(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）フィラー構成要素であって、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有する３３００〜４２００ヌクレオチドの長さの核酸からなり、該ＡＡＶフィラー構成要素は、エンハンサー、プロモーター、スプライシング制御因子、非コードＲＮＡ、アンチセンス配列、またはコード配列を欠き、該ＡＡＶフィラー構成要素が、発現カセットを含むベクター中にあるとき、該ＡＡＶフィラー構成要素は、該発現カセットに活性を与えない、ＡＡＶフィラー構成要素。
【請求項２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）フィラー構成要素であって、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも９８％の同一性を有する３３００〜４２００ヌクレオチドの長さの核酸からなり、該ＡＡＶフィラー構成要素は、エンハンサー、プロモーター、スプライシング制御因子、非コードＲＮＡ、アンチセンス配列、またはコード配列を欠き、該ＡＡＶフィラー構成要素が、発現カセットを含むベクター中にあるとき、該ＡＡＶフィラー構成要素は、該発現カセットに活性を与えない、ＡＡＶフィラー構成要素。
【請求項３】
前記核酸が３５００〜４０００ヌクレオチドである、請求項１または請求項２に記載のＡＡＶフィラー構成要素。
【請求項４】
前記核酸が３７００〜３８５０ヌクレオチドである、請求項１または請求項２に記載のＡＡＶフィラー構成要素。
【請求項５】
前記核酸が、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１に記載のＡＡＶフィラー構成要素。
【請求項６】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、請求項１〜５のいずれか一項に記載のフィラー構成要素および発現カセットを含む、ＡＡＶベクター。
【請求項７】
前記発現カセットがプロモーターを含む、請求項６に記載のＡＡＶベクター。
【請求項８】
前記プロモーターがｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターである、請求項７に記載のＡＡＶベクター。
【請求項９】
前記プロモーターがｍＵ６プロモーターである、請求項８に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１０】
対象のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１１】
前記対象のヌクレオチド配列がＲＮＡｉ分子をコードする、請求項１０に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１２】
前記ＡＡＶベクターが、５’および３’の機能的な逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を有する、請求項６〜１１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１３】
前記ＩＴＲが、ＡＡＶ−１  ＩＴＲ、ＡＡＶ−２  ＩＴＲ、ＡＡＶ−３  ＩＴＲ、ＡＡＶ−４  ＩＴＲ、ＡＡＶ−５  ＩＴＲ、またはＡＡＶ−７  ＩＴＲ；ＡＡＶ−１  ＩＴＲ、ＡＡＶ−２  ＩＴＲ、ＡＡＶ−３  ＩＴＲ、ＡＡＶ−４  ＩＴＲ、ＡＡＶ−５  ＩＴＲ、またはＡＡＶ−７  ＩＴＲの組み合わせ；あるいは、変化したＡＡＶ−１  ＩＴＲ、変化したＡＡＶ−２  ＩＴＲ、変化したＡＡＶ−３  ＩＴＲ、変化したＡＡＶ−４  ＩＴＲ、変化したＡＡＶ−５  ＩＴＲ、または変化したＡＡＶ−７  ＩＴＲである、請求項１２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１４】
前記ＲＮＡｉ分子がｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１２年７月６日に出願された米国特許出願第６１／６６８，８３９号の優先権の利益を主張する。米国特許出願第６１／６６８，８３９号は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、配列表を含み、それはＥＦＳ−ＷｅｂによってＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、そしてこれによってその全体が参考として援用される。２０１３年３月１４日に作られた、当該ＡＳＣＩＩコピーは、１７０２３．１２６ＷＯ１−ＳＬ．ｔｘｔと名づけられ、そして３９，１２５バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
背景
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科の小さい非病原性ウイルスである。ＡＡＶは、その複製についてヘルパーウイルスに依存することによって、この科の他のメンバーと異なる。ＡＡＶの約５ｋｂのゲノムは、プラス極性またはマイナス極性のいずれかの１本鎖ＤＮＡの１つのセグメントからなる。ゲノムの末端は、短い逆方向末端反復配列であり、それはヘアピン構造に折りたたまれてウイルスＤＮＡ複製の起点となり得る。物理的に、パルボウイルスビリオンは、無エンベロープであり、そしてその正二十面体（ｉｃｏｓｏｈｅｄｒａｌ）のカプシドは、直径約２０ｎｍである。
【０００４】
