(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病の発症抑制および／または治療を行うための候補化合物を同定する方法であって、  
ａ）インスリン分泌細胞の第１集団を、１つまたは複数の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率を増大させるのに有効な量のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）と接触させること；
ｂ）インスリン分泌細胞の第２集団を、前記１つまたは複数の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率を増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させること、およびインスリン分泌細胞の前記第２集団をスカベンジャー受容体クラスＢタイプＩ（ＳＲＢＩ）の発現または活性を阻害する分子とさらに接触させることであり、ここで前記ＳＲＢＩの発現または活性を阻害する分子が、抗ＳＲＢＩ抗体、抗ＳＲＢＩアプタマー、ＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡ、ＳＲＢＩ  ｓｈＲＮＡ、ＳＲＢＩアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＳＲＢＩ阻害小分子、インターフェロンアルファ、Ｎ−［４−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルペラジン−１−イル）フェニル］−（２−クロロ−５−ニトロフェニル）カルボキサミド（Ｒ−１３８３２９）、２−ヘキシル−１−シクロペンタノンチオセミカルバゾン、３３Ｍ２０（ＢＬＴ１）、ならびにＭＩＴ９９５２−１、９９５２−２、９９５２−３、９９５２−４、９９５２−５、９９５２−６、９９５２−７、９９５２−８、９９５２−９、９９５２−１０、９９５２−１１、９９５２−１２、９９５２−１３、９９５２−１４、９９５２−１５、９９５２−１６、９９５２−１７、９９５２−１８、９９５２−１９、９９５２−２０、９９５２−２１、９９５２−２２、９９５２−２３、９９５２−２４、９９５２−２５、９９５２−２６、９９５２−２７、９９５２−２８、９９５２−２９、９９５２−３０、９９５２−３１、９９５２−３２、９９５２−３３、９９５２−３４、９９５２−３５、９９５２−３６、９９５２−３７、９９５２−３８、９９５２−３９、９９５２−４０、９９５２−４１、９９５２−４２、９９５２−４３、９９５２−４４、９９５２−４５、９９５２−４６、９９５２−４７、９９５２−４８、９９５２−４９、９９５２−５０、９９５２−５１、９９５２−５２、９９５２−５３、９９５２−５４、９９５２−５５、９９５２−５６、９９５２−５７、９９５２−５８、９９５２−５９、９９５２−６０、９９５２−６１、９９５２−６２、９９５２−６３、９９５２−６４、９９５２−６５、９９５２−６６、９９５２−６７、９９５２−６８、９９５２−６９、９９５２−７０、９９５２−７１、９９５２−７２、９９５２−７３、９９５２−７４、９９５２−７５、９９５２−７６、９９５２−７７、９９５２−７８、９９５２−７９、９９５２−８０、９９５２−８１、９９５２−８２、９９５２−８３、９９５２−８４、９９５２−８５、９９５２−８６、９９５２−８７、９９５２−８８、９９５２−８９、９９５２−９０、９９５２−９１、９９５２−９２、９９５２−９３、９９５２−９４、９９５２−９５、９９５２−９６、９９５２−９７、９９５２−９８、９９５２−９９、９９５２−１００、９９５２−１０１、９９５２−１０２、９９５２−１０３、９９５２−１０４、９９５２−１０５、９９５２−１０６、９９５２−１０７、９９５２−１０８、９９５２−１０９、９９５２−１１０、９９５２−１１１、９９５２−１１２、９９５２−１１３、９９５２−１１４、９９５２−１１５、９９５２−１１６、９９５２−１１７、９９５２−１１８、９９５２−１１９、９９５２−１２��、９９５２−１２１、９９５２−１２２、９９５２−１２３、９９５２−１２４、９９５２−１２５、９９５２−１２６、９９５２−１２７、９９５２−１２８、９９５２−１２９、９９５２−１３０、９９５２−１３１、９９５２−１３２、９９５２−１３３、９９５２−１３４、９９５２−１３５、９９５２−１３６、９９５２−１３７、９９５２−１３８、９９５２−１３９、９９５２−１４０、９９５２−１４１、９９５２−１４２、９９５２−１４３、９９５２−１４４、９９５２−１４５、９９５２−１４６、９９５２−１４７、９９５２−１４８、９９５２−１４９、９９５２−１５０、９９５２−１５１、９９５２−１５２、９９５２−１５３、９９５２−１５４、９９５２−１５５、９９５２−１５６、９９５２−１５７、９９５２−１５８、９９５２−１５９、９９５２−１６０、９９５２−１６１、９９５２−１６２、９９５２−１６３、９９５２−１６４、９９５２−１６５、９９５２−１６６、９９５２−１６７、９９５２−１６８、９９５２−１６９、９９５２−１７０、９９５２−１７１、９９５２−１７２、９９５２−１７３、９９５２−１７４、９９５２−１７５、９９５２−１７６、９９５２−１７７、９９５２−１７８、９９５２−１７９、９９５２−１８０、９９５２−１８１、９９５２−１８２、９９５２−１８３、９９５２−１８４、９９５２−１８５、９９５２−１８６、９９５２−１８７、９９５２−１８８、９９５２−１８９、９９５２−１９０、９９５２−１９１、９９５２−１９２、９９５２−１９３、９９５２−１９４、９９５２−１９５、９９５２−１９６、９９５２−１９７、９９５２−１９８、９９５２−１９９、９９５２−２００、９９５２−２０１、９９５２−２０２、９９５２−２０３、９９５２−２０４、９９５２−２０５、９９５２−２０６、９９５２−２０７、９９５２−２０８、９９５２−２０９、９９５２−２１０、９９５２−２１１、９９５２−２１２、９９５２−２１３、９９５２−２１４、９９５２−２１５、９９５２−２１６、９９５２−２１７、９９５２−２１８、９９５２−２１９、９９５２−２２０、９９５２−２２１、９９５２−２２２、９９５２−２２３、９９５２−２２４、９９５２−２２５、９９５２−２２６、９９５２−２２７、９９５２−２２８、９９５２−２２９、９９５２−２３０、９９５２−２３１、９９５２−２３２、９９５２−２３３、９９５２−２３４、９９５２−２３５、９９５２−２３６、９９５２−２３７、９９５２−２３８、９９５２−２３９、９９５２−２４０、９９５２−２４１、９９５２−２４２、９９５２−２４３、９９５２−２４４、９９５２−２４５、９９５２−２４６、９９５２−２４７、９９５２−２４８、９９５２−２４９、９９５２−２５０、９９５２−２５１、９９５２−２５２、９９５２−２５３、９９５２−２５４、９９５２−２５５、９９５２−２５６、９９５２−２５７、９９５２−２５８、９９５２−２５９、９９５２−２６０、９９５２−２６１、９９５２−２６２、９９５２−２６３、９９５２−２６４、９９５２−２６５、９９５２−２６６、９９５２−２６７、９９５２−２６８、９９５２−２６９、９９５２−２７０、９９５２−２７１、９９５２��２７２、９９５２−２７３、９９５２−２７４、９９５２−２７５、９９５２−２７６、９９５２−２７７、９９５２−２７８、９９５２−２７９、９９５２−２８０、９９５２−２８１、９９５２−２８２、９９５２−２８３、９９５２−２８４、９９５２−２８５、９９５２−２８６、９９５２−２８７、９９５２−２８８、９９５２−２８９、９９５２−２９０、９９５２−２９１、９９５２−２９２、９９５２−２９３、９９５２−２９４、９９５２−２９５、９９５２−２９６、９９５２−２９７、９９５２−２９８、９９５２−２９９、９９５２−３００、９９５２−３０１、９９５２−３０２、９９５２−３０３、９９５２−３０４、９９５２−３０５、９９５２−３０６、９９５２−３０７、９９５２−３０８、９９５２−３０９、９９５２−３１０、９９５２−３１１、９９５２−３１２、９９５２−３１３、９９５２−３１４、９９５２−３１５、９９５２−３１６、９９５２−３１７、９９５２−３１８、９９５２−３１９、９９５２−３２０、９９５２−３２１、９９５２−３２２、９９５２−３２３、９９５２−３２４、９９５２−３２５、９９５２−３２６、９９５２−３２７、９９５２−３２８、９９５２−３２９、９９５２−３３０、９９５２−３３１、９９５２−３３２、９９５２−３３３、９９５２−３３４、９９５２−３３５、９９５２−３３６、９９５２−３３７、９９５２−３３８、９９５２−３３９、９９５２−３４０、９９５２−３４１、および９９５２−３４２、またはこれらの塩からなる群から選択される１つまたは複数のＳＲＢI阻害剤、からなる群から選択されること；ならびに
ｃ）前記ＡｐｏＣＩＩＩが誘導するＣａｖ１チャネルの密度および／または導電率の増大をインスリン分泌細胞の前記第２集団でよりもインスリン分泌細胞の前記第１集団において強く阻害する陽性試験化合物を、糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物として同定すること、を含む方法。
【請求項２】
インスリン分泌細胞の第３集団を、１つまたは複数の候補化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率を増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させること、およびインスリン分泌細胞の前記第３集団をω−アガトキシンＩＶＡ、ω−コノトキシンＧＶＩＡ、ＳＮＸ４８２、ミベフラジル、およびＮＮＣ５５−０３９６からなる群から選択されるＣａｖ２および／またはＣａＶ３チャネル遮断薬とさらに接触させることをさらに含み、前記ＡｐｏＣＩＩＩが誘導する密度および／または導電率の増大をインスリン分泌細胞の前記第１集団でよりもインスリン分泌細胞の前記第３集団において強く阻害する候補化合物が、糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物として好ましい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
インスリン分泌細胞の第４集団を、１つまたは複数の候補化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率を増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させること、およびインスリン分泌細胞の前記第４集団をＰＰ１アナログ、ＰＰ２、アデノシン３’，５’−サイクリックモノホスホロチオエート−Ｒ、Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−９、およびＨ−８９からなる群から選択されるＳｒｃキナーゼ阻害剤および／またはプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）阻害剤とさらに接触させることをさらに含み、前記ＡｐｏＣＩＩＩが誘導するＣａｖ１チャネルの密度および／または導電率の増大をインスリン分泌細胞の前記第４集団でよりもインスリン分泌細胞の前記第１集団において強く阻害するそれらの候補化合物が、糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物として好ましい、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、インスリン分泌細胞の第５集団を、１つまたは複数の候補化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率に有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させること、およびインスリン分泌細胞の前記第５集団をβ１インテグリン抗体、β１インテグリンアンチセンスＲＮＡ、β１インテグリンｓｉＲＮＡ、およびβ１インテグリンｓｈＲＮＡからなる群から選択されるβ１インテグリンの発現または活性を阻害する分子とさらに接触させることをさらに含み、前記ＡｐｏＣＩＩＩが誘導するＣａｖ１チャネルの密度および／または導電率の増大をインスリン分泌細胞の前記第５集団でよりもインスリン分泌細胞の前記第１集団において強く阻害するそれらの候補化合物が、糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物として好ましい、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物を同定する方法であって、
ａ）インスリン分泌細胞の第１集団を、１つまたは複数の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率を増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させること；ならびに
ｂ）対照と比較してインスリン分泌細胞の前記第１集団において前記ＡｐｏＣＩＩＩが誘導するＣａｖ１チャネルの密度および／または導電率の増大を阻害しかつＳＲＢＩの発現または活性を阻害するそれらの陽性試験化合物を同定することであり、前記陽性試験化合物が糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物であること、を含む方法。
【請求項６】
前記対照が、インスリン分泌細胞の第２集団を、試験化合物の非存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率を増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記インスリン分泌細胞が膵臓β細胞である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記方法が細胞をＡｐｏＣＩＩＩと少なくとも６時間接触させることを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記候補化合物が１型糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記候補化合物が２型糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連案件の相互参照
本出願は、２０１２年１２月１８日に出願された、米国仮出願番号６１／７３８８３５号の優先権を主張し、この出願の内容全体を本願に引用して援用する。
【背景技術】
【０００２】
序論
電位依存性カルシウム（Ｃａｖ）チャネルはβ細胞の生理および病態生理において極めて重要である。これらのチャネルはインスリン分泌の調節において中心的位置を占めるだけでなく、タンパク質リン酸化、遺伝子発現および細胞周期の調節を通じてβ細胞の発生、生存および増殖にも関与する。β細胞のＣａｖチャネルの機能および密度は、他の種類の細胞型と共通の、またはβ細胞に特有のいずれかの広範囲にわたる様々なメカニズム、例えばチャネルのリン酸化、他の分子との相互作用、およびグルコース代謝によるシグナル伝達による調節を受ける。Ｃａｖチャネルが正常に機能しないとβ細胞の機能不全が引き起こされ、最も一般的な代謝性疾患である糖尿病においてみられるように死をももたらす。実際、Ｔリンパ球を介した自己免疫性の攻撃は、１型糖尿病におけるβ細胞の死に重大な役割を果たしている。加えて、１型糖尿病の血清中の因子は、β細胞のＣａｖチャネルの過剰な活性化により非生理的な量のＣａ２＋を膵臓β細胞内に侵入させ、結果としてβ細胞のアポトーシスをもたらす。明らかに、このプロセスが自己免疫性の攻撃に加えてさらに疾患の発症を高める。そのような因子は２型糖尿病の血清中にもみられ、この血清中においてもそれらは１型糖尿病の血清中と同じように作用する。実際、β細胞の量の減少およびβ細胞Ｃａｖチャネルの過剰な活性化は、後藤−柿崎ラットにおけるような２型糖尿病の状態下で出現する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
第１の態様において本発明は、糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物を同定する方法を提供し、
（ａ）１つまたは複数の試験化合物の存在下において、インスリン分泌細胞の第１集団を、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率を増大させるのに有効な量のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）と接触させること；
（ｂ）前記１つまたは複数の試験化合物の存在下において、インスリン分泌細胞の第２集団を、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率を増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させること、およびインスリン分泌細胞の第２集団をスカベンジャー受容体クラスＢタイプＩ（ＳＲＢＩ）の発現または活性を阻害する分子とさらに接触させること；および
（ｃ）ＡｐｏＣＩＩＩが誘導するＣａｖ１チャネルの密度および／または導電率の増大をインスリン分泌細胞の第２集団でよりもインスリン分泌細胞の第１集団において強く阻害する陽性試験化合物を、糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物として同定すること、を含む。
【０００４】
一実施形態において本方法は、１つまたは複数の候補化合物の存在下において、インスリン分泌細胞の第３集団を、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率を増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させること、およびインスリン分泌細胞の第３集団をＣａｖ２および／またはＣａＶ３チャネル遮断薬とさらに接触させることをさらに含み、ＡｐｏＣＩＩＩが誘導する密度および／または導電率の増大をインスリン分泌細胞の第１集団でよりもインスリン分泌細胞の第３集団において強く阻害する候補は、糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物として好ましい。
【０００５】
本発明の他の実施形態と組み合わせられるさらなる実施形態において、本方法は、１つまたは複数の候補化合物の存在下において、インスリン分泌細胞の第４集団を、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率を増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させること、およびインスリン分泌細胞の第４集団をＳｒｃキナーゼ阻害剤および／またはプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）阻害剤とさらに接触させることをさらに含み、ＡｐｏＣＩＩＩが誘導するＣａｖ１チャネルの密度および／または導電率の増大をインスリン分泌細胞の第４集団でよりもインスリン分泌細胞の第１集団において強く阻害するそれらの候補化合物は、糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物として好ましい。
【０００６】
本発明の他の実施形態と組み合わせられる別の実施形態において、本方法は、１つまたは複数の候補化合物の存在下において、インスリン分泌細胞の第５集団を、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率を増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させること、およびインスリン分泌細胞の第５集団をβ１インテグリンの発現または活性を阻害する分子とさらに接触させることをさらに含み、ＡｐｏＣＩＩＩが誘導するＣａｖ１チャネルの密度および／または導電率の増大をインスリン分泌細胞の第５集団でよりもインスリン分泌細胞の第１集団において強く阻害するそれらの候補化合物は、糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物として好ましい。
