(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌエピトープに選択的に結合できる抗体であって、配列番号２、３または４を有する断片から選択される、抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体またはｓｃＦｖ断片である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号２を有するｓｃＦｖ断片である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
組織もしくは細胞中またはタンパク質上のＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフの存在の決定または定量のためのアッセイキットであって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体を少なくとも１種含む、アッセイキット。
【請求項５】
ＥＬＩＳＡアッセイ、競合／阻害ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、マイクロアレイに基づくアッセイ、官能化ナノ粒子アッセイ、量子ドット、蛍光タグおよび電気センサなどの他の迅速なアッセイプラットフォーム、免疫組織化学アッセイ、またはフローサイトメトリーアッセイにおいて使用される、請求項４に記載のアッセイキット。
【請求項６】
ヒトの体外における組織もしくは細胞中またはタンパク質上のＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフの存在の決定または定量の方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体の前記組織、細胞またはタンパク質への結合の程度を決定することを含む方法。
【請求項７】
薬学的に許容される担体または賦形剤と共に請求項１〜３のいずれかに記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項８】
Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフの相互作用を介して起こる感染症および病状の治療に使用するための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項９】
疾患検出のためのおよびアナフィラキシーのモニタリングアッセイとしての、ヒト血清中を循環しているＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ特異的抗体の競合形式での決定における、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体の使用であって、但しヒトの体内における使用は除外される、使用。
【請求項１０】
免疫染色および可視化のためのＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフ染色および検出剤としての、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体の使用であって、但しヒトの体内における使用は除外される、使用。
【請求項１１】
天然および組換え生物調製物の両方からＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフ含有分子を精製および単離するための親和性試薬としての、病害防除のためにＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフ含有生物を精製および単離するための親和性試薬としての、または哺乳類細胞系からの治療用糖タンパク質生産物の生産中にＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフの評価および監視のための場所で試験するための親和性試薬としての、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体の使用であって、但しヒトの体内における使用は除外される、使用。
【請求項１２】
タンパク質に結合している、または天然に放出されたもしくは酵素処理によって糖タンパク質から特異的に放出された遊離形態にある、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフ含有グリカンの検出のためのアッセイにおける、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体の使用であって、但しヒトの体内における使用は除外される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌエピトープに選択的に結合可能な抗体断片を提供することに関する。このエピトープは、ヒトへの移植用のブタ組織上でしばしば見出される。本発明はさらに、起こり得る拒絶合併症について移植組織を試験するのに用いるためのこれらの抗体断片を含むアッセイシステムに関する。エピトープはまたバイオ医薬品およびいくつかの感染性病原体上でも見出され、したがって、本発明はこれらのアプリケーションのためのアッセイ系も提供する。
【背景技術】
【０００２】
非ヒトＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌエピトープの免疫学的重要性は、最初はブタの臓器異種移植片の超急性拒絶（ＨＡＲ）におけるその直接的な関与によって強調された。異種移植はヒトのドナー臓器の決定的な不足を克服する直接的手段と広く考えられており、特に、ブタ臓器を用いる方法が最も適しているとみなされている。しかし、ブタ組織は高い割合のＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌエピトープを発現し、ヒトへのブタ異種移植片の移植後に活発な抗Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ抗体反応を誘発する。このエピトープに対する望ましくない免疫反応はまた、細胞組織マトリックスの移植後の準最適な臨床転帰に関与すると考えられている。Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌエピトープに対する天然に存在するヒト抗体はヒトで広く見出されており、ヒト血清中で免疫グロブリン（Ｉｇ）（主にＩｇＧ２サブクラス）の最高３％までを占める。環境刺激、共生細菌および／または寄生虫相互作用によってそれらの抗体が誘導されると考えられており、それらが天然のバリア機能を発揮すると推定される。ＨＡＲへの関与だけでなく、この抗原性グリカン部分の存在は、組換えモノクローナル抗体製剤のエルビタックス（セツキシマブ）を服用している患者で観察されるＩｇＥ媒介性アレルギー／過敏性反応にも関与すると考えられている。アナフィラキシーを誘発するのに必要なＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌエピトープのレベルは決定されておらず、生産物特異的かつ患者依存性であり得る。
【０００３】
近年のバイオシミラー生産プラントの増加によって証明されるように、組換え抗体および関連するバイオ医薬品の生産は、現在、十分に確立されかつ日常的に行われる工業プロセスと見なされている。グリコシル化の制御は、タンパク質機能、アレルギー性および免疫原性の特性、血漿クリアランス率および有効性へのその計り知れない影響のため、組換え治療薬生産中の重要な要因である。現在、特定のグリカン構造がこれらの組換え生産物の安全性に悪影響を与えることが認められている。生産に利用される哺乳類細胞株の、最も一般的なマウス由来の細胞株ＳＰ２／０およびＮＳ０またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）は、「ヒト様」のグリコシル化が起きるのを可能にする。しかし、これらの細胞株のシステムは、Ｇａｌ−α−（１→３）−ＧａｌおよびＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）部分を含む非ヒトグリカン構造を標的タンパク質に組み込む分子機構を有し、ヒトの中でそれらを免疫原性にさせる。Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ部分を有する糖タンパク質を合成する生合成機構の欠如を詳しく述べている以前に受け入れられた報告に反して、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌグリカンを合成するＣＨＯシステムの能力についてごく最近報告された。Ｂｏｓｑｕｅｓらは、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ部分を合成するＣＨＯ細胞の能力およびＣＨＯ作製抗体融合タンパク質である市販の治療用タンパク質アバタセプト（オレンシア）上におけるその部分の存在の両方を立証した。しかし、ＣＨＯシステムで生産されるタンパク質上で検出されるＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌのレベルは、マウス細胞株由来の生産物上で一般的に観察されるものよりも低かった（Ｂｏｓｑｕｅｓら、２０１０）。現在市販されている組換えタンパク質上のＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌの同定と共に、ヒトに使用するための既存のおよび将来の組換え治療薬上のＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌのレベルを監視ならびに定量するための簡便で迅速な分析的アプローチが必要とされている。
【０００４】
さらに、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌエピトープ／天然ヒト抗体システムを利用して自家ワクチンの効力を改善する可能性が最近注目されつつあり、このシステムもまた簡便なアッセイツールを必要とする。
【０００５】
質量分析（ＭＳ）と一体になった高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびエンドグリコシダーゼ消化の組み合わせは、Ｎ−グリカンの同定および測定のための十分な分解能ならびに感度を提供する。さらに、レーザー誘起蛍光検出（ＣＥ−ＬＩＦ）を有するキャピラリー電気泳動も、そのスループットおよび高分解能の分離能力のために、蛍光標識されたＮ−グリカンのプロファイリングに使用されてきた。８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホネート（ＡＰＴＳ）での蛍光標識後のＣＥ−ＬＩＦによる多数の糖タンパク質および組換えｍＡｂのＮ−グリカンの構造解析も報告されている。これらの方法の問題点は、それらが厄介で、実行するのに時間がかかり、かつ専門設備および機器の専門知識を必要とすることである。
【０００６】
トリパノソーマ・クルージ、シャーガス病の病原体、アメリカのリーシュマニア属、真菌植物病原体であるコレトトリカム属およびナイセリア髄膜炎菌などのいくつかの病原性生物も、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌエピトープを発現する。したがって、抗Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ抗体またはその断片は、これらの疾患の診断またはそれらの治療のいずれかで使用できる。このエピトープは、赤肉に見られるオリゴ糖に対するアナフィラキシー反応にも関与しており、したがって、本発明の抗体は、そのような反応の予防または予測に使用できる。
【０００７】
