(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
新規微生物バチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）ＹＣ７００７（受託番号：ＫＣＣＭ１１２７５Ｐ）。
【請求項２】
前記バチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）は、配列番号１と記載される塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡを含むことを特徴とする、請求項１に記載のバチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）。
【請求項３】
前記バチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）は、植物病抵抗性誘導能を有することを特徴とする、請求項１に記載のバチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）。
【請求項４】
前記植物病は、イネもみ枯細菌病、イネ白葉枯病、イネ穂枯病及びイネばか苗病からなる群より選択される１種以上であることを特徴とする、請求項３に記載のバチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）。
【請求項５】
前記バチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）は、植物病原菌抑制能、植物生育促進能及び植物強化能をさらに有することを特徴とする、請求項３に記載のバチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）。
【請求項６】
前記植物生育促進能は、稲に対する植物生育促進能であることを特徴とする、請求項５に記載のバチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物、その培養液または培養ろ液を有効成分として含有する、肥料用、植物保護用及び植物強化用の微生物製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物内生微生物及びそれを含有する微生物製剤に関し、より詳細には、新規微生物バチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）、及びそれを含有する微生物製剤に関する。
【０００２】
本発明は、２０１０年に行われた農林水産食品部所管の「次世代生物農薬開発事業」（課題固有番号：１００４４９０９、課題名：効果持続型の広範囲プロバイオティック作物保護剤の開発）、及び２０１３年に行われた産業通商部所管の「産業融合基盤技術開発事業」（課題固有番号：８０８０１５−３−２、課題名：拮抗微生物を用いた植物病防除用の次世代微生物材料の開発（２０１０−２０１３））の一環としてなされた研究から導き出したものである。
【背景技術】
【０００３】
世界的に、過去数十年間、穀物、野菜、果樹などの作物の収量を増加させるために、毎年、大量の化学肥料や、病害、害虫及び雑草の防除のための化学農薬を使用してきた。このような化学肥料及び農薬の使用により、土壌の酸性化、地力の低下、環境汚染、生態系の破壊、人畜毒性、病害虫、及び雑草の農薬に対する抵抗性の発現などの問題が継続的に提起されている。また、大気中の二酸化炭素量の増加による異常気候変動により、継続的に旱魃及び農地の塩類蓄積が発生し、作物の安定な生産を阻害しているのが実情である。
【０００４】
上述した問題を解決するために、国内外では化学肥料及び農薬の使用量を削減しようとする試みが行われている。特に、韓国では、１９９９年に初めて環境保全型農業育成法を制定して以来、現在まで第３次環境保全型農業育成政策を推進してきている。この計画の目標は、２０１５年まで化学肥料及び農薬の使用量を２０１１年の約１５％程度に削減することである。その一方で、社会的には、生活水準の向上により、安全食品へのニーズが増加しており、農業生産環境及び自然生態系の保全を目指す有機農業や自然農法などの環境保全型農業が急速に拡大している。このため、化学肥料及び農薬を代替できる微生物を用いた肥料及び生物農薬を開発するために、その研究が急速に増加している。近年、多国籍企業では、化学肥料と農薬の限界点を補完できる生物学的作用剤、すなわち植物活性増強剤を開発及び販売しており、その一方では、旱魃地域や塩類集積地域でも生長可能な耐乾性作物の種子育種などを進めている。このようにして開発された微生物製品は、特定の機能を有する微生物を環境から選抜して大量培養後、製剤化し、葉面散布又は粒剤として土壌処理することにより病害虫を防除するか、微生物肥料や植物強化剤として用いられる（非特許文献１参照）。
【０００５】
ここで使用される微生物は、土壌、植物根圏、海洋などの自然環境に広く分布しており、その種類が多様で複数種の代謝産物を分泌するので、環境保全型農業に有効に利用されている。微生物の利用方法は、大きく３つに分けられるが、微生物自体を利用する方法、微生物の発酵により生産される代謝物質を利用する方法、及び新しい農薬を合成するための先導化合物として微生物の代謝物質を利用する方法などがある。中でも、植物病原菌を抑制できる拮抗微生物、植物生育を促進させる植物生育促進根圏細菌（ＰＧＰＲ）及び植物内生（endophytic）微生物の直接使用による場合が殆どであり、特にこれらの微生物による植物病抵抗性の研究が盛んに行われている。
【０００６】
最近１０年間、微生物の中でも植物内生細菌に関する研究が国内外で盛んに行われている。ここで、内生細菌とは、生きている健康な植物の組織内に住み、植物体に実質的な悪影響を与えることなく、様々な利点を与える細菌を指す。一般に、植物内生細菌は、植物細胞の間や細胞内に存在することがあり、直接・間接に植物の病害虫、ストレスへの抵抗性を誘導したり、植物の生長にも大きな影響を与えることが知られている。より具体的には、内生細菌は、窒素固定、リン酸の可溶化、鉄錯体化合物（siderophore）の生産、活性ホルモンの生成、抗菌物質の生産、または植物の病抵抗性を誘導し、病気の感染を防止するとともに植物生長を促進するものと考えられる（非特許文献１〜４参照）。この内生細菌は、寄主植物との親和性を有し、病原菌として認識されることなく、寄主植物の組織に共生することができる（非特許文献５参照）。ある特定の内生細菌は、１つまたはそれ以上のメカニズムを同時に利用して、植物生長促進及び病害防除効果を示すことができ、植物の一生の間の異なる時期に異なるメカニズムが適用されることもある。植物の遺伝子は、細菌の存在により変わり得るが、このようにして変化した遺伝子は、植物での内生細菌の効果への手がかりを提供する（非特許文献６参照）。植物内生細菌は、細胞内で増殖するが、通常、根と茎の始まりの所で全体密度が高く、茎、葉などの植物体の上部に行くほど減少する。トウモロコシの葉の場合は、その密度がｌｏｇ１０３〜ｌｏｇ１０７ｃｆｕ／ｇ程度であることが判明された。現在、分離された内生細菌としては、バチルス（Bacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）、エンテロバクター（Enterobacter）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）などの５０個余りの属に属する１３０種程度が知られている。これらは、トマト、ジャガイモ、トウモロコシ及び稲のような経済的に重要な作物の生長及び病害の発生を抑制することにより作物の生産を増進する。
【０００７】
稲は、世界５大作物の一つであり、様々な病害により莫大な生産損失が発生している。その中でも、いもち病、紋枯病などの病原真菌による被害は、作物の生産に致命的な損失を引き起こすものであり、現在まで抵抗性品種の育種、化学殺菌剤の開発などにより効果的に防除されている。しかし、近年では、主に種子伝染により発病するばか苗病や、細菌病であるもみ枯細菌病及び白葉枯病なども、地域によっては多く発生しており、大きな被害を与えている。これらの病原菌は、水田土壌や周囲の雑草組織で越冬するが、特に暖かく湿った条件では稲が病菌に弱いので、いったん発病が始まると防除が困難である。これらの病原菌の防除は、主に化学殺菌剤に依存してきたが、ほとんどの殺菌剤は、環境汚染や人畜毒性の恐れがあるため、これを代替できる環境保全型の生物農薬への関心が高まっている。
【０００８】
現在、国内外で開発及び販売されている植物病防除用の生物農薬は数十種に達する。しかし、その中で効果が認められたものは、主に、細菌バチルス（Bacillus）とカビであるトリコデルマ（Trichoderma）を用いて製造した製品である（非特許文献７〜１０参照）。バチルス（Bacillus）製品に使用される種としては、バチルス・サブチリス（B．subtilis）、バチルス・プミルス（B．pumilus）、及びバチルス・アミロリケファシエンス（B．amyloliquefaciens）がある。これらの菌株は、ほとんどが抗菌物質であるイツリン（iturin）、サーファクチン（surfactin）などの環状ペプチド（cyclic peptide）を分泌して病菌を直接抑制するメカニズムを有しているか、あるいは寄主の病抵抗性を誘導することが知られている。バチルス（Bacillus sp．）は、内生胞子（endospore）を形成することで、良くない自然環境でも長期間生存できるとともに抗菌力が良好である。このため、多くの研究者は、植物病の生物学的防除のために研究結果を発表している（非特許文献１０参照）。最近では、前述したもののほか、新しい内生細菌のバチルス・メチロトロフィカス（Bacillus methylotrophicus）に関していくつかの研究結果が報告されている。この菌株は、２０１０年に韓国で初めて分離及び命名されたものであり、植物生長促進能を有することが確認されており（非特許文献１参照）、また中国では、高麗人参、トマト、ジャガイモ根圏から分離され、病原菌抑制能および植物生育促進能を有することが報告されている（非特許文献１１〜１３参照）。しかし、これらの研究では、この菌株が、植物病原菌に対する抗菌力のほか、寄主植物の病抵抗性の誘導能や他の病害の抑制能を有するかについては示されていない。稲の根圏微生物の研究は、主に、稲の栽培地域である韓国、中国などの研究者により行われているが、最近、慣行及び無耕耘稲の生育時期別の根圏細菌群集比較に関して研究結果が発表されている。この研究結果によると、プロテオバクテリア（Proteobacteria）に属する細菌の群集は、無耕耘稲においてより多く発見された。また、慣行農業の稲根圏では、相対的にフィルミクテス（Firmicutes）に属する様々な細菌、特にバチルス（Bacillus sp．）種が高い割合で発見された（非特許文献１４参照）。また、稲の根圏から、病原菌であるいもち病菌又はばか苗病菌の生長を抑制する複数種のバチルス（Bacillus sp．）、パエニバチルス（Paenibacillus sp．）、及びシュードモナス（Pseudomonas sp．）種が分離されたことが報告されている（非特許文献１５参照）。稲の根圏に住むいくつかの細菌種の多様性に関して研究がなされているが、本発明のように、稲に特徴的に作用し、かつ様々な機能を有する新規細菌に関する研究は全くない。この他にも、特殊な環境で分離されたバチルス（Bacillus sp．）種について多くの研究が行われたが、実際に商品化されて植物病の防除に効果的に使用されているのは数種に過ぎない（非特許文献１６及び１７参照）。これは、拮抗細菌を分離する際に、単に病原菌を抑制することのみをメカニズムとしているため、比較的防除効果が低いことが原因の一つであると考えられる。したがって、この菌株の特性を生かした上で、より効率のいい防除を行うためには、抗菌活性、寄主植物の病抵抗性誘導能及び生育促進効果をすべて有すること��植物を強化できる新規な多機能微生物の探索及び開発が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Madhaiyan, Ｍ., Poongguzhali, S., Kwon, S. W., and Sa, T. M.（２０１０）.Bacillus methylotrophicus sp. Nov., a methanol−utilizing, plant−growth−promoting bacterium isolated from rice rhizosphere soil. Int J Syst Evol Microbiol 60:2490−2495.
【非特許文献２】Chert, C., Bauske, E. M., Musson, G., Rodriguez−Kabana, R., and Kloepper, J. W.（1995）. Biological control of Fusarium wilt of cotton by use of endophytic bacteria. Biol Cont 5:10−16.
【非特許文献３】Costa, J. M., and Loper, J. E.（1994）. Characterization of siderophore production by the biological control agent Enterobacter cloacae. Mol. Plant−Microbe Interact. 7:440−448.
【非特許文献４】Wakelin, S. A., Warren, R. A., Harvey, P. R., Ryder, M. H.（2004）. Phosphate solubilization by Penicilliumsp. Closely associated with wheat roots. Biology and Fertility of Soils 40:36−43.
【非特許文献５】Rosenblueth, M., and Martinez−Romero, E.（2006）. Bacterial endophytes and their interactions with hosts. Molecular Plant−Microbe Interactions 19:827−837.
【非特許文献６】de Matos Nogueira, E., Vinagre, F., Masuda, H. P., Vargas, C., de P, V. L. M., da Silva, F. R, dos Santos, R. V., Baldani, J. Ｉ., Gomes Ferreira, P. C., and Hemerley.（2001）. Expression of sugarcane genes induced by ｉ noculation with Gluconacetobacter diazotrophicus and Herbaspirillum rubrisubalbicans. Genet. Mol. Biol. 24:199−206.
【非特許文献７】Bibi, F., Yasir, M., Song, G.C., Lee, S.Y., and Chung, Y.R.（2012）. Diversity and characterization of endophytic bacteria associated with tidal flat plants and their antagonistic effects on oomycetous plant pathogens. Plant Pathol J 28:20−31.
【非特許文献８】Cao, C., Park, S., and McSpadden, G.（2010）. Biopesticide controls of plant diseases:resources and products for organic farmenrs in Ohio. Fact Sheet, Agricultural and Natural Resources. SAG−18−10 The Ohio State University.
【非特許文献９】Lee, S. K., Sohn, H. B., Kim, G. G., and Chung, Y. R.（2006）. Enhancement of biological control of Botrytis cinerea on cucumber by foliar sprays and bedpotting mixes of Trichoderma harzianum YC459 and its application on tomat in the greenhouse. Plant Pathol J 22:283−288.
【非特許文献１０】パク・キョンソク（２０１１）「微生物農薬の開発現状とバチルス微生物の重要性」工業化学展望 １４（４）：１−１１.
【非特許文献１１】Kim,B.K.,Chung,J.H.,Kim,S.Y.,Jeong,H.,Kang,S.G.,Kwon,S.K.,Lee,C.H.,Song,J.Y.,Yu,D.S.,Ryu,C.M.,and Kim,J.F.（2012）. Genome sequence of the leaf−colonizing bacterium Bacillus sp strain 5B6, isolated from a cherry tree. J Bacteriol 194:3758−3759.
【非特許文献１２】Ma, L., Cao, Y. H., Cheng, M. H., Huang, Y., Mo, M. H., Wang, Y., Yang, J. Z., and Yang, F. X.（2013）. Phylogenetic diversity of bacterial endophytes of Panax notoginseng with antagonistic characteristics towards pathogens of root−rot disease complex. Ant van Leeuwen 103:299−312.
