(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚における外部寄生虫の感染症および／または外寄生症を、防除、治療および／または予防することにおける使用のためのアザジラクチンを含む魚用飼料。
【請求項２】
アザジラクチンＡを含む、請求項１に記載の使用のための、請求項１に記載の魚用飼料。
【請求項３】
ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／またはＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）製剤を含む、請求項１または２に記載の使用のための、請求項１または２に記載の魚用飼料。
【請求項４】
機能性アザジラクチン、その変異体、その誘導体および／またはその類縁体を含む、請求項１から３のいずれかに記載の使用のための、請求項１から３のいずれかに記載の魚用飼料。
【請求項５】
アザジラクチンＡの豊富な製剤を含む、請求項１から４のいずれかに記載の使用のための、請求項１から４のいずれかに記載の魚用飼料。
【請求項６】
アザジラクチンが以下のものからなる群から選択される、請求項１から５のいずれかに記載の使用のための、請求項１から５のいずれかに記載の魚用飼料。
（ｉ）  インドセンダンから抽出されるアザジラクチン
（ｉｉ）  インドセンダンから抽出されるアザジラクチンＡ
（ｉｉｉ）  アザジラクチンＡを濃縮したニーム抽出物
【請求項７】
ニーム油を含まない、請求項１から６のいずれかに記載の使用のための、請求項１から６のいずれか一項に記載の魚用飼料。
【請求項８】
抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス薬、抗真菌剤、抗寄生虫剤、および／または栄養サプリメントからなる群から選択される１種以上の他の成分をさらに含む、請求項１から７のいずれかに記載の使用のための、請求項１から７のいずれかに記載の魚用飼料。
【請求項９】
有害生物の感染症／外寄生症が、サケジラミにより引き起こされ、またはそれが原因となっている、請求項１から８のいずれかに記載の使用のための、請求項１から８のいずれかに記載の魚用飼料。
【請求項１０】
コイ科、カワスズメ科、パンガシウス科、ニベ科、ハタ科、アジ科、タイ科、スズキ科、モロネ科、ボラ科、コイ目、アカメ科、カワアナゴ科、ティラピア科、およびサケ科からなる群から選択される１種以上の科に属する魚種のためのものである、請求項１から９のいずれかに記載の使用のための、請求項１から９のいずれかに記載の魚用飼料。
【請求項１１】
魚における外部寄生虫の感染症／外寄生症を、防除、予防および／または治療する方法であって、それを必要とする魚に対して、請求項１から７のいずれか一項に記載の魚用飼料の治療量を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚における、有害生物の感染症および／または外寄生症の治療および／または予防に関し、魚用補充飼料および他の組成物だけでなくそれを利用する使用と方法を提供する。さらに、本発明は、魚用補充飼料の作成方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
有害生物は養殖されている多くの製品に侵入し、生産上のおよび経済的なかなりの損失をもたらし得る。例えば、魚は、特に養殖魚は、外部寄生虫の感染症に罹りやすく、養殖のタイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）は、ウミシラミの外寄生症に罹りやすい。もしも治療しないで置くと、外部寄生虫の感染症は病気を引き起こし、魚における発育上の問題を起こし得る。
【０００３】
現在では、有害生物を治療する薬剤は、直接水中に（いわゆる、浴治療と呼ばれている）、または薬剤を魚用飼料と混合するまたはその上に被覆する、「飼料中」治療として適用され得る。例えば、有機リン酸エステル、過酸化水素、およびピレスロイドは、魚における外部寄生虫の外寄生症の治療および／または予防に利用され得る。アベルメクチン化合物は、魚用飼料に加えてもよい。
【０００４】
ウミシラミなどの寄生虫の大発生の防除には、養殖産業にとっては、殺寄生虫剤および設備の購入の必要性、並びに新規の寄生虫防除の方法の管理、防除および／または研究を行うためのスタッフの時間の投資のために、年間４億５０００万ドルもの費用がかかっている。さらに、養魚場は、寄生虫の外寄生症のために、拒絶されたり、規模を拡大できないことがある。寄生虫治療に伴う魚の処置に付随する、ストレスおよび予期しない魚の死亡率のため、魚の中には、治療の前および／または後の絶食のために完全に成長できないものもあり、外部寄生虫の感染症／外寄生症に罹った魚の市場価値は、その外観（寄生虫は魚の皮膚の上に跡を残すことがある。）、大きさが小さいことおよび魚肉中に残存する抗寄生虫剤に対する消費者の懼れにより影響を受けることがある。
【０００５】
さらに、寄生虫の防除のための化学品（時には危険なものもある）の使用は、治療を行うスタッフへの付随するリスク、魚の中に残存する化学品の残留分に遭遇する可能性、および環境への汚染のために、養魚場にとって負の評判を呼ぶことがある。その上、隣接する養魚場の間の、および野生の魚への、交互汚染および寄生虫の（家畜流行性の）大量外寄生症の惹起は、こうした型の外寄生症に付随する他の重要な問題である。こうした要因はすべて、更なる規制による制限および寄生虫の外寄生症および伝染を予防および防除するためのさらに費用のかかる養魚場の運営をもたらすこととなる。
【０００６】
浴治療は、ある既定の期間、完全な浸漬を介する水中に溶解した薬剤の投与である。浴治療の主要な一つの利点は、特にいけす船を用いて投与する場合に、有害生物のすべてが同じ濃度の薬剤に暴露されることである。にもかかわらず、浴治療による投与は、極めて労働集約的であり、いけす船への魚の移動により家畜の損失を招くこともあるし、用いられる薬剤が通常かなり有毒であり環境汚染的である。飼料中治療の場合は、魚および養殖作業者の両者に対してストレスはより少なく、天候の条件によらずすべての魚用ケージに対して同時に治療措置が可能となる。従って、隣接する魚用ケージに同時に浴治療を適用する必要性に伴う交互汚染のリスクを減らすことができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、ますます増加している抵抗性のために、有害生物の感染症および／または外寄生症の新規の治療法および／または予防法が求められており、既存の技術に伴う少なくとも１つの問題を未然に防止しまたは少なくすることが本発明の目的の一つである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様では、本発明は、有害生物防除剤を含む魚用飼料を提供する。
【０００９】
「含む」という用語は、適切な場合には、「から本質的になる」および「からなる」という用語を包含し得ることが理解されるべきである。例えば、本発明の魚用飼料中に含まれる有害生物防除剤は、有害生物防除剤「から本質的になり」または有害生物防除剤「からなる」。さらに、本明細書において提供されるそれぞれの定義は、本発明のそれぞれの態様に適用される。
【００１０】
魚用飼料は、魚にとって食べられるいかなる基質も含み得る。基質は、栄養源を提供するまたは提供しないが、それゆえに、本発明は、栄養のある飼料または栄養になることを意図していない（すなわち、非栄養である）飼料も包含する。魚用飼料は、魚に与えるのに適するいかなる飼料であってもよい。栄養のある魚用飼料は、その食餌の一部として魚用に製剤された食品を含み、本発明の魚用飼料は、栄養源を魚に与える成分を１種以上含んでいてもよい。例として、魚用飼料は、それ自身、１種以上の栄養成分を含んでいる魚用食料を含んでいてもよい。本発明における使用のための魚用飼料の魚用食料成分は、植物および／または動物由来の材料を含んでもよい。動物由来の材料はいずれも、魚および／または何らかの他の（種または魚以外の）種由来でもよい。適切な魚用飼料としては、たんぱく質材料（たんぱく質、ペプチドおよび／またはアミノ酸源として）、炭水化物および脂肪を含んでもよい。さらにまたは代替として、魚用飼料は、魚の組織の品質、量および／または外観を変更するようにデザインされた１種以上の化合物を含んでいてもよい。例えば、魚用飼料は、魚の筋肉組織の外観（色）を改善するためのカロチノイド化合物を含んでいてもよい。
【００１１】
そのようなものとして、本発明は、有害生物防除剤を含む、栄養のあるおよび／または非栄養の魚用飼料を提供する。非栄養の魚用飼料は、魚にとって食べられるある形態の基質を含み得る。
【００１２】
本発明の魚用飼料は、液体または固体の形態で提供され得る。固体形態の飼料としては、ペレットおよび／または薄片を含む。
【００１３】
当業者は、魚用飼料の適切な型についてはなじみがあり、いかなる特定の魚種に対して、最も適切な飼料の製剤および／または形態（例えば、固体飼料および／または液体飼料）が様々に変化し得ることを理解するであろう。
【００１４】
本発明により提供される魚用飼料は、野生のおよび／または養殖魚に与えるために使用し得る。この点に関しては、魚用飼料は、淡水魚および／または塩水（海水）魚に対して使用し得る。
【００１５】
本発明により提供される魚用飼料は、１種以上の有害生物による感染症／外寄生症に罹りやすいいかなる魚に与えられるまたは与えるのに使用されてもよい。例えば、飼料は、例えば、商業的に意味のある魚種を含むいかなる養殖魚に与えられる食餌の成分として、養殖業において特定の用途を見出し得る。例えば、本発明により提供される飼料は、淡水の、汽水のおよび／または海水の魚に与えられる食餌の一部を形成し得る。例えば、本発明の飼料は、コイ科（Ｃｙｐｒｉｎｉｄａｅ）；カワスズメ科（Ｃｉｃｈｌｉｄａｅ）；パンガシウス科（Ｐａｎｇａｓｉｉｄａｅ）；ニベ科（Ｓｃｉａｅｎｉｄａｅ）；ハタ科（Ｓｅｒｒａｎｉｄａｅ）；アジ科（Ｃａｒａｎｇｉｄａｅ）；タイ科（Ｓｐａｒｉｄａｅ）；スズキ科（ｌａｔｅｏｌａｂｒａｃｉｄａｅ）；モロネ科（Ｍｏｒｏｎｉｄａｅ）；ボラ科（Ｍｕｇｉｌｉｄａｅ）；コイ目（Ｃｙｐｒｉｎｉｆｏｒｍｅｓ）；アカネ科（Ｌａｔｉｄａｅ）；カワアナゴ科（Ｅｌｅｏｔｒｉｄａｅ）；ティラピア族（Ｔｉｌａｐｉｉｎｉ）およびサケ科（Ｓａｌｍｏｎｉｄａｅ）に属する種に与えられる食餌の成分としての用途を見出し得る。そのようなものとして、本発明の魚用飼料は、このような科の中の属のいずれかに属する種に、特に、人のまたは動物の消費のために養殖されるこれらの種に与えるのに用い得る。例えば（およびいずれかの特別な例に限られるわけではないが）、本明細書に記載の魚用飼料は、サルモ属（Ｓａｌｍｏ）および／またはオンコリンクス属（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）に属する種に供するのに用い得る。特に、魚用飼料は、例えば、タイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）、タイヘイヨウサケおよび／またはニジマスを含む野生のおよび／または養殖のサケおよび／またはマス種に供するのに用い得る。さらに、魚用飼料は、シーバスまたはビリームなどの養殖産業内の他の魚種のためだけでなく、ペット／観賞用魚産業、例えば、金魚（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ）における有害生物防除のための魚用有害生物防除剤として使用し得る。
【００１６】
