(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物およびヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、変種ＣＨ３ドメインを含む第１の単量体Ｆｃポリペプチドおよび変種ＣＨ３ドメインを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチドを含み、
前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、ヘテロ二量体ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域であり、
第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインおよび第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがそれぞれ独立に、ホモ二量体Ｆｃ領域と比較して前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域の形成を促進するアミノ酸突然変異を含み、
（ａ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがＦ４０５およびＹ４０７の位置のアミノ酸突然変異を含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがＴ３６６およびＴ３９４の位置のアミノ酸突然変異を含み、Ｔ３６６の位置のアミノ酸突然変異がＴ３６６ＩもしくはＴ３６６Ｌであり、Ｔ３９４の位置のアミノ酸突然変異がＴ３９４Ｗであり、Ｆ４０５の位置のアミノ酸突然変異がＦ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｔ、もしくはＦ４０５Ｖであり、かつＹ４０７の位置のアミノ酸突然変異がＹ４０７ＩもしくはＹ４０７Ｖであるか、または
（ｂ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがＹ４０７の位置のアミノ酸突然変異を含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがＴ３６６およびＫ４０９の位置のアミノ酸突然変異を含み、Ｔ３６６の位置のアミノ酸突然変異がＴ３６６Ａ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、もしくはＴ３６６Ｖであり、Ｙ４０７の位置のアミノ酸突然変異がＹ４０７ＡもしくはＹ４０７Ｖであり、かつＫ４０９の位置のアミノ酸突然変異がＫ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｓ、もしくはＫ４０９Ｗであり；
ヘテロ二量体Ｆｃ領域が９０％以上の純度および７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し；
前記単一ドメイン抗原結合構築物が第１および第２の単量体Ｆｃポリペプチドの一方に結合しており；
前記単離ヘテロ多量体が免疫グロブリン軽鎖を欠いており；かつ
アミノ酸残基の番号付けが、Ｋａｂａｔにより記載されたＥＵインデックスに従っている、単離ヘテロ多量体。
【請求項２】
前記単一ドメイン抗原結合構築物が、重鎖抗体構築物であるか、またはＳＨ３誘導性フィノマーもしくはフィブロネクチン誘導性結合ドメインから誘導される、請求項１に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３】
免疫グロブリンの第１の定常（ＣＨ１）領域も欠いている、請求項１または２に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項４】
Ｙ４０７の位置のアミノ酸突然変異がＹ４０７Ｖである、請求項１に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項５】
第１のＦｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメイン、第２のＦｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメイン、または第１および第２のＦｃポリペプチドの両方がアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｘをさらに含み、Ｘが、バリンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項６】
第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインおよび第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインの両方がアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖを含む、請求項５に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項７】
前記アミノ酸突然変異が、Ｌ３５１の位置のアミノ酸突然変異および／またはＫ３９２の位置のアミノ酸突然変異をさらに含み、Ｌ３５１の位置のアミノ酸突然変異がＬ３５１Ｙであり、かつＫ３９２の位置のアミノ酸突然変異がＫ３９２Ｌ、Ｋ３９２ＭまたはＫ３９２Ｆである、請求項１または４に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項８】
第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインが、アミノ酸突然変異Ｔ３６６ＬまたはＴ３６６Ｉのうちの１つとアミノ酸突然変異Ｔ３９４Ｗとを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項９】
（ａ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｙをさらに含むか、または
（ｂ）第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｋ３９２ＭもしくはＫ３９２Ｌのうちの１つをさらに含むか、または
（ｃ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｙをさらに含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｋ３９２ＬもしくはＫ３９２Ｍのうちの１つをさらに含む、
請求項８に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項１０】
第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインが、Ｓ４００またはＱ３４７のうちの１つの位置のアミノ酸突然変異をさらに含み、および／または第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインが、Ｋ３６０またはＮ３９０のうちの１つの位置のアミノ酸突然変異をさらに含み、
Ｓ４００の位置のアミノ酸突然変異がＳ４００ＥまたはＳ４００Ｄであり；
Ｑ３４７の位置のアミノ酸突然変異がＱ３４７ＲまたはＱ３４７Ｅであり；
Ｋ３６０の位置のアミノ酸突然変異がＫ３６０ＤまたはＫ３６０Ｅであり；かつ
Ｎ３９０の位置のアミノ酸突然変異がＮ３９０Ｒである、
請求項８または９に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項１１】
第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｓ４００ＥまたはＱ３４７Ｒのうちの少なくとも１つを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｎ３９０ＲまたはＫ３６０Ｅのうちの少なくとも１つを含む、請求項１０に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項１２】
（ａ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｂ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｃ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｄ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗを含む、
請求項９に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項１３】
（ａ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｓ４００Ｅをさらに含むか、または
（ｂ）第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｎ３９０Ｒをさらに含むか、または
（ｃ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｓ４００Ｅをさらに含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｎ３９０Ｒをさらに含む、
請求項１２に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項１４】
第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含む、請求項１３に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項１５】
（ａ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３６６ＬおよびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｂ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｃ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｄ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｅ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｆ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｒ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｇ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｈ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ｖ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｉ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ｔ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｊ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ｓ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｋ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｌ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｍ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｑ３４７Ｒ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｋ３６０Ｅ、Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｎ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｒ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｄ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｏ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｒ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｐ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｑ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２Ｆ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｒ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｌ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｓ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３９９Ｃ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｃ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｔ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｕ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；または
（ｖ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含む、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項１６】
Ｙ４０７の位置のアミノ酸突然変異がＹ４０７Ａであり、かつＫ４０９の位置のアミノ酸突然変異がＫ４０９Ｆである、請求項１に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項１７】
前記アミノ酸突然変異が、Ｌ３５１Ｙ、Ｌ３５１Ｉ、およびＬ３５１Ｆから選択されるＬ３５１の位置のアミノ酸突然変異をさらに含む、請求項１６に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項１８】
第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインがアミノ酸突然変異Ｌ３５１ＹおよびＹ４０７Ａを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインが、アミノ酸突然変異Ｋ４０９Ｆとアミノ酸突然変異Ｔ３６６Ａ、Ｔ３６６ＬまたはＴ３６６Ｖのうちの１つとを含む、請求項１７に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項１９】
第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインが、Ｄ３９９、Ｓ４００およびＦ４０５のうちの１つまたは複数の位置のアミノ酸突然変異をさらに含み、ならびに
第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインが、Ｔ４１１、Ｎ３９０およびＫ３９２のうちの１つまたは複数の位置のアミノ酸突然変異をさらに含み、
Ｔ４１１の位置のアミノ酸突然変異がＴ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１ＤまたはＴ４１１Ｅであり；
Ｄ３９９の位置のアミノ酸突然変異がＤ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ、またはＤ３９９Ｋであり；
Ｓ４００の位置のアミノ酸突然変異がＳ４００Ｅ、Ｓ４００ＤまたはＳ４００Ｒであり；
Ｆ４０５の位置のアミノ酸突然変異がＦ４０５Ｖであり；
Ｎ３９０の位置のアミノ酸突然変異がＮ３９０ＲまたはＮ３９０Ｋであり；かつ
Ｋ３９２の位置のアミノ酸突然変異がＫ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ、またはＫ３９２Ｅである、
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項２０】
（ａ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインが、アミノ酸突然変異Ｄ３９９ＲもしくはＤ３９９Ｗのうちの１つを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインが、アミノ酸突然変異Ｋ３９２ＥもしくはＫ３９２Ｌのうちの１つとアミノ酸突然変異Ｔ４１１ＥもしくはＴ４１１Ｄのうちの１つとを含むか、または
（ｂ）第１の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインが、アミノ酸突然変異Ｄ３９９ＲもしくはＤ３９９Ｗのうちの１つとアミノ酸突然変異Ｓ４００ＲもしくはＳ４００Ｋのうちの１つとを含み、かつ第２の単量体Ｆｃポリペプチドの変種ＣＨ３ドメインが、アミノ酸突然変異Ｋ３９２ＥもしくはＫ３９２Ｌのうちの１つとアミノ酸突然変異Ｔ４１１ＥもしくはＴ４１１Ｄのうちの１つとを含む、
請求項１９に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項２１】
前記ヘテロ多量体が、１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項２２】
前記ヘテロ多量体が、第１および第２の単量体Ｆｃポリペプチドの一方に結合している第１の単一ドメイン抗原結合構築物と、他方の単量体Ｆｃポリペプチドに結合している第２の単一ドメイン抗原結合構築物とを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項２３】
第１および第２の単一ドメイン抗原結合構築物が異なるエピトープに結合する、請求項２２に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項２４】
前記単一ドメイン抗原結合構築物が、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂまたはＶＨ）、ラクダ科動物抗体（ＶｈＨ）、または軟骨魚類抗体フラグメント（ＶＮＡＲ）から誘導される重鎖抗体構築物である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項２５】
前記単一ドメイン抗原結合構築物がラクダ科動物抗体（ＶｈＨ）から誘導される、請求項２４に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項２６】
前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、ヘテロ二量体ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項２７】
前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、ヘテロ二量体ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域である、請求項２６に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項２８】
前記ヘテロ多量体が、二重特異的抗体または多特異的抗体である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項２９】
前記単一ドメイン抗原結合構築物が腫瘍関連抗原に結合する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３０】
前記単一ドメイン抗原結合構築物がＥＧＦＲまたはＥＧＦＲ１突然変異変種ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する、請求項２９に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３１】
前記単一ドメイン抗原結合構築物が、治療抗体と結合を競合する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３２】
前記治療抗体が、アバゴボマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、アウログラブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、ルミリキシマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ、ミコグラブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、テプリズマブ、トシリズマブ／アトリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、Ｐｒｏｘｉｎｉｕｍ（商標）、Ｒｅｎｃａｒｅｘ（商標）、ウステキヌマブ、およびザルツムマブからなる群から選択される、請求項３１に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３３】
前記ヘテロ多量体が治療剤と複合体化している、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項３５】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項３６】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、哺乳類宿主細胞。
【請求項３７】
その必要がある患者において疾患または障害を治療するための、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体を含む治療薬。
【請求項３８】
前記疾患または障害が癌である、請求項３７に記載の治療薬。
【請求項３９】
前記疾患または障害が免疫障害である、請求項３７に記載の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年５月１０日に出願された米国特許仮出願第６１／６４５，５５５号の、米国特許法１１９条（ｅ）に基づく利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本開示は、一般に、ポリペプチドヘテロ二量体、その組成物、ならびにそのようなポリペプチドヘテロ二量体を作製および使用する方法を提供する。より詳細には、熱安定性抗体構築物が本明細書において提供され、前記構築物はヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、前記構築物は免疫グロブリン軽鎖を欠いている。ある特定の実施形態において、抗体構築物は、多特異的および／または多価である。ある特定の実施形態において、抗体構築物は、免疫グロブリンの第１の構築物（ＣＨ１）領域を欠いている。
【背景技術】
【０００３】
二重特異的治療薬は、２つの別個の異なる標的または同じ抗体の異なるエピトープに同時に結合することができる、抗体に基づいた分子である。二重特異的抗体は、免疫グロブリンドメインに基づいた実体から構成され、抗体分子の成分を構造的および機能的に模倣しようと試みる。二重特異的抗体の使用の１つは、細胞毒性免疫エフェクター細胞を、抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）によるような腫瘍細胞の増強された死滅のために向け直すこととなっている。この文脈において、二重特異的抗体の一方の腕は、腫瘍細胞上の抗原に結合し、他方は、エフェクター細胞に発現している決定基に結合する。腫瘍とエフェクターの細胞を架橋することによって、二重特異的抗体は、エフェクター細胞を腫瘍細胞に近寄せるのみならず、同時にこれらの活性化の引き金も引き、効果的な腫瘍細胞死滅をもたらす。二重特異的抗体は、化学または放射線療法剤を腫瘍組織の中で濃縮して、正常組織への有害な作用を最小限にするためにも使用されている。この設定において、二重特異的抗体の一方の腕は、破壊のために標的化された細胞上に発現している抗原に結合し、他方の腕は、化学療法薬、放射性同位体、または毒素を送達する。二重特異的抗体を超えて、複数の様式を同時に標的にして効力を達成するタンパク質治療薬の必要性が存在する。そのような複合した新規な生物学的効果は、多標的結合および多機能の局面をタンパク質の中に設計したタンパク質治療薬によって達成され得る。
【０００４】
これらの多機能性および多標的結合治療剤を設計するために、他の機能性弾頭または標的タンパク質結合ドメインを融合する骨組みを提供する頑強な足場が必要である。理想的には、足場は骨組みを提供するのみならず、設計された治療薬が、多数の他の治療的に関連する重要な特徴を利用できるようにもするべきである。抗体に基づいた二重特異的および多機能性治療薬の一般的な開発における大きな障害は、前臨床および臨床研究の両方において十分な品質および量の材料を生成するのが困難であるということである。
【０００５】
軽鎖を欠いている（すなわち、単一可変ドメインを含む）抗原結合ポリペプチドは、当該技術において知られており、例えば、ラクダ科動物または軟骨魚類から誘導されるものが含まれる。これらの種類の抗原結合ポリペプチドは、抗原結合フラグメントとして多くの利点を有することが示されており、例えば、これらはより熱安定性があり、腫瘍に浸透し、脳関門を横断することができ、これらは、他の抗原結合ポリペプチドフラグメント（例えば、ＦａｂｓおよびｓｃＦｖｓ）が結合できないエピトープに結合することができる。したがって、この種類の抗原結合ポリペプチドフラグメントを有する一価または二重特異的抗体が開発されてきた。しかし、そのような一価または二重特異的抗体を調製する現存の技術は、理想的ではなく、治療および臨床用途に必要な量および品質でこれらを製造するために必要な純度および／または安定性を欠いている生成物がもたらされる。変種Ｆｃ領域に結合するタンパク質結合ドメインとして単一可変ドメインを含み、前記変種Ｆｃが、増加した安定性および純度を有するヘテロ二量体を選択するように修飾された、Ｆｃエフェクター活性を有するＣＨ３ドメインを含む、ポリペプチド構築物の当該技術における必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００６】
一態様によると、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、未変性ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を有する前記ヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、前記単離ヘテロ多量体が、免疫グロブリン軽鎖を欠いている、単離ヘテロ多量体が提供される。
【０００７】
少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物および免疫グロブリンヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、前記免疫グロブリンヘテロ二量体Ｆｃ領域が、２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含み、単一ドメイン抗原結合構築物が、一方の単量体Ｆｃポリペプチドに結合し、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、未変性ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を有する前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、前記単離ヘテロ多量体が、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリンの第１の定常（ＣＨ１）領域を欠いている、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。
【０００８】
ある特定の実施形態では、１つの単量体Ｆｃポリペプチドに結合している１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。
【０００９】
幾つかの実施形態では、一方の単量体Ｆｃポリペプチドに結合している１つの単一ドメイン抗原結合構築物と、他方の単量体Ｆｃポリペプチドに結合している第２の単一ドメイン抗原結合構築物とを含む、単離ヘテロ多量体が本明細書において記載される。幾つかの実施形態では、両方の単一ドメイン抗原結合構築物が同じエピトープに結合する、単離ヘテロ多量体が、本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、前記１つの単一ドメイン抗原結合構築物が１つのエピトープに結合し、第２の単一ドメイン抗原結合構築物が異なるエピトープに結合する、単離ヘテロ多量体が、本明細書において提供される。幾つかの実施形態において、単一ドメイン抗原結合構築物は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂまたはＶＨ）、ラクダ科動物のナノボディ（ＶｈＨ）、軟骨魚類（ＶＮＡＲ）、ＳＨ３誘導性フィノマー、およびフィブロネクチン誘導性結合ドメインから選択される。単一ドメイン抗原結合構築物がラクダ科動物のナノボディ（ＶｈＨ）である、本明細書に記載されている単離ヘテロ多量体が、本明細書の幾つかの実施形態において提供される。ある特定の実施形態において、単一ドメイン抗原結合構築物は、ＩＬ２、ＩＦＮａ−２ａ／ｂ、ＩＦＮ−１ａ／ｂ、ＩＬ−２１、ＩＬ−１７ａ、ＴＮＦ、ＩＬ２３、ＶＥＧＦ、およびＡＮＧ２から選択される１つ以上のサイトカインまたはケモカインに結合する。幾つかの実施形態において、単一ドメイン抗原結合構築物は、ＥｐＣａｍ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＣＥＡ、またはＧＰ１００のような１つ以上の腫瘍関連抗原に結合する。選択される実施形態において、単一ドメイン抗原結合構築物は、ＣＤ１６、ＣＤ３０、ＣＤ１３７、ＣＤ２２、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ２３、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＫＩＲ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ２５、ＬＡＧ３、またはＢ７−Ｈ３のような１つ以上の免疫調節抗原に結合する。実施形態において、単一ドメイン抗原結合構築物は、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂのような１つ以上の細菌性毒素に結合する。
【００１０】
単一ドメイン抗原結合構築物がＥＧＦＲ１に結合する本明細書に記載されている単離ヘテロ多量体が、本明細書において提供される。一実施形態において、単一ドメイン抗原結合構築物は、ＥＧＦＲ１突然変異変種ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する。
【００１１】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、未変性ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を有する前記ヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３領域を含み、前記単離ヘテロ多量体が、免疫グロブリン軽鎖を欠いている、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。
【００１２】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、未変性ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を有する前記ヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種定常領域を含み、前記単離ヘテロ多量体が、免疫グロブリン軽鎖を欠いている、単離ヘテロ多量体が提供される。
【００１３】
また、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、未変性ホモ二量体Ｆｃ領域に匹敵する安定性を有する前記ヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種定常領域を含み、前記単離ヘテロ多量体が、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリンの第１の定常（ＣＨ１）領域を欠いている、単離ヘテロ多量体が提供される。前記単一ドメイン抗原結合構築物が、ラクダ科動物または軟骨魚類から誘導される、本明細書に記載されている単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。一実施形態では、前記ラクダ科動物がラマである、単離ヘテロ多量体が、本明細書に記載される。また、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性を増加したヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、前記アミノ酸突然変異が、アミノ酸突然変異を含まないＣＨ３ドメインと比較して安定性を増加したヘテロ二量体Ｆｃ領域の形成を促進し、変種ＣＨ３ドメインが、約７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、本明細書に記載されている単離ヘテロ多量体が提供される。一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域と比べてＣＨ３ドメインに追加のジスルフィド結合を含まない、単離ヘテロ多量体が、本明細書に記載される。更なる実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域と比べて変種ＣＨ３ドメインに追加のジスルフィド結合を含むが、但し、ＣＨ３ドメインの約７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）が追加のジスルフィド結合の不在下のものであることが条件である、単離ヘテロ多量体が、本明細書に記載される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が約９０％を超える純度を有する、単離ヘテロ多量体が、本明細書に記載される。更なる実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が約９８％以上の純度を有する、単離ヘテロ多量体が、本明細書に記載される。別の実施形態では、Ｔｍが約７４℃以上である、単離ヘテロ多量体が、本明細書に記載される。一実施形態では、第１のＦｃポリペプチドが、Ｆ４０５およびＹ４０７の位置にアミノ酸修飾を含み、第２のＦｃポリペプチドが、Ｔ３９４の位置にアミノ酸修飾を含む、単離ヘテロ多量体である。別の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドが、Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖから選択される１つ以上のアミノ酸修飾を含み、第２のＦｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗから選択される１つ以上のアミノ酸修飾を含む、単離ヘテロ多量体である。更なる実施形態では、第１のＦｃポリペプチドが、Ｄ３９９およびＹ４０７の位置にアミノ酸修飾を含み、第２のＦｃポリペプチドが、Ｋ４０９およびＴ４１１の位置にアミノ酸修飾を含む、単離ヘテロ多量体が、本明細書に記載される。
【００１４】
本明細書に記載されている単離ヘテロ多量体であって、前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、野生型ＣＨ３ドメインポリペプチドと比較して少なくとも３つのアミノ酸修飾を含む第１の修飾ＣＨ３ドメインを含む第１の単量体Ｆｃポリペプチド、および野生型ＣＨ３ドメインポリペプチドと比較して少なくとも３つのアミノ酸修飾を含む第２の修飾ＣＨ３ドメインを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチドを含み、前記第１および第２のＣＨ３ドメインの一方が、Ｋ３９２Ｊにアミノ酸修飾を含み、Ｊが、Ｌ、Ｉ、Ｍ、またはＫの側鎖量より実質的に大きくない側鎖量のアミノ酸から選択され、前記第１および第２の修飾ＣＨ３ドメインポリペプチドが、少なくとも約７４℃の融解温度（Ｔｍ）および少なくとも９５％の純度を有するヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを優先的に形成し、少なくとも１つのアミノ酸修飾が、前記第１と前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドの間の界面にあるアミノ酸のものではない、本明細書に記載されている単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。
【００１５】
一実施形態では、少なくとも１つのＴ３５０Ｘ修飾を含み、Ｘが、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびその誘導体または変種から選択される天然または非天然のアミノ酸である、単離ヘテロ多量体である。更なる実施形態では、少なくとも１つのＴ３５０Ｖ修飾を含む、単離ヘテロ多量体である。幾つかの実施形態において、前記第１および第２のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｔ３５０Ｖ修飾を更に含む。幾つかの実施形態において、Ｆｃヘテロ二量体ドメインは、約７７℃以上のＴｍを有する。
【００１６】
幾つかの実施形態では、少なくとも１つの単量体Ｆｃポリペプチドが、修飾Ｓ４００Ｚを含み、Ｚが、正荷電アミノ酸および負荷電アミノ酸から選択される、単離ヘテロ多量体が、本明細書に記載される。一実施形態では、当該第１のＦｃポリペプチドが、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｋ、およびＳ４００Ｒから選択されるアミノ酸修飾を含む、単離ヘテロ多量体である。別の実施形態において、当該第１および第２のＦｃポリペプチドの一方は、Ｓ４００ＥおよびＳ４００Ｒから選択されるアミノ酸修飾を含み、他方のＦｃポリペプチドは、Ｎ３９０の位置にアミノ酸修飾を含む。更なる実施形態では、修飾Ｎ３９０Ｚを含み、Ｚが、正荷電アミノ酸および負荷電アミノ酸から選択される、単離ヘテロ多量体である。一実施形態では、前記第２のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｎ３９０ＲまたはＮ３９０Ｋを含む、単離ヘテロ多量体が、本明細書に記載される。
【００１７】
一実施形態において、前記第１のＦｃポリペプチドが、アミノ酸修飾Ｓ４００Ｅを含む修飾ＣＨ３ドメインポリペプチドであり、当該第２のＦｃポリペプチドが、アミノ酸修飾Ｎ３９０Ｒを含む修飾ＣＨ３ドメインポリペプチドである、本明細書に記載されている単離ヘテロ多量体が提供される。一実施形態では、一方の前記Ｆｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｑ３４７Ｒを含み、他方のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｋ３６０Ｅを含む、単離ヘテロ多量体が、本明細書に記載される。
【００１８】
Ｆｃポリペプチドアミノが、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ａ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ４０９Ｆ、Ｔ４１１Ｅ、およびＴ４１１Ｄから選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、第２のＦｃポリペプチドが、Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｄ３９９Ｒ、およびＤ３９９Ｋから選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、単離ヘテロ多量体が、本明細書に記載される。一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、Ｆｃガンマ受容体への選択的結合を促進する非対称アミノ酸修飾を含む変種ＣＨ２ドメインを更に含む、単離ヘテロ多量体である。
【００１９】
一実施形態では、変種ＣＨ２ドメインが、野生型ＣＨ２ドメインと比較して、ＦｃガンマＩＩＩａ受容体に選択的に結合する、単離ヘテロ多量体が、本明細書に記載される。
【００２０】
幾つかの実施形態では、Ｇ型免疫グロブリン（ＩｇＧ）に基づいたＦｃ構築物を含む、単離ヘテロ多量体が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のうちの１つである、単離ヘテロ多量体である。幾つかの実施形態では、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、または免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に基づいたＦｃ構築物を含む、単離ヘテロ多量体である。
【００２１】
当該ヘテロ多量体が、二重特異的抗体または多特異的抗体である、本明細書に記載されている単離ヘテロ多量体が幾つかの実施形態において提供される。
【００２２】
少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物が、ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する、本明細書に記載されている単離ヘテロ多量体が幾つかの実施形態において提供される。幾つかの実施形態では、前記ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩ結合構築物が、抗体またはそのフラグメントから誘導される、単離ヘテロ多量体が、本明細書に記載される。ある特定の実施形態において、前記ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩ結合構築物は、重鎖抗体構築物である。幾つかの実施形態において、前記重鎖抗体構築物は、ラクダ科動物の構築物である。一実施形態において、前記ラクダ科動物の構築物は、図４４に示される配列を含む。
【００２３】
本明細書に記載されている単離ヘテロ多量体と薬学的に許容される担体とを含む組成物が、提供される。
【００２４】
本明細書に記載されている単離ヘテロ多量体をコードする核酸を含む哺乳類宿主細胞が、提供される。
【００２５】
一実施形態では、単一ドメイン抗原結合構築物が、少なくとも１つの治療抗体と結合を競合する、単離ヘテロ多量体が、本明細書に記載される。一実施形態では、当該少なくとも１つの治療抗体が、アバゴボマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、アウログラブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、ルミリキシマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ、ミコグラブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、テプリズマブ、トシリズマブ／アトリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、Ｐｒｏｘｉｎｉｕｍ（商標）、Ｒｅｎｃａｒｅｘ（商標）、ウステキヌマブ、およびザルツムマブからなる群から選択される、単離ヘテロ多量体である。
【００２６】
一実施形態では、癌抗原により特徴付けられる癌を有する患者において癌を治療する方法であって、当該患者に治療有効量の本明細書に記載されている単離ヘテロ多量体を投与することを含む、方法である。一実施形態では、当該癌が、ＥＧＦＲまたはＥＦＧＲｖＩＩＩの過剰発現により特徴付けられる、癌を治療する方法である。
【００２７】
ＥＧＦＲまたはＥＦＧＲｖＩＩＩを過剰発現する癌細胞を治療する方法であって、当該細胞を、本明細書に提供されるある量のヘテロ多量体と接触させることを含む方法が提供される。幾つかの実施形態おいて、当該癌細胞は、乳癌細胞、肺癌細胞、肛門癌細胞、および神経膠芽腫のうちの少なくとも１つである。
【００２８】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されている癌を治療する方法であって、別の治療分子に加えて、当該ヘテロ多量体を投与することを含む方法である。幾つかの実施形態において、当該治療分子はヘテロ多量体と複合体化している。
【００２９】
免疫抗原により特徴付けられる免疫障害を有する患者において免疫障害を治療する方法であって、当該患者に治療有効量の本明細書に記載されている単離ヘテロ多量体を投与することを含む方法が、提供される。
【００３０】
一態様では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、未変性ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を有する当該ヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、当該単離ヘテロ多量体が、免疫グロブリンの第１の定常（ＣＨ１）領域および免疫グロブリン軽鎖を欠いている単離ヘテロ多量体が、本明細書において提供される。
【００３１】
一態様では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、未変性ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を有する当該ヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、当該単離ヘテロ多量体が、免疫グロブリンの第１および第２の定常ドメイン（ＣＨ１およびＣＨ２）、ならびに免疫グロブリン軽鎖を欠いている単離ヘテロ多量体が、本明細書において提供される。
【００３２】
本明細書に提供される単離ヘテロ多量体のある特定の実施形態において、変種ＣＨ３ドメインは、約７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。ある特定の実施形態において、変種ＣＨ３ドメインは、少なくとも約７５℃の融解温度（Ｔｍ）を有する。幾つかの実施形態において、変種ＣＨ３ドメインは、少なくとも約８０℃の融解温度（Ｔｍ）を有する。
【００３３】
本明細書に提供される単離ヘテロ多量体の幾つかの実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、特定のＦｃガンマ受容体への選択的結合を促進する少なくとも１つの非対称アミノ酸修飾を含む変種ＣＨ２ドメインを更に含む。一実施形態において、変種ＣＨ２ドメインは、野生型ＣＨ２ドメインと比較して、ＦｃガンマＩＩＩａ受容体に選択的に結合する。
【００３４】