現在までに、多くの血清学的に異なるＡＡＶが同定され、そしてヒトまたは霊長類から単離された。Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ４」、Ｊ．Ｖｉｒ．、８０（２３）：１１５５６−１１５７０（２００６）。例えば、ＡＡＶ２のゲノムは、長さ４６８０ヌクレオチドであり、そして２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。左のＯＲＦは、非構造的Ｒｅｐタンパク質、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８、およびＲｅｐ７８をコードし、それは１本鎖の子孫ゲノムの産生に加えて、複製および転写の調節に関与する。Ｒｅｐ６８／７８はまた、ＮＴＰ結合活性、ならびにＤＮＡヘリカーゼ活性およびＲＮＡヘリカーゼ活性を有することが示された。Ｒｅｐタンパク質は、核局在化シグナルならびにいくつかの潜在的なリン酸化部位を有する。これらのキナーゼ部位の１つの変異は、複製活性の喪失を引き起こした。
【０００５】
ゲノムの末端は、短い逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）であり、それはウイルスＤＮＡ複製の起点となるＴ型ヘアピン構造に折りたたまれる可能性を有する。ＩＴＲ領域内で、ＩＴＲの機能に中心的である２つのエレメントであるＧＡＧＣリピートモチーフおよび末端分離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）（ｔｒｓ）が記載された。リピートモチーフは、ＩＴＲが直鎖状またはヘアピンコンフォメーションである場合のいずれも、Ｒｅｐに結合することが示された。この結合は、部位および鎖特異的な方式で起こる、ｔｒｓにおける切断のためにＲｅｐ６８／７８を配置するために役立つ。
【０００６】
ＡＡＶは以下の特徴のために、遺伝子導入のための魅力的なベクターである。ＡＡＶベクターは、広い宿主範囲を有する；インビトロおよびインビボにおいて、分裂細胞および非分裂細胞の両方に形質導入し、そして導入遺伝子の高い発現レベルを維持する。ウイルス粒子は熱安定性であり、溶媒、界面活性剤、ｐＨ、温度の変化に耐性であり、そしてＣｓＣｌ勾配で濃縮され得る。ＡＡＶは、いかなる病原性イベントにも関係せず、そしてＡＡＶベクターによる形質導入は、細胞増殖または分化に対して、いかなる持続する負の効果も誘発することが見出されていない。ＩＴＲは、パッケージングのために必要な唯一のｃｉｓエレメントであることが示され、ベクターシステムを作成するためにウイルス遺伝子を完全に抜き取ることを可能にしている。
【０００７】
現在、改善されたパッケージングの特徴を有するＡＡＶベクターに対するニーズが存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ４」、Ｊ．Ｖｉｒ．、８０（２３）：１１５５６−１１５７０（２００６）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ある実施態様において、本発明は、配列番号１または配列番号２と、少なくとも９０％の同一性を有する、長さが３３００〜４２００ヌクレオチドの核酸を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）フィラー構成要素（filler  component）（「スタッファー配列」とも呼ばれる）を提供する。
【００１０】
ある実施態様において、本発明は、配列番号１または配列番号２と、少なくとも９０％の同一性を有する、長さが３３００〜４２００ヌクレオチドの核酸からなる、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）フィラー構成要素を提供する。
【００１１】
ある実施態様において、本発明は、上記で記載したフィラー構成要素を含むＡＡＶベクターを提供する。
本願は特定の態様において例えば以下の項目を提供する：
（項目１）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）フィラー構成要素であって、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有する３３００〜４２００ヌクレオチドの長さの核酸を含む、ＡＡＶフィラー構成要素。
（項目２）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）フィラー構成要素であって、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有する３３００〜４２００ヌクレオチドの長さの核酸からなる、ＡＡＶフィラー構成要素。
（項目３）
前記核酸が３５００〜４０００ヌクレオチドである、項目１または項目２に記載のＡＡＶフィラー構成要素。
（項目４）
前記核酸が３７００〜３８５０ヌクレオチドである、項目１または項目２に記載のＡＡＶフィラー構成要素。
（項目５）
前記核酸が、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有する、項目１〜４のいずれか一項に記載のＡＡＶフィラー構成要素。
（項目６）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、発現カセットに作動可能に連結された項目１〜５のいずれか一項に記載のフィラー構成要素を含む、ＡＡＶベクター。
（項目７）
前記発現カセットがプロモーターを含む、項目６に記載のＡＡＶベクター。
（項目８）
前記プロモーターがｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターである、項目７に記載のＡＡＶベクター。
（項目９）
前記プロモーターがｍＵ６プロモーターである、項目８に記載のＡＡＶベクター。
（項目１０）
標的配列をさらに含む、項目６〜９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目１１）
前記標的配列がＲＮＡｉ分子である、項目１０に記載のＡＡＶベクター。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファー（９１１０ｂｐ）のプラスミドマップである。
