(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
角膜血管新生の非ヒト動物モデルを製造する方法であって、非ヒト動物の少なくとも１つの眼に有効量のベンゼンおよびフェノールから選択される芳香族化合物を適用することを含む方法。
【請求項２】
投与される前記芳香族化合物の有効量が、１μｍｏｌ〜７０μｍｏｌである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非ヒト動物がげっ歯類である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記芳香族化合物が、水性ビヒクルとして投与される請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの眼に麻酔薬を投与することをさらに含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法により調製された角膜血管新生の非ヒト動物モデルであって、角膜に実質的に線維症を有していない前記非ヒト動物モデル。
【請求項７】
角膜拡張性疾患の非ヒト動物モデルを製造する方法であって、非ヒト動物の少なくとも１つの眼に有効量のベンゼンおよびフェノールから選択される芳香族化合物を適用することを含む方法。
【請求項８】
前記芳香族化合物の有効量が、３０μｍｏｌ〜８５μｍｏｌである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記非ヒト動物がげっ歯類である請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記芳香族化合物が、水性ビヒクルとして投与される請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記角膜拡張性疾患が円錐角膜である請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法により調製された角膜拡張性疾患の非ヒト動物モデル。
【請求項１３】
前記の少なくとも１つの眼の角膜が丸い形状から円錐形状となる変化を特徴とする構造的歪みを含む請求項１２に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１４】
角膜血管新生または角膜拡張性疾患を調節するための化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）非ヒト動物の少なくとも１つの眼の角膜にベンゼンおよびフェノールから選択される芳香族化合物の有効量を適用することを含む方法によって、角膜血管新生または角膜拡張性疾患の非ヒト動物モデルを調製すること
；
（ｉｉ）試験化合物を前記非ヒト動物モデルの前記の少なくとも１つの眼に投与すること；および
（ｉｉｉ）前記角膜での血管成長および前記角膜の構造的歪みの少なくとも１つに対する前記試験化合物の効果を判定することを含む前記方法。
【請求項１５】
前記試験化合物が、前記芳香族化合物の適用の前に、同時に、または後に投与される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記芳香族化合物が、水性ビヒクルとして適用される請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記角膜拡張性疾患が円錐角膜である請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、角膜疾患の非ヒト動物モデル、特に、円錐角膜などの角膜拡張性疾患および角膜血管新生の動物モデルに関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、既存の血管から新しい血管が形成される生理学的過程である。治療戦略としての、特に腫瘍および癌の治療のための、血管新生を阻害するという概念は、数十年前から議論されており、現在、血管増殖が構成要素となる一連の病理および病状の治療のための有望なアプローチであると考えられている。抗血管新生戦略は、現在、抗癌療法としてだけでなく、関節炎、網膜症、心疾患および循環系の問題の治療のためにも追求されている。したがって、血管新生の実験動物モデルは、血管形成および血管の成長の研究、異なる化合物の血管新生への影響の評価、ならびに抗血管新生または血管新生促進活性を有する化合物を同定する化合物のスクリーニングにとって重要である。
【０００３】
角膜は無血管であるため生体内血管新生の理想的モデルと考えられており、したがって、任意の血管発達（すなわち、新生血管の発生）は、通常、目の角膜領域に適用される物質または化合物に直接起因する。従って、生体内血管新生を研究するために開発された多くの動物モデルは、角膜血管新生のモデルである。 これらの動物モデルは、一般に、角膜ポケットまたは虹彩インプラントを動物の眼に導入することによって製造される
【０００４】
角膜ポケットモデルでは、腫瘍組織、細胞懸濁液、または増殖因子などの血管新生の誘発因子が、角膜に形成されたポケット内に配置され、新しい血管の形成を誘発する。しかしながら、角膜ポケットの形成は、しばしば困難な手順であり、典型的にはメスを用いた層状切開によって行われ、角膜内に血管形成の誘発物質が導入される空間または「ポケット」を形成する。処置の外科的性質のために、使用される麻酔薬に関連する問題、切開中の眼の前房の穿孔、血管新生の誘発物質の不適切な調製、および外科創傷それ自体に起因する血管形成または外科創傷を縫い合わせるために使用される縫合糸により合併症が起こる。さらに、組織操作および縫合により、ならびにしばしば異物である角膜ポケットに挿入された血管新生の誘発物質に応答して炎症反応が起こり得る。眼内への異物の挿入に対する反応はまた、臓器または組織における余分な線維性結合組織の形成である線維症を引き起こし得る。線維症は、通常、修復または反応プロセスの結果である。
【０００５】
