(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）〜（４）を含む、標的の変異性に対応可能な新規抗生物質製造方法：
（１）原核細胞、真核細胞、ウイルス、またはその生成物である標的を決定すること；
（２）前記標的に直接反応する新規抗生物質の分子構造を設計すること：
ここで、前記新規抗生物質の前記分子構造は以下の一般式で表され：
【化１】
0006412077.tif 000018
式中、Ｒは、前記標的を特異的に認識するか前記標的に特異的に結合する認識領域であり、Ｆは、前記標的への医薬作用を生じさせる作用領域であり、前記医薬作用は、前記標的を特異的に調節する作用、修復する作用、標識化する作用、殺す作用、および／または崩壊させる作用であり、
前記工程（２）の前記設計は以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含み、
（ｉ）配列番号８〜配列番号２０及び配列番号２７〜配列番号３３で表される抗体模倣物をコードする一群のポリヌクレオチドからなる認識領域分子構造ライブラリーを確立すること；
（ｉｉ）作用領域分子構造ライブラリーを確立すること；
（ｉｉｉ）前記一般式に従って、前記認識領域分子構造ライブラリーおよび前記作用領域分子構造ライブラリーに基づいて組換え体分子構造ライブラリーを設計すること；
ここで前記（ｉｉｉ）における前記設計は、作用領域または認識領域として用いられる物質の分子構造に基づいて行われ；
（３）前記組換え体分子構造ライブラリーに含まれる組換え体を製造および検証して候補新規抗生物質を得ること；
（４）前記候補新規抗生物質から医薬品としての要件を満たす新規抗生物質をスクリーニングすること；
前記（ｉ）における前記認識領域分子構造ライブラリーは、前記標的を特異的に認識し且つ／または前記標的に特異的に結合する複数の抗体模倣物および前記複数の抗体模倣物の点突然変異体を人工的に製造することおよびその分子構造を得ることにより確立され；
前記複数の抗体模倣物は、前記標的上の固有の物質を特異的に認識できる複数の免疫グロブリンのアミノ酸配列に従って設計され；
前記複数の免疫グロブリンは、標的上の複数の固有物質を免疫原としてそれぞれ動物を免疫化することにより製造され、
前記複数の抗体模倣物はそれぞれ、前記複数の免疫グロブリンのそれぞれの短いＦａｂアーム上のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＦＲ２、ＶＬＣＤＲ３の領域により構成される、Ｎ末端からＣ末端へＶＨＣＤＲ１−ＶＨＦＲ２−ＶＬＣＤＲ３の構造を有するペプチドである。
【請求項２】
前記標的の変異により有効性が低下した場合に、変異した標的に対応して前記工程（３）及び前記工程（４）を再度行う、請求項１に記載の新規抗生物質製造方法。
【請求項３】
前記標的が、細胞膜またはエンベロープの基本構造としてリン脂質二重膜を有するウイルス、原核細胞、または真核細胞であり；
前記医薬作用が、殺すことおよび／または崩壊させることであり；
前記作用領域分子構造ライブラリーが、前記リン脂質二重膜中にイオンチャネルまたは貫通孔を形成できる複数の生物活性物質を含み、
前記複数の生物活性物質が、緑膿菌のバクテリオシン；コリシンＥ１、Ｉａ、Ｉｂ、Ａ、Ｂ、またはＮ；イオンチャネルを形成できるコリシンＥ１、Ｉａ、Ｉｂ、Ａ、Ｂ、および／またはＮのドメイン；並びにコリシンＥ１、Ｉａ、Ｉｂ、Ａ、Ｂ、またはＮから突然変異により得られ、前記リン脂質二重膜中にイオンチャネルを形成する機能を有する分子、からなる群より選択される、
請求項１又は請求項２に記載の新規抗生物質製造方法。
【請求項４】
前記医薬作用が標識化であり、前記作用領域が標識であり、前記組換え体の製造が、作用領域を認識領域に作動可能に連結することである、請求項１又は請求項２に記載の新規抗生物質製造方法。
【請求項５】
前記組換え体が、組換えポリペプチドであり、前記組換え体の製造が、前記組換えポリペプチドをコードする遺伝子を生物学的発現系に形質転換して融合タンパク質を発現させ、前記融合タンパク質を分離および精製することにより新規抗生物質を得ることである、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の新規抗生物質製造方法。
【請求項６】
前記生物学的発現系が大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）である、請求項５に記載の新規抗生物質製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的医薬品開発技術、特に新規抗生物質製造方法およびそれに基づくプラットフォームシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、医薬業界、特に抗生物質の研究開発は以下の困難に直面している。１．薬物耐性病原菌が増えてきている。現行の抗生物質は薬物耐性病原菌にとって脅威とならず、これらの薬物耐性病原菌による死亡率が上昇してきている。２．新規医薬品開発の速度が薬物耐性病原菌の発生ペースよりはるかに遅い。従来の方法による抗生物質のスクリーニングおよび研究開発からの成果の獲得には長い時間および多くのコストが必要である。３．遺伝子操作または生命工学により開発された新規抗生物質は依然として病原菌の薬物耐性が生じ易い。
【０００３】
ＷＨＯの統計データにより、毎年数百万人の薬物耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の感染者中、最終的に約３０％が死亡することが示されており、これはＡＩＤＳの死亡率より高い。薬物耐性黄色ブドウ球菌の感染を治療するための全世界でのコストは毎年２００億米国ドルを超える。薬物耐性黄色ブドウ球菌発生後、バンコマイシンが黄色ブドウ球菌感染の治療において重要な役割を果たすようになった。しかし、２００２年以降、病院でバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌が発生している。バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌の拡散領域は現在は狭いが、これを効果的に抑制できる薬はほとんどないので、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌の感染による死亡率は非常に高い。最近１０年間で、別の薬物耐性細菌である多剤耐性グラム陰性細菌が発生し、それらはより強い薬物耐性を有する。現在の臨床医学で使用されている抗生物質のほとんどは前記薬物耐性細菌にとって脅威となり得ない。
【０００４】
現在、ほとんどの抗生物質は細菌および真菌により生産されるか、化学修飾により天然抗生物質から得られる。従来の抗生物質スクリーニング方法は、土壌サンプルから微生物を単離すること、前記微生物を生育する培地から分泌物を抽出すること、前記分泌物中の抗菌または滅菌作用を有する物質を検出すること、および医薬品としての潜在的価値を有する個々の医薬成分を分離することを含む。この方法は抗生物質開発の最盛期（１９４０〜１９５０年）には非常に効果的であった。しかし、前記スクリーニング方法は天然の細菌および真菌の分泌物に依存し、すなわち発見された微生物の分泌物のスクリーニングおよび修飾により新規抗生物質が得られるので、現在これは末期を迎えつつある。抗生物質を開発するための上記の従来の方法は、長時間要することは避けられず、結果が不確かである。したがって、過去５０年間、製薬会社は抗生物質のスクリーニングを決して止めていないが、スクリーニングされる新規抗生物質は減ってきている。米国感染症学会（ＩＤＳＡ）の統計データにより、米国ＦＤＡの近年の新規医薬品申請中、新規抗生物質の申請は１６個しかなく、高度に薬物耐性であるグラム陰性細菌に対する抗生物質に関する特許出願は１つもないことが示されている。有名でポピュラーな科学誌「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ」は、２００９〜２０１２年まで連続して、スーパー細菌がヒトの生命の安全にとって脅威となりつつあると警告した。米国のＣＤＣは、現在使用されている抗生物質は１０〜２０年後には完全に無力になると予測している。Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｔｉｍｅｓは、農業における抗生物質の乱用により、５年後にはヒトは如何なる抗生物質も利用可能でなかった時代へと戻るであろうと報告しており、ＮＤＭ−１スーパー細菌変異遺伝子は世界をパニックに陥れた。畜産における抗生物質および薬物耐性細菌の問題も深刻であり、農産物の安全性に影響を与えている。最近４０年は抗生物質開発の空白期間である。要約すると、新規医薬品の開発研究速度は薬物耐性細菌の変異のペースよりはるかに遅い。
【０００５】
現在、新規抗生物質の開発には２つの方法がある。（１）現在の抗生物質を修飾するまたは新たな種類の抗生物質を合成する。（２）抗生物質を合成する細菌に遺伝子修飾を行う。しかし、前記２つの方法はどちらも、前記抗生物質の抗菌メカニズムが細菌にとって新規でないという主要な問題点を克服していない。したがって、例外なく、細菌は前記「新規」抗生物質に対する薬物耐性をすぐに生じさせるであろう。
【０００６】
高い可変性、高い生存率、および強い病原性を有する様々な種の病原性微生物に対抗するために現在緊急に解決すべき問題は以下の通りである：
１．病原菌、特に薬物耐性病原菌に対してより強力な抗菌または滅菌作用を有する抗生物質を提供すること。
２．第１項に記載の前記抗生物質の製造方法、好ましくは、新規なまたは変異型の病原性微生物に感度良く抵抗でき、病原菌の変異性に対応することができる、すなわち開発サイクルの短い抗生物質の開発研究方法を提供すること。
３．前記方法により開発された前記抗生物質が、短期間で病原性微生物の薬物耐性を生じさせないこと。
【０００７】