【０００７】
第２の態様において本発明は、糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物を同定する方法を提供し、
（ａ）１つまたは複数の試験化合物の存在下において、インスリン分泌細胞の第１集団を、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率を増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させること；および
（ｂ）インスリン分泌細胞の第１集団におけるＳＲＢＩの発現または活性を対照と比較して阻害する陽性試験化合物を同定することであって、陽性試験化合物が糖尿病の発症抑制および／または治療を行うための候補化合物であること、を含む。
【０００８】
一実施形態において、対照は、１つまたは複数の試験化合物の非存在下において、インスリン分泌細胞の第２集団を、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率を増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させることを含む。この実施形態は、例えば、細胞の第２集団を、試験化合物が溶解される調合物と類似または同一である調合物、例えばバッファーなどと接触させることを含み得る。
【０００９】
文脈上明白にそうでないと解すべき場合を除いて各々組み合わせることが可能な、本発明のこれらの態様のいずれかの様々な実施形態において、本方法は、細胞をＡｐｏＣＩＩＩと少なくとも６時間接触させることを含み；候補化合物は１型糖尿病の発症抑制および／または治療を行うための候補化合物であり；かつ／または、候補化合物は２型糖尿病の発症抑制および／または治療を行うための候補化合物である。
【００１０】
第３の態様において本発明は、糖尿病の治療および／または発症抑制のための方法を提供し、必要とする対象者にＳＲＢＩの発現および／または活性の阻害剤を有効量投与することを含む。
【００１１】
様々な実施形態において、阻害剤は、抗ＳＲＢＩ抗体、抗ＳＲＢＩアプタマー、ＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡ、ＳＲＢＩ  ｓｈＲＮＡ、ＳＲＢＩのアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＳＲＢＩ発現および／または活性を阻害する小分子から構成される群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】アポリポタンパク質ＣＩＩＩインキュベーションは、β細胞におけるＣａｖ１チャネルの密度および導電率の両方を増大させる。（ａ）対照のビヒクル溶液またはアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）のいずれかとインキュベートしたマウス膵島β細胞の原形質膜パッチにおいて検出された単位Ｃａｖ１チャネル電流の例。（ｂ）対照ビヒクル（ｎ＝３３）またはＡｐｏＣＩＩＩ（ｎ＝３２）のいずれかに曝露したマウス膵島β細胞に付随する原形質膜パッチにおいて測定された単位Ｃａｖ１チャネルの平均数、開確率、平均閉時間および平均開時間。（Ｃ）対照ＲＩＮｍ５Ｆ細胞またはＡｐｏＣＩＩＩで処理した細胞のいずれかに付随する原形質膜パッチにおいて記録された単位Ｃａｖ１チャネル電流の例。（Ｄ）対照ＲＩＮｍ５Ｆ細胞（ｎ＝３４）またはＡｐｏＣＩＩＩとインキュベートした細胞（ｎ＝３５）の原形質膜パッチにおいて検出された単位Ｃａｖ１チャネルの平均数、開確率、平均閉時間および平均開時間。対照群に対し、＊はＰ＜０．０５および＊＊はＰ＜０．０１。
【図２】アポリポタンパク質ＣＩＩＩインキュベーションは全細胞Ｃａ２＋電流を増大させ、Ｃａｖ１チャネル遮断薬ニモジピンとの共インキュベーションはＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるアポリポタンパク質ＣＩＩＩインキュベーションの影響を無効にする。（ａ）対照のビヒクル溶液とインキュベートした細胞（細胞容量：１０．１ｐＦ）およびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）で処理した細胞（細胞容量：１１．１ｐＦ）からの全細胞Ｃａ２＋電流トレースの例。（ｂ）対照細胞（白丸、ｎ＝２６）およびＡｐｏＣＩＩＩで処理した細胞（黒丸、ｎ＝２６）における平均Ｃａ２＋電流密度−電圧関係。対照群に対し、＊はＰ＜０．０５および＊＊はＰ＜０．０１。（ｃ）ニモジピン（Ｎｉｍ）とインキュベートした細胞（細胞容量：１０ｐＦ）およびＡｐｏＣＩＩＩとともにＮｉｍに曝露した細胞（Ｎｉｍ／ＡｐｏＣＩＩＩ）（細胞容量：１１．９ｐＦ）からの全細胞Ｃａ２＋電流トレースの例。（ｄ）Ｎｉｍで処理した細胞（白丸、ｎ＝２０）およびＮｉｍ／ＡｐｏＣＩＩＩと共にインキュベートした細胞（黒丸、ｎ＝２１）における平均Ｃａ２＋電流密度−電圧関係。Ｎｉｍ単独群に対し、＊はＰ＜０．０５および＊＊はＰ＜０．０１。
【図３】ＰＫＡまたはＳｒｃキナーゼ阻害は、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるアポリポタンパク質ＣＩＩＩが誘導する全細胞Ｃａ２＋電流の増大をわずかに低減するが、ＰＫＣ阻害は影響しない。（ａ）対照のビヒクル溶液とインキュベートした細胞（細胞容量：８．５ｐＦ）、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）で処理した細胞（細胞容量：８．２ｐＦ）およびＡｐｏＣＩＩＩ＋ＰＫＡ阻害剤Ｈ−８９に曝露した細胞（ＡｐｏＣＩＩＩ／Ｈ−８９、細胞容量：８．４ｐＦ）からの全細胞Ｃａ２＋電流トレースの例。（ｂ）対照細胞（白丸、ｎ＝３７）およびＡｐｏＣＩＩＩで処理した細胞（黒丸、ｎ＝３６）またはＡｐｏＣＩＩＩ／Ｈ−８９で処理した細胞（黒三角、ｎ＝３６）における平均Ｃａ２＋電流密度−電圧関係。対照群に対し、＊Ｐは＜０．０５および＊＊はＰ＜０．０１。（ｃ）対照細胞（細胞容量：１２．５ｐＦ）、ＡｐｏＣＩＩＩとインキュベートした細胞（細胞容量：１２．０ｐＦ）、ならびにＡｐｏＣＩＩＩおよびＰＫＣ阻害剤カルホスチンＣでの共処理に供した細胞（ＡｐｏＣＩＩＩ／ＣａｌｐＣ、細胞容量：１２．１ｐＦ）において記録された全細胞Ｃａ２＋電流トレースの例。（ｄ）対照細胞（白丸、ｎ＝３３）、ＡｐｏＣＩＩＩで処理した細胞（黒丸、ｎ＝３３）およびＡｐｏＣＩＩＩ／ＣａｌｐＣに曝露した細胞（黒三角、ｎ＝３３）における平均Ｃａ２＋電流密度−電圧関係。対照群に対するＡｐｏＣＩＩＩ群について、＊はＰ＜０．０５および＊＊はＰ＜０．０１。対照群に対するＡｐｏＣＩＩＩ／ＣａｌｐＣ群について、＋はＰ＜０．０５および＋＋はＰ＜０．０１。（ｅ）対照細胞（細胞容量：９．５ｐＦ）、ＡｐｏＣＩＩＩとインキュベートした細胞（細胞容量：９．２ｐＦ）、ならびにＡｐｏＣＩＩＩおよびＳｒｃキナーゼ阻害剤ＰＰ２に曝露した細胞（ＡｐｏＣＩＩＩ／ＰＰ２、細胞容量：１０．０ｐＦ）において得られた全細胞Ｃａ２＋電流トレースの例。（ｆ）対照細胞（白丸、ｎ＝４０）およびＡｐｏＣＩＩＩとインキュベートした細胞（黒丸、ｎ＝４０）またはＡｐｏＣＩＩＩ／ＰＰ２とインキュベートした細胞（黒三角、ｎ＝４０）における平均Ｃａ２＋電流密度−電圧関係。対照群に対するＡｐｏＣＩＩＩ群について、＊＊はＰ＜０．０１。対照群に対するＡｐｏＣＩＩＩ／ＰＰ２群について、＋はＰ＜０．０５。
【図４】ＰＫＡ、ＰＫＣおよびＳｒｃキナーゼの複合的阻害は、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるアポリポタンパク質ＣＩＩＩが誘導する全細胞Ｃａ２＋電流の増大を中和し、かつＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼの共阻害がこの中和作用を得るために十分である。（ａ）ビヒクルとインキュベートした細胞（対照、細胞容量：７．９ｐＦ）、アポリポタンパク質（ＡｐｏＣＩＩＩ）処理後の細胞（細胞容量：７．０ｐＦ）ならびにＨ−８９、カルホスチンＣおよびＰＰ２のタンパク質キナーゼ阻害剤カクテル存在下でＡｐｏＣＩＩＩに曝露した細胞（ＡｐｏＣＩＩＩ／Ｈ−８９／ＣａｌｐＣ／ＰＰ２、細胞容量：７．２ｐＦ）において記録された全細胞Ｃａ２＋電流トレースの例。（ｂ）対照細胞（ｎ＝３５）およびＡｐｏＣＩＩＩに曝露した細胞（ｎ＝３４）またはＡｐｏＣＩＩＩ／Ｈ−８９／ＣａｌｐＣ／ＰＰ２に曝露した細胞（ｎ＝３５）における平均Ｃａ２＋電流密度−電圧関係。対照群およびａｐｏＣＩＩＩ／Ｈ−８９／ＣａｌｐＣ／ＰＰ２群に対し、＊はＰ＜０．０５。（ｃ）対照細胞（細胞容量：８．５ｐＦ）、ＡｐｏＣＩＩＩ処理後の細胞（細胞容量：８．２ｐＦ）ならびにタンパク質キナーゼ阻害剤Ｈ−８９およびＰＰ２の存在下でＡｐｏＣＩＩＩに曝露した細胞（ＡｐｏＣＩＩＩ／Ｈ−８９／ＰＰ２、細胞容量：８．７ｐＦ）からの全細胞Ｃａ２＋電流トレースの例。（ｄ）対照細胞（ｎ＝２６）、ＡｐｏＣＩＩＩに曝露した細胞（ｎ＝２６）およびＡｐｏＣＩＩＩ／Ｈ−８９／ＰＰ２に曝露した細胞（ｎ＝２７）における平均Ｃａ２＋電流密度−電圧関係。対照群に対し、＊はＰ＜０．０５および＊＊はＰ＜０．０１；ＡｐｏＣＩＩＩ／Ｈ−８９／ＰＰ２に対し、＋Ｐ＜０．０５。
【図５】アポリポタンパク質ＣＩＩＩインキュベーションはβ細胞Ｃａｖ１チャネルの発現を変化させない。（ａ）対照のビヒクルまたはアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）とのインキュベーションに供し、抗Ｃａｖ１．２抗体、抗Ｃａｖ１．３抗体および抗ＧＡＰＤＨ抗体をプローブとしてそれぞれ用いたＲＩＮｍ５Ｆ細胞ホモジネートの代表的なイムノブロット。（ｂ）ＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーションに供したＲＩＮｍ５Ｆ細胞ホモジネートにおけるＣａｖ１．２サブユニット（斜線カラム、ｎ＝６）およびＣａｖ１．３サブユニット（黒カラム、ｎ＝６）の、対照（白カラム、ｎ＝６）と比較した相対存在量を示すイムノブロットの定量化。対照細胞およびＡｐｏＣＩＩＩとインキュベートした細胞の間でＣａｖ１．２およびＣａｖ１．３サブユニットの全体的な相対存在量に有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）。
【図６】β１インテグリンのノックダウンは、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるアポリポタンパク質ＣＩＩＩが誘導する全細胞Ｃａ２＋電流の増大を無効にする。（ａ）β１インテグリンｓｉＲＮＡ＃１、陰性対照のｓｉＲＮＡ（ＮＣ  ｓｉＲＮＡ）、およびβ１インテグリンｓｉＲＮＡ＃２でトランスフェクトした細胞における、β１インテグリンおよびＧＡＰＤＨの免疫反応バンドの代表的ブロット。（ｂ）ＮＣ  ｓｉＲＮＡ（白カラム、ｎ＝６）、β１インテグリンｓｉＲＮＡ＃１（斜線カラム、ｎ＝６）、およびβ１インテグリンｓｉＲＮＡ＃２（黒カラム、ｎ＝６）でトランスフェクトしたＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるβ１インテグリンタンパク質のイムノブロットの定量化。ＮＣ  ｓｉＲＮＡに対し、＊＊はＰ＜０．０１。（ｃ）それぞれ、モックトランスフェクションおよび対照ビヒクルとのインキュベーション（ＮＯ  ｓｉＲＮＡ／対照、細胞容量：１２．１ｐＦ）、ＮＣ  ｓｉＲＮＡトランスフェクションおよび対照ビヒクル処理（ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／対照、細胞容量：１１．４ｐＦ）、ＮＣ  ｓｉＲＮＡトランスフェクションおよびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）インキュベーション（ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／ＡｐｏＣＩＩＩ、細胞容量：１２．１ｐＦ）、β１インテグリンｓｉＲＮＡトランスフェクションおよびビヒクル溶液への曝露（β１インテグリンｓｉＲＮＡ／対照、細胞容量：１１．９ｐＦ）ならびにβ１インテグリンｓｉＲＮＡトランスフェクションおよびＡｐｏＣＩＩＩへの曝露（β１インテグリンｓｉＲＮＡ／ＡｐｏＣＩＩＩ、細胞容量：１２．４ｐＦ）が行われた後の個々の細胞において記録された全細胞Ｃａ２＋電流トレースの例。（ｄ）ＮＯ  ｓｉＲＮＡ／対照（黒丸、ｎ＝２９）、ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／対照（白丸、ｎ＝２８）、ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／ａｐｏＣＩＩＩ（黒三角、ｎ＝２８）、β１インテグリンｓｉＲＮＡ／対照（白三角、ｎ＝２９）およびβ１インテグリンｓｉＲＮＡ／ＡｐｏＣＩＩＩ（黒四角、ｎ＝２９）に供した細胞におけるＣａ２＋電流密度−電圧関係。ＮＯ  ｓｉＲＮＡ／対照、ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／対照およびβ１インテグリンｓｉＲＮＡ／対照に対し、＊はＰ＜０．０５および＊＊はＰ＜０．０１。β１インテグリンｓｉＲＮＡ／ＡｐｏＣＩＩＩに対し、＋はＰ＜０．０５。
【図７】ＳＲＢＩのノックダウンは、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるアポリポタンパク質ＣＨＩＩＩが誘導する全細胞Ｃａ２＋電流の増大を妨げる。（ａ）ＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡおよび陰性対照ｓｉＲＮＡ（ＮＣ  ｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトした細胞における、ＧＡＰＤＨおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡのバンドの代表的ブロット。（ｂ）ＮＣ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＲＩＮｍ５Ｆ細胞（白カラム、ｎ＝６）およびＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＲＩＮｍ５Ｆ細胞（黒カラム、ｎ＝６）でのＳＲＢＩタンパク質の定量的免疫ブロット測定。ＮＣ  ｓｉＲＮＡに対し、＊＊はＰ＜０．０１。（ｃ）ＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡおよび陰性対照ｓｉＲＮＡ（ＮＣ  ｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトした細胞における、ＳＲＢＩおよびＧＡＰＤＨの免疫反応バンドのサンプルブロット。（ｄ）ＮＣ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＲＩＮｍ５Ｆ細胞（白カラム、ｎ＝７）およびＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＲＩＮｍ５Ｆ細胞（黒カラム、ｎ＝７）でのＳＲＢＩｍＲＮＡの定量。ＮＣ  ｓｉＲＮＡに対し、＊＊はＰ＜０．０１。（ｅ）それぞれ、モックトランスフェクションおよび対照ビヒクルとのインキュベーション（ＮＯ  ｓｉＲＮＡ／対照、細胞容量：１３．８７ｐＦ）、ＮＣ  ｓｉＲＮＡトランスフェクションおよび対照ビヒクル処理（ＮＣ  ｓｉＲ  ＮＡ／対照、細胞容量：１３．１８ｐＦ）、ＮＣ  ｓｉＲＮＡトランスフェクションおよびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）インキュベーション（ＮＣ  ｓｉＲ  ＮＡ／ＡｐｏＣＩＩＩ、細胞容量：１３．５３ｐＦ）、ＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡトランスフェクションおよびビヒクル溶液への曝露（ＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡ／対照、細胞  容量：１２．９０ｐＦ）ならびにＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡトランスフェクションおよびＡｐｏＣＩＩＩへの曝露（ＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡ／ＡｐｏＣＩＩＩ、細胞容量：１３．０１ｐＦ）に供した後の個々の細胞の代表的な全細胞Ｃａ２＋電流トレース。（ｆ）ＮＯ  ｓｉＲＮＡ／対照（黒丸、ｎ＝３０）、ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／対照（白丸、ｎ＝２９）、ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／ａｐｏＣＩＩＩ（黒三角、ｎ＝３０）、ＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡ／対照（白三角、ｎ＝２９）およびＳＲＢＩ  ｓｉＲＮ  Ａ／ＡｐｏＣＩＩＩ（黒四角、ｎ＝３０）に供した細胞におけるＣａ２＋電流密度−電  圧関係。ＮＯ  ｓｉＲＮＡ／対照、ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／対照およびＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡ／対照に対し、＊はＰ＜０．０５および＊＊はＰ＜０．０１。ＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡ／ＡｐｏＣＩＩＩに対し、＋はＰ＜０．０５。
【図８】ＰＫＡ、ＰＫＣまたはＳｒｃキナーゼの阻害は、基本条件下のＲＩＮｍ５Ｆ細胞における全細胞Ｃａ２＋電流を変化させない。（ａ）対照のビヒクルで処理した細胞（細胞容量：８．８ｐＦ）およびＨ−８９に曝露した細胞（細胞容量：８．５ｐＦ）からの全細胞Ｃａ２＋電流トレースの例。（ｂ）対照細胞（白丸、ｎ＝２０）およびＨ−８９とインキュベートした細胞（黒丸、ｎ＝２０）における平均Ｃａ２＋電流密度−電圧関係。（ｃ）対照細胞（細胞容量：１０．４ｐＦ）およびカルホスチンＣインキュベーションに供した細胞（ＣａｌｐＣ、細胞容量：１１．０ｐＦ）において記録された全細胞Ｃａ２＋電流トレースの例。（ｄ）対照細胞（白丸、ｎ＝２９）およびＣａｌｐＣに曝露した細胞（黒丸、ｎ＝２９）における平均Ｃａ２＋電流密度−電圧関係。（ｅ）対照細胞（細胞容量：９．０ｐＦ）およびＰＰ２処理した細胞（細胞容量：９．１ｐＦ）において得られた全細胞Ｃａ２＋電流トレースの例。（ｆ）対照細胞（白丸、ｎ＝２０）およびＰＰ２とインキュベートした細胞（黒丸、ｎ＝１９）における平均Ｃａ２＋電流密度−電圧関係。
【図９】ＰＫＡ、ＰＫＣおよびＳｒｃキナーゼの複合的阻害またはＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼの共阻害は、基本条件下のＲＩＮｍ５Ｆ細胞における全細胞Ｃａ２＋電流に影響を及ぼさない。（ａ）対照のビヒクル溶液とインキュベートした細胞（細胞容量：１０．８ｐＦ）ならびにＨ−８９、カルホスチンＣおよびＰＰ２で構成されたタンパク質キナーゼ阻害剤カクテルで処理した細胞（Ｈ−８９／ＣａｌｐＣ／ＰＰ２、細胞容量：９．７ｐＦ）において得られた全細胞Ｃａ２＋電流トレース。（ｂ）対照細胞（白丸、ｎ＝３０）およびＨ−８９／ＣａｌｐＣ／ＰＰ２で処理した細胞（黒丸、ｎ＝３０）における平均Ｃａ２＋電流密度−電圧関係。（ｃ）対照のビヒクルで処理した細胞（細胞容量：９．４ｐＦ）ならびにタンパク質キナーゼ阻害剤Ｈ−８９およびＰＰ２で処理した細胞（Ｈ−８９／ＰＰ２、細胞容量：９．１ｐＦ）において得られた全細胞Ｃａ２＋電流トレースの例。（ｄ）対照細胞（白丸、ｎ＝２４）およびＨ−８９／ＰＰ２で処理した細胞（黒丸、ｎ＝２４）における平均Ｃａ２＋電流密度−電圧関係。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