さらに、本発明者の知る限りでは、現在、円錐角膜のような角膜拡張性疾患の動物モデルは存在しない。角膜拡張症は、視力低下、視力障害、またはその両方を伴う角膜の薄化または弱化に起因する角膜の進行性の膨隆である。円錐角膜は、より一般的な角膜拡張性疾患の１つであり、典型的な丸い形状から目の角膜領域から外側に突出または膨らんだ円錐形状となる角膜の構造的歪みを特徴とする。角膜拡張性疾患の動物モデルは、生体内でこれらの疾患を研究するためのツールを提供するだろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、血管新生の従来技術のモデルに関連するいくつかの欠点を克服する生体内血管新生の新しい動物モデルが必要とされている。これらの疾患を研究するために使用することができる角膜拡張性疾患の動物モデルも必要である。本発明は、生体内血管新生の従来技術の動物モデルに関連するいくつかの欠点を克服する角膜血管新生の動物モデルを提供することにより、この必要性を満たす。 本発明はまた、円錐角膜のような角膜拡張性疾患の動物モデルを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの一般的な態様において、本発明は、非ヒト動物の少なくとも１つの眼の角膜に式（Ｉ）の芳香族化合物の有効量を適用することを含む、角膜血管新生の非ヒト動物モデルを製造する方法に関する；
【化１】
0006397937.tif 000002
式中、Ｒは、ヒドロキシル、ハロゲン、アルキル、アルコキシおよびアミノからなる群から選択され、ｎは０、１、２、３、４、５、または６である。
【０００８】
本発明による角膜血管新生の非ヒト動物モデルを製造する方法の特定の実施形態において、投与される式（Ｉ）の芳香族化合物の有効量は、約１μｍｏｌ〜約７０μｍｏｌである。
【０００９】
他の一般的な態様において、本発明は、非ヒト動物の少なくとも１つの眼の角膜に式（Ｉ）の芳香族化合物の有効量を適用することを含む、角膜拡張性疾患の非ヒト動物モデルを製造する方法に関する；
【化２】
0006397937.tif 000003
式中、Ｒは、ヒドロキシル、ハロゲン、アルキル、アルコキシおよびアミノからなる群から選択され、ｎは０、１、２、３、４、５、または６である。
【００１０】
本発明による角膜拡張性疾患の非ヒト動物モデルを製造する方法の特定の実施形態において、式（Ｉ）の芳香族化合物の有効量は、約３０μｍｏｌ〜約８５μｍｏｌである。
【００１１】
さらに別の一般的な局面において、本発明は、角膜血管新生または角膜拡張性疾患を調節するための化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）非ヒト動物の少なくとも１つの眼の角膜に式（Ｉ）の芳香族化合物の有効量を適用することを含む方法によって、角膜血管新生または角膜拡張性疾患の非ヒト動物モデルを調製すること：
【化３】
0006397937.tif 000004
（ｉｉ）試験化合物を上記非ヒト動物モデルの上記の少なくとも１つの眼に投与すること；および
（ｉｉｉ）上記の少なくとも１つの眼における角膜での血管成長および角膜の構造的歪みの少なくとも１つに対する上記試験化合物の効果を判定することを含み、
Ｒは、ヒドロキシル、ハロゲン、アルキル、アルコキシおよびアミノからなる群から選択され、ｎは０、１、２、３、４、５、または６である上記方法に関する。
【００１２】
本発明の他の態様は、本発明の方法によって製造された角膜血管新生および円錐角膜の非ヒト動物モデルに関する。
【００１３】
本発明の特に好ましい実施形態において、式（Ｉ）の芳香族化合物は、ベンゼンまたはフェノールである。
【００１４】
さらに別の一般的な態様において、本発明は、ヒトの健康に有害な物質を同定する方法であって、
（ｉ）非ヒト動物の少なくとも１つの眼の角膜に試験物質を適用すること；および
（ｉｉ）角膜における血管成長および角膜の構造的歪みの少なくとも１つに対する試験物質の影響を測定することを含む。
【００１５】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に記載されている。他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１６】
本発明の上記の概要および以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めばよりよく理解されるであろう。本発明を例示する目的で、図面には現在好ましい実施形態が示されている。しかしながら、本発明は、図面に示され、以下の本発明の詳細な説明に記載された正確な構成および手段に限定されないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、３．０Ｍフェノール溶液で処理する前後のウィスターラットの右眼の写真画像を示す；図１Ａ：フェノールを適用する前の右眼の写真画像；および、図１Ｂ：３．０Ｍフェノール溶液（１０μｌ）を１回局所適用した３週間後の右眼の写真画像であり、角膜内の血管の観察された成長の模式図を示す挿入図である；図１Ｃ：３．０Ｍのフェノール溶液（１０μｌ）を１回局所適用した８週間後の、ヘマトキシリンおよびエオシン染色で染色された角膜上皮膜切片の画像。
【図２】図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、ベンゼン溶液の適用の１５日後に様々な濃度のベンゼン溶液を一度適用して処理したウィスターラットの右眼の写真画像を示す；図２Ａ：４．０Ｍベンゼン溶液（１０μｌ）で処理した眼；図２Ｂ：６．０Ｍベンゼン溶液（１０μｌ）で処理した眼；および、図２Ｃ：７．０Ｍベンゼン溶液（１０μｌ）で処理した眼。
【図３】図３は、７．０Ｍのベンゼン水溶液の適用の１５日後のウィスターラットの眼の写真画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書で言及される全ての特許および刊行物は、参考として援用される。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。そうでなければ、本明細書で使用される特定の用語は、明細書に記載された意味を有する。
