(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）支持体上に１つ以上の標的核酸を捕捉するステップ、
（ｂ）１つ以上の捕捉された核酸をテンプレートとして用いて、支持体上に固定された１つ以上の核酸二本鎖を生成するステップ、
（ｃ）１つ以上の核酸二本鎖およびトランスポゾン組成物が転移反応を実行して１つ以上のタグ付き核酸二本鎖を生成する条件下で、トランスポサーゼおよびトランスポゾンを１つ以上の核酸二本鎖と接触させるステップであって、トランスポゾン組成物が、転移鎖および非転移鎖を含む二本鎖核酸分子を含むステップ、
（ｄ）固定化された鎖の３’末端をテンプレート鎖の５’末端に向かって伸長する条件下で、タグ付き核酸二本鎖を核酸修飾酵素と接触させるステップ、
（ｅ）タグ付き核酸鎖を増幅して複数のタグ付き核酸鎖を生成するステップ、
（ｆ）複数の核酸鎖を検出するステップ、
の工程を含む、１つ以上の標的核酸を検出する方法。
【請求項２】
前記標的核酸が、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的核酸が、支持体上に固定された１つ以上の捕捉プローブに対するハイブリダイゼーションにより捕捉され、前記捕捉プローブが、前記標的核酸の少なくとも一部に相補的である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
３’アダプターを１つ以上の標的核酸に付加するステップを更に含み、前記３’アダプターが、支持体上に固定された１つ以上の捕捉プローブに相補的な配列を含み、前記捕捉するステップが、前記３’アダプターがライゲートされた標的核酸を固定された捕捉プローブにハイブリダイズするステップを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記支持体が、１つのビーズまたは複数のビーズである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記支持体が、平坦な支持体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
タグ付き核酸鎖の増幅により、タグ付き核酸の少なくとも１つのコピーが生成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
タグ付き核酸鎖の増幅により、タグ付き核酸の複数のコピーが生成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
増幅する方法が、ブリッジ増幅である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
複数の核酸鎖の検出が、固体の支持体上で行われる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出が、核酸鎖の少なくとも一部を配列決定することを含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全開示が本明細書に参照により組み込まれる、２０１２年３月６日に出
願された米国仮特許出願第６１／６０７，４１８号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡを含む核酸の配列決定のための配列決定技術が開発された。配列決定技術として
は、例えば、合成による配列決定が挙げられる。合成による配列決定またはサイクル配列
決定は、例えば、それらの全開示が本明細書に参照により組み込まれる、例えば、米国特
許第７，４２７，６７３号；第７，４１４，１１６号；国際公開第ＷＯ０４／０１８４９
７号；第ＷＯ９１／０６６７８号；第ＷＯ０７／１２３７４４号；および米国特許第７，
０５７，０２６号に記載されるような切断性または光退色性色素標識を含有する、ヌクレ
オチドの段階的付加により達成することができる。あるいは、ピロ配列決定技術を用いて
もよい。ピロ配列決定は、特定のヌクレオチドが新生鎖に組み込まれる際の無機ピロリン
酸（ＰＰｉ）の放出を検出する（それらの全開示が本明細書に参照により組み込まれる、
Ｒｏｎａｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）“Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  
ｒｅｌｅａｓｅ,”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４２（１），
８４−９；Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．（２００１）“Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｈｅ
ｄｓ  ｌｉｇｈｔ  ｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１
１（１），３−１１；Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．，Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｎｙｒｅｎ，Ｐ
．（１９９８）“Ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｒｅａ
ｌ−ｔｉｍｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１（５３７５），
３６３；米国特許第６，２１０，８９１号；第６，２５８，５６８号；および第６，２７
４，３２０号）。ピロ配列決定では、放出されたＰＰｉはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）
にＡＴＰスルフリラーゼによりすぐに変換されることにより検出することができ、生成さ
れたＡＴＰのレベルはルシフェラーゼにより生成される光子によって検出される。
【０００３】
配列決定技術としては、ライゲーション技術による配列決定も挙げられる。こうした技
術はＤＮＡリガーゼを用いてオリゴヌクレオチドを組み込み、こうしたヌクレオチドの組
み込みを同定し、それらの全開示が本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第６，
９６９，４８８号；第６，１７２，２１８号；および第６，３０６，５９７号に記載され
る。他の配列決定技術としては、例えば、蛍光インシチュ配列決定（ＦＩＳＳＥＱ）、お
よび大規模並列シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）が挙げられる。
【０００４】
配列決定のためのＤＮＡ試料の調製は比較的簡単であり得、試料調製プロセスを単純化
する、アダプター配列をフラグメント化してＤＮＡフラグメントに付加する転移反応の使
用を含むことができる。例えば、その全開示が本明細書に参照により組み込まれる、国際
公開第ＷＯ２０１０／０４８６０５号を参照されたい。対照的に、ＲＮＡ試料の配列決定
のための現在のプロトコルは、配列決定前に試料中のＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡ型に変換す
る試料調製方法を用いる。よって、配列決定のためのＲＮＡ試料の調製はより労働集約的
である。また、現在のプロトコルは鎖特異的情報を保存するそれらの能力において最適で
はない。より具体的には、ほとんどの方法は、二本鎖ｃＤＮＡに変換された後、もとの一
本鎖ＲＮＡ分子の方向についての鎖情報を保存することができない。鎖特異的情報の保存
は、新しい遺伝子のアノテーションおよび遺伝子発現レベルの決定のために重要である。
いくつかの方法は、アダプターを一本鎖ＲＮＡ分子の末端にライゲートすることにより鎖
特異的情報の保存を試みる。アダプターはＲＮＡ分子から生成される二本鎖ｃＤＮＡの両
端について識別可能な情報を提供する配列を有し得る。しかしながら、この方法は不利点
を有する。例えば、ＲＮＡ分子がフラグメント化される場合、フラグメント化後、分子の
内部部分はそれらの方向（すなわち、鎖特異的）情報を失う。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書ではＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖のタグ付け方法を提供する。本方法は、トランスポ
サーゼおよびトランスポゾン組成物を提供するステップ、支持体上に固定された１つ以上
のＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を提供するステップ、ならびにトランスポサーゼおよびトランス
ポゾン組成物を１つ以上のＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖と、１つ以上のＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖お
よびトランスポゾン組成物に１つ以上のタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を生成する転移反
応が起こる条件下で接触させるステップを含み、トランスポゾン組成物は転移鎖および非
転移鎖を含む二本鎖核酸分子を含む。本方法を行い、固体支持体上に固定されたＤＮＡ：
ＤＮＡ二本鎖をタグ付けすることもできる。
【０００６】
１つ以上の実施形態の詳細を添付の図面および以下の説明に記載する。他の特徴、目的
、および利点は説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかとなるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本明細書において提供される方法の例を示す概略である。ポリＡテール化ｍＲＮＡは、支持体の表面に結合したポリＴＤＮＡ捕捉プローブまたはプライマーとのハイブリダイゼーションによって支持体上で捕捉される。ポリＴ鎖は次に逆転写酵素ポリメラーゼで伸長され、ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を含む二本鎖分子を生成する。次に、トランスポソーム複合体（例えば、モザイク末端（ＭＥ）配列および表面増幅プライマーに相補的な配列と結合したＴｎ５トランスポサーゼ）は支持体に付加され、ＤＮＡアダプターオリゴをＲＮＡ鎖の５’末端にライゲートして二本鎖と転移反応を行い、これをフラグメントする。鎖置換ポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｔポリメラーゼ）を次に用い、トランスポソーム複合体の非転移鎖を置換し、ＲＮＡ鎖をその５’ＤＮＡキメラ末端にコピーしてＤＮＡ鎖の３’末端を伸長することができる。二本鎖分子を次に増幅（例えば、クラスター増幅）、および配列決定プライマーで配列決定することができる。プライマーは部分的にＭＥ配列および上流アダプター配列を含む。あるいは、分子の他端（ポリＴ末端）は、合成による配列決定（ＳＢＳ）化学のサイクルを開始する前に、ポリＴ配列の上流にアニールし、天然ｄＡＴＰヌクレオチドで伸長されるプライマーで配列決定することができる。
【図２】本明細書において提供される方法の例を示す概略である。ＲＮＡはフラグメント化され、ホスファターゼで処理される。一本鎖アダプター分子は表面結合プライマーの補体を含む各ＲＮＡフラグメントの３’末端にライゲートされる。フラグメントは次に支持体に付加され、ハイブリダイゼーションによって捕捉される。ハイブリダイズされたＲＮＡ分子は逆転写酵素ポリメラーゼでＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖に変換される。二本鎖をタグメントするのにトランスポサーゼおよびＰ５を有するＭＥのアダプター二本鎖（すなわち、トランスポゾン）を含むトランスポソーム複合体または組成物が用いられる。鎖置換ポリメラーゼでのＤＮＡ鎖の末端までの伸長後、分子を増幅（例えば、クラスター増幅）および配列決定することができる。
