(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％、有利には≧９７％、特に有利には≧９８％、より特に有利には≧９９％、及び極めて有利には１００％同一であるアミノ酸配列をコードする単離したポリヌクレオチドであって、配列番号２が、５５３位で又はアミノ酸配列の対応する位置で、Ｌ−アスパラギン酸を有し、前記ポリヌクレオチドが、コリネバクテリウム属の微生物から単離された酵素イソプロピルリンゴ酸合成酵素をコードする複製可能なポリヌクレオチドであり、それらによってコードされたタンパク質配列が、配列番号２の５５３位に対応する位置でＬ−アスパラギン酸を有する、前記ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％、有利には≧９７％、特に有利には≧９８％、より特に有利には≧９９％、及び極めて有利には１００％同一であるアミノ酸配列をコードし、配列番号１における１６５７位に対応する位置にグアニンを有する、請求項１に記載の単離したポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号５で示される、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
コリネバクテリウム属の微生物における複製に適している、請求項２又は３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６】
請求項１から３までのいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項７】
請求項１から３までのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項６に記載のポリペプチド、又は請求項４又は５に記載のベクターを含む、コリネバクテリウム属の微生物。
【請求項８】
請求項１から３までのいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが過剰発現型で存在する、請求項７に記載の微生物。
【請求項９】
ポリヌクレオチドが染色体中で組込まれていることを特徴とする、請求項７又は８に記載の微生物。
【請求項１０】
コリネバクテリウム・グルタミクムであることを特徴とする、請求項７から９までのいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１１】
前記微生物が、ファインケミカルを製造する能力を有することを特徴とする、請求項７から１０までのいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１２】
前記ファインケミカルが、Ｌ−ロイシン又はＫＩＣであることを特徴とする、請求項１１に記載の微生物。
【請求項１３】
以下、
ａ）培地中で請求項７から１２までのいずれか１項に記載の微生物の１つを発酵する工程、
ｂ）培地中でＫＩＣ又はＬ−ロイシンを蓄積する工程、ここで発酵ブロスが得られる、
を含む、
ＫＩＣ又はＬ−ロイシンを製造するための発酵法。
【請求項１４】
バッチ法、フェドバッチ法、反復フェドバッチ法及び連続法からなる群から選択される方法であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ファインケミカル又は液体もしくは固体のファインケミカル含有生成物が、ファインケミカルを含有する発酵ブロスから得られることを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｌ−ロイシン又はＫＩＣの発酵生産のための、請求項７から１２までのいずれか１項に記載の微生物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％、有利には≧９７％、特に有利には≧９８％、より特に有利には≧９９％、及び極めて有利には１００％の同一性であるアミノ酸配列をコードする単離されたヌクレオチド配列（その際配列番号２の５５３位又はアミノ酸配列の対応する位置は、Ｌ−ロイシン以外のタンパク質新生アミノ酸である）に、該ヌクレオチド配列を含有する微生物に、及びこの微生物を使用するファインケミカルを製造するための方法にも関する。
【０００２】
特に、アミノ酸、有機酸、ビタミン、ヌクレオシド及びヌクレオチドを含むファインケミカルは、ヒト医学において、医薬品産業において、化粧品において、食品産業において、及び動物飼料において使用される。
【０００３】
多数のこれらの化合物を、コリネフォルム細菌、特にコリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）の株の発酵によって製造する。それらの大きな重要性のために、研究は、製造方法を改善することについて絶えず進行中である。方法の改善は、発酵測定、例えば、撹拌及び酸素の供給、又は栄養培地の組成、例えば発酵中の糖濃度、又は例えばイオン交換クロマトグラフィーによる生成物形成を提供する後処理、又は微生物自体の本質的な性能特性に関連してよい。
【０００４】
突然変異誘発、スクリーニング及び突然変異体選択の方法を、前記微生物の性能特性を改善するために使用する。この方法において、代謝拮抗物質、例えばロイシン類似体４−アザロイシン又は５，５，５−トリフルオロロイシン、及び化学化合物、例えばＬ−アミノ酸、例えばＬ−ロイシンに対して耐性がある株が得られる。一例として、参考文献
Ｃａｓａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４８： ６１３−６２３ １９９７）が挙げられる。
【０００５】
数年間、同様に、組換えＤＮＡ技術の方法は、例えば、個々のアミノ酸生合成遺伝子を増幅又は減衰させ、かつ化学化合物の製造に対する影響を研究する点で、コリネバクテリウム・グルタミクムのＬ−アミノ酸生成株の株改良のために使用されている。
【０００６】
生物学に関しての説明をまとめると、コリネバクテリウム・グルタミクムの遺伝学及び生物工学は、“Ａ Ｎｅｗ Ｅｒａ ｉｎ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０４／１−３， （２００３））のタイトルのＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｈｉｅｆ Ｅｄｉｔｏｒ： Ａ． Ｐｕｈｌｅｒ）の特別号における“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ”（Ｅｄｓ．： Ｌ． Ｅｇｇｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｍ． Ｂｏｔｔ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ， ２００５）のにおいて、及びＴ． Ｓｃｈｅｐｅｒ （Ｍａｎａｇｉｎｇ Ｅｄｉｔｏｒ）による“Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ−Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ”（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７９， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ， ２００３）の本において見いだせる。
【０００７】
コリネバクテリウム・グルタミクムのゲノムのヌクレオチド配列は、Ｉｋｅｄａ及びＮａｋａｇａｗａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６２， ９９−１０９ （２００３））において、ＥＰ １ １０８ ７９０号において、及びＫａｌｉｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ ． （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０４／１−３， （２００３））において記載されている。
【０００８】
コリネバクテリウム・グルタミクムのゲノムのヌクレオチド配列は、同様に、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベースにおいて、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ （ＤＤＢＪ、Ｍｉｓｈｉｍａ、Ｊａｐａｎ）において、又はＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （ＥＭＢＬ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ又はＣａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）の核酸配列データベースにおいて入手できる。
【０００９】
コリネバクテリウム・グルタミクムからのα−イソプロピルリンゴ酸合成酵素をコードするｌｅｕＡ遺伝子は、特に以下に詳細に記載されている。
【００１０】