【００１９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の参照が含まれることに留意されたい。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「非ヒト動物」は、ヒトではない任意の動物、最も好ましくは哺乳動物をいう。哺乳類の例には、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、サル、ヒツジおよびげっ歯類が含まれる。げっ歯類の例としては、ラット、マウス、ウサギ、およびモルモットが含まれる。好ましくは、非ヒト動物は、ラット、マウス、ウサギおよびモルモットからなる群から選択されるげっ歯類であり、より好ましくはラットである。
【００２１】
本明細書で使用される「角膜」という用語は、虹彩、瞳孔、および前房を覆う眼の前の透明組織を指す。角膜は無血管であり、通常は血管がないことを意味する。角膜はまた、典型的には丸い形状を有する。
【００２２】
本明細書で使用される「血管新生」および「新血管形成」は、既存の血管から新しい血管が形成される生理学的過程を指す。本明細書で使用される「角膜血管新生」および「角膜新血管形成」という用語は、角膜における１つまたは複数の新しい血管の成長を指す。角膜は無血管である、すなわち血管を含まないので、角膜内の新しい血管は、典型的には、眼の輪部の血管叢領域から角膜内への血管の成長から生じる。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「線維症」は、通常、修復的または再生的プロセスの結果としての、器官または組織における線維性結合組織の形成を指す。線維性結合組織は瘢痕組織であり得る。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「角膜拡張症（corneal ectasia）」および「角膜拡張性疾患（corneal ectatic disease）」は、乱視の結果として視力の障害を引き起こす角膜の不規則性によって特徴付けられる角膜の非炎症性疾患をいう。角膜拡張症は、円錐角膜、ペルーシド角膜変性（pellucid marginal degeneration）、角膜黄斑、および後角膜形成術を含む状態の群を指し、最も一般的には、特にヒトにおいて円錐角膜である。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態によれば、角膜拡張性疾患は円錐角膜である。「円錐角膜」という用語は、角膜の構造に影響を及ぼす疾患を指す。円錐角膜では、角膜の形状は典型的な丸い形状から外側に膨らんだ円錐形状にゆっくりと変化し、突起を形成する。円錐角膜はまた、角膜の「形状の損失」として説明することができる。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「構造的歪み」は、角膜に関して使用される場合、角膜の膨らみまたは突出によって特徴付けられる角膜の形状の変化を意味する。特定の実施形態では、「構造的歪み」は、角膜の形状が丸い形状から眼の外側に突出する円錐形状に変化することを指す
【００２７】
本明細書で使用される「有効量」は、所望の生理学的結果を誘発するために必要な式（ｉ）の化合物の量を指す。一実施形態では、有効量は、角膜における１つ以上の新しい血管の成長を誘発する量である。別の実施形態において、有効量は、角膜の構造的歪みを引き起こす量である。
【００２８】
本明細書で使用される「アルキル」という用語は、少なくとも１個の炭素原子、好ましくは１〜２０個の炭素原子、より好ましくは１〜３個の炭素原子を含む飽和の、非分枝の、または分枝の炭化水素鎖を意味する。非分枝アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシルが含まれるが、これらに限定されない。分枝アルキル基の例としては、イソプロピルおよびｔｅｒｔ−ブチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「アルコキシ」は、一般式−ＯＲ（式中、Ｒはアルキル基を表す）を有する単位を示す。アルコキシ基の例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシおよびブトキシが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書で使用する「ハロゲン」という用語は、当業者に知られている通常の意味を有する。ハロゲンの非限定的な例としては、フルオロ、ブロモ、クロロおよびヨードが挙げられる
【００３１】
アルキル基は、非置換であるか、または１つ以上の適切な置換基で置換されていてもよい。アルキル基が置換される場合、それは１個以上の置換基、好ましくは１〜３個の置換基、より好ましくは１〜２個の置換基を有することができる。アルキル基が置換され得る適切な置換基の代表的な例としては、ハロゲン、例えばフルオロ、クロロ、ブロモおよびヨード；ヒドロキシル；アルコキシ、例えばメトキシ、エトキシおよびプロポキシ；およびアミノが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明は、角膜血管新生および円錐角膜などの角膜拡張性疾患の非ヒト動物モデルに関する。非ヒト動物モデルは、ベンゼンまたはフェノールなどの芳香族化合物を非ヒト動物の眼に適用することによって製造される。本発明者は、驚くべきことに、眼に適用される芳香族化合物の量に依存して、角膜血管新生および／または角膜拡張性疾患が誘発され得ることを発見した。例えば、芳香族化合物のより少ない量は、角膜血管新生を誘発するが、芳香族化合物の増加した量は、角膜拡張性疾患を誘発するために典型的に必要とされる。
【００３３】
一つの一般的な局面において、本発明は、角膜血管新生の非ヒト動物モデルを製造する方法に関する。本発明の実施形態によれば、この方法は、非ヒト動物の少なくとも１つの眼に有効量の式（Ｉ）の芳香族化合物を適用することを含む；
【化４】
0006397937.tif 000005
式中、Ｒは、ヒドロキシル、ハロゲン、アルキル、アルコキシおよびアミノからなる群から選択され、ｎは０、１、２、３、４、５または６である。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態によれば、式（Ｉ）の芳香族化合物は、ベンゼンまたはフェノールである。ベンゼンは、ｎが０である式（Ｉ）の芳香族化合物である。フェノールは、Ｒがヒドロキシルであり、ｎが１である式（Ｉ）の芳香族化合物である。特に好ましい態様において、芳香族化合物はフェノールである。