本発明のある特定の実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ多量体は、原核生物もしくは真核生物の宿主細胞における発現、ＤＮＡ、または免疫グログロブリンの第１の定常（ＣＨ１）領域を欠いている免疫グロブリンの配列を有するｃＤＮＡの産物である。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖可変領域は、軽鎖を欠いている免疫グロブリンからのものであり、当該免疫グロブリンは、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーナ、およびグアナコであるが、これらに限定されないようなラクダ科動物のリンパ球または他の細胞から得られる。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖可変領域は、軽鎖を欠いている免疫グロブリンからのものであり、当該免疫グロブリンは、ラマのリンパ球または他の細胞から得られる。
【００３５】
本発明の具体的な実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ多量体は、原核生物もしくは真核生物の宿主細胞における発現、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡの産物である。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖可変領域および／またはＦｃヘテロ二量体は、サメ、アカエイ、ガンギエイ、ギンザメ、ラットフィッシュ、ゾウギンザメ、およびアイゴであるが、これらに限定されないような軟骨魚類から得られる、軽鎖を欠いている免疫グロブリンからのものである。特定の実施形態において、少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖可変領域および／またはＦｃヘテロ二量体は、軽鎖を欠いている免疫グロブリンからのものであり、当該免疫グロブリンは、サメから得られる。
【００３６】
ヘテロ二量体のＦｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、当該単離ヘテロ多量体が、免疫グロブリンの第１の定常（ＣＨ１）領域、免疫グロブリン軽鎖を欠いており、場合により免疫グロブリンの第２の定常（ＣＨ２）領域を欠いており、変種ＣＨ３ドメインが、約７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、当該変種ＣＨ３ドメインが、未変性ＩｇＧ１抗体におけるＣＨ３ドメインに匹敵する安定性を有するヘテロ二量体Ｆｃ領域の形成をもたらす単離ヘテロ多量体が、別の態様において提供される。
【００３７】
１つの実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比べてＣＨ３ドメインに追加のジスルフィド結合を含まない。代替的な実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比べて変種ＣＨ３ドメインに少なくとも１つの追加のジスルフィド結合を含むが、但し、約７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）が追加のジスルフィド結合の不在下のものであることが条件である。別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比べて変種ＣＨ３ドメインに少なくとも１つの追加のジスルフィド結合を含み、変種ＣＨ３ドメインは、約７７．５℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。
【００３８】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、当該単離ヘテロ多量体が、免疫グロブリン軽鎖、および免疫グロブリンの第１の定常（ＣＨ１）ドメインを欠いており、場合により免疫グロブリンの第２の定常（ＣＨ２）ドメインを欠いており、変種ＣＨ３ドメインが、約７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、約９０％を超える純度で形成される、またはヘテロ二量体Ｆｃ領域が、約９５％以上の純度で形成される、またはヘテロ二量体Ｆｃ領域が、約９８％以上の純度で形成される単離ヘテロ多量体が、１つの実施形態において提供される。
【００３９】
ある特定の実施形態において、軽鎖を欠いている、本明細書に記載されている免疫グロブリンは、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）が、４本鎖免疫グロブリンのＶＨと異なる特性を有するようなものである。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている重鎖免疫グロブリンの可変ドメインは、軟骨魚類からの重鎖免疫グロブリンの場合のように、ＶＬに相互作用部位を有さない。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている重鎖免疫グロブリンの可変ドメインは、ＶＬまたはＣＨ１ドメインとの正常な相互作用部位を有さず、これらはいずれも、ラクダ科動物および一部の軟骨魚類からの重鎖免疫グロブリンに存在しない。
【００４０】
本明細書に記載されているヘテロ多量体のある特定の実施形態において、少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖は、リンカーによりヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物は、ヒンジ領域によりヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している。可変長さのリンカーおよび／またはヒンジ領域が、本明細書において提供されるヘテロ多量体に利用される。当業者は、リンカーおよび／またはヒンジ領域の長さが、抗原結合部位を隔てる距離の決定に参加することを理解することができる。本明細書において提供されるある特定の実施形態において、ヒンジ領域は、０〜５０個のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態において、ヒンジ領域の配列は、以下である。
ＧＴＮＥＶＣＫＣＰＫＣＰ。
一実施形態において、ヒンジ領域の配列は、
ＥＰＫＩＰＱＰＱＰＫＰＱＰＱＰＱＰＱＰＫＰＱＰＫＰＥＰＥＣＴＣＰＫＣＰ
である。
【００４１】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ多量体構築物に利用される少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物および／または修飾Ｆｃ領域は、Ｇ型免疫グロブリン、例えば、クラス２の免疫グロブリン（ＩｇＧ２）またはクラス３の免疫グロブリン（ＩｇＧ３）と定義される免疫グロブリンを含む。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ多量体構築物に利用される少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物および／または修飾Ｆｃ領域は、免疫グロブリンＭまたはＩｇＭを含む。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ多量体構築物に利用される少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物および／または修飾Ｆｃ領域は、免疫グロブリンＡまたはＩｇＡを含む。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ多量体構築物に利用される少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物および／または修飾Ｆｃ領域は、免疫グロブリンＤまたはＩｇＤを含む。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ多量体構築物に利用される少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物および／または修飾Ｆｃ領域は、免疫グロブリンＥまたはＩｇＥを含む。
【００４２】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ多量体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）、またはＩｇＡ（またはＩｇＭ、ＩｇＤ）から誘導されるＦｃ部分を含む。１つの特定の態様によると、ある特定の実施形態は、修飾「ＩｇＥ誘導Ｆｃ部分」（すなわち、ＩｇＥから誘導されるＦｃ部分）を含む。
【００４３】
ある特定の実施形態において、重鎖の可変ドメインと重鎖のＦｃ部分とを連結しているヒンジは、ＩｇＧアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）、またはＩｇＡ（またはＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）のヒンジ配列から誘導される。
【００４４】
本明細書に記載されているある特定の実施形態において、可変重鎖は、ドメイン抗体（もしくは、ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（もしくは、単一ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」（もしくは、ｄＡｂとしての使用に適したアミノ酸配列）、またはナノボディ（本明細書において定義されており、ＶＨＨ配列が含まれるが、これらに限定されない）、他の単一可変ドメイン、あるいはこれらのいずれかの任意の適切なフラグメントであり得る。（単一）ドメイン抗体の一般的な記載には、上記に引用された従来技術、ならびにヨーロッパ特許第０  ３６８  ６８４号も参照される。用語「ｄＡｂ」には、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  １９８９  Ｏｃｔ．１２；３４１（６２４２）：５４４−６）、Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００３，２１（１１）：４８４−４９０）、ならびに例えば国際公開第０４／０６８８２０号、同第０６／０３０２２０号、同第０６／００３３８８号、およびＤｏｍａｎｔｉｓ  Ｌｔｄ．による他の公開特許出願が参照される。幾つかの実施形態において、可変重鎖は単一ドメイン抗体を含む、または単一可変ドメインは、特定の種のサメから誘導され得る（例えば、いわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えば国際公開第０５／１８６２９号を参照すること）。
【００４５】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、
ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、未変性ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を有する当該ヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種定常ドメインを含み、当該単離ヘテロ多量体が、免疫グロブリンヘテロ軽鎖を欠いている単離ヘテロ多量体が、本明細書において提供されている。
【００４６】
一実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、未変性ホモ二量体Ｆｃ領域に匹敵する安定性を有する当該ヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種定常領域を含み、当該単離ヘテロ多量体が、免疫グロブリン軽鎖、および免疫グロブリンの第１の定常（ＣＨ１）領域を欠いている、単離ヘテロ多量体が提供される。
【００４７】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ多量体は、定常ドメインの配列類似性を維持する、任意の動物源（例えば、ヒト、ネズミ、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ）の抗体から誘導されるＦｃ部分または定常ドメインを含む（図４０Ａ〜４０Ｂ）。ある特定の実施形態において、定常ドメインは、サメ、アカエイ、ガンギエイ、ギンザメ、ラットフィッシュ、ゾウギンザメ、およびアイゴであるが、これらに限定されないような軟骨魚類から誘導される。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ多量体は、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーナ、およびグアナコであるが、これらに限定されないようなラクダ科動物の抗体から誘導される定常ドメインを含む。
【００４８】
本明細書において提供されるある特定の実施形態による単一ドメイン抗原結合構築物は、当該技術に周知の精製方法を使用して、ラマであるが、これに限定されないようなラクダ科動物の血清から精製することにより得られる。
【００４９】
本明細書に提供されるある特定の実施形態において、ヘテロ多量体の免疫グロブリンの可変領域は、骨組み（ＦＷ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）、特に４つの骨組みおよび３つの相補性領域を含む。この可変領域は、不在である軽鎖の可変領域が寄与することなく、１つまたは幾つかの抗原結合部位をそれ自体含有し得るという事実によって、特に、４本鎖免疫グロブリンと区別される。
【００５０】
また、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、増加した安定性を有するヘテロ二量体Ｆｃ領域の形成をもたらす１つ以上のアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、変種ＣＨ３ドメインが、約７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、またはＴｍが約７１℃以上である、またはＴｍが約７４℃以上である単離ヘテロ多量体が、ある特定の実施形態において提供される。別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、約９８％以上の純度および約７３℃のＴｍを有する溶液により形成される、またはヘテロ二量体Ｆｃ領域は、約９０％以上の純度および約７５℃のＴｍにより形成される。
【００５１】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、第１および第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、当該第１および第２のＣＨ３ドメインポリペプチドの少なくとも一方が、アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖを含む、単離ヘテロ多量体が、ある特定の実施形態において提供される。ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチド、および、またアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖを含む第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含む、単離ヘテロ多量体が、ある特定の実施形態において提供される。ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、Ｆ４０５およびＹ４０７の位置にアミノ酸修飾を含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチド、およびＴ３９４の位置にアミノ酸修飾を含む第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含む、単離ヘテロ多量体が、ある特定の実施形態において提供される。ある特定の実施形態において、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｄ３９９およびＹ４０７の位置にアミノ酸修飾を含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｋ４０９およびＴ４１１の位置にアミノ酸修飾を含む。ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸修飾Ｌ３５１ＹおよびＹ４０７Ａを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチド、ならびにアミノ酸修飾Ｔ３６６ＡおよびＫ４０９Ｆを含む第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含む、単離ヘテロ多量体が、ある特定の実施形態において提供される。１つの態様において、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドまたは第２のＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、またはＫ３９２の位置に更なるアミノ酸修飾を含む。Ｔ４１１の位置のアミノ酸修飾は、Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、またはＴ４１１Ｗから選択される。Ｄ３９９の位置のアミノ酸修飾は、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ、またはＤ３９９Ｋから選択される。Ｓ４００の位置のアミノ酸修飾は、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、またはＳ４００Ｋから選択される。Ｆ４０５の位置のアミノ酸修飾は、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ、またはＦ４０５Ｗから選択される。Ｎ３９０の位置のアミノ酸修飾は、Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ、またはＮ３９０Ｄから選択される。Ｋ３９２の位置のアミノ酸修飾は、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ、またはＫ３９２Ｅから選択される。
【００５２】
ある特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸修飾Ｔ３５０ＶおよびＬ３５１Ｙを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチド、ならびにまたアミノ酸修飾Ｔ３５０ＶおよびＬ３５１Ｙを含む第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含む、単離ヘテロ多量体が提供される。
【００５３】
別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸修飾Ｙ４０７Ａを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチド、ならびにアミノ酸修飾Ｔ３６６ＡおよびＫ４０９Ｆを含む第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含む、単離ヘテロ多量体が提供される。１つの態様において、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドまたは第２のＣＨ３ドメインポリペプチドは、更なるアミノ酸修飾Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ、およびＳ４００Ｒを含む。別の態様において、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｄ３９９Ｒ、Ｓ４００Ｒ、およびＹ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ３９２Ｅ、およびＴ４１１Ｅを含む。更なる実施形態において、変種ＣＨ３ドメインは、約７４℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、ヘテロ二量体は、約９５％以上の純度を有する。
【００５４】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、Ｌ３５１の位置にアミノ酸修飾およびアミノ酸修飾Ｙ４０７Ａを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｔ３６６の位置にアミノ酸修飾およびアミノ酸修飾Ｋ４０９Ｆを含む、単離ヘテロ多量体が、別の実施形態において提供される。１つの態様において、Ｌ３５１の位置のアミノ酸修飾は、Ｌ３５１Ｙ、Ｌ３５１Ｉ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｒ、またはＬ３５１Ｆから選択される。別の態様において、Ｙ４０７の位置のアミノ酸修飾は、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｖ、またはＹ４０７Ｓから選択される。なお別の態様において、Ｔ３６６の位置のアミノ酸修飾は、Ｔ３６６Ａ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｃ、Ｔ３６６Ｖ、またはＴ３６６Ｗから選択される。１つの実施形態において、変種ＣＨ３ドメインは、約７５℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、ヘテロ二量体は、約９０％以上の純度を有する。
【００５５】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、Ｆ４０５の位置にアミノ酸修飾、ならびにアミノ酸修飾Ｌ３５１ＹおよびＹ４０７Ｖを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸修飾Ｔ３９４Ｗを含む、単離ヘテロ多量体が、別の実施形態において提供される。１つの態様において、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドまたは第２のＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｋ３９２、Ｔ４１１、Ｔ３６６、Ｌ３６８、またはＳ４００の位置にアミノ酸修飾を含む。Ｆ４０５の位置のアミノ酸修飾は、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ、またはＦ４０５Ｗである。Ｋ３９２の位置のアミノ酸修飾は、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ、またはＫ３９２Ｅである。Ｔ４１１の位置のアミノ酸修飾は、Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、またはＴ４１１Ｗである。Ｓ４００の位置のアミノ酸修飾は、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、またはＳ４００Ｋである。Ｔ３６６の位置のアミノ酸修飾は、Ｔ３６６Ａ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｃ、Ｔ３６６Ｖ、またはＴ３６６Ｗである。Ｌ３６８の位置のアミノ酸修飾は、Ｌ３６８Ｄ、Ｌ３６８Ｒ、Ｌ３６８Ｔ、Ｌ３６８Ｍ、Ｌ３６８Ｖ、Ｌ３６８Ｆ、Ｌ３６８Ｓ、およびＬ３６８Ａである。
【００５６】
別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸修飾Ｔ３９４Ｗを含む、単離ヘテロ多量体が提供される。１つの態様において、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｔ３６６ＬまたはＴ３６６Ｉを含む。
【００５７】
なお別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸修飾Ｙ３４９Ｃ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖのうちの少なくとも１つを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸修飾Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含む、単離ヘテロ多量体が提供される。
【００５８】
ある特定の実施形態において、二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸修飾Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗ、ならびにＴ３６６ＬおよびＴ３６６Ｉの一方を含む、単離ヘテロ多量体が提供される。
【００５９】
別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸修飾Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸修飾Ｔ３６６ＬおよびＴ３９４Ｗを含む、単離ヘテロ多量体が提供される。
【００６０】
別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸修飾Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸修飾Ｔ３６６ＩおよびＴ３９４Ｗを含む、単離ヘテロ多量体が提供される。ヘテロ多量体のある特定の実施形態において、二重特異的抗体または多特異的抗体が提供される。
【００６１】
別の実施形態において、本発明のヘテロ多量体と薬学的に許容される担体とを含む組成物が提供される。
【００６２】
別の実施形態において、本発明のヘテロ多量体をコードする核酸を含む宿主細胞が提供される。
【００６３】
ある特定の実施形態において、ヘテロ多量体による標的結合が、少なくとも１つの他の治療抗体と競合的であるヘテロ多量体が提供される。１つの態様において、治療抗体は、アバゴボマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、アウログラブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、ルミリキシマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ、ミコグラブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、テプリズマブ、トシリズマブ／アトリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、Ｐｒｏｘｉｎｉｕｍ、Ｒｅｎｃａｒｅｘ、ウステキヌマブ、およびザルツムマブからなる群から選択される。
【００６４】
本発明のヘテロ多量体の別の実施形態では、癌抗原により特徴付けられる癌を有する患者において癌を治療する方法であって、当該患者に治療有効量のヘテロ多量体を投与することを含む方法が提供される。
【００６５】
本発明のヘテロ多量体の別の実施形態では、免疫抗原により特徴付けられる免疫障害を有する患者において免疫障害を治療する方法であって、当該患者に治療有効量のヘテロ多量体を投与することを含む方法が提供される。
【００６６】
なお別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、増加した安定性を有するヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、変種ＣＨ３ドメインが、表１、表６、または表７に列記されている変種から選択される、単離ヘテロ多量体が提供される。
【００６７】
ある特定の実施形態において、重鎖免疫グロブリンのクラスに属する修飾抗イディオタイプ抗体を含むヘテロ多量体が提供される。そのような抗イディオタイプは、ヒトまたは動物イディオタイプに対して産生され得る。これらの抗イディオタイプの特性は、これらを、特に糖タンパク質または糖脂質に対するワクチン接種において、炭水化物がエピトープを決定する場合に、イディオタイプワクチンとして使用できることである。
【００６８】
本明細書に記載されているヘテロ多量体がクローンされた細胞または生物体であって、当該ヘテロ多量体が、二量体Ｆｃ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む、細胞または生物体が、本明細書において提供される。そのような細胞または生物体は、所望の事前に選択された特異性、または対応する特定のレパートリーを有するヘテロ多量体を産生する目的に使用され得る。これらは、また、それらが発現された細胞の代謝を修飾する目的で産生され得る。一実施形態において、ヘテロ二量体の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含むヘテロ多量体は、植物細胞、特に遺伝子導入植物において産生される。
[本発明1001]
少なくとも1つの単一ドメイン抗原結合構築物および免疫グロブリンヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、前記免疫グロブリンヘテロ二量体Ｆｃ領域が、2つの単量体Ｆｃポリペプチドを含み、前記単一ドメイン抗原結合構築物が、一方の単量体Ｆｃポリペプチドに結合し、
前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、未変性ホモ二量体Ｆｃ領域に匹敵する安定性を有する前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ3ドメインを含み、
前記単離ヘテロ多量体が、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリンの第1の定常（ＣＨ1）領域を欠いている、単離ヘテロ多量体。
[本発明1002]
一方の単量体Ｆｃポリペプチドに結合している1つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む、本発明1001の単離ヘテロ多量体。
[本発明1003]
一方の単量体Ｆｃポリペプチドに結合している1つの単一ドメイン抗原結合構築物と、他方の単量体Ｆｃポリペプチドに結合している第2の単一ドメイン抗原結合構築物とを含む、本発明1001の単離ヘテロ多量体。
[本発明1004]
両方の単一ドメイン抗原結合構築物が同じエピトープに結合する、本発明1003の単離ヘテロ多量体。
[本発明1005]
前記1つの単一ドメイン抗原結合構築物が1つのエピトープに結合し、前記第2の単一ドメイン抗原結合構築物が異なるエピトープに結合する、本発明1003の単離ヘテロ多量体。
[本発明1006]
前記単一ドメイン抗原結合構築物が、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂまたはＶＨ）、ラクダ科動物のナノボディ（ＶｈＨ）、軟骨魚類（ＶＮＡＲ）、ＳＨ3誘導性フィノマー、およびフィブロネクチン誘導性結合ドメインから選択される、本発明1001〜1005のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1007]
前記単一ドメイン抗原結合構築物がラクダ科動物のナノボディ（ＶｈＨ）である、本発明1001〜1006のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1008]
前記単一ドメイン抗原結合構築物が、ＩＬ2、ＩＦＮａ−2ａ／ｂ、ＩＦＮ−1ａ／ｂ、ＩＬ−21、ＩＬ−17ａ、ＴＮＦ、ＩＬ23、ＶＥＧＦ、およびＡＮＧ2から選択される1つ以上のサイトカインまたはケモカインに結合する、本発明1001〜1007のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1009]
前記単一ドメイン抗原結合構築物が、ＥｐＣａｍ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＣＥＡ、またはＧＰ100のような1つ以上の腫瘍関連抗原に結合する、本発明1001〜1007のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1010]
前記単一ドメイン抗原結合構築物が、ＣＤ16、ＣＤ30、ＣＤ137、ＣＤ22、ＣＤ52、ＣＤ80、ＣＤ23、ＣＤ2、ＣＤ4、ＣＤ40、ＫＩＲ、ＣＤ32ｂ、ＣＤ25、ＬＡＧ3、またはＢ7−Ｈ3のような1つ以上の免疫調節抗原に結合する、本発明1001〜1007のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1011]
前記単一ドメイン抗原結合構築物が、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂのような1つ以上の細菌性毒素に結合する、本発明1001〜1007のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1012]
前記単一ドメイン抗原結合構築物がＥＧＦＲ1に結合する、本発明1001〜1007のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1013]
前記単一ドメイン抗原結合構築物がＥＧＦＲ1突然変異変種ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する、本発明1001〜1007のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1014]
ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも1つの単量体に結合している少なくとも1つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、未変性ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を有する前記ヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ3領域を含み、前記単離ヘテロ多量体が、免疫グロブリン軽鎖を欠いている、単離ヘテロ多量体。
[本発明1015]
ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも1つの単量体に結合している少なくとも1つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、
前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、未変性ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を有する前記ヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種定常ドメインを含み、
前記単離ヘテロ多量体が、免疫グロブリン軽鎖を欠いている、単離ヘテロ多量体。
[本発明1016]
ヘテロ二量体Ｆｃ領域の少なくとも1つの単量体に結合している少なくとも1つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、
前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、未変性ホモ二量体Ｆｃ領域に匹敵する安定性を有する前記ヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種定常ドメインを含み、前記単離ヘテロ多量体が、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリンの第1の定常（ＣＨ1）領域を欠いている、単離ヘテロ多量体。
[本発明1017]
前記単一ドメイン抗原結合構築物が、ラクダ科動物または軟骨魚類から誘導される、本発明1014〜1016のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1018]
前記ラクダ科動物がラマである、本発明1017の単離ヘテロ多量体。
[本発明1019]
前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性を増加したヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ3ドメインを形成する第1および第2のＦｃポリペプチドを含み、前記アミノ酸突然変異が、アミノ酸突然変異を含まないＣＨ3ドメインと比較して安定性を増加したヘテロ二量体Ｆｃ領域の形成を促進し、前記変種ＣＨ3ドメインが、約70℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、本発明1001〜1018のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1020]
前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域と比べてＣＨ3ドメインに追加のジスルフィド結合を含まない、本発明1001〜1019のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1021]
前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域と比べて前記変種ＣＨ3ドメインに追加のジスルフィド結合を含むが、但し、前記ＣＨ3ドメインの約70℃を超える前記融解温度（Ｔｍ）が前記追加のジスルフィド結合の不在下のものであることを条件とする、本発明1019または1020の単離ヘテロ多量体。
[本発明1022]
前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、約90％を超える純度を有する、本発明1019〜1021のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1023]
前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、約98％以上の純度を有する、本発明1019〜1022のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1024]
前記Ｔｍが約74℃以上である、本発明1019〜1023のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1025]
第1のＣＨ3ドメインポリペプチドが、Ｆ405およびＹ407の位置にアミノ酸修飾を含み、第2のＣＨ3ドメインポリペプチドが、Ｔ394の位置にアミノ酸修飾を含む、本発明1019〜1024のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1026]
前記第1のＦｃポリペプチドが、Ｌ351Ｙ、Ｙ405Ａ、およびＹ407Ｖから選択される1つ以上のアミノ酸修飾を含み、前記第2のＦｃポリペプチドが、Ｔ366Ｌ、Ｔ366Ｉ、Ｋ392Ｌ、Ｋ392Ｍ、およびＴ394Ｗから選択される1つ以上のアミノ酸修飾を含む、本発明1019〜1025のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1027]
第1のＦｃポリペプチドが、Ｄ399およびＹ407の位置にアミノ酸修飾を含み、第2のＦｃポリペプチドが、Ｋ409およびＴ411の位置にアミノ酸修飾を含む、本発明1019〜1026のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1028]
前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、
野生型ＣＨ3ドメインポリペプチドと比較して少なくとも3つのアミノ酸修飾を含む第1の修飾ＣＨ3ドメインを含む第1の単量体Ｆｃポリペプチド、および野生型ＣＨ3ドメインポリペプチドと比較して少なくとも3つのアミノ酸修飾を含む第2の修飾ＣＨ3ドメインを含む第2の単量体Ｆｃポリペプチド、を含み、
前記第1および第2のＣＨ3ドメインの一方が、Ｋ392Ｊにアミノ酸修飾を含み、Ｊが、Ｌ、Ｉ、Ｍ、または側鎖量がＫの側鎖量より大幅にに大きくないアミノ酸から選択され、前記第1および第2の修飾ＣＨ3ドメインポリペプチドが、少なくとも約74℃の融解温度（Ｔｍ）および少なくとも95％の純度を有するヘテロ二量体ＣＨ3ドメインを優先的に形成し、
少なくとも1つのアミノ酸修飾が、前記第1と前記第2のＣＨ3ドメインポリペプチドの間の界面にあるアミノ酸のものではない、本発明1001〜1027のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1029]
少なくとも1つのＴ350Ｘ修飾を含み、Ｘが、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびその誘導体、または変種から選択される天然または非天然のアミノ酸である、本発明1019〜1028のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1030]
少なくとも1つのＴ350Ｖ修飾を含む、本発明1019〜1029のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1031]
前記第1および第2のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｔ350Ｖ修飾を更に含む、本発明1019〜1030のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1032]
前記修飾ＣＨ3ドメインが約77℃以上のＴｍを有する、本発明1031の単離ヘテロ多量体。
[本発明1033]
少なくとも1つの単量体Ｆｃポリペプチドが、修飾Ｓ400Ｚを含み、Ｚが、正荷電アミノ酸および負荷電アミノ酸から選択される、本発明1019〜1032のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1034]
前記第1のＦｃポリペプチドが、Ｓ400Ｅ、Ｓ400Ｄ、Ｓ400Ｋ、およびＳ400Ｒから選択されるアミノ酸修飾を含む、本発明1033の単離ヘテロ多量体。
[本発明1035]
前記第1および第2のＦｃポリペプチドの一方が、Ｓ400ＥおよびＳ400Ｒから選択される前記アミノ酸修飾を含み、他方のＦｃポリペプチドが、Ｎ390の位置にアミノ酸修飾を含む、本発明1034の単離ヘテロ多量体。
[本発明1036]
修飾Ｎ390Ｚを含み、Ｚが、正荷電アミノ酸および負荷電アミノ酸から選択される、本発明1035の単離ヘテロ多量体。
[本発明1037]
前記第2のＦｃポリペプチドが、アミノ酸修飾Ｎ390ＲまたはＮ390Ｋを含む、本発明1035の単離ヘテロ多量体。
[本発明1038]
前記第1のＦｃポリペプチドが、前記アミノ酸修飾Ｓ400Ｅを含む修飾ＣＨ3ドメインポリペプチドであり、前記第2のＦｃポリペプチドが、前記アミノ酸修飾Ｎ390Ｒを含む修飾ＣＨ3ドメインポリペプチドである、本発明1019〜1037のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1039]
一方の前記Ｆｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｑ347Ｒを含み、他方のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｋ360Ｅを含む、本発明1001〜1038のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1040]
前記Ｆｃポリペプチドアミノが、Ｔ366Ｖ、Ｔ366Ｉ、Ｔ366Ａ、Ｔ366Ｍ、Ｔ366Ｌ、Ｋ409Ｆ、Ｔ411Ｅ、およびＴ411Ｄから選択される少なくとも1つのアミノ酸修飾を含み、前記第2のＦｃポリペプチドが、Ｌ351Ｙ、Ｙ407Ａ、Ｙ407Ｉ、Ｙ407Ｖ、Ｄ399Ｒ、およびＤ399Ｋから選択される少なくとも1つのアミノ酸修飾を含む、本発明1001〜1039のいずれかの単離ヘテロ多量体、
[本発明1041]
前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、Ｆｃガンマ受容体への選択的結合を促進する非対称アミノ酸修飾を含む変種ＣＨ2ドメインを更に含む、本発明1001〜1040のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1042]
前記変種ＣＨ2ドメインが、野生型ＣＨ2ドメインと比較して、ＦｃガンマＩＩＩａ受容体に選択的に結合する、本発明1001〜1041のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1043]
Ｇ型免疫グロブリン（ＩｇＧ）に基づいたＦｃ構築物を含む、本発明1001〜1042のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1044]
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2ＩｇＧ3、およびＩｇＧ4のうちの1つである、本発明1043の単離ヘテロ多量体。
[本発明1045]
免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、または免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に基づいたＦｃ構築物を含む、本発明1001〜1044のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1046]
前記ヘテロ多量体が、二重特異的抗体または多特異的抗体である、本発明1001〜1045のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1047]
少なくとも1つの単一ドメイン抗原結合構築物が、ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する、本発明1001〜1046のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1048]
前記ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩ結合構築物が、抗体またはそのフラグメントから誘導される、本発明1047の単離ヘテロ多量体。
[本発明1049]
前記ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩ結合構築物が、重鎖抗体構築物である、本発明1047の単離ヘテロ多量体。
[本発明1050]
前記重鎖抗体構築物がラクダ科動物の構築物である、本発明1049の単離ヘテロ多量体。
[本発明1051]
前記ラクダ科動物の構築物が、図44に示される配列を含む、本発明1050の単離ヘテロ多量体。
[本発明1052]
本発明1001〜1051のいずれかの単離ヘテロ多量体および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
[本発明1053]
本発明1001〜1051のいずれかの単離ヘテロ多量体をコードする核酸を含む、哺乳類宿主細胞。
[本発明1054]
前記単一ドメイン抗原結合構築物が、少なくとも1つの治療抗体と結合を競合する、本発明1001〜1051のいずれかの単離ヘテロ多量体。
[本発明1055]
