(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染症の予防または抑制のためのイヌ用ワクチンであって、該ワクチンは、一般式［ｔｃｇ］ｎ（ここで、ｎ＞＝６）を有する免疫刺激性非メチル化ＰＴＯオリゴデオキシヌクレオチドまたは担体もしくはハプテンに結合した当該オリゴデオキシヌクレオチド、抗原成分または抗原成分をコードする核酸、および医薬上許容される担体を含む、前記イヌ用ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリッドｔｏｌｌ（トール）様受容体、そのようなｔｏｌｌ様受容体を含む細胞、そのようなｔｏｌｌ様受容体を使用する、免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドの検出方法、この方法の使用により検出される免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチド、医学におけるそのような免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドの使用、およびそのような免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドを含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
過去２０年間に、微生物感染を検出するための、ならびに病原体の特有の及び保存された特性［同族宿主病原体認識受容体（ＰＲＲ）と相互作用する、いわゆる、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）］の受容体媒介性認識により迅速な免疫活性化を誘発するためのメカニズムを脊椎動物免疫系が有することが、免疫科学において明らかとなった（Ｉｗａｓａｋｉ  Ａ，Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒ．２００１およびＭｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒ．，２００９）。
【０００３】
ある形態の病原体デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）がこれらのＰＡＭＰに含まれることが現在明らかとなっている。１９９５年に、細菌ＤＮＡにおける非メチル化ＣｐＧモチーフがマウスＢ細胞活性化を誘発することが報告された（Ｋｒｉｅｇ，１９９５）。この研究は、細菌免疫刺激性非メチル化ＣｐＧ含有ＤＮＡの特異的認識と、既に認識されていたＣｐＧ抑制および哺乳類ＤＮＡにおける広範なＣｐＧメチル化とを初めて関連づけるものであった。最も有効なＢ細胞刺激性非メチル化ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）は、配列要素ＧＡＣＧＴＴを有することが示された。
【０００４】
この分野における次の画期的な論文は、大阪のＳｈｉｚｕｏ  Ａｋｉｒａの研究室により公開された（Ｈｅｍｍｉら，２０００）。マウスにおける遺伝子クローニングおよび標的化遺伝子ノックアウトアプローチにより、ＣｐＧ−ＯＤＮに対するマウスにおける細胞応答がｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）により媒介されることを明白に示すことができた。ついで、ＣｐＧ−ＯＤＮは、主にＮＦカッパ−Ｂ経路を介してシグナル伝達するＴＬＲ９のアゴニストであることが示された（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  ２００１）。次の１０年間で、基本的研究トピックスおよび一般的潜在的免疫療法用途に関する多数の研究成果が公開されている（例えば、Ｋｒｉｅｇ  ２００２，２００３，２００６；Ｋｌｉｎｍａｎ  ２００４，Ｖｏｌｌｍｅｒ  ２００５，Ｗｉｌｓｏｎら  ２００６，Ｋｉｎｄｒａｃｈｕｋら  ２００８，ＤｏｒｎおよびＫｉｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ  ２００８，ＶｏｌｌｍｅｒおよびＫｒｉｅｇ  ２００９，Ｗｉｌｓｏｎら  ２００９に概説されている）。幾つかの総説は、ＣｐＧ−ＯＤＮの抗感染症用途（Ｋｒｉｅｇ  ２００７）、癌の治療におけるＴＬＲ９アゴニストの使用（Ｋｒｉｅｇ  ２００７，Ｗｅｉｎｅｒ  ２００９）、喘息およびアレルギー治療のためのＴＬＲ９活性化（Ｋｌｉｎｅ  ２００７，ＫｌｉｎｅおよびＫｒｉｅｇ  ２００８，ＦｏｎｓｅｃａおよびＫｌｉｎｅ  ２００９）、ならびにワクチンアジュバントとしての使用（Ｋｌｉｎｍａｎら  ２００４，Ｋｌｉｎｍａｎ  ２００６，Ｄａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ  ２００７，Ｗａｇｎｅｒ  ２００９，Ｍｕｔｗｉｒｉら  ２００９，Ｋｌｉｎｍａｎら  ２００９）に焦点を合わせている。
【０００５】
ＣｐＧ  ＯＤＮは、特にウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ニワトリおよび魚類における獣医学的用途における免疫刺激性物質およびワクチンアジュバントとしても記載され考察されている（Ｂａｂｉｕｋら  ２００３，ＣａｒｒｉｎｇｔｏｎおよびＳｅｃｏｍｂｅｓ  ２００６，Ｇｒｉｅｂｅｌら  ２００５，Ｍｕｔｗｉｒｉら  ２００３，ＳｉｎｇｈおよびＯ’Ｈａｇａｎ  ２００３，ＷｅｒｌｉｎｇおよびＪｕｎｇｉ  ２００３）。
【０００６】
ヒトおよび非ヒト種の両方に対する免疫モジュレーターとしての特異的ＣｐＧ  ＯＤＮの設計は、現在のところ全く無作為なものである。この理由は複数の要因によるものである。まず第１に、ヒトＴＬＲの免疫調節性ＣｐＧモチーフと非ヒト哺乳類種のＴＬＲの免疫調節性ＣｐＧモチーフとの間の相関性に関する知見が存在しない。第２に、非常に低い濃度のＣｐＧ  ＯＤＮの効果の選択的試験を可能にする、十分に低いシグナル対ノイズレベルを有する利用可能な哺乳類ＴＬＲを含むインビトロ細胞系が存在しない。更に、利用可能なハイスループットスクリーニング法が存在せず、たとえそれが存在したとしても、免疫モジュレーターとしてのＣｐＧ  ＯＤＮのインビボ効力とインビトロ効力との間の明らかな相関性が存在しない。
【０００７】
本発明の出願日に未公開であった出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０７４２１１を有するＰＣＴ特許出願において、発明者らは、家禽において使用される免疫モジュレーターとしてのＣｐＧ  ＯＤＮの再現可能なインビトロ試験および選択に適したインビトロ細胞系を記載している。この系は、ニワトリにおけるＴＬＲ９の機能的ホモログであるＴＬＲ２１のクローニングおよび異種発現に基づく。
【０００８】
ヒト種および非ヒト種（例えば、イヌ、ウシおよびブタ種）の両方の哺乳類のための免疫モジュレーターとしてのＣｐＧ  ＯＤＮを試験するための比較しうる系を開発するために、現在ではとりわけイヌ、ウマおよびブタｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ９のクローニングおよび発現に基づくものではあるが、比較しうるアプローチを用いることが決定された。
【０００９】
この目的のために、分泌性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）産生の測定に基づくＮＦ−κＢ活性化レポーター遺伝子アッセイをもたらすｐＮｉｆＴｙ２−ＳＥＡＰ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）の組込み形態をゲノム内に含有するＨＥＫ２９３細胞のクローン系が使用された（実施例を参照されたい）。種々の脊椎動物（ウシ、イヌ、ブタ、ニワトリ）種から単離されたＴＬＲ１／２、ＴＬＲ２／６、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の安定な機能的発現を目的とした実験において、そのような細胞系は広範な用途を有することが発明者らにより示された。
【００１０】
この背景的説明に対して、ウシ、イヌおよびブタＴＬＲ９の発現は直接的であると予想されたが、ニワトリＴＬＲ９機能的ホモログＴＬＲ２１の格別に良く機能するＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆＴｙ２−ＳＥＡＰに基づく機能的発現により、予想は更に強化された。しかし、ウシ、イヌおよびブタＴＬＲ９での反復トランスフェクション実験は、プラスミド導入のための選択（Ｇ４１８またはヒグロマイシン）が成功したにもかかわらず、２００６−ＰＴＯ（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ）または２００７−ＰＴＯ（ＴＣＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ）のような公知標準的ＴＬＲ９アゴニストで刺激されうる細胞系を与えなかった。少数の実験のみにおいて、ポリクローナルトランスフェクタントプールにおいて弱いシグナルが最初に見られた。これらのシグナルは更なる細胞系培養に際して消失し、単細胞クローニングによってはレスキューされ得なかった。別のＮＦ−κＢ活性化レポーター遺伝子を含有する細胞型（ウシマクロファージ細胞系ＢＯＭＡＣ−ｐＮｉｆＴｙ２−ＳＥＡＰ）で類似実験が行われた。成果は、基本的にＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆＴｙ２−ＳＥＡＰで先に示したものと同じである。
【００１１】
機能的発現（ＳＥＡＰシグナルにより示されるもの）の予想外の失敗の原因は依然として不明である。ヒト抗アポトーシスＢｃｌ−ＸＬ遺伝子を発現する２９３ＸＬ／ヌル細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用することによりこの問題を克服する試みも、十分に高いＳＥＡＰ発現レベルを与えなかった。
【００１２】
したがって、高い免疫調節効果を有し、よって哺乳動物において低用量で有効であるＣｐＧ  ＯＤＮの選択のための選択的かつ高感度な系が尚も必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
そのような選択的かつ高感度なＣｐＧ  ＯＤＮ選択系を提供することが本発明の目的の１つである。
【００１４】
驚くべきことに、家禽ＴＬＲ２１のＴｏｌｌ−インターロイキンＩ受容体抵抗性（ＴＩＲ）ドメインと哺乳類ＴＬＲ９の細胞外リガンド結合性ドメインとを含むハイブリッドｔｏｌｌ様受容体が、前記の低い機能的発現または非発現の問題を克服しうることが本発明において見出された。ＴＬＲは、Ｎ末端シグナルペプチド、ロイシンに富む反復配列を含有する細胞外リガンド結合性ドメイン、単一ＴＭドメインおよび主にＴｏｌｌ−インターロイキンＩ受容体抵抗性（ＴＩＲ）ドメインを含む細胞質領域、から構成される、良く保存されたＩ型膜貫通（ＴＭ）タンパク質である。
【００１５】
単なる一例に過ぎないが、マウスＴＬＲ９の細胞外ドメインはａ．ａ．（アミノ酸）１−８２０の領域に伸長し、膜貫通ドメインはａ．ａ．８２０−８３８の領域に伸長し、細胞質ドメインはａ．ａ．８３８−１０３２の領域に伸長する。ＴＩＲドメインは、ａ．ａ．８７２−１０３２の領域に伸長する（Ｋａｊｉｔａら，ＢＢＲＣ  ３４３：５７８−５８４（２００６））。
【００１６】
ＴＬＲ９の及び家禽ホモログＴＬＲ２１の区画化は、「細胞外ドメイン」と称されるＴＬＲ９および２１の部分がエンドリソソーム内に位置する点で、ＴＬＲ１、２、４、５および６の区画化とは或る程度異なっている。その結果、ＴＬＲ９／２１のＴＭ領域は細胞膜ではなくエンドリソソーム膜に伸長する。ＴＬＲのこの態様および細胞生物学全般は、Ｂａｒｔｏｎ  Ｇ．Ｍ．およびＫａｇａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９；５３５−５４２（２００９）に概説されている。哺乳類ＴＬＲの一例に過ぎないが、ウシ、家禽およびイヌＴＬＲ９の配列は、それぞれ配列１、３および５（核酸配列）、ならびに配列番号２、４および６（アミノ酸配列）に記載されている。
【００１７】