そのようなものとして、本発明は、サケ科に属する種に対する魚用飼料を提供し、そこでは、前記魚用飼料は、有害生物防除剤を含む。
【００１７】
用語「有害生物」は、例えば、他の生物の健康、価値および／または外観に対して有害であるいかなる生物を包含する。用語「有害生物」は、外部／内部寄生虫（例えば、虫、蠕虫、吸虫、シラミ、ダニおよび／またはマダニ）、細菌、ウイルス、真菌および／または原虫（例えば、アメーバを含む）の種を包含し得る。
【００１８】
そのようなものとして、本発明の魚用飼料は、寄生虫、細菌、ウイルス、真菌および／または原虫により引き起こされるまたはそれらが原因となっている感染症／外寄生症を防除するための薬剤を含み得る。本発明の魚用飼料中に含まれるそれぞれの薬剤は、それぞれ独立に、１種以上の寄生虫、細菌、ウイルス、真菌または原虫の感染症／外寄生症を防除し得る。
【００１９】
当業者は、有害生物が寄生虫の場合、寄生虫は、内部寄生虫または外部寄生虫であり得ることが判るであろう。そのようなものとして、本発明の魚用飼料は、内部寄生虫および／または外部寄生虫による感染症／外寄生症を防除する薬剤を含み得る。
【００２０】
「内部寄生虫」という用語は、他の生物の１ケ所以上の内部の隙間に住む生物を包含し得る。例えば、内部寄生虫は、宿主生物の組織、器官またはシステムの１ケ所以上に住むことができる。例えば、内部寄生虫は、宿主生物の腸および／または血液中に住むことができる。「外部寄生虫」という用語は、他の種の外部の隙間に住む、または場所を占める生物を含み得る。例えば、外部寄生虫は、宿主種の表面に住むまたは場所を占め得る。魚の場合は、外部寄生虫は、粘液、血液、皮膚および／または鰓から栄養を得て、魚の皮膚に（時には、うろこの間に）住むことができる。
【００２１】
魚の外部寄生虫は、節足動物（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ）門に属する種を含み得る。そのようなものとして、「外部寄生虫」という用語は、宿主の魚に住む甲殻類およびシラミの種を含む。例として、サケ科（例えば、サルモ属および／またはオンコリンクス属に属する魚の場合、本発明により提供される魚用飼料の有害生物防除剤は、例えば、シラミの感染症および／または外寄生症を防除し得る。本発明により提供される魚用飼料の有害生物防除剤は、チョウ属（Ａｒｇｕｌｕｓ）亜種またはウオジラミ属（Ｃａｌｉｇｕｓ）亜種などの外部寄生虫を防除し得る。特に、本明細書に記載の魚用飼料中に用いられる有害生物防除剤は、魚へのカイアシ類（ｃｏｐｅｐｏｄ）の感染症／外寄生症を防除することにおいて有効であり得る。
【００２２】
タイセイヨウサケの外部寄生虫であるカイアシ類の種は、レペオフテイルス属（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ）に属し、サケジラミ（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓ）として知られている。サケ科に属する魚のカイアシ類外部寄生虫の他の型としては、カリガス・クレメンシ（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｃｌｅｍｅｎｓｉ）およびカリガス・ロジェークレセイ（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｅｙｉ）がある。例えば、サケジラミを含むシラミは、サケの種の血液、粘液および皮膚から栄養をとる外部寄生虫である。サケジラミのライフサイクルは、自由に泳げるノープリウス（ｎａｕｐｌｉｕｓ）期に始まる多くの期を含む。この期の後に、ノープリウスは、コペポディッド（ｃｏｐｅｐｏｄｉｔ）期に発育し、魚に付着する。ここから、コペポディッドは、カリムス（ｃｈａｌｉｍｕｓ）期を通じて発育し、約５ｍｍ（オス）および約１０ｍｍ（メス）の長さにまで成長する。カリムスは次いで、前成虫期および成虫期へと進む。前成虫期および成虫期において、シラミは移動できるようになり、宿主の周りをおよびある宿主から他の宿主へ移動し得る。
【００２３】
そのようなものとして、本発明は、レペオフテイルスの感染症および／または外寄生症を治療、予防および／または防除し得る薬剤を含む魚用飼料を提供する。レペオフテイルスの感染症および／または外寄生症は、サケジラミにより引き起こされおよび／またはそれが原因となっている。この場合、魚用飼料はサケ科に属する種に対するものであり得る。例えば、魚用飼料は、サルモ属および／またはオンコリンクス属用の飼料であり得る。しかしながら、当業者ならば、飼料は、レペオフテイルスの感染症および／または外寄生症に罹りやすいいかなる魚に対しても与え得ることが理解できるであろう。
【００２４】
有害生物を「防除する」薬剤（本明細書では有害生物「防除剤」を指す）は、魚における有害生物の感染症／外寄生症の駆除または減少に対して、影響を与え、促進し、または寄与するいかなる薬剤であり得る。さらにまたは代替として、適切な薬剤は、有害生物の感染症／外寄生症に付随する１種以上の症状を、治癒し、減少させ、または改善し得る。本発明における使用の有害生物防除剤は、１種以上の魚の有害生物に対して生物学的に活性であり、適切な薬剤は、有害生物を殺しまたは除去し得る。薬剤は、さらにまたは代替として、有害生物の挙動（例えば、摂食習性／パターン）および／またはライフサイクルを調節（例えば、阻害および／または悪作用を及ぼす）し得る。有害生物のライフサイクルに影響を与える薬剤は、（ライフサイクルの１期以上の相を通じて成長および／または発育を調節して）全般的な発育および／または繁殖力（全般的な生殖力および／または産卵）に影響を与え得る。
【００２５】
一般に、本発明における使用のための薬剤は、抗寄生虫性、抗細菌性、抗ウイルス性、抗真菌性、および／または抗原虫性の効果を有していることを意味する。本発明における使用のための抗寄生虫性薬剤は、内部寄生虫および／または外部寄生虫の防除にも用いられ得る。この型の薬剤は、抗内部寄生虫性および／または抗外部寄生虫性効果を有することを意味する。本発明のいずれの態様において使用するための特定の薬剤はいずれも、１種以上の抗寄生虫性（抗内部寄生虫性、抗外部寄生虫性）、抗細菌性、抗ウイルス性、抗真菌性、および／または抗原虫性の効果を示し得る。
【００２６】
本発明は、抗外部寄生虫性薬剤を含む魚用飼料を提供する。ここで、前記薬剤は、以下の項目からなる群から選択される１種以上の特性を示す。
（ｉ）  外部寄生虫に対する毒性
（ｉｉ）  外部寄生虫の挙動の調節、および
（ｉｉｉ）  例えば、卵の発育、卵の着床、卵の生命力および／または摂食挙動を含む、外部寄生虫のライフサイクルの少なくとも１つの成分および／または相の調節。
【００２７】
本発明の有害生物防除剤は、有害生物の感染症／外寄生症の治療および／または予防を促進し得る。従って、本発明により提供される魚用飼料は、魚における有害生物の感染症／外寄生症を治療および／または予防するための使用（おそらくは、医薬品の形態として）に適切であり得る。魚における有害生物の感染症および／または外寄生症（例えば、外部寄生虫の感染症／外寄生症）の治療に使用するための医薬品は、魚が食べられる基質および有害生物防除剤を含み得る。
【００２８】
本発明の魚用飼料は、１種以上の有害生物防除剤を含むまたはこれにより補われ得ることを理解されるべきである。魚用飼料が、少なくとも２種以上の異なる有害生物防除剤を含む、またはこれによりで補われる場合、それぞれの有害生物防除剤は、独立に、有害生物に対して活性（または生物学的に活性）でありおよび／または有害生物の挙動および／または発育を調節し得る。それぞれの薬剤は、独立に、１種以上の異なる有害生物に対して有効である。
【００２９】
理論に制限されるつもりはないが、魚用飼料の成分として提供されるいかなる有害生物防除剤も、その宿主から栄養をとり、例えば、そこから血液、または粘液の食事をとる有害生物に対して悪い影響を与え得ることが示されている。薬剤への暴露に際して、有害生物は、調節され（すなわち、有害生物の発育／挙動が調節される）、殺されおよび／または宿主から除去され得る。
【００３０】
本発明における使用に適切な有害生物防除剤は、１種以上の合成のおよび／または天然の薬剤を含み得る。
【００３１】
本発明における使用のための有害生物防除剤（すなわち、「活性成分」）は、アザジラクタ（Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ）属に属する植物から入手できる化合物（単数または複数）を含み得る。例えば、薬剤は、アザジラクタ属に属する植物の抽出物を含み得る。薬剤は、インドセンダン（Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ  ｉｎｄｉｃａ）−「ニーム」の木として周知の木である−から入手または抽出され得る。薬剤は、例えば、その葉、茎、樹皮、実および／または種を含んで、植物のどの部分からも入手または抽出され得る。
【００３２】
ニームの木から入手したまたは入手できる抽出物（例えば、組成物および薬剤）は、一連の複雑なテルペノイド化合物（テトラノルトリペノイド（ｔｅｔｒａｎｏｒｔｒｉｐｅｎｏｉｄｓ）またはリモノイド）を含み得る。多くのテルペノイドの中で最も強力なのは、アザジラクチノイドと呼ばれる一群の化合物である。
【００３３】
本発明における使用のための有害生物防除剤は、１種以上のアザジラクチノイドを含み得る。
【００３４】
本発明における使用のための（有害生物防除）薬剤は、テトラノルトリテルペノイド化合物、アザジラクチンを含み得る。「アザジラクチン」は、殺虫的に活性なリモノイドの大きな群に適用される総称である。アザジラクチンの一つ（すなわち、アザジラクチンＡ）は、別途、ジメチル［２ａＲ−［２ａα，３β，４β（１ａＲ＊，２Ｓ＊，３ａＳ＊，６ａＳ＊，７Ｓ＊，７ａＳ＊），４ａβ，５α，７ａＳ＊，８β（Ｅ），１０β，１０ａα，１０ｂβ］］−１０−（アセチロキシ）オクタヒドロ−３，５−ジヒドロキシ−４−メチル−８−［（２−メチル−１−オキソ−２−ブテニル）オキシ］−４−（３ａ，６ａ，７，７ａ）−テトラヒドロ−６ａ−ヒドロキシ−７ａ−メチル−２，７−メタノフロ［２，３−ｂ］オキシレノ［ｅ］オキセピン−１ａ（２Ｈ）−イル）−１Ｈ，７Ｈ−ナフト−［１，８−ｂｃ：４，４ａ−ｃ‘］ジフラン−５，１０ａ（８Ｈ）−ジカルボキシレートとして公知である。
【００３５】
アザジラクチンＡ（アザジラクチンＡ）は、アザジラクチノイド同族体の群の中で最も豊富である。アザジラクチンＡは、ニームの種の殻中のアザジラクチノイドの約８０％をなしている。アザジラクチンＡの構造式は、以下の通りである。
【００３６】
【化１】
0006427117.tif 000002
【００３７】
本明細書で使用する場合、「アザジラクチン」という用語は、アザジラクチンのすべての天然に存在する変異体または誘導体（例えば、アザジラクチンＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋを含むがこれらに限られるわけではない）だけでなく、すべての合成の変異体、フラグメント、類縁体および／または誘導体も包含するということに留意すべきである。このことに関しては、当業者ならば、本発明において使用するためのアザジラクチンの変異体、フラグメント、誘導体および／または類縁体のいずれも機能性であるべきであり、言い換えると、少なくとも１つの抗有害生物特性を示すはずであることを理解するであろう。
【００３８】
