(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ７プロモーターの制御下かつ誘導性プロモーターの制御下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド構築物を含有する原核細胞と、Ｔ７プロモーターの制御下で発現されるタンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターとを含む発現系であって、
前記原核細胞はラムダファージＤＮＡを含有せず、および、Ｔ７プロモーターの制御下かつ誘導性プロモーターの制御下にあるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが、「部位特異的」な組換え手段により原核細胞のゲノム内に特異的に組込まれ、および、前記発現ベクターがプラスミド安定化系を含有する、前記発現系。
【請求項２】
プラスミド安定化系が、多量体分解系（ｍｕｌｔｉｍｅｒ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（ｍｒｓ）、分配系（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）（ｐａｒ）および分裂後致死系（ｐｏｓｔｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎａｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）（ＰＳＫ）の群から選択される、請求項１に記載の発現系。
【請求項３】
原核細胞が、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をゲノム内に含有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株の細胞である、請求項１または２に記載の発現系。
【請求項４】
配列番号１を有するヌクレオチド構築物を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項５】
誘導性プロモーターの制御下のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの標的化組込みが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｐｒｏＢＡ配列内にもたらさせる、請求項３または４に記載の発現系。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の発現系による組換えタンパク質の製造方法であって、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現およびポリヌクレオチド配列から開始する組換えタンパク質の発現に適した抗生物質非含有条件下で、前記発現系を発酵させ、それにより組換えポリペプチドを発現させ、組換えポリペプチドを単離することを特徴とする、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ７発現系、その製造方法、および抗生物質を使用しない組換えタンパク質の製造のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ７発現系は組換えタンパク質の発現に使用される。一般に、Ｔ７プロモーター配列はベクター上に位置し、その下流に、リボソーム結合部位の後に組換えタンパク質のコード領域が存在する。Ｔ７ポリメラーゼは発現生物により産生されないため、そのような発現系は、Ｔ７ポリメラーゼが系内に人為的に導入された場合にのみ機能する。このための最も一般的な方法は産生生物におけるＴ７発現カセットのゲノムアンカリング（ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）である。ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞におけるタンパク質の発現のための、Ｔ７ポリメラーゼに基づく原核生物系は古くから知られている。この系においては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム内の大腸菌のラムダ付着部位内へのＴ７ポリメラーゼの組込みがＤＥ３ラムダファージの補助により生じる。該系において、Ｔ７ファージポリメラーゼはＴ７ファージプロモーターを認識する。しかし、この系は、標的遺伝子発現中のプラスミド安定性が低いという欠点を有する。多数の研究が、Ｔ７発現系の発現レベルを安定化させようと試みてきたが、これまでのところ、明らかな成功は得られていない。更に、大腸菌は約４０ｋｂのラムダファージＤＮＡを含有する。このファージＤＮＡは少なくとも医薬タンパク質の発現のための系においては望ましくない。更に、Ｔ７発現系においては、発現中のクローニングおよび選択のための選択マーカーとして、抗生物質耐性遺伝子を含有する発現ベクターがこれまで常に使用されてきた。
【０００３】
しかし、プラスミドの選択のための抗生物質の使用は、特に治療用タンパク質の製造においては重大な欠点となる。抗生物質を使用しない方法は、製品が患者に対してより安全であるため、規制当局に許容されやすく、最終産物分析（産物中の抗生物質の除去）が軽微であるため、著しく経済的な製造方法が構築されうる。抗生物質を使用しないタンパク質製造方法を可能にする発現ベクターは例えばＥＰ１６９７５２３Ｂ１から公知である。しかし、この発現ベクターはＴ７発現系に適していない。
【０００４】
本発明の目的は、公知Ｔ７発現系と比べて高い発現ベクター安定性を示す発現ベクターと原核細胞とからなる、抗生物質を使用しない組換えタンパク質製造のためのＴ７発現系を提供することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】欧州特許第１６９７５２３号明細書
【発明の概要】
【０００６】
この課題は、Ｔ７プロモーターの制御下かつ誘導性プロモーターの制御下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド構築物を含有する原核細胞と、Ｔ７プロモーターの制御下で発現される組換えタンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターとを含む発現系により解決され、該発現系は、該発現ベクターがプラスミド安定化系を含有することを特徴とする。