哺乳類ＴＬＲ９の細胞外リガンド結合性ドメインのＣｐＧ  ＯＤＮ特異性と家禽ＴＬＲ２１のＴｏｌｌ−インターロイキンＩ受容体抵抗性（ＴＩＲ）ドメインのシグナリング特性とを併せ持つ本発明のハイブリッドＴＬＲは、許容し得ない悪影響を伴うことなくトランスフェクト化細胞により受容され、同時に、それらは、哺乳類種に対して特異的に免疫刺激性であるＣｐＧ  ＯＤＮの特異的検出に非常に良く適していることが判明している。そのようなハイブリッドＴＬＲをコードするＤＮＡを含むプラスミドでの例えばＨＥＫ２９３細胞またはＭＤＣＫ細胞のトランスフェクションはハイブリッドＴＬＲの安定発現をもたらし、そしてこれは、哺乳動物において活性であることが知られている外因性ＣｐＧ  ＯＤＮ（例えば、２００６−ＯＤＮおよび２００７−ＯＤＮ）での刺激に際して顕著なＮＦ−κＢ活性化を招いた。
【００１８】
したがって、本発明の第１実施形態は、家禽ＴＬＲ２１のＴｏｌｌ−インターロイキンＩ受容体抵抗性（ＴＩＲ）ドメインと哺乳類ＴＬＲ９の細胞外リガンド結合性ドメインとを含むことを特徴とするハイブリッドｔｏｌｌ様受容体に関する。
【００１９】
膜貫通領域（ＴＭ領域）の起源および細胞質ドメインの非ＴＩＲ関連部分の起源は決定的に重要なものではなく、これらは、独立して、ＴＬＲ９またはＴＬＲ２１に由来しうる。
【００２０】
この実施形態の好ましい形態においては、哺乳類ＴＬＲ９の細胞外リガンド結合性ドメインは、ヒト、ウシ、ブタまたはイヌ由来である。哺乳類ＴＬＲ９の細胞外リガンド結合性ドメインがウシ、ブタまたはイヌ由来である本発明のハイブリッドＴＬＲの例は、それぞれ、配列番号８、１０および１２（核酸配列）、ならびに配列番号９、１１および１３（アミノ酸配列）に示されている。
【００２１】
「免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド」は、ＮＦ−κＢまたはインターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）のような転写因子の活性化を招くシグナリングカスケードの始動を刺激する非メチル化シチジン−ホスファート−グアノシンジヌクレオチド配列を含有するオリゴデオキシヌクレオチドを意味する。そしてこの活性化は、炎症性サイトカインの発現および他の細胞活性化事象を引き起こす。ＮＦ−κＢ結合部位およびＮＦ−κＢにより影響される遺伝子発現は、とりわけ、ＳｃｈｉｎｄｌｅｒおよびＢａｉｃｈｗａｌ（１９９４）により記載されている。
【００２２】
オリゴデオキシヌクレオチドなる語は、デオキシヌクレオチド（すなわち、ホスファート基に及び交換可能な有機塩基に結合した多数のデオキシリボースを含む分子）の短い核酸重合体を意味する。そのような有機塩基は、置換ピリミジンまたは置換プリンである。具体例としては、それぞれ、シトシンおよびチミンならびにアデニンおよびグアニンが挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドは修飾を含みうる。そのような修飾の例としては、例えば、ヌクレオシドの３’および／または５’末端に位置するホスホジエステルヌクレオシド間架橋における修飾が挙げられる。そのような修飾は、とりわけ、例えばホスホロチオアートまたはホスホロジチオアートによるホスホジエステルの置換に関するものである。基本的に、合成方法に応じて２つのヌクレオチド間の通常の一般結合型は、ホスホジエステル（ＰＤＥ）結合およびホスホロチオアート（ＰＴＯ）結合である。ＣｐＧ  ＯＤＮの安定性および免疫刺激効果を改善するために、合成オリゴデオキシヌクレオチドのビルディングブロックには、それらがＰＴＯ結合を形成するようにホスホロチオアートが付与されうる。
【００２３】
他の修飾としては、例えば、デホスホ架橋によるホスホジエステル架橋の置換が挙げられる。デホスホ架橋の例としては、メチルヒドロキシルアミン、ホルムアセタールおよびジメチレンスルホン基が挙げられる。
【００２４】
更に他の修飾としては、５−フルオロシトシン、７−デアザ−７−置換グアニン、７−デアザ−８−置換グアニン、２−チオウラシル、ジヒドロウラシル、５−ブロモ−シトシン、６−置換シトシンまたはＮ４−置換シトシンのような非天然ヌクレオシド塩基による天然ヌクレオシド塩基の置換に関する修飾が挙げられる。
【００２５】
この場合もまた、他の修飾としては、修飾糖単位、例えばＬ−２’−デオキシリボースまたは２’−Ｌ−アラビノースによる糖単位、すなわち、β−リボース糖またはβ−Ｄ−２’リボース糖単位の置換に関する修飾が挙げられる。
【００２６】
オリゴヌクレオチドにおける更なる洞察を示している書籍としては、例えば、“ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｃａｒｌ  Ｗ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ編，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ；Ｇａｂｒｉｅｌａ  Ｓ．Ｄｒｅｋｓｌｅｒ，Ｕｎｉｆｏｒｍｅｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ＩＳＢＮ  ９７８−０８７９６９６５４−２が挙げられる。
【００２７】
新規ＣｐＧ  ＯＤＮの検出のためには、本発明のハイブリッドＴＬＲを含む細胞を含む系が必要である。
【００２８】
したがって、本発明の第２実施形態は、本発明のハイブリッドＴＬＲを含む細胞に関する。
【００２９】
前記のとおり、ＴＬＲ９に対するＣｐＧ  ＯＤＮアゴニストは、主としてＮＦカッパ−Ｂ（ＮＦ−κＢ）経路を介してシグナル伝達する（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  ２００１）。したがって、細胞における（ＮＦ−κＢ）経路の化合物の量および発生に対するＣｐＧ  ＯＤＮの効果の検出は、ＰＡＭＰとしてのその活性を示す。Ｂｒｏｗｎｌｉｅら（２００９）は、ＮＦ−κＢルシフェラーゼに基づくレポーター系を記載している。他のレポーター系は、例えば、ＩＬ−８転写産物の測定またはサイトカイン分泌またはＮＯ分泌の検出に基づく。
【００３０】
したがって、この実施形態の好ましい形態は、ＮＦ−κＢレポーター遺伝子を含むプラスミドを含むことを特徴とする本発明の細胞に関する。
【００３１】
前記のそのようなレポーター系は、有用ではあるがそれらがそれほど高感度ではないという欠点を有する。既存の及び新たに開発されたＣｐＧ  ＯＤＮの活性の厳密な決定のためには、高感度検出系が予め必要である。本発明者らはここで、驚くほどに高感度であることが判明した本発明における検出系を使用した。この系は、レポーター遺伝子によりコードされるレポーター酵素としての、分泌性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）と称される酵素の使用に基づく。ＳＥＡＰは哺乳類系におけるレポーター酵素である（Ｙａｎｇら，１９９７）。この系においては、ＳＥＡＰ発現は、ＥＬＡＭプロモーターと組合された５つのＮＦ−κＢ転写因子結合部位により制御される（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１，Ｆｅｂ  ５；２６６（４）：２４６６−７３）。
【００３２】
したがって、この第２の実施形態のより好ましい形態は、レポーター遺伝子が分泌性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードしている本発明の細胞に関する。ＳＥＡＰ系は、基質としてのパラ−ニトロフェニルホスファート（ｐＮＰＰ）と共に使用される。
【００３３】
既存の形態と比較した場合のもう１つの重要な改善は、レポーター遺伝子を含有するプラスミドの細胞内への導入および細胞内での安定維持である。これまでは、全ての検出系は、レポーター遺伝子での細胞の一過性トランスフェクションを用いていた。そのような一過性系は、ＣｐＧ  ＯＤＮの効力の信頼しうる並列的比較を可能にしない。通常、プラスミドの安定維持は、プラスミド上に耐性遺伝子が存在する抗生物質のような１以上の選択的試薬の圧力下、細胞を増殖させることにより得られる。したがって、プラスミドの喪失は、プラスミドを喪失した細胞を死亡させる。残存している生細胞はプラスミドを尚も含有するであろう。安定は、プラスミドが、数回の細胞分裂周期後に好ましくは細胞ゲノム内に組込まれて依然として存在することを意味する。ＣｐＧ  ＯＤＮに関する再現可能な用量／反応曲線が本発明において初めて作成可能となったのは、レポーター遺伝子の細胞内への導入および細胞内での安定維持による。そのような曲線は、種々のＣｐＧ  ＯＤＮ活性間の信頼しうる比較を行おうとする場合に必須である。
【００３４】
したがって、細胞に関するこの第２実施形態のもう１つの好ましい形態は、ＮＦ−κＢレポーター遺伝子をコードするプラスミドを含むものであり、プラスミドは細胞内で安定に維持される。そのような細胞は、ＣｐＧ分子のスクリーニング、より詳細には、本発明のＣｐＧ分子のスクリーニングにおける使用に非常に適している。実施例は、細胞内で安定に維持されうるレポーター遺伝子をコードするプラスミドを含むそのような細胞の入手方法に関する十分な指針を記載している。
【００３５】
基本的には、ＮＦ−κＢレポーター遺伝子、好ましくは前記のＳＥＡＰ遺伝子を含有するプラスミドの導入および好ましくは安定維持を可能にする本発明のハイブリッドＴＬＲを含有するいずれかの細胞または細胞系は、ＴＬＲ９特異的ＣｐＧ  ＯＤＮを試験するのに適している。ＴＬＲ９特異的ＣｐＧ  ＯＤＮを試験するためのそのような適当な細胞系の一例は、細胞系ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）である。ＴＬＲ９特異的ＣｐＧ  ＯＤＮを試験するための好ましい細胞系は、細胞系Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙ（メイディン・ダービー）イヌ腎臓（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−３４）（ＭＤＣＫ）である。
【００３６】
したがって、この第２実施形態のもう１つの好ましい形態は、細胞がＨＥＫ２９３細胞、好ましくはＭＤＣＫ細胞である本発明の細胞に関する。
【００３７】
本発明の実施例に詳細に記載されている方法および細胞系は、哺乳類種において使用される種々のＣｐＧ  ＯＤＮ間の信頼しうる並列的比較を初めて可能にする。したがって、本発明の免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドの検出方法に関する本発明の更にもう１つの実施形態は、ａ）オリゴデオキシヌクレオチドを本発明の細胞と接触させ、そして、ｂ）レポーター遺伝子の産物のレベルを検出する工程を含む。
【００３８】
この方法の好ましい形態においては、レポーター遺伝子の産物はＳＥＡＰである。
【００３９】
後記実施例に示されているとおり、本発明のハイブリッドｔｏｌｌ様受容体は、新規ＣｐＧ  ＯＤＮの特定のために広範に使用されている。本発明のＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、ほとんどの場合、インビトロ試験系およびインビボの両方において、２桁または更に時には１桁のナノモル濃度において活性である。オリゴデオキシヌクレオチドの半最大有効濃度（ＥＣ５０）は、経時的に半最大吸光度変化を示す量の、レポーター細胞における（４０５ｎｍで吸光する着色産物を産生する）レポーター酵素ＳＥＡＰを誘導するために必要なオリゴデオキシヌクレオチドの量である。示されているＶｍａｘ指標は、ＳＥＡＰの色素原基質が４０５ｎｍの吸光度を有する着色成分に変化する速度の指標である。高いＶｍａｘは、ＣｐＧ  ＯＤＮがＴＬＲ反応を迅速に誘導しうることを示す。以下の新規免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドは、低いＥＣ５０（２桁または更には１桁のｎＭ濃度）を有し、したがって、既に非常に低い濃度において非常に有効であることが判明した。
【００４０】
［ｇａｃｇｔｔ］ｎ、ここで、ｎ＞＝４
［ｇａｃｇａｔｃｇｔｃ］ｎ、ここで、ｎ＞＝３
［ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｃｇ］ｎ、ここで、ｎ＞＝３
［ｔｃｇｔｃｇｔｔｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔ］ｎ、ここで、ｎ＞＝２
（ｔｘ［ｔｔｃｇｔｔ］ｔｙ）ｎ、ここで、ｎ＞＝５，ｘ＝０−５およびｙ＝０−５［ｔｔｃｇｔＮ１］ｎ、ここで、Ｎ１＝ｔまたはｃ、およびｎ＞＝５
［Ｎ１ｔｃｇｔｃ］ｎ、ここで、Ｎ１＝ｔまたはｃ、およびｎ＞＝５
