(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオセンサーであって、該バイオセンサーは、
少なくとも１つの導電性支持体であって、該導電性支持体は、ヒドロゲルに結合されており、該ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み、ここで該ヒドロゲルは、アルギネートを含む、導電性支持体；ならびに
該少なくとも１つの導電性支持体に作動可能に接続された電流計および／もしくは電圧計
を備え、
該少なくとも１つの導電性支持体は、ロイシンデヒドロゲナーゼ、チロシンデヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、ロイシンオキシドレダクターゼ、チロシンモノオキシゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、もしくはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ；またはこれらの機能的フラグメントから選択される代謝酵素のうちの少なくとも１種もしくは組み合わせを備え、
該少なくとも１種の代謝酵素は、好熱性細菌由来である、バイオセンサー。
【請求項２】
前記少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントは、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄｉａｓｕｓ由来のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼに対して少なくとも７０％相同である、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
前記バイオセンサーは、少なくとも第１の導電性支持体および第２の導電性支持体を備え、ここで該第１の導電性支持体は、ヒドロゲルに結合されており、該ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み、ここで該第１の導電性支持体および該第２の導電性支持体は、その間に電圧を印加するために、前記電圧計および／もしくは電流計に作動可能に接続されている、請求項１または２のいずれかに記載のバイオセンサー。
【請求項４】
前記少なくとも１種のヒドロゲルは、トレハロースを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【請求項５】
前記バイオセンサーは、以下：（ｉ）ウリカーゼもしくはその機能的フラグメント；（ｉｉ）デキストランもしくはその誘導体を含むヒドロゲル；（ｉｉｉ）細菌細胞；（ｉｖ）電気泳動用に構成された電子双極子；および（ｖ）３，４−ＤＨＢ、のうちの１もしくはそれより多くを含まない、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【請求項６】
前記バイオセンサーは、４℃での貯蔵で約１６日間後に、少なくとも７０％生物学的に活性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【請求項７】
前記バイオセンサーは、４℃での貯蔵で約３０日間後に、少なくとも７０％生物学的に活性である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【請求項８】
前記バイオセンサーは、ＵＶ光への曝露にも、該バイオセンサーへの外部からのいずれかの刺激の添加にも、機能的に依存しない、請求項１〜７のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【請求項９】
前記少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントは、配列番号１もしくは配列番号２への少なくとも約７０％の配列同一性を含むか、または配列番号１もしくは配列番号２の機能的フラグメントに対して少なくとも７０％相同である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
前記アルギネートは、以下の式：
【化９】
0006397822.tif 000021
を有するブロックポリマーを含み、
ここで、前記少なくとも１種の電子メディエーターは、チオニン、ｏ−フェニレンジアミン、メチレンブルー、およびトルイジンブルーから選択され、および／または
ここで、前記少なくとも１種の還元剤は、ＮＡＤ＋もしくはＦＡＤ＋から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【請求項１１】
少なくとも１つのコンピューターストレージメモリに作動可能に接続された状態にある、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のバイオセンサーを含むシステム。
【請求項１２】
電気回路によって前記少なくとも１つの導電性支持体に作動可能に接続された状態にあるデジタルディスプレイをさらに備え、該電気回路は、前記電圧計および／もしくは電流計からの電流および／もしくは電圧の差の測定値に対応する電気シグナルを該デジタルディスプレイに運び得、ここで該デジタルディスプレイは、前記少なくとも１種の代謝酵素がそのアミノ酸基質の酸化を触媒するために十分な期間にわたって該少なくとも１つの導電性支持体がサンプルと接触した状態にある場合に、該サンプル中のアミノ酸の濃度値を表示するように構成されている、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
電気回路の中に構成された請求項１〜１２のいずれかに記載のバイオセンサーを備えるキットであって、該電気回路は、少なくとも１つの除去可能な導電性支持体と接触すると、電圧計および／もしくは電流計が少なくとも１つの導電性支持体と作動可能な連絡状態にあるように閉じられている、キット。
【請求項１４】
被験体の体液サンプル中の１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度を定量する方法であって、該方法は、体液サンプルを、請求項１〜１０のいずれかに記載のバイオセンサー、もしくは請求項１１もしくは１２のいずれかに記載のシステム；または任意の試験ストリップに接触させる工程を包含し、該試験ストリップは、
少なくとも１つの導電性支持体であって、該導電性支持体は、ヒドロゲルに結合されており、該ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み、ここで該ヒドロゲルは、アルギネートを含む、導電性支持体；ならびに
該少なくとも１つの導電性支持体に作動可能に接続された電流計および／もしくは電圧計
を備え、
該少なくとも１つの導電性支持体は、ロイシンデヒドロゲナーゼ、チロシンデヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、ロイシンオキシドレダクターゼ、チロシンモノオキシゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、もしくはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ；またはこれらの機能的フラグメントから選択される代謝酵素のうちの少なくとも１種もしくは組み合わせを備え、
該少なくとも１種の代謝酵素は、好熱性細菌由来である、方法。
【請求項１５】
前記接触させる工程は、被験体の前記体液サンプルを、請求項１〜１０のいずれかに記載のバイオセンサーもしくは請求項１１もしくは１２に記載のシステム；または請求項１４に記載の任意の試験ストリップに、前記代謝酵素もしくはその機能的フラグメントによる該体液サンプル中の少なくとも１種のアミノ酸の酸化を可能にするために十分な期間にわたって曝す工程を包含し、前記方法は、前記定量もしくは同定する工程によって得られた濃度値と、１もしくはそれより多くの代謝疾患と関連する閾値とを比較する工程をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法は、前記体液サンプルを前記少なくとも１つの導電性支持体に接触させる前に、該体液サンプルを何の外部刺激にも試薬にも曝す工程を包含しない、請求項１４または１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記体液サンプルは、被験体由来の血液もしくは血清を含むか；または前記体液サンプルは、尿を含まない、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
被験体におけるフェニルケトン尿症、高アンモニア血症、およびメープルシロップ尿症のうちの少なくとも１つもしくは組み合わせを診断する方法において使用するためのバイオセンサー、システムもしくは試験ストリップであって、該方法は、
（ａ）体液サンプルを、該バイオセンサーもしくは該システム；または該試験ストリップに接触させる工程；
（ｂ）該サンプル中のアミノ酸の１もしくはそれより多くの濃度値を定量する工程；
（ｃ）該サンプル中のアミノ酸の該１もしくはそれより多くの濃度値と、健康な範囲にあると同定されたアミノ酸濃度の閾値とを比較する工程；ならびに
（ｄ）該サンプル中のアミノ酸の１もしくはそれより多くの濃度値が該閾値を超えるかまたは下回る場合に、該被験体がフェニルケトン尿症、高アンモニア血症、およびメープルシロップ尿症のうちの少なくとも１つもしくは組み合わせを有すると同定する工程、
を包含し、該バイオセンサーは、請求項１〜１０のいずれかに記載のバイオセンサーであり、該システムは、請求項１１もしくは１２のいずれかに記載のシステムであり、または該試験ストリップは、
少なくとも１つの導電性支持体であって、該導電性支持体は、ヒドロゲルに結合されており、該ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み、ここで該ヒドロゲルは、アルギネートを含む、導電性支持体；ならびに
該少なくとも１つの導電性支持体に作動可能に接続された電流計および／もしくは電圧計
を備え、
該少なくとも１つの導電性支持体は、ロイシンデヒドロゲナーゼ、チロシンデヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、ロイシンオキシドレダクターゼ、チロシンモノオキシゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、もしくはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ；またはこれらの機能的フラグメントから選択される代謝酵素のうちの少なくとも１種もしくは組み合わせを備え、
該少なくとも１種の代謝酵素は、好熱性細菌由来である、
任意の試験ストリップである、バイオセンサー、システムもしくは試験ストリップ。
【請求項１９】
固体支持体、ならびに該固体支持体に結合した少なくとも第１の電極および第２の電極を含む試験ストリップであって、ここで該第１の電極は、ヒドロゲルを含み、該ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメント、および少なくとも１種のアルギネートポリマーを含み；ここで該第２の電極は、コントロール電極もしくは参照電極であり、
前記試験ストリップは、電圧計および／もしくは電流計、ならびにデジタルディスプレイを含む携行式デバイス用に適合されており、その結果、該試験ストリップが該デバイスに接触している場合、該第１の電極および第２の電極は、該電圧計および／もしくは電流計、ならびに該デジタルディスプレイを含む閉じた電気回路に作動可能に接続されるようになり、そして体液サンプルと接触すると、該少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントは、アミノ酸の酸化を触媒して、該体液サンプル中のアミノ酸の濃度値に対応して該第１の電極に電流を生じ、このような濃度値は、該携行式デバイスのディスプレイで読み取り可能であり
該少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントは、ロイシンデヒドロゲナーゼ、チロシンデヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、ロイシンオキシドレダクターゼ、チロシンモノオキシゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、もしくはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ；またはこれらの機能的フラグメントから選択され、
該少なくとも１種の代謝酵素は、好熱性細菌由来である、
試験ストリップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府による支援
本発明は、ＮＩＨ補助金番号ＨＨＳＮ２６８２０１２００３６０Ｐの下で保健福祉長官（Secretary of Health and Human Services）および国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって代表される合衆国政府からの支援によって共同で行われた。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
（関連出願の引用）
本願は、アメリカ合衆国を指定する国際出願であり、２０１２年１０月１７日に出願された米国仮出願第61/714,870号および２０１３年３月１１日に出願された米国仮出願第61,776,371号に対する優先権を主張する米国特許法第１２０条の下で出願された。これらの出願は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、一般に、体液サンプル中のアミノ酸の存在もしくは非存在を定量および同定するデバイスに関する。いくつかの実施形態において、本発明は、体液サンプル中のアミノ酸の存在、非存在、もしくは量を検出することによってアミノアシドパシー（ａｍｉｎｏａｃｉｄｏｐａｔｈｙ）を有する被験体を診断することに関する。いくつかの実施形態において、上記デバイスは、１種もしくはそれより多くのアミノ酸の検出および／もしくは定量のために体液サンプルを必要とするのみの、試薬なしバイオセンサーである。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
多くの代謝障害（例えば、高アンモニア血症およびアミノアシドパシー）は、代謝調節、プロセスおよびクリアランスに関する酵素の機能不全に起因する、特定の代謝産物の慢性的な上昇によって特徴付けられる。これら高レベルの代謝産物は、十分に規定された分析法を使用して血漿レベルを測定することによって生化学的に評価され得、各疾患の総合的症状を定義する特異的組織毒性を生じ得る。どんなことがグルコースおよび糖脳病で例えば起こったかの類似の様式で、リアルタイムで特定の血漿代謝産物を検出し得るセンサーを開発することは、非常に有用で便利である。ポイントオブケアセンサーは、特定の代謝産物の即時の血中レベル評価を行うこと、代謝障害の管理、処置および追跡調査を容易にすることを可能にする。米国における代謝障害および内分泌障害の有病率の最近の予測から、人口のうちの少なくとも５％が内分泌障害を患っており、米国在住者のうちの４７００万人超がメタボリックシンドロームを有することが明らかにされている。非常に多くのひとが患っていることおよびヘルスケアコストに対する大きな影響の他にも、これら疾患の管理は、患者の薬物療法、分析モニタリング、および追跡調査に関して困難かつ高価であるのみならず、多くの症例において、不要な手順および入院をも生じる。糖尿病もしくは高コレステロール血症のような特定の障害において重大な進歩があったにも関わらず、より低い有病率を有する他のものの進歩は、遅れている。例えば、高アンモニア血症およびアミノアシドパシーを有する患者の新たな診断もしくは治療の解決を得ることにおいては、進歩はそれほどない。現在のところ、代謝産物レベルをモニターすることは、特別な質量分析機器を備えた病院で行われなければならず、従って、これら患者がクリーゼ（ｃｒｉｓｉｓ）の出現を有するたびに、その対応する代謝産物の上昇に関連しようと関連しまいと、彼らは、特別な検査が行われるために通院する必要がある。従って、患者のクオリティー・オブ・ライフおよび資金管理両方の観点から、リアルタイムでこれら代謝産物を検出および定量し得るデバイスを開発することは、極めて有利である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、アミノアシドパシーが体液（ヒトおよび非ヒト血液サンプルを含む）中のアミノ酸のレベルもしくは量を同定することによって同定および／もしくは特徴付けられ得るという認識を包含する。いくつかの実施形態において、本言及は、体液を本明細書で開示されるデバイスに接触させることによって、体液中のアミノ酸の量、存在、もしくは非存在を同定することに関する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、上記体液中に１種もしくはそれより多くのアミノ酸が存在するか否か、もしくはどの程度存在するかを同定または定量する前に、上記体液と、いかなる試薬も外部刺激とも接触させる工程を包含しない。
【０００６】
本発明は、少なくとも１種のアミノ酸である少なくとも１種の基質を酸化する少なくとも１種の酵素を含むヒドロゲルによって改変された電極を含む試薬なしシステムを使用してサンプル中の１種もしくは複数種のアミノ酸の総濃度を測定し得るバイオセンサーに関する。本発明は、１種もしくは複数種の特定のアミノ酸の総濃度を測定するためのアミノ酸バイオセンサーを提供し、上記アミノ酸バイオセンサーは、少なくとも第１の導電性表面（測定するため）および少なくとも第２の導電性表面（対電極）を含み、ここで上記第１の導電性表面は、構成要素として、メディエーターならびに基質として複数の特定のアミノ酸を選択的に利用する酵素を有し、ここで上記１種もしくは複数種の酵素は、上記１種もしくは複数種の特定のアミノ酸とそれぞれ基質親和性を有する。上記１種もしくは複数種の酵素は、基質としての上記特定のアミノ酸との反応によって反応生成物を生成し、ここで上記メディエーターは、アミノ酸濃度の測定時に上記反応生成物と上記測定電極との間で電子を輸送し、ここで上記第１の導電性表面と第２の導電性表面との間での測定時の印加電圧は、上記１種もしくは複数種の特定のアミノ酸の各々に関して、電流値と印加された電圧との間の関係性を表す検量線上で、電流値の分布が個々のアミノ酸に関して印加電圧を変化させないような印加電圧を含む。
【０００７】
本発明者らは、上記分析されている代謝産物の酸化還元変換によって生成される電子の流れを測定し得る電極に結合されたポリマー内に特定の酵素を固定化することで、この目的の達成を構想した。血液中の代謝産物の濃度は、少なくとも１つの導電性表面を含む回路上の電子の流れもしくは電流測定値と直線的に相関する。本発明は、上記代謝産物をどのように選択するか、上記固定化される酵素をどのように選択するか、上記固定化をどのように行うか（どのポリマー、どの添加剤など）、上記電極に構成要素をどのように結合させるか、測定をどのように行うか、およびプロトタイプをどのように開発するかを示すこの概念の実施への還元に関する。本発明は、患者の血中の代謝産物をリアルタイムで測定するために使用される。本明細書で開示されるセンサーの他には、提唱される代謝産物をリアルタイムで測定し得る公知のセンサーは存在しない。
【０００８】
本発明は、電圧計および／もしくは電流計に作動可能に接続された少なくとも１つの導電性表面（例えば、電極）を含むデバイスに関し、上記電極は、アミノ酸と合わされてその存在下にある場合、少なくとも１以上の電子を放出する電気化学的反応を起こさせる構成要素を含む。いくつかの実施形態において、上記デバイスは、少なくとも第１の導電性表面および第２の導電性表面を含み、ここで上記導電性表面は、本明細書で開示される酵素を含むヒドロゲルを含み、上記第２の導電性表面は、ヒドロゲルも酵素も含まず；ここで上記電圧計および／もしくは電流計は、上記電圧計がアミノ酸の存在下で上記第１の電極と上記第２の電極との間の電圧差を検出し得るようになっている回路の中に配置されており、そして／または上記電流計は、上記第２の電極と比較して、上記第１の電極における増大した電流を検出し得る。上記少なくとも１以上の電子は、上記ヒドロゲル内の１種もしくはそれより多くの酵素が上記１種もしくはそれより多くのアミノ酸の存在下で体液サンプル中のアミノ酸の酸化を触媒した後に放出される。
【０００９】
ヒドロゲル製剤は、いくつかの実施形態において、上記少なくとも第１の電極表面に対して直ぐ近位にある必須の補因子とともに、上記ヒドロゲルが上記電極センサーからの妨害イオンおよび高分子（上記患者の血液サンプル内に含まれる）の同時の排除を提供して、１種もしくはそれより多くの酵素（その反応の特異的基質として上記代謝産物／分析物を利用する）を捕捉するために使用される。上記被覆された電極は、上記酵素反応によって生成される酸化還元等価物を、電子の流れ（これは、続いて、電流差もしくは電圧差として測定される）へと変換し得る電気化学的検出デバイス内に含まれる。分析物濃度は、電流量の差もしくは電圧差を、上記体液サンプル中のアミノ酸濃度に相関させる較正曲線を使用して得られる。一実施形態において、小体積の全血が上記電極に適用され、その結果は、上記電極への適用もしくは接触の数分内に報告される。まさにその分析物に依存して、特異的酵素および補因子が、分析物特異的な反応および応答を達成するために、上記電極へと組みこまれる。例えば、上昇したフェニルアラニンを検出するために、酵素フェニルアラニンデヒドロゲナーゼが、ヒドロゲル内に必要に応じて含まれる上記少なくとも１つの導電性表面に固定化される。
【００１０】
本発明は、体液サンプルの混合物をソートするための方法を提供し、上記方法は、複数の血液サンプルを本明細書で開示されるデバイスもしくはシステムに接触させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記体液サンプルの混合物をソートするかもしくはカタログ作成するための方法は、体液サンプル中のアミノ酸の１もしくはそれより多くの濃度を、上記デバイスによって測定される電流値もしくは電圧差の値に基づいて決定する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記体液サンプル中のアミノ酸の１もしくはそれより多くの濃度と、１もしくはそれより多くのアミノアシドパシーを有しないもしくは有するとは疑われない被験体から得られる体液サンプル中のアミノ酸の１以上の濃度とを比較する工程、ならびに被験体由来の体液サンプルが、アミノアシドパシーがない被験体由来の体液サンプルへの濃度値のそれらの類似性もしくは差に基づいて、アミノアシドパシーを有するか否かをカタログ作成するか、資料収集するか、もしくは同定する工程をさらに包含する。本発明は、アミノアシドパシーを有する被験体を診断するための方法を提供し、上記方法は、上記被験体由来の少なくとも１つの体液サンプルを本明細書で開示されるデバイスもしくはシステムに接触させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記診断するための方法は、体液サンプル中のアミノ酸の１もしくはそれより多くの濃度を、上記デバイスによって測定される電流値もしくは電圧差の値に基づいて決定する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記被験体由来の１もしくはそれより多くのサンプル中のアミノ酸の１もしくはそれより多くの濃度と、１もしくはそれより多くのアミノアシドパシーを有しないかもしくは有すると疑われていない被験体から得られた体液サンプル中のアミノ酸の１もしくはそれより多くの濃度とを比較する工程、被験体由来の体液サンプルが、アミノアシドパシーがない被験体由来の体液サンプルへの濃度値のそれらの類似性もしくは差に基づいて、アミノアシドパシーを有するか否かを同定する工程をさらに包含する。
【００１１】