しかし、上記の問題は、最新の数世代の抗生物質および従来の抗生物質開発方法で解決されていない本当の「難問」である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記分野の新規抗生物質を得ることの技術的問題に鑑みて、従来の抗生物質開発戦略とは異なる方法およびプラットフォームを提供する。前記方法およびプラットフォームにより、任意の病原性微生物、標的細胞、または標的組織に対する特異的認識および殺能力を有する新規抗生物質を短期間で提供することができる。前記方法は、病原性微生物の連続的突然変異により生じる薬物耐性を高感度で解決することができる、すなわち新たに生じたバリアント株に対する対応する新規抗生物質を迅速に提供する。また、前記方法により製造された前記新規抗生物質は、その新規な滅菌メカニズムのため、病原性微生物の変化および薬物耐性を滅多に生じさせない。本発明の技術的解決法は以下の通りである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
新規抗生物質の製造方法であって、工程は以下の通りである：
（１）標的を決定すること：前記標的は、前記新規抗生物質が直接反応する原核細胞、真核細胞、ウイルス、またはその生産物である；
（２）前記新規抗生物質の分子構造を設計すること：
以下の一般式に従って前記新規抗生物質の前記分子構造を設計し：
【００１０】
【化１】
0006412077.tif 000002
（式中、Ｒは、前記標的を特異的に認識するかこれに特異的に結合する認識領域であり、Ｆは、前記標的への医薬作用を生じさせる作用領域であり、前記医薬作用は、前記標的を特異的に調節すること、修復すること、標識化すること、殺すこと、および／または崩壊させることである）；
認識領域分子構造ライブラリーを確立すること；
作用領域分子構造ライブラリーを確立すること；
前記一般式に従って、前記認識領域分子構造ライブラリーおよび作用領域分子構造ライブラリーに基づいて組換え体分子構造ライブラリーを設計すること；
前記設計は、作用領域または認識領域として用いられる収集、選択、または製造された物質の分子構造に基づいて行われる構造的再調整、構造的組換え、および／または構造的確認のプロセスである；
（３）前記組換え体分子構造ライブラリーに基づき、候補新規抗生物質を得るために組換え体を製造および検証すること；
（４）候補新規抗生物質から医薬品としての要件を満たす新規抗生物質をスクリーニングする。
【００１１】
前記認識領域分子構造ライブラリーの確立は、検索および分析により前記標的を特異的に認識し且つ／もしくはこれに特異的に結合する現在知られている天然物質を収集すること、および／または、前記標的を特異的に認識し且つ／もしくはこれに特異的に結合する人工物質を人工的に製造することである。
【００１２】
前記天然物質は、前記標的のアクセプターが認識できる天然生物活性分子またはバクテリオファージの認識領域であり；
前記人工物質は、抗体模倣物であり、前記抗体模倣物は、前記標的上の固有の物質を特異的に認識できる免疫グロブリンのアミノ酸配列に従って設計される。
【００１３】
前記抗体模倣物は、前記免疫グロブリンの短いＦａｂアーム上のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＦＲ２、ＶＬＣＤＲ３の領域により構成される、Ｎ末端からＣ末端へＶＨＣＤＲ１−ＶＨＦＲ２−ＶＬＣＤＲ３の構造を有する短ペプチドであるか、
前記短ペプチドの変異物であり；前記変異物は、前記標的上の固有物質への認識能を保存している、前記短ペプチド中のＶＨＣＤＲ１の５アミノ酸残基およびＶＬＣＤＲ３の９アミノ酸残基への人為的部位突然変異により得られた生成物である。
【００１４】
前記免疫グロブリンは複合的であり得る。例えば、ＶＨＣＤＲ１−ＶＨＦＲ２−ＶＬＣＤＲ３のＶＨＣＤＲ１が１つの免疫グロブリンに由来し、ＶＬＣＤＲ３が別の免疫グロブリンに由来する。
【００１５】
前記免疫グロブリンは、標的上の固有物質を免疫原として動物を免疫することにより製造される。
【００１６】
前記免疫グロブリンは、複数の標的上の共通する固有物質を免疫原として動物を免疫することにより製造される。
【００１７】
前記免疫グロブリンは、標的上の複数の固有物質を免疫原としてそれぞれ動物を免疫することにより製造される。
【００１８】
前記標的が、細胞膜またはエンベロープの基本構造としてリン脂質二重膜を有するウイルス、原核細胞、真核細胞である場合、前記医薬作用は、殺すことおよび／または崩壊させることであり；
前記作用領域は、前記リン脂質二重膜にイオンチャネルまたは貫通孔（ｐｏｒｅ  ｐａｔｈ）を形成できる生物活性物質である。
【００１９】
前記作用領域は、緑膿菌のバクテリオシンであるピオシンである。
【００２０】
前記作用領域は、コリシンＥ１、Ｉａ、Ｉｂ、Ａ、Ｂ、またはＮであるか、
イオンチャネルを形成できるコリシン分子Ｅ１、Ｉａ、Ｉｂ、Ａ、Ｂ、および／またはＮのドメインであるか、
前記リン脂質二重膜中にイオンチャネルを形成する機能を有する、コリシン分子Ｅ１、Ｉａ、Ｉｂ、Ａ、Ｂ、もしくはＮまたはイオンチャネルを形成できるコリシン分子Ｅ１、Ｉａ、Ｉｂ、Ａ、Ｂ、もしくはＮのドメインからアロステリズムにより得られる分子である。
【００２１】
前記組換え体は、組換えポリペプチドであり、前記組換え体の製造は、前記組換えポリペプチドをコードする遺伝子を生物学的発現系に形質転換して融合タンパク質を発現させ、融合タンパク質を分離および精製することにより候補新規抗生物質を得ることである。
【００２２】
前記生物学的発現系は、大腸菌ｐＥＴシステムの改変細菌大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）である。
【００２３】
前記医薬作用は標識化であり、前記作用領域は標識であり、前記組換え体の製造は、作用領域と認識領域を作動可能に連結することである。
【００２４】
（１）目標提唱システム（ｇｏａｌ  ｐｒｏｐｏｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）、（２）設計システム（ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）、（３）実験室システム（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）の３つの相互運用可能なシステムを含む新規抗生物質製造のプラットフォームシステムであって、
前記プラットフォームが、請求項１〜１４の何れか一項に記載の前記方法に従って新規抗生物質を製造し；前記目標提唱システムが、開発の目標を決定し、前記設計システムにタスク指示を送達し；
前記設計システムが、認識領域分子構造ライブラリーおよび作用領域分子構造ライブラリーを確立し、前記組換え体の分子構造ライブラリーを設計し、前記分子構造ライブラリーを前記実験室システムに提供し；
前記実験室システムが、前記設計システムに実験結果を提供し；前記設計システムが、最終的に選択された候補生成物を開発の成果物としてマーケティングシステムに報告し；
前記設計が、作用領域または認識領域として用いられる収集、選択、または製造された物質の分子構造に基づいた構造的調整、構造的組換え、および／または構造的確認の手順である、プラットフォームシステム。
【００２５】
前記実験室システムは、前記実験を請け負う少なくとも１つの第三者パートナー施設を含む。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の新規抗生物質製造方法により、ほとんどの標的に対する一群の候補新規抗生物質を製造し、候補から認識領域および作用領域を有する前記標的に特異的な新規抗生物質を選択することができる。本発明の方法では、前記標的は原核細胞（例えば、実施例５の薬物耐性を有する黄色ブドウ球菌、実施例６の環境汚染物質であるシアノバクテリア、実施例３の炭疽菌）、真核細胞（例えば、実施例４の抗真菌ポリペプチドの対象である農業真菌（ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ｆｕｎｇｕｓ）、実施例１のＥＢウイルス誘発腫瘍細胞）、ウイルス（例えば、実施例１中ＥＢウイルス中の固有なエンベロープ糖タンパク質）、前記原核または真核細胞の生産物であり得る。
【００２７】
製造中、以下の一般式に従って、認識領域分子構造ライブラリーおよび作用領域分子構造ライブラリーを確立し、組換え体の分子構造ライブラリーを設計する。
【００２８】
【化２】
0006412077.tif 000003
【００２９】
特定の種の細胞に対する特異的認識を示す物質、例えばフェロモン、認識細胞上のアクセプターのリガンド、ヒトまたは動物中で産生される免疫グロブリンが自然界に存在し、更に、動物の免疫系により生体異物に対する免疫グロブリンが自然に産生されるので、人為的に動物を免疫化することで産生されたまたは天然に存在する免疫グロブリンに基づいて、任意の前記標的に対する認識物質を基本的に得ることができ、そのため、本発明の前記方法の適用範囲は広い。
【００３０】
更に、特定の細胞に致死的変化を形成することができる物質も自然界に存在する。例えば、コリシンおよび緑膿菌バクテリオシンはどちらも作用領域として用いることができるが、これらの欠点は、これらが反応する標的細胞の種が限られていることである。
【００３１】
前述の２種類の物質の欠点を克服しつつ、それらの利点を取り、それらの長所を採用することで、本発明の方法によって製造される新規抗生物質に関して、認識領域が組換え分子全体を導いて標的物質を認識させ、作用領域が医薬作用を完成させる。
【００３２】
本発明の方法の原理は、提唱される標的物質に対する認識領域および作用領域の一群の分子構造を収集および／または設計して分子構造ライブラリーを確立し、次いで、確立された分子構造ライブラリーに従って新規抗生物質の分子構造を設計し、一群の組換え体の分子構造ライブラリーを得、その後、組換え体の分子構造ライブラリーの分子構造情報に沿って一群の候補新規抗生物質を製造し、最後に、前記候補新規抗生物質を１つずつ検証して医薬的標準を満たす新規抗生物質を選択し、一般式に基づいて新規抗生物質を製造することである。本発明の製造方法の利点は以下の通りである。
【００３３】
（１）本発明の方法は、原核細胞、真核細胞、ウイルス、またはその生産物のみを標的として新規抗生物質を製造し、上記のこれらの物質は天然の認識物質を有するか固有の表面物質を有し、あるいは、それら自身を、動物を免疫して自身を認識する免疫グロブリンを得るための免疫原とすることができ、これにより、本発明の製造方法により認識領域を常に得、現在の抗生物質開発のボトルネック、すなわち、薬物作用の標的（すなわち、薬物標的）としてのタンパク質は徐々に使い尽くされてきており、残った標的は創薬困難である（すなわち、薬物と反応しない）という現実を効果的に打ち破ることが可能になる。