【図２−１】図２は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファー（スタッファー＃１）の配列である（配列番号３）。
【図２−２】図２は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファー（スタッファー＃１）の配列である（配列番号３）。
【図２−３】図２は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファー（スタッファー＃１）の配列である（配列番号３）。
【図２−４】図２は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファー（スタッファー＃１）の配列である（配列番号３）。
【図２−５】図２は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファー（スタッファー＃１）の配列である（配列番号３）。
【図２−６】図２は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファー（スタッファー＃１）の配列である（配列番号３）。
【図２−７】図２は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファー（スタッファー＃１）の配列である（配列番号３）。
【図２−８】図２は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファー（スタッファー＃１）の配列である（配列番号３）。
【図２−９】図２は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファー（スタッファー＃１）の配列である（配列番号３）。
【図２−１０】図２は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファー（スタッファー＃１）の配列である（配列番号３）。
【図２−１１】図２は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファー（スタッファー＃１）の配列である（配列番号３）。
【図２−１２】図２は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファー（スタッファー＃１）の配列である（配列番号３）。
【図２−１３】図２は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファー（スタッファー＃１）の配列である（配列番号３）。
【図２−１４】図２は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファー（スタッファー＃１）の配列である（配列番号３）。
【図２−１５】図２は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファー（スタッファー＃１）の配列である（配列番号３）。
【図３−１】図３は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファーの様々な個々の構成要素の配列を提供する（配列番号１、４〜１１）。
【図３−２】図３は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファーの様々な個々の構成要素の配列を提供する（配列番号１、４〜１１）。
【図３−３】図３は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファーの様々な個々の構成要素の配列を提供する（配列番号１、４〜１１）。
【図４】図４は、相対的なＨｔｔの発現を示すグラフである。
【図５】図５は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１−スタッファーのプラスミドマップである。
【図６−１】図６は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１−スタッファーのプラスミド配列である（配列番号１２）。
【図６−２】図６は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１−スタッファーのプラスミド配列である（配列番号１２）。
【図６−３】図６は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１−スタッファーのプラスミド配列である（配列番号１２）。
【図６−４】図６は、５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１−スタッファーのプラスミド配列である（配列番号１２）。
【図７−１】図７は、スタッファー配列（スタッファー＃２）を提供する（配列番号２）。
【図７−２】図７は、スタッファー配列（スタッファー＃２）を提供する（配列番号２）。
【図８】完全ビリオン対空ビリオンのＥＭ評価。空ビリオンの２つの例を、矢印によって強調する。このプレップは、約４％の空ビリオンしかなく、それはかなり低い。
【図９】精製ビリオンのカプシド完全性を調査するための銀染色。いくつかの異なるｍｉＲＮＡ発現構築物を、イントロンＩ／ＩＩスタッファーと共にシャトルベクターへ操作して、野生型ゲノムに近いサイズを産生した。その精製ウイルスは、最適なＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質比を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
表１。ｍｉＲ−イントロンＩ／ＩＩビリオンのパッケージング効率％および混入物％。
【００１４】
詳細な説明
ＡＡＶベクターおよび発現カセット