【０００７】
プラスミド安定化系は、例えば、ＳｅｎｇｕｐｔａおよびＡｕｓｔｉｎ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｊｕｌｙ  ２０１１，ｐ．２５０２−２５０９から公知である。好ましくは、それは、多量体分解系（ｍｕｌｔｉｍｅｒ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（ｍｒｓ）、分配系（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）（ｐａｒ）および分裂後致死系（ｐｏｓｔｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎａｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）（ＰＳＫ）の群からのプラスミド安定化系である。特に好ましくは、プラスミド安定化系は多量体分解系の群からの配列を含有し、特に好ましくは、これはｃｅｒ配列である。
【０００８】
誘導性プロモーターは、好ましくは、ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｐおよびｐｈｏＡの群からのプロモーターである。特に好ましくは、それは誘導性プロモーターｌａｃＵＶ５である。
【０００９】
ヌクレオチド構築物は、好ましくは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列、大腸菌からのｌａｃＺ遺伝子の５’末端を含むｌａｃＵＶ５プロモーターのヌクレオチド配列およびＴ７プロモーター配列からなるヌクレオチド構築物である。そのようなヌクレオチド構築物は配列番号１で表される。特に好ましくは、ヌクレオチド構築物は本発明の発現系の原核細胞のゲノム内に組込まれる。
【００１０】
原核細胞は、好ましくは、ゲノム内にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の細胞である。そのような株は、例えば株コレクションにおいて入手可能な野生株のような野生型株から自体公知の方法で産生されうる。そのような株の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＵＳＡ）ＨＭＳ１７４（ＤＳＭ５９３２）またはＣ６００（ＤＳＭ４２６）（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）［Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］，３８１２４  Ｂｒａｕｓｃｈｗｅｉｇ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｅ  ７Ｂから前記ＤＳＭ番号として入手可能）が挙げられる。
【００１１】
好ましくは、本発明のＴ７発現系は、本発明の状況において開発されたＴ７発現ベクターをこれらの株内に導入することにより製造される。
【００１２】
本発明のそのような発現ベクターは、好ましくは、機能的に連結された以下の構成成分を有する：
複製起点（ｏｒｉ）、
調節配列としてのＴ７プロモーター、
発現される組換えタンパク質をコードする配列、
クローニング用の選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子、
ターミネーター、
抑制遺伝子、
抑制遺伝子に適合したオペレーター配列、および
プラスミド安定化系。
【００１３】
好ましくは、それは、既に前記で挙げられているプラスミド安定化系の１つである。特に好ましくは、プラスミド安定化系はｃｅｒ配列を含有する。
【００１４】
好ましくは、複製起点はｐＢＲ３２２−ｏｒｉ、ｐＵＣ１９−ｏｒｉまたはｐ１５Ａ−ｏｒｉ、特に好ましくは、ｐＢＲ３２２−ｏｒｉである。
【００１５】
特に好ましくは、ターミネーターはＴ０、ｒｒｎＢまたはＴ７ターミネーターである。
【００１６】
抑制遺伝子は、プロモーター領域内に結合すると遺伝子の転写を妨げるタンパク質をコードするいずれかの遺伝子である。特に好ましくは、抑制遺伝子はｌａｃＩ遺伝子である。
【００１７】
好ましくは、抗生物質耐性遺伝子はｋａｎ、ｔｅｔ、ｂｌａ、ｃｍＲまたはｔｅｔＡ、特に好ましくはｋａｎである。
【００１８】
本発明のＴ７発現系は、既に公知のＴ７発現系と同様に製造可能であり、それらにおける相違は、本発明の発現ベクターが、ゲノム内にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含有する原核細胞内に導入されることである。
【００１９】
本発明のもう１つの目的は、細胞内へのファージＤＮＡの組込みがプロセスにおいて生じることなく、制御領域を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの組込みをもたらす、本発明のＴ７発現系の一部としての原核細胞の好ましい実施形態の製造方法を提供することである。
【００２０】
この方法は、制御領域を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのコード配列が「部位特異的」な組換え手段により、原核細胞のゲノム内に組込まれることを特徴とする。
【００２１】
そのような「部位特異的」な組換えは、例えば、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ−ｌｏｘ系および酵母由来のＦＬＰ−ＦＲＴ系によって可能となる。染色体細菌ＤＮＡの修飾のための「部位特異的」な組換えの利用は、例えば、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ，ＰＮＡＳ，Ｊｕｎｅ  ６，２０００  ｎｏ．１２，ｐ．６６４０−６６４５に記載されている。
【００２２】
好ましくは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの標的化組込みが、誘導性プロモーターの制御下、大腸菌ゲノム内の一定の位置、好ましくは、大腸菌のｐｒｏＢＡ配列内にもたらさせる。そのような方法は、例えば、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ，ＰＮＡＳ，Ｊｕｎｅ  ６，２０００  ｎｏ．１２，ｐ．６６４０−６６４５から公知である。
【００２３】
