(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
望ましいタンパク質を含有するサンプルの凝集物含量を低減するための方法であって：該方法は、（ｉ）電気陰性表面を有する第一の固体基体である第一の成分を準備し、該第一の成分の表面の電気陰性は部分的にはイミノ二酢酸によって与えられる工程と；（ｉｉ）電気陽性表面を有する第二の固体基体である第二の成分を準備し、該第二の成分の表面の電気陰性は部分的にはトリス（２−アミノエチル）アミンによって与えられる工程と；（ｉｉｉ）前記サンプルを第一および第二の成分と接触させる工程であって、ここでの第一および第二の成分は、前記サンプルが両方の成分と同時に接触し得るように構成されており、また前記操作条件は、前記望ましいタンパク質が前記第一または第二の成分に結合するのを実質的に防止するものである工程と；（ｉｖ）前記望ましいタンパク質を含有し且つ凝集物含量が低下した得られたサンプルを、前記第一および第二の成分から分離する工程を備え、前記望ましいタンパク質は抗体または抗体断片である方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記第一および第二の成分は、前記サンプルと接触する前に混合される方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記サンプルは、電気陰性表面を有する前記第一の基体と接触させる前に、混在した化学的特徴の可溶性有機多価陽イオンと接触される方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記サンプルは、前記第一および第二の成分と接触させる前の適切な時間だけ、混在した化学的特徴の前記可溶性有機多価陽イオンと共にインキュベートされる方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、前記サンプルは、適切な時間だけ前記第一および第二の成分と共にインキュベートされる方法。
【請求項６】
請求項３〜５の何れか１項に記載の方法であって、前記混在した化学的特徴を有する前記有機多価陽イオンは、凝集物含量が低下したサンプルを前記第一および第二の成分から分離する工程において、前記混在した化学的特徴を有する有機多価陽イオンが前記第一もしくは第二の成分の基体と結合される範囲で、前記サンプルから除去される方法。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、前記第一の基体が粒子である方法。
【請求項８】
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、前記第二の基体が粒子である方法。
【請求項９】
請求項７〜８の何れか１項に記載の方法であって、１または複数の前記粒子状基体は、それぞれが複数の粒子として与えられる方法。
【請求項１０】
請求項７〜９の何れか１項に記載の方法であって、前記第一の基体、前記第二の基体またはその両者の粒子は非多孔質である方法。
【請求項１１】
請求項７〜９の何れか１項に記載の方法であって、前記第一の基体、前記第二の基体またはその両者の粒子は多孔質である方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記多孔質粒子の孔サイズは、タンパク質製剤の中のタンパク質の侵入を許容するように十分に大きい方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、前記多孔質粒子の孔サイズは小さすぎて、タンパク質製剤中のタンパク質の侵入を許容しない方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法であって、前記多孔質粒子の平均孔サイズは、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの間である方法。
【請求項１５】
請求項７〜１４の何れか１項に記載の方法であって、前記粒子は多孔質の膜またはモノリスの間にサンドイッチされる方法。
【請求項１６】
請求項７〜１４の何れか１項に記載の方法であって、前記粒子は織布フィルターまたは非晶質繊維フィルターの間にサンドイッチされる方法。
【請求項１７】
請求項７〜１４の何れか１項に記載の方法であって、前記粒子は結晶性フリットの間にサンドイッチされる方法。
【請求項１８】
請求項７〜１４の何れか１項に記載の方法であって、前記粒子は網状ポリマーネットワークの中に埋設される方法。
【請求項１９】
請求項３に記載の方法であって、前記サンプルの導電性は、混在した化学的特徴の前記可溶性有機多価陽イオンに接触しながら、前記サンプルから前記望ましいタンパク質が沈殿するのを実質的に回避するために十分に高いレベルにある方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記サンプルの導電性は２０ｍＳ／ｃｍよりも大きい方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記サンプルの導電性は３０ｍＳ／ｃｍよりも大きい方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法であって、前記サンプルの導電性は約４０ｍＳ／ｃｍよりも大きい方法。
【請求項２３】
請求項２０に記載の方法であって、前記サンプルの導電性は約１００ｍＳ／ｃｍよりも大きい方法。
【請求項２４】
請求項１９に記載の方法であって、前記サンプルの導電性は、前記混在した化学的特徴の可溶性有機多価陽イオンに接触しながら、前記サンプルからの望ましいタンパク質の沈殿を実質的に回避するのに十分な導電性よりも、少なくとも５％、１０％、２０％、５０％、１００％または２００％高い方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４の何れか１項に記載の方法であって、前記凝集物は、前記望ましいタンパク質のホモ凝集物を含んでなるものである方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記望ましいタンパク質のホモ凝集物の存在が実質的に排除される方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６の何れか１項に記載の方法であって、前記凝集物は、望ましいタンパク質と汚染物とのヘテロ凝集物を含んでなるものである方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、前記ヘテロ凝集物は、望ましいタンパク質と実質的に同じ水力学的サイズのものである方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の方法であって、前記汚染物は、核酸、ヌクレオチド、エンドトキシン、金属イオン、タンパク質、脂質、または細胞培養培地成分である方法。
【請求項３０】
請求項２７〜２９の何れか１項に記載の方法であって、前記望ましいタンパク質および汚染物のヘテロ凝集物の存在は、実質的に排除される方法。
【請求項３１】
請求項１〜３０の何れか１項に記載の方法であって、前記望ましいタンパク質は組み換えタンパク質である方法。
【請求項３２】
請求項１に記載の方法であって、前記サンプルは細胞培養回収物、細胞培養上清、細胞培養に由来する抗体含有溶液、またはタンパク質精製の前の段階からの抗体含有溶液である方法。
【請求項３３】
請求項１に記載の方法であって、前記培養細胞は哺乳類細胞、細菌細胞、または酵母細胞である方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載の方法であって、前記サンプルは、タンパク質精製の先の段階からの抗体含有溶液である方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、前記サンプルは、クロマトグラフィーカラムからの溶出液である方法。
【請求項３６】
請求項１〜３５の何れか１項に記載の方法であって、前記サンプルは未精製であってよく、中間レベルの純度で精製されてよく、または高度に精製されてよい方法。
【請求項３７】
請求項１〜３６の何れか１項に記載の方法であって、前記製剤を第一および第二の成分を通して流すことにより、前記サンプルは前記第一および第二の成分と接触される方法。
【請求項３８】
請求項３に記載の方法であって、前記混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、エタクリジン、９−アミノアクリジン（アミナクリン）、３，６−アクリジンジアミン（プロフラビン）、アクリゾルシン、アクリザン（フェナクリダン）、アクリジンオレンジ、キナクリン、アクリシド（アクリサイド（acricide））、アクリドン、アクリジン−９−カルボン酸，  アクラニル（アクラニル（acranil；１−［（６−クロロ−２−メトキシ−９−アクリジニル）アミノ］−３−（ジエチルアミノ）−２−プロパノール二塩酸塩）、フェノサフラニン、フェノキサジン、フェノチアジン、アクリフラビン（ａｃｒｉｆｌａｖｉｎｅ；  ３，６−ジアミノ−１０−メチルアクリジニウム塩化物および３，６−アクリジンジアミン）、ポリエチレンイミン、クロロヘキシジン、およびポリアミノ酸からなる群から選択される方法。
【請求項３９】
請求項３に記載の方法であって、前記混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、エタクリジン、ポリエチレンイミンもしくはクロロヘキシジン、またはそれらの塩である方法。
【請求項４０】
請求項３に記載の方法であって、前記混在した化学的特徴の有機多価陽イオンはエタクリジンまたはその塩である方法。
【請求項４１】
請求項３８〜４０の何れか１項に記載の方法であって、前記混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、約０．０１％〜０．０５％の量で存在する方法。
【請求項４２】
請求項３８〜４０の何れか１項に記載の方法であって、前記混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、約０．０１％未満の量で存在する方法。
【請求項４３】
請求項３８〜４０の何れか１項に記載の方法であって、前記混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、約０．００５％未満の量で存在する方法。
【請求項４４】
請求項３８〜４０の何れか１項に記載の方法であって、前記混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、約０．００１未満の量で存在する方法。
【請求項４５】
請求項３８〜４０の何れか１項に記載の方法であって、前記混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、約０．０２０％〜約０．０２５％の量で存在する方法。
【請求項４６】
請求項３〜４５の何れか１項に記載の方法であって、前記サンプルは、前記サンプルを前記第一および第二の成分に接触させる工程に先立って、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、エタクリジン、クロロヘキシジン、およびそれらの塩からなる群からの２以上の有機多価陽イオンで処理される方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法であって、前記サンプルを前記第一および第二の成分と接触させる工程に先立って前記サンプルを処理するために使用される有機多価陽イオンは、１％未満の濃度で提供される方法。
【請求項４８】
請求項４６に記載の方法であって、前記サンプルを前記第一および第二の成分と接触させる工程に先立って前記サンプルを処理するために使用される有機多価陽イオンは、約０．０１％〜約０．０５％の濃度で提供される方法。
【請求項４９】
請求項４６に記載の方法であって、前記サンプルを前記第一および第二の成分と接触させる工程に先立って前記サンプルを処理するために使用される有機多価陽イオンは、約０．０１％未満の濃度で提供される方法。
【請求項５０】
請求項４６に記載の方法であって、前記サンプルを前記第一および第二の成分と接触させる工程に先立って前記サンプルを処理するために使用される有機多価陽イオンは、約０．００５％未満の濃度で提供される方法。
【請求項５１】
請求項４６記載の方法であって、前記サンプルを前記第一および第二の成分と接触させる工程に先立って前記サンプルを処理するために使用される有機多価陽イオンは、約０．００１％未満の濃度で提供される方法。
【請求項５２】
請求項４６に記載の方法であって、前記サンプルを前記第一および第二の成分と接触させる工程に先立って前記サンプルを処理するために使用される有機多価陽イオンは、約０．０２０％〜約０．０２５％の濃度で提供される方法。
【請求項５３】
請求項１〜５２の何れか１項に記載の方法であって、前記サンプルを第一および第二の成分と接触させる工程に先立って、前記サンプルは更に、非イオン性有機ポリマー、有機溶媒、表面活性剤、およびウレイドからなる群から選択される可溶性有機モジュレータと接触される方法。
【請求項５４】
請求項１〜５３の何れか１項に記載の方法であって、前記サンプルを第一および第二の成分と接触させる工程に先立って、前記サンプルは更に、抗ウイルス剤と接触される方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法であって、前記抗ウイルス剤は非多価有機陽イオンである方法。
【請求項５６】
請求項５４に記載の方法であって、塩化ベンザルコニウム、メチレンブルーおよびリン酸トリ（ｎ−ブチル）からなる群から選択される方法。
【請求項５７】
請求項５４〜５６の何れか１項に記載の方法であって、前記抗ウイルス剤は、約１％（ｗ／ｖ）未満の量で存在する方法。
【請求項５８】
請求項５４に記載の方法であって、前記抗ウイルス剤は、約０．１％（ｗ／ｖ）未満の量で存在する方法。
【請求項５９】
請求項５８に記載の方法であって、前記抗ウイルス剤は、約０．０１％（ｗ／ｖ）未満の量で存在する方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法であって、前記抗ウイルス剤は、約０．００１％（ｗ／ｖ）未満の量で存在する方法。
【請求項６１】
請求項１〜６０の何れか１項に記載の方法であって、前記サンプルを前記第一および第二の成分と接触させる工程に先立って、前記サンプルを、前記タンパク質製剤中でウレイドが過飽和するのに十分な量のウレイドと接触させる工程と、前記サンプルの固体または不溶性タンパク質から、望ましいタンパク質を含有する上清を分離する工程を含んでいる方法。
【請求項６２】
請求項６１に記載の方法であって、前記サンプルをウレイドと接触させる工程は、前記サンプルを、前記混在した化学的特徴の可溶性有機多価陽イオンと接触させる工程に先立って行われる方法。
【請求項６３】
請求項６１に記載の方法であって、前記サンプルをウレイドと接触させる工程は、前記サンプルを、前記混在した化学的特徴の可溶性有機多価陽イオンと接触させる工程と実質的に同時に行われる方法。
【請求項６４】
請求項６１に記載の方法であって、前記サンプルをウレイドと接触させる工程は、前記サンプルを、前記混在した化学的特徴の可溶性有機多価陽イオンと接触させる工程の後に行われる方法。
【請求項６５】
請求項６１〜６４の何れか１項に記載の方法であって、前記ウレイドは、尿素、尿酸、ヒダントイン、アラントイン、アルクロキサ、アルジオキサ、ヘモケイン（ｈｅｍｏｃａｎｅ）、ウレイドヒダントイン、５−ウレイドヒダントイン、グリオキシルウレイド、グリオキシル酸ジウレイド、２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル尿素、およびプリン類からなる群から選択される方法。
【請求項６６】
請求項６５に記載の方法であって、前記ウレイドはアラントインである方法。
【請求項６７】
請求項６５に記載の方法であって、前記ウレイドは尿酸である方法。
【請求項６８】
請求項６６に記載の方法であって、前記アラントインは０．５％（ｗ／ｖ）を超える量で存在する方法。
【請求項６９】
請求項６８に記載の方法であって、前記アラントインは約１％（ｗ／ｖ）を超える量で存在する方法。
【請求項７０】
請求項６７に記載の方法であって、前記尿酸は０．００２５％（ｗ／ｖ）を超える量で存在する方法。
【請求項７１】
請求項６９に記載の方法であって、前記アラントインは約２％（ｗ／ｖ）を超える量で存在する方法。
【請求項７２】
請求項６９に記載の方法であって、前記アラントインは約５％（ｗ／ｖ）を超える量で存在する方法。
【請求項７３】
請求項６９に記載の方法であって、前記アラントインは約１０％（ｗ／ｖ）を超える量で存在する方法。
【請求項７４】
請求項５３に記載の方法であって、前記サンプルを前記有機モジュレータと接触させる工程は、前記サンプルを前記混在した化学的特徴の可溶性有機多価陽イオンと接触させる工程に先立って行われる方法。
【請求項７５】
