(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のリコンビナーゼ認識配列と、野生型の対象遺伝子と、第２のリコンビナーゼ認識配列と、をこの順に有する発現ベクターを、
前記対象遺伝子に変異を有し野生型とは異なる表現型を示す非ヒト動物であって、ＥＳ細胞が樹立されていない非ヒト動物の受精卵、又は前記対象遺伝子を欠失しており野生型とは異なる表現型を示す非ヒト動物であって、ＥＳ細胞が樹立されていない非ヒト動物の受精卵に導入する工程と、
前記受精卵を培養してトランスジェニック非ヒト動物を得る工程と、
を備える、前記表現型がレスキューされたトランスジェニック非ヒト動物の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の製造方法によりトランスジェニック非ヒト動物を製造し、次いで、当該トランスジェニック非ヒト動物に、リコンビナーゼを時期特異的又は組織特異的に作用させ、導入された野生型の前記対象遺伝子を時期特異的又は組織特異的に欠失させる工程を備える、前記対象遺伝子が時期特異的又は組織特異的に変異又は欠失した遺伝子改変非ヒト動物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック非ヒト動物及びその製造方法、遺伝子改変非ヒト動物及びその製造方法、並びに発現ベクター製造用ベクター及び発現ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子機能の解析には、ＥＳ細胞を用いて作製されたノックアウトマウスが広く用いられている。また、時期特異的又は組織特異的な遺伝子機能の解析には、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステム等のリコンビナーゼ／リコンビナーゼ認識配列システムを用いたコンディショナルノックアウトマウスが用いられている（例えば、非特許文献１を参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Nagy A., Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring, Genesis, 26(2), 99-109, 2000.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ノックアウトマウスやコンディショナルノックアウトマウスの作製は、多大なコストを要し、また、ＥＳ細胞の培養技術やキメラマウスの作製技術等の特殊な技術や専用の施設が必要であるため、小規模な研究施設でも実施できる一般的な解析手段にはなっていない。
【０００５】
また、ノックアウトマウスやコンディショナルノックアウトマウスの作製には、順調に進行した場合においても２〜３年程度の時間がかかり、実際には研究ごとに個別の問題が生じるため、目的の解析を行うまでに倍程度の時間が必要とされる。このため、短時間に、高効率で、低コストに時期特異的又は組織特異的な遺伝子の機能を解析できる新規の方法の確立が望まれている。
【０００６】
また、コンディショナルノックアウトマウスの作製にはＥＳ細胞が必要とされるが、現在生殖細胞系列に分化することができるＥＳ細胞のほとんどが１２９系マウス由来のＥＳ細胞であるため、１２９系マウス以外の、特定の系統のマウスのみにおいて特異的な表現型が確認される遺伝子の機能を解析することはできないという問題があった。
【０００７】
そこで、本発明は、より簡便に時期特異的又は組織特異的な遺伝子機能の解析を行うことができ、ＥＳ細胞が樹立されていない動物にも適用することができる、非ヒト動物の製造方法を提供することを目的とする。本発明はまた、上記の製造方法により製造された非ヒト動物、上記の製造方法に用いられる発現ベクター及び当該発現ベクター製造用ベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の通りである。
（１）第１のリコンビナーゼ認識配列と、野生型の対象遺伝子と、第２のリコンビナーゼ認識配列と、をこの順に有する発現ベクターを、前記対象遺伝子に変異を有し野生型とは異なる表現型を示す非ヒト動物であって、ＥＳ細胞が樹立されていない非ヒト動物の受精卵、又は前記対象遺伝子を欠失しており野生型とは異なる表現型を示す非ヒト動物であって、ＥＳ細胞が樹立されていない非ヒト動物の受精卵に導入する工程と、前記受精卵を培養してトランスジェニック非ヒト動物を得る工程と、を備える、前記表現型がレスキューされたトランスジェニック非ヒト動物の製造方法。
（２）第１のリコンビナーゼ認識配列と、野生型の対象遺伝子と、第２のリコンビナーゼ認識配列とをこの順に有するトランスジーンを有するトランスジェニック非ヒト動物であって、表現型が野生型であり、内在性の前記対象遺伝子は、変異を有しているか又は欠失しており、前記非ヒト動物はＥＳ細胞が樹立されていない動物である、トランスジェニック非ヒト動物。
（３）（２）に記載のトランスジェニック非ヒト動物に、リコンビナーゼを時期特異的又は組織特異的に作用させ、導入された野生型の前記対象遺伝子を時期特異的又は組織特異的に欠失させる工程を備える、前記対象遺伝子が時期特異的又は組織特異的に変異又は欠失した遺伝子改変非ヒト動物の製造方法。
（４）第１のリコンビナーゼ認識配列と、野生型の対象遺伝子と、第２のリコンビナーゼ認識配列とをこの順に有するトランスジーンを有するトランスジェニック非ヒト動物であって、内在性の前記対象遺伝子は、変異を有しているか又は欠失しており、前記非ヒト動物はＥＳ細胞が樹立されていない動物であり、前記トランスジーンにおける前記対象遺伝子が時期特異的又は組織特異的に欠失した、遺伝子改変非ヒト動物。
（５）（１）に記載の製造方法に用いられる発現ベクターの製造用ベクターであって、第１のリコンビナーゼ認識配列と、プロモーターと、レスキューカセットと、第２のリコンビナーゼ認識配列と、をこの順に有し、前記レスキューカセットがマルチクローニングサイトを有する、ベクター。
（６）前記レスキューカセットが、マルチクローニングサイトと、蛍光タンパク質遺伝子と、をこの順に有する、（５）に記載のベクター。
（７）前記レスキューカセットが、マルチクローニングサイトと、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列と、蛍光タンパク質遺伝子と、をこの順に有する、（５）に記載のベクター。