アザジラクチンは、例えば、Ｖｅｉｔｃｈら、２００７（“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｚａｄｉｒａｃｈｔｉｎ：ａ  ｌｏｎｇ  ｂｕｔ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｊｏｕｒｎｅｙ”：Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４６（４０）：７６２９〜３２頁：およびＳａｎｄｅｒｓｏｎ，２００７：“Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ  ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｂｏｒｎ  ｋｉｌｌｅｒ”：Ｎａｔｕｒｅ  ４４８（７１５４）：６３０〜１頁も参照）の方法を用いて合成により製造できる。適切なアザジラクチンのフラグメント（すなわち、機能性であるフラグメント）は、“Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ａｎｄ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｃｅｌｌｓ”；Ｓａｌｅｚａｄｅｈ  Ａ．、Ｊａｂｂａｒ，  Ａ．、Ｊｅｎｎｅｎｓ，  Ｌ．Ｌｅｙ、Ｓ．Ｖ．Ａｎｎａｄｕｒａｉ，Ｒ、Ａｄａｍｓ，Ｒ．、Ｓｔｒａｎｇ，Ｒ．Ｈ．Ｃ．  Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇ．Ｓｃｉ  ５８，２６８〜２７６頁（２００２）および“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｚａｄｉｒａｃｈｔｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｃａｌｉｎ（ｐｅｒｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）  ａｎｄ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｕｒａｎａｃｅｔａｌ（ｆｕｒｏ（２，３−ｂ）ｐｙｒａｎ）  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ｏｆ  Ｓ．ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ”；Ｐｅｓｔ．Ｓｃｉ．  ４０，１６９〜１７３頁（１９９４）中に見出されるであろう。これらのすべての文書の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３９】
遺伝子組み換え技術および／または細胞培養技法を用いてアザジラクチンを製造することも可能である。例えば、アザジラクタ属に属する植物由来の細胞をアザジラクチンを発現するような条件下で培養してもよい。
【００４０】
代替として、アザジラクチンは、インドセンダン（例えば、葉、茎、樹皮、実および／または種の１つ以上から）から、１段以上の抽出工程により抽出され得る。適切な抽出方法としては、当業界の技術者には公知であり、例えば、ニームの種（殻）を機械的に圧搾することおよび非極性の溶媒の使用を利用する技法が含まれ得る。さらにまたは代替として、例えば、アルコールおよびＵＳ４５５６５６２およびＵＳ５６９５７６３（ＷＯ９２１６１０９に由来しおよびＥＰ０５７９６２４を含む）に記載されているものを利用する溶媒抽出技法（これらのすべての文書の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）は、本発明の魚用飼料における使用のための「アザジラクチンの豊富な」有害生物防除剤を製造するための手段として利用し得る。例えば、アザジラクチンは、ニームの木の種から、種を砕き、砕いた種からアザジラクチンを水で抽出し、次いで、水と混合せず水よりもアザジラクチンの溶解度が高い非水溶媒または２０°Ｃから８０°Ｃまでの間の濁度温度を有する界面活性剤のいずれかを用いて、アザジラクチンを水から抽出することにより、効率的に回収できる。濃縮したアザジラクチンは、第２の抽出液から容易に回収でき、殺虫剤として高い活性を示す。極性溶媒（例えば、水）を使用する抽出法は、極性成分が豊富な抽出物をもたらす。
【００４１】
疑問を避けるために、ニーム油および／またはインドセンダン（ｍａｒｇｏｓａ）抽出物として（または含む）記載されている組成物は、本発明の有害生物防除剤とは非常に異なっているものであり得ることは明確にされるべきである。本発明の有害生物防除剤は、ニーム油および他の油ベースの製剤よりも、アザジラクチノイド活性成分（特に、アザジラクチンＡ）が豊富である。このことは、アザジラクチンＡなどのアザジラクチノイドは、多くの含酸素官能基を有する比較的極性の複合体テルペノイドであり、そのため、分子を水に対して適度に（２ｇ／Ｌ）可溶としている、という事実に起因する。その結果、極性溶媒を用いて得た抽出物中には、アザジラクチノイド（特に、アザジラクチンＡ）が、ニーム油および／またはインドセンダン抽出物よりもはるかに高い濃度で存在する。理論に拘泥するわけではないが、水ベースの抽出物中の、標的寄生虫に対する活性成分の生体利用度は、水ベースの抽出物の水中への溶解度および／または水との混合容易性が増加していると考えると、ニーム油よりも大きい。
【００４２】
従って、本発明の有害生物防除剤は、ニーム油ではなく、それを含まず、それからならずまたはそれから本質的にならない。本発明により提供される魚用飼料の有害生物防除剤（活性成分）は、アザジラクチンＡを含み、それからなり、またはそれから本質的になる。
【００４３】
活性成分および／または薬剤は、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）および／またはＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌを含み得る。「ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）」という用語は、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌを含め、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）を含むいかなる製剤も指すと以下で理解されるべきである。
【００４４】
ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）は、植物の有害生物防除における主要用途のために販売されている。植物におけるＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）の使用は、昆虫有害生物における摂食阻害に至ることが知られている。ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）はまた、昆虫の脱皮を阻害し、繁殖力および増殖能力を減少させることも知られている。ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）は、ニームの殻からＵＳ５６９５７６３に記載の、水性抽出工程を用いて調製され得る。ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）（植物保護の）製剤は、天然物ベースのニーム抽出物、植物油および界面活性剤を含み得る。
【００４５】
ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌは、極性溶媒を用いて作成されたニームの種の抽出物であり、アザジラクチンＡが非常に豊富である。例えば、ニーム油または他のニーム油ベースの抽出物よりもはるかに安定な抽出物である。ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌは、３５±２％（３５，０００ｐｐｍ）のアザジラクチンＡを含有し得る。他の少量のアザジラクチノイドが、重量の残りの３２％を形成している。残余の成分は、いくらかのたんぱく質および多糖類と共に、少量の生物学的に活性のない他のテルペノイド（サラニン（３〜５％）およびニンビン（３〜５％））からなる。
【００４６】
ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌの組成物は、以下のものを含み得る（％ｗ／ｗ）。
アザジラクチンＡ  ３４
アザジラクチンＢ  約５．５
アザジラクチンＤ  約２．１
アザジラクチンＥ  ≦１
アザジラクチンＦ  ≦１
アザジラクチンＧ  ≦１
アザジラクチンＨ  約２．３
アザジラクチンＩ  約０．８
アザジラクチンＫおよび他のアザジラクチン  ＜２
アザジラクチニン  約２
アザジラクチンの合計  ５１．７％
【００４７】
本発明における使用のためのＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）製剤は、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌの希釈物を含み得る。
【００４８】
本発明における使用のための適切な有害生物防除剤は、Ｒｉｄｄａｎｃｅ（登録商標）の名前で販売されている。Ｒｉｄｄａｎｃｅ（登録商標）はアザジラクチンを含んでいる。
【００４９】
上記の観点から、本発明は、アザジラクチンおよび／またはアザジラクチンＡを含む魚用飼料を提供する。魚用飼料は、魚が食べられる基質を含む栄養のあるまたは非栄養の飼料であり得る。
【００５０】
本発明はさらに、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌを含む魚用飼料を提供する。魚用飼料は、魚が食べられる基質を含む栄養のある飼料または非栄養の飼料であり得る。本発明はさらに、例えば、サケ科内の種に与えるのに適切な飼料である、魚用飼料を提供する。前記飼料は、有害生物防除剤を含み、該有害生物防除剤は、以下のものからなる群から選択される１種以上の薬剤を含む。
（ｉ）  （天然起源の（すなわち、インドセンダンから抽出された）および／または合成的に製造された（おそらくは細胞培養の技法を用いて））アザジラクチン
（ｉｉ）  （天然起源の（すなわち、インドセンダンから抽出された）および／または合成的に製造された（おそらくは細胞培養の技法を用いて））アザジラクチンＡ
（ｉｉｉ）  アザジラクチンＡを濃縮したニーム抽出物
（ｉｖ）  ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ
（ｖ）  ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）製剤
（ｖｉ）  Ｖｅｉｔｃｈら、２００７の方法により製造された合成アザジラクチン
（ｖｉｉ）  機能性アザジラクチン、その変異体、その誘導体および／またはその類縁体、並びに
（ｖｉｉｉ）  ＵＳ４５５６５６２および／またはＵＳ５６９５７６３に記載されている方法により入手できる、アザジラクチンＡの豊富な製剤
（ｉｘ）  Ｒｉｄｄａｎｃｅ（登録商標）
【００５１】
植物抽出物から調製された薬剤は、本質的に複雑であり、本明細書に記載されていない追加の成分を含み得ることは理解されるべきである。アザジラクタ（Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ）属（例えば、インドセンダン）に属する植物から調製された抽出物の場合には、抽出物は単にアザジラクチン（例えば、アザジラクチンＡおよび／または他のアザジラクチン変異体）を含むだけでなく、例えば、リモノイドのサランニン（Ｓａｌａｎｎｉｎ）、ニンビン（Ｎｉｍｂｉｎ）および６−デスアセチルニンビンのある量（時には少量）を含む多くの他の成分をも含み得る。