【００３５】
式（Ｉ）の芳香族化合物の有効量は、非ヒト動物の眼に、限定されるものではないが局所適用および注射を含む当技術分野で公知の任意の方法によって適用することができる。好ましくは、有効量の式（Ｉ）の芳香族化合物を局所投与する。本発明で使用することができる局所用組成物の例としては、クリーム、ゲル、軟膏、および液体組成物、例えば溶液、懸濁液および点眼剤が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい局所用組成物としては、液体組成物、特に点眼剤が挙げられる。
【００３６】
本発明の実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、本開示を考慮して当該分野で公知の任意の方法によって角膜に局所適用することができる。式（Ｉ）の化合物を局所適用するための方法の非限定的な例としては、滴下および拭き取りが挙げられる。好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、滴下によって角膜に投与される。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態において、式（Ｉ）の芳香族化合物は、液体組成物中で眼に局所適用され、より好ましくは水性ビヒクルの形態で適用される。本明細書で使用される「水性ビヒクル」は、水と式（Ｉ）の芳香族化合物とを含む液体組成物である。水性ビヒクルの非限定的な例としては、溶液、懸濁液、点眼剤などが挙げられる。本発明の特定の実施形態において、水性ビヒクルは、水およびベンゼンまたはフェノールを含有する。
【００３８】
本発明の実施形態によれば、式（Ｉ）の芳香族化合物は眼の角膜に適用され、好ましくは角膜の中心に直接適用される。式（Ｉ）の芳香族化合物は、動物の片眼または両眼に適用することができる。本発明の特定の実施形態では、式（Ｉ）の芳香族化合物を動物の一方の眼にのみ適用することが好ましい。これは、第２の未処置の眼が対照として機能することが可能になるからである。
【００３９】
本発明の実施形態によれば、角膜血管新生の非ヒト動物モデルを製造するのに必要な式（Ｉ）の化合物の有効量は、約１μｍｏｌ〜約７０μｍｏｌ、より好ましくは３０μｍｏｌ〜７０μｍｏｌ、例えば、約１μｍｏｌ、５μｍｏｌ、１０μｍｏｌ、３０μｍｏｌ、４０μｍｏｌ、５０μｍｏｌ、６０μｍｏｌ、または７０μｍｏｌである。有効量の式（Ｉ）の化合物を１回または２回以上適用することができる。好ましくは、式（Ｉ）の有効な芳香族化合物は、単一の適用で投与される。
【００４０】
異なる動物種間、時には同じ種の動物間で血管新生応答に差があるため、角膜血管新生を誘発するために動物の眼に適用する式（Ｉ）の芳香族化合物の有効量は、限定されるものではないが、動物の特定の種、動物の年齢などを含む様々な要因に依存し得る。当業者は、本開示の観点から所望の生理学的応答を達成するために、非ヒト動物の眼に適用することができる式（Ｉ）の芳香族化合物の有効量を容易に決定することができるであろう。当業者であれば、式（Ｉ）の芳香族化合物に対する血管新生反応において同じ種の動物間で可変性が存在し得ることも理解するであろう。
【００４１】
当技術分野で公知の任意の方法を用いて、式（Ｉ）の芳香族化合物の特定の量の血管形成活性を評価し、そのような量が所望の量の角膜血管新生を誘発するのに有効であるかどうかを決定することができる。例えば、血管形成活性の効力は、新たに形成された毛細血管および血管の数または成長速度を決定することによって、または血管新生スコアを計算することによって評価することができる。血管形成スコアは、以下の式：（血管密度）×（輪部からの距離）に従って計算することができる。輪部は、角膜と強膜（眼の白）の境界である。血管密度値１は、角膜当たり約０〜２５血管に対応し；２の値は角膜当たり約２５〜５０血管に対応し；３の値は角膜当たり約５０〜７５血管に対応し；値４は、角膜当たり約７５〜１００本の血管に対応し；５の値は角膜当たり１００以上の血管に対応する。輪部からの距離は、眼球グリッドを用いて測定することができる（ｍｍ単位）。
【００４２】
別の例示的な例として、血管形成活性は、組織学的研究によって評価することができる。例えば、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を用いて、切開された角膜組織を染色し、新しい血管の形成を検出することができる。３．０Ｍフェノール溶液の単一局所適用の８週間後に、Ｈ＆Ｅ染色で染色された角膜上皮膜切片の画像である図１Ｃに示すように、異なる生物学的構造を検出して血管形成活性および角膜血管新生の進行を評価することができる。特に、矢印１は正常角膜上皮を指し、矢印２は正常な角膜には存在しないフェノールの適用によって誘発される新血管成長を指し、矢印３は角膜の正常な間質組織を指す。
【００４３】
例示的かつ非限定的な例として、式（Ｉ）の芳香族化合物がベンゼンまたはフェノールである場合、有効量は、約１μｍｏｌ〜約７０μｍｏｌ（すなわち、約７５μｇ〜約５．５ｍｇ）、好ましくは３０μｍｏｌ〜７０μｍｏｌ、例えば１μｍｏｌ、５μｍｏｌ、１０μｍｏｌ、３０μｍｏｌ、４０μｍｏｌ、５０μｍｏｌ、６０μｍｏｌ、または７０μｍｏｌである。
【００４４】
特定の実施形態において、本発明の方法において使用される非ヒト動物は、アルビノ動物である。本明細書で使用される場合、「アルビノ動物」とは、少なくとも目に色素、特にメラニンがない動物をいう。式（I）の芳香族化合物、特にベンゼンを角膜に適用して血管新生を誘発する際、メラニンをその眼に有する色素性動物は、角膜線維症の程度がより大きい傾向があるので、アルビノ動物は、色素性動物と比較して、角膜血管新生のより純粋な動物モデルを生成する。
【００４５】
