(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マツバボタン（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ  Ｈｏｏｋ．）抽出物またはこれの分画物を有効成分として含み、
上記の抽出物は、マツバボタンを水、Ｃ１ないしＣ４の低級アルコールおよびこれらの混合溶媒で構成される群から選ばれる溶媒で抽出して収得したものである、
神経炎症または神経変性疾患の予防または治療用の薬学的な組成物。
【請求項２】
上記の抽出物は、マツバボタンをメタノールで抽出したものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記の分画物は、マツバボタンメタノール抽出物を水、酢酸エチルまたはブタノールを用いて分画して収得したものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
上記の神経変性疾患は、認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、脳卒中、多発性硬化症、学習障害、認知障害、および記憶力損傷からなる群より選ばれるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
マツバボタン（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ  Ｈｏｏｋ．）抽出物またはこれの分画物を有効成分として含み、
上記の抽出物は、マツバボタンを水、Ｃ１ないしＣ４の低級アルコールおよびこれらの混合溶媒で構成される群から選ばれる溶媒で抽出して収得したものである、
神経炎症または神経変性疾患の予防または改善用の食品組成物。
【請求項６】
上記の抽出物は、マツバボタンをメタノールで抽出したものである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
上記の分画物は、マツバボタンのメタノール抽出物を水、酢酸エチルまたはブタノールを用いて分画して収得したものである、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
上記の神経変性疾患は、認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、脳卒中、多発性硬化症、学習障害、認知障害、および記憶力損傷からなる群より選ばれるものである、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
マツバボタン（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ  Ｈｏｏｋ．）抽出物またはこれの分画物を有効成分として含み、
上記の抽出物は、マツバボタンを水、Ｃ１ないしＣ４の低級アルコールおよびこれらの混合溶媒で構成される群から選ばれる溶媒で抽出して収得したものである、
学習能力、または記憶力の増進、または改善用の食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マツバボタン（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ  Ｈｏｏｋ．）抽出物またはこれの分画物を有効成分として含む神経炎症または神経変性疾患の予防、治療または薬学的な組成物および食品組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
炎症反応は、組織（細胞）の損傷や外部感染源（バクテリア、真菌、ウイルス、様々な種類のアレルギー誘発物質）に感染された場合、局所血管と体液の中の様々な炎症媒介因子および免疫細胞が関与される酵素活性化、炎症媒介物質の分泌、体液の浸潤、細胞の移動、組織の破壊などの一連の複合的な生理的反応と紅斑、浮腫、発熱、痛みなど外的症状を示す。正常の場合、炎症反応は、外部感染源を除去し、損傷された組織を再生して生命体の機能回復作用をするが、抗原が削除されなかったり、内部の物質が原因となって炎症反応が過度または持続的に起きると、むしろ粘膜の損傷を促進し、その結果、一部では癌の発生などの疾患につながる。
【０００３】
最近、炎症反応が神経の退行を誘発する主な機転の一つであるという事実が明らかになっている。すなわち、中枢神経系に存在する免疫細胞であるミクログリアは、様々な外因性、内因性の物質によって活性化されることがあり、活性化されたミクログリアは、炎症性のサイトカインであるＴＮＦ-α、およびＩＬ−１β、一酸化窒素、プロスタグランジン、超酸化物などの物質を生産、放出する（Ｇａｏ等、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、８１、１２８５−９７、２００２；  Ｎｅｌｓｏｎ、ＰＴ．など、Ａｎｎ  Ｍｅｄ、３４、４９１−５００、２００２；  Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｗ．Ｓ．など、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、３、  ５、２００６）。このような物質の生成は、短期的には、免疫反応を誘発するが、その過剰な生産や持続的な生産は、近接する神経細胞の死滅を誘導して、最終的に神経の退行を誘発するというものである。また、死滅している神経細胞が放出する物質がミクログリアの活性を再び誘発するようになるので、神経の退行は、継続的な悪循環に陥ることになる。実際にミクログリアの活性がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｔ−Ｊａｋｏｂ  Ｄｉｓｅａｓｅ、ＣＪＤ）、多発性硬化症などの様々な神経変性疾患と関係があることが報告されている。
【０００４】
このように神経変性疾患での神経炎症性の反応の重要性を考慮すれば、このようなミクログリアの内で前炎症性メディエーターの発現レベルを減少させることで、神経炎症及びこれから発症することができる神経変性疾患を治療することができるだろう。
【０００５】
一方、マツバボタン（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ  Ｈｏｏｋ．）は、スベリヒユ科に属する一年生草本植物として、原産地が南アメリカで、世界的に４０種が分布している。マツバボタンの全草をハンシレン（半枝蓮）と言って薬として用いられることもある。マツバボタンの主成分であるａｌｆａｔｏｘｉｎ  Ｂ１およびｃｌｃｙｌｏｐｈｓｐｈａｍｉｄｅがネズミ目で 抗突然変異作用（ａｎｔｉ−ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）の効能を有することが報告されているが、（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｚｈｏｎｇｇｕｏ  Ｚｈｏｎｇ  Ｙａｏ  Ｚａ  Ｚｈｉ、１９９０、６４０、６１７−６２２）、神経炎症または神経変性疾患の予防または治療の目的に対しては、まだ知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は認知症の予防および治療することができる方法を開発するために鋭意研究と努力をした結果、マツバボタン抽出物またはこれの分画物が神経炎症の反応を抑制するだけでなく、学習または記憶力の増進および改善効果を示すことを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的は、マツバボタン（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ  Ｈｏｏｋ．）抽出物またはこれの分画物を有効成分として含む神経炎症または神経変性疾患の予防または治療用の薬学的な組成物を提供するものである。
【０００８】
本発明の他の目的はマツバボタン抽出物またはこれの分画物を有効成分として含む神経炎症または神経変性疾患の予防または改善用の食品組成物を提供するものである。
【０００９】
