(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）の形態型群に属する単離されたバクテリオファージであって、バクテリオファージのゲノムは配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、バクテリオファージは、少なくとも１種のサルモネラ種に感染し、それを溶菌することができる、バクテリオファージ。
【請求項２】
ファージＳ１６（寄託番号：ＣＢＳ１３０４９３）である、請求項１に記載の単離されたバクテリオファージ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のバクテリオファージから得ることができるポリペプチドであって、エンドリシンであるポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、エンドリシンであるポリペプチド。
【請求項５】
配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列及び配列番号１１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むロングテールファイバーポリペプチドであって、外膜タンパク質Ｃ結合活性を有するポリペプチド。
【請求項６】
請求項３又は４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項５に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１若しくは２に記載のバクテリオファージ、請求項３若しくは４に記載のポリペプチド、及び／又は請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む組成物であって、抗菌性である組成物。
【請求項９】
食品保存剤又は消毒剤である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
さらなるバクテリオファージ、静菌剤、殺菌剤、抗生物質、界面活性剤及び酵素からなる群から選択される付加的な有効成分をさらに含む、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１若しくは２に記載のバクテリオファージ、請求項３若しくは４に記載のポリペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチド、及び／又は請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物の、抗菌剤としての使用。
【請求項１２】
食品保存剤又は消毒剤としての、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
個体におけるサルモネラ関連状態の治療、予防又は遅延のための薬剤としての使用のための、請求項１若しくは２に記載のバクテリオファージ、請求項３若しくは４に記載のポリペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチド、及び／又は請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
個体におけるサルモネラ関連状態の治療、予防又は遅延のための薬剤を製造するための使用であって、請求項１若しくは２に記載のバクテリオファージ、請求項３若しくは４に記載のポリペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチド、及び／又は請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１５】
個体におけるサルモネラ関連状態の治療、予防又は遅延のための剤であって、請求項１若しくは２に記載のバクテリオファージ、請求項３若しくは４に記載のポリペプチド、及び／又は請求項６に記載のポリヌクレオチドを有効成分として含有する剤。
【請求項１６】
食品又は飼料の製品中、食品又は飼料の加工装置の上及び／又は中、及び／又は食品又は飼料の容器の上及び／又は中の微生物汚染を制御するための方法であって、請求項１若しくは２に記載のバクテリオファージ、請求項３若しくは４に記載のポリペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチド、及び／又は請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物を、食品若しくは飼料の製品、食品若しくは飼料の加工装置、及び／又は食品若しくは飼料の容器と接触させるステップを含む方法。
【請求項１７】
サルモネラの存在を検出するための方法であって、請求項１若しくは２に記載のバクテリオファージ、請求項３〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項６若しくは７に記載のポリヌクレオチド、及び／又は請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物を、サルモネラを含むことが疑われる試料と接触させるステップと、試料における変化を検出するステップと、を含む方法。
【請求項１８】
サルモネラを検出するためのキットオブパーツであって、請求項１若しくは２に記載のバクテリオファージ、請求項３〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物、及び／又は請求項６若しくは７に記載のポリヌクレオチドを含み、検出試薬、標識試薬、対照試料、対照データ、使用説明書、ハイブリダイゼーション試薬若しくは増幅試薬、及び容器のうちの少なくとも１つをさらに含むキットオブパーツ。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、微生物学の分野に関し、詳細には、好ましくはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）での汚染及び／又はサルモネラに関連する個体における状態を予防、治療又は診断するための、バクテリオファージ、ポリペプチド、並びに相当するポリヌクレオチド、核酸分子及び／又はベクター、及び／又はそのようなポリヌクレオチドを含む細胞、前記バクテリオファージ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、コンストラクト、ベクター及び／又は細胞を含む組成物に関する。さらに本発明は、医薬の使用のための、好ましくは、家畜を治療するための、又は食品添加物若しくは消毒剤としての使用のための、又は細菌を検出するための、好ましくは診断的適用における、抗菌性組成物に関し、前記抗菌性組成物は、バクテリオファージ、ポリペプチド、相当するポリヌクレオチド、コンストラクト及び／又はベクター、及び／又はそのようなポリペプチドを含む細胞、及び／又は本発明による組成物を含む。
【発明の背景】
【０００２】
サルモネラエンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）のメンバーは、世界的な主な食品起因性疾患の一つであるサルモネラ症の原因物質である。サルモネラエンテリカは極めて多様であり、認められている血清型は２５００を超える（Ｇｒｉｍｏｎｔ及びＷｅｉｌｌ、２００７年）。種々の血清型の多くのサルモネラエンテリカ菌株は、サルモネラゲノムアイランド１（ＳＧＩ１）上に位置する抗菌剤耐性遺伝子を含む。多数の異なる血清型及び菌株があるため、サルモネラエンテリカの生物学的防除は特に困難である。
【０００３】
このように、サルモネラエンテリカに特異的でありながら、その種内の広い宿主範囲を標的とするなど、改善された特徴を有する新たな抗菌剤が必要とされている。
【発明の説明】
【０００４】
バクテリオファージ、又は略してファージは、原核生物にもっぱら感染するウイルスである。これらは環境中に遍在的に分布し、地球上で最も大量に存在する自己複製性の実体である（１０３２と推定される（Ｒｏｈｗｅｒ及びＥｄｗａｒｄｓ、２００２年；Ｂｒｕｓｓｏｗ、２００５年））。
【０００５】
本明細書に提供するのは、カウドウイルス（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目に属するファージＳ１６と命名される、単離された新規なバクテリオファージである。ファージＳ１６は、ミオウイルス（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）科の明確な形態学的特色である収縮性のテールを有する。ファージＳ１６は、最初の厳密にビルレントな、非毒性の、広い宿主範囲の、今までに記載されているサルモネラ菌にもっぱら感染するＴ偶数系様のバクテリオファージである。ファージＳ１６は、文献に記載されている他のＴ偶数系ファージの場合と同様、いずれの種類のビルレンス因子をも欠く。ファージＳ１６は、Ｔ偶数系タイプのサブグループに属するＴ４様ウイルス属の新たなメンバーであり、サルモネラへの感染に限定されるＴ４様ファージの最初に完全に特徴付けられたメンバーである。
【０００６】
Ｔ偶数系タイプのバクテリオファージは、当技術分野において、厳密に溶菌性の（ビルレントの）生活様式、宿主染色体の分解、及び標的の種に対する広い宿主範囲により特徴付けられることが知られている。
【０００７】
本発明者らは、驚くべきことに、この新規なＳ１６バクテリオファージの宿主範囲は、サルモネラ属内の殆どの血清型に特異的で、感染性であることが今日までに知られている唯一の広い宿主範囲のバクテリオファージであるＦｅｌｉｘＯ１よりもさらに広いことを見出した。本発明者らは、サルモネラ３２株中２５株、及び試験したＳ．ＴｍＬＴ２のＬＰＳ変異体１４株中１３株が、ファージＳ１６により感染したことを見出した。ファージＳ１６のゲノム配列は決定され、アノテーションされている（表６）。
【０００８】
ファージＳ１６のＤＮＡ修飾系により、ファージＳ１６のゲノムは多くの通常の制限系に免疫となり、ＦｅｌｉｘＯ１を凌ぐさらなる利点がファージＳ１６に与えられる。ファージＳ１６の重要な特徴は、ファージの受容体結合タンパク質及び宿主細胞上の受容体である。これらはそれぞれ、ファージＳ１６では、タンパク質ｇｐ３７（配列番号８によってコードされる配列番号９）三量体の先端に位置する単一のタンパク質であるｇｐ３８タンパク質（配列番号１０によりコードされる配列番号１１）、並びに外膜タンパク質Ｃ（ＯｍｐＣ、配列番号１６によりコードされる配列番号１７）を含む、ロングテールファイバーの遠位サブユニットとして同定されている。このロングテールファイバーの遠位サブユニットは、ＯｍｐＣに結合するのに必要とされる最小構造であり、ｇｐ３７タンパク質三量体の先端に位置する単一のｇｐ３８タンパク質を含む。受容体結合性の特徴はファージＴ４の特徴に似ているが、受容体結合性タンパク質自体はファージＴ２の受容体結合性タンパク質に構造的により緊密に関連しており、テールファイバー及びシャペロンタンパク質ｇｐ３８は成熟したテールファイバーにおけるｇｐ３７にやはり付着しており、外側のリポ多糖（ＬＰＳ）コアの末端のＮアセチルグルコサミン残基を感染に必要とするＦｅｌｉｘＯ１と対照的に（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ、１９６７年；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ及びＨｏｌｍｅ、１９６９年）、ファージＳ１６はディープラフ株にも感染できるようになっている。ディープラフ株は、比較的一般的なディープラフ変異を保有し、不完全なリポ多糖をもたらす菌株であることは、当技術分野において知られている。ファージＳ１６は、サルモネラ属に属さないいかなる菌株には感染しないことが見出されている。本発明者らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）６株又は非病原性分離株２５株のうちどれもファージＳ１６に感受性でなかったことを見出した。ファージＳ１６はすべてのサルモネラ種及び亜種に感染するが、試験した２８のエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＥＮＴ）、さらなる命名：Ｎ０６−１３８２を含む）、クロノバクター（Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ）（４３株）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）（４株）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）（１株）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（１株）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）（１株）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）（１株）、及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（３株）の試験した菌株のいずれにも感染しない。サルモネラ菌株に感染性であり、Ｔ４様ファージを示すこれまでの報告は存在しない。子孫のファージを放出して上首尾に感染するには他に障害が存在し得るが、細菌細胞に感染するのに認識及び結合は不可欠である。ファージテールファイバーが受容体分子に特異性があること、及びサルモネラｏｍｐＣと大腸菌ｏｍｐＣとの間のパーセント同一性が低いこと（サルモネラｏｍｐＣと大腸菌ｏｍｐＣとのパーセント同一性の最高値は≦８１％である）は、大腸菌に特異的なＴ４様ファージのどれもサルモネラ菌株に感染することがかつて報告されていない理由の説明となり得る。本発明者らは、ファージＳ１６のロングテールファイバーは、サルモネラＯｍｐＣを特異的に認識することを見出した。ファージＳ１６は、大腸菌Ｋ１２野生型菌株に対して著しい吸着を示さないが、ファージＳ１６の吸着は、ｏｍｐＣのサルモネラホモログでの置換によりこの菌株に伝達され得る。
【０００９】
これらの発見は、ファージＳ１６がサルモネラと戦うのに比類なく適することを示唆するものである。
【００１０】
第１の態様において、本発明は、ミオウイルスの形態型群に属するバクテリオファージ、好ましくは単離されたバクテリオファージであって、下記特徴からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を含むバクテリオファージを提供する。本発明によるバクテリオファージは、下記特徴の少なくとも２つ、３つ、より好ましくは４つを含むのが好ましい。
・バクテリオファージのゲノムは少なくとも１００ｋｂｐである。
・バクテリオファージのゲノムは、配列番号３、５、７、９及び１１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む。
・バクテリオファージ受容体はサルモネラ外膜タンパク質Ｃ（ＯｍｐＣ）である。
・バクテリオファージは、少なくとも１種のサルモネラ種に感染し、それを溶菌することができる。
【００１１】
本明細書において、形態型群（ｍｏｒｐｈｏｔｙｐｅ  ｇｒｏｕｐ）とは、異なる亜科及び属の科と定義される。
【００１２】
本発明によるバクテリオファージが、好ましくは、少なくともサイズ１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９又は１６０ｋｂｐのゲノムを有するのが好ましい。本発明によるバクテリオファージが約１６０ｋｂｐのゲノムを有するのがより好ましく、ゲノムが１６０，２２１ｂｐであるのが最も好ましい。本発明によるバクテリオファージは、配列番号３、５、７、９及び１１からなる群から選択される１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ、最も好ましくは４つの異なるアミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを含むゲノムを有するのが好ましい。
【００１３】
本発明によるバクテリオファージは、サルモネラ外膜タンパク質Ｃ（ＯｍｐＣ）に結合するのが好ましい。本発明のバクテリオファージのＯｍｐＣに対する結合は、当業者に知られている任意の適切な結合アッセイにより評価することができる。本発明によるバクテリオファージの、細菌細胞に対する結合又は吸着が、実施例１にさらに詳細に記載するプルダウンアッセイにより試験されるのが好ましい。簡潔に述べると、試験しようとする細菌株の一夜培養物（１ｍＬ、ＯＤ６００＝１．０±０．０５）を、ファージ溶液（１０μＬ、１０９ＰＦＵ／ｍＬ）又は対照としてＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス（ＬＢ、１０ｇ／Ｌダイズペプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌを含み、ｐＨ７．５であるのが好ましい）とともにインキュベートし（１０分、ＲＴ）、遠心分離する（２００００ｇ）。上清中のプラーク形成単位（ＰＦＵ）を３回ずつ測定し、上清中のＰＦＵの低下として吸着を計算する。本発明のバクテリオファージは、サルモネラティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＤＴ７１５５ΔｏｍｐＣなどのｏｍｐＣ欠失変異サルモネラ菌株からの細胞を用いる本明細書で規定されるプルダウンアッセイを用いて、野生型サルモネラ菌株、好ましくはサルモネラティフィムリウムＤＴ７１５５ｗｔの細胞と比べて、吸着において好ましくは少なくとも１０、２０、３０、４０、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９又は１００％の統計的に関連のある低減が見出される場合、ＯｍｐＣに結合すると言われる。
【００１４】
サルモネラインファンティス（Ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ケンタッキー（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）、ニューポート（Ｎｅｗｐｏｒｔ）、スタンレー（Ｓｔａｎｌｅｙ）、ハーダー（Ｈａｄａｒ）、ウィルヒョー（Ｖｉｒｃｈｏｗ）、ティフィムリウム、エンテリティディス（Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、アゴナ（Ａｇｏｎａ）、アナツム（Ａｎａｔｕｍ）、ゼンフテンベルグ（Ｓｅｎｆｔｅｎｂｅｒｇ）、モンテビデオ（Ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ）、ムンステール（Ｍｕｅｎｓｔｅｒ）、ジャビアナ（Ｊａｖｉａｎａ）、ハイデルベルグ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、ダービー（Ｄｅｒｂｙ）、ウイーン（Ｗｉｅｎ）、ポーシ（Ｐｏｒｃｉ）、ブレーダーアプップ（Ｂｒａｅｄｅｒｕｐ）、パナマ（Ｐａｎａｍａ）、ニューイングトン（Ｎｅｗｉｎｇｔｏｎ）、リビングストン（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ）、ブレダニー（Ｂｒｅｄｅｎｅｙ）、ダブリン（Ｄｕｂｌｉｎ）、コレラスイス（Ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、ギブ（Ｇｉｖｅ）、アムハースチナ（Ａｍｈｅｒｓｔｉａｎａ）、サルモン（Ｓａｌｍｏｎｅ）、テネシー（Ｔｅｎｎｅｓｅｅ）、ブロックリー（Ｂｌｏｃｋｌｅｙ）、インディアナ（Ｉｎｄｉａｎａ）、及びジャワ（Ｊａｖａ）からなる群に属するサルモネラの全菌株の少なくとも７０、８０、８５、９０、９５又は１００％に好ましくは感染し、それらを溶菌することができる、広い宿主範囲を有する本発明によるバクテリオファージがさらに好ましい。本発明の文脈内で、広い宿主範囲は、本明細書において同定される異なる菌株の少なくとも７０％に本発明のバクテリオファージが感染することを意味する。