高親和性および特異的な結合剤が検体に対して利用可能になると、特異的結合アッセイは、堅牢な分析プラットフォームを提供する。高品質の抗体の利用可能性が限られていることから、抗体にあまり依存せず、レクチンは炭水化物に最も広く使用される親和性試薬である。２種類のレクチンが、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフの検出のために一般的に使用される。Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  ＩイソレクチンＢ４（ＧＳ−Ｉ−Ｂ４）は、末端のＧａｌ−α−１−Ｒ（アルファ−ＧａｌまたはαＧａｌと呼ばれるアルファ−ガラクトシル残基）エピトープを検出するが、末端ガラクトースが炭水化物鎖の最後から２番目のガラクトースの異なる炭素原子に結合している構造体（例えば、Ｇａｌ−α−１→２、Ｇａｌ−α−１→３またはＧａｌ−α−１→４）を区別できない。ＧＳ１−Ｂ４の結合は、多数のグリカン認識分子について報告されているように、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌが細胞表面上または単離された糖タンパク質上にあるかどうかにも依存し得る。Ｍａｒａｓｍｉｕｓ  ｏｒｅａｄｅｓ凝集素（Ｍａｒａｓｍｉｕｓ  ｏｒｅａｄｅｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＭＯＡ）も、Ｇａｌ−α−１−Ｒで終わる構造体と結合することが知られている。多数の抗Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ抗体について説明されているが、ヒヒで作製されたポリクローナル抗体およびＭ８６マウスＩｇＭモノクローナル抗体を含むほんの少数しか市販されておらず、それらの適用はこれまでのところ限られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
炭水化物モチーフを標的にする高品質な抗体は、それらの免疫原性が低いため、それらの作製において重要な課題が残っている。しかし、ヒト血清および多くの動物の血清は、広範な天然の抗炭水化物抗体を含んでいる。未処理であろうと免疫負荷された宿主システムであろうと、免疫グロブリンｃＤＮＡから作製された改変一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）ライブラリーは、これらの抗体へのアクセスを提供することができる。ニワトリは、ヒトと同じく、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌエピトープを生産しないので、このモチーフへの暴露に対する強い免疫反応を発症しない。ニワトリ抗体ライブラリーの作製は、鳥類における免疫グロブリン遺伝子多様化の特有のメカニズムにより、哺乳類種由来のライブラリーよりも単純であることが示されている。ニワトリは単一の機能的な免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子を有しており、嚢におけるＢ細胞増殖の間に連続的に動作する高頻度遺伝子変換機構によって遺伝子に多様性が生じる。本明細書では、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ標的化ファージディスプレイ−ｓｃＦｖライブラリーの作製およびこのエピトープに対するニワトリｓｃＦｖ抗体断片の単離について説明する。これらのｓｃＦｖは、関連するネオ複合糖質（ＮＧＣ）群に対し直接ＥＬＩＳＡ形式で試験した場合に、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフの検出に非常に特異的であることが示された。本発明の抗体断片は、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフに対して高親和性および特異性を有することが実証され、このように公知の抗Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ抗体よりも効果的で、したがって、はるかに商業的に有用であることが証明された。本発明のｓｃＦｖは競合ＥＬＩＳＡ形式でも使用され、それらが糖タンパク質の表面上に存在する場合に、自由溶液中でのＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌの濃度決定が可能になった。発明者の知る限り、これは、非ヒト炭水化物Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフに対する改変ｓｃＦｖ群の最初の報告であり、最も重要なことには糖タンパク質上のこのモチーフの検出に便利な競合ＥＬＩＳＡの最初の報告である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
非ヒトＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ炭水化物エピトープは、多数の組換え治療用タンパク質上に存在することが近年報告されている。この抗原性炭水化物エピトープは、ヒトにおけるこのエピトープに対する自然抗体の存在により、ブタの臓器異種移植片の超急性拒絶反応の主な要因であることが知られている。組換え糖タンパク質上のエピトープの数は組織全体と直接比較すると少ないかもしれないが、循環している抗Ｇａｌ−α−Ｒ免疫グロブリンの免疫反応は、依然としてアナフィラキシーを誘発できる。したがって、バイオ医薬品中の、および組換え哺乳類システムで生産される組換え治療薬中のこのエピトープのレベルの検出、監視ならびに定量のための抗体断片を提供することが本発明の目的である。特定の目的は、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌエピトープに対して高い親和性を有する抗体断片を提供することである。さらなる目的は、組換えタンパク質上または移植予定の組織中のＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌエピトープの検出および測定のためのアッセイシステムを提供することである。このようなアッセイシステムは、迅速で、かつ実行するのに好都合であるべきである。さらなる目的は、ポイントオブケアアッセイシステムを提供することである。さらなる目的は、自家ワクチンの有効性の改善を可能にするためのアッセイツールを提供することである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、可変軽鎖配列および可変重鎖配列を有する抗体が提供され、可変軽鎖配列は配列：
（１）ＳＧＧ−ｘ１−ｘ２−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−ｘ７−Ｙ
（式中、ｘ１はＮもしくはＧであるかまたは存在せず；ｘ２はＳであるかまたは存在せず；ｘ３はＹであるかまたは存在せず；ｘ４はＧＧであるかまたは存在せず；ｘ５はＳであるかまたは存在せず；ｘ６はＹもしくはＧであるかまたは存在せず、かつｘ７はＮまたはＹである）
（２）ＳＮ−ｘ８−ｘ９−ＲＰＳ
（式中、ｘ８はＮまたはＤであり、かつｘ９はＫｍＮまたはＱである）、または
（３）Ｇ−ｘ１０−ＹＤ−ｘ１１−ｘ１２−ｘ１３−ｘ１４−Ｙ−ｘ１５−ＧＶ
（式中、ｘ１０はＡ、ＴまたはＳであり；ｘ１１はＳまたはＮであり；ｘ１２はＳであるかまたは存在せず、ｘ１３はＮであるかまたは存在せず、ｘ１４はＴまたはＳであり、かつｘ１５はＶまたはＡである）、または
（４）配列（１）〜（３）のうちのいずれかと少なくとも８０％の相同性を有する配列
のうちの少なくとも２つを含み、
可変重鎖配列は配列：
（５）ＧＦＴＦＳＳＹＳＭＱ
（６）ｘ１６−ＳＤ−ｘ１７−ＹＴＹＦＧＰＡＶＫＧ
（式中、ｘ１６はＹまたはＮであり、かつｘ１７はＳまたはＲである）
（７）Ｓ−ｘ１８−Ｄ−ｘ１９−ＧＣＴＨＰＷＣＳＡＤＮＩ−ｘ２０−Ａ
（式中、ｘ１８はＡまたはＧであり、ｘ１９ＴＩＹまたはＳＧＮであり、ｘ２０はＤまたはＮである）、または
（８）配列（５）〜（７）のうちのいずれかと少なくとも８０％の相同性を有する配列
のうちの少なくとも２つを含む。
【００１１】
本抗体は、配列（１）〜（３）もしくは（５）〜（７）またはこれらの配列のいずれかと少なくとも８０％の相同性を有する配列の全てを含んでもよい。
【００１２】
本抗体は、以下の式のリンカー配列：
（９）ＧＯＳＳＲＳＳ−ｘ２１−ＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳ
（式中、ｘ２１はＳであるかまたは存在しない）、
または配列（７）と少なくとも８０％の相同性を有する配列
をさらに含んでもよい。
【００１３】
ｓｃＦＶ抗体断片は、以下の一般配列を有してもよい：
ＱＡＡＬＴＱＰＳＳＶＳＴＮＰＧＧＴＶＫＩＴＣＳＧ［Ｓ／−］［Ｙ／−］［Ｇ／−］［Ｇ／−］［Ｓ／−］［Ｇ／Ｙ］［Ｎ／Ｈ／Ｙ］ＹＧＷＹＱＱＫＳＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹＳＮ［Ｎ／Ｄ］［Ｋ／Ｑ／Ｎ］ＲＰＳ［Ｄ／Ｇ］ＩＰＳＲＦＳＧＳ［Ｔ／Ｋ］Ｓ［Ｇ／Ｄ］ＳＴ［Ａ／Ｇ／Ｓ］ＴＬＴＩＴＧＶＱＶＤＤＥＡＶＹ［Ｆ／Ｙ］ＣＧ［Ａ／Ｓ／Ｔ］ＹＤ［Ｎ／Ｓ］［Ｓ／−］［Ｎ／−］［Ｔ／Ｓ］Ｙ［Ｖ／Ａ］Ｇ［Ｖ／Ｉ］ＦＧＡＧＴ［Ｔ／Ａ］ＬＴＶＬＧＱＳＳＲＳＳ［Ｓ／−］ＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳＡＶＴＬＤＥＳＧＧＬＱＴＰＧＧ［Ｇ／Ａ］ＬＳＬＶＣＫＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＱＷＶＲＱ［Ｔ／Ａ］ＰＧＫＧＬＥＦＶＡＧＩＧ［Ｙ／Ｎ］ＳＤ［Ｓ／Ｒ］ＹＴＹＦＧＰＡＶＫＧＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱ［Ｎ／Ｓ］ＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＡＴＹ［Ｙ／Ｆ］ＣＡＲＳ［Ａ／Ｇ］Ｄ［Ｔ／Ｓ］［Ｉ／Ｇ］［Ｙ／Ｎ］ＧＣＴＨＰＷＣＳＡＤＮＩ［Ｄ／Ｎ］ＡＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳＴＳＧＱＡＧＱ
式中、［］は可変アミノ酸を示し、−はアミノ酸の欠失を示す。したがって、［］が示される場合には、アミノ酸は括弧内に記載されたもののいずれかであってよく、ダッシュが示される場合には、アミノ酸が欠失していてもよい。
【００１４】
アミノ酸は以下のように省略される：
略語                １文字略語                アミノ酸名
Ａｌａ                  Ａ                    アラニン
Ａｒｇ                  Ｒ                    アルギニン
Ａｓｎ                  Ｎ                    アスパラギン
Ａｓｐ                  Ｄ                    アスパラギン酸（アスパラギン酸塩）
Ｃｙｓ                  Ｃ                    システイン
Ｇｌｎ                  Ｑ                    グルタミン
Ｇｌｕ                  Ｅ                    グルタミン酸（グルタミン酸塩）
Ｇｌｙ                  Ｇ                    グリシン
Ｈｉｓ                  Ｈ                    ヒスチジン
Ｉｌｅ                  Ｉ                    イソロイシン
Ｌｅｕ                  Ｌ                    ロイシン
Ｌｙｓ                  Ｋ                    リジン
Ｍｅｔ                  Ｍ                    メチオニン
Ｐｈｅ                  Ｆ                    フェニルアラニン
Ｐｒｏ                  Ｐ                    プロリン
Ｓｅｒ                  Ｓ                    セリン
Ｔｈｒ                  Ｔ                    スレオニン
Ｔｒｐ                  Ｗ                    トリプトファン
Ｔｙｒ                  Ｙ                    チロシン