【図３】本明細書において提供される方法の例を示す概略である。２つの表面グラフトプライマー：標準的なグラフトプライマー（例えば、Ｐ５）およびその下流（３’）側に標的特異的捕捉配列を有する修飾グラフトプライマー（例えば、Ｐ７）を含有する支持体が用いられる。標的特異的配列の一例はレトロウイルス逆転写酵素（例えば、ＨＩＶポリメラーゼ）に相補的なオリゴ配列である。精製ウイルスＲＮＡは支持体に付加され、ハイブリダイゼーションによって捕捉され、逆転写酵素でコピーされ、タグメントされる。配列決定は、タグメントされたアダプターまたは他端では捕捉プローブにアニールされたプライマーで達成することができる。
【図４】本明細書において提供される方法の例を示す概略である。ＲＮＡ転写物はグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）転写物配列および表面結合プライマーに相補的な配列（例えば、Ｐ７’配列）を含有するプラスミドから生成される。転写物は、例えば、Ｐ７配列を含む、プライマーを含む支持体にハイブリダイズされる。ハイブリダイズされたＲＮＡ分子は逆転写酵素ポリメラーゼでＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖に変換される。二本鎖をタグメントするのにトランスポソーム複合体が用いられる。鎖置換ポリメラーゼでのＤＮＡ鎖の末端までの伸長およびＲＮＡ鎖の除去後、分子を増幅（例えば、クラスター増幅）および配列決定することができる。
【図５】グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含有するプラスミドから生成し、任意で、ＤＮアーゼで処理され、ＤＮＡ（すなわち、プラスミド）を除去したＲＮＡ転写物を示すゲルの画像である。ＲＮＡ転写物のＤＮアーゼ処理後、残留ＤＮＡ（すなわち、プラスミド）は見られなかった。
【図６】ＳＹＢＲグリーンで染色されたクラスターの画像を示す。レーン１〜４はＰｈｉＸ  ＤＮＡを含有し、レーン５〜８はＧＦＰ  ＲＮＡを含有した。レーン５および６は、ＤＮアーゼで予め処理され、ＤＮＡを除去したＲＮＡを含有した。レーン７および８は、ＤＮアーゼで予め処理され、追加の対照としてＲＮアーゼで処理されたＲＮＡを含有した。第１伸長は、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）（レーン２、４、６および８）またはＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ（レーン１、３、５および７）のいずれかを用いて行われた。レーン３〜８はＰ５アダプターでタグメントされた。等温クラスター増幅は基準として行われ、クラスターはＳＹＢＲグリーンで染色された。
【図７Ａ】図６に記載されたレーン１〜８の配列決定からのアライン配列決定データのカバレッジプロットのグラフを示す。
【図７Ｂ】図６に記載されたレーン１〜８の配列決定からのアライン配列決定データのカバレッジプロットのグラフを示す。
【図８】本明細書において提供されるＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のタグ付け方法の例を示す概略である。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）はフラグメント化され、フラグメントは末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによりポリヌクレオチドで標識される。フラグメントは次に支持体に付加され、ポリＴテールと固体支持体上に固定されたその補体とのハイブリダイゼーションによって捕捉される。ハイブリダイズされたｓｓＤＮＡ分子はＤＮＡポリメラーゼでＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖に変換される。二本鎖をタグメントするのにトランスポサーゼおよびＰ５−ｓｅｑ配列を有するアダプター二本鎖（すなわち、トランスポゾン）を含むトランスポソーム複合体または組成物が用いられる。鎖置換ポリメラーゼでのＤＮＡ鎖の末端までの伸長後、分子を増幅（例えば、クラスター増幅）および配列決定することができる。
【図９】全ｍＲＮＡ転写物試料を用いてデータを生成するように設計された実験からのＳＹＢＲグリーンで染色されたクラスターの画像を示す。レーン１はタグメンテーションのないＰｈｉＸ標準ライブラリーである。レーン２はテーリングが行われなかった負の対照であり、レーン８はｄｓＤＮＡの負の対照である。レーン３およびレーン４は、レーン４についてプライマーが希釈された以外、同じ実験である。レーン５および６は、レーン６についてプライマーが希釈された以外、同じ実験である。レーン７は、ランダムＤＮＡヘキサマーの代わりにランダムＲＮＡヘキサマーを用いる。
【図１０】図１の方法に従ったＧＡＰＤＨのアライン配列決定リードのカバレッジの画像を示す。上の３’捕捉は、対照ポリＡテール化ｍＲＮＡ試料からの捕捉、タグメンテーション、クラスターおよび配列アラインメントを示す。下の全転写物は、本開示の方法を用いて全ｍＲＮＡ転写物カバレッジを示すため複合総ＵＨＲ  ＲＮＡ試料から濃縮され、酵素的にフラグメント化され、ポリアデニル化されたｍＲＮＡ試料からのｍＲＮＡアラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
ＲＮＡ試料の配列決定のための現在のプロトコルはすべて、配列決定前に試料中のＲＮ
Ａを二本鎖ｃＤＮＡ型に変換する試料調製を用いる。本明細書では、二本鎖ｃＤＮＡ中間
体の溶液相調製を回避するＲＮＡ試料の配列決定方法を提供する。提供される方法は配列
決定中の鎖性情報の保存ももたらす。しかしながら、本明細書に記載される方法は、ＤＮ
Ａの標識および配列決定にも用いられ得る。
【０００９】
本明細書ではＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖のタグ付け方法を提供する。本方法は、トランスポ
サーゼおよびトランスポゾン組成物を提供するステップ、支持体上に固定された１つ以上
のＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を提供するステップ、ならびにトランスポサーゼおよびトランス
ポゾン組成物を１つ以上のＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖と、１つ以上のＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖お
よびトランスポゾン組成物に１つ以上のタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を生成する転移反
応が起こる条件下で接触させるステップを含む。トランスポゾン組成物は、転移鎖および
非転移鎖を含む二本鎖核酸分子を含む。下記の例はＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を用いて示され
得るが、それらは適切な場合ＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖にも変更可能であり得る（図８参照）
。
【００１０】
任意で、１つ以上のＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖はＲＮＡ鎖の５’末端上でタグ付けされる。
任意で、転移鎖は鎖情報を保存するタグを含む。転移反応は、トランスポゾン組成物の転
移鎖を含む５’タグ付きＲＮＡ鎖、およびＤＮＡ鎖の３’末端とトランスポゾン組成物の
非転移鎖との間のギャップをもたらす。任意で、本方法は、１つ以上のタグ付きＤＮＡ：
ＲＮＡ二本鎖を核酸修飾酵素と、ＤＮＡ鎖の３’末端を伸長し、ＲＮＡ鎖をそれらの５’
末端にコピーする条件下で接触させるステップをさらに含む。核酸修飾酵素はトランスポ
ゾン組成物の非転移鎖を置換することができる。
【００１１】
図１は本明細書において提供される方法の例を示す概略である。簡潔に、ポリＡテール
化ｍＲＮＡは支持体（例えば、フローセル）上で、支持体の表面に結合したポリＴ  ＤＮ
Ａ捕捉プローブ（またはプライマー）とのハイブリダイゼーションによって捕捉される。
ポリＴ鎖は次に逆転写酵素ポリメラーゼで伸長され、ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を含む二本鎖
分子を生成する。次に、トランスポソーム複合体（例えば、トランスポゾン（例えば、モ
ザイク末端（ＭＥ））配列および表面増幅プライマーに相補的な配列と結合したＴｎ５）
は支持体に付加され、これはＤＮＡアダプターオリゴをＲＮＡ鎖の５’末端にライゲート
して二本鎖を「タグメント」する。鎖置換ポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｔポリメラーゼ）
を次に用い、トランスポソームの「非転移鎖」を置換し、ＲＮＡ鎖をその５’ＤＮＡキメ
ラ末端にコピーしてＤＮＡ鎖の３’末端を伸長することができる。二本鎖分子を次に増幅
（例えば、クラスター化）、ならびに部分的にＭＥ配列および上流アダプター配列を含む
配列決定プライマーで配列決定することができる。あるいは、分子の他端（ポリＴ末端）
は、ＳＢＳ化学のサイクルを開始する前に、ポリＴ配列の上流にアニールし、天然ｄＡＴ
Ｐヌクレオチドで伸長されるプライマーで配列決定することができる。この方法によりペ
アエンド配列決定も可能となる。
【００１２】
配列決定のためにｓｓＤＮＡを提供する場合、同様のアプローチが用いられ得る。例え
ば、一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの３’末端には、末端デオキシヌクレオチジルトラン
スフェラーゼ（ＴｄＴ）およびｄＡＴＰまたはｄＴＴＰのようないずれかのｄＮＴＰを用
いることにより、ヌクレオチドが付加され得る。一連のヌクレオチドをｓｓＤＮＡ分子の
末端に付加するためのいずれかの方法が用いられ得る。図８は、ポリＡ含有捕捉プローブ
が支持体表面上に固定され、ｓｓＤＮＡ−ポリＴテール化分子が捕捉される例である。ハ
イブリダイゼーションが起こり得るように支持体上の捕捉プローブおよびｓｓＤＮＡ上の
ヌクレオチドにより相補的配列が提供される限り、ｓｓＤＮＡ末端のものを含む、いずれ
かの捕捉配列が用いられ得る。前述したようなＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖を作製するＤＮＡポ
リメラーゼによるｄｓＤＮＡを作製する捕捉プローブの伸長、アダプターオリゴの転移ラ
イゲーションおよび鎖置換増幅が行われ、クラスター形成のための二本鎖分子を提供し得
る。二本鎖分子は次に増幅（例えば、クラスター増幅）および配列決定され得る。
【００１３】
別の例（図２）として、ＲＮＡ（総またはポリＡ濃縮）はフラグメント化され、ホスフ
ァターゼで処理された後、一本鎖アダプター分子はＰ７表面結合プライマーの補体を含む
各フラグメントの３’末端にライゲートされる。フラグメントは次に支持体（例えば、フ
ローセル）に付加され、ハイブリダイゼーションによって捕捉される。ハイブリダイズさ
れたＲＮＡ分子は逆転写酵素ポリメラーゼでＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖に変換される。二本鎖
をタグメントするのにトランスポサーゼおよびＰ５プライマー配列を有するＭＥ配列のア
ダプター二本鎖（例えば、トランスポゾン）を含むトランスポソーム複合体を用いること
ができる。鎖置換ポリメラーゼでのＤＮＡ鎖の末端までの伸長後、分子を増幅および配列
決定することができる。
【００１４】
さらなる例（図３）として、２つの表面グラフトプライマー：標準的なグラフトプライ
マー（例えば、Ｐ５）およびその下流（３’）側に標的特異的捕捉プローブを有する修飾
グラフトプライマー（例えば、Ｐ７）を含有する特別な支持体（例えば、フローセル）が
用いられる。標的特異的プローブの一例はレトロウイルス逆転写酵素（例えば、ＨＩＶポ
リメラーゼ）に相補的なオリゴ配列である。精製ウイルスＲＮＡは支持体に付加され、ハ
イブリダイゼーションによって捕捉され、逆転写酵素でコピーされ、タグメントされる。
配列決定は、タグメント化されたアダプターまたは他端では捕捉プローブにアニールされ