引用された参照文献はすべて、参照により全体が本願に援用される。本願においては、別途記載のないかぎり、利用される技法は、いくつかの有名な参照文献、例えば：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、「Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｌ．１８５，１９９１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」の「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ編，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ｉｎｎｉｓら，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」２ｎｄ  Ｅｄ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９８７、Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、ｐ．１０９−１２８、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編、Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ならびにＡｍｂｉｏｎ  １９９８  Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ、Ａｍｂｉｏｎ）のいずれかにおいて見出すことができる。
【００１４】
文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、説明および請求項の全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の単語は、排他的または網羅的な意味とは対照的に包括的な意味で；すなわち、「含むが、これらに限定されない」の意味において解釈されるべきである。単数のまたは複数形で表記される単語はそれぞれ複数または単数の数も含む。また、「本明細書に（ｈｅｒｅｉｎ）」、「上述の（ａｂｏｖｅ）」、および「以下の（ｂｅｌｏｗ）」ならびに類似の主旨の単語は、本出願において使用される場合、本出願全体を参照するものとし、本出願の任意の特定部分を参照するものではない。
【００１５】
本明細書中で使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、複数の指示物を含む。本明細書中で使用される「および、ならびに（ａｎｄ）」は、明示的にそうでないとされる場合を除き、「または、もしくは（ｏｒ）」と互換的に使用される。
【００１６】
本発明のいずれかの態様のすべての実施形態は、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、組み合わせて使用されうる。
【００１７】
第１の態様では、本発明は、糖尿病の発症抑制および／または治療を行うための候補化合物を同定するための方法を提供し、
（ａ）１つまたは複数の試験化合物の存在下において、インスリン分泌細胞の第１集団を、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率を増大させるのに有効な量のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）と接触させること；
（ｂ）前記１つまたは複数の試験化合物の存在下において、インスリン分泌細胞の第２集団を、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率を増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させること、およびインスリン分泌細胞の第２集団をスカベンジャー受容体クラスＢタイプＩ（ＳＲＢＩ）の発現または活性を阻害する分子とさらに接触させること；および
（ｃ）ＡｐｏＣＩＩＩが誘導するＣａｖ１チャネルの密度および／または導電率のの増大をインスリン分泌細胞の第２集団でよりもインスリン分泌細胞の第１集団において強く阻害する陽性試験化合物を、糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物として同定すること、を含む。
【００１８】
本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩインキュベーションが単一チャネルレベルにおいてＣａｖ１チャネルの開確率および密度の著しい増大を引き起こすことを発見した。この処理は全細胞Ｃａ２＋電流を著しく増大させ、またＣａｖ１チャネル遮断薬ニモジピンはこの増大を完全に無効化した。本発明者らはさらに、スカベンジャー受容体クラスＢタイプＩ（ＳＲＢＩ）のノックダウンはＡｐｏＣＩＩＩがβ細胞Ｃａｖチャネルを過剰活性化するのを防止することを発見した。したがって、ＳＲＢＩの阻害剤は、本発明の陽性候補合成物を下方制御するはずである。したがって、ＡｐｏＣＩＩＩが誘導するＣａｖ１チャネルの密度および／または導電率の増大をインスリン分泌細胞の第２集団でよりもインスリン分泌細胞の第１集団において強く阻害するそれらの陽性試験化合物は、糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物である。よって、本発明のこの態様の方法は、ある特定の様式でＣａ２＋依存性の膵臓β細胞の死を抑制するための、およびしたがって糖尿病の発症抑制および／または治療を行うための化合物を同定するために使用可能である。
【００１９】
本明細書中で使用されるように、「ａｐｏＣＩＩＩ」は、配列番号２（ヒト）（ＮＣＢＩ受入番号ＣＡＡ２５２３３）、配列番号４（ラット）（ＮＣＢＩ受入番号、もしくは配列番号６（マカク）（ＮＣＢＩ受入番号ＣＡＡ４８４１９）において示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、またはその機能的等価物を指す。
【００２０】
ａｐｏＣＩＩＩは、例えばＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能な、実質的に精製されたａｐｏＣＩＩＩであってよく、ここで「実質的に精製された」とは、その正常なｉｎ  ｖｉｖｏの細胞環境から取り出されることを意味する。あるいは、ａｐｏＣＩＩＩは、１型糖尿病由来の血清のような混合物中に存在していてもよいし、混合物中から以下に記載されるもののような標準的技法を使用して部分的または完全に精製されてもよい。好ましい実施形態では、実質的に精製されたａｐｏＣＩＩＩが使用される。
【００２１】
以下に議論されるように、同じアミノ酸配列を有するがグリコシル化パターンにおいて異なる、３つの既知のヒトａｐｏＣＩＩＩアイソフォームが存在する。したがって、好ましい実施形態では、グリコシル化されたａｐｏＣＩＩＩが用いられ、グリコシル化は好ましくはシアリル化である。別の好ましい実施形態では、モノシアリル化またはジシアリル化されたａｐｏＣＩＩＩが使用される。そのようなグリコシル化物は、例えばＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入してもよいし、以下に記載されるもののような標準的技法を使用して、部分的または完全に精製されてもよい。
【００２２】
ＳＲ−ＢＩとしても知られるスカベンジャー受容体クラスＢ部材１（ＳＲＢ１）は、ＳＣＡＲＢ１遺伝子によりコードされる。ＳＲＢＩは、肝臓での高比重リポタンパク質からのコレステロールエステルの取込みの促進における役割が最もよく知られている。
【００２３】
ヒトＳＲＢＩのアミノ酸配列は配列番号：９に示される。例示的なｃＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号：１０に示される。
【００２４】
ＳＲＢＩの発現（ＲＮＡまたはタンパク質）または活性を阻害する任意の適切な分子（ＳＲＢＩ遮断を含むがこれに限定しない）が本発明の本方法において使用でき、これには、抗ＳＲＢＩ抗体、抗ＳＲＢＩアプタマー、ＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡ、ＳＲＢＩ  ｓｈＲＮＡ、ＳＲＢＩのアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＳＲＢＩ阻害小分子を含むがこれに限定しない。抗ＳＲＢＩ抗体はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＥｐｉｔｏｍｉｃｓおよびＯｒｉＧｅｎｅを含む、様々な民間のサプライヤーから入手可能である。一実施形態において、阻害剤はインターフェロンアルファを含み、これはＳＲＢＩ発現を阻害することが示されている（Ｇｕｔ．２００８  Ｍａｙ；５７（５）：６６４−７１．Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｎｏｖ  １２）。別の実施形態では、ＳＲＢＩ阻害剤はＮ−［４−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルペラジン−１−イル）フェニル］−（２−クロロ−５−ニトロフェニル）カルボキサミド（Ｒ−１３８３２９）を含み、これはＳＲＢＩ受容体活性を遮断することが示されている（Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００６  Ｄｅｃ；５８（１２）：１６２９−３８）。別の実施形態では、ＳＲＢＩ阻害剤は２−ヘキシル−１−シクロペンタノンチオセミカルバゾン、３３Ｍ２０、ＢＬＴ１、脂質輸送遮断−１、ＣＡＳ番号３２１６７３−３０−７（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）を含む。別の実施形態では、ＳＲＢＩ阻害剤は、米国特許出願２００４０１７１０７３（参照によりその全体に本明細書に組み込む）に開示された１つまたは複数の任意のＳＲＢＩ阻害剤であり、これらの化合物は次の化合物番号として米国特許出願２００４０１７１０７３（表１−２）に示されている。ＭＩＴ９９５２−１、９９５２−２、９９５２−３、９９５２−４、９９５２−５、９９５２−６、９９５２−７、９９５２−８、９９５２−９、９９５２−１０、９９５２−１１、９９５２−１２、９９５２−１３、９９５２−１４、９９５２−１５、９９５２−１６、９９５２−１７、９９５２−１８、９９５２−１９、９９５２−２０、９９５２−２１、９９５２−２２、９９５２−２３、９９５２−２４、９９５２−２５、９９５２−２６、９９５２−２７、９９５２−２８、９９５２−２９、９９５２−３０、９９５２−３１、９９５２−３２、９９５２−３３、９９５２−３４、９９５２−３５、９９５２−３６、９９５２−３７、９９５２−３８、９９５２−３９、９９５２−４０、９９５２−４１、９９５２−４２、９９５２−４３、９９５２−４４、９９５２−４５、９９５２−４６、９９５２−４７、９９５２−４８、９９５２−４９、９９５２−５０、９９５２−５１、９９５２−５２、９９５２−５３、９９５２−５４、９９５２−５５、９９５２−５６、９９５２−５７、９９５２−５８、９９５２−５９、９９５２−６０、９９５２−６１、９９５２−６２、９９５２−６３、９９５２−６４、９９５２−６５、９９５２−６６、９９５２−６７、９９５２−６８、９９５２−６９、９９５２−７０、９９５２−７１、９９５２−７２、９９５２−７３、９９５２−７４、９９５２−７５、９９５２−７６、９９５２−７７、９９５２−７８、９９５２−７９、９９５２−８０、９９���２−８１、９９５２−８２、９９５２−８３、９９５２−８４、９９５２−８５、９９５２−８６、９９５２−８７、９９５２−８８、９９５２−８９、９９５２−９０、９９５２−９１、９９５２−９２、９９５２−９３、９９５２−９４、９９５２−９５、９９５２−９６、９９５２−９７、９９５２−９８、９９５２−９９、９９５２−１００、９９５２−１０１、９９５２−１０２、９９５２−１０３、９９５２−１０４、９９５２−１０５、９９５２−１０６、９９５２−１０７、９９５２−１０８、９９５２−１０９、９９５２−１１０、９９５２−１１１、９９５２−１１２、９９５２−１１３、９９５２−１１４、９９５２−１１５、９９５２−１１６、９９５２−１１７、９９５２−１１８、９９５２−１１９、９９５２−１２０、９９５２−１２１、９９５２−１２２、９９５２−１２３、９９５２−１２４、９９５２−１２５、９９５２−１２６、９９５２−１２７、９９５２−１２８、９９５２−１２９、９９５２−１３０、９９５２−１３１、９９５２−１３２、９９５２−１３３、９９５２−１３４、９９５２−１３５、９９５２−１３６、９９５２−１３７、９９５２−１３８、９９５２−１３９、９９５２−１４０、９９５２−１４１、９９５２−１４２、９９５２−１４３、９９５２−１４４、９９５２−１４５、９９５２−１４６、９９５２−１４７、９９５２−１４８、９９５２−１４９、９９５２−１５０、９９５２−１５１、９９５２−１５２、９９５２−１５３、９９５２−１５４、９９５２−１５５、９９５２−１５６、９９５２−１５７、９９５２−１５８、９９５２−１５９、９９５２−１６０、９９５２−１６１、９９５２−１６２、９９５２−１６３、９９５２−１６４、９９５２−１６５、９９５２−１６６、９９５２−１６７、９９５２−１６８、９９５２−１６９、９９５２−１７０、９９５２−１７１、９９５２−１７２、９９５２−１７３、９９５２−１７４、９９５２−１７５、９９５２−１７６、９９５２−１７７、９９５２−１７８、９９５２−１７９、９９５２−１８０、９９５２−１８１、９９５２−１８２、９９５２−１８３、９９５２−１８４、９９５２−１８５、９９５２−１８６、９９５２−１８７、９９５２−１８８、９９５２−１８９、９９５２−１９０、９９５２−１９１、９９５２−１９２、９９５２−１９３、９９５２−１９４、９９５２−１９５、９９５２−１９６、９９５２−１９７、９９５２−１９８、９９５２−１９９、９９５２−２００、９９５２−２０１、９９５２−２０２、９９５２−２０３、９９５２−２０４、９９５２−２０５、９９５２−２０６、９９５２−２０７、９９５２−２０８、９９５２−２０９、９９５２−２１０、９９５２−２１１、９９５２−２１２、９９５２−２１３、９９５２−２１４、９９５２−２１５、９９５２−２１６、９９５２−２１７、９９５２−２１８、９９５２−２１９、９９５２−２２０、９９５２−２２１、９９５２−２２２、９９５２−２２３、９９５２−２２４、９９５２−２２５、９９５２−２２６、９９５２−２２７、９９５２−２２８、９９５２−２２９、９９５２−２３０、９９５２−２３１、９９５２−２３２、９９５２−２３３、９９５２−２３４、���９５２−２３５、９９５２−２３６、９９５２−２３７、９９５２−２３８、９９５２−２３９、９９５２−２４０、９９５２−２４１、９９５２−２４２、９９５２−２４３、９９５２−２４４、９９５２−２４５、９９５２−２４６、９９５２−２４７、９９５２−２４８、９９５２−２４９、９９５２−２５０、９９５２−２５１、９９５２−２５２、９９５２−２５３、９９５２−２５４、９９５２−２５５、９９５２−２５６、９９５２−２５７、９９５２−２５８、９９５２−２５９、９９５２−２６０、９９５２−２６１、９９５２−２６２、９９５２−２６３、９９５２−２６４、９９５２−２６５、９９５２−２６６、９９５２−２６７、９９５２−２６８、９９５２−２６９、９９５２−２７０、９９５２−２７１、９９５２−２７２、９９５２−２７３、９９５２−２７４、９９５２−２７５、９９５２−２７６、９９５２−２７７、９９５２−２７８、９９５２−２７９、９９５２−２８０、９９５２−２８１、９９５２−２８２、９９５２−２８３、９９５２−２８４、９９５２−２８５、９９５２−２８６、９９５２−２８７、９９５２−２８８、９９５２−２８９、９９５２−２９０、９９５２−２９１、９９５２−２９２、９９５２−２９３、９９５２−２９４、９９５２−２９５、９９５２−２９６、９９５２−２９７、９９５２−２９８、９９５２−２９９、９９５２−３００、９９５２−３０１、９９５２−３０２、９９５２−３０３、９９５２−３０４、９９５２−３０５、９９５２−３０６、９９５２−３０７、９９５２−３０８、９９５２−３０９、９９５２−３１０、９９５２−３１１、９９５２−３１２、９９５２−３１３、９９５２−３１４、９９５２−３１５、９９５２−３１６、９９５２−３１７、９９５２−３１８、９９５２−３１９、９９５２−３２０、９９５２−３２１、９９５２−３２２、９９５２−３２３、９９５２−３２４、９９５２−３２５、９９５２−３２６、９９５２−３２７、９９５２−３２８、９９５２−３２９、９９５２−３３０、９９５２−３３１、９９５２−３３２、９９５２−３３３、９９５２−３３４、９９５２−３３５、９９５２−３３６、９９５２−３３７、９９５２−３３８、９９５２−３３９、９９５２−３４０、９９５２−３４１、および９９５２−３４２。またはこれらの薬学的塩もＳＲＢＩ阻害剤に含む。当業者は、米国２００４０１７１０７３適用における化合物の構造の教示に照らして（表１を参照）、本明細書に提示された化合物名に基づいて化合物の構造を容易に同定し得る。一実施形態では、化合物は、９９５２−５３、９９５２−６１、９９５２−１９、９９５２−２９および／または９９５２−６のうち１つもしくは複数、またはその薬学的塩である。
【００２５】
任意の適切なインスリン分泌細胞、例えば、限定するものではないが膵臓β細胞などが使用されうる。本明細書中で使用されるように、「膵臓β細胞」は膵臓β島細胞を含有する任意の細胞集団である。細胞は、任意の哺乳類生物種から得ることが可能であり、またはアッセイがｉｎ  ｖｉｖｏで行われる場合は哺乳類生物種の体内に存在していてもよい。そのような膵臓β島細胞集団には、膵臓、単離された膵ランゲルハンス氏島（「膵島」）、単離された膵臓β島細胞、およびインスリン分泌細胞株が含まれる。膵臓の単離のための方法は当分野において良く知られており、また膵島を単離する方法は、例えば、Ｃｅｊｖａｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２００３、第５２巻、ｐ．１１７６−１１８１；Ｚａｍｂｒｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９９、第５７巻、ｐ．１１５９−１１６４、およびＦａｇａｎら、Ｓｕｒｇｅｒｙ、１９９８、第１２４巻、ｐ．２５４−２５９、ならびにこれらの文献中において引用された参照文献に見出すことができる。インスリン分泌細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手可能である。膵臓β細胞が使用されるさらなる実施形態では、細胞は、９５％を超えるβ細胞を膵島内に含有しているｏｂ／ｏｂマウスから得られるが、市販でも入手可能である。
【００２６】
Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率の測定は、当分野において標準的な方法、例えば、限定するものではないが単一チャネルおよび全細胞のパッチクランプ測定（セルアタッチ式およびパーフォレイテッド全細胞式のパッチクランプ技法）などによって実行されうる。本明細書中で使用されるように、「Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率の増大」とは、アッセイの過程において、試験化合物の非存在下で見られるよりも大きく増大することを指す。この方法では、試験化合物がその化合物の非存在下で見られるよりも大きくＣａｖ１チャネルの密度および／または導電率の増大を促進する限りは、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率においてベースラインを超える特定量の増大は必要ない。好ましい実施形態では、増大は、標準的な統計解析によって判断されるような統計的に有意な増大である。
【００２７】
インスリン分泌細胞の第１集団をａｐｏＣＩＩＩと接触させることは、細胞を１つまたは複数の試験化合物と接触させることの前、後、または同時に行うことができる。同様に、インスリン分泌細胞の第２集団をＳＢＩＲ阻害剤と接触させることは、細胞を１つまたは複数の試験化合物と接触させることの前、後、または同時に行うことができる。接触させることはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われてもｉｎ  ｖｉｖｏで（例：実験動物モデルにおいて）行われてもよい。本発明の候補同定法のうちのいずれかの方法を実行するために、任意の適切な培養条件が使用でき；好ましくは、細胞の第１および第２集団をａｐｏＣＩＩＩおよび１つまたは複数の試験化合物と接触させる際に同一の実験条件が使用され、細胞の第２集団のＳＢＩＲ阻害剤との接触のみが異なっていることが好ましい。一実施形態において、細胞はＡｐｏＣＩＩＩと少なくとも６時間接触させられる。別の実施形態では、細胞は、１ｍＭ〜１５ｍＭのグルコース；好ましくは３ｍＭ〜１２ｍＭ；好ましくは約１１ｍＭのグルコースを含む培地中で増殖させられる。さらなる実施形態では、細胞はおよそ３７℃で（好ましくは、５％ＣＯ２などの加湿インキュベータ内で）培養されてから、ほぼ室温においてＣａｖ１チャネルの密度および／または導電率の記録がなされる。１つまたは複数の試験化合物およびＳＢＩＲ阻害剤の適切な量は、本明細書の教示に照らして、使用する特定のアッセイの詳細を元に、当業者によって測定され得る。上記およびその他の適切なアッセイ条件は、本明細書中の教示を基にすれば十分に当業者のレベルの範囲内にある。
【００２８】
一実施形態において、候補化合物は、１型糖尿病の発症抑制および／または治療を行うための候補化合物である。別の実施形態では、候補化合物は、２型糖尿病の発症抑制および／または治療を行うための候補化合物である。本発明は、上記スクリーニング方法によって同定された化合物、および治療を必要とする対象者を治療するためのそれらの使用、をさらに提供する。
【００２９】
別の実施形態では、本方法は、膵臓β細胞でａｐｏＣＩＩＩが誘導するＣａｖ１チャネルの密度および／または導電率における増大を阻害する候補化合物の大規模合成をさらに含む。
【００３０】
試験化合物がポリペプチド配列を含む場合、そのようなポリペプチドは化学合成されてもよいし、組換え発現されてもよい。組換え発現は、上に開示されるように、当分野で標準的な方法を使用して遂行できる。そのような発現ベクターはバクテリアまたはウイルスの発現ベクターを含んでよく、またそのような宿主細胞は原核生物であっても真核生物であってもよい。固相法、液相法、もしくはペプチド縮合法の良く知られた技法、またはこれらの任意の組合せを使用して調製される合成ポリペプチドは、天然または非天然のアミノ酸を含むことができる。ペプチド合成に使用されるアミノ酸は、標準的な脱保護、中和、カップリングおよび洗浄プロトコールを用いる標準的なＢｏｃ（Ｎα−アミノが保護されたＮα−ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ酸樹脂であってもよいし、または塩基に不安定な標準的なＮα−アミノが保護された９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸であってもよい。ＦｍｏｃおよびＢｏｃいずれのＮα−アミノ保護アミノ酸も、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ケンブリッジ・リサーチ・バイオケミカル（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＲｅｓｅａｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、またはその他の当業者によく知られた化学企業から入手可能である。加えて、ポリペプチドは当業者によく知られたその他のＮα−保護基を用いて合成されてもよい。固相ペプチド合成は、当業者によく知られた技法によって行うことが可能であり、また自動合成装置の使用などによって提供されてもよい。
【００３１】
試験化合物が抗体を含む場合、そのような抗体はポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。抗体は、ヒト化型、完全なヒト型、またはネズミ科動物型であってよい。そのような抗体は、良く知られた方法、例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）に記載された方法によって作製可能である。
【００３２】
試験化合物が核酸配列を含む場合、そのような核酸もまた、化学合成されてもよいし、組換え発現されてもよい。組換え発現の技法は当業者には良く知られている（例えば上述のＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照）。核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、また一本鎖でも二本鎖でもよい。同様に、そのような核酸は、当分野の標準的技法を使用して、手動反応または自動反応によって化学的にまたは酵素的に合成できる。化学合成されるかまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの酵素的合成によって合成された場合、核酸は細胞内への導入に先立って精製されてもよい。例えば、核酸は、溶媒もしくは樹脂を用いた抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、またはこれらの組合せによって混合物から精製されうる。あるいは、核酸は、試料の処理工程による損失を回避するために精製しないでまたは最低限しか精製せずに使用されてもよい。
【００３３】
試験化合物がポリペプチド、抗体、または核酸以外の化合物を含む場合、そのような化合物は、有機化学合成を行なうための当分野の様々な方法のいずれかにより作製されうる。
【００３４】
一実施形態において、本方法は、１つまたは複数の候補化合物の存在下において、インスリン分泌細胞の第３集団を、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率を増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させること、およびインスリン分泌細胞の第３集団をＣａｖ２および／またはＣａｖ３チャネル遮断薬とさらに接触させることをさらに含み、ＡｐｏＣＩＩＩが誘導する密度および／または導電率の増大をインスリン分泌細胞の第１集団でよりもインスリン分泌細胞の第３集団において強く阻害する候補化合物は、糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物として好ましい。この実施形態では、Ｃａｖ２チャネルおよび／またはＣａｖ３チャネル遮断薬は、Ｃａｖ２チャネルおよび／またはＣａｖ３チャネル選択的であり、かつＣａｖ１チャネル遮断薬としての役割は果たさない。適切なＣａｖ２チャネルおよび／またはＣａｖ３チャネルの遮断薬には、ω−アガトキシンＩＶＡ、ω−コノトキシンＧＶＩＡおよびＳＮＸ４８２（Ｃａｖ２チャネル遮断薬）；ならびにミベフラジルおよびＮＮＣ５５−０３９６（Ｃａｖ３チャネル遮断薬）があるが、これらに限定しない。本明細書中の教示に基づいて、所与のアッセイで有用に使用されうる任意のＣａｖ２チャネルおよび／またはＣａｖ３チャネル遮断薬の量を決定することは、当業者のレベルの範囲内にある。
【００３５】
本発明の他の実施形態と組み合わせられる、さらなる実施形態において、本方法は、１つまたは複数の候補化合物の存在下において、インスリン分泌細胞の第４集団を、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率を増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩを接触させること、およびインスリン分泌細胞の第４集団をＳｒｃキナーゼ阻害剤および／またはプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）阻害剤とさらに接触させることをさらに含み、ＡｐｏＣＩＩＩが誘導するＣａｖ１チャネルの密度および／または導電率の増大をインスリン分泌細胞での第４集団よりもインスリン分泌細胞の第１集団において強く阻害するそれらの候補化合物は、糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物として好ましい。
【００３６】
下記の実施例に示すように、本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩがＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼのＳＲＢＩ／β１インテグリン依存性の共活性化によりβ細胞Ｃａｖ１チャネルを過剰活性化することを発見した。したがって、ＰＫＡおよび／またはＳｒｃの阻害剤は、本発明の陽性候補合成物を下方制御するはずである。したがって、ＡｐｏＣＩＩＩが誘導するＣａｖ１チャネルの密度および／または導電率の増大をインスリン分泌細胞の第４集団でよりもインスリン分泌細胞の第１集団において強く阻害するそれらの候補化合物は、糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物として好ましい。任意の適切なＰＫＡおよび／またはＳｒｃキナーゼ阻害剤、例えば、限定するものではないが以下の実施例に開示されたものが使用されうる。典型的なＳｒｃキナーゼ阻害剤はＰＰ１アナログ、ＰＰ２、および以下の実施例に開示された化合物を含む。典型的なＰＫＡ阻害剤には、アデノシン３’，５’−サイクリックモノホスホロチオエート−Ｒ、Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−９、Ｈ−８９、および以下の実施例において開示される化合物が挙げられる。本明細書中の教示に基づいて、所与のアッセイで有用に使用されうる任意のＳｒｃキナーゼ阻害剤および／またはＰＫＡ阻害剤の量を決定することは、当業者のレベルの範囲内にある。
【００３７】
本発明の他の実施形態と組み合わせられる、別の実施形態において、本方法は、１つまたは複数の候補化合物の存在下において、インスリン分泌細胞の第５集団を、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率に有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させること、およびインスリン分泌細胞の第５集団をβ１インテグリンの発現または活性を阻害する分子とさらに接触させることをさらに含み、ＡｐｏＣＩＩＩが誘導するＣａｖ１チャネルの密度および／または導電率の増大をインスリン分泌細胞の第５集団でよりもインスリン分泌細胞の第１集団において強く阻害するそれらの陽性試験化合物は、糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物として好ましい。
【００３８】
下記の実施例に示すように、本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩがＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼのＳＲＢＩ−β１インテグリン依存性の共活性化によりβ細胞Ｃａｖ１チャネルを過剰活性化することを発見した。したがって、β１インテグリンの阻害剤は、本発明の陽性候補合成物を下方制御するはずである。したがって、ＡｐｏＣＩＩＩが誘導するＣａｖ１チャネルの密度および／または導電率の増大をインスリン分泌細胞の第５集団でよりもインスリン分泌細胞の第１集団において強く阻害するそれらの候補化合物は、糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物として好ましい。任意の適切なβ１インテグリン阻害剤、例えば、限定するものではないが以下の実施例において開示されたものが使用されうる（抗体、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）。本明細書中の教示に基づいて、所与のアッセイで有用に使用されうる任意のβ１インテグリン阻害剤の量を決定することは、当業者のレベルの範囲内にある。
【００３９】
第２の態様において、本発明は、糖尿病の発症抑制および／または治療を行うための候補化合物を同定する方法を提供し、
（ａ）１つまたは複数の試験化合物の存在下において、インスリン分泌細胞の第１集団を、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率を増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させること；ならびに
（ｂ）対照と比較してインスリン分泌細胞の第１集団においてＡｐｏＣＩＩＩが誘導するＣａｖ１チャネルの密度および／または導電率の増大を阻害しかつＳＲＢＩの発現または活性も阻害するそれらの陽性試験化合物を同定することであって、陽性試験化合物が糖尿病の発症抑制および／または治療のための候補化合物であること、を含む。
【００４０】
ＳＲＢＩの発現および／または活性を測定する方法は当技術分野において知られている。非限定的実施形態において、ＲＮＡおよび／またはタンパク質発現は、標準的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、免疫蛍光検査法、または他の技術を使用してモニターできる。ＳＲＢＩの活性は様々な技術を使用してモニターでき、技術としては、例えば限定するものではないが、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２００６  Ｄｅｃ；  ５８（１２）：１６２９−３８で教示されているような受容体遮断のアッセイを含み、本文献を参照により本明細書により組込む。ＳＲＢＩの発現および／または活性を測定するための他の技術を使用することは、十分当業者のレベルの範囲内にある。
【００４１】
対照と比較したＳＲＢＩの発現および／または活性の量はいかなる量でも「阻害」と考えられ；様々な実施形態において、阻害は、対照と比較してＳＲＢＩ発現および／または活性が少なくとも１０％、２０％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であることを含む。
【００４２】
一実施形態において、対照は、１つまたは複数の試験化合物の非存在下において、インスリン分泌細胞の第２集団を、Ｃａｖ１チャネルの密度および／または導電率を増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップを含む。この実施形態は、例えば、細胞の第２集団を、試験化合物が溶解される調合物と類似または同一である調合物と、例えばバッファーなどと接触させることを含み得る。
【００４３】
本発明の第１の態様のすべての実施形態は、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、この第２の態様において使用されうる。
【００４４】
一実施形態において、対照は、試験化合物の非存在下においてインスリン分泌細胞の第２集団をＡｐｏＣＩＩＩと接触させることを含む。実施形態は、例えば、細胞の第２集団を、試験化合物が溶解される調合物と類似または同一である調合物と、例えばバッファーなどと接触させることを含み得る。
【００４５】
第３の態様において本発明は、糖尿病の治療および／または発症抑制のための方法を提供し、必要とする対象に、ＳＲＢＩの発現および／または活性の阻害剤を有効量投与することを含む。様々な実施形態において、阻害剤は、抗ＳＲＢＩ抗体、抗ＳＲＢＩアプタマー、ＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡ、ＳＲＢＩ  ｓｈＲＮＡ、ＳＲＢＩのアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＳＲＢＩ発現および／または活性を阻害する小分子から構成される群から選択される。
【００４６】
