(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式（ＩＩ）で定義される複数の分離リガンドがそのアミン基を介して支持体に固定化されている、分離マトリックス。
【化１】
0006397422.tif 000017
【請求項２】
次の式（ＩＩＩ）で定義される複数の分離リガンドがそのアミン基を介して支持体に固定化されている、分離マトリックス。
【化２】
0006397422.tif 000018
【請求項３】
次の式（ＩＶ）で定義される複数の分離リガンドがそのアミン基を介して支持体に固定化されている、分離マトリックス。
【化３】
0006397422.tif 000019
【請求項４】
次の式（Ｖ）で定義される複数の分離リガンドがそのアミン基を介して支持体に固定化されている、分離マトリックス。
【化４】
0006397422.tif 000020
【請求項５】
遊離形態のリガンドが、１．８以上のオクタノール−水分配係数（ｌｇＰ）を有する、請求項１乃至４のいずれか１項記載の分離マトリックス。
【請求項６】
固定化されている分離リガンドが、次の式（ＶＩ）で定義される通りスペーサＳｐを介して支持体Ｓｕ上に固定化されている、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の分離マトリックス。
【化５】
0006397422.tif 000021
【請求項７】
抗体、抗体フラグメント又は抗体を含む融合タンパク質から選択される生体分子の分離における、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の分離マトリックスの使用。
【請求項８】
液体試料中の１以上の他の化合物から１以上の抗体を分離する方法であって、ａ）抗体及び他の化合物を含む移動相を用意するステップと、ｂ）移動相を、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の分離マトリックスと接触させるステップとを含む、方法。
【請求項９】
請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の分離マトリックスの合成方法であって、
ａ）第二級アミンＲ５−ＮＨ−ＣＨ３（式中、Ｒ５は置換又は非置換５員又は６員環構造或いはヒドロキシエチル基を含む。）を出発化合物として用意するステップと、
ｂ）出発化合物を、求電子試薬Ｒ４−Ｘ（式中、Ｒ４は置換又は非置換５員又は６員環構造を含む。）と反応させて、第三級アミンＲ５−Ｎ（ＣＨ３）−Ｒ４を形成するステップと、
ｃ）第三級アミンを支持体上にアミン基を介して固定化して、分離マトリックスを形成するステップと
を含む、方法。
【請求項１０】
試薬Ｒ４−ＸがアルデヒドＲ’４−ＣＨＯ（式中、Ｒ’４は置換又は非置換５員又は６員環構造である。）であり、ステップｂ）が、出発化合物をＲ’４−ＣＨＯと反応させてシッフ塩基を形成すること、及びシッフ塩基を還元して第三級アミンＲ５−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−Ｒ’４を形成することを含んでいる、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質等の生体分子の精製に使用され得る、新規リガンドを持つ分離マトリックスに関する。本マトリックスは、例えば、抗体の精製に有用である。結果として、本発明は、分離のためのクロマトグラフィーマトリックスの使用、クロマトグラフィーマトリックスを用いて他の化合物から抗体を分離する方法、及び分離リガンドの合成方法も包括する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）の臨床的成功は、インスリン及び血漿タンパク質を、絶大な規模、いくつかの事例では数トンの大量生産で連結する年間生産要件をもたらす、生物医薬品業界における最も刺激的な成果の１つである。ＭＡｂｓは、現在、市場において、成長因子に次いで二番目に大きいバイオ薬物のカテゴリであるが、圧倒的に最も急速に成長しているカテゴリであり、バイオテクノロジー業界の未来であると多くの人が考えている。この需要を満たすために、細胞培養容量は、最大２５０００ｌの反応器により増大している。加えて、現在３から５ｇ／ｌの範囲内である発現レベルは、さらに増大することが期待されており、これが、ハイスループット培地及び処理溶液等の精製ツールの開発に対して追加需要を与えることになる。大規模精製（下流プロセシング）における主要な懸案事項は、実験室規模で典型的なものとは異なり、大規模精製に重点を置くことにより、頑強かつ対費用効果の高いプロトコールを開発し、プロセス全体の経済を改善するために単位操作の数を減少させている。抗体産生における現在の傾向は、タンパク質Ａ培地を使用する親和性クロマトグラフィーが、抗体の捕捉の最も対費用効果の高い代替手段であることを示している。
【０００３】
タンパク質Ａ捕捉ステップ後に残っている一般的な汚染物質は、抗体凝集物、溶出したタンパク質Ａ、ＤＮＡ及び宿主細胞タンパク質である。これら及びあらゆる外来性ウイルス粒子は、さらなる精製ステップ、例えば１以上のクロマトグラフィーステップで除去されなくてはならない。アニオン交換、カチオン交換及び疎水性相互作用クロマトグラフィーステップはいずれも、流入又は結合溶離モードのいずれかで、この目的のために使用されてきた。より最近では、マルチモーダルイオン交換マトリックスが、これらの汚染物質の効率的な浄化を生み出すことが示された。特に、国際公開第２００６／０４３８９６号パンフレットにおいて記述されているマルチモーダルアニオン交換マトリックスは、例えば、流入モードにおける凝集物、宿主細胞タンパク質及び他の汚染物質の除去に有用であり、汚染物質はマトリックスと結合し、抗体は、流入において、及び場合により洗浄緩衝液において回収される。リガンドＮ−メチル、Ｎ−ベンジルエタノールアミンを持つそのようなマトリックスは、カプト（Ｃａｐｔｏ）（商標）アドヘア（ａｄｈｅｒｅ）及びカプトインプレスアドヘアとして市販されている（ＧＥヘルスケア、スウェーデン）。
【０００４】
ＭＡｂｓの大きい生産量及びＭａｂベースの療法に関連する高い費用により、Ｍａｂ精製における生産効率及びスループットを増大させようとする相当な圧力がある。治療的使用のためのＭａｂｓにおける免疫原性及び別様に潜在的に有害な残留汚染物質の量を低減させる一般的必要性もある。これは、特定のステップにおける汚染物質の浄化のあらゆる改善が、生成物中の汚染物質レベルを低減できること、及びより少ないステップで精製プロセスを可能にすることもでき、これにより大幅な費用低減につながることの両方から、有益であることを意味する。
【０００５】
したがって、抗体由来及び抗体フラグメント、抗体融合タンパク質等の同様のタンパク質由来の、抗体凝集物、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、溶出したタンパク質Ａ及びＤＮＡ
等、汚染物質の浄化が改善された、新たなマルチモーダルアニオン交換リガンドが必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１／０１３９７１７号明細書
【発明の概要】
【０００７】
本発明の一態様は、液体の他の成分からの抗体の分離において有用な、新規マトリックスを提供することである。これは、請求項１において定義されている通りのマトリックスを用いて達成される。
【０００８】
１つの利点は、効率的な分離を高イオン強度でも達成できることである。さらなる利点は、抗体収量及び不純物の浄化が改善されることである。
【０００９】
本発明の第２の態様は、生体分子の分離における新規マトリックスの使用である。これは、特許請求の範囲に記載の方法で達成される。
【００１０】
本発明の第３の態様は、他の溶質から抗体を分離する方法である。これは、特許請求の範囲に記載の方法で達成される。
【００１１】
本発明の第４の態様は、抗体分離に使用されるマトリックスの調製に好適な分離リガンドを合成する方法を提供することである。これは、特許請求の範囲に記載の方法で達成される。
【００１２】
本発明のさらなる好適な実施形態は、従属請求項において記述されている。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一態様による還元的アミノ化による第三級アミンリガンドの合成を示す図である。
【図２】リガンド合成の例を示す図である。
【図３】この事例では支持体上でのアリル基の臭素化による、リガンドと支持体（Ｓｕ）とのカップリングの例を示す図である。
【図４】プレディクター（商標）プレートを用いる初期スクリーニングから選択される条件での、本発明によるプロトタイプマトリックスのクロマトグラフプロファイルを示す図である。
【図５】出発試料、流入及び切片画分のＳＥＣ分析のオーバーレイプロットを示す図である（赤色のピークは出発試料を表し、青色ピークは流入を表し、黒色ピークは切片画分を表す）。出発試料及び流入は、モノマーピーク高さに対して正規化されたものである。
【図６】Ｎ−メチル、Ｎ−ベンジルエタノールアミンリガンドを持つ比較マトリックスのクロマトグラフプロファイルを示す図である。
【図７】スペーサを介してカップリングされたリガンドを持つ、本発明による４つのマトリックスの構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
定義
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、本明細書において交換可能に使用される。