請求項５３に記載の方法であって、前記サンプルを前記有機モジュレータと接触させる工程は、前記サンプルを前記混在した化学的特徴の可溶性有機多価陽イオンと接触させる工程と実質的に同時に行われる方法。
【請求項７６】
請求項５３に記載の方法であって、前記サンプルを前記有機モジュレータと接触させる工程は、前記サンプルを前記混在した化学的特徴の可溶性有機多価陽イオンと接触させる工程の後で行われる方法。
【請求項７７】
請求項７４〜７６の何れか１項に記載の方法であって、前記有機モジュレータは、グリセロール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリブチレングリコールからなる群から選択される非イオン性有機ポリマーである方法。
【請求項７８】
請求項７７に記載の方法であって、前記非イオン性有機ポリマーは、約５００Ｄ以下の平均分子量を有する方法。
【請求項７９】
請求項７４〜７６の何れか１項に記載の方法であって、前記有機モジュレータは、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、イソプロパノール、およびフェノキシエタノールからなる群から選択される有機溶媒である方法。
【請求項８０】
請求項７４〜７９の何れか１項に記載の方法であって、前記有機モジュレータは、約１％（ｗ／ｖ）以上の濃度で与えられる方法。
【請求項８１】
請求項７４〜７６の何れか１項に記載の方法であって、前記有機モジュレータは、ツイーン、トリトン、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯおよびオクチルグルコシドからなる群から選択される表面活性剤である方法。
【請求項８２】
請求項８１に記載の方法であって、前記表面活性剤は、約１％（ｗ／ｖ）以下の濃度で与えられる方法。
【請求項８３】
請求項８１に記載の方法であって、前記表面活性剤は、約０．１％（ｗ／ｖ）以下の濃度で与えられる方法。
【請求項８４】
請求項５３に記載の方法であって、前記有機モジュレータは、飽和未満の量で与えられるウレイドである方法。
【請求項８５】
請求項８４に記載の方法であって、前記ウレイドは尿素、ヒダントイン、およびアラントインからなる群から選択される方法。
【請求項８６】
望ましいタンパク質を含有するサンプルの凝集物含量を低減するための方法であって：該方法は、（ｉ）電気陰性表面を有する第一の固体基体である第一の成分を準備し、該第一の成分の表面の電気陰性は部分的にはイミノ二酢酸によって与えられる工程と；（ｉｉ）電気陽性表面を有する第二の固体基体である第二の成分を準備し、該第二の成分の表面の電気陰性は部分的にはトリス（２−アミノエチル）アミンによって与えられる工程と；（ｉｉｉ）前記サンプルを第一および第二の成分と接触させる工程であって、ここでの第一および第二の成分は、前記サンプルが両方の成分と同時に接触し得るように構成されており、また前記操作条件は、前記望ましいタンパク質が前記第一または第二の成分に結合するのを実質的に防止するものである工程と；（ｉｖ）前記望ましいタンパク質を含有し且つ凝集物含量が低下した得られたサンプルを、前記第一および第二の成分から分離する工程を備え、電気陰性表面を有する前記第一の基体を接触させる前に、前記サンプルは混在した化学的特徴の可溶性有機多価陽イオンと接触させられ、前記混在した化学的特徴の可溶性有機多価陽イオンはエタクリジン、ポリエチレンイミン、もしくはクロロヘキシジンまたはそれらの塩であり、前記望ましいタンパク質は抗体または抗体断片である方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質、特に抗体を精製するための材料に関する。特に、本発明はタンパク質凝集物の含量を低減するための材料に関する。更に、本発明は、これらの能力を他の精製方法と統合して、タンパク質の望ましい最終精製レベルを達成することに関する。
【発明の背景】
【０００２】
宿主細胞由来の夾雑物と、インビトロ細胞培養法により産生された組み換えタンパク質との間に、非天然のヘテロ凝集物が生じることが示されてきた（Shukla et al., Biotechnol. Progr. (2008) 24:1115-1121; Luhrs et al., J. Chromatogr. B (2009) 877:1543-1552; Mechetner et al., J. Chromatogr. B (2011) 879:2583-2594; Gagnon et al., J. Chromatogr. A, (2011) 1218:2405-2412; Gagnon, Bioprocessing J. (2010) 9(4):14-24）。これらのヘテロ凝集物は、次の２点において非天然のものと看做されてよい：１）汚染物の成分は、非ヒト宿主細胞により分泌され、または非ヒト宿主細胞の死滅に際して溶解するときに培地中に放出された、非ヒト起源のものであることが多く、このような非ヒト汚染物は生きたヒトには存在しない；および２）死細胞成分が迅速に除去されるヒト・インビボ系に比較して、汚染成分が高濃度に蓄積する。従って、組み換え産物は、典型的には生体系では生じない濃度において、高レベルの強度に相互作用する汚染物に曝される。ところで、組み換えタンパク質の高い発現レベルは、それらを、これら非ヒト汚染物との非特異的結合に適した基体とすることにより、多様な組成の望ましくないヘテロ凝集物の形成に有利に働く。
【０００３】
このヘテロ凝集物の汚染タンパク質含量は、ある程度までは、該汚染タンパク質の直接ターゲッティングを介して（Shukla et al. and Gagnon et al. supra）、並びに汚染タンパク質の原因である対応するDNA成分のターゲッティングを介して間接的に（Luhrs et al. and Gagnon supra）取り扱われてきた。幾つかの複合体が解離するときに、抗体凝集物レベルの低下が示されてきた（Shukla et al., Mechetner et al., and Gagnon supra）。抗体−汚染物複合体のレベルを低下させる陰イオン交換体の能力が開示されているが（Luhrs et al. and Gagnon et al. supra）、ヘテロ凝集物を完全に除去できた陰イオン交換処理は未だ示されていない。ヘテロ凝集物を低減する試みにおいて、サイズ排除クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および親水性相互作用クロマトグラフィーも用いられてきたが、これらの技術は一般的に陰イオン交換よりも劣っている（Gagnon et al. supra）。
【０００４】
抗体との安定な会合体を形成する汚染物の特異的な供給源は、常に知られている訳ではない（例えば、Shukla et al. supra参照）。他の可能な汚染物の特異的供給源には少ししか注意を払わずに、幾つかの努力がＤＮＡ汚染物に向けられてきた（Gagnon et al. and Gagnon supra）。宿主汚染物と凝集物との会合を示す幾つかの努力が、特に染色体異化物を含む汚染物に対して向けられてきた（Luhrs et al. and Mechetner et al. supra）。これらの例において、凝集物は、ヒストンおよびＤＮＡのような染色体異化物に対する抗体の免疫特異性によって直接媒介される可能性がある。染色体異化物はまた、非特異的相互作用を介して抗体との安定な錯体を形成できることも示されている。従って、染色体異化物を含まない抗原についての既知の免疫特異性を持ったモノクローナル抗体は、死滅した宿主細胞の核から誘導されたヌクレオソーム、ヒストン、およびＤＮＡと共に、多様な特徴を備えた極めて安定な凝集物を形成することができる。特に、染色体異化物は、高分子量（ＨＭＷ）凝集物の中に高度に存在することが示されている。ＨＭＷ凝集物は、治療的な中和抗体の形成促進に関与すると思われるため、特に関心が持たれている。ＨＭＷ凝集物は、興味ある複数の小さい抗体よりもサイズの大きい凝集物として一般に定義される。例えば、２分子の抗体会合物はＨＭＷ凝集物とは看做されず、また殆どの４抗体凝集物もそうである。しかし、約８〜約１０以上の抗体に対応するような遥かに大きなサイズの凝集物は、一般に、ＨＭＷ凝集物として分類されてよい。
【０００５】
ヘテロ凝集物を解離すると予測され得る物質を伴った治療用抗体の製剤は、一般に効果的でないことが証明されている。例えば、高濃度の尿素、塩、またはこれら二つの組合せを用いることは、ＩｇＭ汚染物ヘテロ凝集物を実質的に解離させない（Gagnon et al. supra）。尿素、アルコールおよび表面活性剤の溶出前洗浄を伴ったプロテインＡ・アフィニティークロマトグラフィーは、尿素、塩およびＥＤＴＡをプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーと組み合わせる溶出前洗浄がそうであるように（Mecjetmer et al. supra）、洗浄なしの場合よりも、ヘテロ凝集物レベルをより効率的に低減することが示された（Shukla et al. supra）。尿素の溶出前洗浄を伴った陰イオン交換クロマトグラフィーは、尿素洗浄を伴わない場合よりも効率的に、ヘテロ凝集物をより効果的に低減することが示されている（Gagnon et al. supra）。陽イオン交換クロマトグラフィーもまた、溶出前ＥＤＴＡ洗浄を用いることにより、該洗浄を用いない場合よりも効果的にヘテロ凝集物を低減することが示された（Gagnon et al. supra）。最後に、尿素および／または塩の溶出前洗浄を伴ったヒドロキシアパタイトもまた、このような洗浄を伴わない場合よりも効果的に、ヘテロ凝集物を低減した（Gagnon supra）。これらの所見にも拘らず、一般には、クロマトグラフィーカラムに結合した抗体の溶出前洗浄において解離剤を使用することは、中程度に成功したに過ぎなかった。
【０００６】
酸性タンパク質の沈殿のため（Farhner et al., U.S. Patent Application No. 20080193981; Ma et al., J. Chromatogr. B (2010) 878:798-806; Peram et al., Biotechnol. Progr., (2010) 26:1322-1326; Glynn, in U. Gottschalk (ed.), Process Scale Purification of Antibodies, J. T. Wiley and Sons, (2009) Hoboken, 309-324）、並びにＤＮＡおよびエンドトキシンの沈殿のため（Glynn supra; Cordes et al., Biotechnol. Progr., (1990) 6:283-285; Dissing et al., Bioseparation, (1999) 7 221:9-11）、およびウイルスの不活化のために（Bernhardt, U.S. Patent. 5,559,250）、有機多価陽イオンが指定されてきた。多価金属陽イオンはまた、ＤＮＡおよびエンドトキシンを幾つかのタンパク質製剤から除去するためにも指定されてきた（Akcasu et al., Nature, (1960) 187:323-324; Matsuzawa et al., Nucl. Acids Res., (2003) 3(3):163-164; Christensen et al., Prot. Expr. Purif., (2004) 37:468-471; Kejnovsky et al., Nucl. Acids Res., (1997) 25:1870-1871; Ongkudon et al., Anal. Chem., (2011) 83 391:13-17）。
【発明の概要】
【０００７】
一定の実施形態において、本発明は、望ましいタンパク質を含有するタンパク質製剤のようなサンプルの凝集物含量を低減するための方法であって：（ｉ）電気陰性表面を有する第一の固体基体である第一の成分を準備する工程と；（ｉｉ）電気陽性表面を有する第二の固体基体である第二の成分を準備する工程と；（ｉｉｉ）前記サンプルを第一および第二の成分と接触させる工程であって、ここでの第一および第二の成分は、前記望ましいタンパク質が前記第一および第二の成分に結合するのを実質的に防止する操作条件下で、前記サンプルが両方の成分と同時に接触し得るように構成される工程と；（ｉｖ）前記望ましいタンパク質を含有し且つ凝集物含量が低下した得られたサンプルを、前記第一および第二の成分から分離する工程を備えた方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、アラントイン−エタクリジンのバッチ粒子処理を受けたＩｇＭ５２９の精製において、指示された間隔でサンプリングされたサイズ交換クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルの時間コースプロットを示している。Ａｇｇｒ：凝集物、ＨＣＰ：宿主細胞タンパク質、実線：２８０ｎｍ、破線：１５４ｎｍ。全ての時間スケールは中央パネルと同じである。
【図２Ａ】図２Ａは、ＩｇＭ８４でフィルターされた細胞培養上清（ＣＣＳ）のＳＥＤプロファイルを示している。Ａｇｇｒ：凝集物、ＨＭＷ：高分子量凝集物、ＨＣＰ：宿主細胞タンパク質、ＬＭＷ：低分子量細胞培養培地成分、実線：２８０ｎｍ、破線：２５４ｎｍ。
【図２Ｂ】図２Ｂは、アラントイン−エタクリジンおよびカラムフロースルー処理の後に、図２ＡのＩｇＭ８４でフィルターされたＣＣＳのＳＥＤプロファイルを示している。Ａｇｇｒ：凝集物、ＨＣＰ：宿主細胞タンパク質、実線：２８０ｎｍ、破線：２５４ｎｍ。
【図３】アラントイン−エタクリジンおよびカラムフロースルー処理での処置前（左パネル）および処置後（右パネル）における、モノクローナルＩｇＧ・ＨＥＲ２・ＣＣＳのＳＥＣプロファイルを示している。Ａｇｇｒ：凝集物、ＨＣＰ：宿主細胞タンパク質、ＬＭＷ：低分子量細胞培養培地成分、ＬＣ：軽鎖、実線：２８０ｎｍ、破線：２５４ｎｍ。
【発明の詳細な説明】
【０００９】
驚くべきことに、本発明の一定の実施形態において、固体体材料と電気陰性表面との組み合わせ、並びに固体材料と電気陽性表面との組み合わせは、陰イオン交換体または陽イオン交換体にのみ依存する材料よりも、より効果的にタンパク質製剤中の高分子量（ＨＭＷ）凝集物およびヘテロ凝集物の含量を低減できることが発見された。一定の実施形態において、該組成物は特に、ヌクレオソームおよび／またはヒストンおよび／またはＤＮＡのような染色体の残骸を含む凝集体の含有量を低減する。一定の実施形態において、本発明は、タンパク質製剤に加えられたかもしれない多価イオンおよび抗ウイルス化合物のような物質を除去する追加の能力を有する。
【００１０】
驚くべきことに、本発明の一定の実施形態において、タンパク質製剤中の凝集物レベルは、このような製剤に対して、混在した化学的特徴の可溶性多価陽イオン、およびその後には混在した化学的特徴の不溶性粒子または他の基体を組み合わせて添加することによって劇的に低減できることが見出された。実験結果は、この処理が、塩および／またはカオトロープ（chaotropes）、単一機構の固相法、または固相法と意図した凝集物解離洗浄との組み合わせを用いた液相処理よりも、高分子量（ＨＭＷ）凝集物含量およびヘテロ凝集物解離の劇的に大きな低減を可能にすることを示している。このアプローチの価値ある利点は、可溶性物質自身がタンパク質製剤から除去されて、実質的に凝集物を含まず、且つ実質的に多価陽イオンも含まないタンパク質製剤を生じることである。驚くべきことに、多価陽イオンおよび不溶性粒子がごく少量、例えば約０．０２〜約０．２５％および約２〜約５％でそれぞれ存在するときに、これは１時間以下の期間内に生じ得る。実験的証拠は更に、本発明の一定の実施形態において、有機多価陽イオンで前もってサンプル処理することは、電気陰性粒子および電気陽性粒子の組合せで達成される結果を増強することを示している。
【００１１】
一定の実施形態において、本発明は、組み換えタンパク質製剤、特に抗体、第ＶＩＩＩ因子のような凝固因子、および組み換えタンパク質における凝集物含量を低減する方法を提供する。特定の理論に束縛されることなく、且つ予期することなしに、凝集物は外来物質との相互作用により安定化されることが見出された。抗体製剤を、該抗体に対するよりも外来物質に対して高い親和性を有する多官能表面と接触させることは、前記外来物質を置き換える効果を有し、これは次いで、それらが結合している前記多官能表面の単純な除去によって除去することができる。一定の実施形態においては、凝集物のレベルが実質的に低減され、時には抗体の回収が存在すると思われる量を越えて増大し、これは当該方法が凝集物を解離させ、該解離した抗体を精製可能な生成物ポピュレーションに修復する能力を有することを示す。一定の実施形態において、当該方法はまた、単一抗体の汚染物との複合体を解離することができる。より少量の凝集物ポピュレーションを含んだ抗体製剤を製造することに加えて、一定の実施形態では、処理された抗体はまた、より低含量の宿主タンパク質、ＤＮＡ、エンドトキシン、およびウイルス汚染物を示す。
【００１２】