Ｖａｌ                  Ｖ                    バリン
Ａｓｘ                  Ｂ                    アスパラギン酸またはアスパラギン
Ｇｌｘ                  Ｚ                    グルタミンまたはグルタミン酸
【００１５】
本抗体は、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ断片またはＦａｂ断片であり得る。ｓｃＦｖ抗体断片は、本明細書で定義される配列番号２、３または４のいずれか１つの配列を有していてもよい。特に好ましいのは配列番号２である。
【００１６】
２以上のポリペプチド配列の文脈において、「相同性」またはパーセント「同一性」という用語は、コンピュータプログラムもしくは手動アラインメントおよび目視検査によって測定されるように、比較ウインドウまたは特定領域にわたって最大一致のために比較ならびに整列させた場合に、同じであるかまたは指定領域にわたって同じである特定の割合のアミノ酸残基（すなわち、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれより高い同一性）を有する２以上の配列または部分配列を指す。このような配列は、その後、「実質的に同一」または「実質的に相同」であると言われる。定義には、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有するものも含まれる。好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを明らかにできる。好ましくは、同一性は長さが少なくとも約５個のアミノ酸である領域にわたって、またはより好ましくは長さが１０〜１５個のアミノ酸である領域にわたって存在する。
【００１７】
配列比較では、典型的には１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いる場合には、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。好ましくは、デフォルトプログラムパラメータを使用できるか、または別のパラメータを指定できる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列相同性を算出する。本発明は、上記で定義した少なくとも１つの抗体を含む、組織もしくは細胞中またはタンパク質上のＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフの存在の決定または定量のためのアッセイキットも提供する。アッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイ、競合もしくは阻害ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、マイクロアレイに基づくアッセイ、官能化ナノ粒子アッセイ（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅＤＮＡｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｓｓａｙ）、Ｑドット（ＱＤｏｔ）、Ｆｌタグおよび電気センサなどの他の迅速なアッセイプラットフォーム、免疫組織化学アッセイ、またはフローサイトメトリー分析を含むがこれらに限定されない免疫アッセイの任意の形態であってよい。本発明の抗体は、表面がアレイ、ナノ粒子もしくは膜上に提示されるアッセイフォーマット、および／または懸濁液の形態で提示されるアッセイフォーマットで用いることができる。本発明の抗体は、特定の糖タンパク質の検出のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ法において他の抗体と組み合わせて使用することもできる。本抗体は、マイクロアレイ上の印刷成分として機能できる。
【００１８】
別の態様において、本発明は、上記で定義したような組織、細胞またはタンパク質に対する抗体または抗体断片の結合の程度を決定することを含む、組織もしくは細胞中またはタンパク質上のＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフの存在を決定する方法またはその量を定量化する方法を提供する。
【００１９】
本発明の抗体はＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフの相互作用を介して生じる感染症および病状に対する治療薬としても使用でき、ヒト血清中を循環しているＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ特異的抗体の競合形式での決定において、疾患検出のためおよびアナフィラキシーのモニタリングアッセイとして、免疫染色（ＩＨＣ、ＩＦＣ、ＦＡＣＳなど）および可視化のためのＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフ染色および検出剤として、天然および組換え生物調製物の両方からＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフ含有分子を精製および単離するための親和性試薬として、病害防除のためのＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフ含有生物を精製および単離するための親和性試薬として、哺乳類細胞系からの治療用糖タンパク質生産物の生産中にＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフの評価および監視のための場所で試験するための親和性試薬としても使用できる。
【００２０】
さらに別の態様において、本発明は、薬学的に許容される担体または賦形剤と共に、本明細書に定義される抗体断片を含む医薬組成物を提供する。
【００２１】
本抗体は、タンパク質に結合している標的グリカンの検出、およびまた自然に放出されるかまたは酵素処理によって糖タンパク質から特異的に放出された遊離形態の標的グリカンの検出のためのアッセイにも適する。
【００２２】
本抗体は、例えば、少量の分子のみが標的モチーフを保有すると予想される生物医薬品生成において、グリコフォームの混合物から標的モチーフを保有する糖タンパク質を除去することにも使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】（Ａ）直接ＥＬＩＳＡ（血清希釈１：２０，０００）によって決定した時の、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−ＢＳＡによる免疫化に対するニワトリ血清反応。（Ｂ）（ｉ）ｓｃＦｖコード断片の挿入および（ｉｉ）制限消化によって調べた無作為選択クローン間でのこのｓｃＦｖ断片内の多様性を示す写真である。（Ｃ）バイオパニングラウンド２で産出されたファージ粒子のＧａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌ−ＢＳＡへの結合を示すグラフである。
【図２】Ｇａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌ−ＢＳＡに対する直接ＥＬＩＳＡにおける９６個の個々のｓｃＦｖファージ粒子の評価。この集団からさらなる分析のために選択された６つのｓｃＦｖを青で示す。
【図３】アミノ酸変異を示す、３種類の配列決定ｓｃＦｖクローンからのＶＬおよびＶＨ領域のＣＤＲアラインメントの概略図。（Ａ）融合ｓｃＦｖの一般的概略図および（Ｂ）ｓｃＦｖ  ＣＤＲのアラインメント。
【図４】（Ａ）細菌培地からの可溶性ｓｃＦｖのＩＭＡＣ精製。２８０ｎｍでの吸光度ｍＡＵ（青）、流速（ｍＬ／分、黒）、および勾配の傾き（緑）を示す、勾配溶出を用いたＦＰＬＣ出力画像である。（Ｂ）アフィニティー精製ｓｃＦｖ画分の４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰａｇｅゲルでのクマシー染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図５】直接ＥＬＩＳＡでの３種類の抗Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ  ｓｃＦｖの特異性プロファイル。以下のようにウェルをコーティングした：１．Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−ＢＳＡ；２．Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−β−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＨＳＡ；３．Ｇａｌ−α−１−Ｏ−スペーサー−ＩＴＣ−ＢＳＡ；４．Ｇａｌ−β−１−Ｏ−スペーサー−ＩＴＣ−ＢＳＡ；５．Ｇａｌ−α−（１→２）−Ｇａｌ−ＢＳＡ；６．Ｇａｌ−β−（１→４）−Ｇａｌ−ＢＳＡ；７．β−ｘｙｌ−４ＡＰ−ＢＳＡ；８．Ｆｕｃ−α−４ＡＰ−ＢＳＡ；９．Ｆｕｃ−β−４ＡＰ−ＢＳＡ；１０．Ｎｅｕ５Ａｃ−４ＡＰ−ＢＳＡ；１１．ＧｌｃＮＡｃ−ＢＳＡ；１２．ＬＡＣ−β−４ＡＰ−ＢＳＡ；１３．ＬａｃＮＡｃ−ＢＳＡ；１４．ＨＳＡ；１５．ＢＳＡおよび１６．ＢＳＡ−４ＡＰ。エラーバーは、３回の測定の平均値の標準誤差を示す。
【図６】ｓｃＦｖクローンＧ１２、Ａ４、およびＡ１１によって与えられる競合ＥＬＩＳＡの標準曲線。プレートを固定化Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−ＢＳＡ［１０μｇ／ｍｌ］でコーティングし、濃度を増加させた遊離Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌの存在下で２．５μｇ／ｍｌのｓｃＦｖとインキュベートした。エラーバーは、３回の測定の平均値の標準誤差を示す。
【図７】９回の独立した実行からのｓｃＦｖ−Ａ４によって与えられる複合標準曲線。
【図８】α−Ｇａｌ残基に対し高度に特異的であると考えられるレクチンＧＳ−１−Ｂ４の特異的結合パターンと直接比較した、選択されたｓｃＦｖ断片Ａ４、Ａ１１およびＧ１２の関連ＮＧＣ群に対する特異性の比較。
【図９】可溶性タンパク質として発現されエピトープの認識のために提示される、選択されたｓｃＦｖ断片Ａ４、Ａ１１およびＧ１２の融合軽鎖および重鎖アミノ酸配列のアラインメント。
【図１０】相補性決定領域を示す一般的な抗体配列。
【図１１】２０℃、ｐＨ７．２のＮａＰｉ（１０ｍＭ）−ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）中での、４ｍＭのメリビオース（赤）およびＧａｌα（１，３）Ｇａｌβ１−Ｏｍｅ（緑）の存在下ならびに非存在下（黒）で、ｓｃＦｖ  Ｇ１２（Ａ）、Ａ４（Ｂ）およびＡ１１（Ｃ）について記録された残基あたりのモル楕円率として表される近紫外ＣＤスペクトル。試料は限外濾過によって調製した。
【図１２】２０℃、ｐＨ７．２のＮａＰｉ（１０ｍＭ）−ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）中でのｓｃＦｖの、残基あたりのモル楕円率として表される遠紫外ＣＤスペクトル。
【図１３】ｐＨ７．２のＮａＰｉ（１０ｍＭ）−ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）中での、４ｍＭのＧａｌα（１，３）Ｇａｌβ１−Ｏｍｅの存在下および非存在下におけるｓｃＦｖ  Ｇ１２（Ａ）、Ａ４（Ｂ）およびＡ１１（Ｃ）の、残基あたりのモル楕円率として表される遠紫外ＣＤスペクトル。２０℃での純粋なｓｃＦｖ（黒）、９０℃での純粋なｓｃＦｖ（赤）、２０℃での糖を有するｓｃＦｖ（緑）、９０℃での糖を有するｓｃＦｖ（青）。Ｇ１２およびＡ１１の試料は限外濾過によって、およびＡ４の試料は透析によって調製した。
【図１４】ｓｃＦｖ  Ｇ１２（Ａ）、Ａ４（Ｂ）およびＡ１１（Ｃ）の変性プロファイル。連続線は、テキストに記載されている式を用いる、実験データへのシグモイド関数のフィッティングに対応している。純粋なｓｃＦｖ（黒）、ｓｃＦｖ＋Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβｌ−ＯＭｅ（赤）およびｓｃＦｖ＋メリビオース（緑）。
