(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体形態の医薬組成物の再構成のための方法であって、
（ｉ）密封容器中に該固体形態の該医薬組成物を準備するステップであって、該容器内の圧力が、０．５Ｐａから１．２×１０５Ｐａの間を含む初期圧力ｐｉである該ステップと、
（ｉｉ）第１の時点ｔ０で、溶媒を該密封容器中に導入し、制御された時間Δｔ１中、該容器内に得られた圧力ｐｒを維持するステップと、
（ｉｉｉ）第２の時点ｔ２で、完全に再構成されるまで、該容器内の圧力を、該得られた圧力ｐｒよりも高い制御された圧力ｐ２に増加させるステップと
を連続的に含み、
該医薬組成物は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む生物学的部分を含有する、方法。
【請求項２】
ステップ（ｉｉ）の後及び／又はステップ（ｉｉｉ）の後に、前記溶媒及び前記医薬組成物を混合するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記混合するステップを、前記溶媒及び前記医薬組成物の流体再循環によって及び／又は機械的混合によって実施する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記溶媒及び前記医薬組成物の機械的混合を、前記容器を鉛直位置に対して傾けながら、前記容器を回転させることによって実施する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｉ）の前に、前記容器内の圧力を前記初期圧力ｐｉに調節する、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記容器中の前記初期圧力ｐｉが、０．５Ｐａから５×１０４Ｐａである、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｉｉｉ）において、前記容器中に設定された前記制御された圧力ｐ２が、１×１０４Ｐａから１．５×１０６Ｐａである、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記固体形態の前記医薬組成物が、前記医薬組成物の凍結乾燥された形態である、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記固体形態の前記医薬組成物が、粉末である、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶媒を、前記容器中に、前記固体形態の前記医薬組成物に向けられた噴流として導入する、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記制御された圧力ｐ２に達した後、完全に再構成される前に、前記容器内の圧力をさらに増加させる追加のステップ（ｉｖ）をさらに含む、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記制御された圧力ｐ２に達した後、完全に再構成される前に、前記容器を複数の圧力サイクルに供する追加のステップ（ｖ）をさらに含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｉ）における前記容器内の前記初期圧力ｐｉが、０から６×１０４Ｐａであり、ステップ（ｉｉ）における前記制御された時間Δｔ１が、１０秒から２分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｉｉｉ）の後に、前記溶媒及び前記医薬組成物を、流体再循環及び／又は機械的混合によって混合するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体形態の医薬組成物の再構成のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある特定のタイプの医薬活性成分は、後に消化器系によって変化を受けるため、経口投与することができず、一般に、非経口で（parentally）、例えば静脈内投与又は皮下投与される。そのような場合には、これらの医薬活性成分は、液体形態で投与されなければならない。これは特に、大きく複雑な分子である抗体及び他のタンパク質の場合並びにある特定の化学物質の場合である。しかし、抗体及び他の大きな医薬活性成分は、水性環境における安定性が不十分であることが多く、これが医薬組成物の貯蔵寿命を許容されない値まで減少させることがある。
【０００３】
よって、安定性、貯蔵及び輸送の容易さの点から見て、固体形態の医薬組成物を調製することはより有利であり得、固体形態の医薬組成物は、それを患者に投与する直前に、溶媒を用いて再構成することができる。液体形態で、例えば注射によって投与しなければならない固体形態の医薬組成物は、注射用溶液を生成するために、許容される溶媒組成物を使用して即時に溶解させることになっている。固体形態の医薬組成物は、粉末、フリーズドライされた（若しくは凍結乾燥された）組成物、噴霧乾燥された、スプレーフリーズドライされた、真空乾燥された又は超臨界流体乾燥された組成物を含む。
【０００４】
再構成ステップは、再構成方法の複雑さに応じて、患者、親族、看護師又は医療専門家によって実施され得る。典型的には、比較的簡単で、再現可能であり、したがって医療専門家の存在を必要としない再構成方法を使用することが好ましい。このことは、慢性疾患の治療の場合には、特に当てはまる。
【０００５】
そのような再構成は、一部の特定の組成物では簡単で、２、３秒という短さであり得るが、再構成するのに最大で数十分かかるものもある。複雑な一連のステップを含む長い再構成時間は、当該プロトコルのため、より低いコンプライアンスにつながることが多く、したがって、最終的に誤った用量を投与する可能性があり、治療の結果に影響する可能性さえあり得る。
【０００６】
再構成することが困難及び／又は長いそのような固体は、一般に、溶媒に対する湿潤性の乏しさ及び／又は高い最終粘度を共通して有している。他のよくある問題は、泡沫、気泡の形成であり、再構成された医薬組成物の表面にクラウンが創り出されることであり、ゲル又は不十分に湿った凝集体の形成であり、これらは慎重な再構成のためにより多くの時間及び注意を必要とする。
【０００７】
これは特に、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ある特定の組換えタンパク質又はポリペプチド、ステロイドホルモン及び抗生物質などのいくつかの大きな化学物質などの、大きな分子を高濃度で含む医薬組成物の場合である。投与する量を最小限にするために、注射用製剤では一般的に行われているように、もともと固体形態への加工処理中に取り除かれる溶媒容量に比べてより少ない溶媒容量を使用して再構成が行われる場合も同様である。
【０００８】
この点については、Ｐｒａｄｉｐ  Ｈｉｗａｌｅらによる論文［１］を参照することができ、これは注射用乾燥粉末の再構成時間に影響を及ぼす因子を記載し、それらを内因性及び外因性のパラメータに分類している。
【０００９】
いずれの場合でも、固体形態の医薬組成物の再構成のための最も一般的な手動方法は、典型的には、第１の容器から溶媒を取り出すステップ、それを、固体形態の医薬組成物を含有する第２の容器に注入するステップ、第２の容器中の液体を均質化して、泡沫及び／又は乾燥凝集体がないようにするステップ、及び投与するために、再構成された医薬組成物を第２の容器から抜き取るステップを要求する。
【００１０】
上述のこれらのステップ自体のそれぞれは、針又はスパイクを含むいくつかの物品を巧みに操作して、規定された方法を遂行することを必要とし得る。
【００１１】
適用される操作ステップ及び医薬組成物に応じて、再構成方法は、長い再構成時間、溶媒がほとんど到達できない、閉じ込められている乾燥塊域及びゲル域の存在、容量全体における若しくは空気／液体界面での環状部分にのみ限定される、閉じ込められている気泡若しくは泡沫の存在、及び／又は再構成時間の大きな変化をもたらす恐れがあり、それらのそれぞれは、医薬組成物の再構成には許容されない可能性がある。
【００１２】
医薬組成物に関して、正しい再構成を保証するために及び使用者間の再構成の偏差を減じるために、製薬業者は、再構成のプロセスで使用者を導くための「使用説明書」のリーフレットを使用者に提供している。
【００１３】
たいていの場合には、方法は、一般的な溶媒移動段階、並びに均質化については、完全な溶解が達成されるまで、固体を湿らすための撹拌／旋回及び沈降ステップを数回織り交ぜ、再水和を観察した後、最終的に抜き取ることを含む。「すべき」こと又は「すべきでない」ことの推奨事項がある場合がある。
【００１４】
加えて、製薬業者は、使用者が専門家であろうと患者若しくは親族であろうと、使用者のための訓練を推奨することがあり、或いは再構成を専門家に限定することさえもあり得る。
【００１５】
いくつかの凍結乾燥した医薬組成物については、全再構成時間が３０分と長くかかることがある。
【００１６】