本発明の他の目的はマツバボタン抽出物またはこれの分画物を有効成分として含む学習能力または記憶力の増進または改善用の組成物を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のマツバボタン抽出物またはこれの分画物は天然薬材として用いられてきた天然物から由来されて副作用がないながら、炎症関連の因子であるＮＯ、ＰＧＥ２、ｉＮＯＳおよび／またはＣＯＸ−２遺伝子またはタンパク質の発現を抑制するだけでなく、学習または記憶力の増進および改善効果が優れているので、神経炎症または神経変性疾患の予防および治療において有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
図１は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経細胞株でのマツバボタンのメタノール抽出物の処理による脳神経細胞の保護効果を示す図である。
図２は、ＢＶ−２ミクログリアでのマツバボタンのメタノール抽出物の処理によるＮＯの生成の抑制効果を示す図である。
図３は、ＢＶ−２ミクログリアでのマツバボタンのメタノール抽出物の処理によるＰＥＧ２の生成の抑制効果を示す図である。
図４ａおよび図４ｂは、ＢＶ−２ミクログリアでのマツバボタンのメタノール抽出物の処理によるｉＮＯＳタンパク質およびｍＲＮＡの発現の抑制効果を示す図である。
図５ａおよび図５ｂは、ＢＶ−２ミクログリアでのマツバボタンのメタノール抽出物の処理によるＣＯＸ−２タンパク質およびｍＲＮＡの発現の抑制効果を示す図である。
図６は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経細胞株でマツバボタンのメタノール抽出物の処理によるβ−ＣＴＦ発現の抑制効果を示す図である。
図７ａおよび図７ｂは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経細胞株でマツバボタンのメタノール抽出物の処理によるＢＡＣＥ１の発現の抑制効果を示す図である。
図８ａないし図８ｄは、Ｙ−迷路実験を通じるマツバボタン抽出物またはこれの分画物の作業記憶力の増進効果を示す図である。
図９ａないし図９ｄは、スコポラミン誘導の健忘モデルでのＹ−迷路実験を通じるマツバボタン抽出物またはこれの分画物の作業記憶力の改善効果を示す図である。
図１０ａないし図１０ｄは、受動回避試験を通じるマツバボタン抽出物またはこれの分画物の学習および記憶力の増進効果を示す図である。
図１１ａないし図１１ｄは、スコポラミン誘導の健忘モデルでの受動回避試験を通じるマツバボタン抽出物またはこれの分画物の学習および記憶力の改善効果を示す図である。
図１２は、Ａβ２５−３５誘導認知症モデルでのＹ−迷路実験を通じるマツバボタン抽出物の作業記憶力の改善効果を示す図である。
図１３は、Ａβ２５−３５誘導認知症モデルでの受動回避試験を通じるマツバボタン抽出物の学習および記憶力の改善効果の確認を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
上記の目的を達成するための一つの様態として、本発明は、マツバボタン（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ  Ｈｏｏｋ．）の抽出物またはその分画物を有効成分として含む、神経炎症または神経変性疾患の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。
【００１３】
具体的には、本発明の神経炎症または神経変性疾患の予防または治療用の薬学的組成物は、マツバボタン抽出物および／またはこれの分画物を含むことができる。
【００１４】
本発明では、「マツバボタン（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ  Ｈｏｏｋ．）」は、スベリヒユ科に属する一年生の草本植物として、原産地が南アメリカで、世界的に４０種が分布されている。茎は肉質が多く、円柱型で紅色を帯びて横になり枝を打って伸ばすが、大きなものは３０ｃｍほど育つ。葉は肉が多く、線状であり、毛がなく、葉の脇には白い毛が大量に出ている。花は茎の先端に一輪または二輪以上が咲くこともある。夏に紅色または白色で咲くが、萼は２片であり、広い卵形であって、花びらは５個であり、広い倒卵形で先端が尖っている。また、マツバボタンの全草をハンシレン（半枝蓮）と言って薬として用いられることもある。
【００１５】
本発明で、「マツバボタン抽出物」は、マツバボタンを抽出して収得した抽出物である。上記のマツバボタン抽出物は、マツバボタンの粉砕物を乾燥重量の約２ないし２０倍、好ましくは約３〜５倍に達する体積の水、メタノール、エタノール、およびブタノールなどのような炭素数１（Ｃ１）から４（Ｃ４）の低級アルコールの極性溶媒またはこれらの約1：０．１ないし１：１０の混合比を有する混合溶媒を溶出溶媒として用いて、抽出温度は２０ないし１００℃、好ましくは室温で、抽出期間は約１２時間ないし４日、好ましくは３日間熱水抽出、冷浸抽出、還流冷却抽出または超音波抽出などの抽出方法を用いて抽出することができるが、神経炎症または神経変性疾患の予防または治療活性のある物質を抽出する方法であれば制限なく用いることができる。好ましくは冷浸抽出で１回ないし５回連続抽出して減圧濾過し、その濾過抽出物を真空回転濃縮機で２０ないし１００℃、好ましくは室温で減圧濃縮し、水、低級アルコールまたはこれらの混合溶媒に可溶したマツバボタン粗抽出物を収得した結果になることができるが、本発明の神経炎症または神経変性疾患の予防または治療活性を示すことができる限り、これに限定されず、抽出液、抽出液の希釈液または濃縮液、抽出液を乾燥して得られる乾燥物、またはこれらの粗精製物または精製物をすべて含むことができる。上記のマツバボタン抽出物は、天然、雑種、変種植物の様々な機関から抽出することができ、例えば、根、地上部、茎、花、枝、葉、果実、または植物組織培養物などから抽出することができる。
【００１６】
本発明で、「分画物」は、様々な構成成分を含む混合物から特定の成分または特定のグループを分離する分画方法によって得られた結果である。本発明のマツバボタンの分画物は、マツバボタン抽出物を懸濁した後、水、メタノール、エタノールなどの極性溶媒またはヘキサン、酢酸エチルのような非極性溶媒を用いて分画することにより、極性溶媒分画物と非極性溶媒分画物をそれぞれ収得することができる。具体的には、マツバボタン粗抽出物を蒸留水等に懸濁した後、懸濁液の約１ないし１００倍、好ましくは約１ないし５倍の体積の水、炭素数１（Ｃ１）から４（Ｃ４）のアルコール、クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサン、ブタノールまたはこれらの混合溶媒のような極性または非極性溶媒を加えて、１回ないし１０回、好ましくは２回ないし５回にかけて極性または非極性溶媒可溶層を抽出し、分離して収得することができる。
【００１７】
また、本発明の分画物は、さらに、通常の分画工程を行って収得したものであることもできる（Ｈａｒｂｏｒｎｅ  Ｊ．Ｂ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１９９８、３ｒｄ  Ｅｄ．ｐ６−７）。例えば、本発明によるマツバボタン抽出物を一定の分子量カットオフ値を有する限外ろ過膜を通過させて得られた分画物、様々なクロマトグラフィー（サイズ、電荷、疎水性または親和性による分離のために制作されたもの）による分離などでさらに実施された様々な精製方法を通して得られた活性分画物も、本発明のマツバボタン分画物に含まれる。
【００１８】
上記の活性分画物は、分画物から、より高い生理活性などを有する分画を分離したもので、活性分画または有効分画物とも呼ばれている。系統的分画のような通常の分画プロセスを通じて収得した複数の成分が混合されている分画物のうち、濃度勾配カラムクロマトグラフィーなどを通じて活性成分の性質に応じて分離して出すこによって、より強い活性を有する特定の活性分画物を製造することができる。上記のカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル、セファデックス、ＬＨ−２０、ＯＤＳゲル、ＲＰ−１８、ポリアミド、トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）及びＸＡＤ樹脂からなる群から選ばれる充填剤を用いるカラムクロマトグラフィーを行って、活性分画物を分離および精製することができ、カラムクロマトグラフィーは、必要に応じて適切な充填剤を選択して数回実施することができるが、これらに限定されるものではない。上記のクロマトグラフィーを用いることにあり、溶出溶媒、溶出速度および溶出時間は、当業界で一般的に用いられる溶媒、速度または時間を適用することができる。
