(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリンジ構造のベッセルを用いて継代培養及びスフェロイドと培養液の移し替えを閉鎖系で行い、多能性幹細胞や接着性細胞を大量に培養するための大量細胞培養システムであって、前記ベッセルは、外筒部の両端に外形が同一円形のフロントフランジとバックフランジを一体的に設け、溶液の出入口となるヘッドを着脱可能なキャップで塞ぎ、プランジャのガスケットで囲まれた空間内に、細胞を培養液に懸濁した細胞液を充填した状態で、前記フロントフランジとバックフランジを利用して回転培養可能であることを特徴とする大量細胞培養システム。
【請求項２】
前記プランジャの軸部が途中で分離可能な構造である請求項１記載の大量細胞培養システム。
【請求項３】
前記外筒部の先端側内面を円錐形凹部とし、該内面の傾斜角度αは、中心角で８０°〜１６０°の範囲に設定してなる請求項１又は２記載の大量細胞培養システム。
【請求項４】
継代培養間における処理であり、培養後のスフェロイドを共にシリンジ構造のベッセルからなる培養ベッセルから濃縮ベッセルへ移す細胞濃縮ステップを備え、該細胞濃縮ステップは、前記培養ベッセルと濃縮ベッセルのヘッド同士を、接続具を介して連結し、該培養ベッセルのヘッドを下向き姿勢の状態で、それぞれのベッセルの外筒部を保持するとともに、プランジャを押し引き駆動可能なベッセル間細胞液移送装置に装着し、前記培養ベッセルから沈殿したスフェロイド全量を前記濃縮ベッセルへ移し替えてなる請求項１〜３何れか１項に記載の大量細胞培養システム。
【請求項５】
前記培養ベッセルの容量より前記濃縮ベッセルの容量を小さく設定してなる請求項４記載の大量細胞培養システム。
【請求項６】
継代培養間における処理であり、前記濃縮ベッセル内のスフェロイドが濃縮された細胞液の所定量を新しい複数の培養ベッセルに移し替える分注・微細化ステップを備え、濃縮状態の細胞液が入った前記濃縮ベッセルのヘッドと、新しい培養ベッセルのヘッドとを、フィルター内蔵の前記接続具で接続した状態で、前記ベッセル間細胞液移送装置に装着し、前記濃縮ベッセルのプランジャを押し込み方向へ前進させると同時に、前記培養ベッセルのプランジャを引き抜き方向へ後退させ、前記濃縮ベッセル内のスフェロイドが濃縮された細胞液の所定量を、スフェロイドを小スフェロイドに破砕する機能を有する前記フィルターを通過させて前記培養ベッセルに移し替えてなる請求項４又は５記載の大量細胞培養システム。
【請求項７】
継代培養間における処理であり、スフェロイドが濃縮された細胞液の所定量を移し替えた培養ベッセルに新しい培養液を追加する希釈ステップを備え、前記培養ベッセルのヘッドに接続した新しい培養液の供給源から培養液をベッセル内に供給してなる請求項６記載の大量細胞培養システム。
【請求項８】
細胞を培養液に懸濁した細胞液を内部に充填した培養ベッセルを所定速度で回転し、擬微小重力環境下で細胞を浮遊状態で培養可能な回転細胞培養装置であって、シリンジ構造のベッセルであり、外筒部の両端に外形が同一円形のフロントフランジとバックフランジを一体的に設け、溶液の出入口となるヘッドを着脱可能なキャップで塞ぎ、プランジャのガスケットで囲まれた空間内に前記細胞液を充填した状態の前記培養ベッセルと、前記培養ベッセルのフロントフランジとバックフランジの下部をそれぞれ回転可能に支持する一対のローラを備え且つ前記フロントフランジ又はバックフランジに接触したこれらのローラのうち、少なくとも一つのローラを駆動モータで回転する駆動ローラとし、他を従動ローラとするとともに、前記フロントフランジとバックフランジの半径方向外側面を当て止めして姿勢を保つ規制部を備えたことを特徴とする回転細胞培養装置。
【請求項９】
前記培養ベッセルを複数個同時に回転培養可能となすべく、基台に前記駆動ローラ、従動ローラ及び規制部のセットを複数設けてなる請求項８記載の回転細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療等において使用する多能性幹細胞や接着性細胞を大量に培養するのに適した大量細胞培養システム及びそれに用いる回転細胞培養装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人工多能性幹細胞（本明細書では、しばしば「iPS細胞」と称する）の発見（非特許文献１〜３）により、それを用いた再生医療の実用化の機運が高まっている。再生医療等におけるiPS細胞の利用には、実験室で用いられる細胞数１０６個程度の量では到底不十分であり、臨床応用する上では１０９〜１０１０オーダーの細胞数が必要であるが、その大量培養技術はまだ十分に確立されていない。またiPS細胞の場合、一般的に未分化状態を保持して培養するためにマウス胎児由来初代培養線維芽細胞（MEF）やSTO細胞などのフィーダー細胞上で培養する必要があるとされているが、フィーダー細胞の混入は再生医療に用いる上で大きな妨げとなる。
【０００３】
そこで、フィーダーフリーでの細胞培養法の研究も行われており、マトリゲルでコーティングした基材表面上でiPS細胞を培養する手法や、ラミニンやラミニンの部分ペプチドによるコーティングを利用した培養法により、フィーダー細胞の存在がなくとも培養可能な方法が開発されている。また、通常のディッシュ培養ではなく、バッグを用いた培養も行われている。しかし、フィーダーフリーで培養可能な系においてもコーティングした基材上で培養を繰り返す必要があるため、培養工程が複雑であり、また培養にかかるコストが顕著に増大し、一患者の治療を行うための費用が莫大となるという深刻な問題を有している。一方、接着性細胞の場合は、培養後に薬剤を添加して付着細胞を剥離する必要があり、同じく再生医療に用いるには薬剤の混入が問題となる。
【０００４】
ところで、細胞から３次元組織の構築を行う場合、通常適当な足場材料を用いて３次元培養を行うか、撹拌培養を行う必要がある。しかし、従来の撹拌培養では、細胞に与えられる機械的刺激や損傷が強く、大きな組織を得ることは困難か、あるいは得られたとしても内部で壊死を起こしていることが多かった。これに対し、重量を最適化するために設計された一連のバイオリアクターが存在する。その一つであるRWV（Rotating Wall Vessel）バイオリアクターは、NASAが開発したガス交換機能を備えた回転式バイオリアクターである。本発明者らは、以前からこのRWVバイオリアクターを用いた３次元培養による骨髄細胞等からの軟骨再生技術等の研究開発を行ってきた（特許文献１〜３）。
【０００５】
また、本発明者らは培養方法の開発と並行して回転細胞培養装置の開発も行ってきた。例えば、特許文献４〜６では、ガス透過膜を裏側（後側）に備えた偏平円筒形の培養ベッセルを回転制御装置の水平な回転軸に取り付け、裏面側で片持支持した状態で回転させることにより、培養ベッセル内のスフェロイドの重力、浮力と回転による培養液の流れから受ける力をバランスさせ、時間平均すると地上重力の１００分の１という擬微小重力環境を作り出し、スフェロイドが沈降せず一定領域でふわふわと浮いた状態を実現する装置が提案されている。これら装置では培養ベッセルの表側に観察窓を設け、該窓を通じてスフェロイドをカメラで撮像することにより細胞の成長や浮遊状況に応じて回転速度を制御し、常にスフェロイドを前記一定の領域内で浮遊した状態に維持している。
【０００６】
このような状況の基で、未分化性を保持した安定なiPS細胞を効率的に大量培養する方法が本発明者らによって提案されている（特許文献７）。即ち、特許文献７に記載の発明は、擬微小重力環境下で多能性幹細胞、特にiPS細胞を培養することにより、フィーダー細胞やコーティング剤の不在下であっても、未分化性を維持したまま多能性幹細胞を増殖させ、スフェロイドを形成させることができ、しかもコンタミネーションのリスクの少ない閉鎖系で多能性幹細胞を増殖させることができるため、安全性を高めることもできるという利点がある。
【０００７】
尚、特許文献８には、(i) 多能性幹細胞を、細胞塊の平均直径が約２００−約３００μｍとなるまで浮遊培養する工程と、(ii) 工程(i)により得られた細胞塊を、平均直径が約８０−約１２０μｍである均一な細胞塊に分割する工程を繰り返すことを特徴とする、多能性幹細胞の維持増幅方法が開示されている。この方法は、細胞塊同士の接着を起こさない粘度を持つ水溶性高分子成分を含む培地中で、ディシュ等の培養器を用いて静置状態で行うというものである。しかし、この方法は、特殊な培地を用いて培地の比重を重くして、細胞塊が沈まずに中に浮かして静止させた状態で培養する方法で、どうしても細胞塊が分泌する何らかの分子が流れていかずに細胞塊の周囲に残留するため、その影響を受けてしまうという問題がある。実際、細胞塊の直径が３００μｍを超えると、細胞が分泌するサイトカイシン等の影響で微小環境が形成され、分化が誘導されてしまい、また細胞塊の中心部で壊死が起こるため、生細胞の回収率が悪くなる点が指摘されている。更に、細胞塊をフィルトレーションする場合、細胞塊浮遊培地の全量を、ピペットマンを用いてフィルターに通す必要があり、手作業が多く、手間のかかる作業である。その上、培地と細胞塊の分離が難しく、培地の交換に手間がかかる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／０５６０７２号
