(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酢酸ウリプリスタル、またはCDB-3877、CDB-3963、CDB-3236およびCDB-4183からなる群から選択されるその代謝物の何れかを含む、BRCA1および／またはBRCA2遺伝子に変異を有する患者における乳房腫瘍の予防または処置用薬剤。
【請求項２】
乳房腫瘍の予防に使用するための、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
乳房腫瘍が癌である、請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項４】
経口で投与される、請求項１〜３の何れか１項に記載の薬剤。
【請求項５】
静脈内に投与される、請求項１〜３の何れか１項に記載の薬剤。
【請求項６】
膣または子宮内経路によって投与される、請求項１〜３の何れか１項に記載の薬剤。
【請求項７】
それを必要とする患者が女性の患者である、請求項１〜６の何れか１項に記載の薬剤。
【請求項８】
乳房腫瘍が良性腫瘍である、請求項１〜７の何れか１項に記載の薬剤。
【請求項９】
有効成分として酢酸ウリプリスタルを含む、請求項１〜８の何れか１項に記載の薬剤。
【請求項１０】
乳房腫瘍細胞の増殖、およびBRCA1／BRCA2変異乳房細胞の異常増殖に拮抗する、請求項１〜９の何れか１項に記載の薬剤。
【請求項１１】
避妊を必要とする女性患者において乳房腫瘍を予防するための、請求項１〜１０の何れか１項に記載の薬剤。
【請求項１２】
前記女性患者において避妊薬としても作用する、請求項１１に記載の薬剤。
【請求項１３】
酢酸ウリプリスタルまたはその代謝物を５mg〜８０mgの量で含む、請求項１〜１２の何れか１項に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酢酸ウリプリスタルでの乳房腫瘍の予防および治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
酢酸ウリプリスタル(ＵＰＡ)は、プロゲステロン標的組織中のプロゲステロン受容体に有効に結合し、これを阻害するプロゲステロン受容体モジュレーターである。
以前はCDB-2914として知られていたＵＰＡは、式Ｉ：
【化１】
0006322623.tif 000002
によって表される１７α−アセトキシ−１１β−[４−Ｎ, Ｎ−ジメチルアミノ−フェニル)−１９−ノルプレグナ−４,９−ジエン−３,２０−ジオンを示す。
【０００３】
ＵＰＡおよびその製造方法は、例えば、米国特許第4,954,490号；第5,073,548号；および第5,929,262号、ならびに、国際特許出願WO 2004/065405およびWO2004/078709に記載されている。
【０００４】
ＵＰＡは、緊急避妊用(商品名 EllaOne(登録商標))および子宮筋腫処置用(商品名 Esmya(登録商標))として承認されている。多様な他の可能性のある臨床適用が、Chabbert-Buffet et al, Human Reproduction, 2005, 11(3): 293-307に提案されている。
【０００５】
他の抗プロゲスチン剤、例えばミフェプリストンおよびオナプリストンは、乳癌処置用に開発された。１２３人の転移性乳癌を有する閉経後の女性の第二次治療または第三次治療におけるミフェプリストンまたはオナプリストンの投与は、それぞれ１１％の奏効率および４３％の患者の疾患安定化をもたらした(Romieu et al. 1987, Bull Cancer 74(4): 455-461; Klijn, et al. 1989, Cancer Res 49(11): 2851-2856)。残念なことに、それぞれミフェプリストンおよびオナプリストンの抗グルココルチコイド作用および肝毒性副作用のために、臨床試験は継続されなかった。
【０００６】
長時間ＵＰＡ暴露は、ホルモン応答性組織に影響し得て、特に乳房組織にも同様に影響し得る。しかし、Ｔ−４７Ｄ乳癌細胞株における遺伝子レポータートランス活性化試験しか報告されていない(Attardi et al. 2002, Mol Cell Endocrinol 188(1-2): 111-123; Attardi et al. 2004, J Steroid Biochem Mol Biol 88(3): 277-288)。
【０００７】
副作用を起こさないまたは副作用の少ない乳房腫瘍を処置および予防すらする治療薬の必要性が未だ存在する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の概要
本発明者らは、酢酸ウリプリスタル(ＵＰＡ)またはその代謝物の何れかを投与することを含む、患者において、乳房腫瘍を予防または処置する方法を提案する。
このため、患者において乳房腫瘍を予防または処置するのに使用するための、酢酸ウリプリスタル(ＵＰＡ)またはその代謝物の何れかを提供する。
【０００９】
好ましい態様において、患者は、BRCA1および／またはBRCA2遺伝子に変異を有する。
特に好ましい態様において、酢酸ウリプリスタル(ＵＰＡ)またはその代謝物の何れかは、BRCA1および／またはBRCA2遺伝子に変異を有する患者において、乳房腫瘍を予防するのに使用される。
他の好ましい態様において、酢酸ウリプリスタル(ＵＰＡ)またはその代謝物の何れかは、患者において、好ましくは乳癌である乳房腫瘍を処置するのに使用される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の詳細な説明
“患者”は、本発明の予防的または治療的処置の必要があるあらゆる対象、好ましくは女性の対象を意味する。しかし、男性も同様に乳房腫瘍に感受性であり得ることから、男性もまた包含する。
好ましくは、患者は、BRCA1および／またはBRCA2遺伝子に変異を有すると診断されている。
【００１１】
BRCA1およびBRCA2は、腫瘍抑制遺伝子である。
BRCA1またはBRCA2位置の変異事象は、コード配列および非コード配列の欠損、挿入および点変異を含み得る。欠損は、全遺伝子であっても遺伝子の一部のみであってもよい。点変異は、停止コドン、フレームシフト変異またはアミノ酸置換をもたらし得る。体細胞変異は、特定の組織、例えば腫瘍組織にのみ起こるものであって、生殖系列に遺伝されないものである。生殖細胞系列変異は、身体のあらゆる組織または細胞で見られ、遺伝する。単一対立遺伝子のみが変異したならば、乳癌の素因が示される。