【００１９】
本発明の一実施例では、上記で得られたマツバボタンメタノール抽出物に蒸留水を加えて懸濁した後、それぞれ酢酸エチル、ブタノールまたは水を加えて酢酸エチル分画物、ブタノール分画物または水分画物を収得した（実施例１及び実施例２）。
【００２０】
本発明に係るマツバボタン抽出物またはこれの分画物は、炎症関連因子として知られている一酸化窒素（ＮＯ）、プロスタグランジン（ＰＧＥ２）、ｉＮＯＳおよび／またはＣＯＸ−２遺伝子またはタンパク質の発現を抑制することにより、神経炎症又はこれから発症することができる神経変性疾患の予防または治療の目的で用いることができる。
【００２１】
本発明で、「神経炎症」は、神経系、すなわち神経細胞、神経組織などに発生する炎症反応を総称する。中枢神経系に存在する免疫細胞であるミクログリアが様々な外因性、内因性物質によって活性化され、炎症性のサイトカインであるＴＮＦ−α、およびＩＬ−１β、一酸化窒素、プロスタグランジン、超酸化物などの物質を生産、放出する現象を含むことができる。これらの物質の生成は、短期的には、免疫反応を誘発するが、その過剰な生産や持続的な生産は、近接する神経細胞の死滅を誘導して、最終的に神経の退行を誘発すると知られている。
本発明の一実験例では、マツバボタンの抽出物またはこれの分画物が神経細胞に対する毒性を有しないながら、炎症関連因子として知られているＮＯ、ＰＧＥ２、ｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２のタンパク質またはｍＲＮＡの発現レベルを抑制したことを確認することにより、神経炎症の予防または治療効果を確認した（実験例２）。
【００２２】
また、本発明によるマツバボタン抽出物又はこれの分画物は、アルツハイマー病に関連する酵素として知られているβ−ＣＴＦとβ-セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）の発現を抑制することにより、神経変性疾患の予防または治療の目的で用いることができる。
【００２３】
本発明では、「神経変性疾患」は、中枢神経系の神経細胞に退行性変化が現しながら、様々な症状を誘発する疾患を総称して、具体的に認知機能、学習または記憶力が損傷されたり、神経炎症反応を伴う脳神経疾患を含むことができる。本発明による代表的な神経変性疾患には、認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ‘ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、 筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＣＪＤ）、脳卒中（Ｓｔｒｏｋｅ）、多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、認知障害、学習障害、記憶力損傷などがある。
【００２４】
この中でアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＤ）は、老人性認知症の中でも最も重要に台頭している疾患であり、アミロイドβ（ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ、Ａβ）の脳内の蓄積とそれによる神経毒性が発症の重要な原因として知られている。上記のＡβは、アミロイド前駆体（ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＡＰＰ）が膜たんぱく加水分解酵素である β-セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）とγセクレターゼの連続的な作用で作られていることが知られており、したがって、ＢＡＣＥ１タンパク質の発現抑制を通してアルツハイマー病を予防または治療できることは自明である。
【００２５】
本発明の一実験例では、アルツハイマー病に関連する遺伝子として知られているβ-ＣＴＦ（β−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ−ｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）とＢＡＣＥ１（Ｂｅｔａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  １、ｂｅｔａ−ｓｉｔｅ  ＡＰＰ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  １）のタンパク質またはｍＲＮＡの発現レベルも抑制させることを確認することにより、神経変性疾患が予防または治療効果を確認した（実験例３）。
【００２６】
本発明で、「予防」は、上記の組成物の投与で神経炎症または神経変性疾患の発症を抑制または遅延させるすべての行為をいい、「治療」は、上記の組成物によって、神経炎症または神経変性疾患による症状が好転されたり、有利に変更されるすべての行為をいう。
【００２７】
本発明のマツバボタン抽出物またはこれの分画物を含む薬学的組成物は、薬学的組成物の製造に通常的に用いられる適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。この際、上記の組成物に含まれるマツバボタン抽出物又はこれの分画物は、特にこれに限定されないが、組成物の総重量に対して、０．００１重量％ないし９９重量％で、好ましくは０．０１重量％ないし５０重量％を含むことができる。
【００２８】
上記の薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤および坐剤からなる群より選ばれるいずれか一つの剤型を有することができ、経口または非経口の様々な剤形であることができる。製剤化する場合には、普通に用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調剤することができる。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も用いることができる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることがてきる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが用いられることができる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを用いることができる。
【００２９】
もう一つの態様として、本発明は、上記の薬学的組成物を、神経炎症または神経変性疾患の疑いのある個体に投与するステップを含む、神経炎症または神経変性疾患の予防または治療方法を提供する。
【００３０】
本発明で、上記の神経炎症または神経変性疾患の疑いのある個体は、上記の疾患が発病または発病することができる人を含むすべての動物を意味し、本発明の薬学的組成物を、神経炎症または神経変性疾患の疑いの個体に投与することにより、個体を効率的に治療することができる。上記の薬学的組成物および神経炎症または神経変性疾患については、上記で説明した通りである。
【００３１】
本発明では、「投与」は、いかなる適切な方法で、神経炎症または神経変性疾患の疑いのある個体に、本発明の薬学的組成物を導入するものであって、投与経路は、目的組織に到達することができる限り、経口または非経口の様々経路をを通じて投与することができる。
【００３２】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与することができる。
【００３３】
