(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪肝疾患を治療、抑制及び／又は予防する必要のある患者において脂肪肝疾患を治療、抑制及び／又は予防するための薬剤であって、有効量の以下の式
【化１】
0006377713.tif 000037
のシクロヘキセノン化合物、又はその薬学的に許容される塩、代謝産物、若しくは溶媒和物を含み、
前記脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、薬剤。
【請求項２】
前記シクロヘキセノン化合物が第２の成分とともに投与される請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記第２の成分がエルゴステロールである請求項２に記載の薬剤。
【請求項４】
前記シクロヘキセノン化合物の量とエルゴステロールの量とをそれぞれ５０％（ｗ／ｗ）〜９０％（ｗ／ｗ）及び５０％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲で組み合わせる請求項３に記載の薬剤。
【請求項５】
前記脂肪肝疾患が肝硬変又は線維症である請求項１に記載の薬剤。
【請求項６】
前記シクロヘキセノン化合物又はその薬学的に許容される塩、代謝産物、又は溶媒和物が経口、非経口又は静脈内に投与される請求項１に記載の薬剤。
【請求項７】
前記シクロヘキセノン化合物又はその薬学的に許容される塩、代謝産物、又は溶媒和物が経口投与される請求項６に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１３年３月１３日に出願された米国特許出願第１３／８０１６９７号の継続出願であり、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
【０００２】
本発明は、脂肪肝疾患の治療、抑制及び／又は予防するための薬剤に係り、より詳細にはシクロヘキセノン化合物を含む薬剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
脂肪肝は、脂肪が肝臓の総重量の５％超を占める病態を指す。脂肪肝及び脂肪性肝炎は多くの場合、過度のアルコール摂取及び肥満、糖尿病、高脂血症等の人々に認められる。非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、単純性脂肪肝（脂肪症）から非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変（肝臓の不可逆性の進行性瘢痕）に及ぶ広範な肝疾患を指す。通常、ＮＡＦＬＤの全てのステージで肝臓細胞（肝細胞）における脂肪の蓄積（脂肪浸潤）がある。ＮＡＳＨでは、脂肪の蓄積は、肝臓の炎症（肝炎）及び瘢痕（線維化）の様々な段階で関連する。ＮＡＦＬＤの範囲は、単純性脂肪肝（脂肪症）と呼ばれる最も単純なステージに始まり、そこから進行すると考えられている。すなわち、脂肪肝はＮＡＦＬＤの範囲における最初の異常である。単純性脂肪肝は、炎症又は瘢痕を伴わない肝臓細胞における単なる脂肪の蓄積を含む。脂肪は実際には肝臓細胞内に蓄積する特定種類の脂肪（トリグリセリド）からなる。脂肪肝は無害な（良性）病態である。ＮＡＦＬＤの範囲の次のステージで重度のものがＮＡＳＨである。上述のように、ＮＡＳＨは肝臓細胞の脂肪の蓄積及び肝臓の炎症を含む。炎症細胞は肝臓細胞を破壊する恐れがある（肝細胞壊死）。「脂肪性肝炎」及び「脂肪性壊死」という用語における脂肪性（steato）は脂肪浸潤を指し、肝炎は肝臓における炎症を指し、壊死は破壊された肝臓細胞を指す。ＮＡＳＨは単純性脂肪肝とは対照的に、無害な病態でないことが確固たる証拠により示唆されている。これは、ＮＡＳＨが最終的に肝臓の瘢痕（線維化）を引き起こし、次いで不可逆性の進行性瘢痕（肝硬変）となる恐れがあることを意味する。ＮＡＳＨにより生じる肝硬変は、ＮＡＦＬＤの範囲において末期及び最重症度のものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
脂肪肝を治療する治療的に有効な薬剤はほとんどない。運動及び食事制限が推奨されるが、これらは脂肪肝の治療にあまり効果的ではない。それゆえ、有害反応がなく、より優れた効果を有する安全な脂肪肝治療の開発が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、脂肪肝疾患を治療、抑制及び／又は予防することを必要とする患者において脂肪肝疾患を治療、抑制及び／又は予防するための薬剤であって、本明細書に記載の、有効量の式（Ｉ）のシクロヘキセノン化合物を含む薬剤を提供する。例示の実施の形態において、シクロヘキセノン化合物を第２の成分とともに投与する。
【０００６】
一態様において、脂肪肝疾患を治療、抑制及び／又は予防する必要のある患者において脂肪肝疾患を治療、抑制及び／又は予防するための薬剤であって、有効量の以下の式
【化１】
0006377713.tif 000002
のシクロヘキセノン化合物、又はその薬学的に許容される塩、代謝産物、若しくは溶媒和物を含み、脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、薬剤を提供する。
【０００７】
参照による援用
本明細書に記載の全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的及び個別的に示されたかのように、参照により本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１（Ａ−Ｄ）は、脂肪肝疾患モデルのＡ群（ビヒクル対照）及びＢ群（試験化合物、化合物１）の肝臓のＨＥ染色した切片の代表的な顕微鏡写真を示す図である。図１（Ａ）及び図１（Ｂ）は、Ａ群の肝臓のＨＥ染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、２００倍の拡大率で示している。図１（Ｃ）及び図１（Ｄ）は、Ｂ群の肝臓のＨＥ染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、２００倍の拡大率で示している。
【図２】図２（Ａ−Ｄ）は、脂肪肝疾患モデルのＡ群及びＢ群の肝臓のシリウスレッド染色した切片の代表的な顕微鏡写真を示す図である。図２（Ａ）及び図２（Ｂ）は、Ａ群の肝臓のシリウスレッド染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、２００倍の拡大率で示している。図２（Ｃ）及び図２（Ｄ）は、Ｂ群の肝臓のシリウスレッド染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、２００倍の拡大率で示している。
【図３】図３（Ａ−Ｄ）は、脂肪肝疾患モデルのＡ群及びＢ群の肝臓の３型コラーゲンを免疫染色した切片の代表的な顕微鏡写真を示す図である。図３（Ａ）及び図３（Ｂ）は、Ａ群の肝臓の３型コラーゲンを免疫染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、４００倍の拡大率で示している。図３（Ｃ）及び図３（Ｄ）は、Ｂ群の肝臓のシリウスレッド染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、４００倍の拡大率で示している。
【図４】図４は、Ａ群及びＢ群の全血グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す図である。
【図５】図５は、Ａ群及びＢ群の血漿トリグリセライド濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す図である。
【図６】図６は、Ａ群及びＢ群の血漿ＡＳＴ濃度（Ｕ／ｄＬ）を示す図である。
【図７】図７は、Ａ群及びＢ群の血漿ＡＬＴ濃度（Ｕ／ｄＬ）を示す図である。
【図８】図８（Ａ−Ｄ）は、脂肪性肝炎の肝臓細胞の線維化におけるＡ群及びＢ群の肝臓のＨＥ染色した切片の代表的な顕微鏡写真を示す。図８（Ａ）及び図８（Ｂ）は、Ａ群の肝臓のＨＥ染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、２００倍の拡大率で示している。図８（Ｃ）及び図８（Ｄ）は、Ｂ群の肝臓のＨＥ染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、２００倍の拡大率で示している。