たプライマーで達成することができる。任意で、特別な支持体は、多くの異なるＲＮＡ標
的の同時捕捉を可能にする複数の異なる標的特異的捕捉プローブを含有する。
【００１５】
標的ＤＮＡ：ＤＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖をタグ付けし、タグ付きＤＮＡ：ＤＮ
ＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を生成するインビトロ転移反応の使用は、トランスポサー
ゼ、トランスポゾン配列組成物、および適切な反応条件を含む。
【００１６】
本明細書を通して用いられる場合、トランスポゾンの語は、インビトロ転移反応におい
て機能的であるトランスポサーゼまたはインテグラーゼ酵素と複合体を形成するのに必要
なヌクレオチド配列を含有する二本鎖ＤＮＡを指す。トランスポゾンは、複合体、シナプ
ス複合体またはトランスポソーム複合体を形成する。トランスポゾンは、トランスポゾン
配列を認識し、これに結合するトランスポサーゼまたはインテグラーゼとトランスポソー
ム組成物を形成することもでき、インビトロ転移反応においてこれとインキュベートされ
、この複合体はトランスポゾンを標的ＤＮＡに挿入または転移することができる。トラン
スポゾンは、転移トランスポゾン配列または転移鎖および非転移トランスポゾン配列また
は非転移鎖で構成される２つの相補的配列を示す。例えば、インビトロ転移反応において
活性である高活性Ｔｎ５トランスポサーゼ（例えば、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポサ
ーゼ、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国ウィスコンシン州マ
ディソン）と複合体を形成する１つのトランスポゾンは、５’ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡ
ＧＡＧＡＣＡＧ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の転移トランスポゾン配列を示す転移鎖
および５’ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の
非転移トランスポゾン配列を示す非転移鎖を含む。転移鎖の３’末端はインビトロ転移反
応において標的核酸に結合または転移される。転移トランスポゾン末端配列に相補的なト
ランスポゾン末端配列を示す非転移鎖は、インビトロ転移反応において標的核酸に結合ま
たは転移されない。トランスポゾン組成物とは、本明細書において用いられる場合、任意
で追加配列を含む、トランスポゾン（すなわち、トランスポサーゼと作用し、転移反応を
行うことができる最小二本鎖ＤＮＡセグメント）を含む組成物を指す。例えば、トランス
ポゾン組成物は、組み合わされてトランスポゾンの配列を示す、転移トランスポゾンオリ
ゴヌクレオチドまたは転移鎖および非転移トランスポゾンオリゴヌクレオチドまたは非転
移鎖を含有する２つのトランスポゾンオリゴヌクレオチドを含む。一方または両方の鎖は
追加配列を含むことができる。トランスポゾンは天然発生および／または非天然発生ヌク
レオチドならびに天然または非天然骨格結合を含むことができる。任意で、トランスポゾ
ンはトランスポゾンを構成する１つ以上のヌクレオチドに付着した１つ以上の部分も含む
ことができる。例えば、トランスポゾンの一方または両方の鎖はビオチン化してもよく、
または標識、例えば蛍光標識を含有してもよい。
【００１７】
転移トランスポゾンオリゴヌクレオチドおよび転移鎖の語は互換的に用いられ、トラン
スポゾンおよびトランスポゾン組成物の、すなわち、トランスポゾン末端がタグまたは他
の配列もしくは部分に付着しているかにかかわらず、両方の転移部分を指す。同様に、非
転移トランスポゾンオリゴヌクレオチドおよび非転移鎖の語は互換的に用いられ、トラン
スポゾンおよびトランスポゾン組成物の両方の非転移部分を指す。
【００１８】
いくつかの実施形態では、トランスポゾン組成物は、トランスポゾン配列に加えて１つ
以上の他のヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのトランスポゾンを含む、またはこ
れで構成される。よって、いくつかの実施形態では、トランスポゾン組成物は、転移トラ
ンスポゾン配列の１つ以上の他のヌクレオチド配列５’、例えば、タグ配列を有する転移
鎖を含む。転移トランスポゾン配列に加えて、タグは１つ以上の他のタグ部分またはタグ
領域を有することができる。
【００１９】
本明細書において用いられる場合、「タグ」とは、結合する核酸フラグメントを同定ま
たはアドレス指定する手段を提供する核酸成分、一般的にはＤＮＡを指す。例えば、タグ
は、（例えば、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長のためのプライマーのような、オリゴヌク
レオチドをアニールする部位を提供すること、捕捉もしくはライゲーション反応のための
オリゴヌクレオチドを提供すること、または核酸の特定の供給源に由来するとの同定を提
供すること、等により）タグが付着しているＤＮＡの同定、認識、および／または分子も
しくは化学操作を可能にするヌクレオチド配列を含む。タグを核酸分子に結合するプロセ
スは本明細書では「タグ付け」と称されることがあり、タグ付けが行われた、またはタグ
を含有する核酸は「タグ付き」（例えば、「タグ付きＲＮＡ」）と称される。
【００２０】
本明細書を通して用いられる場合、鎖性または鎖特異的情報の語は、もとの一本鎖分子
の方向についての知識の保存を指す。ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖においてＤＮＡ鎖はＲＮＡ鎖
に相補的であることが知られているので、これは提供される方法において保存される。よ
って、ＤＮＡ鎖を配列決定する場合、配列は、鎖特異的情報を保存し、ＲＮＡ分子および
／またはその発現レベルの正しい同定を可能にするＲＮＡ鎖の配列であるだろう。鎖特異
的情報の保存方法は、その全開示が本明細書に参照により組み込まれる、国際公開第ＷＯ
２０１１／００３６３０号にも記載される。しかしながら、国際公開第ＷＯ２０１１／０
０３６３０号に記載される方法は依然として、ＲＮＡ分子の二本鎖ｃＤＮＡ分子への変換
を必要とし、これは、本明細書に記載されるように、本出願において提供される方法ほど
効率的ではない。さらに、国際公開第ＷＯ２０１１／００３６３０号に記載される方法は
、鎖情報を保存するためのタグを必要とする。本明細書において提供される方法では、鎖
特異的情報または鎖性を保存するのにタグは必要ない。ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖のＤＮＡ鎖
（すなわち、第１ＤＮＡ鎖）が増幅され、第１および第２増幅ＤＮＡ鎖を生成する実施形
態では、鎖性は第１ＤＮＡ鎖がもとのＲＮＡ鎖に相補的であり、第２ＤＮＡ鎖が（配列中
のＵｓに代わるＴｓ以外）もとのＲＮＡ鎖と同じ配列であるという知識により維持される
。よって、タグ（例えば、タグ配列はトランスポゾンの転移鎖に含むことができる）は鎖
性を保存するのに用いることができるが、必要ではない。
【００２１】
本明細書において用いられる場合、タグ部分またはタグ領域とは、所望の意図する目的
または用途の配列を示すタグの部分または領域を意味する。１つのタグ部分またはタグ領
域はトランスポゾン領域であり、このタグ部分またはタグ領域は転移トランスポゾン配列
を示す。転移鎖が１つ以上の他のヌクレオチド配列も示すいくつかの実施形態では、タグ
は１つ以上の他のタグ領域も有し、このタグ領域のそれぞれはいずれかの所望の目的のた
めに提供される。例えば、トランスポゾン組成物は、（ｉ）（トランスポゾン配列に加え
て）制限部位タグ領域、捕捉タグ領域、配列決定タグ領域、増幅タグ領域、検出タグ領域
、アドレスタグ領域、および転写プロモーター領域の１つ以上から選択されるタグ領域を
含むことができる１つ以上の追加配列を示す転移鎖；ならびに（ｉｉ）非転移トランスポ
ゾン配列を示す非転移鎖を含むことができる。
【００２２】
タグ領域が説明される場合、異なるタグ領域の名称および説明は、異なる実施形態にお
いてタグの異なる部分または領域の意図する目的および用途を理解および議論することを
より容易にするような、便宜上のものである。しかしながら、これらの名称および説明は
、タグまたはそのタグ領域のいずれかの使用または用途をいずれの方法でも限定すること
を意図していない。よって、いずれかの特定のタグまたはタグ領域は、主な目的もしくは
用途に加えた、またはその代わりの、いずれかの目的に用いることができる。また、１つ
のタグ領域は２つ以上の他のタグ領域を含むことができ（例えば、配列決定タグ領域は捕
捉タグ領域および増幅タグ領域の両方を含むことができ）、または１つのタグ領域は２つ
以上の異なるタグ領域の機能、目的もしくは用途を提供することができる（例えば、捕捉
タグ領域は特定の用途の配列決定タグ領域および／または増幅タグ領域の機能または目的
を提供することもできる）。またさらに、タグは、いずれかの特定の目的、用途または機
能に用いるための１つ以上の異なる領域について説明される必要はない。
【００２３】
本明細書を通して用いられる場合、トランスポサーゼの語は、トランスポゾン含有組成
物（例えば、トランスポゾン、トランスポゾン組成物）と機能的複合体を形成し、インビ
トロ転移反応においてこれとインキュベートされ、トランスポゾン含有組成物の二本鎖標
的核酸への挿入または転移を触媒することができる酵素を指す。提供される方法のトラン
スポサーゼはレトロトランスポゾンおよびレトロウイルスからのインテグラーゼも含む。
提供される方法において用いることができるトランスポサーゼの例としては、Ｔｎ５トラ
ンスポサーゼおよびＭｕＡトランスポサーゼの野生型または変異型が挙げられる。
【００２４】
「転移反応」とは、１つ以上のトランスポゾンが標的核酸にランダムな部位またはほぼ
ランダムな部位で挿入される反応である。転移反応における必須成分は、トランスポサー
ゼならびに転移トランスポゾン配列およびその補体（すなわち、非転移トランスポゾン末
端配列）を含むトランスポゾンのヌクレオチド配列を示すＤＮＡオリゴヌクレオチド、な
らびに機能的転移またはトランスポソーム複合体を形成するのに必要な他の成分である。
本発明の方法は、高活性Ｔｎ５トランスポサーゼおよびＴｎ５型トランスポゾン末端によ
り、またはＭｕＡもしくはＨＹＰＥＲＭｕトランスポサーゼならびにＲ１およびＲ２末端
配列を含むＭｕトランスポゾン末端により形成される転移複合体を用いることにより例示
される（例えば、それらの全開示が本明細書に参照により組み込まれる、Ｇｏｒｙｓｈｉ
ｎ，Ｉ．ａｎｄ  Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｗ．Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：
７３６７，１９９８；およびＭｉｚｕｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｃｅｌｌ，３５：７８５，１９８
３；Ｓａｖｉｌａｈｔｉ，Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１４：４８９３，１９９
５参照）。しかしながら、提供される方法では、トランスポゾン末端をランダムまたはほ
ぼランダムに十分な効率で挿入し、その意図する目的のための標的核酸をタグ付けするこ
とができるいずれかの転移システムを用いることができる。提供される方法において用い
られ得る既知の転移システムの他の例としては、これらに限定されないが、黄色ブドウ球
菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｔｎ５５２、Ｔｙ１、トランスポゾ
ンＴｎ７、Ｔｎ／ＯおよびＩＳ１０、マリナートランスポサーゼ、Ｔｃ１、Ｐエレメント
、Ｔｎ３、細菌挿入配列、レトロウイルス、および酵母のレトロトランスポゾンが挙げら
れる（例えば、それらの全開示が本明細書に参照により組み込まれる、Ｃｏｌｅｇｉｏ  
