薬し、次に、当該周期を再度反復する。評価は、患者の血液学的パラメータが改善しており、当該患者の循環ＣＬＬ細胞数が減少しているように見えることを示している。次に、当該療法はさらに３周期再開し、その後、当該患者の血液学的値及び実験値は、当該患者が部分的な応答を有していることを示す。
【０３７３】
（実施例２６．難治性転移性非小細胞肺癌を治療するためのｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の使用）
本患者は、非小細胞肺癌と診断された５８歳男性である。当該患者にまず、カルボプラチン、ベバシズマブの化学療法投与計画を６か月間与えると、応答を示し、次に進行の後、カルボプラチン、エトポシド、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、ゲムシタビンを用いた化学療法のさらなるコースを続く２年間にかけて受け、偶発的な応答が２か月間以内持続する。次に、当該患者は、左縦隔腫瘤が５．５×３．５ｃｍを測定しかつ胸水がある。
【０３７４】
説明を受け同意に署名の後、当該患者に、ｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を１２ｍｇ／ｋｇの用量で隔週与える。第一の２回の注射の間、短期間の好中球減少症及び下痢を経験したが、これらは、２日以内で対症療法的投薬に対して解決または応答する。合計６回のｈＭＮ−１５−ＳＮ−３８の注入後、標的病変のＣＴ評価は２２％の低下を示す。当該患者は、本療法をさらに２か月間続行し、このとき、４５％の部分的応答がＣＴによってみられる。
【０３７５】
（実施例２７．ｈＡ１９−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いた濾胞性リンパ腫患者の治療）
６０歳男性は、腹痛及び触知可能な腫瘤の存在がある。当該患者は、ＣＴ試験及びＦＤＧ−ＰＥT試験を受け、縦隔、腋窩、頸部のリンパ節において病理学的アデノパチーを有する腫瘤の存在を確認する。臨床検査は、高いＬＤＨ及びβ−２−ミクログロブリン以外は顕著ではない。骨髄生検は、いくつかの傍小柱（ｐａｒａｔｒａｂｅｃｕｌａｒ）リンパ様凝集体及び傍リンパ様凝集体及び血管周囲リンパ様凝集体を明らかにする。これらは、免疫染色によるＣＤ２０、ＣＤ１９、及びＣＤ１０の発現のあるリンパ球性である。最終的な診断は、段階２の濾胞性リンパ腫、第ＩＶＡ期で、ＦＬＩＰＩスコアは４である。関与する最大のリンパ節の最長径は７ｃｍである。当該患者に、ＣＬ２Ａリンカーを用いてＳＮ−３８と結合したヒト化抗ＣＤ１９モノクローナル抗体ＩｇＧ（ｈＡ１９）（ＩｇＧあたり６個の薬剤分子）を付与する。投薬は毎週６ｍｇ／ｋｇを４週連続であり、２週間の休薬の後、４週間の治療周期を６週間ごとに反復する。５周期後に骨髄及び撮像（ＣＴ）による評価は部分的な応答を示し、この場合、測定可能な病変は約６０％減少し、骨髄はほとんど浸潤していない。また、ＬＤＨ及びβ−２−ミクログロブリン力価も低下する。
【０３７６】
（実施例２８．ｈＡ１９−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いた再発性前駆体Ｂ細胞ＡＬＬの治療）
この５１歳の女性は、前駆体であるフィラデルフィア染色体陰性のＢ細胞ＡＬＬについての療法下にあり、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１０、ＣＤ３８、及びＣＤ４５についてのＡＬＬ細胞の染色を示す。骨髄及び血液リンパ芽球の２０％超は、ＣＤ１９及びＣＤ２０を発現する。当該患者は、クロファラビン及びシタラビンを用いた先行療法を受けており、かなりの血液学的毒性を結果として生じるが応答はない。高用量シタラビン（ａｒａ−Ｃ）のコースも開始したが、患者によって耐容し得ない。当該患者に、６ｍｇ／ｋｇの注入による週用量のｈＡ１９−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８療法を５週間付与した後、２週間休薬し、本療法をさらに２回反復する。驚くべきことに、当該患者は、血液及び骨髄の計数における改善を示し、部分的な応答が判断されるのに十分である。好中球減少症（段階３）のため、２か月間の休薬後に、療法を８ｍｇ／ｋｇで隔週でさらに４コースについて再開する。この時、当該患者は非常に改善されているので、幹細胞移植のための候補となり得る病期に当該患者をもっていくことを試行するための維持療法について考慮中である。
【０３７７】
（実施例２９．抗ＣＤ２２−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８免疫複合体を用いたリンパ腫の治療）
