(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の抗体（「ＡＯＩ」）を産生する方法であって、ＡＯＩの発現および分泌に適した条件下で５ｍＭから３０ｍＭの間の濃度にてグリシンを含む細胞培養培地中でＡＯＩを分泌し、発現するように操作されたＮＳＯ細胞を培養し、それによりＡＯＩを産生することを含む方法であって、
ＡＯＩが以下の抗体から選択される方法：
配列番号１のアミノ酸配列のＶＨ領域および配列番号２のアミノ酸配列のＶＬ領域を含むＩｇＧ１モノクローナル抗体であって、配列番号３の完全重鎖アミノ酸配列および配列番号４の完全軽鎖アミノ酸配列を有してもよいＩｇＧ１モノクローナル抗体、
配列番号５のアミノ酸配列のＶＨ領域および配列番号６のアミノ酸配列のＶＬ領域を含むＩｇＧ１モノクローナル抗体、
配列番号７の完全重鎖アミノ酸配列および配列番号８の完全軽鎖アミノ酸配列を有するＩｇＧ１モノクローナル抗体、
配列番号９のアミノ酸配列のＶＨ領域および配列番号１０のアミノ酸配列のＶＬ領域を含むＩｇＧ１モノクローナル抗体、
配列番号１１の完全重鎖アミノ酸配列および配列番号１２の完全軽鎖アミノ酸配列を有するＩｇＧ１モノクローナル抗体、
配列番号１３のアミノ酸配列のＶＨ領域および配列番号１４のアミノ酸配列のＶＬ領域を含むＩｇＧ１モノクローナル抗体、
配列番号１５の完全重鎖アミノ酸配列および配列番号１６の完全軽鎖アミノ酸配列を有するＩｇＧ１モノクローナル抗体、
配列番号１７のアミノ酸配列のＶＨ領域および配列番号１８のアミノ酸配列のＶＬ領域を含むＩｇＧ１モノクローナル抗体、及び
配列番号１９の完全重鎖アミノ酸配列および配列番号２０の完全軽鎖アミノ酸配列を有するＩｇＧ１モノクローナル抗体。
【請求項２】
グリシンの濃度が１０ｍＭから２５ｍＭ、または１５ｍＭから２０ｍＭまたは１６ｍＭから１８ｍＭの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培地が無タンパク質培地である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＡＯＩを回収することをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＡＯＩを回収することが、培養培地からＮＳＯ細胞を分離する工程を含み、ＡＯＩを精製することをさらに含んでもよい、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＮＳＯ細胞が、培養する前に１．５×１０５細胞／ｍＬから２．５×１０５細胞／ｍＬの密度で播種される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．配列表
本出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂによりＡＳＣＩＩフォーマットで提出されている配列表を含み、この全体は参照により本明細書に組み込まれる。２０１３年９月２４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、３８１４９３−７３５ＷＯ（１１８１３４）＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、このサイズは４２，３１３バイトである。
【背景技術】
【０００２】
２．背景
グリコシル化によるタンパク質の翻訳後修飾は、多くの場合、特有の性質を有する、明確なグリコフォームの形成を導く。タンパク質のグリコシル化の相違は、特定の標的分子に対するタンパク質の結合親和性を含む、タンパク質の物理的および化学的性質に多大な影響を与え得る。タンパク質のグリコシル化を調節するいくつかの方法が知られている。異なる発現系は明確なグリコシル化プロファイルを与え得る。さらに、タンパク質コード配列は、特定のグリコフォームのレベルが亢進または減少したタンパク質を産生するように修飾され得る。組換え細胞株が培養される条件もまた、グリコシル化プロファイルに影響を与え得る。
【０００３】
哺乳動物細胞内で組換えにより産生される抗体は、多くの場合、抗体のＦｃおよびＦａｂ領域の両方においてグリコシル化される。多くのグリコシル化抗体は糖フコースを含有する。抗体におけるフコースの存在は、細胞における特定のタンパク質への抗体の結合に影響を与え得る。例えば、抗体のＦｃ領域において高レベルのフコースを含有する抗体は、リンパ球（例えば、ナチュラルキラー細胞）における受容体に対する減少した結合を有し得る。フコースを欠く抗体は、特に低い用量の抗体において、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞毒性）活性の亢進と相関している。Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６。フコースの少ない抗体を調製する方法は、ラット骨髄腫ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２）における増殖を含む。ＹＢ２／０細胞は、タンパク質のフコシル化に必要な酵素（α１，６−フコシルトランスフェラーゼ）をコードする、低レベルのＦＵＴ８  ｍＲＮＡを発現する。ＡＤＤＣ活性を増加させるための代替の方法は、抗体のＦｃ部分における変異、特に、ＦｃγＲ受容体に対する抗体親和性を増加させる変異を含む。増加したＦｃγＲ結合と変異Ｆｃとの間の相関関係は、標的化細胞毒性（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）細胞ベースアッセイを使用して実証されている。Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４；Ｐｒｅｓｔａら、２００２、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：４８７−４９０。
【０００４】
培養培地または供給培地中の成分の濃度はタンパク質のグリコシル化プロファイルに影響を与え得る。理想的には、タンパク質の特定のグリコフォームは、組換え細胞株が増殖する条件の制御によって亢進または減少し得る。培養培地の成分を操作することによってタンパク質の収率を増加させることを対象とする多数の研究が存在しているが、組換えにより操作された細胞が培養される細胞培養培地を修飾することによってタンパク質のグリコシル化を調節することに関する報告はかなり少ない。一例は米国特許第５，７０５，３６４号明細書に開示されており、これは、アルカン酸を培養培地に添加することにより哺乳動物細胞によって産生された糖タンパク質のシアル酸の含有量を制御するためのプロセスを対象とする。しかしながら、組換え抗体が発現される培養培地の修飾によって抗体のＡＤＣＣ活性を増加させる可能性は十分に扱われていない。したがって、減少したレベルのフコースおよび増加したＡＤＣＣ活性を有する抗体を発現するために哺乳動物細胞を培養するための細胞培養培地を開発することが非常に望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，７０５，３６４号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０
【非特許文献２】Ｓｈｉｎｋａｗａら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６
【非特許文献３】Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４
【非特許文献４】Ｐｒｅｓｔａら、２００２、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：４８７−４９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
（発明の要旨）
３．開示の要旨
本開示は、有益な性質を有する糖タンパク質（例えば、抗体）が、高濃度（例えば、少なくとも５ｍＭ）のグリシンを含む培養培地（本明細書以下において「高グリシン培地」）中で哺乳動物細胞を培養することによって産生されるという発見に関する。特に、高グリシン培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することは非フコシル化グリコフォームのレベルを増加させる。哺乳動物細胞は、抗体依存性細胞毒性（「ＡＤＣＣ」）活性の亢進を含む、生物活性の亢進を示す抗体を産生するために使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本開示は、概して、従来の培養培地中で発現された糖タンパク質と比較して、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する組換えタンパク質（例えば、抗体）を発現する方法および組成物を提供する。この方法および組成物は、哺乳動物細胞中で抗体などの糖タンパク質を発現するように高グリシン培地を利用し、有益には、従来の培養培地中で産生された糖タンパク質と比較して、減少したフコシル化レベルを有する糖タンパク質を生じる。
【０００９】
加えて、本開示の方法は、製造の間、タンパク質グリコシル化を調節し、制御するために使用され得る。これは、バッチ回避のリスクを減少させ、製造場所間の技術移転の間およびプロセスのスケールアップの間の制御を改良するので、製造の間の産物のグリコシル化の改良された制御が望まれる。したがって、この方法は、プロセスの変化を導入せずに再現性のある産物のグリコシル化プロファイルを維持するために使用され得る。
【００１０】
組換え糖タンパク質を産生するように操作され得る哺乳動物細胞は、ＮＳ０細胞、ＣＨＯ細胞、マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞、ベビーハムスター腎臓ＢＨＫ−２１細胞およびヒト胚腎臓ＨＥＫ０２９１細胞を含む。特定の実施形態において、ＮＳ０細胞は抗体を産生するように組換えにより操作される。
【００１１】
一態様において、本開示は、５ｍＭから１００ｍＭの間の濃度にてグリシンおよび場合によって本開示に示されている種々の濃度にて他のアミノ酸を含む、哺乳動物細胞培養に適した培養培地を提供する。培養培地は、好ましくは、化学的に定義されている、無タンパク質培地である。細胞培養培地中のグリシンの濃度は、例えば、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２２ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭまたは５０ｍＭであってもよい。特定の実施形態において、細胞培養培地中のグリシンの濃度は、２つの前述の実施形態のいずれか、例えば、５ｍＭから１０ｍＭ、７ｍＭから１０ｍＭ、１０ｍＭから１５ｍＭ、１２ｍＭから１７ｍＭ、１５ｍＭから２０ｍＭ、１６ｍＭから１８ｍＭ、１０ｍＭから３０ｍＭ、１０ｍＭから２５ｍＭ、２０ｍＭから３０ｍＭ、１０ｍＭから５０ｍＭ、２０ｍＭから５０ｍＭなどの濃度範囲に制限される。他のアミノ酸が、概して、従来の基礎培地において典型的に見出されている濃度にて培養培地中に存在してもよい。一実施形態において、本開示の培養培地中のアミノ酸の濃度は表２に列挙されている範囲で見出されている。培養培地はまた、ビタミン、微量元素、エネルギー源、脂肪酸、増殖因子、ヌクレオシド、脂質、ホルモンおよび／または抗体などの１種以上の追加の成分を含んでもよい。さらに、培地は、緩衝液、オスモル濃度調節因子および／または界面活性剤を含んでもよい。このような追加の成分のさらなる詳細はセクション５．１に見出され得る。
【００１２】
別の態様において、グリシン以外の１種以上のアミノ酸は、表３または表４に示されている濃度以下の濃度を有する。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１種のアミノ酸は、表３または表４に列挙されている濃度以下の濃度を有してもよい。一実施形態において、培養培地中のリシンの濃度は０．５ｍＭから５．０ｍＭの間である。
【００１３】
別の態様において、本開示は、対象の糖タンパク質（「ＧＯＩ」）、例えば、対象の抗体（「ＡＯＩ」）を産生する方法であって、少なくとも５ｍＭ、例えば、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２２ｍＭ、２５ｍＭまたは３０ｍＭの濃度にてグリシンを含む細胞培養培地中でＧＯＩまたはＡＯＩを分泌し、発現するように操作された、哺乳動物細胞、例えば、ＮＳ０細胞を培養することを含む、方法を提供する。ＡＯＩは、例えば、マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または完全ヒト抗体であってもよい。特定の実施形態において、細胞培養培地中のグリシンの濃度は、２つの前述の実施形態のいずれか、例えば、５ｍＭから１０ｍＭ、７ｍＭから１０ｍＭ、１０ｍＭから１５ｍＭ、１２ｍＭから１７ｍＭ、１５ｍＭから２０ｍＭ、１６ｍＭから１８ｍＭ、１０ｍＭから３０ｍＭ、１０ｍＭから２５ｍＭ、２０ｍＭから３０ｍＭなどの範囲のグリシンの濃度に制限される。特定の実施形態において、培養培地は化学的に定義されている、無タンパク質培地である。
【００１４】
一実施形態において、ＡＯＩはＨｕＬｕｃ６３（エロツズマブ）である。エロツズマブの成熟ＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号１）、エロツズマブの成熟ＶＬ鎖（配列番号２）、エロツズマブの完全重鎖配列（配列番号３）およびエロツズマブの完全軽鎖配列（配列番号４）は表７に示されている。本開示の細胞培養プロセスは、グリカンの少なくとも４％がフコースを欠き、グリカンの少なくとも２．５％がマンノース５グリカンである、エロツズマブ分子の集団を産生する。一実施形態において、本開示の細胞培養プロセスは、グリカンの少なくとも５％がフコースを欠き、グリカンの少なくとも３％がマンノース５グリカンである、エロツズマブ分子の集団を産生する。
【００１５】
別の実施形態において、対象の抗体はダクリズマブである。ダクリズマブの成熟ＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号５）、ダクリズマブの成熟ＶＬ鎖（配列番号６）、ダクリズマブの完全重鎖配列（配列番号７）およびダクリズマブの完全軽鎖配列（配列番号８）は表７に示されている。本開示の細胞培養プロセスは、グリカンの少なくとも３％がフコースを欠き、グリカンの少なくとも１．５％がマンノース５グリコフォームである、ダクリズマブ分子の集団を産生する。一実施形態において、本開示の細胞培養プロセスは、グリカンの少なくとも４％がフコースを欠き、グリカンの少なくとも２％がマンノース５グリカンである、ダクリズマブ分子の集団を産生する。
【００１６】
別の実施形態において、ＡＯＩはボロキシシマブ（ｖｏｌｏｘｉｃｉｍａｂ）である。ボロキシシマブの成熟ＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号９）、ボロキシシマブの成熟ＶＬ鎖（配列番号１０）、ボロキシシマブの完全重鎖配列（配列番号１１）およびボロキシシマブの完全軽鎖配列（配列番号１２）は表７に示されている。本開示の細胞培養プロセスは、分子の少なくとも１％がフコースを欠き、グリカンの少なくとも０．５％がマンノース５グリカンである、ボロキシシマブ分子の集団を産生する。
【００１７】
さらなる実施形態において、ＡＯＩはＰＤＬ２４１である。ＰＤＬ２４１の成熟ＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号１３）、ＰＤＬ２４１の成熟ＶＬ鎖（配列番号１４）、ＰＤＬ２４１の完全重鎖配列（配列番号１５）、ＰＤＬ２４１の完全軽鎖配列（配列番号１６）は表７に示されている。本開示の細胞培養プロセスは、グリカンの少なくとも１４％がフコースを欠き、グリカンの少なくとも８％がマンノース５グリカンである、ＰＤＬ２４１分子の集団を産生する。一実施形態において、本開示の細胞培養プロセスは、グリカンの少なくとも１５％がフコースを欠き、グリカンの少なくとも９％がマンノース５グリカンである、ＰＤＬ２４１分子の集団を産生する。