［ｇＮ１ｃｇｔｔ］ｎ、ここで、ｎ＞＝４およびＮ１＝ａまたはｔ
［ｔｃｇ］ｘ、ここで、ｎ＞＝６
［ｔｃｇＮ１］ｎ、ここで、Ｎ１＝ｃまたはｇ、およびｎ＞＝６
［Ｎ１ｃｇｔ］ｎ、ここで、Ｎ１＝ｇまたはｃまたはａまたはｔ、およびｎ＞＝６
［ａｃｇａ］ｎ、ここで、ｎ＞＝６。
【００４１】
これらの新規免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドの全ては、ホスホロチオアート（ＰＴＯ）型のものであることに留意すべきである。したがって、本発明の更にもう１つの実施形態は、前記の１２個の一般式のいずれかを有する免疫刺激性非メチル化ＰＴＯオリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【００４２】
全般的には、オリゴデオキシヌクレオチドの活性は、ｎが増加するにつれて増加することが見出された。この効果は、ｎが増加するにつれて一様になる。したがって、基本的には、バックボーン構造の数ｎは、少なくとも示されているｎの数であるべきである。好ましくは、ｎの高域範囲はｎ＜＝１００である。これは、単に、合成配列が長くなればなるほど製造が困難になるからである。したがって、実際には、より好ましいｎの高域範囲はｎ＜＝４０、より一層好ましくは、ｎ＜＝２０である。
【００４３】
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドを、反応性化学基を介して担体またはハプテンに結合させることは十分に可能である。そのような結合は、組み合わされた分子の免疫刺激効果を増強する。そのような成分の単なる具体例としては、例えば、ジゴキシゲニン、アミノヘキシル−、テキサスレッドおよびビオチンが挙げられる。好ましい担体またはハプテンは、３’−および５’−標識テキサスレッドならびに５’−標識ジゴキシゲニンである。ハプテン／担体にオリゴデオキシヌクレオチドを結合させることは、当該技術分野でよく知られている。
【００４４】
したがって、この実施形態の好ましい形態は、前記の１２個の一般式のいずれかを有する免疫刺激性非メチル化ＰＴＯオリゴデオキシヌクレオチドに関するものであり、ここで、オリゴデオキシヌクレオチドは、担体またはハプテンに結合している。
【００４５】
本発明のもう１つの実施形態は、本発明の免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドを含むベクターに関する。そのようなベクターは、核酸分子、例えばプラスミド、ウイルス、バクテリオファージであるか、または分子生物学で使用されるいずれかの他のベクターでありうる。単なる一例であるが、免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドを含むベクターは、例えば、本発明の免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドがクローニングされた、細菌内で増殖しうるプラスミドのようなＤＮＡ分子でありうる。そのようなプラスミドは、好ましくは、多数のプラスミドを宿主内に存在させる活性複製起点を有する。そのような細菌の大規模な増殖およびそれに続くプラスミドの単離は、本発明の免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドの合成的製造の代替手段となる。この実施形態は、ＰＤＥ型の免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドのみに適用されることに留意すべきである。
【００４６】
本発明の目的の１つは、抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報および医薬上許容される担体と共に、感染症を予防または抑制するワクチンにおける有効な免疫刺激成分として使用されうる新規ＣｐＧ  ＯＤＮを提供することである。
【００４７】
一般に、抗原成分なる語は、ヒトまたは動物に投与された場合に免疫応答を誘導、刺激または増強しうる少なくとも１つのエピトープを含む組成物を意味する。
【００４８】
抗原成分は任意の種類の抗原成分でありうるが、好ましくは、野生型形態においてヒトまたは動物に対して病原性である微生物またはウイルスに由来する。
【００４９】
抗原成分は、好ましくは不活化または弱毒化形態の、全病原体、病原体の抽出物、または病原体の免疫原性タンパク質（の免疫原性部分）でありうる。抗原成分が病原体の免疫原性タンパク質（の免疫原性部分）である場合、その免疫原性タンパク質は、好ましくは、インビトロ培養細胞において発現され、または細胞から回収される。
【００５０】
したがって、もう１つの実施形態は、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドおよび／または本発明のベクターの免疫刺激量、抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報の免疫原性量と、医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、感染症を予防または抑制するためのワクチンに関する。
【００５１】
オリゴデオキシヌクレオチドの免疫刺激量と抗原成分の免疫原性量とは強く相関する、と当業者は理解するであろう。感染症を予防または抑制するのに必要な抗原成分の量を低減しうる新規オリゴデオキシヌクレオチドが提供されることが、本発明の利点の１つである。感染症を予防または抑制するのに必要な抗原成分の量は、抗原成分の免疫原性量と称される。オリゴデオキシヌクレオチドの免疫刺激量は、抗原成分の免疫原性量（すなわち、感染症を予防または抑制するのに必要な抗原成分の量）を減少させうる量である。したがって、基本的には、「オリゴデオキシヌクレオチドの免疫刺激量」および「免疫原性量」なる語は、互いに関連していると理解される必要がある。
【００５２】
言うまでもなく、ワクチンが抗原成分をコードする遺伝情報を含む場合、この遺伝情報により発現される抗原成分の量は、感染症を予防または抑制するのに十分なものであるべきである。すなわち、それは免疫原性量でなければならない。
【００５３】
本発明の非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドが免疫刺激性であることは、それらがワクチンにおける抗原成分の免疫学的効力を増強することを意味する。その理由により、本発明のワクチンは、多くの場合、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドが存在しない場合より少ない、抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報を含むであろう。幾つかの場合には、免疫刺激性オリゴヌクレオチドの添加を伴わない抗原成分自体は、いずれにせよ大量が与えられなければならないほどに低い免疫原性特性を有していて、所望の免疫原性レベルには到達しないことがある。そのような場合、所望のレベルの免疫原性を得るために、抗原成分は、今回は本発明のオリゴデオキシヌクレオチドと共に通常の高い濃度で与えられうる。
【００５４】
したがって、本発明のオリゴヌクレオチドと共に投与される抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報の量は、概括的には、オリゴヌクレオチドの非存在下で与えられる量に等しいか又はそれ未満であろう。特定のワクチンの製造に関わる当業者は、その特定のワクチンの量を認識するであろう。また、実施例は、例えば、使用される抗原成分の量に関する指針（例えば、イヌ種に対する狂犬病ワクチンに関するもの）を示している。
【００５５】
抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報と共に投与される必要のある本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの量は、選択されたオリゴデオキシヌクレオチドおよび抗原成分の両方に左右される。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの非常に好適な量は、通常、１〜１００ナノモルの間で変動するであろう。例えば、ナノモル範囲でインビトロ試験において活性であることが示された３０デオキシヌクレオチドの平均長を有する５〜５０μｇの本発明のオリゴデオキシヌクレオチドで、非常に良好なインビボの結果が得られている。ピコモル範囲で活性であるオリゴデオキシヌクレオチドの群からオリゴデオキシヌクレオチドが選択された場合、１ナノモル未満の量、おそらくは１ナノモルよりかなり少ない量、すなわち、ピコモルの量（例えば１００〜１０００ｎｇ）を、ナノモル量を試験する前に試験する価値があると当業者は認識するであろう。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドのそれぞれの最適量が存在しうる、と当業者は認識すべきである。
【００５６】
本発明のワクチンは、医薬上許容される担体を含む。この担体の性質は、とりわけ投与経路に左右される。投与経路が経口または鼻腔内経路である場合、担体は、無菌水、生理的塩溶液またはバッファーのように単純なものでありうるであろう。注射が好ましい経路である場合、担体は、好ましくは等張性であり、それを注射に適したものにするｐＨ制限を有するべきである。しかし、そのような担体は当該技術分野で広く知られている。
【００５７】
本発明のワクチンは、抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報および本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに加えてアジュバントを含む。一般に、アジュバントは、宿主の免疫応答を非特異的に増強する物質である。例えばフロイント完全および不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロック重合体およびポリアミド、例えば硫酸デキストラン、カルボポールおよびピラン、水酸化アルミニウムのような多数のアジュバントが好適であることが当該技術分野で公知である。リン酸化アルミン、サポニン、植物油、例えばトコフェロール、および鉱油も頻繁に使用される。非常に効率的なアジュバントは、水中油型エマルションおよび特に油中水型エマルション（更に、水中油型アジュバントおよび油中水型アジュバントとも称される）である。そのようなエマルションは、当該技術分野でよく知られている。したがって、好ましくは、ワクチンは油中水型アジュバントを含む。
【００５８】
好ましくは、抗原成分は、野生型形態においてヒト、ブタ、イヌまたはウシ種に対して病原性であるウイルスまたは微生物であるか、そのようなウイルスまたは微生物に由来する。
【００５９】
多数の病原体に関するワクチンが商業的に入手可能である。これらの病原体を以下に列挙する。
【００６０】
