(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノバイオ触媒の製造方法であって、
ヒュームドシリカナノ粒子を含む担体材料を液状媒体に懸濁させる工程と、
前記懸濁された担体材料を、４℃〜１０５℃の生物学的に適合可能な範囲内の第１の所定温度で、１分〜２４時間の範囲の第１の所定時間にわたりアミノシランである官能化剤と混合することにより前記担体材料の表面を官能化する工程であって、第１のブロスが結果としてもたらされる工程と、
前記第１の所定時間後に前記第１のブロス中にラッカーゼであるタンパク質を直接適用する工程と、
前記タンパク質を前記第１のブロスと混合し、３℃〜７℃の生物学的に適合可能な範囲内の第２の所定温度で、１分〜２４時間の範囲の第２の所定時間にわたり前記タンパク質をインキュベートする工程であって、第２のブロスが結果としてもたらされる工程と、
グルタルアルデヒドである固定化剤を前記第２のブロスに適用し、前記固定化剤と前記第２のブロスとを、１８℃〜２５℃の生物学的に適合可能な範囲内の第３の所定温度で、２０時間〜３０時間の範囲の第３の所定時間にわたり混合することにより、前記担体材料の前記官能化された表面上に、前記インキュベートされたタンパク質を固定化する工程であって、第３のブロスが結果としてもたらされる工程と、
前記第３のブロスを濾過する工程と、
前記濾過の保持物を収集する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記担体材料が、水に懸濁される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の所定時間が１０時間〜１５時間の範囲にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の所定時間が１２時間である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記懸濁された担体材料と前記官能化剤との混合物が、
【数１】
0006412508.tif 000015
〜
【数２】
0006412508.tif 000016
のヒュームドシリカナノ粒子を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記懸濁された担体材料と前記官能化剤との前記混合物が、
【数３】
0006412508.tif 000017
〜
【数４】
0006412508.tif 000018
のヒュームドシリカナノ粒子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記懸濁された担体材料と前記官能化剤との前記混合物が、
【数５】
0006412508.tif 000019
のヒュームドシリカナノ粒子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記官能化剤が、３−アミノプロピルトリエトキシシランである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ｐＨが、前記懸濁された担体材料が前記第１の所定温度で前記第１の所定時間にわたり前記官能化剤と混合される場合に所定のｐＨ値に調整され、任意選択で、前記所定のｐＨ値は、生物学的に適合可能な範囲内にある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記所定のｐＨ値が３〜９の範囲にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記所定のｐＨ値が７〜８の範囲にある、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記所定のｐＨ値が７．５である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の所定温度が１８℃〜２５℃の範囲にある、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の所定温度が２０℃〜２１℃の範囲にある、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のブロスと前記タンパク質との前記混合物が、官能化されたヒュームドシリカナノ粒子１個当たり０．０１ｍｇ〜１ｍｇの総タンパク質を含む、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のブロスと前記タンパク質との前記混合物が、官能化されたヒュームドシリカナノ粒子１個当たり０．１５ｍｇの総タンパク質を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２の所定温度が５℃である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記インキュベートされたタンパク質が前記担体材料の前記官能化された表面上に固定化される際に、０．００１ｍｏｌ〜１ｍｏｌの架橋剤が、前記第２のブロス１リットル当たり適用される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記インキュベートされたタンパク質が前記担体材料の前記官能化された表面上に固定化される際に、０．