【００５２】
疑問を避けるために、本発明により提供される魚用飼料は、１種以上の本明細書に記載された有害生物防除剤と共に、１種以上の他の薬剤を含み得る。例えば、魚用飼料は、１種以上の他の薬剤と共に、アザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ、および／または本明細書に記載された有害生物防除剤のいずれかを含み得る。１種以上のまたは他の薬剤としては、抗外部寄生虫性薬剤（本明細書で記載された有害生物防除剤（例えば、アザジラクチンＡおよび／またはＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ）のいずれかを含む）、抗微生物剤（抗生剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤）、抗寄生虫剤（例えば、抗内部寄生虫剤）、抗原虫剤および／または栄養のあるサプリメントなどを含み得る。１種以上の他の薬剤は、魚用飼料と混合されていても、されていなくてもまたはその上に被覆されていてもされていなくても（もしくはその中に層を構成していてもしていなくても）よい。１種以上の他の薬剤は、別途に（液体または固体の形態で）提供されてもよく、本発明の飼料とは別途に（それの前にまたはそれの後で）またはそれと同時に投与されてもよい。有害生物防除剤は、魚用飼料に組み込まれていてもまたは混合されていてもよい。薬剤は、魚用飼料のすべてとまたはその一部とにわたって分布するように、製造中に飼料と混合されてもよい。ひとたび薬剤が魚用飼料と混合されると、魚用飼料／薬剤の混合物は、例えば、所望によりペレットおよび／または薄片に成形されてもよい。
【００５３】
薬剤は、１層以上の層またはコートとして魚用飼料に適用してもよい。薬剤は、例えば、ペレットまたは薄片の外部表面上に適用してもよい。この方法では、魚用飼料ペレットまたは薄片は、薬剤でその全体をまたは一部を被覆されていてもよい。薬剤の１層以上の層またはコートを、魚用飼料の薄片またはペレットの外部表面上に適用してもよい。薬剤のいかなる層またはコートが、シール物質の１層以上の追加のコートまたは層の適用により、「シールされて」または保護されていてもよい。例として、薬剤の層またはコートは、魚油の層またはコートの適用によりシールされていてもよい。さらにまたは代替として、魚用飼料の１層以上の更なる層またはコートが、魚用飼料のコートまたは層（場合によりシールされている）に対して適用されていてもよい。この方法で、いかなる所与の魚用飼料の薄片またはペレットは、魚用飼料、シール材および／または薬剤の多層を含んでもよい。
【００５４】
本明細書で記載した薬剤のいずれも、本発明の飼料と混合、その上に被覆、またはその上に層を構成してもよいが、有害生物防除剤はさらにまたは代替として、投与のために、魚用飼料（本発明の飼料を含む）とは別に、それの前に／それの後に、またはそれと同時に提供されてもよい。魚用飼料は、有害生物防除剤を含んでいなくともよいが、有害生物防除剤は、記載されているように、別に投与されるべき組成物として提供される。
【００５５】
そのようなものとして、本発明はさらに、魚に投与するための組成物を提供する。該組成物は、本明細書に記載しているように、有害生物防除剤を含む。例えば、組成物は、アザジラクチン、アザジラクチンＡを濃縮した抽出物、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）製剤、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ、および／または本明細書に記載した有害生物防除剤のいずれかを含む。組成物は、液体のまたは固体の賦形剤、希釈剤および／または担体を含んでもよい。組成物は、魚に対する組成物の「浴治療」型の投与を可能とするために、水に添加して製剤されていてもよい。代替として、組成物は魚が食べられるような形で提供されてもよい。組成物はまた、非経口投与のために製剤されていてもよい。従って、組成物は、医薬として許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含んでもよい。さらに、組成物は、無菌であってもよい。
【００５６】
本発明の組成物は、本明細書に記載のいずれかの魚用飼料の投与の前に、それの間にまたはそれの後に投与してもよい。本発明の組成物は、例えば、アザジラクチン、アザジラクチンＡ，ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）および／またはＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌなどの、１種以上の本明細書に記載の有害生物防除剤を含む液体のおよび／または固体の組成物であり得る。
【００５７】
本明細書に記載の型の魚用補充飼料を利用する治療は、「飼料中治療」を指し得る。従って、本発明は、魚の有害生物−特に外部寄生虫の−治療、防除および／または予防のための、「飼料中」治療を提供する。しかしながら、病気のおよび／または寄生虫の浸入／感染を受けた魚および／またはより不活発な魚ほど、少ししか食べず、少ない用量の治療薬を消費する恐れがある（Ｉｂｇｏｅｌｉら、２０１４）。
【００５８】
従って、本発明の補充されている飼料および組成物の両者の使用を基礎とした治療計画は、その食欲が病気、感染症および／または外寄生症によって影響を受けている魚および／または食べるのが少ない活発でない魚の治療に特に有用であり得る。そのような場合には（そして理論に拘泥するつもりはないが）、本発明の（アザジラクチンを含む）組成物は、浴治療として水中に適用することもでき、このことは、治療への影響を始めることができ、食欲が病気、感染症および／または外寄生症によって悪影響を受けている魚においては、寄生虫による負荷が減少することにより魚が食欲を取り戻し始めることもできる。次いで、魚は、本発明の（アザジラクチンで補充されている）魚用飼料を与えられ得る。飼料は、組成物と同時におよび／またはそれとは別に投与してもよい。「飼料中」型の治療は浴型治療のものよりも好まれるであろう。それゆえ、魚の食欲を改善する初期の治療を促進するために本発明の組成物の使用が、「飼料中」治療の最終的使用を促進し得る。さらに、より活発でない（または食べるのが少ない魚）においては、本発明の組成物を同時に使用することは、正確なアザジラクチン用量が魚に投与されるのを促進しまたは確実にし得る。
【００５９】
一般に、本発明の飼料または組成物に加えられる有害生物防除剤の用量／量は、所望の有害生物防除効果が達成されるように設定される。本発明の魚用飼料（または組成物）に加えられる有害生物防除剤の正確な量は、例えば、魚種および／または給餌される魚の数に依存して変化し得るということを当業者は理解するであろう。飼料に加えられる薬剤の量に影響を与える他の要因としては、例えば、飼料に対する考え得る競争者（すなわち、魚用飼料を食べるであろう標的としていない他の動物種）の存在、防除したい有害生物の型、魚の年齢／成熟度、季節、水の型（ｐＨ、塩濃度、純度、温度）、温度および魚の強欲さが含まれる。
【００６０】
薬剤が、例えば、アザジラクチン（Ａ）および／またはＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌである（または含む）場合、本発明の魚用飼料は、飼料を通じて魚に投与される薬剤の用量が、ほぼ１〜１００ｍｇ、１〜９０ｍｇ、１〜８０ｍｇ、１〜７０ｍｇ、１〜６０ｍｇ、５〜５０ｍｇのＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ／体重ｋｇ／日、約１０−４０ｍｇのＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ／体重ｋｇ／日、約１５〜３５ｍｇのＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ／体重ｋｇ／日、約２０〜３０ｍｇのＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ／体重ｋｇ／日、または約２５ｍｇのＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ／体重ｋｇ／日であるように製剤され得る。
【００６１】
本発明の組成物および／または飼料は、所望の有害生物防除効果が達成されるのに必要な期間だけ投与され得る。例えば、組成物および／または飼料は、約１〜１０日の、約２〜８日の、約３〜７日の、約４〜６日の、約５日の期間にわたって、投与され得る。典型的には、飼料は、約７日間で投与され得る。代替として、本発明の組成物および／または魚用飼料は、低用量でより長い期間投与されてもよい。本発明の組成物および／または飼料の治療計画は、異なる用量に対して調整するために異なる長さの期間であり得ることを理解すべきである。
【００６２】
投与期間の間、組成物および／または飼料は、所望の有害生物防除効果が達成されるのに必要な回数で投与される。例えば、本発明の組成物および／または飼料は、約１、２、３、４またはもっと多くの回数／日で投与されてもよい。
【００６３】
本発明の魚用飼料は少なくとも部分的に薬剤で被覆されていてもよい。
【００６４】
飼料１ｋｇあたり、約０．１〜１００ｇ、約９０ｇ、約８０ｇ、約７０ｇ、約６０ｇ、約５０ｇ、約４０ｇ、約３０ｇ、約２０ｇ、約１〜１０ｇ、約２〜９ｇ、約３〜７ｇ、約４〜６ｇまたは約５ｇのＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌを用いてよい。当業者は、この量が約０．０１〜１０％ｗ／ｗ（ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ／飼料）に相当することが理解できるであろう。
【００６５】
驚くべきことに、発明者たちは、アザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本明細書に記載されているニーム抽出物薬剤のいずれかを含む、それから本質的になる、またはそれからなる有害生物防除剤が、魚における抗外部寄生虫性効果だけでなく、抗真菌性および抗原虫性の効果も示すことを発見した。さらに、アザジラクチンＡおよび／またはＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌを含む抗外部寄生虫性薬剤の水中におけるかなりの不安定性にもかかわらず、魚用飼料に適用された時、アザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／またはニーム抽出物含有の薬剤（単数および／または複数）のいずれかは、組成物および／または魚用飼料の活性成分（すなわち、抗外部寄生虫性薬剤）が、引き伸ばされた期間にわたり、その生物学的活性を完全に発揮し得るように、少なくとも一時的に安定となり得る。理論に拘泥するわけではないが、水中でのＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌの半減期は８日であるが、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌが本発明の魚用飼料に含有された時、水中で約４８時間後も何らの劣化の兆候は見られない。
【００６６】