したがって、より好ましくは、前記ウイルスまたは微生物は、ヒトパピローマウイルス、結核、ジフテリア、百日咳、破傷風、肺炎または髄膜炎を引き起こす細菌、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、マイコバクテリウム・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｍｉａｅ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、口蹄疫ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、ブタ呼吸器および生殖症候群ウイルス、イヌパルボウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌコロナウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、ブタサーコウイルス２、ウシヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス、ブタコレラウイルス、ウマヘルペスウイルス、ブタパルボウイルス、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、パスツレラ（とりわけ、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ））、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）（とりわけ、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ））、仮性狂犬病ウイルス、エリシペロトリクス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、ウシパラインフルエンザウイルス、マンヘイミア（とりわけ、マンヘイミア・ヘモリチカ（Ｍ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ））、フゾバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、クラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｉｄｏｐｈｉｌａ）、アクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ブルセラ・アボルツス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、ジクチオカウリス（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｉｓ）、トキソプラズマ・ゴンジ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）（とりわけ、バベシア・カニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ））、ネオスポラ（Ｎｅｏｓｐｏｒａ）、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）、サルコシスチス（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ）およびリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）からなる群から選択される。
【００６１】
本発明の更にもう１つの実施形態は、医薬としての使用のための、抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報の免疫学的量および医薬上許容される担体と組み合わされた本発明の免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【００６２】
本発明の更にもう１つの実施形態は、哺乳類種、好ましくはヒト、ブタ、ウシおよびイヌ種における感染症の予防または抑制における使用のための、抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報の免疫学的量および医薬上許容される担体と組み合わされた本発明の免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ＭＤＣＫ（イヌ）−ｐＮｉｆＴｙｈｙｇ：種々のＰＡＭＰとの反応性。縦軸：ｍＯＤ４５０ｎｍ／分。
【図２】ＭＤＣＫ（イヌ）−ｐＮｉｆＴｙｈｙｇ：種々のＰＡＭＰとの反応性。縦軸：ｍＯＤ４５０ｎｍ／分。
【図３】ＭＤｃａｎＫ−ｐＮｉｆＴｙｈｙｇ−単細胞クローン１−４６−ｈｕＴＮＦ−アルファ刺激。横軸：左から右へ；クローン１からクローン４６まで、プールおよび対照。
【図４】ＰＣＲ「ソーイング（ｓｅｗｉｎｇ）」法。
【図５】ｃａｎＴＬＲ９−２１ＭＤＣＫｐＮｉｆＴｙｈｙｇ−単細胞クローン１−５４−２００６−ＰＴＯ刺激。横軸：左から右へ；クローン１からクローン５４へ、それに続いて、「ｃａｎＴＬＲ９−ＴＬＲ２１−プール」（単細胞クローニング前のポリクローナル細胞系）。反応性は棒グラフのペアで示されている：左棒グラフ（灰色）は１マイクロＭの２００６−ＰＴＯでの刺激のレベルであり、右棒グラフ（黒色）は対照である。
【図６】〜
【図１８】ＭＤＣＫ−ｐＮｉｆＴｙｈｙｇ−ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ−ｃａｎＴＬＲ９−２１融合体：示されているとおりの幾つかのＰＡＭＰでの刺激。
【図１９】ＭＤＣＫ−ｐＮｉｆＴｙｈｙｇ−ｐｉｇＴＬＲ９／ＴＬＲ２１−単細胞クローン１−７５  ＯＤＮ−２００６−ＰＴＯ刺激。横軸：左から右へ；クローン１からクローン７５へ、「ｃａｎｉｓ−ＴＬＲ９／２１−クローン１７」（陽性対照としてのイヌＴＬＲ９−２１融合クローン細胞系（番号１７））および「ＭＤＣＫ−ｐＮｉｆＴｙｈｙｇ」（トランスフェクション実験に使用される基礎ＭＤＣＫ細胞系）。
【図２０】〜
【図３１】示されているとおりの種々のＰＡＭＰで試験されたＭＤＣＫ−ｐＮｉｆＴｙｈｙｇ−ｐｉｇＴＬＲ９／ＴＬＲ２１−融合体。
【図３２】示されているとおりのｈｉｏ−ｔｃｇ−８−ＰＴＯの存在下および非存在下のノビバック（Ｎｏｂｉｖａｃ）狂犬病ワクチンの抗体価。
【００６４】
参考文献：
【表１】
0006427487.tif 000002
【００６５】
0006427487.tif 000003
【００６６】
0006427487.tif 000004
【００６７】
0006427487.tif 000005
【００６８】
実施例
実施例１
ウシｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ−９）の遺伝子クローニング
ウシＴＬＲ９メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）源として、近所の食肉解体処理場から新鮮なウシ脾臓を得た。市販キットおよびその説明書（ＴＲＩＺＯＬ（登録商標），ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を用いて、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（１９８７）により概説されているのと実質的に同じ方法で、ウシ脾臓組織から総ＲＮＡを調製した。逆転写酵素（−Ｅｘｐａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｒｏｃｈｅ）の供給業者により記載されているのと実質的に同じ方法で、ウシ脾臓総ＲＮＡから第１鎖ｃＤＮＡを合成した。開始コドン領域から終止コドンの下流の３’ＵＴＲ領域までのウシＴＬＲ９（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＹ８５９７２６）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のためのプライマーを設計した（Ｂｏｖ−ＴＬＲ９−ｆｏｒおよびＢｏｖ−ＴＬＲ９−ｒｅｖ，後記を参照されたい）。しかし、完全長産物（予想：〜３１００ｂｐ）の増幅を目的としたウシ脾臓第１鎖ｃＤＮＡを使用する初期ＰＣＲ実験（Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲキット，Ｒｏｃｈｅ）は、反復的に陰性であることが判明した。ウシＴＬＲ９遺伝子の更に詳細な精査は高いＧＣ含量（〜６４％）を示した。したがって、この特定の問題に関して最適化されたＰＣＲ系（Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）ＧＣ２，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を試験することに決定した。対応ＰＣＲ反応は、予想サイズ（〜３１００ｂｐ）の弱いＤＮＡ断片を与えた。
【００６９】
プライマー配列：
Ｂｏｖ−ＴＬＲ９−ｆｏｒ：ＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＣＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＣＣＧＣＡＣ
Ｂｏｖ−ＴＬＲ９−ｒｅｖ：ＧＴＣＴＡＧＡＧＴＣＴＧＴＧＣＴＡＴＴＣＧＧＣＴＧＴＣＧＴＧＧ
ｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内へのＰＣＲ断片のクローニングを行い、ＰＣＲ無過誤形態（ｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ−ウシＴＬＲ９）を特定するために４個のクローンを配列決定した。プライマー導入ＫｐｎＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位を利用することにより、ウシＴＬＲ９インサートを切り出し、アガロースゲルで精製し、ＫｐｎＩ／ＸｂａＩ切断哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（ｎｅｏ）およびｐｃＤＮＡ３．１（ｈｙｇ）（共にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にサブクローニングして、それぞれｐｃＤＮＡ３．１（ｎｅｏ）−ウシＴＬＲ９およびｐｃＤＮＡ３．１（ｈｙｇ）−ウシＴＬＲ９を得た。対応インサートを再配列決定した（後記を参照されたい）。
【００７０】
ｐｃＤＮＡ３．１インサート配列ウシＴＬＲ９（プライマー配列は下線で示されており、開始／終止コドンは太字で示されている），３０９０ｂｐ。
【化１】
0006427487.tif 000006
【００７１】
0006427487.tif 000007
【００７２】
翻訳配列を、Ｇｅｎｂａｎｋに寄託された１０個のウシＴＬＲ９完全長ｃＤＮＡ配列（２０１１年９月，Ｐ８−１４１１０８−ｐｒｏｔ−２８０１０９．ｐｒｏ  Ｂｏｖ−ＴＬＲ９−ＮＭ  １８３０８１．ｐｒｏ  Ｂｏｖ−ｒｏｍ−ＴＬＲ９−ＥＦ０７６７２３．ｐｒｏ  Ｂｏｖ−ａｎｇ−ＴＬＲ９−ＥＦ０７６７２４．ｐｒｏ  Ｂｏｖ−ｂｒａｆ−ＴＬＲ９−ＥＦ０７６７２５．ｐｒｏ  Ｂｏｖ−ｂｒａｈ−ＴＬＲ９−ＥＦ０７６７２６．ｐｒｏ  Ｂｏｖ−ｃｈａｒ−ＴＬＲ９−ＥＦ０７６７２７．ｐｒｏ  Ｂｏｖ−ｈｏｌ−ＴＬＲ９−ＥＦ０７６７２８．ｐｒｏ  Ｂｏｖ−ｌｉｍ−ＴＬＲ９−ＥＦ０７６７２９．ｐｒｏ  Ｂｏｖ−ｐｉｅｄ−ＴＬＲ９−ＥＦ０７６７３１．ｐｒｏ  Ｂｏｖ−ＴＬＲ９−ＡＹ８５９７２６．ｐｒｏ）と整列（アライメント）させた。１１個のウシＴＬＲ９ポリペプチド配列のアライメント（ＣｌｕｓｔａｌＷ；ＤＮＡＳｔａｒ）は、７個の位置において多形を示した。５つのケースにおいて、本発明者らのＴＬＲ９クローン（Ｐ８−１４１１０８−ｐｒｏｔ−２８０１０９）の翻訳配列は大部分のポリペプチド配列に適合した。他の２つの位置においては、Ｇｅｎｂａｎｋ配列ＡＹ８５９７２６の場合と同じ残基が見出された。
【００７３】
したがって、ウシＴＬＲ９の正しい形態がクローニングされていると結論づけられる。
【００７４】
実施例２
ブタｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ−９）の遺伝子クローニング
ブタＴＬＲ９メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）源として、近所の食肉解体処理場から新鮮なブタ脾臓を得た。市販キットおよびその説明書（ＴＲＩＺＯＬ（登録商標），ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を用いて、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（１９８７）により概説されているのと実質的に同じ方法で、ブタ脾臓組織から総ＲＮＡを調製した。逆転写酵素（Ｅｘｐａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｒｏｃｈｅ）の供給業者により記載されているのと実質的に同じ方法で、ブタ脾臓総ＲＮＡから第１鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００７５】
開始コドン領域から終止コドンの下流の３’ＵＴＲ領域までのブタＴＬＲ９（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ  ２１３９５８）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のためのプライマーを設計した（ＰｉｇＴＬＲ９ｆｏｒ１およびＰｉｇＴＬＲ９ｒｅｖ１，後記を参照されたい）。しかし、完全長産物（予想：３２４６ｂｐ）の増幅を目的としたブタ脾臓第１鎖ｃＤＮＡを使用する初期ＰＣＲ実験は、反復的に陰性であることが判明した。したがって、ＰＣＲアプローチにより適した２つのほぼ等しいサイズの断片（それぞれ１５０１ｂｐおよび１７４５ｂｐ）へとブタＴＬＲ９遺伝子を二分するユニークＸｈｏＩ部位を利用することに決定した。この目的のために、ユニークＸｈｏＩ部位の近傍で重複するＰＣＲ断片を得るための、前方向のＸｈｏＩ部位の上流の及び逆方向のＸｈｏＩ部位の下流のプライマーを設計した（ＰｉｇＴＬＲ９ＸｈｏＩ−ｆｏｒおよびＰｉｇＴＬＲ９ＸｈｏＩ−ｒｅｖ，後記を参照されたい）。