本発明のウイルスベクターは、ＡＡＶベクターを利用する。「ＡＡＶ」ベクターは、アデノ随伴ウイルスを指し、そして天然に存在する野生型ウイルス自体またはその誘導体を指すように使用され得る。その用語は、他に必要な場合を除いて、全てのサブタイプ、血清型、および偽型、ならびに天然に存在する、および組換え形式の両方を含む。本明細書中で使用される場合、「血清型」という用語は、規定された抗血清とのカプシドタンパク質反応性に基づいて同定され、そして他のＡＡＶと区別されるＡＡＶを指し、例えば、霊長類ＡＡＶの８個の公知の血清型である、ＡＡＶ−１からＡＡＶ−８が存在する。例えば、血清型ＡＡＶ−２は、ＡＡＶ−２のｃａｐ遺伝子からコードされたカプシドタンパク質、ならびに同じＡＡＶ−２血清型由来の５’および３’ＩＴＲ配列を含むゲノムを含むＡＡＶを指して使用される。
【００１５】
偽型ＡＡＶは、１つの血清型由来のカプシドタンパク質、および２番目の血清型の５’−３’ＩＴＲを含むウイルスゲノムを含むＡＡＶを指す。偽型ｒＡＡＶは、カプシド血清型の細胞表面結合特性、およびＩＴＲ血清型と一致する遺伝的特性を有することが予測される。偽型ｒＡＡＶを、当該分野において記載される標準的な技術を用いて産生する。本明細書中で使用される場合、例えば、ｒＡＡＶ１を、同じ血清型由来のカプシドタンパク質および５’−３’ＩＴＲの両方を有するＡＡＶを指して使用し得るか、またはそれは血清型１由来のカプシドタンパク質、および異なるＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ血清型２由来の５’−３’ＩＴＲを有するＡＡＶを指し得る。
【００１６】
「ｒＡＡＶ」という省略は、組換えアデノ随伴ウイルスを指し、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも呼ばれる。１つの実施態様において、ＡＡＶ発現ベクターを、公知の技術を用いて構築し、少なくとも、転写の方向で作動可能に連結した構成要素として、転写開始領域を含む調節エレメント、関心のあるＤＮＡ、および転写終結領域を提供する。その調節エレメントを、哺乳類細胞において機能的であるように選択する。作動可能に連結した構成要素を含む、そのできた構築物は、機能的ＡＡＶ  ＩＴＲ配列に隣接している（５’および３’）。
【００１７】
「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復配列」または「ＡＡＶ  ＩＴＲ」によって、ＤＮＡ複製の起点として、およびウイルスのパッケージングシグナルとして、ｃｉｓで共に機能する、ＡＡＶゲノムの各末端に見出される、当該分野で認められた領域を意味する。
【００１８】
ＡＡＶ  ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は公知である。本明細書中で使用される場合、「ＡＡＶ  ＩＴＲ」は、示された野生型ヌクレオチド配列を有する必要はないが、例えばヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって変化し得る。さらに、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−７等が挙げられるがこれらに限定されない、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれか由来であり得る。さらに、ＡＡＶベクターにおいて、選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、それらが意図されたように機能する限り、すなわち宿主細胞ゲノムまたはベクターからの関心のある配列の切り出しおよび救出を可能にする限り、必ずしも同一、または同じＡＡＶ血清型もしくは単離物由来である必要はない。
【００１９】
ＡＡＶ  ＩＴＲを、これを含むＡＡＶベクタープラスミドから切り出し、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（２００１）において記載されたもののような、標準的なライゲーション技術を用いて、別のベクターに存在する選択された核酸構築物の５’および３’に融合し得る。例えば、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌのＢＳＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＮａＣｌ、および０℃における４０μＭのＡＴＰ、０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（「付着末端」ライゲーション）、または１４℃における１ｍＭのＡＴＰ、０．３〜０．６（Ｗｅｉｓｓ）ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（「平滑末端」ライゲーション）のいずれかで、ライゲーションを達成し得る。分子間「付着末端」ライゲーションを、通常３０〜１００μｇ／ｍｌの全ＤＮＡ濃度（５〜１００ｎＭの最終全濃度）で行う。ＩＴＲを含むＡＡＶベクターは、例えば米国特許第５，１３９，９４１号において記載されている。特に、いくつかのＡＡＶベクターがそこに記載され、それはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）から、受け入れ番号５３２２２、５３２２３、５３２２４、５３２２５、および５３２２６において入手可能である。
【００２０】
アデノ随伴ウイルスは、全長ゲノム、すなわち、天然のゲノムとおよそ同じサイズであり、そして大き過ぎず小さ過ぎないものを優先的にパッケージングする。多くの標的核酸配列、または標的核酸配列をコードする発現カセットは、非常に小さい。断片化したゲノムのパッケージングを回避するために、本発明者らは、発現カセットに連結した場合に、そのサイズが通常に近い長さであるゲノムをＩＴＲ間に生じる核酸配列をデザインおよび試験した。出発配列は哺乳類起源であるが、この「フィラー構成要素」（「スタッファー配列」とも呼ばれる）が、中でもエンハンサー、プロモーター、スプライシング制御因子、非コードＲＮＡまたはアンチセンス配列を欠くことを保証するように、有意に修飾された。言い換えると、そのスタッファー配列は「サイレント」であり、そして発現カセットに活性を与えない。
