(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化されたカタラーゼ酵素を調製する方法であって、
セルロースである基質、リン酸塩バッファまたはホウ酸塩バッファ、及びカタラーゼ酵素を混合して、固体と液体の混合物を作製するステップと、
前記混合物から前記液体を排出するステップと、
前記固体を水でリンスした後、ポリソルベート２０である界面活性剤を添加するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記カタラーゼ酵素は、マンガン原子を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カタラーゼ酵素は、真菌由来であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記セルロースが、微結晶性セルロースであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記カタラーゼ酵素が、５００，０００ダルトン未満の分子量を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記真菌が、黒色アスペルギルスであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記セルロースが、微結晶性セルロース粉末を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記安定化されたカタラーゼ酵素が、−２０℃で７２時間、４０℃で７２時間、及び５５℃で６時間の熱サイクルを施された後、室温で最大７週間にわたって安定であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許仮出願第６１／７６９４０７号（２０１３年２月２６日出願）を基礎とする優先権を主張するものであり、その全内容を本明細書の一部とする。
【０００２】
本発明は、使用時までの保存可能期間及び安定性保持期間を長くするためにカタラーゼ酵素を安定化する方法に関する。本発明はまた、その安定化された酵素に関する。
【背景技術】
【０００３】
酸素は、生命の維持に必要不可欠である。海洋生物は溶解した形態の酸素を利用し、ヒトを含む陸地の生物種は気体の酸素を利用する。酸素不足、即ち低酸素症は、高齢化により四肢（例えば足）における血液循環の悪化した者や、糖尿病等の病気の患者が通常経験する。研究結果によれば、高齢者の皮膚においては、正常より低い、低酸素ストレスがあることも示されている。これは、皮膚の健康状態の悪化や、皺、乾燥、および皮膚弾力の低下等が過剰に見られる状態をもたらす。長きにわたって、化粧料製造者は、このような老化関連の影響の現れを遅らせ、かつ皮膚の健康を維持するための、皮膚軟化剤、エクスフォリエーター（角質・毛穴汚れ除去剤）、保湿剤等の種々の成分を有する皮膚用製剤を提供してきた。皮膚への酸素の直接的な供給を目的とした製剤はほとんど存在しなかった。
【０００４】
医療用、例えば、損傷した皮膚（創傷、炎症、及び外傷）の治療のため、更に近年では無傷の皮膚の処置のための皮膚への酸素供給が試みられてきた。例えば、Ｌａｄｉｚｉｎｓｋｙは、酸素を発生する創傷用包帯剤の特許を取得した（特許文献１）。最近では、Ｇｉｂｂｉｎｓらが、ポリアクリル酸塩ポリマーをベースにした酸素を発生する発泡包帯剤の製造方法で特許を取得した（特許文献２）。酸素を発生する発泡包帯剤の製造方法は簡単であるが、包帯剤自体はいくつかの欠点を有する。例えば、包帯剤の保存可能期間は、時間の経過につれて包帯剤から酸素が発泡セルから分散してしまうため十分長くはない。短い保存期間の問題を解決するため、発泡包帯剤の代替物として、オンデマンドの酸素発生局所組成物が提案された（Ｌａｄｉｚｉｎｓｋｙ、特許文献３）。特許文献３に開示のものでは、触媒を含むゲルと過酸化物が別々のリザーバに含められ、塗布の直前に混合されて、その混合物は皮膚に塗布されて、接触した状態を維持するように皮膚をカバーする。化粧品用途であれ医療用途であれ、酸素の発生は、概して、通常は過酸化水素である過酸化物の触媒を用いた分解によって達成される。
【０００５】