【００３４】
更に、作用領域としての物質も自然の中に存在するが、前記物質は異なる医薬作用に関連した選択性を有する。例えば、目標が標的細胞を殺す新規抗生物質の製造である場合、コリシン等の物質が前記目標の達成に適しており；目標が調節、干渉、または標識化である場合、そのような作用を有する物質分子を作用領域として選択することで十分である。本発明の方法の前提となる一般式に基づいて、確実に、ほとんどの標的物質に対して新規抗生物質を製造することができ、すなわち、本発明の方法は、成功率が高く、適用範囲が広い。
【００３５】
（２）本発明の方法の最大の利点は、本発明では一般式に基づいてある標的物質に対して新規抗生物質が製造され、作用領域ライブラリーおよび認識領域ライブラリーのそれぞれを確立することにより組換え体ライブラリーが得られ、十分な作用を有する利用可能な組換え体が組換え体ライブラリーから新規抗生物質として選択されるので、１つの標的に対して複数の新規抗生物質を１度に製造できることおよびそれらが病原性微生物の薬物耐性によく対抗するように製造されることである。これにより、病原性微生物に薬物耐性が発生する速度が速く、薬物耐性が生じたときに他の代替的な抗生物質がないという、現在の新規創薬開発の問題が解決される。
【００３６】
本発明の方法では、認識領域ライブラリーを確立する時、設計される認識領域として特異的モノクローナル抗体が好ましくは選択され、すなわち、それらは一般的に設計される単鎖抗体、先行技術中の小分子抗体、または本発明の発明者が以前に開示した表１に示す構造を有する抗体模倣物として設計される。すなわち、確立された認識領域の分子構造は、表１の抗体模倣物または前記抗体模倣物の点突然変異生成物でよく、点突然変異とは、前記標的に対する認識能を有する、抗体模倣物を構成する２つの認識領域のアミノ酸残基上に人為的に点突然変異を行うことにより得られる短いペプチドを指す。
【００３７】
これにより、確立された認識領域分子構造ライブラリーのメンバーが限りなく拡大し、病原体の突然変異により良く対向することができ、本発明の方法の上記第２の利点が強化される。例えば、１つの認識領域上で起こった薬物耐性により標的（病原性細胞）が認識されない場合、候補として多くの同様な認識領域分子構造があり得る。
【００３８】
抗体模倣物は、抗体よりも多くの利点を有し、獲得および人為的操作がより容易である。向けられる標的が様々であるため、認識領域として用いられる物質は、現在のデータベースから収集されるフェロモン、ファージ認識領域、または特異的モノクローナル抗体であり得るが、それらは結局は限定される。植物、動物、または微生物において見出された生物活性物質中、単一分子を認識するための最も有効な生物活性物質は抗体である。サイズが非常に大きい天然抗体の欠点を避けるために、常に、よりサイズが小さい抗体変異物が設計および製造される。しかし、これらの変異物は、数百アミノ酸残基からなり、本発明者らが求める認識領域と比べてまだサイズが非常に大きい。各天然抗体の短いＦａｂアームは６個の抗原結合領域を有し、これらおよびこれらの骨格は複雑な空間構造を形成する。前記空間構造は特異的抗原を認識してこれに結合する機能を有するが、本発明のプラットフォームにより開発される新規抗生物質では、認識領域は認識機能だけを有すれば十分であり、認識領域は対応する抗原に結合する必要はない。Qiu et al（Small antibody mimetic comprising two complementarity-determining regions and a framework region for tumor targeting, Nature Biotechnology 25(8):921-929(2007)）によれば、Qiu et alは、天然抗体の短いＦａｂアーム上の２個の抗原結合領域および１個の骨格領域を選択して、天然抗体の構造を参照して短いペプチド抗体模倣物を形成した。そのサイズは天然抗体の５０〜３００分の１の大きさであるが、天然抗体の基本的な生物学的活性を保存している、すなわちある抗原を特異的に認識することができる。ヒトまたは動物の免疫系は、免疫原で刺激された時、前記免疫原に対して特異的に免疫グロブリンを産生するように反応するので、本発明は、好ましくは、標的を認識するモノクローナル抗体を製造し、モノクローナル抗体およびQiu et al, 2007の論文に開示されている抗体模倣物設計のアイディアに基づく認識領域を提供する。したがって、任意の病原性微生物細胞または未処置の細胞（ｐｅｎｄｉｎｇ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｃｅｌｌ）を狙って特異的モノクローナル抗体を理論上製造することができ、したがって対応する好適な認識領域物質である抗体模倣物を製造することができる。これにより、本発明の方法によるある標的に対する新規抗生物質の製造の成功率が従来の抗生物質製造方法と比べて定性的に飛躍し、生成物を得るための時間が大きく短縮される。理論的に、１個の標的に対する新規抗生物質、更には一群の新規抗生物質を製造するのにかかる時間は、特異的モノクローナル抗体を得るのにかかる時間および生物工学的方法により組換えタンパク質を製造するのにかかる時間に等しい。
【００３９】
前記標的は、共通の表面抗原を有する複数の標的であり、前記抗体模倣物は、前記共通の表面抗原を抗原組成物として動物を免疫することにより製造される。前記抗体模倣物を認識領域とすることにより製造される新規抗生物質は、複数の前記標的を認識することができる、すなわち、これらは広域抗生物質の作用を有する。
【００４０】
本発明の方法により確立された認識領域分子構造ライブラリーに関して、選択された標的表面上の特異的物質が種々の微生物表面に共通する場合、対応する抗体模倣物は広域認識領域となる、すなわち、表面に同様な物質がありさえすれば、微生物細胞が認識され得、それに対して製造される新規抗生物質は広域抗生物質である。選択された特異的物質が１種類の微生物細胞に固有である場合、対応する抗体模倣物は狭域認識領域となり、同様な物質を有する微生物細胞のみが認識され得る。
【００４１】
選択された標的上の種々の表面物質を免疫原として前記表面物質を別個に用いて動物を免疫して前記微生物細胞を特異的に認識できる多種類の抗体模倣物およびその変異物を得ることにより対応するモノクローナル抗体を作製することが、認識領域ライブラリーを拡張するもう１つのアプローチである。これらの抗体模倣物のいずれか１つを、本発明の方法により開発される新規抗生物質の第１の認識領域として最初に選択することができる。特定の期間実際に用いた後、前記微生物が前記認識領域に対する薬物耐性を発生させた場合（例えば、対応する表面物質（抗原）が変化して、前記認識領域に認識されなくなる）、これらの抗体模倣物から別の１つを、本発明の方法により開発される新規抗生物質の第２認識領域、第３認識領域、第４認識領域・・・として選択して、所望により作製される（ｏｐｔｉｏｎａｌ）種々の新規抗生物質を提供することができ、これにより、先行技術で抗生物質に対する薬物耐性が発生した後の処置のための代替的薬物をすぐに提供できないという問題を効果的に克服することができる。本発明の方法は、１つの新規抗生物質の有効適用期間を延ばすことができる。
【００４２】
前記標的が、細胞膜またはエンベロープの基本構造としてリン脂質二重膜を有するウイルス、原核細胞、または真核細胞である場合、前記医薬作用は、殺すことおよび／または崩壊させることであり、
前記作用領域は、リン脂質二重膜にイオンチャネルまたは貫通孔を形成できる生物活性物質、例えば現在知られているコリシンおよび緑膿菌バルテリオシンであるピオシンである。
【００４３】
前記作用領域は、コリシンＥ１、Ｉａ、Ｉｂ、Ａ、Ｂ、またはＮであるか、あるいは、イオンチャネルを形成できるコリシン分子Ｅ１、Ｉａ、Ｉｂ、Ａ、Ｂ、および／またはＮのドメインであるか；
あるいは、コリシン分子Ｅ１、Ｉａ、Ｉｂ、Ａ、Ｂ、もしくはＮからまたはイオンチャネルを形成できるコリシン分子Ｅ１、Ｉａ、Ｉｂ、Ａ、Ｂ、もしくはＮのドメインからアロステリズムにより得られる、前記リン脂質二重膜にイオンチャネルを形成する機能を有する分子である。ヒトが現在および将来に直面する主な病原性微生物はそれらの細胞膜がリン脂質二重膜構造を有するという共通する特徴を有することが背景技術の記載に説明されている。自然界では、細菌の細胞膜を貫通するイオンチャネルを直接形成することにより細菌を殺す多くのバクテリオシンが存在する。典型的な例は、大腸菌により分泌されるバクテリオシンであるコリシンであり、その機能は、他の種の細菌および大腸菌の宿主であるヒトおよび動物は傷つけずに同じ種であるが異なる株の大腸菌を殺すことである。イオンチャネルを形成するコリシンのモデルサンプルとして、１９５２年にＪａｃｏｂによりコリシンＩａが発見された後、コリシンＩａにより人工脂質二重膜中に形成される開口状態および閉口状態のイオンチャネルの膜貫通空間構造が１９９６年に最終的に実証され（Qiu et al, Major transmembrane movement associated with colicin Ia channel gating. J. Gen. Physiology, 107:313-328 (1996)）、これにより、分子レベルで新規抗生物質を設計および製造するための理論的基礎が築かれた。しかし、野生型コリシンは同じ種であるが異なる株の大腸菌にだけ反応するので、コリシンが他の病原菌を攻撃するようにターゲティングを変える必要がある。したがって、コリシンは本発明のプラットフォームによって開発される新規抗生物質の作用領域の理想的な候補である。
【００４４】
前記組換え体が組換えポリペプチドである場合、前述の作用領域と認識領域の連結は、融合タンパク質を発現するための生物学的発現系に前記組換えポリペプチドをコードする遺伝子を形質転換することを意味し、融合タンパク質を分離および精製することにより新規抗生物質が得られる。
【００４５】
前記医薬作用は標識化であり、前記作用領域は標識であり、前記組換え体の製造は作用領域と認識領域とを作動可能に連結することである。例えば、認識領域の分子は放射性マーカーで標識化することができる。