Ｏ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３：２３８４−８，２００１；
Ｋｉｒｂｙ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１７３−８６，
２００２；Ｄｅｖｉｎｅ  Ｓ  Ｅ，ａｎｄ  Ｂｏｅｋｅ  Ｊ  Ｄ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａ
ｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２：３７６５−７２，１９９４；国際公開第ＷＯ９５／２３８７
５号；Ｃｒａｉｇ，Ｎ  Ｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７１：１５１２，１９９６；Ｃｒａｉｇ
，Ｎ  Ｌ，Ｒｅｖｉｅｗ  ｉｎ：Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，２０４：２７−４８，１９９６；Ｋｌｅｃｋｎｅｒ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ
Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：４９−８２，１９９６；Ｌ
ａｍｐｅ  Ｄ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１５：５４７０−９，１９９６；Ｐ
ｌａｓｔｅｒｋ  Ｒ  Ｈ，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２
０４：１２５−４３，１９９６；Ｇｌｏｏｒ，Ｇ  Ｂ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２６０：９７−１１４，２００４；Ｉｃｈｉｋａｗａ  Ｈ，ａｎｄ  Ｏｈｔｓｕｂ
ｏ  Ｅ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１８８２９−３２，１９９０；Ｏｈｔｓｕ
ｂｏ，Ｆ  ａｎｄ  Ｓｅｋｉｎｅ，Ｙ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．２０４：１−２６，１９９６；Ｂｒｏｗｎ  Ｐ  Ｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８６：２５２５−９，１９８９；Ｂｏｅｋｅ  
Ｊ  Ｄ  ａｎｄ  Ｃｏｒｃｅｓ  Ｖ  Ｇ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３
：４０３−３４，１９８９参照）。
【００２５】
トランスポゾンを標的配列に挿入する方法は、いずれかの適切なトランスポゾンシステ
ムを用いてインビトロで行うことができ、これには適切なインビトロ転移システムが入手
可能であり、またはこれは当技術分野における知識に基づき開発することができる。一般
的には、本発明の方法において用いられる適切なインビトロ転移システム、少なくとも、
十分な純度、十分な濃度、および十分なインビトロ転移活性のトランスポサーゼ酵素なら
びに転移反応を触媒することができる各トランスポサーゼと機能的複合体を形成するトラ
ンスポゾンを必要とする。本発明において用いることができる適切なトランスポサーゼト
ランスポゾン配列としては、これらに限定されないが、トランスポサーゼの野生型、誘導
体または変異型から選択されるトランスポサーゼと複合体を形成する野性型、誘導体また
は変異型トランスポゾン配列が挙げられる。
【００２６】
提供される方法では、ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖はさまざまな方法で提供することができる
。例として、支持体は複数のプライマーを含むことができ、ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖は、１
つ以上のＲＮＡ分子を支持体上の固定化プライマーにハイブリダイズし、ＲＮＡ分子にハ
イブリダイズされたプライマーをＲＮＡ分子をテンプレートとして用いて伸長し、１つ以
上のＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を生成することにより提供される。任意で、複数のＤＮＡ：Ｒ
ＮＡ二本鎖は、複数のＲＮＡ分子を支持体上の固定化プライマーにハイブリダイズし、Ｒ
ＮＡ分子にハイブリダイズされたプライマーをＲＮＡ分子をテンプレートとして用いて伸
長し、複数のＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を生成することにより提供される。
【００２７】
上述したように、本方法は、複数のプライマーを有する支持体を提供するステップを含
むことができ；プライマーまたはそのサブセットは１つ以上のＲＮＡ分子に結合すること
ができる配列を含む。例えば、固定化プライマーはポリＴ配列を含んでもよく、ＲＮＡは
ポリＴ配列にハイブリダイズすることができるポリＡ配列を含んでもよい。あるいはまた
はさらに、複数の固定化プライマーは、複数のＲＮＡ分子中の１つ以上のＲＮＡ分子にハ
イブリダイズすることができる標的特異的プライマーを含むことができる。よって、１つ
以上のＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖は、１つ以上の固定化プライマーの少なくとも一
部分に相補的な配列を含む。任意で、複数の固定化プライマーは、第１配列を有するプラ
イマーの第１サブセットおよび第２配列を有するプライマーの第２サブセットを含む。プ
ライマーの第１または第２サブセットはポリＴ配列を含んでもよい。
【００２８】
任意で、３’アダプターは複数のＲＮＡ分子に付加することができ、３’アダプターは
複数の固定化プライマーまたはそのサブセットに相補的な配列を含む。ＲＮＡ分子にライ
ゲートされたこうした３’アダプターは次に固定化プライマーにハイブリダイズすること
ができる。
【００２９】
よって、固定化プライマーまたはそのサブセットは、ポリＴ配列、ＲＮＡ標的特異的配
列またはＲＮＡ分子にライゲートされたアダプターに相補的な配列を含むことができる。
任意で、複数のプライマーは少なくとも２つのプライマーのサブセットを含み、第１サブ
セットはポリＴ配列、ＲＮＡ標的特異的配列またはＲＮＡ分子にライゲートされたアダプ
ターに相補的な配列を含み、プライマーの第２サブセットはＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖のＤＮ
Ａ鎖上の配列に結合することができる配列を含む。こうした配列は、例えば、トランスポ
ゾンの転移鎖の配列と同じ配列であり得る。本明細書を通して記載されるように、転移後
、ＤＮＡ鎖の末端とトランスポゾンの非転移鎖との間にはギャップがあるだろう。ＤＮＡ
鎖を次に伸長し、ＲＮＡ鎖をコピーすることができる。コピーはトランスポゾンの転移鎖
の配列のコピーを含むだろう。ＤＮＡ鎖はトランスポゾンの転移鎖の配列に相補的な配列
および、よって支持体の表面上のプライマーまたはそのサブセットを含むだろう。換言す
ると、１つ以上のプライマーがトランスポゾンの転移鎖と同じまたは類似の配列を含む場
合、ＤＮＡ鎖はプライマーに相補的な配列を含有するので、ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖中のＤ
ＮＡ鎖はプライマーにハイブリダイズすることができるだろう。
【００３０】
ＤＮＡ鎖の３’末端を伸長し、ＲＮＡ鎖をそれらの５’末端にコピーし、トランスポゾ
ンの非転移鎖を置換することができる適切な核酸修飾酵素が知られている。簡潔に、いく
つかのＤＮＡポリメラーゼは、新しいＤＮＡ鎖がポリメラーゼにより合成される際、テン
プレート鎖に相補的な鎖を置換することができる。このプロセスは鎖置換と称され、この
活性を有するＤＮＡポリメラーゼは本明細書では鎖置換ＤＮＡポリメラーゼと称される。
一般的には、提供される方法に用いられるＤＮＡテンプレート特異的ＤＮＡポリメラーゼ
は、テンプレートから解離する（またはＤＮＡの合成を終了する）ことなく、意図する目
的に適切な長さのＤＮＡを効率的に合成し、これは酵素のプロセッシビティと称される。
ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換する能力は、その全開示が本明細書に参照により組み込まれ
る、Ｆｉｒｅ  ａｎｄ  Ｘｕ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：４
６４１−４６４５，１９９５）により記載されるローリングサークル複製アッセイにおい
てポリメラーゼを用いて容易に決定することができる。鎖置換およびＤＮＡポリメラーゼ
プロセッシビティも、その全開示が本明細書に参照により組み込まれる、Ｋｏｎｇ  ｅｔ
ａｌ．（Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５−１９７５，１９９３）に記載さ
れる方法を用いて試験することができる。本明細書では末端トランスフェラーゼもＤＮＡ
ポリメラーゼとして定義され、このＤＮＡポリメラーゼは提供される方法のいくつかの実
施形態では組成物として用いられる。ＤＮＡの３’−ヒドロキシル末端へのｄＮＴＰのテ
ンプレート依存性付加を触媒するので、末端トランスフェラーゼを用いることができる。
【００３１】
本明細書において提供される方法では、本方法は、ＤＮＡ鎖の少なくとも一部分を配列
決定するステップおよび／またはＤＮＡ鎖の少なくとも一部分を増幅するステップをさら
に含むことができる。任意で、ＲＮＡ鎖は配列決定および／または増幅前にＤＮＡ：ＲＮ
Ａ二本鎖から除去することができる。例として、本方法は、ＲＮＡ鎖をＤＮＡ：ＲＮＡ二
本鎖から除去するステップおよびＤＮＡ鎖（すなわち、第１ＤＮＡ鎖）の少なくとも一部
分を配列決定するステップをさらに含む。本方法は、ＤＮＡ鎖の少なくとも一部分をコピ
ーし、ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖のＤＮＡ鎖（すなわち、第１ＤＮＡ鎖）に相補的な第２ＤＮ
Ａ鎖を生成するステップも含むことができる。第２相補的ＤＮＡ鎖は次に所望に応じて配
列決定することができる。任意で、ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖の第１ＤＮＡ鎖は第２相補的Ｄ
ＮＡ鎖の配列決定前に除去することができる。
【００３２】
提供される方法では、任意で、ＲＮＡ鎖のＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖からの除去後、ＤＮＡ
鎖を増幅し、第１および第２増幅鎖を含む複数の二本鎖ＤＮＡ分子を生成してもよい。任
意で、増幅は、以下でより詳細に記載される、クラスターを生成する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鎖が増幅され、複数の二本鎖ＤＮＡ分子を生成した場
合、鎖の一方または両方のいずれかを配列決定することができる。例として、本方法は、
第１増幅鎖を除去するステップ、その後第２増幅鎖の少なくとも一部分を配列決定するス
テップを含むことができる。任意で、第１増幅鎖は第２増幅鎖の少なくとも一部分をコピ
ーすることにより再生することができる。第２増幅鎖はその後、第１増幅鎖の少なくとも
一部分を配列決定するため除去することができる。任意で、第１および第２増幅鎖の一方
または両方の一部または全部の配列リードは、いずれの鎖の全部または一部も除去するこ
となく行うことができる。
【００３４】
さまざまなプロトコルを用い、増幅核酸、例えば、支持体上で増幅された核酸を生成す
ることができる。例えば、核酸はエマルジョンＰＣＲ、またはブリッジＰＣＲにより増幅
することができる（それぞれ本明細書に参照により組み込まれる、Ｍｉｔｒａ  ＆  Ｃｈ
ｕｒｃｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７，ｅ３４（１９９９）；Ｄｒｅｓ
ｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００，８８
