(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
不飽和脂肪酸及びそのエステルをオゾン分解する方法であって、以下の工程：
ａ）不飽和脂肪酸又はそのエステルを、水相の存在下で、有機溶剤を含む有機相中でオゾン分解する工程、及び
ｂ）工程ａ）におけるオゾン分解の終了後に、前記有機相を、カタラーゼを含む水相と接触させる工程
を含み、
その際に、前記不飽和脂肪酸又はそのエステルが、オレイン酸及びエルカ酸及びそれらのメチルエステルを含む群から選択されており、
前記有機溶剤が、Ｒ5Ｒ6Ｒ7Ｃ−Ｏ−Ｒ8又はその分子内エーテルを含む群から選択されており、
ここで、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7はそれぞれ、かつ互いに独立して、水素、炭素原子１〜７個を有するアルキル又はシクロアルキル、並びにアリールを含む群から選択されており、Ｒ8は、水素、炭素原子１〜７個を有するアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシアルキル及びアルコキシアルキル並びにアリール及びベンジルを含む群から選択されており、かつ
前記有機溶剤が、水相の存在下で室温で前記水相とは別個の有機相を形成する有機溶剤である、不飽和脂肪酸及びそのエステルをオゾン分解する方法。
【請求項２】
工程ｂ）の前に、前記水相を工程ａ）から除去する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記有機溶剤が、式Ｒ5Ｒ6Ｒ7Ｃ−ＯＨの化合物であり、かつＲ5、Ｒ6及びＲ7がそれぞれ、かつ互いに独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル及びペンチルを含む群から選択されている、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記有機溶剤が２−メチル−２−ブタノールである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記有機相を接触させる際の前記水相の体積割合は、双方の相の全体積に対して０％超〜５０％である、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記カタラーゼが工程ａ）の際に存在している、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記カタラーゼがウシ肝臓カタラーゼ又はその変異体である、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記有機相と接触させる前の工程ｂ）における前記水相のｐＨ値が、３〜１１である、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
不飽和脂肪酸又はそのエステルのオゾン分解によるオゾン分解生成物を含む反応混合物から、反応性酸素種を除去するための、カタラーゼの使用であって、前記オゾン分解が、以下の工程：
ａ）不飽和脂肪酸又はそのエステルを、水相の存在下で、有機溶剤を含む有機相中でオゾン分解する工程、及び
ｂ）工程ａ）におけるオゾン分解の終了後に、前記有機相を、カタラーゼを含む水相と接触させる工程
を含み、
その際に、前記不飽和脂肪酸又はそのエステルが、オレイン酸及びエルカ酸及びそれらのメチルエステルを含む群から選択されており、
前記有機溶剤が、Ｒ5Ｒ6Ｒ7Ｃ−Ｏ−Ｒ8又はその分子内エーテルを含む群から選択されており、
ここで、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7はそれぞれ、かつ互いに独立して、水素、炭素原子１〜７個を有するアルキル又はシクロアルキル、並びにアリールを含む群から選択されており、Ｒ8は、水素、炭素原子１〜７個を有するアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシアルキル及びアルコキシアルキル並びにアリール及びベンジルを含む群から選択されており、かつ
前記有機溶剤が、水相の存在下で室温で前記水相とは別個の有機相を形成する有機溶剤である、カタラーゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、以下の工程：ａ）不飽和脂肪酸又はその誘導体を、有機溶剤を含む有機相中でオゾン分解する工程、及びｂ）前記有機相を、カタラーゼ及び好ましくは緩衝液を含む水相と接触させる工程［ここで前記不飽和脂肪酸又はその誘導体は、炭素原子を少なくとも８個有する線状鎖を有する］を含む不飽和脂肪酸及びそれらの誘導体をオゾン分解する方法並びに不飽和脂肪酸又はその誘導体のオゾン分解生成物を含む反応混合物から反応性酸素種を除去するためのカタラーゼの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
オゾン分解は、合成有機化学において確立された、不飽和炭化水素のＣ＝Ｃ二重結合を２個のカルボニル化合物の形成下に開裂させる方法である。後者のカルボニル化合物は、特に、カルボン酸、アルデヒド及びアルコールでありうる。機構的には、オゾン分解は、前記二重結合へのオゾンの［３＋２］付加環化を含み、この付加環化は一次オゾニド、すなわち不安定な中間生成物を生じ、これがアルデヒド及びカルボニルオキシドに分解する。後者のカルボニルオキシドは、重合しうるかもしくは１，２，４，５−テトラオキソランに二量化しうるか、又はさらなる付加環化において二次オゾニドを形成しうる。この二次オゾニドは最終的に、酸化的に後処理されてカルボン酸となりうるか、又は還元的に後処理されてアルデヒドとなりうる。前記アルデヒドはさらにアルコールまで還元されうる（Vollhardt/Scholer, 1995、非特許文献３）。
【０００３】
