(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１回以上の親和性精製サイクルにわたって、親和性クロマトグラフィーカラムの結合能を保持する方法であって、
１回以上の親和性精製サイクル後に前記クロマトグラフィーカラムを、３．０より低いｐＨを有する酸性溶液またはアルカリ性溶液で洗浄することを含み、
前記親和性クロマトグラフィーカラムが、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリカーボネートからなる群から選択されるポリマーを含む固体支持体上に固定されたスタフィロコッカス  アウレウス  プロテインＡのＣドメインに由来するプロテインＡリガンドを含むプロテインＡ媒体を含む、
方法。
【請求項２】
プロテインＡリガンドが、配列番号３および配列番号４から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸性溶液が、２．５のｐＨを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
酸性溶液が、２．０のｐＨを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
酸性溶液が、１．５のｐＨを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
１０回以上のサイクルにわたって、結合能が保持される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
５０回以上のサイクルにわたって、結合能が保持される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
１００回以上のサイクルにわたって、結合能が保持される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
２００回以上のサイクルにわたって、結合能が保持される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
固体支持体が、ポリビニルエーテルポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
酸性溶液が、リン酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
カラムの結合能を維持しながら、結合および溶出の複数のサイクル後の親和性クロマトグラフィーカラムを衛生化する方法であって、
前記親和性クロマトグラフィーカラムを、リン酸、酢酸およびベンジルアルコールを含む溶液と、少なくとも３時間接触させること、またはアルカリ性溶液と接触させることを含み、
前記親和性クロマトグラフィーカラムが、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリカーボネートからなる群から選択されるポリマーを含む固体支持体上に固定化されたスタフィロコッカス  アウレウス  プロテインＡのＣドメインに由来するプロテインＡリガンドを含むプロテインＡ媒体を含む、
方法。
【請求項１３】
プロテインＡリガンドが、配列番号３および配列番号４から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
固体支持体が、ポリビニルエーテルポリマーを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
酸性およびアルカリ性両方の溶液を使用して、親和性クロマトグラフィーカラムを洗浄する方法であって、
ａ．親和性精製サイクルのサイクル間に、カラムを、酸性溶液およびアルカリ性溶液の両方と接触させること；または、
ｂ．酸性溶液およびアルカリ性溶液が、交互に使用されるように、前記カラムを、一サイクル後に前記酸性溶液、または、一サイクル後に前記アルカリ性溶液のいずれかと接触させることを含み、
前記親和性クロマトグラフィーカラムが、固体支持体上に固定されたスタフィロコッカス  アウレウス  プロテインＡのＣドメインに由来するプロテインＡリガンドを含むプロテインＡ媒体を含む、
方法。
【請求項１６】
固体支持体が、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリカーボネートからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
酸性溶液が、リン酸を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
アルカリ性溶液が、水酸化ナトリウムを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
方法が、不純物の相乗的な除去をもたらす、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
リガンドが、配列番号３または配列番号４から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインＡクロマトグラフィーカラムを洗浄する方法を提供する。さらに、本発明は、スタフィロコッカス  アウレウスタンパク質のＣドメインに基づくリガンドを含む親和性クロマトグラフィー媒体を使用する、プロテインＡ系親和性クロマトグラフィーカラムを洗浄する方法に関する。
【０００２】
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により組み込まれている配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１４年６月３日に作製され、Ｐ１３−１３６ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、６，２８９バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質精製用の従来法は、典型的には、例えば、所望のタンパク質を産生するように遺伝子組み換え技術によって作られる、哺乳類または細菌の細胞株のいずれかを使用する細胞培養法、続けて、（ａ）例えば分画遠心分離および／またはろ過を使用して細胞および細胞残骸を除去するための浄化工程；ならびに、（ｂ）浄化された細胞培養物フィード中の種々の不純物から所望のタンパク質を分離する１回以上の下流クロマトグラフィー工程を含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
モノクローナル抗体および他のＦｃ含有タンパク質の場合には、精製のための工業規格は、典型的には、多工程法を含む。重要な工程の１つは、プロテインＡと呼ばれる親和性リガンドを使用する精製工程である。プロテインＡは、抗体のＦｃ領域に結合する。典型的には、大部分の不純物が、この工程で除去される。プロテインＡ親和性クロマトグラフィーは、抗体の精製中には非常に有効な工程であるが、プロテインＡを使用することの１つの不利益は、イオン交換樹脂と比較して、プロテインＡが非常に高価なことである。さらに、親和性クロマトグラフィーカラムの梱包および開梱も、非常に労力がいり、かなりのバッファーコストを必要とする。従って、複数のサイクル間で、プロテインＡカラムを洗浄、再利用および衛生化可能であるのが望ましい。
【０００５】
現在、最も商業的に利用可能なプロテインＡ媒体を使用するクロマトグラフィーカラムは、アルカリ性条件または酸性条件のいずれかを使用して洗浄される。例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ（Ｒ）（ＧＥ）、ＫａｎＣａｐ  Ａ（Ｋａｎｅｋａ）およびＴｏｙｏＰｅａｒｌ（Ｒ）ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ６５０Ｆ（Ｔｏｓｏｈ）の媒体を使用するクロマトグラフィーカラムは、アルカリ性溶液、例えば、水酸化ナトリウムを使用して洗浄される。一方、ＰｒｏＳｅｐ（Ｒ）Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ媒体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用するクロマトグラフィーカラムは、酸性溶液を洗浄に使用する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、固体支持体上に固定化された、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ(スタフィロコッカス  アウレウス)プロテインＡのＣドメインに基づくリガンドを含む媒体を使用して、クロマトグラフィーカラムを洗浄する方法であって、カラムは、酸性溶液およびアルカリ性溶液の両方を使用して洗浄され得る方法を提供する。
【０００７】
上記したように、最も商業的に利用可能なプロテインＡ媒体を使用するクロマトグラフィーカラムは、酸性溶液またはアルカリ性溶液に対する長期にわたる暴露に対するプロテインＡリガンドまたはベースマトリクスのいずれかの不安定性のために、酸性溶液またはアルカリ性溶液のいずれかを使用して洗浄され得る。従って、このようなクロマトグラフィーカラムを使用する精製法は、アルカリ性条件下のみでの洗浄または酸性条件下のみでの洗浄のいずれかに適用するように設定される。
【０００８】
本発明に基づく方法は、固体支持体上に固定化されたプロテインＡのＣドメインに基づくリガンドを含む媒体を使用するクロマトグラフィーカラムが、アルカリ性条件下での洗浄に加えて、または、同洗浄に代えて、酸性条件下で洗浄されるのを可能することで、操作時におけるより高い柔軟性を提供する。このような媒体を使用するクロマトグラフィーカラムの効率的な洗浄を可能にすることにより、本明細書に記載された方法は、数多くのサイクルにわたって、カラムの結合能を保持することができる。さらに、このような媒体を使用するクロマトグラフィーカラムの洗浄を可能にすることにより、洗浄のためにアルカリ性条件または酸性条件のいずれかを単独で使用するのと比較して、不純物のより高い除去が達成され、これにより、より高い生成物純度をもたらす。
【０００９】
一部の実施形態では、１回以上の親和性精製サイクルにわたって、親和性クロマトグラフィーカラムの結合能を保持する方法が提供される。本方法は、１回以上の親和性精製サイクル後にクロマトグラフィーカラムを、３．０より低いｐＨを有する酸性溶液で洗浄することを含み、親和性クロマトグラフィーカラムは、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリカーボネートからなる群から選択されるポリマーを含む固体支持体上に固定化された、スタフィロコッカス  アウレウスプロテインＡのＣドメインに由来するプロテインＡリガンドを含む媒体を含む。
【００１０】
