(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）少なくとも１つの天然油を含む粒子状物質を含む少なくとも１つの第１の成分；
（ｉｉ）病原性微生物のアンタゴニストを含む少なくとも１つの第２の成分
を含み、前記少なくとも１つの第１の成分及び前記少なくとも１つの第２の成分がパッケージの別個のコンパートメントに含まれる、パッケージ。
【請求項２】
前記第１の成分が、本質的に乾燥形態の前記粒子状物質を含む、請求項１に記載のパッケージ。
【請求項３】
前記粒子状物質がシリカ（ＳｉＯ２）を含む、請求項１に記載のパッケージ。
【請求項４】
前記粒子状物質が、沈降合成アモルファスシリカビーズを含む、請求項３に記載のパッケージ。
【請求項５】
前記粒子状物質が、１０〜２５μｍのサイズ分布を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項６】
前記粒子状物質が、４００〜５００ｍ２Ｎ２／ｇの表面積及び３００〜３５０ＤＢＰ／１００グラム粒子の油容量のいずれかを示す、請求項１〜５のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項７】
前記天然油が植物油である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項８】
前記天然油が少なくとも１つの精油を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項９】
前記精油オレガノ油、請求項８に記載のパッケージ。
【請求項１０】
前記植物油が炭素に富む栄養性の油である、請求項７に記載のパッケージ。
【請求項１１】
２集団以上の粒子状物質を含み、各粒子状物質集団が異なる種類の天然油を担持する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項１２】
精油を担持する少なくとも１集団の粒子状物質及び炭素に富む栄養性の油を担持する少なくとも１集団の特定の物質を含む、請求項１１に記載のパッケージ。
【請求項１３】
前記精油が少なくともオレガノ油を含む、請求項１２に記載のパッケージ。
【請求項１４】
前記粒子状物質が、前記粒子状物質の総重量中２０〜５０ｗ／ｗ％の天然油を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項１５】
前記天然油が、前記粒子状物質に吸収されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項１６】
前記粒子状物質が少なくとも１つの界面活性剤を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項１７】
前記界面活性剤が脂肪酸のカリウム塩を含む、請求項１６に記載のパッケージ。
【請求項１８】
前記粒子状物質が５〜１０ｗ／ｗ％の前記界面活性剤を含む、請求項１６又は１７に記載のパッケージ。
【請求項１９】
前記第１の成分が、１０％（ｗ／ｗ）以下の水分を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項２０】
前記第１の成分が、有機溶媒を含まないか、５％以下の有機溶媒を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項２１】
前記有機溶媒が極性溶媒である、請求項２０に記載のパッケージ。
【請求項２２】
前記第２の成分がゲルの形態である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項２３】
前記ゲルが多糖ベースのゲルである、請求項２２に記載のパッケージ。
【請求項２４】
前記多糖ベースのゲルが寒天ゲルである、請求項２３に記載のパッケージ。
【請求項２５】
前記少なくとも病原性微生物のアンタゴニストが、土壌細菌であるか、植物部位から単離された細菌である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項２６】
前記アンタゴニストが、植物の土壌から又は前記病原体に対する耐性又は抵抗性を示す植物から単離される、請求項２５に記載のパッケージ。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの第２の成分が、５００ＣＦＵ／ｍｌ〜５，０００ＣＦＵ／ｍｌの濃度でアンタゴニストを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの第２の成分が、約１０００ＣＦＵ／ｍｌの濃度で前記アンタゴニストを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項２９】
２つ以上の第２の成分を含み、前記第２の成分のそれぞれが、異なる種類のアンタゴニスト又はアンタゴニストのカクテルを担持する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項３０】
前記少なくとも１つのアンタゴニストが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌａ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｄｒｉｎａ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５７）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐａｎｉｕｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ（アクセッション番号ＣＢＳ１３４５６６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｈｉｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３４５６７）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３４５６８）からなる群から選択される細菌である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項３１】
前記第１の成分及び前記少なくとも１つの第２の成分を用いてエマルションを形成するための指示を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項３２】
前記指示が、前記第１の成分を前記第２の成分と混合することを含む、請求項３１に記載のパッケージ。
【請求項３３】
植物の病原体感染症の阻害又は植物の病原体感染症の排除に使用するための、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項３４】
前記感染症が、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  Ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ（ＣＢＭ）、ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ（ＸＶ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｓ（Ｓ．Ｓｃａｂｉｅｓ）から選択される病原体により引き起こされるものである、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項３５】
前記植物がナス科の植物である、請求項３４に記載のパッケージ。
【請求項３６】
以下を含むパッケージ：
・少なくとも１つの天然油を含む粒子状物質を含む第１の成分を保持している１又は複数の第１のウェル；
・病原性微生物の少なくとも１つのアンタゴニストを含む第２の成分を保持している１又は複数の第２のウェル；
前記１又は複数の第１のウェル及び前記１又は複数の第２のウェルのそれぞれが、上部開口部及び前記上部開口部から下向きに延びる凹みを備え、前記ウェルが、ほぼ平面状のマトリックス上に一緒に保持されており；
・前記１又は複数の第１のウェルの開口部をシールしている第１のフィルム及び前記１又は複数の第２のウェルの開口部をシールしているフィルム。
【請求項３７】
前記１又は複数の第１のウェル及び前記１又は複数の第２のウェルの少なくとも１つが前記平面状マトリックス中に一体型で形成されている、請求項３６に記載のパッケージ。
【請求項３８】
前記１又は複数の第１のウェル及び１又は複数の第２のウェルの少なくとも１つが、前記平面状マトリックス内の開口部又は凹みに可逆的に取付け可能である、請求項３６に記載のパッケージ。
【請求項３９】
前記１又は複数の第１のウェルのぞれぞれが油適合性ポリマーウェルである、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項４０】
１個の第１のウェルを含む、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項４１】
前記第１のフィルムが、油適合性熱可塑性ポリマーフィルムである、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項４２】
前記第１のフィルムが、流体不透過性熱可塑性ポリマーフィルムである、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項４３】
複数の第２のウェルを含み、各第２のウェルが、同じ又は異なるアンタゴニスト又はアンタゴニストのカクテルを含む、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項４４】
前記複数の第２のウェルをシールしている１枚の第２のフィルムを含む、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項４５】
前記第２のフィルムが、酸素を含むガスに対して透過性である、請求項３６〜４４のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項４６】
前記第２のフィルムが、前記第１のフィルムに重ねられている、請求項３６〜４５のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項４７】
前記第２のフィルムが、前記第１のフィルムにしっかりと付着している、請求項４６に記載のパッケージ。
【請求項４８】
取っ手を含む、請求項３６〜４７のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項４９】
前記第１の成分及び前記第２の成分が、請求項１〜３５のいずれか一項に記載されている通りである、請求項３６〜４８のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項５０】
抗細菌剤を用意する方法であって、
少なくとも１つの精油を粒子状物質の総重量のうち２０〜５０ｗ／ｗ％の精油の量で担持している粒子状物質を含む第１の成分であって、前記精油の少なくとも一部が前記粒子状物質に吸収されている第１の成分と、病原性微生物の少なくとも１つのアンタゴニストを含む少なくとも１つの第２の成分とを混合すること；及び
前記混合物に抗細菌活性を有するエマルションを形成させること；
を含む方法。
【請求項５１】
前記第１の成分及び前記少なくとも１つの第２の成分が、請求項１〜３５のいずれか一項に記載されている通りである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１の成分と前記少なくとも１つの第２の成分との混合により、液滴サイズが３〜１０μｍのエマルションが得られる、請求項５０又は５１に記載の方法。
【請求項５３】
植物の病原体感染症を処理又は防止する方法であって、（ｉ）少なくとも１つの精油を粒子状物質の総重量のうち２０〜５０ｗ／ｗ％の精油の量で担持している粒子状物質であって、前記精油の少なくとも一部が吸収されている粒子状物質と、（ｉｉ）前記病原体感染症を引き起こす病原性微生物の少なくとも１つのアンタゴニストとを含むエマルションを前記植物に適用することを含む、方法。
【請求項５４】
前記エマルションが、前記少なくとも１つの精油を担持している粒子状物質を含む第１の成分及び病原性微生物の前記少なくとも１つのアンタゴニストを含む少なくとも１つの第２の成分を混合することにより得られる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記第１の成分及び前記第２の成分が請求項１〜３５のいずれか一項に記載されている通りである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記エマルションが、前記植物への噴霧又は前記植物の塊茎への灌水若しくは噴霧により植物に適用される、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
数時間から数日の間隔を空けて２回以上前記エマルションを前記植物に適用することを含む、請求項５３〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記エマルションを前記植物に少なくとも５回適用することを含む、請求項５３〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
植付けの日から又は感染症が疑われた最初の日から前記エマルションを前記植物に適用することを含む、請求項５３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  Ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ（ＣＢＭ）、ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ（ＸＶ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｓ（Ｓ．Ｓｃａｂｉｅｓ）から選択される病原体によって引き起こされるトマト植物感染症を処理又は防止するための、請求項５３〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記第２の成分が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌａ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｄｒｉｎａ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５７）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐａｎｉｕｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ（アクセッション番号ＣＢＳ１３４５６６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｈｉｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３４５６７）、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３４５６８）からなる群から選択されるＣＢＭのアンタゴニストの混合物を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