【００１８】
さらに別の実施形態において、ＡＯＩはＰＤＬ１９２（エナバツズマブ）である。エナバツズマブの成熟ＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号１７）、エナバツズマブの成熟ＶＬ鎖（配列番号１８）、エナバツズマブの完全重鎖配列（配列番号１９）およびエナバツズマブの完全軽鎖配列（配列番号２０）は表７に示されている。本開示の細胞培養プロセスは、グリカンの少なくとも５％がフコースを欠き、グリカンの少なくとも２．５％がマンノース５グリカンである、エナバツズマブ分子の集団を産生する。一実施形態において、本開示の細胞培養プロセスは、グリカンの少なくとも６％がフコースを欠き、グリカンの少なくとも３％がマンノース５グリカンである、エナバツズマブ分子の集団を産生する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
４．図面の簡単な説明
【図１】いくつかの典型的なＮ結合型グリカンの構造を示す図である。
【図２】追加のグリシンを補充した基礎培地中で培養されたＮＳ０細胞によって産生された５つの異なる抗体中で結合したＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）を有さない非フコシル化Ｇ０グリカンの相対量を示す図である。この量は、追加のグリシン補充を有さずに対照基礎培地中で培養されたＮＳ０細胞によって産生された抗体に存在するグリカンの量に対する百分率として表される。
【図３】１７ｍＭのグリシン濃度を有する基礎培地中で培養されたＮＳ０細胞によって産生された５つの異なる抗体中で結合したマンノース５（Ｍａｎ５）グリカンの相対量を示す図である。この量は、追加のグリシン補充を有さない対照基礎培地中で培養されたＮＳ０細胞によって産生された抗体に存在するグリカンの量に対する百分率として表される。
【図４】１７ｍＭのグリシン濃度を有する基礎培地中で培養されたＮＳ０細胞によって産生された５つの異なる抗体中で結合した全非フコシル化グリカンの相対量を示す図である。この量は、追加のグリシン補充を有さない対照基礎培地中で培養されたＮＳ０細胞によって産生された抗体に存在するグリカンの量に対する百分率として表される。
【図５】異なる濃度のグリシン（５、１５、３０ｍＭ）を補充した基礎培地中で培養されたＮＳ０細胞によって産生されたＰＤＬ１９２中で結合したＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）およびＭａｎ５型グリコフォームを有さない非フコシル化Ｇ０グリコフォームの相対量を示す図である。この量は、追加のグリシン補充を有さない対照基礎培地中で培養されたＮＳ０細胞によって産生された抗体に存在するグリコフォームの量に対する百分率として表される。
【図６】追加のグリシンを補充した基礎培地中で培養されたＮＳ０細胞によって産生された４つのＩｇＧ１抗体（エロツズマブ、ダクリズマブ、ＰＤＬ１９２およびＰＤＬ２４１）についてのＣＤ１６ａ受容体に対する相対結合効力を示す図である。この量は、追加のグリシン補充を有さない対照基礎培地中で培養されたＮＳ０細胞によって産生された同じ抗体のＣＤ１６ａ結合親和性に対する百分率として表される。
【図７】異なる濃度のグリシン（５、１５、３０ｍＭ）を補充した基礎培地中で培養されたＮＳ０細胞によって産生されたＰＤＬ１９２（エナバツズマブ）についてのＣＤ１６ａ受容体に対する相対結合効力を示す図である。この量は、追加のグリシン補充を有さない対照基礎培地中で培養したＮＳ０細胞によって産生された同じ抗体のＣＤ１６ａ結合親和性に対する百分率として表される。
【図８Ａ】対照および高グリシンプロセスの両方から産生されたエロツズマブのＡＤＣＣ活性を示す図である。この研究は３つの異なるドナー由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において実施された。陰性対照が、ＡＤＣＣ活性を有さない対照抗体および抗体添加をしていない試料を使用してアッセイに含まれた。
【図８Ｂ】対照および高グリシンプロセスの両方から産生されたエロツズマブのＡＤＣＣ活性を示す図である。この研究は３つの異なるドナー由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において実施された。陰性対照が、ＡＤＣＣ活性を有さない対照抗体および抗体添加をしていない試料を使用してアッセイに含まれた。
【図８Ｃ】対照および高グリシンプロセスの両方から産生されたエロツズマブのＡＤＣＣ活性を示す図である。この研究は３つの異なるドナー由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において実施された。陰性対照が、ＡＤＣＣ活性を有さない対照抗体および抗体を添加していない試料を使用してアッセイに含まれた。
【図９Ａ】対照および高グリシンプロセスの両方から産生されたＰＤＬ２４１のＡＤＣＣ活性を示す図である。この研究は２つの異なるドナー由来のＰＢＭＣにおいて実施された。陰性対照が、ＡＤＣＣ活性を有さない対照抗体および抗体を添加していない試料を使用してアッセイに含まれた。
【図９Ｂ】対照および高グリシンプロセスの両方から産生されたＰＤＬ２４１のＡＤＣＣ活性を示す図である。この研究は２つの異なるドナー由来のＰＢＭＣにおいて実施された。陰性対照が、ＡＤＣＣ活性を有さない対照抗体および抗体を添加していない試料を使用してアッセイに含まれた。
【図１０Ａ】対照および高グリシンプロセスの両方から産生されたＰＤＬ１９２（エナバツズマブ）のＡＤＣＣ活性を示す図である。この研究は２つの異なるドナー由来のＰＢＭＣにおいて実施された。陰性対照が、ＡＤＣＣ活性を有さない対照抗体および抗体を添加していない試料を使用してアッセイに含まれた。
【図１０Ｂ】対照および高グリシンプロセスの両方から産生されたＰＤＬ１９２（エナバツズマブ）のＡＤＣＣ活性を示す図である。この研究は２つの異なるドナー由来のＰＢＭＣにおいて実施された。陰性対照が、ＡＤＣＣ活性を有さない対照抗体および抗体を添加していない試料を使用してアッセイに含まれた。
【図１１Ａ】対照および高グリシンプロセスの両方から産生されたダクリズマブのＡＤＣＣ活性を示す図である。この研究は２つの異なるドナー由来のＰＢＭＣにおいて実施された。陰性対照が、ＡＤＣＣ活性を有さない対照抗体および抗体を添加していない試料を使用してアッセイに含まれた。
【図１１Ｂ】対照および高グリシンプロセスの両方から産生されたダクリズマブのＡＤＣＣ活性を示す図である。この研究は２つの異なるドナー由来のＰＢＭＣにおいて実施された。陰性対照が、ＡＤＣＣ活性を有さない対照抗体および抗体を添加していない試料を使用してアッセイに含まれた。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
５．本開示の詳細な説明
本開示は、組換え糖タンパク質（例えば、抗体）発現のための組成物および方法に関する。この組成物および方法は、従来の培養培地中で産生された糖タンパク質と比較して、減少したフコシル化グリコフォームおよび増加したＡＤＣＣ活性を有する糖タンパク質を産生する。本開示の組成物および方法を利用する発現系によって産生された抗体は、有益には、従来の培地中で培養することによって産生された場合より少ないフコシル化を示す。本開示の種々の態様は以下に記載されている。セクション５．１は、タンパク質を発現できる哺乳動物細胞を培養するのに適した向上した濃度（すなわち、高グリシン培地）を含有する培養培地を記載している。セクション５．２は、高グリシン培地中で産生され得る種々の糖タンパク質（例えば、抗体）を記載している。セクション５．３は、糖タンパク質を産生するための核酸および発現系を記載している。セクション５．４は、糖タンパク質を産生するために使用され得る培養方法を記載している。セクション５．５は、本開示の方法によって産生された糖タンパク質を回収し、精製する方法を記載している。セクション５．６は、本開示の方法によって産生された糖タンパク質集団を記載している。セクション５．７は、本開示の方法によって産生された糖タンパク質の医薬組成物を記載している。セクション５．８は、本開示の方法によって産生された例示的な抗体を使用して種々の疾患を治療する方法を記載している。
【００２１】
５．１．細胞培養培地
一態様において、本開示は高濃度のグリシンを含む哺乳動物細胞培養に適した培養培地を提供する。本明細書に使用されている場合、「培養培地」という用語は、インビトロ細胞培養における哺乳動物細胞の増殖に適した培地を指す。本明細書に使用されている場合、「細胞培養」または「培養」という用語は、インビトロ環境における哺乳動物細胞の増殖を指す。典型的な培養培地は、アミノ酸、ビタミン、微量元素、遊離脂肪酸およびエネルギー源を含有する。増殖因子、ヌクレオシド、脂質、ホルモンおよび抗生物質などの追加の増殖成分が培養培地に含まれてもよい。さらに、培地は緩衝液、オスモル濃度調節因子および界面活性剤を含んでもよい。
【００２２】
当業者によって認識されるように、組換えタンパク質（例えば、抗体）産生のための細胞を培養するために使用されている培養および供給培地ならびに供給スケジュール、増殖率、温度および酸素レベルなどの他の変量が、発現タンパク質の収率および質に影響を与え得る。これらの条件を最適化する方法は当業者の範囲内であり、例示的な条件が本開示の例示的な実施形態に記載されている。好ましくは、細胞は、コレステロール起源、血清起源および他の動物起源の成分を含まない培地中で増殖するように適応され、このような場合、培養および供給培地は、好ましくは、このような成分の代わりとなる定義された化学物質を含む。したがって、組換えタンパク質を産生する方法は、動物に由来する成分を含まない、化学的に定義されている培地中で本開示の組換え哺乳動物細胞を培養することを含んでもよい。
【００２３】
本開示の培養培地は高グリシン培地である。本明細書に使用されている場合、「高グリシン培地」という用語は、グリシンの濃度が、典型的な細胞培養培地に見出されるグリシンの濃度より高い培地を指す。以下の表１に示されているように、市販の培養培地（例えば、基礎培地）中のグリシンの濃度は約０．１ｍＭから約２ｍＭの範囲である。
【００２４】
【表１】
0006351598.tif 000002
【００２５】
本開示の培養培地中のグリシンの濃度は、好ましくは、５ｍＭ以上である。例えば、培養培地中のグリシンの濃度は５ｍＭから１００ｍＭ（例えば、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２２ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭまたは５０ｍＭ）であってもよい。特定の実施形態において、培養培地中のグリシンの濃度は、限定されないが、５ｍＭから１０ｍＭ、７ｍＭから１０ｍＭ、１０ｍＭから１５ｍＭ、１２ｍＭから１７ｍＭ、１５ｍＭから２０ｍＭ、１６ｍＭから１８ｍＭ、１０ｍＭから３０ｍＭ、１０ｍＭから２５ｍＭ、２０ｍＭから３０ｍＭ、１０ｍＭから５０ｍＭまたは２０ｍＭから５０ｍＭの範囲の濃度などの２つの前述の値のいずれかに制限され得る。
【００２６】
本開示の培養培地はグリシンに加えて種々のアミノ酸を含有してもよい。例えば、培養培地は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを含む他のアミノ酸を含有してもよい。特定の実施形態において、培養培地は、通常、従来の培地（例えば、基礎培地）中で見出されている濃度で存在するアミノ酸（グリシン以外）を含有してもよい。好適なアミノ酸は表２に列挙されている範囲の濃度を有する。
【００２７】
【表２】
0006351598.tif 000003
【００２８】
特定の実施形態において、本開示は、グリシンが５ｍＭから３０ｍＭの濃度であり、グリシン以外の１種以上のアミノ酸が表３に列挙されている濃度以下の濃度を有する、培養培地を提供する。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１種のアミノ酸は、表３に列挙されている濃度以下の濃度を有してもよい。一実施形態において、培養培地中のリシンの濃度は０．５ｍＭから５．０ｍＭの間である。表２に特定されていない他のアミノ酸が、例えば、表２に列挙されている範囲の濃度にて培養培地中に存在してもよい。
【００２９】
【表３】
0006351598.tif 000004
【００３０】
他の態様において、本開示は、グリシンが５ｍＭから３０ｍＭの濃度であり、グリシン以外の１種以上のアミノ酸が表４に列挙されている濃度以下の濃度を有する、培養培地を提供する。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１種のアミノ酸は、表４に列挙されている濃度以下の濃度を有してもよい。表３に特定されていない他のアミノ酸が、例えば、表２に列挙されている範囲の濃度にて培養培地中に存在してもよい。
【００３１】
【表４】
0006351598.tif 000005
【００３２】
加えて、本開示の培養培地は種々のビタミンを含有してもよい。典型的なビタミンは、限定されないが、ビタミンＢ−１２、ビオチン、コリン、葉酸、ナイアシンアミド（ｎｉｃａｃｉｎａｍｉｄｅ）、パントテン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐａｎｔｈｔｈｅｎａｔｅ）、塩酸ピリドキサール、リボフラビンおよび塩酸チアミンを含む。ビタミンは表５に示されている濃度範囲にて適切に使用され得る。
【００３３】
【表５】
0006351598.tif 000006
【００３４】
加えて、本開示の細胞培養培地は種々の微量元素を含有してもよい。典型的な微量元素は、限定されないが、無水塩化カルシウム、無水塩化マグネシウム、無水硫酸マグネシウム、塩化カリウムおよび無水第二リン酸ナトリウムを含む。微量元素は表６に示された濃度範囲にて培養培地中で適切に使用され得る。
【００３５】
【表６】
0006351598.tif 000007
【００３６】
培養培地はまた、少なくとも１種のエネルギー源を含んでもよい。細胞培養中に含まれ得るエネルギー源の例は、グルコース、マンノース、ガラクトース、マルトースおよびフルクトースを含む。グルコースは５ｇ／Ｌから２０ｇ／Ｌの範囲の濃度にて培養培地に加えられてもよい。
【００３７】
本開示の培養培地はまた、緩衝液を含有してもよい。緩衝液は適切なｐＨにて細胞培養を維持するために使用される。培養培地中に使用され得る緩衝液は、限定されないが、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液（例えば、第一リン酸ナトリウムおよび第二リン酸ナトリウム）および炭酸ナトリウムを含む。緩衝液は、許容可能な範囲、典型的には６．５から７．５の範囲のｐＨ、より典型的には６．８から７．２の範囲のｐＨにて培養培地のｐＨを維持するために使用され得る。
【００３８】
培養培地はオスモル濃度を調節するために塩を含有してもよい。例えば、オスモル濃度調節因子は、典型的には２５０〜４００ミリオスモル（ｍＯｓｍ）の間、より典型的には２７０〜３５０ｍＯｓＭの間の範囲にて培養培地のオスモル濃度を維持するために加えられる。特徴的なオスモル濃度調節因子は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムなどの塩を含む。培養培地中の高グリシン量は培地のオスモル濃度に影響を与えることは当業者により理解される。したがって、培養培地のオスモル濃度は、高グリシンレベルの影響を受けるオスモル濃度を考慮した後、培地に加えられるオスモル濃度調節因子の量を減少させることによって適切な範囲に維持され得る。
【００３９】
本開示の培養培地はまた、脂質因子を含有してもよい。典型的な脂質因子は、限定されないが、リポ酸、塩化コリン、オレイン酸およびホスファチジルコリンを含む。
【００４０】