α−イソプロピルリンゴ酸合成酵素（ＩＰＭＳ、ＥＳ＝２．３．３．１３）は、３−カルボキシ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンタノエート（２−イソプロピルマレート）の形成のための３−メチル−２−オキソブタノエート（２−オキソイソバレレート、ケトイソバレレート）でのアセチル−ＣｏＡのアセチル基の縮合を触媒作用する。ｌｅｕＡ遺伝子は、１８５１塩基対（ｂｐ）を含み、かつＭ（ｒ）６８１８７を有するポリペプチドをコードする。生合成経路の第一工程を触媒作用する酵素について広範にわたるように、α−イソプロピルリンゴ酸合成酵素は、最終生成物のロイシンによるフィードバック調節を受ける（Ｐａｔｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６０：１３３−１４０（１９９４））。さらに、酵素は、二価のカチオン、特に亜鉛の存在で、補酵素Ａによって阻害される（Ｕｌｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １１０（３）：１１１８−１１２６（１９７２）；Ｔｒａｃｙ及びＫｏｈｌｈａｗ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ７２（５）： １８０２−１８０６ （１９７５））。
【００１１】
ＮＣＢＩデータベースの詳細にしたがって、コリネバクテリウム・グルタミクムからのα−イソプロピルリンゴ酸合成酵素をコードするｌｅｕＡ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１で示され、かつコードしたα−イソプロピルリンゴ酸合成酵素のそれらから得られるアミノ酸配列は配列番号４である。配列番号３において、上流及び下流に位置するヌクレオチド配列をさらに報告している。
【００１２】
本発明の目的は、細胞内の及び／又は培地中での生成物の改善した収率もしくはより高い最終濃度を有するケトイソカプロエート又はＬ−ロイシンを製造するための発酵方法を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、さらにロイシンの高い細胞内濃度の存在で、ケトイソカプロエート又はロイシンを製造することができる方法で改質した細胞を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、発酵のために使用した炭素基質の量に対してケトイソカプロエート又はロイシンの収率を改善することである。
【００１５】
本発明は、驚くべきことに、α−イソプロピルリンゴ酸合成酵素の突然変異が、ケトイソカプロエート及びロイシンの製造における増加を導くことが確立されている。あらゆる理論に縛られることなく、本発明は、この突然変異が、酵素のフィードバック阻害、すなわち生成物の酵素への結合によって媒介される酵素活性における減少を現象又はさらに排除すると考える。
【００１６】
“Ｌ−ロイシン”と道義的に使用されている“ロイシン”の表現は、それらの塩、例えば、Ｌ−ロイシンヒドロクロリド、Ｌ−ロイシンスルフェート又はカルシウム塩も含む。同様に、ケトイソカプロエート（ＫＩＣ）の表現は、それらの塩、例えばカルシウム−ＫＩＣ、カリウム−ＫＩＣ又はナトリウム−ＫＩＣも含む。
【００１７】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％、有利には≧９７％、特に有利には≧９８％、より特に有利には≧９９％、及び極めて有利には１００％の同一性であるアミノ酸配列をコードする単離されたヌクレオチド配列に関し、その際配列番号２の５５３位又はアミノ酸配列の対応する位置は、Ｌ−ロイシン以外のタンパク質新生アミノ酸である。
【００１８】
好ましい一実施態様において、本発明による核酸配列によってコードされるアミノ酸配列は、５５３位又は対応する位置で、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、システイン、セリン、トレオニン、リジン、アルギニン、グルタミン及びアスパラギンからなる群から、特に有利にはグルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸を有する。
【００１９】
好ましい一実施態様において、本発明による核酸配列によってコードされるアミノ酸配列は、５５３位又は対応する位置で、Ｌ−アスパラギン酸を有する。
【００２０】
好ましい一実施態様において、本発明による核酸配列は、配列番号５において示されている１６５７位又は対応する位置でグアニンを有する核酸配列である。
【００２１】
“アミノ酸配列の５５３位に対応する位置”又は“アミノ酸配列の５５３位と相容性の位置”の表現は、コードされたポリペプチドのＮ−末端領域（配列番号２の５５３位に基づく）においてアミノ酸をコードするコドンの挿入又は欠失によって、位置ステートメント及び長さステートメントを、挿入の場合に１単位だけ形式的に増加させ、又は欠失の場合に一単位だけ減少させることを意味する。同様に、コードされたポリペプチドのＣ−末端領域（５５３位に基づく）においてアミノ酸をコードするコドンの挿入又は欠失によって、長さステートメントを、挿入の場合に１単位だけ形式的に増加させ、又は欠失の場合に１単位だけ減少させる。かかる比較可能な位置は、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２、４６３７−４６８０（１９９４））又はＭＡＦＦＴ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ（Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ２００５；１６（１）、２２−３３）を使用して、“アライメント”の形でのアミノ酸配列の比較によって容易に同定されてよい。
【００２２】
かかる挿入及び欠失は、酵素活性に実質的に影響しない。“実質的に影響しない”とは、前記変異体の酵素活性が、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドの活性と、最大１０％、最大７．５％、最大５％、最大２．５％又は最大１％だけ異なることを意味する。
【００２３】
イソプロピルリンゴ酸合成酵素の酵素活性を測定するための方法は、Ｋｏｈｌｈａｗ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １６６：４２３−９（１９８８））において記載されており、その試験は、ＣｏＡでの還元によってＤＴＮＢ（５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）、エルマン試薬）から形成されるチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）によって４１２ｎｍでの吸光度における変化を測定することに基づく。
【００２４】
本発明は、同様に、１つ以上の挿入又は欠失を含む、ヌクレオチド配列、及びかかる配列を含み、かつ配列番号２又は６のポリペプチド変異体をコードする核酸分子にも関する。有利には、ポリペプチドは、最大５、最大４、最大３又は最大２のアミノ酸の挿入又は欠失を含む。
【００２５】
コリネバクテリウム種の微生物、特にコリネバクテリウム・グルタミクムから単離された酵素イソプロピルリンゴ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列を複製できることが好ましく、それによってコードされたタンパク質配列は、配列番号２の５５３位二対応する位置でＬ−チロシン以外のタンパク質新生アミノ酸を含む。
【００２６】
さらに、酵素イソプロピルリンゴ酸合成酵素をコードし、かつコリネバクテリウム種の微生物、特にコリネバクテリウム・グルタミクムから単離された複製可能なヌクレオチド配列（ＤＮＡ）が特に好ましく、その際関連するアミノ酸配列は、配列番号６において示される位置５５３でＬ−アスパラギン酸を含む。
【００２７】
本発明は、さらに、酵素イソプロピルリンゴ酸合成酵素をコードし、かつコリネバクテリウム種の微生物、特にコリネバクテリウム・グルタミクムから単離された複製可能なヌクレオチド配列（ＤＮＡ）に関し、その塩基配列は、ヌクレオチド配列が配列番号５において示される位置１６５７でグアニンを含む塩基配列である。
【００２８】
本発明は、さらに、本発明によるヌクレオチド配列を含み、かつ場合により、コリネバクテリウム種の微生物中で複製し、又はそれらに適しているプラスミド及びベクターに関する。
【００２９】
本発明は、さらに、本発明によるヌクレオチド配列、ベクター及びポリペプチドを含むコリネバクテリウム種の微生物に関する。
【００３０】
本発明は、さらに、本発明によるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。代表的なポリペプチドを配列番号６において示す。
【００３１】
特に好ましい一実施態様において、本発明によるポリペプチド、又は本発明によるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、又は本発明による微生物を含むポリペプチドは、野生型酵素に関連する減少させたフィードバック阻害を有する改質したＩＰＭＳであり、すなわちその酵素は、その生成物の１つ又は代謝においてそれらから形成された代謝物、例えばＫＩＣ又はＬ−ロイシンによって野生型酵素よりも阻害しない。