一定の実施形態において、本発明の方法は、望ましい抗体を含有するサンプルを、少なくとも２種類の表面（一方は主に電気的に陰性、他方は主に電気的に陽性）と同時に接触させることを含んでいる。何れかの表面は、追加の化学的官能性を組み込んでもよい。追加の化学的官能性は、中でも疎水性結合、π−π結合、水素結合、または金属親和性官能性を含んでよい。一定の実施形態において、電気陰性表面および電気陽性表面は異なる程度の有用性を提供し、明らかに、それらが個々に異なるサブセットの外来物質との相互作用を好むことを示している。一定の実施形態のこの特徴は、電気陰性表面および電気陽性表面が一緒に適用されるときに、個別的に適用されるよりも更に効果的であるとの所見によって更に実証されている。
【００１３】
一定の実施形態において、これらの表面は、タンパク質製剤の全体に亘って分散された、またはカラム中に充填された、または最初に分散され次いでカラムに充填された、多孔質または非多孔質の粒子を含んでいてよい。
【００１４】
一定の実施形態においては、サンプルを可溶性の有機多価陽イオンの単独または他の薬剤との組合せで前処理することによって凝集体の除去を高めることができ、この場合の当該方法は、前記有機多価陽イオン、および潜在的には前記他の薬剤を除去する追加の有用性を有している。そうでなければ、抗ウイルス剤粒子を単独で、または多価陽イオンの存在下で含めることによって、当該方法の有用性は増強される可能性がある。
【００１５】
一定の実施形態において、本発明は、望ましいタンパク質を含有するタンパク質製剤のようなサンプルの凝集物含量を低減する方法を提供する：一定の方法は、（ｉ）電気陰性表面を有する第一の固体基体である第一の成分を準備する工程と；（ｉｉ）電気陽性表面を有する第二の固体基体である第二の成分を準備する工程と；（ｉｉｉ）前記サンプルを第一および第二の成分と接触させる工程であって、ここでの第一および第二の成分は、前記望ましいタンパク質が前記第一および第二の成分に結合するのを実質的に防止する操作条件下で、前記サンプルが両方の成分と同時に接触し得るように構成される工程と；（ｉｖ）前記望ましいタンパク質を含有し且つ凝集物含量が低下した得られたサンプルを、前記第一および第二の成分から分離する工程を具備する。
【００１６】
幾つかの実施形態において、前記第一および第二の成分は、前記サンプルと接触する前に混合される。
【００１７】
幾つかの実施形態において、前記第一および第二の成分は、帯電または非帯電の化学的表面を備えた追加の成分と混合されてよく、これは当該サンプルの成分との水素結合、疎水性相互作用、金属親和性または他の分枝間相互作用に関与できる追加の化学的部分を備えていてもよい。
【００１８】
１以上の先の実施形態において、当該サンプルは、電気陰性表面を有する前記第一の基体と接触させる前に、混在した化学的特徴の可溶性有機多価陽イオンと接触される。
【００１９】
１以上の先の実施形態において、当該サンプルは、前記第一および第二の成分と接触させる前の適切な時間だけ、混在した化学的特徴の可溶性有機多価陽イオンと共にインキュベートされる。
【００２０】
１以上の先の実施形態において、当該サンプルは、適切な時間だけ前記第一および第二の成分と共にインキュベートされる。
【００２１】
１以上の先の実施形態において、混在した化学的特徴を有する前記有機多価陽イオンは、凝集物含量が低下したサンプルを前記第一および第二の成分から分離する工程において、前記サンプルから除去される。一定の実施形態においては、凝集物含量が低下した前記サンプルを前記第一および第二の成分から分離する工程において、前記混在した化学的特徴を有する有機多価陽イオンが前記第一もしくは第二の成分の基体、または前記第一および第二の成分以外の追加の成分と結合される範囲で、混在した化学的特徴を有する有機多価陽イオンが前記サンプルから除去されるが、該追加の第三の成分は前記第一および第二の成分と混合した状態で前記サンプルと接触される。例えば、このような第三の成分は疎水性官能性をもった材料であってよい。
【００２２】
１以上の先の実施形態において、前記第一の基体は粒子状である。
【００２３】
１以上の先の実施形態において、前記第二の基体は粒子状である。
【００２４】
１以上の先の実施形態において、１または複数の前記粒子状基体は、それぞれが複数の粒子として与えられる。
【００２５】
１以上の先の実施形態において、前記第一の基体、前記第二の基体またはその両者の粒子は非多孔質である。
【００２６】
１以上の先の実施形態において、前記第一の基体、前記第二の基体またはその両者の粒子は多孔質である。
【００２７】
１以上の先の実施形態において、前記多孔質粒子の孔サイズは、タンパク質製剤の中のタンパク質の侵入を許容するように十分に大きい。
【００２８】
１以上の先の実施形態において、前記多孔質粒子の孔サイズは小さすぎてタンパク質製剤中のタンパク質の侵入を許容しない。
【００２９】
１以上の先の実施形態において、前記多孔質粒子の平均孔サイズは、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの間である。
【００３０】
１以上の先の実施形態において、前記粒子は多孔質の膜またはモノリスの間にサンドイッチされる。
【００３１】
１以上の先の実施形態において、前記粒子は織布フィルターまたは非晶質繊維フィルターの間にサンドイッチされる。
【００３２】
１以上の先の実施形態において、前記粒子は結晶性フリットの間にサンドイッチされる。
【００３３】
１以上の先の実施形態において、前記粒子は網状ポリマーネットワークの中に埋設される。
【００３４】
一定の実施形態において、前記第一および／または第二および／または他の成分／基体は非粒子状である。一定のこのような実施形態において、前記第一および／または第二の成分の固体基体は、独立に繊維、中空糸、膜、またはモノリスである。
【００３５】
１以上の先の実施形態において、前記操作条件は、望ましいタンパク質の前記第一および第二の成分への結合を実質的に妨げる性質のものである。一定のこのような実施形態において、該操作条件は更に、前記第一もしくは第二の成分または他の基体の何れかとの相互作用を通して、望ましいタンパク質の実質的なロスを防止する。このような条件は、望ましいタンパク質と第一および第二の成分との間に強力な電荷相互作用を一次停止させるために十分に高い導電性値を含んでいる可能性がある。このような条件はまた、望ましいタンパク質と多価陽イオンもしくは粒子との間の強い電荷相互作用をも一次停止させる可能性がある。このような操作条件は、望ましいタンパク質と第一または第二にの成分との間の他の種類の化学的相互作用を調節するために、第一および第二の成分に加えて、当該サンプルに接触する他の成分の存在を含むかもしれない。
【００３６】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルの導電性は、混在した化学的特徴の前記可溶性有機多価陽イオンに接触しながら、前記サンプルから前記望ましいタンパク質が沈殿するのを実質的に回避するために十分に高いレベルにある。
【００３７】
１以上の実施形態において本発明の方法は、導電性によって測定され得るように、高い塩濃度に耐える能力を示す。例えば、幾つかの実施形態において、サンプルは約１５ｍＳ／ｃｍの導電性を有する溶離液で精製されてよい。１以上の実施形態において、導電性は少なくとも１３ｍＳ／ｃｍであってよい。幾つかの実施形態において、前記導電性は、幾つかのタンパク質についてはもっと低くてよい。但し、前記塩濃度が、望ましいタンパク質の前記第一および第二の成分への結合を防止するために十分であることを条件とする。こうして幾つかの実施形態では、導電性は約５〜約１０ｍＳ／ｃｍと低くてよい。
【００３８】
１以上の先の実施形態においては、前記サンプルの導電性は２０ｍＳ／ｃｍよりも大きい。
【００３９】
１以上の先の実施形態では、前記サンプルの導電性は３０ｍＳ／ｃｍよりも大きい。
【００４０】
１以上の先の実施形態では、前記サンプルの導電性は約４０ｍＳ／ｃｍよりも大きい。
【００４１】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルの導電性は約１００ｍＳ／ｃｍよりも大きい。
【００４２】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルの導電性は、前記混在した化学的特徴の可溶性有機多価陽イオンに接触しながら、前記サンプルからの望ましいタンパク質の沈殿を実質的に回避するのに十分な導電性よりも、少なくとも５％、１０％、２０％、５０％、１００％または２００％高い。１以上の先の実施形態において、前記サンプルの導電性は、前記望ましいタンパク質の前記第一または第二の成分との結合を実質的に回避するのに十分な導電性よりも、少なくとも５％、１０％、２０％、５０％、１００％または２００％高い。
【００４３】
１以上の先の実施形態において、前記凝集物は、望ましいタンパク質のホモ凝集物を含んでなるものである。
【００４４】
１以上の先の実施形態においては、前記望ましいタンパク質のホモ凝集物の存在が実質的に排除される。
【００４５】
１以上の先の実施形態において、前記凝集物は、望ましいタンパク質と汚染物とのヘテロ凝集物を含んでなるものである。
【００４６】
１以上の先の実施形態において、前記ヘテロ凝集物は、望ましいタンパク質と実質的に同じ水力学的サイズのものである。
【００４７】
１以上の先の実施形態において、前記汚染物は、核酸、ヌクレオチド、エンドトキシン、金属イオン、タンパク質、脂質、または細胞培養培地成分であってよい。
【００４８】
１以上の先の実施形態において、前記望ましいタンパク質および汚染物のヘテロ凝集物の存在は、実質的に排除される。
【００４９】
１以上の先の実施形態において、前記望ましいタンパク質は抗体もしくは抗体断片、または抗体もしくは抗体断片の接合体である。一定の実施形態において、前記抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＡである。一定の実施形態において、前記抗体断片はＦｃ融合タンパク質、または免疫複合体である。
【００５０】
１以上の先の実施形態において、前記望ましいタンパク質は、組み換えタンパク質である。
【００５１】
１以上の先の実施形態において、前記望ましいタンパク質は血液凝固因子である。
【００５２】
１以上の先の実施形態において、前記血液凝固因子は第ＶＩＩＩ因子である。
【００５３】
１以上の先の実施形態において、前記望ましいタンパク質は成長ホルモンである。幾つかのこのような実施形態において、前記成長ホルモンはヒト成長ホルモンである。
【００５４】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルは細胞培養回収物、細胞培養上清、細胞培養に由来する抗体含有溶液、またはタンパク質精製の前の段階からの抗体含有溶液である。幾つかのこのような実施形態において、培養細胞は哺乳類細胞である。このような幾つかの実施形態において、前記培養細胞は細菌細胞である。幾つかのこのような実施形態において、前記培養細胞は酵母細胞である。
【００５５】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルは、タンパク質精製の先の段階からの抗体含有溶液である。
【００５６】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルは、クロマトグラフィーカラムからの溶出液である。
【００５７】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルは中間レベルの純度で精製されてよく、または高度に精製されてよい。
【００５８】
１以上の先の実施形態において、前記製剤を第一および第二の成分を通して流すことにより、前記サンプルは前記第一および第二の成分と接触される。
【００５９】
１以上の先の実施形態において、前記第一の成分の表面の電気陰性は、２以上の化学的官能性を組み込んだ１以上の種類の複合化学部分を介して、または表面上に混在する単純および複雑な化学基の組合せ、または異なる化学組成の表面の組合せを介して与えられる。
【００６０】
１以上の先の実施形態において、前記第一の成分の表面電気陰性は、部分的には、イミノ二酢酸、エチレングリコール（アミノエチルエーテル）二酢酸、ニトロ酢酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、カルボン酸、亜硫酸、スルホネート、およびリン酸からなる群からの成分によって与えられる。
【００６１】
１以上の先の実施形態において、前記第二の成分の表面電気陽性は、２以上の化学的官能性を組み込んだ１以上の種類の複合化学部分を介して、または表面上に混在する単純および複雑な化学基の組合せ、または異なる化学組成の表面の組合せを介して与えられる。
【００６２】
１以上の先の実施形態において、前記追加の固体成分／基体の表面は、水素結合、疎水性相互作用、金属親和性、または他の化学的相互作用に関与できるような追加の電気陽性、および／または電気陰性、および／または非帯電性の化学基を帯びていてよい。特別の実施形態において、金属親和性は、金属イオン、ゼロ価金属、またはそれらの組合せについての親和性を含んでいてよい。
【００６３】
１以上の先の実施形態において、前記第二の成分の表面電気陽性は、部分的には、トリス（２−アミノエチル）アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、ＰＡＭＡＭデンドリマー  （エチレンジアミンコア）、デフェロキサミン、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、四級アミノ基およびそれらの組合せからなる群から選択される部分によって与えられる。
【００６４】
１以上の先の実施形態において、前記第一の成分の表面電気陰性は、部分的にはイミノ二酢酸によって与えられ、また前記第二の異成分の表面電気容易性は、部分的にはトリス（２−アミノエチル）アミンによって与えられる。
【００６５】
１以上の先の実施形態において、前記第一の成分は、金属親和性官能性を保持する表面結合した化学部分を有する。
【００６６】
１以上の先の実施形態において、前記第二の成分の電気陽性表面は、金属親和性官能性を保持する表面結合した化学部分を含んでいる。
【００６７】
１以上の先の実施形態において、前記少なくとも一つの基体は、前記金属親和性官能性を有する表面結合した化学部分に加えて1以上の化学部分を有し、かかる追加の化学部分は前記１以上の成分が、前記タンパク質製剤のタンパク質との水素結合、疎水性相互作用またはπ−π結合に関与する能力を高める。
【００６８】
１以上の先の実施形態において、金属親和性官能性を有する前記表面結合した化学部分は、多座配位の金属キレート化部分である。
【００６９】
１以上の先の実施形態において、前記混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、エタクリジン、９−アミノアクリジン（アミナクリン）、３，６−アクリジンジアミン（プロフラビン）、アクリゾルシン、アクリザン（フェナクリダン）、アクリジンオレンジ、キナクリン、アクリシド（アクリサイド（acricide））、アクリドン、アクリジン−９−カルボン酸，  アクラニル（アクラニル（acranil；１−［（６−クロロ−２−メトキシ−９−アクリジニル）アミノ］−３−（ジエチルアミノ）−２−プロパノール二塩酸塩）、フェノサフラニン、フェノキサジン、フェノチアジン、アクリフラビン（acriflavine；  ３，６−ジアミノ−１０−メチルアクリジニウム塩化物および３，６−アクリジンジアミン）、ポリエチレンイミン、クロロヘキシジン、およびポリアミノ酸からなる群から選択される。
【００７０】
１以上の先の実施形態において、前記混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、エタクリジン、ポリエチレンイミンもしくはクロロヘキシジン、またはそれらの塩である。
【００７１】
１以上の先の実施形態において、前記混在した化学的特徴の有機多価陽イオンはエタクリジンまたはその塩である。
【００７２】
１以上の先の実施形態において、前記混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、約０．０１％〜０．０５％の量で存在する。
【００７３】
１以上の先の実施形態において、前記混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、約０．０１％未満の量で存在する。
【００７４】
１以上の先の実施形態において、前記混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、約０．００５％未満の量で存在する。
【００７５】
１以上の先の実施形態において、前記混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、約０．００１未満の量で存在する。
【００７６】
１以上の先の実施形態において、前記混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、約０．０２０％〜０．０２５％の量で存在する。