前記方法の欠点は、前記カルボニルオキシドから、所望の生成物に後処理されることができる二次オゾニドが形成されるだけでなく、一連の副生物、その中でもテトラオキソラン二量体、ヒドロペルオキシドと呼ばれるオゾニド及び水の付加物並びにそれらから生じる過酸化水素も形成されることにある。さらにまた、二次オゾニドの発生及び蓄積(Ansammlung)は、前記反応操作の安全性に関して憂慮すべきである、それというのも、この種の化合物が爆発性として知られているからである。
【０００４】
別の副生物の発生は、前記反応の収率を低下させ、とりわけ、生じる過酸化水素は、その後の工程の生成物を酸化させ、このようにして付加的な副生物も形成しうる。発生する望ましくないカルボニル化合物は、多数の望ましくない縮合生成物の形成をまねきうる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】DE 102011015150.8 (2011): SYNTHESE VON OMEGA-AMINOCARBONSAEUREN UND DEREN ESTERN AUS UNGESAETTIGTEN FETTSAEUREDERIVATEN
【非特許文献】
【０００６】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この背景から、本発明の基礎となる課題は、危険な二次オゾニド及び妨げとなる副生物の発生が減少し、かつ前記反応の収率がそれに応じて改善されている改良法を提供することにある。
【０００８】
さらに、本発明は、不飽和脂肪酸及びそれらの誘導体のオゾン分解生成物を含む反応混合物中の反応性酸素種が、還元当量を消費せずに分解される方法を開発するという課題が基礎になっている。
【０００９】
さらに、本発明は、不飽和脂肪酸及びそれらの誘導体のオゾン分解生成物を含む反応混合物中の反応性酸素種の分解が、これまで使用される触媒に比べて改善された性質を有する代替的な触媒により達成される方法を開発するという課題が基礎になっている。
【００１０】
さらに、本発明は、不飽和脂肪酸及びそれらの誘導体のオゾン分解生成物を含む反応混合物の処理が、二次オゾニドの濃度の低下のために中性条件下で行われ、極端なｐＨ値によりアルデヒド性オゾン分解生成物の助長される副反応を回避する方法を開発するという課題が基礎になっている。
【００１１】
本発明の基礎となるさらなる課題は、前記方法を、溶剤の交換を必要とすることなく、反応性酸素種の促進された分解となるように改良することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
これらの課題及びさらなる課題は、本発明の対象によって、特に添付の独立請求項の対象によっても、解決され、ここで、実施態様は従属請求項から明らかになる。
【００１３】
本発明によれば、前記課題は、第一態様において、以下の工程：
ａ）不飽和脂肪酸又はその誘導体を、有機溶剤を含む有機相中でオゾン分解する工程、及び
ｂ）前記有機相を、カタラーゼ及び好ましくは緩衝液を含む水相と接触させる工程
を含む方法により解決され、ここで、前記不飽和脂肪酸又はその誘導体は、炭素原子を少なくとも８個有する線状鎖を有する。
【００１４】
第一態様の第一実施態様において、前記有機溶剤は、水相の存在下で室温で水相とは別個の有機相を形成する有機溶剤である。
【００１５】
第一実施態様の一実施態様である第二実施態様において、工程ａ）は、水相の存在下で行われる。
【００１６】
第二実施態様の一実施態様である第三実施態様において、工程ｂ）の前に、前記水相は工程ａ）から除去される。
【００１７】
第一実施態様ないし第三実施態様の一実施態様でもある第一態様の第四実施態様において、前記不飽和脂肪酸又はその誘導体は、式（Ｉ）
Ｒ1−（ＣＨ2）x−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ2）y−ＣＯＲ2  （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、ＨＯ−、ＨＳ−、ＣＨＯ−、Ｒ2ＯＣ−、非置換又は置換された、好ましくはハロゲン化された、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリールを含む群から選択されており、
式中、Ｒ2は、ＨＯ−、炭素原子１〜７個を有する置換又は非置換のアルコキシ、アルケンオキシ、アルキンオキシ及びシクロアルコキシ、−ＮＲ3Ｒ4、アリールオキシ及びベンジルオキシを含む群から選択されており、
式中、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ、かつ互いに独立して、水素、アルキル、好ましくはメチル又はエチル、アルケニル、アルキニル、アリール及びベンジルを含む群から選択されており、
かつ式中、ｘ及びｙはそれぞれ、かつ互いに独立して、０又はより大きい整数である］で示される化合物である。
【００１８】
第四実施態様の一実施態様である第五実施態様において、Ｒ1は水素であり、Ｒ2はＨＯ−、メトキシ又はエトキシであり、かつｘ及びｙの和は９又はそれ以上である。
【００１９】
第一実施態様ないし第五実施態様の一実施態様でもある第一態様の第六実施態様において、前記脂肪酸もしくは前記誘導体は、オレイン酸及びエルカ酸及びそれらのエステル、好ましくはメチルエステル又はエチルエステルを含む群から選択されている。
【００２０】
第一実施態様ないし第六実施態様の一実施態様でもある第一態様の第七実施態様において、前記有機溶剤は、Ｒ5Ｒ6Ｒ7Ｃ−Ｏ−Ｒ8又はその分子内エーテルを含む群から選択されており、ここで、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7はそれぞれ、かつ互いに独立して、水素、炭素原子１〜７個を有するアルキル又はシクロアルキル、並びに非置換及び置換されたアリールを含む群から選択されており、ここで、Ｒ8は、水素、炭素原子１〜７個を有するアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシアルキル及びアルコキシアルキル並びに非置換又は置換されたアリール及びベンジルを含む群から選択されており、かつここで、好ましくは基Ｒ5、Ｒ6及びＲ7の少なくとも１つはメチルである。