前記少なくとも1つの治療抗体が、アバゴボマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、アウログラブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、ルミリキシマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ、ミコグラブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、テプリズマブ、トシリズマブ／アトリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、Ｐｒｏｘｉｎｉｕｍ（商標）、Ｒｅｎｃａｒｅｘ（商標）、ウステキヌマブ、およびザルツムマブからなる群から選択される、本発明1054の単離ヘテロ多量体。
[本発明1056]
癌抗原により特徴付けられる癌を有する患者において癌を治療する方法であって、前記患者に治療有効量の本発明1001〜1051のいずれかの単離ヘテロ多量体を投与することを含む、前記方法。
[本発明1057]
前記癌が、ＥＧＦＲまたはＥＦＧＲｖＩＩＩの過剰発現により特徴付けられる、本発明1056の方法。
[本発明1058]
ＥＧＦＲまたはＥＦＧＲｖＩＩＩを過剰発現する癌細胞を治療する方法であって、前記細胞を本発明1047〜1051のうちのいずれかにおいて提供される、ある量のヘテロ多量体と接触させることを含む、方法。
[本発明1059]
前記癌細胞が、乳癌細胞、肺癌細胞、肛門癌細胞、および神経膠芽腫のうちの少なくとも1つである、本発明1058の方法。
[本発明1060]
別の治療分子に加えて、前記ヘテロ多量体を投与することを含む、本発明1056〜1059のいずれかの方法。
[本発明1061]
前記治療分子がヘテロ多量体と複合体化している、本発明1060の方法。
[本発明1062]
免疫抗原により特徴付けられる免疫障害を有する患者において免疫障害を治療する方法であって、前記患者に治療有効量の本発明1001〜1051のいずれかの単離ヘテロ多量体を投与することを含む、前記方法。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ＣＨ３（上部）、ＣＨ２（中間）、および受容体領域を示す野生型抗体の図解三次元構造である。左側の点線の長方形は、右側に拡大されており、ＣＨ３の標的領域の２つの領域である領域１および領域２を示す。
【図２】３６８の位置に野生型残基を示す図解三次元表示である。
【図３】突然変異位置３６８を示す領域１の図解三次元表示である。
【図４】領域２における追加の突然変異の図解三次元表示である。
【図５】最初の３つの変種ＡＺ１、ＡＺ２、およびＡＺ３の衝突スコア、界面面積の差、詰め込みの差、静電エネルギーの差、および全体的な「親和性」スコアのコンピューターによる計算の表である。
【図６】変種ＡＺ１上に「構築」された変種ＡＺ２およびＡＺ３を示している図解三次元像を示す。
【図７】ＡＺ２およびＡＺ３変種の図解三次元表示である。
【図８】図５の表を示しているが、ＡＺ１、ＡＺ２、およびＡＺ３ヘテロ二量体、ならびに潜在的なホモ二量体を示す。親和性スコアは、関連性がないのでホモ二量体では示されていない。
【図９】野生型（左）および突然変異ＡＺ４（右）の三次元表示の図解表示である。
【図１０】ＡＺ４ヘテロ二量体および潜在的なホモ二量体のコンピューターによる計算を示す図５と同じ表である。
【図１１】ＣＨ３変種ＡＺ５（左）およびＡＺ６（右）の図解表示である。
【図１２】ＡＺ４、ＡＺ５、およびＡＺ６のコンピューターデータを示す、図５に記載されている表である。
【図１３】ヘテロ二量体の手法を使用した受容体領域での結合特性の可能性の図を伴う、抗体の左側の図解三次元表示である。
【図１４】ＩｇＧ分子の概略表示である。
【図１５】Ｆｃγ受容体の複数配列の整列を示す。Ｇｅｎｅｂａｎｋ／Ｕｎｉｐｒｏｔ配列番号：ＦｃγＲＩＩＡ（ｓｐ  Ｐ１２３１８）、ＦｃγＲＩＩＢ（ｓｐ  Ｐ３１９９４）、ＦｃγＲＩＩＣ（ｇｉ  １２６１１６５９２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ｓｐ  Ｐ０８６３７）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ｓｐ  Ｏ７５０１５）。
【図１６】Ｆｃ−ＦｃγＲＩＩＩｂ複合体［ＰＤＢ  ＩＤ：１Ｔ８３，Ｒａｄａｅｖ＆Ｓｕｎ］の結晶構造の概略図である。ＦｃとＦｃγ受容体との１：１複合体が、ＦｃおよびＦｃγＲの２つの鎖の間の非対称接触を伴って観察される。
【図１７】本明細書に記載されているヘテロ二量体変種により形成される非対称Ｆｃ足場に基づいた多機能性分子：非対称Ｆｃ足場および非対称Ｆｃ単量体ＩｇＧ腕の概略図を示す。
【図１８】本明細書に記載されているヘテロ二量体変種により形成される非対称Ｆｃ足場に基づいた多機能性分子：非対称Ｆｃ単一特異性ＩｇＧ腕および非対称Ｆｃ二重特異性ＩｇＧ腕（共通軽鎖）の概略図を示す。
【図１９】本明細書に記載されているヘテロ二量体変種により形成される非対称Ｆｃ足場に基づいた多機能性分子の図を示す。非対称Ｆｃ二重特異性ＩｇＧ腕、および毒素のような機能性分子。
【図２０】本明細書に記載されているヘテロ二量体変種により形成される非対称Ｆｃ足場に基づいた多機能性分子：非対称Ｆｃ単一ｓｃＦｖ腕および非対称Ｆｃ二重特異性ｓｃＦｖ腕を図示する。
【図２１】本明細書に記載されているヘテロ二量体変種により形成される非対称Ｆｃ足場に基づいた代替的多機能性分子：非対称Ｆｃ三重特異性ｓｃＦｖ腕および非対称Ｆｃ四重特異性ｓｃＦｖ腕を図示する。
【図２２】ＦｃγＲ選択性が、ＦｃγＲ相互作用を増殖面に、野生型様相互作用を非増殖面により良好に導入するために、Ｆｃの一面に突然変異の非対称設計を示す。Ｆｃの非増殖面における突然変異は、増殖面のみと相互作用するように、ＦｃＲとの相互作用を阻止し、Ｆｃの極性を偏らせるために導入することができる。
【図２３】野生型ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列を示す。
【図２４】下記に詳細に記載されているように、積極的および消極的設計戦略を組み合わせた、Ｆｃヘテロ二量体設計の繰り返し工程処理を示す。
【図２５】図２５Ａ〜２５Ｃは、ヘテロ二量体の純度を決定するために使用されるインビトロアッセイを示す。アッセイは、異なる分子量の２つのＦｃ重鎖を有する完全長単一特異性抗体足場に基づいており、重鎖Ａは、Ｃ末端Ｈｉｓタグ（Ｈｉｓ）を有し、重鎖Ｂは、Ｃ末端切断性ｍＲＦＲタグ（ＲＦＰ）を有する。２つの重鎖Ａ（Ｈｉｓ）およびＢ（ＲＦＰ）は、固定量の軽鎖と一緒に、異なる相対比で発現し、異なる分子量の３つの可能な二量体種を生じる。ａ）ホモ二量体鎖Ａ（Ｈｉｓ）／鎖Ａ（Ｈｉｓ）（約１５０ｋＤａ）、ｂ）ヘテロ二量体鎖Ａ（Ｈｉｓ）／鎖Ｂ（ＲＦＰ）（約１７５ｋＤａ）、ｃ）ホモ二量体鎖Ｂ（ＲＦＰ）／鎖Ｂ（ＲＦＰ）（約２００ｋＤａ）。発現した後、実施例２に記載されているように、２つのホモ二量体に対するヘテロ二量体の比は、非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定し、これは、３つの二量体種を分子量によって分けることを可能にする。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、クーマシーブリリアントブルーにより染色した。図２５Ａ：試験した変種は、ＷＴ鎖Ａ（Ｈｉｓ）のみ、ＷＴ鎖Ｂ（ＲＦＰ）のみ、ＷＴ鎖Ａ（Ｈｉｓ）＋鎖Ｂ（ＲＦＰ）、報告されたヘテロ二量体の純度が＞９５％を有する、対照１鎖Ａ（Ｈｉｓ）＋鎖Ｂ（ＲＦＰ）であった。二量体バンドの組成は、抗体を向けた上記に例示されたＩｇＧ−Ｆｃ（抗Ｆｃ）、ｍＲＦＰタグ（抗ｍＲＦＰ）、およびＨｉｓタグ（抗Ｈｉｓ）を用いるウエスタンブロットにより確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｈｉｓ／Ｈｉｓホモ二量体では単一バンド、Ｈｉｓ／ＲＦＰヘテロ二量体では二重バンド、ＲＦＰホモ二量体では多重バンドを示す。多重バンドは、ｍＲＦＰタグの人為産物であり、Ｆｃヘテロ二量体の物理的特性に影響を与えないことが確認されている。図２５Ｂ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイは、公表されたＦｃヘテロ二量体変種対照１〜４を対照として確認した。表Ａを参照すること。変種を、鎖Ａ（Ｈｉｓ）対鎖Ｂ（ＲＦＰ）の異なる相対比で発現させた。具体的には、比１：３は、ＬＣ、ＨＣ＿Ｈｉｓ、ＨＣ＿ｍＲＦＰ比の２５％、１０％、６５％と、比１：１は、２５％、２０％、５５％と、および比３：１は２５％、４０％、３５％と、それぞれ等しい（鎖Ａ（Ｈｉｓ）と鎖Ｂ（ＲＦＰ）の見掛けの１：１の発現は、ＷＴ  Ｆｃでは２０％／５５％（Ｈｉｓ／ＲＦＰ）に近いことが決定されている）。図２５Ｃは、足場１変種のヘテロ二量体純度を決定する非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイを示す。ヘテロ二量体を、鎖Ａ（Ｈｉｓ）対鎖Ｂ（ＲＦＰ）の異なる相対比で発現させ、図２に記載されているように、非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。具体的には、比１：３は、ＬＣ、ＨＣ＿Ｈｉｓ、ＨＣ＿ｍＲＦＰ比の２５％、１０％、６５％と、比１：１は、２５％、２０％、５５％と、および比３：１は２５％、４０％、３５％と、それぞれ等しい（鎖Ａ（Ｈｉｓ）と鎖Ｂ（ＲＦＰ）の見掛けの１：１の発現は、ＷＴ  Ｆｃでは２０％／５５％（Ｈｉｓ／ＲＦＰ）に近いことが決定されている）。
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｂは、鎖Ａ（Ｈｉｓ）対鎖Ｂ（ＲＦＰ）の特定の相対比で発現させ、（表２を参照すること）、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製され、図２５Ａ〜２５Ｃに記載されているように、非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された、Ｆｃヘテロ二量体変種を示す。図２６Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果の目視検査により観察される純度に基づいたヘテロ二量体の分類を例示する。比較として、等量のプロテインＡ精製産物をゲルに装填した。非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいた純度の定義は、選択された変種に対するＬＣ／ＭＳにより確認した（図２８を参照すること）。図２６Ｂは、選択されたプロテインＡ精製ヘテロ二量体変種（ＡＺ９４、ＡＺ８６、ＡＺ７０、ＡＺ３３、およびＡＺ３４）の例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を提供する。
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｂは、本明細書に記載されているヘテロ二量体変種により形成されたヘテロ二量体ＣＨ３−ＣＨ３ドメインの融解温度を決定するためのＤＳＣ分析を例示する。２つの独立した方法を使用して、融解温度を決定した。図２７Ａは、４つの独立した非２状態遷移に当て嵌められ、かつＨｅｒｃｅｐｔｉｎの約７２℃（ＣＨ２）および約８２℃（Ｆａｂ）の報告された文献の値に近いＣＨ２およびＦａｂの遷移の値を生じるように最適化された温度記録を提供する。図２７Ｂは、ヘテロ二量体変種がＷＴから差し引かれて、ＣＨ３遷移のためだけに正および負のピーク差を生じるように、正規化され、かつベースラインが修正された温度記録を示す。
【図２８】実施例２に記載された変種の例のＡＺ７０のＬＣ／ＭＳ分析を例示する。グリコシル化ヘテロ二量体およびホモ二量体の予測（平均計算）質量が示されている。ヘテロ二量体質量と一致する領域は、グリシンの欠失（−５７Ｄａ）、および１または２つのヘキソースの付加（それぞれ、＋１６２Ｄａおよび＋３２４Ｄａ）に対応する主要なピークを含有する。ヘテロ二量体純度は、いずれかのホモ二量体に対応する有意なピークがない場合、＞９０％と分類される。
【図２９】図２９Ａ〜２９Ｄは、図２９ＡのＷＴ  Ｆｃ、図２９ＢのＡＺ６、図２９ＣのＡＺ３３、図２９ＤのＡＺ１９のＣＨ３界面を示す。発明を実施するための形態に記載されている包括的なコンピューター分析、および変種とＷＴとの比較は、初期ＡＺ３３ヘテロ二量体の安定性がＷＴより低い理由の１つが、Ｙ４０７およびＴ３６６のコア相互作用／詰め込みの欠失であることを示した。初期ＡＺ３３は、図２９Ｂに例示されているように、この疎水性コアにおける非最適詰め込みを示し、この領域、特にＴ３６６の位置の最適化が、ＡＺ３３の安定性を改善することを示唆している。このことは、図２９Ｃおよび図２９ＤのＴ３６６ＩおよびＴ３６６Ｌにおいて例示されている。実験データは、この構造分析と相関し、Ｔ３６６ＬがＴｍに最大の改善を与えたことを示す。実施例５を参照すること。
【図３０】立体配座動力学分析の有用性および重要性を説明し、初期足場１変種ＡＺ８により例示されている。コンピューターによる突然変異誘発の後の構造（ＷＴに近い主鎖立体配座）が、５０ｎｓ分子動力学シミュレーション分析の代表的な構造と重ね合わされている。図は、ＡＺ８変種とＷＴのループ領域Ｄ３９９−Ｓ４００における大きな立体配座の差を強調し、その結果として、これらは疎水性コアを溶媒に曝露し、ＡＺ８ヘテロ二量体の安定性を減少させる。
【図３１】図３１Ａ〜３１Ｃは、包括的なコンピューター分析およびＭＤシミュレーションの情報が、記載されている積極的設計戦略にどのように使用されているかを例示する。図３０に例示されているように、ＡＺ８の安定性がＷＴよりも低い理由の１つは、ループ３９９−４００と４０９との弱められた相互作用であり、これは主にＦ４０５詰め込み相互作用の欠失に起因する（図３１Ａ（ＷＴ）と図３１Ｂ（ＡＺ８）の比較を参照すること）。積極的設計戦略の１つは、３９９−４００ループ立体配座を安定化するため、領域の疎水性詰め込みを最適化することである。このことは、図３１Ｃに例示されている、Ｋ３９２Ｍの突然変異により達成された。図３１Ｃは、ヘテロ二量体ＡＺ３３を表し、これは、初期消極的設計変種ＡＺ８の６８°に対して７４°のＴｍを有する。
【図３２】図３２Ａ〜３２Ｂは、分子動力学軌道の主成分分析を使用して観察された、Ｆｃ分子の動力学を例示する。図３２Ａは、基準としてのＦｃ構造の主鎖追跡を示す。図３２ＢおよびＣは、Ｆｃ構造における最大２つの主な運動様式に沿って観察された動力学の上書きを表す。鎖ＡおよびＢのＣＨ２ドメインは、互いに対して有意な開放／閉鎖運動を示し、一方、ＣＨ３ドメインは、比較的剛性である。ＣＨ３界面における突然変異は、ＣＨ２ドメインにおける開放／閉鎖運動の相対的な柔軟性および動力学に影響を与える。
【図３３】図３３Ａ〜３３Ｃは、ＷＴと比べた２つの足場２変種の疎水性コア詰め込みを例示する。図３３Ａ  ＷＴ  Ｆｃ、図３３Ｂ  ＡＺ６３、および図３３Ｃ  ＡＺ７０。初期足場２変種の包括的なコンピューター分析は、Ｙ−４０７−Ｔ３６６のコアＷＴ相互作用の欠失が、初期足場２変種の安定性がＷＴより低い理由の１つであることを示唆した。Ｙ４０７−Ｔ３６６の欠失は、突然変異Ｋ４０９Ｆにより部分的に代償されるが、図３３Ｂに例示されているように、特にＴ３６６Ａ突然変異は疎水性コアに空洞を残し、これは、ＷＴと比べて変種を不安定化する。この疎水性コアを追加の突然変異Ｔ３６６Ｖ＿Ｌ３５１Ｙにより標的にすることは、図３３ＣにおいてＡＺ７０により示されているように、成功していることが証明されており、ＡＺ７０は、７５．５℃のＴｍが実験的に決定されている。表４および実施例６を参照すること。
【図３４】図３４Ａ〜３４Ｃは、ＷＴと比べた２つの足場２変種のループ３９９−４００の相互作用を例示する。図３４Ａ  ＷＴ  Ｆｃ、図３４Ｂ  ＡＺ６３、および図３４Ｃ  ＡＺ９４。初期足場２変種の包括的なコンピューター分析は、突然変異Ｋ４０９Ｆに起因するＷＴ塩架橋Ｋ４０９−Ｄ３９９の損失（図３４Ａ）、したがって不十分なＤ３９９（図３４Ｂ）が、３９９−４００ループのより「開放された」立体配座をもたらすことを示唆した。このことは、疎水性コアのより大きな溶媒曝露を更にもたらし、ＷＴと比べて変種を更に不安定化する。３９９−４００ループを安定化し、かつＫ４０９−Ｄ３９９相互作用の損失を補うために用いられる戦略の１つは、変種ＡＺ９４について図３４Ｃに例示されているように、追加の塩架橋Ｄ３９９Ｒ−Ｔ４１１ＥおよびＳ４００Ｒ−Ｋ３９２Ｅの設計であった。実験データは、＞９５％の純度および７４℃のＴｍを示した。表４および実施例６を参照すること。更に、ＡＺ９４は、初期足場２変種より顕著に高い純度および安定性（＜９０％の純度、７１℃のＴｍ）を有するが、ＡＺ９４の疎水性コア突然変異は、変種ＡＺ７０において特定された「最良の」疎水性コア突然変異よりも好ましくない（図３３）。ＡＺ７０の疎水性コアにおける突然変異（Ｔ３６６Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ）は、ループ３９９−４００におけるＡＺ９４の塩架橋突然変異から遠位にあるので、ＡＺ７０アミノ酸突然変異と追加のＡＺ９４突然変異との組み合わせは、ＡＺ７０またはＡＺ９４よりも高い融解温度を有することが予測される。組み合わせは、実施例１〜４に記載されているように試験することができる。
【図３５】６つのＦｃガンマ受容体に結合しているホモ二量体ＩｇＧ１  Ｆｃ、ヘテロ二量体変種ｈｅｔ１（対照１）：Ａ：Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｂ：Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｗ、およびｈｅｔ２（対照４）：Ａ：Ｋ４０９Ｄ＿Ｋ３９２Ｄ／Ｂ：Ｄ３９９Ｋ＿Ｄ３５６Ｋの会合定数（Ｋａ（Ｍ−１））を例示する。ヘテロ二量体は、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃと比較して、Ｆｃガンマ受容体への僅かに変化した結合を示す傾向がある。実施例７を参照すること。
【図３６Ａ】野生型結合強度を基準として、ＩＩｂＦ、ＩＩＢＹ、およびＩＩａＲ受容体への野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ、ならびにその変種二量体および非対称突然変異体形態の相対的結合強度を示す。（ＨｏｍｏＦｃ＋Ｓ２６７Ｄ）は、両方の鎖にＳ２６７Ｄ突然変異を有するホモ二量体Ｆｃの結合強度を意味する。（Ｈｅｔ  Ｆｃ＋非対称Ｓ２６７Ｄ）は、Ｆｃの２つの鎖の一方に導入されたＳ２６７Ｄ突然変異を有するヘテロ二量体Ｆｃの結合強度を意味する。２つのＦｃ鎖のいずれかへの突然変異の導入により得られる結合強度の平均が報告されている。１つの鎖へのこの突然変異の導入は、結合強度を、ホモ二量体の方法における同じ突然変異において観察される強度のほぼ半分に低減した。（Ｈｅｔ  Ｆｃ＋非対称Ｓ２６７Ｄ＋非対称Ｅ２６９Ｋ）は、２つのＦｃ鎖の一方に非対称的な方法で導入されたＳ２６７ＤおよびＥ２６９Ｋの両方の突然変異を有するヘテロ二量体Ｆｃの結合強度を意味する。Ｅ２６９Ｋ突然変異は、ＦｃｇＲとＦｃの面の１つとの相互作用を阻止し、結合強度を、それ自体により、非対称Ｓ２６７Ｄ変種（Ｈｅｔ  Ｆｃ＋Ｓ２６７Ｄ）において観察されたもののほぼ半分にすることができる。ここでＨｅｔ  Ｆｃは、図３５の変種ｈｅｔ２（対照４）について示されているように、ＣＨ３突然変異により構成されている。
【図３６Ｂ】多様なＦｃおよび多数のＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩｂ、およびＦｃｇＲＩＩＩａアロタイプを有するその変種の会合定数（Ｋａ（Ｍ−１））を示す。多様なＦｃｇ受容体への野生型ＩｇＧ１のＫａは、水平網掛けの縦棒により表されている。垂直網掛けの棒（ホモ二量体塩基２）は、突然変異Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｓ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａを有するホモ二量体ＦｃのＫａを表す。斜線網掛けの縦棒は、ＣＨ２ドメインにおける非対称突然変異Ａ：Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｓ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ２６９ＫおよびＢ：Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｓ／Ｓ２９８Ａを有するヘテロ二量体ＦｃのＫａを表す。非対称突然変異の導入は、ＩＩＩａとＩＩａ／ＩＩｂの受容体の間における選択性の増加を達成することができる。ここでヘテロ二量体Ｆｃは、図３５の変種ｈｅｔ２（対照４）について示されているように、ＣＨ３突然変異から構成されている。
【図３６Ｃ】野生型ＩｇＧ１と、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインにおけるホモ二量または非対称突然変異を伴う他の３つの構築物との会合定数（Ｋａ（Ｍ−１））を示す。野生型ＦｃのＫａは、格子の網掛け縦棒により表されている。Ｆｃの両方の鎖にホモ二量体の方法で導入された塩基突然変異Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａを有するＦｃ変種（ホモ二量体塩基１）のＫａは、斜線パターン縦棒により示されている。ヘテロ二量体Ｆｃの鎖ＡおよびＢへの非対称的方法による関連突然変異の導入（ヘテロ塩基１）は、水平線により示されている。垂直網掛け線の縦棒は、Ｅ２６９Ｋ突然変異を含む非対称変種（ヘテロ塩基１＋ＰＤ）を表す。ここでヘテロ二量体Ｆｃは、図３５の変種ｈｅｔ２（対照４）について示されているように、ＣＨ３突然変異から構成されている。
【図３７】−表６は、足場１について実施例５に記載されている第３設計段階に基づいた変種ＣＨ３ドメインのリストである。
【図３８】−表７は、足場２について実施例６に記載されている第３設計段階に基づいた変種ＣＨ３ドメインのリストである。
【図３９】図３９Ａ〜３９Ｂは、ＬＣ／ＭＳを使用した、Ｃ末端タグを有さない変種の純度決定を例示する。図３９Ａは、１つの代表的な変種（ＡＺ１６２：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ）のＬＣ／ＭＳスペクトルを示す。変種は、重鎖Ａと重鎖Ｂの３つの異なる比の１：１．５（ＡＺ１３３−１）、１：１（ＡＺ１３３−２）、および１．５：１（ＡＺ１３３−３）を使用して、実施例において記載されている一過性同時発現により発現させた。試料を精製し、Ｅｎｄｏ  Ｓにより３７℃で１時間、脱グリコシル化した。ＭＳ分析の前に、試料をＰｏｒｏｓ  Ｒ２カラムに注入し、２０〜９０％のＡＣＮによる勾配、０．２％のＦＡで３分間溶出した。ＬＣカラムのピークを、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ質量分析器（コーン電圧：５０Ｖ′、管レンズ：２１５Ｖ、ＦＴ解像度：７，５００）により分析し、ソフトウエアＰｒｏｍａｓｓと統合して、分子量プロフィールを生成した。図３９Ｂは、対照２試料のＬＣ／ＭＳスペクトルを示し、これはＫｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅｓの変種を表す。変種は、重鎖Ａと重鎖Ｂの３つの異なる比の１：１．５（対照２−１）、１：１（対照２−２）、および１．５：１（対照２−３）を使用して、実施例において記載されている一過性同時発現により発現させた。試料を精製し、Ｅｎｄｏ  Ｓにより３７℃で１時間、脱グリコシル化した。ＭＳ分析の前に、試料をＰｏｒｏｓ  Ｒ２カラムに注入し、２０〜９０％のＡＣＮによる勾配、０．２％のＦＡで３分間溶出した。ＬＣカラムのピークを、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ質量分析器（コーン電圧：５０Ｖ′、管レンズ：２１５Ｖ、ＦＴ解像度：７，５００）により分析し、ソフトウエアＰｒｏｍａｓｓと統合して、分子量プロフィールを生成した。
【図４０】ＣＨ３ドメイン配列の多重配列整列を提供する。異なる主のＣＨ３配列は、ヒトＩｇＧ１基準およびＥｕ番号付けスキームに従って番号付けされる。ヘテロ二量体形成を達成するために突然変異された残基は、鎖＿Ａには＊、鎖＿Ｂには＋を付けた。足場１の突然変異には、鎖＿Ａ：（３５０Ｖ）＿３５１Ｙ＿４０５Ａ＿４０７Ｖ、および鎖＿Ｂ：（３５０Ｖ）＿３６６Ｌ＿３９２Ｌ＿３９４Ｗが含まれる。配列整列において灰色および黒色枠により例示されている、それぞれの種の対応する位置を突然変異させて、ＩｇＧ１様の方法により高純度でヘテロ二量体を形成することができる。種の説明：ＩｇＧ１＿ヒト（ホモサピエンス）、ＩｇＧ２ａ＿ラクダ  カメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）（ヒトコブラクダ）、ＩｇＧ３＿ラクダ  カメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）（ヒトコブラクダ）、ＩｇＧ２ａ＿ラマ  ラマ・グラマ（Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ）（ラマ）、ＩｇＧ３＿ラマ  ラマ・グラマ（Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ）（ラマ）、ＩｇＧ２ａ＿マウス  ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ハツカネズミ）、ＩｇＧ１＿マウス  ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ハツカネズミ）、ＩｇＧ３＿マウス  ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ハツカネズミ）、ＩｇＧ＿ウサギ  オリクトラグス・クニクルス（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）（ウサギ）、ＩｇＧ１＿ヒツジ  Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ（オビス  アリエス）（ヒツジ）、ＩｇＧ２ａ＿ラット  ラッタス・ノルベギクス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ドブネズミ）、ＩｇＧ１＿ラット  ラッタス・ノルベギクス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ドブネズミ）、ＩｇＹ＿ニワトリ  ガルス・ガルス（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）（ニワトリ）。
【図４１】例示的なヘテロ二量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を描いている。
【図４２】例示的なヘテロ二量体のＵＰＬＣ分析を描いている。
【図４３】ＥＧＦＲに結合する例示的なヘテロ二量体の能力を描いている。
【図４４】ＥＧＦＲに結合するｓｄａｂの核酸配列を描いている。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
ヘテロ多量体の形成を促進する特定のアミノ酸修飾を含む修飾ＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体ＦＣ領域の少なくとも１つの単量体に結合している少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む単離ヘテロ多量体であって、当該単離多量体が、免疫グロブリン軽鎖を欠いており、場合により、免疫グロブリンの第１の定常（ＣＨ１）領域および免疫グロブリンの第２の定常（ＣＨ２）領域を欠いている、単離ヘテロ多量体が、本明細書において提供される。幾つかの実施形態において、修飾ＣＨ３ドメインは、ヘテロ二量体の形成を促進する特定のアミノ酸修飾を含む（例えば、表１．１〜１．３を参照すること）。別の実施形態において、修飾ＣＨ３ドメインは、増加した安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進する特定のアミノ酸修飾を含む（例えば、表４、表６、および表７を参照すること）。安定性は、ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）として測定され、増加した安定性は、約７０℃以上のＴｍを意味する。ＣＨ３ドメインは、ヘテロ多量体多特異的抗体のＦｃ領域の一部を形成する。ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含むヘテロ量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、ヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む修飾または変種ＣＨ３ドメインを含み、変種ＣＨ３ドメインが、表１の列記されている変種から選択される、ヘテロ多量体が、１つの実施形態において本明細書に提供される。第２の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含むヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、増加した安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、変種ＣＨ３ドメインが、約７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、ヘテロ多量体が提供される。
【００７１】
修飾ＣＨ３ドメインを生成するために利用されるアミノ酸修飾には、アミノ酸挿入、欠失、置換、および再編成が含まれるが、これらに限定されない。ＣＨ３ドメインの修飾および修飾ＣＨ３ドメインは、「ＣＨ３修飾」、「修飾ＣＨ３ドメイン」、「変種ＣＨ３ドメイン」、または「ＣＨ３変種」と本明細書において集合的に呼ばれる。ある特定の実施形態において、修飾ＣＨ３ドメインは、選択された分子に組み込まれる。したがって、１つの実施形態において、修飾ＣＨ３ドメインを組み込むＦｃ領域（本明細書で使用されるとき、「Ｆｃ領域」および類似の用語は、ＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む任意の重鎖定常領域ドメインを包含する）を含む、免疫グロブリン（例えば、抗体）および他の結合タンパク質のような分子、例えば、ポリペプチドが提供される。修飾ＣＨ３ドメイン（例えば、１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、置換、または再編成を含むＣＨ３ドメイン）を含むＦｃ領域を含む分子は、本明細書において「Ｆｃ変種」、「ヘテロ二量体」、または「ヘテロ多量体」と呼ばれる。本発明のＦｃ変種は、ヘテロ二量体Ｆｃ変種または領域を生成するように非対称的に修飾されているＣＨ３ドメインを含む。ヘテロ多量体は、２つの重鎖ポリペプチド、鎖Ａおよび鎖Ｂから構成され、これらは交換可能に使用され得るが、但し、それぞれのＦｃ領域が、１つの鎖Ａおよび１つの鎖Ｂポリペプチドを含むこと、ならびに鎖Ａおよび鎖Ｂの少なくとも一方が、重鎖変種領域を含むことが条件である。アミノ酸修飾は、ＣＨ３に非対称様式で導入され、２つの修飾ＣＨ３ドメインがＦｃ変種を形成するときにヘテロ二量体をもたらす（例えば、表１を参照すること）。本明細書で使用されるとき、非対称アミノ酸修飾は、１つのポリペプチド（例えば「鎖Ａ」）の特定の位置におけるアミノ酸が、ヘテロ二量体またはＦｃ変種の同じ位置における第２のポリペプチド（例えば、「鎖Ｂ」）のアミノ酸と異なる、任意の修飾である。これは、鎖Ａおよび鎖Ｂの２つの異なるアミノ酸に対して、２つのアミノ酸のうちの１つのみの修飾、または両方のアミノ酸の修飾をもたらし得る。変種ＣＨ３ドメインが１つ以上の非対称アミノ酸修飾を含むことが、理解される。
【００７２】
定義
本記載において、任意の濃度範囲、百分率範囲、比率範囲、または整数範囲は、特に示されない限り、引用された範囲内の任意の整数の値、適切な場合はその分数（例えば、整数の十分の一および百分の一）を含むことが理解されるべきである。本明細書で使用されるとき、「約」は、特に示されない限り、示されている範囲、値、配列、または構造の±１０％を意味する。用語「ａ」および「ａｎ」は、本明細書で使用されるとき、特に示されない、または文脈によって決まらない限り、列挙された成分の「１つ以上」を意味することが理解されるべきである。代替案（例えば、「または」）の使用は、代替案のいずれかの１つ、両方、または任意の組み合わせを意味することが理解されるべきである。本明細書で使用されるとき、用語「含まれる」および「含む」は、同義的に使用される。加えて、本明細書に記載されている構造および置換基（例えば、変種ＣＨ３ドメイン）の多様な組み合わせから誘導される個別の単一鎖ポリペプチドまたはヘテロ二量体は、まるでそれぞれの単一鎖ポリペプチドまたはヘテロ二量体が個別に記載されているかのように、同じ程度で本出願に開示されていることが理解されるべきである。したがって、個別の単一鎖ポリペプチドまたはヘテロ二量体を形成するために特定の成分を選択することは、本開示の範囲内である。
【００７３】
「第１のポリペプチド」は、第２のポリペプチドと会合するべき任意のポリペプチドであり、本明細書において「鎖Ａ］とも呼ばれる。第１および第２のポリペプチドは、「界面」において出会う。「第２のポリペプチド」は、第１のポリペプチドと「界面」を介して会合するべき任意のポリペプチドであり、本明細書において「鎖Ｂ］とも呼ばれる。当該第１および第２のポリペプチドの少なくとも一方は、少なくとも１つの重鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの重鎖可変ドメインは、重鎖抗体から得られる。幾つかの実施形態において、重鎖抗体は、サメのような軟骨魚類、またはラマのようなラクダ科動物から得られる。「界面」は、第２のポリペプチドの界面における１つ以上の「接触」アミノ酸残基と相互作用する、第１のポリペプチドにおける「接触」アミノ酸残基を含む。本明細書で使用されるとき、界面は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインを含む。幾つかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１抗体などであるが、これに限定されないＩｇＧ抗体から誘導される。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの重鎖可変ドメインは、リンカーによりＣＨ３ドメインに連結している。
【００７４】
本明細書において使用されるとき、「単離」ヘテロ多量体は、天然の細胞培養環境の成分から同定および分離、ならびに／または回収されたヘテロ多量体を意味する。天然環境の汚染成分は、ヘテロ多量体の診断的または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様または非タンパク質様溶質が含まれ得る。
【００７５】
本明細書で使用されるとき、「未変性Ｆｃホモ二量体に匹敵する安定性」は、Ｆｃヘテロ二量体が未変性ホモ二量体と類似する安定性を有することを意味する。ある特定の実施形態において、ヘテロ二量体の安定性は、対応する未変性ホモ二量体Ｆｃの±５℃以内である。幾つかの実施形態において、ヘテロ二量体の安定性は、対応する未変性ホモ二量体Ｆｃの±２℃以内である。
【００７６】
本明細書に記載されているヘテロ多量体は、一般に、実質的に均質に精製される。句「実質的に均質」、「実質的に均質な形態」、および「実質的な均質性」は、生成物が望ましくないポリペプチドの組み合わせ（例えば、ホモ二量体）由来の副産物を実質的に欠いていることを示すために使用される。純度に関する表現としては、実質的な均質性は、副産物の量が１０％を超えない、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは０．５％未満であることを意味し、ここで百分率は重量に基づいている。
【００７７】
当業者に理解されている用語は、本明細書において明確に異なって定義されていない限り、それぞれ当該技術において取得された意味を持つ。抗体は、可変領域、ヒンジ領域、および定常ドメインを有することが知られている。免疫グロブリンの構造および機能は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８８）において概説されている。
【００７８】
抗体の「Ｆａｂフラグメント」（フラグメント抗原結合とも呼ばれる）は、右鎖の定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を、軽および重鎖のそれぞれに可変ドメインＶＬおよびＶＨを伴って含有する。可変ドメインは、抗原結合に関与する相補性決定ループ（ＣＤＲ、超可変領域とも呼ばれる）を含む。Ｆａｂ′フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端への幾つかの残基の付加によって、Ｆａｂフラグメントと異なる。
【００７９】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。１つの実施形態において、Ｆｖポリペプチドは、抗原結合のためにｓｃＦｖを所望の構造に形成することができる、ＶＨとＶＬのドメインの間にあるポリペプチドリンカーを更に含む。ｓｃＦｖについての概説は、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照すること。ＨＥＲ２抗体ｓｃＦＶフラグメントは、国際公開第９３／１６１８５号、米国特許第５，５７１，８９４号、および米国特許第５，５８７，４５８号に記載されている。
【００８０】
非ヒト（例えば、齧歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小限の配列を含有するキメラ抗体である。大部分の場合において、ヒト化抗体は、受給体の超可変領域における残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類のような非ヒト種（供与体の抗体）の超可変領域の残基に代えられているヒト免疫グロブリン（受給体の抗体）である。幾つかの場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基に代えられている。更に、ヒト化抗体は、受給体の抗体または供与体の抗体において見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能を更に洗練するために実行される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを実質的に全て含み、全てまた実質的に全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンに対応し、全てまたは実質的に全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、場合により、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含む。更なる詳細は、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，  Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照すること。
【００８１】
ヘテロ多量体
本発明は、少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合（ｓｄＡｇ）構築物および免疫グロブリンヘテロ二量体Ｆｃ領域を含むヘテロ多量体であって、当該免疫グロブリンヘテロ二量体Ｆｃ領域が、２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含み、単一ドメイン抗原結合構築物が、未変性免疫グロブリンホモ二量体Ｆｃ領域に匹敵する安定性を有するヘテロ二量体Ｆｃ領域の形成を促進するアミノ酸修飾を含む免疫グロブリンヘテロ二量体Ｆｃ領域に結合している１つの単量体Ｆｃポリペプチドに結合しており、ならびにＩｇＧ軽鎖およびＩｇＧ  ＣＨ１領域を欠いているヘテロ多量体を提供する。ヘテロ多量体は、一価および単一特異性、二価および単一特異性、または二価および二重特異性であり得る。本明細書に記載されているヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む本明細書に記載されているヘテロ多量体は、野生型ＩｇＧ１に匹敵する固有の安定性を有し、約８５％を超える純度で形成される。
【００８２】
１つの実施形態において、ヘテロ多量体は、２つの重鎖を含むヘテロ二量体である。
【００８３】
本明細書に記載されているヘテロ多量体は、ｓｃＦｖまたはＦａｂを含む抗体様式と比較して、多機能性の二重特異性抗体の容易な構築および製造を可能にする。本明細書に記載されているヘテロ多量体は、ＩｇＧ軽鎖を欠いているので、２つの軽鎖を含む二重特異性抗体の作製における固有の「軽鎖ごちゃ混ぜ」問題が回避される。
【００８４】
本明細書に記載されているヘテロ多量体は、
ａ）単一ドメイン抗原結合構築物による抗原の高い親和性結合、
ｂ）構成単一ドメイン抗原結合構築物の良好なヘテロ多量体品質および生物物理学的安定性（凝集の欠如）、
ｃ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞発現系における、ならびにｓｃＦＶおよびＦａｂ様式を含む他のヘテロ多量体構築物と比較した製造可能性における高い抗体価
を実証する。
【００８５】
これらの特性は、本明細書に記載されているヘテロ多量体が、二重特異性および多機能性治療抗体、ならびに臨床または標的化試薬の開発を含む多様な用途において使用されることを可能にする。
【００８６】
１つの実施形態において、単離ヘテロ多量体は、少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物および免疫グロブリンヘテロ二量体Ｆｃ領域を含み、当該免疫グロブリンヘテロ二量体Ｆｃ領域は、２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含み、単一ドメイン抗原結合構築物は、一方の単量体Ｆｃポリペプチドに結合し、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、未変性ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を有する当該ヘテロ二量体Ｆｃ領域の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、当該単離ヘテロ多量体は、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリンの第１の定常（ＣＨ１）領域を欠いている。
【００８７】
本明細書に記載されているヘテロ多量体は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域に結合している１つの単一ドメイン抗原結合構築物のみを有し得ることが考慮される。したがって、１つの実施形態において、単離ヘテロ多量体は、１つの単一ドメイン抗原結合構築物および免疫グロブリンヘテロ二量体Ｆｃ領域を含み、当該免疫グロブリンヘテロ二量体Ｆｃ領域は、２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含み、単一ドメイン抗原結合構築物は、一方の単量体Ｆｃポリペプチドに結合している。
【００８８】
本明細書に記載されているヘテロ多量体は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域に結合している２つの単一ドメイン抗原結合構築物を含み得ることが更に考慮される。別の実施形態において単離ヘテロ多量体は、１つの単一ドメイン抗原結合構築物および免疫グロブリンヘテロ二量体Ｆｃ領域を含み、当該免疫グロブリンヘテロ二量体Ｆｃ領域は、２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含み、１つの単一ドメイン抗原結合構築物は、一方の単量体Ｆｃポリペプチドに結合しており、第２の単一ドメイン抗原結合構築物は、第２の単量体Ｆｃポリペプチドに結合している。
【００８９】
単一ドメイン抗原結合構築物
上記に示されているように、本明細書に記載されているヘテロ多量体は、少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物および免疫グロブリンヘテロ二量体Ｆｃ領域を含み、当該免疫グロブリンヘテロ二量体Ｆｃ領域は、２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含み、単一ドメイン抗原結合構築物は、一方の単量体Ｆｃポリペプチドに結合している。
【００９０】
単一ドメイン抗原結合構築物は、標的ポリペプチドに特異的または選択的に結合し得る結合ポリペプチドを含む。用語「特異的結合」は、本明細書で使用されるとき、平衡解離定数Ｋｄにより観察した、抗原に対する抗原結合構築物の高い親和性結合を意味する。Ｋｄは、平衡解離定数であり、ｋｏｆｆ／ｋｏｎに等しい。ｋｏｆｆは、抗原に複合した抗原結合構築物の解離速度を記載し、ｋｏｎは、抗原に対する抗原結合構築物の会合速度を記載する。用語「選択的結合」は、本明細書で使用されるとき、リガンドが１つの標的に別の標的よりも高い親和性を示すように、リガンドが受容体または標的に結合する異なる親和性を意味し、選択的リガンドは、非常に限定された種類の受容体に結合し、一方、非選択的リガンドは、数種類の受容体に結合する。当該技術において知られているように、標的受容体への特異的および選択的結合は、単一ドメイン抗原結合構築物を含む治療薬に、標的を発現する疾患細胞を認識および治療する能力を与えることができる。
【００９１】
適切な単一ドメイン抗原結合構築物の例には、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂまたはＶＨ）、ラクダ科動物のナノボディ（ＶｈＨ）、サメＶＮＡＲ、ＳＨ３誘導性フィノマー、ならびにアドネクチンおよびＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリン反復タンパク質）のようなフィブロネクチン誘導性結合ドメインのような、抗体軽鎖を欠くものが含まれる。これらの単一ドメイン抗体結合構築物は、そのサイズおよび構的立体配座に起因して伝統的なＦａｂでは利用できない、代替的または潜在的エピトープに結合する能力のような特性を示している。
【００９２】
１つの実施形態において、単一ドメイン抗原結合構築物は、ドメイン抗体（もしくは、ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（もしくは、単一ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」（もしくは、ｄＡｂとしての使用に適したアミノ酸配列）、またはナノボディ（本明細書において定義されており、ＶＨＨ配列が含まれるが、これらに限定されない）、他の単一可変ドメイン、あるいはこれらのいずれかの任意の適切なフラグメントから選択される免疫グロブリン重鎖可変領域または可変重鎖である。（単一）ドメイン抗体の一般的な記載には、上記に引用された当該技術、ならびにヨーロッパ特許第０  ３６８  ６８４号も参照される。用語「ｄＡｂ」には、例えばＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  １９８９  Ｏｃｔ．１２；３４１（６２４２）：５４４−６）、Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００３，２１（１１）：４８４−４９０）、ならびに例えば国際公開第０４／０６８８２０号、同第０６／０３０２２０号、同第０６／００３３８８号、およびＤｏｍａｎｔｉｓ  Ｌｔｄ．による他の公開特許出願が参照される。幾つかの実施形態において、可変重鎖は単一ドメイン抗体を含む、または単一可変ドメインは、特定の種のサメから誘導され得る（例えば、いわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えば国際公開第０５／１８６２９号を参照すること）。