【図１５】相対発光を示すｓｃＦｖおよびネオ糖タンパク質のＣＬ−ＥＬＩＳＡデータ。
【図１６】図１５の生データ。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
材料および方法
ニワトリの免疫化
ヒトα−酸性糖タンパク質、ブタのラクトフェリン、ミツバチのホスホリパーゼＡ２、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−ＢＳＡおよびＣＨＯ細胞培地から採取された可溶性糖タンパク質画分で構成されるプールされた複合糖質調製物を等しい割合で混合した。成体雄レグホンニワトリに、２１日間隔で、総体積４００μｌの複合糖質調製物５０μｇを皮下免疫した。最初の用量はフロイント完全アジュバントを用いて調製し、その後の３回の用量は、不完全フロイントアジュバントを用いて投与した。血清抗Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ反応を、直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）分析により第３の接種後７日目に評価した（図１ａ）。簡単に述べると、９６ウェルイムノアッセイプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ社；Ｎｕｎｃ社）を、１０μｇ／ｍｌのＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−ＨＳＡを１００μｌ／ウェルで、４℃で一晩コーティングした。次いで、ウェルを０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｂ）を用いて３７℃で１時間ブロッキングした。血清試料を、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳ−ＢＴ）を含有するＰＢＳ−Ｂで連続希釈し、１００μｌ／ウェルでプレートに添加した。次いで、プレートを３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で１０回洗浄し、ＰＢＳ−ＢＴ中の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−結合抗ニワトリＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて３７℃で１時間プローブした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ウェルを、１００μｌ／ウェルのＨＲＰ基質テトラメチルベンジジン（ＤＡＫＯ社）を用いて発色させ、反応を１００μｌ／ウェルの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。全ての分析を３つ組で行った。
【００２５】
ニワトリのｓｃＦｖライブラリー作製
ライブラリー作製およびファージディスプレイは、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆらによって記載されているプロトコル（Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆら、２０００）を用いて行った。簡単に説明すると、いずれも製造業者のプロトコルに従って、全ＲＮＡを各ニワトリの脾臓および１つの大腿骨の骨髄から単離し（トリゾール試薬、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、一本鎖ｃＤＮＡを合成した（スーパースクリプトＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）。ｓｃＦｖライブラリーは２ステップアプローチを用いて作製し、重鎖および軽鎖を最初に増幅し、その後オーバーラップ伸長ＰＣＲを行い、ライゲーションによりｓｃＦｖ  ｃＤＮＡ産物をｐＣｏｍｂ３ファージミド系に導入し（Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆら、２０００）、続いてエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞［Ｆ’ｐｒｏＡＢ  ｌａｃＩｑＺΔＭ１５  Ｔｎ１０（Ｔｅｔｒ）］（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に導入した。全ての増幅オリゴヌクレオチドは、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆらによって記載されたとおりであった。全ライブラリーサイズは、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン（Ｓｉｇｍａ社）を含むルリア−ベルターニ（ＬＢ）寒天上での抗生物質耐性プレート計数により推定した。ｓｃＦｖ挿入をコロニーＰＣＲによって検証し、ライブラリー配列の多様性をＰＣＲ産物（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のエンドヌクレアーゼＢｓｔＮＩ消化を用いて評価してアガロースゲル電気泳動により可視化した（図１ｂ）。完成したライブラリー調製物をＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞中で増殖させ、グリセロールストックとして保存した。
【００２６】
ｓｃＦｖ提示ファージのレスキュー
ｓｃＦｖ提示ファージをレスキューするために、２％グルコース、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補足した５０ｍｌのスーパーブロス（ＳＢ）に、グリセロールストックライブラリーから約２×１０９細胞を接種した。次いで、培養物をＯＤ６００が０．５に達するまで、回転させながら３７℃でインキュベートした。この時点で、培養物にＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を１０１２コロニー形成単位で同時感染させ、ＳＢで容量を２００ｍｌまで増加した。９０分間のインキュベーション後、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加し、３０℃で一晩のインキュベーションを行った。ファージ粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿により培養液から精製および濃縮して（Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆら、２０００）、１％  ＯＶＡ  ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｏ）に再懸濁した。
【００２７】
Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−ＢＳＡに対するｓｃＦｖファージライブラリーのバイオパニングによる選択
マキシソープイムノチューブ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ）（Ｎｕｎｃ社）を用いて、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−ＢＳＡに対してバイオパニングを行った。簡単に説明すると、チューブを４℃で一晩、１０μｇ／ｍｌのＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−ＢＳＡ（Ｄｅｘｔｒａ社、英国）１ｍｌでコーティングし、次いでＰＢＳ−Ｂでブロッキングした。次いでＰＢＳ−Ｏに懸濁した１×ｌ０１１〜１０１２個のｓｃＦｖ提示ファージを添加して回転により室温で１時間混合した。ＰＢＳ−Ｔで繰り返し洗浄した後、ＰＢＳのみで洗浄した。結合したファージを、ｐＨ２．２の１００ｍＭグリシン−ＨＣｌ  １ｍｌの１０分間の添加により溶出した。溶出ファージを、ｐＨ８．８の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５００μ１を用いて中和した。次いで溶出ファージの増殖およびさらなる操作を、以前に記載された（Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆら、２０００）ように行った。洗浄ステップをパニング１での１０回からパニング２および３での１５回へと漸進的に増加させることにより選択ストリンジェンシーを増強させながら、３ラウンドのパニングを行った。
【００２８】
バイオパニングの各ラウンド後のｓｃＦｖ−ファージ集団プールのＥＬＩＳＡ分析
各ラウンドのパニングから溶出されたｓｃＦｖディスプレイファージ懸濁液を、直接ＥＬＩＳＡ分析によってＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ結合について評価した。イムノアッセイプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ社、Ｎｕｎｃ社）を上記のようにコーティングおよびブロッキングし、（ＰＢＳ−ＢＴ中の）ファージｓｃＦｖ調製物の３倍希釈液をウェルに添加した。ＢＳＡおよびＨＳＡを陰性参照として含めた。３７℃で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、３７℃で１時間、ＰＢＳ−ＢＴ中のＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）でプローブした。蒸留水で十分に洗浄した後、上記のようにウェルを発色させた。
【００２９】
単一ｓｃＦｖファージクローンおよび直接ＥＬＩＳＡ分析
ラウンド２および３からの産出プレートから９６個のランダムクローンを採取し、ディープウェルプレート中で、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン存在下のスーパーブロス（ＳＢ）中、３７℃、３００ｒｐｍで６時間培養した。次いで培養物を２ｍＭのＩＰＴＧで誘導して一晩増殖させた。細胞を４℃で１５分間、２５００ｇで遠心分離によりペレット化し、上清を除去して４℃で保存した。ＰＢＳ１００μｌに細胞ペレットを再懸濁して−８０℃および３７℃で凍結融解を２ラウンド行うことにより、ペリプラズムｓｃＦｖを遊離させた。次いでプレートを上記のように再び遠心分離し、上清を除去してそれぞれの培養上清に添加した。次いで前述のように、ＰＢＳ−ＢＴ中でＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を３７℃で１時間用いて、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−ＢＳＡへの単一ｓｃＦｖファージの結合について直接ＥＬＩＳＡ分析を行った。蒸留水で十分に洗浄した後、先に詳述したように、これらのウェルを１００μｌ／ウェルでＨＲＰ基質（ＤＡＫＯ社）とインキュベートし、反応を１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。
【００３０】
安定な発現のための個々のｓｃＦｖクローンの確立
観察されたＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−ＢＳＡへの結合に基づいて選択したコロニーを用いて、ファージミド精製を行った（ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社）。得られたプラスミド調製物で、大腸菌株ＴＯＰ  １０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をエレクトロポレーションにより形質転換した。各形質転換アリコートをＬＢカルベニシリン寒天上にプレーティングし、単一コロニーを得ることで、単一クローンのｓｃＦｖ特性の試験が可能になった。
【００３１】
可溶性ｓｃＦｖの発現および精製