【００１２】
特定の態様において、患者は、BRCA1またはBRCA2素因対立遺伝子の１コピーまたは２コピーを有し得る。
BRCA1またはBRCA2素因対立遺伝子は野生型対立遺伝子に対して劣性である、すなわち、少なくとも１つの野生型BRCA1またはBRCA2対立遺伝子を含む細胞は癌性ではないと考えられている。しかし、１つの野生型BRCA1またはBRCA2対立遺伝子および１つの素因対立遺伝子を含む細胞は、時折、ランダム変異または細胞分裂中の染色体喪失の何れかによって、野生型対立遺伝子の喪失を経験し得る。このような変異細胞の後代は全て、BRCA1またはBRCA2の野生型機能を失い、腫瘍に発達し得る。従って、BRCA1またはBRCA2の素因対立遺伝子は、癌に感受性であり、その易罹患性は優性に遺伝する。
【００１３】
変異対立遺伝子の大多数が、ナンセンスであるか、またはフレームシフトであり、タンパク質全長の５％〜９９％の長さで変化すると予測される切断型タンパク質を生じる。これらの変異の多くは、６１％のBRCA1コーディング領域を含むBRCA1遺伝子のエクソン11に属する。BRCA1の完全長ｃＤＮＡ配列およびBRCA1遺伝子のコーディング領域は、米国特許第5,747,282号に記載されている。
【００１４】
BRCA1またはBRCA2の変異は、当業者に既知の何れかの方法によって検出され得る。
Myriad社の最新BRCA診断テストであるBRACAnalysis(登録商標)は、BRCA1およびBRAC2遺伝子における乳癌の著しいリスクに関連する変異を識別するために、２つの伝統的な方法、すなわちサンガー配列決定およびＰＣＲの組み合わせを使用する。
【００１５】
BRCA1変異およびBRCA2変異をスクリーニングする他の方法は、一本鎖高次構造多型(ＳＳＣＰ)分析と遺伝子変異体の選択ＤＮＡ配列決定、またはＤＨＰＬＣと遺伝子変異体のＤＮＡ配列決定を含む。
また、BRCA1遺伝子の変異を検出するタンパク質をベースとする系を含む他の方法が、開示されている(米国特許第5,965,377号；第6,514,713号)。
【００１６】
用語“腫瘍”は、非制御増殖、不死性、転移能、急速な成長および増殖、および、特定の特徴的な形態学的特徴を含む、非定型増殖または非定型形態などの性質を有する細胞の存在をいう。“腫瘍”は、良性新生物および悪性(すなわち癌性)新生物を含む。腺腫および嚢腫を包含する。乳癌は乳癌腫を含む。乳癌は、乳房の異なる領域、すなわち乳管、小葉、或る場合では、その間の組織で始まり得る。本発明の内容では、非浸潤性、浸潤性、再発性および転移性乳癌を含む、乳房腫瘍または乳癌のあらゆるタイプを包含する。
特定の態様において、患者は遺伝性乳癌・卵巣癌(ＨＢＯＣ)と診断されている患者である。
【００１７】
本明細書では、乳房腫瘍に対する予防的および治療的方法を記載する。
“予防”または“予防する”は、無症状の患者または乳房腫瘍を示さない患者に、ＵＰＡまたはその代謝物の何れかを投与することを意味する。より具体的には、患者は、例えば、家族歴またはBRCA1および／またはBRCA2遺伝子状態を考慮して乳房腫瘍を発症するリスクがあり得る。このような予防は、乳癌の発症リスクを減らすことを意図する。
【００１８】
“治療的処置”または“処置する”は、ＵＰＡまたはその代謝物の何れかを、乳房腫瘍と診断されている患者に投与することを意味する。この処置は、疾患の症状を軽減し、疾患の進行を遅らせ、退縮を起こし得るか、または、疾患の完全回復をもたらし得る。
【００１９】
特に、ＵＰＡは、特に小葉および乳管(または乳管細胞)の腫瘍細胞、特にBRCA1変異細胞の増殖に拮抗することが示された。
【００２０】
特定の態様において、乳房腫瘍を発症するリスクがあり得るが、必ずしも発症しない患者は、さらに避妊の必要があるかもしれない。これは、特に、患者に定期的な避妊法がないとき、特に有用である。もしそうであれば、ＵＰＡまたはその代謝物の何れかは、定期的な避妊および乳房腫瘍の予防の両方を提供するために適合された形態および投与量で提案され得る。他の態様において、患者は、子宮筋腫を有し得て、子宮筋腫に対する処置および乳房腫瘍に対する治療的または予防的処置の両方の必要がある患者であり得る。或る場合において、ＵＰＡまたはその代謝物の何れかはまた、子宮筋腫の処置および乳房腫瘍の予防または処置の両方を提供するために適合させた形態および投与量で提案され得る。
【００２１】
好ましくは、酢酸ウリプリスタル(ＵＰＡ)が用いられる。しかし、ＵＰＡ代謝物も同様に用いられ得る。酢酸ウリプリスタルの代謝物は、Attardi et al, Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 2004, 88: 277-288に記載されたもの、例えばモノデメチレーテッドCDB-2914 (CDB-3877)；ジデメチレーテッドCDB-2914 (CDB-3963)；１７α−ヒドロキシCDB-2914 (CDB-3236)；CDB-2914の芳香族Ａ環誘導体(CDB-4183)を含む。好ましくは、代謝物は、モノデメチレーテッドCDB-2914 (CDB-3877)である。
【化２】
0006322623.tif 000003
【００２２】
ＵＰＡまたはその代謝物は、経口、静脈内または経皮などの様々な経路によって投与され得る。好ましい投与経路は経口経路である。腫瘍部位への注射もまた可能である。他の投与経路は、膣または子宮内経路を包含する。特定の膣または子宮内デバイスにおける、ＵＰＡまたはその代謝物の持続性放出を可能とするデバイスが特に有用であり得る。さらに、皮下インプラントが考えられ得る。
【００２３】
有用な投与単位を製造する方法および組成は、当業者によく知られている。例えば、有効成分を含む錠剤および丸薬を製造する慣用的な方法は、標準的な参考文献であるChase et al., Remington's Pharmaceutical Sciences, (16th ed., Mack Publishing Co., Easton. Pa., U.S.A., 1980) (“Remington's”)の1553〜1584頁に記載されている。散剤を製造する慣用的な方法および組成は、当該参考文献の1535〜1552頁に記載されている。医薬投与形をコーティングするための慣用的な方法は、Remington'sの1585〜1593頁に記載されている。
