(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼における白内障形成、老眼、又は加齢性水晶体変性の進行を阻害するか、又は後退させるために使用する眼科組成物において、前記眼科組成物は
【化１】
0006397477.tif 000023
の化学式を有する少なくとも１つの前記γクリスタリン帯電マスキング剤を含有し、
白内障の阻害に対する有効量の前記眼科用組成物を眼に接触させて使用する、眼科組成物。
【請求項２】
前記眼科用組成物が、点眼剤又は眼科用デバイスである、請求項１〜２のいずれか一項に記載の眼科組成物。
【請求項３】
前記眼科用デバイスが、コンタクトレンズ、又は涙点プラグである、請求項２に記載の眼科組成物。
【請求項４】
前記眼科用組成物が、注射、イオン電気導入、又は超音波増強により投与される、請求項１に記載の眼科組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つのγクリスタリン帯電マスキング剤は
【化２】
0006397477.tif 000024
の化学式を有する、請求項１に記載の眼科組成物。
【請求項６】
前記眼科組成物は、眼科用溶液、眼科用懸濁液、眼科用軟膏、眼科用スプレー、又は眼科用ゲルの形態にある、請求項１に記載の眼科組成物。
【請求項７】
前記眼科組成物は、緩衝剤、等張化剤、可溶化剤、防腐剤、増粘剤、キレート化剤、抗酸化剤、抗生剤、糖、及びｐＨ調節剤からなる群から選択される１つ以上の用剤を含有する、請求項１に記載の眼科組成物。
【請求項８】
分子の毛に共有結合した反応基を有する二官能価分子を含有する眼科用組成物であって、前記二官能価分子は
【化３】
0006397477.tif 000025
の化学式を有する、眼科用組成物。
【請求項９】
前記反応基が、ＮＨ２、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、及びＣＯＯＨから選択される、請求項８に記載の眼科用組成物。
【請求項１０】
前記眼科用組成物が、点眼剤又は眼科用デバイスである、請求項８に記載の眼科用組成物。
【請求項１１】
前記眼科用デバイスが、眼内レンズ又は涙点プラグである、請求項１０に記載の眼科用組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのγクリスタリン帯電マスキング剤は
【化４】
0006397477.tif 000026
の化学式を有する、請求項８に記載の眼科用組成物。
【請求項１３】
前記眼科用組成物は、眼科用溶液、眼科用懸濁液、眼科用軟膏、眼科用スプレー、又は眼科用ゲルの形態にある、請求項８に記載の眼科組成物。
【請求項１４】
前記眼科用組成物は、緩衝剤、等張化剤、可溶化剤、防腐剤、増粘剤、キレート化剤、抗酸化剤、抗生剤、糖、及びｐＨ調節剤からなる群から選択される１つ以上の用剤を含有する、請求項８に記載の眼科組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、眼の水晶体における加齢性変化の進行を阻害するか、又は後退させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
眼の水晶体は、虹彩のすぐ後方に吊り下げられている透明の構造であり、これにより、光線が網膜上の焦点に導かれる。水晶体は、可溶性タンパク質及び不溶性タンパク質の両方を含有し、これらを合わせると、水晶体の湿重量の３５％を占める。若年の健常な水晶体の場合、一般にクリスタリンと呼ばれる可溶性タンパク質が、水晶体タンパク質の９０％を占める。老化の過程で、水晶体のクリスタリンは、不溶性の凝集物を形成し、これは少なくとも部分的には、近くの物体に対して焦点を変える眼の能力の喪失である老眼を特徴付ける水晶体核の変形能低下の原因となる。老眼における水晶体の不溶性凝集物の形成は、加齢性白内障の形成における早期段階であると考えられている。
【０００３】
白内障は、眼の水晶体における濁り又は混濁化により定義される。個体が加齢するに従い、水晶体内に存在するクリスタリンが凝集物へと変換されて白内障が形成し、これにより、水晶体の混濁が増大する。具体的には、加齢と共に、ヒトの水晶体核における可溶性シャペロンであるαクリスタリンが高分子量の凝集物及び不溶性タンパク質中に組み込まれ、αクリスタリンの濃度が徐々に低下する。凝集物の存在は、水晶体の健康及び機能を損なうため、治療しないまま放置すると、白内障により、実質的な視力喪失、又は失明を招く恐れがある。現在のところ、白内障の最も一般的な治療は、手術である。
【０００４】
クリスタリンは、脊椎動物の眼の水晶体線維細胞において最も高度に発現する構造タンパク質である。クリスタリンは、次の２つのサブファミリー：低分子の熱ショックタンパク質スーパーファミリーのメンバーであり、また構造タンパク質及び分子シャペロンとしても機能するαクリスタリン（αＡ及びαＢクリスタリン）と；水晶体中の構造タンパク質として主に機能し、水晶体構造の透明性及び屈折特性に寄与する、βクリスタリン及びγクリスタリンの進化的に関連するスーパーファミリーに分けられる。白内障の発症における役割以外に、αＡクリスタリン及びαＢクリスタリンは、アレキサンダー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、アルツハイマー病及びパーキンソン病などの神経変性疾患にも関与している。
【０００５】
特許文献１は、シャペロン活性を有するペプチドを治療的処置として用いる、タンパク質の脱凝集化について記載している。具体的には、光散乱により測定される、βクリスタリンのｐＨ誘導による凝集物を脱凝集化するために、αＢペプチドが使用された。水晶体内にαクリスタリンを継続的に供給することは困難である。必要とされるのは、白内障及び老眼の阻害及び／又は後退のためにクリスタリンを脱凝集化する上で好適な別の方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８／０２２７７００号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、眼における白内障形成若しくは老眼の進行を阻害するか、又は後退させる方法は、眼を、少なくとも１種のγクリスタリン帯電マスキング剤を含む、白内障又は老
眼の阻害に有効な量の眼科用組成物と接触させるステップを含み、ここで、前記帯電マスキング剤は、ポリペプチドではない。
【０００８】
別の態様では、眼科用組成物は、分子の毛（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｒｉｓｔｌｅ）に共有結合した脱離基を含有する二官能価分子を含む。
別の態様では、眼における加齢性水晶体変性の進行を阻害するか、又は後退させる方法は、眼を、少なくとも１種のγクリスタリン帯電マスキング剤を含む、白内障又は老眼の阻害に有効な量の眼科用組成物と接触させるステップを含み、ここで、前記γ帯電マスキング剤は、ポリペプチドではない。
【０００９】
また別の態様では、治療を必要とする患者におけるタンパク質フォールディングに関する疾患を治療する方法は、分子の毛に共有結合した脱離基を含有する、治療に有効な量の二官能価分子を投与するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＰＥＧ２４によるγクリスタリンの修飾についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータを示すグラフ。
【図２】ＰＥＧ２４で修飾したγクリスタリンのＮＩＣＦを示すグラフ。
【図３】ＰＥＧ２４で修飾したγクリスタリンの分布関数を示すグラフ。
【図４】ＰＥＧ２４で修飾したγクリスタリンのΓ対ｑ２のグラフ。
【図５】ＰＥＧ４によるγクリスタリンの修飾についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータを示すグラフ。
【図６】ＰＥＧ４で修飾したγクリスタリンのＮＩＣＦを示すグラフ。
【図７】ＰＥＧ４で修飾したγクリスタリンの分布関数を示すグラフ。
【図８】ＰＥＧ４で修飾したγクリスタリンのΓ対ｑ２のグラフ。
【図９】ＣＡＰＥＧによるγクリスタリンの修飾についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータを示すグラフ。
【図１０】ＣＡＰＥＧ４で修飾したγクリスタリンのＮＩＣＦを示すグラフ。
【図１１】ＣＡＰＥＧ４で修飾したγクリスタリンの分布関数を示すグラフ。
【図１２】ＣＡＰＥＧ４で修飾したγクリスタリンのΓ対ｑ２のグラフ。
【図１３】ＭＭＰＥＧで修飾したγクリスタリンの分布関数を示すグラフ。
【図１４】ビオチンで修飾したγクリスタリンの分布関数を示すグラフ。
【図１５】ビオチン−ＰＥＧで修飾したγクリスタリンの分布関数を示す。
【図１６】スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド酢酸塩で修飾したγクリスタリンの分布関数を示すグラフ。
【図１７】帯電マスキング基の実施形態を示す化学式（各構造において、Ｒは、分子の毛である）。
【図１８】分子の毛の実施形態を示す化学式。
【図１９】経上皮輸送の測定の概略図。
【図２０】経上皮輸送実験における細胞の底部に輸送されたＣＡＰＥＧ４を示すグラフ。
【図２１】添加したＣＡＰＥＧ４のｍｇ／ｍｌに対するオピゾル（Ｏｐｉｓｏｌ）（登録商標）のｐＨを示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
当業者は、以下の詳細な説明、図面、及び付属の特許請求の範囲から、上に説明した特徴及び他の特徴を認識し、かつ理解するであろう。
本明細書では、γクリスタリン凝集物を脱凝集化する、及び／又はその形成を阻止する方法であって、γクリスタリン凝集物を、γクリスタリン凝集物の脱凝集化、及び／又はその形成の阻止に十分な量で、γクリスタリン帯電マスキング剤を含む組成物と接触させ
るステップを含む方法が開示される。当業者であれば、本明細書に開示する分子は、γクリスタリン帯電マスキング剤として記載されるが、これらは、βクリスタリンのタンパク質凝集の脱凝集化／阻止も可能であることは認識されよう。さらに、眼における白内障形成の進行を阻害又は後退させる方法であって、眼を、γクリスタリン帯電マスキング剤を含む、白内障の阻害に有効な量の眼科用組成物と接触させるステップを含む方法も開示される。また、眼における老眼の進行を阻害又は後退させる方法であって、眼を、γクリスタリン帯電マスキング剤を含む、老眼の阻害に有効な量の眼科用組成物と接触させるステップを含む方法も開示される。特定の実施形態では、γクリスタリン帯電マスキング剤は、ポリペプチドではない。