【００２１】
第七実施態様の一実施態様である第八実施態様において、前記有機溶剤は、式Ｒ5Ｒ6Ｒ7Ｃ−ＯＨの化合物であり、かつＲ5、Ｒ6及びＲ7はそれぞれ、かつ互いに独立して、メチル、エチル、プロピル、ブチル及びペンチルを含む群から選択されている。
【００２２】
第八実施態様の一実施態様である第九実施態様において、前記有機溶剤は、２−メチル−２−ブタノールである。
【００２３】
第一実施態様ないし第九実施態様の一実施態様でもある第一態様の第十実施態様において、前記有機相を接触させる際の前記水相の体積割合は、双方の相の全体積に対して０超〜５０％、より好ましくは５〜３０％、さらにより好ましくは１５〜２５％である。
【００２４】
第一実施態様ないし第十実施態様の一実施態様でもある第一態様の第十一実施態様において、工程ａ）の際にカタラーゼが存在している。
【００２５】
第一実施態様ないし第十一実施態様の一実施態様でもある第一態様の第十二実施態様において、前記カタラーゼは、ウシ肝臓カタラーゼ又はその変異体(Variante)である。
【００２６】
第一実施態様ないし第十二実施態様の一実施態様でもある第一態様の第十三実施態様において、前記有機相と接触させる前の工程ｂ）における前記水相のｐＨ値は、３〜１１、好ましくは５〜８、さらにより好ましくは６．５〜７．５である。
【００２７】
本発明によれば、前記課題は、第二態様において、不飽和脂肪酸又はその誘導体のオゾン分解生成物を含む反応混合物から、反応性酸素種、好ましくは反応性有機酸素種を除去するための、カタラーゼの使用によって解決される。
【００２８】
第二態様の第一実施態様において、前記不飽和脂肪酸又はそのエステルは、式
Ｒ1−（ＣＨ2）x−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ2）y−ＣＯＲ2  （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、ＨＯ−、ＨＳ−、ＣＨＯ−、Ｒ2ＯＣ−、非置換又は置換された、好ましくはハロゲン化された、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリールを含む群から選択されており、
式中、Ｒ2は、ＨＯ−、炭素原子１〜７個を有する置換又は非置換のアルコキシ、アルケンオキシ、アルキンオキシ及びシクロアルコキシ、−ＮＲ3Ｒ4、アリールオキシ及びベンジルオキシを含む群から選択されており、
式中、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ、かつ互いに独立して、水素、アルキル、好ましくはメチル又はエチル、アルケニル、アルキニル、アリール及びベンジルを含む群から選択されており、
かつ式中、ｘ及びｙはそれぞれ、かつ互いに独立して、０又はより大きい整数である］で示される化合物である。
【００２９】
第一実施態様の一実施態様でもある第二態様の第二実施態様において、前記反応混合物はさらに、有機溶剤、好ましくは、水相の存在下で室温で水相とは別個の有機相を形成する有機溶剤１種を含有し、
ここで、前記有機溶剤は、Ｒ5Ｒ6Ｒ7Ｃ−Ｏ−Ｒ8又はその分子内エーテルを含む群から選択されており、ここで、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7はそれぞれ、かつ互いに独立して、水素、炭素原子１〜７個を有するアルキル又はシクロアルキル、並びに非置換及び置換されたアリールを含む群から選択されており、ここで、Ｒ8は、水素、炭素原子１〜７個を有するアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシアルキル及びアルコキシアルキル並びに非置換又は置換されたアリール及びベンジル群から選択されており、かつここで、好ましくは基Ｒ5、Ｒ6及びＲ7の少なくとも１つはメチルであり、
ここで、好ましくは基Ｒ5、Ｒ6及びＲ7の少なくとも１つはメチルであり、
かつここで、前記有機溶剤は、さらにより好ましくは２−メチル−２−ブタノールである。
【００３０】
第三態様において、本発明の基礎となる課題は、一方では不飽和脂肪酸又はその誘導体のオゾン分解生成物及び有機溶剤を含む有機相と、他方ではカタラーゼ及び好ましくは緩衝液を含む水相とを含む反応混合物によって解決され、ここで、前記脂肪酸又はその誘導体は、炭素原子を少なくとも８個有する線状鎖を有する。
【００３１】
第三態様の第一実施態様において、前記有機溶剤は、水相の存在下で室温で水相とは別個の有機相を形成する。
【００３２】
第一実施態様の一実施態様である第三態様の第二実施態様において、工程ａ）は水相の存在下で行われる。
【００３３】
第二実施態様の一実施態様である第三態様の第三実施態様において、工程ｂ）の前に、前記水相は工程ａ）から除去される。
【００３４】
第一実施態様ないし第二実施態様の一実施態様でもある第三態様の第四実施態様において、前記不飽和脂肪酸又はその誘導体は、式（Ｉ）
Ｒ1−（ＣＨ2）x−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ2）y−ＣＯＲ2  （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、ＨＯ−、ＨＳ−、ＣＨＯ−、Ｒ2ＯＣ−、非置換又は置換された、好ましくはハロゲン化された、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリールを含む群から選択されており、
式中、Ｒ2は、ＨＯ−、炭素原子１〜７個を有する置換又は非置換のアルコキシ、アルケンオキシ、アルキンオキシ及びシクロアルコキシ、−ＮＲ3Ｒ4、アリールオキシ及びベンジルオキシを含む群から選択されており、