【００３２】
本発明は、有利には、さらに、本発明によるヌクレオチド配列、ベクター及び／又はポリペプチドを含むコリネバクテリウム種の微生物中に関し、その微生物において、イソプロピルリンゴ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列は、有利には過剰発現した形で存在する。
【００３３】
本発明は、さらに、本発明によるヌクレオチド配列を含み、かつイソプロピルリンゴ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列が有利には過剰発現した形で存在するコリネバクテリウム種の微生物に関し、その際関連するアミノ酸配列は、配列番号６で示される５５３位でＬ−アスパラギン酸を含む。
【００３４】
配列番号２の５５３位でのアミノ酸変換によって特徴付けられるイソプロピルリンゴ酸合成酵素をコードする本発明によるヌクレオチド配列を生じるために、先行技術に記載されている突然変異法を使用する。
【００３５】
突然変異のために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法、例えば突然変異誘発オリゴヌクレオチド（Ｔ． Ａ． Ｂｒｏｗｎ：Ｇｅｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｆｉｉｒ Ｅｉｎｓｔｅｉｇｅｒ［Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｕｅｒ ｂｅｇｉｎｎｅｒｓ］、Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、１９９３）、又はＮｅｗｔｏｎ及びＧｒａｈａｍによるハンドブック（ＰＣＲ、Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、１９９４）において記載されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してよい。
【００３６】
突然変異体を生じるためのさらなる説明は、先行技術、並びに遺伝学及び分子生物学の公知の教本、例えばＫｎｉｐｐｅｒｓによる教本（“Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｋ”［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ］、第６版、Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１９９５）、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒによる教本（“Ｇｅｎｅ ｕｎｄ Ｋｌｏｎｅ”［Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｓ］、ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１９９０）又はＨａｇｅｍａｎｎによる教本（“Ａｌｌｇｅｍｅｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｋ”［Ｇｅｎｅｒａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ］、Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、１９８６）において見いだせる。
【００３７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ法を使用する場合に、野生型の株の単離された合計ＤＮＡから出発する先行技術において記載されているｌｅｕＡ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅し、場合により適したプラスミドベクター中にクローンし、そしてそのＤＮＡに突然変異誘発法を受けさせる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用するＤＮＡ配列の増幅のための教授は、当業者によって、特にＧａｉｔによるハンドブック：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ、１９８４）において、及びＮｅｗｔｏｎ及びＧｒａｈａｍ：ＰＣＲ（Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１９９４）において見いだされてよい。そして適したｌｅｕＡ対立遺伝子を、単離、調査及び配列決定する。この目的のための教授を、例えばＫａｌｉｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２４：３１７−３２４（１９９０））、Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：１１９７−２０４（１９９１））又はＦｏｌｌｅｔｔｉｅ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７５、４０９６−４１０３（１９９３））において見出してよい。配列決定に対する教授を、例えばＳａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、７４：５４６３−５４６７、（１９７７））において見出してよい。
【００３８】
従って、本発明は、酵素イソプロピルリンゴ酸合成酵素をコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５において示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【００３９】
本発明は、さらに、酵素イソプロピルリンゴ酸合成酵素をコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５において示されるヌクレオチド配列を含み、又はそれらからなる。
【００４０】
生物、例えば微生物において生じるようなヌクレオチド配列の生化学又は化学構造に関する詳細は、特に、Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．による教本“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ”［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ］（Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、２００３；ＩＳＢＮ ３−８２７４−１３０３−６）において見いだしてよい。
【００４１】
好ましい一実施態様において、“ヌクレオチド配列”又は“アミノ酸配列”は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらの改質型からなる群からの核酸分子、又は特定の配列、例えば他の配列と融合している、もしくはそれらからなるポリペプチドを意味する。
【００４２】
ヌクレオチド配列が、核酸塩基又は塩基のアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）を有するデオキシリボヌクレオチドからなる場合に、これは、デオキシリボヌクレオチド配列又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として記載される。ヌクレオチド配列が、核酸塩基又は塩基のアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を有するリボヌクレオチドからなる場合に、これは、リボヌクレオチド配列又はリボ核酸（ＲＮＡ）として記載される。前記ヌクレオチド配列において、モノマーは、３’から５’のホスホジエステル結合によって互いに共有結合する。
【００４３】
遺伝子は、化学的観点から、ヌクレオチド配列である。タンパク質／ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ここで、“遺伝子”の表現と同義的に使用される。“遺伝子”及び“コード領域”の２つの表現は同義的に使用され、かつある場合に、“タンパク質”及び“ポリペプチド”である。
【００４４】
“タンパク質新生アミノ酸”は、天然タンパク質中で、すなわち微生物、植物、動物及びヒトからのタンパク質中で生じるアミノ酸を意味する。それらは、ペプチド結合によって互いに連結されているタンパク質のための構造単位として提供される。
【００４５】
以下でタンパク質新生Ｌ−アミノ酸を挙げる場合に、これは、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ−バリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリン、並びに場合によりＬ−セレノシステイン及びＬ−ピロリジンから選択される、それらの塩を含む１つ以上のアミノ酸を意味する。Ｌ−アミノ酸は同様にＬ−ホモセリンを含む。特に、Ｌ−アミノ酸のＬ−ロイシンが好ましい。