【００１２】
本明細書において、本発明者らは、動的光散乱などの技術を用いて、溶液中のγクリスタリンにより形成される凝集物を調べた。β及びγクリスタリンのいずれも、２つのドメインに４つのグリークキーモチーフを含む極めて安定した構造タンパク質である。βクリスタリンは、二量体、並びにヘテロ及びホモオリゴマーを形成するのに対し、γクリスタリンは、眼において単量体である。さらに、βクリスタリンは、溶液中に斥力を呈示するが、γクリスタリンは、非特異的タンパク質又は水相互作用に起因する引力相互作用を呈示する。また、チオール修飾が、γクリスタリンの凝集物を溶液中に形成させることも仮定されている。
【００１３】
ヒトγクリスタリンファミリーは、５つのメンバー、すなわち、γＡ〜Ｄクリスタリン及びγ−Ｓクリスタリンを含む。γＡ〜Ｄクリスタリンは、発生の早期に発現され、主として水晶体核に存在し；γＣ及びγＤクリスタリンが最も優勢である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのγＤクリスタリンのアンフォールディング及びリフォールディングは、リフォールディングされたタンパク質に安定性が欠如するために、タンパク質凝集の増大を引き起こすことが明らかにされている。γＳ−クリスタリンは、他の結晶性タンパク質の凝集を抑制し、透明な水晶体をもたらす上で重要なタンパク質であることがわかっている。
【００１４】
特定の理論に束縛されるわけではないが、γクリスタリンの凝集は、静電及び疎水性現象の両方であり、静電力が優勢であると考えられている。ヒートショックタンパク質αＡ−及びαＢ−クリスタリンは、γクリスタリン凝集を破壊する。静電相互作用を破壊しうるγクリスタリン帯電マスキング剤は、αクリスタリンのシャペロン活性の代わりになり、γクリスタリン凝集物のサイズを阻止／縮小することが可能である。
【００１５】
γクリスタリン帯電マスキング剤による治療は、白内障及び老眼など、γクリスタリンの凝集を原因とする疾患及び／又は病状を治療するのに用いることができる。本明細書で用いられる場合、白内障とは、水晶体におけるタンパク質相互作用の変化により引き起こされる、眼の水晶体の混濁である。タンパク質相互作用には、タンパク質のミスフォールディングに加えて、凝集など、タンパク質間相互作用も含まれる。老眼は、加齢又は老齢による視覚障害である。老眼の症状としては、近くの物体に焦点を合わせる能力の低下、眼精疲労、細かい印字を読むことの困難、読書時又は照明画面を見る際の疲労、はっきりと接視することの困難、印字を読む際のコントラストの低下、読書のためのより明るく、しかもより直接的な照明の必要性、読書対象をはっきりと見るために読書対象を遠くに保持する必要があること、及び頭痛、とりわけ、近見視力を用いるときの頭痛が挙げられる。老眼を患う個体の視力は正常であることもあるが、時間と共に、近くの物体に焦点を合わせる能力が少なくとも部分的には失われ、老眼を患う個体は、読書など、近見視力を必要とする作業に眼鏡を必要とするようになる。４０歳を過ぎたほとんど全ての個体が、多かれ少なかれ老眼に罹患する。
【００１６】
眼における白内障形成の進行を阻害する方法では、眼をγクリスタリン帯電マスキング剤と接触させる前に、眼は、１つ又は複数の発症しつつあるか又は完全に発症した白内障
を既に含んでいてもよい。従って、眼におけるさらなる白内障の形成を阻害するか、又は眼に既に存在する、発症しつつある白内障から成熟白内障の形成を阻害するために、本方法を用いることができる。あるいは、眼をγクリスタリン帯電マスキング剤と接触させる前に、発症しつつあるか又は完全に発症した白内障が眼になくてもよい。
【００１７】
眼における白内障形成の進行を後退させる方法では、眼を本明細書に開示するγクリスタリン帯電マスキング剤と接触させることにより、眼における白内障の少なくとも部分的な後退から完全な後退までを達成する。
【００１８】
同様に、眼における老眼の進行を阻害する方法では、眼をγクリスタリン帯電マスキング剤と接触させる前に、個体が、１つ又は複数の老眼の症状を既に知覚していてもよい。従って、知覚される症状の進行を抑制するか、又は老眼のさらに別の症状の形成を阻害するために、この方法を用いることができる。あるいは、眼をγクリスタリン帯電マスキング剤と接触させる前に、老眼の症状が眼になくてもよい。
【００１９】
眼における老眼の進行を後退させる方法では、眼を本明細書に開示するγクリスタリン帯電マスキング剤と接触させることにより、眼における老眼の症状の少なくとも部分的な後退から完全な後退までを達成する。
【００２０】
本明細書で用いられる場合、γクリスタリン帯電マスキング剤は、γクリスタリンの凝集をもたらす、γクリスタリンによるタンパク質間静電相互作用を妨害するのに好適な分子である。一実施形態では、上記マスキング剤は、ポリペプチドではない。γクリスタリン帯電マスキング剤は、γクリスタリン凝集物の形成を阻止、及び／又は既に形成された凝集物のサイズを縮小する。
【００２１】
一実施形態では、γクリスタリン帯電マスキング剤は、４００ｍＭを超える塩濃度を有する高濃度塩溶液である。本明細書で用いる「塩」という用語は、限定はしないが、以下のうちの１つ又は複数を含む有機塩又は無機塩を包含することを意図する：ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮＨ４Ｃｌなどのハロゲン化アンモニウム、ＣａＣｌ２などのハロゲン化アルカリ土類金属、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸カルシウム、又はこれらの混合物。さらなる有機塩としては、エチルアンモニウムニトレートなどのアルキルアンモニウム塩、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム、グルコン酸ナトリウム、トリメタミン塩酸塩、コハク酸ナトリウム、及びこれらの組合せが挙げられる。特定の理論に束縛されるわけではないが、例えば、Ｌｉ＋、Ｎａ＋及びＫ＋などのイオンのアイデンティティが、γクリスタリン凝集を阻止するγクリスタリン帯電マスキング剤の能力に影響を及ぼし得ると考えらえる。
【００２２】
意外なことに、本明細書において、３００ｎＭ未満の塩（例えば、ＫＣｌ）濃度は、γクリスタリン凝集物のサイズ縮小をもたらさないことがわかった。しかし、４００〜１０００ｍＭのＫＣｌ濃度では、凝集物形成が有効に阻害された。
【００２３】
別の実施形態では、γクリスタリン帯電マスキング剤は、分子の毛に共有結合した脱離基を含む二官能価分子である。二官能価分子は、陽荷電リシン及びアルギニン残基並びに陰荷電グルタミン酸及びアスパルギン酸残基などのγクリスタリン分子上の電荷と相互作用する。分子の毛は、γクリスタリン分子同士に間隔をもたらし、凝集を阻止する親水性の水溶性種である。特定の理論に束縛されるわけではないが、二価官能価分子が反応して、分子の毛を効果的にタンパク質上に配置し、反応中に脱離基を排出すると考えられる。共有結合した分子の毛は、γクリスタリン分子の凝集を阻止する。特定の理論に束縛され
るわけではないが、本明細書に記載する二官能価分子は、βクリスタリン分子の相互作用阻害剤としても作用し得ると考えられる。
【００２４】
脱離基（反応基とも呼ばれる）の例としては、スクシンイミド及びカルボン酸官能基、特にＮ−ヒドロキシスクシンイミド及びＣＯＯＨが挙げられる。一部の実施形態では、脱離基は、生体適合性である。脱離基の別の例としては、イソシアネート、イソチオシアネート、塩化スルホニル、アルデヒド、カルボジイミド、アシルアジド、無水物、フルオロベンゼン、炭酸塩、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル、エポキシド、及びフルオロフェニルエステルが挙げられる。図１７は、Ｒ基が分子の毛である脱離基の実施形態を示す。二官能価分子が、ＣＯＯＨを含有する場合、これがタンパク質のアミン基と反応すると、水が脱離する。二官能価分子が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを含有する場合、水は放出されない。ＮＨ２反応において、ＮＨ２がタンパク質上のＣＯＯＨ基と反応すると、水が脱離する。
【００２５】
分子の毛の例としては、４個以上のオキシエチレン基、例えば、４〜２００個のオキシエチレン基を有する直鎖又は分岐状ポリエチレングリコールがある。また、４〜２００個、特に４〜２４個のオキシエチレン、アルコキシエチレン又はアリールオキシエチレン基を有するアルコキシ−及びアリールオキシポリエチレングリコールなどの修飾ポリエチレングリコールも含まれる。上記以外の分子の毛としては、ポリ（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、ポリ（２−ヒドロキシエチル）メタクリレート（ＨＥＭＡ）、ポリ（２−オキサジリン）、ポリ（ｍ−ホスホコリン）、ポリリシン、及びポリグルタミン酸が挙げられる。図１８は、分子の毛の実施形態を示す。一実施形態では、分子の毛は、１５０〜８０００の数平均分子量を有する。
【００２６】
具体的実施形態では、二官能価γクリスタリン帯電マスキング剤は、以下：
【００２７】
【化１】
0006397477.tif 000002
【００２８】
である。
一実施形態では、本明細書に開示する二官能価γクリスタリン帯電マスキング剤は、アルツハイマー病、パーキンソン病、及びハンチントン病などのタンパク質フォールディングに関する疾患の治療においても有用である。具体的実施形態では、二官能価γクリスタリン帯電マスキング剤は、経口組成物として投与する。
【００２９】
一実施形態では、γクリスタリン帯電マスキング剤は、ポリペプチドではない。「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において置換え可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１個又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工的化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、並びに天然のアミノ酸ポリマー及び非天然のアミノ酸ポリマーに適用する。