【００７７】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルは、前記サンプルを前記第一および第二の成分に接触させる工程に先立って、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、エタクリジン、クロロヘキシジン、およびそれらの塩からなる群からの２以上の有機多価陽イオンで処理される。
【００７８】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルを前記第一および第二の成分と接触させる工程に先立って前記サンプルを処理するために使用される有機多価陽イオンは、１％未満の濃度、または０．１％未満の濃度で提供される。
【００７９】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルを前記第一および第二の成分と接触させる工程に先立って前記サンプルを処理するために使用される有機多価陽イオンは、約０．０１％〜約０．０５％の濃度で提供される。
【００８０】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルを前記第一および第二の成分と接触させる工程に先立って前記サンプルを処理するために使用される有機多価陽イオンは、約０．０１％未満の濃度で提供される。
【００８１】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルを前記第一および第二の成分と接触させる工程に先立って前記サンプルを処理するために使用される有機多価陽イオンは、約０．００５％未満の濃度で提供される。
【００８２】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルを前記第一および第二の成分と接触させる工程に先立って前記サンプルを処理するために使用される有機多価陽イオンは、約０．００１％未満の濃度で提供される。
【００８３】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルを前記第一および第二の成分と接触させる工程に先立って前記サンプルを処理するために使用される有機多価陽イオンは、約０．０２０％〜約０．０２５％の濃度で提供される。
【００８４】
１以上の先の実施形態においては、前記サンプルを第一および第二の成分と接触させる工程に先立って、前記サンプルは更に、非イオン性有機ポリマー、有機溶媒、表面活性剤、およびウレイドからなる群から選択される可溶性有機モジュレータと接触される。
【００８５】
１以上の先の実施形態においては、前記サンプルを第一および第二の成分と接触させる工程に先立って、前記サンプルは更に、抗ウイルス剤と接触される。
【００８６】
１以上の先の実施形態において、前記抗ウイルス剤は非多価有機陽イオンである。
【００８７】
１以上の先の実施形態において、前記抗ウイルス剤は、塩化ベンザルコニウム、メチレンブルーおよびリン酸トリ（ｎ−ブチル）からなる群から選択される。
【００８８】
１以上の先の実施形態において、前記抗ウイルス剤は、約１％（ｗ／ｖ）未満の量で存在する。
【００８９】
１以上の先の実施形態において、前記抗ウイルス剤は、約０．１％（ｗ／ｖ）未満の量で存在する。
【００９０】
１以上の先の実施形態において、前記抗ウイルス剤は、約０．０１％（ｗ／ｖ）未満の量で存在する。
【００９１】
１以上の先の実施形態において、前記抗ウイルス剤は、約０．００１％（ｗ／ｖ）未満の量で存在する。
【００９２】
１以上の先の実施形態において、前記方法は、前記サンプルを前記第一および第二の成分と接触させる工程に先立って、前記サンプルを、前記タンパク質製剤中でウレイドが過飽和するのに十分な量のウレイドと接触させる工程と、前記サンプルの固体または不溶性タンパク質から、望ましいタンパク質を含有する上清を分離する工程を含んでいる。
【００９３】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルをウレイドと接触させる工程は、前記サンプルを、前記混在した化学的特徴の可溶性有機多価陽イオンと接触させる工程に先立って行われる。
【００９４】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルをウレイドと接触させる工程は、前記サンプルを、前記混在した化学的特徴の可溶性有機多価陽イオンと接触させる工程と実質的に同時に行われる。
【００９５】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルをウレイドと接触させる工程は、前記サンプルを、前記混在した化学的特徴の可溶性有機多価陽イオンと接触させる工程の後に行われる。
【００９６】
１以上の先の実施形態において、前記ウレイドは、尿素、尿酸、ヒダントイン、アラントイン、アルクロキサ、アルジオキサ、ヘモケイン（hemocane）、ウレイドヒダントイン、５−ウレイドヒダントイン、グリオキシルウレイド、グリオキシル酸ジウレイド、２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル尿素、およびプリン類からなる群から選択される。
【００９７】
１以上の先の実施形態において、前記ウレイドはアラントインである。
【００９８】
１以上の先の実施形態において、前記ウレイドは尿酸である。
【００９９】
１以上の先の実施形態において、前記アラントインは０．５％（ｗ／ｖ）を超える量で存在する。
【０１００】
１以上の先の実施形態において、前記アラントインは約１％（ｗ／ｖ）を超える量、または約２％（ｗ／ｖ）を超える量、または約５％（ｗ／ｖ）を超える量、または約１０％（ｗ／ｖ）を超える量で存在する。
【０１０１】
１以上の先の実施形態において、前記尿酸は０．００２５％（ｗ／ｖ）を超える量で存在する。
【０１０２】
１以上の先の実施形態において、前記尿酸は０．０１％（ｗ／ｖ）を超える量で存在する。
【０１０３】
１以上の先の実施形態において、前記尿酸は０．１％（ｗ／ｖ）を超える量で存在する。
【０１０４】
１以上の先の実施形態において、前記尿酸は１％（ｗ／ｖ）を超える量で存在する。
【０１０５】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルを前記有機モジュレータと接触させる工程は、前記サンプルを前記可溶性有機多価陽イオンと接触させる工程に先立って行われる。
【０１０６】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルを前記有機モジュレータと接触させる工程は、前記サンプルを前記混在した化学的特徴の可溶性有機多価陽イオンと接触させる工程に先立って行われる。
【０１０７】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルを前記有機モジュレータと接触させる工程は、前記サンプルを前記混在した化学的特徴の可溶性有機多価陽イオンと接触させる工程と実質的に同時に行われる。
【０１０８】
１以上の先の実施形態において、前記サンプルを前記有機モジュレータと接触させる工程は、前記サンプルを前記混在した化学的特徴の可溶性有機多価陽イオンと接触させる工程の後で行われる。
【０１０９】
１以上の先の実施形態において、前記有機モジュレータは、グリセロール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリブチレングリコールからなる群から選択される非イオン性有機ポリマーである。
【０１１０】
１以上の先の実施形態において、前記非イオン性有機ポリマーは、約５００Ｄ以下の平均分子量を有する。
【０１１１】
１以上の先の実施形態において、前記有機モジュレータは、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、イソプロパノール、およびフェノキシエタノールからなる群から選択される有機溶媒である。
【０１１２】
１以上の先の実施形態において、前記有機モジュレータは、約１％（ｗ／ｖ）以上の濃度で与えられる。前記有機モジュレータがエタノールまたはイソプロパノールである１以上の先の実施形態において、前記有機モジュレータは約１％（ｗ／ｖ）以下の濃度で与えられる。
【０１１３】
１以上の先の実施形態において、前記有機モジュレータは、ツイーン、トリトン、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯおよびオクチルグルコシドからなる群から選択される表面活性剤である。
【０１１４】
１以上の先の実施形態において、前記表面活性剤は、約１％（ｗ／ｖ）以下の濃度で与えられる。
【０１１５】
１以上の先の実施形態において、前記表面活性剤は、約０．１％（ｗ／ｖ）以下の濃度で与えられる。
【０１１６】
１以上の先の実施形態において、前記有機モジュレータは、飽和未満の量で与えられるウレイドである。
【０１１７】
１以上の先の実施形態において、前記ウレイドは尿素、ヒダントイン、およびアラントインからなる群から選択される。
【０１１８】
幾つかの実施形態において、本発明は、先の実施形態の何れかの方法の便宜な実施のためのキットを提供する。
【０１１９】
一定の実施形態において、本発明は、望ましいタンパク質を含有するサンプルの凝集物含量を低減する方法であって、（ｉ）電気陰性表面を有する第一の固体基体である第一の成分を準備する工程と；（ｉｉ）電気陽性表面を有する第二の固体基体である第二の成分を準備する工程と；（ｉｉｉ）前記サンプルを第一および第二の成分と接触させる工程であって、ここでの第一および第二の成分は、前記望ましいタンパク質が前記第一および第二の成分に結合するのを実質的に防止する操作条件下で、前記サンプルが両方の成分と同時に接触し得るように構成される工程と；（ｉｖ）前記望ましいタンパク質を含有し且つ凝集物含量が低下した得られたサンプルを、前記第一および第二の成分から分離する工程を具備する方法を提供する。
【０１２０】
一定の実施形態において、前記混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、前記サンプルを前記第一および第二の成分と接触させる前に、前記サンプルと合体される。一定の実施形態において、前記第一および第二おい成分は、前記タンパク質製剤と接触させる前に合体される。一定の実施形態において、前記サンプルは、該サンプルを前記第一および第二の成分と接触させることに先立って、適切な時間に亘り、前記混在した化学的特徴の有機多価陽イオンと共にインキュベートされる。一定の実施形態において、前記サンプルは、適切な時間に亘って前記第一および第二の成分と共にインキュベートされる。一定の実施形態において、前記混在した化学的特徴を有する有機多価陽イオンは、前記凝集体含量の低減されたサンプルを前記第一および第二の成分から分離する工程において、前記混在した化学的特徴を有する有機多価陽イオンが前記第一または第二の成分の基体と関連づけられる程度にまで前記サンプルから除去される。
【０１２１】
一定の実施形態において、前記第一の基体は粒子状である。一定の実施形態において、前記第二の基体は粒子状である。これら粒子状の基体は、それぞれ複数の粒子として提供することができる。一定の実施形態において、前記第一の基体および第二の基体の何れかまたは両者は、非多孔質または多孔質であることができる。このような多孔質粒子は、タンパク質製剤中のタンパク質の侵入を許容するために十分に大きいか、またはタンパク質製剤中のタンパク質の侵入を許容するには小さ過ぎるか、または約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの平均孔サイズを有することができる。前記基体が粒子である一定の実施形態において、該粒子は多孔質膜の間にサンドイッチされるか、またはモノリスである。一定の実施形態において、該粒子は織布製または非晶質繊維製のフィルターの間にサンドイッチされる。一定の実施形態において、前記粒子は結晶性フリットの間にサンドイッチされる。一定の実施形態において、該粒子は網状ポリマーネットワークの中に埋め込まれる。
【０１２２】
一定の実施形態において、前記サンプルの導電性は、前記第一および第二の基体に接触しながら、前記サンプルからの望ましいタンパク質の沈殿を実質的に回避するために十分に高レベルである。一定の実施形態において、前記サンプルの導電性は２０ｍＳ／ｃｍよりも大きい。換言すれば、前記サンプルは３０ｍＳ／ｃｍより大きく、約４０ｍＳ／ｃｍより大きく、または約１００ｍＳ／ｃｍより大きい。一定の実施形態において、前記サンプルの導電性は、前記サンプルを前記第一および第二の成分と接触させる工程に先立って、前記混在した化学的特徴の有機多価陽イオンに接触しながら該サンプルからの望ましいタンパク質の沈殿を実質的に回避するのに十分な導電性よりも、少なくとも５％、１０％、２０％、５０％、１００％または２００％高い。
【０１２３】
一定の実施形態において、前記凝集体は、望ましいタンパク質のホモ凝集体を含んでいる。一定の実施形態において、望ましいタンパク質のホモ凝集体の存在は実質的に排除される。一定の実施形態において、前記凝集体は望ましいタンパク質と汚染物または複数の汚染物とのヘテロ凝集体を含んでいる。一定の斯かる実施形態において、前記ヘテロ凝集体は、望ましいタンパク質と実質的に同じ水力学的サイズのものである。一定の実施形態において、前記汚染物は核酸、ヌクレオチド、エンドトキシン、金属イオン、タンパク質、脂質、または細胞培養培地成分である。一定の斯かる実施形態において、望ましいタンパク質と汚染物とのヘテロ凝集物の存在は実質的に排除される。一定の実施形態において、サンプル中の凝集体は、ホモ凝集物およびヘテロ凝集物の両方を含んでいる。一定の実施形態において、前記望ましいタンパク質は抗体または抗体断片である。一定の斯かる実施形態において、前記サンプルは、細胞培養回収物、細胞培養上清、細胞培養由来の抗体含有溶液、またはタンパク質精製の前の段階からの抗体含有溶液のような、タンパク質製剤である。一定の斯かる実施形態において、前記タンパク質製剤は、タンパク質精製の前の段階からの抗体含有溶液である。一定の斯かる実施形態において、前記タンパク質製剤は、クロマトグラフィーカラムからの溶出液である。
【０１２４】
一定の実施形態において、前記タンパク質製剤は精製されなくてもよく、中間レベルの純度で生成されてもよく、または高度に精製されてもよい。幾つかの実施形態において、前記サンプルの中間レベルの純度は、約４０％〜約９０％の純度の範囲であってよい。幾つかの実施形態において、前記サンプルの高レベルの純度は、約９０％以上の範囲であってよい。
【０１２５】
一定の実施形態において、前記タンパク質製剤は、該製剤を前記第一および第二の成分を通して流すことにより、前記第一および第二の成分と接触される。
【０１２６】
一定の実施形態において、前記第一の成分の表面の電気陰性は、２以上の化学官能性を組み込んだ１以上の種類の複合化学部分を介して、または該表面上で混合された単純な化学基および複雑な化学基の組合せ、もしくは異なる化学組成の表面の組合せを介して与えられる。一定の実施形態において、前記第一の成分の表面の電気陰性は、部分的には、イミノ二酢酸、エチレングリコール（アミノエチルエーテル）二酢酸、ニトリロ酢酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、カルボン酸、亜硫酸、スルホネート、またはリン酸からなる群から選ばれる部分によって与えられる。一定の実施形態において、前記第二の成分の表面の電気陽性は、２以上の化学官能性を組み込んだ１以上の種類の複合化学部分を介して、または該表面上で混合された単純な化学基および複雑な化学基の組合せ、もしくは異なる化学組成の表面の組合せを介して与えられる。一定の斯かる実施形態において、前記第二の成分の表面の電気陽性は、部分的には、トリス（２−アミノエチル）アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、ＰＡＭＡＭデンドリマー（エチレンジアミンコア）、デフェロキサミン、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、および四級アミノ基からなる群から選択される。一定の実施形態において、該第一の成分の電気陰性は部分的にはイミノ二酢酸によって与えられ、また前記第二の成分の表面の電気陽性は、部分的にはトリス（２−アミノエチル）アミンからなる基由来の部分によって与えられる。一定の実施形態において、前記第一の成分は、金属親和性官能性を保持する表面結合型の化学部分を有しており、また前記第二の成分は電気陽性表面を有する第二の基体である。一定の実施形態において、前記第二の成分は、電気陽性表面を有する第二の基体であり、また該電気陽性表面は、金属親和性官能性を保持する表面結合型化学部分を含んでいる。一定の斯かる実施形態において、少なくとも一つの前記基体は、金属親和性官能性を保持する前記表面結合型化学部分に加えて１以上の化学部分を有しており、斯かる追加の化学部分は、タンパク質製剤のタンパク質との水素結合、疎水性相互作用またはπ−π結合に関与する前記成分の１以上の能力を向上させる。一定の実施形態において、金属親和性官能性を保持する前記表面結合型化学部分は、多座配位金属キレート化部分である。