式中、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ、かつ互いに独立して、水素、アルキル、好ましくはメチル又はエチル、アルケニル、アルキニル、アリール及びベンジルを含む群から選択されており、
かつ式中、ｘ及びｙはそれぞれ、かつ互いに独立して、０又はより大きい整数である］で示される化合物である。
【００３５】
第四実施態様の一実施態様である第三態様の第五実施態様において、Ｒ1は水素であり、Ｒ2は水素又はメチル又はエチルであり、かつｘ及びｙの和は９又はそれ以上である。
【００３６】
第一実施態様ないし第五実施態様の一実施態様でもある第三態様の第六実施態様において、前記脂肪酸もしくは前記誘導体は、オレイン酸及びエルカ酸及びそれらのエステル、好ましくはメチルエステル又はエチルエステルを含む群から選択されている。
【００３７】
第一実施態様ないし第六実施態様の一実施態様でもある第三態様の第七実施態様において、前記有機溶剤は、Ｒ5Ｒ6Ｒ7Ｃ−Ｏ−Ｒ8又はその分子内エーテルを含む群から選択されており、ここで、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7はそれぞれ、かつ互いに独立して、水素、炭素原子１〜７個を有するアルキル又はシクロアルキル、並びに非置換及び置換されたアリールを含む群から選択されており、ここで、Ｒ8は、水素、炭素原子１〜７個を有するアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシアルキル及びアルコキシアルキル並びに非置換又は置換されたアリール及びベンジルを含む群から選択されており、かつここで、好ましくは、基Ｒ5、Ｒ6及びＲ7の少なくとも１つはメチルである。
【００３８】
第七実施態様の一実施態様である第三態様の第八実施態様において、前記有機溶剤は、式Ｒ5Ｒ6Ｒ7Ｃ−ＯＨの化合物であり、かつＲ5、Ｒ6及びＲ7はそれぞれ、かつ互いに独立して、メチル、エチル、プロピル、ブチル及びペンチルを含む群から選択されている。
【００３９】
第八実施態様の一実施態様である第三態様の第九実施態様において、前記有機溶剤は、２−メチル−２−ブタノールである。
【００４０】
第一実施態様ないし第九実施態様の一実施態様でもある第三態様の第十実施態様において、前記有機相を接触させる際の前記水相の体積割合は、双方の相の全体積に対して０超〜５０％、より好ましくは５〜３０％、さらにより好ましくは１５〜２５％である。
【００４１】
第一実施態様ないし第十実施態様の一実施態様でもある第三態様の第十一実施態様において、工程ａ）の際に、カタラーゼが存在している。
【００４２】
第一実施態様ないし第十一実施態様の一実施態様でもある第三態様の第十二実施態様において、前記カタラーゼは、ウシ肝臓カタラーゼ又はその変異体である。
【００４３】
第一実施態様ないし第十二実施態様の一実施態様でもある第三態様の第十三実施態様において、前記有機相と接触させる前の工程ｂ）における前記水相のｐＨ値は、３〜１１、好ましくは５〜８、さらにより好ましくは６．５〜７．５である。
【００４４】
本発明の発明者らは、不飽和脂肪酸及びそれらの誘導体のオゾン分解の効率及び収率並びに反応生成物の純度が、オゾン分解の実施後の前記反応混合物中のカタラーゼの存在により上昇されることができることを意外にも見出した。本発明者らはさらに、カタラーゼの活性が、オゾン分解の際に生じた反応混合物と適合性である(kompatibel)ことを意外にも見出した。最後に、本発明者らは、オゾン分解−反応混合物中のカタラーゼの存在が、二次オゾニドのような反応性酸素種の濃度並びにさらなる副生物の形成を低下させ、かつカルボニル生成物の発生を促進することを意外にも見出した。
【００４５】
好ましい一実施態様において、本明細書で使用されるような、"オゾン分解"という概念は、炭化水素、好ましくは不飽和脂肪酸又はその誘導体のＣ＝Ｃ二重結合が、前記分子へのオゾンの作用により、カルボニル生成物の形成下に酸化的に開裂される方法を意味する。このオゾン分解の実施に適した方法、試剤及び装置は当業者には技術水準から知られている（Baily, 1978、非特許文献１）。このオゾン分解は、通常、溶剤としてのアルコール中で実施され、その際に前記反応混合物はさらに、溶剤の全量を基準として、水を少なくとも０．５質量％含有する。通常、前記不飽和脂肪酸又はそれらの誘導体は、０．１〜１モル／Ｌの濃度で存在する。オゾン分解は、好ましくは０〜４０℃の温度で、さらにより好ましくは１０〜３５℃の温度で、及び特に好ましくは２０〜３０℃の温度で、実施される。通常、オゾンの発生のために、フィードガスとして工業用空気又は二酸化炭素及び酸素の混合物を使用するオゾン発生器が使用される。酸素から、オゾンは、無音放電により製造される。その際に、酸素ラジカルが形成され、これらのラジカルは、別の酸素分子とオゾン分子を形成する。
【００４６】
本発明による方法の特別な強みは、前記方法の改善が、攻撃的な又は危険な化合物もしくは反応条件の使用によってではなく、酵素活性の付加によって達成されることができることにある。有機合成における活性な酵素の使用は今日まで、主に、小規模での方法に限定されている。酵素は、低い基質特異性を有する高価格な試剤として当てはまるだけでなく、多様な効果に基づいて、有機合成において普通の多数の溶剤と不適合性であり、それらの溶剤の使用は多くの場合に常に、所望の反応生成物の経済的な後処理のための必要条件でもある。ポリペプチドとして、酵素は通例、多かれ少なかれ球状の構造を有し、この構造は特に脂肪族アミノ酸側鎖が内部で疎水性のコアを形成することにより安定化されており、それに反して前記酵素の表面では親水性で極性のアミノ酸側鎖が支配的である。それに応じて、前記酵素は、その安定化のために、水分子の水和殻を必要とし、かつ前記酵素が溶剤と接触している場合には変性する傾向があり、この溶剤はこの酵素と、利用可能な少ない水分子を求めて競合する。水相と有機相とを含む二相系の場合に、しばしば界面効果となり、これらの界面効果は相境界上での前記酵素分子の吸収及び不活性化を含みうる。有機溶剤の存在はさらに、前記酵素の速度論的性質、すなわちその活性及びその選択率に、例えば前記酵素の可逆的又は不可逆的な変性により又はその選択率の変化により又は反応平衡の影響により、影響を及ぼしうる。また、酵素の活性にとって本質的である特定のｐＨ範囲の信頼できる調節は、有機溶剤の存在下では難しい（Wong, 1994、非特許文献２）。