本発明はまた、被験体における１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度を、１もしくはそれより多くのアミノアシドパシーを有すると診断されたかもしくは有すると疑われた被験体由来の体液サンプル中でモニターするための方法を提供し、上記方法は、被験体由来の１もしくはそれより多くの体液サンプルを本明細書で開示されるデバイスもしくはシステムに接触させる工程、および１つの時点での上記被験体由来の体液サンプル中の１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度を測定する工程、および異なる時点で少なくとも１回、上記測定の反復を行う工程を包含する。いくつかの実施形態において、被験体における１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度を、１もしくはそれより多くのアミノアシドパシーを有すると診断されたかもしくは有すると疑われた被験体由来の体液サンプル中で経時的にモニターするための上記方法は、上記１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度値を経時的にカタログ作成する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記被験体由来の複数の体液サンプルに由来するアミノ酸の１もしくはそれより多くの濃度を経時的に比較する工程、および上記１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度が医療処置もしくは食餌の変更を要する閾値に達するか、閾値を超えるかもしくは閾値を下回って低下する場合に、被験体を必要に応じて通知する工程をさらに包含する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、体液サンプルは、１もしくはそれより多くのアミノアシドパシーを有すると診断されたかもしくは有すると疑われた被験体から単離される。例えば、いくつかの実施形態において、体液サンプル（例えば、尿サンプルもしくは血液サンプル）は、上記被験体から単離される。上記体液サンプルは、本明細書で開示される少なくとも１種の酵素を含む少なくとも１つの電極に接触させられ、上記体液サンプル中のアミノ酸濃度は、上記少なくとも１つの電極を含むデバイスによって検出される電圧差もしくは電流の大きさに基づいて測定される。さらなる実施形態において、本発明の方法は、体液サンプルを本明細書で開示される固定化された酵素を含む少なくとも１つの電極に接触させる工程、上記少なくとも１つの電極と、本明細書で開示される固定化された酵素を含まない導電性表面との間の電流差もしくは電圧差を測定する工程、上記体液サンプル中の１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度を決定する工程、および必要に応じて、１もしくはそれより多くの濃度値の読み取りを上記体液サンプルが得られた被験体に提供する工程を包含する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本開示は、被験体由来の体液サンプルを、１種もしくはそれより多くの酵素が上に固定化された、必要に応じて、ゲル中に分布させるかもしくは固定化された第１の電極に接触させる工程を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記ゲルは、アルギネートを含むヒドロゲルである。いくつかの実施形態において、本開示は、体液サンプル中の、上記サンプル中の細胞間にあるアミノ酸の存在もしくはレベルを検出する工程を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態において、提供される方法は、検出される相互作用の特定のセットが閾値を規定することを決定する工程を包含する。上記閾値は、これが上記アミノ酸の存在もしくはレベルを、上記被験体由来の別の体液サンプル中の上昇したもしくは上昇していないアミノ酸レベルから、または参照サンプルもしくはコントロールサンプルである体液サンプルから区別するという点で、アミノアシドパシーの増大した重症度の特徴を示し、その結果、本明細書で開示されるデバイスもしくはシステムは、上記閾値に達している場合に、処置もしくは食餌の変更が求められるべきであるというシグナルもしくは通知を上記被験体に提供する。いくつかの実施形態において、上記検出する工程は、体液サンプル中のアミノ酸濃度の存在もしくはレベルを検出する工程を包含し、上記存在もしくはレベルは、上記工程がそれらを参照サンプルもしくはコントロールサンプルである体液サンプルから区別するという点で疾患の特定の重症度の特徴を示す。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法のうちのいずれも、上記体液サンプルと上記少なくとも１つの導電性表面とを接触させる前に、上記体液サンプルを予備処理する工程を包含しない。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法のうちのいずれも、上記サンプルを上記少なくとも１つの電極に接触させる前、接触させると同時、もしくは接触させた後に、上記サンプルを液体クロマトグラフィーおよび／もしくは電気泳動で処置する工程で使用することを含まない。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法のうちのいずれも、上記サンプルを、細菌もしくは植物以外の生物から得られた酵素を含まない少なくとも１つの電極に接触させる工程を包含する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本開示は、必要に応じて被験体のアミノ酸濃度値を資料収集する電子保存媒体に作動可能に接続した状態にある、本明細書で開示される１もしくはそれより多くのデバイスを含むシステムを提供する。いくつかの実施形態において、上記電子保存媒体は、被験体の経時的に資料収集されたアミノ酸濃度値を含む。いくつかの実施形態において、上記システムは、本明細書で開示される酵素、メディエーター、および必要に応じてゲルもしくはヒドロゲルを含む少なくとも１つの導電性表面を含む。いくつかの実施形態において、上記システムは、上記少なくとも１つの電極に作動可能に接続した状態にある電気回路、ならびに上記少なくとも１つの電極が１種もしくはそれより多くのアミノ酸の存在下にある場合に、上記少なくとも１つの電極にわたって上記回路のそれぞれのボルト数および／もしくはアンペア数を測定する電圧計および／もしくは電流計を含む。いくつかの実施形態において、必要に応じて被験体のアミノ酸濃度値を資料収集する電子保存媒体に作動可能に接続した状態にある本明細書で開示される１もしくはそれより多くのデバイスを含むシステムは、体液サンプルが上記少なくとも１つの電極と接触した状態にあり、かつ本明細書で開示される１種もしくはそれより多くの酵素がそのアミノ酸基質を酸化し、上記回路において電圧差もしくは電流変化を作りだし、上記デバイスが１もしくはそれより多くのディスプレイで上記濃度値を表示するために十分な条件下にあり、およびその時間にわたって存在する場合に、上記体液サンプル中のアミノ酸の１もしくは複数の濃度値を決定する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞を含むサンプルと、電極とを接触させる工程を包含する方法を提供する。本発明は、体液を含むサンプルを、上記サンプル中の特定のアミノ酸と、本明細書で記載される１種もしくは複数種のヒドロゲル構成要素との間に相互作用のセットが起こるために十分な条件下でおよびその時間にわたって接触させる工程を包含する方法をさらに提供する。本発明は、以下を備えるバイオセンサーに関する：少なくとも１つの導電性支持体であって、上記導電性支持体は、ヒドロゲルに結合され、上記ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み、ここで上記ヒドロゲルは、アルギネートを含む、少なくとも１つの導電性支持体；ならびに上記少なくとも１つの導電性支持体もしくは表面に作動可能に接続された電流計および／もしくは電圧計。
【００１７】
いくつかの実施形態において、上記バイオセンサーは、少なくとも３つの導電性支持体を含む。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つの導電性支持体は、銀および塩化銀のワイヤである。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つの導電性支持体は、ロイシンデヒドロゲナーゼ、チロシンデヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、ロイシンオキシドレダクターゼ、チロシンモノオキシゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、もしくはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ；またはこれらの機能的フラグメントから選択される代謝酵素のうちの少なくとも１種または組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、上記バイオセンサーは、少なくとも第１の導電性支持体および第２の導電性支持体を含み、ここで上記第１の導電性支持体は、ヒドロゲルに結合され、上記ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み、ここで上記第１の導電性支持体および第２の導電性支持体は、その間に電圧を印加するために、上記電圧計および／もしくは電流計に作動可能に接続されている。
【００１８】
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つの導電性支持体は、電気陰性のもしくはアニオン性の化学成分を含む。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つのヒドロゲルは、トレハロースを含む。いくつかの実施形態において、上記バイオセンサーは、以下のうちの１もしくはそれより多くを含まない：（ｉ）ウリカーゼもしくはその機能的フラグメント；（ｉｉ）デキストランもしくはその誘導体を含むヒドロゲル；（ｉｉｉ）細菌細胞；（ｉｖ）電気泳動用に構成された電子双極子（electronic  dipole）；および（ｖ）３，４−ＤＨＢ。いくつかの実施形態において、上記バイオセンサーは、４℃での貯蔵で約１６日後に、少なくとも７０％生物学的に活性である。いくつかの実施形態において、上記バイオセンサーは、４℃での貯蔵で約３０日後に、少なくとも７０％＞生物学的に活性である。いくつかの実施形態において、上記バイオセンサーは、ＵＶ光への曝露にも、または上記バイオセンサーの外部からのいずれの刺激の添加にも、機能的に依存しない。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種の酵素もしくはその機能的フラグメントは、細菌種に由来し、上記ヒドロゲルの中に固定化される。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種の酵素もしくはその機能的フラグメントは、好熱性細菌種に由来し、上記ヒドロゲルの中に固定化される。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種の酵素もしくはその機能的フラグメントは、配列番号１もしくは配列番号２と少なくとも約７０％配列同一性を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種の酵素は、好熱性細菌細胞から得られるフェニルアラニンデヒドロゲナーゼもしくはその機能的フラグメントであり；ここで上記ヒドロゲルは、トレハロースを含み、ここで上記ヒドロゲルのアルギネート濃度は、少なくとも１つの導電性支持体に結合される総体積の約１％〜約３％  重量／体積であり；そしてここで上記導電性支持体は、上記電圧計および／もしくは電流計に作動可能に接続された状態にある、銀および塩化銀を含むワイヤを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、上記アルギネートは、以下の式：
【化１】
0006397822.tif 000002
を有するブロックポリマーを含み、ここでｍおよびｎは、任意の正の整数である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、上記バイオセンサーにおいて、上記少なくとも１つの導電性支持体は、セルロースもしくはその誘導体を含む膜によって覆われていない。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種の電子メディエーターは、チオニン、ｏ−フェニレンジアミン、メチレンブルー、およびトルイジンブルーから選択される。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種の還元剤は、ＮＡＤ＋もしくはＦＡＤ＋から選択される。
【００２２】
本発明はまた、以下を含むバイオセンサーに関する：少なくとも１つの導電性支持体であって、上記導電性支持体は、少なくとも１つのヒドロゲルに結合され、上記ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み；ここで上記少なくとも１種の酵素もしくはその機能的フラグメントは、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄｉａｓｕｓ由来のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼに対して少なくとも７０％相同性である、少なくとも１つの導電性支持体；ならびに上記少なくとも１つの導電性支持体に作動可能に接続された電流計および／もしくは電圧計。いくつかの実施形態において、上記酵素もしくはその機能的フラグメントは、配列番号１に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同であるか、または配列番号１の機能的フラグメントに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同である。いくつかの実施形態において、上記酵素もしくはその機能的フラグメントは、細菌細胞以外の種に由来しない。いくつかの実施形態において、上記酵素もしくはその機能的フラグメントは、配列番号２に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同であるか、または配列番号２の機能的フラグメントに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同である。
【００２３】
本発明は、以下を備えるバイオセンサーを備えるシステムに関する：少なくとも１つの導電性支持体であって、上記導電性支持体は、ヒドロゲルに結合され、上記ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み、ここで上記ヒドロゲルは、アルギネートを含む、少なくとも１つの導電性支持体；ならびに上記少なくとも１つの導電性支持体もしくは表面に作動可能に接続された電流計および／もしくは電圧計。本発明はまた、以下を備えるバイオセンサーを備えるシステムに関する：少なくとも１つの導電性支持体であって、上記導電性支持体は、ヒドロゲルに結合され、上記ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み、ここで上記ヒドロゲルは、アルギネートを含む、少なくとも１つの導電性支持体；ならびに上記少なくとも１つの導電性支持体もしくは表面に作動可能に接続された電流計および／もしくは電圧計であって；ここで上記バイオセンサーは、少なくとも１つのコンピューターストレージメモリに作動可能に接続された状態にある。いくつかの実施形態において、上記システムは、体液サンプルをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記システムは、上記電圧計および／もしくは電流計からの電流差および／もしくは電圧差の測定値に対応する電気シグナルを上記デジタルディスプレイに運び得る電気回路によって、上記少なくとも１つの導電性支持体（もしくは表面）に作動可能に接続した状態にあるデジタルディスプレイをさらに含み、ここで上記デジタルディスプレイは、上記少なくとも１つの導電性支持体（もしくは表面）が、サンプルと、上記少なくとも１種の代謝酵素が、そのアミノ酸基質の酸化を触媒するために十分な期間にわたって接触した状態にある場合に、上記サンプル中のアミノ酸の１もしくはそれより多くの濃度値を経時的に表示するように構成されている。
【００２４】
いくつかの実施形態において、上記システムは、少なくとも１つのコンピューターストレージメモリと作動可能に接続された状態にあるコンピュータープロセッサをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記代謝酵素は、上記ヒドロゲル内に固定化されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼであり、ここで上記ヒドロゲルのアルギネート濃度は、上記少なくとも１つの導電性支持体に結合および／もしくは接触した全体積の約１％〜約３％  重量／体積である。
【００２５】
本発明はまた、電圧計および／もしくは電流計、ならびに電気回路の中に構成されたディスプレイを備えるバイオセンサーを備えるキットに関する。上記回路は、少なくとも１つの取り外し可能な導電性支持体と接触した際に、上記電圧計および／もしくは電流計が少なくとも１つの導電性支持体（上記導電性支持体は、ヒドロゲルを含み；ここで上記ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメント、およびアルギネートを含む）と作動可能に連絡した状態にあるように、閉じられている。
【００２６】
いくつかの実施形態において、上記キットは、以下のうちの少なくとも１つを含む：１もしくは複数の導電性支持体を含む複数の試験ストリップであって、ここで上記１もしくは複数の導電性支持体は、アルギネートを含むヒドロゲルを含む、複数の試験ストリップ；コントロール体液サンプルもしくは参照体液サンプル；閾値を含むデータのセット；ならびに指示のセットであって、ここで上記指示のセットもしくはデータセットは、電子媒体を通じて必要に応じて遠隔からアクセス可能である、指示のセット。いくつかの実施形態において、上記キットは、少なくとも第１の電極および第２の電極を含む固体支持体を含み、ここで上記第１の電極は、ヒドロゲルを含み、上記ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み；そしてここで上記第２の電極は、コントロール電極もしくは参照電極である。いくつかの実施形態において、上記キットは、本明細書で記載される第１の電極および第２の電極に結合した固体支持体を含む試験ストリップを含む。
【００２７】
本発明はまた、体液サンプル中のアミノ酸の濃度を決定もしくは同定するための方法に関し、上記方法は、（ａ）体液サンプルを、以下：（ｉ）少なくとも１つの導電性支持体であって、上記導電性支持体は、ヒドロゲルに結合され、上記ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み、ここで上記ヒドロゲルは、アルギネートを含む、少なくとも１つの導電性支持体；ならびに上記少なくとも１つの導電性支持体に作動可能に接続された電流計および／もしくは電圧計を備える、バイオセンサー；または（ｉｉ）少なくとも１つの導電性支持体であって、上記導電性支持体は、少なくとも１つのヒドロゲルに結合され、上記ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み；ここで上記少なくとも１種の酵素もしくはその機能的フラグメントは、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄｉａｓｕｓ由来のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼに対して少なくとも７０％相同である、少なくとも１つの導電性支持体；ならびに上記少なくとも１つの導電性支持体に作動可能に接続された電流計および／もしくは電圧計を備えるバイオセンサーを備えるシステム；または（ｉｉｉ）本明細書で開示される試験ストリップ、に接触させる工程；あるいは（ｂ）上記サンプル中のアミノ酸の量を決定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記体液サンプルは、被験体由来の血液もしくは血清を含む。
【００２８】
本発明はまた、体液サンプル中のアミノ酸の濃度を定量するための方法に関し、上記方法は、（ａ）体液サンプルを、（ｉ）少なくとも１つの導電性支持体もしくは表面であって、上記導電性支持体もしくは表面は、ヒドロゲルに結合され、上記ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み、ここで上記ヒドロゲルは、アルギネートを含む、少なくとも１つの導電性支持体もしくは表面；ならびに上記少なくとも１つの導電性支持体もしくは表面に作動可能に接続された電流計および／もしくは電圧計を備える、バイオセンサー；または（ｉｉ）少なくとも１つの導電性支持体もしくは表面であって、上記導電性支持体もしくは表面は、少なくとも１つのヒドロゲルに結合され、上記ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み；ここで上記少なくとも１種の酵素もしくはその機能的フラグメントは、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄｉａｓｕｓ由来のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼに対して少なくとも７０％相同である、少なくとも１つの導電性支持体もしくは表面；ならびに上記少なくとも１つの導電性支持体に作動可能に接続された電流計および／もしくは電圧計を備えるバイオセンサーを備える、システム；または（ｉｉｉ）本明細書で開示される試験ストリップに接触させる工程；あるいは（ｂ）上記サンプル中のアミノ酸の量を決定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記定量する工程もしくは同定する工程によって得られた濃度値と、１もしくはそれより多くの代謝疾患と関連する閾値とを比較する工程をさらに包含する。
【００２９】
本発明はさらに、接触させる工程を包含する方法に関し、ここで被験体の体液サンプルを、本明細書で開示されるバイオセンサー、システム、もしくは試験ストリップのうちのいずれかに接触させる工程は、上記サンプルを、上記代謝酵素もしくはその機能的フラグメントによる上記体液サンプル中の少なくとも１種のアミノ酸の酸化を可能にするために十分な期間にわたって接触させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記サンプルを上記少なくとも１つの導電性支持体に接触させる工程の前に、上記体液サンプルを、何らかの外部刺激もしくは試薬に曝す工程を包含しない。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記サンプルを上記ヒドロゲルを含む少なくとも１つの電極に曝す工程の前、曝す工程と同時もしくは曝す工程の後に、上記体液サンプルを鉄イオンおよび／もしくはヒドラジドイオンに曝す工程を包含しない。いくつかの実施形態において、上記体液サンプルは、被験体由来の血液もしくは血清を含む。いくつかの実施形態において、上記体液サンプルは、尿を含まない。いくつかの実施形態において、上記体液サンプルは、血液もしくは血清以外の体液を含まない。
【００３０】