【００１５】
用語「分離マトリックス」は、本明細書において、官能基を含む１以上のリガンドがカ
ップリングされた支持体から構成される材料を表すために使用される。用語「樹脂」は、時に、この分野での分離マトリックスに使用される。
【００１６】
用語「マルチモーダル」分離マトリックスは、結合される化合物と相互作用する、少なくとも２つの、異なるが共同して働く部位を提供することができるマトリックスを指す。例えば、これらの部位の１つは、リガンドと関心対象の物質との間に魅力的な種類の電荷−電荷相互作用を生み出すことができる。他の部位は、電子受容体−供与体相互作用並びに／又は疎水性及び／もしくは親水性相互作用を生み出すことができる。電子供与体−受容体相互作用は、水素結合、π−π、カチオン−π、電荷移動、双極子−双極子、誘起双極子等の相互作用を包含する。「マルチモーダル」分離マトリックスは、「混合モード」分離マトリックスとしても公知である。
【００１７】
用語「表面」は、本明細書において、すべての外部表面を意味し、多孔質支持体の事例では、外表面及び細孔表面を包含する。
【００１８】
用語「溶離液」は、この分野でのその従来の意味で使用される、すなわち、分離マトリックスから１以上の化合物を放出するために好適なｐＨ及び／又はイオン強度の緩衝液である。
【００１９】
用語「捕捉ステップ」は、液体クロマトグラフィーの文脈で、分離手順の最初のステップを指す。最も一般的には、捕捉ステップは、明確化、濃縮、安定化、及び可溶性不純物からの有意な精製を包含する。捕捉ステップの後、中間精製が続く場合があり、これにより、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、エンドトキシン、栄養素、消泡剤及び抗生物質等の細胞培養培地の成分等の不純物、並びに凝集物、ミスフォールドした種及び凝集物等の生成物に関係する不純物の残っている量をさらに低減させる。
【００２０】
用語「使い捨て」は、本明細書において、クロマトグラフィーカラム及び他の分離マトリックスの文脈で、単一の使用、又は限定された使用回数が意図されているマトリックスを意味する。使い捨て製品は、有利には、極めて少量であっても有害な汚染物質を除去するために使用され、この事例では、汚染物質をマトリックスに吸着させ、次いでマトリックスを廃棄するのに好都合である。使い捨て製品が望ましい別の状況は、滅菌処理のためであり、この事例では、マトリックスは滅菌又は少なくとも無菌である。
【００２１】
用語「研磨ステップ」は、液体クロマトグラフィーの文脈で、最終精製ステップを指し、微量不純物が除去されて、活性で安全な生成物が残る。研磨ステップ中に除去された不純物は、多くの場合、標的分子又は漏出が疑われる生成物の配座異性体である。
【００２２】
用語「Ｆｃ結合タンパク質」は、抗体の結晶化可能部分（Ｆｃ）と結合することができるタンパク質を意味し、例えば、タンパク質Ａ及びタンパク質Ｇ、又は結合特性を維持しているその任意のフラグメントもしくは融合タンパク質を包含する。
【００２３】
一態様では、本発明は、複数の分離リガンドを含む分離マトリックスを開示する。分離リガンドは、次の式（Ｉ）で定義される。
【００２４】
Ｒ1−Ｌ1−Ｎ（Ｒ3）−Ｌ2−Ｒ2    （Ｉ）
Ｒ1はヒドロキシエチルもしくはヒドロキシプロピル基、或いは置換又は非置換５員又は
６員環構造であり、
Ｌ1はメチレン基又は共有結合のいずれかであり、
Ｒ2は置換又は非置換５員又は６員環構造であり、
Ｌ2はメチレン基又は共有結合のいずれかであり、
Ｒ3はメチル基であり、
Ｒ1がヒドロキシエチル基であって、かつＬ1が共有結合であるときは、Ｒ2は、置換芳香
族環構造、或いは置換又は非置換脂肪族環構造である。
【００２５】
式（Ｉ）によって示される通り、リガンドは、支持体上での例えば求電子基とのカップリングに好適な、求核アミン窒素を持つ第三級アミンである。そのようなカップリングの後、窒素は第四級アンモニウム基になり、これが、広いｐＨ間隔にわたるタンパク質とのイオン性相互作用を可能にする。Ｒ1、Ｒ2及びＲ3基は、疎水性相互作用、水素結合、π
電子相互作用等により、タンパク質との好適なレベルの追加の相互作用を提供する。加えて、窒素の周囲にあるＲ1、Ｒ2及びＲ3基の立体配置は、タンパク質との全相互作用強度
及びイオン性相互作用と追加の相互作用との間のバランスを調節することができる。Ｒ１及びＲ２のいずれか又は両方が置換環構造である場合、環上のすべての置換基は、好適には、例えば、メチル基、メトキシ基、トリフルオロメチル基、エチル基及び／又はヒドロキシエチル基等の１又は２つの炭素基によるものであってよい。リガンドは、好適には、３５０Ｄａ未満又は１５０〜３５０Ｄａの区間内等の低分子量を有し得、これにより、タンパク質との過度に強い結合を防止する。各リガンドは、好適には、単一の窒素を含み得、これは、上述した通りの相互作用強度の調節を可能にするという点、及び明確なカップリング部位を可能にするという点で、有利である。
【００２６】
結果として、固定化されている場合、本発明によるリガンドはマルチモーダルアニオン交換リガンドであるとみなされ、これは、該リガンドが、正に帯電した第四級アンモニウム基に加えて、疎水性である環構造も含むからである。多孔質又は非多孔質表面へのリガンドの固定化のための方法はこの分野では周知であり、例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ
Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｔ
ａｌ，Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａ．Ｋｒｉｓｈｎａ  Ｍａｌｌｉａ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｋ．Ｓｍｉｔｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＮＣ，１９９２を参照されたい。ある特定の実施形態では、マトリックス１ｍｌ当たりのリガンド含有量は、従来のイオン交換マトリックスに一般的に使用されるものに近い範囲内である。それは、例えば、２０〜１５０又は２５〜１００μｍｏｌ／ｍｌ等の１０〜２００μｍｏｌ／ｍｌであってよい。
【００２７】
ある実施形態では、分離リガンドは、アミン基を介して固定化されている。上記で概説した通り、これは、アミンから、タンパク質分離に使用されるｐＨ範囲全体にわたって正に帯電している第四級アンモニウム基への変換をもたらす。固定化は、好適には、求電子基を支持体上に導入することによって為され得る。これは、例えば、多糖又は他のヒドロキシ官能性支持体上でのヒドロキシル基の活性化によって行われ得る。この目的のために、数種の活性化試薬、例えば、エピクロロヒドリン、ビス−エポキシ化合物、アリルグリシジルエーテル、塩化トシル、塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）等が、当技術分野で周知の方法に従って使用され得る。
【００２８】
ある実施形態では、遊離形態のリガンド（すなわち、支持体とのカップリング前の第三級アミン）は、１．８〜５、１．８〜４、２〜４、１．８〜３又は２〜３等、１．８以上のオクタノール−水分配係数（ｌｇＰ）を有する。Ｐの値は、オクタノール−水二相系において、Ｐ＝［Ｘ］org／［Ｘ］aqとして定義され、［Ｘ］orgは、オクタノール相中における物質Ｘの平衡濃度であり、［Ｘ］aqは、水相中における平衡濃度である。データは、ｎ−オクタノールを用いて室温（約２５℃）で決定される。ＬｇＰ値は、薬学及び環境科学の両方において、異なる化合物の相対的疎水性を評価するために一般的に使用される。ｌｇＰを測定する方法は、振とうフラスコ法及び例えばＪ  Ｓａｎｇｓｔｅｒ：Ｊ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｆ  Ｄａｔａ  １８（３），１１１１−１２２７（１９８９）において記述されている通りのカラム法を包含する。ＬｇＰは、有機化合物の構造式から、コ
ンピュータソフトウェア、例えばＡＣＤ／Ｌａｂｓ  ＬｏｇＰ  ＤＢ（アドバンストケミストリーデベロップメント社）によって推定することもできる。
【００２９】
実施例において概説されている通り、本発明による固定化されているリガンドを持つマトリックスの、抗体及び凝集物又は宿主細胞タンパク質を識別する能力は、ｌｇＰが少なくとも１．８である場合に高くなり、最良の識別は、ｌｇＰ１．８〜３を持つリガンドで得られる。
【００３０】
ある実施形態では、Ｒ2は、置換又は非置換フェニル又はシクロヘキシル環構造である
。６員の芳香族又は脂肪族環構造は小型であり、過剰な立体障害なしに疎水性を提供する。
【００３１】
ある特定の実施形態では、Ｒ2は、環構造上に、１以上のメチル、メトキシ又はトリフ
ルオロカーボン置換基を含む。これらの置換基は、特定の状況において有用である疎水性をさらに増大させることができる。
【００３２】
ある実施形態では、Ｒ2は、パラ位に単一のトリフルオロカーボン置換基等の置換基を
含むフェニル環である。トリフルオロカーボンは、疎水性を提供するが比較的大きい置換基であり、パラ位に使用されるならば有利である。
【００３３】
ある特定の実施形態では、Ｒ1はヒドロキシエチル基であり、Ｌ1は共有結合である。ヒドロキシエチル基は、水素結合を経由するタンパク質との追加の相互作用を提供することができ、リガンドの全疎水性のバランスをとることにもなる。上述した通り、環構造Ｒ2