（８）前記レスキューカセットが、蛍光タンパク質遺伝子と、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列と、マルチクローニングサイトと、をこの順に有する、（５）に記載のベクター。
（９）（１）に記載の製造方法に用いられる発現ベクターであって、第１のリコンビナーゼ認識配列と、プロモーターと、レスキューカセットと、第２のリコンビナーゼ認識配列と、をこの順に有し、前記レスキューカセットが野生型の対象遺伝子を有する、発現ベクター。
（１０）前記レスキューカセットが、野生型の前記対象遺伝子にコードされるタンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を有する、（９）に記載の発現ベクター。
（１１）前記レスキューカセットが、野生型の前記対象遺伝子と、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列と、蛍光タンパク質遺伝子と、をこの順に有する、（９）に記載の発現ベクター。
（１２）前記レスキューカセットが、蛍光タンパク質遺伝子と、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列と、野生型の前記対象遺伝子と、をこの順に有する、（９）に記載の発現ベクター。
（１３）（１）に記載の製造方法に用いられる発現ベクターの製造用ベクターであって、プロモーターと、第１のリコンビナーゼ認識配列と、レスキューカセットと、第２のリコンビナーゼ認識配列と、第１の蛍光タンパク質遺伝子と、をこの順に有し、前記レスキューカセットがマルチクローニングサイトを有する、ベクター。
（１４）前記レスキューカセットが、マルチクローニングサイトと、第２の蛍光タンパク質遺伝子と、をこの順に有する、（１３）に記載のベクター。
（１５）前記レスキューカセットが、マルチクローニングサイトと、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列と、第２の蛍光タンパク質遺伝子と、をこの順に有する、（１３）に記載のベクター。
（１６）前記レスキューカセットが、第２の蛍光タンパク質遺伝子と、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列と、マルチクローニングサイトと、をこの順に有する、（１３）に記載のベクター。
（１７）（１）に記載の製造方法に用いられる発現ベクターであって、プロモーターと、第１のリコンビナーゼ認識配列と、レスキューカセットと、第２のリコンビナーゼ認識配列と、第１の蛍光タンパク質遺伝子と、をこの順に有し、前記レスキューカセットが、野生型の対象遺伝子を有する、発現ベクター。
（１８）前記レスキューカセットが、野生型の前記対象遺伝子にコードされるタンパク質と第２の蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を有する、（１７）に記載の発現ベクター。
（１９）前記レスキューカセットが、野生型の前記対象遺伝子と、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列と、第２の蛍光タンパク質遺伝子と、をこの順に有する、（１７）に記載の発現ベクター。
（２０）前記レスキューカセットが、第２の蛍光タンパク質遺伝子と、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列と、野生型の前記対象遺伝子と、をこの順に有する、（１７）に記載の発現ベクター。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、より簡便に時期特異的又は組織特異的な遺伝子機能の解析を行うことができ、ＥＳ細胞が樹立されていない動物にも適用することができる、非ヒト動物の製造方法を提供することができる。また、上記の製造方法により製造された非ヒト動物、上記の製造方法に用いられる発現ベクター及び当該発現ベクター製造用ベクターを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ、発現ベクター製造用ベクター（１−１）〜（１−４）の構造を示す模式図である。図中、「ＭＣＳ」はマルチクローニングサイトを意味し、「Ｉｒｅｓ」は、Ｉｒｅｓ配列を意味する。
【図２】（ａ）〜（ｄ）は、発現ベクター（１−１）〜（１−４）の構造を示す模式図である。図中、「融合蛍光タンパク質遺伝子」は、野生型の対象遺伝子にコードされるタンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を意味する。
【図３】（ａ）〜（ｄ）は、発現ベクター製造用ベクター（２−１）〜（２−４）の構造を示す模式図である。
【図４】（ａ）〜（ｄ）は、発現ベクター（２−１）〜（２−４）の構造を示す模式図である。
【図５】（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ、対照群及び試験群のＥＳ細胞を撮影した蛍光顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［トランスジェニック非ヒト動物の製造方法］
１実施形態において、本発明は、第１のリコンビナーゼ認識配列と、野生型の対象遺伝子と、第２のリコンビナーゼ認識配列と、をこの順に有する発現ベクターを、前記対象遺伝子に変異を有し野生型とは異なる表現型を示す非ヒト動物又は前記対象遺伝子を欠失しており野生型とは異なる表現型を示す非ヒト動物の受精卵に導入する工程と、前記受精卵を培養してトランスジェニック非ヒト動物を得る工程と、を備える、前記表現型がレスキューされたトランスジェニック非ヒト動物の製造方法を提供する。
【００１２】
本実施形態の製造方法により、対象遺伝子に変異を有し野生型とは異なる表現型を示す非ヒト動物、又は前記対象遺伝子を欠失しており野生型とは異なる表現型を示す非ヒト動物に、野生型の対象遺伝子を導入し、上記の表現型がレスキューされ、野生型の表現型を示すトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。
【００１３】
後述するように、上記のトランスジェニック非ヒト動物に導入した野生型の対象遺伝子を、時期特異的又は組織特異的に欠失させることにより、対象遺伝子の時期特異的又は組織特異的な機能を解析することができる。
【００１４】