５．２．糖タンパク質
本開示は非フコシル化グリコフォームが豊富にある糖タンパク質を提供する。セクション５．２．１は本開示の方法によって産生され得る抗体を記載している。セクション５．２．２は本開示の方法によって産生され得る他の種類の糖タンパク質を記載している。
【００４１】
５．２．１．抗体
抗体（Ａｂ）および免疫グロブリン（Ｉｇ）は同じ構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は特定の標的に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは標的特異性を欠く抗体および他の抗体様分子の両方を含む。天然抗体および免疫グロブリンは、通常、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各々の重鎖は、一端にて可変ドメイン（ＶＨ）、続いて複数の定常ドメインを有する。各々の軽鎖は、一端にて可変ドメイン（ＶＬ）およびその他端にて定常ドメインを有する。
【００４２】
本開示は非フコシル化グリコフォームが豊富にある抗体を提供する。他に示されない限り、「抗体」（Ａｂ）という用語は、特定の抗原に特異的に結合するまたは特定の抗原に対して免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子を指し、ポリクローナル、モノクローナル、限定されないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディ）を含む、遺伝子操作されたおよび別様で修飾された形態の抗体ならびに例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧおよびｓｃＦｖ断片を含む、抗体の抗原結合断片を含む。さらに、他に示されない限り、「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、インタクトな分子およびタンパク質に特異的に結合できる抗体断片（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片など）の両方を含むことを意図する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、インタクトな抗体のＦｃ断片を欠き、動物の循環からより急速に排出し、インタクトな抗体より非特異的組織にほとんど結合できない（Ｗａｈｌら、１９８３、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６）。「ｓｃＦｖ」という用語は、従来の抗体由来の重鎖および軽鎖の可変ドメインが結合して１つの鎖を形成する、単一鎖Ｆｖ抗体を指す。
【００４３】
「ＶＨ」に対する参照は、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはＦａｂの重鎖を含む、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」に対する参照は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂの軽鎖を含む、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
【００４４】
軽鎖および重鎖可変ドメインの両方は、超可変領域としても知られている、相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。当該分野において公知のように、抗体の超可変領域を示すアミノ酸位置／境界は、当該分野において公知の状況および種々の定義に応じて変化し得る。可変ドメイン内のいくつかの位置は、これらの位置が、１つのセットの基準下で超可変領域内であると考えられ得るのに対して、異なるセットの基準下で超可変領域外であると考えられるという点でハイブリッド超可変位置と見なされ得る。これらの位置の１つ以上はまた、伸長された超可変領域に見出され得る。各鎖内のＣＤＲは、ＦＲ領域に近接し、抗体の標的結合部位の形成に起因して他の鎖に由来するＣＤＲと一緒に保持される（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．１９８７）を参照のこと。本明細書に使用されている場合、免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けは、他に示されない限り、Ｋａｂａｔらの免疫グロブリンアミノ酸残基番号付けシステムに従って行われる。
【００４５】
抗体断片はまた、本開示の組成物および方法を利用して産生され得る。「抗体断片」という用語は、完全長抗体の一部、概して、標的結合または可変領域を指す。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片を含む。「Ｆｖ」断片は、完全な標的認識および結合部位を含有する最小抗体断片である。この領域は、密接した非共有結合会合（ＶＨ−ＶＬ二量体）において１本の重鎖および１本の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この構成において、各可変ドメインの３つのＣＤＲは、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上で標的結合部位を定義するように相互作用する。多くの場合、６つのＣＤＲは抗体に対して標的結合特異性を与える。しかしながら、一部の場合、単一の可変ドメイン（または標的に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｃの半分）でさえ、標的を認識し、結合する能力を有し得る。「単一鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は単一ポリペプチド鎖において抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが標的結合に対する所望の構造を形成できるＶＨとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含む。「単一ドメイン抗体」は、標的に対して十分な親和性を示す単一ＶＨまたはＶＬドメインから構成される。特定の実施形態において、単一ドメイン抗体はラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）抗体である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ、１９９９、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２５−３８を参照のこと）。
【００４６】
Ｆａｂ断片は軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における少しの残基の付与によってＦａｂ断片と異なる。Ｆ（ａｂ’）断片は、Ｆ（ａｂ’）２ペプシン消化産物のヒンジシステインにおけるジスルフィド結合の切断によって産生される。抗体断片のさらなる化学カップリングは当業者に公知である。
【００４７】
特定の実施形態において、本開示の抗体はモノクローナル抗体である。本明細書に使用されている場合、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核生物、原核生物またはファージクローンを含む、単一クローンに由来する抗体を指し、これが産生される方法ではない。本開示により有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換えおよびファージディスプレイ技術またはそれらの組合わせの使用を含む、当該分野において公知の広範な技術を使用して調製され得る。本開示の抗体は、キメラ、霊長類化、ヒト化またはヒト抗体を含む。
【００４８】
本開示の方法および組成物を利用して産生された抗体はキメラ抗体であってもよい。本明細書に使用されている場合、「キメラ」抗体という用語は、ラットまたはマウス抗体などの非ヒト免疫グロブリンおよび典型的にヒト免疫グロブリン鋳型から選択される、ヒト免疫グロブリン定常領域に由来する可変配列を有する抗体を指す。キメラ抗体を産生するための方法は当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９（４７１９）：１２０７−７；Ｏｉら、１９８６、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４−２２１；Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９８５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，８０７，７１５；４，８１６、５６７；および４，８１６３９７（これらはそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。）を参照のこと。
【００４９】
本開示の方法および組成物を利用して産生される抗体はヒト化であってもよい。非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはこれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の標的結合サブドメインなど）である。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域に対応する。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の少なくとも一部を含んでもよい。抗体ヒト化の方法は当該分野において公知である。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−７；米国特許番号：５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６１；５，６９３，７６２；およびＱｕｅｅｎらによる６，１８０，３７０；ＥＰ２３９４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許番号５，２２５，５３９；ＥＰ５９２１０６；ＥＰ５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ、１９９１、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．７：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９６９−９７３；および米国特許番号５，５６５，３３２（これらの全てはそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。）を参照のこと。
【００５０】
本開示の方法および組成物を利用して産生される抗体はヒト抗体であってもよい。完全に「ヒト」抗体はヒト患者の治療的処置に好適であり得る。本明細書に使用されている場合、「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーからまたは１つ以上のヒト免疫グロブリンに対する動物トランスジェニックから単離された抗体を含み、内因性免疫グロブリンを発現しない。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用したファージディスプレイ法を含む当該分野において公知の種々の方法によって作製され得る。米国特許番号４，４４４，８８７および４，７１６，１１１；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６６４５；ＷＯ９８／５０４３３；ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９８／１６６５４；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；ならびにＷＯ９１／１０７４１（これらの各々はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。）を参照のこと。ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンを発現できないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを使用して産生され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；米国特許番号５，４１３，９２３；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，５６９，８２５；５，６６１，０１６；５，５４５，８０６；５，８１４，３１８；５，８８５，７９３；５，９１６，７７１；および５，９３９，５９８（これらはそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。）を参照のこと。加えて、Ｍｅｄａｒｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）、Ａｓｔｅｌｌａｓ  Ｐｈａｒｍａ（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）およびＲｅｇｅｎｅｒｏｎ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）などの会社は、上記の技術と類似の技術を使用して選択抗原に対するヒト抗体を提供することを保証できる。選択エピトープを認識する完全なヒト抗体は、「誘導選択」と称される技術を使用して生成され得る。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体が同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択を誘導するために使用される（Ｊｅｓｐｅｒｓら、１９８８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３）。
【００５１】
本開示の方法および組成物を利用して産生される抗体は霊長類化されてもよい。「霊長類化抗体」という用語は、サル可変領域およびヒト定常領域を含む抗体を指す。霊長類化抗体を産生する方法は当該分野において公知である。例えば、米国特許番号５，６５８，５７０；５，６８１，７２２；および５，６９３，７８０（これらはそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。）を参照のこと。
【００５２】
本開示の方法および組成物を利用して産生される抗体は二重特異性抗体であってもよい。二重特異性抗体は、モノクローナル、多くの場合、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するヒトまたはヒト化抗体である。
【００５３】
本開示の方法および組成物を利用して産生される抗体は誘導体化抗体を含む。例えば、限定の目的ではないが、誘導体化抗体は、典型的に、公知の保護／遮断基、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質などとの連結による、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、誘導体化によって修飾される。多くの化学修飾のいずれかは、限定されないが、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む、公知の技術によって実施され得る。加えて、誘導体は、例えば、ａｍｂｒｘ技術を使用して１種以上の非天然アミノ酸を含有してもよい（例えば、Ｗｏｌｆｓｏｎ、２００６、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３（１０）：１０１１−２を参照のこと）。