【００２４】
経口固体投与形は、好ましくは、コーティングされていてもされていなくてもよい圧縮錠またはカプセル剤である。
【００２５】
カプセル剤は、好ましくは、有効成分と不活性成分の混合物のための容器として硬ゼラチン殻または軟ゼラチン殻の何れかを用いた固体投与形である。硬ゼラチンカプセル剤および軟弾性カプセル剤の製造方法は、当技術分野でよく知られている。
【００２６】
圧縮錠は、実用的なサイズの圧縮錠の製造を可能にするために、有効成分の嵩を増やすための希釈剤である何れかの添加物を含み得る。粉末状物質に接着性をもたらすものである結合剤もまた必要である。澱粉、ゼラチン、乳糖やブドウ糖などの糖類、および天然ゴムや合成ゴムが使用される。崩壊剤は、錠剤において、錠剤の崩壊を助けるために必要である。崩壊剤は、澱粉、クレイ、セルロース、アルギン類、ゴムおよび架橋ポリマーを含む。最後に、製造工程で表面への錠剤原料の付着を防ぐために、そして製造中の粉末物質の流動性を改善するために、錠剤において、滑沢剤や滑剤として知られる少量の物質が含まれる。コロイド状二酸化ケイ素が滑剤として最も一般的に用いられ、タルクやステアリン酸などの化合物が滑沢剤として最も一般的に用いられる。圧縮錠の製造方法は、当業者によく知られている。
【００２７】
特定の態様において、酢酸ウリプリスタルまたはその代謝物は、酢酸ウリプリスタルまたはその代謝物が、乳糖一水和物、ポビドン(ポリビニルピロリドン)、クロスカルメロースナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムである添加物と混合されている、コートされていない錠剤の形態で用いられる(例えば国際特許出願 WO2010/066749に記載された通り)。
【００２８】
長期間処置、例えば少なくとも３ヶ月間の処置が好ましい。
予防において、処置は数年維持され得る。
治療的処置において、ＵＰＡは、数日間から数ヶ月間または数年間、例えば少なくとも３ヶ月間〜約５年間投与され得る。
【００２９】
投与量は、腫瘍の特定の状態および重症度、および、患者の性別および体重に適合させ得る。典型的な投与量は、０.１mg〜１５０mg、好ましくは５mg〜８０mg、さらに好ましくは１０mg〜５０mgの範囲である。毎日の投与が好ましい。
【００３０】
実施例および図面は、その範囲を減らすことなく本発明を説明している。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１：ＵＰＡはＭＭＴＶレポーター遺伝子トランス活性化に作用する。ＨＢＥ細胞に、MMTV-Luc受容体遺伝子を、(Ａ)単独で、または、(Ｂ)ｈＰＲ−ＡおよびｈＰＲ−Ｂ、(Ｃ)ｈＰＲ−Ａ、または(Ｄ)ｈＰＲ−Ｂのアイソフォームのプラスミドと組み合わせてトランスフェクトした。(Ｅ)Ｔ−４７Ｄ細胞をMMTV-Lucでトランスフェクトした。細胞を１００ｎＭのＰで、および／またはＵＰＡで、または、記載したときは１〜１,０００ｎＭ、特定しないときは１００ｎＭのＲＵで処置した。結果は、コントロールに対する誘発倍率に対応する(平均値±ＳＥＭ、ＨＢＥおよびＴ−４７Ｄについてｎ＝３)。＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.００１。
【図２】図２：ＵＰＡはＰＲ標的遺伝子発現に作用する。ＨＢＥ細胞およびＴ−４７Ｄ細胞において、ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、(Ａ)ＦＡＳＮ、(Ｂ)サイクリンＡ、(Ｃ)ＢＣＬ２、および(Ｄ)ＡＬＰＬについて分析した。細胞を１００ｎＭのＰおよび／またはＵＰＡ、および／または１０ｎＭのＥ２で処置した。結果は、コントロールに対する誘発倍率に対応する(平均値±ＳＥＭ、ＨＢＥについてｎ＝５、Ｔ４７Ｄについてｎ＝２)。＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１。
【図３】図３：ＵＰＡはＧＲＥレポーター遺伝子トランス活性化に作用する。GRE-Luc レポーター遺伝子を、(Ａ)ＨＢＥ細胞および(Ｂ)ＭＣＦ−７細胞にトランスフェクトした。細胞を１００ｎＭのＤＥＸおよび／またはＵＰＡによって処置した。結果は、コントロールに対する誘発倍率に対応する(平均値±ＳＥＭ、ＨＢＥについてｎ＝１３、ＭＣＦ−７についてｎ＝３)。＊ｐ＜０.０１、＊＊ｐ＜０.００１。
【図４】図４：ＵＰＡはＧＲ標的遺伝子発現に作用する。ＨＢＥ細胞およびＭＣＦ−７細胞において、ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、(Ａ)ＩＥＸ−１、(Ｂ)Ｇ０Ｓ８、(Ｃ)サイクリンＡ、(Ｄ)ＢＣＬ２について分析した。細胞を１００ｎＭのＤＥＸおよび／またはＵＰＡで処置した。結果は、コントロールに対する誘発倍率に対応する(平均値±ＳＥＭ、ＨＢＥについてｎ＝５、ＭＣＦ−７についてｎ＝２)。＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１、＊＊＊ｐ＜０.００１。
【図５】図５：ＵＰＡはホルモン媒介細胞増殖に作用する。細胞増殖を、[３Ｈ]チミジン取り込みによって、(Ａ)ＨＢＥ細胞、(Ｂ)Ｔ−４７Ｄ細胞および(Ｃ)ＭＣＦ−７細胞において測定した。ＨＢＥ細胞を９６時間、Ｔ−４７Ｄ細胞およびＭＣＦ−７細胞を４８時間、濃度１００ｎＭのＰ、ＤＥＸ、ＵＰＡ、および、１０ｎＭのＥ２で処置した。結果を％コントロールで表す(平均値±ＳＥＭ、ＨＢＥについてｎ＝７、Ｔ４７Ｄについてｎ＝４、ＭＣＦ−７についてｎ＝３)。＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１、＊＊＊ｐ＜０.００１。
【図６】図６：ＵＰＡは、ホルモン媒介細胞アポトーシスに作用する。細胞アポトーシスを、ｓｕｂ−Ｇ１フェーズのフローサイトメトリー定量化によって、(Ａ)ＨＢＥ細胞、(Ｂ)Ｔ−４７Ｄ細胞および(Ｃ)ＭＣＦ−７細胞において測定した。ＨＢＥ細胞を９６時間、Ｔ−４７Ｄ細胞およびＭＣＦ−７細胞を４８時間、濃度１００ｎＭのＰ、ＤＥＸ、ＵＰＡおよび１０ｎＭのＥ２で処置した。結果を％コントロールで表す(平均値±ＳＥＭ、ＨＢＥについてｎ＝９、Ｔ−４７Ｄについてｎ＝３、ＭＣＦ−７についてｎ＝４)。＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.００１。
