(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなるエンドグルカナーゼ触媒領域を有することを特徴とする、超耐熱性エンドグルカナーゼ。
【請求項２】
前記エンドグルカナーゼ触媒領域が、さらに、１１０℃、ｐＨ７．０の条件下でキシラナーゼ活性を有する、請求項１に記載の超耐熱性エンドグルカナーゼ。
【請求項３】
（ａ）配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｄ）配列番号４又は配列番号１２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるエンドグルカナーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、さらに、１１０℃、ｐＨ７．０の条件下でキシラナーゼ活性を有する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
【請求項７】
真核微生物である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の形質転換体内で、超耐熱性エンドグルカナーゼを生産することを含む、超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法。
【請求項９】
請求項１若しくは２に記載の超耐熱性エンドグルカナーゼ、請求項３若しくは４に記載のポリヌクレオチドがコードする超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は請求項８に記載の超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
【請求項１０】
セルロースを含む材料を、請求項１若しくは２に記載の超耐熱性エンドグルカナーゼ、請求項３若しくは４に記載のポリヌクレオチドがコードする超耐熱性エンドグルカナーゼ、請求項６若しくは７に記載の形質転換体、請求項８に記載の超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は請求項９に記載のグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、リグノセルロース分解物を生産することを含む、リグノセルロース分解物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超耐熱性エンドグルカナーゼ、当該超耐熱性エンドグルカナーゼをコードするポリヌクレオチド、当該超耐熱性エンドグルカナーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体及び当該超耐熱性エンドグルカナーゼを用いたリグノセルロース分解物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
輸送用エネルギー供給に関わる懸念に加え、地球温暖化や大気汚染などの環境上の問題から、近年、石油代替エネルギー開発は非常に重要な課題である。植物バイオマスは、地球上に最も豊富にある再生可能エネルギー源であり、石油代替資源として期待されている。植物バイオマスの主要構成要素であるリグノセルロースは、セルロースやヘミセルロース（キシラン、アラビナン及びマンナンを含む）等の多糖類、リグニン、その他ペクチン等である。これらの多糖類は多様なグリコシド加水分解酵素によってグルコースやキシロース等の単糖に加水分解され、バイオ燃料や化成品原料として利用される。
【０００３】
複雑な構造を持つリグノセルロースは難分解性であり、単一の酵素では分解、糖化が難しい。このため、多糖類のうちセルロースの加水分解には、一般的に、グリコシド加水分解酵素のエンドグルカナーゼ（エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．４）、エキソ型のセロビオハイドロラーゼ（１，４−β−セロビオシダーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．９１）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）の３種の酵素が必要とされる。一方、ヘミセルロースはキシラン、アラビナン及びマンナン等を含み、その構成は植物の種類によって異なる。例えば、広葉樹や草本等はキシランが主要な構成成分となっている。キシランの加水分解には、キシラナーゼ（エンド−１，４−β−キシラナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．８）、β−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３７）が必要とされる。
【０００４】
従来のリグノセルロースを資源とするバイオエタノール製造では、エタノールの高エネルギー効率変換を目的として、高固体負荷（３０〜６０％  ｓｏｌｉｄ  ｌｏａｄｉｎｇ）による糖化処理が試みられている。このような高固体負荷によるリグノセルロースの酵素糖化は、バイオマス糖化液の粘性が高く、リグノセルロースの加水分解反応が進み難い。そこで、耐熱性酵素を用いて、例えば８０℃以上の高温で酵素糖化処理を行うことにより、加水分解反応速度が上昇することに加えて、バイオマス糖化液の粘性が低下することから、糖化反応時間の短縮及び酵素量の削減が達成できると期待される。このため、各種グリコシド加水分解酵素について、より耐熱性に優れた酵素の開発が望まれている。
【０００５】
多くの耐熱性グリコシド加水分解酵素は、高温環境に生息する好熱性微生物を分離、同定し、これら培養分離された微生物から遺伝子をクローニングし、ＤＮＡ配列を決定した後、大腸菌や糸状菌などにより発現させることにより得られてきた。高温でのリグノセルロース糖化処理に用いることが可能な耐熱性酵素、特にセルロースの加水分解に必要なエンドグルカナーゼについては、リグノセルロースの分解やセルロース繊維の処理剤、紙パルプの処理を目的として、これまでに好熱性細菌、糸状菌、アーキア等から多数単離されている（例えば、特許文献１〜４、非特許文献１、２参照。）。さらに、ホスト生物の突然変異体や、これら酵素のアミノ酸配列の一部を変更するなどして、比活性や耐熱性を向上させる試みもなされている（例えば、非特許文献３、４参照。）。しかしながら、これらの酵素のほとんどは至適温度が６０〜８０℃であり、さらなる高耐熱性化が望まれている。一方で、超高耐熱性エンドグルカナーゼとして、至適温度が９０℃を超えるものが報告されている（例えば、特許文献５〜７、非特許文献１、５参照。）。非特許文献５によれば、Sulfolobus  solfataricusでは至適温度９５℃のエンドグルカナーゼが報告されているが、比活性は９０℃で５．５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであり、高くはない。当該酵素はキシラナーゼ活性も有するが、キシラナーゼの比活性も９０℃で４．０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎと低い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／００５４５３９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／００７０００３号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３／０１２９７２３号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／０２１５４５０号明細書
【特許文献５】特開２００３−２１０１８２号公報
【特許文献６】特開２０１４−２７９２８号公報
【特許文献７】米国特許出願公開第２００２／０１０２６９９号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ando et al, Applied and Environmental Microbiology，2002, vol.68, p.430-433.
【非特許文献２】Shi et al, Bioresource Technology 2013, vol.142, p338-344.
【非特許文献３】Zhang et al, Journal of Biotechnology，1997, vol.57, p.101-113.
【非特許文献４】Telke et al, PLoS One，2013, vol.8, p.e65727.
【非特許文献５】Maurelli et al, Extremophiles，2008, vol.12, p.689-700.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を基質とした加水分解活性を示す新規な超耐熱性エンドグルカナーゼ、当該超耐熱性エンドグルカナーゼをコードするポリヌクレオチド、当該超耐熱性エンドグルカナーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体、及び当該超耐熱性エンドグルカナーゼを用いたリグノセルロース分解物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、温泉高温土壌から直接ＤＮＡを抽出し、難培養性微生物叢の大規模メタゲノムシーケンスを行うことにより、新規アミノ酸配列を持つ超耐熱性エンドグルカナーゼの取得に成功し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼ、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法、グリコシド加水分解酵素混合物及びリグノセルロース分解物の製造方法は、下記［１］〜［１０］である。
［１］  （Ａ）配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなるエンドグルカナーゼ触媒領域を有することを特徴とする、超耐熱性エンドグルカナーゼ。
［２］  前記エンドグルカナーゼ触媒領域が、さらに、１１０℃、ｐＨ７．０の条件下でキシラナーゼ活性を有する、前記［１］の超耐熱性エンドグルカナーゼ。
［３］  （ａ）配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｄ）配列番号４又は配列番号１２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるエンドグルカナーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
［４］  前記ポリペプチドが、さらに、１１０℃、ｐＨ７．０の条件下でキシラナーゼ活性を有する、前記［３］のポリヌクレオチド。
［５］  前記［３］又は［４］のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
［６］  前記［５］の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
［７］  真核微生物である、前記［６］の形質転換体。
［８］  前記［６］又は［７］の形質転換体内で、超耐熱性エンドグルカナーゼを生産することを含む、超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法。
［９］  前記［１］若しくは［２］の超耐熱性エンドグルカナーゼ、前記［３］若しくは［４］のポリヌクレオチドがコードする超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は前記［８］の超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
［１０］  セルロースを含む材料を、前記［１］若しくは［２］の超耐熱性エンドグルカナーゼ、前記［３］若しくは［４］のポリヌクレオチドがコードする超耐熱性エンドグルカナーゼ、前記［６］しくは前記［７］に記載の形質転換体、前記［８］の超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は前記［９］のグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、リグノセルロース分解物を生産することを含む、リグノセルロース分解物の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有する。このため、当該超耐熱性エンドグルカナーゼは、高温条件下におけるセルロースの糖化処理に好適である。
また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造に好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０がコードするポリペプチド（ＡＲ１５Ｇ−９０）のアミノ酸配列（配列番号１）と、イグニスファエラ・アグレガンス  ＤＳＭ１７２３０のグリコシドハイドロラーゼファミリー１２（配列番号８）のアミノ酸配列アライメント図である。
【図２】実施例１において、ＡＲ１５Ｇ−９０−３遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＡＲ１５Ｇ−９０−３タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。