０５３ｍｏｌの架橋剤が、前記第２のブロス１リットル当たりに適用される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第３の所定時間が２４時間であり、かつ／または、前記第３の所定温度が２０℃〜２１℃の範囲にある、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第３のブロスが、連続的に濾過され、任意選択で、前記第３のブロスの濾過は、一軸ディスク濾過ユニットを用いることにより実施され、任意選択で、前記一軸ディスク濾過ユニットは、複数の回転可能なセラミックフィルターディスクを含み、任意選択で、前記一軸ディスク濾過ユニットは、前記フィルターディスクから保持物を除去するように配置された圧力空気系を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記一軸ディスク濾過ユニットが、ブロス管および保持物管により前記合成容器に連結されており、前記第３のブロスの濾過の間、前記保持物は前記保持物管を介して前記一軸ディスク濾過ユニットから前記合成容器に送達され、前記第３のブロスは前記ブロス管を介して前記合成管から前記一軸ディスク濾過ユニットに送達される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記担体材料の前記表面の官能化、前記タンパク質と前記第１のブロスとの混合、前記タンパク質のインキュベーションおよび前記担体材料の前記官能化された表面上へのインキュベートされたタンパク質の固定化が、攪拌器を備えた合成容器中で実施される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノメートル規模のバイオ触媒の製造に関する。そのようなナノバイオ触媒は、様々な技術分野において広く様々な用途に使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
近年、ナノメートル規模のバイオ触媒、所謂ナノバイオ触媒の使用には、種々の適用分野における種々の目的のために、ますます高い関心が寄せられている。
【０００３】
例えば、地方自治体その他の廃水の処理のために、総称して新興有機汚染物質（ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ：ＥＯＣ）と呼ばれる農薬、工業用界面活性剤、医薬品およびホルモン活性化合物などの汚染物を、ナノバイオ触媒を用いることにより水から除去することは、特に効率的であり得ることが示されている（例えば、［１］参照）。特に、好適なナノバイオ触媒は、酵素を上に結合させた担体材料であって、酵素が、ＥＯＣを除去するか、減少させるか、または無効にする変換プロセスを触媒するものである、担体材料を含み得る。
【０００４】
種々の目的のためのナノバイオ触媒の工業的使用のためには、同等に多くの量の好適なナノバイオ触媒が利用可能でなければならない。これに関して、ナノバイオ触媒を製造するために必要とされる費用は、それらがそれぞれの工業プロセスにおいて適用されるためには重要な問題である。例えば、［１］は、比較的少ない酵素および化学物質の消費量（これらの消費量が１つの主要な費用推進要因であり得る）にてナノバイオ触媒を製造する方法について記載している。特に、記載された方法は、担体材料上に酵素を効率的に固定化することに焦点を当てている。しかしながら、ナノバイオ触媒の大規模または複数キロ規模の製造のためには、これらの方法は、特にそれらの効率に関して、経済的にも環境保護的にも依然として満足のいくものではない。また、これらの方法においては、多くの場合、特に規模を大きくした場合には、製品の性質によって引き起こされるチキソトロピー（ｔｈｉｘｏｔｒｏｐｈｙ）に関する問題が生じ得、その結果、可能であれば、比較的複雑な回避法が実施されなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、比較的大きな規模での、特に複数キロ規模での、ナノバイオ触媒の製造を可能にする方法に対する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、この必要性は、独立請求項１の特徴によって定義される方法によって解決される。好ましい実施形態は、従属請求項の主題である。
【０００７】
本発明に従う方法を、以下に記載される実施例によって、ならびに、添付の図面を参照することによって、より詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、本発明に従う方法の一実施形態を用いてナノバイオ触媒を製造するための装置の概略図を示している。
【図２】図２は、酵素カップリングの間に緩衝剤で処理された実施例１のアミノプロピル化された（ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｉｚｅｄ）ｆｓＮＰのカップリング試験のグラフを示している（洗浄されたアミノ−ｆｓＮＰと洗浄されていないアミノ−ｆｓＮＰとの比較）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