触媒と過酸化物を用いるあらゆる用途でみられる問題は、保存中、短時間の間に触媒が不活性化し得ることである。高温は、多くの触媒の不活性化を促進する。近代的な配送と顧客の利用のために、製品は、パッケージング、配送、展示、販売のために十分な期間にわたって安定であり、かつ及び使用者の自宅や他の場所において安定であることが重要である。組成物中の過酸化物及び／または触媒の安定化は、製品の長期間の保存を可能にする進歩となろう。製品が配送業界において一般的にみられる高温状態でも安定的であれば、それも望ましいことであろう。
【０００６】
長期間かつ高温下で触媒及び／または過酸化物を安定化させる方法の必要性が存在する。これにより、顧客が使用できるようになる前に製品が不活性化することなく、製品を製造、パッケージング、保管、配送することが可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，７９２，０９０号明細書
【特許文献２】米国特許第７，１６０，５５３号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９／００７４８８０号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
より長期間にわたって安定性を維持し得るように、触媒、特にカタラーゼを安定化させる方法が提供される。高温において触媒を安定化させる方法も提供される。
【０００９】
本発明の方法では、セルロースである基質を、リン酸塩バッファまたはホウ酸塩バッファ及びカタラーゼと十分に混合し、水でリンスし、界面活性剤（ポリソルベート２０）を添加する。安定化された粉末は種々のスキンローション（ローション、軟膏等）と混合することができる。カタラーゼ酵素は、過酸化物から酸素を発生する反応を触媒し得る。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
不活性化することなく保管可能となるようにカタラーゼを安定化する方法について、以下に記す。カタラーゼは、通常は細菌及び真菌によって産生される酵素であり、過酸化物を酸素に分解する触媒として使用できる。この分解は非常に短時間で生ずるが、分解は、それがうまく行われるためには、所与の量の過酸化物に対して十分な量のカタラーゼを有しているか否かに依存する。カタラーゼは、時間の経過につれて容易に失活し得るので、カタラーゼの安定化は、その有用な寿命を延ばし、その商品としての利用可能性を向上させ得る。配送中に曝される温度は多くの触媒を不活性化させるのに十分に高い温度であり得ることから、高温での安定化もまた重要である。
【００１１】
下記の実施例では、基質として微結晶性セルロースを用いているが、セラミックや金属を含むあらゆる適切な基質を使用できることに留意されたい。
【００１２】
以下の手順は、カタラーゼが安定化及び保存の後にどの程度その活性を維持するかを決定するために用いられるカタラーゼ活性の測定方法として一般的に利用されるものである。その手順の説明の後に、本発明の安定化されたカタラーゼの調製の実施例を記す。
【００１３】
カタラーゼ活性の有無の解析
【００１４】
カタラーゼ酵素の活性値は、国際単位（ＩＵ）で定められる。溶液または（懸濁液中の）固形粉末は、それが２５℃でｐＨ７のとき一分当たり１マイクロモルの過酸化水素を分解できる場合に１ＩＵ／ｍｌまたはｇの活性を有すると定義される。カタラーゼ活性の解析中に、過酸化水素濃度は好ましくは１０〜５０ｍＭに維持される。カタラーゼ活性を測定するための解析手順は単純で、酵素関連業界の当業者には既知のものである。簡単に説明すると、未知の濃度のカタラーゼ溶液を過酸化水素溶液に添加した後、ＵＶ可視化分光光度計を用いて２４０ｎｍの過酸化物吸収を経時的にモニタする。吸光度は過酸化物濃度に線形相関することから、吸光度−時間データを用いて、過酸化物濃度−時間データが得られる。２４０ｎｍにおける過酸化水素のモル吸光係数は３９．４リットル／モル−ｃｍであることに留意されたい。動的データから、初期値（時間０）が得られ、それがカタラーゼ活性を計算するために用いられる。
【実施例】
【００１５】
実施例１ セルロースに吸収されたカタラーゼ・Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリソルベート２０）スラリー（ＣＣＴ−Ａ）（０１８８−４５／４８）の調製
【００１６】