本発明で、「薬学的に有効な量」は、医学的な治療に適用可能な合理的な恩恵／リスクの割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量のレベルは、個体の種類と重症度、年齢、性別、疾患の種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路、および排出の割合、治療期間、同時に用いられる薬物を含む要素およびその他の医学分野でよく知られている要素に応じて決定されることができる。本発明の組成物は、個別治療剤として投与するか、他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次または同時に投与することができる。そして、単一または複数投与することができる。上記の要素をすべて考慮して、副作用なしに、最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定することができる。
【００３４】
本発明の薬学的組成物は、神経炎症または神経変性疾患を目的とする個体であれば特に限定されず、いかなるものであっても適用可能である。例えば、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、牛、羊、豚、ヤギなどの非人間動物、人間、鳥類および魚類など、いずれも用いることができ、上記の薬学的組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内および鼻腔内に投与することができ、局部的な治療のために、必要であれば病変内投与を含む適切な方法によって投与することができる。本発明の上記の薬学的組成物の好ましい投与量は、個体の状態および体重、疾患の程度、薬物の形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選ぶことができる。例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射によって投与されることができるが、これらに制限されるものではない。
【００３５】
適切な総１日使用量は、正しい医学的な判断の範囲内で処置により決定することができ、一般的に０．００１ないし１０００ｍｇ／ｋｇの量、好ましくは０．０５ないし２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１ないし１００ｍｇ／ｋｇの量を一日１回ないし数回に分けて投与することができる。
【００３６】
またの他の態様として、本発明は、マツバボタン（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ  Ｈｏｏｋ．）抽出物またはこれの分画物を有効成分として含む、神経炎症または神経変性疾患の予防または改善用の食品組成物を提供する。
【００３７】
上記のマツバボタン、これの抽出物、分画物および神経炎症または神経変性疾患については、上記で説明した通りである。
【００３８】
本発明で、「改善」は、マツバボタン抽出物またはこれの分画物を有効成分として含む組成物を用いて予防または治療される神経炎症または神経変性疾患のような疾患の疑いのあるおよび発症の個体の症状が好転したり、有利になるすべての行為を言う。
【００３９】
具体的に、本発明のマツバボタン抽出物またはこれの分画物を、神経炎症または神経変性疾患の予防または改善を目的で、食品組成物に添加することができる。
【００４０】
本発明の食品組成物は、丸剤、粉末、顆粒、浸剤、錠剤、カプセルまたは液剤などの形態を含むことができ、本発明のマツバボタン抽出物またはこれの分画物を添加することができる食品の種類には、特に制限がなく、例えば、様々な飲料、ガム、お茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがある。
【００４１】
上記の食品組成物には、マツバボタン抽出物またはこれの分画物に加えて、他の成分を追加することができ、その種類は特に制限されない。例えば、通常の食品のように、様々な種類の生薬抽出物、食品学的に許容可能な食品補助添加剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができ、これに制限されない。
【００４２】
上記の「食品補助添加剤」は、食品に補助的に添加することができる構成要素として、各剤型の健康機能食品を製造するのに添加されることができ、当業者が適宜選んで用いることができる。食品補助添加剤の例としては、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤、および充填剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などが含まれるが、上記の例により本発明の食品補助添加剤の種類が制限されるものではない。
【００４３】
上記の天然炭水化物の例は、ブドウ糖、果糖などの単糖類;マルトース、スクロースなどの二糖類;およびデキストリン、シクロデキストリンなどの多糖類と、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールがあり、上記したもの以外の香味剤として、天然香味剤（ソーマチンなど）、ステビア抽出物（レバウジオシドＡ、グリチルリチンなど）および合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に用いることができる。
【００４４】
本発明の食品組成物には、健康機能性食品が含まれることができる。上記の「健康機能性食品」は、人体に有用な機能性を有する原料や成分を用いて精製、カプセル、粉末、顆粒、液体及び丸などの形態で製造および加工した食品をいう。ここで、機能性とは、人体の構造および機能について栄養素を調節したり、生理学的な作用などのような保健の用途に有用な効果を得ることをいう。本発明の健康機能性食品は、当業界で通常的に用いられる方法によって製造することが可能であり、上記の製造の際には、当業界で通常的に添加する原料および成分を添加して製造することができる。また、一般的な薬品とは異なり、食品を原料とし、薬品の長期服用の際に発生することができる副作用などがないメリットがあり、携帯性を高めることができる。
【００４５】
有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的な処置）に応じて適切に決定することができる。一般的に、食品の製造の際に、本発明のマツバボタン抽出物またはこれの分画物は、原料組成物の中の１ないし５０重量％、好ましくは５ないし１０重量％の量で添加されることができるが、これらに制限されるものではない。しかし、健康及び衛生を目的にしたりまたは健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、上記の量は、上記の範囲以下でも用いることができる。
【００４６】
上記の食品の種類には、特に制限はない。上記の物質を添加することができる食品の例としては、肉、ソーセージ、パン、チョコレート、飴類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種のスープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料およびビタミン複合剤などがあり、通常の意味での健康機能性食品をすべて含むことができる。
【００４７】
もう一つの態様として、本発明は、マツバボタン（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ  Ｈｏｏｋ．）抽出物またはこれの分画物を有効成分として含む学習能力または記憶力増進または改善用の組成物を提供する。
【００４８】
上記のマツバボタン、これの抽出物、分画物については、上記で説明した通りである。
【００４９】
本発明の一実験例では、マウスモデルを対象にマツバボタン抽出物またはこれの分画物を投与した結果、Ｙ−迷路実験での作業記憶の増進効果および受動回避実験での記憶力の増進効果を確認した。したがって、本発明のマツバボタン抽出物またはこれの分画物は、学習能力または記憶力増進の用途で用いることができ、上記の組成物は、薬学的組成物、医薬部外品の組成物または食品組成物であることができる。
【００５０】
また、本発明は、神経炎症または神経変性疾患の予防、改善または治療のための薬学的組成物または食品組成物の製造のための、マツバボタン（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ  Ｈｏｏｋ．）の抽出物またはこれの分画物の用途を提供する。
