(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号７に示される配列を含むリボソーム結合部位（ＲＢＳ）に作動可能に連結しているフィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）配列番号２に示される配列を含むＲＢＳに作動可能に連結しているβ−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ）をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）配列番号３に示される配列を含むＲＢＳに作動可能に連結しているβ−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＷ）をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｖ）配列番号５に示される配列を含むＲＢＳに作動可能に連結しているイソペンテニルピロリン酸（ｉｄｉ）をコードするポリヌクレオチドと、
（ｖ）配列番号５に示される配列を含むＲＢＳに作動可能に連結しているゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＥ）をコードするポリヌクレオチドと、
（ｖｉ）配列番号３に示される配列を含むＲＢＳに作動可能に連結しているプレフィトエンピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＢ）をコードするポリヌクレオチドと、
（ｖｉｉ）配列番号６に示される配列を含むＲＢＳに作動可能に連結しているβ−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ）をコードするポリヌクレオチドと
を含む、アスタキサンチン経路の酵素をコードする複数の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
（ｉ）配列番号５に示される配列を含むリボソーム結合部位（ＲＢＳ）に作動可能に連結しているフィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）配列番号２に示される配列を含むＲＢＳに作動可能に連結しているβ−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ）をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）配列番号２に示される配列を含むＲＢＳに作動可能に連結しているβ−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＷ）をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｖ）配列番号６に示される配列を含むＲＢＳに作動可能に連結しているイソペンテニルピロリン酸（ｉｄｉ）をコードするポリヌクレオチドと、
（ｖ）配列番号３に示される配列を含むＲＢＳに作動可能に連結しているゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＥ）をコードするポリヌクレオチドと、
（ｖｉ）配列番号７に示される配列を含むＲＢＳに作動可能に連結しているプレフィトエンピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＢ）をコードするポリヌクレオチドと、
（ｖｉｉ）配列番号２に示される配列を含むＲＢＳに作動可能に連結しているβ−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ）をコードするポリヌクレオチドと
を含む、アスタキサンチン経路の酵素をコードする複数の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
単一発現ベクター中に含まれる、請求項１または２に記載の複数のポリヌクレオチド。
【請求項４】
複数の発現ベクター中に含まれる、請求項１または２に記載の複数のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ＲＢＳの各々に、スペーサー配列が隣接する、請求項１または２に記載の複数のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ＲＢＳの各々の上流の前記スペーサー配列が、配列番号８に示される配列と少なくとも８０％相同である、請求項５に記載の複数のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ＲＢＳの各々の下流の前記スペーサーが、配列番号９に示される配列と少なくとも８０％相同である、請求項５または６に記載の複数のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを細菌細胞に発現させて、アスタキサンチンを産生させることを含む、アスタキサンチンを作製する方法。
【請求項９】
前記発現後にアスタキサンチンを単離することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その一部の実施形態において、アスタキサンチンなどの代謝経路の生成物を作製するためのバイオテクノロジー法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌中の天然タンパク質存在量は、５桁に及ぶ。タンパク質発現レベルのバランスをとることが自然生物系が適切に機能するための要であり、また、代謝エンジニアリングの取り組みにとって極めて重要であることが多い。生物系の機能を解明するために、強力な過剰発現および過小発現などの細胞内タンパク質レベルの操作が広く使用されているが、並行して多数の遺伝子のレベルを微調整する能力が、大きな未解決の課題である。タンパク質レベルのバランスをとることが進化の間に選択されている天然生物系とは対照的に、合成系の発現は、タンパク質濃度の不均衡をもたらすことがある。結果として、合成経路は、最初に導入された時点で最適に機能することは稀であり、酵素レベルは、微調整されなければならない。
【０００３】
図１５Ａは、２段階代謝経路モデルに基づいた不均衡な酵素濃度と関連する大きな課題を図式的に表す。第１に、低酵素発現は、経路の流れ、したがって、生成物合成速度（青色領域）を制限し得る。その一方で、過剰の発現は、タンパク質負荷につながることがあり、これは、成長を制限する細胞資源の枯渇をもたらす（紫色領域）。最後に、中間代謝物を生成および消費する酵素間の不均衡が、代謝のボトルネックおよび高濃度の潜在的に毒性の経路中間体（緑色領域）をもたらし得る。
【０００４】
タンパク質の細胞内存在量を制御するためのアプローチとして、プロモーター［非特許文献１］またはリボソーム結合部位(RBS)［非特許文献２、非特許文献３］配列を変更すること、転写物の安定性を調節することおよび成熟タンパク質の分解速度を変更することが挙げられる。
【０００５】
アスタキサンチンなどのカロテノイドは、生存している生物において見られる黄色、橙色および赤色の多くに関与している天然の色素である。カロテノイドは、自然界に広く分布しており、種々の生物系において、２つの主要な生物学的機能を有し、光合成において集光性色素として働き、また、光酸化損傷から保護する。
【０００６】
アスタキサンチンは、最も高価な商業的に使用されるカロテノイド化合物である（今日の市場価値は、３，５００ドル／ｋｇより高い）。さまざまな水生動物において色素沈着をもたらす栄養補給剤として主に使用される。極東では、ニワトリの通常の色素沈着を生じさせるために、家禽に給餌するためにも使用される。また、食品工業のための望ましい、有効な非毒性着色料でもあり、化粧品において価値が高い。近年、アスタキサンチンが、ヒトにおいて強力な抗酸化剤であり、したがって、望ましい食品添加物であると報告された。
【０００７】
アスタキサンチンは、種々の細菌、真菌および藻類において合成されるが、生物系を使用したその産生の重要な制限は、その収率が低いことである。低収率の理由の１つは、アスタキサンチン経路の複雑性であり、そのため、効率的な発現のためには、経路の７種の遺伝子が、細胞において発現されなければならない。これらの遺伝子各々の発現の量の微調整が、アスタキサンチン発現の最適化には必須である。
【０００８】
非特許文献４には、大腸菌におけるアスタキサンチンの発現が教示されている。
【０００９】
非特許文献５には、リボソーム結合部位の配列が教示されている。
【００１０】
特許文献１には、人工プロモーターライブラリーおよび／または修飾されたリボソーム結合部位ライブラリーを含むＤＮＡライブラリーを作製し、ライブラリーを用いて細菌宿主細胞を形質転換して、対象の染色体遺伝子のさまざまな発現レベルを有する細菌クローンの集団を得る方法が教示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２００１５８４９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１１００３９２９９号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４０２６８４３６号明細書
【特許文献４】米国特許第４，６６６，８２８号明細書
【特許文献５】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献６】米国特許第４，８０１，５３１号明細書
【特許文献７】米国特許第５，１９２，６５９号明細書
【特許文献８】米国特許第５，２７２，０５７号明細書
【特許文献９】米国特許第３，７９１，９３２号明細書
【特許文献１０】米国特許第３，８３９，１５３号明細書
【特許文献１１】米国特許第３，８５０，７５２号明細書
【特許文献１２】米国特許第３，８５０，５７８号明細書
【特許文献１３】米国特許第３，８５３，９８７号明細書
【特許文献１４】米国特許第３，８６７，５１７号明細書
【特許文献１５】米国特許第３，８７９，２６２号明細書
【特許文献１６】米国特許第３，９０１，６５４号明細書
【特許文献１７】米国特許第３，９３５，０７４号明細書
【特許文献１８】米国特許第３，９８４，５３３号明細書
【特許文献１９】米国特許第３，９９６，３４５号明細書
【特許文献２０】米国特許第４，０３４，０７４号明細書
【特許文献２１】米国特許第４，０９８，８７６号明細書
【特許文献２２】米国特許第４，８７９，２１９号明細書
【特許文献２３】米国特許第５，０１１，７７１号明細書
【特許文献２４】米国特許第５，２８１，５２１号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】K. Hammer、I. Mijakovic、P. R. Jensen、Synthetic promoter libraries - tuning of gene expression、Trends in Biotechnology 24、53-55(2006)
【非特許文献２】H. M. Salis、E. A. Mirsky、C. A. Voigt、Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression、Nat Biotechnol 27、946-950(2009)
【非特許文献３】H.H.Wang et al.、Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution、Nature 460、894-898(2009)
【非特許文献４】Lemuth et al.、[Microbial Cell Factories 10、29、2011]
【非特許文献５】Salis et al.、Nature Biotechnology Volume 27、No 10、page 946-950、2009
【非特許文献６】Carrie et al.、 (1999) Biotechnol. Prog. 15:58-64
【非特許文献７】Smolke Ed.、The Metabolic Pathway Engineering Handbook: Tools and Applications、CRC Press、New York(2009)
【非特許文献８】Stephanopoulos、Nielsen、 and Aristidou, Eds.、Metabolic Engineering: Principles and Methodology、Academic Press、 New York (1998)
【非特許文献９】Greenberg、Metabolic Pathways: Energetics、Tricarboxylic Acid Cycle、and Carbohydrates、Academic Press、 New York (1967)
【非特許文献１０】D. M. Greenberg's multi-volume series entitled Metabolic pathways、Volume 1-7
【非特許文献１１】CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Vol. 1、eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons Inc、(1987) Chap. 7.
【非特許文献１２】Sambrook、J.、et al.、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)
【非特許文献１３】Hardwood et al. Ed. BACILLUS、Plenum Publishing Corp. 1989中のFerrari et al.、Genetics pgs 57-72
【非特許文献１４】Chang et al.、(1979) Mol. Gen.Genet. 168:11-15
【非特許文献１５】Smith et al.、(1986) Appl. and Env. Microbiol. 51:634
【非特許文献１６】Potter、H. (1988) Anal Biochem 174:361-373
【非特許文献１７】Manual of Methods of General Bacteriology、Eds. P. Gerhardt et al.、American Society for Microbiology、Washington、DC (1981)
【非特許文献１８】T. D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology 2 ed. (1989) Sinauer Associates、Sunderland Mass.
【非特許文献１９】Cherepanov et al. (1995) Gene 158:9-14
【非特許文献２０】Deuschle et al.、EMBO Journal 5(11):2987-2994 (1986)
【非特許文献２１】Sommer et al.、(2000) Microbiol. 146:2643-2653
【非特許文献２２】PROMOTERS: STRUCTURE AND FUNCTION. R. L/Rodriguez and M. J. Chamberlin eds. Praeger Scientific. New York中、Hawley D. K et al.、Chapter 3
【非特許文献２３】「Current Protocols in Molecular Biology」 Volumes I-III Ausubel、R. M.、ed. (1994)
【非特許文献２４】Ausubel et al.、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley and Sons、Baltimore、Maryland (1989)
【非特許文献２５】Perbal、「A Practical Guide to Molecular Cloning」、John Wiley & Sons、New York (1988)
【非特許文献２６】Watson et al.、「Recombinant DNA」、Scientific American Books、New York
【非特許文献２７】Birren et al. (eds) 「Genome Analysis: A Laboratory Manual Series」、Vols. 1-4、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York (1998)
【非特許文献２８】「Cell Biology: A Laboratory Handbook」、Volumes I-III Cellis、J. E.、ed. (1994)
【非特許文献２９】「Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique」 by Freshney、Wiley-Liss、N. Y. (1994)、Third Edition
【非特許文献３０】「Current Protocols in Immunology」Volumes I-III Coligan J. E.、ed. (1994)
【非特許文献３１】Stites et al. (eds)、「Basic and Clinical Immunology」(8th Edition)、Appleton & Lange、Norwalk、CT (1994)
【非特許文献３２】Mishell and Shiigi (eds)、「Selected Methods in Cellular Immunology」、W. H. Freeman and Co.、New York (1980)
【非特許文献３３】「Oligonucleotide Synthesis」 Gait、M. J.、ed. (1984)
【非特許文献３４】「Nucleic Acid Hybridization」 Hames、B. D. and Higgins S. J.、eds. (1985)
【非特許文献３５】「Transcription and Translation」 Hames、B. D.、 and Higgins S. J.、eds.(1984)
【非特許文献３６】「Animal Cell Culture」 Freshney、R. I.、ed. (1986)
【非特許文献３７】「Immobilized Cells and Enzymes」 IRL Press、(1986)
【非特許文献３８】「A Practical Guide to Molecular Cloning」 Perbal、B.、(1984) and 「Methods in Enzymology」 Vol. 1-317、Academic Press
【非特許文献３９】「PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications」、Academic Press、San Diego、CA (1990)
【非特許文献４０】Marshak et al.、「Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual」 CSHL Press (1996)
【非特許文献４１】「Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobrick」(worldwide webdspacedotmitdotedu/handle/1721.1/21168)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、アスタキサンチン経路の酵素をコードする複数の単離ポリヌクレオチド配列であって、
（ｉ）フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）および第１の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）β−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ）および第２の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）β−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＷ）および第３の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと
を含み、
第１、第２および第３の調節配列は、Ｉｃｙ−ＢおよびｃｒｔＷの発現が、ｃｒｔＩの発現のレベルよりも大きいよう選択される、複数の単離ポリヌクレオチド配列が提供される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、２ｍｇ／ｇ細胞乾重を超えるアスタキサンチンを含む細菌細胞が提供される。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、５ｍｇ／ｇ細胞乾重を超えるアスタキサンチンを含む細菌細胞が提供される。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、アスタキサンチン経路の酵素をコードするポリヌクレオチドを発現させることを含む、アスタキサンチンを作製する方法であって、ポリヌクレオチドは、
（ｉ）フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）および第１の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）β−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ）および第２の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）β−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＷ）および第３の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと
を含み、
第１、第２および第３の調節配列は、ｌｃｙ−ＢおよびｃｒｔＷの発現が、ｃｒｔＩの発現のレベルよりも大きいよう選択される、方法が提供される。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、アスタキサンチン経路の酵素をコードするポリヌクレオチドを発現させることを含む、アスタキサンチンを作製する方法であって、ポリヌクレオチドは、
（ｉ）イソペンテニルピロリン酸（ｉｄｉ）および第１の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＥ）および第２の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）プレフィトエンピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＢ）および第３の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｖ）フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）および第４の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｖ）β−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ）および第５の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｖｉ）β−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＷ）および第６の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｖｉｉ）β−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ）および第７の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと
を含み、
第４、第５および第６の調節配列は、ｌｃｙ−ＢおよびｃｒｔＷの発現が、ｃｒｔＩの発現のレベルよりも大きいよう選択される、方法が提供される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、アスタキサンチン経路の酵素をコードする複数の単離ポリヌクレオチド配列であって、