【図７】図７：乳房組織の異種移植片におけるＰＲ、ＥＲおよびＫｉ６７発現。ＥＲ、ＰＲおよびＫｉ６７発現を免疫組織化学的に分析した。(Ａ) マウス中の処置前の元の乳房組織および処置された移植片におけるＥＲおよびＰＲラベリングの代表的な画像。(Ｂ) 移植された組織のＣ、Ｅ２、Ｅ２＋Ｐ、Ｅ２＋Ｐ＋ＵＰＡ処置群におけるＫｉ６７発現。×400倍。(Ｃ) 小葉および乳管における有糸分裂指数(Ｋｉ６７陽性細胞パーセンテージ)、コントロールに対する誘発倍率(平均値±ＳＥＭ、小葉についてｎ＝４、乳管においてｎ＝６)。＊ｐ＜０.０５。
【図８】図８は、移植されたBRCA1変異を有する(BRCA1+/-)または有しない(BRCA1+/+)組織の小葉細胞における、様々な処置に応答する誘発有糸分裂指数(Ｋｉ６７陽性細胞パーセンテージ)を示す。平均値±ＳＥＭ。
【図９】図９は、移植されたBRCA1変異を有する(BRCA1+/-)または有しない(BRCA1+/+)組織の乳管細胞における、様々な処置に応答する誘発有糸分裂指数(Ｋｉ６７陽性細胞パーセンテージ)を示す。平均値±ＳＥＭ。
【実施例】
【００３２】
実施例１：正常乳房上皮細胞(ＨＢＥ)および乳癌細胞株の増殖およびアポトーシスに対するＵＰＡの影響
材料および方法
ステロイド
プロゲステロン受容体アンタゴニスト酢酸ウリプリスタル(ＵＰＡ)およびそのモノ−Ｎ４デメチレーテッド代謝物CDB-3877(ＣＤＢ)は、HRA-Pharma (Paris, France)から恵与された。１７β−エストラジオール(Ｅ２)、プロゲステロン(Ｐ)、デキサメタゾン(ＤＥＸ)およびミフェプリストン／RU-486(ＲＵ)は、Sigma (St Quentin Fallavier, France)から購入した。
【００３３】
細胞培養手順
Ｔ−４７Ｄ細胞株およびＭＣＦ−７細胞株を、それぞれ１０％  ウシ胎児血清(PAA Laboratory, Les Mureaux, France)を加えたＲＰＭＩ １６４０培地およびＤＭＥＭ培地で維持した。Ｔ−４７Ｄ細胞株はヒト乳管癌由来であり、大量のＰＲ(プロゲステロン受容体)およびＥＲ(エストラジオール受容体)を構成的に発現した。正常ヒト乳房上皮細胞(ＨＢＥ)の初代培養物を２０人の女性(年齢１７〜５０歳)から得た。ＨＢＥ細胞の培養に用いられる手順は、Gompelらによって詳細に記載されている(Gompel, et al., 1986, J Clin Endocrinol Metab 63(5): 1174-1180)。ＨＢＥ細胞を、ヒドロコルチゾン(５ng/ml)、トリヨード−Ｌ−チロニン(６.５ng/ml)、コレラ毒素(１０ng/ml)、トランスフェリン(５mg/ml)、インスリン(０.０１６U/ml)、上皮増殖因子(１０ng/ml)(Sigma, St Quentin Fallavier, France)および５％  ヒト血清(Etablissement Francais du Sang)を含むＨＡＭ Ｆ１０培地(PAA Laboratory, Les Mureaux, France)で維持した。ＨＢＥ初代培養物は、上皮マーカー、ならびに低レベルのエストラジオール受容体(ＥＲ)およびエストラジオール誘発ＰＲを発現する(Malet, et al., 1991. J Clin Endocrinol Metab 73(1): 8-17; Courtin, et al., 2011, Breast Cancer Res Treat.)。
【００３４】
ステロイド処理
播種後、細胞を血清およびフェノールレッドを含まない培地中で２４時間培養した。次いで、５％  デキストラン−チャコール処理済み血清を含み、フェノールレッドを含まない培地中で、処理を行った。ＰまたはＤＥＸ単独(１００ｎＭ)、またはそのＵＰＡ、ＲＵ(１ｎＭ〜１μＭ)またはCDB-3877(１００ｎＭ)との組み合わせで、細胞を処理した。コントロール細胞を、１：１０００最終エタノール濃度のビークルとしてエタノールのみで、またはＥ２(１０ｎＭ)で処理した。
【００３５】
レポーター酵素アッセイ
細胞を、グルココルチコイドとプロゲステロン応答エレメント(ＧＲＥ／ＰＲＥ)を含むレポーター遺伝子プラスミドでトランスフェクトした。１) MMTV-Lucは、ｐＦＣ３１ベクターにおいて、蛍ルシフェラーゼ遺伝子上流の１ＧＲＥ／ＰＲＥ回文構造および３ＧＲＥ／ＰＲＥヘミ回文構造を含むマウス乳房腫瘍ウイルス長鎖末端反復プロモーターである。２) GRELucは、ｐＢＬベクターにおいて、蛍ルシフェラーゼ遺伝子上流ＧＲＥ／ＰＲＥ回文構造の６コピーを含む。示された時、ＨＢＥ細胞を、ＰＯＰ３ベクターにおいて構築されたヒトＰＲアイソフォームｈＰＲ−ＡおよびｈＰＲ−Ｂ発現プラスミドでトランスフェクトした。β−ガラクトシダーゼ上流ラウス肉腫ウイルスプロモーター(pRSV-β-Gal)を、コントロールとして各々の実験にトランスフェクトした。トランスフェクションは、製造者の説明書に従って、それぞれ乳癌細胞株またはＨＢＥ細胞のためのリポフェクタミン試薬またはリポフェクタミンＬＴＸ試薬(Invitrogen, Cergy-Pontoise, France)を用いて行った。トランスフェクションの２４時間後、乳癌細胞およびＨＢＥ細胞をそれぞれ２４時間または４８時間処理した。実験の最後に、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイ系(Promega, Charbonnieres-les-bains, France)を用いて決定した。ルシフェラーゼ活性データを標準化するために、β−ガラクトシダーゼ活性をGalacto Star kit (Applied Biosystems, Courtaboeuf, France)を用いて評価した。
【００３６】
リアルタイム定量的逆転写ＰＣＲ(ｑＲＴ−ＰＣＲ)
全ＲＮＡをTriZOL試薬(Invitrogen, Cergy-Pontoise, France)を用いて抽出した。