キャリア内にあってもよい、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌａ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｄｒｉｎａ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５７）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐａｎｉｕｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ（アクセッション番号ＣＢＳ１３４５６６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｈｉｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３４５６７）、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３４５６８）からなる群から選択される単離された拮抗細菌。
【請求項６３】
病原体によって誘発される病気に対する植物の処理又は保護において使用するための、請求項６２に記載の単離された拮抗細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、抗微生物用途の製品、特に植物の保護及び植物の生物学的防除（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）のための製品分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術
本開示の主題の背景として関連すると考えられる参考文献を以下に示す：
米国特許出願公開第２０１１０２８５００号
米国特許出願公開第２０１１０１４５９６号
インド特許出願第０３６０３ＣＨ２０１０号
米国特許第７，４８５，４５１号
Ａｉｔ  Ｂｅｎ  Ａｏｕｍａｒ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｌａｎｔｓ  Ｒｅｓ．６（１７）：４３３２−４３３８，２０１１
Ｐｏｕｖｏｖａ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｚｅｍｄｉｒｂｙｓｔｅ−Ａｇｒｕｃｙｋｔｙｒｅ  ９５（３）：４４０−４４６，２００８
Ｌａｎｔｅｉｇｎｅ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．１０２（１０）：９６７−７３，２０１２
Ｓｌｕｓａｒｓｋｉ  Ｃ．Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  Ｃｒｏｐ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ６９：１２５−１３４  ２００８
【０００３】
本明細書中の上記参考文献の認定は、これらが本開示の主題の特許性に何らかの点で関連することを意味するものと推測されるべきではない。
【０００４】
背景技術
農作物は様々な病原性微生物に感受性であり、これにより年間損失（ａｎｎｕａｌ  ｌｏｓｓ）及び経済的損失が生じる。植物病から作物を保護するために開発された方法に、耐性を得るための植物育種、化学物質の適用、及び生物学的防除が含まれる。
【０００５】
化学的農薬の使用は重度な環境汚染を生じさせ、多くの病原体が既存の化学物質に対する耐性を発達させてきており、多くの農薬は現在使用が禁止されており、有機農法ではそのような物質に頼ることが全く許されていない。したがって、病原体を防除（ｃｏｎｔｒｏｌ）するための新規な環境に優しいツール、すなわち生物学的防除技術を開発することが主な目標である。
【０００６】
米国特許第６，４９５，１３３号は、植物病原体に対する拮抗効果（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を示すＧｌｉｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍの株を記載している。この生物的防除剤（ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ  ａｇｅｎｔ）は、トマト等の種々の植物の真菌病原体から保護するための、種子、土壌、又は植物の処置において使用される。
【０００７】
米国特許出願公開第２０１１０２８５００号及び同第２０１１０１４５９６号は、殺真菌活性を有する天然油又は油製品を含み得る抗植物病原体剤；１又は複数のアントラキノンを含む植物抽出物を含む植物病原体阻害剤の組合せを記載している。
【０００８】
インド特許出願第０３６０３ＣＨ２０１０号は、生物学的防除としての真菌性物の逆エマルション製剤を記載している。製剤は、逆エマルション製剤の形態である。記載されているプロセスは、固体又は液体発酵による真菌胞子の生産；分生子懸濁液又は細胞懸濁液の調製；分生子懸濁液、水、乳化剤、及びグリセロールを混合することによる水相の調製；植物性脂肪混合物を温かい植物油混合物に加えることによる油相の調製；ホモジナイザーを用いて水相と油相を混合して油中水滴型又は逆エマルションの製剤を得ることを含む。生成物は、種子処理、土壌処理、及び葉面噴霧に用いることができる。
【０００９】
米国特許第７，４８５，４５１号も、生きた及び／又は休止中の原核生物及び／又は真核生物の細胞及び組織から選択される細胞材料を含む逆エマルション（油中水滴型エマルション）を記載しており、細胞材料は油中水滴型エマルションと適合性（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）である。細胞材料の例としては、真菌、水生菌類、藻類、酵母、細菌、植物、昆虫、及び動物細胞が含まれる。逆エマルションは更に、植物油及び／又は魚油等の油、可溶性非イオン界面活性剤、並びに水を含む。場合により、組成物はヒュームドシリカ又はベントナイト等の増粘剤を含む。
【００１０】
拮抗効果を有する精油も調べられている。例えば、トマト潰瘍病の原因であるＣｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ（ＣＢＭ）に対するモロッコの植物の抽出物の抗細菌活性が報告されている［Ａｉｔ  Ｂｅｎ  Ａｏｕｍａｒ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｌａｎｔｓ  Ｒｅｓ．６（１７）：４３３２−４３３８，２０１１］。更に、３４種類の芳香植物に由来する植物精油のＣＢＭに対する有効性が調べられている［Ｐｏｕｖｏｖａ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｚｅｍｄｉｒｂｙｓｔｅ−Ａｇｒｕｃｙｋｔｙｒｅ  ９５（３）：４４０−４４６，２００８］。
【００１１】
近年、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＬＢＵＭ３００によるＤＡＰＧ及びＨＣＮの同時産生が、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓにより生じるトマト潰瘍病の生物学的防除に有益であることが見出された［Ｌａｎｔｅｉｇｎｅ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．１０２（１０）：９６７−７３，２０１２］。
【００１２】
更に、ロックウール栽培した温室トマトにおけるＣＢＭの生物学的防除の試みが報告されている。具体的には、２又は３年経ったロックウール平板にＣＢＭ細菌で枯死した植物を人為的に接種すると、植物の枯死率が下がる［Ｓｌｕｓａｒｓｋｉ  Ｃ．Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  Ｃｒｏｐ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ６９：１２５−１３４  ２００８］。
【発明の概要】
【００１３】
植物病の生物学的防除は一般的に、病原体に対する拮抗活性を示す１又は複数の生物の適用による病原体の抑制として定義される。アンタゴニストとして作用する生物は、生物学的防除剤（ＢＣＡ）と見なされ、拮抗作用の機序は、ＢＣＡの種々の生物学的特性に基づく。これらには、抗生物質化合物の産生、病原体の細胞成分の分解を触媒する酵素の発現、空間及び栄養の競合、病原体に寄生する能力、並びに植物防御の誘導が含まれる。
【００１４】
本開示は、微生物感染症に対する作物の生物的防御のため及びそのような感染症の発生を防止するためのすぐに使えるパッケージを提供することを目的とする。以下の説明から明らかなように、長期貯蔵中に生物的防除成分が互いから隔離されており、必要に応じて予め決められた濃度で容易に混合される、パッケージ成分による環境汚染のリスクがないパッケージが提供される。このパッケージ構成により、成分の化学的安定性が確保されること、すなわち長期貯蔵後にダメージがないことが見出された。
【００１５】
したがって、その第１の態様で、本開示は、
・少なくとも１つの天然油を含む粒子状物質を含む少なくとも１つの第１の成分；
・病原性微生物の少なくとも１つのアンタゴニストを含む少なくとも１つの第２の成分；
を含み、少なくとも１つの第１の成分及び少なくとも１つの第２の成分が前記パッケージの別個のコンパートメントに含まれている、パッケージを提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、コンパートメントは、パッケージの一部を形成するキャリア要素内のウェルとして定義される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、パッケージは、
（ｉ）少なくとも１つの天然油を含む粒子状物質を含む第１の成分を保持している１又は複数の第１のウェル（コンパートメント）；
（ｉｉ）病原性微生物の少なくとも１つのアンタゴニストを含む第２の成分を保持している１又は複数の第２のウェル（コンパートメント）；
１又は複数の第１のウェル及び１又は複数の第２のウェルのそれぞれは、上部開口部と前記上部開口部から下向きに延びる凹みとを有し、ウェルは、ほぼ平面状のマトリックス中に一緒に保持されている；
（ｉｉｉ）１又は複数の第１のウェルの開口部をシールする第１のフィルム；及び
（ｉｖ）１又は複数の第２のウェルの開口部をシールする第２のフィルム
を含む。
【００１８】
その第２の態様では、抗細菌剤を用意する方法であって、少なくとも１つの天然油を担持している粒子状物質を含む１又は複数の第１の成分を病原性微生物の少なくとも１つのアンタゴニストを含む１又は複数の第２の成分と混合すること及びそのようにして得られた混合物（カクテル）にエマルションを形成させることを含む方法が提供される。このようにして形成されたエマルションは抗細菌活性を示す。本明細書に開示されている成分により調製されたエマルションは安定なエマルションであり、すなわち、少なくとも数時間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、更には２４時間まで、相分離が見られない。
【００１９】
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に開示されているパッケージを利用する。いくつかの実施形態では、パッケージの使用により、粒子状物質と、界面活性剤と、少なくとも１つの天然油と、植物病原体の少なくとも１つの拮抗細菌とを含む組成物又はエマルションが提供される。いくつかの実施形態では、アンタゴニストは唯一の炭素源としてのゴマ油上で成長できるタイムのものである。
【００２０】
更なるその第３の態様では、本開示は植物の病原体感染症を処理又は防止する方法であって、粒子状物質と、少なくとも１つの天然油と、感染症を引き起こす病原体の少なくとも１つのアンタゴニストとを含むエマルションを前記植物に適用することを含む方法を提供する。
【００２１】
その第４の態様では、本開示は、ＣＢＳ−ＫＮＡＷ研究所に代表サンプルが寄託された、ＣＢＳ１３３２５２、ＣＢＳ１３３２５４、ＣＢＳ１３３２５５、ＣＢＳ１３３２５６、ＣＢＳ１３３２５７、ＣＢＳ１３３２５８、ＣＢＳ１３３２５９、ＣＢＳ１３４５６６、ＣＢＳ１３４５６７、及びＣＢＳ１３４５６８からなる群から選択されるアクセッション番号を有する、単離された拮抗細菌を提供する。いくつかの実施形態では、これらの拮抗細菌は、病原体により誘発される感染症に対する植物の保護又は処理において使用されるものである。
【００２２】
本明細書に開示されている主題を更に深く理解するため及びそれがどのように実施され得るかを例示するために、単に非限定的な例として、添付の図面を参照して以下に実施形態を記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の一実施形態に係るパッケージの一部を形成するキャリア要素を種々の視点から示す図であり、図１Ａは等尺図を示しており、図１Ｂは平面図を示しており、図１Ｃ及び１Ｄは、図１ＢのＸ側及びＹ側からの図を示している。
【図２】本発明の一実施形態に係る、キャリア要素の種々のウェルをシールするフィルムを含む、図１Ａ〜１Ｄに係るキャリア要素の図を示している。
【図３】本発明の一実施形態に係るキャリア要素を種々の視点から示す図であり、図３Ａは、等尺図を示しており、図３Ｂは平面図を示しており、図３Ｃ、３Ｄ、及び３Ｅは図３ＢのＺ、Ｘ、及びＹ側からの図を示している。
【図４】対照（図４Ｃ）と比べた、ＣＢＭ（図４Ａ）及びＸａｎｔｈｒｏｍｏｎａｓ（図４Ｂ）の成長に対する２つの選択されたアンタゴニストの効果を示す図である。
【図５】拮抗細菌有り又は無しの、植物病原体を用いて処理した後の種々の病原体のペトリ皿を示す図である。
【図６】Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ（ＣＢＭ）に曝露した後のトマト植物の枯死率を示すグラフであり、ＣＢＭ接種前に植物を本開示のいくつかの実施形態に係る組合せ又は対照で処理した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、長期貯蔵に適したパッケージを提供すること及び、必要に応じて、作物保護等の種々の用途のための抗微生物組成物を調製するための安全且つ容易な方法を提供することを目的とする。そのために、各ウェル又はウェルのセットが異なる成分を担持する、２個（又はそれ以上）のウェル又はウェルのセットを有するパッケージを開発した。パッケージは、以下に更に説明されるように、とりわけコンパートメント中の物質の種々の物理的及び化学的特徴のために、２個（又はそれ以上）のウェルが別個に且つ異なってシールされるように構成されている。
【００２５】
一般的に、パッケージは、
・少なくとも１つの天然油を含む粒子状物質を含む少なくとも１つの第１の成分；
・病原性微生物のアンタゴニストを含む少なくとも１つの第２の成分
を含み、少なくとも１つの第１の成分及び少なくとも１つの第２の成分は、前記パッケージの別個のコンパートメントに含まれる。言い換えると、キットがシールされている限り、２つの成分は混ざらない又は互いに接触しない。
【００２６】
第１及び第２の成分の混合（すなわち２つの成分をそれらの別個のコンパートメントから取り出した）後、処理又は保護される対象の作物への適用に適した安定なエマルションが得られる。エマルションは微細液滴の形態で適用される。
【００２７】
本開示の文脈において、「粒子状物質（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｍａｔｔｅｒ）」という用語は、複数の粒子の形態である物質を意味して使用される。粒子は任意の粒子形態であり得、そのような粒子形態としては精密に丸められた（ｆｉｎｅｌｙ  ｒｏｕｎｄｅｄ）ビーズからアモルファス構造までが含まれるが、これらに限定されない。粒子状物質は任意の形態の粉末を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、粒子状物質は、二酸化シリカ（ＳｉＯ２、本明細書中では短くシリカと呼ぶ）を含む。シリカは、ベントナイトクレイビーズ等の天然シリカ粒子及び合成シリカビーズであり得る。
