(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流加バッチ又は連続発酵培地において発酵培地に対する炭素添加の速度を制御する方法であって、
二酸化炭素へと消失したＣ−モルを測定するステップ；
炭素添加により添加したＣ−モルを測定するステップ；
所定時間にわたり添加したＣ−モル炭素で、生成されたＣ−モル二酸化炭素を割って得られる、二酸化炭素供給指数、ＦＱを算出するステップ；及び
目的のＦＱに応じて炭素添加速度を調節するステップ
を含むか、又は
消費された酸素のモルを測定するステップ；
炭素添加により添加したＣ−モルを測定するステップ；
所定時間にわたり添加したＣ−モル炭素で、消費されたモル酸素を割って得られる、酸素供給指数、ＯＱを算出するステップ；及び
目的のＯＱに応じて炭素添加速度を調節するステップ
を含み、
前記発酵培地は、目的の化合物を生成する微生物を含むか、又は前記発酵培地は、目的の微生物を産生する微生物を含む方法。
【請求項２】
前記微生物が、細菌又は真菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記目的の化合物が、タンパク質又はペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が、酵素である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記目的の化合物が、多糖である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記多糖が、ヒアルロン酸である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記炭素源が、グルコース、スクロース、ラクトース、グリセロール及びマルトースからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＦＱが、０．２５〜０．７５の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＯＱが、０．２５〜０．７５の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記時間が、１秒〜２０分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
目的の微生物を産生する前記微生物が、酵母である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記目的の化合物が回収される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記真菌が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株である、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵培地への炭素添加の速度を制御する方法であって、前記発酵培地が、目的の化合物を産生する微生物を含むか、又は前記発酵培地が、目的の微生物を産生する微生物を含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌及び真菌微生物は、多種多様な治療薬（例えば、ペニシリン及びセファロスポリン）、医薬タンパク質（例えば、インスリン）、多糖（例えば、ヒロアルン酸）、酵素（例えば、プロテアーゼ）、並びに汎用化学品（例えば、クエン酸）の商業生産に用いられることから、応用微生物学にとって主力商品である。
【０００３】
工業では、流加発酵法を用いることが極めて一般的である。流加発酵法は、培養物への増殖制限栄養基質の供給に基づく方法である。増殖制限栄養基質は、典型的に、炭水化物である。
【０００４】
流加発酵法における増殖を制御するために、様々な戦略が用いられてきた。ＤＯＴ（溶存酸素圧）や、ｐＨ（ｐＨスタット）などの制御パラメータは、通常、注意深く追跡される。
【０００５】
微生物が、目的の化合物を産生するか、又は前記微生物が、目的の微生物を産生する流加発酵法での炭水化物添加速度は、極めて重要なプロセスパラメータである。炭水化物の過剰供給は、例えば、オーバーフロー代謝及び副産物の生成のために、バッチの消失又は著しく低下した生産性を招くことがわかっている。
【０００６】
本発明は、発酵培地中の微生物の炭素利用効率をモニター及び制御し、これによって過剰供給を防止する方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、流加バッチ又は連続発酵培地において発酵培地に対する炭素添加の速度を制御する方法を開示し、この方法は、以下：
二酸化炭素へと消失したＣ−モルを測定するステップ；
炭素添加により添加したＣ−モルを測定するステップ；
所定時間にわたり添加したＣ−モル炭素で、生成されたＣ−モル二酸化炭素を割って得られる、二酸化炭素供給指数、ＦＱを算出するステップ；及び
目的のＦＱに応じて炭素添加速度を調節するステップ
を含むか、又は
消費された酸素のモルを測定するステップ；
炭素添加により添加したＣ−モルを測定するステップ；
所定時間にわたり添加したＣ−モル炭素で、消費されたモル酸素を割って得られる、酸素供給指数、ＯＱを算出するステップ；及び
目的のＯＱに応じて炭素添加速度を調節するステップ
を含み、
ここで、前記発酵培地は目的の化合物を生成する微生物を含むか、又は前記発酵培地は目的の微生物を産生する微生物を含む。
【０００８】
添付の図面を参照にして本発明をさらに詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】バッチＸ、バッチＹ及びバッチＺの正規化酵素濃度を示し、バッチＸは、標準発酵（ＤＯＴ制御）であり；バッチＹは、ＦＱ制御を有する発酵であり；バッチＺは、ＯＱ制御を有する発酵である。
【図２】バッチＸ、バッチＹ及びバッチＺの正規化バイオマス濃度を示す。
【図３】バッチＸ（ＤＯＴ制御）及びバッチＹ（ＦＱ制御）のＦＱプロセス値を示す。
【図４】バッチＸ（ＤＯＴ制御）及びバッチＺ（ＯＱ制御）のＯＱプロセス値を示す。
【図５】バッチＸ、バッチＹ及びバッチＺの栄養素供給速度を示す。
【図６】バッチＸの溶存酸素、及びバッチＸのＤＯＴ設定値（＝２０％）を示す。
【図７】実施例２に従い測定されたＯＱを示す。ＯＱ設定値は、０．３であった。
【図８】実施例２に従うＯＱコントローラによって調節されるグルコース供給速度を示す。
【図９】実施例３に従い測定されたＯＱを示す。ＯＱ設定値は、０ｈの０．４５から７０ｈの０．６までの勾配を有した。
【図１０】実施例３に従うＯＱ制御ラクトース供給を示す。
【図１１】実施例３に従い、７１ｈで指数１００を有する、測定された酵素濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）供給バッチ発酵における炭水化物添加の速度は、極めて重要なプロセスパラメータである。基質の過剰供給は、例えば、バッチの消失又は炭素利用効率の低下を招くことがわかっている。
【００１１】
本発明は、発酵プロセスにおいて微生物炭素利用効率をモニター及び制御する方法を提供し、これにより、過剰供給の危険性を招くことなく、プロセスを最適化することができる。特に、本発明は、好気的かつ炭素制限的発酵において、微生物炭素利用効率をモニター及び制御する方法を提供し、これにより、過剰供給の危険性を招くことなく、プロセスを最適化することができる。
【００１２】
微生物
本発明の目的の化合物を生成又は発現する微生物は、発酵槽において培養することができる、当分野では公知のあらゆる微生物であってよい。
【００１３】
本発明の微生物は、細菌株、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、若しくはストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株などのグラム陽性菌株、又はカンビロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、又はウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）株などのグラム陰性菌株であってよい。