【００９３】
したがって、１つの実施形態において、単離ヘテロ多量体は、単一ドメイン抗体、ラクダ科動物ナノボディ、サメＶＮＡＲ、ＳＨ３誘導性フィノマー、ならびにアドネクチンおよびＤＡＲＰｉｎのようなフィブロネクチン誘導性結合ドメインから選択される単一ドメイン抗原結合構築物を含む。１つの実施形態において、単離ヘテロ多量体は、単一ドメイン抗体、ラクダ科動物ナノボディ、および軟骨魚類ＶＮＡＲから選択される単一ドメイン抗原結合構築物を含む。１つの実施形態において、単離ヘテロ多量体は、ＳＨ３誘導性フィノマーまたはフィブロネクチン誘導性結合ドメインである単一ドメイン抗原結合構築物を含む。１つの実施形態において、フィブロネクチン誘導性結合ドメインは、ＤＡＲＰｉｎまたはアドネクチンである。ＳＨ３誘導性フィノマー、アドネクチン、およびＤＡＲＰｉｎは、当該技術において知られている（例えば、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（２００７）２８２（５）：３１９６−２０４；Ｌｉｐｏｖｓｅｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（２０１１）２４（１−２）：３−９、およびＴａｍａｓｋｏｖｉｃ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（２０１２），５０３，１０１−１３４を参照すること）。
【００９４】
１つの実施形態において、単一ドメイン抗原結合構築物は、単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、単一単量体可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである。ドメイン抗体の適切な例は、当該技術において知られており、例えば、（例えば、Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００９），１９８（３）：１５７−１７４の図４、およびＢａｒｔｈｅｌｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００８）１３８，３６３９−５４の図１Ａを参照すること）。
【００９５】
１つの実施形態において、単一ドメイン抗原結合構築物は、ラクダ科動物ナノボディ（ＶｈＨ）である。ラクダ科動物ナノボディは、軽鎖および重鎖ＣＨ１定常ドメインを欠いているラクダ科動物において見出される重鎖抗体から誘導される抗体フラグメントである。１つの実施形態において、単一ドメイン抗原結合構築物は、軟骨魚類ＶＮＡＲである。そのような軟骨魚類ＶＮＡＲには、サメにおいて見出される重鎖抗体から誘導されるＶＮＡＲ抗体フラグメントが含まれる。これらの抗体フラグメントは、また、軽鎖および重鎖ＣＨ１定常ドメインを欠いている。既知のラクダ科動物およびサメの単一ドメイン抗原結合構築物の例は、Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００９）１９８：１５７−１７４の表１において確認される。例えば、膜タンパク質を標的にする単一ドメイン抗原結合構築物には、免疫されたラマからのＡＲＴ２．２、免疫されたラマからのＣＤ１６、免疫されたラクダ、免役されたラマからのＥＧＦＲ、免疫されたラマからのＣＥＡ癌免疫療法、ラクダおよびラマからのＭＵＣ１腫瘍標的免疫、ならびに免疫されたラクダからのＣＤ１０５（エンドグリン）が含まれる。分泌タンパク質を標的にする単一ドメイン抗原結合構築物には、免役されたラマおよびアルパカからのＴＮＦ、免疫されたヒトコブラクダからのＰＳＡ、免役されたラマからのフォン・ヴィルブランド因子、免役されたヒトコブラクダおよびアルパカからのアミロイドＡペプチド、免役されたヒトコブラクダからのリゾチーム、免役されたラマからのＩｇＧ、ならびに免役されたラマからの血清アルブミンが含まれる。細胞内タンパク質を標的にする単一ドメイン抗原結合構築物には、免疫されていないラマからのＢａｘ、免疫されていないラマからのＨＩＦ−１、免役された、および免疫されていないラマからのＰＡＢＰＮ１が含まれる。
【００９６】
本明細書に記載されているヘテロ多量体への使用に適している単一ドメイン抗原結合構築物は、ラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ、およびアルパカを含む）、ならびにサメのような天然に生じる供給源から得ることができる。単一ドメイン抗原結合構築物は、目的の標的に結合する単一ドメイン抗原結合構築物を選択するため、ファージディスプレーライブラリーのようなライブラリーをスクリーンすることにより得ることもできる。標的特異的単一ドメイン抗原結合構築物を選択するためにそのようなライブラリーをスクリーンする方法は、当該技術において知られている（例えば、Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ（２００６）８６：３４５−５６、およびＶｅｒｈｅｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２０１２）９１１：８１−１０４を参照すること）。
【００９７】
特定の単一ドメイン抗原結合構築物のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は、当該技術において知られている、または公表されている配列データバンク、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、または例えばＥＭＢＬにおいて利用可能であり、したがって、本明細書に記載されている単一ドメイン抗原結合構築物を含むヘテロ多量体の調製を促進する。
【００９８】
標的の選択
上記に示されているように、単一ドメイン抗原結合構築物は、標的抗原に選択的および／または特異的に結合することができる。標的タンパク質は、ヘテロ多量体の意図される使用に基づいて選択される。１つの実施形態において、標的細胞は、癌、感染性疾患、自己免疫性疾患、または炎症性疾患において活性化または増幅される細胞である。１つの実施形態において、ヘテロ多量体がＥＧＦＲ１に結合する場合、標的細胞は、癌、自己免疫性疾患、または炎症性疾患において活性化または増幅される細胞である。
【００９９】
別の実施形態において、標的細胞は、対象が細菌または真菌のような病原性生物による感染に罹患しているときに活性化または増幅されるものである。
【０１００】
別の実施形態において、ヘテロ多量体は、Ｆａｂのような伝統的な抗原結合部分により典型的に利用可能ではない標的抗原を発現する細胞を、標的にするために使用される。ヘテロ多量体の単一ドメイン抗原結合構築物の性質は、立体配座的遮蔽および立体的閉鎖によりホルモン免疫系から保護されている、例えばＣＤ４のような、例えば高度に保存された残基のような標的に結合すること、ならびにより小さなエピトープにより抗原を標的にすることを可能にする。
【０１０１】
特定の標的
１つの実施形態において、本発明のヘテロ多量体は、例えばＩＬ２、ＩＦＮａ−２ａ／ｂ、ＩＦＮ−１ａ／ｂ、ＩＬ−２１、ＩＬ−１７ａ、ＴＮＦ、ＩＬ２３、ＶＥＧＦ、またはＡＮＧ２のような１つ以上のサイトカインまたはケモカインを標的にする。別の実施形態において、本発明のヘテロ多量体は、ＥｐＣａｍ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＣＥＡ、またはＧＰ１００のような１つ以上の腫瘍関連抗原を標的にする。別の実施形態において、本発明のヘテロ多量体は、ＣＤ１６、ＣＤ３０、ＣＤ１３７、ＣＤ２２、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ２３、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＫＩＲ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ２５、ＬＡＧ３、またはＢ７−Ｈ３のような免疫調節抗原を標的にする。
【０１０２】
１つの実施形態では、本発明において提供されるヘテロ多量体は、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂのような１つ以上の細菌性毒素を標的にする。
【０１０３】
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるヘテロ多量体は、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＣＡＭ−１、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂ、ＩＣＡＭ−１、Ｂａｘ−タンパク質、ＣＤＣ５０Ａ、およびイプシロンアイソフォームを含むＣＤ３アイソフォームから選択される１つ以上の標的抗原を標的にするのに有用である。ある特定の実施形態では、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＣＡＭ−１、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂ、ＩＣＡＭ−１、Ｂａｘ−タンパク質、ＣＤＣ５０Ａ、およびイプシロンアイソフォームを含むＣＤ３アイソフォームの１つ以上を標的にする少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む、本明細書に記載されているヘテロ多量体である。ある特定の実施形態では、ラマ重鎖抗体から誘導される少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含み、当該可変重鎖が、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＣＡＭ−１、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂ、ＩＣＡＭ−１、Ｂａｘ−タンパク質、ＣＤＣ５０Ａ、およびイプシロンアイソフォームを含むＣＤ３アイソフォームの１つ以上を標的にする、本明細書に記載されているヘテロ多量体である。ある特定の実施形態では、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＣＡＭ−１、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂ、ＩＣＡＭ−１、Ｂａｘ−タンパク質、ＣＤＣ５０Ａ、およびイプシロンアイソフォームを含むＣＤ３アイソフォームの１つ以上を標的にする単一ドメイン抗原結合構築物を含む、多特異的ヘテロ多量体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されている二重特異的ヘテロ多量体であって、当該ヘテロ多量体が、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＣＡＭ−１、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂ、ＩＣＡＭ−１、Ｂａｘ−タンパク質、ＣＤＣ５０Ａ、およびイプシロンアイソフォームを含むＣＤ３アイソフォームの１つ以上を標的にするラクダ科動物重鎖抗体から誘導される単一ドメイン抗原結合構築物を含む、二重特異的ヘテロ多量体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されている二重特異的ヘテロ多量体であって、当該ヘテロ多量体が、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＣＡＭ−１、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂ、ＩＣＡＭ−１、Ｂａｘ−タンパク質、ＣＤＣ５０Ａ、およびイプシロンアイソフォームを含むＣＤ３アイソフォームの１つ以上を標的にするラマ重鎖抗体から誘導される単一ドメイン抗原結合構築物を含む、二重特異的ヘテロ多量体である。
【０１０４】
１つの実施形態において、単一ドメイン抗原結合構築物は、標的抗原に対して中和活性を有するものである。用語「中和活性」は、単一ドメイン抗原結合構築物の文脈において本明細書で使用されるとき、標的抗原への同族リガンドの結合を阻止する単一ドメイン抗原結合構築物の能力を意味する。別の実施形態において、単一ドメイン抗原結合構築物は、標的抗原に対して中和活性を有さないものである。１つの実施形態において、ヘテロ多量体は、非中和性であるＥＦＧＲ単一ドメイン抗原結合構築物を含む。別の実施形態において、ヘテロ多量体は、中和性であるＥＦＧＲ単一ドメイン抗原結合構築物を含む。中和ＥＦＧＲ単一ドメイン抗原結合構築物の例は、Ｏｍｉｄｆａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）３１：１０１５−１０２６において見出される。
【０１０５】
１つの実施形態において、本発明のヘテロ多量体が２つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む場合、両方の単一ドメイン抗原結合構築物は、同じ抗原に結合する。別の実施形態において、本発明のヘテロ多量体が２つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む場合、両方の単一ドメイン抗原結合構築物は、同じエピトープに結合する。別の実施形態において、本発明のヘテロ多量体が２つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む場合、１つの単一ドメイン抗原結合構築物は１つの標的に結合し、第２の単一ドメイン抗原結合構築物は異なる標的に結合する。更に別の実施形態において、本発明のヘテロ多量体が２つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む場合、１つの単一ドメイン抗原結合構築物は１つのエピトープに結合し、第２の単一ドメイン抗原結合構築物は異なるエピトープに結合する。
【０１０６】
免疫グロブリンヘテロ二量体Ｆｃ領域
上に示されているように、本明細書に記載されているヘテロ多量体は、少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合（ｓｄＡｇ）構築物および免疫グロブリンヘテロ二量体Ｆｃ領域を含み、当該免疫グロブリンヘテロ二量体Ｆｃ領域は、２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含み、単一ドメイン抗原結合構築物は、未変性免疫グロブリンホモ二量体Ｆｃ領域に匹敵する安定性を有するヘテロ二量体Ｆｃ領域の形成を促進するアミノ酸修飾を含む免疫グロブリンヘテロ二量体Ｆｃ領域に結合している１つの単量体Ｆｃポリペプチドに結合しており、ならびにＩｇＧ軽鎖およびＩｇＧ  ＣＨ１領域を欠いている。
【０１０７】
免疫グロブリンヘテロ二量体Ｆｃ領域は、以下に更に記載される。本明細書に他の部分に示されているように、１つの実施形態において、修飾ＣＨ３ドメインを組み込むＦｃ領域（本明細書で使用されるとき、「Ｆｃ領域」および類似の用語は、ＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む任意の重鎖定常領域ドメインを包含する）を含む、免疫グロブリン（例えば、抗体）および他の結合タンパク質のような分子、例えば、ポリペプチドが提供される。修飾ＣＨ３ドメイン（例えば、１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、置換、または再編成を含むＣＨ３ドメイン）を含むＦｃ領域を含む分子は、本明細書において「Ｆｃ変種」、「ヘテロ二量体」、「変種Ｆｃヘテロ二量体」、または「ヘテロ多量体」と呼ばれる。本発明のＦｃ変種は、ヘテロ二量体Ｆｃ変種または領域を生成するように非対称的に修飾されているＣＨ３ドメインを含む。ヘテロ多量体は、２つの重鎖ポリペプチド、または２つの単量体Ｆｃポリペプチドの鎖Ａおよび鎖Ｂから構成され、これらは交換可能に使用され得るが、但し、それぞれのＦｃ領域が、１つの鎖Ａおよび１つの鎖Ｂポリペプチドを含むこと、ならびに鎖Ａおよび鎖Ｂの少なくとも一方が、重鎖変種領域を含むことが条件である。
【０１０８】
野生型ホモ二量体からの変種Ｆｃヘテロ二量体の設計は、安定性と特異性の平衡を保つことによるタンパク質操作の文脈における積極的および消極的設計の概念により例示され、突然変異は、ポリペプチドが細胞培養条件下で発現したとき、ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成を誘導する目的により導入される。消極的設計戦略は、嵩高側鎖を一方の鎖に、小さい側鎖を反対の鎖に導入することにより、例えばＧｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発されたｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ戦略により（Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ，Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ，Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．‘Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ’ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣＨ３  ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｏｒ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１９９６  Ｊｕｌ；９（７）：６１７−２１；Ａｔｗｅｌｌ  Ｓ，Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ，Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ，Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．Ｓｔａｂｌｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｏｆ  ａ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２７０（１）：２６−３５（１９９７）））、またはホモ二量体形成の反発をもたらす静電気操作により、例えばＡｍｇｅｎにより開発された静電気操縦戦略により（Ｇｕｎａｓｋｅｋａｒａｎ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｃ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ＩｇＧ．ＪＢＣ  ２８５（２５）：１９６３７−１９６４６（２０１０））、ホモ二量体の形成のための好ましくない相互作用を最大化する。これらの２つの例では、消極的設計の非対称点突然変異を野生型ＣＨ３ドメインに導入して、ヘテロ二量体形成を導いた。現在まで、消極的設計戦略のみがＦｃヘテロ二量体の開発に使用されてきた。公表されている結果は、消極的設計手法のみを使用して設計されたヘテロ二量体は、＞９５％のヘテロ二量体に高い特性をもたらすが、複合体を著しく不安定化することを示す（上記）。これらの消極的設計のヘテロ二量体は、野生型と比較して追加のジスルフィド結合が不在の修飾ＣＨ３ドメインの融解温度の６９℃以下を有する。以下の表Ａを参照すること。
【表１】
0006351572.tif 000002
＊本発明者たちは、本発明のアッセイ系において対照１には＞９０％の純度を観察したが、文献に以前に報告されたような１００％は観察しなかった。
＊＊本発明者たちは、本発明のアッセイ系において対照４では７７℃を超えるＴｍを観察し、この変種のＴｍは、文献により公表されていなかった。
公表なし−対照３のＴｍは、公表されておらず、本発明のアッセイ系において試験しなかった。
野生型ＩｇＧ１の融解温度は、使用したアッセイ系に応じて文献の値が変動したので、８１〜８３の値として示されており、本発明者たちは、本発明のアッセイ系において８１．５℃の値を報告している。
【０１０９】
消極的設計と対照的に、タンパク質の操作に使用される一般的な概念は積極的設計である。この場合では、アミノ酸修飾が、タンパク質内または間における好ましい相互作用を最大化するために、ポリペプチドに導入される。この戦略は、ホモ二量体への作用を無視しながら、所望のヘテロ二量体を特異的に安定化する多重突然変異を導入したとき、正味の影響が、ホモ二量体よりも所望のヘテロ二量体相互作用へのより良好な特異性であり、したがってより大きなヘテロ二量体特異性となることを想定する。積極的設計戦略は、所望のタンパク質相互作用を最適化するが、まれにしか＞９０％の特異性を達成しないことが、タンパク質操作の文脈において理解される（Ｈａｖｒａｎｅｋ  ＪＪ  ＆  Ｈａｒｂｕｒｙ  ＰＢ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．１０（１）：４５−５２（２００３）；Ｂｏｌｏｎ  ＤＮ，Ｇｒａｎｔ  ＲＡ，Ｂａｋｅｒ  ＴＡ，Ｓａｕｅｒ  ＲＴ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｖｅｒｓｕｓ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．６；１０２（３６）：１２７２４−９（２００５）；Ｈｕａｎｇ  ＰＳ，Ｌｏｖｅ  ＪＪ，Ｍａｙｏ  ＳＬ．Ａ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１６（１２）：２７７０−４（２００７））。本開示の前は、積極的設計戦略は、治療抗体製造および開発における安定性と比較して、より多くの注目が特異性に対して向けられていたので、Ｆｃヘテロ二量体を設計するために使用されてこなかった。加えて、有益な積極的設計の突然変異は、予測するのが困難なことがある。追加のジスルフィド結合のような安定性を改善する他の方法論が、Ｆｃヘテロ二量体の安定性を改善するために試みられ、分子に対する改善において限定された成功を収めた。（表Ａを参照すること）このことは、全ての操作Ｆｃ  ＣＨ３ドメインジスルフィド結合が溶媒に曝露され、それがジスルフィド結合の短い寿命をもたらし、したがって、特に、操作ＣＨ３ドメインが追加のジスルフィド結合なしで７０℃未満のＴｍを有するとき（追加のジスルフィド結合なしで６９℃のＴＭを有する対照４のように（対照２を参照すること）、ヘテロ二量体の長期安定性に対して有意な影響を与えるためであり得る。ジスルフィド結合のような、安定性を改善する他の方法論を本発明のＦｃ変種と共に使用することもできることが考慮されるが、但し、ＣＨ３ドメインの固有の安定性（融点として測定した）が、ジスルフィド結合なしで７０℃以上であること、特に、ＣＨ３ドメインの固有の安定性（融点として測定した）がジスルフィド結合なしで７２℃以上であることが条件である。
【０１１０】
したがって、本発明者たちは、安定性もあり高い特異性もあるヘテロ二量体形成をもたらすＦｃヘテロ二量体を設計する新規方法を本明細書において開示する。この設計方法は、消極的および積極的設計戦略の両方を、構造および計算モデル誘導タンパク質操作技術と共に組み合わせる。この強力な方法は、本発明者たちが突然変異の新規組み合わせをＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインにおいて設計することを可能にし、標準的な細胞培養条件のみを使用することにより、ヘテロ二量体がホモ二量体と比較して９０％を超える純度で形成され、得られたヘテロ二量体が７０℃を超える融解温度を有した。例示的な実施形態において、Ｆｃ変種ヘテロ二量体は、７３℃以上の融解温度および９８％を超える純度を有する。他の例示的な実施形態において、Ｆｃ変種ヘテロ二量体は、７５℃以上の融解温度および９０％を超える純度を有する。本明細書に記載されているヘテロ二量体Ｆｃ変種のある特定の実施形態において、Ｆｃ変種ヘテロ二量体は、７７℃以上の融解温度および９８％を超える純度を有する。本明細書に記載されているヘテロ二量体Ｆｃ変種の幾つかの実施形態において、Ｆｃ変種ヘテロ二量体は、７８℃以上の融解温度および９８％を超える純度を有する。本明細書に記載されているヘテロ二量体Ｆｃ変種のある特定の実施形態において、Ｆｃ変種ヘテロ二量体は、７９℃以上の融解温度および９８％を超える純度を有する。本明細書に記載されているヘテロ二量体Ｆｃ変種のある特定の実施形態において、Ｆｃ変種ヘテロ二量体は、８０℃以上の融解温度および９８％を超える純度を有する。本明細書に記載されているヘテロ二量体Ｆｃ変種のある特定の実施形態において、Ｆｃ変種ヘテロ二量体は、８１℃以上の融解温度および９８％を超える純度を有する。
【０１１１】
ある特定の実施形態において、少なくとも１つの重鎖可変ドメインおよびヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体が提供され、ここでヘテロ二量体Ｆｃ領域は、増加した安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、変種ＣＨ３ドメインは、約７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。本明細書で使用されるとき、「増加した安定性」または「安定したヘテロ二量体」は、約７０℃以上の融解温度を有する、ヘテロ二量体形成における変種ＣＨ３ドメインを意味する。ある特定の実施形態において、「増加した安定性」または「安定したヘテロ二量体」は、約７２℃以上の融解温度を有する、ヘテロ二量体形成における変種ＣＨ３ドメインを意味する。ある特定の実施形態において、「増加した安定性」または「安定したヘテロ二量体」は、約７４℃以上の融解温度を有する、ヘテロ二量体形成における変種ＣＨ３ドメインを意味する。ある特定の実施形態において、「増加した安定性」または「安定したヘテロ二量体」は、約７５℃以上の融解温度を有する、ヘテロ二量体形成における変種ＣＨ３ドメインを意味する。ある特定の実施形態において、「増加した安定性」または「安定したヘテロ二量体」は、約７６℃以上の融解温度を有する、ヘテロ二量体形成における変種ＣＨ３ドメインを意味する。ある特定の実施形態において、「増加した安定性」または「安定したヘテロ二量体」は、約７８℃以上の融解温度を有する、ヘテロ二量体形成における変種ＣＨ３ドメインを意味する。ある特定の実施形態において、「増加した安定性」または「安定したヘテロ二量体」は、約７９℃以上の融解温度を有する、ヘテロ二量体形成における変種ＣＨ３ドメインを意味する。ある特定の実施形態において、「増加した安定性」または「安定したヘテロ二量体」は、約８０℃以上の融解温度を有する、ヘテロ二量体形成における変種ＣＨ３ドメインを意味する。ある特定の実施形態において、「増加した安定性」または「安定したヘテロ二量体」は、約８１℃以上の融解温度を有する、ヘテロ二量体形成における変種ＣＨ３ドメインを意味する。加えて、用語「ヘテロ二量体形成を促進する」は、ホモ二量体形成と比較して９０％を超えるヘテロ二量体形成をもたらす、ＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸修飾を本明細書において意味する。
【０１１２】
更なる実施形態において、この増加した安定性は、追加のジスルフィド結合の不在下のものである。具体的には、増加した安定性は、ＣＨ３ドメインにおける追加のジスルフィド結合の不在下のものである。１つの実施形態において、変種ＣＨ３ドメインは、野生型ＣＨ３ドメインと比較して追加のジスルフィド結合を含まない。代替的な実施形態において、変種ＣＨ３は、野生型ＣＨ３ドメインと比較して少なくとも１つのジスルフィド結合を含むが、但し、変種ＣＨ３がジスルフィド結合の不在下で７０℃以上の融点を有することが条件である。１つの実施形態において、変種ＣＨ３ドメインは、野生型ＣＨ３ドメインと比較して少なくとも１つのジスルフィド結合を含み、変種ＣＨ３ドメインは、約７７．５℃以上の融点（Ｔｍ）を有する。一実施形態において、変種ＣＨ３ドメインは、野生型ＣＨ３ドメインと比較して少なくとも１つのジスルフィド結合を含み、変種ＣＨ３ドメインは、約７８℃以上の融点（Ｔｍ）を有する。別の実施形態において、変種ＣＨ３ドメインは、野生型ＣＨ３ドメインと比較して少なくとも１つのジスルフィド結合を含み、変種ＣＨ３ドメインは、約７８℃を超える、または約７８．５℃を超える、または約７９℃を超える、または約７９．５℃を超える、または約８０℃を超える、または約８０．５℃を超える、または約８１℃を超える、または約８１．５℃を超える、または約８２℃を超える、または約８２．５℃を超える、または約８３℃を超える融点（Ｔｍ）を有する。
【０１１３】
１つの実施形態において、変種ＣＨ３ドメインは、約  ７０℃を超える、または約７０．５℃を超える、または約７１℃を超える、または約７１．５℃を超える、また約７２℃を超える、または約７２．５℃を超える、または約７３℃を超える、または約７３．５℃を超える、または約７４℃を超える、または約７４．５℃を超える、または約７５℃を超える、または約７５．５℃を超える、または約７６℃を超える、または約７６．５℃を超える、または約７７℃を超える、または約７７．５℃を超える、または約７８℃を超える、または約７８．５℃を超える、または約７９℃を超える、または約７９．５℃を超える、または約８０℃を超える、または約８０．５℃を超える、または約８１℃を超える、または約８１．５℃を超える、または約８２℃を超える、または約８２．５℃を超える、または約８３℃を超える融点を有する。別の実施形態において、変種ＣＨ３ドメインは、約７０℃、または約７０．５℃、または約７１℃、または約７１．５℃、または約７２℃、または約７２．５℃、または約７３℃、または約７３．５℃、または約７４℃、または約７４．５℃、または約７５℃、または約７５．５℃、または約７６℃、または約７６．５℃、または約７７℃、または約７７．５℃、または約７８℃、または約７８．５℃、または約７９℃、または約７９．５℃、または約８０℃、または約８０．５℃、または約８１℃の融点を有する。なお別の実施形態において、変種ＣＨ３ドメインは、約７０℃〜約８１℃、または約７０．５℃〜約８１℃、または約７１℃〜約８１℃、または約７１．５℃〜約８１℃、または約７２℃〜約８１℃、または約７２．５℃〜約８１℃、または約７３℃〜約８１℃、または約７３．５℃〜約８１℃、または約７４℃〜約８１℃、または約７４．５℃〜約８１℃、または約７５℃〜約８１℃、または約７５．５℃〜約８１℃、または約７６℃〜約８１℃、または約７６．５℃〜約８１℃、または約７７℃〜約８１℃、または約７７．５℃〜約８１℃、または約７８℃〜約８１℃、または約７８．５℃〜約８２℃、または約７９℃〜約８１℃の融点を有する。なお別の実施形態において、変種ＣＨ３ドメインは、約７１℃〜約７６℃、または約７２℃〜約７６℃、または約７３℃〜約７６℃、または約７４℃〜約７６℃の融解温度を有する。
【０１１４】
安定性を改善することに加えて、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、ヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸修飾を含む変種ＣＨ３ドメインを含む。ヘテロ二量体形成を促進するこれらのアミノ酸修飾は、ホモ二量体形成と比較したものであることが理解される。このホモ二量体形成と比較したヘテロ二量体形成は、本明細書において「純度」、または「特異性」、または「ヘテロ二量体純度」、または「ヘテロ二量体特異性」とまとめて呼ばれる。ヘテロ二量体純度は、ヘテロ二量体種の選択的精製の前に、標準的な細胞培養条件下で溶液中において形成されるホモ二量体種と比較した、形成された所望のヘテロ二量体の率を意味することが理解される。例えば、ヘテロ二量体純度の９０％は、溶液中における９０％の二量体種が所望のヘテロ二量体であることを示す。１つの実施形態において、Ｆｃ変種ヘテロ二量体は、約９０％を超える、または約９１％を超える、または約９２％を超える、または約９３％を超える、または約９４％を超える、または約９５％を超える、または約９６％を超える、または約９７％を超える、または約９８％を超える、または約９９％を超える純度を有する。別の実施形態において、Ｆｃ変種ヘテロ二量体は、約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％、または約１００％の純度を有する。
【０１１５】
ある特定の実施形態において、少なくとも１つの重鎖可変ドメインおよびヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、増加した安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、変種ＣＨ３ドメインが、約７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、得られたヘテロ二量体が、９０％を超える純度を有する、単離ヘテロ多量体が提供される。１つの態様において、得られたヘテロ二量体は、９８％を超える純度を有し、変種ＣＨ３ドメインは、約７０℃を超える、または約７１℃を超える、または約７２℃を超える、または約７３℃を超える、または約７４℃、または約７５℃を超える、または約７６℃を超える、または約７７℃を超える、または約７８℃を超える、または約７９℃を超える、または約８０℃を超える、または約８１℃を超える融解温度を有する。更なる態様において、変種ＣＨ３ドメインは、７０℃以上の融解温度を有し、得られたＦｃ変種ヘテロ二量体は、約９０％を超える、または約９１％を超える、または約９２％を超える、または約９３％を超える、または約９４％を超える、または約９５％を超える、または約９６％を超える、または約９７％を超える、または約９８％を超える、または約９９％を超える純度を有する。
【０１１６】
これらの改善された安定性および純度を有するＦｃ変種を含むヘテロ多量体を設計するため、本発明者たちは、計算設計および実験スクリーニングの繰り返し工程を用いて、積極的および消極的設計戦略の大部分の成功した組み合わせを選択した（図２４を参照すること）。
【０１１７】
具体的には、初期設計段階において、異なる消極的設計Ｆｃ変種ヘテロ二量体を作製し、実施例１〜３に記載されているように、発現および安定性について試験した。初期設計段階には、Ｆｃ変種ヘテロ二量体ＡＺ１〜ＡＺ１６が含まれた（表１を参照すること）。この消極的設計Ｆｃ変種ヘテロ二量体の初期セットでは、これらが低い安定性（例えば、７１℃未満のＴｍ）を有すると予想され、９０％を超える純度および約６８℃以上の融解温度のＦｃ変種ヘテロ二量体が、更なる展開のために選択された。これには、Ｆｃ変種ヘテロ二量体ＡＺ６、ＡＺ８、およびＡＺ１５が含まれた。第２の設計段階において、これらの選択されたＦｃ変種ヘテロ二量体を、積極的設計戦略の使用により更に修飾して、安定性と純度の両方を導き出し、続いて詳細な計算および構造分析を行った。選択されたＦｃ変種ヘテロ二量体（ＡＺ６、ＡＺ８、およびＡＺ１５）を、それぞれ、計算法および包括的構造機能分析により分析して、これらＦｃ変種が、ＩｇＧ１では８１℃である野生型Ｆｃホモ二量体よりも低い安定性を有する構造的理由を確認した。Ｆｃ変種ヘテロ二量体およびＴｍ値のリストは、表４を参照すること。
【０１１８】
ある特定の実施形態において、変種ＣＨ３ドメインは、ＡＺ１、またはＡＺ２、またはＡＺ３、またはＡＺ４、またはＡＺ５、またはＡＺ６、またはＡＺ７、またはＡＺ８、またはＡＺ９、またはＡＺ１０、またはＡＺ１１、またはＡＺ１２、またはＡＺ１３、またはＡＺ１４、またはＡＺ１５、またはＡＺ１６から選択される。選択された実施形態において、変種ＣＨ３ドメインは、ＡＺ６、またはＡＺ８、またはＡＺ１５である。
【０１１９】
計算ツールおよび構造機能分析には、分子動力学分析（ＭＤ）、側鎖／主鎖再詰め込み、知識ベースポテンシャル（ＫＢＰ）、空洞および（疎水性）詰め込み分析（ＬＪ、ＣＣＳＤ、ＳＡＳＡ、ｄＳＡＳＡ（炭素／全原子））、静電気−ＧＢ計算、およびカップリング分析が含まれるが、これらに限定されない。（計算戦略の概要は図２４を参照すること）
【０１２０】
タンパク質操作手法の一態様は、Ｘ線結晶学から誘導されたＦｃ  ＩｇＧタンパク質の構造情報を、野生型および変種形態のＣＨ３ドメインにおける計算モデル形成およびシミュレーションと組み合わせることに依存した。このことは、本発明者たちが個別のアミノ酸およびこれらの協同作用の潜在的な役割について、新規の構造的および物理化学的洞察を得ることを可能にした。安定性および純度に関する得られた経験的データと共に多数の変種ＣＨ３ドメインから得たこれらの構造的および物理化学的洞察は、本発明者たちが、ヘテロ二量体の純度と安定性の関係についての理解を発展させることに役立った。シミュレーションを実施するため、本発明者たちは、完全な信頼性のあるモデルを構築すること、およびＩｇＧ１抗体の野生型Ｆｃ構造の品質を洗練することから始めた。Ｘ線結晶学から誘導されたタンパク質構造は、生理学的条件下での水性媒体におけるタンパク質の特定の特徴に関して詳細が欠如しており、本発明者たちの洗練手順がこの限界について対処した。これらには、多くの場合にループおよび幾つかの残基側鎖のようなタンパク質の柔軟な部分である、タンパク質構造の欠損領域を構築すること、中性および荷電残基のプロトン化状態、ならびにタンパク質と会合する機能的に関連する水分子の電位の配置を評価および定義することが含まれる。
【０１２１】
分子動力学（ＭＤ）アルゴリズムは、タンパク質構造をシミュレートして、水性環境下におけるＦｃホモ二量体および変種ＣＨ３ドメインの固有の動力学的性質を評価する、本発明者たちが使用した１つのツールである。分子動力学シミュレーションは、タンパク質における全ての原子実体とその局所環境との、この場合はＦｃと周囲水分子を構成する原子との間の相互作用および作用する力から生じる運動によってもたらされる分子の動力学的軌道を追跡する。分子動力学シミュレーションに続いて、多様な態様の軌道を分析して、Ｆｃホモ二量体および変種Ｆｃヘテロ二量体の構造的および動力学的特徴についての洞察を得て、本発明者たちは、これを使用して、分子の純度および安定性の両方を改善する特定のアミノ酸突然変異を同定した。
【０１２２】
したがって、生成されたＭＤ軌道を、主要成分分析のような方法の使用により研究して、Ｆｃ構造における運動の固有の低頻度様式を明らかにした。これは、タンパク質の潜在的な立体配座の準安定状態についての洞察を提供する（図３２を参照すること）。Ｆｃ領域の鎖Ａと鎖Ｂの重要なタンパク質間相互作用がＣＨ３ドメインの界面において生じるが、本発明者たちのシミュレーションは、この界面が、ＣＨ２ドメインのＮ末端の互いの「開放」および「閉鎖」に関与する運動においてヒンジとして作用することを示した。ＣＨ２ドメインは、図１６から分かるように、この末端でＦｃｇＲと相互作用する。したがって、理論に束縛されるものではないが、ＣＨ３界面へのアミノ酸突然変異の導入は、ＦｃのＮ末端での開放／閉鎖運動の大きさおよび性質に、したがって、ＦｃがＦｃｇＲとどのように相互作用するかに影響を与えると思われる。実施例４および表５を参照すること。
【０１２３】
生成されたＭＤ軌道を研究して、柔軟性のプロファイリングおよび環境の分析に基づいてＦｃ構造における特定のアミノ酸残基の位置の突然変異性も決定した。このアルゴリズムは、タンパク質構造および機能に影響を与え得る残基を本発明者たちが同定することを可能にし、変種ＣＨ３ドメインの後の設計段階における残基の特徴および突然変異性に対して特有の洞察を提供した。この分析は、本発明者たちが多数のシミュレーションを比較すること、およびプロファイリングの後の外れ値に基づいて突然変異性を評価することも可能にした。
【０１２４】
生成されたＭＤ軌道を研究して、タンパク質における相関残基運動、およびそれらの間のカップリングの結果としての残基のネットワークの形成も決定した。Ｆｃ構造内の残基の動力学的相関およびネットワークを見出すことは、動力学的実体としてタンパク質を理解する、および遠位部位の突然変異の影響についての洞察を発展させる重要なステップである。例えば、実施例６を参照すること
【０１２５】
したがって、本発明者たちは、突然変異の部位における局所環境に対する突然変異の影響を詳細に研究した。鎖ＡおよびＢのＣＨ３界面における十分に詰め込まれたコアの形成は、安定したＦｃ構造における２つの鎖の自発的対形成にとって重要である。良好な詰め込みは、接触している基の間の好ましい相互作用により結合した相互作用分子パートナーの間の強力な構造相補性の結果である。好ましい相互作用は、溶媒曝露により十分に除去された埋没型疎水性接触、および／または疎水性極性基の間の相補的静電接触の形成のいずれかによりもたらされる。これらの疎水性および親水性接触は、ＣＨ３界面における二量体形成の自由エネルギーへのエントロピーおよびエンタルピー的寄与を有する。本発明者たちは、鎖Ａと鎖Ｂの間のＣＨ３界面において正確な詰め込みモデルを作製するために多様なアルゴリズムを用い、続いて多数の関連する物理化学的特性をスコア付けして界面の熱力学的特性を評価する。
【０１２６】
本発明者たちは、柔軟性主鎖を含む多数のタンパク質詰め込み方法を用いて、計算的にスクリーンした多数の変種のモデル構造を最適化および調製した。詰め込みの後、本発明者たちは、接触密度、衝突スコア、水素結合、疎水性、および静電気を含む多数の用語を評価した。溶媒和モデルの使用は、本発明者たちが、溶媒環境に対してより正確に対処すること、およびタンパク質の特定の位置における突然変異の後と代替的な残基の種類との自由エネルギーの差を対比させることを可能にした。接触密度および衝突スコアは、有効なタンパク質詰め込みの重要な態様である相補性の測度を提供する。これらのスクリーニング手順は、知識ベースポテンシャル、または対毎の残基相互作用エネルギーおよびエントロピー計算に依存するカップリング分析スキームの適用に基づいている。
【０１２７】
この包括的コンピューター分析は、界面ホットスポット、非対称性の部位、空洞および不十分に詰め込まれた領域、個別の部位の構造動力学、ならびに局所アンフォールディングの部位に関して、野生型と比較したそれぞれのＦｃ変種の差についての詳細な理解をもたらした。これらの記載されている計算分析を組み合わせた結果は、最適化されてなく、かつ、組み合わせにより低い安定性（例えば、６８℃のＴｍ）および／または＜９０％純度の低い特異性の原因であった、特定の残基、配列／構造モチーフ、および空洞を同定した。第２の設計段階において、本発明者たちは、標的積極的設計を使用し、追加の点突然変異によりこれらの仮定に取り組み、上記に記載された方法論および分析を使用してコンピューター操作によりこれらを試験した（図２４を参照すること）。第２の段階におけるそれぞれの標的設計において安定性および純度を改善するように設計されたＦｃ変種ヘテロ二量体（Ｆｃ変種ヘテロ二量体ＡＺ１７〜ＡＺ１０１）を、実施例１〜４に記載されているように発現および安定性について実験的に検証した。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、増加した安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、変種ＣＨ３ドメインが、ＡＺ１７、またはＡＺ１８、またはＡＺ１９、またはＡＺ２０、またはＡＺ２１、またはＡＺ２２、またはＡＺ２３、またはＡＺ２４、またはＡＺ２５、またはＡＺ２６、またはＡＺ２７、またはＡＺ２８、またはＡＺ２９、またはＡＺ３０、またはＡＺ２１、またはＡＺ３２、またはＡＺ３３、またはＡＺ３４、またはＡＺ３５、またはＡＺ３６、またはＡＺ３７、またはＡＺ３８、またはＡＺ３９、またはＡＺ４０、またはＡＺ４１、またはＡＺ４２、またはＡＺ４３、またはＡＺ４４、またはＡＺ４５、またはＡＺ４６、またはＡＺ４７、またはＡＺ４８、またはＡＺ４９、またはＡＺ５０、またはＡＺ５１、またはＡＺ５２、またはＡＺ５３、またはＡＺ５４、またはＡＺ５５、またはＡＺ５６、またはＡＺ５７、またはＡＺ５８、またはＡＺ５９、またはＡＺ６０、またはＡＺ６１、またはＡＺ６２、またはＡＺ６３、またはＡＺ６４、またはＡＺ６５、またはＡＺ６６、またはＡＺ６７、またはＡＺ６８、またはＡＺ６９、またはＡＺ７０、またはＡＺ７１、またはＡＺ７２、またはＡＺ７３、またはＡＺ７４、またはＡＺ７５、またはＡＺ７６、またはＡＺ７７、またはＡＺ７８、またはＡＺ７９、またはＡＺ８０、またはＡＺ８１、またはＡＺ８２、またはＡＺ８３、またはＡＺ８４、またはＡＺ８５、またはＡＺ８６、またはＡＺ８７、またはＡＺ８８、またはＡＺ８９、またはＡＺ９０、またはＡＺ９１、またはＡＺ９２、またはＡＺ９３、またはＡＺ９４、またはＡＺ９５、またはＡＺ９６、またはＡＺ９７、またはＡＺ９８、またはＡＺ９９、またはＡＺ１００、またはＡＺ１０１である、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。例示的な実施形態において、変種ＣＨ３ドメインは、ＡＺ１７、またはＡＺ１８、またはＡＺ１９、またはＡＺ２０、またはＡＺ２１、またはＡＺ２２、またはＡＺ２３、またはＡＺ２４、またはＡＺ２５、またはＡＺ２６、またはＡＺ２７、またはＡＺ２８、またはＡＺ２９、またはＡＺ３０、またはＡＺ２１、またはＡＺ３２、またはＡＺ３３、またはＡＺ３４、またはＡＺ３８、またはＡＺ４２、またはＡＺ４３、またはＡＺ４４、またはＡＺ４５、またはＡＺ４６、またはＡＺ４７、またはＡＺ４８、またはＡＺ４９、またはＡＺ５０、またはＡＺ５２、またはＡＺ５３、またはＡＺ５４、またはＡＺ５８、またはＡＺ５９、またはＡＺ６０、またはＡＺ６１、またはＡＺ６２、またはＡＺ６３、またはＡＺ６４、またはＡＺ６５、またはＡＺ６６、またはＡＺ６７、またはＡＺ６８、またはＡＺ６９、またはＡＺ７０、またはＡＺ７１、またはＡＺ７２、またはＡＺ７３、またはＡＺ７４、またはＡＺ７５、またはＡＺ７６、またはＡＺ７７、またはＡＺ７８、またはＡＺ７９、またはＡＺ８１、またはＡＺ８２、またはＡＺ８３、またはＡＺ８４、またはＡＺ８５、またはＡＺ８６、またはＡＺ８７、またはＡＺ８８、またはＡＺ８９、またはＡＺ９１、またはＡＺ９２、またはＡＺ９３、またはＡＺ９４、またはＡＺ９５、またはＡＺ９８、またはＡＺ９９、またはＡＺ１００、またはＡＺ１０１である。ある特定の実施形態において、変種ＣＨ３ドメインは、ＡＺ３３またはＡＺ３４である。別の実施形態において、変種ＣＨ３ドメインは、ＡＺ７０またはＡＺ９０である。
【０１２９】
例示的な実施形態において、ヘテロ多量体は、第１および第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含む。別の実施形態において、第１のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｔ３６６Ｉ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含む。
【０１３０】
計算構造機能分析、標的操作、および実験検証の繰り返し工程を使用して、後に続く設計段階において表１の列記されている残りのＦｃ変種を設計し、９０％を超える純度と、７０℃を超える溶融温度のＣＨ３ドメインの増加した安定性とを有するヘテロ多量体をもたらした。ある特定の実施形態において、Ｆｃ変種は、ＡＺ１〜ＡＺ１３６から選択されるアミノ酸突然変異を含む。更なる実施形態において、Ｆｃ変種は、表４に列記されているＦｃ変種から選択されるアミノ酸突然変異を含む。
【０１３１】
第１および第２の設計段階では、２つのコア足場が同定され、足場１および足場２であり、追加のアミノ酸修飾が、これらの足場に導入されて、Ｆｃ変種ヘテロ二量体の純度および安定性を微調整した。ＡＺ８、ＡＺ１７〜６２、および表６に列記されている変種を含む足場１の開発についての詳細な記載は、実施例５を参照すること。ＡＺ１５、ＡＺ６３〜１０１、および表７に列記されている変種を含む足場２の開発についての詳細な記載は、実施例６を参照すること。
【０１３２】
足場１のコア突然変異は、Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗを含む。足場１ａは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを含み、足場１ｂは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを含む。実施例５を参照すること。