コロニーを、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＳＢ５ｍｌ中で一晩培養した（３７℃、２５０ｒｐｍで振盪）。その後、各クローン培養物５０μｌをＳＢ  ５０ｍｌ（５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび２０ｍＭのＭｇＣｌ２）に添加し、２ｍＭのＩＰＴＧの添加によりｓｃＦｖ生産を誘導して一晩培養した。可溶性抗体を単離するために、細菌細胞を遠心分離によりペレット化し、２０ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリドを含有する平衡緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣ３Ｈ４Ｎ２、ｐＨ８．０）に再懸濁した。次いでペリプラズムｓｃＦｖを超音波処理によって遊離させて細胞破片を遠心分離によって除去し、上清を０．２２μｍシリンジフィルターを通して濾過した。可溶性ｓｃＦｖ抗体を、ニッケルキレートクロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ、Ｑｉａｇｅｎ社）により精製した。大規模生産では、培養容量をリットル規模に増加させ、ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ  １ｍｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用い、１０カラム容量の洗浄と全ての溶出のために２５０ｍＭのＣ３Ｈ４Ｎ２までの直線勾配を用いるナイーブな条件下で、ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ  ＦＰＬＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて精製を行った。精製試料をＰＢＳに対し透析し、膜濾過（５ｋＤａの濾過カラム；Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ社）で濃縮した。最終生産物のタンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ社）により推定した。精製ｓｃＦｖを１ｍｇ／ｍｌの濃度で４℃にて保存した。
【００３２】
単一ｓｃＦｖクローンのＤＮＡ配列決定
プラスミドＤＮＡを、可溶性ｓｃＦｖの発現および精製のために、上記のように細菌のペレットから単離した。複数の読取り配列決定反応を、完全なｓｃＦｖインサート（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ社）の両方の鎖について行った。ＣＤＲの多重配列アラインメント、翻訳および認識を、ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）、ＥＢＩのＣｌｕｓｔａｌＷ２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ＭＳＡ／）およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓで行われるＣＤＲリポジトリを用いて行った。
【００３３】
ＥＬＩＳＡによる精製ｓｃＦｖの評価
分析前に、準飽和濃度のｓｃＦｖを、１０ｕｇ／ｍｌのＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−ＢＳＡに対するｓｃＦｖの濃度勾配を試験することにより決定した。４μｇ／ｍｌの濃度が最適であると決定され、さらなる試験全体に適用した。精製ｓｃＦｖの特異性の直接ＥＬＩＳＡ分析を、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−ＢＳＡ、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−β−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＨＳＡ、Ｇａｌ−α−１−Ｏ−スペーサー−ＩＴＣ、Ｇａｌ−β−１−Ｏ−スペーサー−ＩＴＣ、Ｇａｌ−α−（１→２）−Ｇａｌ−ＢＳＡ、Ｇａｌ−β−（１→４）−Ｇａｌ−ＢＳＡ、β−Ｘｙｌ−ＢＳＡ、Ｆｕｃ−α−４ＡＰ−ＢＳＡ、Ｆｕｃ−β−４ＡＰ−ＢＳＡ、Ｎｅｕ５Ａｃ−４ＡＰ−ＢＳＡ、ＧｌｃＮＡｃ−ＢＳＡ、Ｌａｃ−β−４ＡＰ−ＢＳＡ、ＬａｃＮＡｃ−ＢＳＡを含む１３のＮＧＣ群ならびに２つの陰性対照；ＨＳＡおよびＢＳＡを用いて評価した。二次抗体としてＨＲＰコンジュゲート抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ社）を３７℃で１時間ＰＢＳ−ＢＴ中で用いたことを除き、説明したようにＥＬＩＳＡを行った。蒸留水で十分に洗浄した後、ウェルを１００μｌ／ウェルのＨＲＰ基質（ＤＡＫＯ社）とインキュベートし、反応を１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。ビオチン化ＧＳ−Ｉ−Ｂ４レクチン（Ｅｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カリフォルニア州サンマテオ、米国）およびα−Ｇａｌエピトープ（Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ）、ｍＡｂ（Ｍ８６）（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）をアッセイ評価のための対照参照として使用した。使用した二次抗体は、ストレプトアビジン結合ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびポリクローナルウサギ抗マウスＩｇ  ＨＲＰ（Ｐ０２６０、ＤＡＫＯ社）であった。
【００３４】
Ｇａｌ−α−（１，３）−ＧａｌのためのｓｃＦｖベースの競合ＥＬＩＳＡの開発
各ｓｃＦｖを、遊離Ｇａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌを標準物質として用いて競合ＥＬＩＳＡ形式で評価した。前述のように、マイクロタイタープレートのウェルをコーティングおよびブロッキングした。標準溶液を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２μｇ／ｍｌ（５．８４μΜ）〜２０ｍｇ／ｍｌ（５８．４ｍＭ）の濃度範囲で調製した。アッセイでは、各標準物質および緩衝液ブランク５０μｌを指定したウェルに３つ組で添加し、その後、準飽和濃度の適切なｓｃＦｖ（１μｇ／ｍｌ）５０μｌを添加して、アッセイ中の最終標準濃度を１μｇ／ｍｌ（２．９２μΜ）〜１０ｍｇ／ｍｌ（２９．２ｍＭ）とした。プレートを振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、結合したｓｃＦｖを前述のように検出した。ブランクのＯＤに対する各標準物質のＯＤの比（Ｂ／ＢＯ）を標準濃度に対してプロットし、標準曲線をＳｉｇｍａＰｌｏｔ（ｖ１１、Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いてプロットした。検出限界を、ゼロ標準の平均反応マイナス３回の標準偏差（ＳＤ）に対応する濃度として決定した。
【００３５】
遊離糖の群によるｓｃＦｖの阻害
Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−ＢＳＡへのｓｃＦｖ結合を、以下の２１種類の遊離型糖の群に対して決定した；Ｄ−セロビオース、メリビオース、Ｄ−ラフィノース、ラクチュロース、パラチノース、β−ゲンチオビオース、Ｄ＋トレハロース、Ｄ＋ツラノース、Ｌ−フルクトース、Ｄ＋グルコース、スクロース、ガラクト−Ｎ−ビオース、４β−ガラクトビオース、Ｇａｌ−（１，３）−Ｇａｌ−β−（１，４）−Ｇａｌ、Ｇａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌ−β−（１，４）−ｇｌｃ、Ｇａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌ−β−（１，４）−Ｇａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌ、ラミナリビオース、β１−４−Ｄ−キシロビオース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）、（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社および英国のＤｅｘｔｒａ社から供給される）。阻害は、全体を通して用いるＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−ＢＳＡに対するＥＬＩＳＡに先立ち、遊離糖を連続希釈し準飽和濃度のｓｃＦｖを各希釈物に添加して３７℃で６０分間プレインキュベートすることにより行った。使用した阻害濃度範囲を表１に提供する。ｓｃＦｖの結合の割合を遊離Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−ＢＳＡ濃度に対してプロットし、５０％有効量（ＥＤ５０；ｓｃＦｖの５０％置換を引き起こす遊離糖の用量）を決定した。
【００３６】
結果
免疫反応およびライブラリー構築
Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−ＢＳＡで免疫後の血清抗体反応の分析は、免疫した両方のニワトリでの標的グリカンモチーフに対する強い反応を示した（図１ａ）。線状ファージ上に提示されるｓｃＦｖライブラリーを、各ニワトリの脾臓および骨髄から抽出したＲＮＡを組み合わせて作製した（Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆら、２０００）。コロニーＰＣＲにより、試験した全ての個々のクローンがフルサイズのインサートを有していることが明らかになり、増幅産物のＢｓｔＮ１制限マッピングによって配列多様性が確認された（図１ｂ）。各ライブラリーの初期サイズは、約５×１０７形質転換体と推定された。ライブラリーを組み合わせて、単一ｓｃＦｖファージライブラリーとしてパニングした。
【００３７】
抗Ｇａｌ−α−（１→３）−ＧａｌｓｃＦｖファージ粒子の単離
３ラウンドのバイオパニングを、同一条件下でＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−ＢＳＡに対して室温で行い、結合したファージを低ｐＨで溶出した。第２ラウンドのパニング後に、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−ＢＳＡへの結合を示すファージディスプレイｓｃＦｖの濃縮集団の存在を、直接ＥＬＩＳＡにより確認した（図１ｃ）。さらなる濃縮は、第３ラウンド後には観察されなかった。最小の交差反応性が、キャリアタンパク質のＢＳＡまたはＨＳＡに対して観察された。第２および第３のパニングラウンドの産出ファージから、９６個の個々のファージクローンをランダムに選択し、個別に培養して特異的結合活性について分析した。試験した９６個のクローンのうちの７４個は、バックグラウンドの３倍を超える固定化ＮＧＣへの結合を示した（図２）。より高い結合クローン（Ａ４、Ａ１１、Ｄ９、Ｆ１、Ｇ１２およびＨ３）の６個を配列決定のために選択し、その後のアフィニティー精製のための可溶性ｓｃＦｖの誘導発現および作製のために、それらをコードするファージミドでＴＯＰ１０細胞を形質転換した。
【００３８】
単離クローンの配列分析
６個のｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ領域のヌクレオチド配列解析は、生殖細胞系のニワトリＶＨおよびＶＬ領域との高度なコンセンサスを示した。全てのクローンは、ＶＬ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域においてかなりの相違を示したが、ＶＨ領域での相違は少なかった。実際、ＶＨ  ＣＤＲ１は、全てのクローンにわたって保存されていた（図３）。配列データは、単離ｓｃＦｖが未処理の抗体配列であるよりもむしろ、特にＶＬ領域に関して抗原駆動型反応で作製されたことを示唆している。クローンＡ１１／Ｄ９、Ｆ１／Ｇ１２、Ｈ３およびＡ４を示す４つの固有の配列を同定した（図３）。ＶＬ  ＣＤＲ内において、以下のいくつかの位置で単一転移が生じた；（ｉ）チロシン（Ｙ）からヒスチジン（Ｈ）、チロシン（Ｙ）からアスパラギン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）からリジン（Ｋ）に変化する４つのコドンが同定されたＶＬ  ＣＤＲ１；（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）からグルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）からリジン（Ｋ）への変換が生じているＶＬ  ＣＤＲ２および（ｉｉｉ）スレオニン（Ｔ）からセリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）からグリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）からアラニン（Ａ）への変換が観察されたＶＬ  ＣＤＲ３。対照的に、ＶＨ領域にわたって多型部位はそれほど観察されず、Ａ１１／Ｄ９、Ｈ３およびＡ４はＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３にわたってコンセンサスを示した。Ｆ１／Ｇ１２は、ＣＤＲ３領域において他のクローンとは異なっていた。リンカー領域にわたって、Ａ１１／Ｄ９のリンカー領域を短縮させる２つのセリン（Ｓ）欠失と共に、生殖細胞系列配列からの２つの置換（セリン（Ｓ）からグルタミン（Ｑ）およびグリシン（Ｇ）からセリン（Ｓ））が観察された。このようなリンカー領域の変化の観察は同様のライブラリー内で以前に報告されており、ライブラリーの効率に影響を与えない（Ｆｉｎｌａｙら、２００６）。
【００３９】
可溶性ｓｃＦｖの発現および精製
Ａ４、Ａ１１、Ｇ１２およびＨ３によって示される４つの固有のｓｃＦｖクローン配列を、可溶性ｓｃＦｖの発現および精製に進めた。３つ（Ａ４、Ａ１１およびＧ１２）が細菌培養物内でうまく発現し、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製され、ゲル電気泳動により純度が確認された（図４）。精製ｓｃＦｖの収量は約６．５ｍｇ／Ｌ細菌培養培地であった。全ての精製ｓｃＦｖは、ＰＢＳ中で最高６ヶ月間、４℃で安定性を示した。クローンの１つであるＨ３は、未処理および変性条件下のいずれでも精製できなかった。
【００４０】
直接ＥＬＩＳＡによるｓｃＦｖ特異性評価
精製したｓｃＦｖクローンＡ４、Ａ１１およびＧ１２の特異性を、様々なＧａｌ−α−Ｒ関連のネオ複合糖質（ＮＧＣ）に対する直接ＥＬＩＳＡ形式で試験した。３種類の全てのｓｃＦｖはＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−ＢＳＡに特異的であり、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−ＢＳＡと比較してＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−β−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＨＳＡにわずかに高い強度で結合した（図５）。この違いは、おそらく部分的には、アルブミン１分子当たりのグリカンモチーフの異なるモル置換比（二糖および三糖のＮＧＣそれぞれについて１６および２３）によるものであり、違いは予想したほどは大きくなかったが、ｓｃＦｖが三糖と比較してＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ二糖に対してわずかにより高い親和性を有することを示唆している。単糖（Ｇａｌ−α−１−Ｏ−スペーサー−ＩＴＣ）またはＧａｌ−α−（１→２）−Ｇａｌ−ＢＳＡおよびＧａｌ−α−（１→４）−Ｇａｌ−ＢＳＡ構造へではなく、二糖および三糖のエピトープへ結合することは、α−（１→３）結合がこの結合のための必要条件であることを示している。Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌエピトープに対する同様の結合特異性は、ＣＤＲ領域における配列多様性に関係なく、試験した全３種類のｓｃＦｖによって示された（図３）。直接ＥＬＩＳＡで試験した他の構造（Ｇａｌ−α−１−Ｏ−スペーサー−ＩＴＣ−ＢＳＡ、Ｇａｌ−β−１−Ｏ−スペーサー−ＩＴＣ−ＢＳＡ、Ｇａｌ−α−（１→２）−Ｇａｌ−ＢＳＡ、Ｇａｌ−α−（１→４）−Ｇａｌ−ＢＳＡ、Ｄ−キシロース−β−ＢＳＡ、Ｆｕｃ−α−４ＡＰ−ＢＳＡ、Ｆｕｃ−β−４ＡＰ−ＢＳＡ、Ｎｅｕ５Ａｃ−４ＡＰ−ＢＳＡ、ＧｌｃＮＡｃ−ＢＳＡ、ＬＡＣ−β−４ＡＰ−ＢＳＡ、ＬａｃＮＡｃ−ＢＳＡ）への結合またはキャリアタンパク質であるＨＳＡ、ＢＳＡおよびＢＳＡ−４ＡＰへの結合は観察されなかった。比較すると、レクチンＧＳ−１−Ｂ４は、以前の報告と一致して、二糖ＮＧＣと比較して三糖ＮＧＣに著しく高い結合を示し、かつ全てのＧａｌ−α−１−Ｒ含有ＮＧＣにも結合した（図５）。したがって、作製したｓｃＦｖは、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌに対し、ＧＳ−１−Ｂ４レクチンよりも高い特異性を示す。レクチンＧＳ−１−Ｂ４およびモノクローナルＭ８６と同様に、全てのｓｃＦｖは、直接ＥＬＩＳＡにおいて天然の糖タンパク質のマウスラミニン上の標的モチーフを検出できた（データ示さず）。マウスラミニンは、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフを提示することが知られている。
【００４１】
ｓｃＦｖの素晴らしい特異性は、５０を超える異なる構造を含むＮＧＣマイクロアレイ分析によっても決定されている。図８に示すように、本発明の抗体断片Ａ４、Ｇ１２およびＡ１１は、先行技術のレクチンＧＳ−１−Ｂ４よりもＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌエピトープに対してはるかに高い特異性を有する。
【００４２】
ＳｃＦｖベースの競合ＥＬＩＳＡ
０．００１〜１００００μｇ／ｍｌ（２．９３ｎＭ〜２９．３ｍＭ）の濃度範囲の遊離Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ二糖を標準物質として用いて、試験した３種類のｓｃＦｖのそれぞれについて競合的ＥＬＩＳＡを確立した。ｓｃＦｖ  Ｇ１２およびＡ４によって与えられる曲線は非常に類似しており、それぞれ１５８μｇ／ｍｌおよび３１１μｇ／ｍｌ（０．４６および０．９１ｍＭ）のＥＤ５０値を有した（図６）。ＳｃＦｖ  Ａ１１については、より感度の低い標準曲線が得られた（ＥＤ５０＝１２２５μｇ／ｍｌ、３．５８ｍＭ；図６）。同じ濃度範囲内ではレクチンＧＳ−１−Ｂ４またはモノクローナルＭ８６のいずれにおいても標準曲線は作成できなかった（データ示さず）。２１種類の関連糖の群を、ｓｃＦｖベースの競合アッセイにおいて試験した（表１）。試験した糖のうち、Ｇａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌエピトープを有するもののみが検出可能なレベルで阻害を示した。全３種類のｓｃＦｖは、三糖のより低い阻害活性によって示されるように、Ｇａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌ含有三糖よりも二糖に対してより高い反応性を示し、直接ＥＬＩＳＡで得られた結果を支持している。また、ｓｃＦｖＡ４およびＡ１１は、三糖（Ｇａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌ−β−（１，４）−ＧａｌまたはＧａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌ−β−（１，４）−Ｇｌｃ）と比較して、遊離の四糖（Ｇａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌ−β−（１，４）−Ｇａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌ）が提示された場合にわずかに高い（３〜１０％）阻害を示した。示される範囲内の単糖の存在下では阻害は観察されず、単糖構造はｓｃＦｖのＧａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌ構造への結合を阻害できないという直接アッセイの結論を支持している（表１）。
【００４３】
ＳｃＦｖ  Ａ４が最も一貫した測定値を与え、さらなる評価のために選択された。図７はＡ４複合標準曲線を示し、ＥＤ５０は３２７μｇ／ｍｌ［０．９５ｍＭ］であり検出限界は３．９ｎｇ／ｍｌ［約１０ｎＭ］である。このアッセイは、タンパク質がＮＧＣの形態でマウス糖タンパク質ラミニン上に結合している場合にＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌモチーフを検出できた。０．２５〜１ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にわたり得られる反応の並行性によって示されるように、二糖ＮＧＣは遊離糖と同様にｓｃＦｖと相互作用した。アッセイの結果は、１ｍｇ／ｍｌのＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ含有ＮＧＣが、４２μｇ／ｍｌの二糖を含んだことを示した。これは、９．４：１の二糖：タンパク質のモル比に相当した。ＭＡＬＤＩトレースによって決定される範囲は１０〜２５残基であり、アルブミンあたり平均１６：１である。同様に、グリカン：タンパク質のモル比の範囲が１５〜３１であり、ＭＡＬＤＩによる平均が２３：１であるＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ−β−（１，４）−Ｇａｌ含有ＮＧＣは、競合ＥＬＩＳＡによって１９．７：１のモル取り込み率を有すると決定された。天然ラミニンは、競合ＥＬＩＳＡで分析するにはあまりにも粘性が高かった。しかし、熱処理が粘性を低下させ、アッセイ結果は、マウスラミニン１モル当たりのＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ残基が３９モルであることを示した。
【００４４】
親和性の値
ｓｃＦｖの解離定数（Ｋｄ）を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ＢＩＡｃｏｒｅ機器およびソフトウェア（ＧＥ）を用いて測定した結合（ｋｏｎ）速度定数および解離（ｋｏｆｆ）速度定数から計算した。ｓｃＦｖについて決定したＫｄは、以下のとおりである：
Ａ４：５．７３×１０−８Ｍ
Ｇ１２：１．８０×１０−８Ｍ
Ａ１１：８．０４×１０−９Ｍ
【００４５】
同じ条件下では、先行技術のレクチンＧＳ−１−Ｂ４または先行技術のモノクローナル抗体Ｍ８６との結合は観察されなかった。一般的に、レクチン−炭水化物相互作用は抗原−抗体相互作用よりも弱いことが認められており、レクチンはグリカンに対してＫｄ＝１０−３〜１０−６Ｍの範囲の低い親和定数を有する。したがって、ｓｃＦｖは、既存の結合剤よりも、それらの標的グリカンに対してより高い親和性を有する。
【００４６】
（ＳＰＲにおいて定常状態の平衡で決定された）Ｋｄ＝１０−５〜１０−８Ｍの範囲の親和定数を有する多数のグリカンエピトープに対する既報の抗糖質抗体と共に、本明細書で特定したｓｃＦｖは、ＳＰＲによって定義されるように、グリカンエピトープに対して報告される最高親和性抗体断片であることが示された。
【００４７】
配列情報
配列番号１：本発明の断片の一般的配列：
ＱＡＡＬＴＱＰＳＳＶＳＴＮＰＧＧＴＶＫＩＴＣＳＧ［Ｓ／−］［Ｙ／−］［Ｇ／−］［Ｇ／−］［Ｓ／−］［Ｇ／Ｙ］［Ｎ／Ｈ／Ｙ］ＹＧＷＹＱＱＫＳＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹＳＮ［Ｎ／Ｄ］［Ｋ／Ｑ／Ｎ］ＲＰＳ［Ｄ／Ｇ］ＩＰＳＲＦＳＧＳ［Ｔ／Ｋ］Ｓ［Ｇ／Ｄ］ＳＴ［Ａ／Ｇ／Ｓ］ＴＬＴＩＴＧＶＱＶＤＤＥＡＶＹ［Ｆ／Ｙ］ＣＧ［Ａ／Ｓ／Ｔ］ＹＤ［Ｎ／Ｓ］［Ｓ／−］［Ｎ／−］［Ｔ／Ｓ］Ｙ［Ｖ／Ａ］Ｇ［Ｖ／Ｉ］ＦＧＡＧＴ［Ｔ／Ａ］ＬＴＶＬＧＱＳＳＲＳＳ［Ｓ／−］ＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳＡＶＴＬＤＥＳＧＧＬＱＴＰＧＧ［Ｇ／Ａ］ＬＳＬＶＣＫＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＱＷＶＲＱ［Ｔ／Ａ］ＰＧＫＧＬＥＦＶＡＧＩＧ［Ｙ／Ｎ］ＳＤ［Ｓ／Ｒ］ＹＴＹＦＧＰＡＶＫＧＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱ［Ｎ／Ｓ］ＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＡＴＹ［Ｙ／Ｆ］ＣＡＲＳ［Ａ／Ｇ］Ｄ［Ｔ／Ｓ］［Ｉ／Ｇ］［Ｙ／Ｎ］ＧＣＴＨＰＷＣＳＡＤＮＩ［Ｄ／Ｎ］ＡＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳＴＳＧＱＡＧＱ
［］は転移を示す；−は欠失を示す。
【００４８】
各クローンについての固有の個々の配列
配列番号２：ｓｃＦｖ−Ａ４
ＱＡＡＬＴＱＰＳＳＶＳＴＮＰＧＧＴＶＫＩＴＣＳＧＧＮＧＮＹＧＷＹＱＱＫＳＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹＳＮＮＫＲＰＳＤＩＰＳＲＦＳＧＳＫＳＧＳＴＡＴＬＴＩＴＧＶＱＶＤＤＥＡＶＹＦＣＧＡＹＤＮＴＹＶＧＶＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬＧＱＳＳＲＳＳＳＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＧＧＬＳＬＶＣＫＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＱＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＥＦＶＡＧＩＧＹＳＤＳＹＴＹＦＧＰＡＶＫＧＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＮＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＳＡＤＴＩＹＧＣＴＨＰＷＣＳＡＤＮＩＤＡＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳＴＳＧＱＡＧＱ
【００４９】
配列番号３：ｓｃＦｖ−Ｇ１２
ＱＡＡＬＴＱＰＳＳＶＳＡＮＰＧＥＴＶＫＩＴＣＳＧＧＳＹＨＹＧＷＹＱＱＫＳＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹＳＮＮＱＲＰＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＴＳＤＳＴＧＴＬＴＩＴＧＶＱＡＤＤＥＡＶＹＦＣＧＳＹＤＳＳＮＴＹＡＧＩＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬＧＱＳＳＲＳＳＳＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＦＱＴＰＧＧＡＬＳＬＶＣＫＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＱＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＡＧＩＧＮＳＤＲＹＴＹＦＧＰＡＶＫＧＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＬＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＳＧＤＳＧＮＧＣＴＨＰＷＣＳＡＤＮＩＮＡＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳＴＳＧＱＡＧＱ
【００５０】
配列番号４：ｓｃＦｖ−Ａ１１
ＱＡＡＬＴＱＰＳＳＶＳＡＮＰＧＥＴＶＫＩＴＣＳＧＧＧＳＹＧＧＳＹＹＹＧＷＹＱＱＫＳＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹＳＮＤＮＲＰＳＤＩＰＳＲＦＳＧＳＴＳＧＳＴＳＴＬＴＩＴＧＶＱＶＤＤＥＡＶＹＹＣＧＴＹＤＳＳＹＶＧＩＦＧＡＧＴＡＬＴＶＬＧＱＳＳＲＳＳＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＧＧＬＳＬＶＣＫＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＱＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＥＦＶＡＧＩＧＹＳＤＳＹＴＹＦＧＰＡＶＫＧＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＮＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＳＡＤＴＩＹＧＣＴＨＰＷＣＳＡＤＮＩＤＡＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳＴＳＧＱＡＧＱ
【００５１】
ｓｃＦｖ：円偏光二色性による相互作用研究
ｓｃＦｖ  Ａ４、Ａ１１およびＧ１２を用いて、Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβ１−ＯＭｅ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ社）および陰性対照のメリビオースとの相互作用を確認した。
【００５２】
２種類の実験を行った：第１に、４ｍＭの両方の二糖の非存在下および存在下でｓｃＦｖの近紫外円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを比較した。第２に、ｓｃＦｖの熱安定性に対する二糖の効果を研究した。
【００５３】
実験手順：
試料をＮａＰｉ（１０ｍＭ）−ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）ｐＨ７．２中に希釈し、２回の限外濾過により濃縮するか（少量の場合）または徹底的に透析した。１ｎｍの帯域幅、２０ｎｍ／分の走査速度および４秒の応答時間、０．２ｎｍ毎のデータ収集および各スペクトルにつき３つの蓄積を使用して、ペルチェ温度制御システムを備えたＪ−８１０分光偏光計でＣＤスペクトルを２０℃にて取得した。近紫外スペクトルは約１．０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度にて１ｃｍ経路長のセル内で記録し、一方、遠紫外スペクトルは約０．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度にて０．１ｃｍ経路長の石英セル内で記録した。全ＣＤスペクトルについて、対応するバッファベースラインを差し引いた。熱安定性を、４０℃／ｈの一定速度で２０〜９０℃まで昇温しながら、２０８ｎｍでの楕円率変化を測定することにより評価した。楕円率変化を０．２℃ごとに収集し、スペクトルを１０℃毎に収集した。熱変性プロファイルを、以下の式を用いてシグモイド関数にフィットさせた：
【００５４】
【数１】
0006412871.tif 000002
式中、それぞれ、Θ（Ｔ）は温度Ｔ（ケルビン）での楕円率を表し、ΘＮは天然タンパク質の楕円率であり、ｎは転移の数であり、ΔΘＩは転移ｉの楕円率増分であり、Ｒは気体定数、ならびにＴｍｉおよびＨＤｉはそれぞれ、転移中間点の温度（融解温度）および対応する転移の協同性（傾き）を表すパラメータである。
【００５５】
結果：
一般的に、近ＣＤにおいて残基あたりのモル楕円率の値は、３種類のｓｃＦｖについて−８０〜４０ｇｒａｄ  ｃｍ２／ｄｍｏｌであり、これはタンパク質の通常の値からすると低い傾向である。Ｇ１２を始めとして、スペクトル（黒、図１Ａ）は２５０〜２８０ｎｍ（ＰｈｅおよびＴｙｒの電子転移によって支配される領域）で負の楕円率を示し、かつ２９２ｎｍ（Ｔｒｐ電子転移によって支配される領域）では小さい正のバンドを示した。メリビオースは、スペクトルの形状／強度に著しい変化をもたらさなかったが（赤色のスペクトル、図１Ａ）、明確な変化がＧａｌα（１，３）Ｇａｌβ１−ＯＭｅの存在下で検出された。２９２ｎｍでのバンドは消滅する傾向があったが、より高い負の値が２５０〜２９０ｎｍ領域で観察された（緑色のスペクトル、図１Ａ）。したがって、Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβ１−ＯＭｅの存在下でのスペクトルは、スペクトルに寄与する芳香族残基の環境における変化を示すように思われる。
【００５６】
Ａ４の場合には、ＣＤスペクトル（黒、図１Ｂ）はまた２５０〜２９０ｎｍで負であり、２９１ｎｍにもバンドが存在する（Ｇ１２よりも低い強度）。さらに、３００ｎｍに（Ｔｒｐに割り当てられる）明確な負のバンドが存在する。Ｇ１２については、メリビオースの効果は変わらなかった（赤色のスペクトル、図１Ｂ）。しかし、残基あたりのモル楕円率は、一般的に、Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβ１−ＯＭｅの存在下、特に２６０〜２８０ｎｍで減少し、より低い負の値を生じた（緑色のスペクトル、図１Ｂ）。３００ｎｍでのバンドもまた強度の減少を示したが、２９１ｎｍのバンドはほとんど変化しなかった。
【００５７】
Ａ１１に関しては、ＣＤスペクトル（黒、図１Ｃ）はｓｃＦｖ  Ｇ１２およびＡ４のスペクトルと類似しており、２５０〜２９０ｎｍにおける残基当たりのモル楕円率が負の値であり、２本のバンドが存在し、１つ目は２９２ｎｍにおける正のバンドおよび２つ目は３０２ｎｍにおける負のバンドであった。メリビオース（赤色のスペクトル、図１Ｃ）またはＧａｌα（１，３）Ｇａｌβ１−ＯＭｅ（緑色のスペクトル、図１Ｃ）のいずれの存在下でも著しい変化は観察されなかった。これは、糖との相互作用が存在する場合には、タンパク質の芳香族基の環境は著しく影響されないことを示している。
【００５８】
第２セットの実験では、二糖の非存在下および存在下でのｓｃＦｖの熱安定性を調べた。この種の実験で、発明者らは以下のものを得ることができた：１）加熱時のタンパク質の二次構造の変化についての情報を与える、昇温での遠紫外ＣＤスペクトル、および２）転移温度（Ｔｍ）の計算を可能にする、昇温しながらの特定波長での楕円率変化のプロファイル。糖の非存在下および存在下でのＴｍの直接比較は、熱安定化（すなわち、糖の存在下でのＴｍの増加）を相互作用の指標として、ｓｃＦｖに対する糖の影響についての情報をもたらした。
【００５９】
２０℃における全ｓｃＦｖの遠紫外ＣＤスペクトルは、短波長（２０８ｎｍ未満）でのモル楕円率の正の値および２０８〜２４０ｎｍでの負のバンドを示し、これらはβ二次構造に典型的な特徴である（図２および図３の黒色のスペクトル）。図２は、３種類のｓｃＦｖのスペクトルの良好な重ね合わせを示し、それらの３つが類似の二次構造を有することを示す。Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβ１−ＯＭｅ（図３、緑色のスペクトル）のまたはメリビオース（図示せず）のいずれの存在下でもスペクトルの変化は観察されなかった。９０℃で加熱した後、陽性バンドは消失し、かつスペクトルは波長のほぼ全範囲でより高い負の値の楕円率になる傾向があり（図３、赤色のスペクトル）、それらの天然のβ二次構造の損失を示している。Ｇ１２（図３Ａ）およびＡ４（図３Ｂ）について２０℃〜９０℃でのスペクトルのグローバルな変化は、糖の非存在下または存在下で同様であった。しかし、Ａ１１の加熱後の最終的な種は、Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβ１−ＯＭｅの非存在下および存在下で異なっている（図３、青色のスペクトル）。この違いはメリビオースの存在下では観察されなかった。
【００６０】
所定の波長での昇温に伴う楕円率変化のプロファイル比較（図４）は、Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβ１−ＯＭｅが３種類のｓｃＦｖの重要な安定化（７．７℃〜１０．２℃）を誘導したことを明らかに示した（表１）。逆に、メリビオースの存在は、Ｇ１２またはＡ１１のいずれでも顕著な安定化をもたらさなかった（約０．２℃）（Ａ４についてはチェックしなかった）。
【００６１】