トランスジェニック非ヒト動物は、部位特異的な相同組換え等を行う必要がなく、ＥＳ細胞を使用しなくても作製できる点で、ノックアウト非ヒト動物やコンディショナルノックアウト非ヒト動物よりもはるかに容易に作製することができる。本実施形態の製造方法は、トランスジェニック非ヒト動物を作製できれば実施することができるため、より簡便に実施することができ、ＥＳ細胞が樹立されていない動物にも適用することができる。
【００１５】
（非ヒト動物）
本実施形態の製造方法により、トランスジェニック非ヒト動物を作製する対象となる非ヒト動物としては、特に制限されず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、サル、ニワトリ等が挙げられる。ただし、対象遺伝子に変異を有すること、又は対象遺伝子を欠失していることにより、野生型とは異なる表現型を示すことが明らかになっている非ヒト動物である必要がある。本実施形態の製造方法では、このような非ヒト動物に野生型の対象遺伝子を導入することにより、表現型がレスキューされ、野生型の表現型を示すトランスジェニック非ヒト動物を作製する。
【００１６】
本実施形態の製造方法は、例えば、従来の研究で得られた数多くの疾患モデルマウスに適用することができる。これにより、現在まだ解明されていない、数多くの疾患モデルマウスの原因遺伝子に対する、時期特異的又は組織特異的な遺伝子機能の解析を短時間で行うことが可能となる。
【００１７】
（リコンビナーゼ認識配列）
本明細書において、「リコンビナーゼ認識配列」とは、特定のリコンビナーゼがリコンビナーゼ認識配列を認識し、その部分でＤＮＡの組換えを起こす現象を利用した、いわゆるリコンビナーゼ／リコンビナーゼ認識配列システムにおけるリコンビナーゼ認識配列を意味する。また、本明細書において、用語「塩基配列」は、当該塩基配列からなる核酸を意味する場合がある。
【００１８】
リコンビナーゼ／リコンビナーゼ認識配列システムとしては、例えば、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅリコンビナーゼと、Ｃｒｅリコンビナーゼが認識する３４塩基対のｌｏｘＰ配列を利用したＣｒｅ／ｌｏｘＰシステム、酵母由来のＦＬＰリコンビナーゼと、ＦＬＰリコンビナーゼが認識するＦＲＴ配列を利用したＦＬＰ／ＦＲＴシステム、ジゴサッカロマイセス・ロキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）由来のＲリコンビナーゼと、Ｒリコンビナーゼが認識するＲＳ配列を利用したＲ／ＲＳシステム等が挙げられる。したがって、本実施形態の製造方法で用いるリコンビナーゼ認識配列としては、ｌｏｘＰ配列、ＦＲＴ配列、ＲＳ配列等が挙げられる。
【００１９】
ｌｏｘＰ配列としては、５’−ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ−３’（配列番号１）で表される塩基配列のほか、例えば、Siegel R. W., et al., Using an in vivo phagemid system to identify non-compatible loxP sequences, FEBS Lett., 505, 467-473, 2001.に記載された、５’−ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＴＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ−３’（ｌｏｘ５１１、配列番号２）、５’−ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＧＡＴＡＣＴＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ−３’（ｌｏｘ２２７２、配列番号３）、５’−ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ−３’（ｌｏｘＦＡＳ、配列番号４）等の変異ｌｏｘＰ配列等を使用することができる。
【００２０】
ＦＲＴ配列としては、例えば、５’−ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ−３’（配列番号５）等の塩基配列を使用することができる。
【００２１】
ＲＳ配列としては、例えば、５’−ＴＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡＡＴＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＴＴＣＡＴＣＡＡ−３’（配列番号６）等の塩基配列を使用することができる。
【００２２】
ゲノム上にリコンビナーゼ認識配列が存在しても、特定のリコンビナーゼが存在しない限り組換えは起きない。したがって、例えば、リコンビナーゼを時期特異的又は組織特異的に発現する非ヒト動物と、リコンビナーゼ認識配列が導入された同種の非ヒト動物とを交配させることにより、そのＦ１動物において、リコンビナーゼによる組換えを時期特異的又は組織特異的に生じさせることができる。
【００２３】
（発現ベクター）
本実施形態の製造方法で用いる発現ベクターは、第１のリコンビナーゼ認識配列と、野生型の対象遺伝子と、第２のリコンビナーゼ認識配列とをこの順に有し、野生型の対象遺伝子を発現させることができるものであれば特に制限されない。本発現ベクターを、野生型とは異なる表現型を示す上記の非ヒト動物に導入し、野生型の対象遺伝子を発現させることにより、非ヒト動物の表現型がレスキューされ、野生型の表現型を示すトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。
【００２４】
第１のリコンビナーゼ認識配列と第２のリコンビナーゼ認識配列は、上述したリコンビナーゼ／リコンビナーゼ認識配列システムが作動した場合に、野生型の対象遺伝子が切り出されるように配置することが好ましい。したがって、第１のリコンビナーゼ認識配列と第２のリコンビナーゼ認識配列は、野生型の対象遺伝子を挟んで同方向に配置することが好ましい。これにより、リコンビナーゼを作用させた組織において、導入した野生型の対象遺伝子を欠失させることができる。
【００２５】
発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
【００２６】
上記の発現ベクターにおいて、対象遺伝子の発現用プロモーターとしては特に制限されず、例えば、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−ｔｋプロモーター等を使用することができる。