【図３】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１５Ｇ−９０−３タンパク質の各基質に対する加水分解活性の測定結果を示した図である。
【図４】実施例１において、各温度における、大腸菌発現させたＡＲ１５Ｇ−９０−３タンパク質のカルシウムイオン非存在下（図中、「ＡＲ１５Ｇ−９０−３」）及びカルシウムイオン存在下（図中、「ＡＲ１５Ｇ−９０−３＋０．５ｍＭ  Ｃａ２＋」）におけるＣＭＣ加水分解活性（ｐＨ４．０）と、ＴｒＥＧ及びＴｍＥＧのＣＭＣ加水分解活性（ｐＨ４．０）を計測した結果を示した図である。
【図５】実施例１において、各ｐＨにおける、大腸菌発現させたＡＲ１５Ｇ−９０−３タンパク質のＣＭＣ加水分解活性（７０℃）を計測した結果を示した図である。
【図６】実施例１において、各温度における、大腸菌発現させたＡＲ１５Ｇ−９０−３タンパク質のキシラーゼ活性（ｐＨ７．０）を計測した結果を示した図である。
【図７】実施例１において、各ｐＨにおける、大腸菌発現させたＡＲ１５Ｇ−９０−３タンパク質のキシラーゼ活性（７０℃）を計測した結果を示した図である。
【図８】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１５Ｇ−９０−３タンパク質のＣＭＣ加水分解活性（無処理区（プリインキュベーション無し）の活性を１００％とした相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、％））の測定結果を示した図である。
【図９】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１５Ｇ−９０−３タンパク質のキシラーゼ活性（無処理区（プリインキュベーション無し）の活性を１００％とした相対値（％））の測定結果を示した図である。
【図１０】オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０がコードするポリペプチド（ＡＲ１５Ｇ−９０）のアミノ酸配列（配列番号１）と、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０Ｂがコードするポリペプチド（ＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ）のアミノ酸配列（配列番号９）と、イグニスファエラ・アグレガンス  ＤＳＭ１７２３０のグリコシドハイドロラーゼファミリー１２（配列番号８）のアミノ酸配列アライメント図である。
【図１１】実施例２において、各温度における、大腸菌発現させたＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ−１５タンパク質のＣＭＣ加水分解活性（９０℃の活性を１００％とした相対値（％））の測定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［超耐熱性エンドグルカナーゼ］
糸状菌、細菌、アーキアを含む多くの微生物は難培養性であり、土壌など微生物環境に生息する菌の９９％が未知の菌であるといわれている。特に、高温環境に生息する微生物の培養は極めて困難であり、現在の微生物培養技術では土壌中に生息する微生物の０．１％以下を単離及び培養しているにすぎないと考えられている。この高温土壌微生物の難培養性が、耐熱性酵素の開発が進まない一因である。
【００１４】
近年、ギガ塩基対の大量配列解読を可能にした次世代ギガシーケンサーが開発されたことにより、土壌等に含まれる微生物叢のゲノムを丸ごと解読することが可能となった。この解析技術を利用して、土壌などの環境サンプルから微生物集団のゲノムＤＮＡを調製し、ゲノム構成が不均一、雑多な集団について直接ゲノムを網羅的に解読し、並列コンピュータにより解読データをアセンブルすることで微生物叢ゲノム配列を再構成するメタゲノム解析法が提案され、難培養性微生物のゲノム解読が急速に進展した。
【００１５】
本発明者らは、後記実施例１に示すように、採取した高温温泉土壌から微生物集団のゲノムＤＮＡ（メタゲノムＤＮＡ）を調製し、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンス及びアノテーションを行い、既知のエンドグルカナーゼ酵素と類似したアミノ酸配列を持つオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を得た。これらのＯＲＦのうち、エンドグルカナーゼ触媒領域が確認できたＯＲＦ１０６個について、ＯＲＦの塩基配列情報に基づいてプライマーを設計し、ＰＣＲ法により、高温温泉土壌メタゲノムＤＮＡから遺伝子候補をクローニングした。ＰＣＲクローニングされたＤＮＡを大腸菌に組込み、当該塩基配列がコードするタンパク質を発現させ、ＣＭＣ加水分解活性アッセイによる機能スクリーニングを行った。最終的に、これらのＯＲＦの中からエンドグルカナーゼ活性を持つ超耐熱性エンドグルカナーゼ（以下、「ＡＲ１５Ｇ−９０−３」）を得た。ＡＲ１５Ｇ−９０−３のアミノ酸配列を配列番号３に、塩基配列を配列番号４に、それぞれ表す。
【００１６】
なお、ＡＲ１５Ｇ−９０−３は、Ｎ末端が欠損した部分タンパク質であり、後記実施例２に示すように、ＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ−１５が、ＡＲ１５Ｇ−９０−３の全長タンパク質である。ＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ−１５のアミノ酸配列を配列番号１１に、塩基配列を配列番号１２に、それぞれ表す。
【００１７】
後記実施例１＜９＞に示すように、ＡＲ１５Ｇ−９０−３は、リケナン（Ｌｉｃｈｅｎａｎ）に対して特に高い加水分解活性を示し、ＣＭＣ、非結晶性セルロースのリン酸膨潤アビセル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｗｏｌｌｅｎ  Ａｖｉｃｅｌ、ＰＳＡ）、及びキシラン（ｘｙｌａｎ）に対して高い加水分解活性を示し、結晶性セルロースであるアビセル、ラミナリン（Ｌａｍｉｎａｒｉｎ）、及びＰＮＰＣ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシド）に対しても加水分解活性を示す。一方で、ＰＮＰＧ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド）及びＰＮＰＸ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド）に対しては、ほとんど分解活性を示さない。すなわち、ＡＲ１５Ｇ−９０−３は、β−１，４結合グルカンとβ−１，３結合とβ−１，４結合グルカンに対して基質特異性が高く、かつキシラナーゼ活性をも有する超耐熱性エンドグルカナーゼである。
【００１８】
ＡＲ１５Ｇ−９０−３のアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して検索したところ、最も配列同一性が高かったアミノ酸配列は、クレンアーキオータ門イグニスファエラ・アグレガンス  ＤＳＭ１７２３０（Ｉｇｎｉｓｐｈａｅｒａ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ ＤＳＭ１７２３０）のグリコシドハイドロラーゼファミリー１２（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＤＭ２７２９２．１）（配列番号８）であり、その配列同一性（相同性）は全長で５６％、ＧＨ１２触媒領域については６４％であった。基質特異性及び既知のタンパク質とのアミノ酸配列の配列同一性から、ＡＲ１５Ｇ−９０−３は、ＧＨ１２ファミリーに属する新規なエンドグルカナーゼであることが明らかとなった。
【００１９】
ＡＲ１５Ｇ−９０−３は、少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有する。実際に、後記実施例１＜１０＞、＜１１＞に示すように、ＡＲ１５Ｇ−９０−３は、６０〜１６０℃の広い温度範囲内、かつｐＨ３〜８の広いｐＨ範囲内においてエンドグルカナーゼ活性を示し、８０〜１２０℃の温度範囲内、かつｐＨ３〜８において強いエンドグルカナーゼ活性を示し、９０〜１１０℃の温度範囲内、かつｐＨ４〜６において非常に強いエンドグルカナーゼ活性を示す。より詳細には、ＡＲ１５Ｇ−９０−３のＣＭＣを基質としたｐＨ４．０におけるＣＭＣ加水分解活性は、６０〜９０℃の範囲内では温度が高くなるにつれて高くなり、９０〜１１０℃の範囲内では安定して高く、１２０℃以上では緩やかに低下する傾向にある。
【００２０】
また、ＡＲ１５Ｇ−９０−３は、エンドグルカナーゼ活性に加えて、さらに、１１０℃、ｐＨ７．０の条件下でキシラナーゼ活性を有する。実際に、後記実施例１＜１２＞、＜１３＞に示すように、ＡＲ１５Ｇ−９０−３は、４０〜１４０℃の広い温度範囲内、かつｐＨ５〜１０の広いｐＨ範囲内においてキシラナーゼ活性を示し、８０〜１２０℃の温度範囲内、かつｐＨ６〜９．５において強いキシラナーゼ活性を示し、９０〜１１５℃の温度範囲内、かつｐＨ６．５〜９において非常に強いキシラナーゼ活性を示す。より詳細には、ＡＲ１５Ｇ−９０−３のキシランを基質としたｐＨ７．０におけるキシラナーゼ活性は、４０〜１１０℃の範囲内では温度が高くなるにつれて高くなり、１１０℃超では急激に低下する傾向にある。
【００２１】
一般的に何らかの生理活性を有するタンパク質は、その生理活性を損なうことなく、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。つまり、ＡＲ１５Ｇ−９０−３に対しても、グリコシド加水分解活性を失わせることなく、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。
【００２２】
すなわち、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかからなるエンドグルカナーゼ触媒領域を有する、超耐熱性グリコシド加水分解酵素である。
（Ａ）配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（すなわち、ＡＲ１５Ｇ−９０−３）、
（Ｂ）配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド。
【００２３】
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が欠失する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸の一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が置換する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸が別のアミノ酸に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が付加される」とは、ポリペプチド中に新たなアミノ酸が挿入されることを意味する。
【００２４】
前記（Ｂ）のポリペプチドにおいて、配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
【００２５】
前記（Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、７０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、７５％以上１００％未満であることが好ましく、８０％以上１００％未満であることがより好ましく、８５％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９０％以上１００％未満であることがよりさらに好ましく、９５％以上１００％未満であることが特に好ましい。
【００２６】
なお、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００２７】
前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドとしては、人工的に設計されたものであってもよく、ＡＲ１５Ｇ−９０−３等のホモログ又はその部分タンパク質であってもよい。
【００２８】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、アミノ酸配列に基づいて化学的に合成してもよく、後記の本発明に係るポリヌクレオチドを用いて、タンパク質発現系によって生産してもよい。また、前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づいて、アミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて人工的に合成することもできる。
【００２９】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有する。このため、前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドをエンドグルカナーゼ触媒領域として有することにより超耐熱性エンドグルカナーゼが得られる。