はそのとき置換芳香族環又は脂肪族環構造のいずれかであり、それらのいずれも、抗体精製において、非置換芳香族環よりも良好な選択性を提供することができる。
【００３４】
ある実施形態では、Ｒ1は、置換又は非置換の５又は６員環構造である。環構造は、例
えば芳香族であっても非芳香族であってもよく、いずれも全炭素環であってもよいし、硫黄、酸素もしくは窒素等の１以上のヘテロ原子を環中に組み込んでいてもよい。各リガンドが単一の窒素を含む場合、ヘテロ原子は窒素にはならない。これらの実施形態では、リガンドは２つの環構造を含有し、これは、ある特定の用途において有利である。Ｒ1及び
Ｒ2の両方が芳香族環構造であれば、カチオン−π電子相互作用を介して第四級アンモニ
ウム基と相互作用し得ることが推測できる。これにより、標的生体分子上の負の対イオン及び負電荷との電荷相互作用を、有利な手法で調節することができる。ある特定の実施形態では、Ｒ1は、置換又は非置換フェニル又はチオフェン環である。
【００３５】
ある実施形態では、Ｌ1はメチレン基−ＣＨ2−である。Ｒ1が環構造である場合、メチ
レン基の存在は環の可動性を増大させ、環が芳香族であれば、メチレン基は窒素の電子構造に好都合な手法で影響を及ぼすこともできる。
【００３６】
ある特定の実施形態では、リガンドは、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）で定義される。
【００３７】
【化１】
0006397422.tif 000002
【００３８】
支持体は、有機又は無機材料から作製されていてよく、多孔質であっても非多孔質であってもよい。一実施形態では、支持体は、架橋炭水化物材料、例えば、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、キトサン、コンニャク、カラギーナン、ジェラン、アルギン酸塩、ペクチン、デンプン等の天然ポリマーから調製される。天然ポリマー支持体は、簡単に調製され、逆懸濁液ゲル化（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｇｅｌａｔｉｏｎ）等の標準的な方法に従って場合により架橋されている（Ｓ  Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９（２），３９３−３９８（１９６４）。とりわけ有利な実施形態では、支持体は、比較的剛性であるが多孔質のアガロースの一種であり、これは、その流動特性を増強する方法で調製され、例えば、米国特許第６，６０２，９９０号明細書（Ｂｅｒｇ）又はスウェーデン特許第０４０２３２２−２号明細書（Ｂｅｒｇら）を参照されたい。代替的な実施形態では、支持体は、架橋合成ポリマー、例えば、スチレン又はスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリレートエステル、メタクリル酸エステル、ビニルエステル、ビニルアミド等の合成ポリマー又はコポリマーから調製される。そのような合成ポリマーは、簡単に調製され、標準的な方法に従って場合により架橋されており、例えば、「Ｓｔｙｒｅｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」（Ｒ  Ａｒｓｈａｄｙ：Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅ  Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ  ７０（９），７０−７５（１９８８））を参照されたい。天然又は合成ポリマ
ー支持体は、ＧＥヘルスケア、ウプサラ、スウェーデン等の商業的供給源から、例えば多孔質粒子の形態でも入手可能である。また代替的な実施形態では、支持体は、シリカ等の無機ポリマーから調製される。無機多孔質及び非多孔質支持体はこの分野で周知であり、標準的な方法に従って簡単に調製される。支持体は、磁性粒子、例えばアガロースゲル中に分散したマグネタイト粒子、又は高密度粒子、例えばアガロースゲル中に分散した金属合金もしくは炭化タングステン粒子等の、充填剤材料をさらに含み得る。これらの実施形態は、磁気分離及び膨張床分離にそれぞれ有用である。
【００３９】
本分離マトリックスの好適な粒経は、１０〜１００μｍ、例えば２０〜８０μｍ等、５〜５００μｍの直径範囲内であってよい。本質的に球状の事例において、平均粒径は、１０〜５００等の５〜１０００μｍの範囲内であってよい。具体的な実施形態では、平均粒径は、１０〜２００μｍの範囲内である。当業者であれば、使用されるプロセスに応じて、好適な粒経及び多孔性を簡単に選ぶことができる。例えば、大規模プロセスでは、経済的理由により、より多孔質であるが剛性の支持体が、大きい体積の処理を可能にするために、とりわけ捕捉ステップに好ましい場合がある。クロマトグラフィーにおいては、カラムのサイズ及び形状等のプロセスパラメータが選定に影響を及ぼすことになる。
【００４０】
ある特定の実施形態では、支持体は多孔質である。細孔径は好適から適応の範囲内であってよく、タンパク質等の生体高分子の迅速な大量輸送を可能にすることができる。典型的には、細孔容積の少なくとも５０％等、少なくとも２５％が、タンパク質サイログロブリン又は分子量１１０ｋＤａのデキストランによって例示されるように、少なくとも約１２．５ｎｍの流体力学直径を有する高分子に接近しやすいものとなり得る。そのような多孔性を持つ支持体は、例えば、最大６％もしくは最大４％のアガロース濃度のアガロースゲル、又は米国特許第６，６０２，９９０号明細書において記述されている高剛性架橋アガロース支持体であってよい。接近しやすい細孔容積画分、ＫDを測定するための方法は
、例えば、Ｌ  Ｈａｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ  ７４３，３３−４２（１９９６）において記述されている。
【００４１】
ある実施形態では、マトリックスは、不均質構造を持つ粒子の形態である。粒子は、各粒子のコア部分上に大部分が、又はそこだけに、固定化されているリガンドを有し得、コア部分周囲の各粒子の外殻は、より低いリガンド含有量であるか、又はリガンドがない。そのような粒子は、例えば、マトリックスの少なくとも９０％を構成してよく、これらの粒子のコア部分は、粒子体積の少なくとも９０％等、少なくとも５０％を占めていてよく、一方、外殻は、粒子体積の１０％未満等、５０％未満を占めていてよい。殻は、コアと同じ細孔構造を有し得るが、コアよりも少なくとも１０％低い平均細孔直径等、より低い平均孔径を有していてもよい。そのような粒子は、殻の細孔よりも大きい種がコアに入り込んでリガンドと結合することがないという点で有用である。これは、サイズ選択性のさらなる要素を分離に導入する。企図される他の不均質粒子型は、固体コア上の多孔質殻内に大部分がリガンドを持つ薄膜粒子、又は種々の形態の放射状リガンド濃度及び／もしくは孔径勾配を持つ粒子を包含する。
【００４２】
ある特定の実施形態では、固定化されている分離リガンドは、式（ＶＩ）において定義され、図７において例示されている通り、スペーサＳｐを介して支持体Ｓｕ上に固定化されている。
【００４３】
【化２】
0006397422.tif 000003
【００４４】
ある実施形態では、スペーサＳｐは、１以上のエーテル基によって場合により中断され、かつ／又はその中で終端しており、１以上のヒドロキシル基によって場合により置換されている、２〜８個の炭素原子の鎖を含む。カップリングは、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、アリル−グリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル等のビス−エポキシド、ジ−クロロ−プロパノール等のハロゲン置換脂肪族物質の使用によって等、任意の従来の共有結合的カップリング方法論に準じて行われてよく、活性化／カップリング試薬はスペーサを形成する。
【００４５】
具体的な実施形態では、本発明によるリガンドは、延長剤としても公知であるより長いスペーサ分子を介して支持体とカップリングされる。延長剤はこの分野で周知であり、リガンドと支持体との間の距離を立体的に増大させるために一般的に使用される。延長剤は、時に触手又は柔軟アームと表され、考えられる化学構造のより詳細な記述については、例えば、参照により本明細書に包含される米国特許第６，４２８，７０７号明細書を参照されたい。手短に述べると、延長剤は、ホモ−又はコポリマー等のポリマーの形態であってよい。親水性ポリマー延長剤は、合成起源の、すなわち合成骨格を持つもの、又は生物学的起源の、すなわち自然発生的な骨格を持つバイオポリマーであってよい。典型的な合成ポリマーは、ポリビニルアルコール、ポリアクリル−及びポリメタクリルアミド、ポリビニルエーテル等である。典型的なバイオポリマーは、デンプン、セルロース、デキストラン、アガロース等の多糖である。
【００４６】
ある特定の実施形態では、支持体は、多孔質粒子等の粒子を含む。粒子は、本質的に球状の、細長い又は不規則に形成された粒子である。具体的な実施形態では、分離マトリックスは、使用時に液体に浸されてその原形を保持する乾燥粒子等、乾燥させられている。例証的な実施形態では、そのような乾燥分離マトリックスは、乾燥アガロース粒子から構成される。しかしながら、本発明によるマトリックスは、代替として、モノリス、フィルタ又は膜、毛細管、チップ、表面等、分離において慣例的に使用される任意の他の形状をとり得る。支持体は、ナノ粒子又はさらにはリガンド−ポリマーコンジュゲートの形態であってもよく、これは、限外濾過、沈殿、又は水性二層系の形成によって、液体から分離することができる。