（ｉ）イソペンテニルピロリン酸（ｉｄｉ）および第１の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＥ）および第２の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）プレフィトエンピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＢ）および第３の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｖ）フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）および第４の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｖ）β−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ）および第５の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｖｉ）β−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＷ）および第６の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｖｉｉ）β−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ）および第７の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと
を含み、
第４、第５および第６の調節配列は、Ｉｃｙ−ＢおよびｃｒｔＷの発現が、ｃｒｔＩの発現のレベルよりも大きいよう選択される、複数の単離ポリヌクレオチド配列が提供される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、複数の単離ポリヌクレオチド配列は、
（ｉｖ）イソペンテニルピロリン酸（ｉｄｉ）および第４の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドまたは
（ｖ）ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＥ）および第５の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドまたは
（ｖｉ）プレフィトエンピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＢ）および第６の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドまたは
（ｖｉｉ）β−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ）および第７の転写調節配列をコードするポリヌクレオチド
のうち少なくとも１つをさらに含む。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１の調節配列、前記の第２の調節配列および前記の第３の調節配列の各々は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）である。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１の調節配列、第２の調節配列および第３の調節配列の各々は、プロモーターである。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１の調節配列、第２の調節配列および第３の調節配列は、前記ｌｃｙ−Ｂおよび前記ｃｒｔＷの発現が、前記ｃｒｔＩの発現のレベルよりも少なくとも１０倍大きいよう選択される。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、（ｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号４、５、６または７に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＩの発現を引き起こすよう選択され、
ここで、（ｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号２または３に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｌｃｙ−Ｂの発現を引き起こすよう選択され、
（ｉｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号２または３に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＷの発現を引き起こすよう選択される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、（ｉｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号４、５、６または７に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＩの発現を引き起こすよう選択され、
ここで、（ｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号２または３に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｌｃｙ−Ｂの発現を引き起こすよう選択され、
（ｖｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号２または３に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＷの発現を引き起こすよう選択される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、（ｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号５に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｉｄｉの発現を引き起こすよう選択され、
ここで、（ｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号５に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＥの発現を引き起こすよう選択され、
（ｉｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号３に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＢの発現を引き起こすよう選択され、
（ｉｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号７に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＩの発現を引き起こすよう選択され、
（ｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号２に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｌｃｙ−Ｂの発現を引き起こすよう選択され、
（ｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号３に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＷの発現を引き起こすよう選択され、
（ｖｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号６に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＺの発現を引き起こすよう選択される。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、（ｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号６に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｉｄｉの発現を引き起こすよう選択され、
（ｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号３に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＥの発現を引き起こすよう選択され、
（ｉｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号７に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＢの発現を引き起こすよう選択され、
（ｉｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号５に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＩの発現を引き起こすよう選択され、
（ｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号２に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｌｃｙ−Ｂの発現を引き起こすよう選択され、
（ｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号２に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＷの発現を引き起こすよう選択され、
（ｖｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号２に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＺの発現を引き起こすよう選択される。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、複数のポリヌクレオチド配列は、
（ｖｉｉｉ）デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）および第８の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第８の転写調節配列は、配列番号６に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ＤＸＳの発現を引き起こすよう選択される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、複数のポリヌクレオチド配列は、単一発現ベクター中に含まれる。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、複数のポリヌクレオチド配列は、複数の発現ベクター中に含まれる。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＢＳの各々に、スペーサー配列が隣接する。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＢＳの各々の上流のスペーサー配列は、配列番号８に示される配列と少なくとも８０％相同である。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＢＳの各々の下流のスペーサーは、配列番号９に示される配列と少なくとも８０％相同である。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細菌細胞は、大腸菌細胞である。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、アスタキサンチンは、細菌細胞中の封入体において発現される。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細菌細胞は、遺伝子改変される。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細菌細胞は、本発明の複数のポリヌクレオチドを発現する。本発明のいくつかの実施形態によれば、第１の調節配列、第２の調節配列、第３の調節配列、第４の調節配列、第５の調節配列、第６の調節配列および第７の調節配列の各々は、ＲＢＳである。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、調節配列は、Ｉｃｙ−ＢおよびｃｒｔＷの発現が、ｃｒｔＩの発現のレベルよりも少なくとも１０倍大きいよう選択される。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、（ｉｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号４、５、６または７に示されるような配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＩの発現をもたらすよう選択され、
（ｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号２または３に示されるような配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｌｃｙ−Ｂの発現を引き起こすよう選択され、
（ｖｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号２または３に示されるような配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＷの発現を引き起こすよう選択される。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、（ｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号５に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％のｉｄｉの発現を引き起こすよう選択され、
ここで、（ｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号５に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＥの発現を引き起こすよう選択され、
（ｉｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号３に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＢの発現を引き起こすよう選択され、
（ｉｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号７に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＩの発現を引き起こすよう選択され、
（ｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号２に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｌｃｙ−Ｂの発現を引き起こすよう選択され、
（ｖｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号３に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＷの発現を引き起こすよう選択され、
（ｖｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号６に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＺの発現を引き起こすよう選択される。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、（ｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号６に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｉｄｉの発現を引き起こすよう選択され、
ここで、（ｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号３に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＥの発現を引き起こすよう選択され、
（ｉｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号７に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＢの発現を引き起こすよう選択され、
（ｉｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号５に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＩの発現を引き起こすよう選択され、
（ｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号２に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｌｃｙ−Ｂの発現を引き起こすよう選択され、
（ｖｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号２に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＷの発現を引き起こすよう選択され、
（ｖｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号２に示されるような配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＺの発現を引き起こすよう選択される。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、細胞に、デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）をコードするポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＸＳを発現するポリヌクレオチドのＲＢＳの配列は、配列番号６に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ＤＸＳの発現を引き起こすよう選択される。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、発現は、細菌細胞において達成される。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細菌細胞は、大腸菌細胞を含む。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＢＳの各々に、スペーサー配列が隣接する。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＢＳの各々の上流のスペーサー配列は、配列番号８に示される配列と少なくとも８０％相同である。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＢＳの各々の下流のスペーサーは、配列番号９に示される配列と少なくとも８０％相同である。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチドの各々は、単一の発現ベクター上に含まれる。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、発現後にアスタキサンチンを単離することをさらに含む。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、
（ｉ）第１の酵素コード配列と作動可能に連結している第１のＲＢＳと、
（ｉｉ）第２の酵素コード配列と作動可能に連結している第２のＲＢＳと、
（ｉｉｉ）第３の酵素コード配列と作動可能に連結している第３のＲＢＳと
を含む単離ポリヌクレオチドであって、
第２のＲＢＳは、第２の酵素コード配列の発現のレベルが、第１の酵素コード配列の発現のレベルよりも大きいよう選択され、
第３のＲＢＳは、第３の酵素コード配列の発現のレベルが、第２の酵素コード配列の発現のレベルよりも大きいよう選択され、
第１の酵素、第２の酵素および第３の酵素は、同一ではない酵素であり、対象の同一生成物の生合成経路の各部分である、単離ポリヌクレオチドが提供される。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離ポリヌクレオチドは、
（ｉｖ）第４の酵素コード配列と作動可能に連結している第４のＲＢＳ
をさらに含む。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第４の酵素は、第１、第２および第３の酵素と同一ではなく、同一生成物の生合成経路の部分である。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離ポリヌクレオチドは、
（ｖ）第５の酵素コード配列と作動可能に連結している第５のＲＢＳ
をさらに含む。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第５の酵素は、第１、第２、第３および第４の酵素と同一ではなく、対象の同一生成物の生合成経路の部分である。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離ポリヌクレオチドは、
（ｖｉ）第６の酵素コード配列と作動可能に連結している第６のＲＢＳ
をさらに含む。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第６の酵素は、第１、第２、第３、第４および第５の酵素と同一ではなく、対象の同一生成物の生合成経路の部分である。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＢＳの各々に、スペーサー配列が隣接する。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＢＳの各々の上流のスペーサー配列は、配列番号８に示される配列と少なくとも８０％相同である。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＢＳの各々の下流のスペーサーは、配列番号９に示される配列と少なくとも８０％相同である。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象の生成物は、タンパク質である。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象の生成物は、食品、医薬および燃料からなる群から選択される。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、少なくとも３種の酵素を含む生合成経路の生成物である最適量の対象の生成物を合成するために、ポリヌクレオチド配列を選択する方法であって、
（ａ）細胞における対象の生成物の合成を可能にする条件下で本明細書に記載されたポリヌクレオチドを細胞中に導入することと、
（ｂ）対象の生成物の量を測定することと
を含み、対象の生成物の量は、選択されるポリヌクレオチド配列を示す、方法が提供される。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は、細菌細胞、哺乳類細胞、植物細胞、真菌細胞および藻類細胞からなる群から選択される。
【００６５】
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および／または科学用語は、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと
同一の意味を有する。本発明の実施形態の実施または試験において、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料が使用され得るが、例示的方法および／または材料が以下に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて本特許明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は、単に例示的なものであって、必ずしも制限であるよう意図されない。
