(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療剤または造影剤を対象の脳に送達するための組成物の調製におけるナノ粒子の使用であって、
前記ナノ粒子は、表面を有するナノ粒子コアと、
（ａ）前記治療剤または前記造影剤と、
（ｂ）標的化剤であって、リンカーと前記リンカーにより前記ナノ粒子コアの前記表面に結合する標的化リガンドとを含み、前記標的化リガンドは、脳内皮細胞により発現される受容体への結合親和性を有し、前記リンカーは、ジアミノケタール、オルトエステル、アセタール、ケタール、イミン、およびヒドラゾンからなる群から選択されるｐＨ感受性結合により前記ナノ粒子コアの前記表面にコンジュゲートされたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー部分を含む、標的化剤とを含み、
前記リンカーは、約６．８〜２．０の範囲のｐＨで前記ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こす、使用。
【請求項２】
ナノ粒子コアの表面が、カチオン性粘液酸ポリマー（ｃＭＡＰ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、キトサン、ポリエチレンイミンなどの合成ポリマー、デンドリマー、金、または酸化鉄のいずれか１種を含み；
リガンドが、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に特異的な抗体、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン、インスリン受容体に特異的な抗体、インスリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子受容体１に特異的な抗体、インスリン様成長因子受容体１に特異的に結合するポリペプチド、アポリポタンパク質Ｅ、ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的な抗体、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的に結合するポリペプチド；ジフテリア毒素受容体に特異的な抗体、またはジフテリア毒素受容体に特異的に結合するポリペプチドのいずれか１種である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ナノ粒子コアが、構造：
【化１】
0006366690.tif 000021
（ここで、ｍは、５から５０の間の任意の整数である）
を有するカチオン性粘液酸ポリマー（ｃＭＡＰ）を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
ｍが、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のいずれか一つである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
ナノ粒子コアの表面が、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマーを含み、
リガンドが、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に特異的な抗体、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン、インスリン受容体に特異的な抗体、インスリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子受容体１に特異的な抗体、インスリン様成長因子受容体１に特異的に結合するポリペプチド、アポリポタンパク質Ｅ、ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的な抗体、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的に結合するポリペプチド；ジフテリア毒素受容体に特異的な抗体、またはジフテリア毒素受容体に特異的に結合するポリペプチドのいずれか１種である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
ＰＥＧポリマーが、さらに、ジスルフィド結合または酵素切断部位を有するポリペプチドを介してリガンドにコンジュゲートしている、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
ナノ粒子コアが、構造：
【化２】
0006366690.tif 000022
（ここで、ｘおよびｙは、独立して、５から５００の間の任意の整数である）
を有するＰＬＧＡを含む、請求項５または６に記載の使用。
【請求項８】
ｘおよびｙが、独立して、４０、４５、５０、５５、または６０のいずれか一つである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ＰＬＧＡを含むナノ粒子コアが、ＰＥＧリンカーにコンジュゲートしており、かつ構造：
【化３】
0006366690.tif 000023
を有し、ｚが、２から２０００の間の任意の整数であり、ｘおよびｙが、独立して、５から５００の間の任意の整数であり、Ｒが、第一級のアミン、アジド、アルコール、チオール、アルデヒド、またはカルボン酸から選択される、請求項７または８に記載の使用。
【請求項１０】
ｚが、約１１０から約１５０の間の任意の整数であり、ｘおよびｙが５０である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
標的化剤が、
【化４】
0006366690.tif 000024
であり、ｚが、約１１０から約１５０の間の任意の整数であり、ｘおよびｙが５０である、請求項５から１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
ナノ粒子コアの表面が、カチオン性粘液酸ポリマー（ｃＭＡＰ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、キトサン、ポリエチレンイミンなどの合成ポリマー、デンドリマー、金、または酸化鉄のいずれか１種を含み；
リガンドが、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に特異的な抗体、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン、インスリン受容体に特異的な抗体、インスリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子受容体１に特異的な抗体、インスリン様成長因子受容体１に特異的に結合するポリペプチド、アポリポタンパク質Ｅ、ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的な抗体、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的に結合するポリペプチド；ジフテリア毒素受容体に特異的な抗体、またはジフテリア毒素受容体に特異的に結合するポリペプチドのいずれか１種であり；
リンカーが、ＰＥＧにコンジュゲートしたジアミノケタールを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
リンカーが、ナノ粒子が脳内皮細胞内にあるときに、還元され、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすことができるジスルフィド結合をさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
リンカーが、ナノ粒子が脳内皮細胞内にあるときに、酵素的に切断され、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすことができるポリペプチドまたは化学結合をさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１５】
前記リンカーが、約５．５から約２．５の範囲のｐＨで前記ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こす、請求項１に記載の使用。
【請求項１６】
前記リンカーが、約５．５から約４．０の範囲のｐＨで前記ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こす、請求項１に記載の使用。
【請求項１７】
ナノ粒子コアの表面が、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を含む、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
ナノ粒子コアの表面が、カチオン性粘液酸ポリマー（ｃＭＡＰ）を含む、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
ナノ粒子コアの表面が、金を含む、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
ナノ粒子コアの表面が、カチオン性粘液酸（ｃＭＡＰ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、キトサン、ポリエチレンイミンなどの合成ポリマー、デンドリマー、金、または酸化鉄のいずれか１種を含み；
リガンドが、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に特異的な抗体、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン、インスリン受容体に特異的な抗体、インスリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子受容体１に特異的な抗体、インスリン様成長因子受容体１に特異的に結合するポリペプチド、アポリポタンパク質Ｅ、ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的な抗体、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的に結合するポリペプチド；ジフテリア毒素受容体に特異的な抗体、またはジフテリア毒素受容体に特異的に結合するポリペプチドのいずれか１種であり；
リンカーが、ＰＥＧにコンジュゲートしている、オルトエステル、アセタール、ケタール、イミン、またはヒドラゾンから選択される酸切断性化学結合を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項２１】
ナノ粒子が、その表面にコンジュゲートした２００未満の標的化剤を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
ナノ粒子が、その表面にコンジュゲートした２０未満の標的化剤を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
ナノ粒子が、その表面にコンジュゲートした５未満の標的化剤を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
ナノ粒子が、その表面にコンジュゲートした単一の標的化剤を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
ナノ粒子が、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定して約４０ｎｍから約１００ｎｍのサイズを有する、請求項１から２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
ナノ粒子が、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定して約５０ｎｍから約７０ｎｍのサイズを有する、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
ナノ粒子が、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定して５５ｎｍ、５６ｎｍ、５７ｎｍ、５８ｎｍ、５９ｎｍ、６０ｎｍ、６１ｎｍ、６２ｎｍ、６３ｎｍ、６４ｎｍ、６５ｎｍ、６６ｎｍ、６７ｎｍ、６８ｎｍ、または６９ｎｍのサイズを有する、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
ナノ粒子が、位相分析光散乱により測定して約−０．５ｍＶから約−１５．０ｍＶの平均ゼータ電位を有する、請求項１から２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
ナノ粒子が、位相分析光散乱により測定して−５．０、−５．１、−５．２、−５．３、−５．４、−５．５、−５．６、−５．７、−５．８、−５．９、−６．０、−６．１、−６．２、−６．３、−６．４、−６．５、−６．６、−６．７、−６．８、−６．９、−７．０、−７．１、−７．２、−７．３、−７．４、−７．５、−７．６、−７．７、−７．８、−７．９、または−８．０ｍＶの平均ゼータ電位を有する、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
ナノ粒子が、治療剤を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
治療剤が、神経障害に対して有効である、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
治療剤が、セロトニンまたはドーパミンである、請求項３０または３１に記載の使用。
【請求項３３】
ナノ粒子が、造影剤を含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３４】
造影剤がＣｕ−６４である、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
ナノ粒子が、第１の標的化剤および第２の標的化剤を含み、第２の標的化剤は、
脳内皮細胞内にあるときに、ナノ粒子コアからの解離に適合性ではないリンカー、および
粒子を脳内の特定の細胞に標的化するリガンド
を含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３６】
カチオン性粘液酸ポリマー（ｃＭＡＰ）；脳内皮細胞により発現される受容体に特異的な標的化剤であって、前記標的化剤は、脳内皮細胞内にあるときに、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすリンカーにコンジュゲートしているリガンドを含み、前記リンカーは、ジアミノケタール、オルトエステル、アセタール、ケタール、イミン、およびヒドラゾンからなる群から選択されるｐＨ感受性結合により前記ナノ粒子にコンジュゲートされたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー部分を含む標的化剤；およびナノ粒子を構築するための使用説明書を含む、ナノ粒子を作製するためのキット。
【請求項３７】
ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）；脳内皮細胞により発現される受容体に特異的な標的化剤であって、前記標的化剤は、脳内皮細胞内にあるときに、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすリンカーにコンジュゲートしているリガンドを含み、前記リンカーは、ジアミノケタール、オルトエステル、アセタール、ケタール、イミン、およびヒドラゾンからなる群から選択されるｐＨ感受性結合により前記ナノ粒子にコンジュゲートされたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー部分を含む標的化剤；およびナノ粒子を構築するための使用説明書を含む、ナノ粒子を作製するためのキット。
【請求項３８】
リガンドが、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に特異的な抗体、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン、インスリン受容体に特異的な抗体、インスリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子受容体１に特異的な抗体、インスリン様成長因子受容体１に特異的に結合するポリペプチド、アポリポタンパク質Ｅ、ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的な抗体、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的に結合するポリペプチド；ジフテリア毒素受容体に特異的な抗体、またはジフテリア毒素受容体に特異的に結合するポリペプチドのいずれか１種である、請求項３６または３７に記載のキット。
【請求項３９】
治療剤または造影剤をさらに含む、請求項３６から３８のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年５月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／８２２，９８３号の利益を主張する。
【０００２】
政府の権利
本明細書で開示される主題は、国立衛生研究所により与えられた許可番号第Ｒ０１  ＮＳ０７１１１２１号、および国立がん研究所により与えられた許可番号第ＣＡ１５１８４９号に基づく政府の支援により行われた。政府は、本明細書で開示される主題に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
中枢神経系（ＣＮＳ）の慢性疾患は、先進国世界における羅患率および死亡率の大きな原因である。アルツハイマー病単独で、米国の５００万を超える人々に影響を及ぼしており、この疾患は２０５０年までに１３００万超に増加すると予想されている。アルツハイマー病に罹っている人々に対する２０１２年のケアの推定総費用は、２０００億ドルを超え、次の４０年以内には１．２兆ドルに上昇すると予想されている。さらに、米国における死亡率の多くの他の主要な原因、例えば、心臓疾患および脳卒中などによる死亡の割合は、過去１０年間にわたって大きく低下した一方で、アルツハイマー病からの死亡の割合は、６８％増加した。高い経済的費用および処置における進歩の相対的欠如の両方における同様の傾向が、ハンチントン病、パーキンソン病、および多発性硬化症を含めた、多くの他の神経変性疾患で見られる。
【０００４】
これらの疾患の治療において進歩が欠如している大きな理由は、血液脳関門（ＢＢＢ）が存在しているためである。ＢＢＢは、ＣＮＳ内の恒常性の維持に重要な役割を果たす、ＣＮＳ実質と血管系との間の物理的障壁である。極性分子、巨大分子および細胞の傍細胞拡散を阻害するタイトジャンクションが、内皮細胞間に存在している。これは、ＣＮＳ中への溶質輸送に、主に個々の内皮細胞を横切って発生することを強いている。ＣＮＳ恒常性を維持するためには非常に重要であるが、ほとんどの溶質に対してＢＢＢが不浸透性であることは、ＣＮＳへの薬物送達にとって極めて大きい障害であることが証明されている。現在、小分子治療薬の９８％ならびにモノクローナル抗体、タンパク質および遺伝子治療を含めた大分子治療薬の基本的に１００％がＢＢＢを通過しない。