【００４７】
ある実施形態では、支持体は、多孔質膜を含む。膜は、例えば、単一の膜シート、中空糸、シートの堆積、中空糸のロール又は束の形態であってよい。膜は、好適には、例えば、１〜５μｍの範囲内等、０．１μｍから１０μｍの範囲内の平均孔径を持つ、精密濾過膜であってよい。膜は、架橋セルロース膜等のセルロース系膜であってよい。
【００４８】
第２の態様では、本発明は、タンパク質分離等の生体分子分離における、上述した通り
の分離マトリックスの使用を開示する。第１の実施形態では、本発明は、上述した通りの分離マトリックスをタンパク質分離に使用する。本発明の使用の有利な実施形態では、タンパク質は、抗体、抗体フラグメント、又は抗体を含む融合タンパク質である。別の実施形態では、本発明は、上述した通りの分離マトリックスを、任意の他の化合物、例えば、ポリペプチド、核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ又はそのオリゴヌクレオチド、プラスミド、ウイルス、プリオン、原核又は真核細胞等の細胞、脂質、炭水化物、有機小分子等の有機分子、薬物標的、診断マーカー分子からなる群から選択されるものの分離に使用する。使用については、以下でさらに詳細に論じる。当業者であれば気付くであろうように、本願において、分離という用語は、精製、単離、及び化合物の除去を表すのに使用されるが、診断目的等の標的化合物の同定も包括する。
【００４９】
第３の態様では、本発明は、液体試料中の１以上の他の化合物から１以上の抗体を分離する方法であって、抗体及び化合物を含む移動相が、上述した通りの分離マトリックスと接触する方法を開示する。有利な実施形態では、本方法は、液体クロマトグラフィーの原理を使用して、すなわち、移動相に、本発明による分離マトリックスを含むクロマトグラフィーカラム上を通過させることによって行われる。別の代替的な実施形態では、本方法は、バッチ式クロマトグラフィープロセスを使用して行われ、分離マトリックスは、液体試料を含む容器に添加される。具体的な実施形態では、バッチ式モードで添加された分離マトリックスは、乾燥アガロース粒子等の乾燥粒子を含む。別の実施形態では、方法は、膨張床クロマトグラフィーの原理を使用して、すなわち、高密度充填剤を含む本質的に球状の粒子の形態である分離マトリックスの、流動床等の膨張床に、移動相を添加することによって行われる。方法は、磁気分離によって行うこともでき、分離マトリックスは、磁性充填剤を含む粒子の形態である。
【００５０】
本方法の第１の実施形態では、望ましくない化合物は分離マトリックスに吸着され、一方、抗体等の所望化合物は、吸着されることなく移動相中に残っている。当業者によって理解されるように、吸着化合物の性質及び同定は、液体試料の起源によって決まることになる。所望の抗体が吸着されない実施形態では吸着される化合物の例は、細胞及び細胞残屑、タンパク質及びペプチド、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸、エンドトキシン、ウイルス、培養培地からの残留物等である。具体的な実施形態では、本分離マトリックスをクロマトグラフィーカラム中に用意し、移動相を、重力及び／又はポンピングによってカラムに通過させ、抗体をカラムの流入において回収する。故に、この実施形態の利点は、カラムからの抗体生成物のいかなる溶離も必要としないことである。具体的な溶離ステップを回避することは、より少ないステップがより迅速な精製プロトコールをもたらし、結果としてプロセス費用を低減させるため、プロセス観点から魅力的である。加えて、抗体は、例えば、凝集を引き起こす、それらのフォールディングパターンを損なう、又はペプチド結合を攻撃することによってそれらを分解するであろう、ある特定の条件に感受性である。故に、アニオン交換体のための溶離条件は概していかなる極端な化学物質も伴わないが、塩及び／又はｐＨの変化は感受性抗体に影響を及ぼすことがあり、効果は、ｐＩ、電荷分布等に応じて種によって変動する。結果として、この実施形態のもう１つの利点は、溶離液を添加すること及び所望化合物に溶離条件を適用することを、回避することである。化合物の吸着に最も好適な条件を得るために、液体試料を好適な緩衝液又は他の液体と組合せて、移動相を用意する。本実施形態は、アニオン交換マトリックスに慣例的な条件下で実行することができ、この条件は、一般に、比較的低い塩濃度での吸着を伴う。故に、本方法の一実施形態では、移動相の伝導度は、１０〜１５ｍＳ／ｃｍ等、０〜２５の範囲内である。代替的な実施形態では、塩濃度は、イオン交換クロマトグラフィーにおいて通例使用されるものを上回っていてよい。そのとき、移動相の伝導度は、少なくとも１０ｍＳ／ｃｍ、例えば、１０〜３０、１５〜３０又は２０〜３０ｍＳ／ｃｍ等、１０〜５０の範囲内であってよい。一実施形態では、移動相のｐＨは、４〜７、５〜７、５〜６又は６〜７等、約４〜９である。例えばマトリックスの再使用のために吸着化合物をその後放出する
ことが望ましい場合、溶離は、例えば漸増塩勾配の使用によって、より高い塩濃度で行われ得る。ｐＨ値は、吸着化合物を溶離するように同じく又は代替としてシフトされてよく、例えば、漸減ｐＨ勾配であってよい。
【００５１】
本方法の第２の代替的な実施形態では、所望化合物は、従来の液体クロマトグラフィーのようにマトリックスに吸着される。換言すると、分離マトリックスをクロマトグラフィーカラム中に用意し、移動相を、重力及び／又はポンピングによってカラムに通過させ、抗体の少なくとも一部をカラムに吸着させる。追加のステップで、次いで溶離緩衝液をカラムに通過させ、抗体をカラムの通過後に溶離緩衝液において回収する。次いで、生成物の選択的溶離後にマトリックスを再使用してよい。溶離は、適切な緩衝液にカラム上を通過させることによって簡単に実施され、緩衝液は、例えば、マトリックスからの所望化合物の脱離を引き起こす塩含有量及び／又はｐＨを有していてよい。緩衝液は、脱離を誘発するためのディスプレーサ又は水素結合ブレーカー（例えば尿素）を含んでいてもよい。必要ならば、１以上の洗浄ステップを、任意のそのような通過の前又は間に適用してよい。一実施形態では、この実施形態の動作条件は、従来のイオン交換のような、すなわち、上記で論じた通り、低い伝導度を有する移動相を使用する吸着及び高伝導度緩衝液を使用することによる溶離である。当業者であれば、異なる条件を試験することにより条件を簡単に調和させ、吸着化合物及び流入を分析することができる。具体的な実施形態では、所望化合物は抗体である。
【００５２】
上記の第１及び第２の実施形態の間で選び、当業者は、有利にはｐＨ及び／又は伝導度の制御によって、特定化合物を吸着させるための条件を簡単に適合させることができる。例えば、抗体の分離において、異なるクラスの抗体は異なる電荷及び電荷分布パターンを有し、これにより、分離の目的に合わせて、抗体を吸着させること、又は吸着させることなく抗体をカラムに通過させることのいずれがより好ましいかを判断することになる。
【００５３】
分離は、バッチ吸着によって実施することもできる。ある実施形態では、マトリックス粒子の懸濁液をステップｂ）で移動相と接触させる。次いで、追加のステップｃ）で、マトリックス粒子及び移動相を、沈降、遠心分離によって又は磁場の影響下で（マトリックス粒子が磁性であれば）互いに分離する。一実施形態では、望ましくない化合物がマトリックスと結合し、次いで、追加のステップｄ）で抗体を分離された移動相において回収することができる。他の実施形態では、抗体がマトリックスと結合し、分離されたマトリックス粒子を溶離緩衝液と混合することによって回収することができる。
【００５４】
本発明の一実施形態に従って分離された抗体は、表面で培養された細胞等の任意の周知の供給源、又はタンク、バッグもしくは他の容器内でのバッチ式もしくは連続的細胞培養が起源のものであってよい。故に、一実施形態では、液体は、細胞培養から得られた上清である。抗体を分離する必要がある化合物の例は、タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、エンドトキシン、栄養素、消泡剤及び抗生物質等の細胞培養培地の成分、並びにミスフォールドした種及び凝集物等の生成物に関係する不純物である。移動相と本分離マトリックスとの間の接触のステップ、すなわち吸着ステップには、機械的濾過、遠心分離及び／又はクロマトグラフィーのステップが先行してよい。例えば、液体試料が発酵ブロスならば、本マトリックスを使用するステップの前に、細胞残屑、全細胞及び他の比較的大きい成分を機械的に除去することが有利である。
【００５５】
一実施形態では、本方法は、精製プロトコールの捕捉ステップを構成する。具体的な実施形態では、液体試料は粗製供給原料であり、本発明によるクロマトグラフィーマトリックスとの接触前に濾過される。結果として、この実施形態は、液体試料が機械的手段によって予め精製されていても、捕捉ステップを依然として構成するであろう。周知のように、抗体を産生する宿主細胞は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）として一般的に公知である
若干数の他のタンパク質も含むことになる。そのようなＨＣＰは、プロテアーゼ等の酵素、及び宿主細胞によって産生される他のタンパク質を包含する。故に、一実施形態では、液体試料の実質的にすべての宿主細胞タンパク質は、分離マトリックスへの吸着によって等、本方法で除去される。