【０１２７】
一定の実施形態において、前記サンプルは、前記第一および第二の成分の表面に対して露出される前に、混在した化学的特徴の有機多価陽イオンで処理される。このような有機多価陽イオンには、エタクリジン、９−アミノアクリジン（アミナクリン）、３，６−アクリジンジアミン（プロフラビン）、アクリゾルシン、アクリザン、（フェナクリダン）、アクリジンオレンジ、キナクリン、アクリサイド（acricide）、アクリドン、アクリジン−９−カルボン酸、アクラニル（acranil；１−［（６−クロロ−２−メトキシ−９−アクリジニル）アミノ］−３−（ジエチルアミノ）−２−プロパノール二塩酸塩）、フェノサフラニン、フェノキサジン、フェノチアジン、アクリフラビン（３，６−ジアミノ−１０−メチルアクリジニウム塩化物および３，６−アクリジンジアミン）、ポリエチレンイミン、クロロヘキシジン、またはポリアミノ酸が含まれてよい。一定の実施形態において、該混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、エタクリジン、ポリエチレンイミン、もしくはクロロヘキシジンまたはそれらの塩である。一定の実施形態において、該混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、エタクリジンまたはそれらの塩である。一定の実施形態において、該混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、約０．０１％〜０．０５％の量で存在する。一定の実施形態において、該混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、約０．０１％未満の量で存在する。一定の実施形態において、該混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、約０．００５％未満の量で存在する。一定の実施形態において、該混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、約０．００１％未満の量で存在する。一定の実施形態において、該混在した化学的特徴の有機多価陽イオンは、約０．０２０％〜約０．０２５％の量で存在する。
【０１２８】
一定の実施形態において、前記サンプルは、該サンプルを前記第一および第二の成分に接触させる工程に先立って、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、エタクリジン、またはクロロヘキシジンおよびそれらの塩のような１以上の有機多価陽イオンで処理される。一定のこのような実施形態において、サンプルを前記第一および第二の成分と接触させる工程に先立って該サンプルを処理するために使用される前記有機多価陽イオンは、１％未満の濃度で与えられる。一定の実施形態において、サンプルを前記第一および第二の成分と接触させる工程に先立って該サンプルを処理するために使用される前記有機多価陽イオンは、約０．０１％〜約０．０５％の濃度、または約０．０１％未満の濃度、または約０．００５％未満の濃度、または約０．００１％未満の濃度、または約０．０２０％〜約０．０２５％の濃度で与えられる。
【０１２９】
一定の実施形態において、前記サンプルは更に、非イオン性有機ポリマー、有機溶媒、表面活性剤、およびウレイドからなる群から選択される可溶性有機モジュレータと接触され、該サンプルを該可溶性有機モジュレータと接触させる斯かる工程は、該サンプルを前記第一および第二お成分と接触させる工程に先立って行われる。
【０１３０】
一定の実施形態において、前記サンプルは更に抗ウイルス剤と接触され、該抗ウイルス剤に前記サンプルを接触させる斯かる工程は、該サンプルを前記第一および第二の成分と接触させる工程に先立って行われる。一定の斯かる実施形態において、該抗ウイルス剤は塩化ベンザルコニウム、メチレンブルーまたはリン酸トリ（ｎ−ブチル）のような非多価有機陽イオンである。一定の斯かる実施形態において、前記抗ウイルス剤は約１％（ｗ／ｖ）未満の量、または約０．１％（ｗ／ｖ）の量、または約０．０１％（ｗ／ｖ）未満の量、または約０．００１％（ｗ／ｖ）未満の量で存在する。
【０１３１】
一定の実施形態において、本発明は、前記サンプルを、ウレイドが前記タンパク質製剤中で過飽和されるのに十分な量のウレイドと接触させる追加の工程と、前記望ましいタンパク質を含有する上清を前記タンパク質製剤の一部から分離する追加の工程提供するものであり、前記サンプルをウレイドと接触させる斯かる工程は、前記サンプルを前記第一および第二の成分と接触させる工程に先立って行われる。一定のこのような実施形態において、前記ウレイドは尿素、尿酸、ヒダントイン、アラントイン、アルクロキサ、アルジオキサ、ヘモケイン（ｈｅｍｏｃａｎｅ）、ウレイドヒダントイン、５−ウレイドヒダントイン、グリオキシルウレイド、グリオキシル酸ジウレイド、２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル尿素、またはプリン類である。一定の斯かる実施形態において、前記ウレイドはアラントインである。他の実施形態において、前記記ウレイドは尿酸である。一定の実施形態において、前記アラントインは０．５％（ｗ／ｖ）を超える量、または約１％（ｗ／ｖ）を超える量で存在する。一定の実施形態において、前記尿酸は０．００２５％（ｗ／ｖ）を超える量、または約０．０１％（ｗ／ｖ）を超える量、または約０．１％（ｗ／ｖ）を超える量、またはまたは約１％（ｗ／ｖ）を超える量で存在する。
【０１３２】
一定の実施形態において、前記有機モジュレータはポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびポリブチレングリコールからなる群から選択される非イオン性有機ポリマーである。一定の実施形態において、前記非イオン性有機ポリマーは、約５００Ｄ以下の平均分子量を有する。一定の実施形態において、前記有機モジュレータは、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、またはフェノキシエタノールのような有機溶媒である。一定の実施形態において、前記有機モジュレータは、約１％（ｗ／ｖ）以上の濃度で与えられる。一定の実施形態において、前記有機モジュレータはツイーン、トリトン、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯおよびオクチルグルコシドからなる群から選択される表面活性剤である。一定の斯かる実施形態において、前記表面活性剤は、約１％（ｗ／ｖ）未満の量、または約０．１％（ｗ／ｖ）の量、または約０．０１％（ｗ／ｖ）未満の量で与えられる。一定の実施形態において、前記有機モジュレータは、飽和未満の量で与えられるウレイドである。一定の斯かる実施形態において、前記ウレイドは尿素、ヒダントインおよびアラントインからなる群から選択される。
【０１３３】
一定の実施形態において、本発明は、本発明の実施に必要な材料の幾つかまたは全てを、好ましくは本発明の実施のために便宜な量および濃度で含む、本発明の方法の便宜な実施のためのキットを提供する。
【０１３４】
本発明がもっと容易に理解され得るように用語を定義する。追加の定義は、詳細な説明の全体を通して与えられる。
【０１３５】
「凝集体」とは、２以上の分子の会合体であって、生理学的条件で安定であり、且つ広範なｐＨおよび導電性条件に亘って安定なまま残る可能性のあるものを言う。凝集体は、多くの場合、タンパク質、核酸もしくは脂質のような少なくとも一つの生体分子、およびもう一つの分子もしくは金属イオンを含んでなるものである。該召集体は、何らかのタイプの化学的相互作用、または化学的相互作用の何れかの組合せを介して生じる可能性がある。抗体の凝集物は、二つのカテゴリーに分類することができる。「ホモ凝集体」とは、２以上の抗体分子の安定な会合物を意味する。「ヘテロ凝集体」とは、１以上の抗体分子と１以上の非抗体分子との安定な会合物を言う。この非抗体成分は、ヌクレオチド、エンドトキシン、金属イオン、タンパク質、脂質、または細胞培養培地成分からなる群からの１以上の要素からなっていてよい。
【０１３６】
「抗体」とは、免疫グロブリン、その複合体もしくはその断片を言う。この用語は、ヒトまたは他の哺乳動物細胞株由来のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭクラスのポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を含むが、これらに限定されず、またヒト化、ヒト、単鎖、キメラ、合成、組み換え、ハイブリッド、突然変異、グラフト化、およびインビトロ生成のような天然もしくは遺伝子改変された抗体を含んでいる。「抗体」には複合体の形態も含まれ、該複合体には免疫グロブリン部分を含有する融合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。「抗体」はまた、それらが抗原結合機能を保持しても保持しなくても、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、Ｆｃのような抗体断片、および他の組成物をも含むものである。
【０１３７】
「電気陽性表面」とは、陽性電荷が優勢な基体または固体材料の表面を言う。表面の電気陽性は、アミノ、エチレンジアミノ-、ジエチルアミノエチル、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミンのような弱い陰イオン交換基、四級アミノ基のような強い陰イオン交換基；ポリリジン、ポリアルギニン、もしくはトリス（２−アミノエチル）アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラアミン、ＰＡＭＡＭデンドリマー（エチレンジアミンコア）、デフェロキサミンまたは上記の何れかの組合せのような組み合わされた弱−強い交換体によって与えられてよい。正に帯電した表面上の混在した化学的特徴を形成する副次的官能性は、負または正に帯電した基、疎水性基、π−π結合基、水素結合基、または金属キレート化基からなっていてよい。この副次的官能性は、それによって当該粒子が合成される製造材料またはプロセスの偶発的副生成物として電気陽性表面上に存在してよく、或いはそれらは作為的な設計によって存在させられてもよい。該副次的官能性の濃度は、１ミリ等量／ｍＬ粒子未満から１００ミリ等量/ｍＬの範囲に亘ってよい。
【０１３８】
「電気陰性表面」とは、負電荷が支配的である基体または固体材料の表面を言う。表面の電気陰性は、限定されるものではないが、カルボキシル、アミノカルボキシル（イミノ二酸またはニトリロアセチル）、またはホスホリルのような所謂弱陽イオン交換体、或いはスルホもしくはサルフェート部分、ＳＯ３−のような強イオン交換体を含む化学基によって与えられる。負に帯電した表面上に混在した化学的特徴を形成する二次的官能性は、負または正に帯電した基、疎水性基、π−π結合基、水素結合基、もしくは金属キレート化基からなっていてよい。該二次的官能性は、前記粒子が合成される製造プロセスの偶発的副生成物として電気陰性表面に存在してよく、或いは、それらは意図的な設計により存在してもよい。二次的官能性の濃度は、１ｍＬの粒子当たり１ミリ等量未満から１ｍＬ当たり１００ミリ等量超まで変化してよい。
【０１３９】
「エンドトキシン」とは、グラム陰性菌の外膜に存在し、溶解の際に細胞から放出される有毒な熱安定性リポ多糖基体を言う。エンドトキシンは、それらのリン酸およびカルボキシ残基の高含有量に起因して、一般的に酸性である可能性があり、またリピドＡ領域の脂肪酸含量に起因して高度に疎水性である可能性がある。エンドトキシンは、水素結合のための広範な機会を提供することができる。
【０１４０】
「金属親和性官能性」とは、好ましくは１：１の形で金属イオンを結合するために表面ンに固定化され得る化学部分の能力を言う。このような部分は、金属イオンとの配位結合を形成する能力を有していてよく、また斯かる部分はその特徴において二座配位もしくは多座配位であってよい。この能力を備えた電気陰性部分の非限定的な例には、イミノ二酢酸（２−（カルボキシメチルアミノ）酢酸）およびニトリロ酢酸（２，２’，２”−ニトリロ三酢酸）が含まれる。電気陽性化合物の例には、トリス（２−アミノエチル）アミンもしくはジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、およびデフェロキサミンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１４１】
「非イオン性有機ポリマー」とは、帯電基を持たない連結された反復有機サブユニットで構成された天然に存在する炭化水素または合成の炭化水素を言う。それは直鎖状、幾らかの分岐を伴った主に直鎖状、または主に直鎖状であってよい。本発明を実施するために適切な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が含まれるが、これらに限定されない。ＰＥＧは構造式  ＨＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｈを有する。その例には、限定されるものではないが、１００ダルトン未満から１０００ダルトン超に亘る平均ポリマー分子量を備えた組成物が含まれる。
【０１４２】
「有機多価陽イオン」とは、少なくとも一つの正電荷および少なくとも一つの追加の化学官能性を組み込んで多価になった、天然もしくは合成起源の有機分子、陽イオンまたは塩を言う。一定の実施形態においては、前記有機多価陽イオンが２以上の正電荷を帯びるように、有機多価陽イオンの少なくとも一つの追加の化学官能性は追加の正電荷である。前記有機多価陽イオン（またはＯＭＣ）はまた、正味の正電荷または正味の中性電荷を有するように、負の電荷を帯びていてよい。ＯＭＣが正味の正電荷である場合、それは塩化物イオン、臭化物イオン、硫酸イオン、有機酸イオン、乳酸イオン、グルコン酸イオンのような陰イオン、および本方法とは適合しない何れか他の陰イオンと共に与えられてよい。一定の実施形態において、ＯＭＣの一定の正電荷はアミン、イミンまたは他の窒素部分によって供給される。更に、該ＯＭＣは混在した化学的特徴であってよく、また疎水性残基、他の官能性部分を含んでよく、および／または、例えば水素結合、疎水性相互作用、π−π結合、金属配位およびインターカレーションに関与する能力を含む他の型の化学的相互作用に関与する能力を有していてよい。一定の実施形態におけるＯＭＣの例には、ジアミノ酸、ジ−またはトリ−以上の大きなホモ−もしくはヘテロ−ペプチド、例えばポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン；ポリエチレンイミン；ポリアリルアミン；ポリジメトリン（polydimetrine），ポリメチルアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニア；ポリジアリルジメチルアンモニア；ポリビニルベンジルトリメチルアンモニア；ポリビニルグアニジン；ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジン；ＤＥＡＥ−デキストラン；ＤＥＡＥ−セルロース；エタクリジン（ＣＡＳ数４４２−１６−０；  ７−エトキシアクリジン−３，９−ジアミン）；トリス（２−アミノエチル）アミン；グアニジン；クロロヘキシジン；アレキシジン；シトリシダル（citricidal）、プロタミン；  スペルミン；スペルミジン；サルミン（salmine）；キトサン；並びに上記のものの変異体  および誘導体が含まれるが、これらに限定されない。例えば、エタクリジンの変異体および誘導体には、９−アミノアクリジン（アミナクリン）、３，６−アクリジンジアミン（プロフラビン）、アクリゾルシン、アクリザン（フェナクリダン）、アクリジンオレンジ、キナクリン、アクリサイド（acricide）、アクリドン、アクリジン−９−カルボン酸、アクラニル（acranil；１−［（６−クロロ−２−メトキシ−９−アクリジニル）アミノ］−３−（ジエチルアミノ）−２−プロパノール二塩酸塩）、フェノサフラニン、フェノキサジン、フェノチアジン、アクリフラビン（３，６−ジアミノ−１０−メチルアクリジニウム塩化物および３，６−アクリジンジアミン）、およびそれらの塩（例えば塩化物、臭化物、硫酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩）が含まれるものと理解される。
【０１４３】
「有機溶媒」とは、天然に生じる有機化合物または合成有機化合物であって、液体状態で存在するものを言う。本発明を実施するのに適した例には、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、およびフェノキシエタノールが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４４】