【０００５】
ＢＢＢを通過する溶質によって使用されるいくつかの内因性方法の中で、受容体媒介トランスサイトーシス（ＲＭＴ）は、薬物送達における使用に最も有望であることが示された（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｉｌｅｙ等、ＰＮＡＳ、１１０（２１）：８６６２〜６６７頁（２０１３年）を参照のこと）。脳への送達のための標的治療薬の開発に過去２０年にわたって多くの関心がよせられてきたが、臨床研究のための実行可能な候補はいまだ現れていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗｉｌｅｙ等、ＰＮＡＳ、１１０（２１）：８６６２〜６６７頁（２０１３年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ナノ粒子コアおよび標的化剤を有するナノ粒子を対象に投与することによって対象の脳にナノ粒子を送達する方法が、本明細書で記載される。種々の標的化剤が、記載されたナノ粒子の送達を促進するために役立ち得る。例えば、標的化剤は、脳内皮細胞により発現される受容体に特異的なリガンド、およびリガンドをナノ粒子コアの外部表面と連結するリンカーを含んでもよい。さらに、リンカーは、細胞内にあるときにナノ粒子からのリガンドの解離を促進し得る。
【０００８】
記載方法は、種々のナノ粒子を使用して行うことができる。例えば、ナノ粒子コアの表面は、カチオン性粘液酸ポリマー（ｃＭＡＰ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、キトサン、ポリエチレンイミンなどの合成ポリマー、金、酸化鉄、または当業者により理解されるとおりの他の類似物質から作られていることができる。これらのポリマーは、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に特異的な抗体、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン、インスリン受容体に特異的な抗体、インスリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子受容体１に特異的な抗体、またはインスリン様成長因子受容体１に特異的に結合するポリペプチドなどのリガンドと組み合わせることができる。さらに、ナノ粒子コアおよびリガンドは、脳内皮細胞内にあるときに、ナノ粒子からのリガンドの解離を容易にし得るリンカーによってコンジュゲートされ得る。記載される実施形態の一部において、リンカーは、ナノ粒子が脳内皮細胞内にあるときに、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすために還元され得るジスルフィド結合を含んでもよい。記載される実施形態の一部において、リンカーは、ナノ粒子が脳内皮細胞内にあるときに、ナノ粒子からの解離を引き起こすために酵素的に切断され得るポリペプチドを含んでもよい。記載される実施形態の一部において、リンカーは、ナノ粒子が脳内皮細胞内にあるときに、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こす、低ｐＨで分断され得る加水分解性化学結合を含んでもよい。記載される実施形態の一部において、リンカーは、ナノ粒子が脳内皮細胞内にあるときに、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こす、低ｐＨで分断され得るｐＫａを有する化学結合を含んでもよい。
【０００９】
提供される方法は、リガンドをナノ粒子コアにコンジュゲートさせるために、および脳内皮細胞内で直ちにナノ粒子からのリガンドの解離を容易にするために、種々のリンカーを利用する標的化剤によって行われてもよい。一部の実施形態において、記載方法は、リンカーとナノ粒子コアとのデカップリングが酸性ｐＨ（例えば、約６．８から約２．０）で有利に働く、ニトロフェニルボロン酸エステルを形成してナノ粒子コアに結合するナノ粒子に結合していないときに、ニトロフェニルボロン酸を有するリンカーを使用して行なうことができる。別の実施形態において、標的化剤は、脳内皮細胞内で直ちにナノ粒子とリガンドとの解離を容易にするジアミノケタール（ＤＡＫ）連結を含んでもよく、ここで、リンカーとナノ粒子コアとのデカップリングが酸性ｐＨで有利に働く。さらに、記載方法は、脳内皮細胞内で遭遇する還元条件下でナノ粒子からの結合リガンドの解離を容易にし得るジスルフィド結合を有するリンカーと一緒の表面化剤を使用して行なわれてもよい。記載される実施形態の一部において、標的化剤は、リガンドと、ナノ粒子コアへのコンジュゲーションを媒介するセグメントとの間にポリエチレングリコールポリマーを含む。
【００１０】
記載方法を行うために、記載ナノ粒子にコンジュゲートしている標的化剤の数を制御することが有利であり得る。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、１０００程度の多いコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。他の実施形態において、記載ナノ粒子は、５００個程度の多いコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。代わりに、記載ナノ粒子は、約２０個から５０個程度の少ないコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。さらに別の実施形態において、記載ナノ粒子は、５未満のコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。標的化剤の数は、送達されるナノ粒子のタイプ、送達標的、粒子を標的化するために使用されるリガンド、または多数の他の要因に依存して調節されてもよい。
【００１１】
記載方法は、ナノ粒子の対象への投与前に、記載ナノ粒子に目的の治療剤または造影剤を負荷することによって、治療剤または造影剤を対象の脳に送達するために使用されてもよい。負荷ナノ粒子の送達に続いて、標的化剤は、目的の標的細胞、例えば、脳内皮細胞への送達を容易にする。標的細胞による内部移行に続いて、ナノ粒子は、標的化剤から解離する。脳内皮細胞の場合、次いで、内部移行したナノ粒子は、細胞から脳の間質腔の中に排出され、ここで、粒子は不安定化し、負荷された作用物質を分泌し、それにより、作用物質を脳または他の標的場所に送達する。一部の実施形態において、記載方法は、セロトニンまたはドーパミンなどの神経伝達物質を脳に送達するために行なわれてもよく、これは、神経障害を治療するために使用されてもよい。神経障害の治療に使用される他の作用物質も、記載方法によって脳に送達されてもよい。それら自体で脳に容易に接近できない造影剤も、記載方法を使用して送達されてもよい。さらに、記載方法は、１種または複数の治療剤、造影剤、または治療剤と造影剤の両方の組合せを対象の脳に送達するために使用されてもよい。
【００１２】
脳への送達のために標的化されるナノ粒子を作るためのキットも本明細書で記載される。例えば、記載キットは、カチオン性粘液酸ポリマー（ｃＭＡＰ）外部表面またはポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）外部表面、脳内皮細胞により発現される受容体に特異的な標的化剤（標的化剤は、脳内皮細胞内にあるときにナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすリンカーにコンジュゲートしているリガンドを含む）を有するナノ粒子を構築するための物質および試薬；ならびにナノ粒子を構築するための使用説明書を含んでもよい。記載キットは、脳内皮細胞を標的化するためのリガンド、例えば、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に特異的な抗体、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン、インスリン受容体に特異的な抗体、インスリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子受容体１に特異的な抗体、またはインスリン様成長因子受容体１に特異的に結合するポリペプチドを含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】脳実質への治療剤および／または造影剤の送達のためのナノ粒子の一般的設計図である。ナノ粒子は、３つの基本的設計構成要素：（１）ナノ粒子コア；（２）間隔分子（ｓｐａｃｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）；および（３）標的化剤を有する。
【図２】ナノ粒子から離れ落ちる標的化分子によって容易にされる、血液脳関門（ＢＢＢ）を通っての標的ナノ粒子の移行を示す図である。（１）血液中の標的ナノ粒子がＢＢＢ管腔表面に到達する。（２）ナノ粒子リガンドは、ＢＢＢの血液側の上でその受容体に結合する。（３）受容体−ナノ粒子複合体の内部移行。（４）ナノ粒子がＢＢＢを通過するときにナノ粒子が受ける化学的および／または物理的変化は、ナノ粒子残部からのリガンドの脱離を引き起こす。（５）非標的ナノ粒子は、ＢＢＢの脳側に到達する。（６）ナノ粒子はＣＮＳ中に拡散する。ナノ粒子の構成要素は、図の左側の記号解説に明記されている。図の右側の括弧内の用語は、この順序に関与する関連区画を示す。
【図３】ＰＥＧカップリング反応のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す図である。２４時間でのＮＨ２−ＰＥＧ−ＳＨ（３．４ｋＤａ）およびＣＯＯＨ−ＰＥＧ−ＳＨ（２ｋＤａ）の反応のＭＡＬＤＩスペクトルを示す図である。ピークＡおよびＢは、それぞれ、反応物質ＣＯＯＨ−ＰＥＧ−ＳＨおよびＮＨ２−ＰＥＧ−ＳＨに相当する。ピークＣ、Ｄ、およびＥは、それぞれ、スキーム１で概略したとおりの３つの潜在的生成物、４ｋＤａ、５．４ＫＤａおよび６．８ｋＤａポリマーに相当する。
【図４】ジスルフィド切断反応のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す図である。過剰のベータ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を添加後のＮＨ２−ＰＥＧ−ＳＨ（３．４ｋＤａ）およびＣＯＯＨ−ＰＥＧ−ＳＨ（２ｋＤａ）の反応のＭＡＬＤＩスペクトルを示す図である。ピークＡおよびＢは、それぞれ親ポリマー、ＣＯＯＨ−ＰＥＧ−ＳＨおよびＮＨ２−ＰＥＧ−ＳＨに相当する。過剰のＢＭＥにより引き起こされたチオール−ジスルフィド交換によるＰＥＧポリマー間のジスルフィド結合形成からの生成物の証拠はない。
【図５】Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞へのジスルフィド含有ナノ粒子の結合親和力を示す図である。測定データ点は、それぞれ、ジスルフィド含有ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−Ｔｆナノ粒子（Ｓ−Ｓ）、ジチオトレイトールによる処理後のジスルフィド含有ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−Ｔｆナノ粒子（Ｓ−Ｓ＋ＤＴＴ）、およびメトキシ末端ＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子（ｍＰＥＧ）について正方形、ひし形または三角形で示す。各処方についてのモデル曲線は、ラングミュア結合等温線に基づく。
【図６】マウス脳切片中のＰＬＧＡ−ｍＰＥＧナノ粒子の共焦点画像である。パネルＡ：４８８ｎｍ励起、パネルＢ：ＤＡＰＩシグナル、パネルＣ：パネルＡとＢの統合した画像。パネルＤは、パネルＣにおける統合した画像の拡大図を示す。実線矢印は、細胞核と共局在する蛍光を示す。この現象は非標的粒子に関して見られたので、これは正常組織のバックグラウンド蛍光と考えられた。破線矢印は、血管を示す。
【図７】マウス脳切片中の低−ＴｆＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子の共焦点画像である。パネルＡは、４８８ｎｍ励起からの蛍光を示す。パネルＢは、ＤＡＰＩシグナルを示す。パネルＣは、パネルＡとＢの統合した画像を示す。パネルＤは、パネルＣにおける統合した画像の拡大図を示す。実線矢印は、細胞核と共局在する蛍光を示す。破線矢印は、血管を示す。中空白色矢印は、ナノ粒子シグナルであると決定された、細胞核と関係していない実質における蛍光を示す。
【図８】マウス脳切片中の高−ＴｆＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子の共焦点画像である。パネルＡは、４８８ｎｍ励起からの蛍光を示す。パネルＢは、ＤＡＰＩシグナルを示す。パネルＣは、パネルＡとＢの統合した画像を示す。パネルＤは、パネルＣにおける統合した画像の拡大図を示す。実線白色矢印は、細胞核と共局在する蛍光を示す。白色破線矢印は、血管を示す。中空白色矢印は、ナノ粒子シグナルであると決定された、細胞核と関係していない実質における蛍光を示す。
【図９】マウス脳切片中の高−Ｔｆ＋ジスルフィドＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子の共焦点画像である。パネルＡは、４８８ｎｍ励起からの蛍光を示す。パネルＢは、ＤＡＰＩシグナルを示す。パネルＣは、パネルＡとＢの統合した画像を示す。パネルＤは、パネルＣにおける統合した画像の拡大図を示す。実線白色矢印は、細胞核と共局在する蛍光を示す。白色破線矢印は、血管を示す。中空白色矢印は、ナノ粒子であると決定された、細胞核と関係していない実質における蛍光を示す。
【図１０】ＤＳＳ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳのＴｆへのコンジュゲーション反応のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦトレースを示す図である。未反応Ｔｆおよび数オーダーのＰＥＧ化Ｔｆが標識化されている。
【図１１Ａ】時間経過におけるｐＨ５．５緩衝液中のＴｆ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳの分解を示す図である。粗混合物の組成を、５分（Ａ）、１５分（Ｂ）、３０分（Ｃ）、６０分（Ｄ）、１２０分（Ｅ）および２４時間（Ｆ）のインキュベーション時間で示す。
【図１１Ｂ】時間経過におけるｐＨ５．５緩衝液中のＴｆ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳの分解を示す図である。粗混合物の組成を、５分（Ａ）、１５分（Ｂ）、３０分（Ｃ）、６０分（Ｄ）、１２０分（Ｅ）および２４時間（Ｆ）のインキュベーション時間で示す。
【図１１Ｃ】時間経過におけるｐＨ５．５緩衝液中のＴｆ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳの分解を示す図である。粗混合物の組成を、５分（Ａ）、１５分（Ｂ）、３０分（Ｃ）、６０分（Ｄ）、１２０分（Ｅ）および２４時間（Ｆ）のインキュベーション時間で示す。
【図１１Ｄ】時間経過におけるｐＨ５．５緩衝液中のＴｆ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳの分解を示す図である。粗混合物の組成を、５分（Ａ）、１５分（Ｂ）、３０分（Ｃ）、６０分（Ｄ）、１２０分（Ｅ）および２４時間（Ｆ）のインキュベーション時間で示す。
【図１１Ｅ】時間経過におけるｐＨ５．５緩衝液中のＴｆ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳの分解を示す図である。粗混合物の組成を、５分（Ａ）、１５分（Ｂ）、３０分（Ｃ）、６０分（Ｄ）、１２０分（Ｅ）および２４時間（Ｆ）のインキュベーション時間で示す。
【図１１Ｆ】時間経過におけるｐＨ５．５緩衝液中のＴｆ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳの分解を示す図である。粗混合物の組成を、５分（Ａ）、１５分（Ｂ）、３０分（Ｃ）、６０分（Ｄ）、１２０分（Ｅ）および２４時間（Ｆ）のインキュベーション時間で示す。
【図１２】ｐＨ５．５（正方形）またはｐＨ８（ひし形）での緩衝液中インキュベーション１時間後の、Ｔｆ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−Ａｕナノ粒子のＫ５６２細胞への結合性を示す図である。
【図１３】時間経過におけるｂＥｎｄ．３被覆Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｓ（登録商標）の底部ウェルへの３種類の異なるナノ粒子の移動を示す図である。ひし形プロットは、ｍＰＥＧのみで被覆された金ナノ粒子の移動を示し、正方形プロットは、ｐＨ切断性ＤＡＫリンカーなしのＴｆ−ＰＥＧで被覆された金ナノ粒子の移動を示し、三角形プロットは、ｐＨ切断性ＤＡＫリンカーを有するＴｆ−ＰＥＧで被覆された金ナノ粒子の移動を示す。
【図１４】酸切断性リンカーを有するＴｆ含有金ナノ粒子で処置後のマウス脳からの切片の画像を示す。実線矢印は、血管中のＮＰを示し、開放矢印は、脳中のＮＰを示す。
【図１５】組織培養Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）システムの概略図である。
【図１６Ａ】パネルＡは、非切断性ナノ粒子の調製を示す図である。パネルＢは、ジスルフィド含有ナノ粒子の調製を示す図である。各ポリマー混合物は、ナノ沈殿によるナノ粒子の形成前に、１０ｍｇ／ｍＬの合計ＰＬＧＡ濃度にてＤＭＦ中で調製した。
【図１６Ｂ】パネルＡは、非切断性ナノ粒子の調製を示す図である。パネルＢは、ジスルフィド含有ナノ粒子の調製を示す図である。各ポリマー混合物は、ナノ沈殿によるナノ粒子の形成前に、１０ｍｇ／ｍＬの合計ＰＬＧＡ濃度にてＤＭＦ中で調製した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
ナノ粒子を対象の脳に送達する方法が本明細書で提供され、ナノ粒子および関連組成物、方法、ならびに記載ナノ粒子またはナノ粒子中に含有される目的の化合物の送達に関連して使用され得るキットも記載される。
【００１５】
数値範囲、切り捨て、または特定値と関連して使用される場合の「約」という用語は、列挙される値が、記載される値から最大で１０％の大きさまで変わり得ることを示すために使用される。本明細書で使用される数値の多くは、実験的に決定されるので、このような決定は、異なる実験の中でしばしば変わり得ることが当業者によって理解されるべきである。本明細書で使用される値は、この固有の変動によって過度に限定的と考えられるべきでない。「約」という用語は、最大で１０％までの、または１０％に等しいこの種の変動を包含するために使用される。
【００１６】