【００５６】
代替的な実施形態では、本方法は、中間精製又は研磨ステップ等の清浄プロトコールにおいて、第２、第３、又はさらには第４のクロマトグラフィーステップとして使用される。故に、一実施形態では、本分離マトリックスに適用された移動相は、例えば、親和性クロマトグラフィーマトリックス、イオン交換マトリックス、疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックス又はマルチモーダルマトリックスであってよい、分離マトリックスからの抗体含有溶離液を含む。一実施形態では、液体試料は、前述の親和性クロマトグラフィーマトリックスからの溶離液である。この親和性クロマトグラフィーマトリックスは、例えば、タンパク質Ａもしくはその変種、タンパク質Ｇ、タンパク質Ｌ又は一本鎖ラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄｅ）抗体由来リガンド等、ペプチド又はタンパク性リガンドを含み得る。有利な実施形態では、溶離液が得られる分離マトリックスは、タンパク質Ａリガンド等、１以上のＦｃ結合タンパク質リガンドを含む。タンパク質Ａリガンドという用語は、この文脈において、天然及び組み換えタンパク質Ａ、又はそれらの官能性フラグメントを包含する。この文脈において、用語「官能性」フラグメントは、タンパク質の元の結合特性を保持したフラグメントを意味する。そのような親和性マトリックスは、マブセレクト（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ）（商標）又はマブセレクトＳｕＲｅ等、ＧＥヘルスケアから市販されている。結果として、この実施形態では、除去された、好ましくは吸着された化合物は、放出されたタンパク性リガンド、タンパク性リガンド−ＭＡｂ錯体等、タンパク性リガンドと抗体との間に形成された錯体であって、１個のタンパク性リガンド分子と錯体形成した１〜４個の抗体等、タンパク性リガンド分子１個当たり若干数の抗体を含み得る錯体、並びに放出されたタンパク性リガンド又は抗体の凝集物からなる群から選択される１以上であってよい。当業者ならば理解するであろうように、親和性クロマトグラフィー等の前述のステップに使用される特定の条件に応じて、溶離液は、好適な添加又は調整によるコンディショニングを必要とする場合がある。故に、溶離液を好適な緩衝液又は液体と組合せて、移動相を用意する。
【００５７】
本方法は、哺乳類もしくは鳥類宿主、例えばマウス、げっ歯類、霊長類及びヒトが起源である抗体、又はハイブリドーマもしくは血漿が起源である抗体等、任意のモノクローナル又はポリクローナル抗体を、分離又は精製するために有用である。一実施形態では、分離された抗体は、ヒト又はヒト化抗体である。抗体は、任意のクラスの、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＹ及びＩｇＭからなる群から選択されるものであってよい。一実施形態では、抗体は、タンパク質Ａ、又はＦｃ含有抗体フラグメントもしくは融合タンパク質と結合することができる抗体である。具体的な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１等の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。一実施形態では、本方法は、７〜８の範囲内等、６〜９の範囲内のｐＩを有する抗体を精製するために使用される。具体的な実施形態では、精製された抗体のｐＩは、約９である。本文脈においては、用語「抗体」は、抗体フラグメント、及び抗体又は抗体フラグメントを含むあらゆる融合タンパク質も包含することを理解されたい。故に、本発明は、上記で言及した抗体及びそのような抗体を含む融合タンパク質のいずれか１つのフラグメントの分離も包括する。一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。具体的な実施形態では、抗体はヒト化抗体である。分離又は精製によって抗体から除去される化合物は、ＨＣＰ、ＤＮＡ、ウイルス、溶出したタンパク性リガンド、細胞培養培地成分、抗生物質等の生成物に関係しない材料であってよく、又は、凝集した抗体、ミスフォールドした抗体、抗体フラグメント、抗体アイソフォーム等の生成物に関係する材料であってよい。生成物に関係する材料の除去は、概して、抗体との構造的類似性により、いっそう困難であるとみなされる。しかしながら、特に、例えば凝集した抗体は免疫原性となり得るため、該材料を除去することが必要である。
【００５８】
上記から考えられるように、本方法においては、吸着されなかった抗体の実質的に純粋な画分が回収される。この文脈において、用語「実質的に純粋な」は、実質的にすべての非抗体化合物が除去されたことを意味すると理解される。最も有利には、汚染物質の総量の少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９５％等、すなわち９５〜１００％の区間内、例えば少なくとも約９８％等、すなわち９８〜１００％の区間内、好ましくは少なくとも約９９％、すなわち９９〜１００％の区間内が、本分離マトリックスにおいて除去される。しかしながら、当業者であれば分かるように、得られる純度は、分離マトリックスに適用された液体試料中における抗体及び／又は汚染物質の濃度、並びに使用される他の条件によって決まることになる。故に、一実施形態では、本方法に従って分離された抗体は、治療グレードの抗体である。故に、本発明に従って精製された抗体は、ＭＡｂ薬物等の抗体医薬品の研究において、及び調製にも有用である。精製された抗体の代替的使用は、診断への使用である。さらに、精製された抗体は、ヒト用の食品添加物等の食品においても有用である。例えば、本発明に従って精製されたウシ抗体は、食品において有用である。
【００５９】
第４の態様では、本発明は、分離マトリックスを合成する方法であって、
ａ）第二級アミンＲ5−ＮＨ−ＣＨ3を出発化合物として用意し、Ｒ5は、ヒドロキシエチ
ル基、ヒドロキシプロピル基又は５もしくは６員の置換又は非置換環構造を含むステップと、
ｂ）出発化合物を、求電子試薬Ｒ4−Ｘと反応させて、第三級アミンＲ5−Ｎ（ＣＨ3）−
Ｒ4を形成し、Ｒ4は、５又は６員の置換又は非置換環構造を含むステップと、
ｃ）第三級アミンを場合により精製するステップと、
ｄ）第三級アミンを支持体上にアミン基を介して固定化して、分離マトリックスを形成するステップと
を含む、方法を開示する。
【００６０】
この方法は、生体分子の異なる分離に好適な、マルチモーダルアニオン交換リガンドを持つ多種多様な分離マトリックスの合成を可能にする。マトリックスは、イオン性相互作用を可能にする第四級アンモニウム官能基を含み、１又は２つの環構造をさらに含み、これにより、小型リガンド構造を維持しながら、追加の相互作用、特に疎水性相互作用を提供する。窒素上のメチル基は、カップリング中の窒素への立体的な接近を可能にするのに十分小さく、使用中の窒素への好適な程度の接近も可能にする。多数の第二級アミンＲ5
−ＮＨ−ＣＨ3、特に、例えば２−（メチルアミノ）エタノール及びＮ−ベンジル−メチ
ルアミン等の市販の材料を使用してよい。求電子試薬Ｒ4−Ｘは、例えば、後述する通り
、塩化ベンジル等のハロゲン化物、又はアルデヒドＲ’4−ＣＨＯであってよい。ハロゲ
ン化物の事例において、ステップｂ）は単一の反応ステップであってよく、一方、アルデヒドの事例において、ステップｂ）は、以下で概説するシッフ塩基形成及び還元の２つの順次的なサブステップを伴ってよい。精製は、例えば、抽出、フラッシュクロマトグラフィー、イオン交換又は他の周知の方法で達成することができる。精製の１つの目的は、あらゆる残留第二級アミン、又は所望のリガンドとともに支持体上でカップリングされ得る他の求核不純物を除去することである。
【００６１】
ある特定の実施形態では、試薬Ｒ4−ＸはアルデヒドＲ’4−ＣＨＯであり、Ｒ’4は、
５又は６員の置換又は非置換環構造であり、ステップｂ）は、出発化合物をＲ4−ＣＨＯ
と反応させてシッフ塩基を形成すること、及びシッフ塩基を還元して第三級アミンＲ5−
Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−Ｒ’4を形成することを含む。多数のアルデヒドＲ’4−ＣＨＯも利用可能であり、アミンのいずれかと簡単に反応して、対応するシッフ塩基を生成することができる。次いで、例えば、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド、又は例えばＮａＢＨ4もしくはＮａＢＨ3ＣＮ等の当技術分野で公知である別の好適な還元剤を使用すること
によって、還元を実施することができる。
【００６２】
ある実施形態では、出発化合物は２−（メチルアミノ）エタノール又はＮ−ベンジル−メチルアミンであり、これは、市販されており、マルチモーダルアニオン交換リガンドの多様なライブラリを作成するための原材料として有用である。
【００６３】
ある実施形態では、２−（メチルアミノ）エタノールをｐ−トリフルオロメチルベンズアルデヒド又はシクロヘキサンアルデヒドと反応させて、それぞれ式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）で定義されるリガンドを形成する。ある実施形態では、Ｎ−ベンジル−メチルアミンを３，４，５−トリメトキシベンズアルデヒド又はチオフェン−２−カルボキシアルデヒドと反応させて、それぞれ式（ＩＶ）及び（Ｖ）で定義されるリガンドを形成する。