Ｔ７プロモーターの制御下かつ誘導性プロモーターの制御下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする、ゲノム内に組込まれたヌクレオチド構築物を含有し、本方法により製造される原核細胞は、そのような構築物を含有する公知原核細胞と比べて、ラムダファージＤＮＡを含有しない点で異なっている。非常に驚くべきことに、そのような細胞においては、通常の発現ベクターも安定性の増強を示すことが判明した。尤も、本発明の発現ベクターを使用した場合には、より一層高い安定性が得られうる。
【００２４】
したがって、本発明はまた、Ｔ７プロモーターの制御下かつ誘導性プロモーターの制御下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする、ゲノム内に組込まれたヌクレオチド構築物を含有する原核細胞、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞であって、ラムダファージＤＮＡを含有しない、原核細胞に関する。
【００２５】
これとは別に、本発明の利点としては、複合培地内の抗生物質非含有発酵における、その有用性が挙げられ、この場合、一般に、ＥＰ１６９７５２３Ｂ１に記載されている発現系の場合の無機塩培地より高い、産生タンパク質の発現効率が得られうる。したがって、本発明はまた、本発明の発現系による組換えタンパク質の製造方法に関する。
【００２６】
この方法は、Ｔ７プロモーターの制御下かつ誘導性プロモーターの制御下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド構築物を含有する原核細胞内に本発明の発現ベクターを導入し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現およびポリヌクレオチド配列から開始する組換えタンパク質の発現に適した抗生物質非含有条件下、これらの細胞を発酵させ、それにより、組換えポリペプチドを発現させ、組換えポリペプチドを単離することを特徴とする。
【００２７】
本発明においては、発酵プロセス、すなわち、タンパク質の発現のための実際の操作は、抗生物質が全く存在しない環境中で行われる。結果として、プラスミドの選択のための抗生物質の使用に関連した、冒頭に記載されている問題、例えば、規制当局による制限、製品の安全性、最終産物分析（製品中の抗生物質の除去）ならびにそれに関連したリスクおよびコストが回避される。
【００２８】
本発明の場合、タンパク質はペプチドおよびポリペプチドをも意味すると理解されるべきである。
【００２９】
本発明の方法は、好ましくは、バイオリアクター内で実施される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＢＬ２１（ＤＥ３）（先行技術）およびＢＬ２１  ΔｐｒｏＢＡ−Ｔ７ＬｌａｃＺのゲノムにおけるＴ７ヌクレオチド構築物を比較して図示する。ａ）ＤＥ３：修飾ラムダファージによるラムダ付着部位内への組込み（先行技術）。ｂ）Ｓｃｉｌ−Ｔ７：ｐｒｏＢＡの同時欠失による標的化組込み（本発明）。
【図２】ｌａｃＩ、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌａｃＺの５’領域、Ｔ７プロモーターおよびＴ７ファージの遺伝子１（Ｔ７ポリメラーゼ）ならびに２つのＦＲＴ部位に隣接したカナマイシン耐性遺伝子ｋａｎからなるＴ７ヌクレオチド構築物を図示する。
【図３】Ｔ７プロモーター、ｔ０ターミネーター、ｐＢＲ３２２−ｏｒｉ、ｐｒｏＢＡ、ｋａｎおよびｌａｃＩからなる発現ベクターｐＳＣＩＬ００６ｃを図示する。
【図４】Ｔ７プロモーター、ｔ０ターミネーター、ｐＢＲ３２２−ｏｒｉ、ｐｒｏＢＡ、ｋａｎ、ｌａｃＩおよびｃｅｒからなる発現ベクターｐＳＣＩＬ１２２およびｐＳＣＩＬ１２３を図示する。
【図５】Ｔ７プロモーター、ｔ０ターミネーター、ｐＢＲ３２２−ｏｒｉ、ｐｒｏＢＡ、ｋａｎ、ｌａｃＩおよびｃｅｒからなる発現ベクターｐＳＣＩＬ１２４およびｐＳＣＩＬ１２５を図示する。
【図６】Ｔ７プロモーター、ｔ０ターミネーター、ｐＢＲ３２２−ｏｒｉ、ｋａｎ、ｌａｃＩおよびｃｅｒからなる発現ベクターｐＳＣＩＬ１２９を図示する。
【００３１】
以下の実施例は本発明を更に例示するためのものである。
【実施例】
【００３２】
実施例１：本発明の発現ベクターおよびプラスミドの製造
発現プラスミドｐＳＣＩＬ００６ｃの製造
発現ベクターｐＳＣＩＬ００６ｃ（図３）の製造を以下に更に詳細に説明する。
【００３３】
１．ｐＵＣ１９内へのｔ０ターミネーターの挿入＝ｐＳＣＩＬ００１
商業的に入手可能なベクターであるｐＵＣ１９（ＳＤ００６１，ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を発現ベクターの製造のための基礎として使用した。ｐＵＣ１９をエンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｆｌＩＩＩで切断し、これは３５９ｂｐのベクターの欠失をもたらした。プライマーｔ０−ＯＤ−ＭＣＳ−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号２）およびｔ０−ＵＵ−ＭＣＳ−ＡｆｌＩＩＩ（配列番号３）を使用してファージラムダ（ＳＤ００１１，ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）のＤＮＡからｔ０転写ターミネーターを増幅した。ついで、得られた断片をエンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｆｌＩＩＩで切断し、精製（Ｍｉｎｉｅｌｕｔｅ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）後、ｐＵＣ１９ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｆｌＩＩＩ断片内にクローニングした。得られたプラスミドｐＳＣＩＬ１０１を制限分析および配列決定により確認した。
【００３４】
２．ｐＳＣＩＬ００１における抗生物質耐性カセットの置換＝ｐＳＣＩＬ００２