【００３０】
本明細書に記載するγクリスタリン帯電マスキング剤の利点は、例えば、アミノ基転移、酸化、修飾及び機能障害性コネキシンなどのγクリスタリンの翻訳後修飾、並びに高濃度のＣａ＋２などの無機及び有機イオンの存在下で有効であると考えられていることである。
【００３１】
白内障の進行を阻害する及び／若しくは既存の白内障を軽減する、又は老眼の症状を阻害する及び／若しくは軽減するために、γクリスタリン帯電マスキング剤を眼と接触させる。本明細書で用いるように、「眼を接触させる」という用語は、γクリスタリン帯電マスキング剤を、眼に直接適用する方法を包含する。上記で説明した方法では、当業者に周知の適切な手段を用いて、眼を化合物と接触させることができる。このような方法の例としては、限定はしないが、眼科用デバイスの形態で適用されるか、イオン電気導入により適用されるか、又は他の方法で眼に局所適用される、眼内への化合物の注射、又は化合物の点眼若しくは噴霧が挙げられる。
【００３２】
本明細書で用いるように、「白内障の阻害に有効な量」という用語は、眼における白内障の進行若しくは形成を阻害するか、又は眼に既に存在する、発症しつつある白内障の、進行又は成熟白内障の形成を阻害する量を意味する。白内障の阻害に有効なγクリスタリン帯電マスキング剤の量は、当業者には周知の多様な因子に応じて変動する。このような因子としては、眼のサイズ、眼に既に存在する、完全に発症したか又は発症しつつあるあらゆる白内障の数及び進行、並びに投与方式が含まれるがこれらに限定されない。白内障の阻害に有効な量はまた、医薬組成物が、単回投与されるかどうか、又は医薬組成物が、ある期間にわたり定期的に投与されるかどうかによっても変動する。上記の期間は、任意の日数、週数、月数、年数であってよい。一実施形態では、白内障の阻害に有効なγクリスタリン帯電マスキング剤の量は、特に本明細書に記載する二官能価分子の量は、約０．００１ｇ〜約０．１ｇである。具体的には、白内障の阻害に有効な量は、約０．０１ｇ〜約０．０５ｇである。
【００３３】
本明細書で用いるように、「老眼の阻害に有効な量」という用語は、眼における老眼の症状を軽減するか、又は眼における老眼のさらなる症状の進行を阻害する量を意味する。老眼の阻害に有効なγクリスタリン帯電マスキング剤の量は、当業者には周知の多様な因子に応じて変動する。このような因子としては、限定はしないが、眼のサイズ、個体に既に存在する症状の数及び種類、並びに投与方式が挙げられる。白内障の阻害に有効な量はまた、医薬組成物が、単回投与されるかどうか、又は医薬組成物が、ある期間にわたり定期的に投与されるかどうかによっても変動する。上記の期間は、任意の日数、週数、月数、年数であってよい。一実施形態では、老眼の阻害に有効なγクリスタリン帯電マスキング剤、特に本明細書に記載する二官能価分子の量は、約０．００１ｇ〜約０．１ｇである。具体的には、老眼の阻害に有効な量は、約０．０１ｇ〜約０．０５ｇである。
【００３４】
本明細書で用いるように、「眼科用組成物」という用語は、眼への投与に好適な薬学的に許容される製剤、送達デバイス、機構又はシステムを指す。「眼科用組成物」という用語は、限定はしないが、溶液、懸濁液、ゲル、軟膏、スプレー、デポ剤デバイス、又は眼に対するβＬクリスタリン静電相互作用阻害剤の短期的送達若しくは長期的送達に好適な、他の任意の種類の製剤、デバイス若しくは機構を含む。例えば、経口製剤とは対照的に、眼科用組成物は、例えば、結膜及び角膜の刺激、閉瞼、涙液の分泌、並びに痛みを伴う反応など、多様な反応の誘導を回避する、薬学的に許容される眼科用ビヒクルの使用を含む、眼科用組成物の眼への適用と関連する、特定の技術的特徴を示す。具体的な眼科用組成物は、βＬクリスタリン静電相互作用阻害剤を含有する眼科用溶液若しくは眼科用懸濁液（すなわち、点眼液）、眼科用軟膏、又は眼科用ゲルの形態であることが有利である。選択した具体的な形態に応じて、組成物は、緩衝剤、等張化剤、可溶化剤、防腐剤、増粘
剤、キレート化剤、抗酸化剤、抗生剤、糖、及びｐＨ調節剤など、各種の添加剤を含有しうる。
【００３５】
防腐剤の例としては、クロロブタノール、デヒドロ酢酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ピリジニウム、フェネチルアルコール、パラヒドロキシ安息香酸エステル、塩化ベンゼトニウム、酸化エチレンとジメチルエチレンイミンとの親水性二ハロゲン化コポリマー、これらの混合物などが含まれるがこれらに限定されない。増粘剤は、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、硫酸コンドロイチン、及びこれらの塩から選択することができる。適切な可溶化剤として、限定はしないが、ポリオキシエチレン水添ヒマシ油、ポリエチレングリコール、ポリソルベート８０、及びモノステアリン酸ポリオキシエチレンが挙げられる。典型的なキレート化剤としては、限定はしないが、エデト酸ナトリウム、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸の塩、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸、並びにエデト酸ナトリウム及び亜硫酸水素ナトリウムなどの安定化剤が含まれるがこれらに限定されない。
【００３６】
緩衝液の例としては、限定はしないが、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液などが挙げられる。眼科用組成物中の緩衝液濃度は、選択した具体的な緩衝液に応じて、約１ｍＭ〜約１５０ｍＭ以上まで変動しうる。
【００３７】
本明細書で用いる場合、「ビヒクル」という用語は、眼科用途に好適な担体、希釈剤、又は賦形剤を包含することを意図する。「賦形剤」とは、１つ又は複数のバルクを供給し、満足のゆく加工特徴を付与し、溶解速度の制御を補助し、またそれ以外に組成物にさらなる望ましい特徴を与える成分を指す。特に、眼科用組成物が、有効成分を同伴する涙液の分泌を誘発しないように、賦形剤を選択する。許容される賦形剤は、要望される製剤に応じて賦形剤を選択する方法について精通する当業者には周知である。
【００３８】
一実施形態では、γクリスタリン帯電マスキング剤を、コンタクトレンズ又は涙点プラグなどの眼科用デバイスの形態で投与する。好適な眼科用デバイスには、矯正用、美容用、又は治療用の品質を備えた生体適合性デバイスが含まれる。
【００３９】
一実施形態では、γクリスタリン帯電マスキング剤は、任意選択で制御放出組成物として、コンタクトレンズに付着させるか、コンタクトレンズ内に組み込むか、又はコンタクトレンズに結合させてもよい。コンタクトレンズは、既知の材料、例えば、ハイドロゲル、シリコーンハイドロゲル、シリコーンエラストマー、及びポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、メタクリル酸エステルポリマー、オリゴシロキサニルアルキル（メタ）アクリレート単量体／メタクリル酸のコポリマーなどの気体透過性材料を用いて作製することができる。含水性眼科用ソフトレンズ用材料の具体例としては、米国特許第５，８１７，７２６号明細書に記載されている材料、米国特許第５，９０５，１２５号明細書に記載されている２−ヒドロキシエチルメタクリレートポリマー、欧州特許出願第７８１，７７７号明細書に記載されている眼科用レンズ材料、米国特許第５，９４２，５５８号明細書に記載されている、さらに脂質層でコーティングしたハイドロゲルレンズが挙げられる（これら文献は全て、コンタクトレンズに関するその教示について、本明細書に組み込まれる）。前述した公知の材料から作製される、ハードレンズ又は硬質の角膜型レンズ、及びゲルレンズ、ハイドロゲルレンズ、又はソフトレンズなど、一般に使用されるコンタクトレンズを用いることができる。
【００４０】
コンタクトレンズ産業では、コンタクトレンズを次の２つの主要なカテゴリー：従来型のハイドロゲル及びシリコーンハイドロゲルに特徴付けることが一般的である。従来型のハイドロゲルは、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ポリＨＥＭＡ）として開始
し、ｎ−ビニルピロリドン（ｎＶＰ）、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、及びメタクリル化ホスホリルコリンなどの他の親水性部分とのポリＨＥＭＡコポリマーに進化した。また、ポリビニルアルコールレンズを使用してもよい。
【００４１】
シリコーンハイドロゲル（ＳｉＨ）は、典型的には、メタクリル化又はメト（アクリルアミド）シリコーン単量体、プレポリマー又はマクロマーと、典型的な常用のハイドロゲル単量体とのコポリマーから構成される。シリコーン単量体の例としては、「トリス」、アルキル末端の、メタクリル化ポリジメチルシロキサン（ＰＭＤＳ）、及びシリコーン及び親水性単量体のブロックコポリマーが挙げられる。Ａ基が親水性ブロックで、Ｂ基がシリコーン単量体ブロックである、ＡＢＡトリブロックコポリマーが一般的である。メタクリレートに加えて、他の反応基として、ビニル、アクリルアミド、又は連鎖重合が可能な他の任意の反応基が挙げられる。また、架橋及び重合を、二官能価の単量体を用いた段階成長重合により達成することもできる。一例は、２つのアミノ酸におけるカルボン酸とのヒドロキシ基の反応又はテレフタル酸とエチレングリコールに由来するものである。
【００４２】
プラズマコーティング法は、プラズマ酸化及びプラズマコーティングなどのシリコーンハイドロゲルに一般に用いられている。
例えば、コンタクトレンズ及び徐放に関するその教示について本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６５８，５９２号明細書；同第６，０２７，７４５号明細書；国際公開第２００３／００３０７３号パンフレット；米国特許出願公開第２００５−００７９１９７号明細書において説明されている、徐放薬物を含むコンタクトレンズを製造する公知の方法に従い、コンタクトレンズに、γクリスタリン帯電マスキング剤組成物を組み込むか、結合させるか、又は付着させることにより、徐放型γクリスタリン帯電マスキング剤組成物を製造することができる。具体的には、γクリスタリン帯電マスキング剤組成物を、ポリビニルピロリドン、ヒアルロン酸ナトリウムなど、微粒子化するか、又はゲル徐放剤の一部に付着させることにより、コンタクトレンズを製造することができる。加えて、レンズの前面を形成する構成要素、及びレンズの裏面を形成する構成要素からコンタクトレンズを製造するなどによって、γクリスタリン帯電マスキング剤組成物のリザーバを形成することによって、徐放を達成することもできる。