【特許文献２】特開２００９−１５９８８７号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００６／１３５１０３号
【特許文献４】特開２００８−２３７２０３号公報
【特許文献５】特開２００９−７７７０８号公報
【特許文献６】国際公開２０１０／１４３６５１号公報
【特許文献７】国際公開２０１６／０５２６５７号公報
【特許文献８】国際公開２０１３／０７７４２３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Takahashi, K. and Yamanaka, S., (2006) Cell 126, p.663-676
【非特許文献２】Takahashi K., et al., (2007) Cell 131, p.862-872
【非特許文献３】Nakagawa M., et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26(1): p.101-106
【非特許文献４】Okita K., et al.,（2011）Nat. Meth., p.409-412
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献７に記載の細胞培養方法は、浮遊培養で形成された多能性幹細胞のスフェロイドを、小スフェロイドに分離し分散させたものを培養液に播種し、回転培養等の擬微小重力環境下で継代培養することにより、未分化状態を維持したまま大量培養できるというものである。ここで、スフェロイドを小スフェロイド（３０〜２００細胞）に破砕するには、典型的にはフィルターを通して機械的（力学的）に行う点が開示されている。具体的には、ピペット等を用いてスフェロイドに圧力をかけてフィルターを通過させている。
【００１１】
しかしながら、多能性幹細胞の未分化状態を維持するため、１×１０４〜１×１０５細胞／cm３程度の低い細胞密度で培養するが、１０９〜１０１０オーダーの細胞数まで大量培養するには、容量が５０ｍｌ程度のベッセルを用い、１回の培養で３〜５倍に増殖するとすれば、５〜６回の継代培養が必要となり、その都度、培養細胞回収（濃縮）、フィルター処理、細胞分注・培養液追加（希釈）、培養ベッセルへの注入といった作業が必要である。人手によってスフェロイドをフィルターに通して微細化し、それを培養液で希釈して継代培養する方法は、手間が非常にかかるばかりでなく、作業者スキルによるバラツキが大きく、コンタミネーションのリスクも排除できない。
【００１２】
そこで、本発明が前述の状況に鑑み、解決しようとするところは、再生医療等において使用する多能性幹細胞、特にiPS細胞をフィーダー細胞やコーティング剤の不在下であっても、未分化性を維持して大量培養することができ、しかもまた作業者スキルによるバラツキを排除して継代培養を行うことができ、更に接着性細胞についても、付着させることなく浮遊状態で大量に培養するのに適した大量細胞培養システム及びそれに用いる回転細胞培養装置を提供する点にある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、前述の課題解決のために、以下の大量細胞培養システム及びそれに用いる回転細胞培養装置を構成した。
【００１４】
（１）シリンジ構造のベッセルを用いて継代培養及びスフェロイドと培養液の移し替えを閉鎖系で行い、多能性幹細胞や接着性細胞を大量に培養するための大量細胞培養システムであって、前記ベッセルは、外筒部の両端に外形が同一円形のフロントフランジとバックフランジを一体的に設け、溶液の出入口となるヘッドを着脱可能なキャップで塞ぎ、プランジャのガスケットで囲まれた空間内に、細胞を培養液に懸濁した細胞液を充填した状態で、前記フロントフランジとバックフランジを利用して回転培養可能であることを特徴とする大量細胞培養システム。
【００１５】
（２）前記プランジャの軸部が途中で分離可能な構造である、（１）記載の大量細胞培養システム。
【００１６】
（３）前記外筒部の先端側内面を円錐形凹部とし、該内面の傾斜角度αは、中心角で８０°〜１６０°の範囲に設定してなる、（１）又は（２）記載の大量細胞培養システム。
【００１７】
（４）継代培養間における処理であり、培養後のスフェロイドを共にシリンジ構造のベッセルからなる培養ベッセルから濃縮ベッセルへ移す細胞濃縮ステップを備え、該細胞濃縮ステップは、前記培養ベッセルと濃縮ベッセルのヘッド同士を、接続具を介して連結し、該培養ベッセルのヘッドを下向き姿勢の状態で、それぞれのベッセルの外筒部を保持するとともに、プランジャを押し引き駆動可能なベッセル間細胞液移送装置に装着し、前記培養ベッセルから沈殿したスフェロイド全量を前記濃縮ベッセルへ移し替えてなる、（１）〜（３）何れか１に記載の大量細胞培養システム。
【００１８】
（５）前記培養ベッセルの容量より前記濃縮ベッセルの容量を小さく設定してなる、（４）記載の大量細胞培養システム。
【００１９】
（６）継代培養間における処理であり、前記濃縮ベッセル内のスフェロイドが濃縮された細胞液の所定量を新しい複数の培養ベッセルに移し替える分注・微細化ステップを備え、濃縮状態の細胞液が入った前記濃縮ベッセルのヘッドと、新しい培養ベッセルのヘッドとを、フィルター内蔵の前記接続具で接続した状態で、前記ベッセル間細胞液移送装置に装着し、前記濃縮ベッセルのプランジャを押し込み方向へ前進させると同時に、前記培養ベッセルのプランジャを引き抜き方向へ後退させ、前記濃縮ベッセル内のスフェロイドが濃縮された細胞液の所定量を、スフェロイドを小スフェロイドに破砕する機能を有する前記フィルターを通過させて前記培養ベッセルに移し替えてなる、（４）又は（５）記載の大量細胞培養システム。
【００２０】
（７）継代培養間における処理であり、スフェロイドが濃縮された細胞液の所定量を移し替えた培養ベッセルに新しい培養液を追加する希釈ステップを備え、前記培養ベッセルのヘッドに接続した新しい培養液の供給源から培養液をベッセル内に供給してなる、（６）記載の大量細胞培養システム。
【００２１】
（８）細胞を培養液に懸濁した細胞液を内部に充填した培養ベッセルを所定速度で回転し、擬微小重力環境下で細胞を浮遊状態で培養可能な回転細胞培養装置であって、シリンジ構造のベッセルであり、外筒部の両端に外形が同一円形のフロントフランジとバックフランジを一体的に設け、溶液の出入口となるヘッドを着脱可能なキャップで塞ぎ、プランジャのガスケットで囲まれた空間内に前記細胞液を充填した状態の前記培養ベッセルと、前記培養ベッセルのフロントフランジとバックフランジの下部をそれぞれ回転可能に支持する一対のローラを備え且つ前記フロントフランジ又はバックフランジに接触したこれらのローラのうち、少なくとも一つのローラを駆動モータで回転する駆動ローラとし、他を従動ローラとするとともに、前記フロントフランジとバックフランジの半径方向外側面を当て止めして姿勢を保つ規制部を備えたことを特徴とする回転細胞培養装置。
【００２２】
（９）前記培養ベッセルを複数個同時に回転培養可能となすべく、基台に前記駆動ローラ、従動ローラ及び規制部のセットを複数設けてなる、（８）記載の回転細胞培養装置。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、作業者スキルによらず、再生医療等において使用する多能性幹細胞や接着性細胞を大量且つ効率的に培養することができる。また、培養ベッセルがシリンジ構造となっているので、継代培養における細胞の濃縮、フィルター処理、希釈、回転培養を全て閉鎖系で行うことができ、コンタミネーションのリスクが少ない。フィルター処理は、培養後の細胞を他のベッセルに移し替える際に、フィルター内蔵の接続具を介して行うだけで、スフェロイドを何ら薬液を使用することなく機械的に小スフェロイドに微細化することができ、特にiPS細胞を未分化性を維持したまま大量培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の大量細胞培養システムに用いるベッセルを示し、（ａ）は容量５０ｍｌの培養ベッセルの部分断面図、（ｂ）は容量１０ｍｌの濃縮ベッセルの部分断面図である。
【図２】フィルター内蔵接続具の分解状態の断面図である。
【図３】フィルター内蔵接続具の組み立て状態の断面図である。
【図４】フィルター内蔵接続具を介して培養ベッセルと濃縮ベッセルのヘッドを接続した状態の部分拡大断面図である。
【図５】培養後のスフェロイドを培養ベッセルから濃縮ベッセルへ移す細胞濃縮ステップを示し、（ａ）は接続具を介して培養ベッセルと濃縮ベッセルのヘッドを接続した状態の断面図、（ｂ）は培養ベッセルの下部に沈殿したスフェロイドを濃縮ベッセルへ移し替えた状態の断面図である。
【図６】フィルター内蔵接続具を介して濃縮ベッセルと新しい培養ベッセルのヘッドを接続し、スフェロイドを小スフェロイドに微細化しながら分注する分注・微細化ステップを示し、（ａ）は濃縮ベッセルと第１の培養ベッセルのヘッドを接続した状態の断面図、（ｂ）は第１の培養ベッセルに１／ｎのスフェロイドを移し替えた状態の断面図、（ｃ）は第２の培養ベッセルに１／ｎのスフェロイドを移し替えた状態の断面図、（ｄ）は第ｎの培養ベッセルに１／ｎのスフェロイドを移し替えた状態の断面図である。