２μｇの全ＲＮＡについて、ランダムプライマーを用いて、３７℃で１時間逆転写(ＲＴ)を行った。２μｌのＲＴ産物を希釈し(１：１０)、配列特異的プライマー(３００ｎＭ)およびBrillant SYBR GREEN QPCR master mix (Fermentas, Saint-Remy-les-Chevreuse, France)を用いて、Mx3000P装置(Agilent Technologies, Massy, France)で、定量的ＰＣＲを行った。条件は、９５℃で１０分間を１サイクル、続いて９５℃で３０秒間、６０℃で１分間および７２℃で３０秒間を４０サイクルであった。遺伝子発現値を、ハウスキーピング遺伝子36B4に対して標準化した。ステロイド処理時間を、示された遺伝子に最適な刺激となるよう選択した。処理の６時間後にＡＬＰＬおよびＧ０Ｓ８のｍＲＮＡを分析した。処理の２４時間後にＩＥＸ−１、ＦＡＳＮおよびＢＣＬ２を分析した。ＧＲ応答について２４時間後、またはＰＲ応答について４８時間後に、サイクリンＡのｍＲＮＡを分析した。
【００３７】
トリチウム化チミジン組み込み
ホルモン処理の２４時間後、[メチル−１ ３Ｈ]チミジン(Perkin Elmer, Courtaboeuf, France)と共に、３７℃で、ＨＢＥまたは癌細胞についてそれぞれ４８時間または２０時間、細胞をインキュベートした。インキュベーション後、細胞を、ＰＢＳ  １Ｘで２回、５％  トリクロロ酢酸(ＴＣＡ)で１回洗浄した。細胞を、５％  ＴＣＡ中で、４℃で１５分間インキュベートし、０.１ＮのＮａＯＨで３７℃で３０分間溶解させた。全細胞ライセートを、５mlのEcolite scintillation liquid (MP biomedical, Illkirch, France) に加え、放射活性を、β−カウンター HIDEX 300SL(ScienceTec, Courtaboeuf, France)で計数した。
【００３８】
フローサイトメトリー分析
ＨＢＥ細胞またはＭＣＦ−７細胞およびＴ−４７Ｄ細胞についてそれぞれホルモン処理の９６時間後または４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、マトリックスを、accutase酵素(PAA laboratory, Les Mureaux, France)で分離し、１３５０rpmで５分間遠心分離した。細胞を固定し、７０％  エタノール中で−２０℃で凍結した。分析の前に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１０μg/mlのヨウ化プロピジウム(０.８３５U/mlのＲＮＡアーゼＡを含む)(Sigma, St Quentin Fallavier, France)で染色した。各サンプルについて、少なくとも１０,０００細胞を、BD LSR II フローサイトメトリー(BD Biosciences, Le Pont de Claix, France)で計数した。ダブレットとデブリを排除後、サイクル分布を ModFit LT software (Verity Software House,USA)を用いて分析した。
【００３９】
統計分析
結果を平均値±ＳＥＭで表した。処理の統計的有意性を決定するために、一元配置ＡＮＯＶＡおよびテューキー・クレーマー多重比較検定を行い、Instat 3 software (GraphPad, USA)で各処理の相対的有効性を比較した。２つの処理のみを比較したときは、独立ｔ検定を行った。ｐ＜０.０５を有意と考えた。
【００４０】
結果
ＵＰＡはＰＲ遺伝子トランス活性化に作用する
ＰＲ誘発遺伝子トランス活性化に対するＵＰＡのアンタゴニスト性を分析するために、正常ヒト乳房上皮細胞(ＨＢＥ)およびＴ−４７Ｄ乳癌細胞株を、MMTV-Lucレポーター遺伝子でトランスフェクトした(図１)。患者の中で少量および可変量のＰＲを発現したＨＢＥ細胞において(Malet, et al., 1991. J Clin Endocrinol Metab 73(1): 8-17)、プロゲステロン(Ｐ)は、著しくルシフェラーゼ発現を誘発した(コントロールに対する誘発倍率＝１.３８±０.１１, ｐ＜０.０５)(図１Ａ)。ＰＲに対するＵＰＡ投与の効果をより良く試験するために、ＨＢＥ細胞を、ｈＰＲ−ＡおよびｈＰＲ−Ｂ発現プラスミドでコ−トランスフェクトした(図１Ｂ)。ＵＰＡおよびＲＵ−４８６(ＲＵ)は、１,０００〜１０ｎＭで用量依存でＰ誘発MMTV11 Luc トランス活性化を阻害した。次いで、ＰＲアイソフォーム間でのＵＰＡ作用を区別するために、ＨＢＥ細胞をｈＰＲ−ＡのみまたはｈＰＲ−Ｂのみでトランスフェクトした。ＵＰＡアンタゴニスト作用について、各ＰＲアイソフォームのレベル上昇に差異は見られなかった(図１Ｃ、１Ｄ)。Ｔ−４７Ｄ細胞株において、ＵＰＡおよびＲＵは、１,０００〜１０ｎＭで、同様の強力なＰＲアンタゴニスト作用を示した(図１Ｅ)。また、部分アンタゴニスト応答が１ｎＭで検出された(図１Ｅ)。ＨＢＥ細胞およびＴ−４７Ｄ細胞の両方において、ＵＰＡおよびＲＵは、レポーター遺伝子転写に対するプロゲステロンアゴニスト性を示さなかった(図１Ｂ〜Ｅ)。これらの結果は、ＵＰＡが、正常および癌性乳房細胞において、強力なＰアンタゴニストとして作用することを示した。
【００４１】
ＰＲ標的遺伝子のｍＲＮＡ発現に対するＵＰＡ活性
１００ｎＭは、ＨＢＥ細胞において完全アンタゴニスト活性を発揮するのに必要な最も低いＵＰＡ濃度であった。そのため、この濃度が、ＨＢＥ細胞およびＴ−４７Ｄ細胞において特異的Ｐ標的遺伝子に対するＵＰＡの作用をさらに調べるために選択された。以前に報告された通りＰＲ発現を増加させるために、エストラジオール(Ｅ２)をＨＢＥ細胞に加えた。
【００４２】