米国特許出願公開２０１１／０１５５６２０号明細書は、医薬組成物の粉末で満たされたバイアル中を高真空圧又は中真空圧（例えば１００Ｐａ〜６×１０４Ｐａ）とすることは、貯蔵中の組成物の安定化に役立ち、再構成中の溶媒の引き抜きを容易にし、容器の閉鎖完全性を証明し、再構成方法をおそらく迅速化し、泡沫の生成を制限することを記載している。
【００１７】
国際公開第００／０７５３９号パンフレットは、溶媒を容器中に導入する前に、容器内の圧力を大気圧と等しくすることによって、泡立ちを減じることができ、このやり方では、より少ない力及びより低い速度で、溶媒が容器に入ることを教示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
しかし、上述の技術にもかかわらず、投与のための医薬組成物の再構成は、時間のみならず他の特徴に関しても、依然として課題であると考えられている。よって、固体形態の医薬組成物のための再構成方法をさらに改善することが、当技術分野において依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の目的は、当技術分野において知られている方法に比べてより簡単であり、短縮された時間で、より再現可能な仕方での再構成を可能にし、再構成後の液体組成物中の不溶性固体又はゲル及び／又は気泡の存在を制限する、固体形態の医薬組成物の再構成のための方法を提供することである。
【００２０】
そのために、本発明は、固体形態の医薬組成物の再構成のための方法であって、
（ｉ）密封容器中に該固体形態の該医薬組成物を準備するステップであって、該容器内の圧力が、０．５Ｐａから１．２×１０５Ｐａの間を含む初期圧力ｐｉである該ステップと、
（ｉｉ）第１の時点ｔ０に、溶媒を該密封容器中に導入するステップ及び制御された時間Δｔ１中、該容器内に得られた圧力ｐｒを維持するステップと、
（ｉｉｉ）第２の時点ｔ２に、完全に再構成されるまで、該容器内の圧力を、該得られた圧力ｐｒよりも大きい制御された圧力に増加させるステップと
を連続的に含む方法を提供する。
【００２１】
ある実施形態によると、この方法は、ステップ（ｉｉ）の後及び／又はステップ（ｉｉｉ）の後に、前記溶媒及び前記医薬組成物を混合するステップを含む。
【００２２】
ある実施形態によると、前記混合するステップは、前記溶媒及び前記医薬組成物の流体再循環によって及び／又は機械的混合によって実施される。
【００２３】
ある実施形態によると、前記溶媒及び前記医薬組成物の前記機械的混合は、前記容器を鉛直位置に対して傾けながら、前記容器を回転させることによって実施される。
【００２４】
ステップ（ｉ）の前に、前記容器内の圧力を前記初期圧力ｐｉに調節することがある。
【００２５】
ある実施形態によると、前記容器中の前記初期圧力ｐｉは、０．５Ｐａから５×１０４Ｐａである。
【００２６】
ある実施形態によると、ステップ（ｉｉｉ）において、前記容器中に設定された前記圧力ｐ２は、１×１０４Ｐａから１．５×１０６Ｐａである。
【００２７】
ある実施形態によると、前記固体形態の前記医薬組成物は、前記医薬組成物の凍結乾燥された形態である。
【００２８】
また、前記固体形態の前記医薬組成物は、粉末であり得る。
【００２９】
ある実施形態によると、前記溶媒は、前記容器中に、前記固体形態の前記医薬組成物に向けられた噴流として導入される。
【００３０】
この方法は、ステップ（ｉｉｉ）において前記制御された圧力ｐ２に達した後、完全に再構成される前に、前記容器内の圧力をさらに増加させる追加のステップ（ｉｖ）をさらに含み得る。
【００３１】
この方法は、ステップ（ｉｉｉ）において前記制御された圧力ｐ２に達した後、完全に再構成される前に、前記容器を複数の圧力サイクルに供する追加のステップ（ｖ）をさらに含み得る。
【００３２】
ある実施形態によると、ステップ（ｉ）における前記容器内の前記初期圧力（ｐｉ）は、０から６×１０４Ｐａであり、ステップ（ｉｉ）における前記制御された時間Δｔ１は、１０秒から２分である。この方法は、ステップ（ｉｉｉ）の後に、前記溶媒及び前記医薬組成物を、流体再循環及び／又は機械的混合によって混合するステップを含む。
【００３３】
本発明の他の特徴及び利点は、添付の図面に基づいた、後に続く詳細な説明から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】例１の結果を生み出すために使用した仕組み（setup）を概略的に示す図である。
【図１Ｂ】例１の結果を生み出すために使用した仕組み（setup）を概略的に示す図である。
【図１Ｃ】例１の結果を生み出すために使用した仕組み（setup）を概略的に示す図である。
【図２Ａ】本発明による方法の種々の実施形態を示すグラフである。Ｘ軸は時間を表し、Ｙ軸は医薬組成物を含む容器内の圧力を表す。このグラフは、線形線分で引かれているが、圧力の変化は、特に、再構成中に伴う異なる圧力間の移行中には、非線形的に変化し得ることが留意されるべきである。  ・図２Ａは、本発明のある実施形態による再構成方法のための時間枠の例を示す。    再構成方法は、時間ｔ０に始まるとみなし、これは容器中への溶媒の導入開始に相当する。    溶媒の導入直前、容器内の圧力は、初期圧力ｐｉである。    前記圧力は、その事前の貯蔵中の容器内の圧力であり得、これを貯蔵圧力ｐｓと称する。    或いは、図２Ｂに示すように、貯蔵中の容器内の圧力は、ｐｉとは異なる（より大きい又はより小さい）圧力ｐｓであることがあり、圧力は、再構成方法の開始前の短い時間で、ｐｉに設定される。    容器中の溶媒への導入は、圧力をわずかに改変させる効果を有し、こうして得られた圧力をｐｒと称する。    この得られた圧力を正確に測定する必要はないが、得られた圧力ｐｒを規定された時間Δｔ１中維持しなければならない。    ｔ０＋Δｔ１に相当し、再構成がまだ完全ではない時間である規定された時間ｔ２に、容器内の圧力をｐｉ及びｐｒよりも大きい圧力ｐ２に増加させる。    容器内の圧力を、完全な再構成が観察される（時間ｔｒｅｃ）まで、圧力ｐ２に維持する。時間ｔｒｅｃ後に、再構成された組成物を容器から取り出すことができる。
【図２Ｂ】本発明による方法の種々の実施形態を示すグラフである。Ｘ軸は時間を表し、Ｙ軸は医薬組成物を含む容器内の圧力を表す。このグラフは、線形線分で引かれているが、圧力の変化は、特に、再構成中に伴う異なる圧力間の移行中には、非線形的に変化し得ることが留意されるべきである。  ・図２Ｂは、本発明の別の実施形態による再構成方法のための時間枠の例を示す。    図２Ａの方法と比較すると、図２Ｂの方法は、ｐ２での規定された時間後、医薬組成物の完全な再構成が観察される前に、容器内の圧力を圧力ｐ３にさらに増加させる、追加のステップを含む。
【図２Ｃ】本発明による方法の種々の実施形態を示すグラフである。Ｘ軸は時間を表し、Ｙ軸は医薬組成物を含む容器内の圧力を表す。このグラフは、線形線分で引かれているが、圧力の変化は、特に、再構成中に伴う異なる圧力間の移行中には、非線形的に変化し得ることが留意されるべきである。  ・図２Ｃは、圧力ｐ２を適用した後及び圧力ｐ３を適用する前に、連続的な圧力の増加及び減少を含む圧力サイクルを含む再構成方法のための時間枠の例を説明している。
【図２Ｄ】本発明による方法の種々の実施形態を示すグラフである。Ｘ軸は時間を表し、Ｙ軸は医薬組成物を含む容器内の圧力を表す。このグラフは、線形線分で引かれているが、圧力の変化は、特に、再構成中に伴う異なる圧力間の移行中には、非線形的に変化し得ることが留意されるべきである。  ・図２Ｄは、圧力ｐ２から１回のみの圧力減少後に、圧力ｐ３への圧力増加を含む、図２Ｃに示されている時間枠の変動を説明している。
【図３】抗体のＰＥＧ化断片（セルトリズマブペゴル）の凍結乾燥された製剤のＷＦＩでの再構成時間を、ＷＦＩの導入後に得られた圧力が容器中で維持される時間の関数として示すグラフである。
【図４Ａ】容器内の種々の初期圧力について、抗体のＰＥＧ化断片（セルトリズマブペゴル）の凍結乾燥された製剤のＷＦＩでの再構成時間を、ＷＦＩの導入後に得られた圧力が容器中で維持される時間の関数として示すグラフである。
【図４Ｂ】容器内の種々の初期圧力について、抗体のＰＥＧ化断片（セルトリズマブペゴル）の凍結乾燥された製剤のＷＦＩでの再構成時間を、ＷＦＩの導入後に得られた圧力が容器中で維持される時間の関数として説明するグラフである。
【図４Ｃ】容器内の種々の初期圧力について、抗体のＰＥＧ化断片（セルトリズマブペゴル）の凍結乾燥された製剤のＷＦＩでの再構成時間を、ＷＦＩの導入後に得られた圧力が容器中で維持される時間の関数として示すグラフである。
【図４Ｄ】容器内の種々の初期圧力について、抗体のＰＥＧ化断片（セルトリズマブペゴル）の凍結乾燥された製剤のＷＦＩでの再構成時間を、ＷＦＩの導入後に得られた圧力が容器中で維持される時間の関数として示すグラフである。
【図４Ｅ】容器内の種々の初期圧力について、抗体のＰＥＧ化断片（セルトリズマブペゴル）の凍結乾燥された製剤のＷＦＩでの再構成時間を、ＷＦＩの導入後に得られた圧力が容器中で維持される時間の関数として説明するグラフである。