一部の他の実施形態では、酸性溶液およびアルカリ性溶液の両方を使用して、親和性クロマトグラフィーカラムを洗浄する方法が提供される。この場合、本方法は、（ａ）一サイクル後に、カラムを、酸性溶液およびアルカリ性溶液の両方と接触させること；または、（ｂ）酸性溶液およびアルカリ性溶液が、交互に使用されるように、カラムを、一サイクル後に酸性溶液、または、一サイクル後にアルカリ性溶液のいずれかと接触させることを含み、親和性クロマトグラフィーカラムは、固体支持体上に固定化された、スタフィロコッカス  アウレウスプロテインＡのＣドメインに由来するプロテインＡリガンドを含む媒体を含む。
【００１１】
一部の実施形態では、プロテインＡリガンドは、配列番号３および配列番号４から選択されたアミノ酸配列を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、固体支持体は、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリカーボネートからなる群から選択されるポリマーを含む。特定の実施形態では、固体支持体は、ポリビニルエーテルポリマーを含む。
【００１３】
一部の実施形態では、酸性溶液は、１．５のｐＨまたは２．０のｐＨまたは２．５のｐＨを有する。
【００１４】
一部の実施形態では、結合能は、１０回以上のサイクルにわたって保持される。他の実施形態では、結合能は、５０回以上のサイクルにわたって保持される。さらに他の実施形態では、結合能は、１００回以上のサイクルにわたって保持される。さらに他の実施形態では、結合能は、２００回以上のサイクルにわたって保持される。
【００１５】
本明細書において、カラムの結合能を維持しながら、使用後の親和性クロマトグラフィーカラムを衛生化する方法が提供される。この場合、本方法は、親和性クロマトグラフィーカラムを、リン酸、酢酸、ベンジルアルコールを含む溶液と、少なくとも３時間接触させることを含み、親和性クロマトグラフィーカラムは、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリカーボネートからなる群から選択される固体支持体上に固定化された、スタフィロコッカス  アウレウスプロテインＡのＣドメインに由来するプロテインＡリガンドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】（１）０．３％  塩酸  ｐＨ１．５；（２）０．１５Ｍ  リン酸  ｐＨ１．５；（３）０．１Ｍ  ＮａＯＨ；および、（４）０．５Ｍ  ＮａＯＨに対する、２５時間の暴露に対する、樹脂Ａ、ＢおよびＣの静的結合能の保持率（％）を測定した実験結果を示す棒グラフである。２５時間の暴露は、（１５分／サイクルでの）１００サイクルに相当する。３つ全ての樹脂サンプルは、０．３％  ＨＣｌおよび０．１５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４への暴露に対し、２５時間の暴露後に、コントロールに対して９５％を上回る結合能の保持を示す。樹脂ＡおよびＢは、０．１Ｍ  ＮａＯＨへの暴露に対し、コントロールに対して９５％を上回る結合能を保持している。樹脂ＡおよびＢは、０．５Ｍ  ＮａＯＨへの暴露に対し、コントロールに対して約７５％の結合能を保持している。樹脂Ｃは、０．１Ｍ  ＮａＯＨへの暴露に対し、コントロールに対して約６５％の結合能を保持している。樹脂Ｃは、０．５Ｍ  ＮａＯＨへの暴露に対し、コントロールに対して約３８％の結合能を保持している。標準偏差は、約３％である。
【図２】（１）１０サイクル毎に、０．１Ｍ  ＮａＯＨと０．１５Ｍ  リン酸  ｐＨ１．５を交替させることによる洗浄；（２）リン酸洗浄のみによる洗浄；ならびに、（３）０．１Ｍ  ＮａＯＨアルカリ性溶液のみによる洗浄への、樹脂Ｂの暴露の１００および２００サイクル後の動的結合能の保持率（％）（４分滞留時間で、１０％）を測定した実験結果を示す棒グラフである。動的結合能における顕著な変化（１０％ブレークスルー）は、リン酸およびＮａＯＨの交互暴露ならびに０．１５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４の２００サイクル（１５分／サイクル）後；０．１５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４のみへの２００サイクル（１５分／サイクル）暴露後、または、０．１Ｍ  ＮａＯＨへの２００サイクル（１５分／サイクル）暴露後に観察されない。標準偏差は、約１０％である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
プロテインＡ親和性クロマトグラフィーは、カラム中に充填されたプロテインＡ樹脂または媒体（即ち、固体支持体上に固定化されたプロテインＡリガンド）に対するＦｃ含有タンパク質（例えば、免疫グロブリンまたは別のＦｃ融合タンパク質）の結合、および、カラムからのＦｃ含有タンパク質のその後の溶出に関係する。定置洗浄（ＣＩＰ）は、クロマトグラフィーカラムの効率的な使用に重要であり、カラムが再利用され得るサイクル数を最大化するのに重要である。クロマトグラフィー樹脂に対して有害でない、不純物を効率的に除去するクリーニング手法が、一般的に必要とされる。商業的に利用可能なプロテインＡ樹脂の大部分の洗浄および衛生化に典型的に使用される最も一般的な洗浄溶液の１つは、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）である（例えば、Ｈａｇｅｌ  Ｌ  ｅｔ．ａｌ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ．Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；２００８．Ｃｌｅａｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓａｎｉｔｉｚａｔｉｏｎ；ｐｐ．１４７−１５９；Ｇｒｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ．２０１１  Ｍａｒ−Ａｐｒ；３（２）：１９２−２０２を参照のこと。）。典型的には、カラム方式において、数多くの後のサイクルを行う場合、カラムの汚損を引き起こし、カラムの効率および結合能を低下させる、クロマトグラフィー樹脂上の汚染が徐々に蓄積され得る。サイクル間の効率的な洗浄手法は、クロマトグラフィーカラム上の汚染の蓄積を最小化することにより、カラムの寿命を延ばす。これは、カラム再生とも呼ばれる。
【００１８】
最も商業的に利用可能なプロテインＡ樹脂は、アルカリ性溶液、例えば、水酸化ナトリウムを使用して洗浄されるが、ＰｒｏＳｅｐ（Ｒ）Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ樹脂（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）を使用して洗浄される。
【００１９】
本発明は、固体支持体上に固定化された、スタフィロコッカス  アウレウスプロテインＡのＣドメインに基づくリガンドを含む媒体を使用するクロマトグラフィーカラムが、酸性溶液およびアルカリ性溶液の両方で洗浄され得るという、少なくとも驚くべき予想外の発見に基づいている。酸性溶液およびアルカリ性溶液の両方でカラムの洗浄を可能にすることにより、操作におけるより高い柔軟性が達成されるだけでなく、精製過程中の洗浄のためにアルカリ性溶液および酸性溶液の両方を使用する場合、より高いタンパク質純度が達成される。
【００２０】
本開示がより容易に理解され得るために、まず、特定の用語が定義される。更なる定義は、発明を実施するための形態全体を通して説明される。
【００２１】
Ｉ．定義
本明細書で使用する場合、「ＳｐＡ」、「プロテインＡ」または「スタフィロコッカス  アウレウスプロテインＡ」は、細菌であるスタフィロコッカス  アウレウスから単離された、４２ｋＤａのマルチドメインタンパク質を意味する。ＳｐＡは、このカルボキシ末端細胞壁結合領域を介して、細菌の細胞壁に結合している。この領域は、Ｘドメインと呼ばれる。アミノ末端領域には、ＳｐＡは、５つの免疫グロブリン結合ドメインを含む。このドメインは、Ｅ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣと呼ばれる（Ｓｊｏｄｈａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｅｐ  ７８（２）：４７１−９０（１９７７）；Ｕｈｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．Ｆｅｂ  ２５９（３）：１６９５−７０２（１９８４））。これらの各ドメインは、約５８個のアミノ酸残基を含み、これらは、６５から９０％のアミノ酸配列同一性を共有する。
【００２２】
ＳｐＡのＥ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣの各ドメインは、区別できるＩｇ結合部位を有する。１つの部位は、Ｆｃ（ＩｇＧクラスのＩｇの定常領域）のためのものであり、他のものは、特定のＩｇ分子のＦａｂ部（抗原認識を担うＩｇの一部）のためのものである。各ドメインが、Ｆａｂ結合部位を含むことが報告されている。ＳｐＡの非Ｉｇ結合部は、Ｃ末端に位置しており、Ｘ領域またはＸドメインと指定される。
【００２３】
本明細書において互換的に使用されるように、「Ｃドメイン」、「ＳｐＡのＣドメイン」、「プロテインＡのＣドメイン」および「スタフィロコッカス  アウレウスプロテインＡのＣドメイン」という用語は、アミノ酸配列が、配列番号１に説明され、または、例えば、配列番号２に説明されたヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチオドを意味する。「Ｃドメイン」は、３へリックスバンドル構造にフォールドしている５８個のアミノ酸ポリペプチドである。Ｃドメインは、へリックス１および２の表面上の残基を介してＦｃ結合可能であり、または、へリックス２および３の表面上の残基を介してＦａｂに結合可能である。
【００２４】
本明細書に記載された方法において使用する場合、プロテインＡのＣドメインに基づくプロテインＡリガンドは、配列番号１に説明されたアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％または少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％またはそれ以上同一なアミノ酸配列を有するリガンドを含む。
【００２５】