【図７】１／ｎのスフェロイドを移し替えた培養ベッセルに新しい培養液を追加する希釈ステップを示し、（ａ）は培養ベッセルのヘッドに培養液供給管を接続した状態の断面図、（ｂ）は培養ベッセルに培養液を注入した状態の断面図、（ｃ）はヘッドにキャップを装着するとともに、プランジャの軸部を分離した回転培養ベッセル態様の断面図である。
【図８】ベッセル間細胞液移送装置の全体斜視図である。
【図９】ベッセル間細胞液移送装置にベッセルをセットする状態を示す斜視図である。
【図１０】ベッセル間細胞液移送装置の部分縦断面図である。
【図１１】培養ベッセルから濃縮ベッセルに細胞液を移し替える場合のベッセル間細胞液移送装置の部分縦断側面図である。
【図１２】濃縮ベッセルから培養ベッセルに細胞液を移し替える場合のベッセル間細胞液移送装置の部分縦断側面図である。
【図１３】回転細胞培養装置の斜視図である。
【図１４】回転細胞培養装置の駆動機構を示す部分斜視図である。
【図１５】シリンジ（培養ベッセル）の他の実施形態を示す断面図である。
【図１６】接続具の他の実施形態を示す断面図である。
【図１７】第２実施形態の回転細胞培養装置を示す斜視図である。
【図１８】第２実施形態の回転細胞培養装置の分解斜視図である。
【図１９】第２実施形態の回転細胞培養装置の部分分解斜視図である。
【図２０】図１７のＸ−Ｘ線断面図である。
【図２１】第２実施形態の変形例の回転細胞培養装置の分解斜視図である。
【図２２】第２実施形態の回転細胞培養装置３台を取付けた構造の第３実施形態の回転細胞培養装置を示す斜視図である。
【図２３】第３実施形態の回転細胞培養装置の部分分解斜視図である。
【図２４】第４実施形態の回転細胞培養装置を示す斜視図である。
【図２５】図２４のＹ−Ｙ線断面図である。
【図２６】図２４のＺ−Ｚ線断面図である。
【図２７】駆動機構を示す部分斜視図である。
【図２８】７０μｍフィルター通過後の小スフェロイドの位相差像であり、（ａ）は低倍率の位相差像、は高倍率の位相差像を示している。
【図２９】図１５の小スフェロイドを培養後のスフェロイドの位相差像であり、（ａ）は低倍率の位相差像、（ｂ）は高倍率の位相差像を示している。
【図３０】１０ｍｌベッセルを用いたiPS細胞（253G1細胞）の３日間の回転培養後のスフェロイドの位相差像であり、（ａ）はmTeSR1培地での回転培養後のスフェロイドの位相差像、（ｂ）はAK02N培地での回転培養後のスフェロイドの位相差像である。
【図３１】１０ｍｌベッセルを用いたiPS細胞（409B2細胞）の３日間の回転培養後のスフェロイドの位相差像であり、（ａ）はmTeSR1培地での回転培養後のスフェロイドの位相差像、（ｂ）はAK02N培地での回転培養後のスフェロイドの位相差像である。
【図３２】連続継代培養実験における各継代（Ｐ１〜Ｐ１０）時の破砕した直後の小スフェロイドの位相差像である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明において「細胞」とは、培養細胞であり、ES細胞やiPS細胞の多能性幹細胞や接着性細胞である。本発明における細胞は、任意の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ウシなど）由来であってよいが、ヒト由来のiPS細胞であることがより好ましい。
【００２６】
細胞を懸濁する培地（培養液）は、それらの細胞の培養に適した培地であれば特に限定されない。培地には、FBS（ウシ胎仔血清）や、Antibiotic-Antimycotic等の抗生物質を添加してもよい。本発明における大量細胞培養システムで使用する培養液は、静置した場合に分散状態に混合させたスフェロイドが沈降して下部に溜まるような性質のものである。
【００２７】
本発明において「スフェロイド」とは、多数の細胞が凝集した細胞塊を指し、典型的には300μm以上、例えば300〜2000μmの直径を有する細胞塊を指す。また、本発明において「小スフェロイド」とは、比較的少数の細胞から構成される比較的サイズの小さな細胞塊を意味し、典型的には3〜1,000個程度の細胞塊、例えば5〜600細胞、10〜200細胞、30〜100細胞又は20〜40細胞の細胞塊が包含される。
【００２８】
次に、添付図面に示した実施形態に基づき、本発明を更に詳細に説明する。図１〜図７は本発明の培養に用いるベッセルとそれを用いた大量細胞培養手順を示し、図中符号１はシリンジ、２は培養ベッセル、３は濃縮ベッセル、４は接続具それぞれ示している。また、細胞若しくはスフェロイドを符号Ｓで示し、培養液を符号Ｍ、培養液に細胞若しくはスフェロイドが懸濁した状態の細胞液を符号ＳＭで示す。
【００２９】
前記シリンジ１は、図１に示すように、円筒形の外筒部５の両端に外形が同一円形のフロントフランジ６とバックフランジ７を一体的に設け、前記フロントフランジ６の中心部に設けた吐出口となるヘッド８は、標準的なルアーロック構造とし、プランジャ９の軸部１０の先端には前記外筒部５内に摺動可能に弾性嵌合するガスケット１１を設け、基端にプランジャボタン１２を設けた構造である。
【００３０】
ここで、前記プランジャ９の軸部１０は、先端側の短い軸部１０Ａと基端側の長い軸部１０Ｂとに分離可能な構造となっている。本実施形態では、前記軸部１０Ａの端部にメスネジ１０Ｃを設け、前記軸部１０Ｂの端部に前記メスネジ１０Ｃに螺合するオスネジ１０Ｄを形成し、係脱自在な構造を採用し、更に係脱時に前記軸部１０Ａと軸部１０Ｂとを相対的に回転させるために外面にノッチ１０Ｅをそれぞれ形成している。また、前記ガスケット１１の先端チップ１１Ａの形状を円錐形凸部とし、前記外筒部５の先端側内面、即ち前記フロントフランジ６の内面６Ａの形状は、前記先端チップ１１Ａを受け入れる円錐形凹部とし、外筒部５の内部の液体を残さずに吐出できるようにしている。また、前記フロントフランジ６の外面には、ルアーロック構造のステンレス製のヘッド８が一体的に形成されている。
【００３１】
ここで、テーパー形状とした前記内面６Ａの傾斜角度は、後述のように沈降させたスフェロイドを少量の培養液とともに前記ヘッド８から効率良く吐出させるために重要である。本発明では、図４に示すように、前記内面６Ａの傾斜角度αは、中心角で８０°〜１６０°の範囲に設定し、更に好ましくは９０°〜１５０°の範囲に設定している。前記内面６Ａの傾斜角度が大き過ぎると、軸を鉛直方向に向けてスフェロイドを沈降させる場合、該スフェロイドをヘッド８の吐出孔の近傍に集め難く、一方、前記内面６Ａの傾斜角度が小さ過ぎると、軸を水平に向けて回転培養する場合、該内面６Ａで誘起される培養液の角速度が半径によって異なるため、スフェロイドの偏りが生じる可能性があるとともに、該内面６Ａに近い部分の観察が難いという事態が生じる。尚、前記先端チップ１１Ａの形状は、本実施形態では円錐形凸部としたが、前記内面６Ａと同じ傾斜角度あるいはそれよりも大きな傾斜角度でもよく、また平面（１８０°）であってもよい。図１及び図４に示したシリンジ１は、前記内面６Ａの傾斜角度αが中心角で１５０°である。
【００３２】
前記シリンジ１は、オートクレーブ滅菌などの殺菌処理が可能な材質で作成されている。本実施形態では、前記外筒部５は、内部のスフェロイドの浮遊状態や沈降状態を観察するために、透明なパイレックスガラス、前記フロントフランジ６、バックフランジ７及びプランジャ９の軸部１０はステンレス、前記プランジャ９のガスケット１１はＰＴＦＥで作成されている。しかし、前記シリンジ１の材質は前述のものに限定されず、前記フロントフランジ６及びバックフランジ７を前記外筒部５と同じく、パイレックスガラスで作成し、あるいは透明な合成樹脂材で成形してもよい。合成樹脂で前記シリンジ１の外筒部５、フロントフランジ６、バックフランジ７を成形する場合、全体を一体成形してもよく、また複数の部分に分割して成形し、各部品を接着、熱融着又は超音波融着してもよい。
【００３３】
前記培養ベッセル２は、前記シリンジ１をそのまま用いるが、後述の回転細胞培養装置に装着して回転培養する際には、図７（ｃ）に示すように、前記ヘッド８にキャップＣを装着し、前記プランジャ９の軸部１０Ｂを分離した状態で使用する。本発明では、前記シリンジ１と培養ベッセル２は同義であり、区別無く使用するが、狭義において回転培養するための培養ベッセル２という場合には、図７（ｃ）に示す形態を指す。図１（ａ）に示した培養ベッセル２は、容量が５０ｍｌのものであり、前記フロントフランジ６とバックフランジ７の直径が５０ｍｍφ、フロントフランジ６とバックフランジ７の外形間寸法が９１ｍｍである。また、前記プランジャ９のストロークは約６０ｍｍである。前記培養ベッセル２は、前記ヘッド８をキャップＣで塞ぎ、前記プランジャ９のガスケット１１で囲まれた空間内に細胞を培養液に懸濁した細胞液を充填して回転培養するものである。
【００３４】
また、図１（ｂ）に示したシリンジ１は、図１（ａ）の前記シリンジ１と比較して、外筒部５とガスケット１１の径が小さく、容量が１０ｍｌである以外は全く同じ構造、外形寸法である。このシリンジ１は、本発明では濃縮ベッセル３として使用し、培養後のスフェロイドを培養ベッセル２から移し替えて他の新しい複数の培養ベッセル２に分注するために使用するが、勿論容量が小さな培養ベッセルとして使用することも可能である。この濃縮ベッセル３の構造は、前記培養ベッセル２と同様であるので、同一構成には同一符号を付して、その説明は省略する。
【００３５】