【０１３３】
ある特定の実施形態において、ヘテロ多量体は、第１および第２のポリペプチド（本明細書において、鎖Ａおよび鎖Ｂとも呼ばれる）を含み、第１のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｔ３９４Ｗを含む。１つの態様において、ヘテロ多量体は、Ｆ４０５および／またはＫ３９２の位置に点突然変異を更に含む。Ｋ３９２の位置のこれらの突然変異には、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ、またはＫ３９２Ｅが含まれるが、これらに限定されない。Ｆ４０５の位置のこれらの突然変異には、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ、またはＦ４０５Ｗが含まれるが、これらに限定されない。別の態様において、ヘテロ多量体は、Ｔ４１１および／またはＳ４００の位置に点突然変異を更に含む。Ｔ４１１の位置のこれらの突然変異には、Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、またはＴ４１１Ｗが含まれるが、これらに限定されない。Ｓ４００の位置のこれらの突然変異には、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、またはＳ４００Ｋが含まれるが、これらに限定されない。なお別の実施形態において、ヘテロ多量体は、第１および第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｔ３９４Ｗを含み、第１および／または第２のポリペプチドは、Ｔ３６６および／またはＬ３６８の位置にアミノ酸修飾を更に含む。Ｔ３６６の位置のこれらの突然変異には、Ｔ３６６Ａ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｃ、Ｔ３６６Ｖ、またはＴ３６６Ｗが含まれるが、これらに限定されない。例示的な実施形態において、Ｔ３６６の位置のアミノ酸突然変異は、Ｔ３６６Ｉである。別の例示的な実施形態において、Ｔ３６６の位置のアミノ酸突然変異は、Ｔ３６６Ｌである。Ｌ３６８の位置の突然変異には、Ｌ３６８Ｄ、Ｌ３６８Ｒ、Ｌ３６８Ｔ、Ｌ３６８Ｍ、Ｌ３６８Ｖ、Ｌ３６８Ｆ、Ｌ３６８Ｓ、およびＬ３６８Ａが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３４】
ある特定の実施形態において、ヘテロ多量体は、第１および第２のポリペプチド（本明細書において、鎖Ａおよび鎖Ｂとも呼ばれる）を含み、第１のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｔ３６６ＬおよびＴ３９４Ｗを含む。別の実施形態において、ヘテロ多量体は、第１および第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｔ３６６ＩおよびＴ３９４Ｗを含む。
【０１３５】
特定の他の実施形態において、ヘテロ多量体は、第１および第２のポリペプチド（本明細書において、鎖Ａおよび鎖Ｂとも呼ばれる）を含み、第１のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含む。別の実施形態において、ヘテロ多量体は、第１および第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含む。
【０１３６】
なお別の他の実施形態において、ヘテロ多量体は、第１および第２のポリペプチド（本明細書において、鎖Ａおよび鎖Ｂとも呼ばれる）を含み、第１のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含む。別の実施形態において、ヘテロ多量体は、第１および第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含む。
【０１３７】
ある特定の実施形態において、ヘテロ多量体は、第１および第２のポリペプチド（本明細書において、鎖Ａおよび鎖Ｂとも呼ばれる）を含み、第１のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｔ３６６ＬおよびＴ３９４Ｗを含む。別の実施形態において、ヘテロ多量体は、第１および第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｔ３６６ＩおよびＴ３９４Ｗを含む。
【０１３８】
例示的な実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、増加した安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含むヘテロ多量体を含み、ヘテロ多量体が、約７４℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ多量体が、少なくとも１つの重鎖可変ドメイン、および増加した安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、変種ＣＨ３ドメインが、約７４℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、ヘテロ二量体が、約９８％以上の純度を有する、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、増加した安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、変種ＣＨ３ドメインが、約７０℃を超える融解温度（Ｔｍ）を有し、変種ＣＨ３ドメインが、表６から選択される、単離ヘテロ多量体。
【０１４０】
足場２のコア突然変異は、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆを含む。足場２ａは、アミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆを含み、足場２ｂは、アミノ酸修飾Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆを含む。実施例６を参照すること。
【０１４１】
ある特定の実施形態において、ヘテロ多量体は、第１および第２のポリペプチド（本明細書において、鎖Ａおよび鎖Ｂとも呼ばれる）を含み、第１のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｌ３５１ＹおよびＹ４０７Ａを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｔ３６６ＡおよびＫ４０９Ｆを含む。１つの態様において、ヘテロ多量体は、Ｔ３６６、Ｌ３５１、およびＹ４０７の位置に点突然変異を更に含む。Ｔ３６６の位置のこれらの突然変異には、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｃ、Ｔ３６６Ｖ、またはＴ３６６Ｗが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、Ｔ３６６の位置の突然変異は、Ｔ３６６Ｖである。Ｌ３５１の位置の突然変異には、Ｌ３５１Ｉ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｒ、またはＬ３５１Ｆが含まれるが、これらに限定されない。Ｙ４０７の位置の突然変異には、Ｙ４０７ＶまたはＹ４０７Ｓが含まれるが、これらに限定されない。表１のＣＨ３変種ＡＺ６３〜ＡＺ７０、および表４、および実施例６を参照すること。
【０１４２】
例示的な実施形態において、ヘテロ多量体は、第１および第２のポリペプチド（本明細書において、鎖Ａおよび鎖Ｂとも呼ばれる）を含み、第１のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｌ３５１ＹおよびＹ４０７Ａを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｔ３６６ＶおよびＫ４０９Ｆを含む。
【０１４３】
例示的な実施形態では、少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物およびヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、増加した安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸修飾を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、変種ＣＨ３ドメインが、約７５．５℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、ヘテロ多量体が、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリンＣＨ１を欠いており、場合により免疫グロブリンＣＨ２領域を欠いている、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。別の実施形態では、少なくとも１つの重鎖可変領域およびヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、増加した安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、変種ＣＨ３ドメインが、約７５℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、へテロ二量体が、約９０％以上の純度を有する、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。
他のある特定の実施形態において、ヘテロ多量体は、第１および第２のポリペプチド（本明細書において、鎖Ａおよび鎖Ｂとも呼ばれる）を含み、第１のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｌ３５１ＹおよびＹ４０７Ａを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｔ３６６ＡおよびＫ４０９Ｆを含み、変種ＣＨ３ドメインは、Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、および／またはＫ３９２の位置に１つ以上のアミノ酸修飾を含む。Ｄ３９９の位置のこれらの突然変異には、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ、またはＤ３９９Ｋが含まれるが、これらに限定されない。Ｔ４１１の位置の突然変異には、Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、またはＴ４１１Ｗが含まれるが、これらに限定されない。Ｓ４００の位置の突然変異には、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、またはＳ４００Ｋが含まれるが、これらに限定されない。Ｆ４０５の位置の突然変異には、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ、またはＦ４０５Ｗが含まれるが、これらに限定されない。Ｎ３９０の位置の突然変異には、Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ、またはＮ３９０Ｄが含まれるが、これらに限定されない。Ｋ３９２の位置の突然変異には、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ、またはＫ３９２Ｅが含まれるが、これらに限定されない。表１のＣＨ３変種ＡＺ７１〜１０１、および表４、および実施例６を参照すること。
【０１４４】
例示的な実施形態において、ヘテロ多量体は、第１および第２のポリペプチド（本明細書において、鎖Ａおよび鎖Ｂとも呼ばれる）を含むヘテロ二量体であり、第１のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｙ４０７Ａを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｔ３６６ＡおよびＫ４０９Ｆを含む。１つの態様において、このヘテロ二量体は、アミノ酸修飾Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ、およびＳ４００Ｒを更に含む。更なる実施形態において、ヘテロ多量体は、第１および第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｄ３９９Ｒ、Ｓ４００Ｒ、およびＹ４０７Ａを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ３９２Ｅ、およびＴ４１１Ｅを含む。
例示的な実施形態では、少なくとも１つの重鎖可変領域およびヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、増加した安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、変種ＣＨ３ドメインが、約７４℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、へテロ多量体が、免疫グロブリン軽鎖およびＣＨ１ドメインを欠いている、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、増加した安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、変種ＣＨ３ドメインが、約７４℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、ヘテロ二量体が、約９５％以上の純度を有し、へテロ多量体が、免疫グロブリン軽鎖およびＣＨ１ドメインを欠いている、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、増加した安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、変種ＣＨ３ドメインが、約７０℃を超える融解温度（Ｔｍ）を有し、変種ＣＨ３ドメインが、表７から選択され、ヘテロ多量体が、免疫グロブリン軽鎖およびＣＨ１ドメインを欠いている、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。
【０１４６】
更に、少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物と、改善された安定性および純度を有するＦｃ変種ヘテロ二量体とを含むヘテロ多量体を設計するこの新たな方法は、他のクラスおよびアイソタイプのＦｃ領域に適用され得る。ある特定の実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域である。更なる実施形態において、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。幾つかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンのものである。幾つかの実施形態において、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択されるサブタイプのものである。
【表２−１】
0006351572.tif 000003
【表２−２】
0006351572.tif 000004
【表２−３】
0006351572.tif 000005
【表２−４】
0006351572.tif 000006
【表２−５】
0006351572.tif 000007
【表２−６】
0006351572.tif 000008
【表２−７】
0006351572.tif 000009
【表２−８】
0006351572.tif 000010
【表３】
0006351572.tif 000011
【表４】
0006351572.tif 000012
Ｆｃ領域の定義
【０１４７】
本明細書に定義されているＦｃ領域は、ＣＨ３ドメインまたはそのフラグメントを含み、ヒンジ、ＣＨ１、またはＣＨ２を含む１つ以上の付加定常領域ドメインまたはそのフラグメントを追加的に含み得る。ＦＣアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｖａのように、ＥＵインデックスのものであることが理解される。「Ｋａｂａｔにより記載されたＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１  Ｋａｂａｔ抗体のＥＵインデックス番号付けを意味する。便宜上、表Ｂは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの、Ｋａｂａｔにより記載されたＥＵインデックスに従ったアミノ酸番号付けを提供する。
【表５】
0006351572.tif 000013
【０１４８】
ある特定の実施形態において、ヘテロ多量体は、ＣＨ２ドメインを含むＦｃ領域を含む。幾つかの実施形態において、ＣＨ２ドメインは、変種ＣＨ２ドメインである。幾つかの実施形態において、変種ＣＨ２ドメインは、第１および／または第２のポリペプチド鎖に非対称アミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態において、ヘテロ多量体は、当該ヘテロ多量体の１つの鎖がＦｃ受容体に選択的に結合するように、ＣＨ２ドメインに非対称アミノ酸置換を含む。
ＦｃγＲ選択性
【０１４９】
１つの態様において、本出願は、ヘテロ二量体Ｆｃに構築される非対称足場の設計を介して、精巧なＦｃγＲ選択性プロファイルを達成する分子設計を記載する。この足場は、非対称突然変異がＣＨ２ドメインにおいて多様な新規選択性プロファイルを達成することを可能にする。更に、足場は、多機能性（二、三、四、または五機能性）治療分子を操作する、固有の特徴を有する。ある特定の実施形態において、非対称足場は、分子のより良好な再循環を可能にし、かつその半減期および関連する薬物動態特性を増強させるため、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのｐＨ依存性結合特性が最適化される。
【０１５０】
非対称足場は、機能的に関連するＦｃγＲＩ受容体アロタイプへの結合のために最適化され得る。ＦｃγＲＩは、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、乾癬、および多数の肺疾患のような慢性炎症性障害に関与するマクロファージの顕著なマーカーである。
【０１５１】
非対称足場は、プロテインＡ結合のために最適化され得る。プロテインＡ結合は、多くの場合、抗体分子の分離および精製のために用いられる。突然変異は、治療剤の貯蔵の際の凝集を回避するために非対称足場に導入され得る。
【０１５２】
したがって、本発明の重鎖可変領域およびＦｃ変種を含むヘテロ多量体は、血清半減期の増加、結合親和性の増加、免疫原性の低減、産生の増加、ＡＤＣＣもしくはＣＤＣ活性の増強もしくは低減、グリコシル化の変化、ならびに／またはジスルフィド結合および修飾結合の特異性が含まれるが、これらに限定されない好ましい特徴を有する抗体をもたらす、１つ以上の追加のアミノ酸残基置換、突然変異、および／または修飾をとりわけ含有し得ることが、特に考慮される。
【０１５３】
インビボ半減期
本明細書に記載されているヘテロ多量体は、匹敵する分子と比べて、哺乳動物、特にヒトにおけるインビボ半減期（例えば、血清半減期）の増加、インビボ（例えば、血清半減期）および／もしくはインビトロ（例えば、保存寿命）における安定性の増加、ならびに／または融点（Ｔｍ）の増加を含む他の変化した特徴を有し得ることが考慮される。１つの実施形態において、本発明のヘテロ多量体は、１５日を超える、２０日を超える、２５日を超える、３０日を超える、３５日を超える、４０日を超える、４５日を超える、２か月を超える、３か月を超える、４か月を超える、または５か月を超えるインビボ半減期を有する。別の実施形態において、本発明のヘテロ多量体は、１５日を超える、３０日を超える、２か月を超える、３か月を超える、６か月を超える、または１２か月を超える、または２４か月を超える、または３６か月を超える、または６０か月を超えるインビトロ半減期（例えば、液体または粉末製剤）を有する。
【０１５４】
また、本発明のヘテロ多量体は、対象に投与されたとき変化した免疫原生を有し得ることも、当業者に理解される。したがって、Ｆｃ変種の免疫原生を最小化する変種ＣＨ３ドメインは、一般に、治療用途においてより望ましいことが考慮される。
【０１５５】
変化したエフェクター機能
本発明のヘテロ多量体は、エフェクター機能を変化させる修飾が含まれるが、これに限定されない他の修飾と組み合わされ得る。本発明は、本発明のヘテロ多量体を他のＦｃ修飾と組み合わせて、追加的な、相乗的な、または新規の特性を抗体またはＦｃ融合タンパク質にもたらすことを包含する。そのような修飾は、ヒンジまたはＣＨ２（もしくはＣＨ３であるが、但し、本発明の変種ＣＨ３ドメインの安定性および純度特性を否定的に変えないことが条件である）ドメイン、あるいはこれらの組み合わせにおいてであり得る。本発明のヘテロ多量体は、それらが組み合わされる修飾の特性を増強することが考慮される。
【０１５６】
ＦｃγＲ結合
ヘテロ多量体の特徴決定の一部として、これらを、野生型ＩｇＧ１と比較した比として報告される、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２ｂ）への結合親和性について試験した。（実施例４および表５を参照すること）この場合、活性化および阻害的Ｆｃ受容体への結合に対するＣＨ３ドメイン突然変異の影響を評価することが可能であった。１つの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、増加した安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、変種ＣＨ３ドメインが、７０℃を超える融解温度（Ｔｍ）を有し、ＣＤ１６ａへのヘテロ二量体の結合が、野生型ホモ二量体と比較してほぼ同じである、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。ある特定の実施形態において、ＣＤ１６ａへのヘテロ二量体の結合は、野生型ホモ二量体と比較して増加している。代替的な実施形態において、ＣＤ１６ａへのヘテロ二量体の結合は、野生型ホモ二量体と比較して低減している。
【０１５７】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合構築物およびヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、増加した安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸修飾を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、変種ＣＨ３ドメインが、７０℃を超える融解温度（Ｔｍ）を有し、ＣＤ３２ｂへのヘテロ二量体の結合が、野生型ホモ二量体と比較してほぼ同じであり、ヘテロ多量体が、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリンＣＨ１を欠いており、場合により免疫グロブリンＣＨ２領域を欠いている、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。ある特定の実施形態において、ＣＤ３２ｂへのヘテロ二量体の結合は、野生型ホモ二量体と比較して増加している。代替的な実施形態において、ＣＤ３２ｂへのヘテロ二量体の結合は、野生型ホモ二量体と比較して低減している。
【０１５８】
Ｆｃ変種と野生型ホモ二量体の比としてＣＤ１６ａおよびＣＤ３２ｂへの結合のＫＤを報告する代わりに、ＫＤを、ＣＤ１６ａへのＦｃ変種の結合と、ＣＤ３２ｂへのＦｃ変種の結合との比として報告できることは、当業者に理解される（データは示されず）。この比は、野生型と比較して変化なし、増加から減少のいずれかであるＡＤＣＣに対する変種ＣＨ３ドメインの突然変異の指標を提供し、下記により詳細に記載される。
【０１５９】
ＦｃγＲへの本発明のヘテロ多量体の親和性および結合特性は、ＥＬＩＳＡアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイ（下記の表題「特徴決定および機能アッセイ」のセクションを参照すること）、ならびに間接的結合アッセイ、競合阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動、およびクロマトグラフィー（例えばゲル濾過）のような他の方法が含まれるが、これらに限定されない、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用、すなわちＦｃγＲへのＦｃ領域の特異的結合を決定する、当該技術に既知のインビトロアッセイ（生化学または免疫学に基づいたアッセイ）の使用により最初に決定される。これらおよび他の方法は、検査される１つ以上の成分上の標識を利用することができる、および／または色原体、蛍光、発光、または同位体標識が含まれるが、これらに限定されない多様な検出方法を用いることができる。結合親和性および動態学の詳細な記載は、抗体−免疫原相互作用に焦点を合わせる、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，ｅｄ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９９）において見出され得る。
【０１６０】
本発明の分子の結合特性は、１つ以上のＦｃγＲメディエーターエフェクター細胞機能を決定するインビトロ機能アッセイ（下記の表題「特徴決定および機能アッセイ」のセクションを参照すること）によっても特徴決定されることが考慮される。ある特定の実施形態において、本発明の分子は、インビボモデル（例えば、本明細書に記載および開示されているもの）において、インビトロに基づいたアッセイと類似した結合特性を有する。しかし、本発明は、所望の表現型をインビトロに基づいたアッセイにおいて示さないが、所望の表現型をインビボで示す本発明の分子を除外しない。
【０１６１】
本発明は、匹敵する分子と比べて増加した親和性でＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）に結合するＦｃ変種を含むヘテロ多量体を包含する。ある特定の実施形態において、本発明のＦｃ変種は、匹敵する分子と比べて、増加した親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合し、変化しない、または低減した結合親和性でＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２ｂ）に結合する。なお別の実施形態において、本発明のＦｃ変種は、匹敵する分子と比べて減少したＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＢ平衡解離定数（ＫＤ）の比を有する。
【０１６２】
匹敵する分子と比べて減少した親和性でＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）に結合するＦｃ変種を含むヘテロ多量体も、本発明に包含される。ある特定の実施形態において、本発明のＦｃ変種は、匹敵する分子と比べて減少した親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合し、匹敵する分子と比べて変化しない、または増加した結合親和性でＦｃγＲＩＩＢに結合する。
【０１６３】
１つの実施形態において、ヘテロ多量体は、増加した親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合するＦｃ変種を含む。ある特定の実施形態において、当該Ｆｃ変種は、匹敵する分子よりも少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも７倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも３０倍、または少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも６０倍、または少なくとも７０倍、または少なくとも８０倍、または少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも２００倍大きい、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性を有する。他の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくともＳ０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１５０％、または少なくとも２００％増加した、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性を有する。
【０１６４】
別の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて約２倍〜１０倍、または約５倍〜５０倍、または約２５倍〜２５０倍、または約１００倍〜５００倍、または約２５０倍〜１０００倍減少した、Ｆｃリガンド（例えば、ＦｃγＲ、Ｃ１ｑ）の平衡解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１６５】
別の実施形態において、当該Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも７倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも３０倍、または少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも６０倍、または少なくとも７０倍、または少なくとも８０倍、または少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも２００倍、または少なくとも４００倍、または少なくとも６００倍低減した、ＦｃγＲＩＩＩＡの平衡解離定数（ＫＤ）を有する。別の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１５０％、または少なくとも２００％低減した、ＦｃγＲＩＩＩＡの平衡解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１６６】
１つの実施形態において、Ｆｃ変種は、変化しない、または低減した親和性でＦｃγＲＩＩＢに結合する。ある特定の実施形態において、当該Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて変化しない、または少なくとも１倍、もしくは少なくとも３倍、もしくは少なくとも５倍、もしくは少なくとも１０倍、もしくは少なくとも２０倍、もしくは少なくとも５０倍、もしくは少なくとも１００倍低減した、ＦｃγＲＩＩＢへの親和性を有する。他の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて変化しない、または少なくとも１０％、もしくは少なくとも２０％、もしくは少なくとも３０％、もしくは少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％、もしくは少なくとも６０％、もしくは少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも１００％、もしくは少なくとも１５０％、もしくは少なくとも２００％低減した、ＦｃγＲＩＩＢへの親和性を有する。
【０１６７】
別の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて変化しない、または少なくとも２倍、もしくは少なくとも３倍、もしくは少なくとも５倍、もしくは少なくとも７倍、もしくは少なくとも１０倍、もしくは少なくとも２０倍、もしくは少なくとも３０倍、もしくは少なくとも４０倍、もしくは少なくとも５０倍、もしくは少なくとも６０倍、もしくは少なくとも７０倍、もしくは少なくともＳ０倍、もしくは少なくとも９０倍、もしくは少なくとも１００倍、もしくは少なくとも２００倍増加した、ＦｃγＲＩＩＢの平衡解離定数（ＫＤ）を有する。別のある特定の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて変化しない、または少なくとも１０％、もしくは少なくとも２０％、もしくは少なくとも３０％、もしくは少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％、もしくは少なくとも６０％、もしくは少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも１００％、もしくは少なくとも１５０％、もしくは少なくとも２００％増加した、ＦｃγＲＩＩＢの平衡解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１６８】
更に別の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて増加した親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合し、匹敵する分子と比べて変化しない、または減少した親和性でＦｃγＲＩＩＢに結合する。ある特定の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて少なくとも１倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍増加した、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性を有する。別の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて変化しない、または少なくとも２倍、もしくは少なくとも３倍、もしくは少なくとも５倍、もしくは少なくとも７倍、もしくは少なくとも１０倍、もしくは少なくとも２０倍、もしくは少なくとも５０倍、もしくは少なくとも１００倍低減した、ＦｃγＲＩＩＢへの親和性を有する。他の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１５０％、または少なくとも２００％増加した、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性を有し、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて変化しない、または少なくとも１０％、もしくは少なくとも２０％、もしくは少なくとも３０％、もしくは少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％、もしくは少なくとも６０％、もしくは少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも１００％、もしくは少なくとも１５０％、もしくは少なくとも２００％増加した、ＦｃγＲＩＩＢへの親和性を有する。
【０１６９】
なお別の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて減少したＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＢ平衡解離定数（ＫＤ）の比を有する。ある特定の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて少なくとも１倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍減少した、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＢ平衡解離定数（ＫＤ）の比を有する。別のある特定の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１５０％、または少なくとも２００％減少した、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＢ平衡解離定数（ＫＤ）の比を有する。
【０１７０】
別の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて減少した親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合する。ある特定の実施形態において、当該Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて少なくとも１倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍低減した、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性を有する。他の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１５０％、または少なくとも２００％減少した、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性を有する。
【０１７１】
さらに別の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて、減少した親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合し、変化しない、または増加した親和性でＦｃγＲＩＩＢに結合する。ある特定の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて少なくとも１倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍低減した、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性を有する。別のある特定の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子よりも少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも７倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍大きい、ＦｃγＲＩＩＢへの親和性を有する。他の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１５０％、または少なくとも２００％減少した、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性を有し、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べ少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１５０％、または少なくとも２００％増加した、ＦｃγＲＩＩＢへの親和性を有する。
【０１７２】
更に別の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比較して少なくとも１倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍増加した、ＦｃγＲＩＩＩＡの平衡解離定数（ＫＤ）を有する。ある特定の実施形態において、当該Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも７倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍減少した、ＦｃγＲＩＩＢの平衡解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１７３】
ｆｃγＲ選択性のためのＣＨ２変異
この複合体におけるＦｃ−ＦｃγＲタンパク質間相互作用は、ヘテロ多量体の２つの鎖がＦｃγＲ分子の２つの別個の部位と相互作用することを示す。天然のＦｃ分子における２つの重鎖には対称性があるが、１つの鎖の残基の周りの局所ＦｃγＲ環境は、反対側のＦｃ鎖の同じ残基位置の周囲にあるＦｃγＲ残基と異なる。２つの対称関連位置は、ＦｃγＲ残基の異なる選択肢と相互作用する。
【０１７４】
ＦｃとＦｃγＲとの会合における非対称性を考慮すると、Ｆｃ分子の鎖ＡおよびＢへの同時突然変異は、対称的な方法でＦｃγＲとの相互作用に影響を与えない。ホモ二量体Ｆｃ構造のＦｃの１つの鎖におけるその局所ＦｃγＲ環境との相互作用を最適化する突然変異を導入すると、第２の鎖における対応する突然変異は、必要なＦｃγＲ結合および選択性プロファイルにとって好ましい、好ましくない、または寄与しないものであり得る。
【０１７５】
構造および計算誘導手法の使用により、非対称突然変異がＦｃの２つの鎖において操作されて、Ｆｃの両方の鎖に同じ突然変異を導入する伝統的なＦｃ操作戦略の限界を克服する。Ｆｃの２つの鎖が、受容体分子の対応する面への増強された結合のために独立して最適化される場合、受容体間のより良好な結合選択性が達成され得る。
【０１７６】
例えば、Ｆｃの１つの鎖における特定の位置の突然変異は、積極的設計努力において、特定の残基への選択性を増強するために設計され得、一方、消極的設計努力において、同じ残基位置は、代替的なＦｃγ受容体の種類の局所環境と好ましくない相互作用するために突然変異され得、このようにして、２つの受容体間のより良好な選択性を達成する。ある特定の実施形態において、異なるＦｃガンマ受容体と比較して１つのＦｃガンマ受容体に選択的に結合する（例えば、ＦｃｇＲＩＩｂの代わりにＦｃｇＲＩＩＩａに選択的に結合する）非対称アミノ酸修飾を、ＣＨ２ドメインに設計する方法が提供される。他のある特定の実施形態において、ヘテロ二量体の形成を促進するため、ＣＨ３ドメインにアミノ酸修飾を含む変種Ｆｃヘテロ二量体のＣＨ２ドメインに非対称アミノ酸修飾を設計する方法が提供される。別の実施形態において、ＣＨ２ドメインに非対称アミノ酸修飾を含む変種Ｆｃヘテロ二量体に基づいた、異なるＦｃガンマ受容体への選択性を設計する方法が提供される。なお別の実施形態において、Ｆｃ分子の一面へのＦｃガンマ受容体の結合を偏らせる非対称アミノ酸修飾を設計する方法が提供される。他のある特定の実施形態において、Ｆｃガンマ受容体を、ＣＨ２ドメインに非対称アミノ酸修飾を含む変種Ｆｃヘテロ二量体の一面のみと相互作用するように偏らせる、極性ドライバーを設計する方法が提供される。
【０１７７】
ＣＨ２ドメインにおける突然変異の非対称設計は、Ｆｃ分子の一面においてＦｃγＲを認識する目的に合わせて作られ得る。これは、非対称Ｆｃ足場の産生面を構成するが、反対面は、設計された選択性プロファイルのない野生型様相互作用の傾向を表し、非産生面と考慮され得る。消極的設計戦略を用いて、突然変異を非産生面に導入し、非対称Ｆｃ足場のこちら側でＦｃγＲ相互作用を阻止して、それによりＦｃγ受容体に所望の相互作用の傾向を強いることができる。
【表６】
0006351572.tif 000014
（↑／−）は、特定の受容体の種類またはそのアロタイプの１つへの増加した、または野生型様結合を示す変種を示す。（×）は、受容体またはサブセットのアロタイプへの注目すべき結合がないことを示す。
【０１７８】
本明細書において提供されるある特定の実施形態は、Ｆｃ領域に融合した結合ドメインを含む融合ポリペプチドに関し、Ｆｃ領域は、増加した安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変種ＣＨ３ドメインを含み、変種ＣＨ３ドメインは、７０℃を超える融解温度（Ｔｍ）を有する。変種ＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体を含む分子は、当業者に周知の方法により生成され得ることが、特に考慮される。簡潔には、そのような方法には、可変領域を組み合わせること、あるいは所望の特異性を有するドメイン（例えば、ファージディスプレーもしくは発現ライブラリーから単離される、またはヒトもしくは非ヒト抗体から誘導される可変領域、または受容体の結合ドメイン）を変種Ｆｃヘテロ二量体と結合させることが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、当業者は、Ｆｃ領域（例えば、抗体）を含む分子のＦｃ領域におけるＣＨ３ドメインを修飾することにより、変種Ｆｃヘテロ二量体を生成することができる。
【０１７９】
「抗体依存性細胞仲介細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌抗体が、細胞傷害性エフェクター細胞を抗原治癒標的細胞に特異的に結合させ、続いて標的細胞を細胞毒素により死滅させる、細胞傷害性の形態を意味する。標的細胞の表面に向けられた特定の高親和性ＩｇＧ抗体は、細胞傷害性細胞を「武装し」、そのような死滅にとって絶対に必要である。標的細胞の溶解は細胞外であり、直接的な細胞間接触を必要とし、補体を伴わない。
【０１８０】
ＡＤＣＣにより標的細胞の溶解を仲介する任意の特定の抗体の能力を、アッセイすることができる。ＡＤＣＣ活性を評価するため、目的の抗体は、抗原抗体複合体により活性されて標的細胞に細胞溶解をもたらし得る免疫エフェクター細胞との組み合わせにより標的細胞に添加される。細胞溶解は、溶解した細胞からの標識（例えば、放射性基質、蛍光色素、または天然の細胞内タンパク質）の放出により、一般に検出される。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。インビトロＡＤＣＣアッセイの特定の例は、Ｗｉｓｅｃａｒｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，７９：２７７；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６６：１３５１；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５８：１８３；Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：２９、および本明細書（下記の表題「特徴決定および機能アッセイ」のセクションを参照すること）に記載されている。あるいは、または追加的には、目的の抗体のＡＤＣＣ活性をインビボにおいて、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：６５２に開示されているような動物モデルにおいて評価することができる。
【０１８１】
本発明は、増強されたＣＤＣ機能を有するＦｃ変種を含むヘテロ多量体を更に提供する。１つの実施形態において、Ｆｃ変種は増加したＣＤＣ活性を有する。１つの実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子よりも少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍大きいＣＤＣ活性を有する。別の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子よりも少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも７倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍大きい親和性でＣ１ｑに結合する。なお別の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１５０％、または少なくとも２００％増加したＣＤＣ活性を有する。ある特定の実施形態において、本発明のＦｃ変種は、増加した親和性でＣ１ｑに結合し、増強されたＣＤＣ活性を有し、少なくとも１つの抗原に特異的に結合する。
【０１８２】