種々の実施形態において、本明細書に記載された方法において使用されるプロテインＡのＣドメインに基づくプロテインＡリガンドは、配列番号３または配列番号４に説明されたアミノ酸配列を含む。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「クロマトグラフィー」という用語は、ターゲット分子、例えば、ターゲットタンパク質（例えば、免疫グロブリンまたは別のＦｃ含有タンパク質）を、混合物中の他の分子から分離し、これを単離するのを可能にする動的分離技術を意味する。典型的には、クロマトグラフィー法では、移動相（液体または気体）は、所望のターゲット分子を含むサンプルを、固定相（通常、固体）媒体を横切ってまたは同媒体を通過して移動させる。固定相への分配または親和性の差異は、固定相に対して選択された分子の一時的な結合を生じさせ、一方、移動相は、種々のタイミングで、種々の分子を運ぶ。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「親和性クロマトグラフィー」という用語は、分離されるべきターゲット分子、例えば、タンパク質分子（例えば、Ｆｃ含有タンパク質）が、クロマトグラフィー樹脂上に固定化された分子（例えば、プロテインＡ系リガンド）とのこのロックアンドキー相互作用により単離されるクロマトグラフィー方式を意味する。この特異的な相互作用は、ターゲット分子が結合するのを可能にし、一方、望ましくない分子が素通りするのを可能にする。ついで、移動相の温度、ｐＨ、イオン強度を変化させることは、ターゲット分子を高純度で放出する。本明細書に記載された種々の実施形態において、親和性クロマトグラフィーは、プロテインＡのＣドメインに基づくリガンドをその上に有する固体支持体（プロテインＡ親和性クロマトグラフィー媒体または樹脂と呼ばれる。）への、ターゲット分子（例えば、免疫グロブリンまたは別のＦｃ含有タンパク質）を含むサンプルの添加に関係する。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「プロテインＡ親和性クロマトグラフィー」という用語は、プロテインＡまたはプロテインＡのＣドメインに基づくＳｐＡ系リガンド、例えば本明細書に記載されたものを使用する、物質の分離または単離を意味する。この場合、ＳｐＡまたはプロテインＡリガンドは、固体支持体上に固定化される。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「リガンド」という用語は、固体支持体（例えば、多孔性表面）上に固定化され、Ｆｃ含有タンパク質に結合可能な、プロテインＡのＣドメインに基づく生体分子を意味する。本明細書に記載された一部の実施形態では、リガンドは、配列番号３に説明されたアミノ酸配列またはこの変異体、フラグメントもしくは誘導体を含む。本明細書に記載された一部の他の実施形態では、リガンドは、配列番号４に説明されたアミノ酸配列またはこの変異体、フラグメントもしくは誘導体を含む。
【００３０】
「固体支持体」という用語は、一般的には、リガンドが付着している任意の材料（多孔性または非多孔性）を意味する。固体支持体に対するリガンドの付着は、（エーテル、チオエーテル、炭素−炭素結合または他の結合を介した）グラフト化の場合には、共有結合等によるか、または、コーティング、接着、吸着および類似する機構によるかのいずれかであり得る。本明細書に記載された方法に使用される典型的な固体支持体としては、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリカーボネートが挙げられる。
【００３１】
当分野において公知のプロテインＡ親和性クロマトグラフィー媒体／樹脂の例としては、制御された細孔ガラス骨格上に固定化されたプロテインＡを有するもの、例えば、ＰＲＯＳＥＰ（Ｒ）ＡおよびＰＲＯＳＥＰ（Ｒ）ｖＡ媒体／樹脂（ＥＭＤ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）；ポリスチレン固体相上に固定化されたプロテインＡを有するもの、例えば、ＰＯＲＯＳ（Ｒ）５０ＡおよびＰＯＲＯＳ（Ｒ）ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ（ＴＭ）Ａ媒体／樹脂（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ，ＩＮＣ．）；および、アガロース固体支持体上に固定化されたプロテインＡを有するもの、例えば、ｒＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷ（ＴＭ）またはＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（ＴＭ）媒体または樹脂（ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）が挙げられる。種々の実施形態において、本明細書に記載された方法に使用されるプロテインＡリガンドは、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリカーボネートからなる群から選択される固体支持体上に固定化される。
【００３２】
特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に使用されるリガンドは、ポリビニルエーテルポリマー上に固定化される。例えば、米国特許第７，９５１，８８５号明細書を参照のこと。同特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３３】
本明細書において互換的に使用されるように、「親和性樹脂」または「親和性クロマトグラフィー樹脂」または「親和性媒体」または「親和性クロマトグラフィー媒体」という用語は、固体支持体に付着している（例えば、プロテインＡのＣドメインに基づく）親和性クロマトグラフィーリガンド、例えば、本明細書に記載されたもの等を意味する。一般的には、「樹脂」および「媒体」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００３４】
本明細書において互換的に使用されるように、「ターゲットタンパク質」または「所望のタンパク質」という用語は、プロテインＡのＣドメインまたはこの変異体もしくは誘導体を使用して精製され得る任意のタンパク質を意味する。種々の実施形態において、ターゲットタンパク質は、Ｆｃ含有タンパク質、例えば、免疫グロブリンまたはＦｃ融合タンパク質である。
【００３５】
（本明細書において互換的に使用される。）「免疫グロブリン」、「Ｉｇ」または「抗体」という用語は、２本の重鎖および２本の軽鎖からなる、基本的な４本のポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を意味する。前記鎖は、例えば、鎖間ジスルフィド結合により安定化されており、抗原に特異的に結合する能力を有する。（本明細書において互換的に使用される。）「一本鎖免疫グロブリン」または「一本鎖抗体」という用語は、重鎖および軽鎖からなる、２本のポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を意味する。前記鎖は、例えば、鎖間ペプチドリンカーにより安定化されており、抗原に特異的に結合する能力を有する。「ドメイン」という用語は、例えば、β−プリーツシートおよび／または鎖内ジスルフィド結合により安定化された、ペプチドループを含む（例えば、３から４個のペプチドループを含む。）重鎖または軽鎖のポリペプチドの球状領域を意味する。本明細書において、さらに、ドメインは、「定常」ドメインの場合には、種々のクラスのメンバーのドメイン内の配列可変性の相対的な欠落、または、「可変」ドメインの場合には、種々のクラスのメンバーのドメイン内の顕著な可変性に基づいて、「定常」または「可変」と呼ばれる。抗体またはポリペプチドの「ドメイン」は、多くの場合、抗体またはポリペプチドの「領域」と、当分野において互換的に呼ばれる。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、互換的に、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域または「ＣＬ」ドメインと呼ばれる。抗体重鎖の「定常」ドメインは、互換的に、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域または「ＣＨ」ドメインと呼ばれる。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、互換的に、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域または「ＶＬ」ドメインと呼ばれる。抗体重鎖の「可変」ドメインは、互換的に、「重鎖可変領域」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ」領域または「ＶＨ」ドメインと呼ばれる。
【００３６】
免疫グロブリンまたは抗体は、モノクローナルでもよいし、または、ポリクローナルでもよく、単量体型または多量体型で存在してもよい。例えば、ＩｇＭ抗体は、五量体型で存在し、および／または、ＩｇＡ抗体は、単量体型、二量体型または多量体型で存在する。「フラグメント」という用語は、インタクトまたは完全な抗体または抗体鎖より少ないアミノ酸残基を含む、抗体または抗体鎖の一部または部分を意味する。フラグメントは、インタクトまたは完全な抗体または抗体鎖の化学的または酵素的な処理により得られることができる。フラグメントは、組換え手段によっても得られることができる。典型的なフラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃおよび／またはＦｖのフラグメントが挙げられる。
【００３７】
本発明の方法は、プロテインＡに結合し得る任意の抗体またはこのフラグメント、例えば、制限されず、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体またはこれらのフラグメントの精製中に使用され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載された方法は、治療抗体の精製中に使用される。
【００３８】
典型的な治療抗体としては、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（ＴＭ）；Ｒｉｔｕｘａｎ（ＴＭ）；Ａｖａｓｔｉｎ（ＴＭ）；Ｂｅｘｘａｒ（ＴＭ）；Ｃａｍｐａｔｈ（ＴＭ）；Ｅｒｂｉｔｕｘ（ＴＭ）；Ｈｕｍｉｒａ（ＴＭ）；Ｒａｐｔｉｖａ（ＴＭ）；Ｒｅｍｉｃａｄｅ（ＴＭ）；ＲｅｏＰｒｏ（ＴＭ）；Ｐｒｏｌｉａ（Ｒ）；Ｘｇｅｖａ（Ｒ）；Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（ＴＭ）；Ｓｙｎａｇｉｓ（ＴＭ）；Ｘｏｌａｉｒ（ＴＭ）；Ｚｅｎａｐａｘ（ＴＭ）；Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ＴＭ）；およびＶｅｃｔｉｂｉｘ（ＴＭ）が挙げられる。典型的なＦｃ融合タンパク質としては、可溶型の受容体または酵素およびこれらの変異体、誘導体もしくは類似体への融合物、例えば、Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ）が挙げられる。