プライマーＫｍ−ＯＤ−ＡｐａＩ（配列番号４）およびＫｍ−ＵＵ−ＮｈｅＩ（配列番号５）を使用するＰＣＲによりｐＡＣＹＣ１７７（Ｅ４１５１Ｓ，ＮＥＢ）からカナマイシン耐性カセットを増幅した。該断片をゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ（Ａ１３６０，Ｐｒｏｍｅｇａ）内にクローニングした。プラスミドｐＳＣＩＬ１０１をプライマーｐＵＣ２５４１−ＯＤ−ＮｈｅＩ（配列番号６）およびｐＵＣ１４９６−ＵＵ−ＡｐａＩ（配列番号７）によりアンピシリン耐性カセットの非存在下で増幅し、エンドヌクレアーゼＡｐａＩおよびＮｈｅＩで切断した。カナマイシン耐性カセットをエンドヌクレアーゼＡｐａＩおよびＮｈｅＩでｐＧＥＭＴ−Ｔ  ｅａｓｙから切断し、ｐＳＣＩＬ００１（ΔＡｍｐ）ＡｐａＩ／ＮｈｅＩ内にクローニングした。得られたプラスミドｐＳＣＩＬ００２を制限分析により確認した。
【００３５】
３．カナマイシン耐性カセットの配向の改変＝ｐＳＣＩＬ００２ｂ
ｐＳＣＬベクターにおけるカナマイシン耐性カセットの配向はカナマイシン耐性遺伝子のバックグラウンド発現において決定的な役割を有し、したがって、第２のベクターの作製における耐性カセットの配向を、例えばｐＳＣＩＬ００８（ＥＰ１６９７５２３Ｂ１）との比較において改変した。このために、ｐＳＣＩＬ００２のバックボーンを、まず、カナマイシン耐性カセットの非存在下、プライマーＭｕｎＩ−Ｋｍ  ｔｅｒｍ（配列番号８）およびＡｐａＩ−ｐＳＣＩＬ００２（配列番号９）を使用して増幅し、ついでヌクレアーゼＭｕｎＩ（ＭｆｅＩ）およびＡｐａＩで切断した。カナマイシン耐性カセットを、プライマーＫｍ  ５’−ＭｕｎＩ（配列番号１０）およびＫｍ  ３’ＡｐａＩ（配列番号１１）を使用して、ｐＳＣＩＬ００２から増幅し、同様にエンドヌクレアーゼＭｕｎＩ（ＭｆｅＩ）およびＡｐａＩで切断した。ついで両方の断片を連結し、これはプラスミドｐＳＣＩＬ００２ｂを与えた。適切な組込みを配列決定により確認した。
【００３６】
４．ｐＳＣＩＬ００２ｂ内への第２の選択マーカーの挿入＝ｐＳＣＩＬ００３ｂ
ついで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のプロリン合成経路のための遺伝子であるｐｒｏＢＡを第２の選択マーカーとしてｐＳＣＩＬ００２ｂ内に組込んだ。このために、まず、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＤＳＭ  ９０３７，Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｒ  Ｍｉｋｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ；ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）から既に調製されたゲノムＤＮＡから、プライマーｐｒｏＢＡ−ＯＤ−ＡｐａＩ（配列番号１２）およびｐｒｏＢＡ−ＵＵ−ＡｐａＩ（配列番号１３）を使用してｐｒｏＢＡオペロンを増幅した。ＰＣＲ産物をエンドヌクレアーゼＡｐａＩで切断し、同様にＡｐａＩで切断されたベクターｐＳＣＩＬ００２ｂ内にクローニングした。得られたプラスミドｐＳＣＩＬ００３ｂを配列決定により確認した。
【００３７】
５．ｐＳＣＩＬ００３ｂ内への抑制遺伝子ｌａｃＩの挿入＝ｐＳＣＩＬ００４ｂ
天然のプロモーター領域を含むｌａｃＩ遺伝子を、大腸菌株Ｋ１２（ＤＳＭ  ９０３７，Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ；ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）の染色体ＤＮＡから、プライマーｌａｃＩ  ＯＤ  ＮｈｅＩ（配列番号１）およびｌａｃＩ  ＵＵ  ＮｈｅＩ（配列番号１５）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ（Ａ１３６０，Ｐｒｏｍｅｇａ）内にクローニングし、配列決定により確認した。エンドヌクレアーゼＮｈｅＩでの制限消化の後、ｌａｃＩをｐＳＣＩＬ００３ｂ内に連結した。
【００３８】
６．ｐＳＣＩＬ００４ｂ内へのＴ７プロモーターの挿入＝ｐＳＣＩＬ００６ｂ
ｌａｃオペレーター配列を含むＴ７プロモーターを、プライマーＰｒＴ７−ＭｕｎＩ５’（配列番号１６）およびＰｒＴ７−ＥｃｏＲＩ３’（配列番号１７）をプラスミドｐＳＣＩＬ００６（元々はｐＴＹＢ２、＃６７１０、ＮＥＢからのもの）から増幅した。また、プライマーＰｒＴ７−ＥｃｏＲＩ３’を使用して、後期リボソーム結合部位（ＡＧＧＡＧＡ）をＰＣＲ産物内に組込んだ。ＰＣＲ産物をエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＭｕｎＩ（ＭｆｅＩ）で切断し、ＥｃｏＲＩで切断されたベクターｐＳＣＩＬ００４ｂ内にクローニングした。得られたプラスミドｐＳＣＩＬ００６ｂを配列決定により確認した。
【００３９】
７．ｐＳＣＩＬ００６ｂにおける１つのヌクレオチドの置換による複製起点の改変＝ｐＳＣＩＬ００６ｃ
ｐＵＣ１９の派生体として、発現プラスミドｐＳＣＩＬ００６ｃは、３７℃においては、３０℃より遥かに高いコピー数を示す。この理由は元のプラスミドｐＢＲ３２２の複製起点における点突然変異（ＧからＡへ）にある。ｐＳＣＩＬ００６ｂにおけるこの突然変異を逆転させるために、フュージョン（Ｐｈｕｓｉｏｎ）部位特異的突然変異誘発キット（Ｆ−５４１，Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用した。このために、全プラスミドをプライマーｏｒｉ ｍｕｔ ｆｗｄ（配列番号１８）およびｏｒｉ ｒｅｖ（配列番号１９）で増幅し、再連結した。温度には無関係に約６０コピー／細胞のコピー数を有する得られたプラスミドを配列決定により確認し、ｐＳＣＩＬ００６ｃと命名した（図３、配列番号２０を参照されたい）。
【００４０】
発現ベクターｐＳＣＩＬ１２２およびｐＳＣＩＬ１２３の製造
１．ｐＳＣＩＬ００６ｃ内へのｃｅｒの挿入＝ｐＳＣＩＬ１２２およびｐＳＣＩＬ１２３
ｃｅｒ要素を、プラスミドＣｏｌＥ１［ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ，Ｑｉａｇｅｎを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＣ４１１（ＤＳＭ３８７７），ＤＳＭＺから単離されたもの］から、プライマー５’ｃｅｒ ＮｄｅＩ（配列番号２１）および３’ｃｅｒ ＮｄｅＩ（配列番号２２）を使用するＰＣＲにより増幅し、ｐＳＣＩＬ００６ｃにおけるユニークＮｄｅＩ切断部位内に組込んだ。これにおいては、両方の配向（フォワードおよびリバース）が可能である。フォワード配向でｃｅｒを含有する得られたプラスミドをｐＳＣＩＬ１２２と命名し、リバース配向でｃｅｒを含有するプラスミドをｐＳＣＩＬ１２３と命名し、配列決定により確認した（図４、配列番号２３を参照されたい）。