本患者は、再発性びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＣＢＣＬ）を罹患している６２歳男性である。６コースのＲ−ＣＨＯＰ化学免疫療法の後、当該患者は今では、縦隔、腋窩、及び鼠蹊部のリンパ節において広がった広範囲のリンパ節を呈している。当該患者にエプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（抗ＣＤ２２）を１２ｍｇ／ｋｇの用量で毎週×３付与し、１週間休薬した後、さらに２周期ほど再度反復する。１週間後、当該患者をＣＴ撮像によって評価し、当該患者の全腫瘍量を測定すると３５％の減少を示し（部分的応答）、これは、次の３か月にわたって維持されるように見える。副作用は、療法後の血小板減少症ならびに段階１の吐き気及び嘔吐のみであり、２週間以内に解決する。注入反応を低下させるための前療法は与えていない。
【０３７８】
（実施例３０．フロントライン設定におけるベルツズマブ及びエプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いた濾胞性リンパ腫の併用療法）
３５歳女性は、低段階及び良好なＦＬＩＰＩスコアの濾胞性リンパ腫と診断され、頸部リンパ節、両方の腋窩、及び縦隔に存在する。当該患者の脾臓は肥大しておらず、骨髄生検は、疾患への関与を明らかにしていない。当該患者は、症状でみるとあまり影響されておらず、高い体温、寝汗、及び通常より幾分疲労している期間があるのみである。担当医は、経過観察過程を取らないことを決断するが、この女性に、毎週を２週間のコースの抗ＣＤ２２エプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と併用する毎週×４週間（２００ｍｇ／ｍ２）のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体ベルツズマブの皮下コースを組み合わせる低侵襲性療法を与え、各注入は８ｍｇ／ｋｇの用量である。この併用療法は、２か月後に反復し、この後、当該患者をＣＴ及びＦＤＧ−ＰＥＴ撮像試験ならびに骨髄生検によって評価する。驚くべきことに、疾患全部の約９０％の減少がみられ、当該患者は次に、４週間休薬した後、本併用療法のさらにもう一回のコースを与えられる。４週間後の評価は、放射線（及び骨髄生検）の完全応答を示す。担当医は、８か月後に本療法コースを反復することを決断し、放射線検査／病理学的検査は、持続的な寛解完了を示す。
【０３７９】
（実施例３１．ベルツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いた濾胞性リンパ腫のフロントライン療法）
本患者は、測定可能な両側性頸部及び腋窩リンパ節（各２〜３ｃｍ）、４ｃｍ径の縦隔腫瘤、ならびに肥大した脾臓を有する低段階の濾胞性リンパ腫を呈する４１歳女性である。当該患者に３コースのベルツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（抗ＣＤ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）療法を与え、各コースは、３週間に１回注入する１０ｍｇ／ｋｇからなる。療法完了後、ＣＴによる当該患者の腫瘍の測定は、８０％の減少を示す。次に、当該患者に２つの追加的なコースの療法を与え、ＣＴ測定は、完全応答が達成されることを示す。このことは、ＦＤＧ−ＰＥＧ撮像によって確認される。
【０３８０】
（実施例３２．ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と結合した１Ｆ５ヒト化抗体を用いた再発性ＤＬＢＣＬの療法）
５３歳女性は、６周期ほど与えたＲ−ＣＨＯＰ化学療法に対する部分的応答を示した８か月後に縦隔及び腹部の傍大動脈部位で再発性びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫を呈する。当該患者は、より細胞毒性の強い化学療法を受けることを拒否するので、ＣＬ２Ａリンカーを用いた抗体１分子あたり約６分子のＳＮ−２８へ結合したヒト化１Ｆ５抗ＣＤ２０モノクローナル抗体１０ｍｇ／ｋｇからなるより軽度の療法を週１回、隔週で５回注入について与える。ＣＴ試験及びＦＤＧ−ＰＥＴ試験は、当該患者のリンパ腫の４０％のさらなる減少を示すので、４週間の休薬期の後、療法を８ｍｇ／ｋｇの用量で３週間ごとに合計５回の注入で再開する。当該患者の疾患の評価は、約８０％の減少を明らかにする。
【０３８１】
（実施例３３．リツキシマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いた再発性慢性リンパ性白血病の療法）
８年間のＣＬＬの病歴があり、過去にフルダラビン、シクロホスファミド、及びリツキシマブ療法に応答し、再発後にイブルチニブに応答して部分的な応答が９か月間持続した６２歳男性は、進行性の疾患を罹患している。当該患者にリツキシマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８単独療法を１２ｍｇ／ｋｇを２週間ごとに３コース、８ｍｇ／ｋｇへ減らして隔週でさらに４コースの投与計画で与える。５０％超によって反映される血球減少または１１ｇ／ｄｌよりも高いヘモグロビン濃度、１５００個／ｃｍｍよりも高い好中球の絶対数、または１１ｋ／ｃｍｍよりも高い血小板計数の持続的な改善が観察され、これは約９か月間持続可能であった。