本発明はさらに、被験体において代謝疾患を診断するための方法に関し、上記方法は、（ａ）体液サンプルを以下のうちの１つもしくは組み合わせに接触させる工程：（ｉ）少なくとも１つの導電性支持体もしくは表面であって、上記導電性支持体もしくは表面は、ヒドロゲルに結合され、上記ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み、ここで上記ヒドロゲルは、アルギネートを含む、少なくとも１つの導電性支持体もしくは表面；ならびに上記少なくとも１つの導電性支持体もしくは表面に作動可能に接続された電流計および／もしくは電圧計を備える、バイオセンサー；または（ｉｉ）少なくとも１つの導電性支持体もしくは表面であって、上記導電性支持体もしくは表面は、少なくとも１つのヒドロゲルに結合され、上記ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含む、少なくとも１つの導電性支持体もしくは表面；ならびに上記少なくとも１つの導電性支持体に作動可能に接続された電流計および／もしくは電圧計を備えるバイオセンサーを備える、システム；または（ｉｉｉ）本明細書で開示される試験ストリップ；（ｂ）上記サンプル中のアミノ酸の１もしくはそれより多くの濃度値を定量する工程；（ｃ）上記サンプル中のアミノ酸の１もしくはそれより多くの濃度値と、健康な範囲にあるか、もしくはアミノアシドパシーを示す濃度の範囲内にないと同定されたアミノ酸濃度の閾値とを比較する工程；ならびに（ｄ）上記サンプル中のアミノ酸の１もしくはそれより多くの濃度値が上記閾値を超えるかもしくは上記閾値を下回って低下する場合に、上記被験体を代謝疾患を有すると同定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記代謝疾患は、フェニルケトン尿症、高アンモニア血症、およびメープルシロップ尿症のうちの少なくとも１つもしくは組み合わせから選択される。
【００３１】
本発明はまた、治療への患者応答を決定するための方法に関し、上記方法は、（ａ）体液サンプルを以下のうちの１つもしくは組み合わせに接触させる工程：（ｉ）少なくとも１つの導電性支持体もしくは表面であって、上記導電性支持体もしくは表面は、ヒドロゲルに結合され、上記ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み、ここで上記ヒドロゲルは、アルギネートを含む、少なくとも１つの導電性支持体もしくは表面；ならびに上記少なくとも１つの導電性支持体もしくは表面に作動可能に接続された電流計および／もしくは電圧計を備える、バイオセンサー；または（ｉｉ）少なくとも１つの導電性支持体もしくは表面であって、上記導電性支持体もしくは表面は、少なくとも１つのヒドロゲルに結合され、上記ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含む、少なくとも１つの導電性支持体もしくは表面；ならびに上記少なくとも１つの導電性支持体に作動可能に接続された電流計および／もしくは電圧計を備えるバイオセンサーを備える、システム；または（ｉｉｉ）本明細書で開示される試験ストリップ；（ｂ）１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度値を定量する工程；ならびに（ｃ）上記１もしくはそれより多くの濃度値と、代謝疾患と関連する１もしくはそれより多くの閾値とを比較する工程を包含する。
【００３２】
本発明はまた、固体支持体、ならびに上記固体支持体に結合された少なくとも第１の電極および第２の電極を含む試験ストリップに関し、ここで上記第１の電極は、ヒドロゲルを含み、上記ヒドロゲルは、（ｉ）少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメント、およびアルギネート；または（ｉｉ）少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、好熱性細菌種から選択される少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメント、のいずれかを含み；ここで上記第２の電極は、コントロール電極もしくは参照電極である。いくつかの実施形態において、上記試験ストリップは、電圧計および／もしくは電流計、ならびにデジタルディスプレイを含む携行式デバイス用に適合され、その結果、上記試験ストリップが上記デバイスに接触させられる場合、上記第１の電極および第２の電極は、上記電圧計および／もしくは電流計ならびに上記デジタルディスプレイを含む閉じた電気回路に作動可能に接続され、そして体液サンプルと接触した際に、上記少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントは、上記体液サンプル中のアミノ酸の濃度値に対応する上記第１の電極上の電流を生じるアミノ酸の酸化を触媒し、このような濃度値は、上記携行式デバイスのディスプレイ上で読み取り可能である。いくつかの実施形態において、上記試験ストリップは、配列番号１もしくは配列番号２に対して少なくとも７０％相同である少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含む。
【００３３】
本発明はまた、少なくとも１つの電極とヒドロゲルを含む、本明細書で開示されるバイオセンサー、試験ストリップ、システムのうちのいずれかを製造するための方法に関し、上記方法は、上記少なくとも１つの電極と、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメント、およびアルギネートを含む溶液とを接触させる工程；その後、上記少なくとも１つの電極と、約１５０ｍＭ以下の濃度を有する塩化カルシウム溶液とを接触させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記塩化カルシウム濃度は、約１００ｍＭ以下である。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
バイオセンサーであって、該バイオセンサーは、
少なくとも１つの導電性支持体であって、該導電性支持体は、ヒドロゲルに結合されており、該ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み、ここで該ヒドロゲルは、アルギネートを含む、導電性支持体；ならびに
該少なくとも１つの導電性支持体に作動可能に接続された電流計および／もしくは電圧計、
を備える、バイオセンサー。
（項目２）
前記バイオセンサーは、少なくとも３つの導電性支持体を備える、項目１に記載のバイオセンサー。
（項目３）
前記少なくとも１つの導電性支持体は、銀もしくは塩化銀のワイヤである、項目１または２に記載のバイオセンサー。
（項目４）
前記少なくとも１つの導電性支持体は、ロイシンデヒドロゲナーゼ、チロシンデヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、ロイシンオキシドレダクターゼ、チロシンモノオキシゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、もしくはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ；またはこれらの機能的フラグメントから選択される代謝酵素のうちの少なくとも１種もしくは組み合わせを備える、項目１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
（項目５）
前記バイオセンサーは、少なくとも第１の導電性支持体および第２の導電性支持体を備え、ここで該第１の導電性支持体は、ヒドロゲルに結合されており、該ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み、ここで該第１の導電性支持体および該第２の導電性支持体は、その間に電圧を印加するために、前記電圧計および／もしくは電流計に作動可能に接続されている、項目１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
（項目６）
前記少なくとも１つの導電性支持体は、電気陰性のもしくはアニオン性の化学成分を含む、項目１〜５のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
（項目７）
前記少なくとも１種のヒドロゲルは、トレハロースを含む、項目１〜６のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
（項目８）
前記バイオセンサーは、以下：（ｉ）ウリカーゼもしくはその機能的フラグメント；（ｉｉ）デキストランもしくはその誘導体を含むヒドロゲル；（ｉｉｉ）細菌細胞；（ｉｖ）電気泳動用に構成された電子双極子；および（ｖ）３，４−ＤＨＢ、のうちの１もしくはそれより多くを含まない、項目１〜７のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
（項目９）
前記バイオセンサーは、４℃での貯蔵で約１６日間後に、少なくとも７０％生物学的に活性である、項目１〜８のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
（項目１０）
前記バイオセンサーは、４℃での貯蔵で約３０日間後に、少なくとも７０％生物学的に活性である、項目１〜９のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
（項目１１）
前記バイオセンサーは、ＵＶ光への曝露にも、該バイオセンサーへの外部からのいずれかの刺激の添加にも、機能的に依存しない、項目１〜１０のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
（項目１２）
前記少なくとも１種の酵素もしくはその機能的フラグメントは、細菌種に由来し、前記ヒドロゲルの中に固定化される、項目１〜１１のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
（項目１３）
前記少なくとも１種の酵素もしくはその機能的フラグメントは、好熱性細菌種に由来し、前記ヒドロゲルの中に固定化される、項目１〜１２のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
（項目１４）
前記少なくとも１種の酵素もしくはその機能的フラグメントは、配列番号１もしくは配列番号２への少なくとも約７０％の配列同一性を含む、項目１〜１３のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
（項目１５）
前記少なくとも１種の酵素は、好熱性細菌細胞から得られるフェニルアラニンデヒドロゲナーゼもしくはその機能的フラグメントであり；ここで前記ヒドロゲルは、トレハロースを含み、該ヒドロゲルのアルギネート濃度は、前記少なくとも１つの導電性支持体に結合される全体積のうちの約１％〜約３％  ｗ／ｖであり；そして該導電性支持体は、前記電圧計および／もしくは電流計に作動可能に接続された状態で銀および塩化銀を含むワイヤを備える、項目１〜１４のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
（項目１６）
前記アルギネートは、以下の式：
【化９】
0006397822.tif 000003
を有するブロックポリマーを含み、ここでｍおよびｎは、任意の正の整数であるブロックポリマーを含む、項目１〜１５のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
（項目１７）
前記バイオセンサーの前記少なくとも１つの導電性支持体は、セルロースもしくはその誘導体を含む膜によって覆われていない、項目１〜１６のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
（項目１８）
前記少なくとも１種の電子メディエーターは、チオニン、ｏ−フェニレンジアミン、メチレンブルー、およびトルイジンブルーから選択される、項目１〜１７のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
（項目１９）
前記少なくとも１種の還元剤は、ＮＡＤ＋もしくはＦＡＤ＋から選択される、項目１〜１８のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
（項目２０）
バイオセンサーであって、該バイオセンサーは、
少なくとも１つの導電性支持体であって、該導電性支持体は、少なくとも１つのヒドロゲルに結合され、該ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み；ここで該少なくとも１種の酵素もしくはその機能的フラグメントは、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄｉａｓｕｓ由来のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼに対して少なくとも７０％相同である、少なくとも１つの導電性支持体、ならびに
該少なくとも１つの導電性支持体に作動可能に接続される電流計および／もしくは電圧計、
を備える、バイオセンサー。
（項目２１）
前記酵素もしくはその機能的フラグメントは、配列番号１に対して少なくとも７０％相同であるか、または配列番号１の機能的フラグメントに対して少なくとも７０％相同である、項目１〜２０のいずれかに記載のバイオセンサー。
（項目２２）
前記酵素もしくはその機能的フラグメントは、細菌細胞以外の種に由来するのではない、項目１〜２０のいずれかに記載のバイオセンサー。
（項目２３）
少なくとも１つのコンピューターストレージメモリに作動可能に接続された状態にある、項目１〜２２のいずれか１項に記載のバイオセンサーを含むシステム。
（項目２４）
体液サンプルをさらに含む、項目２３に記載のシステム。
（項目２５）
電気回路によって前記少なくとも１つの導電性支持体に作動可能に接続された状態にあるデジタルディスプレイをさらに備え、該電気回路は、前記電圧計および／もしくは電流計からの電流および／もしくは電圧の差の測定値に対応する電気シグナルを該デジタルディスプレイに運び得、ここで該デジタルディスプレイは、前記少なくとも１種の代謝酵素がそのアミノ酸基質の酸化を触媒するために十分な期間にわたって該少なくとも１つの導電性支持体がサンプルと接触した状態にある場合に、該サンプル中のアミノ酸の濃度値を表示するように構成されている、項目２３または２４のいずれか１項に記載のシステム。
（項目２６）
前記少なくとも１つのコンピューターストレージメモリと作動可能に接続された状態にあるコンピュータープロセッサをさらに備える、項目２３〜２５のいずれか１項に記載のシステム。
（項目２７）
前記代謝酵素は、前記ヒドロゲル内に固定化されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼであり、該ヒドロゲルのアルギネート濃度は、前記少なくとも１つの導電性支持体に結合された総体積のうちの約１％〜約３％  ｗ／ｖである、項目２３〜２６のいずれか１項に記載のシステム。
（項目２８）
電気回路の中に構成された電圧計および／もしくは電流計ならびにディスプレイを含むバイオセンサーを備えるキットであって、該電気回路は、少なくとも１つの除去可能な導電性支持体と接触すると、該電圧計および／もしくは電流計が少なくとも１つの導電性支持体と作動可能な連絡状態にあるように閉じられ、該導電性支持体は、ヒドロゲルを含み；ここで該ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメント、およびアルギネートを含む、キット。
（項目２９）
１または複数の導電性支持体を備える複数の試験ストリップであって、ここで該１または複数の導電性支持体は、アルギネートを含むヒドロゲルを含む、試験ストリップ、
体液のコントロールサンプルもしくは参照サンプル、
閾値を含むデータのセット、および
指示のセット、
のうちの少なくとも１つをさらに含み、該指示のセットもしくは該データのセットは、必要に応じて、電子媒体を通じて遠隔からアクセス可能である、項目２８に記載のキット。
（項目３０）
少なくとも第１の電極および第２の電極を含む固体支持体を備えるキットであって、ここで該第１の電極は、ヒドロゲルを含み、該ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、および少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み；ここで該第２の電極は、コントロール電極もしくは参照電極である、キット。
（項目３１）
前記固体支持体は、前記第１の電極および第２の電極に結合された試験ストリップである、項目３０に記載のキット。
（項目３２）
体液サンプル中のアミノ酸の濃度を決定もしくは同定する方法であって、該方法は、体液サンプルを、項目１〜２２のいずれかに記載のバイオセンサーもしくは項目２３〜２７のいずれかに記載のシステム；または本明細書で開示される任意の試験ストリップに接触させる工程；および該サンプル中のアミノ酸の量を決定する工程、を包含する、方法。
（項目３３）
前記体液サンプルは、被験体由来の血液もしくは血清を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
被験体の体液サンプル中の１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度を定量する方法であって、該方法は、体液サンプルを、項目１〜２２のいずれかに記載のバイオセンサー、もしくは項目２３〜２７のいずれかに記載のシステム；または本明細書で開示される任意の試験ストリップに接触させる工程を包含する、方法。
（項目３５）
前記方法は、前記定量もしくは同定する工程によって得られた濃度値と、１もしくはそれより多くの代謝疾患と関連する閾値とを比較する工程をさらに包含する、項目３２〜３４のいずれかに記載の方法。
（項目３６）
前記接触させる工程は、被験体の前記体液サンプルを、項目１〜２２のいずれかに記載のバイオセンサーもしくは項目２３〜２７のいずれかに記載のシステム；または本明細書で開示される任意の試験ストリップに、前記代謝酵素もしくはその機能的フラグメントによる該体液サンプル中の少なくとも１種のアミノ酸の酸化を可能にするために十分な期間にわたって曝す工程を包含する、項目３２〜３５のいずれかに記載の方法。
（項目３７）
前記方法は、前記体液サンプルを前記少なくとも１つの導電性支持体に接触させる前に、該体液サンプルを何の外部刺激にも試薬にも曝す工程を包含しない、項目３２〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
前記体液サンプルは、被験体由来の血液もしくは血清を含む、項目３４〜３７のいずれかに記載の方法。
（項目３９）
前記体液サンプルは、尿を含まない、項目３２〜３７のいずれかに記載の方法。
（項目４０）
被験体における代謝疾患を診断する方法であって、該方法は、
（ａ）体液サンプルを、項目１〜２２のいずれかに記載のバイオセンサーもしくは項目２３〜２７のいずれかに記載のシステム；または本明細書で開示される任意の試験ストリップに接触させる工程；
（ｂ）該サンプル中のアミノ酸の該１もしくはそれより多くの濃度値を定量する工程；
（ｃ）該サンプル中のアミノ酸の該１もしくはそれより多くの濃度値と、健康な範囲にあると同定されたアミノ酸濃度の閾値とを比較する工程；ならびに
（ｄ）該サンプル中のアミノ酸の１もしくはそれより多くの濃度値が該閾値を超えるかまたは下回る場合に、該被験体が代謝疾患を有すると同定する工程、
を包含する、方法。
（項目４１）
前記代謝疾患は、フェニルケトン尿症、高アンモニア血症、およびメープルシロップ尿症のうちの少なくとも１つもしくは組み合わせから選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
治療への患者応答を決定する方法であって、該方法は、
（ａ）体液サンプルを、項目１〜２２のいずれかに記載のバイオセンサーもしくは項目２３〜２７のいずれかに記載のシステム；または本明細書で開示される任意の試験ストリップに接触させる工程；
（ｂ）１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度値を定量する工程；
（ｃ）該１種もしくはそれより多くの濃度値と、代謝疾患と関連する１もしくはそれより多くの閾値とを比較する工程、
を包含する、方法。
（項目４３）
固体支持体、ならびに該固体支持体に結合した少なくとも第１の電極および第２の電極を含む試験ストリップであって、ここで該第１の電極は、ヒドロゲルを含み、該ヒドロゲルは、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメント、およびアルギネートを含み；ここで該第２の電極は、コントロール電極もしくは参照電極である、試験ストリップ。
（項目４４）
前記試験ストリップは、電圧計および／もしくは電流計、ならびにデジタルディスプレイを含む携行式デバイス用に適合されており、その結果、該試験ストリップが該デバイスに接触している場合、該第１の電極および第２の電極は、該電圧計および／もしくは電流計、ならびに該デジタルディスプレイを含む閉じた電気回路に作動可能に接続されるようになり、そして体液サンプルと接触すると、該少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメントは、アミノ酸の酸化を触媒して、該体液サンプル中のアミノ酸の濃度値に対応して該第１の電極に電流を生じ、このような濃度値は、該携行式デバイスのディスプレイで読み取り可能である、項目４４に記載の試験ストリップ。
（項目４５）
項目１〜２２のいずれかに記載のバイオセンサーもしくは項目２３〜２７のいずれかに記載のシステム；または少なくとも１つの電極を含む本明細書で開示される任意の試験ストリップを製造する方法であって、該方法は、前記少なくとも１つの電極と、少なくとも１種の電子メディエーター、少なくとも１種の還元剤、少なくとも１種の代謝酵素もしくはその機能的フラグメント、およびアルギネートを含む溶液とを接触させる工程；その後、該少なくとも１つの電極と、約１５０μＭもしくはそれ未満の濃度を有する塩化カルシウム溶液とを接触させる工程
を包含する、方法。
（項目４６）
前記方法は、前記電極と、約１００μＭもしくはそれ未満の塩化カルシウム濃度を有する塩化カルシウム溶液とを接触させる工程を包含する、項目４５に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、体液サンプルと接触した状態で配置されているポイントオブケアデバイスの模式図を示す。
【図２】図２は、上記デバイスの第１の（測定）電極の拡大表面の模式図を示す。上記実施形態は、フェニルアラニンを、アンモニアおよびフェニルピルビン酸に酸化し得る固定化された酵素を図示する。還元剤（この場合はＮＡＤ＋）は、上記電極の導電性表面への電子（ｅ−）輸送を引き起こす酵素反応によって還元される。
【図３】図３は、上記導電性電極表面がアルギネートおよび少なくとも１種の代謝酵素を含むヒドロゲルで被覆されている実施形態の単純化した模式図を示す。「−」記号によって示される電極表面の負電荷は、上記体液中のアニオンに反発する。負電荷およびアルギネートゲルは、高分子量タンパク質が上記電極と接触しないようにする。アミノ酸基質のような実験種は、上記ヒドロゲルを通過する拡散を通じて電極に近づき得る。アニオン分子および高分子量タンパク質の反発および立体障害は、上記システム中で伝達されるシグナル妨害を低減する。
【図４】図４は、対電極（もしくは第２の電極）と並行して作動されるバイオセンサー電極の構成要素の基本的模式図を示す。参照電極の表面は、十分なコントロールシグナルのために、ヒドロゲルもしくは他の構成要素で官能化されない。
【図５】図５は、ヒドロゲルスラリーがどのように混合され、沈積させられて、電極が作り出されるかの一般的模式図を示す。最も左のパネルは、アルギネートスラリーをＮＡＤ＋、代謝酵素、およびトルイジンブルーと混合した第１の工程を示す。中央のパネルは、上記スラリーの１０マイクロリットルを電極表面に沈積していることを示す。最も右のパネルは、二酸化炭素ミスト中にＣａＣｌ２溶液を霧状にして噴霧し、上記アルギネートを上記電極の表面で固化する改変電極の第３の工程を示す。