【００２７】
上記の発現ベクターは、更に、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点等を有していてもよい。
【００２８】
上記発現ベクターを、例えば、顕微鏡下でマイクロキャピラリー等を用いて非ヒト動物から採取した受精卵前核に注入し、その受精卵をレシピエント動物の卵管内に移植する。続いて、発生した個体から、体細胞及び生殖細胞中に対象遺伝子が組み込まれた個体を選別することにより、目的とするトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。
【００２９】
また、生殖細胞に対象遺伝子が組み込まれた個体を、野生型の非ヒト動物と交配させることにより得られたＦ１動物から、ヘテロ接合体を得ることができる。更に、上記のヘテロ接合体同士を交配させ、得られたＦ１動物から、ホモ接合体を得ることができる。
【００３０】
ヘテロ接合体又はホモ接合体の選択は、例えば、Ｆ１動物から採取した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲ法によりスクリーニングすることにより行うことができる。
【００３１】
［トランスジェニック非ヒト動物］
１実施形態において、本発明は、上述した製造方法により製造されたトランスジェニック非ヒト動物を提供する。本実施形態のトランスジェニック非ヒト動物は、対象組織でリコンビナーゼを作用させることにより、当該組織において導入した野生型の対象遺伝子を欠失させることができる。野生型の対象遺伝子を時期特異的又は組織特異的に欠失させることにより、対象遺伝子の時期特異的又は組織特異的な機能を解析することができる。
【００３２】
［遺伝子改変非ヒト動物の製造方法］
１実施形態において、本発明は、上記のトランスジェニック非ヒト動物に、リコンビナーゼを時期特異的又は組織特異的に作用させ、導入された野生型の前記対象遺伝子を時期特異的又は組織特異的に欠失させる工程を備える、前記対象遺伝子が時期特異的又は組織特異的に変異又は欠失した遺伝子改変非ヒト動物の製造方法を提供する。
【００３３】
上述したように、上記のトランスジェニック非ヒト動物は、もともと対象遺伝子に変異を有しているか又は対象遺伝子を欠失しており、野生型とは異なる表現型を示していた非ヒト動物が、野生型の対象遺伝子の導入によって表現型がレスキューされ、野生型の表現型を示していたものである。
【００３４】
本実施形態の製造方法により、導入されていた野生型の対象遺伝子が時期特異的又は組織特異的に欠失することにより、非ヒト動物がもともと有していた対象遺伝子の変異又は欠失の影響が時期特異的又は組織特異的に顕在化した、非ヒト動物を作製することができる。
【００３５】
したがって、本実施形態の製造方法により、時期特異的又は組織特異的に前記対象遺伝子が変異又は欠失した非ヒト動物を作製することができる。上述したように、ＥＳ細胞が樹立されていない動物においても、このような非ヒト動物を容易に作製することができる。この非ヒト動物を用いて、対象遺伝子の時期特異的又は組織特異的な機能の解析を行うことができる。
【００３６】
リコンビナーゼとしては、上述したリコンビナーゼ／リコンビナーゼ認識配列システムにおけるリコンビナーゼを用いることができ、上記のトランスジェニック非ヒト動物に導入されたリコンビナーゼ認識配列に対応するリコンビナーゼを用いる。
【００３７】
リコンビナーゼとしては、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅリコンビナーゼ、酵母由来のＦＬＰリコンビナーゼ、ジゴサッカロマイセス・ロキシー由来のＲリコンビナーゼ等が挙げられる。
【００３８】
Ｃｒｅリコンビナーゼとして、Ｃｒｅリコンビナーゼと変異エストロゲン受容体の融合タンパク質であるＣｒｅ−ＥＲタンパク質を用いてもよい。Ｃｒｅ−ＥＲタンパク質は通常細胞質に存在するが、エストロゲン誘導体であるタモキシフェンと結合することにより核内に移行し、ｌｏｘＰ配列に対して組換えを起こす。これを利用して、上記のトランスジェニック非ヒト動物にタモキシフェンを全身投与又は局所投与することにより、Ｃｒｅリコンビナーゼを作用させる時期又は組織を調節することも可能である。
【００３９】
リコンビナーゼを時期特異的又は組織特異的に作用させる方法としては、例えば、上述したトランスジェニック非ヒト動物を、時期特異的又は組織特異的プロモーターの制御下でリコンビナーゼを発現するトランスジェニック非ヒト動物と交配する方法が挙げられる。この場合、得られたＦ１動物において、時期特異的又は組織特異的プロモーターが働く部位においてのみ時期特異的又は組織特異的に対象遺伝子が欠失する。また、リコンビナーゼを発現するためのプロモーターを適切に選択することにより、所望の時期特異的又は組織特異的な対象遺伝子の欠失を誘導することができる。
【００４０】
時期特異的な発現を可能にするプロモーターの具体例としては、例えば、Ｎｅｕｒｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｏｌａｓｅ遺伝子（生後３日以降に神経細胞内で発現）、Ｐｃｐ２遺伝子（生後６日以降に小脳プルキンエ細胞内で発現）のプロモーター等が挙げられる。また、組織特異的な発現を可能にするプロモーターの具体例としては、例えば、アルブミン遺伝子（肝細胞で特異的に発現）、インスリン遺伝子（膵β細胞で特異的に発現）、Ｎｅｓｔｉｎ遺伝子（神経幹細胞及びグリア細胞に特異的に発現）のプロモーター等が挙げられる。
【００４１】
リコンビナーゼを時期特異的又は組織特異的に作用させる別の方法として、例えば、上述したトランスジェニック非ヒト動物に、リコンビナーゼの発現ベクター又はリコンビナーゼタンパク質を直接投与することが挙げられる。投与は全身投与であってもよく、局所投与であってもよい。リコンビナーゼの発現ベクター又はリコンビナーゼタンパク質を投与する時期又は投与する組織を調節することにより、リコンビナーゼを作用させる時期又は組織を調節することができる。
【００４２】
［遺伝子改変非ヒト動物］
１実施形態において、本発明は、上記の製造方法により製造された遺伝子改変非ヒト動物を提供する。
【００４３】
上述したように、本実施形態の非ヒト動物では、非ヒト動物がもともと有していた対象遺伝子の変異又は欠失の影響が時期特異的又は組織特異的に顕在化している。したがって、本実施形態の非ヒト動物を用いて、対象遺伝子の時期特異的又は組織特異的な機能の解析を行うことができる。