【００１５】
さらに好ましいのは、バクテリオファージが少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００％のサルモネラエンテリカ菌株に感染し、それらを溶菌することができる、本発明によるバクテリオファージである。本発明によるバクテリオファージは、サルモネラＲｅ−ＬＰＳ変異（ディープラフ）株に感染し、それを溶菌することができるのが好ましく、この菌株には内部コアの２−ケト−デオキシ−ｄ−オクタノエート（ＫＤＯ）残基のみが存在する。これにより、本発明によるバクテリオファージは、感染に外側のＬＰＳコアの末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基を必要とするＦｅｌｉｘＯ１とは対照的に（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ、１９６７年；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ及びＨｏｌｍｅ、１９６９年）、ディープラフ株にも感染することができるようになる。本発明によるバクテリオファージは、サルモネラＬＰＳ合成ノックアウト株に感染し、それを溶菌することができるのが好ましい。本発明によるバクテリオファージを有する所与の細菌株の感染及び溶菌は、当業者に知られている任意の適切なアッセイにより定量的に試験することができる。好ましい一アッセイにおいて、感染及びその後の溶菌を、実施例１に詳しく記載するスポットオンザローン（ｓｐｏｔ−ｏｎ−ｔｈｅ−ｌａｗｎ）方法により試験する。簡潔に述べると、乾燥ＬＢ寒天平板に、試験しようとする細菌株の対数期培養物４ｍＬを充満させ、過剰の培養物を除去し、寒天平板を３０分間乾燥させる（３０℃）。ナトリウム−マグネシウムバッファー中力価１０１１ＰＦＵ／ｍｌ（５．８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４を含む）を有する生成バッチの１０−２から１０−７ファージ希釈液３μＬを平板上にスポットし、３０℃で一夜インキュベートする。本発明の文脈内で、バクテリオファージは、単一のプラークを任意の１つのスポットに観察することができる場合に、菌株に感染したと言われる。
【００１６】
本発明によるバクテリオファージのゲノムが、少なくとも１０、１５、２０、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２個の以下の制限酵素に耐性であるのが好ましい：Ｅｃｏ５２１（ＥａｇＩ）、ＤｐｎＩ、ＨｈａＩ、Ｅｃｏ１０５１（ＳａｎＢＩ）、ＨｉｎｃＩＩ（ＨｉｎｄＩＩ）、ＫｐｎＩ、ＭｌｕＩ、ＭｐＨ１  １０３１（ＮｓｉＩ）、ＭｓｐＩ（ＨｐａＩＩ）、ＮｈｅＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＯｌｉＩ（ＡｌｅＩ）Ｖａｎ９１Ｉ（ＰｆｌＭＩ）、ＰａｅＩ（ＳｐｈＩ）、Ｅｃｏ８８１（ＡｖａＩ）、ＭｓｓＩ（ＰｍｅＩ）、ＰｖｕＩＩ、ＰａｇＩ（ＢｓｐＨＩ）、ＢｓｅＪＩ（ＢｓａＢＩ）、Ｂｓｐ６８Ｉ（ＮｒｕＩ）、ＴａｑＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ（Ｅｃｏ３２１）、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰａｕＩ（ＢｓｓＨＩＩ）、ＦｓｐＢＩ（ＢｆａＩ）ＮｄｅＩ、ＭｂｏＩ（先はすべてＦｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨにより以前に製造されたもの）、ＳｓｐＩ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅにより製造されたもの）、ＰａｃＩ、ＳｗａＩ（ＳｍｉＩ）、ＸｃｍＩ、ＣａｌＩ（後４者はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓにより製造されたもの）。制限酵素の耐性は、当業者に知られている任意の適切なアッセイを用いて試験することができる。そのようなアッセイを、実施例１に詳しく記載する。簡潔に述べると、精製されたファージＤＮＡを制限酵素と、製造元の使用説明書に従った濃度、温度及び時間でインキュベートし、その後ＲＦＬＰパターンを電気泳動で分析することができる。
【００１７】
本発明のバクテリオファージは、ＪＳ９８、ＪＳ１０、ＣＣ３１及びＦ３８７／０８からなる群から選択されるＴ４様ファージのいずれでもないのが好ましい。
【００１８】
サルモネラなどの食品由来病原体の生物的防除において安全に用いようとするバクテリオファージにとって、これらは厳密にビルレントである（溶原性を避ける）必要があり、ファージゲノムにコードされている、知られているビルレンス因子、毒素又は抗生物質耐性遺伝子が存在してはならず、ファージ粒子による宿主ＤＮＡの伝達である普遍形質導入は排除されなければならない（Ｈａｇｅｎｓ及びＬｏｅｓｓｎｅｒ、２０１０年）。本発明によるバクテリオファージは、バクテリオファージのゲノムにコードされているビルレンス因子又は知られている毒素を含まず、厳密にビルレントである（溶原性を避ける）のが好ましい。ビルレンス因子又は知られている毒素の非存在は、当業者によく知られている方法により評価することができる。一実施形態において、ビルレンス因子又は知られている毒素の非存在は、全ゲノムシーケンシング及び知られているビルレンス因子又は毒素に対するスクリーニングにより評価される。望ましくない病原因子又は毒素に、任意のタイプの毒素、抗生物質耐性遺伝子、溶血素、強力な抗原タンパク質、及び／又は炎症因子が含まれるのが好ましい。
【００１９】
本発明によるバクテリオファージは、形質導入活性を実証せず、すなわち、宿主ＤＮＡの他の宿主細胞へのいかなる伝達も示さないのが好ましい。形質導入活性は、当業者によく知られているアッセイにより評価することができる。そのようなアッセイを、実施例１に詳しく記載する。簡潔に述べると、第１の菌株が第１の抗生物質に耐性であり、第２の菌株が第２の抗生物質に耐性である、変異サルモネラ２株が提供される。第１の菌株を、本発明によるバクテリオファージに感染している第２の菌株から調製した溶菌液に感染させる。前記第１の菌株を、第１の抗生物質及び第２の抗生物質の両方を含む平板上でコロニーが増殖するその能力に対して試験することにより、形質導入活性を分析する。本発明の文脈内で、バクテリオファージは、このアッセイにおいてコロニーの増殖が起こらない場合に形質導入活性を示さないと言われる。
【００２０】
形質導入の頻度は、ｒＩＩＡ、ｒＩＩＢ、ｓｔｐ及びａｃにおける変異により増大することが知られている（Ｙｏｕｎｇら、１９８２年）。本発明によるバクテリオファージは、機能的なｎｄｄ、ｄｅｎＢ、ｒＩＩＡ及びｒＩＩＢ遺伝子を特徴とすることが好ましい。本発明の文脈内で、機能性は形質導入アッセイにより保証することができる。
【００２１】
本発明によるバクテリオファージは、ＣＢＳ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＣｅｎｔｒｅにＣＢＳ１３０４９３番の下に寄託され、本明細書において配列番号１によって表される、ファージＳ１６のゲノムに対して少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するゲノムを有するのが好ましい。
【００２２】
本発明によるバクテリオファージは、変異の、キメラの及び／又は組換えのバクテリオファージであってもよい。当業者であれば、当技術分野において知られている方法を用いて、ゲノムに変異を配置することにより、及び／又はゲノム中でコード配列若しくはコード配列の部分を欠失する及び／又は挿入することにより、Ｓ１６から出発してバクテリオファージを構築することができる。
【００２３】
本発明によるバクテリオファージはファージＳ１６であるのが最も好ましい。
【００２４】
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるバクテリオファージの遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、好ましくは単離されたポリペプチド、ポリペプチドバリアント、又はキメラのポリペプチドコンストラクトを提供する。本発明のポリペプチドが、本発明の第１の態様によるバクテリオファージから得ることができるのが好ましい。前記ポリペプチドがロングテールファイバーポリペプチドであり、配列番号３、５、７、９、及び１１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するのが好ましい。成熟Ｓ１６ファージにおいて、配列番号２、４、６、８及び１０によりコードされる、それぞれ配列番号３、５、７、９及び１１により本明細書において同定されるｇｐ３４〜３８は、完全なロングテールファイバー構造を形成することが必要とされる。前記ポリペプチドは、ロングテールファイバー（ＬＴＦ）の遠位ポリペプチドサブユニットであるｇｐ３７ポリペプチドである、配列番号８によりコードされる配列番号９に対して、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するのがより好ましい。前記ポリペプチドは、少なくともアミノ酸５００、６００若しくは７００個の長さ、及び／又は最大でアミノ酸１０００、９００、８００若しくは７５０個の長さを有するのが好ましい。前記ポリペプチドは、アミノ酸７４９個の長さを有するのが最も好ましい。本明細書で規定されるロングテールファイバーポリペプチドを含むポリペプチドバリアント及び／又はポリペプチドコンストラクトも好ましい。
【００２５】
本発明のｇｐ３７ポリペプチドは、合成的に又は組換えで生成することができる。ｇｐ３７ポリペプチドに対する組換え生成方法は、Ｂａｒｔｕａｌら、２０１０年、及び実施例１にさらに詳細に記載される。簡潔に述べると、前記生成は、シャペロンポリペプチドｇｐ５７Ａ及びｇｐ３８の同時発現を必要とする。本発明のポリペプチドのｇｐ３８が、配列番号１０によりコードされる配列番号１１に少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性、並びに少なくともアミノ酸５０、１００若しくは１５０個の長さ、及び／又は最大でアミノ酸４００、３００若しくは２５０個の長さを有するのが好ましい。前記ポリペプチドがアミノ酸２４９個の長さを有するのが最も好ましい。本発明のｇｐ５７Ａが、配列番号１２によりコードされる配列番号１３に少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性、並びに少なくともアミノ酸４０、５０、６０若しくは７０個の長さ、及び／又は最大でアミノ酸１００、９０、８０若しくは７８個の長さを有するのが好ましい。前記ポリペプチドがアミノ酸７５個の長さを有するのが最も好ましい。本発明による発現されたポリペプチドは、低密度Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いた重力流固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）など、当業者により知られている任意の適切な方法を用いて精製することができる。
【００２６】
本発明によるロングテールファイバーの遠位サブユニットが、当業者によく知られている適切な結合アッセイにより確立される通り、外膜タンパク質ＯｍｐＣに結合するのが好ましい。好ましい一アッセイにおいて、本発明によるロングテールファイバーの遠位サブユニットの結合は、実施例１に詳しく記載する通りに確立される。簡潔に述べると、本発明によるｇｐ３８に結合しているｇｐ３７蛍光タグ付けしたポリペプチド三量体を、上記のように生成し、本発明の、ｇｐ３７（配列番号９によりコードされる配列番号８）及びｇｐ３８（配列番号１１によりコードされる配列番号１０）をコードするポリヌクレオチドをそれぞれ、発現系におけるトランスフェクションのためにｐＨＧＦＰ  Ａｍｐｒベクターにクローニングする（Ｌｏｅｓｓｎｅｒら、２００２年）。試験しようとする細菌株の対数期培養物０．５ｍＬをペレット化し、ＳＭバッファー（５．８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）２００μＬに再懸濁する。蛍光ｇｐ３７／ｇｐ３８複合体（複合体は、三量体のＧＦＰ標識化ｇｐ３７及びそれに付着した単一のｇｐ３８からなる）を遠心分離して凝集物を除去し（３０分、３１０００ｇ、４℃）、蛍光ｇｐ３７／ｇｐ３８複合体およそ１μｇを細菌細胞に加える。室温で１０分インキュベートした後、細胞をＳＭバッファー中で洗浄する。蛍光顕微鏡観察に倍率１００倍のＺｅｉｓｓアキシオプラン（ａｘｉｏｐｌａｎ）顕微鏡（励起：ＢＰ４５０〜４９０ｎｍ、ＦＴ５１０ｎｍ、発光ＬＰ５２０ｎｍ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ｇｐ３７／ｇｐ３８蛍光複合体の結合を評価することができる。本発明の文脈内で、ＨＧＦＰ＿ｇｐ３７／ｇｐ３８結合を、ｏｍｐＣサルモネラ欠失変異体、好ましくはＳ．Ｔｍ  ＤＴ７１５５ΔｏｍｐＣに対して、野生型サルモネラ菌株、好ましくはＳ．Ｔｍ  ＤＴ７１５５ｗｔに比べて評価する場合、蛍光シグナルの検出によって評価して観察可能な結合が検出できない場合、ｇｐ３７／ｇｐ３８複合体はＯｍｐＣに結合すると言う。ｇｐ３７／ｇｐ３８複合体によりＯｍｐＣ結合を評価するのに好ましい別の一結合アッセイは、上述のプルダウンアッセイである。本発明の文脈内で、上述のプルダウンアッセイにおいて、前記細胞を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とプレインキュベートした細菌株に比べて、本明細書で規定される蛍光ｇｐ３７／ｇｐ３８複合体ポリペプチドとプレインキュベートした、ＯｍｐＣを発現する細菌株、好ましくは野生型サルモネラ菌株、より一層好ましくはサルモネラティフィムリウムＤＴ７１５５ｗｔを用いて、少なくとも１５、２０、２５、２６、２７、２８、２９又は３０％の吸収の低下が検出される場合、本発明の複合体はＯｍｐＣに結合すると言う。好ましい一実施形態において、本発明のバクテリオファージを加える前に、ＯｍｐＣを発現する前記細菌株、好ましくは野生型サルモネラ菌株、より一層好ましくはサルモネラティフィムリウムＤＴ７１５５ｗｔを、本明細書で規定される蛍光ｇｐ３７／ｇｐ３８複合体２０μｇと１０分間プレインキュベートした。
【００２７】
本発明による別の好ましい一ポリペプチドは、本発明の第１の態様によるバクテリオファージから得ることができるエンドリシンである。本明細書で規定されるエンドリシンを含むポリペプチドバリアント及び／又はポリペプチドコンストラクトも好ましい。
【００２８】
本発明による前記エンドリシンポリペプチドは、配列番号１４によりコードされる配列番号１５に対して少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、並びに少なくともアミノ酸５０、７５若しくは１００個の長さ、及び／又は最大でアミノ酸３００、２５０、２００若しくは１７０個の長さを有するのが好ましい。前記エンドリシンポリペプチドがアミノ酸１６６個の長さを有するのが最も好ましい。本発明による前記エンドリシンポリペプチドは溶菌活性を有するのが好ましい。溶菌活性は、当業者に知られている任意の適切な方法により評価することができる。一実施形態において、溶菌活性は、基質の細胞懸濁液の濁度の低下を測定することにより、分光光度的に評価することができる。濁度は、波長６００ｎｍの光学密度を測定することにより評価され、典型的に、波長６００ｎｍで少なくとも０．３ＯＤの光学密度を示す場合に培養液は濁っている。溶菌活性が、サルモネラ懸濁液の濁度の低下を測定することにより分光光度的に評価することができるのが好ましく、濁度はＯＤ６００を分光光度的に（Ｌｉｂｒａ  Ｓ２２、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）測定することにより定量される。本発明によるエンドリシンポリペプチド２００ｎＭを、分光光度的に（Ｌｉｂｒａ  Ｓ２２、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）評価した１±０．０５の初期ＯＤ６００を有するサルモネラ懸濁液と一緒に、ＰＢＳバッファーｐＨ７．４、１２０ｍＭ塩化ナトリウム中、３７℃で３０分間インキュベートするのがより好ましい。濁度の低下は、インキュベート３０分前のＯＤ６００からインキュベート３０分後のＯＤ６００を差し引くことにより算出される。本発明の文脈内で、本発明のポリペプチドは、このアッセイを用いて少なくとも１０、２０、３０、４０、５０又は６０％の濁度の低下が検出された場合に溶菌活性を有すると言う。少なくとも７０％の低下が検出されるのが好ましい。
【００２９】
本発明の一実施形態はバリアントのポリペプチドを包含する。バリアントのポリペプチドは、天然に存在しない形態のポリペプチドであってもよい。ポリペプチドバリアントは、いくつかの操作方法において、その天然の供給源から単離されるポリペプチドと異なることがある。ポリペプチドバリアントは、本明細書で規定されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から出発し、配列番号２、４、６、８、１０、１２及び／又は１４により示される部位特異的変異誘発により作成することができる。ポリペプチドバリアントが、コードするポリペプチドの生物学的機能を変更しない変異を含むのが好ましい。好ましい実施形態によると、ポリペプチドバリアントは、本明細書において先に同定したアッセイにおいて測定して、配列番号３、５、７、９、１１、１３及び／又は１５それぞれのＯｍｐＣ結合性及び／又は溶菌活性に比べて、同じ又は増強されている、ＯｍｐＣ結合性及び／又は溶菌活性を示す。
【００３０】
本発明は、後述の天然に存在する又は後付けのポリヌクレオチドコンストラクトによりコードされるキメラのポリペプチドをさらに提供する。前記キメラのポリペプチドは、前述のポリペプチドの少なくとも１つを含み、少なくとも１つの付加的な機能的ドメインをさらに含むのが好ましい。本発明の範囲内の機能的ドメインは、シグナル伝達、触媒作用、シャペロン及び／又は結合活性を示す任意のドメインであり得る。
【００３１】
