(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＣＩＭＢ４１９８５で寄託されている植物由来のラクツカ属ミトコンドリアを含む細胞質雄性不稔キクニガナ属植物。
【請求項２】
該細胞質雄性不稔キクニガナ属植物が、配列番号３１および配列番号３２を用いて１５９２ｂｐの分子マーカーによりさらに同定される、請求項１に記載の細胞質雄性不稔キクニガナ属植物。
【請求項３】
該細胞質雄性不稔キクニガナ属植物が、配列番号３３および配列番号３４を用いて２９３ｂｐの分子マーカーによりさらに同定される、請求項１または２に記載の細胞質雄性不稔キクニガナ属植物。
【請求項４】
該キクニガナ属植物が、グリーンチコリ、ラディッキオ・ロッソ、赤チコリ、トレビス（treviso）、白チコリ、シュガー・ローフ、ベルギーエンダイブ（Belgian endive）、ウィットルーフ、カタローニャ、キコリウム・インテュブス変種フォリオスム、エンダイブ（C. endivia）およびキコリウム・インテュブス・エル変種サチバムからなる群より選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の細胞質雄性不稔キクニガナ属植物。
【請求項５】
該キクニガナ属植物が、ＮＣＩＭＢ４２１２５で寄託されている植物由来の母系細胞質を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞質雄性不稔キクニガナ属植物。
【請求項６】
ＮＣＩＭＢ４１９８５で寄託されている植物由来のラクツカ属ミトコンドリアを含む細胞質雄性不稔キクニガナ属植物を同定するための方法であって、該方法が、該細胞質雄性不稔キクニガナ属植物のサンプル中の、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群より選択される１つまたはそれ以上のミトコンドリア核酸配列を証明することを含む、方法。
【請求項７】
ＮＣＩＭＢ４１９８５で寄託されている植物由来のラクツカ属ミトコンドリアを含む細胞質雄性不稔キクニガナ属植物を同定するための方法であって、該方法が、該細胞質雄性不稔キクニガナ属植物のサンプル中の、核酸増幅プライマーである配列番号３１および配列番号３２を用いて１５９２ｂｐの分子マーカーを証明する、および／または核酸増幅マーカーである配列番号３３および配列番号３４を用いて２９３ｂｐの分子マーカーを証明することを含む、方法。
【請求項８】
キクニガナ属植物およびラクツカ属植物の細胞質雄性不稔ハイブリッド植物であって、該細胞質雄性不稔ハイブリッド植物が、ＮＣＩＭＢ４１９８５で寄託されている植物由来のラクツカ属ミトコンドリアを含む、ハイブリッド植物。
【請求項９】
該細胞質雄性不稔ハイブリッド植物が、ＮＣＩＭＢ４２１２５で寄託されている植物である、請求項８に記載の細胞質雄性不稔ハイブリッド植物。
【請求項１０】
該ミトコンドリアが、ＮＣＩＭＢ４１９８５で寄託されているラクツカ属植物由来である、請求項８に記載の細胞質雄性不稔ハイブリッド植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
説明
本発明は、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）キクニガナ属植物、とりわけ細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）グリーンチコリ；細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）ラディッキオ・ロッソ；細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）赤チコリ、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）トレビス、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）シュガー・ローフ、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）白チコリ植物、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）ベルギーエンダイブ（Belgian endive）、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）ウィットルーフ植物、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）カタローニャ植物、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）エンダイブ、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）キコリウム・インテュブス変種フォリオスム植物、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）エンダイブ（C. endivia）植物および細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）キコリウム・インテュブス・エル変種サチバム植物に関する。本発明は、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）キクニガナ属植物およびキクニガナ属植物に細胞質雄性不稔性（ＣＭＳ）を提供するミトコンドリア核酸配列を同定するための方法にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
キクニガナ属植物は、いくつかの異なる栽培品種を利用できる。グリーンチコリ、ラディッキオ・ロッソまたは赤チコリ、トレビス（treviso）、白チコリ、シュガー・ローフ、ベルギーエンダイブ（Belgian endive）（ウィットルーフ）、カタローニャ（全てのキコリウム・インテュブス変種フォリオスム）、エンダイブ（エンダイブ（C. endivia））のみでなく、チコリルート（キコリウム・インテュブス・エル変種サチバム）が知られている。後者は、イヌリンなどのいくつかの産物、ビール用風味剤、コーヒー代用物のみでなく、ポリマー製造のための物質が由来する主根を採るために栽培されている。