１７−８８２２（２００３）；Ａｄｅｓｓｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉ
ｄｓ  Ｒｅｓ．２８，ｅ８７（２０００）；Ｆｅｄｕｒｃｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４，ｅ２２（２００６））。
【００３５】
エマルジョンＰＣＲを用いる実施形態では、核酸は油中水型エマルジョン中でＰＣＲ増
幅することができる。１つの実施形態では、単一のプライマー対が用いられる。ＰＣＲプ
ライマーの１つは支持体（例えば、ミクロンスケールのビーズ）の表面に係留（５’付着
）され、他のプライマーは溶液中にある。任意で、支持体は２つ以上の配列のプライマー
を含み、プライマーは１つ以上の標的ＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができる標的
特異的プライマーであり、溶液中のプライマーは同じ配列（例えば、タグ付きＲＮＡ鎖を
その５’末端にコピーすることによりＤＮＡ鎖に付加された配列に相補的な配列）を有す
る。一般的には、低テンプレート濃度の場合、ほとんどのビーズ含有コンパートメントに
は０個または１個のテンプレート分子が存在する。（ビーズおよびテンプレート分子の両
方が存在する）有効なエマルジョンコンパートメントでは、ＲＮＡ分子を捕捉することが
でき、および／またはＲＮＡ分子の対応するＤＮＡ補体はビーズの表面で増幅することが
できる。エマルジョンを破壊した後、増幅産物を有するビーズは選択的に濃縮することが
できる。各クローン増幅ビーズはその表面上にテンプレートライブラリーからの単一分子
の増幅に対応するＰＣＲ産物を有するだろう。有用なエマルジョンＰＣＲ法のさまざまな
実施形態は、それぞれ本明細書に参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２００５
／００４２６４８Ａ１号；第２００５／００７９５１０Ａ１号および第２００５／０１３
０１７３Ａ１号、ならびに国際公開第ＷＯ０５／０１０１４５号に記載される。
【００３６】
クラスター形成としても知られるブリッジＰＣＲを用いる実施形態では、テンプレート
ライブラリーからの核酸は、支持体の表面上にコーティングされたプライマーを用いて増
幅することができる。プライマーは柔軟なリンカーによりそれらの５’末端に付着させる
ことができる。テンプレートライブラリーのいずれかの所定のメンバーに由来する増幅産
物は起源点の近くに局所的に係留されたままである。ＰＣＲの終了時、各クローンクラス
ターはテンプレートライブラリーの単一のメンバーのいくつかのコピーを含有する。提供
される方法では、各ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖はクローンクラスターの起源を形成する。ＲＮ
Ａ鎖の除去後、ＤＮＡ鎖は支持体に付着したプライマーを用いてコピーし、ＤＮＡ鎖の増
幅コピーを生成し、クローンクラスターを生成することができる。有用なブリッジＰＣＲ
法のさまざまな実施形態は、それぞれ本明細書に参照により組み込まれる、米国特許出願
公開第２００７／０１２８６２４Ａ１号、国際公開第ＷＯ０７／０１０２５１号、米国特
許第６，０９０，５９２号および第５，６４１，６５８号に記載される。増幅を行う方法
も、それらの全開示が本明細書に参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２００９
／０２２６９７５号、国際公開第ＷＯ９８／４４１５１号、第ＷＯ００／１８９５７号、
第ＷＯ０２／４６４５６号、第ＷＯ０６／０６４１９９号、および第ＷＯ０７／０１０２
５１号に記載される。
【００３７】
本明細書に記載される方法は、例えば、少なくとも約１０フィーチャー／ｃｍ２、約１
００／ｃｍ２、５００フィーチャー／ｃｍ２、１，０００フィーチャー／ｃｍ２、５，０
００フィーチャー／ｃｍ２、１０，０００フィーチャー／ｃｍ２、５０，０００フィーチ
ャー／ｃｍ２、１００，０００フィーチャー／ｃｍ２、１，０００，０００フィーチャー
／ｃｍ２、５，０００，０００フィーチャー／ｃｍ２以上を含む、さまざまな密度のいず
れかでフィーチャーを有するアレイを生成または使用することができる。
【００３８】
本明細書において用いられる場合、「核酸」の語は、連結した少なくとも２つのヌクレ
オチドアナログモノマーを指すのに用いることができる。核酸はホスホジエステル結合を
含有することができるが、いくつかの実施形態では、核酸は、例えば、ホスホラミド、ホ
スホロチオエート、ホスホロジチオエート、ペプチド核酸骨格および結合、陽性骨格、ま
たは非イオン性骨格を含む、他のタイプの骨格を有するアナログであり得る。核酸は、（
天然発生ＲＮＡ中に存在する）リボース、（天然発生ＤＮＡ中に存在する）デオキシ−リ
ボースまたはジデオキシリボースのような、ペントース部分を含むことができる。核酸は
、これらに限定されないが、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル
（Ｕ）、シトシン（Ｃ）、イノシン、キサンタニン、ヒポキサンタニン、イソシトシン、
イソグアニン、ニトロピロール（３−ニトロピロールを含む）および／またはニトロイン
ドール（５−ニトロインドールを含む）を含む１つ以上の異なる塩基部分を有することが
できる。本明細書において用いられる核酸は天然または非天然塩基を含むことができる。
よって、核酸は天然発生および／または非天然発生ヌクレオチドならびに天然または非天
然骨格結合を含むことができる。核酸は、指定のとおり、一本鎖もしくは二本鎖であって
もよく、または二本鎖および一本鎖配列の両方の部分を含有してもよい。核酸はＤＮＡ（
例えばゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）、ＲＮＡまたはハイブリッドであってもよい。
【００３９】
本明細書において用いられる場合、「アレイ」の語は、異なる分子をそれらの相対位置
に応じて互いに識別することができるように、１つ以上の支持体に付着した異なる分子の
集合体を意味する。アレイはそれぞれ支持体上の異なるアドレス指定可能な位置（例えば
フィーチャー）に位置する異なる分子を含むことができる。あるいは、アレイはそれぞれ
異なる分子を有する別の支持体を含むことができ、異なるプローブ分子を流体流のような
液体中の支持体の位置に応じて支持体が付着した表面上の支持体の位置に応じて同定する
ことができる。アレイの分子は、例えば、核酸プライマー、核酸プローブ、核酸テンプレ
ートまたはポリメラーゼのような核酸酵素であり得る。例えば、特定の実施形態では、標
的核酸は検出器の表面または支持体の表面に存在する層（例えばアクリルアミド層）に付
着させることができる。本明細書に参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２０１
１／００５９８６５Ａ１号に記載されるもののような、ヒドロゲルがとくに有用である。
【００４０】
本明細書において用いられる場合、「核酸のアレイ」の語は、その上またはその中に配
置された複数の空間的に識別可能な核酸を有する固体支持体を意味する。核酸はフィーチ
ャーの整列またはランダムパターンで配置することができる。個別のフィーチャーは、例
えば、空間的に分離した核酸分子、クラスターのような核酸分子の集合であり得る。アレ
イは、複数の試料の処理を可能にするように構成された複数の個別のアレイを含む、複合
アレイであり得る。個別のアレイは、本明細書において「サブアレイ」と称され、核酸フ
ィーチャーの群を含む。サブアレイはより大きなアレイ内の異なる領域に見られる。サブ
アレイそのものは整列化または非整列化することができる。こうしたサブアレイは任意で
空間的にアドレス指定可能であり得る。サブアレイは同一核酸のクラスターを含むことが
できる。個別のサブアレイで構成された複合アレイの一例は、プレートが全体として核酸
のアレイ（または複合アレイ）であり、各個別ウェルがより大きな複合アレイ内のサブア
レイである、ウェルを有するマイクロタイタープレートである。
【００４１】
本明細書において用いられる場合、「支持体」の語は、核酸のアレイを固定化するため
の基板を指す。「支持体」は、核酸アレイを付着させることができ、またはその上で核酸
を合成および／もしくは修飾することができる、剛性または半剛性表面を有する材料であ
る。支持体としては、いずれかの樹脂、マイクロビーズ、ガラス、制御孔ガラス（ＣＰＧ
）、ポリマー支持体、膜、紙、プラスチック、プラスチックチューブまたはタブレット、
プラスチックビーズ、ガラスビーズ、スライド、セラミック、シリコンチップ、マルチウ
ェルプレート、ナイロン膜、光ファイバー、およびＰＶＤＦ膜を挙げることができる。
【００４２】
支持体としては、いずれかの平坦なウェーハ状の基板、および９６ウェルプレートを含
む、マイクロタイタープレートのような、ウェルを有する平坦な基板を挙げることができ
る。平坦な基板の例としては、チップ、スライド、エッチング基板、マイクロタイタープ
レート、およびｃＢｏｔ配列決定ワークステーションにおいて用いられる８チャネルフロ
ーセルのような、複数のマイクロ流体チャネルを有するマルチレーンフローセルリアクタ
ー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州サンディエゴ）を含む、フローセル
リアクターが挙げられる。用いることができるフローセルの例は、その全開示が本明細書
に参照により組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００７／１２３７４４号にも記載される。
【００４３】
支持体としては、磁気ビーズ、中空ビーズ、および固体ビーズを含む、ビーズを挙げる
こともできる。ビーズは平坦な支持体と併せて用いることができ、こうした平坦な支持体
は任意でウェルも含有する。ビーズ、またはあるいはマイクロスフェアとは、一般的には
剛性または半剛性材料からなる小体を指す。小体は、例えば、規則的または変則的な寸法
を有するかにかかわらず、球形、卵形、小球形、または他の認識される粒子形状として特
徴づけられる形状を有することができる。ビーズのサイズとしては、とくに、限定なく、
直径約１μｍ、約２μｍ、約３μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約２０μｍ、約３０μｍ、
約４０μｍ、約６０μｍ、約１００μｍ、約１５０μｍまたは約２００μｍが挙げられる
。他の粒子は本明細書においてビーズおよびマイクロスフェアについて記載されたものと
同様の方法で用いることができる。
【００４４】
支持体の組成は、例えば、型、化学性質、付着方法および／または核酸合成方法に応じ
て変わり得る。本開示に従って用いることができる支持体材料としては、これらに限定さ
れないが、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ナイロン、金
属、および他の適切な材料が挙げられる。例となる組成物は、支持体、ならびにこれに与
えられた、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／または有機部分合成に用いられる、
化学官能基を含む。こうした組成物は、例えば、プラスチック、セラミック、ガラス、ポ
リスチレン、メラミン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性材料、トリアゾル、
カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックスまたはＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）の
ような架橋デキストラン、セルロース、ナイロン、架橋ミセルおよびＴｅｆｌｏｎ（商標
）、ならびに、例えば、本明細書に参照により組み込まれる、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ、インディアナ州フィッシャーズからの「マイクロスフェア検出ガイド」に
記載されるいずれかの他の材料を含む。支持体粒子は、架橋デンプン、デキストラン、セ