【００４３】
一実施形態では、制御放出の注射剤として、房水又はガラス体にγクリスタリン帯電マスキング剤を挿入してもよい。
一実施形態では、γクリスタリン帯電マスキング剤を涙点プラグにより投与する。本明細書で用いるように、涙点プラグという用語は、下涙点及び上涙点のそれぞれを介して、眼の下涙小管及び上涙小管へと挿入するのに好適なサイズ及び形状を有するデバイスを指す。
【００４４】
一実施形態では、γクリスタリン帯電マスキング剤をイオン電気導入により投与する。イオン電気導入は、小電荷を用いて、薬剤又は他の化学薬品を経皮送達する技術である。
一実施形態では、超音波増強を用いて、眼科用組成物を投与する。
【００４５】
以下の非制限的実施例により、本発明をさらに詳しく説明する。
【実施例】
【００４６】
実施例１：γクリスタリンのクローン化
γＤ及びγＳクリスタリンＤＮＡ配列は、マサチューセッツ工科大学キング研究所（Ｋｉｎｇ  Ｌａｂｓ  ａｔ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、マサチューセッツ（ＭＡ））により提供されたｐＧｅ１プラスミドにおけるものである。γクリスタリンタンパク質配列は、精製の目的で、６×Ｎ末端ヒスチジンタグ（ｈｉｓタグ）を含む。プラスミド
をクローン化コンピテント細胞系に形質転換して、別のプラスミドＤＮＡを作出した。続いて、プラスミドを、タンパク質合成のために発現コンピテント細胞系に形質転換した（ＴＡＭ１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（アクティブ・モティフ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）、カールスバド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア（ＣＡ））。
【００４７】
γクリスタリンプラスミドＤＮＡを、タンパク質合成のためにＭ１５ｐＲｅｐ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に化学的に形質転換した。１Ｌの培養物をタンパク質精製のために増殖させた。Ｎｉアフィニティクロマトグラフィーによりγクリスタリンタンパク質を精製した。γクリスタリンタンパク質に含有されるＮ末端Ｈｉｓタグは、Ｎｉカラムに選択的に結合する。結合したタンパク質は、イミダゾール勾配で溶出することができ、これは、競合的にＮｉに結合し、精製タンパク質を放出する。純度をＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル電気泳動及び高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）により確認した。
実施例２：精製γＤ及びγＳクリスタリンに対するｐＨ及び塩の作用
ｐＨ及び塩は、βクリスタリンの凝集に作用を及ぼすため、ｐＨ及び塩のγクリスタリンへの作用も調べた。動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて、粒度を測定した。
【００４８】
実験の動的光散乱（ＤＬＳ）は、２８８チャネル（ＡＬＶ、ランゲン（Ｌａｎｇｅｎ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））及び２Ｗアルゴンレーザ（コヒレント社（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ｉｎｃ．）、サンタ・クララ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ）、カリフォルニア（ＣＡ））を備えたＡＬＶ−５０００／Ｅ相関器を有するＡＬＶゴニオメータ計器を用い、約４０ｍＷの使用電力で測定した。散乱強度は、８．４１×１０６及び２．３０×１０７ｍ−１の散乱波ベクター（ｑ）範囲に対応する角度３０°〜９０°の範囲において５°間隔で測定した。散乱波ベクターは、ｑ＝４πｎ  ｓｉｎ（θ／２）／λとして定義し、ここで、θは、散乱角度であり、λ＝５１４．５、すなわち真空でのアルゴンレーザの波長であり、ｎは１．３３で、水の屈折率である。サンプルの温度は、循環水浴により４〜３７±０．１℃の一定温度に維持した。
【００４９】
ＣＯＮＴＩＮ分析を用いて、測定角度での相関関数についてのラグタイムを計算して、相関関数を分析した。ピークは、タンパク質の拡散性モードを表している。遅延時間（τ）をΓに変換し、ｑ２に対してグラフ化した。あてはめた直線の傾きが、拡散係数（Ｄ）である。非ゼロの値のｑ＝０は物理学的に不可能であるため、切片がゼロとなるように、直線をあてはめる。Γ対ｑ２プロットは、ｒ２値が０．９５以上の線形であった。
【００５０】
ＤＬＳ測定は、修飾及び非修飾γＤ−及びγＳクリスタリンタンパク質の両方について、濃度０．５ｍｇ／ｍｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液ｐＨ６．８で実施した。０．２２μｍ疎水性ＰＶＤＦ膜（登録商標、フィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、全ての溶液を１０ｍｍ径のホウケイ酸ガラス管中に導入し、計測した。溶液を３０分間平衡させた後、光散乱を測定した。
【００５１】
サイズスケール及びタンパク質が希薄溶液中でどのように挙動するかを理解するために、α−Ａ、α−Ｂ、γＤ−及びγ−Ｓクリスタリンタンパク質の個別の溶液を調べた。（表１）温度は、ＤＬＳにより測定されるように、溶液中のタンパク質サイズにほとんど作用を及ぼさなかった。
【００５２】
表１：修飾及び非修飾γD-及びγ-Sクリスタリンタンパク質の両方について実施したＤＬＳ測定
【００５３】
【表１】
0006397477.tif 000003
【００５４】
αＡクリスタリンの分子量が１９．９ｋＤａ、α−Ｂクリスタリンが２０．１６ｋＤａであることを考慮すると、ＤＬＳ実験で認められたサイズは、溶液中、並びにヒトの眼において３００〜１２００ｋＤａ種へのαクリスタリンの既知の集合体と一致する。
【００５５】
γクリスタリンの３ｎｍＲｈは、単量体γＤ−及びγＳクリスタリンについてそれぞれ２０．６ｋＤａ及び２０．９ｋＤａの分子量と十分に相関する単一タンパク質種を表している。またいずれの種も、γＤ−及びγＳクリスタリンについてそれぞれ１１０及び１００ｎｍのＲｈ値を有する凝集物を示す。γクリスタリンの凝集は、これまで、γクリスタリン同士の引力相互作用に起因するとされてきた。γクリスタリンに特定のタンパク質間相互作用がないために、これらは、溶液中で大きな凝集物を形成することができる。
【００５６】
ｐＨ範囲（５、６、７、８、９、１０、１１）、ＫＣｌ濃度（１００ｍＭ、１５０ｍＭ、３００ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ）及び温度（４．５℃、２２℃、３７℃）などの様々な実験条件にγクリスタリンを付した。４℃で透析を一晩実施することによりｐＨ及び塩濃度を調節し、その最終濃度を１．０ｇ／Ｌに調節した。
【００５７】
表２：γD-及びγ-Sクリスタリンに対するpH及び塩の影響
【００５８】
【表２】
0006397477.tif 000004
【００５９】
表２からわかるように、１０を超える様々なｐＨにより、γＤ−及びγＳクリスタリン溶液から凝集物が除去された。３００ｍｍＫＣｌを超える塩濃度では、γクリスタリン凝集物は個々のタンパク質粒子に縮小されなかった。これらの結果は、γクリスタリン同士の静電相互作用を妨害することにより、γクリスタリンの大きな凝集物が破壊され、阻止されたことを示している。
【００６０】
ジスルフィド結合は、観測されたγクリスタリン凝集物を媒介し得ると仮定されてきた。γクリスタリンタンパク質のＤＬＳも、５ｍＭ  ＤＴＴ中で、１．０ｇ／Ｌのαクリスタリンの存在下で測定した。表３に示すように、ＤＴＴは、γクリスタリン凝集物のサイズに作用を及ぼさなかった。従って、上記の仮定は、正しくなかった。
【００６１】
さらに、合成されたαクリスタリンタンパク質をγクリスタリンタンパク質と混合して、αクリスタリンのシャペロン活性能力がγクリスタリン凝集物を破壊するかどうかを決定した。α−Ａ及びα−Ｂクリスタリンを各々個別にγＤ−又はγＳクリスタリンと、ヒトの眼の水晶体中の比を模倣してそれぞれ３：１のモル比で混合した。全ての溶液を４℃で１時間平衡させた。α−Ａ又はα−Ｂクリスタリンとのインキュベーション後、数百ナノメートルの大きなγクリスタリン凝集物が消失し、個別のγクリスタリン及びαクリスタリン高分子が認められた。（表３）これらのデータは、αクリスタリンが、非特異的タンパク質凝集物を抑制し、これによってγクリスタリンタンパク質の凝集を阻止するという以前の研究を支持する。
【００６２】
表３：γD-及びγ-Sクリスタリンに対するＤＴＴ及びシャペロンの影響
【００６３】
【表３】
0006397477.tif 000005
【００６４】
特定の理論に束縛されるわけではないが、αクリスタリンのサイズの増大（６３〜６８ｎｍ〜７５ｎｍ）は、変性又はミスフォールディングしたγクリスタリンとのαクリスタリンの相互作用によるものと仮定される。αクリスタリンを添加すると、溶液中で、γクリスタリン間の静電荷を破壊することにより、大きなγクリスタリン種の形成を阻止するか、又は破壊することが明らかである。αクリスタリンは、高濃度のγクリスタリンで出現する大きなγクリスタリンの凝集物を破壊することができる。このように、αクリスタリンの非存在下で、γクリスタリンは、静電力によって凝集する大きな可溶性凝集物を形成し、この静電力は、高ｐＨ及び高塩濃度で妨害することができる。
凝集物の特性決定のための材料及び方法
