(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸の産生のための組換え微生物細胞であって、
（ａ）アシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）活性を有する少なくとも１つのポリペプチドであり、ここで該ＬＰＣＡＴ活性を有するポリペプチドは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号４（ＹｌＬＰＣＡＴ）のポリペプチドに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有し、そして前記ＬＰＣＡＴ活性を有するポリペプチドは、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの突然変異膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを含むポリペプチドであり、ここで、配列番号３９の２位のアミノ酸残基がＣであり、３位のアミノ酸残基が、Ａ、ＣおよびＧから選択され、６位のアミノ酸残基が、Ｈ、Ｇ、ＮおよびＹから選択され、７位のアミノ酸残基が、Ａ、Ｎ、Ｇ、ＨおよびＭから選択され、１６位のアミノ酸残基が、Ｑ、ＮおよびＨから選択され、そして１７位のアミノ酸残基が、Ａ、ＶおよびＮから選択される、ポリペプチド；
（ｂ）リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）活性を有する少なくとも１つのポリペプチドであり、ここで該ＰＤＡＴ活性を有するポリペプチドは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号３２（ＹｌＰＤＡＴ）のポリペプチドに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド；および
（ｃ）少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生し得る多価不飽和脂肪酸生合成経路
を含み、
ここで（ａ）および（ｂ）の前記ポリペプチドは発現され、（ａ）および（ｂ）の前記ポリペプチドが発現されない組換え微生物細胞である対照細胞と比較して増加量の、総脂肪酸の重量パーセントとして計測される多価不飽和脂肪酸を含む組換え微生物細胞。
【請求項２】
前記対照細胞と比較して以下：
（ｉ）増加したＣ１８からＣ２０への伸長変換効率または
（ｉｉ）増加量の、乾燥細胞重量の重量パーセントとして計測される総脂肪酸
の少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
【請求項３】
前記増加したＣ１８からＣ２０への伸長変換効率は、増加したΔ９エロンガーゼ変換効率または増加したΔ６エロンガーゼ変換効率の効果である、請求項２に記載の組換え微生物細胞。
【請求項４】
前記長鎖多価不飽和脂肪酸は、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
【請求項５】
藻類、酵母、ユーグレナ、ストラメノパイル、卵菌および真菌からなる群から選択される、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
【請求項６】
油性酵母である、請求項５に記載の組換え微生物細胞。
【請求項７】
前記油性酵母は、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のものである、請求項６に記載の組換え微生物細胞。
【請求項８】
前記ＬＰＣＡＴ活性を有するポリペプチドは、（ｉ）配列番号４（ＹｌＬＰＣＡＴ）のポリペプチドに対して少なくとも９７％同一であり、そして（ｉｉ）配列番号４の１３６位のアミノ酸残基および３８９位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基において置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
【請求項９】
前記１３６位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基は、セリンまたはバリンで置換され、前記３８９位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基は、アラニン、システインまたはセリンで置換されている、請求項８に記載の組換え微生物細胞。
【請求項１０】
少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸の産生を改善する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の組換え微生物細胞を発酵性炭素源の存在下で生育させること
を含む方法。
【請求項１１】
（ｂ）前記長鎖多価不飽和脂肪酸を回収すること
をさらに含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換え微生物細胞は、油性酵母であり、前記長鎖多価不飽和脂肪酸は、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される、請求項１０または１１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記油性酵母は、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のものである、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、両方とも参照により全体として本明細書に援用されるそれぞれ２０１２年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／６６１，６１５号明細書および米国仮特許出願第６１／６６１，６２３号明細書の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、バイオテクノロジーの分野におけるものである。より具体的には、本発明は、組換え微生物細胞中での長鎖多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］の産生を改善する手段としてのアシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列およびリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列の両方の過剰発現に関する。
【背景技術】
【０００３】
生体膜の主な構成要素であるグリセロリン脂質は、ｓｎ−１位およびｓｎ−２位においてＲ基として付着している脂肪酸と、ｓｎ−３位においてホスホジエステル結合を介して結合している極性頭部基とを有するグリセロールコアを含有する。規定の極性頭部基は、特定のグリセロリン脂質に与えられる名称を決定する（例えば、コリン頭部基は、ホスファチジルコリンをもたらす）。グリセロリン脂質は、様々なホスホリル頭部基から生じるだけでなく、その脂肪酸の種々の鎖長および飽和度の結果としての著しい多様性を有する。一般に、飽和および一価不飽和脂肪酸はｓｎ−１位においてエステル化される一方、多価不飽和脂肪酸はｓｎ−２位においてエステル化される。
【０００４】
グリセロリン脂質生合成は、特許文献１にまとめられており、種々のアシルトランスフェラーゼ、例としてグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）［Ｅ．Ｃ．２．３．１．１５］、アシルＣｏＡ：リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）［Ｅ．Ｃ．２．３．１．５１］、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）［Ｅ．Ｃ．２．３．１．２０］およびリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）［Ｅ．Ｃ．２．３．１．１５８］を要求する。
【０００５】
これらのデノボ合成後、グリセロリン脂質は、ｓｎ−２位において脂肪酸アシル組成の急速な代謝回転を受け得る。この「リモデリング」または「アシルエディティング」は、膜構造および機能、ストレス条件に対する生物学的応答ならびにバイオテクノロジー的応用における脂肪酸組成および量の操作に重要である。具体的には、リモデリングは、グリセロリン脂質の脱アシル化および再アシル化の組合せに起因する。例えば、Ｌａｎｄｓサイクル（非特許文献１）において、リモデリングは、１）ホスファチジルコリンのｓｎ−２位から脂肪酸を放出するホスホリパーゼ、例えばホスホリパーゼＡ２および；２）ｓｎ−２位においてリゾホスファチジルコリン［「ＬＰＣ」］を再アシル化する（それにより、細胞アシルＣｏＡプールからアシルＣｏＡ脂肪酸を除去し、リン脂質プール中のｓｎ−２位においてリゾリン脂質基質をアシル化する）アシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＬＡＴ」］、例えばアシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＣＡＴ」］の協調的作用を介して生じる。リモデリングは、可逆的ＬＰＣＡＴ活性にも起因する（非特許文献２）。
【０００６】
脂肪酸生合成はアシルＣｏＡプールとリン脂質プールとの間のアシル基の急速な交換を要求するため、多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］産生に対するＬＰＣＡＴ（およびＬＰＣＡＴ活性を有する他のＬＰＬＡＴ）の効果が企図されている。具体的には、不飽和化が主にリン脂質のｓｎ−２位中で生じる一方、伸長がアシルＣｏＡプール中で生じる。より具体的には、特許文献２は、アシルトランスフェラーゼ、例としてＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴが、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＴＡＧ画分中でのＰＵＦＡ（例えば、エイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」］、２０：５  ω−３）の蓄積において重要であり得ることを仮定した。この文献に記載のとおり、この仮定は、以下の研究に基づくものであった：１）非特許文献２、アシルＣｏＡプールとＰＣプールとの間の交換がＬＰＣＡＴの正および逆反応に起因し得ることを仮定した；２）非特許文献３、酵母中でのホスファチジルコリン［「ＰＣ」］のｓｎ−２位におけるγ−リノレン酸［「ＧＬＡ」］の蓄積およびアラキドン酸［「ＡＲＡ」］（２０：４  ω−６）の効率的な合成不能が、アシルＣｏＡプール内で生じるＰＵＦＡ生合成に関与する伸長ステップの結果である一方、Δ５およびΔ６不飽和化ステップが主にＰＣのｓｎ−２位において生じることを示唆した；３）非特許文献４、トランスジェニック油糧種子植物中でのＰＵＦＡ蓄積の制約の分析に基づきＬＰＣＡＴがΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路の良好な再構成において重要な役割を担うことを示唆した；および４）特許文献３、Δ６伸長に好適な外因性脂肪酸基質をフィードされたＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で遺伝子導入されたΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路における伸長の効率を実質的に改善したカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）（Ｔ０６Ｅ８．１）からのＬＰＣＡＴをコードする遺伝子を提供した。Ｒｅｎｚらは、デサチュラーゼがＰＣ結合脂肪酸中の二重結合の導入を触媒する一方、エロンガーゼがＣｏＡエステル化脂肪酸（アシルＣｏＡ）の伸長を単独で触媒するため、ＬＰＣＡＴがリン脂質とアシルＣｏＡプールとの間で新たに合成された脂肪酸の効率的および継続的交換を可能とすることを結論づけた。
【０００７】
特許文献１は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＴＡＧ画分中のＬＰＣＡＴがＥＰＡおよびドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」］（２２：６  ω−３）の蓄積において実際に重要であるさらなる支持を提供した。ＬＰＣＡＴの過剰発現は、Δ９エロンガーゼ変換効率および／またはΔ４デサチュラーゼ変換効率の改善をもたらし得ることが見出された（変換効率は、特定の酵素が基質を産物に変換し得る効率を指す用語である）。したがって、ＥＰＡを産生するように遺伝子操作された株において、Δ９エロンガーゼ変換効率の改善は、増加したＥＰＡ％ＴＦＡまたはＥＰＡ％ＤＣＷをもたらすことが実証された。同様に、ＤＨＡを産生するように遺伝子操作された株におけるΔ９エロンガーゼおよび／またはΔ４デサチュラーゼ変換効率の改善は、増加したＤＨＡ％ＴＦＡまたはＤＨＡ％ＤＣＷをもたらすことが実証された。
【０００８】
多数の他の参照文献は、一般に、トランスジェニック生物の油中の所望の脂肪酸の量を増加させ、総油含有量を増加させ、または所望の脂肪酸の含有量を選択的に増加させるためのＬＰＬＡＴ生合成遺伝子とＰＵＦＡ生合成遺伝子の同時発現の利益を記載している（例えば、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８）。しかしながら、これらの参照文献は、ＬＰＣＡＴおよびリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）が両方とも過剰発現される場合にＬＣ−ＰＵＦＡの高レベル産生について遺伝子操作された生物において達成された利益を記載していない。ＰＤＡＴは、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン）のｓｎ−２位から脂肪酸アシル基を１，２−ジアシルグリセロールのｓｎ−３位に転移してアシルＣｏＡ非依存性機序を介してリゾリン脂質およびＴＡＧを産生することを担う酵素である。
【０００９】
さらに、刊行物および特許文献の両方におけるＬＰＣＡＴ内の種々の保存膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼ［「ＭＢＯＡＴ」］ファミリータンパク質モチーフ配列の報告にかかわらず、それらのモチーフ内の規定の突然変異に関する詳細な調査はこれまで実施されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０−０３１７８８２−Ａ１号明細書
【特許文献２】米国特許第７，９３２，０７７号明細書
【特許文献３】国際公開第２００４／０７６６１７Ａ２号パンフレット（Ｒｅｎｚら）
【特許文献４】国際公開第２００４／０８７９０２号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００６／０６９９３６号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００９／００１３１５号パンフレット
【特許文献８】国際公開第２００９／０１４１４０号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｌａｎｄｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３１：８８３−８８８（１９５８）
【非特許文献２】Ｓｔｙｍｎｅ  ａｎｄ  Ｓｔｏｂａｒｔ（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，２２３（２）：３０５−３１４（１９８４）
【非特許文献３】Ｄｏｍｅｒｇｕｅら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：３５１１５−３５１２６（２００３））
【非特許文献４】Ａｂｂａｄｉら（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１６：２７３４−２７４８（２００４））
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一実施形態において、本発明は、少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の産生のための組換え微生物細胞に関する。組換え微生物細胞は、
（ａ）アシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）活性を有する少なくとも１つのポリペプチド；
（ｂ）リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）活性を有する少なくとも１つのポリペプチド；および
（ｃ）少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生し得る多価不飽和脂肪酸生合成経路を含み；
（ａ）および（ｂ）のポリペプチドは、組換え微生物細胞中で過剰発現される。組換え微生物細胞は、対照細胞中の総脂肪酸の重量パーセントとして計測されるＰＵＦＡの量と比較して増加量の、総脂肪酸の重量パーセントとして計測されるＰＵＦＡも含む。
【００１３】
第２の実施形態において、組換え微生物細胞は、以下：
（ｉ）対照細胞のＣ１８からＣ２０への伸長変換効率に対して増加したＣ１８からＣ２０への伸長変換効率または
（ｉｉ）対照細胞中の乾燥細胞重量の重量パーセントとして計測される総脂肪酸の量と比較して増加量の、乾燥細胞重量の重量パーセントとして計測される総脂肪酸
の少なくとも１つをさらに含む。
【００１４】
好ましくは、増加したＣ１８からＣ２０への伸長変換効率は、組換え微生物細胞中の増加したΔ９エロンガーゼ変換効率または増加したΔ６エロンガーゼ変換効率の効果である。
【００１５】
第３の実施形態において、ＰＤＡＴ活性を有するポリペプチドは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号３２（ＹｌＰＤＡＴ）および配列番号３０（ＳｃＰＤＡＴ）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して少なくとも９０％または９５％
のアミノ酸同一性を有する。
【００１６】
第４の実施形態において、ＬＰＣＡＴ活性を有するポリペプチドは、以下のものからなる群から選択される：
（ａ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２（ＳｃＬＰＣＡＴ）および配列番号４（ＹｌＬＰＣＡＴ）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して少なくとも４５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）以下のものからなる群から選択される少なくとも１つの膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを含むポリペプチド：配列番号５（ＷＨＧ−Ｘ３−ＧＹ−Ｘ３−Ｆ）、配列番号６（Ｙ−Ｘ４−Ｆ）、配列番号７（Ｙ−Ｘ３−ＹＦ−Ｘ２−Ｈ）、配列番号８（Ｍ−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｉ］−Ｘ２−Ｋ−［Ｌ／Ｖ／Ｉ］−Ｘ８−ＤＧ）、配列番号９（ＲｘＫＹＹ−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−［Ｅ／Ｄ］−［Ａ／Ｇ］−Ｘ５−ＧｘＧ−［Ｆ／Ｙ］−ｘＧ）、配列番号１０（ＥＸ１１ＷＮ−Ｘ２−［Ｔ／Ｖ］−Ｘ２−Ｗ）、配列番号１１（ＳＡｘＷＨＧ−Ｘ２−ＰＧＹ−Ｘ２−［Ｔ／Ｆ］−Ｆ）、配列番号１２（Ｍ−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ］−［Ｖ／Ｃ／Ａ／Ｔ］−［Ｍ／Ｌ／Ｑ］−Ｋ−［Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ｓ／Ｔ／Ｙ／Ｉ］−［Ｓ／Ｔ／Ａ／Ｍ／Ｇ］−［Ｆ／Ｌ／Ｃ／Ｙ］−［Ｃ／Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ｗ／Ｙ／Ｍ／Ｉ／Ｆ／Ｃ］−［Ｎ／Ｓ／Ｅ／Ｑ／Ｄ］−［Ｖ／Ｙ／Ｌ／Ｉ］−［Ｈ／Ｙ／Ａ／Ｎ／Ｓ／Ｔ］−ＤＧ）、配列番号１３（Ｒ−［Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｗ／Ｐ／Ｙ］−ＫＹＹ−［Ｇ／Ａ／Ｆ／Ｈ／Ｓ］−［Ｖ／Ａ／Ｉ／Ｃ］−Ｗ−［Ｙ／Ｅ／Ｔ／Ｍ／Ｓ／Ｌ］−［Ｌ／Ｉ／Ｎ］−［Ｔ／Ｓ／Ａ］−［Ｅ／Ｄ］−［Ｇ／Ａ］−［Ａ／Ｓ／Ｉ／Ｖ］−［Ｃ／Ｓ／Ｉ／Ｎ／Ｈ／Ｌ］−［Ｖ／Ｉ／Ｎ］−［Ｌ／Ｉ／Ｎ／Ａ／Ｃ］−［Ｓ／Ｃ／Ｗ／Ａ／Ｉ］−Ｇ−［Ｍ／Ｉ／Ｌ／Ａ／Ｆ］−Ｇ−［Ｙ／Ｆ］−［Ｎ／Ｅ／Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ］−Ｇ）、配列番号１４（Ｅ−［Ｔ／Ｆ／Ｌ／Ｍ］−［Ａ／Ｓ］−［Ｑ／Ｄ／Ｐ／Ｋ／Ｔ］−［Ｎ／Ｓ］−［Ｓ／Ｉ／Ｔ／Ｌ／Ａ／Ｍ／Ｆ］−［Ｈ／Ｋ／Ｒ／Ｖ］−［Ｇ／Ｃ／Ｅ／Ｔ／Ｑ／Ｄ／Ｍ］−［Ｙ／Ａ／Ｍ／Ｌ／Ｉ／Ｆ］−［Ｌ／Ｓ／Ｐ／Ｉ］−［Ｇ／Ｅ／Ａ／Ｌ／Ｎ／Ｄ］−［Ｓ／Ａ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ｎ］−ＷＮ−［Ｋ／Ｍ／Ｉ／Ｃ］−［Ｎ／Ｋ／Ｑ／Ｇ］−［Ｔ／Ｖ］−［Ｎ／Ａ／Ｓ］−［Ｈ／Ｋ／Ｎ／Ｔ／Ｒ／Ｌ］−Ｗ）、配列番号１５（ＳＡ−［Ｆ／Ｍ／Ｖ／Ｉ］−ＷＨＧ−［Ｆ／Ｖ／Ｔ／Ｌ］−［Ｙ／Ｓ／Ｒ］−ＰＧＹ−［Ｙ／Ｍ／Ｉ］−［Ｌ／Ｍ／Ｉ／Ｆ］−［Ｔ／Ｆ］−Ｆ）、配列番号１６（Ｍ−［Ｖ／Ｉ］−Ｌ−Ｘ２−ＫＬ）、配列番号１７（ＲｘＫＹＹ−Ｘ２−Ｗ）および配列番号１８（ＳＡｘＷＨＧ）；
（ｃ）以下のものからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを含むポリペプチド：
（ｉ）配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む突然変異モチーフ（配列番号３８は、配列番号１６（Ｍ−［Ｖ／Ｉ］−Ｌ−Ｘ２−ＫＬ）と、Ｖ２Ｃ、Ｉ２Ｃ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｃ、Ｌ３Ｇ、Ｋ６Ｈ、Ｋ６Ｇ、Ｋ６Ｎ、Ｋ６Ｙ、Ｌ７Ａ、Ｌ７Ｎ、Ｌ７Ｇ、Ｌ７Ｈ、Ｌ７ＩおよびＬ７Ｍからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異だけ異なる）；（ｉｉ）配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含む突然変異モチーフ（配列番号３９は、配列番号８（Ｍ−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｉ］−Ｘ２−Ｋ−［Ｌ／Ｖ／Ｉ］−Ｘ８−ＤＧ）と、Ｖ２Ｃ、Ｉ２Ｃ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｃ、Ｌ３Ｇ、Ｉ３Ａ、Ｉ３Ｃ、Ｉ３Ｇ、Ｋ６Ｈ、Ｋ６Ｇ、Ｋ６Ｎ、Ｋ６Ｙ、Ｌ７Ａ、Ｌ７Ｎ、Ｌ７Ｇ、Ｌ７Ｈ、Ｌ７Ｍ、Ｖ７Ａ、Ｖ７Ｎ、Ｖ７Ｇ、Ｖ７Ｈ、Ｖ７Ｍ、Ｉ７Ａ、Ｉ７Ｎ、Ｉ７Ｇ、Ｉ７Ｈ、Ｉ７Ｍ、Ｄ１６Ｑ、Ｄ１６Ｎ、Ｄ１６Ｈ、Ｇ１７Ａ、Ｇ１７ＶおよびＧ１７Ｎからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異だけ異なる）；
（ｉｉｉ）配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む突然変異モチーフ（配列番号４０は、配列番号５（ＷＨＧ−Ｘ３−ＧＹ−Ｘ３−Ｆ）と、Ｆ１２Ｎ、Ｆ１２Ｃ、Ｆ１２ＧおよびＦ１２Ｔからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異だけ異なる）；ならびに
（ｉｖ）配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含む突然変異モチーフ（配列番号４１は、配列番号１１（ＳＡｘＷＨＧ−Ｘ２−ＰＧＹ−Ｘ２−［Ｔ／Ｆ］−Ｆ）と、Ｔ１４Ａ、Ｔ
１４Ｃ、Ｔ１４Ｓ、Ｆ１４Ａ、Ｆ１４Ｃ、Ｆ１４Ｓ、Ｆ１５Ｎ、Ｆ１５Ｃ、Ｆ１５ＧおよびＦ１５Ｔからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異だけ異なる）；（ｄ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２１（ＭａＬＰＡＡＴ１）、配列番号２３（ＹｌＬＰＡＡＴ１）および配列番号２４（ＳｃＬＰＡＡＴ）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；ならびに
（ｅ）配列番号２５（ＮＨｘｘｘｘＤ）および配列番号２６（ＥＧＴＲ）からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼファミリーモチーフを含むポリペプチド。
【００１７】
第５の実施形態において、長鎖ＰＵＦＡは、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される。好ましくは、ＰＵＦＡはエイコサペンタエン酸である。
【００１８】
第６の実施形態において、組換え微生物細胞は、藻類、酵母、ユーグレナ、ストラメノパイル、卵菌および真菌からなる群から選択される。好ましくは、組換え微生物細胞は、油性酵母である。油性酵母は、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のものであり得る。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、少なくとも１つの長鎖ＰＵＦＡの産生を改善する方法に関する。この方法は、
（ａ）本発明の組換え微生物細胞を発酵性炭素源の存在下で生育させること；および
（ｂ）場合により、長鎖ＰＵＦＡを回収すること
を含む。
【００２０】
本方法の一態様において、組換え微生物細胞は、油性酵母であり、長鎖ＰＵＦＡは、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される。好ましくは、ＰＵＦＡは、エイコサペンタエン酸である。本方法の別の態様において、油性酵母は、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のものである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＰＤＡＴによるホスファチジルコリン（ＰＣ）基質使用およびＬＰＣＡＴによる再生のサイクルを説明する。ＰＣ１およびＰＣ２は、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）を生じさせるためにＰＤＡＴによりＰＣ１から除去される脂肪酸が、ＰＣ２を生じさせるＬＰＣＡＴによりＬＰＣに付加される脂肪酸と異なり得るという点で異なり得る。
【図２】ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を説明し、この経路の説明を考慮する場合に一緒に参照すべきである。
【図３】以下の（Ａ）ｐＹ１９６および（Ｂ）ｐＹ３０１についてのプラスミドマップを提供する。
【図４】ｐＹ３０６−Ｎについてのプラスミドマップを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、以下の詳細な説明および本出願の一部を形成する付属の配列の説明（表１）からより十分に理解することができる。
【００２３】
【表１】
0006351582.tif 000002
【００２４】
【表２】
0006351582.tif 000003
【００２５】
【表３】
0006351582.tif 000004
【００２６】
【表４】
0006351582.tif 000005
【００２７】
【表５】
0006351582.tif 000006
【００２８】
発明の詳細な説明
本明細書に引用される全ての特許、特許出願および刊行物は、参照により全体として本明細書に援用される。
【００２９】