【００２９】
いくつかの実施形態では、粒子状物質は合成シリカ粒子を含む。種々の合成シリカ粒子が本開示の文脈で使用され得る。例えば、粒子状物質は、市販製品であるＴｉｘｏｓｉｌ及びＡｅｒｏｓｉｌ  ２００等の沈降合成アモルファスシリカビーズを含み得る。
【００３０】
いくつかの別の実施形態では、粒子状物質は、天然油を吸収する能力を有する合成又は天然由来ビーズを含む。そのようなビーズとしては、限定されるものではないが、ラテックスビーズ；炭酸カルシウム吸着剤粒子；セルロースビーズ；ポリスチレン吸着剤ビーズ、例えば、疎水性架橋ポリスチレンコポリマー吸収樹脂であるＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ（登録商標）−２；木炭；セファロース（商標）ビーズ；エマルサン−アルギン酸ビーズ；キトサンビーズ；アルギン酸ナトリウム；スチレン−マレイン酸コポリマービーズ；及びスチレン−ジビニルベンゼンビーズ；セルロース紙ビーズ（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｐａｐｅｒ  ｂｅａｄｓ）が含まれ得る。
【００３１】
いくつかの実施形態では、最終エマルションの良好な分布が可能になるように、粒子状物質（粒子）は１０〜２５μｍのサイズ分布を有する。
【００３２】
粒子状物質は更に、限定されるものではないが、いくつかの実施形態では４００〜５００ｍ２Ｎ２／ｇの、表面積、及び３００〜３５０ＤＢＰ／１００グラム粒子の油容量、の１又は複数を特徴とし得る。
【００３３】
第１の成分は、天然油の１つ又は組合せを保持する粒子状物質を含む。本開示の文脈では、「天然油」は自然から得られるあらゆる有機油を包含すると理解される。
【００３４】
天然油は好ましくは植物に由来する油である。いくつかの実施形態では、天然油は精油として知られる。精油は好ましくは抗微生物（例えば、抗細菌、抗真菌、抗線虫）特性を示すことが知られているものである。
【００３５】
抗微生物特性と言う場合、以下に更に説明されるように、これは任意の病原性微生物に対して有効であると理解される。
【００３６】
それに限定されるものではないが、本開示に従って使用される精油は、植物Ｏｒｉｇａｎｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ及びＯｒｉｇａｎｕｍ  ｓｐｐ．（例えば、オレガノ）、Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｐ．（ミント）、Ｔｈｙｍｕｓ  ｓｐｐ．（タイム）、Ｍｙｒｔｕｓ  ｓｐｐ．、Ｏｃｉｍｕｎ  ｓｐｐ．（例えば、バジルとしても知られるＯｃｉｍｕｎ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）、Ｌａｖａｎｄｕｌａ  ｓｐｐ．（例えば、ラベンダー）、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｃｏｒｉａｎｄｕｍ  ｓｐｐ．（例えば、コリアンダー／パセリ）、Ａｌｏｙｓｉａ  ｓｐｐ．、Ｍｅｌｉｓｓａ  ｓｐｐ．、Ｓａｌｖｉａ  ｓｐｐ．、Ｐｅｔｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｓｐｐ．、Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｓｐｐ．（例えば、ローズマリー）、Ｐｒｕｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｃｕｍｉｎｕｍ  ｓｐｐ（例えば、クミン）に由来するものであり得る。
【００３７】
いくつかの別の実施形態では、天然油は、拮抗微生物の炭素源として、例えば食物／栄養分として用いられる植物由来油である。これらを本明細書中では「炭素ベース油（ｃａｒｂｏｎ−ｂａｓｅ  ｏｉｌ）」又は「炭素に富む栄養油（ｃａｒｂｏｎ−ｒｉｃｈ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｏｉｌ）」と呼ぶ。いくつかの実施形態では、炭素ベース油は植物油である。炭素ベース油は、ゴマ油、オリーブ油、ピーナッツ油、綿実油、大豆油、パーム油（ｐａｌｍ  ｏｉｌ）、ひまわり油、ベニバナ油、キャノーラ油、ひまし油、ヤシ油（ｃｏｃｏｎｕｔ  ｏｉｌ）、落花生油からなる群から選択されるが、これに限定されない。
【００３８】
いくつかの実施形態では、「天然油」という用語は、複数で使用される場合、どちらも天然源のものである少なくとも１つの精油及び少なくとも１つの炭素ベース油の組合せを包含する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、天然油は、少なくとも１つの炭素ベース油と組み合わせた少なくともオレガノ油を含む。オレガノ油は、少なくともゴマ油と組み合わされることもある。
【００４０】
予期せずして、ゴマ油等の炭素ベース油上での成長能力により、拮抗細菌を少なくともＣＢＭに対する拮抗活性を示さない他の細菌から区別できることが見出された。一実施形態では、全ての拮抗細菌が成長する（一方、調べた非拮抗細菌は成長しない）炭素ベース油はゴマ油である。
【００４１】
第１の成分内の（例えば、粒子状物質に保持されている）天然油の量は、使用される天然油の種類、ローディング時の量、粒子状物質の種類、粒子状物質上に天然油をローディングする条件、ローディングに用いられる界面活性剤又は溶媒等に応じて変わり得る。
【００４２】
粒子状物質上への油のローディングと言う場合、油と粒子状物質（例えば、シリカ粒子）との間の任意の形態の会合を意味すると理解される。それに限定されるものではないが、油は、粒子上及び／又は中への吸収により粒子状物質によって保持される。粒子と油との間の会合は可逆的であり、すなわち、好適な条件下（水と接触させる等）で、油は容易に粒子から放出されてエマルションを形成する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、粒子状物質は、粒子状物質の総重量（ローディング後）の２０〜５０ｗ／ｗ％の天然油を保持する。これは、以下にも例示されているように、ＨＰＬＣ又はＧＣクロマトグラフィー等の従来技術によって測定される。いくつかの別の実施形態では、粒子状物質は約３０ｗ／ｗ％の天然油（「約」は、２５〜３５％、場合によっては２８％〜３２％、又はおよそ３０％を包含する）を保持する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、天然油は、精油のみ又は少なくとも１つの精油と少なくとも１つの炭素ベース油との組合せのいずれかを含む。したがって、天然油と言う場合、精油及び炭素ベース油を包含するものと理解される。少なくとも１つの精油及び少なくとも１つの炭素ベース油の比率は６０：４０〜１００：０の範囲であり、場合により範囲は約８０：２０である。
【００４５】
油の組合せを用いる場合、それらは粒子状物質上に一緒に吸収されてよく、すなわち、同じ粒子状物質が２種以上の油を保持していると理解される。いくつかの実施形態では、扱い易いように、粒子状物質が保持している油の種類によってそれぞれが特徴付けられる異なる種類の粒子状物質が形成されるように、各種油が粒子状物質上に別個に保持される。
【００４６】
したがって、オレガノ及びゴマを８０：２０の比率で提供する特定の物質に言及する場合、８０％がオレガノ油を担持して２０％がゴマ油を担持する２つの粒子状物質集団の混合物又は各粒子に２つの油が決められた又は所望の比率で吸収されている単一の粒子集団（すなわち、油を事前に混合した後、吸収キャリア／粒子に接触させる）と理解される。油の種類に関わらず、粒子状物質の総重量の２０〜５０ｗ／ｗ％が、それにローディングされた油によるものである。
【００４７】
粒子状物質は少なくとも１つの界面活性剤を含み得る。理解されているように、界面活性剤は、液体の表面張力及びしたがって２つの液体間の界面張力を低下させて例えばエマルションの形成を可能にする化合物である。界面活性剤は、使用が安全である（例えば、植物又は動物にとって非毒性）と当該技術分野で知られている任意の種類のもの、例えばイオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、及び双性イオン性（又は非イオン性）界面活性剤であり得る。
【００４８】
いくつかの実施形態では、界面活性剤は、有機農業において許容される種類のものである。本開示に従って使用可能な界面活性剤の非限定的なリストとしては、ポリエチレングリコールトリオレイン酸ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ、例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８５、Ｔｗｅｅｎ  ６５）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、Ｓｐａｎ  ４０）が含まれる。
【００４９】
いくつかの別の実施形態では、界面活性剤は脂肪酸の塩を含む。塩は、アルカリ塩、例えばカリウム、カルシウム、ナトリウム塩、及びアンモニウム塩を含み得る。
【００５０】
いくつかの実施形態では、脂肪酸の塩は、脂肪酸のカリウム塩（石けん塩（ｓｏａｐ  ｓａｌｔ）としても知られる）を含み、これは殺虫剤、除草剤、殺真菌剤、及び／又はアルジサイドとして用いられることもある。いくつかの実施形態では、脂肪酸のカリウム塩は、動物性脂肪及び植物性脂肪中に見出されるような天然脂肪酸に水酸化カリウムを加えることにより得ることができる。脂肪酸は、オリーブ、綿実、大豆、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、ナタネ、ゴマ油、アマランス（Ａｍａｒａｎｔｈ）、トウモロコシ、ジャトロファ属から抽出され得る。
【００５１】
界面活性剤を形成する脂肪酸は、合成脂肪酸及び半合成（例えば、修飾を受けた天然脂肪酸）であってもよい。
【００５２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの界面活性剤は、殺虫剤及び／又は殺真菌剤の活性を有するとして認識又はラベルされているものである。殺虫性及び／又は殺真菌性の界面活性剤としては、どちらもイスラエルのＺｏｈａｒ  Ｄａｌｉａ社により製造されている市販製品Ｚｏｈａｒ  ＰＴ−５０及びＺｏｈａｒ  ＬＱ−２１５が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
特定の一実施形態では、界面活性剤はＺｏｈａｒ  ＰＴ−５０及びＺｏｈａｒ  ＬＱ−２１５から選択される。
【００５４】
これらの界面活性剤の組成はＺｏｈａｒ  Ｄａｌｉａ社から入手可能である。例えば、Ｚｏｈａｒ  ＰＴ−５０は以下の組成であることが知られている：
【００５５】
0006306687.tif 000002
0006306687.tif 000003
【００５６】
本明細書に記載の結果は、本明細書に開示の脂肪酸の塩が、粉末の安定性及び／又は乳化特性、並びに抗微生物活性の点で、市販されている公知のＴｗｅｅｎ  ２０又はＴｗｅｅｎ  ８０等の他の公知の界面活性剤を超える幾分の利点を有していたことを示している。
【００５７】
第１の成分中の界面活性剤の量は異なり得る。しかし、いくつかの実施形態では、粒子状物質は５〜１０ｗ／ｗ％の界面活性剤又は界面活性剤の組合せを含む。
【００５８】
粒子状物質を含む第１の成分は本質的に乾燥形態である。「本質的に乾燥」と言う場合、第１の成分が少量の水、いくつかの実施形態では１０％（ｗ／ｗ）以下の水を含み得ると理解される。いくつかの他の又は更なる実施形態では、第１の成分中の水分は１〜７％（ｗ／ｗ）の範囲内である。いくつかの更に別の実施形態では、「本質的に乾燥」とは、従来の方法で水が検出されない（すなわち、検出可能な量の水がない）ことを包含すると理解される。
【００５９】
第１の成分は更に、いくらかの微量の有機溶媒を含み得る。以下に更に説明されるように、粒子状物質の調製に溶媒が必要な場合があり、溶媒が毒性でない限り、幾分の残留量が残ってもよい。いくつかの実施形態では、第１の成分は溶媒を含まない（すなわち、検出可能な量の有機溶媒を含まない）か、微量、すなわち５、４、３、又は２ｗ／ｗ％以下の有機溶媒を含む。溶媒は通常、有機揮発性極性溶媒、限定されるものではないが例えば、アセトン、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、エタノール、及びメタノールからなる群から選択される溶媒である。
【００６０】
いくつかの実施形態では、微量のアルコールが第１の成分中に検出される。
【００６１】
第１の成分の粒子状物質は、粒子状物質を水と接触させると安定なエマルションを形成できる点でユニークである。これはとりわけ、第１の成分中の界面活性剤の存在により実現される。界面活性剤は、成分を乾燥させる前に、油と共に粒子に加えられる。
【００６２】
本開示の文脈において、安定なエマルションと言う場合、これはエマルション形成後少なくとも１時間、場合によっては少なくとも２、３、４、５、１０、又は更には２４時間にわたる、水（分散媒）中への油（分散相）の分散を意味すると理解される。言い換えると、安定性は、油相及び水相への分離の欠如により決定される。分離の欠如は、目視検査を含む当該技術分野で公知の任意の手段によって決定され得る。
【００６３】
理論により限定されないが、本発明者らは、粒子状物質中への界面活性剤の取込みが、形成されるエマルションの安定性に寄与しているという立場である。これは、脂肪酸のカリウム塩の使用により安定性及び安全性の点で他の種類の市販の界面活性剤を超える利点が示された、本明細書中の以下に記載される非限定的な例からも明らかである。
【００６４】
エマルションを形成するために、粒子状物質を水と混合する。水の量は粒子状物質の量に依存する。いくつかの実施形態では、粒子状物質（その３０％が油）１グラムにつき、１リットルのエマルションが得られるように水を添加する。したがって、１リットルのエマルション中、０．１グラムの粒子物質は、０．０３ｖ／ｖ）％の油濃度となる。いくつかの実施形態では、最終エマルション中の油のパーセンテージは０．０３〜２ｖ／ｖ％である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、粒子状物質と水の混合により、液滴サイズが１〜２０μｍ、いくつかの実施形態では３〜１０μｍのエマルションが得られる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、エマルションは抗微生物エマルションである。
【００６７】
パッケージは、病原性微生物の少なくとも１つのアンタゴニストを含む第２の成分を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、病原性微生物の少なくとも１つのアンタゴニストは、ゲル又はゲル様のキャリア中に保持される。アンタゴニストを担持するためのゲル形態の形成に種々の材料を用いることができる。
【００６９】
例えば、ゲルは、多糖から又は多糖と他の物質との組合せから形成され得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ゲルは、当該技術分野で知られるように、寒天ゲル（寒天）グアーガム、ゼラチン、キサンタンガム、メチルセルロースゲル（セルロースガム）、ペクチンベースのゲル、ゼラチンゲル、及びその他からなる群から選択される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、第２の成分は寒天を含み、これにより微生物アンタゴニストを保持するゲルを形成する。
【００７２】
