(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１、２および３の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号４、５および６の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲ；
ｂ）配列番号３６、３７および３８の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号３９、４０および４１の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲ；
ｃ）配列番号６４、６５および６６の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号６７、６８および６９の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲ
からなる群から選択される、Ａｘｌと結合することができ、Ａｘｌのインターナリゼーションを誘導することにより細胞にインターナライズされる、モノクローナル抗Ａｘｌ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
配列番号１、２および３の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号８の配列または配列番号８と少なくとも９０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる、請求項１に記載の抗体またはその任意の抗原結合フラグメント。
【請求項３】
配列番号７の配列または配列番号７と少なくとも９０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号４、５および６の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる、請求項１に記載の抗体またはその任意の抗原結合フラグメント。
【請求項４】
配列番号３６、３７および３８の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号４３の配列または配列番号４３と少なくとも９０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる、請求項１に記載の抗体またはその任意の抗原結合フラグメント。
【請求項５】
配列番号４２の配列または配列番号４２と少なくとも９０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号３９、４０および４１の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
配列番号６４、６５および６６の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号７１の配列または配列番号７１と少なくとも９０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
配列番号７０の配列または配列番号７０と少なくとも９０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号６７、６８および６９の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
配列番号７の配列または配列番号７と少なくとも９０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号８の配列または配列番号８と少なくとも９０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
配列番号４２の配列または配列番号４２と少なくとも９０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号４３の配列または配列番号４３と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
配列番号７０の配列または配列番号７０と少なくとも９０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７１の配列または配列番号７１と少なくとも９０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
ａ）２００８年４月２日にＣＮＣＭ（パスツール研究所、フランス）に寄託されたハイブリドーマＩ−３９５９に由来するモノクローナル抗体１１０Ｄ７またはその抗原結合フラグメント；
ｂ）２０１１年７月２８日にＣＮＣＭ（パスツール研究所、フランス）に寄託された、ハイブリドーマＩ−４４９９に由来するモノクローナル抗体１００３Ａ２またはその抗原結合フラグメント；
ｃ）２０１１年７月２８日にＣＮＣＭ（パスツール研究所、フランス）に寄託されたハイブリドーマＩ−４５０１に由来するモノクローナル抗体１０２４Ｇ１１、またはその抗原結合フラグメント
からなる群から選択されるモノクローナル抗体からなる、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
ａ）２００８年４月２日にＣＮＣＭ（パスツール研究所、フランス）に寄託されたマウスハイブリドーマＩ−３９５９；
ｂ）２０１１年７月２８日にＣＮＣＭ（パスツール研究所、フランス）に寄託されたマウスハイブリドーマＩ−４４９９；
ｃ）２０１１年７月２８日にＣＮＣＭ（パスツール研究所、フランス）に寄託されたマウスハイブリドーマＩ−４５０１
から選択される、マウスハイブリドーマ。
【請求項１３】
タンパク質Ａｘｌ細胞外ドメイン、に局在するエピトープからなる宿主標的部位に、細胞傷害性薬剤を送達するためのアドレッシング産物として使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
前記エピトープがヒトタンパク質Ａｘｌ細胞外ドメインに局在する、請求項１３に記載の使用のための抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
前記エピトープがヒトタンパク質Ａｘｌ細胞外ドメインに局在し、該ヒトタンパク質Ａｘｌ細胞外ドメインが配列番号３１もしくは３２の配列またはその天然変異体配列を有する、請求項１３または１４に記載の使用のための抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
細胞傷害性薬剤と結合された請求項１〜１１および１３〜１５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる免疫複合体。
【請求項１７】
癌の治療に使用するための、請求項１６に記載の免疫複合体を含んでなる医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１６に記載の免疫複合体と少なくとも１種類の賦形剤および／または薬学的に許容可能なビヒクルとを含んでなる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質Ａｘｌと結合することができる、新規な抗原結合タンパク質、特に、モノクローナル抗体、ならびに上記タンパク質をコードするアミノ酸配列および核酸配列に関する。一面から、本発明は、Ａｘｌと結合することができ、Ａｘｌのインターナリゼーション(interalization)を誘導することにより細胞にインターナライズ(internalized)され得る新規な抗原結合タンパク質または抗原結合フラグメントに関する。本発明はまた、毒素、放射性元素または薬物などの他の抗癌化合物と組み合わせたアドレッシング産物としての上記抗原結合タンパク質の使用、およびある種の癌の治療のためのその使用も含んでなる。
【０００２】
「Ａｘｌ」（「Ｕｆｏ」、「Ａｒｋ」または「Ｔｙｒｏ７」とも呼ばれる）は、慢性骨髄性白血病患者から、マウスＮＩＨ３Ｔ３により過剰発現された際に形質転換を誘発する癌遺伝子としてクローニングされた。Ａｘｌは、ＴＡＭ（Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、Ｍｅｒ）ファミリーと呼ばれる受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の一ファミリーに属し、Ｔｙｒｏ３（Ｒｓｅ、Ｓｋｙ、Ｄｔｋ、Ｅｔｋ、Ｂｒｔ、Ｔｉｆ）、Ａｘｌ、およびＭｅｒ（Ｅｙｋ、Ｎｙｋ、Ｔｙｒｏ−１２）を含む[Lemke G. et al. Nat. Rev. Immunol. (2008).8, 327-336]。
【０００３】
ヒトタンパク質Ａｘｌは、アミノ酸８９４個のタンパク質であり、その配列は配列表に配列番号２９として示されている。アミノ酸１〜２５はシグナルペプチドに相当し、このペプチドシグナルを含まないヒトタンパク質Ａｘｌは、配列表に配列番号３０として示されている。
【０００４】
当初は成長停止特異的遺伝子として単離されたＧａｓ６は、ＴＡＭファミリーのメンバーに共通のリガンドである[Varnum B.C. et al. Nature (1995).373, 623-626]。Ｇａｓ６は、Ａｘｌに対して最大の親和性を示し、次にＴｙｒｏ３、最後にＭｅｒが続く[Nagata K. et al. J. Biol. Chem. (1996).271, 30022-30027]。Ｇａｓ６は、リン脂質膜との結合を仲介するγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）リッチドメイン、４つの上皮細胞増殖因子様ドメイン、および２つのラミニンＧ様（ＬＧ）ドメインからなる[Manfioletti G., Brancolini,C., Avanzi,G. & Schneider,C. Mol. Cell Biol. (1993).13, 4976-4985]。多くの他のＲＴＫと同様、リガンドの結合は、受容体の二量体形成、および様々な細胞内シグナル伝達分子のドッキング部位として働くチロシン残基（受容体Ａｘｌに対しては、チロシン残基７７９、８２１および８６６）の自己リン酸化をもたらす[Linger R.M., Keating,A.K., Earp,H.S. & Graham,D.K. Adv. Cancer Res. (2008).100, 35-83]。さらに、Ａｘｌ受容体は、リガンド非依存性のプロセスを介しても活性化され得る。この活性化は、Ａｘｌ受容体が過剰発現される場合に起こり得る。