好ましい一実施形態において、本発明は、そのＣ末端上で疎水性ペンタペプチドに共有結合性に連結している、本明細書で規定されるエンドリシンを含むキメラのポリペプチドに関し、前記疎水性ペンタペプチドはＰｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏであるのが好ましく、Ｉｂｒａｈｉｍら、１９９４年（ＪＢＣ、１９９４年、２６９巻、５０５３〜５０６３頁）により報告される通り、特にグラム陰性細菌に対して、エンドリシンの殺菌作用の増大がもたらされる。
【００３２】
第３の態様において、本発明は、本発明の第２の態様によるポリペプチド、ポリペプチドバリアント又はキメラのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、好ましくは分離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は１４のいずれかの配列に対して少なくとも５０、６０、７０、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するのが好ましい。本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２若しくは１４の対応配列に対して最小の配列同一性を有することができ、又は代替的に、ストリンジェントな条件下でこれらの所与の配列とハイブリダイズすることができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば、６×ＳＳＣ（１０００ｍｌあたり２０×ＳＳＣ：１７５．３ｇＮａＣｌ、１０７．１ｇクエン酸ナトリウム５Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．０）、０．１％ＳＤＳ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、５＊デンハート液、及び２０μｇ／ｍｌ変性ニシン精子ＤＮＡ中、５６℃、１８〜２４時間のハイブリダイゼーション、引き続き、５６℃の５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の洗浄を３０分２回、及び５６℃の２×ＳＳＣ、０．１％ＳＳＣ中の洗浄を３０分２回など、当技術分野において理解されているものである。本発明のポリヌクレオチドが、少なくともアミノ酸４０、５０、６０、７０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００若しくは７００個の長さ、及び／又は最大でアミノ酸１５００、１４００、１３００、１０００、９００、８００、７５０、４００、３００、２５０、１７０若しくは１００個の長さを有するのが好ましい。
【００３３】
本発明によるポリペプチド又はポリヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０個以上の、それぞれヌクレオチド又はアミノ酸を、置換、挿入、欠失又は付加することにより、本発明に示すポリペプチド又はポリヌクレオチドの１つに由来し得る。本発明によるポリペプチドは、安定性、溶解性及び活性を増大するために、付加的なＮ末端若しくはＣ末端のアミノ酸又は化学的部分を加えることにより、本明細書に同定されるポリペプチドの１つに由来し得る。
【００３４】
本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は１４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドのバリアントであってもよい。ポリヌクレオチドバリアントが、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００又は５００ｂｐからなるのが好ましい。ポリヌクレオチドバリアントを、前述のポリペプチドバリアントを調製するのに用いることができる。本発明によるポリヌクレオチドバリアントは、上述のいずれかのポリヌクレオチドのフラグメントであり得る。ポリヌクレオチドバリアントはまた、遺伝暗号の縮重のおかげで、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は１４と異なる配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチドバリアントはまた、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は１４の配列を有するポリヌクレオチドのアレルバリアントであってもよい。アレルバリアントは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の２つ以上の代替的な形態のいずれかを意味する。本発明による好ましい一ポリヌクレオチドバリアントは、サイレント変異を含むヌクレオチド配列を有する。代替的に又は組み合わせて、ポリヌクレオチドバリアントは、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの別のアミノ酸配列を生じないが、本発明のポリペプチドの生成を意図する宿主生物のコドン使用頻度に相当する、ヌクレオチド置換の導入によっても得ることができる。好ましい一実施形態によると、本発明によるポリヌクレオチドバリアントは、その生物学的機能を依然として表すポリペプチドをコードする。本発明によるポリヌクレオチドバリアントが、ＯｍｐＣ結合活性又はエンドリシン活性を表すポリペプチドをコードするのがより好ましい。本発明によるポリヌクレオチドバリアントは、前述の、増強されたＯｍｐＣ結合活性又はエンドリシン活性を有するポリペプチドをコードするのがさらに好ましい。増強された活性は、本明細書において、本発明のポリペプチドの活性に比べて、少なくとも１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、３００、４００又は５００％以上の活性を有すると規定される。ＯｍｐＣ結合活性又はエンドリシン活性を表すポリペプチドをコードする、本発明によるポリヌクレオチドは、当業者に知られている任意の適切な方法により、合成的又は組換えにより生成することができる。これらのバリアントはすべて、プローブをデザインするのに用いることができる、配列番号２、４、６、８、１０、１２若しくは１４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、又はこれらのバリアントとの、低度から中度から高度のハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションによるライブラリーのスクリーニング（例えば、サザンブロッティング手順を用いて）など、当業者に知られている技術を用いて得ることができる。低度から中度から高度のストリンジェンシー条件は、４２℃で５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、せん断及び変性したサケ精子ＤＮＡ２００ｐｇ／ｍｌ、並びに低度から中度から高度のストリンジェンシーに対してそれぞれ２５％、３５％又は５０％のいずれかのホルムアミド中でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを���味する。引き続き、ハイブリダイゼーション反応を、３０分間、各々２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、及び低度から中度から高度のストリンジェンシーに対して５５℃、６５℃、又は７５℃のいずれかを用いて、３回洗浄する。
【００３５】
第４の態様において、本発明は、本発明の第２の態様によるポリペプチドをコードする本発明の第３の態様によるポリヌクレオチド、及び／又はコンストラクト内の任意の可能な位置に機能的ドメインを含む核酸コンストラクトをさらに提供する。本発明内の機能的ドメインは、シグナル伝達、触媒作用、シャペロン及び／又は結合活性を示す任意のドメインであり得る。好ましい一実施形態において、前記機能的ドメインは、タンパク質精製タグ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔａｇ）とも名づけられた、精製を容易にするための結合ドメインである。そのような本発明のタンパク質精製タグは、これらに限定されないが、キチン結合性タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリ（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ｃ−ｍｙｃタグ、又はＨＡタグであり得る。本明細書において、異種性のヌクレオチド配列を含む前記核酸コンストラクトは「後付けのコンストラクト」（“ｒｅｔｒｏｆｉｔｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ”）として定義される。
【００３６】
第５の態様において、本発明は、本発明の第３の態様によるポリヌクレオチド、又は本発明の第４の態様による核酸コンストラクトを含む発現ベクターを提供する。好ましくは、発現ベクターは、本発明の第３の態様によるポリヌクレオチド、又は本発明の第４の態様による核酸コンストラクトを含み、核酸コンストラクトは１つ又は複数の制御配列に作動可能に連結されており、制御配列は、細胞、対象、又は細胞フリーの発現系においてコードされたポリペプチドの生成又は発現を指示する。
【００３７】
発現ベクターは、組換え発現ベクターとして見ることができる。このベクターは、本発明によるポリヌクレオチドを導入することにより形質転換される、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ又はウイルスであり得る。宿主生物の形質転換を可能にする、そのような形質転換ベクターは、当業者によく知られており、広く文献に記載されている。
【００３８】
本発明のさらなる一主題は、本発明によるポリヌクレオチドを少なくとも１つ導入することによる、宿主生物を形質転換するためのプロセスであり、この形質転換は、専門家の文献、特に本出願において引用する参考文献に広く記載されている任意の適切な公知の手段により、より詳しくは本発明によるベクターにより、行うことができる。
【００３９】
第６の態様において、本発明は、本発明の第３の態様によるポリヌクレオチド、本発明の第４の態様による核酸コンストラクト、又は本発明の第５の態様による発現ベクターを含む細胞を提供する。細胞は、本発明のポリペプチドの発現に適する、任意の微生物性、原核生物又は真核生物の細胞であり得る。好ましい一実施形態において、前記細胞は大腸菌である。さらに好ましい一実施形態において、前記細胞は大腸菌ＸＬ１ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’である。
【００４０】
好ましい一実施形態において、本発明は、本発明のバクテリオファージの繁殖及び／又は生成のための細胞を提供する。本発明のバクテリオファージは、当業者に知られている任意の適切な方法により、繁殖及び／又は生成並びに任意選択により精製することができる。本発明のバクテリオファージを、Ｇｒａｔｉａ、１９３６年及び実施例１に詳細に記載されている二重寒天重層法（ｄｏｕｂｌｅ  ａｇａｒ  ｏｖｅｒｌａｙ  ｍｅｔｈｏｄ）により繁殖及び精製するのが好ましい。簡潔に述べると、４ｍＬ  ＬＣ軟寒天（７．５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌトリプトン、１％グルコース、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２）を、細菌一夜培養物、好ましくはサルモネラエンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）分離株ナンバー１３  １００μＬ、及び本発明のバクテリオファージのバクテリオファージ希釈物１０μｌと混合し、ＬＢ底寒天平板（ＬＢ  ｂｏｔｔｏｍ  ａｇａｒ  ｐｌａｔｅｓ）（６ｇ／寒天１Ｌ）上に注いだ。平板を３０℃で一夜インキュベートし、セミコンフルエントの平板を、室温で５時間、ＳＭバッファー（５．８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）５ｍＬで掻き取り、ＳＭバッファーを平板から回収し、ファージを０℃で一夜、ＰＥＧで沈殿させた（０．５Ｍ  ＮａＣｌ中、８％ＰＥＧ８０００（Ｆｌｕｋａ））。遠心分離後（１５分、１００００ｇ、４℃）、ペレットをＳＭバッファー５ｍＬ中に再懸濁し、ＣｓＣｌ勾配で２回精製して（段階勾配）、高度に純粋なバクテリオファージ粒子を得た（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ、２００１年）。
【００４１】
第７の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるバクテリオファージ、及び／又は本発明の第２の態様によるポリペプチド、及び／又は本発明の第３の態様によるポリヌクレオチド、及び／又は本発明の第４の態様による核酸コンストラクト、及び／又は本発明の第５の態様によるベクター、及び／又は本発明の第６の態様による細胞を含む組成物を提供し、前記組成物が、本発明の第１の態様によるバクテリオファージ、及び／又は本発明の第２の態様によるエンドリシンを含むのが好ましく、前記組成物が本発明の第１の態様によるバクテリオファージを含むのが最も好ましい。本発明による組成物が抗菌性であるのが好ましく、食品保存剤又は殺菌剤であるのが好ましい。前記抗菌性が、細菌、好ましくはサルモネラ属の細菌、より好ましくはサルモネラエンテリカ種の細菌を死滅させるためであるのが好ましい。本発明による組成物が、広い宿主範囲のサルモネラ感染の性質を表し、厳密にビルレントであり、形質導入の性質を示さず、本明細書で規定されるＯｍｐＣ結合活性及び／又は溶菌活性を有するのが好ましい。
【００４２】
本発明による組成物は、本発明による異なるバクテリオファージ及び／又はポリペプチド及び／又はポリヌクレオチド及び／又は核酸コンストラクト及び／又はベクター及び／又は細胞の混合物を含むことができる。
【００４３】
本明細書で規定される組成物は、好ましくは効果的であることが知られている濃度における、１つ又は複数の付加的な有効成分をさらに含むことができる。本明細書において、有効とは、好ましくは、前述のＯｍｐＣ及び／又はＬＰＳ結合性及び／又は溶菌活性を示すこと、又は任意のそのような活性を補助及び／又は増強することと定義される。本発明内で、有効成分はまた、サルモネラ以外の１つ又は複数の他の原核生物、好ましくは病原性原核生物、より一層好ましくは病原性細菌、より一層好ましくは細菌性食品由来病原体、例えば、これらに限定されないが、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、大腸菌、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、リステリアモノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ブドウ球菌腸炎菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオバルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、エルシニアエンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、及び仮性結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対する溶菌活性を示すことが当技術分野において知られている成分も含む。前記有効成分が、その他の場合に存在する食品由来病原体の数の著しい低下をもたらすのに、当技術分野で知られている濃度において存在するのが好ましい。前記１つ又は複数の付加的な有効成分が、さらなるバクテリオファージ、静菌剤、殺菌剤、抗生物質、界面活性剤及び／又は酵素からなる群から選択されるのが好ましい。本発明の抗生物質は、抗生物質及び化学療法剤を含み、また、バンコマイシン、ナイシン、ダノフロキサシン及びネオマイシンを含む（これらに限定されない）、当技術分野において知られている任意の抗生物質であり得る。本発明の組成物において有用な酵素は、これらに限定されないが、生物膜（例えば、食品加工装置に見出される生物膜）を分解するのに助けとなる酵素、例えば、これらに限定されないが、多糖解重合酵素及びプロテアーゼが含まれる。本発明の組成物において有用な界面活性剤は、バクテリオファージが種々の表面にわたって適切に分布するように表面を湿潤する助けとなり、サルモネラがバクテリオファージに接近できるように汚れを溶解し除去する助けとなる。適切な界面活性剤には、これらに限定されないが、ポリソルベート（ｔｗｅｅｎ）８０、２０及び８１並びにＤｏｂａｎｏｌｓ（Ｓｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．ＲＴＭ）が含まれる。
【００４４】
本発明の抗菌性消毒剤組成物は、これらに限定されないが、安息香酸及びＰＢＴ、好ましくは、本発明のバクテリオファージがそれと適合性である消毒剤など、当技術分野において知られている表面消毒剤をさらに含むことができる。
【００４５】
本発明による組成物におけるさらなるバクテリオファージは、本発明のバクテリオファージ以外の、文献において知られている任意のファージであり得る。そのようなさらなるバクテリオファージには、これらに限定されないが、ミオウイルス、シホウイルス（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、及びポドウイルス（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）からなる、カウドウイルス目のテイルドファージが含まれるのが好ましい。前記さらなるバクテリオファージが、広い宿主範囲のファージＦｅｌｉｘＯ１であるのが最も好ましい。ＦｅｌｉｘＯ１及び本発明のバクテリオファージは、大部分重複するが、それにもかかわらず相補的な宿主範囲を示す。十分に研究された広い宿主範囲のサルモネラファージＦｅｌｉｘＯ１と合わせて、本明細書において非限定的に列挙する、種々の適用においてサルモネラ菌を打ち負かすのに唯一有用である、本発明のバクテリオファージとＦｅｌｉｘＯ１の組合せを作成することにより、殆んど完全な宿主範囲を実現することができる。
【００４６】
さらに、ファージＦｅｌｉｘＯ１及び本発明のバクテリオファージは、サルモネラ細胞上の異なる受容体を有する（それぞれリポ多糖、すなわちＬＰＳ及びＯｍｐＣ）ため、２つのファージのうち１つに対する耐性をもたらす変異でも、依然として細胞は他のファージに感受性である。
【００４７】
本発明による組成物は、賦形剤、好ましくは薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができる。薬学的に許容される賦形剤をさらに含む本発明による組成物を、本明細書において、本発明による薬学的組成物と呼び、好ましくは、医薬又は薬剤としての使用のためのものである。本発明の第１の態様によるバクテリオファージ、本発明の第２の態様によるポリペプチド、本発明の第３の態様によるポリヌクレオチド、本発明の第４の態様による核酸コンストラクト、本発明の第５の態様によるベクター、及び／又は本発明の第６の態様による細胞を送達するためのビヒクルとして使用することができる賦形剤は、当業者であれば明らかである。本発明の薬学的組成物を、個体におけるサルモネラ関連状態の治療、予防又は遅延に用いるのが好ましい。