【００３９】
本明細書に記載された方法を使用して精製されたターゲットタンパク質は、Ｆｃ領域を含むため、プロテインＡによる精製を受け入れられるものであることが理解される。本明細書で使用する場合、「Ｆｃ領域」または「Ｆｃ」という用語は、プロテインＡと相互作用する、免疫グロブリン分子のアミノ酸残基を意味する。Ｆｃ領域は、抗体の結晶性テイル領域であり、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体と相互作用する。
【００４０】
「Ｆｃ結合」、「Ｆｃ部に結合する」または「Ｆｃ部への結合」という用語は、抗体の定常部（Ｆｃ）に結合する、本明細書に記載された親和性リガンドの能力を意味する。一部の実施形態では、本発明に基づくリガンドは、少なくとも１０−７Ｍまたは少なくとも１０−８Ｍまたは少なくとも１０−９Ｍの親和性で、抗体（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４）のＦｃ部に結合する。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「フラグメント」という用語は、全長Ｆｃ含有タンパク質、例えば、免疫グロブリン等の一部を意味する。フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、一本鎖抗体分子、ディアボディ、線状抗体および、抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【００４２】
本明細書に記載された方法を使用して精製される免疫グロブリンおよび他のＦｃ含有タンパク質は、任意の適切な発現系または細胞種を使用して発現されてもよい。一部の実施形態では、免疫グロブリンまたは別のＦｃ含有タンパク質は、哺乳類の細胞、例えば、ＣＨＯまたはＮＳ０細胞、ハイブリドーマ、マウス細胞等において発現される。別の実施形態では、免疫グロブリンまたは別のＦｃ含有タンパク質は、非哺乳類の細胞培養物（例えば、昆虫細胞、酵母細胞、大腸菌等）を使用して発現される。細胞培養物における発現後、典型的には、不溶性種が、浄化法、例えば、深層ろ過、遠心分離、凝集／沈殿（例えば、酸沈殿または刺激応答性ポリマー）を使用して除去される。この浄化された細胞培養物は、典型的には、プロテインＡカラムに充填されて、可溶性不純物、例えば、宿主細胞のタンパク質、ＤＮＡ、ウイルスまたは他の不純物から、免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質を分離する。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「精製されたポリペプチド」または「精製されたタンパク質」という用語は、本明細書に記載されたｐＨ勾配またはｐＨ段階法を使用して、プロテインＡ親和性工程から溶出された生成物である。精製されたポリペプチド／タンパク質は、好ましくは、主にポリペプチドモノマーを含む。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「未精製のポリペプチド」、「未精製のタンパク質」または「タンパク質ロード」という用語は、プロテインＡ親和性精製工程前の充填材料または開始材料中のポリペプチドまたはタンパク質である。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ含有タンパク質の純度」という用語は、精製過程後のプロテインＡクロマトグラフィーカラムの総溶出タンパク質に対する、ターゲットタンパク質（即ち、Ｆｃ含有タンパク質）のモノマー種として定義される。精製過程は、本明細書に記載された洗浄手法を使用する。従って、純度は、最終的な溶出プール中の総タンパク質に対する総モノマーの割合により算出され得る。総タンパク質は、ターゲットタンパク質およびこの変異体の１つ以上のタンパク質フラグメント、凝集体、モノマー種を含み得る。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「洗浄」という用語は、カラムの性能および完全性を保持するために、親和性クロマトグラフィーカラム、例えば、プロテインＡカラムに残留した微量レベルの不純物を除去することを必要とする、ターゲットタンパク質（例えば、免疫グロブリンまたは別のＦｃ含有タンパク質）の精製過程中の工程を意味する。洗浄工程は、カラムから不純物を除去するが、結合能（カラムが精製し得るターゲットタンパク質の量）および／または分解能（望ましくない実体からターゲットタンパク質を分離するカラム中の樹脂または媒体についての能力）を使用して測定される場合、理想的には、カラムの性能における最小の影響を有するべきである。例えば、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓプロテインＡまたはこの誘導体を使用する、最も商業的に利用可能な親和性クロマトグラフィーカラムは、酸性溶液またはアルカリ性溶液のいずれかを使用して洗浄される。例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（Ｒ）プロテインＡカラムは、希釈されたＮａＯＨで洗浄される。一方、Ｐｒｏｓｅｐ（Ｒ）プロテインＡカラムは、一般的には、リン酸を使用して洗浄される。しかしながら、現在、商業的に利用可能なプロテインＡ樹脂は、極端なｐＨ下において不安定であるため、酸性およびアルカリ性条件の両方を使用して洗浄されることができない。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「定置洗浄」または「ＣＩＰ」という用語は、パイプ、容器、プロセス機器、フィルタおよび関連する付属品の内部表面を、分解することなく洗浄する方法である。ＣＩＰを使用する利益は、洗浄がより速く、労働集約性がより低く、より繰り返し可能であり、人間に対する化学的暴露がより少ないことである。クロマトグラフィーカラムについて、ＣＩＰは、樹脂材料ならびにカラム本体および端部付属品を、カラムを開梱せずに洗浄することを意味する。通常、ラン後に洗浄されたクロマトグラフィーカラムは、次のランのために、直ちに平衡化され、または、短期もしくは長期の保存のために衛生化される。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「サイクル」または「親和性サイクル」または「プロテインＡ親和性クロマトグラフィー精製サイクル」という用語は、プロテインＡ系樹脂を使用するクロマトグラフィーカラムを、中性バッファーでの平衡化で開始し、続けて、浄化された細胞培養物フィードをカラムに充填し（この場合、浄化された細胞培養フィードは、精製されるべきＦｃ含有タンパク質（例えば、モノクローナル抗体）を含む。）；続けて、１から３種類のバッファーで、カラムを洗浄して、緩く結合している不純物を除去し（この不純物は、プロテインＡ樹脂に対するＦｃ含有タンパク質の結合を妨害しない。）；続けて、（例えば、２．５から４．５のｐＨを有する。）溶出バッファーを使用して、Ｆｃ含有タンパク質をプロテインＡカラムから溶出する、多工程法を意味する。平衡化、充填、洗浄および溶出のこの多工程法は、サイクル、または結合および溶出のサイクルを構成する。サイクル後には、典型的には、次のサイクル前に、カラム上の微少レベルの不純物を除去する洗浄工程が行われる。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「キャンペーン（ｃａｍｐａｉｇｎ）」という用語は、所望の量の材料を特定期間内に産生するために、次々に行われる、個々の精製過程またはサイクルの複数回のラウンドを意味する。Ｆｃ含有タンパク質、例えば、モノクローナル抗体を精製する場合、キャンペーンは、典型的には、複数のバイオリアクターでのラン、加えて最後の充填のために精製される、設定された量のタンパク質を提供するためのその後の精製工程を含む。洗浄は、キャンペーン内のラン間でルーチンに実施されるが、キャンペーンが完了した時点で、クロマトグラフィーカラム、例えば、プロテインＡ系リガンドを使用するクロマトグラフィーカラムは、カラムが次のキャンペーンに再度典型的に使用される場合、さらに、保存のために衛生化される。次のキャンペーンは、数日または数週間または数か月後であり得る。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「衛生化（ｓａｎｉｔｉｚａｔｉｏｎ）」または「衛生化すること（ｓａｎｉｔｉｚｉｎｇ）」または「衛生化する（ｓａｎｉｔｉｚｅ）」という用語は、キャンペーン完了後に使用される工程であり、ＦＤＡまたは他の監督官庁により決定されたのと同様に、微生物集合を安全または許容可能と考えられるレベルに減少させるように設定される。衛生化は、典型的には、熱または化学物質を使用して達成される。次のキャンペーンまで保存されるべきクロマトグラフィーカラムは、熱による衛生化の非実用性のために、一般的には、化学的手段により衛生化される。ほとんどの親和性クロマトグラフィーカラム、例えば、最も商業的に利用可能なプロテインＡリガンドを使用するものは、０．５Ｍ以下のＮａＯＨを使用して衛生化される。ただし、０．５Ｍ  ＮａＯＨは、プロテインＡリガンドにおけるＮａＯＨの脱アミノ化作用により、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂の性能を、著しく低下させることも公知である。本明細書に記載された一部の実施形態では、リン酸、酢酸およびベンジルアルコールを含む溶液（ＰＡＢ）が、衛生化に使用される。ＰＡＢ（１２０ｍＭ  リン酸、１６７ｍＭ  酢酸、２．２％  ベンジルアルコール）が、ＰｒｏＳｅｐ（Ｒ）ファミリーのプロテインＡ親和性媒体の場合に、サニタントとして使用される場合があることが以前から示されているが、全てのプロテインＡ媒体、特に、アルカリ性条件下において、一般的に洗浄または衛生化される媒体に適しているとは考えられていない。Ｍ．Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  １２１６（２００９）４５８９−４５９６を参照のこと。
【００５１】
「充填密度」または「充填する密度」という用語は、クロマトグラフィー媒体の容量あたりの、クロマトグラフィーカラム上に充填される、免疫グロブリンまたは別のＦｃ含有タンパク質を含むサンプルの量である。充填密度は、ｇ／Ｌで測定される。一部の実施形態では、サンプルは、５ｇ／Ｌまたは１０ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌまたは１５ｇ／Ｌまたは２０ｇ／Ｌまたは３０ｇ／Ｌまたは４０ｇ／Ｌまたはそれ以上の充填密度で充填される。
【００５２】
