(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１に記載のグルコース酸化酵素であって、２つのアミノ酸置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、前記配列番号１におけるＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；Ｖ５６０の群より選択される６つの位置のうちの任意の位置に少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を有するグルコース酸化酵素、または
ｂ）ｂ）のグルコース酸化酵素が２つのアミノ酸置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、前記配列番号１におけるＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；Ｖ５６０の群より選択される６つの位置のうちの任意の位置に少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を有するという条件で、ａ）のグルコース酸化酵素に少なくとも９０％より高いアミノ酸配列同一性を示すグルコース酸化酵素、ただし、
ｂ）のグルコース酸化酵素は、ａ）のグルコース酸化酵素の酵素活性の少なくとも７０％より高い酵素活性を示し、および、ａ）のグルコース酸化酵素のグルコースに対する酵素特異性の少なくとも７０％より高い酵素特異性を示し、かつ
ｂ）のグルコース酸化酵素は、配列番号１のグルコース酸化酵素の、電子受容体としての酸素に対する活性より５倍低下された活性を示す、または配列番号１のグルコース酸化酵素の、酸素以外の電子受容体に対する活性より１．５倍増大された活性を示すか、またはその両方である、
からなる群より選択されるグルコース酸化酵素であって、
前記追加の置換のためのアミノ酸が、
Ｓ５３位におけるＰｈｅ；および／または
Ａ１３７位におけるＬｅｕ；および／または
Ａ１７３位におけるＩｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ；および／または
Ａ３３２位におけるＳｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ；および／または
Ｆ４１４位におけるＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ；および／または
Ｖ５６０位におけるＬｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ
の群より選択される、グルコース酸化酵素。
【請求項２】
前記ｂ）のグルコース酸化酵素が、前記ａ）のグルコース酸化酵素の酵素活性の少なくとも８０％より高い酵素活性を示すグルコース酸化酵素である請求項１記載のグルコース酸化酵素。
【請求項３】
前記ｂ）のグルコース酸化酵素が、前記ａ）のグルコース酸化酵素の酵素活性の少なくとも９０％より高い酵素活性を示すグルコース酸化酵素である請求項１または２記載のグルコース酸化酵素。
【請求項４】
前記ｂ）のグルコース酸化酵素が、前記ａ）のグルコース酸化酵素のグルコースに対する酵素特異性の少なくとも８０％より高い酵素特異性を示すグルコース酸化酵素である請求項１〜３のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項５】
前記ｂ）のグルコース酸化酵素が、前記ａ）のグルコース酸化酵素のグルコースに対する酵素特異性の少なくとも９０％より高い酵素特異性を示すグルコース酸化酵素である請求項１〜４のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項６】
電子受容体としての酸素に対する前記活性が、以下の工程
ａ）７５μＬのサンプル酵素溶液が１００μＬのリン酸バッファー（ｐＨ７）を含む平底９６ウェルマイクロプレートへと移される工程
ｂ）２０μＬの反応混合物が、以下の濃度、０．９１Ｕ／ｍＬ  ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）；２．３ｍＭ  ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））、をもたらすようにそれぞれのウェルへと添加される工程
ｃ）２５μＬのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の３０秒間の１０００ｒｐｍでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
ｄ）ＡＢＴＳの酸化がマイクロプレートリーダーを用いて４１４ｎｍで速度論的に測定される工程
を含むＡＢＴＳアッセイによって測定されており、
酸素以外の電子メディエーターの前記活性が、以下の工程
ａ）７５μＬの酵素溶液が平底９６ウェルマイクロプレートへと移される工程
ｂ）１００μＬのメディエーター溶液（１９．０５ｍＭのＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−ニトロソアニリン）；５％（ｗ／ｗ）ポリビニルピロリドン、ｐＨ７および２０μＬの２５ｍＭ  りんモリブデン酸が添加される工程
ｃ）２５μＬのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の１分間の１０００ｒｐｍでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
ｄ）りんモリブデン酸還元の反応速度がマイクロプレートリーダーを用いて７００ｎｍでモニターされる工程
を含むメディエーターアッセイによって測定される請求項１〜５のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項７】
前記酸素以外の電子メディエーターが、ニトロソアニリンおよびその誘導体、アゾ化合物、フェナジンおよびその誘導体、フェノチアジンおよびその誘導体、フェノキサジンおよびその誘導体、フェロセンおよびその誘導体、フェリシアン化カリウム、Ｒｕ−およびＯＳ−錯体、キノンおよびその誘導体、インドールフェノール、ビオロゲン、テトラチアフルバレンおよびその誘導体、ならびに、フタロシアニンを含む群より選択される請求項１〜６のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項８】
配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、配列番号１に記載のＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０の群より選択される６つの位置のうちの任意の位置に、追加の、２つのアミノ酸置換を有する請求項１〜７のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項９】
配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、配列番号１に記載のＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０の群より選択される６つの位置のうちの任意の位置に、追加の、３つのアミノ酸置換を有する請求項１〜７のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項１０】
配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、配列番号１に記載のＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０の群より選択される６つの位置のうちの任意の位置に、追加の、４つのアミノ酸置換を有する請求項１〜７のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項１１】
配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、配列番号１に記載のＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０の群より選択される６つの位置のうちの任意の位置に、追加の、５つのアミノ酸置換を有する請求項１〜７のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項１２】
配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、配列番号１に記載のＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０の群より選択される６つの位置のうちの任意の位置に、追加の、６つのアミノ酸置換を有する請求項１〜７のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項１３】
配列番号１に記載の前記Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖの置換に加えて、Ｆ４１４および／またはＶ５６０の位置における少なくとも１つの追加のアミノ酸置換が、Ａ１３７および／またはＡ１７３および／またはＡ３３２の位置における少なくとも１つのアミノ酸置換と組み合わせられている請求項１〜１２のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項１４】
前記Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖの置換に加えて、配列番号４に記載のＡ１７３Ｉ；Ａ３３２Ｓ；およびＦ４１４Ｌの前記追加のアミノ酸置換を有する請求項１〜１３のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項１５】
前記Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖの置換に加えて、配列番号３に記載のＡ１７３Ｖ；Ａ３３２Ｓ；Ｆ４１４Ｉ；およびＶ５６０Ｔの前記追加のアミノ酸置換を有する請求項１〜１４のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項１６】
前記Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖの置換に加えて、配列番号６に記載のＡ１７３Ｖ；Ａ３３２Ｎ；Ｆ４１４Ｖ；およびＶ５６０Ｌの前記追加のアミノ酸置換を有する請求項１〜１５のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項１７】
以下の工程
ａ）７５μＬの酵素溶液が平底９６ウェルマイクロプレートへと移される工程
ｂ）１００μＬのメディエーター溶液（１９．０５ｍＭのＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−ニトロソアニリン）；５％（ｗ／ｗ）ポリビニルピロリドン、ｐＨ７および２０μＬの２５ｍＭ  りんモリブデン酸が添加される工程
ｃ）２５μＬのそれぞれの糖である基質溶液を添加することおよびその後の１分間の１０００ｒｐｍでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
ｄ）りんモリブデン酸還元の反応速度がマイクロプレートリーダーを用いて７００ｎｍでモニターされる工程
を含むメディエーターアッセイによって測定される場合に、少なくとも９９．９％のグルコース特異性および／または４％未満のガラクトース特異性および／または０．３％未満のマルトース特異性および／または６％未満のキシロース特異性および／または０．１％未満のマルトトリオース特異性を示す請求項１〜１６のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項１８】
以下の工程
ａ）７５μＬの酵素溶液が平底９６ウェルマイクロプレートへと移される工程
ｂ）１００μＬのメディエーター溶液（１９．０５ｍＭのＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−ニトロソアニリン）；５％（ｗ／ｗ）ポリビニルピロリドン、ｐＨ７および２０μＬの２５ｍＭ  りんモリブデン酸が添加される工程
ｃ）２５μＬのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の１分間の１０００ｒｐｍでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
ｄ）りんモリブデン酸還元の反応速度がマイクロプレートリーダーを用いて７００ｎｍでモニターされる工程
を含むメディエーターアッセイによる配列番号１のＧＯｘのニトロソアニリンメディエーター活性と比較して、４００％より大きい電子移動のためのニトロソアニリンメディエーターに対する活性を示し、かつ
以下の工程
ａ）７５μＬのサンプル酵素溶液が１００μＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７）を含む平底９６ウェルマイクロプレートへと移される工程
ｂ）２０μＬの反応混合物が、以下の濃度、０．９１Ｕ／ｍＬ  ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）；２．３ｍＭ  ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））、をもたらすようにそれぞれのウェルへと添加される工程
ｃ）２５μＬのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の３０秒間の１０００ｒｐｍでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
ｄ）ＡＢＴＳの酸化がマイクロプレートリーダーを用いて４１４ｎｍで速度論的に測定される工程
を含むＡＢＴＳアッセイによる配列番号１のＧＯｘの酸素活性と比較して、３０％以下の酸素活性を示す請求項１〜１７のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項１９】
前記メディエーターアッセイによる配列番号１のＧＯｘのニトロソアニリンメディエーター活性と比較して、５００％より大きい電子移動のためのニトロソアニリンメディエーターに対する活性を示す請求項１〜１８のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項２０】
前記メディエーターアッセイによる配列番号１のＧＯｘのニトロソアニリンメディエーター活性と比較して、６００％より大きい電子移動のためのニトロソアニリンメディエーターに対する活性を示す請求項１〜１９のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項２１】
前記ＡＢＴＳアッセイによる配列番号１のＧＯｘの酸素活性と比較して、２５％未満の酸素活性を示す請求項１〜２０のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項２２】
前記ＡＢＴＳアッセイによる配列番号１のＧＯｘの酸素活性と比較して、２０％未満の酸素活性を示す請求項１〜２１のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項２３】
前記ＡＢＴＳアッセイによる配列番号１のＧＯｘの酸素活性と比較して、１５％未満の酸素活性を示す請求項１〜２２のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項２４】
前記ＡＢＴＳアッセイによる配列番号１のＧＯｘの酸素活性と比較して、１０％以下の酸素活性を示す請求項１〜２３のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素をエンコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素によってエクスビボサンプルにおいてグルコースを検出する、決定する、または測定するための方法であって、前記検出、決定または測定が、エクスビボサンプルを前記グルコース酸化酵素に接触させることを含む方法。
【請求項２７】
グルコースの前記検出、決定または測定が、センサーまたはテストストリップ装置を使用して行われる請求項２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規グルコース酸化酵素変異体に関する。本明細書において提供されるグルコース酸化酵素は、基質グルコースに特異的であり、そして、これにより、顕著に低下した酸素消費速度を示す。別の態様において、本発明は、基質グルコースに特異的であり、そして、これにより、顕著に低下した酸素消費速度および／または酸素以外の電子メディエーターに対する増大した酵素活性を示すグルコース酸化酵素を提供する。さらに、本発明は、グルコースの測定のためのキットおよびセンサーにおける使用のための前記グルコース酸化酵素に関する。
【０００２】
特には、本発明は、配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、追加で、Ｓ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０の群より選択される６つの位置のうちの任意の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）由来のグルコース酸化酵素に関する。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病は、世界中に広く見られ得る代謝性疾患である。糖尿病患者は、血糖のレベルを制御するインシュリンホルモンの産生が損なわれている、または産生が失なわれており、したがって、これら患者には、高血糖のリスクと同時に不適切なインシュリン適用の場合の低血糖のリスクがある（非特許文献１）。
【０００４】
高度に特異的であり、正確、かつ取扱いが容易なグルコース測定システムの正確な適用を確実なものとするには、自己測定システムおよび臨床スケールでのハイスループットな測定システムの両方が必要である。
【０００５】
血液中のグルコース濃度の適切な測定を可能とするためおよび測定を高度に特異的なものとするため、酵素的反応が関与している。今日まで、糖尿病分析において使用されている２種類の酵素として、グルコース脱水素酵素（以下「ＧＤＨ（ｓ）」）およびグルコース酸化酵素（以下「ＧＯｘ（ｓ）」）が示されている（非特許文献２）。
【０００６】
ＧＤＨｓの主たる利点は、その酸素−非依存的グルコース酸化であるが、酵素はある種の他の臨床上関連する糖に対するわずかな副活性（side-acrivities）を示し、そしてこのため、ＧＤＨは非特異的である（非特許文献３）。これとは対照的に、ＧＯｘｓは、グルコースに高度に特異的であるが、しかしながら、その酸化は、強い酸素依存性を示す（非特許文献４、非特許文献５）。
【０００７】
より詳細には、フラビンタンパク質としてのＧＯｘｓは、酸化還元酵素のファミリー（すなわち、β−Ｄ−グルコース：酸素  １−酸化還元酵素）に属する。天然または野生型（以下、「ＷＴ」）のＧＯｘｓは、電子受容体として酸素分子を用いることによるβ−Ｄ−グルコースのＤ−グルコノ−δ−ラクトンおよびＨ2Ｏ2への酸化を触媒する（例えば、非特許文献６などを参照のこと）。前記反応は、以下の式：
Ｄ−グルコース＋Ｏ2→グルコノラクトン＋Ｈ2Ｏ2
によって表される。
【０００８】
ＧＯｘｓの基質は、２つの群に分けられ得る。すなわち、ｉ）酸化的半反応の電子受容体、およびii）還元的半反応の電子供与体、例えば、非特許文献７などを参照のこと。当業者であれば、Ｄ−グルコースの他に、Ｄ−グルコースの様々な誘導体がＧＯｘｓの還元的半反応における潜在的な基質であることを認識する。
【０００９】
種々の起源からのＧＯｘｓがこれまでに開示されてきている。例えば、海藻ヤハズツノマタ（chondrus crispus）由来のＧＯｘが特許文献１および特許文献２に記載されており、糸状菌クラドスポリウム（Cladosporium）種由来のＧＯｘが特許文献３および特許文献４に記載されており、そして、タラロマイセス  フラバス（Talaromyces flavus）由来のＧＯｘが特許文献５に記載されている。
【００１０】
文献において最もよく記載されているＧＯｘは、アスペルギルス  ニガー由来のものである（非特許文献８、非特許文献９）。
【００１１】
特許文献６は、組換えシステムにおけるアスペルギルス  ニガー由来のＧＯｘｓの産生を記載しており、そして特許文献７は、向上された保管安定性をもたらす組成物中に処方されているアスペルギルス  ニガーから得られたＧＯｘに関する。
【００１２】
それは大きさが１６０ｋＤａである二量体を形成する特性が良く明らかにされているタンパク質であり、そして、その結晶構造は解析されている（非特許文献１０）。
【００１３】
さらに、特にアスペルギルス  ニガーの野生型のＧＯｘ（以下、「ＧＯｘ−ＷＴ」）が、顕著な温度安定性および基質グルコースへの特異性を示すことが知られている。ＧＯｘは高マンノース型糖鎖の含有量が１０〜１６％である糖タンパク質である（非特許文献１１、非特許文献１２）。
【００１４】