本明細書で使用される場合の「ナノ粒子」という用語は、ナノスケール寸法の複合構造を示す。特に、ナノ粒子は、典型的には約１ｎｍから約１０００ｎｍの範囲の大きさの粒子であり、通常は球形であるが、異なる形態がナノ粒子組成に依存して可能である。ナノ粒子に対して外部の環境に接触するナノ粒子の部分は、一般にナノ粒子の表面と特定される。本明細書で記載されるナノ粒子において、大きさの限定を二つの寸法に制限することができ、従って、本明細書で記載されるナノ粒子は、約１ｎｍから約１０００ｎｍの直径を有する複合構造を含み、ここで、具体的な直径は、ナノ粒子組成、および実験設計に従うナノ粒子の意図された使用に依存する。例えば、いくつかの治療用途で使用されるナノ粒子は、典型的には約２００ｎｍまたはそれ未満の大きさを有し、特にがん治療に関連する送達のために使用されるものは、典型的には約１ｎｍから約１００ｎｍの直径を有する。
【００１７】
ナノ粒子のさらなる望ましい特性、例えば、表面電荷および立体安定化も、目的の特定の用途を考慮して変わり得る。粒子の特性は、本開示を読んだ後で当業者によって理解され得る。ナノ粒子の寸法および特性は、当技術分野で知られた技術によって検出され得る。粒子寸法を検出するための例示的な技術としては、これらに限定されないが、動的光散乱（ＤＬＳ）およびナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）ならびに様々な顕微鏡法、例えば、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）が挙げられる。粒子形態を検出するための例示的な技術としては、これらに限定されないが、ＴＥＭおよびＡＦＭが挙げられる。ナノ粒子の表面電荷を検出するための例示的な技術としては、これに限定されないが、ゼータ電位法が挙げられる。他の化学的特性を検出するのに適切なさらなる技術は、１Ｈ、１１Ｂ、および１３Ｃならびに１９Ｆ  ＮＭＲ、ＵＶ／Ｖｉｓおよび赤外／ラマン分光法、ならびに蛍光分光法および顕微鏡法（ナノ粒子が蛍光標識と組み合わせて使用される場合）ならびに当業者により特定できるさらなる技術を含む。
【００１８】
本明細書で使用される場合の「送達する」および「送達」という用語は、化合物の空間的位置に影響を及ぼす、特に、化合物の好ましい位置を特定する活動を示す。従って、本開示の意味で化合物を送達することは、ある特定の条件下、ある特定の時間での化合物の位置付けおよび移動に影響を及ぼす能力を示し、従って、それらの条件下での化合物の位置付けおよび移動は、そうでなければ化合物が有する位置付けおよび移動に対して変更される。
【００１９】
本明細書で使用される場合の「標的」という用語は、臓器、組織、またはそれらの任意の部分を含めた、目的の生物学的系を示し、インビトロまたはインビボ生物学的系またはそれらの任意の部分を包含してもよい。
【００２０】
本明細書で使用される場合の「ポリマー」という用語は、典型的には共有化学結合で連結された繰り返し構造単位からなる大分子を示す。好適なポリマーは、線状および／または分岐状であってもよく、ホモポリマーまたはコポリマーの形態を取ることができる。コポリマーが使用される場合、コポリマーは、ランダムコポリマーまたは分岐コポリマーであってもよい。例示的なポリマーは、水分散性、特に、水可溶性ポリマーを含む。例えば、好適なポリマーとしては、これらに限定されないが、多糖、ポリエステル、ポリアミド、ポリエーテル、ポリカーボネート、ポリアクリレートなどが挙げられる。治療的および／または薬学的使用および用途の場合、ポリマーは、低い毒性プロファイル、特に毒性または細胞毒性でないプロファイルを有すべきである。好適なポリマーとしては、約５００，０００またはそれ未満の分子量を有するポリマーが挙げられる。特に、好適なポリマーは、約１００，０００およびそれ未満の分子量を有し得る。
【００２１】
本明細書で使用される場合の「ボロン酸を含有するポリマー」または「ボロン酸を有するリンカー」などの用語は、ポリオールを含有するポリマーのヒドロキシル基に結合するために提示された少なくとも１個のボロン酸基を含有することを示す。特に、本明細書で記載されるナノ粒子の、ボロン酸を含有するポリマーとしては、少なくとも一つの構造単位で炭素−ホウ素化学結合を有するアルキルまたはアリール置換ボロン酸を含むポリマーが挙げられる。好適なボロン酸ポリマーは、ボロン酸が末端構造単位または得られるポリマーに親水性特性を与える任意の他の適切な位置にあるポリマーを含む。本明細書で記載されるナノ粒子において、ポリマーは、ボロン酸ポリマーにカップリングされる。２つの分子間の結合に関連して本明細書で使用される場合の「カップリングされた」または「カップリングする」という用語は、可逆的共有連結を形成する相互作用を示す。特に、適切な媒体の存在下で、ボロン酸ポリマー上で提示されるボロン酸は、急速で可逆的なペアワイズ共有結合相互作用を介してポリオールのカルボキシル基と相互作用して、適切な媒体でボロン酸エステルを形成する。好適な媒体としては、水およびいくつかの水溶液ならびに当業者が特定することができるさらなる有機媒体が挙げられる。特に、水性媒体中で接触する場合、ボロン酸ポリマーおよびポリオールポリマーは反応し、副生成物として水を生成する。ボロン酸ポリオール相互作用は、一般に水溶液中でより有利であるが、有機媒体中で進行することも知られている。さらに、１，２および１，３ジオールと形成される環状エステルは、一般にそれらのアクリル酸エステル対応物よりも安定である。
【００２２】
本明細書で使用される場合の「結合する」、「結合した」または「結合」という用語は、２つ以上の構成要素を一緒に保つために結合、連結、力または結び（ｔｉｅ）によって連結または一体化することを指し、これは、例えば、第１の化合物が第２の化合物に直接結合している場合、および一つまたは複数の中間化合物（特に分子）が第１の化合物と第２の化合物の間に配置されている実施形態のような、直接または間接の結合のいずれかを包含する。
【００２３】
本開示で使用される場合の「リガンド」または「標的化リガンド」という用語は、例えば、ナノ粒子の細胞受容体結合を可能にすることによって、特定の標的、特に、特定の細胞認識に携わる目的のためにナノ粒子の表面で提示され得る任意の分子を示す。好適なリガンドの例としては、これらに限定されないが、ビタミン（例えば、葉酸）、タンパク質（例えば、トランスフェリン、およびモノクローナル抗体）、単糖（例えば、ガラクトース）、ペプチド、および多糖が挙げられる。特に、標的化リガンドは、トランスフェリン受容体（「ＴｆＲ」）などの、ある特定の表面の細胞受容体に対する抗体であり得る。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「トランスフェリン」（「Ｔｆ」と略される）という用語は、タンパク質の変異体およびアイソフォーム、ならびにトランスフェリン受容体（「ＴｆＲ」）に結合することができるタンパク質の断片を包含することを意味する。例えば、この用語は、ハロトランスフェリンおよびトランスフェリンそれ自体を包含する。
【００２５】
「抗体」という用語は、特定の抗原と反応性である免疫グロブリン分子への言及を包含する。この用語は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）および組換え単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）などの遺伝子操作された形態、ジスルフィド安定化（ｄｓＦｖ）Ｆｖ断片、またはｐＦｖ断片も包含する。「抗体」という用語は、抗体の抗原結合形態（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびｒｌｇＧ）も包含する。特定の抗原と免疫学的に反応性の、またはそれに「特異的な」抗体は、関連用語であり、抗体により示される非特異的結合について観察されるよりも少なくとも１０倍高い親和性で抗体がその抗原に結合することを意味する。従って、所与の抗原に「特異的」であるといわれる抗体は、実際、それが非特異的相互作用で示すよりも１０倍高い親和性で他の抗原に選択的に結合し得る。
【００２６】
多数の衰弱性神経疾患を治療するために、より大きな量でＣＮＳに到達することができる標的治療薬を開発することが必要である。ＣＮＳ内の治療薬の蓄積を増加させるためにＲＭＴ中に受ける化学変化を利用することが可能であり得る。対象にナノ粒子コアおよび標的化剤を有するナノ粒子を投与することによって、対象の脳にナノ粒子を送達する方法が、本明細書で記載される。種々の標的化剤が、記載ナノ粒子の送達を促進するために役立ち得る。例えば、標的化剤は、脳内皮細胞により発現される受容体に特異的なリガンド、およびリガンドをナノ粒子コアの外部表面に連結するリンカーを含んでもよい。さらに、リンカーは、細胞内にあるときにナノ粒子からのリガンドの解離を促進し得る。
【００２７】
記載方法は、種々のナノ粒子を使用して行なうことができる。例えば、ナノ粒子コアの表面は、カチオン性粘液酸ポリマー（ｃＭＡＰ）から作ることができる。一部の実施形態において、記載されるｃＭＡＰナノ粒子コアは、以下：
【００２８】
【化１】
0006366690.tif 000002
（式中、ｎは、２から約２０の任意の整数である）
のいずれか一つにより表される構造を有するｃＭＡＰから作られていてもよい。一部の実施形態において、ｎは、２から約１０の任意の整数である。一部の実施形態において、ｎは、２から約５の任意の整数である。一部の実施形態において、ｎは、２、３、または４である。
【００２９】
記載ナノ粒子コアを作製するために使用されるｃＭＡＰは、式Ｖ：
【００３０】
【化２】
0006366690.tif 000003
（式中、ｍは、５から約２００の任意の整数である）
の構造を有してもよい。一部の実施形態において、ｍは、５から約１５０の任意の整数である。一部の実施形態において、ｍは、５から約１００の任意の整数である。一部の実施形態において、ｍは、５から約５０の任意の整数である。一部の実施形態において、ｍは、５から約２５の任意の整数である。一部の実施形態において、ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のいずれか一つであってもよい。本明細書で提供される場合、一部の実施形態において、ｍは１１である。
【００３１】
記載方法の一部の実施形態において、ナノ粒子は、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマーのコアで作られている。ＰＬＧＡポリマーは、式ＶＩ：
【００３２】
【化３】
0006366690.tif 000004
（式中、ｘおよびｙは、互いに独立して、約５から約５００の任意の整数である）
の構造を有してもよい。一部の実施形態において、ｘおよびｙは、互いに独立して、約５から約１００の任意の整数である。一部の実施形態において、ｘおよびｙは、互いに独立して、約２０から約８０の任意の整数である。一部の実施形態において、ｘおよびｙは、互いに独立して、約４０から約６０の任意の整数である。一部の実施形態において、ｘおよびｙは、互いに独立して、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、または６０である。一つの実施形態において、ｘおよびｙは、両方とも５０である。ＰＬＧＡポリマーを有するナノ粒子コアは、必要に応じてさらに改変されて、標的化剤の結合に対応することができる。例えば、標的化剤が、標的化剤上に存在するボロン酸とナノ粒子の表面上に存在するジオールとの反応による一つまたは複数のエステル結合の形成を介してナノ粒子にコンジュゲートしている事例において、ＰＬＧＡナノ粒子は、改変されて、その外部表面上にジオールを有してもよい。一つの実施形態において、ＰＬＧＡナノ粒子コアは、さらに改変されて、粒子をボロン酸含有標的化剤にコンジュゲートさせる適切なヒドロキシル基を有する糖を組み込むことができる。他のこのような改変は、本明細書で記載される標的化剤のコンジュゲーションを容易にするために行なうか、または本開示を考慮して当業者に明らかにすることができる。
【００３３】
ｃＭＡＰおよびＰＬＧＡから作られているコアを有するナノ粒子の記載に加えて、記載ナノ粒子は、金、キトサン、ポリエチレンイミンなどの合成ポリマー、デンドリマー、金、または酸化鉄で作られるコアで作製されてもよい。さらに、リポソームまたはポリマーミセルも、記載方法による使用のためのナノ粒子を形成するために使用することができる。例えば、金コアを有するナノ粒子は、金粒子が脳内皮細胞を標的化することを可能にし、金ナノ粒子を脳実質に送達させるために、Ｔｆに結合しているｐＨ感受性リンカーを有する標的化剤にコンジュゲートすることができる。
【００３４】
記載方法は、対象における好ましいまたは望ましい場所にナノ粒子を優先的に局在化させる標的化剤にコンジュゲートしている、本明細書で記載されるとおりのコアを有するナノ粒子を使用して行われてもよい。記載される標的化剤は、２つの主セグメント、すなわち、リンカーおよびリガンドを有する。リンカーは、ナノ粒子の外部表面への標的化剤の結合を媒介するセグメントを含み、リガンドは、目的の標的に優先的または特異的に結合する分子である。例えば、一部の実施形態において、標的化剤は、一端でナノ粒子コアのポリマーに共有結合しており、他端でＴｆに結合しており、それにより、ＴｆＲを発現している細胞にナノ粒子を標的化するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを有してもよい。記載される標的化剤および関連リンカーは、本明細書で記載されるナノ粒子コアを作製するために使用される様々な物質と使用することができる。一部の実施形態において、標的化剤およびリンカーは、ｃＭＡＰ、ＰＬＦＡ、金、キトサン、ポリエチレンイミンなどの合成ポリマー、デンドリマー、金、または酸化鉄で作られたナノ粒子コアと共に使用されてもよい。さらに、リポソームまたはポリマーミセルも、記載される標的化剤およびリンカーを使用してナノ粒子を形成するために使用されてもよい。
【００３５】
種々のリンカーが、記載方法を行なうために使用されてもよく、いくつかの事例においては、異なる粒子と一緒に使用されてもよい。記載される実施形態の一部において、リンカーは、ナノ粒子が脳内皮細胞内にあるときに、化学的または酵素的に切断され、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすことができるポリペプチドまたは化学結合を含んでもよい。例えば、リンカーは、結合リガンドの直前に酵素標的配列を組み込んで、細胞エンドソーム中への移入後のリガンドの切断を容易にし、それにより、リガンドをナノ粒子から分離することができる。一つの実施形態において、リンカーは、ナノ粒子からのリガンドの解離を促進するためにカテプシン切断部位を含んでもよい。酵素により標的化された他の配列を、そのリガンドからのナノ粒子の解離を引き起こすために同様の様式で用いることができ、このことが、細胞による排出後にナノ粒子がＣＮＳの実質中に移動することを可能にすることを当業者は理解する。代わりに、プロテアソーム分解タグもリンカー中に組み込んでリガンドを分解させるが、ナノ粒子それ自体は無傷で残すことができる。これは、細胞取り込み後にリガンドとナノ粒子とを有効に解離させるからである。化学的に切断され得る特定の化学結合、例えば、オルトエステル、アセタール、ケタール、イミン、およびヒドラゾンを有するリンカーの使用も本開示の範囲内にあると理解されるべきであり、当業者は、このような結合が、リガンドのコンジュゲートされたナノ粒子からの解離を容易にするために使用され得ることを理解する。
【００３６】
記載される実施形態の一部において、リンカーは、ナノ粒子が脳内皮細胞内にあるときに還元され、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすことができるジスルフィド結合を含んでもよい。一つの実施形態において、ジスルフィド結合は、ナノ粒子とリガンドとを架橋する２つの構成要素ポリマー間に置かれてもよく、その結果、ジスルフィド結合の還元後、ナノ粒子およびリガンドは分離される。一つの実施形態において、リンカーは、ジスルフィド結合により連結されている２つのＰＥＧポリマーから構成され、ここでＰＥＧポリマーの一方はナノ粒子コアにコンジュゲートしており、他方はナノ粒子コアに連結されるときに標的化を媒介するリガンドにコンジュゲートしている。このような粒子が細胞によりエンドサイトーシスされた後、リガンドはナノ粒子から解離され、これは、ＣＮＳの実質中にナノ粒子が出て行くことを促進する。
【００３７】
記載される実施形態の一部において、リンカーは、ナノ粒子が脳内皮細胞内にあるときに、低ｐＨで分断され、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすことができる加水分解性化学結合を含んでもよい。一つの実施形態において、加水分解性結合は、ナノ粒子とリガンドとを架橋する２つの構成要素ポリマー間に置かれてもよく、その結果、結合の加水分解後に、ナノ粒子およびリガンドは分離される。一つの実施形態において、リンカーは、一端でナノ粒子コアにコンジュゲートし、標的化を媒介するリガンドにジアミノケタール（ＤＡＫ）を介して連結されたＰＥＧポリマーから構成される。このような粒子が細胞によりエンドサイトーシスされた後、リガンドは、ナノ粒子から、それが低ｐＨの環境に遭遇するときに解離され、これは、ＣＮＳの実質中にナノ粒子が出て行くことを促進する。特定の実施形態において、低ｐＨで分断され、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすことができる加水分解性化学結合を有する標的化剤は、ＰＥＧ−オルトピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）に結合しているＤＡＫリンカーに結合したリガンドを有することによって形成されることができ、ここで、リガンドおよびＯＰＳＳは、標的化剤の反対端にある（例えば、以下のスキーム２を参照のこと）。
【００３８】
記載される実施形態の一部において、リンカーは、ナノ粒子が脳内皮細胞内にあるときに、低ｐＨで分断され、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすことができるｐＫａを有する化学結合を含んでもよい。一つの実施形態において、この加水分解性結合は、ナノ粒子コアへのコンジュゲーションを媒介するために標的化剤の一端に置かれていてもよい。この配置において、ナノ粒子コアと標的化剤との間の結合の加水分解に有利に働くｐＨのシフトは、コアを標的化剤上のリガンドから分離させるようにする。一つの実施形態において、標的化剤は、ＰＥＧセグメントの反対端にリガンドを有するＰＥＧ化ニトロフェニルボロン酸であってもよく、ナノ粒子コアは、ｃＭＡＰで作られていてもよい。ｃＭＡＰ上に存在するジオールとボロン酸は、粒子コアと標的化剤との共有結合を可能にするが、これらの結合は、およそ６．８のｐＫａを有する。従って、一旦粒子が細胞によりエンドサイトーシスされると、リガンドは、ナノ粒子から、それが低ｐＨの環境に遭遇するときに解離され、これは、ＣＮＳの実質中にナノ粒子が出て行くことを促進する。一つの実施形態において、本明細書で記載される標的化剤は、式ＶＩＩ：
【００３９】
【化４】
0006366690.tif 000005
（ここで、ｎは、２から２０００の間の任意の整数であり、Ｒは、これらに限定されないが、第一級のアミン、アジド、アルコール、チオール、アルデヒド、またはカルボン酸を含めた官能基である）
の構造を有してもよい。ある特定の実施形態において、ｎは、約１２０から約１８０の間の任意の整数であってもよい。一部の実施形態において、ｎは、約１４０から１６０の間の任意の整数であってもよい。一部の実施形態において、ｎは、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、または１６０のいずれか一つであってもよい。