【００５１】
また、本発明は、学習能力または記憶力増進または改善のための食品組成物の製造のための、マツバボタン（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ  Ｈｏｏｋ．）抽出物またはこれの分画物の用途を提供する。
【００５２】
また、本発明は、マツバボタン（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ  Ｈｏｏｋ．）抽出物またはこれの分画物を、これを必要とする個体に投与することにより、個体の学習能力または記憶力を増進または改善させる方法を提供する。
【００５３】
発明の実施のための形態
以下、実施例を通じて本発明の構成および効果をより具体的に説明しようとするが、これらの実施例は、本発明の例示的な記載に過ぎなく、本発明の範囲がこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００５４】
１．薬物および試薬
Ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ２５−３５（Ａβ２５−３５）、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）、３０％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ、ｐｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ、３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２ 、５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）、Ｎ−（１−ｎａｐｈｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ｓｕｌｐｈａｎｉｌａｍｉｄｅ、Ｔｗｅｅｎ−２０、ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅおよびａｎｔｉ−β-ａｃｔｉｎ抗体は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．  （Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）のものを用いた。 Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）は、Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）社のものを用いた。 Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡおよびｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｍｉｘｔｕｒｅはＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＡ、ＵＳＡ）社のものを用いた。Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｎｋｅｄ ＩｇＧ抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）社のものを用いた。 Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ＡＰＰ、ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ＢＡＣＥ１、ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ＣＯＸ−２そしてｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｉＮＯＳ抗体は、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＴＲＩＺＯＬ、ｃＤＮＡ合成ｋｉｔはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、ＯＲ、ＵＳＡ）社のものを用いた。 ＰＧＥ２  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ、ＭＩ、ＵＳＡ）を用いた。その他の実験に用いられた試薬は、最高の製品のものを購入して用いた。
【００５５】
２．実験動物の準備
４週齢のＩＣＲ系の雄マウス（２５−３０ｇ）をコアテック（京畿、大韓民国）から供給を受けて成均館大学校の薬学大学の動物飼育室で１週間以上飼育して適応させて用いたし、水と飼料は自由に摂取するようにし、温度（２３±２℃）、湿度（５５±１０％）およびコントラストのサイクル（１２時間）は、自動的に調整されるようにした。
【００５６】
＜Ａβ２５−３５誘導認知症モデルの製作＞
Ａβ２５−３５を最終濃度１ｍＭのｓａｌｉｎｅに溶かし、３７℃に５日間活性化させた後、上記の４週齢のＩＣＲ系の雄マウス（２５−３０g）をエントバーで麻酔の後、 脳定位固定装置（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて左側の脳室に６ｎｍｏｌ／３μｌのＡβ２５−３５を注射した。注射の後、回復のために、３７℃以上の保温下で実験動物を安定化させた。
【００５７】
３．細胞の培養
ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ｓｗｅｄｉｓｈ形質転換細胞およびマウスＢＶ−２ミクログリアは不活性化させた１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）と抗生剤が含有されたＤＭＥＭ（ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）の培地の下で培養した。培養器を３７℃の温度に維持し、９５％の空気と５％ＣＯ２が混合された気体を供給し続けて細胞培養の適切な条件を備えた。細胞は、６、２４、そして９６ウェルプレートに２．５×１０４、５×１０５、そして１×１０６細胞を、実験の２４時間の前に培養した。過酸化水素は４００μＭで決定したし、ＬＰＳは１００ｎｇ／ｍｌで決定した。マツバボタンメタノール粗抽出物は、１００％ＤＭＳＯに溶かして、最終の濃度０．１％以下で用いた。
【００５８】
４．統計処理
すべての実験の結果は、ＡＮＯＶＡ（ｏｎｅ  ｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ）を用いて統計処理し、有意性が検証される場合Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  ｔｅｓｔを用いてp<０．０５レベル以下で有意性の検定を実施した。
【００５９】
実施例１：マツバボタンメタノール抽出物の製造
中国雲南省から採取したマツバボタンの陰干しされたものを（分譲番号、ＦＢＭ０１６−０６８）韓国生命工学研究院の海外生物素材ハーブセンターから分譲して用いた。乾燥されたマツバボタン３００ｇを完全に乾燥させた後、粉砕してマツバボタン３００gを９５％メタノール３Ｌに８５℃の温度で３回繰り返して抽出した後、これを減圧濃縮器（ＥＹＥＬＡ社、Ｎ−１０００、日本）で減圧濃縮した後、凍結乾燥してマツバボタンメタノール粗抽出物９０gを収得した。
【００６０】
実施例２：マツバボタン分画物の製造
【００６１】
実施例２−１：マツバボタン酢酸エチル分画物の製造
上記の実施例１と同様な方法でマツバボタン３００gから得たマツバボタンメタノール粗抽出物の中の３６．３ｇを水１Ｌで懸濁した後、酢酸エチル（ＥｔＡｃ）１Ｌに２回にかけって抽出し、酢酸エチル可溶分画物８ｇを収得した。
【００６２】
実施例２−２：マツバボタンブタノール分画物の製造
上記の実施例２−１で分画した後の水層に再びブタノール（ＢｕＯＨ）１Ｌに２回にかけって抽出してブタノール可溶分画物５．７９ｇを収得した。
【００６３】
実施例２−３：マツバボタンの水分画物の製造
上記の実施例２−２で得られたマツバボタンブタノール可溶分画物を分画した後の水層を濃縮し、水分画物２０．５５gを収得した。
【００６４】