今日では、ＧＯｘｓは、工業用溶液中または被験者の体液中、例えば血液および尿中などのグルコースの検出のためのバイオセンサーにおいて一般に使用されている。
【００１５】
現在入手可能な自己測定装置の大部分は、原則的に
ａ）生物化学的成分、すなわち基質としてグルコースを有する各酵素、
ｂ）インジケーター（電子的成分）、および
ｃ）シグナル変換子
からなる電気化学的センサーである。
【００１６】
測定装置において、グルコースからの電子は、生物学的成分によって、（ａ）電極へと、（ｂ）メディエーターを介して、移動される。シグナル変換子が、（ｃ）その後、電気的信号を、移動された電子の量に比例しているリアルタイムのグルコース濃度へと変換する。
【００１７】
前述の電気化学的センサー以外に、測光センサーもまた使用され得る。ここでの違いは、グルコースからの電子が酸化還元インジケーター色素（インジケーターとして作用する）へと移動されていることである。還元された色素の結果として生じる色の変化が測光法で測定される。
【００１８】
他の主たる応用は、血流からのグルコースを燃焼そしてそれによって微小な診断装置またはポンプを動力で動かす埋め込まれたおよび微小化されたバイオ燃料セルの陽極コンパートメント中におけるＧＯｘｓの使用であり得る。
【００１９】
さらに、食品産業におけるＧＯｘの応用は、抗菌効果を有する過酸化水素を産生するその能力が、ある種の食品製品、例えばチーズ、バターおよびフルーツジュースなどの保管安定性を改良するために使用され得るため、多数存在する。
【００２０】
化粧用組成物中でのＧＯｘｓの応用もまた、抗菌特性を利用し得る。医薬組成物および化粧用組成物におけるヘキソースオキシダーゼの使用の可能性が、例えば特許文献２、特許文献８および特許文献９に提案された。
【００２１】
さらに、ＧＯｘの使用は、害虫または病気へのより低下された感受性または増加された抵抗性を有する遺伝子組換えの植物および他の生物の産生において提案されている（特許文献１０参照のこと）。
【００２２】
しかしながら、グルコースバイオセンサーにおけるＧＯｘｓの使用は、本発明によれば、非常に興味深いものである。この点について、特許文献１１は、金属表面へのその付着性について改良された遺伝子組換えのＧＯｘ変異体を含むグルコースセンサーを開示している。
【００２３】
Ｚｈｕらは、２００６および２００７年に、Ｔ３０Ｖおよび／またはＩ９４Ｖで突然変異されているアスペルギルス  ニガー由来のＧＯｘの突然変異体を開示した。そして、対応する二重変異体Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖもまた開示されている（非特許文献１３、非特許文献１４）（以下、「Ｚｈｕら、２００６／２００７」）。
【００２４】
特には、Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖの置換を有する前述の二重変異体は、ＧＯｘ−ＷＴと比較して、酵素活性においてわずかに増大（ｋcatが６９．５／ｓから１３７．７／ｓへ）しており、５８℃〜６２℃の範囲における増大された熱安定性、および、８〜１１の範囲における向上されたｐＨ安定性を示す。しかしながら、アスペルギルス  ニガー由来の前記二重変異体は、ＧＯｘ−ＷＴと比較して等しい酸素消費速度を示す。
【００２５】
特許文献１２は、ＧＯｘ活性を有するが以下のアミノ酸位置、２、１３、３０、９４および１５２位の少なくとも３つの位置で突然変異されている核酸分子およびそのポリペプチドを記載する。特に、特許文献１２に記載の、Ｎ２Ｙ、Ｋ１３Ｅ、Ｔ３０Ｖ、Ｉ９４Ｖ、およびＫ１５２Ｒの置換を有するＭ１２変異体は、サッカロミセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）における増加された発現レベルに加えて、電子受容体としての酸素に対する２倍に増大された活性を示している。
【００２６】
Ｈｏｒａｇｕｃｈｉら（非特許文献１５）は、２０１２年に、ペニシリウム  アマガサキエンス（Penicillium amagasakiense）のＧＯｘおよびアスペルギルス  ニガーのＧＯｘ変異体である、そこで記載されているＧＯｘ変異体の酸化的半反応に関与している１つのアミノ酸残基の位置を同定した。その一つの位置は、ペニシリウム  アマガサキエンスＧＯｘ変異体のＳ１１４であり、および、アスペルギルス  ニガー変異体の対応するＴ１１０である。両方の位置が、電子受容体としての酸素に対する活性における低下をもたらすアミノ酸アラニンによって置換された。例えば、アスペルギルス  ニガーのＧＯｘ変異体は、６．６倍の低下した酸素消費を示し、そして、これゆえ、３６３％のメディエーター活性に加えて、３０．４％の低下した酸素活性を有していた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２７】
【特許文献１】米国特許第７，５４４，７９５号明細書
【特許文献２】米国特許第６，９２４，３６６号明細書
【特許文献３】国際公開第９５／２９９９６号
【特許文献４】国際公開第１９９８／０２０１３６号
【特許文献５】米国特許第６，０５４，３１８号明細書
【特許文献６】国際公開第８９／１２６６７５号
【特許文献７】国際公開第２００８／０７９２２７号
【特許文献８】米国特許第６，２５１，６２６号明細書
【特許文献９】国際公開第２００７／０４５２５１号
【特許文献１０】国際公開第１９９５／０２１９２４号
【特許文献１１】国際公開第２００９／１０４８３６号
【特許文献１２】欧州特許出願公開第２４１５８６３号明細書
【非特許文献】
【００２８】
【非特許文献１】Definition and diagnosis of diabetes mellitus and intermediate hyperglycaemia, WHO, and IDF (2006); WHO Document Production service ISBN 9241594934
【非特許文献２】Hoenes, J., Mueller, P., and Surridge, N. (2008). The Technology Behind Glucose Meters: Test Strips. DIABETES TECHNOLOGY & THERAPEUTICS 10, 10-26
【非特許文献３】Olsthoorn, A.J., and Duine, J.A. (1998). On the mechanism and specificity of soluble, quinoprotein glucose dehydrogenase in the oxidation of aldose sugars. Biochemistry 37, 13854-13861
【非特許文献４】Bankar, S.B., Bule, M.V., Singhal, R.S., and Ananthanarayan, L. (2009). Glucose oxidase -- an overview. Biotechnology Advances 27, 489-501
【非特許文献５】Bentley, R., and Neuberger, A. (1949). The mechanism of the action of notation. Biochem J 45, 584-590
【非特許文献６】Pazur, J.H., and Kleppe, K. (1964). The Oxidation of Glucose and Related Compounds by Glucose Oxidase from Aspergillus Niger. Biochemistry 3, 578-583
【非特許文献７】Leskovac, V., Trivic, S., Wohlfahrt, G., Kandrac, J., and Pericin, D. (2005). Glucose oxidase from Aspergillus niger: the mechanism of action with molecular oxygen, quinones, and one-electron acceptors. Int J Biochem Cell Biol 37, 731-750
【非特許文献８】Hecht, H.J., Schomburg, D., Kalisz, H., and Schmid, R.D. (1993). The 3D structure of glucose oxidase from Aspergillus niger. Implications for the use of GOD as a biosensor enzyme. Biosensors & Bioelectronics 8, 197-203
【非特許文献９】Wohlfahrt, G., Witt, S., Hendle, J., Schomburg, D., Kalisz, H.M., and Hecht, H.J. (1999). 1.8 and 1.9 A resolution structures of the Penicillium amagasakiense and Aspergillus niger glucose oxidases as a basis for modelling substrate complexes. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 55, 969-977
【非特許文献１０】Hecht, H.J., et al., Crystal-Structure Of Glucose-Oxidase From Aspergillus-Niger Refined At 2.3 Angstrom Resolution. Journal Of Molecular Biology, 1993. 229(1): p. 153-172
【非特許文献１１】Hayashi, S., and Nakamura, S. (1981). Multiple forms of glucose oxidase with different carbohydrate compositions. Biochim Biophys Acta 657, 40-51
【非特許文献１２】Pazur, J.H., Kleppe, K., and Cepure, A. (1965). A glycoprotein structure for glucose oxidase from Aspergillus niger. Arch Biochem Biophys 111, 351-357
【非特許文献１３】Zhu, Z., Momeu, C., Zakhartsev, M., and Schwaneberg, U. (2006). Making glucose oxidase fit for biofuel cell applications by directed protein evolution. Biosensors and Bioelectronics 21, 2046-2051
【非特許文献１４】Zhu, Z., Wang, M., Gautam, A., Nazor, J., Momeu, C., R, P., and U, S. (2007). Directed evolution of glucose oxidase from Aspergillus niger for ferrocenemethanol-mediated electron transfer. Biotechnology Journal 2, 241-248
【非特許文献１５】Horaguchi, Y., Saito, S., Ferri, S., Mori, K., Kojima, K., Tsugawa, W., and Sode, K. (2012). Turning Glucose Oxidase into Essentially Dehydrogenase. Meet. Abstr., Volume MA2012-02, Issue 18, Pages 2057
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
グルコースに非特異的であるＧＤＨｓおよび酸素依存性ＧＯｘｓは、現在のグルコース測定システムのカギとなる酵素である。
【００３０】
本発明の開示における意味において、「グルコースに非特異的（unspecific for glucose）」、「酸素依存度（oxygen-dependent）」および「酸素依存性（oxygen-dependency）」という表現は、定義の項において規定される意味を有する。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明の根底にある課題に対する解法は、特に修飾されそしてそれゆえ最適化された、真菌アスペルギルス  ニガー由来のＧＯｘ変異体を提供することである。
【発明の効果】
【００３２】
驚くべきことに、および予期せぬことに、本発明者らは、グルコースに特異的であるが、グルコース酸化のための酸素には非依存性であり、したがってグルコース測定においてより正確であるアスペルギルス  ニガー由来の新規ＧＯｘ変異体を発見した。
【００３３】
さらに、本発明は、驚くべきことに、および予期せぬことに、グルコースに特異的であり、したがって、顕著に低減された酸素消費速度および／または酸素以外の電子メディエーターに対する顕著に増加されたメディエーター活性を示す、新規ＧＯｘ変異体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本明細書で提供されるＧＯｘ変異体における、酸素に対する活性の測定の原理を示す図である。ＧＯｘの還元的半反応のあいだに産生されるＨ2Ｏ2およびＨＲＰが発色剤ＡＢＴＳを酸化するために使用される。ＡＢＴＳの色の変化が４１４ｎｍでの吸収によってモニターされる。この原則は、材料および方法の段落のｇｇ）の項において記載されるＡＢＴＳアッセイの原則を形成する。
【図２】媒介された電子移動を検出するためのメディエーターアッセイまたはＰＭＯアッセイ（りんモリブデン酸）を示す図である。メディエーター化合物はＧＯｘの還元的半反応のあいだ２段階で還元される。メディエーターは酸化還元インジケーターＰＭＯに２電子を移動し、そして、ＰＭＯはその後還元される。還元のあいだのＰＭＯの色の変化が７００ｎｍでの吸収によってモニターされる。
【図３】本発明によるタンパク質構造中の、アミノ酸置換のための６つの位置の明確な場所を示す図である。
【図４ａ】本発明による種々のＧＯｘ変異体の酸素消費速度を示す図である。ａ）時間の関数としての相対的酸素濃度の進行。アッセイの実施材料および方法の段落のｈｈ）の項において記載される。酵素は２Ｕ／Ｌに標準化された。
【図４ｂ】本発明による種々のＧＯｘ変異体の酸素消費速度を示す図である。ｂ）１分あたりの相対的酸素消費速度。アッセイの実施材料および方法の段落のｈｈ）の項において記載される。酵素は２Ｕ／Ｌに標準化された。
【図５】本発明による種々のＧＯｘ変異体のミカエリス−メンテン速度論を示す図である。活性の測定のために、特性評価のためのメディエーターアッセイが材料および方法の段落のｆｆ）の項において説明されるように適用された。点線は、最小二乗法を適用するマイクロソフトエクセルで計算された。
【図６】本発明による種々のＧＯｘ変異体の温度安定性特性を示す図である。アッセイは、材料および方法の段落のｉｉ）の項において説明されるように実施された。追加のコントロールとして、脱グリコシル化されたおよび過度にグリコシル化されたＧＯｘが使用された。
【図７】ＧＯｘ−ＷＴ、ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖ、および本発明のＧＯｘ変異体Ｖ（すなわち、Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖの置換に加えた、Ａ１７３Ｖ；Ａ３３２Ｓ；Ｆ４１４Ｉ；Ｖ５６０Ｔ）の相対的酸素消費速度を示す図である。アッセイの実施は、材料および方法の段落のｈｈ）の項において記載される。酵素濃度は１．７ｍｇ／Ｌに標準化された。
【図８】グルコースと比較した異なる糖に対する、ＧＯｘ−ＷＴ、ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４ＶおよびＧＯｘ変異体ＥＺ０７の残余活性を示す図である。残余活性の測定のため、特性評価のためのメディエーターアッセイが材料および方法の段落のｆｆ）の項において記載されるように適用された。基質濃度は、反応混合物中１８１．８ｍＭであった。
【図９】ＧＯｘ−ＷＴ、ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４ＶおよびＧＯｘ変異体ＥＺ０７に関する酵素パラメータを示す図である。パラメータはマイクロソフトエクセルにおける最小二乗法を適用しているミカエリス−メンテンにしたがって計算された。活性測定のため、特性評価のためのメディエーターアッセイが材料および方法の段落のｆｆ）の項において記載されるように適用された。
【図１０】２５℃〜６７℃のあいだの種々の温度において１５分間インキュベーションした後の、ＧＯｘ−ＷＴ、ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４ＶおよびＧＯｘ変異体ＥＺ０７の残余活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の主題は、配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、追加で、Ｓ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０の群より選択される６つの位置のうちの任意の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を有する新規ＧＯｘ変異体である。
【００３６】
本開示の意味において、「グルコースに対する酵素特異性（enzyme specificity for glucose）」または「グルコースに特異的（specific for glucose）」との表現は、本明細書において提供されるＧＯｘｓの基質グルコースに対する活性が、材料および方法の段落のｆｆ）の項において記載されるメディエーターアッセイによって決定される場合に、９９．５％より大きい、または９９．９％より大きいこと、特には、１００％であることを示す。これは暗に、グルコース以外の糖、例えばガラクトース、マルトース、キシロース、およびマルトトリオースなどに対する本明細書で提供されるＧＯｘｓの残余活性が、材料および方法の段落のｆｆ）の項において記載されるメディエーターアッセイによって決定される場合に、６％より小さいことを示している。
【００３７】
本発明の開示の意味において、「顕著に低減された酸素消費速度（significantly reduced oxygen-consumption rates）」との表現は、本明細書において提供されるＧＯｘｓ変異体において、酸素依存性が、材料および方法の段落のｇｇ）の項において記載されるＡＢＴＳアッセイにしたがって発色剤ＡＢＴＳの酸化によって間接的に測定される場合に、３分間で残存酸素含有量が９５％より大きいことを示す。
【００３８】
本発明の開示の意味において、「顕著に低減された酸素活性（significantly reduced oxygen activity）」または「電子受容体としての酸素に対する顕著に低減された活性（significantly reduced activity for oxygen as electron acceptor）」との表現は、材料および方法の段落のｇｇ）の項において記載されるＡＢＴＳアッセイによって決定される場合の残余の酸素活性が、３０％以下、または２５％より小さい、または２０％より小さい、特には１５％より小さい、または１０％以下であることによって特徴付けられるＧＯｘ活性を示す。
【００３９】
本発明の開示の意味において、「顕著に増大されたメディエーター活性（significantly increased mediator activity）」または「酸素以外の電子メディエーターに対する顕著に増大された活性（significantly increased activity for electron mediators other than oxygen）」との表現は、材料および方法の段落のｆｆ）の項において記載されるメディエーターアッセイによって測定される場合に、配列番号１に記載されるグルコース酸化酵素の酸素以外の電子メディエーターに対する活性の少なくとも１．５倍の、増大した活性によって特徴付けられるＧＯｘ活性を示す。
【００４０】
本発明のこのように最適化されたＧＯｘ変異体は、改良された血糖測定システムに組み入れられることに適している。
【００４１】
発明の概要
驚くべきことに、および予期せぬことに、本発明者らは、Ｚｈｕら（２００６、２００７）において記載されたＧＯｘの二重突然変異体Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖ（以下、「ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖ」と略される）が、基質グルコースに対する特異性を維持しながら、顕著に低減されたオキシダーゼ活性および同時に顕著に増大されたデヒドロゲナーゼ活性を有する酸素非依存性のＧＯｘ変異体を得るためのさらなる特異的アミノ酸置換（または複数の置換）の基礎として適切であることを発見した。さらに、本発明者らは、本発明にしたがい、追加でまたは単独で酸素以外の電子メディエーターに対する顕著に増大されたメディエーター活性を示すＧＯｘ変異体を発見した。この意味において、本発明者らはまた、本発明にしたがい、電子移動のための酸素以外の特定の電子メディエーターを受容するＧＯｘ変異体を発見した。したがって、本発明によるＧＯｘ変異体は、改良されたグルコース測定、とりわけ、改良された血糖測定に適切である。
