(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含むヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を治療するための医薬組成物であって、前記ＭＳＣがＨＩＶ抗ウイルス融合阻害剤を発現し、前記ＨＩＶ抗ウイルス融合阻害剤はＣ４６もしくはｍａＣ４６のペプチドまたは抗体であり、当該医薬組成物はＨＩＶを有する対象に投与される、医薬組成物。
【請求項２】
前記ＨＩＶ抗ウイルス融合阻害剤が中和抗体である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
ａ）ＨＩＶ抗ウイルス融合阻害剤をウイルスベクター中に組み込んで遺伝子送達ベクターを形成するステップであって、前記ＨＩＶ抗ウイルス融合阻害剤はＣ４６もしくはｍａＣ４６のペプチドまたは抗体である、ステップ；及び、
ｂ）前記遺伝子送達ベクターを間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に形質導入するステップであって、ここで、前記ＭＳＣは形質導入後にＨＩＶ抗ウイルス融合阻害剤を発現する、ステップ；
を含む、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を有する対象に投与するため及びＨＩＶを治療するための医薬組成物を製造する方法。
【請求項４】
前記抗体が中和抗体である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
静脈内に注入される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
皮下に注入される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
腹腔内に注入される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記対象が、動物である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記対象が、ヒトである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記対象に投与するための抗レトロウイルス剤を更に含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ａ）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を有する対象に投与するための抗ウイルス剤、及び
ｂ）対象に投与するための、請求項１または２に記載の組成物のいずれか、
を含むＨＩＶを治療するためのキット。
【請求項１２】
請求項１または２からの１種以上の組成物が投与される、請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
前記抗ウイルス剤が、請求項１または２に記載の組成物の前に投与される、請求項１１記載のキット。
【請求項１４】
前記抗ウイルス剤が、請求項１または２に記載の組成物の後に投与される、請求項１１記載のキット。
【請求項１５】
ａ）及びｂ）が、動物に投与される、請求項１１記載のキット。
【請求項１６】
ａ）及びｂ）が、ヒトに投与される、請求項１１記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
従来の関連出願
本開示は、２０１３年４月３日に出願され、参照により本明細書に完全に組み込まれるＵＳ  ６１／８０８０９７の優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
該当なし
【０００３】
マイクロフィッシュ付録に対する参照
該当なし
【０００４】
開示の分野
本開示は、一般的に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を治療する方法に関するものであり、詳しくは、形質導入された間葉系幹細胞を使用してＨＩＶを治療することに関する。
【背景技術】
【０００５】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、ヒトにおける免疫系の進行性破壊を誘導し、致死的な日和見感染及び活発に増殖する癌へのドアを開けるゆっくりと複製するレトロウイルスである。ＨＩＶの感染は：非感染バイスタンダー細胞のアポトーシス；感染細胞の直接的なウイルスによる死滅；及び、感染細胞を認識するＣＤ８細胞障害性リンパ球による感染ＣＤ４＋Ｔ細胞の死滅、を包含する多くのメカニズムを介して、結果としてＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇をもたらす。ＣＤ４＋Ｔ細胞の喪失は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こす。ＨＩＶ及びＡＩＤＳに由来する免疫機能の喪失により、全世界で２５００万人を超える人がＡＩＤＳで死亡している。
【０００６】
ＨＩＶを管理はするが治癒させることはない多くの治療法が存在している。抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）は、例えば、ウイルス血症、すなわちウイルスが血流に入って身体の残りの部分にアクセスする状態を制御する。利用可能な抗ＨＩＶ薬剤は、ＨＩＶのライフサイクルの異なるフェーズを標的にしており、各薬剤は、阻害するフェーズに従って分類される。しかしながら、標準的なＡＲＴは、ＨＩＶライフサイクルの複数のフェーズが阻害され、複製が可能な限り抑制されるような組み合わせで使用される少なくとも３種の抗レトロウイルス剤から成る。
【０００７】