前記接続具４は、図２〜図４に示すように、前記培養ベッセル２と濃縮ベッセル３との間で、培養液を移し替える際に使用するものであり、両ベッセル２，３のそれぞれのヘッド８，８同士を接続できるものである。前記接続具４は、第１部材１３と第２部材１４とからなっている。第１部材１３は、中心に流路１５を設けるとともに、軸方向一端側に内部が中空のハウジング部１６を設け、該ハウジング部１６の内周にメスネジ部１７を設け、軸方向他端側に前記ヘッド８との接続部１８を設けたものである。第２部材１４は、中心に流路１９を設けるとともに、軸方向一端側に前記第１部材１３のメスネジ部１７に螺合するオスネジ部２０を設け、軸方向他端側に前記ヘッド８との接続部２１を設けたものである。そして、前記第２部材１４のオスネジ部２０の先端には、凹部２２を形成し、該凹部２２内にフィルター２３とパッキン２４及びスペーサー２５を積層して配置し、前記第１部材１３のメスネジ部１７に前記第２部材１４のオスネジ部２０を螺合した状態で、前記第１部材１３のハウジング部１６の半径方向内面と前記第２部材１４の凹部２２の半径方向内面との間に圧縮してシールする。前記パッキン２４とスペーサー２５には、前記流路１５，１９と連通する中心孔を有している。尚、図示しないが、前記フィルター２３を２枚のパッキン２４，２４で挟んでもよい。
【００３６】
前記フィルター２３は、生成したスフェロイドをより小さいサイズを有する小スフェロイドに破砕することができるろ過粒度を有するものを使用することができ、ろ過粒度４０〜１００μｍ、好ましくは６０〜８０μｍ、例えば７０μｍを有するものが好ましい。尚、フィルター通過による破砕で得られる小スフェロイドは一般的には細長い形状となる。スフェロイドは、フィルター２３を通して１回又は２回以上破砕してもよい。フィルター通過による破砕を２回以上行う場合、それぞれのフィルター通過の際に、ろ過粒度が同一のフィルター２３を用いてもよいし、ろ過粒度が異なるフィルター２３を用いてもよい。例えば、フィルター２３に通してスフェロイドを破砕した後、破砕されたスフェロイド（小スフェロイド）を、より大きなろ過粒度を有するフィルター２３に通してさらに破砕してもよく、それによって、得られる小スフェロイドの大きさ（とりわけ長径）をより狭い範囲に揃えることができる。本実施形態では、前記フィルター２３として、２００メッシュのステンレスフィルターを使用し、ろ過粒度は７０μｍである。
【００３７】
前記フィルター２３を内蔵した接続具４を使用することによって、ベッセルから他のベッセルへスフェロイドを含む細胞液を移し替えると同時に、該フィルター２３をスフェロイドが通過することによってろ過粒度に応じた大きさの小スフェロイドに破砕されるのである。尚、スフェロイドを破砕せずに、単に細胞液をベッセルから他のベッセルへ移し替えるだけの場合には、前記フィルター２３を除去した接続具４を使用すればよい。
【００３８】
次に、図５〜図７を用いて本発明の大量細胞培養システムの概要を説明する。最初に前記培養ベッセル２に所定数の細胞と培養液を注入し、１×１０４〜１×１０５細胞／cm３程度の細胞液を調製し、後述の回転細胞培養装置Ｂによる３日間の培養により細胞数が約５倍に増殖した後の処理を説明する。培養細胞として、iPS細胞（２５３Ｇ１）を選択し、mTeSR1(Y27632含有)培地を用い、得られたスフェロイドのALP染色、未分化マーカーのmRNA発現、フローサイトメトリーの結果から、iPS細胞としての未分化性を維持し、かつ三胚葉への分化能を有していることが確認されている。
【００３９】
先ず、図５に基づいて、培養後のスフェロイドを培養ベッセルから濃縮ベッセルへ移す細胞濃縮ステップを説明する。図５（ａ）に示すように、培養ベッセル２のプランジャ９の軸部１０Ａに、培養中に分離していた軸部１０Ｂを接続して、通常構造のシリンジとし、該培養ベッセル２のヘッド８からキャップＣを外してフィルター無しの前記接続具４の一方の接続部２１に接続するとともに、前記濃縮ベッセル３のヘッド８に該接続具４の他方の接続部１８を接続し、前記培養ベッセル２のヘッド８が下向きになるように配置して静置する。尚、前記接続具４は双方向で使用できる構造であるから、前記接続部１８を培養ベッセル２のヘッド８に、前記接続部２１を濃縮ベッセル３のヘッド８に接続してもよい。
【００４０】
図５（ａ）の状態で静置すると、前記培養ベッセル２のヘッド８側の下部にスフェロイドＳが沈殿する。この状態で、図５（ｂ）に示すように、前記培養ベッセル２のプランジャ９を押し込み方向へ前進させると同時に、前記濃縮ベッセル３のプランジャ９を引き抜き方向へ後退させ、前記培養ベッセル２内のスフェロイドＳの全量を培養液Ｍとともに前記濃縮ベッセル３に移し替える。前記濃縮ベッセル３の内部は、細胞数が約５倍に増殖した状態で容量が１／５になって濃縮状態の細胞液ＳＭとなる。
【００４１】
次に、図６に基づいて、フィルター内蔵接続具４を介して濃縮ベッセル３と新しい培養ベッセル２のヘッド８，８を接続し、スフェロイドを小スフェロイドに微細化しながら分注する分注・微細化ステップを説明する。図６（ａ）に示すように、濃縮状態の細胞液ＳＭが入った前記濃縮ベッセル３のヘッド８と、新しい第１の培養ベッセル２のヘッド８とを、フィルター内蔵の前記接続具４で接続する。そして、図６（ｂ）に示すように、前記濃縮ベッセル３のプランジャ９を押し込み方向へ前進させると同時に、前記培養ベッセル２のプランジャ９を引き抜き方向へ後退させ、前記濃縮ベッセル３内のスフェロイドＳが濃縮された細胞液ＳＭの１／５を前記培養ベッセル２に移し替える。同様に、図６（ｃ）に示すように、第２の新しい培養ベッセル２を接続して、前記濃縮ベッセル３内の細胞液ＳＭの１／５を前記培養ベッセル２に移し替える。そして、図６（ｄ）に示すように、第５の新しい培養ベッセル２を接続して、前記濃縮ベッセル３内の細胞液ＳＭの１／５を前記培養ベッセル２に移し替える。
【００４２】
この濃縮ベッセル３から培養ベッセル２にフィルター２３を通して細胞液ＳＭを移し替えると、スフェロイドはフィルター２３によって小スフェロイドに破砕される。尚、図５に示した細胞濃縮ステップにおいて、フィルター内蔵接続具４を用いることにより、このステップでもスフェロイドをフィルター２３によって小スフェロイドに破砕される。つまり、第２世代培養後、次のｎ＋１世代培養までに２回のフィルター処理を行うことができ、小スフェロドをより球形に近づけることができる。
【００４３】
次に、図７に基づいて、スフェロイドＳが濃縮された細胞液ＳＭの１／５を移し替えた培養ベッセル２に新しい培養液Ｍを追加する希釈ステップを説明する。図７（ａ）に示すように、分注・微細化ステップによって濃縮スフェロイドの１／５を含む細胞液ＳＭを移し替えた培養ベッセル２のヘッド８に培養液供給管２６を接続し、図７（ｂ）に示すように、プランジャ９を引き抜き方向へ後退させながら培養液Ｍを吸引し、新しい培養液Ｍを追加して希釈する。また、新しい培養液を前記培養ベッセル２に追加する他の方法として、新しい培養液が入ったシリンジ（図示せず）を用意し、該シリンジを接続具４を介して前記培養ベッセル２に接続し、該シリンジから培養液を注入してもよい。この場合、前述の細胞濃縮ステップ、分注・微細化ステップ及び希釈ステップの全てを、後述のベッセル間細胞液移送装置Ａを用いて閉鎖系で行うことができる。
【００４４】
最後に、濃縮スフェロイドを培養液で希釈した後、図７（ｃ）に示すように、前記培養ベッセル２のヘッド８にキャップＣを装着して閉鎖するとともに、前記プランジャ９の軸部１０Ｂを軸部１０Ａから分離し、回転細胞培養装置Ｂに装着できるように準備する。
【００４５】
次に、図８〜図１２に基づいて、本発明のベッセル間細胞液移送装置Ａを説明する。ベッセル間細胞液移送装置Ａは、二つのベッセルのヘッド８，８同士を接続具４で接続した状態で、外筒部５を固定し、具体的にはバックフランジ７を軸方向移動不能に保持し、プランジャボタン１２を把持してプランジャ９を軸方向へ駆動し、一定速度で所定量の液体を一方のベッセルから他方のベッセルに移し替えることができる自動化装置である。
【００４６】
前記ベッセル間細胞液移送装置Ａは、互いに同一鉛直方向に対向する第１機構２７と第２機構２８とを共通のベース部２９を設け、それぞれにベッセルを装着して、外筒部５を固定した状態で、プランジャ９を前進、後退駆動するのである。ここで、本発明において「前進」とはベッセルのヘッド８から液体を吐出する方向に進むことを意味し、「後退」とは外部から液体を吸引する方向に進むことを意味し、前進と逆に進むことを意味している。
【００４７】
本実施形態では、図８〜図１１に示すように、前記第１機構２７に前記培養ベッセル２を装着し、前記第２機構２８に前記濃縮ベッセル３を装着する例で説明する。具体的には、前記第１機構２７には、前記培養ベッセル２の外筒部５を固定する固定部３０とプランジャ９を進退駆動する可動部３１と、該可動部３１を駆動する駆動機構部３２とを備えている。一方、前記第２機構２８にも、前記濃縮ベッセル３の外筒部５を固定する固定部３３とプランジャ９を進退駆動する可動部３４と、該可動部３４を駆動する駆動機構部３５とを備えている。ここで、前記第１機構２７の可動部３１と駆動機構部３２は、前記第２機構２８の可動部３４と駆動機構部３５と同一構造であり、互いに上下反転したものとなっている。前記第１機構２７の可動部３１と、前記第２機構２８の可動部３４は、前記接続具４を流れる流量が一致するように、それぞれのベッセルの断面積に応じて同調して進退駆動される。