【図５】抗体のＰＥＧ化断片（セルトリズマブペゴル）の凍結乾燥された製剤（セルトリズマブペゴル）のＷＦＩでの再構成時間の、  （ａ）本発明による、例３に記載されている再構成方法；  （ｂ）米国特許出願公開２０１１／０１５５６２０明細書による、溶媒導入の間中、得られた真空を維持し、再構成が完全になるまで旋回する再構成方法；  （ｃ）パッケージ中に提供されている使用説明書に従う再構成方法の間の比較を示すグラフである。
【図６Ａ】再構成前のセルトリズマブペゴル（Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））の３つのバイアルを示す写真である。図５に記載されている３つの再構成方法によって再構成されたバイアル：（ａ）−左バイアル−、（ｂ）−中央バイアル−、（ｃ）−右バイアル−である。
【図６Ｂ】図５に記載されているような方法（ａ）−左バイアル−、（ｂ）−中央バイアル−及び（ｃ）−右バイアル−による再構成方法中の、種々の時間でのバイアル内容物の視覚的外観を示す写真である。
【図６Ｃ】図５に記載されているような方法（ａ）−左バイアル−、（ｂ）−中央バイアル−及び（ｃ）−右バイアル−による再構成方法中の、種々の時間でのバイアル内容物の視覚的外観を示す写真である。
【図６Ｄ】図５に記載されているような方法（ａ）−左バイアル−、（ｂ）−中央バイアル−及び（ｃ）−右バイアル−による再構成方法中の、種々の時間でのバイアル内容物の視覚的外観を示す写真である。
【図６Ｅ】図５に記載されているような方法（ａ）−左バイアル−、（ｂ）−中央バイアル−及び（ｃ）−右バイアル−による再構成方法中の、種々の時間でのバイアル内容物の視覚的外観を示す写真である。
【図６Ｆ】図５に記載されているような方法（ａ）−左バイアル−、（ｂ）−中央バイアル−及び（ｃ）−右バイアル−による再構成方法中の、種々の時間でのバイアル内容物の視覚的外観を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
背景技術のセクションにおいて明らかにされた問題は、本明細書において、固体形態の医薬組成物の再構成のための新規方法を提供することによって解決される。
【００３６】
したがって、第１の実施形態において、本発明は、固体形態の医薬組成物の再構成のための方法であって、
（ｉ）密封容器中に該固体形態の該医薬組成物を準備するステップであって、該容器内の圧力が、初期圧力ｐｉである該ステップと、
（ｉｉ）第１の時点ｔ０に、溶媒を該密封容器中に導入し、制御された時間Δｔ１中、該容器内に得られた圧力ｐｒを維持するステップと、
（ｉｉｉ）第２の時点ｔ２に、完全に再構成されるまで、該容器内の圧力を、該得られた圧力ｐｒよりも高い制御された圧力ｐ２に増加させるステップと
を連続的に含む方法に関する。
【００３７】
本明細書において使用される場合、「再構成」又は「固体形態の医薬組成物の再構成」という用語は、溶媒を加えることによって、固体形態の医薬組成物を液体状態に変換することを指す。
【００３８】
本明細書において使用される場合、「再構成時間」は、上記で定義されているように、固体の医薬組成物が溶媒で再構成を受ける時間を指す。
【００３９】
本明細書において使用される場合、「固体形態」の医薬組成物という用語は、粉末、噴霧乾燥された組成物又は凍結乾燥された（若しくはフリーズドライの）組成物である。
【００４０】
本明細書において使用される場合、「完全な再構成」は、容器中の医薬組成物の９０％又はその代わりに９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は９９．９％が液体状態である状態を指す。
【００４１】
本明細書において使用される場合、「容器」は、医薬組成物を含有する、貯蔵する、移送する又はそれ以外に処理するために使用される品物を指す。製薬業界において幅広く使用されている容器のタイプはバイアルであるが、当業者であれば、そのような目的に適した他の手段を提供することができる。
【００４２】
本明細書において使用される場合、「溶媒」という用語は、溶質を溶かして溶液にする物質である。適した溶媒は、例えば、医薬組成物を再構成するための溶媒として幅広く使用されている注射用水（ＷＦＩ）を含む。しかし、溶媒は、限定されないが、リン酸塩、ヒスチジン、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩又は乳酸塩緩衝剤などの、注射用溶液に一般的に使用されている、適した緩衝溶液を含み得る。他の場合には、緩衝剤は必要でない可能性があり、生理食塩溶液又は例えば、５％デキストロース溶液、通常の生理食塩水及び静菌水も、当技術分野において使用されている一般的な溶媒である。
【００４３】
一般に、固体形態の医薬組成物を含有する容器は、貯蔵中又は輸送中に医薬組成物の無菌性を維持するために、固く閉じられる。例えば、バイアルは多くの場合、隔膜によって閉じられ、クリンプで密封される。本発明の一実施形態では、医薬組成物を再構成するための溶媒は、針又はスパイクを用い、これらを隔膜に突き刺して注入される。また、容器内の圧力に実質的に影響を及ぼすことなく溶媒を導入する他の任意のやり方も用いることができ、これには、バイアルアダプター及び／又はコック若しくは適切なバルブを含む、組み合わされたシリンジアダプター又は当業者に知られている他の手段などがある。
【００４４】
本発明の特定の実施形態によると、初期圧力ｐｉは、０．５Ｐａから１．２×１０５Ｐａである。或いは、ｐｉは、５×１０３Ｐａから１×１０５Ｐａまで、１×１０４Ｐａから８×１０４Ｐａまで、２×１０４Ｐａから７×１０４Ｐａまで、３×１０４Ｐａから６×１０４Ｐａまで又は４×１０４Ｐａから５×１０４Ｐａまでである。例えば、固体形態が凍結乾燥された組成物である場合には、それは、凍結乾燥によって得られ得、容器内の圧力は、凍結乾燥された組成物の貯蔵を考慮して、所与の圧力に設定されている可能性がある。この圧力は、本発明の方法を始めるのに適切であり得る。それ故に、本発明の特定の実施形態では、ｐｉは、０．５Ｐａから２×１０４Ｐａまでが含まれ、或いは０．５Ｐａから１×１０４Ｐａまで、１０Ｐａから１×１０４Ｐａまで、１００Ｐａから１×１０４Ｐａまで、１００Ｐａから１×１０３Ｐａまで、１００Ｐａから５×１０３Ｐａまで又は２×１０３Ｐａから１×１０４Ｐａまで又は５×１０３Ｐａから１×１０４Ｐａまでが含まれる。他の場合には、容器はより高い又はより低い圧力に設定され得、それ故に、別の実施形態では、ｐｉは、３×１０４Ｐａから６×１０４Ｐａまで、或いは４×１０４Ｐａから５．５×１０４Ｐａまで又は４．７５×１０４Ｐａから５．５×１０４Ｐａである。
【００４５】
また、その貯蔵中の容器内の圧力は、再構成方法の第１のステップに求められる初期圧力ｐｉとは異なり得る。
それ故に、本発明のさらなる実施形態では、容器内の圧力は、再構成方法を始める前に、初期圧力ｐｉに設定される。容器内の圧力は、例えば、容器中のある量の空気を吸引することによって又は容器中にある量の空気を注入することによって調整することができる。
【００４６】
本発明は、大気圧（すなわち、およそ１×１０５Ｐａ）未満である初期圧力ｐｉに限定されず、初期圧力が大気圧又は１×１０５Ｐａを超える容器中に封入されている、固体の医薬組成物にも適用され得る。
【００４７】
ある特定の容量の溶媒を容器中に導入した結果として、容器内の圧力は、わずかに変化し得る。特に、気体の体積が減少するため、得られる圧力ｐｒはｐｉに対して増加する傾向にあり、前記導入された溶媒から脱気する可能性があるため、それ自体が、得られる圧力をｐｉに対してさらに増加し得る。
【００４８】
前記得られた圧力ｐｒは、決定された時間Δｔ１中、容器内で維持される。
【００４９】
これは、溶媒の導入中に、容器の密封を維持することを必要とする。
【００５０】
ある特定の実施形態によると、溶媒は、固体形態の医薬組成物に向けられた噴流として導入される。
【００５１】
本明細書において使用される場合、「噴流」という用語は、限定されないが、針状又はスパイク状開口部などの小さい開口部から強引に押し出される液体の急速な流れを指す。
【００５２】
別の実施形態によると、溶媒は、容器の壁に向けられた噴流として導入される。
【００５３】
得られた圧力ｐｒは、溶媒の導入後、それぞれの医薬組成物に応じて、規定された時間Δｔ１中維持される。
【００５４】
本発明の具体的な実施形態では、Δｔ１は、１秒から２分まで、或いは２秒から１．５分まで又は１秒から１分まで、或いは１秒から５０秒まで、或いは１５から４５秒まで、或いは２０から４０秒まで又は２０から３０秒である。
【００５５】
医薬組成物に応じて決まる最適時間Δｔ１が存在し、これが、相対圧力の増加によって、まだ乾燥している固体の部分に溶媒を引き込むこと、及び／又はトラップされた気泡などの空気の量を減じることを可能にする。
【００５６】
それ故に、本発明の方法の特定の実施形態では、ステップ（ｉｉ）の制御された時間Δｔ１は、全再構成時間ｔｒｅｃを、得られた圧力が溶媒の導入から容器中で維持される時間Δｔ１の関数として表す曲線の最小値に相当すると決定される。
【００５７】