この目的は、カタラーゼ活性が、湿潤状態（スラリー）でより高い程度に保持されるか否かを調べることであった。予め重量が測定された空の円錐形の底部を有するＰＰ（ポリプロピレン）管（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ製）に、所定の重量（０．５ｇ）の微結晶性粉末（Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＣ１０５）を添加した。この添加の後、４．５ｍｌのリン酸塩バッファまたはホウ酸塩バッファ（０．０５Ｍ、ｐＨ：６．７）及び十分な量のカタラーゼ酵素溶液（グレード１５００Ｌ、活性：５０，０００ＩＵ／ｍｌ（ＢＩＯ−ＣＡＴ  Ｉｎｃ．米国バージニア州トロイ））を、ＣＣＴ−Ａの目標の理論上の活性が約１０，０００ＩＵ／ｇとなるように添加した。内容物をボルテックスミキサー上で短時間混合し、管を８００ｒｐｍで２４時間に設定したシェーカーに置いた。
【００１７】
２４時間後、管から液体を流し出し、残った固形物を５ｍｌの脱イオン水で３回リンスした。各リンス後に、固形物を遠心分離し、上清液は廃棄した。カタラーゼを吸収した湿潤セルロース固形物の重量を測定し、測定値約１．３３ｇを得た。これは概ね０．８３ｇの水分が存在することを意味する。次に、セルロース上に吸収されたカタラーゼの活性を測定し、２３９６ＩＵ／ｇの測定値を得た。円錐形ＰＰ管内の湿潤セルロースに、２．６７ｇの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリソルベート２０）を添加し、内容物を一様になるようにボルテックスして、ＣＣＴ−Ａのくすんだ緑色の粘性のあるスラリー（４．０ｇ）を得た。
【００１８】
実施例２ ＣＣＴ−Ａ（０１８８−４５／４８及び０１９０−３０／３１）の活性に対する熱サイクルの効果
【００１９】
あらゆる市販のカタラーゼの調製物は、実質的に活性を失うことなく、異なる環境条件の下での配送中に生ずる熱ストレスに耐えられるものでなければならない。本発明者は、実施例１で調製したＣＣＴ−Ａサンプルを、３段階からなる完全な熱サイクルの下で試験した。第１段階は、サンプルを−２０℃で７２時間維持し、第２段階は、４０℃で７２時間、第３の最終段階では５５℃で６時間維持した。
その後、サンプルを室温まで戻して、活性の有無を試験した。試験結果は以下の通りである：
条件        ：  活性（ＩＵ／ｇ）
熱サイクル前：  ２３９６
熱サイクル後：  ２６９５
【００２０】
熱サイクルの後に測定された活性値は、開始時の値より大きいが、これは熱サイクルが活性を向上させたと解するべきではなく、むしろ失活が生じなかったと解すべきである。活性が高くなった理由は、活性値の計算方法にあったとも考えられる。本活性値計算方法では、その値が動的データから得られた初期値に非常に影響を受けやすい。
【００２１】
熱サイクルに曝されたあらゆるサンプルでは、測定時の性質が短時間で劣化を示すものではないが、熱サイクル試験の終了後ある程度の時間が結果すると劣化を示すことがあり得る。本発明者は、これが当てはまるか否かを検証したいと考えた。熱サイクルの後カタラーゼスラリーのサンプルを室温で７週間維持し、時間間隔をおいてその活性を測定した。
その結果は以下の通りである。
期間              ：  活性（ＩＵ／ｇ）
熱サイクル１週間後：  ２８５６
熱サイクル５週間後：  ２５９２
熱サイクル７週間後：  ２４５５
【００２２】
１週間後、５週間後、及び７週間後に観察され活性値はそれぞれ、ＣＣＴ−Ａサンプルについてみられた初期値に匹敵する値である。明らかに、熱サイクル後７週間にわたる活性の安定化が観察されており、これは前記ＣＣＴ−Ａの調整方法により、長期にわたって安定な製剤が得られることを示している。
【００２３】
実施例３ ＣＣＴ−Ａ製剤の初期活性の向上及びスケールアップ実験
【００２４】
実施例１では、ＣＣＴ−Ａ製剤の初期カタラーゼ活性は、約２５００ＩＵ／ｇであった。この値は、カタラーゼの液体から吸収された状態への変換効率が低いことに部分的に起因して低くなっていると考えられた。本発明者は、カタラーゼ液体製剤とともに強力なカタラーゼ粉末を用いると、後にベースの化粧料ローション、軟膏、またはクリームに混合する際には、それらの物理的特性を変えないように非常に低いレベルでしか混合され得ない、長期にわたって安定的で、高いカタラーゼ濃度の製剤が吸収の必要なく生成されるであろうと考えた。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