【００４１】
発現ベクターｐＳＣＩＬ１２４およびｐＳＣＩＬ１２５の製造
１．ｐＳＣＩＬ００６ｃにおけるｋａｎの欠失＝ｐＳＣＩＬ１１２
カナマイシン耐性カセットの欠失のために、フュージョン（Ｐｈｕｓｉｏｎ）部位特異的突然変異誘発キット（Ｆ−５４１，Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用した。このために、ｐＳＣＩＬ００６ｃのバックボーンを、プライマーｐＳＣＩＬ Ｎｃｏ Ｐ（配列番号２４）およびｐＳＣＩＬ Ｓｐｅ Ｐ（配列番号２５）で増幅し、再連結し、これはカナマイシン耐性カセットの欠失をもたらした。得られたプラスミドを配列決定により確認し、ｐＳＣＩＬ１１２と命名した。
【００４２】
２．ｐＳＣＩＬ１１２内へのｔｅｔＡの挿入＝ｐＳＣＩＬ１０５
テトラサイクリン耐性カセットを、プライマーｔｅｔＡ ５’ｐｒｏｍｏ ＮｃｏＩ（配列番号２６）およびｔｅｔＡ ３’ ＳｐｅＩ（配列番号２７）を使用してｐＢＲ３２２（Ｄ１５１１，Ｐｒｏｍｅｇａ）から増幅した。ＰＣＲ産物をエンドヌクレアーゼＮｃｏＩおよびＳｐｅＩで切断し、同様にＮｃｏＩおよびＳｐｅＩで切断されたベクターｐＳＣＩＬ１１２内にクローニングした。得られたプラスミドは、１コピーではなく２コピーのテトラサイクリン耐性カセットを有していたため、フュージョン（Ｐｈｕｓｉｏｎ）部位特異的突然変異誘発キット（Ｆ−５４１，Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用して１コピーを除去した。このために、該プラスミドをプライマー１０５ ｆｗｄ Ｐ（配列番号２８）および１０５ ｒｅｖ Ｐ（配列番号２９）で増幅し、再連結した。得られたプラスミドを配列決定により確認し、ｐＳＣＩＬ１０５と命名した。
【００４３】
３．ｐＳＣＩＬ１０５内へのｃｅｒの挿入＝ｐＳＣＩＬ１２４およびｐＳＣＩＬ１２５
ｃｅｒ要素を、プラスミドＣｏｌＥ１［ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ，Ｑｉａｇｅｎを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＣ４１１（ＤＳＭ３８７７），ＤＳＭＺから単離されたもの］から、プライマー５’ｃｅｒ ＮｄｅＩ（配列番号２１）および３’ｃｅｒ ＮｄｅＩ（配列番号２２）を使用するＰＣＲにより増幅し、ｐＳＣＩＬ１０５におけるユニークＮｄｅＩ切断部位内に組込んだ。これにおいては、両方の配向（フォワードおよびリバース）が可能である。フォワード配向でｃｅｒを含有する得られたプラスミドをｐＳＣＩＬ１２４と命名し、リバース配向でｃｅｒを含有するプラスミドをｐＳＣＩＬ１２５と命名し、配列決定により確認した（図５、配列番号３０を参照されたい）。
【００４４】
発現ベクターｐＳＣＩＬ１２９の製造
１．ｐＳＣＩＬ１２３におけるｐｒｏＢＡの欠失＝ｐＳＣＩＬ１２９
発現ベクターのプラスミドサイズを減少させるために、ｐｒｏＢＡカセットを再び除去した。このために、フュージョン（Ｐｈｕｓｉｏｎ）部位特異的突然変異誘発キット（Ｆ−５４１，Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用した。プラスミドｐＳＣＩＬ１２３をプライマーｐＳＣＩＬ−ｐｒｏＢＡ ｒｅｖ−Ｐ（配列番号３１）およびｐＳＣＩＬ  −ｐｒｏＢＡ ｆｗｄ−Ｐ（配列番号３２）で増幅して、後続の再連結の後、ｐｒｏＢＡオペロンを欠失させた。得られた発現ベクターをｐＳＣＩＬ１２９と命名し、配列決定により確認した（図６、配列番号３３を参照されたい）。
【００４５】
実施例２：本発明の発現系の製造
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＨＭＳ１７４（ＤＳＭ５９３２）およびＣ６００’（ＤＳＭ４２６）をＳｔｒａｔａｇｅｎｅまたはＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓｔａｍｍｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）から得た。株ＢＬ２１、ＨＭＳ１７４およびＣ６００’を、それぞれ、ラムダファージのＲｅｄ（レッド）リコンビナーゼをコードするプラスミドｐＫＤ４６（ＣＧＳＣ，Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＵＳＡ）で形質転換した。これにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム内へのＴ７構築物の標的化組込みが可能である。得られた株ＢＬ２１  ｐＫＤ４６、ＨＭＳ１７４  ｐＫＤ４６およびＣ６００’  ｐＫＤ４６から、コンピテント細胞を再び産生させた。ｐＫＤ４６の選択を寒天プレート上のアンピシリンまたは液体培養内のカルベニシリンで行った。ｌａｃＩ、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌａｃＺの５’領域、Ｔ７プロモーターおよびＴ７ファージの遺伝子１（Ｔ７ポリメラーゼ）ならびに２つのＦＲＴ部位に隣接するカナマイシン耐性遺伝子ｋａｎからなる図２に示されているＤＮＡ構築物を以下のとおりに製造した。まず、それらの成分を別々に増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ（Ａ１３６０，Ｐｒｏｍｅｇａ）内に一緒にクローニングした。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子（遺伝子１）をプライマーＴ７  ５’ ＢａｍＨＩ Ｘｈｏ（配列番号３４）およびＴ７  ３’ Ｈｉｎｄ（配列番号３５）でＴ７ファージ（３１０００５，Ｂｉｏｒｏｎ  ＧｍｂＨ）のＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物をＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、突出アデニン残基を利用してベクターｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ（Ａ１３６０，Ｐｒｏｍｅｇａ）内にクローニングした。得られたプラスミドｐＧＥＭ：：Ｔ７を配列決定により確認した。