【００５４】
本開示のさらに別の実施形態において、抗体またはこの断片は、対応する野生型配列に対して少なくとも１つの定常領域により媒介される生物学的エフェクター機能を変化させるように配列が修飾されている抗体または抗体断片であってもよい。
【００５５】
例えば、一部の実施形態において、本開示の抗体は、非修飾抗体に対して少なくとも１つの定常領域により媒介される生物学的エフェクター機能を減少させる（例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に対する結合を減少させる）ように修飾されてもよい。ＦｃＲ結合は、ＦｃＲ相互作用に必要な特定の領域において抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを変異することによって減少され得る（例えば、ＣａｎｆｉｅｌｄおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９１、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９１；ならびにＬｕｎｄら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７−２６６２を参照のこと）。
【００５６】
他の実施形態において、本開示の方法および組成物を利用して産生される抗体は、非修飾抗体に対して少なくとも１つの定常領域により媒介される生物学的エフェクター機能を獲得するまたは改良する、例えば、ＦｃγＲ相互作用を亢進させるように修飾される（例えば、ＵＳ２００６／０１３４７０９を参照のこと）。例えば、対応する野生型定常領域より高い親和性でＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡに結合する定常領域を有する抗体は、本明細書に記載されている方法に従って産生され得る。
【００５７】
本開示の方法を使用して産生され得る抗体の例は、限定されないが、アダリムマブ、エロツズマブ、エナバツズマブ、ダクリズマブ、ボロキシシマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、イステキヌマブ（ｉｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、アブシシマブ（ａｂｃｉｃｉｍａｂ）、ベシレソマブ、エタラシズマブ、ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、オマリズマブ、ペルツズマブ、ナタリズマブ、スレソマブ（ｓｕｌｅｓｏｍａｂ）、テフィバズマブ（ｔｅｆｉｂａｚｕｍａｂ）、ボツムマブ（ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、モタビズマブ、オレゴボマブム（ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂｍ）、パニツムマブ、ザルツムマブ、イゴボマブ（ｉｇｏｖｏｍａｂ）、ベバシズマブ、バシリキシマブ、アトリズマブ（ａｔｌｉｚｕｍａｂ）、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベリムマブ、アレムツズマブ、ニモツズマブ、メポリズマブ、アルツモマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、パリビズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、フォントリズマブ、ノフェツモマブ（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ）、オファツムマブ、アルシツモマブ、セツキシマブ、イムシロマブ（ｉｍｃｉｒｏｍａｂ）、セルトリズマブ、ロベリズマブ（ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）、ルプリズマブ（ｒｕｐｌｉｚｕｍａｂ）、イピリムマブ、ラベツズマブ、カツマキソマブ（ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、カナキヌマブ（ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）、デノスマブ、エクリズマブ、ファノレソマブ（ｆａｎｏｌｅｓｏｍａｂ）、エファリズマブ、インフリキシマブ、エドレコロマブ、エフングマブ（ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）、ギレンツキシマブ（ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）およびトクリズマブ（ｔｏｃｌｉｚｕｍａｂ）を含む。
【００５８】
５．２．２．他の糖タンパク質
本開示の方法は、治療目的のためのタンパク質を含む、任意のタンパク質の糖タンパク質を産生するために使用され得る。本開示に従って産生され得るタンパク質の例は、限定されないが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ヒト慢性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、アンチトロンビンＩＩＩ、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン６、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、アンチトロンビンＩＩＩ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマなどの増殖因子、第ＶＩＩＩｍ因子、第ＩＸ因子およびヒトプロテインＣ、上皮細胞増殖因子、成長ホルモン放出因子、上皮細胞増殖因子、アンギオスタチン、血管内皮細胞増殖因子−２およびプラスミノーゲン活性化因子などの凝固因子を含む。
【００５９】
５．３．核酸および発現系
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、ｅｄｓ．、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、１９８９）ならびに米国特許番号４，８１６，３９７に記載されているものなどの標準的な組換えＤＮＡ方法論が、本開示の方法に従って糖タンパク質を産生するのに適した組換え哺乳動物細胞を産生するために使用され得る。
【００６０】
糖タンパク質配列は当業者に周知である。糖タンパク質が抗体である実施形態において、組換え技術が、抗体重鎖および軽鎖遺伝子を得、これらの遺伝子を組換え発現ベクター内に組み込み、ベクターを宿主細胞内に導入するために使用され得る。抗体を組換えにより発現させるために、軽鎖および重鎖が宿主細胞内で発現し、場合により、宿主細胞が培養される培地内に分泌し、その培地から抗体が回収され得るように、宿主細胞は抗体の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ断片を保持する１種以上の組換え発現ベクターでトランスフェクトされる。抗体をコードする核酸を生成するために、軽鎖および重鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片が最初に得られる。これらのＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して軽鎖および重鎖可変配列をコードする生殖細胞ＤＮＡまたはｃＤＮＡの増幅および修飾により得られ得る。ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子についての生殖細胞ＤＮＡ配列は当該分野において公知である（例えば、「ＶＢＡＳＥ」ヒト生殖細胞配列データベースを参照のこと；また、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２Ｔ：１１６−１９８；およびＣｏｘら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６も参照のこと；これらの各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる。）。抗体の重鎖または軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片は、慣用の突然変異誘発技術を使用して本明細書に記載されているバリアントを生成するために突然変異誘発のための鋳型として合成されてもよく、使用されてもよく；あるいは、バリアントをコードするＤＮＡ断片が直接合成されてもよい。
【００６１】
一旦、抗体をコードするＤＮＡ断片が得られると、これらのＤＮＡ断片は、例えば、可変領域遺伝子を、完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作されてもよい。これらの操作において、ＶＬをコードするまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域またはフレキシブルなリンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。「作動可能に連結される」という用語は、本文脈において使用されている場合、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように２つのＤＮＡ断片が結合することを意味することが意図されている。
【００６２】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３および場合によってＣＨ４）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当該分野において公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照のこと。）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得られ得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であってもよいが、特定の実施形態において、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子について、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。
【００６３】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって完全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該分野において公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）を参照のこと。）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得られ得る。軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域であってもよいが、特定の実施形態において、カッパ定常領域である。ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨおよびＶＬ配列が、フレキシブルなリンカーによって結合しているＶＬおよびＶＨ領域を有する、隣接している単一鎖タンパク質として発現され得るように、ＶＨをコードするおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片は、フレキシブルなリンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号２１）をコードする別の断片に作動可能に連結される（例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４を参照のこと）。
【００６４】
糖タンパク質を発現するために、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結するように、糖タンパク質をコードするＤＮＡが発現ベクター内に挿入される。この文脈において、「作動可能に連結される」という用語は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、糖タンパク質をコードする配列の転写および翻訳を調節するこれらの意図する機能を果たすように、糖タンパク質をコードする核酸がベクター中にライゲーションされることを意味することが意図されている。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。糖タンパク質が抗体である場合、軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子が別のベクター内に挿入され得るまたはより典型的には、両方の遺伝子が同じ発現ベクター内に挿入される。
【００６５】
糖タンパク質をコードする核酸は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクターにおける相補的制限部位のライゲーションまたは制限部位が存在しない場合、平滑末端ライゲーション）によって発現ベクター内に挿入され得る。抗体軽鎖または重鎖配列の挿入前に、糖タンパク質が抗体である場合、発現ベクターは既に抗体定常領域配列を保持していてもよい。例えば、抗体ＶＨおよびＶＬ配列を完全長抗体遺伝子に変換するための１つのアプローチは、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように、これらを、重鎖定常領域および軽鎖定常領域のそれぞれを既にコードしている発現ベクター内に挿入することである。加えてまたは代替として、組換え発現ベクターは、宿主細胞から抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードできる。シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子はベクター中にクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であってもよい。
【００６６】
組換え発現ベクターは、宿主細胞内で糖タンパク質をコードする配列の発現を制御する調節配列を保持できる。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図されている。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９０）に記載されている。調節配列の選択を含む、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような要因に依存し得ることは当業者により理解される。哺乳動物宿主細胞発現のための好適な調節配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマなどの、哺乳動物細胞中で高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルスエレメントを含む。ウイルス調節エレメントおよびこの配列のさらなる詳細に関して、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許番号５，１６８，０６２、Ｂｅｌｌらによる米国特許番号４，５１０，２４５およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許番号４，９６８，６１５を参照のこと。
【００６７】