【００２１】
本発明において、ＡＡＶベクターにおいて使用するために適切なＤＮＡ分子は、例えばスタッファー配列および本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする発現カセットを含む。多くの発現カセット、例えば阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）を発現するものは非常に小さい。従って、全長または全長近いＡＡＶゲノムを生じるように、配列をカセットに加える必要がある。もしＡＡＶ産生において小さいゲノムのみを使用すれば、組換えビリオンは不均一であり、そして様々なサイズのゲノムを含む。これは、ウイルスは全長ゲノムをパッケージングするのを好むので、そのスペースを埋めるために他のＤＮＡ断片をピックアップするからである。野生型ゲノムサイズの１０５％を超えるＡＡＶゲノムは、一般的にパッケージングされないので、そのスタッファーは、大き過ぎるものとはなりえない。
【００２２】
ある実施態様において、本発明は、配列番号１または配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する、３３００〜４２００ヌクレオチドの長さの核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）フィラー構成要素（「スタッファー配列」とも呼ばれる）を提供する。
【００２３】
（配列番号１）
【化１−１】
0006366581.tif 000002
【化１−２】
0006366581.tif 000003
【００２４】
（配列番号２）
【化２−１】
0006366581.tif 000004
【化２−２】
0006366581.tif 000005
【００２５】
ある実施態様において、本発明は、配列番号１または配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する、３３００〜４２００ヌクレオチドの長さの核酸からなる、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）フィラー構成要素を提供する。ある実施態様において、そのフィラー構成要素は、配列番号１または配列番号２と少なくとも９０％の同一性からなる。ある実施態様において、そのフィラー構成要素は、配列番号１または配列番号２と、９５％の同一性、９８％の同一性、９９％の同一性、または１００％の同一性さえも有する。ある実施態様において、そのフィラー構成要素は、約３５００〜４０００ヌクレオチド、または約３７００〜３８５０ヌクレオチドの長さを有する。本発明において、そのフィラー構成要素は、エンハンサー、プロモーター、スプライシング制御因子、非コードＲＮＡ、アンチセンス配列、またはコード配列を欠くという点で、生物学的活性に関して「サイレント」である。
【００２６】
「核酸」という用語は、糖、リン酸およびプリンまたはピリミジンのいずれかである塩基を含むモノマー（ヌクレオチド）から構成される、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）および１本鎖または２本鎖形態のいずれかのそのポリマーを指す。具体的に限定されなければ、その用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、そして天然に存在するヌクレオチドと同様の方式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を包含する。他に示されなければ、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾された変異体（例えば縮重コドン置換）および相補的配列、および明白に示された配列を包含する。具体的には、１つまたはそれより多くの選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を産生することによって、縮重コドン置換を達成し得る。「核酸断片」は、所定の核酸分子の部分である。
【００２７】
「ヌクレオチド配列」は、１本鎖または２本鎖であり得、ＤＮＡまたはＲＮＡポリマーに組み込まれ得る、合成、非天然、または変化したヌクレオチド塩基を必要に応じて含む、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーである。「核酸」、「核酸分子」、「核酸断片」、「核酸配列またはセグメント」、または「ポリヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、そしてまた遺伝子、ｃＤＮＡ、ＤＮＡおよび遺伝子によってコードされるＲＮＡと交換可能に使用され得る。
【００２８】
本発明は、単離された、または実質的に精製された核酸組成物を包含する。本発明の関係において、「単離された」または「精製された」ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、その天然環境から離れて存在し、従って天然の産物ではない、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。単離されたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、精製された形態で存在し得るか、または例えばトランスジェニック宿主細胞のような、非天然環境に存在し得る。例えば、「単離された」または「精製された」核酸分子またはその生物学的に活性な部分は、組換え技術によって産生された場合、実質的に他の細胞物質または培養培地を含まない、または化学的に合成された場合、実質的に化学的前駆体または他の化学物質を含まない。