【００１４】
一形態では、上記の株は、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、又はバチルス・チューリンゲニシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）株；特に、上記株は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株である。
【００１５】
別の形態では、上記の株は、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ピロゲネス  （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）、又はストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）株である。
【００１６】
別の形態では、上記の株は、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、又はストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）株である。
【００１７】
微生物は真菌株であってもよい。例えば、この株は、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、若しくはヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株などの酵母株；  又はアクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ボトリオスパエリア属（Ｂｏｔｒｙｏｓｐａｅｒｉａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、カエトミジウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス属（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コクリオボラス属（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、コプリノプシス属（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ）、コプトテルメス属（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ）、コリナスカス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クリホネクトリア属（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ジプロディア属（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、エキシディア属（Ｅｘｉｄｉａ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ギベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ホロマスチゴトイデス属（Ｈｏｌｏｍａｓｔｉｇｏｔｏｉｄｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、レンチヌラ属（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）、レプトスパエリア属（Ｌｅｐｔｏｓｐａｅｒｉａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、メラノカルパス属（Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ）、メリピラス属（Ｍｅｒｉｐｉｌｕｓ）、ムコル属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフソラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチックス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ネウロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ポイトラシア属（Ｐｏｉｔｒａｓｉａ）、シュードプレクタニア属（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｃｔａｎｉａ）、シュードトリコニンファ属（Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ）、リゾムコル属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、シタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、トリコファエア属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ）、ベルチシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ボルバリエラ属（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ）、又はキシラリア属（Ｘｙｌａｒｉａ）株などの糸状真菌であってもよい。
【００１８】
別の形態では、上記の株は、アクレモニウム・セルロリチカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アキュレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ホエチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンズランジカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トプロピカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナタム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、フサリウム・バクレイジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウム・クロックウェレンズ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フサリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・レチキュラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フサリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリウム・サルコロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フサリウム・トリコセシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏ���ａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、イプレックス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ）、ムコル・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオプソラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ネウロスポラ・クラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、フェニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、チエラビア・アクロマチカ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｃｈｒｏｍａｔｉｃａ）、チエラビア・アルボミセス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｌｂｏｍｙｃｅｓ）、チエラビア・アルボピロサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｌｂｏｐｉｌｏｓａ）、チエラビア・アウストラレインシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｕｓｔｒａｌｅｉｎｓｉｓ）、チエラビア・フィメチ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｆｉｍｅｔｉ）、チエラビア・ミクロスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）、チエラビア・オビスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｏｖｉｓｐｏｒａ）、チエラビア・ペルビアナ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｐｅｒｕｖｉａｎａ）、チエラビア・セトサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｅｔｏｓａ）、チエラビア・スペデドニウム（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｐｅｄｅｄｏｎｉｕｍ）、チエラビア・サブサーモフィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｕｂｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンジブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）株である。
【００１９】
別の形態では、上記の株は、酵母株、例えば、サッカロミセス・カルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、又はサッカロミセス・オビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）株である。
【００２０】
これらの種の株は、多数の培養物寄託所、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、及びＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）から容易に入手可能である。
【００２１】
目的の微生物を産生する微生物
発酵の産物は、微生物であってもよく、例えば、目的の微生物は、酵母又は細菌株、特にサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）株又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株若しくはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）胞子であってもよい。
【００２２】
目的の化合物
本発明の化合物は、ペニシリン若しくはセファロスポリン若しくはエリスロマイシンなどの抗生物質、又はクエン酸などの汎用化学品であってもよい。
【００２３】
目的の化合物はまた、ヒロアルン酸などの多糖、インスリンなどの治療用ポリペプチド、又はペプチド、又は酵素などのタンパク質であってもよい。
【００２４】
本発明の好ましいペプチドは、２〜１００アミノ酸；好ましくは１０〜８０アミノ酸；より好ましくは１５〜６０アミノ酸；さらに好ましくは１５〜４０アミノ酸を含む。
【００２５】
好ましい実施形態において、目的の化合物は酵素、特に加水分解酵素（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅに従いクラスＥＣ３；Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）である。
【００２６】
特に好ましい実施形態において、以下の加水分解酵素が好ましい：
プロテアーゼ：好適なプロテアーゼとしては、動物、植物又は微生物由来のものがある。微生物由来のものが好ましい。化学的に修飾した、又はタンパク質改変突然変異体も含まれる。プロテアーゼは、酸性プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼであってよく、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼであってよい。アルカリ性プロテアーゼの例として、スブチリシン、特に、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のもの、例えば、スブチリシンＮｏｖｏ、スブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、スブチリシン３０９、スブチリシン１４７及びスブチリシン１６８（国際公開第８９／０６２７９号パンフレットに記載）が挙げられる。トリプシン様プロテアーゼの例は、国際公開第８９／０６２７０号パンフレット及び国際公開第９４／２５５８３号パンフレットに記載されているトリプシン（例えば、ブタ若しくはウシ由来）及びフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼである。
【００２７】
有用なプロテアーゼの実施形態の例は、国際公開第９２／１９７２９号パンフレット、国際公開第９８／２０１１５号パンフレット、国際公開第９８／２０１１６号パンフレット、及び国際公開第９８／３４９４６号パンフレット、特に以下の位置：２７、３６、５７、７６、８７、９７、１０１、１０４、１２０、１２３、１６７、１７０、１９４、２０６、２１８、２２２、２２４、２３５及び２７４の１つ以上に置換を有する変異体である。
【００２８】
好ましい市販のプロテアーゼ酵素としては、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ（商標）、ＤＵＲＡＬＡＳＥ（商標）、ＥＳＰＥＲＡＳＥ（商標）、ＲＥＬＡＳＥ（商標）、及びＫＡＮＮＡＳＥ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（商標）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ  ＯＸＰ（商標）、ＦＮ２（商標）、及びＦＮ３（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）がある。
【００２９】
リパーゼ：好適なリパーゼとしては、細菌又は真菌由来のものがある。化学的に修飾した、又はタンパク質改変突然変異体も含まれる。有用なリパーゼの例として、欧州特許第２５８  ０６８号明細書及び欧州特許第３０５  ２１６号明細書に記載されているフミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（別称：サーモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ））由来、例えば、Ｈ．ラヌギノサ（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ．ラヌギノサ（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来、又は国際公開第９６／１３５８０号パンフレットに記載のＨ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来のリパーゼ、例えば、Ｐ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）若しくはＰ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（欧州特許第２１８  ２７２号明細書）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）（欧州特許第３３１  ３７６号明細書）、Ｐ．スツゼリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（英国特許第１，３７２，０３４号明細書）、Ｐ．フルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス種株ＳＤ  ７０５（国際公開第９５／０６７２０号パンフレット及び国際公開第９６／２７００２号パンフレット）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（Ｐ．ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（国際公開第９６／１２０１２号パンフレット）由来のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ、例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｄａｒｔｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１３１，２５３−３６０）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（日本国特許第６４／７４４９９２号明細書）、若しくはＢ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）（国際公開第９１／１６４２２号明細書）由来のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼが挙げられる。
【００３０】
その他の例としては、国際公開第９２／０５２４９号明細書、国際公開第９４／０１５４１号パンフレット、欧州特許第４０７  ２２５号明細書、欧州特許第２６０  １０５号明細書、国際公開第９５／３５３８１号パンフレット、国際公開第９６／００２９２号パンフレット、国際公開第９５／３０７４４号パンフレット、国際公開第９４／２５５７８号パンフレット、国際公開第９５／１４７８３号パンフレット、国際公開第９５／２２６１５号パンフレット、国際公開第９７／０４０７９号パンフレット及び国際公開第９７／０７２０２号パンフレットに記載されているようなリパーゼ変異体がある。
【００３１】
好ましい市販のリパーゼ酵素としては、ＬＩＰＯＬＡＳＥＴＭ（商標）、ＬＩＰＯＬＡＳＥ  ＵＬＴＲＡＴＭ（商標）及びＬＩＰＥＸ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）がある。
【００３２】
アミラーゼ：好適なアミラーゼ（α及び／又はβ）としては、細菌又は真菌由来のものがある。化学的に修飾した、又はタンパク質改変した突然変異体も含まれる。アミラーゼは、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特定の株から得られるα−アミラーゼが含まれ、これは、英国特許第１，２９６，８３９号明細書により詳しく記載されている。
【００３３】
有用なアミラーゼの例としては、国際公開第９４／０２５９７号パンフレット、国際公開第９４／１８３１４号パンフレット、国際公開第９６／２３８７３号パンフレット、国際公開第９７／４３４２４号パンフレット及び国際公開第０１／６６７１２号パンフレットに記載の変異体、特に、下記の位置：１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９７、２０２、２０８、２０９、２４３、３０４、３０５、３９１、４０８、及び４４４の１つ以上に置換を有する変異体がある。
【００３４】
市販のアミラーゼには、ＤＵＲＡＭＹＬ（商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（商標）、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ  ＬＣ（商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ  ＳＣ（商標）、ＬＩＱＵＩＺＹＭＥ−Ｘ（商標）及びＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（商標）及びＰＵＲＡＳＴＡＲ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．製）がある。
【００３５】
セルラーゼ：好適なセルラーゼとしては、細菌又は真菌由来のものがある。化学的に修飾した、又はタンパク質改変した突然変異体も含まれる。好適なセルラーゼとしては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、例えば、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオプソラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）及びフサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から産生される真菌セルラーゼがあり、これらは、米国特許第４，４３５，３０７号明細書、米国特許第５，６４８，２６３号明細書、米国特許第５，６９１，１７８号明細書、米国特許第５，７７６，７５７号明細書、及び国際公開第８９／０９２５９号パンフレットに記載されている。
【００３６】
特に、好適なセルラーゼは、カラーケアの利点を有するアルカリ性又は中性セルラーゼである。このようなセルラーゼの例としては、欧州特許第０  ４９５  ２５７号明細書、欧州特許第０  ５３１  ３７２号明細書、国際公開第９６／１１２６２号パンフレット、国際公開第９６／２９３９７号パンフレット、国際公開第９８／０８９４０号パンフレットに記載されているセルラーゼである。その他の例は、国際公開第９４／０７９９８号パンフレット、欧州特許第０  ５３１  ３１５号明細書、米国特許第５，４５７，０４６号明細書、米国特許第５，６８６，５９３号明細書、米国特許第５，７６３，２５４号明細書、国際公開第９５／２４４７１号パンフレット、国際公開第９８／１２３０７号パンフレット、及びＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９に記載されているものなどのセルラーゼ変異体がある。
【００３７】
市販のセルラーゼとしては、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（商標）、ＣＡＲＥＺＹＭＥ（商標）、及びＣＡＲＥＺＹＭＥ  ＣＯＲＥ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＣＬＡＺＩＮＡＳＥ（商標）、及びＰＵＲＡＤＡＸ  ＨＡ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）、並びにＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（Ｋａｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）がある。
【００３８】
プルラナーゼ：プルラナーゼは、細菌又は真菌由来のものがある。化学的に修飾した、又はタンパク質改変した突然変異体も含まれる。
【００３９】
本発明のプルラナーゼは、好ましくは、例えばピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）又はバチルス・アシドプルリチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）などのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば、Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １１５：９７−１０６に記載されているもの；又はＰｒｏｍｏｚｙｍｅ（商標）などのＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓから市販されているプルラナーゼである。