量、濃度または他の値もしくはパラメータが範囲、好ましい範囲または好ましい上方値および好ましい下方値の列挙のいずれかとして挙げられる場合、これは、範囲が別個に開示されているかどうかにかかわらず、任意の範囲上限または好ましい上方値と、任意の範囲下限または好ましい下方値との任意のペアから形成される全ての範囲を具体的に開示していると理解すべきである。本明細書において数値の範囲が引用されている場合、特に別記しない限り、この範囲は、その終点および範囲内の全ての整数および分数を含むものとする。本発明の範囲は、範囲を定義する場合において引用される規定の値に限定されるものではない。
【００３０】
本明細書において使用される用語「発明」または「本発明」は、特許請求の範囲および本明細書に記載の本発明の全ての態様および実施形態を指すものとし、いかなる特定の実施形態または態様にも限定されるものと読まれるべきではない。
【００３１】
本開示において、多数の用語および略語が使用される。アミノ酸は、参照により本明細書に援用されるＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３：３０２１−３０３０（１９８５）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２１９（２）：３４５−３７３（１９８４）に記載のＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ規格に準拠するアミノ酸についての一文字コードまたは三文字コードのいずれかにより同定される。
【００３２】
「オープンリーディングフレーム」は「ＯＲＦ」と略される。
【００３３】
「ポリメラーゼ連鎖反応」は「ＰＣＲ」と略される。
【００３４】
「Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」は「ＡＴＣＣ」と略される。
【００３５】
「多価不飽和脂肪酸」は「ＰＵＦＡ」と略される。
【００３６】
「長鎖多価不飽和脂肪酸」は「ＬＣ−ＰＵＦＡ」と略される。
【００３７】
「トリアシルグリセロール」は「ＴＡＧ」と略される。
【００３８】
「総脂肪酸」は「ＴＦＡ」と略される。
【００３９】
「脂肪酸メチルエステル」は「ＦＡＭＥ」と略される。
【００４０】
「乾燥細胞重量」は「ＤＣＷ」と略される。
【００４１】
「アシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ」または「リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ」は「ＬＰＬＡＴ」と略される。
【００４２】
「リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ」は「ＬＰＣＡＴ」と略される。
【００４３】
「膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼ」は「ＭＢＯＡＴ」と略される。
【００４４】
「リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」は「ＰＤＡＴ」と略される。
【００４５】
用語「グリセロリン脂質」は、ｓｎ−１位およびｓｎ−２位における脂肪酸と、ｓｎ−３位においてホスホジエステル結合を介して結合している極性頭部基（例えば、リン酸、コリン、エタノールアミン、グリセロール、イノシトール、セリン、カルジオリピン）とを有するグリセロールコアを有する幅広い分子クラスを指す。したがって、グリセロリン脂質としては、ホスファチジルコリン［「ＰＣ」］、ホスファチジルエタノールアミン［「ＰＥ」］、ホスファチジルグリセロール［「ＰＧ」］、ホスファチジルイノシトール［「ＰＩ」］、ホスファチジルセリン［「ＰＳ」］およびカルジオリピン［「ＣＬ」］が挙げられる。
【００４６】
「リゾリン脂質」は、グリセロリン脂質からｓｎ−２位の脱アシル化により誘導される。リゾリン脂質としては、例えば、リゾホスファチジン酸［「ＬＰＡ」］、リゾホスファチジルコリン［「ＬＰＣ」］、リゾホスファチジルエタノールアミン［「ＬＰＥ」］、リゾホスファチジルセリン［「ＬＰＳ」］、リゾホスファチジルグリセロール［「ＬＰＧ」］およびリゾホスファチジルイノシトール［「ＬＰＩ」］が挙げられる。
【００４７】
用語「アシルトランスフェラーゼ」は、ドナー脂質からのアシル基のアクセプター脂質分子への転移を担う酵素を指す。
【００４８】
用語「アシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ」または「リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ」［「ＬＰＬＡＴ」］は、ｓｎ−２位において種々のリゾリン脂質基質をアシル化する能力を有する幅広いアシルトランスフェラーゼクラスを指す。種々のＬＰＬＡＴ、例としてＬＰＡＡＴ（ＬＰＡのＰＡへの変換を触媒する）、ＬＰＥＡＴ（ＬＰＥのＰＥへの変換を触媒する）、ＬＰＳＡＴ（ＬＰＳのＰＳへの変換を触媒する）、ＬＰＧＡＴ（ＬＰＧのＰＧへの変換を触媒する）およびＬＰＩＡＴ（ＬＰＩのＰＩへの変換を触媒する）が同定されている。ＬＰＣアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＣＡＴ」］は、本出願の焦点であり、ＬＰＣのＰＣへの変換を触媒する能力を有する。ＬＰＬＡＴ命名法の標準化は正式には行われていないため、当技術分野においては他の種々の命名が使用される（例えば、ＬＰＣＡＴは、アシルＣｏＡ：１−アシルリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼと称されることが多い）。さらに、一部のＬＰＬＡＴ、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａｌｅ１（ＯＲＦ  ＹＯＲ１７５Ｃ；配列番号２）が幅広い特異性を有し、したがって単一の酵素が、いくつかのＬＰＬＡＴ反応、例としてＬＰＡＡＴ、ＬＰＣＡＴおよびＬＰＥＡＴ反応を触媒し得ることに留意することが重要である（Ｔａｍａｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８２：３４２８８−３４２９８（２００７）；Ｓｔａａｈｌら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８２：３０５−３０９（２００８）；Ｃｈｅｎら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８１：５５１１−５５１６（２００７）；Ｂｅｎｇｈｅｚａｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８２：３０８４５−３０８５５（２００７）；Ｒｉｅｋｈｏｆら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８２：２８３４４−２８３５２（２００７））。
【００４９】
より具体的には、用語「リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＣＡＴ」］活性を有するポリペプチド」は、反応：アシルＣｏＡ＋１−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン→ＣｏＡ＋１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを触媒し得る酵素（ＥＣ２．３．１．２３）を指す。２つの構造的に区別されるタンパク質ファミリー、すなわちＬＰＡＡＴタンパク質ファミリー（Ｈｉｓｈｉｋａｗａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０５：２８３０−２８３５（２００８）；国際公開第２００４／０７６６１７号パンフレット）およびＡＬＥ１タンパク質ファミリー（Ｔａｍａｋｉら，Ｓｔａａｈｌら，Ｃｈｅｎら，Ｂｅｎｇｈｅｚａｌら，Ｒｉｅｋｈｏｆら）におけるＬＰＣＡＴ活性について記載されている。
【００５０】
用語「ＬＰＣＡＴ」は、１）ＬＰＣＡＴ活性を有し（ＥＣ２．３．１．２３）、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２（ＳｃＡｌｅ１）および配列番号４（ＹｌＡｌｅ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して少なくとも約４５％のアミノ酸同一性を共有し；ならびに／または２）ＬＰＣＡＴ活性を有し（ＥＣ２．３．１．２３）、下記の少なくとも１つの膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼ［「ＭＢＯＡＴ」］タンパク質ファミリーモチーフを有するＡＬＥ１タンパク質ファミリーのタンパク質を指す。ＡＬＥ１ポリペプチドの例としては、ＳｃＡｌｅ１およびＹｌＬＰＣＡＴが挙げられる。
【００５１】
用語「ＳｃＡｌｅ１」は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離されたＬＰＣＡＴ（ＯＲＦ「ＹＯＲ１７５Ｃ」）を指す。ＳｃＡｌｅ１は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる配列番号２のアミノ酸配列を有し得る。
【００５２】
用語「ＹｌＡｌｅ１」または「ＹｌＬＰＣＡＴ」は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離されたＬＰＣＡＴを指す。ＹｌＬＰＣＡＴは、配列番号３に記載のヌクレオチド配列によりコードされる配列番号４のアミノ酸配列を有し得る。
【００５３】
用語「保存ドメイン」または「モチーフ」は、進化的関連性を示すタンパク質のアラインメントされた配列に沿った規定の位置において保存されている一組のアミノ酸を意味する。他の位置におけるアミノ酸は相同タンパク質間で変動し得る一方、規定の位置において高度に保存されているアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性または活性に不可欠なアミノ酸を示す可能性が高い。これらのアミノ酸はタンパク質相同体ファミリーのアラインメントされた配列におけるそれらの高い保存度により同定されるため、新たに決定された配列を有するタンパク質が既に同定されているタンパク質ファミリーに属するかどうかを判断するための識別子または「シグネチャ」として使用することができる。
【００５４】
種々の膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼ［「ＭＢＯＡＴ」］ファミリーモチーフが提案されてきた。これらのモチーフは、以下の表２にまとめられ、米国特許出願公開第２０１０−０３１７８８２−Ａ１号明細書においてさらに考察される。
【００５５】
【表６】
0006351582.tif 000007
【００５６】
用語「少なくとも１つの突然変異膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼ［「ＭＢＯＡＴ」］タンパク質ファミリーモチーフを含むＬＰＣＡＴ活性を有する突然変異ポリペプチド」または「少なくとも１つの突然変異ＭＢＯＡＴモチーフを含むＬＰＣＡＴ活性を有する突然変異ポリペプチド」は、配列番号５〜１８に関する少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む本発明のポリペプチドを指す。
【００５７】
本明細書に開示のＭＢＯＡＴモチーフ中のそれぞれのアミノ酸置換について、最初の文字は、野生型ＭＢＯＡＴモチーフ中のアミノ酸に対応し、２番目の文字は、突然変異ＭＢＯＡＴモチーフ中の同一位置に見出されるアミノ酸に対応し、例えば配列番号１６［Ｍ−［Ｖ／Ｉ］−Ｌ−Ｘ２−ＫＬ］中のＬ３Ａ突然変異は、配列番号１６中の３位におけるＬｅｕ［Ｌ］からＭＢＯＡＴ突然変異体中のＡｌａ［Ａ］への変化を示す。この命名法は、ＬＰＣＡＴモチーフおよび本明細書に記載のタンパク質内の突然変異を指すために本明細書全体にわたり使用され；同様の表記は、ヌクレオチド配列内の置換を説明するために使用される（例えば、Ａ９Ｇは、ＭＢＯＡＴモチーフをコードするヌクレオチド配列中の塩基９位におけるアデニン［Ａ］からグアニン［Ｇ］への変化を示す）。
【００５８】
好ましくは、少なくとも１つの突然変異ＭＢＯＡＴモチーフを含む少なくともＬＰＣＡＴ活性を有する突然変異ポリペプチド（例えば、配列番号５〜８の１つの突然変異形態）は、突然変異ポリペプチド中の突然変異ＭＢＯＡＴモチーフの野生型バージョンである少なくとも１つのＭＢＯＡＴモチーフを含むＬＰＣＡＴ活性を有する対照ポリペプチド（例えば、配列番号５〜１８の１つ）と比較して同等のまたは改善されたＬＰＣＡＴ活性を有する。
【００５９】
「突然変異」としては、任意の欠失、挿入および点突然変異（またはそれらの組合せ）を挙げることができるが、好ましい実施形態において、少なくとも１つの突然変異ＭＢＯＡＴモチーフを含むリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＣＡＴ」］活性を有する突然変異ＬＰＣＡＴは、配列番号１９に記載され、配列番号１９は、配列番号４［ＹｌＬＰＣＡＴ］と、少なくとも１つのアミノ酸突然変異だけ異なり：
（ａ）少なくとも１つのアミノ酸突然変異の１つは、残基１３３、残基１３４、残基１３５、残基１３６、残基１３７、残基１３８、残基１３９、残基１４０、残基１４１、残基１４２、残基１４３、残基１４４、残基１４５、残基１４６、残基１４７、残基１４８からなる群から選択されるアミノ酸残基中に存在し；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸突然変異の１つは、残基３７８、残基３８２、残基３８３、残基３８５、残基３８８、残基３８９および残基３９０からなる群から選択されるアミノ酸残基中に存在し；ならびに／または
（ｃ）前記少なくとも１つのアミノ酸突然変異は、少なくとも２つのアミノ酸突然変異を含み：
（ｉ）第１のアミノ酸突然変異は、区分（ａ）に記載の群から選択されるアミノ酸残基中に存在し、
（ｉｉ）第２のアミノ酸突然変異は、区分（ｂ）に記載の群から選択されるアミノ酸残基中に存在する。
【００６０】
用語「ＬＰＣＡＴ」は、ＬＰＣＡＴ活性（ＥＣ２．３．１．２３）を有し、他のアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性（例えば、ＬＰＡＡＴ活性、ＬＰＥＡＴ活性、ＬＰＳＡＴ活性、ＬＰＧＡＴ活性、ＬＰＩＡＴ活性）も有し得るタンパク質も指す。例えば、ポリペプチドは、ＬＰＣＡＴおよびＬＰＡＡＴ活性の両方を有し得、したがって従来の文献においてＬＰＡＡＴポリペプチドと分類されているにもかかわらず、本明細書においてＬＰＣＡＴとみなすべきである。これらのＬＰＣＡＴは、ＬＰＡＡＴタンパク質の構造的特徴を有し得る。
【００６１】
用語「リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＡＡＴ」］活性を有するポリペプチド」は、反応：アシルＣｏＡ＋１−アシル−ｓｎ−グリセロール３−リン酸→ＣｏＡ＋１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール３−リン酸を触媒し得る酵素（ＥＣ２．３．１．５１）を指す。
【００６２】
用語「ＬＰＡＡＴ」は、１）ＬＰＡＡＴ活性を有し、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２１（ＭａＬＰＡＡＴ１）、配列番号２３（ＹｌＬＰＡＡＴ１）および配列番号２４（ＳｃＬＰＡＡＴ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して少なくとも約４３．９％のアミノ酸同一性を共有し；ならびに／または２）ＬＰＡＡＴ活性を有し、ＮＨｘｘｘｘＤ（配列番号２５）およびＥＧＴＲ（配列番号２６）からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼファミリーモチーフを有するタンパク質を指す。より具体的には、Ｌｅｗｉｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８：５７６４−５７７１（１９９９））およびＹａｍａｓｈｉｔａら（Ｂｉｏｃｈｉｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１７７１：１２０２−１２１５（２００７））は、細菌、酵母、線虫および哺乳動物からの配列のアラインメントに基づき以下の１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＡＡＴ」］ファミリーモチーフが、「アシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ」または「リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ」［「ＬＰＬＡＴ」］活性に重要であることを提案した：ＮＨｘｘｘｘＤ（配列番号２５）、ＧｘｘＦＩ−［Ｄ／Ｒ］−Ｒ（配列番号２７）、ＥＧＴＲ（配列番号２６）および［Ｖ／Ｉ］−［Ｐ／Ｘ］−［Ｉ／Ｖ／Ｌ］−［Ｉ／Ｖ］−Ｐ−［Ｖ／Ｉ］（配列番号２８）またはＩＶＰＩＶＭ（配列番号２９）のいずれか。ＬＰＡＡＴポリペプチドの例としては、ＳｃＬＰＡＡＴ、ＭａＬＰＡＡＴ１およびＹｌＬＰＡＡＴ１が挙げられる。
【００６３】
用語「ＳｃＬＰＡＡＴ」は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離されたＬＰＡＡＴ（例えば、ＯＲＦ「ＹＤＬ０５２Ｃ」、配列番号２４）を指す。
【００６４】
用語「ＭａＬＰＡＡＴ１」は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）から単離されたＬＰＡＡＴを指す。ＭａＬＰＡＡＴ１は、配列番号２０に記載のヌクレオチド配列によりコードされる配列番号２１のアミノ酸配列を有し得る。ＮＨｘｘｘｘＤ（配列番号２５）およびＥＧＴＲ（配列番号２６）モチーフはＭａＬＰＡＡＴ１中に存在するが、他のＬＰＡＡＴモチーフは存在しない。
【００６５】
用語「ＹｌＬＰＡＡＴ１」および「ＹｌＬＰＡＡＴ２」は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離されたＬＰＡＡＴを指す。ＹｌＬＰＡＡＴは、配列番号２２に記載のヌクレオチド配列によりコードされる配列番号２３のアミノ酸配列を有し得る。ＮＨｘｘｘｘＤ（配列番号２５）およびＥＧＴＲ（配列番号２６）モチーフはＹｌＬＰＡＡＴ１中に存在するが、他のＬＰＡＡＴモチーフは存在しない。
【００６６】
用語「リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ［「ＰＤＡＴ」］活性を有するポリペプチド」は、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン）のｓｎ−２位から脂肪酸アシル基を１，２−ジアシルグリセロールのｓｎ−３位に転移し得［Ｅ．Ｃ．２．３．１．１５８］、したがってリゾリン脂質およびＴＡＧをもたらす酵素を指す。ＰＤＡＴおよびアシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）［Ｅ．Ｃ．２．３．１．２０］の両方がＴＡＧ生合成の最終ステップに関与するが、ＰＤＡＴのみがアシルＣｏＡ非依存性機序を介してＴＡＧを合成し得る。配列番号３０に記載の代表的なＰＤＡＴ酵素は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のＬＲＯ１遺伝子によりコードされる（Ｄａｈｌｑｖｉｓｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７：６４８７（２０００））。
【００６７】
用語「ＹｌＰＤＡＴ」は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離されたＰＤＡＴを指す。ＹｌＰＤＡＴは、配列番号３１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる配列番号３２のアミノ酸配列を有し得る（参照により本明細書に援用される米国特許第７，９０１，９２８号明細書）。
【００６８】
用語「オルソログ」は、系統樹分析の１つのクレードに存在することにより明らかなとおり共通の祖先タンパク質から進化し、同一の酵素反応を触媒する異なる種からの相同タンパク質を指す。
【００６９】
用語「油」は、２５℃において液体であり、通常、多価不飽和の脂質物質を指す。油性生物において、油は総脂質の大部分を構成する。「油」は、主としてトリアシルグリセロール［「ＴＡＧ」］から構成されるが、他の中性脂質、リン脂質および遊離脂肪酸も含有し得る。油中の脂肪酸組成と総脂質の脂肪酸組成とは一般に類似しており；したがって、総脂質中のＰＵＦＡ濃度の増加または減少は油中のＰＵＦＡ濃度の増加または減少に対応し、その逆も同様である。
【００７０】
「中性脂質」は、脂質体の細胞中に蓄積脂肪として一般に見出される脂質を指し、細胞ｐＨにおいて脂質は荷電基を担持しないため、そのように呼ばれる。一般に、中性脂質は完全に非極性であり、水に対する親和性を有さない。中性脂質は、一般に、グリセロールと脂肪酸とのモノ−、ジ−および／またはトリエステルを指し、それぞれモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールもしくはトリアシルグリセロールとも、またはまとめてアシルグリセロールとも称される。アシルグリセロールから遊離脂肪酸を放出させるためには加水分解反応が生じなければならない。
【００７１】
用語「トリアシルグリセロール」［「ＴＡＧ」］は、グリセロール分子にエステル化された３個の脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す。ＴＡＧは、ＬＣ−ＰＵＦＡおよび飽和脂肪酸ならびにより短鎖の飽和および不飽和脂肪酸を含有し得る。
【００７２】
本明細書において用語「総脂肪酸」［「ＴＦＡ」］は、例えばバイオマスまたは油であり得る所与の試料において塩基エステル交換反応法（当技術分野において公知のとおり）により脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に誘導体化され得る全ての細胞脂肪酸の合計を指す。したがって、総脂肪酸は、中性脂質画分（ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロールおよびＴＡＧを含む）および極性脂質画分（ＰＣおよびＰＥ画分を含む）からの脂肪酸を含むが、遊離脂肪酸を含まない。
【００７３】
細胞の「総脂質含有率」という用語は、乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］のパーセントとしてのＴＦＡの尺度であるが、総脂質含有率は、ＤＣＷのパーセントとしてのＦＡＭＥの尺度［「ＦＡＭＥ％ＤＣＷ」］として近似することができる。したがって、総脂質含有率［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］は、例えばＤＣＷ１００ミリグラム当たりの総脂肪酸のミリグラム数と同等である。総脂質含有率は、油含有率と称することもできる。
【００７４】
総脂質中の脂肪酸の濃度は、本明細書においてＴＦＡの重量パーセント［「％ＴＦＡ」］、例えばＴＦＡ１００ミリグラム当たりの所与の脂肪酸のミリグラム数として表現される。本明細書において具体的に別記しない限り、総脂質に対する所与の脂肪酸のパーセントの参照は％ＴＦＡとしての脂肪酸の濃度と同等である（例えば、総脂質の％ＥＰＡは、ＥＰＡ％ＴＦＡと同等である）。
【００７５】
一部の場合、細胞中の所与の脂肪酸の含有率を、乾燥細胞重量のその重量パーセント［「％ＤＣＷ」］として表現することが有用である。したがって、例えばＥＰＡ％ＤＣＷは、以下の式、すなわち（ＥＰＡ％ＴＦＡ）＊（ＴＦＡ％ＤＣＷ）］／１００に従って決定することができる。しかしながら、乾燥細胞重量の重量パーセント［「％ＤＣＷ」］としての細胞中の所与の脂肪酸の含有率は、（ＥＰＡ％ＴＦＡ）＊（ＦＡＭＥ％ＤＣＷ）］／１００として近似することができる。
【００７６】
用語「脂質プロファイル」および「脂質組成」は同義であり、特定の脂質画分中、例えば総脂質中または油中に含有される個々の脂肪酸の量を指し、その量はＴＦＡの重量パーセントとして表現される。混合物中のそれぞれの個々の脂肪酸のパーセントの合計は１００であるべきである。
【００７７】
用語「脂肪酸」は、約Ｃ１２からＣ２２の様々な鎖長の長鎖脂肪酸（アルカン酸）を指すが、より長い鎖長およびより短い鎖長の酸の両方が公知である。大部分の鎖長はＣ１６からＣ２２である。脂肪酸の構造は「Ｘ：Ｙ」の単純な表記体系により表され、Ｘは特定の脂肪酸中の炭素［「Ｃ」］原子の総数であり、Ｙは二重結合の数である。「飽和脂肪酸」とそれに対する「不飽和脂肪酸」、「一価不飽和脂肪酸」とそれに対する「多価不飽和脂肪酸」［「ＰＵＦＡ」］および「ω−６脂肪酸」［「ｎ−６」］とそれに対する「ω−３脂肪酸」［「ｎ−３」］との区別に関する追加の詳細は、参照により本明細書に援用される米国特許第７，２３８，４８２号明細書に提供されている。
【００７８】
本明細書においてＰＵＦＡを記載するために使用される命名法を表３に挙げる。表題「省略表記」の列に、ω参照体系を使用して炭素数、二重結合数およびこの目的のために番号１が付されるω炭素から数えてω炭素に最も近い二重結合の位置を示す。表３の残りの部分は、ω−３およびω−６脂肪酸およびそれらの前駆体の一般名、本明細書全体にわたり使用される略称ならびにそれぞれの化合物の化学名をまとめる。
【００７９】
【表７】
0006351582.tif 000008
【００８０】
表３に列挙されるω−３／ω−６ＰＵＦＡは、本明細書に記載の方法を使用して微生物および植物宿主の油画分中に蓄積される可能性が最も高いが、この列挙は、限定としても完全なものとしても解釈すべきではない。
【００８１】
用語「長鎖多価不飽和脂肪酸」［「ＬＣ−ＰＵＦＡ」］は、Ｃ２０以上の鎖長を有するＰＵＦＡを指す。したがって、用語ＬＣ−ＰＵＦＡとしては、少なくともＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＤＰＡおよびＤＨＡが挙げられる。
【００８２】
用語「ＰＵＦＡ生合成経路」は、オレイン酸をω−６脂肪酸、例えばＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＲＡ、ＤＴＡおよびＤＰＡｎ−６ならびにω−３脂肪酸、例えばＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡに変換する代謝プロセスを指す。このプロセスは文献に十分記載されている（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第７，７９３２，０７７号明細書参照）。要約すれば、このプロセスは、小胞体膜中に存在する「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と称される一連の特殊な伸長および不飽和化酵素を介する、炭素原子の付加を介する炭素鎖の伸長および二重結合の付加を介する分子の不飽和化を含む。より具体的には、「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」は、ＰＵＦＡの生合成に関連する以下の酵素（および前記酵素をコードする遺伝子）、例としてΔ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼおよび／またはＣ２０／２２エロンガーゼのいずれかを指す。
【００８３】
用語「少なくとも１つの長鎖多価不飽和産物脂肪酸を産生し得るＰＵＦＡ生合成経路」は、少なくとも１つの長鎖多価不飽和産物脂肪酸の産生を可能とするＰＵＦＡ生合成経路酵素を含むＰＵＦＡ生合成経路を指す。図２は、ＰＵＦＡ生合成経路の例を示す。
【００８４】
用語「変換効率」および「基質変換パーセント」は、特定の酵素、例えばデサチュラーゼまたはエロンガーゼが基質を産物に変換し得る効率を指す。変換効率は、以下の式：（［産物］／［基質＋産物］）＊１００に従って計測され、式中、「産物」は、直接の産物およびそれから誘導された全ての産物を含む。より具体的には、それぞれのＰＵＦＡ生合成経路酵素は、１００％の効率で機能して基質を産物に変換することはまれであるため、宿主細胞中で産生される未精製油の最終脂質プロファイルは、典型的には、所望のω−３／ω−６脂肪酸からなる種々のＰＵＦＡおよび種々の上流の中間ＰＵＦＡの混合物である。したがって、それぞれの酵素の変換効率は、規定の宿主生物中での所望の脂肪酸の生合成を最適化する場合に考慮されることが多い。
【００８５】