本発明は、本発明の方法によって製造された角膜血管新生の非ヒト動物モデルにも関する。本発明の実施形態によれば、角膜血管新生の非ヒト動物モデルは、眼の角膜に実質的に線維症を有していない。さらに、角膜血管新生の非ヒト動物モデルは、動物の少なくとも１つの眼の角膜に１つ以上の新しい血管を含む。線維症は、組織修復において起こり得る天然の生物学的過程であるので、本発明の非ヒト動物モデルの角膜において、いくらかの線維症が観察され得る。しかし、観察される線維症の量は、もしあるとしても、他の角膜血管新生動物モデルで観察される線維症の量よりも有意に少ない。
【００４６】
したがって、角膜血管新生の非ヒト動物モデルは、従来技術の角膜血管新生動物モデルと比較していくつかの利点を有する。特に、角膜に線維化が実質的に存在しないため、角膜血管新生のより純粋な動物モデルが製造される。より具体的には、角膜血管新生の従来技術の動物モデルは、複雑な血管新生応答を有し、新血管の成長に加えて、線維症または瘢痕組織形成も、通常、角膜において観察される。線維症および瘢痕組織の存在は、血管新生プロセスを理解することを困難かつより複雑にする。対照的に、本発明の角膜血管新生の非ヒト動物モデルで観察される、線維症の量の実質的な排除または少なくとも有意な減少は、血管新生プロセスをより容易に研究することを可能にする。
【００４７】
さらに、ベンゼンが使用される場合に観察される量と比較して、フェノールが使用される場合、より少ない線維化および瘢痕組織形成が観察される。したがって、フェノールは、本発明での使用に好ましい式（Ｉ）の芳香族化合物である。
【００４８】
角膜における線維症の実質的に減少した量に加えて、本発明による角膜血管新生の非ヒト動物モデルは、従来技術の動物モデルよりも他の利点を有する。例えば、動物モデルは、式（Ｉ）の芳香族化合物、例えばベンゼンまたはフェノールの溶液の点眼剤を非ヒト動物の眼に単に投与することによって製造することができる。従って、外科的処置は必要とされない。これは、しばしば、組織操作、切開部位での感染、および眼の前房の穿刺による炎症反応など、外科的処置と関連するか、またはそれに起因する多くの合併症を排除する。さらに、縫合は不要であり、合併症をさらに軽減する。したがって、本発明の非ヒト動物モデルを製造する方法は、角膜血管新生の動物モデル、例えば角膜ポケットモデルを製造するための以前の方法よりも、実施が簡単であり、費用がかからず、必要な時間がより短い。
【００４９】
別の一般的な態様において、本発明は、角膜拡張性疾患の非ヒト動物モデルを製造する方法に関する。本発明の実施形態によれば、上記方法は、非ヒト動物の少なくとも１つの眼の角膜に有効量の式（Ｉ）の芳香族化合物を適用することを含む；
【化５】
0006397937.tif 000006
式中、Ｒは、ヒドロキシル、ハロゲン、アルキル、アルコキシおよびアミノからなる群から選択され、ｎは０、１、２、３、４、５または６である。
【００５０】
本明細書に記載の式（Ｉ）の芳香族化合物のいずれも、角膜拡張性疾患の非ヒト動物モデルを製造する方法に使用することができる。好ましい実施形態では、式（Ｉ）の芳香族化合物はベンゼンまたはフェノールである。
【００５１】
本発明の角膜血管新生の非ヒト動物モデルを製造することに関して本明細書に記載の非ヒト動物の眼の角膜に式（Ｉ）の芳香族化合物を適用する方法のいずれも、本発明による角膜拡張性疾患の非ヒト動物モデルを製造する方法において使用される。好ましい適用方法としては局所適用が挙げられ、好ましい局所組成物としては液体組成物、例えば水溶液または他の水性ビヒクルが挙げられる。好ましい実施形態では、水溶液またはビヒクルが点眼剤によって角膜に適用される。
【００５２】
本発明の実施形態によれば、角膜拡張性疾患の非ヒト動物モデルを製造するのに必要な式（Ｉ）の化合物の有効量は、約３０μｍｏｌ〜８５μｍｏｌ、例えば３０μｍｏｌ、４０μｍｏｌ、５０μｍｏｌ、６０μｍｏｌ、６５μｍｏｌ、７０μｍｏｌ、７５μｍｏｌ、８０μｍｏｌ、または８５μｍｏｌである。一般に、角膜拡張性疾患の非ヒト動物モデルを製造するための式（Ｉ）の芳香族化合物の有効量は、角膜血管新生の非ヒト動物モデルを製造するための式（Ｉ）の芳香族化合物の有効量より多い。有効量は、単一の適用または複数の適用で適用することができ、好ましくは単一の適用で適用される。
【００５３】
本発明の特定の実施形態では、約７０μｍｏｌ〜８５μｍｏｌのベンゼン（すなわち、約５．５ｍｇ〜約７．０ｍｇのベンゼン）を非ヒト動物の眼に適用して、円錐角膜のモデルを製造することができる。例えば、点眼剤の形態のような水性ビヒクル中に７．０Ｍ〜８．５Ｍのベンゼンを適用すると、角膜の構造的歪みが誘発され、円錐角膜のモデルが得られる。図３を参照されたい。別の特定の実施形態では、約３０μｍｏｌ〜８５μｍｏｌのフェノールを非ヒト動物の眼に適用して、円錐角膜のモデルを製造することができる。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態では、角膜拡張性疾患は、円錐角膜である。円錐角膜は、ヒトにおいて発症する、より一般的な角膜拡張性疾患の１つである。本発明の実施形態によれば、円錐角膜の非ヒト動物モデルにおいて、角膜の構造的歪みは、角膜の丸い形状から円錐形状への形状の変化として特徴付けることができる。例えば、図３を参照されたい。円錐角膜が式（Ｉ）の芳香族化合物の適用後に発達するにつれて、角膜は薄くなり、目から外側に突き出て膨らみを生じる。
【００５５】
特定の実施形態によれば、アルビノ動物は、角膜拡張性疾患の非ヒト動物モデルを製造するための本発明の方法において使用することができる。
【００５６】
本発明はまた、本発明の方法によって製造された角膜拡張性疾患の非ヒト動物モデルにも関する。本発明の実施形態によれば、角膜拡張性疾患の非ヒト動物モデルは、丸い形状から円錐形状への形状の変化として特徴付けられる構造的歪みを含む角膜を有する。
【００５７】
本発明者の知る限りでは、円錐角膜のような角膜拡張性疾患の動物モデルは今まで知られていなかった。従って、本発明は、製造が簡単で安価であり、かつ複雑な器具を必要としない角膜拡張性疾患の動物モデルを提供することによってこの必要性を満たす。
【００５８】