ＳＲＢＩの発現または活性を阻害する任意の適切な分子が本発明の治療方法において使用でき、抗ＳＲＢＩ抗体、抗ＳＲＢＩアプタマー、ＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡ、ＳＲＢＩ  ｓｈＲＮＡ、ＳＲＢＩのアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＳＲＢＩ阻害小分子を含むがこれらに限定しない。抗ＳＲＢＩ抗体はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＥｐｉｔｏｍｉｃｓおよびＯｒｉＧｅｎｅを含む、様々な民間のサプライヤーから入手可能である。一実施形態において、阻害剤はインターフェロンアルファを含み、これはＳＲＢＩ発現を阻害することが示されている（Ｇｕｔ．  ２００８  Ｍａｙ；５７（５）：６６４−７１．  Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｎｏｖ  １２）。別の実施形態では、ＳＲＢＩ阻害剤はＮ−［４−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルペラジン−１−イル）フェニル］−（２−クロロ−５−ニトロフェニル）カルボキサミド（Ｒ−１３８３２９）を含み、これはＳＲＢＩ受容体活性を遮断することが示されている（Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２００６  Ｄｅｃ；  ５８（１２）：１６２９−３８）。別の実施形態では、ＳＲＢＩ阻害剤は２−ヘキシル−１−シクロペンタノンチオセミカルバゾン、３３Ｍ２０、ＢＬＴ１、脂質輸送−１遮断、ＣＡＳ番号３２１６７３−３０−７（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）を含む。別の実施形態では、ＳＲＢＩ阻害剤は、米国特許出願２００４０１７１０７３（参照によりその全体に本明細書に組み込む）に開示された１つまたは複数の任意のＳＲＢＩ阻害剤であり、かつＭＩＴ９９５２−１、９９５２−２、９９５２−３、９９５２−４、９９５２−５、９９５２−６、９９５２−７、９９５２−８、９９５２−９、９９５２−１０、９９５２−１１、９９５２−１２、９９５２−１３、９９５２−１４、９９５２−１５、９９５２−１６、９９５２−１７、９９５２−１８、９９５２−１９、９９５２−２０、９９５２−２１、９９５２−２２、９９５２−２３、９９５２−２４、９９５２−２５、９９５２−２６、９９５２−２７、９９５２−２８、９９５２−２９、９９５２−３０、９９５２−３１、９９５２−３２、９９５２−３３、９９５２−３４、９９５２−３５、９９５２−３６、９９５２−３７、９９５２−３８、９９５２−３９、９９５２−４０、９９５２−４１、９９５２−４２、９９５２−４３、９９５２−４４、９９５２−４５、９９５２−４６、９９５２−４７、９９５２−４８、９９５２−４９、９９５２−５０、９９５２−５１、９９５２−５２、９９５２−５３、９９５２−５４、９９５２−５５、９９５２−５６、９９５２−５７、９９５２−５８、９９５２−５９、９９５２−６０、９９５２−６１、９９５２−６２、９９５２−６３、９９５２−６４、９９５２−６５、９９５２−６６、９９５２−６７、９９５２−６８、９９５２−６９、９９５２−７０、９９５２−７１、９９５２−７２、９９５２−７３、９９５２−７４、９９５２−７５、９９５２−７６、９９５２−７７、９９５２−７８、９９５２−７９、９９５２−８０、９９５２−８１、９９５２−８２、９９５２−８３、９９５２−８４、９９５２−８５、９９５２−８６、９９５２−８７、９９５２−８８、９９５２−８９、９９５２−９０、９９��２−９１、９９５２−９２、９９５２−９３、９９５２−９４、９９５２−９５、９９５２−９６、９９５２−９７、９９５２−９８、９９５２−９９、９９５２−１００、９９５２−１０１、９９５２−１０２、９９５２−１０３、９９５２−１０４、９９５２−１０５、９９５２−１０６、９９５２−１０７、９９５２−１０８、９９５２−１０９、９９５２−１１０、９９５２−１１１、９９５２−１１２、９９５２−１１３、９９５２−１１４、９９５２−１１５、９９５２−１１６、９９５２−１１７、９９５２−１１８、９９５２−１１９、９９５２−１２０、９９５２−１２１、９９５２−１２２、９９５２−１２３、９９５２−１２４、９９５２−１２５、９９５２−１２６、９９５２−１２７、９９５２−１２８、９９５２−１２９、９９５２−１３０、９９５２−１３１、９９５２−１３２、９９５２−１３３、９９５２−１３４、９９５２−１３５、９９５２−１３６、９９５２−１３７、９９５２−１３８、９９５２−１３９、９９５２−１４０、９９５２−１４１、９９５２−１４２、９９５２−１４３、９９５２−１４４、９９５２−１４５、９９５２−１４６、９９５２−１４７、９９５２−１４８、９９５２−１４９、９９５２−１５０、９９５２−１５１、９９５２−１５２、９９５２−１５３、９９５２−１５４、９９５２−１５５、９９５２−１５６、９９５２−１５７、９９５２−１５８、９９５２−１５９、９９５２−１６０、９９５２−１６１、９９５２−１６２、９９５２−１６３、９９５２−１６４、９９５２−１６５、９９５２−１６６、９９５２−１６７、９９５２−１６８、９９５２−１６９、９９５２−１７０、９９５２−１７１、９９５２−１７２、９９５２−１７３、９９５２−１７４、９９５２−１７５、９９５２−１７６、９９５２−１７７、９９５２−１７８、９９５２−１７９、９９５２−１８０、９９５２−１８１、９９５２−１８２、９９５２−１８３、９９５２−１８４、９９５２−１８５、９９５２−１８６、９９５２−１８７、９９５２−１８８、９９５２−１８９、９９５２−１９０、９９５２−１９１、９９５２−１９２、９９５２−１９３、９９５２−１９４、９９５２−１９５、９９５２−１９６、９９５２−１９７、９９５２−１９８、９９５２−１９９、９９５２−２００、９９５２−２０１、９９５２−２０２、９９５２−２０３、９９５２−２０４、９９５２−２０５、９９５２−２０６、９９５２−２０７、９９５２−２０８、９９５２−２０９、９９５２−２１０、９９５２−２１１、９９５２−２１２、９９５２−２１３、９９５２−２１４、９９５２−２１５、９９５２−２１６、９９５２−２１７、９９５２−２１８、９９５２−２１９、９９５２−２２０、９９５２−２２１、９９５２−２２２、９９５２−２２３、９９５２−２２４、９９５２−２２５、９９５２−２２６、９９５２−２２７、９９５２−２２８、９９５２−２２９、９９５２−２３０、９９５２−２３１、９９５２−２３２、９９５２−２３３、９９５２−２３４、９９５２−２３５、９９５２−２３６、９９５２−２３７、９９５２−２３８、９９５２−２３９、９９５２−２４０、９９５２−２４１、９９５２−２４２、９９５２−２４３��９９５２−２４４、９９５２−２４５、９９５２−２４６、９９５２−２４７、９９５２−２４８、９９５２−２４９、９９５２−２５０、９９５２−２５１、９９５２−２５２、９９５２−２５３、９９５２−２５４、９９５２−２５５、９９５２−２５６、９９５２−２５７、９９５２−２５８、９９５２−２５９、９９５２−２６０、９９５２−２６１、９９５２−２６２、９９５２−２６３、９９５２−２６４、９９５２−２６５、９９５２−２６６、９９５２−２６７、９９５２−２６８、９９５２−２６９、９９５２−２７０、９９５２−２７１、９９５２−２７２、９９５２−２７３、９９５２−２７４、９９５２−２７５、９９５２−２７６、９９５２−２７７、９９５２−２７８、９９５２−２７９、９９５２−２８０、９９５２−２８１、９９５２−２８２、９９５２−２８３、９９５２−２８４、９９５２−２８５、９９５２−２８６、９９５２−２８７、９９５２−２８８、９９５２−２８９、９９５２−２９０、９９５２−２９１、９９５２−２９２、９９５２−２９３、９９５２−２９４、９９５２−２９５、９９５２−２９６、９９５２−２９７、９９５２−２９８、９９５２−２９９、９９５２−３００、９９５２−３０１、９９５２−３０２、９９５２−３０３、９９５２−３０４、９９５２−３０５、９９５２−３０６、９９５２−３０７、９９５２−３０８、９９５２−３０９、９９５２−３１０、９９５２−３１１、９９５２−３１２、９９５２−３１３、９９５２−３１４、９９５２−３１５、９９５２−３１６、９９５２−３１７、９９５２−３１８、９９５２−３１９、９９５２−３２０、９９５２−３２１、９９５２−３２２、９９５２−３２３、９９５２−３２４、９９５２−３２５、９９５２−３２６、９９５２−３２７、９９５２−３２８、９９５２−３２９、９９５２−３３０、９９５２−３３１、９９５２−３３２、９９５２−３３３、９９５２−３３４、９９５２−３３５、９９５２−３３６、９９５２−３３７、９９５２−３３８、９９５２−３３９、９９５２−３４０、９９５２−３４１、および９９５２−３４２として識別されるもの、またはそれらの塩である。一実施形態では、化合物は、９９５２−５３、９９５２−６１、９９５２−１９、９９５２−２９および／または９９５２−６の１つもしくは複数、またはその薬学的塩である。
【００４７】
この第３の態様の一実施形態において、本方法は、糖尿病の治療または発症抑制を行うためにＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼの阻害剤の有効量を投与することをさらに含む。典型的なＳｒｃキナーゼ阻害剤はＰＰ１類似体、ＰＰ２、および下記の実施例に開示される化合物を含む。典型的なＰＫＡ阻害剤には、アデノシン３’，５’−サイクリックモノホスホロチオエート−Ｒ、Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−９、Ｈ−８９、および以下の実施例において開示される化合物が挙げられる。
【００４８】
この第３の態様の別の実施形態において、本発明は、β１インテグリンの発現および／または活性の阻害剤を有効量投与することをさらに含む。様々な実施形態において、阻害剤は、抗β１インテグリン抗体、抗β１インテグリンアプタマー、β１インテグリンｓｉＲＮＡ、β１インテグリンｓｈＲＮＡ、およびβ１インテグリンのアンチセンスオリゴヌクレオチドで構成される群から選択される。
【００４９】
この第３の態様のさらなる実施形態において、本発明は、膵臓β細胞のＡｐｏＣＩＩＩ活性化の阻害剤を有効量投与することを含む。本明細書中で使用されるように、ａｐｏＣＩＩＩ活性化の「阻害剤」には、ａｐｏＣＩＩＩＤＮＡのＲＮＡへの転写を低減する化合物、ａｐｏＣＩＩＩ  ＲＮＡのタンパク質への翻訳を低減する化合物、およびａｐｏＣＩＩＩタンパク質の機能を低減する化合物が含まれる。そのような阻害は完全阻害でも部分阻害でもよく、ａｐｏＣＩＩＩの発現および／または活性が低減される結果、細胞内カルシウム濃度を増大させる能力の低減をもたらすような阻害である。そのような阻害剤は、ａｐｏＣＩＩＩに結合する抗体；ａｐｏＣＩＩＩ活性を妨げることができるアプタマー；ａｐｏＣＩＩＩタンパク質、ＤＮＡ、またはｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド；ａｐｏＣＩＩＩタンパク質、ＤＮＡ、またはｍＲＮＡを標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびａｐｏＣＩＩＩ活性を妨げることができるその他の化学物質または生体化合物、で構成される群から選択される。
【００５０】
これらの治療態様の各々の一実施形態において、本方法は糖尿病を治療するための方法である。この実施形態では、対象は１型または２型糖尿病であると診断されている。本明細書中で使用されるように、「糖尿病」は、膵臓によるインスリンの生産が不十分であるかまたは行われず、その結果高レベルの血糖がもたらされることを特徴とする。
【００５１】
本明細書中で使用されるように、「糖尿病の治療」とは、下記：（ａ）糖尿病または糖尿病合併症の重症度を低減すること；（ｂ）糖尿病合併症の発症を抑制または防止すること；（ｃ）糖尿病合併症または糖尿病に特徴的な症状の悪化を阻止すること；（ｄ）糖尿病合併症または糖尿病に特徴的な症状の再発を抑制または防止すること；（ｅ）以前症状を有していた患者において糖尿病合併症または糖尿病に特徴的な症状の再発を抑制または防止すること、のうち１つまたは複数を行うことを意味する。
【００５２】
糖尿病に特徴的な症状には、例えば、限定するものではないが、血糖レベルの上昇、インスリン産生の減少、インスリン抵抗性、タンパク尿、および糸球体クリアランスの低下が含まれる。本発明の方法に従って治療されうる糖尿病合併症には、例えば、限定するものではないが、神経の合併症（糖尿病性神経障害など）および平滑筋細胞制御不全に関連した合併症（例えば、限定するものではないが勃起機能不全、膀胱機能不全、ならびに血管合併症、例えば、限定するものではないがアテローム性動脈硬化症、卒中および末梢血管疾患）が含まれる。
【００５３】
別の実施形態では、本方法は糖尿病の発症抑制のための方法である。この態様では、対象は１型または２型糖尿病のリスクを有し、かつ利点は糖尿病および／または糖尿病合併症の発症を抑制することである。糖尿病を発症するリスクを有する任意の対象、例えば、限定するものではないが、メタボリック症候群、糖尿病に関する既知の遺伝的リスク要因、糖尿病の家族歴、および肥満のうち１以上を備えた対象が治療されうる。
【００５４】
さらなる実施形態では、糖尿病および／または糖尿病合併症を治療または発症抑制するための方法は、対照と比較してａｐｏＣＩＩＩを過剰発現していると同定された個体を治療することをさらに含む。ａｐｏＣＩＩＩ発現の増大は糖尿病合併症の発症に先行し、したがって本実施形態は、本発明の方法を使用する治療に適した患者の早期発見を可能にする。
【００５５】
本明細書中で使用されるように、「過剰発現」とは対照を上回る任意の量のａｐｏＣＩＩＩ発現である。任意の適切な対照、例えば、糖尿病に罹患していないことが分かっている対象のａｐｏＣＩＩＩ発現レベル、またはあらかじめ決定された同様の患者試料集団に由来する標準化されたａｐｏＣＩＩＩ発現レベルを含む対照を使用できる。対照に比べて増大したａｐｏＣＩＩＩ発現の任意の量は「過剰発現」と考えられ；様々な実施形態において、過剰発現は対照と比較して少なくとも１０％、２０％、５０％、１００％、２００％、またはそれより増大したａｐｏＣＩＩＩ発現を含む。好ましい実施形態では、ａｐｏＣＩＩＩ発現は血液試料または血清試料中において検出される。血清中のａｐｏＣＩＩＩのレベルを評価する一実施形態において、アルブミンは、例えばＭｏｎｔａｇｅ（登録商標）アルブミン枯渇キット（Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｄｅｐｌｅｔｅ  Ｋｉｔ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはＡｌｂｕＳｏｒｂ（商標）（Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｇｒｏｕｐ）の使用など標準的技法を使用して血清試料から除去される。収集された血清試料は次いで一晩凍結乾燥され、ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８で処理されうる。溶出されたタンパク質は凍結乾燥され、その後１００μＬの０．１％ＴＦＡに溶解され、ＡＣＥ  Ｃ１８  １０ｃｍ×０．２１ｃｍカラム２０−６０％にかけられ、それからａｐｏＣＩＩＩが溶出する曲線について曲線下面積を求めることが可能である。ＡｐｏＣＩＩＩは、任意の適切な技法、例えば、限定するものではないがＭＡＬＤＩ質量分析法などを使用して同定できる。
【００５６】
本明細書中で使用されるように、「対象」または「患者」という用語は、治療が望まれる任意の対象、例えばヒト、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、昆虫、ウマ、ニワトリなどを意味する。最も好ましくは、対象はヒトである。
【００５７】
治療薬は、任意の適切な経路によって、例えば、限定するものではないが、経口、局所、非経口、鼻腔内、肺、または直腸内経路により、従来の無毒な薬学的に許容可能な担体、アジュバントおよびビヒクルを含有する投与単位製剤に含めて、投与されうる。本明細書中で使用されるような非経口という用語には、経皮、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、または髄腔内への注射または注入技法などが含まれる。加えて、本発明の化合物および薬学的に許容可能な担体を含む医薬製剤が提供される。治療薬は、１つまたは複数の無毒な薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤および／またはアジュバント、ならびに必要に応じてその他の活性成分を伴って存在しうる。治療薬は経口使用に適した形態であってよく、例えば、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性もしくは油性の懸濁剤、分散可能な散剤もしくは果粒剤、乳剤、硬カプセル剤もしくは軟カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤の形態であってよい。
【００５８】
治療薬は薬学的に許容される担体と組み合わせられる。そのような塩を形成できる適切な酸には無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸などがあり；また有機酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、桂皮酸、ナフタリンスルホン酸、スルファニル酸などがある。そのような塩を形成できる適切な塩基には無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどがあり、また有機塩基、例えばモノ、ジおよびトリアルキル、ならびにアリルアミン類（例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン等）ならびに任意で置換したエタノールアミン類（例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン等）がある。
【００５９】
用量域は、化合物の選択、投与経路、製剤の性質、対象者の病状の性質、および担当医の判断に応じて変化する。例えば、経口投与は静脈内注射による投与よりも高用量を必要とすると予想されるであろう。当分野において十分理解されているように、これらの用量レベルの変動は、最適化のための標準的な日常的実験を使用して調整できる。
【００６０】
実施例１  アポリポタンパク質ＣＩＩＩはＰＫＡおよびＳｒｃのＳＲＢＩ／β１インテグリン依存性の共活性化によりβ細胞Ｃａｖ１チャネルを過剰活性化する
概要
アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）はトリグリセリド加水分解の阻害剤としての役割を果たすのみならず、炎症過程および膵臓β細胞の電位依存性Ｃａ２＋（Ｃａｖ）チャネルの過剰活性化のような糖尿病に関連する病理学的事象にも関与する。しかしながら、ＡｐｏＣＩＩＩがβ細胞Ｃａｖチャネルを過剰活性化する分子メカニズムについては何も知られていない。本発明者らは今回、ＡｐｏＣＩＩＩがＣａｖ１チャネルの開確率および密度を増大させたことを実証する。ＡｐｏＣＩＩＩは全細胞Ｃａ２＋電流を増大させ、Ｃａｖ１チャネル遮断薬であるニモジピンはこの増大を完全に無効にした。ＡｐｏＣＩＩＩのこの作用は、ＰＫＡ、ＰＫＣまたはＳｒｃの個々の阻害によっては影響を受けなかった。しかしながら、ＰＫＡ、ＰＫＣおよびＳｒｃの複合的阻害によりＡｐｏＣＩＩＩの該作用は中和され、またＰＫＡおよびＳｒｃの共阻害によって同様の結果が得られた。さらに、β１インテグリンまたはスカベンジャー受容体クラスＢタイプＩ（ＳＲＢＩ）のノックダウンはＡｐｏＣＩＩＩがβ細胞Ｃａｖチャネルを過剰活性化するのを防止した。これらのデータは、ＡｐｏＣＩＩＩがＰＫＡおよびＳｒｃのＳＲＢＩ／β１インテグリン依存性の共活性化によりβ細胞Ｃａｖ１チャネルを過剰活性化することを示している。
【００６１】
結果
アポリポタンパク質ＣＩＩＩは、β細胞におけるＣａｖ１チャネルの密度および導電率を増大させる。本発明者らのかつての研究から、ＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーションはマウス膵島β細胞における全細胞Ｃａ２＋電流を著しく増大させることが明らかとなっている５。いかなる種類のβ細胞Ｃａｖチャネルが影響を受け、密度または導電率のいずれが影響を受けるのかを明確にするために、本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーション後のマウス膵島β細胞（図１ａ）およびＲＩＮｍ５Ｆ細胞（図１ｃ）において、持続的開口を伴う大きな単位Ｂａ２＋コンダクタンスを特徴とする、単位Ｃａｖ１チャネル電流を分析した。マウス膵島β細胞での実験では、本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩで処理した細胞の原形質膜パッチにおいて、対照細胞の原形質膜パッチよりも、より多層の単位Ｂａ２＋電流によって反映されるより多くのＣａｖ１チャネルを観察した（図１ａ）。ＡｐｏＣＩＩＩで処理した細胞（ｎ＝３２）の単位Ｃａｖ１チャネルの平均数、開確率および平均開時間は、対照ビヒクルに曝露した細胞（ｎ＝３３）よりも有意に大きかった（図１ｂ）。ＡｐｏＣＩＩＩとインキュベートした細胞のパッチにおいて記録された単位Ｃａｖ１チャネルの平均閉時間は、対照のパッチにおける平均閉時間よりも有意に短かった（図１ｂ）。同様に、ＡｐｏＣＩＩＩの類似の作用はインスリン分泌性のＲＩＮｍ５Ｆ細胞のＣａｖ１チャネルについても生じた。ＡｐｏＣＩＩＩとインキュベートした細胞の原形質膜パッチは、ビヒクルで処理した細胞の原形質膜パッチと比較してより多くのＣａｖ１チャネルを提供した（図１ｃ）。前者のＣａｖ１チャネルは、後者のＣａｖ１チャネルよりも高頻繁で開口した（図１ｃ）。ＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーション群（ｎ＝３５）は、ビヒクル溶液とのインキュベーション群（ｎ＝３４）と比較して、有意にＣａｖ１チャネルのチャネル数を増大させ、開確率を高め、平均開時間を延長し、かつ平均閉時間を短縮させた（図１ｄ）。このデータは明らかに、ＡｐｏＣＩＩＩがβ細胞Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率の両方を増大させたことを示している。
【００６２】