【００４０】
上述の開示に基づいて、リンカーの変異形態が、記載される標的ナノ粒子の送達を可能にし、次いで、ナノ粒子のリガンドからの解離を媒介するために、記載される標的化剤と一緒に使用されてもよいことを当業者は理解する。このような代替は、本開示および当技術分野の通常の知識を考慮し当業者に容易に明らかであるので、本開示の範囲にあると考えられる。
【００４１】
記載されるポリマー、ナノ粒子コア、およびリンカーは、記載ナノ粒子の標的化を媒介するために１種または複数のリガンドと組み合わされてもよい。一部の実施形態において、リガンドは、脳内皮細胞により発現される受容体または表面タンパク質に特異的に結合する。さらなる実施形態において、リガンドは、トランスサイトーシスを受ける脳内皮細胞により発現される受容体または表面タンパク質に特異的に結合する。トランスサイトーシスを受けるタンパク質の細胞輸送は、それらを、本明細書で提供される方法を行なうための（絶対に必要とは限らないが）望ましい標的にする。トランスサイトーシスを受ける標的化細胞タンパク質は、提供される方法の成功の見込みを増大させ得、これは、これらの細胞タンパク質がしばしば協調された様式で、細胞の一側から他側にタンパク質および他の分子を輸送することが知られているからである。記載方法によって使用されてもよいリガンドとしては、これらに限定されないが、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に特異的な抗体、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン、インスリン受容体に特異的な抗体、インスリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子受容体１に特異的な抗体、インスリン様成長因子受容体１に特異的に結合するポリペプチド、アポリポタンパク質Ｅ、ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的な抗体、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的に結合するポリペプチド；ジフテリア毒素受容体に特異的な抗体、またはジフテリア毒素受容体に特異的に結合するポリペプチドが挙げられる。当技術分野で知られているトランスサイトーシスを容易にすることができる他の細胞タンパク質も、本明細書で開示される方法を行なうためのリガンドにより標的化されてもよい。
【００４２】
種々のリガンドが、記載方法を行なうために使用されてもよく、異なるナノ粒子およびリンカーと共に使用されてもよい。記載方法によって使用されてもよいリガンドとしては、これらに限定されないが、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に特異的な抗体、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン、インスリン受容体に特異的な抗体、インスリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子受容体１に特異的な抗体、インスリン様成長因子受容体１に特異的に結合するポリペプチド、アポリポタンパク質Ｅ、ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的な抗体、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的に結合するポリペプチド；ジフテリア毒素受容体に特異的な抗体、またはジフテリア毒素受容体に特異的に結合するポリペプチドが挙げられる。記載される実施形態の一部において、記載リガンドは、ナノ粒子が脳内皮細胞内にあるときに、化学的または酵素的に切断され、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすことができるポリペプチドまたは化学結合とコンジュゲーションで使用されてもよい。例えば、リガンドに結合したリンカーは、結合リガンドの直前に酵素標的配列を組み込み、細胞エンドソーム中への移入後のリガンドの切断を容易にし、それにより、リガンドをナノ粒子から分離することができる。一つの実施形態において、切断部位は、ナノ粒子からのリガンドの解離を促進するためのカテプシン標的配列を含んでもよい。酵素により標的化される他の配列が、そのリガンドからのナノ粒子の解離を引き起こすために同様の様式で用いられてもよく、このことが、細胞による排出後にナノ粒子がＣＮＳの実質中に移動することを可能にすることを当業者は理解する。代わりに、プロテアソーム分解タグもリンカーに組み込まれてリガンドを分解させるが、ナノ粒子それ自体は無傷のままとすることができる。これは、細胞取り込み後にリガンドとナノ粒子とを有効に解離させるからである。化学的に切断され得る特定の化学結合、例えば、オルトエステル、アセタール、ケタール、イミン、およびヒドラゾンを有するリンカーの使用も、本開示の範囲内にあることが理解されるべきであり、このような結合がリガンドのコンジュゲートされたナノ粒子からの解離を容易にするために使用され得ることを当業者は理解する。
【００４３】
記載される実施形態の一部において、記載リガンドは、ナノ粒子が脳内皮細胞内にあるときに、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすために還元され得るジスルフィド結合を有するリンカーと一緒に使用されてもよい。記載方法によって使用されてもよいリガンドとしては、これらに限定されないが、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に特異的な抗体、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン、インスリン受容体に特異的な抗体、インスリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子受容体１に特異的な抗体、インスリン様成長因子受容体１に特異的に結合するポリペプチド、アポリポタンパク質Ｅ、ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的な抗体、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的に結合するポリペプチド；ジフテリア毒素受容体に特異的な抗体、またはジフテリア毒素受容体に特異的に結合するポリペプチドが挙げられる。一つの実施形態において、ジスルフィド結合は、ナノ粒子とリガンドとを架橋する２つの構成要素ポリマー間に置かれてもよく、その結果、ジスルフィド結合の還元後、ナノ粒子およびリガンドは分離される。一つの実施形態において、リンカーはジスルフィド結合により連結される２つのＰＥＧポリマーから構成され、ここで、ＰＥＧポリマーの一方はナノ粒子コアにコンジュゲートしており、他方はナノ粒子コアに連結されるときに標的化を媒介する本明細書のリガンドにコンジュゲートしている。このような粒子が細胞によりエンドサイトーシスされた後、リガンドは、ナノ粒子から解離され、これは、ＣＮＳの実質中にナノ粒子が出て行くことを促進する。
【００４４】
記載される実施形態の一部において、記載リガンドは、ナノ粒子が脳内皮細胞内にあるときに、低ｐＨで分断され、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすことができる加水分解性化学結合を有するリンカーと会合していてもよい。記載方法によって使用されてもよいリガンドとしては、これらに限定されないが、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に特異的な抗体、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン、インスリン受容体に特異的な抗体、インスリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子受容体１に特異的な抗体、インスリン様成長因子受容体１に特異的に結合するポリペプチド、アポリポタンパク質Ｅ、ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的な抗体、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的に結合するポリペプチド；ジフテリア毒素受容体に特異的な抗体、またはジフテリア毒素受容体に特異的に結合するポリペプチドが挙げられる。一つの実施形態において、加水分解性結合は、ナノ粒子と本明細書で記載されるリガンドのいずれか１種とを架橋する２つの構成要素ポリマーの間に置かれてもよく、その結果、結合の加水分解後、ナノ粒子およびリガンドは分離される。一つの実施形態において、リンカーは、一端でナノ粒子コアにコンジュゲートされ、かつ反対端で、記載リガンドのいずれか一つにジアミノケタール（ＤＡＫ）を介して連結されたＰＥＧポリマーポリマーから構成される。このような粒子が細胞によりエンドサイトーシスされた後、リガンドは、ナノ粒子から、それが低ｐＨの環境に遭遇するときに解離され、これは、ＣＮＳの実質中にナノ粒子が出て行くことを促進する。一つの実施形態において、低ｐＨで分断され、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすことができる加水分解性化学結合を有する標的化剤は、ＰＥＧ−オルトピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）に結合しているＤＡＫリンカーに結合した記載リガンドのいずれか一つを有することによって形成することができ、ここで、リガンドおよびＯＰＳＳは、標的化剤の反対端にある。特定の実施形態において、低ｐＨで分断され、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすことができる加水分解性化学結合を有する標的化剤は、ＰＥＧオルトピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）に結合しているＤＡＫリンカーに結合したＴｆを有することによって形成することができ、ここで、リガンドおよびＯＰＳＳは標的化剤の反対端にある（例えば、以下のスキームを参照のこと）。
【００４５】
記載される実施形態の一部において、記載リガンドは、ナノ粒子が脳内皮細胞内にあるときに、低ｐＨで分断され、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすことができるｐＫａを有する化学結合を含むリンカーによって、ナノ粒子コアにコンジュゲートしていてもよい。記載方法によって使用されてもよいリガンドとしては、これらに限定されないが、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に特異的な抗体、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン、インスリン受容体に特異的な抗体、インスリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子受容体１に特異的な抗体、インスリン様成長因子受容体１に特異的に結合するポリペプチド、アポリポタンパク質Ｅ、ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的な抗体、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的に結合するポリペプチド；ジフテリア毒素受容体に特異的な抗体、またはジフテリア毒素受容体に特異的に結合するポリペプチドが挙げられる。一つの実施形態において、加水分解性結合は、ナノ粒子コアへのコンジュゲーションを媒介するために標的化剤の一端に置かれてもよい。この配置において、ナノ粒子コアと標的化剤との間の結合の加水分解に有利に働くｐＨのシフトは、コアを標的化剤上のリガンドから分離させるようにする。一つの実施形態において、標的化剤は、ＰＥＧセグメントの反対端に記載リガンドのいずれか１種を有するＰＥＧ化ニトロフェニルボロン酸であってもよい。対応するナノ粒子コアは、ｃＭＡＰで作られていてもよい。ｃＭＡＰ上に存在するジオールとボロン酸は、粒子コアと標的化剤との共有結合を可能にする；しかし結合がおよそ６．８またはそれ未満のｐＫａを有する場合、標的化剤は、ナノ粒子から、それが低ｐＨの環境に遭遇するときに解離する。この解離は、ＣＮＳの実質中にナノ粒子が出て行くことを促進する。一つの実施形態において、本明細書で記載される標的化剤は、Ｔｆリガンドに付加された式ＶＩＩ：
【００４６】
【化５】
0006366690.tif 000006
（ここで、ｎは、２から２０００の間の任意の整数である）
の構造を有してもよい。ある特定の実施形態において、ｎは、約１２０から約１８０の間の任意の整数であってもよい。一部の実施形態において、ｎは、約１４０から１６０の間の任意の整数であってもよい。一部の実施形態において、ｎは、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、または１６０のいずれか一つであってもよい。代わりに、本明細書で記載されるリンカーのいずれかと共に使用されるＰＥＧセグメントは、約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約６ｋＤａ、約７ｋＤａ、約８ｋＤａ、約９Ｄａ、約１０ｋＤａ、約１１ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１３ｋＤａ、約１４ｋＤａ、または約１５ｋＤａであってもよい。
【００４７】
上述の開示に基づいて、リンカーの変異形態が記載リガンドと共に使用され、記載される標的ナノ粒子の送達を可能にし、次いで、ナノ粒子のリガンドからの解離を媒介するために、種々の標的化剤を形成してもよいことを当業者は理解する。このような代替は、本開示および当技術分野で通常の知識を考慮して当業者に容易に明らかであるので、本開示の範囲内にあると考えられる。
【００４８】
記載方法を行うために、記載ナノ粒子にコンジュゲートしている標的化剤の数を制御することが有利であり得る。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、１０００個程度の多いコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。他の実施形態において、記載ナノ粒子は、５００個程度の多いコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、４００個程度の多いコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、３００個程度の多いコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、２００個程度の多いコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、１００個程度の多いコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。さらに、記載ナノ粒子は、約２０個から５０個程度の少ないコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。さらに別の実施形態において、記載ナノ粒子は、１５未満のコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。さらに別の実施形態において、記載ナノ粒子は、１０のコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。さらに別の実施形態において、記載ナノ粒子は、９つのコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。さらに別の実施形態において、記載ナノ粒子は、８つのコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。さらに別の実施形態において、記載ナノ粒子は７つのコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。さらに別の実施形態において、記載ナノ粒子は、６つのコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。さらに別の実施形態において、記載ナノ粒子は、５つのコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。さらに別の実施形態において、記載ナノ粒子は、４つのコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。さらに別の実施形態において、記載ナノ粒子は、３つのコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。さらに別の実施形態において、記載ナノ粒子は、２つのコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。さらに別の実施形態において、記載ナノ粒子は、一つのコンジュゲートされた標的化剤を有してもよい。標的化剤の数は、送達されるナノ粒子の種類、送達標的、粒子を標的化するために使用されるリガンド、または多数の他の要因に依存して調節されてもよい。
【００４９】