ＨＩＶ及びＡＩＤＳの治療においては有望ではあるが、ＡＲＴには欠点がある。３０種を超える異なるタイプの薬剤がＡＲＴでは利用可能であるが、ほんの少数の組み合わせのみが所定の患者に作用し得る。患者は、作用するものを見つける前に、複数の組み合わせ及び投与量を一巡しなければならないだろう。複数のピルを、特定のスケジュールに基づいて、１日に１回以上服用して患者のウイルス量を減少させなければならない。治療スケジュールからのあらゆる逸脱が、現用の薬剤の組み合わせに対して抵抗性であるかもしれないＨＩＶ／ＡＩＤＳ株の突然変異をもたらすことがある。更に、これらの投薬は、副作用、例えばインスリン耐性または脂質異常を引き起こす場合があるので、ＡＲＴと組み合わせて追加の投薬も必要である。而して、ＡＲＴ薬剤レジメンは、複雑且つ高価であり、潜在的な副作用に関して生涯にわたる介入処置を要する。
【０００８】
殆どのウイルスと同様に、ＨＩＶはウイルスエンベロープを有する。ＨＩＶのウイルスエンベロープにはＥｎｖとして公知のタンパク質が組み込まれており、それは、糖蛋白（ｇｐ）１２０と呼ばれている３つの分子からできているキャップ（ｃａｐ）と、ウイルスエンベロープ中にウイルス構造を固定する３つのｇｐ４１分子から成る幹（ｓｔｅｍ）とから成っている。この糖蛋白複合体は、ウイルスを標的細胞に付着させ且つ融合させて感染を開始させることができ、その糖蛋白は、治療及びワクチンによる標的にされる。
【０００９】
エンフュービルタイド（ｆｕｚｅｏｎ、またはＴ−２０）は、標的細胞との融合の最終段階でＨＩＶ−１分子機構を崩壊させる新しいクラスの融合阻害剤のＦＤＡ認可薬である。エンフュービルタイドは、融合中のｇｐ４１糖蛋白を標的とする。詳しくは、ｇｐ４１は、構造変化して、標的細胞に対するＨＩＶ−１の融合を可能にする。エンフュービルタイドは、ｇｐ４１に結合して、ウイルスのための侵入孔の生成を妨害し、細胞から遠ざける。
【００１０】
しかしながら、この注射可能な薬剤は、重大な副作用と、殆どの患者がいくつかの局所的な注射部位反応を発症するような薬剤送達の問題とを有する。更に、エンフュービルタイドは、半減期が短く、１日２回の投与を必要とするので、局所的な注射部位反応を弱める必要がある。エンフュービルタイドの皮下適用も、複雑な経口療法によって既に負担がかけられている患者にとっては明白に不利である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
而して、より複雑でなく且つより適応性がある新規な療法に関するニーズが存在する。理想的には、新規な療法は、副作用が限定されていて、且つ半減期が長い。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本開示は、ＨＩＶ感染の抗ウイルス融合阻害剤を発現する１種以上のレトロウイルス及び／またはレンチウイルスのベクターで形質導入されたＭＳＣの新規な組成物と、その使用法を提供する。本発見にしたがって、本開示は、これらの阻害剤を発現する形質導入されたＭＳＣを使用してＨＩＶ感染を阻害する方法も提供する。
【００１３】
多能性幹細胞、例えば間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、これらの細胞を含有する組織及び臓器に特異的な細胞へと分化できる幹細胞であり、胎児期、新生児期及び成人期の成長と発達に関与しているが、また、成人組織のホメオスタシスの維持と、組織損傷時に再生を誘導する機能化にも関与している。ＭＳＣが分化することができる様々な細胞型は図１に示してある。
【００１４】
ＭＳＣは、これらの細胞が炎症部位に移動することが明らかになったことから、多くの疾患の治療に対して提案されてきた。殆どの他のヒト成体幹細胞とは違って、ＭＳＣは、臨床応用に適する量で得ることができるので、組織修復で使用するのに良好な候補となる。更に、ＭＳＣは、抗増殖性、免疫調節性及び抗炎症性の効果を有し、且つ低免疫原性である。ＭＳＣの免疫抑制性効果の基礎になっているメカニズムは、明確に規定されていないが、それらの免疫抑制性は臨床の場で既に利用されてきた。したがって、ＭＳＣは、同種移植拒絶、移植片対宿主病、関節リウマチ、自己免疫炎症性腸疾患の治療にとって、及び、免疫調節と組織修復が必要とされる他の障害の治療にとって意味がある。
【００１５】
組織修復に加えて、ＭＳＣは、ある種のウイルス治療でも使用されてきた。ＷＯ２０１００５３３５０は、肝炎ウイルスの感染を阻害するためのＭＳＣの使用を記載している。そこでは、ウイルスを複製している細胞を、ＭＳＣを含有する液体またはＭＳＣの滲出液と接触させる。しかしながら、ＭＳＣは、ＨＩＶのようなウイルスの阻害剤を発現させるためには決して用いられてこなかった。
【００１６】
本開示では、ＭＳＣを、「トロイのバイオリアクター（ｔｒｏｊａｎ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ）」として使用して、感染局所にＨＩＶ阻害剤を運び且つ発現させ得ることを確認した。ＭＳＣは、ＨＩＶ感染の抗ウイルス融合阻害剤（ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）と一緒にパッケージされたレトロウイルス及びレンチウイルスのベクターで形質導入された。形質導入されたＭＳＣは、阻害剤を発現させることができ、且つ分化能力を維持することができた。ＨＩＶ融合を阻害することに加えて、これらの形質導入されたＭＳＣは、他の疾患徴候においてＭＳＣ治療によって示されたようなＨＩＶ感染症患者でしばしば観察される一般的な免疫活性化を低減することも期待される。
【００１７】
一つの実施形態では、本開示は、ある種の阻害剤を発現させる形質導入されたＭＳＣを提供してＨＩＶを治療する。詳しくは、ＨＩＶ抗ウイルス融合阻害剤は、送達ビヒクルに、例えばレトロウイルス及びレンチウイルスに組み込まれる。これらの送達ビヒクルは、ＭＳＣ中に導入され、ここで、細胞は形質導入を受ける。次に形質導入されたＭＳＣは、重要な特性、例えば骨形成分化、脂肪生成分化、及び軟骨形成分化の能力を保持しながら、ＨＩＶペプチド阻害剤を発現させることができる。
【００１８】
別の実施形態では、ＨＩＶ感染の抗ウイルス融合阻害剤を発現させる間葉幹細胞を投与することによってヒト免疫不全ウイルスを治療する方法を開示する。ＭＳＣは、現在利用できる注射可能なＨＩＶ阻害剤と関連のある副作用が無い、例えば注射部位の刺激感及び取扱いの難しさが無い阻害剤の長期持続発現を提供する。
【００１９】
別の実施形態では、本開示は、抗ウイルス融合阻害剤を発現させる形質導入されたＭＳＣ由来の馴化培地を投与することによって、ＨＩＶ感染を阻害する方法を提供する。
【００２０】