特に、本発明の要旨は次に述べるものである。すなわち、ナノバイオ触媒の製造方法は、以下の工程、すなわち、担体材料を液状媒体に懸濁させる工程と；懸濁された担体材料を第１の所定温度で第１の所定時間にわたり官能化剤と混合することにより担体材料の表面を官能化する工程であって、第１のブロスが結果としてもたらされる工程と；第１の所定時間後に第１のブロス中にタンパク質を直接適用する工程と；タンパク質を第１のブロスと混合し、第２の所定温度で第２の所定時間にわたりタンパク質をインキュベートする工程であって、第２のブロスが結果としてもたらされる工程と；担体材料の官能化された表面上に、インキュベートされたタンパク質を固定化する工程であって、第３のブロスが結果としてもたらされる工程と；第３のブロスを濾過する工程と；濾過の保持物を収集する工程と、を含む。
【００１０】
第１のブロスおよび第２のブロスを直接加工することにより、本発明に従う方法は、ナノバイオ触媒の連続的なプロセスおよび製造を提供することを可能にする。これにより、時間、水、化学物質およびエネルギーの消費に関して製造が最適化され得る。また、本発明に従う方法は、チキソトロピー（ｔｈｉｘｏｔｒｏｐｈｙ）に関する問題が最小限に抑えられ得るナノバイオ触媒製造を可能にする。これらの効果は、プロセスの効率を劇的に高め得、それにより、比較的速い速度でのナノバイオ触媒の製造を可能にし得る。さらに、本発明に従う方法は、資源を節約することも可能にし、その結果、この点でも効率が高められ得る。
【００１１】
本発明に従う方法において、担体材料は、好ましくは、液状媒体としての水に懸濁される。この文脈における用語「水」は、任意の種類の水（例えば、蒸留水、純水、脱イオン水、塩水など）に関し得る。特に、水は、普通の水道水（ｔａｂ  ｗａｔｅｒ）であり得る。本発明に従う方法において可能である液状媒体として水を使用することにより、当該プロセスは、費用効果的で、環境に優しくかつ効率的な様式で実施され得る。
【００１２】
好ましくは、担体材料は、ヒュームドシリカナノ粒子を含む。ヒュームドシリカナノ粒子は、ばら材料として入手可能であり得、固定化担体材料の有利な特徴、すなわち、高表面積、多孔性、耐薬品性、純度、非有害性（ｎｏｎ−ｈａｚａｒｄｏｕｓ）を提供し得る。特に、生体適合性の多孔性の無機材料から作られたそのようなナノ粒子は、タンパク質を効率的に利用可能な状態にしておくことを可能にする。ヒュームドシリカナノ粒子は、それらの比較的大きな比表面積、取るに足らないほどの膨潤、比較的高い安定性、比較的低い毒性および比較的低い価格のため、特に有利であり得る。
【００１３】
好ましくは、懸濁された担体材料と官能化剤との混合物は、約
【００１４】
【数１】
0006412508.tif 000002
〜約
【００１５】
【数２】
0006412508.tif 000003
のヒュームドシリカナノ粒子、好ましくは約
【００１６】
【数３】
0006412508.tif 000004
〜約
【００１７】
【数４】
0006412508.tif 000005
のヒュームドシリカナノ粒子、特に約
【００１８】
【数５】
0006412508.tif 000006
のヒュームドシリカナノ粒子を含む。ある属性またはある値を伴って本明細書で使用される用語「約」は、特に、それぞれその属性を正確に、またはその値を正確に規定しもする。さらに、ある所与の数値（ｎｕｍｅｒａｔｅ  ｖａｌｕｅ）または範囲との関連において、この用語は、例えば、その所与の値または範囲の２０％以内、１０％以内、５％以内、または２％以内である値または範囲をいう。懸濁された担体材料のそのような濃度は、本発明に従う方法を効率的に実施することを可能にし、ヒュームドシリカナノ粒子を担体材料として用いた場合であってもチキソトロピー（ｔｈｉｘｏｔｒｏｐｈｙ）効果による深刻な問題を防ぐことを可能にする。
【００１９】
好ましくは、官能化剤は、オルガノシランまたはアミノシランまたは特に３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）である。さらに、懸濁された担体材料と官能化剤との混合物は、好ましくは約０．００１ｍＭ〜約１ｍＭの官能化剤、特に約０．１８ｍＭ〜約０．２７ｍＭの官能化剤を含む。また、第１の所定時間は、好ましくは約１分〜約２４時間の範囲、好ましくは約１０時間〜約１５時間の範囲にあり、特に約１２時間であり、ここで、第１の所定温度は、好ましくは生物学的に適合可能な範囲内、好ましくは約４℃〜約１０５℃の範囲、より好ましくは約１８℃〜約２５℃の範囲、特に約２０℃〜約２１℃の範囲にある。なおさらに、ｐＨは、好ましくは、懸濁された担体材料が第１の所定温度で第１の所定時間にわたり官能化剤と混合される場合に所定のｐＨ値に調整され、所定のｐＨ値は、好ましくは生物学的に適合可能な範囲内、好ましくは約３〜約９の範囲、より好ましくは約７〜約８の範囲にあり、特に約７．５である。これに関して、ｐＨは、好ましくは、ｐＨ活性化合物、特に、容易で環境に優しいｐＨの調整を可能にする飽和クエン酸溶液を適用することにより調整される。
【００２０】