【０００５】
Ｇａｓ６／Ａｘｌシグナル伝達は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで多様な細胞において、細胞の増殖、接着、移動および生存を含む様々な細胞プロセスを調節することが示されている[Hafizi S. & Dahlback,B. FEBS J. (2006).273, 5231-5244]。さらに、ＴＡＭ受容体は自然免疫の制御に関与し、樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージにおいて病原体に対する炎症性応答を阻害する。また、ＴＡＭ受容体は、これらの免疫細胞によるアポトーシス細胞の貪食も駆動し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の成熟および殺傷活性に必要とされる[Lemke G. et al. Nat. Rev. Immunol. (2008).8, 327-336]。
【０００６】
通常の細胞では発現は弱いが、Ｇａｓ６／Ａｘｌ系は、主として線維芽細胞、骨髄前駆細胞、マクロファージ、神経系組織、心筋および骨格筋に見られ、そこで主要には細胞の生存を助ける。Ｇａｓ６／Ａｘｌ系は、血管平滑筋細胞のホメオスタシスを調節することにより血管生物学に重要な役割を果たしている[Korshunov,V.A., Mohan,A.M., Georger,M.A. & Berk,B.C. Circ. Res. (2006).98, 1446-1452; Korshunov,V.A., Daul,M., Massett,M.P. & Berk,B.C. Hypertension (2007).50, 1057-1062]。
【０００７】
腫瘍細胞では、Ａｘｌは、細胞の浸潤および移動の調節に重要な役割を果たしている。Ａｘｌの過剰発現は、予後の悪さに関連しているだけでなく、乳癌、結腸癌、食道癌、肝細胞癌、胃癌、神経膠腫、肺癌、黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎臓癌、甲状腺癌および子宮内膜癌で報告されているように、様々なヒト癌の浸潤性の増長にも関連している[総説としてLinger R.M., Keating, A.K., Earp, H.S. & Graham, D.K. Adv. Cancer Res. (2008).100, 35-83およびVerma A. Mol. Cancer Ther. (2011).10, 1763-1773]。乳癌では、Ａｘｌは、上皮間葉移行（ＥＭＴ）の強力なエフェクターであると思われ、ＥＭＴプログラムは、その生物において癌細胞の移動および転移に積極的に寄与している[Thiery J.P. Curr. Opin. Cell Biol. (2003).15, 740-746]。
【０００８】
また、Ａｘｌは、血管新生を調節することも示されている。実際に、内皮細胞におけるＡｘｌのノックダウンは、管の形成および移動に障害を来す [Holland S.J. et al. Cancer Res. (2005).65, 9294-9303] とともに、特定の血管新生シグナル伝達経路を妨げた[Li Y. et al. Oncogene (2009).28, 3442-3455]。
【０００９】
もっと最近では、ある範囲の細胞モデルに対して、薬剤耐性現象におけるＡｘｌ過剰発現の関与を記載している研究がいくつかある。下表１にこれらの研究をまとめる。
【００１０】
【表１】
0006445444.tif 000002
【００１１】
上記表１に挙げた完全な出典は次の通り：
Macleod K. et al. Cancer Res. (2005).65, 6789-6800
Mahadevan D. et al. Oncogene (2007).26, 3909-3919
Lay J.D. et al. Cancer Res. (2007).67, 3878-3887
Hong C.C. et al. Cancer Lett. (2008).268, 314-324
Liu L. et al. Cancer Res. (2009).69, 6871-6878
Keating A.K. et al. Mol. Cancer Ther. (2010).9, 1298-1307
Ye X. et al. Oncogene (2010).29, 5254-5264
【００１２】
このような文脈では、Ａｘｌ  ＲＴＫは、腫瘍学において興味深い標的と考えられる。いくつかのグループが、すでに、裸のモノクローナル抗体または標的化小分子を用いて、このｇａｓ６／Ａｘｌ軸を標的とする抗腫瘍戦略を開発している[Verma A. Mol. Cancer Ther. (2011).10, 1763-1773]。
【００１３】
第１の実施態様では、本発明は、ｉ）ヒトタンパク質Ａｘｌと結合し、かつ、ｉｉ）その上記ヒトタンパク質Ａｘｌとの結合の後にインターナライズされる、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００１４】
より一般的には、本発明は、その上記標的Ａｘｌとの結合の後にインターナライズされ得る抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントの選択のための、タンパク質Ａｘｌの使用に関する。より詳しくは、上記標的は、Ａｘｌの細胞外ドメインである。
【００１５】
従って、この特定の面では、本発明は、哺乳動物細胞に目的分子を送達またはインターナライズすることができる化合物またはその結合フラグメントのスクリーニングのためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を対象とし、上記目的分子は上記化合物に共有結合され、上記方法は、以下の工程：
ａ）Ａｘｌタンパク質、またはその細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、またはそのエピトープと結合することができる化合物を選択する工程；
ｂ）場合により、上記目的分子または対照分子を、工程ａ）で選択された上記化合物と共有結合させて複合体を形成する工程；
ｃ）工程ａ）で選択された上記化合物、または工程ｂ）で得られた上記複合体を、その表面でＡｘｌタンパク質またはその機能的フラグメントを発現する哺乳動物細胞、好ましくは、生細胞と接触させる工程；
ｄ）上記化合物または上記目的分子または上記複合体が上記哺乳動物細胞に細胞内送達またはインターナライズされたかどうかを決定する工程；および
ｅ）上記化合物を哺乳動物生細胞に目的分子を送達またはインターナライズすることができる化合物として選択する工程
を含んでなる。
【００１６】
好ましい実施態様では、目的分子を哺乳動物生細胞に送達またはインターナライズすることができる上記化合物は、タンパク質（本明細書ではポリペプチドまたはペプチドとも呼ばれる）またはペプチド構造、特に、少なくとも５、１０、１５またはそれを超えるアミノ酸残基のアミノ酸配列、を含んでなるタンパク質様化合物であり、上記アミノ酸残基はグリコシル化することができる。
【００１７】
目的分子を哺乳動物生細胞に送達またはインターナライズすることができる上記化合物がタンパク質またはタンパク質様化合物である場合、上記化合物は、本明細書では、「抗原結合タンパク質」とも呼ばれ、上記抗原結合タンパク質またはその結合フラグメントは、
ｉ）タンパク質Ａｘｌ、好ましくは、ヒトＡｘｌタンパク質と結合することができ、かつ、
ｉｉ）上記Ａｘｌタンパク質が上記哺乳動物細胞の表面で発現された場合に、その上記タンパク質Ａｘｌとの結合の後に、哺乳動物細胞にインターナライズされ得る。
【００１８】
好ましい実施態様では、上記哺乳動物生細胞は、ヒト細胞、好ましくは、Ａｘｌタンパク質受容体を天然に発現する細胞である。
【００１９】
特定の実施態様では、工程ｃ）の哺乳動物生細胞は、それらの表面で組換えＡｘｌタンパク質を発現する哺乳動物細胞である。
【００２０】
これもまた好ましい実施態様において、上記目的分子は、細胞傷害性分子（本明細書では細胞傷害性または細胞増殖抑制薬剤とも呼ばれる）である。
【００２１】
これもまた好ましい実施態様において、上記目的分子は、リンカー、より好ましくは、ペプチドリンカー、より好ましくは、切断可能なペプチドリンカー、より好ましくは、哺乳動物細胞に、特に、上記哺乳動物細胞のサイトゾルに含まれる天然の細胞内化合物により切断され得るリンカーを用いて、Ａｘｌタンパク質と結合することができる上記化合物に共有結合される。
【００２２】
これもまた好ましい実施態様において、Ａｘｌタンパク質と結合することができる上記化合物は、Ａｘｌタンパク質に、またはＡｘｌ  ＥＤＣドメインに局在するそのエピトープに特異的に向けられている抗体、またはその機能的結合フラグメントである。
【００２３】
ｅ）の選択工程は、細胞内送達またはインターナリゼーションの評価に関して当業者に知られているいずれの方法によっても具現化することができる。Ａｘｌタンパク質と特異的に結合することができる上記化合物の、または上記化合物と上記目的分子によって形成される上記複合体の、または上記化合物と共有結合されている上記目的分子の、存在、不在、または活性を証明または評価することができるアッセイまたは試験は当業者に周知である（以下に開示されるこのような試験またはアッセイのいくつかの例を参照。ただし、これらの試験は以下の試験例に限定されない）。
【００２４】
より詳しくは、これらの試験またはアッセイは、ＦＡＣＳ、免疫蛍光、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、細胞傷害性／細胞増殖抑制性評価などによって具現化することができる。