組換え発現ベクターは、宿主細胞内でベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択可能なマーカー遺伝子などのさらなる配列を保持してもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、全てＡｘｅｌらによる、米国特許番号４，３９９，２１６、４，６３４，６６５および５，１７９，０１７を参照のこと）。例えば、典型的に、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞において、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を与える。好適な選択可能なマーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を用いてＤＨＥＲ−宿主細胞において使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を含む。軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターが、標準的な技術によって宿主細胞内にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」という用語の種々の形態は、外因性ＤＮＡを哺乳動物宿主細胞内に導入するために一般に使用されている広範囲の技術を包含することが意図されている。
【００６８】
本開示の糖タンパク質は、適切に折り畳まれて、免疫学的に活性なタンパク質の最適な分泌のために哺乳動物宿主細胞内で発現され得る。本開示の組換え抗体を発現するための例示的な哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、１９８２、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されている、ＤＨＦＲ選択可能なマーカーと共に使用される、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載されている、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含む。）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＥＢ６６（Ｒ）細胞およびＰＥＲ．Ｃ６（Ｒ）細胞を含む。糖タンパク質をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞内に導入される場合、糖タンパク質は、宿主細胞内で糖タンパク質の発現または宿主細胞が増殖する培養培地内の糖タンパク質の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生される。好適な培養技術はセクション５．４に記載されている。糖タンパク質は、例えば、セクション５．５に記載されているような標準的なタンパク質精製法を使用して培養培地から回収され得る。
【００６９】
５．４．培養方法
本開示は、セクション５．１に記載されている培養培地などの高グリシン培養培地中で糖タンパク質を発現するように操作された哺乳動物細胞を培養することによって糖タンパク質（例えば、抗体）を産生する方法を提供する。本開示の方法は、従来の培養培地中で産生された糖タンパク質と比較して減少したフコシル化グリコフォームを有する糖タンパク質を提供する。
【００７０】
セクション５．３に記載されている組換え哺乳動物細胞は、好適な培地中ならびに糖タンパク質を発現できるおよび／または単離できる条件下で実施される実験室または工業発酵において、スモールスケールまたはラージスケール発酵（連続、バッチ、供給バッチまたは固体状態発酵を含む）においてフラスコ培養を振盪することなどにより、懸濁液中で培養され得る。あるいは、哺乳動物細胞は固体基質に付着している間に培養されてもよい。
【００７１】
特定の実施形態において、組換え哺乳動物細胞は、０．５〜５×１０５細胞／ｍＬの範囲、より典型的には１．５〜２．５×１０５細胞／ｍＬの範囲の開始細胞濃度にて基礎培地に加えられる。培養物は、通常、接種後、約８日から２０日の間、より典型的には、接種後、１０日から１４日の間に収集される。
【００７２】
哺乳動物細胞の接種後、細胞の増殖は所定の供給スケジュールに従う栄養素の添加によって促進され得る。培養への供給培地の添加は、連続培養、バッチ培養および供給バッチ培養などの当該分野において公知のプロセスにより行われ得る。細胞の増殖を補助するために、供給溶液が接種後の断続的な時間にて培養に加えられてもよい。本明細書に使用されている場合、「供給」という用語は、接種後、培養に加えられる栄養素を指す。「供給溶液」または「供給培地」という用語は、接種後、培養に加えられる供給を含有する溶液を指す。
【００７３】
５．５．回収および精製
発現タンパク質を回収し、精製する技術は当該分野において周知であり、組換え哺乳動物細胞によって発現される特定の糖タンパク質に合わせられ得る。糖タンパク質は培養培地およびまたは細胞溶解物から回収され得る。方法が分泌糖タンパク質を産生することを対象とする実施形態において、糖タンパク質は培養培地から回収され得る。タンパク質は、限定されないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧−乾燥、蒸発または沈殿を含む、当該分野において公知の種々の手段によって培養培地から回収または精製され得る。回収された糖タンパク質は、次いで、限定されないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマト分画およびサイズ排除）、電気泳動手段（例えば、分取等電点電気泳動（ＩＥＦ）、異なる溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）または抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ、編、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９を参照のこと。）を含む、当該分野において公知の種々の手段によってさらに精製され得る。
【００７４】
糖タンパク質が抗体である実施形態において、抗体は、プロセス中間体を希釈しない連続フロープロセスを可能にする、強陰イオン交換（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）クロマトグラフィーおよび弱陽イオン交換（ＣＭ−６５０Ｍ）クロマトグラフィーと併せてプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを利用するプロセスによって精製され得る。精製抗体を得るこの方法は以下の工程を必要とする：
（ｉ）他の細胞培養成分から抗体を単離するためのプロテインＡ親和性クロマトグラフィー、
（ｉｉ）低ｐＨウイルス不活性化、
（ｉｉｉ）ＤＮＡを除去するための強陰イオン交換クロマトグラフィー、
（ｉｖ）凝集体を減少させるための弱陽イオン交換クロマトグラフィー、および
（ｖ）ウイルスを除去するための濾過。
工程（ｉｉ）−（ｖ）は任意の順序で実施され得る。
【００７５】
一旦、単離すると、所望の場合、抗体は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｏｒｋ  ａｎｄ  Ｂｕｒｄｏｎ、ｅｄｓ．、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８０を参照のこと。）によってまたはＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）でのゲル濾過クロマトグラフィーによってさらに精製され得る。
【００７６】
５．６．タンパク質グリコフォーム
グリコシル化によるタンパク質の翻訳後修飾はタンパク質の生化学および物理的特性に影響を与え得る。例えば、抗体の特性は抗体のＦｃおよびＦａｂ領域の両方においてグリコシル化により影響を受け得る。「グリコシル化」とは、タンパク質（例えば、抗体）と炭水化物（例えば、オリゴ糖鎖）との共有結合修飾を指す。糖タンパク質における典型的な糖は、マンノース、グルコース、ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸を含む。
【００７７】
個々のグリコシル化分子（例えば、グリコシル化抗体）は、本明細書において、グリコフォームと称されている。「グリコシル化プロファイル」とは、特定の試料におけるグリコフォームのセットを指す。グリコシル化は、一般に、Ｎ結合型グリコシル化またはＯ結合型グリコシル化を指す。「Ｎ結合型グリコシル化」という用語は、タンパク質のアスパラギン残基とのオリゴ糖鎖の共有結合を指し、それによりＮ結合型オリゴ糖を形成する。Ｎ結合型オリゴ糖はまた、Ｎ結合型グリカンと称されている。「Ｏ結合型グリコシル化」という用語は、タンパク質のセリンまたはトレオニン残基のヒドロキシル基とのオリゴ糖鎖の共有結合を指し、それによりＯ結合型オリゴ糖を形成する。Ｏ結合型オリゴ糖はまた、Ｏ結合型グリカンと称されている。
【００７８】
Ｎ結合型グリカンは、これらがＮ結合型−Ｎ−アセチルグルコサミンに結合したフコースを含有するか否かに関わらず、これらの末端におけるガラクトース残基の数によってさらに特徴付けられている。Ｎ結合型Ｎ−アセチルグルコサミンに結合したフコース分子を有するＮ結合型グリカンは、本明細書において、フコシル化Ｎ結合型グリカンと称されている。フコシル化Ｎ結合型グリカンを有するタンパク質は、本明細書において、フコシル化グリコフォームと称されている。４つの異なるフコシル化Ｎ結合型グリカンの特徴は以下に列挙されている（図１も参照のこと。）：
・  Ｇ０：コア構造の各分岐においてＮ結合型Ｎ−アセチルグルコサミンに結合したフコースおよび１つのＮ−アセチルグルコサミンを有する二分岐（すなわち、２つのアンテナを有する）コア構造。
【００７９】
・  Ｇ１：コア構造の各分岐においてＮ結合型Ｎ−アセチルグルコサミンに結合したフコース、１つのＮ−アセチルグルコサミンおよびコア構造の１つの分岐において末端ガラクトースを有する二分岐コア構造。
【００８０】
・  Ｇ２：コア構造の各分岐においてＮ結合型Ｎ−アセチルグルコサミンに結合したフコース、１つのＮ−アセチルグルコサミンおよび１つの末端ガラクトースを有する二分岐コア構造。
【００８１】
・  Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃ：コア構造の１つの分岐においてＮ結合型Ｎ−アセチルグルコサミンに結合したフコース、１つのＮ−アセチルグルコサミンを有し、末端ガラクトースを有さない二分岐コア構造。
【００８２】
フコース分子を含有しないＮ結合型グリカンは、非フコシル化グリカンと称されている。非フコシル化グリカンを有するタンパク質は、非フコシル化グリコフォームと称されている。例えば、Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃ−フコースＮ結合型グリカンは、コア構造の１つの分岐においてＮ結合型Ｎ−アセチルグルコサミンに結合したフコース、１つのＮ−アセチルグルコサミンを有さず、末端ガラクトースを有さない二分岐コア構造を有する。Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃ−フコースＮ結合型グリカンを含有する抗体は、本明細書において、Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃ−フコースＮ結合型グリコフォームと称されている。
【００８３】
Ｎ結合型グリコシル化プロファイルは種々の方法によって評価され得る。例えば、Ｎ結合型グリコシル化プロファイルは、トリプシンを用いて抗体を消化し、種々の糖ペプチドの質量分析検出および定量と共に逆相クロマトグラフィーを使用して、得られたペプチド混合物を分析することによって評価され得る。特定の方法において、消化されたペプチドは、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱ、５ｕｍ粒径、１２０Å孔径、２．０ｍｍ×２５０ｍｍ逆相カラム（ＹＭＣ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ、カタログ番号ＡＱ１２Ｓ０５−２５０２ＷＴ）を使用して分析され、溶出したペプチドは、Ｔｈｅｒｍｏ  ＬＣＱ  Ｄｅｃａ  ＸＰ＋質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ）を使用して検出され、定量される。各グリコフォームの相対存在量は、全ての観察された糖ペプチドのピーク面積の合計に対して、対応する糖ペプチドの質量分析抽出イオンクロマトグラムピーク面積に基づいて決定される。
【００８４】
あるいは、Ｎ結合型グリコシル化プロファイルは、蛍光標識を有するオリゴ糖を誘導体化し、蛍光検出と共に順相ＨＰＬＣにより、得られた混合物を分析する、アミダーゼＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いてＮ結合型オリゴ糖を切断することによって評価され得る。特定の方法において、誘導体化され、切断されたＮ結合型グリカンは、２５０×４．６ｍｍポリマーアミン結合Ａｓａｈｉｐａｋ  Ａｍｉｎｏ  ＮＨ２Ｐ−５０４Ｅカラム（５μｍ粒径、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ．カタログ番号ＣＨＯ−２６２８）で５０℃にて分割される。
【００８５】
ＩｇＧのグリコシル化プロファイルの研究により、ＩｇＧが少なくとも３０個の異なるＮ結合型オリゴ糖を保持することが明らかにされている。Ｄｗｅｋら、１９９５、Ｊ．Ａｎａｔ．１８７：２７９−２９２を参照のこと。Ｎ結合型グリコシル化部位（ｃｉｔｅｓ）は多くの抗体のＦｃ領域およびＦａｂ領域の両方に見出されている。シアル酸基を１つも有さないＮ結合型オリゴ糖は、多くの場合、中性Ｎ結合型オリゴ糖と称されている。オリゴ糖の非還元糖末端において１つまたは２つのシアル酸基を有するＮ結合型オリゴ糖はそれぞれ、モノシアル化またはジシアル化Ｎ結合型オリゴ糖と称されている。ＩｇＧに関して、Ｆｃグリコシル化はモノシアル化およびジシアル化構造の低い発生率によって特徴付けられているのに対して、Ｆａｂグリコシル化は、モノシアル化およびジシアル化構造の高い発生率によって特徴付けられている。
【００８６】
さらなるＮ結合型グリカンが抗体のＦｃ領域において特定されている。例えば、マンノースを含有する残りの残基と共に２つのＮ−アセチルグルコサミンのみを含有するグリカンによって特徴付けられている多量のマンノースを含有するグリカンは、「高マンノースグリカン」と称されている。マンノース残基はオリゴ糖の２位においてＧｌｃＮＡｃに共有結合している。高マンノース５グリカンの一例は「マンノース５グリカン」である。マンノース５グリカンは５個のマンノース残基を含有する。マンノース５グリカンを有するタンパク質は、本明細書において、「マンノース５グリコフォーム」と称されている。高マンノースグリカンは非フコシル化グリカンの例である。
【００８７】
本開示は、フルコースを含有しないグリコフォーム（すなわち、非フコシル化グリコフォーム）が豊富にある抗体を産生する方法を提供する。非フコシル化グリコフォームの例は、限定されないが、Ｇ０−ＧＬｃＮＡｃ−フコースグリコフォームおよびマンノース５グリコフォームを含む。フコースを欠く抗体はＡＤＣＣ（抗体依存性細胞毒性）活性の亢進と相関している。リンパ球、特にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は抗体のＦｃ領域に結合できる表面結合受容体を含有する。例えば、ＮＫ細胞におけるヒトＣＤ１６ａ受容体は標的細胞に結合した抗体のＦｃ領域に結合し、それにより標的細胞の殺傷を開始する。理論によって束縛されないが、本開示の方法に従って産生された非フコシル化グリコフォームは、増加したＡＤＣＣ活性の原因である、フコースを含有するグリコフォーム（すなわち、フコシル化グリコフォーム）よりＮＫ細胞におけるＣＤ１６ａ受容体に対して高い結合親和性を示すと考えられる。