【００４６】
過剰発現は、一般的に、出発株（親株）又は野生株（これが出発株である場合に）と比較して、リボ核酸、タンパク質（ポリペプチド）又は酵素の細胞内濃度又は活性における増加を意味する。出発株（親株）は、過剰発現を導く方法を実施する株を意味する。
【００４７】
過剰発現において、組換え過剰発現の方法が好ましい。これらは、微生物がｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれるＤＮＡ分子を使用して製造される全ての方法を含む。かかるＤＮＡ分子は、例えば、プロモーター、発現カセット、遺伝子、対立遺伝子、コード領域等を含む。これらは、形質転換、接合、形質導入又は同様の方法の方法によって所望の微生物中に導入される。
【００４８】
発現又は過剰発現の範囲は、遺伝子によって転写されたｍＲＮＡの量を測量することによって、ポリペプチドの量を測定することによって、又は酵素活性を測定することによって確立されてよい。
【００４９】
ｍＲＮＡの量を測定するために、特に、ノーザンブロット法及び定量ＲＴ−ＰＣＲを使用してよい。定量ＲＴ−ＰＣＲにおいて、逆転写を、ポリメラーゼ連鎖反応の上流に連結する。この目的のために、Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒTM Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、例えばＪｕｎｇｗｉｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８１、１９０−１９７（２００８））において記載されているように使用してよい。タンパク質の濃度を、１次元及び２次元タンパク質ゲル分離及び続く対応する評価ソフトウェアを使用するゲル中のタンパク質の光学同定によって測定してよい。コリネフォルム細菌のためのタンパク質ゲルの製造のための及びタンパク質を同定するための通常の方法は、Ｈｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２２：１７１２−２３（２００１））によって記載されている方法である。タンパク質濃度を、同様に、検出されるべきタンパク質のための抗体特異性を有するウェスタンブロットハイブリダイゼーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． ２nd Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）、及び続く濃度を測定するための対応するソフトウェアでの光学評価（Ｌｏｈａｕｓ及びＭｅｙｅｒ（１９９８）Ｂｉｏｓｐｅｋｔｒｕｍ ５：３２−３９；Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ ３２１：２６３０−２６４７ （１９９９））によって測定できる。得られたデータの統計的有意性を、Ｔ試験（Ｇｏｓｓｅｔ， Ｂｉｏｍｅｔｒｉｋａ ６（１）：１−２５（１９０８））を使用して測定する。
【００５０】
過剰発現を得るために、先行技術において、多様な方法が入手できる。これらは、さらに、遺伝子の発現を制御するヌクレオチド配列を改質すること及びコピー数を増加することも含む。
【００５１】
コピー数は、微生物の細胞質中で複製するプラスミドによって増加されうる。この目的のために、先行技術において、多数のプラスミドは、遺伝子のコピー数における所望の増加を設定できるプラスミドを有する最も広い群の微生物について記載されている。コリネバクテリウム種の適した微生物は、例えばＴａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０４（１−３）、２７−４０、（２００３））において、又はＳｔａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７１、５９２０−５９２８（２００５））において記載されている。
【００５２】
コピー数は、さらに、微生物の染色体中に他のコピーを挿入することによる少なくとも１つの（１）コピーによって増加されうる。コリネバクテリウム種に適した方法は、例えば、特許文献ＷＯ ０３／０１４３３０号、ＷＯ ０３／０４０３７３号及びＷＯ ０４／０６９９９６号において記載されている。
【００５３】
遺伝子発現を、さらに、複数のプロモーターが、所望の遺伝子の上流に配置され、かつ発現されるべき遺伝子に機能的に連結され、そしてこの方法で増加した発現を得ることで、増加できる。それらの例は、特許文献ＷＯ ２００６／０６９７１１号において記載されている。
【００５４】
遺伝子の転写を、転写を抑制するタンパク質（リプレッサータンパク質）、又は転写を促進するタンパク質（活性化タンパク質）によって制御してよい。従って、過剰発現を得るために、同様に、活性タンパク質の発現を増加すること、又はリプレッサータンパク質を低減させること、又はそれらを消失すること、又はリプレッサータンパク質の結合部位を除去することが可能である。
【００５５】
伸長の速度はコドンの使用に影響し、しばしば出発株において生じるトランスファー（ｔ）−ＲＮＡのためのコドンの使用は、翻訳を増幅しうる。さらに、多くの微生物において最も多く生じる（大腸菌において７７％）出発コドンのコドンＡＴＧへの変換は、多くの翻訳をたかめ、それというのも、ＲＮＡレベルで、コドンＡＵＧは、例えばコドンＧＵＧ及びＵＵＧよりも２〜３倍有効であるからである（Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３２（２）：３６９−７１（１９８８）；Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ ８２（１７）：５６５６−６０（１９８５））。また、出発コドンの配列環境を最適化でき、それというのも、出発コドンとフランキング領域との間の相互作用が記載されているからである（Ｓｔｅｎｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ ２７３（２）：２５９−６５（２００１）；Ｈｕｉ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ３（３）：６２３−９（１９８４））。
【００５６】
ＤＮＡ、ＤＮＡの消化及びライゲーション、形質転換、並びに形質転換体のスクリーニングの取扱いに対する説明を、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．によるハンドブック“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”、第二版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）において見出してよい。
【００５７】
本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターにも関連する。
【００５８】
Ｋｉｒｃｈｎｅｒ及びＴａｕｃｈ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０４：２８７−２９９（２００３））は、コリネバクテリウム・グルタミクムにおいて使用されるべきベクターの選択を記載している。
【００５９】
本発明は、さらに、本発明によるヌクレオチド配列を染色体に組込むことを特徴とする、本発明による微生物に関する。相同組換えは、本発明によるベクターの使用で、染色体上のＤＮＡ部分の、ベクターによって細胞に導入された本発明によるポリヌクレオチドへの変換を可能にする。ベクターの環状ＤＮＡ分子と染色体上の標的ＤＮＡとの効率的な組換えのために、本発明によるポリヌクレオチドを含む変換されるべきＤＮＡ領域は、末端で、ヌクレオチド配列相同体で標的部位に提供され、これらは、ベクターの組込みの部位及びＤＮＡの変換部位を決定する。
【００６０】
例えば、本発明によるポリヌクレオチドを、染色体における天然遺伝子部位で天然ｌｅｕＡに変換され、又は他の遺伝子部位で組込むことができる。
【００６１】
発現又は過剰発現を、有利には、コリネバクテリウム種の微生物中で実施する。コリネバクテリウム種に関して、次の種に基づく株が好ましい：コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）（このタイプの株はＤＳＭ４４５４９として示される）、コリネバクテリウム・グルタミクム（このタイプの株はＡＴＣＣ１３０３２として示される）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）（このタイプの株はＡＴＣＣ６８７１として示される）。コリネバクテリウム・グルタミクムの種が非常に特に好ましい。
【００６２】