【００２５】
この面では、本発明はまた、細胞傷害性化合物を哺乳動物細胞、好ましくは、生細胞に送達することができる細胞傷害性または細胞増殖抑制性複合体の作製のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法も対象とし、上記方法は、
細胞傷害性薬剤を、
ｉ）Ａｘｌタンパク質、好ましくは、ヒトＡｘｌタンパク質と結合することができ、かつ、
ｉｉ）上記Ａｘｌタンパク質が上記哺乳動物細胞の表面で発現された場合に、その上記タンパク質Ａｘｌとの結合の後に、哺乳動物細胞にインターナライズされる
化合物に共有結合させる工程を含んでなる。
【００２６】
好ましくは、上記化合物は、タンパク質様タンパク質、より好ましくは、Ａｘｌタンパク質に、またはＡｘｌ  ＥＤＣドメインに局在するそのエピトープに向けられた抗体、または上記抗体の機能的結合フラグメントである。
【００２７】
好ましい実施態様では、上記細胞傷害性薬剤は、上記抗Ａｘｌ抗体またはその機能的フラグメントに、リンカー、より好ましくは、ペプチドリンカー、より好ましくは、切断可能なペプチドリンカー、より好ましくは、限定されない例として天然の細胞内化合物により切断され得るリンカーを用いて共有結合される。
【００２８】
ＴＡＭファミリーの他のメンバーと同様に、Ａｘｌ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は細胞接着分子の細胞外ドメインに近い構成を有する。Ａｘｌ  ＥＣＤは、２つの免疫グロブリン様ドメインの次に２つの隣接するフィブロネクチンＩＩＩ型様ドメインがくる組合せを特徴とする[O'Bryan J.P. et al.  Mol. Cell Biol. (1991).11, 5016-5031]。この２つのＮ末端免疫グロブリン様ドメインは、Ｇａｓ６リガンド結合に十分なものである[Sasaki T. et al. EMBO J. (2006).25, 80-87]。
【００２９】
ヒトタンパク質ＡｘｌのＥＣＤは、配列番号２９の配列のアミノ酸１〜４５１に相当するアミノ酸４５１個のフラグメントであり、その配列は配列表に配列番号３１として示されている。アミノ酸１〜２５はシグナルペプチドに相当し、このシグナルペプチドを含まないヒトタンパク質ＡｘｌのＥＣＤは、配列番号２９の配列のアミノ酸２６〜４５１に相当し、配列番号３２の配列により示される。
【００３０】
これまでに、種々のインターナリゼーション様式が確認されている。これらのインターナリゼーション様式は、細胞内におけるタンパク質またはタンパク質複合体のインターナリゼーションを方向付ける。エンドサイトーシス後、ほとんどの膜タンパク質または脂質は細胞表面に戻るが（リサイクリング）、一部の膜成分は後期エンドソームまたはゴルジに送達される[Maxfield F.R. & McGraw, T.E. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. (2004).5, 121-132]。
【００３１】
好ましい実施態様では、本発明は、ｉ）ヒトタンパク質Ａｘｌと結合し、かつ、ｉｉ）その上記ヒトタンパク質Ａｘｌとの結合の後に、インターナライズされる、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００３２】
最も好ましい実施態様では、本発明は、
ｉ）好ましくは配列番号２９もしくは３０の配列またはその天然変異体配列を有する、ヒトタンパク質Ａｘｌと結合し、かつ、
ｉｉ）その上記ヒトタンパク質Ａｘｌとの結合の後にインターナライズされる、
抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００３３】
「結合タンパク質」または「抗原結合タンパク質」とは、別のタンパク質または分子（一般に抗原と呼ばれる）と特異的または全般的な親和性を有するペプチド鎖である。タンパク質を接触させると、結合が可能であれば、複合体を形成する。本発明の抗原結合タンパク質は、限定されるものではないが、好ましくは、抗体、抗体のフラグメントもしくは誘導体、タンパク質またはペプチドであり得る。
【００３４】
本発明によれば、抗原結合タンパク質の「抗原結合フラグメント」とは、抗原結合タンパク質の標的（一般に抗原とも呼ばれる）と特異的に結合する能力を保持し、かつ、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列の、少なくとも５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基、または少なくとも２５０個の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含んでなる、任意のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を示すものとする。
【００３５】
抗原結合タンパク質が抗体である好ましい実施態様では、このような「抗原結合フラグメント」は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは一本鎖を表す）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントもしくはダイアボディー、またはその半減期が、ポリ（アルキレン）グリコール、例えば、ポリ（エチレン）グリコールの付加（「ペグ化」）（ペグ化フラグメントはＦｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれる）（「ＰＥＧ」はポリ（エチレン）グリコールを表す）などの化学修飾によるか、またはリポソームへの封入によって延長されたと考えられる任意のフラグメントからなる群から選択され、上記フラグメントは、本発明による抗体の特徴的なＣＤＲのうち少なくとも１つを有する。好ましくは、上記「抗原結合フラグメント」は、それらが由来する抗体の可変重鎖または軽鎖の部分配列からなるか、またはそれを含んでなると考えられ、上記部分配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性と、標的に対して十分な親和性、好ましくは、それが由来する抗体の親和性の少なくとも１／１００、より好ましい様式では、少なくとも１／１０に相当する親和性とを保持するのに十分なものである。このような機能的フラグメントは、それが由来する抗体の配列の、最低５個のアミノ酸、好ましくは、１０、１５、２５、５０および１００個の連続するアミノ酸を含むと考えられる。
【００３６】
用語「エピトープ」は、抗体を含む抗原結合タンパク質により結合される抗原の領域である。エピトープは、構造的または機能的と定義することができる。機能的エピトープは一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を持つ。エピトープはまた、コンフォメーション的でもあり得、すなわち、非直鎖アミノ酸から構成される。特定の実施態様では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの化学的に活性な表面分子群である決定基を含み得、特定の実施態様では、特定の三次元構造の特徴および／または特定の電荷特徴を持ち得る。
【００３７】
本出願では、エピトープは、ヒトタンパク質Ａｘｌの細胞外ドメインに局在する。
【００３８】
本発明の好ましい実施態様によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、ヒトタンパク質Ａｘｌ細胞外ドメインに局在し、好ましくは、配列番号３１もしくは３２の配列またはその天然変異体配列を有するエピトープと特異的に結合する。
【００３９】
「結合する(“binding”, “binds”)」などは、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントが、生理学的条件下で抗原と比較的安定な複合体を形成することを意図する。２つの分子が結合するかどうかを決定するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などが含まれる。
【００４０】
この意味で、「ＥＣ５０」は、５０％効果濃度を意味する。より厳密には、この５０％効果濃度（ＥＣ５０）という用語は、ある特定の暴露時間の後にベースラインと最大値の中間の応答を誘導する薬物、抗体または毒物の濃度に相当する。これは薬物の効力の尺度として慣用されている。従って、段階的用量反応曲線(graded dose response curve)のＥＣ５０は、その最大効果の５０％が見られる化合物の濃度を表す。素量的用量反応曲線(quantal dose response curve)のＥＣ５０は、特定の暴露期間の後に、その集団の５０％が応答を示す化合物の濃度を表す。濃度の尺度は一般に、比較的小さい濃度変化で急速に増加するＳ字曲線をたどる。これはベストフィット直線の微分によって数学的に求めることができる。
【００４１】
好ましい実施態様として、本発明で決定されたＥＣ５０は、ヒト腫瘍細胞上に露出しているＡｘｌ  ＥＣＤに対する抗体結合の抗力を特徴付けた。ＥＣ５０パラメーターは、ＦＡＣＳ分析を用いて決定される。ＥＣ５０パラメーターは、ヒト腫瘍細胞上で発現されたヒトＡｘｌに対して最大結合の５０％が見られる抗体濃度を表す。各ＥＣ５０値は、４パラメーター回帰曲線フィッティングプログラム（Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて用量反応曲線の中央値として計算した。このパラメーターは、生理的状態／病的状態の代表例として選択されたものである。
【００４２】
本発明の一実施態様では、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、そのエピトープと、少なくとも１０−９Ｍ、優先的には１０−９〜１０−１２Ｍの間のＥＣ５０で結合する。
【００４３】
本発明の別の実施態様は、哺乳動物細胞、好ましくは、ヒト細胞、好ましくは、生細胞に、細胞内にインターナライズされ得る抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントを選択するためのプロセスまたは方法であり、