【００４２】
本開示の意味において、「電子移動のための酸素以外の特定の電子メディエーターを受容する（accept certain electron mediators other than oxygen for electron transfer）」との表現は、本明細書において提供されるＧＯｘの、ニトロソアニリンおよびその誘導体、アゾ化合物、フェナジンおよびその誘導体、フェノチアジンおよびその誘導体、フェノキサジンおよびその誘導体、フェロセンおよびその誘導体、フェリシアン化カリウム、Ｒｕ−およびＯＳ−錯体、キノンおよびその誘導体、インドールフェノール、ビオロゲン、テトラチアフルバレンおよびその誘導体、ならびに、フタロシアニンを含む群より選択される、媒介される電子移動のためのメディエーターと相互作用し、そして受容する能力を示す。
【００４３】
本発明は、配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、追加で、Ｓ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０の群より選択される６つの位置のうちの任意の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアスペルギルス  ニガー由来のＧＯｘ変異体に関する。
【００４４】
別の態様において、本発明は、配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、追加で、Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０の群より選択される４の位置のうちの任意の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアスペルギルス  ニガー由来のＧＯｘ変異体に関する。
【００４５】
さらなる態様において、本発明は、配列番号１に記載のＧＯｘのＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０の群より選択される６つの位置のうちの任意の位置に、少なくとも２つ、または３つ、または４つ、または５つ、またはさらに６つの協同的な、そしてしたがって種々のアミノ酸置換を有し、これによって酸素消費速度における顕著な低下がもたらされているＧＯｘ変異体に関する。
【００４６】
さらに、本発明は、配列番号１に記載のＧＯｘのＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０の群より選択される６つの位置のうちの任意の位置に、少なくとも２つ、または３つ、または４つ、または５つ、またはさらに６つの協同的な、そしてしたがって種々のアミノ酸置換を有し、これによって酸素消費速度における顕著な低下および／または酸素以外の特定の電子メディエーターに対するメディエーター活性における顕著な増加がもたらされているＧＯｘ変異体に関する。
【００４７】
これにより、本発明の発明者らは、ＧＯｘ−ＷＴおよび配列番号１に記載のＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖと比較してそのオキシダーゼ活性が顕著に低下されており、一方、同時に、酵素のデヒドロゲナーゼ活性は、ＧＯｘ−ＷＴおよびＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖと比較して顕著に増大されているＧＯｘ変異体を提供することが可能となった。
【００４８】
この意味において、さらに、Ｆ４１４およびＶ５６０位における特異的なアミノ酸置換が、材料および方法の段落のｇｇ）の項において記載されるＡＢＴＳアッセイにおいて、ＧＯｘ−ＷＴおよびＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖと比較した場合に、本明細書において提供されるＧＯｘ変異体の酸素消費速度を顕著に低下させることは予期できない、および驚くべき発見である。前記置換のために適切なアミノ酸は、残りの全ての１９個のタンパク質を構成するアミノ酸である、特には、適切なアミノ酸は、Ｆ４１４位に関して、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＶａ、ならびに、Ｖ５６０位に関して、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、およびＶａｌである。
【００４９】
他の予期せぬおよび驚くべき発見として、本明細書において提供されるＧＯｘ変異体において、Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖの２つの置換に加えて、Ｆ４１４およびＶ５６０位の両方における組み合わされた特異的なアミノ酸置換が、ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖと比較した場合に、酸素以外の電子メディエーターに対するメディエーター活性を顕著に増大させる。前記置換のために適切なアミノ酸は、残りの全ての１９個のタンパク質を構成するアミノ酸である、特には、適切なアミノ酸は、Ｆ４１４位に関して、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＶａｌ、ならびに、Ｖ５６０位に関して、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＶａｌである。
【００５０】
さらなる発見として、本発明は、本明細書において提供されるＧＯｘ変異体において２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、Ａ１７３位およびＡ３３２位のそれぞれが、ＧＯｘ−ＷＴおよびＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖと比較した場合に、ＧＯｘ活性における増大を一般的に導くことを明らかにしている。前記置換のために適切なアミノ酸は、残りの全ての１９個のタンパク質を構成するアミノ酸である、特には、適切なアミノ酸は、Ａ１７３位に関して、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、およびＶａ、ならびに、Ａ３３２位に関して、ＳｅｒおよびＡｓｎである。
【００５１】
したがって、本発明は、当業者が、顕著に低下された酸素消費速度を有するＧＯｘ変異体を取得することを可能にする。
【００５２】
加えて、本発明は、当業者が、特異的なアミノ酸置換（または複数の置換）を介して、顕著に低下された酸素消費速度および／または酸素以外の特定の電子メディエーターに対する顕著に増大されたメディエーター活性を、個々に、または両方の特徴を組み合わせて有するＧＯｘ変異体を、取得することを可能にする。
【００５３】
発明の詳細な説明
糖尿病患者は、毎日の生活のなかで正確な血糖測定を必要とする。科学的背景の項に概説されているように、既存の酵素的測定システムは、酸素依存性ＧＯｘｓおよびグルコースに非特異的なＧＤＨｓに基づいている。
【００５４】
アスペルギルス  ニガー由来のＧＯｘ−ＷＴにおいて、オキシダーゼ活性は、そのデヒドロゲナーゼ活性と比較して約３〜４倍高い。したがって、溶解された酸素が血糖アッセイシステム中に存在している場合、基質グルコースの酸化のあいだに産生される電子は酸素へも移動されるであろう。したがって、電子メディエーターの存在下で測定された酵素活性は、溶存酸素濃度によって影響を受けるかもしれない。しかしながら、アスペルギルス  ニガー由来のＧＯｘ−ＷＴは、グルコースに特異的であり、および、十分な温度安定性を示す。
【００５５】
これとは対照的に、ＧＤＨ（ｓ）は、血液サンプル中に溶解されている酸素に抵抗性であるが、グルコースに対して十分に特異的ではなく、したがって、血液サンプル中に存在する他の糖タイプ、例えばマルトース、ガラクトース、キシロース、およびマルトトリオースによっても影響を受ける可能性がある。
【００５６】
ＧＯｘｓに基づく血糖測定のあいだの溶存酸素の影響を、その有利な特性を維持したままおよびさらには増大させながら、排除することが本発明の目的であった。
【００５７】
したがって、本発明の発明者らは、そのオキシダーゼ活性がＧＯｘ−ＷＴおよび配列番号１記載のＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖと比較して顕著に低下されており、一方同時に、酵素のデヒドロゲナーゼ活性はＧＯｘ−ＷＴおよびＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖと比較して顕著に増大されているＧＯｘ変異体を提供することを可能としている。
【００５８】
本明細書において使用される「オキシダーゼ活性（oxidase activity）」とは、電子受容体として酸素を利用してグルコノラクトンを産生するためにグルコースの酸化を触媒する本明細書において提供されるＧＯｘ変異体の酵素的活性である。「オキシダーゼ活性」は、当該技術分野において公知の任意の方法によって、産生されるＨ2Ｏ2の量を測定することによってアッセイされ得る。例えば、「オキシダーゼ活性」は、例えば４ＡＡ／ＴＯＤＢ／ＰＯＤ（４−アミノアンチピリン（Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアラニン二ナトリウム塩／ホースラディッシュペルオキシダーゼ）などのＨ2Ｏ2検出のための試薬によって、またはＰｔ電極によってアッセイされ得る。
【００５９】
本明細書において使用される相対的または定量的活性という意味において、オキシダーゼ活性は、２５℃で、１０ｍＭ  ＰＰＢ  ｐＨ７．０、１．５ｍＭ  ＴＯＤＢ、２Ｕ/ｍＬホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、および１．５ｍＭ  ４−アミノアンチピリン（４ＡＡ）中で産生されるＨ2Ｏ2の量によって測定される、単位時間当たりに酸化される基質（グルコース）のモル量であると特異的に規定される。キノンイミン色素の形成が５４６ｎｍで分光光度的に測定されてもよい。
【００６０】
本明細書において使用される、「デヒドロゲナーゼ活性（dehydrogenase activity）」とは、電子受容体として酸素以外の電子メディエーターを利用することによってグルコノラクトンを産生するためにグルコースの酸化を触媒する本明細書において提供されるＧＯｘ変異体の酵素的活性である。「デヒドロゲナーゼ活性」は、使用された、酸素以外のメディエーターに移動された電子の量を測定することによってアッセイされ得る。
【００６１】
本明細書において使用されるように、相対的または定量的活性という意味において、「デヒドロゲナーゼ活性」は、２５℃で、１０ｍＭ  ＰＰＢ（ｐＨ７．０）、０．６ｍＭ  メトキシＰＭＳ  （ｍＰＭＳ）中で酸素以外のメディエーターに移動された電子の量によって測定される、単位時間当たりに酸化される基質（グルコース）のモル量であると具体的に規定される。
【００６２】
本開示の意味において、「電子メディエーター（electoron mediator(s)）」および「酸素以外のメディエーター（mediators(s) other than oxygen）」との表現は、酸化型および還元型両方で存在することのできる有機または無機の小分子の化学物質であって、電子を迅速に供与または受容して反応する化学物質を意味する。とりわけ、「電子メディエーター」および「酸素以外のメディエーター」との表現は、グルコースのための電子受容体であり、したがって酸化型から還元型へと変換される小分子の有機または無機化学物質を意味する。これに次いで、前記メディエーターは、還元型において、電気化学的グルコース測定のための作用電極へ、または血糖アッセイシステムにおける比色測定のためのインジケーター分子へと電子を送る。いくつかの電子受容体は、それ自身によりインジケーター分子として作用し、かつ、グルコースの比色測定のために直接的に使用され得る（例えば欧州特許第８３１３２７号明細書を参照のこと）。
【００６３】
本発明の特定の態様において、電子メディエーターまたは酸素以外のメディエーターは、ニトロソアニリンおよびその誘導体、アゾ化合物、フェナジンおよびその誘導体、フェノチアジンおよびその誘導体、フェノキサジンおよびその誘導体、フェロセンおよびその誘導体、フェリシアン化カリウム、Ｒｕ−およびＯＳ−錯体、キノンおよびその誘導体、インドールフェノール、ビオロゲン、テトラチアフルバレンおよびその誘導体、ならびに、フタロシアニンを含む群より選択される。
【００６４】
より特定の別の態様において、電子メディエーターまたは酸素以外のメディエーターは、例えばフェナントリジノン、１，４−ジアミノアントラキノンおよびフェナントリジノンの金属錯体などのキノン、ならびに、例えばＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−ニトロソアニリンまたはＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−メトキシ−４−ニトロソアニリンなどのニトロソアニリンを含む群より選択される。最後の２つのニトロソアニリンのどちらもが、以下、「ニトロソアニリンメディエーター（nitrosoaniline mediator）」と称されるであろう。
【００６５】
前述されるようなこのような電気メディエーターは、例えば、米国特許第５，３９３，６１５、米国特許第５，３９３，６１５、米国特許第５，４９８，５４２、米国特許第５，５２０，７８６、国際公開第２００９／１２９１０８号、米国特許出願公開第２００９／００９５６４２号明細書、国際公開第９３／２５８９８号、特開昭５７−１２８６７８号公報、欧州特許第０４４１２２２号明細書、およびPrevoteau, A. et al., Electrochemistry Communications (2010), 12(2), 213-215、Berchmans, S. et al., Materials Chemistry and Physics (2003), 77(2), 390-396などに充分に記載されている。
【００６６】
本開示の主題に関して特に適切なものは、ＦＡＤＨ２によって迅速に還元されるが、アスコルビン酸によっては還元されないかまたはゆっくりとしか還元されない電子メディエーターである。このようなメディエーターは例えば、２−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−ジアゼンカルボアミドの誘導体などである。
【００６７】
本明細書において記載されている、「テーラーメイド（tailor made）」の酸素非依存性ＧＯｘ変異体を作製するための方法の別の使用は、個々のＧＯｘ変異体を固定化されたメディエーターに適合させることである。
【００６８】
この意味において、用語「テーラーメイド（tailor made）」とは、本発明のそれぞれのＧＯｘ変異体のポリペプチド配列が、ＧＯｘが特定の固定化されたメディエーターと相互作用し、そしてそれからの電子を受容することを可能にさせることを意味している。
【００６９】
「特定の固定化されたメディエーター（certain immobilized mediator）」との表現は、ニトロソアニリンおよびその誘導体、アゾ化合物、フェナジンおよびその誘導体、フェノチアジンおよびその誘導体、フェノキサジンおよびその誘導体、フェロセンおよびその誘導体、フェリシアン化カリウム、Ｒｕ−およびＯＳ−錯体、キノンおよびその誘導体、インドールフェノール、ビオロゲン、テトラチアフルバレンおよびその誘導体、ならびに、フタロシアニンを含む群より選択される、電子メディエーターまたは酸素以外のメディエーターを示す。
【００７０】
本開示の別の非常に特定の態様において、ニトロソアニリンの群からの、特にはｐ−ニトロソアニリンまたはその誘導体の群からの、および特にはニトロソアニリンメディエーターまたはその誘導体のメディエーターが本発明による電子メディエーターとして好ましい。一般的に、ニトロソアニリンの群からのメディエーターは、ｉｎ  ｓｉｔｕで、例えばテストストリップ上で、グルコースおよびＧＯｘと、電子メディエーターとして作用する種を形成するように反応する。グルコース測定およびメディエーター活性という文脈におけるニトロソアニリンは、Hoenes, J., Mueller, P., and Surridge, N. (2008). The Technology Behind Glucose Meters: Test Strips. Diabetes Technology & Therapeutics 10, 10-26、および欧州特許第０３５４４４１号明細書に詳細に記載されている。
【００７１】
上記のリストは、本発明の酸素以外のメディエーターを限定するものではなく、また当業者に公知の市販されている他の電子メディエーターもまた本開示に完全に包含される。
【００７２】
本開示の別の非常に特定の態様において、配列番号２から配列番号９までの配列のＧＯｘ変異体は、材料および方法の段落のｆｆ）の項において記載されるメディエーターアッセイによって測定される場合、配列番号１に記載のＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖのそれぞれのメディエーター活性と比較して、メディエーターＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−ニトロソアニリンに対して１５０％のメディエーター活性を示す。
【００７３】
本開示の別の非常に特定の態様において、配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、以下
Ａ１７３Ｖ；Ａ３３２Ｓ；Ｆ４１４Ｙ；およびＶ５６０Ａ、または
Ａ１７３Ｖ；Ａ３３２Ｓ；およびＦ４１４Ｙ
の追加のアミノ酸置換を有するＧＯｘ変異体は、材料および方法の段落のｆｆ）の項において記載されるメディエーターアッセイによって測定される場合、配列番号１に記載のＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖのそれぞれのメディエーター活性と比較して、メディエーターＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−メトキシ−４−ニトロソアニリンに対して１５０％のメディエーター活性を示す。
【００７４】
配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えた、上記の置換
Ａ１７３Ｖ；Ａ３３２Ｓ；Ｆ４１４Ｙ；およびＶ５６０Ａ、または
Ａ１７３Ｖ；Ａ３３２Ｓ；およびＦ４１４Ｙ
は、本明細書において提供されるＧＯｘ変異体の別の特徴、すなわち、電子移動のための酸素以外の特定の電子メディエーター、この場合ではＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−メトキシ−４−ニトロソアニリンメディエーターを受容する能力を反映する。
【００７５】
この意味において、「酸素以外の特定の電子メディエーター（certain electron mediator(s) other than oxygen）」との表現は、ニトロソアニリンおよびその誘導体、アゾ化合物、フェナジンおよびその誘導体、フェノチアジンおよびその誘導体、フェノキサジンおよびその誘導体、フェロセンおよびその誘導体、フェリシアン化カリウム、Ｒｕ−およびＯＳ−錯体、キノンおよびその誘導体、インドールフェノール、ビオロゲン、テトラチアフルバレンおよびその誘導体、ならびに、フタロシアニンを含む群より選択される、電子メディエーターまたは酸素以外の電子メディエーターを示す。
【００７６】
第１の態様において、本発明は、
ａ）配列番号１に記載のグルコース酸化酵素であって、２つのアミノ酸置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、前記配列番号１におけるＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；Ｖ５６０の群より選択される６つの位置のうちの任意の位置に少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を有するグルコース酸化酵素、または
ｂ）ｂ）のグルコース酸化酵素が２つのアミノ酸置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、前記配列番号１におけるＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；Ｖ５６０の群より選択される６つの位置のうちの任意の位置に少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を有するという条件で、ａ）のグルコース酸化酵素に少なくとも７０％、特には少なくとも８０％、または９０％より高いアミノ酸配列同一性を示すグルコース酸化酵素、ただし、