【０００３】
ウィットルーフ(witloof)は、初め、その主根を採るために栽培され、後に、周知のウィットルーフ、ベルギーエンダイブ（Belgian endive）またはチコリ（chicon）を製造するために暗所で栽培された。この栽培は、水耕法また従来法で行われる。
【０００４】
リーフチコリ（キコリウム・インテュブス変種フォリオスム）の例は、ラディッキオ・ロッソ（色とりどりの赤および緑の葉、ときには白色の葉脈を有する）、トレビス（treviso）、カタローニャおよびグリーンハーテッドチコリである。全てのチコリ品種は、典型的に、やや苦味がある。タンポポ連（Cichorieae）の別のメンバーは、エンダイブ、チコリ・エンダイブ（C. endivia）である。
【０００５】
チコーリア（chicoriae）は、キク科（以前は、キク属）の１種であり、とりわけヒマワリ属（Helianthus）、ラクツカ属（lactuca）、キンセンカ属、アスター属およびエキナセア属に属する。
【０００６】
当技術分野の現在の技術水準を用いて、市販のキクニガナ属のハイブリッド種子（ラディッキオ・ロッソ、トレビス（treviso）など）を受精競争（certation）を用いて製造する。
【０００７】
受精競争とは、花粉管間に成長速度の差を示す競争がある植物における現象である。同じ植物の花粉管（自家受粉）は、別の他家受粉植物の花粉管よりも遅い様式で伸びる。この機構は、交雑受精の割合を高め、自己受精の割合を抑制するが、結果として所望のハイブリッド植物（交雑種）の不純物がもたらされ、これを排除できない。実際に、生産された種子の３０％までは自己受精の産物で構成され、言い換えれば、ハイブリッド植物の代わりに同系交配植物で構成されている。種子精選法を用いることにより、この割合を１０−２０％に低減できるが、依然として望ましくないほど高い。
【０００８】
受精競争を用いるさらなる欠点は、雌系統（受精競争を有する）の保存時に、より多くの花粉を生じる個体植物が、より効率的に集団内でその遺伝子を拡散させ、結果として数世代後に受精競争による潜在的な損失をもたらし、使用できない親系統をもたらすことである。
【０００９】
さらに、受精競争は、キクニガナ属植物のすべての系統に存在するのではなく、従って、商業的に価値のあるハイブリッド植物を生産するための組み合わせの可能性を低下させる。
【００１０】
従って、上記の全ての形態でのチコリの栽培のために、高度に均一な、好ましくは実質的に１００％均一なＦ１（雑種第一代）を利用可能とすることは有利であり得る。これらのキクニガナ属のハイブリッドは、現在一般的に利用可能な品種に比べていくつかの利点を有する。
【００１１】
最も重要な利点は、そのようなＦ１雑種が優れた均一性、すなわち実質的に１００％の均一性を提供することである。このことは、作物の選別後損失を最小にすると共に、一度にまたは同時に収穫することを可能とする。
【００１２】
例えば、ラディッキオ・ロッソは、高温かつ強烈な日光に長時間曝されると、色が薄くなる。この作物を同時に収穫することの可能性は、栽培者への損失の低減をもたらす。
【００１３】
キクニガナ属植物が、その遺伝子構成、すなわちゲノム構成に関して、高い均一性または実質的に１００％の均一性を有するならば、種子の生産者および作物の栽培者の両者にとっていくつかの利点が生じる。
【００１４】
高度に均一なＦ１ハイブリッドが提供されるなら、生産者は、親系統のより多くの組み合わせを利用することができ、結果としてより広範なハイブリッドが利用できるという利点が生じる。
【００１５】
現在、種子ロットの均一性が低すぎるため、種子のプライミングなどの処理などまたは種子の選別は、ほとんど利用されていない。所望の高均一性を有するハイブリッドの高品質の種子が利用可能になったとき、種子のプライミングなどの処理および他の種子処理技術が有用となる。
【００１６】
栽培者にとって、高い均一性のハイブリッド種の利点は、いわゆる異型株を含まず高度に均一な産物からなるため、全作物を収穫および処理するための時間が短いことである。このため、作物を収穫し、販売のために準備するのに要する労力を削減できる。
【００１７】
高均一性または実質的に１００％の均一性のハイブリッドは、一定の品質を有し、例えばラディッキオ・ロッソを考慮するとき、とりわけ色が安定している。現在、市場で入手可能な品種は、この安定した品質を保証し得ない。
【００１８】
最後に、高度に均一なＦ１ハイブリッドが、良好な種子の出現を示し得ることが特記される。
【００１９】
エンダイブ（endive）に関して、現在の技術水準でのハイブリッドの生産は不可能である。受精競争などの機構がエンダイブには存在しない。従って、エンダイブは１００％自家受粉作物であり、高度の均一性を示すにも関わらず、雑種強勢が起こりにくい。
【００２０】
上記の点を改善するために多くの研究が行われ、キクニガナ属植物におけるハイブリダイゼーションのための他の方法が開発されている。該方法の１つは、Enza ZadenおよびFlorimond Desprezによる特許出願(それぞれ、NL1001554 およびWO97/45548)に記載されており、ここでは、キクニガナ属植物種にヒマワリ（Helianthus annuus）由来の細胞質因子を細胞融合により導入している。これは結果として、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）キクニガナ属植物育種材料をもたらす。同様の特許出願が、株式会社サカタのタネによりＷＯ２００７／０４９７３０として出願されており、ここでは、ヒマワリ由来のＣＭＳをラクツカ属（ラクツカ・サティバ）に移植している。
【００２１】
さらに別の方法が、Az. Agricola T＆T社による特許出願ＷＯ２０１２／１６３３８９に記載されており、ここでは、雄性不稔性をコードする劣性遺伝子または遺伝物質核酸を突然変異誘発によってキクニガナ属植物に導入している。このシステムを用いて作製されたＦ１ハイブリッドは、上記の劣性形質を有するため、雄性不稔性である。このシステムのさらなる欠点は、雄性不稔母系統（ｍｓ／ｍｓと表記）が、インビトロまたはインビボ法により栄養繁殖されなければならないことである。
【発明の概要】
【００２２】
上記事情を考慮すると、従来技術の上記の欠点を回避して、細胞質雄性不稔キクニガナ属植物を提供することが、他の目的も含めて、本発明の目的である。