ｉ）Ａｘｌ、好ましくは、そのＥＤＣドメインまたはそのエピトープと結合する抗原結合タンパク質を選択する工程、および
ｉｉ）哺乳動物細胞の表面で発現されたＡｘｌタンパク質とのそれらの結合の後に、哺乳動物細胞にインターナライズされる、上記工程ｉ）から得られた上記抗原結合タンパク質を選択する工程
を含んでなる。
【００４４】
特定の実施態様では、上記哺乳動物細胞は、それらの表面でＡｘｌタンパク質受容体を天然に発現するか、またはそれらの表面で組換えＡｘｌタンパク質を発現する哺乳動物細胞、好ましくは、ヒト細胞である。
【００４５】
このような方法またはプロセスは、ｉ）Ａｘｌと少なくとも１０−９ＭのＥＣ５０で結合する抗原結合タンパク質を選択する工程、およびｉｉ）それらのＡｘｌとの結合の後にインターナライズされる、上記工程から得られた抗原結合タンパク質を選択する工程を含んでなり得る。ｉｉ）の選択工程は、インターナリゼーションの評価に関して当業者に知られているいずれの方法によっても具現化することができる。より詳しくは、試験は、ＦＡＣＳ、免疫蛍光、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、細胞傷害性評価などによって具現化することができる。
【００４６】
本発明による抗原結合タンパク質のもう一つの特徴は、腫瘍細胞の増殖に対していずれの顕著な活性も持たないということである。より詳しくは、以下の例で示されるように、本発明による抗原結合タンパク質は、増殖ＳＮ１２Ｃモデルに対していずれの顕著なｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性も持たない。
【００４７】
腫瘍学において、ｍＡｂが治療効力を発揮し得る機構は複数存在するが、それらの活性は持続的利益をもたらすには十分でない場合が多い。従って、特に化学療法薬としての薬物とそれらを組み合わせることでそれらの活性を増強するためにいくつかの戦略が採られてきた。組合せプロトコールに対する有効な代替法として、免疫毒素が癌を治療するための新規な治療選択肢となる[Beck A. et al. Discov. Med. (2010).10, 329-339; Alley S.C. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. (2009).330, 932-938]。抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）は、ｍＡｂの特異性を利用し、かつ、細胞傷害性薬剤の送達を腫瘍に標的化する能力がｍＡｂ活性と薬物活性の両方を著しく増強し得る一つのアプローチである。ｍＡｂは抗原と特異的に結合し、腫瘍細胞では実質的発現を伴うが、正常な細胞では発現が限定されることが理想的である。
【００４８】
本発明は、抗Ａｘｌ結合タンパク質、より詳しくは、Ａｘｌ結合の後にインターナライズされる高い能力を示す特異的抗Ａｘｌ抗体を対象とする。このような抗原結合タンパク質は、それらが連結された細胞傷害薬を標的癌細胞に向けることから、免疫−薬物複合体成分の一つとして注目されている。ひと度インターナライズされると、細胞傷害薬は癌細胞の死を誘発する。
【００４９】
免疫複合体療法で成功するための重要な鍵は、標的抗原特異性と、抗原結合タンパク質複合体の癌細胞へのインターナリゼーションであると考えられる。明らかに、非インターナライズ性の抗原は、インターナライズ性の抗原よりも細胞傷害性薬剤を送達する効果が低い。インターナリゼーションプロセスは抗原間で異なり、結合タンパク質により影響を受け得る複数のパラメーターに依存する。細胞表面ＲＴＫは、このようなアプローチを検討するために注目される抗原ファミリーを構成する。
【００５０】
この生体分子では、細胞傷害薬は細胞傷害活性をもたらし、使用する抗原結合タンパク質は癌細胞に対するその特異性をもたらすとともに、細胞傷害薬を細胞内に入れて適切にアドレス指定するためのベクターとなる。
【００５１】
よって、免疫複合体分子を改良するためには、担体結合タンパク質は、標的癌細胞への高いインターナライズ能を示さなければならない。結合タンパク質がインターナリゼーションを媒介した効率は、標的エピトープによって有意に異なる。強力なインターナライズ性抗Ａｘｌ結合タンパク質の選択には、Ａｘｌのダウンレギュレーションを研究するだけでなく、細胞内に入る抗Ａｘｌ結合タンパク質を追跡する様々な実験データが必要である。
【００５２】
好ましい実施態様では、本発明による抗原結合タンパク質のインターナリゼーションが、好ましくは、免疫蛍光（本出願の下記に例示される）またはインターナリゼーション機構を専門とする当業者に知られているいずれかの方法またはプロセスによって評価することができる。
【００５３】
別の好ましい実施態様では、本発明によるＡｘｌ−抗原結合タンパク質複合体は、本発明の結合タンパク質が上記ＡｘｌのＥＣＤに結合した後にインターナライズされるので、細胞表面のＡｘｌ量の減少が引き起こされる。この減少は、当業者に知られているいずれかの方法（ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、免疫蛍光など）によって定量することができる。
【００５４】
本発明の実施態様では、この減少（従ってインターナリゼーションを反映する）は、好ましくはＦＡＣＳにより測定し、非処理細胞で測定された平均蛍光強度（ＭＦＩ）と、本発明による抗原結合タンパク質で処理した細胞で測定されたＭＦＩとの間の差すなわちΔとして表すことができる。
【００５５】
本発明の非限定例として、このΔは、ｉ）本発明の抗原結合タンパク質との２４時間のインキュベーション期間の後のヒト腎腫瘍ＳＮ１２Ｃ細胞、およびｉｉ）Ａｌｅｘａ４８８で標識された二次抗体を用い、非処理細胞および実施例９に記載の本発明の抗原結合タンパク質で処理した細胞で得られたＭＦＩに基づいて決定される。このパラメーターは、下式で計算されると定義される。

Δ（ＭＦＩ２４ｈ非処理細胞−ＭＦＩ２４ｈ抗原結合タンパク質処理細胞）

ＭＦＩは細胞表面で発現されたＡｘｌに比例するので、このＭＦＩ間の差はＡｘｌのダウンレギュレーションを反映する。
【００５６】
より好ましく、有利な面では、本発明の抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも２００、好ましくは、少なくとも３００のΔ（ＭＦＩ２４ｈ非処理細胞−ＭＦＩ２４ｈ処理細胞）を誘発するモノクローナル抗体、好ましくは、単離されたＭａｂからなる。
【００５７】
本発明による抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも２００のＭＦＩ減少を誘導する。
【００５８】
より詳しくは、上述のΔは、以下のプロセス（例示的、非限定的例とみなされなければならない）に従って測定することができる：
ａ）目的の腫瘍細胞を本発明の抗原結合タンパク質で処理およびインキュベートし、
ｂ）工程ａ）の処理細胞と、並行して非処理細胞を、本発明の抗原結合タンパク質で処理し、
ｃ）処理および非処理細胞に関して、抗原結合タンパク質と結合することができる二次標識抗体を用いてＭＦＩ（表面に存在するＡｘｌの量を表す）を測定し、
ｄ）Δを、非処理細胞で得られたＭＦＩから処理細胞で得られたＭＦＩを差し引いた差として計算する。
【００５９】
用語「抗体(“antibody”, “antibodies”)」または「免疫グロブリン」は、互換的に、広義に使用され、モノクローナル抗体、好ましくは、単離されたＭａｂ（例えば、全長または完全モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体または多重特異性抗体（例えば、それらが所望の生物活性を示す限り、二重特異性抗体）を含む。
【００６０】
より詳しくは、このような分子は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を含んでなる糖タンパク質からなる。各重鎖は、重鎖可変領域（またはドメイン）（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）と重鎖定常領域を含んでなる。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含んでなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）と軽鎖定常領域を含んでなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬを含んでなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存性の高い領域が散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端方向に以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を仲介することができる。
【００６１】
本発明の意味における抗体はまた、ある特定のその抗体フラグメントも含む。上記抗体フラグメントは、供給源または免疫グロブリンのタイプ（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡなど）にかかわらず、所望の結合特異性および親和性を示し、すなわち、抗体フラグメントは、本発明の全長抗体に匹敵する親和性でＡｘｌタンパク質と特異的に結合することができる。
【００６２】
一般に、モノクローナル抗体またはそれらの機能的フラグメント、特にマウス起源のものの調製には、特に手引き書“Antibodies” (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)に記載されている技術またはKohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975)により記載されているハイブリドーマからの作製技術を参照することができる。
【００６３】