用語「Ｃ１８からＣ２０への伸長変換効率」は、Ｃ１８／２０エロンガーゼがＣ１８基質（すなわちＬＡ、ＡＬＡ、ＧＬＡ、ＳＴＡなど）をＣ２０産物（すなわちＥＤＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡなど）に変換し得る効率を指す。これらのＣ１８／２０エロンガーゼは、Δ９エロンガーゼまたはΔ６エロンガーゼのいずれかであり得る。
【００８６】
用語「Δ９伸長変換効率」および「Δ９エロンガーゼ変換効率」は、Δ９エロンガーゼがＣ１８基質（すなわちＬＡ、ＡＬＡ）をＣ２０産物（例えばＥＤＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ）に変換し得る効率を指す。Δ９エロンガーゼ変換効率は、本明細書において、「％変換」または「ｄ９ｅ  ＣＥ（％）」と称される。
【００８７】
用語「Δ６伸長変換効率」および「Δ６エロンガーゼ変換効率」は、Δ６エロンガーゼがＣ１８基質（例えばＧＬＡ、ＳＴＡ）をＣ２０産物（例えばＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡなど）に変換し得る効率を指す。
【００８８】
本明細書において用語「増加した」は、より大きい量または活性、例えば元の量もしくは活性よりもほんのわずかに大きい量もしくは活性、または例えば元の量もしくは活性と比較して大過剰の量もしくは活性を有することおよびその間の全ての量または活性を含むことを意味する。あるいは、「増加した」は、増加した量または活性が比較される量または活性よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％大きい量または活性を指し得る。
【００８９】
用語「微生物細胞」および「微生物」は、本明細書において同義に使用され、外来または異種遺伝子を受容し得、それらの遺伝子を発現し得る微生物を指す。「組換え微生物細胞」は、組換え遺伝子操作された微生物宿主細胞を指す。
【００９０】
一般に、用語「油性」は、エネルギー源を油の形態で貯蔵する傾向がある生物を指す（Ｗｅｅｔｅ，Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄＥｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ，１９８０）。本出願の目的のため、用語「油性」は、乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］の少なくとも約２５％を油として蓄積し得る微生物を指す。
【００９１】
用語「油性酵母」は、油を作製し得、すなわち油がＤＣＷの約２５％を超えて蓄積し得る酵母として分類される油性微生物を指す。油性酵母の例としては、以下の属：ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポミセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。酵母のＤＣＷの約２５％を超えて油を蓄積する能力は、組換え遺伝子操作の試みを介してまたは生物の天然能力を介するものであり得る。
【００９２】
用語「保存的アミノ酸置換」は、所与のタンパク質中のアミノ酸残基の、そのタンパク質の化学的性質も機能的性質も変えない別のアミノ酸による置換を指す。例えば、所与の部位において化学的に同等のアミノ酸の産生をもたらす（しかし、コードされ、折り畳まれるタンパク質の構造的および機能的特性に影響を与えない）遺伝子の変更が一般的であることが当技術分野において周知である。本明細書における目的のため、「保存的アミノ酸置換」は、以下の５つの群の１つの中での交換と定義される：
１．小型脂肪族非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ［Ａ］、Ｓｅｒ［Ｓ］、Ｔｈｒ［Ｔ］（Ｐｒｏ［Ｐ］、Ｇｌｙ［Ｇ］）；
２．極性負荷電残基およびそのアミド：Ａｓｐ［Ｄ］、Ａｓｎ［Ｎ］、Ｇｌｕ［Ｅ］、Ｇｌｎ［Ｑ］；
３．極性正荷電残基：Ｈｉｓ［Ｈ］、Ａｒｇ［Ｒ］、Ｌｙｓ［Ｋ］；
４．大型脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ［Ｍ］、Ｌｅｕ［Ｌ］、Ｉｌｅ［Ｉ］、Ｖａｌ［Ｖ］（Ｃｙｓ［Ｃ］）；ならびに
５．大型芳香族残基：Ｐｈｅ［Ｆ］、Ｔｙｒ［Ｙ］、Ｔｒｐ［Ｗ］。
【００９３】
したがって、わずかに疎水性のアミノ酸Ａｌａは、別の低疎水性残基（例えばＧｌｙ）により置換することができる。同様に、ある負荷電残基の、別のものに代える（例えばＡｓｐをＧｌｕに代える）またはある正荷電残基、別のものに代える（例えばＬｙｓをＡｒｇに代える）置換をもたらす変化を使用して機能的に同等の産物を産生することもできる。したがって、保存的アミノ酸置換は、一般に、１）置換の領域中のポリペプチド骨格の構造；２）標的部位中の分子の電荷もしくは疎水性；または３）側鎖のかさを維持する。さらに、多くの場合においてタンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部分の変更も、タンパク質の活性を変更するとは予期されない。
【００９４】
用語「非保存的アミノ酸置換」は、タンパク質特性の最大変化を産生するために使用されるアミノ酸置換を指す。したがって、例えば非保存的アミノ酸置換は、以下のものである：１）親水性残基が疎水性残基に代えて／により（例えばＳｅｒまたはＴｈｒがＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌに代えて／により）置換され；２）ＣｙｓもしくはＰｒｏが任意の他の残基に代えて／により置換され；３）陽性側鎖を有する残基が、陰性残基に代えて／により（例えばＬｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓがＡｓｐまたはＧｌｕに代えて／により）置換され；または４）かさ高い側鎖を有する残基が側鎖を有さないものに代えて／により（例えばＰｈｅがＧｌｙに代えて／により）置換される。５つの群の２つの間の非保存的アミノ酸置換は、コードされるタンパク質の活性に影響を与えないこともある。
【００９５】
用語「サイレント突然変異」は、コードされるポリペプチド中のアミノ酸変化をもたらさないＤＮＡ配列中の突然変異を指す。これらの突然変異は、２つ以上のコドンが１つのアミノ酸を規定し得る遺伝子コードの縮重の結果として生じることが多い。例えば、ＴＣＴ、ＴＣＡ、ＴＣＧおよびＴＣＣは全て、アミノ酸Ｓｅｒをコードし；したがって、ＤＮＡ配列中のＴＣＴからＴＣＡへの突然変異は、合成タンパク質中のアミノ酸の変化が存在しないため、遺伝子（またはそのｍＲＮＡ）のシーケンシングによってのみ検出される。
【００９６】
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸分子」、「核酸断片」および「単離核酸断片」は、本明細書において同義的に使用される。本明細書において使用される「単離核酸断片」は、場合により合成、非天然または変更ヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態の単離核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントを含み得る。
【００９７】
本明細書において使用される核酸断片は、一本鎖形態の核酸断片が温度および溶液イオン強度の適切な条件下で他の核酸断片にアニールし得る場合、別の核酸断片、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ分子と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、参照により本明細書に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、特に第１１章および表１１．１に例示されている。
【００９８】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、ポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を、当業者による配列の手作業での評価またはアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３））を使用するコンピュータにより自動化された配列比較および同定のいずれかによりそのポリペプチドまたは遺伝子を推定上同定するのに十分に含む部分である。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列を既知のタンパク質または遺伝子と相同であると推定上同定するためには、１０個以上の連続するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関して、配列依存的な遺伝子同定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離方法、例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチュハイブリダイゼーションにおいては、２０〜３０個の連続するヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用することができる。さらに、ＰＣＲにおいて１２〜１５塩基の短鎖オリゴヌクレオチドを増幅プライマーとして使用してそのプライマーを含む特定の核酸断片を得ることができる。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、その配列を含む核酸断片を具体的に同定し、および／または単離するのに十分な配列を含む。本明細書における開示は、特定のＬＰＣＡＴおよびＰＤＡＴをコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者は、本明細書に報告される配列の利益を有し、目下、当業者に公知の目的のために開示される配列の全てまたは実質的な部分を使用することができる。
【００９９】
用語「相補的」は、互いにハイブリダイズし得るヌクレオチド塩基間の関係を説明するために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的である。
【０１００】
用語「相同性」、「相同的」、「実質的に類似」および「実質的に対応する」は、本明細書において同義的に使用される。これらは、類似するが同一でない配列を有する核酸断片またはポリペプチドを指す。これらの用語は、得られる核酸断片の機能的特性を初期の未改変断片に対して実質的に変えない（例えば、１つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入を介する）核酸断片の改変を指すこともある。したがって、当業者が認識するとおり、本発明に包含されるのは具体的な例示的配列だけではないことが理解される。
【０１０１】
核酸またはポリペプチド配列に関する「配列同一性」または「同一性」は、規定の比較窓上で最大対応についてアラインメントされた場合に同一である２つの配列中の核酸塩基またはアミノ酸残基を指す。
【０１０２】
したがって、「配列同一性の割合」または「同一性パーセント」は、比較窓上で２つの最適にアラインメントされた配列を比較することにより決定される値を指し、比較窓中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントのために参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。割合は、両方の配列中の同一核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定してマッチ位置の数を得、マッチ位置の数を比較窓中の位置の総数により除し、結果に１００を乗じて配列同一性の割合を得ることにより算出される。
【０１０３】
「同一性パーセント」および「類似性パーセント」を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。同一性パーセントおよび類似性パーセントは、公知の方法、例として、限定されるものではないが、１）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ：ＮＪ（１９９４）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；および５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載のものにより容易に算出することができる。
【０１０４】
配列アラインメントおよび同一性または類似性パーセント算出は、相同配列を検出するために設計された種々の比較法、例として、限定されるものではないが、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングパッケージソフト（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを使用して決定することができる。配列の多重アラインメントは、「Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法」を使用して実施され、この方法は、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖアラインメント法」および「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法」（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２）により記載）を含む数種類のアルゴリズムを包含し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングパッケージソフト（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）（バージョン８．０．２）プログラムに見出される。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法を使用する多重タンパク質アラインメントのデフォルトパラメータは、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ、「ｓｌｏｗ−ａｃｃｕｒａｔｅ」オプションに対応する。いずれかのＣｌｕｓｔａｌプログラムを使用する配列のアラインメント後、プログラムの「配列距離」表を確認することにより「同一性パーセント」を得ることが可能である。
【０１０５】
配列同一性の多くのレベルが他の種からのポリペプチドの同定において有用であることが当業者により十分理解され、そのようなポリペプチドは、同一または類似の機能または活性を有する。好適な核酸断片、すなわち本明細書の開示による単離ポリヌクレオチドは、本明細書に報告されるアミノ酸配列と少なくとも約７０〜８５％同一であるポリペプチドをコードする一方、より好ましい核酸断片は、少なくとも約８５〜９５％同一であるアミノ酸配列をコードする。好ましい範囲は上記のものであるが、アミノ酸配列同一性パーセントの有用な例としては、４５％から１００％の任意の整数割合、例えば４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が挙げられる。また、この単離ヌクレオチド断片の任意の全長または部分相補体も対象となる。
【０１０６】
好適な核酸断片は上記の相同性を有するだけでなく、典型的には、少なくとも５０アミノ酸、好ましくは少なくとも１００アミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００アミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０アミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【０１０７】
「コドン縮重」は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えないヌクレオチド配列の変動を可能とする遺伝子コードにおける性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドコドンの使用において規定の宿主細胞により示される「コドンバイアス」を十分に理解する。したがって、宿主細胞中での発現を改善するために遺伝子を合成する場合、コドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に接近するように遺伝子を設計することが望ましい。
【０１０８】
「合成遺伝子」は、当業者に公知の手順を使用して化学合成されるオリゴヌクレオチドビルディングブロックから組み立てることができる。これらのオリゴヌクレオチドビルディングブロックをアニールし、次いでライゲートして遺伝子セグメントを形成し、次いでそれを酵素的に組み立てて遺伝子全体を構築する。したがって、遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映するためのヌクレオチド配列の最適化に基づき、最適な遺伝子発現に適応させることができる。当業者は、コドン使用が宿主に好都合なコドンに偏っている場合に良好な遺伝子発現の可能性を認識する。好ましいコドンの決定は、配列情報が利用可能である宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づき得る。例えば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）についてのコドン使用プロファイルが、参照により本明細書に援用される米国特許第７，１２５，６７２号明細書に提供されている。
【０１０９】
「遺伝子」は、規定のタンパク質を発現する核酸配列を指し、これはコード領域単独を指し得、またはコード配列の上流および／もしくは下流の調節配列を含み得る（例えば、コード領域の転写開始部位の上流の５’非翻訳領域、３’非コード領域）。「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列とともに天然に見出されるとおりの遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然遺伝子ではなく、天然では一緒に見出されない（すなわち互いに関して異種の）調節およびコード配列を含む任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列または同一の供給源に由来するが、天然に見出されるものとは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含み得る。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム中でその天然の位置に存在する天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、遺伝子導入により宿主生物中に導入された遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新たな位置中に導入された天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含み得る。「トランス遺伝子」は、形質転換手順によりゲノム中に導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」は、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するよう設計されたコドン使用頻度を有する遺伝子である。
【０１１０】
「コード配列」は、規定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「調節配列」は、コード配列の転写開始部位の上流に位置するヌクレオチド配列、５’非翻訳領域および３’非コード配列を指し、関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性または翻訳に影響し得る。調節配列としては、限定されるものではないが、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ステム−ループ構造およびターミネーターを挙げることができる。
【０１１１】
「プロモーター」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御し得るＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、全体として天然遺伝子に由来し得、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されていてよく、またはさらには合成ＤＮＡセグメントを含み得る。当業者は、異なるプロモーターが異なる組織もしくは細胞型における、または異なる発生段階での、または異なる環境もしくは生理学的条件に応答して遺伝子の発現を指向し得ることを理解する。大部分の細胞型においてほとんどの場合に遺伝子の発現を生じさせるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。ほとんどの場合に調節配列（特にその５’末端におけるもの）の正確な境界は完全には定義されていないため、異なる長さのＤＮＡ断片が同一プロモーター活性を有し得ることがさらに認識される。
【０１１２】
用語「３’非コード配列」、「転写ターミネーター」、「ターミネーター」および「終結配列」は、コード配列の３’下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これはポリアデニル化認識配列と、ｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を与え得る調節シグナルをコードする他の配列とを含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を与えることを特徴とする。３’領域は、関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性または翻訳に影響し得る。
【０１１３】
「ＲＮＡ転写産物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写から生じる産物を指す。ＲＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写産物と称され、または一次転写産物の転写後プロセシングに由来するＲＮＡ配列であり得、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」は、イントロンを有さず、細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡと相補的な、およびそれから誘導される二本鎖ＤＮＡを指す。
【０１１４】
用語「作動可能に連結している」は、一方の機能が他方により影響を受けるような単一核酸断片上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現に影響を与え得る場合、そのコード配列と作動可能に連結している。すなわちコード配列はプロモーターの転写制御下にある。調節配列をコード配列にセンスまたはアンチセンス方向で作動可能に連結することができる。
【０１１５】
用語「組換え」または「異種」は、例えば化学合成による、または遺伝子操作技術による核酸の単離セグメントの操作による２つの他では別個の配列セグメントの人為的な組換えを指す。
【０１１６】
本明細書において使用される用語「発現」は、センス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定的な蓄積を指す。発現は、ｍＲＮＡのタンパク質（前駆体または成熟のいずれも）への翻訳も指し得る。
【０１１７】
「形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝的形質をもたらす、核酸分子の宿主生物中への導入を指す。核酸分子は、例えば自己複製するプラスミドであり得、または核酸分子は宿主生物のゲノム中に組み込まれ得る。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換」または「形質転換体」生物と称される。
【０１１８】
用語「プラスミド」および「ベクター」は、細胞の中央代謝の一部ではなく、通常、環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態の遺伝子を担持することが多い染色体外エレメントを指す。このようなエレメントは、自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列を有し得、任意の供給源に由来する直鎖または環状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、そこでは多数のヌクレオチド配列が結合され、または組み換えられて発現カセットを細胞中に導入し得る固有の構成となっている。
【０１１９】
用語「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて外来宿主中でのその遺伝子の発現を可能とするエレメントを有するＤＮＡの断片を指す。一般に、発現カセットは、選択された遺伝子のコード配列と、選択された遺伝子産物の発現に要求されるコード配列に先行する（５’非コード配列）および後続の（３’非コード配列）調節配列とを含む。したがって、発現カセットは、典型的には、１）プロモーター配列；２）コード配列［すなわちＯＲＦ］；および３）通常、真核生物においてはポリアデニル化部位を含有するターミネーターから構成される。発現カセットは、通常、ベクター内に含めてクローニングおよび形質転換を容易にする。それぞれの宿主について正確な調節配列が使用される限り、種々の発現カセットを種々の生物、例として細菌、酵母、植物および哺乳動物細胞中に形質転換することができる。
【０１２０】
用語「組換え構築物」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」および「組換えＤＮＡ構築物」は、本明細書において同義的に使用される。組換え構築物は、核酸断片、例えば天然では一緒に見出されない調節およびコード配列などの人為的組合せを含む。例えば、組換えＤＮＡ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列または同一の供給源に由来するが、天然に見出されるものとは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含み得る。このような構築物は、それ自体で使用することができ、またはベクターと同時に使用することができる。ベクターが使用される場合、当業者に周知のとおり、ベクターの選択は、宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。当業者は、本明細書に記載の単離核酸断片のいずれかを含む宿主細胞を良好に形質転換し、選択し、増殖させるために、ベクター上に存在しなくてはならない遺伝子エレメントを十分理解する。当業者は、異なる独立した形質転換イベントが、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらすことも認識し（Ｊｏｎｅｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：２４１１−２４１８（１９８５）；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１８：７８−８６（１９８９））、したがって所望の発現レベルおよびパターンを示す株または系統を得るために、複数のイベントをスクリーニングしなくてはならないことも認識する。このようなスクリーニングは、とりわけＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノザン分析、タンパク質発現のウエスタンおよび／もしくはＥＬＩＳＡ分析、規定産物の形成、表現型分析またはＰＵＦＡ産物のＧＣ分析により達成することができる。
【０１２１】
用語「宿主細胞」および「宿主生物」は、本明細書において同義的に使用され、外来または異種遺伝子を受容し得、それらの遺伝子を発現し得る任意の生物、例えば微生物または植物（例えば、油料種子植物）を指す。「組換え宿主細胞」は、組換え遺伝子操作された宿主細胞を指す。