【００２３】
上記の目的は、本発明により、他の目的とともに、後記の特許請求の範囲に記載の植物を提供することにより、達成された。
【００２４】
具体的には、上記の目的は、他の目的と共に、本発明により達成され、第一の面によれば、ラクツカ属のミトコンドリアを含む細胞質雄性不稔キクニガナ属植物であって、該ラクツカ属のミトコンドリアが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群より選択される少なくとも１つのミトコンドリア核酸配列を含む、植物によって達成された。
【００２５】
研究計画は、キクニガナ属植物に細胞質雄性不稔性（ＣＭＳ）を導入するのに好適な供与体となり得る植物種を同定することから開始した。本明細書中、“好適な”とは、先行技術の欠点が除かれることも意味する。
【００２６】
レタス（ラクツカ種）には、ＣＭＳは存在しない。ラクツカ属およびキクニガナ属植物は、キク科ファミリーに属し、それぞれこのファミリー内のタンポポ連（Tribe CichorieaeまたはLactuceae）に属する。
【００２７】
ラクツカ属植物およびキクニガナ属植物の組み合わせは、キクニガナ属植物の核にラクツカ属植物の細胞質を組み合わせることで、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）のキクニガナ属植物が生じるかどうかを決定するために研究された。
【００２８】
レタス（ラクツカ種）には、ＣＭＳは存在しない。ラクツカ属植物はキクニガナ属植物と関係があり、両方ともキク科ファミリーに属し、それぞれこのファミリー内のタンポポ連（Tribe CichorieaeまたはLactuceae）に属する。従って、この植物は、キクニガナ属植物を用いる交雑および非対称細胞融合法の両方の候補として選択された。
【００２９】
上記のラクツカ属とキクニガナ属植物との組み合わせは、キクニガナ属植物の核とラクツカ属植物の細胞質との組み合わせが細胞質雄性不稔のキクニガナ属植物を生じるかどうかを決定するために研究された。初期の研究では、キクニガナ属植物とラクツカ属植物との交雑が限られた量の種子しか生じないことが明らかになったため、この研究は、とりわけいくつかのラクツカ属種を標的とした。これらの種子から成長した植物は、フローサイトメトリーおよび分子分析の両方によりハイブリッド植物であると認識された。
【００３０】
キクニガナ属植物とラクツカ属植物とのこのハイブリッド植物を得た後、キクニガナ属植物の遺伝的セットアップ（genetic setup）を再び獲得するために、数回の戻し交雑を行う必要があった。キクニガナ属植物のような作物では、交雑の産物におけるこの種の完全なゲノムを再構築するのに少なくとも８年はかかる。次いで、異なる種間の交雑は、とりわけ第一世代において極めて非効率的であり、そのため得られる種子の量が初期には極めて制限される。
【００３１】
数世代後、ラクツカ属のゲノム量は十分に希釈されたが、自家受粉によって作られた同系交配世代は、ハイブリッド植物の生産のために必要な遺伝的に安定な候補親系統を選択することが必要とされる。しかしながら、この材料は雄性不稔性となるため、この最終的な自家受粉工程が不可能である。
【００３２】
上記の欠点を解決するために、Bejo Zaden B.V.社は、キクニガナ属種とラクツカ属種との非対称細胞融合法を行った。
【００３３】
要約すれば、両種由来のプロトプラストを単離した。キクニガナ属植物由来のプロトプラスト（受容体）を、ヨードアセトアミド（ＩＯＡ）またはヨード酢酸（ＩＡ）で処理して、細胞質を不活性化した。ラクツカ種のプロトプラスト（供与体）を電離放射線で処理して、核ゲノムを不活性化または破壊したが、細胞質中の遺伝的要素（葉緑体およびミトコンドリア）を活性のまま維持した。
【００３４】
ＰＥＧ／Ｃａ２＋を用いる細胞融合後、１つまたはそれ以上の新規の細胞がキクニガナ属植物の核ゲノムを有し、かつラクツカ属植物の細胞質を有して形成された（従って、栽培特性を有する）。この融合は、試験管またはペトリ皿の何れかで行うことができる。ここで、ＰＥＧは、細胞の結合を促進するために作用し、高ｐＨおよびＣａ２＋イオンは、細胞の実際の融合のための必要条件である。ＦＤＡ染色法は、得られた細胞が生細胞であることを確認するために用いられる。
【００３５】
水、塩類、ビタミン類、糖類および植物ホルモンを含む好適な培地を用いて、カルスの形成を促進する。その後、植物の再生を、最終的に根付いた新芽の出現を促進することにより実施した。また、これらの段階は、好適な植物ホルモンの適用に依存している。
【００３６】
再生後、得られた植物を、フローサイトメトリーを用いて、正しいＤＮＡ含量について検査する。その後、この検査による二倍体植物は、ラクツカ属の細胞質の存在を確認するために分子検査の対象とする。この目的で、ＲＡＭＰ技術を用いて、キクニガナ属植物とラクツカ属の細胞質を区別した。
【００３７】
ラクツカ属の細胞質と組み合わされたキクニガナ属植物の核物質を含む植物のさらなる試験は、再生成された融合植物中に、雌性可稔性を維持するが雄性不稔である植物個体、すなわち、本発明による植物が発生していることを示した。かかる植物が同定された頻度は、２１個の元の融合植物に対して約１個であった。
【００３８】
得られた植物は、葯上に可視性の花粉粒を持つ花を有していたが、ＦＤＡ染色法では野生型の花粉粒よりも小さいことが示され、ハイブリッド植物の花粉は発芽能力がないことが示された。従って、Ｆ１ハイブリッド植物は雄性不稔である。従って、上記融合植物から、本発明のキクニガナ属植物が得られ、これは、キクニガナ属植物の１００％純粋なハイブリッドを産生するのに適している。
【００３９】
本発明の植物の代表的なサンプルは、NCIMB, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, UKに２０１３年３月２８日に寄託され、寄託番号ＮＣＩＭＢ４２１２５が付与された。
【００４０】
この第一の面の好ましい態様により、本発明は、細胞質雄性不稔であるキクニガナ属植物に関し、該細胞質雄性不稔であるキクニガナ属植物は、配列番号３１および配列番号３２を用いて１５９２ｂｐの分子マーカーによりさらに同定され得る。
【００４１】