【図６】図６は、固定化したグルタミン酸デヒドロゲナーゼを含むバイオセンサーから得られた測定値を示す。このグラフは、どの程度時間を経れば、上記改変電極上での電流応答が、溶液中の遊離グルタミン酸アミノ酸が上記電極と接触するにつれて増大するかを示す。
【図７】図７は、図６で利用されるバイオセンサーで集められたデータを使用したグラフを示す。このグラフは、種々の濃度のグルタミン酸を使用して集めた平均電流測定値が、濃度とシグナルとの間の直線的関係性を生じたことを示す。これらデータは、特定の電流測定値が、特定のアミノ酸濃度に正に相関することを示唆する。
【図８】図８は、２つの実験変数を用いて、上記バイオセンサーに接触している２種の濃度のグルタミン酸を使用する電流測定値のセットを示す。そのデータは、リン酸緩衝化生理食塩水溶液中のグルタミン酸が、結晶流体中で検出されるグルタミン酸シグナル強度と比較して、非常に弱い電流シグナル／強度を提供したことを示す。上記結果はまた、固定化した酵素が、ヒドロゲルの表面に固定化していないグルタミン酸デヒドロゲナーゼと比較して、シグナル対ノイズ比をより大きく特殊化することを示す。
【図９】図９は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼバイオセンサーで行われた実験を示し、これは、シグナル中の誤差（ｅｒｒｏｒ  ｉｎ  ｓｉｇｎａｌ）（標準偏差計算によって説明される）が、ウシ肝臓由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼの遊離および固定化されたバージョンと比較して、固定化された細菌グルタミン酸デヒドロゲナーゼを利用することによってどの程度減少するかを実証する。
【図１０】図１０は、マイクロモルレベルでグルタミン酸濃度の変動に関してピーク／最終電流の比を示す。
【図１１】図１１は、検出された電流シグナルがどのようにして特定の血液サンプル中のアミノ酸の濃度と一致している読み取り値へと増幅されるかに関する工程の一般的フロー図を示す。
【図１２】図１２は、電流シグナルがどのように得られ、デバイス内で増幅されるかに関する単純な回路図を示す。
【図１３】図１３は、フェニルアラニン濃度が、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをフェニルアラニンデヒドロゲナーゼで置換し、上記電極をフェニルアラニンに曝すことによって検出され得る実施形態の一般的模式図を示す。固定化されたグルタミン酸デヒドロゲナーゼを利用する実施形態に類似して、この実施形態で示されるバイオセンサーは、還元剤ＮＡＤ＋によって電子（ｅ−）の流れを作りだし、酵素反応から生じる電子生成物を電子メディエーターへ、上記電極の導電性表面へ輸送する。
【図１４】図１４は、ヒスチジンレベルが、２つの代謝酵素の固定化および還元剤としての過酸化水素の使用によって、決定され得る別の実施形態の一般的模式図を示す。
【図１５】図１５は、負に荷電したバリア（例えば、電極システムからの分子を物理的にフィルターにかけ、それによって、シグナルの妨害を低減する膜）を利用する実施形態を示す。図１５はまた、サンプル構成要素をフィルターにかけて妨害を減少させるための分子量フィルターの使用を示す。
【図１６】図１６は、物理的膜フィルターもしくは分子量フィルターを使用しないが、シグナルにおける妨害を減少させる方法として上記ヒドロゲルの化学的特性のみを使用する、本発明の一実施形態を示す。図３で示される実施形態とは異なって、この実施形態は、アルギネートを含まないヒドロゲルを利用する。
【図１７】図１７は、選択した代謝酵素を単離するために採用されるクローニングストラテジーおよび工程を示す。
【図１８】図１８は、代謝酵素のサブクローニングされたバージョンを組換え生成するために使用されるプラスミドｐＥＴ２８ａの制限マップを示す。
【図１９】図１９は、代謝酵素のサブクローニングされたバージョンを組換え生成するために使用されるプラスミドｐＥＴ２４ａの制限マップを示す。
【図２０】図２０は、患者情報が資料収集され、保存され、そして患者（図の左側）もしくはヘルスケア提供者（図の右側）によってアクセスされ得るインターネットコンテンツのウェブページマップの階層パターンで設計される電子インターフェイスを示す。
【図２１】図２１は、アルギネートおよび種々の濃度のＣａＣｌ２を含むヒドロゲルキャップ電極に対する血液サンプルの関数として電流応答の効果を示す。電極を１００μＭ  ＣａＣｌ２と組み合わせて１％  重量／体積比のアルギネート溶液で処理すると、上記サンプル中のグルタミン酸濃度のシグナルが大いに改善された。
【図２２】図２２は、所定のサンプル中のグルタミン酸の濃度に直線的に比例している、図２１で使用されるバイオセンサーの電流測定値を示す。
【図２３】図２３は、アルギネートなしのヒドロゲルを含むバイオセンサー（左側の棒グラフ）に対して試験されている、図２１で使用されたバイオセンサーの電流測定値（右側のグラフ）を示す。このデータは、約１％のアルギネート濃度を有するヒドロゲルを含むバイオセンサーが、健康な被験体から採取された血液サンプルと、グルタミン酸代謝に関連するアミノアシドパシーを有すると診断された被験体から採取された血液サンプルとの間と同程度に、非常に区別しやすい電流測定値をより多く作り出すことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
（発明の詳細な説明）
本発明の方法および他の局面に関する種々の用語は、本明細書および特許請求の範囲全体を通じて使用される。このような用語は、別段示されなければ、当該分野でのそれらの通常の意味が示されるものとする。他の具体的に定義される用語は、本明細書で提供される定義と一致した様式で解釈されるものとする。
【００３６】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ（１つの、ある）」、「ａｎ（１つの、ある）」および「ｔｈｅ（上記、この、その）」とは、状況が明らかに別のことを示さなければ、複数形への言及を含む。
【００３７】
用語「約」とは、量、時間的持続などのような測定可能な値に言及するときに本明細書で使用される場合、具体的な値から±２０％、±１０％、±５％、±１％、もしくは±０．１％のバリエーションを含むと意味され、よって、バリエーションは、開示される方法を行うために適している。
【００３８】
用語「アドレス指定可能位置」とは、本明細書で使用される場合、１種もしくは複数種の構成要素が表面を官能化するために固定化される固体支持体上の不連続の表面領域もしくは位置を意味する。いくつかの実施形態において、１種もしくはそれより多くの構成要素は、アミノ酸を含むサンプルへの上記１種もしくは複数種の構成要素の十分な期間にわたる曝露が、上記アミノ酸の酸化を生じるように、上記少なくとも１つの導電性表面の表面に結合したヒドロゲルに固定化もしくは吸収される。いくつかの実施形態において、本発明は、電極であって、約１０ナノメートルから約１０センチメートルまでの幅もしくは直径を有する電極の１もしくは複数のアドレス指定可能位置を含むものに関する。いくつかの実施形態において、そのアレイの上記１もしくは複数のアドレス指定可能位置は、ピペットによって手動で、もしくはロボットデバイスによって自動的に突き止められる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「結合する（ａｔｔａｃｈ）」、「結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）」、「付着する（ａｄｈｅｒｅ）」、「付着した（ａｄｈｅｒｅｄ）」、「付着の（ａｄｈｅｒｅｎｔ）」もしくは類似の用語は、一般に、例えば、基、化合物もしくは酵素を表面に、例えば、物理的吸収、化学的結合、および類似プロセス、またはこれらの組み合わせによって、固定化もしくは固定することをいう。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「生検」とは、分析のために被験体もしくは患者から取り出された細胞サンプル、細胞の集まり、もしくは体液を意味する。いくつかの実施形態において、上記生検は、骨髄生検、パンチ生検、内視鏡生検、針生検、薄片生検（ｓｈａｖｅ  ｂｉｏｐｓｙ）、切開生検、摘出生検、もしくは外科的切除である。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「体液」とは、被験体から単離される任意の流体（血液サンプル、血清サンプル、尿酸プル、粘液サンプル、唾液サンプル、および汗サンプルが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない）を意味する。上記サンプルは、静脈穿刺、生検、スワブ、毛細管吸引（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｄｒａｗ）、ランセット、針吸引、排出流体の単純な捕捉による収集のような任意の手段によって被験体から得られ得る。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「電子媒体」とは、電子的アクセス技術を使用する任意の物理的保存（ハードディスク、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＲＡＭ、フラッシュメモリ、不揮発性メモリ、もしくは任意の実質的かつ機能的に等価な媒体が挙げられる）を意味する。いくつかの実施形態において、上記ソフトウェア保存は、本発明の一実施形態を実施するプロセッサと同じ場所に配置され得るか、または少なくとも上記ソフトウェア保存の一部は、遠隔に配置され得るが、必要とされる場合にはアクセス可能であり得る。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「アミノアシドパシー」とは、被験体の身体においてアミノ酸の生成にわたってもしくは生成中に生じる、アミノ酸の代謝的触媒作用の機能不全によって特徴付けられる疾患もしくは障害をいうことが意味される。アミノアシドパシーの例は、代謝疾患（本願において交換可能に使用される用語）の定義に列挙される。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「配列同一性」とは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のｆｔｐサイトから検索され得る、２つの配列をブラストする（ｂｌａｓｔｉｎｇ）ために（ｂｌ２ｓｅｑ）それだけで実行可能なデフォルトパラメーターを使用してＢＬＡＳＴエンジンプログラムを使用することによって決定される（Ｔａｔｕｓｏｖａ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，  １９９９，  １７４，  ２４７−２５０；これは、その全体において本明細書に参考として援用される）。用語「〜に対して相同である」を使用することは、測定される「配列同一性」と類義語である。
【００４５】
用語「被験体」とは、体液サンプルが採取される動物を説明するために、本明細書全体を通じて使用される。ある実施形態において、上記動物は、ヒトである。特定の被験体（例えば、ヒト）に対して特異的である状態の診断のために、用語「患者」は、交換可能に使用され得る。本発明の説明のいくつかの場合に、用語「患者」とは、特定の疾患もしくは障害に罹患しているヒト患者をいう。いくつかの実施形態において、上記被験体は、アミノアシドパシーを有すると疑われているか、またはアミノアシドパシーを発生させるリスクがあると同定されつつあるヒトであり得る。いくつかの実施形態において、上記被験体は、少なくとも１つのアミノアシドパシーを有すると診断され得る。いくつかの実施形態において、上記被験体は、フェニルケトン尿症を有すると疑われているかもしくはフェニルケトン尿症と既に診断されている。いくつかの実施形態において、上記被験体は、アミノアシドパシーを有すると疑われているかもしくはアミノアシドパシーを発症させるリスクがあると同定されつつあるヒトであり得る。いくつかの実施形態において、上記被験体は、その単離される体液サンプルの供給源として機能する哺乳動物であり得る。いくつかの実施形態において、上記被験体は、体液サンプルが単離されるかもしくは提供される非ヒト動物であり得る。用語「哺乳動物」とは、ヒトおよび非ヒトの両方を包含し、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、およびブタが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「保存的」アミノ酸置換は、以下の表Ａ、表Ｂ、もしくは表Ｃ中に示されるように定義され得る。代謝酵素としては、保存的置換が、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの改変によって導入されたアミノ酸配列を含む。アミノ酸は、物理的特性、ならびに二次タンパク質構造および三次タンパク質構造への寄与に従って分類され得る。保存的置換は、１つのアミノ酸を、類似の特性を有する別のアミノ酸で置換することとして当該分野で認識される。例示的な保存的置換は、表Ａに示される。
【表Ａ】
0006397822.tif 000004
【００４７】
あるいは、保存的アミノ酸は、表Ｂに示されとおりＬｅｈｎｉｎｇｅｒに記載されるように（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．  ＮＹ，  Ｎ．Ｙ．  （１９７５），  ｐｐ．  ７１−７７）グループ分けされ得る。
【表Ｂ】
0006397822.tif 000005
【００４８】
あるいは、例示的な保存的置換は、表Ｃに示される。
【表Ｃ】
0006397822.tif 000006
【００４９】
本明細書で記載される細胞外マトリクスと関連するポリペプチド配列を含むポリペプチドは、アミノ酸残基の１個もしくはそれより多くの（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）挿入、欠失、もしくは置換、またはこれらの任意の組み合わせ、ならびにアミノ酸残基の挿入、欠失もしくは置換以外の改変を有するポリペプチドを含むことが意図されると理解されるべきである。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「予後予測する」とは、疾患のあり得る経過および転帰を決定することを意味する。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語「機能的フラグメント」は、フラグメントが基づく野生型ポリペプチドに類似もしくは実質的に類似である少なくとも部分的な生物学的機能を保持するために十分な長さがあるポリペプチドの任意の一部を意味する。いくつかの実施形態において、代謝酵素の機能と関連するポリペプチドの機能的フラグメントは、表２に開示される任意のポリペプチドの少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％配列同一性を含み、上記ポリペプチドに結合する１種もしくは複数種のリガンドに対して少なくとも部分的結合親和性を保持するために十分な長さを有するポリペプチドである。いくつかの実施形態において、上記フラグメントは、表２に開示されるいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約１０個、約２０個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、もしくは約１００個の連続したアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、上記フラグメントは、表２に開示されるいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約５０個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、上記フラグメントは、表２に開示されるいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約１００個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、上記フラグメントは、表２に開示されるいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約１５０個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、上記フラグメントは、表２に開示されるいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約２００個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、上記フラグメントは、表２に開示されるいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約２５０個のアミノ酸の長さを有する。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「代謝酵素と関連するポリペプチド配列」は、いずれかの多細胞生物の細胞によって天然に生成されかつ本明細書で開示されるとおりの代謝酵素もしくはその機能的フラグメントである任意の高分子（例えば、糖分子もしくは高分子）によって改変されているかまたは改変されていない、いずれかのポリペプチドもしくはそのフラグメントである。いくつかの実施形態において、細胞外マトリクスと関連するポリペプチド配列は、配列が表２に開示されるポリペプチドのうちのいずれかを含む、いずれかのポリペプチドである。いくつかの実施形態において、上記代謝酵素と関連するポリペプチド配列は、表２に開示されるポリペプチドのうちのいずれかを含むいずれかのポリペプチド配列または表２に開示されるポリペプチドもしくはこれらの機能的フラグメントと８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を共有する配列である。いくつかの実施形態において、上記代謝酵素と関連するポリペプチド配列は、表２に開示されるポリペプチドのうちのいずれか、または表２に開示されるポリペプチドと８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を共有する配列からなる。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」とは、天然であろうが、完全にもしくは部分的に合成して生成されていようが、任意の免疫グロブリンをいう。いくつかの実施形態において、抗体は、４つの全長ポリペプチド鎖から構成され、その各々が、可変領域および定常領域を含む複合体（例えば、実質的には、Ｂ細胞によって本質的には生成される抗体の構造）である。いくつかの実施形態において、抗体は、１本鎖である。いくつかの実施形態において、抗体は、ラクダ様（ｃａｍｅｌｏｉｄ）である。いくつかの実施形態において、抗体は、抗体フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗体は、キメラである。いくつかの実施形態において、抗体は、二重特異的である。いくつかの実施形態において、抗体は、多重特異的である。いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナルである。いくつかの実施形態において、抗体は、ポリクローナルである。いくつかの実施形態において、抗体は結合体化されている（すなわち、他のタンパク質、放射性標識、サイトカインに結合体化もしくは融合している抗体）。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、マウス抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ウサギ抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ラット抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ロバ抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるバイオセンサーもしくはシステムは、１種もしくは複数種の抗体を備える。
【００５４】
特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）：本明細書で使用される場合、用語「特徴、特徴的、特徴を示す（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）」とは、体液サンプルの任意の検出可能な特徴であって、上記体液サンプルを、匹敵する体液サンプルから区別可能にするものに言及する。いくつかの実施形態において、特徴は、アミノ酸の量もしくは独自性である。いくつかの実施形態において、特徴は、遺伝子転写物の量もしくは配列である。いくつかの実施形態において、特徴は、アミノ酸の量、配列もしくは改変である。いくつかの実施形態において、特徴は、炭水化物の量である。いくつかの実施形態において、特徴は、低分子の量である。
【００５５】
匹敵する：本明細書で使用される場合、用語「匹敵する」とは、比較を可能にするために十分類似であるが、少なくとも１つの特徴において異なっている２つの実体をいうために使用される。
【００５６】
代謝酵素：本明細書で使用される場合、用語「代謝酵素」とは、１種もしくはそれより多くのアミノ酸の代謝経路における少なくとも１つの工程の触媒を担う酵素を意味する。いくつかの実施形態において、上記代謝酵素は、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、そのそれぞれの機能的フラグメントもしくは組み合わせ、またはそれらの融合タンパク質である。
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語「代謝疾患」は、１種もしくはそれより多くのアミノ酸の代謝経路における酵素工程にあるか、またはある種のアミノ酸の細胞内もしくは細胞外への輸送に必要なタンパク質メディエーターにある、欠陥によって引き起こされる障害のグループのうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態において、上記代謝疾患は、以下から選択される：アルギニン血症（ＡＲＧ、アルギナーゼ欠損症）、アルギノコハク酸尿症（ＡＳＡ、アルギノスクシナーゼ）、シトルリン血症Ｉ型（ＣＩＴ−Ｉ、アルギのスクシネートシンターゼ）、シトルリン血症ＩＩ型（ＣＩＴ−ＩＩ、シトリン欠損症）、ビオプテリンコファクター生合成（ＢＩＯＰＴ−ＢＳ）の欠損、ビオプテリンコファクター再生（ＢＩＯＰＴ−ＲＧ）の欠損、ホモシスチン尿症（ＨＣＹ、シスタチオニンβシンターゼ）、高フェニルアラニン血症（Ｈ−ＰＨＥ）、高メチオニン血症（ＭＥＴ）、メープルシロップ尿症（ＭＳＵＤ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ）、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、チロシン血症Ｉ型（ＴＹＲ−１，フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ）、チロシン血症ＩＩ型（ＴＹＲ−ＩＩ、チロシンアミノトランスフェラーゼ）、およびチロシン血症ＩＩＩ型（ＴＹＲ−ＩＩＩ、ヒドロキシフェニルピルビン酸デオキシゲナーゼ）。ここで各疾患状態の後にある括弧の中の語句は、上記疾患状態に罹患している被験体において一般に欠損している酵素によって起こる疾患の略語を表す。
【００５８】