【非特許文献１３】Yan,X.,He,L.,Song,G.,and Wang,R.（2011）. Antagonistic bioactivity of endophytic strains isolated from Salvia mitiorrhiza. Afr J Biotech 10:15117−15122.
【非特許文献１４】Aslam,Z.,Yasir,M.,Yoon,H. S.,Jeon,C.O.,and Chung,Y.（2013）. Diversity of the bacterial community in the rice rhizosphere managed under conventional and no−tillage practices. J Microbiol 51:747−756.
【非特許文献１５】Yang,J.H.,Liu,H.X.,Zhu,G.M.,Pan,Y.L.,Xu,L.P.,and Guo,J.H.（2008）. Diversity analysis of antagonists from rice−associated bacteria and their application in biocontrol of rice diseases. J Appl Microbiol 104:91−104.
【非特許文献１６】Gatson,J.W.,Benz,B.F.,Chandrasekaran,C.,Satomi,M.,Venkateswaran,K.,and Hart,M.E.（2006）. Bacillus tequilensis sp. Nov., isolated from a 2000−year−old Mexican shaft−tomb, is closely related to Bacillus subtilis. Int J Syst Evol Microbiol 56:1475−1484.
【非特許文献１７】Sumpavapol,P.,Tongyonk,L.,Tanasupawat,S.,Chokesajjawatee,N.,Luxananil,P.,and Visessanguan,W.（2010）. Bacillus siamensia sp. Nov., isolated from salted crab（poo−khem）in Thailand. Int J Syst Evol Microbiol 60:2364−2370.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明は、前述の欠点を補完できる方法により、植物病原真菌及び細菌の生育を広範囲に抑制できるとともに、寄主植物である稲に特異的に作用して、病抵抗性誘導及び植物生育促進効果をすべて有する新規多機能植物内生細菌を分離及び大量培養して製剤化することにより、微生物肥料としての効能、植物強化能及び植物保護能をすべて有する新しい微生物製剤を開発して提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決すべく、本発明は、新規微生物バチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）または該バチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）と７０％以上のＤＮＡ−ＤＮＡ関連性値（DNA−DNA relatedness value）を有するバチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）を提供する。
【００１２】
また、前記バチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）は、配列番号１または配列番号２と記載される塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡを含むことを特徴とするバチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）を提供する。
【００１３】
さらに、前記バチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）は、バチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）ＹＣ７００７（受託番号：ＫＣＣＭ１１２７５Ｐ）又はバチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）ＹＣ７０１０（受託番号：ＫＡＣＣ １８２２８）であることを特徴とするバチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）を提供する。
【００１４】
また、前記バチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）は、植物病抵抗性誘導能を有することを特徴とするバチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）を提供する。
【００１５】
また、前記植物病は、イネもみ枯細菌病、イネ白葉枯病、イネ穂枯病及びイネばか苗病からなる群より選択される１種以上であることを特徴とするバチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）を提供する。
【００１６】
また、前記バチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）は、植物病原菌抑制能、植物生育促進能及び植物強化能をさらに有することを特徴とするバチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）を提供する。
【００１７】
また、前記植物生育促進能は、稲に対する植物生育促進能であることを特徴とするバチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）を提供する。
【００１８】
また、前記微生物、その培養液または培養ろ液を有効成分として含有する肥料用、植物保護用、及び植物強化用の微生物製剤を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によると、作物の重要な植物病原真菌および細菌の生長を同時に抑制でき、寄主植物の病抵抗性誘導及び生育促進効果をすべて有する多機能細菌バチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）を用いて、抗生物質、生育促進及び奇主の全身性病抵抗性誘導物質を分泌して植物病原菌を直接抑制するだけでなく、稲に特異的に作用し、生育促進、全身性病抵抗性誘導能をすべて有する多機能細菌を含有する製剤であって、これまで報告されているいかなる細菌よりも、天然の植物保護剤、植物強化剤および微生物肥料としての役割を同時に行うことができる優れた微生物製剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＹＣ７００７菌株（ａ）及びＹＣ７０１０菌株（ｂ）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図２】図２は、ＹＣ７００７菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列解析により作成した系統樹である。
【図３】図３は、ＹＣ７００７菌株の遺伝子解析（ＢＯＸ−ＰＣＲ）を用いて類似菌株との比較分析を行った結果を示す写真である。
【図４】図４は、イネもみ枯細菌病の防除効果を説明するための処理区別の比較写真である。
【図５】図５は、イネ白葉枯病の防除効果を説明するための処理区別の比較写真である。
【図６】図６は、ＹＣ７００７菌株の培養ろ液の培養期間による抗菌効果を示すグラフ（ａ）及び写真（ｂ）である。
【図７】図７は、ＹＣ７００７菌株の培養ろ液の処理温度による抗菌効果を示すグラフである。
【図８】図８は、ＹＣ７００７菌株の培養ろ液による主な種子由来の細菌病原菌の成長抑制能を示すグラフである。
【図９】図９は、ＹＣ７００７菌株に対して、イネ白葉枯病（bacterial blight）及び穂枯病（panicle blight）に対する全身抵抗性誘導活性を調べた結果を示す写真（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。以下で使用される用語や単語は、通常的又は辞書的な意味に限定して解釈してはならず、本発明の技術的思想に符合する意味と概念として解釈しなければならない。従って、本明細書に記載された実施例の構成は、本発明の好ましい一実施例に過ぎず、本発明の技術的思想をすべて代弁するのではないので、本出願時点においてこれらの実施例を代替できる多様な均等物と変形例があり得ることを理解しなければならない。
【００２２】
本発明者らは、植物病原真菌および細菌の生育を広範囲に抑制するとともに、寄主植物である稲に特異的に作用し、病抵抗性誘導及び植物生育促進の効果をすべて有する多機能植物内生細菌を分離及び大量培養して製剤化することにより、微生物肥料としての効果も有する新型の生物農薬として用いることができる新菌株を発見した。
【００２３】
つまり、水田から分離された細菌を探索した結果、新たな種の細菌が前記効能をすべて備えていることを確認した。これに対して、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の決定及び分析と、ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性実験などを行った結果、バチルス属（Bacillus sp．）に属する新種微生物に同定され、「バチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）ＹＣ７００７」と名づけた。
【００２４】
本発明において、新種微生物は、バチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）だけでなく、Ｇｏｒｉｓらの論文（Goris, J., Konstantinidis, K. T., Klappenbach, J. A., Coenye, T., Vandamme, P., and Tiedje, JM.（2007）．DNA−DNA hybridization values and their relationship to whole−genome sequence similarities．Int J Syst Evol Microbiol57:81−91）に基づいてＤＮＡ−ＤＮＡ交雑（hybridization）を行った場合に、７０％以上のＤＮＡ−ＤＮＡ関連性値（relatedness value）を示す微生物も、本発明のバチルスオリジコラに含まれるものと解釈されるべきである。すなわち、Ｇｏｒｉｓらの論文に基づいてＤＮＡ−ＤＮＡ混成化を行った場合に７０％以上のＤＮＡ−ＤＮＡ関連性値を示す微生物は、本発明のバチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）と同一の微生物として扱うことができる。
【００２５】
本発明の好ましい具体例によると、前記バチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）は、配列番号１または配列番号２と記載される塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡを含むことができる。また、前記バチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）は、バチルスオリジコラＹＣ７００７（受託番号：ＫＣＣＭ１１２７５Ｐ）またはバチルスオリジコラＹＣ７０１０（受託番号：ＫＡＣＣ１８２２８）であってもよい。
【００２６】
以下では、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。本実施例では、ＹＣ７００７菌株に関する実験を中心とした実施例１と、ＹＣ７０１０菌株に関する実験を中心とした実施例２とに分けて説明する。
【００２７】
実施例１
ＹＣ７００７菌株の分離及び同定
（１）ＹＣ７００７菌株の分離
ＹＣ７００７菌株は、晋州市所在の慶尚大学（Gyeongsang National University）の試験圃場の水田土壌で育った稲の根の内部組織から分離した。まず、植物内生細菌を分離するために、根の切断片の表面を１％次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）溶液に１０分間浸漬し、表面を殺菌した。これらの切断片を１／１０ＴＳＡ培地（Tryptic Soy Broth ３ｇ、寒天１６ｇ／蒸留水１Ｌ）に載せて２〜３日程度培養しながら、表面で細菌が生長するかどうかを観察し、表面が殺菌されたかを確認した。切断片の表面殺菌が確認された根片を１．０ｇ取り、高圧滅菌器で滅菌された蒸留水９．０ｍＬを入れて殺菌された乳鉢と乳棒により摩砕した。この摩砕した液の０．１ｍＬを取って、殺菌された蒸留水０．９ｍＬに入れて１０倍ずつ希釈（１０−３）し、さらに、順次に１０倍ずつ希釈（１０−４及び１０−５）した。希釈液を１／１０ＴＳＡ培地に３等分して分注した後、均一に塗抹した。この培養器を２８℃で２〜３週間培養し、生育された単一のコロニーを純粋に分離し、これをＹＣ７００７菌株と名づけた。
【００２８】
（２）ＹＣ７００７菌株の同定
前記分離したＹＣ７００７菌株の同定のために、下記のようにして形態学的特性、生理・生化学的特性を調べた。前記分離したＹＣ７００７菌株と類似の標準菌株（type species）を対象として、形態学的特性は走査電子顕微鏡により、生理・生化学的特性は本発明者が開発した分析方法及び通常の分析法により調べた（非特許文献７参照）。
【００２９】
分離したＹＣ７００７菌株はグラム（Gram）陽性であり、運動性がある。細胞は、棒状（幅０．６μｍ、長さ１．８〜２．６μｍ）で、内生胞子を形成しており、嫌気性条件では生長が不可能であった。この菌株と類似した種との生理・生化学的特性を調べた結果を下記表１に示す。ＤＮＡ−ＤＮＡ関連性値は、下記表２に示す。表１で使用された全ての菌株に関する結果は、前述の分析方法による調査結果である。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
表１を参照すると、ＹＣ７００７菌株の生理・生化学的特性を、他の類似バチルス（Bacillus）種と比較した結果、ＹＣ７００７菌株は、ｐＨ４．５とｐＨ１２での生長、１４％塩溶液での生長、６０℃での生長、ゼラチンの分解、カルボキシメチルセルロースの非分解、ＡＰＩ ｋｉｔ試験におけるアルブチン、Ｄ−ラクトース、澱粉、グリコーゲン、ゲンチオビオースの分解、ナフトール−ＡＳ−ＢＩ−ホスホヒドロラーゼ、ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ酵素などの重要な表現型的特性において近縁種と異なることを確認できる。
【００３２】
一方、ＹＣ７００７菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（１５１３ｂｐ、図１参照）を決定し、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのデータベースと相同性検索を行い、系統学的位置を検討した。図２では、ＹＣ７００７菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列解析で作成した系統樹を示している。図２中の交点の数字は、反復１，０００回におけるブートストラップ値（bootstrap value）を示す。
【００３３】