Ｃａｖ１チャネルの薬理学的除去は、β細胞Ｃａｖチャネルのアポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化を防止する。単一チャネル分析によるＣａｖ１チャネルに対するＡｐｏＣＩＩＩの作用の検証は、ＡｐｏＣＩＩＩがＣａｖ１チャネルのみを攻撃するということを必ずしも意味するものではない。この作用が他の種類のＣａｖチャネルについても生じるかどうかを調べるために、本発明者らは、Ｃａｖ１チャネル遮断薬であるニモジピンの非存在下および存在下においてＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーション後のＲＩＮｍ５Ｆ細胞における全細胞Ｃａ２＋電流を分析した。ＡｐｏＣＩＩＩとインキュベートした細胞の全細胞Ｃａ２＋電流は、ビヒクル溶液で処理した細胞よりも大きかった（図２ａ）。ＡｐｏＣＩＩＩ群において１０〜３０ｍＶの電圧範囲で観察された全細胞Ｃａ２＋電流密度は、対照群よりも有意に高かった（図２ｂ）。極めて対照的なことに、全細胞Ｃａ２＋電流は、ニモジピン存在下においては対照細胞およびＡｐｏＣＩＩＩとインキュベートした細胞の間で同様であった（図２ｃ）。２つの処理群の間で全細胞Ｃａ２＋電流密度に有意差はなかった（図２ｄ）。このデータは、ＡｐｏＣＩＩＩが専らβ細胞Ｃａｖ１チャネルに影響を及ぼすことを確認するものである。
【００６３】
アポリポタンパク質ＣＩＩＩはＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼの共活性化を介してβ細胞Ｃａｖチャネルを過剰活性化する。ＡｐｏＣＩＩＩによるβ細胞Ｃａｖ１チャネルの開確率の増大、およびＡｐｏＣＩＩＩシグナル伝達におけるプロテインキナーゼの媒介的役割は、ＡｐｏＣＩＩＩが何らかのプロテインキナーゼの上流にシグナルを送ってβ細胞Ｃａｖチャネルを過剰活性化することを示唆している１６、１９−２２。したがって、本発明者らは、β細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化におけるＰＫＡ、ＰＫＣおよびＳｒｃキナーゼの関与について調査した。
【００６４】
第１に、本発明者らは、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化に対するＰＫＡ阻害剤Ｈ−８９の影響について調べた。対照細胞において記録された全細胞Ｃａ２＋電流はＡｐｏＣＩＩＩで処理した細胞よりも大きく、一方ＡｐｏＣＩＩＩに加えてＨ−８９とともにインキュベートした細胞において記録された全細胞Ｃａ２＋電流は中間の大きさであった（図３ａ）。ＡｐｏＣＩＩＩで処理した細胞（黒丸、ｎ＝３６）において測定された平均Ｃａ２＋電流密度は、１０〜５０ｍＶの範囲の電圧において、ビヒクル処理対照細胞（白丸、ｎ＝３７）より有意に高かった（図３ｂ）。しかしながら、ＡｐｏＣＩＩＩおよびＨ−８９で共処理した細胞（黒三角、ｎ＝３６）は、Ｃａ２＋電流密度の点ではＡｐｏＣＩＩＩで処理した細胞または対照細胞のいずれとも有意な差はなかった（図３ｂ）。さらに、Ｈ−８９処理は、基本条件下すなわちＡｐｏＣＩＩＩの非存在下におけるＣａ２＋電流密度に影響を及ぼさなかった（図８ａおよびｂ）。これらの結果は、ＰＫＡ阻害がβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化をわずかに低減したことを示す。
【００６５】
第２に、本発明者らは、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化に対するＰＫＣ阻害剤カルホスチンＣ（ＣａｌｐＣ）の影響について試験した。本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩとインキュベートした細胞およびＡｐｏＣＩＩＩ／ＣａｌｐＣで共処理した細胞が同様の全細胞Ｃａ２＋電流を示し、それがビヒクルで処理した細胞において得られる全細胞Ｃａ２＋電流よりも大きいことを観察した（図３ｃ）。電圧範囲１０〜５０ｍＶにおけるＡｐｏＣＩＩＩで処理した細胞（黒丸、ｎ＝３３）および電圧範囲２０〜５０ｍＶにおけるＡｐｏＣＩＩＩ／ＣａｌｐＣに曝露した細胞（黒三角、ｎ＝３３）の平均Ｃａ２＋電流密度は、ビヒクル処理対照細胞（白丸、ｎ＝３３）と比較して有意に増大した（図３ｄ）。Ｃａ２＋電流密度に関してはＡｐｏＣＩＩＩで処理した細胞とＡｐｏＣＩＩＩ／ＣａｌｐＣで共処理した細胞との間に差はない（図３ｄ）。更に、対照ビヒクルに曝露した細胞は、Ｃａ２＋電流密度に関してＣａｌｐＣで処理した細胞と同様であった（図８ｃおよびｄ）。これらのデータは、ＰＫＣの阻害がβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化に影響を及ぼさないことを実証している。
【００６６】
第３に、本発明者らは、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化に対するＳｒｃキナーゼ阻害剤ＰＰ２の影響について評価した。本発明者らは、ビヒクル溶液とのインキュベーション後の細胞およびＡｐｏＣＩＩＩとインキュベートした細胞においてそれぞれ、より小さな全細胞Ｃａ２＋電流およびより大きな全細胞Ｃａ２＋電流を観察した（図３ｅ）。ＡｐｏＣＩＩＩおよびＰＰ２に曝露した細胞は、全細胞Ｃａ２＋電流に関し、ビヒクル対照細胞とＡｐｏＣＩＩＩで処理した細胞との間であった（図３ｅ）。ＡｐｏＣＩＩＩで処理した細胞（黒丸、ｎ＝４０）において電圧範囲１０〜５０ｍＶで定量された全細胞Ｃａ２＋電流密度は、ビヒクル対照細胞（白丸、ｎ＝４０）において測定されたものと比較して有意に増大していた（図３ｆ）。ＡｐｏＣＩＩＩおよびＰＰ２の共処理に供した細胞（黒三角、ｎ＝４０）は、電圧範囲２０〜４０ｍＶにおいてビヒクル処理対照細胞（白丸、ｎ＝４０）よりも有意に大きなＣａ２＋電流を示した。しかしながら、ＡｐｏＣＩＩＩ／ＰＰ２で共処理した細胞およびビヒクル溶液とインキュベートした細胞の間のＣａ２＋電流密度の差は、ＡｐｏＣＩＩＩで処理した細胞およびビヒクル処理対照細胞の間の差ほど顕著ではない（図３ｆ）。さらに、ビヒクルで処理した細胞（白丸、ｎ＝２０）およびＰＰ２とインキュベートした細胞（黒丸、ｎ＝１９）は、同程度のＣａ２＋電流密度を示した（図９ｅおよびｆ）。これらの結果は、Ｓｒｃキナーゼの阻害がβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化を減少させる傾向を有することを示唆している。
【００６７】
β細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化に対するＰＫＡ、ＰＫＣまたはＳｒｃキナーゼ阻害剤の影響が微小および皆無であることから、本発明者らは、上記すべてのキナーゼのより複合的な阻害が適用された場合に何が起こるかと考えた。この疑問を解決するために、本発明者らは、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞のβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化に対するプロテインキナーゼ阻害剤カクテルＨ−８９、ＣａｌｐＣ、およびＰＰ２の影響について、特性を解析した。ＡｐｏＣＩＩＩで処理した細胞において大きな全細胞Ｃａ２＋電流が見られた一方、ビヒクル処理対照細胞ならびにＨ−８９、ＣａｌｐＣおよびＰＰ２の存在下でＡｐｏＣＩＩＩ処理した細胞においてはより小さな全細胞Ｃａ２＋電流が生じた（図４ａ）。ＡｐｏＣＩＩＩ処理群（黒丸、ｎ＝３５）は電圧範囲１０〜５０ｍＶにおいて、ビヒクル処理対照群（白丸、ｎ＝３５）ならびにＨ−８９、ＣａｌｐＣおよびＰＰ２とともにＡｐｏＣＩＩＩ処理した群（黒三角、ｎ＝３４）と比較して、Ｃａ２＋電流密度が有意に増大した。Ｈ−８９、ＣａｌｐＣおよびＰＰ２の存在下でＡｐｏＣＩＩＩに曝露した細胞におけるＣａ２＋電流密度のプロファイルは、ビヒクル処理対照細胞のプロファイルに類似していた（図４ｂ）。更に、プロテインキナーゼ阻害剤カクテルＨ−８９、ＣａｌｐＣおよびＰＰ２を用いた対照細胞の処理は、基本条件下、すなわちＡｐｏＣＩＩＩの非存在下での全細胞Ｃａ２＋電流に対しては有意な影響を及ぼさなかった（図９ａおよびｂ）。これらの結果は、ＰＫＡ、ＰＫＣおよびＳｒｃキナーゼの複合的阻害がβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化を有効に除去することを実証している。
【００６８】
全細胞Ｃａ２＋電流に対するＰＫＡまたはＳｒｃキナーゼ阻害剤単独での作用が微小であることから、ＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼの共阻害はβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化を防止するのに十分であるのかという疑問が必然的に生じた。本発明者らは、Ｈ−８９およびＰＰ２の共処理後のＲＩＮｍ５Ｆ細胞における全細胞Ｃａ２＋電流を分析することにより、この疑問の答えを出した。本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩで処理した細胞の全細胞Ｃａ２＋電流が、対照細胞またはＨ−８９およびＰＰ２の存在下でＡｐｏＣＩＩＩ処理に供した細胞より大きいことを観察した（図４ｃ）。ＡｐｏＣＩＩＩ群（黒丸、ｎ＝２６）において、対照群（白丸、ｎ＝２６）またはＨ−８９およびＰＰ２の存在下でＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーションに供した群（黒三角、ｎ＝２７）と比較して有意に高い全細胞Ｃａ２＋電流の密度が出現した（図４ｄ）。さらに、対照細胞での全細胞Ｃａ２＋電流は、Ｈ−８９およびＰＰ２で処理した細胞で観察されたものに類似していた（図９ｃおよびｄ）。これらのデータは、ＡｐｏＣＩＩＩがＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼの共活性化を介して全細胞Ｃａ２＋電流を増大させることを示している。
【００６９】
アポリポタンパク質ＣＩＩＩはβ細胞Ｃａｖ１チャネルの発現に影響を及ぼさない。ＡｐｏＣＩＩＩとの終夜インキュベーションはβ細胞Ｃａｖ１チャネルの発現に影響を及ぼす可能性がある。この可能性について試験するために、本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーション後のＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるβ細胞Ｃａｖ１チャネルの発現を分析した。本発明者らは、抗Ｃａｖ１．２抗体、抗Ｃａｖ１．３抗体および抗ＧＡＰＤＨ抗体によりそれぞれ明瞭なＣａｖ１．２、Ｃａｖ１．３およびＧＡＰＤＨの免疫反応バンドが検出されることを見出した。対照試料およびＡｐｏＣＩＩＩで処理した試料は、同様の強度のＣａｖ１．２、Ｃａｖ１．３およびＧＡＰＤＨ免疫反応性を示した（図５ａ）。図５ｂは、ＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーションに供したＲＩＮｍ５Ｆ細胞ホモジェネートにおけるＣａｖ１．２サブユニット（斜線カラム、ｎ＝６）およびＣａｖ１．３サブユニット（黒カラム、ｎ＝６）の相対存在量に、ビヒクルとのインキュベーション（白カラム、ｎ＝６）と比較して有意差がなかったことを示している（Ｐ＞０．０５）。このデータは、ＡｐｏＣＩＩＩインキュベーションはβ細胞Ｃａｖ１チャネルの発現をタンパク質レベルでは変化させなかったことを示している。
【００７０】
アポリポタンパク質ＣＩＩＩはβ１インテグリンを介してβ細胞Ｃａｖチャネルを上方制御する。β１インテグリンは、ＡｐｏＣＩＩＩと、ＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼを含むいくつかのプロテインキナーゼとの間の媒介物としての役割を果たすことが確認されている１６、１９−２２。このことは、ＡｐｏＣＩＩＩがＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼの共活性化を介してβ細胞Ｃａｖチャネルを過剰活性化したという本発明者らの結果と併せて、β１インテグリンがβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化を媒介する可能性を提示している。本発明者らは、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞で全細胞Ｃａ２＋分析と組み合わせてＲＮＡ干渉を行うことにより、この可能性について調査した。２つのβ１インテグリンｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションはβ１インテグリンの発現をタンパク質レベルで有意に減少させることが判明した（図６ａおよびｂ）。β１インテグリンｓｉＲＮＡ前トランスフェクションがβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化を効果的に防止したことは重大である（図６ｃおよびｄ）。β１インテグリンｓｉＲＮＡであらかじめトランスフェクションし、ＡｐｏＣＩＩＩでインキュベートした細胞（β１インテグリンｓｉＲＮＡ／ＡｐｏＣＩＩＩ）の全細胞Ｃａ２＋電流は、陰性対照のｓｉＲＮＡであらかじめトランスフェクションしＡｐｏＣＩＩＩに曝露した細胞（ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／ａｐｏＣＩＩＩ）における電流よりも有意に小さかったが、３セットの対照細胞と同様であった（図６ｃ）。これらの対照細胞はモック（ＮＯ  ｓｉＲＮＡ／対照）、陰性対照ｓｉＲＮＡ（ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／対照）およびβ１インテグリンｓｉＲＮＡ前トランスフェクション（β１インテグリンｓｉＲＮＡ／対照）にそれぞれ供され、その後対照ビヒクルとインキュベーションした（図６ｃ）。β１インテグリンｓｉＲＮＡ／ＡｐｏＣＩＩＩに供した細胞（ｎ＝２９）は、ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／ＡｐｏＣＩＩＩ（黒三角  ｎ＝２８）に供した細胞と比較してＣａ２＋電流密度の有意な減少を示した（図６ｄ）。ＮＯ  ｓｉＲＮＡ／対照（ｎ＝２９）、ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／対照（ｎ＝２８）またはβ１インテグリンｓｉＲＮＡ／対照（ｎ＝２９）に供したものと比較すると、前者は類似のＣａ２＋電流密度を示したが、後者はこれらより大きなＣａ２＋電流密度を示した（図６ｄ）。総合すると、これらの結果は、ＡｐｏＣＩＩＩがβ細胞Ｃａｖチャネルを過剰活性化するためにβ１インテグリンに極めて依存していることを実証している。
【００７１】
アポリポタンパク質ＣＩＩＩはＳＲＢＩを介してβ細胞Ｃａｖチャネルを過剰活性化する。前の調査では、β１インテグリンとＡｐｏＣＩＩＩとの直接の相互作用がないことが示された１６、１８。ＡｐｏＣＩＩＩおよびβ１インテグリンの間の分子ブリッジの調査において、本発明者らは、ＳＲＢＩに注目した。なぜならこの受容体はＡｐｏＣＩＩＩと物理的に結合し、β１インテグリンと相互作用するからである１０、２３。本発明者らはｓｉＲＮＡを媒介とした遺伝子抑制および全細胞Ｃａ２＋電流の分析を組み合わせて、ＳＲＢＩがβ細胞Ｃａｖ１チャネルを過剰活性化する際にＡｐｏＣＩＩＩとβ１インテグリンとの間の分子ブリッジとして作用するかどうかを検証した。図７ａ、ｂ、ｃ、ｄに示されるように、ＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡトランスフェクションはＲＩＮｍ５Ｆ細胞においてｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方でＳＲＢＩを著しく低下させた。このような下方制御がＡｐｏＣＩＩＩによる全細胞Ｃａ２＋電流の増大を十分に消失させたことに注目することが重要である（図７ｅ、ｆ）。図７ｅは、ＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡであらかじめトランスフェクションした細胞をＡｐｏＣＩＩＩ（ＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡ／ＡｐｏＣＩＩＩ）でインキュベートすると、陰性対照のｓｉＲＮＡであらかじめトランスフェクションし、ＡｐｏＣＩＩＩに曝露した細胞（ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／ａｐｏＣＩＩＩ）に比べて、全細胞Ｃａ２＋電流が小さくなったことを示す。ＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡ／ＡｐｏＣＩＩＩに供した細胞の全細胞Ｃａ２＋電流は、モック（ＮＯ  ｓｉＲＮＡ／対照）、陰性対照ｓｉＲＮＡ（ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／対照）、およびＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡ前トランスフェクション（ＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡ／対照）にそれぞれ供し、対照ビヒクルで処理した細胞におけるものと違いは無かった（図７ｅ）。対照的に、ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／ａｐｏＣＩＩＩ処理細胞の全細胞Ｃａ２＋電流は、前述の対照細胞において観察したものより大きかった（図７ｅ）。ＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡ／ＡｐｏＣＩＩＩ群（ｎ＝３０）におけるＣａ２＋電流密度は、ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／ａｐｏＣＩＩＩ群（黒三角、ｎ＝３０）におけるものと比較して著しく減少した（図７ｆ）。ＮＯ  ｓｉＲＮＡ／対照（ｎ＝３０）、ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／対照（ｎ＝２９）またはＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡ／対照（ｎ＝２９）と比較すると、前者は類似しているが、後者はこれらよりも著しく大きい（図７ｆ）。これらのデータは、ＡｐｏＣＩＩＩがＳＲＢＩをこのａｐｏｌｉｐｒｏｔｅｉｎからβ細胞Ｃａｖチャネルへのシグナル伝達のための不可欠な輸送手段として使用していることを実証する。
【００７２】
考察
Ｃａｖチャネルの全体的な導電率は、細胞の原形質膜中の機能的チャネルの密度および活性に依存する。１型糖尿病の血清およびその因子ＡｐｏＣＩＩＩによる全細胞Ｃａ２＋電流の増大は、β細胞原形質膜の機能的Ｃａｖチャネルの密度上昇および／または導電率増大に起因する可能性がある４、５。しかしながら、１件４を除く全ての研究１、２、５、２４は、これまでのところ全細胞レベルについてしかＣａｖチャネルに対する１型糖尿病の血清の作用を検討していない。Ｊｕｎｔｔｉ−Ｂｅｒｇｇｒｅｎらによる研究では、１型糖尿病の血清によるβ細胞Ｃａｖチャネル活性の増大が、単一チャネルおよび全細胞レベルの両方において特徴付けられた４。しかしながら、この研究では、１型糖尿病の血清がβ細胞原形質膜における機能的Ｃａｖチャネルの密度を変化させることができるかどうかは解析されなかった４。本発明者らはこれまでに、ＡｐｏＣＩＩＩが１型糖尿病の血清因子としての役割を果たしてβ細胞Ｃａｖチャネルを過剰活性化することを明らかにしているが、全細胞パッチクランプ分析しか実施しなかった５。ＡｐｏＣＩＩＩで処理した細胞における単一Ｃａｖチャネルの生物物理学的特性の詳細な検討を行い、このアポリポタンパク質によるβ細胞Ｃａｖチャネルの過剰活性化を機械論的に詳細に分析するべきであることは確かである。興味深いことに、本研究におけるセルアタッチモードの単一チャネル記録から、ＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーションは個々のβ細胞Ｃａｖ１チャネルの活性を増大させるだけでなく、β細胞原形質膜の記録エリア内の機能的Ｃａｖ１チャネルの数も増加させることが明らかである。単一Ｃａｖ１チャネルの活性の増大は、平均開時間の延長および平均閉時間の短縮に起因する開確率の増大として観察される。機能的Ｃａｖ１チャネルの数の増加は、より多くのレベルの単一Ｃａｖ１チャネルのコンダクタンスが出現することによって確認される。