官能化剤、好ましくはそのような官能化剤を、好ましくはそのような濃度で、好ましくはそのような時間範囲の間、好ましくはそのような温度にて、好ましくはそのようなｐＨにおいて使用することは、担体材料の表面を効率的に官能化し、それにより次に続く工程における担体材料の表面上のタンパク質のインキュベーションおよび固定化を増加させることを可能にする。これに関して、官能化のこれらの好ましい態様の各１つ１つが官能化の比較的少ない資源消費量で全体的な効率を高めることができ、これらの組み合わせ、特に全てのこれらの好ましい態様の組み合わせは、特に有利であり得る。
【００２１】
例えば、酵素および担体材料の後の架橋のためのアンカーポイント（ａｎｃｈｏｒ  ｐｏｉｎｔ）を生成するために、シラン化が、自己組織化（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）によってヒュームドシリカの表面を覆うように適用され得る。ヒュームドシリカの表面は、シラン上のアルコキシ基を攻撃して置き換えるためのヒドロキシル基を含有しているため、シラン化され得る。それに伴い共有−Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ−結合を形成する。ＡＰＴＥＳを用いることにより、ヒュームドシリカを効率的に被覆することが可能であり得る。
【００２２】
好ましくは、タンパク質は酵素であり、より好ましくはラッカーゼである。本発明に従う方法における酵素の使用は、種々の用途に使用され得るナノバイオ粒子、特にナノバイオ触媒を製造することを可能にする。特に、ラッカーゼの使用は、廃水を例えばその新興有機汚染物質（ＥＯＣ）を減少させることにより処理するのに好適なナノバイオ触媒を効率的に製造することを可能にする。
【００２３】
第１のブロスとタンパク質との混合物は、好ましくは、官能化されたヒュームドシリカナノ粒子１個当たり約０．０１ｍｇ〜約１ｍｇの総タンパク質、特に官能化されたヒュームドシリカナノ粒子１個当たり約０．１５ｍｇの総タンパク質を含む。さらに、第２の所定時間は、約１分〜約２４時間の範囲、好ましくは約１時間〜約３時間の範囲であり、特に約２時間である。なおさらに、第２の所定温度は、生物学的に適合可能な範囲内、好ましくは約３℃〜約７℃の範囲であり、特に約５℃である。
【００２４】
好ましくは、そのような濃度を、好ましくはそのような時間範囲の間、好ましくはそのような温度範囲において適用することは、担体材料の表面上のタンパク質を効率的にインキュベートし、それにより次に続く工程における担体材料の表面上へのタンパク質の固定化を増加させることを可能にする。これにより、インキュベーションのこれらの好ましい態様の各１つ１つがインキュベーションの全体的な効率を高め得、これらの組み合わせ、特に全てのこれらの好ましい態様の組み合わせは、特に有利であり得る。このように、各ナノバイオ触媒の効率的で資源節約的な製造が可能である。
【００２５】
好ましくは、第２のブロスに固定化剤を適用し、この固定化剤と第２のブロスとを第３の所定温度で第３の所定時間にわたり混合することにより、インキュベートされた酵素が担体材料の官能化された表面上に固定化されて、第３のブロスを結果としてもたらす。固定化剤は、好ましくは二官能性架橋剤、特にグルタルアルデヒドである。これに関して、約０．００１ｍｏｌ〜約１ｍｏｌ、特に約０．０５３ｍｏｌの架橋剤が、第２のブロス１リットル当たりに好ましくは適用される。さらに、第３の所定時間は、好ましくは、約２０時間〜約３０時間の範囲であり、特に約２４時間である。なおさらに、第３の所定温度は、生物学的に適合可能な範囲内、好ましくは約１８℃〜約２５℃の範囲、特に約２０℃〜約２１℃の範囲にある。
【００２６】
好ましくは、そのような固定化剤を、好ましくはそのような濃度で、好ましくはそのような時間範囲の間、好ましくはそのような温度範囲において適用することは、担体材料の表面上にタンパク質を効率的に固定化し、それにより担体材料の表面上へのタンパク質の固定化を増加させることを可能にする。これに関して、固定化のこれらの好ましい態様の各１つ１つがインキュベーションの全体的な効率を高め得、これらの組み合わせ、特に全てのこれらの好ましい態様の組み合わせは、特に有利であり得る。このように、各ナノバイオ触媒の効率的で資源節約的な製造が可能である。
【００２７】
本発明に従う方法の好ましい実施形態において、第３のブロスは連続的に濾過される。連続的に第３のブロスを濾過することは、連続的に全プロセスを提供することを可能にし、その結果、バイオ触媒の効率的な製造が可能となる。これに関して、第３のブロスの濾過は、好ましくは、一軸ディスク濾過ユニットを用いることにより実施され、一軸ディスク濾過ユニットは、好ましくは複数の回転可能なセラミックフィルターディスクを含む。そのような一軸ディスク濾過ユニットは、連続プロセスにおける第３のブロスの効率的な濾過を可能にする。これに関して、一軸ディスク濾過ユニットは、好ましくは、フィルターディスクから保持物を除去するように配置された圧力空気系を含む。そのような圧力空気系は、製造されたナノバイオ触媒が効率的に収集され得るように保持物を好都合にかつ完全に除去するための好適な手段であり得る。
【００２８】
第３のブロスの濾過の濾液または透過液は、好ましくは処分される。プロセスの生成物、すなわちナノバイオ触媒は、保持物中に含まれているので、濾液または透過液は処分され得、これにより、プロセスデバイスをさらなる加工のために再び用いることが可能になる。