ＹＣ７００７菌株と近縁種との相違を明確にするために、ＤＮＡ−ＤＮＡ交雑を調べた。その結果を下記表２に示す。実験方法は、ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Roche Applied Science）を用いて、Ｌｅｅらの論文（Lee, S. H., Shim, J. K., Kim, J. M., Choi, H. K. and Jeon, C. O.（2011）．Henriciella litoralis sp. Nov., isolated from a tidal flat, transfer of Maribaculum marinum Lai et al., 2009 to the genus Henriciella as Henriciella aquimarina nom. Nov．and emended description of the genus Henriciella．Int J Syst Evol Microbiol 61:722−727）を参考とした。抽出した誘電体ＤＮＡ（genomic DNA）をそれぞれ異なる濃度に希釈した後、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液を加え、８０℃の熱を加えて変性させる。その後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロン膜（Amersham Pharmacia Biotech）に３反復で付着する。制限酵素ＨａｅＩＩＩを処理して得られた個々のＤＮＡ片は、菌株間の交差交雑（hybridization）のための標識されたＤＮＡプローブ（Labelled DNA probe）として用いられた。また、混成化及び洗浄（washing）温度は、指示マニュアルに従った。ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ＤＩＧ）−ｄＵＴＰと混成体（hybrids）で標識されたランダム初回ＤＮＡ（labelled random primed DNA）は、ＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ（Roche Applied Science）を使用した酵素免疫分析（enzyme immunoassay）により、ナイロン膜（nylon membrane）に検知された。交雑信号（hybridization signals）は、スキャナー（ＨＰ Ｓｃａｎｊｅｔ ３７７０）及びアドビフォトショップ（登録商標）（ｖ．７．０）を用いて確認及び分析した。標的ＤＮＡ（Target DNA）とプローブ（Probe）の交雑信号を１００％とした。菌株間のＤＮＡ−ＤＮＡ関連性（relatedness）値は、希釈による自己交雑（self−hybridization）の信号の強度により算出した。その結果、ＹＣ７００７菌株は、ＹＣ７０１０菌株とは関連性値が９１．５％であったが、他のバチルス・アミロリケファシエンス（B．amyloliquefaciens）、バチルス・メチロトロフィカス（B．methylotrophicus）、バチルス・シアメンシス（B．siamensis）、バチルス・サブチリス（B．subtilis）、バチルス・テクィレンシス（B．tequilensis）とは関連性値が５０．４％以下であり、これらの種とは異なる種であることが確認された。類似種とのＤＮＡ−ＤＮＡ関連性値が７０％以上である場合のみに同一種として認められ、この値よりも低い場合は、異なる種として認められる（Goris, J., Konstantinidis, K. T., Klappenbach, J．A., Coenye, T., Vandamme, P., and Tiedje, J M.（2007）．DNA−DNA hybridization values and their relationship to whole−genome sequence similarities．Int J Syst Evol Microbiol57:81−91）。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
ＹＣ７００７菌株と近縁種との脂肪酸分析を行い、その結果を下記表３に示す。表３から分かるように、ＹＣ７００７菌株は、近縁種と全体的なパターンが類似するが、Ｃ１６：１ω７ｃ ａｌｃｏｈｏｌ、Ｃ１６：１ω１１ｃが発見されず、他の脂肪酸の量において若干の差異があった。
【００３６】
【表３】
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【００３７】
図３では、ＹＣ７００７菌株の遺伝子解析（ＢＯＸ−ＰＣＲ）を用いて、近縁種との遺伝子比較分析を行った結果を示している。遺伝子解析（ＢＯＸ−ＰＣＲ）のために、ポリメラーゼ（polymerase）としては、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Invitrogen）を用い、プライマー（primer）としては、ＢＯＸＡＲ１（５'−ＣＡＴＣＧＧＣＡＡＧＧＣＧＡＣＧＣＴＧＡＣＧ−３'）を用いた。ＰＣＲの条件は、初期変性（initial denaturation）を９５℃で７分間、変性（denaturation）、アニーリング（annealing）、伸長（extension）を、それぞれ９０℃で３０秒間、４０℃で１分間、７２℃で３分間で３５サイクルとし、最後の伸長（final extension）を７２℃で１０分間反応して増幅させた。この過程を経て得られたＰＣＲ産物に対して、１％ＬＥ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ（Seakem）を用いて増幅有無を確認した。図３中、Ｍは１ｋｂマーカー（marker）、１はＹＣ７００７菌株、２はバチルス・メチロトロフィカス（Bacillus methylotrophicus）ＫＡＣＣ１３１０５菌株、３はバチルス・シアメンシス（Bacillus siamensis）ＰＤ−Ａ１０Ｔ菌株を示す。
【００３８】
図３に示すように、ＹＣ７００７菌株と学名が同じ標準菌株とより詳細に比較するために遺伝子解析（ＢＯＸ−ＰＣＲ）を行った結果、ＹＣ７００７菌株は近縁種の菌株とは異なるものと判明した。
【００３９】
したがって、本発明の微生物は、前記で得られた生理・生化学的、分子生物学的な結果から、新たな菌株であることが確認され、その名称をバチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）ＹＣ７００７菌株と名づけた。また、２０１２年４月１８日に韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ：Korean Culture Center of Microorganisms）からＫＣＣＭ１１２７５Ｐの受託番号を与えられている。
【００４０】
新規バチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）の分類学的な特徴は、次の通りである。
【００４１】
グラム陽性菌で、内生胞子を形成できる好気性、桿菌（０．６〜１．０×２．５〜２．８μｍ）であり、細胞は、単独または対をなしている。１／１０ＴＳＡ培地に２４時間培養したとき、菌叢は、クリーミーな白色（creamy white）で、中央が凸（convex）となっており、正常なエッジ（regular edge）の形態を有する。温度２０〜６０℃、ｐＨ４．５〜１２、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度０〜１３％で生長する。抗生物質抵抗性をテストしたところ、３０μｇ／ｍＬ濃度のクロラムフェニコール（chloramphenicol）に抵抗性を有していたが、１０μｇ／ｍＬのアンピシリン（ampicillin）、ゲンタマイシン（gentamicin）、ペニシリン（penicillin）、及び３０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（tetracyclin）、ストレプトマイシン（streptomycin）、バンコマイシン（vancomycin）、カナマイシン（kanamycin）には、抵抗性を有していなかった。主な脂肪酸は、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０とｉｓｏ−Ｃ１５：０であった。
【００４２】
ＹＣ７００７菌株の病原真菌及び細菌に対する培養器内の抑制能の検定
ＹＣ７００７菌株を含む分離内生細菌１０種に対して、病原真菌及び細菌の抑制能を検定するために、下記のようにして抗菌活性を調べた。
【００４３】
内生細菌ＹＣ７００７の抗菌活性は、重要な４種の植物病原真菌〔Gibberella fujikuroi（イネばか苗病）、Pythium ultimum（立枯病）、Bipolaris oryzae（イネごま葉枯病菌）、Magnaporthe grisea（イネいもち病）〕、及び３種の病原細菌〔Burkholderia glumae（イネもみ枯細菌病）、Xanthomonas oryzae pv．oryzae、Xanthomonas oryzae pv．oryzae（イネ白葉枯病）〕に対して、生物検定法（confrontation bioassay）で生長抑制を調査することにより確認した。
【００４４】
上記の病原真菌とＹＣ７００７菌株は、ジャガイモ寒天砂糖培地（ＰＤＢ、Ｄｉｆｃｏ）５ｇを含む生育培地（寒天１６ｇ／蒸留水１Ｌ）１／５ＰＤＡと１／１０ＴＳＡにて平板ディスク測定法（paper disc method）を用いて生長抑制効果を調べた。ペーパーディスク（直径５ｍｍ）を培養器の縁部から１ｃｍ同じ距離に置いて、菌株培養液１００μＬをペーパーディスクに十分染み込ませた。その中央にＰＤＡ培地で４日間育った病原真菌菌糸ディスク（６ｍｍ）を置き、病菌によって２４〜２８℃で４〜６日間培養した。
【００４５】
病原細菌の抑制は、２８℃で一晩培養した病原細菌を殺菌蒸留水に懸濁し（Ｏ．Ｄ６００＝０．１）、懸濁液０．１ｍＬを培地に塗抹後、ＹＣ７００７菌株の病菌生長の抑制程度を測定することにより調べた。ＹＣ７００７菌株が生産する培養ろ液の病菌抑制効果は、菌株を、寒天を除いた培養液体培地で２８℃、７２時間まで振とう培養（１２０ｒｐｍ）し、培養液を遠心分離後、ミリポアフィルター（millipore filter）でろ過したろ液を用いて確認した。培養ろ液の温度への反応を調べるために、各々の処理温度に保持される温水に１０分間処理後、抑制効果を調べた。
【００４６】
下記表４に、ＹＣ７００７菌株の、主要な植物病原真菌及び主要な植物病原細菌に対する抗菌活性を調べた結果を示す。
【００４７】
【表４】
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【００４８】
表４を参照すると、内生細菌ＹＣ７００７菌株の植物病原真菌に対する抗菌活性は、培地によって若干異なるが、３〜１０ｍｍの菌糸生長抑制効果を示すことを確認できる。
【００４９】
また、下記表５から、内生細菌ＹＣ７００７菌株の植物病原細菌に対する抗菌活性は、１／１０ＴＳＡにおいて、培養液は４〜１０ｍｍ、培養ろ液は３〜８ｍｍの生長抑制効果を示すことを確認できる。
【００５０】
【表５】
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【００５１】
これらの結果から、現在までに知られているいかなる拮抗細菌よりも、より広範な病原菌抑制効果を有することが分かる。
【００５２】
ＹＣ７００７菌株の病原真菌に対するポート実験防除能の検定
前記実施例２による実験室の培養器内の試験の抑制効果に基づいて、ＹＣ７００７菌株の７種の主要な植物病に対する防除効果を、下記のように直接植物に処理して調べた。防除能の検定は、韓国化学研究院に依頼して実施した。対象となる植物病は、イネいもち病、イネ紋枯病、トマト灰色かび病、トマト疫病（病原菌：Phytophthora infestans）、コムギ赤さび病（病原菌：Puccinia recondita）、ムギうどんこ病（病原菌：Blumeria graminis f．sp．hordei）、及びトウガラシ炭疽病（病原菌：Colletotrichum coccodes）であった。
【００５３】
薬剤処理は、ＹＣ７００７菌株懸濁液を接種１日前に植物病ごとに植物２ポートずつを回転円板の上に置いて回転させながら、噴霧銃（１ｋｇ／ｃｍ２）により植物体全体に万遍なく十分に付着するように散布することで行った。ＹＣ７００７菌株懸濁液の灌注処理による病抵抗性誘導効果の調査は、菌株を病原菌接種７日前に各寄主植物３ポート当たり５ｍＬずつ灌注し、温室で１週間栽培した後、病害の発生程度を調べることにより行った。菌株懸濁液は、１／１０ＴＳＢ培地で２８℃で一晩振とう培養した後、遠心分離し、細菌細胞を１０ｍＭ ＭｇＳＯ４溶液に懸濁させ、２×１０６ｃｆｕ／ｍＬの濃度に調節して使用した。病原菌の接種及び発病の調査は、菌株を処理した植物に７種の病原菌の胞子及び菌体を、各々の寄主植物に接種することにより行った。各々の植物病に対する具体的な実験方法は、次の通りである。
【００５４】
イネいもち病（ＲＣＢ）では、病原菌であるマグナポルテ・グリセア（M．grisea）ＫＪ２０１菌株を、米ぬか寒天培地に接種し、２５℃培養器で２週間培養して形成した胞子を殺菌蒸留水で収穫し、一定濃度の胞子懸濁液（３×１０５ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬ）を準備した。これを、薬剤処理した洛東（Nakdong）稲（本葉３〜４葉期）に、流れ落ちる程度に十分噴霧した。接種された稲は、湿室で暗状態で２４時間培養した後、相対湿度８０％以上、温度２６℃の恒温恒湿室で４日間発病させ、病斑面積率を調べた。
【００５５】
イネ紋枯病（ＲＳＢ）では、適当量のふすまを１Ｌ培養瓶に入れて滅菌した後、病原菌であるリゾクトニア・ソラニ（R．solani）ＡＧ１菌株を接種し、２５℃培養器で７日間培養した。病の接種は、培養された菌糸塊を適当に細かく摩砕し、薬剤処理された４〜５葉期の洛東稲が育ったポートに均一に接種した。その後、湿室（２５℃）で７日間培養して発病させた後、葉鞘（sheath）に形成された病斑面積率を調べた。
【００５６】
トマト灰色かび病（ＴＧＭ）では、病原菌であるボトリチス・シネレア（B．cinerea）をジャガイモ寒天培地に接種し、２５℃恒温器で培養して形成した胞子を接種原として用いた。病の接種は、胞子を収穫し、血球計を用いて胞子濃度を３×１０５胞子／ｍＬにした後、薬剤処理されたトマト幼苗（２〜３葉期）に噴霧接種した。接種されたトマト幼苗は、２０℃湿室（相対湿度９５％以上）に入れて３日間発病を誘導した後、病斑面積率を調べた。
【００５７】
トマト疫病（ＴＬＢ）では、病原菌であるフィトフトラ・インフェスタンス（P．infestans）菌株をオートミール培地に接種し、２０℃培養器で培養して遊走子嚢を形成した。病原菌の接種は、形成された遊走子嚢を殺菌蒸留水を添加して収穫し、胞子濃度が３×１０４胞子嚢／ｍＬの胞子懸濁液を作成した。これらを冷蔵庫に入れて低温処理することで遊走子を流出させ、遊走子懸濁液を準備した。これを薬剤処理されたトマト幼苗（２〜３葉期）に噴霧接種した。病原菌を接種したトマト幼苗は、２０℃湿室で２日間湿室処理し、恒温恒湿室で発病させ、接種３日後の葉に発生した病斑面積率を調べた。
【００５８】
コムギ赤さび病（ＷＬＲ）では、病原菌であるプッシニア・レコンジタ（P．recondita）は、活物寄生菌であるため、実験室で植物体に直接継代培養しながら小麦幼苗に形成された夏胞子を接種原として用いた。菌株の薬効を調べるために、使い捨てのポート（直径：４．５ｃｍ）に小麦種子（品種：銀波（Eunpa））を５粒ずつ播種した。温室で８日間栽培した１葉期の幼苗に薬剤を処理し、１日後に接種原（胞子０．１１ｇ／Ｌ）を噴霧接種した。接種された小麦幼苗は、２０℃の湿室で１日間湿室処理した後、相対湿度が７０％である２０℃の恒温恒湿室に移して発病を誘導し、接種７日後に病斑面積率を調べた。
【００５９】
ムギうどんこ病（ＢＰＭ）では、病原菌であるブルメリア・グラミニス（B．graminis f．sp．hordei）が活物寄生菌であるため、実験室で麦幼苗で継代培養しながら麦に形成された胞子を接種原として用いた。薬効の調査は、使い捨てのポート（直径：４．５ｃｍ）に麦種子（品種：ドンボリ（Dongbori））を５粒ずつ播種し、温室で８日間栽培した１葉期の幼苗に薬剤を散布し、温室で風乾した後、薬剤処理された麦にうどんこ病の胞子を叩いて接種した。接種された麦幼苗は、２０〜２３℃、相対湿度６０％程度の恒温恒湿室に置いて７日間発病させた後、病斑面積率を調べた。
【００６０】
トウガラシ炭疽病（ＲＰＡ）では、病原菌であるコレトトリクム・ココデス（C．coccodes）をオートミール培地に接種し、２５℃で１０日間培養して形成した胞子を収穫し、胞子濃度をｍＬあたりに２×１０５ｓｐｏｒｅｓとなるように調整し、胞子懸濁液を準備した。この胞子懸濁液を薬剤処理された唐辛子の幼苗（３〜４葉期）に噴霧接種した。これを湿室（２５℃）に入れて２日間湿室処理した後、恒温恒湿室（２５℃、７５％ＲＨ）で発病させた。接種３日後、唐辛子の葉に形成された病斑面積率を調べた。
【００６１】
防除価は、病気の調査により得られた病斑面積率から下記の式１に基づいて算出した。
【００６２】
【数１】
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【００６３】
下記表６に、ＹＣ７００７菌株に対して、主要な植物病の防除効果を調べた結果を示す。
【００６４】
【表６】
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【００６５】
表６を参照すると、７種の主要な植物病のうち、イネいもち病、コムギ赤さび病、ムギうどんこ病、及びトウガラシ炭疽病の場合は、７０〜８３％程度の防除価を示しているが、イネ紋枯病、トマト灰色カビ病及びトマト疫病の場合は、３６％以下の低い防除価を示している。特に、土壌に灌注した後の病抵抗性誘導による防除効果は、稲の場合にのみ３５％と示された。これらのことから、ＹＣ７００７菌株は、稲に対する寄主特異性を有していることが分かった。