プライマーｌａｃＩ  ５’ ＢａｍＨＩ ｃｏｌｉ（配列番号３６）およびｌａｃＩ  ３’ ＵＶ５ Ｘｈｏ（配列番号３７）を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｋ１２（ＤＳＭ９０３７，Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ；ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）のゲノムＤＮＡからｌａｃＩ遺伝子を増幅した。また、プライマーｌａｃＩ  ３’ ＵＶ５ Ｘｈｏ（配列番号３７）の補助によりｌａｃＵＶ５プロモーターの配列をＰＣＲ産物内に組み込んだ。ＰＣＲ産物をＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、突出アデニン残基を利用してベクターｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ（Ａ１３６０，Ｐｒｏｍｅｇａ）内にクローニングした。得られたプラスミドｐＧＥＭ：：ｌａｃＩ−ｌａｃＵＶ５を配列決定により確認し、ついでエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断した。得られた断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、同様に切断され精製されたプラスミドｐＧＥＭ：：Ｔ７内にクローニングした。得られたプラスミドｐＧＥＭ：：ｌａｃＩ−ｌａｃＵＶ５−Ｔ７を配列決定により確認した。ＦＲＴ部位に隣接するカナマイシン耐性遺伝子を、プライマーＨｉｎｄ ｐＫＤ４  ５’（配列番号３８）およびｐＫＤ４  ３’ Ｈｉｎｄ ｃｏｌｉ（配列番号３９）を使用してプラスミドｐＫＤ４（ＣＧＳＣ，Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＵＳＡ）から増幅した。ＰＣＲ産物をエンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同様にＨｉｎｄＩＩＩで切断されたプラスミドｐＧＥＭ：：ｌａｃＩ−ｌａｃＵＶ５−Ｔ７内にクローニングした。最終プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ：：ｌａｃＩ−ｌａｃＵＶ５−Ｔ７−ｋａｎ−ＦＲＴをエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの制限消化により確認した。
【００４６】
ＤＥ３に類似したＴ７ヌクレオチド構築物を製造するために、まず、ｌａｃＩ、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌａｃＺの５’領域およびＴ７ファージの遺伝子１の最初の２５７４ｂｐ（内部ＭｆｅＩ切断部位まで）からなる領域を、プライマーＴ７ ｎｅｕ ＢａｍＨＩ ｆｏｒ０１（配列番号４０）およびＴ７ ｎｅｕ ＭｆｅＩ ｒｅｖ０２（配列番号４１）を使用して、ＢＬ２１（ＤＥ３）［Ｎｏｖａｇｅｎ  ６９３８７−３］から既に単離されたゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）から増幅した。精製（Ｗｉｚａｒｄ（Ｒ）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ，Ｐｒｏｍｅｇａ）後、このＰＣＲ産物をエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＭｆｅＩで切断し、精製（Ｗｉｚａｒｄ（Ｒ）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ，Ｐｒｏｍｅｇａ）後、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ：：ｌａｃＩ−ｌａｃＵＶ５−Ｔ７−ｋａｎ−ＦＲＴＢａｍＨＩ／ＭｆｅＩの４６４７ｂｐの断片内にクローニングした。ＴＯＰ１０Ｆ’（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内への形質転換および１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンでのＬＢプレート上の選択の後、生じたプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ：：ｌａｃＩ−ｌａｃＵＶ５ ｌａｃＺ Ｔ７−ｋａｎ（配列番号４２）を得た。次に、全構築物をエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩでプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ：：ｌａｃＩ−ｌａｃＵＶ５ ｌａｃＺ Ｔ７−ｋａｎ（配列番号４２）から切り出した。このようにして得られた６０２６ｂｐの断片をＷｉｚａｒｄ（Ｒ）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ−Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により精製した。ついで株ＢＬ２１  ｐＫＤ４６、ＨＭＳ１７４  ｐＫＤ４６およびＣ６００’  ｐＫＤ４６をこのＤＮＡ断片で形質転換し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム内への組込みが可能となるように室温で一晩インキュベートした。
【００４７】
ｐｒｏＢＡオペロンの隣接領域に合致するＤＮＡ構築物の隣接領域（配列番号４３：ｒｅｃ部位１および配列番号４４：ｒｅｃ部位２）の選択の結果として、ｐｒｏＢＡオペロンは組込み中に同時に欠失する。図２に示されているＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ構築物に関する選択を、培地内でカナマイシンを使用して行った。ヘルパープラスミドｐＫＤ４６の喪失はアンピシリンまたはカルベニシリン含有培地能力の喪失により検出された。
【００４８】