そのようなものとして、本発明は、魚の有害生物防除剤としての使用に対して本明細書に記載した、アザジラクチンをベースとした薬剤を含む組成物および／または魚用飼料を提供する。そこでは、薬剤は少なくとも一時的に安定であり、そのため組成物の活性成分はその生物学的活性を完全に発揮する。
【００６７】
さらに、アザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本発明のニーム抽出物薬剤のいずれかは、魚または人に対して何の毒性効果を示さず、それゆえ野生のおよび養殖の魚群の両者に対して使用するのに安全であることに留意すべきである。
【００６８】
アザジラクチンＡがその主要な例であるアザジラクチノイドは、いくつかの重要な特徴を有する。
ａ）  その標的に対して高い特異性を示す。節足動物および他の無脊椎動物に対しては一般に有効だが、抽出物は高等動物に対してはほとんどまったく無害である。実際、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌは、ハチおよびテントウムシと共に園芸においてＩＰＭの一部として使用されている。
ｂ）  それらは神経毒ではない。しかしいくつかの標的分子を有するように見える。それらは速効のノックダウン効果は持たないが、数日から数週の期間にわたって効果を有する。
ｃ）  環境中では半減期が短い。
ｄ）  アメリカ合衆国およびＥＵ地域でほぼ２０年の間、市販の殺生物剤および植物保護製品として使用されてきたが、標的生物において抵抗性の兆候が出たという報告はない。
【００６９】
アザジラクチン含有の抽出物の利用に関して昆虫およびダニ類で行われた非常に多くの研究の結果明らかとなった一つの重要な事実は、節足動物および他の非脊椎動物は活性成分（すなわち、アザジラクチンＡ）に対して感受性であるが、哺乳類を含む高等生物は影響を受けないというものである。ラットにおいてＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌに対する急性致死性の用量は、＞５０００ｍｇ／ｋｇ体重である。慢性の悪作用はなく、ガン化効果または生殖に対する兆候はない。殺虫剤マニュアル（Ｔｈｅ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｍａｎｕａｌ）は、アザジラクチンＡを最も毒性の少ないカテゴリー（Ｖ）に入れている。
【００７０】
さらに、アザジラクチンＡ，ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本発明のいずれかのニーム抽出物は、容易に水に溶解するので、これらは魚中に残存しないし蓄積しない。むしろ、いったん投与を中止すると薬剤は急激にその効力を失い、代謝され、分解されおよび／または排出される。このことは、養殖魚群の場合、本発明の魚用飼料または組成物の投与の後、捕獲までの時間の減少を保証する。
【００７１】
しばしば廃棄物または消費されなかった魚用飼料が問題となる、環境を汚染し得るからである。このことは、それが消費されなかったときに、環境に蓄積しエコシステムおよび他の生物に損害を与え得る１種以上の治療用化合物で補充された魚用飼料において特にそうである。アザジラクチンＡ，ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本明細書に記載のニーム抽出物薬剤のいずれかを含む組成物は、環境中で急速に分解し、汚染のリスクを少なくしている。
【００７２】
大部分の植物由来の殺生物剤に共通であるが、アザジラクチンテルペノイドは環境中で半減期が短い。水中で加水分解し、よりアルカリ性の水中ではその消失はもっと速い。例えば、ｐＨ  ７．０で、２０°Ｃで、アザジラクチンテルペノイドの半減期は、１９．５日であり、ｐＨ  ８．０では、４．４日である。海水はややアルカリ性（ｐＨ  ７．５〜８．４）であり、溶解しているアザジラクチンテルペノイドはいずれも、１週間以内にほぼ消失する。アザジラクチンは、土中の微小植物で急速に代謝分解される。種々の土中での半減期は、平均で３日であることが判っている。Ｓｋｙｅ（スコットランド）のケージの下からのいくつかの沈積物でのおよびそれに続く実験室でＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）を注入した沈殿物での予備的な研究によれば、沈積物中に加えられ１５°Ｃで培養されたＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌについて、半減期は３週間であることが示された。変化しないで排出された物質は水中で無限に希釈され、生物学的活性のない小さなフラグメントに数日のうちに加水分解された。
【００７３】
それゆえ、本発明は、魚における有害生物防除剤として使用するためのアザジラクチンを含む組成物および／または魚用飼料を提供する。そこでは、アザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本明細書に記載の有害生物防除剤のいずれかを含む組成物は、環境中で急速に分解され、汚染のリスクを少なくする。
【００７４】
さらに、アザジラクチンＡ，ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本明細書に記載のニーム抽出物薬剤のいずれかを含む抗外部寄生虫性薬剤が、強力な殺昆虫特性を示すことは公知であるが、魚に投与された場合および／または魚用飼料のサプリメントとして存在する場合、この型の有害生物防除剤は、強力な抗外部寄生虫性効果を示すことを発明者たちは見出した。実際、発明者たちは、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌが、タイセイヨウサケにおいて、サケジラミに対してかなりの効果を有し得ることを示した。ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌで補充された（その上に被覆したまたはその中に組み込まれた）魚用飼料は、（ｉ）タイセイヨウサケに付着しているサケジラミのカリムスの数、（ｉｉ）成虫に成長している前成虫の数、（ｉｉｉ）メスの産卵数、（ｉｖ）成虫メスの総数、および（ｖ）妊娠しているものの割合、の各項の減少をもたらし得る。特に、カリムス期および前成虫期のサケジラミに感染した魚（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）において、カリムスの約９２％、および前成虫のメスの７４％が、本発明により提供される魚用飼料（すなわち、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌで補充された魚用飼料）の使用後に除去されたことを、本発明者等は認めた。
【００７５】
第２の態様では、本発明は、魚における有害生物の感染症または外寄生症を、防除、予防または治療する方法であって、それを必要とする魚に対して、本発明の魚用飼料のある量を投与することを含む方法を提供する。該方法は、野生のおよび／または養殖の魚におけるサケジラミの感染症または外寄生症を含む感染症および／または外寄生症を含む、外部寄生虫の感染症および／または外寄生症の予防および／または治療における特定の用途を見出し得る。この型の方法においては、魚用飼料は、アザジラクタ属の植物から入手可能の薬剤を含み得る。例えば、魚用飼料は、アザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本明細書に記載の有害生物防除剤のいずれかを含み得る。
【００７６】
本発明の方法は、例えば、アザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本明細書に記載の有害生物防除剤のいずれかを含む液体の（または水性の）組成物の使用をさらに含み得る。この型の組成物は、本発明の魚用飼料とは別におよび／またはそれと同時に投与されてもよい。
【００７７】
様々な型の治療が魚の食欲に影響を与えることが認識されている。さらに、病気している／外寄生されている魚および／またはより活動的でない魚は、健康で、優勢な魚よりも少ししか食べない傾向がある。有害生物を防除するためにおよび病気、感染症および／または外寄生症による食欲の喪失に伴う問題を克服するためには、本明細書に記載のように有害生物防除剤をいずれかの形態で、治療を始めるためにおよび食欲を改善するために、浴治療として水中に直接加えてもよい。その後、本発明の魚用飼料を投与し得る。
【００７８】
従って、本発明は、魚における有害生物の感染症／外寄生症を防除、治療および／または予防することにおける使用のための、アザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本明細書に記載の有害生物防除剤のいずれかを含む魚用飼料およびアザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本明細書に記載の有害生物防除剤のいずれかを含む組成物を提供する。そこでは、飼料は、組成物と共に／それと同時に、それの後におよび／またはそれとは別に、投与されることを意図している。
【００７９】
本発明はまた、魚における有害生物の感染症／外寄生症を防除、予防および／または治療する方法を提供する。前記方法は、それを必要とする魚に対して、アザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本明細書に記載の有害生物防除剤のいずれかを含む組成物およびアザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本明細書に記載の有害生物防除剤のいずれかを含む飼料を投与することを含み、組成物は、飼料と共に／それと同時に、それの後におよび／またはそれとは別に投与される。
【００８０】
従って、本発明の方法は、組成物および／または魚用飼料を利用し得る。該組成物および／または該飼料は、例えば、サケ科に属するものも含む、上記で詳細に述べた種々の科に属するいかなる魚も含む魚に適しており、アザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本明細書に記載の有害生物防除剤のいずれかを含んでいる。
【００８１】
「それを必要とする」魚とは、例えば、外部寄生虫（例えば、サケジラミ）を含む１種以上の有害生物に感染および／または侵入されている魚、または外部寄生虫を含む有害生物の感染症／外寄生症の素因があるおよび／または受けやすい魚の場合もあることは理解されるべきである。
【００８２】
魚用飼料の一部として投与される薬剤の「量」（言い換えると、薬剤（例えば、アザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本明細書に記載の有害生物防除剤のいずれか）の用量）は、外部寄生虫を含む有害生物の感染症／外寄生症を治療または予防するのに効果的であるいかなる量または用量であり得る。投与される量は、魚のおよび／または寄生虫の種、魚の年齢、水の条件および／または感染症の程度などの多くの要因に依存して変化し得る。
【００８３】
第３の態様では、本発明は、魚における有害生物（外部寄生虫）の感染症および／または外寄生症の治療および／または予防に使用するための有害生物防除剤（例えば、抗外部寄生虫性薬剤）を提供する。有害生物防除剤は、浴治療としておよび／または非経口の投与によって魚用飼料に薬剤を適用することにより投与されてもよい。有害生物防除剤は、アザジラクチンＡを含み得る。有害生物防除剤は、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本発明の有害生物防除剤のいずれかを含むまたはさらに含み得る。アザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本発明の有害生物防除剤を含む本発明の組成物は、水に添加するために、製剤され得ることを、当業者は理解するであろう。