上記のマツバボタン抽出物およびこれの分画物は、それぞれ熱水処理して減圧濃縮して実験に用いた。
【００６５】
実験例１：マツバボタン抽出物の神経細胞の保護効果
マツバボタン抽出物の処理による神経細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）の生存率を測定するためにＭＴＴ還元アッセイを用いた。実験を行った９６ウェルプレートにＭＴＴ溶液を最終濃度０．５ｍｇ/ｍｌになるように、それぞれのウェルに入れた。培養器で２時間反応させて培地とＭＴＴ溶液を除去した後、ＤＭＳＯを入れて攪拌した。完全に溶解されたときに、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳＡ）を用いて５４０ｎｍでＵＶ吸光度を測定した。
測定された吸光度の値を下記の［数学式］に代入して、細胞の生存率を計算した。
［数学式１］
細胞生存率（％）＝（（対照群Ｏ．Ｄ．−試験群Ｏ．Ｄ．）／対照群Ｏ．Ｄ．）×１００
その結果、マツバボタン抽出物の処理なしに過酸化水素のみを処理した細胞の生存率は４８％で大幅に減少したが、マツバボタン抽出物を処理した結果抽出物の用量依存的に細胞生存率が増加したことを確認し、これはマツバボタン抽出物の有意な神経保護効果を示唆する（図１）。
【００６６】
実験例２：マツバボタン抽出物の抗炎症の効果
【００６７】
実験例２−１：マツバボタン抽出物の一酸化窒素（ＮＯ）の抑制効果
マツバボタン抽出物の抗炎症の効能を確認するために、炎症媒介物質であるＮＯの生産量を定量的に測定した。具体的に、２．５×１０５個のＢＶ−２ミクログリアを２４−ウェルプレートに、実験の２４時間の前に分注して、神経炎症誘発物質であるＬＰＳ１００ｎｇ／ｍｌと、上記の実施例１で製造したマツバボタン抽出物を濃度別に添加した後、培養器で２４時間反応させ、それぞれ５０μｌのグリース試薬（Ｇｒｉｅｓｓ  ｒｅａｇｅｎｔ;１％  ｓｕｌｆｏｎｉｌａｍｉｎｅ／０．１％Ｎ−（１−ｎａｐｈｔｙｌ）−ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ／５％リン酸）を添加した後、１５分間反応させた。以来、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳＡ）を用いて５４０ｎｍの波長で神経炎症反応の抑制効果を測定した。
【００６８】
その結果、ＢＶ−２ミクログリアでＬＰＳ処理によってＮＯ生成量が大幅に増加し、ＬＰＳによって著しく増加したＮＯ生成量は、マツバボタン抽出物の用量依存的に抑制されたことを確認した（図２）。
【００６９】
実験例２−２：マツバボタン抽出物のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の抑制効果
マツバボタン抽出物の抗炎症の効能を確認するために、炎症媒介物質であるＰＧＥ２の生産量を定量的に測定した。具体的には、ＢＶ−２ミクログリアは、２４ウェルプレートに２．５×１０５細胞を、実験の２４時間の前に分注して、神経炎症誘発物質であるＬＰＳ １００ｎｇ／ｍｌと、上記の実施例１で製造したマツバボタン抽出物を濃度別に添加した後、培養器で２４時間反応させ、２４時間の後に、それぞれの濃度で処理されたウェルの上澄み液を収集し、遠心分離器を用いて４００g、３分間沈殿させ、ＰＧＥ２ ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを用いて、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳＡ）を用いて４９０ｎｍでＵＶ吸光度を測定した。測定された吸光度値をｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｕｒｖｅの定量グラフを用いて、ＰＧＥ２の生成を計算した。
【００７０】
その結果、ＢＶ−２ミクログリアでＬＰＳ処理によりＰＧＥ２生成量が顕著に増加し、ＬＰＳによって著しく増加されたＰＧＥ２の生成量は、マツバボタン抽出物の用量依存的に抑制されたことを確認した（図３）。
【００７１】
実験例２−３：マツバボタン抽出物のｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２タンパク質およびｍＲＮＡ発現の抑制効果
ＢＶ−２ミクログリアでマツバボタン抽出物の神経炎症に関連されるタンパク質およびｍＲＮＡ発現の同定実験のためにウエスタンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲ実験を実施した。実験を行った６ウェルプレートにマツバボタン抽出物を３０分間前処理をした後、ＬＰＳで処理した後、６時間または２４時間の間、培養器で反応させた。６時間または２４時間後に、それぞれの濃度で処理されたウェルの上澄み液を収集し、遠心分離器を用いて４００ｇ、３分間沈殿させ、細胞は冷たいＰＢＳで洗浄した後、Ｔｐｅｒ溶解バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ） １００μｌを添加して３０分間溶解させた。溶解物は遠心分離器を用いて、１００００g、４℃で１５分間遠心分離させ、遠心分離の後、上澄み液は、実験のためのサンプルとして用いる前まで７０℃で保管した。タンパク質は、ＢＣＡ定量分析キット（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）を用いて定量分析し、８％ないし１２％のＳＤＳゲルで溶出した後、ＰＶＤＦ膜に移した。タンパク質の発現を確認するために、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｍｉｌｕｍｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）で蛍光発色させ確認するが、まず５％脱脂粉乳で膜を１時間反応させ、一次抗体であるｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２およびβ-ａｃｔｉｎで４℃で一晩標識させて、ＴＴＢＳで５回洗浄した後、二次抗体であるＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ、そしてａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ抗体を室温で１時間標識した。標識の後、１０分間ＴＴＢＳを用いて５回洗浄し、洗浄された膜はＥＣＬを用いて 、ｘ−ｒａｙフィルムを用いて、発色させ、濃度は定量分析法により定量分析プログラム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、ｊａｐａｎ）を用いて分析した。また、ｍＲＮＡの発現を確認するために、ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全体ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。上記のＲＴ−ＰＣＲは、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２およびβ-ａｃｔｉｎのプライマーを用いて、プライマー配列を下記の［表１］に示した。
【００７２】
【表１】
0006377857.tif 000002
その結果、ＬＰＳ処理によりｉＮＯＳとＣＯＸ−２タンパク質およびｍＲＮＡの発現レベルが著しく増加した一方、マツバボタン抽出物を投与した結果、これらのタンパク質およびｍＲＮＡの発現レベルが顕著に減少することを確認した（図４及び図５）。
【００７３】
実験例３：マツバボタン抽出物のアルツハイマー関連の遺伝子およびタンパク質発現の抑制効果
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ｓｗｅｄｉｓｈ形質転換の神経細胞株でマツバボタン抽出物の認知症（アルツハイマー病）に関連するタンパク質およびｍＲＮＡ発現の同定実験のためにβ−ＣＴＦとＢＡＣＥ１について、それぞれウエスタンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲ実験を実施した。実験を行った６ウェルプレートにマツバボタン抽出物を２４時間前処理をした後、培養器で反応させた。２４時間の後、それぞれの濃度で処理されたウェルの上澄み液を収集し、遠心分離器を用いて４００g、３分間沈殿させ、細胞は、冷たいＰＢＳで洗浄した後、Ｔｐｅｒ溶解バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）１００μｌを添加して３０分間溶解させた。溶解物は遠心分離器を用いて、１００００g、４℃で１５分間遠心分離させ、遠心分離の後、上澄み液は、実験のためのサンプルとして用いる前まで７０℃で保管した。