【００７６】
プライマー配列：
【化２】
0006427487.tif 000008
【００７７】
プライマーペアＰｉｇＴＬＲ９ｆｏｒ１／  ＰｉｇＴＬＲ９ＸｈｏＩ−ｒｅｖ（５’遺伝子断片の増幅用）およびＰｉｇＴＬＲ９ＸｈｏＩ−ｆｏｒ／ＰｉｇＴＬＲ９ｒｅｖ１（３’遺伝子断片の増幅用）を使用して、ＰＣＲ反応（Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲキット，Ｒｏｃｈｅ）を行った。対応ＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製し、ｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内へクローニングし、ＰＣＲ無過誤形態を特定するために３個のクローンのそれぞれを配列決定した。ベクターに基づく及びＰＣＲ断片に基づくＸｈｏＩ部位を利用することにより、対応する５’−および３’−ＰＣＲ断片を完全長ブタＴＬＲ９遺伝子に結合させた。対応構築物（ｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ−ブタＴＬＲ９）から、インサートをＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ消化により切り出し、アガロースゲルで精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ切断哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（ｎｅｏ）およびｐｃＤＮＡ３．１（ｈｙｇ）（共にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にサブクローニングして、それぞれｐｃＤＮＡ３．１（ｎｅｏ）−ブタＴＬＲ９およびｐｃＤＮＡ３．１（ｈｙｇ）−ブタＴＬＲ９を得た。対応インサートを再配列決定した（後記を参照されたい）。
【００７８】
ｐｃＤＮＡ３．１インサート配列ブタＴＬＲ９（プライマー配列は下線で示されており、開始／終止コドンは太字で示されており、ユニークＸｈｏＩ部位は太字で示されている）
【化３】
0006427487.tif 000009
【００７９】
0006427487.tif 000010
【００８０】
翻訳配列を、Ｇｅｎｂａｎｋに寄託された４個のブタＴＬＲ９完全長ｃＤＮＡ配列（２０１１年９月，Ｐ１−１８１１０９−ｐｒｏｔ．ｐｒｏ，ｐｉｇ−ＴＬＲ９−ＮＭ  ２１３９５８．ｐｒｏ，ｐｉｇ−ＴＬＲ９−ＡＫ３４９０１３．ｐｒｏ，ｐｉｇ−ＴＬＲ９−ＧＵ１３８０２９．ｐｒｏ，ｐｉｇ−ＴＬＲ９−ＡＹ８５９７２８．ｐｒｏ）と整列（アライメント）させた。５個のブタＴＬＲ９ポリペプチド配列のアライメント（ＣｌｕｓｔａｌＷ；ＤＮＡＳｔａｒ）は、９個の位置において多形を示した。各場合において、本発明者らのＴＬＲ９クローン（Ｐ８−１８１１０９−ｐｒｏｔ）の翻訳配列は大部分のポリペプチド配列に適合し、ｃＤＮＡクローンＡＹ８５９７２８の翻訳と同一であった。したがって、ブタＴＬＲ９の正しい形態がクローニングされていると結論づけられる。
【００８１】
実施例３
イヌｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ−９）の遺伝子クローニング
イヌリンパ節およびイヌ脾臓からの総ＲＮＡをＺｙａｇｅｎから購入し、ＴＬＲ９メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）源として使用した。逆転写酵素（Ｅｘｐａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｒｏｃｈｅ）の供給業者により記載されているのと実質的に同じ方法で、イヌ脾臓またはリンパ節総ＲＮＡから第１鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００８２】
開始コドン領域から終止コドンの下流の３’ＵＴＲ領域までのイヌＴＬＲ９（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ  ００１００２９９８）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のためのプライマーを設計した（Ｃａｎｉｓ（イヌ）−ＴＬＲ９ｆｏｒおよびＣａｎｉｓ−ＴＬＲ９ｒｅｖ１，後記を参照されたい）。しかし、完全長産物（予想：〜３１００ｂｐ）の増幅を目的としたイヌリンパ節および脾臓第１鎖ｃＤＮＡを使用する初期ＰＣＲ実験は、反復的に陰性であることが判明した。したがって、ＰＣＲ重複伸長アプローチのための準備のために、ＰＣＲアプローチにより適した２つの重複ＴＬＲ９遺伝子断片を調製することに決定した。この目的のために、〜１６００ｂｐの５’−ＰＣＲイヌＴＬＲ９産物を得るためのプライマー（Ｃａｎｉｓ−ＴＬＲ９−ｆｏｒおよびＣａｎＴＬＲ９ｏｌｒ，後記を参照されたい）、および〜１７００ｂｐの３’−ＰＣＲイヌＴＬＲ９産物を得るためのプライマー（ＣａｎＴＬＲ９ｏｌｆおよびＣａｎｉｓ−ＴＬＲ９−ｒｅｖ）を設計した。
【００８３】
プライマー配列：
【化４】
0006427487.tif 000011
【００８４】
ＰＣＲ反応（Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲキット，Ｒｏｃｈｅ）を行い、対応ＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製し、ｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内へクローニングし、対応翻訳産物をお互いに対して及びデータベース配列ＮＭ  ００１０２９９８およびＡＹ８５９７２３に対して比較することにより、ＰＣＲ無過誤形態を特定するために３個のクローンのそれぞれを配列決定した。ついで、重複伸長アプローチによりイヌＴＬＲ９遺伝子の５’および３’領域を結合させるために、これら（ｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ−ｃａｎＴＬＲ９−ＮｔｅｒｍおよびｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ−ｃａｎＴＬＲ９−Ｃｔｅｒｍ）を使用した。この目的のために、ｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ−ｃａｎＴＬＲ９−Ｎｔｅｒｍ（プライマー：Ｃａｎｉｓ−ＴＬＲ９−ｆｏｒおよびＣａｎＴＬＲ９ｏｌｒ）およびｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ−ｃａｎＴＬＲ９−Ｃｔｅｒｍ（プライマー：ＣａｎＴＬＲ９ｏｌｆおよびＣａｎｉｓ−ＴＬＲ９−ｒｅｖ）のインサートを、プルーフリーディングポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して９サイクルでＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製し、ついで、プライマーＣａｎｉｓ−ＴＬＲ９−ｆｏｒおよびＣａｎｉｓ−ＴＬＲ９−ｒｅｖを使用する組合せ重複伸長ＰＣＲにおいて併用した。得られた〜３１００ｂｐのＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製し、ｐＣＲＢｌｕｎｔ−ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングした。４個の独立したクローンを配列決定し、１個のクローンを更なる加工のために選択した（ｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ−イヌＴＬＲ９）。
【００８５】
この構築物から、インサートをＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ消化により切り出し、アガロースゲルで精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ切断哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（ｎｅｏ）およびｐｃＤＮＡ３．１（ｈｙｇ）（共にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にサブクローニングして、それぞれｐｃＤＮＡ３．１（ｎｅｏ）−イヌＴＬＲ９およびｐｃＤＮＡ３．１（ｈｙｇ）−イヌＴＬＲ９を得た。対応インサートを再配列決定した（後記を参照されたい）。
【００８６】
ｐｃＤＮＡ３．１インサート配列イヌＴＬＲ９（プライマー配列は下線で示されており、開始／終止コドンは太字で示されている）
【化５】
0006427487.tif 000012
【００８７】
0006427487.tif 000013
【００８８】
0006427487.tif 000014
【００８９】
翻訳配列を、Ｇｅｎｂａｎｋに寄託された２個のイヌＴＬＲ９完全長ｃＤＮＡ配列（２０１１年９月，Ｐ１−０１０７０９−ｐｒｏｔ．ｐｒｏ，ＴＬＲ−９−ＮＭ  ００１００２９９８．ｐｒｏ，ＴＬＲ−９−ＡＹ８５９７２３．ｐｒｏ）と整列（アライメント）させた。３個のイヌＴＬＲ９ポリペプチド配列のアライメント（ＣｌｕｓｔａｌＷ；ＤＮＡＳｔａｒ）は、８個の位置において多形を示した。１個の位置（本発明者らの配列におけるＴ４５９、それらの２つのデータベース配列におけるＰ４５９）を除き、本発明者らのＴＬＲ９クローン（Ｐ１−０１０７０９−ｐｒｏｔ）における全ての多形位置は、ＮＭ  ００１０２９９８または、ＡＹ８５９７２３に適合した。Ｔ４５９はイヌリンパ節および脾臓ｃＤＮＡからの４個の独立したＰＣＲ産物において確認されており、このことは、これがドナーイヌの遺伝子型に対応することを示唆している。したがって、イヌＴＬＲ９の正しい形態がクローニングされていると結論づけられる。
【００９０】
実施例４
ＮＦ−κＢ活性化レポーター細胞としてのメイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞
ＭＥＭ、１×非必須アミノ酸、８％（ｖ／ｖ）ｉＦＣＳ内で維持されたメイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞をＡＴＣＣから得た。分泌性アルカリホスファターゼ活性の存在に関する消費増殖培地の試験は陰性であり、これはレポーター遺伝子アッセイにおけるこの細胞系の使用のための前提条件である。
【００９１】
第１段階として、選択マーカーとしてのゼオシン耐性遺伝子およびＮＦ−κＢ結合部位の制御下の分泌性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を含有するプラスミドであるｐＮｉｆＴｙ２−ＳＥＡＰ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）でＭＤＣＫ細胞をトランスフェクトすることを計画した。しかし、本発明者らの研究は、ＭＤＣＫ細胞はかなりゼオシン（ｍｇ／ｍｌ範囲）に耐性であることを示しており、このことはｐＮｉｆＴｙ２−ＳＥＡＰの使用を妨げる。したがって、ｐｃＮＡ３．１（ｈｙｇ）におけるポリリンカーの部分（プラスミドのＮｒｕＩ／ＸｂａＩ消化および大きな断片のアガロースゲル単離）およびＣＭＶプロモーター領域を、ｐＮｉｆＴｙ２−ＳＥＡＰのＳＥＡＰ遺伝子およびＮＦ−κＢ結合部位を含有するＳｗａＩ／ＮｈｅＩ断片により置換することにより、「ｐＮｉｆＴｙ−ｈｙｇ−ＳＥＡＰ」を作製することに決定した。それにより、ＭＤＣＫ細胞上で有効な細胞増殖抑制物質であるヒグロマイシンの培地への添加により、レポーター遺伝子カセットの存在が今や選択可能となった。
【００９２】
ＭＤＣＫ細胞をｐＮｉｆＴｙ−ｈｙｇ−ＳＥＡＰでトランスフェクトし、選択圧を適用し（３００μｇ／ｍｌ  ヒグロマイシン）、選択培地内の反復継代培養により耐性系を選択した。選択された細胞系を、ヒト腫瘍壊死因子（ｈｕＴＮＦ−α；ＮＦ−κＢ経路の適切な機能およびレポーター遺伝子活性化に関する陽性対照）により、および病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポ多糖（ＬＰＳ、ＴＬＲ４）、ポリ−Ｉ／ポリＣ（二本鎖ＲＮＡ，ＴＬＲ３）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ，ＮＯＤ２）、ＰＡＭ３ＣｙｓＳＫ４（合成リポペプチド，ＴＬＲ１／２）およびＲ−８４８（ＴＬＲ７の低分子量アゴニスト））の選択により、ＳＥＡＰ誘導に関して試験した。結果を図１および２に示す（図２は図１のｙ軸拡大図である）。