ｓｃＦｖ  Ｇ１２について、変性を２つの異なる波長で監視した（表１）。糖の非存在下および存在下で２１８ｎｍでの楕円率の変化を測定することによる、Ｇ１２の熱安定性に対する糖の効果の比較分析により、４ｍＭのメリビオースの添加はアンフォールディングプロセスのＴｍも（協同性を説明する）ＨＤも変化させないが、一方で４ｍＭのＧａｌα（１，３）Ｇａｌβ１−ＯＭｅの存在は両方のパラメータを増加させたことが示されている。２０８ｎｍで得られたデータは、Ｔｍにおける８．８℃の増加およびＧａｌα（１，３）Ｇａｌβ１−ＯＭｅの存在下でのわずかにより協同的なアンフォールディング（＋６．８Ｋｃａｌ／モル）も明らかにした。明確にするために、Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβ１−ＯＭｅの非存在下および存在下で２０８ｎｍにて収集した変性プロファイルのみを図４Ａに示す。
【００６２】
【表１】
0006412871.tif 000003
【００６３】
Ｇ１２について２０８ｎｍでのモル楕円率の変化が２１８ｎｍの場合よりも著しく大きかったので（図３参照）、ｓｃＦｖの残りについて２０８ｎｍでの監視を選択した。Ａ４の場合には、プロセスの協同性（表１に示され、図４Ｂにおける変性曲線の傾きによって証明される）は著しく変化しなかったが（−４．７Ｋｃａｌ／モル）、Ｔｍは４ｍＭのＧａｌα（１，３）Ｇａｌβ１−ＯＭｅの存在下で約１０℃増加した。最後に、Ａ１１について、発明者らはＴｍの値だけでなくプロセスの協同性にも違いを観察し、これはＧ１２およびＡ４よりも明らかに高く（表１）、かつ変性の終わりにモル楕円率の値の違いも観察した（表１および図４Ｃ）。メリビオースの存在下または非存在下で得られた曲線間に著しい違いはないが、Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβ１−ＯＭｅが存在する場合には抗体のＴｍは７．７℃増加し、興味深いことに、この二糖の非存在下での同じｓｃＦｖと比較すると協同性は大きく減少した（−３８．５Ｋｃａｌ／モル）。Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβ１−ＯＭｅの存在下でのＧ１２およびＡ４のプロセスの協同性と比較した場合、３種類のタンパク質の値は、この二糖の非存在下の場合よりも近くなる。
【００６４】
要約すると、得られた結果は、３種類のｓｃＦｖ、Ａ４、Ａ１１およびＧ１２とＧａｌα（１，３）Ｇａｌβ１−ＯＭｅとの間の相互作用の存在を明瞭に証明する。さらに、メリビオースとの相互作用の欠如は、認識における特異性を証明する。Ｇ１２は、近紫外ＣＤスペクトルにおいて著しい変化を示し、このことは二糖の結合が芳香族残基の環境に著しく影響を与えることを示している。さらに、熱変性実験は、３種類のｓｃＦｖに対するＧａｌα（１，３）Ｇａｌβ１−ＯＭｅの安定効果を明白に示し、Ａ４の安定化は１０．２℃、Ｇ１２については８．８℃およびＡ１１については７．７℃であった。
【００６５】
考察
３０年以上にわたって知られているが、二糖の合成に関与する酵素を欠くヒトおよびニワトリを除く、広範な種での糖タンパク質および糖脂質上の末端モチーフとしてよく見られるＧａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌモチーフに依然としてかなりの関心がある。このグリカン構造は異種移植努力に依然として関連したままであり、癌免疫療法における免疫原性を増加させるために、ヒト血清中に存在する比較的大量の天然の抗Ｇａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌ抗体を活用する可能性が広く調査されてきた。癌細胞またはムチンなどの癌関連分子のＧａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌエピトープでの修飾は、抗原提示細胞による取り込みを増加させ、かつ免疫反応を増強することが示されている。細胞上のモチーフの負荷を測定する能力はこの研究にとって重要であるが、患者に有害反応をもたらす、最近報告された糖タンパク質バイオ医薬品上でのこの免疫原性モチーフの出現は、Ｇａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌに対する特異的結合剤および便利な分析法の必要性を特に強調している。
【００６６】
Ｇａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌエピトープの検出およびプロファイリングのために最も一般的に利用される生体分子は、α−Ｇａｌ残基に非常に特異的であるレクチンＧＳ−１−Ｂ４である。異なるα−Ｇａｌ炭水化物に対するＧＳ−１−Ｂ４の親和性は、Ｇａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌの信頼できるマーカーとしてこのレクチンを使用することにおける欠点である。キノコＭａｒａｓｍｉｕｓ  ｏｒｅａｄｅｓ（ＭＯＡ）のレクチンは、Ｇａｌ−α−（１，３）−ＧａｌおよびＧａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌ−β−（１，４）−ＧｌｃＮＡｃエピトープにより特異的であると報告されているが、還元末端でＧａｌと結合したＬ−Ｆｕｃ−α−（１，２）を含むＢ型の血液型抗原に強く結合する。これおよび他の非ヒトグリカンエピトープに対する天然に存在する血清中のヒト抗体は、分析ツールとして確実に使用されてはいない。従来の免疫化アプローチは、特定の炭水化物部分に対する高親和性抗体の作製にそれほど信頼性がなく、多くの場合、アッセイ開発に好適な特性を有する抗体を生じない。組換え抗体断片のライブラリーとファージディスプレイ技術の使用はより有望であり、寛容化のため通常は得られない抗自己抗体を含む抗体の大きなレパートリーへとアクセスできる。しかし、これまでにほんの少ししか成功例が公開されていない。炭水化物部分に対する抗体の作製は、その親和性の低さのためこれまで困難であり、ほとんど成功例が公開されていない。最初のライブラリー源の選択および可能性のある免疫化計画は、慎重な思考およびデザインを必要としており、自然条件下で発生するグリカン提示の模倣を可能にする。免疫化ニワトリのライブラリーを利用する本明細書の選択は、固有の機能的ＶＨおよびＶＬ遺伝子に隣接する保存領域を標的にするシングルプライマーが増幅して、ｓｃＦｖとして融合するのを可能にした。これは、より複雑なシステムとは対照的に、非常に多様性のあるニワトリ免疫グロブリンレパートリーのその後のクローニングにより、再編成された可変断片の完全なスペクトルを可能にする。
【００６７】
マウスまたはヒト由来の抗体のように、ニワトリ組換え抗体は様々な形態（ＦａｂまたはｓｃＦｖ）で発現させることができ、多数のグループが様々なタンパク質標的に対するニワトリ組換え抗体の構築を報告している。パニング条件の最適化は炭水化物標的に対するファージディスプレイの成功のための鍵であり、炭水化物−タンパク質相互作用がタンパク質−タンパク質相互作用と比べ親和性がより低いこと考慮する。
【００６８】
競合結合アッセイは、実行可能な代替手段がない場合が多いため、複雑な試料中の低分子量化合物の決定に広く使用されている。それらは、多用途の堅牢なアッセイ構成を示し、ハイスループットまたは使い捨て、ポイント・オブ・ケアの形式に適応可能である。しかし、競合アッセイは結合剤に関する要求が厳しく、アッセイ感度は検体に対する結合剤の親和性に直接依存している。発明者らは、精製した全３種類のｓｃＦｖがＧａｌ−α−（１，３）−Ｇａｌの競合アッセイにおいて使用でき、低いｎｇ／ｍｌレベルでの（検出限界は３．９ｎｇ／ｍｌ［約１０ｎＭ］と見積もられる）二糖の検出を可能にすることを実証し、これは、類似のプレートアッセイで試験した場合に一般的にμｇ／ｍｌレベルである、報告されたほとんどのレクチンの検出限界を超えている。ｓｃＦｖの例外的な特異性もこの形式で保持された。発明者らは、アッセイが糖タンパク質との関連でモチーフを検出でき、かつタンパク質上のこのモチーフの取り込みレベルを決定するために用いることができることを示した。したがって、このアッセイは、関心のある糖タンパク質上のモチーフの直接分析または例えば、ウェルシュ菌由来の酵素のエンド−β−ガラクトシダーゼＣによる放出後の二糖の測定のいずれかの選択を提供する。
【００６９】
最もよく特徴付けられた３種類のｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ−Ｇ１２、ｓｃＦｖ−Ａ４およびｓｃＦｖ−Ａ１１）間のＣＤＲ配列において観察された差異は、それぞれの個々の動物中のＧａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌ特異的Ｂ細胞の様々なインビボ集団またはおそらくライブラリーを作製するために使用した２種類の動物のプールしたｃＤＮＡに起因したのかもしれない。いくつかのアミノ酸変化（Ｓ→Ｑ；Ｇ→Ｓ）および欠失（一般的にセリン）が、配列決定された断片のそれぞれのリンカー配列で生じた。リンカー領域内の変更は、リンカーの安定性または機能に著しく影響を与えるようには見えなかった。単一のｓｃＦｖクローンは、細菌培養物中で誘導され、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーにより容易に精製される可溶性ｓｃＦｖを生産した。最適化しなくとも、可溶性ｓｃＦｖの収率は満足できるものであり、かつ再現性があった。ｓｃＦｖの安定性および提示は、他の要因とともに濃度、ｐＨおよび温度によって影響され得る。ｓｃＦｖの個々の調製物は、機能的に二価であり観察される反応速度に変化をもたらし得る二量体抗体を、未知の割合で含んでいる可能性がある。
【００７０】
精製および試験されたｓｃＦｖ抗体（Ａ４、Ａ１１およびＧ１２）は、Ｇａｌ−α−（１→３）−Ｇａｌエピトープに対する高い特異性を示し、それらがこのエピトープに対する優れた特異性試薬として将来使用され得ることを示している。
【００７１】
【表２】
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【００７２】
本発明に関連して本明細書で使用される場合、単語「含む／含んでいる」および単語「有する／含めた」は、述べられた特徴、整数、ステップまたは構成要素の存在を特定するために使用されるが、１以上の他の特徴、整数、ステップ、構成要素またはそれらのグループの存在または追加を排除しない。
【００７３】
明確にするため、別々の実施形態との関連で記載されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせても提供できることを理解されたい。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態との関連で記載されている本発明の様々な特徴は、別個にまたは任意の適切なサブコンビネーションでも提供され得る。
【００７４】
参考文献
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Ｂｏｓｑｕｅｓ  ＣＪ，Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＢＥ，Ｍｅａｄｏｒ  ＪＷ，Ｓａｒｖａｉｙａ  Ｈ，Ｍｕｒｐｈｙ  ＪＬ，Ｄｅｌｌｏｒｕｓｓｏ  Ｇ，Ｂｕｌｉｋ  Ｄ  ａ，Ｈｓｕ  Ｉ−Ｈ，Ｗａｓｈｂｕｒｎ  Ｎ，Ｓｉｐｓｅｙ  ＳＦ，Ｍｙｅｔｔｅ  ＪＲ，Ｒａｍａｎ  Ｒ，Ｓｈｒｉｖｅｒ  Ｚ，Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ  Ｒ，Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ  Ｇ（２０１０）Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ−α−１，３−ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：１１５３−６；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／２１０５７４７９［２０１１年８月１２日にアクセスした］で利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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