脂肪酸合成(ＦＡＳＮ)は、正常乳房細胞分化および乳房腫瘍進行に関与している。ＰＲを介したプロゲスチンによるＦＡＳＮのｍＲＮＡの上方制御が、以前に、インビトロおよびインビボで、正常乳房細胞および腫瘍性乳房細胞において証明された。図２Ａに示す通り、ＵＰＡは、Ｔ−４７Ｄ細胞で見られるように、ＦＡＳＮのｍＲＮＡ発現のＰ誘発をＨＢＥにおいて防ぐことができた。我々は、ＰＲによってトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞で以前に報告された通り(Lin, et al., 2003, Endocrinology 144(12): 5650-5657.)、正常乳房細胞およびＴ−４７Ｄ細胞において、ＰがサイクリンＡのｍＲＮＡ発現を下方制御することを観察した(図２Ｂ)。ＵＰＡは、ＨＢＥおよびＴ−４７Ｄにおいて、Ｐ誘発サイクリンＡのｍＲＮＡ下方制御を逆転させた(図２Ｂ)。我々は、以前に、正常乳房細胞および腫瘍性乳房細胞において、プロゲスチン処理下での抗アポトーシスＢ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２(ＢＣＬ２)タンパク質発現の減少を報告した(Kandouz, et al., 1996, Int J Cancer 68(1): 120-125; Gompel, et al., 2000, Steroids 65(10-11): 593-598)。図２Ｃに示された通り、我々はまた、ＨＢＥ細胞およびＴ−４７Ｄ細胞において、ＰによるＢＣＬ２のｍＲＮＡ発現の減少を観察した。
【００４３】
それにもかかわらず、ＵＰＡは、ＨＢＥ細胞において、Ｐによって誘発されるＢＣＬ２のｍＲＮＡ下方制御を逆転しなかったが、ＵＰＡは、Ｔ−４７Ｄ細胞において、この転写に対するＰの阻害作用に拮抗した(ｐ＜０.０１)(図２Ｃ)。組織非特異的アルカリホスファターゼ(ＡＬＰＬ)は、乳癌の転移に関与するＰ応答性遺伝子である。Ｔ−４７Ｄにおいて、ＵＰＡは、Ｐが媒介するＡＬＰＬ転写の強力な誘発を完全に阻害した(図２Ｄ)。ＨＢＥ細胞において、ＡＬＰＬのｍＲＮＡ発現は、Ｐ処理によって修飾されなかった(データ示さず)。ＵＰＡは、これらの遺伝子に対するＰＲアゴニスト活性を全く示さなかった。
【００４４】
ＵＰＡはＧＲ遺伝子トランス活性化に作用する
この試験は、以前に報告された通りに(Courtin, et al.; 2011, Breast Cancer Res Treat.)、多量のＧＲを発現したＨＢＥ細胞およびＭＣＦ−７細胞で行った。細胞をGRE-Lucレポーター遺伝子でトランスフェクトさせ、デキサメタゾン(ＤＥＸ)、ＵＰＡおよびその近位モノデメチレーテッド代謝物であるCDB-3877(ＣＤＢ)(ＵＰＡより抗グルココルチコイド活性が低いことが知られている (Attardi, et al., 2004, J Steroid Biochem Mol Biol 88(3): 277-288.))で処理した。ＵＰＡは４１.３±５.８％までＤＥＸ誘発ルシフェラーゼトランス活性化を阻害するが、この代謝物はＨＢＥ細胞においてＤＥＸ活性を阻害しなかった(１８.１±１１.８％)(図３Ａ)ことから、我々は、この代謝物の低下した抗グルココルチコイド活性を確認した。しかし、ＭＣＦ−７細胞では、ＵＰＡおよびＣＤＢの両方が、それぞれ５９±３.４％および２６.５±９.１％までＤＥＸ誘発ルシフェラーゼトランス活性化に顕著に拮抗した(図３Ｂ)。これらの結果は、ＵＰＡの抗グルココルチコイド効力が、ＨＢＥ細胞よりもＭＣＦ−７乳癌細胞で強いことを示唆している。
【００４５】
ＧＲ標的遺伝子のｍＲＮＡ発現に対するＵＰＡ活性
ＨＢＥ細胞およびＭＣＦ−７細胞におけるＵＰＡ抗グルココルチコイド作用をより良く定義するために、様々なグルココルチコイド応答性遺伝子のｍＲＮＡ発現を、ＤＥＸおよびＵＰＡ処理後に分析した。最初期応答３(ＩＥＸ−１)およびＧタンパク質シグナリング２レギュレーター(Ｇ０Ｓ８)は、それぞれ、ストレス条件下での細胞生存およびＧタンパク質シグナリングに関与する。ＩＥＸ−１およびＧ０Ｓ８は、グルココルチコイド応答性遺伝子として特性決定された。図４Ａに示された通り、ＩＥＸ−１のｍＲＮＡ発現は、ＤＥＸによって下方制御され、ＵＰＡは、ＨＢＥ細胞およびＭＣＦ−７細胞において、この応答に拮抗しなかった。他方、ＵＰＡは、Ｇ０Ｓ８のｍＲＮＡ上方制御に対して、僅かに、有意でない拮抗作用を奏したが、その抗グルココルチコイド活性は、ＭＣＦ−７細胞において強力であった(ｐ＜０.００１)(図４Ｂ)。サイクリンＡおよびＢＣＬ２遺伝子は、以前に、インビトロで、骨芽細胞および神経芽腫においてそれぞれＤＥＸによって制御されることが示された。このため、ＨＢＥ細胞およびＭＣＦ−７細胞において、サイクリンＡおよびＢＣＬ２のｍＲＮＡ発現に対するＤＥＸおよびＵＰＡの作用を分析した。ｍＲＮＡ発現がＨＢＥ細胞中で誘発され、ＭＣＦ−７細胞で抑制されるため、サイクリンＡは、２種の細胞で、ＤＥＸによって異なって制御された(図４Ｃ)(Courtin, et al.; 2011, Breast Cancer Res Treat.)。両方の細胞モデルにおいて、ＵＰＡは、サイクリンＡのｍＲＮＡ発現に対するＤＥＸの作用を一部阻害した。ＢＣＬ２のｍＲＮＡは、ＨＢＥ細胞およびＭＣＦ−７細胞において、ＤＥＸによって下方制御された(図４Ｄ)。しかし、ＵＰＡは、ＨＢＥ細胞において、ＢＣＬ２のｍＲＮＡのＤＥＸ下方制御を逆転しなかったが、ＵＰＡは、ＭＣＦ−７細胞においてこの効果に一部拮抗した。ＵＰＡは、これらの遺伝子に対してグルココルチコイドアゴニスト活性を全く示さなかった(図４)。
【００４６】
増殖およびアポトーシスに対するＵＰＡの作用
Ｐおよびグルココルチコイドは、正常および腫瘍性乳房細胞に対する異なる増殖作用および生存作用を誘発できる。これらの細胞事象に対するＵＰＡの役割を評価するために、増殖およびアポトーシスを、３つの細胞モデルで、トリチウム化チミジン取り込み(図５)およびフローサイトメトリー(図６)によってそれぞれ測定した。ＰＲに対するＵＰＡの作用を、ＨＢＥおよびＴ−４７Ｄで試験したが、我々は以前にＭＣＦ−７細胞株でＰＲ機能性がないことを証明したことから(Courtin, et al.; 2011, Breast Cancer Res Treat.)、ＭＣＦ−７細胞では試験しなかった。本明細書で用いられるＴ−４７Ｄ細胞はＧＲを発現しないため(Courtin, et al.; 2011, Breast Cancer Res Treat.)、ＧＲに対するＵＰＡの作用は、ＨＢＥ細胞およびＭＣＦ−７細胞でのみ試験した。ＨＢＥ細胞において、ＵＰＡは、Ｐによって誘発される抗増殖作用を阻害しなかった(図５Ａ)。逆に、ＵＰＡは、ＤＥＸによって誘発される強い増殖活性を阻害した(図５Ａ)。Ｔ−４７Ｄ細胞において、ＵＰＡは、Ｐの抗増殖活性を逆転させた(図５Ｂ)。ＭＣＦ−７細胞において、ＵＰＡは、ＤＥＸの弱い抗増殖作用を妨げる傾向があった(図５Ｃ)。ＵＰＡ処理のみでは、何れのタイプの細胞においても、増殖に対して作用を有さなかった(図５)。アポトーシスは、フローサイトメトリー分析による細胞のｓｕｂ−Ｇ１パーセンテージの定量化によって測定した。Ｐは、ＨＢＥ細胞において、抗アポトーシス性を表すＤＥＸとは対照的に、強いアポトーシス促進作用を奏した(図６Ａ)。ＵＰＡと組み合わせたとき、両方のホルモンの活性を逆転させた。同様に、Ｐはｓｕｂ−Ｇ１細胞のパーセンテージを増加させ、ＵＰＡはＴ−４７Ｄ細胞においてこの効果を阻害する傾向があった(図６Ｂ)。ＭＣＦ−７において、ＤＥＸは、アポトーシス促進性を示すが、これはＵＰＡによって完全に阻害された(図６Ｃ)。ＵＰＡはそれ自身ではアポトーシス性または生存性はないが、ＨＢＥ細胞、Ｔ−４７Ｄ細胞およびＭＣＦ−７細胞において、ＰおよびＤＥＸ作用の大部分を相殺する。