コンピテント細胞を、得られた株ＢＬ２１  ΔｐｒｏＢＡ−Ｔ７ｌａｃＺ：：ｋａｎ、ＨＭＳ１７４  ΔｐｒｏＢＡ−Ｔ７ｌａｃＺ：：ｋａｎおよびＣ６００’ΔｐｒｏＢＡ−Ｔ７ｌａｃＺ：：ｋａｎから産生させ、ヘルパープラスミドｐＣＰ２０（ＣＧＳＣ，Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＵＳＡ）で形質転換した。この工程は、ｐＣＰ２０上にコードされているＦＬＰリコンビナーゼによる、第１工程でゲノム内に組込まれたカナマイシン耐性の欠失に有用である。ｐＣＰ２０を含有する株に関する選択をアンピシリン含有プレート上で行った。該細胞を４３℃で一晩インキュベートすることにより、ヘルパープラスミドｐＣＰ２０が喪失する。得られた株ＢＬ２１  ΔｐｒｏＢＡ−Ｔ７ｌａｃＺ、ＨＭＳ１７４  ΔｐｒｏＢＡ−Ｔ７ｌａｃＺおよびＣ６００’ΔｐｒｏＢＡ−Ｔ７ｌａｃＺは抗生物質耐性を有さず、ゲノム内にｐｒｏＢＡオペロンの代わりに図１に示されているＴ７構築物を含有する。該方法からの「瘢痕」としてゲノム内に残存する１つのＦＲＴ部位がＦＬＰリコンビナーゼによるカナマイシン耐性カセットの欠失により生じる。該株をサザンハイブリダイゼーションにより確認した。この過程において、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのコード配列の組込みおよびｐｒｏＢＡの欠失が検出された。
【００４９】
このようにして得られたＢＬ２１  ΔｐｒｏＢＡ−Ｔ７ｌａｃＺおよびＨＭＳ１７４  ΔｐｒｏＢＡ−Ｔ７ｌａｃＺ内へ、実施例１からの発現プラスミドをエレクトロポレーションにより導入した。
【００５０】
実施例３：本発明のＴ７発現系と先行技術のＴ７発現系とのプラスミド安定性の比較
ＢＬ２１（ＤＥ３）（先行技術の株）およびＢＬ２１  ΔｐｒｏＢＡ−Ｔ７ｌａｃＺ（本発明の株）における先行技術のＴ７発現プラスミドおよび本発明のＴ７発現プラスミドの安定性を調べるために、振とうフラスコおよびフェドバッチ（流加）発酵において実験を行った。このために、遺伝子合成（Ｇｅｎｅａｒｔ，  Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ）により得られたヒト成長因子ｐｒｏＮＧＦの遺伝子を、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを使用して、該発現ベクター内にクローニングした。振とうフラスコにおいてプラスミド安定性を調べるための手順は以下のとおりであった。まず、調べる発現株、すなわち、標準的発現プラスミドｐＳＣＩＬ００６ｃΔｐｒｏＢＡ：：ｐｒｏＮＧＦ（先行技術）を含有するＢＬ２１（ＤＥ３）、安定発現プラスミドｐＳＣＩＬ１２９：：ｐｒｏＮＧＦ（本発明の発現プラスミド）を含有するＢＬ２１（ＤＥ３）、標準的発現プラスミドｐＳＣＩＬ００６ｃΔｐｒｏＢＡ：：ｐｒｏＮＧＦを含有するＢＬ２１  ΔｐｒｏＢＡ−Ｔ７ｌａｃＺ（プラスミド安定化系の非存在下で発現プラスミドを含有する本発明の発現株）および安定発現プラスミドｐＳＣＩＬ１２９：：ｐｒｏＮＧＦを含有するＢＬ２１  ΔｐｒｏＢＡ−Ｔ７ｌａｃＺ（本発明の発現系）の前培養物を、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含有する複合培地［３４．５ｇ／ｌ  酵母エキス（Ｍｅｒｃｋ  １．０３７５３．０５００）、２．４７５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、９．３４７ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、６２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１５ｇ／ｌ  グルコース］内で、振とうしながら３７℃で一晩培養した。翌朝、ＯＤ６００＝０．２〜０．３の光学密度まで本培養を接種するのに必要な該細胞を６５００ｒｐｍ（５分間）の遠心分離により無菌的に集めた。このようにして接種した本培養（１００ｍｌ  エーレンマイヤーフラスコ内の、抗生物質を含有しない２０ｍｌの複合培地）を、ＯＤ６００＝０．８に達するまで、２１０ｒｐｍで振とうしながら３７℃でインキュベートした。この時点で、標的遺伝子発現を１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加により誘導した。該誘導物質の添加の３時間後（３時間ｐｉ（誘導後））および２４時間後（２４時間ｐｉ）、該培養の無菌希釈物を得、ＬＢ培地［５ｇ／ｌ  酵母エキス（Ｍｅｒｃｋ  １．０３７５３．０５００）、１０ｇ／ｌ  大豆ペプトン（Ｍｅｒｃｋ  １．０７２１２．０５００）、８５．５６ｍＭ  ＮａＣｌ］上にプレートアウトした。これらのプレートを３７℃で一晩インキュベートした。各場合の成長コロニーからの１００個のコロニーをＬＢおよびＬＢ＋５０μｇ／ｍｌ  カナマイシン上に並行して穿刺した。したがって、例えば１０％のプラスミド安定性は、ＬＢ上で増殖したコロニーの１０％のみがＬＢ＋カナマイシン上でも成長（増殖）することを意味する。ＬＢ＋カナマイシン上で成長しうるコロニーは尚も該発現プラスミドを有する。ＬＢ上のみで成長しうるコロニーは該発現プラスミドを喪失している。各場合において、プラスミド安定性に関する結論を導き出すために、４回の独立した実験を行った。結果を、標準偏差を伴う平均値として表１に示す。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
先行技術の発現系は誘導の３時間後には８６％、そして誘導の２４時間後には僅か５％の非常に低いプラスミド安定性を示すに過ぎないことが判明した。本発明のｃｅｒによる発現プラスミドの安定化により、誘導の３時間後には１００％、そして誘導の２４時間後には８８％へのプラスミド安定性の増強がＢＬ２１（ＤＥ３）において可能である。安定発現プラスミドｐＳＣＩＬ１２９：：ｐｒｏＮＧＦを含有するＢＬ２１  ΔｐｒｏＢＡ−Ｔ７ｌａｃＺからなる本発明のＴ７発現系の使用によってのみ、誘導の２４時間後に約１００％へのプラスミド安定性の増強が達成可能であった。しかし、驚くべきことに、ＢＬ２１  ΔｐｒｏＢＡ−Ｔ７ｌａｃＺにおける標準的発現プラスミドも誘導の３時間後に９０％、そして誘導の２４時間後に８４％の高いプラスミド安定性を示したが、同時に、ＢＬ２１（ＤＥ３）における同じプラスミドは既に実質的に喪失していた（誘導の２４時間後に５％）。これらの実験における標的遺伝子として、ヒト成長因子ｐｒｏＮＧＦを発現させた。ｐｒｏＮＧＦの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
【００５３】