【００６６】
ＹＣ７００７菌株の病抵抗性誘導によるイネもみ枯細菌病の防除能の検定
ＹＣ７００７菌株の病抵抗性誘導によるイネもみ枯細菌病の防除能を検定するために、下記のようにして防除効果を調べた。
【００６７】
植物育成箱（２８〜３０℃、相対湿度８０％以上）で５週間栽培した稲（品種：ドンジン（Dongjin）１号）の幼苗を滅菌または非滅菌の稲栽培用床土に植え替えた後、すぐに菌株懸濁液（２×１０７ｃｆｕ／ｍＬ）１０ｍＬを床土（１２０ｇ）に分注処理した。ＹＣ７００７菌株の懸濁液は、１／１０ＴＳＢ培地で２８℃で一晩振とう培養した後、遠心分離し、細菌細胞を１０ｍＭ ＭｇＳＯ４溶液に懸濁させ、濃度を適切に調節した。処理５日後にイネもみ枯細菌病菌（B．glumae）懸濁液（５×１０７ｃｆｕ／ｍＬ、ＯＤ６００＝０．１）を接種針につけ、各葉に３回反復で２０個の葉に接種した。病原菌の懸濁液は、Ｒ２Ａ培地で２４時間培養後、遠心分離し、細菌細胞を１０ｍＭ ＭｇＳＯ４溶液に懸濁させ、濃度を適切に調節して使用した。病原菌接種後５日間育成箱に置いた後、病斑の壊死程度を調べた。発病度は０〜３（０：病徴なし、１：小型の壊死斑点、２：いくつかの壊死斑点が集められて大型の褐斑をなす、３：全壊死）に区分した。防除価は、対照区に対する病気の抑制程度を計算して算出した。稲の病抵抗性誘導の対照薬剤としては、ベンゾチアジアゾール（benzothiadiazole（ＢＴＨ）、１ｍＭ溶液）を使用した。
【００６８】
下記表７に、ＹＣ７００７菌株の土壌処理によるイネもみ枯細菌病の防除効果を調べた結果を示す。また、図４に、イネもみ枯細菌病の防除効果を説明する処理区別の比較写真を示す。
【００６９】
【表７】
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【００７０】
表７及び図４から分かるように、ＹＣ７００７菌株懸濁液を土壌に処理した５日後に病菌を接種して防除効果を調べた結果、菌株処理区は葉病斑の長さ２．０ｍｍ、発病度１．１であり、病菌のみを処理した対照区の葉病斑の長さ１７．４ｍｍ、発病度２．４に比べて遥かに少なかった。また、防除価は、５４％であり、対照薬剤であるＢＴＨの５７％と同程度の寄主病抵抗性の誘導効果が確認された。
【００７１】
ＹＣ７００７菌株の病抵抗性誘導によるイネ白葉枯病の防除能の検定
ＹＣ７００７菌株の病抵抗性誘導によるイネ白葉枯病の防除能を検定するために、下記のようにして防除効果を調べた。
【００７２】
植物育成箱（２８〜３０℃、相対湿度８０％以上）で５週間栽培した稲（ドンジン１号）の幼苗を滅菌または非滅菌の稲栽培用床土に植え替えた後、直ちに菌株懸濁液（２×１０７ｃｆｕ／ｍＬ）１０ｍＬを床土（１２０ｇ）に分注処理した。処理５日後にイネ白葉枯病菌（X．oryzae pv．oryzae）懸濁液（１×１０７ｃｆｕ／ｍＬ、ＯＤ６００＝０．１）を接種針につけて、各葉に３回反復で２０個の葉に接種した。イネ白葉枯病菌の懸濁液は、前記イネもみ枯細菌病菌と同様な方法により準備した。病菌接種後５日間育成箱に置いた後、病斑の壊死程度を調べた。発病度は０〜９（０：病徴なし、１：小型の壊死斑点、２〜４：いくつかの壊死斑点が集められて中型の褐斑をなす、５〜８：いくつかの壊死斑点が集められて大型の褐斑をなす、９：全壊死）に区分した。防除価は、対照区に対する病気の抑制程度を計算して算出した。
【００７３】
下記表８に、ＹＣ７００７菌株の土壌処理によるイネ白葉枯病の防除効果を調べた結果を示す。また、図５には、イネ白葉枯病の防除効果を説明する処理区別の比較写真を示す。
【００７４】
【表８】
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【００７５】
表８及び図５を参照すると、ＹＣ７００７菌株の懸濁液を土壌に処理した５日後に病菌を接種して防除効果を調べた結果、病原菌の接種方法、すなわち針接種（pin prick）とクリッピング（clipping）接種によって若干の差異があるが、病原菌のみを処理した葉は発病度がそれぞれ７．４及び５．６７であるのに対し、ＹＣ７００７菌株処理区は２．３及び２．２であり、それぞれ６９％及び６１％（平均６５％）の防除価を示した。このことから、優れた寄主病抵抗性の誘導効果が確認された。
【００７６】
ＹＣ７００７菌株の病抵抗性誘導によるイネばか苗病の防除能の検定
ＹＣ７００７菌株の病抵抗性誘導によるイネばか苗病の防除能を検定するために、下記のようにして防除効果を調べた。
【００７７】
植物育成箱（２８〜３０℃、相対湿度８０％以上）で２週間栽培した稲（ドンジン１号）の幼苗を滅菌または非滅菌の稲栽培用床土に植え替えた後、直ちに菌株懸濁液（１０５〜１０７ｃｆｕ／ｍＬ）１５ｍＬを床土（１５０ｇ）に分注処理した。処理３日後にイネばか苗病菌（G．fujikuroｉ）（５×１０５ｃｆｕ／ｇ）を３反復で、反復あたり１０個ずつの幼苗に１．５ｇ／ｐｏｔずつ接種した。接種後１０〜３０日間育成箱に置いた後、病害の発生程度を調べた。発病度は、０〜５（０：病徴なし、１：葉の若干の黄化及び茎の矮化、２〜３：葉の黄化及び茎の伸び、５：全壊死）に区分した。防除価は、対照区に対する病気の抑制程度を計算して算出した。
【００７８】
下記表９に、ＹＣ７００７菌株の土壌処理によるイネばか苗病の防除効果を調べた結果を示す。
【００７９】
【表９】
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【００８０】
表９を参照すると、ＹＣ７００７菌株の懸濁液を土壌に処理した３日後に病菌を接種して防除効果を調べた結果、病原菌のみを処理したところでは、発病度が３．４であるのに対し、菌株処理区では１．４であり、５８．８％の防除価を示した。このことから、優れた寄主病抵抗性の誘導効果が確認された。
【００８１】
ＹＣ７００７菌株処理による稲の生育促進能の検定
ＹＣ７００７菌株処理による稲の生育促進能を検定するために、下記のようにして植物生育促進能を調べた。
【００８２】
稲栽培用床土１ｋｇを菌株懸濁液（２×１０７ｃｆｕ／ｍＬ）２００ｍＬと均一に混合した後、発芽した稲種子を播種した。播種後、植物育成箱（２８〜３０℃、相対湿度８０％以上）で栽培しながら、１０日（幼苗期）、３０日（分蘖期）、７５日（出穂期）後において、それぞれ茎と根の生長程度を調べた。対照区は、同量の１０ｍＭ ＭｇＳＯ４緩衝溶液のみで混合した土壌を使用した。接種３０日後の分蘖期に、細菌密度を維持するために、ＹＣ７００７菌株の懸濁液５ｍＬを稲の根のところの土壌に再び灌注処理した。各処理は３反復であり、反復あたり１０株の植物を使用した。
【００８３】
下記表１０にＹＣ７００７菌株の稲の生育促進能を調べた結果を示す。
【００８４】
【表１０】
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【００８５】
表１０を参照すると、ＹＣ７００７菌株を稲栽培用床土に処理し、ポートに栽培しながら生育期ごとに生長促進効果を調べた結果、ＹＣ７００７菌株処理区は、幼苗期において茎と根の長さが１９．３ｃｍ及び７．７ｃｍであり、無処理区の１１．７ｃｍ及び２．７ｃｍに比べて遥かに長かった。また、分蘖期においても、茎の長さが２７．４％増加し、分蘖された数も５２％程度多かった。出穂期においても、ＹＣ７００７菌株の処理区は、茎の長さが１０．８％増加し、分蘖された数も３２％程度多いことが示された。このことから、ＹＣ７００７菌株処理による稲の生育促進能が確認された。
【００８６】
病原菌抑制抗菌物質の生産及び効果の調査
ＹＣ７００７菌株による病原菌の抑制が抗菌物質の生産によるものであるかを確認するために、１／１０ＴＳＢ液体培地における抗菌物質の生産有無を調べた。抗菌物質の抑制効果の程度は、前述したディスク拡散法（disc diffusion method）を行い、ペーパーディスクの周囲に形成されたカビの菌糸又は細菌細胞の生長抑制距離を測定することにより確認した。ＹＣ７００７菌株を液体培地で２８℃で７２時間振とう（１８０ｒｐｍ）培養し、９０００ｇで１０分間遠心分離した。その後、培養ろ液をミリポアフィルター（millipore filter、０．２μｍ）で濾過した後、培養時間別に抗菌活性を測定した。
【００８７】
図６は、ＹＣ７００７菌株の培養ろ液の培養期間別の抗菌効果を示すグラフ（ａ）及び写真（ｂ）である。図７は、ＹＣ７００７菌株の培養ろ液の処理温度別の抗菌効果を示すグラフである。
【００８８】
まず、図６を参照すると、ＹＣ７００７菌株の培養ろ液の培養期間別の抗菌効果は、イネ病原細菌（B．glume、X．oryzae）及びばか苗病（G．fujikuroi）に対しては、菌株の培養時間が増加するほど抑制効果が増加し、６０時間培養ろ液で最も良好であったが、７２時間培養ろ液では急速に効果が減少した。
【００８９】
また、図７を参照すると、培養ろ液の熱に対する安定性を調べた結果、９０℃処理時までは抗菌活性が維持されたが、１００℃を超えると抑制効果がやや減少することが分かった。この結果から、ＹＣ７００７菌株により生産される抗菌物質は、相対的に熱に安定した物質であるといえる。
【００９０】
ＹＣ７００７菌株の製剤化
ＹＣ７００７菌株の活性及び保管中の密度維持のために、下記のようにして粉末と液剤の形態に製剤化した。
【００９１】
菌株を大型醗酵器（１トン以上）で培養して得られた細菌の培養液、または遠心分離後に得られた菌体を、カオリン（kaolin）、ベントナイト（bentonite）、泥炭（peat）などの粘土鉱物と１：１００で混合し、低温で乾燥した。その後、均一に粉砕して粉末状の固相剤として製造した。同時に菌培養体を前記粘土鉱物と１：１００で混合し、液剤懸濁液のタイプでも製造した。
【００９２】
前記のようにして製剤化した試料の密度を調べた結果、ほとんどの製剤において１０８ｃｆｕ／ｇ以上を含んでおり、粘土鉱物と混合して製剤化した液剤懸濁液も１０８ｃｆｕ／ｍＬ以上の密度を含有することが確認された。
【００９３】
実施例２
米は、世界人口の半分以上の主食であり、２０１３年には約７．４５億トンが生産されたものと推定される。アジアで最も多く生産されているが、主な阻害要因である病害により毎年２４〜４１％の損失が発生する（Annonymous 2014．Rice market monitor．In:Monthly report、Food and Agriculture Organization of the United Nations, vol．17, iss．1, pp1−4（http://www.Fao.org/3/a-13735e.pdf）;Savary,  S., Willocquet, L., Elazegui, F. A., Castilla, N. P．and Teng, P．S．2000．rice pest constrainsts in tropical Asia:Quantification of yield losses due to rice pests in a range of production situations．Plant Dis．84:357−369．）。稲において、カビ、バクテリア、ウイルス及び線虫類（nematodes）による病害が７０種以上記録されている。特に、いもち病（rice blast）、細菌性葉枯病（bacterial leaf blight）、イネもみ枯細菌病（grain rot）及びイネばか苗病（bakanae）は、収穫量を減少させる最も深刻な種子伝染病である（Ou, S．H．1985．Rice disease．2nd ed．Commonwealth Mycol．Inst., 361pp．Key, England．）。ザントモナス・オリゼ（Xanthomonas oryzae pv．oryzae）による白葉枯病（bacterial blight）は、状況によって全米生産量の１０〜５０％を減少させ、大きな影響を与えている（Mew, T．W．1992．Foliar disease，bacterial blight．In:Compendium of Rice Diseases，eds．By R．K．Webster and P．S．Gunnell，pp.10-11．）。バークホルデリア・グルメ（Burkholderia glumae）による苗立枯病及び苗腐敗病（seedling blight and rot）、葉鞘腐敗病（leaf sheath rot）、葉褐変病（leaf browning）、穂枯病（panicle blight）、細菌性萎凋病（bacterial wilt）及びイネもみ枯細菌病（grain rot）を含む他の細菌性病は、場合によっては収穫量の７５％までも減少させる（Croplife 2015．Bacterial panicle blight、the disease with the greatest impact on rice crops．（http://www.croplifela.org/en/disease-of-the-month.html?id=182）; Kim，J.，Kang，Y.，Kim，J．G.、Choi，O．and Hwang，Ｉ．2010．Occurrence of Burkholderia glumae on rice and field crops in Korea．Plant Pathol．J．26:271-272; Ura，H.，Furuya，N.，Iiyama，K.，Hidaka，M.，Tsuchiya，K. and Matsuyama，N．2006．Burkholderia gladioli associated with symptoms of bacterial grain rot and leaf-sheath browning of rice plants．J．Gen．Plant Pathol．72:98-103．）。フサリウム・フジクロイ（Fusarium fujikuroi）によるイネばか苗病（bakanae）による収穫量の減少は、アジアでの稲栽培地域において約１０〜５０％と推定される（Bonman，J．M．1992．Root and crown disease，bakanae．In:Compendium of Rice Diseases，eds．By R．K．Webster and P．S． Gunnell，p．27）。これらの病害を防除するために、アジアのほとんどの国では、過去数十年間、化学殺菌剤を広く使用していたが、最近では耐性により殺菌剤の薬効が減少している（Yang，Y．R.，Kim，Y．C.，Lee，S．W.、Lee，S．W.，An，G．G．and Kim，Ｉ．S.、2012．Involvement of an efflux transporter in prochloraz resistance of Fusarium fujikuroi CF245 causing rice bakanae disease．J．Korean Soc．Appl．Biol．Chem．55:571-574.）。また、化学殺菌剤の誤用は、農業環境と作業者に副作用を引き起こす。このため、これを代替できる防除手段の開発、特に拮抗細菌を用いる生物学的防除が多くのアジアの国で試みられている（Gnanamanickam，S．S．2009．An overview of progress in biological control．In:Biological control of rice diseases，Progress in biological control，ed．By S．S．Gnanamanckam，vol．8，pp．43-51．Springer，Netherlands．）。
【００９４】