本発明による再構成のための方法の１つの利点は、当技術分野において知られている再構成方法に反して、再構成後の医薬組成物の表面に気泡のクラウンがほとんど又は全く残らないということである。そのような気泡及び／又は泡沫が減少すると、使用可能な組成物の容器からの回収率が増加するため、生産時における、所与の回収／用量目標のための、容器中の固体形態の医薬組成物の開始量がより少なくて済む。
【００５８】
この時間Δｔ１後、容器内の圧力は、上記に記載した得られた圧力ｐｒに比べて大きい圧力ｐ２に増加される。
【００５９】
例えば、溶媒の導入後の容器内の圧力ｐｒが大気圧未満である場合には、圧力ｐ２は大気圧に設定することができる。
【００６０】
本発明の特定の実施形態では、ｐ２は少なくとも１．５×ｐｉである。
【００６１】
例えば、初期圧力ｐｉが、０．９８×１０５Ｐａなどの、概算でわずかに大気圧未満であり、ｐ２が、シリンジを用いて得ることが可能な非常に穏やかな超過圧力１．５×１０５Ｐａである場合には、ｐ２は、たいていの患者の状況では（すなわち、現地の大気圧を約１×１０５Ｐａと仮定して）１．５×ｐｉを超える。或いは、初期圧力ｐｉが０．３×１０５Ｐａであり、ｐ２が大気圧である場合には、ｐ２は、たいていの患者の状況では（すなわち、現地の大気圧を約１×１０５Ｐａと仮定して）３×ｐｉを超える。別の例では、初期圧力ｐｉが１００Ｐａであり、ｐ２が大気圧である場合には、ｐ２は、たいていの患者の状況では（すなわち、現地の大気圧を約１×１０５Ｐａと仮定して）１０００×ｐｉを超える。さらに別の例では、初期圧力ｐｉが、一般的な医薬用フリーズドライ容器中で容易に達成される１０Ｐａであり、ｐ２が大気圧である場合には、ｐ２は、たいていの患者の状況では（すなわち、現地の大気圧を約１×１０５Ｐａと仮定して）容易に約１×１０４×ｐｉである。
【００６２】
この増加された圧力ｐ２は、固体形態の医薬組成物の完全な再構成が達成されるまで維持される。
【００６３】
次いで、再構成された組成物は、直ちに使用される又は適した状態で短時間貯蔵される。
【００６４】
任意選択で、本発明の別の実施形態では、再構成方法は、溶媒及び医薬組成物を混合するさらなるステップを含む。
【００６５】
前記混合は、溶媒を用いると、医薬組成物の再構成を促進することができ、結果的に追加の気泡を壊すことにもつながり得る。それ故に、この追加のステップは、結果的に、再構成時間のさらなる短縮及び／又は最上部の泡沫の環のさらなる減少及び／又は気泡のさらなる減少をもたらすことができる。
【００６６】
本発明の１つの特定の実施形態では、前記混合は、溶媒及び医薬組成物の流体再循環によって実施され得る。そのような流体再循環は、容器内の混合物の吸引及び放出による、流体の変位を意味する。この混合のやり方は、混合物の粘度が低く、１５０センチポアズ未満、１００センチポアズ未満、９０センチポアズ未満、８０、７０又は６０センチポアズ未満、好ましくは５０センチポアズ未満などである場合及び／又は固体形態が流体再循環系を詰まらせない場合に効果的である。
【００６７】
しかし、混合物の粘度が高い場合又は固体形態の乾燥凝集体がそのような流体再循環の実施を困難にする場合には、その代わりに、容器内に導入されている外来物（foreign object）の重力、加速又は運動によって混合物が容器内を移動及び剪断されるように、混合は機械的混合によって効果的に行われる。それ故に、本発明のさらなる代替の実施形態では、医薬組成物を溶媒中で混合するステップは、機械的混合によって行われる。
【００６８】
例えば、鉛直位置からの傾斜角での容器の回転又は容器の旋回が、機械的混合の方法である。回転は、持続的又は非持続的であり得る。
【００６９】
本発明のさらなる実施形態では、溶媒及び医薬組成物を混合するステップは、流体再循環と機械的混合とを組み合わせるものであり、この組合せは、任意の順序で同時に及び／又は別々に実施される。
【００７０】
特定の実施形態では、そのような混合ステップは、溶媒を容器中に導入した後、容器内の圧力をｐ２に増加させる前に実施され得る。或いは、この混合ステップは、容器内の圧力をｐ２に増加させた後に実施され得る。さらに別の特定の実施形態では、混合ステップは、圧力をｐ２に増加させる前と後に行われ得る。
【００７１】
当業者であれば理解するように、本発明による方法のステップは、手動で行うことができ、或いはこの方法は、自動デバイス又は自動システムを利用して行うこともできる。
【００７２】
さらなる実施形態では、本発明の実施形態のいずれかによる方法は、ｐ２での規定された時間後、医薬組成物の完全な再構成前に、容器内の圧力を圧力ｐ３にさらに増加させる、追加のステップを含む。
【００７３】
一実施形態では、ｐｉ及びｐｒが大気圧、すなわち１×１０５Ｐａ未満であり、ｐ２が大気圧である場合には、ｐ３は、１．５×１０５Ｐａから１．５×１０６Ｐａであり得る。
【００７４】
本発明の特定の実施形態では、ｐ３は少なくとも１．５×ｐ２である。
【００７５】
本発明のさらなる実施形態では、本発明の実施形態のいずれかによる方法において、連続的な圧力の増加及び減少を含む圧力サイクルが、圧力ｐ２への上昇後及び圧力ｐ３への上昇前に適用される。そのような追加の圧力サイクルは、残存するたいていの気泡及び／又は泡沫を除去するのに役立つ。
【００７６】
本発明の追加の実施形態では、これらの圧力サイクルは、混合と同時に及び／又はその代わりに適用される。実際に、圧力変化及び混合は、気泡の合体及び除去に有利である。
【００７７】
本発明による方法の種々の実施形態を理解する上でさらなる助けとするために、図２Ａから図２Ｄが含まれている。当業者であれば理解するように、他の時間枠が可能であり、ただし、溶媒の導入から得られる圧力は、規定された時間Δｔ１中維持され、次いで増加される。
【００７８】
本発明の特定の実施形態では、再構成される固体形態の医薬組成物は、凍結乾燥された組成物である。
【００７９】
別の実施形態では、この固体形態の医薬組成物は、組換えタンパク質、抗体又はステロイドホルモンなどの生物学的部分を含む。さらなる特定の実施形態では、この生物学的部分は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む。
【００８０】
本明細書において使用される「抗体（単数又は複数）」という用語は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を指す。本明細書において使用される「抗体（単数又は複数）」という用語は、限定されないが、当技術分野において知られているような組換え技術によって生成される組換え抗体を含む。「抗体（単数又は複数）」は、任意の種の抗体、特に哺乳動物の種の抗体を含み、これらには、ヒト抗体のＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ及びＩｇＭを含む任意のアイソタイプ並びにその改変された変異体、非ヒト霊長類の抗体、例えばチンパンジー、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザル由来の抗体；齧歯動物の抗体、例えばマウス、ラット又はウサギ由来の抗体；ヤギ又はウマの抗体；及びラクダ科の動物の抗体（例えばＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標）などのラクダ又はラマ由来の抗体）及びそれらの誘導体；或いはニワトリの抗体などの鳥類の種の抗体又はサメの抗体などの魚類の種の抗体などが含まれる。「抗体（単数又は複数）」という用語はまた、少なくとも１つの重鎖及び／又は軽鎖の抗体配列の第１の部分が第１の種由来であり、重鎖及び／又は軽鎖の抗体配列の第２の部分が第２の種由来である「キメラ」抗体を指す。本明細書における目的のキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界ザル）から誘導される可変ドメイン抗原結合性配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む。「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体から誘導される配列を含有するキメラ抗体である。たいていは、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性及び活性を有する、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域［又は相補性決定領域（ＣＤＲ）］からの残基で置き換えられているヒト抗体（レシピエント抗体）である。たいていの場合には、ＣＤＲを除いた、すなわちフレームワーク領域（ＦＲ）におけるヒト（レシピエント）抗体の残基が、対応する非ヒト残基で追加的に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体において見出されない残基を含み得る。抗体の性能をさらに磨くために、これらの改変が行われる。ヒト化することで、ヒトにおける非ヒト抗体の免疫原性が低下するため、ヒトの疾患の治療に抗体を適用することが容易になる。ヒト化抗体及びそれらを生み出すためのいくつかの異なる技術は、当技術分野においてよく知られている。「抗体（単数又は複数）」という用語はまた、ヒト化に代わるものとして生成され得るヒト抗体を指す。