【００６６】
本発明の一部の実施形態が、添付の図面を参照して単に例として本明細書において記載されている。ここで、図面を詳細に特に参照して、示される詳細は例としてであり、本発明の実施形態の例示的考察を目的とするということが強調される。この関連で、図面と一緒にされた説明によって、本発明の実施形態が実施され得る方法は当業者には明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】多重遺伝子構築物のコンビナトリアルアセンブリーのためのモジュラークローニング戦略の図である。正しくアセンブルされた構築物の直接選択によって偽陽性クローンを排除する方法を開発した。対象の各遺伝子を、ＮｈｅＩ（「Ｎ」）およびＰｃｉＩ（「Ｐ」）制限部位が隣接するクロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性カセットと接続した。アセンブリーのために指定される配列は、上流ＳｐｅＩ（「Ｓ」）制限部位を含有する。第１の標的配列をベクター中にアセンブルするために、ＤＮＡをＳｐｅＩおよびＰｃｉＩを使用してまず消化し、続いて、ライゲーションし、形質転換した。細胞を、Ｃｍを含む選択寒天上にプレーティングした。骨格ベクターは、Ｃｍ耐性を含まないので、適切にアセンブルされた（すなわち、指定された配列および耐性マーカーを含有する）クローンが、コロニーを形成する。次の標的配列を組み込むために、アセンブリー生成物を細胞から抽出し、ＮｈｅＩおよびＰｃｉＩを用いて消化し、構築物から耐性マーカーを効果的に廃棄した。第１のものと同様に、第２の標的配列を、ＳｐｅＩおよびＰｃｉＩを用いて消化し、ベクターにアセンブルした。重要なことに、ＮｈｅＩおよびＳｐｅＩ制限部位の付着末端は適合し一緒に接続されて、ＮｈｅＩまたはＳｐｅＩによって切断され得ない配列（「ｘ」）である、傷跡（scar）を形成する。第２のアセンブリーラウンド後に、新規構築物は、ここで、標的配列およびＣｍ耐性の両方を含有し、陽性構築物の直接選択をもう一度可能にする。多重遺伝子オペロンをアセンブルするために、この一連の事象が反復され得る。
【図２】標的ＯＲＦのＲＢＳ調節の図である。所望のコード配列を、耐性カセットと対を形成させ、次いで、挿入部位の上流にＲＢＳを含有するベクターにアセンブルする。バーコード付加および非バーコード付加アセンブリーは、同一論理に頼るものであるが、技術的理由のために制限部位が異なる。
【図３】ｐＮｉｖ骨格プラスミドの図である。アセンブリープロセスを通じて漏出性発現を最小にするために、ＲＲＮＢターミネーターを、多重クローニング部位の上流に置いた。
【図４】隔離されたＲＢＳユニット設計の模式図である。隣接する配列の組成が、所与のＲＢＳの発現レベルに影響を及ぼすとわかった。このような続発的効果を最小にしようとして、ＲＢＳ配列の上流および下流に一定のスペーサーおよびタグ配列を導入した。
【図５】ｐＳＢ４Ｋ５：Ｐｔａｃ−発現プラスミドの図である。多重クローニング部位の上流のｐＳＢ４Ｋ５プラスミド骨格に、ハイブリッドＰｔａｃプロモーターを置いた。
【図６Ａ−Ｄ】種々の蛍光タンパク質および誘導条件を使用するＲＢＳセットのフローサイトメトリー蛍光測定のグラフ図である。
【図７】予測されたＲＢＳ活性と、実験による蛍光測定の比較のグラフ図である。ＣＦＰ（青色）、ＹＦＰ（緑色）およびｍＣｈｅｒｒｙ（赤色）リポーターを、ＲＢＳ配列（Ａ〜Ｆ、文字によって示される通り）と各々対を形成させた。ｘ軸は、各配列の予測されたＲＢＳ活性を表し、一方、ｙ軸は、測定された蛍光レベルを表す。蛍光レベルを正規化し、その結果、予測されたダイナミックレンジの中点−（予測された最大−予測された最小／２）−が、各リポーターの実験によって測定されたダイナミックレンジの中点−（測定された最大−測定された最小／２）対応する。
【図８】単一チューブコンビナトリアルアセンブリーの図である。アセンブリー反応において、ｐＮｉｖ：ＲＢＳプラスミドの、６種の別個のＲＢＳ配列との等モル混合物を使用した。標的コード配列をプラスミド混合物にライゲーションし、すべて同一コード配列を含有するが、その上流に位置する異なるＲＢＳ上流を有する６種の別個の生成物を得た。
【図９】ＲＢＳ調節される遺伝子の合成オペロンのアセンブリーの図である。
【図１０】バーコード付加ＲＢＳ部位を有する合成オペロンのアセンブリーの図である。各アセンブリーステップで、新規にアセンブルされたＲＢＳによって調節されるコード配列に対応するバーコードが、オペロンの３’末端に積み重ねられる。
【図１１】バーコード付加ＲＢＳ混合物の単一チューブコンビナトリアルアセンブリーの図である。標的挿入物をｐＲＢＳバーコード付加混合物とライゲートし、得られたライブラリーは、その上流に種々のＲＢＳ配列を有する標的コード配列を含有する。
【図１２】３色リポーターオペロン−プラスミドマップの図である。
【図１３】第１の遺伝子（ＹＦＰ）に対するオペロン（ｍＣｈｅｒｒｙ）中の第２の遺伝子の依存のグラフ図である。ｍＣｈｅｒｒｙを制御するＲＢＳ配列は、色（ＲＢＳ  Ａについては青色、ＲＢＳ  Ｃについては赤色およびＲＢＳ  Ｅについては緑色）を使用して示されおり、ＹＦＰを制御するＲＢＳ配列は、形（ＲＢＳ  Ａについてはアステリスク、ＲＢＳ  Ｂについては丸、ＲＢＳ  Ｃについては三角、ＲＢＳ  Ｄについては四角、ＲＢＳ  Ｅについては十字およびＲＢＳ  Ｆについては星）に対応する。ＹＦＰの発現レベルがｍＣｈｅｒｒｙの発現を調節する翻訳共役の効果は、明らかである。ＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙレベル間の依存は、対数領域において直線傾向をたどり、約１／３の傾きを有する。
【図１４】カロテノイド生合成オペロン−プラスミドマップの図である。
【図１５Ａ−Ｂ】バランスのとれた経路機能のために酵素発現レベルの調節が必要であることを示す図である。（Ａ）２種の酵素からなる可逆性ミカエリス−メンテン速度論に基づく簡単な定量的モデルを使用して、バランスのとれていない酵素発現の結果を表した。白色で示される酵素濃度空間の小さい領域のみが、最適製造を持続する。（Ｂ）ＲＢＳ配列の小さいセットが、数桁規模のタンパク質発現に及ぶ。６種の予めキャラクタライズされたＲＢＳ配列を使用し、誘導プロモーターの下流の対象の遺伝子と対を形成させた。＃８  （ＲＢＳ−Ａ）：ＡＧＧＡＧＧＴＴＴＧＧＡ（配列番号２）＃１  （ＲＢＳ−Ｂ）：ＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＧＧＴＡＣＴＧＡＧ（配列番号３）＃１７（ＲＢＳ−Ｃ）：ＡＡＧＴＴＡＡＧＡＧＧＣＡＡＧＡ（配列番号４）＃２７（ＲＢＳ−Ｄ）：ＴＴＣＧＣＡＧＧＧＧＧＡＡＧ（配列番号５）＃２０（ＲＢＳ−Ｅ）：ＴＡＡＧＣＡＧＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＧ（配列番号６）「Ｄｅａｄ−ＲＢＳ」（ＲＢＳ−Ｆ）：ＣＡＣＣＡＴＡＣＡＣＴＧ（配列番号７）
【図１５Ｃ−Ｄ】バランスのとれた経路機能のために酵素発現レベルの調節が必要であることを示す図である。（Ｃ）ＲＢＳ配列のセットと対を形成したＹＦＰのフローサイトメトリー蛍光測定（１５）。（Ｄ）アセンブルされた部分のバーコード付加および正しくアセンブルされた構築物の直接選択を可能にする多重遺伝子構築物のコンビナトリアルアセンブリーのモジュラークローニング戦略。対象の各遺伝子は、クロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性カセットと接続され、ＲＢＳ配列のライブラリーと対を形成している。第１の遺伝子がベクター中にアセンブルされると、適切にアセンブルされたクローンが、Ｃｍ耐性のために選択される。次の遺伝子を挿入するために、マーカーは廃棄され、さらなる部分がベクター中にアセンブルされる。新規に形成された構築物は、２種のＲＢＳによって調節される遺伝子および耐性マーカーを含有し、陽性構築物の直接選択をもう一度可能にする。ＲＢＳによって調節される多重遺伝子オペロンのコンビナトリアルライブラリーを容易にアセンブルするために、この一連のステップが反復され得る。
【図１６Ａ−Ｃ】３種の蛍光タンパク質のＲＢＳ調節が色空間に及ぶことを示す図である。（Ａ）ＣＦＰ、ＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙを、存在するＲＢＳセットの３種の代表（配列「Ａ」、「Ｃ」および「Ｅ」）と組合せ的に接続し、遺伝子を一緒にアセンブルした。得られたオペロンライブラリーは、遺伝子発現を調節するＲＢＳ配列においてのみ異なっている。（Ｂ）オペロンライブラリーで形質転換された大腸菌コロニーの蛍光顕微鏡イメージング。観察された色は、蛍光タンパク質の各々に割り当てられた３種の原色の付加的組合せを表す。不規則なコロニーの形は、隣接するコロニーの接触境界の結果である。弱いＲＢＳを有するいくつかのコロニーは、黒く現れる。差し込み図：明視野像。（Ｃ）３色ＲＢＳ調節性オペロンを含有する大腸菌コロニーの蛍光イメージング。像は、３Ｄグリッドに配置されており、各軸上の位置は、蛍光タンパク質のＲＢＳの強度に対応する。
【図１６Ｄ】３種の蛍光タンパク質のＲＢＳ調節が色空間に及ぶことを示す図である。（Ｄ）２色オペロンライブラリーからサンプリングされたクローンのＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光レベル。バーコード配列決定によって決定されるようなＲＢＳ組成（関係オンラインテキストを参照のこと）が示されている。同一遺伝子型（個別の色で標識された各々）は、蛍光空間中に一緒に密集している。ＹＦＰの発現レベルが、ｍＣｈｅｒｒｙの発現を、最大５倍調節する翻訳共役の効果もまた明らかである。
【図１７Ａ−Ｂ】カロテノイド蓄積プロフィールが、生合成遺伝子のＲＢＳ配列とともに変わることを示す図である。（Ａ）カロテノイド生合成経路の７種の遺伝子の各々を調節するＲＢＳ配列が異なる合成オペロンのライブラリーを作製した。（Ｂ）オペロンライブラリーで形質転換された大腸菌コロニーの両眼顕微鏡イメージング。コロニーの色は、各々特徴的な色を有する蓄積されたカロテノイドの組成に対応する。
【図１７Ｃ】カロテノイド蓄積プロフィールが、生合成遺伝子のＲＢＳ配列とともに変わることを示す図である。（Ｃ）形質転換されたライブラリーからサンプリングされたクローンのカロテノイド蓄積プロフィールおよびＲＢＳ組成。各サンプリングされたクローンのＲＢＳ組成を、配列決定すること（バーコードでコードするＲＢＳは、３Ａに例示されるような遺伝子の順序を指す）によって決定し、各クローンのカロテノイドプロフィールを、ＨＰＬＣを使用して分析した。異なる遺伝子型は、別個の表現型、すなわち、別個のカロテノイド蓄積プロフィールをもたらす。円の面積は、右に記載された代謝経路に従うカロテノイド中間体の製造収率を示す（１５）。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本発明は、その一部の実施形態において、アスタキサンチンなどの代謝経路の生成物を作製するためのバイオテクノロジー法に関する。
【００６９】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、必ずしも、以下の説明に示される、または実施例によって例示されるその適用に詳細に制限されないということは理解されなければならない。本発明は、他の実施形態であり得る、または種々の方法で実行もしくは実施され得る。
【００７０】
組換え酵素の発現を調整することは、代謝経路の最適化に必須である（図１５Ａ）。バランスのとれた発現レベルを達成するための２つの主な戦略がある。合理的設計は、経路の成分各々の相対および絶対量の算出または推定を含む。しかし、このような試みは、経路成分の速度論、エネルギー論および調節に関する十分な情報を欠くことによって制限されることが多い。あるいは、調節エレメントのランダム突然変異誘発に基づく戦略は、発現空間をサンプリングし、所望の表現型をスクリーニングまたは選択できる。しかし、突然変異体の大きなプールでさえ、発現空間の適切なカバレッジを保障せず、遺伝子型の大部分が、表現型空間の小さい部分に密集していることが多い。さらに、ランダム突然変異誘発は、所望の表現型のスクリーニングが困難なものであり、または実現不可能でさえあり得る大きなライブラリーをもたらすことが多い。
【００７１】
本発明者らは、調節エレメントのコンパクトなセットを使用する表現型空間の調査を促進する戦略を取り入れた。合成オペロン中の同義遺伝子の発現を調節する、十分にキャラクタライズされたＲＢＳ配列の小さいセットを使用することによって、本発明者は、各軸において数桁規模にわたって多次元発現空間を効率的にサンプリングできた。小さな大きさのＲＢＳセットが、ライブラリー中の遺伝子変異体の数を制限し、迅速なスクリーニングを可能にすることが重要である。
【００７２】
本発明者らは、カロテノイド生合成に関与する遺伝子のリボソーム結合部位を調節することによって、経路の代謝生成物の蓄積が、その成分酵素を調節するＲＢＳ配列に従って大幅に変わることを実証する。本発明者らは、アスタキサンチン生合成経路のコンビナトリアルアセンブリーが、従来のアセンブリーおよび選択法を上回って４倍の収量増大をもたらすことを見出し、それによって、キャラクタライズされた調節エレメントの小さいセットを使用する発現空間のサンプリングの強度を例示する。
【００７３】
本明細書において示される戦略は、種々の方法で拡大され得る。具体的には、他の調節エレメントは、遺伝子発現をさらに調節し得る。例えば、オペロンの転写を制御するためのプロモーターの小さいライブラリーを使用することによって、発現空間全体のスパンが数桁規模でさらに増大され得る。
【００７４】
本発明者らは、代謝経路の生成物の最適製造に必要な代謝経路の酵素の割合を決定するために、異なる強度のものである、少なくとも３種の異なるＲＢＳ配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製した。この構築物への、種々の順列での代謝経路の関連酵素をコードする配列の導入は、最適ＲＢＳ酵素組合せのスクリーニングを可能にする。
【００７５】
したがって、本発明の一態様によれば、
（ｉ）第１の酵素コード配列と作動可能に連結している第１のＲＢＳと、
（ｉｉ）第２の酵素コード配列と作動可能に連結している第２のＲＢＳと、
（ｉｉｉ）第３の酵素コード配列と作動可能に連結している第３のＲＢＳと
を含む単離ポリヌクレオチドであって、
第２のＲＢＳは、第２の酵素の発現のレベルが、第１の酵素の発現のレベルよりも大きいよう選択され、
第３のＲＢＳは、第３の酵素の発現のレベルが、第２の酵素の発現のレベルよりも大きいよう選択され、
第１の酵素、第２の酵素および第３の酵素は、同一ではない酵素であり、同一生成物の生合成経路の各部分である、単離ポリヌクレオチドが提供される。
【００７６】
語句「単離ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列および／または複合ポリヌクレオチド配列（例えば、上記の組合せ）の形態で単離され、提供される一本鎖または二本鎖核酸配列を指す。
【００７７】
本明細書において、語句「相補的ポリヌクレオチド配列」とは、逆転写酵素または任意の他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用するメッセンジャーＲＮＡの逆転写に起因する配列を指す。このような配列は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでその後増幅され得る。
【００７８】
本明細書において、語句「ゲノムポリヌクレオチド配列」は、染色体に由来する（単離された）配列を指し、したがって、染色体の連続部分を表す。
【００７９】
本明細書において、語句「複合ポリヌクレオチド配列」とは、少なくとも部分的に相補的であり、少なくとも部分的にゲノムの配列を指す。複合配列は、本発明のポリペプチドをコードするために必要ないくつかのエキソン配列ならびにその間に入っているいくつかのイントロン配列を含み得る。イントロン配列は、他の遺伝子のものを含めた任意の供給源のものであり得、通常、保存されたスプライシングシグナル配列を含む。このようなイントロン配列は、シス作動性発現調節エレメントをさらに含み得る。
【００８０】
「リボソーム結合部位」（ＲＢＳ）は、普通、約４〜１６の塩基対を含む短いヌクレオチド配列であり、コードされるタンパク質の翻訳のためにリボソームをｍＲＮＡ分子上に位置付けることによって機能する。
【００８１】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合に「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターは、配列の転写に影響を及ぼす場合にコード配列と作動可能に連結され、またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するよう位置付けられる場合に、コード配列と作動可能に連結される。核酸配列の連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成され得る。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは、アセンブリーＰＣＲなどの従来の実行に従って使用され得る。
【００８２】
例示的ＲＢＳの配列およびその相対強度は、参照により本明細書に組み込まれた、その補足情報を含めて非特許文献５に見出され得る。好ましくは、ＲＢＳは、その強度が下流配列によって影響を受けないものに選択される。ＲＢＳの相対強度を選択する方法もここに開示されている。例えば、ＲＢＳの相対強度は、検出マーカーをコードするポリヌクレオチド配列を連結することおよび細胞においてマーカーを発現させることによって決定され得る。マーカーは、蛍光タンパク質、リン光タンパク質または抗体を使用して検出され得る任意のタンパク質であり得る。検出可能なタンパク質の量は、ＲＢＳの強度と相関する。
【００８３】
例示的ＲＢＳ配列として、例えば、
（ＲＢＳ−Ａ）：ＡＧＧＡＧＧＴＴＴＧＧＡ（配列番号２）
（ＲＢＳ−Ｂ）：ＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＧＧＴＡＣＴＧＡＧ（配列番号３）
（ＲＢＳ−Ｃ）：ＡＡＧＴＴＡＡＧＡＧＧＣＡＡＧＡ（配列番号４）
（ＲＢＳ−Ｄ）：ＴＴＣＧＣＡＧＧＧＧＧＡＡＧ（配列番号５）
（ＲＢＳ−Ｅ）：ＴＡＡＧＣＡＧＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＧ（配列番号６）
（ＲＢＳ−Ｆ）：ＣＡＣＣＡＴＡＣＡＣＴＧ（配列番号７）
が挙げられる。
【００８４】
さらなるＲＢＳ配列は以下の通りである：
ＡＧＧＡＡＡ、（配列番号７０）、ＡＧＡＡＡＡ（配列番号７１）、ＡＧＡＡＧＡ（配列番号７２）、ＡＧＧＡＧＡ（配列番号７３）、ＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡ（配列番号７４）、ＡＡＧＧＡＡＡＡ（配列番号７５）、ＡＡＧＧＡＡＡＧ（配列番号７６）、ＡＡＧＧＡＡＡＵ（配列番号７７）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡ（配列番号７８）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＧ（配列番号７９）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＵ（配列番号８０）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ（配列番号８１）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧ（配列番号８２）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＵ（配列番号８３）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号８４）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧ（配列番号８５）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＵ（配列番号８６）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号８７）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧ（配列番号８８）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＵ（配列番号８９）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号９０）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧ（配列番号９１）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＵ（配列番号９２）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号９３）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧ（配列番号９４）、ＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡ（配列番号９５）およびＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＵ（配列番号９６）。
【００８５】
一実施形態によれば、第３のＲＢＳは、第２のＲＢＳの少なくとも２倍、３倍、５倍またはさらに１０倍強力である。
【００８６】
別の実施形態によれば、第２のＲＢＳは、第１のＲＢＳの少なくとも２倍、３倍、５倍またはさらに１０倍強力である。
【００８７】
当然のことではあるが、特定の代謝経路の酵素の数に応じて、また使用される特定の細胞系において天然に発現される酵素の数に応じて、ポリヌクレオチドは、さらなるＲＢＳを含み、さらなる酵素をコードし得る。したがって、単離ポリヌクレオチドは、代謝経路中に存在する異なる酵素コード配列と作動可能に連結している第４、第５または第６のＲＢＳを含み得る。
【００８８】
転写調節エレメント（例えば、ＲＢＳ）に隣接する配列は、発現レベルに影響を及ぼし得るので、その上流および下流に位置するスペーサー配列、すなわち、１０〜５０ｂｐ、例えば、約２０ｂｐの一定の配列が、発現構築物中に挿入され得る。
【００８９】
本明細書において、用語「スペーサー配列」とは、論じられている配列の上流または下流のいずれかである任意の配列を指す（例えば、遺伝子ＡＢＣについては、遺伝子Ｂに、ＡおよびＣ遺伝子配列が隣接する）。いくつかの実施形態では、隣接配列は、ＤＮＡ断片の一方の側にのみ（３’または５’のいずれか）存在するが、好ましい実施形態では、隣接される配列の各側にある。
【００９０】
ＲＢＳの上流に置かれ得る例示的配列として、（配列番号８）に対して少なくとも７０％相同、少なくとも８０％相同、少なくとも９０％相同または１００％相同な配列がある。ＲＢＳの下流に置かれ得る例示的配列として、（配列番号９）に対して少なくとも７０％相同、少なくとも８０％相同、少なくとも９０％相同または１００％相同な配列がある。
【００９１】
上記で本明細書において記載されたように、本発明は、発現構築物への安定化ｍＲＮＡ配列の挿入をさらに考慮する。
【００９２】
「安定化ｍＲＮＡ」は、遺伝子発現に影響を及ぼすよう使用される核酸配列挿入断片である。これらの挿入断片は、一般に、遺伝子または核酸配列の転写および翻訳開始部位の間に位置する。
【００９３】
安定化ｍＲＮＡ配列は、当技術分野で周知であり、非特許文献６が参照される。好ましいｍＲＮＡ安定化配列として、以下の配列：
ＧＧＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＴＧＡＣＧ、（配列番号９７）；ＧＧＴＧＧＡＣＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＴＧＡＣＧ、（配列番号９８）；ＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＴＧＡＣＧ、（配列番号９９）；ＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＴＧＡＣＧ、（配列番号１００）；ＣＧＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＴＧＡＣＧ、（配列番号１０１）；ＧＧＴＧＧＡＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＴＧＡＣＧ、（配列番号１０２）およびＧＣＴＧＧＡＣＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＴＧＡＣＧ、（配列番号１０３）