【００３０】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、β−１，３結合とβ−１，４結合からなるグルカン、β−１，４結合からなるグルカン、及びキシランを基質とするものである。β−１，３結合とβ−１，４結合からなるグルカンとしては、リケナン、β−グルカン等が挙げられる。β−１，４結合からなるグルカンとしては、アビセル、結晶性バクテリアセルロース(Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＢＭＣＣ)、濾紙などの結晶性セルロース、ＣＭＣ、ＰＳＡ、セロビオース等が挙げられる。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼとしては、ＣＭＣとキシランに加えて、リケナン、β−グルカン、ＰＳＡ、アビセル、ＰＮＰＣ、又はキシログルカンを基質とするものが好ましく、ＣＭＣ、キシラン、リケナン、ＰＳＡ、及びキシログルカンを基質とするものがより好ましく、ＣＭＣ、キシラン、及びリケナンを基質とするものがさらに好ましい。
【００３１】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、その他のグルカン等を基質としてもよい。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼが基質とし得るものとしては、例えば、ＰＮＰＸ、ＰＮＰＧ、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｌ−アラビノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−マンノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；ラミナリン等のβ−１，３結合とβ−１，６結合からなるグルカン；β−１，３結合からなるグルカン；ゲンチオビオース等のβ−１，６結合からなるグルカン等が挙げられる。
【００３２】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、少なくともｐＨ４．０の条件下で、ＣＭＣ加水分解活性を、９０〜１１０℃の温度範囲内で示すことが好ましく、８０〜１２０℃の温度範囲内で示すことがより好ましく、６０〜１６０℃の広い温度範囲内で示すことがさらに好ましい。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼのＣＭＣ加水分解活性の至適温度は、ｐＨ４．０の条件下で、９０〜１２０℃の範囲内にあることが好ましい。
【００３３】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼが有するエンドグルカナーゼ活性の至適ｐＨは、反応温度や基質に依存して変化するものの、ｐＨ４．０〜５．０の範囲内にある。例えば、基質がＣＭＣの場合の７０℃における至適ｐＨは４．４である。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼとしては、少なくともｐＨ４〜６の範囲内においてエンドグルカナーゼ活性を示すものが好ましく、ｐＨ３〜８の範囲内においてエンドグルカナーゼ活性を示すものがより好ましい。
【００３４】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、少なくともｐＨ７．０の条件下で、キシラナーゼ活性を、９０〜１１５℃温度範囲内で示すことが好ましく、８０〜１２０℃の温度範囲内で示すことがより好ましく、４０〜１４０℃の広い温度範囲内で示すことがさらに好ましい。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼのキシラナーゼ活性の至適温度は、ｐＨ７．０の条件下で、９０〜１２０℃の範囲内にあることが好ましく、１００〜１１５℃の範囲内にあることがより好ましい。
【００３５】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼが有するキシラナーゼ活性の至適ｐＨは、反応温度等に依存して変化するものの、ｐＨ６．５〜９．０の範囲内にあり、ｐＨ７．５〜８．５の範囲内にあることが好ましい。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼとしては、少なくともｐＨ６．５〜９．０の範囲内においてキシラナーゼ活性を示すものが好ましく、ｐＨ５〜１０の範囲内においてキシラナーゼ活性を示すものがより好ましい。
【００３６】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、エンドグルカナーゼ活性及びキシラナーゼ活性以外のグリコシド加水分解活性を有していてもよい。その他のグリコシド加水分解活性としては、β−キシロシダーゼ活性、β−グルコシダーゼ活性、又はセロビオハイドロラーゼ活性等が挙げられる。
【００３７】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのいずれかからなるエンドグルカナーゼ触媒領域のみからなる酵素であってもよく、その他の領域を含んでいてもよい。その他の領域としては、公知のグリコシド加水分解酵素が有する、酵素触媒領域以外の領域が挙げられる。例えば、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼには、公知のグリコシド加水分解酵素に対し、酵素触媒領域を前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドに置換することによって得られる酵素も含まれる。
【００３８】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼがエンドグルカナーゼ触媒領域以外の領域を含む場合、セルロース結合モジュールを含むことも好ましい。セルロース結合モジュールは、エンドグルカナーゼ触媒領域の上流（Ｎ末端側）にあってもよく、下流（Ｃ末端側）にあってもよい。また、セルロース結合モジュールとエンドグルカナーゼ触媒領域は、直接結合していてもよく、適当な長さのリンカー領域を介して結合していてもよい。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼとしては、エンドグルカナーゼ触媒領域の上流又は下流に、リンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものが好ましく、エンドグルカナーゼ触媒領域の上流にリンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものがより好ましい。
【００３９】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼが含むセルロース結合モジュールは、セルロースとの結合能、例えば、ＰＳＡや結晶性アビセルとの結合能を有する領域であればよく、そのアミノ酸配列は特に限定されるものではない。当該セルロース結合モジュールとしては、例えば、既知のタンパク質が有するセルロース結合モジュール又はそれを適宜改変したものを用いてもよい。また、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼがエンドグルカナーゼ触媒領域とセルロース結合モジュールを有する場合、これらはリンカー配列を介して結合していることが好ましい。当該リンカー配列のアミノ酸配列やその長さ等は特に限定されるものではない。
【００４０】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、その他にも、そのＮ末端又はＣ末端に、細胞内の特定の領域に移行させて局在させ得るシグナルペプチドや、細胞外へ分泌するシグナルペプチドを有していてもよい。このようなシグナルペプチドとして、例えば、アポプラスト移行シグナルペプチド、小胞体保留シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、又は分泌型シグナルペプチド等がある。小胞体保留シグナルペプチドとして、例えば、ＨＤＥＬのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド等がある。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼが、そのＮ末端又はＣ末端にシグナルペプチドを有している場合には、形質転換体中で発現させた超耐熱性エンドグルカナーゼを、細胞外へ分泌させたり、細胞中の小胞体等に局在させることができる。
【００４１】
また、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、その他にも、発現系を用いて生産した場合に簡便に精製可能とするため、例えば当該超耐熱性エンドグルカナーゼのＮ末端やＣ末端に、各種タグが付加されていてもよい。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現又は精製において汎用されているタグを用いることができる。
【００４２】
［超耐熱性エンドグルカナーゼをコードするポリヌクレオチド］
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼをコードする。当該超耐熱性エンドグルカナーゼは、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、当該宿主の発現系を利用して生産することができる。
【００４３】
具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドは、下記（ａ）〜（ｅ)のいずれかの塩基配列からなるエンドグルカナーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチドである。
【００４４】
（ａ）配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号３又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号４又は配列番号１２で表される塩基配列と７０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号４又は配列番号１２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
【００４５】
なお、本願及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が欠失する」とは、ポリヌクレオチドを構成しているヌクレオチドの一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が置換する」とは、ポリヌクレオチドを構成している塩基が別の塩基に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が付加される」とは、ポリヌクレオチド中に新たな塩基が挿入されることを意味する。
【００４６】
本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００４７】
前記（ａ）〜（ｅ）の塩基配列においては、縮重コドンは、宿主のコドン使用頻度の高いものを選択することが好ましい。例えば、前記（ａ）の塩基配列としては、配列番号４又は配列番号１２で表される塩基配列であってもよく、配列番号４又は配列番号１２で表される塩基配列を、コードするアミノ酸配列は変更せずに、宿主において使用頻度の高いコドンへ改変した塩基配列であってもよい。コドンの改変は、公知の遺伝子配列変異技術又は人工遺伝子合成によって行うことができる。
【００４８】
配列番号４又は配列番号１２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、塩基配列情報に基づいて化学的に合成してもよく、ＡＲ１５Ｇ−９０−３をコードする遺伝子（「ＡＲ１５Ｇ−９０−３遺伝子」ということがある。）又はＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ−１５をコードする遺伝子（「ＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ−１５遺伝子」ということがある。）の全長若しくはエンドグルカナーゼ触媒領域を含む部分領域（ＡＲ１５Ｇ−９０−３遺伝子の場合、配列番号３中の１０１位のグリシン（Ｇ）から２７１位のロイシン（Ｌ）までの１７１アミノ酸残基からなる部分領域をコードする領域）を遺伝子組換え技術によって自然界から取得したものであってもよい。ＡＲ１５Ｇ−９０−３遺伝子又はＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ−１５遺伝子の全長又はその部分領域は、例えば、自然界から微生物を含むサンプルを取得し、当該サンプルから回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号４又は配列番号１２で表される塩基配列に基づいて常法により設計したフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。当該サンプルから回収したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型としてもよい。なお、鋳型となる核酸を回収するサンプルは、温泉土壌等の高温環境下から採取されたサンプルであることが好ましい。