代わりに、本明細書で記載されるナノ粒子は、標的化剤とナノ粒子コアに結合している間隔分子（結合リガンドを有しない標的化剤）との混合物を有してもよい。一部の実施形態において、ナノ粒子コアにコンジュゲートした標的化剤の数は、結合スペーサ分子の数を上回る。一部の実施形態において、標的化剤とナノ粒子のコアにコンジュゲートしたスペーサ分子との比は、約１００：１、約５０：１、約２０：１、約１０：１、約７：１、約５：１、約４：１、約３：１、または約２：１であってもよい。一部の実施形態において、標的化剤とナノ粒子のコアにコンジュゲートしたスペーサ分子との比は、およそ同じ−約１：１であってもよい。一部の実施形態において、ナノ粒子コアにコンジュゲートしたスペーサ分子の数は、結合標的化剤を上回る。一部の実施形態において、スペーサ分子とナノ粒子のコアにコンジュゲートした標的化剤との比は、約１００：１、約５０：１、約２０：１、約１０：１、約７：１、約５：１、約４：１、約３：１、または約２：１であってもよい。スペーサ分子とナノ粒子のコアにコンジュゲートした標的化剤との相対分布を理解するための別の方法は、標的化剤である合計結合コンジュゲートのパーセントを単位とする。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約１００％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約９０％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約８０％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約７０％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約６０％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約５０％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約４０％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約３０％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約２０％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約１９％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約１８％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約１７％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約１６％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約１５％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約１４％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約１３％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約１２％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約１１％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約１０％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約９％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約８％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約７％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約６％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約５％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約４％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約３％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約２％である。一部の実施形態において、標的化分子である（残りはスペーサ分子である）ナノ粒子コアに結合したコンジュゲートの合計パーセントは、約１％である。本明細書で記載される比およびパーセントにより、２つ以上の標的化剤および／またはスペーサ分子がナノ粒子コアに結合している実施形態などの、コンジュゲートの混合群が説明されてもよい。
【００５０】
本明細書で記載される方法は、粒子の脳実質への局在を可能にする、記載ナノ粒子の細胞輸送に部分的に依存する。ほとんどの場合、記載方法は、標的脳内皮細胞を通してエンドソーム輸送のいくつかの形態を利用する。この態様および粒子親和性などの実用上の態様は、提供される方法による使用のためのナノ粒子を設計する際に、粒子サイズを考慮すべき重要な要因にする。提供される方法による使用に適した粒子は、約４０ｎｍから約１００ｎｍであってもよい。一部の実施形態において、本明細書で記載される方法は、本明細書で記載される標的化剤のいずれか一つにコンジュゲートしている、本明細書で記載されるナノ粒子コアを含む標的ナノ粒子を使用して行なわれてもよく、ここで、標的ナノ粒子の合計サイズは、約２０ｎｍから約１００ｎｍである。一部の実施形態において、標的ナノ粒子のサイズは、約４０ｎｍから約１００ｎｍである。一部の実施形態において、標的ナノ粒子のサイズは、約４０ｎｍから約９０ｎｍである。一部の実施形態において、標的ナノ粒子のサイズは、約４０ｎｍから約８０ｎｍである。一部の実施形態において、標的ナノ粒子のサイズは、約４０ｎｍから約７０ｎｍである。一部の実施形態において、標的ナノ粒子のサイズは、約４０ｎｍから約６０ｎｍである。一部の実施形態において、標的ナノ粒子のサイズは、約４０ｎｍから約５０ｎｍである。一部の実施形態において、標的ナノ粒子のサイズは、約５０ｎｍから約１００ｎｍである。一部の実施形態において、標的ナノ粒子のサイズは、約５０ｎｍから約９０ｎｍである。一部の実施形態において、標的ナノ粒子のサイズは、約６０ｎｍから約８０ｎｍである。一部の実施形態において、標的ナノ粒子のサイズは、約５０ｎｍから約７０ｎｍである。一部の実施形態において、標的ナノ粒子のサイズは、約７０ｎｍから約１００ｎｍである。
【００５１】
本明細書で記載される方法は、粒子の脳実質への局在を可能にする、記載ナノ粒子の細胞輸送に部分的に依存する。血液脳関門の脳内皮細胞を通過するナノ粒子を設計する際に、粒子とこれらの内皮細胞との相互作用を抑制するよりはむしろ容易にし得る粒子の態様を考慮にいれることが重要である。このような特性の一つは、粒子の電荷である。従って、記載方法は、本明細書で記載される標的化剤のいずれか一つにコンジュゲートしている、本明細書で記載されるとおりのナノ粒子コアを含む標的ナノ粒子を使用して行なわれてもよく、ここで、標的ナノ粒子の電荷は、ほとんど中性である。記載粒子のゼータ電位は、粒子コアを作製するために使用される材料、使用されるリンカー、およびリガンドに依存して変わり得る。ほとんどの場合、標的ナノ粒子のゼータ電位は、陰性の範囲に入る。本明細書で記載される方法による使用のためのナノ粒子のゼータ電位は、約−０．５ｍＶから約−１５．０ｍＶの範囲であり得る。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、約−２．０ｍＶから約−１１．０ｍＶのゼータ電位を有する。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、約−３．０ｍＶから約−１１．０ｍＶのゼータ電位を有する。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、約−４．０ｍＶから約−１１．０ｍＶのゼータ電位を有する。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、約−５．０ｍＶから約−１１．０ｍＶのゼータ電位を有する。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、約−６．０ｍＶから約−１１．０ｍＶのゼータ電位を有する。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、約−７．０ｍＶから約−１１．０ｍＶのゼータ電位を有する。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、約−８．０ｍＶから約−１１．０ｍＶのゼータ電位を有する。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、約−９．０ｍＶから約−１１．０ｍＶのゼータ電位を有する。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、約−２．０ｍＶから約−１０．０ｍＶのゼータ電位を有する。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、約−２．０ｍＶから約−９．０ｍＶのゼータ電位を有する。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、約−２．０ｍＶから約−８．０ｍＶのゼータ電位を有する。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、約−２．０ｍＶから約−７．０ｍＶのゼータ電位を有する。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、約−４．０ｍＶから約−８．０ｍＶのゼータ電位を有する。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、約−５．０ｍＶから約−７．０ｍＶのゼータ電位を有する。一部の実施形態において、記載ナノ粒子は、−５．０、−５．１、−５．２、−５．３、−５．４、−５．５、−５．６、−５．７、−５．８、−５．９、−６．０、−６．１、−６．２、−６．３、−６．４、−６．５、−６．６、−６．７、−６．８、−６．９、−７．０、−７．１、−７．２、−７．３、−７．４、−７．５、−７．６、−７．７、−７．８、−７．９、または−８．０ｍＶのゼータ電位を有する。
【００５２】
記載方法は、記載ナノ粒子に、ナノ粒子の対象への投与前に目的の治療剤または造影剤を負荷させることによって、治療薬または造影剤を対象の脳に送達するために使用されてもよい。負荷ナノ粒子の送達後、標的化剤は、目的の標的細胞、例えば、脳内皮細胞への送達を容易にする。標的細胞による内部移行の後に、ナノ粒子は標的化剤から解離する。脳内皮細胞の場合、次いで、内部移行したナノ粒子は、細胞から脳の間質腔に排出され、ここで、粒子は負荷作用物質を不安定化および分泌し、それにより、作用物質を脳または他の標的場所に送達する。一部の実施形態において、記載方法は、セロトニンまたはドーパミンなどの神経伝達物質を脳に送達するために行なわれてもよく、これは、神経障害を治療するために使用されてもよい。神経障害の治療における使用のための他の作用物質も、記載方法によって脳に送達されてもよい。それ自体で脳に容易に接近し得ない造影剤も、記載方法を使用して送達されてもよい。一部の実施形態において、記載方法は、画像化を可能にするために造影剤Ｃｕ６４を対象の脳に運ぶナノ粒子を送達するために使用されてもよい。さらに、記載方法は、１種または複数の治療剤、造影剤、または治療剤、造影剤の両方の組合せを対象の脳に送達するために使用されてもよい。
【００５３】
本明細書で記載されるナノ粒子は、例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、溶液剤などの任意の許容される剤形で経口的に投与されてもよい。ナノ粒子はまた、これらに限定されないが、皮下、静脈内、筋内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、および頭蓋内の注射または注入技術を含めて、非経口的に投与されてもよい。代わりにナノ粒子は、例えば、注射によって静脈内または腹腔内に投与される。
【００５４】
対象は、任意の動物であってもよく、好ましくは哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ロバ、ウシ、ウマ、ブタなどである。最も好ましい哺乳動物はヒトである。一部の実施形態において、対象は、少なくとも１種の記載ナノ粒子で、対象の体重１ｋｇ当たり０．０１μｇから５００ｍｇの１日用量範囲で投与されてもよい。対象に投与される用量はまた、１日当たり投与される少なくとも１種の記載ナノ粒子の合計量で測定されてもよい。一部の実施形態において、対象は、用量当たり少なくとも１種の記載ナノ粒子で５ミリグラムから５０００ミリグラム投与される。一部の実施形態において、対象は、用量当たり少なくとも１種の記載ナノ粒子で最大で１０ミリグラムまで投与される。一部の実施形態において、対象は、用量当たり少なくとも１種の記載ナノ粒子で最大で１００ミリグラムまで投与される。一部の実施形態において、対象は、用量当たり少なくとも１種の記載ナノ粒子で最大で２５０ミリグラムまで投与される。一部の実施形態において、対象は、用量当たり少なくとも１種の記載ナノ粒子で最大で５００ミリグラムまで投与される。一部の実施形態において、対象は、用量当たり少なくとも１種の記載ナノ粒子で最大で７５０ミリグラムまで投与される。一部の実施形態において、対象は、用量当たり少なくとも１種の記載ナノ粒子で最大で１０００ミリグラムまで投与される。一部の実施形態において、対象は、用量当たり少なくとも１種の記載ナノ粒子で最大で１５００ミリグラムまで投与される。一部の実施形態において、対象は、用量当たり少なくとも１種の記載ナノ粒子で最大で２０００ミリグラムまで投与される。一部の実施形態において、対象は、用量当たり少なくとも１種の記載ナノ粒子で最大で２５００ミリグラムまで投与される。一部の実施形態において、対象は、用量当たり少なくとも１種の記載ナノ粒子で最大で３０００ミリグラムまで投与される。一部の実施形態において、対象は、用量当たり少なくとも１種の記載ナノ粒子で最大で３５００ミリグラムまで投与される。一部の実施形態において、対象は、用量当たり少なくとも１種の記載ナノ粒子で最大で４０００ミリグラムまで投与される。一部の実施形態において、対象は、用量当たり少なくとも１種の記載ナノ粒子で最大で４５００ミリグラムまで投与される。一部の実施形態において、対象は、用量当たり少なくとも１種の記載ナノ粒子で最大で５０００ミリグラムまで投与される。一部の実施形態において、記載方法は、本明細書で記載されるナノ粒子が、対象に、週１回、週２回、月１回、月２回、半年に１回、または年１回投与されるように行なわれてもよい。処置は、最適用量未満である比較的少量の投与量で開始し、続いて、状況下の最適効果が達せられるまで処置の過程にわたって投与量を増加させてもよい。
【００５５】
本明細書で提供される方法は、薬学的に許容される担体中で懸濁される一方で、本明細書で記載されるナノ粒子を対象に投与することによって行われてもよい。このような組成物は、例えば、神経障害を治療するための患者への投与に有用である。組成物は、当技術分野で知られており、かつ適切である様々な調製物のいずれに製剤化されてよい。一部の実施形態において、組成物は水性製剤である。水性溶液剤は、ナノ粒子を水または適切な生理学的緩衝液中で混合し、要望に応じて適切な着色剤、保存剤、安定化剤および増粘剤などを任意選択により添加することによって調製されてもよい。水性懸濁剤も、ナノ粒子を、粘性物質、例えば、天然または合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および他の周知の懸濁化剤と一緒に水または生理学的緩衝液に分散させることによって作製されてもよい。
【００５６】
使用の直前に液体調製物に変換されることが意図される液体製剤および固体形態調製物も挙げられる。このような液剤としては、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、スラリー剤、および乳剤が挙げられる。液体調製物は、薬学的に許容される添加物、例えば、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪もしくは油）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、または分留植物油）；および保存剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）と一緒に慣用手段によって調製されてもよい。これらの調製物は、活性剤に加えて、着色剤、香味料、安定剤、緩衝剤、人工および天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含有してもよい。組成物は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、滅菌水、生理学的緩衝液、食塩水、またはアルコールとの構成のための粉末または凍結乾燥形態であってもよい。
【００５７】
組成物は、対象への注射のために製剤化されてもよい。注射の場合、記載される組成物は、水もしくはアルコールなどの水性溶液、またはハンクス液などの生理学的適合緩衝液、リンゲル液、もしくは生理学的食塩水緩衝液中で製剤化されてもよい。溶液剤は、１種または複数の調合剤、例えば、懸濁化剤、安定剤または分散剤を含有してもよい。注射剤はまた、使用の直前に、例えば、適切なビヒクル、例えば、滅菌水、食塩水、またはアルコールとの構成によって注射に適した液体形態調製物に変換されることが意図される固体形態調製物として調製されてもよい。
【００５８】
脳への送達のために標的化されたナノ粒子を作製するためのキットが、本明細書で記載される。例えば、記載キットは、カチオン性粘液酸ポリマー（ｃＭＡＰ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、キトサン、ポリエチレンイミンなどの合成ポリマー、金、酸化鉄、または当業者により理解されるとおりの他の類似物質；脳内皮細胞により発現される受容体に特異的な標的化剤（ここで、標的化剤は、脳内皮細胞内にあるときに、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすリンカーにコンジュゲートしているリガンドを含む）の外部表面を有するナノ粒子を構築するための材料および試薬；ならびにナノ粒子を構築するための使用説明書を含んでもよい。記載キットはまた、トランスサイトーシスを受けることが知られた脳内皮細胞タンパク質を標的化するためのリガンドを含んでもよい。
【００５９】
脳への送達のために標的化されたナノ粒子を作製するためのキットも、本明細書で記載される。例えば、記載キットは、カチオン性粘液酸ポリマー（ｃＭＡＰ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、キトサン、ポリエチレンイミンなどの合成ポリマー、金、酸化鉄、または当業者により理解されるとおりの他の類似物質；脳内皮細胞により発現される受容体に特異的な標的化剤（ここで、標的化剤は、脳内皮細胞内にあるときに、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすリンカーにコンジュゲートしているリガンドを含む）の外部表面を有するナノ粒子を構築するための材料および試薬；ならびにナノ粒子を構築するための使用説明書を含んでもよい。記載キットはまた、脳内皮細胞を標的化するためのリガンド、例えば、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に特異的な抗体、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン、インスリン受容体に特異的な抗体、インスリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子受容体１に特異的な抗体、インスリン様成長因子受容体１に特異的に結合するポリペプチド、アポリポタンパク質Ｅ、ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的な抗体、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的に結合するポリペプチド；ジフテリア毒素受容体に特異的な抗体、またはジフテリア毒素受容体に特異的に結合するポリペプチドを含んでもよい。
【００６０】
前に記載された主題の例証的実施形態が以下に提供される。これらの実施形態は、上述の開示を、限定することではなく、例証することを意味する。
【００６１】