【０１２２】
本明細書において使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）において；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）により；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）により、より十分に記載されている。
【０１２３】
第１の実施形態において、本明細書において、少なくとも１つの長鎖（ＬＣ）多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の産生のための組換え微生物細胞であって、
（ａ）ＬＰＣＡＴ活性を有する少なくとも１つのポリペプチド；
（ｂ）ＰＤＡＴ活性を有する少なくとも１つのポリペプチド；および
（ｃ）少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生し得るＰＵＦＡ生合成経路
を含み、
（ａ）および（ｂ）のポリペプチドは過剰発現され、対照細胞と比較して増加量の、総脂肪酸の重量パーセント［「重量％ＴＦＡ」］として計測される少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を有する組換え微生物細胞が記載される。
【０１２４】
ＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴの過剰発現は、例えばそれらの酵素をコードするポリヌクレオチド（すなわちトランス遺伝子）を細胞に導入することにより達成することができる。好ましくは、このようなポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドを含有するように改変された細胞中での遺伝子発現を可能とする調節配列、例えばプロモーターに作動可能に連結している。ＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴの過剰発現は、対照細胞中のＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴの発現に対するものである。
【０１２５】
ＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴを過剰発現する組換え微生物細胞の総脂肪酸の重量パーセント［「重量％ＴＦＡ」］として計測される少なくとも１つの長鎖ＰＵＦＡ（例えばＥＰＡ）の量の増加は、対照細胞の総脂肪酸の重量パーセントとして計測される少なくとも１つの長鎖ＰＵＦＡの量に対して少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％であり得る。
【０１２６】
ＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴの過剰発現に関して、対照細胞、対応する対照細胞または好適な対照細胞は、組換え微生物細胞に対応するが、過剰発現されるＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴポリペプチドを含まない野生型または組換え細胞であり得る。例えば、対照細胞は、ＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド配列を含まないことによりＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴポリペプチドを過剰発現しない。また、例えば、対照細胞は、ＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド配列を含むが、発現しないことによりＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴポリペプチドを過剰発現しない。対照細胞は、ＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴポリペプチドを過剰発現するように改変される前に存在したままの組換え微生物細胞（すなわち親細胞）であり得、またはＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴをコードする組換えポリヌクレオチドを含有するように改変されたが、組換えＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴポリペプチドを過剰発現しない組換え微生物細胞（例えばＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴポリペプチドを過剰発現する組換え微生物細胞と並行して調製された細胞）であり得る。
【０１２７】
ＰＤＡＴは、リン脂質、例えばホスファチジルコリン［「ＰＣ」］、ホスファチジルエタノールアミン［「ＰＥ」］およびホスファチジン酸［「ＰＡ」］のｓｎ−２位からアシル基を１，２−ジアシルグリセロール［「ＤＡＧ」］のｓｎ−３位に転移することによりＴＡＧ生合成を触媒する。この反応は、リゾリン脂質、例えばリゾホスファチジルコリン［「ＬＰＣ」］、リゾホスファチジルエタノールアミン［「ＬＰＥ」］、リゾホスファチジン酸［「ＬＰＡ」］およびリゾホスファチジルグリセロール［「ＬＰＧ」］をもたらす。ＬＰＣＡＴは、アシルＣｏＡからアシル基をその基質ＬＰＣのｓｎ−２位に転移することによりＰＣを再生し得る。脂肪酸リモデリングは、このように生じ得る。それというのも、ＰＣ１（図１）は、ＰＤＡＴにより除去された脂肪酸を置き換えるためにアシルＣｏＡプールからのどの脂肪酸が使用されるかに応じてＰＣ２と同等であり得ないためである。ＰＤＡＴによるＰＣ基質使用（ＰＣ１）およびＬＰＣＡＴによる再生（ＰＣ２）のこのサイクルを図１に図式化する。
【０１２８】
ＬＰＣＡＴおよびＰＤＡＴを過剰発現する組換え微生物細胞が、対照細胞と比較して増加量の、重量％ＴＦＡとして計測される長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する一方、組換え微生物細胞は、対照細胞と比較して（ｉ）増加したＣ１８からＣ２０への伸長変換効率；および／または（ｉｉ）増加した総脂質含有率（すなわち乾燥細胞重量の重量パーセントとして計測される総脂肪酸の量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］）も有し得る。
【０１２９】
増加したＣ１８からＣ２０への伸長変換効率は、増加したΔ９エロンガーゼ変換効率の効果（すなわち組換え微生物細胞のＰＵＦＡ生合成経路がΔ９エロンガーゼを含む場合）および／または増加したΔ６エロンガーゼ変換効率の効果（すなわち組換え微生物細胞のＰＵＦＡ生合成経路がΔ６エロンガーゼを含む場合）のいずれかであり得る。ＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴを過剰発現する組換え微生物細胞のＣ１８からＣ２０への伸長変換効率、Δ９エロンガーゼ変換効率および／またはΔ６エロンガーゼ変換効率の増加は、対照細胞のＣ１８からＣ２０への伸長変換効率、Δ９エロンガーゼ変換効率および／またはΔ６エロンガーゼ変換効率に対してそれぞれ少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％であり得る。
【０１３０】
総脂質含有率［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］は、ＬＰＣＡＴおよびＰＤＡＴを過剰発現する組換え微生物細胞中で増加され得る。当業者に周知のとおり、組換え微生物宿主細胞中のＬＣ多価不飽和脂肪酸の経済的な商業的産生には、種々の変量、例としてＬＣ多価不飽和脂肪酸濃度［「ＬＣ多価不飽和脂肪酸％ＴＦＡ」］、総脂質含有率［ＴＦＡ％ＤＣＷ］およびＬＣ多価不飽和脂肪酸産生率［「ＬＣ多価不飽和脂肪酸％ＤＣＷ」］の考慮が要求される。商業目的に好ましい株の選択には、ＬＣ多価不飽和脂肪酸％ＴＦＡ）およびＴＦＡ％ＤＣＷの両方が考慮される。それというのも、この両方の因子が乾燥細胞重量のパーセントとしてのＬＣ多価不飽和脂肪酸の細胞含有率に影響を与えるためである。
【０１３１】
ＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴを過剰発現する組換え微生物細胞の総脂質含有率（ＴＦＡ％ＤＣＷ）の増加は、対照細胞の総脂質含有率に対して少なくとも約１％、２％、３％、４％または５％であり得る。総脂質含有率の増加は、ＥＰＡ％ＴＦＡの増加と一致し得る。
【０１３２】
本発明の組換え微生物細胞は、ＰＤＡＴ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを過剰発現する。Ｄａｈｌｑｖｉｓｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７：６４８７−６４９２（２０００））およびＯｅｌｋｅｒｓら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：１５６０９−１５６１２（２０００））は、ＴＡＧ合成がアシルＣｏＡの不存在下で、アシルＣｏＡ非依存性ＰＤＡＴ酵素（タンパク質のレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼファミリーに構造的に関連する）を介して生じ得ることを認識する最初の文献であった。より具体的には、ＤａｈｌｑｖｉｓｔらおよびＯｅｌｋｅｒｓらは、ＰＤＡＴ（配列番号３０；「ＳｃＰＤＡＴ」）をコードするサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＬＲＯ１遺伝子の過剰発現が増加したＴＡＧ含有率をもたらす一方、ＳｃＰＤＡＴの欠失がＴＡＧ合成の顕著な低減を引き起こすことを実証した。この研究後、米国特許第７，２６７，９７６号明細書は、ＰＤＡＴをコードするヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２遺伝子（本明細書における配列番号３１および３２）のクローニング、過剰発現およびノックアウトを記載し、それはＳｃＰＤＡＴと４７．１％のアミノ酸配列同一性を共有することが決定された。ＰＤＡＴが破壊されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、野生型株と比較して低い油含有率［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］（約２９〜３８％）を有することが見出された一方、ＰＤＡＴ２およびＤＧＡＴ２の両方が破壊された株は、対照と比較して１７〜２７％の油含有率を有するにすぎないことが実証された。次いで、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＤＡＴが天然ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２遺伝子が破壊されたＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株中で発現され；ＴＦＡ％ＤＣＷは、対照と比較して形質転換体株中で２倍になった。
【０１３３】
本明細書の目的のため、ＰＤＡＴ活性を有するポリペプチドは、（ａ）本質的に配列番号３０および配列番号３２からなる群から選択される配列からなる配列；ならびに（ｂ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号３０および配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して少なくとも９０％または９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドからなる群から選択することができる。この意味において、ＰＤＡＴ活性を有するポリペプチドは、例えば酵母に由来し得；好ましくは、酵母ＰＤＡＴポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に由来する。
【０１３４】
当業者は、配列番号３０および３２に記載の配列のいずれかまたはその一部を使用して同一または他の藻類、真菌、卵菌、ユーグレナ、ストラメノパイル、酵母または植物種中のＰＤＡＴ相同体を、配列分析ソフトウェアを使用して探索することができることを認識する。一般に、このようなコンピュータソフトウェアは、相同性の程度を種々の置換、欠失および他の改変に割り当てることにより類似配列をマッチさせる。ソフトウェアアルゴリズム、例えば低複雑性フィルタおよび以下のパラメータ：期待値＝１０、マトリックス＝Ｂｌｏｓｕｍ  ６２を有するＢＬＡＳＴＰアラインメント法（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））の使用が、任意のＰＤＡＴタンパク質を核酸またはタンパク質配列のデータベースに対して比較し、それにより好ましい宿主生物内の類似の既知配列を同定するために周知である。
【０１３５】
あるいは、公的に利用可能なＰＤＡＴ配列またはそのモチーフが、相同体の同定のためのハイブリダイゼーション試薬であり得る。ハイブリダイゼーション法は、上記のとおり当業者に周知である。
【０１３６】
配列依存性プロトコルを使用する相同遺伝子の単離が、当技術分野において周知である。配列依存性プロトコルの例としては、限定されるものではないが、１）核酸ハイブリダイゼーションの方法；２）核酸増幅技術の種々の使用により例示されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応［「ＰＣＲ」］（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）；リガーゼ連鎖反応［「ＬＣＲ」］（Ｔａｂｏｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１０７４（１９８５））；または鎖置換増幅［「ＳＤＡ」］（Ｗａｌｋｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２））；ならびに３）ライブラリー構築および相補性によるスクリーニングの方法が挙げられる。
【０１３７】
当業者に利用可能な周知の方法に基づき、選択された任意の好ましい真核生物中のＰＤＡＴ遺伝子相同体を同定および／または単離することが可能である。任意の推定ＰＤＡＴ遺伝子の活性は、ＬＣ−ＰＵＦＡ産生宿主生物内での遺伝子の発現により容易に確認することができる。それというのも、ＴＦＡの重量％として計測されるＬＣ多価不飽和脂肪酸は、ＬＰＣＡＴおよびＰＤＡＴトランス遺伝子を過剰発現しない対照内のものに対して増加するためである（好適なＰＤＡＴと同時発現される場合）。
【０１３８】
本発明の組換え微生物細胞は、ＬＰＣＡＴ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを過剰発現し、ポリペプチドは、野生型タンパク質または合成により創成される（すなわち天然では生じない）突然変異タンパク質であり得る。このポリペプチドは、好ましくは、以下のものからなる群から選択される：
（ａ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２（ＳｃＬＰＣＡＴ）および配列番号４（ＹｌＬＰＣＡＴ）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して少なくとも４５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）以下のものからなる群から選択される少なくとも１つの膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを含むポリペプチド：配列番号５（ＷＨＧ−Ｘ３−ＧＹ−Ｘ３−Ｆ）、配列番号６（Ｙ−Ｘ４−Ｆ）、配列番号７（Ｙ−Ｘ３−ＹＦ−Ｘ２−Ｈ）、配列番号８（Ｍ−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｉ］−Ｘ２−Ｋ−［Ｌ／Ｖ／Ｉ］−Ｘ８−ＤＧ）、配列番号９（ＲｘＫＹＹ−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−［Ｅ／Ｄ］−［Ａ／Ｇ］−Ｘ５−ＧｘＧ−［Ｆ／Ｙ］−ｘＧ）、配列番号１０（ＥＸ１１ＷＮ−Ｘ２−［Ｔ／Ｖ］−Ｘ２−Ｗ）、配列番号１１（ＳＡｘＷＨＧ−Ｘ２−ＰＧＹ−Ｘ２−［Ｔ／Ｆ］−Ｆ）、配列番号１２（Ｍ−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ］−［Ｖ／Ｃ／Ａ／Ｔ］−［Ｍ／Ｌ／Ｑ］−Ｋ−［Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ｓ／Ｔ／Ｙ／Ｉ］−［Ｓ／Ｔ／Ａ／Ｍ／Ｇ］−［Ｆ／Ｌ／Ｃ／Ｙ］−［Ｃ／Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ｗ／Ｙ／Ｍ／Ｉ／Ｆ／Ｃ］−［Ｎ／Ｓ／Ｅ／Ｑ／Ｄ］−［Ｖ／Ｙ／Ｌ／Ｉ］−［Ｈ／Ｙ／Ａ／Ｎ／Ｓ／Ｔ］−ＤＧ）、配列番号１３（Ｒ−［Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｗ／Ｐ／Ｙ］−ＫＹＹ−［Ｇ／Ａ／Ｆ／Ｈ／Ｓ］−［Ｖ／Ａ／Ｉ／Ｃ］−Ｗ−［Ｙ／Ｅ／Ｔ／Ｍ／Ｓ／Ｌ］−［Ｌ／Ｉ／Ｎ］−［Ｔ／Ｓ／Ａ］−［Ｅ／Ｄ］−［Ｇ／Ａ］−［Ａ／Ｓ／Ｉ／Ｖ］−［Ｃ／Ｓ／Ｉ／Ｎ／Ｈ／Ｌ］−［Ｖ／Ｉ／Ｎ］−［Ｌ／Ｉ／Ｎ／Ａ／Ｃ］−［Ｓ／Ｃ／Ｗ／Ａ／Ｉ］−Ｇ−［Ｍ／Ｉ／Ｌ／Ａ／Ｆ］−Ｇ−［Ｙ／Ｆ］−［Ｎ／Ｅ／Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ］−Ｇ）、配列番号１４（Ｅ−［Ｔ／Ｆ／Ｌ／Ｍ］−［Ａ／Ｓ］−［Ｑ／Ｄ／Ｐ／Ｋ／Ｔ］−［Ｎ／Ｓ］−［Ｓ／Ｉ／Ｔ／Ｌ／Ａ／Ｍ／Ｆ］−［Ｈ／Ｋ／Ｒ／Ｖ］−［Ｇ／Ｃ／Ｅ／Ｔ／Ｑ／Ｄ／Ｍ］−［Ｙ／Ａ／Ｍ／Ｌ／Ｉ／Ｆ］−［Ｌ／Ｓ／Ｐ／Ｉ］−［Ｇ／Ｅ／Ａ／Ｌ／Ｎ／Ｄ］−［Ｓ／Ａ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ｎ］−ＷＮ−［Ｋ／Ｍ／Ｉ／Ｃ］−［Ｎ／Ｋ／Ｑ／Ｇ］−［Ｔ／Ｖ］−［Ｎ／Ａ／Ｓ］−［Ｈ／Ｋ／Ｎ／Ｔ／Ｒ／Ｌ］−Ｗ）、配列番号１５（ＳＡ−［Ｆ／Ｍ／Ｖ／Ｉ］−ＷＨＧ−［Ｆ／Ｖ／Ｔ／Ｌ］−［Ｙ／Ｓ／Ｒ］−ＰＧＹ−［Ｙ／Ｍ／Ｉ］−［Ｌ／Ｍ／Ｉ／Ｆ］−［Ｔ／Ｆ］−Ｆ）、配列番号１６（Ｍ−［Ｖ／Ｉ］−Ｌ−Ｘ２−ＫＬ）、配列番号１７（ＲｘＫＹＹ−Ｘ２−Ｗ）および配列番号１８（ＳＡｘＷＨＧ）；
（ｃ）下記の少なくとも１つの突然変異膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを含むポリペプチド；
（ｄ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２１（ＭａＬＰＡＡＴ１）、配列番号２３（ＹｌＬＰＡＡＴ１）および配列番号２４（ＳｃＬＰＡＡＴ）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；ならびに
（ｅ）配列番号２５（ＮＨｘｘｘｘＤ）および配列番号２６（ＥＧＴＲ）からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼファミリーモチーフを含むポリペプチド。
【０１３９】
あるいは、ＬＰＣＡＴ活性を有するポリペプチドは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２（ＳｃＬＰＣＡＴ）および配列番号４（ＹｌＬＰＣＡＴ）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して少なくとも９０％または９５％のアミノ酸同一性を有し得る。この意味において、ＬＰＣＡＴ活性を有するポリペプチドは、例えば酵母から由来し得；好ましくは、酵母ＬＰＣＡＴポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に由来する。
【０１４０】
本明細書において配列番号２［ＳｃＬＰＣＡＴ］および配列番号４［ＹｌＬＰＣＡＴ］に記載のＬＰＣＡＴ配列のいずれかもしくはその一部、または本明細書において配列番号２４［ＳｃＬＰＡＡＴ］、配列番号２１［ＭａＬＰＡＡＴ１］および配列番号２３［ＹｌＬＰＡＡＴ１］に記載のＬＰＡＡＴもしくはその一部を使用して同一または他の種中のＬＰＣＡＴ相同体を、ＰＤＡＴに関して上記の配列分析ソフトウェアを使用して探索することができる。
【０１４１】
既知配列のデータベースを探索するためのソフトウェアアルゴリズムの使用は、公的に利用可能なＬＰＣＡＴ配列、例えば配列番号２および４に記載のものに対して比較的低い同一性パーセントを有する相同体の単離に特に好適である。単離は、公的に利用可能なＬＰＣＡＴ配列と少なくとも約７０％〜８５％の同一性のＬＰＣＡＴ相同体について比較的容易であることが予測可能である。さらに、少なくとも８５〜９０％同一であるそれらの配列は単離に特に好適であり、少なくとも約９０〜９５％同一であるそれらの配列は最も容易に単離される。
【０１４２】
ＬＰＣＡＴ相同体は、ＬＰＣＡＴ酵素に特有のモチーフ、例えば膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼ［「ＭＢＯＡＴ」］ファミリーモチーフ、例えば表２に記載のものの使用により同定することもできる。ＬＰＣＡＴおよびＬＰＡＡＴ活性の両方を有するＬＰＣＡＴを、ＬＰＡＡＴ酵素に特有のモチーフ、例えばＮＨｘｘｘｘＤ（配列番号２５）およびＥＧＴＲ（配列番号２６）からなる群から選択される１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼファミリーモチーフの使用により同定することもできる。
【０１４３】
当業者に利用可能な周知の方法に基づき、選択された任意の好ましい真核生物中のＬＰＣＡＴ遺伝子相同体を同定および／または単離することが可能である。任意の推定ＬＰＣＡＴ遺伝子の活性は、ＬＣ−ＰＵＦＡ産生宿主生物内での遺伝子の発現により容易に確認することができる。それというのも、ＴＦＡの重量％として計測されるＬＣ−ＰＵＦＡは、ＬＰＣＡＴおよびＰＤＡＴトランス遺伝子の両方を過剰発現しない生物内のものに対して増加するためである（好適なＰＤＡＴと同時発現される場合）（上記）。
【０１４４】
本発明の一態様において、ＬＰＣＡＴ活性を有する非天然存在突然変異ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドの同定にかなりの労力が投資され、前記突然変異ポリペプチドは、少なくとも１つの突然変異膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質モチーフを含み、前記突然変異モチーフは、以下のものからなる群から選択される：
（ａ）配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含む突然変異モチーフ（配列番号３３は、配列番号１６（Ｍ−［Ｖ／Ｉ］−Ｌ−Ｘ２−ＫＬ）と少なくとも１つのアミノ酸突然変異だけ異なり、前記突然変異は、Ｍ１Ａ、Ｍ１Ｎ、Ｍ１Ｃ、Ｍ１Ｇ、Ｍ１Ｑ、Ｍ１Ｈ、Ｍ１Ｉ、Ｍ１Ｌ、Ｍ１Ｆ、Ｍ１Ｐ、Ｍ１Ｓ、Ｍ１Ｔ、Ｍ１Ｗ、Ｍ１Ｙ、Ｍ１Ｖ、Ｖ２Ａ、Ｖ２Ｎ、Ｖ２Ｃ、Ｖ２Ｇ、Ｖ２Ｑ、Ｖ２Ｈ、Ｖ２Ｌ、Ｖ２Ｍ、Ｖ２Ｆ、Ｖ２Ｐ、Ｖ２Ｓ、Ｖ２Ｔ、Ｖ２Ｗ、Ｖ２Ｙ、Ｉ２Ａ、Ｉ２Ｎ、Ｉ２Ｃ、Ｉ２Ｇ、Ｉ２Ｑ、Ｉ２Ｈ、Ｉ２Ｌ、Ｉ２Ｍ、Ｉ２Ｆ、Ｉ２Ｐ、Ｉ２Ｓ、Ｉ２Ｔ、Ｉ２Ｗ、Ｉ２Ｙ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｎ、Ｌ３Ｃ、Ｌ３Ｇ、Ｌ３Ｑ、Ｌ３Ｈ、Ｌ３Ｍ、Ｌ３Ｆ、Ｌ３Ｐ、Ｌ３Ｓ、Ｌ３Ｔ、Ｌ３Ｗ、Ｌ３Ｙ、Ｌ３Ｖ、Ｋ６Ａ、Ｋ６Ｒ、Ｋ６Ｎ、Ｋ６Ｇ、Ｋ６Ｈ、Ｋ６Ｐ、Ｋ６Ｓ、Ｋ６Ｔ、Ｋ６Ｙ、Ｌ７Ａ、Ｌ７Ｎ、Ｌ７Ｃ、Ｌ７Ｇ、Ｌ７Ｑ、Ｌ７Ｈ、Ｌ７Ｉ、Ｌ７Ｍ、Ｌ７Ｆ、Ｌ７Ｐ、Ｌ７Ｓ、Ｌ７Ｔ、Ｌ７ＷおよびＬ７Ｙからなる群から選択される）；
（ｂ）配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む突然変異モチーフ（配列番号３４は、配列番号８（Ｍ−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｉ］−Ｘ２−Ｋ−［Ｌ／Ｖ／Ｉ］−Ｘ８−ＤＧ）と少なくともアミノ酸突然変異だけ異なり、前記突然変異は、Ｍ１Ａ、Ｍ１Ｎ、Ｍ１Ｃ、Ｍ１Ｇ、Ｍ１Ｑ、Ｍ１Ｈ、Ｍ１Ｉ、Ｍ１Ｌ、Ｍ１Ｆ、Ｍ１Ｐ、Ｍ１Ｓ、Ｍ１Ｔ、Ｍ１Ｗ、Ｍ１Ｙ、Ｍ１Ｖ、Ｖ２Ａ、Ｖ２Ｎ、Ｖ２Ｃ、Ｖ２Ｇ、Ｖ２Ｑ、Ｖ２Ｈ、Ｖ２Ｌ、Ｖ２Ｍ、Ｖ２Ｆ、Ｖ２Ｐ、Ｖ２Ｓ、Ｖ２Ｔ、Ｖ２Ｗ、Ｖ２Ｙ、Ｉ２Ａ、Ｉ２Ｎ、Ｉ２Ｃ、Ｉ２Ｇ、Ｉ２Ｑ、Ｉ２Ｈ、Ｉ２Ｌ、Ｉ２Ｍ、Ｉ２Ｆ、Ｉ２Ｐ、Ｉ２Ｓ、Ｉ２Ｔ、Ｉ２Ｗ、Ｉ２Ｙ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｎ、Ｌ３Ｃ、Ｌ３Ｇ、Ｌ３Ｑ、Ｌ３Ｈ、Ｌ３Ｍ、Ｌ３Ｆ、Ｌ３Ｐ、Ｌ３Ｓ、Ｌ３Ｔ、Ｌ３Ｗ、Ｌ３Ｙ、Ｌ３Ｖ、Ｉ３Ａ、Ｉ３Ｎ、Ｉ３Ｃ、Ｉ３Ｇ、Ｉ３Ｑ、Ｉ３Ｈ、Ｉ３Ｍ、Ｉ３Ｆ、Ｉ３Ｐ、Ｉ３Ｓ、Ｉ３Ｔ、Ｉ３Ｗ、Ｉ３Ｙ、Ｉ３Ｖ、Ｋ６Ａ、Ｋ６Ｒ、Ｋ６Ｎ、Ｋ６Ｇ、Ｋ６Ｈ、Ｋ６Ｐ、Ｋ６Ｓ、Ｋ６Ｔ、Ｋ６Ｙ、Ｌ７Ａ、Ｌ７Ｎ、Ｌ７Ｃ、Ｌ７Ｇ、Ｌ７Ｑ、Ｌ７Ｈ、Ｌ７Ｉ、Ｌ７Ｍ、Ｌ７Ｆ、Ｌ７Ｐ、Ｌ７Ｓ、Ｌ７Ｔ、Ｌ７Ｗ、Ｌ７Ｙ、Ｖ７Ａ、Ｖ７Ｎ、Ｖ７Ｃ、Ｖ７Ｇ、Ｖ７Ｑ、Ｖ７Ｈ、Ｖ７Ｉ、Ｖ７Ｍ、Ｖ７Ｆ、Ｖ７Ｐ、Ｖ７Ｓ、Ｖ７Ｔ、Ｖ７Ｗ、Ｖ７Ｙ、Ｉ７Ａ、Ｉ７Ｎ、Ｉ７Ｃ、Ｉ７Ｇ、Ｉ７Ｑ、Ｉ７Ｈ、Ｉ７Ｍ、Ｉ７Ｆ、Ｉ７Ｐ、Ｉ７Ｓ、Ｉ７Ｔ、Ｉ７Ｗ、Ｉ７Ｙ、Ｄ１６Ａ、Ｄ１６Ｎ、Ｄ１６Ｇ、Ｄ１６Ｅ、Ｄ１６Ｑ、Ｄ１６Ｈ、Ｄ１６Ｆ、Ｄ１６Ｓ、Ｄ１６Ｔ、Ｇ１７Ａ、Ｇ１７Ｎ、Ｇ１７Ｈ、Ｇ１７Ｌ、Ｇ１７Ｍ、Ｇ１７Ｆ、Ｇ１７Ｓ、Ｇ１７ＴおよびＧ１７Ｖからなる群から選択される）；
（ｃ）配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含む突然変異モチーフ（配列番号３５は、配列番号５（ＷＨＧ−Ｘ３−ＧＹ−Ｘ３−Ｆ）と少なくとも１つのアミノ酸突然変異だけ異なり、前記突然変異は、Ｇ７Ａ、Ｇ７Ｎ、Ｇ７Ｃ、Ｇ７Ｈ、Ｇ７Ｉ、Ｇ７Ｌ、Ｇ７Ｋ、Ｇ７Ｍ、Ｇ７Ｆ、Ｇ７Ｓ、Ｇ７Ｔ、Ｇ７Ｗ、Ｇ７Ｙ、Ｇ７Ｖ、Ｙ８Ａ、Ｙ８Ｇ、Ｙ８Ｈ、Ｙ８Ｌ、Ｙ８Ｆ、Ｙ８Ｐ、Ｙ８Ｓ、Ｙ８Ｔ、Ｙ８Ｖ、Ｆ１２Ａ、Ｆ１２Ｎ、Ｆ１２Ｃ、Ｆ１２Ｇ、Ｆ１２Ｈ、Ｆ１２Ｌ、Ｆ１２Ｍ、Ｆ１２Ｐ、Ｆ１２Ｓ、Ｆ１２ＴおよびＦ１２Ｖからなる群から選択される）；
（ｄ）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む突然変異モチーフ（配列番号３６は、配列番号１１（ＳＡｘＷＨＧ−Ｘ２−ＰＧＹ−Ｘ２−［Ｔ／Ｆ］−Ｆ）と少なくとも１つのアミノ酸突然変異だけ異なり、前記突然変異は、Ｓ１Ａ、Ｓ１Ｇ、Ｓ１Ｈ、Ｓ１Ｌ、Ｓ１Ｆ、Ｓ１Ｐ、Ｓ１Ｔ、Ｓ１Ｖ、Ａ２Ｎ、Ａ２Ｇ、Ａ２Ｈ、Ａ２Ｌ、Ａ２Ｆ、Ａ２Ｐ、Ａ２Ｓ、Ａ２Ｔ、Ａ２Ｖ、Ｐ９Ａ、Ｐ９Ｒ、Ｐ９Ｇ、Ｐ９Ｈ、Ｐ９Ｉ、Ｐ９Ｌ、Ｐ９Ｋ、Ｐ９Ｍ、Ｐ９Ｆ、Ｐ９Ｓ、Ｐ９Ｔ、Ｐ９Ｗ、Ｐ９Ｙ、Ｐ９Ｖ、Ｇ１０Ａ、Ｇ１０Ｎ、Ｇ１０Ｃ、Ｇ１０Ｈ、Ｇ１０Ｉ、Ｇ１０Ｌ、Ｇ１０Ｋ、Ｇ１０Ｍ、Ｇ１０Ｆ、Ｇ１０Ｓ、Ｇ１０Ｔ、Ｇ１０Ｗ、Ｇ１０Ｙ、Ｇ１０Ｖ、Ｙ１１Ａ、Ｙ１１Ｇ、Ｙ１１Ｈ、Ｙ１１Ｌ、Ｙ１１Ｆ、Ｙ１１Ｐ、Ｙ１１Ｓ、Ｙ１１Ｔ、Ｙ１１Ｖ、Ｔ１４Ａ、Ｔ１４Ｃ、Ｔ１４Ｇ、Ｔ１４Ｈ、Ｔ１４Ｉ、Ｔ１４Ｌ、Ｔ１４Ｍ、Ｔ１４Ｆ、Ｔ１４Ｐ、Ｔ１４Ｓ、Ｔ１４Ｗ、Ｔ１４Ｙ、Ｔ１４Ｖ、Ｆ１４Ａ、Ｆ１４Ｃ、Ｆ１４Ｇ、Ｆ１４Ｈ、Ｆ１４Ｉ、Ｆ１４Ｌ、Ｆ１４Ｍ、Ｆ１４Ｐ、Ｆ１４Ｓ、Ｆ１４Ｗ、Ｆ１４Ｙ、Ｆ１４Ｖ、Ｆ１５Ａ、Ｆ１５Ｎ、Ｆ１５Ｃ、Ｆ１５Ｇ、Ｆ１５Ｈ、Ｆ１５Ｌ、Ｆ１５Ｍ、Ｆ１５Ｐ、Ｆ１５Ｓ、Ｆ１５ＴおよびＦ１５Ｖからなる群から選択される）；および
（ｅ）区分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のヌクレオチド配列の相補体（相補体およびヌクレオチド配列は、同数のヌクレオチドからなり、１００％相補的である）。
【０１４５】
したがって、本発明の一態様は、アシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）活性を有する突然変異ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、突然変異ポリペプチドは、少なくとも１つの突然変異膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質モチーフを含み、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結している単離ポリヌクレオチドに関する。