拮抗細菌を用いる生物学的防除は、環境的に安全であり、集約された病害管理手段として実現することができる。バチルス（Bacillus）、バークホルデリア（Burkholderia）、リソバクター（Lysobacter）、パントエア（Pantoea）、シュードモナス（Pseudomonas）、及びストレプトマイセス（Streptomyces）のような様々な微生物属が、多くの農作物病害の防除のための生物学的防除剤として使用されている。しかし、稲の病害の生物学的防除については、いくつかの研究のみが報告されている（Bouizgarne，B．2013．Bacteria for plant growth promotion and disease management．In:Bacteria in agrobiology，Disease mangement，ed．By D．K．Maheshwari，pp．15-34．Springer-Verlag，Berlin，Heidelberg;McSpadden Gardener，B．2010．Biocontrol of plant pathogens and plant growth promotion by Bacillus．In:Recent developments in management of plant diseases，Plant pathology in the 21st Century．Eds．by U．Gisi，1．Chet and M．L．Gullino，chapt．6，pp．71-79．Springer-Amsterdam．）。拮抗細菌ストレプトマイセス（Streptomyces）及びバチルス（Bacillus）の多重利用が、イネ紋枯病（rice sheath blight）の防除のために試みられた（Sung，K．C．and Chung，Y．R．1997．Enhanced suppression of rice sheath blight using combination of bacteria which produce chitinases or antibiotics．In:Proceedings of the 4th international workshop on plant growth promoting rhizobacteria present status and future prospects，eds．By A．Ogoshi，K．Kobayashi，Y．Homma，F．Kodama，N．Konodo and S．Akino，pp．370-373．OECD，Paris．）。いもち病（rice blast）及び紋枯病（sheath blight）は、バチルス・バリスモルティス（Bacillus vallismortis）ＥＸＴＮ−１及び二つの拮抗細菌菌株シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ｍｃ７５及びｐｃ７８により効果的に防除された（Choi，G．J.，Kim，J．C.，Park，E．J.，Choi，Y．H.，Jang，K．S.，Lim，H．K.，Cho，K．Y．and Lee，S．W．2006．Biological control activity of two isolates of Pseudomonas fluorescens against rice sheath blight．Plant Pathol．J．22:289-294．;Park，K．S.，Paul，D．and Yeh，W．H．2006．Bacillus vallismortis EXTN-1 mediated growth promotion and disease suppression in rice．Plant Pathol．J．22:278-282．）。フザリウム・モニリフォルメ（Fusarium moniliforme）及びフサリウム・フジクロイ（F．fujikuroi）によるイネばか苗病（bakanae）及びイネ苗腐敗病（seedling rot of rice）もまた、拮抗細菌シュードモナス・フルオレッセンス（P．fluorescens）及びバチルス・セレウス（Bacillus cereus）により防除された（Kazempour，M．N．and Elahinia，S．A．2007．Biological control of Fusarium fujikuroi，the causal agent of bakanae disease by rice associated antagonistic bacteria．Bulg．J．Agric．Sci．13:393-408;Rosales，A．M．and Mew，T．W．1997．Suppression of Fusarium moniliformein rice by rice-associated antagonistic bacteria．Plant Dis．81:49-52．）。様々な拮抗細菌の中でも、いくつかのバチルス種が商業的な生物農薬として開発されている。バチルス種は、内生胞子を生産し、処理後、長期間自然環境で持続するからである（Hu，X.，Roberts，D．P.，Maul，J．E.，Emche，S．E.，Liao，X.，Guo，X.，Liu，Y.，McKenna，L．F.，Buyer，J．S．and Liu，S．2011．Formulations of the endophytic bacterium Bacillus subtilisTu-100 suppress Sclerotinia sclerotiorumon oilseed rape and improve plant vigor in field trials conducted at separate locations．Can．J．Microbiol．57:539-546．）。
【００９５】
他の宿主において、多くの植物病の生物学的防除に広く使用されているバチルス種として、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・パスツーリ（Bacillus pasteurii）、バチルス・セレウス（B．cereus）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）、及びバチルス・スフェリカス（Bacillus sphaericus）がある（Kloepper，J．W.，Ryu，C．M．and Zhang，S．2004．Induced systemic resistance and promotion of plant growth by Bacillus spp．Phytopathology 94:1259-1266;McSpadden Gardener，B．2010．Biocontrol of plant pathogens and plant growth promotion by Bacillus．In:Recent developments in management of plant diseases，plant pathology in the 21stCentury．Eds．by U．Gisi，Ｉ．Chet and M．L．Gullino，chapt．6，pp．71-79．Springer-Amsterdam．）。バチルス・サブチリス（B．subtilis）ＧＢ０３及びバチルス・アミロリケファシエンス（B．amyloliquefaciens）ＩＮ９３７は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）において、細菌性病原菌であるエルウィニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora subsp．carotovora）を防除することが証明された（Ryu et al．、2004）。また、バチルス・セレウス（B．cereus）ＡＲ１５６及びバチルス・サブチリス（B．subtilis）は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）において、耐性を誘導し、シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae pv．tomato）ＤＣ３０００を防除することが証明された（Niu，D．D.，Liu，H．X.，Jiang，C．H.，Wang，Y．P.，Wang，Q．Y.，Jin，H．L．and Guo，J．H．2011．The plant growth promoting rhizobacterium Bacillus cereus AR156 induces systemic resistance in Arabidopsis thaliana by simultaneously activating salicylate-and jasmonate/ethylene dependent signaling pathways．Mol．Plant-Microbe Interact．24:533-542．）。これらのバチルス種のいくつかは、宿主植物で抗真菌性、抗細菌性、植物成長促進及び耐性誘導活性の点で特徴がある（Park，K．S.，Paul，D.，Kim，J．S．and Park，J．W．2009．L-alanine augments Rhizobacteria induced systemic resistance in cucumber．Folia Microbiol．54:322-326;Ryu，C．M．2013．Promoting plant protection by root-associated microbes．Plant Pathol．J．29:123-124．）。様々なバチルス種が様々な陸上及び塩生植物から分離されたが、これらの一部は内生性を示す（非特許文献７参照）。バチルス属は、現在２９９種があり、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列、ＤＮＡ−ＤＮＡ混成化分析、脂肪酸プロファイル、物理学・生化学的実験を含む多相研究に基づいて、３０種以上が過去５年間新たに報告されている（LPSN．2015．List of prokaryotic names with standing in nomenclature．（http://www.bacterio.net/bacillus.html））。
【００９６】
本実施例では、稲の根から分離した２つのバチルス菌株ＹＣ７００７及びＹＣ７０１０に対して、多機能活性を有する新しい生物学的防除剤の開発を検討し、多相アプローチにより分類を特徴化した。また、稲の生長促進だけでなく、白葉枯病（bacterial blight）及び穂枯病（panicle blight）に対する耐性誘導により、新しいＹＣ７００７及びＹＣ７０１０菌株の防除能を調べた。
【００９７】
材料及び方法
（１）内生細菌の分離及び培養
慶尚大学の農場（Jinju-shi、Korea）の水田土壌で収集した稲の根から内生細菌菌株を分離した。分離のために、サンプル片を流水で数回洗浄し、７０％エタノールで５分間、１．２％次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）溶液により１０分間表面滅菌を行い、最後に滅菌蒸留水で数回洗浄した。滅菌を確認するために、洗浄した切片を１／１０ＴＳＡ（one-tenth strength tryptic soy broth agar）に２８℃で３日間置き、細菌の成長を観察した。細菌コロニーが存在しないことを確認した後、サンプル切片を７０％エタノールでさらに数秒間滅菌し、高圧滅菌器に滅菌蒸留水を入れて殺菌された乳鉢と乳棒により摩砕した（非特許文献７参照）。摩砕液の一部を高圧滅菌水で１０倍ずつ順次希釈した後、それの一部（０．１ｍＬ）をシクロヘキシミド（cycloheximide）で補充された１／１０ＴＳＡ培地に置き、プレートを３０℃で３日間培養した。培地上に成長した細菌コロニーを明確なコロニーの形態に基づいて選別した。純粋に分離した細菌菌株を１／１０ＴＳＡ培地で継代培養し、後続使用のために−７０℃で保管した。細菌菌株の培養のために、蒸留水１リットル当たりにプロテアーゼペプトン（protease peptone）１０ｇ、酵母抽出物１０ｇ、塩化アンモニウム４ｇ、硫酸マグネシウム４ｇ、グルコース１０ｇ及び寒天１５ｇを含有する培地を準備した。
【００９８】
（２）真菌及び細菌病原体に対する拮抗活性
内生細菌に対して、アルテルナリア・パナックス（Alternaria panax）ＫＡＣＣ ４２４６１、フサリウム・フジクロイ（F．fujikuroi）ＫＡＣＣ４４０２２、プサリウム・オキシスポラム（F．oxysporum）ＫＣＴＣ １６９０９、スクレロティニア・スクレロティオラム（Sclerotinia sclerotiorum）ＧＳＣＣ ５０５０１、ピシウム・ウルチマム（Pythium ultimum）ＧＳＣＣ ５０６５１、バイポラリス・オリゼ（Bipolaris oryzae）ＫＡＣＣ ４０８５３、ボトリティス・シネレア（Botrytis cinerea）ＫＣＴＣ ６９７３、マグナポルテ・グリセア（Magnaporthe grisea）ＫＡＣＣ ４０４１５、ボトライオスパエリア・ドチデア（Botryosphaeria dothidea）ＧＳＣＣ ５０２０１及びリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）ＫＣＴＣ ４０１０１のような主要な植物真菌病原体に対して実験を行った。細菌菌株の拮抗活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ対照生物試験法を用いて、ＰＤＡ（potato dextrose agar）培地で真菌病原体の菌糸生長抑制領域を測定することにより評価した（非特許文献７参照）。抗菌実験のために、バークホルデリア・グルメ（B．glumae）ＫＡＣＣ１０３５９及びザントモナス・オリゼ（X．oryzae pv．oryzae）ＫＡＣＣ１０２０８を、それぞれＲ２Ａ（one-half strength R2A）及びＹＧＣ培地（１０ｇ ｇｌｕｃｏｓｅ、３０ｇ ＣａＣＯ３、５ｇ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔおよび１５ｇ ａｇａｒ ｐｅｒ ｌｉｔｅｒ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）で成長させた。その後、拡散ペーパーディスク法（diffusion paper disc method）を用いて抑制活性を実験した。細菌菌株ＹＣ７００７の培養ろ液は、培養液から遠心分離（５，０００ｇ、１０ｍｉｎ）及びミリポアフィルター（０．２μｍ）による濾過により、異なる培養時間で準備された。
【００９９】
（３）細菌病原体に対する誘導抵抗性の検定
ザントモナス・オリゼ（X．oryzae pv．oryzae）ＫＡＣＣ １０２０８及びバークホルデリア・グルメ（B．glumae）ＫＡＣＣ１０３５９の各々に対して、白葉枯病（bacterial blight）及び穂枯病（panicle blight）に対するＹＣ７００７種の抵抗性誘導を実験（pot test）した。稲種子（Oryza sativa L．cultivar Dongjin）を１．２％次亜塩素酸ナトリウム溶液で１０分間、および７０％エタノールで５分間表面を滅菌した後、滅菌蒸留水で３回洗った。その後、発芽のために、３０℃の暗室で３日間保管した。水は毎日交換した。発芽した種子を常用の床土（nursery soil、Dasuran Sangto、Youngnong Sun Up、Korea）に播種し、栽培のために温室に置いた。その後、２週間経過した苗を、２日間、一日２０分ずつ１２１℃で高圧滅菌処理された床土約１５０ｇを含むプラスチックポート（９．５×８×７ｃｍ３）に植え替えた。ＹＣ７００７の細菌懸濁液を準備するために、細菌細胞を回転式バイブレーター（１６０ｒｐｍ、２８℃）上の培地（liquid mass culture medium）で２日間培養した。遠心分離（５，０００ｇ、１０ｍｉｎ）して懸濁液を取り、緩衝液（１０ｍＭ ＭｇＳＯ４）で様々な濃度（５．６×１０５、３．６×１０６、２×１０７ＣＦＵ／ｍＬ）に合わせた。２週間経過した苗を植え替える間、同時にＹＣ７００７の細胞懸濁液（１５ｍＬ）を、高圧滅菌された土（１５０ｇ）を含むプラスチックポートに灌注した。最適な濃度（２×１０７ＣＦＵ／ｍＬ）のＹＣ７００７を白葉枯病（bacterial blight）及び穂枯病（panicle blight）に対する追加の抵抗誘導実験に使用した。１０ｍＭ硫酸マグネシウムにより１０倍希釈した６０ｈ培養液から準備されたＹＣ７００７菌株の培養ろ液を防除効果の確認のために、滴になるまで葉に噴霧した。その後、ＹＣ７００７で処理してから５日後に細菌病原体を接種した。緩衝液を対照群として用いた。全ての実験は、各処理ごとに３回反復し、１０個の植物を用いて行った。
【０１００】
（４）細菌病原体の接種原の準備
２つの細菌病原体の接種原として、回転式バイブレーター（１６０ｒｐｍ、２８℃）上のＲ２Ａ及びＹＧＣ培地でそれぞれ培養した後、細胞懸濁液を用いてバークホルデリア・グルメ（B．glumae）ＫＡＣＣ１０３５９及びザントモナス・オリゼ（X．oryzae pv．oryzae）ＫＡＣＣ １０２０８を準備した。バークホルデリア・グルメ（B．glumae）の培養液を遠心分離（５，０００ｇ、１０ｍｉｎ）し、６×１０７ＣＦＵ／ｍＬの濃度に調整された緩衝液（１０ｍＭ ＭｇＳＯ４）で細胞ペレットを懸濁させた。バークホルデリア・グルメ（B．glumae）懸濁液を接種するために、生物試験法（pin-prick bioassay）を行った。３−４ ｐｉｎｓ／ｎｅｅｄｌｅｓ束を懸濁液に投入し、束のニードルで葉を引き抜いた。５週間経過した苗に病原体を接種した後、５日目の発病度を評価した。評価基準は、次のとおりである。０＝症状なし、１＝若干の感染、病変は殆どなし、２＝全体的に褐変した凝集病変、３＝ｎｏ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｖａｉｌａｂｌｅ。（Cottyn，B.，Cerez，M．T.，Van Outryve，M．F.，Barroga，J.，Swings，J． and Mew，T．W．1996．Bacterial diseases of rice．1．Pathogenic bacteria associated with sheath rot complex and grain discoloration of rice in the Philippines．Plant Dis．80:429-437．）。白葉枯病（bacterial blight）の場合、ザントモナス・オリゼ（X．oryzae pv．oryzae）の懸濁液は、バークホルデリア・グルメ（B．glumae）の場合と同様な過程を経て準備し、１．２×１０７ＣＦＵ／ｍＬの濃度に調整した。白葉枯病（bacterial blight）に対する生物試験（clipping bioassay）は、懸濁液に入れた鋏を用いて上部の葉を切る方法により行った。接種７日後に１−９点法に基づいて発病度を評価した（Misra，J．K.，Mew，T．W．and Merca，S．D．1994．Field inspection．In:A manual of rice seed health testing，eds．By T．W．Mew and J．K．Misra，pp．52-55．International Rice Research Institute，Philippines．）。病減少率は、下記数式２に基づいて算出した。