１．対象の脳にナノ粒子を送達する方法であって、対象にナノ粒子コアおよび標的化剤を有するナノ粒子を投与するステップを含み、前記標的化剤は、脳内皮細胞により発現される受容体に特異的なリガンド、およびリガンドをナノ粒子コアに連結するリンカーを含み、前記リンカーは、脳内皮細胞内にあるときに、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こし、前記リガンドは、リンカーによってナノ粒子コアの外部表面にコンジュゲートしている方法。
【００６２】
２．ナノ粒子コアの表面が、カチオン性粘液酸ポリマー（ｃＭＡＰ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、キトサン、ポリエチレンイミンなどの合成ポリマー、デンドリマー、金、または酸化鉄のいずれか１種を含み；
リガンドが、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に特異的な抗体、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン、インスリン受容体に特異的な抗体、インスリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子受容体１に特異的な抗体、インスリン様成長因子受容体１に特異的に結合するポリペプチド、アポリポタンパク質Ｅ、ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的な抗体、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的に結合するポリペプチド；ジフテリア毒素受容体に特異的な抗体、またはジフテリア毒素受容体に特異的に結合するポリペプチドのいずれか１種であり；
リンカーが、ナノ粒子に結合していないときにニトロフェニルボロン酸を含み、ナノ粒子に結合しているときにニトロフェニルボロン酸エステルを形成する、実施形態１に記載の方法。
【００６３】
３．ナノ粒子コアが、構造：
【００６４】
【化６】
0006366690.tif 000007
（ここで、ｍは、５から５０の間の任意の整数である）
を有するカチオン性粘液酸ポリマー（ｃＭＡＰ）を含む、実施形態２に記載の方法。
【００６５】
４．ｍが、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のいずれか一つである、実施形態３に記載の方法。
【００６６】
５．標的化剤のリンカーが、前記ニトロフェニルボロン酸と前記リガンドとの間にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーをさらに含む、実施形態１から４のいずれか一つに記載の方法。
【００６７】
６．リンカーが、構造：
【００６８】
【化７】
0006366690.tif 000008
（ここで、ｎは、２から２０００の間の任意の整数であり、Ｒは、第一級のアミン、アジド、アルコール、チオール、アルデヒド、またはカルボン酸から選択される官能基である）
を有する、実施形態５に記載の方法。
【００６９】
７．標的化剤が、
【００７０】
【化８】
0006366690.tif 000009
であり、ｎが２から２０００の間の任意の整数である、実施形態１から６のいずれか一つに記載の方法。
【００７１】
８．ｎが約１１０から約１５０の任意の整数である、実施形態６または７に記載の方法。
【００７２】
９．
ナノ粒子コアの表面が、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマーを含み、
リガンドが、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に特異的な抗体、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン、インスリン受容体に特異的な抗体、インスリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子受容体１に特異的な抗体、インスリン様成長因子受容体１に特異的に結合するポリペプチド、アポリポタンパク質Ｅ、ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的な抗体、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的に結合するポリペプチド；ジフテリア毒素受容体に特異的な抗体、またはジフテリア毒素受容体に特異的に結合するポリペプチドのいずれか１種であり；
リンカーが、ＰＥＧポリマーを含む、実施形態１に記載の方法。
【００７３】
１０．ＰＥＧポリマーが、ジスルフィド結合または酵素切断部位を有するポリペプチドを介してリガンドにコンジュゲートしている、実施形態９に記載の方法。
【００７４】
１１．ナノ粒子コアが、構造：
【００７５】
【化９】
0006366690.tif 000010
（ここで、ｘおよびｙは、独立して、５から５００の間の任意の整数である）
を有するＰＬＧＡを含む、実施形態９または１０に記載の方法。
【００７６】
１２．ｘおよびｙが、独立して、４０、４５、５０、５５、または６０のいずれか一つである、実施形態１１に記載の方法。
【００７７】
１３．ＰＬＧＡを含むナノ粒子コアが、ＰＥＧリンカーにコンジュゲートしており、構造：
【００７８】
【化１０】
0006366690.tif 000011
を有し、ｚが、２から２０００の間の任意の整数であり、ｘおよびｙが、独立して、５から５００の間の任意の整数であり、Ｒが、第一級のアミン、アジド、アルコール、チオール、アルデヒド、またはカルボン酸から選択される、実施形態１１または１２に記載の方法。
【００７９】
１４．ｚが、約１１０から約１５０の任意の整数であり、ｘおよびｙが５０である、実施形態１３に記載の方法。
【００８０】
１５．標的化剤が、
【００８１】
【化１１】
0006366690.tif 000012
であり、ｚが、約１１０から約１５０の任意の整数であり、ｘおよびｙが５０である、実施形態９から１４のいずれか一つに記載の方法。
【００８２】
１６．ナノ粒子コアの表面が、カチオン性粘液酸ポリマー（ｃＭＡＰ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、キトサン、ポリエチレンイミンなどの合成ポリマー、デンドリマー、金、または酸化鉄のいずれか１種を含み；
リガンドが、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に特異的な抗体、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン、インスリン受容体に特異的な抗体、インスリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子受容体１に特異的な抗体、インスリン様成長因子受容体１に特異的に結合するポリペプチド、アポリポタンパク質Ｅ、ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的な抗体、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的に結合するポリペプチド；ジフテリア毒素受容体に特異的な抗体、またはジフテリア毒素受容体に特異的に結合するポリペプチドのいずれか１種であり；
リンカーが、ＰＥＧにコンジュゲートしたジアミノケタールを含む、実施形態１に記載の方法。
【００８３】
１７．リンカーが、ナノ粒子が脳内皮細胞内にあるときに、還元され、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすことができるジスルフィド結合を含む、実施形態１に記載の方法。
【００８４】
１８．リンカーが、ナノ粒子が脳内皮細胞内にあるときに、酵素的に切断され、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすことができるポリペプチドまたは化学結合を含む、実施形態１に記載の方法。
【００８５】
１９．リンカーが、ナノ粒子が脳内皮細胞内にあるときに、低ｐＨで分断され、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすことができる加水分解性化学結合を含む、実施形態１に記載の方法。
【００８６】
２０．リンカーが、ナノ粒子が脳内皮細胞内にあるときに、低ｐＨで分断され、ナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすことができるｐＫａを有する化学結合を含む、実施形態１に記載の方法。
【００８７】
２１．低ｐＨが、約６．８から約２．０の値である、実施形態１９または２０に記載の方法。
【００８８】
２２．低ｐＨが、約５．５から約２．５の値である、実施形態２１に記載の方法。
【００８９】
２３．低ｐＨが、約５．５から約４．０の値である、実施形態２１に記載の方法。
【００９０】
２４．ナノ粒子コアの表面が、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を含む、実施形態１７から２３のいずれか一つに記載の方法。
【００９１】
２５．ナノ粒子コアの表面が、カチオン性粘液酸ポリマー（ｃＭＡＰ）を含む、実施形態１７から２３のいずれか一つに記載の方法。
【００９２】
２６．ナノ粒子コアの表面が、金を含む、実施形態１７から２３のいずれか一つに記載の方法。
【００９３】
２７．ナノ粒子コアの表面が、カチオン性粘液酸（ｃＭＡＰ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、キトサン、ポリエチレンイミンなどの合成ポリマー、デンドリマー、金、または酸化鉄のいずれか１種を含み；
リガンドが、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に特異的な抗体、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン、インスリン受容体に特異的な抗体、インスリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子受容体１に特異的な抗体、インスリン様成長因子受容体１に特異的に結合するポリペプチド、アポリポタンパク質Ｅ、ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的な抗体、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的に結合するポリペプチド；ジフテリア毒素受容体に特異的な抗体、またはジフテリア毒素受容体に特異的に結合するポリペプチドのいずれか１種であり；
リンカーが、ＰＥＧにコンジュゲートしている、オルトエステル、アセタール、ケタール、イミン、またはヒドラゾンから選択される酸切断性化学結合を含む、実施形態１に記載の方法。
【００９４】
２８．ナノ粒子が、その表面にコンジュゲートした２００未満の標的化剤を含む、実施形態１から２７のいずれか一つに記載の方法。
【００９５】
２９．ナノ粒子が、その表面にコンジュゲートした２０未満の標的化剤を含む、実施形態１から２８のいずれか一つに記載の方法。
【００９６】
３０．ナノ粒子が、その表面にコンジュゲートした５未満の標的化剤を含む、実施形態１から２９のいずれか一つに記載の方法。
【００９７】
３１．ナノ粒子が、その表面にコンジュゲートした単一の標的化剤を含む、実施形態１から３０のいずれか一つに記載の方法。
【００９８】
３２．ナノ粒子が、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定して約４０ｎｍから約１００ｎｍのサイズを有する、実施形態１から３１のいずれか一つに記載の方法。
【００９９】
３３．ナノ粒子が、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定して約５０ｎｍから約７０ｎｍのサイズを有する、実施形態３２に記載の方法。
【０１００】
３４．ナノ粒子が、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定して５５ｎｍ、５６ｎｍ、５７ｎｍ、５８ｎｍ、５９ｎｍ、６０ｎｍ、６１ｎｍ、６２ｎｍ、６３ｎｍ、６４ｎｍ、６５ｎｍ、６６ｎｍ、６７ｎｍ、６８ｎｍ、または６９ｎｍのサイズを有する、実施形態３３に記載の方法。
【０１０１】
３５．ナノ粒子が、位相分析光散乱により測定して約−０．５ｍＶから約−１５．０ｍＶの平均ゼータ電位を有する、実施形態１から３４のいずれか一つに記載の方法。
【０１０２】
３６．ナノ粒子が、位相分析光散乱により測定して−５．０、−５．１、−５．２、−５．３、−５．４、−５．５、−５．６、−５．７、−５．８、−５．９、−６．０、−６．１、−６．２、−６．３、−６．４、−６．５、−６．６、−６．７、−６．８、−６．９、−７．０、−７．１、−７．２、−７．３、−７．４、−７．５、−７．６、−７．７、−７．８、−７．９、または−８．０ｍＶの平均ゼータ電位を有する、実施形態３５に記載の方法。
【０１０３】
３７．ナノ粒子が、治療剤をさらに含む、実施形態１から３６のいずれか一つに記載の方法。
【０１０４】
３８．治療剤が、神経障害に対して有効である、実施形態３７に記載の方法。
【０１０５】
３９．治療剤が、セロトニンまたはドーパミンである、実施形態３７または３８に記載の方法。
【０１０６】
４０．ナノ粒子が、造影剤をさらに含む、実施形態１から３９のいずれか一つに記載の方法。
【０１０７】
４１．造影剤がＣｕ−６４である、実施形態４０に記載の方法。
【０１０８】
４２．ナノ粒子が、第１の標的化剤および第２の標的化剤を含み、第２の標的化剤は、
脳内皮細胞の内側にあるときにナノ粒子コアからの解離に適合性ではないリンカー、および
粒子を脳内の特定の細胞に標的化するリガンド
を含む、実施形態１から４１のいずれか一つに記載の方法。
【０１０９】
４３．カチオン性粘液酸ポリマー（ｃＭＡＰ）；脳内皮細胞により発現される受容体に特異的な標的化剤であって、前記標的化剤は、脳内皮細胞内にあるときにナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすリンカーにコンジュゲートしているリガンドを含む標的化剤；およびナノ粒子を構築するための使用説明書を含む、脳への送達のために標的化されたナノ粒子を作製するためのキット。
【０１１０】
４４．ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）；脳内皮細胞により発現される受容体に特異的な標的化剤であって、前記標的化剤は、脳内皮細胞内にあるときにナノ粒子からのリガンドの解離を引き起こすリンカーにコンジュゲートしているリガンドを含む標的化剤；およびナノ粒子を構築するための使用説明書を含む、脳への送達のために標的化されたナノ粒子を作製するためのキット。
【０１１１】
４５．リガンドが、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に特異的な抗体、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン、インスリン受容体に特異的な抗体、インスリン受容体に特異的に結合するポリペプチド、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子受容体１に特異的な抗体、インスリン様成長因子受容体１に特異的に結合するポリペプチド、アポリポタンパク質Ｅ、ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的な抗体、低密度リポタンパク質受容体もしくはリポタンパク質受容体関連タンパク質に特異的に結合するポリペプチド；ジフテリア毒素受容体に特異的な抗体、またはジフテリア毒素受容体に特異的に結合するポリペプチドのいずれか１種であり；かつリンカーが、ナノ粒子に結合していないときにニトロフェニルボロン酸を含み、ナノ粒子に結合しているときにニトロフェニルボロン酸エステルを形成する、実施形態４３または４４に記載のキット。
【０１１２】
４６．治療剤または造影剤をさらに含む、実施形態４３から４５のいずれか一つに記載のキット。
【０１１３】
以下の実施例は、本明細書で記載される実施形態をより詳細に記載するために提供される。それらは、実施形態を例証し、限定しないことを意図する。
【実施例１】
【０１１４】
還元感受性リンカーを使用する、ナノ粒子からのリガンドの解離
試験は、コンジュゲートされた標的化剤を有するナノ粒子が、還元感受性リンカーを使用して標的化剤のリガンドから解離することができるかどうか評価するために行なわれた。最初の試験は、ジスルフィド連結ポリマーが分離して、元のポリマーを生じることができるかどうかを決定するために行なわれた。この研究の場合、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）−ポリエチレングリコール（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）分子を、末端チオール基を有する２つのＰＥＧ分子の酸化反応によってＰＥＧ分子の中心の近くにジスルフィド結合を有するように合成した（スキーム１）。マトリックス支援レーザ脱イオン／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いて、酸化反応が進行したことを確認した（図３）。次いで、還元剤ベータ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）をジスルフィド連結ＰＥＧポリマーに添加し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより、ジスルフィド結合が還元され、２つの親ポリマーが再生することが確認された（図４）。
【０１１５】
【化１２】
0006366690.tif 000013
スキーム１．２つのＰＥＧポリマー間のジスルフィドの形成。ポリマー分子量は、適当な反応物質または生成物の下に記入される。
【０１１６】
ジスルフィド連結ポリマーが還元され、元の構成要素ポリマーを生じることができることを決定し、この同じ原理が標的化ナノ粒子に結合したリガンドを解離するために使用し得るかどうか決定するために試験を行なった。これを評価するために、ＴｆＲを発現するＮｅｕｒｏ２Ａ細胞を、還元剤ジチオトレイトール（ＤＴＴ）で処理後に、様々な濃度のメトキシ末端ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール）酸ポリエチレングリコール粒子（ＰＬＧＡ−ｍＰＥＧ）、ジスルフィド含有ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−Ｔｆ（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ−Ｔｆ）、またはジスルフィド含有ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−Ｔｆと一緒にインキュベートした。これらの処方のそれぞれの結合曲線を図５に示す。それぞれの処方のナノ粒子サイズおよびゼータ電位を表１に記載する。
【０１１７】
【表１】
0006366690.tif 000014
【０１１８】