上記表中の組成物においては、カタラーゼ７５００をカタラーゼ１５００Ｌに溶解した。このカタラーゼ溶液に、それぞれ所定の重量のセルロース粉末及び界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を添加し、その内容物を均一になるように混合した。目標活性値が４０，０００ＩＵ／ｇまたは５０，０００ＩＵ／ｇのいずれかであるように組成を変えた、カタラーゼ・Ｔｗｅｅｎ２０スラリーのブレンドを３種類作製した。測定すると、実測活性値は２つの組成物で僅かに異なっていた。それでも、これらの組成物は目標値と比較可能であった。このことは、単に市販のカタラーゼ製剤の量を操作することによって、どのような活性値のものであっても作製できたことを示唆している。表１に記載された３種の製剤（ＣＣＴＳと称する）のいずれも、吸収ステップを必要としていなかった点に注意されたい。
【００２７】
ローションまたはクリームとなるようにブレンドすることの容易さに関しては、製剤０４Ｆ１及び０４Ｆ２は最適ではない。製剤０４Ｆ１は、皮膚保湿ローションにブレンドするのが困難であった。また、製剤０４Ｆ２はローションをいくらか水っぽいものにしてしまった。製剤０４Ｆ３は、滑らかで流動性の高いローションを生成する、最も良いブレンドとなることが判明した。このローションを含む試験用ブレンドでは、１０％以下の分量の上述の製剤を用いた。
【００２８】
スケールアップ実験
【００２９】
より大きいスケールであっても、上記のＣＣＴＳ製剤のいずれも目標活性値にブレンドできるか否かを判定するために、本発明者は、目標カタラーゼ活性値が５０，０００ＩＵ／ｇのＣＣＴＳ製剤０１９３−０４Ｆ３の１００ｇのバッチを３つ調製した。いずれの１００ｇバッチを用いても、１０００ＩＵ／ｇのカタラーゼ活性値を有する約５ｋｇのローションを概ね作製することができた。このことは、１００ｇスケールがスケールアップをうまく行える好例であることを意味している。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
１００ｇスケールのＣＣＴＳバッチの調製に特に問題はなかった。卓上ミキサーを用いて、ブレンドはガラスビーカー内で容易に調製できた。この手順は適宜スケールアップすることも容易である。各実測活性値が目標値に近いことで、調製したブレンドが均一な組成物であることが確認できた。使用しないとき、サンプルバッチは４℃で保管した。興味深いことに、それらの活性は、この保管条件の下で実際上変化しない（平均６％程度しか低下しない）。カタラーゼがタンパク質で、細菌または真菌に誘導された劣化を受けやすいことを考えると、この結果は驚くべきことである。
【００３２】
実施例４ ＣＣＴＳ製剤をブレンドしたエマルジョン組成物の、熱による経時劣化の試験
【００３３】
この試験の目的は、ＣＣＴＳを含むエマルジョン組成物を、５５℃で６時間の熱ショックの後、４０℃で１２週間にわたって熱的に経時劣化させることである。熱ショックは、配送中の高温条件をシミュレートするものである（本発明者は、５５℃に曝すことで最大の影響が生ずることを発見したため、長期間の４０℃及び−２０℃への曝露は省略した）。１２週間にわたって４０℃に曝すことによりシミュレートされる加速された経時劣化は、特定の能力基準が満たされた場合、化粧品業界に認められた基準の下で実時間で２年間の保存可能期間にみたてることができた。
【００３４】
実施例３のＣＣＴＳ製剤０１９３−０４Ｆ３のサンプルを、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国カリフォルニア州、ファウンテンバレー）製の皮膚保湿ローション製剤１５５３−０７のベースにブレンドして、それぞれ１０００ＩＵ／ｇ及び５００ＩＵ／ｇの２つのローションサンプルを得た。これらのサンプルを（ｉ）５５℃に６時間曝し、次に（ｉｉ）４０℃でオーブン内に配置した。
【００３５】
各週毎に、サンプルを取り出し、室温まで冷まして効果の有無を試験した。効果の有無を試験するために、各サンプルのアリコット（約０．５ｇ）を、同じ量のローション含有０．９％過酸化水素（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製０２Ｒｅｓｅｒｖｏｒ、製剤１５７４−０６）に１：１の比率で混合した。２０分後、その１：１の混合物を、ＨＲＰアッセイによって残存過酸化物の有無について解析した。対照として、０２Ｒｅｓｅｒｖｏｒ（室温に維持）を、過酸化物の有無について解析した。０２Ｒｅｓｅｒｖｏｒ中の過酸化物の値及び残存過酸化物値から、過酸化水素の％分解率を求めた。