【００４６】
本発明の方法に関して、標的に対して認識領域分子が確認された後、作用領域分子が選択され、作用領域分子の選択は、前記抗生物質確立の目標に関連する。例えば、目標が標的の調節である場合、修復機能を有する分子を選択することができ、目標が標的を殺すことまたはその成長および発達を制限することである場合、コリシンのような、標的の細胞膜を貫通する致死的なイオンチャネルを形成できる生物学的ポリペプチドを選択することができ、目標が標的の標識化またはイメージングである場合、標識またはイメージング剤を認識領域に連結して標識化のための新規抗生物質を得ることができ、標識化細胞に対する連続的治療または研究を行うために、認識領域を介して標識を標的に結合させる。
【００４７】
ほとんどの標的はその細胞膜またはエンベロープの基本構造としてリン脂質二重層を有するので、新規抗生物質を開発するための本発明の方法において、認識領域ライブラリーの確立が重要な作業である。本発明の方法において、コリシン、緑膿菌のバクテリオシンであるピオシンを作用領域として好ましく選択される。コリシンは、大腸菌間の生存競争および生物多様性維持のための効果的な調節の原動力であり、大腸菌はコリシンによる死滅を避けるために連続的に変化する。コリシンは数十億年前から存在し、個々の多細胞生物のそれぞれの消化管中で未だに代替不可能な生理学的役割を果たしている。本発明の方法により製造される新規抗生物質の攻撃標的は他の種の微生物または細胞であり、これらの微生物または細胞はコリシンにより攻撃されたことがないので、これらの細菌が細菌と同様な免疫タンパク質を産生するまでには長い時間がかかる。したがって、本発明の方法により得られる新規抗生物質は従来の抗生物質より適用寿命が長いと予想される。標的の膜を貫通するイオンチャネルを形成することで、コリシンは強力な滅菌作用を有し、これはペニシリン、シンネマチン（ｃｙｎｎｅｍａｔｉｎ）、バンコマイシン、ストレプトマイシン、カルバペネム、チゲサイクリン等の従来の抗生物質の適切に数百倍、更には数万倍である。本発明の方法により好ましく選択される作用領域は、従来の抗生物質よりもはるかに強い滅菌作用を本発明の方法により製造される新規抗生物質に付与する。
【００４８】
認識領域および作用領域の両方がポリペプチド分子の組換え体である場合、認識領域を作用領域に結合させる方法は、好ましくは、前記組換え体をコードするヌクレオチド配列を合成し、次いで、前記ヌクレオチド配列を乗せた組換え発現ベクターを構築し、最後に、前記組換え発現ベクターを生物学的発現系に形質転換すること、例えば、前記組換え体を、大腸菌の改変株中で発現させて分離することである。更に、大腸菌改変株ｐＥＴシステム、すなわち大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）が本発明の方法における生物学的発現系として好ましく選択され、このシステム中での前記組換えタンパク質の発現率は検証を通じてより高い。
【００４９】
本発明の方法により製造される新規抗生物質について、組換え体を得るステップで一群の組換え体が得られ、従来の機能検証、すなわちその標的および非標的を用いた組換え体の認識および薬理作用の検証により、少なくとも標的に対する認識および薬理作用を有する組換え体、すなわち新規抗生物質が最終的に選択される。標的に対する作用を有さないが非標的に対する作用を有するいくつかの組換え体について、更なる検証によりそれらの作用域を確認することができる。
【００５０】
本発明は更に、新規抗生物質を開発するための前述の方法を運用するプラットフォームシステムを提供し、これは新規抗生物質開発方法の運用を標準化およびモデル化して新規抗生物質の開発効率を向上させる。前記プラットフォームは、３つの協調したシステム群、すなわち（１）目標提唱システム、（２）設計システム、および（３）実験室システムを含む。
【００５１】
前記目標提唱システムは、開発の目標を決定し、設計システムにタスク指示を与え、前記目標提唱システムのタスクは、新規抗生物質を開発するためにどの標的を狙うべきか、新規抗生物質が前記標的に対してどの薬理作用を実行するかを確認し、例えば、探索により、医薬分野の需要、抗生物質の薬物耐性状態を分析し、新規病原体ならびにその情報および実験データまたはアウトソーシング化された契約プロジェクトを収集および計数して、開発目標を確認する。本発明では、前記医薬作用は、調節、修復、マーキング、致死、および／または崩壊の作用である。前記目標提唱システムは、研究開発チーム、マーケティングチームのコアメンバーを含んでいてよく、決定された目標は、いくつかの病原性微生物に対する新規抗生物質を開発するように指示するアウトソーシング化された契約プロジェクトであってもよい。
【００５２】
設計システムは、前記組換え体の認識領域、作用領域、および分子構造を設計し、目標提唱システムからのタスク指示および前記一般式に従い望ましい実験タスクを実験室システムに提唱し；新規抗生物質の設計システムは、目標提唱システムからのタスク指示に従い認識領域ライブラリーおよび作用領域ライブラリーを確立する必要がある。目標提唱システムからの指示に基づいて、認識領域として前記標的を特異的に認識する物質が収集、選択、および製造され；前記標的を特異的に認識する物質の前記製造は、前記標的から分離した固有の物質または前記標的を免疫原として用いた動物の免疫により前記標的を特異的に認識するモノクローナル抗体を得るための製造およびスクリーニングであり；
前記実験室システムは、新規抗生物質設計システムに実験結果を提供し、新規抗生物質設計システムは、最終的に選択された開発成果物の候補生成物を目標提唱システムに報告し；
前記設計は、収集、選択、または製造された物質の分子構造に基づく構造的調整、構造的組換え、および／または構造的確認の手順である。
【００５３】
本発明のプラットフォームシステムにおいて、前記実験室システムは、新規抗生物質設計システムからの指示に従い、実験作業、例えば、認識領域としての候補のモノクローナル抗体の製造、作用領域としてのポリペプチドの製造、および前記組換え体の製造、ならびに一連の検証作業の実施を完了する。基本的に、前記実験室システムの作業は、標的に対するモノクローナル抗体の製造、シークエンシングによりモノクローナル抗体のアミノ酸配列を得ること、設計された抗体模倣物の遺伝子合成、組換え体をコードする遺伝子の合成、組換え体の製造および精製または組換え体の製造、組換え体の検証、実験レポートの作製、ならびに設計システムへのフィードバックを含む。
【００５４】
本発明の開発プラットフォームでは、設計システムが技術のコアであり、実験室システム中の全ての作業は先行技術により完了することができるので、独自の完全な実験室ワークチームを構築することができ、また、実験室ワークチームに管理者を配置するだけにし、実験室システム管理者が、対応する段階の実験作業に注力した第三者パートナー施設に実験室作業をアウトソーシングすることも可能である。前述のプロセスにより、開発作業を高品質、効率的に完了することができ、研究開発リソースが高い費用対効果で統合される。本発明により確立された開発プラットフォームは新規抗生物質の研究開発工場に等しい。
【００５５】
本発明の前記プラットフォームシステムの各システムは、その独自の機能を発揮し、協調してプラットフォームシステム全体を効率的に働かせ、わずか約半年で標的新規抗生物質を作製することを可能にする。実際、この半年の間に、１つの標的に対する一群の新規抗生物質が作製され、抗生物質の製造効率は従来の製造法よりはるかに高い。更に、各システムの作業は狙いを定めて行われるので、会社または研究機関の資金が、実用上適切な意義または販売需要のないプロジェクトに盲目的に投資されるのではなく明確な目標をもって割り当てられる。特に、本発明のプラットフォーム中、システムのいくつかの作業は、対応する分野に特化した第三者パートナーにアウトソーシングすることができる。その結果、研究開発の設備およびリソースの高効率な統合および利用を実現できるだけでなく、研究開発コストが下がり、かかる時間が短縮される。
【００５６】
本発明の前記プラットフォームシステムの作業フローチャートを図５に示す。これは開発作業中の無駄および反復を最大限避けている。
【００５７】
要約すると、本発明の方法およびプラットフォームシステムは医薬品の新規な製造方法を提供し、従来の抗生物質製造方法より優れた利点は以下の通りである。
【００５８】
（１）抗生物質をスクリーニングする従来の方法の制限を受けない：本発明の方法により製造される新規抗生物質は共通する構造的構成を有し、すなわち作用領域および認識領域からなる。リン脂質二重細胞膜を有する標的に対する開発プロジェクトでは、現在のコリシンを作用領域として選択することができ、認識領域の導入下、新規抗生物質のコリシンは、リン脂質二重細胞膜構造を有するほぼ全ての細胞膜を貫通する致死的なイオンチャネルを形成することができる。
【００５９】
ほとんどの微生物の細胞膜表面には属固有、種固有、または株固有の表面物質が存在しているので、前記表面物質または前記表面物質を含む細胞を免疫原として用いることによる標的を特異的に認識するモノクローナル抗体の製造は現在非常に成熟した技術であり、前記モノクローナル抗体を得た後、本発明者の以前の発明における抗体模倣物設計のアイディアに鑑みて、抗体模倣物が認識領域として得られる。それにより、本発明の開発方法は、現在発見されている薬物作用の標的（すなわち、薬物標的）としてのタンパク質が徐々に尽きてきており、残った標的が薬理学的に重要である（創薬困難、すなわち薬物と反応しない）という制限を受けず、ほとんどの病原性微生物に対して特異的に新規抗生物質を開発することができる。
【００６０】