【０１４６】
例えば、ポリヌクレオチドは、モチーフＩおよび／またはモチーフＩＩ中の突然変異を有する突然変異酵母（例えば、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ））ＬＰＣＡＴポリペプチドをコードし得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号４（野生型ＹｌＬＰＣＡＴ）と少なくとも９０％または９５％同一であるＬＰＣＡＴ活性を有し、モチーフＩ（配列番号４の残基１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８）および／またはモチーフＩＩ（配列番号４の残基３７６、３７７、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８９、３９０）中の１つ以上の突然変異（例えば、アミノ酸置換、欠失および／または挿入）を有するアミノ酸配列をコードし得る。置換突然変異は、例えば本明細書に記載のもののいずれかであり得る。好ましくは、ポリヌクレオチドによりコードされる突然変異ＬＰＣＡＴポリペプチドの活性は、野生型ＹｌＬＰＣＡＴ（例えば配列番号４）の活性と同等以上である。このような活性は、突然変異ＬＰＣＡＴを過剰発現する組換え細胞（例えば、微生物細胞）中のＥＰＡ％ＴＦＡおよび／またはｄ９ｅＣＥ（％）を、対照細胞中のＥＰＡ％ＴＦＡおよび／またはｄ９ｅＣＥ（％）と比較することにより測定することができる。
【０１４７】
別の例において、ポリヌクレオチドは、ＬＰＣＡＴ活性を有し、ポリペプチドが１３６位におけるセリンおよび３８９位におけるアラニンを有する配列番号７９；ポリペプチドが１３６位におけるセリンおよび３８９位におけるシステインを有する配列番号８１；ポリペプチドが１３６位におけるセリンおよび３８９位におけるセリンを有する配列番号８３；ポリペプチドが１３６位におけるバリンおよび３８９位におけるシステインを有する配列番号８５；ポリペプチドが１４４位におけるアラニンおよび３９０位におけるセリンを有する配列番号８７；ポリペプチドが１４８位におけるアラニンおよび３９０位におけるセリンを有する配列番号８９；ポリペプチドが１４８位におけるアスパラギンおよび３８２位におけるイソロイシンを有する配列番号９１；またはポリペプチドが１４８位におけるアスパラギンおよび３９０位におけるセリンを有する配列番号９３と少なくとも９０％または９５％同一であるポリペプチドをコードし得る。
【０１４８】
配列を合成し、配列を編成する方法は、文献において十分確立されている。天然存在遺伝子の突然変異（このような突然変異としては、欠失、挿入および点突然変異またはそれらの組合せを挙げることができる）を得るために多くの技術が一般に用いられる。本研究は、少なくとも１つのＬＣ−多価不飽和脂肪酸を産生するように遺伝子操作された微生物細胞中で発現される場合に酵素内で許容されるＬＰＣＡＴ（例えば、ＹｌＬＰＣＡＴ［例えば配列番号４］）内の好適な突然変異の同定を目的として実施した。より好ましくは、ＴＦＡの重量％および／またはＣ１８からＣ２０への伸長変換効率として計測されるＬＣ−多価不飽和脂肪酸の量を増加させる突然変異の同定が、ＰＵＦＡ生合成の全体の比率および量を増加させる手段として特に望まれた。
【０１４９】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＣＡＴポリペプチド内の２つの規定の保存モチーフ中の種々のＬＰＣＡＴ突然変異が、本明細書に記載される。具体的には、一組の部位飽和ライブラリーを、配列番号８（Ｍ−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｉ］−Ｘ２−Ｋ−［Ｌ／Ｖ／Ｉ］−Ｘ８−ＤＧ）に対応するモチーフＩ内の１７アミノ酸残基内で、および配列番号１１（ＳＡｘＷＨＧ−Ｘ２−ＰＧＹ−Ｘ２−［Ｔ／Ｆ］−Ｆ）に対応するモチーフＩＩの１５アミノ酸残基の１２残基内で、ＹｌＬＰＣＡＴ（配列番号４）をテンプレートとして使用して創成し、ＹｌＬＰＣＡＴは、キメラＹＡＴ１：：ＹｌＬＰＣＡＴ：：Ｌｉｐ１遺伝子を含むプラスミド構築物内に含有させた。次いで、ＹｌＬＰＣＡＴポリペプチドに関する単一アミノ酸変化をそれぞれ含む部位飽和ライブラリーを、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中に形質転換し、改善されたΔ９エロンガーゼ変換効率［「％変換」］（すなわちＣ１８ＰＵＦＡからＣ２０ＰＵＦＡへの変換率に基づく）および／またはＧＣ分析に基づくＴＦＡの重量パーセント［「ＥＰＡ％ＴＦＡ」］としての改善されたＥＰＡの産生についてスクリーニングした。直接的方法とは対照的に、これらの間接的手段を利用してＬＰＣＡＴ活性を分析した。
【０１５０】
より具体的には、ＹｌＬＰＣＡＴ内のアミノ酸残基１３２から１４８（モチーフＩ）およびアミノ酸残基３７６から３７８および３８２から３９０（モチーフＩＩ）を個々に突然変異させた。突然変異体の全３２９種は、ＥＰＡ％ＴＦＡが対照ＹｌＬＰＣＡＴポリペプチドのＥＰＡ％ＴＦＡの少なくとも７５％であるように機能し；突然変異体の全ては、対照ＹｌＬＰＣＡＴポリペプチドの％変換の少なくとも８７．６％である％変換で機能した。５６種のＹｌＬＰＣＡＴ突然変異体が、同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡおよび同等のまたは改善された％変換を示すことが見出された。別の１４種のＹｌＬＰＣＡＴ＊突然変異体は、対照と比較して同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡを有することが決定され（しかし、同等の％変換も改善された％変換も有さなかった）；別の１２種の突然変異体は、対照と比較して同等のまたは改善された％変換を有することが決定された（しかし、同等のＥＰＡ％ＴＦＡも改善されたＥＰＡ％ＴＦＡも有さなかった）。したがって、この研究により、ＹｌＬＰＣＡＴのＬＰＣＡＴ活性は、実際に悪影響なしで改変することができ、さらにはタンパク質遺伝子操作により改善することができたことが実証された。
【０１５１】
同等のまたは改善されたＬＰＣＡＴ活性をもたらす突然変異体を、モチーフＩ内のアミノ酸残基１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７および１４８において生成し、それにより、配列番号８（Ｍ−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｉ］−Ｘ２−Ｋ−［Ｌ／Ｖ／Ｉ］−Ｘ８−ＤＧ）のメチオニン［Ｍ］残基のみが変異を許容し得ないと考えられることを実証した。同様に、同等のまたは改善されたＬＰＣＡＴ活性をもたらす突然変異体を、モチーフＩＩ中のアミノ酸残基３７８、３８２、３８３、３８５、３８８、３８９および３９０において生成し、それにより、配列番号１１（ＳＡｘＷＨＧ−Ｘ２−ＰＧＹ−Ｘ２−［Ｔ／Ｆ］−Ｆ）のセリン［Ｓ］、アラニン［Ａ］、プロリン［Ｐ］およびチロシン［Ｙ］が変異を許容し得ないと考えられることを実証した。残基３７９〜３８１におけるアミノ酸（すなわちＷＨＧ）は、突然変異に供しなかった。それというのも、ＹｌＬＰＣＡＴのＨ３８０に対応する他のＬＰＣＡＴのヒスチジンは、活性部位残基である可能性が高いと報告されているためである（Ｌｅｅら，２００８，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９：１１７４−１１８４）。
【０１５２】
したがって、本明細書の一実施形態において、少なくとも１つの突然変異膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質モチーフを含むリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＣＡＴ」］活性を有する非天然存在突然変異ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、
（ａ）突然変異ポリペプチドは、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含み、配列番号１９は、配列番号４（ＹｌＬＰＣＡＴ）と少なくとも１つのアミノ酸突然変異だけ異なり、（ｉ）アミノ酸突然変異は、残基１３３、残基１３４、残基１３５、残基１３６、残基１３７、残基１３８、残基１３９、残基１４０、残基１４１、残基１４２、残基１４３、残基１４４、残基１４５、残基１４６、残基１４７および残基１４８からなる群から選択される残基におけるアミノ酸置換であり；
（ｉｉ）アミノ酸突然変異は、残基３７８、残基３８２、残基３８３、残基３８５、残基３８８、残基３８９および残基３９０からなる群から選択される残基におけるアミノ酸置換であり；または
（ｉｉｉ）少なくとも２つのアミノ酸突然変異が存在し：
（１）第１のアミノ酸突然変異は、区分（ｉ）に記載の群から選択されるアミノ酸置換であり、
（２）第２のアミノ酸突然変異は、区分（ｉｉ）に記載の群から選択されるアミノ酸置換であり；
（ｂ）少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生し得る多価不飽和脂肪酸生合成経路を含む組換えヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞中の突然変異ポリペプチドの過剰発現は、
（ｉ）対照ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞により産生される量と少なくとも同一以上である、総脂肪酸の重量パーセントとして計測される少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸の量；および
（ｉｉ）対照ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞の変換効率と少なくとも同一以上であるＣ１８からＣ２０への伸長変換効率
からなる群から選択される結果を産生する単離ポリヌクレオチドが開示される。
【０１５３】
上記単離ポリヌクレオチドによりコードされるＬＰＣＡＴ活性を有する突然変異ポリペプチドも、本明細書において本出願人らにより想定される。
【０１５４】
１つの好ましい実施形態において、突然変異ＹｌＬＰＣＡＴポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含み、配列番号３７は、配列番号４（ＹｌＬＰＣＡＴ）と異なり、前記差異は、Ｌ１３４Ａ、Ｌ１３４Ｃ、Ｌ１３４Ｇ、Ｃ１３５Ｄ、Ｃ１３５Ｉ、Ｍ１３６Ｇ、Ｍ１３６Ｐ、Ｍ１３６Ｓ、Ｍ１３６Ｖ、Ｋ１３７Ｎ、Ｋ１３７Ｇ、Ｋ１３７Ｈ、Ｋ１３７Ｙ、Ｌ１３８Ａ、Ｌ１３８Ｈ、Ｌ１３８Ｍ、Ｓ１３９Ｌ、Ｓ１３９Ｗ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１４０Ｈ、Ｓ１４０Ｐ、Ｓ１４０Ｗ、Ｆ１４１Ａ、Ｆ１４１Ｍ、Ｆ１４１Ｗ、Ｇ１４２Ｈ、Ｗ１４３Ｌ、Ｎ１４４Ａ、Ｎ１４４Ｋ、Ｎ１４４Ｆ、Ｎ１４４Ｔ、Ｎ１４４Ｖ、Ｖ１４５Ａ、Ｖ１４５Ｇ、Ｖ１４５Ｅ、Ｖ１４５Ｍ、Ｖ１４５Ｆ、Ｖ１４５Ｗ、Ｙ１４６Ｇ、Ｙ１４６Ｌ、Ｙ１４６Ｍ、Ｄ１４７Ｎ、Ｄ１４７Ｑ、Ｄ１４７Ｈ、Ｇ１４８Ａ、Ｇ１４８Ｎ、Ｔ３８２Ｉ、Ｔ３８２Ｐ、Ｒ３８３Ｍ、Ｌ３８８Ｇ、Ｌ３８８Ｙ、Ｔ３８９Ａ、Ｔ３８９Ｃ、Ｔ３８９Ｓ、Ｆ３９０Ｃ、Ｖ１３３Ｃ、Ｍ１３６Ｎ、Ｌ１３８Ｇ、Ｌ１３８Ｉ、Ｌ１３８Ｎ、Ｓ１３９Ｇ、Ｓ１３９Ｎ、Ｗ１４３Ｈ、Ｇ１４８Ｖ、Ｌ３８８Ｈ、Ｌ３８８Ｔ、Ｆ３９０Ｇ、Ｆ３９０Ｎ、Ｆ３９０Ｔ、Ｃ１３５Ｆ、Ｍ１３６Ｔ、Ｓ１４０Ｙ、Ｓ１４０Ｉ、Ｆ１４１Ｖ、Ｇ１４２Ｉ、Ｇ１４２Ｖ、Ｄ１４７Ｅ、Ｆ３７８Ｙ、Ｔ３８２Ｙ、Ｒ３８３ＡおよびＦ３９０Ｓからなる群から選択されるアミノ酸突然変異である。
【０１５５】
より具体的には、任意の組換え微生物細胞（例えば、前記ＬＣ多価不飽和産物脂肪酸産生細胞は、ＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴの両方を過剰発現している）における使用のための適用可能性について、少なくとも１つの突然変異膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質モチーフを含むＬＰＣＡＴ活性を有するポリペプチドも本明細書において記載され、突然変異モチーフは、以下のものからなる群から選択される：
（ａ）配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む突然変異モチーフ（配列番号３８は、配列番号１６（Ｍ−［Ｖ／Ｉ］−Ｌ−Ｘ２−ＫＬ）と、Ｖ２Ｃ、Ｉ２Ｃ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｃ、Ｌ３Ｇ、Ｋ６Ｈ、Ｋ６Ｇ、Ｋ６Ｎ、Ｋ６Ｙ、Ｌ７Ａ、Ｌ７Ｎ、Ｌ７Ｇ、Ｌ７Ｈ、Ｌ７ＩおよびＬ７Ｍからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異だけ異なる）；（ｂ）配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含む突然変異モチーフ（配列番号３９は、配列番号８（Ｍ−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｉ］−Ｘ２−Ｋ−［Ｌ／Ｖ／Ｉ］−Ｘ８−ＤＧ）と、Ｖ２Ｃ、Ｉ２Ｃ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｃ、Ｌ３Ｇ、Ｉ３Ａ、Ｉ３Ｃ、Ｉ３Ｇ、Ｋ６Ｈ、Ｋ６Ｇ、Ｋ６Ｎ、Ｋ６Ｙ、Ｌ７Ａ、Ｌ７Ｎ、Ｌ７Ｇ、Ｌ７Ｈ、Ｌ７Ｉ、Ｌ７Ｍ、Ｖ７Ａ、Ｖ７Ｎ、Ｖ７Ｇ、Ｖ７Ｈ、Ｖ７Ｍ、Ｉ７Ａ、Ｉ７Ｎ、Ｉ７Ｇ、Ｉ７Ｈ、Ｉ７Ｍ、Ｄ１６Ｑ、Ｄ１６Ｎ、Ｄ１６Ｈ、Ｇ１７Ａ、Ｇ１７ＶおよびＧ１７Ｎからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異だけ異なる）；
（ｃ）配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む突然変異モチーフ（配列番号４０は、配列番号５（ＷＨＧ−Ｘ３−ＧＹ−Ｘ３−Ｆ）と、Ｆ１２Ｎ、Ｆ１２Ｃ、Ｆ１２ＧおよびＦ１２Ｔからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異だけ異なる）；および
（ｄ）配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含む突然変異モチーフ（配列番号４１は、配列番号１１（ＳＡｘＷＨＧ−Ｘ２−ＰＧＹ−Ｘ２−［Ｔ／Ｆ］−Ｆ）と、Ｔ１４Ａ、Ｔ１４Ｃ、Ｔ１４Ｓ、Ｆ１５Ｎ、Ｆ１５Ｃ、Ｆ１５ＧおよびＦ１５Ｔからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異だけ異なる）。
【０１５６】
上記の規定の突然変異は、上記の方法に従ってＹｌＬＰＣＡＴ内で同定された突然変異に対応し、それは同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡおよび／または同等のまたは改善された％変換を有する突然変異体をもたらすことが実証された。
【０１５７】
単一アミノ酸突然変異をＹｌＬＰＣＡＴ（配列番号４）のモチーフＩまたはモチーフＩＩ内のいずれかで創成した上記研究後、次いで１８種の異なる単一モチーフＩ突然変異を１６種の好ましい単一モチーフＩＩ突然変異の１つと組み合わせ、１６７種の二重突然変異体（すなわちＬＰＣＡＴは、モチーフＩ内の単一突然変異およびモチーフＩＩ内の単一突然変異の両方を含む）の生成をもたらした。これらの二重突然変異体をヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ８４０６Ｕ２中に形質転換し、次いで二重突然変異体の脂質プロファイルを親ＹｌＬＰＣＡＴの脂質プロファイルと比較した。
【０１５８】
ここでも、得られた突然変異ＹｌＬＰＣＡＴタンパク質のＬＰＣＡＴ活性に対するそれぞれの二重突然変異の効果を、ＥＰＡ％ＴＦＡおよび％Δ９変換効率に基づきスクリーニングした。１６７種のＹｌＬＰＣＡＴ突然変異体の大部分は、ＹｌＬＰＣＡＴと比較してほぼ同等のまたは改善された活性で機能した。より具体的には、二重突然変異体の１０６種は、対照と比較して同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡおよび同等のまたは改善された％変換を示し、二重突然変異体の１５種は、同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡを有した一方、二重突然変異体の別の６種は、対照と比較して同等のまたは改善された％変換を有することが決定された。
【０１５９】
次いで、これらの二重突然変異体の２５種を、総脂質含有率および組成の詳細分析についてのフラスコアッセイに供した。これらの二重突然変異体の１７種は、同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡおよび同等のまたは改善された％変換を有する一方、残りの８種は、同等のまたは改善された％変換を有することが観察された。さらに、これら２５種の突然変異体の２２種は、モチーフＩ内の単一突然変異およびモチーフＩＩ内の単一突然変異を含む突然変異ＹｌＬＰＣＡＴを発現していない対照株と比較して改善されたＥＰＡ産生率［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］を有することが実証された。
【０１６０】
したがって、本明細書において、配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含む突然変異ＹｌＬＰＣＡＴポリペプチドのアミノ酸配列が開示され、配列番号４２は、配列番号４（ＹｌＬＰＣＡＴ）と異なり、前記差異は、表４に記載の突然変異のペアのいずれか１つである（例えば、モチーフＩ中のＬ１３４Ａ突然変異を、モチーフＩＩ中のＴ３８２Ｉ突然変異、Ｌ３８８Ｇ突然変異、Ｆ３９０Ｇ突然変異またはＦ３９０Ｔ突然変異のいずれかと組み合わせることができ、それにより突然変異体Ｌ１３４Ａ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｌ１３４Ａ＿Ｌ３８８Ｇ、Ｌ１３４Ａ＿Ｆ３９０ＧおよびＬ１３４Ａ＿Ｆ３９０Ｔを生成する）。
【０１６１】
【表８】
0006351582.tif 000009
【０１６２】
上記に基づき、代替的なモチーフＩ内の単一突然変異およびモチーフＩＩ内の単一突然変異を組み合わせることにより種々の他の二重突然変異を生成することができることが当業者により理解され、単一突然変異は、好ましくは、対照に対して同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡを示すことが見出された１４種のＹｌＬＰＣＡＴ突然変異体内に存在したものから、または対照と比較して同等のまたは改善された％変換を示すことが見出された１２種のＹｌＬＰＣＡＴ突然変異体内に存在したものから選択される。より好ましくは、単一突然変異は、同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡおよび同等のまたは改善された％変換を示すことが見出された５６種のＹｌＬＰＣＡＴ突然変異体内に存在したものである。
【０１６３】
本発明の一態様において、単離ポリヌクレオチドによりコードされる突然変異ＬＰＣＡＴポリペプチドは、配列番号７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１および９３からなる群から選択される配列を含む。
【０１６４】
ＬＰＣＡＴアミノ酸突然変異のある組合せは本明細書に開示されるが、当業者は、本明細書に開示のモチーフＩおよびモチーフＩＩ突然変異の他の組合せを組み合わせることもできることを容易に認識する。したがって、開示のモチーフＩ突然変異の１つ以上を、突然変異ＬＰＣＡＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの調製において開示のモチーフＩＩ突然変異の１つ以上との組合せにおいて使用することができる。
【０１６５】
本明細書に記載の突然変異ポリペプチド（すなわち少なくともＬＰＣＡＴ活性を有する）は、少なくとも１つの長鎖［「ＬＣ」］多価不飽和脂肪酸の改善された産生のための組換え微生物細胞中でのＰＤＡＴ活性を有するポリペプチドの過剰発現と同時の過剰発現に有用であり、ＰＤＡＴおよび突然変異ＬＰＣＡＴの過剰発現は、対照細胞と比較して、重量％ＴＦＡとして計測される少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸の増加をもたらす。これらの結果は、ＰＤＡＴの過剰発現なしの本明細書に記載の突然変異ＬＰＣＡＴポリペプチドの過剰発現時にも達成されることにも留意すべきである。
【０１６６】
具体的には、本明細書において、ＬＰＣＡＴ活性を有する非天然存在突然変異ポリペプチドをコードする本明細書に記載の単離ポリヌクレオチドのいずれか１つを含む組換え細胞であって、少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生し得るＰＵＦＡ生合成経路をさらに含み、単離ポリヌクレオチドは過剰発現され、以下：
（ａ）対照細胞により産生される量と少なくとも同一以上である総脂肪酸の重量パーセントとして計測される少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸の量または
（ｂ）対照細胞の変換効率と少なくとも同一以上であるＣ１８からＣ２０への伸長変換効率（例えば、Δ９エロンガーゼ変換効率またはΔ６エロンガーゼ変換効率）
の少なくとも１つを含む組換え細胞が開示される。
【０１６７】
組換え細胞中での突然変異ＬＰＣＡＴ（モチーフＩおよび／またはモチーフＩＩ中の突然変異を含有する）の過剰発現に関して、突然変異ＬＰＣＡＴの過剰発現は、例えば突然変異ＬＰＣＡＴをコードするポリヌクレオチド（すなわちトランス遺伝子）を細胞に導入することにより達成することができる。好ましくは、このようなポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドを含有するように改変された細胞（例えば微生物細胞）中での遺伝子発現を可能とする調節配列、例えばプロモーターに作動可能に連結している。突然変異ＬＰＣＡＴの過剰発現は、対照細胞中のＬＰＣＡＴの発現に対するものである。
【０１６８】
突然変異ＬＰＣＡＴ（モチーフＩおよび／またはモチーフＩＩ内の突然変異を含有する）を過剰発現する組換え細胞の総脂肪酸の重量パーセント［「重量％ＴＦＡ」］として計測される少なくとも１つの長鎖ＰＵＦＡ（例えば、ＥＰＡ）の量の増加は、対照細胞の総脂肪酸の重量パーセントとして計測される少なくとも１つの長鎖ＰＵＦＡの量に対して少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％であり得る。
【０１６９】
突然変異ＬＰＣＡＴ（モチーフＩおよび／またはモチーフＩＩ中の突然変異を含有する）を過剰発現する組換え細胞のＣ１８からＣ２０への伸長変換効率、Δ９エロンガーゼ変換効率および／またはΔ６エロンガーゼ変換効率の増加は、対照細胞のＣ１８からＣ２０への伸長変換効率、Δ９エロンガーゼ変換効率および／またはΔ６エロンガーゼ変換効率に対してそれぞれ少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％であり得る。
【０１７０】
総脂質含有率（ＴＦＡ％ＤＣＷ）は、突然変異ＬＰＣＡＴを過剰発現する組換え細胞中で増加され得る。組換え細胞の総脂質含有率の増加は、対照細胞の総脂質含有率に対して少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％または１２％であり得る。総脂質含有率の増加は、ＥＰＡ％ＴＦＡの増加と一致し得る。
【０１７１】
突然変異ＬＰＣＡＴの過剰発現に関して、対照細胞、対応する対照細胞または好適な対照細胞は、組換え微生物細胞に対応するが、過剰発現される突然変異ＬＰＣＡＴポリペプチドを含まない野生型または組換え細胞であり得る。例えば、対照細胞は、突然変異ＬＰＣＡＴポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド配列を含まないことにより突然変異ＬＰＣＡＴポリペプチドを過剰発現しない。また、例えば、対照細胞は、突然変異ＬＰＣＡＴポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド配列を含むが、発現しないことにより突然変異ＬＰＣＡＴポリペプチドを過剰発現しない。対照細胞は、突然変異ＬＰＣＡＴポリペプチドを過剰発現するように改変される前に存在したままの組換え微生物細胞（すなわち親細胞）であり得、または突然変異ＬＰＣＡＴをコードする組換えポリヌクレオチドを含有するように改変されたが、突然変異ＬＰＣＡＴポリペプチドを過剰発現しない組換え細胞（例えば、突然変異ＬＰＣＡＴポリペプチドを過剰発現する組換え細胞と並行して調製された細胞）であり得る。
【０１７２】
当業者は、１）巨大分子、例えばＤＮＡ分子、プラスミドなどの構築、操作および単離のための規定の条件および手順；２）組換えＤＮＡ断片および組換え発現構築物の生成：ならびに３）クローンのスクリーニングおよび単離を説明する標準的文献資料を認識する。上記のＭａｎｉａｔｉｓ、ＳｉｌｈａｖｙおよびＡｕｓｕｂｅｌ参照。
【０１７３】
一般に、組換え発現構築物中に含まれる配列の選択は、所望の発現産物、宿主細胞の性質および形質転換細胞と非形質転換細胞とを分離する提案手段に依存する。典型的には、ベクターは、少なくとも１つの発現カセット、選択マーカーおよび自己複製または染色体組込みを可能とする配列を含有する。好適な発現カセットは、典型的には、プロモーター、選択遺伝子のコード配列（例えば、少なくともＬＰＣＡＴまたはＰＤＡＴ活性を有するポリペプチドをコードする）およびターミネーター（すなわちキメラ遺伝子）を含む。好ましくは、対照領域の両方は、形質転換宿主細胞からの遺伝子に由来する。
【０１７４】
本明細書における本発明のポリペプチドをコードするＯＲＦの発現を指向し得る実質的に任意のプロモーター（すなわち天然、合成またはキメラ）が好適であるが、宿主種からの転写および翻訳領域が特に有用である。宿主細胞中での発現は、誘導または構成的様式で生じ得る。誘導的発現は、関心対象のＬＰＣＡＴおよび／またはＰＤＡＴ遺伝子に作動可能に連結している調節可能なプロモーターの活性を誘導することにより生じる一方、構成的発現は、関心対象の遺伝子に作動可能に連結している構成的プロモーターの使用により生じる。
【０１７５】
ターミネーターは、プロモーターが得られた遺伝子の３’領域に、または異なる遺伝子に由来し得る。多数の終結領域が公知であり、それらが由来したのと同一および異なる属および種の両方で利用される場合、種々の宿主中で十分に機能する。ターミネーターは、通常、任意の特定の特性のためにというよりも、便宜上選択される。好ましくは、ターミネーターは酵母遺伝子に由来する。当業者は、利用可能な情報を利用してターミネーターを設計および合成することができるため、ターミネーターは合成物でもよい。ターミネーターは不要なこともあるが、高度に好ましい。
【０１７６】
高い発現率を得るため、多くの特殊化した発現ベクターが創成されている。このようなベクターは、転写、ＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質安定性および位置ならびに宿主細胞からの分泌を制御するある特性を調整することにより作製される。これらの特性として、以下のものが挙げられる：関連転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質；クローニング遺伝子のコピー数（追加のコピーを単一発現構築物内でクローニングすることができ、および／またはプラスミドコピー数を増加させ、もしくはクローニング遺伝子のゲノム中への多重組込みにより、追加のコピーを宿主細胞中に導入することができる）；遺伝子が、プラスミド由来かまたは宿主細胞ゲノム中に組み込まれているか；合成タンパク質の最終細胞局在；宿主生物中でのタンパク質の翻訳および正確な折り畳みの効率；宿主細胞内のクローニング遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質の固有安定性；ならびにコドン使用頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に接近するようなクローニング遺伝子内のコドン使用。