ルロース、タンパク質、ポリスチレンおよびメチルスチレンを含むスチレンポリマーを含
む有機ポリマー、ならびに他のスチレンコポリマー、プラスチック、ガラス、セラミック
、アクリルポリマー、磁気応答性材料、コロイド、トリアゾル、カーボングラファイト、
二酸化チタン、ナイロン、ラテックスまたはＴＥＦＬＯＮ（登録商標）から製造すること
ができる。その全開示が本明細書に参照により組み込まれる、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、インディアナ州フィッシャーズからの「マイクロスフェア検出
ガイド」は有用なガイドである。本開示の範囲内の支持体のさらなる例としては、例えば
、それらの全開示が本明細書に参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２００２／
０１０２５７８号および米国特許第６，４２９，０２７号に記載されるものが挙げられる
。
【００４５】
核酸の支持体への付着は、剛性または非剛性にかかわらず、共有または非共有結合によ
って起こり得る。例となる結合は、それぞれ本明細書に参照により組み込まれる、米国特
許第６，７３７，２３６号、第７，２５９，２５８号、第７，３７５，２３４号および第
７，４２７，６７８号、ならびに米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５Ａ１号に
記載される。いくつかの実施形態では、核酸または他の反応成分は、その後固相支持体に
付着または接着させるゲルまたは他の半固体支持体に付着させることができる。こうした
実施形態では、核酸または他の反応成分は固相であると理解されるだろう。
【００４６】
任意で、支持体はビーズまたは複数のビーズである。任意で、支持体は平坦な支持体で
ある。任意で、複数のビーズが提供され、各ビーズは１つ以上のＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を
含む。ビーズが２つ以上のＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を含む場合、二本鎖は同じ配列または異
なる配列を有することができる。任意で、複数のビーズが提供され、各ビーズはＤＮＡ：
ＲＮＡ二本鎖を含む。複数のビーズ中のビーズは同じまたは異なるＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖
を含むことができる。例えば、複数のビーズ中のビーズの第１サブセットは第１配列を有
するＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を含むことができ、複数のビーズ中のビーズの第２サブセット
は第２配列を有するＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を含むことができる。
【００４７】
さまざまな配列決定プロトコルのいずれかおよび各試薬は、本明細書に記載されるいず
れかの方法またはデバイスにおいて用いることができる。合成による配列決定（ＳＢＳ）
技術は一般的には、テンプレート鎖に対するヌクレオチドの反復付加による新生核酸鎖の
酵素伸長を含む。ＳＢＳは、ターミネーター部分を有するヌクレオチドモノマーまたはい
ずれのターミネーター部分も有さないものを用いることができる。ターミネーターを有す
るモノマーを用いる方法としては、例えば、それらの全開示が本明細書に参照により組み
込まれる、国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７，０５７，０２６号明細書、
国際公開第９１／１０６６７８号、国際公開第０７／１２３７４４号、米国特許出願公開
第２００７／０１６６７０５号明細書、米国特許出願公開第２００６／０１８８９０１号
明細書、米国特許出願公開第２００６／０２４０４３９号明細書、米国特許出願公開第２
００６／０２８１１０９号明細書、国際公開第０５／０６５８１４号、米国特許出願公開
第２００５／０１００９００号明細書、国際公開第０６／０６４１９９号または国際公開
第０７／０１０２５１号に記載されるものが挙げられる。Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、
カリフォルニア州サンディエゴから商業的に利用可能なＳＢＳ法も有用である。
【００４８】
ＳＢＳ技術は、標識部分を有するヌクレオチドモノマーまたは標識部分を有さないもの
を用いることができる。従って、組み込み事象は、標識の蛍光のような標識の特徴；分子
量または電荷のようなヌクレオチドモノマーの特徴；ピロリン酸または光子の放出のよう
なヌクレオチドの組み込みの副産物；等に基づき検出することができる。異なるヌクレオ
チドは互いに識別可能であり得、またはあるいは、２つ以上の異なる標識は用いられる検
出技術下で識別不能であり得る。例えば、配列決定試薬中に存在する異なるヌクレオチド
は異なる標識を有することができ、それらはＳｏｌｅｘａ（現Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ
.）により開発された配列決定方法により例示されるような適切な光学系を用いて識別す
ることができる。しかしながら、配列決定試薬中に存在する２つ以上の異なるヌクレオチ
ドに同じ標識を用いる、または異なる標識を必ずしも識別しない検出光学系を用いること
も可能である。
【００４９】
例えば、ピロ配列決定を含む、ターミネーターを有さないヌクレオチドモノマーを用い
る方法も有用である。ピロ配列決定は、特定のヌクレオチドが新生鎖に組み込まれる際の
無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する（それらの全開示が本明細書に参照により組
み込まれる、Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．,Ｋａｒａｍｏｈａｍｅｄ，Ｓ．，Ｐｅｔｔｅｒｓｓ
ｏｎ，Ｂ．，Ｕｈｌｅｎ，Ｍ.  ａｎｄ  Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．（１９９６）“Ｒｅａｌ−ｔ
ｉｍｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｙ
ｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｌｅａｓｅ,”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ  ２４２（１），８４−９：Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．（２００１）“Ｐｙｒｏｓｅ
ｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｈｅｄｓ  ｌｉｇｈｔ  ｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，”
Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１１（１），３−１１；Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．，Ｕｈｌｅｎ，Ｍ
．ａｎｄ  Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．（１９９８）“Ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  
ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，”Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ  ２８１（５３７５），３６３；米国特許第６，２１０，８９１号；第６，２５８，５
６８号；および第６，２７４，３２０号）。ピロ配列決定では、放出されたＰＰｉはアデ
ノシン三リン酸（ＡＴＰ）にＡＴＰスルフリラーゼによりすぐに変換されることにより検
出することができ、生成されたＡＴＰのレベルはルシフェラーゼにより生成される光子に
よって検出される。
【００５０】
いくつかの実施形態はライゲーション技術による配列決定を用いることができる。こう
した技術はＤＮＡリガーゼを用い、オリゴヌクレオチドを組み込む。本明細書に記載され
る方法およびシステムと用いることができるＳＢＳシステムおよび方法の例は、それらの
全開示が本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第６，９６９，４８８号、第６，
１７２，２１８号、および第６，３０６，５９７号に記載される。
【００５１】
いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを含む方
法を用いることができる。ヌクレオチド組み込みは、例えば、（それぞれ本明細書に参照
により組み込まれる）米国特許第７，３２９，４９２号および第７，２１１，４１４号に
記載されるフルオロフォア含有ポリメラーゼとｙ−リン酸標識ヌクレオチドとの間の蛍光
共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）相互作用によって検出することができ、またはヌクレオ
チド組み込みは、例えば、（本明細書に参照により組み込まれる）米国特許第７，３１５
，０１９号に記載されるゼロモード導波管で、ならびに例えば、（それぞれ本明細書に参
照により組み込まれる）米国特許第７，４０５，２８１号および米国特許出願公開第２０
０８／０１０８０８２号に記載される蛍光ヌクレオチドアナログおよび遺伝子操作ポリメ
ラーゼを用いて検出することができる。照射は、蛍光標識ヌクレオチドを低バックグラウ
ンドで観察することができるように、表面係留ポリメラーゼの周りのゼプトリットルスケ
ールの体積に制限することができる（それらの全開示が本明細書に参照により組み込まれ
る、Ｌｅｖｅｎｅ，Ｍ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．“Ｚｅｒｏ−ｍｏｄｅ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅｓ
ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｃｏ
ｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９，６８２−６８６（２００３）；
Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．“Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｒｅａｌ  ｔｉｍ
ｅ．”Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３３，１０２６−１０２８（２００８）；Ｋｏｒｌａｃｈ，Ｊ
ｅｔ  ａｌ．“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｐａｓｓｉｖａｔｉｏｎ  ｆ
ｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｚｅｒｏ−ｍｏｄｅ  ｗａｖｅｇ
ｕｉｄｅ  ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ  １０５，１１７６−１１８１（２００８））。
【００５２】
開示される方法および組成物に用いることができ、これらと併せて用いることができ、
これらの調製に用いることができ、またはこれらの産物である材料、組成物、および成分
が開示される。これらおよび他の材料が本明細書に開示され、これらの材料の組み合わせ
、サブセット、相互作用、群、等が開示される場合、それぞれのさまざまな個別および集
合的な組み合わせおよび順列の特定の参照は明示的に開示されない場合があり得るが、そ
れぞれは本明細書において具体的に考慮および説明されていると理解される。例えば、あ
る方法が開示および議論され、方法ステップに行うことができる多数の変更が議論される