【図９】図９（Ａ−Ｄ）は、脂肪性肝炎の肝臓細胞の線維化におけるＡ群及びＢ群の肝臓のシリウスレッド染色した切片の代表的な顕微鏡写真を示す。図９（Ａ）及び図９（Ｂ）は、Ａ群の肝臓のシリウスレッド染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、２００倍の拡大率で示している。図９（Ｃ）及び図９（Ｄ）は、Ｂ群の肝臓のシリウスレッド染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、２００倍の拡大率で示している。
【図１０】図１０（Ａ−Ｄ）は、脂肪性肝炎の肝臓細胞の線維化におけるＡ群及びＢ群の肝臓の３型コラーゲンを免疫染色した切片の代表的な顕微鏡写真を示す。図１０（Ａ）及び図１０（Ｂ）は、Ａ群の肝臓の３型コラーゲンを免疫染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、４００倍の拡大率で示している。図１０（Ｃ）及び図１０（Ｄ）は、Ｂ群の肝臓のシリウスレッド染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、４００倍の拡大率で示している。
【図１１】図１１は、Ａ群及びＢ群の全血グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す図である。
【図１２】図１２は、Ａ群及びＢ群の血漿トリグリセライド濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す図である。
【図１３】図１３は、Ａ群及びＢ群の血漿ＡＳＴ濃度（Ｕ／ｄＬ）を示す図である。
【図１４】図１４は、Ａ群及びＢ群の血漿ＡＬＴ濃度（Ｕ／ｄＬ）を示す図である。
【図１５】図１５（Ａ−Ｆ）は、Ａ群（ビヒクル対照）、Ｂ群（試験化合物及びエルゴステロール）及びＣ群（試験化合物のみ）の脂肪肝病態アッセイにおける肝臓のＨＥ染色した切片の代表的な顕微鏡写真を示す図である。図１５（Ａ）及び図１５（Ｂ）は、Ａ群の肝臓のＨＥ染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、２００倍の拡大率で示している。図１５（Ｃ）及び図１５（Ｄ）は、Ｂ群の肝臓のＨＥ染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、２００倍の拡大率で示している。図１５（Ｅ）及び図１５（Ｆ）は、Ｃ群の肝臓のＨＥ染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、２００倍の拡大率で示している。
【図１６】図１６（Ａ−Ｆ）は、Ａ群からＣ群の肝臓のシリウスレッド染色した切片の代表的な顕微鏡写真を示す図である。図１６（Ａ）及び図１６（Ｂ）は、Ａ群の肝臓のシリウスレッド染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、２００倍の拡大率で示している。図１６（Ｃ）及び図１６（Ｄ）は、Ｂ群の肝臓のシリウスレッド染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、２００倍の拡大率で示している。図１６（Ｅ）及び図１６（Ｆ）は、Ｃ群の肝臓のシリウスレッド染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、２００倍の拡大率で示している。
【図１７】図１７（Ａ−Ｆ）は、Ａ群からＣ群の肝臓の３型コラーゲンを免疫染色した切片の代表的な顕微鏡写真を示す図である。図１７（Ａ）及び図１７（Ｂ）は、Ａ群の肝臓の３型コラーゲンを免疫染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、４００倍の拡大率で示している。図１７（Ｃ）及び図１７（Ｄ）は、Ｂ群の肝臓のシリウスレッド染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、４００倍の拡大率で示している。図１７（Ｅ）及び図１７（Ｅ）は、Ｃ群の肝臓のシリウスレッド染色した切片をそれぞれ５０倍の拡大率、４００倍の拡大率で示している。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
いくつかの実施形態において、本発明は、特筆すべきことに本明細書に記載のシクロヘキセノン化合物が脂肪肝疾患を効果的に治療、抑制及び／又は予防することを見つけた。
【００１０】
「ａ」及び「ａｎ」という用語は、その冠詞の文法上の対象物の１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指す。
【００１１】
「治療する」、「治療」又は「治療すること」という用語は、患者が罹患する脂肪肝疾患の症状の頻度、程度、重症度及び／又は期間を低減させることを意味する。
【００１２】
「予防する」、「予防」又は「予防すること」という用語は、脂肪肝疾患に関連する症状の抑制、リスク低下、発症の低減又は防止を意味する。
【００１３】
「薬学的に許容される塩」という用語は、遊離塩基の生物学的な有効性及び特性を保持し、無機酸又は有機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、リンゴ酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸等と反応することにより得られる塩を指す。
【００１４】
「有効量」という用語は、脂肪肝疾患を治療、抑制及び／又は予防するのに有効な本明細書に記載の化合物の量を意味する。例えば、本明細書に記載の化合物の有効量は、脂肪細胞数を減らし、肝臓の大きさを小さくし、脂肪細胞浸潤を抑制し（すなわち、或る程度まで遅延させ、好ましくは停止させる）、炎症（肝炎）、瘢痕（肝硬変）又は壊死を抑制し（すなわち、或る程度まで遅延させ、好ましくは停止させる）、及び／又は疾患に関連する症状の１つ又は複数を或る程度まで緩和させる。
【００１５】
植物及びキノコは、癌を治療する新規の、天然由来の作用物質を発見及び開発するための貴重な供給源である。アントロディアカンフォラータ（Antrodia camphorata：ベニクスノキタケ）は、チャン−ジ（Chang-Zhi）、ニウチャング（Niu Chang-Gu）、レッドカンファーマッシュルーム等とも呼ばれ、ヒダナシタケ目（Aphyllophorales）サルノコシカケ（Polyporaceae）科に属する多年生キノコである。牛樟（Cinnamomum kanehirae Hay）の、内部が腐朽した心材壁に育つ台湾固有の種である。牛樟は稀にしか分布せず、違法に過伐され、野生の木の内部で育つアントロディアカンフォラータはかなり希少となっている。アントロディアカンフォラータの価格は、６月から１０月にだけ成長する天然のアントロディアカンフォラータの成長速度が極めて遅いため非常に高価である。従来、アントロディアカンフォラータは、中国では食中毒、アルコール中毒及び薬物中毒、下痢、腹痛、高血圧、皮膚の痒み及び肝臓癌用の医薬品として使用されている。トリテルペノイドは、アントロディアカンフォラータの多くの組成物のうち最も研究された成分である。
【００１６】
米国特許第７３８５０８８号は、新規化合物及びその使用、特にいくつかのがん細胞の成長を効果的に阻害するアントロディアカンフォラータ抽出物から単離されたアントロキノノールＢ及びアントロキノノールＣに関する。米国特許第７３４２１３７号は、アントロディアカンフォラータから単離および精製された抽出物、特に４−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシ−６−メチル−５（３，７，１１−トリメチル−ドデカ−２，６，１０−トリエニル）−シクロヘキサ−２−エノンである、腫瘍成長阻害におけるシクロヘキセノン化合物及びその使用を提供する。さらに、化合物である４−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシ−６−メチル−５（３，７，１１−トリメチル−ドデカ−２，６，１０−トリエニル）−シクロヘキサ−２−エノンのいくつかの使用法が開発された。米国特許第７４１１００３号は、ＨＢＶの阻害における４−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシ−６−メチル−５（３，７，１１−トリメチル−ドデカ−２，６，１０−トリエニル）−シクロヘキサ−２−エノンの使用を開示する。