【００４７】
実施例２：ヌードマウスに異種移植された正常ヒト乳房組織を有するインビボ実験モデルに対するＵＰＡの影響
材料および方法
患者
乳房組織サンプルを、臨床試験に関するフランスの法律に従ってインフォームドコンセントを得た乳房縮小術のための手術を行う６人の女性(２９〜４２歳)から得た。患者には乳房の疾患の病歴はなく、ヘマトキシリン−フロキシン−サフラン(ＨＰＳ)染色を含む免疫組織学的試験は、正常乳房組織のみを示した。
【００４８】
マウスにおけるヒト乳房異種移植およびペレット処置
４週齢の卵巣切除したメスのNMRInu/nu 20胸腺欠損マウスを、Janvier laboratory (Le Genest Saint Isle, France)から購入した。乳房組織サンプルを６人の女性(２９〜４２齢)から得た。ヒト乳腺組織を２×２×２mmの断片に切断し、４つの断片を群当たり４匹のマウスの背中に皮下で異種移植した。４つの処置群とした：コントロール、Ｅ２、Ｅ２＋Ｐ、および、Ｅ２＋Ｐ＋ＵＰＡ。処置は、各マウスの首にステロイドペレットを移植することによって投与した。実験条件を、最初に、ペレットにコレステロールと混合したホルモンの投与量範囲を用いることによって決定した。血液サンプルアッセイを処置２週後および４週後に行い、血漿ホルモン濃度を測定した。最後に、期待される血液濃度を提供するように、０.３mgのＥ２および２０mgのＰおよびＵＰＡの投与量を用いた。コントロール群について、コレステロールのみを含むペレットを用いた。月経周期条件を再現するために、実験初日に、マウスに、コレステロール、Ｅ２および／またはＵＰＡを含むペレットを移植し、１４日目に、コレステロールまたはプロゲステロンを含むペレットを、コントロール群およびＥ２群に、または、Ｅ＋Ｐ群およびＥ２＋Ｐ＋ＵＰＡ群にそれぞれ移植した。実験開始後２８日目にマウスを屠殺した。各マウスの血液を集め、血清をホルモン濃縮まで−２０℃で凍結した。
【００４９】
分析
乳房組織断片を集め、免疫組織化学的分析のために、すぐにパラホルムアルデヒド溶液で固定化した。全ての実験プロトコルおよび動物の部屋の環境条件は、the French Ethic committee for the care and use of laboratory animals Charles Darwinによって承認されたものである。
【００５０】
ホルモン濃縮分析
臨床アッセイエストラジオール−２(Sorin Biomedica Diagnostics SpA, Saluggia, Italia)を用いた放射イムノアッセイによって、エストラジオールを測定した。プロゲステロンレベルを、Acquity ＵＰＬＣ および Quattro Premier XE (Waters, Milford MA, USA)を用いるＵＰＬＣ−ＭＳＭＳによって評価した。
ＵＰＡ濃度を、MPI Research (State College, Pennsylvania, USA)によって、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を用いて測定した。
【００５１】
免疫組織化学的分析
Ｋｉ６７抗体を用いて有糸分裂指数を計算し、マウスに移植した各乳房組織について決定した。免疫組織化学的分析は、BOND-MAX workstation (Leica, Nanterre, France)を用いて行った。乳房組織異種移植片のパラフィン切片を脱蝋して３０分間再水和した後、Ｋｉ６７抗体についてクエン酸回収溶液(ｐＨ ６.０)またはＰＲおよびＥＲα抗体についてＥＤＴＡ回収溶液(ｐＨ ９.０)を用いて抗原を回収した。次いで、切片を、１：１００のＫｉ６７(Novocastra, NCL5 L-Ki67-MM1)、１：８０のＰＲ(Biogenex, MU-328-UC)または１：３００のＥＲ(Novocastra, NCL-L6 ER-6F11)モノクローナル抗体と共にインキュベートした。シグナル検出のために、the Kit Bond Polymer Refire Detectionを用いた。試薬を Menarini-Diagnostic (Rungis, France)から購入した。ネガティブコントロール(第１抗体を除く)を各セットに含めた。それぞれのマーカーについて、各マウスに移植された４つの乳房組織断片中の総量１,０００個の小葉細胞および１,０００個の乳管細胞において、陽性細胞の割合を決定した。各実験において、各処置の最終パーセントは、群当たり４匹のマウスで得られたパーセンテージの平均値であった。
【００５２】
結果
乳房組織増殖に対するＵＰＡ作用
発明者らは、乳房組織へのＵＰＡの長期間投与を調べるために、インビボモデルを開発した。ヒト正常乳房組織サンプルを、Ｅ２またはＥ２＋ＰまたはＥ２＋Ｐ＋ＵＰＡ、またはコレステロール(コントロール)で処置された胸腺欠損マウスに異種移植した(実験手順を参照のこと)。ヒトの女性の月経周期で生じるＥ２およびＰ分泌の時系列を再現するために、Ｅ２ペレットを実験の最初に移植し、一方、Ｐペレットを１４日目に移植した。慢性処置を模倣するために、ＵＰＡペレットを実験の最初に移植した。マウスの血清中のＥ２、ＰおよびＵＰＡ濃度を測定し、処置方法を確認した。マウスの血清中の平均Ｅ２濃度は、卵胞期に報告された生理的Ｅ２レベルの低い範囲に対応して、３６.８８±４.２５pg/mlであった(平均±ＳＥＭ)。Ｐレベルは、黄体中期の女性の平均Ｐ血清レベルと同じ１３.０５±１.１４ng/mlであった(平均値±ＳＥＭ)。ＵＰＡ濃度は、臨床的使用で見られる範囲と同じ範囲で、６３.４９±１０.４６ng/ml(平均値±ＳＥＭ)であった。ホルモンレベルは、コントロールマウスで検出できなかった(Ｅ２＜０.