１つの実施態様において、「単離された」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて、その核酸に天然に隣接する配列（すなわち、その核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、様々な実施態様において、その単離された核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて、その核酸分子に天然に隣接する、約５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満、約３ｋｂ未満、約２ｋｂ未満、約１ｋｂ未満、約０．５ｋｂ未満、または約０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。開示されたヌクレオチド配列の断片およびバリアントも、本発明によって包含される。「断片」または「部分」によって、全長または全長未満のヌクレオチド配列を意味する。
【００２９】
「天然に存在する」、「天然」、または「野生型」は、人工的に産生されたものとは異なる、天然において見出し得るものを説明するために使用される。例えば、天然の供給源から単離され得る、および研究室の人によって意図的に改変されていない、生物（ウイルスを含む）に存在するタンパク質配列またはヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００３０】
「ゲノム」は、生物の完全な遺伝物質を指す。
【００３１】
「ベクター」は、とりわけ、自己伝染性または動員可能であり得るか、またはそうでないかもしれず、そして原核生物宿主または真核生物宿主を形質転換し得る、２本鎖または１本鎖で、直鎖状または環状の形態の、あらゆるウイルスベクター、およびあらゆるプラスミド、コスミド、ファージ、またはバイナリーベクターを包含するよう定義される。
【００３２】
ＡＡＶ  ＩＴＲ
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（好ましくは、野生型ＡＡＶの全てのカプシドタンパク質による）およびカプシド形成したポリヌクレオチドから構成されるウイルス粒子を指す。もしその粒子が異種のポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞に伝達される導入遺伝子のような、野生型ＡＡＶゲノムではないポリヌクレオチド）を含むなら、それは典型的には「ｒＡＡＶ」と呼ばれる。
【００３３】
１つの実施態様において、そのＡＡＶ発現ベクターは、転写の方向で作動可能に連結した構成要素として、転写開始領域を含む調節エレメント、関心のあるＤＮＡ、および転写終止領域を少なくとも提供するために、公知の技術を用いて構築される。その調節エレメントは、哺乳類細胞において機能的であるように選択される。作動可能に連結した構成要素を含む、できた構築物は、機能的ＡＡＶ  ＩＴＲ配列に隣接している（５’および３’）。
【００３４】
「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復配列」または「ＡＡＶ  ＩＴＲ」によって、ＡＡＶゲノムの各末端において見出される、ＤＮＡ複製起点として、およびウイルスのパッケージングシグナルとして、ｃｉｓで共に機能する、当該分野で認められる領域を意味する。ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域と共に、それらを発現するプラスミドからの効率的な切り出しを提供する。
【００３５】
ＡＡＶ  ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は公知である。本明細書中で使用される場合、「ＡＡＶ  ＩＴＲ」は、示された野生型ヌクレオチド配列を有する必要はないが、例えばヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって変化し得る。さらに、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７等が挙げられるがこれらに限定されない、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれか由来であり得る。さらに、ＡＡＶベクターにおいて選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、それらが意図されるように機能する限り、すなわち関心のある配列のベクターからの切り出しおよび救出を可能にし、そして望ましいゲノムをＡＡＶビリオンへパッケージングする限り、必ずしも同一である必要はなく、または同じＡＡＶ血清型または単離物由来である必要はない。
【００３６】
１つの実施態様において、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７等が挙げられるがこれらに限定されない、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれか由来であり得る。さらに、ＡＡＶ発現ベクターにおいて、選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、それらが意図されるように機能する限り、すなわち関心のある配列のベクターからの切り出しおよび救出を可能にし、そして望ましいゲノムのＡＡＶビリオンへのパッケージングを可能にする限り、必ずしも同一である必要はなく、または同じＡＡＶ血清型または単離物由来である必要はない。
【００３７】
ある実施態様において、本発明は、発現カセットに作動可能に連結した、上記で記載したようなフィラー構成要素を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。ある実施態様において、その発現カセットは、プロモーターを含む。ある実施態様において、そのプロモーターは、ｐｏｌＩＩＩプロモーターである。ある実施態様において、そのプロモーターは、ｍＵ６プロモーターである。ある実施態様において、そのＡＡＶベクターは、さらに標的配列を含む。ある実施態様において、その標的配列は、ＲＮＡｉ分子である。