本発明の実施形態によれば、本明細書に記載の通り、非ヒト動物を製造する方法において角膜拡張性疾患を誘発するために必要とされる式（Ｉ）の芳香族化合物の量と比較して、より少ない量が、角膜血管新生を誘発するために必要とされる。例えば、非ヒト動物の眼に適用した場合、約１μｍｏｌ〜７０μｍｏｌのベンゼンまたはフェノールが角膜血管新生を誘発するのに十分であるのに対し、約７０μｍｏｌ〜８５μｍｏｌのベンゼンまたは３０μｍｏｌ〜７０μｍｏｌのフェノールが、円錐角膜のような角膜拡張性疾患を誘発するために必要である。例えば、図２および図３を参照されたい。
【００５９】
したがって、例示的な例として、非ヒト動物の角膜血管新生モデルを製造する方法において、０．１Ｍ〜７．０Ｍのベンゼン溶液１０μＬを非ヒト動物の眼に投与することができるのに対し、角膜拡張性疾患の非ヒト動物モデルを製造する方法において、７．０Ｍ〜８．５Ｍのベンゼン溶液１０μＬを非ヒト動物の眼に投与することができる。ベンゼンの濃度はまた、角膜血管新生が誘発される速度を調節し、新しい血管成長の量を調節するために変化させることができる。これは、適用されたベンゼンの濃度が増加するにつれて、ラット角膜で観察される血管成長の量が増加することを実証している図２を参照されたい。当然のことながら、当業者は、血管新生応答および円錐角膜または観測される他の角膜拡張性疾患の発症の両方において、同じ動物の種間で生物学的可変性が存在し得ることを容易に理解するであろう。
【００６０】
角膜血管新生は、角膜拡張性疾患を誘発するのに必要な量よりも少ない量の式（Ｉ）の芳香族化合物によって誘発することができるので、角膜拡張性疾患の動物モデルは、高濃度の式（Ｉ）の芳香族化合物の適用時に観察される角膜の構造的歪みとともに、眼の角膜に１つ以上の新しい血管をも含み得る。これは、より高濃度の式（Ｉ）の芳香族化合物を使用する場合、角膜の構造的歪みを引き起こすことに加えて、新しい血管が典型的に成長するからである。
【００６１】
本発明の実施形態によれば、麻酔剤は、角膜血管新生または角膜拡張性疾患の非ヒト動物モデルを製造する方法において、式（Ｉ）の芳香族化合物に加えて、非ヒト動物の眼に投与することができる。麻酔薬は、鎮痛効果を引き起こす、すなわち、痛みおよび／または感覚の欠如を誘発する薬物である。局所、部分および全身麻酔薬を含む、外科的眼の処置に使用される任意の麻酔薬を使用することができる。好ましくは、部分麻酔剤が使用される。本発明で使用できる麻酔薬の例としては、キシロカイン、パラカイン、テトラカイン、ブピバカイン、およびリドカインが挙げられるが、これらに限定されない。麻酔薬は、外科的眼の処置のための麻酔薬を局所適用などにより投与するための当該分野で公知の任意の方法によって投与することができる。麻酔剤はまた、式（Ｉ）の芳香族化合物、例えば水溶液と同じ組成物で眼に投与することもできる。
【００６２】
麻酔薬を投与する目的は、式（Ｉ）の芳香族化合物の適用に伴う疼痛または不快感を軽減することである。麻酔剤は、式（Ｉ）の芳香族化合物の前に、式（Ｉ）の芳香族化合物の適用と同時に、または式（Ｉ）の芳香族化合物の適用後に、眼に投与することができ、好ましくは、式（Ｉ）の芳香族化合物を適用する前に、または同時に適用する。
【００６３】
他の一般的な局面において、本発明は、本発明の非ヒト動物モデルを使用して、角膜血管新生および角膜拡張性疾患（例えば、円錐角膜）を研究する方法に関する。例えば、本発明の非ヒト動物モデルは、角膜血管新生を調節して、生体内血管新生の増加または減少に関連する疾患を治療または予防するために使用され得る角膜血管新生のモジュレーターを同定する化合物をスクリーニングするために使用され得る。本発明の非ヒト動物モデルはまた、円錐角膜のような角膜拡張性疾患の治療または予防に有効な化合物をスクリーニングするために使用することができる。
【００６４】
本発明の実施形態によれば、角膜血管新生または角膜拡張性疾患を調節する化合物をスクリーニングする方法は、
（ｉ）非ヒト動物の少なくとも１つの眼に有効量の式（Ｉ）の芳香族化合物を適用することを含む、角膜血管新生または角膜拡張性疾患の非ヒト動物モデルを調製すること；
（ｉｉ）試験化合物を上記非ヒト動物モデルの上記の少なくとも１つの眼に投与すること；および
（ｉｉｉ）角膜における血管成長および角膜の構造的歪みの少なくとも１つに対する上記試験化合物の効果を判定することを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかを使用して、本発明の化合物をスクリーニングする方法における使用のための非ヒト動物モデルを製造することができる。
【００６５】
本発明の実施形態によれば、試験化合物は、式（Ｉ）の芳香族化合物の適用の前に、同時に、または適用後に投与することができる。試験化合物は、局所適用および注射を含むがそれらに限定されない、当該分野で公知の任意の方法によって投与することができる。好ましくは、試験化合物は、液体組成物、溶液または水性ビヒクルなどで局所投与される。特定の実施形態では、試験化合物および有効量の式（Ｉ）の芳香族化合物を、単一の組成物で一緒に投与する。試験化合物および式（Ｉ）の芳香族化合物の有効量は、非ヒト動物の一方の眼に投与することができ、有効量の式（Ｉ）の芳香族化合物を他方の眼に投与することができる。試験化合物で処理した眼と試験化合物で処理していない眼とを比較することにより、角膜血管新生および／または角膜拡張性疾患に対する試験化合物の効果を判定することができる。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「調節する」という用語は、角膜血管新生または角膜拡張性疾患の発症、発症または進行に影響を及ぼすことを意味する。一実施形態では、調節とは、角膜血管新生または角膜拡張性疾患の１つまたは複数の徴候または症状の発症を阻害する、進行を遅らせる、または改善することを指す。１つの特定の実施形態において、調節は、角膜血管新生、例えば新しい血管の成長を増加または減少させることを指す。別の特定の実施形態では、調節とは、角膜の構造的歪みまたは「形状の損失」の発生を低減または抑制することを指す。
【００６７】
本発明の実施形態によれば、角膜血管新生のモジュレーターは、例えば、１つまたは複数の新しい血管の成長を低減または排除することによって角膜血管新生を治療または予防するために有用であり得、また、生体内血管新生に関連する他の疾患を治療または予防するために有用であり得る。角膜拡張性疾患のモジュレーターは、円錐角膜のような角膜拡張性疾患を治療または予防するために有用であり得る。