【００４８】
本発明の組成物は、液体、固体又は半流動体若しくは半固体の形態であってもよい。
【００４９】
第８の態様において、本発明は、薬剤、好ましくは、個体におけるサルモネラ関連状態の治療、予防又は遅延のための薬剤としての使用のための、本発明の第１の態様によるバクテリオファージ、及び／又は本発明の第２の態様によるポリペプチド、及び／又は本発明の第３の態様によるポリヌクレオチド、及び／又は本発明の第４の態様による核酸コンストラクト、及び／又は本発明の第５の態様によるベクター、及び／又は本発明の第６の態様による細胞、及び／又は本発明の第７の態様による組成物を提供する。本発明の第７の態様による組成物が、薬剤としての使用のためであるのが好ましい。この薬剤が、個体におけるサルモネラ関連状態の治療、予防又は遅延に対するものであるのが好ましい。本明細書において、個体とは、家畜を含む任意のヒト又は動物対象と定義される。本発明は、薬学的組成物又は医薬組成物にも関する。本明細書において、薬学的組成物又は医薬組成物とは、薬用の性質を有し、好ましくは抗菌性の性質を有し、より好ましくは特定の抗菌性の性質を有し、より一層好ましくはサルモネラ菌を特異的に溶菌する性質を有する、任意の物質と定義される。本発明は、感染性疾患を予防するための、薬学的組成物又は医薬組成物に関するのがさらに好ましい。本発明は、細菌、好ましくはサルモネラ属の細菌、より好ましくはサルモネラエンテリカ種の細菌により引き起こされる感染性疾患を予防するための、薬学的組成物又は医薬組成物に関するのが好ましい。前記感染性疾患がサルモネラ症であるのが好ましい。
【００５０】
本発明による薬学的組成物は、サルモネラに感染し、又はサルモネラに感染するリスクのある個体、好ましくは動物及びヒトを含む哺乳動物を治療するのに使用することができる。前記組成物は、経口、エアロゾル、又は肺に送達するための他の装置、鼻噴霧、静脈内、筋肉内、腹腔内、くも膜下腔内、膣内、直腸内、局所、腰椎穿刺、並びに脳及び／又は髄膜に対する直接適用を含む（これらに限定されない。）任意の適切な投与経路を用いて投与することができる。本発明による薬学的組成物は、個体又は細胞、前記個体の組織又は器官に、効果的な投与量を、１回、２回、３回以上、少なくとも１週間、１か月、６か月、１年以上の間、投与することができる。
【００５１】
一実施形態において、本発明の組成物は、家畜の飼料に、好ましくは、屠殺前の家畜に混合して、前記家畜におけるサルモネラを制御するものである。本発明の組成物を混合した試料を与えた家畜又は家畜に由来する肉は、本発明の組成物が非存在である飼料を与えた家畜又は家畜に由来する肉に比べて、存在するサルモネラ菌の量が低減しているのが好ましい。
【００５２】
別の一実施形態において、本発明の組成物は、本明細書で規定される対象の静脈内（ＩＶ）投与に用いるためのものである。例えば、本発明の第１の態様によるフリーファージ（ｆｒｅｅ  ｐｈａｇｅ）、本発明の第２の態様によるエンドリシン、及び／又は本発明の第６の態様によるエンドリシンを含む宿主細菌は、凍結乾燥された形態であってもよく、ＩＶ注射による投与の直前に溶解してもよい。本明細書において、有効投与量とは、後述の個体若しくは前記個体の細胞に存在するサルモネラ菌の量における低減、及び／又は後述の個体におけるサルモネラ関連状態の治療、予防若しくは遅延である、所望の効果を生成する投与量と定義される。バクテリオファージに対する投与の投与量は、約１０３から約１０１３ＰＦＵ／ｋｇ／日の範囲４０、好ましくは約１０１２ＰＦＵ／ｋｇ／日であることが企図される。エンドリシンに対する投与の投与量は、約２〜２０００ｎｇ／ｇ／日、好ましくは約２０〜２００ｎｇ／ｇ／日の範囲であることが企図される。バクテリオファージ、エンドリシン、及び／又はエンドリシンを含む宿主細菌を、サルモネラ菌の上首尾な排除が実現するまで、又はサルモネラモノサイトゲネス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の量が実質的に低減するまで、投与する。
【００５３】
本発明による薬学的組成物は、個体に、又は前記個体の細胞に、又は細胞株に、又は細胞フリーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系に存在するサルモネラ菌の量を低減し、好ましくは、サルモネラ菌の初期の量の９９％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％以下が依然として検出可能であることを意味する場合に、好ましくは、活性であり、機能的若しくは治療的に活性であり、あるいはサルモネラ関連状態を治療、予防及び／又は遅延することができるという。サルモネラ菌が検出されないのが好ましい。この段落において、「サルモネラ菌の量」の表現は、生存性のサルモネラ菌を意味するのが好ましい。サルモネラ菌は、免疫磁気分離法などのサルモネラ特異的抗体を用いた免疫組織学的技術、凝集及び酵素結合免疫測定法、免疫クロマトグラフィー法、若しくは蛍光検出、キシロース−リジン−デソキシコレート（ＸＬＤ）などの選択培地上で特異的に濃縮する増殖アッセイ、及び／又はＰＣＲ若しくはハイブリダイゼーションなどのＤＮＡ技術など、当業者に知られている標準的な技術を用いて検出することができる。生存性のサルモネラ菌は、微生物学的細菌培養技術及び／又は細菌のｍＲＮＡに対してアッセイするためのリアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応など、当業者に知られている標準的技術を用いて検出することができる。
【００５４】
サルモネラ菌の量のパーセント値における低減は、試料又は個体の組織若しくは細胞において、本発明の前記組成物又はポリペプチドで処置する前の前記試料又は個体に存在する量に比較することにより評価するのが好ましい。あるいは、比較は、処置が局所的である場合、本発明による前記薬学的組成物で未だ処置していない、試料又は前記個体の組織若しくは細胞で行うことができる。
【００５５】
第９の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるバクテリオファージ、及び／又は本発明の第２の態様によるポリペプチド、及び／又は本発明の第３の態様によるポリヌクレオチド、及び／又は本発明の第４の態様による核酸コンストラクト、及び／又は本発明の第５の態様によるベクター、及び／又は本発明の第６の態様による細胞、及び／又は本発明の第７の態様による組成物の、好ましくは抗菌剤としての、より好ましくは食品保存剤又は殺菌剤としての、好ましくは細菌を制御するための、好ましくは前記細菌、好ましくはサルモネラ属の細菌、より好ましくはサルモネラエンテリカ種の細菌を溶菌することによる使用を提供する。バクテリオファージ、エンドリシン、及び／又は前記バクテリオファージ若しくはエンドリシンを含む細胞、又は本発明による組成物を用いて、サルモネラ菌の計数値を低減し、及び／又は食品製品（これに限定されないが、乳業におけるものを含む。）において、同様に食品製品を加工する食品加工工場において、例えば、加工装置上及び食品産業施設の他のサイト上で（例えば食品貯蔵容器）サルモネラ菌の増殖を最初に予防するのが好ましい。
【００５６】
抗菌剤としての使用のための、本発明の第１の態様によるバクテリオファージ、及び／又は本発明の第２の態様によるポリペプチド、及び／又は本発明の第３の態様によるポリヌクレオチド、及び／又は本発明の第４の態様による核酸コンストラクト、及び／又は本発明の第５の態様によるベクター、及び／又は本発明の第６の態様による細胞、及び／又は本発明の第７の態様による組成物は、これらに限定されないが、前記バクテリオファージ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸コンストラクト、ベクター、細胞又は組成物を、混合し、噴霧し又は直接適用することを含む数々の手段により、食品製品上に若しくは食品製品中に、及び／又は食品加工工場内の種々の物理的なサイト中の食品加工装置の上若しくは中に適用される。
【００５７】
さらなる一実施形態において、本発明の第２の態様によるポリペプチドは、本発明の第６の態様による細胞から単離することができ、又は本発明の第２の態様によるポリペプチドを含む本発明の第６の態様による細胞は、前記ポリペプチドを単離せずに直接適用又は投与することができる。例えば、本発明のポリペプチドを生成する細胞を、対象（ヒト若しくは動物）に投与してもよく、又は本発明のポリペプチドが食品中に分泌される表面に、表面上に若しくは対象の腸管中に適用してもよい。本発明のポリペプチドを、次いで、この環境に存在する細菌、好ましくはサルモネラ属の細菌、より好ましくはサルモネラエンテリカ種の細菌の細胞に結合させ、任意選択により溶菌させることができる。本明細書で規定される適用は、その他の場合には存在するサルモネラ菌の数を大幅に低減する。
【００５８】
一実施形態において、本発明の食品保存剤又は殺菌剤は、１つ又は複数のさらなる有効成分と組み合わせて用いられる。本明細書において、有効とは、好ましくは、本明細書で先に規定されたＯｍｐＣ及び／又はＬＰＳ結合性及び／又は溶菌活性を示すこと、又は任意のそのような活性を補助及び／又は増強することと定義される。本発明内で、有効成分はまた、サルモネラ以外の１つ又は複数の他の原核生物、好ましくは病原性原核生物、より一層好ましくは病原性細菌、より一層好ましくは細菌性食品由来病原体、例えば、これらに限定されないが、カンピロバクタージェジュニ、ウェルシュ菌、大腸菌、セレウス菌、リステリアモノサイトゲネス、シゲラ、黄色ブドウ球菌、ブドウ球菌腸炎菌、レンサ球菌、コレラ菌、腸炎ビブリオ菌、ビブリオバルニフィカス、エルシニアエンテロコリティカ、及び仮性結核菌に対する溶菌活性を示すことが当技術分野において知られている成分も含む。前記有効成分が、その他の場合に存在する食品由来病原体の数の著しい低下をもたらすのに、当技術分野で知られている濃度において存在するのが好ましい。前記１つ又は複数の付加的な有効成分が、さらなるバクテリオファージ、静菌剤、殺菌剤、抗生物質、界面活性剤及び／又は酵素からなる群から選択されるのが好ましい。本発明の抗生物質は、抗生物質及び化学療法剤を含み、また、バンコマイシン、ナイシン、ダノフロキサシン及びネオマイシンを含む（これらに限定されない。）当技術分野において知られている任意の抗生物質であり得る。本発明の組成物において有用な酵素は、これらに限定されないが、生物膜（例えば、食品加工装置に見出される生物膜）を分解するのに助けとなる酵素、例えば、これらに限定されないが、多糖解重合酵素及びプロテアーゼが含まれる。本発明の組成物において有用な界面活性剤は、バクテリオファージが種々の表面にわたって適切に分布するように表面を湿潤する助けとなり、サルモネラがバクテリオファージに接近できるように汚れを溶解し除去する助けとなる。適切な界面活性剤には、これらに限定されないが、ポリソルベート（ｔｗｅｅｎ）８０、２０及び８１並びにＤｏｂａｎｏｌｓ（Ｓｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．ＲＴＭ）が含まれる。
【００５９】
本発明による組成物におけるさらなるバクテリオファージは、本発明のバクテリオファージ以外の、文献において知られている任意のファージであり得る。そのようなさらなるバクテリオファージには、これらに限定されないが、ミオウイルス、シホウイルス及びポドウイルスからなる、カウドウイルス目のテイルドファージが含まれるのが好ましい。前記さらなるバクテリオファージが、広い宿主範囲のファージＦｅｌｉｘＯ１であるのが最も好ましい。ＦｅｌｉｘＯ１及び本発明のバクテリオファージは、大部分重複するが、それにもかかわらず相補的な宿主範囲を示す。十分に研究された広い宿主範囲のサルモネラファージＦｅｌｉｘＯ１と合わせて、本明細書において非限定的に列挙する、種々の応用においてサルモネラ菌を打ち負かすのに唯一有用である、本発明のバクテリオファージとＦｅｌｉｘＯ１の組合せを作成することにより、殆んど完全な宿主範囲を実現することができる。
【００６０】
さらに、ファージＦｅｌｉｘＯ１及び本発明のバクテリオファージは、サルモネラ細胞上に異なる受容体を有する（それぞれリポ多糖、すなわちＬＰＳ及びＯｍｐＣ）ため、２つのファージのうち１つに対する耐性をもたらす変異でも、依然として細胞は他のファージに感受性である。
【００６１】
さらに別の一実施形態において、本発明は、本発明の第１の態様によるバクテリオファージ、及び／又は本発明の第２の態様によるポリペプチド、及び／又は本発明の第３の態様によるポリヌクレオチド、及び／又は本発明の第４の態様による核酸コンストラクト、及び／又は本発明の第５の態様によるベクター、及び／又は本発明の第６の態様による細胞、及び／又は本発明の第７の態様による組成物の、細菌を検出するための、より好ましくはサルモネラ属の細菌、より好ましくはサルモネラエンテリカ種の細菌を検出するための使用に関する。前記バクテリオファージ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸コンストラクト、ベクター、細胞及び／又は組成物を、診断用途において用いるのが好ましい。前記バクテリオファージ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸コンストラクト、ベクター、細胞及び／又は組成物は、他の検出試薬と一緒に用いられることが可能である。
【００６２】
第１０の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるバクテリオファージ、及び／又は本発明の第２の態様によるポリペプチド、及び／又は本発明の第３の態様によるポリヌクレオチド、及び／又は本発明の第４の態様による核酸コンストラクト、及び／又は本発明の第５の態様によるベクター、及び／又は本発明の第６の態様による細胞、及び／又は本発明の第７の態様による組成物の、薬剤、好ましくは本発明の第８の態様による個体におけるサルモネラ関連状態の治療、予防又は遅延のための薬剤を製造するための使用に関する。
【００６３】
第１１の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるバクテリオファージ、及び／又は本発明の第２の態様によるポリペプチド、及び／又は本発明の第３の態様によるポリヌクレオチド、及び／又は本発明の第４の態様による核酸コンストラクト、及び／又は本発明の第５の態様によるベクター、及び／又は本発明の第６の態様による細胞、及び／又は本発明の第７の態様による組成物を投与することを含む、個体におけるサルモネラ関連状態の治療、予防又は遅延のための方法を提供する。
【００６４】
本発明が、感染性疾患の治療、予防又は遅延の方法を提供するのが好ましい。本発明が、細菌、好ましくはサルモネラ属の細菌、より好ましくはサルモネラエンテリカ種の細菌により引き起こされる感染性疾患の治療、予防又は遅延の方法に関するのがより好ましい。個体におけるサルモネラ関連状態の治療、予防又は遅延の方法も好ましい。本明細書において、個体とは、家畜を含む任意のヒト又は動物対象と定義される。前記感染性疾患がサルモネラ症であるのが好ましい。
【００６５】
本発明の治療、予防又は遅延の方法において、これらに限定されないが、経口、エアロゾル、又は肺に送達するための他の装置、鼻噴霧、静脈内、筋肉内、腹腔内、くも膜下腔内、膣内、直腸内、局所、腰椎穿刺、並びに脳及び／又は髄膜に対する直接適用を含む任意の適切な投与経路を用いることができる。本発明による治療、予防又は遅延の前記方法は、本発明の第１の態様によるバクテリオファージ、及び／又は本発明の第２の態様によるポリペプチド、及び／又は本発明の第３の態様によるポリヌクレオチド、及び／又は本発明の第４の態様による核酸コンストラクト、及び／又は本発明の第５の態様によるベクター、及び／又は本発明の第６の態様による細胞、及び／又は本発明の第７の態様による組成物を、本明細書で規定される個体又は前記個体の細胞、組織若しくは器官に、有効な投与量を、１回、２回、３回以上、少なくとも１週間、１か月、６か月、１年以上の間投与することを含み得る。
【００６６】
一実施形態において、本発明の治療、予防又は遅延の方法は、本発明の第１の態様によるバクテリオファージ、及び／又は本発明の第２の態様によるポリペプチド、及び／又は本発明の第３の態様によるポリヌクレオチド、及び／又は本発明の第４の態様による核酸コンストラクト、及び／又は本発明の第５の態様によるベクター、及び／又は本発明の第６の態様による細胞、及び／又は本発明の第７の態様による組成物を、家畜におけるサルモネラを制御するために、家畜の飼料に、好ましくは屠殺前の家畜に、混合することを包含する。本発明の組成物を混合した試料を与えた家畜又は家畜に由来する肉は、本発明の組成物が非存在である飼料を与えた家畜又は家畜に由来する肉に比べて、存在するサルモネラ菌の量が低減しているのが好ましい。
【００６７】
別の一実施形態において、本発明の治療、予防又は遅延の方法は、本明細書で規定される対象の静脈内（ＩＶ）投与を包含する。例えば、本発明の第１の態様によるフリーファージ、本発明の第２の態様によるエンドリシン、及び／又は本発明の第６の態様によるエンドリシンを含む宿主細菌は、凍結乾燥された形態であってもよく、ＩＶ注射による投与の直前に溶解してもよい。本明細書において、有効投与量とは、後述の個体若しくは前記個体の細胞に存在するサルモネラ菌の量における低減、及び／又は後述の個体におけるサルモネラ関連状態の治療、予防若しくは遅延である、所望の効果を生成する投与量と定義される。バクテリオファージに対する投与の投与量は、約１０３から約１０１３ＰＦＵ／ｋｇ／日の範囲４０、好ましくは約１０１２ＰＦＵ／ｋｇ／日であることが企図される。エンドリシンに対する投与の投与量は、約２〜２０００ｎｇ／ｇ／日、好ましくは約２０〜２００ｎｇ／ｇ／日の範囲であることが企図される。バクテリオファージ、エンドリシン及び／又はエンドリシンを含む宿主細菌を、サルモネラ菌の上首尾な排除が実現するまで、又はサルモネラモノサイトゲネスの量が実質的に低減するまで投与する。
【００６８】
本発明の治療、予防又は遅延の方法は、本発明による薬学的組成物は、個体に、又は前記個体の細胞に、又は細胞株に、又は細胞フリーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系に存在する、サルモネラ菌の量を低減する場合に効果的であると言われるのが好ましく、サルモネラ菌の初期の量の９９％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％以下が依然として検出可能であり、又は本発明の治療、予防若しくは遅延の方法が提供されない場合に存在することを意味するのが好ましい場合に、効果的であると言われるのが好ましい。サルモネラ菌が検出されないのが好ましい。この段落において、「サルモネラ菌の量」の表現は、生存性のサルモネラ菌を意味するのが好ましい。サルモネラ菌は、免疫磁気分離法などのサルモネラ特異的抗体を用いた免疫組織学的技術、凝集及び酵素結合免疫測定法、免疫クロマトグラフィー法、又は蛍光検出；キシロース−リジン−デソキシコレート（ＸＬＤ）などの選択培地上で特異的に濃縮する増殖アッセイ；及び／又はＰＣＲ若しくはハイブリダイゼーションなどのＤＮＡ技術など、当業者に知られている標準的な技術を用いて検出することができる。生存性のサルモネラ菌は、微生物学的細菌培養技術及び／又は細菌のｍＲＮＡに対してアッセイするためのリアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応など、当業者に知られている標準的技術を用いて検出することができる。