本開示の文脈において、病原性微生物のアンタゴニスト又は病原体アンタゴニストという場合、これは植物病原体（植物病原体は植物病原性物質ということもある）を阻害する生物学的実体と理解される。本開示の文脈において、阻害とは、病原体の成長を少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、又は更には病原体を本質的に排除することにより、低減させることと理解される。本発明の文脈において、植物病原体とは、任意の原核又は真核生物、限定されるものではないが例えば、細菌、真菌、原虫、線虫、又は任意の他の疾患の原因となる寄生虫であり得る。したがって、少なくとも１つのアンタゴニストの微生物活性は、抗細菌、抗真菌、抗原虫、抗線虫等のいずれかであり得る。
【００７３】
いくつかの実施形態では、第２の成分は少なくとも１つのアンタゴニストを含む。いくつかの別の実施形態では、第２の成分はアンタゴニストのカクテルを含む。カクテルとは、同じ又は異なる濃度で組み合わされた２以上の、場合により３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５のアンタゴニストの組合せと理解される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアンタゴニストは、以下の表３に示されるような唯一の炭素源としてのゴマ油上で成長できる種類のものである。そのようなアンタゴニストは、ゴマを唯一の炭素源として用いて従来の培養アッセイを行い、実験成長期間を生き延びた培養変種を同定することにより、容易に同定することができる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、アンタゴニストは、静菌性、すなわち生物の成長を遅らせるものとして言及され得、いくつかの別の実施形態では、アンタゴニストは殺菌性、すなわち生物を殺すものとして言及され得る。
【００７６】
いくつかの実施形態では、病原性微生物の少なくとも１つのアンタゴニストは、土壌アンタゴニスト（ｓｏｉｌ  ｂｏｒｎ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）である。この文脈では、少なくとも１つのアンタゴニストは、病原性微生物に対して耐性（例えば、一部抵抗性）又は抵抗性であることが示された植物の根、土壌、及び／又は根圏から獲得又は単離され得ると理解される。
【００７７】
いくつかの別の実施形態では、病原性微生物の少なくとも１つのアンタゴニストは、例えば葉、茎、花、維管束系等の植物部位から単離された、植物由来アンタゴニストである。
【００７８】
病原性微生物の少なくとも１つのアンタゴニストは、存在してよく、したがって、土壌に由来してもよく（すなわち、土壌性）、植物部位（例えば、維管束系）に由来してもよい。
【００７９】
いくつかの実施形態では、アンタゴニストは、トマト植物の感染症を生じさせる病原体のものである。
【００８０】
別のいくつかの実施形態では、アンタゴニストは、処理が望まれる病原体のものである。
【００８１】
第２の成分は１又は複数のアンタゴニストを含み得る。いくつかの実施形態では、第２の成分は、同じゲル中に複数のアンタゴニストの組合せを含む。しかし、いくつかの別の実施形態では、アンタゴニストの組合せが用いられる場合、それらはそれぞれ別個のゲルによって担持されて、使用前にのみ混合される。言い換えると、第２の成分は、各アンタゴニストが別個に維持されて、処理する病原体の種類に応じて植物の暴露前に組み合わされる、複数の「第２の成分」の組合せである。
【００８２】
アンタゴニストの組合せが用いられる場合、アンタゴニストは、同じ量（ＣＦＵ／ｍｌ）又は異なる量で植物に供給／適用され得る。
【００８３】
いくつかの実施形態では、第２の成分中のアンタゴニストの量（単一アンタゴニストとして又はアンタゴニストのカクテルとして）は５００〜５，０００ＣＦＵ／ｍｌであり得る。カクテルとして用いられる場合、アンタゴニストの比率は、処理する病原体の種類によって異なり得、通常の実験方法、例えば培養皿での最大の静菌／殺菌降下によって推測的（ａ  ｐｒｉｏｒｉ）に決定され得る。
【００８４】
アンタゴニストの種類は、パッケージによって処理される対象の病原体の種類によって決まる。
【００８５】
いくつかの更なる実施形態では、病原体は、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  Ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ（ＣＢＭ）である。この実施形態では、ＣＢＭに耐性を示したトマト植物から単離されたいくつかのアンタゴニストは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌａ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｄｒｉｎａ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５７）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐａｎｉｕｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５９）からなる非限定的な群から選択される。
【００８６】
その内容を参照により本明細書に援用するＲｅｐｏｒｔ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｎｏｘｉｏｕｓ  Ａｎｉｍａｌｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔｓ［Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｃ．Ｎｉｃｏｔ  ２０１１］の表４に記載されているような他のアンタゴニストが当該技術分野で公知である。
【００８７】
いくつかの別の実施形態では、他の植物のアンタゴニストが、本明細書に開示されているパッケージの第２の成分の一部を形成し得る。これらは、他の農作物、限定されるものではないが例えば、ナス科に由来するもの、例えばトマト、コショウ、ナス、ジャガイモ；ウリ科に由来するもの、例えばカボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、メロン、ヒョウタン（ｇｏｕｒｄ）、キュウリ、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）、ヘチマ（ｌｕｆｆ）、及びスイカを含み得るが、園芸の植物、木等を含む任意の他の種子植物も含み得る。パッケージは通常、第１の成分及び第２の成分を用いて植物に適用するエマルションを形成するための指示を含む。指示は、少なくとも第１の成分を第２の成分と、必要に応じて水を加えて、混合してエマルションを形成することを含む。いくつかの実施形態では、エマルション中の少なくとも１つのアンタゴニストの濃度は、最低１，０００ＣＦＵ／ｍｌ又は５００ＣＦＵ／ｍｌ〜５，０００ＣＦＵ／ｍｌである。
【００８８】
更に、アンタゴニストは種々の文献中に見出すことができ、そのような文献としては参照により本明細書に援用する以下のものが含まれるが、これらに限定されるものではない：
【００８９】
0006306687.tif 000004
0006306687.tif 000005
0006306687.tif 000006
0006306687.tif 000007
【００９０】
前述した通り、いくつかの実施形態では、アンタゴニストは、唯一の炭素源のゴマ油上で成長できる種類のものである。
【００９１】
場合により、エマルションを調製するために水が加えられてもよい。水を加える場合、水の量は第１の成分の量によって決まる。いくつかの実施形態では、第１の成分１グラム（例えば、その３０％が油）につき、１リットルのエマルションが得られるように水が加えられる。したがって、１リットルのエマルション中に０．１グラムの粒子状物質は０．０３ｖ／ｖ％の油濃度を与える。
【００９２】
いくつかの実施形態では、最終的なエマルション中の油のパーセンテージは０．０３〜２ｖ／ｖ％である。
【００９３】
上記に従い、２０グラムの第１の成分の粉末（３０％が油）及び１２０ｍｌの第２の成分のアンタゴニストゲルを含むパッケージによって最終製剤が提供され得、指示は、第１の成分と第２の成分を水と混合して０．３ｖ／ｖ％の油を含む２０リットルのエマルションを形成することを含み得る。
【００９４】
同様に、パッケージは、５０グラム又は１００グラムの第１の成分の粉末及び１２０ｍｌの第２の成分のアンタゴニストを含み得、指示は、第１の成分と第２の成分を水と混合して５０又は１００リットルのエマルションを形成することを含み得る。
【００９５】
いくつかの実施形態では、第２の成分は、各単位がゲル中に異なるアンタゴニストを担持する別個の単位でパッケージ中に提供される。例えば、合計１２０ｍｌのゲルを含むパッケージにおいて、ゲルは、各ゲル単位が同じ又は異なるアンタゴニストを担持する複数のゲル単位、例えばそれぞれ１５ｍｌの８個のゲルから構成され得る。これにより、使用するアンタゴニストの種類の選択及び必要に応じてカクテル中の組合せを変更することが可能になり、病原体のより良い生物的防除（ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ）が可能となる。
【００９６】
本開示のパッケージは、新規エマルションの準備に適している。この点で、本開示は更に、粒子状物質と、界面活性剤と、少なくとも１つの天然油と、少なくとも１つの細菌アンタゴニスト（全て本明細書中でパッケージの成分として定義された通り）とを含むエマルションであって、少なくとも１つのアンタゴニストが唯一の炭素源としてのゴマ油上で成長する種類のものである、エマルションを提供する。
【００９７】
本明細書に開示されているパッケージは、植物における病原体感染症の防止又は処理における使用に特に適している。処理は、病原体成長阻害（静菌効果）及び病原体感染の完全排除（殺菌効果）を含み得る。
【００９８】
いくつかの実施形態では、処理又は防止は、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  Ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ（ＣＢＭ）によって引き起こされる感染症の処理又は防止である。
【００９９】
いくつかの実施形態では、処理又は防止は、ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａにより引き起こされる感染症の処理又は防止である。いくつかの別の実施形態では、処理又は防止はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｓにより引き起こされる感染症の処理又は防止である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、処理又は防止は、ナス科に属する植物、例えばトマト、コショウ、ナス、ジャガイモにおける感染症の処理又は防止である。一実施形態では、植物はトマト植物である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本開示に係るパッケージは、
・少なくとも１つの天然油を含む粒子状物質を含む少なくとも１つの第１の成分を担持するための１又は複数の第１のコンパートメント／ウェルと病原性微生物の少なくとも１つのアンタゴニストを含む少なくとも１つの第２の成分を担持するための１又は複数の第２のウェル／コンパートメントとを一緒に保持しているほぼ平面状のマトリックスを含むキャリア要素；１又は複数の第１のウェル及び１又は複数の第２のウェルのそれぞれは、上部開口部と上部開口部から下向きに延びる凹みとによって定義される；
・１又は複数の第１のウェルの開口部をシールしている第１のフィルム；及び
・１又は複数の第２のウェルの開口部をシールしている第２のフィルム
を含む。
【０１０２】
理解されるように、各ウェルは別個の実体であり、１個のウェルの内容物と他方との混合は、シーリングフィルムを開けた後にのみ可能である。
【０１０３】
キャリア要素の非限定的な例が、１個の第１のウェル１２０及び間隔を置いた複数の第２のウェル１３０を含む平面状マトリックス１１０を含む要素１００の等尺図（図１Ａ）並びに平面図及び側面図（図１Ｂ〜１Ｄ）を提供する図１Ａ〜１Ｄに示されている。この非限定的な例では、第１のウェル１２０が、平面状マトリックス１１０に設けられた窪み１４０に可逆的に取付け可能である。いくつかの別の実施形態では、取付け可能なウェル、例えばウェル１２０は、平面状マトリックス１１０の開口部（孔）内に嵌合し得る（図示せず）。あるいは、第１のウェルは、平面状マトリックス１１０の一体型部分（ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｐａｒｔ）として形成され得る（図示せず）。
【０１０４】
複数の第２のウェル１３０は、この特定の実施形態では、平面状マトリックス１１０の一体型部分として形成される。別の実施形態では、第２のウェル１３０のいずれも、第１のウェル１２０について図解されているように窪み１４０中に又は平面状マトリックス中に設けられた開口部中に可逆的に取付け可能である種類のものであってもよい（図示せず）。この実施形態では、第１のウェル１２０は、事実上、使用前に平面状マトリックスの（保持ウェルの形態の）窪みから取り外すことができる一種のカップである。
【０１０５】
キャリア要素１００は、ハンドルの形態である握持ユニット（ｇｒｉｐｐｉｎｇ  ｕｎｉｔ）１５０も含む。握持ユニットは、第１及び第２のウェルの内容物を放出させるためにパッケージからシーリングフィルムを剥がして除去する時にキャリア要素を安定的にしっかりと保持し易いように、他の形態及び形状であってもよい。
【０１０６】
この非限定的な実施形態によれば、拮抗細菌を保持するように構成された第１のウェル１１０の内径Ａは８０〜３００ｍｍ、場合により１００〜２００ｍｍ、又は１２０〜１５０ｍｍであり得る。同じ又は異なる細菌アンタゴニストを保持するように構成された第２のウェル１３０の内径Ｂは、２０〜４０ｍｍ、場合により２５〜３５ｍｍである。ウェルの深さは通常２０〜６０ｍｍ、場合により２０〜３０ｍｍである。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、パッケージの総寸法は、長さ５００〜５５０ｍｍ、幅３０〜４０ｍｍである。
【０１０８】
図１Ｂの図である図１Ｃには、第１のウェル１２０を保持するための窪み（凹み又は保持ウェル）１４０も示されており、窪み１４０は、キャリア要素の上側１６０に関して下向きに延びている。図１Ｄは、図１ＢのＹ側から見た、要素１００のもう１つの図である。
【０１０９】
第１のフィルム及び第２のフィルムは、それぞれ第１のウェル及び第２のウェルをそれぞれ別個に覆ってシールしてよい。いくつかの実施形態では、図２Ａ及び２Ｂにも示されるように、図１Ａ〜１Ｄに示されるキャリア要素１００は、第１のウェル１２０の開口部を部分的に覆う第１のフィルム１７０及び第１のフィルム１７０に重ねられて第２のウェル１３０を覆う（シールする）第２のフィルム１８０と組み合わされる。第１のフィルム１７０及び第２のフィルム１８０は、第２のフィルム１８０を引き剥がした時に第１のフィルム１７０も剥がれるように互いにしっかりと付着していてよく、これにより、第１のウェル１２０及び第２のウェル１３０をほぼ同時に開けることができる。しかし、同様に、第１のウェル１２０及び第２のウェルを独立して開けられるように、第１のフィルム１７０は第２のフィルム１８０とは別個であってもよい。
【０１１０】
ここで図３Ａ〜３Ｅを見ると、本開示の別の実施形態に係るパッケージで使用するための要素が示されている。したがって、単純にするために、図１Ａ〜１Ｄで使用したのと同様な参照符号を１００ずらして用いることにより図３Ａ〜３Ｅ中の同様な機能を有する構成要素を示す。例えば、図１Ａの構成要素１１０は図２Ａのウェル２１０と同じ機能を有するウェルである。