ｂ）のグルコース酸化酵素は、ａ）のグルコース酸化酵素の酵素活性の少なくとも７０％、特には少なくとも８０％、または９０％より高い酵素活性を示し、および、ａ）のグルコース酸化酵素のグルコースに対する酵素特異性の少なくとも７０％、特には少なくとも８０％、または９０％より高い酵素特異性を示し、かつ
ｂ）のグルコース酸化酵素は、配列番号１のグルコース酸化酵素の、電子受容体としての酸素に対する活性より５倍低下された活性を示す、または配列番号１のグルコース酸化酵素の、酸素以外の電子受容体に対する活性より１．５倍増大された活性を示すか、またはその両方であり、
ｃ）ａ）またはｂ）に記載のグルコース酸化酵素の活性フラグメントであって、ただし、ｃ）の活性フラグメントにおいて、ａ）またはｂ）において記載されるようなアミノ酸置換が、ａ）またはｂ）に記載のグルコース酸化酵素と比較して保持されており、かつ
ｃ）のグルコース酸化酵素は、ａ）のグルコース酸化酵素の酵素活性の少なくとも７０％、特には少なくとも８０％、または９０％より高い酵素活性を示し、および、ａ）のグルコース酸化酵素のグルコースに対する酵素特異性の少なくとも７０％、特には少なくとも８０％、または９０％より高い酵素特異性を示し、かつ
ｃ）のグルコース酸化酵素は、配列番号１に記載のグルコース酸化酵素の、電子受容体としての酸素に対する活性より５倍低下された活性を示すか、または配列番号１に記載のグルコース酸化酵素の、酸素以外の電子受容体に対する活性より少なくとも１．５倍増大された活性を示すか、またはその両方である、
からなる群より選択される、配列番号１に記載のグルコース酸化酵素という主題に関する。
【００７７】
本発明の明細書の意味において、「アミノ酸配列における追加の修飾（additional modification(s) in the amino acid sequence）」および「追加のアミノ酸置換（additional amino acid substitution(s)）」との表現は、配列番号１のＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０位の任意の位置におけるタンパク質を構成する残りの１９個のアミノ酸の任意のアミノ酸による少なくとも１つのアミノ酸の置換を示す。さらに、上記の表現はまた、少なくとも２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つの位置が配列番号１のＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０位の群より選択される任意の位置において置換されている限り、任意の、残りの１９個のタンパク質を構成するアミノ酸またはそれらの化学的等価物による協同的なアミノ酸置換を包含する。
【００７８】
本発明のＧＯｘ変異体に関連した用語「酵素活性（enzyme activity）」とは、β−Ｄ−グルコースのＤ−グルコノ−１，５−ラクトンへの酸化（Ｄ−グルコース＋Ｏ2→グルコノラクトン＋Ｈ2Ｏ2）（これはその後グルコン酸へと加水分解され得る）を触媒するタンパク質を特定する。
【００７９】
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様を特定している以下の実施態様の主題に関する。
【００８０】
ある態様において、本発明の主題は、第１の態様によるＧＯｘ変異体であって、
電子受容体としての酸素に対する前記活性が、以下の工程
ａ）７５μＬのサンプル酵素溶液が１００μＬのリン酸バッファー（ｐＨ７）を含む平底９６ウェルマイクロプレートへと移される工程
ｂ）２０μＬの反応混合物が、以下の濃度、０．９１Ｕ／ｍＬ  ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）；２．３ｍＭ  ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））、をもたらすようにそれぞれのウェルへと添加される工程
ｃ）２５μＬのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の３０秒間の１０００ｒｐｍでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
ｄ）ＡＢＴＳの酸化がマイクロプレートリーダーを用いて４１４ｎｍで速度論的に測定される工程
を含むＡＢＴＳアッセイによって測定されており、
酸素以外の電子メディエーターの前記活性が、以下の工程
ａ）７５μＬの酵素溶液が平底９６ウェルマイクロプレートへと移される工程
ｂ）１００μＬのメディエーター溶液（１９．０５ｍＭのＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−ニトロソアニリン）；５％（ｗ／ｗ）ポリビニルピロリドン、ｐＨ７および２０μＬの２５ｍＭ  りんモリブデン酸が添加される工程
ｃ）２５μＬのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の１分間の１０００ｒｐｍでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
ｄ）りんモリブデン酸還元の反応速度がマイクロプレートリーダーを用いて７００ｎｍでモニターされる工程
を含むメディエーターアッセイによって測定される。
【００８１】
上記の態様に関連する別の態様において、酸素以外の電子メディエーターは、ニトロソアニリンおよびその誘導体、アゾ化合物、フェナジンおよびその誘導体、フェノチアジンおよびその誘導体、フェノキサジンおよびその誘導体、フェロセンおよびその誘導体、フェリシアン化カリウム、Ｒｕ−およびＯＳ−錯体、キノンおよびその誘導体、インドールフェノール、ビオロゲン、テトラチアフルバレンおよびその誘導体、ならびに、フタロシアニンを含む群より選択される。
【００８２】
上記の態様に関連する別の態様において、本発明の主題は、配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、配列番号１に記載のＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０の群より選択される６つの位置のうちの任意の位置に、追加で、２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つのアミノ酸置換を有するＧＯｘ変異体である。
【００８３】
上記の態様に関連する別の態様において、本発明は、ＧＯｘ変異体を提供し、ここで、前記追加の置換（複数の置換）のためのアミノ酸は、置換アミノ酸が配列番号１の対応する位置に存在するものとは別のものである限り、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌの群より選択される。
【００８４】
任意の上記の態様に関連する別の態様において、本発明は、ＧＯｘ変異体を提供し、ここで、追加の置換（複数の置換）のためのアミノ酸は、置換アミノ酸が配列番号１の対応する位置に存在するものとは別のものである限り、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、およびＰｒｏの群より選択される。
【００８５】
任意の上記の態様に関連する別の態様において、本発明は、ＧＯｘ変異体を提供し、ここで、追加の置換（複数の置換）のためのアミノ酸は、
Ｓ５３位におけるＰｈｅ；および／または
Ａ１３７位におけるＳｅｒ、Ｌｅｕ；および／または
Ａ１７３位におけるＩｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ；および／または
Ａ３３２位におけるＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｖａｌ；および／または
Ｆ４１４位におけるＡｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ；および／または
Ｖ５６０位におけるＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＶａｌ
の群より選択される。
【００８６】
任意の上記の態様に関連する別の態様において、本発明は、ＧＯｘ変異体を提供し、ここで、配列番号１に記載のＴ３０ＶおよびＩ９４Ｖの置換に加えて、Ｆ４１４および／またはＶ５６０の位置における少なくとも１つの追加のアミノ酸置換が、Ａ１３７および／またはＡ１７３および／またはＡ３３２の位置における少なくとも１つのアミノ酸置換と組み合わせられている。
【００８７】
任意の上記の態様に関連する別の態様において、本発明は、配列番号１に記載のＴ３０ＶおよびＩ９４Ｖの置換に加えて、Ａ１７３Ｉ；Ａ３３２Ｓ；およびＦ４１４Ｌの追加のアミノ酸置換を有する配列番号４のＧＯｘ変異体を提供する。
【００８８】
任意の上記の態様に関連する別の態様において、本発明は、配列番号１に記載のＴ３０ＶおよびＩ９４Ｖの置換に加えて、Ａ１７３Ｖ；Ａ３３２Ｓ；Ｆ４１４Ｉ；およびＶ５６０Ｔの追加のアミノ酸置換を有する配列番号３のＧＯｘ変異体を提供する。
【００８９】
任意の上記の態様に関連する別の態様において、本発明は、配列番号１に記載のＴ３０ＶおよびＩ９４Ｖの置換に加えて、Ａ１７３Ｖ；Ａ３３２Ｎ；Ｆ４１４Ｖ；およびＶ５６０Ｌの追加のアミノ酸置換を有する配列番号６のＧＯｘ変異体を提供する。
【００９０】
任意の上記の態様に関連する別の態様において、本発明は、以下の工程
ａ）７５μＬのサンプル酵素溶液が１００μＬのリン酸バッファー（ｐＨ７）を含む平底９６ウェルマイクロプレートへと移される工程
ｂ）２０μＬの反応混合物が、以下の濃度、０．９１Ｕ／ｍＬ  ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）；２．３ｍＭ  ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））、をもたらすようにそれぞれのウェルへと添加される工程
ｃ）２５μＬのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の３０秒間の１０００ｒｐｍでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
ｄ）ＡＢＴＳの酸化がマイクロプレートリーダーを用いて４１４ｎｍで速度論的に測定される工程
を含むＡＢＴＳアッセイによる電子受容体としての酸素に対する活性が、アスペルギルス  ニガー由来の野生型ＧＯｘと比較しておよび／または配列番号１のＧＯｘと比較して、少なくとも５倍低下したＧＯｘ変異体を提供する。
【００９１】
任意の上記の態様に関連する別の態様において、本発明は、ＧＯｘ変異体を提供し、前記ＧＯｘ変異体は、以下の工程
ａ）７５μＬの酵素溶液が平底９６ウェルマイクロプレートへと移される工程
ｂ）１００μＬのメディエーター溶液（１９．０５ｍＭのＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−ニトロソアニリン）；５％（ｗ／ｗ）ポリビニルピロリドン、ｐＨ７および２０μＬの２５ｍＭ  りんモリブデン酸が添加される工程
ｃ）２５μＬのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の１分間の１０００ｒｐｍでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
ｄ）りんモリブデン酸還元の反応速度がマイクロプレートリーダーを用いて７００ｎｍでモニターされる工程
を含むメディエーターアッセイによって測定される場合に、配列番号１のＧＯｘと比較して、酸素以外の電子メディエーターに対して少なくとも１．５倍増大した活性を示す。
【００９２】
任意の上記の態様に関連する別の態様において、本発明は、以下の工程
ａ）７５μＬの酵素溶液が平底９６ウェルマイクロプレートへと移される工程
ｂ）１００μＬのメディエーター溶液（１９．０５ｍＭのＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−ニトロソアニリン）；５％（ｗ／ｗ）ポリビニルピロリドン、ｐＨ７および２０μＬの２５ｍＭ  りんモリブデン酸が添加される工程
ｃ）２５μＬのそれぞれの糖である基質溶液を添加することおよびその後の１分間の１０００ｒｐｍでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
ｄ）りんモリブデン酸還元の反応速度がマイクロプレートリーダーを用いて７００ｎｍでモニターされる工程
を含むメディエーターアッセイによって測定される場合に、少なくとも９９．９％のグルコース特異性および／または４％未満のガラクトース特異性および／または０．３％未満のマルトース特異性および／または６％未満のキシロース特異性および／または０．１％未満のマルトトリオース特異性を示すＧＯｘ変異体を提供する。
【００９３】
本開示の意味において、「グルコースに特異的または基質グルコースに特異的（specific for glucose or specific for the substrate glucose）」という表現は、本明細書で提供されるＧＯｘの基質グルコースに対する活性が、以下の材料および方法の段落に概説されるメディエーターアッセイによって測定される場合に１００％であることを示す。黙示されるように、本明細書で提供されるＧＯｘｓのグルコース以外の糖、例えばガラクトース、マルトース、キシロース、およびマルトトリオースなどに対する残余の活性は、材料および方法の段落のｆｆ）の項において記載されるメディエーターアッセイによって測定される場合６％未満である。
【００９４】
任意の上記の態様に関連する別の態様において、本発明は、以下の工程
ａ）７５μＬの酵素溶液が平底９６ウェルマイクロプレートへと移される工程
ｂ）１００μＬのメディエーター溶液（１９．０５ｍＭのＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−ニトロソアニリン）；５％（ｗ／ｗ）ポリビニルピロリドン、ｐＨ７および２０μＬの２５ｍＭ  りんモリブデン酸が添加される工程
ｃ）２５μＬのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の１分間の１０００ｒｐｍでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
ｄ）りんモリブデン酸還元の反応速度がマイクロプレートリーダーを用いて７００ｎｍでモニターされる工程
を含むメディエーターアッセイによって測定される場合に、配列番号１のＧＯｘのニトロソアニリンメディエーター活性と比較して、４００％より大きい、または５００％より大きい、または６００％より大きい電子移動のためのニトロソアニリンメディエーターに対する活性を示し、
かつ、以下の工程
ａ）７５μＬのサンプル酵素溶液が１００μＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７）を含む平底９６ウェルマイクロプレートへと移される工程
ｂ）２０μＬの反応混合物が、以下の濃度、０．９１Ｕ／ｍＬ  ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）；２．３ｍＭ  ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））、をもたらすようにそれぞれのウェルへと添加される工程
ｃ）２５μＬのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の３０秒間の１０００ｒｐｍでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
ｄ）ＡＢＴＳの酸化がマイクロプレートリーダーを用いて４１４ｎｍで速度論的に測定される工程
を含むＡＢＴＳアッセイにより、配列番号１のＧＯｘの酸素活性と比較して、３０％以下、または２５％未満、または２０％未満、特には１５％未満、または１０％以下の酸素活性を示す
ＧＯｘ変異体を提供する。
【００９５】
別の態様において、本発明の主題は、任意の上記の態様のＧＯｘ変異体またはその活性フラグメントをエンコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
【００９６】
別の態様において、本発明は、本発明によるＧＯｘ変異体の活性な（機能的）等価物／フラグメントを提供する。
【００９７】
用語「その活性な等価物（複数の等価物）／フラグメント（複数のフラグメント）（active equivalent(s)/fragment(s) thereof）」またはその同意語「その機能的等価物（複数の等価物）／フラグメント（複数のフラグメント）（functional equivalent(s)/fragment(s) thereof）」とは、本発明による任意の修飾されたおよびそれによって最適化されたＧＯｘ変異体を意味しており、ここで、そのような等価物（複数の等価物）／フラグメント（複数のフラグメント）が、配列番号１に記載のＴ３０ＶおよびＩ９４Ｖの置換を少なくとも有し、およびさらに、配列番号１のＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０からなる群より選択される任意の位置において少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を有することにより、酵素活性、酵素特異性および顕著に低下された酸素消費速度および／または酸素以外の特異的メディエーターに対する顕著に増大された活性に関する不可欠な特性を示している限り、少なくとも１つのアミノ酸が、欠損しているか、または配列番号１の対応する配列において別のアミノ酸によって置換されている。
【００９８】
本発明の特定の態様において、本発明のＧＯｘ変異体の機能的等価物（複数の等価物）／フラグメント（複数のフラグメント）は、配列番号２から配列番号９に記載の配列と少なくとも７０％相同である、特には少なくとも８０％相同である、または９０％より高く相同であるアミノ酸配列を包含する。
【００９９】
別の態様において、本発明の主題は、本発明のＧＯｘ変異体またはその活性フラグメントによってエクスビボサンプルにおいてグルコースを検出する、決定する、または測定するための方法に関し、前記検出、決定または測定は、エクスビボサンプルを前記ＧＯｘ変異体またはその活性フラグメントに接触させることを含む。
【０１００】
上記態様に関連する別の態様において、グルコースの前記検出、決定または測定は、センサーまたはテストストリップ装置を使用して行われる。
【０１０１】
本発明はまた、本発明のＧＯｘ変異体を産生するための方法に、前記酵素をエンコードしている核酸に、ベクター、宿主細胞に関し、および、サンプル中のグルコースを前記酵素を使用して検出、決定または測定するための方法に、および前記酵素を含む装置にも関する。
【０１０２】
特定の態様において、本発明は、サンプル中のグルコースをアッセイするための、本発明の少なくとも１つのＧＯｘ変異体および酸素以外の電子メディエーターを含む装置を提供する。
【０１０３】
本発明の別の特定の態様において、電子メディエーターまたは酸素以外のメディエーターは、ニトロソアニリンおよびその誘導体、アゾ化合物、フェナジンおよびその誘導体、フェノチアジンおよびその誘導体、フェノキサジンおよびその誘導体、フェロセンおよびその誘導体、フェリシアン化カリウム、Ｒｕ−およびＯＳ−錯体、キノンおよびその誘導体を含む群より選択される。
【０１０４】
任意の上記の態様の主題と関連する本発明の別の態様は、配列番号１に記載のＴ３０ＶおよびＩ９４Ｖの２つの置換に加えて、配列番号１のＡ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０の群より選択される４つの位置のうちの任意の位置における少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を有するＧＯｘ変異体である。
【０１０５】
本発明によって意図される本明細書で提供されるＧＯｘ変異体の主な応用の１つは、糖尿病患者のエクスビボサンプルにおける血糖レベルをモニターするためのテストストリップ中でのそれらの使用である。当たり前のことであるが、多くの種類のサンプルが検査され得る。とりわけ、血液、血清および血漿などの体液がそのようなサンプルのサンプル源である。
【０１０６】
したがって、別の態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明のＧＯｘ変異体を担持している酵素電極を提供し、ここで前記少なくとも１つの本発明のＧＯｘ変異体は前記電極上に固定されている。
【０１０７】
別の態様において、本発明は、作用電極として本発明の酵素電極、およびしたがって、少なくとも１つの本発明のＧＯｘ変異体を担持している酵素電極を含む、グルコースをアッセイするための酵素センサーを提供する。
【０１０８】
また別の態様において、本発明は、本発明に基づく少なくとも１つのＧＯｘ変異体および酸素以外の電子メディエーターを含む、サンプル中のグルコースをアッセイするためのキットを提供する。
【０１０９】
グルコースの測定のためのキットは、少なくとも１つの本発明のＧＯｘ変異体を使用して構成され得る。本発明のＧＯｘ変異体に加えて、キットは、測定に必要なバッファー、酸素以外の適切な電子メディエーター、特にはニトロソアニリンメディエーター、および、必要な場合、ペルオキシダーゼなどの酵素、ならびに較正曲線を作製するためのグルコース標準溶液および使用説明書を含む。