米国特許第７４５６２２５号は、肝臓保護、例えば化学物質により誘発された肝臓損傷及び線維化を改善し、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血清濃度の低下における４−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシ−６−メチル−５（３，７，１１−トリメチル−ドデカ−２，６，１０−トリエニル）−シクロヘキサ−２−エノンの使用を開示する。米国特許第７４６８３９２号は、疲労の遅延における４−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシ−６−メチル−５（３，７，１１−トリメチル−ドデカ−２，６−１０−トリエニル）−シクロヘキサ−２−エノンの使用を開示する。米国特許第７５０１４５４号は、自己免疫疾患の治療における４−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシ−６−メチル−５（３，７，１１−トリメチル−ドデカ−２，６，１０−トリエニル−）−シクロヘキサ−２−エノンの使用に関する。米国特許第８２３６８６０号は、膵癌細胞の生存の阻害における４−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシ−６−メチル−５−（３，７，１１−トリメチル−ドデカ−２，６，１０−トリエニル）−シクロヘキサ−２−エノンの使用を提供する。米国特許出願公開第２０１１００６００５５号、同第２０１１００６００５６号、同第２０１１００６００５７号、同第２０１１００６００５８号及び同第２０１１００６００５９号はそれぞれ、リンパ腫、胃癌、皮膚癌、卵巣癌及び膀胱癌細胞の生存の阻害における４−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシ−６−メチル−５（３，７，１１−トリメチル−ドデカ−２，６，１０−トリエニル−）−シクロヘキサ−２−エノンの使用を開示する。
【００１７】
しかし、先行の参照文献はいずれも、上記のシクロヘキセノン化合物を脂肪肝疾患、特にＮＡＦＬＤの治療及び／又は予防に使用することができることを教示及び示唆していない。
【００１８】
したがって、本発明は、脂肪肝疾患を治療、抑制及び／又は予防する必要のある患者において脂肪肝疾患を治療、抑制及び／又は予防する方法であって、有効量の以下の式（Ｉ）：
【化２】
0006377713.tif 000003
（式中、Ｘ及びＹのそれぞれが独立して酸素、ＮＲ５又は硫黄であり、
Ｒが水素又はＣ（＝Ｏ）Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のそれぞれが独立して水素、メチル又は（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３であり、
Ｒ４がＮＲ５Ｒ６、ＯＲ５、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ７、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ５、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、ハロゲン、５員又は６員のラクトン環、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、アリール、グルコシルであり、５員又は６員のラクトン環、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、アリール及びグルコシルが場合によりＮＲ５Ｒ６、ＯＲ５、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ７、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ５、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル及びＣ１−Ｃ８ハロアルキルから選択される１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｒ５及びＲ６のそれぞれが独立して水素又はＣ１−Ｃ８アルキルであり、
Ｒ７がＣ１−Ｃ８アルキル、ＯＲ５又はＮＲ５Ｒ６であり、
ｍが１−１２であり、
ｎが１−１２である）
のシクロヘキセノン化合物、又はその薬学的に許容される塩、代謝産物、溶媒和物若しくはプロドラッグを投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、脂肪肝疾患は、原発性脂肪肝疾患又は二次性脂肪肝疾患である。いくつかの実施形態において、二次性脂肪肝疾患は、アルコール性肝疾患、慢性肝炎感染に関連する脂肪肝、完全非経口栄養（ＴＰＮ）、ライ症候群、胃腸疾患又は胃不全麻痺及び過敏性腸（ＩＢＳ）疾患である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、以下の構造：
【化３】
0006377713.tif 000004
を有するシクロヘキセノン化合物を任意の適切な出発材料から合成又は半合成して調製する。他の実施形態において、シクロヘキセノン化合物を発酵などにより調製する。例えば、化合物１（アントロキノノール（Ａｎｔｒｏｑｕｉｎｏｎｏｌ：商標）又は「Ａｎｔｒｏｑ」としても知られる）又は化合物３は、いくつかの例において４−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシ−６−メチルシクロヘキサ−２，５−ジエノンから調製される。非限定的な例示の化合物を以下に示す。
【化４】
0006377713.tif 000005
【化５】
0006377713.tif 000006
【化６】
0006377713.tif 000007
【化７】
0006377713.tif 000008
【化８】
0006377713.tif 000009
【化９】
0006377713.tif 000010
【化１０】
0006377713.tif 000011
【化１１】
0006377713.tif 000012
【化１２】
0006377713.tif 000013
【化１３】
0006377713.tif 000014
【化１４】
0006377713.tif 000015
【化１５】
0006377713.tif 000016
【化１６】
0006377713.tif 000017
【化１７】
0006377713.tif 000018
【化１８】
0006377713.tif 000019
【化１９】
0006377713.tif 000020
【化２０】
0006377713.tif 000021
【化２１】
0006377713.tif 000022
【化２２】
0006377713.tif 000023
【化２３】
0006377713.tif 000024
【００２１】
他の実施形態において、以下の構造：
【化２４】
0006377713.tif 000025
を有するシクロヘキセノン化合物をアントロディアカンフォラータの有機溶媒抽出物から単離する。いくつかの実施形態において、有機溶媒は、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール等）、エステル類（例えば、酢酸メチル、酢酸エチル等）、アルカン類（例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン等）、ハロゲン化アルカン類（例えば、クロロメタン、クロロエタン、クロロホルム、塩化メチレン等）等から選択される。例えば、例示の化合物１−７を有機溶媒抽出物から単離する。いくつかの実施形態において、有機溶媒はアルコールである。いくつかの実施形態において、アルコールはエタノールである。いくつかの実施形態において、シクロヘキセノン化合物がアントロディアカンフォラータの水性抽出物から単離される。
【００２２】