【０１１１】
具体的には、図２Ａは等尺図であり、図３Ｂは平面図、図３Ｃ〜３Ｅは要素２００のＺ、Ｘ、及びＹ側からの側面図であり、要素２００は、全体的に長方形（矩形）の形状であり、平面状マトリックス２１０は、平面状マトリックス２１０に設けられた窪み２４０に可逆的に取付け可能な１個の第１のウェル及び複数の間隔を開けた第２のウェル２３０を含む。この非限定的な実施形態では、第１のウェル２２０及び第２のウェル２３０は多角形の形状であり、この特定の実施形態では四辺形である。
【０１１２】
更に、この非限定的な実施形態では、第２のウェル２３０がキャリア要素２００の一体化された部分として示されているが、これは、図１Ａの非限定的な例に示されているのと同様に取り外し可能であってよい。
【０１１３】
この実施形態に係るキャリア要素の寸法は、要素１００に関して述べられたものと異なってよく、この特定の実施形態では、総寸法は、長さ２００〜３００ｍｍ、幅１５０〜２５０ｍｍであり得、ウェルはより深くても、すなわち深さが５０〜６０ｍｍであってもよい。
【０１１４】
理解されるように、キャリア要素の寸法及び特にそれにより提供されるウェルの寸法は、パッケージの具体的な用途及びそれによって担持される材料に応じて変わり得る。当業者には、キャリアを具体的な用途に合わせるために寸法に必要な調節が容易に理解される。
【０１１５】
上記に詳説したように、本開示に係るパッケージの第１のウェルは、油を含む組成物を保持する。したがって、少なくとも１又は複数の第１のウェルが、油適合性ポリマーから形成される。油適合性ポリマーと言う場合、不活性であり、天然油を含む複合材料の特性を変化させないポリマーを意味すると理解される。同じ理由で、第１のウェルを覆う第１のフィルムは油適合性ポリマーで構成される。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、それぞれの第１のウェルの第１のフィルムは、油適合性熱可塑性ポリマーであるか、それを含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、乾燥形態の複合材料を維持する必要がある。そのために、第１のフィルムは流体不透過性ポリマーである。これは当該技術分野でハイバリア（ＨＢ）フィルムと呼ばれる。ＨＢフィルムは３〜４ｇ／ｍ３／２４ｈｒのＨ２Ｏ透過性及び６〜８ｃｍ３／ｍ２／２４ｈｒのＯ２透過性により定義することができる。
【０１１８】
第１のフィルムを形成し得るＨＢポリマーのいくつかの非限定的な例としては、ポリオレフィン、ポリビニル、ポリエステルのいずれかに由来するものが挙げられる。
【０１１９】
ＨＢフィルムは典型的にはキャリアから容易に剥がすことができる種類のものである。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、第１のシーリングフィルムは、厚さが４０〜１００μｍ、場合により６０〜８０μｍのラミネートである。
【０１２１】
１又は複数の第２のウェルについて、いくつかの実施形態では、第２のウェルは生き物を担持するので、これらの第２のウェルのシーリングフィルム、すなわち第２のフィルムはガス透過性であることが望ましい。いくつかの実施形態では、第２のフィルムは、酸素又は酸素含有ガスに対して透過性である。そのために、第２のフィルムは、Ｈ２Ｏに対する透過性が８〜１０ｇ／ｍ３／２４ｈｒ、Ｏ２に対する透過性が約１，２００ｃｍ３／ｍ２／２４ｈｒであり得る。
【０１２２】
第１及び第２のフィルムは、二軸延伸ポリエチレンテレフタラート（ＢＯＰＥＴ）、二軸延伸ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）、ポリ塩化ビニリデン（ＰＶＤＣ）、ポリエチレン  ポリプロピレン、ポリビニルアルコールからなる群から選択される単一のポリマー又はポリマーのブレンドを含む熱可塑性フィルムで構成され得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、フィルムは二軸延伸ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）を含む。いくつかの別の実施形態では、フィルムは、ＢＯＰＰと、ポリエチレン（ＰＥ）等の別のポリマーとのラミネートである。ラミネートは、２、３の更なるラミネート層を含み得る。使用されるフィルムは、例えばＧｌｏｂ−Ｐｌａｓｔ社（イスラエル）から市販されており（Ｐｌａｓｔａｒｔ）、当該技術分野で広く使用されている。
【０１２４】
本開示は更に、植物における病原体感染症を処理又は防止するための組成物を提供する方法であって、少なくとも１つの天然油を含む粒子状物質を含む第１の成分を病原性微生物の少なくとも１つのアンタゴニストを含む第２の成分と混合すること及び前記混合物にエマルションを形成させることを含む、方法を提供する。得られたエマルションを本明細書中では抗微生物（例えば、殺菌、殺真菌等）有効エマルションということがある。
【０１２５】
この方法の態様では、第１の成分及び第２の成分は本明細書で定義される通りである。
【０１２６】
混合は、エマルションを形成させるために水の添加を必要とすることもある。いくつかの実施形態では、混合により、液滴サイズが１〜２０μｍ、いくつかの実施形態では３〜１０μｍのエマルションが得られる。
【０１２７】
本開示は更に、植物における病原体感染症を処理又は防止する方法であって、粒子状物質と、少なくとも１つの天然油と、病原性微生物の少なくとも１つのアンタゴニストとを含むエマルションを前記植物に適用することを含む方法を提供する。本開示のこの態様では、エマルションは、好ましくは適用の直前に、本明細書で定義される第１の成分と第２の成分を混合することにより得られる。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、処理又は防止の方法は、エマルションを植物上に適用することを含む。エマルションの適用は、農学分野で公知の任意の手段によってよく、そのような手段としては植物への噴霧、灌水が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２９】
いくつかの更に別の実施形態では、処理又は防止は、ジャガイモ塊茎の噴霧等の植物塊茎への適用（塊茎の低噴霧（ｌｏｗ  ｓｐｒａｙｉｎｇ）と呼ばれることもある）を含み得る。
【０１３０】
エマルションは、抗微生物効果を得るために１回又は２回以上植物に適用され得る。２回以上適用される場合、投薬は、適用間に１日間隔から１日を超える（２、３、及びそれ以上の日数の）間隔の時間間隔を置いて与えられ得る。異なる投薬は、アンタゴニストの量、天然油の量、又は両方が同じであってもよく、異なってもよく、与えられるアンタゴニスト及び／又は天然油の種類も同じであってもよく、異なってもよい。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、２回以上適用される場合、種々の適用は、２〜１０日、場合により３〜８日の間隔である。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、少なくとも２、３、４、場合により少なくとも５回分の本開示に係るエマルションが植物に与えられる。
【０１３３】
処理の頻度及び用量は感染症の種類（例えば、それがどれだけ激しい／有害／命を脅かすか）、既に発症している場合の感染症の重症度、環境条件等によって決まる。農学に精通している者は、一般に用いられるパラメーターに基づいて処理スケジュールを決定することができる。
【０１３４】
感染症の発症を防止するために、いくつかの実施形態では、植物の植付け日から又は感染が疑われた最初の日からエマルションを植物に適用することが必要である。
【０１３５】
感染症を処理するために、いくつかの実施形態では、疑われる感染症の検出日から植物にエマルションを適用する必要がある。
【０１３６】
本開示は更に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌａ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｄｒｉｎａ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５７）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３４５６８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐａｎｉｕｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３３２５９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ（アクセッション番号ＣＢＳ１３４５６６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｈｉｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３４５６７）、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（アクセッション番号ＣＢＳ１３４５６８）からなる群から選択される単離された拮抗細菌を提供する。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、単離された拮抗細菌はキャリア内にある。いくつかの実施形態では、キャリアは上記で定義したようにゲル又はゲル様のキャリアである。
【０１３８】
単離された細菌には種々の用途がある。いくつかの実施形態では、単離された細菌は、単独で又は細菌カクテルとして、上記に開示したような病原体により引き起こされる疾患に対して植物を処理又は保護するために用いることができる。以下に本発明を実施するためのいくつかの非限定的な例を示す。示されているように、植物病を防除するための製剤、油成分、並びにゴマ油又はその代替物とオレガノ油及びその代替物との間の比率はほぼ一定（１：０．２５％（ｗ／ｗ）比のオレガノ油：ゴマ油）であるが、油製剤に補われるその他のものの量は、植物、有害生物、及び環境条件によって変わる。可能性のある細菌のうちの少なくとも１つの拮抗細菌が植物病を防除するために油製剤と組み合わせて用いられる。
【実施例】
【０１３９】
非限定的な実施例の説明
実験は３つの部分からなる：（ｉ）病原体及び潜在的アンタゴニストの単離及び増殖；（ｉｉ）Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ（ＣＢＭ）に対する潜在的アンタゴニストのインビトロスクリーニング；及び（ｉｉｉ）トマト青枯病の防除についての選択されたアンタゴニストのインビボ評価。
【０１４０】
病原体及び潜在的拮抗細菌株の単離
トマト植物（Ｄａｎｉｅｌａ；イスラエル、Ｈａｚｅｒａ）を、点滴灌漑システムを備えた各苗床上で植物２列にして温室で育てた。苗木を１メートルの列当たり約３植物で植え、ダッチ（Ｄｕｔｃｈ（Ｈｏｌｌａｎｄ））法に従って培養した。ＣＢＭによる感染症の発症についてこの小区画を監視した。感染後、感染症を生き延びた植物を同定し、根の部分、土壌（深さ３０ｃｍ）、及び根圏を含むサンプルを滅菌バッグに取り、実験室に運んだ。
【０１４１】
実験室で、根の部分、土壌、及び根圏をそれぞれが含む１０グラムのサンプルを、９０ｍｌの寒天液０．１ｗ／ｖ％（再蒸留水（ＤＤＷ）で希釈し、密封し、オートクレーブを用いて１２１℃、１ａｔｍ、２０分間滅菌した）を含むストマッカーバッグに入れた。滅菌後、サンプルを速度２０ｒｐｍ、室温で２時間振盪した。その後、バッグを中速で１分間ストマッカーデバイスに移した。
【０１４２】
サンプルをストマックした後、各バッグを無菌のはさみで開封し、それぞれ９ｍｌの寒天液（０．１ｗ／ｖ％）を含む無菌チューブ中にサンプルの種々の希釈物を調製した。最初の希釈は、１ｍｌのサンプルを９ｍｌの寒天中に入れ（×１０−２希釈）、×１０−８希釈まで続けた。
【０１４３】
各希釈サンプルから、１００μｌを、以下の寒天：ジャガイモデキストロース寒天（ＰＤＡ、ディフコ社）、栄養寒天、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｇａｒ  Ｆ（ディフコ社）のいずれかから選択される培地を補ったペトリ皿に移し、インキュベーター（２８℃）中で５日間インキュベートした。目的のコロニーのものに印を付け、細菌用の針を用いて新鮮な培地（単離前の成長に用いたのと同じ）に移して、単一種類の単離された潜在的アンタゴニストの微生物コロニーを得た。
【０１４４】
単離されたアンタゴニストの増殖
拮抗効果を有すると思われる微生物コロニーを、層流フード（ｌａｍｉｎａｒ  ｆｌｏｗ  ｈｏｏｄ）下で寒天プレート上で成長している微生物から精製し、三角フラスコを用いて、ペプトン（１０グラム／リットル）、酵母抽出物（２０グラム／リットル）、グリセロール（１０グラム／リットル）、ＭｇＳ０４（０．１グラム／リットル）、ＣａＣＯ３（２グラム／リットル）を含む培養液中で再度培養した。各フラスコに１個の単離されたコロニーを入れて純粋なアンタゴニストとして培養し、各フラスコをプラスチック製のキャップで覆い、１２１℃で２０分間オートクレーブを用いて滅菌し、室温に１日置いた。
【０１４５】
ＣＢＭ及び／又はＸａｎｔｈｒｏｍｏｎａｓの効果的アンタゴニストのスクリーニング
拮抗活性を示した培養液を、細菌用の針を用いて、０．１％酵母抽出物と１％グリセロールとを補ったＮＡ培地（栄養寒天培地）を含むペトリ皿に疑われるアンタゴニストのそれぞれを移すことにより、病原体の効果的なインビトロ抑制についてスクリーニングした。細菌を皿上に直線状に置いた後、皿を２８℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション時間後、細菌線に対して垂直な想像線上にＣＢＭ病原体を播種し、皿をインキュベーションに更に３日間戻した。細菌が拮抗活性を示し、インキュベーション中に細菌線と病原体線との間にギャップが形成された場合、より大きなギャップが形成されたものを潜在的アンタゴニストとして選択した。オランダ微生物株保存センター（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｒｏｙａｌ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ａｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＢＳ−ＫＮＡＷ）によりこれらを更に特定した。
【０１４６】
表１はＣＢＳ−ＫＮＡＷ研究所に２０１２年１１月１９日に寄託され、最終的な組合せ／カクテルに用いた種のリストを示している。種は、グリセロール溶液（１５％）中で−８０で保存した。
【０１４７】
0006306687.tif 000008
【０１４８】
更に、図４Ａ〜４Ｃは、同じ拮抗細菌のソースから単離した非拮抗細菌であってゴマ油を含まない培地上で成長させた対照の効果（対照細菌、図４Ｃ）と比較した、ＣＢＭ及びＸａｎｔｈｒｏｍｏｎａｓ（プレート上の２つの別個の拡散（ｓｐｒｅａｄ）／線）の成長に対するアンタゴニストＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｄｒｉｎａ（ＣＢＳ１３３３２５６、「ＡＮ４」）（図４Ａ）及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（ＣＢＳ１３３３２５８、「ＡＮ１９」）（図４Ｂ）の効果を示している。具体的には、図４Ａ及び図４Ｂ中、ＣＢＭ及びＸａｎｔｈｒｏｍｏｎａｓの病原体の拡散が拮抗線に向かって成長できなかった非成長ゾーンが示されている。対照の図４Ｃでは、ＣＢＭ及びＸａｎｔｈｒｏｍｏｎａｓの病原体拡散が対照細菌線まで到達した。これらの結果は、ＡＮ４及びＡＮ１９が少なくともＣＢＭ及びＸａｎｔｈｒｏｍｏｎａｓに対する拮抗活性を有することを示している。