【００４８】
図１０及び図１１は、図８に示した保護カバー類３６を全て取り去って内部構造を示したものである。前記ベース部２９は、図１０に示すように、水平なベース板３７の上面の中央部に垂直な支持板３８を立起状態で固定するとともに、該支持板３８の背面側の両側縁に沿って補強板３９，３９を立設し、前記ベース板３７と支持板３８に固定し、平面視コ字形の剛性の高い構造となっている。
【００４９】
そして、前記支持板３８の前面上部には、前記駆動機構部３２を構成する上下方向に延びたリニアガイド４０と、該リニアガイド４０に沿って設けたリニアアクチュエータ４１が配置されている。そして、前記リニアガイド４０に前記可動部３１を上下移動可能に保持するとともに、前記リニアアクチュエータ４１で前記可動部３１を駆動している。前記リニアガイド４０は、２本の平行なガイドレール４２，４２で構成し、前記可動部３１がガイドレール４２，４２に沿って移動する可動ブロック４３，４３を背面に備えたステージ４４の上に固定されている。前記リニアアクチュエータ４１は、ステッピングモータやサーボモータ等の回転数を制御可能な駆動モータ４５で回転駆動される送りネジ機構４６で構成している。前記送りネジ機構４６のネジ軸４６Ａが前記ガイドレール４２，４２の間に平行に配置され、該ネジ軸４６Ａに螺進退可能に連係したナット部材４６Ｂを前記ステージ４４の背面に固定している。尚、送りネジ機構４６の代わりに更に精度の高いボールネジを用いてもよい。
【００５０】
一方、前記支持板３８の前面下部には、前記駆動機構部３５を構成する上下方向に延びたリニアガイド４７と、該リニアガイド４７に沿って設けたリニアアクチュエータ４８が配置されている。そして、前記リニアガイド４７に前記可動部３４を上下移動可能に保持するとともに、前記リニアアクチュエータ４８で前記可動部３４を駆動している。前記リニアガイド４７は、２本の平行なガイドレール４９，４９で構成し、前記可動部３４がガイドレール４９，４９に沿って移動する可動ブロック５０，５０を背面に備えたステージ５１の上に固定されている。前記リニアアクチュエータ４８は、ステッピングモータやサーボモータ等の回転数を制御可能な駆動モータ５２で回転駆動される送りネジ機構５３で構成している。前記送りネジ機構５３のネジ軸５３Ａが前記ガイドレール４９，４９の間に平行に配置され、該ネジ軸５３Ａに螺進退可能に連係したナット部材５３Ｂを前記ステージ５１の背面に固定している。この場合も、送りネジ機構５３の代わりに更に精度の高いボールネジを用いてもよい。
【００５１】
前記第１機構２７の固定部３０と前記第２機構２８の固定部３３は、前記支持板３８の表面側に間隔を置いて平行に固定した共通の固定ステージ５４に直接又は間接的に取付けて設けている。本実施形態では、前記固定部３３は、前記固定ステージ５４の下部に直接取付け、前記固定部３０は、前記固定ステージ５４の上部に設けた上下方向に移動可能となした可動ステージ５５上に取付け、更に前記固定部３３に対して間隔調整具５６を介して前記固定部３０に連結している。前記間隔調整具５６は、ネジ機構によって伸縮する機構であり、前記固定部３０は前記間隔調整具５６と固定部３３を介して前記固定ステージ５４に固定されている。前記間隔調整具５６を設ける理由は、前記接続具４の寸法や、前記ベッセルのヘッド８に対する当該接続具４の接続深さの誤差を吸収するためである。
【００５２】
前記第１機構２７の可動部３１は、前記ステージ４４上に設けられ、該ステージ４４に対して前記プランジャ９のプランジャボタン１２を保持するプランジャ保持部５７を、上下方向に位置を微調整して固定できるようになっている。具体的には、前記ステージ４４の表面に調整板５８を接合状態で、ピン５９とスリット溝６０とで上下方向に移動案内し、該調整板５８の中心に開口した上下方向に延びた長孔６１を通して締付ネジ６２を前記ステージ４４に螺合した構造である。前記締付ネジ６２に設けたハンドル６３を持って手動で簡単に締め付け、緩めることができるようになっている。ここで、前記プランジャ保持部５７は、図９に示すように、前記プランジャボタン１２を前面側から係合する係合凹部６４で構成している。
【００５３】
また、同様に、前記第２機構２８の可動部３４は、前記ステージ５１上に設けられ、該ステージ５１に対して前記プランジャ９のプランジャボタン１２を保持するプランジャ保持部６５を、上下方向に位置を微調整して固定できるようになっている。具体的には、前記ステージ５１の表面に調整板６６を接合状態で、ピン６７とスリット溝６８とで上下方向に移動案内し、該調整板６６の中心に開口した上下方向に延びた長孔６９を通して締付ネジ７０を前記ステージ５１に螺合した構造である。前記締付ネジ７０に設けたハンドル７１を持って手動で簡単に締め付け、緩めることができるようになっている。ここで、前記プランジャ保持部６５は、図９に示すように、前記プランジャボタン１２を前面側から係合する係合凹部７２で構成している。
【００５４】
前記第１機構２７の固定部３０には、前記培養ベッセル２の外筒部５を保持する外筒部保持部７３を設けている。具体的には、前記外筒部保持部７３は、図９に示すように、外筒部５を受け入れるＵ字状凹部７４と、前記フロントフランジ６を嵌合するフランジ嵌合溝７５と、前記フロントフランジ６を外側から押さえて保持する保持部材７６とからなる。前記保持部材７６は、一端を水平回動可能に保持するとともに、他端を弾性的にフック７７で係脱できるように構成している。ここで、前記外筒部保持部７３は、前記バックフランジ７も同時に保持できるようにすることも好ましい。
【００５５】
また、同様に、前記第２機構２８の固定部３３には、前記濃縮ベッセル３の外筒部５を保持する外筒部保持部７８を設けている。具体的には、前記外筒部保持部７８は、図９に示すように、外筒部５を受け入れるＵ字状凹部７９と、前記フロントフランジ６を嵌合するフランジ嵌合溝８０と、前記フロントフランジ６を外側から押さえて保持する保持部材８１とからなる。前記保持部材８１は、一端を水平回動可能に保持するとともに、他端を弾性的にフック８２で係脱できるように構成している。ここで、前記外筒部保持部７８は、前記バックフランジ７も同時に保持できるようにすることも好ましい。
【００５６】
また、図示しないが、安全のためとホームポジションを決定するために、各可動部の可動範囲を制限するリミット機構が設けられている。リミット機構は、固定部分に設けた近接センサと、可動部分に設けた規制片とで構成し、規制片を近接センサが検出すると、前記駆動モータ４５，５２を強制停止するようになっている。更に、前記ベース板３７の下面にゴム製の接地パッド８３，…を設けるとともに、前記補強板３９，３９の端縁にもゴム製の接地パッド８４，…を設け、当該ベッセル間細胞液移送装置Ａを水平に倒した状態でも使用できるようにしている。尚、下側の濃縮ベッセル３を単純な容器とし、培養ベッセル２からフィルトレーションしてスフェロイドを小スフェロイドに破砕しながら容器に移し替えることも可能である。つまり、前記ベッセル間細胞液移送装置Ａの第１機構２７のみを備えた装置でも、フィルトレーション作業は可能である。
【００５７】
以上のように構成した前記ベッセル間細胞液移送装置Ａに、前記培養ベッセル２と濃縮ベッセル３を装着するには、図９に示すように、先ず前記培養ベッセル２と濃縮ベッセル３のヘッド８，８同士を前記接続具４で連結しておき、前記保持部材７６，８１は解放するとともに、前記締付ネジ６２，７０を緩めておいた状態で、前記培養ベッセル２のフロントフランジ６をフランジ嵌合溝７５に嵌合するとともに、前記プランジャボタン１２を係合凹部６４に係合し、前記濃縮ベッセル３のフロントフランジ６をフランジ嵌合溝８０に嵌合するとともに、前記プランジャボタン１２を係合凹部７２に係合し、それから前記保持部材７６，８１を閉じてそれぞれフロントフランジ６を保持する。それから、前記締付ネジ６２，７０を締め付けてセットする。
【００５８】
図８及び図１１に示した状態は、図５（ａ）に示した状態に対応する。暫くこの状態を維持して、前記培養ベッセル２の内部でスフェロイドを沈殿させる。それから、前記第１機構２７の駆動モータ４５と前記第２機構２８の駆動モータ５２を回転駆動して、前記可動部３１を前進させて前記培養ベッセル２のプランジャ９を押し込むと同時に、前記可動部３４を後退させて前記濃縮ベッセル３のプランジャ９を引き抜き方向へ移動させ、スフェロイドが濃縮された細胞液を濃縮ベッセル３に移し替えるのである。
【００５９】
また、スフェロイドが濃縮された細胞液を入れた濃縮ベッセル３から新しい培養ベッセル２に細胞液を分注するには、図１２に示すように、当該濃縮ベッセル３に新しい培養ベッセル２を、フィルター内蔵接続具４を介して接続した状態で、前記同様に前記ベッセル間細胞液移送装置Ａに装着する。図１２に示した状態は、図６（ａ）に示した状態に対応する。この場合も、前記第１機構２７の駆動モータ４５と前記第２機構２８の駆動モータ５２を回転駆動して、前記可動部３１を前進させて前記濃縮ベッセル３のプランジャ９を押し込み方向へ前進させると同時に、前記可動部３４を後退させて前記培養ベッセル２のプランジャ９を引き抜き方向へ後退させ、前記濃縮ベッセル３内のスフェロイドが濃縮された細胞液を所定量だけ前記培養ベッセル２に移し替える。
【００６０】