【００９３】
ｈｕＴＮＦ−αは、ポリクローナルＭＤＣＫ−ｐＮｉｆＴｙ−ｈｙｇ−ＳＥＡＰ細胞系においてＳＥＡＰ産生を強力に誘導し、これはレポーター遺伝子アッセイにおけるこの細胞系の使用のための第２の前提条件である。ＮＦ−κＢ経路内に供給される５つの異なるパターン認識受容体を扱うＰＡＭＰは、低いＳＥＡＰ誘導を示すか又はＳＥＡＰ誘導を全く示さず、このことは、本発明者らのＭＤＣＫ−ｐＮｉｆＴｙ−ｈｙｇ−ＳＥＡＰ細胞系が対応受容体のコピーを全く発現しないか又はごく僅かしか発現しないことを示唆しており、これはレポーター遺伝子アッセイにおけるこの細胞系の使用のための第３の前提条件である。最高バックグラウンド（それでも非常に低いが）がｄｓＲＮＡで見られ、これにＭＤＰが続き、一方、ＬＰＳ、ＰＡＭ３ＣｙｓＳＫ４およびＲ−８４８は実質的に全く示さなかった。
【００９４】
これらの結果は、本発明者らがＭＤＣＫ−ｐＮｉｆＴｙ−ｈｙｇ−ＳＥＡＰ細胞系の単細胞クローニングを行うこと、ポリクローナル系において見られる特性を安定化させること、およびより優れたクローンを特定することを促した。９６ウェルプレートにおける限外希釈により４６個のクローンを選択し、増殖後、それらをｈｕＴＮＦ−αで刺激して、最高ＮＦ−κＢ誘導性ＳＥＡＰ産生能を有するクローンを特定した（図３を参照されたい）。
【００９５】
実施例５
イヌ、ブタおよびウシＴＬＲ９−２１融合構築物の作製および発現ベクターｐＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ内へのサブクローニング
ウシＴＬＲ９の細胞外ドメインおよびニワトリＴＬＲ２１の細胞内ドメインをコードする融合構築物を、「ＰＣＲソーイング（ｓｅｗｉｎｇ）」法を用いて作製した。
【００９６】
「ＰＣＲソーイング」は３つの工程を含む（図４を参照されたい）。第１に、１つの構築物へと融合されるべきＤＮＡ断片に、相補的配列をＰＣＲにより付加する。第２に、相補的配列を有するそれらの２つの断片を、プライマーを加えることなくＰＣＲ反応において一緒にする。相補的配列は、それらの断片がアニールしＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を始動することを可能にする。第３のＰＣＲ工程において、キメラ分子の５’および３’末端にアニールするプライマーを付加して、融合分子を増幅する。ウシＴＬＲ９の細胞外ドメインをコードする配列をｐｃＤＮＡ３．１（ｎｅｏ）−ウシＴＬＲ９構築物（断片１）からＰＣＲにより増幅し、ニワトリＴＬＲ２１の膜貫通および細胞内ドメインをコードする配列をｐｃＤＮＡ３．１（ｎｅｏ）−ニワトリＴＬＲ２１（後記配列）から増幅した。５’突出部を有するプライマー（後記配列）を使用して、ＰＣＲにより、相補的配列を細胞外（ＴＬＲ９）断片の３’末端およびＴＬＲ２１断片の５’末端に付加した。全てのＰＣＲにＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用した。
【００９７】
ｃＤＮＡ３．１（ｎｅｏ）−ニワトリＴＬＲ２１インサート配列；開始／終止コドンが太字で示されている
【化６】
0006427487.tif 000015
【００９８】
0006427487.tif 000016
【００９９】
ウシＴＬＲ９（細胞外ドメイン）のためのプライマー：
ｃｏｗＴ９−ｃｈＴ２１  ５’Ｅｃｏ：ＧＣＧＧＡＴＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＣＣＴＡＣＴＧＴＧＣ
ｃｏｗＴ９−ｃｈＴ２１ｆｕｓＲＶ：ＡＴＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＧＣＡＧＧＴＣＣＴＧＴＧＴ
ニワトリＴＬＲ２１（膜貫通および細胞内ドメイン）のためのプライマー：
ｃｏｗＴ９−ｃｈＴ２１ｆｕｓＦＷ：ＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＧＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＴＡＴ
ｃｏｗＴ９−ｃｈＴ２１  ３’Ｅｃｏ：ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＣＴＣＣＴＴ。
【０１００】
融合産物をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、１個のクローンを配列決定して、配列がＰＣＲ無過誤であるかどうかを調べた。配列は１個のコード化突然変異を含有し、これを、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ部位特異的突然変異誘発キットおよび以下のプライマーを使用して矯正した。
【０１０１】
突然変異誘発プライマー：
１８−ＣｏｗＴ９−ｃｈＴ２１：ＣＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＣＧＣＡＧＡＣＴＣＡＡＣＣ
１９−ＣｏｗＴ９−ｃｈＴ２１：ＧＧＴＴＧＡＧＴＣＴＧＣＧＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＧＴＣＧＴＴＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＧＴＣＴＴＧＧ
突然変異誘発法の後、部位特異的突然変異誘発が成功し新たな突然変異が導入されなかったかどうかを調べるために、複数（５個）のクローンを配列決定した。プライマーにより導入されたＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶ部位を使用して、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内に融合構築物を再クローニングするために、正しいクローンを使用した。得られたベクター（ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ−ｂｏｖＴＬＲ９−２１）における融合構築物を再配列決定した（後記を参照されたい）。
【０１０２】
ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ−ｂｏｖＴＬＲ９−２１インサート配列；（部分）プライマー配列が下線で示されており、ＴＬＲ２１（コード化）配列がイタリック体で示されており、開始／終止コドンが太字で示されている。
【化７】
0006427487.tif 000017
【０１０３】
0006427487.tif 000018
【０１０４】
0006427487.tif 000019
【０１０５】
ブタＴＬＲ９の細胞外ドメインとニワトリＴＬＲ２１の膜貫通および細胞内ドメインとの融合構築物のクローニング
ブタＴＬＲ９の細胞外ドメインとニワトリＴＬＲ２１の細胞内ドメインとをコードする融合構築物を、前記の「ＰＣＲソーイング」法を用いて作製した。
【０１０６】
ｐｃＤＮＡ３．１（ｎｅｏ）−ブタＴＬＲ９構築物（実施例２に記載されている）からのブタＴＬＲ９の細胞外ドメインをコードする配列、ならびにｐｃＤＮＡ３．１（ｎｅｏ）−ニワトリＴＬＲ２１（前記配列）からのニワトリＴＬＲ２１の膜貫通および細胞内ドメインをコードする配列をＰＣＲにより増幅した。５’突出部を有するプライマー（後記配列）を使用して、ＰＣＲにより相補的配列を細胞外（ＴＬＲ９）断片の３’末端およびＴＬＲ２１断片の５’末端に付加した。全てのＰＣＲにＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用した。
【０１０７】
ブタＴＬＲ９（細胞外ドメイン）のためのプライマー：
ｐｉＴ９−ｃｈＴ２１  ５’Ｅ：ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＣＣＣＧＣＴＧＣＡＣ
ｐｉｇＴ９−ｃｈＴ２１ｆｕｓＲＶ：ＡＴＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＧＣＡＧＧＴＣＴＴＧＣＧＣ
ニワトリＴＬＲ２１（膜貫通および細胞内ドメイン）のためのプライマー：
ｐｉｇＴ９−ｃｈＴ２１ｆｕｓＦＷ：ＧＣＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＴＡＴ
ｐｉｇ／ｄｏｇＴ９−ｃｈＴ２１−：ＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＣＴＣＣＴＴ
融合産物をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、１個のクローンを配列決定して、配列がＰＣＲ無過誤であるかどうかを調べた。このクローンは適切であり、これを使用して、プライマーにより導入されたＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ部位を用いてｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内に融合構築物を再クローニングした。ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３における融合構築物の５’および３’連結部位を配列決定して、プラスミドにおける断片の適切な挿入を確認した。適切な得られたベクターは、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ−ｐｏｒＴＬＲ９−２１（後記配列）である。
【０１０８】
ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ−ｐｏｒＴＬＲ９−２１インサート配列；（部分）プライマー配列が下線で示されており、ＴＬＲ２１（コード化）配列がイタリック体で示されており、開始／終止コドンが太字で示されている。
【化８】
0006427487.tif 000020
【０１０９】
0006427487.tif 000021
【０１１０】
イヌＴＬＲ９の細胞外ドメインとニワトリＴＬＲ２１の膜貫通および細胞内ドメインとの融合構築物のクローニング
イヌＴＬＲ９の細胞外ドメインとニワトリＴＬＲ２１の細胞内ドメインとをコードする融合構築物を、前記の「ＰＣＲソーイング」法を用いて作製した。
【０１１１】
ｐｃＤＮＡ３．１（ｎｅｏ）−イヌＴＬＲ９構築物（実施例３に記載されている）からのイヌＴＬＲ９の細胞外ドメインをコードする配列、ならびにｐｃＤＮＡ３．１（ｎｅｏ）−ニワトリＴＬＲ２１（前記配列）からのニワトリＴＬＲ２１の膜貫通および細胞内ドメインをコードする配列をＰＣＲにより増幅した。５’突出部を有するプライマー（後記配列）を使用して、ＰＣＲにより、相補的配列を細胞外（ＴＬＲ９）断片の３’末端およびＴＬＲ２１断片の５’末端に付加した。全てのＰＣＲにＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用した。
【０１１２】
イヌＴＬＲ９（細胞外ドメイン）のためのプライマー：
ｄｏＴ９−ｃｈＴ２１  ５’Ｅ：ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＧ
ｄｏｇＴ９−ｃｈＴ２１ｆｕｓＲＶ：ＡＴＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＧＣＡＧＧＴＣＣＴＧＴＧＣ
ニワトリＴＬＲ２１（膜貫通および細胞内ドメイン）のためのプライマー：
ｄｏｇＴ９−ｃｈＴ２１ｆｕｓＦＷ：ＧＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＧＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＴＡＴ
ｐｉｇ／ｄｏｇＴ９−ｃｈＴ２１−：ＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＣＴＣＣＴＴ
融合産物をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、１個のクローンを配列決定して、配列がＰＣＲ無過誤であるかどうかを調べた。配列は１個のコード化突然変異および１個のサイレント突然変異を含有していた。このコード化突然変異を、Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびプライマーを使用して矯正した。