【０１４９】
表１の拮抗細菌のリストに載せた単離された各細菌について同じ実験を行った。
【０１５０】
拮抗微生物ゲルの調製
単離されたアンタゴニストを別個に、増殖に用いた培地（０．１５％粒状寒天（ディフコ社）を補ったペプトン（１０グラム／リットル）、酵母抽出物（２０グラム／リットル）、グリセロール（１０グラム／リットル）、ＭｇＳ０４（０．１グラム／リットル）、ＣａＣ０３（２グラム／リットル）及び濃度１０７〜１０８ＣＦＵ／ｍｌの各アンタゴニストを含む三角フラスコに移し、２８℃で７２時間振盪した。その後、得られたゲル様カクテルを使用時まで室温にてゲル形態で維持した。アンタゴニストはこの形態で１２ヶ月まで保存できることが示され、細菌数の減少は対数オーダーで２以下であった。
【０１５１】
アンタゴニストを維持するための培地の決定
拮抗細菌を貯蔵するための最も適切な培地を決定するために、以下の貯蔵培地候補を試験した：
【０１５２】
試験した拮抗細菌：
試験した拮抗細菌はＣＢＳ  １３３２５２；ＣＢＳ  １３３２５５、及びＣＢＳ  １３４５６７であった。
【０１５３】
ＡＮ培地を含むペトリ皿上で各拮抗細菌を４８時間成長させた。各細菌のコロニーを成長培地の表面から滅菌蒸留水に終濃度１０９ＣＦＵ／ｍｌで回収した。
【０１５４】
試験した貯蔵培地：
ａ．蒸留水（ＤＷ）
ｂ．オレガノ油７９％、ゴマ油１９％、及びＤＷ２％。
ｃ．ＤＷ中のオレガノ油４％及びゴマ油０．８％。
ｄ．オレガノ油４％及びゴマ油０．８％を含むＤＷ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ８０（界面活性剤ＴＷＥＥＮ（登録商標）  ８０（製品番号：Ｐ４７８０、ブランド：シグマ社）を含むエマルション。
ｅ．０．１５％粒状寒天（ディフコ社）を補った酵母抽出物（２０グラム／リットル）、グリセロール（１０グラム／リットル）、ＭｇＳＯ４（０．１グラム／リットル）、ＣａＣＯ３（２グラム／リットル）を含むソフトゲルとしての拮抗培地（「ＡＮ培地」）。
【０１５５】
貯蔵培地の調製：
各試験貯蔵培地（９ｍｌ）を無菌条件下で１５ｍｌの無菌チューブに注いだ。各試験貯蔵培地につき合計１２０本のチューブ。
【０１５６】
各チューブに、１ｍｌの予め作製しておいた拮抗細菌調製物（１０９細胞／ｍｌ）を加え、各チューブ中の試験細菌の終濃度が１０８ＣＦＵになるように各チューブに接種した。接種したチューブを約２５℃の室温で３００日間インキュベートした。
【０１５７】
種々の貯蔵培地中における試験細菌の生存の評価：
２９４日間のインキュベーション中、各チューブのサンプル（それぞれ５複製分）を定期的に採取した。各チューブから滅菌蒸留水中への１０倍希釈物を１〜１０−８で作製した。その後、各希釈物から、１００マイクロリットルを表面ＡＮ培地に分けた。２５℃で５日間インキュベートした後、特定の時間に採取した元の試験チューブのＣＦＵ／ｍｌとして菌数を評価した。結果は各時点の５複製分の平均値である。
【０１５８】
結果：
生存結果を以下の表２Ａ〜２Ｅに要約する。
【０１５９】
0006306687.tif 000009
【０１６０】
0006306687.tif 000010
【０１６１】
0006306687.tif 000011
【０１６２】
0006306687.tif 000012
【０１６３】
0006306687.tif 000013
【０１６４】
具体的には、表２Ａ〜２Ｅに示されている結果は、最初の４つの試験貯蔵培地中で、試験した３つの拮抗細菌の生存がゲルベースの培地と著しく異なっていることを示している。
【０１６５】
具体的には、ゲル（寒天含有）培地だけが拮抗細菌の長期（２９４日）生存を支えた。実験の終わりに、ＣＢＳ  １３３２５２及びＣＢＳ  １３３２５５の菌数は５．０×１０４ＣＦＵ／ｍｌを超えており、ＣＢＳ  １３３２５５は約８．０×１０５のレベルで生存した。他の全ての試験培地で、拮抗細菌は約４０日後には生存していなかった。
【０１６６】
拮抗細菌の更なる特徴解析
拮抗細菌を更に特徴付けるために、種々の炭素源材料上での細菌（及び非アンタゴニスト）の成長の差を調べた。具体的には、別個の炭素源としてのゴマ油、グルコース、又はグリセロール上で１０種類の拮抗細菌及び６種類の非拮抗細菌の成長を調べた。炭素源を含まない培地を対照として用いた。
【０１６７】
材料
成長培地には、
蒸留水                ５００ｍｌ
ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４        ０．１０ｇ
ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ    ０．０１ｇ
ＫＣｌ                ０．１０ｇ
試験炭素源            ４．２０ｇ
を含めた。
【０１６８】
細菌ストック溶液には、
を含めた。
【０１６９】
２４時間細菌培養物から細菌を回収し、蒸留水で１：１００希釈して４８０ｎｍでの吸光度が０．６５の溶液を調製した。
【０１７０】
方法
試験炭素源を含む又は含まない１０ミリリットルの成長培地を３０ｍｌの三角フラスコに注ぎ、１００μｌの選択された細菌溶液を接種した。接種したフラスコを２６℃で２４時間インキュベートした後、１０倍希釈して計数した。水を対照として用いた。
【０１７１】
試験した各炭素源及び細菌のコロニー形成単位／ｍｌを表３に示す。表３で、表１の単離及び寄託された細菌を前述の土壌から単離した細菌と比較したが、拮抗活性を示さないことが見出された。それらはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ  １２（Ｐ．ｓｐｐ  １２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ  １３（Ｐ．ｓｐｐ  １３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ  １４（Ｐ．ｓｐｐ  １４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ  １５（Ｐ．ｓｐｐ  １５）、Ｂａｃｉｌｕｓ  ｓｐｐ  ３６、Ｅ．ｃｏｌｉ  ４として参照されている。
【０１７２】
表３の結果は、拮抗活性が確認されなかった細菌が唯一の炭素源としてのゴマ油上で成長できなかったことを示している。
【０１７３】
0006306687.tif 000014
【０１７４】
精油の抗細菌効果の検証
材料及び方法
精油の抗細菌効果を検証するために以下のアッセイを行った。
【０１７５】
油：以下の特徴を有するオレガノ油：原産国：ブルガリア；植物部分：顕花植物；培養方法：認定有機農法；抽出方法：水蒸気蒸留。
【０１７６】
細菌株：大腸菌、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ、及びＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓはイスラエルのＧ．Ｋｒｉｔｚｍａｎ教授のコレクションから入手した。
【０１７７】
ディスク拡散法：普通ブイヨン（ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ）試験管中、２７℃で２４時間細菌を成長させた。ディスク拡散法の準備として濾紙ディスクをオートクレーブで滅菌した。各細菌（１００μｌ）を栄養寒天（ＮＡ）プレート上に置き、３〜５分乾燥させた。濾紙ディスクを１００％濃度のオレガノ精油（２０μｌ）中で飽和させ、その後、細菌でコーティングしたばかりの各ＮＡプレート上に置いた。陽性対照に３％Ｈ２Ｏ２溶液を用い、陰性対照はＤＩ水とした。プレートを２７℃で４８時間インキュベートした。標準的な定規で阻害ゾーンを測定した。
【０１７８】
結果
細菌に対する市販の有機油の抗細菌効果を表４に要約する。対照と比べてオレガノ油において、処理された細菌で阻害ゾーンがより大きいことが示されている。
【０１７９】
0006306687.tif 000015
【０１８０】
精油粉末の調製
材料
油粉末の調製に以下の材料を用いた：
天然油：
・オレガノ油１００％（精油）及びゴマ油１００％（炭素系油）。どちらも米国、ペンシルベニア州、ランカスターのＭａｋｅｓ  Ｓｃｅｎｔｓ  Ｎａｔｕｒａｌ  ＳＰＡ  ｌｉｎｅから購入。
界面活性剤：
・チモール、カルバクロール、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｔｗｅｅｎ  ６５、Ｔｗｅｅｎ  Ｒ８５、及び卵レシチン。全てシグマ  アルドリッチ社から購入。
・イスラエルのフルカ社（Ｆｌｕｋａ）から購入したＳｐａｎ  ４０
・Ｚｏｈａｒ  Ｄａｌｉａ社から購入したＺｏｈａｒ  ＬＱ−２１５（脂肪酸カリウム）及びＺｏｈａｒ  ＰＴ−５０（脂肪酸カリウム）。
シリカビーズ：
・Ｒｈｏｄｉａグループから購入したＴｉｘｏｓｉｌ（ＳｉＯ２）。
・エボニック  インダストリーズＡＧ社（Ｅｖｏｎｉｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  ＡＧ）から購入したＡｅｒｏｓｉｌ  ２００及びＳｉｐｅｒｎａｔ  ５０Ｓ（ＳｉＯ２、２０μｍ）。
溶媒：
・Ｊ．Ｔ．ベッカー社（Ｊ．Ｔ．  Ｂｅｃｋｅｒ）から購入したアセトン及びアセトニトリル、ガドット社（Ｇａｄｏｔ）のイソプロパノール（ＩＰＡ）。
【０１８１】
方法
粉末調製
実験室規模の製造のために、サイズ２０〜５０ｍｌの実験ボトル、スパチュラ、マグネチックスターラー、及び加温板を含む一般的な実験室のガラス製品セットアップを用いて天然油と、界面活性剤と、シリカビーズとを含む粉末を調製した。概略的には、天然油を計量し、２０ｍｌのバイアル中でそれぞれを選択された界面活性剤と別個に混合し、これに溶媒を加えた。各油の混合物を混合し、均質な溶液が得られるまで温度約４０℃に加熱した。この均質溶液に、液体がビーズに吸収されるまでシリカビーズを加えた。全ての溶媒が蒸発するまでボトルをドラフト中に一晩置いた。
【０１８２】
最終乾燥粉末中の各油のローディング量は３０〜４２％であった。乾燥粉末は２〜７％の水を含んだ。
【０１８３】
粉末調製物の成分の全割合を表５Ａ〜５Ｄに示す。
【０１８４】
0006306687.tif 000016
【０１８５】
0006306687.tif 000017
【０１８６】
より多量に得るために、工業において使用されるものと同様な実験室用の電気機械的手段を用いた。これらには以下が含まれる：
１．プロペラを備えたＶｅｒｔｉｃａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｔｉｒｒｅｒ  ＤＣ  Ｈｓｉａｎｇｔａｉ；
２．Ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ  ｐｕｍｐ  ４．４  Ｃａｒｔｅｒ  ４／６カセットマノスタット及び管類；
３．リボン型混合羽根を備えたＤｙｎａｍｉｃ  Ｅｘｉｍ社製５Ｌ粉末ミキサー
４．バランス
５．１〜２Ｌのビーカー及び１〜３Ｌの容器。
【０１８７】
調製は、１Ｌビーカー中での油の計量及び界面活性剤との混合を含み、均質な溶液が得られるまで混合しながらこれにイソプロピルアルコールを加えた。シリカビーズ（Ｓｉｐｅｒｎａｔ  ５０Ｓ）を２Ｌビーカーに加え、これに、全ての液体がビーズに吸収されるまで、混合（３０ｒｐｍ）しながら均質な溶液をゆっくり速度（１０ｍｌ／分）と加えた。
【０１８８】
粉末調製物の成分の全ての割合を表６Ａ及び６Ｂに示す。約３０〜４２％の油のローディング量を維持した。
【０１８９】
0006306687.tif 000018
【０１９０】
更に、粉末の混合物（オレガノ油を含むもの及びゴマ油を含むもの）も調製した。具体的には、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｅｘｉｍ社の５Ｌ粉末ミキサーを用いて４００ｇの製剤ＯＲＧ−３４（オレガノ油を担持するビーズ）を１００ｇの製剤ＳＥＳ−３５（ゴマ油を担持するビーズ）と１０ｒｐｍで混合してＯ＆Ｓ−Ａを生成した。
【０１９１】
２集団を一緒に混合する前に、真空乾燥器を用いて４０℃で２４時間、各種の油ベース粉末を乾燥した。［
【０１９２】
異なるプロセスにおいて、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｅｘｉｍ社の５Ｌ粉末ミキサーを用いて１０ｒｐｍで８００ｇの製剤ＯＲＧ−３８を２００ｇの製剤ＳＥＳ−３９と混合して混合ビーズ製剤Ｏ＆Ｓ−Ｂを生成した。
【０１９３】
この混合ビーズ粉末をそのまま用いた。
【０１９４】
特徴解析
粉末中の含水量の決定
ＵＳＰ＜９２１＞の方法に従いＭｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＤＬ−３８  Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｈｅｒ滴定装置を用いて含水量を決定した。
【０１９５】
粉末中のイソプロパノール含有量の決定
以下のパラメーターに従ってヘッドスペース分析を用いてＩＰＡ含有量を決定した：
【０１９６】
0006306687.tif 000019
【０１９７】
ＨＰＬＣを用いた乾燥粉末中のオレガノ油のアッセイ
Ｈ．Ｈａｊｉｍｅｈｄｉｐｏｏｒ“Ａ  ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｙｍｏｌ  ａｎｄ  ｃａｒｖａｃｒｏｌ  ｉｎ  Ｔｈｙｍｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｌ．ｖｏｌａｔｉｌｅ  ｏｉｌ”ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｎ  Ｍａｇ．２０１０  Ｊｕｌ−Ｓｅｐ；６（２３）：１５４  １５８により報告され、ＳｏｌｕＢｅｓｔに採用された方法に従って不純物プロファイルを決定した。この目的のために、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  １００  Ｃ１８  ＨＤ、３μ、１５０×３ｍｍカラム、並びにフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器及びＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．８０ソフトウェアパッケージを備えたＵｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  Ｄｉｏｎｅｘ（ドイツ）ＨＰＬＣシステムを用いた。移動相はアセトニトリル：水（５０：５０、ｖ／ｖ）である。カルバクロールピークとチモールピークの間の最低分解能は１．５である。
【０１９８】
以下のように標準溶液を２連（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で調製した：
約３ｍｇのチモール及び２０ｍｇのカルバクロールを計量して５０ｍＬメスフラスコに入れ、４０ｍＬの希釈剤に溶解した後、希釈剤でメスアップして混合した。得られたチモール標準溶液の濃度は約０．０６ｍｇ／ｍＬであり、カルバクロール標準溶液の濃度は約０．４ｍｇ／ｍＬであった。
【０１９９】
以下のようにサンプル溶液を２連で調製した：
約７０ｍｇの粉末化サンプルを計量して２５ｍＬのメスフラスコに入れた後、アセトンでメスアップして混合した。
【０２００】
ＧＣを用いた製剤中のゴマ油のアッセイ
シリカビーズに吸収されたゴマ油を、メタノール性ＨＣｌ溶液を用いて６０℃で一晩メチル基転移させた。誘導体化の前にビーズに内部標準として用いたヘプタデカン酸を加えた。ＧＣ分析の前に、脂肪酸のメチルエステルをヘキサンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。
【０２０１】
種々の濃度のゴマ油及びブランクビーズから較正標準を調製した。誘導体化の条件及び内部標準の量はサンプル調製で記載したのと同じにした。