この第一の面の別の好ましい態様により、本発明は、細胞質雄性不稔であるキクニガナ属植物に関し、該細胞質雄性不稔であるキクニガナ属植物は、配列番号３３および配列番号３４を用いて２９３ｂｐの分子マーカーによりさらに同定され得る。
【００４２】
とりわけ好ましい態様によれば、本発明は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または１０個のミトコンドリア核酸配列を有する、細胞質雄性不稔であるキクニガナ属植物に関する。
【００４３】
本発明の植物は、好ましくは、グリーンチコリ、ラディッキオ・ロッソ、赤チコリ、トレビス（treviso）、白チコリ、シュガー・ローフ、ベルギーエンダイブ（Belgian endive）、ウィットルーフ、カタローニャ、キコリウム・インテュブス変種フォリオスム、エンダイブ（C. endivia）およびキコリウム・インテュブス・エル変種サチバムからなる群より選択される。
【００４４】
本発明の最も好ましい態様によれば、本発明の植物は、ＮＣＩＭＢ４１９８５で寄託されている植物由来のラクツカ属植物のミトコンドリアを含み、および／または本発明の植物は、ＮＣＩＭＢ４２１２５で寄託されている植物由来の母性細胞質を含む。
【００４５】
第二の面によれば、本発明は細胞質雄性不稔であるキクニガナ属植物を同定するための方法であって、該方法が、該細胞質雄性不稔であるキクニガナ属植物のサンプル中の、１つまたはそれ以上の本発明のミトコンドリア核酸配列、すなわち配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群より選択される核酸配列の存在を証明することを含む、方法に関する。
【００４６】
第三の面によれば、本発明は、細胞質雄性不稔であるキクニガナ属植物を同定するための方法であって、該方法が、該細胞質雄性不稔であるキクニガナ属植物のサンプル中の、配列番号３１および配列番号３２の核酸増幅プライマーを用いて１５９２ｂｐの分子マーカー、および／または配列番号３３および配列番号３４の核酸増幅マーカーを用いて２９３ｂｐの分子マーカーの存在を証明することを含む、方法に関する。
【００４７】
第四の面によれば、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるミトコンドリア核酸配列に関する。
【００４８】
第五の面によれば、本発明は、キクニガナ属およびラクツカ属の細胞質雄性不稔ハイブリッド植物に関し、該細胞質雄性不稔ハイブリッド植物はラクツカ属のミトコンドリアを含み、該ミトコンドリアは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群より選択される少なくとも１つのミトコンドリア核酸配列を含む。
【００４９】
本発明のこの第五の面の好ましい態様によれば、本発明の細胞質雄性不稔ハイブリッド植物は、ＮＣＩＭＢ４２１２５にて寄託されている細胞質雄性不稔ハイブリッド植物であり、および／またはＮＣＩＭＢ４１９８５にて寄託されているラクツカ属植物由来のミトコンドリアを含む。
【００５０】
第六の面によれば、本発明は、細胞質雄性不稔であるキクニガナ属植物を得るためにラクツカ属植物のミトコンドリアを使用することに関し、本発明の使用は、好ましくは、供与体としてのラクツカ属の核ゲノム不活性化プロトプラストと、受容体としてのキクニガナ属植物のミトコンドリアゲノム不活性化プロトプラストとのプロトプラスト融合を含む。
【００５１】
以下に、本発明は、本発明の好ましい態様の例においてさらに説明される。該例において、以下の図面を引用する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、それぞれのフローサイトグラムを示す：（Ａ）キコリウム・インテュブス・エル（左上）；（Ｂ）ラクツカ種（右上）；（Ｃ）ハイブリッド１（本発明の植物；左下）；および、（Ｄ）Ａ、ＢおよびＣの混合サンプル（右下）。
【図２】図２は、ＲＡＭＰ法を用いる核ＤＮＡの分子特性分析の結果を示す。左レーンから右レーンへ、キコリウム・インテュブス（Ｐ１５５）；ラクツカ種（Ｐ１５７）；ハイブリッド１〜３（Ｈ１−Ｈ３、すなわちＰ１５５からＰ１５７の交雑によるハイブリッド植物；識別バンド（discriminating band）が示される。
【図３】図３は、キクニガナ属植物、ラクツカ属および選択された融合植物Ｐ１５３の花粉サイズを図示したものである。この図の説明：−Ｘ軸：花粉粒の直径（μｍ２）−Ｙ軸：異なるサイズの花粉粒の割合。
【図４】図４は、写真を示す。上：得られた記載される融合産物から選択された植物である、Ｐ１５３の花の写真。下：（非機能的）花粉粒を示す葯の拡大写真。
【図５】図５は、写真を示す。上：キコリウム・インテュブス・エルの稔性を有する花の写真。下：葯の拡大写真。
【実施例】
【００５３】
実施例
実施例１．種子の滅菌および播種
供与体（ラクツカ種、２０１２年６月１日にＮＣＩＭＢ寄託、Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, UK、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１９８５）および受容体（キコリウム・インテュブス・エル）の両方の種子をインビトロで播種した。この目的のために、各種の１００個の種子を７０％エタノール水溶液中で濯ぐことにより滅菌し、その後、ブリーチ液（脱イオン水中、１％（ｗ／ｖ）ＮａＯＣｌ＋０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０）で処理した。滅菌脱イオン水で十分に濯いだ後、種子を１／２ＭＳ１５のような好適な培地上に播き、２５℃で、１６／２４時間の照明下で成長させた。４週間後、プロトプラストの単離に好適であった。
【００５４】
実施例２．プロトプラストの単離
４週令の植物の若い、表面を滅菌した葉を集めた。これらの葉を、プラズモリシス液 ＷＳ９Ｍ中、ＴＣ規格のペトリ皿（Greiner Bio−One, article 664160）に１−２ｍｍの切片に切断した。全ての材料を集めた後、この溶液を、ペクチナーゼおよび／またはセルラーゼのような細胞壁分解酵素を含む酵素溶液２０ｍｌに置き換えた。オービタルシェーカー上で３０ｒｐｍの速度で一晩インキュベーション（暗所、２５℃）後、材料を、それぞれ１１０μｍおよび５３μｍのフィルターを用いて篩い分けした。これらのフィルターを１０ｍｌの洗浄液で２回洗浄した。