【００６９】
サルモネラ菌の量のパーセント値における低減は、試料、又は個体の組織若しくは細胞において、本発明の前記組成物又はポリペプチドで処置する前の前記試料又は個体に存在する量に比べることにより評価するのが好ましい。あるいは、比較は、処置が局所的である場合、本発明による前記薬学的組成物で未だ処置していない試料又は前記個体の組織若しくは細胞で行うことができる。
【００７０】
第１２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるバクテリオファージ、及び／又は本発明の第２の態様によるポリペプチド、及び／又は本発明の第３の態様によるポリヌクレオチド、及び／又は本発明の第４の態様による核酸コンストラクト、及び／又は本発明の第５の態様によるベクター、及び／又は本発明の第６の態様による細胞、及び／又は本発明の第７の態様による組成物を、食品若しくは飼料製品と、食品若しくは飼料加工装置と、及び／又は食品若しくは飼料容器と接触させることを含む、食品若しくは飼料製品中、食品若しくは飼料加工装置上、及び／又は食品若しくは飼料加工装置中、食品若しくは飼料容器の上及び／又は食品若しくは飼料容器中の微生物汚染を制御するための方法に関する。
【００７１】
前記方法が、サルモネラ属の細菌、より好ましくはサルモネラエンテリカ種の細菌を制御するためであるのが好ましい。前記制御の方法が、サルモネラ菌の計数値を低減し、及び／又は食品製品（これに限定されないが、乳業におけるものを含む。）において、同様に食品製品を加工する食品加工工場において、例えば、加工装置上及び食品産業施設の他のサイト上で（例えば食品貯蔵容器）、サルモネラ菌の増殖を最初に予防するのが好ましい。本発明の方法は、本発明の第１の態様によるバクテリオファージ、及び／又は本発明の第２の態様によるポリペプチド、及び／又は本発明の第３の態様によるポリヌクレオチド、及び／又は本発明の第４の態様による核酸コンストラクト、及び／又は本発明の第５の態様によるベクター、及び／又は本発明の第６の態様による細胞、及び／又は本発明の第７の態様による組成物の、これらに限定されないが、前記バクテリオファージ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸コンストラクト、ベクター、細胞又は組成物を混合し、噴霧し又は直接適用することを含む数々の手段により、食品製品上に若しくは食品製品中に及び／又は食品加工工場内の種々の物理的なサイト中の食品加工装置の上若しくは中に適用することを包含する。
【００７２】
さらなる一実施形態において、本発明の第２の態様によるポリペプチドは、本発明の第６の態様による細胞から単離することができ、又は本発明の第２の態様によるポリペプチドを含む本発明の第６の態様による細胞を、前記ポリペプチドを単離せずに直接適用又は投与することができる。例えば、本発明のポリペプチドを生成する細胞を、対象（ヒト若しくは動物）に投与してもよく、又は本発明のポリペプチドが食品中に分泌される表面に、表面上に、又は対象の腸管中に適用してもよい。本発明のポリペプチドを、次いで、この環境に存在する細菌、好ましくはサルモネラ属の細菌、より好ましくはサルモネラエンテリカ種の細菌の細胞に結合させ、任意選択により溶菌させることができる。本明細書で規定される適用は、その他の場合には存在するサルモネラ菌の数を大幅に低減する。
【００７３】
第１３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるバクテリオファージ、本発明の第２の態様によるポリペプチド、本発明の第３の態様によるポリヌクレオチド、本発明の第４の態様による核酸コンストラクト、本発明の第５の態様によるベクター、本発明の第６の態様による細胞、及び／又は本発明の第７の態様による組成物を、サルモネラを含むことが疑われる試料と接触させることを含む、サルモネラの存在を検出するための方法に関する。好ましい一実施形態において、及び試料における変化を検出する。サルモネラ菌の量のパーセント値における低減は、試料又は個体の組織若しくは細胞において、組成物又は本発明のポリペプチドで処置する前の前記試料又は個体に存在する量と比べることにより評価するのが好ましい。あるいは、処置が局所的である場合は、本発明による前記薬学的組成物で未だ処置していない試料又は前記個体の組織若しくは細胞と、比較を行ってもよい。前記試料は、食品製品若しくは食品の試料でも、又は固体表面、好ましくは食品製品が加工若しくは貯蔵される固体表面のスワブであってもよい。
【００７４】
本発明のバクテリオファージは、食品上（又は食品内）に存在するサルモネラ菌、及び食品を処理加工している食品加工工場の装置若しくは一般的環境に又は食品の貯蔵に用いられる容器上に存在するサルモネラ菌、及びサルモネラに感染した動物におけるサルモネラ菌を同定するのに用いられる。当業者に知られている任意の適切な方法を、本明細書において意味する検出に用いることができる。サルモネラに特異的である本発明のバクテリオファージを用いて、組換えＤＮＡベクターを調製する方法を用いるのが好ましい。ベクターには、サルモネラ菌の遺伝子産物ではない１つ又は複数の検出可能なタンパク質の発現をコードするＤＮＡを含む遺伝子系が含まれる。ＤＮＡベクターは、サルモネラ属の細菌に感染し、遺伝子系を細菌に伝達する。検出可能なタンパク質が細菌により発現され、検出可能なタンパク質が検出されればサルモネラ属の細菌の存在が指摘される。
【００７５】
サルモネラ属の細菌の存在を検出するには、マーカー遺伝子を用いる。マーカー遺伝子は、細胞を適切な宿主細胞のベクターによって感染させ、引き続きマーカー遺伝子の発現に適する条件下で培養した時に検出することができる遺伝子である。マーカー遺伝子は、サルモネラ属の細菌に生じないものであり、組換え技術を用いて、ベクター、本発明のバクテリオファージ中に挿入されるものであるのが好ましい。そのような遺伝子及びその遺伝子産物は当技術分野において知られており、ビブリオ属などの、種々の発光細菌におけるバリアントに生じるｌｕｘ遺伝子などの生物発光タンパク質が含まれる。ｌｕｘ遺伝子を組み入れることで、発光の測定による検出が可能となる。ｌｕｘ遺伝子の一例は、ビブリオハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）からのｌｕｘＡＢ遺伝子である。他の適切なタンパク質には、これらに限定されないが、ルシフェラーゼ、及び緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質が含まれる。
【００７６】
検出反応は、これらに限定されないが、試験用ストリップを含む固体表面上で起こり得る。この実施形態において、マーカー遺伝子を含むベクターを、試料適用ゾーンに、又は試料適用ゾーンから下流に可逆的に固定してもよい。あるいは、ベクターを、試験用ストリップ上に適用する前に、試料とインキュベートしてもよい。抗サルモネラ抗体を、ベクター及び試料適用ゾーンから下流に不可逆的に固定化する。サルモネラを含む試料が適用されると、ベクターがサルモネラに感染し、検出可能なタンパク質が発現される。試料が試験用ストリップを移動すると、サルモネラは抗サルモネラ抗体により固定化される。次いで、マーカータンパク質が、固定化されたサルモネラにおいて検出される。
【００７７】
さらなる一態様において、本発明は、キットオブパーツ、好ましくはサルモネラを検出するためのキットオブパーツであって、本発明によるバクテリオファージ、ポリペプチド若しくはそのフラグメント、ポリヌクレオチド若しくはそのフラグメント、核酸コンストラクト、ベクター、細胞、及び／又は組成物を含み、検出試薬、標識化試薬、対照飼料、対照データ、使用説明書、ハイブリダイゼーション試薬若しくは増幅試薬、及び容器の少なくとも１つをさらに含むキットオブパーツを提供する。
【００７８】
定義：
本明細書において、「配列同一性」とは、配列を比較することにより決定される、２つ以上のアミノ酸（ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質）配列間、又は２つ以上の核酸（ヌクレオチド、ポリヌクレオチド）配列間の関係と定義される。当技術分野において、「同一性」はまた、場合に応じて、一続きのアミノ酸又はヌクレオチド配列の間の適合により決定されるように、アミノ酸間又はヌクレオチド配列間の配列の関連性の度合いを意味する。本発明の範囲内で、特定の配列との配列同一性は、前記特定のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の全体の長さにわたる配列同一性を意味するのが好ましい。本明細書に提供する配列情報は、誤って同定されたベースを含むことを必要とするほど狭義に解釈してはならない。当業者であれば、このように誤って同定されたベースを同定することができ、そのような誤りを修正する方法を知っている。
【００７９】
２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのペプチド又はポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されているアミノ酸置換を、第２のペプチド又はポリペプチドの配列と比較することにより決定される。好ましい一実施形態において、同一性又は類似性は、本明細書で同定する配列番号全体にわたって算出される。「同一性」及び「類似性」は、これらに限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．編集、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．、及びＧｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｅ、Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；並びにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．編集、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年；並びにＣａｒｉｌｌｏ、Ｈ．、及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ．、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８巻：１０７３頁（１９８８年）に記載されているものを含む公知の方法によって容易に算出することができる。
【００８０】
同一性を決定するのに好ましい方法は、試験する配列間に最大の適合をもたらすようにデザインされている。同一性及び類似性を決定するための方法は、公的に入手できるコンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性及び類似性を決定するのに好ましいコンピュータプログラム方法には、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２巻（１）：３８７頁（１９８４年））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）が含まれる。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の供給源から公的に入手できる（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）。よく知られているＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、同一性を決定するのに用いることができる。
【００８１】
ポリペプチド配列比較に好ましいパラメータには以下が含まれる：Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４３〜４５３頁（１９７０年）；Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｔｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、８９巻：１０９１５〜１０９１９頁（１９９２年）からのＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＳＵＭ６２；Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ：１２；及びＧａｐ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ：４。これらのパラメータで有用なプログラムは、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにある、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐからの「Ｏｇａｐ」プログラムとして公的に入手できる。上述のパラメータは、アミノ酸比較のためのデフォルトパラメータである（末端のギャップに対するペナルティはない）。
【００８２】
核酸比較に好ましいパラメータには以下が含まれる：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４３〜４５３頁（１９７０年）；比較マトリクス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；Ｇａｐペナルティ：５０；Ｇａｐ長ペナルティ：３。Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓにある、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐからＧａｐプログラムとして入手できる。上記に示すのは、核酸比較用のデフォルトパラメータである。
【００８３】
当業者には明らかである通り、任意選択により、アミノ酸類似性の度合いを決定する上で、当業者であれば、いわゆる「保存的な」アミノ酸置換も考慮に入れることもできる。保存的なアミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群はセリン及びスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン及びヒスチジンであり、イオウ含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換の群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書に開示するアミノ酸配列の置換のバリアントは、開示する配列における少なくとも１個の残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されているものである。アミノ酸の変更が保存的であるのが好ましい。天然に存在するアミノ酸各々に対する好ましい保存的置換は以下の通りである：ｓｅｒに対してａｌａ、ｌｙｓに対してａｒｇ、ｇｌｎ又はｈｉｓに対してａｓｎ、ｇｌｕに対してａｓｐ、ｓｅｒ又はａｌａに対してｃｙｓ、ａｓｎに対してｇｌｎ、ａｓｐに対してｇｌｕ、ｐｒｏに対してｇｌｙ、ａｓｎ又はｇｌｎに対してｈｉｓ、ｌｅｕ又はｖａｌに対してｉｌｅ、ｉｌｅ又はｖａｌに対してｌｅｕ、ａｒｇに対してｌｙｓ、ｇｌｎ又はｇｌｕ、ｌｅｕ又はｉｌｅに対してｍｅｔ、ｍｅｔ、ｌｅｕ又はｔｙｒに対してｐｈｅ、ｔｈｒに対してｓｅｒ、ｓｅｒに対してｔｈｒ、ｔｙｒに対してｔｒｐ、ｔｒｐ又はｐｈｅに対してｔｙｒ、及びｉｌｅ又はｌｅｕに対してｖａｌ。
【００８４】
ポリヌクレオチドはヌクレオチド配列によって表される。ポリペプチドはアミノ酸配列によって表される。核酸コンストラクトとは、天然に存在する遺伝子から単離されたポリヌクレオチド、又は別の方法では天然に存在しないやり方で組み合わされ若しくは並べられるポリヌクレオチドのセグメントを含むように修飾されているポリヌクレオチドと定義される。任意選択により、核酸コンストラクトに存在するポリヌクレオチドは、細胞において又は対象において前記ペプチド又はポリペプチドの生成又は発現を指示する１つ又は複数の制御配列に作動可能に連結される。
【００８５】
本明細書において、「異種性の配列」又は「異種性の核酸」の語は、前記第１のヌクレオチド配列の隣接の配列として作動可能に連結していることが天然に見出されないものである。本明細書において、「異種性」の語は「組換え」を意味し得る。「組換え」は、天然に一般的に見出されるものとは別の遺伝的実体を意味する。ヌクレオチド配列又は核酸分子に適用するものとして、これは、前記ヌクレオチド配列又は核酸分子が、クローニング、制限、及び／又はライゲーションステップ、並びに天然に見出される配列又は分子と別個であるコンストラクトの生成をもたらす他の手順の種々の組合せの産物であることを意味する。
【００８６】
本明細書において、「作動可能に連結される」とは、制御配列が、細胞及び／又は対象において本発明のペプチド又はポリペプチドの生成／発現を指示するように、制御配列が、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対する位置に適切に配置されている立体配置と定義される。
【００８７】
「作動可能に連結される」はまた、キメラのポリペプチドが細胞及び／又は対象においてコードされるように、配列が、機能的ドメインをコードする別の配列に対する位置に適切に配置されている立体配置を規定するのに用いてもよい。
【００８８】
発現は、これらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾及び分泌を含む、ペプチド又はポリペプチドの生成に関与する任意のステップを含むことが理解されよう。任意選択により、核酸コンストラクトに存在するヌクレオチド配列により表されるプロモーターは、本明細書において同定されるペプチド又はポリペプチドをコードする別のヌクレオチド配列に作動可能に連結している。
【００８９】
「形質転換」の語は、新たなＤＮＡ（すなわち、細胞にとって外来性のＤＮＡ）を組み入れた後、細胞に導入される、永続的な、又は一過性の遺伝子の変更を意味する。細胞が細菌細胞である場合、本発明において意図する通り、この語は通常、選択性の抗生物質耐性を抱え持つ、染色体外の、自己複製性のベクターを意味する。
【００９０】