【０１７７】
適切な細胞中での発現に好適なＤＮＡカセット（例えば、プロモーター、ＬＰＣＡＴ活性またはＰＤＡＴ活性を有するポリペプチドをコードするＯＲＦおよびターミネーターを含むキメラ遺伝子を含む）を得たら、宿主細胞中で自己複製し得るプラスミドベクター中に入れ、またはそれを宿主細胞のゲノム中に直接組み込む。発現カセットの組込みは、宿主ゲノム内でランダムに行うことができ、または宿主遺伝子座との組換えをターゲティングするために十分な宿主ゲノムとの相同性の領域を含有する構築物の使用を介してターゲティングすることができる。構築物を内因性遺伝子座にターゲティングする場合、転写および翻訳調節領域の全部または一部を内因性遺伝子座により提供することもできる。
【０１７８】
関心対象のキメラ遺伝子を含む構築物は、任意の標準的技術により例えば油性酵母中に導入することができる。このような技術としては、形質転換（例えば酢酸リチウム形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８６−１８７（１９９１）］）、バイオリスティックインパクト、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたは関心対象の遺伝子を宿主細胞中に導入する他の任意の方法が挙げられる。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に適用可能なより具体的な教示としては、参照により本明細書に援用される米国特許第４，８８０，７４１号明細書および米国特許第５，０７１，７６４号明細書ならびにＣｈｅｎら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４８（２）：２３２−２３５（１９９７））が挙げられる。宿主のゲノム中への線状ＤＮＡ断片の組込みは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主細胞の形質転換において好ましい。ゲノム内の複数の位置中への組込みは、高レベルの遺伝子発現が望まれる場合、特に有用であり得る。好ましい遺伝子座としては、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に教示されているものが挙げられる。
【０１７９】
形質転換宿主細胞は、導入された構築物上に含有されるマーカーについての選択により同定することができる。あるいは、多くの形質転換技術は多くのＤＮＡ分子を宿主細胞中に導入するため、別個のマーカー構築物を所望の構築物とともに同時形質転換することができる。
【０１８０】
微生物宿主細胞中に組み込まれたＤＮＡ断片の安定性は、個々の形質転換体、受容株および使用されるターゲティングプラットフォームに依存することが多い。したがって、所望の発現レベルおよびパターンを示す株を得るため、特定の組換え微生物宿主の複数の形質転換体をスクリーニングすべきである。ＤＮＡブロットのサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のノザン分析（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．，６１８（１−２）：１３３−１４５（１９９３））、タンパク質発現のウエスタン分析、表現型分析またはＧＣ分析が、好適なスクリーニング方法である。
【０１８１】
本明細書において、本発明の単離ポリヌクレオチドを含む組換え構築物が開示される。例えば、組換え構築物は、ＬＰＣＡＴ活性を有する非天然存在突然変異ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含み得、突然変異ポリペプチドは、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結している少なくとも１つの突然変異膜ＭＢＯＡＴタンパク質モチーフを含む。
【０１８２】
本明細書において、本発明の組換え構築物を含む組換え細胞が開示される。本明細書に記載の組換え細胞は全て、少なくとも１つのＬＣ多価不飽和脂肪酸を産生し得るＰＵＦＡ生合成経路を含む。好ましくは、長鎖多価不飽和脂肪酸は、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される。
【０１８３】
オレイン酸がＬＣ−ＰＵＦＡに変換される代謝プロセスは、炭素原子の付加を介する炭素鎖の伸長および二重結合の付加を介する分子の不飽和化を含む。これには、小胞体膜中に存在する一連の特殊な不飽和化および伸長酵素が要求される。しかしながら、図２において把握されるとおり、および下記のとおり、ＬＣ−ＰＵＦＡ産生には複数の代替経路が存在する。
【０１８４】
具体的には、図２は下記の経路を示す。全ての経路には、オレイン酸がΔ１２デサチュラーゼにより１番目のω−６脂肪酸であるリノール酸［「ＬＡ」］に最初に変換されることが要求される。次いで、「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」および基質としてのｓＬＡを使用して、以下のとおり長鎖ω−６脂肪酸が形成される：１）ＬＡがΔ９エロンガーゼによりエイコサジエン酸［「ＥＤＡ」］に変換され；２）ＥＤＡがΔ８デサチュラーゼによりジホモ−γ−リノレン酸［「ＤＧＬＡ」］に変換され；３）ＤＧＬＡがΔ５デサチュラーゼによりアラキドン酸［「ＡＲＡ」］に変換され；４）ＡＲＡがＣ２０／２２エロンガーゼによりドコサテトラエン酸［「ＤＴＡ」］に変換され；５）ＤＴＡがΔ４デサチュラーゼによりドコサペンタエン酸［「ＤＰＡｎ−６」］に変換される。
【０１８５】
「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」は、基質としてα−リノレン酸［「ＡＬＡ」］も使用して以下のとおり長鎖ω−３脂肪酸を産生し得る：１）ＬＡがΔ１５デサチュラーゼによりＡＬＡに変換され；２）ＡＬＡがΔ９エロンガーゼによりエイコサトリエン酸［「ＥＴｒＡ」］に変換され；３）ＥＴｒＡがΔ８デサチュラーゼによりエイコサテトラエン酸［「ＥＴＡ」］に変換され；４）ＥＴＡがΔ５デサチュラーゼによりエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」］に変換され；５）ＥＰＡがＣ２０／２２エロンガーゼによりドコサペンタエン酸［「ＤＰＡ」］に変換され；６）ＤＰＡがΔ４デサチュラーゼによりドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」］に変換される。場合により、ω−６脂肪酸はω−３脂肪酸に変換され得る。例えば、ＥＴＡおよびＥＰＡは、Δ１７デサチュラーゼ活性によりそれぞれＤＧＬＡおよびＡＲＡから産生される。
【０１８６】
ω−３／ω−６脂肪酸の生合成の代替経路はΔ６デサチュラーゼおよびＣ１８／２０エロンガーゼを利用し、すなわち「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」である。より具体的には、ＬＡおよびＡＬＡがΔ６デサチュラーゼによりそれぞれＧＬＡおよびステアリドン酸［「ＳＴＡ」］に変換され得；次いでＣ１８／２０エロンガーゼがＧＬＡをＤＧＬＡに、および／またはＳＴＡをＥＴＡに変換する。
【０１８７】
ＬＣ−ＰＵＦＡ産生組換え細胞は、上記の生合成経路の少なくとも１つを有し、この経路は、細胞由来であるか遺伝子操作によるかを問わない。好ましくは、組換え細胞は、組換え細胞の総脂質中の少なくとも約２〜５％のＬＣ−ＰＵＦＡ、より好ましくは、総脂質中の少なくとも約５〜１５％のＬＣ−ＰＵＦＡ、より好ましくは、総脂質中の少なくとも約１５〜３５％のＬＣ−ＰＵＦＡ、より好ましくは、総脂質中の少なくとも約３５〜５０％のＬＣ−ＰＵＦＡ、より好ましくは、総脂質中の少なくとも約５０〜６５％のＬＣ−ＰＵＦＡ、最も好ましくは、総脂質中の少なくとも約６５〜７５％のＬＣ−ＰＵＦＡを産生し得る。ＬＣ−ＰＵＦＡの構造形態は限定されず；したがって、例えばＥＰＡまたはＤＨＡが総脂質中に遊離脂肪酸としてまたはエステル化形態、例えばアシルグリセロール、リン脂質、スルホ脂質もしくは糖脂質で存在し得る。
【０１８８】
「ＬＣ多価不飽和脂肪酸」は、ＰＵＦＡ生合成経路が産生するように設計されたＰＵＦＡを指す。したがって、例えば本実施例において、Δ１２デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼおよびΔ１７デサチュラーゼ遺伝子を含むＰＵＦＡ生合成経路を発現するように遺伝子操作されたヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、脂質中の種々の脂肪酸、例としてパルミテート、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡを産生した。しかしながら、株はＰＵＦＡ生合成経路の産物として主としてＥＰＡを産生するように設計されたため、この脂肪酸は、ＬＣ多価不飽和産物脂肪酸としてみなすべきである。
【０１８９】
種々の真核生物、例えば植物、真菌および微生物、例として酵母、藻類、ストラメノパイル、卵菌およびユーグレナを本明細書において使用してＬＣ−ＰＵＦＡを産生（または産生するように遺伝子操作）することができる。これらは、種々の原料、例として単炭水化物または複合炭水化物、脂肪酸、有機酸、油、グリセロールおよびアルコールおよび／または炭化水素上で広範な温度およびｐＨ値にわたり生育する細胞を含み得る。したがって、これらの生物のいずれも、本発明のポリヌクレオチドによる形質転換に好適な宿主細胞である。
【０１９０】
好ましい微生物は油性生物である。これらの油性生物は、天然に油合成および蓄積し得、総油含有率は、乾燥細胞重量の約２５％超、より好ましくは、乾燥細胞重量の約３０％超、最も好ましくは、乾燥細胞重量の約４０％超を構成し得る。種々の細菌、藻類、ユーグレナ、蘚類、真菌、酵母およびストラメノパイルは、必然的に油性と分類される。この微生物の広いグループ内で、ω−３／ω−６脂肪酸を天然で産生する生物に特に関心が持たれる。例えば、ＡＲＡ、ＥＰＡおよび／またはＤＨＡは、キクロテラ属種（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｓｐ．）、クリプテコジニウム属種（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．）、モルティエレラ属種（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｓｐ．）、ニッチア属種（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｓｐ．）、クサレカビ属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、ヤブレツボカビ属種（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）およびシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種により産生される。したがって、例えば誘導性または調節プロモーターの制御下における、本ＬＰＣＡＴ遺伝子のいずれかによる（場合によりＰＤＡＴの同時発現とともに）、ＡＲＡの産生のために商業的に使用されるモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）の形質転換は、増加量のＡＲＡを合成し得る形質転換生物を生じ得た。Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）の形質転換法は、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６：４６５５（２０００））により記載されている。同様に、ヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）微生物（例えばヤブレツボカビ属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））の形質転換法は、米国特許第７，００１，７７２号明細書に開示されている。代替的な実施形態において、非油性生物、例えば酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を油性になるように遺伝子改変することができる（米国特許出願公開第２００７／００１５２３７−Ａ１号明細書）。
【０１９１】
より好ましい実施形態において、微生物細胞は油性酵母である。油性酵母として典型的に同定されている属としては、限定されるものではないが、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポミセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。より具体的には、例示的な油合成酵母としては、ロドスポリジウム・トルイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポミセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルティナス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）として分類されていた）が挙げられる。油性酵母ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が最も好ましく；さらなる実施形態において、ＡＴＣＣ＃７６９８２、ＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４および／またはＬＧＡＭ  Ｓ（７）１と命名されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株が最も好ましい（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．，ａｎｄ  Ａｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，８２（１）：４３−９（２００２））。
【０１９２】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でのＡＲＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡ産生の遺伝子操作に適用可能な具体的教示は、それぞれ全て参照により本明細書に援用される米国特許第７，５８８，９３１号明細書、米国特許第７，９３２，０７７号明細書、米国特許出願公開第２００９−０９９３５４３−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書および米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７−Ａ１号明細書ならびに米国特許第７，５５０，２８６号明細書に提供されている。これらの参照文献は、線状ＤＮＡ断片を宿主のゲノム中に組み込むことによりヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で遺伝子を発現させる好ましい方法、好ましいプロモーター、終結領域、組込み遺伝子座および破壊ならびにこの特定の宿主種を使用する場合に好ましい選択法も記載している。
【０１９３】
同様に、種々の植物は、少なくとも１つのＬＣ多価不飽和脂肪酸を産生し得る（または産生するように遺伝子操作することができる）（例えば、国際公開１９９８／４６７６４号パンフレット、米国特許出願公開第２００４−０１７２６８２−Ａ１号明細書参照）、したがって、本明細書に記載のポリヌクレオチドによる形質転換に好適な宿主細胞である。例えば、米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書は、一般に「油糧種子」植物（例えばグリシンおよびダイズ属種［ＧｌｙｃｉｎｅおよびＳｏｊａ  ｓｐ．］、ナタネ属種［Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．］、ヒマワリ属種［Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｐ．］、トウモロコシ、ワタ、アマ属種［Ｌｉｎｕｍ  ｓｐ．］およびベニバナ属種［Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｓｐ．］が挙げられる）と称される油性植物に関する詳細な考察ならびにこれらの種のための好適な組換え構築物を遺伝子操作し、形質転換および形質転換された植物組織および細胞の再生を可能とする手段を提供している。
【０１９４】
形質転換された組換え細胞は、本発明のキメラ遺伝子の発現を最適化し、ＬＣ多価不飽和脂肪酸の最大および最も経済的な収率を産生する条件下で生育させる。一般に、培地条件は、炭素源の種類および量、窒素源の種類および量、炭素／窒素比、様々なミネラルイオンの量、酸素レベル、生育温度、ｐＨ、バイオマス産生期の長さ、油蓄積期の長さならびに細胞収集の時間および方法を改変することにより最適化することができる。
【０１９５】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、一般に、複合培地、例えば酵母エキス−ペプトン−デキストロースブロス［「ＹＰＤ」］または生育に必要な構成要素を欠き、それにより所望の発現カセットの選択を強制する規定最小培地（例えば酵母窒素基礎培地（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））中で生育させる。
【０１９６】
本明細書に記載の方法および宿主細胞のための発酵培地は、例えば米国特許第７，２３８，４８２号明細書および米国特許出願公開第２０１１−００５９２０４−Ａ１号明細書に教示される好適な炭素源を含有しなければならない。利用される炭素源は多種多様な炭素含有供給源を包含し得ることが企図されるが、好ましい炭素源は、糖、グリセロールおよび／または脂肪酸である。グルコース、スクロース、転化スクロース、フルクトースおよび／または１０〜２２個の炭素を含有する脂肪酸が最も好ましい。例えば、発酵性炭素源は、転化スクロース、グルコース、フルクトースおよびそれらの組合せからなる群から選択することができ、但し、グルコースは転化スクロースおよび／またはフルクトースとの組合せで使用される。
【０１９７】
窒素は、無機源（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機源（例えば尿素またはグルタメート）から供給することができる。適切な炭素および窒素源に加え、発酵培地は、好適なミネラル、塩、補因子、緩衝液、ビタミンおよび／または当業者に公知の、宿主細胞の生育およびＬＣ多価不飽和脂肪酸産生のための酵素的経路の促進に好適な他の構成要素も含有しなければならない。特に、脂質およびＰＵＦＡの合成を促進するいくつかの金属イオン、例えばＦｅ＋２、Ｃｕ＋２、Ｍｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２およびＭｇ＋２に留意される（Ｎａｋａｈａｒａ，Ｔ．ら，Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌｓ，Ｄ．Ｊ．Ｋｙｌｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｃｏｌｉｎ，ｅｄｓ．ｐｐ  ６１−９７（１９９２））。
【０１９８】
本明細書に記載の方法および宿主細胞に好ましい生育培地は、一般の市販調製培地、例えば酵母窒素基礎培地（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）である。他の規定または合成生育培地を使用することもでき、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の生育に適切な培地は微生物学または発酵科学の当業者に公知である。発酵に好適なｐＨ範囲は、典型的には約ｐＨ４．０からｐＨ８．０であり、ｐＨ５．５からｐＨ７．５が初期生育条件のための範囲として好ましい。発酵は好気性または嫌気性条件下で実施することができ、微好気性条件が好ましい。
【０１９９】
典型的には、油性酵母細胞中での高レベルのＰＵＦＡの蓄積には、生育と脂肪の合成／貯蔵との間で代謝状態を「平衡」させなければならないため、２段階プロセスが要求される。したがって、最も好ましくは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でのＬＣ多価不飽和脂肪酸の産生には２段階発酵プロセスが必要である。このアプローチは、米国特許第７，２３８，４８２号明細書に、種々の好適な発酵プロセス設計（すなわち回分、流加および連続）および生育の間の考慮事項として記載されている。
【０２００】
したがって、一態様において、本発明は少なくとも１つのＬＣ多価不飽和脂肪酸の産生を改善する方法であって、
（ａ）本発明の組換え微生物細胞を発酵性炭素源の存在下で生育させること；および
（ｂ）場合により、ＬＣ多価不飽和脂肪酸を回収すること
を含む方法を対象とする。
【０２０１】
好ましくは、本方法において生育させる組換え微生物細胞は、油性酵母、例えばヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）（例えばＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））のものである。本方法により産生されるＬＣ  ＰＵＦＡは、好ましくは、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される。
【実施例】
【０２０２】
本発明をさらに以下の実施例において記載し、実施例は本発明の実施の簡略を説明するが、その考えられる変法の全てを完全に定義するものではない。
【０２０３】
一般的方法
本実施例において使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当技術分野において周知であり、１）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；２）Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ，ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；および３）Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）により記載されている。
【０２０４】
微生物培養物の維持および生育に好適な材料および方法は、当技術分野において周知である。以下の実施例における使用に好適な技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｅｄｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４））において；またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．ＢｒｏｃｋによりＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）に記載のとおり見出すことができる。微生物細胞の生育および維持に使用される全ての試薬、制限酵素および材料は、別記しない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、典型的にはルリア・ベルターニ［「ＬＢ」］プレート上で３７℃において生育させた。
【０２０５】
一般的な分子クローニングは、標準的方法に従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上記）。ＤＮＡ配列は、ベクターおよびインサート特異的プライマーの組合せを使用するダイターミネーター技術を使用してＡＢＩ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃシーケンサー上で生成した。配列編集は、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）中で実施した。
【０２０６】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＡＴＣＣ＃２０３６２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載のとおり２８〜３０℃においていくつかの培地（例えば基礎最小培地［「ＭＭ」］、最小培地＋５−フルオロオロチン酸［「ＭＭ＋５−ＦＯＡ」］、高グルコース培地［「ＨＧＭ」］および発酵培地［「ＦＭ」］）中で定型的に生育させた。
【０２０７】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載のとおり実施した。
【０２０８】
脂肪酸［「ＦＡ」］分析のため、細胞を遠心分離により回収し、Ｂｌｉｇｈ  ａｎｄ  Ｄｙｅｒ（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７：９１１−９１７（１９５９））による記載のとおり脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドによる脂質抽出物のエステル交換反応により脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］を調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ  ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｄａ，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７６（１）：３８−４６（１９９０））、続いて３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）のＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを装着したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣにより分析した。オーブン温度は、３．５℃／分において１７０℃（２５分間保持）から１８５℃とした。
【０２０９】
直接の塩基エステル交換反応のため、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞（０．５ｍＬ培養物）を収集し、蒸留水中で１回洗浄し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ中で５〜１０分間真空下で乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１％の１００μｌ）および既知量のＣ１５：０トリアシルグリセロール（Ｃ１５：０ＴＡＧ；カタログ番号Ｔ−１４５、Ｎｕ−Ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｅｐ，Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）を試料に添加し、次いで試料を５０℃において３０分間ボルテックスにかけ、揺動させた。３滴の１ＭのＮａＣｌおよび４００μｌのヘキサンを添加した後、試料をボルテックスにかけ、回転させた。上層を取り出し、ＧＣにより分析した。
【０２１０】
あるいは、Ｌｉｐｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，２００３に記載の塩基触媒エステル交換反応法の改変法を、発酵またはフラスコ試料のいずれかからのブロス試料のルーチン分析に使用した。具体的には、ブロス試料を室温水中で急速解凍し、次いで０．２２μｍのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）Ｓｐｉｎ−Ｘ（登録商標）遠心チューブフィルタ（カタログ番号８１６１）を備えた、タール被覆の２ｍＬ微小遠心チューブ中に０．１ｍｇに秤量した。試料（７５〜８００μｌ）は、予め測定されたＤＣＷに応じて使用した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５４３０遠心分離機を使用して、試料を１４，０００ｒｐｍにおいて５〜７分間またはブロスを除去するのに必要な限り、遠心分離した。フィルタを取り出し、液体を排水し、約５００μｌの脱イオン水をフィルタに添加して試料を洗浄した。遠心分離して水を除去した後、フィルタを再び取り出し、液体を排水し、フィルタを再挿入した。次いで、チューブを遠心分離機中に再挿入し、今度は上部を約３〜５分間開口して乾燥させた。次いで、フィルタをチューブのほぼ中段で切断し、新たな２ｍＬ丸底Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ（カタログ番号２２  ３６  ３３５−２）中に挿入した。