【００４７】
好ましい一実施態様において、本明細書で使用されるような、"カタラーゼ"という概念は、水及び酸素への過酸化水素の分解を触媒する、酵素的に活性なポリペプチドであると理解される。触媒反応は、好ましい一実施態様において、触媒的に有効なポリペプチドの検出可能な量の存在下での過酸化水素の分解が、その不在下でよりも迅速に進行する場合に存在する。好ましい一実施態様において、酵素的に活性なポリペプチドは、カタラーゼ活性に加えて、１つ又は１つよりも多い別の活性を有する多機能性酵素である。本発明により使用可能なポリペプチドの例は、ウシ肝臓カタラーゼ（データベースコードNP_001030463）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、例えばデータベースコード、CAA00083.1、さらに技術水準に記載された全てのカタラーゼ（Abad-Zapatero, 1992、非特許文献５；Abe et al. 1973、非特許文献６；Altomare et al, 1974、非特許文献７；Baird et al, 1987、非特許文献８）、Balasubramaniam et al., 1987、非特許文献９；Barlow & Margoliash, 1969、非特許文献１０；Beers & Sizer, 1952、非特許文献１１；Beyer & Fridovich, 1985、非特許文献１２；Boismenu et al., 1989、非特許文献１３；Browett & Stillman, 1980、非特許文献１４；Chance, 1951、非特許文献１６；Chance, 1955、非特許文献１７；Chance, 1973、非特許文献１８；Chance et al., 1973、非特許文献１９；Chatterjee et al., 1989、非特許文献２０；Ch et al., 1975、非特許文献２１；Corrall et al., 1974、非特許文献２２；Darr & Fridovich, 1985、非特許文献２３；Davison et al., 1986、非特許文献２４；Deisseroth & Dounce, 1969、非特許文献２５；Diesseroth et al., 1967、非特許文献２６；Eglinton et al., 1983、非特許文献２７；Escobar et al., 1990、非特許文献２８；Evans & Recheigl, 1967、非特許文献２９；Feinstein et al., 1967、非特許文献３０；Feinstein et al., 1967、非特許文献３１；Fita & Rossman, 1985、非特許文献３２；Furuta et al., 1974、非特許文献３３；Ghadermarzi & Moosavi-Movahedi, 1996、非特許文献３４；Goldacre & Galston, 1953、非特許文献３５；Goldstein, 1968、非特許文献３６；Goth, 1989、非特許文献３７；Goth, 1991、非特許文献３８；Gregory & Fridovich, 1974、非特許文献３９；Gadermarzi & Moosavi-Movahedi, 1996；Goldacre & Galston, 1953；Goldstein, 1968；Goth, 1989；Goth, 1991；Gregory & Fridovich, 1974；Haining & Legan, 1972、非特許文献４０；Halliwell, 1973、非特許文献４１；Heidrich, 1968、非特許文献４２；Higashi et al., 1974、非特許文献４３；Holmes, 1972、非特許文献４４；Holmes & Masters, 1972、非特許文献４５；Johansson & Borg, 1988、非特許文献４６；Jones & Masters, 1975、非特許文献４７；Jones, 1973、非特許文献４８；Jones & Middlemiss, 1972、非特許文献４９；Kirkman & Gaetani, 1984、非特許文献５０；Kiselev et al., 1967、非特許文献５１；Kremer, 1970、非特許文献５２；Kroll et .al, 1989、非特許文献５３；Kyle et .al, 1987、非特許文献５４；Lanir & Schejter, 1975、非特許文献５５；Lardinois, 1995、非特許文献５６；Lee et al., 1987、非特許文献５７；Liebermann & Ove, 1958、非特許文献５８；Loewen & Seitala, 1987、非特許文献５９；Longley, 1967、非特許文献６０；Maehly & Chance, 1954、非特許文献６１；Maimoni et al., 1999、非特許文献６２;Margoliash & Novogorodsky, 1958、非特許文献６３；Marklund, 1972、非特許文献６４；Mastersc, 1986、非特許文献６５；McPherson & Rich, 1973、非特許文献６６；Mitchel & Anderson, 1965、非特許文献６７；Miyahara et al., 1978、非特許文献６８；Murphy et al., 1967、非特許文献６９；Madler et al., 