コリネバクテリウム・グルタミクムの種のいくつかは、先行技術において他の名前でも知られている。これらは、例えばコリネバクテリウム・アセトアシドフィリウム（Corynebacterium acetoacidophilum）と言われる株ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）と言われる株ＤＳＭ２０１３７、コリネバクテリウム・メラセコラ（Corynebacterium melassecola）と言われる株ＡＴＣＣ１７９６５、ブレビバクテリウム・フラブム（Brevibacterium flavum）と言われる株ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Brevibacterium lactofermentum）と言われる株ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ジバリカタム（Brevibacterium divaricatum）と言われる株ＡＴＣＣ１４０２０を含む。
【００６３】
コリネバクテリウム・グルタミクムについて“ミクロコッカス・グルタミクム”の表現を同様に使用する。コリネバクテリウム・エフィシエンスのいくつかは、先行技術において、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、例えば株ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９とも言われる。
【００６４】
フィードバック耐性ＩＰＭＳを導入する方法のために使用される微生物又は株（出発株）は、有利には、既に、ＫＩＣ又はＬ−ロイシンを周囲の栄養培地中に分泌し、そしてそれらを蓄積する可能性を示す。このプロセスのために、以下で、“製造”の表現も使用する。特に、過剰発現法のために使用される株は、細胞中で又は栄養培地中で、≦１２０時間、≦９６時間、≦４８時間、≦３６時間、≦２４時間又は≦１２時間で（≦は多くともを意味する）、≧０．１０ｇ／ｌ、０．２５ｇ／ｌ、≧０．５ｇ／ｌ、≧１．０ｇ／ｌ、≧１．５ｇ／１ｌ、≧２．０ｇ／ｌ、≧４ｇ／ｌ又は≧１０ｇ／ｌの（≧は少なくともを意味する）Ｌ−ロイシン又はＫＩＣを蓄積する能力を示す。出発株は、有利には、突然変異誘発及びスクリーニングによって、組換えＤＮＡ技術によって、又は双方の組合せによって製造される株である。
【００６５】
野生株中で、例えばコリネバクテリウム・グルタミクムのタイプの株ＡＴＣＣ １３０３２中で又は株ＡＴＣＣ １４０６７中で、最初に、配列番号５に従った本発明によるプリヌクレオチドを挿入して、そして微生物を、先行技術に記載の他の遺伝的方法によって生じ、所望のＫＩＣ又はＬ−ロイシンを製造する本発明の方法に適した微生物で得ることもできることは当業者に理解できる。
【００６６】
この群の細菌の株の分類学的分類についての情報は、特に、Ｓｅｉｌｅｒ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １２９、１４３３−１４７７（１９８３））、Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ（１９８５、Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ、ｐ． １１５−１４２． Ｉｎ： Ｄｅｍａｉｎ ａｎｄ Ｓｏｌｏｍｏｎ（ｅｄ）、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ． Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）、Ｋａｅｍｐｆｅｒ及びＫｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔ（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４２、９８９−１００５（１９９６））、Ｌｉｅｂｌ ｅｔ ａｌ．（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ４１、２５５−２６０（１９９１））において及びＵＳ−Ａ−５，２５０，４３４号において見いだせる。
【００６７】
“ＡＴＣＣ”の名称を有する株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から得られる。“ＤＳＭ”の名称を有する株は、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ、Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。“ＮＲＲＬ”の名称を有する株は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＲＳ、Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、ＵＳ）から得られる。“ＦＥＲＭ”の名称を有する株は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＡＩＳＴ Ｔｓｕｋｕｂａ Ｃｅｎｔｒａｌ ６、１−１−１ Ｈｉｇａｓｈｉ、Ｔｓｕｋｕｂａ Ｉｂａｒａｋｉ、Ｊａｐａｎ）から得られる。
【００６８】
ＫＩＣ分泌株又はＫＩＣ製造株は、例えば以下に基づく：
コリネバクテリウム・グルタミクムの株ＡＴＣＣ １３０３２、
ブレビバクテリウム・フラブムの株ＡＴＣＣ １４０６７、及び
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムの株ＡＴＣＣ １３８６９。
【００６９】
ケトイソカプロエートの製造との組合せで、さらに、有利には、以下の群から選択されるケトイソカプロエートの生合成の酵素をコードするヌクレオチド配列の１つ以上の遺伝子を（過剰）発現する：
ａ） アセトラクテート合成酵素（ＩｌｖＢＮ、ＥＣ Ｎｏ．：４．１．３．１８）のサブユニットをコードするポリヌクレオチド（ｉｌｖＢ遺伝子及びｉｌｖＮ遺伝子）
ｂ） イソメロレダクターゼ（ＩｌｖＣ、ＥＣ Ｎｏ．：１．１．１．８６）をコードするポリヌクレオチド（ｉｌｖＣ遺伝子）
ｃ） ジヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ（ＩｌｖＤ、ＥＣ Ｎｏ．：４．２．１．９）をコードするポリヌクレオチド（ｉｌｖＤ遺伝子）
ｄ） トランスアミナーゼ（ＩｌｖＥ、ＥＣ Ｎｏ．：２．６．１．４２）をコードするポリヌクレオチド（ｉｌｖＥ遺伝子）
ｅ） イソプロピルリンゴ酸合成酵素（ＬｅｕＡ、ＥＣ Ｎｏ．：２．３．３．１３）をコードするポリヌクレオチド（ｌｅｕＡ遺伝子）
ｆ） イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＢ、ＥＣ Ｎｏ．：１．１．１．８５）をコードするポリヌクレオチド（ｌｅｕＢ遺伝子）
ｇ） イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（ＬｅｕＣ、ＥＣ Ｎｏ．：４．２．１．３３）をコードするポリヌクレオチド（ｌｅｕＣ遺伝子）
ｈ） イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼの小さいサブユニット（ＬｅｕＤ、ＥＣ Ｎｏ．：４．２．１．３３）をコードするポリヌクレオチド（ｌｅｕＤ遺伝子）
ここで、遺伝子ｉｌｖＢＮ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＡ、ｌｅｕＢ、ｌｅｕＣ及びｌｅｕＤが、α−イソカプロン酸（ＫＩＣ）のために特に好ましい。
【００７０】
本発明は、ＫＩＣ又はＬ−ロイシンを製造する微生物を提供し、その際該微生物は、配列番号５に従った本発明によるポリヌクレオチドの使用のためにフィードバック耐性α−イソプロピルリンゴ酸合成酵素を有する。
【００７１】
ファインケミカルＫＩＣ又はＬ−ロイシンを製造するための発酵プロセスは、次の工程を含む：
ａ）培地中で請求項７から１２のいずれか１に記載の微生物の１つを発酵する工程、
ｂ）培地中でＫＩＣ又はＬ−ロイシンを蓄積する工程、
ここで、発酵ブロスが得られる。この場合に、ファインケミカル又は液体もしくは固体のファインケミカル含有生成物が、ファインケミカル含有発酵ブロスから得られる。
【００７２】
本発明によるかかる方法の使用は、ケトイソカプロエート製造に関連する実施例４において示されているように、又はＬ−ロイシン製造に関連する実施例５において示されているように、それぞれの出発株と比較して収率における極端な増加を導く（実施例４、ＫＩＣ：０．０２７ｇ／ｇ 対 ０．０１２ｇ／ｇ；実施例５、ロイシン：０．０４１ｇ／ｇ 対 ０．００２ｇ／ｇ）。
【００７３】
さらに、本発明による微生物は、ＫＩＣ又はＬ−ロイシンを製造することが特に好ましく、さらにより有利にはＫＩＣ又はＬ−ロイシンを培地中で分泌する。製造された微生物を、連続して（例えばＷＯ ０５／０２１７７２号において記載されているように）又は不連続的に、バッチ法（バッチ培養又はバッチ法）で、又はフェドバッチもしくは反復フェドバッチ法で、所望の有機化学化合物の製造の目的のために培養してよい。公知の培養方法に関する一般的なタイプの要約は、Ｃｈｍｉｅｌによるテキスト（Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ １． Ｅｉｎｆｕｅｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄｉｅ Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ ［Ｐｒｏｃｅｓｓ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １． Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ］ （Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、１９９１））において、又は