「バッファー」は、この酸−塩基共役成分の作用によるｐＨにおける変化に抵抗する溶液である。使用され得る種々のバッファーは、例えば、バッファーの所望のｐＨに応じて、Ｂｕｆｆｅｒｓ．Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｕｆｆｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｕｅｆｆｒｏｙ，Ｄ．，Ｅｄ．Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９７５）に記載されている。
【００５３】
本明細書において、「平衡化バッファー」は、ターゲットタンパク質を充填するための（固定化されたプロテインＡを含む。）固体支持体を調製するのに使用されるものである。
【００５４】
本明細書において、「洗浄バッファー」は、ターゲットタンパク質の充填後で、溶出前に、（固定化されたプロテインＡを含む。）固体支持体を通り過ぎるバッファーを意味するのに使用される。
【００５５】
「結合能」という用語は、所定条件下で実行されるカラム中に充填された所定容量の樹脂または媒体に結合する分子の量を意味する。結合能は、静的結合能または動的結合能として測定され得る。静的結合能の場合には、分子および樹脂が無限量の時間接触する場合に所定容量の樹脂に結合する分子の量として決定される。静的結合能は、樹脂が結合し得るターゲット分子の最大量を測定する。実際に、この値は、多くの場合、過剰のターゲット分子を樹脂と、最小の流れでまたは流れを伴わず、４時間以上接触させることにより得られる。一方、動的結合能は、設定流速において樹脂の容量あたりに、樹脂が結合し得るターゲット分子の量である。任意の樹脂の動的結合能は、基礎をなす条件に非常に依存性である。一般的には、流速が遅いほど、動的結合能は高くなる。流速がゼロに近づくと、結合能は、最大利用可能能−静的結合能に近づくことになる。適切な洗浄および衛生化を行わないと、複数回の結合および溶出サイクル後に、プロテインＡ樹脂の結合能は、典型的には、最初の値を下回って低下する。結合能が、クロマトグラフィー法／過程の開発中に設定された特定の値を下回る場合、著しい量のターゲットタンパク質が、不純物を含む通過画分と共に、「ブレークスルー」または共溶出してしまい、生成物の損失をもたらし得る。適切な化学物質を使用する適切な洗浄は、長期間にわたって樹脂の結合能を維持し得る。これは、典型的には、種々の商業的に利用可能な樹脂について設定されている条件に基づいて、アルカリ性溶液、例えば、０．１Ｍ  ＮａＯＨまたは酸性溶液、例えば、０．１５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４のいずれかを使用して達成される。ただし、本明細書に記載された方法の場合には、酸性溶液およびアルカリ性溶液の両方が、樹脂の結合能を保持しながら、洗浄に使用され得る。
【００５６】
ＩＩ．プロテインＡクロマトグラフィー
プロテインＡクロマトグラフィーは、Ｆｃ含有タンパク質、例えば、免疫グロブリンまたは抗体等の精製に最も一般的に使用されている親和性クロマトグラフィーの形式である。一般的には、ターゲットタンパク質（例えば、免疫グロブリンまたは別のＦｃ含有タンパク質）は、適切な細胞培養物中で発現され、細胞培養物フィードが浄化に供され、その後、例えば、クロマトグラフィーカラムに充填されたプロテインＡクロマトグラフィー媒体上に浄化されたフィードを充填する。
【００５７】
プロテインＡクロマトグラフィーは、一般的には、その上に固定化された適切なプロテインＡリガンドを有する固体支持体、例えば、多孔性ビーズまたは樹脂等を使用する。ついで、プロテインＡ結合固体支持体は、クロマトグラフィーカラムに充填される。まず、カラムは、適切な平衡化バッファーにより平衡化され得る。これは、通常、３から１０カラム容量（ＣＶ）の中性ｐＨバッファー、例えば、リン酸緩衝生理食塩水またはＴｒｉｓバッファーを、ｐＨ７から７．５において、プロテインＡ樹脂を通過させて流すことにより達成される。ついで、ターゲットタンパク質を含む浄化されたフィードは、ターゲットタンパク質を含むサンプル（例えば、ターゲットタンパク質を含む浄化された細胞培養物フィード）をカラムに充填することにより、カラム中の固体支持体と接触される。充填される浄化フィードの量は、フィード中のＦｃ含有タンパク質の濃度（力価）および設定された流速におけるプロテインＡ樹脂に対するＦｃ含有タンパク質の結合能により決定される。典型的には、可溶性の不純物、例えば、宿主細胞のタンパク質およびＤＮＡは、プロテインＡには結合しないため、通過画分に除去され、廃棄物になる。充填が完了した後、カラムは、多くの場合、１から３種類のバッファーにより洗浄されて、緩く結合している不純物を除去する。この不純物は、プロテインＡ樹脂へのターゲットタンパク質の結合を妨害しない。この工程は、中間洗浄工程とも呼ばれる。この工程は、ターゲットタンパク質が、（例えば、２．５から４．５のｐＨを有する。）溶出バッファーを使用して、プロテインＡカラムからその後に溶出される際に、ターゲットタンパク質の純度を、さらに改善する。一般的な溶出バッファーは、酢酸およびクエン酸、ｐＨ２．５から４．５である。溶出用の典型的な流速は、６０カラム容量（ＣＶ）／時間から５ＣＶ／時間の範囲である。勾配溶出の場合、典型的には、溶出は、５から６０カラム容量にわたって行われる。一部の実施形態では、高ｐＨバッファーおよび低ｐＨバッファーが混合されて、ｐＨ７．０から３．０の範囲のｐＨ勾配を生成する。一部の実施形態では、ｐＨ勾配は、７．０または約６．８または約６．６または約６．４または約６．２または約６．０または約５．８または約５．６または約５．４または約５．２または約５．０または約４．８または約４．６または約４．４または約４．２または約４．０で開始し、ｐＨ勾配は、３．０または約３．２または約３．４または約３．６または約３．８で終了する。
【００５８】
平衡化、充填、洗浄および溶出の工程は、サイクルまたは結合および溶出サイクルを構成する。典型的なプロテインＡ精製サイクルのこの結合および溶出サイクルの後には、通常、カラム上の微少レベルの不純物を除去する洗浄工程、続けて、別の結合および溶出サイクルが行われる。典型的な精製キャンペーンは、次々と行われる複数回の結合および溶出サイクル、およびサイクル間または各サイクル後に行われる洗浄工程を構成する。
【００５９】
プロテインＡ親和性樹脂の洗浄は、樹脂が樹脂の寿命全体を通して一致して精製を行うことを確保するために、即ち、樹脂の結合能を保持するために、一般的には、各サイクル後に実施される。（１）プロテインＡ樹脂は、イオン交換樹脂または疎水性相互作用（ＨＩＣ）樹脂と比較して、高い初期コストを有すること、および；（２）プロテインＡクロマトグラフィー樹脂は、典型的には、より高いレベルの不純物を含む浄化された細胞培養物に暴露される、という２つの理由のために、洗浄は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に、特に重要である。従って、一部の残留した不純物は、プロテインＡ樹脂に結合し得、これにより、樹脂の再利用に基づいて、結合能の損失または溶出プールの不純物の増大をもたらす。このことは、（結合能の低下による）低下した生産性およびより低い生成物純度をもたらすため、製造現場において非常に望ましくない。このため、各プロテインＡ結合および溶出サイクル後のルーチンな洗浄は、一致した生成物純度およびプロセススループットをもたらす一致した樹脂性能を確保するのに重要である。
【００６０】
洗浄は、典型的には、極端なｐＨ、例えば、２つの一般的に使用される洗浄試薬である、０．１５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４（ｐＨ  １．５）または０．１Ｍ  ＮａＯＨ（ｐＨ＝１３）を使用して達成される。例えば、０．１５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４は、ＰｒｏＳｅｐ（Ｒ）ファミリーのプロテインＡ親和性樹脂に推奨および使用されている。Ｈ３ＰＯ４洗浄の利点は、プロテインＡ樹脂の結合能を犠牲にすることなく、Ｈ３ＰＯ４が樹脂を洗浄することである。一方、０．１Ｍ  ＮａＯＨは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（Ｒ）ファミリーのプロテインＡ親和性樹脂に推奨および使用されている。ただし、アルカリ性溶液、例えば、ＮａＯＨは、タンパク質リガンドの脱アミノ化により、潜在的に、プロテインＡ樹脂の結合能を経時的に低下させ得る。
【００６１】
本明細書に記載された一部の実施形態では、洗浄は、酸性溶液およびアルカリ性溶液の両方を使用して行われる。一部の実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、各サイクル後に、酸性溶液およびアルカリ性溶液の両方と接触される。他の実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、酸性溶液およびアルカリ性溶液が、精製キャンペーンを通して、交互に使用されるように、一サイクル後に、酸性溶液またはアルカリ性溶液のいずれかと接触される。例えば、クロマトグラフィーカラムが、第１のサイクル後に、アルカリ性溶液と接触される場合、ついで、クロマトグラフィーカラムは、第２のサイクル後に、酸性溶液と接触され、続けて、第３のサイクル後に再度、アルカリ性溶液と接触される等である。逆に、クロマトグラフィーカラムが、第１のサイクル後に、酸性溶液と接触される場合、ついで、クロマトグラフィーカラムは、第２のサイクル後に、アルカリ性溶液と接触され、続けて、第３のサイクル後に、酸性溶液と接触される等である。
【００６２】
洗浄用の酸性溶液およびアルカリ性溶液の使用は、酸性溶液またはアルカリ性溶液のみの使用に比較して、不純物の相乗的な除去をもたらす。即ち、洗浄用の酸性溶液およびアルカリ性溶液の両方の使用（本明細書に記載されたように、サイクル後の両方の使用、または、交互での使用）は、精製過程を通して、酸性洗浄単独またはアルカリ性洗浄単独だけの使用による除去の合計より、高い不純物の除去をもたらす。理論に拘束されるものではないが、酸性およびアルカリ性の各溶液は、異なる種類の不純物を除去することが考察される。
【００６３】
ＩＩＩ．本明細書に記載された方法に使用される典型的なリガンド
本発明に基づく方法は、プロテインＡのＣドメインに基づくプロテインＡリガンドを使用する。一部の実施形態では、本明細書に記載された方法に使用されるリガンドは、配列番号１に説明されたアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％または少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％またはそれ以上同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載された方法に使用されるプロテインＡリガンドは、配列番号３に説明されたアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本明細書に記載された方法に使用されるプロテインＡリガンドは、配列番号４に説明されたアミノ酸配列を含む。Ｆｃ含有タンパク質に結合する、これらの配列の変異体、フラグメントおよび誘導体も、本発明に包含される。