【００７４】
タンパク質は、ＢＣＡ定量分析キット（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）を用いて定量分析したし、１２．５％のＳＤＳゲルで溶出した後、ＰＶＤＦ膜に移した。タンパク質の発現を確認するために、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｍｉｌｕｍｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）で蛍光発色させ確認するが、まず５％の脱脂粉乳で膜を1時間反応させ、一次抗体であるＡＰＰ、β-ＣＴＦ、ＢＡＣＥ１およびβ-ａｃｔｉｎに４℃で一晩標識させ、ＴＴＢＳで５回洗浄した後、二次抗体であるＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ、そしてａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ抗体を室温で１時間標識した。標識の後、１０分間ＴＴＢＳを用いて、５回洗浄し、洗浄された膜はＥＣＬを用いて、Ｘ−ｒａｙフィルムを用いて発色させ、濃度は定量分析法により定量分析プログラム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、ｊａｐａｎ）を用いて分析した。
【００７５】
一方、ｍＲＮＡの発現を確認するために、ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全体のＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。上記のＲＴ−ＰＣＲは、ＢＡＣＥ１とβ-ａｃｔｉｎのプライマーを用いて、プライマー配列を下記の［表２］に示した。
【００７６】
【表２】
0006377857.tif 000003
【００７７】
その結果、β-ＣＴＦ（β−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ−ｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）タンパク質の発現レベルは、処理したマツバボタン抽出物の用量依存的に抑制したことを確認した（図６）。
【００７８】
ＢＡＣＥ１タンパク質およびｍＲＮＡ発現レベルも、処理したマツバボタン抽出物の用量依存的に抑制したことを確認した（図７ａ及び図７ｂ）。
【００７９】
実験例４：マツバボタン抽出物またはこれの分画物の作業記憶力の増進効果
【００８０】
実験例４−１：Ｙ−迷路実験を通じるマツバボタン抽出物またはこれの分画物の作業記憶力の増進効果の確認
マウスをそれぞれの群ごとに１４匹ずつ４の群に分けた。第１群は１０％Ｔｗｅｅｎ２０を含む蒸留水投与群（対照群）、第２群ないし第４群は、それぞれマツバボタン抽出物またはこれのブタノール、酢酸エチル、水溶性分画物６．２５、１２．５、および２５ｍｇ／ｋｇ投与群（実験群）とした。
【００８１】
マツバボタン抽出物またはこれの分画物を１０％Ｔｗｅｅｎ２０を含む蒸留水に溶解させ、６．２５、１２．５、および２５ｍｇ／ｋｇの容量でマウスに経口投与し、１時間後に、マウスをＹ−迷路に入れて、それぞれＡ、ＢおよびＣの枝にマウスが自由に入ることを測定した。この際に、新しい枝に入ると１点を与えることになり、 交替行動％は、下記の［数学式２］によって計算した。
［数学式２］
交替行動（％）＝（三つの枝すべてに入った回数／（各枝に入った回数−２））×１００
その結果、マツバボタン抽出物またはこれの分画物を投与していない第１群（対照群）のマウスに比べてマツバボタン抽出物またはこれの分画物を投与した第２群ないし第４群（実験群）のマウスからマツバボタン抽出物またはこれの分画物の濃度依存的に交替行動の割合を増加させたことを確認した。
【００８２】
これは、Ｙ−迷路実験での作業記憶の増進効能を示す結果であって、上記の実験結果からマツバボタンメタノール粗抽出物及びこれの分画物がそれぞれのマウスの作業記憶力を顕著に増加させることができることを確認した（図８ａ−図８ｄ）。
【００８３】
実験例４−２：スコポラミン誘導の健忘モデルでのＹ−迷路実験を通じるマツバボタン抽出物またはこれの分画物の作業記憶力の改善効果の確認
マウスをそれぞれの群ごとに１４匹ずつ５の群に分けた。第１群は１０％Ｔｗｅｅｎ２０を含む蒸留水投与群（対照群）、第２群は１０％Ｔｗｅｅｎ２０を含む蒸留水およびスコポラミン投与群（陽性対照群）、第３群ないし第５群は、マツバボタン抽出物またはこれのブタノール、酢酸エチル、水溶性分画物の投与群（実験群）とした。
【００８４】
マツバボタン抽出物またはこれの分画物を、それぞれ１０％Ｔｗｅｅｎ２０を含む蒸留水に溶解させ、６．２５、１２．５、および２５ｍｇ／ｋｇの容量でマウスに経口投与し、３０分後にスコポラミン０．５ｍｇ／ｋｇを皮下注射した。
【００８５】
１時間の後に、マウスをＹ−迷路に入れてＡ、Ｂ、およびＣの枝にマウスが自由に入ることを測定した。この際に、新しい枝に入ると、１点を与えることになり、交替行動％は、下記の［数学式２］によって計算した。
［数学式２］
交替行動（％）＝（三つの枝すべてに入った回数／（各枝に入った回数−２））×１００
その結果、スコポラミンを投与していない第１群（対照群）のマウスに比べてスコポラミンを投与した第２群（陽性対照群）で交替行動の割合が低くなることによって、 健忘症が誘導されたことを確認した。
【００８６】
一方、マツバボタン抽出物またはこれの分画物を投与した第３群ないし第５群（実験群）のマウスで交替行動の割合を増加させたことを確認した。上記の実験の結果を通じてマツバボタンメタノール抽出物またはこれの分画物が記憶力の損傷を効果的に予防することができることを確認した（図９ａないし図９ｄ）。
【００８７】
実験例４−３：Ａβ２５−３５誘導認知症モデルでのＹ−迷路実験を通じるマツバボタン抽出物の作業記憶力の改善効果の確認
マウスをそれぞれの群ごとに１１〜１２匹ずつ５の群に分けた。第１群は１０％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む蒸留水投与群（対照群）、第２群は１０％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む蒸留水およびＡβ２５−３５投与群（陽性対照群）、第３群ないし第５群は、濃度別のマツバボタン抽出物の投与群（実験群）とした。
【００８８】
マツバボタン抽出物をそれぞれ１０％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む蒸留水に溶解させ、６．２５、１２．５、および２５ｍｇ／ｋｇの容量でマウスに経口投与し、１時間の後にＡβ２５−３５６ｎｍｏｌを左側の脳室に脳定位固定装置を用いて注射した。 ５日間のそれぞれの群に１０％Ｔｗｅｅｎ２０を含めてマツバボタン抽出物６．２５、１２．５、および２５ｍｇ／ｋｇを投与した。
【００８９】
５日目にそれぞれのマツバボタン抽出物を投与の１時間後に、マウスをＹ−迷路に入れてＡ、Ｂ、およびＣの枝にマウスが自由に入ることを測定した。この際に、新しい枝に入ると、１点を与えることになり、交替行動％は、下記の［数学式２］によって計算した。
［数学式２］
交替行動（％）＝（三つの枝すべてに入った回数／（各枝に入った回数−２））×１００
その結果、Ａβ２５−３５を投与していない第1群（対照群）のマウスの交替行動の割合（６７％）に比べてＡβ２５−３５を投与した第２群（陽性対照群）で交替行動の割合（５２％）が低くすることで、認知症が誘導されたことを確認した（ｐ＜０．０１）。
【００９０】
一方、マツバボタンメタノール抽出物６．２５ｍｇ／ｋｇ投与群、１２．５ｍｇ／ｋｇ投与群および２５ｍｇ／ｋｇ投与群はそれぞれ５８％、６７％、および６２％の交替行動の割合を示しＡβ２５−３５誘導認知症モデル群（陽性対照群）に比べて著しく交替行動の割合を増加させたことを確認した。