【００４４】
［発現ベクター製造用ベクター（１）］
１実施形態において、本発明は、上述したトランスジェニック非ヒト動物の製造方法に用いられる発現ベクターを製造するためのベクターであって、第１のリコンビナーゼ認識配列と、プロモーターと、レスキューカセットと、第２のリコンビナーゼ認識配列と、をこの順に有し、前記レスキューカセットがマルチクローニングサイトを有する、ベクター（以下、「発現ベクター製造用ベクター（１−１）」という場合がある。）を提供する。
【００４５】
図１（ａ）は、発現ベクター製造用ベクター（１−１）の構造を示す模式図である。図中、「第１の認識配列」は第１のリコンビナーゼ認識配列を意味し、「第２の認識配列」は第２のリコンビナーゼ認識配列を意味し、「ＭＣＳ」はマルチクローニングサイトを意味し、以下同様である。発現ベクター製造用ベクター（１−１）は、レスキューカセットのマルチクローニングサイトに野生型の対象遺伝子を組み込むことにより、対象遺伝子に変異を有するか又は前記対象遺伝子を欠失しており、野生型とは異なる表現型を示す非ヒト動物の表現型をレスキューするための、野生型の対象遺伝子を発現させるベクターを製造するのに適している。
【００４６】
第１のリコンビナーゼ認識配列、プロモーター、第２のリコンビナーゼ認識配列については上述したものと同様である。
【００４７】
発現ベクター製造用ベクター（１−１）は、レスキューカセットにマルチクローニングサイトを有しているため、野生型の対象遺伝子を容易に導入し、上記ベクターを製造することができる。
【００４８】
発現ベクター製造用ベクター（１−１）は、更に、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点等を有していてもよい。
【００４９】
発現ベクター製造用ベクター（１−１）のレスキューカセットは、マルチクローニングサイトと、蛍光タンパク質遺伝子と、をこの順に有していてもよい（以下、「発現ベクター製造用ベクター（１−２）」という場合がある。）。
【００５０】
図１（ｂ）は、発現ベクター製造用ベクター（１−２）の構造を示す模式図である。発現ベクター製造用ベクター（１−２）は、マルチクローニングサイトに野生型の対象遺伝子を導入すると、野生型の対象遺伝子産物と蛍光タンパク質との融合タンパクの発現ベクターが得られるように構築されていることが好ましい。当該発現ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト動物は、野生型の対象遺伝子を発現している部位で蛍光タンパク質に由来する蛍光を発する。
【００５１】
したがって、例えば蛍光顕微鏡を用いて当該蛍光を検出することにより、野生型の対象遺伝子が発現しているか否かを容易に判断することができる。
【００５２】
蛍光タンパク質遺伝子としては、特に制限されず、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ、クロンテック社）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ＴａｇＲＦＰ（Ｅｖｒｏｇｅｎ社）、ＴａｇＧＦＰ２（Ｅｖｒｏｇｅｎ社）の遺伝子等が挙げられる。
【００５３】
発現ベクター製造用ベクター（１−１）のレスキューカセットは、マルチクローニングサイトと、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列と、蛍光タンパク質遺伝子と、をこの順に有していてもよい（以下、「発現ベクター製造用ベクター（１−３）」という場合がある。）。
【００５４】
図１（ｃ）は、発現ベクター製造用ベクター（１−３）の構造を示す模式図である。図では、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列としてＩｒｅｓ配列を使用した場合が示されており、図中の「Ｉｒｅｓ」は、Ｉｒｅｓ配列を意味し、本明細書において以下同様である。蛍光タンパク質遺伝子については、発現ベクター製造用ベクター（１−２）と同様である。
【００５５】
（ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列）
ポリシストロニックな発現とは、１つのｍＲＮＡから複数のタンパク質を発現することを意味する。ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列としては、Ｉｒｅｓ配列、２Ａペプチドをコードする塩基配列等が挙げられる。
【００５６】
Ｉｒｅｓ配列とは、内部リボソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）をコードする塩基配列を意味する。ｍＲＮＡの途中にＩｒｅｓ配列が存在すると、当該配列にリボソームが結合し、そこから翻訳を開始することができる。Ｉｒｅｓ配列としては、特に制限されず、例えば、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）のＩｒｅｓ配列等が挙げられる。
【００５７】
また、２Ａペプチドをコードする塩基配列もポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列として知られている。ｍＲＮＡ中に２Ａペプチドをコードする塩基配列が存在すると、その部位で翻訳時にリボソームスキッピングと呼ばれる機構により、ポリペプチド鎖の伸長が阻害されて切断される。これにより、２Ａペプチドをコードする塩基配列の上流側にコードされていたタンパク質と、下流側にコードされていたタンパク質の２種類のタンパク質が翻訳される。２Ａペプチドをコードする塩基配列としては、例えば口蹄疫ウイルスの２Ａペプチドをコードする塩基配列等が挙げられる。
【００５８】
発現ベクター製造用ベクター（１−３）は、マルチクローニングサイトに野生型の対象遺伝子を導入すると、野生型の対象遺伝子と蛍光タンパク質遺伝子との双方を発現する発現ベクターが得られるように構築されていることが好ましい。
【００５９】
このような発現ベクターは、例えば、野生型の対象遺伝子産物が、蛍光タンパク質との融合タンパク質の形態では機能を発揮することができない場合等に有効に用いられる。当該発現ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト動物は、野生型の対象遺伝子を発現している部位で蛍光タンパク質に由来する蛍光を発する。