Ｓｔｏｒｈａｓによるテキスト（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ ｕｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ ［Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ］ （Ｖｉｅｗｅｇ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、１９９４））において入手できる。
【００７４】
使用されるべき培地又は発酵培地は、それぞれの株の要求を適切に満たす必要がある。種々の微生物の培地の記載は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙのハンドブック“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡ、１９８１）において含まれる。培地及び発酵培地又は媒質は、相互に交換可能である。
【００７５】
炭素源として、糖及び炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、甜菜糖又はサトウキビの加工からのスクロース含有溶液、デンプン、デンプン加水分解物及びセルロース、オイル及び脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ油、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸、アルコール、例えばグリセロール、メタノール及びエタノール、並びに有機酸、例えば酢酸又は乳酸を使用してよい。
【００７６】
窒素源として、有機窒素化合物、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンシロップ水、大豆ミール及び尿素又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムを使用してよい。窒素源を、個々で又は混合物として使用してよい。
【００７７】
リン源として、リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウム又は対応するナトリウム含有塩を使用してよい。
【００７８】
培養液は、さらに、成長のために必要である塩、例えば金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム及び鉄の塩化物又は硫酸塩、例えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄の形で含む必要がある。最終的に、必須の成長物質、例えばアミノ酸、例えばホモセリン及びビタミン、例えばチアミン、ビオチン又はパントテン酸を、前記物質に加えて使用してよい。
【００７９】
前記出発材料を、シングルバッチの形で培養液に添加してよく、又は培養中に適した方法で供給してよい。
【００８０】
塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水、又は酸性化合物、例えばリン酸もしくは硫酸を、培養のｐＨ制御のための適した方法で使用する。ｐＨを、一般に、６．０〜８．５、有利には６．５〜８に調整する。泡の発生を制御するために、脱泡剤、例えば脂肪酸のポリグリコールエステルを使用してよい。プラスミドの安定性を維持するために、適切に選択した作用物質、例えば抗生物質を、培地に添加してよい。発酵を、有利には、好気的条件化で実施する。該好気的条件を維持するために、酸素又は酸素含有ガス混合物、例えば空気を、培養物中に導入する。過酸化水素で富化した液体の使用が同様に可能である。場合により、発酵を、超大気圧で、例えば０．０３〜０．２ＭＰａの超大気圧で実施する。培養物の温度は、通常、２０℃〜４５℃、及び有利には２５℃〜４０℃、特に有利には３０℃〜３７℃である。バッチ又はフェドバッチの場合において、有利には、所望の有機化学化合物を得る基準に十分な量を形成させるまで、培養を続ける。この目的は通常１０時間〜１６０時間以内で達せられる。連続プロセスにおいて、より長い培養時間が可能である。微生物の活性のために、発酵培地における及び／又は微生物の細胞におけるファインケミカルの富化（蓄積）が生じる。
【００８１】
適した発酵培地の例は、特に、ＵＳ ５，７７０，４０９号、ＵＳ ５，９９０，３５０号、ＵＳ ５，２７５，９４０号、ＷＯ ２００７／０１２０７８号、ＵＳ ５，８２７，６９８号、ＷＯ ２００９／０４３８０３号、ＵＳ ５，７５６，３４５号又はＵＳ ７，１３８，２６６号において見出してよく、適した変更を、場合により使用した株の要求まで実施してよい。
【００８２】
Ｌ−アミノ酸を、Ｓｐａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１１９０〜１２０６（１９５８年））において記載されているように、イオン交換クロマトグラフィー、有利には陽イオン交換クロマトグラフィー、続いてニンヒドリンを使用するポストカラム誘導体化法によるＬ−アミノ酸の分離による発酵の過程における１つ以上の時点で濃度の測定のために分析してよい。ニンヒドリンの代わりに、オルト−フタルジアルデヒドをポストカラム誘導体化法のために使用してもよい。イオン交換クロマトグラフィーに対する総説は、Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ（ＬＣ−ＧＣ（Ｍａｇａｚｉｎｅ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ）７（６）、４８４−４８７（１９８９））において見出してよい。
【００８３】
同様に、オルト−フタルジアルデヒド又はフェニルイソチオシアネートを使用するプレカラム誘導体化法を実施して、有利には高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の形で逆相クロマトグラフィーによって得られたアミノ酸誘導体を分離することもできる。かかる方法は、例えば、Ｌｉｎｄｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ． （Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１： １１６７−１１７４ （１９７９））において記載されている。
【００８４】
検出を測光法（吸収、蛍光）で実施する。
【００８５】
アミノ酸分析に対する提示の要約は、特にＬｏｔｔｓｐｅｉｃｈ及びＺｏｒｂａｓによる参考書“Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ”［Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ］（Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ １９９８）において見出してよい。
【００８６】
発酵の過程における１つ以上の時点で濃度を測定するためのα−ケト酸、例えばＫＩＣの分析を、Ｈ＋形で、例えば０．０２５Ｎ硫酸を使用し続いて２１５ｎｍ（代わりに２３０又は２７５ｎｍでも）でのＵＶ検出でスルホン化スチレン−ジビニルベンゼンポリマー上で、イオン交換クロマトグラフィー、有利には陽イオン交換クロマトグラフィーによってケト酸及び他の分泌生成物を分離することによって実施してよい。有利には、ＲＥＺＥＸ ＲＦＱ−Ｆａｓｔ Ｆｒｕｉｔ Ｈ＋カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を使用してよく、分離相について他の供給者（例えばＢｉｏＲａｄ社製のＡｍｉｎｅｘ）が可能である。同様に分離は、供給者の対応する適用例において記載されている。
【００８７】
濃度（体積毎の形成した化合物）、収率（消費した炭素源毎の形成した化合物）、構成（体積及び時間毎の形成した化合物）及び特定の構成（細胞乾燥質量又は生体乾燥質量毎の形成した化合物、並びに細胞タンパク質及び時間毎の形成した時間又は化合物）、又は他のプロセスパラメータ及びそれらの組合せに関する本発明によるプロセス又は発酵プロセスの実施は、本発明によるプロモーター変異体が存在する微生物でのプロセス又は発酵プロセスに対して、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも１．５％又は少なくとも２％だけ増加する。
【００８８】
発酵の測定のために、所望のファインケミカル、有利にはアミノ酸又は有機酸を含有する発酵ブロスを得る。
【００８９】
そして、ファインケミカルを含有する液体又は固体の形での生成物を提供し、又は製造し、又は得る。
【００９０】