【００９１】
上記の実験結果を通じてマツバボタン抽出物がアルツハイマー性の記憶力損傷を効果的に予防することができることを確認した（図１２）。
【００９２】
実験例５：マツバボタン抽出物またはこれの分画物の学習および記憶力の増進効果
【００９３】
実験例５−１：受動回避試験を通じるマツバボタン抽出物またはこれの分画物の学習および記憶力の増進効果の確認
マウスをそれぞれの群ごとに１４匹ずつ４の群に分けた。第１群は１０％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む蒸留水投与群（対照群）、第２群ないし第４群は、それぞれマツバボタン抽出物またはこれの可溶分画物（酢酸エチル、ブタノール、水）６．２５、１２．５、および２５ｍｇ／ｋｇ投与群（実験群）とした。
【００９４】
マツバボタン抽出物またはこれの可溶分画物（酢酸エチル、ブタノール、水）をそれぞれ１０％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む蒸留水に溶解させ、６．２５、１２．５、および２５ｍｇ／ｋｇの容量でマウスに経口投与した。１時間後にマウスをステップ-スルー（ｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ）装置に入れ、暗い箱に入ると０．２５ｍＡの電気ショックを３秒間加えて学習（ｔｒａｉｎｉｎｇ）させた。 ２４時間の後に、マウスを再び明るい箱に入れて、黒い箱に入るまでの滞在時間を測定して、学習および記憶力の指標とした。この際に、マウスのカット−オフ時間（ｃｕｔ−ｏｆｆ  ｔｉｍｅ）は、３００秒で対照群と比較した。
【００９５】
その結果、マツバボタン抽出物またはこれの分画物を投与していない第１群（対照群）のマウスに比べてマツバボタン抽出物またはこれの分画物を投与した第２群ないし第４群（実験群）のマウスに滞在時間が増加することを確認した。
【００９６】
上記の実験結果から、マツバボタンメタノール粗抽出物およびこれの分画物がマウスの学習と記憶力を顕著に増加させることができることを確認した（図１０ａないし図１０ｄ）。
【００９７】
実験例５−２：スコポラミン誘導の健忘モデルでの受動回避試験を通じるマツバボタン抽出物またはこれの分画物の学習および記憶力の改善効果の確認
【００９８】
マウスをそれぞれの群ごとに１４匹ずつ５の群に分けた。第１群は１０％Ｔｗｅｅｎ２０を含む蒸留水投与群（対照群）、第２群は１０％Ｔｗｅｅｎ２０を含む蒸留水およびスコポラミン投与群（陽性対照群）、第３群ないし第５群は、マツバボタン抽出物またはこれの可溶分画物（酢酸エチル、ブタノール、水）の投与群（実験群）とした。
【００９９】
マツバボタン抽出物またはこれの分画物を、それぞれ１０％Ｔｗｅｅｎ２０を含む蒸留水に溶解させ、６．２５、１２．５、および２５ｍｇ／ｋｇの容量でマウスに経口投与して、３０分の後にスコポラミン０．５ｍｇ／ｋｇを皮下注射した。
【０１００】
３０分後にマウスをステップ-スルー（ｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ）装置に入れ、暗い箱に入ると０．２５ｍＡの電気ショックを３秒間加えて学習（ｔｒａｉｎｉｎｇ）させた。２４時間後に、マウスを再び明るい箱に入れて、黒い箱に入るまでの滞在時間を測定し、スコポラミン誘導健忘症に対する学習および記憶力の指標とした。この際に、マウスのカット−オフ時間（ｃｕｔ−ｏｆｆ  ｔｉｍｅ）は、３００秒にして対照群と比較した。
【０１０１】
その結果、スコポラミンを投与していない第１群（対照群）のマウスに比べてスコポラミンを投与した第２群（陽性対照群）での滞在時間が短縮されることで、健忘症が誘導されたことを確認した。
【０１０２】
一方、マツバボタン抽出物またはこれの酢酸エチル、ブタノール、水溶性分画物を、それぞれ投与した第３群ないし第５群（実験群）のマウスで滞在時間が増加したことを確認した。上記の実験結果を通じてマツバボタンメタノール抽出物またはこれの分画物が記憶力の損傷を効果的に予防することができることを確認した（図１１ａないし図１１ｄ）。
【０１０３】
実験例５−３：Ａβ２５−３５誘導認知症モデルでの受動回避試験を通じるマツバボタン抽出物の学習および記憶力の改善効果の確認
【０１０４】
マウスをそれぞれの群ごとに１１〜１２匹ずつの５の群に分けた。第１群は１０％Ｔｗｅｅｎ２０を含む蒸留水投与群（対照群）、第２群は１０％Ｔｗｅｅｎ２０を含む蒸留水およびＡβ２５−３５投与群（陽性対照群）、第3群ないし第５群は、濃度別のマツバボタンメタノール抽出物の投与群（実験群）とした。
【０１０５】
マツバボタンメタノール抽出物をそれぞれ１０％Ｔｗｅｅｎ２０を含む蒸留水に溶解させ、６．２５、１２．５、および２５ｍｇ／ｋｇの容量でマウスに経口投与し、１時間後にＡβ２５−３５６ｎｍｏｌを左側の脳室に脳定位固定装置を用いて注射した。５日間のそれぞれの群に１０％Ｔｗｅｅｎ２０を含めてマツバボタン抽出物６．２５、１２．５、および２５ｍｇ／ｋｇを投与した。
【０１０６】
１時間後にマウスをステップ-スルー（ｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ）装置に入れ、暗い箱に入ると０．３ｍＡの電気ショックを３秒間加えて学習（ｔｒａｉｎｉｎｇ）させた。２４時間後に、マウスを再び明るい箱に入れて、黒い箱に入るまでの滞在時間を測定し、Ａβ２５−３５誘導認知症に対する学習および記憶力の指標とした。この際に、マウスのカット-オフ時間（ｃｕｔ−ｏｆｆ  ｔｉｍｅ）は、３００秒にして対照群と比較した。
【０１０７】
その結果、Ａβ２５−３５を投与していない第１群（対照群）のマウスの滞在時間（２１８秒）に比べてＡβ２５−３５を投与した第２群（陽性対照群）で滞在時間（７３秒）が短縮されることで健忘症が著しく誘導されたことを確認した（ｐ＜０．００１）。
【０１０８】
一方、マツバボタンのメタノール抽出物６．２５ｍｇ／ｋｇ投与群、１２．５ｍｇ／ｋｇ投与群と２５ｍｇ／ｋｇ投与群は、それぞれ９７秒、１６３秒、および１５３秒の滞在時間を示しＡβ２５−３５誘導認知症モデル群（陽性対照群）に比べて著しい滞在時間の増加効果を示した。
【０１０９】
上記の実験結果を通じてマツバボタン抽出物がアルツハイマー性の記憶力損傷を効果的に予防することができることを再び確認した（図１３）。
【図１】
0006377857.tif 000004
【図２】
0006377857.tif 000005
【図３】
0006377857.tif 000006
【図４ａ】
0006377857.tif 000007
【図４ｂ】
0006377857.tif 000008
【図５ａ】
0006377857.tif 000009
【図５ｂ】
0006377857.tif 000010
【図６】
0006377857.tif 000011
【図７ａ】
0006377857.tif 000012
【図７ｂ】
0006377857.tif 000013
【図８ａ】
0006377857.tif 000014
【図８ｂ】
0006377857.tif 000015
【図８ｃ】
0006377857.tif 000016
【図８ｄ】
0006377857.tif 000017
【図９ａ】
0006377857.tif 000018
【図９ｂ】
0006377857.tif 000019
【図９ｃ】
0006377857.tif 000020
【図９ｄ】
0006377857.tif 000021
【図１０ａ】
0006377857.tif 000022
【図１０ｂ】
0006377857.tif 000023
【図１０ｃ】
0006377857.tif 000024
【図１０ｄ】
0006377857.tif 000025
【図１１ａ】
0006377857.tif 000026
【図１１ｂ】
0006377857.tif 000027
【図１１ｃ】
0006377857.tif 000028
【図１１ｄ】
0006377857.tif 000029
【図１２】
0006377857.tif 000030
【図１３】
0006377857.tif 000031
【配列表】
0006377857000001.app