【００６０】
したがって、例えば蛍光顕微鏡を用いて当該蛍光を検出することにより、野生型の対象遺伝子が発現しているか否かを容易に判断することができる。
【００６１】
発現ベクター製造用ベクター（１−１）のレスキューカセットは、蛍光タンパク質遺伝子と、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列と、マルチクローニングサイトと、をこの順に有していてもよい（以下、「発現ベクター製造用ベクター（１−４）」という場合がある。）。
【００６２】
図１（ｄ）は、発現ベクター製造用ベクター（１−４）の構造を示す模式図である。図では、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列としてＩｒｅｓ配列を使用した場合が示されている。蛍光タンパク質遺伝子については、上述したものと同様である。本実施形態の発現ベクター製造用ベクターは、発現ベクター製造用ベクター（１−３）において、蛍光タンパク質遺伝子とマルチクローニングサイトとが入れ替わったものであり、機能的には発現ベクター製造用ベクター（１−３）と同様である。
【００６３】
［発現ベクター（１）］
１実施形態において、本発明は、第１のリコンビナーゼ認識配列と、プロモーターと、レスキューカセットと、第２のリコンビナーゼ認識配列と、をこの順に有し、前記レスキューカセットが野生型の対象遺伝子を有する、発現ベクター（以下、「発現ベクター（１−１）」という場合がある。）を提供する。
【００６４】
図２（ａ）は、発現ベクター（１−１）の構造を示す模式図である。発現ベクター（１−１）は、上述したトランスジェニック非ヒト動物の製造用に好適に用いることができる。
【００６５】
発現ベクター（１−１）は、上述した発現ベクター製造用ベクター（１−１）のレスキューカセットのマルチクローニングサイトに、野生型の対象遺伝子を導入することにより得られる。
【００６６】
第１のリコンビナーゼ認識配列、プロモーター、第２のリコンビナーゼ認識配列については、上述した発現ベクター製造用ベクター（１−１）と同様である。
【００６７】
発現ベクター（１−１）のレスキューカセットは、野生型の前記対象遺伝子にコードされるタンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を有していてもよい（以下、「発現ベクター（１−２）」という場合がある。）。
【００６８】
図２（ｂ）は、発現ベクター（１−２）の構造を示す模式図である。図中、「融合蛍光タンパク質遺伝子」は、野生型の対象遺伝子にコードされるタンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を意味し、以下同様である。発現ベクター（１−２）は、上述した発現ベクター製造用ベクター（１−２）のレスキューカセットのマルチクローニングサイトに、野生型の対象遺伝子を導入することにより得られる。
【００６９】
蛍光タンパク質遺伝子については、上述した発現ベクター製造用ベクター（１−２）と同様である。
【００７０】
発現ベクター（１−２）を導入したトランスジェニック非ヒト動物は、野生型の対象遺伝子を発現している部位で蛍光タンパク質に由来する蛍光を発する。
【００７１】
したがって、例えば蛍光顕微鏡を用いて当該蛍光を検出することにより、野生型の対象遺伝子が発現しているか否かを容易に判断することができる。
【００７２】
発現ベクター（１−１）のレスキューカセットは、野生型の前記対象遺伝子と、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列と、蛍光タンパク質遺伝子と、をこの順に有していてもよい（以下、「発現ベクター（１−３）」という場合がある。）。
【００７３】
図２（ｃ）は、発現ベクター（１−３）の構造を示す模式図である。図では、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列としてＩｒｅｓ配列を使用した場合が示されている。発現ベクター（１−３）は、上述した発現ベクター製造用ベクター（１−３）のレスキューカセットのマルチクローニングサイトに、野生型の対象遺伝子を導入することにより得られる。
【００７４】
発現ベクター（１−３）を導入したトランスジェニック非ヒト動物は、野生型の対象遺伝子を発現している部位で蛍光タンパク質に由来する蛍光を発する。
【００７５】
したがって、例えば蛍光顕微鏡を用いて当該蛍光を検出することにより、野生型の対象遺伝子が発現しているか否かを容易に判断することができる。
【００７６】
発現ベクター（１−１）のレスキューカセットは、蛍光タンパク質遺伝子と、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列と、野生型の前記対象遺伝子と、をこの順に有していてもよい（以下、「発現ベクター（１−４）」という場合がある。）。
【００７７】
図２（ｄ）は、発現ベクター（１−４）の構造を示す模式図である。図では、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列としてＩｒｅｓ配列を使用した場合が示されている。発現ベクター（１−４）は、発現ベクター（１−３）において、蛍光タンパク質遺伝子と野生型の前記対象遺伝子とが入れ替わったものであり、機能的には発現ベクター（１−３）と同様である。
【００７８】
［発現ベクター製造用ベクター（２）］
１実施形態において、本発明は、上述したトランスジェニック非ヒト動物の製造方法に用いられる発現ベクターを製造するためのベクターであって、プロモーターと、第１のリコンビナーゼ認識配列と、レスキューカセットと、第２のリコンビナーゼ認識配列と、第１の蛍光タンパク質遺伝子と、をこの順に有し、前記レスキューカセットがマルチクローニングサイトを有する、ベクター（以下、「発現ベクター製造用ベクター（２−１）」という場合がある。）を提供する。
【００７９】
図３（ａ）は、発現ベクター製造用ベクター（２−１）の構造を示す模式図である。発現ベクター製造用ベクター（２−１）は、レスキューカセットのマルチクローニングサイトに野生型の対象遺伝子を組み込むことにより、対象遺伝子に変異を有するか又は前記対象遺伝子を欠失しており、野生型とは異なる表現型を示す非ヒト動物の表現型をレスキューするための、野生型の対象遺伝子を発現させるベクターを製造するのに適している。
【００８０】