【００８８】
本明細書に記載されている高グリシン培地中に産生された抗体は、従来の培地中に産生された抗体より顕著に多い非フコシル化グリコフォームを含有する。セクション５．３に記載されているように、フコースを欠くグリカンの全量は、一般に、培養培地中のグリシンの濃度が２ｍＭから３０ｍＭに増加するにつれて増加する。特に、Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃ−フコースおよびマンノース５グリカンの百分率は、ＮＳ０細胞が、本開示に従って産生された培養培地中で培養される場合、増加する。本開示の培養培地中で産生された非フコシル化抗体の量はＡＯＩに依存するが、フコースを欠くグリカンの百分率の増加は、一般に、従来の培地（すなわち、２ｍＭ未満のグリシン濃度を有する培地）中で産生された抗体に対して少なくとも１２０％である。例えば、本開示の培養培地中で産生された抗体においてフコースを欠く全グリカンのパーセントの増加は、従来の培地中で産生された抗体に対して１２０％、１５０％、１８０％、２００％、２５０％、３００％または４００％であってもよい。特定の実施形態において、従来の基礎培地中で産生された抗体に対して本開示の方法によって産生された抗体においてフコースを欠く全グリカンのパーセントの増加は、限定されないが、１２０〜１５０％、１５０〜１８０％、１５０〜２００％または２００〜３００％などの２つの前述の値のいずれかによって制限される。
【００８９】
本開示は、従来の培地中で産生された抗体に対して変化したグリコシル化プロファイルを有する対象の特定の抗体を含む組成物をさらに提供する。特に、本開示の方法によって産生された抗体は、従来の培地中で産生された抗体より多い百分率の非フコシル化グリコフォームを有する。結果として、本開示の方法によって産生された抗体は、一般に、従来の培地中で産生された抗体より高いＡＤＣＣ活性を示し、ＮＫ細胞におけるＣＤ１６ａ受容体との高い結合を示す。
【００９０】
１つの特定の実施形態において、本開示の方法は、配列番号１のアミノ酸配列のＶＨ領域および配列番号２のアミノ酸配列のＶＬ領域を有するモノクローナル抗体を産生するために使用され得る。エロツズマブ（ＨｕＬｕｃ  ６３）と称されているモノクローナル抗体は、それぞれ配列番号４１および配列番号４４のＶＨおよびＶＬ領域を有するとしてＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００６／００２４２９６（この内容は本明細書に参照により組み込まれる。）に開示されていた。エロツズマブは、配列番号３の完全重鎖アミノ酸配列および配列番号４の完全軽鎖アミノ酸配列を有する。エロツズマブは、原発性骨髄腫細胞においてインビトロ抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）およびインビボ抗腫瘍活性を示す（Ｈｓｉら、（２００８）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１４（９）：２７７５）。
【００９１】
本開示は、グリカンの少なくとも４％がフコースを欠き、本開示の細胞培養プロセスに従って産生される、エロツズマブ分子の集団を含む組成物を提供する。例えば、エロツズマブにおけるグリカンの少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％または少なくとも８％はフコースを欠く。特定の実施形態において、本開示の細胞培養プロセスに従って産生されたエロツズマブの非フコシル化グリカンは、限定されないが、Ｇ０−ＧｌｃＮＡＣ−フコースおよびマンノース５グリカンなどのＮ結合型グリカンを含む。これらの実施形態において、Ｎ結合型グリカンの少なくとも４％はフコースを欠く。他の実施形態において、本開示は、マンノース５グリカンとして存在する全グリカンの少なくとも２．５％を有するエロツズマブ分子を提供する。例えば、エロツズマブにおけるグリカンの少なくとも３％、少なくとも４％または少なくとも５％はマンノース５グリカンとして存在し得る。
【００９２】
別の実施形態において、本開示の方法は、配列番号５のアミノ酸配列のＶＨ領域および配列番号６のアミノ酸配列のＶＬ領域を有するモノクローナル抗体を産生するために使用され得る。ダクリズマブと称されている、モノクローナル抗体は、リンパ球活性化の重要なメディエーターである、ヒトインターロイキン−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）のアルファサブユニット（ＣＤ２５またはＴａｃとも称されている）に特異的に結合するヒト化ＩｇＧ１抗体である。ダクリズマブは配列番号７の完全重鎖アミノ酸配列および配列番号８の完全軽鎖アミノ酸配列を有する。
【００９３】
本開示は、グリカンの少なくとも３％がフコースを欠き、本開示の細胞培養プロセスに従って産生される、ダクリズマブ分子の集団を含む組成物を提供する。例えば、ダクリズマブにおけるグリカンの少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％または少なくとも８％はフコースを欠く。特定の実施形態において、本開示の細胞培養プロセスに従って産生されたダクリズマブの非フコシル化グリカンは、限定されないが、Ｇ０−ＧｌｃＮＡＣ−フコースおよびマンノース５グリカンなどのＮ結合型グリカンを含む。これらの実施形態において、Ｎ結合型グリカンの少なくとも３％はフコースを欠く。他の実施形態において、本開示は、マンノース５グリカンとして存在する全グリカンの少なくとも２％を有するダクリズマブ分子を提供する。例えば、ダクリズマブにおけるグリカンの少なくとも３％、少なくとも４％または少なくとも５％はマンノース５グリカンとして存在し得る。
【００９４】
別の実施形態において、本開示の方法は、配列番号９のアミノ酸配列のＶＨ領域および配列番号１０のアミノ酸配列のＶＬ領域を有するモノクローナル抗体を産生するために使用され得る。ボロキシシマブと称されている、モノクローナル抗体は、種々の進行した段階の腫瘍の治療に使用されるα５β１インテグリンに特異的に結合する高親和性のＩｇＧ４キメラ（８２％ヒト、１８％マウス）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。ボロキシシマブは配列番号１１の完全重鎖アミノ酸配列および配列番号１２の完全軽鎖アミノ酸配列を有する。
【００９５】
本開示は、グリカンの少なくとも１％がフコースを欠き、本開示の細胞培養プロセスに従って産生される、ボロキシシマブ分子の集団を含む組成物を提供する。例えば、ボロキシシマブにおけるグリカンの少なくとも１％はフコースを欠く。特定の実施形態において、本開示の細胞培養プロセスに従って産生されるボロキシシマブの非フコシル化グリカンは、限定されないが、Ｇ０−ＧｌｃＮＡＣ−フコースおよびマンノース５グリカンなどのＮ結合型グリカンを含む。これらの実施形態において、Ｎ結合型グリカンの少なくとも１％はフコースを欠く。他の実施形態において、本開示は、マンノース５グリカンとして存在する全グリカンの少なくとも０．５％を有するボロキシシマブ分子を提供する。
【００９６】
別の実施形態において、本開示の方法は、配列番号１３のアミノ酸配列のＶＨ領域および配列番号１４のアミノ酸配列のＶＬ領域を有するモノクローナル抗体を産生するために使用され得る。ＰＤＬ２４１と称されている、モノクローナル抗体はタンパク質ＣＳ１（しかしエロツズマブと異なるエピトープにおいて）に結合するヒト化ＩｇＧ１抗体である。ＰＤＬ２４１は配列番号１５の完全重鎖アミノ酸配列および配列番号１６の完全軽鎖アミノ酸配列を有する。
【００９７】
本開示は、グリカンの少なくとも１４％がフコースを欠き、本開示の細胞培養プロセスに従って産生される、ＰＤＬ２４１分子の集団を含む組成物を提供する。例えば、ＰＤＬ２４１におけるグリカンの少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％または少なくとも１９％はフコースを欠く。特定の実施形態において、本開示の細胞培養プロセスに従って産生されるＰＤＬ２４１の非フコシル化グリカンは、限定されないが、Ｇ０−ＧｌｃＮＡＣ−フコースおよびマンノース５グリカンなどのＮ結合型グリカンを含む。これらの実施形態において、Ｎ結合型グリカンの少なくとも１４％はフコースを欠く。他の実施形態において、本開示は、マンノース５グリカンとして存在する全グリカンの少なくとも８％を有するＰＤＬ２４１分子を提供する。例えば、ＰＤＬ２４１におけるグリカンの少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％または少なくとも１２％は、マンノース５グリカンとして存在し得る。
【００９８】
別の実施形態において、本開示の方法は、配列番号１７のアミノ酸配列のＶＨ領域および配列番号１８のアミノ酸配列のＶＬ領域を有するモノクローナル抗体を産生するために使用され得る。エナバツズマブ（ＰＤＬ１９２）と称されている、モノクローナル抗体は、２つの機構：ＴｗｅａｋＲによる直接シグナル伝達および抗体依存性細胞毒性によって前臨床モデルにおいて抗腫瘍活性を示すＴｗｅａｋＲに対するヒト化ＩｇＧ１抗体である。エナバツズマブは配列番号１９の完全重鎖アミノ酸配列および配列番号２０の完全軽鎖アミノ酸配列を有する。
【００９９】
本開示は、グリカンの少なくとも５％がフコースを欠き、本開示の細胞培養プロセスに従って産生される、エナバツズマブ分子の集団を含む組成物を提供する。例えば、エナバツズマブにおけるグリカンの少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％または少なくとも１０％はフコースを欠く。特定の実施形態において、本開示の細胞培養プロセスに従って産生されるエナバツズマブの非フコシル化グリカンは、限定されないが、Ｇ０−ＧｌｃＮＡＣ−フコースおよびマンノース５グリカンなどのＮ結合型グリカンを含む。これらの実施形態において、Ｎ結合型グリカンの少なくとも５％はフコースを欠く。他の実施形態において、本開示は、マンノース５グリカンとして存在する全グリカンの少なくとも２．５％を有するエナバツズマブ分子を提供する。例えば、エロツズマブにおけるグリカンの少なくとも３％、少なくとも４％または少なくとも５％は、マンノース５グリカンとして存在し得る。
【０１００】
以下の表７は、上記に特定されているエロツズマブ、ダクリズマブ、ボロキシシマブ、ＰＤＬ２４１およびエナバツズマブの配列を提供する。
【０１０１】
【表７】
0006351598.tif 000008
0006351598.tif 000009
0006351598.tif 000010
0006351598.tif 000011
【０１０２】
５．７．医薬組成物
上記の糖タンパク質組成物は、医薬として許容可能な担体を含む滅菌医薬組成物の一部として供給され得る。この組成物は、（患者にこれを投与する所望の方法に応じて）任意の好適な形態であり得る。糖タンパク質組成物は、経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、髄腔内、局所または局部などの種々の経路によって患者に投与され得る。任意の所与の場合、最も好適な投与経路は、特定の糖タンパク質、対象ならびに疾患の性質および重症度ならびに対象の健康状態に依存する。典型的に、糖タンパク質組成物は静脈内または皮下に投与される。
【０１０３】
医薬組成物は、好都合には、１回の用量当たり本開示の所定量の糖タンパク質組成物を含有する単位用量形態で存在し得る。このような単位は、例えば、限定せずに、０．５ｍｇから５ｇ、例えば１０ｍｇから１ｇまたは２０から５０ｍｇを含有できる。本開示に使用するための医薬として許容可能な担体は、例えば、治療される病態または投与経路に応じて、多種多様な形態をとることができる。
【０１０４】
本開示の糖タンパク質組成物の治療製剤は、所望の程度の純度を有する糖タンパク質を、典型的に当該分野において利用されている、場合による医薬として許容可能な担体、賦形剤または安定剤（これらの全ては「担体」として本明細書で称されている。）、すなわち、緩衝剤、安定化剤、防腐剤、等張剤、非イオン性洗浄剤、酸化防止剤および他の種々雑多な添加剤と混合することによって凍結乾燥製剤または水溶液として貯蔵するために調製され得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版（Ｏｓｏｌ、ｅｄ．１９８０）を参照のこと。このような添加剤は、利用される投薬量および濃度にて受容者に対して非毒性でなければならない。
【０１０５】
緩衝剤は生理的状態に近い範囲にｐＨを維持するのに役立つ。これらは約２ｍＭから約５０ｍＭの範囲の濃度にて存在し得る。本開示と共に使用するための好適な緩衝剤は、有機および無機酸の両方ならびにクエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｇｌｙｕｃｏｎａｔｅ）混合物など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）および酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）などのこれらの塩を含む。加えて、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびトリスなどのトリメチルアミン塩が使用されてもよい。
【０１０６】
防腐剤が、微生物増殖を遅らせるために加えられてもよく、０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で加えられてもよい。本開示と共に使用するための好適な防腐剤は、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｃｏｎｉｕｍ）ハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物およびヨウ化物）、ヘキサメトニウムクロリドおよびメチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび３−ペンタノールを含む。時々「安定剤」としても知られている等張剤が、本開示の液体組成物の等張性を確保するために加えられてもよく、多価糖アルコール、例えば、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールなどの三価または高級糖アルコールを含む。安定剤とは、充填剤から、治療剤を可溶化するまたは変性もしくは容器の壁への接着を防ぐのに役立つ添加剤までの機能が様々であり得る賦形剤の広義のカテゴリーを指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上記に挙げた）；アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニンなどのアミノ酸、イノシトールなどのシクリトールを含む、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクチトール、グリセロールなどの有機糖または糖アルコール；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤；低分子量ポリペプチド（例えば、１０残基以下のペプチド）；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；キシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなどのポリビニルピロリドン単糖などの親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｙｌｉｃ）ポリマー；ラクトース、マルトース、スクロースなどの二糖およびラフィノースなどの三糖（ｔｒｉｓａｃｃａｃｈａｒｉｄｅ）；およびデキストランなどの多糖であってもよい。安定剤は、活性タンパク質の重量部当たり０．１から１０，０００重量の範囲で存在し得る。
【０１０７】