【００４９】
前記（ｄ）の塩基配列において、配列番号４又は配列番号１２で表される塩基配列との配列同一性は、７０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、７５％以上１００％未満であることが好ましく、８０％以上１００％未満であることがより好ましく、８５％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９０％以上１００％未満であることがよりさらに好ましく、９５％以上１００％未満であることが特に好ましい。
【００５０】
なお、塩基配列同士の配列同一性（相同性）は、２つの塩基配列を、対応する塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く塩基配列全体に対する一致した塩基の割合として求められる。塩基配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明における塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００５１】
例えば、前記（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号４又は配列番号１２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、１又は２以上の塩基を欠失、置換若しくは付加することによって人工的に合成することができる。また、前記（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）の塩基配列としては、ＡＲ１５Ｇ−９０−３遺伝子（又は、ＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ−１５遺伝子）のホモログ遺伝子の全長配列又はその部分配列であってもよい。ＡＲ１５Ｇ−９０−３遺伝子（又は、ＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ−１５遺伝子）のホモログ遺伝子は、塩基配列が既知の遺伝子のホモログ遺伝子を取得する際に用いられる遺伝子組換え技術によって取得することができる。
【００５２】
本発明に係るポリヌクレオチドは、エンドグルカナーゼ触媒領域をコードする領域のみを有するものであってもよく、当該領域に加えて、セルロース結合モジュール、リンカー配列、各種シグナルペプチド、各種タグ等をコードする領域を有していてもよい。
【００５３】
［発現ベクター］
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドを発現し得る。すなわち、前記本発明に係るポリヌクレオチドが、前記本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを発現し得る状態で組込まれた発現ベクターである。具体的には、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、前記本発明に係るポリヌクレオチド、及びターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットが、発現ベクターに組込まれていることが必要である。なお、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより、ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことができる。ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組み込みでは、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
【００５４】
本発明及び本願明細書において、発現ベクターとは、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、外来ＤＮＡを組込むための配列を有するＤＮＡ、及びターミネーター配列を有するＤＮＡを含むベクターである。
【００５５】
当該発現ベクターとしては、大腸菌等の原核細胞へ導入されるものであってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞へ導入されるものであってもよい。これらの発現ベクターとしては、それぞれの宿主に応じて通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。
【００５６】
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された細胞と形質転換されていない細胞の選抜を容易に行うことができるためである。当該薬剤耐性遺伝子として、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びビアラホス耐性遺伝子等がある。
【００５７】
［形質転換体］
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る発現ベクターが導入されている。当該形質転換体中では、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを発現させ得る。発現ベクターを導入する宿主としては、大腸菌等の原核細胞であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞であってもよい。大腸菌の形質転換体を培養することにより、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを、より簡便かつ大量に生産することができる。一方で、真核細胞内ではタンパク質に糖鎖修飾が施されるため、真核細胞の形質転換体を用いることにより、原核細胞の形質転換体を用いた場合よりも、より耐熱性に優れた超耐熱性エンドグルカナーゼを生産し得る。
【００５８】
発現ベクターを用いて形質転換体を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換体を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。当該方法として、例えば、ヒートショック法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等がある。このうち、宿主が植物細胞である場合には、パーティクルガン法又はアグロバクテリウム法で行うことが好ましい。
【００５９】
宿主として、原核細胞、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、又は哺乳培養細胞等を用いた場合には、得られた形質転換体は、一般的には、形質転換前の宿主と同様にして、常法により培養することができる。
【００６０】
［超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法］
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、超耐熱性エンドグルカナーゼを生産する方法である。前記本発明に係るポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体内では、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼが恒常的に発現している。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体に対しては、それぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことにより、当該形質転換体内に超耐熱性エンドグルカナーゼを発現させる。
【００６１】
形質転換体によって生産された超耐熱性エンドグルカナーゼは、当該形質転換体内に留めた状態で使用してもよく、当該形質転換体から抽出・精製してもよい。
【００６２】
形質転換体から本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを抽出又は精製する方法は、当該超耐熱性エンドグルカナーゼのグリコシド加水分解活性を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織からポリペプチドを抽出する場合に通常用いられている方法によって抽出することができる。当該方法として、例えば、形質転換体を適当な抽出バッファーに浸し、超耐熱性エンドグルカナーゼを抽出した後、抽出液と固形残渣に分離する方法が挙げられる。当該抽出バッファーとしては、界面活性剤等の可溶化剤を含有するものが好ましい。形質転換体が植物である場合には、抽出バッファーに浸す前に、予め当該形質転換体を細断又は粉砕しておいてもよい。また、抽出液と固形残渣を分離する方法としては、例えば、濾過方法、圧縮濾過方法、又は遠心分離処理方法等の公知の固液分離処理を用いることができ、抽出バッファーに浸した状態の形質転換体を搾ってもよい。抽出液中の超耐熱性エンドグルカナーゼは、塩析法、限外濾過法、又はクロマトグラフィー法等の公知の精製方法を用いて精製することができる。
【００６３】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを、形質転換体内で分泌型シグナルペプチドを有する状態で発現させた場合には、当該形質転換体を培養した後、得られた培養物から形質転換体を除いた培養液上清を回収することにより、簡便に超耐熱性エンドグルカナーゼを含む溶液を得ることができる。また、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼが、Ｈｉｓタグ等のタグを有している場合、当該タグを利用したアフィニティクロマトグラフィ法により、抽出液や培養上清中の超耐熱性エンドグルカナーゼを簡便に精製することができる。
【００６４】
すなわち、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、超耐熱性エンドグルカナーゼを生産すること、及び所望により前記形質転換体から前記超耐熱性エンドグルカナーゼを抽出し精製することを含む。
【００６５】
［グリコシド加水分解酵素混合物］
前記本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は前記本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を含むグリコシド加水分解酵素混合物として使用することもできる。前記本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼは、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出又は精製されたものであってもよい。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを、その他のグリコシド加水分解酵素との混合物として多糖類の加水分解反応に用いることにより、難分解性であるリグノセルロースをより効率よく分解させることができる。
【００６６】
当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記超耐熱性エンドグルカナーゼ以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、リグノセルロースの加水分解活性を有するものであれば特に限定されるものではない。当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記超耐熱性エンドグルカナーゼ以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、例えば、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ等のヘミセルラーゼ、セロビオハイドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、又はエンドグルカナーゼ等が挙げられる。本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物としては、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼの少なくとも一方を含むものが好ましく、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼを両方含むものがより好ましい。中でも、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼからなる群より選択される１種以上のグリコシド加水分解酵素を含むものが好ましく、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼを全て含むものがより好ましい。
【００６７】