【００４０】
本発明のプルラナーゼはまた、バチルス・ナガノエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｇａｎｏｅｎｃｉｓ）、又はバチルス・デラミフィカンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）、例えば、バチルス・デラミフィカンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）（米国特許第５，７３６，３７５号明細書）由来のものなどであってもよい。
【００４１】
オキシドレダクターゼ：オキシドレダクターゼは、細菌又は真菌由来のものがある。化学的に修飾した、又はタンパク質改変した突然変異体も含まれる。オキシドレダクターゼには、ペルオキシダーゼ、並びにラッカーゼ及びカタラーゼなどのオキシダーゼが含まれる。
【００４２】
他の好ましいヒドラーゼは、ＭＡＮＮＡＷＡＹ（商標）などのカルボヒドロラーゼである。その他の好ましい酵素は、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、及びリガーゼである。
【００４３】
発酵
本発明は、ガス組成物、ガス流、及び炭水化物流を測定することができるあらゆるスケールでの任意の流加バッチ又は連続発酵に有用となりうる。
【００４４】
従って、本発明は、ミクロ規模の培地を有するあらゆる発酵、並びに工業スケール、例えば、典型的に１０００リットル〜５００，０００リットルの工業規模の培地を有するあらゆる発酵に有用である。
【００４５】
微生物は、当分野で公知の任意の方法で発酵させることができる。発酵培地は、ダイズミール、ダイズタンパク質、ダイズタンパク質加水分解物、綿実油かす、コーンスティープリカー、酵母エキス、カゼイン、カゼイン加水分解産物、ジャガイモタンパク質、ジャガイモタンパク質加水分産解物、モラッセなどの複合窒素及び／又は炭素源を含む複合培地であってよい。発酵培地は、例えば、国際公開第９８／３７１７９号パンフレットに定義されているような合成培地であってよい。
【００４６】
発酵は、炭素制限条件を用いて実施してもよい。炭素制限条件は、微生物の増殖が炭素源の添加により制御されることを意味する。
【００４７】
炭素源
本発明は、代謝可能な炭素を測定することができるあらゆる炭素源について有用でありうる。
【００４８】
グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、ラクトース、マルツロース、マンノース、グリセロール、及びガラクトースからなる群から選択される炭水化物又は炭素源が好ましい；特に、グルコース、スクロース、ラクトース、グリセロール及びマルトースからなる群から選択される炭素源が好ましい。
【００４９】
二酸化炭素供給指数（ＦＱ）
利用効率は、二酸化炭素（ＣＯ２）に消失したＣ−モルと、炭水化物供給により添加したＣ−モルとの間の比率（二酸化炭素供給指数若しくはＦＱと呼ぶ）として測定し、ここで、
１Ｃ−モル＝モルｘＮｃであり、
式中、Ｎｃは、分子中の炭素原子の数であり、「モル」は、モルで表した物質の量である。
【００５０】
これは、１モルのグルコースが、６Ｃ−モルのグルコースに等しいことを意味する。
【００５１】
発酵槽の炭素バランスを用いて、二酸化炭素供給指数（ＦＱ）をオンラインでモニターする。消失したＣＯ２は、指定の時間間隔にわたり、空気流量の測定と組み合わせた、流入ガス及びオフガスについてガス分析器により測定する。
【００５２】
炭水化物溶液の形態で、指定の時間間隔にわたり発酵槽に投与したＣ−モル炭水化物は、炭水化物の種類、及び例えば、屈折率（ＲＩ）で測定した濃度についてのデータと組み合わせた、容量計量供給速度によって測定する。
【００５３】
好適な時間は、典型的には１秒から２０分、特に１分〜１５分であってよい。
【００５４】
この時間の経過後に、ＣＯ２へと消失したＣ−モルを、添加したＣ−モル炭水化物で割ることにより、ＦＱを算出する。
【００５５】
ＦＱは、プロセスコンピュータにより記録され、ユーザ指定のＦＱ設定値と比較されるが、この点から、炭水化物供給の新たな設定値が計算され、例えば、ＰＩコントローラの使用により自動的に調節される。
【００５６】
ユーザ指定の設定値は、一連の発酵を実施して、そこから最適ＦＱをみいだすことにより決定することができる。最適ＦＱは、典型的に、ＦＱが≧０．２であるとき；特に、ＦＱが、０．２〜０．７５の範囲；例えば、０．２〜０．７の範囲；例えば、０．２５〜０．７５の範囲にあるときである。
【００５７】
発酵は、発酵全体を通し、定ＦＱを用いて実施してもよいし；あるいは、勾配を付けてもよい。勾配がある場合には、典型的に約０．５のＦＱで開始し、約０．７のＦＱで終了してよい。ＦＱは、典型的に、増殖を十分に促進するために、低い値で開始してよい。
【００５８】
ＦＱコントローラの実行は、非常に簡単であり、当分野で現在入手可能な標準的計装で容易に実施可能である。
【００５９】
本発明の基本仮定は、各種の発酵について臨界ＦＱ値が存在することである。この臨界ＦＱ値を下回ると、過剰供給が起こり、関連するオーバーフロー代謝が開始する。
【００６０】
従って、本発明の概念は、ＦＱを設定値に、かつ臨界ＦＱ値（約０．５）を上回って維持するように、炭水化物供給速度をオンラインで制御することにより、過剰供給を自動的に回避すると同時に、必要な増殖及び産物形成を促進することである。
【００６１】
発酵中の過剰供給を回避することが可能である：ＦＱが、予め指定した設定値より低ければ、発酵は過剰投与される（十分な炭素がＣＯ２に変換されていない−一部が代謝されないままであるか、又はオーバーフロー代謝物に変換されている）。ＦＱコントローラを実行すれば、その時点の設定値を下回るＦＱによって、炭水化物供給速度の減少が自動的に起こり、そのため、過剰供給が回避される。
【００６２】
供給を最大化する：ＦＱが、予め指定した設定値を上回っていれば、発酵によって、より多くの供給量を処理することができるため、供給速度が増加する。
【００６３】
発酵槽当たりの目的の化合物の収率を最大化する：最適ＦＱが存在するため、本発明により、このパラメータの最適化が可能になる。
【００６４】
ＦＱコントローラを用いた実験の実施によって、様々なスケールでの本発明の使用が可能であることが判明した。
【００６５】
好気条件を確実にするために、ＦＱ制御を、ＤＯＴ制御のような他の標準的制御方式と組み合わせてもよい：供給速度は、その場合、ＤＯＴ及びＦＱの両方が高い場合にのみ増加するが、ＤＯＴ又はＦＱの一方が低い場合には減少する。
【００６６】
酸素供給指数（ＯＱ）
利用効率は、モル消費酸素（Ｏ２）と、糖供給により添加したＣ−モル炭素の比率（酸素供給指数若しくはＦＱと呼ぶ）として測定する。
【００６７】
発酵槽の元素バランスを用いて、酸素供給指数（ＯＱ）をオンラインでモニターする。消費されたＯは、指定の時間間隔にわたり、空気流量の測定と組み合わせた、流入ガス及びオフガス中の酸素分の差としてガス分析器により測定する。
【００６８】
炭水化物溶液の形態で、指定の時間間隔にわたり発酵槽に投与したＣ−モル炭水化物は、炭水化物の種類、及び例えば、屈折率（ＲＩ）で測定した濃度についてのデータと組み合わせた、容量計量供給速度によって測定する。
【００６９】
好適な時間は、典型的には１秒から２０分、特に１分〜１５分の範囲であってよい。
【００７０】
この時間の経過後に、消費されたモルＯ２を、添加したＣ−モル炭水化物で割ることにより、ＯＱを算出する。
【００７１】
ＯＱは、プロセスコンピュータにより記録され、ユーザ指定のＯＱ設定値と比較されるが、この点から、炭水化物供給の新たな設定値が計算され、自動的に調節される。
【００７２】
ユーザ指定の設定値は、一連の発酵を実施して、そこから最適ＯＱをみいだすことにより決定することができる。最適ＯＱは、典型的に、ＯＱが≧０．２であるとき；特に、ＯＱが、０．２〜０．７５の範囲；例えば、０．２〜０．７の範囲；例えば、０．２５〜０．７５の範囲にあるときである。
【００７３】
発酵は、発酵全体を通し、定ＯＱを用いて実施してもよいし；あるいは、勾配を付けてもよい。勾配がある場合には、典型的に約０．４５のＯＱで開始し、約０．６５のＯＱで終了してよい。
【００７４】