発酵ブロスは、好ましい一実施態様において、微生物をある時間又はある温度で培養する発酵培地又は栄養培地を意味する。発酵培地、又は発酵中に使用される培地は、所望の化合物の製造を確実にし、かつ典型的に成長及び／又は生存を確実にする全ての物質又は構成成分を含む。
【００９１】
発酵の完了に関して、得られた発酵ブロスは、したがって、
ａ）微生物の細胞の成長から得られる微生物のバイオマス（細胞質量）、
ｂ）発酵の過程において形成される所望のファインケミカル、
ｃ）恐らく発酵の過程において形成される有機副生成物、及び
ｄ）使用した発酵培地の成分、又は発酵によって消費されない出発材料、例えばビタミン、例えばビオチン、もしくは塩、例えば硫酸マグネシウムの成分
を含む。
【００９２】
有機副生成物は、それぞれの所望の化合物に加えて、発酵において使用した微生物によって生じ、かつ恐らく分泌される物質を含む。
【００９３】
発酵ブロスを、場合により採取され、かつファインケミカルを含有する液体又は固体の形で生成物を提供するために使用される培養容器又は発酵コンテナから抜き出す。“ファインケミカル含有生成物を得ること”の表現もそれらのために使用する。最も簡単な場合に、発酵コンテナから抜き出されたファインケミカル含有発酵ブロスは、それ自体得られた生成物である。
【００９４】
以下、
ａ） 部分的（＞０％〜＜８０％）から完全な（１００％）又は事実上完全な（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％）、水の除去、
ｂ） 部分的（＞０％〜＜８０％）から完全な（１００％）又は事実上完全な（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％）、バイオマスの取り出し、ここで、これは場合により取り出し前に不活性化される、
ｃ） 部分的（＞０％〜＜８０％）から完全な（１００％）又は事実上完全な（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、≧９９．３％、≧９９．７％）、発酵の過程で形成された有機副生成物の取り出し、及び
ｄ） 部分的（＞０％）から完全な（１００％）又は事実上完全な（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、≧９９．３％、≧９９．７％）、使用した発酵培地の構成成分又は発酵によって消費されない出発材料の取り出し
の群から選択された１つ以上の測定によって、所望の有機化学化合物の濃度又は精製を、発酵ブロスから得る。この方法で、化合物の所望の含有率を有する生成物を単離する。
【００９５】
部分的（＞０％〜＜８０％）から完全な（１００％）又は事実上完全な（≧８０％〜＜１００％）、水の取り出し（測定ａ）は、乾燥ともいう。
【００９６】
前記プロセスの変法において、完全な又は事実上完全な水、バイオマス、有機副生成物及び使用した発酵培地の消費されない構成成分の取り出しによって、所望の有機化学化合物、有利にはＬ−アミノ酸の純な（≧８０質量％、≧９０質量％）又は高純度の（≧９５質量％、≧９７質量％、≧９９質量％）形が、巧く得られる。ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）による測定のために、非常に多様な技術指示が先行技術において入手できる。
【００９７】
コリネバクテリウム属の細菌を使用して、ＫＩＣ又はＬ−ロイシンを製造するためのプロセスの場合に、発酵ブロスのあらゆる構成成分を含まない生成物を得るプロセスが好ましい。これらの生成物を、特に、ヒト用薬物において、医薬品産業において、及び食品産業において使用する。
【００９８】
本発明によるプロセスは、ＫＩＣ又はＬ−ロイシンの発酵性製造のために提供する。
【００９９】
本発明は、最終的に、ＫＩＣ又はＬ−ロイシンの発酵性製造のための本発明による微生物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ｌｅｕＡ＿Ｙ５５３Ｄのマップを示す図。
【０１０１】
本発明を、例示的な実施態様に関連して、以下でより詳細に記載する。
【０１０２】
実施例１
変換ベクターｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ｌｅｕＡ＿Ｙ５５３Ｄの製造
８１２ｂｐの長い変換構成物の合成を、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した（配列番号７を参照）。その断片は、野生型ｌｅｕＡ遺伝子の最後の５９４ｂｐ（Ｃ末端）〜ＡＴＣＣ１３０３２のｌｅｕＡ遺伝子の下流領域の２０６ｂｐ、並びにベクターｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ中へのクローニングのために要求されるＳｐｈｌ及びＢａｍＨＩ切断部位を含む。ｌｅｕＡ遺伝子の３’末端の上流の１９５位で、この変換断片において、塩基Ｔを、塩基Ｇに突然変異し、これは、野生型コドンＴＡＣ（アミノ酸Ｙ、チロシンをコードする）をコドンＧＡＣ（アミノ酸Ｄ、アスパラギン酸をコードする）に変換する。断片をベクターｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ中にクローニングすることを、ＧｅｎｅＡｒｔ社で実施した。得られた変換ベクターｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ｌｅｕＡ＿Ｙ５５３Ｄを、ＧｅｎｅＡｒｔによって提供し、そして実施例の株を製造するために使用した（実施例３を参照）。
【０１０３】
実施例２
株Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｉｌｖＥの製造
株Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２を、プラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ＿ＤｉｌｖＥ（Ｍａｒｉｅｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ ． ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８７：７６３９−７６４６ （２００５））でエレクトロポレーションによって形質転換した。エレクトロポレーションを、Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６１： ３２９−３３４ （１９８９））のプロトコルに従って実施した。
【０１０４】
プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ又はｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ＤｉｌｖＥは、独立してＣ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２を複製できず、かつ組換えの結果として染色体中に組込まれている場合に細胞中で維持されるのみであった。組込まれたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ＤｉｌｖＥを有するクローンのスクリーニングを、エレクトロポレーションバッチ又はカナマイシン１５ｍｇ／ｌで補ったＬＢ寒天（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ ． ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９）をプレートアウトすることによって実施した。成長したクローンを、カナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＬＢ寒天プレート上に画線し、そして３３℃で１５時間インキュベートした。第二の組換えの結果としてプラスミドを切り出した（ｅｘｃｉｚｅ）突然変異体のスクリーニングのために、クローンを、非選択的にＬＢ液体培地（＋酢酸カリウム５ｇ／ｌ）中で２０時間培養し、そして１０％スクロースを含有するＬＢ寒天上に画線し、そして２４時間インキュベートした。
【０１０５】
プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ＤｉｌｖＥは、出発プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢと同様に、カナマイシン耐性遺伝子に加えて、枯草菌（Bacillus subtilis）からのレバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子のコピーを含む。スクロース誘導性発現は、レバン、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍについての毒性生成物の合成を触媒作用するレバンスクラーゼの形成を導く。スクロースを有するＬＢ寒天（酢酸カリウム５ｇ／ｌを含有する）上で、したがって、それらのクローンのみが成長し、組込まれたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢが再度切り出される。切り出しにおいて、プラスミドと一緒に、ｉｌｖＥの完全な染色体コピーを切り出すか、又はｉｌｖＥの内部消失で不完全なコピーであってよい。