プロモーター、第１のリコンビナーゼ認識配列、第２のリコンビナーゼ認識配列については上述したものと同様である。
【００８１】
第１の蛍光タンパク質遺伝子としては、発現ベクター製造用ベクター（１−１）の蛍光タンパク質遺伝子と同様のものを用いることができる。
【００８２】
発現ベクター製造用ベクター（２−１）は、レスキューカセットにマルチクローニングサイトを有しているため、野生型の対象遺伝子を容易に導入し、上記ベクターを製造することができる。
【００８３】
発現ベクター製造用ベクター（２−１）は、更に、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点等を有していてもよい。
【００８４】
発現ベクター製造用ベクター（２−１）に野生型の対象遺伝子を導入して得られたベクターに、リコンビナーゼが作用すると、レスキューカセットが切り出されて欠失し、プロモーターと第１の蛍光タンパク質遺伝子が残る。そして、第１の蛍光タンパク質が発現する。
【００８５】
この結果、リコンビナーゼが作用した部位では第１の蛍光タンパク質に由来する蛍光が検出される。
【００８６】
したがって、例えば蛍光顕微鏡を用いて、リコンビナーゼが作用し、野生型の対象遺伝子が欠失したか否かを容易に判断することができる。
【００８７】
発現ベクター製造用ベクター（２−１）のレスキューカセットは、マルチクローニングサイトと、第２の蛍光タンパク質遺伝子と、をこの順に有していてもよい（以下、「発現ベクター製造用ベクター（２−２）」という場合がある。）。
【００８８】
図３（ｂ）は、発現ベクター製造用ベクター（２−２）の構造を示す模式図である。第２の蛍光タンパク質遺伝子としては、発現ベクター製造用ベクター（１−１）の蛍光タンパク質遺伝子と同様のものを用いることができるが、第１の蛍光タンパク質遺伝子とは異なる波長の蛍光を発する蛍光タンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。
【００８９】
発現ベクター製造用ベクター（２−２）は、マルチクローニングサイトに野生型の対象遺伝子を導入すると、野生型の対象遺伝子産物と第２の蛍光タンパク質との融合タンパクの発現ベクターが得られるように構築されていることが好ましい。当該発現ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト動物は、野生型の対象遺伝子を発現している部位で第２の蛍光タンパク質に由来する蛍光を発する。
【００９０】
更に、当該ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト動物に、リコンビナーゼが作用すると、レスキューカセットが切り出されて欠失し、プロモーターと第１の蛍光タンパク質遺伝子が残る。そして、第１の蛍光タンパク質が発現する。この結果、リコンビナーゼが作用した部位では第１の蛍光タンパク質に由来する蛍光が検出される。
【００９１】
したがって、例えば蛍光顕微鏡を用いて当該蛍光を検出した結果、第２の蛍光タンパク質に由来する蛍光が検出された部位では、野生型の対象遺伝子が発現していると判断でき、第１の蛍光タンパク質に由来する蛍光が検出された部位では、リコンビナーゼが作用して野生型の対象遺伝子が欠失していると判断できる。この判断は、蛍光顕微鏡による検出のみで容易に行うことができる。
【００９２】
なお、第２の蛍光タンパク質遺伝子の３’側には、確実に転写を終了させる配列が存在することが好ましい。さもないと、第２の蛍光タンパク質とともに第１の蛍光タンパク質も発現してしまう場合がある。確実に転写を終了させる配列としては、例えばポリＡ付加シグナル等が挙げられる。
【００９３】
発現ベクター製造用ベクター（２−１）のレスキューカセットは、マルチクローニングサイトと、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列と、第２の蛍光タンパク質遺伝子と、をこの順に有していてもよい（以下、「発現ベクター製造用ベクター（２−３）」という場合がある。）。
【００９４】
図３（ｃ）は、発現ベクター製造用ベクター（２−３）の構造を示す模式図である。図では、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列としてＩｒｅｓ配列を使用した場合が示されている。発現ベクター製造用ベクター（２−３）は、マルチクローニングサイトに野生型の対象遺伝子を導入すると、野生型の対象遺伝子と第２の蛍光タンパク質遺伝子との双方を発現する発現ベクターが得られるように構築されていることが好ましい。
【００９５】
当該発現ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト動物では、例えば蛍光顕微鏡を用いて蛍光を検出した結果、第２の蛍光タンパク質に由来する蛍光が検出された部位では、野生型の対象遺伝子が発現していると判断でき、第１の蛍光タンパク質に由来する蛍光が検出された部位では、リコンビナーゼが作用して野生型の対象遺伝子が欠失していると判断できる。この判断は、蛍光顕微鏡による検出のみで容易に行うことができる。
【００９６】
発現ベクター製造用ベクター（２−１）のレスキューカセットは、第２の蛍光タンパク質遺伝子と、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列と、マルチクローニングサイトと、をこの順に有していてもよい（以下、「発現ベクター製造用ベクター（２−４）」という場合がある。）。
【００９７】
図３（ｄ）は、発現ベクター製造用ベクター（２−４）の構造を示す模式図である。図では、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列としてＩｒｅｓ配列を使用した場合が示されている。発現ベクター製造用ベクター（２−４）は、発現ベクター製造用ベクター（２−３）において、第２の蛍光タンパク質遺伝子とマルチクローニングサイトとが入れ替わったものであり、機能的には発現ベクター製造用ベクター（２−３）と同様である。
【００９８】
［発現ベクター（２）］
１実施形態において、本発明は、プロモーターと、第１のリコンビナーゼ認識配列と、レスキューカセットと、第２のリコンビナーゼ認識配列と、第１の蛍光タンパク質遺伝子と、をこの順に有し、前記レスキューカセットが、野生型の対象遺伝子を有する、発現ベクター（以下、「発現ベクター（２−１）」という場合がある。）を提供する。
【００９９】