当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれるその他のグリコシド加水分解酵素は、少なくとも８５℃でグリコシド加水分解酵素活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましく、７０〜９０℃でグリコシド加水分解酵素活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることがより好ましい。当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる全ての酵素が耐熱性であることにより、当該グリコシド加水分解酵素混合物によるリグノセルロースの分解反応を高温条件下で効率よく行うことができる。すなわち、当該グリコシド加水分解酵素混合物が耐熱性グリコシド加水分解酵素のみを含む場合、当該グリコシド加水分解酵素混合物をリグノセルロース糖化処理に用いることにより、糖化温度７０〜９０℃の高温環境下でリグノセルロース加水分解反応を行うことが可能になる。この高温糖化により、酵素量と糖化時間を著しく減らすことができ、糖化コストが大幅に削減される。
【００６８】
［リグノセルロース分解物の製造方法］
本発明に係るリグノセルロース分解物の製造方法は、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼによりセルロースやへミセルロースを加水分解して、オリゴ糖を産生することによってリグノセルロース分解物を得る方法である。具体的には、ヘミセルロース若しくはセルロースを含む材料を、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼ、本発明に係る形質転換体、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、ヘミセルロース若しくはセルロース分解物を生産する。
【００６９】
ヘミセルロース、若しくはセルロースを含む材料としては、ヘミセルロース、若しくはセルロースが含まれていれば特に限定されるものではない。当該材料としては、例えば、雑草や農業系廃棄物等のセルロース系バイオマス、又は古紙等が挙げられる。当該セルロースを含む材料は、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼと接触させる前に、破砕若しくは細断等の物理的処理、酸若しくはアルカリ等による化学処理、又は適当なバッファーへの浸漬又は溶解処理等を行っておくことが好ましい。
【００７０】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼによるヘミセルロースの加水分解反応の反応条件は、当該超耐熱性エンドグルカナーゼがエンドグルカナーゼ活性を示す条件であればよく、エンドグルカナーゼ活性とキシラナーゼ活性を示す条件であることが好ましい。例えば、６０〜１６０℃、ｐＨ３〜８で反応を行うことが好ましく、８０〜１２０℃、ｐＨ５．０〜８．０で反応を行うことがより好ましく、９０〜１１０℃、ｐＨ４．０〜７．０で反応を行うことがさらに好ましい。前記加水分解反応の反応時間は、加水分解に供されるセルロースを含む材料の種類、前処理の方法、又は量等を考慮して適宜調整される。例えば、１０分間〜１００時間、セルロース系バイオマスを分解する場合には、１〜１００時間の反応時間で前記加水分解反応を行うことができる。
【００７１】
リグノセルロースの加水分解反応には、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼに加えて、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を用いることも好ましい。その他のグリコシド加水分解酵素としては、前記グリコシド加水分解酵素混合物に含められるグリコシド加水分解酵素と同様のものを用いることができ、少なくとも８５℃で、好ましくは少なくとも７０〜９０℃でグリコシド加水分解酵素活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましい。また、当該リグノセルロース分解物の製造方法には、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼ、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼに代えて、前記グリコシド加水分解酵素混合物を用いてもよい。
【実施例】
【００７２】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７３】
［実施例１］温泉土壌からの新規超耐熱性エンドグルカナーゼのクローニング
＜１＞  温泉土壌からのＤＮＡ抽出と全ゲノムシーケンス（Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＷＧＳ）
超耐熱性エンドグルカナーゼの遺伝子探索を目的として、中性〜弱アルカリ性温泉から土壌ＤＮＡを採取し、これらの土壌を構成する微生物叢メタゲノムＤＮＡの塩基配列解読を行った。
中性〜弱アルカリ性温泉土壌サンプルとして、野外にて高温の温泉が噴き出している日本国内の３ヶ所、５地点（メタゲノムＤＮＡサンプルＮ２、ＡＲ１９、ＡＲ１５、ＯＪ１、及びＨ１）から、土壌、泥、バイオマットを含む温泉水を採取した。これらの温泉土壌サンプルは、採取時の温度５８〜７８℃、ｐＨ７．２〜８のレンジにあった。
【００７４】
採取した温泉土壌サンプル各１０ｇから、ＤＮＡ抽出キット（ＩＳＯＩＬ  Ｌａｒｇｅ  ｆｏｒ  Ｂｅａｄｓ  ｖｅｒ．２、ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ社製）を使い、ＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡのうち５μｇに対して、ロシュダイアグノスティックス社製のシーケンサーＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ４５４を用いて、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンスを行った。残りのＤＮＡは、エンドグルカナーゼ遺伝子のＰＣＲクローニングに用いた。
温泉土壌サンプルＡＲ１５について、メタゲノムＤＮＡの配列解読を行い、平均リード長３７０ｂｐ、総リード数５，４１９,４０６個、総ゲノム解読量２，００７，７２５，０４０ｂｐの全ゲノムシーケンス（ＷＧＳ）データセットを得た。
【００７５】
＜２＞  温泉メタゲノムデータのアセンブルと統計量
４５４シーケンサーで読みとられた塩基配列は、Ｒｏｃｈｅ  ４５４の出力（ｓｆｆファイル）をＰｙｒｏＢａｙｅｓ（Quinlan et al., Nature Methods，2008，vol.5，p.179-81.）にて再ベースコールし、ＦＡＳＴＡ形式の配列ファイル及びＱｕａｌｉｔｙ値ファイルを取得した。得られたシーケンスリードは、端を切り落とし品質を上げ、４５４  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのアセンブルソフトウェアＮｅｗｂｌｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．３を使ってアセンブルした。アセンブルは、「ｍｉｎｉｍｕｍ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｍａｔｃｈ  （ｍｉ）＝０．９」、「ｏｐｔｉｏｎ：−ｌａｒｇｅ（ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ  ｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅｓ，ｓｐｅｅｄｓ  ｕｐ  ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｂｕｔ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ａｃｃｕｒａｃｙ．)」に設定して行った。
１００ｂｐ以上にアセンブルされた総コンティグ長は、 合計１１８，６００，８４６ｂｐであり、このデータセットをセルラーゼ酵素遺伝子解析に用いた。リード総数５，４１９，４０６リードのうち４，８０５，６４０リードが、平均で１，１４６ｂｐ以上のコンティグにアセンブルされ（計１０３，５０８コンティグ）、このうち最大コンティグ長は１５１，５８５ｂｐであった。
【００７６】
＜３＞  エンドグルカナーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測
ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（http://www.uniprot.org/）からＥＣ番号が３．２．１．４（セルラーゼ）、３．２．１．２１（β−グルコシダーゼ)、３．２．１．３７（β−キシロシダーゼ) 、３．２．１．９１（セルロース  １，４−β−セロビオシダーゼ)、３．２．１．８（エンド１，４−β−キシラナーゼ）の配列をダウンロードし（アクセス日：２０１１／１２／９）、これらグリコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースを構築した。アノテーションソフトウェアＯｒｐｈｅｌｉａ（Hoff et al.，Nucleic Acids Research，2009，37(Web Server issue：W101-W105)を使用して、前記＜２＞で得たコンティグ配列から、遺伝子領域（＝オープンリーディングフレーム）を推定した（Ｏｒｐｈｅｌｉａ  ｏｐｔｉｏｎ：ｄｅｆａｕｌｔ（ｍｏｄｅｌ＝Ｎｅｔ７００，ｍａｘｏｖｅｒｌａｐ＝６０）。推定されたＯＲＦからグリコシド加水分解酵素遺伝子を抽出するために、ＢＬＡＳＴＰ（ｂｌａｓｔａｌｌ  ｖｅｒ. ２．２．１８）を使い、前記ローカルデータベースに参照した。ＢＬＡＳＴＰのｏｐｔｉｏｎ条件は、「Ｆｉｌｔｅｒ  ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝ｆａｌｓｅ」、「Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ（Ｅ）＜１ｅ−２０」［以下、デフォルト値：Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ａ  ｇａｐ＝−１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｇａｐ＝−１、Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝０、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｆｏｒ  ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｈｉｔｓ＝０、Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ＝ｄｅｆａｕｌｔ］とし、ヒットしたＯＲＦ配列をグリコシド加水分解酵素遺伝子として収集した。収集された塩基配列は、セルラーゼ、エンドヘミセルラーゼ、脱分岐酵素等のグリコシド加水分解酵素を含んでいた。
【００７７】
＜４＞  遺伝子のグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリー分類
前記＜３＞で収集された塩基配列について、タンパク質の機能領域配列データベースｐｆａｍ  ＨＭＭｓ（Ｐｆａｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２３．０  ａｎｄ  ＨＭＭＥＲ  ｖ２．３；Finn et al.，Nucleic Acids Research Database，2010，Issue 38，p.D211-222)を基準に、機能分類を行った。具体的には、タンパク質モチーフ検索プログラムＨＭＭＥＲ（Durbin et al.，‘The theory behind profile HMMs. Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids’, 1998，Cambridge University Press.；ｈｍｍｐｆａｍ（Ｖｅｒ．２．３．２）、Ｅ−ｖａｌｕｅ  ｃｕｔｏｆｆ＜１ｅ−５; Ｄａｔａｂａｓｅ＝Ｐｆａｍ＿ｆｓ（ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｆｉｎｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．))を用いて、Ｐｆａｍ領域データベースとの相同性から、前記＜３＞で収集された各塩基配列についてグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリーを決定した。なお、ＧＨ触媒ドメインの配列を７０％以上カバーしているものを、各ファミリーに属する酵素遺伝子としてカウントした。
【００７８】