ポリペプチド：用語「ポリペプチド」とは、本明細書で使用される場合、一般に、少なくとも３個のアミノ酸のポリマーのその分野で認識された意味を有する。当業者は、用語「ポリペプチド」が、本明細書で記載される完全配列を有するポリペプチドを包含するのみならず、このような完全ポリペプチドの機能的フラグメント（すなわち、少なくとも１つの活性を保持するフラグメント）を表すポリペプチドをも包含することに関して、十分に一般的であることが意図されることを認識している。さらに、当業者は、タンパク質配列が、活性を破壊することも有意に低下させることもなく、ある種の置換を一般に許容することを理解する。従って、活性を保持し、かつ同じクラスの別のポリペプチドと少なくとも約３０〜４０％の全体的な配列同一性（しばしば、約５０％超（ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ  ａｂｏｕｔ  ５０％＞）、約６０％超、約７０％超、約７５％超、約８０％超、もしくは約８５％超）、およびさらに、通常は、１もしくはそれより多くの（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）非常に保存された領域において遙かに高い同一性を共有し、しばしば、９０％超＞またはさらには９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の少なくとも１つの領域を含み、通常は、少なくとも３〜４個、およびしばしば、最大２０個までもしくはこれより多くのアミノ酸を含むいずれかのポリペプチドは、本明細書で使用される場合に、関連する用語「ポリペプチド」内に包含される。
【００５９】
本明細書で使用される場合、用語「閾値」は、体液サンプル中のアミノ酸の量が、特定の障害（例えば、代謝疾患）の診断を生じるかもしくはその診断を疑われる、異常に高いもしくは低いと考えられるか否かを示す、上記体液サンプル中のアミノ酸の濃度である。例えば、血液サンプルの場合には、ある種のアミノアシドパシーに関する公知の閾値は、以下の表１に示される：
【表１】
0006397822.tif 000007
【００６０】
いくつかの実施形態において、閾値もしくは参照体液サンプルについての情報は、体液実験サンプルについての情報より前に、もしくはその情報と同時に得られる。いくつかの実施形態において、参照細胞もしくは細胞型についての情報は、過去の情報である（ｉｓ  ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ）。いくつかの実施形態において、閾値もしくは体液参照サンプルについての情報は、例えば、コンピューター読み取り可能な保存媒体中に保存される。いくつかの実施形態において、特定の濃度値と、閾値もしくは体液参照サンプルとの比較は、体液実験サンプル中の１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度値と、上記閾値とを区別し、それによって、１もしくはそれより多くの代謝疾患を有する被験体の診断または１もしくはそれより多くの代謝疾患の重症度の変化を生じる比較を可能にする。
【００６１】
参照電極：状況から理解されるように、参照電極もしくはコントロール電極は、導電性支持体（例えば、上記参照電極もしくはコントロール電極と上記ヒドロゲルおよび／もしくは本明細書で開示される固定化した酵素を含む少なくとも１つの導電性支持体との間の電圧差の想定的比較を可能にするために、ヒドロゲルおよび／もしくは本明細書で開示される固定化した酵素を含む少なくとも１つの導電性支持体とともに回路の中に配置された電極）である。
【００６２】
サンプル：本明細書で使用される場合、用語「サンプル」とは、本明細書で記載されるように、目的の供給源から得られるかもしくはこれに由来する生物学的サンプルをいう。いくつかの実施形態において、目的の供給源は、生物（例えば、動物もしくはヒト）を含む。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、生物学的組織もしくは流体を含む。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、骨髄；血液；血球；腹水；組織もしくは細針生検サンプル；細胞含有体液；遊離の浮遊核酸；喀痰；唾液；尿；脳脊髄液、腹膜液（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｆｌｕｉｄ）；胸水；糞便；リンパ；婦人科学的流体；皮膚スワブ；膣スワブ；口内スワブ；鼻内スワブ；洗液または洗浄液（ｗａｓｈｉｎｇｓ  ｏｒ  ｌａｖａｇｅｓ）（例えば、管洗浄液（ｄｕｃｔａｌ  ｌａｖａｇｅｓ）もしくは気管支肺胞洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｅｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅｓ））；吸引物；掻き取り物；骨髄吸引標本；組織生検標本；手術標本；糞便、他の体液、分泌物、および／もしくは排出物；ならびに／またはそれらに由来する細胞などであってもよいし、これらを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、体液であるか、または体液を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、いずれかの適切な手段によって目的の供給源から直接得られた「一次サンプル」である。例えば、いくつかの実施形態において、一次生物学的サンプルは、生検（例えば、細針吸引物もしくは組織生検）、手術、体液の集まり（例えば、血液、リンパ、糞便など）などからなる群より選択される方法によって得られる。いくつかの実施形態において、状況から明らかであるように、用語「サンプル」とは、一次サンプルを加工処理することによって（例えば、一次サンプルの１種もしくはそれより多くの構成要素を除去することによって、および／もしくは１種もしくはそれより多くの薬剤を一次サンプルに添加することによって）、例えば、半透膜を使用する濾過によって、得られる調製物をいう。このような「加工処理されたサンプル」は、サンプルから抽出されるか、またはｍＲＮＡの増幅もしくは逆転写、ある種の構成要素の単離および／もしくは精製などのような技術に一次サンプルを供することによって得られる、例えば、核酸もしくはタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、加工処理されたサンプルを含まない。
【００６３】
本発明は、複数の特定のアミノ酸の総濃度を測定するためのアミノ酸バイオセンサーに関する。上記アミノ酸バイオセンサーは、構成要素として、メディエーターおよび酵素（上記複数の、各々基質として働く特定のアミノ酸に対して選択的に作用する）を含む測定電極、ならびに対電極を含む。上記アミノ酸バイオセンサーにおいて、上記酵素は、上記複数の特定のアミノ酸の各々に対して基質親和性を有する。上記酵素は、基質としての上記複数の特定のアミノ酸の各々において反応を触媒して、反応生成物を形成するように機能する。上記メディエーターは、アミノ酸濃度測定の間に、上記反応生成物と上記測定電極との間で電子を運ぶように機能する。さらに、上記アミノ酸バイオセンサーは、測定点において、上記測定電極と上記対電極との間に電圧を、印加される電圧と、上記複数のと工程のアミノ酸の各々に関する特定の濃度における電流値との間の関係を表す分析曲線において、その印加される電圧が、同じ濃度でおよび同じ印加される電圧で上記アミノ酸の種々の電流値を可能にする電圧であるような様式で印加するように設計されている。
【００６４】
いくつかの実施形態において、上記測定電極（少なくとも第１の電極）は、補酵素もしくは還元剤を構成要素として含むヒドロゲルをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記酵素は、デヒドロゲナーゼからなる。さらに、上記反応生成物は、上記補酵素の還元によって得られる還元型補酵素からなり、上記メディエーターは、上記アミノ酸濃度測定の間に、上記還元型補酵素から上記測定電極へと電子を運ぶように機能する。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるバイオセンサーもしくはシステムは、以下とともに使用される：
１．上記電極と電気的に接続した状態にあり、上記電極間に、上記作用電極の表面で上記メディエーターの還元型の拡散律速電極酸化（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）を引き起こすために十分な電位差を供給し得る電源；および
２．上記電極と電気的に接続した状態にあり、上記の電位差が印加されている、上記メディエーターの還元型の酸化によって生じた拡散律速電流を測定し得る少なくとも１つの計器（例えば、電圧計および／もしくは電流計）。
【００６６】
上記計器は、通常、上記電流測定値にアルゴリズムを適用して、それによって分析物濃度が提供されかつ視覚的に表示されるように適合させられる。このような電源、計器、およびバイオセンサーシステムにおける改善は、出願人に譲渡された米国特許第４，９６３，８１４号（１９９０年１０月１６日発行）；米国特許第４，９９９，６３２号（１９９１年３月１２日発行）；米国特許第４，９９９，５８２号（１９９１年３月１２日発行）；米国特許第５，２４３，５１６号（１９９３年９月７日発行）；米国特許第５，３５２，３５１号（１９９４年１０月４日発行）；米国特許第５，３６６，６０９号（１９９４年１１月２２日発行）；Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ，  米国特許第５，４０５，５１１号（１９９５年４月１１日発行）；およびＷｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ，  米国特許第５，４３８，２７１号（１９９５年８月１日発行）の主題である（これらの開示は、明示的に参考として援用される）。
【００６７】
多くの流体サンプルが分析され得る。例えば、当業者に容易に明らかであるヒトおよび非ヒト体液（例えば、全血、血漿、血清、リンパ、胆汁、尿、精液、脳脊髄液、髄液、涙液および糞便標本、ならびに他の生物学的流体）が、測定され得る得る。ヒトおよび非ヒト動物由来の組織の流体調製物はまた、食品、発酵生成物および環境物質（これは、潜在的に環境汚染物質を含む）とともにアッセイされ得る。いくつかの実施形態において、ヒト血清は、本発明でアッセイされる。
【００６８】
反応が完了した後、電源（例えば、バッテリー）は、電極間に電位差を付与する。上記電位差が付与される場合、補助電極におけるメディエーターの酸化型の量および上記電位差は、上記作用電極の表面において上記少なくとも１種のメディエーターの還元型の拡散律速電極酸化を引き起こすために十分でなければならない。いくつかの実施形態において、上記作用電極は、本明細書で開示されるヒドロゲルを含む。電流測定計器（示されない）は、上記作用電極の表面において上記メディエーターの還元型の酸化によって生成される拡散律速電流を測定する。その測定された電流は、以下の要件が満たされる場合に、サンプル中の１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度に正確に相関し得る：
１．上記メディエーターの還元型の酸化速度が、上記作用電極の表面への上記メディエーターの還元型の拡散速度によって左右される。
２．上記生じた電流は、上記作用電極の表面において上記メディエーターの還元型の酸化によって制限される。
【００６９】
バイオセンサーを製造するために、金属化フィルムのロールが、除去／洗浄および乾燥ステーションへとガイドロールを通じて供給される。底部プレート要素１４を除去し得るレーザーシステムは、当業者に公知である。その非限定的な例としては、除去のパターンが鏡、レンズ、およびマスクによって制御されるエキシマレーザーが挙げられる。このようなシステムの非限定的な例は、ＬＰＸ−３００もしくはＬＰＸ−２００（ともに、ＬＰＫＦ  Ｌａｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ＧｍｂＨ（Ｇａｒｂｓｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販されている）である。
【００７０】
レーザーアブレーターにおいて、上記金属化フィルムの金属層は、単離された電極セットのリボンを形成するために、所定のパターンで除去される。上記金属化フィルムは、上記単離された電極セットが、電気化学的領域に隣接して配置された陥凹部を作るために形成され後に、さらに除去される。次いで、上記リボンは、より多くのガイドロールと引っ張りループ（ｔｅｎｓｉｏｎ  ｌｏｏｐ）とを通過し、選択肢的な検査用カメラを通過する。上記カメラは、欠陥をチェックするために、品質管理に使用される。
【００７１】
試薬は、混ぜ合わされ、分与および乾燥ステーションで上記電気化学的領域の中央に液体形態で適用される。試薬適用技術は、米国特許第５，７６２，７７０号（その開示は、本明細書に明示的に参考として援用される）に記載されるように、当業者に周知である。試薬が液体もしくは他の形態でアレイに適用され得、本開示に従って、上記電気化学的領域の中央で乾燥もしくは半乾燥され得ることは、認識される。
【００７２】
さらに、ロールもしくは上部プレート要素材料は、スペーサー材料のロールとともに、アセンブリステーションに供給される。上記スペーサー材料のいずれかの側にあるライナーは、そのステーションで除去され、上記上部プレート要素もしくは表面足場は、上部プレート要素／スペーサーサブアセンブリを形成するために、上記スペーサー材料の片側に適用される。上記上部プレート要素／スペーサーサブアセンブリは、バイオセンサーの列に適した幅へと細長く裁断される。次に、新たな剥離ライナーが、カバーの反対側にある上記スペーサーの側面に付加され、上記サブアセンブリは、ロールへと巻かれる。
【００７３】
上記試薬を被覆した底部プレート要素のリボンはほどかれ、上記上部プレート要素／スペーサーサブアセンブリとともに、センサーアセンブリステーションへと供給される。上記ライナーは、上記スペーサーから除去去れ、上記サブアセンブリは、試薬を覆うために底部プレート要素上に配置される。次に、上記アセンブリされた材料は、個々のバイオセンサーを形成するために切断され、これらセンサーはソートされ、バイアルへと詰められ、各々ストッパーで閉じられて、詰められたセンサー試験ストリップを与える。
【００７４】
除去陥凹部が本明細書で記載されるものの、底部プレート要素に陥凹部を形成するための方法も同様に限定されないことは認識される。例えば、上記陥凹部は、エッチング（例えば、フォトリソグラフィー法を使用して）もしくは上部プレート要素の表面の一部を別の方法で除去することによって、形成され得る。最も近い電極縁部は、上記陥凹部から約１０μｍ〜５００μｍ、好ましくは、上記陥凹部から１００μｍ〜４００μｍ、最も好ましくは、上記陥凹部から２００μｍ〜３００μｍにある。本開示に従う陥凹部とともに形成されるバイオセンサーは、化合物（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の概して均一な厚みを有する試薬プロフィールを生じる。概して均一な厚みは、より正確なサンプル分析を可能にする。
【００７５】
上記のプロセスおよび生成物は、使い捨てバイオセンサー、特に、診断デバイスにおける使用のためのものを含む。
【００７６】
（電極）
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるバイオセンサー、システムもしくは試験ストリップは、１もしくはそれより多くの電極を含む。いくつかの実施形態において、上記１もしくはそれより多くの電極は、上記代謝酵素もしくはその機能的フラグメントとその１種もしくはそれより多くの基質との間の反応によって生成される電流バリエーションを伝える。いくつかの実施形態において、上記１種もしくはそれより多くの基質は、１種もしくはそれより多くのアミノ酸である。いくつかの実施形態において、上記電極は、金属を含む。いくつかの実施形態において、上記電極は、金属が沈積される炭素足場を含む。いくつかの実施形態において、上記電極は、カーボンナノチューブの炭素足場を含む。
【００７７】
本発明に適した電極構造およびこのような構造を生成するための方法は、他の目的のために、バイオセンサー技術で既に示唆されてきた。この点に関して、米国特許第６，６４５，３５９号が参照され、その内容は、その全体において本明細書に参考として援用される。電極もしくは導電性の通路（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｒａｃｋｓ）は、第１の表面に作られるかもしくは単離される。通路は、バイオセンサーの電極を表す。本明細書で使用される場合、語句「電極セット」は、少なくとも２つの電極、例えば、２〜２００、もしくは３〜２０個の電極のセットである。これら電極は、例えば、作用（もしくは測定）電極および補助電極であり得る。いくつかの実施形態において、通路は、陥凹部の周囲内に位置づけられた櫛形電極（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）アレイおよびアレイから末端に向かって陥凹部の間に延びる導線を形成するように協同する。
【００７８】
通路は、導電性材料から構築される。導電性材料の非限定的な例としては、アルミニウム、炭素（例えば、グラファイト）、コバルト、銅、ガリウム、金、インジウム、イリジウム、鉄、鉛、マグネシウム、水銀（アマルガムとして）、ニッケル、ニオブ、オスミウム、パラジウム、白金、レニウム、ロジウム、セレン、ケイ素（例えば、高度にドープされた多結晶ケイ素）、銀、タンタル、スズ、チタン、タングステン、ウラン、バナジウム、亜鉛、ジルコニウム、これらの混合物、およびこれら元素の合金、酸化物、もしくは金属化合物が挙げられる。好ましくは、通路は、金、白金、パラジウム、イリジウム、もしくはこれら金属の合金を含む。なぜならこのような貴金属およびこれらの合金は、生物学的系において無反応であるからである。いくつかの実施形態において、上記通路は、銀および／もしくは塩化銀から作製された作用電極であり、通路は、同様に銀および／もしくは塩化銀から作製され、上記作用電極と実質的に同じサイズである補助電極である。
【００７９】
通路は、レーザーアブレーションによって上記導電性表面の残りから単離される。レーザーアブレーションを使用して表面に電極を形成するための技術は公知である。レーザーアブレーションを使用して表面に電極を形成するための技術は公知である。例えば、米国特許出願第０９／４１１，９４０号（１９９９年１０月４日出願、標題「ＬＡＳＥＲ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＦＥＡＴＵＲＥＳ  ＦＯＲ  ＰＡＴＴＥＲＮＥＤ  ＬＡＭＩＮＡＴＥＳ  ＡＮＤ  ＥＬＥＣＴＲＯＤＥ」、その開示は、本明細書に明示的に参考として援用される）を参照のこと。通路は、好ましくは、上記導電性材料を上記電極の周りに延びる領域から除去することによって作り出される。従って、通路は、約５μｍ〜約５００μｍの幅を有する間隙によって表面上の導電性材料の残りから単離され、好ましくは、上記間隙は、約１００μｍ〜約２００μｍの幅を有する。あるいは、通路は、レーザーアブレーションのみで底部表面に作り出され得ることが認識される。さらに、通路は、積層されてもよいし、スクリーン印刷されてもよいし、フォトリソグラフィーによって形成されてもよい。
【００８０】
複数電極配置はまた、本開示によれば可能である。例えば、さらなる導電性通路を含むバイオセンサーが形成され得ることが、企図される。図４に示される配置のような３電極配置では、第１の通路は、作用電極であり、第２の通路は、対電極であり、第３の電極は、参照電極である。通路が作用電極であり、第３の電極が補助電極もしくは参照電極として提供されるもう１つの３電極配置が考えられることもまた、認識される。通路の数、ならびにアレイの中の通路間の間隔は、本開示に従って変動し得、そして当業者によって認識されるように多くのアレイが形成され得ることが認識される。いくつかの実施形態において、上記電極は、固体支持体に埋め込まれるかもしくは結合される（例えば、プラスチックおよび／もしくは紙材料を含む試験ストリップ）。
【００８１】
微小電極アレイは、非常に小さな寸法の２つの電極（代表的には、各電極は、一般的元素および電極元素を有する）もしくは微小電極を一般に有する構造である。「櫛形」であれば、上記アレイは、交互に組まれた指のような様式で配置される（例えば、米国特許第５，６７０，０３１号を参照のこと）。これらは、概して微小電極のサブクラスである。微小電極櫛形アレイ、もしくはＩＤＡは、所望の精嚢特徴を示し得る；例えば、それらの小さな寸法に起因して、ＩＤＡは、優れたシグナル対ノイズ比を示し得る。
【００８２】
櫛形アレイは、集積回路フォトリソグラフィー法を使用して、ケイ素もしくはガラス基板のような非可撓性の基板に配置されてきた。ＩＤＡは、非常に小さな寸法（例えば、１〜３μｍ範囲の外形寸法を有する）で使用される場合、優れた性能特性を提供すると考えられたので、非可撓性基板上で使用されてきた。このような小さな寸法では、基板の表面構造（例えば、平面度もしくは粗さ）は、上記ＩＤＡの性能に重要になる。非可撓性基板、特にケイ素は、極めて優れた滑らかで、平坦な表面をに加工処理され得るので、これらは、ＩＤＡで使用されてきた。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つの電極は、本明細書で開示されるいずれかのＩＤＡの構成要素である。
【００８３】
（ヒドロゲル）
上記ヒドロゲルは、水の中で膨潤するが、溶解しない架橋されたポリマー物質であり得る。上記ヒドロゲルが、それ自体の重量の少なくとも約１〜約１０倍、および一実施形態では、少なくとも約１００倍の液体を吸収でき得ることは、想定される。上記バイオセンサーにおける使用に選択されたヒドロゲルは、官能化の方法に直接依存するはずである。上記ヒドロゲルが生体適合性であり得ることは想定される。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、アルギン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、約０．１％〜約５％  ｗ／ｖ  アルギネートを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、約０．１％〜約４％  ｗ／ｖ  アルギネートを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、約０．１％〜約３％  ｗ／ｖ  アルギネートを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、約０．１％〜約２％  ｗ／ｖ  アルギネートを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、約０．１％〜約１％  ｗ／ｖ  アルギネートを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、約０．１％〜約１％  ｗ／ｖ  アルギネートを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、約０．２％〜約１％  ｗ／ｖ  アルギネートを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、アルギン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、約０．３％〜約１％  ｗ／ｖ  アルギネートを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、約０．４％〜約１％  ｗ／ｖ  アルギネートを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、約０．５％〜約１％  ｗ／ｖ  アルギネートを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、約０．６％〜約１％  ｗ／ｖ  アルギネートを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、約０．７％〜約１％  ｗ／ｖ  アルギネートを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、約０．８％〜約１％  ｗ／ｖ  アルギネートを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、約０．９％〜約１％  ｗ／ｖ  アルギネートを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、約１．０％〜約３．０％  ｗ／ｖ  アルギネートを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、約１．０％〜約２．０％  ｗ／ｖ  アルギネートを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、約１．０％〜約１．５％  ｗ／ｖ  アルギネートを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、約１％、約２％、もしくは約３％  ｗ／ｖ  アルギネートを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、アルギン酸ナトリウムを含む。上記アルギネートは、バルク形態、またはモノマー、Ｇブロック、Ｍブロック、および／もしくはＧＭブロックの反復パターン（ｒｅｐｉｔｉｖｅ  ｐａｔｔｅｒｎ）において使用されるアルギネートのいずれかの個々のポリマーであり得る。いくつかの実施形態において、上記アルギネートは、以下の式：