いくつかの実施形態において、Ｒが水素、Ｃ（＝Ｏ）Ｃ３Ｈ８、Ｃ（＝Ｏ）Ｃ２Ｈ５又はＣ（＝Ｏ）ＣＨ３である。いくつかの実施形態において、Ｒ１が水素又はメチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ２が水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル又はヘキシルである。いくつかの実施形態において、Ｒ３が水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル又はヘキシルである。いくつかの実施形態において、Ｒ４がハロゲン、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、Ｃ（＝Ｏ）Ｃ２Ｈ５、Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ３、Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ２Ｈ５、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ３、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣ２Ｈ５、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ３、ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ２Ｈ５、ＯＣ（＝Ｏ）ＯＣＨ３、ＯＣ（＝Ｏ）ＯＣ２Ｈ５、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ３、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＣ２Ｈ５又はＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２である。いくつかの実施形態において、Ｒ４がＣ２Ｈ５Ｃ（ＣＨ３）２ＯＨ、Ｃ２Ｈ５Ｃ（ＣＨ３）２ＯＣＨ３、ＣＨ２ＣＯＯＨ、Ｃ２Ｈ５ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＯＨ、Ｃ２Ｈ５ＯＨ、ＣＨ２Ｐｈ、Ｃ２Ｈ５Ｐｈ、ＣＨ２ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨＯ）、ＣＨ２ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）（Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３）、５員又は６員のラクトン環、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、アリール及びグルコシルであり、５員又は６員のラクトン環、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、アリール及びグルコシルが場合によりＮＲ５Ｒ６、ＯＲ５、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ７、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ５、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル及びＣ１−Ｃ８ハロアルキルから選択される１つ又は複数の置換基で置換される。いくつかの実施形態において、Ｒ４がＣＨ２ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）２である。いくつかの実施形態において、上記の化合物が、
【化２５】
0006377713.tif 000026
である。
【００２３】
本発明によれば、いくつかの実施形態において、本明細書で提供される化合物を脂肪肝疾患の治療、抑制及び／又は予防に使用する。脂肪肝疾患又は肝臓疾患の例として、原発性脂肪肝疾患のＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨ、並びに二次性脂肪肝疾患（例えば、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、慢性肝炎感染に関連する脂肪肝、完全非経口栄養（ＴＰＮ）、ライ症候群及び胃腸疾患、例えば腸内細菌異常増殖（ＩＢＯ）、胃不全麻痺、過敏性腸（ＩＢＳ）疾患等）がある。これらの例は例として挙げたに過ぎず、この一覧はこれらの疾患に対する治療を制限することを意図しない。
【００２４】
併用治療
いくつかの実施形態において、治療を組み合わせて複数の薬剤を使用すると、治療有効用量が変わる。併用治療は更に、患者の臨床管理を補助するために種々の時間で開始及び停止する定期的な治療を含む。本明細書に記載の併用療法において、共投与される化合物の用量は、使用される併用薬の種類、使用される特定の薬剤、治療される疾患、疾患又は病態等に応じて異なる。
【００２５】
いくつかの実施形態において、緩和が求められる病態（複数の場合あり）を治療、予防又は改善する投与法を種々の因子に従い変更することが理解される。これらの因子には、対象を苦しめる疾患並びに対象の年齢、体重、性別、食事及び病状がある。したがって、他の実施形態において実際に使用される投与法は多種多様であり、ここで示した投与法からは外れる。
【００２６】
化合物（すなわち、本明細書に記載のシクロヘキセノン化合物）と他の脂肪肝疾患治療剤との併用を包含することを目的とする。いくつかの実施形態において、脂肪肝疾患治療剤の例として以下があるがそれらに限定されない：エルゴステロール、ビタミンＥ、セレン、ベタイン、インスリン増感剤（例えば、メトホルミン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、チアゾリジンジオン等）及びスタチン等。
【００２７】
いくつかの実施形態において、シクロヘキセノン化合物と本明細書に記載の他の脂肪肝疾患治療剤との併用は、他の薬剤との更なる治療法及び処置方法を包含する。いくつかの実施形態において、このような更なる治療法及び処置方法は、別の脂肪肝疾患療法を含む。別法として、他の実施形態において、更なる治療法及び処置方法は、脂肪肝疾患に関連する付加的病態又は併用療法の上記の薬剤の副作用を治療するために使用される他の作用物質を含む。更なる実施形態において、補助剤又は促進剤を本明細書に記載の併用療法とともに投与する。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本発明のシクロヘキセノン化合物が第２の成分とともに投与される。本発明によれば、第２の成分がエルゴステロールである。シクロヘキセノン化合物の量とエルゴステロールの量とをそれぞれ５０％（ｗ／ｗ）−９０％（ｗ／ｗ）及び５０％（ｗ／ｗ）−１０％（ｗ／ｗ）の範囲で組み合わせる。一般に、本明細書に記載の組成物、及び併用療法を本明細書に記載の作用機序に基づいて使用する実施形態における他の作用物質は、同じ薬学的組成物として投与される必要はなく、いくつかの実施形態において、異なる物理特性及び化学特性のため異なる経路により投与される。いくつかの実施形態において、確立しているプロトコルに従って最初の投与が為された後、用量、投与様式及び投与時間を、観察された効果に基づき当業者が変更する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される化合物は、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内又は経皮を含む任意の従来の経路により投与される。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康及び体重、用いる場合は併用治療の種類及び所望の効果の性質によって決まる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、投与について、有効化合物の薬学的に使用される調製物への加工を促進する賦活剤及び助剤を含む１つ又は複数の生理学的に許容される担体と、本明細書で提供される化合物とを混合する。適切な配合は選択された投与経路によって決定される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、経口投与について、本明細書で提供される化合物を個別の単位、例えばそれぞれが所定の量の本発明の化合物を含有するカプセル、カシェ若しくは錠剤として、粉末若しくは顆粒として、水性液体若しくは非水性液体における溶液若しくは懸濁液として、又は水中油型乳濁液若しくは油中水型乳濁液として配合する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、注入について、本明細書で提供される化合物は、水溶液、好ましくは生理学的に相溶性のある緩衝液、例えばハンクス液、リンゲル液又は生理食塩緩衝液に配合される。経粘膜投与について、バリアを貫通するのに適した浸透剤を配合物に使用する。このような浸透剤、例えばポリエチレングリコールは当技術分野において一般に既知である。いくつかの実施形態において、経口使用される医薬組成物にはプッシュフィットカプセルがある。
【００３３】