（２）病原性微生物の薬物耐性に感度良く対抗する能力：病原性微生物中には表面抗原物質が１つだけではないので、対応するモノクローナル抗体を作製するための動物の免疫に、標的微生物の表面上の種々の表面物質を選択することができ、したがって、前記微生物細胞を特異的に認識できる多種類の抗体模倣物およびその変異物が得られる。図３に示されるように、これらの抗体模倣物のいずれかを、本発明の方法により開発される新規抗生物質の第１認識領域として最初に選択することができる。実際に一定期間用いた後、前記微生物が前記認識領域に対して薬物耐性を発生した場合（例えば、対応する表面物質（抗原）の構造が変化して前記認識領域に認識されなくなる）、これらの抗体模倣物から別のものを本発明の方法により開発される新規抗生物質の第２認識領域、第３認識領域、第４認識領域・・・として選択することができ、したがって、所望により作製される種々の新規抗生物質が提供され、これにより、先行技術において抗生物質に対する薬物耐性が発生した後に治療のための代替的薬物をすぐに提供できないという問題が効果的に克服される。本発明の方法は、１つの新規抗生物質の有効適用期間を延ばすことができる。
【００６１】
（３）本発明の前記プラットフォームまたは方法で提供される認識領域物質は、抗体模倣物および前記抗体模倣物の短ペプチド上の点突然変異による変異物を好ましくは含む。したがって、図４に示すように、標的病原性微生物の表面抗原上で突然変異が起こった場合、前記表面抗原の認識用の候補抗体模倣物が１つだけでないので、本発明の開発方法が薬物耐性に対抗する能力は更に改善される。
【００６２】
（４）標的が薬物耐性を発生しにくい。本発明の方法では、新規抗生物質の作用領域の物質としてコリシンを選択することが好ましく、コリシンの殺菌メカニズムはほとんどの現行の抗生物質と異なり、病原性微生物にあまり知られておらず、病原性微生物で薬物耐性が生じるまでに長い時間がかかり、次世代抗生物質を開発するための多くの時間が得られる。
【００６３】
（５）標的の膜を貫通するイオンチャネルの形成を用いることにより、コリシンは強力な滅菌作用を有し、これは、ペニシリン、シンネマチン、バンコマイシン、ストレプトマイシン、カルバペネム、チゲサイクリン等の従来の抗生物質の適切に数百倍、更には数万倍である。本発明の方法の好ましい作用領域として、コリシンは本発明の方法により製造される新規抗生物質に従来の抗生物質よりはるかに強い滅菌作用を付与する。
【００６４】
（６）長時間かかる従来の抗生物質スクリーニング方法と異なり、本発明の方法では種々の病原性微生物に対する一群の新規抗生物質の製造に４〜６ヶ月しか要しない。手順は、種々の抗原を用いて動物（マウス）を免疫し、２〜３週間の抗体産生期間の後に、対応するモノクローナル抗体を瀉血（ｈａｅｍｏｓｐａｓｉａ）によりスクリーニングし、モノクローナル抗体のＦａｂセグメントの重鎖および軽鎖の可変領域および骨格をコードするヌクレオチド配列をタンパク質シークエンシングおよび遺伝子翻訳技術により得、得られたヌクレオチド配列に基づき、認識領域である抗体模倣物をコードする遺伝子を設計し、これを作用領域であるコリシンをコードする遺伝子に連結して組換えプラスミドを構築し、改変された細菌に前記組換えプラスミドを形質転換して増殖により新規抗生物質を発現させることである。その後、分離および精製された新規抗生物質の抗生作用および細胞破壊作用の特異性および感度を検証する。手順全体で一群の新規抗生物質をスクリーニングするのに約半年しか要しない。このような高効率の構築および生産は、従来の抗生物質の構築および生産に革命的変化をもたらすであろう。
【００６５】
（７）本発明のプラットフォームは、新規抗生物質を効率的に開発するための共同作業（ｔｅａｍｗｏｒｋ）アプローチおよびリソース利用方法を提供する。開発される抗生物質は共通する構造的特徴を有するので、本発明の前記プラットフォームにより、研究開発リソースが効果的に統合され、開発作業をフローライン生産（ｆｌｏｗ−ｌｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）として行うことができ、これは新規抗生物質の研究開発工場に匹敵する。
【００６６】
要約すると、本発明の新規抗生物質を開発する方法およびプラットフォームシステムは、ほとんどの病原性微生物および標的に対する特異的認識領域および作用領域を有する新規抗生物質を提供することができる。ほとんどの標的について、現在知られているバクテリオシンが作用領域の役割をする構成要素であるので、新規抗生物質の開発サイクルは、分子構造を設計する時間ならびに組換え体を製造および検証する時間に依存する。認識領域は、選択される天然物質にだけ依存するのではなく、認識領域として人工的に製造される抗体模倣物に主に依存し、一方、免疫原を用いて動物を免疫化することによりモノクローナル抗体を得た後、前記モノクローナル抗体のアミノ酸配列を得ることは現在成熟した技術であるので、現在の生物工学のレベルに基づいて、新規抗生物質の開発にかかる時間を基本的に短期間に調整することができる。本発明の前記開発方法を運用するためのプラットフォームにより、ヒューマンリソースおよび技術リソースが完全に最適化、利用、および統合されて、開発プロセスの効率的実施が確実になり、新規抗生物質開発がフローライン生産として運用される。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明の方法により開発される新規抗生物質の一般式を示す図であり、Ｆは作用領域、Ｒは認識領域である。
【図２】抗体模倣物の構造を示す図である。
【図３】認識領域を構築する戦略１を示す図である。
【図４】認識領域を構築する戦略２を示す図である。
【図５】プラットフォーム作業フローチャートを示す図である。Ｍは目標提唱システムを表し、Ｄは設計システムを表し、Ｌは実験室システムを表し、矢頭が２つの矢印は、新規抗生物質製造中の情報交換方向を表す。
【図６】ＥＢウイルス誘発バーキットリンパ腫に対する新規抗生物質のインビトロ殺作用を比較した図である。（Ａ）対照群、（Ｂ）新規抗生物質第１群で処置された群。
【図７】メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４２）、バンコマイシン耐性エンテロコッカス（ＡＴＣＣ  ７００８０２）、多剤耐性緑膿菌（華西病院（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｉｎａ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）の臨床単離株１３５７８）に対する、本発明により製造された新規抗生物質、野生型コリシン、および抗黄色ブドウ球菌ポリペプチド（中国特許第０１１２８８３６．１号）の阻害についての生存曲線の比較を示す図である。  縦軸は最小阻止濃度（ｎＭｏｌ）を表す。  Ａ、バンコマイシン耐性エンテロコッカス、（１）抗黄色ブドウ球菌ポリペプチド、ＭＩＣ＝０．９１ｎＭｏｌ、（２）野生型コリシンＩａ、ＭＩＣ＝０．９１ｎＭｏｌ、（３）ＰＭＣ−ＡＭ１、ＭＩＣ＝０．２３ｎＭｏｌ；Ｂ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、（１）抗黄色ブドウ球菌ポリペプチド、ＭＩＣ＝０．０６ｎＭｏｌ、（２）野生型コリシンＩａ、ＭＩＣ＝０．２３ｎＭｏｌ、（３）ＰＭＣ−ＡＭ１、ＭＩＣ＝０．０６ｎＭｏｌ；Ｃ、多剤耐性緑膿菌、（１）抗黄色ブドウ球菌ポリペプチド、ＭＩＣ＝０．９１ｎＭｏｌ、（２）野生型コリシンＩａ、ＭＩＣ＝０．９１ｎＭｏｌ、（３）ＰＭＣ−ＡＭ１、ＭＩＣ＝０．２３ｎＭｏｌ。
【図８Ａ】液体培地中で生育中のミクロキスティス・エルギノサ（ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対する抗シアノバクテリアポリペプチドの阻害の試験結果を示す図である。左のフラスコは対照、右のフラスコは３５μｇ／ｍｌの抗シアノバクテリアポリペプチドである。
【図８Ｂ】液体培地中で生育中のアナベナに対する抗シアノバクテリアポリペプチドの阻害の試験結果を示す図である。左のフラスコは対照、右のフラスコは３５μｇ／ｍｌの抗シアノバクテリアポリペプチドである。
【図８Ｃ】液体培地中で生育中のクロレラに対する抗シアノバクテリアポリペプチドの阻害の試験結果を示す図である。左のフラスコは対照、右のフラスコは３５μｇ／ｍｌの抗シアノバクテリアポリペプチドである。
【図８Ｄ】液体培地中で生育中のセネデスムス（ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）に対する抗シアノバクテリアポリペプチドの阻害の試験結果を示す図である。左のフラスコは対照、右のフラスコは３５μｇ／ｍｌの抗シアノバクテリアポリペプチドである。
【実施例】
【００６８】
以下に現在完了している開発例を用いて本発明の方法およびプラットフォームを説明する。
【００６９】
実施例１
ウイルス誘発腫瘍に対する新規抗生物質の製造
（１）標的の決定：ＥＢウイルス誘発腫瘍細胞に対する致死的新規抗生物質を決定する。
（２）新規抗生物質の分子構造の設計：
以下の一般式に従って以下の設計作業を行った。
【００７０】
【化３】
0006412077.tif 000004
式中、Ｆは作用領域であり、Ｒは認識領域である。
【００７１】
認識領域分子構造ライブラリーの確立：
ＥＢウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体である抗ＥＢウイルスエンベロープ糖タンパク質抗体ｇｐ３２０、すなわちＡＴＣＣ  ＨＢ−１６８ハイブリドーマ細胞により分泌されるモノクローナル抗体および先行技術中にあったそのアミノ酸配列情報をデータベース検索により見出した。
【００７２】
前記モノクローナル抗体に基づき、本発明者らは、表１に示す一連の抗体模倣物構造を設計し、表１に記載した構造の抗体模倣物の最初の５個および最後の９個のアミノ酸のランダム点突然変異により一連の変異物を得た。
【００７３】
【表１】
0006412077.tif 000005
【００７４】
作用領域分子構造ライブラリーの構築：
製造の目標がＥＢウイルス誘発腫瘍細胞に対する致死的新規抗生物質であり、コリシンが、それ自体で、同じ種であるが異なる株の大腸菌の細胞膜を貫通する致死的イオンチャネルを形成して同じ種であるが異なる株の大腸菌を殺すことができるので、これを作用領域の適切な候補物質とした。そこで、コリシンＩａ、Ｉｂ、Ａ、Ｂ、およびＮまたは変異配列を作用領域ライブラリーの物質として選択し、実験室システムに提供した。
【００７５】
設計された組換え体分子構造ライブラリーの予備的獲得：
アミノ末端からカルボキシル末端へ、コリシンまたはその変異物＋ＥＢウイルスエンベロープ糖タンパク質を認識する２８ペプチド模倣物、およびいくつかの組換え体の分子構造を表２に示す。
【００７６】
【表２】