更に、上記方法は、抗ＨＩＶ薬物療法と組み合わせることができる。抗ウイルス剤の投与前、投与中または投与後に、ＭＳＣを投与することができる。好ましくは、ＭＳＣは、抗ウイルス剤の後に投与する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、形質導入されたＭＳＣは、対象に直接投与する。他の実施形態では、ＭＳＣまたは馴化培地を、投与用の適当な薬学的担体と混合する。好ましい投与経路は、静脈内注射、皮下注射、及び腹腔内注射である。
【００２２】
複数のＨＩＶ抗ウイルス融合阻害剤を、本発明の組成物及び方法と一緒に使用することができる。ＣＣＲ５、ＣＤ４−結合、ｇｐ４１及びエンベロープによってＨＩＶ複製及び融合機構における異なるポイントをブロックするペプチド阻害剤を、上記実施形態で使用することができる。ペプチド阻害剤に加えて、またはそれの代わりに、中和抗体をベクター内にパッケージすることができる。中和抗体は、生物学的に有するあらゆる効果を阻害または中和することによって抗原または感染体から細胞を防御する。
【００２３】
例示のペプチド阻害剤は、Ｃ４６ペプチドであり、それはｇｐ４１のＨＲ２遺伝子に由来する。完全に本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１００２７２４０に記載されているようなＣ４６のための分泌可能な抗ウイルス侵入阻害（ＳＡＶＥ）ペプチドを使用することもできる。例えば、カスタマイズされたＣ４６ペプチド：ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦ（配列番号１）を、本開示の方法のいくつかの実施形態で使用した。Ｔ−２０：ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ，ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＡＩＤＳ，ＮＩＡＩＤ，ＮＩＨから提供されるＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦ（配列番号２）：ＡＩＤＳ，ＮＩＡＩＤから入手されるＴ−２０融合阻害剤は、別の可能なペプチド阻害剤である。前記ＳＡＶＥペプチドは、ｇｐ４１ウイルスエンベロープタンパク質をブロックすることによって、融合機構を破壊することが知られている。Ｃ４６  ＳＡＶＥペプチドに加えて、ＨＩＶ複製に関する他のペプチド阻害剤も、本開示の組成物及び方法において許容可能であるだろう。
【００２４】
ペプチド阻害剤の配列は、ＭＳＣに形質導入される前に、レトロウイルス及びレンチウイルスのベクターに組み込まれる。形質導入の成功は、ペプチド阻害剤の発現を確認するために一般的に許容されている手法を用いてＭＳＣを分析することによって、確認される。発現が確認されるならば、ＭＳＣを、ＨＩＶを有するか、ＨＩＶに曝露されているか、またはＨＩＶに曝露される危険に晒されているヒトに注射することができる。
【００２５】
前記阻害剤は、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して、典型的には購入したキットを使用して、レトロウイルス及びレンチウイルスのベクターにパッケージすることができる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎは、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎのようなレンチウイルスパッケージングキットを提案している。更に、発現の確認を容易にするために、また形質導入効率を測定するために、緑色蛍光タンパク質のようなマーカーをパッケージすることもできる。
【００２６】
本発明の方法のためのＭＳＣは、感染の段階及び免疫不全の程度に応じて、同種異系または自己由来であり得る。すべての許容可能なＭＳＣ抽出法を本発明で使用することができる。好ましくは、サンプルの単位体積あたりの細胞数が多いという理由で、脂肪組織由来のＭＳＣが利用される。更に、脂肪組織は、骨髄のような他の供給源に比べてアクセスするのがより容易であり、免疫無防備の対象にとって特に重要である。しかしながら、形質導入される前にＭＳＣは培養で増殖させることができるので、ＭＳＣの他の供給源、例えば骨髄を利用することができる。
【００２７】
記載の組成物及び治療法は、動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトに適用することができる。
【００２８】
開示の文脈では、「ＨＩＶ」はＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２のタイプを包含している。更に、すべての天然ＨＩＶ株（準種または分離株）が包含される。この点で、ＨＩＶ株は、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅにリストされているすべての公知のＨＩＶ株を包含するものと理解される。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「間葉系幹細胞」とは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（ＩＳＣＴ）のＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって示されている基準を満たすあらゆる細胞を意味している。この基準の下で、ＭＳＣは：１）標準培養条件下で（特にヒトまたはウシの胎児血清の存在下で）維持されるときには、プラスチック付着性であり；２）骨形成分化、脂肪生成分化、及び軟骨形成分化の能力を有し；３）ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５を発現し；そして４）造血系統マーカーであるｃキット、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ７９、及びヒト白血球抗原−ＤＲの発現を欠く。
【００３０】
本明細書で使用する用語「自己由来」は、同じ個体由来のものを意味している。
【００３１】