用語「モノクローナル抗体」または「Ｍａｂ」は、本明細書で使用する場合、特定の抗原に向けられ、かつ、Ｂ細胞の単一クローンまたはハイブリドーマによって生産され得る抗体分子を意味する。モノクローナル抗体はまた組換え型であってもよく、すなわち、タンパク質工学によって作製されてもよい。さらに、一般に様々な決定基またはエピトープに対する様々な抗体を含むポリクローナル抗体の作製とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原の単一のエピトープに対するものである。本発明は、単離された、または天然源から精製により得られた、または遺伝子組換えもしくは化学合成により得られた抗体に関する。
【００６４】
本発明の好ましい実施態様は、
ａ）配列番号１、２および３の配列、または配列番号１、２および３と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号４、５および６の配列、または配列番号４、５および６と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号３６、３７および３８の配列、または配列番号３６、３７および３８と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号３９、４０および４１の配列、または配列番号３９、４０および４１と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｃ）配列番号６４、６５および６６の配列、または配列番号６４、６５および６６と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号６７、６８および６９の配列、または配列番号６７、６８および６９と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
からなる群から選択される抗体を含んでなる、またはからなる抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントである。
【００６５】
本発明のより好ましい実施態様では、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、
ａ）配列番号１、２および３の配列を含んでなる、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号４、５および６の配列を含んでなる、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される３つの重鎖ＣＤＲを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号３６、３７および３８の配列を含んでなる、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号３９、４０および４１の配列を含んでなる、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｃ）配列番号６４、６５および６６の配列を含んでなる、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号６７、６８および６９の配列を含んでなる、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
からなる群から選択される抗体からなる。
【００６６】
好ましい面では、ＣＤＲ領域またはＣＤＲとは、ＩＭＧＴにより定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を示すものとする。相反する記述がなければ、ＣＤＲは、本明細書では、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される。
【００６７】
ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、抗原受容体、鎖のタイプ、または種が何であれ可変ドメインを比較するために定義されたものである[Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]。ＩＭＧＴ独自ナンバリングでは、保存されているアミノ酸は常に同じ位置を有し、例えば、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）がそうである。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、フレームワーク領域の標準画定（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６番、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５番、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４番およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８番）および相補性決定領域の標準画定：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８番、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５番およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７番を提供する。ギャップは非占有の位置を表し、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（括弧の間にドットで区切って示される、例えば、［８．８．１３］）は、重要な情報となる。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、ＩＭＧＴ  Ｃｏｌｌｉｅｒｓ  ｄｅ  Ｐｅｒｌｅｓと呼ばれる２次元グラフ[Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]、およびＩＭＧＴ／３次元構造−ＤＢの３次元構造[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]で用いられる。
【００６８】
本明細書において相反する記述がなければ、相補性決定領域またはＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を意味するものと理解しなければならない。
【００６９】
しかしながら、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステム(Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991および後続版)に従って定義することもできる。３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。ここで、用語「ＣＤＲ(“CDR” and “CDRs”)」は、それが認識する抗原またはエピトープに対する抗体の結合親和性を担うアミノ酸残基の大部分を含有する領域の、場合に応じて１以上の、またはさらには全部を示して用いられる。
【００７０】
Ｋａｂａｔナンバリングシステムによれば、本発明は、
ａ）配列番号９、１０および１１の配列、または配列番号９、１０および１１と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って定義される３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号１２、１３および１４の配列、または配列番号１２、１３および１４と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って定義される３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号４４、４５および４６の配列、または配列番号４４、４５および４６と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って定義される３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号４７、４８および４９の配列、または配列番号４７、４８および４９と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って定義される３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｃ）配列番号７２、７３および７４の配列、または配列番号７２、７３および７４と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って定義される３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号７５、７６および７７の配列、または配列番号７５、７６および７７と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って定義される３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
からなる群から選択される抗体からなる抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００７１】