【０１１０】
サンプル中のグルコースの濃度は、酵素反応によって生成される電子の量を測定することによって決定され得る。様々なセンサーシステムが公知であり、例えば、炭素電極、金属電極、および白金電極などが挙げられる。本発明のＧＯｘ変異体は、電極上に固定される。固定化のための手段の例としては、架橋、高分子マトリックス中へのカプセル化、透析膜へのコーティング、光学的架橋ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマー、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１１１】
アッセイ装置は、血糖レベルを測定するための、任意の従来の、市販されている電流測定バイオセンサーテストストリップと類似する構造を有し得る。このような装置の１つの例は、絶縁性基板上に配置されている２つ電極（作用電極および参照または対電極）、試薬ポートおよびサンプル受容部を有する。試薬ポートは、本発明のＧＯｘ変異体および酸素以外の電子メディエーターを含む。血液サンプルなどのサンプルがサンプル受容部に添加されると、サンプル中に含まれるグルコースがＧＯｘ変異体と反応し、これにより、電子移動はサンプル中のグルコースの量を示す。酵素基質の測定のために適した電気化学的センサーの典型的な例は、例えば国際公開第２００４／１１３９００号および米国特許第５，９９７，８１７号明細書などから公知である。代替的な電気化学的センサーとして、光学的検出技術が使用されてもよい。典型的には、このような光学装置は、酵素、電子メディエーターおよびインジケーターを含む試薬システム中で起こる色の変化に基づく。色の変化は、蛍光、吸収または緩和測定を用いて定量化され得る。酵素基質の測定のために適した光学装置の典型的な例は、例えば米国特許第７，００８，７９９号明細書、米国特許第６，０３６，９１９号明細書および米国特許第５，３３４，５０８号明細書などから公知である。
【０１１２】
別の態様において、本発明は、本発明のＧＯｘ変異体またはその活性フラグメントをエンコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【０１１３】
別の態様において、本発明は、本発明のＧＯｘ変異体またはその活性フラグメントをエンコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞（本明細書において形質転換体とも称される）を提供する。
【０１１４】
別の態様において、本発明は、本発明のＧＯｘ変異体またはその活性フラグメントを産生するための方法を提供し、前記方法は、上記の形質転換体を培養する工程を含む。
【０１１５】
別の態様において、本発明は、上記の方法によって得られ得る本発明のＧＯｘ変異体またはその活性フラグメントを提供する。
【０１１６】
別の特定の態様において、本発明によって提供される発現ベクターは、好ましくは、本発明のＧＯｘ変異体をエンコードしているＤＮＡ配列の１つの全てまたは一部分を含む。
【０１１７】
本発明によって提供されるＧＯｘ変異体の所望のコード配列および制御配列を含む適切な発現ベクターは、当該技術分野において公知の標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて構成され得、それらの多くについては、Sambrook et al., in “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”(1989), Cold Spring Habor, NY Cold Spring Habor Laboratory Pressに記載されている。
【０１１８】
適切な宿主細胞の例としては、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社より入手可能なＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ３３６９４）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社より入手可能なＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’などが挙げられる。適切なピキア（Pichia）宿主細胞としては例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（５７９１  Ｖａｎ  Ａｌｌａｎ  Ｗａｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ９２００８、ＵＳＡ）より入手可能なｐ．パストリス  Ｘ３３またはｐ．パストリス  ｋｍ７１Ｈなどが挙げられる。
【０１１９】
本発明のＧＯｘ変異体の組換え産生は、公知の宿主中で行われ得る。適切な宿主は、糸状菌（filamentous fungi）株、例えば、アスペルギルス  ニガー、アスペルギルス  ソーヤ（Aspergillus sojae）、およびアスペルギルス  オリゼ（Aspergillus oryzae）などから選択され得る。適切な宿主は、イースト菌株、例えば、ピキア  パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、およびハンゼヌラ  ポリモルファ（Hansenula polymorpha）などから選択されてもよい。
【０１２０】
別の特定の態様において、本発明のＧＯｘ変異体およびその機能的等価物は、イースト菌中、とりわけサッカロミセス  セレビシエ中での前記ＧＯｘ変異体をエンコードするポリヌクレオチドの発現によって得られ得る。
【０１２１】
発現ベクターは、当該技術分野において公知の様々な方法によって宿主細胞中へと導入され得る。例えば、発現ベクターを用いた宿主細胞の形質転換は、ポリエチレングリコール媒介のプロトプロスト形質転換方法（Sambrookら、1989, supra）によって行われ得る。しかしながら、宿主細胞内へと発現ベクターを導入するための他の方法、例えば、エレクトロポレーション、バリスティックＤＮＡインジェクション、またはプロトプラスト融合もまた行われ得る。
【０１２２】
本発明によるＧＯｘ変異体を含む発現ベクターが適切な宿主細胞内へと導入されると、宿主細胞が、本発明による所望のＧＯｘ変異体の発現を可能にする条件下で培養され得る。所望の発現ベクター（およびしたがって、本発明によるＧＯｘ変異体をエンコードするＤＮＡ配列を担持している）を含む宿主細胞は、例えば抗生物質選択または栄養要求性変異体の補完および最小培地からの選択などによって容易に同定され得る（J. Sambrook, D. W. Russell:“Molecular Cloning: a laboratory manual”, 3rd edition, Cold Spring Harbor, New York (2001)）。本発明によって提供されるＧＯｘ変異体の発現は、ＧＯｘのｍＲＮＡ転写物の産生量の測定、遺伝子産物の免疫学的検出または遺伝子産物の酵素活性の検出などの当業者にとって公知の種々の方法によって特定され得る。特には、材料および方法の段落のｆｆ）の項でのメディエーターアッセイで概説されるように、酵素的アッセイが適用される。追加で、本発明によって提供されるＧＯｘ変異体は、本発明にしたがって、材料および方法の段落のｇｇ）の項において概説されるようにＡＢＴＳアッセイによって測定される場合に、顕著に低減された酸素消費速度によって同定され得る。
【０１２３】
本発明の別の態様において、本明細書に記載される本発明のＧＯｘ変異体のためのポリペプチドは、本発明のＧＯｘ変異体の１つをエンコードしているＤＮＡ配列を発現している宿主細胞中での産生によって得られ得る。本発明のポリペプチドは、本発明のＧＯｘ変異体の１つをエンコードしているＤＮＡ配列によってエンコードされているｍＲＮＡのインビトロ翻訳によって得られてもよい。例えば、ＤＮＡ配列が適切な発現ベクター内にインサートされてもよく、これが続いてインビトロ転写／翻訳システムにおいて使用され得る。
【０１２４】
無細胞ペプチド合成システム中でその発現を促進することのできるプロモーター配列と作動可能に連結されている、上記で規定されるおよび説明されるような単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、本発明の別の具体的な実施形態を表している。
【０１２５】
例えば上述の工程によってなどにより産生されるポリペプチドは、その後、単離され、そして様々な通例のタンパク質精製技術を用いて精製され得る。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーおよびアフィニティクロマトグラフィーなどのクロマトグラフ工程が行われ得る。
【０１２６】
別の態様において、本発明は、本発明の少なくとも１つのＧＯｘ変異体またはその活性フラグメントを含む医薬組成物を提供する。
【０１２７】
別の態様において、本発明のＧＯｘ変異体は、基質グルコースに特異的なその本質的特性を維持しながら、しかし、配列番号１に記載の置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えた特定の位置におけるアミノ酸配列中への少なくとも１つの追加のアミノ酸置換に起因して、材料および方法の段落のｇｇ）の項において概説されるようなＡＢＴＳアッセイによって測定される場合に、最大の残余の酸素活性が３０％以下に低下されている。同時に、本発明で提供されるＧｏｘｓは、材料および方法の段落のｆｆ）の項において概説されるようなメディエーターアッセイによって測定される場合に、酸素以外の電子メディエーターに対して４００％より高い、または５００％より高い、または６００％より高い酵素活性を示す。
【０１２８】
上記の点から、本発明は、本発明で提供されるＧＯｘ変異体中に、
ｉ）ＧＯｘｓのグルコース特異性特性
ii）オキシダーゼ活性からデヒドロゲナーゼ活性へのシフトを介するＧＤＨｓの酸素非依存性の酵素活性特性を有し
iii）および任意には酸素以外の特定の電子メディエーターに対する増大された活性
を、正確なグルコース測定、とりわけ正確な血糖測定を達成するために、備える。
【０１２９】
本発明によるＧＯｘ変異体の意味において、「オキシダーゼ活性からデヒドロゲナーゼ活性へのシフト（shift from oxidase activity towards dehydrogenase activity）」とは、
材料および方法の段落のｇｇ）の項において概説されるようなＡＢＴＳアッセイによって測定される場合に、参照としてＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖの１．０から始まり、０．３以下、または０．２５より小さい、または０．２より小さい、特には０．１５より小さい、または０．１以下の本発明によるＧＯｘ変異体の残余の酸素活性へとむかう、酸素活性における低下、および
材料および方法の段落のｆｆ）の項において概説されるようなメディエーターアッセイによって測定される場合に、参照としてＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖのメディエーター活性１．０から始まり、本発明によるＧＯｘ変異体の少なくとも１．５のメディエーター活性へとむかう、デヒドロゲナーゼ活性における同時的な増大
を示す。
【０１３０】
上記の値は、酸素活性およびメディエーター活性という観点においては、本発明のＧＯｘ変異体の酵素活性と、参照としてのＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖの対応する酵素活性のあいだの比（商）を表している。比（商）は、材料および方法の段落のｅｅ）の項において概説されるようなＥＬＩＳＡによって測定される場合の、両方のＧＯｘ活性（酸素活性およびメディエーター活性（Ｕ／ｍｇ）に基づいている。
【０１３１】
本発明の配列番号１１から配列番号１７までの配列に基づくそれぞれの核酸分子は、配列番号１のポリペプチドをエンコードしている配列番号１０（ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖ）由来の修飾ポリペプチドまたはそのフラグメントをエンコードする。
【０１３２】
本明細書において使用される用語「ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖ」は、配列番号２記載のアスペルギルス  ニガーの野生型（ＷＴ）配列に基づくＧＯｘであって、Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖの２つの置換をそのポリペプチド配列中にさらに有する、すなわち配列番号１のＧＯｘを示す。
【０１３３】
本明細書において使用される用語「ＧＯｘ二重変異体（GOx double-mutant）」とは、同じく、配列番号２記載のアスペルギルス  ニガーのＷＴ配列に基づくＧＯｘであって、Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖの２つの置換をそのポリペプチド配列中に有する、すなわち配列番号１のＧＯｘを示す。そのようなＧＯｘ二重変異体は、Ｚｈｕらによりもたらされている（２００６；２００７）。
【０１３４】
本発明にしたがって、配列番号１に対応する核酸分子（すなわち配列番号１０）は、本発明にしたがって、オキシダーゼ活性からデヒドロゲナーゼ活性へのシフトによって特徴づけられるＧＯｘ酵素の速度論的特性をさらに改良するために用いられた。これは、本発明者らによって、配列番号１により２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖは既に存在しつつ、Ｓ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０のうちの少なくとも１つの位置にアミノ酸置換をもたらす特定のヌクレオチド配列修飾を介して達成された。
【０１３５】
別の態様において、本発明は、配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、配列番号１のＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０の群より選択される６つの位置のうちの任意の位置に少なくとも２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つの追加のアミノ酸置換を有し、これによってＧＯｘ酵素活性における協同的な効果を示すＧＯｘ変異体を提供する。
【０１３６】
本発明の意味において、「ＧＯｘ酵素活性における協同的な効果（cooperative effects on GOx enzyme activity）」との表現は、配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、Ｓ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０の任意の位置における少なくとも２つの追加のアミノ酸置換であって、ＧＯｘの酸素消費速度を低下させるという観点においてＧＯｘ酵素活性に影響を及ぼしていることを意味している。
【０１３７】
本発明の意味において、「ＧＯｘ酵素活性における協同的な効果（cooperative effects on GOx enzyme activity）」との表現は、配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、Ｓ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０の任意の位置における少なくとも２つの追加のアミノ酸置換であって、ＧＯｘの酸素消費速度を低下させるおよび／または酸素以外の電子メディエーターに対するＧＯｘのメディエーター活性を増大させるという観点においてＧＯｘ酵素活性に影響を及ぼしていることを意味している。
【０１３８】
追加で、本発明の意味において、「ＧＯｘ酵素活性における協同的な効果（cooperative effects on GOx enzyme activity）」との表現は、配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、Ｓ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０の任意の位置における少なくとも２つの追加のアミノ酸置換であって、電子移動のための特定の酸素以外の電子メディエーターを受容するという観点においてＧＯｘ酵素活性に影響を及ぼしていることを意味している。特定の態様において、本発明は、配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２の位置におけるタンパク質を構成する残りの１９個のアミノ酸のうちの任意のアミノ酸によるアミノ酸の置換と組み合わせられる、Ｆ４１４およびＶ５６０の位置におけるタンパク質を構成する残りの１９個のアミノ酸のうちの任意のアミノ酸による追加のアミノ酸の置換を有するＧＯｘ変異体を提供する。
【０１３９】
特定の態様において、本発明は、配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、Ｆ４１４およびＶ５６０の位置におけるタンパク質を構成する残りの１９個のアミノ酸のうちの任意のアミノ酸による追加の組み合わされたアミノ酸の置換を有するＧＯｘ変異体を提供する。
【０１４０】
本発明のさらなる特定の態様は、上記の態様と関連し、そして、配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、Ｆ４１４ＭまたはＦ４１４ＶおよびＶ５６０ＰまたはＶ５６０Ｌの追加の組み合わされたアミノ酸の置換を有するＧＯｘ変異体を提供する。
【０１４１】
さらなる特定の態様において、本発明は、配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、Ｖ５６０ＰまたはＶ５６０Ｌおよび／またはＡ１３７Ｌおよび／またはＡ１７３ＩまたはＡ１７３Ｖおよび／またはＡ３３２ＳまたはＡ３３２ＶまたはＡ３３２Ｔのアミノ酸置換（または複数の置換）と組み合わされたＦ４１４ＭまたはＦ４１４Ｖの追加のアミノ酸置換を有するＧＯｘ変異体を提供する。
【０１４２】
さらなる特定の態様において、本発明は、配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、Ｖ５６０ＰまたはＶ５６０Ｌおよび／またはＡ１３７Ｌおよび／またはＡ１７３ＩまたはＡ１７３Ｖおよび／またはＡ３３２ＳまたはＡ３３２ＶまたはＡ３３２Ｔのアミノ酸置換（または複数の置換）と組み合わされたＦ４１４ＭまたはＦ４１４Ｖの追加のアミノ酸置換を有するＧＯｘ変異体を供給する。
【０１４３】
本発明のさらなる態様は、上記の態様と関連し、そして、配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、上記の置換のうちの任意の置換から選択される少なくとも２つの組み合わされたアミノ酸の置換を有するＧＯｘ変異体を提供する。
【０１４４】
酸素以外の電子メディエーターに対するＧＯｘ特異性は、材料および方法の段落のｆｆ）の項において概説されるメディエーターアッセイによって測定され得る。
【０１４５】
別の特定の態様において、本発明は、材料および方法の段落のｆｆ）の項において記載されるメディエーターアッセイによって測定される場合に、電子メディエーターＮ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−４−ニトロソアニリンに対して４００％より大きい、または４５０％より大きい、または５００％より大きい、または５５０％より大きい、または６００％より大きいメディエーター活性を有するＧＯｘ変異体を提供する。
【０１４６】
別の特定の態様において、本発明は、材料および方法の段落のｇｇ）の項において概説されるＡＢＴＳアッセイを用いて、ＧＯｘ−ＷＴと比較した場合、または配列番号１に記載のＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖと比較した場合、電子受容体としての酸素に対して少なくとも５倍低下された活性、または電子受容体としての酸素に対して少なくとも６倍低下された活性、または電子受容体としての酸素に対して少なくとも７倍低下された活性を有するＧＯｘ変異体を提供する。
【０１４７】
別の特定の態様において、本発明は、材料および方法の段落のｇｇ）の項において概説されるＡＢＴＳアッセイによって測定される場合に、ＧＯｘ  ＷＴのオキシダーゼ活性のまたは配列番号１に記載のＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖのオキシダーゼ活性の３０％以下の残存オキシダーゼ活性を有する、または特には、ＧＯｘ−ＷＴのオキシダーゼ活性のまたは配列番号１に記載のＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖのオキシダーゼ活性の２０％より小さいまたは１５％より小さい残存オキシダーゼ活性を有する、またはより特には、ＧＯｘ−ＷＴのオキシダーゼ活性のまたは配列番号１に記載のＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖのオキシダーゼ活性の１０％より小さい残存オキシダーゼ活性を有するＧＯｘ変異体を提供する。