【化２】
0006397822.tif 000008
を含み、ここでｍおよびｎは、任意の正の整数である。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、アクリルモノマーから重合され得る。上記アクリルモノマーは、以下のうちの１つもしくは組み合わせであり得る：アクリルアミド−グリコール酸、アクリルアミド−メチル−プロパン（ｐｒｏｐａ−ｎｅ）−スルホン酸、アクリルアミド−エチルホスフェート、ジエチル−アミノエチル−アクリルアミド、トリメチル−アミノ−プロピル−メタクリルアミド、Ｎ−オクチルアクリルアミド、Ｎ−フェニル−アクリルアミドおよびｔｅｒｔ−ブチル−アクリルアミド。上記デバイスが架橋剤を含む実施形態において、例示的な架橋剤としては、Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミド、Ν，Ν’−メチレン−ビスメタクリルアミド、ジアリル酒石酸ジアミド（ｄｉａｌｌｙｌｔａｔａｒｄｉａｍｉｄｅ）およびポリ（エチレングリコール）ジメタクリレートであり得る。適切なヒドロゲルの例としてはまた、シリコンウェハ、ホウケイ酸ガラス基板、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられ得る。
【００８４】
上記ヒドロゲルは、任意の数の分子を含み得る。例えば、上記ヒドロゲルは、重合かモノマーもしくはヒドロゲル  架橋剤および必要に応じて化学物質もしくはＵＶ光活性化誘発剤を含み得る。このようなモノマーもしくはダイマーの例としては、以下が挙げられる：ビニルアセテート、ビニルピロリドン、ビニルエーテル、オレフィン、スチレン、ビニルクロリド、エチレン、アクリレート、メタクリレート、ニトリル、アクリルアミド、マレエート、エポキシド、エポキシド、ラクトン、エチレンオキシド、エチレングリコール、エチルオキサゾリン、アミノ酸、サッカリド、タンパク質、無水物、アミド、カーボネート、フェニレンオキシド、アセタール、スルホン、フェニレンスルフィド、エステル、フルオロポリマー、イミド、アミド−イミド、エーテルイミド、イオノマー、アリールエーテルケトン、アミン、フェノール、酸、ベンゼン、シンナメート、アゾール、シラン、クロリド、およびエポキシド、Ν，Ν’−メチレンビスアクリルアミド、メチレンビスメタクリルアミド、エチレングリコール−ジメタクリレート、Ν，Ν’−メチレンビスアクリルアミド、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）、ポリエチレングリコールジメタクリレート（ＰＥＧＤＭＡ）、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）、ポリエチレングリコールジメタクリレート（ＰＥＧＤＭＡ）、ポリ（ビニリデンフルオリド）（ＰＶｄＦ）ベースのポリマー、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）ベースのポリマー、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ベースのポリマー、ポリビニルクロリド（ＰＶＣ）ベースのポリマー、ならびにポリ（ビニリデンフルオリド）（ＰＶｄＦ）ベースのポリマーと、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）ベースのポリマー、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ベースのポリマー、ポリビニルクロリド（ＰＶＣ）ベースのポリマーとの混合物、ならびにこれらのいずれか２種以上の混合物。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、３，４−ジヒドロキシ安息香酸（３，４−ＤＨＢ）もそのアナログも含まない。
【００８５】
架橋剤および選択肢的な化学物質もしくはＵＶ光活性化誘導剤としては、以下が挙げられる：Ν，Ν’−メチレンビスアクリルアミド、メチレンビスメタクリルアミドエチレングリコール−ジメタクリレートおよび薬剤Ν，Ν’−メチレンビスアクリルアミド。Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９（Ｃｉｂａ）；２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン、２−メトキシ−２−フェニルアセトン、ベンジル−ジメチル−ケタール、硫酸アンモニウム、ベンゾフェノン、エチルベンゾインエーテル、イソプロピルベンゾインエーテル、α−メチルベンゾインエーテル、ベンゾインフェニルエーテル、２，２−ジエトキシアセトフェノン、１，１−ジクロロアセトフェノン、２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニルプロパン  １−オン、１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン、アントラキノン、２−エチルアントラキノン、２−クロロアントラキノン、チオキサントン、イソプロピルチオキサントン、クロロチオキサントン、２，２−クロロベンゾフェノン、安息香酸ベンジル、および安息香酸ベンゾイル、ＴＥＭＥＤ、ならびに過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、細胞外環境へと細胞によって分泌される、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、および／もしくは炭水化物を含む。いくつかの実施形態において、上記分泌されるタンパク質、ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、および／もしくは炭水化物、またはこれらから構成される構造物。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの被覆を含む被覆されたバイオセンサーデバイスに関し、ここで上記バイオセンサーは、上記被覆に共有結合もしくは固定化された代謝酵素を含み、ここで上記代謝酵素は、配列番号１もしくは配列番号２と少なくとも７０％配列同一性を共有するか、または配列番号１もしくは配列番号２の機能的フラグメントと少なくとも７０％配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの被覆を含む被覆されたバイオセンサーデバイスに関し、ここで上記バイオセンサーは、上記被覆内に共有結合もしくは固定化された代謝酵素を含み、ここで上記被覆は、ヒドロゲルマトリクスを含む組成物を含み、上記マトリクスは、アルギネート、トレハロース、少なくとも１種の電子メディエーター、および少なくとも１種の還元剤のうちのいずれか１つもしくは組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの被覆を含む被覆されたバイオセンサーデバイスに関し、ここで上記バイオセンサーは、上記被覆に共有結合もしくは固定化された代謝酵素を含み、ここで上記被覆は、ヒドロゲルマトリクスを含む組成物を含み、上記マトリクスは、以下のうちのいずれか１種もしくは組み合わせを含む：分子量約１０００を有するポリ（エチレングリコール）ジメチルアクリレート（poly(ethylene  glycol)ｄｉｍｅｔｈｙａｃｒｙｌａｔｅ）（ＰＥＧＤＭＡ−１０００）、２−ヒドロキシ−２  メチルプロピオフェノン（ＨＭＰＰ）および少なくとも１種のアクリレート（ここで上記アクリレートは、メタクリル酸（ＭＡＡ）およびメチルメタクリレート（ＭＭＡ）からなる群より選択され、ここでＰＥＧＤＭＡ：アクリレートの比は、約１０：９０  ｍｏｌ％〜約７０：３０  ｍｏｌ％であり、上記ＨＭＰＰは、総重量に対して約０．２％〜約０．６％の濃度にある）。
【００８７】
いくつかの実施形態において、硬化前の上記ヒドロゲル溶液は、約１ｎＭ〜約９９９ｍＭの濃度のトレハロースもしくはそのアナログを含む。いくつかの実施形態において、硬化前の上記ヒドロゲル溶液は、約１μＭ〜約１０ｍＭの濃度のトレハロースを含む。いくつかの実施形態において、硬化前の上記ヒドロゲル溶液は、約１μＭ〜約９ｍＭの濃度のトレハロースを含む。いくつかの実施形態において、硬化前の上記ヒドロゲル溶液は、約１μＭ〜約８ｍＭの濃度のトレハロースを含む。いくつかの実施形態において、硬化前の上記ヒドロゲル溶液は、約１μＭ〜約７ｍＭの濃度のトレハロースを含む。いくつかの実施形態において、硬化前の上記ヒドロゲル溶液は、約１μＭ〜約６ｍＭの濃度のトレハロースを含む。いくつかの実施形態において、硬化前の上記ヒドロゲル溶液は、約１μＭ〜約５ｍＭの濃度のトレハロースを含む。いくつかの実施形態において、硬化前の上記ヒドロゲル溶液は、約１μＭ〜約４ｍＭの濃度のトレハロースを含む。いくつかの実施形態において、硬化前の上記ヒドロゲル溶液は、約１μＭ〜約３ｍＭの濃度のトレハロースを含む。いくつかの実施形態において、硬化前の上記ヒドロゲル溶液は、約１μＭ〜約２ｍＭの濃度のトレハロースを含む。いくつかの実施形態において、硬化前の上記ヒドロゲル溶液は、約１μＭ〜約１ｍＭの濃度のトレハロースを含む。いくつかの実施形態において、硬化前の上記ヒドロゲル溶液は、約１０μＭ〜約１ｍＭの濃度のトレハロースを含む。いくつかの実施形態において、硬化前の上記ヒドロゲル溶液は、約１００μＭ〜約１ｍＭの濃度のトレハロースを含む。いくつかの実施形態において、硬化前の上記ヒドロゲル溶液は、約２００μＭ〜約１ｍＭの濃度のトレハロースを含む。いくつかの実施形態において、硬化前の上記ヒドロゲル溶液は、約３００μＭ〜約１ｍＭの濃度のトレハロースを含む。いくつかの実施形態において、硬化前の上記ヒドロゲル溶液は、約４００μＭ〜約１ｍＭの濃度のトレハロースを含む。いくつかの実施形態において、硬化前の上記ヒドロゲル溶液は、約５００μＭ〜約１ｍＭの濃度のトレハロースを含む。いくつかの実施形態において、硬化前の上記ヒドロゲル溶液は、約６００μＭ〜約１ｍＭの濃度のトレハロースを含む。いくつかの実施形態において、硬化前の上記ヒドロゲル溶液は、約７００μＭ〜約１ｍＭの濃度のトレハロースを含む。いくつかの実施形態において、硬化前の上記ヒドロゲル溶液は、約８００μＭ〜約１ｍＭの濃度のトレハロースを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲル溶液は（上記電極と接触させる前に）、約９００μＭ〜約１ｍＭの濃度のトレハロースを含む。
【００８８】
（メディエーター）
いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、メディエーターを含む。いくつかの実施形態において、上記メディエーターは、上記電極に電子を輸送するのを促進する。いくつかの実施形態において、上記メディエーターは、上記電極に結合される。いくつかの実施形態において、上記メディエーターは、上記ヒドロゲルの中に埋め込まれる。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、以下から選択されるメディエーターのうちの１種もしくは組み合わせを含む：メディエーター  ２−アクリルアミド−２−メチルプロパノール（ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅｌ）、スルホン酸ＩＶ、エタクリル酸（ｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、２−スルホエチルメタクリレート、および２−プロペン−１−スルホン酸。米国特許第４，２５４，２２２号（１９８１；  Ｏｗｅｎ）および米国特許第４，３５１，８９９号（１９８２；  Ｏｗｅｎ）は、β−ヒドロキシブチレートのアッセイ（ここで３−ヒドロキシブチレートは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）の存在下でβ−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（ＨＢＤＨ）によってアセト酢酸へと酸化される）を開示する。この反応から生成された還元型ＮＡＤＨは、続いて、テトラゾリウム色素と反応して、着色したホルマザン化合物を形成する。色の移り変わりの程度および強度は、サンプル溶液中のβ−ヒドロキシブチレートの濃度に相関する。米国特許第５，５１０，２４５号（１９９６；  Ｍａｇｅｒｓ）および米国特許第５，３２６，６９７号（１９９４；  Ｍａｇｅｒｓ）は、リポアミドデヒドロゲナーゼ（ＬＡＤＨ）およびチオール感受性インジケーター色素（例えば、エルマン試薬）に基づく還元経路を利用する改善されたカロリメトリック法（ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）を開示する。ＮＡＤＨ（β−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ酵素反応から生成される）は、リポアミドデヒドロゲナーゼ（ＬＡＤＨ）およびＤ，Ｌ−リポアミドと相互作用して、チオール化合物（６，８−ジメルカプトオクタアミド（６，８−ｄｉｍｅｒｃａｐｔｏｏｃｔａｍｉｄｅ））を形成し得ることが見出された。次いで、上記６，８−ジメルカプトオクタアミドは、チオール応答性インジケーター色素（例えば、エルマン試薬）と相互作用する。反応の際に、上記チオール感受性インジケーター色素は、血液サンプル中で３−ヒドロキシブチレートのレベルを測定するために使用され得る検出可能な色の移り変わりを受ける。３−ヒドロキシブチレートに関する比色法は、不十分な安定性、血中のアスコルベート、グルタチオンなどのような共存する種に由来する妨害、ならびに不十分な感度および精度という欠点を有する。ＮＡＤ依存性およびＮＡＤＰ依存性酵素は、多くが臨床的価値がある基質（例えば、グルコース、Ｄ−３−ヒドロキシブチレート、ラクテート、エタノール、およびコレステロール）を有する限りにおいて非常に重要である。これら基質および他の分析物を検出するための電流測定電極は、酵素のこのクラスを組みこんで、還元型補因子ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの媒介された酸化を介して上記電極と電気的連絡を確立することによって設計され得る。ＮＡＤ依存性およびＮＡＤＰ依存性酵素は、一般に、��胞内オキシドレダクターゼである。上記オキシドレダクターゼは、これらが作用する基質のドナー基が何であるかに従って、さらに分類される。オキシドレダクターゼのカテゴリーはまた、上記酵素によって利用されるアクセプターのタイプに従って分類される。関連する酵素は、アクセプターとしてＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋を有する。これら酵素は、一般に、それらの活性部位内にスルフヒドリル基を有するので、チオール反応性試薬（例えば、ヨードアセテート）によって不可逆的に阻害され得る。不可逆的インヒビターは、しばしば、酵素活性に必須である特定のアミノ酸残基と共有結合を形成することを通じて、安定な化合物を形成する。米国特許第６，５４１，２１６号（２００３；  Ｗｉｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）は、電流測定器を使用して、血中ケトン体を検査するためのバイオセンサーおよび方法を開示する。上記試験ストリップは、サンプル中のβ−ヒドロキシブチレートと反応性であり、電気出力シグナル（これは、上記サンプル溶液中のβ−ヒドロキシブチレートの濃度に関連する）を生成する試薬を有する。この方法における試薬は、メディエーターとしてフェリシアン化塩、β−ヒドロキシブチレートの酸化を触媒するように機能する第１の酵素としてβ−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、上記第１の酵素に対応する補因子としてＮＡＤ＋、および上記補因子（ＮＡＤＨ）の還元型の酸化を触媒するように機能する第２の酵素としてジアホラーゼを含む。上記メディエーターの酸化型は、上記第２の酵素から電子を受け取って、上記電極表面で電気シグナルを生成する。上記電気シグナルは、β−ヒドロキシブチレートの濃度レベルに関連する。米国特許第６，７３６，９５７号（２００４；  Ｆｏｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．）および研究論文（Ｎ．Ｊ．  Ｆｏｒｒｏｗ  ｅｔ．ａｌ，  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，  ２００５，  ２０，  １６１７−１６２５）は、細胞内デヒドロゲナーゼ酵素の活性部位にあるチオール基に不可逆的に結合しないＮＡＤ＋およびＮＡＤＰのメディエーター化合物の発見に基づく、β−ヒドロキシブチレートの電流測定バイオセンサーを開示する。これらメディエーター化合物（例えば、１，１０−フェナントロリンキノン（１，１０−ＰＱ）（これは、それらの電気化学的測定システムにおいて電子メディエーターとして使用される））は、ＮＡＤ依存性およびＮＡＤＰ依存性の酵素から構築される電流測定電極における安定性および応答を増大させ得る。その乾燥試薬は、１，１０−フェナントロリンキノン（１，１０−ＰＱ）、β−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼおよび補因子としてのＮＡＤ＋を含む。このセンサーは、血液サンプル中のβ−ヒドロキシブチレートの濃度レベルに対して信頼性のあるかつ感度の高い応答を示す。メルドラブルー（ＭＢ）はまた、上記システムにおいてメディエーターとして研究されたが、ＭＢは、ＭＢによるβ−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ酵素活性の阻害および試験ストリップの長期間安定性が不十分であったことから、それらの電気化学的試験システムにおいて十分に機能しないことがわかった。
【００８９】
上記デヒドロゲナーゼ酵素（例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ、Ｄ−３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（ＨＢＤＨ）、および乳酸デヒドロゲナーゼなど）は、バイオセンサーの構築のための一般的なデヒドロゲナーゼであることが公知である。Ｆｏｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌによって開示されるように、ＮＡＤＨの効率的メディエーターと考えられているが、不可逆的な酵素インヒビターであるある種のメディエーター（例えば、メルドラブルー、４−メチル−１，２−ベンゾキノン（４−ＭＢＱ）、１−メトキシフェナジンメトスルフェート（１−Ｍｅｏ−ＰＭＳ）および２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）が存在し、これらは、デヒドロゲナーゼ酵素を含むセンサーにおいて、酵素活性の喪失、感度の低い応答および不十分な安定性を引き起こす。いくつかの実施形態において、上記バイオセンサー、システム、もしくは試験ストリップは、本明細書で開示されるメディエーターのうちの１種もしくはそれより多くを含む。いくつかの実施形態において、上記メディエーターは、それらの基本的構造要素においてオルト−キノン、パラ−キノンおよびキノンイミンのうちの１種もしくは組み合わせから選択される。キノイド構造タイプの代表例としては、ベンゾ−α−フェナゾキソニウムクロリド（ｂｅｎｚｏ−．ａｌｐｈａ．−ｐｈｅｎａｚｏｘｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルドラブルー（ＭＢ）、３，４−メチル−１，２−ベンゾキノン、１−メトキシフェナジンメトスルフェート、１，１０−フェナントロリンキノン（１，１０−ＰＱ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種のメディエーターは、以下の化合物のうちの１種もしくは混合物から選択される：
【化３】
0006397822.tif 000009
【００９０】
（補因子／還元剤）
（酵素）
いずれか１種もしくはそれより多くの代謝酵素は、本発明とともに使用されるように選択され得る。本明細書で開示されるバイオセンサー、システムもしくは試験ストリップで個々にもしくは組み合わせて使用され得る代謝酵素としては、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、ヒスチジンオキシダーゼ（ｍｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）、フェニルアラニンリアーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼのいずれの細菌クローンが挙げられる。いくつかの実施形態において、上記酵素は、以下で開示される酵素、または全長酵素もしくはこのような酵素をコードする核酸に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相同であるそれらそれぞれの機能的フラグメントのうちのいずれか１種もしくは組み合わせから選択される。
【表２】
0006397822.tif 000010
【００９１】
【化４−１】
0006397822.tif 000011
【化４−２】
0006397822.tif 000012
【００９２】
（固体支持体）
アミノ酸測定デバイスには多くの形態がある；１つの一般的タイプは、酵素ベースの試験ストリップを介して血液サンプルを受容する携行式電子機器によって表される。これらシステムを使用するにあたって、患者は、例えば、血液サンプルを得るために指もしくは代わりの身体部位を刺し得、上記ストリップは、上記計器ハウジングの中の試験ストリップ開口部に挿入され、上記サンプルは、上記試験ストリップに適用され、上記計器における電子機器が、上記試験ストリップにおける酵素反応によって生成された電流をアミノ酸濃度値に変換する。
【００９３】
本発明の固体支持体は、固体状態であり得るが、可撓性基板である。本発明によれば、櫛形アレイ電極もしくは少なくとも１つの電極は、可撓性基板の近位に、例えば、その上に配置される。可撓性基板として作用するために、材料は可撓性で、そしてまた絶縁性でなければならず、代表的には、比較的薄い。上記基板は、ＩＤＡの構成要素、もしくはセンサーのさらなる構成要素を、その表面に接着できるはずである。このような薄い、絶縁性の、可撓性基板は、可撓性回路およびフレックス回路フォトリソグラフィーの分野で公知である。「可撓性基板」は、本開示によれば、集積回路（ＩＣ）フォトリソグラフィーにおいて（しかし可撓性回路フォトリソグラフィーにおいてではない）使用される非可撓性基板に対比され得る。ＩＣフォトリソグラフィーにおいて使用される非可撓性基板の例としては、ケイ素、酸化アルミニウム、および他のセラミックが挙げられる。これら非可撓性基板は、非常に平坦な表面に加工処理可能であるように選択される。本発明における使用に代表的な可撓性基板は、薄いプラスチック材料、例えば、ポリエステル、特に、高温ポリエステル材料；ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）；およびポリイミド、またはこれらのうちの２種以上の混合物から構築される。ポリイミドは、例えば、商標名Ｋａｐｔｏｎ（登録商標）の下で、Ｉ．Ｅ．  ｄｕＰｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｄｅｌ．）（ｄｕＰｏｎｔ）から市販されている。ポリエチレンナフタレートは、Ｋａｌａｄｅｘ（登録商標）として、同様にｄｕＰｏｎｔから市販されている。特に好ましい可撓性基板は、７ミル厚のＫａｌａｄｅｘ（登録商標）フィルムである。