【００８４】
そのようなものとして、本発明は、魚のための浴治療を提供する。前記治療は、アザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本明細書に記載の有害生物防除剤のいずれかを含む。
【００８５】
上記の観点から、本発明はまた、魚におけるウミシラミの感染症／外寄生症を治療または予防することにおける使用のための、アザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本発明の有害生物防除剤のいずれかを提供する。
【００８６】
本発明はまた、魚における有害生物の感染症／外寄生症を治療および／または予防するための医薬品の製造における、アザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本発明の有害生物防除剤の使用を提供する。本発明の医薬品は、魚における外部寄生虫の感染症／外寄生症を治療および／または予防することに特定の用途を見出し得る。本発明の医薬品は、サケ科に属する魚におけるウミシラミの感染症および／または外寄生症の治療および／または予防において利用され得る。
【００８７】
本発明の使用および医薬品のための有害生物防除剤は、浴治療としておよび／または飼料中で非経口的に投与されてもよい。
【００８８】
第４の態様では、本発明は、魚における外部寄生虫の感染症／外寄生症の治療および／または予防することにおける使用のための本発明の第１の態様に記載の魚用飼料を提供する。使用するための魚用飼料は、アザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本明細書に記載の有害生物防除剤のいずれかを含み得る。
【００８９】
第５の態様では、本発明は、魚用飼料サプリメントを提供する。該サプリメントは、本発明の（すなわち、本明細書に記載の型の）有害生物防除剤を含む。該サプリメントは、本発明の魚用飼料を提供するために魚用飼料と混合してもよい。該サプリメントは、固体または液体の形態であり得る。前記サプリメントは、アザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本明細書に記載の有害生物防除剤のいずれかを含んでもよい。
【００９０】
第６の態様では、本発明は、本発明の補充された魚用飼料を作成するための方法を提供する。前記方法は、補充された魚用飼料を提供するために、本明細書に記載の１種以上の組成物および／または有害生物防除剤を魚用飼料に混合するステップを含む。本発明の補充された魚用飼料を作成する方法は、アザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本明細書に記載の有害生物防除剤のいずれかなどの有害生物防除剤のある量と魚用飼料を混合することを含む。魚用飼料は、固体の飼料または液体の飼料であり得ることは理解されるべきである。魚用飼料が固体飼料である場合、抗外部寄生虫性薬剤は、最初に魚用飼料に混合され補充された魚用飼料を与え、次いで補充された魚用飼料は、必要に応じてペレットおよび／または薄片に形成されてもよい。
【００９１】
さらにまたは代替として、本発明の補充された魚用飼料を作成する方法は、魚用飼料を用意するステップ、ある量の有害生物防除剤を飼料の表面に適用するステップを含み得る。例えば、方法は、ある量の有害生物防除剤で飼料の最上層に被覆することを含み得る。有害生物防除剤が、例えば、アザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本明細書に記載の有害生物防除剤のいずれかを含む場合、方法は、（例えば、約０．１ｇから約１０００ｇ／ｋｇで、または０．１ｇ／ｋｇ、１ｇ／ｋｇ、２ｇ／ｋｇ、３ｇ／ｋｇ、４ｇ／ｋｇ、５ｇ／ｋｇ、６ｇ／ｋｇ、７ｇ／ｋｇ、８ｇ／ｋｇ、９ｇ／ｋｇまたは１０ｇ／ｋｇ、２０ｇ／ｋｇ、３０ｇ／ｋｇ、４０ｇ／ｋｇ、５０ｇ／ｋｇ、６０ｇ／ｋｇ、７０ｇ／ｋｇ、８０ｇ／ｋｇ、９０ｇ／ｋｇ、１００ｇ／ｋｇ、２５０ｇ／ｋｇ、５００ｇ／ｋｇ、７５０ｇ／ｋｇ）のアザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本明細書に記載の有害生物防除剤のいずれかのある量を、魚用飼料、例えば、魚用飼料ペレットまたは魚用飼料薄片の、表面に適用することを含み得る。方法はさらに、魚用飼料の表面に適用された有害生物防除剤をシールするステップを含んでもよい。有害生物防除剤は、有害生物防除剤が被覆された魚用飼料に対して魚油のコートを適用することによりシールされてもよい。有害生物防除剤をシールするのに用いるいずれのシール物質も、有害生物防除剤の被覆のすべてをまたは一部を被覆するように適用されてもよい。
【００９２】
第７の態様では、本発明は、魚における有害生物の感染症および／または外寄生症を治療するまたは予防することにおいて使用するためのアザジラクチンＡを提供する。有害生物の感染症および／または外寄生症は、本明細書に記載の型の外部寄生虫により引き起こされまたはそれが原因となっている。例として、外部寄生虫は、ある種のシラミ（例えば、ウミシラミ）でもよい。
【００９３】
第８の態様では、本発明は、魚における有害生物の感染症および／または外寄生症を治療するまたは予防することにおける使用のためのＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌを提供する。有害生物の感染症および／または外寄生症は、本明細書に記載の型の外部寄生虫により引き起こされまたはそれが原因となっている。例として、外部寄生虫は、ある種のシラミ（例えば、ウミシラミ）でもよい。
【００９４】
第９の態様では、本発明は、魚における有害生物の感染症および／または外寄生症を治療するまたは予防することにおける使用のためのアザジラクチン含有の有害生物防除剤を提供する。有害生物の感染症および／または外寄生症は、本明細書に記載の型の外部寄生虫により引き起こされまたは原因となっている。例として、外部寄生虫は、ある種のシラミ（例えば、ウミシラミ）でもよい。ある実施態様では、本発明は、魚における有害生物の感染症および／または外寄生症を治療するまたは予防することにおける使用のための、ニーム抽出物を含む魚用飼料を提供する。
【００９５】
本発明の第１０の態様では、本発明は、魚における有害生物の感染症および／または外寄生症を治療するまたは予防する方法を提供する。該方法は、それを必要とする魚に、アザジラクチンＡ、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／または本明細書に記載の有害生物防除剤のいずれかのある量を投与することを含む。ある「量」のアザジラクチンおよび／またはＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）は、有害生物の感染症／外寄生症を治療または予防するために有効ないかなる量であり得る。「それを必要とする魚」とは、有害生物の感染症／外寄生症を有するまたはそれを患っているいかなる魚または有害生物に暴露されるおよび／または受けやすいいかなる魚でもよい。有害生物は、外部寄生虫でもよい。外部寄生虫は、ある種のシラミ（例えば、ある種のウミシラミ）でもよい。
【００９６】
用語「有害生物」、「魚」、「アザジラクチン」、「アザジラクチンＡ」、「ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）」、「ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ」、「インドセンダン抽出物」、および「ニーム抽出物」を含む用語の定義は、本明細書の第１の（および他の）態様で使用される場合、上記の第２〜第１０の態様を含む本発明のすべての他の態様の種々の実施形態に適用されると理解されるべきである。従って、本発明の第７、第８および第９の態様に記載の使用のための有害生物防除剤および本発明の第２および第１０の態様の方法は、サケ科に属する魚の有害生物の感染症および／または外寄生症を治療および／または予防することに適用され得る。さらに、本発明の第７、第８および第９の態様に記載の使用のための有害生物防除剤および本発明の第２および第１０の態様の方法は、サケ科に属する魚の外部寄生虫（例えば、サケジラミ）、真菌および／またはアメーバの感染症および／または外寄生症の治療および／または予防に適用し得る。
【００９７】
以下の図面を参照して本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】付着したサケジラミの時間に対する発育の図である。シラミ負荷群ＩＩ−第２日。
【図２】付着したサケジラミの時間に対する発育の図である。治療終了−第６日。
【図３】付着したサケジラミの時間に対する発育の図である。試料１−第１３日。
【図４】付着したサケジラミの時間に対する発育の図である。試料２−第２８日。
【図５】小実験Ａ：第１３日（治療後７日）のシラミの数（すべての期）の図である。
【図６】小実験Ａ：第１３日（治療後７日）のシラミの数（カリムス＞前成虫）の図である。結果は、前成虫に発育しているカリムスの数が、約９２％に減少していることを示している。
【図７】小実験Ａ：第１３日（治療後７日）のシラミの数（前成虫＞成虫）の図である。結果は、成虫に発育している前成虫の数が、わずかに減少していることを示している。
【図８】小実験Ａ：第１３日（治療後７日）のシラミの数（成虫オス対成虫メス）の図である。結果は、成虫メスに発育している前成虫シラミが、約７４％に減少していることを示している。結果はまた、成虫オスに成長しているものにはほとんど影響がなかったことを示している。
【図９】小実験Ａ：第１３日（治療後７日）のシラミの数（妊娠している対妊娠していないメス）の図である。結果は、対照槽中の成虫メスの５７％が卵嚢を有していることおよび治療槽の成虫メスの５％が卵嚢を有していることを示している。このことは、卵嚢の形成において、９８％の減少であることに等しい。
【図１０Ａ】小実験Ａ：第２８日（治療後３週）のシラミの数の図である。第１３日；Ａ：第１３日前成虫および成虫。
【図１０Ｂ】小実験Ａ：第２８日（治療後３週）のシラミの数の図である。Ｂ：第２８日成虫のみ。
【図１１】小実験Ａ：第２８日（治療後３週）のオスシラミの数の図である。オスシラミ（前成虫および成虫のすべてを含む）；対照群では、数は３５％減少。治療群では、数は３０％減少。オスシラミに対しては、有意な影響はなかった。
【図１２】小実験Ａ：第２８日（治療後３週）のメスシラミの数の図である。メスシラミ（前成虫および成虫のすべてを含む）；対照群では、数は４２％減少。治療群では、数は６０％減少。第１３日の治療した魚におけるメスシラミの約３０％が、対照群に比べて、第２８日までにいなくなった。
【図１３】小実験Ａ：第２８日（治療後３週）のシラミ（妊娠している対妊娠していないメス）の数の図である。結果は、対照槽中の成虫メスの６６％が卵嚢を有していたのに対し、対照槽中の成虫メスの１３％が卵嚢を有していた。このことは、卵嚢の形成に対して９８％の減少があったことに等しい。
【図１４】小実験Ｂ第Ｉ部：第１３日（治療後７日）のシラミ（成虫オス対メス）の数の図である。成虫オスまたはメスの数において有意な差はなかった。