【０１４８】
本発明のさらに特定の態様において、配列番号１１から配列番号１７で示されるヌクレオチド分子の機能的等価物／フラグメントは、前記ＤＮＡ配列または配列番号１１から配列番号１７の配列と実質的に相補的な配列によってエンコードされている、対応するＲＮＡ分子である。
【０１４９】
本発明の意味において、「ＲＮＡ分子（RNA molecule）」との用語は、一重鎖であり、および、本明細書において示される配列番号３から配列番号９に記載のＧＯｘ変異体のタンパク質合成のためのテンプレートとして機能する、リボヌクレオチド分子の直鎖のポリマーを意味する。
【０１５０】
本発明のさらなる特定の態様において、ホモロジーの程度または割合は、配列番号３から配列番号９に対して少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％または１００％であり、ただしそれらは、本明細書を通じて概説されるように同じ置換を示し、およびさらに、本発明によるＧＯｘ変異体として実質的に同じ特性を示し、これら不可欠な特性とは、酵素活性、グルコースに対する酵素特異性、および顕著に低下された酸素消費速度および／または顕著に増大された酸素以外の特定の電子メディエーターに対する活性である。
【０１５１】
配列相同性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ｔｈｅ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）(Altschul, S.F. et al. 1990. J. Mol. Biol. 215:403; Altschul, S.F. et al. 1997. Nucleic Acid Res. 25:3389-3402)によって決定され得る。本明細書において記載されるアミノ酸配列相同性の割合とは、前記ＢＬＡＳＴアルゴリズムによる配列相同性の決定を意味し、ここで、相同性が決定される領域は、本発明のＧＯｘ変異体の全体の配列である。配列相同性は、配列のアライメントおよび比較を目的とする、当業者に公知の任意の他の方法によって決定されてもよい。
【０１５２】
当業者であれば、本明細書において記載されるＧＯｘ変異体は、前記ＧＯｘ変異体の不可欠な特性、すなわち、本発明の意味におけるグルコースに対する特異性、顕著に低下された酸素消費速度および／または顕著に増大された酸素以外の特定の電子メディエーターに対する活性を変化させることなく、前述の置換とは異なるさらなる修飾を有していてもまたは有していなくてもよい。
【０１５３】
本発明の別の特定の態様は、本発明のＧＯｘ変異体またはその活性等価物／フラグメントをエンコードする単離ポリヌクレオチドである。単離されたポリヌクレオチドは、配列表の項に明示的にリストされている以下の配列、すなわち配列番号１１から配列番号１７をエンコードしているＤＮＡもしくはＲＮＡ分子またはそれらの対応する遺伝子であってもよい。
【０１５４】
別の特定の態様において、本発明によって提供されるＧＯｘ変異体は、材料および方法の段落のｆｆ）の項において概説されるようなメディエーターアッセイによって測定される場合に、３０℃〜４７℃の範囲において少なくとも７０％、特には少なくとも８０％の残余の酵素活性を有することによる温度安定性を示す。
【０１５５】
別の特定の態様において、本発明によって提供されるＧＯｘ変異体は、材料および方法の段落のｆｆ）の項において概説されるようなメディエーターアッセイによって測定される場合に、４８℃〜６０℃の範囲において少なくとも１０％の残余の酵素活性を有することによる温度安定性を示す。
【０１５６】
本発明のＧＯｘ変異体は、例えば凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中での溶液としてなど、様々な形状で提供され得る。
【０１５７】
本発明によって提供されるＧＯｘ変異体はより正確な糖尿病のための血糖試験装置における応用を主に意図している。とりわけ、本発明の酸素非依存製ＧＯｘ変異体は、顕著に低下された酸素消費速度によってのみしか電子移動のために酸素を利用せず、これは、酸素に対する残余のＧＯｘ活性が、材料および方法の段落のｇｇ）の項において概説されるようなＡＢＴＳアッセイによって測定される場合に、３０％以下、または２５％より小さい、または２０％より小さい、特には１５％より小さい、または１０％以下であることを意味している。したがって、顕著な量のグルコースがより適切な血糖測定のためにメディエーターに関連する反応において反応され、一方、血液サンプル中の溶存酸素との反応は顕著に低減される。これは、糖尿病患者にとって、動脈血、静脈血、毛細管血が測定の原料である場合、または、海抜の異なる地点で血糖濃度を測定する場合に有益である。
【０１５８】
別の態様において、本発明は、顕著に低下された酸素消費速度および／または顕著に増大された酸素以外の特定の電子メディエーターに対する活性を示すＧＯｘ変異体を提供し、これは、より正確な血糖測定を同様にもたらし、これにより糖尿病患者は利益を享受する。
【０１５９】
定義
本明細書の意味において、「酸素依存性（oxygen-dependent）」および「酸素依存度（oxygen dependency）」との表現は、材料および方法の段落のｇｇ）の項において概説されるようなＡＢＴＳアッセイによって測定される場合に、残余の酸素活性が、３０％より大きいことによって特徴づけられるＧＯｘ活性を意味している。
【０１６０】
対照的に、「酸素非依存性（oxygen-independent）」および「酸素非依存度（oxygen-independency）」との表現は、材料および方法の段落のｇｇ）の項において概説されるようなＡＢＴＳアッセイによって測定される場合に、残余の酸素活性が、３０％以下、または２５％より小さい、または２０％より小さい、特には１５％より小さい、または１０％より小さいことによって特徴づけられるＧＯｘ活性を意味している。
【０１６１】
本明細書の意味において、「グルコースに非特異性（unspecific for glucose）」との表現は、本発明によって提供されるＧＯｘ変異体は、材料および方法の段落のｆｆ）の項において概説されるようなメディエーターアッセイによって測定される場合に、基質グルコースに対するＧＯｘ活性が１００％未満、または９９．９％未満、または９９．５％未満であることを意味する。これは暗に、「グルコースに非特異性」であるＧＯｘが、材料および方法の段落のｆｆ）の項において概説されるメディエーターアッセイによって決定される場合に、グルコース以外の糖、例えばガラクトース、マルトース、キシロース、およびマルトトリオースなどに対して、６％より大きいＧＯｘ活性を示すことを意味している。
【０１６２】
本発明のＧＯｘ変異体に関連した「修飾された（modified）」または「修飾（modification）」との用語は、配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、配列番号１に記載のポリペプチド配列中に少なくとも１つの追加のアミノ酸置換をＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０の任意の位置に含むＧＯｘタンパク質を意味する。本用語はまた、そのような「修飾された」ＧＯｘ変異体をエンコードするそれぞれのポリヌクレオチドまたは配列保存的なそれらの変異体を意味する。
【０１６３】
ポリヌクレオチド配列の「配列保存的な変異（sequence-conservative variations）」とは、任意のコドン位置における一またはそれ以上のヌクレオチドの変化がその位置でエンコードされるアミノ酸においてなんらの変化ももたらさないようなものである。
【０１６４】
用語「ＧＯｘ変異体（GOx variant(s)）」とは、配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖ、ならびに、配列番号１に記載のポリペプチド配列中に少なくとも１つの追加のアミノ酸置換をＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０の任意の位置（または複数の位置）に有する本発明によるグルコース酸化酵素であって、基質グルコースに酵素特異性示し、および、顕著に低下された酸素消費速度および／または顕著に増大された酸素以外の特定の電子メディエーターに対する活性を示すことによって特徴づけられる。
【０１６５】
本明細書を通して、アミノ酸配列の番号付けは、配列番号１に記載の成熟ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖタンパク質における最初のＳ（Ｓｅｒ、セリン）を１として始めていることが理解されるべきである。
【０１６６】
本発明における用語「酵素（enzyme）」とは、多かれ少なかれ特異的に、一または二以上の化学反応または生化学反応を触媒するまたは促進する、全体的または大部分がタンパク質またはポリペプチドからなる任意の物質を意味する。用語「酵素」はまた、触媒的なポリヌクレオチド（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ）も意味し得る。
【０１６７】
用語「酸化反応（oxidation reaction）」とは、一般的な用語として、酸素の基質への付加を含む、酸素化されたまたは酸化された基質または生成物を形成する化学的反応または生化学的反応を意味する。酸化反応は、典型的には還元反応を伴う（したがって、用語「酸化還元（redox）」反応は、両反応、酸化および還元を包含する）。化合物は、酸素を受容した場合または電子を失った場合、「酸化される（oxidized）」。化合物は、酸素を失った場合または電子を得た場合、「還元される（reduced）」。ＧＯｘは典型的には、第一級アルコール基のアルデヒドへの酸化を触媒する。
【０１６８】
本明細書を通じて使用される用語「グルコース酸化酵素（glucose oxidase(s)）」とは、β−Ｄ−グルコースのＤ−グルコノ−１，５−ラクトンへの酸化（Ｄ−グルコース＋Ｏ2→グルコノラクトン＋Ｈ2Ｏ2）（これはその後グルコン酸へと加水分解され得る）を触媒するタンパク質を特定する。したがって、グルコース酸化酵素は酵素である。さらに、用語「グルコース酸化酵素の活性を有するポリペプチド（a polypeptide having the activity of a glucose oxidase）」は、上記の活性を有するポリペプチドを意味する。グルコース酸化酵素は、「ＧＯｘ（ｓ）」または「Ｅ．Ｃ．１．１．３．４．」と略され得る。本明細書を通じて使用される「ＧＯｘ−ＷＴまたはＷＴ」は、真菌アスペルギルス  ニガー由来の野生型ＧＯｘを意味する。用語「ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖ、またはＴ３０ＶＩ９４Ｖ、または二重変異体（double-mutant）、または親変異体（parent-mutant）」とは、Ｚｈｕら（２００６；２００７）により記載されている配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖを有するＧＯｘ変異体を意味する。
【０１６９】
本発明によるＧＯｘ変異体はすべて、共通して配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖ、ならびにＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０位の任意の位置における、本発明による置換に適切である、タンパク質を構成する残りの１９個のアミノ酸の１つによる少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を有する。それぞれの「ＥＺ」番号は、本明細書の文章を通して本発明によるＧＯｘ変異体を短縮するものであってもよい。「ＥＺ」は酵素を表している。
【０１７０】
酵素「グルコース酸化酵素」は、したがって、供給源またはドナーから基質へと酸素を付加する、挿入する、付与するまたは移動させることによって酸化反応を触媒する酸化酵素の種類のメンバーである。このような酵素はまた、酸化還元酵素（oxidoreductases）または酸化還元酵素（redox enzymes）とも称され、そして、オキシゲナーゼ、ヒドロゲナーゼまたはレダクターゼ、オキシダーゼ、およびペルオキシダーゼを包含する。
【０１７１】
この意味において、用語「酸素ドナー（oxygen donor）」、「酸化剤（oxidizing agent）」および「酸化体（oxidant）」は、酸化反応において酸素を基質へと供与する物質、分子または化合物を意味する。典型的には、酸素ドナーは、還元される（電子を受容する）。酸素ドナーとしての例としては例えば、酸素分子または二原子酸素（Ｏ2）、および過酸化物としては例えば、ｔ−ブチルパーオキサイドなどのアルキルパーオキサイド、および最も好ましくは過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）が挙げられる。「過酸化物（peroxide(s)）」とは、互いに結合している２つの酸素原子を有する任意の化合物である。
【０１７２】
上述されるように、グルコース酸化酵素の、または本明細書で使用されるＧＯｘ変異体の「活性（activity）」または「酵素活性（enzyme activity）」は、酸化反応Ｄ−グルコース＋Ｏ2→グルコノラクトン＋Ｈ2Ｏ2を触媒するその能力を測定することに向けられており、反応の生成物が生成されるその速度として表されるかもしれない。例えば、グルコース酸化酵素活性は、単位時間当たり、またはグルコース酸化酵素の単位ユニット（例えば濃度または重量）当たりに生成される生成物（グルコノラクトンおよび／またはＨ2Ｏ2）の量として表され得る。
【０１７３】
一般的に、本発明のポリペプチドはまた、本明細書において「突然変異体（mutant）」、「ムテイン（mutein）」、または「変異体（variant）」であることを意味していてもよく、また、「修飾されたＧＯｘ（a modified GOx）」または「修飾（modification）」とは、アスペルギルス  ニガー由来のＧＯｘ−ＷＴ自身から、または配列番号１記載のＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖから作製された、変化された、派生された、またはなんらか異なっている、または改変されていることを意味している。
【０１７４】
アスペルギルス  ニガーのＧＯｘ−ＷＴタンパク質は、配列番号２に記載の天然のアミノ酸配列を含む。したがって、「親の変異体」または「二重変異体」は、本明細書において記載される任意の方法、ツールまたは技術を用いて、本明細書で提供される他の任意のポリペプチドがそれから派生されるまたは作製されるＧＯｘポリペプチドである。本発明によれば、「親突然変異体」または「二重変異体」は、配列番号１のポリペプチドである。
【０１７５】
したがって、「親ポリヌクレオチド（parent polynucleotide）」は、親ポリペプチド、すなわち配列番号１０に記載のポリヌクレオチドをエンコードするものである。
【０１７６】
用語「突然変異（mutation）」または「変異（variation）」または「改変（modification）」は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡなどの遺伝物質における任意の検出可能な変化、またはそのような変化の任意のプロセス、機序、または結果を意味する。これは、そこで遺伝子の構造（例えばＲＮＡまたはＲＮＡ配列）が変化される遺伝子突然変異、任意の突然変異プロセスより生じる任意の遺伝子またはＤＮＡまたはＲＮＡ、および改変された遺伝子またはＤＮＡ配列によって発現される任意の発現産物（例えばタンパク質またはポリヌクレオチド）を包含する。このような変化はまた、プロモーター、リボソーム結合部位などにおける変化を含む。
【０１７７】
本発明の開示の意味において、「酸素以外の特定のメディエーター（certain mediators other than oxygen）」、「酸素以外の特定の電子メディエーター（certain electron mediators other than oxygen）」、「特定の固定化されたメディエーター（certain immobilized mediator）」および「酸素以外の特定の電子受容体（certain electron acceptors other than oxygen）」との表現は、ニトロソアニリンおよびその誘導体、アゾ化合物、フェナジンおよびその誘導体、フェノチアジンおよびその誘導体、フェノキサジンおよびその誘導体、フェロセンおよびその誘導体、フェリシアン化カリウム、Ｒｕ−およびＯＳ−錯体、キノンおよびその誘導体、インドールフェノール、ビオロゲン、テトラチアフルバレンおよびその誘導体、ならびに、フタロシアニンを含む群より選択されるメディエーター／電子メディエーターを意味する。
【０１７８】
したがって、本発明による「酸素以外の特定のメディエーター」、「酸素以外の特定の電子メディエーター」、「特定の固定化されたメディエーター」および「酸素以外の特定の電子受容体」はまた、ＦＡＤＨ２によって迅速に還元されるが、例えば２−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−ジアゼンカルボキシアミドの誘導体などのアスコルビン酸によっては還元されない電子メディエーターを意味する。
【０１７９】
略語
ＡＡ  アミノアンチピリン
ＨＲＰ  ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＧＯｘ  グルコース酸化酵素
ＧＯｘ−ＷＴまたはＷＴ  真菌アスペルギルス  ニガー由来の野生型ＧＯｘ
ＧＤＨ  グルコース脱水素酵素
ＡＢＴＳ  ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸
ＰＭＯ  りんモリブデン酸
【０１８０】
以下の実施例の項において、全ての試薬、制限酵素、および他の材料は、他の市販供給元が特定されていない限り、Roche Diagnostics Germanyから得られ、そして、供給業者によって提供された取扱説明書にしたがって使用された。ＤＮＡの精製、特性評価およびクローニングのために適用される操作および方法は、当該技術分野において広く公知であり（Ausubel, F., et al., in“Current protocols in molecular biology”(1994), Wiley）、そして、当業者によって必要に応じて適応され得る。
【実施例】
【０１８１】
本発明は以下の実施例によってさらに詳細に説明されるであろう。しかしながら、本発明はこれらの具体的な実施例に限定されるべきではない。
【０１８２】
本発明の核心は、血糖測定の分野における公知のＧＯｘｓに対して改良された特性、すなわち基質グルコースに対するその特異性およびオキシダーゼ活性からデヒドロゲナーゼ活性へのシフトを介した顕著に低下した酸素消費速度を維持していることおよび／または酸素以外の電子メディエーターに特異的な増大した酵素活性を有していること、を示す特定のＧＯｘ変異体の予期し得ないおよび驚くべき発見である。
【０１８３】
本発明のよるＧＯｘ変異体のＧＯｘ特性を証明するために、本発明者らは酸素分子の過酸化水素への還元を示す最も利用しやすい活性アッセイに頼ることができなかった。具体的には、媒介される電子移動に関してＺｈｕら（２００６；２００７）は、生成物ベースのＧＯｘ検出アッセイ（以下、ＧＯＤＡと称する）を確立した（Zhu, Z., Momeu, C., Zakhartsev, M., and Schwaneberg, U. (2006). Making glucose oxidase fit for biofuel cell applications by directed protein evolution. Biosensors and Bioelectronics 21, 2046-2051; Zhu, Z., Wang, M., Gautam, A., Nazor, J., Momeu, C., R, P., and U, S. (2007). Directed evolution of glucose oxidase from Aspergillus niger for ferrocenemethanol-mediated electron transfer. Biotechnology Journal 2, 241-248）。このアッセイは、実際グルコノラクトンの酸素非依存性の検出を可能にするが、しかしながら依然として、酸素の存在下では、酸素以外のメディエーターによって媒介される電子移動を特異的に検出することは不可能であり、これは、リアルタイム血糖分析装置の場合に、大いに関連性がある。
【０１８４】
以下の実施例において、本発明者らは、したがって、本発明の特定のＧＯｘ変異体を、本発明の核心を証明するために、それが媒介する電子移動、酸素による電子移動、およびそのグルコース特異性を別々に試験した。さらに、温度安定性に関する特性もまた試験された。
【０１８５】
結果として、本発明者らは、酸素に対するＧＯｘ変異体の活性を検出するために、広く公知のＡＢＴＳアッセイ（Sun, L., Bulter, T., Alcalde, M., Petrounia, I.P., and Arnold, F.H. (2002). Modification of galactose oxidase to introduce glucose 6-oxidase activity. Chembiochem 3, 781-783）を使用した。図１は、酸素に対する活性測定の原則を示している。