【００３８】
本明細書中で使用される「発現カセット」は、適切な宿主細胞において、特定のヌクレオチド配列の発現を指示し得る核酸配列を意味し、それは終止シグナルに作動可能に連結し得る関心のあるヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターを含み得る。そのコード領域は通常、関心のある機能的ＲＮＡ、例えばＲＮＡｉ分子をコードする。関心のあるヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであり得る。その発現カセットはまた、天然に存在するが、異種性の発現のために有用な組換え形態で得たものであり得る。
【００３９】
２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、多くの生物において、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知である過程による、配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを誘導し得る。ＲＮＡ断片は、ＲＮＡｉの配列特異的メディエーターである。これらのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子による、遺伝子発現の干渉は、現在多くの生物の細胞において、遺伝子をサイレンシングするための天然に存在する戦略として認識されている。
【００４０】
本発明のある実施態様は、単離されたＲＮＡｉ分子をコードするベクターを提供する。本明細書中で使用される場合、「〜によってコードされる」という用語は、特許用語における「含む」という用語と同様に、広い意味で使用される。ＲＮＡｉ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および例えばＲＮＡ干渉によって標的遺伝子の発現を調節し得る、またはする能力のある、他の小さいＲＮＡを含む。そのような小さいＲＮＡとしては、ｓｈＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４１】
「作動可能に連結した」は、配列の１つの機能が、別の配列によって影響されるような、単一の核酸断片に対する核酸配列の結合を指す。例えば、もしその２つの配列が、調節性ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列の発現に影響を与える（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡが、プロモーターの転写調節下にある）ように位置するなら、その調節性ＤＮＡ配列は、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、「作動可能に連結している」または「結合している」と言われる。コード配列は、センスまたはアンチセンスの方向で、調節配列に作動可能に連結し得る。
【００４２】
作動可能に連結した核酸は、別の核酸配列と機能的関係におかれた核酸である。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、もしそれが配列の転写に影響を与えるなら、そのコード配列に作動可能に連結している；またはリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を促進するよう配置されているなら、そのコード配列に作動可能に連結している。一般的に、作動可能に連結したＤＮＡ配列および連結したＤＮＡ配列は、近接している。しかし、エンハンサーは、近接している必要はない。連結は、都合のよい制限部位におけるライゲーションによって達成される。もしそのような部位が存在しないなら、従来の慣習に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
【００４３】
本発明を、以下の制限しない実施例によって説明する。
【実施例】
【００４４】
実施例１
ＡＡＶ２ＩＴＲ、ｍＵ６プロモーター、ｍｉＨＤＳ１標的配列、フィラー構成要素スタッファー、およびＡＡＶバックボーンを含む、プラスミドＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファーを産生した（図１）。５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１ＡＡＶスタッファーの配列を、図２において提供し、そのプラスミドの個々の構成要素の配列を、図３において提供する。全長フィラー構成要素（「スタッファー配列」）は、３７７６ヌクレオチドからなっていた。
【００４５】
実施例２
ｍｉＨＤＳ１を発現するベクターの、インビボにおけるサイレンシング効率を比較した。４つのベクター：（１）コントロール配列（ｍｉＳＡＦＥ）を発現し、そしてコントロール配列（ｅＧＦＰ）を含むベクター、（２）標的配列（ｍｉＨＤＳ１）を発現し、そしてコントロール配列（ｅＧＦＰ）を含むベクター、（３）コントロール配列（ｍｉＳＡＦＥ）を発現し、そして実施例１で記載したスタッファー配列を含むベクター、および（４）標的配列（ｍｉＨＤＳ１）を発現し、そして実施例１で記載したスタッファー配列を含むベクターを構築した。
（１）ＡＡＶ２／１  ｍＵ６ｍｉＳＡＦＥ−ｅＧＦＰ（４．８１Ｅ１２μｇ／ｍｌ）
（２）ＡＡＶ２／１  ｍＵ６ｍｉＨＤＳ１−ｅＧＦＰ（４．８１Ｅ１２μｇ／ｍｌ）
（３）ＡＡＶ２／１  ｍＵ６ｍｉＳＡＦＥ−スタッファー（４．８１Ｅ１２μｇ／ｍｌ）
（４）ＡＡＶ２／１  ｍＵ６ｍｉＨＤＳ１−スタッファー（４．８１Ｅ１２μｇ／ｍｌ）
【００４６】