【００５５】
集めた濾液を、６０ｘ ｇで５分間、遠心した。１０ｍｌの洗浄液に該ペレットを再懸濁後、この遠心工程を繰り返した。プロトプラストを、さらなる処理まで氷上で保持した。
【００５６】
実施例３．発芽能力制御
単離したプロトプラストおよび花粉粒の発芽能力の検査をＦＤＡを用いて行った。この目的のために、供与体および受容体の両方からの染色したプロトプラストのサンプル、または供与体もしくは選択された融合植物から採取した花粉を、好適なフィルターを用いて、１０倍の倍率を用いて蛍光顕微鏡で調べた。
【００５７】
発芽能力のある細胞を淡黄緑色で認識することができ、発芽能力のない細胞は蛍光を発しない。
【００５８】
実施例４．単離したプロトプラストの前処理
供与体（ラクツカ属）から単離したプロトプラストを、好適な電離放射線源（例えば、レントゲンのＸ線またはγ放射線）で処理した。好適な線量は、吸収されたエネルギーの尺度として２５０〜５００グレーの範囲内である。受容体（キコリウム・インテュブス変種フォリオスム）から単離されたプロトプラストから、細胞小器官を、４℃で１０分間、終濃度１０ｍＭのＩＯＡ（６０ｍＭのＩＯＡ原液から供給される）で処理して不活性化した。この処理後、細胞を洗浄液で２回洗浄し、６０ｘ ｇで５分間、遠心した。
【００５９】
得られたプロトプラストの融合およびその後の再形成は、それぞれ実施例５および６ａ（液体培地中で培養）および実施例５および６ｂ（アルギン酸ナトリウムを用いて、固形培地中に包埋）に記載の通り、２通りの方法で実施することができる。
【００６０】
実施例５．プロトプラストの融合
１０ｍｌチューブ（丸底、Greiner、カタログ番号１６３１８９）当たり、１ｘ１０６個のプロトプラスト（受容体：供与体の比が、１：１または２：１）を洗浄液に懸濁して添加した。
【００６１】
遠心後（６０ｘ ｇで５分間）、各ペレットを０．３ｍｌ洗浄液中に再懸濁した。その後、試験管１本あたり０．４ｍｌのＰＥＧ１５００溶液数滴をチューブに滴下することにより加えた。この時点でさらなる混合はしなかった。３０分間静置後、０．８ｍｌのＰＥＧ希釈液を試験管壁をゆっくり流下させて加えた。さらに混合することなく、細胞をさらに１０分間置いた。
【００６２】
この後、チューブに最終容量１０ｍｌまでＣＰＷ−Ｃａ＋＋溶液を加えて、さらに混合することなく、細胞を６０ｘ ｇで５分間、遠心した。ＣＰＷ−Ｃａ２＋溶液で３回洗浄後、ペレットをＰＭ１培養培地に再懸濁して、最終濃度２０．０００プロトプラスト／ｍｌとした。
【００６３】
実施例６．融合プロトプラストの培養
実施例６ａ．液体再生培地の使用：
培養を暗所にて２５℃で行い、毎週、培養培地の一部を交換した：
−６ｃｍディッシュ：３ｍｌ（４．５ｍｌのうち）を、３ｍｌの新鮮なＰＭ１培地で置換した
−９ｃｍディッシュ：５ｍｌ（９ｍｌのうち）を、５ｍｌの新鮮なＰＭ１培地で置換した。
【００６４】
最初の細胞分裂が観察されたら直ぐに（２〜４細胞期）、培養培地をＰＭ２培地に交換し、またこの培地を、上記の通り１週間に１回交換した。
【００６５】
直径２ｍｍのカルスを、固形ＣＲＭ培地上に１０００ｌｕｘで置いた。カルスが緑色に変わると直ぐに、光の量を約１７００ｌｕｘに増加させた。シュートなしのカルスを、新鮮なＣＲＭ培地に３週間に１回移した。
【００６６】
出現したシュートをカルスから切り取り、可能な限り多くのカルスを残し、ジャーまたはペトリディッシュの何れかにおいて、ＭＳ３０ゲルライト培地上に置いた。発根を促進するために、シュートを切断し、残ったカルスを採取して、新鮮なＭＳ３０ゲルライト培地に移した。
【００６７】
実施例６ｂ．アルギン酸塩への包埋：
実施例５に記載の融合プロトプラストから出発して、プロトプラストを溶液Ａに懸濁した；チューブ当たり、１ｘ１０６個のプロトプラストを含んだ。それぞれのチューブに、２．５ｍｌの溶液Ａを添加した。慎重に細胞を再懸濁後、２．５ｍｌのアルギン酸ナトリウム溶液を添加した。１ｍｌの懸濁液を固形培地Ｂに添加した。１時間後、プロトプラストを含む固化した培地をＰＭ１培地で濯ぎ、それぞれ３個の６ｍｌのＰＭ１培地を含むディッシュ（それぞれ直径６または９ｃｍのペトリ皿）に移した。さらなる培地の交換は実施例６ａに記載のものと同様である。
【００６８】
カルスが直径２ｍｍに達すると直ぐに、アルギン酸マトリックスを、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム溶液で培地を交換することにより、溶解させた。各アルギン酸ディスクを８個に切断し、ディッシュをオービタルシェーカー（３０ｒｐｍ）上に２時間置いた。
【００６９】
マイクロカルスをピペットで採取し、試験管に移した。このチューブに、ＰＭ２培地を加えて、最終容量を１０ｍｌとし、その後、該チューブを６０ｘ ｇで５分間、遠心した。
【００７０】
ＰＭ２培地で２回洗浄後、カルスをＣＲＭ培地上に１０００ｌｕｘで置いた。緑色に変わったカルスを、さらに１７００ｌｕｘで成長させた。カルスをこの培地で維持し、必要に応じて、新鮮なＣＲＭ培地に３週毎に交換した。
【００７１】
これらのカルス上に出現したシュートをカルスから切り取り、ペトリ皿またはガラスビンの何れかのＭＳ３０ゲルライト培地上に置き、シュートを、発根が形成されるまで、同じ組成の新鮮な培地上に移した。根付いた植物をＭＳ３０培地上に置いた。
【００７２】
実施例７．倍数性レベルの決定
キクニガナ属植物とラクツカ属植物との細胞融合または交雑の結果生じる植物から、相対的な倍数性レベルを決定した。この目的のために、１ｃｍ２の葉組織の小片を試験する植物から採取し、ＣｙＳｔａｉｎ(登録商標)ＵＶ Ｐｌｏｉｄｙ バッファー（Partec, Muenster, Germany）中でカミソリの刃で刻んだ。
【００７３】
濾過後、サンプルの倍数性レベルをPartec PAフローサイトメーターを用いて決定し、キクニガナ属植物およびラクツカ属植物からのサンプルの結果と比較した。細胞融合から生じる二倍体植物のみを維持した。
【００７４】
キクニガナ属植物とラクツカ種との交雑から得られた植物は、キクニガナ属植物とラクツカ種との間の中間倍数性レベルを有している（図１）。
【００７５】
実施例８．ゲノムＤＮＡの分子特性化
キクニガナ属植物（ＩＤ＝Ｐ１５５）とラクツカ属植物（ＩＤ＝Ｐ１５７）との交雑の結果、いくつかの種子が収穫され、それらのうち３つの発芽種子を実施例７に記載のとおりに分析し、ハイブリッド植物として同定した。さらにこれらの植物を特徴付けるために、分子分析を行った。