【０２１１】
カットフィルタ容器の縁部に接触するのみで、試料にもフィルタ材料にも接触しない適切な道具を用いてチューブの底部にフィルタを押しつけた。トルエン中の既知量のＣ１５：０ＴＡＧ（上記）を添加し、新たに作製された５００μｌの１％ナトリウムメトキシドのメタノール中溶液を添加した。試料ペレットを強く崩壊させ、チューブを密封し、５０℃加熱ブロック（ＶＷＲカタログ番号１２６２１−０８８）中で３０分間静置した。次いで、チューブを少なくとも５分間放冷した。次いで、４００μｌのヘキサンおよび５００μｌの１ＭのＮａＣｌ水溶液を添加し、チューブを２×６秒間ボルテックスにかけ、１分間遠心分離した。約１５０μｌの上部（有機）層をインサートを有するＧＣバイアルに入れ、ＧＣにより分析した。
【０２１２】
ＧＣ分析を介して記録されたＦＡＭＥピークは、それらの保持時間を既知脂肪酸の保持時間と比較して同定し、ＦＡＭＥピーク面積を既知量の内部標準（Ｃ１５：０ＴＡＧ）のＦＡＭＥピーク面積と比較することにより定量した。したがって、任意の脂肪酸ＦＡＭＥの近似量（μｇ）［「μｇ  ＦＡＭＥ」］は式：（規定の脂肪酸についてのＦＡＭＥピーク面積／標準ＦＡＭＥピーク面積）＊（標準Ｃ１５：０ＴＡＧのμｇ）に従って計算する一方、任意の脂肪酸の量（μｇ）［「μｇ  ＦＡ」］は、１μｇのＣ１５：０ＴＡＧが０．９５０３μｇの脂肪酸に等しいため、式：（規定の脂肪酸についてのＦＡＭＥピーク面積／標準ＦＡＭＥピーク面積）＊（標準Ｃ１５：０ＴＡＧのμｇ）＊０．９５０３に従って計算する。０．９５０３の変換係数は、０．９５から０．９６の範囲である大部分の脂肪酸について決定された値の近似であることに留意されたい。
【０２１３】
ＴＦＡの重量パーセント（すなわちＦＡ％ＴＦＡ）としてそれぞれ個々の脂肪酸の量をまとめた脂質プロファイルは、個々のＦＡＭＥピーク面積を全てのＦＡＭＥピーク面積の合計により除し、１００を乗じて決定した。
【０２１４】
個々の脂肪酸または総脂肪酸の量を乾燥細胞重量の重量パーセント［「％ＤＣＷ」］として定量するため、１０ｍＬの培養物からの細胞を遠心分離により回収し、１０ｍＬの水により１回洗浄し、遠心分離により再度回収した。細胞を１〜２ｍＬの水中で再懸濁させ、予め秤量されたアルミニウム秤量パン中に注ぎ、１〜２ｍＬの水によりすすぎ、さらに同一の秤量パンに添加した。パンを真空下で８０℃において一晩静置した。パンを秤量し、空のパンの重量を減じることによりＤＣＷを算出した。次いで、％ＤＣＷとしての脂肪酸の測定は、μｇ  ＤＣＷの分数としてのμｇ  ＦＡＭＥまたはμｇ  ＦＡのいずれかに基づき算出することができる（例えば、ＦＡＭＥ％ＤＣＷは、μｇ  ＦＡＭＥ／μｇ  ＤＣＷ＊１００として算出した）。
【０２１５】
特定のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株中の総脂質含有率および組成を詳細に分析するため、フラスコアッセイを以下のとおり実施した。具体的には、新たに画線された細胞の１つのループを３ｍＬのＦＭ培地中に接種し、２５０ｒｐｍおよび３０℃において一晩生育させた。ＯＤ６００ｎｍを計測し、１２５ｍＬフラスコ中の２５ｍＬのＦＭ培地中に０．３の最終ＯＤ６００ｎｍまで細胞のアリコートを添加した。２５０ｒｐｍにおける３０℃の振とうインキュベータ中で２日後、６ｍＬの培養物を遠心分離により収集し、１２５ｍＬフラスコ中の２５ｍＬのＨＧＭ中で再懸濁させた。２５０ｒｐｍにおける３０℃の振とうインキュベータ中で５日後、１ｍＬのアリコートを脂肪酸分析に使用し、１０ｍＬを乾燥細胞重量測定のために乾燥させた。
【０２１６】
実施例１
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＣＡＴの単離
参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１０−０３１７８８２−Ａ１号明細書は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａｌｅ１（すなわち「ＳｃＡｌｅＩ」；配列番号２；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０１４８１８；米国特許第７，７３２，１５５号明細書；国際公開第２００９／００１３１５号パンフレット）に対するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）相同体の同定を記載している。この相同体は、その文献においてＹｌＡｌｅＩまたはＹｌＬＰＣＡＴ（配列番号４）のいずれかと命名され、ＯＲＦ  ＹＡＬＩ０Ｆ１９５１４ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿５０５６２４；国際公開第２００９／００１３１５号パンフレット）に対応し、ＳｃＡｌｅＩと４５％同一であることが見出された。
【０２１７】
ＹｌＬＰＣＡＴを分析し、参照により本明細書に援用される米国特許第７，７３２，１５５号明細書および米国特許出願公開第２００８−０１４５８６７−Ａ１号明細書に同定されたＡｌｅ１相同体中に存在する非植物モチーフの存在または不存在を決定した。具体的には、これらのモチーフは、配列番号８〜１５（表２）である。他のＬＰＣＡＴの研究（Ｌｅｅら，２００８，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９：１１７４−１１８４）を考慮すると、配列番号１１（ＳＡｘＷＨＧ−Ｘ２−ＰＧＹ−Ｘ２−［Ｔ／Ｆ］−Ｆ）中のＨｉｓ残基は、タンパク質内の活性部位残基であり得る。ＹｌＬＰＣＡＴは、少なくともモチーフ配列番号８〜１１を含むことが決定された。本明細書において、これらの保存モチーフは、触媒作用に関与する可能性が高いと仮定される。
【０２１８】
ＥＰＡを産生するように遺伝子操作されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株中のＹｌＬＰＬＡＴの過剰発現は、ＴＦＡの重量％としてのＬＡ（１８：２）の濃度［「ＬＡ％ＴＦＡ」］の顕著な低減、ＴＦＡの重量％としてのＥＰＡの濃度［「ＥＰＡ％ＴＦＡ」］の増加およびΔ９エロンガーゼの変換効率の増加をもたらした（米国特許出願公開第２０１０−０３１７８８２−Ａ１号明細書）。
【０２１９】
実施例２
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でのＰＤＡＴとＬＰＣＡＴまたはＬＰＡＡＴとの同時発現
本実施例は、高レベルのエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」］含有脂質を産生するように遺伝子操作されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株中でのＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＤＡＴ（リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．１５８］）と、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＣＡＴ（アシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．２３］）またはＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ（アシルＣｏＡ：リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．５１］）のいずれかとの過剰発現を記載する。ＰＤＡＴおよびＬＰＡＡＴを同時発現するヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）形質転換体と比較して、ＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴを同時発現する形質転換体は、増加量の、総脂肪酸の重量パーセント（ＥＰＡ％ＴＦＡ）として計測されるＥＰＡを産生した。さらに、ＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴの同時発現は、増加したΔ９エロンガーゼ変換効率パーセントとして計測される増加したＣ１８からＣ２０への伸長変換効率および増加量の、乾燥細胞重量の重量パーセント（ＴＦＡ％ＤＣＷ）として計測される総脂肪酸をもたらした。
【０２２０】
ＰＤＡＴとＬＰＡＡＴまたはＬＰＣＡＴとの過剰発現のためのベクターの構築
ＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴの酵素活性が相乗的に機能してヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中での油およびＥＰＡ産生を改善するかどうかを試験するため、ＰＤＡＴとＬＰＡＡＴとの同時発現の効果をＰＤＡＴとＬＰＣＡＴとの同時発現の効果と比較した。
【０２２１】
プラスミドｐＹ１９６（図３Ａ、配列番号４３）およびｐＹ３０１（図３Ｂ、配列番号４４）をそれらの酵素ペアをＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で同時発現するように構築した。表５および６にそれぞれ列挙されるとおり、これらのプラスミドの両方は、野生型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＤＡＴ（配列番号３２）を発現するためのキメラＹＡＴ１：：ＹｌＰＤＡＴ：：Ｐｅｘ１６遺伝子を含有した。ｐＹ１９６は、野生型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ１（配列番号２３）を発現するためのキメラＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１遺伝子も含有した一方、ｐＹ３０１は、野生型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＣＡＴ（配列番号４）を発現するためのキメラＹＡＴ１：：ＹｌＬＰＣＡＴ：：Ｌｉｐ１遺伝子も含有した。
【０２２２】
【表９】
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【０２２３】
【表１０】
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【０２２４】
ｐＹ１９６またはｐＹ３０１により形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｚ５５６７Ｕ１９中での脂質産生
プラスミドｐＹ１９６およびｐＹ３０１をＰｍｅＩおよびＳｗａＩにより消化した。それぞれの消化物の大きいほうの断片をカナマイシン耐性遺伝子断片から離してアガロース精製し、それを使用してヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株Ｚ５５６７Ｕ１９を染色体組込みにより形質転換した。Ｚ５５６７Ｕ１９は、Ｚ５５６７のＵｒａ−株であり、増加量の長鎖多価不飽和脂肪酸含有脂質を産生する。株Ｚ５５６７およびＺ５５６７Ｕ１９の開発に関する詳細は、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７Ａ１号明細書に提供されている。プラスミドＤＮＡを含めない対照形質転換も実施した。
【０２２５】
形質転換細胞をＭＭプレート上にプレーティングし、３０℃において５日間維持した（ＭＭは、１リットル当たり：２０ｇのグルコース、１．７ｇのアミノ酸を有さない酵母窒素基礎培地、１．０ｇのプロリン、ｐＨ６．１（調整不要）を含む）。次いで、それぞれの実験形質転換（すなわちＰＤＡＴ＋ＬＰＣＡＴ［ｐＹ３０１］またはＰＤＡＴ＋ＬＰＡＡＴ［ｐＹ１９６］のいずれか）についての１１個のコロニーをＭＭプレート上に再画線し、続いて脂質含有率について分析した。
【０２２６】
表７は、それぞれの形質転換体および対照における総乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］、ＴＦＡ％ＤＣＷ、ＴＦＡの重量パーセントとしてのＥＰＡの濃度［「ＥＰＡ％ＴＦＡ」］、ＥＰＡ％ＤＣＷならびにＬＡおよびＡＬＡのＥＰＡへの総Δ９エロンガーゼパーセント変換効率［「ｄ９Ｅ  ＣＥ」］をまとめる。ｄ９ｅ  ＣＥの算出は、式：（ＥＤＡ＋ＨＧＬＡ＋ＡＲＡ＋ＥＲＡ＋ＥＴＡ＋ＥＰＡ）／（Ｃ１８：２＋Ｃ１８：３＋ＥＤＡ＋ＨＧＬＡ＋ＡＲＡ＋ＥＲＡ＋ＥＴＡ＋ＥＰＡ）＊１００に従って行った。
【０２２７】
【表１１】
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【０２２８】
ｐＹ１９６およびｐＹ３０１形質転換体の両方が、対照と比較して改善されたＥＰＡ％ＴＦＡおよびｄ９ｅ  ＣＥを有した。具体的には、ｐＹ３０１形質転換体（ＰＤＡＴ＋ＬＰＣＡＴ）に関して、それらは、対照に対してそれぞれ約６．５％および６．６％のＥＰＡ％ＴＦＡおよびｄ９ｅ  ＣＥの平均増加を示した。さらに、ｐＹ３０１形質転換体は、ｐＹ１９６形質転換体について計測されたそれぞれの平均値よりもそれぞれ２０．５％、１．６％、２．１％および２．５％高い平均ＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、ＥＰＡ％ＴＦＡおよびｄ９Ｅ  ＣＥ値をそれぞれ有した。
【０２２９】
ある個々の形質転換体の脂質の差異も比較した。具体的には、ｐＹ１９６形質転換体Ｌ３１４およびｐＹ３０１形質転換体Ｌ３１７の脂質プロファイルを相互および対照の株Ｌ３１３と比較してさらに分析した（表８）。
【０２３０】
【表１２】
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【０２３１】
形質転換体Ｌ３１７は、対照および形質転換体Ｌ３１４の両方と比較して改善されたＴＦＡ％ＤＣＷ、ＥＰＡ％ＴＦＡ、ＥＰＡ％ＤＣＷおよびｄ９ｅ  ＣＥを有した。
【０２３２】
他の方針によるヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中の脂質を向上させる従来の試みは、大部分が増加した総脂質含有率［ＴＦＡ％ＤＣＷ］を生じたが、ＴＦＡの重量パーセントとしてのＥＰＡ濃度［ＥＰＡ％ＴＦＡ］は減少し、その逆も同様であった（すなわちＴＦＡ％ＤＣＷが低下すればＥＰＡ％ＴＦＡが高くなる）。しかしながら、形質転換体Ｌ３１７において、これらの因子の両方が対照およびＬ３１４に対して増加した。したがって、形質転換体Ｌ３１７中でのＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴの同時過剰発現は、ホスファチジルコリン［「ＰＣ」］中に含有されるＥＰＡがＤＡＧに転移される比率を増加させる一方、ＥＰＡ−ＣｏＡを使用してＰＣがリゾホスファチジルコリンから再貯蔵される比率も増加させることにより、アシルＣｏＡ貯蔵物（すなわちＥＰＡ−ＣｏＡ）からのＥＰＡのＴＡＧへの平衡移動を可能とし得る。
【０２３３】
ＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴの過剰発現（株Ｌ３１７）は、ＰＤＡＴおよびＬＰＡＡＴの過剰発現（株Ｌ３１４）と比較して利点を有すると考えられる。これは、リン脂質由来脂肪酸を使用するＴＡＧの合成におけるＰＤＡＴとＬＰＡＡＴとの間よりも大きいＰＤＡＴとＬＰＣＡＴとの間の相乗作用を指摘し得る。両方の過剰発現系において、ＰＤＡＴは、ＰＣおよびホスファチジン酸［「ＰＡ」］貯蔵物から脂肪酸をＤＡＧに転移する。ＰＤＡＴおよびＬＰＣＡＴを使用して観察されたＰＤＡＴおよびＬＰＡＡＴと比較して高レベルの脂質産生は、継続ＰＤＡＴ活性のための脂肪酸源としてのそれぞれＬＰＣＡＴおよびＬＰＡＡＴによるＰＣおよびＰＡの再生の比率のこれまで認識されなかった差異を反映し得る。
【０２３４】
実施例３
バリアントＹｌＬＰＣＡＴを含むプラスミドｐＹ３０６−Ｎの合成
本実施例は、バリアントＹｌＬＰＣＡＴ配列を含むヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）自己複製ベクター（プラスミドｐＹ３０６−Ｎ、配列番号４８）の構築を記載する。本明細書においてＹｌＬＰＣＡＴ＊（配列番号４５）と命名されるバリアントＹｌＬＰＣＡＴポリヌクレオチド配列は、野生型ＹｌＬＰＣＡＴコード領域中に存在する２つのＮｃｏＩ制限酵素部位を欠く。これらの内部ＮｃｏＩ部位の除去は、後続のクローニング手順を容易にした。
【０２３５】
対照として、野生型ＹｌＬＰＣＡＴ  ＯＲＦ（配列番号３；実施例１）をヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）自己複製ベクター中にクローニングし、ＣｏｌＥ１プラスミド複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、ｆ１複製起点およびＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｕｒａ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ３０６４２１）を含むプラスミドｐＹ３０６（配列番号４７）をもたらした。
【０２３６】
バリアントＹｌＬＰＣＡＴ配列は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により合成した。２つの内部ＮｃｏＩ制限部位をサイレント突然変異の創成により除去した一方、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位をＹｌＬＰＣＡＴオープンリーディングフレームの５’および３’末端においてそれぞれ付加してクローニングを容易にした。具体的には、Ａ１２Ｔ突然変異（すなわちＹｌＬＰＣＡＴ（配列番号３）中の１２位におけるアデノシン［Ａ］のＹｌＬＰＣＡＴバリアント中のチミン［Ｔ］への変化）およびＴ９１８Ｃ突然変異（すなわちＹｌＬＰＣＡＴ（配列番号３）中の９１８位におけるチミン［Ｔ］の、ＹｌＬＰＣＡＴバリアント中のシトシン［Ｃ］への変化）を、ＹｌＬＰＣＡＴコード配列中に導入した。これら２つのヌクレオチド置換は、バリアント配列によりコードされるアミノ酸に関してサイレントであった。内部ＮｃｏＩ部位を欠くバリアントＹｌＬＰＣＡＴ（すなわちＹｌＬＰＣＡＴ＊）をコードするヌクレオチド配列を配列番号４５により表わす一方、それによりコードされるアミノ酸を配列番号４６により表し、それは配列番号４（野生型ＹｌＬＰＣＡＴ）と同一である。
【０２３７】
続いて、ＹｌＬＰＣＡＴ＊をプラスミドｐＹ３０６中にクローニングし、それによりｐＹ３０６−Ｎ（配列番号４８；図４）を産生した。したがって、構築物ｐＹ３０６−Ｎは以下の構成要素を含有した。
【０２３８】
【表１３】
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【０２３９】
プラスミドｐＹ３０６−Ｎを使用してＹｌＬＰＣＡＴタンパク質の単一および二重突然変異体をそれぞれ以下の実施例４および６に記載のとおり調製した。
【０２４０】
実施例４
改変モチーフを有する突然変異ＹｌＬＰＣＡＴ酵素の設計および合成
ＹｌＬＰＣＡＴ内の保存アミノ酸モチーフが触媒作用に関与する可能性が高いという前提に基づき、バリアントモチーフを有する突然変異体の生成が、改善された機能活性を有するＬＰＣＡＴ酵素の同定をもたらし得ることが結論づけられた。
【０２４１】
一連の単一アミノ酸置換を、配列番号４のアミノ酸残基１３２から１４８に跨る保存配列（すなわちモチーフＩ）内および配列番号４のアミノ酸残基３７６から３９０に跨る保存配列（すなわちモチーフＩＩ）内で設計した。モチーフＩ内では、表１０に示されるとおり、モチーフ内の１７アミノ酸残基のそれぞれにおける種々の置換を創成することにより合計１９５種のアミノ酸置換を設計した。
【０２４２】
【表１４】
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【０２４３】
同様に、モチーフＩＩ内では、表１１に示されるとおり、モチーフ内の１５アミノ酸残基の１２残基内の種々の置換を創成することにより合計１３４種のアミノ酸置換を設計した。置換は、Ｗ３７９、Ｈ３８０およびＧ３８１において行わなかった。それというのも、ＹｌＬＰＣＡＴのＨ３８０に対応する他のＬＰＣＡＴのヒスチジンは、活性部位残基である可能性が高いことが報告されているためである（Ｌｅｅら，２００８，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９：１１７４−１１８４）。
【０２４４】
【表１５】
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【０２４５】
上記表１０および１１に記載の３２９種のＹｌＬＰＣＡＴ突然変異体のそれぞれを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により個々に合成し、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ切断ｐＹ３０６−Ｎベクター中にクローニングした。
【０２４６】
実施例５
改善されたＬＰＣＡＴ活性を有するＹｌＬＰＣＡＴ中の単一アミノ酸置換の同定
本実施例は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ８４０６Ｕ２中へのＹｌＬＰＣＡＴ突然変異ポリヌクレオチド配列（実施例４）を含む３２９種のｐＹ３０６−Ｎベクターのそれぞれの形質転換と、それに続く形質転換体の脂質プロファイルの分析を記載する。
【０２４７】
改善されたＬＰＣＡＴ活性は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７８８２−Ａ１号明細書に記載の観察に基づき間接的に評価し、実施例１（上記）にまとめた。具体的には、突然変異ＹｌＬＰＣＡＴを含むＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ８４０６Ｕ２形質転換体内の改善されたＬＰＣＡＴ活性が、ＴＦＡの重量％としてのＥＰＡの濃度［「ＥＰＡ％ＴＦＡ」］の増加および／またはΔ９エロンガーゼの変換効率の増加（因子のいずれかを親野生型ＹｌＬＰＣＡＴタンパク質を発現するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ８４０６Ｕ２中のＥＰＡ％ＴＦＡまたはΔ９エロンガーゼの変換効率とそれぞれ比較した場合）に基づき結論づけられた。
【０２４８】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ８４０６Ｕ２の形質転換
実施例４において調製された突然変異ＹｌＬＰＣＡＴを含有するｐＹ３０６−Ｎベクターのそれぞれの１つを個々に発現するように株Ｙ８４０６Ｕ２を形質転換した。Ｙ８４０６Ｕ２は、Ｙ８４０６のＵｒａ−株である。株Ｙ８４０６およびＹ８４０６Ｕ２の開発に関する詳細は、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１０−０３１７８８２−Ａ１号明細書に提供されている。形質転換後、細胞をＭＭプレート上に入れ、次いでそれぞれの形質転換の３つの個々の形質転換体を新たなＭＭプレート上で画線し、３０℃のインキュベータ中で２日間保持した。画線されたプレートからの細胞を、３ｍＬのＭＭを有する２４ウェルブロック中で培養し、２５０ｒｐｍにおいて振とうさせながら３０℃において２日間インキュベートした。次いで、細胞を遠心分離により回収し、３ｍＬの高グルコース培地［「ＨＧＭ」］（高グルコース培地は、１リットル当たり：８０ｇのグルコース、２．５８ｇのＫＨ２ＰＯ４および５．３６ｇのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５（調製不要）を含む）中で再懸濁させた。細胞を２００ｒｐｍにおいて振とうさせながら３０℃においてさらに５日間インキュベートした。ＨＧＭ中での生育の５日後、細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出し、ＦＡＭＥをナトリウムメトキシドによる脂質抽出物のエステル交換反応（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｉ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７６（１）：３８−４６（１９９０））により調製し、続いてガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析した。
【０２４９】
ＹｌＬＰＣＡＴの単一突然変異体の発現のために形質転換されたヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内の脂質プロファイルの分析
以下の表１２（バッチ１）、１３（バッチ２）、１４（バッチ３）、１５（バッチ４）および１６（バッチ５）は、特定の単一突然変異ＹｌＬＰＣＡＴ（モチーフＩまたはモチーフＩＩ中の単一アミノ酸置換）を発現するためのプラスミドを含む個々のＹ８４０６Ｕ２形質転換体の脂肪酸プロファイルおよびΔ９エロンガーゼ変換効率を示す。これらの計測は、ある対照についても行った：空のベクター［「ＥＶ」］（すなわちＬＰＣＡＴ遺伝子を有さない複製プラスミド［バッチ＃１のみ］）またはｐＹ３０６−Ｎ（野生型ＹｌＬＰＣＡＴタンパク質発現［「ＷＴ」］）を含む形質転換体。
【０２５０】
より具体的には、それぞれの表は、それぞれの特定の形質転換体について分析されたレプリケートの数［「＃」］、ＴＦＡの重量パーセントとしてのそれぞれの脂肪酸の平均濃度［「％ＴＦＡ」］、ＥＰＡ％ＴＦＡについての標準偏差［「ＥＰＡ  ＳＤ」］およびΔ９エロンガーゼ変換効率［「％変換」］をまとめる。％変換は、それぞれの形質転換体について以下の式：（ＥＤＡ＋ＨＧＬＡ＋ＡＲＡ＋ＥＲＡ＋ＥＴＡ＋ＥＰＡ）／（Ｃ１８：２＋Ｃ１８：３＋ＥＤＡ＋ＨＧＬＡ＋ＡＲＡ＋ＥＲＡ＋ＥＴＡ＋ＥＰＡ）＊１００に従って算出した。
【０２５１】
計測された脂肪酸は、１６：０（パルミテート）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（リノール酸）、ＡＬＡ（α−リノレン酸）、ＥＤＡ（エイコサジエン酸）、ＤＧＬＡ（ジホモ−γ−リノレン酸）、ＡＲＡ（アラキドン酸）、ＥＴｒＡ（エイコサトリエン酸）、ＥＴＡ（エイコサテトラエン酸）およびＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）であった。
【０２５２】
野生型ＹｌＬＰＣＡＴ対照に対するそれぞれの突然変異体の性能の比較は、それぞれの突然変異体が分析された特定のバッチ内でのみ行うべきである（すなわち例えば比較はバッチ＃１とバッチ＃２との間で行うべきではない）。太字フォントとそれに続く「＋」により示される突然変異体を、下記のさらなる試験のために選択した。
【０２５３】
【表１６】
0006351582.tif 000017
【０２５４】
【表１７】
0006351582.tif 000018
【０２５５】
【表１８】
0006351582.tif 000019
【０２５６】
【表１９】
0006351582.tif 000020
【０２５７】
【表２０】
0006351582.tif 000021
【０２５８】
【表２１】
0006351582.tif 000022
【０２５９】
【表２２】
0006351582.tif 000023
【０２６０】
【表２３】
0006351582.tif 000024
【０２６１】
【表２４】
0006351582.tif 000025
【０２６２】
【表２５】
0006351582.tif 000026
【０２６３】
【表２６】
0006351582.tif 000027
【０２６４】
【表２７】
0006351582.tif 000028
【０２６５】
【表２８】
0006351582.tif 000029
【０２６６】
【表２９】
0006351582.tif 000030
【０２６７】