本発明の意味において、２つの核酸またはアミノ酸配列間の「同一性パーセンテージ」は、最適なアラインメントの後に得られる、比較する２つの配列間で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは単に統計的なものであり、２つの配列間の違いはそれらの全長にわたってランダムに分布している。２つの核酸またはアミノ酸配列の比較は、それらを最適にアラインした後にこれらの配列を比較することにより慣行するが、この比較はセグメントによるか、または「アライメントウインドウ」を用いて行うことができる。比較のための配列の最適アライメントは、手作業による比較の他、Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]の類似性検索法の手段によるか、またはこれらのアルゴリズムを用いるコンピューターソフトウエア（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、または比較ソフトウエアＢＬＡＳＴ  ＮＲもしくはＢＬＡＳＴ  Ｐ）の手段によって行うことができる。
【００７２】
２つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、最適にアラインしたこれら２つの配列を比較することにより決定され、比較される核酸またはアミノ酸配列は、これらの２配列間の最適なアライメントのために、参照配列に対して付加または欠失を含み得る。同一性パーセンテージは、２配列間で、好ましくは２つの完全な配列間で、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基(the amino acid nucleotide or residue)が同一である位置の数を求め、この同一の位置の数をアライメントウインドウの位置の総数で割り、その商に１００を掛け、これらの２配列間の同一性パーセンテージを得ることにより算出される。
【００７３】
例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlのサイトで利用可能なＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」(Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174:247-250)を、デフォルトパラメーター（特に、パラメーター「オープンギャップペナルティー」：５、および「エクステンションギャップペナルティー」：２；選択されるマトリックスは、例えば、このプログラムにより提案されている「ＢＬＯＳＵＭ  ６２」マトリックスである）とともに使用することができ、比較する２配列間の同一性パーセンテージはこのプログラムにより直接算出される。
【００７４】
参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示すアミノ酸配列の好ましい例としては、参照配列、ある種の改変、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、末端切断または延長を含むものが挙げられる。１以上の連続的または非連続的アミノ酸の置換の場合、被置換アミノ酸が「等価な」アミノ酸に置き換えられる置換が好ましい。ここで「等価なアミノ酸」という表現は、対応する抗体の生物活性を改変せずに構造アミノ酸の１つで置換され得る任意のアミノ酸を示すものとし、これらの具体例は以下に定義される。
【００７５】
等価なアミノ酸は、それらに代わって置換されるアミノ酸との構造的相同性か、または生成可能な種々の抗原結合タンパク質間の生物活性の比較試験の結果のいずれかに対して決定することができる。
【００７６】
限定されない例として、下表２に、対応する改変抗原結合タンパク質の生物活性の著しい改変を生じさせることなく実施可能な置換の可能性をまとめる。当然のことながら、同じ条件で逆の置換も可能である。
【００７７】
【表２】
0006445444.tif 000003
【００７８】
本発明の実施態様は、配列番号１、２および３の配列、または配列番号１、２および３と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号８の配列、または配列番号８と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００７９】
本発明の好ましい実施態様によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１、２および３の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号８の配列、または配列番号８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる。
【００８０】
本発明の別の好ましい実施態様によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８の配列、または配列番号８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインを含んでなる。
【００８１】
「配列番号８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列」とは、３つの重鎖ＣＤＲ、配列番号４、５および６を示し、加えて、それらのＣＤＲに相当する配列、すなわち、配列番号４、５および６以外の配列番号８の全配列と少なくとも８０％の同一性を示す配列を称することを意図する。
【００８２】
本発明の別の実施態様は、配列番号７の配列、または配列番号７と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号４、５および６の配列、または配列番号４、５および６と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００８３】
本発明の好ましい実施態様によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７の配列、または配列番号７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号４、５および６の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる。
【００８４】
本発明の別の好ましい実施態様によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７の配列、または配列番号７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる。
【００８５】
「配列番号７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列」とはまた、３つの軽鎖ＣＤＲ、配列番号１、２および３を示し、加えて、これらのＣＤＲに相当する配列、すなわち、配列番号１、２および３以外の配列番号７の全配列と少なくとも８０％の同一性を示す配列を称することを意図する。
【００８６】
本発明の別の実施態様は、配列番号７の配列、または配列番号７と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号８の配列、または配列番号８と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００８７】
本発明の好ましい実施態様によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７の配列、または配列番号７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号８の配列、配列番号８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる。
【００８８】
本発明の一実施態様は、配列番号３６、３７および３８の配列、または配列番号３６、３７および３８と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号４３の配列、または配列番号４３と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００８９】
本発明の好ましい実施態様によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３６、３７および３８の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号４３の配列、または配列番号４３と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる。
【００９０】
本発明の別の好ましい実施態様によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４３の配列、または配列番号４３と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインを含んでなる。
【００９１】
「配列番号４３と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列」とは、３つの重鎖ＣＤＲ配列番号３９、４０および４１を示し、加えて、これらのＣＤＲに相当する配列、すなわち、配列番号３９、４０および４１以外の配列番号４３の全配列と少なくとも８０％の同一性を示す配列を称することを意図する。
【００９２】
本発明の別の実施態様は、配列番号４２の配列、または配列番号４２と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号３９、４０および４１の配列、または配列番号３９、４０および４１と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００９３】
本発明の好ましい実施態様によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４２の配列、または配列番号４２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号３９、４０および４１の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる。
【００９４】