メタゲノムＡＲ１５シーケンスデータを用いたＢＬＡＳＴＰによる相同性検索から、エンドグルカナーゼ配列として１０６個のＯＲＦがエンドグルカナーゼ遺伝子と予測された。このＯＲＦ１０６個のＧＨファミリー分類を表１に示す。表１に示すように、メタゲノムＡＲ１５から、ＧＨ５ファミリーに属するエンドグルカナーゼ完全長ＯＲＦ１３個と、ＧＨ９ファミリーに属する完全長ＯＲＦ４個と、ＧＨ１２ファミリーに属する完全長ＯＲＦ４個とが得られた。エンドグルカナーゼ遺伝子と推定された全ての完全長ＯＲＦについて、プライマーを設計し、温泉土壌メタゲノムＤＮＡからＰＣＲにより遺伝子をクローニングした。この結果、ＧＨ１２ファミリーに属しエンドグルカナーゼ配列を持つＯＲＦであるＡＲ１５Ｇ−９０からエンドグルカナーゼ遺伝子が単離された。
【００７９】
【表１】
0006268486.tif 000002
【００８０】
＜５＞  オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０
オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０は、２８３アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードし、１位のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）で、３’末端が終始コドンで終わる不完全長配列（配列番号１）である。モチーフの配列相同性から、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０は、１０１位のグリシン（Ｇ）から２７１位のロイシン（Ｌ）までの１７１アミノ酸残基がＧｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  １２の触媒ドメインをコードしていると推測された。当該ＯＲＦと最も配列同一性が高かった既知アミノ酸配列は、クレンアーキオータ門イグニスファエラ・アグレガンス  ＤＳＭ１７２３０が持つグリコシドハイドロラーゼファミリー１２（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＤＭ２７２９２．１）であった。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムにより算出した両者のアミノ酸配列の相同性は、全長で５６％、ＧＨ１２触媒領域については６４％であったため、当該ＯＲＦは新規な配列であると確認された。
【００８１】
図１に、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０がコードするポリペプチドのアミノ酸配列と、イグニスファエラ・アグレガンス  ＤＳＭ１７２３０のグリコシドハイドロラーゼファミリー１２のアミノ酸配列（配列番号８）のアライメントを示す。図１中、黒白反転のアミノ酸は、これらの全アミノ酸配列において同一アミノ酸残基（identical）を示し、「−」は欠失（ギャップ）を示す。
【００８２】
＜６＞  オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０からの遺伝子クローニング
配列番号７で表される塩基配列からなるフォワードプライマー（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＧＣＣＧＡＧＴＡＣＡ−３’：配列番号５で表される塩基配列の５’末端側に４塩基（ＣＡＣＣ）と開始コドン（ＡＴＧ）を付加したもの。５’側に付加したＣＡＣＣは、ベクターに挿入するための配列である。）と配列番号６で表される塩基配列からなるリバースプライマー（５’−ＣＴＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＣ−３’）を用い、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  Ｖ２  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＧＥヘルスケア社製）で増幅した温泉土壌ＤＮＡをテンプレートにして、ＰＣＲを行った。配列番号５で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列の１〜２１位の塩基からなる部分配列と相同的な（同一の）塩基配列である。また、配列番号６で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列の８３１〜８５２位の塩基からなる部分配列と相補的な塩基配列である。増幅したＰＣＲ産物は、Ｃｈａｍｐｉｏｎ  ｐＥＴ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ（登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）のｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入し、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０株に形質転換した。コロニーＰＣＲによりポジティブクローンを選抜し、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃、２００ｒｐｍで１７〜２０時間培養した後、ミニプレップキット（Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）  ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドの調製を行った。調製したプラスミドは、ライフテクノロジーズ社の３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンサーを用いて配列確認を行った。
【００８３】
ＰＣＲクローニングにより、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０から５個の遺伝子クローンＡＲ１５Ｇ−９０−２、ＡＲ１５Ｇ−９０−３、ＡＲ１５Ｇ−９０−９、ＡＲ１５Ｇ−９０−１２、及びＡＲ１５Ｇ−９０−１３を得た。エンドグルカナーゼ候補遺伝子ＡＲ１５Ｇ−９０−３の塩基配列（配列番号４）は、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０（配列番号２）と同様、 ８５２ｂｐを含み、ＯＲＦとは４塩基異なっていた。すなわち、９３番目の塩基が、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０ではＴ（チミン）であるが、クローニングされたＡＲ１５Ｇ−９０−３遺伝子においてはＣ（シトシン）であり、 ３３５番目の塩基が、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０ではＧ（グアニン）であるが、クローニングされたＡＲ１５Ｇ−９０−３遺伝子においてはＡ（アデニン）であり、６５２番目の塩基が、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０ではＧであるが、クローニングされたＡＲ１５Ｇ−９０−３遺伝子においてはＡであり、６９９番目の塩基が、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０ではＧであるが、クローニングされたＡＲ１５Ｇ−９０−３遺伝子においてはＡであった。このうち２ヶ所の塩基の違いはアミノ酸も異なるものであり、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０のアミノ酸配列（配列番号１）とエンドグルカナーゼ候補遺伝子ＡＲ１５Ｇ−９０−３のアミノ酸配列（配列番号３）は２アミノ酸残基異なっていた。すなわち、１１２位のアミノ酸残基が、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０ではアルギニン（Ｒ）であるが、クローニングされたＡＲ１５Ｇ−９０−３遺伝子においてはリジン（Ｋ）であり、 ２１８位のアミノ酸残基が、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０ではバリン（Ｖ）であるが、クローニングされたＡＲ１５Ｇ−９０−３遺伝子においてはイソロイシン（Ｉ）であった。
【００８４】
＜７＞  ＡＲ１５Ｇ−９０−３遺伝子の遺伝子発現及び酵素タンパクの精製
酵素タンパク質の精製には、Ｃ末端側にヒスチジンタグを付加させたタンパク質を用いた。上記ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターにエンドグルカナーゼ候補遺伝子ＡＲ１５Ｇ−９０−３のストップコドンを外したものを挿入することによって、ヒスチジンタグ付加配列を作製した。タグ配列が付加された目的遺伝子をもつプラスミドを、ヒートショック法によりタンパク質発現用大腸菌へ導入した。形質転換用コンピテントセルは、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（Ｍｅｒｃｋ社製）を用いた。目的の遺伝子をもつ大腸菌を１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００＝０．２〜０．８程度まで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、さらに５〜２０時間培養することによって、目的タンパク質の発現誘導を行った。培養後、遠心分離を行って大腸菌を回収し、培養液の１／１０容量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置ａｓｔｒａｓｏｎ３０００（ＭＩＳＯＮＩＸ社製）を用いて、５分間破砕−５分間休止工程を７〜８回繰り返し、目的タンパク質を含む遺伝子組換え大腸菌の粗抽出物を得た。当該遺伝子組換え大腸菌粗抽出物をフィルター（孔径φ＝０．４５μｍ、ミリポア社製）で濾過し、得られた濾液を遺伝子組換え大腸菌破砕上清とした。
【００８５】
当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清に、終濃度５００ｍＭとなるようにＮａＣｌを加え、５００ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したイオン交換カラムＨｉＴｒａｐ  ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、中高圧液体クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡ  ｄｅｓｉｇｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、５００ｍＭのＮａＣｌと５００ｍＭのイミダゾールを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜１００％の濃度勾配でタンパク質を分画した。ＣＭＣ加水分解活性のあった分画は、まとめて混合した後、遠心式の限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ社製）によって７５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）へ溶液交換した。溶液交換後のＣＭＣ加水分解活性分画を、同液で平衡化した疎水性相互作用分離カラムＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｎｅｎｙｌ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜１００％の濃度勾配でタンパク質を分画した。ＣＭＣ加水分解活性のあった分画は、まとめて混合した後に、液量が８ｍＬ程度になるまでＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０を用いて濃縮した。濃縮したサンプルは、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したゲル濾過カラムＨｉｌｏａｄ２６／６０  ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、カラム体積の１〜１．５倍容の同バッファーを流速２〜３ｍＬ／ｍｉｎで流すことによって分画した。ＣＭＣ加水分解活性のあった分画は、まとめて混合した後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換と濃縮を行い、終濃度約１ｍｇ／ｍＬの精製酵素を得た。
【００８６】
遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により確認した。前記上清５μｇ及び精製酵素０．５μｇに対し、２−メルカプトエタノール含有試料用緩衝４倍濃縮液（和光純薬社製）を１倍になるように混合した後に９５℃で４分間処理し、１０％のクライテリオンＴＧＸステインフリーゲル（バイオラッド社製）を用いて電気泳動を行った。泳動終了後、画像撮影システムＣｈｅｍｉＤｏｃ（バイオラッド社製）により、タンパク質のバンドを可視化した。
【００８７】