本明細書で使用する用語「同種異系」は、治療される個体とは別の個体由来のものを意味している。
【００３２】
特許請求の範囲または明細書における「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と一緒に使用されるとき、単語「ａ」または「ａｎ」の使用は、特に断りがなければ、１以上を意味している。
【００３３】
用語「約」は、表示値に測定誤差限界をプラスもしくはマイナスした値か、または、測定法が示されていない場合には、プラスもしくはマイナス１０％の値を意味している。
【００３４】
特許請求の範囲における用語「または」は、代替のみを言及するように明確に指摘されていない場合、または、代替が相互に排他的である場合には、「及び／または」を意味するために使用される。
【００３５】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「有する」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」（及びそれらの変形）は、制限のない連結動詞であり、特許請求の範囲で使用されるときには、他の要素を追加することができる。
【００３６】
フレーズ「から成る」は、排他的であり、すべての追加の要素を排除する。
【００３７】
フレーズ「から本質的に成る」は、追加の物質要素を排除するが、開示の性質を実質的に変えない非物質要素を包含することができる。
【００３８】
本明細書では以下の省略形を使用する：
【表１】
0006397890.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ＭＳＣ分化時に可能性のある細胞型の実例である。
【図２】ＨＩＶ融合機構の図解である。Ｄｒｕｇｓ  Ｆｕｔ．  １９９９，２４（１２）：１３５５より。
【図３】いくつかのベクターの設計を示している図である。
【図４】ＧＦＰ＋細胞を使用して形質導入レベルを測定している図である。
【図５】フローサイトメトリーによるＧＦＰ＋レベルを示している図である。
【図６】形質導入されたＲｈＢＭＳ分化アッセイの確認を示している図である。
【図７Ａ】ウイルスベクター中にパッケージされた様々なＨＩＶペプチド阻害剤で形質導入されたＭＳＣのウェスタンブロットを示している図である。ここで、ＲｈＢＭＳ細胞は図７Ａである。
【図７Ｂ】ウイルスベクター中にパッケージされた様々なＨＩＶペプチド阻害剤で形質導入されたＭＳＣのウェスタンブロットを示している図である。ここで、２９３Ｔ細胞は図７Ｂである。
【図８】異なる阻害剤で形質導入されたＭＳＣ由来の馴化培地を使用しているＣＥＭｘ１７４細胞における一回の感染／阻害アッセイを示している図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
詳細な説明
本開示は、ＨＩＶウイルス−細胞融合阻害剤を発現する新規な形質導入された間葉幹細胞（ＭＳＣ）と、ＨＩＶを治療するための使用法を説明する。詳しくは、間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、ＨＩＶの抗ウイルス融合阻害剤を発現する１種以上のレトロウイルス及び／またはレンチウイルスのベクターで形質導入される。その形質導入されたＭＳＣは、重要なＭＳＣの特徴、例えば分化する能力を失うことなく、阻害剤を発現する。
【００４１】
新規の組成物を使用する方法は、ＨＩＶ感染に罹患している動物、好ましくはヒトを治療することを含むことができ、そしてその場合、ペプチド阻害剤または中和抗体をウイルスまたは非ウイルスのベクターに組み込み、次いでそれを、ＭＳＣが前記阻害剤を発現できるように、ＭＳＣ中に形質導入する。次いで、形質導入されたＭＳＣを、単独でまたは抗レトロウイルス療法と組み合わせて、対象に投与する。ＭＳＣは、自己由来または同種異系であることができ、骨髄または脂肪組織を包含する任意の供給源から採取できる。好ましいウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、またはそれらの任意の組み合わせである。阻害剤としては、例えば、分泌性の抗ウイルス侵入阻害（ＳＡＶＥ）ペプチド、Ｃ４６、ｍａＣ４６または中和抗体のうちの１種以上が挙げられる。ＭＳＣは、静脈内に、皮下に、または腹腔内に投与することができる。
【００４２】
図２は、ＨＩＶが新しい細胞に感染する融合機構を示している。標的細胞とのＨＩＶ融合は、ＣＤ４＋受容体のＮ末端ドメインへのｇｐ１２０の付着から始まる（Ｂ）。付着したら、ｇｐ１２０は、細胞コレセプターのための結合部位を露出するように構造変化する（Ｃ）。ウイルスが結合したら、構造変化により、ＣＤ４＋細胞の膜に対してｇｐ４１のＮ末端疎水性領域が露出され、「プレヘアピン中間体」になる。Ｇｐ４１は、構造変化し（Ｄ）（コイルドコイルバンドルとも呼ばれる）、ウイルスと細胞膜を一緒にしてウイルスと細胞の融合を媒介する（Ｅ）。
【００４３】
本開示の一つの態様では、ＨＩＶの融合を阻害するために、ＭＳＣは、ＨＩＶペプチド阻害剤で形質導入される。ｍａＣ４６及びＣ４６ペプチドならびに中和抗体を包含する多くのＨＩＶペプチド阻害剤が存在する。ＨＩＶ侵入阻害剤ｍａＣ４６は、ＨＩＶ−１膜内外糖蛋白ｇｐ４１の第２の７アミノ酸の繰り返しに由来する膜固定ペプチドである。Ｃ４６ペプチドは、ｇｐ４１の機能を阻害することによって新しい細胞の感染を効率的にブロックする抗レトロウイルス剤の新融合阻害剤クラスのメンバーである。Ｃ４６ペプチドは、膜結合型であり得るか、または分泌性であり得る。
【００４４】
ペプチド阻害剤は、レトロウイルスまたはレンチウイルスのベクターに組み込まれ、そしてそれは、ペプチド阻害剤でＭＳＣを形質導入するための遺伝子送達ビヒクルとして作用する。ベクターとしては、例えば、マウス白血病ベクター（ＭＬＶ）及び自己不活化レンチウイルスベクター（ＨＳＲＴ）が挙げられるが、他のウイルスまたは非ウイルスのベクターシステムも適用できるだろう。図３は、ペプチド阻害剤、特にｍａＣ４６及びＳＡＶＥペプチド配列を組み込んだウイルスベクターのいくつかを示している。ベクターは、形質導入の成功をモニターするのを助けるＧＦＰのような蛍光マーカーを含有することもできる。
【００４５】