【０２０２】
ＦＩＤ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ７８９０ガスクロマトグラフを用いてビーズ中のゴマ油の定量分析を行った。化合物をＤＢ−２３キャピラリーカラムで分離した。
【０２０３】
結果
オレガノ油及びゴマ油アッセイのための通常のＨＰＬＣ及びＧＣ分析法を用いた。
【０２０４】
試験した粉末のクロマトグラムにより、粉末の調製及び貯蔵中に油の分解（従来のマーカー、チモール及びカルバクロール芳香族化合物による）が生じなかったことが示された。以下の表７に、ＨＰＬＣによるチモール及びカルバクロール芳香族化合物分析に基づくそれぞれ粉末中のオレガノ油及びゴマ油の％を示す。
【０２０５】
0006306687.tif 000020
【０２０６】
ＧＣクロマトグラフにより決定された製剤中のゴマ油の％を表８に示す。
【０２０７】
0006306687.tif 000021
【０２０８】
Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｈｅｒ滴定を用いて測定された含水量により、粉末が５〜７％の水を含んでいることが見出された。水の供給源は、５０％の水を含むＺｏｈａｒ  ＰＴ  ５０界面活性剤であると考えられる
【０２０９】
ＩＰＡ含有量に関して、ＧＣヘッドスペース精密分析により製剤中のＩＰＡ含有量が示される。これを表９に要約する。
【０２１０】
0006306687.tif 000022
【０２１１】
表９に見られるように、ＩＰＡの量は５〜１３％で異なる。しかし、この分野において、製剤は少なくとも３０倍に希釈されるので、ＩＰＡ含有量は０．１７〜０．４３％になり、これは無視できる非常に安全な量である。
【０２１２】
調製した様々な種類の乾燥粉末は、長期（１年超）貯蔵後にも安定であった。上記に加え、粉末は特徴的な臭いを有している。オレガノ油ベースの製剤はオフホワイト色であり、ゴマ油ベースの粉末は白色である。
【０２１３】
水と接触後、試験製剤（ＯＲＧ−２８及びＳＥＳ−２９はすぐにエマルションを形成し、これは２４時間安定であった。エマルションは３〜１０ミクロンの液滴からなっていた。エマルションの噴霧性は良好であり、フィルターを詰まらせなかった。
【０２１４】
当該技術分野における安全性試験により、試験した油ベース粉末が安全であることが示された。これは、通常の植物毒性パラメーターにより決定される、植物の日焼けの存在（又は非存在）により決定された。
【０２１５】
更に、粉末の長期（８週間）安定性を決定した。具体的には、オレガノ及びゴマベースの粉末を別個にアルミホイルバッグ中にシールし、加速貯蔵条件（４０℃で８週間）に置いた。オレガノ油のアッセイは、２つの主要成分カルバクロール及びチモールを介して、安定性試験の始め（開始点）及び８週間後にＨＰＬＣ−ＵＶ技術を用いて測定した。得られた値を、純粋なオレガノ油中のマーカーの量に対して標準化した。
【０２１６】
ゴマ油のアッセイは、２つの主要成分Ｃ１６：０及びＣ１８：０を介して、安定性試験の始め（開始点）及び８週間後に、メチル化脂肪酸のＧＣ−ＦＩＤ分析を用いて測定した。Ｃ１７：０を内部標準として用いて酸性触媒（及びＭｅＯＨ／ＨＣｌ）上でメチル基転移を行った。得られた値を、純粋なゴマ油中のマーカーの量に対して標準化した。
【０２１７】
どちらの製剤においても有意な変化は観察されず、オレガノ油及びゴマ油の量は安定性試験の前後で同様であった。
【０２１８】
Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｈｅｒ法を用いて含水量を調べた。水の量は、両方の製剤において、加速条件での８週間の貯蔵後に４２％減少していた。
【０２１９】
ＧＣ法を用いてイソプロパノール含有量を調べた。ＩＰＡの量は、オレガノ製剤では、加速条件で８週間貯蔵した後、３６％減少していたが、ゴマ製剤では保存されていた。
【０２２０】
理論により限定されるものではないが、容器が漏出性（ｌｅａｋｙ）であったと考えられるので、水又はＩＰＡの減少を低減するために、容器はより密閉的にシールされてよい。
【０２２１】
４０℃で８週間貯蔵した粉末は良好な安定性を示し、最初の粉末と同様な安定なエマルションを形成した。安定性測定値を以下の表１０に要約する。
【０２２２】
0006306687.tif 000023
【０２２３】
種々の界面活性剤を用いた可溶化及び抗細菌活性
安定な水中油滴型エマルションを作成するために、ＨＬＢが８〜２０の界面活性剤（乳化剤）が必要である。そこで、以下では、２つの界面活性剤、ＨＬＢ値が１５のＴｗｅｅｎ  ８０並びにパーム（ｐａｌｍ）、ココナッツ（ｃｏｃｏｎｕｔ）、オリーブ、ヒマ（ｃａｓｔｏｒ）、及び綿実植物から抽出した脂肪酸のカリウム塩（オレイン酸のカリウム塩のＨＬＢ値は２０）を調べた。
【０２２４】
脂肪酸のカリウム塩を用いた場合、オレガノ油の安定なエマルションを得るために必要な油／界面活性剤の比率は１：０．４であり、Ｔｗｅｅｎ  ８０を用いた場合には、必要な油／界面活性剤の比率は１：１であることが見出された。
【０２２５】
今回のオレガノ油のケースでは、各界面活性剤のＨＬＢ値と可溶化能との間に相関が見られ、すなわち、脂肪酸のカリウム塩でより可溶化が良好であった。イソプロパノールをプロセス補助化合物として用い、これによりエマルションを生成するための更なる安定性が付与された。
【０２２６】
抗細菌効果について、水中のオレガノ油及びゴマ油を用いて、複数の乳化剤を試験した。
【０２２７】
試験した乳化剤には、Ｔｗｅｅｎ  ２０；Ｔｗｅｅｎ  ８０；Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００；レシチン；ＳＤＳ；ステアリン酸ナトリウム；及び脂肪酸カリウムが含まれる。２５％オレガノ油及び５％ゴマ油を含む水の混合物で、各乳化剤を１、５、１０、１５、２０の濃度（パーセンテージ）で試験した。
【０２２８】
各エマルションの最初の２４時間の安定性（すなわち相分離の欠如）及び抗細菌活性を決定した。植物病原性細菌Ｃｌａｖｉ  ｂａｃｔｅｒ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．に対する２０μｌのエマルションの阻害ゾーンを測定し、植物毒性症状の試験植物としてのコショウ植物にエマルションを噴霧することにより抗細菌活性を決定した。
【０２２９】
結果は、１０％濃度の安定なエマルションの作成に脂肪酸カリウムが最も好適な材料であることを示しており、脂肪酸のカリウム塩の阻害ゾーンは他の試験エマルションより大きく、コショウ植物に対する植物毒性を示さなかった。得られたデータ（非掲載）は、乳化剤がＴｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、又はＳＤＳの時にコショウ植物に対する植物毒性を明確に示しており、それらを用いて作成されたエマルションを噴霧された植物は枯れたが、一方、脂肪酸カリウムのステアリン酸ナトリウムを噴霧された場合には非常に元気であった。
【０２３０】
種々の組の実験で、オレガノ油及び界面活性剤をシリカビーズに吸収させた（上記したようにイソプロパノール雰囲気を使用）。０．５％のオレガノベース粉末を水に分散させた時に良好な抗細菌結果が得られた。この粉末は約２５％のオレガノ油及び１０％の脂肪酸カリウム乳化剤を含み、すなわちエマルション中の濃度０．１２５％のオレガノ油は充分に活性であり、粉末形態から可溶化するために必要な界面活性剤はわずか０．０５％であった。
【０２３１】
驚くべきことに、更により低濃度の粉末でも、室温実験で良好な作物保護を得るのに充分であった。たった０．２％の粉末、したがって、０．０５％のオレガノ油を（エマルションを形成するために）水に分散させれば充分であり、再現性のある優れた抗細菌効果を示し、それで処理された植物は、感染はしたが未処理の対照と比べて、完全に元気なままであった。
【０２３２】
生物的防除カクテルの調製
以下のように３つの生物的防除カクテルを調製した：
上記表１に記載の細菌のカクテルを含む拮抗ゲルのそれぞれを各アンタゴニスト１０７〜１０８ＣＦＵ／ｍｌの量で用いた。
【０２３３】
次いで、拮抗ゲルのぞれぞれを２つの濃度で用いた。１つめは、略語ＮＢで参照される０．０３％天然油を担持するビーズ（１リットルの水中の１グラムのビーズに相当）と混合した得られたままの、すなわち希釈なしのもの（各アンタゴニストから１０７〜１０８ＣＦＵ／ｍｌ）であり、２番目の製剤は、水で２倍希釈して製剤ＮＢ×２を形成したものであり、油濃度は０．０６％である。
【０２３４】
生物的防除実験
生物的防除アッセイで、以下の油粉末組成を用いた：
材料及び組成物
油：ゴマ油１００％（ＳＰＡｌｉｎｅ社のロットｓｉｃＰ１Ａ１１／０１）オレガノ油１００％（ＳＰＡｌｉｎｅ社のロット００１５１８１）
界面活性剤：Ｚｏｈａｒ  ＰＴ−５０（Ｚｏｈａｒ  Ｄａｌｉａ社、バッチ０５５１１ＰＭ１１４２）
ＳｉＯ２粒子：Ｓｉｐｅｒｎｅｔ  ５０Ｓ（２０μｍ、エボニック  インダストリーズ社、ロット１４６２）
アルコール：イソプロパノール（ＩＰＡ、ガドット社）。
【０２３５】
0006306687.tif 000024
【０２３６】
粉末の調製
最初に、オレガノ油及びゴマ油を混合し、均質な溶液が得られるまでＩＰＡを加えた。この溶液に、非粘稠性の均質溶液が得られるまで混合することにより界面活性剤を加えた。この溶液をＳ１Ｏ２粉末上に噴霧し、全ての液体が吸収されるまで低剪断力の機器を用いて混合し、更に１５〜３０分続けた。その後、粉末を粉砕して凝集体を壊し、１，０００μｍのメッシュで篩った。貯蔵のために、粉末を含むバッグを密封して貯蔵した。貯蔵は１５〜３０℃で少なくとも２年間とした。
【０２３７】
生物的防除実施例１−種々の病原体に対する生物的防除カクテルのインビトロ効果
試験病原体：以下の４つの拮抗細菌を試験した（寄託アクセッション番号で特定）：ＣＢＳ  １３３２５２、ＣＢＳ  １３３２５４、ＣＢＳ  １３４５６７、及びＣＢＳ  １３３２５９。
【０２３８】
Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ及び酵母を本発明の個人的コレクションから取った。
【０２３９】
方法：
病原体の調製−各試験病原体を別個に酵母抽出物デキストロース寒天（ＹＤＣ）にプレーティングし、２５±１℃で４８時間成長させた後、各プレートの表面を滅菌蒸留水で洗浄した。次いで、滅菌蒸留水を含むチューブ中に病原体を回収した。試験のため、２つの試験病原体を組み合わせ、ペトリ皿にプレーティングした。
【０２４０】
アンタゴニストの調製−上記の試験アンタゴニストのいずれかのサンプル（１００μｌ）を、ＹＤＣ培地を含むペトリ皿の表面に広げ、アンタゴニスト培地（本明細書に開示されている寒天ベースの培地）上で２５℃±１℃にて４８時間アンタゴニストを成長させることによりアンタゴニストを調製した。その後、コルクカッターを用いて、アンタゴニストカクテルを含む培地の小片を取り、組合せインキュベーションのために２つの病原体を担持するプレートの表面に置いた。
【０２４１】
病原体を各アンタゴニストと一緒に２５±１℃で２４時間インキュベートした後、アンタゴニストの小片の周りに阻害ゾーンが形成された。阻害ゾーンはコロニーの周りのハロによって示された。図５Ａに、アンタゴニスト処理なしの病原体細菌の成長を示し、図５Ｂに、ＣＢＳ  １３３２５２の効果を示し、図５Ｃに、ＣＢＳ  １３３２５４の効果を示し、図５ＤにＣＢＳ  １３３５６７の効果を示し、図５Ｅに、ＣＢＳ  １３３２５９の効果を示す。
【０２４２】
生物的防除実施例２−トマト青枯病に対する生物的防除カクテルの効果
３つのネット温室でインビボ評価を行い、トマトＤａｎｉｅｌｌａ植物上で３つの生物的防除カクテルの抗細菌活性を評価した。トマト植物はトレリスを用いて成長させた。
【０２４３】
陽性対照として水酸化銅（Ｋｏｃｉｄｅ、Ｍｉｌｃｈａｎ  Ｂｒｏｓ社）を濃度０．３％で用いた（銅対照）。
【０２４４】
非処理植物を陰性対照として用いた。
【０２４５】
植えた後の連続３日間、全ての植物に、５０ｍｌの生物的防除カクテル又は銅対照と一緒に又は何もなしで（陰性対照）水をやり、その後、７日毎に植物に噴霧した。噴霧のために、バックパックモーター噴霧器の容器中で精油粉末（それぞれの量）及び拮抗ゲルを直接混合し、葉及び茎を含む植物全体に噴霧した。
【０２４６】
２週間後、温室中の各成長列の２番目の植物に、イスラエルのＢｅｓｏｒ地域で育った感染植物から単離した２つのＣＢＭ株を含むＣＢＭ接種材料を感染させた。接種材料は、２株のＣＢＭ、株番号３２（株名１８９／１−１）及び株番号４２（株名１８９／６−１）を含んだ［Ｆｒｉｄａ  Ｋｌｅｉｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  Ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  Ｓｕｂｓｐ．  Ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｓｒａｅｌ  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ  （２００８）  １２１：４６３−４７５］。
【０２４７】
植物の茎近くの葉の切り口を入れ、ＣＢＭ接種材料に葉を浸すことにより接種を行った。
【０２４８】
生育中、植物を監視し、感染した植物が観察された。
【０２４９】
統計的検定
結果はスチューデントのｔ検定を用いて分析した。
【０２５０】
結果
上記野外試験を６回繰り返した。６回の結果を、トマト植物の枯死率を示す表１１Ａ及びＣＢＭ用のａｇｒｉａキット（Ｃｍｍ  ＩｍｍｕｎｏＳｔｒｉｐ  Ｔｅｓｔ、カタログ番号ＳＴＸ  ４４００１；３０３８０  Ｃｏｕｎｔｙ  Ｒｏａｄ  ６  Ｅｅｌｋｈａｒｔ，  Ｉｎｄｉａｎａ  ４６５１４  ＵＳＡのａｇｄｈｉａ社（Ａｇｄｉａ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ））を用いて試験した、ＣＢＭによる感染レベルを示す表１１Ｂに要約する。
【０２５１】
0006306687.tif 000025
【０２５２】
表１１Ａの結果の統計比較を表１２に示す。
【０２５３】
0006306687.tif 000026
【０２５４】
表中の「○」は、統計的に有意な差があることを意味し、「×」は、統計的に有意な差が無いことを意味する。表９は、ＮＢを任意の他の処理群と比較した時に、プラスの効果が統計的に有意であることを示している。銅対照と陰性対照を比較した場合、水酸化銅処理のプラスの効果は有意でない。２倍の用量（ＮＢ対ＮＢ×２の濃度）も、統計的に有意な効果の増大を示している。
【０２５５】
更に、表１３及び図６は、植物枯死に対する処理の効果を示している。
【０２５６】
0006306687.tif 000027
【０２５７】
具体的には、表１３は、非処理、陰性対照群（対照）、及び銅群（Ｃｕ）の枯死率が、処理群ＮＢ及びＮＢ×２より高いことを示している。各群で、端の列は中央の列より感受性であった（非掲載）。端側の列と中央側の列との差は、温室中の端側の列の位置が外部のパラメーターの影響を受けることによるものであると考えられる。
【０２５８】
結果は更に相乗効果を示している。表１４は、幅広い温度範囲で、天然油（ゴマ油ビーズ及びオレガノ油ビーズ）とアンタゴニストとの組合せが、各成分単独の効果よりもはるかに大きく植物の生存率を増大させることを示している［（Ａ＋Ｂ）／Ｃ＞１］。
【０２５９】
具体的には、結果は、アンタゴニストのみ（Ａ）及び油のみ（Ｂ）を合わせた効果を対照（Ｃ）で割ったものが１より大きいこと、すなわち相乗効果を示している。
【０２６０】
0006306687.tif 000028
【０２６１】
生物的防除実施例２−コショウに対する生物的防除カクテルの効果
ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ（ＸＶ）によるコショウ感染症を防止するために、実施例１と同じ生物的防除カクテルを同じ処理方法で用いる。病原体はコショウ植物及びコショウ実生から本発明者によって最初に単離されたものである。ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ（ＸＶ）の単離株はＧ．Ｋｒｉｔｚｍａｎのコレクションのものである。
【０２６２】
生物的防除実施例３−ジャガイモに対する生物的防除カクテルの効果
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｓを引き起こす原因であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．によるジャガイモ感染症を防止するために、前述したリストの一部である上記方法に従って得られた３つのアンタゴニスト単離株を含む生物的防除カクテルを用いた。３つのアンタゴニストを以下の表１５に示す。
【０２６３】
0006306687.tif 000029
【０２６４】
タンク混合物中の細菌アンタゴニストの終濃度を１０３ＣＦＵ／ｍｌの一定濃度にして、上記と同様に生物的防除カクテルを３つの濃度、１％（希釈なし）、０．５％（１：１希釈）、及び０．０２５％（１：４希釈）の（油製剤の）活性成分で調製する。
【０２６５】
使用前に、アンタゴニストを混合タンク中で混合し、乾燥製剤の１つは、とりわけ、成分オレガノ油乾燥粉末及びゴマ油乾燥粉末（前述したように比率８０：２０）を含んだ。ジャガイモ種塊茎はコンベヤー上での回転により噴霧セルに入る。セル中で、塊茎は雲状の液滴（ａ  ｃｌｏｕｄ  ｏｆ  ｄｒｏｐｓ）（それぞれ直径約８０μ）を通過する。各塊茎がその軸の周りに約８回回転した後、処理された塊茎を乾燥処理塊茎として容器に回収する。ここで、処理された塊茎は完全製剤の微細な層でコーティングされており、処理の７２時間後まで、植える用意が出来ている。
【０２６６】
ジャガイモそうか病の場合、処理効率は、塊茎に人為的に接種するのではなく、各種塊茎上で多くの典型的な症状が自然に多く見られるジャガイモ種ロットを選択することにより試験される。これは一般的な種類のそうか病又は深く窪んだそうか病（ｄｅｅｐ  ｐｉｔｔｅｄ  ｓｃａｂ）症状のものであり得る。種は２つの方法で調べられる：
（ａ）２複製分（２  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）の６０塊茎のサンプルを実験室に持って来る。実験室で、市販のジャガイモピーラーを用いて全ての塊茎の皮をむく。これは皮むき手順中、塊茎を濡らさずに行われる。ジャガイモの皮の大量のサンプルを回収する。１０グラムを、０．０５％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸を補った９０ｍｌの０．１％（ｗ／ｖ）水寒天を含むストマッカーバッグに入れる。この懸濁液をロータリーシェーカー上で２時間、その後ストマッカー中で１分間混合する。この均質化後、１０倍希釈し、１００μｌのアリコートを、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ単離のための半選択培地を含むペトリ皿の表面に接種する。２８℃で５日間インキュベートした後、処理されたジャガイモ種の皮１ｇ当たりのＣＦＵを計算し、未処理対照と比較する。
（ｂ）処理及び未処理ジャガイモ種を試験場にそれぞれ少なくとも４複製分植える。このような実験で、収穫時の娘塊茎の成長及び収率のパラメーター並びにそうか病対照を評価する。
【０２６７】
皮１グラム当たりのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの菌数を計算し、結果を表１６に示す。
【０２６８】
0006306687.tif 000030
【０２６９】
更なる生物的防除実験
他の病原体感染症の処理又は防止を調べるために以下のプロトコールが用いられ得る。
【０２７０】
Ｉ．インビトロ拮抗活性のためのプロトコール
白金耳（ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｌｏｏｐ）を用いて各拮抗細菌を別個のペトリ皿（９ｃｍ）に移して皿の直径に沿って１本の拮抗線（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ｌｉｎｅ）を形成させ、２８℃で４８時間皿をインキュベートする。
【０２７１】
皿の壁に触れずに拮抗線に垂直な線に沿って試験病原体を移す。
【０２７２】
２５〜２８℃の温度で皿を更に５日間インキュベートする。
【０２７３】
アンタゴニストが病原体の成長を阻害したゾーンを測定する（「阻害ゾーン」）。阻害ゾーンのサイズは細菌の拮抗活性のレベルを示している。
【０２７４】
ＩＩ．アンタゴニストを含まない油製剤の影響
試験病原菌の培養に適した培地（３７℃で液体である寒天を含む培養培地）に油の終濃度１ｗ／ｖ％で油粉末を溶解することにより油製剤（前述、拮抗細菌なし）のストック溶液を作成する。ストック溶液から、培養培地で油製剤の２倍希釈系列（（１：１、１：２、１：４、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８、１：２５６、及び１：５１２の希釈））を作成する。ペトリ皿に入れ、油含有培地を固める。
【０２７５】
４８時間培養した後に、食塩水コロニーで希釈して病原体懸濁液を調製し、懸濁液の病原体濃度を較正して４８０ｎｍで０．６ＡＵの吸光度に到達させる。
【０２７６】
病原菌を１０−８／ｍｌの濃度まで希釈し、固まった油含有培養培地に１００μｌをプレーティングする。
【０２７７】
各プレートを種々の油濃度で２５〜２８℃で５日間インキュベートした後、コロニー数を決定する。
【０２７８】
ＩＩＩ．殺菌又は静菌活性
滅菌水及び１ｍｌ当たり１０３アンタゴニストの一定濃度のアンタゴニストの各希釈油製剤を用いるが、前述したように希釈された種々の量の油を含む拮抗製剤を調製する。
【０２７９】
種々の油希釈物を用いた９ｍｌのアンタゴニスト製剤を、１ｍｌのアリコートの濃度１０８ＣＦＵ／ｍｌの試験病原体懸濁液とチューブ中でインキュベートした。７２時間培養後に培養液から病原体懸濁液を調製した。
【０２８０】
３時間インキュベートした後、各チューブの中身を０．４５ｍｍメッシュメンブレン及び滅菌水を用いて濾過し、その後、滅菌水を用いて病原体をメンブレンから洗い落とし、ボルテックスする。
【０２８１】
次いで、洗い落とした細菌を１０−８ＣＦＵ／ｍｌの濃度まで１０倍ずつ段階希釈する。各希釈物から１００ｍｌのアリコートを好適な培養培地と共にペトリ皿にプレーティングし、培養する。コロニーの形成は、製剤の静菌活性を示しており、コロニーがない場合、これは殺菌活性を示している。
【０２８２】
ＩＶ．植物試験：
ポット又は温室中で植物試験を行う。葉が少なくとも５枚の植物を試験に用いる。
【０２８３】
ポット中で：
１日目、種々の濃度の試験油／アンタゴニスト製剤を植物に噴霧し、１２時間後に、濃度約１０６ＣＦＵ／ｍｌの病原体溶液を植物に噴霧する。
感染の２時間後、同じ油／アンタゴニスト製剤を再度植物に噴霧し、６週間にわたり６日毎に連続的に噴霧する。６週間後、病気の発生を評価して記録する。
【０２８４】
野外試験場又は温室では：
温室の分野における通常の植付け及び生育方法を用いて植物を生育する。
植付け後、約１００ｍｌ油／アンタゴニスト製剤／植物の量で植物に灌水し、その後、５〜６日毎に連続噴霧で各植物に同じ製剤を噴霧する。
病気の発生を評価及び記録する。
【０２８５】
毒性試験
以下のように、それぞれ濃度が１０９の全ての寄託アンタゴニスト（表１）のカクテルを含む製剤を用いて種々の毒性試験を行った：
【０２８６】
（ｉ）ラットにおける急性経口毒性：
プロトコール：
雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（商標）（ＳＤ（商標））ラットを２つの群（ｎ＝３）に分け、２つの群の間の投与間隔を２４時間として、それぞれに２０００ｍｇ／ｋｇの試験製剤（投与体積１．９７ｍｌ／ｋｇ、）を経口胃管栄養法（ｏｒａｌ  ｇａｖａｇｅ：ＰＯ）で単回投与した。
【０２８７】
結果：
・１４日間の観察期間全体にわたり、試験したラットはいずれも死亡しなかった。
・投薬直後又は１４日間の観察期間全体で、いずれの動物においても投薬に対する反応に顕著な臨床徴候は見られなかった。
・全動物の１４日間の実験期間の終わりにおける体重増加は通常予想される値の範囲内であった。
・いずれの動物においても計画剖検時に顕著な病理学的所見は見られなかった。
・限界試験用量２０００ｍｇ／ｋｇでのラットへの単回経口投与後に有害反応がなかったことから、試験製剤はこの投与経路による急性毒性リスクを示さないと考えられ、急性経口半数致死量（ＬＤ５０）は２０００ｍｇ／ｋｇより大きい。
【０２８８】
（ｉｉ）急性経皮毒性
プロトコール：
５匹の雌及び５匹の雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ（商標））ラットに単一用量レベル２０００ｍｇ／ｋｇの試験製剤を局所適用して２４時間暴露した。ラットを合計１４日間観察した。
【０２８９】
結果：
・１４日間の実験期間全体にわたり、いずれのラットも死亡しなかった。
・１４日間の観察期間全体にわたり、いずれのラットにおいても投薬に対する反応における顕著な臨床徴候は見られなかった。
・１４日間の実験期間の終わりにおける全てのラットの体重増加は通常予想される値の範囲内であった。
・計画剖検時にいずれのラットにおいても顕著な病理学的所見は見られなかった。
・ラットへの単回経皮適用後に有害反応がなかったことから、試験製剤はこの投与経路による急性毒性リスクを有さず、推定急性経皮半数致死量（ＬＤ５０）は２０００ｍｇ／ｋｇより大きいと決定された。
【０２９０】
ウサギにおける急性皮膚刺激性／腐食性
プロトコール：
２００２年４月２４日に採択されたＯＥＣＤの化学物質の試験に関するガイドライン、セクション４、Ｎｏ．４０４「急性皮膚刺激性／腐食性」により推奨される試験方法に従い３匹の雄のＮＺＷウサギの群に単回経皮適用した後に試験製剤の潜在的皮膚刺激効果を評価した。
【０２９１】
具体的には、全てのウサギにそれぞれ０．５ｍｌの試験製剤で湿らせた２×３ｃｍの吸収性ガーゼの１回分サンプルを、４時間の暴露期間中、局所適用した。暴露期間全体にわたり、各ガーゼパッチを非刺激性テープ及び好適な半密閉性の包帯材（ＴＵＢＩＧＲＩＰストッキネット）で皮膚に接触させたままにしてガーゼパッチ及び試験製剤を保持した。
【０２９２】
パッチ除去の１、２４、４８、及び７２時間後の標準時点に皮膚反応をスコア化して記録した。
【０２９３】
結果：
・７２時間の実験期間全体にわたり、いずれのウサギにおいても紅斑又は浮腫は見られなかった。
・実験期間全体にわたり、いずれのウサギにおいても他の皮膚反応は見られなかった。
・全実験期間を通していずれのウサギにおいても処理に対する反応に顕著な臨床徴候は見られなかった。
・全実験期間を通して、いずれのウサギにおいても異常な体重変化は見られなかった。
・計算された一次皮膚刺激性指数（Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ：ＰＩＩ）が０であったことから、刺激反応は無視できる（ｎｅｇｌｉｇｉｂｌｅ）ものとして分類されると結論付けられる。
【０２９４】
（ｉｉｉ）皮膚感作（局所リンパ節試験）
プロトコール：
２０１０年７月２２日に採択されたＯＥＣＤの化学物質の試験に関するガイドライン、セクション４、Ｎｏ．４２９「皮膚感作：局所リンパ節試験」による試験手順に基づいて、試験製剤が皮膚感作を引き起こす可能性を評価した。
【０２９５】
具体的には、試験製剤の３つの希釈物を生理食塩水中に調製した。適用前に、プルロニック（登録商標）Ｌ９２（１ｖ／ｖ％）を各投与液に加えた。
【０２９６】
試験手順の再現性及び感度を確実にするために、周知の弱から中程度の接触アレルゲンである２５％ＨＣＡを本実験に含め、使用される陰性対照で希釈した。
【０２９７】
３群のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（ｎ＝５）に試験製剤（１つの群につき１つの希釈物）を１日１回、連続３日間にわたり、投与体積２５μｌで各外耳の背部に適用した。更に２つの同じサイズの群に同一条件下で陰性対照（生理食塩水）又は陽性対照（２５％ＨＣＡ）のいずれかを適用した。
【０２９８】
最初の局所適用から５日後、全てのマウスに３Ｈ−メチルチミジンを静脈（ＩＶ）注射した。約５時間後、全てのマウスを安楽死させ、耳介リンパ節を切除した。個々の動物からの左及び右リンパ節細胞の両方の単一細胞懸濁液を調製した。
【０２９９】
βカウンターで３Ｈ−メチルチミジンの取込みを測定し、壊変毎分（ＤＰＭ）／動物として表した。
【０３００】
試験製剤希釈物及び陽性対照で処理された群の刺激指数（ＳＩ）を計算した。全希釈物でＳＩ値は３より低く、陽性対照のＳＩ値は３より高かった。
【０３０１】
結果：
・５日間の実験期間全体にわたり、全ての群でいずれのマウスも死亡しなかった。
・５日間の実験期間全体にわたり、試験製剤又は陰性対照で処理されたマウスのいずれにおいても処理に対する反応に顕著な臨床徴候は見られなかった。全ての陽性処理マウスは耳の発赤を示した。
・全てのマウスが、５日間の実験期間の終わりに体重増加を示した。
・計算された刺激指数値から、実験条件下で、試験製剤は皮膚感作に関連する反応を生じさせないと結論付けられた。
【０３０２】
（ｉｖ）ウサギにおける急性眼刺激性／腐食性
プロトコール：
２０１２年１０月２日に採択されたＯＥＣＤの化学物質の試験に関するガイドライン、セクション４、Ｎｏ．４０５「急性眼刺激性／腐食性」による試験手順に従って、３匹の雄ＮＺＷウサギの群への単回点眼後に試験製剤の潜在的な眼刺激性／腐食性効果を評価した。
【０３０３】
最初に、単一用量の０．１ｍｌ試験製剤を１匹のウサギ（初回試験）、その後、更に２匹のウサギ（確認試験）の右眼に適用した。各ウサギの左眼は処理せずに対照とした。
【０３０４】
適用後１、２４、４８、及び７２時間の標準時点で眼反応をスコア化して記録した。
【０３０５】
結果：
・７２時間の実験期間全体にわたり、いずれのウサギにおいても眼反応は見られなかった。
・実験期間全体を通していずれのウサギにおいても処理に対する反応に顕著な臨床徴候は見られなかった。
・実験期間全体を通していずれのウサギにおいても異常な体重変化は見られなかった。
・本実験の条件下で、試験製剤は眼刺激性／腐食性に関連する反応を生じさせないと結論付けられた。
【図１Ａ】
0006306687.tif 000031
【図１Ｂ】
0006306687.tif 000032
【図１Ｃ】
0006306687.tif 000033
【図１Ｄ】
0006306687.tif 000034
【図２Ａ】
0006306687.tif 000035
【図２Ｂ】
0006306687.tif 000036
【図３Ａ】
0006306687.tif 000037
【図３Ｂ】
0006306687.tif 000038
【図３Ｃ】
0006306687.tif 000039
【図３Ｄ】
0006306687.tif 000040
【図３Ｅ】
0006306687.tif 000041
【図４Ａ】
0006306687.tif 000042
【図４Ｂ】
0006306687.tif 000043
【図４Ｃ】
0006306687.tif 000044
【図５Ａ】
0006306687.tif 000045
【図５Ｂ】
0006306687.tif 000046
【図５Ｃ】
0006306687.tif 000047
【図５Ｄ】
0006306687.tif 000048
【図５Ｅ】
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【図６】
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