例えば、免疫付与時に、内因性ネズミ抗体を産生することなく、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが可能である。例えば、キメラマウス及び生殖細胞系変異マウスにおける抗体重鎖結合部領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体産生を完全に阻害することが記載されている。そのような生殖細胞系変異マウスにおいて、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを導入すると、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニック動物の特定の抗原での免疫付与時に、この抗原に対して特異性を有するヒト抗体の産生がもたらされる。そのようなトランスジェニック動物を作製する技術並びにそのようなトランスジェニック動物からヒト抗体を単離及び生成する技術は、当技術分野において知られている。或いは、トランスジェニック動物；例えばマウスにおいて、マウス抗体の可変領域をコードする免疫グロブリン遺伝子のみが、対応するヒト可変免疫グロブリン遺伝子配列で置き換えられる。抗体定常領域をコードするマウス生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子は、変化しないままである。この方法では、トランスジェニックマウスの免疫系における抗体エフェクター機能及びその結果としてのＢ細胞の発生は本質的に変化せず、このことによって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗原投与時の抗体応答が改善され得る。目的の特定の抗体をコードする遺伝子が、そのようなトランスジェニック動物からいったん単離されると、定常領域をコードする遺伝子は、ヒト定常領域遺伝子で置き換えられて、完全なヒト抗体を得ることができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてヒト抗体／抗体断片を得るための他の方法は、ファージディスプレイ又はリボソームディスプレイ技術などのディスプレイ技術に基づいており、少なくとも一部分で人工的に又はドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから生成される組換えＤＮＡライブラリーが使用される。ヒト抗体を生み出すためのファージ及びリボソームディスプレイ技術は、当技術分野においてよく知られている。ヒト抗体は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて目的の抗原で免疫され、続いて融合されてハイブリドーマを形成した単離されたヒトＢ細胞からも生成され得、次いでこのハイブリドーマを、最適なヒト抗体についてスクリーニングすることができる。本明細書において使用される「抗体（単数又は複数）」という用語はまた、非グリコシル化抗体（aglycosylated antibody）を指す。
【００８１】
本明細書において使用される「抗体（単数又は複数）」という用語はまた、抗体断片も指す。抗体の断片は、当技術分野において知られているような、少なくとも１つの重鎖又は軽鎖免疫グロブリンドメインを含み、抗原に結合する。本発明による抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ及びｓｃＦｖ断片；並びにダイアボディ；トリアボディ；テトラボディ；ミニボディ；ｓｄＡｂｓ、ＶＨＨ及びＶＮＡＲ断片などのドメイン抗体（ｄＡｂｓ）；一本鎖抗体；抗体断片又は抗体から形成される、限定されないがＦａｂ−Ｆｖ構築体又はＦａｂ−Ｆｖ−Ｆｖ構築体を含む、二重特異性、三重特異性、四重特異性又は多重特異性抗体を含む。上記で定義されているような抗体断片は、当技術分野において知られている。
【００８２】
本発明のある特定の実施形態では、抗体は、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレングリコール）とポリ（プロピレングリコール）とのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）又はポリ（プロリン）などの水溶性ポリマーなどの機能性部分の共有結合によって修飾された抗体であり、それらのすべてが、対応する修飾されていないタンパク質に比べて、静脈内注射後、血液中で実質的により長い半減期を示すことが知られている。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分などの機能性部分に結合されている抗体である。１つの特定の実施形態では、抗体は、抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、抗体断片に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離のアミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル又はカルボキシル基を介して結合され得る。そのようなアミノ酸は、抗体断片中に自然発生し得る又は組換えＤＮＡ方法を使用して、断片中に工学的に作製され得る（例えば、米国特許第５，２１９，９９６号明細書；米国特許第５，６６７，４２５号明細書；国際公開第９８／２５９７１号パンフレットを参照のこと）。別の実施形態では、本発明のＦａｂ断片は、機能性部分の結合を可能にするために、その重鎖のＣ−末端に、１つ又は複数のアミノ酸を付加することによって修飾される。好ましくは、追加のアミノ酸は、機能性部分が結合され得る１つ又は複数のシステイン残基を含有する、修飾されたヒンジ領域を形成する。２つ以上のＰＥＧ分子を結合するために、複数の部位を使用することができる。
【００８４】
本発明のある特定の態様では、ＰＥＧ分子は、本発明の抗体断片に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合される。修飾された抗体断片に結合されるそれぞれのＰＥＧ分子は、断片に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合され得る。共有結合は、一般に、ジスルフィド結合又は特に、硫黄−炭素結合である。チオール基が結合点として使用される場合、適切に活性化された機能性部分、例えば、マレイミドなどのチオール選択的誘導体及びシステイン誘導体が使用され得る。活性化されたＰＥＧは、上記に記載されているＰＥＧ−修飾された抗体断片の調製における出発材料として使用され得る。活性化されたＰＥＧは、α−ハロカルボン酸又はエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドなどのチオール反応基を含有する任意のＰＥＧであり得る。ある特定の実施形態では、抗体コンジュゲートは、２つのマレイミド分子を有する２つのＰＥＧ分子を含み得る。出発材料は、商業的に得ることができるか又は市販の出発材料から、従来の化学的手法を使用して調製することができる。特定のＰＥＧ分子は、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡを含む。
【００８５】
１つの好ましい実施形態では、本発明の抗体は、例えばＥＰ０９４８５４４に開示されている方法に従って、ＰＥＧ化されている、すなわち、それに共有結合されているＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を有する、修飾されたＦａｂ断片である。一例では、ＰＥＧは、ヒンジ領域においてシステインに結合されている。別の例では、ＰＥＧ修飾されたＦａｂ断片は、修飾されたヒンジ領域において、単一チオール基に共有結合されるマレイミド基を有する。リシン残基は、マレイミド基に共有結合され得、リシン残基上のアミン基のそれぞれに、およそ２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーが結合され得る。それ故に、Ｆａｂ断片に結合されているＰＥＧの全分子量は、およそ４０，０００Ｄａであり得る。
【００８６】
別の実施形態では、機能性部分はＰＥＧであり、国際公開第９８／２５９７１号パンフレット及び国際公開第０４／７２１１６号パンフレットに記載されている方法を使用して結合され、それによって、リシル−マレイミド基が、重鎖のＣ−末端においてシステイン残基に結合され、リシル残基のそれぞれのアミノ基は、それ、すなわち約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基に共有結合している。それ故に、抗体に結合されているＰＥＧの全分子量は、およそ４０，０００Ｄａである。
【００８７】