【００２９】
好ましい実施形態において、担体材料の表面の官能化、酵素と第１のブロスとの混合、酵素のインキュベーションおよび担体材料の官能化された表面上へのインキュベートされた酵素の固定化は、撹拌器を備えた合成容器中で実施される。このようなプロセス実施は、本発明に従う方法の特定の費用効果的な効率的な適用を可能にする。これに関して、一軸ディスク濾過ユニットは、好ましくは、ブロス管および保持物管により合成容器に連結されており、第３のブロスの濾過の間、保持物は保持物管を介して一軸ディスク濾過ユニットから合成容器に送達され、第３のブロスはブロス管を介して合成管から一軸ディスク濾過ユニットに送達される。
【００３０】
特定の実施形態において、上記の方法およびこの文脈において記載される全ての態様は、バイオ触媒以外のバイオ分子を製造するためにも使用され得る。
【００３１】
本発明のこれらの態様および他の態様は、以下に記載される実施形態から明らかになり、それらの実施形態を参照して解明されよう。
【００３２】
実施形態／実施例の説明
図１は、ナノバイオ触媒を製造するために本発明に従う方法の一実施形態を実施するための装置１の一実施形態を示している。装置１は、２つの運搬導管を介して濾過ユニット３に連結されている合成ユニット２を含み、運搬導管の一方のものは媒体を合成ユニット２から濾過ユニット３に供給するように配置され、運搬導管の他方のものは、媒体を反対方向に供給するように配置されている。合成ユニット２は、撹拌器２２を備えた合成容器２１を有している。濾過ユニット３は、長手方向軸に沿って配置された複数の回転可能な濾過ディスク３１を備えた濾過容器３２を有している。濾過ディスク３１は、モーター６を介して空気室７と連結されている。
【００３３】
装置１は、複数のポンプ５を備えており、第１のポンプ５１および第２のポンプ５２は、運搬導管を介して合成ユニット２と濾過ユニット３との間において媒体を供給し、保持物または廃水をそれぞれ装置１から外に供給するように配置されている。第３のポンプ５３は、水導管を介して合成容器２１内に水道水（ｔａｂ  ｗａｔｅｒ）を供給するように配置されており、第４のポンプ５４は、循環導管を介しての合成容器２１内の循環媒体のために配置されている。第５のポンプ５５は、合成容器２１内にクエン酸溶液を供給するように配置されており、第６のポンプ５６は、生成物を濾過容器３２から外に供給するように配置されている。
【００３４】
第１のポンプ５１、第２のポンプ５２および第６のポンプ５６は、一緒になって、濾過ユニット３内の圧力条件を調整するための第１の圧力系を構成する。同様に、第１のポンプ５１、第２のポンプ５２、第３のポンプ５３、第４のポンプ５４および第５のポンプ５５は、一緒になって、合成ユニット３内の圧力条件を調整するための第２の圧力系を構成する。
【００３５】
当該装置は、装置１によって実施されるプロセスを制御するためのインターフェース４をさらに含む。
【実施例】
【００３６】
［実施例１］
実施例１において、本発明に従う方法を、装置１を用いて実施する。アミノプロピル化に関しては、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を用いての担体材料としてのヒュームドシリカナノ粒子（ｆｓＮＰ）の初期表面官能化を、［１］に基づいて行う（適用される技術および配合に関する劇的な改変が実施される）。ＡＰＴＥＳで官能化されたｆｓＮＰの特性決定を、ニンヒドリンアッセイおよびゼータ電位測定によって調査する。
【００３７】
例えば［２］に記載されるニンヒドリン試薬による第１級アミンの定量測定のための方法が、僅かに改変される。ＭＰＣ緩衝剤の代わりに通常の水道水を使用する。適用されたＡＰＴＥＳによるｐＨ上昇を、飽和クエン酸溶液でｐＨ７．５に調整する。３００Ｌ混合タンク（「ＳｐｌｉｔＯｍａｔ」）である合成容器２１をｆｓＮＰのアミノプロピル化のために使用する。ここで適用される条件は、反応ブロス１Ｌ当たり８．３ｍＬのＡＰＴＥＳ、反応ブロス１Ｌ当たり約５０ｇのｆｓＮＰ、２０．４℃の室温、および撹拌器２２の最大撹拌速度における１２時間のインキュベーションである。
【００３８】
アミノ−ｆｓＮＰ上へのラッカーゼの収着に関しては、生成されたアミノ−ｆｓＮＰを徹底的な洗浄後に用いる代わりに、生成物を何らの洗浄手順もなしに適用する。ラッカーゼ（アミノ−ｆｓＮＰ１個当たり１Ｕｍｇ）を反応ブロスと混合し、５℃で２時間にわたりインキュベートする。
【００３９】
ラッカーゼとアミノ−ｆｓＮＰとのカップリングに関しては、２０Ｌバッチ中で、収着されたラッカーゼを、反応ブロス１Ｌ当たり１０ｍＬのグルタルアルデヒドを用いてアミノ−ｆｓＮＰ上に固定化する。この反応を、２４時間にわたり連続混合下において室温（２０．４℃）で実施する。
【００４０】
ナノバイオ触媒の生成物の清浄化または洗浄に関しては、複数のセラミックフィルターディスク（６０ｎｍのカットオフ；０．１ｍ２の濾過面積）（例えば、３〜７個のフィルターディスクなど）と、１個の蠕動ポンプ（供給）と、回転（３０Ｈｚ）用の電気エンジンと、フィルターディスク３１をバックフラッシュするための加圧空気系とを備えた一軸ディスク濾過ユニット（ＳＳＤＦ、Ｎｏｖｏｆｌｏｗ）として濾過ユニット３を用いて、生成物洗浄を実施する。