γＤ−及びγＳクリスタリンの化学的修飾を実施して、これらのタンパク質の凝集挙動を修飾した。修飾γＤ−及びγＳクリスタリンを特性決定するのに用いる方法は、マトリックス支援レーザ脱離イオン−飛行時間法（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ）（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、円偏光二色性、及び動的光散乱である。
マトリックス支援レーザ脱離イオン−飛行時間法（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ）
約２ｍｇの標準又は修飾γクリスタリンタンパク質を５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（トリスＨＣｌ）ｐＨ７に一晩透析した。溶液を一晩冷凍保存（フリーズドライ）して、乾燥クリスタリンタンパク質粉末を得た。
【００６５】
３３７ｎｍ窒素レーザを備えるＯｍｎｉｆｌｅｘ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（ブルカー・ダルトニクス社（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、ビレリカ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）、マサチューセッツ（ＭＡ））で、質量分析データを取得した。サンプル（２ｍｇ／ｍｌ）を、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５０％アセトニトリル及び３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸からなるマトリックスと混合（１：１）した。続いて、１μＬの溶液をステンレス鋼標的上に載せた。データ取得のために計器を線形モードで用いた。
円偏光二色性
クリスタリンサンプルを１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液ｐＨ６．８中に一晩透析した後、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で測定した。１ｍｍ経路長さの石英セルを用い、２２℃にて、Ｊａｓｃｏ  Ｊ７１５分光偏光計でＣＤスペクトルを測定した。サンプルを５分間平衡させた後、２５０〜１９５ｎｍの範囲でスペクトルを取得した。
動的光散乱
実験の動的光散乱（ＤＬＳ）は、２８８チャネル（ＡＬＶ、ランゲン（Ｌａｎｇｅｎ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））及び２Ｗアルゴンレーザ（コヒレント社（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ｉｎｃ．）、サンタ・クララ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ）、カリフォルニア（ＣＡ）
）を備えたＡＬＶ−５０００／Ｅ相関器を有するＡＬＶゴニオメータ計器を用い、約４０ｍＷの使用電力で測定した。散乱強度は、８．４１×１０６及び２．３０×１０７ｍ−１の散乱波ベクター（ｑ）範囲に対応する角度３０°〜９０°の範囲において５°間隔で測定した。散乱波ベクターは、ｑ＝４πｎ  ｓｉｎ（θ／２）／λとして定義し、ここで、θは、散乱角度であり、λ＝５１４．５、すなわち真空でのアルゴンレーザの波長であり、ｎは１．３３で、水の屈折率である。サンプルの温度は、循環水浴により４〜３７±０．１℃の一定温度に維持した。
【００６６】
ＣＯＮＴＩＮ分析を用いて、測定角度での相関関数についてのラグタイムを計算して、相関関数を分析した。ピークは、タンパク質の拡散性モードを表している。遅延時間（τ）をΓに変換し、ｑ２に対してグラフ化した。あてはめた直線の傾きが、拡散係数（Ｄ）である。非ゼロの値のｑ＝０は、物理学的に不可能であるため、切片がゼロとなるように、直線をあてはめる。Γ対ｑ２のプロットは、ｒ２値が０．９５以上の線形であった。
【００６７】
ＤＬＳ測定は、修飾及び非修飾γＤ−及びγＳクリスタリンタンパク質の両方について、濃度０．５ｍｇ／ｍｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液ｐＨ６．８で実施した。０．２２μｍ疎水性ＰＶＤＦ膜（登録商標、フィッシャーサイエンティフィック）を用いて、全ての溶液を１０ｍｍ径のホウケイ酸ガラス管中に導入した後、計測した。溶液を３０分間平衡させた後、光散乱を測定した。
実施例３：ＰＥＧ２４を用いたγＤ−及びγＳクリスタリンの化学修飾
ＮＨＳＰＥＧ２４を用いて、γクリスタリンの第１修飾を実施した。一級アミノ酸、リシン及びアルギニンを含有するアミノ酸は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）官能化ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）上に求核置換を実施することができる。ＮＨＳは、良好な脱離基であるため、Ｓｎ２反応機序を加速する活性化エステルである。求核置換は、ＰＥＧ又はペグ化γクリスタリンタンパク質で修飾されたタンパク質を生成する。ＰＥＧによるタンパク質の修飾は、溶解度を増すと共に、３次元構造又は特性に影響を与えないことがわかっているため、ペグ化を選択した。具体的には、付加される適度な分子量（１１００．３９）及びスペーサアーム長さ（８．８２ｎｍ）により、ＰＥＧ２４を選択した。
【００６８】
【化２】
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【００６９】
ＰＥＧ２４によるγクリスタリンの修飾は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで観測されるγクリスタリン分子量の大きな増大によって証明される通り、成功した。γＤクリスタリンの最大相対強度は、２４，１４８ｍ／ｚ、すなわち２ＰＥＧ２４単位であったのに対し、γＳクリスタリンの場合、ピークは、２６，７１１ｍ／ｚで、これは４ＰＥＧ２４単位に対応する（図１）。溶液中に存在する非修飾γクリスタリンが全くなかったため、過剰反応物質及び反応条件は十分であった。γＤクリスタリンのより高い解像度のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータは、２３，０５６ｍ／ｚ及び２５，２０６ｍ／ｚにさらに２つのはっきりとしたピークを示し、これらは１つ及び３つのＰＥＧ２４修飾に対応する。
【００７０】
ＣＤ分光法は、いずれのクリスタリンタンパク質も、修飾にもかかわらず、その天然の状態を保持していることを明らかにした。γＤクリスタリンは、タンパク質濃度の若干の差に起因すると思われるピーク及び深さの増大を示した。ペグ化は、タンパク質の二次構造に干渉しないことが以前証明されているため、この実験データとの良好なフィットが予想される。（データは示していない）
２２℃及び３７℃で、ＰＥＧ２４で修飾したγＤ−及びγＳクリスタリンについてＤＬＳを実施した。ＮＩＣＦは、Γ対ｑ２グラフに認めることができる角度依存を有する単一セットのピークを含む分布関数を付与した。（図２〜４）ＰＥＧ２４修飾γクリスタリンタンパク質は、小さなサイズ分布を有し、凝集物形成を示し得る、より長い緩和時間での別のモードはなかった。γＤクリスタリンの場合、拡散係数から計算したＲｈは、２２℃及び３７℃で３．１ｎｍであったのに対し、γＳクリスタリンは、２２℃及び３７℃で３．１ｎｍのＲｈを有した。Ｒｈ値は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによりそれぞれ測定されたγＤ−及びγＳクリスタリンの２４．１ｋＤａ及び２６．７ｋＤａ分子量と申し分なく相関した。
【００７１】
ＮＨＳＰＥＧ２４によるγクリスタリンのペグ化は、ＤＬＳにおいて明らかなように、希薄溶液中のあらゆる凝集イベントを有効に阻止した。ＰＥＧは、親水性ポリマーであり、溶液中のタンパク質の溶解度を高めることがわかっている。特定の理論に束縛されるわけではないが、凝集現象が、疎水性相互作用又は静電に関連する溶解性の問題によるものであるならば、ペグ化に伴う溶解度の増加は、γクリスタリンタンパク質の凝集を阻止すると考えられる。
【００７２】
同様に考えて、特定の理論に束縛されるわけではないが、タンパク質の全表面電荷は、ＰＥＧとの反応により改変されていると考えられる。タンパク質の等電点において、等電点に関連する電荷的中性により溶解度の低下が起こる。一級アミンを含むアミノ酸は、このタイプの修飾の標的部位であった。リシン及びアルギニンの一級アミンは、タンパク質構成及び溶液条件に応じて、それと関連する陽電荷を有し得る。ＮＨＳＰＥＧをリシン及びアルギニン基と反応させることにより、潜在的に荷電した部位を親水性ＰＥＧが占めるようにし、これによって、タンパク質表面電荷を変化させる。凝集イベントが、静電相互作用によるものか、又はタンパク質が等電点に近接していることによるものである場合、上記の推論は、なぜ凝集体が溶液からなくなるのかを説明し得る。他の反応機序を介したＰＥＧによるγクリスタリンタンパク質の修飾を用いて、この可能性を調べることにする。
【００７３】
特定の理論に束縛されるわけではないが、溶液中に凝集物がない理由の最終的説明は、スペーサの問題である。剛球コロイドの分野では、スペーサ分子の添加が凝集を抑制し得ることが証明されている。γクリスタリンにＰＥＧ２４部分を添加すると、タンパク質の表面上に親水性スペーサ分子がもたらされる。γクリスタリンタンパク質の凝集を阻止するのに、ＰＥＧにより賦与されるタンパク質間のスペーシングだけで十分なこともある。実施例４：ＰＥＧ４を用いたγＤ−及びγＳクリスタリンの化学修飾
ＰＥＧ４を用いて、γクリスタリンタンパク質を修飾し、γクリスタリンタンパク質凝集に対するスペーサアーム長さの作用を調べた。ＮＨＳ官能化ＰＥＧ（ＮＨＳＰＥＧ４）との反応を再度実施して、修飾方法を同一に維持した。ＰＥＧ４は、２１９．３３ｇ／モルの付加分子量及び１．６ｎｍのスペーサアームを有し、そのいずれもＰＥＧ２４より小さい。
【００７４】
【化３】