【０１１３】
突然変異誘発プライマー：
ｄＴ９−ｃｈＴ２１ｍｔ  ＦＷ：ＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＧＣＧＣＴＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＧＧＧＣ
ｄＴ９−ｃｈＴ２１ｍｔ  ＲＶ：ＧＣＣＣＴＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＴＡＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣ
突然変異誘発法の後、部位特異的突然変異誘発が成功したかどうかを調べるために、複数（８個）のクローンを配列決定した。１個のクローンは適切なヌクレオチドを含有していた。このクローンを使用して、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ内に存在するプライマー導入ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶ部位を用いてｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内に融合構築物を再クローニングした。得られたベクター（ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ−ｃａｎＴＬＲ９−２１）を、完全に配列決定した。配列は、アミノ酸配列に影響を及ぼさない２つのサイレント突然変異を特定した。したがって、このクローンが更なる用途に使用可能であると結論づけられた。
【０１１４】
ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ−ｃａｎＴＬＲ９−２１インサート配列；（部分）プライマー配列が下線で示されており、ＴＬＲ２１（コード化）配列がイタリック体で示されており、開始／終止コドンが太字で示されている。
【化９】
0006427487.tif 000022
【０１１５】
0006427487.tif 000023
【０１１６】
実施例６
イヌＴＬＲ９−２１融合構築物でのＭＤＣＫ−ｐＮｉｆＴｙｈｙｇ−ＳＥＡＰのトランスフェクション
ａ）クローンのトランスフェクションおよび選択
ＴＬＲ９−２１融合構築物の発現および検出のためのＭＤＣＫ−ｐＮｉｆＴｙｈｙｇ−ＳＥＡＫ−クローン１５の可能性を調べるために、このクローン細胞系をｐＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ−イヌＴＬＲ９−２１でトランスフェクトした。３００μｇ／ｍｌ  ヒグロマイシンおよび８μｇ／ｍｌ  ピューロマイシンで補足された培地での反復継代によりトランスフェクタントを選択した。標準的なオリゴヌクレオチドＯＤＮ−２００６−ＰＴＯでの得られたポリクローナル細胞系の試験は、ＳＥＡＰ分泌の誘導を示した。単細胞クローニングを行い、ＯＤＮ−２００６−ＰＴＯでの更なる試験のために５４個のクローンを増殖させた（後記グラフを参照されたい）。大量のＳＥＡＰの誘導を示す多数のクローンが特定された。最良のシグナル対ノイズ比を有する４個のクローン（番号１７、２３、３２および４０）を増殖および凍結安定体の作製のために選択した。再試験後、クローン番号１７を更なる実験のために選択した（図５を参照されたい）。
【０１１７】
ｂ）ＭＤＣＫ−ｐＮｉｆＴｙｈｙｇ−ＳＥＡＰ−ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ−ｃａｎＴＬＲ９−２１−クローン１７：オリゴヌクレオチドの刺激活性の試験
実験１：
ヒト用医薬からの標準的なオリゴヌクレオチド２００６−ＰＴＯおよび２００７−ＰＴＯと共に、一連のホスホロチオアートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ−ＯＤＮ，ｔｈｉｏ（チオ）５−４からｔｈｉｏ５−１０まで）を試験した。
【表２】
0006427487.tif 000024
【０１１８】
この実験から、作製されたｐＩＲＥＳｐｕｒｏ−ｃａｎＴＬＲ９−２１発現ＭＤＣＫ−ｐＮｉｆＴｙｈｙｇ細胞系は、ＥＣ５０値の計算により種々の効力を定めうると推定されうる（図６を参照されたい）。
【０１１９】
ｇｔｃｇｔｃのような構造要素を有する免疫刺激性ＯＤＮに関しては、ｃｇ要素の数が重要である（９＞７＞６＞５＞＞４＞＞３）と示されうる（前記表を参照されたい）。この実験は構造活性相関（ＳＡＲ）の入手および免疫刺激性ＯＤＮのリード最適化のためのこの細胞系の潜在性の概要をも直ちに示す。
【０１２０】
また、ヒト研究から既知のＰＴＯ−ＯＤＮ（２００６−ＰＴＯおよび２００７−ＰＴＯ）はイヌＴＬＲ９−２１融合タンパク質に対して非常に有効であることが示されたが、本発明者らの初期「リード最適化」の少なくとも１つの候補（ｔｈｉｏ５−１０）は、イヌＴＬＲ９−２１に対してこれらのヒト標準ＯＤＮと同等に強力またはそれらより若干強力であることが判明した。
【０１２１】
実験２：
ヒト用医薬からの標準的なオリゴヌクレオチド２００６−ＰＴＯと共に、ニワトリＴＬＲ２１（融合部分のドナー）に対して非常に強力であることが判明した一連のホスホジエステルオリゴヌクレオチド（１０個のＰＤＥ−ＯＤＮ）をイヌＴＬＲ９−２１融合体に対して試験した。
【０１２２】
結果：これらの１０個のＰＤＥ−ＯＤＮはいずれも試験範囲（５００ｎＭ〜３．９ｎＭ）においてＳＥＡＰ誘導活性を全く示さなかったが、２００６−ＰＴＯは、このＯＤＮの予想範囲である〜４ｎＭのＥＣ５０を示した。
【０１２３】
解釈：ＯＤＮの認識は、Ｎ末端融合部分（この場合はイヌＴＬＲ９）によって決まる。ＰＤＥ−ＯＤＮ認識の劇的な種特異性が存在する。なぜなら、試験されたＯＤＮは、ニワトリＴＬＲ２１に対しては１桁のｎＭまたは更にはｐＭのＥＣ５０値を示しているが、２００６−ＰＴＯは、この受容体に対してはイヌＴＬＲ９−２１融合体に対してほどは強力ではない（３１ｎＭ）からである。
【０１２４】
実験３：
ここでは、ヒトおよびマウスの場合に文献において使用されているＰＴＯ−ＯＤＮ（１６６８−ＰＴＯ、２２１６−ＰＴＯおよび２３９５−ＰＴＯ）に関する実験を行った。
【表３】
0006427487.tif 000025
【０１２５】
0006427487.tif 000026
【０１２６】
３個全てのＰＴＯ−ＯＤＮは、２桁のｎＭ  ＥＣ５０値でイヌＴＬＲ９−２１融合体に対して活性である。しかし、ＳＥＡＰ産生の最大達成可能刺激（Ｖｍａｘ）に関しては、効力の順序は１６６８＞２３９５＞２２１６である（図８を参照されたい）。顕著なことに、ニワトリＴＬＲ２１に対する同じＯＤＮの試験は、２２１６−ＰＴＯが不活性であり、１６６８−ＰＴＯが〜１０００ｎＭのＥＣ５０を有し、２３９５−ＰＴＯのみが、３９．４ｎＭのＥＣ５０を示すことにおいて、幾らかの効力を有することを示している。
【０１２７】
実験４：
公開されているオリゴヌクレオチド１６６８−ＰＴＯ、２２１６−ＰＴＯおよび２３９５−ＰＴＯからの恐らく活性要素でありうるものに基づいて、「リード最適化」を試みた。これらの活性要素は親ＯＤＮにおいては下線および／またはイタリック体で示されており、ｍｏｄ１／２  ＯＤＮにおいては反復配列内に配置されている。
【表４】
0006427487.tif 000027
【０１２８】
ＥＣ５０値に基づけば、「リード最適化」は成功であることが判明している。全３個の場合において、ｍｏｄ１／２  ＰＴＯ−ＯＤＮ形態はそれらの親ＰＴＯ−ＯＤＮより強力であった。更に、２２１６−ＰＴＯおよび２３９５−ＰＴＯの場合、Ｖｍａｘの有意な増加が視認可能であった。６個中５個の新たに設計されたＰＴＯ−ＯＤＮが模範２００６−ＰＴＯの活性範囲内である（図９を参照されたい）。
【０１２９】
実験５：
可能な活性要素に基づく「リード最適化」を、公開されているオリゴヌクレオチド２００７−ＰＴＯに関して試みた。
【表５】
0006427487.tif 000028
【０１３０】
５’末端または３’末端またはそれらの両方へのｃｇ含有要素の付加、および２００７−ＰＴＯの二量体化は、活性の改善につながらなかったが（ＥＣ５０およびＶｍａｘの両方に関して）、それは活性喪失を招かなかった。１桁のナノモル活性が維持されている。挙げられているＯＤＮは、いずれも現在までに文献において報告されていない（図１０を参照されたい）。
【０１３１】
実験６：
ここでは、文献に記載されている２個のＰＴＯ−ＯＤＮ（ＯＤＮ−１７およびＯＤＮ−Ｌｉｎｇ１）を試験した。また、ｔｈｉｏ５−８におけるＣｐＧ要素の完全（ｔｈｉｏ５−８ｐｄｅ２Ａ）および部分（ｔｈｉｏ５−８ｐｄｅ２Ｂ）ホスホロチオアート結合の置換の影響を試験した。更に、免疫調節要素−ｔｔｃｇｔｃ−の多量体を試験した。
【表６】
0006427487.tif 000029
【０１３２】
0006427487.tif 000030
【０１３３】
ＣｐＧ要素内のＰＤＥ結合によるＰＴＯの置換は、ＰＴＯ−ＯＤＮの刺激活性を時には増強することが文献において報告されている。この見解をｔｈｉｏ５−８で試験した。本発明者らの場合においては、ＰＤＥ修飾形態は、イヌＴＬＲ９−２１融合体に対して、親「ＰＴＯのみ」ＯＤＮより遥かに低い活性を示した。本発明者らは、イヌＴＬＲ９−２１融合体に対して２００６−ＰＴＯと同様に活性である１個の更に新規のＰＴＯ−ＯＤＮ（ｔｈｉｏ９−５）を特定した。更に、Ｌｉｎｇ１−ＰＴＯは強力なＰＴＯ−ＯＤＮであることが判明した（図１１を参照されたい）。
【０１３４】
実験７：
ここでは、５’−および３’ｄＧ連続（ｒｕｎ）と組合された場合にニワトリＴＬＲ２１に対して高活性であることが判明したＰＤＥオリゴヌクレオチドのＰＴＯ形態の幾つかを試験した。しかし、ＰＴＯ形態は、５’−および３’ｄＧ連続を欠いている（したがって、マイナスＧ，「ｍＧ」）。
【表７】
0006427487.tif 000031
【０１３５】
全ての試験ＯＤＮは、標準ＰＴＯ−ＯＤＮ  ２００６と同じ又は近いＥＣ５０およびＶｍａｘ値を有し、非常に強力であることが判明した（図１２を参照されたい）。
【０１３６】
実験８：
更に、ＯＤＮ  Ｘ４、Ｘ４３、Ｚ１１およびＣＣ−Ｘの活性要素（ニワトリＴＬＲ２１）に基づく一連のＰＴＯ−ＯＤＮを、イヌＴＬＲ９−２１融合体にするそれらの効力に関して試験した。
【表８】
0006427487.tif 000032
【０１３７】
全ての新規ＰＴＯ−オリゴヌクレオチドは、２ｎＭ未満のＥＣ５０を有するＺ１１−３０−ＰＴＯおよびＣＣ−Ｘ−３０−ＰＴＯの場合に、イヌＴＬＲ９−２１に対して高い刺激活性（１桁のナノモル範囲のＥＣ５０）および比較しうるＶｍａｘを有する。これらのＰＴＯ−ＯＤＮは、いずれもイヌにおけるそれらの使用に関して未だ記載されていない（図１３および１４を参照されたい）。
【０１３８】
実験９：
この実験においては、頻繁に使用される免疫刺激性要素ｇａｃｇｔｔおよびｇｔｃｇｔｔの反復配列を、イヌＴＬＲ９−２１融合体に対するそれらの効力に関して試験した。
【表９】
0006427487.tif 000033
【０１３９】
0006427487.tif 000034
【０１４０】
反復要素ｇａｃｇｔｔの場合、反復数が重要であることを実験は示している。五量体は２ｎＭ未満のＥＣ５０に達する。この新たなバッチの２２１６−ＰＴＯの低いＥＣ５０ついては明らかでないところがある。しかし、Ｖｍａｘ値は、試験された全ての他のＯＤＮの場合より明らかに低い（図１５を参照されたい）。
【０１４１】
実験１０：
この実験においては、三つ組および四つ組要素の反復配列をイヌＴＬＲ９−２１融合体に対するそれらの効力に関して試験した。
【表１０】
0006427487.tif 000035
【０１４２】
0006427487.tif 000036
【０１４３】
ＴＣＧ−８は高活性であるが、ＡＣＧ−８はイヌＴＬＲ９−２１融合体の刺激を何ら示さないことが注目される。この研究においては、ＰＴＯ−ＯＤＮ  ＴＣＧＴ−６の「ＳＡＲ」を詳細に調べた。５’Ｔ、ついで３’Ｔを全ての他の塩基で置換した。意外にも、誘導体の全てがＥＣ５０に関して高活性であることが判明しており、劇的な活性低下は認められなかった。Ｖｍａｘに関しては、ＣＣＧＴ−６では効力の大きな低下が認められ、ＧＣＧＴ−６では小さな低下が認められた。Ｇ／Ｃのみを含有するＰＴＯ−ＯＤＮはこのアッセイにおいて限界的に活性であるに過ぎなかった。
【０１４４】
これは、テトラヌクレオチドモチーフの六量体に基づくｃａｎＴＬＲ９−２１に関する包括的な構造活性相関の決定である（図１６および１７を参照されたい）。