最後に、図１３及び図１４に基づいて、前記回転細胞培養装置Ｂを説明する。この回転細胞培養装置Ｂは、図７（ｃ）に示した状態の培養ベッセル２を複数同時に回転させることができるものである。本実施形態の回転細胞培養装置Ｂは、同時に４つの培養ベッセル２，…を所定速度で回転し、擬微小重力環境下で細胞を浮遊状態で培養できるようにしている。また、本発明の回転細胞培養装置Ｂは、温度調節機能を備えたインキュベータ内に設置して使用できるように、コンパクトに設計されている。
【００６１】
本発明において、「擬微小重力環境」とは、宇宙空間等における微小重力環境を模して人工的に作り出された微小重力（simulated microgravity）環境を意味する。こうした擬微小重力環境は、例えば、回転で生じる応力によって地球の重力を相殺することにより実現される。本発明の前記回転細胞培養装置Ｂは、培養ベッセルの回転速度を制御し、該培養ベッセル内のスフェロイドの重力、浮力と回転による培養液の流れから受ける力をバランスさせ、時間平均すると地上重力の１／１０〜１／１００程度という擬微小重力環境を作り出し、スフェロイドが沈降せず一定領域でふわふわと浮いた状態を実現する装置である。
【００６２】
前記回転細胞培養装置Ｂは、前記培養ベッセル２のフロントフランジ６とバックフランジ７の下部をそれぞれ一対の駆動ローラ８５，８５と従動ローラ８６，８６で回転可能に支持するとともに、フロントフランジ６とバックフランジ７の半径方向外側面を規制ローラ８７，８７で当て止めし、軸方向へずれないようにしている。この規制ローラ８７は、本発明における規制部である。
【００６３】
具体的には、内部に制御回路を組み込んだ基台８８の上面の中央部に、駆動機構８９を内蔵した中央ブロック９０と、該中央ブロック９０に対して前記培養ベッセル２のフロントフランジ６とバックフランジ７を受け入れるだけの最小限の間隔を隔てて側部ブロック９１，９１を突設し、前記中央ブロック９０の両側に４対の駆動ローラ８５，８５を側設するとともに、該駆動ローラ８５，８５に対抗する位置の側部ブロック９１，９１にそれぞれ２対の前記従動ローラ８６，８６を側設している。前記駆動ローラ８５と従動ローラ８６は共に水平で同一方向を向いた回動軸９２，９３を備えている。また、前記規制ローラ８７は、前記側部ブロック９１の上面中央部に突設した突出部９４の両端に、前記回動軸９２，９３と直交する水平な回転軸９５を備えている。ここで、前記従動ローラ８６，８６は、前記培養ベッセル２のフロントフランジ６とバックフランジ７の一方を安定に載支し、該培養ベッセル２の回転に伴って自由に回転する。また、前記規制ローラ８７は、前記フロントフランジ６とバックフランジ７の半径方向外面が接触したときにのみ従動回転し、前記フロントフランジ６とバックフランジ７が駆動ローラ８５，８５及び従動ローラ８６，８６から脱落しないように姿勢を保つものである。
【００６４】
図１４に示すように、前記駆動機構８９は、平行に配置した４本の回転軸９２，…の中央部に、それぞれプーリ９６，…を固定し、それぞれ対となった回転軸９２，９２のプーリ９６，９６にベルト、好ましくはタイミングベルト９７を巻回し、更に異なる対である中央部の２本の回転軸９２，９２に固定したプーリ９８，９８と、一つの駆動モータ９９の駆動軸１００に固定したプーリ１０１とにベルト、好ましくはタイミングベルト１０２を巻回し、全ての駆動ローラ８５，…が同じ方向に回転するように駆動する。尚、４本の回転軸９２，…の両端に前記駆動ローラ８５，…が固定されているので、一つの駆動モータ９９で４つの培養ベッセル２，…を軸回りに回転させて、内部の細胞を浮遊培養できるようになっている。尚、前記駆動モータ９９の回転数を調節するためと、電源スイッチを兼ねた回転数調整つまみ１０３を前記基台８８の側面に設けてある。
【００６５】
前述の駆動機構８９は拡張性があり、更に多数の培養ベッセル２を同時に回転培養することができるように構成することが可能である。また、前記フロントフランジ６とバックフランジ７の寸法を共通化することにより、外筒部５の直径が異なっても、つまり容量が異なっても同じ回転細胞培養装置Ｂで回転培養することが可能である。また、本発明の大量細胞培養システムに用いる場合には、継代培養によって培養ベッセル２の本数が多数になるので、それに応じて使用する回転細胞培養装置Ｂの台数も増えるので、安価なものを採用する必要がある。
【００６６】
図１５は、前記培養ベッセル２又は前記濃縮ベッセル３として使用する他の実施形態のシリンジ１Ａを示している。前記シリンジ１Ａは、前記同様に円筒形の外筒部５の両端に外形が同一円形のフロントフランジ６とバックフランジ７を一体的に設け、前記フロントフランジ６側の外筒部５の端部に、中心部に設けた吐出口となるヘッド８は、標準的なルアーロック構造とし、またプランジャ９の短い軸部１０Ａの先端には前記外筒部５内に摺動可能に弾性嵌合するガスケット１１を設け、短い軸部１０Ａの他端部にメスネジ１０Ｃを設けた構造である。図１５に示したシリンジ１は、前記内面６Ａの傾斜角度αが中心角で９０°である。
【００６７】
尚、前記シリンジ１Ａは、前記外筒部５とバックフランジ７及びルアーロック構造のヘッド８を合成樹脂で一体成形し、前記フロントフランジ６を前記外筒部５の端部に半径方向からのネジ１０４で締め付けて固定した構造であるが、該フロントフランジ６を合成樹脂の成形品とし、前記外筒部５の端部に接着、熱融着若しくは超音波融着しても良い。また、ネジ１０４による機械的固定手段を用いる場合には、前記フロントフランジ６を金属で切削により作製しても良い。図１５に示したシリンジ１Ａは、容量が１０ｍｌ用であるが、５０ｍｌ用も基本的には同じ構造である。
【００６８】
図１６には、他の実施形態の前記接続具４Ａを示している。本実施形態の前記接続具４は、第１部材１０５と第２部材１０６とからなっている。第１部材１０５は、中心に流路１５を設けるとともに、軸方向一端側にフィルター２３を保持する支持面１０７を設け、軸方向他端側に前記ヘッド８との接続部１８を設けたものである。第２部材１０６は、中心に流路１９を設けるとともに、軸方向一端側に前記第１部材１０５の支持面１０７と接合する支持面１０８を設け、軸方向他端側に前記ヘッド８との接続部２１を設けたものである。そして、第１部材１０５の支持面１０７の周囲に形成したフランジ部１０９を、前記第２部材１０６の支持面１０８の周囲に設けたフランジ部１１０の凹部１１１に嵌合する。前記第１部材１０５の支持面１０７と前記第２部材１０６の支持面１０８の間に、前記フィルター２３を挟み込み、前記第１部材１０５の前記フランジ部１０９と前記第２部材１０６のフランジ部１１０とを超音波溶着して一体化する。ここで、前記流路１５、１９は直径が２ｍｍであり、前記フィルター２３も直径２ｍｍの領域でスフェロイドをフィルトレーションする。つまり、前記スフェロイドによって前記フィルター２３の有効面の全面が覆われた状態で、前記流路１５と流路１９に圧力差を与えることで、培養液の通過を最小限に抑制することができる。
【００６９】
図１７は、前記回転細胞培養装置Ｂ１を示している。本実施形態の回転細胞培養装置Ｂ１は、一つの培養ベッセル２を、軸が水平な姿勢で所定の回転速度で回転可能な装置である。
前記培養ベッセル２のフロントフランジ６とバックフランジ７の下部をそれぞれ一対のローラで回転可能に支持するが、本実施形態では一側を駆動ローラ１１２と従動ローラ１１３の対、他側を従動ローラ１１４，１１４の対で支持する。具体的には、基台１１５の上面の中央部に中央ブロック１１６を固定するとともに、側部に側部ブロック１１７を固定し、各ブロックの対向面側に設けた凹部１１８に前記培養ベッセル２のフロントフランジ６とバックフランジ７の下部を受け入れることができるようにしている。前記中央ブロック１１６には、本体を該中央ブロック１１６に固定した駆動モータ１２０も駆動軸１２１に直結した前記駆動ローラ１１２と、自由回転する従動ローラ１１３とを前記凹部１１８の底部に並設している。一方、前記側部ブロック１１７には、自由回転する従動ローラ１１４，１１４を前記凹部１１８の底部に並設している。
【００７０】
また、前記中央ブロック１１６と側部ブロック１１７の凹部１１８の立壁部には、前記培養ベッセル２の軸方向への変位を規制するためのボールプランジャ１２２，１２２を埋設している。通常は、前記ボールプランジャ１２２と前記フロントフランジ６又はバックフランジ７の外側面との間には微小間隙を設け、負荷なく培養ベッセル２が回転できるようになっている。このボールプランジャ１２２は、本発明における規制部である。そして、前記基台１１５の下面の一側には、固定脚１２３を着脱自在に設けるとともに、他側には上下高さを調節可能なアジャスター１２４を着脱自在に設けている。更に、前記基台１１５には、水準器１２５を内蔵している。
【００７１】
図２１は、前記回転細胞培養装置Ｂ１の改良版であり、前記中央ブロック１１６が基台１１５の他端まで延び、内部に前記駆動モータ１２０を格納する空間を設け、駆動部を前記基台１１５と中央ブロック１１６とで密閉状態に格納した構造である。
【００７２】
図２２及び図２３は、前記回転細胞培養装置Ｂ１を３台、共通の基台１２６の上に並べて着脱自在に取付けた構造の回転細胞培養装置Ｂ２を示している。この場合、前記回転細胞培養装置Ｂ１の固定脚１２３とアジャスター１２４を取り去り、それらを取付けていた螺孔を利用して前記基台１２６の上面にネジ止めする。そして、前記基台１２６の四隅にアジャスター１２７，…を取り付けて水位調節を行うことができるようにしている。尚、前記アジャスター１２７は、前記回転細胞培養装置Ｂ１から外したアジャスター１２４を利用してもよく、更に一部のアジャスター１２７の代わりに前記固定脚１２３を用いてもよい。