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【００７５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータは、γクリスタリン分子量全体の増大を明らかにしたが、これは、ＰＥＧ４による修飾を示すものである。（図５）γＤクリスタリンに認められる最大相対強度は、２２，８２０ｍ／ｚで起こったのに対し、γＳクリスタリンの場合、これは、２３，３２９ｍ／ｚで発生し、これらは、それぞれ、各々のタンパク質に付加された、４及び５ＰＥＧ４単位に相当する。相対強度ピーク付近にガウス分布があることに留意すべきであり、これは、高低両方の修飾度を有するタンパク質が存在することを示唆している。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータはまた、非修飾クリスタリンタンパク質が全く存在しないことも明らかにした。
【００７６】
ＣＤ分光法はここでも、ペグ化がγ及びαクリスタリンタンパク質の二次構造に有意に影響しないことを示した。（データは示してない）ネイティブ及びＰＥＧ４改変γクリスタリンタンパク質の間には優れた一致が認められた。
【００７７】
ＰＥＧ４で修飾したγクリスタリンタンパク質のＮＩＣＦは、単一指数関数的減衰を有したが、これは、溶液中の単一のサイズスケールの存在を示している。（図６）ＰＥＧ２４で修飾したγクリスタリンと同様に、凝集物は溶液中に存在しなかった。分布関数（図７）はここでも、Γ対ｑ２グラフにおける線形角度依存を示す単一セットのピークを呈示した（図８）。ＤＬＳにより測定したγＤクリスタリンのＲｈは、２２℃及び３７℃でそれぞれ２．８及び２．９ｎｍであった。Ｒｈサイズは、ほぼ２２．８ｋＤａの修飾分子量と申し分なく相関する。修飾γＤクリスタリンタンパク質のＲｈは、その非修飾の先行物質より若干大きいため、タンパク質単量体サイズの若干の増加がＤＬＳでも観測された。ＰＥＧ４修飾γＳクリスタリンタンパク質は、２２℃及び３７℃で２．９ｎｍのＲｈを有した。修飾タンパク質の全体的サイズは、非修飾γＳクリスタリンと比較して増大せず、Ｒｈは、約２３．３ｋＤａの分子量と一致する。
【００７８】
ＮＨＳＰＥＧ４及びＮＨＳＰＥＧ２４で修飾したγクリスタリンタンパク質は、２２°及び３７℃で凝集を全く示さなかった。ＰＥＧ４による修飾は、一般に、４〜５つの低分子量付加をもたらしたのに対し、ＰＥＧ２４の場合、γクリスタリンタンパク質毎に２〜３個の基が付加された。タンパク質毎に実施されたＰＥＧ４による修飾の数が多くなっても、凝集の阻止に有意な利益をもたらさなかった。同様に、より高い総量をＰＥＧ２４でγクリスタリンに付加しても、凝集の阻止には全く利点をもたらさなかった。
【００７９】
ＰＥＧ２４で修飾したγクリスタリンタンパク質は、ＰＥＧ４修飾と比較してやや大きなＲｈを有した。いずれの修飾も、凝集物を生じなかったため、スペーサアーム長さは、凝集の阻止に有意に寄与しないと結論付けた。より大きなＰＥＧ鎖によって同様の結果が得られると推定される。
実施例５：ＣＡＰＥＧを用いたγＤ−及びγＳクリスタリンの化学修飾
γクリスタリンのペグ化のための別の反応機序を調べるために、ＣＡＰＥＧ４による修
飾を実施した。生理学的ｐＨ（６．８）で、ＣＡＰＥＧ４の一級アミンは、やや陽荷電であるため、陰荷電アミノ酸であるアスパルギン酸及びグルタミン酸と反応することができる。あるいは、陽荷電アミノ酸が、ＣＡＰＥＧ４のカルボン酸（ＣＡ）と反応することもできる。ＣＡＰＥＧ４は、ＮＨＳＰＥＧ４と同様の理由で、単位当たりの付加分子量が小さく（２６５．３ｇ／モル）、スペーサアームが短い（１．８１ｎｍ）ものを選択した。
【００８０】
【化４】
0006397477.tif 000008
【００８１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、ＣＡＰＥＧ４による修飾の結果生じたγクリスタリン分子量の相当の増大を明らかにした。（図９）いずれの溶液中にも非修飾γクリスタリンは一切なかったが、これは、反応条件が、タンパク質修飾に十分であったことを示唆している。γＤクリスタリンについて２３，２７３ｍ／ｚでの相対強度ピークは、５ＣＡＰＥＧ単位がタンパク質に付加されたことを示している。γＳクリスタリンについて、より高い解像度のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルは、複数のはっきりしたピークが、２２，８６７ｍ／ｚすなわち２ＣＡＰＥＧ４単位、２３，０８９ｍ／ｚでの相対強度最大値すなわち３ＣＡＰＥＧ４単位、及び２３，５９１ｍ／ｚすなわち５ＣＡＰＥＧ４単位を含むことを示した。
【００８２】
γクリスタリンのＣＡＰＥＧ４修飾のＣＤ分光法は、ＰＥＧ４及びＰＥＧ２４で実施した修飾と類似の傾向を示した。（データは示していない）γＳクリスタリン＋ＣＡＰＥＧ４は、非修飾γクリスタリンタンパク質との優れた相関を示した。修飾γＤクリスタリンはここでも、２２０ｎｍに若干の変動を呈示したが、全体として、曲線はネイティブγＤクリスタリンと同様の形状をしている。
【００８３】
ＣＡＰＥＧによるγクリスタリンの修飾も、タンパク質の凝集を阻止した。ＮＩＣＦは、Γ対ｑ２線形依存を有する分布関数を生成する単一指数関数により表すことができる。（図１０〜１２）修飾γクリスタリンタンパク質は、２２°及び３７℃の両方においてその単量体形態で認められ、Ｒｈは、温度依存的であった。γＤクリスタリンについては、拡散係数から、２．８ｎｍの計算Ｒｈが得られ、γＳクリスタリンの場合、この値は２．９ｍであった。Ｒｈ値は、ＰＥＧ４で修飾したγクリスタリンとサイズが類似する以外に、それぞれγＤ−及びγＳクリスタリンの２３ｋＤａ及び２３．５ｋＤａ修飾分子量と申し分なく相関した。
【００８４】
生理ｐＨ（６．８）でのＣＡＰＥＧによるペグ化によって、酸性アミノ酸をターゲティングした。ＮＨＳＰＥＧを用いて実施した反応と同様に、ＣＡＰＥＧ修飾は、タンパク質の表面電荷全体を改変するはずである。陰荷電アミノ酸と反応することにより、親水性ＰＥＧ鎖は、潜在的に荷電したアミノ酸を占めている。ＮＨＳＰＥＧ４と同様のサイズ及び修飾数（４〜５）を有するため、ＣＡＰＥＧ４で改変したγクリスタリンは、酷似した修飾をもたらす。ＮＨＳＰＥＧに代わりＣＡＰＥＧ４を用いる潜在的な利点は、反応物中にＮＨＳ脱離基がないことである。
【００８５】
特定の理論に束縛されるわけではないが、ＣＡＰＥＧ修飾もやはり、タンパク質表面電荷が、γクリスタリン凝集物の形成に重要な因子であることを示唆している。ＰＥＧ部分はタンパク質に添加されるため、表面の疎水性が改変され、凝集を阻止することも可能である。この実験から得られた極めて重要な情報は、酸性又は塩基性酸による修飾によって凝集を阻止できることである。
実施例６：ＭＭＰＥＧを用いたγＤ−及びγＳクリスタリンの化学修飾
マレイミド官能化ＰＥＧは、γクリスタリンタンパク質がペグ化され得るさらに別の反応機序である。チオール基は、マレイミド官能基の二重結合によってマイケル（Ｍｉｃｈａｅｌ）付加反応が可能である。いずれのγクリスタリンタンパク質も、チオール末端基を含有する複数のシステインアミノ酸残基を含む。ＭＭＰＥＧ２４（ＭＭ）によるγクリスタリンのペグ化は、システインアミノ酸によってそのようにして起こる。この反応機序による修飾は、総タンパク質電荷が影響されないと考えられるため、前のペグ化実験に特有のものである。特に、単位当たり付加される高い分子量（１２３９．４４ｇ／モル）及び長いスペーサアーム（９．５３ｎｍ）が、ＰＥＧ２４と同等であることから、ＭＭＰＥＧ２４を選択した。
【００８６】
【化５】
0006397477.tif 000009
【００８７】
ＭＭＰＥＧ２４で修飾したγクリスタリンタンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルは、最小からゼロの非修飾γクリスタリンが認められる３つのはっきりしたピークを示した。（データは示していない）４つのγＤクリスタリンピークが、１つ、２つ、及び３つの修飾に対応する２３１８７、２４４２６、２５６６６ｍ／ｚで観測された。γＳクリスタリンの場合、１つ、２つ、及び３つの修飾に対応する２３５６５、２４４２６、２５６６６ｍ／ｚでピークが観測された。両クリスタリンタンパク質の最も高い相対強度は、２つ修飾で発生した。
【００８８】
ここでも、ネイティブ及びペグ化γクリスタリンタンパク質の間で優れた一致が認められた。いくつかの例では、システインのチオール基が、二次構造をもたらす構造統合性を付与する分子内ジスルフィド結合に関与することがわかっている。ＭＭ修飾γＤ−及びγＳクリスタリンスペクトルのいずれも、ネイティブγクリスタリン状態と同様の二次構造を示すことから、修飾によってタンパク質構造は変化しなかったと結論付けた。（データは示していない）
そのシステイン残基を介したγクリスタリンのペグ化は、凝集を阻止しなかった。ＮＩＣＦ曲線（データは示していない）は、角度依存を有し、これにより、２つのはっきりしたピークのセットを持つ分布機能がもたらされた（図１３）。Γ対ｑ２グラフは、線形角度依存を有する２つの傾きを呈示したが、これは、低速及び高速拡散係数の存在を示している。（データは示していない）３７℃で、低速なモードにより、γＤクリスタリンについては８０ｎｍ、またγＳクリスタリンについては８５ｎｍのＲｈが得られた。大きなサイズは、タンパク質が溶液中に凝集していることを示した。高速モードは、γＤ−及びγＳクリスタリンについて２．８ｎｍ及び３．０ｎｍのＲｈを有する単量体γクリスタリン
タンパク質に３７℃で対応する。
【００８９】
マレイミド官能価を介したペグ化が、凝集を阻止しなかったことは、γクリスタリン凝集物の形成に関する重要な情報を提供する。ＭＭＰＥＧ２４及びＮＨＳＰＥＧ２４は、いずれも同様の数の修飾をもたらすことから、表面被覆及びγクリスタリンタンパク質周辺のスペーサ基も同等でなければならない。ＭＭＰＥＧ２４修飾で観測された凝集物から、凝集の阻止が、完全には親水性スペーサ分子に依存性となりえないことが明らかである。
【００９０】
非荷電アミノ酸によるタンパク質のペグ化が凝集を阻止しなかったことをみいだしたことで、凝集機序への重要な眼識が得られた。ＭＭＰＥＧとＮＨＳＰＥＧ又はＣＡＰＥＧの重要な違いは、マレイミド反応によるペグ化が、タンパク質の荷電アミノ酸をターゲティングしない点である。特定の理論に束縛されるわけではないが、これは、表面電荷及び静電が、凝集の形成に主要な役割を果たしており、凝集を破壊する場合、これらをターゲティングしなければならないことを示唆している。