ｍｉＳＡＦＥおよびｍｉＨＤＳ１の配列は、以前に議論された（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２４９０４を参照のこと、それはこれによってその全体として本明細書中で参考として援用される）。野生型マウスの線条体に、４つのベクターを注射した。１ヶ月後、マウスを屠殺し、そしてＨｔｔの発現を、ＱＰＣＲによって、Ａｃｔｂの発現レベルと比較して決定した。図４は、ｍｉｓａｆｅ／ｅＧＦＰ発現カセットとｍｉＨＤＳ１／ｅＧＦＰ発現カセットとの間には、発現の２０％の減少があり、一方ｍｉｓａｆｅ／スタッファー発現カセットとｍｉＨＤＳ１／スタッファー発現カセットとの間には、発現の６０％の減少があったこと、すなわち、スタッファーを使用した場合、発現の６０％の減少があったことを示す。
【００４７】
実施例３
ＡＡＶ２  ＩＴＲ、ｍＵ６プロモーター、ｍｉＨＤＳ１標的配列、フィラー構成要素スタッファー、およびＡＡＶバックボーンを含む、プラスミド５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１スタッファーを産生した（図５）。プラスミド５ｐＦＢＡＡＶｍＵ６ｍｉＨＤＳ１ＡＡＶ−スタッファーの配列を、図６において提供する。そのスタッファー（スタッファー＃２）の配列を、図７において提供する。
【００４８】
実施例４
ＡＡＶパッケージングに関して考慮する点の１つは、最適なゲノムサイズを維持することである。これが起こる場合、ゲノムを欠くものを形成するビリオンの比は、最小限になる。新しいスタッファー配列のパッケージング効率を試験する実験を行い、そして高い効率のパッケージングを見出した。例えば、表１「Ａｖｅｒａｇｅ  ｅｍｐｔｙ」および図８を参照のこと。パッケージングされた遺伝物質が、非ｍｉＲＮＡ：イントロンスタッファー配列を含んでいるかどうかも測定した。ウイルス産生に使用した意図しないゲノム物質の組み込みは、非常に低いことが見出された（Ｃａｐ／ｒＡＡＶ、Ａｍｐ／ｒＡＡＶ、Ｇｅｎｔ／ｒＡＡＶ）。最後に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の後に、銀染色によって、ウイルスの質を分析し、そして適切な割合の様々なカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３；図９）を含むことが見出された。要約すると、イントロンＩ／ＩＩスタッファー配列は、望ましい導入遺伝子のＡＡＶカプシドへの最適なパッケージングを可能にする。
【００４９】
全ての出版物、特許、および特許出願は、本明細書中で参考として援用される。前述の明細書において、本発明はそのある好ましい実施態様に関連して記載され、そして多くの詳細が説明の目的のために述べられたが、本発明は、さらなる実施態様が可能であり、そして本明細書中で記載された詳細のいくらかは、本発明の基本的な原理から離れることなく、かなり変化し得ることが、当業者に明らかである。
【００５０】
本発明の説明に関して、「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語および同様の指示対象の使用は、本明細書中で他に示されなければ、または文脈によって明らかに否定されなければ、単数形および複数形の両方を含むと解釈される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、他に示されなければ、制限のない用語であると解釈される（すなわち、「が挙げられるがこれらに限定されない」を意味する）。本明細書中の値の範囲の引用は単に、本明細書中で他に示されなければ、その範囲内に含まれる別々の値それぞれを個々に指す省略した方法となることが意図され、そして別々の値それぞれは、それが個々に本明細書中で引用されたかのように、明細書中に組み込まれる。本明細書中で記載される全ての方法を、本明細書中で他に示されなければ、または文脈によって明らかに否定されなければ、あらゆる適切な順番で行い得る。本明細書中で提供される、あらゆるおよび全ての例または代表的な言語（例えば「〜のような」）の使用は単に、本発明をより良く明らかにすることが意図され、そして他に請求されなければ、本発明の範囲に制限をかけない。明細書中のどの言語も、その請求されない要素も本発明の実施に必須であると示すと解釈されるべきではない。
【００５１】
本発明を実施するために発明者らに公知である最良の方式を含む、本発明の実施態様を本明細書中で記載する。それらの実施態様のバリエーションが、前述の説明を読むと当業者に明らかとなり得る。発明者らは、当業者がそのようなバリエーションを適切に採用することを期待し、そして発明者らは、本発明が、本明細書中で具体的に記載されたのとは異なる方法で実施されることを意図する。よって、本発明は、準拠法によって許可されるように、ここに付随する請求項において引用される主題の全ての修飾および同等物を含む。さらに、本明細書中で他に示されなければ、または文脈によって明らかに否定されなければ、上記で記載した要素の、その全ての可能なバリエーションにおけるあらゆる組み合わせが、本発明によって包含される。
【表１】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図２−１０】
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【図２−１１】
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【図２−１２】
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【図２−１３】
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【図２−１４】
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【図２−１５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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