【００７６】
これらの推定ハイブリッド植物および両親株から、標準的な単離法に従って±０．３ｃｍ２の葉外植片からＤＮＡを単離した。
【００７７】
この単離されたＤＮＡにおいて、キクニガナ属植物とラクツカ属植物との間に生じた多型を、２つのプライマーを用いてＲＡＭＰ分析を行った。その結果、ハイブリッド植物は両親株のゲノムＤＮＡを有することが明確に示され、従って、この植物は、実際に、キクニガナ属植物とラクツカ属植物とのゲノムハイブリッドであることが証明された。
【００７８】
反応に用いたプライマーは以下の通りであった。
Ｂｅｊｏｐ０９６３１    ＡＧＴＣＧＧＧＴＧＧ（配列番号３７；ＲＡＰＤプライマー）
Ｂｅｊｏｐ０１７５１    ＣＣＡＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴ（配列番号３８；ｉＳＳＲプライマー）。
【００７９】
ＰＣＲ条件。
９３℃にて２分、
９３℃にて３０秒;３５℃にて３０秒;７２℃にて９０秒;７２℃にて５分、を４０サイクル。
加熱を０．３℃／秒で行う。
【００８０】
実施例９．ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＲＡＭＰパターンを分析するために、“Ｇｅｎｅ ＲｅａｄＩＲ ４２００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ”（Licor Inc.）を用いた。６．５％アクリルアミドの最適濃度に基づき、サイズの異なる１塩基対ＤＮＡフラグメントを分離することができた。標識（ＩＲＤｙｅ標識）されたこれらのフラグメントを予想するために、複数のプライマーを用い、フォワードプライマーの量の３分の１が、標識した同一のプライマーに置き換えられた。
【００８１】
その結果、得られた植物が両親株のゲノムＤＮＡを有することが明確に示され、従って、これらの３つの植物（Ｈ１からＨ３）が、実際に、キクニガナ属植物とラクツカ属植物とのハイブリッドであることが証明された（図２）。
【００８２】
実施例１０．選択された融合植物のミトコンドリアＤＮＡの特徴付け
ミトコンドリアＤＮＡを、実際に、キクニガナ属植物の細胞質がラクツカ属の細胞質に置き換えられたことを証明するために、特徴付けた。
【００８３】
用いたバッファーは、本質的に記載されている通りであった。しかしながら、いくつかのバッファーは、“溶液および化合物”部分に記載のとおりに調整された。全ての実験工程は、他にこれと異なる記載がない限り、予め冷却したバッファーを４℃で用いて行った。
【００８４】
新鮮な葉１００グラムを、２５０ｍｌのＧＢバッファー中、ブレンダーを用いて氷上で均質化した。ホモジネートを、４層のチーズクロスおよび２層のナイロンメッシュ（７５μｍ）上で真空濾過した。残渣を、予め冷却した乳鉢および乳棒を用いてさらに均質化し、その後、上記の通り濾過した。
【００８５】
濾液を集め、１０分間、１，０００ｘ ｇで遠心した。上清を２，０００ｘ ｇでさらに遠心した。最後に、ミトコンドリアを１６，０００ｘ ｇでの遠心により集めた。得られたペレットを、１０ｍｌのＤＮＡｓｅ保存バッファー中に絵筆を用いて再懸濁した。
【００８６】
２，０００ｘ ｇで遠心後、得られた上清を遠心チューブにピペットで入れ、５０μｌの２Ｍ  ＭｇＣｌ２および２００μｌの５ｍｇ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅを加えた。１時間インキュベート後、この混合物に２０ｍｌの保存バッファーをピペットで加えた。
【００８７】
１４，０００ｘ ｇで遠心後、得られたペレットを１０ｍｌの保存バッファー中に再懸濁した。懸濁液を、１６，０００ｘ ｇで１０分間、遠心し、ペレットを６００μｌの溶解バッファーに溶解し、１．５ｍｌのエッペンドルフ試験管に移した。ミトコンドリアＤＮＡを含むこの溶解物において、１ｍｇのプロテイナーゼＫを溶解し、１０μｌのＲＮＡｓｅ−Ａ溶液を加えた。最初の６０分間、３７℃でインキュベーションを行いその後３０分間、６５℃でインキュベーションした。
【００８８】
このインキュベーション後、２００μｌの５Ｍ  ＫＡｃを加えてＤＮＡを沈殿させ、試験管を回転させて混合し、その後、氷上に最大で１５分間静置した。次に、室温にて１０分間、２０．０００ｘ ｇにて遠心した。最後に、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールおよびクロロホルム／イソアミルアルコールでＤＮＡを抽出した。残りの水相を、４００μｌのイソプロパノールおよび２７μｌの７．５Ｍ  酢酸アンモニウムと混合した。
【００８９】
１０分間、２０．０００ｘ ｇ（２０℃）にて遠心後、残ったペレットを５００μｌの７０％エタノール水溶液で洗浄し、２分間、２０．０００ｘ ｇ（２０℃）にて再度遠心した。乾燥後、得られたＤＮＡを２００μｌのＴＥバッファーに溶解した。
【００９０】
２０μｌの７．５Ｍ  酢酸ナトリウムおよび１５０μｌのイソプロパノールを添加して、第二のＤＮＡ沈殿を行い、混合物を数秒間穏やかに混合した。
【００９１】
次の遠心を、２０．０００ｘ ｇ（２０℃）にて１０分間行った。ペレットを５００μｌの７０％エタノール水溶液で洗浄し、短時間（２分）、２０．０００ｘ ｇ（２０℃）にて遠心した。ペレットを乾燥させ、２２μｌの滅菌超純水に溶解した。４℃で貯蔵した。
【００９２】
ＤＮＡの純度および濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００分光光度計、Ｑｕｂｉｔ ２．０ 蛍光光度計および標準アガロースゲル電気泳動法を用いて決定した。
【００９３】
単離したミトコンドリアＤＮＡの配列を、当業者に一般に公知の配列決定法を用いて、次世代シークエンシング法にて決定した。
【００９４】
この配列決定は、いくつかの領域を同定し、ここで、選択したＣＭＳキクニガナ属植物のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）が、元の可稔のキクニガナ属植物またはラクツカ属植物供与体のいずれかに等しく、該選択したＣＭＳキクニガナ属植物のミトコンドリアＤＮＡが、元の可稔のキクニガナ属植物およびラクツカ属植物供与体の両方のｍｔＤＮＡの再配置であることを明らかにした。