本発明の別の好ましい実施態様によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４２の配列、または配列番号４２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる。
【００９５】
「配列番号４２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列」とはまた、３つの軽鎖ＣＤＲ配列番号３６、３７および３８を示し、加えて、これらのＣＤＲに相当する配列、すなわち、配列番号３６、３７および３８以外の配列番号４２の全配列と少なくとも８０％の同一性を示す配列を称することを意図する。
【００９６】
本発明の別の実施態様は、配列番号４２の配列、または配列番号４２と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号４３の配列、または配列番号４３と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００９７】
本発明の好ましい実施態様によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４２の配列、または配列番号４２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号４３の配列、または配列番号４３と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる。
【００９８】
本発明の一実施態様は、配列番号６４、６５および６６の配列、または配列番号６４、６５および６６と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号７１の配列、または配列番号７１と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００９９】
本発明の好ましい実施態様によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号６４、６５および６６の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号７１の配列、または配列番号７１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる。
【０１００】
本発明の別の好ましい実施態様によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７１の配列、または配列番号７１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインを含んでなる。
【０１０１】
「配列番号７１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列」とは、３つの重鎖ＣＤＲ配列番号６７、６８および６９を示し、加えて、これらのＣＤＲに相当する配列、すなわち、配列番号６７、６８および６９以外の配列番号７１の全配列と少なくとも８０％の同一性を示す配列を称することを意図する。
【０１０２】
本発明の別の実施態様は、配列番号７０の配列、または配列番号７０と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号６７、６８および６９の配列、または配列番号６７、６８および６９と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
【０１０３】
本発明の好ましい実施態様によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７０の配列、または配列番号７０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号６７、６８および６９の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる。
【０１０４】
本発明の別の好ましい実施態様によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７０の配列、または配列番号７０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる。
【０１０５】
「配列番号７０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列」とはまた、３つの軽鎖ＣＤＲ配列番号６４、６５および６６を示し、加えて、これらのＣＤＲに相当する配列、すなわち、配列番号６４、６５および６６以外の配列番号７０の全配列と少なくとも８０％の同一性を示す配列を称することを意図する。
【０１０６】
本発明の別の実施態様は、配列番号７０の配列、または配列番号７０と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７１の配列、または配列番号７１と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
【０１０７】
本発明の好ましい実施態様によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７０の配列、または配列番号７０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７１の配列、または配列番号７１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる。
【０１０８】
より明確にするため、下表３ａ〜３ｃに、本発明の抗原結合タンパク質に相当する種々のアミノ酸配列をまとめる。
【０１０９】
【表３】
0006445444.tif 000004
【０１１０】
【表４】
0006445444.tif 000005
【０１１１】
【表５】
0006445444.tif 000006
【０１１２】
本発明の特定の面は、マウス抗体、またはその誘導化合物もしくは抗原結合フラグメントに関し、上記抗体はまた、マウスとは異種の、特にヒトの抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域も含んでなることを特徴とする。
【０１１３】
本発明の別の特定の面は、キメラ抗体、またはその誘導化合物もしくは抗原結合フラグメントに関し、上記抗体はまた、マウスとは異種の、特にヒトの抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域も含んでなることを特徴とする。
【０１１４】
本発明のさらに別の特定の面は、ヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは抗原結合フラグメントに関し、ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域がそれぞれ、λまたはκ領域、およびγ−１、γ−２またはγ−４領域であることを特徴とする。
【０１１５】
本発明の別の面は、
ａ）２００８年４月２日にＣＮＣＭ（パスツール研究所、フランス）に寄託されたハイブリドーマＩ−３９５９に由来するモノクローナル抗体１１０Ｄ７、またはその抗原結合フラグメント；
ｂ）２０１１年７月２８日にＣＮＣＭ（パスツール研究所、フランス）に寄託されたハイブリドーマＩ−４４９９に由来するモノクローナル抗体１００３Ａ２、またはその抗原結合フラグメント；
ｃ）２０１１年７月２８日にＣＮＣＭ（パスツール研究所、フランス）に寄託されたハイブリドーマＩ−４５０１に由来するモノクローナル抗体  １０２４Ｇ１１、またはその抗原結合フラグメント
からなる群から選択されるモノクローナル抗体からなる抗原結合タンパク質である。
【０１１６】
別の面によれば、本発明は、本発明による抗原結合タンパク質を分泌することができるマウスハイブリドーマ、特に、Ｆｒｅｎｃｈ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリ、フランス）に２００８年４月２日にＩ−３９５９の番号で、２０１１年７月２８日にＩ−４４９９の番号で、または２０１１年７月２８日にＩ−４５０１の番号で提出されたマウス起源のハイブリドーマに関する。
【０１１７】
上記ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫マウス脾細胞／リンパ球と骨髄腫Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ  １４細胞株の細胞との融合により得られたものである。
【０１１８】
別の面によれば、本発明は、配列番号１、２および３の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号４、５および６の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体を分泌することができるマウスハイブリドーマに関し、上記ハイブリドーマは、２００８年４月２日にＣＮＣＭ（パスツール研究所、パリ、フランス）にＩ−３９５９の番号で提出されている。
【０１１９】
別の面によれば、本発明は、配列番号３６、３７および３８の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号３９、４０および４１の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体を分泌することができるマウスハイブリドーマに関し、上記ハイブリドーマは、２０１１年７月２８日にＣＮＣＭ（パスツール研究所、パリ、フランス）にＩ−４４９９の番号で提出されている。
【０１２０】
別の面によれば、本発明は、配列番号６４、６５および６６の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号６７、６８および６９の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体を分泌することができるマウスハイブリドーマに関し、上記ハイブリドーマは、２０１１年７月２８日にＣＮＣＭ（パスツール研究所、パリ、フランス）にＩ−４５０１の番号で提出されている。