吸入による投与について、本発明において使用される分子は、従来、加圧パックからのエアロゾル噴霧形式又は適切な噴射ガス、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン又は二酸化炭素を使用したネブライザーの形態で送達される。いくつかの実施形態において、加圧エアロゾルの場合、用量単位は、計量した量を送達するための弁を設けることで決定される。いくつかの実施形態において、吸入器又は送気装置に使用されるゼラチン等のカプセル及びカートリッジは、ポリペプチドと、ラクトース又はデンプン等の適切な粉末基剤との粉末混合物を含有させて配合する。
【００３４】
用量は生成された化合物の活性及び対象の病態並びに治療を受ける対象の体重又は表面積により決定される。用量のサイズ及び投与法も特定の対象における特定の化合物の投与に付随する任意の有害な副作用の存在、性質及び程度により決定される。投与される化合物の有効量を決定する場合に、医師は血漿濃度、毒性及び疾患の進行を評価する必要がある。
【実施例】
【００３５】
実施例１：例示的シクロヘキセノン化合物の単離
アントロディアカンフォラータの菌糸、子実体又はそれらの混合物１００ｇをフラスコに入れた。適量の水及びアルコール（７０％−１００％アルコール溶液）をフラスコに添加し、少なくとも１時間摂氏２０度−２５度（℃）にて撹拌した。溶液をフィルター及び０．４５μｍ（マイクロメートル）膜に通して濾過し、濾液を抽出物として回収した。アントロディアカンフォラータの濾液は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供した。ＨＰＬＣは、ＲＰ１８カラム、移動相としてメタノール（Ａ）及び０．１％〜０．５％酢酸（Ｂ）を用いて、流速１ｍｌ／分で９５％〜２０％のＢを０分〜１０分、２０％〜１０％のＢを１０分〜２０分、１０％〜１０％のＢを２０分〜３５分、１０％〜９５％のＢを３５分〜４０分の勾配で行った。溶出液を、紫外可視検出器を用いてモニタリングした。
【００３６】
２５分〜３０分の間の画分を回収して濃縮し、化合物１である４−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシ−６−メチル−５−（３，７，１１−トリメチル−ドデカ−２，６，１０−トリエニル）−シクロヘキサ−２−エノンを、明黄色油の生成物として得た。４−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシ−６−メチル−５−（３，７，１１−トリメチル−ドデカ−２，６，１０−トリエニル）−シクロヘキサ−２−エノンの分子式、分子量及び融点は、それぞれＣ２４Ｈ３８Ｏ４、３９０及び４８℃から５２℃であった。化合物のＮＭＲスペクトルは、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）＝１．５１、１．６７、１．７１、１．７５、１．９４、２．０３、２．０７、２．２２、２．２５、３．６８、４．０５、５．０７、及び５．１４；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）＝１２．３１、１６．１、１６．１２、１７．６７、２５．６７、２６．４４、２６．７４、２７．００、３９．７１、３９．８１、４．０２７、４３．３４、５９．２２、６０．５９、１２０．９７、１２３．８４、１２４．３０、１３１．３２、１３５．３５、１３５．９２、１３８．０５、１６０．４５、及び１９７．１２を示す。
【００３７】
２１．２分〜２１．４分の間で回収した画分を回収して濃縮し、淡黄色液体の生成物として化合物５を得た。化合物５を分析したところ、化合物５は分子量４０８（分子式：Ｃ２４Ｈ４０Ｏ５）の４−ヒドロキシ−５−（１１−ヒドロキシ−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６−ジエニル）−２，３−ジメトキシ−６−メチルシクロヘキサ−２−エノンであった。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）＝１．２１、１．３６、１．６７、１．７１、１．７５、１．９４、２．０３、２．０７、２．２２、２．２５、３．６８、４．０５、５．７１及び５．５６。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１２．３１、１６．１、１６．１２、１７．６７、２５．６７、２６．４４、２６．７４、２７．００、３０．１０、４０．２７、４３．３４、５９．２２、６０．５９、７１．８、１２０．９７、１２３．８４、１２４．３０、１３１．３２、１３４．６１、１３５．９２、１３８．０５、１６０．４５、及び１９７．１１。
【化２６】
0006377713.tif 000027
【００３８】
化合物５：４−ヒドロキシ−５−（１１−ヒドロキシ−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６−ジエニル）−２，３−ジメトキシ−６−メチルシクヘキサ−２−エノン
２３．７分〜２４．０分の間で回収した画分を回収して濃縮し、淡黄色液体の生成物として化合物７を得た。化合物７を分析したところ、化合物７は分子量４２２（Ｃ２５Ｈ４２Ｏ５）の４−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシ−５−（１１−メトキシ−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６−ジエニル）−６−メチルシクロヘキサ−２−エノンであった。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）＝１．２１、１．３６、１．７１、１．７５、１．９４、２．０３、２．０７、２．２２、２．２５、３．２４、３．６８、４．０５、５．１２、５．５０、及び５．６１。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１２．３１、１６．１、１６．１２、１７．６７、２４．４４、２６．４４、２６．７４、２７．００、３７．８１、３９．８１、４０．２７、４３．３４、４９．００、５９．２２、６０．５９、１２０．９７、１２３．８４、１２４．３０、１３５．９２、１３８．０５、１６０．４５及び１９７．１２。
【化２７】
0006377713.tif 000028
【００３９】
化合物７：４−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシ−５−（１１−メトキシ−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６−ジエニル）−６−メチルシクロヘキサ−２−エノン
化合物１の代謝産物である化合物６は、動物試験において化合物１を与えたラットの尿サンプルから得た。化合物６は、分子量３１２（Ｃ１６Ｈ２４Ｏ６）の４−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシ−６−メチル−５−（３−メチル−２−ヘキセン酸）シクロヘキサ−２−エノンであると決定した。３，４−ジヒドロキシ−２−メトキシ−６−メチル−５−（３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニル）シクロヘキサ−２−エノン（分子量３７６、Ｃ２３Ｈ３６Ｏ４）として決定された化合物４は、化合物１を６時間４０℃を超える条件下にした時に得られた。
【化２８】
0006377713.tif 000029
【化２９】
0006377713.tif 000030
【００４０】
別法として、例示の化合物を４−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシ−６−メチルシクロヘキサ−２，５−ジエノン等から調製することができる。同様に、構造：
【化３０】
0006377713.tif 000031
を有する他のシクロヘキセノン化合物が、アントロディアカンフォラータから単離又は適切な出発材料から合成又は半合成して調製される。当業者であれば、このような合成における適切な条件を容易に利用できるだろう。
【００４１】
実施例２：化合物１（４−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシ−６−メチル−５−（３，７，１１−トリメチル−ドデカ−２，６，１０−トリエニル）−シクロヘキサ−２−エノン）による脂肪肝病態の低減