【００６４】
ある特定の実施形態では、ステップｄ）は、合成された分離リガンド種を支持体上にアミン基を介して固定化して、分離マトリックスを形成することをさらに含む。好適な固定化方法については上記で論じた。ステップｄ）は、ある実施形態では、分離マトリックスを、タンパク質、例えば抗体及び１以上の他の化合物を含む移動相と接触させること、並びにタンパク質及び１以上の他の化合物とマトリックスとの結合の程度を測定することを含んでもよい。次いで、測定されたデータを使用して、特定の移動相からの特異的タンパク質又は抗体の分離に好適なマトリックスを選択することができる。
【００６５】
ある実施形態では、方法は、ステップｄ）の後に、
ｅ）出発化合物及び求電子試薬Ｒ4−Ｘ、例えばアルデヒドＲ’4−ＣＨＯの新たな組合せを用いて、ステップａ）〜ｄ）を繰り返すステップをさらに含む。これにより、特定の分離問題に好適なマトリックスの、又はその分離において有用な分離マトリックスのライブラリを作成する。
【００６６】
ある特定の実施形態では、ステップｅ）は、少なくとも１０回等、少なくとも５回繰り返される。
【実施例１】
【００６７】
リガンド合成
２−（メチルアミノ）エタノール及びＮ−ベンジルメチルアミンは容易に入手可能であり、これらのアミンを、還元的アミノ化条件下で異なるアルデヒドと反応させて、対応する第三級アミンを得ることができる。ＮａＢＨ４はアルデヒド及びケトンを還元して副産物を生み出すこと、並びにＮａＢＨ３ＣＮは高度に毒性であり、ワークアップ時にＨＣＮ及びＮａＣＮ等の毒性生成物を生成し、シアン化物による生成物の汚染の可能性があることから、ＮａＢＨ4、ＮａＢＨ3ＣＮ及びＮａＢＨ（ＯＡｃ）3のような還元的アミノ化に
利用可能な異なる試薬から、本発明人らはＮａＢＨ（ＯＡｃ）3を選んだ。ＮａＢＨ（Ｏ
Ａｃ）3は、還元剤として著しい選択性を呈する穏やかな試薬である。アルデヒド及びケ
トンは、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３によって還元される可能性が低い。還元的アミノ化スキームを図１に描写する。Ａｃはアセチル基を表す。
【００６８】
図２は、溶媒としてのＴＨＦ中、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリドの存在下での、２−（メチルアミノ）エタノールと３，４，５−トリメトキシベンズアルデヒドとの例示的な反応を示す。反応物のワークアップにより、所望生成物（１４．２）を９７％収率で提供した。この反応を他のアルデヒドに施して、表１に記載の対応する例示的な第三級アミンを生成した。
【００６９】
【表１】
0006397422.tif 000004
【００７０】
0006397422.tif 000005
【００７１】
方法：
Ａ：ＴＨＦ中の、アミン（１ｍｏｌ当量）、アルデヒド（１．２ｍｏｌ当量）及びナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（ＳＴＡＢ）（１．５〜１．６ｍｏｌ当量）の混合物を、室温で、表１に記載されている時間にわたって撹拌した。反応混合物を１Ｍ  ＮａＯＨ（ＮａＣｌで飽和したもの）で、ｐＨ１０〜１１になるまでクエンチした。反応混合物を酢酸エチル（６×１００ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を乾燥させ、蒸発させた。粗
生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。
【００７２】
Ｂ：反応を方法Ａの通りに行った。方法Ａからの酢酸エチル層を、１Ｍ  ＨＣｌ（３×２０ｍＬ）で処理した。層を分離し、水性層を冷却し、１Ｍ  ＮａＯＨ（ＮａＣｌで飽和したもの）で中和した。得られた生成物を酢酸エチル（６×１００ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を乾燥させ、蒸発させた。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。
【００７３】
Ｃ：反応混合物中へのＡｃＯＨ（１〜２ｍｏｌ当量）の添加を伴い、方法と同じ。
【００７４】
＊生成物１４．２から１４．１２について、ワークアップ中に、水性層を固体ＮａＣｌでさらに飽和させて、より良好な収率を得た。
【００７５】
２−（Ｎ−（シクロヘキシルメチル）−Ｎ−メチルアミノ）エタノール（１４．３）：
ＴＨＦ（６０ｍＬ）中の、２−（メチルアミノ）エタノール（１．２５ｇ、１６．６４ｍｍｏｌ）、シクロヘキサンアルデヒド（２．２４ｇ、１９．９７ｍｍｏｌ）及びＳＴＡＢ（５．６４ｇ、２６．６２ｍｍｏｌ）の混合物を、方法Ａのように反応させた。（溶離液として１００：１  酢酸エチル／イソプロピルアミン）を使用するシリカゲルクロマトグラフィーによる精製により、無色油を提供した。収率：２．７２ｇ（９５％）、Ｒｆ：０．３（１００：１  酢酸エチル／イソプロピルアミン）。スペクトルデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ３．５５（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），２．４９（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ），２．１７（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．７９−１．６０（ｍ，５Ｈ），１．５４−１．４０（ｍ，１Ｈ），１．３０−１．０９（ｍ，４Ｈ），０．９４−０．７６（ｍ，２Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ６４．６８，５９．２８，５８．２２，４２．０７，３５．６４，３１．５８，２６．７４，２６．００．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１０Ｈ２１ＮＯ  １７２．１６９５  ｆｏｕｎｄ  １７２．１６９２。
【００７６】
２−（Ｎ−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）−Ｎ−メチルアミノ）エタノール（１４．８）
ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の、２−（メチルアミノ）エタノール（０．７１ｇ、９．５３ｍｍｏｌ）、４−トリフルオロメチルベンズアルデヒド（ｔｒｉｆｌｕｒｏｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ）（２．００ｇ、１１．４４ｍｍｏｌ）、ＳＴＡＢ（３．０２ｇ、１４．２９ｍｍｏｌ）及び酢酸（０．５５ｍＬ、９．５３ｍｍｏｌ）の混合物を、方法Ｃのように反応させた。（溶離液として１７：１７：１  酢酸エチル／ヘプタン／イソプロピルアミン）を使用するシリカゲルクロマトグラフィーによる精製により、無色油を提供した。収率：２．００ｇ（９０％）、Ｒｆ：０．２７（１７：１７：１  酢酸エチル／ヘプタン／イソプロピルアミン）。スペクトルデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．５９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），３．７０−３．６２（ｍ，４Ｈ），２．６４（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），２．２７（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １４２．７５，１２９．４７（ｑ，２ＪＣＦ＝３２．５Ｈｚ），１２９．０７，１２５．２６（ｑ，３ＪＣＦ＝３．７Ｈｚ），１２４．４０（ｑ，１ＪＣＦ＝２７３．４Ｈｚ），６１．８１，５８．５３，５８．４５，４１．５６．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１１Ｈ１４Ｆ３ＮＯ  ２３４．１１００  ｆｏｕｎｄ  ２３４．１０９９。
【００７７】
Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチル（チオフェン−２−イル）メタンアミン（１４．１５）
ＴＨＦ（３５ｍＬ）中の、Ｎ−ベンジルメチルアミン（１．２４ｇ、１０．１８ｍｍｏ
ｌ）、チオフェン−２−カルボキシアルデヒド（１．３７ｇ、１２．２１ｍｍｏｌ）及びＳＴＡＢ（３．２３ｇ、１５．２７ｍｍｏｌ）の混合物を、方法Ｂのように反応させた。（１００：１：１、ヘプタン／酢酸エチル／イソプロピルアミン）を使用するシリカゲルクロマトグラフィーによる精製により、無色油を提供した。収率：２．１２ｇ（９６％）、Ｒｆ：０．２３（１００：１：１、ヘプタン／酢酸エチル／イソプロピルアミン）。スペクトルデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．４０（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３５（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３０−７．２５（ｍ，２Ｈ），６．９９−６．９６（ｍ，１Ｈ），６．９６（ｂｓ，１Ｈ），３．７９（ｓ，２Ｈ），３．５７（ｓ，２Ｈ），２．２８（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １４２．８３，１３８．９７，１２８．８７，１２８．２２，１２６．９７，１２６．３２，１２５．６０，１２４．８２，６１．０６，５６．０２，４２．１０．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１３Ｈ１５ＮＳ  ２１８．０９９８  ｆｏｕｎｄ  ２１８．０９９６。