「ポリヌクレオチド」とは、鎖状に共有結合された複数のヌクレオチドモノマーで構成されるバイオポリマーを言う。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）は、ポリヌクレオチドの例である。ポリヌクレオチドは、水素結合の形成のための高い性向を有することができる。
【０１４５】
「タンパク質」とは、炭素、水素、酸素、窒素、および通常は硫黄を含有し、また主にペプチド結合で連結されたアミノ酸の１以上の鎖で構成された、一群の複雑な有機マクロ分子を意味する。該タンパク質は、天然起源または組み換え起源のものであってよい。タンパク質は、グリコシル化、ＰＥＧ化、または他の化学部分との結合を介したような、非アミノ酸部分で修飾されてよい。タンパク質の例には、抗体、凝固因子、酵素およびペプチドホルモンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４６】
「タンパク質製剤」とは、細胞を含有する細胞培養回収物、（実質的に）細胞を含まない細胞培養上清、またはある精製段階からの興味あるタンパク質を含有する溶液のような、興味あるタンパク質を含有する何らかの水性または殆ど水性の溶液を言う。
【０１４７】
「基体」または「固体材料」とは、天然において粒状、結晶性、ポリマー状、繊維状、多孔質中空繊維状、多孔性モノリシックであってよい不溶性の有機固体を言う。粒状であれば、該粒子は大まかに球状であってもよく、球状でなくてもよく、１００ｎｍ未満から１００ミクロン超の範囲に亘るサイズであってよい。多孔質粒子の平均孔サイズは、１０ｎｍ未満（微孔質）から１００ｎｍ超（マクロ孔質）に亘って変化する可能性がある。膜における平均孔サイズは、１００ｎｍ未満から１ミクロン超に亘って変化する可能性がある。膜またはモノリスにおける平均孔サイズは、１ミクロン未満から１０ミクロン超に亘って変化する可能性がある。更に、該固体材料は複合構造からなっていてよく、例えば、網目状マトリックス中に粒子が埋設され、膜の間にサンドイッチされされ、またはその両方であってよい。
【０１４８】
「過飽和されたウレイド」とは、特にタンパク質製剤中において一般的な条件下において、最大溶解度を超える量のウレイドを含有する溶液を言う。一定の実施形態において、本発明は、斯かるウレイドの溶解度よりも多い量で存在するウレイドを伴ったサンプルを提供する。一定の実施形態において、本発明は、かかるウレイドの幾らかの画分が該サンプル中において不溶性の形態で存在するような、斯かるサンプルについての条件下で斯かるウレイドの溶解度よりも多い量で存在するウレイドを伴ったサンプルを提供する。
【０１４９】
「表面活性剤」とは、一般に、それらを両親媒性にするような疎水性部分および親水性部分を組み込んだ、斯かる種類の有機分子のような「表面活性化物質」を含むものである。表面活性剤は、水性溶液中での十分な濃度では、疎水性部分を中心に集積して水との接触を最小化し、且つ親水性部分を放射状に外側に向けて水との接触を最大化させることにより、クラスターへと自己会合することができる。生物学的製剤、特に疎水性の特徴を有し、または疎水性の特徴領域を保有するものの存在において、表面活性剤の疎水性部分は、前記疎水性材料の幾つかの部分と自然に会合し、前記表面活性剤の親水性部分の影響によってその溶解度を増大させる傾向がある。それらはまた、何れも水性溶媒中に溶解された異なる疎水性材料の間で生じる疎水性相互作用を調節するために使用されてよい。本発明の一定の実施形態を実施するために適した表面活性剤の例には、ポリソルビン酸表面活性剤（例えばツイーン２０、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、およびツイーン８０、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート）、およびトリトン（例えば、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）、および両イオン性表面活性剤、例えばＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）、およびオクチルグルコシド（例えば、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−６−オクトキシオキサン−３，４，５−トリオール）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５０】
「ウレイド」とは、天然もしくは合成起源の環状または非環状の有機分子であって、１以上の尿素部分またはその誘導体を含んでなるものである。一定の実施形態において、本発明は、尿素、尿酸、ヒダントイン、アラントイン（ＣＡＳ数９７−５９−６；アルクロキサ、アルジオキサ、ヘモケイン（hemocane）、ウレイドヒダントイン、５−ウレイドヒダントイン、グリオキシルウレイド、グリオキシル酸ジウレイド、２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル尿素）、プリン類、およびそれらの誘導体のようなウレイドを提供する。一定の実施形態において、本発明は、式Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ２  またはＲ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ’またはＲ’Ｒ’ ’ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ’ ’ ’Ｒ’ ’ ’の有機分子を提供し、ここで関連の「Ｒ基」はＨまたは何らかの有機部分である。
【０１５１】
「ウイルス」または「ビリオン」とは、生きた宿主、主にバクテリア、植物、および動物の細胞内でのみ複製する超微視的（直径が大略２０〜３００ｎｍ）、かつ代謝的に不活性な感染物質であり：ＲＮＡまたはＤＮＡコア、タンパク質コート、および更に複雑な種類では周囲の外皮で構成される。
【０１５２】
本発明を実施するために使用する固体材料には、天然起源または合成起源の不溶性粒子が含まれ、これは例えばクロマトグラフィーを実施するために通常用いられる多孔性微粒子であるが、これに限定されない。斯かる粒子は、タンパク質（例えば抗体であるが、これに限定されない）の拡散による侵入を許容する大きな孔を組み込んでよく；或いは、塩、糖、およびヘテロ凝集体解離剤のような小さい化学種の拡散的侵入を許容するが、抗体のようなタンパク質の侵入を許容するには小さすぎる小さい孔を組み込んでもよい。
【０１５３】
或いは、この固体材料は、非多孔質の粒子、膜もしくはモノリス、多孔質壁の中空繊維を含む繊維、多孔質膜、および／または上記要素の組合せを用いた複合構造体を含んでいてよい。
【０１５４】
本発明の一定の実施形態を実施するために使用される混在した化学的特徴の粒子は、特に、不溶性有機粒子を含んでいる。このような粒子は、非多孔質または多孔質であってよい。もし多孔質であれば、限定するものではないが抗体のようなタンパク質の拡散による侵入を許容する大きな孔を組み込んでよく；或いは、塩、糖、およびヘテロ凝集体解離剤のような小さい化学種の拡散的侵入を許容するが、小さ過ぎて抗体のようなタンパク質の侵入を許容しない小さい孔を組み込んでもよい。このような粒子により組み込まれる化学的特徴物の混合体は、混在した化学的特徴物の可溶性多価陽イオン物質を取り除くための電気陰性の官能性を含んでいてよく、また更に、凝集体含量を低減する能力を向上させ、および／または限定するものではないが電気陽性、水素結合、疎水性相互作用、π−π結合、および金属配位を含む可溶性物質の除去を容易にする可能性がある。
【０１５５】
電気的陽性の基は、所謂強陰イオン交換基および／または所謂弱陰イオン交換基を含んでいてよい。弱陰イオンン交換または混合型の強−弱陰イオン交換の電気的陽性基は、溶解された金属イオンとの配位相互作用に関与して、適用された生物学的サンプルから汚染金属イオンを除去する望ましい結果を生じるそれらの能力のために、更に好まれるであろう。金属配位能力を備えたこのような混合型の弱−強陰イオン交換基の非限定的な例は、トリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）である。混在した化学的特徴は、単一の複合化学基の中に、単一タイプの表面上にある異なる特徴の別々の化学基の中に、異なる表面上に、またはこれらの何れかの組合せにおいて存在してよい。
【０１５６】
電気的陰性基は、所謂強陽イオン交換基または所謂弱陽イオン交換機を含んでよい。弱陽イオン交換または混合型強−弱陽イオン交換の電気的陰性基は、溶解された金属イオンとの配位相互作用に関与して、適用された生物学的サンプルから汚染金属イオンを除去する望ましい結果を生じるそれらの能力のために、より好ましいかもしれない。金属配位能力を備えたこのような陽イオン交換基の非限定的な例には、カルボキシ基、ホスホリル基、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）基、およびニトリロ酢酸（ＮＴＡ）基が含まれる。弱いイオン交換基もまた、強いイオン交換基に比較して水素結合を形成するそれらの高められた能力のために好ましいかも知れない。該粒子が１以上の電気陽性官能性を含む限りにおいて、それらは、所謂強陰イオン交換基および／または所謂弱陰イオン交換基によって与えられてよい。
【０１５７】
一定の実施形態において、前記電気陽性もしくは電気陰性材料の表面はまた、脂肪族および／または、または芳香族の特徴の疎水性基を組み込んでもよく、後者は、所謂π−π結合に関与するそれらの能力のために好ましいかもしれない。混合型の化学的特徴は、単一の複合化学基の中に、単一型表面上における異なる特徴の別々の化学基の中に、異なる表面上に、またはこれらの何れかの組合せの中に存在してよい。
【０１５８】
一定の実施形態では、１以上の電気陰性および／または１以上の電気陽性の表面組成が同時に用いられてよく、またそれらは、それらの化学組成および／またはそれらの物理的形態に関して相互に異なってもよい。電気陽性官能性は、電気陰性粒子とは異なり且つ分離された粒子によって媒介されてよい。該粒子は、タンパク質製剤の全体に分散された、または柱の中に充填された、または最初は分散され次いで柱の中に充填された多孔質または非多孔質の粒子を含んでよい。
【０１５９】
個々の特徴が異なる複数の化学的官能性を、特定のサンプル組成の必要性に対してカスタマイズされた種々の比率で用いてよい。例えば、清澄化された細胞培養上清の処理を目的とした組合せは、過剰な電気陽性表面を含んでよいのに対して、エタクリジンまたはポリエチレンイミンのような電気陽性ヘテロ凝集体解離剤で既に処理された上清の処理を目的とした組合せは、過剰量の電気陰性表面を含んでよい。
【０１６０】
本発明の一定の実施形態を実施するために使用される混在した化学的特徴の可溶性多価陽イオンは、少なくとも一つの正電荷を備え、且つ水素結合、疎水性相互作用、π−π結合、金属配位、およびインターカレーションに関与する能力を与える部分のような混在した化学的特徴を与える追加の特徴を備えた有機分子を含んでよい。これらの特徴を組み込んだ多価陽イオンの例には、ポリエチレンイミン、エタクリジン、クロロヘキシジン、その他の数多くのものが含まれる。このような物質は０．００１％〜１．０％に亘る濃度で適用されてよいが、一般には、０．０１〜０．１０％、特に０．０２〜０．０６％または０．０２％〜０．０５％に亘る濃度で使用したときに、凝集体の低減およびタンパク質生成物回収の最良のバランスを提供する。
【０１６１】
一定の実施形態において、当該方法の凝集体低減特性および／または望ましいタンパク質の回収は、可溶性有機物質の同時添加によって向上されてよく、該有機物質は、独立では本発明の他の実施形態と同レベルの凝集物低減を達成するための十分な化学的影響を欠くものである。このような追加の添加剤の例には、ツイーン、トリトン、ブリジ（Brij）、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、およびオクチルグルコシドのような非イオン性または両イオン性の表面活性剤；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、およびポリビニルピロリドン、好ましくは分子量１０００ダルトン未満のもの等の有機ポリマー；エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、フェノキシエタノールのような有機溶媒；炭水化物；尿素、ヒダントイン、およびアラントインを含むウレイドが含まれるが、これらに限定されない。また、限定するものではないが、ウイルスの不活性化等のもう一つ別の目的で添加される可溶性非多価陽イオン物質もまた、この例に含まれてよい。これには、中でも塩化ベンザルコニウム、メチレンブルー、およびリン酸トリ（ｎ−ブチル）が含まれる。一定の実施形態における例には、過飽和量のウレイド、例えば０．００２５％を超える量の尿酸、および０．５６％を超える量のアラントインが含まれる。
【０１６２】
＜シーケンシング＞  一定の実施形態において、前記多価陽イオンおよび混在した化学的特徴の粒子は、凝集物低減を達成するために十分な期間に亘って一緒に存在しなければならない。それらは一緒に添加され、または可溶性物質は不定期間だけ先行して添加されてよい。幾つかの実施形態において、多価陽イオンの先行添加はより良好な結果を生じることができるが、他のフォーマットは多くの応用のために十分な結果を生じるであろう。本発明を実施するために必要な時間は、多価陽イオンの濃度、粒子の比率、および程度は低いがタンパク質製剤の凝集物含量にも直接依存するであろう。
【０１６３】
一定の実施形態において、本発明は、第一および第二の成分の混在した化学的特徴の可溶性物質および固体物質の添加のためのサンプルを調製する方法工程を提供する。その条件は、多価陽イオンまたは粒子の何れかとの相互作用を介した、興味あるタンパク質の実質的ロスを防止する性質のものであるべきである。このような条件は、興味あるタンパク質と多価陽イオンまたは粒子の間の強い電荷相互作用を停止させるために十分に高い導電性値を含むであろし、また他の種類の化学的相互作用を調節するための他の添加物を含めることを包含するかも知れない。
【０１６４】
一定の実施形態において、本発明は、実質的に上昇した導電性（塩濃度）での、効果的な凝集物低減および可溶性物質の除去を提供する。帯電粒子は、それらの特性が低い導電率（典型的には１０ｍＳ／ｃｍ未満、最も頻繁には５ｍＳ／ｃｍ未満）の水性環境に依存することについて特に知られている。これらの値は、概略的に言えば１００ｍＭ・ＮａＣｌおよび５０ｍＭ・ＮａＣｌにそれぞれ等しい。一定の実施形態において、本発明は２０〜３０ｍＳ、多くは４０ｍＳ／ｃｍ以下、時には１００ｍＳ／ｃｍ以上の導電性値における、効果的な凝集物低減および可溶性物質の除去を支援する。実際、一定の実施形態においては、より高い塩濃度においてヘテロ凝集物の解離は増大する。
【０１６５】
一定の実施形態において、本発明は、後続の精製法で使用するクロマトグラフィーカラムを詰まらせる可能性があるサンプル成分の除去を提供する。例えば、ＩｇＧ抗体は固定化されたプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製されることが非常に多い。有効ではあるが、この方法を実施するために用いられるクロマトグラフィー媒質は極めて高価であり、またその有用なサイクル寿命は、粗製サンプルの適用によって顕著に減少する可能性がある。一定の実施形態において、本発明により処理されたサンプルはキラキラし且つ光学的に透明で、プロテインＡまたは他のクロマトグラフィー媒質の機能を損ない得る懸濁した破片がない。一定の実施形態において、本発明の方法に従うサンプルの精製は、プロテインＡのＩｇＧ結合能力を１０％以上にまで増大させ、他の捕獲もしくは後続のクロマトグラフィー方法に対して同様の有益な効果を与えるであろう。一定の実施形態において、本発明の使用は、プロテインＡが汚染宿主タンパク質含量を５倍以上低減することを可能にするであろう。
【０１６６】
一定の実施形態において、本発明は後続の精製法を可能にし得る方法を提供するものであり、さもなくば、未精製の供給源からの初期の抗体捕獲が実施不可能な点まで、該精製法はサンプル成分により損なわれるであろう。宿主細胞ＤＮＡは、例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体よりも強く陰イオン交換体およびヒドロキシアパタイト媒体に結合する。これは、それらの抗体結合能力および精製特性の両方を低下させ、それらの初期捕獲法としての適性を損なう。一定の実施形態において、本発明は、サンプルをこれら後続の方法に適用する前にＤＮＡの大部分の除去を促進して、陰イオン交換体およびヒドロキシアパタイト媒体を初期抗体捕獲／精製のための実用的なツールにする。
【０１６７】