【０３８２】
（実施例３４．ベンダムスチンと併用するベルツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いたＤＬＢＣＬのフロントライン療法）
５９歳男性は、ＣＴ、ＦＤＧ−ＰＥＴ、及び免疫組織学的診断／病理学的診断によって確認されるような、胸部、腹部、鼠蹊部のリンパ節、及び肥大した脾臓を含む、ＤＬＢＣＬの複数部位を呈する。ベンダムスチンは、９０ｍｇ／ｍ２の用量で１日後及び２日後に付与し、７日後及び１４日後に６ｍｇ／ｋｇの用量のベルツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と併用して４週間ごとに４周期付与する。その後、放射線による評価は部分的な応答を示す。２か月間の休薬の後、当該療法はさらに２周期反復し、次に放射線評価は完全応答を示す。血球減少、主に好中球減少症は管理可能であり、段階３のレベルに達していない。
【０３８３】
（実施例３５．レナリドマイドと併用したベルツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いたマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）のフロントライン療法）
本患者は、消化管愁訴及び嗜眠を呈した後にＭＣＬと診断された６８歳男性である。大腸内視鏡検査は、７ｃｍの盲腸腫瘤を開示し、当該患者の精密検査は当該患者が第ＩＶ期疾患に罹患していることを明らかにする。当該患者に、２５ｍｇのレナリドマイドを毎日経口で１日後〜２１日後に２８日間の併用療法を付与する。２周期後、当該患者にベルツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を隔週で１０ｍｇ／ｋｇの用量で３回の治療について付与し、２週間休薬する。これを次に再度反復する。本療法完了の２週間後、当該患者は、測定された自身の指標病変の部分的応答、及び可視化した他のリンパ節の減少を示す。４か月後、レナリドマイド療法を２１日間反復した後、２コースのベルツズマブ−ＳＮ−３８を行う。当該患者の疾患は次に、さらにより減少することが示されるが、なおも完全応答ではない。
【０３８４】
（実施例３６．再発性／難治性びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）患者のエプラツズマブ−ＳＮ−３８療法）
体重減少の症状のある６５歳男性は、胃周囲腫瘤の生検を受け、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫と診断される。当該患者は、６周期の標準的なＲ−ＣＨＯＰ（リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾン）を用いて治療される。当該患者は、軽度の血小板減少症（５０〜７０ｋ／ｍｌ）とともに長期間のかつ持続的な好中球減少症（７００ＡＮＣ）を罹患しているが、実際の貧血はない。当該患者のＩＰＩは高い。胃周囲腫瘤は本療法後にいずれの変化も示さず、当該患者は、抗ＣＤ２２エプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の軽度の治療投与計画を履行する。これは、隔週に注入される４ｍｇ／ｋｇの４回注入、次いで３週間に１回ごとのさらなる３回注入からなる投与計画である。当該患者の胃周囲リンパ腫は、１週間後にＣＴによって測定され、５２％の顕著な減少を示す。当該患者は、本治療を３週間ごとにさらに３か月間続行し、自身のリンパ腫腫瘤のこの減少とともに、当該患者の体重の安定化ならびに当該患者の活力及び活動の改善を示し続ける。
【０３８５】
（実施例３７．再発性濾胞性リンパ腫患者のヒト化ＲＦＢ４療法）
４２歳女性は、背中まで広がっている、下腹部に鋭く定常的なかつ重度の疼痛を呈している。臨床検査は顕著ではないが、腹部超音波は、前方左下にある、７．５×６．２×７．０ｃｍを測定する異質な固形腫瘤を示す。ＣＴ走査は、左側の小腸腸間膜内に大きな腫瘤を、隣接するリンパ節の関与とともに明らかにする。当該腫瘤のＣＴ誘導型針生検は、当該腫瘤が段階３の濾胞性リンパ腫であることを示す。免疫組織化学的検査は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−６についての陽性結果を有するＢ細胞型を示す。ＰＥＴ試験は、横隔膜上、骨髄中、及び脾臓中に何ら疾患を明らかにしないが、骨髄生検はリンパ腫の関与を確認する。当該患者は、６周期のＲ−ＣＨＯＰ化学療法を受け、結果的に本療法に対する完全応答を４か月後に生じる。