【０１８６】
ＧＯｘ変異体の試験
グルコース特異性、低下した酸素消費速度および／または酸素以外の電子メディエーターに対する増大した活性の観点から、ＧＯｘ特性におけるその改良のための適切なアミノ酸置換を試験するために、本発明の特定のＧＯｘ変異体が
（ｉ）その酸素消費速度に関して、すなわち、呈色ＡＢＴＳアッセイにおける電子受容体としての酸素を使用する酵素活性に関して、
（ii）メディエーターの例としてのニトロソアニリンメディエーターによって媒介される電子移動に関して、
（iii）基質として種々の糖、すなわちグルコース、ガラクトース、マルトース、キシロース、マルトトリオースの存在下、メディエーターの例としてのニトロソアニリンメディエーターによって媒介される電子移動に関して
試験された。
【０１８７】
前記媒介される電子移動のために、ｐ−ニトロソアニリン化合物が使用された（Becker, O. (2005). Die Glucose-Dye-Oxidoreduktase in der klinischen Diagnostik. DISSERTATION thesis, Technische Universitat Kaiserslautern, Kaiserslautern）。図２は、メディエーターアッセイ、すなわちＰＭＯ（りんモリブデン酸）−アッセイの原則が示されており、ここでは、ニトロソアニリンメディエーター、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−ニトロソアニリンが適用されている。
【０１８８】
上述のアッセイにおいて、メディエーター反応から生じる２つの電子が、ＰＭＯに移動される。ＰＭＯが続いて還元される。酸化ＰＭＯの淡黄色から、還元ＰＭＯの濃青色への色の変化が７００ｎｍでの吸収によってモニターされた。
【０１８９】
本発明による特定のＧＯｘ変異体を試験するために、上述のメディエーターアッセイは、リン酸カリウム緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．０）中、０．６５Ｕ／Ｌから２２Ｕ／Ｌまでの幅広い線形検出範囲を示す酵母細胞上澄み液中での低いＧＯｘ活性に適合された。前記条件下、９６ウェルプレート上において１０．２％の標準偏差が得られた。標準偏差の計算のため、バックグラウンドは、ネガティブコントロールの値を差し引くことによって考慮された（真の標準偏差）。
【０１９０】
グルコース酸化酵素変異体
本発明によって、Ｚｈｕら（２００６；２００７）に記載されている二重変異体が本明細書で提供される特定のアミノ酸置換のための出発物質として選択された。この二重変異体は、本質的に存在している２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖを有する（配列番号１）。ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖは、改善された熱安定性、改善されたｐＨ安定性および増加されたＫｃａｔ値（６９．５／ｓから１３７．７／ｓ）を示す（Zhu, Z., Wang, M., Gautam, A., Nazor, J., Momeu, C., R, P., and U, S. (2007). Directed evolution of glucose oxidase from Aspergillus niger for ferrocenemethanol-mediated electron transfer. Biotechnology Jounal 2, 241-248）。
【０１９１】
低グリコシル化サッカロミセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株が発現の宿主として選択された（Lehle, L., Eiden, A., Lehnert, K., Haselbeck, A., and Kopetzki, E. (1995). Glycoprotein biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae: ngd29, an N-glycosylation mutant allelic to och1 having a defect in the initiation of outer chain formation. FEBS Lett 370, 41-45）。
【０１９２】
本発明による特定のアミノ酸置換を担持する細胞クローンの培養後、メディエーターアッセイおよびＡＢＴＳアッセイが並行して行われた。増大したメディエーター活性、低下した酸素活性、またはその両方を示すクローンがさらなる試験のために選択された。したがって、選択されたクローンおよびコントロールが培養され、そして１２回スクリーニングされた。続いて、本発明による改良された変異体のＧＯｘ遺伝子が単離され、そしてシークエンシングされた。後に、選択された変異体の前記遺伝子はさらなる特異的なアミノ酸置換のためのテンプレートとして機能した。
【０１９３】
アミノ酸位置の特性分析
本発明者らはさらに、本明細書で提供されるＧＯｘ変異体の特定のアミノ酸位置、すなわちＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０を明らかにした。これらの位置は、図３に示されている。
【０１９４】
予備特性分析
特定のＧＯｘ変異体をさらに試験するために、本発明者らは、以下の特性
１）酸素消費、
２）基質としてのグルコース特異性、
３）ミカエリス−メンテン速度論（メディエーター活性／グルコース親和性）、および
４）温度安定性
を考慮して予備特性分析を行った。
【０１９５】
対応する細胞クローンの培養が従来の振とうフラスコ中で行われた。上済み液が濃縮され、そしてｐＨ７の０．２Ｍ  リン酸カリウム中で緩衝された。
【０１９６】
１）酸素消費速度
酸素消費は、材料および方法の段落のｇｇ）の項において概説されるように発色性基質ＡＢＴＳの酸化によって間接的に測定された。このデータを試験するために、酸素消費が光学的酸素プローブを用いて直接的に測定された。ＧＯｘ変異体は、反応導入において２Ｕ／Ｌに標準化された。
【０１９７】
２）特異性
上記に既に概説されているように、基質グルコースに対するＧＯｘ特異性は、グルコース周辺には例えばガラクトース、マルトース、キシロース、およびマルトトリオースの４つの糖などの臨床的に関連する糖が存在しているため、酵素的グルコース測定において主要な役割を果たしている。したがって、本明細書で提供されるＧＯｘ変異体の特性を証明するために、前記糖が選択され、そして、グルコースと比較された。これらの試験のためにはメディエーターアッセイが使用され、１８１．８ｍＭのそれぞれの糖が適用された。
【０１９８】
３）メディエーター活性／グルコース親和性
メディエーター活性におけるより詳細な試験のため、およびグルコース親和性のため、本発明者らは本明細書において開示される変異体のミカエリス−メンテン速度論に関する試験を行った。
【０１９９】
４）温度安定性
本発明の選択されたＧＯｘ変異体の温度安定性は、材料および方法の段落のｆｆ）の項において概説されるようなメディエーターアッセイを適用して分析された。追加のコントロールとして、アスペルギルス  ニガーにおいて発現された、過度にグリコシル化されたＧＯｘおよび脱グリコシル化されたＧＯｘ−ＷＴもまた分析された。
【０２００】
ＧＯｘ変異体ＧＯｘ−ＥＺ０７の最終的な特性分析
最終的な特性分析のために、ＧＯｘ−ＥＺ０７を発現しているＳ．セレビシエの各株が１０Ｌの発酵槽中で培養され、得られたＧＯｘ−ＥＺ０７が続いて精製された。最終的な酵素調製物の純度は、ｐＨ７の５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液中、９０％より高かった。予備特性分析段階と同様に、酸素消費、特異性、活性、およびグルコース親和性が試験された。ＧＯｘ濃度の具体的な決定には、ＥＬＩＳＡが適用された（材料および方法の段落のｅｅ）の項参照）。
【０２０１】
変異体ＧＯｘ−ＥＺ０７はまた、以下の観点
１ａ）酸素消費、
２ａ）基質としてのグルコース特異性、
３ａ）ミカエリス−メンテン速度論（メディエーター活性／グルコース親和性）、および
４ａ）温度安定性
においても特性分析された。
【０２０２】
１ａ）ＧＯｘ−ＥＺ０７の酸素消費
測定は１）に記載されるように行われた。全ての試験された酵素（ＧＯｘ−ＷＴ、ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖ、およびＧＯｘ−ＥＺ０７）は、材料および方法の段落のｄｄ）の項において概説されるような標準的なプロトコールで精製され、そして、５μｇ／ｍＬのタンパク質濃度に調製された。
【０２０３】
以下の酸素消費速度が検出された［％／分］：ＧＯｘ−ＷＴ：１７．４４；ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖ：２４．２２；および本発明のＧＯｘ−ＥＺ０７：３．８６．ＧＯｘ−ＥＺ０７の残余の酸素活性は、ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖと比較して１５．９％、および、ＧＯｘ−ＷＴと比較して２２．１３％である。
【０２０４】
２ａ）ＧＯｘ−ＥＺ０７の特異性
測定は２）に記載されるように行われた。
【０２０５】
３ａ）ＧＯｘ−ＥＺ０７のミカエリス−メンテン速度論
測定は３）に記載されるように行われた。
【０２０６】
４ａ）温度安定性
測定は４）に記載されるように行われた。
【０２０７】
結果
本発明者らは、低下した酸素消費速度および／または増大した酸素以外の電子メディエーターに対するメディエーター活性の原因となる、６つの別個のアミノ酸位置Ｓ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０を発見した。さらに、本発明者らは、当業者らが、グルコース特異性、顕著に低下した酸素消費速度、および／または酸素以外の電子メディエーターに対する増大した活性の観点からＧＯｘ変異体をデザインすることを可能にさせる６つのアミノ酸位置のあいだの協同的効果を発見した。
【０２０８】
とりわけ、本発明者らはＶ５６０およびＦ４１１の位置が、単独であるいは組み合わせで、顕著に低下した酸素消費速度の原因であること、および／または、顕著に増大したメディエーター活性の原因であることを発見した。加えて、位置Ａ１７３およびＡ３３２が、組み合わせで両方、すなわち本明細書で提供されるメディエーター活性の顕著な向上および同時にＧＯｘ変異体の酸素消費速度における顕著な低下の原因であることを発見した。位置Ｓ５３およびＡ１３７が酸素以外の特定のメディエーターに対するメディエーター活性を顕著に増加させることの原因であることが判明した。さらに、本発明者らは、本発明によって提供されるＧＯｘ変異体に適した特定のアミノ酸を発見した。
【０２０９】
【表１】
0006427110.tif 000002
【０２１０】
本発明の試験されたＧＯｘ変異体の特定の活性が表２にそれぞれのＥＺ番号付けによって示されている。表は、本発明の試験されたＧＯｘ変異体の、メディエーターアッセイを介したメディエーター活性およびＡＢＴＳアッセイを介した酸素消費特性に関する比較である。
【０２１１】
結果は、本発明のＧＯｘ変異体と親変異体、すなわち出発物質としてのＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖとのあいだの比（商）の形で示されている。種々のマイクロリットルプレートの結果が比較できた。比は、材料および方法の段落のｅｅ）の項において概説されるような従来のＥＬＩＳＡ法によって決定される、特定の活性（Ｕ／ｍｇ）に基づいている。表はまた、本発明による試験されたアミノ酸位置の正確な置換を示している。
【０２１２】
【表２】
0006427110.tif 000003
【０２１３】
結果は、本発明による不可欠な特性、すなわち顕著に減少された酸素消費速度をもたらす低下された酸素親和性および／または親変異体であるＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖと比較して増大されたメディエーター活性を有する種々の特定の変異体（ＥＺ０３、ＥＺ０５、ＥＺ１２、ＥＺ０６、ＥＺ０７、ＥＺ０８、ＥＺ１０、ＥＺ１１、ＥＺ１５）を示している。変異体ＥＺ０３、ＥＺ０５、ＥＺ０７、ＥＺ０８、およびＥＺ１０についてさらなる検討が行われた。
【０２１４】
例えば、本発明者らは、親変異体と比較して、ＧＯｘ−ＥＺ０７およびＥＺ１０が増大されたメディエーター活性に関する顕著な向上と酸素アッセイにおける顕著な減少との両方を示すことを発見した。
【０２１５】
とりわけ、本発明者らは、前記変異体の対応する特異的アミノ酸置換に全く限定されることなく、変異体ＥＺ０７が本発明による顕著に改善されたＧＯｘ変異体であることを発見した。ＥＺ０７は、親変異体と比較して４．４倍増大したメディエーター活性を示し、かつ、ＡＢＴＳアッセイにおいて親変異体の酸素活性の０．１倍の酸素活性しか示さなかった。対照的に、ＧＯｘ変異体ＥＸ１２およびＥＸ１５は、親変異体と比較して、メディエーター活性および酸素活性の両方において同時の増大を示している。ＥＺ１２は親変異体と比較してＳ５３位に追加の置換を担持している（表２参照のこと）。さらに、ＥＺ１５は、Ａ１３７Ｌのアミノ酸置換に起因してメディエーター活性において６倍の増大を有していることが発見された。
【０２１６】
アミノ酸位置の特性分析
Ａ１７３およびＡ３３２の位置は、活性部位からかなり離れている。Ａ１７３は、表面に位置しており、Ａ３３２は基質入口チャネルに近接して位置している。酸素活性に影響を及ぼすＦ４１４およびＶ５６０の２つの位置は、活性部位に近接して位置している。Ｆ４１４はグルコース結合部位の上方に位置しており、そして、Ｖ５６０はグルコースおよびＦＡＤに接して位置している。２つの活性位置Ａ１３７およびＳ５３の両方はＦＡＤに近接する表面位置である。
【０２１７】
予備特性分析
選択された予備特性分析された変異体の結果は以下のとおりである。
【０２１８】
１）酸素消費速度
図４は時間の関数としての反応混合物中の酸素含有量の進行（ａ）および１分あたりの酸素消費速度（ｂ）を示している。対照として、ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖ、ＧＯｘ−ＷＴおよびネガティブコントロール株の上澄み液が同様に分析された。
【０２１９】
ＧＯｘ−ＷＴおよびＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖは類似の挙動を示す。したがって、ここで試験されたＧＯｘ変異体（ＥＺ０３、ＥＺ０５、ＥＺ０７、ＥＺ０８、ＥＺ１０）の全てが、顕著に低下された酸素消費速度を有する。さらに、本発明の驚くべきおよび予期し得ぬ発見として、試験された変異体は、ネガティブコントロールから明確に識別されることができず、これは、それぞれの酸素活性が選択された条件下でのアッセイの検出範囲以下ですらあることを示している。
【０２２０】
２）特異性
表３はグルコースに関する残余のＧＯｘ酵素活性を示している。
【０２２１】
【表３】
0006427110.tif 000004
【０２２２】
ＧＯｘ−ＷＴおよび配列番号１に記載の親変異体ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖと比較して、本発明のＧＯｘ変異体のいずれも、マルトースまたはマルトトリオースとの顕著な干渉を示さなかった。ＥＺ０７およびＥＺ１０は、全ての試験された糖に関して最も良好な結果を与えている。
【０２２３】
３）メディエーター活性／グルコース親和性
ミカエリス−メンテン速度論が図５に示されている。表４は、ＶｍａｘおよびＫＭの計算値を示している。
【０２２４】
【表４】
0006427110.tif 000005
【０２２５】
表４は、親変異体ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖとの比較においておよそ７．５倍高いＶmax値をもつ一方、他方ではほぼ２倍高いＫM値を有していることを示している。しかしながら、高いＫM値は、高いＶmax値の結果である。図５において、低い基質濃度におけるＧＯｘ−ＥＺ０７の能力がＷＴおよび親変異体ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖに匹敵することが明確に把握され得る。ＧＯｘ−ＥＺ１０は類似の結果に到達したが、しかしながら、より低いＶmax値であった。
【０２２６】
４）温度安定性
図６に、８つの異なる温度における残余の活性が図示されている。
【０２２７】
本発明によって試験されたＧＯｘ変異体、ＧＯｘ−ＷＴおよびＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖ親変異体は、類似の結果を示している。温度安定性における顕著な降下が脱グリコシル化されたＧＯｘ−ＷＴにおいて観察され得るが、過度にグリコシル化されたＧＯｘ分子はより高い温度安定性を示している。
【０２２８】
結論
全ての予備特性分析試験における特定の試験１）〜４）の決論において、ＧＯｘ−ＥＺ０７およびＧＯｘ−ＥＺ１０変異体が最も重要な結果を示した。酸素活性における顕著な降下およびメディエーター活性における顕著な増大が、予備特性分析結果にしたがって達成された。ＧＯｘ−ＥＺ０７およびＧＯｘ−ＥＺ１０の特異性はほぼ変化せず、キシロースに対するわずかな活性変化のみが検出された。ＥＺ０７の活性はＥＺ１０の活性よりおよそ１．７倍高いため、ＧＯｘ−ＥＺ０７が最終的な特性分析に選択された。
【０２２９】
上記の結果は未精製の本発明のＧＯｘ変異体を用いて作製されたことが強調されるべきであろう。したがって当業者であれば、同様の精製されたＧＯｘ変異体を使用した後には結果が変わるかもしれないことに気付くであろう。またＥＬＩＳＡを適用する細胞上澄み液中の特定のタンパク質測定もまた不純物によって影響されるかもしれない。
【０２３０】
変異体ＧＯｘ−ＥＺ０７の最終的な特性分析
最終的な特性分析のために、精製されたＧＯｘ−ＥＺ０７変異体が選択された。
【０２３１】
１ａ）ＧＯｘ−ＥＺ０７の酸素消費
ＧＯｘ−ＷＴ、ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４ＶおよびＧＯｘ−ＥＺ０７のそれぞれの酸素消費速度が図７に示されている。
【０２３２】
選択された条件下、ＧＯｘ−ＥＺ０７の酸素消費速度は、ＧＯｘ−ＷＴと比較して１０倍以上低下しており、これは予備特性分析試験のデータを確証している。
【０２３３】
２ａ）ＧＯｘ  ＥＺ０７の特異性
図８は、グルコース（１００％）に関するＧＯｘ−ＷＴ、ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４ＶおよびＧＯｘ−ＥＺ０７の残余の活性を示している。図８は、ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４ＶおよびＧＯｘ−ＷＴと比較してＧＯｘ−ＥＺ０７の特異性において顕著な変化はないことを示している。
【０２３４】
３ａ）ＧＯｘ変異体ＧＯｘ−ＥＺ０７のミカエリス−メンテン速度論
図９は、メディエーターアッセイにおけるＧＯｘ−ＷＴ、ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４ＶおよびＧＯｘ−ＥＺ０７の速度論を比較している。
【０２３５】
図９によれば、ＧＯｘ変異体ＧＯｘ−ＥＺ０７は、ＧＯｘ−ＷＴと比較して、メディエーターアッセイにおいて６４１．５％の残余の活性、および、ＡＢＴＳアッセイにおいて１７．５％の残余の活性を示し、これは３７倍の低下されたオキシダーゼ活性をもたらしている。
【０２３６】
４ａ）ＧＯｘ−ＥＺ０７の温度安定性
図１０は、ＧＯｘ−ＷＴおよびＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖと比較して、ＧＯｘ−ＥＺ０７の温度安定性がそれぞれの置換によって維持されていたことを示している。
【０２３７】
ＧＯｘ変異体に関する結論
本明細書において提供されるＧＯｘ変異体のグルコース特異性、媒介される電子移動に関する酵素活性および酸素活性に影響を示す６つのアミノ酸位置が、親変異体ＧＯｘ−Ｔ３０Ｖ；Ｉ９４Ｖにおいて特定された。全ての位置が個々に飽和されている。協同的効果を調べるために活性部位（Ｓ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；Ｖ５６０）の周囲にクラスター化されている位置が同時に飽和された。親変異体の特性と比較して改良されたメディエーター活性および／または低下された酸素消費速度のための最も重要な変異体が予備特性分析のために選択された。変異体ＧＯｘ−ＥＺ０７（Ａ１７３Ｖ；Ａ３３２Ｓ；Ｆ４１４Ｉ；およびＶ５６０Ｔの追加の置換を有する）が、本発明の意味におけるグルコース特異性、メディエーター活性および酸素消費速度の試験された特性において最も顕著な結果を示している。
【０２３８】