【０１４５】
実験１１：
この実験においては、免疫調節性六量体および四量体配列要素の組合せをイヌＴＬＲ９−２１融合体に対するそれらの効力に関して試験した（図１８を参照されたい）。
【表１１】
0006427487.tif 000037
【０１４６】
結論：ＭＤＣＫ−ｐＮｉｆＴｙｈｙｇ−ＳＥＡＰ−ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ−ｃａｎＴＬＲ９−２１は、イヌＴＬＲ９リガンドの特定のための特有のスクリーニング手段であることが示されている。幾つかの新規活性ＯＤＮが特定されている。
【０１４７】
実施例７
ブタＴＬＲ９−２１融合構築物でのＭＤＣＫ−ｐＮｉｆＴｙｈｙｇ−ＳＥＡＰのトランスフェクション
ａ）クローンのトランスフェクションおよび選択
ＭＤＣＫ−ｐＮｉｆＴｙｈｙｇ−ＳＥＡＫ−クローン１５を、ｐＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ−ブタＴＬＲ９−２１でトランスフェクトした。３００μｇ／ｍｌ  ヒグロマイシンおよび８μｇ／ｍｌ  ピューロマイシンで補足された培地での反復継代によりトランスフェクタントを選択した。標準的なオリゴヌクレオチドＯＤＮ−２００６−ＰＴＯでの得られたポリクローナル細胞系の試験は、ＳＥＡＰ分泌の誘導を示した。単細胞クローニングを行い、ＯＤＮ−２００６−ＰＴＯでの更なる試験のために、７５個のクローンを増殖させた。ＳＥＡＰの誘導を示す多数のクローンが特定された。最良のシグナル対ノイズ比を有する幾つかのクローンを、増殖および凍結安定体の作製のために選択した。再試験後、クローン番号２０を更なる実験のために選択した（図１９を参照されたい）。
【０１４８】
ｂ）ＭＤＣＫ−ｐＮｉｆＴｙｈｙｇ−ＳＥＡＰ−ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ−ブタＴＬＲ９−２１−クローン２０：オリゴヌクレオチドの刺激活性の試験
実験１：
ヒト用医薬からの標準的なオリゴヌクレオチド２００６−ＰＴＯと共に、一連のホスホロチオアートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ−ＯＤＮｓ，ｔｈｉｏ（チオ）５−４からｔｈｉｏ５−１０まで、ｔｈｉｏ９−３およびｔｈｉｏ９−５）を試験した。
【表１２】
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【０１４９】
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【０１５０】
この実験から、作製されたｐＩＲＥＳｐｕｒｏ−ブタＴＬＲ９−２１発現ＭＤＣＫ−ｐＮｉｆＴｙｈｙｇ細胞系は、ＥＣ５０値の計算により種々の効力を定めうると推定されうる。
【０１５１】
ｇｔｃｇｔｃのような構造要素を有する免疫刺激性ＯＤＮに関しては、ｃｇ要素の数が重要である（９〜７＞６＞５＞４＞３）と示されうる（前記表を参照されたい）。この実験は構造活性相関（ＳＡＲ）の入手および免疫刺激性ＯＤＮのリード最適化のためのこの細胞系の潜在性の概要をも直ちに示す。
【０１５２】
また、ヒト研究から、既知の２００６−ＰＴＯは、ブタＴＬＲ９−２１融合タンパク質に対して非常に有効であることが示された。更に、ｔｈｉｏ５−８におけるＣｐＧ要素の完全（ｔｈｉｏ５−８ｐｄｅ２Ａ）および部分（ｔｈｉｏ５−８ｐｄｅ２Ｂ）ホスホロチオアート結合の置換の影響を試験した。本発明者らの場合においては、ＰＤＥ修飾形態は、ブタＴＬＲ９−２１融合体に対して、親「ＰＴＯのみ」ＯＤＮより遥かに低い活性を示した。最後に、モチーフｔｔｃｇｔｃの三量体および四量体であるそれぞれｔｈｉｏ９−３およびｔｈｉｏ９−５を試験した（結果、図２０を参照されたい）。
【０１５３】
実験２：
ここでは、５’−および３’ｄＧ連続（ｒｕｎ）と組合された場合にニワトリＴＬＲ２１に対して高活性であることが判明したＰＤＥオリゴヌクレオチドのＰＴＯ形態の幾つかを試験した。しかし、ＰＴＯ形態は、５’−および３’ｄＧ連続を欠いている（したがって、マイナスＧ，「ｍＧ」）。
【表１３】
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【０１５４】
0006427487.tif 000041
【０１５５】
更に、公開されている報告からの２つのＰＴＯ−ＯＤＮ（ＯＤＮ１７およびＯＤＮ−Ｌｉｎｇ１）を試験した。Ｘ４−Ｘ４−Ｉ−およびＸ４−ＩＩ−ＰＴＯ−誘導体は、全て３０〜５０ｎＭのＥＣ５０値の強い活性を有することが判明したが、ニワトリＴＬＲ２１に対して高活性であるＸ４−ｐｅｎｔ−ＰＤＥは、ＥＣ５０および予想Ｖｍａｘのどちらに関しても低刺激物質であることが判明した。興味深いことに、ＯＤＮ−１７−ＰＴＯ（ｇｔｃｇｔｔ三つ組）は１００ｎＭを超えるＥＣ５０を示したが、ＯＤＮ−Ｌｉｎｇ１−ＰＴＯは２００６−ＰＴＯと同程度に活性であることが判明した（図２１を参照されたい）。
【０１５６】
実験３：
この実験においては、三つ組および四つ組要素の反復配列をブタＴＬＲ９−２１融合体に対するそれらの効力に関して試験した。
【表１４】
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【０１５７】
0006427487.tif 000043
【０１５８】
ＡＣＧ−８は、ブタＴＬＲ９−２１融合体の僅かな刺激を示しているに過ぎず、一方、ＴＣＧ−８は、〜６２ｎＭのＥＣ５０を示す。この研究においては、ＰＴＯ−ＯＤＮ  ＴＣＧＴ−６の「ＳＡＲ」を詳細に調べた。５’Ｔ、ついで３’Ｔを全ての他の塩基により置換した。ＥＣ５０に関しては、ＴＣＧＴ−６は、標準的２００６−ＰＴＯより一層良好に働く明らかに最良の誘導体であることが判明した。ｃａｎＴＬＲ９−２１の場合と同様に、Ｖｍａｘについても、ブタＴＬＲ９−２１に対して、ＣＣＧＴ−６に関しては大きな効力低下が認められ、ＧＣＧＴ−６に関しては小さな効力低下が認められた。Ｇ／Ｃのみを含有するＰＴＯ−ＯＤＮはこのアッセイにおいて限界的に活性であるに過ぎず、ＧＣＧＣ−６が最良のものであった。
【０１５９】
これは、テトラヌクレオチドモチーフの六量体に基づくブタＴＬＲ９−２１に関する包括的な構造活性相関の決定である（図２２および２３を参照されたい）。
【０１６０】
実験４：
ここでは、公開されているオリゴヌクレオチド１６６８−ＰＴＯ、２２１６−ＰＴＯおよび２３９５−ＰＴＯからの恐らく活性要素でありうるものに基づいて、「リード最適化」を試みた。これらの「活性要素」は、親ＯＤＮにおいては下線および／またはイタリック体で示されており、ｍｏｄ１／２  ＯＤＮにおいては反復配列内に配置されている。
【表１５】
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【０１６１】
0006427487.tif 000045
【０１６２】
結果：図２４、２５および２６を参照されたい。
【０１６３】
実験５：
この実験においては、頻繁に使用される免疫刺激性要素ｇａｃｇｔｔおよびｇｔｃｇｔｔの反復配列を、ブタＴＬＲ９−２１融合体に対するそれらの効力に関して試験した。
【表１６】
0006427487.tif 000046
【０１６４】
結果：図２７を参照されたい。
【０１６５】
実験６：
ここでは、公開されているオリゴヌクレオチド２００７−ＰＴＯからの可能な活性要素に基づく「リード最適化」を試みた。
【表１７】
0006427487.tif 000047
【０１６６】
結果：図２８を参照されたい。
【０１６７】
実験７：
更に、ＯＤＮ  Ｘ４、Ｘ４３、Ｚ１１およびＣＣ−Ｘの活性要素（ニワトリＴＬＲ２１）に基づく一連のＰＴＯ−ＯＤＮを、ブタＴＬＲ９−２１融合体に対するそれらの効力に関して試験した。
【表１８】
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【０１６８】
ほとんどの新規ＰＴＯ−オリゴヌクレオチドは、ブタＴＬＲ９２１に対する高い刺激活性（１桁のナノモル範囲のＥＣ５０）および比較しうるＶｍａｘを有する。Ｚ１１（ｃｔｃｇｔｃ）のモチーフが特に強力であるらしい。これらのＰＴＯ−ＯＤＮはいずれも、ブタに関しては未だ記載されていない（図２９および３０を参照されたい）。
【０１６９】
実験８：
この実験においては、免疫調節性六量体および四量体配列要素の組合せをブタＴＬＲ９−２１融合体に対するそれらの効力に関して試験した。
【表１９】
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【０１７０】
この実験においては、ｇｔｃｇｔｃ−、ｇｔｃｇｔｔ−、ｇｔｃｇａｃ−およびｔｃｇｔ−含有ＰＴＯ  ＯＤＮの種々の組合せは、ブタＴＬＲ９−２１に対する同様の２桁のナノモル効力を有することが判明した（図３１を参照されたい）。
【０１７１】
実施例８
実験計画
狂犬病に対するワクチン接種がされていない３〜４月齢の５頭のビーグル子イヌ（このうちの雌イヌは過去１２カ月間に狂犬病に対するワクチン接種がされていない）の２群を使用した。子イヌに１ｍｌのそれぞれのワクチン組成物をワクチン接種した。ワクチン接種の直前（Ｔ＝０）ならびにワクチン接種後のＴ＝２、Ｔ＝４、Ｔ＝６、Ｔ＝８、Ｔ＝１２、Ｔ＝１６、Ｔ＝２０およびＴ＝２４週の時点で血液サンプルを採取し、狂犬病ウイルスに対する抗体価を決定した。
【表２０】
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【０１７２】
ワクチン
Ｎｏｂｉｖａｃ（登録商標）Ｒａｂｉｅｓ（狂犬病）
製剤：商標的に入手可能なワクチン
提供形態：１０ｍｌの栓付小瓶
供給業者：Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＢＶ，Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ。
【０１７３】
投与量および投与
１ｍｌ当たり５μｇのＴｈｉｏ−ｔｃｇ−８−ＰＴＯ（ＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ）の添加を伴う（群２）または伴わない（群１）１ｍｌのＮｏｂｉｖａｃ（登録商標）Ｒａｂｉｅｓワクチンを、子イヌの頸部の皮下（ｓ．ｃ．）にワクチン接種した。
【０１７４】
抗体の誘導
ワクチン接種の直前（Ｔ＝０）ならびにワクチン接種後のＴ＝２、Ｔ＝４、Ｔ＝６、Ｔ＝８、Ｔ＝１２、Ｔ＝１６、Ｔ＝２０およびＴ＝２４週の時点で血液サンプルを各子イヌから採取した。血液サンプルを２〜８℃で一晩にわたって凝固させた。遠心分離後、血清を適当な容器内に移し、分析まで−２０℃で保存した。ウイルス中和試験である迅速蛍光フォーカス抑制試験（Ｒａｐｉｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｆｏｃｕｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ）（ＲＦＦＩＴ）を用いて、血清における狂犬病に対する抗体価を決定した。
【０１７５】
迅速蛍光フォーカス抑制試験（ＲＦＦＩＴ）
ＲＦＦＩＴは、狂犬病中和抗体の存在を定量するための標準的なインビトロ試験として国際的に認識されている。検査すべき血清の系列３倍希釈物を調製し、標準的用量（３０〜３００フォーカス形成単位（ＦＦＵ）の力価を有するＷＨＯ／ＰＨＥＵＲによるもの）を含有する等体積の狂犬病ウイルス懸濁液と混合した。血清／ウイルス混合物を３７℃および５％  ＣＯ２において９０分間インキュベートした。プレインキュベーション期間後の非中和ウイルスを増殖させるために、感受性細胞（ＢＨＫ細胞）を混合物中に加え、３７℃および５％  ＣＯ２において２４時間インキュベートして、単層を形成させた。インキュベーションおよび狂犬病ウイルス特異的免疫染色の後、顕微鏡検査により蛍光フォーカスに関して単層を観察し、ついで力価（単位：ＩＵ／ｍｌ）を計算した。
【０１７６】
結果：
図３２から認められうるとおり、Ｎｏｂｉｖａｃ狂犬病ワクチンおよびＣｐＧ  ＯＤＮ  Ｔｈｉｏ−ｔｃｇ−８−ＰＴＯ（ＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ）が投与されたイヌにおいて見出された抗狂犬病ウイルス力価は、このＣｐＧ  ＯＤＮを含有しない同じ狂犬病ワクチンの場合の量の３倍である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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