形質導入後に、ＭＳＣを分析して、蛍光顕微鏡検査、ＰＣＲ、分化アッセイ及び他の一般的に用いられている技術を用いて、ペプチド阻害剤の発現を確認することができる。
【００４６】
本開示を、以下の実施例及び図によって、例示する。しかしながら、これは例示のみであり、本開示は、ＨＩＶライフサイクルのすべてのフェーズ用のあらゆるＨＩＶ融合阻害剤を組み込むように広範に適用することができ、また、あらゆる動物のために使用することができる。以下の実験及び実施例は、単に例示であり、添付の特許請求の範囲を過度に限定しないことを意図している。
【実施例１】
【００４７】
遺伝子の導入及び発現は、以下の工程で行った：
【００４８】
細胞：ヒト骨髄幹細胞（ＨｕＭＳＣ）、アカゲザル骨髄幹細胞（ＲｈＭＳＣ）、及びアカゲザル脂肪幹細胞（ＲｈＡＣＳ）を、形質導入の前日に、抗生物質を有していないアルファ−ＭＥＭ／２０％  ＦＢＳに対して１０，０００／ｃｍ２で播種した。
【００４９】
形質導入のために、播種した細胞を、対照ベクター、例えばＬＺＲＳ−ＧＦＰ（１９）もしくはＨＲＳＴ−ｃｍｖＧＦＰ（３８）、または治療ベクター、例えば、図３に示してあるＣ４６ペプチド配列を含有する、Ｔ４２（不明）、Ｔ６０（２２）、及びＭ２１８（不明）の様々なＭＯＩに曝露した。次いで、プレートを１０００回転／分で１〜２時間遠心分離した。その後、ＭＳＣを３７℃及び５％ＣＯ２で２日間培養した。２日後、細胞を、標準培養条件に戻し、ここで、完全な馴化培地中に再懸濁させ、そして７０ｍｍの細胞ストレーナーでろ過した。
【００５０】
発現の確認：ＧＦＰを用いてＣ４６ペプチドの発現を評価するために、蛍光顕微鏡検査及びフローサイトメトリーを使用した。リアルタイムＰＣＲも実施した。
【００５１】
図４に示すように、細胞を、蛍光顕微鏡下で観察し、形質導入された細胞におけるＧＦＰの形質導入及び発現を確認した。上のパネルは、左から、非形質導入（ＮＴ）ＭＳＣ、位相差を有するｒｈＡＳＣ、及び位相差像の上にオーバーレイされたＧＦＰ発現である。下のパネルは、ＨＲＳＴ−ｃｍｖＧＦＰで形質導入された、ＨｕＭＳＣ、ＲｈＭＳＣ、及びＲｈＡＣＳにおけるＧＦＰ発現のオーバーレイを示している。認められるように、ＧＦＰは、ヒト及びアカゲザルの幹細胞で容易に発現される。
【００５２】
図５は、ＨｕＭＳＣ、ＲｈＭＳＣ、及びＲｈＡＣＳに関するフローサイトメトリー蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣｓ）の結果を示している。この分析のために、細胞をトリプシン処理し、１％のマウス血清で洗浄した。洗浄の後、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現について分析した。ＮＴ対照集団は、背景蛍光として設定した。
【００５３】
ＨＲＳＴ−ＧＦＰは、ＦＡＣｓ分析によって、すべての３集団において最も高い発現レベルを示した。ＬＺＲＳ形質導入ＭＳＣは、すべての３つのＭＳＣ集団において、わずかに高いレベルのＧＦＰ発現を示した。
【００５４】
遺伝子の導入及び発現は、蛍光顕微鏡検査及びフローサイトメトリーによって、ＭＳＣで最大６９％まで検出可能であった。
【００５５】
以下に示したベクター骨格に関するリアルタイムＰＣＲの結果は、Ｔ６０及びＭ２１８中にＰｓｉパッケージング要素を含有したヒトＭＳＣ、アカゲザルＭＳＣ、及びＨＥＫ２９３細胞の５〜２５％を検出した。Ｔ６０及びＭ２１８の両方は、マウス白血病ウイルスに基づくベクターである。
【表２】
0006397890.tif 000003
【００５６】
分化アッセイも行って、阻害剤がＭＳＣの分化を妨げないことを試験するために形質導入されたＲｈＭＳＣを確認した。結果は表６に示してある。ＭＳＣの骨形成分化、脂肪生成分化、及び軟骨形成分化の能力を、Ｍ２１８、Ｔ６０、ＨＲＳＴ−ＧＦＰ及びＴ４２ベクターについて、２１日目に撮った。図６に見られるように、使用されるベクターまたはペプチド阻害剤に関係なく、ＭＳＣは、複数の細胞に分化する能力を保持していた。これは、形質導入された後でも、ＭＳＣがそれらの分化能力を失わなかったことを示している。
【００５７】
結果：ＨＩＶ  １−に基づくレンチウイルスベクターＨＲＳＴ−ｃｍｖＧＦＰは、遺伝子導入の頻度及び発現レベルの両方で、ＬＺＲＳ−ＧＦＰより優れていた。更に、リアルタイムＰＣＲデータから、ＭＳＣにおけるＭＬＶ  Ｃ４６ベクターの形質導入率は５〜２５％であることが分かった。
【実施例２】
【００５８】
上記の方法は、より多くの様々な細胞に適用された。
【００５９】
細胞：殆どの細胞は、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍから得た。ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍは、最先端のＨＩＶ研究材料のための世界的な供給源であり、そのいくつかはまだ市販されていない。ＨＩＶウイルスに容易に感染されるので、ＣＤ４、Ｔ細胞及びＢ細胞マーカーを発現するＣＥＭｘ１７４細胞（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ  カタログ番号２７２）を入手した。マクロファージ及びＴ細胞指向性ウイルスの増殖を許容し、ＣＤ４、ＣＸＣＲ４、及びＣＣＲ５を発現するＨｕＴ７８（ヒトＴ細胞リンパ腫）のサブクローンである二次Ｔ細胞株「ＰＭ−１」（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ  カタログ番号３０３８）を入手した。すべてのＴ細胞株を、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地で培養した。
【００６０】
ＪＣ５３−ｂ１（クローン１３）と従来呼ばれているヒトＴＺＭ−ｂ１細胞（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ  カタログ番号８１２９）はＨｅＬａ細胞株である。親細胞株（ＪＣ．５３）は、大量のＣＤ４及びＣＣＲ５を安定に発現する。ＴＺＭ−ｂ１細胞株を、ＨＩＶ−１プロモーターの制御下で、ルシフェラーゼ遺伝子及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の別々の統合コピーを導入することによって、ＪＣ．５３細胞から発生させた。すべての培地に、１０％のウシ胎児血清、４ｍＭのＬ−グルタミン、１０，０００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを補充した。