発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順にかけると便利であり得、細胞及び／又は対象における本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現をもたらし得る、任意のベクターであり得る。本明細書において、「プロモーター」の語は、遺伝子の転写開始点の転写の方向に関して上流に位置する、１つ又は複数の遺伝子又は核酸の転写を制御するように機能する核酸フラグメントを意味する。これは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、転写開始点、並びに転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位、及びプロモーターからの転写の量を直接的又は間接的に調節するように作用することが当業者に知られている任意の他の配列のヌクレオチドを含む（これらに限定されない。）任意の他のＤＮＡ配列に対する結合部位の存在により同定される結合部位に関連する。本発明の文脈内で、プロモーターが、転写開始点（ＴＳＳ）のヌクレオチド−１で終わるのが好ましい。
【００９１】
本明細書において、「ポリペプチド」は、任意のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、遺伝子産物、発現産物又はタンパク質を意味する。ポリペプチドは、連続したアミノ酸からなる。「ポリペプチド」の語は、天然に存在する分子又は合成の分子を包含する。
【００９２】
本明細書において、「制御配列」の語は、ポリペプチドの発現に必要又は有利であるすべてのコンポーネントを含むものとする。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列から生じたものでも、又は外来性のものでもよい。そのような制御配列には、これらに限定されないが、リーダー、最適の翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋ、１９９１年；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻：１９８６７〜１９８７０頁に記載される）、ポリアデニレーション配列、プロ−ペプチド配列、プレ−プロ−ペプチド配列、プロモーター、シグナル配列及び転写ターミネーターが含まれる。最低で、制御配列は、プロモーター、並びに転写及び翻訳のストップシグナルを含む。
【００９３】
制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域との該制御配列のライゲーションを促進する特異的な制限部位を導入するためのリンカーとともに提供され得る。
【００９４】
制御配列は、核酸配列を発現するために宿主細胞により認識される核酸配列である適切なプロモーター配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を媒介する、転写制御配列を含む。プロモーターは、変異の、切断された及びハイブリッドのプロモーターを含む、細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であり得、細胞に対して相同又は非相同いずれかの、細胞外又は細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【００９５】
制御配列はまた、転写を終結することが宿主細胞により認識される配列である、適切な転写終結配列であってもよい。終結配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結している。本発明では、細胞において機能的である任意のターミネーターを使用することができる。
【００９６】
制御配列はまた、宿主細胞による翻訳にとって重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域である、適切なリーダー配列であってもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結している。本発明では、細胞において機能的である任意のリーダー配列を使用することができる。
【００９７】
制御配列はまた、核酸配列の３’末端に作動可能に連結している配列であり、転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞により認識される、ポリアデニレーション配列であってもよい。本発明では、細胞において機能的である任意のポリアデニレーション配列を使用することができる。
【００９８】
本明細書及び特許請求の範囲において、動詞「含む」（“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”）及びその活用は、この語の後に続く項目は含まれるが、特に言及されない項目は排除されないことを意味する、非限定的な意味で用いられる。さらに、動詞「からなる」（“ｃｏｎｓｉｓｔ”）は、本明細書で規定される、産物、又は組成物、又は核酸分子、又はペプチド、又は核酸コンストラクトのポリペプチド、又はベクター、又は細胞が、具体的に同定するもの以外の付加的なコンポーネントを含み得、前記付加的なコンポーネントは本発明の独特な特徴を改変しないことを意味する、「から本質的になる」によって置き換えることができる。さらに、不定冠詞「一つの」（“ａ”又は“ａｎ”）による構成要素の指示は、１つ及びたった１つの構成要素が存在することを文脈が明らかに要求しなければ、１つを超える構成要素が存在する可能性を排除するものではない。不定冠詞「一つの」（“ａ”又は“ａｎ”）は通常「少なくとも１つ」を意味する。
【００９９】
本明細書に引用する特許及び参考文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０１００】
以下の実施例は説明の目的で提供されるものにすぎず、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
本発明の実施形態は例えば下記実施形態１〜１５を含む。
実施形態１：
ミオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）の形態型群に属する単離されたバクテリオファージであって、下記特徴からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を含むバクテリオファージ。
・バクテリオファージのゲノムは少なくとも１００ｋｂｐである。
・バクテリオファージのゲノムは、配列番号３、５、７、９及び１１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む。
・バクテリオファージ受容体はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の外膜タンパク質Ｃである。
・バクテリオファージは、少なくとも１種のサルモネラ種に感染し、それを溶菌することができる。
実施形態２：
ファージＳ１６  ＣＢＳ１３０４９３である、実施形態１に記載の単離されたバクテリオファージ。
実施形態３：
実施形態１又は２に記載のバクテリオファージから得ることができるエンドリシン。
実施形態４：
配列番号１５に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するエンドリシン。
実施形態５：
配列番号３、５、７、９及び１１からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するロングテールファイバーポリペプチド。
実施形態６：
実施形態３〜５のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
実施形態７：
実施形態１若しくは２に記載のバクテリオファージ、実施形態３〜５のいずれかに記載のポリペプチド、又は実施形態６に記載のポリヌクレオチドを含む組成物であって、好ましくは抗菌性であり、好ましくは食品保存剤又は消毒剤である組成物。
実施形態８：
さらなるバクテリオファージ、静菌剤、殺菌剤、抗生物質、界面活性剤及び酵素からなる群から選択される付加的な有効成分をさらに含む、実施形態７に記載の組成物。
実施形態９：
実施形態１若しくは２に記載のバクテリオファージ、実施形態３〜５のいずれかに記載のポリペプチド、実施形態６に記載のポリヌクレオチド、及び／又は実施形態７若しくは８に記載の組成物の、抗菌剤、好ましくは食品保存剤又は消毒剤としての使用。
実施形態１０：
薬剤、好ましくは個体におけるサルモネラ関連状態の治療、予防又は遅延のための薬剤としての使用のための、実施形態１若しくは２に記載のバクテリオファージ、実施形態３〜５のいずれかに記載のポリペプチド、実施形態６に記載のポリヌクレオチド、及び／又は実施形態７若しくは８に記載の組成物。
実施形態１１：
薬剤、好ましくは個体におけるサルモネラ関連状態の治療、予防又は遅延のための薬剤を製造するための使用であって、実施形態１若しくは２に記載のバクテリオファージ、実施形態３〜５のいずれかに記載のポリペプチド、実施形態６に記載のポリヌクレオチド、及び／又は実施形態７若しくは８に記載の組成物の使用。
実施形態１２：
個体におけるサルモネラ関連状態の治療、予防又は遅延のための方法であって、実施形態１若しくは２に記載のバクテリオファージ、実施形態３〜５のいずれかに記載のポリペプチド、実施形態６に記載のポリヌクレオチド、及び／又は実施形態７若しくは８に記載の組成物を個体に投与するステップを含む方法。
実施形態１３：
食品又は飼料の製品中、食品又は飼料の加工装置の上及び／又は中、食品又は飼料の容器の上及び／又は中の微生物汚染を制御するための方法であって、実施形態１若しくは２に記載のバクテリオファージ、実施形態３〜５のいずれかに記載のポリペプチド、実施形態６に記載のポリヌクレオチド、及び／又は実施形態７若しくは８に記載の組成物を、食品若しくは飼料の製品、食品若しくは飼料の加工装置、及び／又は食品若しくは飼料の容器と接触させるステップを含む方法。
実施形態１４：
サルモネラの存在を検出するための方法であって、実施形態１若しくは２に記載のバクテリオファージ、実施形態３〜５のいずれかに記載のポリペプチド、実施形態６に記載のポリヌクレオチド、及び／又は実施形態７若しくは８に記載の組成物を、サルモネラを含むことが疑われる試料と接触させるステップと、試料における変化を検出するステップと、を含む方法。
実施形態１５：
サルモネラを検出するためのキットオブパーツであって、実施形態１若しくは２に記載のバクテリオファージ、実施形態３〜５のいずれかに記載のポリペプチド、実施形態７若しくは８に記載の組成物、及び／又は実施形態６に記載のポリヌクレオチド、又はそのフラグメントを含み、検出試薬、標識試薬、対照試料、対照データ、使用説明書、ハイブリダイゼーション試薬若しくは増幅試薬、及び容器のうちの少なくとも１つをさらに含むキットオブパーツ。
【０１０１】
配列：
0006351119.tif 000002
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を２番目のカラムにおけるカッコの中に示し、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の後にＳ１６遺伝子産物の連続番号を示す（表６を参照されたい）。さらに本明細書において、Ｓ１６のコード配列及び遺伝子産物を、そのＴ４対応物のｇｐ番号によって示す（例えば、Ｓ１６ｇｐ１６６はｇｐ３４としての適用におけるものを意味する）。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】Ｆｉｇ１：  Ｓ１６の透過型電子顕微鏡写真。Ａ：テールファイバーは、テールに沿って「積み込まれた」（“ｓｔｏｗｅｄ”）位置にある（矢印）。Ｂ：テールファイバーは拡張している。２部構造のファイバーは、「ニー」（“ｋｎｅｅ”）（矢印）により分割される近位及び遠位の部分からなることに留意されたい。Ｃ：収縮したテール及び拡張したテールファイバー。テールチューブ（矢印）が、ミオウイルス特有の形態学的特徴である収縮したテールシースから突出していることに留意されたい（ＴＥＭ、倍率５２０００倍、バーの長さは１００ｎｍであり、２％ＰＷＳ、Ｍａｘ  Ｐｌａｎｃｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｅｒｌｉｎ、ＧｅｒｍａｎｙのＤｒ．Ｒｕｄｉ  Ｌｕｒｚにより撮影された）。
【図２】Ｆｉｇ２：  Ｓ１６ＤＮＡの制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析。ゲノムは、高度に制限酵素耐性である。試験した３４個の酵素のうち、ＳｗａＩ、ＴａｑＩ、ＮｄｅＩ及びＳｓｐＩだけがＳ１６のゲノムＤＮＡを消化することができる。
【図３】Ｆｉｇ３：  Ｓ１６、Ｔ４及びＴ２間の配列の比較。矢印はアノテーションされたコード配列を表す。影付きは、タンパク質間の％アミノ酸配列同一性を示す。
【図４】Ｆｉｇ４：  ｇｐ３８アドヘシンタンパク質の系統樹。Ｓ１６ｇｐ３８は、Ｔ２様ファージと一緒に明らかに配置されるが、別々の枝を表す（ＵＰＧＭＡアルゴリズム、ブートストラップ複製１０００、ＣＬＣ  ｂｉｏ）。
【図５】Ｆｉｇ５：  ６５℃の、Ｓ１６＿ｇｐ３７の変性勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。数字は、６５℃での分におけるインキュベート時間に相当する。最後の試料は、ゲル上にローディングする１０分前に煮沸した。
【図６】Ｆｉｇ６：  ＨＧＦＰ＿ｇｐ３７結合アッセイの蛍光顕微鏡写真。１０ｍＭアラビノースで誘導した（Ｇ，Ｈ）Ｓ．Ｔｍ．ＤＴ７１５５ｗｔ（Ａ，Ｂ）、Ｓ．Ｔｍ．ＤＴ７１５５ΔｏｍｐＦ（Ｃ，Ｄ）、Ｓ．Ｔｍ．ＤＴ７１５５ΔｏｍｐＣ（Ｅ，Ｆ）及びＳ．Ｔｍ．ＤＴ７１５５ΔｏｍｐＣ：：ｏｍｐＣ（ＤＴ）の、位相差画像（Ａ，Ｃ，Ｅ及びＧ）及び蛍光画像（Ｂ，Ｄ，Ｆ及びＨ）。
【図７】Ｆｉｇ７：  Ｓ１６のＳ．Ｔｍ．ＤＴ７１５５に対する吸着。Ｓ１６の吸着は、外膜タンパク質Ｃ（ＯｍｐＣ）の存在又は非存在によって大幅に影響を受ける。Ａ：Ｓ．Ｔｍ．ＤＴ７１５５ｗｔ；Ｂ：Ｓ．Ｔｍ．ＤＴ７１５５ΔｏｍｐＣ；Ｃ：１０ｍＭアラビノースで誘導したＳ．Ｔｍ．ＤＴ７１５５ΔｏｍｐＣ：：ｏｍｐＣ（ＤＴ）；Ｄ：ＧＦＰ＿ｇｐ３７とプレインキュベートしたＳ．Ｔｍ．ＤＴ７１５５ｗｔ；Ｅ：ＧＦＰとプレインキュベートしたＳ．Ｔｍ．ＤＴ７１５５ｗｔ（値は３回の実験の平均を示し、エラーバーは相当する標準偏差を示す）。
【図８】Ｆｉｇ８：  Ｓ１６の大腸菌Ｋ−１２に対する吸着。大腸菌Ｋ−１２ΔｏｍｐＣにおけるｏｍｐＣ（ＤＴ）の発現は、ファージＳ１６の吸着を有意に増大するが、ｏｍｐＣ（Ｋ−１２）の発現は増大しない。Ａ：Ｓ．Ｔｍ．ＤＴ７１５５ｗｔ；Ｂ：大腸菌Ｋ−１２ｗｔ；Ｃ：１０ｍＭアラビノースで誘導した大腸菌Ｋ−１２ΔｏｍｐＣ：：ｏｍｐＣ（ＤＴ）；Ｄ：１０ｍＭアラビノースで誘導した大腸菌Ｋ−１２ΔｏｍｐＣ：：ｏｍｐＣ（ＤＴ）（値は３回の実験の平均を示し、エラーバーは相当する標準偏差を示す）。
【実施例】
【０１０３】
［実施例１］
材料及び方法：
菌株及びプラスミド：
この試験に用いた菌株及びプラスミドの概要を、表１及び表２に示す。宿主範囲の分析において用いたさらなる菌株を列挙し、表６に掲載する。細菌はすべて、別段の指摘がなければ、振盪機における試験管中、３７℃のＬＢ培地中で増殖させた。用いた抗生物質の濃度は以下の通りである：アンピシリン（Ａｍｐ、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ  ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）：１００μｇ／ｍｌ；クロラムフェニコール（Ｃｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）：２５μｇ／ｍｌ；カナマイシン（Ｋａｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）：液体培地用２００μｇ／ｍｌ及び寒天平板用５０μｇ／ｍｌ；テトラサイクリン（Ｔｅｔ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）：１８μｇ／ｍｌ。
【０１０４】
ファージの繁殖及び精製：
バクテリオファージを、二重寒天重層法（Ｇｒａｔｉａ、１９３６）により繁殖させた。４ｍｌ  ＬＣ軟寒天（７．５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、５ｇ／ｌ酵母エキス、１０ｇ／ｌトリプトン、１％グルコース、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２）を、細菌一夜培養物１００μｌ及びファージ希釈液１０μｌと混合し、ＬＢ底寒天平板（６ｇ／ｌ寒天）上に注いだ。平板を３０℃で一夜インキュベートした。セミコンフルエントの平板を、室温で５時間、ＳＭバッファー（５．８ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）５ｍｌで掻き取った。ＳＭバッファーを平板から回収し、ファージを０℃で一夜、ＰＥＧで沈殿させた（８％ＰＥＧ８０００Ｆｌｕｋａ；０．５Ｍ  ＮａＣｌ）。遠心分離後（１５分、１００００ｇ、４℃）、ファージをＳＭバッファー５ｍｌ中に再懸濁し、２回ＣｓＣｌ勾配で精製して（段階的勾配）、高度に純粋なファージ粒子を得た（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ、２００１年）。
【０１０５】
ファージＤＮＡの調製：
２倍のＣｓＣｌ勾配で精製したファージを、１０００倍過剰のＳＭバッファーに対して透析した。溶液を、３７℃で２０分間、ＲＮＡｓｅ（１０μｇ／ｍｌ）及びＤＮＡｓｅ（２０μｇ／ｍｌ）で処理した。２０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）及びプロテイナーゼＫ（５０μｇ／ｍｌ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を５６℃で１時間加えた後、ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ、２００１年）。
【０１０６】
制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析：
精製したファージＤＮＡ５００ｎｇを、少なくとも２０倍の過剰消化で、製造元の使用説明書に従って消化した。ＲＦＬＰパターンを電気泳動により分析した。表３は、用いた制限酵素を列挙したものである。
【０１０７】
１段階増殖曲線：
全ステップをＬＢ培地中３７℃で行った。一夜培養物をＬＢ培地中１：１００希釈し、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ６００）０．５に増殖させた。ＭＯＩ  ０．０１のファージを加え、混合し、５分間インキュベートした。この吸着ステップの後、懸濁液を、予め加温した培地で１００倍希釈し、引き続きプラーク形成単位（ＰＦＵ）を、標準軟寒天重層により５分ごとに決定した。
【０１０８】
形質導入アッセイ：
普遍形質導入の能力を、本発明者らが以下に記載する部位特異的変異誘発を用いて構築したサルモネラティフィムリウムの異なる２つの変異体である、ＤＴ７１５５：Δ１４９３：：Ｃｍｒ（Ｃｍ：クロラムフェニコール）及びΔＰｈｏＮ：：Ｋａｎｒ（Ｋａｎ：カナマイシン）を用いて試験した。ファージライセートをＣｍｒ株に対して調製し、Ｋａｎｒ株に感染させるのに用いた。培養物を、両方の抗生物質を含む平板上のコロニーの増殖に対して試験した。
【０１０９】
ゲノムのシーケンシング、アセンブリー、アノテーション、及び比較：