【図１５】小実験Ｂ第Ｉ部：第１３日（治療後７日）のシラミ（妊娠している対妊娠していないメス）の数の図である。結果は、対照槽中の成虫メスの９５％が卵嚢を有していたのに対し、対照槽中の成虫メスの３％が卵嚢を有していたことを示す。このことは、卵嚢の形成に対して９３％の減少があったことに等しい。
【図１６】小実験Ｂ第Ｉ部：第２８日（治療後３週）のシラミ（オス）の数の図である。すべてのオスシラミ；対照群では、数は２０％減少。治療群では数は２７％減少。オスの数に対して有意な影響はなかったことを示す。
【図１７】小実験Ｂ第Ｉ部：第２８日（後処理の後３週）のシラミ（メス）の数の図である。すべてのメスシラミ；対照群では、数は４８％減少した。治療群では、数は７７％減少した。差異は、槽間での変動のため統計的に有意ではない。
【図１８】小実験Ｂ：第２８日（治療後３週）のシラミ（妊娠している対妊娠していないメス）の数の図である。結果は、対照槽中の成虫メスの９７％が卵嚢を有するのに対し、対照槽中の成虫メスの７％が卵嚢を有する。このことは、卵嚢の形成に対して９６％の減少があったことに等しい。
【図１９】小実験Ｂ第ＩＩ部：第３６日、負荷後７日、治療後４週の図である。
【図２０】小実験Ｂ第ＩＩ部：第３６日、負荷後７日、治療後４週の図である。結果は、成虫オスまたはメスの数において有意な減少はないことを示している。
【図２１】小実験Ｂ第ＩＩ部：第３６日、負荷後７日、治療後４週の図である。妊娠している対妊娠していないメス；結果は、対照槽中の成虫メスの９４％が卵嚢を有していたのに対し、治療槽中の成虫メスの８８％が卵嚢を有していた。有意な減少はない。
【図２２】小実験Ｂ第ＩＩ部：第５５日、負荷後３週、治療後７週の図である。オス対メス；成虫オスまたはメスの数において有意な減少はない。
【図２３】小実験Ｂ第ＩＩ部：第５５日、負荷後３週、治療後７週の図である。
【図２４】小実験Ｂ第ＩＩ部：第５５日、負荷後３週、治療後７週の図である。妊娠している対妊娠していないメス；結果は、対照槽中の成虫メスの８８％が卵嚢を有していたのに対し、治療槽中の成虫メスの８４％が卵嚢を有していた。有意な減少はない。
【図２５】３５匹のタイセイヨウサケ２槽分を実験的にサケジラミに感染させ、次いで運動性のある成虫オスおよび妊娠している成虫メスの各期へ発育させた実験の結果を示す図である。
【図２６】治療された魚に感染しているメスシラミにおける産卵は著しく減少していたことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００９９】
タイセイヨウサケに感染しているサケジラミに対するＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）の効力の評価
下記は、サケ科におけるサケジラミの感染症／外寄生症に対する、魚用飼料に添加した有害生物防除剤（すなわち、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標））の効果の主たる試験の結果を表す。試験は、承認された研究所において実施され、サケにおけるウミシラミの治療に対するアザジラクチン含有の有害生物防除剤の効力を示す。しかしながら、市場での使用においては、用量、治療時間、および保護の期間は表示のためだけのものであって、これらに限るわけではないが、魚種、淡水での使用か海水での使用か、水温、標的の有害生物、摂食挙動、および環境条件を含む多数の要因により、変化し得る。
【０１００】
目的
以下のように、ウミシラミの異なる生育期に対してＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌの効力を評価する。
１．  妊娠しているシラミの数、産卵および卵の生存率に対する治療的処置の効果
２．  カリムスおよび前成虫シラミの数に対する治療的処置の効果
３．  カリムス期を通じて、コペポディッドの付着と発育に対する前治療の効果
４．  運動性シラミによる再感染に対する前治療の効果
【０１０１】
材料と方法
・  ２つの小実験ＡおよびＢを並行に行った。
・  温度  １２〜１５°Ｃ
・  実験室の培養で産生したサケジラミ
・  実験的な負荷モデルを用いてコペポディッドで感染させた魚
・  シラミを必要な期まで生育させた。
・  任意の給餌により７日間投与した。
・  魚に麻酔をかけるか殺してシラミについて（数および期）検査した。
・  化学的分析のために筋肉をサンプリングした。
【０１０２】
投与
・  ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）２５ｍｇ／ｋｇ／日で７日間を目標とした。
・  アザジラクチンＡ約１０ｍｇ／ｋｇ／日に相当した。
・  生物量の０．５％の給餌率を用いて投与した。
・  ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）５ｇ／ｋｇ飼料（０．５％ｗ／ｗ）を用い、魚油でシールした、上層被覆された試験用飼料。
・  ２〜４回／日、手撒き給餌。
・  実際の取り込みを推定するために、食べられなかった飼料を集めた。
・  前日の食べられなかった飼料を補償するために、毎日、給餌量を調整した。
【０１０３】
小実験Ａ
・  カリムス期および前成虫期に既に感染した魚の治療
・  治療後１および３週間のカリムスおよび前成虫の数に対する効果を評価
・  ウミシラミの産卵および生存率に対する効果を評価
【０１０４】
【表１】
0006427117.tif 000003
【０１０５】
【表２】
0006427117.tif 000004
【０１０６】
小実験Ｂ
・  第Ｉ部：付着した成虫シラミに対する治療的処置の効果を測定した。
・  第ＩＩ部：コペポディッドの着床および発育、運動性シラミの再感染の起こしやすさ、および成虫メスシラミにおける産卵および成育に対する予防的処置の効果を測定した。
【０１０７】
小実験Ｂ：第Ｉ部
・  成虫シラミに対する治療的処置の効果を確立した。
・  一群のシラミに感染した魚
・  シラミを成虫まで成長させ産卵を始めた。
・  魚に対して７日間治療を行った。
・  治療後１および３週間でシラミの数および期（オス、妊娠している／妊娠していないメス）を測定した。
【０１０８】
小実験Ｂ：第ＩＩ部
・  コペポディッドの着床および成虫の再感染に対する治療後３週間での効力を測定した。
・  第Ｉ部からの成虫は除去した。
・  魚に、治療後３週間でコペポディッドおよび成虫シラミを再負荷した。
・  シラミを、７日および３週（治療後４週および７週）後に試料採取した。
【０１０９】
【表３】
0006427117.tif 000005
【０１１０】
【表４】
0006427117.tif 000006
【０１１１】
議論
飼料に添加された活性成分の主要な試験の結果を参照しながら、本発明を詳細に記載する。
【０１１２】
要旨：実験は、それぞれ２０匹のサケを有する６個の槽からなり、３個が対照（“Ａ”）、３個が治療槽（“Ｂ”）である。
【０１１３】
実験槽の魚は、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）で処理された魚用ペレットを、平均でＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）２５ｍｇ／ｋｇ体重／日で７日間受けるように与え、その後、処理されていない魚用飼料を与えられた。対照は処理されていない飼料が与えられた。
【０１１４】
シラミを３回負荷した。第１回（図１〜１３）には、負荷は未成熟のシラミで行い、第２回においては、成虫のみを用いた（図１４〜１８）、第３回の負荷は、治療の３週間後に未成熟のおよび成熟したシラミを用いた（図１９〜２４）。
【０１１５】
第１回の負荷は、発育に対する効果を見ることを意図し、第２回の負荷は、ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）で処理した魚用飼料の成虫シラミ、特にメスの繁殖力への効果を研究し、および最後の負荷は、活性成分の効果の時間に伴う消失を研究することを狙った。
【０１１６】
実験を通じて適当な間隔で、付着したシラミの数を数え、および未成熟のおよび成虫のシラミの数並びにその性を確認した。メスの繁殖力を卵嚢の存在で測定した。図１〜４は、４週間にわたる試験の間にその発育期を通じてシラミの成長を示し、カリムスと前成虫期の混合状態から出発して、２８日後には、成虫のみとなった。
【０１１７】
小実験Ａ：治療後７日の重要な発見
・  対照群に比べて、カリムス（前成虫に至る）の９２％が試験群において除去された。
・  前成虫（成虫に至る）のメスの７４％が除去された。
・  前成虫（成虫に至る）のオスにはほとんど影響がなかった。
・  メスの数の減少および妊娠しているものの割合における減少の結果として、メスシラミにおける産卵は９８％減少した。
・  試験群において形成された卵のうち、孵化し正常に発育するものはほとんどなかった。
【０１１８】
図５は、両方の性の、発育のすべての期の、魚に付着したものの、治療の７日後のシラミの総数を表す。これをオスおよびメスに分解すると、両性とも前成虫期で９２％減少した。成虫シラミの数は、減少してはいるものの、対照群と統計的には差異はない。
【０１１９】
図６は、治療後７日で前成虫へ成長しているカリムス期の数を表す。数字は、前成虫へ発育し得るカリムス期のシラミの数においては、（上記したように）９２％の減少を示す。
【０１２０】
図７は、治療後７日で成虫に成長している前成虫シラミの数を表す。結果は、前成虫期から成虫期へ成長しているオスのシラミに対して活性成分による治療には有意な効果はないことを示すが、メスの成虫シラミでは７６％の有意な減少があった。
【０１２１】
図８は、治療後７日の成虫のオスおよびメスシラミの数を表す。数は上記の知見をまとめて示しており、メスの成虫期への発育はひどく制限を受けていることを強調している。
【０１２２】
図９は、治療後７日の妊娠しているおよび妊娠していないメスの数を表す。対照の魚では、妊娠しているメスの数は、全メスの平均５７％であり、一方本発明の飼料を与えられた魚では、妊娠しているメスの数は、５％に低下した。治療を受けた魚におけるメスシラミの減少した数を考慮に入れると、このことは、卵嚢では９８％の減少を意味する。
【０１２３】
小実験Ａ：治療後３週での重要な発見
・  オスシラミの数には、なお何の影響もなかった。
・  対照群におけるよりも試験群ではより多くのメスシラミが失われていた。
・  産卵は、なお試験群において阻害されていた。
・  試験群において産卵された卵は、正常に発育した。
【０１２４】
図１０は、治療後７日（Ａ）および治療後２１日（Ｂ）のシラミの総数を表す。治療を終了して３週後、ほとんどのシラミが未成熟期にある７日の数とは対照的に、魚の上にはただ成虫のみが存在した。本発明の飼料での治療は、両方の性の生存している成虫の数を８７％減少させた。
【０１２５】
図１１および図１２は、図１０の結果を性によって分解して示す。治療が終わって３週後、成虫オスの数は対照群に比べて６４％減少したが、生存しているメスは、対照群に比べて９０％減少した。
【０１２６】
図１３は、治療後３週の妊娠しているメスの数を示す。本発明の飼料での治療の結果として、メスの総数が９０％減少しただけでなく、生存しているもののうちほとんどすべては妊娠していなかった。対照魚群で６６％に対して１２％である。最終的に、対照魚群は、合計で８８４個の卵嚢を作ったが、治療した魚では、たった１６個の卵嚢を作ったにすぎず、卵嚢の数でみて９８％の減少であった。
【０１２７】
小実験Ｂ第Ｉ部：１３日（治療後７日）における重要な発見