本発明は、低減したＣＤＣ機能を有するＦｃ変種を含むヘテロ多量体も提供する。１つの実施形態において、Ｆｃ変種は低減したＣＤＣ活性を有する。１つの実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子よりも少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍小さいＣＤＣ活性を有する。別の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて少なくとも１倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍低減した親和性でＣ１ｑに結合する。別の実施形態において、Ｆｃ変種は、匹敵する分子と比べて少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１５０％、または少なくとも２００％減少したＣＤＣ活性を有する。ある特定の実施形態において、Ｆｃ変種は、減少した親和性でＣ１ｑに結合し、低減したＣＤＣ活性を有し、少なくとも１つの抗原に特異的に結合する。
【０１８３】
幾つかの実施形態において、Ｆｃ変種は、１つ以上の操作されたグリコフォーム、すなわちＦｃ領域を含む分子に共有結合している炭水化物組成物を含む。操作されたグリコフォームは、エフェクター機能を増強または低減することが含まれるが、これらに限定されない多様な目的に有用であり得る。操作されたグリコフォームは、当業者に既知の任意の方法により、例えば、操作もしくは変種発現株の使用により、１つの以上の酵素、例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１）を用いる同時発現により、Ｆｃ領域を含む分子を多様な生物体もしくは多様な生物体の細胞系に発現させることにより、またはＦｃ領域を含む分子を発現させた後に炭水化物を修飾することにより生成され得る。操作されたグリコフォームを生成する方法は、当該技術において知られており、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１７：１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１７  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６−３４７３）米国特許第６，６０２，６８４号、米国特許出願第１０／２７７，３７０号、米国特許出願第１０／１１３，９２９号、ＰＣＴ国際公開第００／６１７３９Ａ１号、ＰＣＴ国際公開第０１／２９２２４６Ａ１号、ＰＣＴ国際公開第０２／３１１１４０Ａ１号、ＰＣＴ国際公開第０２／３０９５４Ａ１号、Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）グリコシル化操作技術（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。例えば、国際公開第０００６１７３９号、ユーラシア特許第０１２２９１２５号、米国特許出願第２００３０１１５６１４号、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＪＭＢ，３３６：１２３９−４９を参照すること。
【０１８４】
Ｆｃ変種は、可変領域およびヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む抗体を含み、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、増加した安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異を含むＣＨ３ドメインを含み、変種ＣＨ３ドメインは、７０℃を超える融解温度（Ｔｍ）を有することが考慮される。抗体であるＦｃ変種は、少なくとも１つの抗原に特異的に結合する可変ドメイン、そのフラグメントと、変種ＣＨ３ドメインを含むヘテロ多量体Ｆｃ領域とを組み合わせることにより、「デノボ」で産生され得る。あるいは、ヘテロ二量体Ｆｃ変種は、抗原に結合する抗体を含有するＦｃ領域のＣＨ３ドメインを修飾することにより産生され得る。
【０１８５】
本発明のヘテロ多量体は、単一特異的、二重特異的、三重特異的であり得る、またはより大きな多特異性を有し得る。多特異的抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープに特異的に結合し得る、または標的分子はもとより、異種ポリペプチドもしくは固体支持体材料のような異種エピトープにも特異的に結合し得る。例えば、国際公開公報第９４／０４６９０号、同第９３／１７７１５号、同第９２／０８８０２号、同第９１／００３６０号、および同第９２／０５７９３号、Ｔｕｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９、米国特許第４，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、同第５，５７３，９２０号、および同第５，６０１，８１９号、ならびにＫｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７を参照すること）。
【０１８６】
分子を多機能的に標的にする多様な実施形態は、図２０に示されているこの非対称足場に基づいて設計され得る。
【０１８７】
二重特異的または多特異的抗体
多特異的ヘテロ多量体は、少なくとも２つの異なる抗原への結合特異性を有する抗体に基づいている。そのような分子は、通常、２つの抗原のみに結合するが（すなわち、二重特異的抗体、ＢｓＡｂ）、三重特異的抗体のような追加の特異性を有する抗体は、本発明に包含される。ＢｓＡｂの例には、一方の腕が腫瘍細胞抗原に向けられ、他方の腕が細胞傷害性分子に向けられている、または両方の腕が２つの異なる腫瘍細胞抗原に向けられている、または両方の腕が２つの異なる可溶性リガンドに向けられている、または一方の腕が可溶性リガンドに向けられ、他方の腕が細胞表面受容体に向けられている、または両方の腕が、２つの異なる細胞表面受容体に向けられているものが含まれるが、これらに限定されない。二重特異的抗体を作製する方法は、当該技術において知られている。
【０１８８】
異なる手法に応じて、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原組み合わせ部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。融合は、少なくとも一部のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインによるものであり得る。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡが、別々の発現ベクターに挿入され、適切な宿主生物体に同時形質移入される。このことは、構築に使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比が最適な収量をもたらす場合、実施形態における３つのポリペプチドフラグメントの相互割合の調整に大きな柔軟性をもたらす。実施例１および表２を参照すること。しかし、等しい比の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収量をもたらす場合、または比が特に有意ではない場合、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１８９】
二重特異的抗体には、架橋または「ヘテロ複合体」抗体が含まれる。例えば、ヘテロ複合体における一方の抗体は、アビジンに結合することができ、他方はビオチンに結合することができる。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に向けて標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、ならびにＨＩＶ感染を治療するために（国際公開第９１／００３６０号、同第９２／２００３７３号、およびヨーロッパ特許第０３０８９号）、提案されている。ヘテロ複合体抗体は、任意の従来の架橋方法を使用して作製され得る。適切な架橋剤は、当該技術において良く知られており、多数の架橋技術と共に米国特許出第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０１９０】
変種ＣＨ３ドメインを組み込んでいる２価を超える抗体、および得られる本発明のＦｃヘテロ二量体が考慮される。例えば、三重特異的抗体が調製され得る。例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）を参照すること。
【０１９１】
血清半減期
本発明の抗体は、１５日を超える、２０日を超える、２５日を超える、３０日を超える、３５日を超える、４０日を超える、４５日を超える、２か月を超える、３か月を超える、４か月を超える、または５か月を超える、哺乳動物（例えば、ヒト）における半減期（例えば、血清半減期）を有するものも包含する。哺乳動物（例えば、ヒト）における本発明の抗体の増加した半減期は、哺乳動物における当該抗体または抗体フラグメントの高い血清力価をもたらし、したがって、当該抗体もしくは抗体フラグメントの投与頻度を低減する、および／または投与される当該抗体もしくは抗体フラグメントの濃度を低減する。増加したインビトロ半減期を有する抗体は、当業者に既知の技術により生成され得る。例えば、増加したインビボ半減期を有する抗体は、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との相互作用に関与することが同定されているアミノ酸残基の修飾（例えば、置換、欠失、または付加）により生成され得る（例えば、国際公開公報第９７／３４６３１号、同第０４／０２９２０７号、米国特許第６，７３７，０５６号、および米国特許公開第２００３／０１９０３１１号を参照すること）。
【０１９２】
治療抗体
ある特定の実施形態において、少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖可変領域および変種ＣＨ３ドメインを含む変種Ｆｃヘテロ二量体は、多特異的抗体であり、ヘテロ多量体は、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリンＣＨ１領域を欠いており、場合により免疫グロブリンＣＨ２領域を欠いており（本明細書において、本発明の抗体と呼ばれる）、本発明の抗体は、目的の抗原に特異的に結合する。特に、本発明の抗体は、二重特異的抗体である。１つの実施形態において、本発明の抗体は、ポリペプチド抗原に特異的に結合する。別の実施形態において、本発明の抗体は、非ポリペプチド抗原に特異的に結合する。なお別の実施形態において、疾患または障害に罹患している哺乳動物への本発明の抗体の投与は、その哺乳動物に治療利益をもたらし得る。
【０１９３】
ＡＬＫ受容体（プレイオトロフィン受容体）、プレイオトロフィン、ＫＳ１／４汎癌腫抗原；卵巣癌抗原（ＣＡ１２５）；前立腺酸性ホスフェート；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）；黒色腫関連抗原ｐ９７；黒色腫抗原ｇｐ７５；高分子量黒色腫抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）；前立腺特異的膜抗原；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；多形上皮ムチン抗原；ヒト乳脂肪球抗原；ＣＥＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＯ１７−１Ａ、ＧＩＣＡ１９−９、ＣＴＡ−１、およびＬＥＡのような直腸結腸腫瘍関連抗原；バーキットリンパ腫抗原３８．１３；ＣＤ１９；ヒトＢリンパ腫抗原ＣＤ２０；ＣＤ３３；ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、およびガングリオシドＧＭ３のような黒色腫特異的抗原；腫瘍特異的移植型細胞表面抗原（ＴＳＴＡ）；Ｔ抗原、ＤＮＡ腫瘍ウイルス、およびＲＮＡ腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原を含むウイルス誘発性腫瘍抗原；結腸のＣＥＡ、５Ｔ４癌胎児性栄養芽細胞糖タンパク質、および膀胱腫瘍癌胎児性抗原のような癌胎児性抗原−アルファ−フェトプロテイン；ヒト肺癌抗原Ｌ６およびＬ２０のような分化抗原；線維肉腫の抗原；ヒト白血病Ｔ細胞抗原Ｇｐ３７；ネオ糖タンパク質；スフィンゴ脂質；ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）のような乳癌抗原；ＮＹ−ＢＲ−１６；ＮＹ−ＢＲ−１６およびＨＥＲ２抗原（ｐ１８５ＨＥＲ２）；多形上皮ムチン（ＰＥＭ）；悪性ヒトリンパ球抗原ＡＰＯ−１；胎児の赤血球において見出されるＩ抗原のような分化抗原；成人の赤血球において見出される一次内胚葉Ｉ抗原；着床前胚；胃腺癌において見出されるＩ（Ｍａ）；乳房上皮において見出される  Ｍ１８、Ｍ３９；骨髄細胞において見出されるＳＳＥＡ−１；ＶＥＰ８；ＶＥＰ９；Ｍｙｌ；Ｖａ４−Ｄ５；結腸直腸癌において見出されるＤ１５６−２２；ＴＲＡ−１−８５（血液型Ｈ）；精巣および卵巣癌において見出されるＳＣＰ−１；結腸腺癌において見出されるＣ１４；肺腺癌において見出されるＦ３；胃癌において見出されるＡＨ６；Ｙハプテン；胚性癌腫細胞において見出されるＬｅｙ；ＴＬ５（血液型Ａ）；Ａ４３１細胞において見出されるＥＧＦ受容体；膵癌において見出されるＥ１シリーズ（血液型Ｂ）；胚性癌腫細胞において見出されるＦＣ１０．２；胃腺癌抗原；腺癌において見出されるＣＯ−５１４（血液型Ｌｅａ）；腺癌において見出されるＮＳ−１０；ＣＯ−４３（血液型Ｌｅｂ）；Ａ４３１細胞のＥＧＦ受容体において見出されるＧ４９；結腸腺癌において見出されるＭＨ２（血液型ＡＬｅｂ／Ｌｅｙ）；結腸癌において見出される  １９．９；胃癌ムチン；骨髄細胞において見出されるＴ５Ａ７；黒色腫において見出されるＲ２４；胚性癌腫において見出される４．２、ＧＤ３、Ｄ１．１、ＯＦＡ−１、ＧＭ２、ＯＦＡ−２、ＧＤ２、およびＭ１：２２：２５：８、ならびに４〜８細胞期の胚において見出されるＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４；皮膚Ｔ細胞リンパ腫抗原；ＭＡＲＴ−１抗原；Ｓｉａｌｙ  Ｔｎ（ＳＴｎ）抗原；結腸癌抗原ＮＹ−ＣＯ−４５；肺癌抗原ＮＹ−ＬＵ−１２勇者Ａ；腺癌抗原ＡＲＴ１；腫瘍随伴関連脳−精巣癌抗原（癌神経抗原ＭＡ２、腫瘍随伴性神経抗原）；神経癌腹側抗原２（ＮＯＶＡ２）；肝細胞癌抗原遺伝子５２０；ＴＵＭＯＲ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＡＮＴＩＧＥＮ  ＣＯ−０２９；腫瘍関連抗原ＭＡＧＥ−Ｃ１（癌／精巣抗原ＣＴ７）、ＭＡＧＥ−Ｂ１（ＭＡＧＥ−ＸＰ抗原）、ＭＡＧＥ−Ｂ２（ＤＡＭ６）、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−４−ａ、ＭＡＧＥ−４−ｂ、およびＭＡＧＥ−Ｘ２；癌−精巣抗原（ＮＹ−ＥＯＳ−１）、ならびに上記に列記されたポリペプチドの任意のフラグメントが含まれるが、これらに限定されない癌抗原に特異的結合する本発明の抗体も提供される。
【０１９４】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるヘテロ多量体は、少なくとも１つの治療抗体の少なくとも１つのドメインと競合する。幾つかの実施形態において、治療抗体は癌標的抗原と結合する。一実施形態において、治療抗体は、アバゴボマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、アウログラブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、ルミリキシマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ、ミコグラブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、テプリズマブ、トシリズマブ／アトリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、Ｐｒｏｘｉｎｉｕｍ（商標）、Ｒｅｎｃａｒｅｘ（商標）、ウステキヌマブ、ザルツムマブ、および任意の他の抗体からなる群から選択され得る。
【０１９５】
抗体誘導体
本発明の抗体には、修飾されている（すなわち、共有結合のような抗体への任意の種類の分子の共有結合により）誘導体が含まれる。例えば、限定するものではないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合などにより修飾された抗体が含まれる。多数の化学修飾のいずれも、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などが含まれるが、これらに限定されない既知の技術により実施され得る。加えて、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。
【０１９６】
増加したインビボ半減期を有する抗体またはそのフラグメントは、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリマー分子を抗体または抗体フラグメントに結合することによって、生成され得る。ＰＥＧは、抗体もしくは抗体フラグメントのＮもしくはＣ末端へのＰＥＧの部位特異的複合体化、またはリシン残基に存在するイプシロン−アミノ基のいずれかを介して、多機能性リンカーを用いて、または用いることなく、当該抗体または抗体フラグメントに結合され得る。生物学的活性の最小限の損失をもたらす直鎖または分岐鎖ポリマー誘導体化が、使用される。複合体化の程度は、抗体へのＰＥＧ分子の適切な複合体化を確実にするため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により密接にモニターされる。未反応ＰＥＧは、例えばサイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体−ＰＥＧ複合体から分離され得る。
【０１９７】
更に、抗体は、インビボにおいてより安定した抗体もしくは抗体フラグメントを作製するため、またはインビボにおいてより長い半減期を有するため、アルブミンと複合体化され得る。技術は、当該技術において良く知られており、例えば、国際公開公報第９３／１５１９９号、同第９３／１５２００号、および同第０１／７７１３７号、ならびにヨーロッパ特許第４１３，６２２号を参照すること。本発明は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣剤、合成薬剤、無機分子、および有機分子が含まれるが、これらに限定されない１つ以上の部分に複合体化または融合した抗体またはそのフラグメントの使用を包含する。
【０１９８】
本発明は、融合タンパク質を生成するための、異種タンパク質またはポリペプチドに（またはそのフラグメントに、例えば、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個または少なくとも１００個のアミノ酸のポリペプチドに）組み換え的に融合または化学的に複合体化した（共有および非共有複合体化の両方を含む）、抗体またはそのフラグメントの使用を包含する。融合は、必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介して生じ得る。例えば、抗体は、抗体を特定の細胞表面受容体に特異的な抗体と融合または複合体化させることにより、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、特定の細胞型に対して異種ポリペプチドを標的化するために使用され得る。異種ポリペプチドに融合または複合体化した抗体は、当該技術に既知の方法を使用するインビトロ免疫アッセイおよび精製方法にも使用され得る。例えば、国際公開公報第９３／２１２３２号、ヨーロッパ特許第４３９，０９５号、Ｎａｒａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９、米国特許第５，４７４，９８１号、Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＰＮＡＳ８９：１４２８−１４３２、およびＦｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２を参照すること。
【０１９９】
本発明は、抗体フラグメントに融合または複合体化した異種タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを含む組成物を更に含む。例えば、異種ポリペプチドは、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬ  ＣＤＲ、またはこれらのフラグメントに融合または複合体化し得る。ポリペプチドを抗体部分に融合または複合体化する方法は、当該技術において良く知られている。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５１号、および同第５，１１２，９４６号、ヨーロッパ特許第３０７，４３４号および同第３６７，１６６号、国際公開公報第９６／０４３８８号および同第９１／０６５７０号、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００、およびＶｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１１３３７−１１３４１を参照すること。
【０２００】
例えば、抗原（例えば、上記）に特異的に結合する抗体の追加の融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング、および／またはコドンシャフリング（集合手に「ＤＮＡシャフリング」と呼ばれる）の技術によって生成され得る。ＤＮＡシャフリングは、本発明の抗体またはそのフラグメントの活性を変えるために用いることができる（例えば、高い親和性および低い解離速度を有する抗体またはそのフラグメント）。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３、Ｈａｒａｙａｍａ，１９９８，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２、Ｈａｎｓｓｏｎ，ｅｔａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６、およびＬｏｒｅｎｚｏ  ａｎｄ  Ｂｌａｓｃｏ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２４（２）：３０８−３１３を参照すること。抗体もしくはそのフラグメント、またはコードされた抗体もしくはそのフラグメントは、組み換えの前に、エラー−プローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法によるランダム突然変異誘発に付されることより変えられ得る。抗体または抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドの、抗原に特異的に結合する１つ以上の部分は、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、セクション、一部、ドメイン、フラグメントなどと組み合わされ得る。
【０２０１】
薬剤複合体化
本発明は、治療剤または細胞毒素に複合体化した変種Ｆｃヘテロ二量体またはそのフラグメントを含むヘテロ多量体の使用を更に包含する。
【０２０２】
抗体またはそのフラグメントは、細胞毒素、例えば細胞増殖抑制もしくは細胞破壊剤、治療剤、または放射性金属イオン、例えばアルファ−放射体のような治療部分と複合体化し得る。細胞毒素または細胞傷害剤には、細胞に有害な任意の薬剤が含まれる。例には、リボヌクレアーゼ、モノメチルアウリスタチンＥおよびＦ、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、およびシクロホスファミド、ならびにこれらの類縁体または相同体が含まれる。治療剤には、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれるが、これらに限定されない。治療部分のより広範囲なリストは、ＰＣＴ公開公報第０３／０７５９５７号において見出され得る。
【０２０３】
抗体をポリペプチド部分に融合または複合体化する方法は、当該技術において知られている。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５１号、および同第５，１１２，９４６号、ヨーロッパ特許第３０７，４３４号、ヨーロッパ特許第３６７，１６６号、ＰＣＴ国際公開公報第９６／０４３８８号および同第９１／０６５７０号、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８８：１０５３５、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０、およびＶｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８９：１１３３７を参照すること。部分への抗体の融合は、必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介して生じ得る。そのようなリンカー分子は、当該技術において一般に知られており、Ｄｅｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４：２４８３、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １０：５５３、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ２６：９４３、Ｇａｒｎｅｔｔ，２００２，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５３：１７１に記載されている。
【０２０４】
組み換え発現
ヘテロ多量体、その誘導体、類縁体、またはフラグメント（例えば、本発明の抗体または融合タンパク質）は、ヘテロ多量体（例えば、抗体または融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。ヘテロ多量体（例えば、抗体または融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドが得られると、ヘテロ多量体（例えば、抗体または融合タンパク質）を産生するベクターは、当該技術において周知の技術を使用して組み換えＤＮＡ技術により産生され得る。したがって、ヘテロ多量体（例えば、抗体または融合タンパク質）コードヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現するタンパク質を調製する方法が、本明細書に記載される。当該技術において周知の方法を使用して、ヘテロ多量体（例えば、抗体または融合タンパク質）コード配列、ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組み換えが含まれる。したがって本発明は、プロモーターに機能的に結合している、本発明のヘテロ多量体をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能ベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、国際公開公報第８６／０５８０７号、国際公開公報第８９／０１０３６号、および米国特許第５，１２２，４６４号を参照すること、ならびに抗体の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み得る、あるいはＦｃ変種を生成するポリペプチドは、完全長抗体鎖（例えば、重もしくは軽鎖）を発現するため、そのようなベクターに、または非抗体誘導ポリペプチドと、少なくとも１つの変種ＣＨ３ドメインを組み込むＦｃ領域との融合体を含む完全Ｆｃ変種に、クローンされ得る。
【０２０５】
発現ベクターは、従来の技術により宿主細胞に移動され、次に形質移入細胞は、従来の技術により培養されて、本発明のＦｃ変種を産生する。したがって、本発明は、異種プロモーターに機能的に結合している、本発明のヘテロ多量体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主を含む。二本鎖抗体を含むヘテロ多量体の発現におけるある特定の実施形態において、重と軽の両方の鎖をコードするベクターは、全免疫グロブリン分子の発現のために、宿主細胞において同時発現され得、下記に詳述される。
【０２０６】
多様な宿主発現ベクター系を利用して、本発明のヘテロ多量体（例えば、抗体または融合タンパク質分子）を発現することができる（例えば、米国特許第５，８０７，７１５号を参照すること）。そのような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、続いて精製され得るビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換または形質移入されたとき、その場で本発明のヘテロ多量体を発現し得る細胞も表す。これらには、ヘテロ多量体をコードする配列を含有する組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌（例えば、大腸菌および枯草菌）のような微生物；Ｆｃ変種コード配列を含有する組み換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｐｉｃｈｉａ（サッカロミセス・ピキア））；ヘテロ多量体コード配列を含有する組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）により感染された昆虫細胞系；Ｆｃ可変コード配列を含有する、組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）により感染された、もしくは組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）により形質転換された、植物細胞系；または哺乳類細胞のゲノムから誘導されたプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、もしくは哺乳類ウイルスから誘導されたプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組み換え発現構築物を持つ哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０、および３Ｔ３細胞）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、大腸菌のような細菌細胞または真核生物細胞は、組み換え抗体または融合タンパク質分子であるヘテロ多量体の発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳類細胞は、ヒトサイトメガロウイルスからの主要中間体初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと一緒になって、抗体の有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４５：１０１およびＣｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２）。ある特定の実施形態において、本発明のＦｃ変種（例えば、抗体または融合タンパク質）をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターにより調節される。
【０２０７】
細菌系では、多数の発現ベクターが、発現されるヘテロ多量体（例えば、抗体または融合タンパク質）に意図される使用に応じて有利に選択され得る。例えば、大量のそのようなタンパク質がＦｃ変種の薬学的組成物の生成のために産生される場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが、望ましいことがある。そのようなベクターには、ｌａｃ−Ｚ融合タンパク質が産生されるように、ヘテロ多量体コード配列がｌａｃ  Ｚコード領域のフレーム内のベクターと個別に連結され得る大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，ＥＭＢＯ  １２：１７９１）、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９）などが含まれるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターも、グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために使用され得る。一般に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、吸着およびグルタチオンアガロースビーズのマトリックスへの結合により、続いて遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解細胞から容易に精製され得る。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、これにより、クローンされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得る。
【０２０８】
挿入系では、オートグラファカリフォルニアニュークレア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ）多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するために使用される。このウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞において増殖する。ヘテロ多量体（例えば、抗体または融合タンパク質）コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個別にクローンされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれる。
【０２０９】
哺乳類宿主細胞では、多数のウイルスに基づいた発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的のヘテロ多量体（例えば、抗体または融合タンパク質）コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーター、および三者間リーダー配列に連結され得る。次にこのキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボ組み換えによりアデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入は、感染された宿主において、生存可能であり、かつヘテロ多量体（例えば、抗体または融合タンパク質）を発現することができる組み換えウイルスをもたらす（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３５５−３５９を参照すること）。特定の開始シグナルは、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のためにも必要であり得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするため、所望のコード配列のリーディングフレームと位相があっていなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の、多様な由来のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることにより増強され得る。（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照すること）。
【０２１０】
ヘテロ多量体（例えば、抗体または融合タンパク質）の発現は、当該技術において癌値の任意のプロモーターまたはエンハンサーエレメントにより制御され得る。ヘテロ多量体（例えば、抗体または融合タンパク質）をコードする遺伝子の発現を制御するために使用され得る、プロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター領域  （Ｂｅｒｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３′長末端反復に含有されるプロモーター  （Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター  （Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１）；β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５；“Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ”ｉｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，１９８０，２４２：７４−９４も参照すること）のような原核生物発現ベクター；ノパリンシンセターゼプロモーター領域（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９−２１３）またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター（Ｇａｒｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：２８７１）および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：１１５−１２０）を含む植物発現ベクター；Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターのような酵母または他の真菌からのプロモーターエレメント、ならびに、組織特異性を示し、かつ遺伝子導入動物に利用されている以下の動物転写制御領域：膵腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）、膵ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２）、リンパ球細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７���６５８；Ａｄａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）、精巣細胞、乳腺細胞、リンパ球細胞、およびマスト細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−４９５）、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）、肝臓において活性なアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域  （Ｋｒｕｍｌａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８；肝臓において活性なアルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）、骨髄細胞において活性なベータ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４；脳の希突起神経膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２）、骨格筋において活性なミエリン軽鎖２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−２８６）、神経細胞において活性な神経特異的エノラーセ（ＮＳＥ）（Ｍｏｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５７１−８３）、神経細胞において活性な脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）遺伝子制御領域（Ｔａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２５３：８１８−８２３）、星状膠細胞において活性なグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター（Ｇｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ３２（５）：６１９−６３１；Ｍｏｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５７１−８３）、および視床下部において活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８）からのプロモーターエレメントが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１１】
本発明のヘテロ多量体（例えば、抗体または融合タンパク質）をコードする遺伝子の挿入物を含有する発現ベクターは、３つの一般的な手法の（ａ）核酸ハイブリッド形成、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または不在、および（ｃ）挿入配列の発現により同定され得る。第１の手法では、発現ベクター中のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または融合タンパク質をコードする遺伝子の存在は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または融合タンパク質をそれぞれコードする挿入遺伝子と相同的である配列を含むプローブの使用による核酸ハイブリッド形成により検出され得る。第２の手法では、組み換えベクター／宿主系は、ベクター中の抗体または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の挿入により引き起こされる特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する抵抗、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける包埋体の形成など）の存在または不在に基づいて同定および選択され得る。例えば、ヘテロ多量体（例えば、抗体または融合タンパク質）をコードするヌクレオチド配列が、ベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、抗体または融合タンパク質挿入物をコードする遺伝子を含有する組み換え体は、マーカー遺伝子機能の不在により同定され得る。第３の手法では、組み換え発現ベクターは、組み換え体により発現されている遺伝子産物（例えば、抗体または融合タンパク質）をアッセイすることにより同定され得る。そのようなアッセイは、例えば、インビトロアッセイ系における融合タンパク質の物理的または機能的特性、例えば抗生理活性分子抗体との結合に基づくことができる。
【０２１２】
加えて、宿主細胞株は、挿入配列の発現を調節する、または望ましい特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセスするように選択され得る。特定のプロモーターによる発現は、特定のインデューサーの存在により高められ得、このように遺伝子操作融合タンパク質の発現が制御され得る。更に、異なる宿主細胞は、翻訳および後翻訳、ならびに修飾（例えば、タンパク質のグリコシル化、リン酸化）についての特徴および特定の機構を有する。適切な細胞系統または宿主系は、発現された外来性タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを確実にするために選択され得る。例えば、細菌系における発現は、非グリコシル化産物を産生し、酵母における発現は、グリコシル化産物を産生する。遺伝子産物の一次転写物の正確なプロセシング（例えば、グリコシル化およびリン酸化）の細胞機構を有する真核宿主細胞が、使用され得る。そのような哺乳類宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＮＳ０、特に、例えばＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＦＩ、ＳＫ−Ｎ−ＤＺヒト神経芽細胞腫のような神経細胞（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．７３：５１−５７）、ＳＫ−Ｎ−ＳＨヒト神経芽細胞腫（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，１９８２，７０４：４５０−４６０）、Ｄａｏｙヒト小脳髄芽細胞腫（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１１４４−１１４８）ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ神経膠芽腫細胞（Ｋｒｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２８Ａ：６０９−６１４）、ＩＭＲ−３２ヒト神経芽細胞腫（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９７０，３０：２１１０−２１１８）、１３２１Ｎ１ヒト星状膠細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７７，７４：４８１６）、ＭＯＧ−Ｇ−ＣＣＭヒト星状細胞腫（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９８４，４９：２６９）、Ｕ８７ＭＧヒト神経膠芽腫−星状細胞腫（Ａｃｔａ  Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．，１９６８，７４：４６５−４８６）、Ａ１７２ヒト神経膠芽腫（Ｏｌｏｐａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：２５２３−２５２９）、Ｃ６ラットグリオーマ細胞（Ｂｅｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９６８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６１：３７０−３７１）、Ｎｅｕｒｏ−２ａマウス神経芽細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７０，６５：１２９−１３６）、ＮＢ４１Ａ３マウス神経芽細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９６２，４８：１１８４−１１９０）、ＳＣＰヒツジ脈絡叢（Ｂｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４８：２１１−２２１）、Ｇ３５５−５、ＰＧ−４ネコ正常星状膠細胞（Ｈａａｐａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３：８２７−８３３）、Ｍｐｆフェレット脳（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １８：９５２−９６０）、ならびに、例えばＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような、例えばＣＴＸ  ＴＮＡ２ラット正常脳皮質（Ｒａｄａｎｙ  ｅｔ  ａ���．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６４６７−６４７１）のような正常な細胞系統が含まれるが、これらに限定されない。更に、異なるベクター／発現系は、異なる程度でプロセシング反応を実施し得る。