しかしながら、１０か月後には、当該患者は、ＰＥＴ試験及び生検試験によって判定されるような自身の腹部腫瘤及び隣接するリンパ節の再発ならびに脾臓肥大及びより多くの骨髄関与を伴う再発を経験する。当該患者は今では、ＣＬ２Ａリンカーを用いてＩｇＧあたり６個のＳＮ−３８分子と結合したヒト化抗ＣＤ２２モノクローナル抗体ＲＦＢ４を８ｍｇ／ｋｇの用量で毎週、３週間用いた後に８ｍｇ／ｋｇで隔週をさらに４回の治療について持続するコースの療法を開始する。２週間後、当該患者はＣＴ試験及びＦＤＧ−ＰＥＴ試験を受け、当該患者の腹部病変及び脾臓は４０％の減少、ならびに骨髄の関与の漸進的な低下を示す。４週間の休薬後、４ｍｇ／ｋｇで毎週、４週間の療法に次ぐ６ｍｇ／ｋｇの隔週でのさらなる５回の治療についての療法を実施し、測定する病変すべてのサイズの合計のさらなる測定可能な減少が合計６０％である。当該患者は、８ｍｇ／ｋｇのｈＲＦＢ４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の月１回の次の５か月間についての維持療法を続行し、自身の治療応答を維持している。
【０３８６】
（実施例３８．再発性／難治性急性リンパ芽球性白血病患者のエプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８療法）
ＣＤ２２＋前駆体Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を罹患している２９歳男性は、ＰＥＧ−アスパラギナーゼ、シクロホスファミド、ダウノルビシン、シタラビン（ａｒａ−Ｃ）、ビンクリスチン、ロイコボリン、プレドニゾン、メトトレキサート、及び６−メルカプトプリンを用いた療法、ならびに改変型Ｌａｒｓｏｎプロトコルの下での誘導／維持療法として付与するＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）を用いた支持療法に対して応答しなかった。当該患者の白血病はフィラデルフィア染色体陰性である。血液及び骨髄の白血病芽球（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｂｌａｓｔ）計数をもとに、当該患者は最低限の応答しか示さず、疾患は４か月後に進行する。当該患者は次に、６ｍｇ／ｋｇの初期計画でエプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を毎週４週間の投与を与えた後、６ｍｇ／ｋｇの隔週でさらなる６回注入に減らす。当該患者は次に、血液及び骨髄の白血病芽球（ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｂｌａｓｔ）ならびに脾臓サイズ及び骨髄関与に関するＦＤＧ試験によって評価し、部分的応答に達するとともに、患者の全身レベルの徴候及び症状における付随する改善がある。本療法は次に、次の８か月間にわたって続行するが、５ｍｇ／ｋｇで隔週であり、３週間は療法を続行し、２週間は休薬して、完全な寛解を達成する。当該患者は今では、造血幹細胞移植のための候補として評価中である。
【０３８７】
（実施例３９．再発型／難治性急性リンパ芽球性白血病患者のヒト化ＲＦＢ４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８療法）
ＨＩＤＡＣ（高用量ａｒａ−Ｃ療法）に対して応答し損ねた後、前駆体Ｂ細胞型急性リンパ芽球性白血病を罹患しているこの２０歳男性に、ＳＮ−３８へ結合したｈＲＦＢ４ＩｇＧ（ＩｇＧあたり平均６個の薬剤分子）を用いたヒト化抗ＣＤ２２療法を１０ｍｇ／ｋｇの投薬計画で毎週、２週間投薬した後、１週間休薬し、次いで、１０ｍｇ／ｋｇの注入を隔週でさらに５回の治療について与える。当該患者は次に、血液及び骨髄の白血病芽球の存在について評価し、９０％超の減少を示す。４週間の休薬後、本療法コースを反復し、４週間後の評価は、ＰＣＲによって測定するように、最低限の残留疾患がないまま完全な応答を示す。
【０３８８】
（実施例４０．Ｒ−ＣＨＯＰ化学療法を受けているＤＬＢＣＬ患者におけるエプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いた地固め療法）