一定の実施形態では、本発明を使用するための準備において、処理すべきサンプルの組成を評価するのが賢明である。最初の主要な変数は、サンプルの凝集体含量である。これは、サイズ排除クロマトグラフィーにより、特に２５４〜２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの波長での同時モニタリングで分画をモニターすることによって、容易に決定することができる。この方法はまた、それらの水力学的サイズが精製抗体に密接に近似しているときであっても、抗体−ＤＮＡ複合体を含んでなるヘテロ凝集物の検出のために便利である。高い凝集体レベルを含むか、または０．５以上の２５４／２８０比を呈する凝集体を含むか、または高い２５４／２８０比を持った抗体−ＤＮＡヘテロ凝集物を含むサンプルは、該サンプルを混在した化学的特徴の表面に露出させる前に凝集物の解離を促進するために、混在した化学的特徴の可溶性物質（例えばエタクリジンおよび／またはポリエチレンイミンであるが、これに限定されない）でサンプルを処理するための有利な候補である。「高い凝集体レベル」の語は、該サンプルが全体の精製プロセスのどこに由来するかに依存するので、相対的なものと理解される。細部培養上清における「高い」凝集体レベルは、抗体に比較して５０％以上までであり得るのに対して、最初の精製後の「高い」凝集体レベルは、５％またはそれ以下のものをも含むであろう。
【０１６８】
一定の実施形態においては、精製すべきタンパク質の本来の化学的特徴を評価することもまた得策であろう。ＩｇＧ抗体は、特徴において電気的に中性からアルカリ性である傾向にあり、電気陽性表面に結合する傾向はないか又は弱いが、電気陰性表面に結合する傾向は穏やか乃至中程度である。ＩｇＭ抗体は、その特徴においてアルカリ性から酸性に亘って変化し、一般には電気陽性表面に結合する強い傾向を備え、また電気陰性表面に結合する温和ないし中程度の傾向を備えている。抗体表面の特徴の実際的な決定は、一対の単純な実験によって達成することができ、そこでは抗体がｐＨ７．０において陽イオン交換体に適用されて線形の塩勾配で溶出され、同じ条件下に陰イオン交換体に適用および溶出される。各交換体から抗体が溶出する塩濃度は、電気陰性表面もしくは電気陽性表面に結合する抗体の相対的な傾向、および斯かる相互作用を制御するために必要な塩濃度の便利な指標を提供する。このような特徴付けは、興味ある特定のタンパク質に特有の電荷についてのより完全な理解を得るために、複数のｐＨ値において行うことができる。
【０１６９】
一定の実施形態では、混在した化学的特徴の１以上の多価陽イオンを選択することが望ましいであろう。実験データは、一般的な問題として、多価陽イオンの疎水性が低いほど、興味あるタンパク質の回収が高いことを明らかにしている。また、疎水性が低いほど、タンパク質の有意なロスなしに多価陽イオンが適用され得る濃度範囲は広く且つ高い。従って、弱い疎水性のＰＥＩは、より疎水性のエタクリジンまたは遥かに疎水性のクロロヘキシジンよりも良好な候補であると考えられる。しかしながら、生成物の回収に加えて、他の問題もまた考慮に入れる必要があるかも知れない。ＰＥＩは周知の細胞毒性を有しており、また精製プロセスの全過程を通して、そのサンプルからの除去を容易に確認するために充分な感度で検出するのは困難である。エタクリジンは、血漿タンパク質分画の分野での、また抗ウイルス剤としてのその長い歴史のため、好ましいものである。加えて、その明るい黄色および特有の蛍光は、所定のサンプル中におけるその含量の鋭敏な測定を容易にし、それによって当該方法の実施後に、その除去の記録を補助する。それ以外に、異なる多価陽イオンは、望ましい効果を媒介するそれらの能力に影響する異なる副次的化学官能性を組み込む可能性がある。例えばＰＥＩは、主に静電的相互作用および水素結合を介してＤＮＡに結合すると理解される。エタクリジンは、両方の相互作用についての幾つかの機会を提供するが、ＤＮＡにインターカレーとすることが知られている。それはまた、一般的にはより効果的な凝集体低減を支援する。
【０１７０】
一定の実施形態において、エタクリジン、クロロヘキシジン、およびポリエチレンイミンのような物質は、抗体の特性およびサンプルの組成に依存して、０．００１％未満〜１％に亘って変化する濃度で効果的に適用されてよい。高い濃度は、可溶性物質を除去することが必要な混在した化学的特徴の電気陰性固体量を増大させるので、殆どの場合、最低の有効濃度が好ましいであろう。実験データによって、０．０１〜０．１の濃度、特に０．０２〜０．０６％または０．０２％〜０．０５％の濃度がこの考えを満たすことが明らかにされている。最も効果的な物質および作業濃度を、各々の特定のケースについて特定およびカスタマイズすることができる。当業者には、一定の上記物質はウイルスを不活化する能力が知られており、ＤＮＡおよびエンドトキシンの除去を増強する追加の利点を有することが明らかであろう。２以上位の種の多価陽イオンが用いられてよい。多価陽イオンでのサンプルの前処理は、幾つかの実施形態において低い凝集体レベルを達成する本発明の能力を増大する可能性がある。
【０１７１】
一定の実施形態においては、望ましいタンパク質およびそれが存在する供給流の特徴に最も良く適応するように、種々の特徴の電気陽性および／または電気的陰性の基体を評価することが有益であるかもしれない。例えば、幾つかの場合には、四級アミン官能基を有する電気陽性材料が、凝集物および／または他の汚染物を低減するためのより低い能力を有するが、望ましいタンパク質のより高い回収をサポートする可能性があるのに対して、ＴＲＥＮの形態の電気陽性材料は逆の結果を支持するかもしれない。幾つかの場合、一つの望ましいタンパク質のためには好ましい電気陽性表面が、別のものについては劣ると判断される可能性がある。例えば、ＴＲＥＮはＩｇＧのために好ましい可能性がある一方、四級アミンはＩｇＭのために好ましい可能性がある。基体上でのリガンドの密度もまた、例えばサンプル成分と化学的表面の間の副次的相互作用を介して、本発明の一定の実施形態の特性に影響するかもしれない。例えば、実験データは、一定の実施形態では、高い密度のＴＲＥＮを有する基体は低い密度のＴＲＥＮを有する基体よりも性能が優れる可能性があることの証拠を提供する。
【０１７２】
一定の実施形態においては、サンプルに対する固体の混合容量比での、混在した化学的特徴の粒子の等しくバランスした混合物で始めることが便利であるかもしれない。特定のサンプルの必要性に最も適合するように当該システムを最適化する過程を通して、特定のサンプル／処理システムのための有効性閾値を同定するために、サンプル容積に対する固体の比率を低下させてよい。電気陽性官能性に対する電気陰性官能性の比率は、当該表面に含まれる副次的化学官能性が選択され得るのに伴って変化される可能性がある。これらの変化を評価するための実験的な負担は、統計に基づく実験設計（いわゆるＤｏＥ）を適用することによって、実質的に低減することができる。混在した化学的特徴の便利な粒子は、商業的な陰イオン交換体および陽イオン交換体、キレート化樹脂、疎水性樹脂、並びに所謂混合様式のクロマトグラフィーを行うために市販される製品を含んでよい。
【０１７３】
一定の実施形態において、評価のための初期条件は、種々の表面への結合による抗体のロスを防止するｐＨおよび導電性の値で行われるべきであるが、更に、実験はより高い導電性レベルを特別に評価すべきである。何故なら、それらは凝集体および／または抗体汚染複合体の向上した解離を支援する可能性があるからである。便宜上の問題として、ＩｇＧ抗体を用いた初期実験は、６．５〜７．５のｐＨおよび１０〜１５ｍＳ／ｃｍの導電性で行うことができる。ＩｇＭ抗体を用いた初期実験は、同じｐＨおよび２０〜３０ｍＳ／ｃｍの導電性で行うことができる。後続の実験は、凝集体の低減および抗体の回収の最良の組合せを支援する条件を決定するために、それぞれより高いおよびより低い導電性、および／またはより高いまたはより低いｐＨ値で行うことができる。宿主細胞タンパク質汚染物のレベルを低減することは本発明の主要な目的ではないが、それはこの点に関して、特に高度にアルカリ性および／または高度に酸性の宿主タンパク質の含量に関して、有意な寄与を提供するかもしれない。
【０１７４】
一定の実施形態において、混在した化学的特徴の可溶性物質および固体物質が存在すべき時間は単純な実験によって決定でき、そこでは時間経過に亘って、例えば１時間に亘って１０分毎に、または以下に記載する実施例のデータにより示される他の増分および持続期間に亘って、サンプルがＳＥＣにより分析される。
【０１７５】
当業者には、ホモ凝集物およびヘテロ凝集物の含量を低減することに加えて、本発明の一定の実施形態はまた、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、エンドトキシンおよびウイルスの含量を実質的に低減する可能性があることを理解するであろう。
【０１７６】
一定の実施形態において、前記第一および第二の成分の固体物質は、使用後に浄化および再利用されてよい。一定の実施形態では、それらは使用後に廃棄されてよい。
【０１７７】
一定の実施形態において、本発明の方法は、他のクロマトグラフィー工程に先立って実施されてよく、この実施はクロマトグラフィー媒体を細胞培養培地成分による汚染から保護し、また標的産物を未処理サンプル中にあるときよりも更に均一な状態に置くことによって精製の質を改善するという二重の利益を有する。
【０１７８】
一定の実施形態において、本発明は、混合され、かつ中性材料に囲まれ、中性材料に埋め込まれ、またはそれ自体が電気陰性および／または電気陽性である材料に取り囲まれ、またはその中に埋め込まれた電気陰性粒子および電気陽性粒子を使用するための方法を提供する。一定の実施形態において、前記電気陰性および／電気陽性の表面は追加の化学官能性を備えてよく、それには疎水性相互作用、π−π結合、水素結合、および金属親和性に関与する能力が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７９】
本発明の追加の目的および利点は、一部は以下の説明に記載されるであろうし、また一部は該説明から明らかであるか、または本発明の実施により学習され得るであろう。本発明の目的および利点は、特許請求の範囲において特定された要素および組合せにより実現および達成されるであろう。
【０１８０】
上記の一般的説明および以下の詳細な説明は、両者とも単に例示的および説明的なものであるに過ぎず、特許請求の範囲に記載の発明を限定するものでないことが理解されるべきである
【実施例】
【０１８１】
以下の実施例は、本発明の一定の実施形態の効果を立証するプロトタイプを例示するものである。
【０１８２】
実施例１：  電気陽性表面および電気陰性表面のプロトタイプ混合物を用いた処理による、ＤＮＡの一体的除去を伴ったＤＮＡ−抗体ヘテロ凝集物の解離。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を２００ｍＭの最終濃度まで、モノクローナルＩｇＭ８５を含有する清澄化された１００ｍＬの細胞培養上清（導電性２１ｍＳ／ｃｍ）に加えた。２．５ｍＬの電気陽性マクロ多孔性粒状材料（ＮｕｖｉａＱ）を、２．５ｍＬの電気陰性マクロ多孔性粒状材料（ＮｕｖｉａＳ）と混合し、次いでポリビニリデン二フッ化物（ＰＦＤＦ）フィルターの間にサンドイッチした。これらの粒子を５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．０と共に平衡化した。該粒子を通してサンプルを流し、次いで、平衡化バッファーでチェイスした。これらの粒子を３Ｍのグアニジンで清浄化した。未処理サンプルおよび処理済みサンプルを、分析用のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムに掛け、２５４および２８０ｎｍＵＶでモニターした。未処理サンプルにおけるＩｇＭピークの２５４／２８０比は０．５４６であり、ＤＮＡの実質的量がＩｇＭと会合していることが示された。処理後におけるＩｇＭピークの２５４／２８０比は０．４９９であり、遥かに低いＤＮＡ含量を示した。凝集物含量は約３％から１％未満にまで減少した。この実験、およびＩｇＭモノクローナル抗体についての結果を記載するその後の実験は、８０〜１００％まで増殖した細胞培養物を使用して行われたが、当業者はこれを、凝集物および汚染物の含量に関して最悪のシナリオを表すと理解するであろう。従って、より高レベルの細胞生存率で回収された細胞培養体は、殆どの商業的応用において普通であるように、実質的により低い容積および恐らくは異なる組成の混合化学で適用される可能性がある。異なるＩｇＭクローン（ＩｇＭ−５２９）を用いた平行実験においては、粒子上の抗体ロスを回避するために、導電性を２５ｍＳ／ｃｍに上昇させることが必要とされた。
【０１８３】
実施例２：  上昇したＮａＣｌ濃度における、ヘテロ凝集体の解離およびＩｇＭ製剤からの汚染物の除去。モノクローナルＩｇＭ８５を含有し、且つ約２５ｍＳ／ｃｍの導電性を達成するために塩を添加した１００ｍＬの細胞培養上清（導電性２１ｍＳ／ｃｍ）を、マクロ多孔質電気陰性固相（ＮｕｖｉａＳ）、マクロ多孔質電気陽性固相（ＮｕｖｉａＱ）、ミクロ多孔質電気陽性固相（ＱＳｅｐｈａｄｅｘＡ２５）、およびミクロ多孔質電気陰性固相（ＣＭ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ２５）の各々の０．２５ｍＬのプロトタイプ混合物上に通し、ＰＶＤＦフィルターの間にサンドイッチし、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２５０ｍＭ  のＮａＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化した。画分を回収して、効果を決定した。約２０混合粒子容積以下のサンプル負荷において、ＨＭＷ凝集体およびヘテロ凝集体は実質的に存在しなかった。１００粒子容積以下のサンプル付加においてさえ、ＤＮＡの９０％超が除去された。これらの結果は、ＩｇＭのロスを回避するために必要な最小量よりも３０％高い導電性値における、本発明の効果的な使用を立証している。ＩｇＭ回収は９８％であった。
【０１８４】
実施例３：  上昇したＮａＣｌ濃度における、ヘテロ凝集物の解離およびＩｇＧ製剤からの汚染物の除去：  モノクローナルＩｇＧ、クローンＨｅｒ２は、１ｍＳ／ｃｍ未満の導電性でも、電気陽性媒体（ＮｕｖｉａＱ）に結合しないことが分かった。１２ｍＳ（ｐＨ７．０）を超える導電性においては、電気陰性媒体（ＮｕｖｉａＳ）に結合しないことが分かった。該サンプルは１５ｍＳの導電性にまで上昇し、実施例２に記載したのと同じ幾つかのプロトタイプ混合物に通された。宿主タンパク質汚染物の約半分と共に、ＤＮＡを除去した。ＨＭＷ凝集物は、１０％超から０．２％未満にまで減少した。ヘテロ凝集物は、２５４／２８０比により決定されるように、実質的に除去された。ＩｇＧモノクローナル抗体を用いた結果を記載するこの実験および後続の実験は、５０〜８０％の致死率まで増殖された細胞培養物を用いて行われ、これはサンプル中の凝集物および汚染物の含量に関して最悪の場合のシナリオを表すことを、当業者は理解するであろう。従って、より高いレベルの細胞生存率で回収された細胞培養物は、殆どの商業的応用で共通するように、実質的により低い容積で適応され、また恐らくは異なる組成の混合された特徴物である可能性がある。
【０１８５】
実施例４：  実施例２に記載した固体材料の１０ｍＬの同じ混合物を、円筒状ガラスアセンブリーの中のナイロン織布製保持器（約５μｍの多孔性）の間にサンドイッチした。該粒子を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化した。モノクローナルＩｇＧを含有する５００ｍＬの細胞培養上清を、粒子を通して流し、回収した。処理されたサンプルの回収を可能にするために、該サンプルを平衡化バッファーでチェイスした。この流出液はＨＭＷ凝集物含量のモノクローナルＩｇＧを含有しており、明らかなヘテロ凝集物は存在しなかった。該粒子を５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ＭのＮａＣｌで溶出させて、強く着色した黄褐色の流出液を得た。
【０１８６】
実施例５：  １００ｍｇのエタクリジンを、ＩｇＧモノクローナル抗体を含有する１Ｌの細胞培養培地に加えて撹拌し、黄色の沈殿を遠心分離により除去する前に、１５分間インキュベーとした。実施例２に記載した固体材料の同じ混合物８０ｍＬを、ガラスアセンブリーの中のナイロン織布保持器の間にサンドイッチした。エタクリジン処理からの黄褐色であるが光学的にクリアな上清を、粒子上に流して回収した。処理されたサンプルの回収を可能にするために、該サンプルは平衡化バッファーでチェイスされた。該カラムを、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０への１段階で溶出させた。塩の溶出ピークは、エタクリジン処理によるＤＮＡの除去に起因して、概略的には未処理サンプルで得られたサイズの半分であった。２８０ｎｍおよび２５４ｎでのＵＶ吸収の比を、各サンプルについて計算した。未処理サンプルは、２．０６の２８０／２５４比を生じた。エタクリジン処理されたサンプルは、２．３３の比を与え、実質的に低下したヘテロ凝集物含量を示した。この流出したサンプルは２．３９の比を与え、更にもう一つのＤＮＡ増分の除去を示した。ＨＭＷ凝集物は０．１％未満に減少した。適用されたサンプル容積の２％に等しい混合媒体を用いた先の実験は、エタクリジンを完全に除去するには不十分であった。平行実験は、少なくとも５ｃｍのベッド高さが、最小容積の混合媒体で最良の結果を与えることを示した。