【００７３】
インスリン分泌性のＲＩＮｍ５Ｆ細胞はＣａｖ１、Ｃａｖ２およびＣａｖ３チャネルを備えている１、２。本発明者らは、このインスリン分泌細胞でＡｐｏＣＩＩＩがＣａｖ１チャネルを選択的に過剰活性化するのか、またはこれらの３種のＣａｖチャネル全てに無差別に影響を及ぼすのかについて調査した。β細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化は、Ｃａｖ１チャネルの薬理学的除去の後には生じ得ないことが判明した。これは、β細胞の生理および病態生理において他の種類のＣａｖチャネルを上回る重要な役割を果たしている主要なＣａｖチャネル種であるＣａｖ１チャネルを、ＡｐｏＣＩＩＩが選択的に過剰活性化することを意味している。ＡｐｏＣＩＩＩによるβ細胞Ｃａｖ１チャネルの選択的な過剰活性化は、Ｃａ２＋依存性のβ細胞死におけるこのリポタンパク質の病態生理学的役割を説明するものである１、２、６。
【００７４】
ＰＫＡおよびＰＫＣのような一連のプロテインキナーゼは、Ｃａｖチャネルを有効にリン酸化してリン酸化により誘導されるこれらのチャネルの構造変化により開チャネル密度および活性の増大をもたらすことができる３、２５、２６。ＡｐｏＣＩＩＩによる機能的Ｃａｖチャネルの数および開確率の増大は、プロテインキナーゼによって媒介されるということも考えられる。ＡｐｏＣＩＩＩは単球細胞においてβ１インテグリンを通じてＰＫＣを活性化することが実証されている１６。更に、β１インテグリンの活性化は、ＰＫＡ、ＰＫＣおよびＳｒｃキナーゼの刺激を通じてニューロン、心室筋細胞および血管平滑筋細胞のＣａｖ１チャネルを上方制御することもできる１９−２２。これらの成分はすべてβ細胞中に存在しており２、２７−３０、ＡｐｏＣＩＩＩがβ１インテグリン−ＰＫＡ／ＰＫＣ／Ｓｒｃキナーゼカスケードを使用してβ細胞Ｃａｖチャネルを過剰活性化することを示唆しているかもしれない。実際に、本研究は、ＰＫＡ、ＰＫＣおよびＳｒｃキナーゼの複合的阻害がβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化を事実上無効化すること、ならびにＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼの共阻害がこの作用に十分であることを示している。しかしながら、ＰＫＡ、ＰＫＣまたはＳｒｃキナーゼの個々の阻害は、β細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化に対し、あるとしても微小な作用しか生じなかった。従って、本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩは並行するＰＫＡ経路およびＳｒｃ経路に依存してβ細胞Ｃａｖチャネルを上方制御すると結論する。
【００７５】
β細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化が生じるには、終夜のインキュベーションを必要とする。故に、その作用はＣａｖチャネルの発現の増大によって説明されると考えられる。したがって、本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩとの終夜インキュベーション後のＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるＣａｖ１．２サブユニットおよびＣａｖ１．３サブユニットの免疫反応性を定量した。しかしながら、インキュベーションはβ細胞Ｃａｖ１チャネルの発現に影響を及ぼさなかった。したがって本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩがβ細胞Ｃａｖ１チャネルの発現を高めるという可能性を除外した。
【００７６】
膜貫通受容体β１インテグリンは、他のインテグリンと非共有結合により結合して一連のヘテロダイマーを形成する。これらのヘテロダイマーは、多数の可溶性タンパク質および表面結合タンパク質を認識して細胞−細胞間、細胞−細胞外マトリックス間および細胞−病原体間の相互作用を媒介する３１。β１インテグリンは、ある種の細胞においてはＡｐｏＣＩＩＩの下流およびＰＫＡ／ＰＫＣ／Ｓｒｃキナーゼの上流に位置している１６、１９−２２。このことから本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩ−β１インテグリン−ＰＫＡ／ＰＫＣ／Ｓｒｃキナーゼ経路が、それによってこのアポリポタンパク質がＣａｖ１チャネルを過剰活性化するメカニズムとしてβ細胞内で作用しているのかどうかについて調べた。興味深いことに、β１インテグリンのノックダウンは、ＡｐｏＣＩＩＩの非存在下ではβ細胞Ｃａｖチャネル活性には影響を及ぼさないが、β細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化を有意に無効化する。この結果は、β１インテグリンがβ細胞Ｃａｖ１チャネル活性に対するＡｐｏＣＩＩＩの作用を媒介するにあたって重要な役割を果たしていることを明白に実証している。
【００７７】
β１インテグリンは対応する下流のエフェクターＰＫＡ、ＰＫＣおよびＳｒｃキナーゼにＡｐｏＣＩＩＩを連結できるが、β１インテグリンは恐らくこのアポリポタンパク質と直接に相互作用しない１６、１９−２２。本研究で本発明者らは、ＳＲＢＩ遺伝子抑制がβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性過剰活性化を効率的に無効にすることから、ＳＲＢＩはＡｐｏＣＩＩＩとβ１インテグリンの間の分子ブリッジとして作用していることを実証した。これは、β細胞Ｃａｖチャネル過剰活性化の新しいカスケード、すなわちＡｐｏＣＩＩＩ−ＳＲＢＩ−β１インテグリン−ＰＫＡ／Ｓｒｃの全体像を作りだす。
【００７８】
本研究で観察されたβ細胞ＣａＶ１チャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘性過剰活性化は、細胞が１０ｍＶより大きく陽電位に脱分極した際に起こった。ＡｐｏＣＩＩＩの効果は、パーフォレイテッド全細胞モードのパッチクランプ記録方式を使用して、最適なＣａ２＋電流を得るために細胞外溶液に１０ｍＭのＣａ２＋を追加した実験条件下で検出された。細胞外Ｃａ２＋の生理学的濃度（２．５ｍＭ）と比較してこのような高濃度の細胞外Ｃａ２＋（１０ｍＭ）では、Ｉ−Ｖ曲線がより高い陽電位へと著しくシフトしうる。パーフォレイテッド全細胞モードのパッチクランプ記録方式でも類似の効果がある。従って、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下でＡｐｏＣＩＩＩは、生理学的な膜電位範囲内でβ細胞ＣａＶ１電流に影響しうると考えられる。
【００７９】
結論として、本発明者らの研究結果は、ＡｐｏＣＩＩＩが、ＳＲＢＩ／β１インテグリン依存的な方式で、並列するＰＫＡ経路およびＳｒｃキナーゼ経路を通じてβ細胞Ｃａｖ１チャネルを選択的に過剰活性化することを実証している。β細胞Ｃａｖ１チャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化は、β細胞原形質膜中の機能的Ｃａｖ１チャネルの密度増大および活性上昇を特徴とする。この新規なシグナル伝達経路は、糖尿病に関連するＣａ２＋依存的β細胞死の防止のための画期的新薬発見の基盤として役立つ可能性がある。
【００８０】
方法
細胞の培養および処理
成体の雄および雌のマウスからランゲルハンス島を単離し、単一β細胞となるように分散させた。約７０％コンフルエントのＲＩＮｍ５Ｆ細胞をトリプシン処理した。得られた細胞懸濁液をペトリ皿または１２ウェルプレートに播種した。細胞は、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１００Ｕ／１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａ）が補足されたＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、加湿された５％ＣＯ２インキュベータで３７℃に維持した。これらの細胞を一晩増殖させ、次いでｓｉＲＮＡトランスフェクションに供した。パッチクランプ分析については、細胞をＡｐｏＣＩＩＩ、ＰＫＡ阻害剤Ｈ−８９（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ＰＫＣ阻害剤カルホスチンＣ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｓｒｃキナーゼ阻害剤ＰＰ２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）およびＣａｖ１チャネル遮断薬ニモジピン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）でＲＰＭＩ培地中それぞれ終濃度２０μｇ／ｍｌ、０．５μＭ、０．１μＭ、０．１μＭおよび５μＭにて終夜処理した。ＡｐｏＣＩＩＩは０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解して１ｍｇ／ｍｌの保存溶液を作り、Ｈ−８９、カルホスチンＣ、ＰＰ２およびニモジピンはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解してそれぞれ５ｍＭ、１ｍＭ、１ｍＭおよび１０ｍＭの保存溶液を形成した。０．００２％ＴＦＡおよび／または０．０３％ＤＭＳＯをビヒクル対照として使用した。
【００８１】
ｓｉＲＮＡの設計およびトランスフェクション。ラットのβ１インテグリンを標的とする２対の２１量体ｓｉＲＮＡ二重鎖（β１インテグリンｓｉＲＮＡ＃１、ＩＤ１２７９７１およびβ１インテグリンｓｉＲＮＡ＃２、ＩＤ１２７９７２）およびＳＲＢＩ（ＩＤ  １２８９２９）を設計し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）によって化学合成した。これらの配列を、その特異性を確認するためにＢＬＡＳＴ検索に供した。いかなる遺伝子産物も標的としないＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ陰性対照ｓｉＲＮＡ（４３９０８４３）、およびヒト、マウスおよびラットの細胞内のＧＡＰＤＨを効率的にサイレンシングするＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ  ＧＡＰＤＨ陽性対照ｓｉＲＮＡ（４３９０８４９）は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ  （Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）から購入した。ＲＩＮｍ５Ｆ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸを用いてリバーストランスフェクションした。簡潔に述べると、陰性対照ｓｉＲＮＡ、β１インテグリンｓｉＲＮＡ＃１、β１インテグリンｓｉＲＮＡ＃２またはＳＲＢＩ  ｓｉＲＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸと混合した後に室温で２０分間インキュベートした。続いて、細胞をこのｓｉＲＮＡ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ混合物に加えた後に穏やかに撹拌し、加湿された５％ＣＯ２インキュベータ内で３７℃に維持した。７２時間後、トランスフェクションした細胞を約７０％コンフルエントまで増殖させ、イムノブロットアッセイまたは様々な処理に供した。
【００８２】
半定量的ＲＴ−ＴＣＲ。全ＲＮＡを、メーカー（Ｑｉａｇｅｎ  Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）推奨のＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔを使用して、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞から単離した。ＲＴ−ＰＣＲプライマー対はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により合成した。ＳＲＢＩプライマー対は、順方向プライマー５’−ＣＡＡＧＡＡＧＣＣＡＡＧＣＴＧＴＡＧＧＧ−３（配列番号：１１）および逆方向プライマー５’−ＣＣＣＡＡＣＡＧＧＣＴＣＴＡＣＴＣＡＧＣ−３（配列番号：１２）から構成した。ＧＡＰＤＨプライマー対は、順方向プライマー５’−ＴＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＧ−３’（配列番号：１３）および逆方向プライマー５’−ＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧＴＡＧ−３’（配列番号：１４）を含む。５００ｎｇの全ＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で逆転写した。ＰＣＲをＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施した。鋳型を完全に変性させ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを活性化するため９４°Ｃで９０秒間実施し、９４°Ｃで３０秒間の変性サイクルを２９サイクル行い、５５°Ｃで３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長させ、最後に７２℃で５分間伸長させて終了した。増幅したＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色方法によって検出した。
【００８３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析
様々に処理された後のＲＩＮｍ５Ｆ細胞を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ＰＭＳＦおよびプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で構成されている溶解バッファー（ｐＨ７．５）中に溶解した。溶解産物は細胞残屑と核を除去するために８００×ｇで４℃にて１０分間遠心分離処理された。得られた試料のタンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質測定試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて決定した。試料をＳＤＳサンプルバッファー中９６℃で３分間加熱することにより変性させ、その後ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびイムノブロット解析に供した。簡潔に述べると、５０、９０または１８０μｇのタンパク質を、４％アクリルアミドの濃縮用ゲル（ｐＨ６．８）および８％アクリルアミドの分離用ゲル（ｐＨ８．８）で構成された不連続ゲル中で分離した。その後、分離されたタンパク質を疎水性のポリビニリデンジフルオリド膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）にエレクトロブロットした。ブロットは、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．５）を含有する洗浄用バッファー中で５％脱脂粉乳と１時間インキュベーションすることによってブロッキングした。その後、該ブロットを、β１インテグリン（１：５００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、ＳＲＢＩ（１：２５００；Ｎｏｖｕｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、Ｃａｖ１．２（１：２００）およびＣａｖ１．３（１：２００）それぞれに対するアフィニティ精製されたウサギポリクローナル抗体と４℃で一晩インキュベートし、またグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼに対するマウスモノクローナル抗体（ＧＡＰＤＨ，１：４０００；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）とそれぞれ室温で１時間インキュベートした。洗浄用バッファーですすいだ後、該ブロットを、二次抗体（ワサビペルオキシダーゼ結合型ヤギ抗ウサギＩｇＧまたはワサビペルオキシダーゼ結合型ヤギ抗マウスＩｇＧのいずれか；１：５０，０００；Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）と室温で４５分間インキュベートした。免疫反応バンドを、ＥＣＬ  ｐｌｕｓ（商標）ウェスタンブロッティング検出システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて視覚化した。
【００８４】
電気生理学。様々に処理された後のマウス膵島細胞およびＲＩＮｍ５Ｆ細胞を、単一チャネルおよび全細胞のパッチクランプ測定に供した。セルアタッチモードおよびパーフォレイテッド全細胞モードのパッチクランプ構成を使用した。電極はホウケイ酸ガラスキャピラリーから作製され、熱焼きし、先端付近にＳｙｌｇａｒｄを用いたコーティングを施した。電極のうちいくつかを、単一チャネル測定のため、（ｍＭ単位で）１１０のＢａＣｌ２、１０のＴＥＡ−Ｃｌおよび５のＨＥＰＥＳ（Ｂａ（ＯＨ）２を用いてｐＨ７．４）を含有する溶液で充填した。その他の電極は、全細胞電流の記録のために、（ｍＭ単位で）７６のＣｓ２ＳＯ４、１のＭｇＣｌ２、１０のＫＣｌ、１０のＮａＣｌおよび５のＨＥＰＥＳ（ＣｓＯＨを用いてｐＨ７．３５）、ならびにアムホテリシンＢ（０．２４ｍｇ／ｍｌ）からなる溶液で充填した。電極抵抗は、電極溶液で充填されかつ浴槽液に浸漬された時に４〜６ＭΩの範囲であった。電極のオフセット電位をギガシール形成に先立って浴槽液中で補正した。単一チャネル記録は、（ｍＭ単位で）１２５のＫＣｌ、３０のＫＯＨ、１０のＥＧＴＡ、２のＣａＣｌ２、１のＭｇＣｌ２および５のＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．１５）を含有する、脱分極用の外部記録液の中に浸された細胞を用いて実施した。この溶液は細胞内電位を０ｍＶとするために使用した。パーフォレイテッド全細胞電流測定については、細胞を、（ｍＭ単位で）１３８のＮａＣｌ、５．６のＫＣｌ、１．２のＭｇＣｌ２、１０のＣａＣｌ２、５のＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を含有する溶液中に浸漬した。単一チャネル電流および全細胞電流は、それぞれＡｘｏｐａｔｃｈ２００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＥＰＣ−９パッチクランプ増幅器（ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ，Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ／Ｐｆａｌｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、室温（約２２℃）で記録した。単一チャネルおよび全細胞の電流データの取得および分析は、それぞれソフトウェアプログラムｐＣＬＡＭＰ（登録商標）１０（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）およびソフトウェアプログラムＰａｔｃｈＭａｓｔｅｒ／ＦｉｔＭａｓｔｅｒ（ＨＥＫＡ）を使用して行った。全細胞電流の大きさは細胞容量によって正規化した。