ファージＳ１６のゲノムのシーケンシングを、４５４パイロシーケンシング技術（ＦＬＸチタニウム試薬、ＧＡＴＣ  ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ、Ｋｏｎｓｔａｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により行った。配列を、ＧＳ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏアセンブラーソフトウエア（Ｎｅｗｂｌｅｒ、Ｖｅｒｓｉｏｎ２．３、Ｒｏｃｈｅ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、単一のコンティグに組み立てた。ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（Ｖｅｒｓｉｏｎ６．０、ＣＬＣ  ｂｉｏ）を用いてさらなる分析を行った。読み取り長さは平均３５８ｂｐであり、８６４ｂｐ及び３６ｂｐがそれぞれ最長及び最短の読みであった。ゲノムの平均適用範囲は８４．３８リードである（最小＝３１、最大＝１３０）。不明瞭なコンセンサスを有する遺伝子座をＰＣＲ増幅し、Ｓａｎｇｅｒシーケンシング（ＧＡＴＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ、Ｋｏｎｓｔａｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により確認した。Ｓ１６のゲノムの予備的なアノテーションを、「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｕｔｉｌｉｔｙ」（ＧＡＴＵ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｉｒｏｌｏｇｙ．ｃａ／ｇａｔｕで入手可能）、及びリファレンスとしてバクテリオファージＴ４完全ゲノム（ＮＣ＿０００８６６）を用いて行った（Ｔｃｈｅｒｅｐａｎｏｖら、２００６年）。アノテーションを手操作で洗練させた。推定上のｔＲＮＡを、ｔＲＮＡｓｃａｎ−ＳＥ  ｖ．１．２１（ｈｔｔｐ：／／ｌｏｗｅｌａｂ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｔＲＮＡｓｃａｎ−ＳＥ／で入手可能（Ｌｏｗｅ及びＥｄｄｙ、１９９７年））を用いてアノテーションした。アノテーションしたＳ１６のゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＨＱ３３１１４２の下で入手可能である。
【０１１０】
ホスト範囲分析：
乾燥ＬＢ寒天平板に対数期培養物４ｍｌを充満させ、過剰の培養物を除去し、３０℃で３０分間乾燥させた。＞１０１２ＰＦＵ／ｍｌのＣｓＣｌ保存液の１０−２から１０−７のファージ希釈液３μｌを平板上にスポットし、３０℃で一夜インキュベートした（スポットオンザローン（ｓｐｏｔ−ｏｎ−ｔｈｅ−ｌａｗｎ）法）。
【０１１１】
ＰＣＲ産物を用いた部位特異的変異誘発：
大腸菌及びサルモネラエンテリカ亜種エンテリカ（ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）における挿入変異株を、以前に記載されている通りに創製した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ、２０００年）。対象の遺伝子の最初の１８ヌクレオチド及び最後の３６ヌクレオチドが非改変のままであるような、相同の配列を選択した。残りの遺伝子を制限カセットにより置き換えた（すなわち、ΔｏｍｐＣ：：Ｋａｎｒ、又は短縮して単にΔｏｍｐＣ）。耐性のコロニーを、遺伝子座のサイズに対してスクリーニングした。陽性のクローンは、アンピシリン感受性について精製し、引き続き試験した単一のコロニーであった（ｐＫＤ４６の減少）。欠失変異体を、アラビノースにより誘導されるベクターｐＢＡＤ１８＿Ａｍｐｒ（（Ｇｕｚｍａｎら、１９９５）、Ｄｒ．Ｔｈｉｌｏ  Ｆｕｃｈｓ、ＴＵ  Ｍｕｎｉｃｈの厚意により提供された）上トランスの、Ｓ．Ｔｍ．ＤＴ７１５５（ｏｍｐＣ（ＤＴ））又は大腸菌Ｋ−１２（ｏｍｐＣ（Ｋ−１２））のいずれかのｏｍｐＣを補うことにより補完した。
【０１１２】
タンパク質の発現及び精製：
ファージＳ１６のロングテールファイバーを、ｐＨＧＦＰ  Ａｍｐｒベクター中にクローニングした（Ｌｏｅｓｓｎｅｒら、２００２年）。このプラスミドにより、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）による転写の誘導が可能になり、このプラスミドはＮ末端６×Ｈｉｓタグ（本発明者らは、６×Ｈｉｓ−タグを頭文字Ｈと略す；すなわち、ＨＧＦＰ）を含む。ｇｐ３７特異的シャペロンｇｐ３８を、バイシストロニック転写物におけるロングテールファイバー遺伝子の下流にクローニングした（１３ＲＢＳとしてＡＧＧＡＧＧを用いて）。一般的な三量体形成シャペロンであるｇｐ５７Ａを、アラビノース誘導性プロモーター下、第２のプラスミド１４（ｐＢＡＤ１８＿Ｃｍｒ）上に配置した（（Ｇｕｚｍａｎら、１９９５年）、Ｄｒ．Ｔｈｉｌｏ  Ｆｕｃｈｓ、ＴＵ  Ｍｕｎｉｃｈの厚意により提供された）。用いた発現株は、大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）であった。タンパク質の発現を０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ａｘｏｎ  Ｌａｂ、Ｂａｄｅｎ−Ｄａｔｔｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で誘導し、２０℃で一夜行った。精製を、低密度Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて重力流固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により行った。
【０１１３】
統計学的分析：
データの値を平均し、標準偏差を算出した。スチューデントのｔ検定（片側、不等分散の２標本、有意水準α＝０．０５）のＰ値を決定した（Ｅｘｃｅｌ  ２０１０、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）。
【０１１４】
ＧＦＰ融合タンパク質との結合アッセイ：
結合アッセイを、対数期培養物を用いて行った。０．５ｍｌをペレット化し、ＳＭバッファー２００μｌに再懸濁した。タンパク質を遠心分離して凝集物を除去し（３０分、３１０００ｇ、４℃）、タンパク質およそ１μｇを細胞に加えた。室温で１０分インキュベートした後、細胞をＳＭバッファーで洗浄した。倍率１００倍のＺｅｉｓｓ  ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡を、蛍光顕微鏡観察に用いた（励起：ＢＰ  ４５０〜４９０ｎｍ、ＦＴ  ５１０ｎｍ、発光：ＬＰ  ５２０ｎｍ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０１１５】
プルダウンアッセイ：
一夜培養物１ｍｌをＯＤ６００＝１．０±０．０５に調節し、ファージ溶液（１０９ｐｆｕ／ｍＬ）１０μｌを加えた。試料を室温で１０分間インキュベートし、引き続き遠心分離した（１０分、２００００ｇ）。上清を除去し、ｐｆｕを３回ずつ測定した。ＬＢ対照に対する吸着のパーセント値を決定した。ＨＧＦＰ＿ｇｐ３７によるプルダウンアッセイの阻害を、以下の改変で決定した：ファージを加える前に、細胞を、ＨＧＦＰ＿ｇｐ３７およそ２０μｇと１０分間プレインキュベートした。また、ファージとのインキュベートを、試験管の３回転倒に減らしたが、これにより陽性対照の結合が低下することはなかった。
【０１１６】
結果：
ファージＳ１６はＴ４様ミオウイルスである：
ファージＳ１６はカウドウイルス目に属する。これの収縮性のテールは、ミオウイルス科の決定的な形態学的特徴である（Ｆｉｇ１）。さらに、Ｓ１６は、長さ１１７．２±４．１ｎｍ、及び幅９１．５±２．８ｎｍ（偏平−偏平）のわずかに伸びたヘッドを特徴とする（ｎ＝１０）。このテールの長さの平均は１２０．２±２．８ｎｍである（ｎ＝１０）。このように、これは形態学的にファージＴ４に非常に似ており、ファージＴ４のヘッドは長さ１２０ｎｍ及び幅８５ｎｍで、テールは長さ１１３ｎｍである（Ｔｅｔａｒｔら、２００１年；Ｃａｌｅｎｄａｒ、２００６年）。Ｓ１６は、ヘッドの形態学のＡ２群内に配置することができ、この群は、知られているすべてのテールファージのおよそ３．２％を構成する（Ａｃｋｅｒｍａｎｎ、１９９８年）。Ｓ１６のベースプレートをＦｉｇ１Ａに示し、テールのシースディスク（ｓｈｅａｔｈ  ｄｉｓｋ）はＦｉｇ１Ｂにおいて最も明瞭に見ることができる。カラー（ｃｏｌｌａｒ）及びテールシース（ｔａｉｌ  ｓｈｅａｔｈ）の収縮はＦｉｇ１Ｃにおいて見ることができる。ロングテールファイバーをそれが貯蔵される位置に保持するウイスカー（ｗａｃ）は、電子顕微鏡写真で観察することはできない。
【０１１７】
ファージＳ１６はサルモネラに特異的に感染する：
ファージＳ１６の感染を、サルモネラ（３２株、及びＳ．Ｔｍ  ＬＴ２のＬＰＳ変異体１４株）並びに大腸菌（６株プラス表４にはない非病原性単離株２５株）に対して試験した。Ｓ１６は、スポットすると、サルモネラ臨床分離株１株以外のすべてを溶菌することができる。３２分離株中２５株に単一のプラークが観察された。大腸菌はこのファージに感受性ではないことが見出された。Ｓ．Ｔｍ．ＬＴ２のＬＰＳノックアウト変異体は、１つを除いてすべて感染した。内部コアの２−ケト−デオキシ−ｄ−オクタノエート（ＫＤＯ）残基の後のいかなる糖を完全に欠く再変異（Ｒｅ−ｍｕｔａｎｔ）株でさえ感受性であった。Ｒｄ２変異体は、Ｓ１６により感染されなかった。より長いＬＰＳコアタイプ及びより短いＬＰＳコアタイプの両方とも感染され得、ＬＰＳ変異株は同質遺伝子でなければならないため、この結果は極めて不可解である。ファージＳ１６は、サルモネラに対して非常に広範に、かつ特異的に有効であることが証明されている。
【０１１８】
Ｓ１６は速やかに複製する：
増殖のパラメータは、ファージの特徴付けに不可欠な部分である。上記のように、１段階の増殖曲線を３回ずつ行った。ファージのバーストが、合計インキュベート時間２０分後に開始し、インキュベート３０分から３５分に終了した。３回の独立した実験の平均のバーストは、細胞１個あたり３７．２±１．３粒子であった。増殖速度は、このように、他のＴ偶数系ファージに匹敵する（Ｔ２及びＴ４の両方に対して潜伏期２３分）。しかし、バーストサイズは、関連のファージに対して報告されているよりも低い（Ｔ２：１３５、Ｔ４：１５０（Ｄｅ  Ｐａｅｐｅ及びＴａｄｄｅｉ、２９、２００６年））。
【０１１９】
Ｓ１６は宿主のＤＮＡを形質導入しない：
ファージの中には、自身のＤＮＡだけではなくファージの宿主生物のＤＮＡもパッケージするものもあることが知られている。このプロセスは形質導入と呼ばれ、遺伝子水平伝播の主な源である（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ及びＭａｕｒｅｒ、１９９１年）。ファージを生物的防除剤として使用することを究極的に意図するのであれば、形質導入は排除しなければならない（Ｈａｇｅｎｓ及びＬｏｅｓｓｎｅｒ、２０１０年）。陽性対照としてファージＰ２２（ＨＴ変異体（Ｓｃｈｍｉｅｇｅｒ、１９７２年））を用いた。このファージでは、Ｃｍ及びＫａｎの両方に耐性であるコロニーが容易に観察された。両方の抗生物質に耐性であるコロニーは、Ｓ１６では観察されなかった。したがって、これは、試験した条件下で非形質伝達性のファージである。
【０１２０】
ゲノムのシーケンシング及びアセンブリー：
Ｓ１６のゲノムは長さ１６０．２２１ｂｐであり、Ｇ＋Ｃ含量３６．９％を特徴とするが、その宿主はＧ＋Ｃ含量５２．２％を特徴とする。Ｓ１６はまた、高度に制限酵素耐性であり、試験した制限酵素３４個中４個しかＳ１６  ＤＮＡを消化することができない（Ｆｉｇ２）。Ｓ１６のゲノムの全体的な概観及びＴ４のアラインメントをＦｉｇ３に示す。コード配列（ＣＤＳ）１８９個及びｔＲＮＡ遺伝子３個（Ｍｅｔ、Ｇｌｎ及びＡｒｇ、並びにそれぞれアンチコドンＣＡＴ、ＴＴＧ及びＴＣＴ）をアノテーションした。Ｓ１６はＴ４に似ているため、本発明者らは、すべてのＣＤＳの６１．３８％に機能を割り当てることができた。他の３８．６２％は、Ｓ１６のみにアノテーションされた仮想（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ）タンパク質、及び他のＴ４様ファージに近い相同体を有するが割り当てられた機能がないその他の両方を表す。ＣＤＳは平均長さ７０４ヌクレオチドであり、１ｋｂあたり１．１８ＣＤＳである。推定コード能力（ｃｏｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）は８３％である。アノテーションされた開始コドンの利用頻度は、ＡＴＧ（８８．３６％）、ＴＴＧ（４．７６％）、ＡＴＴ（２．６５％）、ＧＴＧ（２．１２％）、ＡＴＣ及びＣＴＧ各１．０６％である。Ｓ１６はＴ４様ウイルスに属する。最近、遺伝子がゲノムレベルで見直され、１セットのコア遺伝子が規定されている（Ｐｅｔｒｏｖら、２０１０年）。Ｓ１６とＴ４との間のコアゲノムタンパク質の比較を表５に示す。Ｔ４様コアゲノムの３９遺伝子のうち２つが、Ｓ１６では欠損している。Ｓ１６のゲノムには、ｕｖｓＷ（組換えＤＮＡ  ＲＮＡヘリカーゼ及びＤＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ）に対する全長の遺伝子は存在しない。その代り、２つの別々の、短い遺伝子が見出された。これら２つのタンパク質（ＵｖｓＷ１及び２と命名した）はそれぞれ、Ｔ４ＵｖｓＷ残基１から２３４及び２１６から５０２に非常に似ている。Ｔ４ＵｖｓＷの結晶構造は以前に解明されている（Ｓｉｃｋｍｉｅｒら、２００４年；Ｋｅｒｒら、２００７年）。Ｓ１６ＵｖｓＷ１及び２の２次構造予測を（ＨＨｐｒｅｄ；ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｋｉｔ．ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ．ｍｐｇ．ｄｅ／ｈｈｐｒｅｄを用いて）行った。両タンパク質とも、Ｔ４ＵｖｓＷに非常に強力な類似性を有する（Ｓ１６ＵｖｓＷ１及び２それぞれに対して、ドメイン２ｏｃａ＿Ａ；確率１００％、Ｅ値１．３＊１０〜３３及び確率：９９．９７％、Ｅ値：２＊１０〜３０）。このように、２つの別々の遺伝子以外、基本的にＴ４ＵｖｓＷタンパク質全体がＳ１６ゲノムにコードされている。これらが同じ機能を遂行できるか否かは依然として分かっていない。第２の欠損したコア遺伝子はｇｐ４９（エンドヌクレアーゼＶＩＩ）である。ｇｐ４９はＴ４における不可欠なタンパク質であるが、大腸菌ファージＲＢ１６及びアエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）ファージ６５では、他のエンドヌクレアーゼ（Ｉ−ＴｅｖＩＩに類似の触媒作用のドメインを有する）により置換されていることが見出された（Ｐｅｔｒｏｖ、Ｎｏｌａｎら、２００６年）。Ｓ１６は、２６９ａａ長のホーミングエンドヌクレアーゼであり、ファージＲＢ３のＩ−ＴｅｖＩＩＩに非常に似ている（８８．５２％同一性、Ｅ値：０．００（Ｒｏｂｂｉｎｓら、２００７年））Ｉ−ＴｅｖＩＩＩを特徴とする。Ｔ４では、ホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＴｅｖＩＩＩは消滅している。Ｉ−ＴｅｖＩＩＩはアミノ酸長がたった９７個であり、Ｎ末端の触媒作用ドメインが欠損している（Ｒｏｂｂｉｎｓら、２００７年）。Ｓ１６のＩ−ＴｅｖＩＩＩは、おそらく、大腸菌ファージＲＢ１６及びアエロモナスファージ６５の場合におけるＩ−ＴｅｖＩＩのように、ｇｐ４９の非存在を補償する。さらなる差異の層として、Ｔ４様ファージの属をゲノムタイプに細分した。その定義によると、ＤＮＡ修飾遺伝子（２つのグリコシルトランスフェラーゼ及び１つのｄＣＭＰヒドロキシメチラーゼ）の存在及び全体的なゲノム構造により、Ｓ１６はＴ偶数系タイプのファージの群に配置される（Ｐｅｔｒｏｖ、Ｒａｔｎａｙａｋａら、２０１０年）。細菌のビルレンス因子又は毒素遺伝子はＳ１６のゲノムにコードされていないことが見出された。完全なアノテーションは、表６において見出すことができる。
【０１２１】
テールファイバー遺伝子の同定及びインシリコ分析：
Ｔ４様ファージのロングテールファイバー（ＬＴＦ）は、宿主細胞表面の、初期の、可逆性の認識を媒介する。この相互作用は天然におけるショートテールファイバーの結合よりも選択的であり、ショートテールファイバーは、Ｔ４の場合、すべての腸内細菌に共通するＬＰＳ内部コアに結合する。ｇｐ３４からｇｐ３７は、ＬＴＦを近位から遠位のセグメントまで構成する。ＬＴＦを三量体化するのに、２つのシャペロンが必要とされる。全体的なシャペロンｇｐ５７Ａ及びｇｐ３７特異的ｇｐ３８（Ｆｉｇ３は、Ｓ１６、Ｔ２及びＴ４のＬＴＦ遺伝子並びにこれらのシャペロンのアラインメントを示す（Ｃａｌｅｎｄａｒ、２００６年））。Ｔ４では、ｇｐ３７のＣ末端部分が、その受容体に対する結合を媒介する。特異性は、いわゆるＨｉｓボックスにより決定されると思われる（コンセンサス配列：ＧＸＨＸＨ（Ｔｅｔａｒｔら、１９９６年））。Ｓ１６のｇｐ３７にＨｉｓボックスは見出されなかった。Ｔ２及びＴ６では、対照的に、結合はｇｐ３８シャペロン自体により媒介される。これはアドヘシンとして作用し、ｇｐ３７のＣ末端部分に付着し、細胞表面に対する結合を媒介する（Ｒｉｅｄｅら、１９８５年）。Ｔ２のｇｐ３８に記載されているものと同様のグリシンアイランドも、Ｓ１６において同定され得る。これらのアイランドは比較的保存されている領域であり、アドヘシンの受容体特異性を決定する可能性があるより多様な領域の限界を定めるものである（Ｔｅｔａｒｔら、１９９６年；Ｔｒｏｊｅｔら、２０１１年）。Ｓ１６のｇｐ３７及びｇｐ３８のホモロジー検出及び２次構造予測（ＨＨｐｒｅｄ；ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｋｉｔ．ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ．ｍｐｇ．ｄｅ／ｈｈｐｒｅｄを用いて）は、Ｔ４の相当するタンパク質よりもＴ２の相当するタンパク質に対する類似性を示している。具体的に、Ｓ１６及びＴ２両方のｇｐ３７が、これらのＣ末端において、ファージＫ１Ｆのエンド−Ｎ−アセチルノイラミニダーゼドメインに対して強力な類似性を有する（確率：それぞれ９９．４９及び９９．３５、並びにＥ値：２．６＊１０〜１４及び４．９＊１０〜１３）。同定された弱い構造的相同性は、Ｓ１６及びＴ２クラスタのｇｐ３８は、Ｓ１６及びＴ４のｇｐ３８よりも接近していることを指摘する。Ｓ１６のｇｐ３８を、系統樹における他のシーケンシングされたＴ４様ファージのｇｐ３８と比較することで、Ｓ１６は明らかに、Ｔ４よりもＴ２及びＴ６に近くにグループ分けされる（Ｆｉｇ４）。これらの分析より、Ｓ１６のＬＴＦは、Ｔ２のＬＴＦに近く関連する構造を有することが予想され、ｇｐ３８は、ｇｐ３７のＣ末端先端部に結合している。
【０１２２】
精製された全長のロングテールファイバー（ＬＴＦ）タンパク質を得た：