ヒトの不健康な食事傾向、例えば高カロリー食の過剰摂取をシミュレーションするために、実施例では慢性肝損傷に対する効果を評価するための高脂肪食を与えたラットを用いた動物モデルを構築する。その後、効果を生化学アッセイにより明らかにし、本明細書で提供される例示の化合物、例えば化合物１である４−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシ−６−メチル−５−（３，７，１１−トリメチル−ドデカ−２，６，１０−トリエニル）−シクロヘキサ−２−エノン（試験化合物）の脂肪肝低減を証明することができる。
【００４２】
アッセイにより「メタボリック症候群」モデルを用いて高脂肪食により生じる肝疾患をシミュレーションする。すなわち、モデルはＣＣｌ４等の毒性成分により生じた従来の化学物質誘発型モデルと異なる。このモデルはウイルス又はアルコールにより生じるモデルと区別することができる。
【００４３】
以下に長期高脂肪食の確立について説明する：まず、日本チャールス・リバー株式会社（日本、神奈川）からＣ５７ＢＬ／６マウスを得た。動物を特定病原体除去（ＳＰＦ）条件下において飼育した。雄マウス１８匹において出生後２日（２日目）にストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の皮下注射により肝損傷を発症させた。４週間後、高脂肪食の市販の齧歯類用飼料（日本クレア株式会社）を自由摂取にて与えた。これらのマウスを処置の前に３群に無作為抽出した。試験化合物を１日２回３週間、１０ｍｌ／ｋｇの容量で投与した。対照群（Ａ群）において、６匹のラットにビヒクル（Sigma Chemical Co.製のコーン油）を挿管法により与えた。Ｂ群の６匹のマウスにビヒクル及び試験化合物を１日２回４８ｍｇ／ｋｇの用量（１日当たり９６ｍｇ／ｋｇ）で経口投与した。表１に試験の進行表を要約する。
【００４４】
【表１】
0006377713.tif 000032
【００４５】
表２に処置スケジュールを要約する。
【００４６】
【表２】
0006377713.tif 000033
【００４７】
組織学的分析
（１）ＨＥ染色。ＨＥ染色法を以下のように行った。肝薄片を肝臓の左側から切除し、ティシュー・テック（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ：登録商標）ＯＣＴ（商標）コンパウンド（サクラファインテックジャパン株式会社、日本）で包埋し、液体窒素でスナップ凍結して−８０℃で保存した。５μｍの切片に切断して空気乾燥させ、アセトンで固定し、再度空気乾燥させて、最後にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次いで、ヘマトキシリン及びエオジン染色法において、肝切片をブアン液（ホルマリン−酢酸）で１週間予め固定した後、リリーマイヤヘマトキシリン（武藤化学株式会社、日本）及びエオジン液（和光純薬工業株式会社、日本）で染色して脂質沈着、炎症、細胞壊死及び線維化を可視化、又はマッソントリクローム液で染色して肝線維化発症の細胞外マトリクス及びコラーゲン線維を可視化した。
【００４８】
（２）シリウスレッド染色。シリウスレッド染色法を以下のように行った。肝薄片を肝臓の左側から切除し、ティシュー・テック（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ：登録商標）ＯＣＴ（商標）コンパウンド（サクラファインテックジャパン株式会社、日本）で包埋し、液体窒素でスナップ凍結して−８０℃で保存した。５μｍの切片に切断して空気乾燥させ、アセトンで固定し、再度空気乾燥させて、最後にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次いで、肝切片をピクロシリウスレッド液（Waldeck GmbH & KG、ドイツ）で染色し、コラーゲン沈着を観察した。
【００４９】
（３）３型コラーゲンに対する免疫組織化学。３型コラーゲンに対する免疫組織化学アッセイを以下のように行った。肝薄片を肝臓の左側から切除し、ティシュー・テック（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ：登録商標）ＯＣＴ（商標）コンパウンド（サクラファインテックジャパン株式会社、日本）で包埋し、液体窒素でスナップ凍結して−８０℃で保存した。５μｍの切片に切断して空気乾燥させ、アセトンで固定し、再度空気乾燥させて、最後にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。免疫組織化学については、内因性ペルオキシターゼ活性を０．０３％Ｈ２Ｏ２で５分間遮断した後、Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ（大日本住友製薬株式会社、日本）で１０分間インキュベーションした。切片は、抗３型コラーゲン抗体の最適希釈液で４℃にて一晩インキュベーションする。適切な二次抗体でインキュベーション後、ＤＡＢ／Ｈ２Ｏ２液（株式会社ニチレイ、日本）を用いて基質反応を行った。
【００５０】
全血及び血漿生化学
（１）全血グルコース。血液サンプルをヘパリン処理したシリンジ（ノボ・ヘパリン５０００単位／５ｍｌ、持田製薬株式会社、日本）に心穿刺により回収して氷上に保持し、４℃、１０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を回収し、使用時まで−８０℃で保存した。全血サンプルの血中グルコースは、Ｇチェッカー（三光純薬株式会社、日本）を用いて測定した。
【００５１】
（２）血漿アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）。血漿ＡＳＴ及びＡＬＴの検出を以下のように行った。血液サンプルをヘパリン処理したシリンジ（ノボ・ヘパリン５０００単位／５ｍｌ、持田製薬株式会社、日本）に心穿刺により回収して氷上に保持し、４℃、１０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を回収し、使用時まで−８０℃で保存した。ＡＳＴ、ＡＬＴ濃度を富士ドライケム７０００（富士フィルム株式会社、日本）で測定した。
【００５２】
非化学損傷により生じた脂肪肝疾患
図１から図７は、アントロディアカンフォラータから抽出した例示の化合物（化合物１）が非化学損傷により生じた脂肪肝疾患の程度を効率的に低下させたことを証明した。この低下は、組織学的分析、例えばＨＥ染色、シリウスレッド染色及びコラーゲン免疫染色により、さらに血漿生化学マーカー、例えば血中グルコース、血漿トリグリセライド、血漿ＡＬＴ及び血漿ＡＳＴにより、脂肪沈着の肝損傷の程度を評価して判断した。
【００５３】
ＨＥ染色は、炎症細胞浸潤下の肝細胞の形態、並びに、大滴性及び小滴性脂肪沈着を明らかにする。図１（Ａ−Ｄ）は、Ａ群及びＢ群の肝臓のＨＥ染色した切片の代表的な顕微鏡写真を示し、図１（Ａ）及び図１（Ｃ）は５０倍の拡大率を示し、図１（Ｂ）及び図１（Ｄ）は２００倍の拡大率を示す。図１（Ａ）及び図１（Ｂ）に示されるように、Ａ群（ビヒクル）の図は、肝臓切片の炎症細胞の浸潤、大滴性及び小滴性脂肪沈着、胆管増殖及び肝細胞の風船様腫大を明らかにした。図１（Ｃ）及び図１（Ｄ）に示されるように、Ｂ群（試験化合物、化合物１）の処置は、Ａ群に比べ、炎症細胞の浸潤を低下させる傾向にあり、また大滴性脂肪沈着を低下させる傾向にあった。
【００５４】
シリウスレッド染色を利用してコラーゲン沈着を検出する。図２はＡ群及びＢ群の肝臓のシリウスレッド染色の代表的な顕微鏡写真を示し、図２（Ａ）及び図２（Ｃ）は５０倍の拡大率を示し、図２（Ｂ）及び図２（Ｄ）は２００倍の拡大率を示す。図２（Ａ）及び図２（Ｂ）に示されるように、Ａ群においてシリウスレッド染色は中心静脈、胆管及び変性肝細胞の周囲にコラーゲン沈着を示した。図２（Ｃ）及び図２（Ｄ）に示されるように、Ｂ群（試験化合物、化合物１）の処置では、中心静脈及び胆管の周囲のコラーゲン沈着が減少した。
【００５５】
３型コラーゲン染色を使用してコラーゲン線維の分布を検出する。図３は、Ａ群及びＢ群の肝臓の３型コラーゲンに対して免疫染色した切片の代表的顕微鏡写真を示し、図３（Ａ）及び図３（Ｃ）は５０倍の拡大率を示し、図３（Ｂ）及び図３（Ｄ）は４００倍の拡大率を示す。図３（Ａ）及び図３（Ｂ）に示されるように、３型コラーゲン染色は、ビヒクル対照のＡ群の洞様領域並びに胆管及び中心静脈の周囲にコラーゲン線維の蓄積を示す。図３（Ｃ）及び図３（Ｄ）に示されるように、Ｂ群（試験化合物、化合物１）の処置は、洞様領域のコラーゲン線維の厚さ及び／又は長さを減少させる傾向にあった。
【００５６】