場合、方法ステップのそれぞれすべての組み合わせおよび順列、ならびに可能な変更は、
とくに逆の指定のない限り、具体的に考慮されている。同様に、これらのいずれかのサブ
セットまたは組み合わせも具体的に考慮および開示される。この概念は本開示のすべての
態様に適用される。よって、行うことができるさまざまな追加ステップがある場合、これ
らの追加ステップのそれぞれは開示される方法のいずれかの特定の方法ステップまたは方
法ステップの組み合わせで行うことができ、こうした組み合わせまたは組み合わせのサブ
セットのそれぞれは具体的に考慮され、開示されているとみなされるべきであると理解さ
れる。
【００５３】
本出願を通して、さまざまな刊行物が参照される。これらの刊行物の全開示は本出願に
参照により組み込まれる。
【００５４】
多数の実施形態が記載された。それにもかかわらす、さまざまな変更を行ってもよいこ
とが理解されるだろう。従って、他の実施形態は下記の特許請求の範囲内である。
【実施例】
【００５５】
（実施例１．ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖のタグメンテーション反応を用いるＲＮＡ配列決定）
Ｐ７’適合ＲＮＡ転写物での例となる実験を行い、その概略を図４に示す。ＲＮＡ転写
物を、Ｐｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソン）からのＲｉｂｏｐｒｏｂｅ（登録
商標）インビトロ転写システムキットを製造業者のプロトコルに従って用い、グリーン蛍
光タンパク質（ＧＦＰ）を含有するプラスミドから生成した。
【００５６】
ＧＦＰ発現カセットの配列を以下に示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）。
0006341984.tif 000002
【００５７】
ｐＭＡ−Ｔ系プラスミドはＰ５（下線）、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター（太字）、開
始コドン（太字および斜体）、Ｈｉｓタグ（斜体および下線）、ＦＬＡＧタグ（大文字）
、ＧＦＰ配列、ＴＡＡ終止コドン（下線および太字）、Ｔ７ターミネーター（太字、斜体
および下線）およびＰ７’（大文字および太字）を含有する。
【００５８】
ＲＮＡ転写物はプロモーター配列からＴ７終了配列まで伸長するはずである。しかしな
がら、Ｔ７ターミネーターは転写を完全には停止せず、よって得られるＲＮＡ転写物のい
くつかはＨｉｓ＿ＦＬＡＧ＿ＧＦＰ＿Ｐ７’である。ＲＮＡ転写物はＤＮアーゼで処理し
、そうしなければクラスターを形成するだろうＤＮＡを除去した。ＤＮアーゼ処理が効果
的だったことを確認するため、反応を行い、ゲル上で分析し、ＤＮアーゼ処理がＤＮＡの
除去に効果的だったことを示した。ＲＮＡ転写物のＤＮアーゼ処理後、残留ＤＮＡ（すな
わち、プラスミド）は見られなかった（図５）。
【００５９】
ＰｈｉＸ  ＤＮＡライブラリーおよびＤＮアーゼ処理ＧＦＰ−Ｐ７’ＲＮＡ転写物を、
テンプレートハイブリダイゼーションの標準的なクラスタープロトコルに従って、フロー
セルの異なるレーンにハイブリダイズした。レーン１〜４はＰｈｉＸ  ＤＮＡを含有し、
レーン５〜８はＧＦＰ  ＲＮＡを含有した。レーン５および６は、ＤＮアーゼで予め処理
され、ＤＮＡを除去したＲＮＡを含有した。レーン７および８は、ＤＮアーゼで予め処理
され、追加の対照としてフローセル上でＲＮアーゼで処理されたＲＮＡを含有した。両方
の配列およびそれらの補体がテンプレート中に存在するので、ＰｈｉＸ  ＤＮＡライブラ
リーはＰ５またはＰ７によってハイブリダイズすることができる。対照的に、ＧＦＰ−Ｐ
７’ＲＮＡテンプレートは、それらの「鎖性」およびＰ５配列の欠如のため、Ｐ７表面プ
ライマーのみにハイブリダイズする。
【００６０】
第１伸長を、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）（レーン２、４、６
および８）またはＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ（レーン１、３、５および７）のい
ずれかを用いて行った。ＡＭＶ−ＲＴはＲＮＡまたはＤＮＡテンプレートのいずれかから
ｃＤＮＡ鎖を生成することができ、ＰｈｕｓｉｏｎはＤＮＡテンプレートからのみＤＮＡ
鎖を生成することができる。
【００６１】
いくつかのレーンを、トランスポゾン配列Ｐ５アダプター配列を含有するトランスポソ
ーム複合体を用いて転移した（レーン３〜８）。転移事象後に残ったＤＮＡ配列中のギャ
ップを、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを含有する鎖置換伸長反応を用いて埋めた。ＧＦＰ＿
Ｐ７’ＲＮＡを含有するレーンにおいて、Ｐ５アダプターを付加し、クラスターを生成す
ることができるテンプレートを生成するには、転移事象が必要である。等温クラスター増
幅を標準として行い、クラスターをＳＹＢＲグリーンで染色した。クラスターの画像は図
６に示す。
【００６２】
レーン１は、ＰＨＵＳＩＯＮ  ＤＮＡポリメラーゼで伸長された標準型ＤＮＡ試料を含
有するので、クラスター生成の対照だった。図６に示されるように、クラスター生成は成
功した。
【００６３】
レーン２は、ＤＮＡテンプレートを逆転写酵素によりうまく伸長し（ＤＮＡ：ＤＮＡ二
本鎖を生成し）、標準的な条件下でクラスターを生成することができることを示した（図
６）。
【００６４】
レーン３および４は、（ＰＨＵＳＩＯＮ  ＤＮＡポリメラーゼまたはＡＭＶ−ＲＴのい
ずれかで伸長された）ＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖をＴｎ５アダプターでタグメントし、クラス
ターを生成することができることを示した（図６）。
【００６５】
レーン５は、ＰＨＵＳＩＯＮ  ＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡ鎖に対向して伸長しないこ
とが以前報告されているため、クラスターを生成するとは予想されないだろう。観察され
た少数のクラスターは、ＤＮアーゼ処理にもかかわらず残留したＤＮＡテンプレートが用
いられてＲＮＡを生成したため、またはＰＨＵＳＩＯＮ  ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮ
ＡのＲＮＡに対向するある程度の伸長のためであり得る（図６）。
【００６６】
レーン７および８は、テンプレートがＲＮアーゼおよびＤＮアーゼ処理されたため、い
ずれのクラスター形成を示すことも予想されないだろう。レーン５において見られたよう
に、観察された少数のクラスターは、ＤＮアーゼ処理にもかかわらず残留したＤＮＡテン
プレートが用いられてＲＮＡを生成したためであり得る（図６）。
【００６７】
図６のレーン６は、予想どおりＲＮＡテンプレートに対するＤＮＡ鎖の伸長を示す。こ
れらの伸長テンプレートは、Ｐ５配列を有さないので、クラスターを形成するとは予想さ
れなかった。しかしながら、（レーン６に示される）Ｐ５アダプターでのタグメンテーシ
ョン後、それらはクラスターを形成する。レーン５、７および８における少数のクラスタ
ーはＲＮＡ試料中に低レベルのＤＮＡ汚染があることを示すが、レーン６におけるクラス
ターのほとんどはＲＮＡから生成されることを示す。
【００６８】
フローセル上のクラスターを次に配列決定した。表１は配列決定の結果を示す。
【００６９】
配列決定概要
【表１】
0006341984.tif 000003
【００７０】
レーン１、３、５および７はＲＮＡを増幅するとは考えられないＰｈｕｓｉｏｎで増幅
した。
レーン２、４、６および８はＤＮＡおよびＲＮＡを増幅するＡＭＶ−ＲＴで増幅した。
非転移レーン１および２はＳＢＳ３＋Ｔで、転移レーン３〜８はＮｘＲ１プライマーで
配列決定した。
マトリックスおよび移相を調節し、レーン５〜８をＧＦＰにアラインした。
【００７１】
予想どおり、レーン１および２について９０％超のクラスターが純度フィルターを通り
、これらの９８％超が予想どおりＰｈｉＸにアラインした（表１）。タグメントＤＮＡ：
ＤＮＡ二本鎖を含有したレーン３および４は、フィルターを通るクラスターの１０〜２０
％の低減を示し、そのうち７５〜８７％のクラスターがＰｈｉＸにアラインした。タグメ
ンテーションはテンプレートの長さを、いくつかの例では効果的にアラインするには短す
ぎる長さまで低減し得るため、フィルターを通り、アラインするクラスターの低減は予想
外ではない。レーン７および８におけるクラスターは、（汚染ＤＮＡテンプレートまたは
未消化ＲＮＡ断片は例外として）いずれのテンプレートも存在するはずがないため、十分
に配列決定するはずがない。予想どおりフィルターを通るクラスターは非常に少なかった
：７％未満のクラスターがフィルターを通り、そのうちＰＨＵＳＩＯＮ  ＤＮＡポリメラ
ーゼ伸長テンプレートについて１２％のみがアラインし、ＡＭＶ−ＲＴ伸長テンプレート
について４１％がアラインした。ＤＮアーゼのみで、ＲＮアーゼ処理が行われず、ＲＮＡ
がＰｈｕｓｉｏｎで伸長された場合、クラスターの３２％がフィルターを通り、そのうち
５６±１６％がアラインした（レーン５、表１）。これは、残留ＤＮＡテンプレートおよ
びＰＨＵＳＩＯＮ  ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡのＲＮＡに対向するいくらかの伸長
の組み合わせのためであり得る。対照的に、ＤＮアーゼ処理ＲＮＡテンプレートがＡＭＶ
−ＲＴで伸長されたレーン６では約５０％多いクラスターが観察され、そのうちレーン６
と同様の％（〜２７％）がフィルターを通り、２５％がアラインした。
【００７２】
アラインデータを用い、カバレッジプロットを作成した（図７）。レーン１〜４は、予
想どおりＰｈｉＸの完全なゲノムカバレッジをもたらした。タグメントＤＮＡを含有する
レーン（レーン３および４）はより不均一なカバレッジをもたらした。タグメントＲＮＡ
試料を含有するレーン５〜８はすべてＧＦＰの部分カバレッジを示し、テンプレートのタ
グメンテーションがクラスターを生成したことを示した。このいくつかは残留ＤＮＡテン
プレートに由来し得るので、レーン６はＧＦＰテンプレートのもっとも広範なカバレッジ
を示し、ＡＭＶ−ＲＴ伸長ＲＮＡ分子がうまくタグメントされたことを示す。
【００７３】
（実施例２．ヒト試料のタグメンテーション反応を用いるＲＮＡ配列決定）
下記のように、ポリＡテールを含むＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができるプラ
イマーを含む、８つのレーンを有するフローセルを調製した。レーン１はＰ５およびＰ７
オリゴのみを含む標準的なオリゴ混合物でグラフトし、レーン２〜８は標準混合物（Ｐ５
およびＰ７オリゴ）および捕捉オリゴ（すなわち、ポリＡテールを含むＲＮＡ分子に結合
するためのポリＴ配列を含むプライマー）でグラフトした。プライマーグラフト化後、フ
ローセルは使用されるまで４℃で保存した。
【００７４】
レーン１および２について、５ｐＭのＰｈｉＸ対照ライブラリー試料を調製し、ハイブ
リダイゼーションのためフローセルに添加した。各レーン３〜８について、４００ｎｇの
ＲＮＡ試料を調製し、ハイブリダイゼーションのためフローセルに添加した。レーン３お
よび４はＣｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州マウンテンビュー）からのヒトＲＮＡを含
有した。レーン５および６は脳からのヒトＲＮＡを含有した。レーン７および８はユニバ
ーサルヒト参照（ＵＨＲ）ＲＮＡを含有した。テンプレートハイブリダイゼーション後、
ハイブリダイズされていないテンプレートの除去のため洗浄バッファーをフローセルに通
した。すべてのレーンにおいて、ハイブリダイズされたテンプレートをＡＭＶ−ＲＴ（Ｎ
ＥＢ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）を用いて伸長し、これはレーン３〜８におい
てＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を生成した。
【００７５】
レーン３〜８をトランスポソーム複合体と接触させ、レーン１および２を当量の洗浄バ