したがって、ＧＯｘ−ＥＺ０７がそのメディエーター活性、オキシダーゼ活性、グルコース特異性、およびその温度安定性特性について集中的に調べられた。変異体は、媒介された電子移動に対する特異的活性において６．４倍の増加（ＧＯｘ−ＷＴ：７．４；ＧＯｘ−ＥＺ０７：４７．５  Ｕ／ｍｇ）およびＡＢＴＳアッセイにおいて５．７倍低下された活性（ＧＯｘ−ＷＴ：４５１．１  Ｕ／ｍｇ；ＧＯｘ−ＥＺ０７：７８．８６  Ｕ／ｍｇ）を示し、これは３６．５倍の低下されたオキシダーゼ活性をもたらしている。ＧＯｘ−ＥＺ０７は、温度安定性または特異性において何らの顕著な変化も示さない。
【０２３９】
材料および方法
全ての化学薬品は、分析用グレードであり、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＣａｒｌ  Ｒｏｔｈ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入された。全ての酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＫ）およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入された。ｐＨＥＳ２シャトルベクターおよび大腸菌株ＤＨ５ａは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入された。サッカロミセス  セレビシエ株７０８７（ｎｇｄ２９ｍｎｎｎ１）は、Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓより提供された（Lehle, L., Eiden, A., Lehnert, K., Haselbeck, A., and Kopetzki, E. (1995). Glycoprotein biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae: ngd29, an N-glycosylation mutant allelic to och1 having a defect in the initiation of outer chain formation. FEBS Lett 370, 41-45）。ＤＮＡはＮａｎｏＤｒｏｐ光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）を用いて定量化された。シークエンシングおよびオリゴヌクレオチド合成は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって行われた。使用されたプライマーは、表５に示されている（補足情報）。
【０２４０】
ａａ）多重サイトおよび単一サイト飽和的変異
多重サイトの飽和的変異のため、Ｏｍｎｉｃｈａｎｇｅプロトコールが適用された（Dennig, A., Shivange, A.V., Marienhagen, J., and Schwaneberg, U. (2011). OmniChange: The Sequence Independent Method for Simultaneous Site-Saturation of Five Codons. PLoS ONE 6, e26222）。４００μＬのＰＣＲ反応混合物は、１ｎｇ／μＬのプラスミドテンプレート、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１Ｕ  Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼおよび２００μＭ  ｄＮＴＰ’Ｓを含んでいた。反応混合物は、４つの等しい容積に分注され、そして、特定のサイトを標的とする２５０ｎＭのフォーワードプライマーおよびリバースプライマーがフラグメント増幅のために添加された。ベクター骨格増幅のための混合物において、追加のｄＮＴＰ’Ｓが最終的な濃度３００μＭに到達するように添加された。Ａ１７３を標的とするフラグメント１のために、プライマーＰ７およびＰ８がマスターミックスに添加された。一方、Ａ３３２飽和のためにはＰ９およびＰ１０が使用された。Ｆ４１４サイトはＰ１１およびＰ１２を使用することにより標的化された。Ｖ５６０サイトはベクターの骨格に含まれ、Ｐ１３およびＰ１４によって増幅された。フラグメント増幅のためのＰＣＲプログラムは、９８℃で４５秒間（１サイクル）；９８℃で１５秒間；６５℃で３０秒間；７２℃で３０秒間（２０サイクル）；７２℃で５分間（１サイクル）であった。ベクターの骨格の増幅のためには、伸長時間４分が適用された。全てのフラグメントはカラム精製され、そして、濃度がＮａｎｏＤｒｏｐ光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）上で測定された。ＰＣＲ産物は続いて、ＤＰｎＩによる終夜消化（それぞれ５Ｕ）に付された。
【０２４１】
フラグメントの消化およびライゲーション：インサートフラグメントの濃度は、０．０６ｐｍｏｌ／μＬに調製された。一方、ベクターの骨格の濃度は、０．０２ｐｍｏｌ／μＬに調製された（ＤｐｎＩ消化にともなう希釈因子もまた考慮された）。１μＬの切断溶液（５０％の（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０）、３０％の（１００ｍＭ  エタノール中のヨウ素）および２０％のｄＨ2Ｏ）がそれぞれのフラグメント  ４μＬに添加された。反応はその後７０℃で５分間インキュベートされた。切断されたフラグメントは一緒に混合され、そして、ライブラリー増幅のためのケミカルコンピテント大腸菌ＤＨ５ａの形質転換前に、室温（ＲＴ）にて５分間、インキュベートされた。酵母形質転換のために、遺伝子ライブラリーがプラスミド単離キット、「ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ」（ＭＡＣＨＥＲＹ−ＮＡＧＥＬ、Ｄｕｅｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて大腸菌ＤＨ５ａから単離された。
【０２４２】
個々の部位飽和変異導入（ＳＳＭ（site saturation mutagenesis））のために、２段階のＰＣＲプロトコールが行われた（Sambrook, J., and Russel, D. (2001). Molecular cloning: a laboratory manual, Volume 2 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)）。５０μＬのＰＣＲ反応混合物は、１ｎｇ／μＬのプラスミドテンプレート、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１Ｕ  Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼおよび３００μＭ  ｄＮＴＰ’Ｓを含んでいた。反応混合物は、２つの等しい容積に分注され、そして、標的とされたサイトの４００ｎＭのフォーワードプライマーおよびリバースプライマーが個々の反応混合物に添加された。ＰＣＲプログラムは、９８℃で４５秒間（１サイクル）；９８℃で１５秒間；６５℃で３０秒間；７２℃で４分間（５サイクル）；７２℃で５分間（１サイクル）であった。第１段階の後、両方の反応物がプールされ、そして、同じプログラムが、さらに１５回の伸長サイクルの繰り返しを伴って行われた。以下のプライマー、１７３位に対してＰ１５／Ｐ１６、３３２位に対してＰ１７／Ｐ１８、４１４位に対してＰ１９／Ｐ２０、および５６０位に対してＰ２１／Ｐ２２、が使用された。ＰＣＲ産物はカラム精製され、そしてその後、ＤＰｎＩ消化に付された。
【０２４３】
ｂｂ）遺伝子クローニングおよび酵母菌形質転換
突然変異されたＧＯｘ遺伝子のｐＹＥＳ２ベクターの骨格へのクローニングは、リガーゼフリーの方法を介する組換えによって行われた（Oldenburg, K.R., Vo, K.T., Michaelis, S., and Paddon, C. (1997). Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast. Nucleic Acids Research 25, 451-452）。始めに、２μｇのｐＹＥＳ２−ＧＯｘ  Ｔ３０Ｖ、Ｉ９４Ｖ二重変異体がＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ消化（１０Ｕ／μｇ  ＤＮＡ、６時間、３７℃）によって直鎖化され、続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩ−ｋｉｔ（ＭＡＣＨＥＲＹ−ＮＡＧＥＬ、Ｄｕｅｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いるゲル抽出により精製された。ライブラリーの増幅に使用されるプライマーは、プライマー配列の全体が直鎖化されたベクターの骨格に相補的であるようにデザインされた。
【０２４４】
次に、直鎖化されたｐＹＥＳ２ベクターおよび増幅された遺伝子ライブラリーが１：３の比率（２５０ｎｇ／７５０ｎｇ）で混合された。このＤＮＡミックスが、酢酸リチウム法（Gietz, R.D., and Schiestl, R.H. (2007). High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols 2, 31-34）を用いてサッカロミセス  セレビシエ７０８７の形質転換に使用された。形質転換体は、２％グルコースを含むＳＣ−Ｕ選択プレート上で培養された。環状プラスミドの形質転換には、３００ｎｇのＤＮＡが使用された。
【０２４５】
ｃｃ）９６ウェル中における培養および発現
２％グルコースを含むＳＣ−Ｕ選択寒天プレート上で培養されたシングルコロニーが、１ウェル当たり１００μＬのＳＣ−Ｕ培養液（１％グルコース）を含む９６ウェルマイクロリッタープレート（ＰＳ−Ｆ底、ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）中に楊枝を用いて移された。前培養のための培養は、以下の条件、９００ｒｐｍ、３０℃、７０％湿度、２４時間、の下、プレートシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ  ＧｍｂＨ、Ｅｉｓｅｎａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で行われた。一定の量の前培養物がそれぞれのウェルからディープウェルプレート（ｒｉｐｌａｔｅ−ｒｅｃｔａｎｇｕｌａｒ、ｒｉｔｔｅｒ）中の５００μＬ  ＳＣ−Ｕ自己誘導培養液（０．５％グルコース／２％ガラクトース）へと移された。本培養は、前培養と同じ条件下で、ただし７２時間培養された。プレートは２０分間、室温（ＲＴ）で、４０００ｒｐｍで遠心分離された。結果として得られた上澄み液が活性測定に使用された。
【０２４６】
ｄｄ）組換えＧＯｘの産生および精製
前培養：５００ｍＬのＳｙｎＹ培養液（２％グルコース）がＳｃ７０８７／ｐＹＥＳ２−ＧＯｘの終夜培養物を用いて、ＯＤ  ６００＝０．２まで播種され、培養が３０℃で１２時間および２５０ｒｐｍで５Ｌの振とうフラスコ中で行われた。本培養：１０ＬのＳｙｎＹ培養液（１％グルコース）が５００ｍＬの前培養物で播種された。培養のためには、１０Ｌの発酵槽が、以下の条件、温度：３０℃、攪拌：４００ｒｐｍ、通気：１ｖｖｍ、時間：４８時間、を適用して使用された。
【０２４７】
細胞分離およびバッファー交換：ＧＯｘを含有する上澄み液がマイクロろ過によって回収された。この目的のため、クロスフローろ過ユニットＳａｒｔｏＪｅｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が単一フィルターカセット（Ｓａｒｔｏｃｏｎ（登録商標）スライス、Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標）  ０．４５μｍ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に使用された。フィード圧は、２．０ｂａｒに、および出口圧は１．０ｂａｒに調節された。同じろ過システムが、限外ろ過用カセット（Ｓａｒｔｏｃｏｎ（登録商標）スライス, Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標）  １０ｋＤａ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を適用して、以下の条件、バッファー：５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ６；バッファー交換容積：７；フィード圧：２．０ｂａｒ；出口圧：１．０ｂａｒ；最終体積：０．５Ｌのもと、緩衝液交換およびサンプル濃縮のために使用された。
【０２４８】
酵素精製のため、アニオン交換クロマトグラフィーが、ＡＫＴＡパイロットシステムおよびＦｉｎｅＬＩＮＥ  パイロット  ３５  カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行われた。カラムは２２０ｍＬのレジン（フラクトゲル（登録商標）  ＴＳＫ  ＤＥＡＥ−６５０ｓ  Ｍｅｒｃｋ）で充填され、６２．５ｃｍ／時間の流速が選択された。平衡：４４０ｍＬの５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ６；ロードされたサンプル：０．５Ｌ濃縮物；洗浄：４４０ｍＬの５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ６；溶出：９５％  ５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ６／５％  １Ｍ  ＮａＣｌ（ステップ勾配）。ＧＯｘ含有留分がプールされ、その後５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ７に対する最終的なバッファー交換が行われた（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３０ｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃｏｒｋ、Ｉｒｅｌａｎｄ）。
【０２４９】
ｅｅ）タンパク質濃度の標準化
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）がＧＯｘ濃度の特異的測定のために使用された。ストレプトアビジンでコートされたマイクロリッタープレート（Ｒｏｃｈｅ−Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｎｏ.１１６４３６７３００１）のそれぞれのウェルが１００μＬの一次抗体溶液（２μｇ／ｍＬ；ウサギ  ＰＡＫ  ＧＯＤ−ビオチン  Ａｃｒｉｓ  Ｒ１０８３Ｂ）で満たされ、プレートは１時間、室温にてインキュベートされた。その後の洗浄工程（４回の、３５０μＬの９ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ_０．１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０）の後、１００ｍＬの酵素サンプルがピペットにてウェルに加えられ、第二のインキュベーション工程に続けられた。洗浄工程が繰り返され、そして、プレートが１００μＬの二次抗体溶液（１０μｇ／ｍＬ；ウサギ  ＰＡＫ  ＧＯＤ−ＨＲＰ  Ａｃｒｉｓ  Ｒ１０８３ＨＲＰ）によって満たされた。第３のインキュベーションおよび洗浄工程の後、プレートは１００μＬのＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液（１１６８４３０２００１、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって満たされた。プレートは、４０５ｎｍでの吸収が測定される前に、室温にて３０分インキュベートされた。アスペルギルス  ニガー由来のグルコース酸化酵素（Ｇ７１４１−５０ＫＵ  ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）が内部標準として使用された。
【０２５０】
ｆｆ）メディエーターアッセイ
液体取扱いのために、Ｂｒａｎｄ社製のマルチチャネルピペット（Ｔｒａｎｓｆｅｒｐｅｔｔｅ（登録商標）  Ｓ−８）およびＥｐｐｅｎｄｏｒｆ社製のマルチチャネルピペット（Ｒｅｓｅａｒｃｈ（登録商標）  ｐｒｏ）が使用された。７５μＬのサンプル（調製された上澄み液／酵素溶液）が９６ウェル平底マイクロプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）に移された。１００μＬのメディエーター溶液（１９．０５ｍＭ  Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−ニトロソアニリン（Becker, O. (2005). Die Glucose-Dye-Oxidoreduktase in der klinischen Diagnostik. DISSERTATION thesis, Technische Universitat Kaiserslautern, Kaiserslautern）、Ｒｏｃｈｅ−Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｎｏ.１０００８８３１４；５％（ｗ／ｗ）ポリビニルピロリドン、Ｒｏｃｈｅ−１０００３４７６９６４；ｐＨ７）および１０μＬの２５ｍＭ  りんモリブデン酸（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｎｉｓｙｓ−ｎｒ.：１１８８９８９３００１）が添加された。反応は２５μＬの基質溶液を添加すること、およびその後、１分間１０００ｒｐｍでプレートを振とうすることによって開始された。りんモリブデン酸還元の速度が、マイクロプレートリーダー、Ｔｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅ（登録商標）（Ｔｅｃａｎ  Ｔｒａｄｉｎｇ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて７００ｎｍでモニターされた。速度分析のため、ＶｍａｘおよびＫＭ値が、基質濃度の関数としてプロットされた（線形相関係数は０．９９より大きかった）初期速度データから決定された。
【０２５１】
ｇｇ）ＡＢＴＳアッセイ
液体取扱いのために、Ｂｒａｎｄ社製のマルチチャネルピペット（Ｔｒａｎｓｆｅｒｐｅｔｔｅ（登録商標）  Ｓ−８）およびＥｐｐｅｎｄｏｒｆ社製のマルチチャネルピペット（Ｒｅｓｅａｒｃｈ（登録商標）  ｐｒｏ）が使用された。７５μＬのサンプル（調製された上澄み液／酵素溶液）が、１００μＬのリン酸バッファー（ｐＨ７）を含む９６ウェル平底マイクロプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）に移された。２０μＬの反応混合物がそれぞれのウェルに添加され、以下の濃度が達成された：０．９１Ｕ／ｍＬ  ＨＲＰ；２．３ｍＭ  ＡＢＴＳ。反応は２５μＬの基質溶液を添加すること、およびその後、３０秒間１０００ｒｐｍでプレートを振とうすることによって開始された。ＡＢＴＳの酸化が、マイクロプレートリーダー、ＦＬＵＯｓｔａｒ（登録商標）  Ｏｍｅｇａ（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ）を用いて４１４ｎｍで速度論的に測定された。速度分析のため、ＶｍａｘおよびＫＭ値が、基質濃度の関数としてプロットされた（線形相関係数は０．９９より大きかった）初期速度データから決定された。
【０２５２】
ｈｈ）酸素消費アッセイ
酸素消費の直接的な測定のために、光学的な酸素プローブ「Ｆｉｂｏｘ３−ミニセンサー  酸素濃度計」（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ＧｍｂＨ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が使用された。１５４０μＬの反応混合物は、８４０μＬのリン酸バッファー（０．２Ｍ／ｐＨ７）、１７５μＬの基質溶液および５２５μＬのＧＯｘ溶液から構成された。酸素消費（％／分）が速度論的に決定された。
【０２５３】
ｉｉ）温度安定性
１００μＬの酵素溶液が１５分間、対応する温度でインキュベートされ、そしてその後、５分間氷上で冷却された。活性測定のために７５μＬが使用された。以下の温度：３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、および６５℃が試験された。
【０２５４】
【表５】
0006427110.tif 000006
【図１】
0006427110.tif 000007
【図２】
0006427110.tif 000008
【図３】
0006427110.tif 000009
【図４ａ】
0006427110.tif 000010
【図４ｂ】
0006427110.tif 000011
【図５】
0006427110.tif 000012
【図６】
0006427110.tif 000013
【図７】
0006427110.tif 000014
【図８】
0006427110.tif 000015
【図９】
0006427110.tif 000016
【図１０】
0006427110.tif 000017
【配列表】
0006427110000001.app