【００６８】
本発明の実施形態によれば、試験化合物が式（Ｉ）の芳香族化合物の適用の前または後に眼に適用される場合、適用の間の時間は、特定の試験化合物、その作用様式、その有効性などに依存して、数分から数時間、数日まで変化し得る。例えば、試験化合物を一方の眼に適用し、次いで式（Ｉ）の芳香族化合物を２４時間後に両眼に適用することができる。別の例として、式（Ｉ）の芳香族化合物を両眼に適用し、次いで角膜血管新生の発症が観察された後３週間後に試験化合物を適用することができる。当業者は、所望の目的に応じてスクリーニング実験を適切に設計することができるであろう。
【００６９】
本発明の実施形態によれば、角膜血管新生および／または円錐角膜の調節に対する試験化合物の効果は、本開示を考慮して当技術分野で公知の任意の方法によって判定することができる。例えば、効果は、目視観察または組織学的研究によって判定することができる。組織学的研究は、角膜の一部を血管を染色する染料で処理し、顕微鏡下で観察することによって行うことができる。組織学的研究に用いることができる例示的な色素は、ヘマトキシリンおよびエオジン染色である。
【００７０】
本発明はまた、ヒトの健康に有害な物質を同定する方法に関する。本発明の実施形態によれば、この方法は、
（ｉ）非ヒト動物の少なくとも１つの眼の角膜に試験物質を適用すること；および
（ｉｉ）角膜における血管成長および角膜の構造的歪みの少なくとも１つに対する上記試験物質の影響を測定することを含む。
角膜血管新生または円錐角膜のような角膜拡張性疾患を誘発する化合物または物質は、ヒトの健康に有害であり得る。「人の健康に有害な」物質は、有毒であり、致命的な疾病（例えば、癌）の発生率を増加させるか、または刺激、発疹などの他の有害生物反応を引き起こすものである。したがって、本発明の方法により角膜血管新生および角膜拡張性疾患に対する効果のために化合物をスクリーニングすることにより、健康に有害であるか、またはヒトなどの哺乳動物に重大な健康リスクをもたらす物質を同定することができる。
【００７１】
本発明の実施形態によれば、ヒト健康に有害な物質を同定する方法を、食品産業、医薬品産業およびエレクトロニクス産業を含むがこれらに限定されない任意の産業で使用される物質をスクリーニングするために用いることができる。任意の物質、例えば化合物、物質、溶媒などをスクリーニングすることができる。本発明の実施形態によれば、試験物質は、非ヒト動物の眼の角膜に、本開示を考慮して、注射または点滴または拭き取ることによるような局所適用を含む当技術分野で既知の任意の方法を用いて適用される。
【００７２】
いかなる理論に拘束されることを望むものではないが、ベンゼンおよびフェノールなどの式（Ｉ）の芳香族化合物で観察された血管成長への影響に関する１つの可能な説明を以下に要約する。光エネルギーなどの電磁エネルギーの吸収時に水分子を水素および酸素に分割するメラニンおよびその誘導体、類似体、および変異体の本来の能力は、以前に米国特許第８４５５５１４号に報告されている。高レベルの酸素は、抗血管新生効果を有することも知られている。ベンゼンおよびフェノールは、メラニンを産生する細胞であるメラノサイトの機能を損なう可能性があると考えられている。メラノサイトは、他の場所の中でも、目の中間層に位置する。メラニン細胞の機能を損なうことによって、産生されるメラニンの量が有意に減少し、したがってメラニンによって産生される酸素の量も減少し、酸素レベルが低下し、血管新生が促進される。一方、メラニンが豊富になると、水分子の解離がより速くおよび／またはより容易に起こり、結果として酸素の分圧が高くなり、その結果、血管新生の量が減少すると考えられている。従って、メラニンのレベル低下は血管新生を刺激し、メラニンレベルの増加は血管新生を阻害するか、または少なくとも有意に減少させると考えられる。
【００７３】
これもいかなる理論に束縛されることを望むものではないが、角膜拡張性疾患の発症を誘発するためにはメラニン産生をより多く阻害することが必要であるため、角膜血管新生を誘発するためには、角膜拡張性疾患を誘発するためよりも必要とする式（Ｉ）の化合物の量がより少ないという仮説が立てられている。対照的に、メラニン産生のより少ない阻害で角膜血管新生を引き起こすのに足りると考えられている。この仮説は、以下の実施例でさらに詳細に論じるように、円錐角膜を誘発するのに必要な式（Ｉ）の芳香族化合物の濃度と比較して、式（Ｉ）の芳香族化合物がより低い濃度で角膜血管新生を誘発することができるという観察に基づいている。
【００７４】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、よりよく理解されるであろうが、当業者は、実施例が本発明を説明するに過ぎず、本発明を限定するものではないことを容易に認識するであろう。
【実施例】
【００７５】
実施例１：フェノールにより製造される角膜血管新生および角膜拡張性疾患のラットモデル
【００７６】
角膜血管新生および円錐角膜のラットモデルは以下のよう製造した。０．１Ｍ、０．５Ｍ、１．０Ｍ、３．０Ｍ、５．６Ｍ、または８．５Ｍの濃度を有するフェノールの水溶液を、フェノールと水とを混合することによって調製した。次いで、溶液を１００℃で１５分間加熱することによって滅菌した。次いで、２ヶ月齢のウィスターラットの右眼の角膜の中心に滅菌フェノール溶液１０μＬを局所適用した。試験した各フェノール濃度について５匹のラットを処置した。フェノール溶液を眼に吸収させ、１回のみ適用した。目には独自の自然保護機構があるため、適用終了時に目を洗浄する必要はなかった
【００７７】
フェノール溶液を適用する前に、角膜に目に見える血管はなかった（図１Ａ）。代わりに、目に見える血管は目の虹彩にある。しかし、各群の少なくとも１匹のラットにおいてフェノール水溶液の適用から１週間後に試験された全ての濃度のフェノール溶液で処置すると、新しい血管が角膜に形成され始めた。角膜で観察された新しい血管の量は、適用後３週間でさらに大きかった（図１Ｂ、３Ｍ溶液の適用）。４ヶ月間、血管の成長が観察された。図１Ｂに示すように、深刻な血管新生が強角膜輪部から始まり、角膜表面の中心に向かって進行した。新しい角膜血管を除いて、他の解剖学的または炎症性の変化は観察されなかった。虹彩の血管は、角膜で成長した血管よりも深く、瞳孔境界で区切られている。試験したフェノール（３．０Ｍ、５．６Ｍ、および８．５Ｍ）のより高い濃度では、角膜拡張症に関連する変化、特に円錐角膜もいくつかのラットで観察された。結果を以下の表１に要約する。