【００４１】
濾過チャンバーの圧力を、０．５バールに設定し、第２の蠕動ポンプまたは第１の圧力系によって調整する。濾液は廃物になる。洗浄の間、保持物は、インキュベーションタンクを含む閉ループ内にある。ビン詰めについては、第２のポンプ５２によって保持物を容器に小分けする。
【００４２】
アミノプロピル化に関しては、実施例１では、ＡＰＴＥＳを用いたｆｓＮＰの初期表面官能化が、［１］に従って行われることとなる。そこにおいて、著者らは、ｆｓＮＰ１ｍｇ当たり０．８μｍｏｌのＡＰＴＥＳが、収着および酵素固定化を向上させる程度までｆｓＮＰの表面電荷を変化させるのに十分な改質剤であることを明らかにした。ＡＰＴＥＳを用いたｆｓＮＰのアミノプロピル化は、室温での１２時間の官能化後に、６．３１±０．１０ｍＶというｐＨ７での正のゼータ電位およびｆｓＮＰ１ｇ当たり８．３５±０．２９ｍｇのＮＨ２という第１級アミンの適用範囲を結果としてもたらす。
【００４３】
負のゼータ電位（−２５．１±０．４ｍＶ）を示す官能化されていないｆｓＮＰと比べると、ｆｓＮＰの成功裏のアミノプロピル化を示す、正電荷に向かう３１．４ｍＶのシフトが検出される。比較すると、［１］によって実施されたシラン化は、３．５±０．４ｍＶという僅かにより低いゼータ電位および等量のアミン部分（ｆｓＮＰ１ｇ当たり８．０３±０．４１ｍｇのＮＨ２）を結果としてもたらした。
【００４４】
【表１】
0006412508.tif 000007
【００４５】
実施例１は、化学物質消費量の改善を示す。ＡＰＴＥＳ改質の間、緩衝剤で処理された水性系を全く使用しない。したがって、リン酸塩（粒子１ｋｇ当たり５２３ｇのリン酸水素二ナトリウム）および５０％のクエン酸塩（粒子１ｋｇ当たり約１５．１ｇ）が節約され得るであろう。
【００４６】
図２は、生成物の最終活性が、アミノプロピル化された粒子が洗浄されようとされまいとほぼ同じであることを示す、洗浄されたアミノ−ｆｓＮＰおよび洗浄されていないアミノ−ｆｓＮＰの試験を示している。
【００４７】
洗浄工程が全く必要ではないという事実は、節約量を劇的に増加させる。合計で、３１．７８ｋｇのリン酸水素二ナトリウムおよび１．６ｋｇのクエン酸が節約され得る。さらに、水消費量は、３分の１（ｆｓＮＰ１ｋｇ当たり−４５Ｌ）に低減される。
【００４８】
アミノ−ｆｓＮＰ上へのラッカーゼの収着に関しては、実施例１では、インキュベーション（２時間；２回、室温および５℃の２０Ｌバッチ）後に、ＡＢＴＳアッセイ（ＭＰＣ緩衝剤；ｐＨ３）により活性損失が全く検出され得ないこととなる。酵素は、ｐＨ７．５において懸濁液（）中で安定である。
【００４９】
ラッカーゼとアミノ−ｆｓＮＰとのカップリングに関しては、実施例１では、酵素がアミノ−ｆｓＮＰ上に収着された後に、グルタルアルデヒド（２００ｍＬ）がバッチと混合され、インキュベーション（最低１２時間、５℃または室温）の間、連続的に撹拌されることとなる。表２に示されるように、酵素の固定化には、１２時間のインキュベーションが十分である。
【００５０】
【表２】
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【００５１】
カップリング効率を定量するために、最終生成物の活性を、２つの異なる試料画分、すなわち、２１，０００×ｇ（２分）での遠心分離後に得られる１．懸濁液および２．上清について測定する。
【００５２】
表３に示される試験結果は、懸濁液と上清との間においてさらに一層良好な活性の分布を示す。したがって、ラッカーゼ（チエラビア属）のカップリングは、２０℃で実施され得る。
【００５３】
【表３】
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【００５４】
ナノバイオ触媒の生成物の清浄化および洗浄に関しては、実施例１では、最終生成物（２０Ｌ）の洗浄が、上記の濾過ユニット３（ＳＳＤＦ）を用いて連続的に行われることとなる。ＭＰＣ緩衝剤を用いる代わりに４０Ｌの水道水で生成物を洗浄した後に、これを試験する。したがって、リン酸塩（粒子１ｋｇ当たり５２３ｇのリン酸水素二ナトリウム）およびクエン酸塩（粒子１ｋｇ当たり３０．３５ｇ）が、この場合もまた節約され得る。連続的洗浄のためにＭＰＣ緩衝剤が全く使用されないということ、これらの節約量は３倍またはさらにはそれを超えて増大し得る。さらに、水消費量は１．５分の１減少し、ｆｓＮＰ１ｋｇ当たり２２．５Ｌの水が節約され得る。
【００５５】
廃液（濾液）の色［ＯＤ（５２０ｎｍ）］を、十分な洗浄プロセスの指標として使用する。ＯＤ（５２０ｎｍ）が０．１未満になったら当該プロセスは止められる。
【００５６】
最終生成物の活性を測定する。全プロセス後の活性の全回収率を計算すると、最初に適用された活性のほぼ９８％が回収される。ほんの２％が液体操作により失われるにすぎない。
【００５７】
上記のことをまとめると、実施例１におけるように改善されたプロトコルを用いる本発明に従う方法を用いることにより、１日およそ５ｋｇのナノバイオ触媒を製造することが可能である。さらに、資源節約量に関する劇的な改善が、酵素カップリングプロセスの間に活性を失うことなしに達成され得るであろう。さらに、全プロセスが室温で実施され得るという事実は、多くのエネルギーを節約する。