実施例７：ＢＩＯＴＩＮを用いたγＤ−及びγＳクリスタリンの化学修飾
ビオチンは、アビジンに対するその高い結合親和性のために、タンパク質修飾に一般に用いられる分子である。タンパク質をビオチンで標識し、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの反応に付した後、アビジンカラムを用いて、バルクから分離又は精製することができる。ＮＨＳビオチン分子は、ＰＥＧ４及びＰＥＧ２４と同じ機序により反応するが、付加される分子は、もはや親水性ではなく、むしろ高度に荷電された末端基を含むことから、これを選択した。単位当たり付加された分子量は、２２６．３８ｇ／モルで、スペーサアームは１．３８ｎｍであった。
【００９１】
【化６】
0006397477.tif 000010
【００９２】
γクリスタリンタンパク質は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦに示される通り、首尾よくビオチンで修飾した。（データは示していない）γＤクリスタリンのピーク修飾は、８単位（２３７５８ｍ／ｚ）であったが、γＳクリスタリンのピーク発生は、４単位（２３３２５ｍ／ｚ）であった。いずれの系も、非修飾γクリスタリンを全く呈示しなかったが、これは、完全な修飾のために反応条件が十分であることを示している。
【００９３】
ＣＤスペクトルは、タンパク質のネイティブ構造と比較してかなり大きな上向きのシフトを示した。（データは示していない）２２０ｎｍ付近で、より浅いウェルが認められたが、これは、修飾と二次構造の間の良好な相関の傾向に反するものである。スペクトルの変化は、タンパク質の二次構造が修飾により乱されたことを示し得る。スペクトルのシフトにもかかわらず、曲線の全体的形状は、類似しており、無秩序又はランダムなコイルの兆候はなかった。
【００９４】
ビオチンで修飾したγクリスタリンについて、γクリスタリンタンパク質の凝集を観察した。ＮＩＣＦは、２セットのピークを有する分布関数もたらす低速及び高速モードを示
した（図１４）。分布関数の角度依存を、Γ対ｑ２グラフに認めることができ、ここで、低速及び高速モードの間に量的な差が見られた。２２℃で、高速及び低速モードのＲｈは、γＤクリスタリンについては２．８ｎｍ及び１５０ｎｍであり、またγＳクリスタリンの場合、これらの値は２．６ｎｍ及び１８０ｎｍであった。低速及び高速モードは、３７℃でも観測され、Ｒｈ値は、２２℃の値と類似していた。
【００９５】
ＮＨＳＢｉｏｔｉｎで修飾したγクリスタリンの凝集から、修飾分子（すなわち、分子の毛）の官能価が重要であることがわかる。機構的に、ビオチンは、ＮＨＳＰＥＧと同じ様式でγクリスタリンを修飾した。従って、γクリスタリンの荷電アミノ酸を修飾するだけでは、凝集を阻止するのに不十分である。ビオチン及びＰＥＧ４を用いて同等程度の修飾が起こったが、これは、タンパク質の等電点の同等のシフトを意味する。ビオチンで修飾したγクリスタリンの場合に起こった凝集のために、γクリスタリンタンパク質の等電点を単にシフトするだけでは、凝集を阻止するのに不十分である。さらにビオチン化系のＤＬＳ測定もまた、γクリスタリンの表面にスペーサ分子を単に付加することによって凝集を阻止することはできないという見解を支持している。
【００９６】
ＰＥＧとビオチンの間の化学的性質の明瞭な相違が、一方は凝集を阻止し、他方は阻止しない理由である。ＰＥＧは、柔軟な親水性分子であるのに対し、ビオチン官能基は、水素結合及び陰荷電の安定化を可能にする。従って、ＰＥＧの特性は、タンパク質の溶解性を促進するが、ビオチンは、凝集物の疎水性及び静電性質に寄与する。
【００９７】
実施例８：ＢＩＯＴＩＮ−ＰＥＧを用いたγＤ−及びγＳクリスタリンの化学修飾
ビオチンを用いたγクリスタリンタンパク質の修飾により、凝集が起こったため、タンパク質とビオチン官能基との間に親水性スペーサを組み込んだＮＨＳＢｉｏｔｉｎＰＥＧを用いることが提案された。ＰＥＧの親水性が、γクリスタリン凝集の阻止における重要な因子であると考えられた。ＮＨＳ官能化を用いて、反応機序を一定に維持する。単位当たり付加された分子量は、８２５．６４ｇ／モルであり、スペーサアームは５．６ｎｍであった。
【００９８】
【化７】
0006397477.tif 000011
【００９９】
分子量の明らかなシフトがＭＡＬＤＩ−ＴＯＦに認められ、これは、ＢｉｏｔｉｎＰＥＧ１２によるγクリスタリンタンパク質の修飾を示している。（データは示していない）γＤクリスタリンは、１つ、２つ、及び３つの修飾に対応する２２７６０、２３５８２、及び２４４０４ｍ／ｚで観測可能な３つのはっきりしたピークを有した。γＳクリスタリンの解像により、１〜５つの修飾に対応する２３００１、２３８１６、２４６６９、２５４７０、及び２６１２２ｍ／ｚにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦピークが得られた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルも、非修飾γクリスタリンを全く示さなかったため、十分な反応条件を証明した。
【０１００】
修飾したγクリスタリンタンパク質の二次構造は、ＣＤスペクトルに認められるように、ネイティブγクリスタリンのそれとよく一致した。（データは示していない）ビオチンだけで修飾したγクリスタリンについてのＣＤスペクトルに認められるウェルは、もはやはっきりとしない。修飾のＰＥＧ部分は、タンパク質とビオチン官能基との間にスペーサを提供する以外に、溶解度の増大をもたらす可能性が高い。
【０１０１】
ビオチン官能基へのＰＥＧの組込みにもかかわらず、ＮＩＣＦの低速及び高速モードに認められるように、依然として溶液中に凝集物が存在した。（データは示していない）分布関数（図１５）は、２セットのピークを含み、これらは角度依存を示す。Γ対ｑ２グラフは、明らかに２つの明瞭な線形フィットを示し、その傾きは、低速及び高速拡散モードをもたらす。（データは示していない）高速拡散係数は、単量体γクリスタリンに対応し、ここで、γＤクリスタリンは、２２℃で２．７ｎｍのＲｈを有し、γＳクリスタリンは、２．６ｎｍであった。低速拡散係数は、２２℃でγＤクリスタリンについては１０５ｎｍ、γＳクリスタリンについては１１５ｎｍのＲｈで、溶液中に存在する大きな凝集物を呈示した。同様のＲｈの凝集物が、３７℃でも観測された。
【０１０２】
タンパク質とビオチン官能基との間のスペーサとしてのＰＥＧの使用は、凝集を阻止する助けとならなかった。特定の理論に束縛されることなく、また、ビオチンがγクリスタリンの等電点をシフトしたことに関する上の論述を参照して、これらの実験結果は、凝集物形成において疎水性が静電より優位であることも示唆している。また、ＢｉｏｔｉｎＰＥＧの長いスペーサアームによっても、凝集は阻止されなかったが、これは、スペーサ分子の長さが、凝集を回避する（ｄｅｔｕｒｉｎｇ）上で重要な因子ではないという傾向をさらに支持するものである。ＢｉｏｔｉｎＰＥＧで改変したγクリスタリンが、低速モード、又はビオチン修飾より小さい凝集物Ｒｈを有し、これは、ＰＥＧが凝集の抑制を助けることを示唆することに留意すべきである。
【０１０３】
実施例９：スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド酢酸塩（ＳＡ）を用いたγＤ−及びγＳクリスタリンの化学修飾
大きな分子量及びスペーサアームによる前の修飾が依然として凝集を招いたことから、低侵襲性の修飾が研究された。最終的修飾は、最小分子量（４３ｇ／モル）及びスペーサアーム（酢酸塩分子）を組み込んだスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド酢酸塩を用いて実施した。反応機序は、ＰＥＧ４のそれと同様であり、従って、荷電アミノ酸基を介して反応させることにより、γクリスタリンの等電点は影響を受けるであろう。
【０１０４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにおいて、γクリスタリンタンパク質の重量にわずかなシフトが観測された。（データは示していない）γＤクリスタリンについてのピーク相対強度は、２２２０９ｍ／ｚで、γＳクリスタリンについては、２２５６２ｍ／ｚで発生し、それぞれ、６個及び７個のアセテート基に対応する。ピークは、非修飾タンパク質を呈示しなかったが、これは、十分な反応条件を示すものである。ピーク相対強度付近のガウス分布は、一部のクリスタリンタンパク質が、高低両方の程度の修飾を有することを示した。
【０１０５】
いずれの修飾γクリスタリンタンパク質についてのＣＤスペクトルも、ネイティブγクリスタリンと比較して、２２０ｎｍ付近に、より小さなウェルを示した。（データは示していない）ＣＤスペクトルの変化は、ビオチン修飾でも観測された。ランダム又は無秩序状態の兆候はないが、修飾により二次構造がやや影響され得ると考える根拠がある。
【０１０６】
ＮＩＣＦを調べると、アセテート基によるγクリスタリンの修飾は、凝集を阻止しなかったことが明らかである。（データは示していない）分布関数を図１６に示す。低速及び高速拡散モードの角度依存をΓ対ｑ２グラフに認めることができる。（データは示していない）３７℃でのγＤクリスタリンの場合、高速及び低速拡散係数は、２．６ｎｍ及び８
５ｎｍのＲｈに対応する。３７℃でのγＳクリスタリンのＲｈは、２．５ｎｍ及び９０ｎｍであった。高速モードＲｈは、分子量が約２２ｋＤａの修飾γクリスタリンタンパク質に適切なサイズである。室温で実施した測定から得られたＲｈ値は、同様の結果を示した。
【０１０７】
最小スペーサアームを用いて、タンパク質の等電点をシフトする試みで、ＳＡ修飾を実施した。凝集物は溶液中に存在したものの、凝集物サイズは、非修飾γクリスタリンより小さかった。タンパク質当たりの多数の修飾により、等電点の実質的シフトが凝集物のサイズを縮小したことが考えられる。特定の理論に束縛されるわけではないが、凝集は依然として溶液中に存在することから、γクリスタリンタンパク質が等電点に近いことだけが凝集現象の原因になるわけではないと結論付けた。
【０１０８】
実施例３〜９の結果を以下の表にまとめる：
表４：二官能価帯電マスキング剤を用いた結果のまとめ
【０１０９】
【表４】
0006397477.tif 000012
【０１１０】