【００８５】
統計解析
データはすべて平均±ＳＥＭとして示されている。統計的有意差は一元配置分散分析とその後の最小有意差（ＬＳＤ）検定によって決定した。２群の比較時には、対応のないスチューデントｔ検定またはマン・ホイットニーＵ検定を使用した。有意水準は０．０５または０．０１に設定した。
【００８６】
参考文献
１．  Ｙａｎｇ，  Ｓ．  Ｎ．  ＆  Ｂｅｒｇｇｒｅｎ，  Ｐ．  Ｏ．  β−Ｃｅｌｌ  ＣａＶ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２８８，  Ｅ１６−Ｅ２８  （２００５）．
２．    Ｙａｎｇ，  Ｓ．  Ｎ．  ＆  Ｂｅｒｇｇｒｅｎ，  Ｐ．  Ｏ．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  β−ｃｅｌｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．  ２７，  ６２１−６７６  （２００６）．
３．    Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，  Ｗ．  Ａ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  Ｃａ２＋  ｃｈａｎｎｅｌｓ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  １６，  ５２１−５５５  （２０００）．
４．    Ｊｕｎｔｔｉ−Ｂｅｒｇｇｒｅｎ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｌ−ｔｙｐｅ  Ｃａ２＋  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｓｅｒｕｍ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，  ８６−９０  （１９９３）．
５．    Ｊｕｎｔｔｉ−Ｂｅｒｇｇｒｅｎ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＣＩＩＩ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｃａ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  β  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１，  １００９０−１００９４  （２００４）．
６．    Ｓｏｌ，  Ｅ．  Ｍ．，  Ｓｕｎｄｓｔｅｎ，  Ｔ．  ＆  Ｂｅｒｇｓｔｅｎ，  Ｐ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＭＡＰＫ  ｉｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＣＩＩＩ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ＩＮＳ−１Ｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｄｉｓ．  ８，  ３  （２００９）．
７．    Ｈｏｌｍｂｅｒｇ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｏｗｅｒｉｎｇ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＣＩＩＩ  ｄｅｌａｙｓ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０８，  １０６８５−１０６８９  （２０１１）．
８．    Ｇａｎｇａｂａｄａｇｅ，  Ｃ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＣＩＩＩ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８３，  １７４１６−１７４２７  （２００８）．
９．    Ｊｏｎｇ，  Ｍ．  Ｃ．，  Ｈｏｆｋｅｒ，  Ｍ．  Ｈ．  ＆  Ｈａｖｅｋｅｓ，  Ｌ．  Ｍ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＡｐｏＣｓ  ｉｎ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＡｐｏＣ１，  ＡｐｏＣ２，  ａｎｄ  ＡｐｏＣ３．  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．  １９，  ４７２−４８４  （１９９９）．
１０．  Ｘｕ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ＨＤＬ  ｃａｎ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＳＲ−ＢＩ，  ａｎ  ＨＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｌｉｐｉｄ  ｕｐｔａｋｅ．  Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  ３８，  １２８９−１２９８  （１９９７）．
１１．  Ｃｌａｖｅｙ，  Ｖ．，  Ｌｅｓｔａｖｅｌ−Ｄｅｌａｔｔｒｅ，  Ｓ．，  Ｃｏｐｉｎ，  Ｃ．，  Ｂａｒｄ，  Ｊ．  Ｍ．  ＆  Ｆｒｕｃｈａｒｔ，  Ｊ．  Ｃ．  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＣＩ，  ＣＩＩ，  ＣＩＩＩ，  ａｎｄ  Ｅ．  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．  １５，  ９６３−９７１  （１９９５）．
１２．  Ｈｕａｒｄ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｃ−ＩＩ  ａｎｄ  Ｃ−ＩＩＩ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｌｏｗ−  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ  ｉｎ  ＨｅｐＧ２  ｃｅｌｌｓ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３７，  １３０８−１３１８  （２００５）．
１３．  Ｃｈａｎ，  Ｄ．  Ｃ．，  Ｗａｔｔｓ，  Ｇ．  Ｆ．，  Ｒｅｄｇｒａｖｅ，  Ｔ．  Ｇ．，  Ｍｏｒｉ，  Ｔ．  Ａ．  ＆  Ｂａｒｒｅｔｔ，  Ｐ．  Ｈ．  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ−１００  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｏｂｅｓｉｔｙ：  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍａ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ−ＩＩＩ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ５１，  １０４１−１０４６  （２００２）．
１４．  Ｓｕｎｄｓｔｅｎ，  Ｔ．，  Ｏｓｔｅｎｓｏｎ，  Ｃ．  Ｇ．  ＆  Ｂｅｒｇｓｔｅｎ，  Ｐ．  Ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ｎｅｗｌｙ  ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ−−ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆａｍｉｌｙ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｓ．  Ｒｅｖ．  ２４，  １４８−１５４  （２００８）．
１５．  Ａｔｚｍｏｎ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ  ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．  ４，  ｅ１１３  （２００６）．
１６．  Ｋａｗａｋａｍｉ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＣＩＩＩ  ｉｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１３，  ６９１−７００  （２００６）．
１７．  Ｆａｎｇ，  Ｄ．  Ｚ．  ＆  Ｌｉｕ，  Ｂ．  Ｗ．  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ−ＩＩＩ  ｃａｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０７，  ５７−６４  （２０００）．
１８．  Ｋａｗａｋａｍｉ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＣＩＩＩ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＴＨＰ−１  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃα−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−ｋＢ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２７，  ２１９−２２５  （２００７）．
１９．  Ｒｕｅｃｋｓｃｈｌｏｓｓ，  Ｕ．  ＆  Ｉｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｇ．  Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  Ｌ−ｔｙｐｅ  Ｃａ２＋  ｃｕｒｒｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｇｕｉｎｅａ−ｐｉｇ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ５６０，  ４０３−４１１  （２００４）．
２０．  Ｗａｉｔｋｕｓ−Ｅｄｗａｒｄｓ，  Ｋ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  α４β１  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−ｔｙｐｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｉｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃａｕｓｅｓ  ａｒｔｅｒｉｏｌｅ  ｖａｓｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ．  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  ９０，  ４７３−４８０  （２００２）．
２１．  Ｗｕ，  Ｘ．，  Ｄａｖｉｓ，  Ｇ．  Ｅ．，  Ｍｅｉｎｉｎｇｅｒ，  Ｇ．  Ａ．，  Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｅ．  ＆  Ｄａｖｉｓ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌ−ｔｙｐｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｙ  α５β１  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  ３０２８５−３０２９２  （２００１）．
２２．  Ｇｕｉ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｃｏｎｖｅｒｇｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｖ１．２  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｂｙ  ｃ−Ｓｒｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ  ｐａｔｈｗａｙｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８１，  １４０１５−１４０２５  （２００６）．
２３．  Ｂａｍｂｅｒｇｅｒ，  Ｍ．  Ｅ．，  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｍ．  Ｅ．，  ＭｃＤｏｎａｌｄ，  Ｄ．  Ｒ．，  Ｈｕｓｅｍａｎｎ，  Ｊ．  ＆  Ｌａｎｄｒｅｔｈ，  Ｇ．  Ｅ．  Ａ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｏｒ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２３，  ２６６５−２６７４  （２００３）．
２４．  Ｒｉｓｔｉｃ，  Ｈ．，  Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，  Ｓ．，  Ｈａｌｌ，  Ｋ．  Ｅ．，  Ｓｉｍａ，  Ａ．  Ａ．  ＆  Ｗｉｌｅｙ，  Ｊ．  Ｗ．  Ｓｅｒｕｍ  ｆｒｏｍ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ＢＢ／Ｗ  ｒａｔｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｕｒｒｅｎｔｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．  ８０，  １２３６−１２４４  （１９９８）．
２５．  Ｋａｖａｌａｌｉ，  Ｅ．  Ｔ．，  Ｈｗａｎｇ，  Ｋ．  Ｓ．  ＆  Ｐｌｕｍｍｅｒ，  Ｍ．  Ｒ．  ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １７，  ５３３４−５３４８  （１９９７）．
２６．  Ｙａｎｇ，  Ｊ．  ＆  Ｔｓｉｅｎ，  Ｒ．  Ｗ．  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎ−  ａｎｄ  Ｌ−ｔｙｐｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｃｕｒｒｅｎｔｓ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ｉｎ  ｆｒｏｇ  ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ．  Ｎｅｕｒｏｎ  １０，  １２７−１３６  （１９９３）．
２７．  Ｍｕｋａｉ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｅｎｄｉｎ−４  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  Ｓｒｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｇｏｔｏ−Ｋａｋｉｚａｋｉ  ｒａｔ  ｉｓｌｅｔｓ  ｉｎ  ａｎ  Ｅｐａｃ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６０，  ２１８−２２６  （２０１１）．
２８．  Ｋａｎｔｅｎｇｗａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  α３β１  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｏｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｒａｔ  ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２３７，  ３９４−４０２  （１９９７）．
２９．  Ｂｏｓｃｏ，  Ｄ．，  Ｍｅｄａ，  Ｐ．，  Ｈａｌｂａｎ，  Ｐ．  Ａ．  ＆  Ｒｏｕｉｌｌｅｒ，  Ｄ．  Ｇ．  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｍａｔｒｉｘ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｉｓｌｅｔ  β−ｃｅｌｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：  ｒｏｌｅ  ｏｆ  α６β１  ｉｎｔｅｇｒｉｎ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９，  ２３３−２４３  （２０００）．
３０．  Ｎｉｋｏｌｏｖａ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ：  ａ  ｎｉｃｈｅ  ｆｏｒ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  β  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．  Ｄｅｖ．  Ｃｅｌｌ  １０，  ３９７−４０５  （２００６）．
３１．  Ｌｕｏ，  Ｂ．  Ｈ．，  Ｃａｒｍａｎ，  Ｃ．  Ｖ．  ＆  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  Ｔ．  Ａ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２５，  ６１９−６４７  （２００７）
【図１】
0006322209.tif 000002
【図２】
0006322209.tif 000003
【図３】
0006322209.tif 000004
【図４】
0006322209.tif 000005
【図５】
0006322209.tif 000006
【図６】
0006322209.tif 000007
【図７】
0006322209.tif 000008
【図８】
0006322209.tif 000009
【図９】
0006322209.tif 000010
【配列表】
0006322209000001.app