【００９５】
この目的のために、４セットのＰＣＲプライマーを開発し、ＣＭＳ表現型をもたらす選択された融合植物の固有の再配置されたｍｔＤＮＡを同定した。また、選択された融合産物をさらに特徴付けるために、１７個のＳＮＰセットを開発した（表２）。このデータから、選択されたＣＭＳキクニガナ属植物が、固有の再配置されたミトコンドリアＤＮＡと共に、記載される植物のＣＭＳ特徴を有する両親系統の断片を含むことが、結論付けられる。
【００９６】
実験の詳細は、以下の表に記載されている。
【表１】
0006268292.tif 000002
【００９７】
この反応のＰＣＲ条件は以下の通りであった。
全ＤＮＡを、記載のとおりに若い葉組織から単離し、ＲＮＡｓｅＡ／Ｔ１で処理した。ＤＮＡの完全性をアガロースゲル電気泳動により確認した。全てのサンプルからのＤＮＡを、ＰＣＲ反応のために１５ｎｇ／μｌに希釈した。鋳型ＤＮＡの量は、ＰＣＲ反応当たり１５ｎｇであった。両方のマーカーの組み合わせについてのＰＣＲを、２０μｌの反応において、１０ｐｍｏｌの上記の各プライマーを用いて、Biomix Red （GC Biotech）を用いて行った。ＰＣＲパラメーターは以下の通りであった。
９４℃にて１分。
９４℃にて１５秒；５８℃にて１５秒；７２℃にて１分を、３０サイクル。
７２℃にて５分。
４℃にて貯蔵。
【００９８】
５μｌのＰＣＲ反応物を１％アガロースゲルにローディングし、当業者に公知の標準技術を用いて分離した。
【表２】
0006268292.tif 000003
【００９９】
実施例１１．花粉粒の特性化
元の可稔のキクニガナ属植物と選択した融合植物との相違を説明するために、利用可能な花粉粒を用いて研究を行った。選択した融合植物Ｐ１５３を研究することにより、“それらしい”花粉粒が観察されたが、試みた自家受精およびＦＤＡ染色（実施例３）の両方が、この“それらしい”花粉が機能していないことを示した。
【０１００】
キクニガナ属植物および選択した融合植物の花粉のさらなる試験は、後者の花粉が有意に小さいことを明らかにした。ＷＳ９Ｍに懸濁した花粉粒を、１０倍の対物レンズを用いて倒立顕微鏡で明視野技術を用いて画像化し、３ＭＢ  ＣＣＤカメラで記録した。花粉粒のデジタル画像を処理し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Rasband, W.S., ImageJ, U.S.National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997−2012）を用いて分析した。
【０１０１】
画像を８ビットの二値化画像に変換した。ホールを閉じ、暗い境界線を除き（半径＝１０ピクセル）、そして互いに触れる花粉粒の突出部を、“Watershed（領域分割）”コマンドを用いて分離した。得られた画像を、花粉粒の突出部の表面積を得るために“粒子分析”コマンドを用いて分析した。画像のエッジに触れるオブジェクトは除外した。マイクロソフトのエクセルの統計関数を用いて、測定値はμｍ２に変換し、平均した。
【０１０２】
選択した融合植物の花粉表面積は、１１５０から１８５０μｍ２（ＳＤ＝１８０）の間で変化し、元のキクニガナ属植物の花粉粒については、決定された表面積は１５５０から２５５０μｍ２（ＳＤ＝２２６）の間であった。さらに、スチューデントのＴ検定分析は、花粉粒の両集団が等しくなる確立が０．０１を下回ることを示した（図３）。
【０１０３】
溶液および化合物
特に断らない限り、全ての溶液をオートクレーブ処理した（１２０℃にて２０分）。
【表３】
0006268292.tif 000004
【０１０４】
ＷＳ９Ｍ培地
ＫＨ２ＰＯ４              ０．２０ｍＭ
ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ      １０ｍＭ
ＫＮＯ３                 １ｍＭ
ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ      １ｍＭ
ＭＥＳ（一水和物）      ２．８ｍＭ
マンニトール            ０．５Ｍ
ｐＨ５．６；５８０ｍＯｓｍ／ｋｇ
【０１０５】
酵素溶液：
ＷＳ９Ｍ培地に以下のものを添加した。
ヤクルトのセルラーゼ“オノヅカ”Ｒ１０        ０．２％（ｗ／ｖ）
ペクチナーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ４３００）        ０．２％（ｗ／ｖ）
ｐＨ５．６−５．７、フィルター滅菌。
【０１０６】
洗浄溶液：
ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ          １３．６ｍＭ
ＫＣｌ                       ０．３４Ｍ
ＭＥＳ（一水和物）           ２．８ｍＭ
ｐＨ５．８；６４０ｍＯｓｍ／ｋｇ
【０１０７】
６０ｍＭ  ＩＯＡストック溶液：
２０ｍｌの洗浄液当たり、０．２２２ｇのＩＯＡ。
【０１０８】
ＰＥＧ１５００溶液：
ＰＥＧ１５００                  ４０％（ｗ／ｖ）
無水グルコース（ｗ／ｖ）        ０．３Ｍ
ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ             ５０ｍＭ
フィルター滅菌。
【０１０９】
ＰＥＧ希釈溶液
グリシン              ５０ｍＭ
無水グルコース        ０．３Ｍ
ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ   ５０ｍＭ
ｐＨ１０．５；５２０ｍＯｓｍ／ｋｇ；フィルター滅菌。
【０１１０】
ＣＰＷ−Ｃａ＋＋溶液              ２００ｍｌ
１０ｘＣＰＷ塩  ストック（ｒｅｆ．３）      ２０ｍｌ
ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ                         ５０ｍＭ
マンニトール                                ０．３６５Ｍ
ｐＨ５．７；５３０ｍＯｓｍ／ｋｇ；フィルター滅菌。
【０１１１】
【表４】
0006268292.tif 000005
【０１１２】