図４（ａ）は、発現ベクター（２−１）の構造を示す模式図である。発現ベクター（２−１）は、上述したトランスジェニック非ヒト動物の製造用に好適に用いることができる。
【０１００】
発現ベクター（２−１）は、上述した発現ベクター製造用ベクター（２−１）のレスキューカセットのマルチクローニングサイトに、野生型の対象遺伝子を導入することにより得られる。
【０１０１】
発現ベクター（２−１）を導入したトランスジェニック非ヒト動物に、リコンビナーゼが作用すると、レスキューカセットが切り出されて欠失し、プロモーターと第１の蛍光タンパク質遺伝子が残る。そして、第１の蛍光タンパク質が発現する。この結果、リコンビナーゼが作用した部位では第１の蛍光タンパク質に由来する蛍光が検出される。
【０１０２】
したがって、例えば蛍光顕微鏡を用いて、リコンビナーゼが作用し、野生型の対象遺伝子が欠失したか否かを容易に判断することができる。
【０１０３】
発現ベクター（２−１）のレスキューカセットは、野生型の前記対象遺伝子にコードされるタンパク質と第２の蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を有していてもよい（以下、「発現ベクター（２−２）」という場合がある。）。
【０１０４】
図４（ｂ）は、発現ベクター（２−２）の構造を示す模式図である。発現ベクター（２−２）は、上述した発現ベクター製造用ベクター（２−２）のレスキューカセットのマルチクローニングサイトに、野生型の対象遺伝子を導入することにより得られる。
【０１０５】
発現ベクター（２−２）を導入したトランスジェニック非ヒト動物は、野生型の対象遺伝子を発現している部位で第２の蛍光タンパク質に由来する蛍光を発する。
【０１０６】
更に、当該ベクター（２−２）を導入したトランスジェニック非ヒト動物に、リコンビナーゼが作用すると、レスキューカセットが切り出されて欠失し、プロモーターと第１の蛍光タンパク質遺伝子が残る。そして、第１の蛍光タンパク質が発現する。この結果、リコンビナーゼが作用した部位では第１の蛍光タンパク質に由来する蛍光が検出される。
【０１０７】
したがって、例えば蛍光顕微鏡を用いて当該蛍光を検出した結果、第２の蛍光タンパク質に由来する蛍光が検出された部位では、野生型の対象遺伝子が発現していると判断でき、第１の蛍光タンパク質に由来する蛍光が検出された部位では、リコンビナーゼが作用して野生型の対象遺伝子が欠失していると判断できる。この判断は、蛍光顕微鏡による検出のみで容易に行うことができる。
【０１０８】
発現ベクター（２−１）のレスキューカセットは、野生型の前記対象遺伝子と、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列と、第２の蛍光タンパク質遺伝子と、をこの順に有していてもよい（以下、「発現ベクター（２−３）」という場合がある。）。
【０１０９】
図４（ｃ）は、発現ベクター（２−３）の構造を示す模式図である。発現ベクター（２−３）を導入したトランスジェニック非ヒト動物では、例えば蛍光顕微鏡を用いて蛍光を検出した結果、第２の蛍光タンパク質に由来する蛍光が検出された部位では、野生型の対象遺伝子が発現していると判断でき、第１の蛍光タンパク質に由来する蛍光が検出された部位では、リコンビナーゼが作用して野生型の対象遺伝子が欠失していると判断できる。この判断は、蛍光顕微鏡による検出のみで容易に行うことができる。
【０１１０】
発現ベクター（２−１）のレスキューカセットは、第２の蛍光タンパク質遺伝子と、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列と、野生型の前記対象遺伝子と、をこの順に有していてもよい（以下、「発現ベクター（２−４）」という場合がある。）。
【０１１１】
図４（ｄ）は、発現ベクター（２−４）の構造を示す模式図である。図では、ポリシストロニックな発現を可能にする塩基配列としてＩｒｅｓ配列を使用した場合が示されている。発現ベクター（２−４）は、発現ベクター製造用ベクター（２−３）において、第２の蛍光タンパク質遺伝子とマルチクローニングサイトとが入れ替わったものであり、機能的には発現ベクター（２−３）と同様である。
【実施例】
【０１１２】
次に、実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【０１１３】
［実験例］
ＥＳ細胞に、「ｌｏｘＰ配列」−「ＥＦ１αプロモーター」−「Ｉｎｖ遺伝子と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質をコードする遺伝子」−「ｌｏｘＰ配列」の構造を有する発現ベクターを導入した群（対照群）を準備した。また、上記のＥＳ細胞に更にＣｒｅリコンビナーゼの発現ベクターを導入した群（試験群）を準備した。なお、Ｉｎｖ遺伝子は、左右軸の形成や腎臓形成において重要な働きを有する遺伝子である。
【０１１４】
上記の各細胞を、抗ＧＦＰ抗体を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察した。図５に蛍光顕微鏡写真を示す。図５（ａ）は、対照群の細胞を撮影した写真であり、図５（ｂ）は、試験群の細胞を撮影した写真である。
【０１１５】
その結果、試験群の細胞ではＧＦＰの発現細胞が全く認められなかったのに対し、対照群の細胞ではＧＦＰの発現細胞が多数認められた。この結果は、試験群の細胞では、Ｃｒｅリコンビナーゼによる遺伝子組換えにより「Ｉｎｖ遺伝子と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質をコードする遺伝子」が欠失したことを示し、本システムが効果的に機能することを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明により、より簡便に時期特異的又は組織特異的な遺伝子機能の解析を行うことができ、ＥＳ細胞が樹立されていない動物にも適用することができる、非ヒト動物の製造方法を提供することができる。また、上記の製造方法により製造された非ヒト動物、上記の製造方法に用いられる発現ベクター及び当該発現ベクター製造用ベクターを提供することができる。
【図１】
0006327712.tif 000002
【図２】
0006327712.tif 000003
【図３】
0006327712.tif 000004
【図４】
0006327712.tif 000005
【図５】
0006327712.tif 000006
【配列表】
0006327712000001.app