本明細書に示す結果から、静電がγクリスタリン凝集の重要な要素であることがわかる。静電による凝集は、高塩濃度又は二官能価帯電マスキング剤を用いて、有効に阻止することができる。γクリスタリン凝集の機序について理解を深めることにより、白内障及び老眼の治療に特に有用な新規クラスの薬剤が得られた。
方法：ヒト死体水晶体の摘出及び特性決定
死亡から約２４時間以内に、眼球を摘出し、スライスして、ガラス体を採取する。水晶体を切除して、オプティゾル（Ｏｐｔｉｓｏｌ）（登録商標）と称するインキュベーション培地に導入する。オプティゾル（Ｏｐｔｉｓｏｌ）（登録商標）は、コンドロイチン硫
酸、デキストラン４０、オプティゾルベース粉末、二酸化ナトリウム、ゲンタマイシン、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、２−メルカプトエタノール及び精製水を含有する角膜保存培地である。ＯＤは右眼、ＯＳは左目である。
【０１１１】
【化８】
0006397477.tif 000013
【０１１２】
水晶体混濁は、ＬＯＣＳ  ＩＩＩシステムに従い分類する。ＬＯＣＳ  ＩＩＩ測定は、スリットランプ顕微鏡を用いて実施した。ＬＯＣＳ  ＩＩＩは、白内障研究センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｔａｒａｃｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ボストン、マサチューセッツ（ＭＡ）の白内障スライドライブラリーの縦断的研究から選択される標準の広範なセットを含有する。これは、核の色（ＮＣ）及び核の乳光（ＮＯ）を等級付けするための６つのスリットランプ画像、皮質白内障（Ｃ）を等級付けするための５つの反帰光線法画像、並びに後嚢下（Ｐ）白内障を等級付けするための５つの反帰光線法画像を含む。白内障の重症度は、小数点以下の桁数で等級付けし、標準は、スケール上に規則的にあけた間隔を有する。
実施例１０：上皮を介したヒト死体水晶体輸送におけるＣＡＰＥＧ４の試験
上皮構築物を介したＣＡＰＥＧ４の輸送を調べた。上皮は、角膜の外層であり、上皮からの輸送は、困難であることがわかっている。目標は、ＣＡＰＥＧ４構築物を、眼の前方からの輸送のための点眼製剤に使用できることを証明することであった。
【０１１３】
具体的には、溶液中のＣＡＰＥＧ４構築物を、培地及び上皮構築物を含有する装置の上部に添加した。（図１９）。上皮構築物は、１層のヒト角膜上皮細胞から構成される。１５〜１２０分で、培地の上部及び底部からアリコートを採取した。図２０は、細胞の底部に輸送されたＣＡＰＥＧ４を示す。
【０１１４】
図２１は、添加したＣＡＰＥＧ４のｍｇ／ｍｌに対するオピゾル（Ｏｐｉｓｏｌ）（登録商標）のｐＨを示す。表５及び表６にもデータを示す。全体として、ここで、クエン酸によりオプティゾル（Ｏｐｔｉｓｏｌ）（登録商標）培地のｐＨを、ＣａＰＥＧアミンを含有するオプティゾル（Ｏｐｔｉｓｏｌ）（登録商標）の同じｐＨへと単純に変える（低下させる）だけでは皮質白内障に軽減は見られなかったことから、皮質及び後嚢下白内障の軽減は、ＣＡＰＥＧ４によるものであって、培地のｐＨ作用によるものではないことが立証された。混濁の軽減には、活性剤の存在が必要であった。
【０１１５】
表５：1m g/ml CAPEG4 
【０１１６】
【表５】
0006397477.tif 000014
【０１１７】
表５：16mg/mL 
【０１１８】
【表６】
0006397477.tif 000015
【０１１９】
実施例１１：ヒト死体水晶体でのＣＡＰＥＧ４の試験−ヒト死体水晶体における白内障の軽減
全てのケースで、対照は、オプティゾル（Ｏｐｔｉｓｏｌ）（登録商標）培地である。
残るデータポイントは、オプティゾル（Ｏｐｔｉｓｏｌ）（登録商標）を含むＣＡＰＥＧ４溶液を用いて処理した単離ヒト死体水晶体についてである。
【０１２０】
表６は、対照培地又は１０ｍｇ／ｍＬのＣＡＰＥＧ４と一緒にインキュベートした水晶体の、時間に対する結果を示す。表６では、前面皮質下で、１０ｍｇ／ｍｌのＣＡＰＥＧ４とインキュベートした水晶体の場合、１．０、１．０及び０．９のＬＯＣＳ  ＩＩＩ等級が認められる。対照のＬＯＣＳ等級は、１．０、１．２及び０．９である。１０ｍｇ／ｍｌでは、対照サンプルに対する実験に有意な変化はなかった。
【０１２１】
表６：オプティゾル(Optisol) (登録商標)又は10mg/ml のCAPEG4と一緒にインキュベートした白内障の、時間に対するLOCS III等級付け
【０１２２】
【表７】
0006397477.tif 000016
【０１２３】
表７は、対照培地又は５０ｍｇ／ｍｌのＣＡＰＥＧ４と一緒にインキュベートした水晶体の、時間に対する結果を示す。表７では、前面皮質下で、全サンプルについて、１．０のＬＯＣＳ  ＩＩＩ等級、及び全サンプルについて２．０の核混濁（ＮＯ）等級が認められる。対照及び７２時間までの５０ｍｇ／ｍｌインキュベーションとの間に、皮質白内障及びＮＯについて有意な差はなかった。核の色（ＮＣ）は、対照及び５０ｍｇ／ｍｌのＣＡＰＥＧ４溶液中でのインキュベーション時の両方で、時間と共にやや増加した。後嚢下白内障において、０及び２４時間の時点で１．１から０．９へと若干の改善が見られた。
【０１２４】
表７：オプティゾル(Optisol) (登録商標)又は50mg/ml のCAPEG4と一緒にインキュベートした白内障の、時間に対するLOCS III等級付け
【０１２５】
【表８】
0006397477.tif 000017
【０１２６】
表８は、対照培地又は１００ｍｇ／ｍｌのＣＡＰＥＧ４と一緒にインキュベートした水晶体の、時間に対する結果を示す。ＣＡＰＥＧ４インキュベーションについて、それぞれ０及び２４時間の時点で乳光の低下（ＮＯ：１．８から１．２）、並びに７２時間までの皮質及び核の色のわずかな改善が見られる。
【０１２７】
表８：オプティゾル(Optisol) (登録商標)又は100mg/mlのCAPEG4と一緒にインキュベートした白内障の、時間に対するLOCS III等級付け
【０１２８】
【表９】
0006397477.tif 000018
【０１２９】
表９は、様々な眼を用いた表８の実験の反復を示す。ＰＳ（後嚢下白内障）下、１００ｍｇ／ｍｌのＣＡＰＥＧ４でインキュベートしたサンプルは、０、２４及び７２時間でそれぞれ１．８、１．５、及び１．０の値を有した。また、０、２４及び７２時間でそれぞれ３．０から２．６及び２．０へと皮質白内障の軽減も見られた。
【０１３０】
表１０：オプティゾル(Optisol) (登録商標)又は100mg/mlのCAPEG4と一緒にインキュベートした白内障の、時間に対するLOCS III等級付け
【０１３１】
【表１０】
0006397477.tif 000019
【０１３２】
表１０は、対照培地又は２００ｍｇ／ｍＬのＣＡＰＥＧ４と一緒にインキュベートした水晶体の、時間に対する結果を示す。皮質白内障は、０、２４、及び７２時間の時点でそれぞれ２．５から２．２そして２．０へと軽減した。対照も、２４及び７２時間の時点でそれぞれ３．３から３．０へと皮質白内障に若干の軽減を示している。
【０１３３】
表１０：オプティゾル(Optisol) (登録商標)又は200mg/mlのCAPEG4と一緒にインキュベートした白内障の、時間に対するLOCS III等級付け
【０１３４】
【表１１】
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【０１３５】
表１１は、対照培地又は２００ｍｇ／ｍｌのＣＡＰＥＧ４と一緒にインキュベートした水晶体の、時間に対する結果を示す。ＣＡＰＥＧ４溶液の皮質白内障に、０、２４、及び７２時間の時点でそれぞれ１．３から１．０そして０．９へとわずかな低減が観測された。
【０１３６】
表１１：オプティゾル(Optisol) (登録商標)又は200mg/mlのCAPEG4(オプティゾル(Optisol) (登録商標)中)と一緒にインキュベートした白内障の、時間に対するLOCS III等級付け
【０１３７】
【表１２】
0006397477.tif 000021
【０１３８】
表１２は、ＣＡＰＥＧ４を添加せずに、オプティゾル（Ｏｐｔｉｓｏｌ）（登録商標）のｐＨを変えた結果を示す。ｐＨは、クエン酸の添加により低下させた。白内障に対してオプティゾル（Ｏｐｔｉｓｏｌ）（登録商標）のｐＨの変化の影響はなかった。
【０１３９】
表１２：オプティゾル(Optisol) (登録商標)のpHの白内障に対する影響
【０１４０】
【表１３】
0006397477.tif 000022
【０１４１】
死体水晶体の試験の場合、ＬＯＣＳ  ＩＩＩ等級の出発点が異なるのは、患者の出発状態がまちまちであるためである。オプティゾル（Ｏｐｔｉｓｏｌ）中のＣＡＰＥＧ４の濃度が増すにつれ、水晶体嚢胞にしわが観察され、客観的にも水晶体体積の幾分かの減少を示した。
【０１４２】
「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」という用語は、量の限定を示すのではなく、指示された項目のうちの少なくとも１つの存在を示す。「又は」という用語は、「及び／又は」を意味する。「含む」、「有する」、「包含する」、及び「含有する」という用語は、オープンエンドの用語（すなわち、「限定はしないが、〜を含む」を意味する）と解釈すべきである。本明細書に開示する範囲は全て、包括的で、組み合わせが可能である。
【０１４３】
本明細書では、本発明者らが知る最良の形態を含む実施形態が説明される。以上の説明を読めば、当業者には、このような実施形態の変形が明らかになるであろう。当業者は、必要に応じてこのような変形を用いることが予想され、開示された方法は、本明細書で具体的に記載されたものとは別の形で実施されることが予想される。従って、本明細書に添付する特許請求の範囲で列挙される対象物に対するあらゆる改変物及び同等物が、関連法
規により許容される範囲まで包含される。さらに、本明細書で別途指示されるか、あるいは、文脈から明らかに矛盾しない限り、考えられるあらゆる変形における、上に記載した要素の任意の組合せも包含される。
【図１】
0006397477.tif 000027
【図２】
0006397477.tif 000028
【図３】
0006397477.tif 000029
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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