両側性頸部アデノパチー及び１．５〜２．０ｃｍを測定する頸部リンパ節ならびに３ｃｍの右腋窩リンパ節、ならびに２．５〜３．０ｃｍを測定する腹部後リンパ節及び両側性骨盤リンパ節を有するこの５６歳女性は、ＣＤ２０及びＣＤ２２について陽性である第３期びらん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫と診断される。当該患者は、２１日間ごとにフィルグラスチム及び予防性抗生物質を付与する標準的なＲ−ＣＨＯＰ化学療法投与計画を履行する。本療法６周期を受けた後、当該患者に２か月間の休薬期間を付与した後、８ｍｇ／ｋｇのエプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を隔週で３回の治療について注入する地固め療法を履行する。Ｒ−ＣＨＯＰ化学療法を後の応答が最低限である（測定した病変における３０％未満の変化）のに対し、エプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８との地固め療法は結果的に部分的応答を生じる（指標病変全部の合計における５０％超の低下）。３か月間の休薬後、エプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いる本療法コースを反復し、それとともに当該患者は再度、フィルグラスチム及び予防性抗生物質を付与され、当該患者の良好な寛解を維持する。
【０３８９】
（実施例４１．ＩＭＭＵ−３１−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いた再発性転移性精巣癌の治療）
本患者は、右精巣の精巣癌の切除歴のある、両肺への同期性転移癌が併用化学療法に十分応答する３０歳男性である。診断時に当該患者のα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の血液力価は、１１１０ｎｇ／ｍｌに上昇するが、療法の成功後は１０９ｎｇ／ｍｌまで低下する。本患者は現在では、３年間の期間にわたるＡＦＰ力価の漸増を呈し、それゆえ、当該患者の身体のＣＴ走査及びＦＤＧ−ＰＥＴ走査を実施し、両肺における肺転移癌の再発を明らかにする。当該患者は、ＩｇＧあたり６個の薬剤分子でＳＮ−３８と結合した抗ＡＦＰ抗体ＩＭＭＵ−３１ＩｇＧを用いた療法を受ける。当該患者は、本抗体−薬剤複合体１２ｍｇ／ｋｇの週用量を４週周期のうちの３週間受け、さらに１周期を反復するが、治療薬は１０ｍｇ／ｋｇまで減少させる。これを次にさらに２周期反復する。２週間後、当該患者の両肺の放射線検査は、転移癌が消失したことを明らかにする。当該患者の血中ＡＦＰ力価は今では１８ｎｇ／ｍｌである。当該患者は、完全応答に達したとともに正常な活動に戻る。
【０３９０】
（実施例４２．ＩＭＭＵ−３１−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いた再発性転移性肝細胞癌の治療）
Ｂ型肝炎感染、アルコール過剰及び喫煙歴のある５８歳男性はまず、肝硬変に至り、次に、肝細胞癌の診断に至る。当該患者の肝臓の一部を切除した後の当該患者では当時、所属リンパ節も関与している。当該患者はソラフェニブ療法のコースを受け、何らかの全身性改善を示すが、所属リンパ節または２つの肺（右肺）の転移癌のいずれの減少もない。肝臓のＣＴも、残留している肝実質における再発があるかもしれないことを示唆する。この患者は今や、ＩＭＭＵ−３１−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いた３コースの療法を付与され、各コースは、４週周期のうちの２週間は毎週１６ｍｇ／ｋｇの計画を含む。６用量を含む３コースの後、当該患者を再評価し、循環ＡＦＰ力価が２０００ｎｇ／ｍｌの基準値から１７０ｎｇ／ｍｌまで低下すること、及び当該患者の測定した指標病変の合計の２０％の低下を示す。２か月間の休薬後、３周期からなるが、１回の注入当たり１ｍｇ／ｋｇまで用量の減少するさらなるコースの療法を開始する。１か月後、測定した病変すべてが基準値の３５％までより大きく減少するとともに、ＡＦＰ血中力価の１００ｎｇ／ｍｌまでのわずかな低下がある。当該患者は、疾患の進行及び制限する毒性がない限り、１か月あたり１用量の維持療法を続行中である。
【０３９１】
（実施例４３．免疫複合体の保存）
実施例２において説明した複合体は、２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ６．５）で精製及び緩衝液交換し、トレハロース（２５ｍＭ終濃度）及びポリソルベート８０（０．０１％（ｖ／ｖ）終濃度）を用いてさらに製剤化し、最終緩衝液濃度は賦形剤の添加の結果、２２．２５ｍＭとなった。製剤化した複合体は、密封したバイアル中で凍結乾燥及び保存し、２℃〜８℃で保存した。凍結乾燥した免疫複合体は、当該保存条件下で安定であり、当該免疫複合体の生理学的活性を維持した。
【０３９２】
上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に理解することができ、かつ本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の種々の変更及び改変を行って、それを過度の実験なしで種々の使用法及び条件へ適応させることができる。本発明に引用する特許、特許出願及び公開物はすべて、参照により組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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