【００５８】
本発明を図面および上述の明細書において詳細に例示し説明してきたが、そのような例示および説明は、説明または例示するものと見なされるべきであり、限定するものと見なされるべきではない。変更形態および改変形態が、以下の特許請求の範囲の範囲および趣旨の範囲内で当業者によりなされ得ることが理解されよう。特に、本発明は、以上および以下に記載される様々な実施形態からの特徴の任意の組み合わせを有するさらなる実施形態を対象として含む。例えば、合成ユニットおよび濾過ユニットが１つの単一のユニットにおいて提供される実施形態において本発明を実施することが可能である。
【００５９】
本発明はまた、図に個々に示されている全てのさらなる特徴も対象として含むが、それらは、上記または下記の説明において記載されていないものであり得る。また、図および明細書に記載された実施形態の個々の代替物およびそれらの特徴の個々の代替物は、本発明の主題または開示された主題によって免責され得る。本開示は、特許請求の範囲または例示的な実施形態において定義された特徴からなる主題および前記特徴を含む主題を含む。
【００６０】
さらに、特許請求の範囲において、用語「含む」は、他の構成要素または工程を排除せず、また、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、複数であることを排除しない。単一のユニットまたは工程は、特許請求の範囲に記載されるいくつかの特徴の機能を果たし得る。特定の措置が互いに異なる従属請求項に記載されているということだけでは、これらの措置の組み合わせが有利に使用され得ないということを示すことにならない。ある属性またはある値を伴う用語「実質的に」、「約」、「およそ」などは、特に、それぞれその属性を正確に、またはその値を正確に規定しもする。ある所与の数値（ｎｕｍｅｒａｔｅ  ｖａｌｕｅ）または範囲との関連における用語「約」は、例えば、その所与の値または範囲の２０％以内、１０％以内、５％以内、または２％以内である値または範囲をいう。
【００６１】
本開示は、以下の実施形態をさらに含む。実施形態１は、ナノバイオ触媒の製造方法であって、担体材料を液状媒体に懸濁させる工程と；懸濁された担体材料を第１の所定温度で第１の所定時間にわたり官能化剤と混合することにより担体材料の表面を官能化する工程であって、第１のブロスが結果としてもたらされる工程と；第１の所定時間後に第１のブロス中にタンパク質を直接適用する工程と；タンパク質を第１のブロスと混合し、第２の所定温度で第２の所定時間にわたりタンパク質をインキュベートする工程であって、第２のブロスが結果としてもたらされる工程と；担体材料の官能化された表面上に、インキュベートされたタンパク質を固定化する工程であって、第３のブロスが結果としてもたらされる工程と；第３のブロスを濾過する工程と；濾過の保持物を収集する工程とを含む方法である。
【００６２】
実施形態２は、担体材料が、水に懸濁される、実施形態１の方法である。
【００６３】
実施形態３は、担体材料が、ヒュームドシリカナノ粒子を含む、実施形態１または２の方法である。
【００６４】
実施形態４は、懸濁された担体材料と官能化剤との混合物が、約
【００６５】
【数６】
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〜約
【００６６】
【数７】
0006412508.tif 000011
のヒュームドシリカナノ粒子、好ましくは約
【００６７】
【数８】
0006412508.tif 000012
〜約
【００６８】
【数９】
0006412508.tif 000013
のヒュームドシリカナノ粒子、特に約
【００６９】
【数１０】
0006412508.tif 000014
のヒュームドシリカナノ粒子を含む、実施形態１〜３のいずれか１つの方法である。
【００７０】
実施形態５は、官能化剤が、オルガノシラン、好ましくはアミノシラン、特に３−アミノプロピルトリエトキシシランである、実施形態１〜４のいずれか１つの方法である。
【００７１】
実施形態６は、懸濁された担体材料と官能化剤との混合物が、約０．００１ｍＭ〜約１ｍＭの官能化剤、特に約０．１８ｍＭ〜約０．２７ｍＭの官能化剤を含む、実施形態１〜５のいずれか１つの方法である。
【００７２】
実施形態７は、第１の所定時間が、約１分〜約２４時間の範囲、好ましくは約１０時間〜約１５時間の範囲にあり、特に約１２時間である、実施形態１〜６のいずれか１つの方法である。
【００７３】
実施形態８は、第１の所定温度が、生物学的に適合可能な範囲内、好ましくは約４℃〜約１０５℃の範囲、より好ましくは約１８℃〜約２５℃の範囲、特に約２０℃〜約２１℃の範囲にある、実施形態１〜７のいずれか１つの方法である。
【００７４】
実施形態９は、ｐＨが、懸濁された担体材料が第１の所定温度で第１の所定時間にわたり官能化剤と混合される場合に所定のｐＨ値に調整される、実施形態１〜８のいずれか１つの方法である。
【００７５】
実施形態１０は、所定のｐＨ値が、生物学的に適合可能な範囲内、好ましくは約３〜約９の範囲、より好ましくは約７〜約８の範囲にあり、特に約７．５である、実施形態９の方法である。
【００７６】
実施形態１１は、ｐＨが、ｐＨ活性化合物、特に飽和クエン酸溶液を適用することにより調整される、実施形態９または１０の方法である。