【０１８７】
実施例６:プロトタイプ粒子混合物を、０．５ｍＬのキレート化多孔質粒子（Ｃｈｌｅｘ−１００）および０．５ｍＬの電気陽性多孔質粒子（Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ・Ｈｉｇｈ−Ｑ）から調製し、混合し、ガラスアセンブリー中のセルロースフィルターの間にサンドイッチした。精製されたＩｇＧモノクローナル抗体のサンプル（Ｈｅｒ２）を、ほぼ生理学的条件（ｐＨ７．０、１０ｍＳ／ｃｍ）でロスなく粒子上に通した。未精製の抗体を用いた実験を、２５ｍＳ／ｃｍ、２０ｍＳ／ｃｍ、および３０ｍＳ／ｃｍで行った。全ての場合に、ヘテロ凝集物およびＨＭＷ凝集物を除去した。０．０２％エタクリジンを含有する未精製抗体を用いた実験を、同じ導電性において行った。全ての場合にヘテロ凝集物およびＨＭＷ凝集物を除去したところ、３６５ｎｍでのＵＶ吸収の欠失によって実証されるように、流出液はエタクリジンを含まなかった。
【０１８８】
実施例７：  実施例６との一組の平行実験において、精製したＩｇＭモノクローナル抗体のサンプル（クローン５２９）を、上昇した塩条件（ｐＨ７．０，２００ｍＳ／ｃｍ）で粒子上にロスなく通した。未精製の抗体、および０．０２％エタクリジンを含有する未精製の抗体を、２０、３０、および４０ｍＳ／ｃｍで適用した。ヘテロ凝集物およびＨＭＷ凝集粒は全ての場合に除去され、流出物は３６５ｎｍでのＵＶ吸収の欠失により実証されるように、エタクリジンを含んでいなかった。これらの実験を、０．２％エタクリジンを用いて反復した。ヘテロ凝集物およびＨＭＷ凝集物は全ての場合に除去され、流出液にはエタクリジンが含まれていなかった。
【０１８９】
実施例８：  Ｃｈｌｅｘ−１００およびＭａｃｒｏｐｒｅｐ・Ｈｉｇｈ−Ｑの等容積混合物からなる充填ベッド上に通すときの、モノクローナルＩｇＭ培養上清からのＤＮＡおよび凝集物の除去能力の研究。それぞれ０．５ｍＬのＣｈｅｌｅｘ−１００およびＭａｃｒｏＰｒｅｐ・Ｈｉｇｈ−Ｑを、ＰＶＤＦ膜の間にサンドイッチした。Ｍ５２９細胞上清を１ｍＬ／ｍｉｎで負荷し、流出サンプルを２５，５０において採取した。１００ｍＬを分析ＳＥＣにより解析した。最大負荷においてさえ、２５４優勢なヘテロ凝集物は本質的に流出物から排除された。種々の負荷（低から高まで）でのＩｇＭ回収は、それぞれ５８％、７３％および８５％であった。この実験を、ＮａＣｌを加えて２５ｍＳ／ｃｍの導電性にした状態で繰り返した。ヘテロ凝集物の減少に影響はなかったが、回収率はそれぞれ約８５％、９０％および９５％に増加した。
【０１９０】
実施例９：  実施例８の実験を繰り返したが、ミクロ多孔性および膜と多孔質の電気陽性および電気陰性媒質の組合せ、加えてミクロ多孔質の親油性粒子類は等容積であった：  ＱＡＥセファデックスＡ−２５、ＳＰセファデックスＣ−２５、Ｎｕｖｉａ−Ｑ、Ｎｕｖｉａ−ＳおよびセファデックスＬＨ−２０。アラントインおよびエタクリジンを、それぞれ最終濃度１％（過飽和）および０．０２％になるまで、５％血清を補充したモノクローナルＩｇＭ上清に加えた。この上清を遠心分離により清澄化し、次いで、前記ベッドを通して流出させた（充填されたベッド１ｍＬ当たり２０ｍＬの上清）。次いで、ＩｇＭを陽イオン交換体上に補足した。ＩｇＭ回収率は２段階プロセスに亘って８０％で、また分析ＳＥＣによる純度は９０％超であり、明らかな凝集物はなかった。
【０１９１】
実施例１０：  電気陰性、金属配位多孔質粒子（Ｃｈｅｌｅｘ−１００）および電気陽性多孔質粒子（Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ・Ｈｉｇｈ−Ｑ）の各々０．６ｍＬを、４５ｍＬのＭ５２９ＩｇＭ清澄化培養上清に加え、その直後にエタクリジンを２５ｍＳ／ｃｍの導電性で０．０２％の最終濃度にまで加え、ロータリーシェーカー上で連続的に混合した。サンプルを１０分間の間隔で１時間に亘って抜き取った。分析ＳＥＣによって、ＨＭＷおよびヘテロ凝集物が漸進的に低下し、５０分において略完了に近づくが、更に１０分間で僅かに改善されることが示された。３６５ｎｍでのプロファイルによって示されるように、エタクリジンも除去された。
【０１９２】
実施例１１：  １リットルのモノクローナルＩｇＧ含有細胞培養上清を、１％アラントインおよび０．０２％エタクリジンで１５分間処理した。黄色の沈殿を膜濾過により除去し、光学的に輝く透明な明るい黄色の濾液を、Ｃｈｅｌｅｘ−１００およびＭａｃｒｏｐｒｅｐ・Ｈｉｇｈ−Ｑの等量混合物を充填した１０ｍＬカラムに適用した。次いで、この処理された材料を、２０ｍｇ・ｍＬの負荷までプロテインＡカラムに適用し、１０カラム容量で洗浄し、ＩｇＧを溶出させた。溶出したＩｇＧと、未処理細胞培養上清を負荷されたプロテインＡから溶出した抗体との比較は、大まかに５倍低い宿主細胞タンパク質汚染物を含んでいた。処理されたサンプルおよび未処理サンプルを負荷したプロテインＡカラムのダイナミック結合容量を決定するために、平行実験を設定した。処理されたサンプルを負荷したカラムでのダイナミック容量は、未処理サンプルを負荷されたカラムよりも約１０％高かった。
【０１９３】
実施例１２：  イミノ二酸基を持ったミクロ多孔質スチレンジビニルベンゼン粒子（Ｃｈｅｌｅｘ・１００）およびトリス（２−アミノエチル）アミンを持ったマクロ多孔性アガロース粒子（ＢｉｏＷｏｒｋｓ・ＴＲＥＮ、ｈｉ−ｓｕｂ）の等量混合物を、ポリエチレンフリットの間にサンドイッチし、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、  ｐＨ７．０を用いて平衡化した。ＩｇＧを含有する濾過された哺乳動物細胞培養上清（クローンＨＥＲ２）を、前記アセンブリーに通し、サイズ排除クロマトグラフィーにより解析した。未処理サンプルは約１０％の凝集物を含んでいた。処理されたサンプルは、０．２％未満の凝集物を含んでいた。ＡｃｃｕＢｌｕｅでの試験により、この処理は９５％のＤＮＡをも除去することが明らかになった。
【０１９４】
実施例１３：  実施例１２の粒子混合物を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対して平衡化し、ＥｇＧを含有する濾過された哺乳動物細胞培養上清（クローンＨＥＲ２）に直接加え、１時間撹拌しながらインキュベートし、次いで膜濾過により除去した。解析により、大まかに言って実施例１２の半分の凝集物低減およびＤＮＡ除去が明らかになった。撹拌しながら１６時間インキュベートしたところ、４において実施例１２の約ｋ８０％の効率が示された。
【０１９５】
実施例１４：  負に帯電した金属キレート化スチレンジビニルベンゼン粒子（Ｃｈｅｌｅｘ１００）、正に帯電したポリメタクリレート多孔質粒子（Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ・Ｈｉ−Ｑ）、および負に帯電したポリメタクリレート粒子（Ｍａｃｒｏｐｒｅ・Ｈｉ−Ｓ）を、先に２０ｍＳ／ｃｍの最終導電性にまでＮａＣｌで処理されたＩｇＭ−５２９のサンプル、１％アラントイン、および０．０２５％エタクリジンと混合した。サンプルに対する粒子の容積比は１：２０であった。１０分、２０分、４０分、および６０分の時点でサンプルを採取し、ミクロ濾過により粒子を除去した。図１は、全ての時点における高分子量凝集物の動的減少を示しているが、経時的に全ての凝集物が漸進的に大きく低下し、同様に、宿主細胞タンパク質の凝集物の実質的に明らかな低下が伴った。その後の解析によって、凝集物および宿主タンパク質の両方の低下は、サンプルからのクロマチン残遺物の合算された減少を反映することが示された。エタクリジンもまた、全ての時点においてサンプルから除去された。
【０１９６】
実施例１５：  図２Ａおよび２Ｂは、実施例７と同様にＮａＣｌ、アラントイン、およびエタクリジンで処理され、次いで実施例７におけるのと同じ媒質混合物の処理ではあるが、該サンプルを、前記粒子を保持するために十分に狭いメッシュのポリマー織布製保持器の間に前記混合媒質がサンドイッチされた装置を通すことによって処理された、ＩｇＭ−８４の処理前後のサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを図示している。ＨＭＷ凝集物は、大部分のより小さい凝集物と共に完全に除去された。下記の表１は、ＤＮＡおよびヒストンが最初は、ＩｇＧ画分と共に全ての凝集体画分に亘って、且つ全てのタンパク質含有画分に亘って分布していたことを示している。
【表１】
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【０１９７】
実施例１６：  表１はまた、ＤＮＡのサイズ分布を示しており、これは幾つかの凝集物ポピュレーションが、ＤＮＡおよびヒストンに加えて、種々の数のヌクレオソームを含むヌクレオソームアレイを含んでいるとの予期しない発見に導いた。この処理からのＩｇＭの回収は９８％であった。
【０１９８】
実施例１７：  図３は、抗ＨＥＲ２モノクローナルＩｇＧ抗体の、実施例１６と同じ手順の前後におけるサイズ排除クロマトグラフィーを示している。その結果は本質的に同じではあるが、元々の細胞培養上清中の抗体の濃度が約１０倍高いので、少なくとも一部は、恐らく実施例８を凌駕する程度に改善された。
【０１９９】
実施例１８：  １Ｌの細胞培養回収物を、１％アラントインおよび０、０２５％エタクリジンの添加により処理し、撹拌しながら１５分インキュベートし、その後に細胞および他の粒子を遠心分離により除去した。その上清を、イミノ二酢酸で置換されたスチレンジビニルベンゼン粒子（Ｃｈｅｌｅｘ１００）、ＴＲＥＮで置換されたアガロース粒子（ＢｉｏＷｏｒｋｓ・ＴＲＥＮ、ｈｉ−ｓｕｂ）、およびブチル残基で置換されたアクリレート粒子（Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ・Ｔ−ブチル）を等比率で含有するアセンブリーに、合計容積５０ｍＬ、寸法２．６×１０ｃｍ、および流速２５ｍＬ／ｍｉｎの条件で通した。１２％よりも大きい初期凝集物含量が、０．１％未満にまで低減された。過剰のエタクリジンが除去された。宿主タンパク質汚染物は、２５０，０００ｐｐｍから１４２，０００ｐｐｍまで６０％低減された。ｑＰＣＲにより測定されたＤＮＡは、６ｌｏｇだけ低減された。抗体回収率は９９％であった。混濁度は２．０ＮＴＵ（比濁分析における濁度単位）であった。分析ＳＥＣでは２つの極端に遅い溶出成分が示され、これらは極端に疎水性の細胞培養培地添加物に対応するものと解釈された。
【０２００】
実施例１９：  １Ｌの細胞培養回収物を、１％アラントインおよび０．０２５エタクリジンの添加により処理し、撹拌しながら１５分間インキュベートし、その後、細胞および他の粒子を遠心分離により除去した。この上清を、イミノ二酢酸で置換されたスチレンジビニルベンゼン粒子（Ｃｈｅｌｅｘ１００）、アミノ基で置換されたスチレンジビニルベンゼン粒子（Ｄｏｗｅｘ・ＡＧ１×８）、およびブチル残基で置換されたアクリレート粒子（Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ・Ｔ−ブチル）を等比率で含有するアセンブリーに、合計容積５０ｍＬ、寸法２．６×１０ｃｍ、および流速２５ｍＬ／ｍｉｎの条件で通した。１２％よりも大きい初期凝集物含量が、０．１％未満にまで低減された。抗体回収率は９５％であった。それ以外の結果は実施例１８と同一であった。
【０２０１】
実施例２０：  １Ｌの細胞培養回収物を、１％アラントインおよび０．０２５エタクリジンの添加により処理し、撹拌しながら１５分間インキュベートし、その後、細胞および他の粒子を遠心分離により除去した。この上清を、イミノ二酢酸で置換されたスチレンジビニルベンゼン粒子（Ｃｈｅｌｅｘ１００）、アミノ基で置換されたスチレンジビニルベンゼン粒子（Ｄｏｗｅｘ・ＡＧ１×２）、およびＴＲＥＮで置換されたアガロース粒子（ＢｉｏＷｏｒｋｓ・ＴＲＥＮ、ｈｉ−ｓｕｂ）を等比率で含有するアセンブリーに、合計容積５０ｍＬ、寸法２．６×１０ｃｍ、および流速２５ｍＬ／ｍｉｎの条件で通した。１２％よりも大きい初期凝集物含量が、０．１％未満にまで低減された。抗体回収率は９５％であった。分析ＳＥＣでは、実施例１８において観察された極端に遅い溶出成分の不存在が示された。それ以外の結果は実施例１８と同一であった。
【０２０２】
実施例２１：  Ｄｏｗｅｘ・ＡＧ１×２の比率を半分に減少させ、且つＴ−ｂｕｔｙｌの同じ増分を加え、それによってＣｈｅｌｅｘ、ＢｉｏＷｏｒｋｓ・ＴＲＥＮ、Ｄｏｗｅｘ、およびＴ−ブチルの２：２：１：１混合物を作成した以外は、実施例２０の実験を繰り返した。抗体回収率は９８％でああり、ＳＥＣは遅く溶出する成分の除去を示した。この実施例は、実施例１８〜２０との組合せで、どのようにして、特定の汚染物または汚染物のクラスを標的とするように特定のサンプルを適合させるために、表面化学およびそれらの比率の選択を如何にして調節できるかに焦点を当てている。
【０２０３】
実施例２２：  大腸菌中で産生され、蔗糖を用いた浸透圧ショックにより回収され、次いで濾過して細胞破片を除去された１ＬのＦａｂ断片を、１％のアラントイン、０．０２５％のエタクリジンと混合し、１５分間撹拌しながらインキュベートした後に、ポリエチレンフリットの間にサンドイッチされたＭａｃｒｏｐｒｅｐ・Ｈｉ−Ｓ（電気陰性）およびＭａｃｒｏｐｒｅｐ・Ｈｉ−Ｑ（電気陽性）の５０ｍＬの等量混合物上を通した。カラム中の条件は、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．７であった。サンプルの導電性およびｐＨは、この同じ条件に調節された。ＤＮＡは、ＡｃｃｕＢｌｕｅにより測定したときに９９％減少した。宿主タンパク質は、ＥＬＩＳＡにより測定したときに約６５％減少した。Ｆａｂ回収率は９７％であり、処理されたサンプルは光学的に清澄であった。
【０２０４】
当業者には、細胞の広範な多様性、細胞培養処方、産物特性および発現レベル、および回収時の相対的細胞致死率および回収を仮定すれば、何れかの細胞培養培地内で産生され且つ特定の範囲の細胞致死率内で回収された何れかの所定のタンパク質は、粒子の特定のタイプ、それらの相対的容積、および特定の条件が、個々のベースで実験的に開発されることを必要とするであろうことが明らかであろう。更に、ここに提供される実施例およびガイダンスに基づけば、材料および条件の最良の組合せを同定するために必要な実験が、当業者の知識の範囲内であることもまた明らかであろう。
【０２０５】
使用された後に、固体の帯電材料は、任意に廃棄または再生されてよい。
【０２０６】
本発明は、望ましいレベルの精製を達成するために、種々の精製方法と組み合わされてよい。その例には、プロテインＡのような抗体の精製に通常使用される他の方法、および他の形態のアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン区間クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、および追加の混合型クロマトグラフィー法が含まれるが、これらに限定されない。種々の方法のための適切な条件を開発し、それをここでの本発明に組み込んで特定の抗体の必要な精製を達成することは、当業者の知識の範囲内である。
【０２０７】
ここに引用した全ての参照文献は、それらの全体において、且つ全ての目的について、それぞれの個々の刊行物または特許もしくは特許出願が、全ての目的についてその全体が本明細書に援用される旨指示されたのと同じ範囲で、参照により本明細書に組み込まれるものである。本明細書中で援用される刊行物および特許もしくは特許出願が、本明細書に含まれる開示と矛盾する範囲において、本明細書はこのような矛盾する如何なる文献をも無効にし、および／またはこれら文献に優先するものである。
【０２０８】
本明細書および特許請求の範囲において使用される成分、クロマトグラフィー条件等の量を表す全ての数字は、全ての場合において「約」の語により修飾されるものとして理解すべきである。従って、逆に指示しない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、本発明によって得られるように求められている望ましい特性に依存して変化し得る近似値である。
【０２０９】
当業者には明らかであるように、本発明の本質および範囲を逸脱することなく、本発明の多くの修飾および変形を行うことができる。ここに記載した特定の実施形態は、例としてのみ提供されるものであり、如何なる意味でも限定的であることを意味しない。本明細書および実施例は例示としてのみ考慮されるべきであり、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって表示されるものである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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