【００６４】
ＩＶ．本明細書に記載された方法に使用される典型的な固体支持体
一部の実施形態では、本明細書に記載された方法に使用されるプロテインＡリガンドは、支持体、例えば、固体支持体または可溶性支持体に固定化されて、生体分子、例えば、免疫グロブリンおよび他のＦｃ含有タンパク質等の分離に適した、親和性クロマトグラフィー媒体または樹脂を生成する。
【００６５】
典型的な固体支持体としては、合成ポリマー、例えば、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリカーボネートに基づくものが挙げられる。
【００６６】
典型的な固体支持体の形式としては、制限されず、ビーズ（球形または不規則）、中空繊維、中まで詰まった繊維、パッド、ゲル、膜、カセット、カラム、チップ、スライド、プレートまたはモノリスが挙げられる。
【００６７】
任意の適切な技術が、本明細書に記載されたリガンドを、固体支持体に付着させるのに使用され得る。例えば、一部の実施形態では、リガンドは、例えば、リガンドに存在するアミノおよび／またはカルボキシ基を使用する従来のカップリング技術により、固体支持体に付着していてもよい。例えば、ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、ＣＮＢｒ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等が、周知のカップリング試薬である。一部の実施形態では、スペーサは、固体支持体とリガンドとの間に導入される。スペーサは、リガンドの利用能を改善し、リガンドの支持体への化学的カップリングを容易にする。
【００６８】
本発明に包含される一部の実施形態では、リガンド上の２つ以上の部位が、このような固体支持体に付着している（即ち、多点付着）。
【００６９】
一般的には、プロテインＡ系クロマトグラフィーリガンドの固体支持体への付着は、多くの種々の方法により達成され得る。これらのほとんどは、当分野において周知であり、本明細書に記載されたものである。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５１−１３６（１９９２）を参照のこと。
【００７０】
Ｖ．プロテインＡクロマトグラフィーカラムの洗浄および衛生化
クロマトグラフィーカラムの洗浄は、カラム性能を維持し、カラムの寿命を延ばすのに、各サイクル後に一般的に使用される実務である。通常、各ランが完了した後、洗浄液が、カラムに１５から３０分間充填され、続けて、再平衡化バッファーまたは（カラムが保存準備されている場合）衛生化バッファーが充填される。一般的な洗浄液は、０．０５から０．３Ｍ  ＮａＯＨまたは０．１５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４である。洗浄中の流速は、典型的には、使用される具体的な樹脂およびクロマトグラフィーシステムに基づいて決定される。ＮａＯＨが、生物薬学産業において一般的に使用される洗浄液であるが、酸性溶液、例えば、０．１５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４も、汚染を効果的に除去することができ、特定の例において使用される。
【００７１】
プロテインＡクロマトグラフィーについて、ＰｒｏＳｅｐ（Ｒ）ファミリーの製品を洗浄するのに、Ｈ３ＰＯ４を使用するのが一般的である。一方、ＮａＯＨは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（Ｒ）ファミリーの製品の洗浄に使用される。ただし、最も商業的に利用可能なプロテインＡ媒体は、アルカリ性溶液または酸性溶液のいずれかでのみ洗浄され得る。
【００７２】
しかしながら、本明細書に記載された方法の場合には、固体支持体上に固定化された、スタフィロコッカス  アウレウスのＣドメインに基づくプロテインＡ樹脂は、酸性溶液およびアルカリ性溶液の両方を使用して洗浄され得る。アルカリ性溶液および酸性溶液の両方を使用することは、各溶液個々と比較して、望ましくない不純物の相乗的な除去をもたらす。
【００７３】
クロマトグラフィーカラムの衛生化は、カラムがキャンペーンに使用された後で、カラムが保存準備される前に、一般的に行われる。衛生化溶液は、予め設定された流速で、３から５カラム容量で、カラム上に充填される。ついで、流れが止められ、サニタントについての設定時間が、目的の微生物殺菌を達成するこの方法を行うのを可能にする。ついで、サニタントは、保存バッファーにより置き換えられ、カラムは、保存準備される。ＮａＯＨは、イオン交換および疎水性相互作用のクロマトグラフィーについての一般的なサニタントであるが、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーにはほとんど耐久性がない。ＮａＯＨは、タンパク質上のアスパラギンを攻撃するのが公知であり、同攻撃は、タンパク質の分解をもたらす。プロテインＡリガンドも例外ではない。アスパラギンを変異させることにより、プロテインＡリガンドのアルカリ安定性を改善する努力がなされてきた。しかしながら、野生型に比較してより遅い速度の場合のみ、ＮａＯＨは、プロテインＡを分解してしまう。このことは、ＮａＯＨ（０．１から０．３Ｍ）による１５から３０分間での洗浄と比較して、衛生化はより長い期間（即ち、３から４時間）で、より高い濃度のＮａＯＨ（０．５Ｍ）を必要とするため、特に、衛生化の場合に問題となる。
【００７４】
ＰＡＢと呼ばれる、より効果的な衛生化溶液が、本明細書に記載されている。ＰＡＢは、１２０ｍＭ  リン酸、１６７ｍＭ  酢酸、２．２％  ベンジルアルコールからなる。ＰＡＢは、微生物を効果的に素早く殺菌する。ＰＡＢは、ＰｒｏＳｅｐ（Ｒ）ファミリーの製品に使用されることが以前に記載されている。この製品は、酸性溶液を使用してのみ洗浄されることができ、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈとＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎとにより共同開発された（Ｍ．Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  １２１６（２００９）４５８９−４５９６）。
【００７５】
本発明は、下記実施例によりさらに例示される。下記実施例は、限定として解釈されるべきものではない。この出願および図面全体を通して引用された、全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００７６】
［実施例１］
ＳｐＡリガンドの生成
配列番号３および配列番号４に説明されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする合成遺伝子が、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）から取得される。各合成遺伝子の５’端は、開始メチオニンについてのコドンを含む。各遺伝子の５’および３’端はそれぞれ、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を含む。これらの合成遺伝子および使用される発現ベクター、即ち、ｐＥＴ１１ａ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）により消化し、ＤＮＡフラグメントを、０．７％  アガロースＴＡＥゲル上で分離し、適切なＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡＧＥＮ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）からのゲル抽出キットを使用して、切除および精製する。精製したインサートを、ｐＥＴ１１ａまたは任意の他の適切な発現ベクターの骨格内に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用してライゲートする。
【００７７】
ライゲーション反応物を、メーカーの説明書通りに、ＤＨ５α（コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内に形質転換し、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンを含むＴｅｃｈｎｏｖａ  ＬＢ培地上に播種し、３７℃で一晩インキュベートする。精製したＤＮＡを得るために、個々のコロニーを選び、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンを含むＬＢ培地中で、一晩培養する。ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）からのスピンミニプレップキットを使用して精製する。組換えプラスミドの特定を、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用する制限消化分析により確認する。
【００７８】
［実施例２］
ＳｐＡ系リガンドの発現および精製
任意の適切な微生物発現系が、本明細書に記載された種々のＳｐＡリガンドを発現させるのに使用され得る。例えば、このタンパク質は、ｐＥＴベクター、例えば、ｐＥＴ１１ａ（ＥＭＤ）を使用して、大腸菌株、例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ＰＲＯＭＥＧＡ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）中で発現されてもよい。
【００７９】
単一コロニーを、プレートから選択し、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンを含むＬＢ培地中において、３７℃で一晩増殖させる。一晩培養物は、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンを含む新たなＬＢ培地中で、１００倍希釈し、６００ｎｍでの光学密度が約０．８となる細胞密度に増殖させる。１ｍＭ  イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシドの添加後に、細胞を、さらに２時間増殖させる。発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびウェスタンブロットにより確認する。
【００８０】