ＯＱコントローラの実行は、非常に簡単であり、当分野で現在入手可能な標準的計装で容易に実施可能である。
【００７５】
本発明の基本仮定は、各発酵について臨界ＯＱ値が存在することである。この臨界ＯＱ値を下回ると、微生物が過量になり始める。
【００７６】
データから、０．４５を下回るＯＱ値のバッチは、過剰投与を被ることがわかっている。従って、本発明の概念は、ＯＱを設定値に、かつ臨界ＯＱ値（例えば、０．４５）を上回って維持するように、炭水化物供給速度をオンラインで制御することによって、過剰供給を自動的に回避することである。
【００７７】
発酵中の過剰供給の自動的回避：ＯＱが、予め指定した設定値より低ければ、発酵は過剰投与される（代謝炭素と消費酸素のバランスが取れていない）。ＯＱコントローラを実行すれば、その時点の設定値を下回るＯＱによって、炭水化物供給速度の減少が自動的に起こり、これにより、過剰供給が回避される。
【００７８】
供給を最大化する：ＯＱが、予め指定した設定値を上回っていれば、発酵によって、より多くの供給量を処理することができるため、供給速度が増加する。
【００７９】
発酵槽当たりの目的の化合物の収率を最大化する：最適ＯＱが存在するため、本発明により、このパラメータの最適化が可能になる。
【００８０】
ＯＱコントローラを用いた実験の実施により、試験及び生産において同じ活性レベルに達することが可能であることが判明した。
【００８１】
ＯＱ制御ＤＯＴ制御のような他の標準的制御方式と組み合わせてもよい：供給速度は、その場合、ＤＯＴ及びＯＱの両方が高い場合にのみ増加するが、ＤＯＴ又はＯＱの一方が低い場合には供給速度は減少する。
【００８２】
ＦＱ制御とＯＱ制御は、通常併用しない。目的の発酵に応じて−試験を実施し−最良の結果をもたらす制御を選択する。
【００８３】
目的の化合物の回収
本発明のさらに別の形態は、発酵ブロスの下流処理に関する。発酵プロセスが終わった後、目的の化合物のために開発された標準的技術を用いて、発酵ブロスから目的の化合物を回収してよい。
【００８４】
適用しようとする関連の下流処理技術は、目的の化合物の性質に応じて異なる。
【００８５】
発酵槽から目的の化合物を回収する方法は、典型的に（しかし、これに限定されない）以下のステップの一部又は全部を含む：
１）ブロスの前処理（凝集）
２）ブロスからの細胞及び他の固体材料の除去（一次分離）
３）濾過
４）濃縮
５）安定化及び標準化
【００８６】
上に挙げたユニット操作以外に、多数の他の回収方法及びステップを適用してもよく、例えば、ｐＨ調節、温度変更、結晶化、活性炭素による目的の化合物を含む溶液の処理、クロマトグラフィーの使用、及び各種吸着剤の使用がある。
【００８７】
以下の実施例で本発明をさらに詳しく説明するが、実施例を、請求される本発明の範囲に何ら限定する意図はない。
【実施例】
【００８８】
実施例１
プロセス頑健性及び酵素産生を増加するために実行されるＦＱ及びＯＱ制御を用いた、プルラナーゼを発現するバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の流加発酵
材料及び方法
株及び増殖条件
すべての実験において、プルラナーゼ（バチルス・アシドプルリチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）プルラナーゼ−国際公開番号０９／０７５６８２号パンフレットに記載のプルラナーゼ３）を発現するバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を用いた。
【００８９】
貯蔵のために、培地を３７℃のＬＢブロス中で増殖させ、グリセロールを１５％（ｗ／ｖ）の最終濃度まで添加した。
【００９０】
懸濁物を１ｍｌクライオチューブに分け、−７０℃より低い温度で維持した。
【００９１】
接種のために、０．１ｍｌの解凍したクライオチューブ懸濁物を、下記の組成物と一緒にＳＳＢ４斜面培地に塗布した：ダイズペプトンＳＥ５０ＭＫ１０ｇ／ｌ、スクロース１０ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ２ｇ／ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  ５ｇ／ｌ、ビタミン（チアミン−ヒドロクロリド１１．４ｍｇ／ｌ、リボフラビン０．９５ｍｇ／ｌ、ニコチンアミド７．８ｍｇ／ｌ、カルシウムＤ−パントテネート９．５ｍｇ／ｌ、ピリドキサル−ＨＣｌ  １．９ｍｇ／ｌ、Ｄ−ビオチン０．３８ｍｇ／ｌ、葉酸２．９ｍｇ／ｌ）、微量金属（ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ９．８ｍｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ３９．３ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ３．９ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ８．２ｍｇ／ｌ）、寒天２５ｇ／ｌ。脱イオン水を用い、ＮａＯＨでｐＨをｐＨ７．３〜ｐＨ７．４に調節した後、培地を滅菌した。
【００９２】
細胞を３７℃にて２４時間寒天上で増殖させた後、滅菌脱イオン水に再懸濁させ、これを用いて、呼び容積２０ｌの種発酵槽に接種した。
【００９３】
種発酵槽に、１５ｌの複合増殖培地を下記の組成物と一緒に用いた（滅菌後）：粗挽きダイズ１１０ｇ／ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  ５ｇ／ｌ。飲用水を用いて、培地を調製した。接種前に、アンモニア水又はＨ３ＰＯ４でｐＨを７．０に調節した。発酵中、給気を１．５ｖｖｍに制御し、温度を３７℃に制御し、背圧を１ａｔｍに制御し、撹拌を１０００ｒｐｍに制御した。全酸素吸収が、任意の値である２．６モルに達したとき、種培養を停止した。主要発酵槽を各々１０％（ｗ／ｖ）の種培養物で接種した。
【００９４】
発酵条件
出発用量８ｌの３つの発酵バッチ（バッチＸ，バッチＹ及びバッチＺ）を種発酵槽から接種した。
【００９５】
発酵培地は、下記のものを含んだ（接種前及び滅菌後）：ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ４ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ７  ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  ７ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ４ｇ／ｌ、Ｋ２ＳＯ４  ５ｇ／ｌ、クエン酸０．７８ｇ／ｌ、ビタミン（Ｄ−ビオチン１．２５ｍｇ／ｌ）、微量金属（ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ  ３９．２ｍｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ  １５７ｍｇ／ｌ；ＣｕＳＯ４、５Ｈ２Ｏ  １５．６ｍｇ／ｌ；ＺｎＳＯ４、７Ｈ２Ｏ  ３２．８ｍｇ／ｌ）、消泡剤（ＳＢＦ２１２１）１．２５ｍｌ／ｌ、スクロース１０ｇ／ｌ（バッチＸのみ）。飲用水を用いて、培地を調製した。接種前に、アンモニア水又はＨ３ＰＯ４でｐＨを６．０に調節した。培養中、温度を３７℃に制御し、最小ｐＨを６．０に調節し（アンモニア水）、最大ｐＨを７．０に調節し（Ｈ３ＰＯ４）、撹拌を８００ｒｐｍ（０ｈ）に設定した後、１０００ｒｐｍまで勾配を付け（１時間）、給気を１．５ｖｖｍに制御し、背圧を１ａｔｍに制御した。
【００９６】
供給培地として６５０ｇ／ｌのスクロース溶液を用いたが、これは、飲用水で調製した後、滅菌した。
【００９７】
３つの流加発酵プロセスを以下に記載するように実施した：
【００９８】
バッチＸ：初期バッチフェーズ、続いて、溶存酸素（ＤＯＴ）制限栄養素供給（ＰＩ制御）を行う流加バッチ。供給は、初期糖の枯渇を示す二酸化炭素発生の低下後に開始した。ＤＯＴ制御のための設定値は２０％に設定した（図６参照）。
【００９９】
バッチＹ：発酵の開始からＦＱ制御（ＰＩ制御）栄養素供給を行う流加バッチ。コントローラの設定値は、予め定めたプロフィールに従った（図３参照）。