図２に、ＡＲ１５Ｇ−９０−３遺伝子を導入した形質転換大腸菌から調製された遺伝子組換え大腸菌破砕上清及び当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清から精製された精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す。レーン１はタンパク質質量指標、レーン２は遺伝子組換え大腸菌破砕上清、レーン３は精製酵素の電気泳動パターンである。この結果、前記遺伝子組換え大腸菌破砕上清（レーン２）において、アミノ酸配列（配列番号３）及びｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターのヒスチジンタグから予想される質量３５．６ｋＤａ近傍にバンドが認められた。精製酵素（レーン３）では、当該バンドに対応する強いバンドと共に２つの弱いバンドが検出されたが、主な含有タンパク質は当該酵素タンパク質であることが確認された（図中、矢印）。
【００８８】
＜８＞  ＡＲ１５Ｇ−９０−３のＣＭＣ加水分解活性測定
まず、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース、Ｓｉｇｍａ社製）を基質とし、ＡＲ１５Ｇ−９０−３遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＡＲ１５Ｇ−９０−３）のＣＭＣ加水分解活性を調べた。
前記＜７＞で得られた遺伝子組換え大腸菌破砕上清、又は精製途中の酵素試料のＣＭＣ加水分解活性測定は、１００μＬの１質量％ＣＭＣ水溶液、 ５０μＬの２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ４．０）、５０μＬの遺伝子組換え大腸菌破砕上清又は精製途中の酵素試料からなる混合液を、４０〜９９℃で１０〜１５分間反応させることにより行った。全ての計測において、遺伝子組換え大腸菌破砕上清又は精製酵素試料の代わりに５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を入れて同条件で反応させた混合液をコントロール区とした。また、基質溶液と酵素は、反応温度で５分間それぞれ別々に保温した後に混合し、反応開始とした。反応終了後は、等量の３，５−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＮＳ溶液）を加えて１００℃で５分間加熱処理し、５分間の冷却後に遠心し、上清を得た。上清中の還元糖量を、分光光度計を用いて５４０ｎｍによって吸光度を計測し、グルコースで作成した検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。
【００８９】
＜９＞  ＡＲ１５Ｇ−９０−３の基質特異性
ＡＲ１５Ｇ−９０−３遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＡＲ１５Ｇ−９０−３）に対して、様々なセルロース基質とヘミセルロース基質に対する加水分解活性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素溶液（０．２ｍｇ／ｍＬ）を用いた。また、基質として、ＰＳＡ、アビセル粉末（微結晶性セルロース粉末、Ｍｅｒｃｋ社製）、ＣＭＣ（Ｓｉｇｍａ社製）、キシラン（ブナ材由来、Ｓｉｇｍａ社製）、リケナン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、ラミナリン（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｄｉｇｉｔａｔａ由来、Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＣ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＸ（Ｓｉｇｍａ社製）、及びＰＮＰＧ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
ＰＳＡはリン酸溶液でアビセル粉末（微結晶性セルロース粉末、Ｍｅｒｃｋ社製）を一旦溶解させた後に滅菌蒸留水を加えて析出させた後、ｐＨが５以上になるまで洗浄することによって調製した。なお、以降の実験に用いたＰＳＡは全て当該方法により調製した。
【００９０】
具体的には、まず、反応液として、５０μＬの２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ４．０）（キシランの場合はマッキルベインバッファー（ｐＨ７．０））と、５μＬの精製酵素溶液（０．２ｍｇ／ｍＬ）と、４５μＬの精製水とからなる混合液を７０℃で５分間プリインキュベーションした後、さらに同様に保温した１００μＬの各基質溶液（ＰＳＡ、アビセル粉末、ＣＭＣ、キシラン、リケナン、及びラミナリンは１質量％水溶液、ＰＮＰＧ、ＰＮＰＸ、及びＰＮＰＣは３．４ｍＭ水溶液）を添加し、得られた混合液を７０℃で２０分間インキュベートすることにより酵素反応を行った。反応中、不溶性基質の沈殿を防ぐため、サーモミキサー（エッペンドルフ社製）により混合液に１４００ｒｐｍの振動を加えて撹拌した。全ての計測において、精製酵素溶液の代わりに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を入れて同条件で反応させた混合液をコントロール区とした。
【００９１】
反応終了後、ＰＳＡ、アビセル粉末、ＣＭＣ、キシラン、リケナン、又はラミナリンを基質とした反応においては、前記＜８＞のＡＲ１５Ｇ−９０−３のＣＭＣ加水分解活性を調べた場合と同様にして、加水分解によって生成した還元糖量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。ただし、キシランの場合は、キシロースで作成した検量線を用いた。
ＰＮＰＧ、ＰＮＰＸ、又はＰＮＰＣを基質とした反応においては、反応終了後は、等量の２００ｍＭ  炭酸ナトリウム水溶液を加えて５分間遠心し、上清を得た。上清中のｐ−ニトロフェノール量を、分光光度計を用いて４２０ｎｍによって吸光度を計測し、ｐ−ニトロフェノールで作成した検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求めた。１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。
【００９２】
各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。測定結果を図３に示す。この結果、ＡＲ１５Ｇ−９０−３は、ＣＭＣ、キシラン、ＰＳＡ、及びリケナンに対し加水分解活性を示したが、アビセル、ラミナリン及びＰＮＰＣに対する加水分解活性は非常に小さく、ＰＮＰＧ及びＰＮＰＸに対しては加水分解活性をほとんど示さなかった。
【００９３】
＜１０＞  ＣＭＣ加水分解活性の温度依存性
酵素タンパク質（ＡＲ１５Ｇ−９０−３）のＣＭＣ加水分解活性の温度依存性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で０．１３ｍｇ／ｍＬに希釈した精製酵素溶液を用いた。また、基質としては、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース、Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
【００９４】
具体的には、５０μＬの２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ４．０）と、４０μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）と、１０μＬの精製酵素溶液（０．１３ｍｇ／ｍＬ）と、１００μＬの１質量％ＣＭＣ水溶液からなる混合液を、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０又は１６０℃で１５分間反応させることにより行った。１００℃以上の活性測定を行う場合には、ガラスバイアルとゴム栓、アルミシール（日電理化硝子社製）を使用した。反応終了後、前記＜８＞と同様にして酵素による加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＣＭＣ分解活性（比活性）（Ｕ／ｍｇ）を算出した。また、反応溶液に、０．５ｍＭカルシウムイオンを添加して同様にしてＣＭＣ分解活性を測定した。
【００９５】
また、既知のエンドグルカナーゼとして、ＴｒＥＧ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＥＧ２；Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）、及びＴｍＥＧ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ＥＧ；Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）を用い、同様にしてＣＭＣ分解活性を測定した。バッファーは、２００ｍＭ  酢酸バッファーに代えて、ＴｒＥＧは２００ｍＭのマッキルベインバッファー（ｐＨ４．０）を、ＴｍＥＧは２００ｍＭのマッキルベインバッファー（ｐＨ５．０）を用い、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００℃で反応させた。
【００９６】
各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。計測結果を図４に示す。ＡＲ１５Ｇ−９０−３は、温度範囲６０〜１６０℃においてＣＭＣ分解活性を示した。最も高い活性を示した至適温度（Ｔｏｐｔ）は、ｐＨ４．０において１００℃であった。また、０．５ｍＭカルシウムイオンを酵素−基質反応液中に添加すると、Ｔｏｐｔは、１１０℃に上昇し、各温度の比活性も上昇した。これに対し、既知のエンドグルカナーゼのＴｏｐｔは、ＴｒＥＧが６０℃、ＴｍＥＧが８０℃であった。つまり、ＡＲ１５Ｇ−９０−３は、超高熱菌であるＴ．ｍａｒｉｔｉｍａのＥＧよりも、至適温度が２０℃以上も高かった。
【００９７】
また、全ての温度域において、カルシウムイオン添加により、ＡＲ１５Ｇ−９０−３のＣＭＣ分解活性の向上が認められた。特に顕著であったのは、カルシウムイオン存在下では１２０℃以上のＣＭＣ分解活性の減少傾向が緩やかになっており、カルシウムイオン非存在下では１４０℃における活性が至適温度における活性の４０％程度なのに対して、カルシウムイオン存在下では、１６０℃における活性が至適温度における活性の６０％を維持した。これは、カルシウムイオンの存在による酵素タンパク質の安定化がもたらした効果であると考えられた。
【００９８】
＜１１＞  ＣＭＣ加水分解活性のｐＨ依存性
酵素タンパク質（ＡＲ１５Ｇ−９０−３）のＣＭＣ加水分解活性のｐＨ依存性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で０．１３ｍｇ／ｍＬに希釈した精製酵素溶液を用いた。また、基質としては、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース、Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
【００９９】
具体的には、５０μＬのマッキルベインバッファー（ｐＨ３〜８）と、３０μＬの精製水と、２０μＬの精製酵素溶液（０．１３ｍｇ／ｍＬ）と、１００μＬの１質量％ＣＭＣ水溶液からなる混合液を、７０℃で１５分間反応させることにより行った。反応終了後、前記＜８＞と同様にして酵素による加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＣＭＣ加水分解活性（比活性）（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
【０１００】
各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。計測結果を図５に示す。ｐＨは、基質とバッファーと酵素の混合液の実測値をプロットした。
ＡＲ１５Ｇ−９０−３は、ｐＨ３〜８の範囲において、ＣＭＣ加水分解活性を示した。至適ｐＨは、７０℃でｐＨ４．４（基質、バッファーと酵素の混合液の実測値）であった。
【０１０１】
＜１２＞  キシラナーゼ活性の温度依存性
ＡＲ１５Ｇ−９０−３はキシラン分解活性（キシラナーゼ活性）も示したため、キシラナーゼ活性の温度依存性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で０．１３ｍｇ／ｍＬに希釈した精製酵素溶液を用いた。また、基質としては、キシラン（ブナ材由来、Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
【０１０２】
具体的には、５０μＬのマッキルベインバッファー（ｐＨ７．０）と、２０μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）と、３０μＬの精製酵素溶液（０．１３ｍｇ／ｍＬ）と、１００μＬの１質量％キシラン水溶液からなる混合液を、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０又は１４０℃で１５分間反応させることにより行った。１００℃以上の活性測定を行う場合には、ガラスバイアルとゴム栓、アルミシール（日電理化硝子社製）を使用した。反応終了後、キシロースで作成した検量線を用いて算出した以外は前記＜８＞と同様にして酵素による加水分解によって生成した還元糖量を求め、キシラナーゼ活性（比活性）（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
【０１０３】