細胞を、遠心分離（４０００ｒｐｍ、４℃、５分）により収集し、２０ｍＭ  イミダゾールを含む、３ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁する。細胞を、超音波処理により溶解する。細胞の残骸を、遠心分離（４０００ｒｐｍ、４℃、３０分）によりペレット化する。ＳｐＡリガンドを、５０ｍＬのＩｇＧ親和性樹脂（制御された細孔ガラス上に固定されているポリクローナルｈＩｇＧ）を使用し、５００ｍＬの細胞ライゼートをアプライして精製する。カラムを、３０ｍＬのリン酸緩衝整理食塩水で洗浄する。ＳｐＡを、０．１Ｍ  クエン酸、ｐＨ３中で溶出する。ＳｐＡを、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（Ｒ）水（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）中で一晩透析する。タンパク質濃度を、理論的な吸光係数（Ｐａｃｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４：２４１１（１９９５）に基づいて、ＵＶ分光計を使用して確認する。
【００８１】
［実施例３］
ＳｐＡ系リガンドの固体支持体への付着
実施例１および２に記載されたように、種々のリガンドの生成および発現後に、リガンドを、多点付着により、固体支持体に固定する。
【００８２】
典型的な実験では、プロテインＡリガンド（配列番号３に説明されたアミノ酸配列、１０から２０ｍｇ／ｍＬ）を、１から１．１Ｍ  Ｎａ２ＳＯ４の存在下において、ポリビニルエーテル固体支持体（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ  ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ）を、固体支持体上のエポキシ基とリガンド上の数多くのアミノ基との反応により、架橋して一晩固定する（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｔ．ａｌ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２，ｐａｇｅ  １１８）。この樹脂を、樹脂Ａと指定する。
【００８３】
配列番号４に説明されたアミノ酸配列を有するリガンドおよびネイティブなプロテインＰ（Ｌｏｎｚａ，Ｌｔｄ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のカップリング法は、上記方法に類似する。対応する樹脂を、樹脂Ｂおよび樹脂Ｃと指定する。
【００８４】
［実施例４］
酸性溶液およびアルカリ性溶液への樹脂Ａ、ＢおよびＣの長期暴露
この実験において、上記した樹脂Ａ、ＢおよびＣをそれぞれ、種々の酸性溶液およびアルカリ性溶液に暴露する。下記溶液：ＨＣｌ（０．３％、ｖ／ｖ）、ｐＨ１．５；Ｈ３ＰＯ４（０．１５Ｍ）、ｐＨ１．５；０．１Ｍ  ＮａＯＨおよび０．５Ｍ  ＮａＯＨが調製される。
【００８５】
樹脂Ａ、ＢおよびＣ（２ｍＬの各樹脂が、各溶液条件についてダプリケートで使用される。）は、５”使い捨てカラム（Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）内に移され、前述の溶液の１つにおいて、５分間慣らされる。溶液は、真空により除去され、樹脂は、１５ｍＬのポリプロピレン製コニカルチューブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に移され、続けて、１０ｍＬの対応する溶液を添加する。対応する溶液中での樹脂スラリーのチューブが、ＬａｂＱｕａｋｅ（Ｒ）回転機（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に、室温で２５時間装填され、続けて、Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ  ５”使い捨てカラム中で５回洗浄され、４ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ（Ｒ）水（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で３回洗浄される。
【００８６】
【表１】
0006306189.tif 000002
【００８７】
［実施例５］
長期のアルカリおよび酸暴露前後での、樹脂Ａ、ＢおよびＣの静的結合能評価
この実験では、（１ｍＬ容量における）樹脂Ａ、ＢおよびＣそれぞれを、コントロールサンプルと共に、０．３％  ＨＣｌ；０．１５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４；０．１Ｍ  ＮａＯＨ；または０．５Ｍ  ＮａＯＨに暴露し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０％  エタノールの保存バッファー中に保存し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（Ｒ）水（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）中で、１０％スラリーに調製する。１ｍＬの各樹脂スラリーを、１０ｍＭ  リン酸緩衝生理食塩水中において、１５ｍＬのポリクローナルＩｇＧ（ＳＥＲＡＣＡＲＥ、１ｍｇ／ｍＬ）に添加し、室温で４時間穏やかに混合する。２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光の低下を、酸またはアルカリ暴露前後における、樹脂ＩｇＧ結合能を算出するのに使用する。保持されたＩｇＧ結合能の割合を、酸またはアルカリ暴露後のＩｇＧ結合能を、酸またはアルカリ条件に暴露されていないコントロールサンプルの同結合能で割ることにより算出する。
【００８８】
図１は、このような実験の結果を示す。３つ全ての樹脂サンプルは、０．３％  ＨＣｌまたは０．１５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４のいずれかに対する２５時間の暴露に対し、コントロールに対して最初の結合能の９５％を上回る保持を示す。樹脂ＡおよびＢは、０．１Ｍ  ＮａＯＨへの暴露に対し、コントロールに対して９５％を上回る結合能を保持しており、０．５Ｍ  ＮａＯＨへの暴露に対し、コントロールに対して約７５％の結合能を保持している。樹脂Ｃは、０．１Ｍ  ＮａＯＨへの暴露に対し、コントロールに対して約６５％の結合能を保持しており、０．５Ｍ  ＮａＯＨへの暴露に対し、コントロールに対して約３８％の結合能を保持している。試験の標準偏差は、約１から３％である。このため、樹脂ＡおよびＢのアルカリ溶液暴露に対して保持された結合能は、同等と考えられる。
【００８９】
［実施例６］
長期の酸暴露前後での樹脂Ｂの動的結合能評価
この実験では、市販のポリクローナルＩｇＧを使用して樹脂の動的能力を試験するための標準的な方法を使用する。簡潔に、本発明に基づく樹脂Ｂを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｗ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＴＤＡ、ｐＨ７．２（ＥＱバッファー）中のＯｍｎｉｆｉｔカラム（６．６ｍｍ×５０ｍｍ）内に充填する。流速を、１００ｃｍ／時間に設定する。充填したカラムを、１０カラム容量（ＣＶ）のＥＱバッファーで平衡化する。ＵＶ２８０ｎｍが、最初のＩｇＧ濃度の５０％超に達するまで、ポリクローナルＩｇＧ（Ｓｅｒａｃａｒｅ、ＥＱバッファーにおける２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２）を、カラム上に充填する。平衡化バッファーによる洗浄後、ＩｇＧを、０．１Ｍ酢酸、ｐＨ３．０で溶出する。最初のランのＥＱバッファーを使用するカラム平衡化後に、樹脂を、０．１５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を使用して、流速５０ｃｍ／時間で２５時間洗浄し、続けて、更なるＩｇＧ動的能力を測定する。０．１５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４への更なる２５時間の暴露を行い、続けて、３回目の動的結合能測定を行う。暴露サイクルを、１５分間の暴露として定義する。従って、２５時間の暴露は、合計１００サイクルを表現している。２回の２５時間暴露は、合計２００サイクルの暴露を表現する。
【００９０】
１０％ブレークスルーでの動的結合能を、ＵＶ２８０ｎｍが最初のＩｇＧ濃度の１０％に達した時点での、充填したＩｇＧ量に基づいて算出する。２５時間および５０時間の暴露前後で測定した動的結合能を比較し、図２に示す。０．１５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４への２００サイクル（１５分／サイクル）の暴露に対する樹脂の動的結合能において、顕著な変化は観察されない。
【００９１】
［実施例７］
長期のアルカリ暴露前後での樹脂Ｂの動的結合能評価
この実験では、市販のポリクローナルＩｇＧを使用して樹脂の動的能力を試験するための標準的な方法を使用する。簡潔に、本発明に基づく樹脂Ｂを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｗ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＴＤＡ、ｐＨ７．２中のＯｍｎｉｆｉｔカラム（６．６ｍｍ×５０ｍｍ）内に充填する。流速を、１００ｃｍ／時間に設定する。充填したカラムを、１０カラム容量（ＣＶ）のＥＱバッファーで平衡化する。ＵＶ２８０ｎｍが、最初のＩｇＧ濃度の５０％超に達するまで、ポリクローナルＩｇＧ（Ｓｅｒａｃａｒｅ、ＥＱバッファーにおける２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２）を、カラム上に充填する。平衡化バッファーによる洗浄後、ＩｇＧを、０．１Ｍ酢酸、ｐＨ３．０で溶出する。最初のランのＥＱバッファーを使用するカラム平衡化後に、樹脂を、０．１Ｍ  ＮａＯＨを使用して、流速５０ｃｍ／時間で２５時間洗浄し、続けて、更なるＩｇＧ動的能力を測定する。０．１Ｍ  ＮａＯＨへの更なる２５時間の暴露を行い、続けて、３回目の動的結合能測定を行う。暴露サイクルを、１５分間の暴露として定義する。従って、２５時間の暴露は、合計１００サイクルを表現している。２回の２５時間暴露は、合計２００サイクルの暴露を表現する。暴露サイクルを、１５分間の暴露として定義する。このため、２５時間の暴露は、合計１００サイクルを表現している。
【００９２】
１０％の動的結合能を、ＵＶ２８０ｎｍが最初のＩｇＧ濃度の１０％に達した時点での、充填したＩｇＧ量に基づいて算出する。２５時間および５０時間の暴露前後で測定された動的結合能を比較し、図２に示す。０．１Ｍ  ＮａＯＨへの２００サイクル（１５分／サイクル）の暴露に対する樹脂の動的結合能において、顕著な変化は観察されない。
【００９３】
［実施例８］
交互法における長期の酸およびアルカリ暴露前後での樹脂Ｂの動的結合能評価