【０２１３】
組み換えタンパク質の長期で高収量の産生のためには、安定した発現が多くの場合に好ましい。例えば、本発明のヘテロ多量体（例えば、抗体または融合タンパク質）を安定して発現する細胞系統は、操作され得る。ウイルス由来の複製を含有する発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択可能なマーカーにより制御されたＤＮＡにより形質転換することができる。外来性ＤＮＡの導入の後、操作細胞は、濃縮培地において１〜２日間増殖することが可能であり得、次に選択培地に交換される。組み換えプラスミドにおける選択可能なマーカーは、選択に対して抵抗性を付与し、細胞がプラスミドを染色体に安定して組み込み、増殖して、次には細胞系統にクローンおよび展開され得る増殖巣を形成することを可能にする。この方法は、抗原に特異的に結合するヘテロ多量体を発現する細胞系統を操作するために有利に使用され得る。そのような操作細胞系統は、抗原に特異的に結合するヘテロ多量体（例えば、ポリペプチドまたは融合タンパク質）の活性に影響を与える化合物をスクリーンおよび評価することに特に有用であり得る。
【０２１４】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７，Ｃｅｌｌ  １１：２２３）、ヒポキサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２６）が含まれるが、これらに限定されない多数の選択系を使用することができ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：８１７）遺伝子をｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞にそれぞれ用いることができる。また、代謝拮抗物質抵抗性は、メトトレキセートに対して抵抗性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５６７；Ｏ′Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７）、ミコフェノール酸に対して抵抗性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２）、アミノグリコシドＧ−４１８に対して抵抗性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１）、およびハイグロマイシンに対して抵抗性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｇｅｎｅ  ３０：１４７）遺伝子を選択の基礎として使用することができる。
【０２１５】
精製
本発明のヘテロ多量体（例えば、抗体または融合タンパク質）が組み換え発現により産生されると、タンパク質の精製について任意の既知の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、特にプロテインＡの後での特定の抗原への親和性によるアフィニティー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度、またはタンパク質の精製における任意の他の標準的な技術により精製され得る。
【０２１６】
ヘテロ多量体は、分泌ポリペプチドとして培養培地から一般に回収されるが、分泌シグナルなしで直接産生されたときは、宿主細胞溶解産物から回収され得る。ヘテロ多量体が膜結合している場合、これを適切な洗剤溶液（例えば、トリトンＸ１００）の使用により膜から遊離させることができる。
【０２１７】
ヘテロ多量体が、ヒト由来以外の組み換え細胞から産生される場合、ヒト由来のタンパク質またはポリペプチドを完全に含有していない。しかし、組み換え細胞タンパク質またはポリペプチドからヘテロ多量体を精製して、ヘテロ多量体として実質的に均質である調製物を得ることが必要である。第１のステップとして、培養培地または溶解産物は、粒状細胞片を除去するため、通常、遠心分離される。
【０２１８】
抗体定常ドメインを有するヘテロ多量体は、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーにより都合良く精製され得、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿のようなタンパク質精製の他の技術も、回収されるポリペプチドに応じて利用可能である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの安定性は、使用される免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプによって左右される。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づいている免疫グロブリンＦｃ領域を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ３に推奨されている（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティーリガンドが結合しているマトリックスは、ほとんどの場合にアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定したマトリックスは、アガロースにより達成され得るより速い流速および短いプロセシング時間を可能にする。イムノアドヘシンをプロテインＡまたはＧアフィニティーカラムに結合する条件は、Ｆｃドメインの特徴、すなわち、その種およびアイソタイプによって全面的に決まる。一般に、正確なリガンドが選択される場合、効率的な結合が無条件培養液から直接生じる。結合した変種Ｆｃヘテロ二量体は、酸性ｐＨ（３．０以上）または弱カオトロピック塩を含有する中性ｐＨの緩衝液のいずれかにより効率的に溶出され得る。アフィニティークロマトグラフィーステップは、純度が＞９５％の変種Ｆｃヘテロ二量体調製物をもたらし得る。
【０２１９】
ヘテロ多量体（例えば、抗体または融合タンパク質）の発現レベルは、ベクター増幅により増加され得る（概説には、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照すること）。例えば、抗体または融合タンパク質を発現するベクター系におけるマーカーが増幅されるとき、宿主細胞の培養物に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加する。増幅領域が抗体遺伝子と会合するので、抗体または融合タンパク質の酸性も増加する（Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７）。
【０２２０】
特徴決定および機能アッセイ
本発明のＦｃ変種（例えば、抗体または融合タンパク質）は、多様な方法で特徴決定され得る。１つの実施形態において、変種Ｆｃヘテロ二量体の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、ウエスタンブロット、密度測定、または質量分析が含まれるが、これらに限定されない当該技術に周知の技術を使用して評価される。タンパク質安定性は、サイズ排除クロマトグラフィー、紫外可視およびＣＤスペクトル測定、質量分析、示差光散乱、ベンチトップ安定性アッセイ、他の特徴決定技術と結合した凍結融解、示差走査熱量測定、示差走査蛍光定量、疎水性相互作用クロマトグラフィー、等電点電気泳動、受容体結合アッセイ、またはタンパク質相対発現レベルであるが、これらの限定されない一連の技術を使用して特徴決定され得る。例示的な実施形態において、変種Ｆｃヘテロ二量体の安定性は、示差走査熱量測定または示差走査蛍光定量のような当該技術に周知の技術を使用して野生型ＣＨ３ドメインと比較した、変種ＣＨ３ドメインの融解温度により評価される。
【０２２１】
本発明のＦｃ変種は、リガンド（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、Ｃ１ｑ）に特異的に結合する能力についてもアッセイされ得る。そのようなアッセイは、溶液（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：４１２−４２１，１９９２）、ビーズ（Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４，１９９１、チップ（Ｆｏｄｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３６４：５５５−５５６，１９９３）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１８６５−１８６９，１９９２）、またはファージ（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：３８６−３９０，１９９０；Ｄｅｖｌｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：４０４−４０６，１９９０；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８−６３８２，１９９０、およびＦｅｌｉｃｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：３０１−３１０，１９９１）において実施され得る。リガンド（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、Ｃ１ｑ、または抗原）に特異的に結合することが同定されている分子は、次にリガンドへの親和性についてアッセイされ得る。
【０２２２】
本発明のＦｃ変種は、当該技術に既知の任意の方法により、抗原（例えば、癌抗原および他の抗原との交差反応性）、またはリガンド（例えばＦｃγＲ）のような分子への特異的結合についてアッセイされ得る。特異的結合および公差反応性を分析するために使用され得るイムノアッセイには、幾つか挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル核酸沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイのような技術を使用する競合および非競合アッセイ系が含まれるが、これらに限定されない。そのようなアッセイは、日常的であり、当該技術において良く知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照すること）。
【０２２３】
抗原またはリガンド（例えば、ＦｃγＲ）のような分子への本発明のＦｃ変種の結合親和性、および相互作用のオフレートは、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの一例は、ＦｃγＲのような標識リガンド（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉを、ＦｃγＲのような非標識リガンドの増加量の存在下で目的の分子（例えば、本発明のＦｃ変種）と共にインキュベートすること、および標識リガンドに結合した分子を検出することを含む。リガンドへの本発明の分子の親和性、および結合オフレートは、スキャッチャード分析により飽和データから決定され得る。
【０２２４】
親和性成熟
当該技術において知られているように、単一ドメイン抗原結合構築物が同定され、標的抗原への親和性が測定されると、必要であれば、その標的抗原への単一ドメイン抗原結合構築物の親和性は、当該技術に既知の方法による親和性成熟により改善され得る。抗体の標的抗原の結晶構造が利用可能な抗原結合ドメインの親和性成熟における１つの例示的な方法が、以下に記載される。抗原抗体複合体の構造がモデル形成のために使用される。分子動力学（ＭＤ）を用いて、水性環境におけるＷＴ複合体の無傷の動力学的性質を評価することができる。平均場およびデッドエンド排除方法を柔軟性主鎖と共に使用して、スクリーンされる突然変異体のモデル構造を最適化および調製することができる。詰め込みの後、接触密度、衝突スコア、疎水性、および静電気を含む多数の特徴がスコア付けされる。一般化されたＢｏｒｎ法は、溶媒条件の作用を正確にモデル形成すること、およびタンパク質における特定の位置の突然変異後の、代替残基型との自由エネルギーの差を計算することを可能にする。接触密度および衝突スコアは、有効なタンパク質詰め込みの重要な態様である相補性の測度を提供する。スクリーニング手順は、知識ベースポテンシャル、ならびに対毎の残基相互作用エネルギーおよびエントロピー計算に依存するカップリング分析スキームを用いる。
【０２２５】
Ｆｃ変種の動態パラメーターも、当該技術に既知の任意の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づいたアッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ動態分析）の使用により決定され得る。ＳＰＲに基づいた技術の概説には、Ｍｕｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２：７７−９１；Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｒｅｖｉｅｗ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，８２：３０３−２３；Ｆｉｖａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９７−１０１；Ｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：５４−６１を参照すること。加えて、米国特許第６，３７３，５７７号、同第６，２８９，２８６号、同第５，３２２，７９８号、同第５，３４１，２１５号、同第６，２６８，１２５号に記載されているタンパク質間相互作用を測定する任意のＳＰＲ器機およびＳＰＲに基づいた方法が、本発明の方法に考慮される。
【０２２６】
当業者に既知の任意の技術を使用する蛍光標識細胞選別（ＦＡＣＳ）は、細胞表面に発現した分子へのＦｃ変種（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ）の結合の特徴決定に使用され得る。流動選別機は、ライブラリー挿入物を含有する大量の個別の細胞を素早く検査することができる（例えば、１時間あたり１０〜１億個の細胞）（Ｓｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１９９５）。生体細胞を選別および検査するフローサイトメーターは、当該技術において良く知られている。既知のフローサイトメーターは、例えば、米国特許４，３４７，９３５号、同第５，４６４，５８１号、同第５，４８３，４６９号、同第５，６０２，０３９号、同第５，６４３，７９６号、および同第６，２１１，４７７号に記載されている。他の既知のフローサイトメーターは、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙにより製造されたＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（商標）システム、およびＵｎｉｏｎ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａにより製造されたＣＯＰＡＳ（商標）システムである。
【０２２７】
本発明のＦｃ変種は、ＦｃγＲ仲介エフェクター細胞機能を仲介する能力によって特徴決定され得る。アッセイされ得るエフェクター細胞機能の例には、抗体依存性細胞仲介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食菌作用、オプソニン化、オプソニン化貪食作用、Ｃ１ｑ結合、および補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）が含まれるが、これらに限定されない。エフェクター細胞機能を決定する当業者に既知の任意の細胞に基づいた、または細胞無含有アッセイを使用することができる（エフェクター細胞アッセイには、Ｐｅｒｕｓｓｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２１：１７９−９２；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，４４（１０）：８４１−８；Ｌｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４３（１−２）：２２９−４２；Ｂｒｏｗｎ  Ｅ  Ｊ．１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，４５：１４７−６４；Ｍｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７２：２３１−２３７，Ａｂｄｕｌ−Ｍａｊｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：７０−８１；Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：４０３−４１１を参照すること）。
【０２２８】
特に、本発明のＦｃ変種は、当業者に既知の任意の標準的な方法の使用により、エフェクター細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞）におけるＦｃγＲ仲介ＡＤＣＣ活性についてアッセイされ得る（例えば、Ｐｅｒｕｓｓｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２１：１７９−９２を参照すること）。本発明の分子のＡＤＣＣ活性を決定する例示的なアッセイは、標的細胞を［５１Ｃｒ］Ｎａ２ＣｒＯ４（この細胞膜浸透性分子は、細胞質タンパク質に結合するので標識に一般的に使用されており、遅い動態で細胞から自然放出されるが、標的細胞の壊死の後では大量に放出される）により標識すること、標的細胞を本発明のＦｃ変種でオプソニン化すること、オプソニン化された放射標識標的細胞をマイクロタイタープレートにおいて標的細胞とエフェクター細胞の適切な比によりエフェクターと組み合わせること、細胞の混合物を３７℃で１６〜１８時間インキュベートすること、上澄みを収集すること、および放射能を分析することから構成される、５１Ｃｒ放出アッセイに基づいている。次に、本発明の分子細胞傷害性は、例えば以下の式：溶解％＝（実験ｃｐｍ−標的漏出ｃｐｍ）／（洗剤溶解ｃｐｍ−標的漏出ｃｐｍ）×１００％を使用して決定され得る。あるいは、溶解％＝（ＡＤＣＣ−ＡＩＣＣ）／（最大放出−自然放出）である。特異的溶解は、式：特異的溶解＝本発明の分子による溶解％−本発明の分子の不在下での溶解％を使用して計算され得る。グラフは、標的エフェクター細胞比また抗体濃度を変えることにより生成され得る。
【０２２９】
Ｃ１ｑに結合し、補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）を仲介するＦｃ変種の能力を特徴決定する方法は、当該技術において良く知られている。例えば、Ｃ１ｑ結合を決定するために、Ｃ１ｑ結合ＥＬＩＳＡを実施することができる。例示的なアッセイには、以下が含まれ得る。アッセイプレートを、ポリペプチド変種または被覆緩衝液中の出発ポリペプチド（対照）により４Ｃで一晩被覆することができる。次にプレートを洗浄し、ブロックすることができる。洗浄した後、ヒトＣ１ｑのアリコートを各ウエルに加え、室温で２時間インキュベートすることができる。更に洗浄した後、１００ｕＬのヒツジ抗補体Ｃ１ｑペルオキシダーゼ結合抗体を各ウエルに加え、室温で１時間インキュベートすることができる。再びプレートを緩衝液で洗浄することができ、１００ｕｌのＯＰＤ（Ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（Ｓｉｇｍａ））含有基質緩衝液を各ウエルに加えることができる。黄色の出現により観察される酸化反応を、３０分間進行させ、１００ｕｌの４．５ＮＨ２  ＳＯ４の添加により停止させることができる。次に吸光度を（４９２〜４０５）ｎｍで読み取ることができる。
【０２３０】
補体活性化を評価するために、補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）アッセイを実施することができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３に記載されている）。簡潔には、多様な濃度のＦｃ変種およびヒト補体を緩衝剤により希釈することができる。Ｆｃ変種が結合する抗体を発現する細胞を、約１×１０６細胞／ｍｌの濃度に希釈することができる。Ｆｃ変種、希釈ヒト補体、および抗体を発現している細胞の混合物を、平底組織培養９６ウエルプレートに加え、３７Ｃおよび５％ＣＯ２で２時間インキュベートして、補体仲介細胞溶解を促進することができる。次に５０ｕＬのアラマーブルー（Ａｃｃｕｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を各ウエルに加え、３７Ｃで一晩インキュベートすることができる。吸光度は、５３０ｎｍ  ｎの励起および５９０ｎｍの発光により９６ウエル蛍光光度計を使用して測定される。結果を相対蛍光単位（ＲＦＵ）により表すことができる。試料濃度を標準曲線から計算することができ、匹敵する分子（すなわち、非修飾または野生型ＣＨ３ドメインを有するＦｃ領域を含む分子）と比べた活性率が、目的のＦｃ変種について報告される。
【０２３１】
補体アッセイは、モルモット、ウサギ、またはヒト血清により実施され得る。標的細胞の補体溶解は、Ｋｏｒｚｅｎｉｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６４（３）：３１３−２０、およびＤｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１５（１）：６１−９に記載されているように、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）のような細胞内酵素の放出、または標的細胞が標識されるユーロピウム、クロム５１、もしくはインジウム１１１のような細胞内標識の放出をモニターすることによって検出され得る。
【０２３２】
薬物動態安定性
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるヘテロ多量体は、市販の治療抗体に匹敵する薬物動態（ＰＫ）またはインビボ安定性を示す。１つの実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ多量体は、血清濃度、ｔ１／２、ベータ半減期、および／またはＣＬに関して既知の治療抗体と類似したＰＫ特性を示す。
【０２３３】
幾つかの実施形態において、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）による取り込みのような能動輸送過程も、結合タンパク質の間の抗体の体内分布に対して影響を与える。１つの実施形態において、ヘテロ多量体は、市販の治療抗体と比較して類似した親和性でＦｃＲｎに結合する。
【０２３４】
ヒト化単一ドメイン抗原結合構築物
幾つかの実施形態において、例えば、単一ドメイン抗体結合構築物がラクダ科動物またはサメから得られる場合、本明細書に記載されているヘテロ多量体に使用される前に、単一ドメイン抗原結合構築物をヒト化する必要があり得る。非ヒト抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小限の配列を含有するキメラ抗体である。大部分の場合において、ヒト化抗体は、受給体の超可変領域における残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類のような非ヒト種（供与体の抗体）の超可変領域の残基に代えられているヒト免疫グロブリン（受給体の抗体）である。幾つかの場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基に代えられている。更に、ヒト化抗体は、受給体の抗体または供与体の抗体において見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能を更に洗練するために実行される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを実質的に全て含み、全てまた実質的に全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンに対応し、全てまたは実質的に全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、場合により、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含む。更なる詳細は、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，  Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照すること。
【０２３５】
治療方法
本発明は、本発明の１つ以上のヘテロ多量体（例えば、抗体）を、疾患、障害、または感染に関連する１つ以上の症状を予防、治療、または改善するため、動物、特に哺乳動物、とりわけヒトに投与することを包含する。
【０２３６】
１つの実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ多量体は、Ｆｃエフェクター機能活性を介して治療効果を発揮する。１つの実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ多量体は、細胞傷害性薬剤分子に複合体化し、標的細胞へのヘテロ多量体および細胞傷害性薬剤分子の内部移行を介して治療効果を発揮する。
【０２３７】
１つの実施形態において、ヘテロ多量体は、細菌または真菌のような病原性生物の感染を治療するために使用される。
【０２３８】
本発明のヘテロ多量体は、エフェクター細胞機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ）の効力の変更が望ましい場合、疾患または障害の治療または予防に特に有用である。ヘテロ多量体およびその組成物は、原発性または転移性の新生物性疾患（すなわち、癌）および感染性疾患の治療または予防に特に有用である。本発明の分子は、当該技術に既知である、または本明細書に記載されている薬学的に許容される組成物により提供される。下記に詳述されるように、本発明の分子は、癌（特に、受動的免疫療法において）、自己免疫性疾患、炎症性障害、または感染性疾患の治療または予防の方法に使用され得る。
【０２３９】
本発明のヘテロ多量体は、また、癌、自己免疫性疾患、炎症性障害、または感染性疾患の治療または予防のため、当該技術に既知の他の治療剤との組み合わせにより有利に利用され得る。ある特定の実施形態において、本発明のヘテロ多量体は、例えば、分子と相互作用するエフェクター細胞の数を増加するため、および免疫反応を増大するために役立つモノクローナルもしくはキメラ抗体、リンホカイン、または造血成長因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、およびＩＬ−７）と組み合わせて使用され得る。本発明のヘテロ多量体は、また、例えば抗癌剤、抗炎症剤、または抗ウイルス剤のような疾患、障害、または感染の治療に使用される１つ以上の薬剤と組み合わせて有利に利用され得る。
【０２４０】
したがって、本発明は、本発明の１つ以上のヘテロ多量体を投与することによって、癌および関連状態に関する１つ以上の症状を予防、治療、または改善する方法を提供する。任意の作用機構に束縛されることを意図しないが、匹敵する分子より大きな親和性でＦｃγＲＩＩＩＡおよび／もしくはＦｃγＲＩＩＡに結合し、匹敵する分子より小さな親和性でＦｃγＲＩＩＢに更に結合する、本発明のヘテロ多量体、ならびに／または当該ヘテロ多量体は、増強されたエフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、食菌作用、オプソニン化などを有し、癌細胞の選択的標的化および効率的な破壊をもたらす。
【０２４１】
本発明は、本発明の１つ以上のヘテロ多量体を、現行の標準的および実験的な化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法、または外科的手術が含まれるが、これらに限定されない癌の治療または予防のため、当業者に既知の他の療法と組み合わせて投与することを更に含む。幾つかの実施形態において、本発明の分子は、癌の治療および／または予防のため、治療または予防有効量の当業者に既知の１つ以上の抗癌剤、治療抗体、または他の薬剤と組み合わせて投与され得る。本発明のヘテロ多量体と組み合わせて使用され得る投与レジメンおよび療法の例は、当該技術において良く知られており、他において詳細に記載されている（例えば、ＰＣＴ公開公報第０２／０７０００７号および同第０３／０７５９５７号を参照すること）。
【０２４２】
本発明の方法および組成物により治療または予防され得る癌および関連障害には、以下が含まれるが、これらに限定されない。白血病  、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨および結合組織肉腫、脳腫瘍、乳癌、副腎癌、甲状腺癌、膵癌、下垂体癌、眼癌、膣癌、外陰癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、肺癌、精巣癌、前立腺癌、陰茎癌、口腔癌、唾液腺癌咽頭癌、皮膚癌、腎癌、膀胱癌  （そのような疾患の概説には、  Ｆｉｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ａｎｄ  Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｉｎｆｏｒｍｅｄ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ａｎｄ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ，Ｖｉｋｉｎｇ  Ｐｅｎｇｕｉｎ，Ｐｅｎｇｕｉｎ  Ｂｏｏｋｓ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａを参照すること）。
【０２４３】
１つの実施形態において、ヘテロ多量体が、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ１、または突然変異体ＥＧＦＲ変種ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）発現細胞に結合する単一ドメイン抗原結合構築物を含む場合、ヘテロ多量体は、ＥＧＦＲ１を過剰発現する癌、またはＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合による治療の抵抗性がある癌細胞の治療に使用され得る。
【０２４４】
本発明は、抗体が本発明の変種ＣＨ３ドメインを組み込むＦｃ領域を含むように、癌および関連障害の治療および／または予防のため、当該技術に既知の任意の抗体を操作することを更に考慮する。
【０２４５】
ある特定の実施形態において、変種Ｆｃヘテロ二量体を含む本発明の分子（例えば、抗体は、本発明の当該分子の存在下で原発性腫瘍の増殖または転移と比べて、原発性腫瘍の増殖または癌性細胞の転移を少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、または少なくとも１０％阻害または低減する。
【０２４６】
本発明は、対象において炎症性障害に関連する１つ以上の症状を予防、治療、または管理するための、本発明の１つ以上のヘテロ多量体の使用を包含する。任意の作用機構に束縛されることを意図しないが、ＦｃγＲＩＩＢへの増強された親和性を有するヘテロ多量体は、活性化受容体の減衰、したがって免疫応答の減衰をもたらし、自己免疫性障害を治療および／または予防するのに治療効力を有する。更に、炎症性障害に関連する、変種Ｆｃヘテロ二量体を含む二重特異性抗体のような１つを超える標的に結合する抗体は、一価の治療よりも相乗的な効果をもたらし得る。
【０２４７】
本発明は、本発明のヘテロ多量体を、治療または予防有効量の１つ以上の抗炎症剤と組み合わせて投与することを更に包含する。本発明は、自己免疫性疾患に関連する１つ以上の症状を予防、治療、または関する方法であって、当該対象に、本発明のヘテロ多量体を治療または予防有効量の１つ以上の免疫調節剤と組み合わせて投与することを更に含む方法も、提供する。本発明のヘテロ多量体を投与することにより治療され得る自己免疫性障害の例には、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫性疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡニューロパチー、若年性関節、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合型結合組織疾患、多発性硬化症、１型または免疫仲介性真性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフ・マン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、疱疹状皮膚炎血管炎のような血管炎、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症が含まれるが、これらに限定されない。炎症性障害の例には、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性障害、敗血症性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、ならびに慢性ウイルスおよび細菌感染によりもたらされる慢性炎症が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの自己免疫性障害は炎症状態と関連し、したがって、自己免疫性障害と炎症性障害と考慮されるものには重複がある。したがって、幾つかの自己免疫性障害は、炎症性障害としても特徴決定され得る。本発明の方法により予防、治療、または管理されうる炎症性障害の例には、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性障害、敗血症性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、ならびに慢性ウイルスおよび細菌感染によりもたらされる慢性炎症が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４８】
本発明のヘテロ多量体は、炎症性障害を有する動物、特にヒトにより経験される炎症を低減するためにも使用され得る。ある特定の実施形態において、本発明のＦｃは、当該分子が投与されない動物における炎症と比べて、動物における炎症を少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、少なくとも１０％低減する。
【０２４９】
本発明は、抗体が本発明のＦｃ領域を含むように、自己免疫性疾患または炎症性疾患の治療および／または予防のため、当該技術に既知の任意の抗体を操作することを更に考慮する。
【０２５０】
本発明は、対象において感染性疾患を治療または予防する方法であって、本発明の治療または予防有効量の１つ以上のヘテロ多量体を投与することを含む方法も包含する。本発明の多量体により治療または予防され得る感染性疾患は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、およびウイルスが含まれるが、これらに限定されない感染性病原体により引き起こされる。
【０２５１】
本発明のヘテロ多量体を本発明の方法と一緒に使用して治療または予防され得るウイルス疾患には、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、フンタウイルス、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘、エプスタイン・バーウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、およびウイルス性髄膜、脳炎、デング熱、または天然痘のようなウイルス疾患の病原体より引き起こされるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０２５２】
本発明のヘテロ多量体を本発明の方法と一緒に使用して治療または予防され得る、細菌により引き起こされる細菌性疾患には、マイコバクテリア・リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、Ｓ．ニューモニア、ボレリア・ブルグドルフェリ（ライム病）、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、破傷風、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、マイコバクテリア、破傷風、百日咳、コレラ、ペスト、ジフテリア、クラミジア、Ｓ．アウレウス、およびレジオネラが含まれるが、これらに限定されない。本発明のヘテロ多量体を本発明の方法と一緒に使用して治療または予防され得る、原虫により引き起こされる原虫病には、リーシュマニア、コクジジオア（ｋｏｋｚｉｄｉｏａ）、トリパノソーマ、またはマラリアが含まれるが、これらに限定されない。本発明のヘテロ多量体を本発明の方法と一緒に使用して治療または予防され得る、寄生虫により引き起こされる寄生虫病には、クラミジアおよびリケッチアが含まれるが、これらに限定されない。
【０２５３】
幾つかの実施形態において、本発明のヘテロ多量体は、感染性疾患治療および／または予防のため、治療または予防有効量の当業者に既知の１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて投与され得る。本発明は、感染性疾患の治療およびまたは予防のため、抗生物質、抗真菌剤、および抗ウイルス剤が含まれるが、これらに限定されない当該技術に既知の他の分子と組み合わせた本発明の分子の使用を考慮する。
【０２５４】
本発明は、本発明のヘテロ多量体（例えば、抗体、ポリペプチド）を含む方法および薬学的組成物を提供する。本発明は、本発明の有効量の１つ以上のヘテロ多量体、または本発明の１つ以上のヘテロ多量体を含む薬学的組成物を対象に投与することによる、疾患、状態、または感染に関連する１つ以上の症状を治療、予防、および改善する方法も提供する。１つの態様において、ヘテロ多量体は実質的に精製されている（すなわち、その効果を制限する、または望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まず、これにはホモ二量体および他の細胞材料が含まれる）。ある特定の実施形態において、対象は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）、ならびに霊長類（例えば、カニクイザルおよびヒト）を含む哺乳動物のような動物である。ある特定の実施形態において、対象はヒトである。なお別のある特定の実施形態において、本発明の抗体は、対象として同じ種からのものである。
【０２５５】
組成物の投与経路は、治療される状態に応じて決まる。例えば、静脈内注射は、リンパ性癌または転移した腫瘍のような全身性障害の治療に好ましいことがある。投与される組成物の投与量は、過剰な実験を用いることなく、標準的な用量応答研究と併せて当業者により決定され得る。これらの決定を行うために考慮される関連する環境には、治療される状態、投与される組成物の選択肢、個別の患者の年齢、体重、および応答、ならびに患者の症状の重篤度が含まれる。状態に応じて、組成物は、患者に経口、非経口、鼻腔内、膣内、直腸内、舌側、舌下、頬側、頬内、および／または経皮投与され得る。
【０２５６】
したがって、経口、舌側、舌下、頬側、および頬内投与のために設計された組成物は、過剰な実験を行うことなく、当該技術に周知の方法により、例えば不活性希釈剤または食用担体と共に作製され得る。組成物は、ゼラチンカプセルに封入され得る、または錠剤に圧縮され得る。経口治療投与の目的において、本発明の薬学的組成物には賦形剤が組み込まれ得、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハ剤、チューインガム剤などの剤形で使用され得る。
【０２５７】
錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、結合剤、受給体、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、および／または風味剤も含有し得る。結合剤の幾つかの例には、微晶質セルロース、トラガカントガム、およびゼラチンが含まれる。賦形剤の例には、デンプンおよびラクトースが含まれる。崩壊剤の幾つかの例には、アルギン酸、トウモロコシデンプンなどが含まれる。潤滑剤の例には、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸カリウムが含まれる。滑剤の例は、コロイド二酸化ケイ素である。甘味剤の幾つかの例には、スクロース、サッカリンなどが含まれる。風味剤の例には、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ風味などが含まれる。これらの多様な組成物の調製に使用される材料は、薬学的に純粋であり、使用される量で非毒性であるべきである。
【０２５８】
本発明の薬学的組成物は、例えば静脈内、筋肉内、鞘内、および／または皮下注射のように非経口投与され得る。非経口投与は、本発明の組成物を液剤または懸濁剤に組み込むことにより達成され得る。そのような液剤または懸濁剤は、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、および／または他の合成溶剤のような滅菌希釈剤も含み得る。非経口製剤は、例えばベンジルアルコールおよび／またはメチルパラベンのような抗菌剤、例えばアスコルビン酸および／または重亜硫酸ナトリウムのような酸化防止剤、ならびにＥＤＴＡのようなキレート剤も含み得る。酢酸塩、クエン酸塩、およびリン酸塩のような緩衝液、ならびに塩化ナトリウムおよびデキストロースのような等張性調整用の薬剤も、加えることができる。非経口調合剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、および／または多回用量バイアルに封入され得る。直腸内投与は、組成物を直腸および／または大腸に投与することを含む。このことは、坐剤および／または浣腸の使用により達成され得る。坐剤製剤は、当該技術に既知の方法により作製され得る。経皮投与には、皮膚を介した組成物の経皮吸収が含まれる。経皮製剤には、パッチ剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、膏薬が含まれる。本発明の組成物は、患者に経鼻投与され得る。本明細書で使用されるとき、経鼻的投与または経鼻投与は、組成物を患者の鼻道および／または鼻腔の粘膜に投与することを含む。
【０２５９】
本発明の薬学的組成物は、疾患、障害、または感染に関連する１つ以上の症状を予防、治療、または改善するため、本発明の方法に従って使用され得る。本発明の組成物は、滅菌であり、対象への投与に適した剤形であることが考慮される。
【０２６０】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、内毒素および／または関連する発熱性物質を実質的に含まない発熱物質無含有製剤である。内毒素には、微生物内に留まり、微生物が分解または死亡したときに放出される毒素が含まれる。発熱性物質には、細菌および他の微生物の外膜からの発熱誘発性で熱安定性の物質（糖タンパク質）も含まれる。これらの物質は、両方とも、ヒトに投与されると発熱、低血圧、およびショックを引き起こし得る。潜在的な有害作用に起因して、低量であっても、内毒素を静脈内投与用薬学的薬剤溶液から除去することが有益である。食品医薬局（「ＦＤＡ」）は、静脈用薬剤用途では１時間に体重１キログラムあたり１用量毎に５内毒素単位（ＥＵ）の上限を設定している（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ  ２６（１）：２２３（２０００））。治療タンパク質が、モノクローナル抗体の場合のように、体重１キログラムあたり数百または数千ミリグラムの量で投与されるとき、微量の内毒素であっても除去することが有益である。ある特定の実施形態において、組成物における内毒素および発熱物質のレベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満、または５ＥＵ／ｍｇ未満、または１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。
【０２６１】
本発明は、疾患、障害、または感染に関連する１つ以上の症状を予防、治療、または改善する方法であって、（ａ）１つ以上のヘテロ多量体を含む予防または治療有効量の組成物の用量を、それを必要とする対象に投与すること、および（ｂ）当該ヘテロ多量体の１つ以上の続く用量を投与して、ヘテロ多量体の血漿レベルを、抗原に連続的に結合する所望のレベル（例えば、約０．１〜約１００μｇ／ｍｌ）に維持することを含む当該方法を提供する。ある特定の実施形態において、ヘテロ多量体の血漿濃度は、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌ、または５０μｇ／ｍｌに維持される。ある特定の実施形態において、投与されるヘテロ多量体の当該有効量は、１用量あたり少なくとも１ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。別のある特定の実施形態において、投与されるヘテロ多量体の当該有効量は、１用量あたり少なくとも４ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇである。なお別のある特定の実施形態において、投与されるヘテロ多量体の当該有効量は、１用量あたり５０ｍｇ〜２５０ｍｇである。更に別のある特定の実施形態において、投与されるＦｃ変種の当該有効量は、１用量あたり１００ｍｇ〜２００ｍｇである。
【０２６２】
本発明は、ヘテロ多量体が、ヘテロ多量体および／または変種融合タンパク質以外の治療（例えば、予防または治療剤）と組み合わせて使用される、疾患、障害、または感染に関連する１つ以上の症状を予防、治療、または改善するプロトコールも包含する。本発明は、本発明のヘテロ多量体が、現行の標準的および実験的化学療法を含む他の癌療法を強化し、他の癌療法と相乗作用し、他の癌療法の効果を増強し、他の癌療法の許容性を改善し、および／または他の癌療法により引き起こされる副作用を低減するという認識に部分的に基づいている。本発明の併用治療は、追加の効力、追加の治療効果、または相乗効果を有する。本発明の併用治療は、疾患、障害、または感染に関連する１つ以上の症状を予防、治療、もしくは改善するヘテロ多量体と一緒に利用した療法（例えば、予防または治療剤）の低い投与量を可能にして、ならびに／あるいは疾患、障害、または感染を有する対象へのそのような予防または治療剤の低い投与頻度を可能にして、当該対象の生活の質を改善する、および／または予防もしくは治療効果を達成する。更に、本発明の併用治療は、現行の単一薬剤療法および／または現存する併用療法に関連する不要または有害な副作用を低減または開始し、次には治療プロトコールへの患者の服薬順守を改善する。本発明のヘテロ多量体と組み合わせて利用され得る多数の分子は、当該技術において良く知られている。例えば、ＰＣＴ国際公開公報第０２／０７０００７号、同第０３／０７５９５７号、および米国特許公開第２００５／０６４５１４号を参照すること。