が挙げられる。
【００９４】
本発明のポリヌクレオチドは、発現構築物として使用され得るようなさらなる配列（例えば、プロモーター）を含み得る。さらに、ポリヌクレオチドは、このベクターを、原核生物、真核生物または好ましくは、両方における複製および組込みに適したもの（例えば、シャトルベクター）にする配列を含み得る。通常のクローニングベクターは、以下に本明細書において記載されるような、転写および翻訳開始配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）ならびに転写および翻訳ターミネーター（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含有する。
【００９５】
一実施形態によれば、ポリヌクレオチド中の酵素コード配列の各々は、プロモーターと作動可能に連結している。一実施形態では、同一プロモーターが、ポリヌクレオチド中にコードされる酵素の各々の発現を制御する。別の実施形態によれば、異なるプロモーターが、ポリヌクレオチド中にコードされる酵素の発現を制御する。
【００９６】
特定のプロモーターの例が、本明細書において以下に記載される。
【００９７】
一実施形態によれば、発現構築物は、選択マーカーをコードする。
【００９８】
本明細書において、用語「選択マーカー」とは、導入された核酸またはベクターを含有する宿主の容易な選択を可能にする、宿主細胞において発現可能な遺伝子を指す。このような選択マーカーの例として、それだけには限らないが、抗菌剤（例えば、カナマイシン、エリスロマイシン、アクチノマイシン、クロラムフェニコールおよびテトラサイクリン）が挙げられる。したがって、用語「選択マーカー」とは、宿主細胞が、外因性ポリヌクレオチド配列を取り込んだという指標またはいくつかの他の反応が起こったという指標を提供する遺伝子を指す。通常、選択マーカーは、宿主細胞に抗菌剤耐性または代謝上の利点を付与して、外因性ＤＮＡを含有する細胞が、形質転換の際に任意の外因性配列を受け取っていない細胞と区別されるのを可能にする遺伝子である。
【００９９】
記載されたように、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、同一生成物の生合成経路の一部である酵素をコードする。
【０１００】
本明細書において、語句「生合成経路」または「代謝経路」とは、複数の酵素を含み、１種または複数の酵素によって作用される基質、酵素によって触媒される反応の生成物、酵素によって利用される補助因子などをさらに含み得る、基質を対象の生成物に変換するための細胞系または細胞（細胞不含）系を指す。系は、無傷の細胞中に、または細胞の溶解物中に存在し得る。
【０１０１】
微生物系において、多数の代謝経路が公知であり、記載されており、公的データベースにおいて利用できる；例えば、各々参照により本明細書に組み込まれる、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、および非特許文献１０を参照のこと。
【０１０２】
一実施形態では、経路は、食品、医薬または燃料の製造を指示する。
【０１０３】
生合成経路は、例えば、炭水化物、アミノ酸、核酸、ステロイド、脂肪酸および天然物生合成に関与する経路を含み得、それだけには限らないが、
ａ）抗生物質；例えば、アクチノマイシン、ブレオマイシン、リファマイシン、クロラムフェニコール、カルバペネム、テトラサイクリン、リンコマイシン、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、シクロヘキサミド、ピューロマイシン、サイクロセリン、バシトラシン、ペニシリン、セファロスポリン、バンコマイシン、ポリミキシンおよびグラミシジン；
ｂ）生物界面活性剤；例えば、ラムノリピド、ソホロ脂質、糖脂質およびリポペプチド；
ｃ）生物燃料；例えば、バイオエタノール、バイオディーゼルおよびバイオブタノール；
ｄ）アミノ酸；例えば、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−プロリン（ヒドロキシプロリン）、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−チロシンおよびＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン；
ｅ）有機酸；例えば、クエン酸、乳酸、グルコン酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、フマル酸およびイタコン酸；
ｆ）脂肪酸；例えば、アラキドン酸、ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＢＡ）およびα−リノール酸；
ｇ）アルコールおよびポリオール；例えば、グリセロール、マンニトール、エリトリトール、キシリトール、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸、イソブタノールおよび１−ブタノール；
ｈ）香味料および香料；例えば、バニリン、ベンズアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、４−（Ｒ）−デカノリドおよび２−アクチル−１−ピロリン；
ｉ）ヌクレオチド；例えば、５’−グアニル酸および５’−イノシン酸；
ｊ）ビタミン；例えば、ビタミンＣ、ビタミンＦ、ビタミンＢ２、プロビタミンＤ２、ビタミンＢ１２、葉酸、ニコチンアミド、ビオチン、２−ケト−Ｌ−グロン酸およびプロビタミンＱ１０；
ｋ）色素；例えば、アスタキサンチン、β−カロテン、ロイコペン(leucopene)、モナスコルブリン(monascorubrin)およびルブロプンクタチン(rubropunctatin);
ｌ）糖類およびポリ糖類；例えば、リボース、ソルボース、キサンタン、ゲラン(gellan)およびデキストラン；ならびに［００６６］ｍ）生体高分子およびプラスチック；例えば、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリ−γグルタミン酸および１，３−プロパンジオールを含めた種々の化合物および材料の合成を包含する。
【０１０４】
対象の生合成経路のその他の例として、種々の大腸菌代謝生成物の合成が挙げられる。
【０１０５】
「代謝生成物」は、代謝（例えば、酵素、基質または生成物）の間に使用されるか、または製造される任意の物質である。本明細書において、代謝生成物は、常にではないが、しばしば、対象の経路中の酵素の生成物である。
【０１０６】
例示的大腸菌代謝生成物として、それだけには限らないが、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２−ケトグルタル酸、３−ホスホグリセリン酸、４−ヒドロキシ安息香酸、６−ホスホグルコン酸、アセトアセチル−ＣｏＡ、アセチル−ＣｏＡ、アセチルリン酸、アデニン、アデノシン、アデノシンホスホ硫酸、ＡＤＰ、ＡＤＰ−グルコース、アラニン、ＡＭＰ、アントラニル酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、ＡＴＰ、カルバミルアスパラギン酸、シス−アスコット酸、クエン酸、シトルリン、ＣＭＰ、補酵素Ａ、ＣＴＰ、サイクリックＡＭＰ、シチジン、シトシン、ｄＡＭＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシリボース−５−Ｐ、ｄＧＭＰ、ジヒドロオロト酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、ｄＴＤＰ、ｄＴＴＰ、エリトロース−４−リン酸、ＦＡＤ、フラビンモノヌクレオチド、フルクトース−１，６−ビスリン酸、フルクトース−６−リン酸、フマル酸、ＧＤＰ、グルコン酸、グルコノラクトン、グルコサミン−６−リン酸、グルコース−６−リン酸、グルコース−１−リン酸、グルタミン酸、グルタミン、グルタチオン、グルタチオンジスルフィド、グリセルアルデヒド−３−リン酸、グリセリン酸、グリセロール−３−リン酸、ＧＭＰ、ＧＴＰ、グアニン、グアノシン、ヒスチジン、ヒスチジノール、ホモシステイン、イノシン二リン酸、イノシン一リン酸、イノシン三リン酸、イソロイシン、リシン、リンゴ酸、マロニル−ＣｏＡ、メチオニン、ミオ−イノシトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン−１Ｐ、Ｎ−アセチル−オルニチン、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ、オルニチン、オキサロ酢酸、フェニルアラニン、フェニルピルビン酸、ホスホエノールピルビン酸、プロリン、プロピオニル−ＣｏＡ、ＰＲＰＰ、ピルビン酸、キノリン酸、リボフラビン、リボース−５−リン酸、リブロース−５−リン酸、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、セリン、シキミ酸、シキメート、コハク酸、スクシニル−ＣｏＡ、トレオニン、トリプトファン、チロシン、ＵＤＰ、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルクロン酸、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ウリジン、ＵＴＰ、バリンおよびキシルロース−５−リン酸が挙げられる。
【０１０７】
特定の実施形態では、対象の経路は、シキミ酸および／またはシキメート（シキメートは、シキミ酸のアニオン型である）およびその合成中間体、イソプレノイドまたはテルペン（例えば、アモルファジエン、フェルネセン、リコピン、アスタキサンチン、ビタミンＡ、メントール、β−カロテン）、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸、イソブタノールおよび１−ブタノールの合成を提供する。
【０１０８】
いくつかの反応は、対象の生合成経路中の酵素によって触媒され得る。括弧中に提供される酵素分類番号によって同定され得る広範なクラスの酵素として、それだけには限らないが、
（ＥＣ１）オキシドレダクターゼ；例えば、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、オキシドレダクターゼ、シンターゼ、オキシゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、トランスヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、エポキシダーゼ、ヒドロキシラーゼ、デメチラーゼ、不飽和化酵素、ジムスターゼ、ヒドロキシルトランスフェラーゼ、デハロゲナーゼおよびデヨードナーゼ；
（ＥＣ２）トランスフェラーゼ；例えば、トランスアミナーゼ、キナーゼ、ジキナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ホルミルトランスフェラーゼ、ホルムイミノトランスフェラーゼ、カルボキシトランスフェラーゼ、カルバモイルトランスフェラーゼ、アミジノトランスフェラーゼ、トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼパルミトイルトランスフェラーゼ、スクシニルトランスフェラーゼ、マロニルトランスフェラーゼ、ガロイルトランスフェラーゼ、シナポイルトランスフェラーゼ、チグロイルトランスフェラーゼ、テトラデカノイルトランスフェラーゼ、ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ、フェルロイルトランスフェラーゼ、ミコリルトランスフェラーゼ、ベンゾイルトランスフェラーゼ、ピペロイルトランスフェラーゼ、トリメチルトリデカノイルトランスフェラーゼ、ミリストイルトランスフェラーゼ、クマロイルトランスフェラーゼ、チオラーゼ、アミノアシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ヘキソシルトランスフェラーゼ、ペントシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、ピリジニラーゼ、ジホスホリラーゼ、シクロトランスフェラーゼ、スルフリラーゼ、アデノシルトランスフェラーゼ、カルボキシビニルトランスフェラーゼ、イソペンテニルトランスフェラーゼ、アミノカルボキシプロピルトランスフェラーゼ、ジメチルアリルトランスフェラーゼ、ファルネシルトランストランスフェラーゼ、ヘキサプレニルトランストランスフェラーゼ、デカプレニルシストランスフェラーゼ、ペンタプレニルトランストランスフェラーゼ、ノナプレニルトランスフェラーゼ、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、アミノカルボキシプロピルトランスフェラーゼ、オキシイミノトランスフェラーゼ、プリントランスフェラーゼ、ホスホジムスターゼ、ホスホトランスフェラーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、コリンホスホトランスフェラーゼ、ホスホリルムターゼ、硫黄トランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼおよびＣｏＡ−トランスフェラーゼ；
（ＥＣ３）ヒドロラーゼ；例えば、リパーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、ペプチダーゼ、ヒドロラーゼ、ラクトナーゼ、デアシラーゼ、デアセチラーゼ、フェオホルビダーゼ、デポリメラーゼ、チオールエステラーゼ、ホスファターゼ、ジホスファターゼ、トリホスファターゼ、ヌクレオチダーゼ、フィターゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスホリパーゼ、スルファターゼ、シクラーゼ、オリゴヌクレオチダーゼ、リボヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、グリコシダーゼ、ヌクレオシダーゼ、グリコシラーゼ、アミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、ω−ペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、トレオニンエンドペプチダーゼ、アミナーゼ、アミダーゼ、デスクシニラーゼ、デホルミラーゼ、アシラーゼ、デイミナーゼ、デアミナーゼ、ジヒドロラーゼ、シクロヒドロラーゼ、ニトリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、ＧＴＰアーゼ、ハライダーゼ(halidase)、デハロゲナーゼおよびスルホヒドロラーゼ；
（ＥＣ４）リアーゼ；例えば、デカルボキシラーゼ、カルボキシラーゼ、カルボキシキナーゼ、アルドラーゼ、エポキシリアーゼ(epoxylyase)、オキソ酸リアーゼ、炭素−炭素リアーゼ、デヒドラターゼ、ヒドラターゼ、シンターゼ、エンドリアーゼ、エキソリアーゼ、アンモニア−リアーゼ、アミジン−リアーゼ、アミン−リアーゼ、炭素−硫黄リアーゼ、炭素−ハライドリアーゼ(carbon-halide lyase)、リン−酸素リアーゼおよびデヒドロクロリナーゼ；
（ＥＣ５）イソメラーゼ；例えば、イソメラーゼ、ラセマーゼ、ムターゼ、トートメラーゼ、ホスホムターゼ、ホスホグルコムターゼ、アミノムターゼ、シクロイソメラーゼ、シクラーゼ、トポイソメラーゼ；および
（ＥＣ６）リガーゼ；例えば、シンセターゼ、ｔＮＲＡ−リガーゼ、酸−チオールリガーゼ、アミドシンターゼ、ペプチドシンターゼ、シクロリガーゼ、カルボキシラーゼ、ＤＮＡ−リガーゼ、ＲＮＡ−リガーゼおよびシクラーゼ
が挙げられる。
【０１０９】
酵素のより具体的なクラスとして、制限するものではないが、以下に提供されるような、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼのサブクラスが挙げられる。例示的オキシドレダクターゼとして、それだけには限らないが、
（ＥＣ１．１）ドナーおよびアクセプターのＣＨ−−ＯＨ基に作用するオキシドレダクターゼ、
（ＥＣ１．２）ドナーおよびアクセプターのアルデヒドまたはオキソ基に作用するオキシドレダクターゼ、
（ＥＣ１．３）ドナーおよびアクセプターのＣＨ−−ＣＨ基に作用するオキシドレダクターゼ、
（ＥＣ１．４）ドナーおよびアクセプターのＣＨ−−ＮＨ２基に作用するオキシドレダクターゼ、
（ＥＣ１．５）ドナーおよびアクセプターのＣＨ−−ＮＨ基に作用するオキシドレダクターゼ、
（ＥＣ１．６）ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨおよびアクセプターに作用するオキシドレダクターゼ、
（ＥＣ１．７）ドナーおよびアクセプターとしての他の窒素性化合物に作用するオキシドレダクターゼ、
（ＥＣ１．８）ドナーおよびアクセプターの硫黄基に作用するオキシドレダクターゼ、
（ＥＣ１．９）ドナーおよびアクセプターのヘム基に作用するオキシドレダクターゼ、
（ＥＣ１．１）ドナーおよびアクセプターとしてのジフェノールおよび関連物質に作用するオキシドレダクターゼ、
（ＥＣ１．１１）アクセプターとして過酸化物に作用するオキシドレダクターゼ、
（ＥＣ１．１２）ドナーおよびアクセプターとしての水素に作用するオキシドレダクターゼ、
（ＥＣ１．１３）分子酸素を組み込んで単一ドナーに作用し、１個または２個の酸素原子を組み込むオキシドレダクターゼ、
（ＥＣ１．１４）分子酸素の組込みまたは還元を伴って対を形成するドナーに作用し、ドナーが、２−オキソグルタル酸、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、還元型フラビン、フラボタンパク質、プテリジン、鉄−硫黄タンパク質、アスコルビン酸であるオキシドレダクターゼ、
（ＥＣ１．１５）アクセプターとしてのスーパーオキシドラジカルに作用するオキシドレダクターゼ、
（ＥＣ１．１６）金属イオンおよびアクセプターを酸化するオキシドレダクターゼ、
（ＥＣ１．１７）ＣＨまたはＣＨ２基およびアクセプターに作用するオキシドレダクターゼ、
（ＥＣ１．１８）ドナーおよびアクセプターとしての鉄−硫黄タンパク質に作用するオキシドレダクターゼ、
（ＥＣ１．１９）ドナーおよびアクセプターとしての還元型フラボドキシンに作用するオキシドレダクターゼ、
（ＥＣ１．２）ドナーおよびアクセプター中のリンまたはヒ素に作用するオキシドレダクターゼならびに
（ＥＣ１．２１）Ｘ−−ＨおよびＹ−−Ｈに作用して、Ｘ−−Ｙ結合を形成し、アクセプターに作用し、各ドナーカテゴリーのアクセプターが、制限されるものではないが、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ヘムタンパク質、酸素、ジスルフィド、キノン、鉄−硫黄タンパク質、フラビン、窒素性基、シトクロム、二窒素およびＨ＋を含み得る、オキシドレダクターゼ
が挙げられる。
【０１１０】
例示的トランスフェラーゼとして、それだけには限らないが、
（ＥＣ２．１）１炭素基を転移するトランスフェラーゼ、
（ＥＣ２．２）アルデヒドまたはケトン化合物基を転移するトランスフェラーゼ、
（ＥＣ２．３）アシルトランスフェラーゼ；
（ＥＣ２．４）グリコシルトランスフェラーゼ；
（ＥＣ２．５）メチル基以外のアルキルまたはアリール基を転移するトランスフェラーゼ、
（ＥＣ２．６）窒素性基を転移するトランスフェラーゼ、
（ＥＣ２．７）リン含有基を転移するトランスフェラーゼ、
（ＥＣ２．８）硫黄含有基を転移するトランスフェラーゼ、ならびに
（ＥＣ２．９）セレン含有基を転移するトランスフェラーゼ
が挙げられる。
【０１１１】
例示的ヒドロラーゼとして、それだけには限らないが、
（ＥＣ３．１）エステル結合に作用するヒドロラーゼ、
（ＥＣ３．２）グリコシラーゼ、
（ＥＣ３．３）エーテル結合に作用するヒドロラーゼ、
（ＥＣ３．４）ペプチド結合作用するヒドロラーゼ（ペプチダーゼ）、
（ＥＣ３．５）ペプチド結合以外の炭素−窒素結合に作用するヒドロラーゼ、
（ＥＣ３．６）酸無水物に作用するヒドロラーゼ、
（ＥＣ３．７）炭素−炭素結合に作用するヒドロラーゼ、
（ＥＣ３．８）ハロゲン化物結合に作用するヒドロラーゼ、
（ＥＣ３．９）リン−窒素結合に作用するヒドロラーゼ、
（ＥＣ３．１）硫黄−窒素結合に作用するヒドロラーゼ、
（ＥＣ３．１１）炭素−リン結合に作用するヒドロラーゼ、
（ＥＣ３．１２）硫黄−硫黄結合に作用するヒドロラーゼおよび（ＥＣ３．１３）炭素−硫黄結合に作用するヒドロラーゼ
が挙げられる。
【０１１２】
例示的リアーゼとして、それだけには限らないが、
（ＥＣ４．１）炭素−炭素リアーゼ、
（ＥＣ４．２）炭素−酸素リアーゼ、
（ＥＣ４．３）炭素−窒素リアーゼ、
（ＥＣ４．４）炭素−硫黄リアーゼ、
（ＥＣ４．５）炭素−ハロゲン化物リアーゼおよび
（ＥＣ４．６）リン−酸素リアーゼ
が挙げられる。
【０１１３】
例示的イソメラーゼとして、それだけには限らないが、
（ＥＣ５．１）ラセマーゼおよびエピメラーゼ、
（ＥＣ５．２）シス−トランス−イソメラーゼ、
（ＥＣ５．３）分子内イソメラーゼ
（ＥＣ５．４）分子内トランスフェラーゼ（ムターゼ）および
（ＥＣ５．５）分子内リアーゼ
が挙げられる。
【０１１４】
例示的リガーゼとして、それだけには限らないが、
（ＥＣ６．１）炭素−酸素結合を形成するリガーゼ、
（ＥＣ６．２）炭素−硫黄結合を形成するリガーゼ、
（ＥＣ６．３）炭素−窒素結合を形成するリガーゼ、
（ＥＣ６．４）炭素−炭素結合を形成するリガーゼ、
（ＥＣ６．５）リン酸エステル結合を形成するリガーゼおよび
（ＥＣ６．６）窒素−金属結合を形成するリガーゼ
が挙げられる。
【０１１５】
アイソザイム（イソ酵素としても知られる）は、アミノ酸配列が異なるが、同一化学反応を触媒する酵素である。対象の経路においていくつかの点で、２種以上のアイソザイムが存在し得る。アイソザイムは、異なる動態パラメータおよび／または異なる調節特性を示し得る。
【０１１６】
対象の経路または関連経路に関与する酵素はまた、酵素の役割に従って分類され得る。細胞または細胞溶解物中の直接関与酵素（クラス１）は、経路中の反応を触媒する。このような直接酵素が、第１の酵素の生成物が、第２の酵素の基質であり、第２の酵素の生成物が、第３の酵素の基質などであり、最終的に対象の生成物をもたらす連鎖の１種である経路に特有である。細胞または細胞溶解物中の関節関与酵素（クラス２）は、関連経路において、普通、対象の経路において使用される基質の製造において反応する。
【０１１７】
本明細書において記載されるものの方法において使用するための対象の経路は、普通、少なくとも１種の酵素、少なくとも２種の酵素、少なくとも３種の酵素、少なくとも４種の酵素またはそれ以上、例えば、１〜５０種の間の酵素、１〜４０種の間の酵素、１〜３０種の間の酵素、１〜２０種の間の酵素、１〜１０種の間の酵素、１〜５種の間の酵素、１〜２種の間の酵素、２〜５０種の間の酵素、２〜４０種の間の酵素、２〜３０種の間の酵素、２〜２０種の間の酵素、２〜１０種の間の酵素、２〜５種の間の酵素、２〜４種の間の酵素、５〜５０種の間の酵素、５〜４０種の間の酵素、５〜３０種の間の酵素、５〜２０種の間の酵素、５〜１０種の間の酵素、５〜８種の間の酵素、１０〜５０種の間の酵素、１０〜４０種の間の酵素、１０〜３０種の間の酵素または１０〜２０種の間（両端値を含む）の酵素を含む。
【０１１８】
経路中の酵素は、天然に存在し得るか、または対象の特定の特徴、例えば、基質特異性、反応速度論、溶解度および／またはフィードバック阻害に対する非感受性を最適化するよう改変され得る。さらに、いくつかの場合には、酵素を発現する遺伝子は、宿主細胞内でのコドン使用に向けて最適化される。いくつかの実施形態では、完全経路は、単一生物由来の酵素を含むが、このようなことは必要ではなく、複数の生物に由来する酵素を組み合わせることも考慮される。いくつかの理由のために、経路は、宿主細胞にとって内因性であり得るが、このようなことも必要ではなく、完全経路または経路の成分は、宿主細胞中に導入され得る。系が無傷の細胞において提供される場合には、対象の経路の酵素の完全なセットが細胞中に存在し得る。
【０１１９】