【０１０６】
約４０〜５０コロニーを、表現型“スクロースの存在での成長”及び“カナマイシンの存在での非成長”について試験した。消失したｉｌｖＥ対立遺伝子は、染色体において残り、表現型“スクロースの存在での成長”及び“カナマイシンの存在での非成長”を有する約２０コロニーを、ポリメラーゼ連鎖反応を使用するＩｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．の標準ＰＣＲ法（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， １９９０， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）にしたがって研究した。この場合に、コロニーの染色体ＤＮＡから、消失したｉｌｖＥ領域の周辺領域を有する１つのＤＮＡ断片を増幅した。次のプライマーオリゴヌクレオチドをＰＣＲのために選択した。
【０１０７】
0006341907.tif 000002
【０１０８】
プライマーは、完全なｉｌｖＥ遺伝子座を有する対照クローンにおいて、約１．４ｋｂサイズのＤＮＡ断片の増幅を可能にする。消失したａｒｇＦＲＧＨ遺伝子座を有するクローンにおいて、約０．６ｋｂのサイズを有するＤＮＡ断片を増幅した。
【０１０９】
増幅したＤＮＡ断片を、０．８％濃度のアガロースゲル中で電気泳動によって同定した。それにより、その株が、染色体上で消失したｉｌｖＥを有することを示すことができた。その株を、Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｉｌｖＥと名付け、そしてそのイソカプロエートを製造する能力について生産試験（実施例４を参照）で試験した。
【０１１０】
実施例３
株Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｉｌｖＥ＿ｌｅｕＡＹ５５３Ｄ及びＣ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡＹ５５３Ｄの製造
株Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２及び実施例２からの株Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｉｌｖＥを、実施例１からのプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ｌｅｕＡ＿Ｙ５５３Ｄでエレクトロポレーションにより形質転換した。その方法は、実施例２において詳細に記載されている。
【０１１１】
野生型コドンＴＡＣ（５５３位でアスパラギン酸をコードする）を、表現型“スクロースの存在での成長”及び“カナマイシンの存在での非成長”の多数の候補クローンをスクリーニングによって証明した。この目的のために、最初に、プライマー
0006341907.tif 000003
を有するｌｅｕＡ−１（７６７ｂｐの長さ）のＰＣＲ断片を製造し、そしてこれを、プライマー
0006341907.tif 000004
で配列決定した。陽性の候補クローンを選択肢、そして続く性能試験（実施例４及び５）で試験した。
【０１１２】
実施例４
Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｉｌｖＥ及びＣ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｉｌｖＥ＿ｌｅｕＡＹ５５３Ｄでのケトイソカプロエートの製造
それらのケトイソカプロエートを製造する能力を試験するために、株Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｉｌｖＥ及びＣ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤｉｌｖＥ＿ｌｅｕＡＹ５５３Ｄを、試験培地１０ｍｌ中で、それぞれの場合に１６時間３３℃で前培養した。生成試験について、試験培地のそれぞれ１０ｍｌを、出発ＯＤ６００（６００ｎｍでの光学密度）が０．１である方法で得られたプレカルチャーで接種した。それぞれのクローンを、それぞれの株を合計で９個の撹拌フラスコによって示す方法で３つの撹拌フラスコ中で試験した。試験培地は、Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （１９９３） １７５： ５５９３−５６０３）に記載されたＣｇＸＩＩ培地と同一であるが、さらに、アミノ酸、Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−イソロイシンをそれぞれ２００ｍｇ／ｌ含有した。単純化のために、試験培地の組成を以下の表１において要約する。
【０１１３】
【表１】
0006341907.tif 000005
【０１１４】
培養を、３３℃及び２００ｒｐｍで、１００ｍｌ撹拌フラスコ中で実施した。撹拌機の振幅は５ｃｍであった。２４時間後に、試料を培養液から抜き出し、そしてその光学密度を測定した。続いて、細胞を、簡単に遠心分離（ベンチ遠心分離タイプ５４１５Ｄ （Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、１３０００ｒｐｍ、１０分、室温で）し、そして、グルコースの内容物及びケトイソカプロエートの内容物を上清において測定した。
【０１１５】
その光学密度を６６０ｎｍの波長で、ＧＥＮｉｏｓマイクロタイタープレートフォトメータ（Ｔｅｃａｎ、Ｒｅａｄｉｎｇ ＵＫ）を使用して測定した。その試料を、測定前に脱イオン水で１：１００に希釈した。その濃度の測定についてＫＩＣの分析は、０．０２５Ｎ硫酸を使用してＨ＋形でスルホン化スチレン−ジビニルベンゼンポリマー上での陽イオン交換クロマトグラフィー（ＲＥＺＥＸ ＲＦＱ − Ｆａｓｔ Ｆｒｕｉｔ Ｈ＋ カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ））によるケト酸及び他の分泌生成物の分離、続いて２１５ｎｍでのＵＶ検出によって実施する。
【０１１６】
ＫＩＣ収率の計算のために、形成したＫＩＣの量を、消費したデキストロースの量で割った。
【０１１７】
ケトイソカプロエート形成の撹拌フラスコ実験の結果を表２において示す。
【０１１８】
【表２】
0006341907.tif 000006
【０１１９】
実施例５：
Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２及びＣ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡＹ５５３ＤでのＬ−ロイシンの製造
それらのロイシンを製造するための能力の調査のために、株Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２及びＣ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡＹ５５３Ｄを、それぞれの場合に試験培地１０ｍｌ中で１６時間３３℃で前培養した。生成試験を、この試験のために補足のロイシン、バリン及びイソロイシンを含まない試験培地を適用することを除いて、実施例４と同様の方法で実施した。試験培地は、Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （１９９３） １７５： ５５９３−５６０３）において記載されたＣｇＸＩＩ培地と同一であった。
【０１２０】
その光学密度を６６０ｎｍの波長で、ＧＥＮｉｏｓマイクロタイタープレートフォトメータ（Ｔｅｃａｎ、Ｒｅａｄｉｎｇ ＵＫ）を使用して測定した。その試料を、測定前に脱イオン水で１：１００に希釈した。形成したロイシンの量を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−ＢｉｏＴｒｏｎｉｋ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）社製のアミノ酸分析器を使用して、イオン交換クロマトグラフィー及びニンヒドリン検出でのポストカラム誘導体化法によって測定した。
【０１２１】
表３において、ロイシン形成に対する撹拌フラスコ実験から得られた性能データを要約する。
【０１２２】
ロイシン収率の計算のために、形成したロイシンの量を、消費したデキストロースの量で割った。
【０１２３】
【表３】
0006341907.tif 000007
【０１２４】
図１：プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ｌｅｕＡ＿Ｙ５５３Ｄのマップ
使用した省略及び名前は、以下の意味を有する。
ｏｒｉＶ：ｐＭＢ１からのＣｏｌＥ１様起源
ｓａｃＢ：タンパク質レバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子
ＲＰ４−ｍｏｂ：ＲＰ４可動部位
Ｋａｎ：カナマイシンについての耐性遺伝子
ｌｅｕＡ−３’：ｌｅｕＡ遺伝子の５９４ｂｐ（Ｃ末端）
【図１】
0006341907.tif 000008
【配列表】
0006341907000001.app