【０１００】
バッチＺ：発酵の開始からＯＱ制御（ＰＩ）栄養素供給を行う流加バッチ。コントローラの設定値は、予め定めたプロフィールに従った（図４参照）。
【０１０１】
全３つの流加バッチにおいて、スクロースをバッチＸに初期炭素源として添加した以外、培地成分及び培地濃度は、このタイプのプロセスの一般に容認されている標準実施と同じである。これは、新規のプロセスタイプであるＹ＆Ｚには必要ではなく、従って、供給は、接種直後に開始した。
【０１０２】
発酵プロセスを通じて、乾燥重量測定について３つのサンプルと、酵素活性及びアトライン（ａｔ−ｌｉｎｅ）ｐＨについて単一サンプルを毎日採取した。活性分析のＣＶは３．２％未満である。制御ループは、分散制御システムＤｅｌｔａＶ（（登録商標）Ｅｍｅｒｓｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ）内に延びており、データ取得は、全パラメータについて同じシステム内で、オンラインで実施した。同様に、ＦＱ、ＯＱ及びＤＯＴ栄養素供給コントローラをＤｅｌｔａＶ（（登録商標）Ｅｍｅｒｓｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ）で実施した。質量分析計により、ＣＯ2及びＯ2のオフガス測定をオンラインで実施した。
【０１０３】
結果
ＦＱ制御（バッチＹ）及びＯＱ制御（バッチＺ）を用いたバッチは、当分野で公知の標準発酵栄養素供給方法を用いたバッチ（バッチＸ）より、有意に高い酵素力価を達成した。発酵プロセスの終了時に、バッチＹは、バッチＸの最も高いレベルより２０％高い酵素力価を有した。同様に、バッチＺは、バッチＸの最も高いレベルより６０％高い力価に達した（図１参照）。
【０１０４】
加えて、ＦＱ（バッチＹ）及びＯＱ（バッチＺ）により制御される発酵プロセスは、より高いバイオマスレベルを促進した。発酵プロセスの終了時に、バッチＹ及びバッチＺの両方が、バッチＸで得られた最も高いレベルより２０％高いバイオマスレベルを有した。
【０１０５】
栄養素供給速度の自動操作によるＦＱ及びＯＱの制御は、全発酵プロセスを通して非常に正確であり、そのため、プロセス値は、予め定めた設定値プロフィールとほぼ一列に並んだ（図３及び図４参照）。
【０１０６】
発酵プロセスの終了時に、バッチＹでは約４５時間、またバッチＺでは約４０時間後に、ＦＱ及びＯＱの突然の降下が起こった。この降下は、発酵バッチが、その代謝速度を突然落としたため、過剰供給の危険性があることを示している。しかし、ＦＱ及びＯＱコントローラは、供給速度を調節し、これを、新たな培養条件に適した、より低いレベルまで自動的に低下させる（図５参照）。
【０１０７】
その結果、発酵プロセスの制御が維持され、ＦＱ及びＯＱパラメータは、幾分かの変動を経て、設定値プロフィールに戻った（それぞれ図３及び図４参照）。
【０１０８】
標準実施方法を実行する発酵バッチ（バッチＸ）では、ＤＯＴレベルは、２５時間まで発酵への栄養素供給速度により正確に制御される。
【０１０９】
この時点で、過剰供給に関連する代謝の問題が起こり、ＤＯＴが突然上昇する。これは、バッチＹ及びバッチＺにおいて認められたものと類似している。この問題は、バッチＹ及びバッチＺと比較して、バッチＸでほぼ２０時間速く起こった。標準実施方法では、ＤＯＴ制御供給速度を用いているため、ＤＯＴ上昇に応答して、コントローラが供給速度を増加した（図５）。これは、供給速度が供給ポンプの最大能力に達するまで続き、残りのプロセスでは、ＤＯＴがプロセス設定値を上回った。このように、異なる制御戦略によって生理的条件に対する応答は根本的に異なる：過剰供給後、ＦＱ及びＯＱコントローラは、供給速度を自動的に減少させ、ＦＱ及びＯＱが、それぞれの設定値に戻るとプロセス制御を維持する（それぞれ、図３及び図４参照）が、ＤＯＴ制御は、供給速度を高め、プロセスをもはや制御することができない状態にまで至らせる（図６参照）。
【０１１０】
結論
標準発酵方法（バッチＸ）を、２つの制御戦略；それぞれバッチＹ及びバッチＺにおけるＦＱ及びＯＱを評価するための比較として用いた。
【０１１１】
結果から、これらの新規制御戦略の使用によって、より頑健な発酵プロセスが促進されることが明らかであり、このプロセスでは、発酵全体を通してプロセス制御を維持することができる。第２に、生理的変化は、ＦＱ及びＯＱ制御により制御されるバッチではるかに遅れて起こり、バッチＸよりほぼ２０時間遅く起こる。最後に、ＦＱ及びＯＱ制御バッチは、当分野では公知の標準方法を実施するプロセスより有意に高い最終力価及びバイオマスレベルを達成する。
【０１１２】
実施例２
ＯＱ制御グルコース供給速度を用いた、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の流加発酵
材料及び方法
株及び増殖条件
この実験では、商品名：ＥｔｈａｎｏｌＲｅｄ（登録商標）のサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母を用いた。
【０１１３】
貯蔵：顆粒化乾燥酵母をプラスチック容器中に５℃で維持した。
【０１１４】
単一コロニーの選択：顆粒をＹＰＤ寒天上に塗布し、３０℃で３日インキュベートした。ＹＰＤ寒天は、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、バクトペプトン２０ｇ／Ｌ、デキストロース３０ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌを含有した。
【０１１５】
ＹＰＤ寒天での増殖：単一のコロニーをＹＰＤ寒天から採取し、Ｍ９バッファーに溶解させた。次に、細胞含有バッファー溶液をＹＰＤ寒天に塗布し（φ＝１１ｃｍ）、３０℃で３日インキュベートした。１００ｍｌの０．１％Ｔｗｅｅｎ溶液を用いて、φ＝１１ｃｍＹＰＤ寒天からすべての細胞をこそぎ落とすことにより、１００ｍｌの接種材料を取得し、これを種発酵槽に移した。
【０１１６】
種発酵槽条件
呼び容積が２０リットルで、１０リットルの滅菌培地を含有する種発酵槽に、５０ｍｌの接種材料を接種した。
【０１１７】
種増殖培地は、接種前に下記のものを含有していた：グルコース２７．３ｇ／Ｌ、バクトペプトン２０ｇ／Ｌ、バクト酵母エキス１０ｇ／Ｌ、Ｈ２ＳＯ４（９６％）２ｍｌ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ９ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  １４．３ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ８ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １．３ｇ／Ｌ、微量金属（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ３７ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  １８ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １７７ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・１Ｈ２Ｏ  １０７ｍｇ／Ｌ）、Ｈ３ＰＯ４０．６ｇ／Ｌ、Ｄｏｗｆａｘ６３ｎ１０  １ｍｌ／Ｌ、ビタミン溶液（ｍ−イノシトール、１．９６ｇ／Ｌ、コリンクロリド０．９８ｇ／Ｌ、チアミンクロリド０．１９６ｇ／Ｌ、ピリドキシン（Ｂ６ビタミン）０．１９６ｇ／Ｌ、ニアシンアミド（ニコチンアミド）０．１９６ｇ／Ｌ、ｄ−Ｃａ−パントテナト０．１４７ｇ／Ｌ、Ｄ−ビオチン０．００９８ｇ／Ｌ、葉酸０．００９８ｇ／Ｌ）。滅菌前にＨ３ＰＯ４によりｐＨを５．５に調節した。ビタミン溶液及びグルコース溶液（６６％ｗ／ｗ）を滅菌濾過して、種混合物の滅菌後のバッチに導入した。飲用水を用いて培地を調製した。接種前に、アンモニアガス（ＮＨ３）でｐＨを５．５に調節した。
【０１１８】
種発酵中、給気を１．２ＶＶＭに維持し、温度を３２℃に制御し、背圧を１．３バールに制御し、撹拌を０時間の６００ＲＰＭから、６時間の９００ＲＰＭまで勾配を付け、その後最後まで９００ＲＰＭに維持した。種発酵を２４時間後に停止し、約１００ｍｌを各主要発酵層に移した。