別の実施形態では、機能性部分はＰＥＧであり、国際公開第９８／２５９７１パンフレット及び国際公開第０４／０７２１１６号パンフレットに記載されている方法を使用して、Ｆ（ａｂ）２断片に結合され、それによって、リシル−ジマレイミド基が、それぞれのＦａｂ重鎖のＣ−末端においてシステイン残基に結合され、リシル残基のそれぞれのアミノ基は、それ、すなわち約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基に共有結合している。それ故に、Ｆ（ａｂ）２抗体に結合されているＰＥＧの全分子量は、およそ４０，０００Ｄａである。
【００８８】
本発明のある特定の実施形態では、本発明の抗体は、完全にヒト又はヒト化であり得るＦａｂ’抗体断片であり、重鎖、軽鎖又は両方においてＰＥＧ化されている。他の実施形態では、完全にヒト又はヒト化であり得る抗体断片は、一方の若しくは両方の重鎖又は一方の若しくは両方の軽鎖、又は両方の重鎖及び軽鎖上でＰＥＧ化されている。
【００８９】
よって、ある特定の実施形態では、抗体は、ＰＥＧが、システイン残基において又はリシン残基において、抗体に結合されているＰＥＧ−結合抗体（例えば、ＰＥＧ−結合ヒト抗体）である。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ化抗体は、少なくとも２４ｋＤの流体力学的サイズを有する。他の実施形態では、ＰＥＧは、サイズがだいたい２０から６０ｋＤまで（２０及び６０を含む）の範囲で変化し得る。さらなる実施形態では、ＰＥＧ−結合抗体は、少なくとも２００ｋＤの流体力学的サイズを有する。抗体がＰＥＧ部分に結合されている本発明実施形態では、ＰＥＧ化抗体は、ＰＥＧ部分を欠く抗体に比べて増加されたｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有し得る。
【００９０】
「ペグ化」、「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」という用語は、ポリアルキレングリコール化合物又はその誘導体を含み、カップリング剤の有無又はカップリング部分若しくは活性化部分との（例えば、チオール、トリフラート、トシラート、アジリジン（azirdine）、オキシランとの、又は好ましくはマレイミド部分との、例えば、ＰＥＧ−マレイミドなどの）誘導体化の有無を問わない。他の適切なポリアルキレングリコール化合物には、マレイミドモノメトキシＰＥＧ、活性化ＰＥＧポリプロピレングリコールのみならず、デキストラン、コロミン酸若しくは他の炭水化物をベースとしたポリマー、アミノ酸のポリマー及びビオチン並びに他の親和性試薬誘導体といったタイプの荷電ポリマー又は中性ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
本発明の抗体の完全性及び寿命を改善するのに有用であり得る他の機能性部分は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてポリペプチドを含む。例えば、本発明の抗体又は抗体断片は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ポリペプチドを含むために修飾され得る。そのような抗体コンジュゲートは、非コンジュゲート抗体又は抗原結合性断片と比較して、安定化の増加及び血清中半減期の増加を示し得る。例えば、ある特定の実施形態では、ＨＳＡにコンジュゲートされた抗体は、非コンジュゲート抗体に比べてｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の増加を示し得る。ＨＳＡ−コンジュゲート抗体の半減期（ｔα半減期−又はｔβ−半減期）は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又はそれ以上増加し得る。ｔα−半減期は、例えば、０．２５分〜１２時間の範囲内であり得るが、一方、ｔβ−半減期は、例えば、１２〜４８時間の範囲内であり得る。ｔα−半減期又はｔβ−半減期は、好ましくは、少なくとも３日、少なくとも７日、少なくとも１４日、少なくとも２１日、少なくとも２８日、少なくとも１カ月又はそれ以上であり得る。
【００９２】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の抗体は、検出可能なマーカー、例えば、放射性同位体、酵素、色素若しくはビオチン又は他の親和性試薬で標識することによって、機能性部分で修飾された抗体である。
【００９３】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の抗体は、治療薬、例えば、放射性同位体若しくは放射性核種（例えば、１１１Ｉｎ若しくは９０Ｙ）、毒素部分（例えば、破傷風トキソイド若しくはリシン）、トキソイド又は化学療法剤（米国特許第６，３０７，０２６号明細書）にコンジュゲートされることによって、機能性部分で修飾された抗体である。
【００９４】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の抗体は、造影剤にコンジュゲートされることによって修飾された抗体である。造影剤は、例えば、容易な単離又は検出のための標識部分（例えば、ビオチン、蛍光性部分、放射性部分、ヒスチジンタグ若しくはｍｙｃタグ又は他のペプチドタグ）を含み得る。
【００９５】
本発明の抗体を修飾するための又はコンジュゲートさせるための機能性部分のさらなる例は、細胞に対して有害である（例えば、死滅させる）任意の薬剤を含むセロトキシン又は細胞毒性剤を含み得る。例として、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンギスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステルリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン並びにその類似体又は同族体が含まれる。
【００９６】
コンジュゲーションの際に有用な機能性部分には、葉酸代謝拮抗剤（例えば、アミノプテリン及びメトトレキサート）、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ並びにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン、ＣＣ−１０６５、エンジイン（enedieyene）、ネオカルチノスタチン）並びに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
他の機能性部分は、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２並びにタングステン１８８／レニウム１８８、２１１アスタチンなどのキレート化放射性核種；又は限定されないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンなどの薬物を含み得る。
【００９８】
さらなる機能性部分は、タンパク質、ペプチド及び酵素を含む。目的の酵素には、タンパク分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない。目的のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドには、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素若しくはジフテリア毒素などの毒素、メイタンシノイド（例えば、限定されないが、ＤＭ１）、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子若しくは組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質、血栓症の薬剤若しくは抗血管新生剤、例えば、アンギオスタチン若しくはエンドスタチン、アンジオゲニン、ゲロニン、ドルスタチン（ｄｏｌｓｔａｔｉｎ）、副溝結合剤、ビス−ヨード（ido）−フェノールマスタード又はリンフォカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）若しくは他の増殖因子などの生体応答調節物質が含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】
他の機能性部分は、例えば、診断において有用な検出可能な物質を含み得る。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性核種、陽電子放出金属（陽電子放出断層撮影法で使用するためのもの）及び非放射性常磁性金属イオンが含まれる。診断用薬剤として使用するための抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンに関しては、一般に、米国特許第４，７４１，９００号明細書を参照のこと。適した酵素には、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適した補欠分子族には、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンが含まれ；適した蛍光材料には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル及びフィコエリトリンが含まれ；適した発光材料には、ルミノールが含まれ；適した生物発光材料には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが含まれ；適した放射性核種には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃが含まれる。