【００６１】
アカゲザルの骨髄／脂肪細胞由来の間葉系幹細胞を単離し、完全培地において、すなわち、０．８５％のＮａＣｌ溶液中の、２０％のＦＢＳ  ＭＥＭ  α（最小必須培地α）、それと共に１−グルタミン、ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｐｒｅｍｉｕｍ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＦＢＳ）、ペニシリンＧ（１０，０００単位／ｍＬ）、及び硫酸ストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社／ＧＩＢＣＯ社）において、維持した。
【００６２】
ヒト胎生腎細胞株２９３Ｔは、ＡＴＣＣから入手し、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において維持した。
【００６３】
骨髄及び脂肪由来の間葉系幹細胞の単離及び培養：骨髄由来間葉系幹細胞を、幹細胞研究や再生医療のためのチューレーンセンタープロトコル（Ｔｕｌａｎｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅプロトコル）に従う非連続的な密度勾配遠心分離法によって単離した。端的に言えば、ＬＳＭ（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ，ＩＣＮ５０４９４，ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｎｏ．：０８５０４９４）一工程分離培地を、骨髄混合物の下に下層とした。そのサンプルを、４０分間、１４００回転／分（約４００ｇ）で遠心分離した。低密度単核球を白色界面において捕集し、新鮮な培地で洗浄した。最後の遠心分離の後、上清を廃棄し、溶解バッファー（ＡＣＫ溶解バッファー，Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１０４９２−０１）を使用して残存赤血球を除去した。
【００６４】
捕集した細胞を、１５ｃｍの組織培養皿において約１〜２００万細胞の濃度で播種し、３７℃で５％のＣＯ２中で培養した。次の日に（２４時間後に）完全培地を変え、新鮮な完全培地と交換した。そのプレートが約７０〜８０％の集密度であるとき（約１４日）、細胞を、トリプシン処理し、Ｐ１へ増殖されるまで、液体Ｎ２中にＰ０で凍結させるか、または、ＤＮＡ及びタンパク質を分析するためのペレットとして凍結させた。
【００６５】
脂肪由来の幹細胞を、幹細胞研究や再生医療のためのチューレーンセンタープロトコルに従って単離した。端的に言えば、脂肪組織を、無菌メスを使用して小さい切片に細かく切り刻む前に、５％のリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ  ５％  ｐ／ｓ）で、広範囲に洗浄した。その切片を、ＰＢＳ中０．０７５％コラーゲナーゼタイプＩ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１７１００−０１７）を有する１５ｃｍ皿の中に配置した。コラーゲナーゼ処理した組織を、５％のＣＯ２で、３７℃で３０分間培養した。液体部分を取り除き、プレートを、ＰＢＳ  ２％  ｐ／ｓで数回洗浄し、遠心分離して、ペレットを得た。ＡＣＫ溶解バッファー（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１０４９２−０１）で溶解させた後、脂肪由来細胞を、洗浄し、そして氷上で１０分間培養して、あらゆる赤血球を溶解させた。その細胞を、２０ｍｌのＰＢＳ  ２％  ｐ／ｓで再度洗浄し、上清を廃棄した。細胞ペレットを、完全な馴化培地中に再懸濁させ、そして７０ｍｍの細胞ストレーナーでろ過した。
【００６６】
捕集した細胞を、細胞ペレットの大きさ応じて、適当な大きさの培養皿に播種し、５％のＣＯ２、３７℃で培養した。その培地を、翌日変え、新鮮な培地に置き換えた。そのプレートが約７０〜８０％の集密度であるとき、培地を吸引した。Ｐ１へ増殖させるために細胞を使用するまで、液体Ｎ２中に細胞を凍結保存し、次いでＤＮＡ及びタンパク質を分析するためのペレットを凍結させた。
【００６７】
ペプチドクローニング及び間葉系幹細胞形質導入：本実験で使用されるＣ４６ペプチドは配列番号１であった。
【００６８】
マウスの白血病ウイルス（ＭＬＶ）及びレンチウイルス（Ｍ２１８、Ｔ６０及びＴ４２）と、対照ベクター（ＬＺＲＳ−ＧＦＰ及びＨＲＳＴ−ｃｍｖ−ＧＦＰ）によって駆動されるＣ４６ペプチドを、製造者の手順にしたがって、ワンショットｓｔｂ１３キットを用いて、コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ｃ７３７３−０３）で形質転換した。一晩静置した後に、コロニーを選択し、単一コロニーを、ＬＢ培地＋アンピシリンにおいて、一晩増殖させた。ＤＮＡミニ調製を、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１８２０−０１）で行った。
【００６９】
ＭＬＶ及びレンチウイルスベクターによる２９３Ｔ細胞の一過性形質導入は、リン酸カルシウム沈殿法によって完了させた。リン酸カルシウム形質導入法は、ＤＮＡを哺乳動物細胞に導入するために使用され、リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿物を形成することに基づいている。リン酸カルシウムは、細胞表面へのＤＮＡの結合を容易にする。次いで、ＤＮＡはエンドサイトーシスによって細胞に入る。
【００７０】