【０１１９】
主要発酵条件
呼び容積が２０リットルで、５リットルの出発容量を有する種発酵槽を種発酵槽からの１００ｍｌで接種した。接種前に、発酵培地は、５．３ｇ／Ｌの低グルコース濃度以外は種発酵と同じものを含有していた。
【０１２０】
培養中、温度を３２℃に制御し、撹拌を０時間の６００ＲＰＭから、６時間の９００ＲＰＭまで勾配を付け、給気を１２Ｌ／分に維持し、背圧を１．３バールに制御した。６６０ｇ／ｌのグルコース溶液を供給培地として用いたが、これは、飲用水で調製し、滅菌したものである。最大ｐＨをＮＨ３で５．５に維持し、ＤＯＴは２００ｍｍＨｇを決して下回らなかった（飽和の約４０％）。グルコース供給は、ＯＱ設定値０．３の発酵の開始からＯＱ制御（ＰＩ制御）した。
【０１２１】
制御ループはすべて、制御システムＰｒｏｃｏｓ  ＩＩ内に延びており、データ取得は、全パラメータについて同じシステムで、オンラインで実施した。同様に、ＯＱ栄養素供給コントローラをＰｒｏｃｏｓ  ＩＩで実施した。ＣＯ2及びＯ2のオフガス測定は、光音響ガス分析器によってオンラインで実施した。
【０１２２】
結果
発酵は、０〜４時間のバッチフェーズを有し、ここで、主要ミックスからの過剰グルコース（５．３ｇ／Ｌ）が消費された。培養物がグルコース制限されたこの初期段階後、ＯＱコントローラは、０．３の設定値でＯＱを制御した。終点付近でＯＱ設定値を超えるわずかな増加（０．０５）があった（図７を参照）が、これは、ＯＱコントローラにおけるＰＩパラメータの控え目過ぎる調整によって説明することができる。それでも、グルコース供給速度は、酵母培養物の天然の対数増殖に従い増加した（図８を参照）。
【０１２３】
結論
ＯＱコントローラは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の発酵中の必要性及び制限に応じて、グルコース供給速度を自動的に調節することができ、これにより、過剰代謝の危険性なしに増殖速度を最適化することが判明した。
【０１２４】
実施例３
ＯＱ制御ラクトース供給速度を用いた、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の流加発酵
材料及び方法
株及び増殖条件
この実験では、セルロース分解酵素を産生する非ＧＭＯトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）を用いた。
【０１２５】
貯蔵：バイアルを−８０℃で維持した。
【０１２６】
ＰＤＡ寒天上での増殖：固化斜面寒天を含む５０ｍｌ  Ｍチューブ中に、３０℃で１０〜１６日胞子を発生させた。注射器及び１０ｍｌの転写バッファー（Ｍ９−バッファー）を用いて、胞子をこそぎ落とすことにより胞子を回収した。得られた懸濁液の３ｍｌを無菌状態で種発酵槽に移した。
【０１２７】
種発酵槽条件
呼び容積が２０リットルで、１０ｋｇの滅菌増殖培地を含有する種発酵槽を３ｍＬの接種材料で接種した。種発酵は、７０時間のバッチフェーズから成るものであった。
【０１２８】
種増殖培地は、接種前に下記のものを含有していた：
スクロース５０ｇ／Ｌ、コーンスティープ粉末６．２５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ４ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ６．３５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４，７Ｈ２Ｏ  ２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２  ０．５３ｇ／Ｌ、消泡オイル（Ｄｏｗｆａｘ  ６３ｎ１０）１．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４，７Ｈ２Ｏ  ０．００２５ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４，Ｈ２Ｏ  ０．００１６ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４，７Ｈ２Ｏ  ０．００１４ｇ／Ｌ。増殖培地のｐＨは滅菌前に、４．８８であった。滅菌後、ＮＨ３でｐＨを５．０に調節した。
【０１２９】
バッチフェーズの間、ｐＨは低下し、７０時間でｐＨは４．２まで下がったが、これは、移行のシグナルであった。給気８Ｌ／分、背圧０．５バール及び撹拌６００〜７５０ｒｐｍにより、ＤＯＴを維持した。温度は２５℃であった。１．２ｋｇの種培養物を主要発酵層に移した。
【０１３０】
主要発酵条件
呼び容積が２０リットルで、１０ｋｇの滅菌増殖培地を含む主要発酵槽を、１．２ｋｇの種培養物で接種した。
【０１３１】
種増殖培地は、接種前に下記のものを含有していた：
コーンスティープ粉末６．２５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ４ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ６．３５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４，７Ｈ２Ｏ  ２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２  ０．５３ｇ／Ｌ、消泡オイル（Ｄｏｗｆａｘ  ６３ｎ１０）１．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４，７Ｈ２Ｏ  ０．００２５ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４，Ｈ２Ｏ  ０．００１６ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４，７Ｈ２Ｏ  ０．００１４ｇ／Ｌ。増殖培地のｐＨは滅菌前に、５．０８であった。滅菌後、Ｈ３ＰＯ４でｐＨを４．５に調節した。
【０１３２】
発酵中、温度を２５℃に制御し、撹拌は９５０〜１１００ＲＰＭであり、給気は０．８〜１．２ｖｖｍ、背圧は１．３バールであった。２０％ｗ／ｗのラクトース溶液を供給培地として用いた。ＮＨ３ガスでｐＨを４．５に調節した。ＤＯＴは、６０ｍｍＨｇの最小設定値を決して下回らなかった。ラクトース供給を接種直後に開始し、０時間で０．４５及び７０時間で０．６の勾配ＯＱ設定値を用いて、ＯＱ制御した。ラクトース供給は、最大供給速度１５２ｍｌ／時に相当する１．５の固定ｒｐｍを有する蠕動ポンプによって添加した。ＯＱ調節装置によって指令される平均供給速度は、６０秒の所定サイクル時間内のパルス時間の自動調節によって達成した。消泡オイル（Ｐ２０００）を３時間毎に１．５ｍｌのパルスで発酵槽に予防的に添加した。
【０１３３】
制御ループはすべて、制御システムＰｒｏｃｏｓ  ＩＩ内に延びており、データ取得は、全パラメータについて同じシステム内で、オンラインで実施した。ＣＯ2及びＯ2のオフガス測定は、光音響ガス分析器によってオンラインで実施した。
【０１３４】
結果
主要発酵は、ラクトース供給速度を０時間から７０時間まで増加したＯＱコントローラによって調節することに成功した（図９及び図１０参照）。ＯＱは、４時間まで設定値勾配をやや下回ったが、その後、設定値勾配に維持した。セルラーゼ測定値により、プロセスの間、酵素が生成された（７１時間で指数１００）ことが確認される（図１１参照）。
【０１３５】
結論
ＯＱコントローラは、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の発酵中の必要性及び制限に応じて、ラクトース供給速度を自動的に調節することができ、これにより、指定された代謝状態を維持することが判明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006306519.tif 000009
【図９】
0006306519.tif 000010
【図１０】
0006306519.tif 000011
【図１１】
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