0006412077.tif 000006
【００７７】
（３）実験室システム：提供された作用領域および認識領域を連結することにより組換え体ライブラリーを得、前記組換え体をコードする遺伝子を発現ベクターに挿入して組換え体発現ベクターを得、改変された細菌に前記組換え体発現ベクターを形質転換することにより一群の組換えポリペプチドを得た。
【００７８】
得られた組換え体の抗標的検証実験を行った（検証方法および実験デザインは中国特許第２００４１００８１４４６．８号に記載のものと同じ）。表２の組換え体３および９がＥＢウイルス誘発腫瘍細胞に対する最も強い殺作用を示した。これらのＥＢウイルス誘発バーキットリンパ腫でのインビトロ殺作用実験の結果を図６に示す。他の９種類の組換え体は、組換え体３および９より弱い、ＥＢウイルス誘発腫瘍に対する様々な殺作用を有していた。全ての組換え体は正常細胞への毒性作用および副作用を有さなかった。検証の実験プロセスは中国特許第２００４１００８１４４６．８号の実施例２〜５に記載のものと同じである。
【００７９】
認識領域として組換え体３および９における抗体模倣物の変異体を用いて製造された組換え体は、表３中、認識領域として配列番号２〜６を有する組換え体が組換え体３または９と基本的に同等なＥＢウイルス誘発腫瘍細胞に対する殺作用を有することが検証された。
【００８０】
【表３】
0006412077.tif 000007
【００８１】
この製造に要した時間は６ヶ月未満であり、標的に対する特異的殺作用を有する一群の候補新規抗生物質を得ることに成功した。
【００８２】
本実施例中の各組換え体を得るために採用した実験方法および材料は、ベクター構築時に挿入した遺伝子配列以外は中国特許第２００４１００８１４４６．８号に記載のものと全く同じであるので、ここでは繰り返さない。
【００８３】
実施例２
ディプロコッカス・イントラセルラリス（ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）に対する新規抗生物質の製造
（１）標的の決定：ディプロコッカス・イントラセルラリス。
（２）新規抗生物質の分子構造の設計：
以下の一般式に従って以下の設計作業を行った。
【００８４】
【化４】
0006412077.tif 000008
式中、Ｆは作用領域であり、Ｒは認識領域である
【００８５】
認識領域分子構造ライブラリーの確立：
ポーリンは、グラム陽性細菌、例えばブドウ球菌、連鎖球菌、エンテロコッカス；グラム陰性細菌、例えば大腸菌、肺炎杆菌、緑膿菌、ボウマン・アシネトバクター（ｂｏｗｍａｎ  ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター・クロアカ（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、バチルス・ブレスラビエンシス（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ）、セラチア・マルセセンス（ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、エロモナス（ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、ビブリオ（ｖｉｂｒｉｏ）、ミキソコッカス（ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、および結核菌に共通する外側膜タンパク質の１つであり、これは理想的な抗原タンパク質であり、ＰｏｒＡはポーリンの１種である。
【００８６】
先行技術中に存在していたポーリンＰｏｒＡを特異的に認識するモノクローナル抗体をデータベース検索により発見した。その重鎖ペプチドのＰＵＢＭＥＤ  ＩＤは２ＭＰＡ＿Ｈであり、その軽鎖ペプチドのＰＵＢＭＥＤ  ＩＤは２ＭＰＡ＿Ｌである。前記モノクローナル抗体に基づき、発明者らは実施例１の表１に示すような一連の抗体模倣物分子構造を設計した。
【００８７】
作用領域分子構造ライブラリーの確立：
製造目標がディプロコッカス・イントラセルラリスに対する致死的新規抗生物質であったので、コリシンが作用領域の適切な候補物質であった。そこで、コリシンＩａ、Ｉｂ、Ａ、Ｂ、およびＮを作用領域ライブラリーの物質として選択し、コリシンＩａ、Ｉｂ、Ａ、Ｂ、およびＮ、そのイオンチャネルドメイン分子、ならびにその変異体分子で作用領域分子構造ライブラリーを構成する。
【００８８】
予備的に設計された組換え体ライブラリーの分子構造は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、コリシンまたはそのイオンチャネルドメインもしくはその変異物＋抗ＰｏｒＡ抗体模倣物であり、いくつかの組換え体の分子構造を表４に示す。
【００８９】
【表４】
0006412077.tif 000009
【００９０】
（３）実験室システム：
前記組換え体をコードする遺伝子を発現ベクターに挿入して組換え体発現ベクターを得、改変された細菌に前記組換え体発現ベクターを形質転換することで一群の組換えポリペプチドを得た。
【００９１】
得られた組換え体の抗標的検証実験を行った。多剤耐性緑膿菌、バンコマイシン耐性エンテロコッカス、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、ボウマン・アシネトバクター、肺炎桿菌、および結核菌に対して、得られた組換え体の殺作用の検証実験を行った（検証方法および実験デザインは中国特許第２００９１００９２１２８．４号に記載されているものと同じである）。表４の組換え体３が前記病原菌に対して最も強い殺作用を有していた。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４２）、バンコマイシン耐性エンテロコッカス（ＡＴＣＣ  ７００８０２）、多剤耐性緑膿菌（華西病院の臨床単離株１３５７８）に対する本発明により製造された新規抗生物質の阻害についての生存曲線の比較を図７に示す。他の５種類の組換え体は、前記薬物耐性細菌に対して組換え体３より弱い様々な殺作用を有していた。全ての組換え体は正常細胞に対する毒性作用および副作用を有さなかった。検証の実験プロセスは中国特許第２００９１００９２１２８．４号の実施例２〜６に記載されているものと同じである。
【００９２】
組換え体３における抗体模倣物の変異体を認識領域とし、コリシンＩａを作用領域として製造された組換え体は、表５中、認識領域として配列番号９〜１３を有する組換え体が基本的に組換え体３に匹敵する前述の病原菌に対する殺作用を有することが検証された。
【００９３】
【表５】
0006412077.tif 000010
【００９４】
この製造に要した時間は６ヶ月未満であり、広域抗菌作用を有する一群の候補新規抗生物質を得ることに成功した。
【００９５】
本実施例中の各組換え体を得るために採用した実験方法および材料は、ベクター構築時の挿入遺伝子配列以外は中国特許第２００９１００９２１２８．４号に記載されているものと全く同じであるので、ここでは繰り返さない。
【００９６】
実施例３
炭疽菌に対する新規抗生物質の製造
（１）目標提唱システムにより、炭疽毒素または炭疽菌が標的として決定された。炭疽毒素または炭疽菌により生じる致死的感染症疾患はヒトの健康にとって大きな脅威である。また、テロリストの攻撃では、炭疽毒素が兵器として最も恐ろしい病原体または毒素である。
【００９７】
この調製の目標は、炭疽菌または炭疽毒素の毒性を破壊する、すなわち炭疽毒素ＰＡ抗原が活性なＰＡ７量体を形成するのを阻害または妨害する新規抗生物質を提供することである。
【００９８】
（２）新規抗生物質の設計：
以下の一般式に従って以下の設計作業を行った。
【００９９】
【化５】
0006412077.tif 000011
式中、Ｆは作用領域であり、Ｒは認識領域である。
【０１００】
炭疽毒素の一般的特徴は、炭疽毒素が生物に非常に有害な２成分毒素であり、タンパク質抗原ＰＡ、ネクロシン、および浮腫因子（ＬＦ／ＥＦ）からなることである。タンパク質抗原ＰＡは輸送構造体であり、標的細胞を認識することができ、ネクロシンおよび浮腫因子（ＬＦ／ＥＦ）を標的細胞中に輸送する。動物実験により、タンパク質抗原とネクロシンを別個に与えても何の反応も起こらないが、タンパク質抗原とネクロシンの組合せはすぐに細胞死を引き起こすことができることが示されている。新規抗生物質の認識領域が炭疽菌ＰＡ抗原を認識でき、新規抗生物質の作用領域が炭疽毒素ＰＡ抗原の活性ＰＡ７量体形成を阻害または妨害できるように、新規抗生物質を予備的に設計した。
【０１０１】
認識領域分子構造ライブラリーの確立：
カニクイザル中で生成された抗炭疽菌タンパク質抗原致死因子複合体抗体（ＮＣＢＩ  ＣＡＬ５８６７１）およびハツカネズミ中で生成された抗炭疽菌タンパク質抗体（ＮＣＢＩＡＢＦ６９３５０）がデータベース検索により発見された。これらは炭疽毒素のタンパク質抗原ＰＡを特異的に認識することができる。前記抗体のアミノ酸情報に基づき、野生型炭疽毒素を認識できるＶＨＣＤＲ１−ＶＨＦＲ２−ＶＬＣＤＲ３の構造を有する一連の抗体模倣物構造およびその突然変異体を設計して、認識領域分子構造ライブラリーを構築し、実験室システムに提供した。
【０１０２】
作用領域分子構造ライブラリーの確立：
製造目標が炭疽毒素ＰＡ抗原の活性ＰＡ７量体形成を阻害することであるので、炭疽毒素の感染メカニズムに従い、本実験では、炭疽毒素ＰＡ抗原の人為的突然変異により得られた、標的細胞の対応する受容体の認識能を失ったいくつかの変異体炭疽毒素ＰＡ抗原（中国特許第２００８１００４５２１２．６号に記載の配列番号１０参照）を作用領域分子構造ライブラリーのメンバーとした。前記変異炭疽毒素ＰＡ抗原および野生型炭疽毒素ＰＡ抗原はヘテロＰＡ７量体を構成し、これは膜貫通活性を完全または部分的に失っており、したがって、炭疽毒素の感染能を妨げた。
【０１０３】
（３）実験室システム：提供された作用領域と認識領域を連結することにより組換え体ライブラリーを得、前記組換え体をコードする遺伝子を発現ベクターに挿入して組換え体発現ベクターを得、改変された細菌に前記組換え体発現ベクターを形質転換することにより一群の組換えポリペプチドを得た。
【０１０４】