８pg/ml；Ｐ＜０.４ng/ml；ＵＰＡ＜０.５ng/ml)。図７Ａに示された通り、エストラジオール受容体(ＥＲ)およびＰＲ発現は、移植前の元の乳房組織と比較して、実験終了時の処置され移植された乳房組織断片で維持された。我々は、処置による腺性小葉および乳管における乳房組織の増殖活性を決定するために、有糸分裂Ｋｉ６７発現マーカーを分析した(図７Ｂ、Ｃ)。移植された組織のコントロール群において、有糸分裂細胞の割合は低く均一であり、小葉で１.７±０.４％、乳管で１.８±０.６％であった。増殖活性は、コントロール群と比較したとき、Ｅ２処置群の小葉において、僅かに、有意でない程度に増加した(図７Ｂ、Ｃ)。しかし、乳管において、有糸分裂指数は、Ｅ２処置群で著しく上昇した(コントロール群に対して３.１±０.７誘発倍率, ｐ＜０.０５)。小葉構造および乳管構造のＥ２処置と比較して、Ｅ２＋Ｐ群およびＥ２＋Ｐ＋ＵＰＡ群で有意な差異は観察されなかった(図７Ｂ、Ｃ)。これらの結果は、乳房組織の増殖活性が主にＥ２によって媒介されることを強く示唆している。また、我々は、ＵＰＡが正常上皮乳房細胞の増殖速度にあまり影響しないことを示した。
【００５３】
実施例３：ヌードマウスに異種移植されたBRCA1ヒト乳房組織に対するＵＰＡの影響
材料および方法
変異乳房組織サンプルをBRCA1に変異を有する５人の女性(３６〜５７歳)から得た。
異種移植を上記(実施例２)の通り行った。通常、１人のBRCA1変異を有さない患者由来の４つの乳房組織断片と、１人のBRCA1変異を有する患者由来の４つの乳房組織断片を、同じマウスの脊椎左側および右側にそれぞれ移植した。同じ群を形成した。
【００５４】
結果
発明者らは、BRCA1変異を有する患者で集めたヒト乳房組織の増殖に対するホルモンの作用を調べるために、上の章で記載したものと同じモデルを用いた。移植前には、ＥＲα発現に関する高変動性が、BRCA1変異を有する患者の小葉構造と乳管構造の両方で観察された。ＰＲの基礎発現レベルは、野生型対立遺伝子を有する患者の小葉構造と比較して、BRCA1変異を有する患者で低かった。対照的に、BRCA1状態は乳管構造でＰＲ発現レベルに影響しなかった。Ｋｉ６７の発現による増殖状態の測定値は、BRCA1患者由来の小葉細胞で高いが、乳管細胞では野生型の患者よりも低い。
【００５５】
移植後、処置を行っていないとき、ＥＲα発現の有意な統計学的修飾は見られず、一方、小葉構造と乳管構造の両方において、ＰＲ発現レベルは移植前よりもさらに低い傾向であった。両方の構造において、ホルモン刺激のないことが、増殖の減少をもたらした。
【００５６】
Ｅ２、Ｐ、Ｅ２＋ＰまたはＥ２＋Ｐ＋ＵＰＡによる２８日間の処置は、ＥＲα発現レベルの有意な変動をもたらさなかった。Ｅ２またはＥ２＋ＰまたはＥ２＋Ｐ＋ＵＰＡの何れかを受けたマウスにおいて、乳房組織断片でＰＲ発現の増加傾向が観察された。この増加は、BRCA1変異を有する３人の患者の小葉構造で、より特定的に観察された。
増殖がＥ２＋Ｐ処置の組み合わせによって刺激された各場合において、ＵＰＡは、抗増殖活性を示した(図８および図９参照)。
【００５７】
実施例４：ヌードマウスに異種移植されたヒト乳房腫瘍増殖に対するＵＰＡの影響
材料と方法
この試験に用いた異種移植片モデルは、ＨＢＣｘ−３４であった。ＨＢＣｘ−３４は、野生型Ｐ５３を有し、ＨＥＲ２の過剰発現がなく、ＰＲとＥＲαの過剰発現がある乳管癌である。腫瘍は、アドリアマイシン／シクロホスファミドに高応答性であり、ドセタキセルおよびカペシタビンに応答性であった。ＨＢＣｘ−３４は、悪液質性を示さなかった。
【００５８】
腫瘍移植片モデル誘発：前処置手順
ＨＢＣｘ−３４腫瘍(P14.0.0/2)を、５〜１０匹のマウス(ドナーマウス, 継代(ｎ−１), メスの胸腺欠損ヌードマウス(Hsd:Athymic Nude-Fox1nu), ６〜９週齢, Harlan Laboratories (Gannat, France))に皮下移植した。これらの腫瘍が１０００〜２０００mm3に達したとき(６０〜７８日間)、ドナーマウスを頸部脱臼によって屠殺し、腫瘍を無菌的に切除し、解剖した。壊死領域を除いた後、腫瘍を約２０mm3に測って断片に切断し、さらなる成分を全く含まない滅菌ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地に、移植前に最大１０分間移した。
【００５９】
健康な６〜９週齢の少なくとも２０ｇの体重があるマウスを、試験に含めた。マウスをケタミン／キシラジンで麻酔し、皮膚をクロルヘキシジン溶液で殺菌し、肩甲骨間領域のレベルで切開し、２０mm3の腫瘍組織断片を皮下組織に配置した。皮膚をクリップで閉じた。
【００６０】
腫瘍移植片モデル誘発：処置フェーズ
腫瘍体積に従ってマウスを異なる群に振り分け、各処置アームで同じ平均および中間腫瘍体積とした。７５〜１４４mm3の間のＨＢＣｘ−３４腫瘍を有する１０マウス／群を、腫瘍体積に従って、実験群にランダム化し、処置(ＵＰＡ １３０mg/kg, 経口, またはコントロールビークル)を、腫瘍移植後３３日目に、４２日間の全持続時間で開始した。
【００６１】
分析
外見、行動および臨床変化についてマウスを観察した。動物の体重を、全実験期間中、週２回測った。異なる処置の毒性を体重減少として決定した。
腫瘍体積を、全実験期間中、週２回評価した。腫瘍を処置の終了時に回収し、秤量し、分析のために処理した。
【００６２】
結果
ＵＰＡ処置は耐容性がよく、この試験中で著しい体重減少は記録されなかった。処置関連臨床所見は実験期間中報告されなかった。
処置開始時の平均腫瘍体積(ＴＶ)は、コントロール群およびＵＰＡ処置群において、それぞれ１１２.２±７.１mm3および１０２.４±７.７mm3であった。
【００６３】
処置終了時で、腫瘍体積は、コントロール群において４.６３倍増加し、６２５.０±１０８.６mm3の平均腫瘍体積であった。
ＵＰＡは、抗腫瘍活性を示した。平均ＴＶは、ＵＰＡ処置マウスにおいて、２.１７倍増加した(屠殺時の平均ＴＶ：３３２.０±６１.０mm3)。処置群 対 コントロール群(Ｔ／Ｃ)のＴＶ比は５３％であった。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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