・  成虫オスまたは成虫メスシラミの数において有意な減少はなかった。
・  造られる卵嚢の数で、９３％減少した。
・  産卵された卵は正常に発育した。
【０１２８】
図１４は、成虫シラミのみで侵入させた後、治療後７日のシラミの数を表す。侵入が成虫シラミのみで行われた時、治療後７日でのシラミの有意な死亡率はなかった。このことは、昆虫での研究から予想できたように、活性成分は発育過程を阻害することにおいて主要な効果を有することを示している。
【０１２９】
図１５は、治療後７日の妊娠しているメスの数を表す。対照のメスの９５％が卵嚢を有したのに対して、活性成分で治療を受けたメスのたった３％が妊娠しており、卵嚢の形成において９３％の減少であった。このことは、活性成分含有の餌の抗繁殖性効果は、成熟しているメスに働くことを示している。
【０１３０】
小実験Ｂ第Ｉ部：２８日（治療後３週）での重要な発見
・  成虫オスおよびメスの数に対しては何も有意な効果はなかった。
・  卵を持つメスに対して継続して効果があったが、なお、産卵に対して効果はなかった。
【０１３１】
図１６および図１７は、治療後１３および２８日でのオスおよびメスシラミの数を表す。活性成分含有の餌の結果として成熟しているオスの数について減少はなかった。メスの数において見かけ上の減少はあったが、槽間の差のためそれは統計的に有意ではなかった。
【０１３２】
図１８は、治療後３週のメスシラミの繁殖力を示す。結果は、活性成分含有の餌の効果は、卵嚢の形成における減少が９６％に等しいように、３週後でもなお存在することを示している。
【０１３３】
小実験Ｂ第ＩＩ部：重要な発見
・  付着したカリムスの数に対しては予防的な効果はなかった。（１２〜１５°Ｃでの治療後３週で負荷）
・  成虫（オスまたはメス）の数に対しては予防的な効果はなかった。
・  産卵に対して予防的な効果はなかった。
【０１３４】
図１９、図２０および図２１は、シラミ、オスおよびメスの数および治療後４週での種々の発育期での繁殖力を表す。シラミの負荷は、数える１週前、および活性成分含有の餌を中止後４週で行った。結果は、全身性の活性成分材料の有効性はなくなっていたことを示す。
【０１３５】
図２２は、シラミの負荷後３週、および治療後７週での、成虫シラミ、オスおよびメスの数を表す。結果は、シラミが治療後４〜７週の間において成虫への発育に対して何の制限も受けていなかったことを示し、活性成分の有効量は、魚中に存在していなかったことを確認している。
【０１３６】
図２３および図２４は、シラミ負荷後の３週および治療後７週でのメスシラミの数および繁殖力を表す。試験槽の一つを例外として成虫メスの数またはその繁殖力のいずれにおいても差異はなかった。
【０１３７】
結論
・  魚用飼料を含むＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）での治療は、付着したカリムスの数を、９０％超も減少させることにおいて非常に有効であった。
・  治療は、前成虫の数を減少することにおいて有効であり、より低い程度であるが、オスよりもメスが影響を受けた（前成虫オスで１７％減少および前成虫メスで７６％減少）。
・  成虫シラミの数に対しては効果は小さかった。メスはやや減少したが、オスの数は、治療群および非治療群において同様であった。
・  治療は、妊娠しているメスにおいて産卵を効果的に除去した。治療は、治療を逃れた発育中のシラミにおける産卵を防止した。
【０１３８】
追加のデータ
３５匹のタイセイヨウサケ２槽分を実験的にサケジラミで感染させた。次いで運動性のある成虫オスおよび妊娠している成虫メスの各期へ発育させた。１槽の魚は、ニームベースの製品（ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標））を含む医薬品飼料を用いて、２５ｍｇ／ｋｇ生物量／日で７日間、随時給餌して治療した。もう一つの槽は治療しないで置いた。医薬品飼料はよく消費されているように見えた。試験の魚のいずれにおいても、死亡例も悪作用の兆候もなかった。治療後３週で数えた付着したサケジラミの数は、ニームベースの製品で治療した槽の中の方が有意に低かった（治療槽中の魚あたりシラミ７．８±３匹対対照槽中の魚あたり、シラミ１６．７１±５．８匹）。結果は、図２５に示した。さらに、治療された魚に感染しているメスシラミにおける産卵は著しく減少していた。治療した魚について、合計で１１７匹の成虫メスシラミの中で、たった２匹が卵嚢を有していた（１．７％）。対照槽では、合計で１７７匹の成虫メスシラミが記録されており、そのうち１７３匹が卵嚢を有していた（９７．７％）。結果は、図２６に示されている。
【０１３９】
アザジラクチンＡの特徴
ＣＩＰＡＣ  Ｎｏ．：６２７
ＣＡＳ  Ｎｏ．：１１１４１−１７−６
分子式：Ｃ３５Ｈ４４Ｏ１６
分子量：７２０．７ｇ／ｍｏｌ
水中溶解度（２０°Ｃ）：２．９ｇ／Ｌ
Ｌｏｇ  Ｐｏｗ：０．８５〜０．９５
ＤＴ５０（淡水中）：ｐＨ４．０：５０日
ｐＨ７．０：１９日
ｐＨ８．０：４日
ＤＴ５０（日射下）：１１８分
ＤＴ５０（土中）（２０°Ｃ）：４〜５日ＤＴ５０（海水中）（１６°Ｃ）：８日（ＧＬＰ／ＧＥＰではない）
ＤＴ５０（養魚場沈積物中（Ｓｋｙｅ））：３週（ＧＬＰ／ＧＥＰではない）
（付記）
［１］アザジラクチンを含む魚用飼料。
［２］アザジラクチンＡを含む、上記［１］に記載の魚用飼料。
［３］ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌおよび／またはＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）製剤を含む、上記［１］または［２］に記載の魚用飼料。
［４］機能性アザジラクチン、その変異体、その誘導体および／またはその類縁体を含む、上記［１］から［３］のいずれかに記載の魚用飼料。
［５］ＵＳ４５５６５６２および／またはＵＳ５６９５７６３に記載の方法により入手し得る、アザジラクチンＡの豊富な製剤を含む、上記［１］から［４］のいずれかに記載の魚用飼料。
［６］アザジラクチンが以下のものからなる群から選択される、上記［１］から［５］のいずれかに記載の魚用飼料。
（ｉ）  インドセンダンから抽出されるアザジラクチン
（ｉｉ）  合成的に製造されたアザジラクチン
（ｉｉｉ）  インドセンダンから抽出されるアザジラクチンＡ
（ｉｖ）  合成的に製造されたアザジラクチンＡ
（ｖ）  アザジラクチンＡを濃縮したニーム抽出物
（ｖｉ）  ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ
（ｖｉｉ）  ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）製剤
（ｖｉｉｉ）    Ｖｅｉｔｃｈら、２００７の方法により製造された合成アザジラクチン
（ｉｘ）機能性アザジラクチン、その変異体、その誘導体および／またはその類縁体、並びに
（ｘ）  ＵＳ４５５６５６２および／またはＵＳ５６９５７６３に記載されている方法により入手し得る、アザジラクチンＡの豊富な製剤。
［７］ニーム油を含まない、上記［１］から［６］のいずれかに記載の魚用飼料。
［８］抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス薬、抗真菌剤、抗寄生虫剤、および／または栄養サプリメントからなる群から選択される１種以上の他の成分をさらに含む、上記［１］から［７］のいずれかに記載の魚用飼料。
［９］魚における有害生物の感染症および／または外寄生症を、防除、治療および／または予防することにおける使用のための、上記［１］から［７］のいずれかに記載の魚用飼料。
［１０］有害生物の感染症／外寄生症が、外部寄生虫の感染症／外寄生症である、上記［９］に記載の使用のための、上記［９］に記載の魚用飼料。
［１１］有害生物の感染症／外寄生症が、サケジラミにより引き起こされ、またはそれが原因となっている、上記［９］または［１０］に記載の使用のための、上記［９］または［１０］に記載の魚用飼料。
［１２］コイ科、カワスズメ科、パンガシウス科、ニベ科、ハタ科、アジ科、タイ科、スズキ科、モロネ科、ボラ科、コイ目、アカメ科、カワアナゴ科、ティラピア科、およびサケ科からなる群から選択される１種以上の科に属する魚種のためのものである、上記［１］から［１１］のいずれかに記載の魚用飼料。
［１３］魚における有害生物の感染症／外寄生症を、防除、予防および／または治療する方法であって、それを必要とする魚に対して、上記［１］から［７］のいずれかに記載の魚用飼料の治療量を投与することを含む方法。
［１４］上記［１］から［７］のいずれか一項に記載の魚用飼料および魚における有害生物の感染症／外寄生症を、防除、治療および／または予防することにおける使用のためのアザジラクチンを含む組成物であって、前記飼料が、前記組成物と共に／それと同時に、それの後におよび／またはそれとは別に、投与されることを意図しているものである、魚用飼料および組成物。
［１５］魚における有害生物の感染症／外寄生症を、防除、予防および／または治療する方法であって、前記方法が、それを必要とする魚に対して、アザジラクチンを含む組成物と上記［１］から［６］のいずれかに記載の魚用飼料とを投与することを含み、前記組成物が、前記飼料と共に／それと同時に、それの後におよび／またはそれとは別に、投与されることを意図しているものである、方法。
［１６］上記［１４］に記載の使用または上記［１５］に記載の方法のための、上記［１４］に記載の魚用飼料および組成物であって、前記組成物が、以下のものからなる群から選択されるアザジラクチンを含む、魚用飼料および組成物。
（ｘｉ）  インドセンダンから抽出されるアザジラクチン
（ｘｉｉ）  合成的に製造されたアザジラクチン
（ｘｉｉｉ）  インドセンダンから抽出されるアザジラクチンＡ
（ｘｉｖ）  合成的に製造されたアザジラクチンＡ
（ｘｖ）  アザジラクチンＡを濃縮したニーム抽出物
（ｘｖｉ）  ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ
（ｘｖｉｉ）  ＮｅｅｍＡｚａｌ（登録商標）製剤
（ｘｖｉｉｉ）  Ｖｅｉｔｃｈら、２００７の方法により製造された合成アザジラクチン
（ｘｉｘ）  機能性アザジラクチン、その変異体、その誘導体および／またはその類縁体、並びに
（ｘｘ）  ＵＳ４５５６５６２および／またはＵＳ５６９５７６３に記載されている方法により入手し得る、アザジラクチンＡの豊富な製剤。
［１７］魚に対する有害生物の感染症／外寄生症の治療、防除および／または予防における使用のためのアザジラクチンＡ。
［１８］魚に対する有害生物の感染症／外寄生症の治療、防除および／または予防のための医薬品の製造におけるアザジラクチンＡの使用。
［１９］魚が、コイ科、カワスズメ科、パンガシウス科、ニベ科、ハタ科、アジ科、タイ科、スズキ科、モロネ科、ボラ科、コイ目、アカネ科、カワアナゴ科、ティラピア科、およびサケ科からなる群から選択される１種以上の科に属する１種以上の種である、上記［１７］に記載の使用および上記［１８］に記載の使用のための、上記［１７］に記載のアザジラクチンＡ。
［２０］有害生物の感染症／外寄生症が、外部寄生虫の感染症／外寄生症である、上記［１７］に記載の使用および上記［１８］に記載の使用のための、上記［１７］に記載のアザジラクチンＡ。
［２１］アザジラクチンを含む、魚用飼料サプリメント。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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