1986、非特許文献７０；Nelson & Niesow, 1972、非特許文献７１；Nicholls et al., 1963、非特許文献７２；Orr, 1967a、非特許文献７３；Orr, 1967b、非特許文献７４；Oshino et al., 1973、非特許文献７６；Percy et al., 1990、非特許文献７７；Perrin et al., 1990、非特許文献７８；Pitts, 1992、非特許文献７９；Poznansky et al., 1974、非特許文献８０；Pritchard & Hudson, 1967、非特許文献８１；Roth & Jensen, 1967、非特許文献８２；Rossman & Labaw, 1967、非特許文献８３；Sakamoto & Highashi, 1974、非特許文献８４；Samejima, Kita, 1969、非特許文献８５；Samejima et al., 1962、非特許文献８６；Schroeder et al., 1969、非特許文献８７；Scibior & Czeczot, 2006、非特許文献８８；Scott et al., 1991、非特許文献８９；Seah & Kaplan, 1973、非特許文献９０；Seah et al., 1973、非特許文献９１；Sharma et al., 1989、非特許文献９２；Shimiza et al., 1984、非特許文献９３；Spreti et al., 1995、非特許文献９４；Sumner & Dounce, 1937、非特許文献９５；Sumner et al., 1940、非特許文献９６；Sund et al., 1967、非特許文献９７；Tanaka et al., 1991、非特許文献９８；Tanford & Lovrien, 1962、非特許文献９９；Tauber & Petit, 1952、非特許文献１００；Tudhope, 1967、非特許文献１０１；Vuilaum et al., 1988、非特許文献１０２；Wheeler et al., 1990、非特許文献１０３；Whiteside et al., 1988、非特許文献１０４；Yasukochi et al., 1972、非特許文献１０５；Zidoni & Kremer, 1974、非特許文献１０６）及びそれらの変異体を含む。
【００４８】
カタラーゼの活性のために、過酸化水素に加えて、さらに、別の基質及び／又は１種又は１種よりも多い補因子が必要である場合には、前記カタラーゼはこれを含む。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼの使用の場合に、２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）の存在が必要である。
【００４９】
使用されるカタラーゼは、前記反応混合物に、多様な形で及び多様な精製段階で、カタラーゼ活性を有する細胞の未加工の溶液又はペレットから、完全に精製された酵素まで、添加されることができる。好ましい一実施態様において、前記カタラーゼは、完全で、生存可能な細胞又は溶解された細胞に関連したポリペプチド、例えば原核の全細胞触媒、好ましくは細菌的素質(bakterieller Natur)により発現されるポリペプチドである。その際に、細胞は、これが全細胞触媒として使用される場合には、前記カタラーゼがその内部で発現する必要はなく、外膜上に局在化されたカタラーゼ、例えば内因性の外膜タンパク質との融合タンパク質も可能である。好ましいさらなる一実施態様において、前記カタラーゼを細胞内部で発現させる細胞の、好ましくは細菌的素質の、溶解産物である。さらなる一実施態様において、単離され、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％、特に好ましくは１００％の純度のポリペプチドの溶液であるか又は凍結乾燥物である。この種の細胞又はポリペプチドの製剤は、商業的に入手可能であるか又は当業者には生化学的な標準法に基づいて製造可能である。
【００５０】
前記カタラーゼの濃度は、好ましい一実施態様において、工程ｂ）の際の水相の０．００１〜１質量％、さらにより好ましくは０．０１〜０．５質量％、最も好ましくは０．０２５〜０．１質量％である。
【００５１】
工程ａ）及びｂ）の順序及び実施は、前記カタラーゼが、前記脂肪酸又はその誘導体のオゾン分解の生成物と接触する限りは、考えられる全ての変法で行われることができる。工程ｂ）の際にカタラーゼを含む水相の存在が本質的であるのに対し、これは工程ａ）の場合に任意である。例えば、工程ａ）及びｂ）の際に同じ水相が存在していてよいが、しかしながら、工程ａ）を水相の存在下で実施するが、しかしこの水相を除去し、かつ工程ｂ）のために他の水相を使用することも可能である。同じように、工程ａ）中又は工程ａ）の前に、カタラーゼを有するか又は有しない水相を有機相に添加し、かつ前記カタラーゼを、工程ａ）におけるオゾン分解の終了後に前記水相へ添加することが可能である。特に好ましい一実施態様において、前記カタラーゼは、オゾン分解後にはじめて、有機相に添加される。
【００５２】
当業者には、触媒活性なカタラーゼが野生型細胞又は組換え型細胞から精製されることができる多数の方法及びプロトコルが知られている、例えばYumoto et al., 2000、非特許文献４、参照。
【００５３】