これとは別に、フェドバッチ発酵において本発明の発現系を先行技術と比較した。まず、調べる発現株、すなわち、標準的発現プラスミドｐＳＣＩＬ００６ｃΔｐｒｏＢＡ：：ｐｒｏＮＧＦ（先行技術）を含有するＢＬ２１（ＤＥ３）、安定発現プラスミドｐＳＣＩＬ１２９：：ｐｒｏＮＧＦ（本発明の発現プラスミド）を含有するＢＬ２１（ＤＥ３）、標準的発現プラスミドｐＳＣＩＬ００６ｃΔｐｒｏＢＡ：：ｐｒｏＮＧＦを含有するＢＬ２１  ΔｐｒｏＢＡ−Ｔ７ｌａｃＺ（プラスミド安定化系の非存在下で発現プラスミドを含有する本発明の発現株）および安定発現プラスミドｐＳＣＩＬ１２９：：ｐｒｏＮＧＦを含有するＢＬ２１  ΔｐｒｏＢＡ−Ｔ７ｌａｃＺ（本発明の発現系）の前培養物を、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含有する複合培地［３４．５ｇ／ｌ  酵母エキス（Ｍｅｒｃｋ  １．０３７５３．０５００）、２．４７５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、９．３４７ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、６２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１５ｇ／ｌ  グルコース］内で、振とうしながら３７℃で一晩培養した。発酵のために、各場合において、抗生物質を含有しない２リットルの複合培地［５０ｇ／ｌ  酵母エキス（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒ  ０２０６）、２．４７５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、９．３４７ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、６２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１０ｇ／ｌ  グルコース、０．２ｍｌ／ｌ  消泡剤Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（Ｃｒｏｄａ  ＥＴＫ０８７９）］を５リットルの実験用発酵槽に入れ、０．０６の開始ＯＤ６００（６００ｎｍにおける光学密度）が得られるように、それに該発現株の前培養物を接種した。６．５時間後、グルコースが消費された後、基質の添加によりフェドバッチ相を開始させた。この場合の基質供給流は、式：供給流＝定数＊ｅｘｐ（μ１＊ｔ）の指数関数に従い生じる。ここで、μは、μ１＝定数＜μｍａｘが適合する比成長速度であり、すなわち、瞬間的に利用可能なグルコース濃度は常に最大瞬間需要量より低く保たれ、その結果、準最大成長速度が達成され、グルコースの蓄積が妨げられる。例えば、値μ１＝０．２５  ｈ−１が設定される。一定の光学密度、例えば、ＯＤ６００＝５０±５において、タンパク質発現がＩＰＴＧの添加により誘導される（例えば、１ｍＭ）。この時点で、基質供給流は６時間にわたって直線的に７０％減少し、ついで一定に保たれる。該過程は一定の誘導時間（例えば、２４時間）の後で終了する。
【００５４】
ＯＤ６００＝５０±５が得られたら、標的遺伝子発現を１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加により誘導した。この時点ならびに誘導の６時間、８時間および２４時間後、プラスミドの安定性を前記のとおりに分析し、ヒト成長因子ｐｒｏＮＧＦの発現を確認した。データを表２に示す。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
フェドバッチ発酵においては、先行技術の発現系は誘導の６時間後に発現プラスミドの８９％を既に喪失しているが（ＰＳ  １１％）、本発明の発現系は誘導の２４時間後においてさえも１００％のプラスミド安定性を示すことが判明した。ここでは、プラスミド安定化系ｃｅｒを含有する本発明の発現プラスミド（ｐＳＣＩＬ１２９：：ｐｒｏＮＧＦ）、そしてまた、本発明の発現株ＢＬ２１  ΔｐｒｏＢＡ−Ｔ７ｌａｃＺの両方が、先行技術の発現系と比較した場合の明らかな利点を有する。なぜなら、ここでは、誘導の２４時間後のプラスミド安定性（すなわち、それぞれ１００％および９５％）は先行技術の発現系のもの（すなわち、２％）より有意に高いからである。
【００５７】
ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＢＬ２１  ΔｐｒｏＢＡ−Ｔ７ｌａｃＺにおける本発明のＴ７発現プラスミドの安定性を更に調べるために、振とうフラスコにおける更なる実験を行った。このために、遺伝子合成（Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ）により得られたヒトプレトロンビンの遺伝子を、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを使用して、発現ベクターｐＳＣＩＬ００６ｃ（通常の発現プラスミド）およびｐＳＣＩＬ１２３（安定発現プラスミド）内にクローニングした。振とうフラスコにおけるプラスミド安定性の研究のために、前記の手順を用いた。結果を表３に示す。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
先行技術の発現系は極めて低いプラスミド安定性を示すことが判明した。誘導の３時間後には既に、僅か５％のプラスミド含有株が尚も存在するに過ぎず、２４時間後には、ほぼ全ての細胞がプラスミドを含有しなかった。発現プラスミドｐＳＣＩＬ１２３：：プレトロンビンの使用により、発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＢＬ２１  ΔｐｒｏＢＡ−Ｔ７ｌａｃＺの両方において、誘導の３時間後に１００％のプラスミド安定性が達成可能であった。誘導の２４時間後、本発明の発現系（ｐＳＣＩＬ１２３：：プレトロンビンを含有するＢＬ２１  ΔｐｒｏＢＡ−Ｔ７ｌａｃＺ）のプラスミド安定性である７８％は先行技術の発現株（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＳＣＩＬ１２３：：プレトロンビン）の場合（４１％）の約２倍高い。ヒトプレトロンビンの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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