非イオン性界面活性剤または洗浄剤（「湿潤剤」としても知られている）が、糖タンパク質を可溶化するのに役立つように加えられてもよく、撹拌により誘導される凝集に対して糖タンパク質を保護するように加えられてもよく、これによりまた、タンパク質の変性を引き起こさずに圧力を受ける剪断面に製剤が露出されることを可能にする。好適な非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（ｐｏｌｙｏｘａｍｅｒ）（１８４、１８８など）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（Ｒ）−２０、ＴＷＥＥＮ（Ｒ）−８０など）を含む。非イオン界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１．０ｍｇ／ｍｌ、例えば、約０．０７ｍｇ／ｍｌから約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在し得る。
【０１０８】
さらなる種々雑多の賦形剤は、充填剤（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化物質（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）および共溶媒を含む。
【０１０９】
５．８．治療方法
５．８．１．エロツズマブおよびＰＤＬ２４１組成物
セクション５．６に記載されているエロツズマブおよびＰＤＬ２４１組成物は、例えば、多発性骨髄腫を含む、腫瘍細胞におけるタンパク質ＣＳ１の増加した発現に関与すると考えられている種々の障害および病態を治療するのに有用である。特定の患者集団、製剤、投与様式および投薬量ならびに多発性骨髄腫を治療するまたは予防するのに有用なスケジュールは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許番号７，７０９，６１０に記載されている。これらの製剤、投与様式、投薬量およびスケジュールならびに開示されている特定の患者集団および併用療法の全ては、本明細書に記載されているエロツズマブおよびＰＤＬ２４１組成物に同等に適合される。
【０１１０】
本明細書に記載されているエロツズマブおよびＰＤＬ２４１組成物および製剤は治療的有用性を提供する量で投与される。治療的有用性は、限定されないが、基礎疾患の治療を含む。治療的有用性はまた、標準的な診断および他の試験を使用して評価した場合、特定の疾患の症状または副作用を好転することまたは改善することを含んでもよい。多発性骨髄腫について、治療的有用性を評価する種々の手段は米国特許番号７，７０９，６１０に記載されている。これらの種々の試験の全ては、多発性骨髄腫を罹患している患者に関して治療的有用性を評価するために使用され得る。
【０１１１】
５．８．２．ボロキシシマブ組成物
セクション５．６に記載されているボロキシマブ組成物は、例えば、種々の固形腫瘍を含む、α５β１インテグリンに関与すると考えられている種々の障害および病態を治療するのに有用である。特定の患者集団、製剤、投与様式および投薬量ならびに固形腫瘍を治療するまたは予防する、血管形成を減少させる、癌細胞増殖を抑制するのに有用なスケジュールは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許番号７，６６２，３８４に記載されている。これらの製剤、投与様式、投薬量およびスケジュールならびに開示されている特定の患者集団および併用療法の全ては、本明細書に記載されているボロキシシマブ組成物に同等に適合される。
【０１１２】
本明細書に記載されているボロキシシマブ組成物および製剤は治療的有用性を提供する量で投与される。治療的有用性は、限定されないが、基礎疾患の治療を含む。治療的有用性はまた、標準的な診断および他の試験を使用して評価した場合、特定の疾患の症状または副作用を好転することまたは改善することを含んでもよい。腫瘍の治療について、治療的有用性を評価する種々の手段は、米国特許番号７，６６２，３８４に記載されている。これらの種々の試験の全ては、癌を罹患している患者に関して治療的有用性を評価するために使用され得る。
【０１１３】
５．８．３．エナバツズマブ組成物
セクション５．６に記載されているエナバツズマブ組成物は、例えば、種々の固形腫瘍を含む、Ｔｗｅａｋ受容体（ＴｗｅａｋＲ）に関与すると考えられている種々の障害および病態の治療に有用である。特定の患者集団、製剤、投与形式および投薬量ならびに固形腫瘍を治療するまたは予防する、血管形成を減少させる、癌細胞増殖を抑制するのに有用なスケジュールは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開２００９／００７４７６２に記載されている。これらの製剤、投与様式、投薬量およびスケジュールならびに開示されている特定の患者集団および併用療法の全ては、本明細書に記載されているエナバツズマブ組成物に同等に適合される。
【０１１４】
本明細書に記載されているエナバツズマブ組成物および製剤は治療的有用性を提供する量で投与される。治療的有用性は、限定されないが、基礎疾患の治療を含む。治療的有用性はまた、標準的な診断および他の試験を使用して評価した場合、特定の疾患の症状または副作用を好転することまたは改善することを含んでもよい。腫瘍の治療について、治療的有用性を評価する種々の手段は、米国特許出願公開２００９／００７４７６２に記載されている。これらの種々の試験の全ては、癌を罹患している患者に関して治療的有用性を評価するために使用され得る。
【実施例】
【０１１５】
６．実施例
本明細書に記載されている本発明の種々の態様および特徴は以下の実施例によってさらに記載されている。特定の実施形態（上記の要旨であるか以下の実施例であるかに関わらず）に関連している記載されている特徴は、実質的に影響を与えずに本開示の方法および組成物の望ましい特性から逸脱されてもよく、さらに異なる実施形態が、明確に互いに矛盾しない限り、種々の方式で一緒に組み合わされ、使用されてもよい。したがって、以下に提供されている実施例は、例示であり、限定ではないことを意図し、以下の請求項を限定すると解釈されるべきではないことが理解される。
【０１１６】
６．１．ＮＳ０安定細胞株の産生
６．１．１エロツズマブ
Ｈａｒｔｍａｎら、２００７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９６（２）：２９４−３０６に記載されているマウス骨髄腫細胞株ＮＳ０−Ｗ（Ｗは、ＮＳ０細胞が血清およびコレステロールについてのこれらの要求を断ち切られたことを示す。）を、無タンパク質基礎培地中に維持した。ＮＳ０−Ｗ細胞を、エレクトロポレーションによりｐＨｕＬｕｃ６３発現プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。発現プラスミドを安定に組み込んだトランスフェクタントを、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中のミコフェノール酸の存在下で選択した。高レベルのＨｕＬｕｃ６３を産生したＮＳ０−Ｗトランスフェクタントから開始して、サブクローニングを限界希釈によって実施した。許容可能な産生性および産生特性を有するサブクローンを、最終産生細胞株として選択し、１９２−Ｃ１７と指定した。
【０１１７】
６．１．２．ダクリズマブ
マウス骨髄腫細胞株ＮＳ０は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣカタログ番号８５１１０５０３、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から得た。これらのＮＳ０細胞のバイアルを１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ内で解凍した。細胞を続いて、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを補充した基礎培地ＳＦＭ−３中で培養した。ＳＦＭ−３は、１０ｍｇ／のＬインスリンおよび１０ｕｇ／ｍＬのトランスフェリンを補充したＤＭＥＭおよびＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２の１：１混合物である。約３カ月の期間にわたって、ＮＳ０細胞を、ＦＢＳが除かれるまで培養培地中に存在するＦＢＳの量を徐々に減少させることによって、補充していないＳＦＭ−３に適応させ、次いで最後に単一工程においてＢＳＡを除去した。得られた宿主細胞株をＳＦＭ−３中で１５から２０回継代し、凍結バンクを調製した。
【０１１８】
ＳＦＭ−３適応細胞をエレクトロポレーションによってｐＨＡＴ．ＩｇＧ１．ｒｇ．ｄＥでトランスフェクトした。ベクターを安定に組み込んだトランスフェクタントを、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中のミコフェノール酸の存在下で選択した。高レベルのＤＡＣ  ＨＹＰを産生したＮＳ０安定トランスフェクトから開始して、限界希釈クローニングまたは蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）のいずれかによってサブクローニングを実施した。許容可能な産生性および産生特性を有するサブクローンを最終産生細胞として選択し、７Ａ１１−５Ｈ７−１４−４３と指定した。
【０１１９】
６．１．３．ボロキシシマブ
Ｍ２００産生細胞株、４６−１２は、発現プラスミドＰ−２００ＭでトランスフェクトしたＮＳ０−Ｗ細胞に由来した。トランスフェクションの前に、ＥＣＡＣＣ（ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）から受け取ったＮＳ０細胞を、ＰＤＬにて無血清および無コレステロ−ル条件に適応させ、ＮＳ０−Ｗと指定した。ＮＳ０−Ｗ細胞を、エレクトロポレーションによってＰ−２００Ｍ発現プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。発現プラスミドを安定に組み込んだトランスフェクタントを、５％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中でミコフェノール酸の存在下で選択した。高レベルのＭ２００を産生したＮＳ０−Ｗトランスフェクタントから開始して、限界希釈クローニングによってサブクローニングを実施した。許容可能な産生性および産生特徴を有するサブクローンを最終産生細胞株として選択し、４６−１２と指定した。
【０１２０】
６．１．４．ＰＤＬ２４１
Ｈａｒｔｍａｎら、２００７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９６（２）：２９４−３０６に記載されているマウス骨髄腫細胞株ＮＳ０−Ｗ（Ｗは、ＮＳ０細胞が血清およびコレステロールについてのこれらの要求を断ち切られたことを示す。）を、無タンパク質基礎培地中に維持した。ＮＳ０−Ｗ細胞を、エレクトロポレーションによりＰＤＬ２４１発現プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。発現プラスミドを安定に組み込んだトランスフェクタントを、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中のミコフェノール酸の存在下で選択した。高レベルのＰＤＬ２４１を産生したＮＳ０−Ｗトランスフェクタントから開始して、サブクローニングを限界希釈クローニングによって実施した。許容可能な産生性および産生特性を有するサブクローンを選択し、２６−５Ｃ６と指定した。
【０１２１】
６．１．５．エナバツズマブ
Ｈａｒｔｍａｎら、２００７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９６（２）：２９４−３０６に記載されているマウス骨髄腫細胞株ＮＳ０−Ｗ（Ｗは、ＮＳ０細胞が血清およびコレステロールについてのこれらの要求を断ち切られたことを示す。）を、無タンパク質基礎培地中に維持した。ＮＳ０−Ｗ細胞を、エレクトロポレーションによりｐＨｕ１９．２．１発現プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。発現プラスミドを安定に組み込んだトランスフェクタントを、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中のミコフェノール酸の存在下で選択した。高レベルのＰＤＬ１９２を産生したＮＳ０−Ｗトランスフェクタントから開始して、サブクローニングを限界希釈によって実施した。許容可能な産生性および産生特性を有するサブクローンを最終産生細胞株として選択し、２９９−９と指定した。
【０１２２】
６．２．抗体の産生
６．２．１．細胞培養および回収
細胞を単一細胞バンクバイアルから解凍し、産生スケールが達成されるまで、Ｔフラスコ、ローラーボトル、スピナーフラスコおよびバイオリアクタ内で徐々に体積を増加させて増殖させた。産生培養の完了時に、細胞培養流体を遠心分離および深層濾過によって清浄し、収集貯蔵タンクに移した。産生培養期間は約１０日である。
【０１２３】
細胞培養および回収は、当該分野において知られている標準装置を使用した種々の異なる細胞培養設備において実施され得る。別の例において、細胞を単一細胞バンクバイアルから解凍し、産生スケールが達成されるまで、シェーカーフラスコおよびバイオリアクタ内で徐々に体積を増加させて増殖させた。産生培養の完了時に、細胞培養流体を遠心分離および深層濾過によって清浄し、収集貯蔵タンクに移した。産生培養期間は約１０日である。
【０１２４】
６．２．１．１接種物調製
産生バッチは単一の細胞バンクバイアルを解凍することによって開始される。対照培地（すなわち、過剰グリシンを有さない）を生成するために、細胞を、化学的に定義されている培地、無タンパク質基礎培地−２（ＰＦＢＭ−２）を含有するＴフラスコに移す。ＰＦＢＭ−２を作製するための特注の粉末は、再構成した場合、５ｍｇ／Ｌの濃度を生じ、再構成した場合、残存成分の濃度が再構成したハイブリドーマ−ＳＦＭと同じになるように調整した残存成分の量を有する、一定量のＥＤＴＡ鉄（ＩＩＩ）ナトリウム塩を含む、ＮａＣｌ、フェノールレッド、トランスフェリンおよびインスリンを有さずに調製したハイブリドーマ−ＳＦＭ培地粉末を要求することによってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから注文できる。調製したＰＦＢＭ−２培地は以下の成分：８ｇ／Ｌの特注の粉末；２．４５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム；３．１５ｇ／ＬのＮａＣｌ；および１６．５ｇ／ＬのＤ−グルコース一水和物（１５ｇ／Ｌのグルコース）を含有する。ＰＦＢＭ−２培地中のグリシンの濃度は２ｍＭである。
【０１２５】
グリシン培地を産生するために、ＰＦＢＭ−２を上記のように最初に産生する。次いで追加のグリシン（例えば、５ｍＭ、１５ｎＭまたは３０ｎＭ）をＰＦＢＭ−２培地に加える。高グリシン培地がＰＦＢＭ−２対照培地とほぼ同じオスモル濃度を有することを確保するために、適切なレベルのＮａＣｌを加えることによってオスモル濃度を調整する。例えば、表８は、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を達成するために対照培地および３つの高グリシン培地に加えられているＮａＣｌの量を示す。
【０１２６】
【表８】
0006351598.tif 000012
【０１２７】
細胞をその後２日毎にローラーボトルまたはスピナーフラスコ内の連続継代によって増殖させる。Ｔ−フラスコ、ローラーボトルおよびスピナーフラスコを、Ｔ−フラスコおよびローラーボトルについて７．５％ＣＯ２ならびにスピナーフラスコについて５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃の温度設定点下で作動するインキュベータに入れる。