当然のことではあるが、本明細書に記載される実施形態と関連する酵素をコードする遺伝子は、種々の供給源から得られ得る。当業者ならば承知するであろうが、これらの標的とされる酵素の相同遺伝子は、多数の種において存在し、例えば、ＮＣＢＩインターネットサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で入手可能なタンパク質ＢＬＡＳＴ検索による相同性検索によって同定され得る。これらの酵素をコードする遺伝子は、当業者によって理解されるように、例えば、縮重プライマーを使用して、所与の酵素を含有する任意の供給源から得られたＤＮＡからＰＣＲ増幅され得る。いくつかの実施形態では、所与の酵素をコードする遺伝子は、合成的なもの（人為的なもの）、例えば、糖、窒素ベースの化合物、リン酸およびＤＮＡ合成に必要な他の化合物／試薬から合成されたＤＮＡであり得る。本明細書において論じられる酵素をコードする遺伝子を得る任意の手段が、本明細書に記載される実施形態の態様と適合する。
【０１２０】
経路の生成物は、安定である場合も、相対的に不安定である場合もあるが、いくつかの場合には、細胞、細胞溶解物または反応混合物から単離され得る最終生成物は十分に安定である。
【０１２１】
反応において生じた生成物の量は、種々の方法で、例えば、着色または蛍光生成物をもたらす酵素的アッセイによって、または高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法によって測定され得る。ある種の実施形態では、生成物は、生じる特定の生成物の活性または濃度を測定するアッセイを利用して測定される。生成物がタンパク質である場合には、ＲＮＡまたはタンパク質レベルで定量され得る。
【０１２２】
当業者ならば、ポリヌクレオチドを宿主細胞に、特に、大腸菌、バチルスおよびパントエア宿主細胞に導入するための方法を十分に承知している。一般的な形質転換技術は、非特許文献１１および非特許文献１２に開示されている。エレクトロポレーション、プロトプラスト形質転換および会合を含めた形質転換、形質導入およびプロトプラスト融合の方法が開示されている、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５および非特許文献１６も参照される。形質転換の方法は、特に好ましい。細菌細胞の維持および成長に適した方法は、周知であり、非特許文献１７および非特許文献１８が参照される。
【０１２３】
本明細書において、細胞に核酸配列を挿入することに関連して使用される、用語「導入された」は、「トランスフェクション」、「形質転換」または「形質導入」を意味し、核酸配列が細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチドまたはミトコンドリアＤＮＡ）組み込まれ、自律的レプリコンに変換され得る、または一時的に発現され得る（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）、真核細胞または原核細胞への核酸配列の組込みへの言及を含む。
【０１２４】
本明細書において、細胞に関連して使用される、用語「形質転換された」、「安定に形質転換された」および「トランスジェニック」とは、細胞が、そのゲノム中に統合された、または２以上の世代を通して維持されるエピソームプラスミドとして、非天然（異種性）核酸配列を有することを意味する。
【０１２５】
形質転換宿主細胞は、挿入ＤＮＡ構築物中に提供された選択マーカーに対する表現型反応に基づいて選択される。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、宿主細胞から切り出され得る（非特許文献１９）。
【０１２６】
経路エンジニアリングのための宿主細胞として、それだけには限らないが、細菌、真菌および原生動物を含めたさまざまな従属栄養性および独立栄養性微生物が挙げられる。ある種の実施形態では、宿主細胞として、ポリペプチドが細胞区画または細胞外区画に向けられ得る手段が公知であるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載される核酸のうち任意の１種または複数を組換えによって発現する任意の種類の細胞である。このような細胞は、原核細胞およびの真核細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、エシェリキア属種、ストレプトマイセス属種、ザイモナス属種、アセトバクター属種、シトロバクター属種、シネコシスティス属種、リゾビウム属種、クロストリジウム属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトコッカス属種、キサントモナス属種、ラクトバチルス属種、ラクトコッカス属種、バチルス属種、アルカリゲネス属種、シュードモナス属種、エロモナス属種、アゾトバクター属種、コマモナス属種、マイコバクテリア属種、ロドコッカス属種、グルコノバクター属種、ラルストニア属種、アシジチオバチルス属種、ミクロルナタス属種、ジオバクター属種、ジオバチルス属種、アルスロバクター属種、フラボバクテリウム属種、セラチア属種、サッカロポリスポラ属種、サーマス属種、ステノトロホモナス属種、クロモバクテリウム属種、シノリゾビウム属種、サッカロポリスポラ属種、アグロバクテリウム属種およびパントエア属種などの細菌細胞である。細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などのグラム陰性細胞またはバチルス種の種などのグラム陽性細胞であり得る。他の実施形態では、細胞は、酵母細胞、例えば、サッカロマイセス属種、シゾサッカロマイセス属種、ピキア属種、パフィア属種、クリベロマイセス属種、カンジダ属種、タラロミセス属種、ブレタノマイセス属種、パチソレン属種、デバリオマイセス属種、ヤロウィア属種および工業的倍数体酵母株などの真菌細胞である。真菌の他の限定されない例として、アスペルギルス属種、ペニシリウム属種、フザリウム属種、リゾプス属種、アクレモニウム属種、ニューロスポラ属種、ソルダリア属種、マグナポルテ属種、アロマイセス属種、ウスチラゴ属種、ボトリチス属種およびトリコデルマ属種が挙げられる。他の実施形態では、細胞は、藻類細胞、植物細胞または哺乳類細胞である。当然のことではあるが、本明細書において記載される実施形態と適合する一部の細胞は、本明細書において記載される１種または複数の遺伝子の内因性コピーならびに組換えコピーを発現し得る。対象の種として、制限するものではないが、Ｓ．セレビシエ、大腸菌、シュードモナス属種、クレブシエラ属種およびシネコシスティス属種が挙げられる。
【０１２７】
特定の経路における適当なＲＢＳ酵素組合せの選択後、その生成物の商業的量を調製するために、ポリヌクレオチドは、別個の発現ベクターとして細胞系中に、または単一発現ベクターで導入され得る。次いで、最終生成物は単離され得る。本明細書において記載された実施形態と関連する単離ポリペプチドを得るために、当業者に周知の種々の方法が利用され得る。ポリペプチドは、イムノクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび免疫アフィニティークロマトグラフィーによって細胞から精製され得る。
【０１２８】
反応は、大規模リアクターを利用する場合もあり、または複数の同時合成を実施するために小規模が多重化される場合もある。連続反応は、供給機構を使用して試薬の流れを導入し、最終生成物をプロセスの一部として単離できる。活発な合成の期間を延長するためにさらなる試薬が経時的に導入され得るバッチ系も対象である。リアクターは、バッチ、拡張バッチ(extended batch)、セミバッチ、セミ連続、フェッドバッチおよび連続などの任意の様式で実施されてもよく、これらは、適用目的に従って選択される。
【０１２９】
反応は、小規模（例えば、普通、少なくとも約１ｍｌおよび約１５ｍｌ以下）の、または大規模な反応（例えば、反応容量が、少なくとも約１５ｍｌ、普通、少なくとも約５０ｍｌ、より普通には、少なくとも約１００ｍｌであり、５００ｍｌ、１０００ｍｌまたはそれ以上、最大何千リットルの容量であり得る）のいずれかの任意の容量であり得る。反応は、任意の規模で実施され得る。
【０１３０】
本明細書において記載される戦略を使用して、本発明者らは、アスタキサンチンの合成のための最適ＲＢＳ酵素組合せを明らかにした。
【０１３１】
したがって、本発明の別の態様によれば、アスタキサンチン経路の酵素をコードするポリヌクレオチドを発現させることを含む、アスタキサンチンを作製する方法であって、ポリヌクレオチドは、
（ｉ）フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）および第１の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）β−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ）および第２の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）β−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＷ）および第３の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと
を含み、
第１、第２および第３の調節配列は、ｌｃｙ−ＢおよびｃｒｔＷの発現が、ｃｒｔＩの発現のレベルよりも大きいよう選択される、方法が提供される。
【０１３２】
本発明の方法は、アスタキサンチン経路の酵素をコードする少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種のさらなるポリヌクレオチドの発現を考慮する。
【０１３３】
さらなるポリヌクレオチドは、
（ｉｖ）イソペンテニルピロリン酸（ｉｄｉ）および第４の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｖ）ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＥ）および第５の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｖｉ）プレフィトエンピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＢ）および第６の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
（ｖｉｉ）β−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ）および第７の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと
を含む。
【０１３４】
本明細書において、用語「アスタキサンチン」とは、分子式Ｃ４０Ｈ５２Ｏ４を有する、３，３’−ジヒドロキシ−β−カロテン−４，４’−ジオン、としても知られる、その３種の立体異性体（３Ｒ，３’Ｒ）、（３Ｒ，３’Ｓ）（メソ）および（３Ｓ，３’Ｓ）のいずれか１種を指す。
【０１３５】
生体細胞においてアスタキサンチンを作製するために、細胞は、アスタキサンチン経路の酵素を発現することが好ましい。
【０１３６】
例示的酵素は、以下に本明細書において列挙される。
【０１３７】
ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＥまたはＧＧＰＰシンターゼ）：用語「ｃｒｔＥ」とは、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）をゲラニルゲラニル二リン酸ＧＧＰＰ（ＥＣ２．５．１．２９）に変換できる酵素を指す。ｃｒｔＥの限定されない例のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、以下および参照により本明細書に組み込まれる特許文献２の表１５に列挙されている。本発明のｃｒｔＥはまた、相同体（例えば、デフォルトパラメータを使用するＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用して決定されるような、以下に本明細書において列挙されるｃｒｔＥ配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％またはそれ以上、およそ１００％相同であるポリペプチド）を指す。相同体はまた、その欠失、挿入またはアミノ酸置換を含めた置換変異体およびその生物学的に活性なポリペプチド断片を指す場合もある。
【０１３８】
ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼのヌクレオチド配列の例示的例として、それだけには限らないが：（ＡＴＨＧＥＲＰＹＲＳ；シロイヌナズナ）、（ＢＴ００５３２８；シロイヌナズナ）、（ＮＭ＿１１９８４５；シロイヌナズナ）、（ＮＺ＿ＡＡＪＭ０１０００３８０、遺伝子座ＺＰ＿００７４３０５２；バチルス・チューリンゲンシス血清型イスラエレンシス、ＡＴＣＣ  ３５６４６ｓｑ１５６３）、（ＣＲＧＧＰＰＳ；ニチニチソウ）、（ＮＺ＿ＡＡＢＦ０２００００７４、遺伝子座ＺＰ＿００１４４５０９；フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ビンセンティー、ＡＴＣＣ  ４９２５６）、（ＧＦＧＧＰＰＳＧＮ；ジベレラ・フジクロイ）、（ＡＹ３７１３２１；イチョウ）、（ＡＢ０５５４９６；パラゴムノキ）、（ＡＢ０１７９７１；ヒト）、（ＭＣＩ２７６１２９；ムーコル・シルシネロイデスｆ．ルシタニクス）、（ＡＢ０１６０４４；ハツカネズミ）、（ＡＡＢＸ０１０００２９８、遺伝子座ＮＣＵ０１４２７；ニューロスポラ・クラッサ）、（ＮＣＵ２０９４０；ニューロスポラ・クラッサ）、（ＮＺ＿ＡＡＫＬ０１０００００８、遺伝子座ＺＰ＿００９４３５６６；ラルストニア・ソラナケアルムＵＷ５５１）、（ＡＢ１１８２３８；ラット）、（ＳＣＵ３１６３２；サッカロミセス・セレビシエ）、（ＡＢ０１６０９５；シネココッカス・エロンガタス）、（ＳＡＧＧＰＳ；シナピス・アルバ）、（ＳＳＯＧＤＳ；スルホロブス・アシドカルダリウス）、（ＮＣ＿００７７５９、遺伝子座ＹＰ＿４６１８３２；シントロファス・アシディトロフィカスＳＢ）および（ＮＣ＿００６８４０、遺伝子座ＹＰ＿２０４０９５；ビブリオ−フィッシェリＥＳ１１４）が挙げられる。特定の実施形態によれば、ＧＧＰＰシンターゼは、パントエア・アグロメランに由来する配列−ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ２１２６０．１（配列番号６２）を含む。
【０１３９】
プレフィトエンピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＢ）：本明細書において、用語「ｃｒｔＢ」とは、フィトエンシンターゼとしても知られるＧＧＰＰをフィトエンに変換する酵素（ＥＣ＝２．５．１．３２）を指す。ｃｒｔＢの限定されない例のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、参照により本明細書に組み込まれる特許文献２の表１８に列挙されている。本発明のｃｒｔＢはまた、相同体（例えば、デフォルトパラメータを使用するＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用して決定されるような、特許文献２の表１８に列挙されるｃｒｔＥ配列に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％またはそれ以上、およそ１００％相同であるポリペプチド）を指す。相同体はまた、その欠失、挿入またはアミノ酸置換を含めた置換変異体およびその生物学的に活性なポリペプチド断片を指す場合もある。
【０１４０】
特定の実施形態によれば、ｃｒｔＢは、パントエア・アグロメラン由来の配列−ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ２１２６４．１（配列番号６３）を含む。
【０１４１】
フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）：本明細書において、用語「ｃｒｔＩ」は、フィトエンをリコピンに変換する酵素（ＥＣ＝１．１４．９９）を指す。ｃｒｔＩの限定されない例のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、参照により本明細書に組み込まれる特許文献２の表１７Ａおよび１７Ｂに列挙されている。本発明のｃｒｔＥはまた、相同体（例えば、デフォルトパラメータを使用するＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用して決定されるような、特許文献２の表１７Ａおよび１７Ｂに列挙されるｃｒｔＩ配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％またはそれ以上、およそ１００％相同であるポリペプチド）を指す。相同体はまた、その欠失、挿入またはアミノ酸置換を含めた置換変異体およびその生物学的に活性なポリペプチド断片を指す場合もある。
【０１４２】
特定の実施形態によれば、ｃｒｔＩは、パントエア・アグロメランに由来する配列−ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ２１２６３．１（配列番号６４）を含む。
【０１４３】
イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ（ｉｄｉ）：本明細書において、用語「ｉｄｉ」とは、相対的に非反応性のイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の、より反応性の求電子物質ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）への変換を触媒するイソメラーゼ酵素（ＥＣ＝５．３．３．２）を指す。イソペンテニル二リン酸δイソメラーゼとしてもまた知られている。ｉｄｉの限定されない例のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、参照により本明細書に組み込まれる特許文献２の表１３に列挙されている。本発明のｉｄｉはまた、相同体（例えば、デフォルトパラメータを使用するＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用して決定されるような、特許文献２の表１３に列挙されるｉｄｉ配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％またはそれ以上、およそ１００％相同であるポリペプチド）を指す。相同体はまた、その欠失、挿入またはアミノ酸置換を含めた置換変異体およびその生物学的に活性なポリペプチド断片を指す場合もある。
【０１４４】
特定の実施形態によれば、ｉｄｉは、ヘマトコッカス藻に由来する配列−ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＣ３２２０８．１（配列番号６５）を含む。
【０１４５】
β−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ）：本明細書において、用語「ｌｃｙ−Ｂ」とは、リコピンのカロテンへの変換を触媒する酵素を指す。ｌｃｙ−Ｂの限定されない例のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、参照により本明細書に組み込まれる特許文献２の表２３に列挙されている。本発明のｌｃｙ−Ｂはまた、相同体（例えば、デフォルトパラメータを使用するＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用して決定されるような、特許文献２の表２３に列挙されるｌｃｙ−Ｂ配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％またはそれ以上、およそ１００％相同であるポリペプチド）を指す。相同体はまた、その欠失、挿入またはアミノ酸置換を含めた置換変異体およびその生物学的に活性なポリペプチド断片を指す場合もある。
【０１４６】
特定の実施形態によれば、ｌｃｙ−Ｂは、トマトに由来する配列−ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＲ５７２３２．１（配列番号６６）を含む。
【０１４７】
β−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ）：本明細書において、用語「ｃｒｔＺ」とは、カロテンのゼアキサンチンへの変換を触媒する酵素および／またはカンタキサンチンのアスタキサンチンへの変換を触媒する酵素（ＥＣ１．１４．１３）を指す。ｃｒｔＺの限定されない例のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、参照により本明細書に組み込まれる特許文献２の表２０に列挙されている。本発明のｃｒｔＺはまた、相同体（例えば、デフォルトパラメータを使用するＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用して決定されるような、特許文献２の表２０に列挙されるｃｒｔＺ配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％またはそれ以上、およそ１００％相同であるポリペプチド）を指す。相同体はまた、その欠失、挿入またはアミノ酸置換を含めた置換変異体およびその生物学的に活性なポリペプチド断片を指す場合もある。
【０１４８】
特定の実施形態によれば、ｃｒｔＺは、パントエア・アナナティスに由来する配列−Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ２１６８８．１（配列番号６７）を含む。
【０１４９】
β−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＷ）：本明細書において、用語「ｃｒｔＷ」とは、カロテンのカンタキサンチンへの変換を触媒する酵素および／またはゼアキサンチンのアスタキサンチンへの変換を触媒する酵素を指す。ｃｒｔＷの限定されない例のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、参照照により本明細書に組み込まれる特許文献２の表１９に列挙されている。本発明のｃｒｔＷはまた、相同体（例えば、デフォルトパラメータを使用するＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用して決定されるような、特許文献２の表１９に列挙されるｃｒｔＷ配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％またはそれ以上、およそ１００％相同であるポリペプチド）を指す。相同体はまた、その欠失、挿入またはアミノ酸置換を含めた置換変異体およびその生物学的に活性なポリペプチド断片を指す場合もある。特定の実施形態によれば、ｃｒｔＷは、ノストック・スフェロイデス由来の配列−ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＢ７４８８８．１（配列番号６８）を含む。
【０１５０】
好ましくは、細胞はまた、１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ（ｄｘｓ）を発現する。
【０１５１】
本明細書において、用語「１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ（ｄｘｓ）」とは、ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸のＤ−１−デオキシキシルロース５−リン酸（ＤＯＸＰ）への縮合を触媒する酵素を指す（ＥＣ２．２．１．７）。例示的受託番号として、参照により本明細書に組み込まれる特許文献３の表３に提供されるものが挙げられる。本発明のｄｘｓはまた、相同体（例えば、デフォルトパラメータを使用するＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用して決定されるような、特許文献３の表３に列挙されるｄｘｓ配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％またはそれ以上、およそ１００％相同であるポリペプチド）も指す。相同体はまた、その欠失、挿入またはアミノ酸置換を含めた置換変異体およびその生物学的に活性なポリペプチド断片を指す場合もある。特定の実施形態によれば、ｄｘｓは、大腸菌に由来する配列−Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ａ７ＺＸ７２．１（配列番号６９）を含む。
【０１５２】
宿主系においても発現され得るアスタキサンチン経路のさらなる酵素は、参照によって本明細書に組み込まれる特許文献２に記載されている。