Ｔｆ標的化ジスルフィド含有ナノ粒子は、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞にほとんど結合し、ＴｆＲに対して最高の親和性を有する。ＤＴＴでの処理によるジスルフィド結合の切断、その後のＴｆのナノ粒子からの解離は、最大蛍光強度の低下で見られるように、ナノ粒子のＮｅｕｒｏ２Ａ細胞への結合を大きく低下させる。非標的（ＰＬＧＡ−ｍＰＥＧ）ナノ粒子は、本質的にＤＴＴ処理ナノ粒子と同じ結合曲線を有し、ＤＴＴ処理粒子による結合のほとんどが、ナノ粒子と細胞表面との非特異的相互作用によることを示唆する。これらの結果は、ジスルフィド含有ナノ粒子が高い親和性でＴｆＲに結合するが、一旦Ｔｆがナノ粒子から離れ落ちると、それらは、ちょうど非標的ナノ粒子のようにＮｅｕｒｏ２Ａ細胞に非特異的に結合することを実証する。これは、ジスルフィド結合がナノ粒子に存在することを示し、ジスルフィド結合が切断される場合には、ナノ粒子からの標的化リガンドの消失およびその後の標的化リガンドの受容体に対する結合親和性の消失を引き起こすことを示す。
【０１１９】
解離性リガンドを有する標的化剤と一緒のナノ粒子が、血液脳関門を通過する能力の改善を示すかどうかを決定するために、試験を行なった。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、外側尾部静脈注射によって、４種類の蛍光標識ＰＬＧＡナノ粒子処方、すなわち、（１）非標的ナノ粒子（ｍＰＥＧ）；（２）低親和性ナノ粒子（ナノ粒子当たり３０Ｔｆ）；（３）高親和性ナノ粒子（ナノ粒子当たり３００Ｔｆ）、および（４）ジスルフィドリンカーを有する高親和性ナノ粒子（ナノ粒子当たり３００Ｔｆ＋Ｓ−Ｓ）を投与した。図６〜図９は、それぞれのナノ粒子処方が、どの程度脳実質に到達し観察されたかを例証する。ナノ粒子は、明瞭に血管から離れて、実質中に自己蛍光を超える、明確な蛍光シグナルとして陽性に確認された。細胞核に関連する蛍光が、陰性対照に見られ、従って、ナノ粒子に特異的であるとは考えられなかった。非標的ＰＬＧＡ−ｍＰＥＧナノ粒子は、脳実質に接近せず、もっぱら血管系に残った（図６）。低ＴｆＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子は、他の観察と一致して実質中に存在した（図７）。高ＴｆＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子は、ＰＬＧＡ−ｍＰＥＧ処方と同様の蛍光パターンを有して、脳実質に明瞭には見られなかった（図８）。これは、脳実質中への首尾よい放出のために調整されるナノ粒子の親和性に対する必要性と一致する。高Ｔｆ＋Ｓ−Ｓナノ粒子は、脳実質内に最大量の蛍光を与えた（図９）。
【実施例２】
【０１２０】
ｐＨ感受性リンカーを有するナノ粒子
ｐＨ感受性リンカーを使用する、ナノ粒子からのリガンドの解離
ジアミノケタール（ＤＡＫ）がＴｆおよびＰＥＧを連結し、弱酸性ｐＨでＴｆの解離を可能にし得るかどうか決定するために、予備試験を行なった。ＤＡＫを、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳのアミン反応性末端に付加し、続いて、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）と反応させて、アミン反応性官能基を再導入した。ＤＳＳ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳをヒトホロ−Ｔｆに加えて、Ｔｆ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳを調製した（スキーム２）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより首尾よいコンジュゲーションを検証した（図１０）。コンジュゲートの酸感受性は、粗混合物中Ｔｆ−ＰＥＧの遅い分解をｐＨ５．５緩衝液中２４時間にわたって観察することにより検証した（図１１）。より高いオーダーのＰＥＧ化の大きな低下は、１５分までに明瞭であり、ほとんどすべてのＰＥＧが２時間までに切断された。
【０１２１】
【化１３】
0006366690.tif 000015
スキーム２：ＤＳＳ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳの合成およびそのＴｆへのコンジュゲーション
【０１２２】
次に、金ナノ粒子（Ａｕ−ＮＰ）を、ナノ粒子当たり１２０Ｔｆ−ＤＡＫ−ＰＥＧ分子によって調製した。非標的（ｍＰＥＧ）およびＴｆ−ＤＡＫ含有粒子の典型的なバッチについてのナノ粒子特徴付けデータを表２に示す。
【０１２３】
【表２】
0006366690.tif 000016
表２：典型的なバッチについてのＮＰ特徴付けデータ。ＤＬＳ直径およびゼータ電位について３つの測定値からの平均値にプラス／マイナス１の標準偏差を与える。ＮＴＡについて３つの測定値からの平均モードプラス／マイナス１の標準偏差を与える。
【０１２４】
Ｔｆ−ＤＡＫ  ＡＮ−ＮＰは、酸性ｐＨでインキュベーション後に親和性の低下について評価した。ｐＨ５．５でインキュベーション１時間後、Ｔｆ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−Ａｕ  ＮＰは、Ｋ５６２細胞に対して非常に低い結合親和性を示す（図１２）。ｐＨ８でそのままにした粒子のＫｄは、０．０２９４ｎＭであったが、ｐＨ５．５でのＫｄは、０．２ｎＭより大きかった。これは、ｐＨ５．５の緩衝液に曝露後に、Ｋ５６２細胞上のＴｆＲに結合すべき粒子にＴｆが十分にコンジュゲートしていなかったことを示す。
【０１２５】
ｐＨ感受性リンカーと一緒の標的化剤を有するナノ粒子のインビトロトランスサイトーシス
Ｔｆ−ＤＡＫ  ＡＵ−ＮＰのナノ粒子トランスサイトーシスは、ＢＢＢ内皮細胞についてのモデルとしてｂＥｎｄ．３細胞を使用して測定した。切断性、非切断性および非標的ナノ粒子をそれぞれ、ｂＥｎｄ．３被覆Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｓ（登録商標）の頂部チャンバーに加えた。１時間から６時間で、切断性Ｔｆを有するナノ粒子は、底部ウェルへの送達の増加を示したが、非切断性および非標的粒子は、トランスサイトーシスを受ける互いに同様の能力を示した（図１３、表３）。これらの結果は、酸感受性リンカーの存在が、ＢＢＢのインビトロモデルを通過するナノ粒子の可能性を増加させたことを証明する。ＮＴＡ法の測定対測定の変動性は、決定されないままであり、潜在外れ値が観察された（例えば、図１３および表３におけるｍＰＥＧ試料の６０分時点）
【０１２６】
【表３】
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表３：各処方について時間経過における底部ウェル中の合計ＮＰのパーセント。可能外れ値は、アスタリスクで示す。
【０１２７】
ｐＨ感受性リンカーと一緒の標的化剤を有するナノ粒子のインビボトランスサイトーシス
粒子当たり１２０Ｔｆ−ＤＡＫ−ＰＥＧ分子を有する金ナノ粒子を、外側尾部静脈注射によってＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した。注射１２時間後に脳を分離し、固定し、切片化し、銀強化溶液で染色した。金ナノ粒子を、光学顕微鏡検査により区別できる、個別の黒色点として特定した（図１４）。血管の境界を明確に越えて特定されたナノ粒子は、脳実質内のナノ粒子であると決定した。大量のナノ粒子が実質内で特定され、酸切断性連結の存在がナノ粒子のＢＢＢを通過する能力を増加させたことを示した。
【実施例３】
【０１２８】
ｐＨ感受性リンカーと一緒の標的化剤を有するナノ粒子を使用する、治療剤の脳への送達
神経障害の治療上の関心および実験上の有用性を有する薬物の一つは、ドーパミンである。パーキンソン病は、中脳内の黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの破壊によって特徴付けられる。これは、中脳内のドーパミンのレベル低下、ならびに硬直、動作緩慢、振戦および神経精神変化を含めた一連の臨床症状をもたらす。ドーパミンは、ＢＢＢを通過することができないので、疾患を治療するための直接の使用はできない。
【０１２９】
最適Ａｕ−ＮＰ処方と同じ切断性リガンド密度、流体力学直径およびゼータ電位をもつＰＬＧＡナノ粒子を調製し、３Ｈ−標識ドーパミンを負荷した。この粒子をマウスの静脈内に投与し、ＢＢＢを通過する薬物の能力を測定するための代表的標準である、静脈内注射技術を使用してドーパミンを定量化した。遊離ドーパミンは、血流に制限されないので、陰性対照として使用することができる。実質に蓄積するドーパミンの量を、全身投与後に脳に到達するＬ−ＤＯＰＡ（ＢＢＢを通過することができ、パーキンソン病の治療に現在使用されているドーパミンプロドラッグ）の濃度と比較する。
【０１３０】
ＰＬＧＡ粒子は、遊離薬物単独よりもＣＮＳにより多くのドーパミンを送達することができるはずである。粒子用量は、治療上有用な量に到達するのに十分に高いように調整することができる。標的化およびトランスサイトーシスの開始は、Ｔｆ−ＴｆＲ相互作用に依存し、従って、一旦ＮＰがＢＢＢ内皮細胞に到達すると、ＰＬＧＡ粒子は、Ａｕ−ＮＰと同様に作用するはずである；しかしながら、より低い密度のナノ粒子コア、例えば、ＰＬＧＡが、ＢＢＢでの血流中のナノ粒子の流れに影響を及ぼし、表面Ｔｆ−ＴｆＲ相互作用の流量に影響を及ぼすかどうかは知られていない。このことは、Ｔｆ−ＴｆＲ相互作用を増加または低下させ、最大量のトランスサイトーシスをもたらすためのＴｆ−リガンド密度および／または投与量の最適化を必要とし得る。
【０１３１】
方法
特に断らない限り、前の実施例に記載した実験を行うために以下の方法を使用した。
【０１３２】
ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ−Ｔｆナノ粒子の調製、特徴付けおよび分析
ＰＥＧ内ジスルフィド結合の調製
アミン−ＰＥＧ−チオール（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＳＨ、３．４ｋＤａ）を２０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＦに溶解させた。カルボキシ−ＰＥＧ−チオール（ＣＯＯＨ−ＰＥＧ−ＳＨ、２ｋＤａ）を等モル濃度で添加した（スキーム１）。過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を添加して、最終濃度３％Ｈ２Ｏ２を得た。この反応混合物を室温で２４時間撹拌し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分析した。１０００×モル過剰のベータ−メルカプトエタノールをポリマーに添加することによって、ジスルフィド結合がＰＥＧポリマーに連結することを確認し、ジスルフィドが切断しポリマーが解離することをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより検証した。
【０１３３】
ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーの合成（スキーム３）。２５０ｍｇのカルボキシ末端ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（５０／５０）（ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ）を１．１ｍＬのアセトニトリルに溶解させることによって、ＰＬＧＡ−ＮＨＳを調製した。１０モル過剰の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）をこの溶液に添加し、室温で９０分間撹拌した。３０ｍＬのメタノールを添加することにより生成物を溶液から沈殿させ、続いて、２７００ｇで１０分間遠心分離した。上清を捨て、生成物を３０ｍＬのメタノールで洗浄し、再度遠心分離により収集した。この過程を合計で３回の洗浄について２回以上繰り返した。精製ＰＬＧＡ−ＮＨＳを真空下で乾燥させた。
【０１３４】
種々のヘテロ−２官能ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーをＰＬＧＡ−ＮＨＳに添加して、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーを形成した。ＰＥＧポリマーはすべて、ＰＬＧＡポリマー上でＮＨＳエステルと反応するためのアミン末端、および他端にカルボキシル（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ；５ｋＤａ）；メトキシ（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＯＣＨ３、５ｋＤａ）；またはスルフィドリル（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＳＨ；３．４ｋＤａ）末端のいずれかを含有した。乾燥ＰＬＧＡ−ＮＨＳを５ｍＭの濃度でアセトニトリルに溶解させ、続いて、１．５×モル過剰のヘテロ−２官能性ＰＥＧおよび１０×モル過剰のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエタノールアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加した。室温で２４時間穏やかに撹拌し、その後３０ｍＬのジエチルエーテルを添加することにより、生成物を沈殿させた。ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーを２７００ｇで１０分間遠心分離することにより収集した。上清を捨て、生成物をさらに３０ｍＬのエーテルで洗浄し、再度遠心分離により収集した。この過程を合計で３回の洗浄について２回以上繰り返した。生成物を真空下で乾燥させた。
【０１３５】
【化１４】
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スキーム３．ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーの合成。ステップ２におけるヘテロ２官能ＰＥＧポリマー中の「Ｒ」と標識した化学基は、メトキシ基、カルボン酸または遊離チオールに相当する。
【０１３６】
ジスルフィド含有ＰＬＧＡ−ＰＥＧコポリマーの合成（スキーム４）。１００ｍｇのＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＳＨを２ｍｌのＤＭＦに溶解させることにより、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨを調製した。これに、５×モル過剰のＳＨ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（２ｋＤａ）を添加した。ＳＨ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨの溶解に続いて、この反応混合物に２００μＬの３０％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を添加して、最終濃度３％Ｈ２Ｏ２を得た。この反応物を室温で２４時間撹拌したままにした。
【０１３７】
【化１５】
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スキーム４．ジスルフィド含有ＰＬＧＡ−ＰＥＧポリマーの合成
【０１３８】
ＰＬＧＡ−ＡＦ４８８の合成。５０ｍｇのＰＬＧＡ−ＮＨＳを１ｍＬのＤＭＧに溶解させ、続いて、０．５ｍＬのＤＭＦに溶解させた１ｍｇのＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ４８８カダベリン（ＡＦ４８８）を添加することにより、蛍光標識ＰＬＧＡポリマーを調製した。生成物を２０ｍＬのメタノールで沈殿させ、続いて、２７００ｇで１０分間遠心分離することにより１時間後に収集した。生成物をさらに２０ｍＬのメタノールで洗浄し、再度遠心分離により収集した。この過程を合計で３回の洗浄について２回以上繰り返した。精製生成物を真空下で乾燥させた。
【０１３９】
ＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子の調製（スキーム５）。ＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子をナノ沈殿により調製した（図１６）。様々な組合せのＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーを、１０ｍｇ／ｍＬのＰＬＧＡ−ＰＥＧコポリマーの合計濃度で３ｍＬのＤＭＦに溶解させた。各処方は、２．５重量％のＰＬＧＡ−ＡＦ４８８を含有した。このポリマー混合物を３０ｍＬの撹拌する水に滴下して加え、２時間混合させた。得られたナノ粒子混合物を０．２μｍフィルタに通して、２７００ｇで１０分間５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ遠心フィルタで限外濾過により精製した。ナノ粒子保持液を１０ｍＬの水に再懸濁させ、合計で３回の洗浄について限外濾過２回以上により収集した。最終の洗浄サイクル後、濃縮ナノ粒子を１ｍＬのＰＢＳ中で再懸濁させた。４つの異なるナノ粒子処方物を作製するために使用した各ポリマーの相対量を表４に示す。各処方物は、２．５％のＰＬＧＡ−ＡＦ４８８を含有した。
【０１４０】
【表４】
0006366690.tif 000020
【０１４１】
ヒトホロ−トランスフェリンのナノ粒子への添加。ナノ粒子濃度は、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）を使用して決定した。ナノ粒子処方物をＰＢＳ中０．０００１ｍｇ／ｍＬに希釈し、粒子濃度を、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ５００を使用して決定した。ＥＤＣおよびＮＨＳを、処方物中存在するカルボキシ末端ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマー（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨまたはＰＬＧＡ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）の合計量に対して１０×モル過剰でナノ粒子に添加し、室温で１０分間撹拌した。ＮＴＡにより決定したナノ粒子濃度に基づいて、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中で調製したヒトホロ−トランスフェリン（Ｔｆ）を、低Ｔｆ処方物について３０×モル過剰、高Ｔｆおよびジスルフィド含有処方物について３００×モル過剰で添加した。この反応混合物を室温で９０分間撹拌し、次いで、３０００ｇで１０分間の１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ遠心フィルタでの限外濾過により精製した。ナノ粒子保持液を０．５ｍＬのＰＢＳに再懸濁させ、再度限外濾過により収集した。この過程を、合計で３回の洗浄について２回以上繰り返した。
【０１４２】
ＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子の特徴付け。粒子サイズおよびゼータ電位を、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＤＬＳおよびＺｅｔａＰＡＬＳで測定した。粒子直径を、２分間にわたってＰＢＳ中で測定した。ゼータ電位を、１．５ｍＭ  ＫＣｌ（ｐＨ７．０）中で取得し、０．０１８の標的残差で３回の実行から平均化した。
【０１４３】
ジスルフィド含有ナノ粒子結合親和性のインビトロ決定。Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞を、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシン中で培養した。ナノ粒子と一緒のインキュベーション前に、細胞をＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ（登録商標）中４℃で１５分間固定し、洗浄し、ＰＢＳ＋４％ＢＳＡ中で再懸濁させた。様々な濃度のナノ粒子処方物を１×１０６個細胞／ｍＬで２×１０６個細胞と一緒に９０分間インキュベートした。ジスルフィド含有ナノ粒子処方物中に存在するジスルフィド結合を切断するために、これらの粒子を、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞への添加前にジチオトレイトール（ＤＴＴ）によって室温で３０分間処理した。ナノ粒子をＰＢＳ中で洗浄し、それらを限外濾過により収集することによって、過剰のＤＴＴを除去した。細胞を２００ｇで５分間ペレット化し、２００μＬのＰＢＳ中で再懸濁させた。４８８ｎｍ励起、５２５ｎｍ発光で蛍光強度を測定することによって、ナノ粒子結合性を決定した。データをラングミュア結合等温線に当てはめ、ＢｍａｘおよびＫｄは、Ｍａｔｌａｂ関数ｎｌｉｎｆｉｔを使用してその数値を決定した。
【０１４４】
動物試験。動物はすべて、カリフォルニア工科大学の動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｅｅ）により承認された、動物の管理と使用（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ）についてのＮＩＨガイドラインに従って処置した。１×１０１０から１×１０１１個の粒子を含有するナノ粒子処方物を、１５０μＬのＰＢＳ中で調製し、外側尾部静脈を介して雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した。マウスを注射１時間後にＣＯ２窒息により犠牲にした。脳を取り出し、さらなる組織処理のために４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定した。
【０１４５】
共焦点顕微鏡法。ホルムアルデヒド固定組織をパラフィンに埋め込み、切片化し、脱パラフィン化した。Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（登録商標）Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬をＤＡＰＩ（核染色）と一緒に使用して、組織をマウントした。Ｚｅｉｓｓ  ＰｌａｎＮｅｏｆｌｕａｒ  ４０×／１．３油対物レンズを有するＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０倒立型共焦点走査顕微鏡上で切片を画像化した。ＤＡＰＩに対する励起波長は、７１０ｎｍ（二光子レーザ）およびＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８標識ナノ粒子に対するものは、４８８ｎｍであった。それらの対応する発光フィルタは、それぞれ、３９０〜４６５ｎｍおよび５３０〜５６０ｎｍであった。
【０１４６】
ケタール含有ＰＥＧ（ＤＳＳ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳ）の合成：ジアミノケタール（ＤＡＫ；図４）をＴｆとＰＥＧの間に組み込んだ。簡潔に言えば、１５０ｍｇのＯＰＳＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（５ｋＤａ、Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ）を乾燥ＤＣＭに溶解させた。これに２０×モル過剰のＴＥＡおよび２０×ＤＡＫ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。この溶液をアルゴン下で室温にて５時間撹拌した。予め浸したＮ−（２−アミノエチル）アミノメチルポリスチレンビーズ（ＮＨ２−ビーズ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をＤＡＫに１０×モル過剰で添加し、同じ条件下で１時間撹拌した。この溶液を濾過し、１５０ｍＬのジエチルエーテルを添加することにより沈殿させた。室温で１５分間置いた後、沈殿物を３２２０ｇで１５分間の遠心分離により分離した。固体をエーテルで洗浄し、遠心分離２回以上により収集した。生成物を真空下で乾燥させて、高密度で白色の固体を得た。得られたＤＡＫ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳ（１００ｍｇ）を乾燥ＤＣＭに溶解させた。スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ、Ｐｉｅｒｃｅ）およびＴＥＡを１０×モル過剰で添加した。反応物を室温で９０分間撹拌した。６０ｍＬのエーテルを添加することにより生成物を沈殿させた。室温で３０分間置いた後、沈殿物を３２２０ｇで１５分間の遠心分離により単離した。固体をエーテルで洗浄し、遠心分離２回以上により収集した。それを真空下で乾燥させて、高密度で白色の固体を得た。
【０１４７】
ＤＳＳ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳのＴｆへのコンジュゲーション：ヒトホロ−Ｔｆ（２０ｍｇ）を９００μＬの、１００ｍＭのＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．５に溶解させた。ＤＳＳ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳ（２×モル過剰）を１００μＬのＤＭＳＯに溶解させ、Ｔｆに添加した。この溶液を、軽く撹拌しながら６０分間室温に置いた。過剰のＰＥＧを除去し、反応物を１４０００ｇで５分間５０ｋＤａ  ＭＷＣＯスピンフィルタ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して遠心分離によりクエンチした。保持液を１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ８．０で２回以上洗浄した。シナピン酸マトリックスを使用してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによりコンジュゲーションを検証した。
【０１４８】
Ｔｆ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳの精製：５０ｍＭのリン酸ナトリウムと一緒の１Ｍ硫酸アンモニウムの高塩濃度緩衝液ｐＨ７．５および５０ｍＭのリン酸ナトリウムの塩のみからなる溶離緩衝液を使用してＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ  Ｐｌｕｓ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、５ｍＬのＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌカラム）上で疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により混合物から比較的高いオーダーのＰＥＧ化を除去した。混合物中に残存するモノＰＥＧ化Ｔｆの量を、ジピリジルジスルフィド切断アッセイにより決定した。Ｔｆ−ＰＥＧ混合物を、５ｍＭのＥＤＴＡと一緒のＰＢＳ  ｐＨ７．２中に希釈し、３４３ｎｍでの吸光度を記録した。ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加して、１．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得た。室温で１５分後、３４３ｎｍでの吸光度を再度記録した。吸光度の差を用いて、混合物中に存在するＯＰＳＳの量、その後に、Ｔｆ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳの量を計算した。１００ｍＭのＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．６中クエン酸鉄をモノＰＥＧ化画分に２．５×モル過剰で添加し、軽く撹拌しながら室温で６０分間インキュベートした。５０ｋＤａ遠心フィルタを通して１００ｍＭの重炭酸ナトリウムの６回洗浄で過剰の鉄を除去した。Ｔｆの鉄負荷含量は、Ａ４６５／Ａ２８０の比率によってＵＶ−ＶＩＳにより測定し、元の非処理ホロ−Ｔｆの同じ比率と比較した。０．８を超えるＡ４６５／Ａ２８０比率は、鉄負荷についての適切な証拠であると考えられた。
【０１４９】
ｐＨ５．５でのＴｆ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳ半減期の推定：Ｔｆ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳを３７℃で１００ｍＭのＮａＯＡｃ  ｐＨ５．５中１．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。様々な時点で、アリコートを取り出し、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ８．０中１：１０で希釈し、ＣＯ２（ｓ）上で凍結させた。最後のアリコートを取り出した直後、すべての試料を融解させ、シナピン酸マトリックスを使用してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより直ちに測定した。
【０１５０】
Ｔｆ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳの合成および精製：ＯＰＳＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（５ｋＤａ、Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ）を、１ｍＬの、１００ｍＭのＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．５中８×モル過剰でヒトホロ−Ｔｆ（２０ｍｇ）に添加した。この反応物を、軽く撹拌しながら９０分間室温に置いた。過剰のＰＥＧを除去し、１４０００ｇで５分間の５０ｋＤａ  ＭＷＣＯスピンフィルタ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して遠心分離により反応物をクエンチした。保持液を、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ８．０で２回以上洗浄した。シナピン酸マトリックスを使用してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによりコンジュゲーションを検証した。モノＰＥＧ化画分をＨＰＬＣ（１２００シリーズ、Ａｇｉｌｅｎｔ、直列で２本のＴＯＳＯＨ  ＴＳＫゲルＧ３０００ｓｗｘｌカラムを使用する）により単離し、シナピン酸マトリックスを使用してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより検証した。
【０１５１】
Ｔｆ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−Ａｕナノ粒子の調製：Ｔｆ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳまたはＴｆ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳのいずれかを、５０ｎｍ直径の金ナノ粒子（ＢＢＩ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｎａｌ）に１２０×モル過剰で添加した。この溶液を９０分間激しく撹拌した。ｍＰＥＧ−ＳＨ（５ｋＤａ、Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ）を１０，０００×過剰で添加し、さらに６０分間撹拌した。粒子を２０，０００ｇで１０分間の遠心分離により収集し、ｄＨ２Ｏで洗浄し、短時間超音波処理した。この過程を２回以上繰り返して、合計で３回の洗浄を与えた。最終の遠心分離後、粒子を１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ８．０中で再懸濁させた。非標的粒子（Ａｕ−ｍＰＥＧ）を調製するために、ｍＰＥＧ−ＳＨのみを５０ｎｍの金コアに激しく撹拌しながら６０分間添加した。粒子を上で記載したとおりに精製した。
【０１５２】
ナノ粒子特徴付け：ナノ粒子をＰＢＳに希釈し、動的光散乱（ＤＬＳ）およびナノ追跡分析（ＮＴＡ）を使用して流体力学直径を測定した。粒子濃度（粒子／ｍＬ）も、同じ試料における３回の測定値の平均を使用してＮＴＡにより決定した。ゼータ電位を、０．０２の標的残差を使用して１．５ｍＭのＫＣｌ（ｐＨ７．０）中ＤＬＳにより測定した。
【０１５３】
Ｋ５６２細胞へのナノ粒子結合親和性：Ｋ５６２細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシンと一緒のＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞スクレーパを使用して取り出した。３００ｇで３分間遠心分離後、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して細胞を４℃で２０分間固定した。細胞を洗浄し、ＰＢＳ＋４％ＢＳＡ中で再懸濁させた。１２０Ｔｆ／粒子を有するＴｆ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−ＡｕＮＰを、１００ｍＭのＮａＯＡｃ  ｐＨ５．５または１００ｍＭのＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．５中、３７℃で１時間インキュベートした。粒子を２０，０００ｇで１０分間の遠心分離により収集し、ＰＢＳ＋４％ＢＳＡ中で再懸濁させた。増加する濃度のナノ粒子を５ｅ６細胞／ｍＬでの１ｅ６細胞に添加し、９０分間室温に置いた。細胞を３００ｇで３分間遠心分離し、１５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。最後に、細胞を銀増強溶液（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ）で染色し、１５分間現像し、プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ９００）を使用して蛍光を読み取った（３１０ｎｍ励起、４００ｎｍ発光）。Ｍａｔｌａｂ中ｎｌｉｎｆｉｔを使用してデータをラングミュア結合等温線に当てはめ、ＫＤを計算した。
【０１５４】
ｂＥｎｄ３細胞を横切ってのナノ粒子トランスサイトーシス。ｂＥｎｄ３細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシンと一緒のＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。細胞を、１２ｍｍＰＥＴ被覆Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）支持体（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に８２，５００個細胞／ウェルで播種した。培地を３日毎に頂部（ａｐｉｃａｌ）および底部（ｂａｓａｌ）ウェルにおいて置き換えた。経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を、Ｅｎｄｏｈｍチャンバー内で、ＥＶＯＭ抵抗計（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定した。ＴＥＥＲが≧３０オーム＊ｃｍ２に達するとすぐに、トランスサイトーシス実験を行なった。切断性、非切断性および非標的粒子を頂部ウェルにｌｅ１０粒子／ウェルで添加した。様々な時点で、５０μＬを底部ウェルから取り出し、新鮮培地で置き換えた。ＰＢＳを使用してアリコートを２５０μＬに希釈し、ＮＴＡを使用してナノ粒子濃度を測定した。頂部ウェル中合計ナノ粒子の実行検数（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｔａｌｌｙ）を計算し、トランスサイトーシス能を決定するために使用した（図１５）。
【０１５５】
ＢＡＬＢ／ｃマウス中へのＴｆ−ＤＡＫ−ＰＥＧ−Ａｕナノ粒子注射。すべての動物を、カリフォルニア工科大学の動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｅｅ）により承認された、動物の管理と使用（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ）についてのＮＩＨガイドラインに従って処置した。粒子当たり１２０Ｔｆ−ＤＡＫ−ＰＥＧ分子を含む、合計で４．５×１０１１個の金ナノ粒子を前に記載したとおりに調製した。精製に続いて、粒子を１５０μＬのＰＢＳ  ｐＨ７．４中で懸濁させ、雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の外側尾部静脈に注射した。マウスを注射１２時間後にＣＯ２窒息により安楽死させた。脳を直ちに取り出し、１０％中性緩衝ホルマリンに入れ、４℃で一晩保存した。次いで、脳を、増加する濃度のエタノール（３×３０分ごと）中で脱水し、キシレン中で平衡化し（３×３０分洗浄）、５０％キシレン／５０％溶融パラフィン中で平衡化した（３０分）。組織を、純溶融パラフィン中に入れ（３×１時間）、パラフィン型内に入れ、冷却させ、５μｍの切片を得た。切片をキシレンで脱パラフィン化し、エタノールの連続希釈液で再脱水した。製造業者ガイドラインに従って、銀増強溶液（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ）で染色することによりナノ粒子を可視化した。増加する量のエタノールおよびキシレンで組織を脱水し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ）でマウントした。光学顕微鏡検査画像はすべて、ＱＣａｐｔｕｒｅ  Ｐｒｏイメージングソフトウェア（ＱＩｍａｇｉｎｇ）を使用して４０×対物レンズを有するＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ５０顕微鏡で撮影した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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