認識領域としての表６に記載のアミノ酸配列および作用領域としての変異炭疽毒素ＰＡ抗原（中国特許第２００８１００４５２１２．６号に記載の配列番号１０参照）を有する一群の組換え体を検証により得、これらは炭疽菌に感染したマウスを保護することができた。検証実験およびその結果は中国特許第２００８１００４５２１２．６号に記載のｐＣＨＣＡ−ＰＡ１の効果と同様である。
【０１０５】
【表６】
0006412077.tif 000012
【０１０６】
この製造に要した時間は６ヶ月未満であり、炭疽菌感染に対する保護効果を有する一群の新規抗生物質の獲得に成功した。
【０１０７】
本実施例中の各組換え体を得るために採用した実験方法（例えば、ベクター構築、形質転換、検証実験等）および材料は、新規抗生物質の挿入遺伝子以外は中国特許第２００８１００４５２１２．６号に記載の実施例と全く同じであるので、ここでは繰り返さない。
【０１０８】
実施例４
真菌に対する新規抗生物質の製造
（１）目標提唱システムにより、カンジダ・アルビカンスが標的として決定され、目標は農業真菌カンジダ・アルビカンスを殺す新規抗生物質の製造に決定された。
【０１０９】
（２）新規抗生物質の設計：
以下の一般式に従って以下の設計作業を行った。
【０１１０】
【化６】
0006412077.tif 000013
式中、Ｆは作用領域であり、Ｒは認識領域である。
【０１１１】
認識領域分子構造ライブラリーの確立：
近年、真菌の基礎研究は大きく進歩した。カンジダ・アルビカンスのフェロモンのアミノ酸配列（配列番号２１）は１４アミノ酸残基からなる。これは生物学的培地中を自由に動き回ることができ、同じ種の真菌細胞の細胞膜上の対応する受容体を自動的に探索するという生物学的活性を有する。したがって、そのような自動的探索活性に基づき、認識領域として真菌フェロモンを用いて、細胞膜を貫通するイオンチャネルを形成することによりコリシン等の細菌外毒素のような作用領域を導入してこれらの真菌を殺すことができるので、そのように一群の新規な生物学的殺生物剤を構築した。
【０１１２】
したがって、配列番号２１で表されるカンジダ・アルビカンスのフェロモンを認識領域として選択した。
【０１１３】
作用領域分子構造ライブラリーの確立：
調製目標が標的である農業真菌カンジダ・アルビカンスに対する致死的な新規抗生物質であったので、コリシンがその特徴から作用領域の適切な候補物質であった。そこで、コリシンＩａ、Ｉｂ、Ａ、Ｂ、およびＮ、ならびにそのイオンチャネルドメインを作用領域分子構造ライブラリーのメンバーとして選択し、実験室システムに提供した。
【０１１４】
予備的に設計された新規抗生物質の分子構造は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、コリシンまたはそのイオンチャネルドメインまたはその変異物＋カンジダ・アルビカンスのフェロモンであった。
【０１１５】
（３）実験室システム：
作用領域と認識領域を連結することにより組換え体ライブラリーを得た。前記組換え体をコードする遺伝子を発現ベクターに挿入して組換え体発現ベクターを得、改変された細菌に前記組換え体発現ベクターを形質転換することにより組換えポリペプチドを発現させた。これにより作用領域と認識領域が作動可能に連結された。
【０１１６】
得られた組換え体は、全てがイネイモチ病菌（ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・フラブス（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）のような真菌に感染したイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）に保護効果を有することおよびイネイモチ病へのその保護効果が現在の農業用抗真菌薬より数千倍高いことが検証された。
【０１１７】
本製造中の各組換え体の獲得に関連する実験およびデータ（例えば、ベクター構築、形質転換）は、中国特許第２００７１００５０９２６．１号の実施例中に記載されているか、先行技術の記載に基づいており、当業者は限定された数の実験により本発明の製造に必要な実験方法を得ることができるので、それらはここでは繰り返さない。
【０１１８】
この製造には６ヶ月かかり、野外実験を含めて１．５〜２年しかかからず、この効率および成功率は現在の新薬製造よりはるかに高い。
【０１１９】
実施例５
薬物耐性黄色ブドウ球菌に対する新規抗生物質の製造
（１）目標提唱システムにより黄色ブドウ球菌が標的として決定された。ペニシリン等の抗生物質は１９４４年から適用されているので、細菌、特にヒトの生命を脅かす病原菌、例えば黄色ブドウ球菌、肺炎球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、緑膿菌、結核菌等では薬物耐性を生じており、ヒトにとって薬物耐性菌に対する新規抗生物質の開発が急務である。
【０１２０】
（２）新規抗生物質の設計：
以下の一般式に従って以下の設計作業を行った。
【０１２１】
【化７】
0006412077.tif 000014
式中、Ｆは作用領域であり、Ｒは認識領域である。
【０１２２】
認識領域分子構造ライブラリーの確立：
多くの細胞は細胞の外にシグナル伝達ポリペプチドを分泌する。これらのポリペプチドは同じ種の細菌の細胞膜上の対応する受容体を自動的に探索し、前記受容体に結合して前記細菌中に情報を輸送することができる。ブドウ球菌は細胞外にシグナル伝達ポリペプチドを分泌する。これらのポリペプチドは同じ種の細菌の細胞膜上の対応する受容体を自動的に探索して前記受容体に結合して前記細菌中に情報を輸送することができる。これらのシグナル伝達ポリペプチドは数個から１０個より多いアミノ酸からなり、ブドウ球菌に対する理想的な認識領域である。検索により配列番号２２〜２６のフェロモン配列が認識領域ライブラリーのメンバーとして収集された。
【０１２３】
作用領域の提供：
製造目標が、標的である薬物耐性黄色ブドウ球菌カンジダ・アルビカンスに対する致死的な新規抗生物質であったので、コリシンがその特徴から作用領域の適切な候補物質であった。したがって、コリシンＩａ、Ｉｂ、Ａ、Ｂ、およびＮ、ならびにそのイオンチャネルドメインを作用領域として選択し、実験室システムに提供した。
【０１２４】
予備的に設計された新規抗生物質の分子構造は、アミノ末端からカルボキシル末端へと、コリシンまたはそのイオンチャネルドメインまたはその変異体＋フェロモンおよびフェロモン＋コリシンまたはそのイオンチャネルドメインまたはその変異物であった。
【０１２５】
（３）実験室システム：
作用領域と認識領域を連結することにより組換え体ライブラリーが得られた。前記組換え体をコードする合成遺伝子を発現ベクターに挿入して組換え体発現ベクターを得た。改変された細菌に前記組換え体発現ベクターを形質転換することにより、組換えポリペプチドを発現させて、作用領域と認識領域の作動可能な連結を実現した。
【０１２６】
組換えプラスミドｐＢＨＣ−ＳＡ１、ｐＢＨＣ−ＳＡ２、ｐＢＨＣ−ＳＡ３、ｐＢＨＣ−ＳＡ４、ｐＢＨＣ−ＳＥ、およびｐＢＨＣ−ＰＡにより発現された組換えポリペプチド等の一群の組換え体を得た（中国特許第２００９１０１５７５６４．５号に記載されているように）。これらは全て、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、ペニシリン耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン耐性エンテロコッカス、緑膿菌、および多剤耐性緑膿菌に対する有意な殺作用を有する。
【０１２７】
この製造中の各組換え体の獲得に関連する実験およびデータ（例えば、ベクター構築、形質転換）は、中国特許第２００９１０１５７５６４．５号の実施例中に記載されているか、先行技術中の記録の基づいており、当業者は限定された数の実験により本発明の製造に必要な実験方法を得ることができるので、それらはここでは繰り返さない。
【０１２８】
薬物耐性細菌に対する一群の新規抗生物質の製造には５か月かかった。この効率および成功率は現在の新薬製造よりはるかに高い。
【０１２９】
実施例６
シアノバクテリアに対する新規抗生物質の製造
（１）目標提唱システムにより、シアノバクテリアが標的に決定された。水の富栄養化、水質汚染により生じるシアノバクテリアの増殖は世界の水環境を脅かす最もひどい害であり、ヒトにとって大きな経済的損失を引き起こし地球の生物圏に修復されない害を生じさせる。中国の経済発展により生じた加速的な工業化および都会化と共に、生態学的な環境の汚染および破壊が徐々に悪化しており、水環境の生態学的制御は我々が向き合って解決しなければならない大きな問題である。現在の抗微生物薬はシアノバクテリアにほとんど効果を有さない。シアノバクテリアは、細菌界のシアノバクテリア門に属する原核細胞であり、現在、硫酸銅等の重金属の化学薬品だけがシアノバクテリアを制御できる。しかし、実際的な応用において、効果が限定的であるため、過剰量の化学物質を繰り返し使用する必要があり、シアノバクテリアを殺す時に他の有益な藻類、水生植物、および水生生物が破壊され、環境への不可逆的且つ持続的なダメージとなる。
【０１３０】
目的はシアノバクテリアを殺すまたは抑制する新規抗生物質を製造することである。
（２）新規抗生物質の設計：
以下の一般式に従って以下の設計作業を行った。
【０１３１】
【化８】
0006412077.tif 000015
式中、Ｆは作用領域であり、Ｒは認識領域である。
【０１３２】
認識領域分子構造ライブラリーの確立：
シアノバクテリアを抗原としてマウスを免疫することにより抗シアノバクテリアモノクローナル抗体を分泌する一群のハイブリドーマ細胞を得た。前記ハイブリドーマ細胞の株の１つの寄託番号はＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．４７８３である。
【０１３３】
シークエンシングにより得られた前記モノクローナル抗体のアミノ酸配列に基づき、表１に示す一群の抗体模倣物を設計し、抗体模倣物の最初の５個および最後の９個のアミノ酸上でのランダム点突然変異により抗体模倣物の変異物を得た。前記抗体模倣物分子およびその変異物をメンバーとすることで認識領域分子構造ライブラリーを構築した。ここで、ハイブリドーマ細胞（ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．４７８３）により分泌されるモノクローナル抗体のＶＨＣＤＲ１−ＶＨＦＲ２−ＶＬＣＤＲ３の構造を有する抗体模倣物のアミノ酸配列は配列番号２７に示されている。