１５μｇのＭＬＶベクタープラスミドを、ＬＺＲＳ−ＧＦＰ及びＬＺＲＳ−Ｔ６０のために使用し、２μｇのＬＺＲＳ−Ｍ２１８を、Ｐｈｏｅｎｉｘ（広宿主性）パッケージング細胞株の、すなわちＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞に基づく細胞株の形質移入のために使用した。それらは、ＭＬＶ  Ｇａｇ／Ｐｏｌ及び広宿主性エンベロープ遺伝子を構成的に発現する。ベクターゲノムを加えると、上清において、複製不完全ＭＬＶに基づくレトロウイルス粒子が発生するだろう。ＨＩＶに基づくレンチウイルスベクターに関して、１３μｇのＨＲＳＴ−ＧＦＰまたはＴ４２ベクターＤＮＡは、ＨＩＶパッケージングプラスミド［ｐＨＤＭ−Ｈｇｍ２（ｇａｇ／ｐｏｌ），ｐＲＣ／Ｒｅｖ，ｐＨＤＭ−Ｔａｔ  １ｂ，エンベロープ  ＨＩＶ−１  ＪＲＦＬまたはＶＳＶ−Ｇ（ｐＨＤＭ．Ｇ）］またはパッケージングベクター（Ｍ４３８）と一緒に、形質移入された。
【００７１】
複製不完全レンチウイルス粒子を含有する細胞培養上清を、形質導入後２４〜４８時間で捕集し、ろ過し（０．２２μｍの孔径）、使用するまで−８０℃で保管した。
【００７２】
レンチウイルスベクター及びＭＬＶベクターによる間葉系幹細胞の形質導入：１×１０５細胞／ウェルのＭＳＣを、形質導入の１日前に、６ウェルプレートに播種した。所望量のウイルス上清を、例えば１ｍｌの非濃縮ウイルス性上清または１００μｌの濃縮ウイルス上清を、各ウェルに加えた。スピノキュレーション（１時間、１２００回転／分、３１℃）によって、ＭＳＣを、ＭＬＶベクター及びレンチウイルスベクターの上清で形質導入し、次いで５％のＣＯ２中３７℃で培養した。
【００７３】
２日目に、ウイルス性上清を取り除き、抗生物質の無い新鮮な２０％のＦＢＳα−ＭＥＭをＭＳＣに加えた。４日目に、この培地を、抗生物質の無い２０％のＦＢＳα−ＭＥＭと変えた。６〜７日目に、細胞数密度に応じて、リアルタイムＰＣＲによって、蛍光顕微鏡検査法、フローサイトメトリー、及び定量プロウイルス組込み（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｖｉｒａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）のために細胞を調製した。形質導入の有効性は、フローサイトメトリーによって、形質導入３日後に測定した。
【００７４】
Ｃペプチドの分泌性型の検出：間葉細胞培養上清及び細胞溶解産物における分泌性Ｃ４６ペプチドを測定するために、ウェスタンブロット分析を行った。その結果は図７Ａ及び図７Ｂに示してある。ヒトＨＩＶ−１  ｇｐ４１モノクローナル抗体（２Ｆ５）は、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍから入手した。２Ｆ５は、すべての利用可能なＣペプチドに対する抗体の結合を可能にした。
【００７５】
分泌性ペプチドは、５．８２ｋＤレベルであることは明らかであった。このことは、ペプチド阻害剤がＭＳＣによって分泌され、ＨＩＶ治療に利用可能であり得ることを示している。
【００７６】
ＨＩＶ偽型粒子の調製：形質導入の前日、９  ｘ  １０６細胞の２９３Ｔ細胞を、１５ｃｍ培養皿上に播種し、合計１０のプレートを調製した。追加のプレートを、ＶＳＶ−Ｇ対照のために調製した。形質導入の当日に、８０％の集密度が顕微鏡検査下で確認された。
【００７７】
一過性形質移入のために、ＨＲＳＴ−ＧＦＰを、ｐＨＤＭ−Ｈｇｍ２（ｇａｇ／ｐｏｌ）、ｐＲＣ／Ｒｅｖ、ｐＨＤＭ−Ｔａｔ  １ｂ、及びエンベロープ遺伝子（ＨＩＶ−１  ＪＲＦＬエンベロープまたはＶＳＶ−Ｇ対照エンベロープ、ｐＨＤＭ．Ｇ）と混合した。ＪＲＦＬエンベローププラスミドがＩｎｎｓｂｒｕｃｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤｒ．Ｄｏｒｏｔｈｅｅ  ｖｏｎ  Ｌａｅｒによって提供された以外は、すべての記載したプラスミドベクターは、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＤｒ．Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎから贈られたものであった。２．５ＭのＣａＣｌ２及び２Ｘ  ＨＢＳ溶液を等しい割合で加えた。形質導入混合物の最終的な量を１ｍｌにして各培養皿に適用した。６時間後に、新鮮な１０％のＤＭＥＭ媒体と交換した。形質導入２４〜４８時間後にウイルス上清を捕集し、０．２２μｍサイズでろ過し、そして５Ｘ  ＰＥＧ−ｉｔウイルス沈殿溶液（ＰＥＧ−ｉｔ（商標）Ｖｉｒｕｓ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５ｘ），ＳＢＩ，カタログ番号ＬＶ８１０Ａ−１／ＬＶ８２５Ａ−１）で４８〜７２時間処理した。黄淡褐色のペレットが確認され、製造プロトコルに従って、４℃で３０分間、１５００ｇで遠心分離することによって、ウイルスを濃縮した。ウイルスペレットを捕集し、ＰＢＳ溶液中に再懸濁し、使用するまで−８０℃で保管した。
【００７８】
ＭＳＣ中に形質導入されたＣ４６による偽型ＨＩＶ−１システムのウイルス一回感染／阻害アッセイ：ＨＩＶ感染システムを模倣するために、ＨＲＳＴ（ＣＭＶ−ＧＦＰ）をＨＩＶエンベロープ、ＪＲＦＬでパッケージングした。ＣＤ４＋細胞株ＣＥＭｘ１７４を、対照（ＨＲＳＴ−ＧＦＰ、ＬＺＲＳ−ＧＦＰ）またはＣ４６（Ｔ−６０、Ｍ２１８、及びＴ−４２）形質導入ＭＳＣ由来の馴化培地（ＣＭ）で処理し、そして、リン酸カルシウム法によって生成された様々なＭＯＩの濃縮偽型ＨＩＶ−１ウイルス様粒子を感染させた。４８時間後に、細胞を回収し、４％のＰＦＡで固定した。Ｔｕｌａｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＣｅｎｔｅｒにおいてＢＤ  ＦＡＣ  Ｖｅｒｓｅ（商標）フローサイトメトリーによってＧＦＰ（＋）について、サンプルを分析した。ＧＦＰ（＋）フロー分析は、ＦｌｏｗＪｏ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １０プログラムによって行った。
【００７９】
得られた一回感染／阻害アッセイを図８に示す。対照細胞由来のＣＭは、最も高いＧＦＰ発現のレベルを有していた（偽型ウイルス粒子による感染）。Ｃ４６形質導入ＭＳＣ由来のＣＭによる処理は感染をブロックした。ＣＥＭｘ１７４細胞におけるＧＦＰ発現のレベルを、対照集団における発現と関連させてグラフに示した。而して、Ｃ４６形質導入ＭＳＣ由来の馴化培地は、一回阻害アッセイにおいて、ＨＩＶ−１偽型ウイルスの感染をブロックすることができた。