【０１０１】
【数２】
0006377262.tif 000013
【０１０２】
（５）生長促進の測定
ＹＣ７００７菌株の細菌懸濁液（２×１０７ＣＦＵ／ｍＬ）の処理による稲の生長促進を栽培期間にわたって調べた。培地（１０ｍＬ １／２ ＭＳ ｍｅｄｉａ ｗｉｔｈ ０．８％ ａｇａｒ）を含有するテストチューブ（長さ：１８ｃｍ）でＹＣ７００７の細菌懸濁液（１ｍＬ）を５日経過した苗の根圏に灌注した。細菌処理７日後に生長程度を記録した（１２日目）。ポート実験の場合、２週間経過した苗を約１５０ｇの高圧滅菌された床土及び細菌懸濁液（１５ｍＬ）を含むプラスチックポートに植え替え、移植７日目に灌注した。細菌処理９日後に生長程度を記録した（３０日目）。さらに、細菌懸濁液（１５ｍＬ）を分蘖期（tillering stage）（３０日目）に灌注し、分蘖期から細菌処理４０日後の出穂期（booting stage）に生長程度を記録した（７０日目）。テストチューブ及びポート実験では、各処理ごとに３回反復し、１０個の植物を用いて生長促進活性実験を行い、緩衝液を対照群として使用した。
【０１０３】
（６）１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列及びＤＮＡ−ＤＮＡ混成化に基づく系統分類学的分析
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を常用抽出キット（Intron Biotech、Seoul、Korea）で抽出した誘電体ＤＮＡからプライマー（bacterial universal primers 27F及び1492R）を用いて増幅させ、精製されたＰＣＲ産物に対してシーケンス（GenoTech Inc．、Daejeon、Korea）を行った（Lane，D．J．1991.16S/23S rRNA sequencing．In:Nucleic acid techniques in bacterial systematics，eds．By E．Stackebrandt and M．Goodfellow，pp．115-175．Chichester:Wiley．）。新しい内生細菌と他の近縁種との系統分類学的位置を確認するために、菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を、データベース（NCBI and the EzTaxon-e database server）から得られた配列と比較した（Kim，O．S.，Cho，Y．J.，Lee，K.，Yoon，S．H.，Kim，M.，Na，H.，Park，S．C.，Jeon，Y．S.，Lee，J．H.，Yi，H.，Won，S．and Chun，J．2012．Introducing EzTaxon-e:a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species．Int．J．Syst．Evol．Microbiol．62:716-721．）。ＣＬＵＳＴＡＬ_Ｘソフトウェアを用いて、配列の多重整列を行った（Thompson，J．D.，Gibson，T．J.，Plewniak，F.，Jeanmougin，F．and Higgins，D．G．1997．The CLUSTAL＿X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools．Nucleic Acids Res．25:4876-4882．）。また、ＢｉｏＥｄｉｔプログラムを用いてギャップを編集した（Hall，T．A．1999．BioEdit:a user friendly biological sequence aligned editor and analysis program for Windows 95/98/NT．Nucleic Acids Symp．Ser．41:95-98．）。反復１，０００回におけるブートストラップ値（bootstrap value）で系統樹を行うために、近隣結合法（neighbor-joining method;Saitou，N．and Nei，M．1987．The neighbor-joining method:a new method for reconstructing phylogenetic trees．Mol．Biol．Evol．4:406-425．）、最大節約法（maximum-parsimony;Fitch，W．M．1972．Toward defining the course of evolution:minimum change for a specific tree topology．Syst．Biol．20:406-416．）、ＭＥＧＡ５．１０ソフトウェアにおける最大可能性アルゴリズム（maximum-likelihood algorithms;Tamura，K.，Peterson，D.，Peterson，N.，Stecher，G.，Nei，M．and Kumar，S．2011．MEGA5:molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods．Mol．Biol．Evol．28:2731-2739．）が用いられた（Felsenstein，J．1985．Confidence limits on phylogenies:an approach using the bootstrap．Evolution 39:783-791．）。菌株間のＤＮＡ−ＤＮＡ関連性値を決定するために、メーカーの指示及び前述の方法（Lee，S．H.，Shim，J．K.，Kim，J．M.，Choi，H．K．and Jeon，C．O．2011．Henriciella litoralis sp．Nov.，isolated from a tidal flat，transfer of Maribaculam marinum Lai et al．to the genus Henriciella as Henriciella aquimarina nom．Nov．and emended description of genus Henriciella．Int．J．Syst．Evol．Microbiol．61:722-727．）に基づいて、キット（DIG DNA labeling and detection kit、Roche Applied Science）を用いたＤＮＡ−ＤＮＡ混成化を行った。
【０１０４】
（７）形態学、表現型及び化学分類的特性
光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，×１０００）を用いて細胞の形態を観察した。２８℃ Ｒ２Ａ培地で２４時間成長した細胞培養液を用いて、透過電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ，ｍｏｄｅｌ Ｈ−６００）により鞭毛の存在を観察した。キット（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ Ｇｒａｍ ｓｔａｉｎ ｋｉｔ）を用いて、メーカーの指示に従ってグラム反応を調べた。菌株の加水分解実験は、標準プロトコルに基づき、カゼイン、エスクリン（esculin）、ゼラチン、澱粉、Ｌ−チロシン（L-tyrosine）、尿素（urea）、Ｔｗｅｅｎ２０及びＴｗｅｅｎ８０を用いて行った（Smibert，R．M．and Krieg，N．R．1994．Phenotypic characterization．In:Methods for general and molecular bacteriology，eds．By P．Gerhardt，R．G．E．Murray，W．A．Wood and N．R．Krieg，pp．607-654．American Society for Microbiology，Washington，DC．;Reichenbach，H．1992．The order Cytophagales．In:The Prokaryotes，eds．By A．Balows，H．G．Truper，M．Dworkin，W．Harder and K．H．Schleifer，2nd ed.，vol．4，pp．3631-3675．Springer，New York．）。酵素活性、様々な炭水化物からの酸の生成、様々な基質の吸収および炭水化物での成長に対して、常用システム（それぞれＡＰＩ ＺＹＭ、ＡＰＩ ２０Ｅ、ＡＰＩ ２０ＮＥ及びＡＰＩ ５０ＣＨ ｋｉｔｓ）を用いて、２８℃でメーカーの指示に従って調べた（BioMerieux）。様々な温度及びｐＨ（ｐＨ４．０〜１４．０ ａｔ ｉｎｔｅｒｖａｌｓ ｏｆ ０．５ ｐＨ ｕｎｉｔｓ）での成長に対しては、適切な緩衝液を用いて、Ｒ２Ａ培養液で５日間培養した後に調べた（Xu，P.，Li，W．J.，Tang，S．K.，Zhang，Y．Q.，Chen，G．Z.，Chen，H．H.，Xu，L．H．and Jiang，C．2005．Naxibacter alkalitolerans gen．nov.，sp．nov.，a novel member of the family‘Oxalobacteraceae’isolated from China．Int．J．Syst．Evol．Microbiol．55:1149-1153．）。また、２８℃で５日間培養後、１−１４％（ｗ／ｖ、ａｔ １％ ｉｎｔｅｒｖａｌｓ）塩化ナトリウムで補充されたＲ２Ａ培養液で耐塩性を評価した。複製抗生物質−感受性（Duplicate antibiotic-sensitivity）実験は、様々な抗生物質（10μg ampicillin、30μg chloramphenicol、10μg penicillin、10μg gentamycin、3μg kanamycin、30μg vancomycin、30μg streptomycin及び30μg tetracycline）でディスク拡散法（filter-paper disc diffusion assays）を用いて行った（Yasir，M.，Aslam，Z.，Song，G．C.，Jeon，C．O．and Chung，Y．R．2010．Sphingosinicella vermicomposti sp．Nov.，isolated from vermicompost，and emended description of the genus Sphingosinicella．Int．J．Syst．Evol．Microbiol．60:580-584．）。細胞壁の準備及びペプチドグリカンの分析は、Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒの方法（Schleifer，K．H．1985．Analysis of the chemical composition and primary structure of murein．Methods Microbiol．18:123-156．）において、ＴＬＣをペーパークロマトグラフィーの代わりにセルロースシートを用いる修正された方法で行った。細胞脂肪酸の分析のために、細菌菌株を２８℃ Ｒ２Ａ培養液で培養し、微生物細胞を中央指数増殖段階（mid-exponential growth phase）（ＯＤ６００＝０．４−０．５）で取った。脂肪酸メチルエステル（fatty acid methyl esters）分析は、微生物識別システム（microbial identification system、ＭＩＤＩ；Microbial ID、Inc．）の指示に従って行った。ＧＣで抽出物を分析し（Agilent 6890）、Ｓｈｅｒｌｏｃｋソフトウェア（ｖｅｒ．４．０）で提供するＴＳＢＡ４０データベースで脂肪酸プロファイルを比較して識別した。細菌菌株の全細胞加水分解物のアミ���酸を抽出し、Ｓｔａｎｅｃｋ及びＲｏｂｅｒｔｓの方法（Stanek，J．L．and Roberts，G．D．1974．Simplified approach to identification of aerobic actinomycetes by thin-layer chromatography．Appl．Microbiol．28:226-231．）に基づいて分析した。イソプレノイドキノン（Isoprenoid quinones）を抽出し、Ｋｏｍａｇａｔａ及びＳｕｚｕｋｉの方法（Komagata，K．and Suzuki，K．1987．Lipid and cell-wall analysis in bacterial systematics．Methods Microbiol．19:161-207．）に基づき、逆相（reverse-phase）ＨＰＬＣを用いて分析した。染色体ＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量を測定するために、ＹＣ７０１０菌株の誘電体ＤＮＡを抽出し、Ａｕｓｕｂｅｌらの方法（Ausubel，F．W.，Brent，R.，Kingston，R．E.，Moore，D．D.，Seidman，J．G.，Smith，J．A．and Struhl，K．1995．Current Protocols in Molecular Biology，New York:Wiley．）に基づいて精製し、酵素的に分解されたヌクレオシド及びＧ＋Ｃ含有量をカラム（reverse-phase C18 column）で測定した（Mesbah，M.，Premachandran，U．and Whitman，W．B．1989．Precise measurement of the G+C content of deoxyribonucleic acid by high-performance liquid chromatography．Int．J．Syst．Bacteriol．39:159-167．）。Ｍｉｎｎｉｋｉｎら（１９８４）の方法を変形して極性脂質を抽出し、Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０−ＨＰＴＬＣにてＴＬＣで分離した。また、プレートにニンヒドリン溶液（0.2％（w/v）solution of ninhydrin in butanol saturated with water）をスプレーした後、１０５℃で１０分間加熱してアミノ脂質を検出した（Ross，H．N．M.，Grant，W．D．and Harris，J．E．1985．Lipids ｉn archaebacterial taxonomy．In:Chemical Methods in Bacterial Systematics，eds．By M．Goodfellow and D．E．Minnikin，pp．289-300．Academic Press，London．）。また，Ｄｉｔｔｍｅｒ及びＬｅｓｔｅｒ（Dittmer，J．C．and Lester，R．L．1964．A simple，specific spray for the detection of phospholipids on thin-layer chromatograms．J．Lipid Res．15:126-127．）のＺｉｎｚａｄｚｅ試薬をプレートにスプレーし、リン脂質を検出した。また、１−ナフトールスプレー試薬で３〜５分間加熱して糖脂質を検出した（Jacin，H．and Mishkin，A．R．1965．Separation of carbohydrates on borate impregnated silica gel G plates．J．Chromatogr．18:170-173．）。ホスファチジルコリン（phosphatidylcholine）の検出には、Ｄｒａｇｅｎｄｏｒｆｆ試薬（Sigma-Aldrich;St．Louis、Mo）を用いた。また、リンモリブデン酸溶液（phosphomolybdic acid solution，Sigma-Aldrich;St．Louis，Mo）をスプレーした後、１５０℃で１０分間加熱し、合計脂質プロファイルを検出した。
【０１０５】
（８）統計分析
ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、完全ランダムな単一要素で分散デザインされた分析を用いてデータを分析した。ｉｎ ｖｉｖｏでは、完全ランダムにブロックデザインされた分析を用いた。また、ダンカンの方法（Duncan‘s multiple range test（ＤＭＲＴ））を用いて、平均差（mean differences）を比較した。全ての分析において、ＳＰＳＳソフトウェア（ver．17;SPSS Inc．in Chicago）を使用した。
【０１０６】
実験結果
（１）分離された菌株の拮抗活性
稲根圏から分離した２５０個の細菌菌株のうち１５個の内生細菌が、フサリウム・フジクロイ（F．fujikuroi）の菌糸成長に対して２〜２０ｍｍ以上の範囲で抑制活性を示した。これらの細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づくと、パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）、バチルス・シアメンシス（Bacillus siamensis）、パエニバシラス・ジャミラエ（Paenibacillus jamilae）、バチルス・メチロトロフィカス（Bacillus methylotrophicus）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・セレウス（B．cereus）、バチルス・シンプレクス（Bacillus simplex）及びバチルス・ダリエンシス（Bacillus daliensis）と関連があることが確認された。これらの分離された細菌は、実験により識別したところ、その類似性が９９．２７〜１００％であり、近縁属に属する。分離された細菌のうち、特に２つの菌株、すなわちＹＣ７００７及びＹＣ７０１０は、バチルス・シアメンシス（Ｂ．ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）と最も高い類似性を有する菌株であり、フサリウム・フジクロイ（Ｆ．ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）に対して強い拮抗活性（＞20mm inhibition zone）を示した（下記表１１参照）。ＹＣ７００７はまた、他のイネ病原菌であるＢ．ｏｒｙｚａｅ、Ｍ．ｇｒｉｓｅａ、Ｆ．ｆｕｋｉｋｕｒｏｉと他の主要な植物病原菌に対して、ＰＤＡで１０〜２９ｍｍの抑制範囲で強い拮抗活性を示した（下記表１２参照）。異なる培養時間（different cultivation times）から準備されたＹＣ７００７菌株の培養ろ液もまた、フサリウム・フジクロイ（F．fujikuroi）及び２つの主要種子由来の細菌病原菌であるバークホルデリア・グルメ（B．glumae）及びザントモナス・オリゼ（X．oryzae pv．oryzae）に対して良好な成長抑制能を示した（図８参照）。６０ｈ−ｏｌｄ培養液の培養ろ液は、それぞれの培養培地でフサリウム・フジクロイ（F．fujikuroi）、ザントモナス・オリゼ（X．oryzae pv．oryzae）、及びバークホルデリア・グルメ（B．glumae）のそれぞれに対して、３０ｍｍ、２４ｍｍ及び１９．７ｍｍの抑制範囲として最も強力な活性を示した。
【０１０７】
【表１１】
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【０１０８】
【表１２】
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【０１０９】
（２）穂枯病（panicle blight）及び白葉枯病（bacterial blight）に対する全身抵抗性誘導
ＹＣ７００７菌株に対して、稲の白葉枯病（bacterial blight）及び穂枯病（panicle blight）に対する全身抵抗性誘導活性を調べた。３つの異なる濃度（５．６×１０５、３．６×１０６及び２×１０７ＣＦＵ／ｍＬ）のＹＣ７００７菌株を土壌に灌注したところ、葉腐敗（leaf rot）の発病度を対照群（２．５）に比べて１．４、０．９及び０．８と非常に低下させる（ｐ＜０．０５）ことが分かった（図９参照）。しかし、１０６及び１０７の濃度の間で有意差は見られなかった。２×１０７ＣＦＵ／ｍＬの濃度のＹＣ７００７菌株を根圏土壌に灌注する場合、穂枯病（panicle blight）及び白葉枯病（bacterial blight）の防除効果は、それぞれ６５．２％及び６１．２％であり、優れていることが分かった。培養ろ液を葉面噴霧した場合も、対照群に比べて穂枯病（panicle blight）及び白葉枯病（bacterial blight）の発病度を、それぞれ７０．８％及び７０．５％程度大幅に減少させることが確認された（下記表１３参照）。ＹＣ７００７菌株は、対照群に比べて穂枯病（panicle blight）及び白葉枯病（bacterial blight）の発病度を大幅に減少（ｐ＜０．０１）させることが確認された。
【０１１０】
【表１３】
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【０１１１】
（３）ＹＣ７００７による生長促進
ＹＣ７００７菌株は、稲の幼苗期、分叢期及び出穂期のような全ての実験段階において、対照群に比べてかなりの生長促進活性（ｐ＜０．０５）を有することが示された。稲根圏に細菌懸濁液（２×１０７ＣＦＵ／ｍＬ）を処理することにより、テストチューブでの芽の長さは、幼苗期では１１．６７ｃｍから１９．３３ｃｍに、分蘖期では３６．４５ｃｍから４６．３３ｃｍに、出穂期では５５．３３ｃｍから６１．０ｃｍにそれぞれ増加した。主根の長さは、幼苗期では２．６７ｃｍから７．６７ｃｍに増加した。分叢数（numbers of tillers）もまた、分蘖期では１．９から２．９に、出穂期では５．３から７．０に増加した（下記表１４参照）。
【０１１２】
【表１４】
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【０１１３】
（４）ＹＣ７００７及びＹＣ７０１０拮抗細菌の同定
１５個の拮抗細菌のうち、最も強力な拮抗活性を有する２つの内生細菌ＹＣ７００７及びＹＣ７０１０を、多相アプローチ法により同定した。両菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は、１，５１３ｂｐが連続して伸びているものであり、２つのヌクレオチドを除いては、同じように整列されている（database accession numbers KP203893（YC7007）and KP201498（YC7010T）in GenBank/EMBL/DDBJ）（図１参照）。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列解析から、両菌株は、系統樹において同じ枝長さを有する同じ分岐群（clade）にあるものであり、バチルス・シアメンシス（B．siamensis）ＫＡＣＣ １５８５９Ｔ（９９．６７％）、バチルス・メチロトロフィカス（B．methylotrophicus）ＫＡＣＣ １３１０５Ｔ（９９．６５％）、バチルス・アミロリケファシエンス（B．amyloliquefaciens subsp．plantarum）ＫＡＣＣ １７１７７Ｔ（９９．６０％）、及びバチルス・テクィレンシス（B．tequilensis）ＫＡＣＣ １５９４４Ｔ（９９．４５％）と最も高い類似性を示すことが分かった（表１１及び図２を参照）。ＹＣ７０１０菌株及びこれに最も近縁の菌株であるバチルス・シアメンシス（B．siamensis）ＫＡＣＣ １５８５９ＴとのＤＮＡ−ＤＮＡ関連性値は５０．４±３．５であったが、ＹＣ７００７とＹＣ７０１０との間では９１．５±１１．０％であった（表２参照）。両菌株はグラム陽性、運動性あり、棒状であり、１３〜６０℃（好適には２８〜３０℃）及びｐＨ４〜１２（好適にはｐＨ７）で良好な成長を示す。これらの菌株は、１〜１３％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウムを含有する０．１ＴＳＡ培地で成長可能であるが、成長のために塩化ナトリウムが求められることはなかった。これらの菌株は、３０μｇ／ｍＬ濃度のクロラムフェニコール（chloramphenicol）に抵抗性を有している。また、これらの菌株は、細胞壁ペプチドグリカンでの拮抗ジアミノ酸としてのメゾ−ジアミノピメル酸（meso-diaminopimelic acid）及び主要な呼吸キノンシステム（major respiratory quinine system）としてのＭＫ−７を含有する。ＹＣ７００７及びＹＣ７０１０菌株の他の生理学的及び生化学的な特徴を前記表１にまとめて示した。ＹＣ７００７及びＹＣ７０１０菌株の主要な脂肪酸は、それぞれａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０（３８．４及び３２．０％）及びｉｓｏ Ｃ１５：０（２８．１及び２７．７％）であった。ＹＣ７０１０の他の細胞脂肪酸プロファイルは、Ｃ１６：０（７．７％）、ｉｓｏ Ｃ１７：０（６．４％）、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１７：０（５．３％）、ｉｓｏ Ｃ１６：０（５．２％）、Ｃ１８：０（５．１％） 、Ｃ１６：１ω７c ａｌｃｏｈｏｌ（３．４％）、ｉｓｏ Ｃ１４：０（２．９％）、ｉｓｏ−Ｃ１７：１ω１０c（１．７％）、Ｃ１６：１ω１１c（１．４％）、Ｃ１４：０（１．１％）、及びＣ２０ ：１ω７c（０．２％）で構成された（表３参照）。ＹＣ７００７及びＹＣ７０１０菌株誘電体ＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量は、それぞれ５０．５ｍｏｌ％及び５１．２ｍｏｌ％であった。これらの菌株は、ＰＥ（phosphatidylethanolamine）、ＰＧ（phosphatidylglycerol）、ＤＰＧ（diphosphatidylglycerol）、ＧＬ（unknown glycolipid）、及びＡＬ１−２（unknown aminolipids）で構成された極性脂質プロファイルを示した。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列解析、ＤＮＡ−ＤＮＡ関連性値、脂肪酸の組成、生化学的・生理学的な特性を���析したところ、ＹＣ７００７及びＹＣ７０１０菌株は、バチルス（Bacillus）属の新しい種であることが確認され、その名称をバチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola sp．nov．）と提案した。
【０１１４】
（５）バチルスオリジコラＹＣ７０１０（Bacillus oryzicola YC7010T sp．nov．）の詳細
細胞は、グラム−陽性、棒状（０．８〜０．９×２．０〜３．０μｍ）である。２８℃Ｒ２Ａ寒天培地で２日間成長したコロニーは、クリーミな白色（white-cream）、円形、全体縁部から平らに高まる（flat elevation with an entire margin）形態である。細胞は、単一の極鞭毛であり、運動性を有する。細胞壁は、拮抗ジアミノ酸としてメゾ−ジアミノピメル酸を含有する。細胞は、通常、カタラーゼ−陽性及びオキシダーゼ−陰性であり、単一または対をなして示され、１３〜６０℃及びｐＨ４〜１２．０で成長する。カゼイン及びゼラチン加水分解は陽性であるが、澱粉、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、チロシン（tyrosine）及びカルボキシメチルセルロース（carboxymethyl cellulose）に対しては陰性である。また、Ｄ−グルコース（D-glucose）、Ｄ−フルクトース（D-fructose）、Ｄ−マンノース（D-mannose）、Ｄ−マンニトール（D-mannitol）、メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（methyl-アルファ-D-glucopyranoside）、Ｎ−アセチル−グルコサミン（N-acetyl-glucosamine）、アミグダリン（amygdalin）、アルブチン（arbutin）、エスクリンフェリックシトラート（esculin ferric citrate）、サリシン（salicin）、Ｄ−セリオビオース（D-celiobiose）、Ｄ−マルトース（D-maltose）、Ｄ−ラクトース（D-lactose）、Ｄ−サッカロース（D-saccharose）、Ｄ−トレハロース（D-trehalose）、Ｄ−ラフィノース（D-raffinose）、澱粉、グリコーゲン（glycogen）、ゲンチオビオース（gentiobiose）、トリソデューム（trisodium）、シトラート（citrate）及びＫｏｈｎ’ｓゼラチンを消費する。また、ＡＰＩ ＺＹＭ ｋｉｔの結果、エステラーゼ（esterase）（Ｃ４）、エステラーゼリパーゼ（esterase lipase）（Ｃ８）、ナフトール−ＡＳ−Ｂｌ−ホスホヒドロラーゼ（naphthol-AS-Bl-phosphohydrolase）及びＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（N-acetyl-ベータ-glucosaminidase）の酵素的活性を示すが、リパーゼ（lipase）（Ｃ−１４）、ロイシンアリールアミターゼ（leucine arylamidase）、バリンアリールアミターゼ（valine arylamidase）、シスチンアリールアミターゼ（cystine arylamidase）、トリプシン（trypsin）、α−キモトリプシン（α-chymotrypsin）、α−ガラクトシダーゼ（α−galactosidase）、β−ガラクトシダーゼ（β−galactosidase）、β−グルコシダーゼ（β−glucosidase）、α−マンノシダーゼ（α−mannosidase）及びα−フコシダーゼ（α−fucosidase）に対しては、活性を示さない。また、３０μｇ／ｍＬ濃度のクロラムフェニコール及びストレプトマイシンに抵抗性を有しているが、１０μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリン（ampicillin）、ペニシリン（penicillin）、ゲンタマイシン（gentamycin）及び３０μｇ／ｍＬ濃度のカナマイシン（kanamycin）、バンコマイシン（vancomycin）、テトラサイクリン（tetracycline）は、許容する。１３％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウムを含有するＲ２Ａ培養液では成長が観察されるが、１４％（ｗ／ｖ）ではそうではない。主要なキノンは、ＭＫ−７である。極性脂質は、ＰＥ（phosphatidylethanolamine）、ＰＧ（phosphatidylglycerol）、ＤＰＧ（diphosphatidylglycerol）、ＧＬ（unknown glycolipid）及びＡＬ１−２（unknown aminolipids）である。基準株（type strain）のＤＮＡ Ｇ＋Ｃ含有量は、５１．２ｍｏｌ％である。基準株ＹＣ７０１０Ｔ（＝ＫＡＣＣ１８２２８Ｔ）は、稲（Jinju、Korea）の根から分離した。
【０１１５】