ＣＲＭ培地
ＭＳ培地（Duchefa；Ｍ０２２２）              ４．４０ｇ
スクロース                                   ３０ｍＭ
ゼアチン                                     ４．５６μＭ
ＢＡ                                         ２．２２μＭ
カゼイン加水分解物（Duchefa；Ｃ１３０１）    ３００ｍｇ／ｌ
寒天（Duchefa；Ｍ１００２）                  ８ｇ／ｌ
ｐＨ５．７
【０１１３】
クエン酸ナトリウム  ５０ｍＭ：
溶液Ａ、アルギン酸ナトリウム溶液、培地Ｂ：ｒｅｆ．５
Ｇａｍｂｏｒｇ  Ｂ５培地：
【０１１４】
ＰＣＲミックス：
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）          ７５ｍＭ
ＮＨ４ＳＯ４                             ２０ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ２０                          ０．０１％（ｖ／ｖ）
ＭｇＣｌ２                               ２．８ｍＭ
ｄＮＴＰｓ                              ０．２５ｍＭ
フォワードプライマー                    ０．１５μＭ
リバースプライマー                      ０．２μＭ
Ｒｅｄ  Ｈｏｔ(登録商標)ＤＮＡポリメラーゼ
（ＡＢｇｅｎｅ、Ｅｐｓｏｍ  Ｕ．Ｋ．）  ０．０４ユニット／μｌ
植物ゲノムＤＮＡ                        〜０．２ｎｇ／μｌ
【０１１５】
ＧＢ（粉砕バッファー）
ソルビトール                            ０．３５Ｍ
マンニトール                            ０．１Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６            ５０ｍＭ
Ｎａ２−ＥＤＴＡ                         ５ｍＭ
ＢＳＡ                                  ０．２％（ｗ／ｖ）
ＰＶＰ                                  １．０％（ｗ／ｖ）
スペルミジン                            ０．０２５％（ｗ／ｖ）
β−メルカプトエタノール                ０．１２５％（ｖ／ｖ）
ＤＩＥＣＡ                              １０ｍＭ
【０１１６】
ＤＮａｓｅ保存バッファー：
酢酸ナトリウム                          ５Ｍ
ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ                     １Ｍ
酢酸を用いてｐＨ４．５に調整；
使用前に、等量のグリセロールを添加。
【０１１７】
ＤＮａｓｅバッファー（ＤＢ）（４℃）
ＤＩＥＣＡ（使用直前に添加）            １０ｍＭ
【０１１８】
保存バッファー（ＳＢ）
スクロース                              ０．６Ｍ
Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．２            １０ｍＭ
Ｎａ２−ＥＤＴＡ                         ２０ｍＭ
ＤＩＥＣＡ（使用直前に添加）            １０ｍＭ
【０１１９】
ＴＥバッファー
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５            ５０ｍＭ
Ｎａ２−ＥＤＴＡ                         １０ｍＭ
ＤＮａｓｅ保存バッファー中、５ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ
２Ｍ  ＭｇＣｌ２
プロテイナーゼＫ
ＲｎａｓｅＡ溶液：Thermo Scientific社、製品番号ＥＮ０５５１ ５Ｍ  ＫＡｃ
フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）
クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）
７．５Ｍ  ＮＨ４−酢酸
７．５Ｍ  Ｎａ−酢酸  ｐＨ４．５−５．２。
【０１２０】
略語：
ＢＡ        ６−ベンジルアミノプリン
ｂｐ        塩基対
ＢＳＡ      ウシ血清アルブミン
ＣＭＳ      細胞質雄性不稔（性）
ＤＩＥＣＡ  Ｎａ−ジエチルジチオカルバメート
ＥＤＴＡ    エチレンジアミンテトラ酢酸
ＦＤＡ      フルオレセインジアセタート 
ＩＯＡ      ヨードアセトアミド
ＩＡ        ヨード酢酸
ＭＥＳ      ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
ｍｔＤＮＡ  ミトコンドリアＤＮＡ
ＮＡＡ      １−ナフタレン酢酸
ｎｇ        ナノグラム
ＰＣＲ      ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＥＧ      ポリエチレングリコール
ＰＶＰ      ポリビニルピロリドン
ＲＡＭＰ    ランダム増幅マイクロサテライト多型
ＳＤ        標準偏差
ＳＮＰ      一塩基多型
Ｋ          ＧまたはＴ  ）ＩＵＰＡＣのルールに従う
Ｍ          ＡまたはＣ  ）ヌクレオチドアンビギュイティーコード
Ｒ          ＧまたはＡ  ）
Ｙ          ＴまたはＣ  ）
【図１】
0006268292.tif 000006
【図２】
0006268292.tif 000007
【図３】
0006268292.tif 000008
【図４】
0006268292.tif 000009
【図５】
0006268292.tif 000010
【配列表】
0006268292000001.app