この実験では、市販のポリクローナルＩｇＧを使用して樹脂の動的能力を試験するための標準的な方法を使用する。簡潔に、本発明に基づく樹脂Ｂを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｗ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＴＤＡ、ｐＨ７．２中のＯｍｎｉｆｉｔカラム（６．６ｍｍ×５０ｍｍ）内に充填する。流速を、１００ｃｍ／時間に設定する。充填したカラムを、１０カラム容量（ＣＶ）のＥＱバッファーで平衡化する。ＵＶ２８０ｎｍが、最初のＩｇＧ濃度の５０％超に達するまで、ポリクローナルＩｇＧ（Ｓｅｒａｃａｒｅ、ＥＱバッファーにおける２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２）を、カラム上に充填する。平衡化バッファーによる洗浄後、ＩｇＧを、０．１Ｍ酢酸、ｐＨ３．０で溶出する。最初のランのＥＱバッファーを使用するカラム平衡化後に、まず、樹脂を、０．１Ｍ  ＮａＯＨを使用して、流速５０ｃｍ／時間で、２．５時間（各１５分の１０サイクル）洗浄し、続けて、中性のＥＱバッファーに３０分間暴露する。これを、工程１と呼ぶ。その後、樹脂を、０．１５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を使用して、流速５０ｃｍ／時間で、２．５時間洗浄し、続けて、ＥＱバッファーに３０分間暴露する。これを、工程２と呼ぶ。ついで、工程１および２を、もう４回繰り返し、２５時間または１００サイクルの合計酸およびアルカリ暴露に達することにより、交互に酸およびアルカリ条件に樹脂を暴露する。その後、更なるＩｇＧ動的能力測定を行い、続けて、上記した交互の０．１Ｍ  ＮａＯＨおよび０．１５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４への更なる２５時間の暴露を行う。この後、更なる動的結合能測定を行う。１０％の動的結合能を、ＵＶ２８０ｎｍが最初のＩｇＧ濃度の１０％に達した時点での、充填したＩｇＧ量に基づいて算出する。２５時間および５０時間の交互の酸およびアルカリ暴露前後で測定された動的結合能を比較し、図２に示す。リン酸およびＮａＯＨへの合計２００サイクル（１５分／サイクル）の交互暴露に対する樹脂の動的結合能において、顕著な変化は観察されない。
【００９４】
［実施例９］
長期の酸暴露後、長期のアルカリ暴露後ならびに長期の酸およびアルカリ暴露後の樹脂Ｂにより得られた生成物の純度
ポリクローナルＩｇＧ（Ｓｅｒａｃａｒｅ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を、非発現ＣＨＯ−Ｓフィード（Ｘｃｅｌｌｅｒｅｘ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）に添加し、０．２２μｍの滅菌フィルタを通してろ過する。ろ過したフィード中の最終的なＩｇＧ濃度は、３．５ｍｇ／ｍＬである。このフィードを、実施例６（酸暴露）、７（アルカリ暴露）および８（酸およびアルカリの交互暴露）からのクロマトグラフィーカラム、ならびに、保存溶液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０％エタノール）中の樹脂Ｂが充填したコントロールカラム上に、樹脂１ｍＬあたり２０ｍｇのＩｇＧにおいて、４分の滞留時間で充填する。樹脂を、０．１Ｍ  クエン酸塩、ｐＨ５．５で洗浄し、０．１Ｍ  酢酸、ｐＨ３．０で溶出する。溶出プールを、Ｃｙｇｎｕｓ（Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ）３Ｇ  ＣＨＯ−Ｓ  ＥＬＩＳＡキットを使用して、宿主細胞タンパク質レベルについて分析する。生成物の純度を、以下の表２に示す。
【００９５】
これらのサンプルの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は全て低いが、交互の酸およびアルカリ溶液で洗浄されている樹脂サンプルは、溶出プールにおける最も低いレベルのＨＣＰを示す。これは、おそらく、酸およびアルカリ洗浄の相乗的な洗浄効果によるものである。
【００９６】
【表２】
0006306189.tif 000003
【００９７】
［実施例１０］
ＰＡＢ溶液への暴露に対して保持された樹脂の静的結合能研究
樹脂ＡおよびＢ（各５ｍＬ、各条件についてダプリケートで使用される。）を、ＰＡＢ溶液（１２０ｍＭ  リン酸、１６７ｍＭ  酢酸、２．２％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール）中に、４時間または２４時間のいずれかで浸す。ついで、ＰＡＢ浸漬樹脂サンプルを、直ちにリン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）により、２カラム容量で少なくとも３回フラッシュする。ついで、樹脂を、１ｍＬ容量のＭｉｌｌｉ−Ｑ（Ｒ）水（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に添加し、ついで、１０％スラリーに調製する。１ｍＬのこのスラリーを、１０ｍＭ  リン酸緩衝生理食塩水中において、１５ｍＬのポリクローナルＩｇＧ（ＳＥＲＡＣＡＲＥ、１ｍｇ／ｍＬ）に添加し、室温で４時間回転させる。２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光の低下を、ＰＡＢ暴露前後における能力を算出するのに使用する。保持されたＩｇＧ結合能を、４時間および２４時間でのＰＡＢ暴露後のＩｇＧ結合能を、ＰＡＢに暴露されていないコントロールの同結合能で割ることにより算出する。表３に示されたように、４時間および２４時間の暴露後に、静的結合能における顕著な変化は観察されない。
【００９８】
【表３】
0006306189.tif 000004
【００９９】
［実施例１１］
非発現ＣＨＯフィードによる樹脂ＡおよびＢの洗浄研究
浄化した細胞培養物に暴露したプロテインＡ樹脂についてのＨ３ＰＯ４およびＮａＯＨの洗浄能は、Ｈ３ＰＯ４が極端に酸性であり、一方、ＮａＯＨが非常にアルカリ性であるため、おそらく異なる。
【０１００】
洗浄能における差異を試験し、Ｈ３ＰＯ４およびＮａＯＨ洗浄後に汚損されたプロテインＡ樹脂に残ったものに基づいて比較する。
【０１０１】
非発現ＣＨＯ−Ｓの浄化された細胞培養物を、酸またはアルカリの溶液の洗浄能を理解するために、樹脂ＡおよびＢで充填したカラムを汚損させるのに使用する。樹脂ＡおよびＢを、Ｏｍｎｉｆｉｔカラム（内径６．６ｍｍ×ベッド高さ３ｃｍ）内に、各２つのカラム（樹脂Ａの２つのカラムおよび樹脂Ｂの２つのカラム）で充填する。この試験の流速を、１００ｃｍ／時間で設定する。４つ全てのカラムを、本明細書に記載されたＥＱバッファーで平衡化し、細胞培養物溶液で２４時間充填および再循環する。１セットの樹脂ＡおよびＢを含むカラムを、０．１Ｍ  ＮａＯＨで３０分間洗浄し、ついで、ＥＱバッファーで３０分間再度平衡化する。他のセットの樹脂ＡおよびＢを含むカラムを、０．１５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４、ｐＨ１．５で３０分間洗浄し、ついで、ＥＱバッファーで３０分間再平衡化する。ついで、各カラムの上部１ｃｍにおける樹脂を、分析用に取り出す。
【０１０２】
［実施例１２］
実施例１１からの抽出物の樹脂抽出および分析
実施例１１におけるカラムの上部からの樹脂を、平衡化バッファーでさらに洗浄し、ｐＨ７．０、５０℃での２０ｍＭ  Ｔｒｉｓにおける２％  ＳＤＳで、２５０ｒｐｍでのインキュベータ中で一晩抽出する。翌日、サンプルを、微量遠心分機において、１３５００ｒｐｍでスピンする。
【０１０３】
ついで、ＳＤＳを除去し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ装置（３ＫＤ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して、少なくとも５回のバッファー交換後に、平衡化バッファーに交換する。少量のバッファー交換済み樹脂抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、２Ｄゲルおよび／またはＬＣ−ＭＳにより分析する。
【０１０４】
観察されたように、樹脂Ａについて、酸洗浄およびアルカリ洗浄は、異なる宿主タンパク質種を異なる程度で除去する。このことは、酸およびアルカリでの洗浄がそれぞれ、汚損されたカラムから、異なる不純物を除去し得ることを証明している。従って、酸性溶液、例えば、Ｈ３ＰＯ４およびアルカリ性溶液、例えば、ＮａＯＨにより交互洗浄は、プロテインＡカラムの不純物の相乗的除去およびより効果的な洗浄効果をもたらすため、カラムの寿命を延ばす。
【０１０５】
本明細書は、本明細書内で引用された参考文献の教示を考慮して、最も完全に理解される。同参考文献は、参照により組み込まれる。本明細書内の実施形態は、本発明における実施形態の例示を提供し、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。多くの他の実施形態が本発明に包含されることは、当業者であれば容易に理解する。全ての刊行物および発明は、その全体が参照により包含される。参照により組み込まれた資料が本明細書を否定する、または、本明細書と矛盾する限りにおいて、本明細書が、任意のこのような資料に取って代わるものとする。本明細書における任意の参考文献の引用は、このような参考文献が本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。
【０１０６】
別段の指示がない限り、特許請求の範囲を含む本明細書に使用される成分、細胞培養物、処理条件等の量を現す全ての数は、全ての事例において、「約」という用語により修飾されると理解されたい。従って、別段の指示がない限り、数的パラメータは、近似であり、本発明により得られるべき求められた所望の特性に応じて変動し得る。別段の指示がない限り、一連の要素に先立つ「少なくとも」という用語は、この一連における全ての要素を意味すると理解されたい。通例の実験により、本明細書に記載された発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を、当業者であれば理解するか、または、確認可能である。このような均等物は、下記特許請求の範囲に含むものとする。
【０１０７】
当業者に明らかであるように、発明の精神および範囲を逸脱することなく本発明の多くの修飾および変更を加える事ができる。本明細書に記載された特定の実施形態は、例示としてのみ提供され、何ら限定するものではない。明細書および実施例は、例示としてのみ考えられ、本発明の真の範囲および精神は、下記特許請求の範囲により示されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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