オゾン分解のための出発物質として、考えられる全ての脂肪酸及びそれらの誘導体、天然に存在するか並びに人工的に合成され、偶数並びに奇数の炭素原子を有し、かつ分枝鎖状並びに非分枝鎖状の、脂肪酸及びそれらの誘導体、特にウンデシレン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、ペトロセリン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、イコセン酸、セトレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸及びそれらの誘導体、好ましくはそれらのメチルエステルが考慮に値する。さらに、ポリ不飽和脂肪酸、例えばリノール酸、リノレン酸、カレンド酸、プニカ酸、エレオステアリン酸、アラキドン酸、チムノドン酸、イワシ酸及びセルボン酸及びそれらの誘導体、好ましくはそれらのメチルエステルが使用されることもできる。好ましい一実施態様において、本明細書で使用されるような、"脂肪酸又はその誘導体が、炭素原子を少なくとも８個有する線状鎖を有する"ことは、カルボキシル基の炭素原子が、分枝を有していてもよい、炭素原子を少なくとも８個有する線状鎖の、好ましくは末端の、部分であり、その限りでは炭素原子８個の長さは炭素骨格中でできる限り最長の線状鎖で得られていることを意味する。
【００５４】
好ましい一実施態様において、本明細書で使用されるような、"アルコキシ"、"アルケンオキシ"もしくは"アルキンオキシ"と呼ばれる置換基は、式Ｒ−Ｏ−の置換基であり、ここで、Ｒは、アルキル、アルケニルもしくはアルキニルである。
【００５５】
本発明による方法の特別な利点は、オゾン分解及び反応性酸素種の除去が、双方の反応と適合性の溶剤もしくは溶剤混合物、すなわちワンポット反応において実施されることができるので、前記溶剤の費用のかかる交換がなされずにすみうることにある。好ましい一実施態様において、工程ｂ）はそれに応じて、前記溶剤を交換せずに又は工程ａ）からの前記反応混合物の成分を分離せずに同じ反応容器中で実施される。
【００５６】
特別な一実施態様において、前記有機相を接触させる際の前記水相の体積割合は、双方の相の全体積に対して０．５％超、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％又は０％超〜５０％、１％超〜４０％、２．５％超〜２５％、より好ましくは５％〜３０％、さらにより好ましくは１５〜２５％である。
【００５７】
原則的に、工程ａ）のためには、多数の溶剤、例えば脂肪族化合物、例えばヘキサン又はシクロヘキサン、芳香族化合物、アルキル化された芳香族化合物、例えばベンゼン、トルエン又はキシレン、ハロゲン化された脂肪族化合物又は芳香族化合物、例えばジクロロメタンもしくはクロロベンゼン、ケトン、例えばアセトン又はシクロヘキサノン、アルコール及びそれらのエーテル、例えば２−ブタノール、２−メチル−２−プロパノール又はメチル−ｔ−ブチルエーテル、カルボン酸及びそれらのエステル、例えば酢酸又は酢酸エチル、スルホキシド、例えばジメチルスルホキシド、及びヘテロ環式化合物、例えばテトラヒドロフラン又はジオキサンが使用されることができる。特に好ましい溶剤は、第二級及び第三級のアルコール、その中でも、特に２−プロパノール及びｔ−ブタノールを含む。前記溶剤が式Ｒ5Ｒ6Ｒ7Ｃ−Ｏ−Ｒ8の溶剤である場合には、基Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8はそれぞれ、対になってかつ互いに独立して、式−（ＣＨ2）z−のアルキレン橋を形成してよく、ここでｚは、相応する環が、少なくとも３員、好ましくは少なくとも５員を有するように選択されている。さらに、前記基は、形式的に２個のヒドロキシ含有基の縮合の結果である分子内エーテルも形成することができる。例えば、Ｒ5＝Ｒ6＝メチルであり、Ｒ7がヒドロキシプロピルであり、かつＲ8が水素である場合の本発明による溶剤は、式
【化１】
0006327783.tif 000002
で示される化合物である。
【００５８】
前記有機溶剤の分離は、特にこれらの溶剤が無関係に前記水相とは別個の相を形成する場合には、当業者に単純であり、かつ例えばデカンテーション、分液漏斗の使用等により行われる。
【００５９】
好ましい一実施態様において、本明細書で使用されるような、"水相とは別個の有機相"という概念は、室温で主に、好ましくは少なくとも９０体積％が、有機溶剤からなる均質な液相であると理解され、この相は水相と接触させた後にさらに無関係に、この水相から、好ましくは純粋に視覚的に確認可能であるように、沈降するので、平衡の調節後に、２つの別個の相の形成となる。
【００６０】
工程ａ）及びｂ）に続き、通例、反応性酸素種が除去されたオゾン分解生成物のさらなる加工が行われる。可能であるのは、例えば、アルデヒド又はケトンがアミン化される還元的アミノ化、すなわちω−オキソ−カルボン酸−オゾン分解生成物の場合に、ω−アミノカルボン酸の形成となる。そのような還元的アミノ化は、好ましくは、ラネーニッケル触媒及び水素を用いて、技術水準、例えばChan et al., 1994、非特許文献１５に記載されているように、実施される。選択的に、α，ω−ジカルボン酸へのさらなる酸化が有意義でありうる。
【００６１】
本発明は、さらに、以下の図及び限定されない例により説明され、それらから、本発明のさらなる特徴、実施態様、態様及び利点を読みとることができる。
【００６２】
図１は、例１に記載されているように、異なる量の凍結乾燥ウシ肝臓カタラーゼでのオゾン分解生成物の溶液の本発明による処理後の反応性酸素種の濃度の降下を示す。ｙ軸は、反応性酸素種の量を質量％で示す。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】例１による反応性酸素種の濃度の降下を示す線図。
【実施例】
【００６４】
例１：メチル−シス−１３−ドコセノアート（エルカ酸メチル）のオゾン分解、引き続きカタラーゼ処理