【０１２８】
細胞培養体積に応じて、ヘッドスペース内を覆うことまたは培養内に散布することのいずれかによってスピナーフラスコに５％ＣＯ２を補充し、インペラー速度を一定の毎分回転数（ＲＰＭ）に制御する。全ての接種物増殖継代にて目標とする播種密度は約２．５×１０５生存細胞／ｍＬである。
【０１２９】
細胞をその後２日毎にシェーカーフラスコ内で連続継代によって増殖させる。シェーカーフラスコを、７．５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃の温度設定点下で作動するインキュベータに入れる。
【０１３０】
シェーカーフラスコを、インキュベータ内のシェーカープラットフォームにおいて一定の毎分回転数（ＲＰＭ）にて撹拌する。全ての接種物増殖継代にて目標とする播種密度は約２．２〜２．５×１０５生存細胞／ｍＬである。
【０１３１】
細胞バンク解凍の約１４日後、十分な数の生存細胞が産生されている場合、最初にいくつか、典型的に３または４個のステンレス鋼撹拌タンク播種バイオリアクタに接種する。使用前に、播種バイオリアクタをその場で洗浄し、その場でスチームし、適切な体積のＰＦＢＭ−２培養培地を充填する。ｐＨおよび溶存酸素プローブを、バイオリアクタをその場でスチームする前に較正する。第１の播種バイオリアクタに、２．０〜２．５×１０５生存細胞／ｍＬの開始細胞密度を目標とするように十分な数の細胞を接種する。より多くの体積（典型的に、１００Ｌから３００Ｌ、次いで１，０００Ｌの播種バイオリアクタまたは６０Ｌから２３５Ｌ、９５０Ｌおよび３７５０Ｌの播種バイオリアクタ）へ連続的に移すことを、各リアクタ内の増殖の約２日後に実施し、２．０〜２．５×１０５生存細胞／ｍＬの開始細胞密度を目標とする。培養ｐＨを自動制御によりＣＯ２ガスまたは１Ｍの炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）のいずれかの添加によって維持する。播種および産生バイオリアクタの目標とする作動条件は、３７℃の温度設定点、ｐＨ７．０および３０％溶存酸素（空気飽和の百分率として）を含む。１００Ｌ、３００Ｌおよび１，０００Ｌバイオリアクタをそれぞれ１００ｒｐｍ、８０ｒｐｍおよび７０ｒｐｍにて撹拌する。一部の場合、播種および産生バイオリアクタの目標とする作動条件は、３７℃の温度設定点、ＣＯ２散布を伴う７．０のｐＨおよび塩基添加制御および３０％溶存酸素（空気飽和の百分率として）を含む。より多くの体積のバイオリアクタは１００ｒｐｍ、８０ｒｐｍ、７０ｒｐｍまたは４０ｒｐｍの速度にて撹拌され得る。
【０１３２】
６．２．２．細胞培養産生バイオリアクタ
１，０００Ｌ播種バイオリアクタ内で約２日後、接種物を、ステンレス鋼撹拌タンク産生バイオリアクタ内に移す。産生バイオリアクタは約１０，０００Ｌの作業体積を有する。使用前に、バイオリアクタをその場で洗浄し、その場でスチームし、約４，０００ＬのＰＦＢＭ−２対照培地または高グリシン培地を充填する。ｐＨおよび溶存酸素プローブを、バイオリアクタをその場でスチームする前に較正する。
【０１３３】
別の例において、接種物を、使用前にその場で洗浄し、その場でスチームし、約４，０００〜７，０００ＬのＰＦＢＭ−２培地または高グリシン培地を充填した、約１５，０００Ｌの作業体積を有するステンレス鋼撹拌タンク産生バイオリアクタに移す前に３７５０Ｌの播種バイオリアクタ内で増殖させる。
【０１３４】
産生バイオリアクタの目標とする播種密度は２．０〜２．５×１０５生存細胞／ｍＬの範囲である。化学的に定義されている無タンパク質供給培地濃度（ＰＦＦＭ−３）（ＰＦＦＭ３副次成分１および２、Ｌ−グルタミン、Ｄ−グルコース、第二リン酸ナトリウム七水和物、Ｌ−チロシン、葉酸、塩酸および水酸化ナトリウムを再構成することによって作製された化学的に定義されている濃縮された供給培地）を培養の間に加える。ＰＦＦＭ３は表９に示されている成分を含有する：
【０１３５】
【表９】
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【０１３６】
ＰＦＦＭ３副次成分１は以下の表１０に示されている成分を含有する：
【０１３７】
【表１０】
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【０１３８】
ＰＦＦＭ３副次成分２は以下の表１１に示されている成分を含有する：
【０１３９】
【表１１】
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【０１４０】
培養へのＰＦＦＭ−３の添加のタイミングおよび量は以下の表１２に示されているように行う：
【０１４１】
【表１２】
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【０１４２】
培養ｐＨを、ＣＯ２ガスおよび１Ｍ炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）添加の自動制御によって約ｐＨ７．０、好ましくはｐＨ７．０からｐＨ７．１の間に維持する。溶存酸素含有量は飽和空気の約３０％まで下げることができる。酸素／空気混合物を培養に散布して、一定の総ガス流量を達成し、溶存酸素を、必要に応じて、空気対酸素ガスの比を調整することによって制御し、最大の酸素対空気比に到達した後、撹拌速度を増加させることによって制御する。別の例において、撹拌は一定の電力／体積比を維持するように調整される。シメチコンベースの消泡剤エマルションを、泡のレベルに基づいて必要な基準に応じて、バイオリアクタに加える。試料を、細胞密度、細胞生存、産物濃度、グルコースおよび乳酸塩濃度、溶存Ｏ２、溶存ＣＯ２、ｐＨおよびオスモル濃度を試験するために定期的に採取する。バイオリアクタ培養を接種の約１０日後に収集する。収集前に、バイオリアクタ内容物を未処理バルクとしてサンプリングする。
【０１４３】
供給条件および供給スケジュールが、力価を最適化するように各抗体を産生するために調整され得ることは理解される。培養培地のオスモル濃度は、必要に応じて、最適な力価を得るように調整され得る。加えて、グルコースおよびグルタミンレベルが最適な力価を維持するように産生段階の間に調整され得る。
【０１４４】
６．２．３．収集および細胞除去
収集する直前に、産生バイオリアクタを最初に１５℃未満に冷却し、次いで０．５Ｍまたは１Ｍまたは２Ｍクエン酸を使用して５．０±０．１のｐＨに調整し、約３０〜９０または４５〜６０分の時間の間、保持して、収集容器に移す前に細胞および細胞残屑を凝集させる。次いでｐＨを調整した収集物を、バッチ記録文書に定義されているボウル速度および流量について規定のパラメータ下で作動する連続遠心分離によって清浄する。
【０１４５】
遠心分離液を、深層フィルタ、続いて０．２２μｍ膜フィルタを通して濾過し、予め滅菌したタンクに回収する。無細胞収集物を、１〜２Ｍのトリス溶液を使用して約６．４のｐＨに調整し、さらなる処理のために２〜８℃にて保存する。一部の場合、このｐＨ調整は、オリジナルのバイオリアクタのｐＨ５．０へのｐＨ調整の１２時間以内に行われる。
【０１４６】
６．２．４．抗体精製
パイロットスケール試験（５０リットル以上）からの収集物質を、低ｐＨウイルス不活性化工程、ウイルス濾過工程、限外濾過／透析濾過工程および製剤化工程と組み合わせた３つのクロマトグラフィー技術（ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡ親和性クロマトグラフィー、Ｑ−セファロース陰イオン交換クロマトグラフィーおよびＣＭ−セファロース陽イオン交換クロマトグラフィー）に基づいて精製した。２リットル収集物からの物質を、プロテインＡカラム、続いてサイズ排除クロマトグラフィーを通して処理した。
【０１４７】
６．３．グリコシル化プロファイルの決定
６．３．１．物質および方法
異なる培養条件から精製した抗体（低グリシンを有する対照条件対高グリシンを有する実験条件）を分析的に特徴付けた。ペプチドマッピングを使用して、抗体産物における異なるグリコフォームを定量した。抗体を最初にジチオスレイトールで還元し、ヨード酢酸でアルキル化し、次いでトリプシンで消化し、最後にＭＳ検出を用いてＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。各グリコフォームのピーク面積を得て、次いで各グリコフォームの相対百分率を全ピーク面積から算出した。
【０１４８】
６．３．２．結果
２ｍＭのグリシンを含有する対照基礎培地または１５ｍＭ（１７ｍＭの総濃度）を補充した基礎培地のいずれかで培養されたＮＳ０細胞から産生された５つの異なる抗体に存在する各グリコフォームの相対百分率を表１３に示す。対照培地に対してグリシンを補充した培地中で形成した、５つの異なる抗体、Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃ−フコースグリコフォームおよびＭａｎ５グリコフォームについての２つの非フコシル化グリコフォームの百分率の増加は図２および図３に示されている。対照に対して非フコシル化抗体の合わせた総百分率の増加は図４に示されている。このデータは、高濃度のグリシン下で培養した細胞由来の抗体が、低濃度のグリシンを用いた対照プロセス由来の同じ抗体より高いレベルの非フコシル化グリコフォームを示すことを示す。Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃ−フコースグリコフォームに関して、より高いグリシン濃度培養培地において培養された細胞由来の５つの抗体のうちの４つは、対照に対してこのグリコフォームの１５０％からほぼ３００％を示す。Ｍａｎ５グリコフォームに関して、５つの抗体のうちの４つについての範囲は、対照に対してこのグリコフォームの１５０％から２００％超の増加である。全体として非フコシル化抗体の総量を考慮すると、抗体の５つ全ては、細胞がより高いグリシン濃度培地中で培養される場合、１．５〜２．５倍の増加を示す。
【０１４９】
【表１３】
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【０１５０】
用量反応研究において、２ｍＭのグリシンを含有する対照基礎培地または異なる濃度のグリシン（７、１７および３２ｍＭ）を補充した基礎培地のいずれかで培養された細胞から産生された抗体ＰＤＬ１９２（エナバツズマブ）に存在する各グリコフォームの百分率は表１４に示されている。対照培地に対してグリシンを補充した培地中で形成された、ＰＤＬ１９２、Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃ−フコースグリコフォームおよびＭａｎ５グリコフォームの２つの非フコシル化グリコフォームの百分率の増加は図５に示されている。このデータは、余剰のグリシンを有する条件下で産生されたＰＤＬ１９２が、対照プロセスから産生された抗体より高いレベルの非フコシル化グリコフォームを示すことを示す。より具体的には、非フコシル化Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃ−フコースグリコフォームについて、グリコフォームの量は、用量依存的に培養培地中でのグリシンの増加した濃度と共に増加する。増加の百分率は、グリシン濃度が７から３２ｍＭに増加すると、対照に対して１２０％から１６０％超の範囲である。
【０１５１】
【表１４】
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【０１５２】
６．４．ＣＤ１６ａ結合アッセイ
６．４．１．物質および方法
ＣＤ１６ａ結合アッセイを、ヒトＣＤ１６ａ受容体に対する４つの異なる抗体の抗体Ｆｃ領域の結合効力を評価するためにアルファスクリーン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）法を使用して実施した。抗体溶液を組換えヒトＣＤ１６ａ溶液およびアッセイ緩衝液と最初に混合し、次いでアルファスクリーンドナービーズおよび抗体アクセプタービーズを加えた。混合物を、室温にて４時間、光から保護した位置においてインキュベートし、６８０ｎｍにおけるレーザー励起および発光５２０〜６２０ｎｍを用いてプレートリーダーを使用して蛍光信号を検出した。過剰なグリシンを有さない基礎培地中で培養した抗体参照に対する結合効力を報告した。
【０１５３】
６．４．２．結果
４つの異なるＩｇＧ１抗体（エロツズマブ、ダクリズマブ、ＰＤＬ１９２およびＰＤＬ２４１）についてのＣＤ１６ａ効力アッセイからの結果は表１５に示されている。高濃度のグリシン下で培養した細胞由来の４つ全てのＩｇＧ１抗体は一貫して、ヒトＣＤ１６ａ受容体に対する結合親和性において４０％超の増加を示し、最も極端な場合、過剰なグリシンを有さない基礎培地（すなわち、２ｍＭのグリシンの培養培地）中で産生した対照抗体に対する結合効力に関して２倍の増加を示した。図６は、４つのＩｇＧ１抗体についてのＣＤ１６ａ受容体に対する相対結合効力を示す。この量は、追加のグリシン補充を有さない対照基礎培地中で培養されたＮＳ０細胞によって産生された同じ抗体のＣＤ１６ａ結合親和性に対する百分率として表される。
【０１５４】
【表１５】
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【０１５５】
ＰＤＬ１９２についての用量反応研究からのＣＤ１６ａ効力の結果は表１４および図７に示されている。５、１５および３０ｍＭの余剰のグリシンを補充した条件下で培養した細胞由来のＰＤＬ１９２は対照プロセス由来の抗体より高いＣＤ１６ａ結合親和性を示したが、ＣＤ１６ａ結合において用量依存的な増加は観察されなかった。
【０１５６】
６．５．抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）
６．５．１．物質および方法
発現抗体のＡＤＣＣ活性をインビトロで分析した。標的細胞を最初に５１Ｃｒで標識し、エフェクター細胞（ヒト末梢血単核細胞、ＰＢＭＣ）を全血から調製した。細胞および抗体溶液を次いで３７℃にて４時間インキュベートした。上清中の放射能を、実験的放出（Ｅ）、自然放出（Ｓ、エフェクター細胞および抗体を有さない標的から放出）および全溶解物（Ｔ、洗浄剤１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理した標的細胞から放出）について測定した。細胞毒性のパーセントを［（Ｅ−Ｓ）／（Ｔ−Ｓ）］×１００として算出した。
【０１５７】
６．５．２．結果
４つの異なる抗体（エロツズマブ、ＰＤＬ２４１、ＰＤＬ１９２およびダクリズマブ）のＡＤＣＣアッセイからの結果は、図８Ａ−Ｃ、９Ａ−Ｂ、１０Ａ−Ｂおよび１１Ａ−Ｂに示されており、各アッセイは２つまたは３つの異なるドナー由来のＰＢＭＣにおいて実施した。４つの全ての図において、より高い濃度のグリシン下で培養した細胞由来の抗体は、対照プロセス下で培養した細胞由来の同じ抗体と比較して増加したＡＤＣＣ活性を示した。この結果は、ＡＤＣＣ活性がＣＤ１６ａ結合効力と一致することを示し、両方のアッセイの結果は、抗体のグリコシル化パターンと相関する。
【０１５８】
７．参照によって組み込まれる、特定の実施形態
本出願に引用されている全ての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、各々の個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書が、全ての目的のために参照により組み込まれることを個々に示されているのと同じ程度まで全ての目的のために、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５９】
種々の特定の実施形態が例示され、記載されているが、種々の変更が、本発明の趣旨および範囲から逸脱せずになされてもよいことは理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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