【０１５３】
種々の原核細胞または真核細胞または真核細胞は、本発明のポリペプチドを発現するための宿主発現系として使用され得る。これらとして、それだけには限らないが、ポリペプチドコード配列を含有する、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌などの微生物；ポリペプチドコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換された酵母などのＣＨＯ細胞、真菌などの哺乳類発現系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、またはポリペプチドコード配列を含有するＴｉプラスミドなどの組換えプラスミド発現ベクターを用いて形質転換された、藻類および植物細胞系が挙げられる。さらなる宿主発現系は、本明細書において上記でさらに記載されている。
【０１５４】
好ましい実施形態によれば、アスタキサンチン経路の酵素は、細菌細胞において発現される。
【０１５５】
一実施形態では、宿主細胞は、グラム陽性菌などの細菌細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は、グラム陰性菌である。いくつかの好ましい実施形態では、この用語は、パントエア属、バチルス属の細胞および大腸菌細胞を指す。
【０１５６】
本明細書において、「バチルス属」は、それだけには限らないが、Ｂ．スブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．クラウジィ、Ｂ．ハロデュランス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ロータスおよびＢ．チューリンゲンシスを含めた当業者に公知のすべてのメンバーを含む。バチルス属が、分類学的再編成を受け続けていることは認識されている。したがって、属は、それだけには限らないが、現在「ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス」と名づけられているＢ．ステアロサーモフィラスのような生物を含めた再分類された種を含むと意図される。酸素の存在下での耐性内生胞子の製造が、バチルス属の決定的な特徴と見なされるが、この特徴はまた、最近名づけられたアリシクロバチルス、アンフィバチルス、アネウリニバチルス、アノキシバチルス、ブレビバチルス、フィロバチルス、グラシリバチルス、ハロバチルス、ペニバチルス、サリバチルス、サーモバチルス、ウレイバチルスおよびビルジバチルスにも当てはまる。
【０１５７】
本明細書において、「パントエア属」は、それだけには限らないが、Ｐ．アグロメランス、Ｐ．ディスペルサ、Ｐ．パンクタータ、Ｐ．シトレア、Ｐ．テレア、Ｐ．アナナスおよびＰ．ステラルティを含めた当業者に公知のすべてのメンバーを含む。パントエア属が分類学的再編成を受け続けていることは認識されている。したがって、属は、それだけには限らないが、エルウイニア・ヘルビコラのような生物を含めた再分類された種を含むと意図される。
【０１５８】
本発明のポリヌクレオチド配列は、細胞におけるアスタキサンチン経路のポリペプチドの発現を可能にするよう、発現ベクター（すなわち、核酸構築物）中に挿入される。
【０１５９】
特定の細胞系において発現ベクターを使用して発現されるのに必要とされる酵素の数は、その特定の細胞系において内因性に発現されるそれらの酵素の数による。したがって、例えば、特定の細胞系が、ｃｒｔＷを十分な程度に内因性に発現する場合には、その酵素は、組換え法を使用して外因性発現される必要がない場合がある。
【０１６０】
本発明は、単一発現ベクター上のアスタキサンチン経路のポリペプチドのうち１、２、３、４、５、６、７または８種をコードするポリヌクレオチド配列を挿入することを考慮する。したがって、ポリペプチドの発現は、必要な酵素をすべてコードする単一発現ベクターまたはアスタキサンチン経路のポリペプチドの種々の組合せをコードする複数のベクターを導入するによって達成され得る。
【０１６１】
本発明者らは、アスタキサンチンの最適発現のためには、アスタキサンチン経路の成分をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結している転写調節エレメントが、特定の割合の発現を確実にするよう選択されなければならないということを見出した。
【０１６２】
特定の実施形態によれば、Ｉｃｙ−ＢおよびｃｒｔＷ両方の発現が、その発現レベルが、ｃｒｔＩの発現のレベルよりも高いよう操作されなければならない。好ましくは、Ｉｃｙ−ＢおよびｃｒｔＷ両方の発現のレベルは、ｃｒｔＩの発現のレベルの少なくとも２倍である。別の実施形態によれば、Ｉｃｙ−ＢおよびｃｒｔＷ両方の発現のレベルは、ｃｒｔＩの発現のレベルの少なくとも５倍である。別の実施形態によれば、Ｉｃｙ−ＢおよびｃｒｔＷ両方の発現のレベルは、ｃｒｔＩの発現のレベルの少なくとも１０倍である。別の実施形態によれば、Ｉｃｙ−ＢおよびｃｒｔＷ両方の発現のレベルは、ｃｒｔＩの発現のレベルの少なくとも２０倍である。別の実施形態によれば、Ｉｃｙ−ＢおよびｃｒｔＷ両方の発現のレベルは、ｃｒｔＩの発現のレベルの少なくとも５０倍である。別の実施形態によれば、Ｉｃｙ−ＢおよびｃｒｔＷ両方の発現のレベルは、ｃｒｔＩの発現のレベルの少なくとも１００倍である。
【０１６３】
本明細書において、語句「転写調節エレメント」とは、その転写を制御するポリヌクレオチドのタンパク質コーディング領域と作動可能に連結している塩基の配列を指す。
【０１６４】
転写調節エレメントの例として、それだけには限らないが、プロモーター、エンハンサー、ｍＲＮＡ安定性達成配列およびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）が挙げられる。
【０１６５】
本出願の目的上、「プロモーター」または「プロモーター領域」は、転写の開始の際にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識および結合される核酸配列である。プロモーターは、他の転写および翻訳調節エレメントと一緒に、所与の遺伝子または遺伝子の群（オペロン）を発現するのに必要である。プロモーターは、ＩＰＴＧまたは構成プロモーターによって誘導される、Ｐｔｒｃなどの調節プロモーターであり得る。
【０１６６】
本発明による人工プロモーターを作製するのに有用なプロモーター配列として、以下の表１に列挙される前駆体プロモーターが挙げられる。表中のすべてのプロモーターは、β−ラクタマーゼプロモーターＰｂｌａに対してキャラクタライズされており、プロモーター強度は、「Ｐｂｌａ単位」で示されている。（非特許文献２０）。プロモーターおよびその核酸配列のさらなる例は、参照により本明細書において組み込まれる特許文献１に提供されている。一般に、本発明において有用なプロモーターは、転写開始部位（＋１）から上流に２００〜２０塩基対（ｂｐ）の間、好ましくは、１５０〜２５ｂｐ、より好ましくは、１００〜３０ｂｐの間、最も好ましくは、５０〜３０ｂｐの間のプロモーター配列を含む。
【０１６７】
本発明において有用なさらなるプロモーターは、Ｐｔａｃおよび１個または２個の塩基対の変更を含有する変異体の配列が教示される非特許文献２１に開示されている。
【０１６８】
表１
【表１】
0006306583.tif 000002
【０１６９】
プロモーター強度は、ＤＮＡの特定の一部とのＲＮＡポリメラーゼの結合の速度論を測定し、また、転写開始の測定を可能にするｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を使用して定量化され得る（非特許文献２２）。さらに、プロモーター強度は、本明細書において以下にさらに記載されるような、プロモーターを、検出可能なタンパク質（例えば、蛍光マーカー）をコードするポリヌクレオチド配列と連結することによって定量化され得る。ｉｎ  ｖｉｖｏ法も、プロモーター強度を定量化するために使用されてきた。この場合には、アプローチは、プロモーターを、リポーター遺伝子と融合し、ＲＮＡ合成の効率を測定してきた。
【０１７０】
記載されるように、転写調節エレメントは、上記で本明細書においてさらに記載される、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含み得る。
【０１７１】
特定の実施形態によれば、ｃｒｔＩに連結されたＲＢＳとは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一細胞において、同時に、同一温度で、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核酸配列について配列番号４、５、６または７に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の発現を起こすものである。
【０１７２】
特定の実施形態によれば、ｌｃｙＢと連結されたＲＢＳとは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核酸配列について配列番号２または３に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の発現を引き起こすものである。
【０１７３】
特定の実施形態によれば、ｃｒｔＷと連結されたＲＢＳとは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核酸配列について配列番号２または３に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の発現を引き起こすものである。
【０１７４】
本発明者によって考慮される配列の１つの特定の組合せは、以下の通りである：
ｉｄｉをコードするポリヌクレオチド配列に連結されたＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核酸配列について配列番号５に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の発現を引き起こすものである。
【０１７５】
ｃｒｔＥをコードするポリヌクレオチド配列に連結されたＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核酸配列について配列番号５に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の発現を引き起こすものである。
【０１７６】
ｃｒｔＢをコードするポリヌクレオチド配列に連結されたＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核酸配列について配列番号３に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の発現を引き起こすものである。
【０１７７】
ｃｒｔＩをコードするポリヌクレオチド配列に連結されたＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核酸配列について配列番号７に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の発現を引き起こすものである。
【０１７８】
ｌｃｙ−Ｂをコードするポリヌクレオチド配列に連結されたＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核酸配列について配列番号２に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の発現を引き起こすものである。
【０１７９】
ｃｒｔＷをコードするポリヌクレオチド配列に連結されたＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核酸配列について配列番号３に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の発現を引き起こすものである。
【０１８０】
ｃｒｔＺをコードするポリヌクレオチド配列に連結されたＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核酸配列について配列番号６に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の発現を引き起こすものである。
【０１８１】
配列の別の例示的組合せは、以下の通りである：
ｉｄｉをコードするポリヌクレオチド配列に連結されたＲＢＳは、同一転写条件下（すなわち、同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核酸配列について配列番号６に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の発現を引き起こすものである。
【０１８２】
ｃｒｔＥをコードするポリヌクレオチド配列に連結されたＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核酸配列について配列番号３に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の発現を引き起こすものである。
【０１８３】
ｃｒｔＢをコードするポリヌクレオチド配列に連結されたＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核酸配列について配列番号７に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の発現を引き起こすものである。
【０１８４】
ｃｒｔＩをコードするポリヌクレオチド配列に連結されたＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核酸配列について配列番号５に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の発現を引き起こすものである。
【０１８５】
ｌｃｙ−Ｂをコードするポリヌクレオチド配列に連結されたＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核酸配列について配列番号２に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の発現を引き起こすものである。
【０１８６】
ｃｒｔＷをコードするポリヌクレオチド配列に連結されたＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核酸配列について配列番号２に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の発現を引き起こすものである。
【０１８７】
ｃｒｔＺをコードするポリヌクレオチド配列に連結されたＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核酸配列について配列番号２に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の発現を引き起こすものである。
【０１８８】
上記で本明細書において記載されたように、本発明者らは、ＤＸＳを発現させることをさらに考慮する。好ましくは、ＤＸＳをコードするポリヌクレオチド配列に連結されたＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核酸配列について配列番号６に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の発現を引き起こすものである。
【０１８９】
アスタキサンチンを発現するために本明細書において記載される方法を使用して、本発明者は、２ｍｇ／ｇ細胞乾重を超えるアスタキサンチンを含む、３ｍｇ／ｇ細胞乾重を超えるアスタキサンチンを含む、４ｍｇ／ｇ細胞乾重を超えるアスタキサンチンを含む、５ｍｇ／ｇ細胞乾重を超えるアスタキサンチンを含む、１０ｍｇ／ｇ細胞乾重を超えるアスタキサンチンを含む細菌細胞（大腸菌細胞）を得た。
【０１９０】
形質転換された細胞を、多量の組換えポリペプチドの発現を可能にする有効な条件下で培養する。有効な培養条件は、それだけには限らないが、タンパク質製造を可能にする有効な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件を含む。有効な培地とは、細胞が、本発明の組換えポリペプチドを製造するよう培養される任意の培地を指す。このような培地は、通常、同化可能な炭素、窒素およびリン酸供給源ならびに適当な塩、ミネラル、金属およびビタミンなどの他の栄養素を有する水溶液を含む。本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリプレートにおいて培養され得る。培養は、組換え細胞にとって適当な温度、ｐＨおよび酸素含量で実施され得る。このような培養条件は、当業者の専門知識の範囲内にある。
【０１９１】
所定の時間の培養後、アスタキサンチンの回収が達成され、分光光度分析またはＨＰＬＣによる分析が実施され得る。
【０１９２】
本明細書において使用される、語句「アスタキサンチンを回収すること」は、アスタキサンチンを含有する全発酵培地を収集することを指し、分離または精製のさらなるステップを暗示する必要はない。
【０１９３】
細菌細胞または培養後の培養溶液からカロテノイドおよび／またはアスタキサンチンを収集するために、例えば、細菌細胞は、遠心分離などによって培養溶液から分離され、適当な有機溶媒によってそれから抽出され得る。このような有機溶媒の例として、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロホルム、ジメチルホルムアミドおよびジメチルスルホキシドが挙げられる。それらの中でも、アセトンが好ましい。さらに、分離および高純度への精製は、液体クロマトグラフィーなどを利用することによって達成され得る。液体クロマトグラフィーは、例えば、イオン交換の分離原理、疎水性相互作用および分子篩に基づくものであり得る。逆相クロマトグラフィーおよび順相クロマトグラフィーが好ましい。あるいは、細胞からの抽出は、超臨界流体抽出によって実施され得る。
【０１９４】
あるいは、培養を完了した後、細菌細胞は、例えば、遠心分離、デカンテーションまたは濾過によって培養溶液から分離され得る。得られた細菌細胞に水が添加されて、好都合な粘度を有するスラリーにされる。アスタキサンチンなどのカロテノイドの分解を防ぐために、スラリーに適当な添加物が加えられてもよい。このような添加物の例として、それだけには限らないが、アスコルビン酸などの抗酸化剤が挙げられる。その後、調製されたスラリーは、ガラスビーズもしくはジルコニアビーズを使用するグラインダーまたは高圧ホモジナイザーを使用してホモジナイズされ、その後の使用のために乾燥される。好ましい乾燥法は、噴霧乾燥である。
【０１９５】
細菌細胞は、養殖された魚などのための餌に直接添加され得る。あるいは、それらは、使用前に上記のような極性溶媒などから抽出され得る。アスタキサンチンなどのカロテノイドの抽出後に残り、ほとんど色素を含有しない細胞体は、養鶏におけるタンパク質およびビタミンの理想的供給源としてとして使用され得る。
【０１９６】
明確にするために、別個の実施形態との関連で記載される本発明の特定の特徴はまた、単一実施形態において組み合わせて提供され得るということは理解される。逆に、明確にするために、単一の実施形態との関連で簡潔に記載される本発明の種々の特徴はまた、別個に、または任意の適した部分的組合せで、または本発明の任意の他の記載された実施形態において適したように提供され得る。種々の実施形態に関連して記載される特定の特徴は、実施形態がそれらの要素を伴わない場合に動作不能でない限り、それらの実施形態の必須の特徴と考えられてはならない。
【０１９７】
本明細書において上記に描写され、以下の特許請求の範囲の節において特許請求されるような、本発明の種々の実施形態および態様は、以下の実施例において実験的確証を見出す。
【実施例】
【０１９８】
ここで、上記の説明と一緒に、本発明のいくつかの実施形態を限定されない様式で例示する以下の実施例が参照される。
【０１９９】
概ね、本明細書において使用される命名法および本発明において利用される実験室手順は、分子的、生化学的、微生物学的および組換えＤＮＡ技術を含む。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、非特許文献１２、非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献２７、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７および特許文献８に示される方法論、非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０、非特許文献３１、非特許文献３２を参照のこと；利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広く記載されている、例えば、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９、特許文献２０、特許文献２１、特許文献２２、特許文献２３および特許文献２４、非特許文献３３、非特許文献３４、非特許文献３５、非特許文献３６、非特許文献３７、非特許文献３８、非特許文献３９、非特許文献４０を参照のこと；それらのすべては、本明細書において十分に示されるかのように参照により組み込まれる。その他の一般的な参考文献は、この文書を通じて提供される。それにおける手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それに含有されるすべての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２００】
一般的な材料および方法
株、培地および試薬：クローニングおよび構築物アセンブリーに使用した細菌株は、別に明記しない限り、大腸菌ＤＨ５αであった。プラスミドＤＮＡの精製のために、細胞を、３７℃で適した抗生物質を含むＬＢ培地で培養し、ＤＮＡを標準キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して培養物から精製した。すべてのプライマーをＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｓｒａｅｌによって合成した。プライマーの詳細な説明は、本明細書において以下の表２に見出され得る。
【０２０１】
表２
【表２−１】
0006306583.tif 000003
【表２−２】
0006306583.tif 000004
【表２−３】
0006306583.tif 000005
【０２０２】
ＰＣＲ反応は、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して実施した。クローニング手順は、Ｃｌｏｎｅ  ｍａｎａｇｅｒ  ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ｓｕｉｔｅ  （Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＆  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓｔａｔｅ  Ｌｉｎｅ、ＵＳ−ＰＡ）を使用して設計した。制限酵素は、別に明記しない限り、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  （Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＵＳ−ＭＡ）から購入した。ライゲーション反応は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）を使用して実施した。機器、試薬、供給業者および関連カタログ番号のすべての詳細な説明は、本明細書において以下の表３に見出され得る。
【０２０３】
表３
【表３】
0006306583.tif 000006
【０２０４】
「バックグラウンドなし」アセンブリー：全体的なクローニングスキーム：複数のＤＮＡ配列の単一構築物への連続アセンブリーを促進する目的で、「バックグラウンドなし」アセンブリー戦略を開発した。すべてのＤＮＡ構築物は、以下に記載される方法論に従って作製した。「バックグラウンドなし」アセンブリーは、ＢｉｏＢｒｉｃｋ標準としても知られる、非特許文献４１に記載される原理に忠実である。ＢｉｏＢｒｉｃｋ系に記載される主な特徴を保つことに加えて、中間体構築物が多段階アセンブリープロセスの間を通して正しくアセンブルされたことをスクリーニングし、検証する必要性を排除するさらなる特徴を加えた。