全ての化学薬品及び溶剤は、できるだけ高い品質で（少なくとも分析用純度で）商業的に入手可能であり、さらに精製もしくは処理せずに使用し、水のみを脱塩品質で使用した。リン酸塩緩衝溶液（ｐＨ＝７．０）を、Bernd Kraft GmbH（デュースブルク、独国）から購入し、凍結乾燥ウシ肝臓カタラーゼをSigma-Aldrich（セントルイス、ＵＳＡ）から購入した。脂肪酸エステルのメチル−シス−９−オクタデセノアート（オレイン酸メチル）及びメチル−シス−１３−ドコセノアート（エルカ酸メチル）を、≧９５％材料として、Croda（ゴーダ、オランダ）から購入した。ＧＣ分析（未校正）によれば、Ｃ１８：１−もしくはＣ２２：１−メチルエステルの純度は９５．２％もしくは９５．０％であった。前記オレイン酸メチルの場合に、不純物として３．６％のＣ１８：２−メチルエステル並びに合計で１．２％の飽和メチルエステルのメチルヘキサデカノアート、メチルオクタデカノアート及びメチルエイコサノアート（パルミチン酸メチル、ステアリン酸メチル及びアラキン酸メチル）、すなわち９８．８％の不飽和メチルエステル、すなわち開裂可能なメチルエステルが存在した。前記エルカ酸メチルの場合に、不純物は、１．３％のＣ２２：２−メチルエステル、０．７％のＣ２０：１−メチルエステル及び１．０％のＣ２４：１−メチルエステル並びに合計で２．０％の飽和メチルエステルのメチルエイコサノアート、メチルドコサノアート及びメチルテトラコサノアート（アラキン酸メチル、ベヘン酸メチル及びリグノセリン酸メチル）を含み、すなわち出発物質の９８．０％は、不飽和の、開裂可能なメチルエステルであった。
【００６５】
２−メチル−２−ブタノール１６０ｍＬ及び水３０ｍＬ中のメチル−シス−１３−ドコセノアート（エルカ酸メチル）８０．０ｇの溶液からなる０．９１２質量モル濃度の二相混合物を、底部排出部（テフロンコック）を備えた円錐形の２５０ｍＬ３つ口容器(Dreihalsvorlage)中に用意する。この底部排出部を介して、ホースポンプが接続されており、中央の（ＮＳ２９）共通すり合わせを介して、上部及び下部にあるガス供給部並びに上部にあるガス排出部を備え、ラシヒリング（６×６×０．６５ｍｍ）が充填されたトリクルベッドガラス塔（８００×３０ｍｍ）が接続されている。側部の一方の（ＮＳ１４）共通すり合わせを介して、内部温度計が接続されており、他方の共通すり合わせは空いている（試料採取箇所）。前記ポンプを介して、前記二相混合物を、目下、室温で前記塔の上部へ循環させる（流速：１２０ｍＬ／分）。溶液の流れに対して向流で、前記塔の下方から、オゾン発生器からのＯ2／Ｏ3混合物からなる反応性ガスを導通する（Ｏ2流１５００標準ｍＬ／分、発生器の最大出力）。前記塔の上方から、キャリヤーガスもしくはすすぎガスとしてのＣＯ2を、Ｏ3の減損したＯ2流出物中へ混入する（同様に１５００標準ｍＬ／分）。排ガス流を、氷冷を有する中間接続されたコールドトラップを経て、オゾン指示薬として５質量％ヨウ化カリウム水溶液１００ｍＬに通す。試料採取のために、数滴の反応混合物をピペットにより取り出し、酢酸エチル／水（１：１）２ｍＬに取り、短く振とう抽出し、有機相をついでＧＣにより分析する（１５ｍ DB-1カラム）。
【００６６】
６５分後に、双方の相の完全混合が起こり、１１０分後に、前記反応が終わっており（転化率＞９９．５％もしくは残留出発物質＜０．５％）、前記ポンプの電源を切り、双方のガスの導通を終える。前記反応混合物の温度は、全ての時間中で１０℃よりも明らかに少なく上昇する。
【００６７】
得られた反応溶液中の生成物として、ＧＣ分析によれば、ノナナール及びメチル−１３−オキソデカノアートが等量で、＞９５％の相対純度で存在する；これらの双方の化合物のさらなる酸化の生成物であるノナン酸（ペラルゴン酸）もしくは１３−ヒドロキシ−１３−オキソメチルトリデカノアート（ブラシル酸メチル）が前記溶液中に各＜５％見出される。
【００６８】
前記生成物溶液を、前記装置から排出し、空にした装置を２−メチル−２−ブタノール及びテトラヒドロフラン各１６０ｍＬですすぎ、得られた溶液を、３つ等量で各２００ｍＬに分ける。３つの溶液のそれぞれに、目下、リン酸塩緩衝溶液（ｐＨ＝７．０）中のウシ肝臓カタラーゼの新たに調製された水溶液１００ｍＬを添加し、その際に前記水溶液中のウシ肝臓カタラーゼの最終濃度は、第一の場合に０質量％（空試験）、第二の場合に０．０５質量％、かつ第三の場合に１．０質量％である。３つ全ての溶液を、もう一度、緩衝溶液１００ｍＬと共に注ぎ込む(einspuelen)。こうして得られた二相混合物を、室温で激しく撹拌し、１、２、４、９及び２２ｈ後に、各４０ｍＬの試料を取り出し、反応性酸素の含量を分析する。
【００６９】
そのためには、前記試料を、保護ガス（Ｎ2）下に過剰のヨウ化ナトリウムの存在下で還流で煮沸する。冷却した後に、生じたヨウ素を、チオ硫酸塩溶液を用いて電位差滴定する：試験のためにエルレンマイヤーフラスコ中にはかり入れた試料に、まず最初にドライアイス、引き続き１−プロパノール８０ｍｌ、酢酸４ｍｌ並びにイソプロパノール性ヨウ化ナトリウム溶液２０ｍｌを添加する。還流冷却器を載置した後に、窒素を冷却器に導通する。反応混合物を引き続き、室温で半時間放置し、ついで１０分間煮沸する。冷却した後に、冷却器を経た水約２０ｍｌですすぎ、引き続き、前記混合物をチオ硫酸ナトリウム溶液０．０１モル／ｌで当量点まで滴定する。並行して、同じようにして、空試験値測定を実施する。
【００７０】
相応する結果は、第１表もしくは図１から読みとることができる。
第１表：オゾン分解生成物及びエルカ酸メチルを有する反応混合物に異なる量のカタラーゼを添加した後の反応性酸素種の濃度
【表１】
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【００７１】
従って、空試験に比べて、既に０．０５質量％ウシ肝臓カタラーゼの溶液の使用が、有機生成物溶液中の潜在的に酸化作用のある成分の割合が、２分の１未満に低下し、１質量％ウシ肝臓カタラーゼの溶液の使用の場合に、それどころかほぼ１０分の１になることを生じさせることが明らかに認められる。
【００７２】
特に、前記処理の最初の迅速な降下は、そのような処理を用いて、生成物溶液が脂肪族アルデヒドのような極めて不安定な化合物のさらなる酸化に対して、この意味で安定化されることができることが達成されることを明らかに示している。
【図１】
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