【００７８】
Ｎ−ベンジル（３，４，５−トリメトキシフェニル）−Ｎ−メチルメタンアミン（１４．１９）
ＴＨＦ（３０ｍＬ）中の、Ｎ−ベンジルメチルアミン（０．８９ｇ、７．３５ｍｍｏｌ）、３，４，５−トリメトキシベンズアルデヒド（１．７４ｇ、８．８２ｍｍｏｌ）及びＳＴＡＢ（２．３３ｇ、１０．９９ｍｍｏｌ）の混合物を、方法Ｂのように反応させた。（５０：１．５：１、ヘプタン／酢酸エチル／イソプロピルアミン）を使用するシリカゲルクロマトグラフィーによる精製により、無色油を提供した。収率：１．２ｇ（６０％）、Ｒｆ：０．２１（５０：１．５：１、ヘプタン／酢酸エチル／イソプロピルアミン）。スペクトルデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．３８−７．２９（ｍ，５Ｈ），６．６２（ｓ，２Ｈ），３．８７（ｓ，６Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），３．５１（ｓ，２Ｈ），３．４７（ｓ，２Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １５３．０７，１３９．１５，１３６．７３，１３４．９６，１２８．８５，１２８．２０，１２６．９４，１０５．４９，６２．１６，６１．６１，６０．８２，５６．０５，４２．４１．．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１８Ｈ２３ＮＯ３  ３０２．１７５０  ｆｏｕｎｄ  ３０２．１７５１。
【実施例２】
【００７９】
リガンドの固定化
ベースマトリックス：米国特許第６，６０２，９９０号明細書において記述されている方法に従って調製した、高剛性架橋アガロースビーズ。平均ビーズ直径は８０μｍであり、多孔性は、プローブ分子としてデキストランを用いる逆サイズ排除クロマトグラフィーによって決定した通り、分子量１１０ｋＤａのデキストランについて０．５４のＫD値に
対応し、これは、ビーズ体積の５４％がデキストラン分子に利用可能であったことを意味するものであった。多孔性決定の方法は、Ｌ  Ｈａｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ  ７４３，３３〜４２（１９９６）において記述されている。
【００８０】
アリル化：蒸留水で５回洗浄した２５０ｇのアガロースビーズ（２５０ｍＬの排水ゲル）を、ガラスフィルタ漏斗内のゲルに通す真空吸引によって２１０ｇまで乾燥させ、次いで、１Ｌの丸底フラスコに入れた。次いで、フラスコに、５０％ＮａＯＨ（３４０ｍＬ）及び１ｇの水素化ホウ素ナトリウムを添加した。フラスコを５０℃の水浴に浸漬し、撹拌を適用した。３０分後、６８ｍＬのアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）を添加した。次いで、反応を１６．５時間進めた。ゲルを、蒸留水（３×ＧＶ）、エタノール（３×ＧＶ）、最後に蒸留水（８×ＧＶ）で洗浄した。
【００８１】
固定化：求核基を持つリガンドをアリル化ゲルとカップリングするために、アリル基を
活性化させなくてはならない。活性化は、アリル化ゲルビーズ（ビーズは図３においてＳｕと表されている）をＢｒ２と水中で反応させることによって行われ（図３）、これは、溶液中のゲル及び臭素イオン上でのブロモニウム基の形成につながる。ブロモニウムイオンはＨＢｒとの反応時にブロモヒドリンを形成し、これが今度はＮａＯＨによる処理後にエポキシドに変換される。最後に、このエポキシドを求核リガンドと反応させて、固定化ゲルを得る。
【００８２】
固定化されているリガンドを持つ分離マトリックスを、表２に収載する。この表は、ソフトウェアＡＣＤ／Ｌａｂｓ  Ｌｏｇ  Ｐ  ＤＢ  ｖ．９．０によって構造から推定される通り、固定化前の各リガンドについてオクタノール−水分配係数も収載している。さらに、表は、硝酸銀による塩化物容量滴定によって決定される通りの、マトリックスプロトタイプのイオン容量（ＩＣ）を収載している。所与のリガンドについて複数のＩＣ値が収載されている場合、異なるリガンド含有量を持つ１つを超えるプロトタイプは、主としてアリル含有量をであるが、いくつかの事例では、リガンド濃度又は固定化温度も変動させることとによって調製したものである。
【００８３】
【表２】
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【００８４】
0006397422.tif 000007
【００８５】
0006397422.tif 000008
【実施例３】
【００８６】
分離マトリックスプロトタイプの評価
試料調製：試料は、タンパク質Ａ精製の第１ステップ後に得られたｍＡｂ供給原料であった。最初に、試料を０．２μｍのフィルタで濾過した。これに続いて、ハイプレップ（商標）脱塩カラムを用いる、２．５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０への緩衝液交換を行った。ランは、ＡＫＴＡエクスプローラ（商標）１００クロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケア、スウェーデン）を用いて実施した。すべての実験について、セントリコンフィルタを３０ｋＤａの分子量カットオフで使用することにより、試料を所要の濃度に濃縮した。
【００８７】
緩衝液調製：プレート実験のための緩衝液は、自動フリーダムＥｖｏ（商標）テカンフリーダムＥＶＯ−２２００ロボットシステムを使用して調製した。
【００８８】
プレート調製：初期スクリーニング相において、９６ウェルプレディクター（商標）フィルタプレート（ＧＥヘルスケア、スウェーデン）に異なるプロトタイプ培地を充填し、各ウェルに６μｌの培地を含有させた。各ウェル中６μｌの培地を構成する３００μｌの培地を２％スラリーから採取するようにプログラムされたギブソンロボットシステムを使用して、プレートを充填した。
１）培地が漏出しないように注意しながら、プレートを数回逆さに傾けた。
２）上部及び下部の封を穏やかに除去し、２０％エタノールである保存溶液を真空下で除去した。
３）プレートの下部を拭き取って、微量の保存溶液を除去した。
【００８９】
平衡
１）９６ウェルのそれぞれに、２００μｌのそれぞれの緩衝液を充填し、シェーカー内、１１００ｒｐｍで２分間保った。
２）緩衝液を真空で除去した。
３）ステップ１及び２を２回繰り返した。
４）５００＊ｇで１分間の遠心分離によって緩衝液を除去したこと以外は、第１のステップを再度繰り返した。
５）緩衝液及び体積は、すべての実験において同じであった。これらの緩衝液中で試料を
希釈しなくてはならなかったため、緩衝液を二倍濃縮した。
【００９０】
試料のローディング及び収集
１）２００μｌの試料をウェルのそれぞれに添加した。試料は緩衝液交換後に二倍濃縮したものであるため、これを二倍濃縮緩衝液で希釈した。
２）試料がすべての９６ウェルにロードされたら、プレディクタープレートをホイルで覆い、シェーカー内、１１００ｒｐｍで６０分間インキュベートした。
３）５００＊ｇで１分間の遠心分離によって、流入を収集プレート中に収集した。
【００９１】
緩く結合したタンパク質の除去
１）残っている標的タンパク質を完全に回収するために、平衡緩衝液を用いて１又は２回の洗浄（２＊２００μｌ）を実施した。
２）５００＊ｇで１分間の遠心分離によって、洗浄液を収集プレート中に収集した。
【００９２】
最適条件のスクリーニング：この研究のために、２０の異なるプロトタイプを、異なるリガンド密度で行ったいくつかのプロトタイプとともに分析した。ｍＡｂ試料を緩衝液交換し、その後、ｍＡｂ試料の最終濃度は５ｇ／ｌ前後であった。すべての実験について、２つの緩衝系、２５ｍＭクエン酸及び５０ｍＭリン酸を、緩衝系のそれぞれについて３つのｐＨで使用した。２５ｍＭクエン酸のｐＨは４．６から６．０までで変動し、５０ｍＭリン酸のｐＨは６．０から７．４までで変動した。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度は０ｍＭから３５０ｍＭまでで変動した。各実験条件を１回複製した。各プレディクター（商標）プレート中、２つの異なるプロトタイプ培地を、プレートの半分ずつに充填した。
【００９３】
２．５ｍＭリン酸に緩衝液交換した後のｍＡｂ試料の濃度は、ＵＶ分光光度計を使用して２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定した。ｍＡｂの吸光係数は１．５０である。プレート中にロードされるｍＡｂ試料の濃度は、５ｇ／ｌ前後であった。
【００９４】
サイズ排除クロマトグラフィーによる分析：この研究におけるすべての分析は、２つの相互接続したスーパーデックス２００  ５／１５０  ＧＬカラムが接続されたＡＫＴＡ（商標）エクスプローラ１０システムで実行した。各分析について、１０μｌの試料をカラムにロードし、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）を移動相として０．３５ｍｌ／分の流速で１５分間使用した。