以上のように、本実施例では、稲の根から分離した多くの内生細菌菌株の中で、バチルス（Bacillus）属の６％が拮抗性であり、植物病原体の菌糸成長を抑制することが判明された。以前の研究によると、干潟の植物から分離された複数のバチルス（Bacillus）属及び他のグラム−陰性細菌を含む内生細菌の約９％は、卵菌類植物病原体（oomycetous phytopathogens）に対して拮抗性を有することが報告されている（非特許文献７参照）。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列によると、バチルス（Bacillus）属に属する本発明に係る菌株は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ実験において、主要な稲真菌性および細菌性病原菌に対して拮抗活性を有することが確認された。これらの分離された菌株の中でバチルス・シアメンシス（B．siamensis）と最も高い類似性を有するＹＣ７００７及びＹＣ７０１０菌株は、イネばか苗病の病原菌（bakanae pathogen）であって、最も重要なイネ種子由来の病原菌であるフサリウム・フジクロイ（F．fujikuroi）の菌糸成長を抑制する強力な拮抗活性を示した。ＹＣ７００７の培養ろ液もまた、イネばか苗病（bakanae）、白葉枯病（bacterial blight）及びイネもみ枯細菌病（grain rot）に対して強力な抑制活性を有しているため、抗真菌物質を生産する菌株であると言える。いくつかのバチルス属は、フェンギシン（fengycin）、イツリン（iturin）及びサーファクチン（surfactin）のような若干のペプチド及びリポペプチドを生産し、植物病原体に良い抑制効果を有することが報告されている（Bais，H．P.，Fall，R．and Vivanco，J．M．2004．Biocontrol of Bacillus subtilisagainst infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production．Plant Physiol．134:307-319;Crane，J．M.，Gibson，D．M.，Vaughan，R．H．and Bergstrom，G．C．2013．Iturin levels on wheat spikes linked to biological control of Fusarium head blight by Bacillus amyloliquefaciens．Phytopathology 103:146-155;Dimkic，1.，Zivkovic，S.，Beric，T.，Ｉvanovic，Z.，Gavrilovic，V.，Stankovic，S．and Fira，D．2013．Characterization and evaluation of two Bacillus strains，SS-12.6 and SS-13.1，as potential agents for the control of phytopathogenic bacteria and fungi．Biol．Control 65:312-321．）。ＹＣ７００７菌株の細胞懸濁液を灌注することにより、穂枯病（panicle blight）及び白葉枯病（bacterial blight）の発病を抑制できることをポート実験から確認した。これは、全身抵抗性誘導を意味する。穂枯病（panicle blight）の発病度は、１０５（ＣＦＵ／ｍＬ）濃度のＹＣ７００７菌株の処理により減少し、１０６から１０７ＣＦＵ／ｍＬのより高い濃度で６２％以上発病を抑制した。ＹＣ７００７の培養ろ液もまた、対照群と比較して、穂枯病（panicle blight）及び白葉枯病（bacterial blight）の発病を７０％以上減少させた。バチルス・サブチリス（B．subtilis）（２．５×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）及びバチルス・セレウス（B．cereus）ＡＲ１５６（５×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）の細胞懸濁液の処理により、それぞれシロイヌナズナ（Arabidopsis）の根及び葉の斑点病（speck diseases）を防除することが判明されている（Bais et al.，2004;Niu，D．D.，Liu，H．X.，Jiang，C．H.，Wang，Y．P.，Wang，Q．Y.，Jin，H．L．and Guo，J．H．2011．The plant growth promoting rhizobacterium Bacillus cereus AR156 induces systemic resistance in Arabidopsis thaliana by simultaneously activating salicylate-and jasmonate/ethylene dependent signaling pathways．Mol．Plant-Microbe Interact��24:533-542．）。バチルス・サブチリス（B．subtilis）及びバチルス・セレウス（B．cereus）ＡＲ１５６は、細菌濃度（１０８ＣＦＵ／ｍＬ）がＹＣ７００７（１０６ＣＦＵ／ｍＬ）の１００倍以上であり、生産農家で実用的に使用するには現実的ではない。生物農薬としての拮抗細菌を開発するためには、細菌の最適濃度が、使用者の最終使用時の希釈因子を考慮したとき、１０７ＣＦＵ／ｍＬのレベル以下でなければならない（Chen，X．H.，Scholz，R.，Borriss，M.，Junge，H.，Mogel，G.，Kunz，S．and Borriss，R．2009．Difficidin and bacilysin produced by plant associated Bacillus amyloliquefaciensare efficient in controlling fire blight disease．J．Biotechnol．140:38-44．）。病原菌に対して拮抗活性を有する細菌懸濁液を稲の根圏に灌注し、培養ろ液を葉面噴霧することにより、ＹＣ７００７菌株が病原菌の間で直接及び／又は間接的に相互作用をしているものと推定される。穂枯病（panicle blight）及び白葉枯病（bacterial blight）は、灌注または噴霧処理により防除されるが、ＹＣ７００７菌株が病害の抑制において、誘導全身抵抗性（induced systemic resistance；ＩＳＲ）又は全身獲得抵抗性（systemic acquired resistance；ＳＡＲ）を通じて作用して防除されるものと考えられる（Ahn，Ｉ．P.，Lee，S．W．and Suh，S．C．2007．Rhizobacteria induced priming in Arabidopsis is dependent on ethylene，jasmonic acid，and NPR1．Mol．Plant-Microbe Interact．20:759-768;Niu et al.，2011）。反応メカニズムは、ＳＡＲ又はＩＳＲにおいてサリチリック（salicylic）、ジャスモニック（jasmonic）又はエチレン（ethylene）の経路を通したホルモン信号の側面で決定する必要がある。
【０１１６】
複数のバチルス種は、不利な環境で長期間に渡って持続性があり、生物農薬として実用化されている。そのいくつかは、全身抵抗性を誘導することにより、多くの植物において機能を発揮している（Hu et al．、2011;Kloepper et al．、2004）。バチルス・バリスモルティス（B．vallismortis）ＥＸＴＮ−１及びバチルス・セレウス（B．cereus）は、いもち病（rice blast）、イネ紋枯病（rice sheath blight）及びイネばか苗病（bakanae）の防除に使用されている（Kazempour and Elahinia、2007;Park et al．、2006）。バチルス菌株ＹＣ７００７が、穂枯病（panicle blight）及び白葉枯病（bacterial blight）の主要な細菌病に対して、稲での抵抗性誘導に長期持続活性を有することは、本研究で初めて報告するものと考えられる。さらに、ＹＣ７００７菌株は、発芽直後、幼苗期に細菌懸濁液を１回適用することにより、稲の生長を促進させるのに有効であることが示された。ＹＣ７００７菌株は、対照群に比べて幼苗期、分蘖期及び出穂期において、芽及び根の長さを１．１−２．９倍増加させた。また、分蘖期及び出穂期において分蘖数を１．３倍増加させた。これは、プロバイオティックバクテリウムＹＣ７００７による抵抗性誘導及び生長促進活性が幼苗期から出穂期まで長く持続することを意味する（Picard，C.，Baruffa，E．and Bosco，M．2008．Enrichment and diversity of plant probiotic microorganisms in the rhizosphere of hybrid maize during four growth cycles．Soil Biol．Biochem．40:106-115．）。宿主抵抗性の誘導は、ジベレリン酸及びオーキシンの植物ホルモンに関連する成長を抑制する点で、宿主植物に負の影響を与えることが知られている。免疫システムは、それぞれ稲及びシロイヌナズナ（Arabidopsis）において少なくとも部分的にホルモンとの相互作用（negative cross talk）を通してジベレリン酸及びオーキシンを抑制するブラシノステロイド（brassinosteroids）及びサリチル酸（salicylic acid）により調節される（De Vleesschauwer，D.，Van Buyten，E.，Satoh，K.，Balidion，J.，Mauleon，R.，Choi，Ｉ．R.，Vera Cruz，C.，Kikuchi，S．and Hofte，M．2012．Brassinosteroids antagonize gibberellins and salicylate mediated root immunity in rice．Plant Physiol．158:1833-1846;Wang，D，Mukhtar，K．P.，Culler，A．H．and Dong，X．2007．Salicylic acid inhibits pathogen growth in plants through repression of the auxin signaling pathway．Curr．Biol．17:1784-1790．）。サリチル酸、ＢＴＨ（benzothiadiazole）の化学的誘導体は、稲、キュウリ、シロイヌナズナ及び胡椒において寄生栄養病原菌に対してサリチル酸の信号網を介して全身抵抗性を誘導するが、オーキシン反応を阻害して植物の生長を遅延させる。一方、バチルス種を含むいくつかの根圏細菌は、植物の生長に負の影響を与えることなく抵抗性誘導を増大させる（Ahn et al.，2005;Ryu et al.，2004;Yang，J．W.，Yu，S．H．and Ryu，C．M．2009．Priming of defense-related genes confers root-colonizing Bacilli-elicited induced systemic resistance in pepper．Plant Pathol．J．25:389-399．）。これらのことから、ＹＣ７００７菌株は、副作用なしに稲での抵抗性誘導及び生長促進の多機能性を有する生物防除剤の開発において、良い候補であると言える。また、ＹＣ７００７菌株は、抗生物質の生産により抗真菌性及び抗細菌性活性を有すると考えられる。
【０１１７】
本発明において、ＹＣ７００７及びＹＣ７０１０と名づけられた２つの内生菌株は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列、ＤＮＡ−ＤＮＡ混成化、脂肪酸の分析および他の物理的・生化学的実験を含む多相研究に基づいてさらに特徴化された。両菌株は、系統樹で同じ枝長さを有する同一の分岐群（clade）にあるバチルス属の新たな種と同定された。両菌株は、合計配列分岐比率は同じであったが、系統樹分岐群で他の近縁種とは相違していた。ＹＣ７００７及びＹＣ７０１０菌株は、１００％の類似性を示し、９１．５％の非常に高いＤＮＡ−ＤＮＡ関連性値を示した。このことから、両菌株は同一のバチルス種であることが分かった。ＹＣ７０１０基準株と比較すると、バチルス・シアメンシス（B．siamensis）、バチルス・メチロトロフィカス（B．methylotrophicus）、バチルス・サブチリス（B．subtilis subsp．inaquosorum）、バチルス・アミロリケファシエンス（B．amyloliquefaciens subsp．plantarum）及びバチルス・テクィレンシス（B．tequilensis）などの他の関連菌株のＤＮＡ−ＤＮＡ混成化値は、７０％未満であり、ＹＣ７０１０菌株は新型であることが分かった（Goris，J.，Konstantinidis，K．T.，Klappenbach，J．A.，Coenye，T.，Vandamme，P．and Tiedje，J．M．2007．DNA-DNA hybridization values and their relationship to whole genome sequence similarities．Int．J．Syst．Evol．Microbiol．57:81-91．;Stackebrandt，E．and Goebel，B．M．1994．Taxonomic Note:A place for DNA-DNA reassociation and 16s rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology．Int．J．Syst．Bacteriol．44:846-849．）。また、両菌株は、ＡＰＩ ｋｉｔｓを用いた物理的・生化学的実験においてほぼ同じ反応を示したが、他の参考基準株に対しては異なる反応を示した。このことから、両菌株は、他の関連するバチルス菌株とは区別されるものであることが分かった。塩化ナトリウムに対する耐性において、両菌株は、１３％塩化ナトリウムまで生存したが、バチルス・メチロトロフィカス（B．methylotrophicus）は、１０％塩化ナトリウムで成長しなかった（非特許文献１参照）。ＹＣ７００７及びＹＣ７０１０の主要な細胞脂肪酸は、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０及びｉｓｏ Ｃ１５：０であり、バチルス属の他の関連種と同一であった。両菌株の少量の他の脂肪酸は、近縁種のバチルス菌株のものとは異なるものであることが示された。各細菌は、特有の脂肪酸プロファイルを有しており、細菌分類の効果的な手段として脂肪酸分析が用いられる（Kampfer，P．1994．Limits and possibilities of total fatty acid analysis for classification and ｉdentification of Bacillus species．Syst．Appl．Microbiol．17:86-98．）。ＹＣ７００７及びＹＣ７０１０菌株の主要なイソプレノイドキノンは、バチルス属の基準株と同様に、ＭＫ−７（menaquinone-7）であった（Chen，J．H.，Tian，X．R.，Ruan，Y.，He，Z．Q.，Tang，S．K.，Li，W．J.，Shi，H．and Chen，Y．G．2015．Bacillus crassostreae sp.，nov.，isolated from an oyster in the South China Sea．Int．J． Syst．Evol．Microbiol．Doi:10.1099/ijs．0．000139．;Kang，H.，Weerawongwiwat，V.，Kim，J．H.，Sukhoom，A．and Kim，W．2013．Bacillus songkensis sp．Nov.，isolated from soil．Int．J．Syst．Evol．Microbiol．63:4189-4195．）。両菌株のＤＮＡ Ｇ＋Ｃ含有量は、５０．５〜５１．２ｍｏｌ％と類似するが、他のバチルス種に比べて若干高かった（非特許文献１及び非特許文献１７参照）。両菌株の主要な極性���質は、ＰＥ、ＰＧ及びＤＰＧであり、バチルス・シアメンシス（B．siamensis）及びバチルス・ソンクレンシス（B．songklensis）と相応した（Kang et al．、2013；非特許文献１７）。
【０１１８】
多相研究の全てのデータに基づくと、菌株ＹＣ７００７及びＹＣ７０１０は、バチルス属に属するものである。したがって、ＹＣ７００７及びＹＣ７０１０菌株を新たな種として提案し、基準株としてバチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola YC7010T sp．nov．）と名づけた。結論として、内生菌株バチルスオリジコラ（B．oryzicola）ＹＣ７００７は、稲において多機能性活性を有する菌株であり、真菌性および細菌性病原菌の直接的な抑制、全身抵抗性誘導及び植物生長促進能を発揮し、生産農家で微生物接種剤として実用的に使用することができる。
【０１１９】
以上で説明した本発明の好ましい実施例は、技術的課題を解決するために開示されたものであり、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、本発明の思想及び範囲内で様々な修正、変更、付加等が可能であることが分かる。このような修正、変更などは、以下の特許請求の範囲に属するものと解釈されるべきである。
【０１２０】
（１）配列表１は、本発明の他のバチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）ＹＣ７００７菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
（２）配列表２は、本発明の他のバチルスオリジコラ（Bacillus oryzicola）ＹＣ７０１０菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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