【００９４】
本発明の櫛形アレイは、電極を組みこむことが一般に公知の適用、特に、櫛形電極アレイを含めることが公知の適用において使用され得る。種々の適用が、電子工学および電気化学の分野で公知である（プロセスおよびフローモニタリング、もしくは制御、ならびに化学分析法に関連する適用が挙げられる）。上記アレイは、可撓性基板の使用に、価値、利点、もしくはコスト効率が与えられる場合、または非可撓性基板上に従来から配置されている櫛形アレイの寸法より比較的大きな寸法の櫛形アレイを有することで価値、利点もしくはコスト効率がある場合、電気化学的センサーの構成要素として特に有用であり得る。
【００９５】
本発明の櫛形アレイは、例えば、電気化学的検出法において使用される電気化学的センサー（ときおり、「バイオセンサー」もしくは単純に「センサー」といわれる）に含まれ得る。電気化学的検出法は、電気学および化学、または電気化学の原理に、例えば、基板を通じて流れる電流の大きさ、基板の抵抗、もしくは上記基板内の化学種の存在に対して既知の電流が与えられる場合の上記基板にかかる電圧に影響する。これら方法のうちのいくつかは、それらがどのように実施されるか、例えば、電位差もしくは電流が制御されるのか測定されるのかに依存して、電位差、時間電流測定、もしくはインピーダンスに対して言及され得る。上記方法およびセンサー（本発明のセンサーを含む）は、血液、血清、間質液、もしくは別の体液内の化合物のような特定の化合物（例えば、分析物もしくは電気活性化合物）の存在に直接的もしくは間接的に起因して、例えば、アミノ酸、血液尿素、窒素、コレステロール、ラクテートなどのレベルを同定するために、基板を通じて流れる電流を測定し得る。いくつかの電気化学的方法および電気化学的センサーの適合、ならびにそれらの構築、電子機器、および電気化学的操作の特徴は、例えば、米国特許第５，６９８，０８３号、同第５，６７０，０３１号、同第５，１２８，０１５号、および同第４，９９９，５８２号（これらの各々は、本明細書に参考として援用される）に記載される。
【００９６】
（方法）
本発明は、ＰＫＵ、メープルシロップ尿症、もしくは高アンモニア血症を有する被験体の臨床転帰を診断もしくは予後予測するための方法に関し、上記方法は、本明細書で開示されるセンサー、システム、もしくは試験ストリップと、上記被験体由来の体液サンプルとを接触させる工程、および上記サンプル中のアミノ酸レベルを定量する工程；および上記サンプル中のアミノ酸レベルと、上記体液中で正常アミノ酸レベルと考えられる閾値とを比較する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、少なくとも１つのアミノアシドパシーを有すると疑われるか、または以前にそうと診断された被験体の臨床転帰を診断もしくは予後予測するための方法に関する。いくつかの実施形態において、上記方法は、ＰＫＵ、メープルシロップ尿症、もしくは高アンモニア血症のうちの少なくとも１つを有すると疑われるか、または以前にそうと診断された被験体の臨床転帰を診断もしくは予後予測するための方法に関する。
【００９７】
本発明は、体液中のアミノ酸の存在もしくは非存在を検出するための方法に関し、本発明はまた、被験体の体液中のアミノ酸濃度を定量するための方法に関する。定量は、後に回路内の検出可能な電流の生成によって引き起こされる迅速な酵素反応読み取り値に起因してポイントオブケアで起こり得る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるデバイスもしくはシステムは、ヒトが血中に異常に高レベルのアミノ酸を有するか否かを検出するために利用され得る。その後、電子メッセージもしくはディスプレイが、そこで上記デバイスもしくはシステムのユーザーに提供され得るか、または上記被験体の１種もしくはそれより多くの濃度値を含む１種もしくはそれより多くのストレージメモリに遠隔にもしくは直接アクセスする１もしくはそれより多くのプロセッサによってディスプレイ上に作動され得る。いくつかの実施形態において、複数の濃度値が、同時にもしくは連続してのいずれかで得られ得、本明細書で開示されるデバイスもしくはシステムに作動可能に接続された１もしくはそれより多くのプロセッサによって比較もしくは分析され得る。いくつかの実施形態において、一定期間にわたる被験体の複数の濃度値は、本明細書で開示されるデバイスもしくはシステムに作動可能に接続された上記１もしくはそれより多くのプロセッサによって比較もしくは分析され得、その後、上記濃度値および／もしくは閾値を含むメッセージが表示される。いくつかの実施形態において、上記メッセージは、必要に応じて、上記被験体のアミノ酸レベルを制御するために、上記被験体が医療処置を要求するか、または食餌を変えるべきであることを示すシグナルを含む。
【００９８】
いくつかの実施形態において、本開示は、サンプル中のアミノ酸濃度を定量するためのコンピューター実施法に関する。
【００９９】
いくつかの実施形態において、本開示は、被験体のサンプル中のアミノ酸濃度を定量するためのコンピューター実施法を行う、プロセッサを含むシステムに関する。いくつかの実施形態において、上記システムは、経時的な被験体の濃度値を保存するコンピューターストレージメモリに作動可能に接続された、必要に応じて遠隔位置に位置するかまたはインターネット接続によってアクセス可能なプロセッサを含む。いくつかの実施形態において、上記被験体もしくは上記被験体のヘルスケア提供者は、インターネットにアクセスして、上記コンピューターストレージメモリにリンクしたサーバーと通信し得る。被験体データレポートは、上記プロセッサを通じて命令された検索を開始した後に、上記被験体によって生成され得るかもしくは得られ得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、バイオセンサーによって生成される電気シグナルをサンプルの特定のアミノ酸の濃度へと変換する関数を行うコンピュータープログラムプロダクトを含む。いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１つのプロセッサおよびコンピューター読み取り可能なメモリ（上記コンピューター読み取り可能なメモリは、体液サンプル中のアミノ酸濃度を定量するためのプログラムコードをそこに保存している）を含むシステムに関し、上記システムは、被験体と関連するデータを保存するための手段；バイオセンサーもしくはそのコンピューターストレージメモリからの電流応答のレベルを受け取り、ユーザーインターフェイスの一部としてユーザーに濃度値を提供するための手段を含む。いくつかの実施形態において、上記ユーザーは、上記被験体もしくは上記被験体のヘルスケア提供者である。いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１つのプロセッサ、上記プロセッサに実行可能なプログラムコードを保存するプログラム保存（例えば、メモリ）、ならびに１種もしくはそれより多くの入力／出力デバイスおよび／もしくはインターフェイス（例えば、データコミュニケーションおよび／もしくは周辺デバイスおよび／もしくはインターフェイス）を含むシステムに関する。いくつかの実施形態において、上記ユーザーデバイスおよびコンピューターシステムは、多くの他のクライアントおよび／もしくはサーバーコンピューターシステムにも接続され得るデータ通信ネットワーク（例えば、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、インターネットなど）によって通信可能に接続されている。上記ユーザーデバイスならびにクライアントおよび／もしくはサーバーコンピューターシステムは、システムソフトウェアを適切に操作する工程をさらに包含し得る。
【０１００】
本発明は、一般に、定義および／もしくは被験体の行動の変容を特徴付ける濃度値に関する。いくつかの実施形態において、体液サンプル中の上記アミノ酸濃度に対応する濃度値は、被験体がどの程度、食餌を変えるかもしくは医療処置を要求するように助言されるかを特徴付け得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、本発明は、診断アッセイにおける使用のために、バイオセンサーもしくは試験ストリップを提供する。いくつかの実施形態において、上記バイオセンサーおよび／もしくは試験ストリップは、診断キットもしくは検出キットの一部として提供される。ある種の実施形態において、本発明に従う使用のためのキットは、１もしくはそれより多くの参照サンプル；指示書（例えば、サンプルを加工処理すること、試験を行うこと、結果を解釈することなどに関する）；媒体；および／もしくは試験を行うために必要な他の試薬を含み得る。
【０１０２】
本発明は、固体支持体および複数の電極を含む試験ストリップを提供し、ここで少なくとも１つの電極は、本明細書で開示されるヒドロゲルを含む。いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、ポリマーで必要に応じて被覆されたスライドである。いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、ポリマーで被覆される。いくつかの実施形態において、上記ポリマーは、ポリアクリルアミドである。いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、ポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｅｒｅｎｅ）（ＴＣＰＳ）、ガラス、石英、石英ガラス、ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）、ポリエチレン、ポリビニルジフルオリド（ＰＶＤＦ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリオレフィン、エチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド、ポリビニルクロリド、ポリビニルフェノール、ならびにこれらのコポリマーおよび混合物から選択される材料である。いくつかの実施形態において、上記試験ストリップは、紙製品である。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つの電極は、上記固体支持体に結合される。
【０１０３】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、コンピューター読み取り可能な保存媒体にコードされ、実行される場合に、アミノ酸濃度値の計算に関する作動を引き起こす指示（例えば、プログラムされたスクリプトなど）を必要に応じて含む、ソフトウェア構成要素もしくは他の非一時的コンピュータープログラムプロダクトを提供する。いくつかの実施形態において、上記コンピュータープログラムプロダクトは、実行される場合に：１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度値を定量する；上記１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度値をコントロールデータセットに対して正規化する；被験体のアミノ酸プロフールもしくはシグナチャーを作る；および上記プロフールもしくはシグナチャーを上記コンピュータープログラムプロダクトのユーザーに表示する、コンピューター読み取り可能な保存媒体にコードされる。いくつかの実施形態において、上記コンピュータープログラムプロダクトは、実行される場合に：１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度値を計算する、上記１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度値を正規化する、およびアミノ酸シグナチャーを作る、コンピューター読み取り可能な保存媒体にコードされ、ここで上記コンピュータープログラムプロダクトは、必要に応じて、上記アミノ酸シグナチャーおよび／もしくは１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度値を、ユーザーによって操作されるディスプレイに表示する。いくつかの実施形態において、本発明は、１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度値を定量する；および上記１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度値を上記コンピュータープログラムプロダクトのユーザーに表示するための指示を含むコンピューター読み取り可能な保存媒体にコードされた非一時的コンピュータープログラムプロダクトに関する。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度値を計算する工程は、上記デバイスもしくは試験ストリップと、体液の１もしくはそれより多くのサンプルとを接触する反復試験に対する計算の平均および標準偏差を定量する工程を包含する。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、上記１つ以上のヒドロゲル被覆電極は、固相支持体に結合される。いくつかの実施形態において、固相支持体は、任意の固体もしくは半固体の表面を含む。いくつかの実施形態において、固相は、ペトリ皿、ビーカー、フラスコ、試験管、マイクロタイタープレート、および／もしくは培養スライドを含む、培養中の細胞を増殖もしくは維持するための任意の旧来の実験材料を含む。いくつかの実施形態において、固相は、ガラススライド、プラスチックスライド、紙製試験ストリップ、もしくはこれらの組み合わせを含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、上記１つ以上のヒドロゲル被覆電極は、固相支持体上の不連続なアドレス指定可能部位に結合される。いくつかの実施形態において、固相は、ポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル化合物（例えば、ポリビニルクロリド）、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ニトロセルロース、コットン、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、セルロース、デキストラン、ゼラチン、ガラス、フルオロポリマー、フッ素化エチレンプロピレン、ポリビニリデン、ポリジメチルシロキサン、ポリスチレン、シリコン基板（例えば、溶融シリカ、ポリシリコン、もしくは単結晶シリコン（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｉｌｉｃｏｎ  ｃｒｙｓｔａｌｓ））またはこれらの組み合わせを含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書で記載される方法のうちの１もしくはそれより多くから生じる試験の試験結果を含む、被験体に関する医療記録のカタログに関する。このようなカタログは、いくつかの実施形態において、無線インターネット接続を通じて遠隔からアクセス可能であるコンピューター読み取り可能な媒体に保存される。
【０１０８】
上記で記載されるように、本発明のある種の実施形態は、アミノアシドパシーを有するかもしくは有すると疑われる被験体と代謝疾患を有しない被験体とから得られた体液サンプル間を区別するために使用され得る。このシステムは、例えば、疾患があるか否かを決定するために、被験体の血液サンプルを検査する場合に潜在的に有用である。１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度値を使用して患者を診断することは、例えば、被験体由来のサンプルの１種もしくはそれより多くのアミノ酸の濃度値と、測定された参照値もしくは被験体の閾値とを比較する工程を包含する。
【０１０９】
（キット）
いくつかの実施形態において、本開示に従うキットは、体液サンプル中のアミノ酸濃度を定量するために使用され得る。
【０１１０】
本発明はさらに、本明細書で開示されるポリペプチドもしくはフラグメントのうちの１もしくは複数を含む１もしくは複数の容器を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、上記キットは、試験ストリップおよび／もしくは試験ストリップを含むバイオセンサー、または細胞の培養もしくは増殖を増給する任意の動物ベースの血清派生物を含む。いくつかの実施形態において、上記キットは、以下を含む：本明細書で開示されるバイオセンサー、本明細書で開示される任意の試験ストリップ、および本明細書で開示されるいずれかの方法のうちのいずれか１もしくはそれより多くの工程を行うための指示を必要に応じて含む本明細書で開示されるコンピュータープログラムプロダクト。いくつかの実施形態において、上記キットは、細胞培地を含まない。いくつかの実施形態において、上記キットは、本明細書で開示される少なくとも１つの電極を埋め込んだ固体支持体を含む。いくつかの実施形態において、上記キットは、ヒドロゲルを固体支持体に固定するためのデバイスを含む。
【０１１１】
上記キットは、２以上の容器、パック、もしくはディスペンサーを、アレイを調製するための指示書と一緒に含み得る。いくつかの実施形態において、上記キットは、本明細書で記載されるバイオセンサーもしくはシステムを含む少なくとも１つの容器、ならびに上記バイオセンサーを維持、使用、および保存するための手段（例えば、保存緩衝液）を含む第２の容器を含む。いくつかの実施形態において、上記キットは、溶液中の、または凍結乾燥もしくは乾燥されて再水和混合物が付随する本明細書で開示されるいずれかのポリペプチドを含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドおよび再水和混合物は、１もしくはそれより多くのさらなる容器中にあり得る。
【０１１２】
上記キットに含まれる組成物は、種々の構成要素の貯蔵寿命が保たれるように何らかの種類の容器であって、この容器の材料に吸着されないかもしくは上記材料によって変化しない容器中に供給され得る。例えば、適切な容器としては、ガラス、有機ポリマー（例えば、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、セラミック、金属または試薬もしくは食品を保持するために代表的に使用される任意の他の材料から製作され得る単純なボトル；ホイル裏打ちされた内側（例えば、アルミニウムもしくは合金）からなり得るエンベロープが挙げられる。他の容器としては、試験管、バイアル、フラスコ、およびシリンジが挙げられる。上記容器は、外した際に組成物の構成要素が混合されることを可能にする、容易に除去可能な膜によって分離される２つの区画を有し得る。除去可能な膜は、ガラス、プラスチック、ゴム、もしくは他の不活性材料であり得る。
【０１１３】
キットはまた、指示資料とともに供給され得る。指示は、紙もしくは他の基材に印刷され得、そして／または電子読み取り可能な媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープ、もしくは他の読み取り可能な記録保存デバイス）として供給され得る。詳細な指示は、上記キットと物理的に関連づけられていなくてもよい；代わりに、ユーザーは、上記キットの製造業者もしくは販売業者によって特定されるインターネットウェブサイトに指示されてもよいし、電子メールとして与えられてもよい。
【０１１４】
本発明はまた、以下を含むキットを提供する：固体支持体および複数の電極を備えるバイオセンサーであって、ここで少なくとも１つの電極は、本明細書で開示されるヒドロゲルを含み、いくつかの実施形態では、上記ヒドロゲルは、固定化された代謝酵素もしくはその機能的フラグメントを含み；ならびに必要に応じて、    を備える、バイオセンサー。いくつかの実施形態において、上記キットは、以下のうちの少なくとも１つをさらに含む：サンプル、および電子媒体を通じて、必要に応じて遠隔からアクセス可能な指示のセット。
【０１１５】
図１は、本発明に従うバイオセンサー１０を示す。バイオセンサー１０は、アウターケーシング５０を通じてユーザーの目に見えるように形成されるディスプレイ７５を含む。上記デバイス１０の試験ストリップ（必要に応じて、取り外し可能）１００は、第１の（作用）電極３００および第２の（対）電極４００を含む。上記試験ストリップ（この実施形態では、導電性表面）はまた、参照電極（上記第１の電極３００と第２の電極４００との間に配置される）を含む。使用中の場合には、ユーザーは、体液サンプル２００を上記バイオセンサー１０の試験ストリップ１００に接触させ得る。上記作用電極の少なくとも一部を被覆する上記ヒドロゲルに起因して、上記サンプル２００内のアミノ酸分析物／基質は、上記少なくとも１つの導電性表面への単純な拡散によって、上記作用電極表面で検出され得る。
【０１１６】
本明細書で開示されるいずれかのおよび全ての学術論文、特許出願、発行された特許、もしくは他の引用された参考文献は、それらそれぞれの全体において参考として援用される。
【実施例】
【０１１７】
（実施例１：グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）
２つのバイオセンサーを、２種の異なるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（その両方を、販売業者、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）から購入した）を使用して作製した。Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐ．（ＣＡＳ  ９０２９−１１−２）由来のＬ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ）を、使用前に１×ＰＢＳ中で水和した。ウシ肝臓由来のＬ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、タイプＩＩＩ（ＣＡＳ  Ｎｕｍｂｅｒ  ９０２９−１２−３，  凍結乾燥粉末，  ＞２０単位／ｍｇ  タンパク質）を、使用前に１×ＰＢＳ中で水和した。
【０１１８】
（実施例２：グルタミン酸センサー製作ヒドロゲル）
ヒドロゲルマトリクスを製作するために（図５中に見える模式図）、以下を含む１×リン酸緩衝化生理食塩水中に１ｍＬ  ストック溶液を調製した：
ａ．４０単位のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ここで１単位は、アンモニウムイオンの存在下でｐＨ７．３、２５℃で１分間あたり１．０μモルのα−ケトグルタル酸をＬ−グルタミン酸に還元する）
ｂ．２０ｍＬの０．０５Ｍ  トルイジンブルー
ｃ．５ｍＭ  β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型二カリウム塩）
ｄ．褐藻由来の１％  重量／体積  アルギン酸ナトリウム。
【０１１９】
１０ｍＬのプレゲル溶液を、３電極スクリーン印刷炭素電極に拡げた。上記電極は、対電極および作用電極、ならびに銀／塩化銀の参照電極の両方を含む。上記作用電極は、検知電極として作用する。次いで、上記電極上のプレゲル溶液を、Ｂａｄｇｅｒ  ２００Ｎエアブラシを使用して７．５ｐｓｉで１秒間、０．１Ｍ  ＣａＣｌ２溶液を噴霧し、約５ｍＬのＣａＣｌ２溶液を沈積させた。加湿環境において３０分間ゲルを硬化させた。
【０１２０】