【０１３４】
作用領域分子構造ライブラリーの確立：
製造目標がシアノバクテリアを殺すまたは抑制する新規抗生物質であり、コリシンが、それ自体で、同じ種であるが異なる株の大腸菌の細胞膜を貫通する致死的イオンチャネルを形成して同じ種であるが異なる株の大腸菌の死を引き起こすことができるので、これが作用領域の適切な候補物質であった。したがって、コリシンＩａ、Ｉｂ、Ａ、Ｂ、およびＮまたはその変異体配列が作用領域分子構造ライブラリーのメンバーとして選択された。
【０１３５】
設計された新規抗生物質の分子構造の予備的取得：
アミノ末端からカルボキシル末端へ、コリシンまたはその変異物＋抗シアノバクテリア抗体模倣物／変異物。
【０１３６】
（３）実験室システム：
作用領域と認識領域を連結することで組換え体の分子構造を得た。前記組換え体をコードする遺伝子を発現ベクターに挿入して組換え体発現ベクターを得た。改変された細菌に前記組換え体発現ベクターを形質転換することにより組換え体を発現させ、単離した。
【０１３７】
得られたシアノバクテリアに対する組換え体の抑制作用の検証により（検証実験のデザインおよび操作は中国特許第２０１１１０１５５２２１．２号の実施例３〜５に記載されているものと同じである）、前記組換え体がミクロキスティス・エルギノサ、アナベナに対する有意な抑制作用を有するが、他の有益な藻類、例えばクロレラ、珪藻、セネデスムスは抑制しないことが明らかになった。実験結果の一部を図８Ａ〜８Ｄに示す。いくつかの選択された組換え体の分子構造を表７に示す。
【０１３８】
【表７】
0006412077.tif 000016
【０１３９】
この製造に要した時間は１１ヶ月未満であり、標的に対する殺作用を有する一群の検証された新規抗生物質を得ることに成功した。
【０１４０】
この製造中の組換え体を得るために採用した実験方法および材料は、ベクターコンストラクション中の新規抗生物質の挿入遺伝子以外は中国特許第２０１１１０１５５２２１．２号に記載されているものと全く同じであるので、ここでは繰り返さない。
【０１４１】
実施例７．本発明の方法のための好適な生物学的発現系のスクリーニング実験
実施例５〜６に記載の新規抗生物質製造中に組換えプラスミド、ｐＢＨＣ−ＳＡ１、ｐＢＨＣ−ＳＡ２、ｐＢＨＣ−ＳＡ３、ｐＢＨＣ−ＳＡ４、ｐＢＨＣ−ＳＥ、ｐＢＨＣ−ＰＡ、およびｐＢＨＣ−ＰｏｒＡ１を得た。
【０１４２】
ステップ１．コンピテント細胞の形質転換
ＢＬ−２１（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、Ｎｏｖａ  Ｂｌｕｅ（ＤＥ３）、および６１８（ノバジェン社製）等のｐＥＴシステムの種々の改変細菌４０４０μｌをそれぞれ１００ｎｇの組換え変異プラスミドでトランスフェクトし、氷で冷やしながら５分間インキュベートし、４２℃で３０秒間ヒートショックを与え、２分間氷浴に入れ、１６０μｌのＳＯＣ培地を加え、２２０ｒｐｍ、３７℃で振盪しながら１時間インキュベートし、その後、プレート（１％寒天および５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地）上に広げて３７℃で一晩インキュベートした。モノクローナルコロニーを選択して増殖することで株を得、この株を低温で保存した。
【０１４３】
ステップ２．株の回収
１．株の回収
前記保存株を４℃で解凍し、１．５ｍｌの株を１０ｍｌのＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌのＡＭＰを含む）に加え、２２０ｒｐｍ、３７℃で５〜８時間インキュベートした。
【０１４４】
２．モノクローナル株の接種
回収した株培養液を１０４または１０５倍に希釈し、１０μｌの希釈された株培養液を、調製したＬＢ固体培地（５０μｇ／ｍｌ  ＡＭＰ）プレートに入れて広げた。プレートを湿箱の中に置いて３７℃で１０〜１２時間、プレートの表面に丸い単一コロニーが生じるまでインキュベートした。
【０１４５】
ステップ３．株の選択および増殖
（１）インキュベートしたプレートから、縁が滑らかな通常の丸い単一コロニーを、滅菌した爪楊枝または接種ループで選択し、１．５ｍｌのＬＢ培地に入れ、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で５〜８時間培養した。
【０１４６】
（２）１．５ｍｌのＬＢ培地を１００ｍｌのＬＢ培地に加え、２２０ｒｐｍ、３７℃で５〜８時間振盪しながら培養した。
【０１４７】
（３）１次増幅培養：
前のステップから得られた１００ｍｌの株培養液を７００ｍｌの改良ＦＢ−Ｍ９複合培地に加え、２２０ｒｐｍ、３７℃で５〜８時間振盪培養した。
【０１４８】
（４）２次増幅培養：
前のステップから得られた７００ｍｌの株培養液に６×７００ｍｌの改良ＦＢ−Ｍ９複合培地に加え、２２０ｒｐｍ、３７℃で５〜８時間振盪培養した。
【０１４９】
（５）３次増幅培養：
前のステップから得られた６×７００ｍｌの株培養液を２０Ｌの改良ＦＢ−Ｍ９複合培地に加え、振盪速度２２０ｒｐｍ、最大酵素含有量、３７℃で３〜５時間、発酵槽中で培養した。
【０１５０】
（６）改変細菌発酵およびタンパク質発現の誘導：
前のステップから得られた２０Ｌの株培養液を２００Ｌの改良ＦＢ−Ｍ９複合培地に加え、３０℃で２〜４時間、次いで４２℃で０．５時間、最後に３７℃で１〜２時間、２２０ｒｐｍの振盪速度、最大酸素含有量で発酵槽中で培養してタンパク質を発現させた。注：４２℃に達した時に終濃度０．５ｍＭでＩＰＴＧを加えた。
【０１５１】
ステップ４．遠心による株の回収
株培養液を６０００ｇ、４℃で２０分間遠心した。遠心後、沈殿を回収し、５０ｍＭのホウ酸バッファー（ｐＨ９．０）中に再懸濁した。注：２ｍＭ  ＰＭＳＦ（ベンジルスルフリルフルオリドセリンプロテアーゼ阻害剤）をホウ酸バッファーに加えた。菌体再懸濁後の操作は４℃で行わなければならない。
【０１５２】
ステップ５．菌体の破砕
菌体をｐＨ９．０のホウ酸バッファーに完全に懸濁した後、菌体を高圧ホモジナイザーを用いて５００〜６００ｂａｒで破砕した。３〜５分間隔で破砕を７回繰り返した。
【０１５３】
ステップ６．菌体ＤＮＡの沈殿
破砕した株培養液を５５０００ｇ、４℃で４０分間遠心した。上清を単離し、硫酸ストレプトマイシンを加え（１６瓶、液体２００ｍｌ毎に１００万単位の硫酸ストレプトマイシンを加えた）、マグネチックスターラ−を用いて１時間撹拌した。
【０１５４】
ステップ７．透析
前のステップから得られた株培養液を５５０００ｇ、４℃で２０分間遠心した。上清を単離し、透析バッグに入れ、ホウ酸バッファー中に置き、８〜１２時間透析した。透析液を４時間毎に交換した。
【０１５５】
ステップ８．タンパク質精製により得られた抗菌改変ポリペプチド薬
透析後の株培養液を５５０００ｇ、４℃で２０分間遠心した。上清をビーカーに入れ、イオン交換法によるタンパク質精製を行った。上清をＣＭイオン交換カラムにローティングし、タンパク質濃度を検出して単位体積当たりのタンパク質含有量を測定した。ローディング体積とＣＭイオンゲル粒子の比率は操作マニュアルに従って決定した。十分にすすいだ後、０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭホウ酸バッファーで溶出して新規な抗菌改変ポリペプチドを得た。
【０１５６】
表８に示す結果に、大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）におけるＰＭＣ−ＳＡの発現率が最高であったことが示されている。
【０１５７】
【表８】
0006412077.tif 000017
【０１５８】
同じ操作および比較を他の６種類の組換え変異プラスミドに行った結果、全てで表に示されているのと同じ傾向が示された。すなわち、他の改変細菌と比べ、大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）中で７種類の組換え変異プラスミドの発現率は全て最大であった。
【０１５９】
このスクリーニング実験に基づき、新規抗生物質を効率的に発現および製造して得るために、本発明の方法における発現系として大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）を選択することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【０１６０】
要約すると、本発明の新規抗生物質製造方法およびプラットフォームシステムは、ほとんどの病原性微生物および標的に対する特異的な認識領域および作用領域を有する新規抗生物質を提供することができる。ほとんどの標的で、現在知られているコリシンが作用領域としての役割をするのに適切であり、したがって、新規抗生物質製造のサイクルタイムは、分子構造の設計にかかる時間、認識領域分子情報を提供するのにかかる時間、ならびに組換え体を製造および検証するのにかかる時間に依存する。認識領域は、選択された天然物質に依存するだけでなく、認識領域としての人工的に製造された抗体模倣物に主に依存するので、現在の生物工学のレベルに鑑みて、新規抗生物質の製造にかかる時間は基本的に非常に短期間に調整することができる。本発明の前記製造方法を運用するためのプラットフォームにより、ヒューマンリソースおよび技術リソースが完全に最適化、利用、および統合されて、開発プロセスの効率的実施が確実になり、新規抗生物質開発がフローライン生産として運用される。
【図１】
0006412077.tif 000019
【図２】
0006412077.tif 000020
【図３】
0006412077.tif 000021
【図４】
0006412077.tif 000022
【図５】
0006412077.tif 000023
【図６】
0006412077.tif 000024
【図７】
0006412077.tif 000025
【図８Ａ】
0006412077.tif 000026
【図８Ｂ】
0006412077.tif 000027
【図８Ｃ】
0006412077.tif 000028
【図８Ｄ】
0006412077.tif 000029
【配列表】
0006412077000001.app