【００７７】
実施形態１２は、タンパク質が、酵素である、実施形態１〜１１のいずれか１つの方法である。
【００７８】
実施形態１３は、酵素が、ラッカーゼである、実施形態１２の方法である。
【００７９】
実施形態１４は、第１のブロスとタンパク質との混合物が、官能化されたヒュームドシリカナノ粒子１個当たり約０．０１ｍｇ〜約１ｍｇの総タンパク質、特に官能化されたヒュームドシリカナノ粒子１個当たり約０．１５ｍｇの総タンパク質を含む、実施形態３〜１３のいずれか１つの方法である。
【００８０】
実施形態１５は、第２の所定時間が、約１分〜約２４時間の範囲、好ましくは約１時間〜約３時間の範囲にあり、特に約２時間である、実施形態１〜１４のいずれか１つの方法である。
【００８１】
実施形態１６は、第２の所定温度が、生物学的に適合可能な範囲内、好ましくは約３℃〜約７℃の範囲にあり、特に約５℃である、実施形態１〜１５のいずれか１つの方法である。
【００８２】
実施形態１７は、固定化剤を第２のブロスに適用し、固定化剤と第２のブロスとを第３の所定温度で第３の所定時間にわたり混合することにより、インキュベートされた酵素が担体材料の官能化された表面上に固定化されて、第３のブロスを結果としてもたらす、実施形態１〜１６のいずれか１つの方法である。
【００８３】
実施形態１８は、固定化剤が、二官能性架橋剤、特にグルタルアルデヒドである、実施形態１７の方法である。
【００８４】
実施形態１９は、約０．００１ｍｏｌ〜約１ｍｏｌ、特に約０．０５３ｍｏｌの架橋剤が、第２のブロス１リットル当たりに適用される、実施形態１８の方法である。
【００８５】
実施形態２０は、第３の所定時間が、約２０時間〜約３０時間の範囲にあり、特に約２４時間である、実施形態１７〜１９のいずれか１つの方法である。
【００８６】
実施形態２１は、第３の所定温度が、生物学的に適合可能な範囲内、好ましくは約１８℃〜約２５℃の範囲、特に約２０℃〜約２１℃の範囲にある、実施形態１７〜２０のいずれか１つの方法である。
【００８７】
実施形態２２は、第３のブロスが、連続的に濾過される、実施形態１〜２１のいずれか１つの方法である。
【００８８】
実施形態２３は、第３のブロスの濾過が、一軸ディスク濾過ユニットを用いることにより実施される、実施形態２２の方法である。
【００８９】
実施形態２４は、一軸ディスク濾過ユニットが、複数の回転可能なセラミックフィルターディスクを含む、実施形態２３の方法である。
【００９０】
実施形態２５は、一軸ディスク濾過ユニットが、フィルターディスクから保持物を除去するように配置された圧力空気系を含む、実施形態２４の方法である。
【００９１】
実施形態２６は、第３のブロスの濾過の濾液または透過液が処分される、実施形態１〜２５のいずれか１つの方法である。
【００９２】
実施形態２７は、担体材料の表面の官能化、酵素と第１のブロスとの混合、酵素のインキュベーション、および担体材料の官能化された表面上へのインキュベートされた酵素の固定化が、撹拌器を備えた合成容器中で実施される、実施形態１〜２６のいずれか１つの方法である。
【００９３】
実施形態２８は、一軸ディスク濾過ユニットが、ブロス管および保持物管により合成容器に連結されており、第３のブロスの濾過の間、保持物は保持物管を介して一軸ディスク濾過ユニットから合成容器に送達され、第３のブロスはブロス管を介して合成管から一軸ディスク濾過ユニットに送達される、実施形態２７および実施形態２２〜２６のいずれか１つの方法である。
【００９４】
引用リスト
［１］Ｇ．Ｈｏｍｍｅｓ，Ｃ．Ａ．Ｇａｓｓｅｒ，Ｃ．Ｂ．Ｃ．Ｈｏｗａｌｄ，Ｒ．Ｇｏｅｒｓ，Ｄ．Ｓｃｈｌｏｓｓｅｒ，Ｐ．Ｓｈａｈｇａｌｄｉａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｆ．Ｘ．Ｃｏｒｖｉｎｉ（２０１２）“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｏｂｕｓｔ  ｎａｎｏｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ  ｆｏｒ  ｍｕｎｉｃｉｐａｌ  ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，オンラインで入手可能，２０１１年１２月８日，ＩＳＳＮ  ０９６０−８５２４，１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｒｔｅｃｈ．２０１１．１１．１２９
［２］Ｓ．Ｗ．Ｓｕｎ，Ｙ．Ｃ．Ｌｉｎ，Ｙ．Ｍ．Ｗｅｎｇ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｃｈｅｎ（２００６）“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ｎｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，１９，１１２−１１７
【図１】
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【図２】
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