【表３０】
0006351582.tif 000031
【０２６８】
上記データに基づくと、ＹｌＬＰＣＡＴ単一アミノ酸突然変異体のいくつかは、親野生型ＹｌＬＰＣＡＴ酵素（配列番号４６）と比較してほぼ同等のまたは改善された活性で機能することが明らかであった。この結論は、ＥＰＡ％ＴＦＡおよび／または％変換に応じたＬＰＣＡＴ活性の計測に基づきなされた。実際、突然変異体ＹｌＬＰＣＡＴ形質転換体の全ては、対照（野生型ＹｌＬＰＣＡＴによる形質転換体）において計測されたＥＰＡ％ＴＦＡの少なくとも７５％のＥＰＡ％ＴＦＡを有した。また、突然変異ＹｌＬＰＣＡＴ形質転換体の全ては、対照において計測された％変換の少なくとも８７．６％の％変換を有した。
【０２６９】
５６種のＹｌＬＰＣＡＴ突然変異体（配列番号４６に関して以下の突然変異の１つを含む：Ｌ１３４Ａ、Ｌ１３４Ｃ、Ｌ１３４Ｇ、Ｃ１３５Ｄ、Ｃ１３５Ｉ、Ｍ１３６Ｇ、Ｍ１３６Ｐ、Ｍ１３６Ｓ、Ｍ１３６Ｖ、Ｋ１３７Ｎ、Ｋ１３７Ｇ、Ｋ１３７Ｈ、Ｋ１３７Ｙ、Ｌ１３８Ａ、Ｌ１３８Ｈ、Ｌ１３８Ｍ、Ｓ１３９Ｌ、Ｓ１３９Ｗ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１４０Ｈ、Ｓ１４０Ｐ、Ｓ１４０Ｗ、Ｆ１４１Ａ、Ｆ１４１Ｍ、Ｆ１４１Ｗ、Ｇ１４２Ｈ、Ｗ１４３Ｌ、Ｎ１４４Ａ、Ｎ１４４Ｋ、Ｎ１４４Ｆ、Ｎ１４４Ｔ、Ｎ１４４Ｖ、Ｖ１４５Ａ、Ｖ１４５Ｇ、Ｖ１４５Ｅ、Ｖ１４５Ｍ、Ｖ１４５Ｆ、Ｖ１４５Ｗ、Ｙ１４６Ｇ、Ｙ１４６Ｌ、Ｙ１４６Ｍ、Ｄ１４７Ｎ、Ｄ１４７Ｑ、Ｄ１４７Ｈ、Ｇ１４８Ａ、Ｇ１４８Ｎ、Ｔ３８２Ｉ、Ｔ３８２Ｐ、Ｒ３８３Ｍ、Ｌ３８８Ｇ、Ｌ３８８Ｙ、Ｔ３８９Ａ、Ｔ３８９Ｃ、Ｔ３８９ＳおよびＦ３９０Ｃ）は、同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡおよび同等のまたは改善された％変換を示すことが見出された。別の１４種のＹｌＬＰＣＡＴ突然変異体は、対照と比較して同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡを有することが決定され（しかし、同等のまたは改善された％変換を有さなかった）、それとしては突然変異体Ｖ１３３Ｃ、Ｍ１３６Ｎ、Ｌ１３８Ｇ、Ｌ１３８Ｉ、Ｌ１３８Ｎ、Ｓ１３９Ｇ、Ｓ１３９Ｎ、Ｗ１４３Ｈ、Ｇ１４８Ｖ、Ｌ３８８Ｈ、Ｌ３８８Ｔ、Ｆ３９０Ｇ、Ｆ３９０ＮおよびＦ３９０Ｔが挙げられる。別の１２種の突然変異体は、対照と比較して同等のまたは改善された％変換を有することが決定され（しかし、同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡを有さなかった）、それとしては突然変異体Ｃ１３５Ｆ、Ｍ１３６Ｔ、Ｓ１４０Ｙ、Ｓ１４０Ｉ、Ｆ１４１Ｖ、Ｇ１４２Ｉ、Ｇ１４２Ｖ、Ｄ１４７Ｅ、Ｆ３７８Ｙ、Ｔ３８２Ｙ、Ｒ３８３ＡおよびＦ３９０Ｓが挙げられる。
【０２７０】
モチーフＩまたはモチーフＩＩ内のいずれかの単一突然変異をそれぞれ含み、同等のもしくは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡおよび／または同等のもしくは改善された％変換を有する合計２６種のＹｌＬＰＣＡＴ突然変異体を、さらなる評価（以下、実施例６）のために選択した：Ｌ１３４Ａ（１００．４％、１００．６％）、Ｌ１３４Ｇ（１０１．３％、１００．７％）、Ｍ１３６Ｓ（１０４．０％、１０４．０％）、Ｍ１３６Ｖ（１０２．２％、１０３．３％）、Ｋ１３７Ｈ（１０７．３％、１０４．４％）、Ｋ１３７Ｎ（１０１．８％、１０２．０％）、Ｓ１４０Ｈ（１０７．３％、１０４．３％）、Ｓ１４０Ｗ（１０３．２％、１０３．８％）、Ｆ１４１Ｍ（１０５．４％、１０６．７％）、Ｆ１４１Ｗ（１０１．２％、１０１．６％）、Ｎ１４４Ａ（１０５．３％、１０３．４％）、Ｎ１４４Ｔ（１０１．８％、１０１．６％）、Ｖ１４５Ｍ（１０２．０％、１０４．０％）、Ｖ１４５Ｗ（１００．４％、１００．５％）、Ｄ１４７Ｈ（１０５．３％、１０２．３％）、Ｄ１４７Ｑ（１０３．６％、１０１．２％）、Ｇ１４８Ａ（１０１．３％、１０１．８％）、Ｇ１４８Ｎ（１０２．２％、１０１．８％）、Ｔ３８２Ｉ（１０２．９％、１０２．５％）、Ｔ３８２Ｐ（１００．２％、１００．２％）、Ｒ３８３Ｍ（１０３．６％、１０４．０％）、Ｌ３８８Ｇ（１０１．６％、１００．２％）、Ｌ３８８Ｙ（１００．０％、９９．９％）、Ｔ３８９Ａ（１０２．２％、１０１．２％）、Ｔ３８９Ｃ（１０２．１％、１０１．５％）、Ｔ３８９Ｓ（１０１．９％、１０１．７％）、それぞれの括弧の組内の１番目および２番目の割合は、野生型ＹｌＬＰＣＡＴ対照形質転換体におけるＥＰＡ％ＴＦＡおよび％変換に対する突然変異ＹｌＬＰＣＡＴ形質転換体におけるＥＰＡ％ＴＦＡおよび％変換の割合比にそれぞれ対応する。モチーフＩまたはモチーフＩＩ内のいずれかの単一突然変異をそれぞれ含む別の８種の突然変異体も、さらなる評価（以下、実施例６）のために選択した：Ｆ３７８Ｙ（９９．６％、１０１．１％）、Ｔ３８２Ｙ（９９．８％、１００．８％）、Ｐ３８４Ａ（９８．７％、９９．０％）、Ｐ３８４Ｇ（９９．２％、９８．６％）、Ｌ３８８Ｔ（１００．５％、９８．３％）、Ｆ３９０Ｇ（１０２．４％
、９９．８％）、Ｆ３９０Ｓ（９９．４％、１００．５％）およびＦ３９０Ｔ（１０１．６％、９９．３％）、括弧の組は上記のとおりである。
【０２７１】
実施例６
改善されたＬＰＣＡＴ活性を有するＹｌＬＰＣＡＴ中の二重アミノ酸置換の同定
本実施例は、モチーフＩ内の単一突然変異およびモチーフＩＩ内の単一突然変異の両方を含む二重ＹｌＬＰＣＡＴ突然変異体の合成を記載する。これらの二重突然変異体をＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ８４０６Ｕ２中に形質転換し、次いで形質転換体の脂質プロファイルを分析した。実施例５におけるとおり、改善されたＬＰＣＡＴ活性がＥＰＡ％ＴＦＡおよび％変換に基づき間接的に評価された。
【０２７２】
二重ＹｌＬＰＣＡＴ突然変異体の生成
好ましいモチーフＩ内の単一突然変異（Ｌ１３４Ａ、Ｌ１３４Ｇ、Ｍ１３６Ｓ、Ｍ１３６Ｖ、Ｋ１３７Ｈ、Ｋ１３７Ｎ、Ｓ１４０Ｈ、Ｓ１４０Ｗ、Ｆ１４１Ｍ、Ｆ１４１Ｗ、Ｎ１４４Ａ、Ｎ１４４Ｔ、Ｖ１４５Ｗ、Ｖ１４５Ｍ、Ｄ１４７Ｈ、Ｄ１４７Ｑ、Ｇ１４８ＡおよびＧ１４８Ｎ）を、好ましいモチーフＩＩ内の単一突然変異（Ｆ３７８Ｙ、Ｔ３８２Ｉ、Ｔ３８２Ｐ、Ｔ３８２Ｙ、Ｒ３８３Ｍ、Ｐ３８４Ａ、Ｐ３８４Ｇ、Ｌ３８８Ｇ、Ｌ３８８Ｔ、Ｌ３８８Ｙ、Ｔ３８９Ａ、Ｔ３８９Ｃ、Ｔ３８９Ｓ、Ｆ３９０Ｇ、Ｆ３９０Ｓ、Ｆ３９０Ｔ）と組み合わせて二重突然変異ＹｌＬＰＣＡＴ配列の種々の組合せを生成した。したがって、例えば、モチーフＩ内のＳ１４０Ｗ突然変異およびモチーフＩＩ内のＴ３８２Ｉ突然変異を含むＹｌＬＰＣＡＴ突然変異体は、本明細書においてＹｌＬＰＣＡＴ突然変異体Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８２Ｉと称される。これらの二重突然変異体をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により個々に合成し、ＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ切断ｐＹ３０６−Ｎベクター中にクローニングし；配列番号４２が、クローニングされた配列によりコードされる突然変異ＹｌＬＰＣＡＴタンパク質を表す。
【０２７３】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ８４０６Ｕ２の形質転換およびｐＹ３０６−Ｎ形質転換体内の脂質プロファイルの分析
プラスミドをＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ８４０６Ｕ２中に形質転換し、続いて形質転換体を生育させ、実施例５に記載のとおり脂質分析に供した。表１７（バッチ６）、１８（バッチ７）、１９（バッチ８）および２０（バッチ１０）は、Ｙ８４０６Ｕ２の個々の形質転換体の脂肪酸プロファイルおよびΔ９エロンガーゼ変換効率を示す。これらの計測は、ｐＹ３０６−Ｎ（野生型ＹｌＬＰＣＡＴタンパク質発現［「ＷＴ」］）を含む対照形質転換体についても行った。表を実施例５に記載のとおり形式化する。
【０２７４】
野生型ＹｌＬＰＣＡＴ対照に対するそれぞれの突然変異体の性能の比較は、それぞれの突然変異体が分析された特定のバッチ内でのみ行うべきである（すなわち比較は、バッチ＃６とバッチ＃７との間で行うべきではない）。太字フォントとそれに続く「＋」により示される突然変異体を、下記のフラスコアッセイを含むさらなる試験のために選択した。
【０２７５】
【表３１】
0006351582.tif 000032
【０２７６】
【表３２】
0006351582.tif 000033
【０２７７】
【表３３】
0006351582.tif 000034
【０２７８】
【表３４】
0006351582.tif 000035
【０２７９】
【表３５】
0006351582.tif 000036
【０２８０】
【表３６】
0006351582.tif 000037
【０２８１】
【表３７】
0006351582.tif 000038
【０２８２】
【表３８】
0006351582.tif 000039
【０２８３】
【表３９】
0006351582.tif 000040
【０２８４】
上記データセットに基づくと、上記で分析された１６７種のＹｌＬＰＣＡＴ二重突然変異体の大部分が、親野生型酵素（配列番号４６）と比較してほぼ同等のまたは改善された活性で機能したことが明らかである。この結論は、ＥＰＡ％ＴＦＡおよび／または％変換に応じたＬＰＣＡＴ活性の計測に基づきなされた。
【０２８５】
より具体的には、モチーフＩ内の単一アミノ酸突然変異およびモチーフＩＩ内の単一アミノ酸突然変異を含む１０６種のＹｌＬＰＣＡＴ突然変異体は、同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡおよび同等のまたは改善された％変換を示すことが見出された。これらの突然変異体は、Ｌ１３４Ａ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｌ１３４Ａ＿Ｌ３８８Ｇ、Ｌ１３４Ａ＿Ｆ３９０Ｔ  Ｍ１３６Ｓ＿Ｆ３７８Ｙ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８２Ｐ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８２Ｙ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｒ３８３Ｍ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｐ３８４Ａ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｌ３８８Ｙ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ａ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ｓ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８２Ｐ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８２Ｙ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｐ３８４Ａ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｌ３８８Ｙ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８９Ａ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８９Ｓ、Ｋ１３７Ｈ＿Ｐ３８４Ｇ、Ｋ１３７Ｈ＿Ｌ３８８Ｇ、Ｋ１３７Ｈ＿Ｌ３８８Ｔ、Ｋ１３７Ｈ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｋ１３７Ｈ＿Ｆ３９０Ｔ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｔ３８２Ｐ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｒ３８３Ｍ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｐ３８４Ｇ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｆ３７８Ｙ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｌ３８８Ｇ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｌ３８８Ｔ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｔ３８９Ａ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｔ３８９Ｓ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｆ３９０Ｇ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｆ３９０Ｔ、Ｓ１４０Ｈ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｓ１４０Ｈ＿Ｐ３８４Ｇ、Ｓ１４０Ｈ＿Ｌ３８８Ｇ、Ｓ１４０Ｈ＿Ｌ３８８Ｔ、Ｓ１４０Ｈ＿Ｆ３９０Ｇ、Ｓ１４０Ｈ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８２Ｐ、Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８２Ｙ、Ｓ１４０Ｗ＿Ｒ３８３Ｍ、Ｓ１４０Ｗ＿Ｐ３８４Ａ、Ｓ１４０Ｗ＿Ｌ３８８Ｙ、Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８９Ａ、Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｆ１４１Ｍ＿Ｆ３７８Ｙ、Ｆ１４１Ｍ＿Ｔ３８２Ｙ、Ｆ１４１Ｍ＿Ｒ３８３Ｍ、Ｆ１４１Ｍ＿Ｐ３８４Ａ、Ｆ１４１Ｍ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｆ１４１Ｗ＿Ｆ３７８Ｙ、Ｆ１４１Ｗ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｆ１４１Ｗ＿Ｔ３８２Ｐ、Ｆ１４１Ｗ＿Ｔ３８２Ｙ、Ｆ１４１Ｗ＿Ｒ３８３Ｍ、Ｆ１４１Ｗ＿Ｐ３８４Ａ、Ｆ１４１Ｗ＿Ｔ３８９Ａ、Ｆ１４１Ｗ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｆ１４１Ｗ＿Ｔ３８９Ｓ、Ｎ１４４Ａ＿Ｐ３８４Ｇ、Ｎ１４４Ａ＿Ｌ３８８Ｇ、Ｎ１４４Ａ＿Ｌ３８８Ｔ、Ｎ１４４Ａ＿Ｆ３９０Ｇ、Ｎ１４４Ａ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｎ１４４Ａ＿Ｆ３９０Ｔ、Ｎ１４４Ｔ＿Ｆ３７８Ｙ、Ｎ１４４Ｔ＿Ｔ３８２Ｐ、Ｎ１４４Ｔ＿Ｔ３８２Ｙ、Ｎ１４４Ｔ＿Ｒ３８３Ｍ、Ｎ１４４Ｔ＿Ｐ３８４Ａ、Ｎ１４４Ｔ＿Ｌ３８８Ｙ、Ｎ１４４Ｔ＿Ｔ３８９Ａ、Ｎ１４４Ｔ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｎ１４４Ｔ＿Ｔ３８９Ｓ、Ｖ１４５Ｍ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｖ１４５Ｍ＿Ｒ３８３Ｍ、Ｖ１４５Ｍ＿Ｔ３８９Ａ、Ｖ１４５Ｍ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｖ１４５Ｗ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｄ１４７Ｈ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｄ１４７Ｈ＿Ｌ３８８Ｇ、Ｄ１４７Ｈ＿Ｌ３８８Ｔ、Ｄ１４７Ｈ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｄ１４７Ｑ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｄ１４７Ｑ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｇ１４８Ａ＿Ｆ３７８Ｙ、Ｇ１４８Ａ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｇ１４８Ａ＿Ｔ３８２Ｙ、Ｇ１４８Ａ＿Ｒ３８３Ｍ、Ｇ１４８Ａ＿Ｐ３８４Ｇ、Ｇ１４８Ａ＿Ｌ３８８Ｇ、Ｇ１４８Ａ＿Ｌ３８８Ｙ、Ｇ１４８Ａ＿Ｔ３８９Ａ、Ｇ１４８Ａ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｇ１４８Ａ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｇ１４８Ａ＿Ｆ３９０Ｔ、Ｇ１４８Ｎ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｇ１４���Ｎ＿Ｌ３８８Ｔ、Ｇ１４８Ｎ＿Ｆ３９０ＧおよびＧ１４８Ｎ＿Ｆ３９０Ｓ）であった。
【０２８６】
別の１５種のＹｌＬＰＣＡＴ二重突然変異体（分析された１６７種のうち）は、対照と比較して同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡを有した一方、別の６種のＹｌＬＰＣＡＴ二重突然変異体（分析された１６７種のうち）は、対照と比較して同等のまたは改善された％変換を有することが決定された。
【０２８７】
フラスコアッセイによる改善されたＬＰＣＡＴ活性の確認
モチーフＩ内の単一アミノ酸突然変異およびモチーフＩＩ内の単一アミノ酸突然変異をそれぞれ含み、同等のもしくは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡおよび／または同等のもしくは改善された％変換を有する合計２３種のＹｌＬＰＣＡＴ二重突然変異体を、さらなる評価のために選択した（これらの突然変異体は、表１７〜２０に太字および「＋」により示す）。これらの突然変異体は、Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８２Ｐ、Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８９Ａ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８９Ａ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８９Ｓ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｔ３８９Ａ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｔ３８９Ｓ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ａ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ｓ、Ｆ１４１Ｗ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｌ１３４Ａ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｆ３９０Ｇ、Ｋ１３７Ｈ＿Ｌ３８８Ｇ、Ｋ１３７Ｈ＿Ｌ３８８Ｔ、Ｓ１４０Ｈ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｓ１４０Ｈ＿Ｌ３８８Ｇ、Ｎ１４４Ａ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｄ１４７Ｈ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｇ１４８Ａ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｇ１４８Ｎ＿Ｔ３８２ＩおよびＧ１４８Ｎ＿Ｆ３９０Ｓであった。さらに、対照と比較してわずかに縮小したＥＰＡ％ＴＦＡおよびわずかに縮小した％変換をそれぞれ有する突然変異体Ｍ１３６Ｖ＿Ｆ３７８ＹおよびＧ１４８Ａ＿Ｌ３８８Ｔをさらなる評価のために選択した。
【０２８８】
これらの二重突然変異ＹｌＬＰＣＡＴタンパク質を発現する形質転換体を、総脂質含有率および組成の詳細分析のためにフラスコアッセイに供した。具体的には、二重突然変異株を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎ（商標）チューブ中の３ｍＬのＦＭ中に個々に接種し、３０℃および２５０ｒｐｍにおいて一晩生育させた。ＯＤ６００ｎｍを計測し、１２５ｍＬのフラスコ中の２５ｍＬのＦＭ培地中に０．３の最終ＯＤ６００ｎｍまで細胞のアリコートを添加した。２５０ｒｐｍおよび３０℃におけるＭｕｌｔｉｔｒｏｎ振とうインキュベータ中で２日後、６ｍＬの培養物を遠心分離により収集し、元の１２５ｍＬのフラスコ中の２５ｍＬのＨＧＭ中で再懸濁させた。２５０ｒｐｍおよび３０℃における振とうインキュベータ中で５日後、水をフラスコに添加して総容量を２５ｍＬに戻した（それにより蒸発分を占めた）。アリコートを脂肪酸分析（上記）に使用し、１０ｍＬの培養物を乾燥細胞重量測定のために乾燥させた。
【０２８９】
ＤＣＷ測定のため、１０ｍＬの培養物をＢｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ遠心分離機中のＢｅｃｋｍａｎ  ＧＨ−３．８ロータ中で４０００ｒｐｍにおける５分間の遠心分離により収集した。ペレットを２５ｍＬの水中で再懸濁させ、上記のとおり再収集した。洗浄されたペレットを２０ｍＬの水中で再懸濁させ、予め秤量されたアルミニウムパンに移した。細胞懸濁液を真空オーブン中で８０℃において一晩乾燥させた。細胞の重量を測定した。
【０２９０】
フラスコアッセイ結果を、以下の表２１（グループＩ）および２２（グループＩＩ）に示す。表は、それぞれの特定の形質転換体について分析されたレプリケートの数［「＃」］、細胞の平均総乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］、細胞の平均総脂質含有率［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］、ＴＦＡの重量パーセントとしてのそれぞれの脂肪酸の平均濃度［「％ＴＦＡ」］、Δ９エロンガーゼ変換効率［「％変換」］および乾燥細胞重量のパーセントとしての平均ＥＰＡ含有率［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］をまとめる。
【０２９１】
【表４０】
0006351582.tif 000041
【０２９２】
【表４１】
0006351582.tif 000042
【０２９３】
モチーフＩ内の単一アミノ酸突然変異およびモチーフＩＩ内の単一アミノ酸突然変異をそれぞれ含む分析された２５種のＹｌＬＰＣＡＴ二重突然変異体のうち、１７種が同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡおよび同等のまたは改善された％変換の両方を有する一方、残りの８種は同等のまたは改善された％変換を有することが観察された。
【０２９４】
上記データセットに基づくと、上記で分析された２５種のＹｌＬＰＣＡＴ二重突然変異体の２２種は、親野生型酵素（配列番号４６）と比較して改善された活性で機能した。
【０２９５】
また、ある二重突然変異ＬＰＣＡＴタンパク質の過剰発現は、組換えヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中で増加した総脂質含有率（ＴＦＡ％ＤＣＷ）をもたらした。例えば、Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８２Ｐ、Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８９Ａ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８９ＳおよびＦ１４１Ｗ＿Ｔ３８２ＩまたはＫ１３７Ｈ＿Ｌ３８８Ｇ突然変異ペアを含む突然変異ＬＰＣＡＴポリペプチドの過剰発現は、対照の総脂質含有率に対して８％以上増加した総脂質含有率をもたらした（表２１および２２）。興味深いことに、ある形質転換体は、増加した総脂質含有率およびＥＰＡ％ＴＦＡの両方を有した。例えば、Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８９Ａ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８９ＡまたはＭ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ｓ突然変異ペアを有するＬＰＣＡＴを過剰発現する形質転換体は、対照に対して総脂質含有率の少なくとも５％の増加およびＥＰＡ％ＴＦＡの少なくとも約３％の増加を有した（表２１および２２）。従来、総脂質含有率およびＥＰＡ％ＴＦＡの両方の同時増加を誘導することは困難であったため、このことは重要な観察である。通常、総脂質含有率の増加はＥＰＡ％ＴＦＡの減少に対応し、その逆も同様であった。
【０２９６】
表２１および２２に太字および「＋」により列挙された二重突然変異ＹｌＬＰＣＡＴポリペプチド、すなわちＭ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ａ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ｓ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｎ１４４Ａ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｇ１４８Ａ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｇ１４８Ｎ＿Ｔ３８２ＩおよびＧ１４８Ｎ＿Ｆ３９０Ｓは、本明細書においてそれぞれ配列番号７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１および９３として開示される。
【０２９７】
実施例７
ＥＰＡ産生のための突然変異ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＣＡＴの過剰発現と同時のヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＤＡＴの過剰発現
本実施例は、高レベルのエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」］含有脂質を産生するように遺伝子操作されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株中でのＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＤＡＴの過剰発現を記載し、株は、モチーフＩ内の単一突然変異および／またはモチーフＩＩ内の単一突然変異を含む突然変異Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＣＡＴも過剰発現する。
【０２９８】
より具体的には、実施例６に記載の好ましい突然変異ＹｌＬＰＣＡＴポリヌクレオチドのいずれかを発現プラスミドｐＹ３０１（配列番号４４、実施例２）中にクローニングして野生型ＹｌＬＰＣＡＴをコードするポリヌクレオチドを突然変異ＹｌＬＰＣＡＴをコードするポリヌクレオチドにより置き換える。次いで、この改変プラスミドを使用してＰＵＦＡ、例えばＥＰＡを産生するように遺伝子操作されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の任意の好ましい株を形質転換する。形質転換されたヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）を生育させ、実施例２におけるとおり脂質含有率およびＰＵＦＡ産生について分析する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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