【００８０】
間葉系幹細胞分化アッセイ：阻害剤がＭＳＣの分化を妨げないことを試験するために、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｇｉｂｃｏ  Ａ１００７２０１，Ａ１００７００１，及びＡ１００７１０１を用いて骨形成、脂質生成、及び軟骨形成の分化アッセイを、ＬＺＲＳ−ＧＦＰ、ＬＺＲＳ−Ｔ６０、ＨＲＳＴ−ＧＦＰ、Ｍ２１８、Ｔ４２、及び非形質導入ＲｈＭＳＣに関して行った。アッセイ手順は、製造プロトコルに従った。端的に言うと、アッセイ用に接種される細胞数は、それぞれ骨形成及び脂質生成の分化のために、１２ウェル中へ、５×１０３細胞／ｃｍ２及び１×１０４細胞／ｃｍ２であった。１．６×１０７生細胞／ｍｌを、軟骨形成分化に関する古典的染色のために、マルチウェルプレートのウェル中央に５μｌの細胞溶液の液滴を接種することによって、播種した。細胞増殖による約２１日の培養後に、骨形成、脂質生成、及び軟骨形成の分化を、それぞれアリザリンレッドＳ、オイルレッドＯ、及びサフラニンＯの溶液で染色した。染色された細胞を観察し、明視野光学顕微鏡下で写真を撮った。
【実施例３】
【００８１】
実験１及び２でＨＩＶ阻害剤ペプチドを発現させたＭＳＣを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗ウイルス剤と組み合わせて、相乗効果を評価することができる。ＰＭＰＡ（テノホビルジソプロキシルフマル酸塩（ＴＤＦ）またはテノホビル）及びＦＴＣ（エムトリバまたはエムトリシタビン）は、例示の抗ウイルス剤であり、上記ＭＳＣとのその相乗効果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞培養モデルで測定することができる。
【００８２】
例えば、ＣＥＭｘ１７４細胞は、様々なＭＯＩのＳｉｍｉａｎ−ＨＩＶ  ８９．６ｐまたはＨＩＶ株で感染させることができる。次いで、ＭＳＣを、マイトマイシンＣで処理することができ、それを用いて有糸分裂的に不活性なＭＳＣフィーダー細胞を発生させる。次いで、ＣＥＭｘ１７４細胞を、追加の抗ウイルス剤（例えば２μＭのＰＭＰＡ及び１．５μＭのＦＴＣなど）を用いてまたは用いずに、最長１４日間、処理されたＭＳＣと共培養することができる。ＣＥＭｘ１７４細胞におけるＨＩＶの複製は、ｐ２７フローサイトメトリーまたはＥＬＩＳＡ、またはＲＴ−ＰＣＲ、または他の方法を用いて、モニターすることができる。ウイルス複製の阻害は、限界希釈法アッセイによって定量される。
【００８３】
あるいは、ＣＥＭｘ１７４細胞は、対照（ＨＲＳＴ−ＧＦＰ、ＬＺＲＳ−ＧＦＰ）またはＣ４６（Ｔ−６０、Ｍ２１８もしくはＴ−４２）形質導入ＭＳＣ由来の馴化培地で処理することができ、そしてＰＭＰＡ及びＦＴＣ（または他の標準的なＨＩＶ薬）と組み合わせることができる。次いで、ＣＥＭｘ１７４細胞をＨＩＶウイルス様粒子に曝露する。ＣＥＭｘ１７４細胞のＨＩＶ感染の阻害は、ＧＦＰ発現で測定する。
【００８４】
更に、感染したＣＥＭｘ１７４細胞が、抗ウイルス剤の前に、形質導入ＭＳＣで処理されるか、または抗ウイルス剤と一緒に共投与されるように、処理の順序は変えることができる。
【実施例４】
【００８５】
実験１及び２単独で、または、抗ウイルス剤と組み合わせて、ＨＩＶ阻害剤ペプチドを発現するＭＳＣを使用する動物モデル試験は、小さな及び大きな動物モデルで行うことができる。
【００８６】
例示の小さい動物モデルは、免疫不全マウスモデルである。表１には、多くの利用可能なマウスモデルと、ある種のマウスモデルが動物試験にとってより良好な候補であり得ることを示唆するそれらの利点または欠点とがリストしてある。
【表３】
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【００８７】
ヒト化マウスモデルにおける幹細胞の治療的有効性は、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、及びＣＤ１９のような汎ヒトマーカー（ｐａｎｈｕｍａｎ  ｍａｒｋｅｒ）について染色した後、末梢血単核細胞のフローサイトメトリーにより、ヒト細胞移植の程度を分析することで測定することができる。
【００８８】
非ヒト霊長類モデルは、大規模な動物モデル試験に使用することができる。前記霊長類モデルでは、サルのＨＩＶ（Ｓ−ＨＩＶ）感染を用いることができるだろう。動物の血漿中におけるＳ−ＨＩＶウイルスの量は、リアルタイムＰＣＲを使用して測定できる。幹細胞の治療有効性は、感染した霊長類由来の血液及び組織のサンプルを、ＭＳＣ、毒性及びペプチド測定値の体内分布について分析することによって、決定することができる。
【００８９】
当業者は、例示された開示の形態及び詳細における、また、その運転における様々な省略、改良、置換及び変更が、本開示の趣旨からいかなる形であれ逸脱することなく成され得ることを理解しているだろうから、示唆され且つ記載された本開示のある種の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲で示されるが、規定された詳細に限定されることは意図していない。「重要」または「必須」であるという断りがない場合は、本開示の特徴は重要または必須ではない。
【００９０】
更に、上記の実験及び実施例は、開示の組成物または方法の範囲を、ある種の細胞または動物に限定することを意図していない。
【００９１】
以下の文献は、参照により完全に組み込まれるものとする。
【００９２】
ＷＯ２０１００５３３５０
【００９３】
ＵＳ２０１００２２６９７６
【００９４】
ＵＳ２０１１００２７２４０
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
0006397890.tif 000011
【図７Ｂ】
0006397890.tif 000012
【図８】
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【配列表】
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