【０２０５】
本方法の重要な特徴は、アセンブリーのために指定されるＤＮＡ配列の各々への、クロラムフェニコール耐性マーカー（ＣｍＲ）：構成プロモーターと、それに続くクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼコード配列の連結である。アセンブリープロセスの前にＰＣＲオーバーラップ伸長を使用して、ＣｍＲカセットを、ＤＮＡ配列と対を形成させる。標的ＤＮＡ配列（ここで、ＣｍＲと対を形成された）が、標準制限ライゲーションプロセスを使用してベクターにアセンブルされる場合には、適切にアセンブルされたクローンのみが、Ｃｍを含む寒天プレート上にコロニーを形成できる。
【０２０６】
耐性カセットは、制限部位が隣接するので（図１）、次のアセンブリーサイクルのためのベクターを調製するときに容易に除去され得る。このように、単一耐性マーカーを使用しながら複数のアセンブリーラウンドを実施することが可能である。「バックグラウンドなし」アセンブリー戦略の全体的なスキームは、図１に記載されている。
【０２０７】
クロラムフェニコール耐性カセットの構築：耐性カセットは、構成プロモーターおよび耐性マーカーとしてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有する。カセットを、鋳型としてｐＳＢ３Ｃ５プラスミド（ＢｉｏＰａｒｔ：ＢＢａ＿Ｐ１００４）を使用するＰＣＲによって増幅した。耐性カセットが、５’でＮｈｅＩ部位が、ならびにその３’においてＸｈｏＩおよびＰｃｉＩ部位が隣接するように、制限部位を加えた（表１、本明細書において上記で）。
【０２０８】
0006306583.tif 000007
【０２０９】
発現空間に広がるようＲＢＳ配列のコンパクトなセットを選択すること：発現空間の大きな画分に広がるＲＢＳ配列の小さいセットを見出すために、非特許文献５の研究において実験的に分析されたフォワード設計されたＲＢＳシリーズを使用した。まず、種々の遺伝子につながれたＲＢＳ配列の各々の予測される翻訳速度を、コンピュータによって算出した［Ｓａｌｉｓ  Ｌａｂ：  Ｔｈｅ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ．  ａｔ  ｓａｌｉｓｄｏｔｐｓｕｄｏｔｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／］。その強度が下流配列によって一番少なく影響を受けるようなＲＢＳ配列を選択した。この制限されたセットから、最大の発現空間に広がった５種のＲＢＳ配列を実験によって選んだ［非特許文献５］。これらのＲＢＳ配列は以下であった：
＃８  （ＲＢＳ−Ａ）：ＡＧＧＡＧＧＴＴＴＧＧＡ（配列番号２）
＃１  （ＲＢＳ−Ｂ）：ＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＧＧＴＡＣＴＧＡＧ（配列番号３）
＃１７（ＲＢＳ−Ｃ）：ＡＡＧＴＴＡＡＧＡＧＧＣＡＡＧＡ（配列番号４）
＃２７（ＲＢＳ−Ｄ）：ＴＴＣＧＣＡＧＧＧＧＧＡＡＧ（配列番号５）
＃２０（ＲＢＳ−Ｅ）：ＴＡＡＧＣＡＧＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＧ（配列番号６）
「Ｄｅａｄ−ＲＢＳ」（ＲＢＳ−Ｆ）：ＣＡＣＣＡＴＡＣＡＣＴＧ（配列番号７）
「インスレーター」配列が隣接する：ＲＢＳに隣接する配列は、発現レベルに影響を及ぼし得るので、インスレーター配列、すなわち、−ＲＢＳの各々の上流および下流に位置する約２０ｂｐの一定の配列を使用した。このような単離配列は、プロモーターの場合には、隣接する配列の効果の低減において有効であるとこれまでに報告されている。上流インスレーター配列は、大腸菌では天然に見られない、１９塩基対：ＴＡＡＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡ（配列番号８）であるようとり、一方で、下流インスレーター配列をＡＴＧＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣ（配列番号９）、６Ｈｉｓ−タグをコードする配列であるようとった。
【０２１０】
標的ＯＲＦのＲＢＳ調節：ＲＢＳ調節のために標的コード配列をクローニングするために、まず、ＰＣＲによって増幅し、上記のＣｍ耐性マーカーと対を形成させた。ひとたび、標的遺伝子を耐性カセットと対を形成させると、生成物を直線化したＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋プラスミド中にライゲーションした。次いで、標的ＯＲＦを、ＮｓｉＩおよびＰｃｉＩのいずれか（非バーコード付加アセンブリー）またはＮｓｉＩおよびＸｈｏＩを使用してプラスミドから切り出した。次いで、標的配列を含有する得られた断片および耐性マーカーを、挿入部位の上流にＲＢＳ配列を含有するＲＢＳ骨格ベクター（ＲＢＳ骨格）上でアセンブルした。得られた構築物は、図２に記載されるように、所望のＲＢＳと、それに続く標的ＯＲＦおよび耐性マーカーを含有する。
【０２１１】
ｐＮｉｖ−骨格プラスミド：ベースとしてＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  Ｋｓ＋を使用して骨格プラスミドを構築した。ＬａｃＺ遺伝子を排除し、元の多重クローニング部位を、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩおよびＰｃｉＩ制限部位を含有する新規部位と交換した（図３）。アセンブリープロセス中を通じて漏出性遺伝子発現を最小にするために、強力なＲＲＮＢターミネーター（鋳型としてｐＥＮＴＥＲ１１−Ｇａｔｅｗａｙを使用するＰＣＲによって増幅された）を新規クローニング部位の上流に挿入した。すべてのＤＮＡ配列改変は、ＰＣＲオーバーハング伸長法を使用することによって達成した。
【０２１２】
ｐＮｉｖ：ＲＢＳ−Ａ−ＹＦＰ〜ｐＮｉｖ：ＲＢＳ−Ｆ−ＹＦＰ−プラスミドセット：６種のコアＲＢＳ配列の各々および隣接するインスレーター配列は、合成オリゴデオキシヌクレオチドとして購入した。コアＲＢＳ配列の各々は、インスレーション配列が上流および下流で隣接し、アセンブリーＰＣＲ反応においてＹＦＰリポーター遺伝子と融合される（表１を参照のこと）。得られた６種のＲＢＳ−ＹＦＰ反応生成物（すなわち、ＲＢＳ−Ａ〜ＲＢＳ−Ｆ）を、制限させ、骨格プラスミドｐＮｉｖ中にライゲーションして、６種の指定されたプラスミド−ｐＮｉｖ：［ＲＢＳ−Ａ〜ＲＢＳ−Ｆ］−ＹＦＰを得た−図４を参照のこと。
【０２１３】
発現プラスミド：ＤＮＡアセンブリープロセスを、指定されたプロモーターを含有しないｐＮｉｖ骨格プラスミドで実施した。ひとたび、アセンブリープロセスが完了すると、得られた生成物を、発現プラスミド−ｐＳＢ４Ｋ５：Ｐｔａｃ中にサブクローニングした。このプラスミドは、ｐＳＢ４Ｋ５、ＢｉｏＢｒｉｃｋ標準ベクターから低コピーｐＳＣ１０１複製起点（ＢｉｏＰａｒｔ：ＢＢａ＿Ｉ５００４２）およびカナマイシン抗生物質耐性マーカー（ＢｉｏＰａｒｔ：ＢＢａ＿Ｐ１００３）を用いて誘導した。ＬａｃＩｑ  Ｂｒｉｃｋ（ＢｉｏＰａｒｔ：ＢＢａ＿Ｃ００１２）およびＴａｃプロモーター（ＢｉｏＰａｒｔ：ＢＢａ＿Ｋ３０１０００）を、標準アセンブリー法を使用してｐＳＢ４Ｋ５上、多重クローニング部位の上流にアセンブルして、ｐＳＢ４Ｋ５：Ｐｔａｃを得た（図５）。
【０２１４】
フローサイトメトリーを使用するＲＢＳ発現調節の実験測定：ｉｎ−ｖｉｖｏで発現レベルに対するＲＢＳ配列の効果を定量するために、ＹＦＰリポーター遺伝子を、これまでに記載したクローニング戦略を使用してｐＳＢ４Ｋ５：Ｐｔａｃプラスミド上、ＲＢＳ配列の各々の上流に置いた。大腸菌ＭＧ１６５５細胞を、ｐＳＢ４Ｋ５：Ｐｔａｃ−［ＲＢＳ−Ａ〜ＲＢＳ−Ｆ］−ＹＦＰプラスミドを用いて形質転換し、０．２％グルコースを含む最小培地中３７℃で、対数増殖期中期（ＯＤ＝約０．３）までインキュベートした。蛍光をＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターを使用して定量した。青色レーザー（４８８ｎｍ）および５３０±３０ｎｍ発光フィルターを使用してＹＦＰ蛍光を測定し、黄色レーザー（５６０ｎｍ）および６１０±２０ｎｍ発光フィルターを使用してｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を測定した。各実験で約１００，０００個の細胞を記録した（図６Ａ〜Ｄ）。予測されたＲＢＳ強度対実験測定値間の相関が、図７に例示される。
【０２１５】
ｐＮｉｖ−ＲＢＳ混合物調製：６種のｐＮｉｖ−ＲＢＳ−ＹＦＰプラスミドの各々を、ＮｓｉＩおよびＰｃｉＩを用いて別個に消化し、骨格ベクターからＹＦＰを除去した。消化生成物を仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理し、ゲル精製した。クローニング部位の上流のＲＢＳ配列においてのみ各々異なる、６種の得られた直線化されたベクターの等モル混合物を調製した。このベクター混合物（ｐＲＢＳミックス）を使用して、任意の標的を用いる１チューブコンビナトリアルアセンブリーを実施した（図８）。
【０２１６】
ＲＢＳ混合物のコンビナトリアルアセンブリー：対象の任意のコード配列について、上記のようにコード配列をクローニングした。コード配列を、ＲＢＳセットと組合せ的に対を形成させるために、コード配列を、直線化したｐＲＢＳベクター混合物中にサブクローニングした。この結果、すべて、同一コード配列を含有するが、上流に異なるＲＢＳ（ＲＢＳ−Ａ〜ＲＢＳ−Ｆ）配列を有するライゲーション生成物の混合物が得られた（図８）。
【０２１７】
ＲＢＳ調節される合成オペロンをアセンブルすること：すべて、同一のコード配列を有するが、上流に異なるＲＢＳ配列（ＲＢＳ−Ａ〜ＲＢＳ−Ｆ）を有する構築物の混合物を含有する得られたライブラリーが、ベクターとして、または挿入断片としてのいずれかで使用され得る。まず、ＮｈｅＩおよびＰｃｉＩを使用して混合物を制限することによって、耐性カセットが除去され、プラスミドライブラリーが、より多くのＲＢＳ調節されるコード配列がアセンブルされるベクターとして使用され得る。あるいは、ＳｐｅＩおよびＰｃｉＩを用いて混合物を消化することによって、コード配列（上流ＲＢＳとともに）を切り出し、それをさらなるアセンブリーラウンドのための挿入断片として使用することが可能である。
【０２１８】
各変異体が遺伝子の同一組合せを含有するが、ＲＢＳの異なる組合せを有するオペロンのライブラリーをアセンブルするために、所望の遺伝子の各々についてＲＢＳ調節される混合物を上記のように構築した。次いで、各ステップで、さらなるＲＢＳ調節されるコード配列がオペロンの前に加えられる反復性アセンブリーステップを実施した。図９に示されるように、ステップごとに、先のラウンドの生成物をＮｈｅＩおよびＰｃｉＩを用いて消化し、Ｃｍ耐性カセットを除去した。反応生成物をＣＩＰを用いて処理し、ゲル精製した。精製された生成物、Ｃｍ耐性を有さない直線化されたベクターは、次のアセンブリーステップにおいてベクターとして働く。
【０２１９】
さらなるＲＢＳ調節されるコード配列をオペロンにアセンブルするために、指定の挿入断片のＲＢＳ調節される混合物を、ＳｐｅＩおよびＰｃｉＩを使用して消化し、その結果、コード配列の上流にＲＢＳ配列の混合物および耐性カセットを含有するＤＮＡ断片を得た。この断片を、オペロンライブラリー（すでに第１のＲＢＳ調節されるコード配列を有する）中にライゲーションした。このアセンブリープロセスは、各変異体がコード配列の上流に別個のＲＢＳ組成を有する、コンビナトリアル混合物ＲＢＳ調節されるコード配列をもたらす。ライブラリーを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、Ｃｍを含むＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。最後に組み込まれた遺伝子と対を形成している耐性カセットが、新規に付加されたＲＢＳ調節される配列を含有する構築物のみが、さらなるアセンブリーラウンドのために継続することを保証した。
【０２２０】
新規に構築されたオペロンライブラリーに由来するプラスミドＤＮＡを、コロニーをプレートから直接掻きとることによってプレートから回収し、オペロンライブラリーをコードするプラスミドを抽出した。したがって、本発明者らは、各ラウンドにおいて、さらなるＲＢＳ調節されるコード配列がコンビナトリアルオペロンライブラリーに付加されたこのプロセスを、Ｎラウンド反復することによって、所定の順序で同一のＮ個のコード配列を含有し、６種のＲＢＳの変動する組合せによって駆動されるプラスミドのコンビナトリアル混合物を連続的にアセンブルした。
【０２２１】
バーコード付加されたＲＢＳ混合物−アプローチ：ＲＢＳ調節されるコード配列のオペロンライブラリーは、コンビナトリアル法で構築されるので、特定のクローンのＲＢＳ組成を決定する順に、全オペロンにわたってＲＢＳ配列のすべてを並べることが必要である。このプロセスを促進し、オペロン中に広がるＲＢＳのすべてを並べる必要性を排除するために、本発明者らは、各ＲＢＳに３塩基対バーコード配列を割り当てた。これらのバーコードによって、図１０に記載されるように積み重ねられたバーコードの３’末端で単一配列決定反応を使用して各クローンの完全なＲＢＳ組成を容易に決定することが可能となる。
【０２２２】
バーコードは以下の通りにコンピュータによって計算される：各ＲＢＳ（Ａ〜Ｆ）に数字（１〜６）が割り当てられ、次いで、これが、２文字ＤＮＡコードでコードされた。所与の２文字コードワード（ｂ１ｂ２＝ＡＴ、例えば）は、式ｂ１＋４＊ｂ２（式中、ｂ１およびｂ２は、コードワードの塩基に割り当てられた数値である（以下の表を参照のこと））によって特定の数字に割り出される。本例については、ＡＴは、０＋４＊２＝８となる。
【０２２３】
表４
【表４】
0006306583.tif 000008
【０２２４】
第３の塩基をチェック塩基として付加した。この塩基は、以下の通りに、先の２個の塩基からコンピュータによって計算された：ｂ３＝（ｂ１＋５＊ｂ２）％４（式中、「％」は、モジュロ演算子を表す）。このチェック塩基によって、任意の単一塩基突然変異または配列決定エラーの検出が可能となる。以下の表５は、各ＲＢＳのバーコード値を提供する。ここでは６種のＲＢＳのみが使用されるが、３ｂｐスキームを使用して合計最大１６種のＲＢＳを潜在的にコードできるということは留意されたい。アプローチはまた、コード長が対数的に拡張し増大したかなり大きなライブラリーサイズに拡張可能である。
【０２２５】
表５
【表５】
0006306583.tif 000009
【０２２６】
ｐＮｉｖ−ＲＢＳセットへのバーコードの付加：ＲＢＳ−ＹＦＰ挿入断片（ＲＢＳ−Ａ〜ＲＢＳ−Ｆ）を含有する６種のｐＮｉｖプラスミドの各々は、バーコード塩基および制限部位が指定のプライマー（表２）を使用して付加されるＰＣＲ反応の鋳型として働いた。ＸｈｏＩ制限部位は、バーコード領域の上流に付加され、一方で、ＳａｌＩおよびＰｓｔＩ部位は下流に付加された。６種のｐＮｉｖ−ＲＢＳ−ＹＦＰバーコード付加プラスミドの各々を、ＮｓｉＩおよびＸｈｏＩを用いて別個に消化し、ＹＦＰコード配列を除去した。６種の得られた直線化されたベクターの等モル混合物（すなわち、ｐＲＢＳバーコード混合物）を、本明細書において上記で記載されたように調製した。
【０２２７】
バーコード付加ＲＢＳ混合物を使用する単一チューブコンビナトリアルアセンブリー：バーコード付加ＲＢＳプラスミドセットの使用は、制限酵素の異なる使用に起因するいくつかの技術的変化を除いて上記に記載されたものと同一の論理に頼る。標的コード配列が、上記のようにまずクローニングされ、ＮｓｉＩおよびＸｈｏＩを使用して消化される。挿入断片はｐＲＢＳ−バーコード混合物とライゲーションされ、ＤＨ５α細胞に形質転換される。このプロセスの図式的説明が、図１１において以下に説明されている。
【０２２８】
単純性のために、図１１に示されるアセンブリープロセスは、各々、特異的ＲＢＳを有する、オペロン中にアセンブルされた２つのコード配列のみを含有する。プロセスは、さらなるアセンブリーサイクルによって反復して拡張され得る。さらに、特定の１種に代わりに、コンビナトリアルＲＢＳ混合物が使用されてもよい。
【０２２９】
発現プラスミドへのサブクローニング：アセンブリープロセスが完了した後、得られたオペロンを、指定されたプロモーターを含有する発現ベクターにサブクローニングした。これは、最終オペロンに隣接する指定された制限部位を使用することによって得られた。さらに、発現プラスミドが、オペロンと対を形成しているＣｍマーカーとは異なる耐性マーカーを有していたので、両抗生物質を用いて選択する間に、陽性コロニーのみが増殖でき、自己ライゲーションした発現プラスミドまたはライブラリードナープラスミドのいずれかで形質転換されたクローンは増殖できなかった。
【０２３０】
ＲＧＢ−３色リポーター系
細菌株および増殖条件：クローニングおよび構築物アセンブリープロセスに使用される細菌株は、大腸菌ＤＨ５αとした。蛍光測定のために、プラスミドを大腸菌Ｋ１２  ＭＧ１６５５に形質転換し、これを０．２％グルコースおよびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含む最小培地で３７℃で増殖させた。
【０２３１】
遺伝子：以下のプラスミドｐＲＳＥＴＢ−ＹＦＰ、ｐＲＳＥＴＢ−ＣＦＰおよびｐＲＳＥＴＢ−ｍｃｈｅｒｒｙからのＰＣＲによって、ｍＹＦＰ、ｍＣＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙを増幅させた。ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子上のＰｓｔＩ制限部位は、単一サイレント突然変異を導入することによって排除した（表１を参照のこと）。
【０２３２】
アセンブリープロセス：ｍＹＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＣＦＰを、まず、上記で説明される耐性カセットと対を形成させた。上記の節に記載されたようにバーコード付加ＲＢＳセットを使用してオペロンをアセンブルした。ｐＲＢＳ−ｍＹＦＰ−バーコード１を、ベクターとして使用するために、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を用いて消化し、一方で、ｐＲＢＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ−バーコード２は、挿入断片として使用するためにＳｐｅＩおよびＳａｌＩを用いて消化した。これら２種の制限生成物をライゲーションし、その結果、新規生成物ｐＲＢＳ−ｍＹＦＰ−ＲＢＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ−バーコード２−バーコード１を得た。この生成物をベクターとして、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩを用いて消化し、一方で、ｐＲＢＳ−ｍＣＦＰ−バーコード３は、挿入断片として、ＳｐｅＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、得られた生成物をライゲーションして、以下のオペロンを、ｐＮｉｖプラスミド：ｐＲＢＳ−ｍＹＦＰ−ｍｃｈｅｒｒｙ−ｍＣＦＰ−バーコード３−バーコード２−バーコード１にアセンブルした。次いで、オペロンを消化し、上記の発現プラスミド中にサブクローニングした。
【０２３３】
ＲＧＢ蛍光ライブラリーの測定
自動化蛍光測定：細胞を、自動化ロボットプラットフォーム（Ｅｖｏｗａｒｅ  ＩＩ、Ｔｅｃａｎ）において、Ｍ９＋０．２％グルコースを含有する９６ウェルプレート中で増殖させた。１５分毎に、プレートをロボットアームによってマルチウェル蛍光光度計（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００−ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ）に移した。各測定では、ＯＤを６００ｎｍでサンプリングし、ｍＣｈｅｒｒｙを５８７ｎｍでの励起および６２０ｎｍでの発光測定によってサンプリングし、ＹＦＰを、５２０ｎｍでの励起および５５５ｎｍでの発光測定によってサンプリングした。
【０２３４】
データ解析：ＯＤおよび蛍光の生データを、細胞を有さない培地を含有するウェルを差し引くことによってバックグラウンド補正した。
【０２３５】
大きく必要とされるダイナミックレンジのために、低い細菌濃度で弱いＲＢＳを有するウェルを分析することが可能ではなかった。したがって、本発明者らは、中期から後期対数増殖期で働くよう選択した。細胞を、標準の１ｃｍ経路長を用いて、約０．２のＯＤ６００に相当する培地差引後に、プレートリーダーによって測定されるような０．１のＯＤ６００値あたりで分析した。各測定点について、活性を、測定時間を中心に１時間の時間窓の間に測定された平均ＯＤによって除した、その間の蛍光の増大として定義した：
【０２３６】
【数１】
0006306583.tif 000010
［式中、Ａは、ＲＢＳ活性であり、Ｆは、蛍光測定値であり、τ＝３０分である］。結果は、細胞数によって除された１時間の間の蛍光の増大を反映する。平均活性は、各サンプルのＯＤ０．１あたりの５回の測定にわたる平均をとることによって算出した：
【０２３７】
【数２】
0006306583.tif 000011
すべての分析ステップは、特別注文のＨａｓｋｅｌｌソフトウェアを使用して実施した。
【０２３８】
細菌コロニーの蛍光顕微鏡観察：照明のためにＮｉｋｏｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｌｉｇｈｔ  （Ｃ−ＨＧＦＩＥ）を備えたＮｉｋｏｎ  ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｅ８００顕微鏡を使用して蛍光像をとった。彩度フィルターキューブセットを使用して、蛍光タンパク質を撮像した。ｍＣｈｅｒｒｙ（励起フィルター５３０〜５６０ｎｍ、発光フィルター５９０〜６５０、３０ｍｓ露出）、シアン蛍光タンパク質（ｍＣＦＰ）（励起フィルター４２６〜４４６ｎｍ、発光フィルター４６０〜５００ｎｍ、６０ｍｓ露出）および黄色蛍光タンパク質（ｍＹＦＰ）（励起フィルター４９０−５１０ｎｍ、発光フィルター５２０〜５５０ｎｍ、８００ｍｓ露出）。カメラおよびＮＩＳ−エレメントＢＲ３．２２ソフトウェアを用いて像を獲得した。種々のチャネルを重ねて、示される図を得た。
【０２３９】
翻訳共役：単一オペロン内の連続する遺伝子の翻訳が上流遺伝子に依存性であることが示された、翻訳共役と呼ばれる現象である。具体的には、遺伝子の発現レベルは、それに先行する遺伝子の発現レベルによって調節される。翻訳共役は、大腸菌ならびにその他の原核生物において種々のオペロンについて観察された。翻訳共役は、長年知られていたが、粗く定量されているだけで、その根底にある機序は、議論中である。
【０２４０】
図１６Ｄに示されるＲＧＢ格子は、翻訳共役を実証する。ＹＦＰの蛍光は、それを制御するＲＢＳの強度のみに応じて変わるが、一方、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光は、それを制御するＲＢＳおよびＹＦＰの蛍光の両方に応じて変わる。この効果をさらに分析するために、本発明者らは、ＹＦＰが、６種のＲＢＳ（Ａ〜Ｆ）のうち１種によって制御され、一方、ｍＣｈｅｒｒｙが、弱いＲＢＳ（Ｅ）、中程度の強度のＲＢＳ（Ｃ）または強力なＲＢＳ（Ａ）のいずれかによって制御されるクローンを利用した。次いで、各ライブラリー変異体のＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を測定し、互いに対してプロットした。
得られた格子（図１３）は、翻訳共役：第１の遺伝子（すなわち、ＹＦＰ）発現レベルが、それを制御するＲＢＳの強度に応じて変わり、使用されるＲＢＳが強力であるほど、測定されるＹＦＰ蛍光は大きいことを明確に実証する。対照的に、第２の遺伝子（ｍＣｈｅｒｒｙ）発現レベルは、それを制御するＲＢＳに、および第１の遺伝子を制御するＲＢＳの両方に応じて変わる。すわなち、ｍＣｈｅｒｒｙについて同一ＲＢＳを共有するクローンが、上流ＹＦＰ発現レベルに依存して異なるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光レベルを示す。交差蛍光は、このような効果の原因として除外された：単一蛍光タンパク質（ＹＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙのいずれか）を含有するクローンは、高レベルの発現についても相互蛍光チャネルでシグナルをもたらさない。本系におけるＹＦＰ発現レベルによるｍＣｈｅｒｒｙの最大翻訳増強は、約６倍であるとわかった。ＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙレベル間の依存性は、対数空間で線形依存を示す（図１３）。線形回帰は、約１／３の傾きをもたらす（９５％信頼区間０．２６〜０．３６）。