各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。計測結果を図６に示す。ＡＲ１５Ｇ−９０−３は、温度範囲４０〜１４０℃においてキシラナーゼ活性を示した。最も高い活性を示した至適温度（Ｔｏｐｔ）は、ｐＨ７．０において１１０℃であった。
【０１０４】
＜１３＞  キシラナーゼ活性のｐＨ依存性
ＡＲ１５Ｇ−９０−３のキシラナーゼ活性のｐＨ依存性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で０．１ｍｇ／ｍＬに希釈した精製酵素溶液を用いた。また、基質としては、キシラン（ブナ材由来、Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
【０１０５】
具体的には、２５μＬのＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファー（ｐＨ５〜１０）と、１５μＬの精製水と、１０μＬの精製酵素溶液（０．１ ｍｇ／ｍＬ）と、５０μＬの１質量％キシラン水溶液からなる混合液を、７０℃で１５分間反応させることにより行った。反応終了後、前記＜１２＞と同様にして酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、キシラナーゼ活性（比活性）（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
【０１０６】
各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。計測結果を図７に示す。ｐＨは、基質とバッファーと酵素の混合液の実測値をプロットした。ＡＲ１５Ｇ−９０−３は、ｐＨ５〜１０の範囲においてキシラナーゼ活性を示した。至適ｐＨは、７０℃でｐＨ８．６（基質、バッファーと酵素の混合液の実測値）であった。
【０１０７】
＜１４＞  ＣＭＣ及びキシランを基質としたＡＲ１５Ｇ−９０−３の熱安定性
タンパク質の熱安定性に関わる指標として、熱変性温度又は熱崩壊温度Ｔｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）がしばしば使われる。一定時間の予備加温（プリインキュベーション）により酵素活性が無処理区の５０％に減少するプリインキュベーション温度Ｔ５０はタンパク質の熱崩壊温度Ｔｍにほぼ等しく、酵素活性を計測することにより求めることができる。この方法により、ＡＲ１５Ｇ−９０−３の熱崩壊温度Ｔｍを求めた。
【０１０８】
具体的には、基質無添加条件下で５０〜１３０℃で３０分間の予備加温（プリインキュベーション）を行った後に酵素反応を行った。酵素反応の反応液の組成は、ＣＭＣ基質の場合は前記＜１０＞と同様にして、キシラン基質の場合は前記＜１２＞と同様にして、７０℃で１５分間反応させた。ＣＭＣ加水分解活性又はキシラン加水分解活性が５０％に減少する温度Ｔ５０を指標として、ＡＲ１５Ｇ−９０−３の熱安定性を調べた。各データはロジスティック関数による近似を行い、近似曲線が相対活性値５０％となる温度をＴ５０（すなわち、Ｔｍ）とした。
【０１０９】
ＣＭＣ加水分解活性の測定結果を図８に、キシラン加水分解活性の測定結果を図９に、それぞれ示す。酵素活性は、無処理区（プリインキュベーション無し）の活性を１００％とした相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、％）として示した。ＡＲ１５Ｇ−９０−３のＣＭＣ分解活性は、Ｔ５０＝１０８．６℃であり、キシラン分解活性はＴ５０＝１０７．６℃であった。
【０１１０】
［実施例２］
温泉土壌サンプルＡＲ１５の全ゲノムシーケンスデータセットを元に、バージョンアップしたアセンブルソフトウェアで再度アセンブルを行い、ＡＲ１５Ｇ−９０の全長配列の取得を試みた。
【０１１１】
＜１＞  温泉メタゲノムデータの再アセンブル
実施例１の＜１＞において４５４シーケンサーで読みとられた塩基配列に対して、４５４  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのアセンブルソフトウェアＮｅｗｂｌｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．７を使ってアセンブルを行った。設定は実施例１の＜２＞と同様にして行った。
【０１１２】
＜２＞  エンドグルカナーゼのＯＲＦ予測
アノテーションソフトウェアとしてＭｅｔａｇｅｎｅ（Noguchi et al., DNA Research，2008,15(6)）を使用した以外は、実施例１の＜３＞と同様にして、前記＜２＞で得たコンティグ配列からＯＲＦ予測を行った。
【０１１３】
＜３＞  オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ
実施例１の＜４＞と同様にして、遺伝子のグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリー分類を行い、ＢＬＡＳＴＰによる相同性検索及びＨＭＭＥＲにより、ＡＲ１５Ｇ−９０のＮ末側アミノ酸が５５アミノ酸残基長いＯＲＦ（オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ）が得られた。オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０Ｂは、３３８アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードし、１位のアミノ酸残基がメチオニン（Ｍ）で、３’末端が終始コドンで終わる完全長配列（配列番号９）であった。５６位のアミノ酸残基であるバリン（Ｖ）以降はＡＲ１５Ｇ−９０と同一配列であった。シグナル配列予測ソフトウェアＳｉｇｎａｌＰ  ４．１を使った解析によれば、シグナルペプチドは予想されなかった。当該ＯＲＦと最も配列同一性が高かった既知アミノ酸配列は、クレンアーキオータ門イグニスファエラ・アグレガンス  ＤＳＭ１７２３０が持つグリコシドハイドロラーゼファミリー１２（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＤＭ２７２９２．１）であり、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムにより算出した両者のアミノ酸配列の相同性は、全長で５５％であったため、当該ＯＲＦは新規な配列であると確認された。
【０１１４】
図１０に、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０Ｂがコードするポリペプチド（ＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ）のアミノ酸配列（配列番号９）、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０がコードするポリペプチド（ＡＲ１５Ｇ−９０）のアミノ酸配列（配列番号１）、及びイグニスファエラ・アグレガンス  ＤＳＭ１７２３０のグリコシドハイドロラーゼファミリー１２のアミノ酸配列（配列番号８）のアライメントを示す。図１０中、黒白反転のアミノ酸は、これらの全アミノ酸配列において同一アミノ酸残基（identical）を示し、「−」は欠失（ギャップ）を示す。
【０１１５】
＜４＞  オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０Ｂからの遺伝子クローニング
配列番号１４で表される塩基配列からなるフォワードプライマー（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＡＧＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＧＴＴＴＡＣＡＴＡＧＣＴＡＴＡＧＣ−３’：配列番号１３で表される塩基配列の５’末端側に４塩基（ＣＡＣＣ）を付加したもの。５’側に付加したＣＡＣＣは、ベクターに挿入するための配列である。）を用いた以外は、実施例１の＜６＞と同様にして、遺伝子クローニングを行った。
【０１１６】
ＰＣＲクローニングにより、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０Ｂから遺伝子クローンＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ−１５を得た。エンドグルカナーゼ候補遺伝子ＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ−１５の塩基配列（配列番号１２）は、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ（配列番号１０）と同様、 １，０１７ｂｐを含み、ＯＲＦとは１３塩基異なっていた（表２）。このうち３ヶ所の塩基の違いはアミノ酸も異なるものであり、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０Ｂのアミノ酸配列（配列番号９）とエンドグルカナーゼ候補遺伝子ＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ−１５のアミノ酸配列（配列番号１１）は３アミノ酸残基異なっていた。すなわち、１２２位のアミノ酸残基が、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０Ｂではセリン（Ｓ）であるが、クローニングされたＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ−１５遺伝子においてはアスパラギン（Ｎ）であり、 ２７３位のアミノ酸残基が、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０Ｂではバリン（Ｖ）であるが、クローニングされたＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ−１５遺伝子においてはイソロイシン（Ｉ）であり、３１４位のアミノ酸残基が、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−９０Ｂではメチオニン（Ｍ）であるが、クローニングされたＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ−１５遺伝子においてはトレオニン（Ｔ）であった。
【０１１７】
【表２】
0006268486.tif 000003
【０１１８】
＜５＞  ＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ−１５の遺伝子発現及びＣＭＣ加水分解活性測定
実施例１の＜７＞及び＜８＞と同様にして、大腸菌を用いて遺伝子を発現させ、ＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ−１５遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ−１５）のエンドグルカナーゼ活性を調べた。ＣＭＣ加水分解活性測定は、遺伝子組換え大腸菌破砕上清を用い、５０、７０、９０℃で１時間反応させることにより行った。計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。各温度における、ＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ−１５タンパク質によるＣＭＣ加水分解（ｐＨ４．０）によって生じた還元糖量を、最も高い還元糖量の値を１００％とした相対値（％）とし、これをＣＭＣ加水分解活性の相対値としてプロットした（図１１）。ＡＲ１５Ｇ−９０Ｂ−１５は、各温度においてＣＭＣ加水分解活性を示し、計測した３点では９０℃が最も高い活性を示した温度であった。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、少なくとも１１０℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有しており、高温条件下におけるセルロース含有バイオマスの糖化処理に好適である。このため、当該超耐熱性エンドグルカナーゼ及びその生産に用いられるポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、例えば、セルロース含有バイオマスからのエネルギー産生の分野において利用が可能である。
【図１】
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【図２】
0006268486.tif 000005
【図３】
0006268486.tif 000006
【図４】
0006268486.tif 000007
【図５】
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【図６】
0006268486.tif 000009
【図７】
0006268486.tif 000010
【図８】
0006268486.tif 000011
【図９】
0006268486.tif 000012
【図１０】
0006268486.tif 000013
【図１１】
0006268486.tif 000014
【配列表】
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