【０１００】
以下に記載されている実験結果によって示されるように、本発明による再構成方法は、当技術分野において知られている他の方法と比較すると著しく速い。
【０１０１】
実際に、特定の例において、本発明による再構成のための方法は、約１０分以下という再構成時間をもたらすのに対して、他の知られている方法は、２０分を超える再構成時間となる。
【実施例】
【０１０２】
実験結果
（例１）
図１Ａ〜１Ｃは、固体形態の医薬組成物がバイアル１中に含有され、隔膜１１及び金属クリンプ１０で密封されている、本発明の特定の実施形態を例示している。この場合には、図１Ａに示すように、次いで、針２０を装着したシリンジ２を使用して、溶媒が導入される。この際、針２０は隔膜１１を貫通し、容器１は上向き直立位である。
【０１０３】
上記に言及されている図１Ａの例では、溶媒は、適した噴流としても注入することができる。これは、溶媒を含有するシリンジの針を、隔膜に垂直に深く固体近くに挿入し、溶媒に高い圧力を与え、針を通じて溶媒を容器に高速で移動させることによって得られる。次いで、溶媒注入中、湿った固体を、環状固体又は崩壊した固体として観察することができる。
【０１０４】
この例では、初期圧力ｐｉ及び溶媒の注入後の得られた圧力ｐｒの両方は、大気圧未満である。この例では、溶媒の注入後、いかなる漏れ及び大気の吸い込みも避け、得られた圧力ｐｒを維持するために、針及びシリンジはバイアルの中に入れたままにする。それ故に、図１Ｂに図解するように、単に、大気圧につながる中空針３を容器１の隔膜に突き刺すことによって、容器中のｐ２を大気圧へ設定することができる。
【０１０５】
図１Ｃにおいて、本発明の実施形態の１つによる方法は、溶媒を固体形態の医薬組成物と機械的混合する追加のステップを含む。この場合には、容器１を約４５°に傾け、その縦軸に沿って回転させる。その角度は、混合物を低剪断混合し、容器壁に付着した固体形態の乾燥物に湿った溶液を行き渡らせ、こうしてより多くの乾燥した形態を回収し、その結果として全体的な回収率を改善するのに役立つ。
【０１０６】
（例２）
この特定の場合には、本発明の方法を、抗体（Ｆａｂ’）のＰＥＧ化断片である、凍結乾燥されたセルトリズマブペゴルを再構成するのに使用した。
【０１０７】
以下の方法を実施したところ、再構成時間は約１０分に短縮された。すなわち、
・医薬品製造業者から入手可能な、バイアル中におよそ６００Ｐａで凍結乾燥された形態のセルトリズマブペゴル２００ｍｇを準備するステップ；
・２０ゲージ針を装着したシリンジから、上向き直立位のバイアル中に、注射用水（ＷＦＩ）を、凍結乾燥されたケーキの中心に向けた噴流で、得られた不完全真空圧力を解放することなく急速導入するステップ；
・上向き直立位で待機するステップ；
・ＷＦＩの導入開始から２０〜３０秒後に、バイアル内の圧力を大気圧に解放するステップ；
・バイアルを上向き直立位にして、完全に再構成するのを待つステップ
である。
【０１０８】
本明細書において使用される「ケーキ」という用語は、凍結乾燥加工処理から容器中に得られた固体を意味する。
【０１０９】
（例３）
この特定の場合には、本発明の方法を、抗体（Ｆａｂ’）のＰＥＧ化断片である、凍結乾燥されたセルトリズマブペゴルを再構成するのに使用した。
【０１１０】
以下の方法を実施したところ、再構成時間は平均８分及び６分という短い時間に短縮された。すなわち、
・医薬品製造業者から入手可能なバイアル中におよそ６００Ｐａで、凍結乾燥された形態のセルトリズマブペゴル２００ｍｇを準備するステップ；
・１インチの２０ゲージ針を装着したシリンジから、上向き直立位のバイアル中に、注射用水（ＷＦＩ）１ｍＬを、凍結乾燥されたケーキの中心に向けた噴流で、得られた不完全真空圧力を解放することなく急速導入するステップ；
・上向き直立位で待機するステップ；
・ＷＦＩの導入開始から２０〜３０秒後に、バイアル内の圧力を大気圧に解放するステップ；
・バイアルを上向き直立位にして、２０秒待機するステップ
・バイアルを４５°に傾け、１〜２ｒｅｖ／ｓで回転させて、完全に再構成させるステップ
である。
【０１１１】
医薬組成物は、いったんそれが完全に透明ないし乳白色又は淡黄色になり、実質的に、懸濁液中に固体又は不十分に湿った部分若しくはゲルの部分又は粒子状物質が存在しなくなれば再構成されているとみなされ、拡大はせずに、バイアル通して目視でモニターした。
【０１１２】
セルトリズマブペゴルの再構成のこの例では、いったんＷＦＩをバイアル中に加えたら、圧力を大気のレベルに増加する前に、種々の時間Δｔ１を使用して、以下に記載されているように最適時間Δｔ１を決定した。よって、時間Δｔ１＝０は、溶媒導入直後の真空の解放に相当する。出願人は、この場合の再構成時間は、真空が溶媒導入前に解放される場合（例４を参照のこと）と実質的に同じであるが、後者の場合には、再構成方法の終了時により安定な気泡が残存し、結果的に再構成の質がより低くなることに留意している。
【０１１３】
図３は、セルトリズマブペゴルの再構成時間ｔｒｅｃを最小にするために溶媒の導入で得られる圧力ｐｒを維持する必要がある最適時間Δｔ１の決定を示す。
【０１１４】
図３から明らかなように、再構成時間は、時間Δｔ１の関数として、Ｕ型曲線の形で変化した。
【０１１５】
このＵ型曲線の最小値が最適時間Δｔ１であると規定する。本明細書には示されていないが明確にするために述べると、Δｔ１は、種々の混合シナリオによってほとんど影響を受けなかった。しかし、圧力を厳密に前記最適時間で増加させる代わりに、この最適時間の８０から１２０％までの間を含む時間Δｔ１後に、再構成時間を著しく延長させることなく、圧力を増加できることが決定された。
【０１１６】
（例４）
この特定の場合には、本発明の方法を、抗体（Ｆａｂ’）のＰＥＧ化断片である、凍結乾燥されたセルトリズマブペゴルを再構成するのに使用した。
【０１１７】
以下の方法を実施した。すなわち、
・医薬品製造業者から入手可能な、バイアル中に種々の圧力レベルで凍結乾燥された形態のセルトリズマブペゴル２００ｍｇを準備するステップ；
・１インチの２０ゲージ針を装着したシリンジから、上向き直立位のバイアル中に、注射用水（ＷＦＩ）１ｍＬを、凍結乾燥されたケーキの中心に向けた噴流で、得られた不完全真空圧力を解放することなく急速導入するステップ；時間基準ｔ＝０は、バイアル中にＷＦＩを導入した直後に測定する；
・いったんＷＦＩをバイアル中に加えたら、圧力を大気のレベルに増加する前に、種々の時間Δｔ１を使用して、以下に記載されているように最適時間Δｔ１を決定するステップ；
・バイアルを４５°の角度で１分間、穏やかに回転させ（手動で約３０回転）、ＷＦＩが固体ケーキと完全に接触できるようにするステップ；
・バイアルを、作業台表面に上向き直立位にし、ｔ＝０から２分が経過するまで静置させるステップ；
・バイアルを取り上げ、それを４５°の角度で再び１分間、穏やかに回転させ（手動で約３０回転）、ＷＦＩを固体原料と確実に接触させるステップ；
・バイアルを、作業台表面に上向き直立位にし、ｔ＝０から４分が経過するまで静置させるステップ；
・バイアルを取り上げ、それを４５°の角度で再び１分間、穏やかに回転させ（手動で約３０回転）、ＷＦＩを固体原料と確実に接触させ；バイアルを２回ゆっくり反転させる（例えば、上部と底部を逆さまにし、再び元に戻すことを２回行う）ステップ；
・バイアルを、作業台表面に上向き直立位にして静置させるステップ；
・ｔ＝０から１０分が経過した時、バイアルを取り上げ、それを再び４５°の角度でおよそ１分間、穏やかに回転させ（手動で約３０回転）、ＷＦＩを固体原料と確実に接触させ；バイアルを２回ゆっくり反転させる（例えば、上部と底部を逆さまにし、再び元に戻すことを２回行う）ステップ；
・バイアルを、作業台表面に上向き直立位にして静置させるステップ；
・バイアルを観察して、完全な再構成が達成されているかどうかを決定するステップ
である。
【０１１８】
医薬組成物は、いったんそれが完全に透明ないし乳白色又は淡黄色になり、実質的に、懸濁液中に固体又は不十分に湿った部分若しくはゲルの部分又は粒子状物質が存在しなくなれば再構成されているとみなし、拡大はせずに、バイアルを通して目視によってモニターした。完全な再構成が達成される時間を書き留めて、これをｔｒｅｃとする。
【０１１９】
ｔ＝１５分時点で、完全な再構成が達成されていない場合には、バイアルを取り上げ、４５°の角度で１分間、穏やかに回転させて（手動で約３０回転）ＷＦＩを固体原料と確実に接触させ、２回ゆっくり反転させ（例えば、上部と底部を逆さまにし、再び元に戻すことを２回行う）；次いで、バイアルを作業台表面に上向き直立位にして静置させ、観察して、いつ完全な再構成が達成されたのかを決定した。必要ならば、完全な再構成が達成されるまで、回転及び反転を５分毎にさらに実施した。