【０２４１】
カロテノイド生合成経路のＲＢＳ調節
細菌株および増殖条件：クローニングおよび構築物アセンブリープロセスに使用される細菌株は、大腸菌ＤＨ５αとした。カロテノイド発現のために、形質転換された細胞を、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で３７℃で増殖させた。
【０２４２】
アスタキサンチン生合成経路の遺伝子
アスタキサンチン合成のために、以下の遺伝子を使用した：
・パントエア・アグロメラン由来のゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＥ）−ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ２１２６０．１（配列番号６２）。
【０２４３】
・パントエア・アグロメラン由来のプレフィトエンピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＢ）−ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ２１２６４．１（配列番号６３）。
【０２４４】
・パントエア・アグロメラン由来のフィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）−ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ２１２６３．１（配列番号６４）。
【０２４５】
・ヘマトコッカス藻由来のイソペンテニルピロリン酸（ｉｄｉ）−ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＣ３２２０８．１（配列番号６５）。
【０２４６】
・トマト由来のβ−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ）−ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＲ５７２３２．１（配列番号６６）。
【０２４７】
・パントエア・アナナティス由来のβ−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ）−Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ２１６８８．１（配列番号６７）。
【０２４８】
・ノストック・スフェロイデス由来のβ−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＷ）−ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＢ７４８８８．１（配列番号６８）。
【０２４９】
・大腸菌由来の１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ（ｄｘｓ）−Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ａ７ＺＸ７２．１（配列番号６９）。
【０２５０】
ＣｔｒＺは、アセンブリーＰＣＲを使用して合成し、アセンブリーＰＣＲのためのプライマーは、Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｌａｂオリゴマーカー（３４）を使用して算出した。サイレント突然変異を導入することによって、列挙された遺伝子から制限部位ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＮｓｉＩ、ＮｈｅＩ、ＰｓｔＩおよびＰｃｉＩを排除した。
【０２５１】
アセンブリープロセス：ｉｄｉ、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｌｃｙ−Ｂ、ｃｒｔＷ、ｃｒｔＺおよびｄｘｓを、ＰＣＲによって増幅し、次いで、上記に説明されるように、耐性カセットと対を形成させた。上記で記載されるように各遺伝子にＲＢＳを付加した。生合成経路に沿った遺伝子の順序に従って、反復プロセスでライブラリーをアセンブルした。完全オペロンを、記載されるような発現プラスミド中にサブクローニングした。
【０２５２】
カロテノイド分析
カロテノイド抽出：カロテノイド経路の生合成遺伝子を有するプラスミドを保持する大腸菌細胞を、１００ｍｌのＬＢ培地を含有する振盪フラスコ中で懸濁培養で増殖させた。培養は、３７℃で実施した。４８時間後、２０ｍｌのサンプルを培養物から引き出し、遠心分離によって細胞を回収した。細胞ペレットを冷水で洗浄し、アセトン（２０ｍｌ）とともに激しく振盪することによってカロテノイドを抽出した。抽出物の不溶性成分を遠心分離（１５，０００ｇ）によって除去し、上清をガラス製丸底フラスコ中に移し、ロータリーエバポレーターを使用して蒸発させた。乾燥抽出物を１．５ｍｌのアセトンで再溶媒和させ、５０μｌのサンプルをＨＰＬＣ分析のために採取した。
【０２５３】
ＨＰＬＣによるカロテノイド分析：ＨＰＬＣ分析を、Ｂｏｒｗｉｎソフトウェアとともに取り付けられた高圧混合、Ｐ４９８７ポンプおよびＭＤ−９１５フォトダイオードアレイ検出器を備えたＪａｓｃｏプラットフォームで実施した。ＹＭＣパックＯＤＳ−Ａカラム（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ、１２ｎｍ）に５０μｌを注入することによってサンプルを分析した。溶媒Ａ：７５％メタノール水溶液、溶媒Ｂ：酢酸エチル。０．６ｍｌ／分の溶媒流速を使用し、以下の勾配を用いた：１５〜８５％のＢ（０〜２４分）、８５％（２４〜３０分）、８５〜１５％（３０〜３４分）、１５％（３４〜７４５  ４０分）。フォトダイオードアレイ検出機（３００〜９００ｎｍ）を用いて、溶出されたカロテノイドのスペクトルをオンラインで記録した。カロテノイド化合物を、認証標準化合物を用いるコクロマトグラフィーによって、およびそのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルの分析によって同定した。カロテノイド化合物の定量化のために、積分したピーク面積を、認証標準のものと比較した。標準溶液の濃度は、分光光度法で決定した（Ｊａｓｃｏ  Ｖ−５７０機器）（３５）。さらなる同定のために、ＨＰＬＣによって単離されたピークを収集し、質量分析計（Ｚ−スプレーＥＳＩインターフェースおよびＷａｔｅｒｓ  Ｍａｓｓｌｙｎｘ  ｖ４．１ソフトウェアを備えたＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｕｌｔｉｍａタンデム四重極機器）に直接注入した。得られたフルスキャン（ＥＳＩ（＋）、ｍ／ｚ  １００−１０００）質量スペクトル（３６）から、対応する質量を分析した。
【０２５４】
写真：可視光下で両眼顕微鏡（ＷＩＬＤ  Ｍ８；Ｈｅｅｒｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、図１６において現れるコロニーの写真をとった。
【０２５５】
結果
数桁規模のタンパク質発現に及ぶとこれまでに見出されている６種のＲＢＳ配列を選択した（９，１４）（図１５Ｂ）。まず、各配列をＹＦＰリポーターの上流に置くことおよびフローサイトメトリーを使用して蛍光シグナルを測定することによって、発現レベルに対する種々のＲＢＳ配列の効果を定量化した（１５）。６種のＲＢＳを、発現レベルによって降順に「Ａ」から「Ｆ」と示した。図１５Ｃに示されるように、ＲＢＳの小さいセットは、数桁規模のタンパク質発現レベルに及び得る。次いで、本発明者らは、いくつかの遺伝子の発現空間に及ぶライブラリーを同時にアセンブルするためにＲＢＳ配列のこの小さいセットを使用することが可能かどうかを問うた。各メンバーが同一遺伝子を含有するが、異なるＲＢＳ配列の翻訳調節下にあるオペロンのライブラリーを作製した。これを達成するために、本発明者らは、対象の遺伝子の各々を、ＲＢＳ配列のセットと組合せ的に対を形成させ、これらのＲＢＳ−遺伝子構築物をアセンブルして、合成オペロンのライブラリーを作製した（１５）。
【０２５６】
アセンブリープロセスを促進するために、増強されたＢｉｏＢｒｉｃｋ（１６）クローニング戦略を開発した。時間のかかるスクリーニングステップの必要性を回避する陽性選択手順を使用して、遺伝子部分を反復してアセンブルした（１５）。手短には、アセンブルされる予定のすべての遺伝子部分に、クロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性カセットを接続した。各ステップにおいて、さらなる遺伝子部分を構築物中に挿入し（図１５Ｄ）、一方で、耐性カセットが、適切にアセンブルされた構築物の直接選択を可能にした。次いで、ベクターを、耐性カセットを切り出すことによって次の反復のために「再生利用した」（図１５Ｄ）。この戦略によって、中間スクリーニングステップが回避され、迅速で効率的なオペロン構築が可能になる。次いで、得られたオペロンのライブラリーを、細胞中に形質転換し、所望の表現型についてスクリーニングした。特定のクローンのＲＢＳ組成の推測は、遺伝子の３’ＵＴＲに位置するバーコードを配列決定することによって実施した（材料および方法に記載される通り）。バーコードは、オペロンの３’ＵＴＲに短い同定配列を反復して連結することによって、アセンブリープロセスの間に作製された。ライブラリー中の各遺伝子変異体は、オペロン中のすべての遺伝子のＲＢＳ組成が、単一配列決定反応で推測され得るものとは異なるバーコード配列を含有する。
【０２５７】
ＲＢＳの組合せが、多次元発現空間に及び得るかどうかを調べるために、３色リポーター系を構築した。ＣＦＰ、ＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙを各々、本ＲＢＳセットの３種の代表（ＲＢＳ配列「Ａ」、「Ｃ」および「Ｅ」）と無作為に対を形成させ、オペロンに一緒にアセンブルした。したがって、得られたオペロンライブラリーは、３３＝２７種の遺伝子変異体を含有しており、各メンバーは、同一順序であるが、異なるＲＢＳ配列の調節下に３種の遺伝子を含有する（図１６Ａ）。形質転換すると、コロニーは、蛍光リポーターの差示的発現に起因して別個の色パターンを示す（図１６Ｂ）。観察される色空間は、ＲＢＳ配列のコンビナトリアルアセンブリーが、オペロン内の同義遺伝子の発現レベルを大幅に調節し得ることを示す（図１６Ｃ）。本発明者らは、サンプルクローンを配列決定し、その蛍光レベルを定量化することによって、観察される異なる色が、ＲＢＳ配列の異なる組合せに起因することを検証した（１５）。さらに、本発明者らは、ＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙからなるオペロンの蛍光レベルを測定し、図１６Ｄに示される９つのクラスターの格子を見出した。各クラスターは、同一のＲＢＳを有するクローンを含有する。さらに、クラスターの広がりは、ＲＢＳ調節が、発現空間の各次元において約１００倍に及ぶことを実証する。特に、ＹＦＰの発現レベルは、それを調節するＲＢＳ配列にのみ依存する。ＹＦＰ（このオペロン中の最初に位置する）の上流に同一ＲＢＳを有するすべてのコロニーが垂直に整列され、同様のレベルのタンパク質発現を示す。しかし、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光（ＹＦＰの下流に位置する）は、そのＲＢＳおよび上流遺伝子の発現レベルの両方に依存する（図１６Ｄ）。上流遺伝子の発現の１０倍の増大につき、約２倍の発現増大を示す、約１／３のべき乗指数を有する、２桁を超える規模にわたる共役が見出された（図１６Ｄ）。依存性は、交差蛍光によるものではなく（１５）、むしろ、オペロン中の隣接する遺伝子間の翻訳共役の現れである（１７）。
【０２５８】
本３色リポーター系は、ＲＢＳ配列のコンビナトリアルアセンブリーが、発現空間の大きな画分に広がり得ることを実証する。本発明者らは、代謝経路の作動に対してこのような発現調節の効果がどのように及ぶかを検討した。この問題に対処するために、カロテノイド生合成経路を構成する７種の遺伝子を、大腸菌にクローニングした。この外因性代謝経路の最終生成物は、アスタキサンチン、その強力な抗酸化特性のために公知である高価なキサントフィル（１９）である。大腸菌におけるアスタキサンチンの生合成に対するコンビナトリアルＲＢＳ調節の効果を調査するために、カロテノイド経路の遺伝子の各々を、ＲＢＳセットと無作為に対を形成させ、合成オペロンにアセンブルした（図１７Ａ）。得られたライブラリーは、単一試験管中に６７種の遺伝子変異体を含有する。図１７Ｂに示されるように、形質転換された大腸菌コロニーは、多種多様な色および強度を示す。各コロニーの色パターンは、各々独特の色を有する別個のカロテノイド中間体の差示的蓄積に起因する。
【０２５９】
配列決定することによって、サンプリングされたクローンのＲＢＳ組成を決定し、ＨＰＬＣを使用してカロテノイドプロフィールを分析した（１５）。図１７Ｃは、そのＲＢＳ組成が異なるクローンは、多様なカロテノイドプロフィールを示すことを示す。いくつかのクローンは、主に単一の生成物を蓄積するが、他のものは、相当なレベルの種々のカロテノイドを製造した。本コンビナトリアルＲＢＳアプローチを使用することで、アスタキサンチン生産性を２．６ｍｇ／細胞乾重１ｇ、大腸菌においてこれまでに製造されたものの約２倍ほどに高めることが可能となった。さらに、ｄｘｓ−カロテノイド経路に絡む遺伝子−をＲＢＳ調節下でオペロン中に組み込むことにより、アスタキサンチン生成が５．８ｍｇ／細胞乾重１ｇに増大した。これは、これまでに報告された最良の結果を上回るアスタキサンチン製造の４倍の増大に相当する。
【０２６０】
本発明は、その特定の実施形態とともに記載してきたが、多数の代替物、改変および変法が当業者に明らかとなることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲内に入る、このような代替物、改変および変法のすべてを包含するものとする。
【０２６１】
本明細書に記載されたすべての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許および特許出願が具体的に個別に参照により本明細書に組み込まれると示されるように同程度に、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。さらに、本出願における任意の参考文献の引例または同定は、このような参考文献が、本発明の先行技術として利用可能であるということの承認と解釈されてはならない。節の見出しが使用される限りにおいて、それらは必ずしも制限と解釈されてはならない。
【０２６２】
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【配列表フリーテキスト】
【０２６３】
配列番号１：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２：リボソーム結合部位Ａ（ＲＢＳ−Ａ）
配列番号３：リボソーム結合部位Ｂ（ＲＢＳ−Ｂ）
配列番号４：リボソーム結合部位Ｃ（ＲＢＳ−Ｃ）
配列番号５：リボソーム結合部位Ｄ（ＲＢＳ−Ｄ）
配列番号６：リボソーム結合部位Ｅ（ＲＢＳ−Ｅ）
配列番号７：デッド−ＲＢＳ（ＲＢＳ−Ｆ）
配列番号８：上流インスレーター配列
配列番号９：下流インスレーター配列
配列番号１０：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１１：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１２：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１３：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１４：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１５：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１６：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１７：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１８：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１９：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２０：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２１：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２２：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２３：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２４：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２５：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２６：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２７：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２８：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２９：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３０：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３１：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３２：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３３：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３４：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３５：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３６：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３７：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３８：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３９：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４０：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４１：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４２：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４３：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４４：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４５：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４６：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４７：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４８：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４９：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号５０：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号５１：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号５２：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号５３：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号５４：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号５５：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号５６：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号５７：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号５８：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号５９：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号６０：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号６１：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号７０：例示のＲＢＳ配列
配列番号７１：例示のＲＢＳ配列
配列番号７２：例示のＲＢＳ配列
配列番号７３：例示のＲＢＳ配列
配列番号７４：例示のＲＢＳ配列
配列番号７５：例示のＲＢＳ配列
配列番号７６：例示のＲＢＳ配列
配列番号７７：例示のＲＢＳ配列
配列番号７８：例示のＲＢＳ配列
配列番号７９：例示のＲＢＳ配列
配列番号８０：例示のＲＢＳ配列
配列番号８１：例示のＲＢＳ配列
配列番号８２：例示のＲＢＳ配列
配列番号８３：例示のＲＢＳ配列
配列番号８４：例示のＲＢＳ配列
配列番号８５：例示のＲＢＳ配列
配列番号８６：例示のＲＢＳ配列
配列番号８７：例示のＲＢＳ配列
配列番号８８：例示のＲＢＳ配列
配列番号８９：例示のＲＢＳ配列
配列番号９０：例示のＲＢＳ配列
配列番号９１：例示のＲＢＳ配列
配列番号９２：例示のＲＢＳ配列
配列番号９３：例示のＲＢＳ配列
配列番号９４：例示のＲＢＳ配列
配列番号９５：例示のＲＢＳ配列
配列番号９６：例示のＲＢＳ配列
配列番号９７：好適なｍＲＮＡ安定化配列
配列番号９８：好適なｍＲＮＡ安定化配列
配列番号９９：好適なｍＲＮＡ安定化配列
配列番号１００：好適なｍＲＮＡ安定化配列
配列番号１０１：好適なｍＲＮＡ安定化配列
配列番号１０２：好適なｍＲＮＡ安定化配列
配列番号１０３：好適なｍＲＮＡ安定化配列
【図１】
0006306583.tif 000012
【図２】
0006306583.tif 000013
【図３】
0006306583.tif 000014
【図４】
0006306583.tif 000015
【図５】
0006306583.tif 000016
【図６Ａ−Ｄ】
0006306583.tif 000017
【図７】
0006306583.tif 000018
【図８】
0006306583.tif 000019
【図９】
0006306583.tif 000020
【図１０】
0006306583.tif 000021
【図１１】
0006306583.tif 000022
【図１２】
0006306583.tif 000023
【図１３】
0006306583.tif 000024
【図１４】
0006306583.tif 000025
【図１５Ａ−Ｂ】
0006306583.tif 000026
【図１５Ｃ−Ｄ】
0006306583.tif 000027
【図１６Ａ−Ｃ】
0006306583.tif 000028
【図１６Ｄ】
0006306583.tif 000029
【図１７Ａ−Ｂ】
0006306583.tif 000030
【図１７Ｃ】
0006306583.tif 000031
【配列表】
0006306583000001.app