【００３６】
カタラーゼ含有ローションのサンプルの性能基準は、２０分間の経過後に１：１混合物中の過酸化水素の少なくとも６０％の分解が確認されることとした。理想的には、カタラーゼ活性の失活がなければ、過酸化水素の％分解率は１００％となる。
【００３７】
加速経時劣化試験結果は、後に示す表３に示す（ＮＤは未判定を表す）。以下のデータから、初期活性値１０００ＩＵ／ｇのカタラーゼ含有ローションは、実際上は全体として５００ＩＵ／ｇの過酸化物分解能力を保持することができ、６０％最小過酸化物分解の特定の基準に僅かに足りない程度となることが分かる。
【００３８】
これに対して、同レベルの活性を有するが、Ｔｗｅｅｎ２０及び微結晶性セルロースなしでカタラーゼ液（ＢＩＯＣＡＴ  Ｉｎｃ．グレード１５００Ｌ）に直接ブレンドすることによって調製された２種類のＳＨサンプルの結果は、非常に異なっている（表３の下側２行を参照）。両サンプルは５５℃に６時間曝されると、Ｔｗｅｅｎ２０を用いる安定化方法を利用して作製されたサンプルと比較して、カタラーゼ活性をそれぞれ２６％及び５９％失活した。これらの２つのサンプルを４０℃で１２週にわたって経時劣化させると、カタラーゼ活性は初期値を最高値として平均約１０％失活した。
【００３９】
経時劣化試験（４０℃で１２週）の結論において効果の試験結果を比較すると、Ｔｗｅｅｎ２０及びセルロースによる安定化効果は明白であった。安定化によって、カタラーゼ活性の失活が１．５倍遅くなった。即ち、Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０００ＩＵサンプル及びＴｗｅｅｎ２０を含まない１０００ＩＵサンプルはそれぞれ、９５％及び６４％のＨ２Ｏ２分解率を示し、対応する５００ＩＵサンプルはそれぞれ５７％及び６２％の分解率を示した。
【００４０】
１．５倍という率はあまり大きくないとみられることもあり得よう。しかし、このことは、Ｔｗｅｅｎ２０／セルロース安定化法を用いると、同じ分解効果を達成するために、高額な生化学的物質であるカタラーゼの量は２／３しか必要でなくなることを意味する。カタラーゼの安定化に使用される２種の化学物質は、市販されており比較的安価である。従って、本発明の安定化方法は、従来技術と比較して明らかな利点をもたらす。
【００４１】
【表３】
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【００４２】
実施例によって示されたように、本明細書には、微結晶性セルロース粉末、リン酸塩バッファまたはホウ酸塩バッファ、及びカタラーゼ酵素を十分に混合して、固形物と液体の混合物を作製するステップを含む安定化されたカタラーゼ酵素を調製する方法が提示される。次に、前記混合物から前記液体を流し出し、残った固形物を水でリンスした後、界面活性剤を添加し、その混合物を乾燥させる。
【００４３】
本明細書に記載されたカタラーゼの安定化に加えて、予想外の発見として、異なる生物に由来するカタラーゼのなかで、真菌、黒色アスペルギルスに由来するものが、曝される熱や化学的環境に対して最も安定的であることも見いだされた。セルロースに吸収された状態にあるバッファ溶液中のカタラーゼは、化粧料組成物中の化学物質成分または熱による劣化に対する耐性を示し、厳しい条件の配送中に活性を失わず、かつ加速された経時劣化をシミュレートする熱の下での経時劣化期間を長期化させた組成物を製造するために必要な活性を保持した。
【００４４】
当業者は、望ましいカタラーゼ源が真菌の黒色アスペルギルスであるとしても、他の種々の市販されている真菌株も利用できることを理解されよう。本発明は、あらゆる真菌株を含む、あらゆるカタラーゼ源に由来するカタラーゼを包含することに留意することは重要である。黒色アスペルギルスに由来するカタラーゼ分子は、マンガン原子を含むことが知られている。カタラーゼは遺伝子組換え生物に由来するものであってもよく、この場合、黒色アスペルギルスまたは一般的に真菌に由来するものであり得るカタラーゼ生成ベクターが導入されるホスト生物が真菌または他の生物であり得る。従って、より広い態様では、本発明は、真菌または他の生物等の由来とは無関係に、その分子構造の内部に１つまたは複数のマンガン原子を有するカタラーゼを包含する。その分子構造にマンガン分子を有し、かつ分子量が５００，０００ダルトン未満のカタラーゼが望ましい。