ファージＴ４と同様、ｇｐ３８及びｇｐ５７Ａの２つのシャペロンが、Ｓ１６のＬＴＦタンパク質の遠位サブユニット（ｇｐ３７）のフォールデングを正すのに必要とされることが見出された（Ｂａｒｔｕａｌら、２０１０年；Ｌｅｉｍａｎら、２０１０年）。可溶性タンパク質は、両者の同時発現なしで得ることはできなかった（データは示さず）。Ｔ４様ファージのＬＴＦは、三量体の状態において活性である（Ｃｅｒｒｉｔｅｌｌｉら、１９９６年）。これらは高頻度の遺伝子水平伝播を指摘するモザイク状構造であるため、Ｔ４様ファージのｇｐ３７ホモログはすべて三量体であることが想定される（Ｈａｓｈｅｍｏｌｈｏｓｓｅｉｎｉら、１９９６年）。タンパク質のオリゴマー構造を説明するために、精製したＨＧＦＰ＿ｇｐ３７を熱変性勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（Ｆｉｇ５）。明らかに見ることができる、高分子量のバンドの低分子量バンドへの段階的な変性が観察され、高次構造の解明を指摘するものであった。変性されたＳ１６  ＨＧＦＰ＿ｇｐ３７の電気泳動の移動性は、インシリコ予測から予想したものよりも高かった。全長のタンパク質の予測分子量は１０８．５ｋＤａであるが、観察されたバンドは９７ｋＤａを下回った（Ｆｉｇ５，最終レーン）。ファージＴ２のｇｐ３７は、タンパク質分解性のプロセシングを受け、そのＣ末端の１２０個のアミノ酸の除去をもたらすことが以前に示されている（Ｄｒｅｘｌｅｒら、１９８６年）。そのようなＣ末端の最終の１２０個のアミノ酸をタンパク質分解性に除去することで、観察されたバンドサイズに相当する９４．３ｋＤａのタンパク質が生じる。タンパク質のバンドを、ＭＳ／ＭＳ分析により分析した（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｚｕｒｉｃｈ、ＦＧＣＺ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。Ｓ１６のｇｐ３７のＣ末端の２０１個のアミノ酸に、単一の６ａａペプチド１個以外、ペプチドのヒットは存在しなかった。両方のシャペロンともＭＳ／ＭＳにより検出された（ｇｐ３８に対してペプチド２個、ｇｐ５７Ａに対して１個）。これらの観察に基づき、構造予測と合わせて（上記を参照されたい）、Ｓ１６のｇｐ３７のＣ末端のタンパク質分解性のプロセシングが起こっている可能性がある。
【０１２３】
Ｓ１６のＬＴＦは外膜タンパク質Ｃ（ＯｍｐＣ）に結合する：
可溶性のＨＧＦＰ＿ｇｐ３７と結合アッセイを行うことにより、Ｓ１６のＬＴＦの受容体を同定することができた（Ｆｉｇ６）。サルモネラティフィムリウムＤＴ７１５５ｗｔを陽性対照として供した（Ｆｉｇ６Ａ，Ｂ）。Ｓ１６がＴ２及びＴ４に似ていることから、これら両方のファージの受容体タンパク質をノックアウトして、ＨＧＦＰ＿ｇｐ３７の結合を評価した。ＯｍｐＦ（ファージＴ２の受容体（Ｈａｎｔｋｅ、１９７８年））を除去しても、ＨＧＦＰ＿ｇｐ３７による細胞の装飾は妨げられなかった（Ｆｉｇ６Ｃ，Ｄ）。一方、ＯｍｐＣ（ファージＴ４の受容体（Ｙｕ及びＭｉｚｕｓｈｉｍａ、１９８２年））を欠失すると、そのような結合は妨害された（Ｆｉｇ６Ｅ，Ｆ）。ＨＧＦＰ＿ｇｐ３７の付着は、ｐＢＡＤ１８  Ａｍｐｒ上にトランスのｏｍｐＣを提供することにより回復することができた（Ｆｉｇ６Ｇ，Ｈ）。これらの結果は、ＯｍｐＣが、Ｓ１６のＬＴＦのサルモネラティフィムリウムＤＴ７１５５に対する結合に必要であり、十分であることを実証するものである。
【０１２４】
Ｓ１６はサルモネラＯｍｐＣを有する細胞に吸着する：
プルダウンアッセイを行って、全ファージの吸着もＯｍｐＣに依存的であることを証明した（Ｆｉｇ７）。Ｓ１６のサルモネラティフィムリウムＤＴ７１５５ΔｏｍｐＣに対する吸着は未だに観察することができるが、野生型の吸着よりずっと低い（野生型の９８．４３％に対し４７．４６％、ｐ値：０．００８４）。ｏｍｐＣ（ＤＴ）でのｐＢＡＤ  Ａｍｐｒに対する補完は、ほぼ野生型の吸着レベル（９７．５０％）を回復した。さらに、ＨＧＦＰ＿ｇｐ３７を加えることで、Ｓ１６の吸着率を有意に低減することができたが（野生型９８．４３％に比べて６７．２５％、ｐ値：０．０４８３）、ＨＧＦＰ単独では低減しなかった（吸着率９３．７６％）。ファージの感染には耐性であっても、大腸菌Ｋ−１２に対するＳ１６のいくらかの吸着を観察することができる。しかし、これはサルモネラティフィムリウムＤＴ７１５５より有意に低い（２８．０６％対９８．４３％；ｐ値：０．０１２７；Ｆｉｇ８）。大腸菌Ｋ−１２ΔｏｍｐＣ株（ＣＧＳＣ４４０１）を構築し、Ｋ−１２のｏｍｐＣ遺伝子（ｏｍｐＣ（Ｋ−１２））又はサルモネラティフィムリウムＤＴ７１５５のｏｍｐＣ遺伝子（ｏｍｐＣ（ＤＴ））のいずれかで補完した。Ｋ−１２株の常在性のｏｍｐＣ遺伝子の欠失、及びｏｍｐＣ（ＤＴ）での補完により、Ｓ１６の吸着率は９１．５３％に有意に増大した（ｐ値：０．０１５５；Ｆｉｇ８）。同じ実験を、ｏｍｐＣ（Ｋ−１２）を補完して行った。大腸菌Ｋ−１２ｗｔに比べて吸着の増大は観察されなかった（２６．４４％；Ｆｉｇ８）。この対照は、種々の細胞内レベルのＯｍｐＣによる可能な効果を除外するものである。これらの所見は、ＬＴＦ結合だけではなく全ファージ粒子の吸着もＯｍｐＣに依存的であることを実証するものである。さらに、ファージＳ１６は、サルモネラティフィムリウムのＯｍｐＣに特異的に結合し、大腸菌Ｋ−１２ｗｔのＯｍｐＣには結合しない。
【０１２５】
考察：
ファージは細菌の天敵である。細菌の病原菌を制御するのにファージを用いることは、現在、多くの研究者によって評価されている。サルモネラエンテリカ亜種エンテリカに属する菌株は、世界中の食品由来疾患の主な原因の一つである。この亜種は非常に多様であり、２５００を超える血清型が認められており（Ｇｒｉｍｏｎｔ及びＷｅｉｌｌ、２００７年）、広い宿主範囲を有するファージを獲得するのが比較的困難になっている。この研究において、新規な広い宿主範囲のサルモネラミオウイルスのＳ１６を記載した。ゲノム配列を決定し、アノテーションした。Ｓ１６は、絶えず拡大しているＴ４様ウイルスの属の新メンバーであり、Ｔ偶数系型のサブグループに属する。本発明者らが知る限り、Ｓ１６は、サルモネラへの感染に限定されるＴ４様ファージの、最初に完全に特徴付けられたメンバーである（Ｐｅｔｒｏｖら、２０１０年）。Ｓ１６のゲノム構造はファージＴ４に非常に似ている（Ｆｉｇ３）。Ｓ１６の宿主範囲は、サルモネラ属内で非常に広いが、試験した大腸菌分離株はどれも感受性ではなかった。Ｓ１６は、２つの大きな理由から、ＦｅｌｉｘＯ１よりも生物的防除に適するファージであると論じることができる。第１に、ＦｅｌｉｘＯ１は、感染に外側のＬＰＳコアの末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基を必要とする（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ、１９６７年；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ及びＨｏｌｍｅ、１９６９年）。Ｓ１６は、Ｔ４同様、内部コアの２−ケト−デオキシ−ｄ−オクタノエート（ＫＤＯ）残基しか必要としないことが実証された（再変異体）。このため、Ｓ１６は、ＦｅｌｉｘＯ１とは対照的に、ディープラフ株にも感染することができる。本発明者らが試験した、すべての同質遺伝子の、逐次的なＬＰＳコア合成ノックアウト株のサルモネラティフィムリウムＬＴ２の中で、１株が耐性であった。このＲｄ２変異体のＬＰＳコアだけが、３個の２−ケト−デオキシ−ｄ−オクタノエート（ＫＤＯ）残基及び単一の七単糖を含む。ＬＰＳ構造だけに基づくと、この菌株が耐性であることが証明される理由の説明を見出すことができなかった。異常な構造をもたらすＬＰＳ合成に対する極性効果（ｐｏｌａｒ  ｅｆｆｅｃｔ）などの、他の意図せぬ変更がこの菌株に生じた可能性がある。第２に、Ｓ１６のＤＮＡ修飾系により、Ｓ１６のゲノムが多くの通常の制限系に不感受性となり（Ｆｉｇ２）、Ｓ１６にＦｅｌｉｘＯ１を凌ぐさらなる利点をもたらしている。特異性は別にして、食品由来病原体の生物的防除に用いられるファージには、他の基準がいくつか存在する。ファージは厳密にビルレントである必要があり（溶原性を避ける）、ファージゲノムにコードされているビルレンス因子又は既知のアレルゲンがあってはならない。ファージ粒子による宿主ＤＮＡの輸送である、普遍形質導入もまた、排除されなければならない（Ｈａｇｅｎｓ及びＬｏｅｓｓｎｅｒ、２０１０年）。最初の２点は、全ゲノムのシーケンシング及びアノテーションにより除外することができた。３番目は、形質導入実験により評価された。本発明者らのＳ１６でのセットアップに、耐性カセットの形質導入は観察されなかった。形質導入は、ファージＰ２２（ＨＴ変異体（Ｓｃｈｍｉｅｇｅｒ、１９７２年））の場���に容易に観察することができた。Ｔ４自体は、いくつかの変異なしで宿主ＤＮＡを形質導入することは知られていない（Ｗｉｌｓｏｎら、１９７９年）。具体的に、宿主の核破壊（ｎｕｃｌｅａｒ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）（ｎｄｄ）に加えてエンドヌクレアーゼＩＶ（ｄｅｎＢ）に対する遺伝子における変異、及びおそらくＤ１領域（ｒＩＩＢとｄｅｎＢとの間）の遺伝子における変異がすべて、Ｔ４を普遍形質導入性のファージに変換するのに必要である。形質導入の頻度は、ｒＩＩＡ、ｒＩＩＢ、ｓｔｐ及びａｃにおける変異により増大され得る（Ｙｏｕｎｇら、１９８２年）。Ｓ１６は、インタクトなｎｄｄ、ｄｅｎＢ、ｒＩＩＡ及びｒＩＩＢ遺伝子を特徴とする。このように、普遍形質導入に対する必要条件はこのファージには与えられない。Ｓ１６は遺伝子ｓｔｐ及びａｃを欠くが、これらの遺伝子の非存在だけでは、形質転換性のファージへの変換に十分ではない。そこで、Ｓ１６は、サルモネラ亜種を生物的防除するための主な候補を代表すると結論付けることができる。ファージ受容体結合タンパク質及び受容体は、その主要な特徴の一つである。Ｓ１６では両方とも同定されている。Ｓ１６のロングテールファイバー（ＬＴＦ）の遠位サブユニットは同定されている。それは遺伝子産物ｇｐ３７である。全長の、ＧＦＰタグ付けされたｇｐ３７（ＨＧＦＰ＿ｇｐ３７）は、発現及び精製することができた。用いた発現のための方法は、（Ｂａｒｔｕａｌら、２０１０年）に最初に記載されたものである。この著者らはＴ４のＬＴＦを、三量体化シャペロンｇｐ５７Ａ及びｇｐ３８との同時発現により、大量に生成した。同じ研究で、この方法が他のＴ４様ファージに適用できることが提唱された。この現在の研究において、この取組みは実際に、他のファージにも適用可能であることを実証した。得られた天然のＨＧＦＰ＿ｇｐ３７タンパク質は、熱変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、オリゴマーであることを明らかに示した（Ｆｉｇ５）。このｇｐ３７タンパク質の機能性を、結合アッセイにより（Ｆｉｇ６）、及びファージ吸着を低減するその能力により（Ｆｉｇ７）、確立することができた。欠失変異体により、このタンパク質はサルモネラの外膜タンパク質Ｃ（ＯｍｐＣ）に特異的に結合することが示された。ＯｍｐＣを欠くサルモネラティフィムリウムＤＴ７１５５は、タグ付け及び蛍光顕微鏡により可視化することができず、結合は、トランスのＯｍｐＣを提供することにより再構成することができた（Ｆｉｇ６）。また、ＯｍｐＣを欠く細胞に対するファージ粒子の吸着速度は低下し、トランスのＯｍｐＣを補完することにより、再構成することができた（Ｆｉｇ７）。さらに、ファージ全体の結合に、サルモネラエンテリカ亜種エンテリカのＯｍｐＣが必要であることが示された。ファージの吸着速度は、野生型大腸菌Ｋ−１２及び大腸菌Ｋ−１２ΔｏｍｐＣ：：ｏｍｐＣ（Ｋ−１２）の両方に比べて、大腸菌Ｋ−１２ΔｏｍｐＣ：：ｏｍｐＣ（ＤＴ）では大幅に増大した（Ｆｉｇ８）。このように、大腸菌Ｋ−１２のＯｍｐＣではなく、サルモネラティフィムリウムＤＴ７１５５のＯｍｐＣは、ファージＳ１６の吸着に十分な受容体であることが見出された。Ｔ４（大腸菌におけるＯｍｐＣ又はＬ���Ｓ）及びＴ２（ＯｍｐＦ又はＦａｄＬ）の場合のように、Ｓ１６のＬＴＦが結合することができるさらなる表面構造は存在し得る（Ｈａｎｔｋｅ、１９７８年；Ｙｕ及びＭｉｚｕｓｈｉｍａ、１９８２年；Ｔｒｏｊｅｔら、２０１１年）。ＯｍｐＣ及びＯｍｐＦの他に、以下のノックアウトも試験した：ｏｍｐＡ、ｏｍｐＸ  ｂｔｕＢ  ｔｏｎＢ、及びｔｓｘ。これらの変異株のどれも、Ｓ１６に対する感受性の低下を示さなかった（データは示さず）。ｇｐ３８における変異は受容体特異性を変更することができることは以前に示されている。例えば、Ｔ２様ファージであるＭ１は、その受容体としてＯｍｐＡを用いる。しかし、Ｍ１の特異性は、ＯｍｐＣ又はＯｍｐＴに対して変化し得る。これらの変化は、グリシンアイランド間の可変領域において、主にチロシン、トリプトファン、セリン又はアスパラギンのアミノ酸置換により媒介されると思われる（Ｈａｓｈｅｍｏｌｈｏｓｓｅｉｎｉら、１９９４年；Ｔｅｔａｒｔら、１９９８年；Ｔｒｏｊｅｔら、２０１１年）。このように柔軟性であれば、ＯｍｐＦではなくＯｍｐＣに対して結合性のＴ２様ｇｐ３８配列を見出すのは驚くにはあたらない。ｇｐ３８は、Ｔ４の場合はアドヘシンとして作用しないので、Ｔ偶数系ｇｐ３８タンパク質の系統樹では、Ｔ４のｇｐ３８は、明らかに残りと隔てられている。ｇｐ３８がアドヘシンとして作用するファージの群内で、Ｓ１６は、新規な別個の枝を規定している（Ｆｉｇ４）。樹において表される他のファージはすべて大腸菌ファージであることに留意されたい。さらにサルモネラのＴ偶数系ファージは、Ｓ１６と同じ枝に配置することができ、Ｔ偶数系ファージの新たなサブグループの形成を指摘することができる。この研究において、新規な、広い宿主範囲のサルモネラファージＳ１６が完全に特徴付けられた。Ｓ１６は、サルモネラに特異的なＴ４様属の最初のメンバーである。その宿主範囲は、ＦｅｌｉｘＯ１の宿主範囲よりさらに広い。Ｓ１６はＤＮＡ修飾系のため、及びラフ株に感染する能力のため、Ｓ１６は生物防除剤として優れた選択肢であることが提唱される。
【０１２６】
表１：  この試験で使用された菌株
【表１】
0006351119.tif 000003
【０１２７】
表２：  この試験で使用されたプラスミド
【表２】
0006351119.tif 000004
【０１２８】
表３：  この試験で使用された制限酵素
酵素は、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ（Ｓｔ．Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）又はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｅｎｇｌａｎｄ）により製造されたものである。
【表３】
0006351119.tif 000005
【０１２９】
表４：  ファージＳ１６の宿主範囲の分析（スポットにおける溶菌：＋＋：サルモネラティフィムリウムＤＴ７１５５に匹敵；＋：サルモネラティフィムリウムＤＴ７１５５に比べて２ｌｏｇを超えて低減した溶菌；−：溶菌は観察されず；単一プラーク：＋：プラークが観察された；−：プラークは観察されなかった）  ＊：（６８）；†：（４９）
供給源１：実験室保存株；２：Ｄｒ．ｍｅｄ．Ｈｅｌｍｕｔ  Ｂｒａｄｅ教授（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｂｏｒｓｔｅｌ；Ｇｅｒｍａｎｙ）；３：Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；４：Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）；５：Ｈｏｒｎ教授／Ｆｒｏｓｃｈ教授（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｕｒｚｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；６：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＥＮＴ）；７：Ｄｒ．Ｔｈｉｌｏ  Ｆｕｃｈｓ（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；８：Ｄｒ．Ｃｈｅｎｇ−Ｈｓｕｎ  Ｃｈｉｕ（Ｃｈａｎｇ  Ｇｕｎｇ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｔａｉｗａｎ）；９：Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｒ．Ｔｈｏｍｓｏｎ（Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵＫ）；１０：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＳＧＳＣ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｇａｒｙ、Ｃａｎａｄ）の菌株（Ｄｒ．Ｕｗｅ  Ｍａｍａｔ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｂｏｒｓｔｅｌ；Ｇｅｒｍａｎｙ）により提供された。）
【表４−１】
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【表４−２】
0006351119.tif 000007
供給源Ｎｏ．１０のＬＰＳ変異株はすべて、サルモネラ遺伝子保存センター（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｏｃｋ  ｃｅｎｔｅｒ）、ＳＧＳＣ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｇａｒｙ、Ｃａｎａｄａ）から得たものであり、ｈｔｔｐ：／／ｐｅｏｐｌｅ．ｕｃａｌｇａｒｙ．ｃａ／〜ｋｅｓａｎｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇｕｅ．ｈｔｍｌの、無料で入手できるカタログにおいて検索することができる。
【０１３０】
表５：  Ｓ１６及びＴ４のＴ４様コアゲノムタンパク質のアミノ酸レベルの比較
Ｐｅｔｒｏｖら，２０１０年において規定された通りに選択及びアレンジしたコアゲノムタンパク質
【表５−１】
0006351119.tif 000008
【表５−２】
0006351119.tif 000009
【０１３１】
表６：  Ｓ１６のアノテーション表
＜は逆方向を示す。サイズ［ｎｔ］は終止コドンを含むが、サイズ［ａａ］は含まない。
【表６−１】
0006351119.tif 000010
【表６−２】
0006351119.tif 000011
【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表６−７】
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【参考文献】
【０１３２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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