【００７３】
図２４〜図２７は、前記回転細胞培養装置Ｂの変形例であり、３つの培養ベッセル２を同じ培養条件で同時に回転培養することができる回転細胞培養装置Ｂ３を示す。基本的には、前述の回転細胞培養装置Ｂ２と同じ使い方が可能である。本実施形態の回転細胞培養装置Ｂ３は、基台１２８の上面に駆動機構を内蔵した駆動側ブロック１２９と対向ブロック１３０とを対向させて固定している。前記駆動側ブロック１２９には、二つの駆動ローラ１３１，１３１を並設するとともに、更にその外側に従動ローラ１３２，１３２を並設し、中央部の二つの駆動ローラ１３１，１３１に中央部の培養ベッセル２のバックフランジ７を載支し、外側の従動ローラ１３２と一方の駆動ローラ１３１に外側の培養ベッセル２のバックフランジ７を載支する。二つの駆動ローラ１３１，１３１は同じ方向に同調して回転するようになっている。一方、前記対向ブロック１３０には、前記駆動ローラ１３１，１３１と対向した位置に同じ大きさの従動ローラ１３３，１３３を設けるとともに、前記駆動ローラ１３１，１３１と対向した位置に同じ大きさの従動ローラ１３４，１３４を設けている。本実施形態でも、前記凹部１１８と同様な凹部１３５を前記駆動側ブロック１２９と対向ブロック１３０に設けてあり、その立壁部に培養ベッセル２の軸方向の変位を制限するためにボールプランジャ１３６を各フランジ６，７に対応させて設けている。
【００７４】
前記駆動ローラ１３１，１３１の駆動機構は、図２７に示すように、前記基台１２８の下方に設けたボックス１３７内に駆動モータ１３８を配置し、該駆動モータ１３８の駆動軸１３９に固定したプーリ１４０と、前記駆動ローラ１３１，１３１の各回転軸１４１に固定したプーリ１４２とにタイミングベルト１４３を巻回し、両駆動ローラ１３１，１３１を同じ方向に回転駆動するようになっている。尚、前記ボックス１３７内には、前記駆動モータ１３８の制御部を内蔵し、前記培養ベッセル２の回転速度を制御するとともに、下端にはアジャスター１４４，１４４を設けて水平調整できるようになっている。
【実施例１】
【００７５】
以下に示す手順で本発明の有効性を検証実験した。先ず、容量５０ｍｌの培養ベッセルに所定細胞数のiPS細胞（253G1）を培養液（mTeSR1）とともに入れ、前記回転細胞培養装置Ｂで３日間回転培養した。そして、前記ベッセル間細胞液移送装置Ａを用いて、容量１０ｍｌの濃縮ベッセルに全ての球状スフェロイドを集めて移し替えた。それから、前記ベッセル間細胞液移送装置Ａを用いて、濃縮ベッセルから球状スフェロイドを、７０μｍフィルターを通すことにより破砕した小スフェロイドを新しい５０ｍｌ培養ベッセルに移し替えた。図２８は、この小スフェロイドの位相差像であり、図２８（ａ）は低倍率の位相差像（図中のバーは１０００μｍ）、図２８（ｂ）は高倍率の位相差像（図中のバーは５００μｍ）を示している。フィルトレーション後の小スフェロイドは、やや長細い形状であることが分かる。
【００７６】
次に、前述の小スフェロイドに培養液を追加して希釈し、さらに３日間回転培養した。図２９は小スフェロイドを培養後のスフェロイドの位相差像であり、図２９（ａ）は低倍率の位相差像（図中のバーは１０００μｍ）、図２９（ｂ）は高倍率の位相差像（図中のバーは５００μｍ）を示している。この結果、培養後には球形のスフェロイドに増殖し、正常なスフェロイドの状態の細胞を維持していることがわかり、本発明のベッセル間細胞液移送装置Ａでもマニュアルによるフィルタリングと同様な結果を得ることができた。
【００７７】
そして、本発明の大量細胞培養システムでは、継代８回までは安定に未分化状態を維持し、増殖率３〜５倍で増殖し続けることが分かった。初期の細胞投入数にもよるが、１０９〜１０１０オーダーの細胞数まで大量培養するには、増殖率３〜５倍の継代６回程度で達成できることが分かる。本発明による大量細胞培養システムを用いて、継代１０回まで実施可能であることが確認されている。
【００７８】
以下の実施例ではヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）として253G1細胞並びに409B2細胞を用いた。253G1細胞（Oct3/4、Sox2、及びKlf4導入; 非特許文献２参照）は細胞番号HPS0002の下で、409B2細胞（Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Lin28、及びp53 shRNA導入；非特許文献４参照）は細胞番号HPS0076の下で、理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室（RIKEN BRC CELL BANK）（日本）より購入した。
【実施例２】
【００７９】
＜シリンジ型培養ベッセルを用いた３次元培養によるヒト人工多能性幹細胞（hiPSC；253G1細胞）からのスフェロイド作製＞
（１）球状スフェロイドの構築
253G1細胞は、マトリゲル（BD MatrigelTM, BD Biosciences）をコートした６ｃｍ又は１０ｃｍ培養ディッシュを用いて、ヒトES/iPS細胞維持用培地mTeSR1（STEM CELL TECHNOLOGIES）またはStemFit AK02N（Ajinomoto）中で培養し、隔日培養液交換を行い、5mM EDTAを用いて継代維持した。３次元培養を行うため、播種に用いる253G1細胞を、5mM EDTAを用いておよそ２０〜４０細胞からなる小スフェロイド（直径およそ５０μｍ〜２００μｍのルーズな細胞塊）に剥離した。５×１０５細胞の剥離した253G1細胞（小スフェロイド）を、シリンジ型１０ｍｌベッセル中、ROCK（ロック; Rho-associated kinase; Rho結合キナーゼ）インヒビターY27632（WAKO Pure Chemicals、10μM）含有mTeSR1培地（１０ｍｌ）、またはROCKインヒビターY27632含有StemFit AK02N培地（１０ｍｌ）に播種し、回転細胞培養装置を用いて３７℃、６ｒｐｍで３日間回転培養した。培養後、培養液中に生成した球状スフェロイドの位相差像を倒立顕微鏡EVOS（ThermoFisher）を用いて撮影した（図３０参照）。図３０は、１０ｍｌベッセルを用いたiPS細胞（253G1細胞）の３日間の回転培養後のスフェロイドの位相差像であり、図３０（ａ）はmTeSR1培地での回転培養後のスフェロイドの位相差像、図３０（ｂ）はAK02N培地での回転培養後のスフェロイドの位相差像である。図中の白いバーは２００μｍを示す。得られた球状スフェロイドは、約５０個で主な大きさは直径２００〜４００μｍであった。
【実施例３】
【００８０】
＜シリンジ型培養ベッセルを用いた３次元培養によるヒト人工多能性幹細胞（hiPSC；409B2細胞）からのスフェロイド作製＞
409B2細胞は、マトリゲル（BD MatrigelTM, BD Biosciences）をコートした６ｃｍ又は１０ｃｍ培養ディッシュを用いて、ヒトES/iPS細胞維持用培地mTeSR1（STEM CELL TECHNOLOGIES）またはStemFit AK02N（Ajinomoto）中で培養し、隔日培養液交換を行い、5mM EDTAを用いて継代維持した。３次元培養を行うため、播種に用いる409B2細胞を、5mM EDTAを用いておよそ20〜40細胞からなる小スフェロイド（直径およそ５０μｍ〜２００μｍのルーズな細胞塊）に剥離した。５×１０５細胞の剥離した409B2細胞（小スフェロイド）を、シリンジ型１０ｍｌベッセル中、ROCKインヒビターY27632含有mTeSR1培地（１０ｍｌ）、またはROCKインヒビターY27632含有StemFit AK02N培地（１０ｍｌ）に播種し、回転細胞培養装置を用いて３７℃、６ｒｐｍで３日間回転培養した。培養後、培養液中に生成した球状スフェロイドの位相差像を倒立顕微鏡EVOS（ThermoFisher）を用いて撮影した（図３１参照）。図３１は、１０ｍｌベッセルを用いたiPS細胞（409B2細胞）の３日間の回転培養後のスフェロイドの位相差像であり、図３１（ａ）はmTeSR1培地での回転培養後のスフェロイドの位相差像、図３１（ｂ）はAK02N培地での回転培養後のスフェロイドの位相差像である。図中の白いバーは２００μｍを示す。得られた球状スフェロイドは、約５０個で主な大きさは直径２００〜４００μｍであった。
【実施例４】
【００８１】
＜連続継代培養試験＞
本実施例では連続継代培養試験を行った。その手順は模式的に図５〜図７に示した通りである。つまり、培養ベッセルに用いて回転培養し、継代間に前記ベッセル間細胞液移送装置Ａを用いてフィルトレーションと同時に新しい培養ベッセルに小スフェロイドを移した。