ッファーと接触させた。２つの異なる濃度のトランスポソーム複合体混合物を調製した。
レーン３、５および７の混合物を、１．２５μｌのトランスポソーム複合体、１００μｌ
のバッファーおよび４００μｌの水で調製した。レーン４、６および８の混合物を、０．
６２５μｌのトランスポソーム複合体、１００μｌのバッファーおよび４００μｌの水で
調製した。９５μｌのトランスポソーム複合体混合物をタグメンテーションのためフロー
セルのレーン３〜８に添加した。タグメンテーション後トランスポサーゼを除去するため
、カオトロピックバッファーをフローセルのレーン３〜８に添加し、２分間インキュベー
トした。フローセルのレーンを次に２回洗浄した。洗浄後、Ｂｓｔ酵素をタグメントＤＮ
Ａ：ＲＮＡ二本鎖の鎖置換伸長に用い、トランスポゾンの非転移鎖を除去し、クラスター
化のためＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖のＤＮＡ鎖を全長にした。ＲＮＡ鎖を除去し、クラスター
を次に等温増幅を用いて生成した。クラスターを次に配列決定した。表２は配列決定の結
果を示す。
【００７６】
配列決定概要
【表２】
0006341984.tif 000004
【００７７】
配列決定結果を、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定方法に従い、標準的なＩｌｌｕｍ
ｉｎａ配列決定試薬を用いて行われたヒト脳ＲＮＡおよびユニバーサルヒト参照ＲＮＡの
標準的なＲＮＡ配列決定について得られた結果と比較した。こうした方法はＴｒｕＳｅｑ
ＲＮＡ試料調製ガイドおよびＨｉＳｅｑ２０００ユーザーガイドに記載される。ガイドお
よび試薬はＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手可能
である。結果は表３に示す。
【００７８】
タグメンテーション方法と標準的なＲＮＡ配列決定方法の比較
【表３】
0006341984.tif 000005
【００７９】
結果は、本明細書において提供されるタグメンテーション方法を用いて配列決定された
ＲＮＡ試料の正常なアラインメント分布を示す。結果は、タグメンテーション方法により
分析されたＲＮＡ試料の３’ＵＴＲ領域において、おそらくより多数のポリＡ配列および
反復のため、より多数の反復マスククラスターを示す。使用可能なリードは、同様におそ
らくの分析されたＲＮＡにおけるより多数の反復のため、標準的なＲＮＡ配列決定プロト
コルより約１０％低かった。リボソームＲＮＡの量は、ｍＲＮＡが本明細書において提供
されるタグメンテーション方法で単離および配列決定されたので、予想どおり低い。ミト
コンドリアＲＮＡは正常の範囲内である。
【００８０】
（実施例３．タグメンテーション反応および細胞ライセートを用いるＲＮＡ配列決定）
この実施例は、核酸テンプレートは粗細胞ライセートを用いて固体支持体上で捕捉、タ
グメントおよび配列決定することができることを示す。簡潔に、マウス細胞をＴｒｉｔｏ
ｎ−ＸおよびプロテイナーゼＫ溶液を用いて溶解した。ライセートをフローセルに塗布し
、ｍＲＮＡを捕捉およびタグメントし、クラスターを形成および配列決定した。対照とし
ておよび比較のため、ユニバーサルヒト参照総ＲＮＡ（ＵＨＲ）も捕捉、タグメント、ク
ラスター化および配列決定した。表４は各試料タイプの二本鎖リードの結果をまとめる。
【００８１】
ＵＨＲ及びライセットｍＲＮＡ間の配列比較
【表４】
0006341984.tif 000006
【００８２】
表４は配列が粗マウス細胞ライセートから捕捉されたｍＲＮＡから直接得られたことを
示す。ｍＲＮＡが粗細胞ライセートから直接捕捉された場合、アラインリードのパーセン
トはＵＨＲ  ＲＮＡ試料（ＰＦリード中のアライン％）と比較して約１０％のみ低下した
。ＵＨＲ対照をマウスライセート由来のｍＲＮＡと比較するさらなる配列決定データは、
正しい鎖が捕捉され、ＵＨＲおよびマウスライセートからのｍＲＮＡの両方について＞９
７％でアラインしたことを報告した。さらに、カバレッジはＵＨＲ対照とライセートから
のｍＲＮＡとの間で同程度であり；約６５％は非翻訳領域（ＵＴＲ）、約１６％はコード
領域、約１３％は遺伝子間領域、わずか数パーセントはイントロンリードだった。よって
、粗ライセートからのｍＲＮＡを捕捉、タグメント、クラスター化および配列決定するの
に本方法を用いることができる。
【００８３】
（実施例４．全ｍＲＮＡ転写物からのタグメンテーション反応を用いるＲＮＡ配列決定）
この実験を行い、本明細書に開示される方法に従って全転写物からのｍＲＮＡ試料を固
体支持体上で捕捉およびタグメントし、配列情報を提供することができたことを示した。
簡潔に、ポリＡ  ＲＮＡ濃縮を５０μｇのＵＨＲ総ＲＮＡ（Ａｇｉｌｅｎｔ）からＰｏｌ
ｙＡ  Ｐｕｒｉｓｔ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。濃縮ポリＡｍＲＮＡのＲ
ＮＡフラグメンテーションを、１００ｎｇのポリＡ  ＲＮＡを有する２５μｌの１倍Ｔ４
ＰＮＫバッファー（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）中で行い、試料を９５℃まで５分間加熱し、氷
上で冷却した。フラグメント化ＲＮＡをＴ４ＰＮＫでリン酸化し、フラグメントを２ｍＭ
のＡＴＰを含有する５０μｌの２倍ポリＡポリメラーゼバッファー（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ
）中の４ユニットの大腸菌ポリＡポリメラーゼを用いてポリＡテール化した。ポリアデニ
ル化したフラグメント化ｍＲＮＡを、ＲＮＡ精製・濃縮キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ）を用いて精製した。対照は、配列決定化学性能を確認するＰｈｉＸ対照、ならびに
複合総ＲＮＡ  ＵＨＲプールから捕捉されたｍＲＮＡ全転写物と比較するため捕捉および
タグメントされた非総ｍＲＮＡ由来のポリアデニル化試料を含む。
【００８４】
２つのうちの複製物１（Ｒ１）からの配列決定データを、ＰｈｉＸ対照（ｃｔｒｌ）、
対照ｍＲＮＡ試料（３’捕捉）および総ＲＮＡ試料に由来するｍＲＮＡ（全転写物）につ
いて表５に報告する。
【００８５】
全ｍＲＮＡ転写物の複製物配列概要
【表５】
0006341984.tif 000007
【００８６】
表５は、アラインリードのパーセント（％アライン（ＰＦ））は、高いクラスター生成
を有するｍＲＮＡ供給源にかかわらず同程度だったと報告する。また、配列データは、対
照ｍＲＮＡ（３’捕捉）の転写物カバレッジが、約７０％はＵＴＲ、１９％はコード領域
、次に遺伝子間およびイントロン領域カバレッジだったことを示した。複合総ＲＮＡに由
来するｍＲＮＡの転写物カバレッジは、約４３％はＵＴＲ、３７％はコードならびに遺伝
子間およびイントロン領域については比較的同様だった。図１０は、代表的な遺伝子、Ｇ
ＡＰＤＨのアライン転写物カバレッジを示し；対照ｍＲＮＡ（３’捕捉）は予想どおり主
に遺伝子の３’領域におけるカバレッジを示すが、総ＲＮＡに由来するｍＲＮＡ（全転写
物）からのカバレッジは、エクソンおよびＵＴＲ領域の両方のより完全なカバレッジを示
す。従って、対照ｍＲＮＡ配列は転写物の３’末端に関連する領域（ポリＡテール領域）
にアラインしたが、総ＲＮＡ由来のｍＲＮＡからのカバレッジはより完全な全転写物リー
ドを示し、これにより試料から全転写物情報を得る方法の有用性を示した。
【００８７】
全転写物配列決定のためＵＨＲ総ＲＮＡ試料からｍＲＮＡを濃縮する代替ワークフロー
も行った。二本鎖ｃＤＮＡを５００ｎｇのＵＨＲ総ＲＮＡおよび５０ｎｇのランダムＤＮ
Ａヘキサマーから調製した。過剰なプライマーを、２０ユニットのエキソヌクレアーゼＩ
（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後、酵素熱不活
性化を行うことにより分解した。ＲＮＡを１ＵのＲＮアーゼおよび１／１０Ｕのハイブリ
ダーゼ（ＲＮアーゼＨ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）の酵素混合物により５５℃で１０分間除去
した。反応物を当量のＡＭＰｕｒｅビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を用いて精製し、ＤＮ
Ａを１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）バッファー中に溶離した。ｃＤＮＡを、２０
Ｕの末端トランスフェラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、１ｍＭのＡ
ＴＰおよび１倍トランスフェラーゼバッファーを用い、３７℃で１０分間インキュベート
した後、熱不活性化を行ってポリＡテール化した。試料のいくつかについて、ランダムＤ
ＮＡヘキサマーの１：１０希釈物を用いた。さらに、試料のいくつかについて、エキソヌ
クレアーゼＩステップを省略した。試料を次にフローセルに塗布し、捕捉、タグメント、
クラスター化および配列決定した。対照は、ＰｈｉＸ対照（ｃｔｒｌ）、非テール化ｃＤ
ＮＡ（非テール化ｃｔｒｌ）、ｄｓＤＮＡ陰性対照、およびランダムＲＮＡヘキサマーを
用い、エキソヌクレアーゼＩステップを省略した以外、上述した同じ方法に従った精製ｍ
ＲＮＡ試料を含んだ。
【００８８】
表６は２つの複製物のうち第１の配列決定ランをまとめる。
【００８９】
代替全ｍＲＮＡ転写物の複製物配列決定概要
【表６】
0006341984.tif 000008
【００９０】
表６は、試料をヌクレアーゼ、ＥｘｏＩならびにＲＮアーゼＨおよびＩで処理した後、
ビーズ精製およびポリＡテーリングを行う調製方法を用い、配列決定のため全ｍＲＮＡ転
写物試料を提供することができることを示す。図９は、表６において同定される異なる条
件についてのフローセル上でのクラスター化の画像を示す。表１におけるレーン１〜８は
図９におけるレーン１〜８に対応する。ＰｈｉＸ陽性対照は、配列決定データ中のもっと
も高い収率およびクラスター数に対応する多数のクラスターを示す。少数のクラスターを
示す陰性対照レーン２および８も、配列決定データ中のもっとも低い収率およびクラスタ
ー数の３つのうちの２つに対応する。ランダムＤＮＡヘキサマープライマーを１：１０に
希釈することは、調製方法におけるエキソヌクレアーゼ消化にかかわらず、配列決定には
最適ではなく、表６において低いクラスター数を示し、これは表９で見られるより少ない
クラスターによって裏付けられた。全ｍＲＮＡ転写物の試料調製中にＲＮアーゼＨおよび
ＩをエキソヌクレアーゼＩと用いる方法は、エキソヌクレアーゼＩ消化を行わない調製方
法に従ったＰｈｉＸ陽性対照の次に、もっとも大きな数のクラスター生成およびアライン
メント％をもたらした。さらに、アラインリードのパーセント（アライン％（ＰＦ））は
、試験レーンのなかでもそれぞれレーン５およびレーン３についてもっとも高い。結果は
、本出願に記載される捕捉およびタグメンテーション方法を用いて配列決定することによ
り、この実施例に記載されるｃＤＮＡを生成するための代替方法を用いて全ｍＲＮＡ転写
物情報を提供することができることを示す。
【００９１】
試料調製の追加の選択肢としては、これに限定されないが、開示される方法の細菌ｍＲ
ＮＡのようなポリアデニル化ＲＮＡを有さない種からのＲＮＡの配列決定のための使用が
挙げられる。この場合、リボソームＲＮＡがまず除去され得、残ったｍＲＮＡが前述した
ようにフラグメント化およびポリＡテール化され得る。ｍＲＮＡは次に上述したように捕
捉、タグメント、クラスター増幅および配列決定され得る。
【００９２】
これらの結果は、さまざまな異なるタイプのＲＮＡ試料およびＲＮＡ試料に由来するＤ
ＮＡ試料を本明細書において提供される方法を用いて配列決定することができ、本明細書
において提供される方法が現在の標準的なＲＮＡ配列決定プロトコルとほぼ同等の配列決
定結果を提供することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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