【０１２０】
図４Ａ〜４Ｅは、バイアル中の以下の初期圧力：それぞれ３．５Ｐａ；６５０Ｐａ；１０，０００Ｐａ；２５，０００Ｐａ及び５０，０００Ｐａについて、セルトリズマブペゴルの再構成時間ｔｒｅｃを最小にするために、溶媒の導入で得られた圧力ｐｒを維持する必要がある最適時間Δｔ１の決定を示す。
【０１２１】
図４Ａ〜４Ｅから証明することができるように、初期圧力２５，０００Ｐａ未満について、再構成時間は、時間Δｔ１の関数として、Ｕ型曲線の形で変化した。バイアル中の初期圧力が増加するにつれて、Ｕ型曲線がより平らになり、再構成時間ｔｒｅｃが増加することも観察することができる。しかし、この例では、図３とは異なり、図４Ａ〜４ＥにプロットされたΔｔ１＝０のデータポイントでは、バイアルが最初に、溶媒導入直前に、大気圧と平衡する状態にある。
【０１２２】
図５は、以下について得られた、凍結乾燥されたセルトリズマブペゴルの再構成時間ｔｒｅｃを示す。
（ａ）本発明の実施形態による、例３に記載されている再構成方法。
（ｂ）バイアルがおよそ６００Ｐａの初期圧力に設定されており、溶媒注入後及び完全な再構成まで、容器内の圧力のいかなる増加もない、当技術分野において知られている再構成方法。そのために、完全な再構成前に、いかなる漏れも避けるために、針及びシリンジはバイアルの中に入れたままにする。
（ｃ）製造業者からセルトリズマブペゴルとともに提供された、現行の使用説明書による再構成方法。溶媒をバイアル壁に接触させてバイアルに加え、旋回操作をする前に針を隔膜から引き抜くことによって、初期の低い圧力が部分的に失われる際に得られる圧力で、再構成を実施する、
【０１２３】
より明確にするために述べると、凍結乾燥された医薬組成物のパッケージ中に提供されているリーフレットには、納入されたパッケージ内に提供される構成要素（注射用の滅菌水のバイアル、ＵＳＰ（１ｍＬ）、使い捨てのプラスチックシリンジ、２０ゲージ再構成針）を用い、「適切な無菌技術」を使用して実行されるべき以下の指示が含まれる。
・Ｃｉｍｚｉａ（登録商標）の凍結乾燥されたバイアルを、注射用滅菌水（ＷＦＩ）１ｍＬで、未使用の２０ゲージ針を用いて再構成する。滅菌ＷＦＩは、Ｃｉｍｚｉａ（登録商標）の上に直接当てるよりもむしろ、バイアル壁の方に向けるべきである；
・Ｃｉｍｚｉａ（登録商標）のバイアルを、約１分間、振盪せずに穏やかに旋回し、すべての粉末が滅菌ＷＦＩと確実に接触するようにする。泡立ちの影響を創り出すのを避けるために、旋回は、可能な限り穏やかに行うべきである；
・溶けていない粒子が観察される限り、５分毎に旋回し続ける。全再構成時間が３０分と長くかかることがある。最終再構成溶液は、透明ないし乳白色、無色ないし淡黄色の液体であり、実質的に、粒子状物質が存在するべきではない。
【０１２４】
前記Ｃｉｍｚｉａ（登録商標）リーフレットは、凍結乾燥された粉末が、医療専門家によって調製されるべきであることを明記している。
【０１２５】
図５における再構成時間の比較から、本発明による再構成方法（ａ）が、最短の再構成時間をもたらしたことは明らかである。
【０１２６】
加えて、再構成時間の変動が、方法（ａ）において著しく減少した。
【０１２７】
図６Ａ〜６Ｆは、本例において使用された３つのバイアルの、再構成方法の種々の時間での視覚的外観の写真を示しており、上記に記載されているように、左のバイアルは方法（ａ）によって調製され、中央のバイアルは方法（ｂ）によって調製され、右のバイアルは方法（ｃ）によって調製されたものである。
【０１２８】
溶媒の導入直後に高かった容器内の混合物のレベル（混合物の体積は、固体の体積と溶媒の体積との和と考えられる）が、迅速に低くなった時に、効果的な湿潤が観察された。実際に、レベルの急降下は、固体が溶媒によって湿っており、溶媒で固体粒子間の隙間が置き換わっていることを示す。得られた溶液はまた、溶媒中に乾燥ケーキの大きな塊があるというよりもむしろ、迅速に乳状又は泡の多いゲルのように見えるだろう。
【０１２９】
図６Ａの写真の縮尺は、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、図６Ｆと比較すると、バイアル全体が見えるように調節されている。
【０１３０】
図６Ａは、溶媒の導入直前（ｔ０）の３つのバイアルを示す。
【０１３１】
３つすべての場合において、バイアルの内容物は、不透明な白色を有する。
【０１３２】
図６Ｂは、溶媒の導入から１分（ｔ０＋１分）での３つのバイアルを示す。
【０１３３】
バイアル（ａ）（本発明による方法）の場合には、バイアル内の圧力を、Δｔ１＝３０ｓで解放した。
【０１３４】
この段階の終了時、バイアル（ｂ）及び（ｃ）と比較して、バイアル（ａ）の視覚的外観に著しい相違があった。バイアル（ａ）において、溶液は既に半透明の外観を有しており、泡沫がないのに対して、バイアル（ｂ）及び（ｃ）では、大量の泡沫が観察された。バイアル（ｂ）及び（ｃ）では、泡沫のほかに、最初の凍結乾燥されたケーキの大部分が、湿らないまま残っていることがわかる。
【０１３５】
図６Ｃは、溶媒の導入から４分（ｔ０＋４分）での３つのバイアルを示す。
【０１３６】
バイアル（ａ）中の溶液は、全体として実質的に透明及び均一であり、バイアルの壁に接触している溶液の表面に、ほんのわずかの中程度の及び大きな気泡が存在した。再構成は、ほとんど完了していると考えられた。
【０１３７】
バイアル（ｂ）及び（ｃ）では、溶液はほとんど半透明であり、バイアルの壁に接触している溶液の表面に、かなりの量の気泡が存在し、不十分に湿った凝集体の大部分が存在した。
【０１３８】
図６Ｄは、溶媒の導入から１０分（ｔ０＋１０分）での３つのバイアルを示す。
【０１３９】
バイアル（ａ）中の溶液は、全体として透明及び均一であり、バイアルの壁に接触している溶液の表面に、ほんのわずかの気泡が存在する。再構成は、回転又は旋回などのバイアル操作を止めた時点であるｔ０＋８分で、完了していると考えられた。この時点の画像は含まれていない。
【０１４０】
バイアル（ｂ）及び（ｃ）では、溶液は主に透明であったが、半透明な凝集体が溶液内を浮遊していた；加えて、バイアルの壁に接触している溶液の表面に、かなりの量の気泡がまだ存在した。バイアル（ｃ）は、泡沫の環と考えられるものをまだ示していた。
【０１４１】
図６Ｅは、溶媒の導入から２０分（ｔ０＋２０分）での３つのバイアルを示す。
【０１４２】
バイアル（ａ）中の溶液は、溶媒の導入から１０分での図６Ｄのものに類似している。
【０１４３】
バイアル（ｂ）では、溶液は主に透明であったが、半透明な凝集体（図６Ｄのものよりも小さい）が溶液内を浮遊しているのを見ることができ、ゲルもバイアルの底部に観察された。
【０１４４】
バイアル（ｃ）では、溶液は主に透明であったが、半透明な凝集体をバイアルの底部に見ることができた；加えて、バイアルの壁に接触している溶液の表面に、かなりの量の小さな気泡がまだ存在し、泡沫の環から小さい気泡へと推移した。拡大すると、溶液の大部分は、バイアルの底部に、いくつかの小さい気泡及びゲルも含有することが観察された。
【０１４５】
図６Ｆは、溶媒の導入から２５分（ｔ０＋２５分）での３つのバイアルを示す。
【０１４６】
バイアル（ａ）中の溶液は、図６Ｅのものに類似しているように見えた。
【０１４７】
バイアル（ｂ）では、溶液は主に透明であったが、小さい半透明な凝集体が、バイアルの底部に見えるままであった。
【０１４８】
バイアル（ｃ）では、溶液は主に透明であったが、小さい半透明な凝集体をバイアルの底部に見ることができた。加えて、バイアルの壁に接触している溶液の表面に、かなりの量の小さな気泡がまだ存在した。
【０１４９】
興味深いことに、方法（ａ）から（ｃ）までのすべてにおいて、容器中に導入された溶媒の量は、凍結乾燥加工処理中に、液体形態の医薬組成物から除去された溶媒の量に比べてより少なかったことも言及することができる。
（参照文献）
0006397933.tif 000002
【図１Ａ】
0006397933.tif 000003
【図１Ｂ】
0006397933.tif 000004
【図１Ｃ】
0006397933.tif 000005
【図２Ａ】
0006397933.tif 000006
【図２Ｂ】
0006397933.tif 000007
【図２Ｃ】
0006397933.tif 000008
【図２Ｄ】
0006397933.tif 000009
【図３】
0006397933.tif 000010
【図４Ａ】
0006397933.tif 000011
【図４Ｂ】
0006397933.tif 000012
【図４Ｃ】
0006397933.tif 000013
【図４Ｄ】
0006397933.tif 000014
【図４Ｅ】
0006397933.tif 000015
【図５】
0006397933.tif 000016
【図６Ａ】
0006397933.tif 000017
【図６Ｂ】
0006397933.tif 000018
【図６Ｃ】
0006397933.tif 000019
【図６Ｄ】
0006397933.tif 000020
【図６Ｅ】
0006397933.tif 000021
【図６Ｆ】
0006397933.tif 000022