アルギネートを使用する目的は、上記酵素を固定化し、上記酵素におよび上記電気化学的センサーにより大きな安定性をもたらすことであった。負に荷電した性質のアルギネートは、尿酸およびアスコルビン酸の拡散を阻害するように作用する。上記酵素、補因子およびメディエーターを含むアルギネート溶液を、上記電極に沈積させた。この溶液の１０μＬを使用した。上記アルギネート濃度は、１〜３％  重量／体積の範囲に及んだ。次いで、その表面にＣａＣｌ２溶液が霧状にされた上記ヒドロゲルプレ溶液は、上記システムにゲルを形成させる。ＣａＣｌ２の濃度は、１００〜２００ｍＭの範囲に及んだ。沈積させたＣａＣｌ２の体積は、２．５〜１０μＬの範囲に及んだ。
【０１２１】
上記アルギネートヒドロゲルを、上記分析物および電気的に活性なＮＡＤＨ（しかし、尿酸ではない）の拡散を可能にするように最適化した。最適化を試験するために、ＮＡＤＨ拡散が上記ヒドロゲルによって阻害されるか否かを決定するために、アルギネート改変電極にＮＡＤＨ溶液を適用した。
【０１２２】
図２１に認められるように、上記ヒドロゲルを、ＣａＣｌ２濃度１００ｍＭ、１５０ｍＭおよび２００ｍＭを使用して形成した。２００ｍＭは、電気化学的お糖のいずれのタイプをも妨げた。１５０ｍＭは、上記電気化学的応答をひどく阻害した一方で、約１００ｍＭは、非常に大きな電気化学的応答を可能にした。これは、上記電極と約１％  アルギネート溶液とを接触させた後に行った。このデータは、１％より高いアルギネート濃度によっては示されなかった。この濃度はまた、上記電気化学的応答を妨げたかもしくはひどく阻害した。上記アルギネート改変電極は、図２２に示されるように、血漿中で一定範囲のグルタミン酸濃度を検出できた。
【０１２３】
図２３は、血漿中のグルタミン酸の病的レベル（２０００ｍＭ）および生理学的レベル（３５ｍＭ）の両方に対する電気化学的応答間の差を示す。各場合に、いずれのアルギネート「フィルター」も、存在するか、または存在しない。認められるように、妨害の量は、アルギネートの存在によって劇的に低減される。アルギネートが存在する場合に、より高レベルのグルタミン酸に関して大きな応答が認められる。アルギネートが存在しない場合、大きな程度の妨害がその２つのシグナルを区別しにくくする。
【０１２４】
（実施例３：グルタミン酸センサー法）
この概念を試験するために、類似の実験設定を、図３および図４で開示した設定を使用して、溶液中でグルタミン酸を検出するためにグルタミン酸デヒドロゲナーゼで行った。カーボンスクリーン印刷電極および銀／塩化銀（図４）参照電極から構成される３電極システムを、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびＮＡＤ＋の溶液に曝した。次いで、種々の濃度のグルタミン酸を上記溶液に添加し、生成した電流を測定した。図６は、１００μＭの溶液中のグルタミン酸の添加および経時的なサンプル中のグルタミン酸のその後の検出を示す。そうしたところ、この電流応答、ならびに濃度の変化の結果は、グルタミン酸濃度に相関した。図７は、これら実験の結果を示す。グルタミン酸は、１μＭ〜１００μＭの範囲で検出可能であり、その検出された電流と上記サンプル中のアミノ酸の濃度との間には高度の相関があった。図７の結果は、経時的に検出される平均電流は、溶液中のアミノ酸の濃度に直線的に関連することを示す。
【０１２５】
図６：グルタミン酸を含む分析物を添加すると、上記酵素によって行われる酸化還元反応に起因して、その電流は指数関数的に増大する。その電流を、電流計を使用して測定した。
【０１２６】
図７：電流計によって生じた電流値を使用して、グルタミン酸濃度および電流応答を相関させる標準曲線を作った。０〜１００μＭの範囲に及ぶ濃度を試験したところ、線形性の程度は強く、ｒ２値は０．９８であった。
【０１２７】
図８：この図は、血中の継承（ｉｎｈｅｒｉｔ）電気的妨害を低減することにおいてアルギネートヒドロゲルの有効性を実証する。上記電極上の溶液中の酵素は、低濃度グルタミン酸と高濃度グルタミン酸との間に直線的応答を生じた。血漿中のアルギネートフィルターの非存在下で反応を行うと、より大きな程度の妨害が生じ、線形性が失われた。アルギネートフィルターを導入すると、血漿に曝した場合ですら、高濃度および低濃度のグルタミン酸に関する直線的応答が可能になった。
【０１２８】
図９：グルタミン酸デヒドロゲナーゼの細菌形態の使用は、測定値の誤差を半分にした。これは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼのウシ形態が上記酵素の細菌形態とは異なって、溶液中で集合体を形成することに起因する。これは、上記酵素の細菌形態を有する酵素電極のより一貫した構築をもたらす。
【０１２９】
図１０：グルタミン酸デヒドロゲナーゼの細菌形態を使用すると、３５〜１０００μＭの濃度範囲において血漿中のグルタミン酸の直線的検出が可能になった（この範囲は、上記アミノ酸の正常レベルおよび病的レベルの両方を代表する）。上記アルギネートフィルターは、妨害を３５μＭおよび１０００μＭが、互いに統計的に有意であった点まで低減した。
【０１３０】
（実施例４：フェニルアラニンデヒドロゲナーゼクローニング）
ＰＫＵを診断するために長期間の待ち時間があるという欠点に対処するために、血糖値測定器に類似のセンサーは、検出時間および患者のクオリティー・オブ・ライフを大いに改善する。アンモニアおよび種々のアミノ酸に関するこのタイプのセンサーの開発は、現在行われている最中である。調査されるべき第１の代謝産物は、フェニルアラニンである。フェニルアラニンの高い血清レベルは、一般に、アミノアシドパシー、フェニルケトン尿症と関連する。フェニルアラニンの濃度を決定するために、酵素ベースの電流測定電気化学的センサーを使用する。試験される特異的酵素は、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼである。
【０１３１】
Ｇｅｏｂａｃｉｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄｉａｓｉｕｓ  Ｃ５６−ＹＳ９３由来のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＰｈｅＤＨ）をコードする遺伝子をクローニングし、そのタンパク質を、図１８および図１９に示されるとおりの細菌クローニング／発現系を使用して発現する。特別設計のプライマーおよび種々の発現ベクター（ｐＥＴ２４ａおよびｐＥＴ２８ａ）を使用することによって、上記酵素の３つの異なるパターンを生成した：Ｎ−Ｈｉｓタグ、Ｃ−Ｈｉｓ質およびタグなし。
【０１３２】
簡潔には、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄｉａｓｉｕｓのＤＮＡを単離し、そのＰｈｅＤＨ遺伝子を、以下のプライマーを使用してＰＣＲによって増幅した：
【化５】
0006397822.tif 000013
【０１３３】
正方向プライマーは、ＮｈｅＩ制限部位を導入し、逆方向プライマーは、２つの余分な終止コドンと、ＸｈｏＩ制限部位を導入する。増幅生成物サイズを、アガロース電気泳動によって決定した。上記単離されたゲノム配列からクローニングしたＤＮＡ配列は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄｉａｓｉｕｓ由来のＰｈｅＤＨタンパク質である以下のアミノ酸配列をコードする：
【化６】
0006397822.tif 000014
【０１３４】
ＰＣＲ生成物を、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）キットを使用して、製造業者の説明書を使用して、ＰＣＲ反応混合物から直接精製し、その後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎキットを製造業者の説明書とともに使用して、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯベクターへのサブクローニングに使用した。サブクローニング反応を使用して、ＴＯＰ  １０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））を形質転換し、陽性クローンを、抗生物質カナマイシンへの耐性によって選択した。上記カナマイシン耐性コロニーに存在するプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）キットを使用して、製造業者の説明書を使用して単離し、制限酵素（ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ）によってプラスミド中の挿入物の存在に関してスクリーニングした。陽性コロニーを、制限酵素での消化の後に、上記ＰＣＲ生成物のサイズに対応するバンドの存在によって同定した。１つの陽性コロニーを、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）  ｍａｘｉｐｒｅｐｒキットを製造業者の説明書に従って使用して、より多量のプラスミドＤＮＡの単離のために選択した。所望の遺伝子をクローニングするために、目的ベクター（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ）（発現ベクター）ｐＥＴ２４ａおよびｐＥＴ２８ａ（図１８および図１９）を、選択した陽性プラスミドと同時に制限酵素ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、使用される予定のその消化したフラグメントを、これらが分離されたアガロースゲルから単離した。上記遺伝子を上記発現ベクターにクローニングするために、本発明者らは、比１：３  ベクター：挿入物でライゲーション反応のために使用した。ライゲーション反応がいったん完了したら、それを、ＴＯＰ  １０ケミカルコンピテントセルを形質転換するために直接使用した。プラスミド含有コロニーを、抗生物質カナマイシンへの耐性によって選択肢、陽性コロニー（上記プラスミドに挿入された遺伝子を有するもの）を、制限酵素での消化によってスクリーニングし、得られたフラグメントを、アガロース電気泳動によって分離した。１つの陽性コロニーを、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）  ｍａｘｉｐｒｅｐｒキットを製造業者の説明書に従って使用して、より多量のプラスミドＤＮＡの単離のために選択した。
【０１３５】
陽性プラスミドを、Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）から市販されている発現細胞株Ｒｏｓｅｔｔａ  ２への形質転換によって導入した。タンパク質生成を、細胞が対数増殖期中期に達したときに、終濃度１００μＭのＩＰＴＧを添加することによって誘導した。タンパク質を、誘導およびその活性を３７℃で３０分後に消費されたフェニルアラニンの量をアミノ酸分析によって決定することによって試験した後に、封入体から精製した。
【０１３６】
【化７−１】
0006397822.tif 000015
【化７−２】
0006397822.tif 000016
【化７−３】
0006397822.tif 000017
【化７−４】
0006397822.tif 000018
【化７−５】
0006397822.tif 000019
【０１３７】
（クローニング検証（推定））
クローニングした遺伝子を、発現ベクターにサブクローニングする前に、確認のために配列決定する。タンパク質を、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して（Ｈｉｓタグ化バージョン）、もしくは熱による望ましくないタンパク質の沈殿によって（タグ化していないバージョン）、精製する。酵素活性を、必要であれば、部位指向性変異誘発によって改善して、基質に対する親和性もしくは安定性を増大させる。このような改変は、デヒドロゲナーゼ酵素ファミリーの他のメンバーで行われた結晶学的および生化学的研究に基づいて行われる。本発明者らは、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよびグルタミン酸デヒドロゲナーゼの各々の２バージョンを、それぞれ、Ｇ．ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄｉａｓｉｕｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ生物から単離および精製する。精製は、例えば、細胞培養物を回収し、上記細胞を溶解し、その細胞溶解物を、Ｈｉｓタグ化タンパク質配列に対して親和性を有するニッケルタグ化カラムに流し、続いて、標準的溶離を行った後で、完了し得る。
【０１３８】
（実施例５：フェニルアラニンセンサー製作（推定））
デヒドロゲナーゼは、一級アミンを切断し、それによってアンモニアを生成することによって、一般にアミノ酸に影響を及ぼす。これらの酵素に対する補因子は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）である。触媒事象の間に、ＮＡＤ＋は、ＮＡＤＨに還元される。これは、ＮＡＤＨが電気化学を使用して検出され得る還元剤であることから有利である。この反応が特定の電圧の下で露出した電極上で行われる場合、ＮＡＤＨは、電流を生じる電極へと電子を遊離する。そこで、この電流の大きさは、フェニルアラニンの濃度に相関し得る。
【０１３９】
ヒドロゲルマトリクスを製作するために（図５中に見える模式図）、以下を含む１×リン酸緩衝化生理食塩水中の１ｍＬ  ストック溶液を、以下のように調製する：
ａ．４０単位のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ
ｂ．２０ｍＬの０．０５Ｍ  トルイジンブルー（メディエーター）
ｃ．５ｍＭ  β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型二カリウム塩）
ｄ．褐藻由来の１％  重量／体積  アルギン酸ナトリウム。
【０１４０】
１０ｍＬのプレゲル溶液を、３電極スクリーン印刷炭素電極に拡げる。上記電極は、対電極および作用電極、ならびに銀／塩化銀参照電極の両方を含む。上記作用電極は、検知電極として作用する。次いで、上記電極上のプレゲル溶液に、０．１Ｍ  ＣａＣｌ２溶液を、Ｂａｄｇｅｒ  ２００Ｎエアブラシを７．５ｐｓｉで１秒間使用して噴霧し、約５ｍＬのＣａＣｌ２  溶液を沈積させる。上記ゲルを、加湿環境において３０分間硬化させる。
【０１４１】
さらなる構成要素（例えば、種々の濃度のトレハロース）を、上記のヒドロゲルマトリクス混合物に添加する。上記ヒドロゲルのさらなる構成要素としてはまた、１種もしくはそれより多くのアニオン性モノマーおよび架橋剤が挙げられ得る。
【０１４２】
（アニオン性モノマー（推定））
アニオンフィルターの増強のためのいくつかの候補を同定した。そのうちの各々は、電極を妨害し得るいかなるアニオンにも反発するように、負電荷を含む。２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）は、上記酵素、補因子および架橋剤とともに溶液中でのラジカル重合を介して重合され得る、永久的な負電荷を有するスルホン酸含有モノマーである。他の適切なアニオン性モノマー候補としては、メタクリル酸、２−スルホエチルメタクリレート、および２−プロペン−１−スルホン酸が挙げられる。酵素活性は、各組成に関してポテンショスタットでの電流検出を通じて、他のヒドロゲル構成要素に関して確認される。
【化８】
0006397822.tif 000020
【０１４３】
メディエーターといわれる容易に還元される分子は、電気化学的事象の拡がりを容易にし得る。メディエーターは、ＮＡＤＨから電極へ電子を効率的に往き来させ、より高い感度および電極表面の完全性の保護を可能にする。理想的には、メディエーター分子は、電極表面近くに固定化されて、電子の拡がりにおいて律速工程として拡散を排除する。ＮＡＤＨから電子を往き来させるための一般的なメディエーターとしては、チオニン、ｏ−フェニレンジアミン、メチレンブルーおよびトルイジンブルーが挙げられる。
【０１４４】
トルイジンブルーは、電解重合によって電極表面に固定化される。さらに、この電解重合事象の間に酵素が存在する場合、上記酵素は、メディエーターおよび必要に応じたアルギネート溶液の重合した層の中に捕捉され得る。このような固定化の利点は、上記酵素がこの重合したメディエーター層の付近でＮＡＤＨを直接生成し、電流応答の拡がりの律速工程としての拡散を完全に排除することにある。
【０１４５】
（架橋剤（推定））
ポリエチレングリコールジメタクリレート（ＰＥＧＤＡ）もしくたテトラエチレングリコールジアクリレート（ＴＥＧＤＡ）は、上記アニオン性およびメディエーターポリマーにおいて選択肢的な架橋剤として使用され、分子量カットオフフィルターおよび上記酵素およびその補因子のための固定化機構として働くヒドロゲルを作り出す。
【０１４６】
これらポリエチレングリコール誘導体の量および分子量を変動させると、拡散および立体障害に起因して、種々の酵素安定性および動力学が生じ、同様に、分子量カットオフフィルターメッシュサイズが変化する。ポリエチレングリコール誘導体は、架橋剤の選択肢である。なぜならそれらは、酵素が吸着を妨げる相互作用および改変を最小限にするからである。ＰＥＧＤＡおよびＴＥＧＤＡは両方とも、上記酵素および補因子を含むモノマー溶液中で、ラジカル重合を介して重合される。酵素活性は、他のヒドロゲル構成要素と関連して検証される。
【０１４７】
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼの生成が成功した際には、フェニルアラニンの電気化学的検出が緩衝化溶液中の理想的条件下で行われる。フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ濃縮物、ＮＡＤ＋、およびトルイジンブルーは、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解され、銀／塩化銀参照電極、作用（もしくは測定）電極、および対電極を含むスクリーン印刷炭素電極に配置される。上記電極が平衡化した後、ＰＢＳ中のフェニルアラニンのストック溶液は、上記電極上の酵素溶液に直接添加され、ポテンショスタットを使用して、電流検出によって電流が測定される。検出は、サイクリックボルタンメトリーによって決定される動作電圧で行われる。６０〜１２００ｍＭの間の濃度の範囲に及ぶフェニルアラニン濃度は、健康な個体およびＰＫＵを有する個体の生理学的範囲内で標準曲線を生成するために使用される。データ分析に関する種々の技術が、電流生成をフェニルアラニン濃度に相関させるための最も正確かつ再現性のある方法を同定するために利用される。この仕事は、生理学的フェニルアラニン濃度を検出し、この範囲における正確な検出に必要な酵素および補因子濃度を同様に決定する能力があることを示す。
【０１４８】
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよびその補因子の固定化のための最良の候補を同定した後、電流生成を、６０〜１２００ｍＭの範囲のフェニルアラニン濃度の電流検出を介して定量する。これは、健康な個体およびＰＫＵを有する個体の生理学的範囲内で標準曲線を生成するために使用される。データ分析に関する種々の技術が、電流生成をフェニルアラニン濃度に対応させるための最も正確かつ再現性のある方法を同定するために利用される。センサー安定性は、室温、約４℃、および約−２０℃で長期間の貯蔵によって評価される。次いで、検出の持続可能性は、ＰＢＳ中のフェニルアラニンのストック溶液を使用する各貯蔵条件に関して、１週間、３週間、５週間、および１０週間で決定される。
【０１４９】
（実施例６：代替のフェニルアラニンセンサー（推定））
体液（例えば、血液サンプルもしくは血漿）中のフェニルアラニンの量を測定するための唯一の方法に依存するのではなく、上記デバイスの他の実施形態は、種々のヒドロゲルおよび上記の構成要素での電極表面改変のために同じ沈積化学現象を利用して行われる。フェニルアラニンデヒドロゲナーゼは、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）（配列番号７もしくは配列番号７に少なくとも７０％相同であるその機能的フラグメント）の固定化を用いた実施形態において置換され得る。この酵素は、フェニルアラニンの反応を触媒し、ケイ皮酸およびアンモニアを生成する。ケイ皮酸は、ＦｅおよびＫＯＨの存在下で青色を生じることから、分光光度計で測定され得る。過酸化水素の存在下でのアンモニア放出は、ヒドロゲルで被覆された電極への電子の移動を生じる。上記の方法に類似した電子の移動による流れは、上記作用電極によって検出され得る（図１４に示される電極に類似）。
【０１５０】
（実施例７：フェニルアラニンセンサー法）
上記ヒドロゲルがアニオンおよび分子量カットオフフィルターとして作用する能力は、フェニルアラニンレベルを乏血小板血漿および全血から測定することによって検証される。フェニルアラニンは、一定の濃度範囲を達成するために試験される血清に添加され、次いで、ヒドロゲル被覆電極に直接添加される。以前に行われたように、フェニルアラニン濃度は、ポテンショスタットを使用する電流検出によって測定される。全ての電流測定による濃度測定値は、正確度を検証するために、タンデム質量分析による分析に対して比較される。
【０１５１】
上記バイオセンサーの機能性の検証はまた、以下の実験設計を使用して行われる。上記フェニルアラニンセンサーの効力の評価は、アルギネート、ＣａＣｌ２、トルイジンブルー、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、およびＮＡＤ（Ｐ）＋からなるアルギネートヒドロゲルで改変された３炭素電極の構築を要する。上記ヒドロゲルは、全血中の低分子およびタンパク質からの妨害を防止するためのフィルターとして作用する。最初に、３２の全血算プルを、約３５μＭ〜約２０００μＭの範囲に及ぶフェニルアラニン濃度で試験する。具体的には、以下のＰｈｅ濃度を酵素電極で試験する：３５μＭ、１００μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、１０００μＭ、１２５０μＭ、１５００μＭ、２０００μＭ。この実験では、３５μＭは、生理学的に正常な濃度を表し、１００μＭを超える他の濃度は各々、種々の異なる病的濃度を表す。これら濃度は、３５μＭより低い濃度の全血を薬物添加する（ｄｏｐｉｎｇ）ことによって生成する。さらに、被験体のサンプルを、上記センサーが患者の全血での予見されない異常性による問題なしに機能することを確実にするために試験する。全てのフェニルアラニン濃度を、血中フェニルアラニンレベルを決定するための常套手段である高速液体クラマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の使用によって検証する。上記サンプルは、予備加工処理を要しない。血液を、ヘパリンナトリウム真空管を使用して採取し、次いで、上記血液をより高いフェニルアラニン濃度で薬物添加する以外には改変せずに使用される。予測される検出限界は、３５〜２０００μＭの範囲および分離能２０μＭで３５μＭである。統計的評価は、濃度測定値の信頼性を評価するために行われる。その濃度測定値を、ＡＮＯＶＡ一元配置分析を使用して分析して、正常なデータ分布を想定して群間の差を示す。信頼区間が評価され、上記方法の感度および再現性が示される。信頼区間  ９５％（ｐ＜０．０５）以上で正常な生理学的状態から病的状態までの範囲に及ぶ濃度測定値は、統計的に有意とみなされる。病的な濃度レベルと健康な生理学的濃度レベルとの間の統計的差が初めて実証される。その後の実験は、別個の濃度値の全範囲にわたる定量を検証するために使用される。
【０１５２】
（均等物）
当業者は、慣用的な実験のみを使用して、本明細書で記載される発明の具体的実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または確かめ得る。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるとは意図されず、むしろ以下の特許請求の範囲に記載される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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