図４はＡ群及びＢ群の全血グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）の図を示す。図４に示されるように、Ｂ群の処置（試験化合物、化合物１）は、Ａ群の処置の結果に比べて全血グルコース濃度の低下を示した（Ａ群：６３６±１３７ｍｇ／ｄＬ、Ｂ群：５８０±１２２ｍｇ／ｄＬ）。
【００５７】
図５はＡ群及びＢ群の血漿トリグリセライド（ＴＧ）濃度（ｍｇ／ｄＬ）の図を示す。図５に示されるように、Ｂ群の処置（試験化合物、化合物１）は、Ａ群の処置の結果に比べて血漿ＴＧの顕著な低下を示した（Ａ群：６４３±４０２ｍｇ／ｄＬ、Ｂ群：２２９±１４４ｍｇ／ｄＬ）。
【００５８】
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）はヒトの器官、例えば肝臓、心臓、筋肉等のアミノ酸合成に重要な酵素である。ＡＳＴ及びＡＬＴは、通常、肝細胞損傷の診断評価の一部として臨床的に測定され、肝臓の健常性を決定する。血清中のこれらの酵素の含有量は正常な状態下では低い。ＡＳＴ及びＡＬＴの濃度がかなり高いと、多くの場合肝損傷の存在が示唆される。図６及び図７は、それぞれＡ群及びＢ群の血漿ＡＳＴ濃度及び血漿ＡＬＴ濃度（Ｕ／ｄＬ）を示す。図６に示されるように、Ｂ群（試験化合物、化合物１）の処置は、Ａ群（ビヒクル）の処置に比べ、血漿ＡＳＴ濃度を僅かに減少させるようである（Ａ群：２０２±１７７Ｕ／Ｌ、Ｂ群：１４１±３５Ｕ／Ｌ）。図７に示されるように、Ｂ群（試験化合物、化合物１）の処置は、Ａ群（ビヒクル）の処置に比べ、血漿ＡＬＴ濃度を僅かに減少させるようである（Ａ群：６４±６４Ｕ／Ｌ、Ｂ群：３４±１０Ｕ／Ｌ）。
【００５９】
要約すると、試験化合物の処置は、血漿ＴＧ濃度を低下させ、血中グルコース濃度を抑制する傾向にあり、血漿ＡＳＴ及びＡＬＴを僅かに低下させた。試験化合物の処置はまた、肝小葉の炎症細胞の浸潤及び脂肪沈着を低下させた。さらに、試験化合物はシリウスレッド染色及び３型コラーゲン染色の両方で示されるように、コラーゲン沈着を抑制する傾向にあり、試験化合物が肝線維化脂肪性肝炎に対する抗線維化効果を有することが示唆された。
【００６０】
非化学損傷により生じた脂肪性肝炎の線維化
図８から図１４は、試験化合物である化合物１が非化学損傷により誘発された脂肪性肝炎の肝臓細胞の線維化を効果的に低下させることを示す。この低下は、組織学的分析、例えばＨＥ染色、シリウスレッド染色及びコラーゲン免疫染色により、さらに血漿生化学マーカー、例えば血中グルコース、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ及び血漿アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼにより、肝線維化における肝損傷の程度を評価して判断した。
【００６１】
図８は、Ａ群及びＢ群の肝臓のＨＥ染色した切片の代表的な顕微鏡写真を示し、図８（Ａ）及び図８（Ｃ）は５０倍の拡大率を示し、図８（Ｂ）及び図８（Ｄ）は２００倍の拡大率を示す。図８（Ａ）及び図８（Ｂ）に示されるように、Ａ群（ビヒクル）の図は、肝臓切片の炎症細胞の浸潤、大滴性及び小滴性脂肪沈着、胆管増殖、及び肝細胞の風船様腫大を明らかにする。図８（Ｃ）及び図８（Ｄ）に示されるように、Ｂ群（試験化合物、化合物１）の処置は、Ａ群に比べて大滴性脂肪沈着を低下させる傾向にあった。
【００６２】
図９は、Ａ群及びＢ群の肝臓のシリウスレッド染色の代表的な顕微鏡写真を示し、図９（Ａ）及び図９（Ｃ）は５０倍の拡大率を示し、図９（Ｂ）及び図９（Ｄ）は２００倍の拡大率を示す。図９（Ａ）及び図９（Ｂ）に示されるように、Ａ群においてシリウスレッド染色は、中心静脈、胆管及び変性肝細胞の周囲にコラーゲン沈着を示す。Ａ群の処置において、中心静脈相互の架橋性線維化が観察され、肝臓細胞の重篤な線維化を示す。図９（Ｃ）及び図９（Ｄ）に示されるように、Ｂ群（試験化合物、化合物１）の処置において、中心静脈及び胆管の周囲のコラーゲン沈着が減少した。
【００６３】
図１０は、Ａ群及びＢ群の肝臓の３型コラーゲンに対する免疫染色した切片の代表的な顕微鏡写真を示し、図１０（Ａ）及び図１０（Ｃ）は５０倍の拡大率を示し、図１０（Ｂ）及び図１０（Ｄ）は４００倍の拡大率を示す。図１０（Ａ）及び図１０（Ｂ）に示されるように、３型コラーゲン染色は、ビヒクル対照のＡ群の洞様領域並びに胆管及び中心静脈の周囲にコラーゲン線維の蓄積を示す。図１０（Ｃ）及び図１０（Ｄ）に示されるように、Ｂ群（試験化合物、化合物１）の処置は、洞様領域のコラーゲン線維の厚さ及び／又は長さを減少させる傾向にあった。
【００６４】
図１１はＡ群及びＢ群の全血グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）の図を示す。図１１に示されるように、Ｂ群の処置（試験化合物、化合物１）は、Ａ群の処置の結果に比べて全血グルコース濃度の顕著な低下を示した（Ａ群：７２８±１０９ｍｇ／ｄＬ、Ｂ群：５６６±６５ｍｇ／ｄＬ）。
【００６５】
図１２は、Ａ群及びＢ群の血漿トリグリセライド（ＴＧ）濃度（ｍｇ／ｄＬ）の図を示す。図１２に示されるように、Ｂ群の処置（試験化合物、化合物１）は、Ａ群の処置の結果に比べて血漿ＴＧの僅かな低下を示した（Ａ群：７５８±８７７ｍｇ／ｄＬ、Ｂ群：７０４±４５０ｍｇ／ｄＬ）。
【００６６】
図１３及び図１４は、それぞれＡ群及びＢ群の血漿ＡＳＴ濃度及び血漿ＡＬＴ濃度（Ｕ／ｄＬ）の図を示す。図１３において、Ｂ群（試験化合物、化合物１）の処置はＡ群（ビヒクル）の処置に比べて血漿ＡＳＴ濃度を僅かに増加させるが、この変化は有意ではない（Ａ群：１４３±４２Ｕ／Ｌ、Ｂ群：１６７±８７Ｕ／Ｌ）。図１４に示されるように、Ｂ群（試験化合物、化合物１）の処置はＡ群（ビヒクル）の処置に比べて血漿ＡＬＴ濃度を減少させる（Ａ群：４７±２２Ｕ／Ｌ、Ｂ群：３８±１１Ｕ／Ｌ）。
【００６７】
要約すると、試験化合物（例えば、化合物１）での処置は、血中グルコース濃度、血漿ＴＧ濃度を低下させて、肝小葉の脂肪沈着及びＡＬＴ濃度を低下させる傾向にあり、本明細書に記載のシクロヘキセノン化合物が脂質及び炭水化物の代謝に対する改善効果並びに高脂肪食により生じた肝損傷に対しての保護作用を有することが示唆される。また、例示のシクロヘキセノン化合物（例えば、化合物１）は、シリウスレッド染色及び３型コラーゲン染色の両方に示されるように、コラーゲン沈着を抑制する傾向にあり、本明細書で提供されるシクロヘキセノン化合物は肝臓の脂肪性肝炎に対する抗線維化作用を有することを示す。
【００６８】
それと合わせて、本発明は、試験化合物の処置がメタボリック症候群により、特に高脂肪食処置から誘発された脂肪肝疾患及び肝線維化の程度を効果的に低下させることを例証することに成功した。
【００６９】
実施例３：化合物１及びエルゴステロールを含む組成物による脂肪肝病態の低減
試験群及び治療スケジュールを除いて、「メタボリック症候群」モデルの材料及びプロセス、組織学的分析、全血及び血漿生化学、及び非化学損傷により生じる脂肪肝疾患は、実施例２に記載のものと同様である。
【００７０】
対照群（Ａ群）では、６匹のラットに胃管を用いてビヒクル（Sigma chemical co.製のコーン油）を与えた。Ｂ群の６匹のラットには、ビヒクル及び試験化合物（化合物１）を１日２回４８ｍｇ／ｋｇの用量（１日当たり９６ｍｇ／ｋｇ）、及びエルゴステロールを１日２回１２ｍｇ／ｋｇの用量（１日当たり２４ｍｇ／ｋｇ）で経口投与した。Ｃ群の６匹のマウスには、ビヒクル及び試験化合物（化合物１）を１日２回４８ｍｇ／ｋｇの用量（１日当たり９６ｍｇ／ｋｇ）で経口投与した。
【００７１】
以下の表１は試験の進行表の要約を示す。
【００７２】
【表３】
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【００７３】
表２は治療スケジュールを示す。
【００７４】
【表４】
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【００７５】
ＨＥ染色
図１５は、Ａ群からＣ群の肝臓のＨＥ染色した切片の代表的な顕微鏡写真を示し、図１５（Ａ）、図１５（Ｃ）、図１５（Ｅ）は５０倍の拡大率を示し、図１５（Ｂ）、図１５（Ｄ）、図１５（Ｆ）は２００倍の拡大率を示す。図１５（Ａ）及び図１５（Ｂ）に示されるように、Ａ群は肝臓切片の炎症細胞の浸潤、大滴性及び小滴性脂肪沈着、胆管増殖並びに肝細胞の風船様腫大を明らかにした。図１５（Ｃ）及び図１５（Ｄ）に示されるように、試験化合物（化合物１）及びエルゴステロールの併用処置は、大滴性脂肪沈着及び炎症細胞の浸潤を低下させた。肝細胞の有糸分裂像の数はＡ群に比べてＢ群で高値である。図１５（Ｅ）及び図１５（Ｆ）に示されるように、試験化合物のみの処置は大滴性脂肪沈着を低下させる傾向にあるが、炎症細胞の浸潤に影響しなかった。