【０２６３】
産業上の使用
ヘテロ多量体の単一ドメイン抗原結合構築物およびヘテロ二量体Ｆｃ領域の両方の生物物理学的安定性の観点から、本明細書に記載されているヘテロ多量体は、単一ドメイン抗原結合構築物フラグメント（例えば、単離ＶｈＨ）それ自体が有用性を有する産業上の用途にも使用され得ることが考慮される（ｄｅ  Ｍａｒｃｏ（２０１１）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  １０：４４を参照すること）。したがって、１つの実施形態において、本発明のヘテロ多量体は、毒素を同定および解毒するため、免疫検出、精製、およびバイオ分離の試薬として、またはタンパク質凝集および活性調節を研究するツールとして使用されうる。
【０２６４】
キット
本発明は、疾患、障害、または感染に関連する１つ以上の症状をモニター、診断、予防、治療、または改善する使用のため、検出剤、治療剤、または薬剤と複合体化した抗原に特異的に結合する、ＦｃγＲｓおよび／またはＣ１ｑへの変更された結合親和性、ならびに変更されたＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を有する１つ以上のヘテロ多量体を１つ以上の容器中に含むキットを提供する。
【実施例】
【０２６５】
下記の実施例は、本発明の実施を例示するために提示される。これらは、本発明の全範囲を限定または定義することを意図しない。
【０２６６】
実施例１：  ヘテロ二量体Ｆｃドメインを有する二価単一特異性抗体の生成。
抗体重鎖をコードする遺伝子は、ヒト／哺乳類発現に最適化されたコドンを使用する遺伝子合成を介して構築した。配列は、既知のＨｅｒ２／ｎｅｕ結合Ａｂから生成し（Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ  Ｐ１８５  Ｈｅｒ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８９，４２８５）、ＦｃはＩｇＧ１アイソタイプ（配列番号１）であった。最終遺伝子産物を、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（ＮＲＣ−ＢＲＩ，Ｃａｎａｄａ）にサブクローンした（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．，Ｐｅｒｒｅｔ，Ｓ．＆  Ｋａｍｅｎ，Ａ．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｇｒｏｗｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１  ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０，Ｅ９（２００２））。ＣＨ３ドメインにおける突然変異は、ｐＴＴ５テンプレートベクターの部位特異的突然変異誘発を介して導入した。表１および表６、ならびに実施された変種ＣＨ３ドメイン突然変異のリストは表７を参照すること。
【０２６７】
ヘテロ二量体の形成を推定するため、およびホモ二量体とヘテロ二量体の比を決定するために、２つのヘテロ二量体重鎖を、異なるサイズのＣ末端延長（具体的には、Ｃ末端Ｈｉｓタグを有する鎖Ａ、およびＣ末端ｍＲＦＰ＋ＳｔｒｅｐタグＩＩを有する鎖Ｂ）により設計した。この分子量の差は、図２５Ａに例示されているように、非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてホモ二量体とヘテロ二量体の差異化を可能にする。
【０２６８】
ＨＥＫ２９３細胞を水性１ｍｇ／ｍＬの２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、２．５：１のＰＥＩ：ＤＮＡ比で対数増殖期（１．５〜２百万細胞／ｍＬ）に形質移入した。（Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．５５（１）：４４−５１（２０１１））。ヘテロ二量体を形成する最適濃度範囲を決定するため、ＤＮＡを、２つの重鎖の３つの別々の比で形質移入した。例えば、これは、５％のＧＦＰ、４５％のサケ精子ＤＮＡ、２５％の軽鎖、および２５％の全重鎖から構成される、２ｍｌの培養物量および形質移入ＤＮＡにおいて実施され、ここで、重鎖Ａプラスミド（Ｃ末端Ｈｉｓタグを有する）および重鎖Ｂプラスミド（Ｃ末端ＳｔｒｅｐタグＩＩ＋ＲＦＰを有する）６５％／５５％／３５％または１０％／２０％／４０％により）を３つの異なる相対比（鎖＿Ａ（Ｈｉｓ）／鎖＿Ｂ（ｍＲＦＰ））の１０％／６５％、２０％／５５％、４０％／３５％で試料採取した（ＷＴ＿Ｈｉｓ／ＷＴ＿ｍＲＦＰのヘテロ二量体の見掛け発現比の１：１は、ＤＮＡ比の２０％／５５％に近いと決定された）。Ｆ１７血清無含有培地得（Ｇｉｂｃｏ）に形質移入した４〜４８時間後、ＴＮ１ペプトンを最終濃度０．５％で加える。発現した抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、最適なヘテロ二量体形成に最適な重と軽の鎖の比を決定した（図２５ＢおよびＣを参照すること）。
【０２６９】
選択されたＤＮＡ比、例えば、５０％の軽鎖プラスミド、２５％の重鎖Ａプラスミド、２５％の重鎖ＢのＡＺ３３およびＡＺ３４、５％のＧＦＰ、ならびに４５％のサケ精子ＤＮＡを使用して、上記に記載されたように、１５０ｍＬの細胞培養物に形質移入した。形質移入された細胞を、５〜６日後に培養培地から採取し、４０００ｒｐｍで遠心分離して収集し、０．４５μｍフィルターの使用により清澄化した。純度および融解温度の決定を含む更なるアッセイのために生成された、ＣＨ３突然変異を有するそれぞれの抗体のための規模拡大形質移入アッセイに使用される軽および重鎖ＡおよびＢプラスミドの率のリストは、下記の表２を参照すること。
【表７】
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【０２７０】
実施例２：  ヘテロ二量体Ｆｃドメインを有する二価単一特異性抗体の精製。
清澄化された培養培地をＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡカラムに装填し、１０カラム容量のＰＢＳ緩衝液によりｐＨ７．２で洗浄した。抗体を１０カラム容量のクエン酸緩衝液によりｐＨ３．６で溶出し、プールした画分は、ＴＲＩＳによりｐＨ１１で中和された抗体を含有した。タンパク質をＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ  １０ＤＧカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の使用により最終的に脱塩した。重鎖ＢのＣ末端ｍＲＦＰタグは、抗体をＰＢＳにおいてエンテロキナーゼ（ＮＥＢ）と１：１０，０００の比により２５℃でインキュベートすることにより除去した。抗体をゲル濾過により混合物から精製した。ゲル濾過では、３．５ｍｇの抗体混合物を１．５ｍＬに濃縮し、流速１ｍＬ／分によりＡＫＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＦＰＬＣを介してＳｅｐｈａｄｅｘ  ２００  ＨｉＬｏａｄ  １６／６００  ２００ｐｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に装填した。ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を流速１ｍＬ／分で使用した。精製抗体に対応する画分を収集し、約１ｍｇ／ｍＬに濃縮し、−８０℃で保存した。
【０２７１】
ホモ二量体と比較したヘテロ二量体の形成を、非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析の使用によりアッセイした。プロテインＡ精製抗体に４〜１２％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、非還元的ゲルを実施して、エンテロキナーゼ（ＥＫ）処理前に形成されたヘテロ二量体の率を決定した（図２６を参照すること）。質量分析では、全てのＴｒａｐ  ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）実験を、Ｗａｔｅｒｓ  Ｑ−ＴＯＦ２質量分析機が接続されているＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムにより実施した。５μｇのゲル濾過精製抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭｉｃｒｏＴｒａｐ（１．０×８．０ｍｍ）に注入し、１％のアセトニトリルにより８分間、１〜２０％のアセトニル／０．１％のギ酸の勾配により２分間洗浄し、次に２０〜６０％のアセトニル／０．１％のギ酸の勾配により２０分間溶出した。溶出物（３０〜５０μＬ／分）を、毎秒得たスペクトル（ｍ／ｚ８００〜４，０００）で分光計に導いた。（図２８を参照すること）それぞれ８５％を超えるヘテロ二量体形成を有したＡＺ１２およびＡＺ１４を除いて、９０％を超えるヘテロ二量体を有する変種を、更なる分析により選択した。
【０２７２】
実施例３：  示差走査熱量測定（ＤＳＣ）の使用によるヘテロ二量体Ｆｃを有する二価単一特異性抗体の安定性の決定。
全てのＤＳＣ実験は、ＧＥ  ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ器機を使用して実施した。タンパク質は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に緩衝液を交換し、０．４〜０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、０．１３７ｍＬを試料セルに装填し、１℃／分の走査速度により２０〜１００℃で測定した。データは、ＰＢＳ緩衝液バックグラウンドを差し引いて、Ｏｒｉｇｉｎソフトウエア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の使用により分析した（図２７を参照すること）。試験した変種および決定した融解温度について、表３を参照すること。７０℃以上の融解温度を有する変種、およびそれぞれの変種に特定のＴｍのリストは、表４を参照すること。
【表８】
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【表９−１】
0006351572.tif 000017
【０２７３】
実施例４：表面プラズモン共鳴を用いたＦＣガンマＲ結合の評価
全ての結合実験は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４により２５℃でＢｉｏＲａｄ  ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６器機を使用して実施した。組み換えＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ｐ１８５，ＥｒｂＢ−２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．））は、およそ３０００共鳴単位（ＲＵ）が停止した残りの活性基により固定化されるまで、１０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）中４．０μｇ／ｍＬを２５μＬ／分で注入することにより、活性化ＧＬＭセンサーチップに捕捉させた。４０μｇ／ｍＬの、変種ＣＨ３ドメインを含む精製された抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体は、２５μＬ／分により２４０秒間注入し（およそ５００ＲＵをもたらした）、続いて緩衝液注入により安定したベースラインを確立したとき、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質を結合することによりセンサーチップに間接的に捕捉された。ＦｃガンマＲ（ＣＤ１６ａ（ｆアロタイプ）およびＣＤ３２ｂ）濃度（６０００、２０００、６６７、２２２、および７４．０ｎＭ）を、１８０秒の解離相を伴って６０μＬ／分を１２０秒間注入して、一連の結合センサグラムを得た。得られたＫＤ値は、報告された値を３つの個別の実施からの平均として用いる平衡当て嵌めを使用した結合等温線により決定した。比較は、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと行い、結合は、野生型のｋＤと変種のｋＤの比として表す（表５を参照すること）。
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【０２７４】
実施例５：Ｆｃ＿ＣＨ３操作を使用するヘテロ多量体−足場１（１ａおよび１ｂ）の合理的な設計、ならびにＡＺ１７−６２およびＡＺ１３３−ＡＺ２４３８の開発
初期ＡＺ８の安定性および純度を改善するため、上記に記載された構造および計算戦略を用いた。（図２４を参照すること）例えば、ＡＺ８の徹底的な構造機能分析は、野生型ヒトＩｇＧ１と比較して、ＡＺ８の導入された突然変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｖ３９７Ｓ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｋ３９２Ｖ＿Ｔ３９４Ｗのそれぞれについて詳細な理解を提供し、重要なコアヘテロ二量体突然変異が、Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗであり、一方、Ｖ３９７Ｓ、Ｋ３９２Ｖがヘテロ二量体形成に関連性のないことを示した。コア突然変異（Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ）は、本明細書において「足場１」突然変異と呼ばれる。分析は、野生型（ＷＴ）ホモ二量体形成に関して損失した重要な界面ホットスポットが、ＷＴ−Ｆ４０５−Ｋ４０９、Ｙ４０７−Ｔ３６６の相互作用、ならびにＹ４０７−Ｙ４０７および−Ｆ４０５の詰め込みであることを、更に明らかにした（図２９を参照すること）。このことは、ループ領域Ｄ３９９−Ｓ４００−Ｄ４０１（図３０を参照すること）およびＫ３７０での会合βシートにおいて大きな立体配座の差を示す、詰め込み、空洞、およびＭＤ分析を反映した。これは、鎖間相互作用Ｋ４０９−Ｄ３９９の損失（図３０を参照すること）、およびＥ３５７への強力なＫ３７０水素結合の弱まりをもたらした（Ｋ３７０は、もはやＳ３６４およびＥ３５７と直接接触していないが、溶媒に完全に曝露されている）。ＷＴ  ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインにおいて、これらの領域は、縁で界面と連結し、コア相互作用を嵩高溶媒との競合から保護し、好ましい疎水性のファンデルワールス相互作用の動力学的な発生を増加する。結果は、ＷＴと比較してＡＺ８の低い埋没表面、および疎水性コアの高い溶媒利用能であった。このことは、ＷＴの安定性と比較してＡＺ８の低い安定性における最も重要な要因は、ａ）ＷＴ−Ｆ４０５−Ｋ４０９の相互作用およびＦ４０５の詰め込みの損失、ならびにｂ）Ｙ４０７−Ｙ４０７およびＹ４０７−Ｔ３６６の強力な詰め込み相互作用の損失であったことを示した。図２９を参照すること
【０２７５】
したがって、本発明者たちは、ＷＴと比較して低いＡＺ８の安定性の原因である主要な残基／配列モチーフを同定した。ＡＺ８の安定性およびヘテロ二量体特異性を改善するため、続く積極的設計操作努力は、したがって、より「閉鎖した」ＷＴ様の立体配座における３９９−４０１の位置でループ立体配座を安定化すること（図３０を参照すること）、ならびにＴ３６６およびＬ３６８の位置における疎水性コアの詰め込みの全体的な僅かな減少（ゆるまり）を補うことに特に焦点を合わせた（図２９を参照すること）。
【０２７６】
３９９−４０１の位置のループ立体配座の安定化を達成するため、記載されている計算手法を使用して、異なる標的設計構想を評価した。具体的には、３つの異なる独立したヘテロ多量体ＡＺ８の選択肢を分析して、安定性を改善するため、同定された主要な領域を最適化した。第１には、Ｋ４０９およびＦ４０５Ａの位置に近い空洞を、疎水性コアを保護すること、および３９９−４００のループ立体配座を安定化することの両方のために、より良好な疎水性詰め込みについて評価した（図３０を参照すること）。これらには、Ｆ４０５およびＫ３９２の位置における追加の点突然変異が含まれるが、これに限定されない。第２には、３９９−４００のループ立体配座を安定化するため、および疎水性コアを保護するために、３９９−４０９の位置の静電相互作用を改善する選択肢を評価した。これらには、Ｔ４１１およびＳ４００の位置における追加の点突然変異が含まれるが、これに限定されない。第３には、Ｔ３６６、Ｔ３９４Ｗ、およびＬ３６８の位置のコア詰め込みにおける空洞を、コア疎水性詰め込みを改善するために評価した（図２９を参照すること）。これらには、Ｔ３６６およびＬ３６８の位置における追加の点突然変異が含まれるが、これに限定されない。異なる独立した積極的設計構想を、コンピューターにより試験し、計算ツールを使用した最高ランクの変種（ＡＺ１７−ＡＺ６２）を、実施例１〜４の記載されたように、発現および安定性について実験的に確認した。７０℃以上の融解温度を有するこの設計段階でのヘテロ多量体のリストは、表４を参照すること。
【０２７７】
ヘテロ多量体ＡＺ３３は、足場１が修飾されて、安定性および純度を改善する足場１ａ突然変異をもたらす、ヘテロ多量体の開発の一例である。このヘテロ多量体は、疎水性コアを保護すること、および３９９−４００のループ立体配座を安定化することの両方のために、３９２−３９４−４０９および３６６の位置における疎水性詰め込みを改善する目的でＡＺ８に基づいて設計された。このヘテロ多量体ＡＺ３３ヘテロ二量体は、ＡＺ８、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３６６Ｉのコア突然変異と異なる２つの追加の点突然変異を有する。突然変異Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖは、本明細書において「足場１ａ」突然変異と呼ばれる。突然変異Ｋ３９２Ｍは、疎水性コアを保護し、３９９−４００のループ立体配座を安定化するために、Ｋ４０９およびＦ４０５Ａの位置に近い空洞における詰め込みを改善するように設計された（図３１を参照すること）。Ｔ３６６Ｉは、コア疎水性詰め込みを改善するため、およびＴ３９４Ｗ鎖のホモ二量体の形成を排除するために設計された（図２９を参照すること）。ＡＺ３３の実験データは、初期の消極的設計ヘテロ多量体ＡＺ８（Ｔｍ６８℃）よりも有意に改善された安定性を示し、ＡＺ３３は、７４℃のＴｍおよび＞９８％のヘテロ二量体含有量を有する。（図２５Ｃを参照すること）
【０２７８】
ヘテロ多量体ヘテロ二量体の第３の設計段階での足場１突然変異の使用によるヘテロ多量体の開発
ＡＺ３３は、初期の出発変種ＡＺ８よりも安定性および特異性（または純度）の有意な改善を提供するが、本発明者たちの分析は、ヘテロ二量体の安定性への更なる改善が、ＡＺ３３の実験データおよび上記に記載された設計方法を使用した更なるアミノ酸修飾により実施され得ることを示す。異なる設計構想を、発現および安定性について独立して試験したが、独立した設計構想は、移転可能であり、最も成功したヘテロ二量体は、異なる設計の組み合わせを含有する。具体的には、ＡＺ８の詰め込みの最適化において、Ｋ４０９−Ｆ４０５Ａ−Ｋ３９２に近い空洞における突然変異を、Ｌ３６６Ｔ−Ｌ３６８の残基におけるコア詰め込みを最適化する突然変異から独立して評価した。これらの２つの領域３６６−３６８および４０９−４０５−３９２は、互いに遠位であり、独立していると考慮される。例えばヘテロ多量体ＡＺ３３は、４０９−４０５−３９２における詰め込みが最適化されているが、３６６−３６８では最適化されておらず、これは、これらの最適化突然変異が別々に評価されているからである。３６６−３６８突然変異の比較は、Ｔ３６６Ｌが、Ｔ３６６より、また、ヘテロ多量体ＡＺ３３の開発に使用された点突然変異であるＴ３６６Ｉより改善された安定性を有することを示唆している。したがって、本発明の実験データは、例えば、Ｔ３６６Ｉの代わりにＴ３６６Ｌの導入によるＡＺ３３の更なる最適化を直ちに示唆している。したがって、ＣＨ３ドメインのアミノ酸修飾Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖは、本明細書において「足場１ｂ」突然変異と呼ばれる。
【０２７９】
類似の方法により、完全な実験データを分析して、現行のＦｃ変種ヘテロ二量体ＡＺ３３を更に改善するために使用できる点突然変異を同定した。これらの同定された突然変異を、上記に記載された計算手法により分析し、ランク付けして、表６に示されているように、ＡＺ３３に基づいた追加のＦｃ変種ヘテロ二量体のリストを生じた。
【０２８０】
実施例６：Ｆｃ＿ＣＨ３操作を使用するヘテロ多量体−足場２（ａおよびｂ）の合理的な設計、ならびにＡＺ６３−１０１およびＡＺ２１９９−ＡＺ２５２４の開発
初期の消極的設計段階のヘテロ多量体ＡＺ１５を安定性および純度について改善するため、上記に記載された構造および計算戦略を用いた（図２４を参照すること）。例えば、ヘテロ多量体ＡＺ１５の徹底的な構造機能分析は、野生型（ＷＴ）ヒトＩｇＧ１と比較して、ＡＺ１５の導入された突然変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｅ３５７Ｌ＿Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ＿Ｔ４１１Ｎのそれぞれについて詳細な理解を提供し、重要なコアヘテロ二量体突然変異が、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆであり、一方、Ｅ３５７Ｌ、Ｔ４１１Ｎが、ヘテロ二量体の形成および安定性に直接的な関連性のないことを示した。コア突然変異（Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ）は、本明細書において「足場２」突然変異と呼ばれる。分析は、野生型（ＷＴ）ホモ二量体形成に関して損失した重要な界面ホットスポットが、塩架橋Ｄ３９９−Ｋ４０９、水素結合Ｙ４０７−Ｔ３６６、およびＹ４０７−Ｙ４０７の詰め込みであることを、更に明らかにした。下記に提供される本発明者たちの詳細な分析は、独自のヘテロ多量体ＡＺ１５の安定性、ならびに改善された安定性を有するヘテロ多量体を達成するために行われた位置およびアミノ酸修飾をどのように改善したかを記載する。
【０２８１】
足場２を使用したヘテロ多量体の開発および足場２ａ突然変異の更なる開発
本発明者たちのコンピューター分析は、ヘテロ多量体ＡＺ１５の突然変異Ｋ４０９Ｆ＿Ｔ３６６Ａ＿Ｙ４０７Ａの非最適化詰め込み、ＷＴ−Ｙ４０７−Ｙ４０７相互作用の損失に起因する疎水性コアの全体的に減少した詰め込みを示した。続く操作段階での積極的設計努力は、初期Ｆｃ変種ＡＺ１５におけるこれらの詰め込み欠陥を補うために点突然変異に焦点を合わせた。標的残基には、Ｔ３６６、Ｌ３５１、およびＹ４０７の位置が含まれた。これらの異なる組み合わせを、コンピューターにより試験し、計算ツールを使用した最高ランクの変種（ＡＺ６３−ＡＺ７０）を、実施例１〜４の記載されたように、発現および安定性について実験的に確認した。
【０２８２】
Ｆｃ変種ＡＺ７０は、足場２が修飾されて、安定性および純度を改善する足場２ａ突然変異をもたらす、ヘテロ多量体の開発の一例である。このヘテロ多量体は、上記に記載されているように、疎水性コアにおけるより良好な詰め込みを達成する目的でＡＺ１５に基づいて設計された。ヘテロ多量体ＡＺ７０は、Ｔ３６６が、Ｔ３６６Ａの代わりにＴ３６６Ｖに突然変異されたことを除いて、上記に記載されたものと同じ足場２コア突然変異（Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ）を有する（図３３）。Ｌ３５１Ｙ突然変異は、３６６Ａ＿４０９Ｆ／４０７Ａ変種の融解温度を７１．５℃から７４℃に改善し、３６６Ａから３６６Ｖへの追加の変化は、Ｔｍを７５．５℃に改善する。（それぞれ７１．５℃、７４℃、および７５．５℃のＴｍを有する、表４のＡＺ６３、ＡＺ６４、およびＡＺ７０を参照すること）コア突然変異（Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ）は、本明細書において「足場２ａ」突然変異と呼ばれる。Ｆｃ変種ＡＺ７０の実験データは、初期の消極的設計Ｆｃ変種ＡＺ１５（Ｔｍ７１℃）よりも有意に改善された安定性を示し、ＡＺ７０は、７５．５℃のＴｍおよび＞９０％のヘテロ二量体含有量を有する（図３３および２７）。
【０２８３】
足場２を使用したヘテロ多量体の開発および足場２ｂ突然変異の更なる開発
分子動力学シミュレーション（ＭＤ）および詰め込み分析は、ループ３９９−４００の好ましいより「開放された」立体配座を示し、これは、ＷＴ塩架橋Ｋ４０９−Ｄ３９９の損失に起因する可能性があった。このことは、不十分なＤ３９９をもたらし、次にはＫ３９２との相互作用を補うので好ましく、ループのより「開放された」立体配座を誘導した。このより「開放された」ループ立体配座は、コアＣＨ３ドメイン界面残基の全体的に減少した詰め込み、および高い溶媒利用能をもたらし、次には有意に不安定化されたヘテロ二量体複合体をもたらす。したがって、標的積極的設計努力の１つは、Ｄ３９９−Ｋ４０９塩架橋およびＫ４０９の詰め込み相互作用の損失を補う追加の点突然変異によって、このループをより「閉鎖された」ＷＴ様立体配座に連結することであった。標的残基には、Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、Ｋ３９２、およびこれらの組み合わせの位置が含まれた。異なる詰め込み、疎水性および静電気積極的操作戦略を、上記の位置に関してコンピューターにより試験し、計算ツールの使用により決定された最高ランクのヘテロ多量体（ＡＺ７１−ＡＺ１０１）を、実施例１〜４に記載されているように、発現および安定性について実験的に確認した。
ヘテロ多量体ＡＺ９４は、足場２が修飾されて、安定性および純度を改善する、追加の点突然変異を伴う足場２ｂをもたらす、Ｆｃ変種の開発の一例である。このＦｃ変種は、上記に記載されたように、ループ３９９−４００をより「閉鎖された」ＷＴ様立体配座に連結し、Ｄ３９９−Ｋ４０９塩架橋の損失を補う目的でＡＺ１５に基づいて設計された。ＦＣ変種ＡＺ９４は、足場２への４つの追加の点突然変異（Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ）を有し、Ｌ３５１Ｙを野生型Ｌ３５１に戻して、このＦＣ変種のコア突然変異として（Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ）を残す。コア突然変異Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆは、本明細書において「足場２ｂ」突然変異と呼ばれる。ＡＺ９４の４つの追加の点突然変異は、Ｋ３９２Ｅ＿Ｔ４１１Ｅ／Ｄ３９９Ｒ＿Ｓ４００Ｒである。突然変異Ｔ４１１Ｅ／Ｄ３９９Ｒは操作されて、追加の塩架橋を形成し、Ｋ４０９／Ｄ３９９相互作用の損失を補った（図３４）。加えて、この塩架橋は、両方の潜在的なホモ二量体において電荷間相互作用を避けることにより、ホモ二量体形成を防止するように設計された。追加の突然変異Ｋ３９２Ｅ／Ｓ４００Ｒは、別の塩架橋を形成し、したがって、３９９＿４００ループをより「閉鎖された」ＷＴ様立体配座に更に連結することが意図された（図３４）。ＡＺ９４の実験データは、初期の消極的設計Ｆｃ変種ＡＺ１５（Ｔｍ７１℃、純度＞９１％）よりも改善された安定性および純度を示し、Ｆｃ変種ＡＺ９４は、７４℃のＴｍおよび＞９５％のヘテロ二量体含有量または純度を有する。
【０２８４】
ヘテロ二量体の第３の設計段階での足場２突然変異の使用によるヘテロ多量体の開発
両方のＦｃ変種ＡＺ７０およびＡＺ９４は、初期の消極的設計Ｆｃ変種ＡＺ１５より安定性および純度に有意な改善をもたらすが、本発明者たちの分析およびＡＺ７０とＡＺ９４の比較は、ＦＣ変種ヘテロ二量体の安定性への更なる改善が更なるアミノ酸修飾により実施され得ることを直接的に示している。例えば、Ｆｃ変種ＡＺ７０およびＡＺ９４は、初期変種ＡＺ１５の２つの別個の非最適化領域を標的にするように設計されており、これは、３９９−４０１の位置のループ立体配座を安定化するために、疎水性コアの詰め込みを改善すること、ならびに追加の塩架橋および水素結合をもたらすコア界面残基の外側に突然変異を起こすことによって実施した。Ｆｃ変種ＡＺ７０およびＡＺ９４の追加の点突然変異は、互いに遠位であり、したがって独立しており、２ａおよび２ｂ突然変異を含む同じ足場２コア突然変異の周辺を設計した他のＦｃ変種に移転され得る。具体的には、ＡＺ７０は、最適化コア突然変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆのみを有するが、追加の塩架橋を有さず、一方、ＡＺ９４は、４つの追加の静電突然変異（Ｋ３９２Ｅ＿Ｔ４１１Ｅ／Ｄ３９９Ｒ＿Ｓ４００Ｒ）を含むが、疎水性コア界面に１つ少ない突然変異（Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ）を有する。これらの足場２ｂ突然変異は、ＡＺ７０よりも安定性が少ないが（例えば、ＡＺ９４と同等のコア突然変異を有し、７２℃のＴｍを有するＡＺ６３を参照すること）、Ｋ３９２Ｅ＿Ｔ４１１Ｅ／Ｄ３９９Ｒ＿Ｓ４００Ｒ突然変異の付加により補われる。本発明の実験安定性および純度データは、疎水性コアを最適化するＡＺ７０の突然変異と、ＡＺ９４の静電突然変異とを組み合わせることによって、Ｆｃ変種を含むヘテロ二量体の安定性および純度を更に改善するはずであることを示す。類似の方法により、足場２Ｆｃ変種（ＡＺ６３−１０１）の完全な実験データを分析して、Ｆｃ変種ヘテロ二量体ＡＺ７０およびＡＺ９４を更に改善することに使用できる点突然変異を同定した。これらの同定された突然変異を、上記に記載された計算手法により更に分析し、ランク付けして、表７に示されているように、ＡＺ７０およびＡＺ９４に基づいた追加のＦｃ変種ヘテロ二量体のリストを生じた。
【０２８５】
実施例７：ＦｃｇＲ結合に対するヘテロ二量体ＣＨ３の作用
ＦｃｇＲによるヘテロ二量体Ｆｃ活性の原型例として、本発明者たちは、ヘテロ二量体Ｆｃ領域Ａ：Ｋ４０９Ｄ＿Ｋ３９２Ｄ／Ｂ：Ｄ３９９Ｋ＿Ｄ３５６Ｋ（対照１（図３５のｈｅｔ  １））およびＡ：Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｂ：Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｗ（対照４（図３５のｈｅｔ  ２））を有する２つの変種抗体を、ＦｃｇＲ結合について実施例４に記載されているＳＰＲアッセイにおいて、Ｈｅｒ２結合Ｆａｂ腕を用いて試験した。図３５に示されているように、本発明者たちは、両方のヘテロ二量体Ｆｃ領域が、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域と同じ相対強度で異なるＦｃガンマ受容体に結合するが、全体的に、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、それぞれのＦｃｇＲに野生型抗体より僅かに良好に結合したことを観察する。このことは、ＦｃのＣＨ３界面における突然変異が、本発明者たちの分子動力学シミュレーションおよび分析により観察されたように、ＣＨ２ドメイン全体にわたってＦｃガンマ受容体へのＦｃ領域の結合強度に影響を与え得ることを示す。
【０２８６】
実施例８：ＦｃｇＲ結合に対するヘテロ二量体ＦｃのＣＨ２における非対称突然変異の作用
Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインにおける２６７の位置のセリンの、アスパラギン酸への突然変異（Ｓ２６７Ｄ）は、ＣＨ２ドメインの２つの鎖にホモ二量体的方法で導入されたとき、ＦｃガンマＩＩｂＦ、ＩＩｂＹ、およびＩＩａＲ受容体への結合を増強することが知られている。この突然変異は、図３６Ａに提示されたデータが示すように、この突然変異がホモ二量体ＣＨ２  Ｆｃに導入されたときに比べて結合強度における改善のほぼ半分を得るため、ヘテロ二量体Ｆｃ分子のＣＨ２ドメインの１つのみに導入され得る。一方、Ｆｃのホモ二量体ＣＨ２ドメインにおけるＥ２６９Ｋ突然変異は、ＦｃｇＲへのＦｃ領域の結合を防止する。本発明者たちは、ＦｃのＣＨ２ドメインの２つ鎖の一方に、これらの好ましいおよび好ましくない突然変異の非対称導入により、Ｆｃｇ受容体へのＦｃ領域の結合強度の増強された操作についてのスキームを提示する。ヘテロ二量体ＦｃにおけるＣＨ２鎖の１つへの非対称的な方法によるＥ２６９Ｋ突然変異の導入は、提示される面においてＦｃｇＲの結合を阻止し、Ｆｃの他の面が通常の方法でＦｃｇＲと相互作用することを放置する、極性ドライバーとして作用する。この実験の結果を図３６Ａに表す。独立した方法によりＦｃの両方の鎖を介して結合強度を選択的に変える機会は、ＦｃとＦｃｇ受容体の結合強度および選択性を操作する機会の増加を提供する。したがって、ＣＨ２ドメインにおける突然変異のそのような非対称設計は、特定の結合モデルを好み、または避けて、選択性を導入する大きな機会を提供する、積極的および消極的設計戦略の導入を可能にする。
【０２８７】
続く実験において、本発明者たちは、ＦｃガンマＩＩＩａＦおよびＩＩＩａＶ受容体への増加した結合強度を示し、同時にＦｃガンマＩＩａＲ、ＩＩｂＦ、およびＩＩｂＹ受容体への弱い結合を示し続ける、塩基Ｆｃ突然変異体Ｓ２３９Ｄ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｉ３３２Ｅ＿Ｓ２９８Ａの選択性プロファイルを変更した。これは、図３６Ｂに示されている結合プロファイルにおいて示されている。鎖Ａに非対称突然変異Ｅ２６９Ｋを導入し、鎖ＢにおいてＩ３３２Ｅ突然変異を開始することにより、ＩＩａおよびＩＩｂ受容体結合を更に弱め、ＦｃをＩＩＩａ受容体結合に対してより特異的にする、新規ＦｃｇＲ結合プリファイルを生成することができた。
【０２８８】
図３６Ｃに示されている別の例では、非対称突然変異が、ＣＨ２ドメインに突然変異Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａを伴うホモ二量体Ｆｃと比べて強調される。野生型ＩｇＧ１  Ｆｃと比べて、この変種は、ＩＩＩａ受容体への増加した結合を示すが、ＩＩａおよびＩＩｂ受容体にも野生型Ｆｃよりわずかに強く結合する。これらの突然変異の非対称的な方法による導入Ａ：Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２ＥおよびＢ：Ｓ２９８Ａは、ＩＩＩａ結合を低減しながら、ＩＩａ／ＩＩｂ受容体結合も増加し、その過程において選択性がゆるまる。このヘテロ二量体変種への非対称Ｅ２６９Ｋ突然変異を導入する、すなわち、Ａ：Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ２６９ＫおよびＢ：Ｓ２９８Ａにより、ＩＩａ／ＩＩｂ結合を低減して、野生型レベルに戻すことができる。このことは、ＦｃのＣＨ２ドメインにおける非対称突然変異の使用が、改善されたＦｃガンマＲ選択性を設計する有意な機会をもたらし得るという事実を強調している。
【０２８９】
実施例に用いられる試薬は、市販されている、または市販の器機、方法を使用して調製され得る、または当該技術に既知の試薬であり得る。前述の実施例は、本発明の多様な態様および本発明の方法の実施を例示する。実施例は、本発明の多くの実施形態の網羅的な記載を提供することを意図しない。したがって、前述の発明は、理解を明確にする目的で例示および例により幾らか詳細に記載されてきたが、当業者は、多くの変更および修正を、添付の特許請求の範囲の精神および範囲を逸脱することなく実施できることを容易に理解する。
【０２９０】
実施例９：ＳＰＲにより決定されるＦｃＲｎ結合
ＦｃＲｎへの結合は、２つの異なる方向においてＳＰＲにより決定した。
１．固定化されたＦｃＲｎに対するヘテロ二量体変種の流れ：この実験では、高密度表面のおよそ５０００ＲＵを、標準的なＮＨＳ／ＥＤＣカップリングの使用により作製した。１００ｎＭのＷＴおよび各変種を、ＭＥＳ  ｐＨ６処理緩衝液により６００秒の解離で５０ｕＬ分により１２０秒間、三重に注入した。
２．間接的に捕捉されたヘテロ二量体変種に対するＦｃＲｎの流れ：このＳＰＲ実験において、ヤギ抗ヒトＩｇＧ表面を使用して、抗体を間接的に捕捉し（それぞれ、およそ４００ＲＵ）、続いて３倍のＦｃＲｎ希釈系列を注入した（高濃度の６０００ｎＭ）。処理緩衝液は、１０ｍＭのＭＥＳ／１５０ｍＭのＮａＣｌ／３．４ｍＭのＥＤＴＡ／０．０５のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ６であった。ヤギポリクローナル表面へのＦｃＲｎの有意な結合はなかった。全ての変種は、ＷＴセンサグラムと類似したものを示す。下記に表８は、流動ＦｃＲｎ（２）による間接的固定化により決定されたＫｄを示す。
【表１１】
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【０２９１】
実施例１０：  例示的なヘテロ多量体の調製
１つの単一ドメイン抗原結合構築物を含む以下のヘテロ多量体を調製した。
１．  ｖ１３２３、一価抗ＥＧＦＲ抗体（ＥＧ２）であり、ＥＧＦＲ結合ドメインは、鎖Ａにおけるラクダ科動物ＶｈＨであり、Ｆｃ領域は、鎖Ａに突然変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、および鎖ＢにＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを有するヘテロ二量体である。
この構築物を以下のように調製し、発現させた。
【０２９２】
抗体重鎖およびＦｃ領域をコードする遺伝子は、ヒト／哺乳類発現に最適化されたコドンを使用する遺伝子合成を介して構築した。抗ＥＧＦＲ  ｓｄＡｂをコードするｓｄＡｂ配列は、既知のＥＧＦＲ結合抗体ＥＧ２から生成した（Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２８９：８１）。
【０２９３】
最終遺伝子産物を、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（ＮＲＣ−ＢＲＩ，Ｃａｎａｄａ）にサブクローンし、ＣＨＯ細胞において発現させた（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．，Ｐｅｒｒｅｔ，Ｓ．＆  Ｋａｍｅｎ，Ａ．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｇｒｏｗｉｎｇ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０，Ｅ９（２００２））。
【０２９４】
ＣＨＯ細胞を水性１ｍｇ／ｍＬの２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、２．５：１のＰＥＩ：ＤＮＡ比で対数増殖期（１．５〜２百万細胞／ｍＬ）に形質移入した。（Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．５５（１）：４４−５１（２０１１））。ＤＮＡを、ヘテロ二量体形成を可能にする鎖Ａ（ＣＨＡ）と鎖Ｂ（ＣＨＢ）の最適なＤＮＡ比（例えば、ＣＨＡ／ＣＨＢ比＝５０：５０）で形質移入した形質移入された細胞を、５〜６日後に培養培地から採取し、４０００ｒｐｍで遠心分離して収集し、０．４５μｍフィルターの使用により清澄化した。
【０２９５】
実施例１１：例示的なヘテロ多量体の精製および特徴決定
実施例１に記載されたヘテロ多量体を、下記に記載されたようにプロテインＡクロマトグラフィーにより発現させ、精製した。
【０２９６】
プロテインＡ精製
清澄化された培養培地をＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡカラムに装填し、１０カラム容量のＰＢＳ緩衝液によりｐＨ７．２で洗浄した。抗体を１０カラム容量のクエン酸緩衝液によりｐＨ３．６で溶出し、プールした画分は、ＴＲＩＳによりｐＨ１１で中和された抗体を含有した。
【０２９７】
プロテインＡ精製後のヘテロ二量体純度のＵＰＬＣ−ＳＥＣ分析
ｖ１３２３の純度は、下記に記載されている標準的条件下でＵＰＬＣ−ＳＥＣを使用して決定した。
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ２００  ＳＥＣ、１．７μｍの粒子、４．６×１５０ｍｍ
溶媒：２５ｍＭのＮａＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．００＠２３．４℃、２０．００ｍＳ／ｃｍ＠２３．４℃
流速：０．４ｍｌ／分、約４２８０ｐｓｉ
温度：  ３０℃
試料：ｖ１３２３  １２０６０７−ＫＢ
３回の注入（注入１回あたり約２μｇ）
【０２９８】
図４１および４２は、プロテインＡ精製後の例示的なヘテロ多量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＵＰＬＣ−ＳＥＣ分析の結果をそれぞれ描写している。図４１は、プロテインＡ精製後の相対純度を例示し、Ｖ１３２３が、検出可能な汚染種を含有しなかったこと、およびＳＥＣによる追加の精製を必要としなかったことを示す。図４２は、例えば、１３２３がプロテインＡ精製後に＞９７％のヘテロ二量体純度であることを例示して、図４１の観察を支持するＵＰＬＣ−ＳＥＣ分析を含有する。
表９は、Ｖ１３２３の精製手順および収量のまとめを提供する。
【表１２】
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【０２９９】
実施例１２：ヘテロ多量体はＥＧＦＲ−ＥＤ結合ドメイン特性を維持する
ＥＧＦＲの細胞外ドメイン（ＥＤ）に結合するＥＧＦＲ結合ドメインを含むｖ１３２３の能力を、ＢＩＯ−ＲＡＤからのＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムの使用により表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により試験した。
【０３００】
およそ３０００ＲＵの抗ヒトＩｇＧ  ２５ｕｇ／ｍｌを、標準的なアミンカップリングの使用によりＧＬＣチップに固定化した。例示的なＳＤＡＣを、およそ７００ＲＵの捕捉レベルで抗ヒトＩｇＧ固定化チップに捕捉した。組み換えヒトＥＧＦＲ−ＥＤを、処理緩衝液で希釈し、５０μｌ／分の流速で２分間注入し、続いて更に４分間解離させた。センサグラムを、１：１のラングミュア結合モデルに包括的に当て嵌めた。全ての実験は室温で実施した。
【０３０１】
ｖ１３２３のＳＰＲ曲線を図４３に示す。結果は、ｖ１３２３が、３〜４．５ｎＭの低いナノモル範囲で高い親和性によりＥＧＦＲ−ＥＤに結合することを示す。
【０３０２】
実施例１３：Ａ５４９、ＢｘＰｃ３、およびＵ８７細胞に結合するＶ１３２３の能力
細胞の表面に発現させたＥＧＦＲに結合するｖ１３２３の能力は、下記に記載される蛍光細胞結合アッセイによりＡ５４９、ＢｘＰｃ３、およびＵ８７細胞を使用して試験した。
【０３０３】
例示的な二重特異的ＳＤＡＣの、Ａ５４９、ＢｘＰｃ３、およびＵ８７細胞の表面への結合は、フローサイトメトリーにより決定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭに１×１０５細胞／１００μｌで懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を、それぞれのマイクロ遠心分離管に加え、続いて１０μｌ／管の抗体変種を加えた。管を回転機により４℃で２時間インキュベートした。マイクロ遠心分離管を２０００ＲＰＭにより室温で２分間遠心分離し、細胞ペレットを５００μｌの培地で洗浄した。それぞれの細胞ペレットを、培地で２μｇ／試料に希釈された１００μｌの蛍光標識二次抗体に再懸濁した。次に試料を回転機により４℃で１時間インキュベートした。インキュベートした後、細胞を２０００ＲＰＭにより２分間遠心分離し、培地で洗浄した。細胞を５００μｌの培地に再懸濁し、５μｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する管で濾過し、製造会社の使用説明書に従ってＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターにより分析した。
【０３０４】
この実験の結果は、ｖ１３２３が、試験した細胞に結合できることを示した（データ示されず）。
【０３０５】
本明細書に記述された全ての公報、特許、および特許出願は、まるでそれぞれ個別の公報、特許、および特許出願が特定的および個別に参照として組み込まれるように示されているかのように、同じ程度で、参照として本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３７−３】
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【図３７−４】
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【図３７−２３】
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【図３７−２９】
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【図３７−３０】
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【図３７−３１】
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【図３７−３２】
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【図３７−３３】
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【図３７−３４】
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【図３７−３５】
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【図３７−３６】
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【図３７−３７】
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【図３７−３８】
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【図３７−３９】
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【図３７−４０】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【図３８−３】
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【図３８−４】
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【図３８−５】
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【図３８−６】
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【図３８−７】
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【図３８−８】
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【図３８−９】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【配列表】
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