【００９５】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析で得られたデータから、各実験条件について、モノマー及び凝集物両方の容量（Ｑ）を、数式１を使用して算出した。
【００９６】
数式１：
【００９７】
【数１】
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【００９８】
Ｑはモノマー容量（Ｑm）又は凝集物容量（Ｑa）のいずれかであり、Ｃiniは初期濃度
であり、ＣFTはモノマー又は凝集物のいずれかの流入の濃度である。ＶSampleはプレディクター（商標）プレート中の各ウェルに添加された試料の体積を表し、ＶMediumは各ウェル中の培地の体積である。
【００９９】
カラム予測：ＳＥＣ分析からの結果を使用して、カラム挙動を予測した。プロトタイプ培地のそれぞれの可変ロードについて収率及び純度を算出して、所望の収率（数式２）及び純度（数式３）を生み出すある特定の実験条件を確認した。
【０１００】
数式２：
【０１０１】
【数２】
0006397422.tif 000010
【０１０２】
数式３：
【０１０３】
【数３】
0006397422.tif 000011
【０１０４】
数式１からのＱは所与の実験条件におけるモノマー又は凝集物容量のいずれかを示し、Ｖloadはロード（単位：ｍｌ）であり、Ｃiniは初期モノマー又は凝集物濃度のいずれか
であり、ＣＶはカラム体積である。
【０１０５】
自動データ評価及びカラム予測：プレディクター（商標）プレートからのすべての実験条件についてのモノマー及び凝集物ピークの自動積分は、マイクロソフトエクセルマクロを活用して行った。マクロは、異なる条件についての膨大なデータの好都合でより速い分析を可能にした。次いで、マイクロソフトエクセルにおいてビルトイン関数を使用して、予測を実施した。
【０１０６】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）分析：ＨＣＰレベルは、ジャイロラボバイオアフィ２０ＨＣマイクロラボラトリーディスクを使用し、市販の抗ＣＨＯ抗体で測定した。実験は、ジャイロラボ（商標）ワークステーションＬＩＦ（ジャイロスＡＢ、スウェーデン）と呼ばれる自動イムノアッセイ機器で実施した。
【０１０７】
結果：典型的な２ステッププロセスは、最初の捕捉ステップとしてタンパク質Ａ由来培地であるマブセレクトＳｕｒｅ（商標）、凝集物除去及びＨＣＰ低減のための第２ステップとしてカプト（商標）アドヘアに基づく。本発明人らは、カプト（商標）アドヘアの代替としての異なるマルチモーダルリガンドを調査し、凝集物除去及びＨＣＰ低減に対するそれらの影響を研究する。これらの研究のために、およそ１５％の凝集物を含有するモノクローナル抗体供給原料を、すべてのプロトタイプ培地について第２ステップのための試料として使用した。プロセス条件のスクリーニング及び最適化は、許容される収率及び最終生成物におけるＨＣＰレベルの相当な低減で、１％未満の凝集物を得る目的で実施した。
【０１０８】
プレディクター（商標）プレートを用いる初期条件のスクリーニング：初期スクリーニング相の１つの目的は、並列化フォーマットにおけるプロトタイプ培地のぞれぞれについて最適な実験条件を決定することであった。
【０１０９】
プレディクター（商標）プレートを用いる流入実験：約１５％の凝集物を含有するＩｇＧ試料を使用した。試料をプレディクター（商標）プレートにロードした後、流入画分を洗浄液とともに収集し、ＳＥＣ分析に供した。ＳＥＣ分析からの結果を使用して、容量（Ｑ）を算出した（数式１）。プレートデータから推定されるカラム収率及び純度を算出するために、数式２及び３を使用した。
【０１１０】
収率及び純度についてのこれらのカラム予測は、最良の条件についてすべてのプロトタイプを用いて実施した。収率及び純度についての予測は、マイクロソフトエクセル（商標）を使用し、異なるロードについて算出した。
【０１１１】
高い純度及び異なる収率でのプロトタイプについての予測を、異なる条件とともに、表１に示す。
【０１１２】
【表３】
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【０１１３】
比較すると、８７ｇ／ｌのロード、ｐＨ６．０で塩を添加せずに、アリル化マトリックスの臭素化を介してカップリングされた１００μｍｏｌ／ｍｌのＮ−ベンジル−ｎ−メチルエタノールアミンを持つ、同じベースマトリックス上のプロトタイプは、９９．１％の純度及び６４％の収率を生み出した。Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンリガンドは、１．７３のｌｇＰ値及び７．９３のｐＫａを有する。この実験からのクロマトグラムを図６に示す。
【０１１４】
カラム実験：予測における許容される収率で、１％未満の凝集物（約９９％モノマー純度）を得るという目的を満たしたプロトタイプを、小さいトリコーン（商標）カラムに流すために選択した。したがって、所定の条件を満たした６つの異なるプロトタイプ培地が選択された。４つの最良性能のプロトタイプの構造及び米国特許第７，８６７，７８４号明細書の教示に従って調製された基準プロトタイプと比較したそれらの特性を、表２に示す。
【０１１５】
【表４】
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【０１１６】
６つのプロトタイプ培地をカラムに詰め、所望の収率及び純度を生み出したプレディクター（商標）プレート実験からの最良の実験条件について、ランを実施した（表３）。カラムラン中に為された１つの重要な観察は、ｐＨ６未満の２５ｍＭクエン酸に沈殿する傾向があることであり、それ故、５０ｍＭリン酸中での次善条件がカラムランに選ばれた。
【０１１７】
【表５】
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【０１１８】
すべてのプロトタイプについて滞留時間は５分であった。有望なプロトタイプの１つについてのカラムランのクロマトグラフプロファイルを、図４に示す。
【０１１９】
ＳＥＣ分析結果：３つの画分（出発試料、流入及び切片）からクロマトグラフのピークを持つプロトタイプの１つのＳＥＣ分析結果を、図５に示す。
【０１２０】
プレディクター（商標）プレート実験からのＨＣＰ結果：プレート実験後の流入中におけるＨＣＰ含有量を、より低いＱm／Ｑa値によって生み出された条件で、すべてのプロトタイプについて決定した。４つのプロトタイプは、プレート中で大きいロード行われたにもかかわらず（およそ１７０ｍｇ／ｍｌ）、ＨＣＰの相当な低減（４００ｐｐｍ未満）を示した。表４から、低い塩濃度はＨＣＰ除去に対して相当な影響を有することが明らかである。これはおそらく、塩化ナトリウムイオンがリガンドとの結合においてＨＣＰと競合するという事実に起因する。興味深いことに、ＨＣＰ低減において良好な性能を示す４つのプロトタイプのうち２つは、凝集物除去においても良好であった。
【０１２１】
【表６】
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【０１２２】
ＨＣＰ結果は、表５から分かるように、出発試料中に存在する大量のＨＣＰと比較して、ＨＣＰ含有量の相当な低減を示す。クエン酸緩衝液中におけるタンパク質沈殿の影響により、カラム実験のための緩衝液を５０ｍＭリン酸に投入したため、これらの結果をプレディクター（商標）プレート実験からのＨＣＰ結果と直接比較することはできない。このデータから観察される１つの一般的傾向は、低い塩濃度では、他と比較してわずかに高いＮａＣｌ濃度を有する第１のプロトタイプ（１４．８）を除き、より良好なＨＣＰ除去があることである。第１のプロトタイプ（１４．８）の性能は、低い塩濃度でのさらなる調査に十分な信憑性を与えるものである。
【０１２３】
【表７】
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【０１２４】
３３の異なる種類のマルチモーダルリガンドを、９６ウェルプレディクター（商標）プレートの能力を用いるハイスループットプロセス開発（ＨＴＰＤ）を使用して研究した。この研究から高い純度及び収率を生み出した２つの最良のプロトタイプは１４．８及び１４．３であり、その構造は表１及び２に示す通りである。
【０１２５】
概して、疎水性の増大は、ログＰ値から観察される通り、ある特定の程度まで、高収率でのより良好な凝集物除去につながる。カラム実験からのＨＣＰの低減は、８８１ｐｐｍの初期ＨＣＰレベルから、ＨＣＰ含有量におけるほぼ４０倍の低減である最良性能のプロトタイプについては２４ｐｐｍまで低減していることから、有意である。タンパク質沈殿の影響により緩衝液が投入されたことから、プレート及びカラム実験の間の結果が同程度でなくても、これらの結果は著しいものである。
【０１２６】
この書面による明細は、例を使用して最良の形態を包含する本発明を開示し、また、任意のデバイス又はシステムを作製及び使用すること、並びに任意の組み込まれた方法を実施することを包含する本発明を、当業者が実践できるようにするものである。本発明の特許性のある範囲は請求項で定義され、当業者が想到する他の例を包含し得る。そのような他の例は、請求項の逐語的文言と相違のない構造要素を有するならば、又は請求項の逐語的文言との相違がごくわずかな同等の構造要素を包含するならば、請求項の範囲内であるように意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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