実施例２に記載の方法に従い、5mM EDTAを用いて小スフェロイドに剥離した253G1細胞（5x105個）をシリンジ型１０ｍｌベッセルに播種し、10μM ROCKインヒビターY27632含有StemFit AK02N培地中で回転培養装置を用いて３日間回転培養し、球状スフェロイドを作製した。続いて、回転培養で使用したシリンジ型１０ｍｌベッセルをフィルター内蔵接続部及び回収用シリンジ型１０ｍｌベッセルと接続し、ベッセル間細胞液移送装置を用いた。フィルターを通すことで球状スフェロイドを小スフェロイドに砕いた。得られた小スフェロイドへ、新しい培地を充填し、回転細胞培養装置を用いて３７℃、６ｒｐｍで４日間回転培養し、球状スフェロイドを作製した。その後、フィルター内蔵接続部及びベッセル間細胞液移送装置を用いた破砕、培地の充填、４日日間の培養を１０回繰り返した（連続継代培養）。各継代時の破砕した直後の小スフェロイドの位相差像を図３２に示す。各培養期間において毎回球状スフェロイドを得ることができた。それらの主な直径は２００〜４００μｍであり、最大では直径７００μｍを超すものもできた。各破砕時の小スフェロイドは、同じような棒状の形態をしていた。トータルの培養日数４０日間で、コンタミネーションを起こすことはなかった。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明は、再生医療等に用いるために、多能性幹細胞、特にiPS細胞や接着性細胞を効率よく、低コストで大量培養するのに利用できる。
【符号の説明】
【００８３】
Ａ  ベッセル間細胞液移送装置、
Ｂ、Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３  回転細胞培養装置、
Ｃ  キャップ、
Ｍ  培養液、
Ｓ  スフェロイド、
ＳＭ  細胞液、
１  シリンジ、                ２  培養ベッセル、
３  濃縮ベッセル、            ４  接続具、
５  外筒部、                  ６  フロントフランジ、
７  バックフランジ、          ８  ヘッド、
９  プランジャ、              １０  軸部、
１０Ａ  軸部、                １０Ｂ  軸部、
１０Ｃ  メスネジ、            １０Ｄ  オスネジ、
１０Ｅ  ノッチ、              １１  ガスケット、
１２  プランジャボタン、      １３  第１部材、
１４  第２部材、              １５  流路、
１６  ハウジング部、          １７  メスネジ部、
１８  接続部、                １９  流路、
２０  オスネジ部、            ２１  接続部、
２２  凹部、                  ２３  フィルター、
２４  パッキン、              ２５  スペーサー、
２６  培養液供給管、          ２７  第１機構、
２８  第２機構、              ２９  ベース部、
３０  固定部、                ３１  可動部、
３２  駆動機構部、            ３３  固定部、
３４  可動部、                ３５  駆動機構部、
３６  保護カバー類、          ３７  ベース板、
３８  支持板、                ３９  補強板、
４０  リニアガイド、          ４１  リニアアクチュエータ、
４２  ガイドレール、          ４３  可動ブロック、
４４  ステージ、              ４５  駆動モータ、
４６  送りネジ機構、          ４６Ａ  ネジ軸、
４６Ｂ  ナット部材、          ４７  リニアガイド、
４８  リニアアクチュエータ、  ４９  ガイドレール、
５０  可動ブロック、          ５１  ステージ、
５２  駆動モータ、            ５３  送りネジ機構、
５３Ａ  ネジ軸、              ５３Ｂ  ナット部材、
５４  固定ステージ、          ５５  可動ステージ、
５６  間隔調整具、            ５７  プランジャ保持部、
５８  調整板、                ５９  ピン、
６０  スリット溝、            ６１  長孔、
６２  締付ネジ、              ６３  ハンドル、
６４  係合凹部、              ６５  プランジャ保持部、
６６  調整板、                ６７  ピン、
６８  スリット溝、            ６９  長孔、
７０  締付ネジ、              ７１  ハンドル、
７２  係合凹部、              ７３  外筒部保持部、
７４  Ｕ字状凹部、            ７５  フランジ嵌合溝、
７６  保持部材、              ７７  フック、
７８  外筒部保持部、          ７９  Ｕ字状凹部、
８０  フランジ嵌合溝、        ８１  保持部材、
８２  フック、                ８３  接地パッド、
８４  接地パッド、            ８５  駆動ローラ、
８６  従動ローラ、            ８７  規制ローラ（規制部）、
８８  基台、                  ８９  駆動機構、
９０  中央ブロック、          ９１  側部ブロック、
９２  回転軸、                ９３  回動軸、
９４  突出部、                ９５  回転軸、
９６  プーリ、                ９７  タイミングベルト、
９８  プーリ、                ９９  駆動モータ、
１００  駆動軸、              １０１  プーリ、
１０２  タイミングベルト、    １０３  回転数調整つまみ、
１０４  ネジ、                １０５  第１部材、
１０６  第２部材、            １０７  支持面、
１０８  支持面、              １０９  フランジ部、
１１０  フランジ部、          １１１  凹部、
１１２  駆動ローラ、          １１３  従動ローラ、
１１４  従動ローラ、          １１５  基台、
１１６  中央ブロック、        １１７  側部ブロック、
１１８  凹部、                １２０  駆動モータ、
１２１  駆動軸、              １２２  ボールプランジャ（規制部）、
１２３  固定脚、              １２４  アジャスター、
１２５  水準器、              １２６  基台、
１２７  アジャスター、        １２８  基台、
１２９  駆動側ブロック、      １３０  対向ブロック、
１３１  駆動ローラ、          １３１  駆動ローラ、
１３２  従動ローラ、          １３２  従動ローラ、
１３３  従動ローラ、          １３４  従動ローラ、
１３５  凹部、                １３６  ボールプランジャ（規制部）、
１３７  ボックス、            １３８  駆動モータ、
１３９  駆動軸、              １４０  プーリ、
１４１  回転軸、              １４２  プーリ、
１４３  タイミングベルト、    １４４  アジャスター、
α  傾斜角度。
【図１】
0006268342.tif 000002
【図２】
0006268342.tif 000003
【図３】
0006268342.tif 000004
【図４】
0006268342.tif 000005
【図５】
0006268342.tif 000006
【図６】
0006268342.tif 000007
【図７】
0006268342.tif 000008
【図８】
0006268342.tif 000009
【図９】
0006268342.tif 000010
【図１０】
0006268342.tif 000011
【図１１】
0006268342.tif 000012
【図１２】
0006268342.tif 000013
【図１３】
0006268342.tif 000014
【図１４】
0006268342.tif 000015
【図１５】
0006268342.tif 000016
【図１６】
0006268342.tif 000017
【図１７】
0006268342.tif 000018
【図１８】
0006268342.tif 000019
【図１９】
0006268342.tif 000020
【図２０】
0006268342.tif 000021
【図２１】
0006268342.tif 000022
【図２２】
0006268342.tif 000023
【図２３】
0006268342.tif 000024
【図２４】
0006268342.tif 000025
【図２５】
0006268342.tif 000026
【図２６】
0006268342.tif 000027
【図２７】
0006268342.tif 000028
【図２８】
0006268342.tif 000029
【図２９】
0006268342.tif 000030
【図３０】
0006268342.tif 000031
【図３１】
0006268342.tif 000032
【図３２】
0006268342.tif 000033