【００７６】
図１５から、試験化合物（化合物１）及びエルゴステロールでの処置（Ｂ群）は大滴性脂肪沈着を減少させることができることがわかる。試験化合物のみでの処置（Ｃ群）に比べ、試験化合物及びエルゴステロールでの処置（Ｂ群）は炎症細胞浸潤を更に抑制し、その結果、Ｃ群に対するより良好な抗炎症効果を示している。
【００７７】
シリウスレッド染色
図１６はＡ群からＣ群の肝臓のシリウスレッド染色した切片の代表的な顕微鏡写真を示し、図１６（Ａ）、図１６（Ｃ）、図１６（Ｅ）は５０倍の拡大率を示し、図１６（Ｂ）、図１６（Ｄ）、図１６（Ｆ）は２００倍の拡大率を示す。図１６（Ａ）及び図１６（Ｂ）に示されるように、Ａ群におけるシリウスレッド染色は、中心静脈、胆管及び変性肝細胞の周囲のコラーゲン沈着を示し、これらは中心静脈相互の架橋性線維化を表し、重篤な線維化脂肪性肝炎を示す。図１６（Ｃ）及び図１６（Ｄ）に示されるように、試験化合物（化合物１）及びエルゴステロールの併用処置はコラーゲン沈着を低下させる傾向にあった。図１６（Ｅ）及び図１６（Ｆ）に示されるように、シクロヘキセノンのみの処置は、対照群のものに比べてコラーゲン沈着を僅かに減少させる傾向であった。
【００７８】
要約すると、本明細書で提供されるシクロヘキセノン化合物（例えば、化合物１）での処置及びエルゴステロール処置（Ｂ群）並びに試験化合物のみでの処置（Ｃ群）はコラーゲン沈着を抑制する傾向にあるため、肝線維化を予防する。更に詳細には、本明細書で提供されるシクロヘキセノン化合物（例えば、化合物１）及びエルゴステロールの併用処置は、試験化合物のみでの処置に比べてより良好な抗肝臓線維化能をもたらす。
【００７９】
３型コラーゲンに対する免疫組織化学
図１７はＡ群からＣ群の肝臓の３型コラーゲンに対して免疫染色した切片の代表的な顕微鏡写真を示し、図１７（Ａ）、図１７（Ｃ）、図１７（Ｅ）は１００倍の拡大率を示し、図１７（Ｂ）、図１７（Ｄ）、図１７（Ｆ）は４００倍の拡大率を示す。図１７（Ａ）及び図１７（Ｂ）に示されるように、３型コラーゲン染色はビヒクル対照群の洞様領域並びに胆管及び中心静脈の周囲においてコラーゲン線維の蓄積を示す。図１７（Ｃ）、図１７（Ｄ）、図１７（Ｅ）及び図１７（Ｆ）に示されるように、シクロヘキセノン（例えば、化合物１）及びエルゴステロールの処置の併用及びシクロヘキセノンのみの処置は、洞様領域のコラーゲン線維の厚さの低下により証明されたコラーゲン沈着を減少させる傾向にあり、抗線維化能を示した。
【００８０】
実施例４：糖尿病及び推定ＮＡＦＬＤ患者における化合物１の試験
本試験の主な目的は、２型糖尿病（ＤＭ）及び推定非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の患者において以下を判断することである：
化合物１の複数回投与の安全性及び忍容性、
インスリン耐性及びグルコース恒常性に対する化合物１の２種類の用量レベル（５０ｍｇ及び１００ｍｇ）の効果、
肝臓酵素並びに肝機能及び代謝機能及び炎症の生化学マーカーの評価を用いて測定された肝細胞機能に対する化合物１の効果。
【００８１】
試験の種類：介入型
試験計画：割当：無作為抽出
エンドポイントの分類：安全性／有効性試験
介入モデル：並行群間比較
マスキング：二重盲検（対象、治験責任医師）
主な目的：治療
【００８２】
主要評価項目
インスリン耐性及びグルコース恒常性［時間枠：ベースライン及び６週間］［安全性問題としての指定（Designated as safety issue）：なし］
【００８３】
インスリン耐性及びグルコース恒常性の変化を評価する主な目的を実現するため、ベースライン（０日目）及び処置６週間目の終わり（４３日目）に正常血糖クランプ法を行う。
【００８４】
副次評価項目
肝細胞機能［時間枠：ベースライン及び６週間］［安全性問題としての指定：あり］
【００８５】
【表５】
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【００８６】
詳細な説明
本試験は、多施設、二重盲検、無作為化、プラセボ対照、複数回投与、並行群間比較試験である。患者１２名の３つのコホートそれぞれにプラセボ、５０ｍｇの化合物１又は１００ｍｇの化合物１のいずれかを経口で毎日６週間与えた。
【００８７】
インスリン耐性及びグルコース恒常性の変化を評価する主な目的を実現するため、ベースライン（０日目）及び処置６週間目の終わり（４３日目）に正常血糖クランプ法を行う。他のエンドポイントを有害事象、バイタルサイン、臨床検査値、血漿薬物及び代謝産物の濃度並びに全般的な健常性及び健康状態をモニタリングすることにより評価する。
【００８８】
適格性
試験に適した年齢：１８歳から７５歳
試験に適した性別：男女
健常ボランティアの受け入れ：なし
【００８９】
選択基準
米国糖尿病学会（ＡＤＡ）により定義された、以下の基準の１つを含む２型糖尿病
【００９０】
糖尿病に加えて、随時血漿グルコース濃度が２００ｍｇ／ｄＬ（１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ）を超えるか、又は空腹時血漿グルコースが１２６ｍｇ／ｄＬ（７．０ｍｍｏｌ／Ｌ）を超えるか、又は７５ｇの経口ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）中の負荷２時間後のグルコースが２００ｍｇ／ｄＬ（１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ）を超える。
【００９１】
以下の基準の１つにより定義された推定ＮＡＦＬＤ
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）  女性で４７Ｕ／Ｌ以上及び男性で５６Ｕ／Ｌ以上
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）  女性で４７Ｕ／Ｌ以上及び男性で６０Ｕ／Ｌ以上
肝肥大（超音波又は他の画像法により表示）
以前の生検（過去５年以内）で示された診断用組織学的所見
【００９２】
除外基準
ビリルビン  ＵＬＮ（基準値上限）の２倍超
ＡＬＴ  女性で１５５Ｕ／Ｌ超及び男性で１８５Ｕ／Ｌ超
ＡＳＴ  女性で１５５Ｕ／Ｌ超及び男性で２００Ｕ／Ｌ超
メトホルミン及びスルホニルウレアを除く任意の抗糖尿病薬を服用している患者。ＨｂＡ１ｃが１１％未満である場合、プロトコルで明記されている他の全ての糖尿病薬により除外されている患者を治験責任医師の裁量により参加させることができる。
【００９３】
実施例５：経口配合物
経口送達用の医薬組成物を調製するために、１００ｍｇの例示の化合物１を１００ｍｇのコーン油と混合する。その混合物を経口投与に適したカプセルの経口投薬ユニットに組み入れる。
【００９４】
いくつかの例において、本明細書に記載の化合物１００ｍｇをデンプン７５０ｍｇと混合する。その混合物を経口投与に適した硬質ゼラチンカプセル等の経口投薬ユニットに組み入れる。
【００９５】
実施例６：舌下（硬質トローチ剤）配合物
硬質トローチ剤等の頬内送達用の医薬組成物を調製するために、本明細書に記載の化合物１００ｍｇを糖粉末混合物４２０ｍｇ、明色コーンシロップ１．６ｍＬ、蒸留水２．４ｍＬ及びミント抽出物０．４２ｍＬと混合する。その混合物を静かに混和し、金型に注いで頬内投与に適したトローチ剤を形成する。
【００９６】
実施例７：吸入組成物
吸入送達用の医薬組成物を調製するために、本明細書に記載の化合物２０ｍｇを無水クエン酸５０ｍｇ及び０．９％塩化ナトリウム溶液１００ｍＬと混合する。混合物を、吸入投与に適したネブライザー等の吸入送達単位に組み込む。
【００９７】
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、記載したが、このような実施形態が例示に過ぎないことは当業者であれば明らかであるだろう。この先、多くの変形、変更及び置換が本発明から逸脱することなく当業者により為されるだろう。本明細書に記載の本発明の実施形態の種々の代替物を本発明の実施に使用することができることが理解されるはずである。添付の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これによってこれらの特許請求の範囲及び均等物の範囲内の方法及び構造が包含されることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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