【００７８】
【表１】
0006397937.tif 000007
【００７９】
組織学的研究は、フェノールの適用後８週間後に行った。角膜を切除し、角膜上皮片をヘマトキシリンおよびエオシン染色で染色した。図１Ｃに示すように、角膜上皮の基底膜の下でよく分化した血管が見られる（矢印２で示される）。
【００８０】
上記の表１に示された実験の結果は、ラットの眼に直接適用されたフェノールが角膜血管新生を誘発すること、および動物の眼にフェノールを適用することによって角膜血管新生の動物モデルが製造され得ることを実証する。この結果はまた、より高濃度のフェノールを適用すると、角膜拡張性疾患も誘発されることを示している。
【００８１】
実施例２：ベンゼンを用いて製造された角膜血管新生のラットモデル
【００８２】
角膜血管新生のラットモデルは以下のようにして製造した。所望の濃度（３．０Ｍ〜７．０Ｍの間）を有する水性ベンゼン組成物を、ベンゼンと水とを混合することによって調製した。その後、水性組成物を１００℃で１５分間加熱して滅菌した。特に、３．０Ｍ、４．０Ｍ、５．０Ｍ、６．０Ｍ、または７．０Ｍの水性ベンゼン組成物を調製した。次いで、各組成物１０μＬを、２〜３ヶ月齢のウィスターラットの右眼の角膜の中心に局所適用した。ベンゼン水性組成物を眼に吸収させ、１回のみ適用した。目には独自の自然保護機構があるため、適用終了時に目を洗浄する必要はなかった。
【００８３】
ベンゼンを適用する前に、角膜に目に見える血管はなく、ラットの角膜は、図１Ａに示すものと同様に見えた。しかし、図２に示すように、適用後１５日目にはすべての濃度のベンゼンで処理すると、新しい血管が角膜に形成され始めた。角膜で観察された新しい血管の量は適用後３週間でさらに大きく、観察された新しい血管の成長は、ベンゼンの最初の適用から少なくとも４ヶ月間持続し、その時点で組織学的研究のために眼を犠牲にした。
【００８４】
実験の結果は、ラットの眼に直接適用されたベンゼンが角膜血管新生を誘発し、動物の眼にベンゼンを適用することによって角膜血管新生の動物モデルが製造され得ることを実証する。この結果はまた、より高い濃度のベンゼンが最初に適用されたとき、適用後15日以内に観察された新しい血管の量も増加したことを示している。したがって、ラットにおける新血管成長の量は、芳香族化合物の濃度に依存し得、より高い濃度では、より低い濃度と比較して角膜血管新生をより迅速に誘発することができる。結果はさらに、観察された角膜血管新生の量が、芳香族化合物の最初の適用後に経時的に増加することを示す。
【００８５】
実施例３：円錐角膜のラットモデル
【００８６】
角膜円錐角膜のラットモデルを以下のようにして製造した。７．０Ｍ〜８．５Ｍの濃度を有する水性ベンゼン組成物を、水とベンゼンを混合することによって調製した。次いで、溶液を１００℃で１５分間加熱することによって組成物を滅菌した。水性ベンゼン組成物（１０μＬ）を、マイクロピペット操作によってウィスターラットの片眼の角膜の中心に直接局所適用した。ラットは３ヶ月齢であり、ベンゼンは１回のみ適用した。
【００８７】
血管新生（すなわち、新たな血管成長）に加えて、角膜組織は著しい薄化および外側への突出によって特徴付けられた（図３）。観察された角膜の変化は、ベンゼンの適用後の最初の１週間以内に角膜の透明性の変化として起こり始め、続いて角膜周囲に新しい血管が成長し（すなわち、血管新生）、そして最後に、適用後２週間以内に角膜が突出した。この変化は、非炎症性角膜拡張症、特に円錐角膜に適合していた。
【００８８】
９．０Ｍ水性ベンゼン組成物１０μＬを同じ手順に従ってウィスターラットの眼に適用した場合、円錐角膜が非常に深刻だったのでラットが眼内炎を発症した（眼内感染）ことにも留意すべきである。
【００８９】
実験の結果は、ベンゼンをラットの眼に適用すると、円錐角膜を誘発し、円錐角膜の動物モデルは、式（Ｉ）の芳香族化合物を動物の眼に投与することによって製造することができることを示す。
【００９０】
実施例４：角膜血管新生および／または角膜拡張性疾患を調節する化合物のスクリーニング
【００９１】
潜在的な治療剤（すなわち、試験化合物）を、角膜血管新生および角膜拡張性疾患の調節について試験する。式（Ｉ）の芳香族化合物の水溶液を調製し、げっ歯動物の両眼の角膜に点眼剤の形態で局所適用する。次いで、候補治療薬の溶液を、上記げっ歯類の一方の眼の角膜に局所適用する。上記げっ歯類の眼を観察し、候補治療薬で治療した眼を未治療眼と比較して、もしあれば、角膜血管新生または角膜拡張性疾患の調節について試験化合物の有効性を判定する。視覚的観察および組織学的研究を実施して、試験化合物の効果を判定する。
【００９２】
実施例５：ヒトの健康に有害な物質の同定
【００９３】
潜在的に有害な物質および材料（すなわち、試験物質）は、角膜血管新生および角膜拡張性疾患の誘発に対するそれらの効果について試験される。試験物質は、げっ歯類の一方の眼の角膜に局所適用される。上記げっ歯類の目を観察し、試験物質で処置した眼を未処置の眼と比較して、もしあれば、角膜血管新生または角膜拡張性疾患を引き起こす際の上記試験物質の効果を判定する。目視観察および組織学的研究を実施して、上記試験物質の効果を判定する。角膜血管新生または角膜拡張性疾患を誘発する試験物質は、ヒトの健康に潜在的に有害であると同定されている。
【００９４】
当業者であれば、本発明の広い概念から逸脱することなく、上述の実施形態に変更を加えることができることが理解されよう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲内の変更をカバーすることが意図されていることが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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