【０１２１】
上記ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫マウス脾細胞／リンパ球と骨髄腫Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ  １４細胞株の細胞との融合により得られたものである。
【０１２２】
本発明の対象は、
ａ）２００８年４月２日にＣＮＣＭ（パスツール研究所、フランス）に寄託されたマウスハイブリドーマＩ−３９５９；
ｂ）２０１１年７月２８日にＣＮＣＭ（パスツール研究所、フランス）に寄託されたマウスハイブリドーマＩ−４４９９；
ｃ）２０１１年７月２８日にＣＮＣＭ（パスツール研究所、フランス）に寄託されたマウスハイブリドーマＩ−４５０１
から選択されるマウスハイブリドーマである。
【０１２３】
本発明の抗原結合タンパク質はまた、キメラまたはヒト化抗体も含んでなる。
【０１２４】
キメラ抗体は、所与の種の抗体に由来する天然可変領域（軽鎖および重鎖）を、その所与の種とは異種の抗体の軽鎖および重鎖の定常領域と組み合わせて含有するものである。
【０１２５】
抗体、またはそのキメラフラグメントは、組換え遺伝学の技術を用いることにより作製することができる。例えば、キメラ抗体は、プロモーターと、本発明の非ヒト、特にマウス、モノクローナル抗体の可変領域をコードする配列と、ヒト抗体定常領域をコードする配列とを含有する組換えＤＮＡをクローニングすることによって作製することができる。このような１つの組換え遺伝子によりコードされている本発明によるキメラ抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラであり得、この抗体の特異性は、マウスＤＮＡに由来する可変領域によって決定され、そのアイソタイプは、ヒトＤＮＡに由来する定常領域によって決定される。キメラ抗体を作製するための方法については、Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988)を参照。
【０１２６】
別の面では、本発明は、キメラ抗体からなる結合タンパク質を記載する。
【０１２７】
特定の好ましい実施態様では、本発明のキメラ抗体、またはその抗原結合フラグメントは、
ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン配列を含んでなり、そこに配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン配列を含んでなる抗体；
ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン配列を含んでなり、そこに配列番号４３のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン配列を含んでなる抗体；
ｃ）配列番号７０のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン配列を含んでなり、そこに配列番号７１のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン配列を含んでなる抗体
からなる群から選択される。
【０１２８】
別の面では、本発明は、ヒト化抗体からなる結合タンパク質を記載する。
【０１２９】
「ヒト化抗体」とは、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲ領域を含有し、その抗体分子の他の部分は１つ（または数個の）ヒト抗体に由来する抗体を意味する。さらに、骨格セグメント残基（ＦＲと呼ばれる）のいくつかは結合親和性を保存するために改変することができる(Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988)。
【０１３０】
本発明のヒト化抗体またはそのフラグメントは、当業者に知られている技術（例えば、文献Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992;およびBebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992に記載されているものなど）によって作製することができる。このようなヒト化抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける予防的処置および／もしくは治療的処置を含む方法におけるそれらの使用のために好ましい。例えば、ＰＤＬにより欧州特許第０４５１２６１号、同第０６８２０４０号、同第０９３９１２７号、同第０５６６６４７号または米国特許第５，５３０，１０１号、同第６，１８０，３７０号、同第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６１号に記載されている「ＣＤＲグラフト」技術など、他のヒト化技術も当業者に知られている。米国特許第５，６３９，６４１号または同第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号も引用することができる。
【０１３１】
さらに、本発明はまた、上記のマウス抗体から生じるヒト化抗体に関する。
【０１３２】
好ましい様式では、ヒト抗体由来の軽鎖および重鎖の定常領域はそれぞれ、λまたはκ、およびγ−１、γ−２またはγ−４領域である。
【０１３３】
本発明の新規な面は、以下の核酸（いずれの縮重遺伝コードも含む）：
ａ）本発明による抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸；
ｂ）
・配列番号１５〜２８、５０〜６３および７８〜９１からなる群から選択される核酸配列、または
・配列番号１５〜２０もしくは５０〜５５もしくは７８〜８３の６つの核酸配列を含んでなる核酸配列、または
・配列番号２１と２２もしくは５６と５７もしくは７８と８５の２つの核酸配列を含んでなる核酸配列
を含んでなる核酸；
ｃ）ａ）またはｂ）に定義された核酸と相補的な核酸；および
ｄ）パートａ）もしくはｂ）に定義された核酸配列と、またはパートａ）もしくはｂ）に定義された核酸配列との最適なアラインメントの後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列と、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる、好ましくは少なくとも１８ヌクレオチドを有する、核酸
の中から選択されることを特徴とする単離された核酸に関する。
【０１３４】
下表４ａ〜４ｃに、本発明の結合タンパク質に関する種々のヌクレオチド配列をまとめる。
【０１３５】
【表６】
0006445444.tif 000007
【０１３６】
【表７】
0006445444.tif 000008
【０１３７】
【表８】
0006445444.tif 000009
【０１３８】
用語「核酸」、「核酸配列(nucleic sequence)」、「核酸配列(nucleic acid sequence)」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は、本明細書において互換的に用いられ、改変または非改変型の、核酸のフラグメントまたは領域を定義し、非天然ヌクレオチドを含有する、または含有しない、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたはこれらのＤＮＡの転写産物のいずれかである、ヌクレオチドの正確な配列を意味する。
【０１３９】
本発明の配列は単離および／または精製されたものであり、すなわち、それらは、少なくとも部分的に改変されたそれらの環境から、例えばコピーによって直接的または間接的にサンプリングされたものである。ここでまた、例えば宿主細胞の手段による組換え遺伝学によって得られた、または化学合成によって得られた単離された核酸も記載しておくべきであろう。
【０１４０】
「最適なアライメントの後に好ましい配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性パーセンテージを示す核酸配列」とは、参照核酸配列に対して、特に、欠失、末端切断、延長、キメラ融合および／または置換、特に規則的なものなどの特定の改変を示す核酸配列を意味する。好ましくは、これらは参照配列と同じアミノ酸配列をコードする配列（これは遺伝コードの縮重に関連する）、または好ましくは高ストリンジェント条件下、特に以下に定義される条件下で、参照配列と特異的にハイブリダイズし得る相補的配列である。
【０１４１】
高ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションとは、温度およびイオン強度に関する条件が、２つの相補的ＤＮＡフラグメント間でハイブリダイゼーションを維持させるように選択されることを意味する。単に例であるが、上記のポリヌクレオチドフラグメントを定義するためのハイブリダイゼーション工程の高ストリンジェント条件は有利には以下の通りである。
【０１４２】
ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは、（１）５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム溶液に相当する）、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×デンハート液、５％デキストラン硫酸および１％サケ精子ＤＮＡを含有するリン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中、４２℃で３時間のプレハイブリダイゼーション；（２）プローブ長に応じた温度（すなわち、プローブ＞１００ヌクレオチド長の場合は４２℃）で２０時間の主要ハイブリダイゼーションの後、２×ＳＳＣ＋２％ＳＤＳ中、２０℃、２０分の洗浄２回、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中、２０℃、２０分の洗浄１回、という二段階で行う。最後の洗浄は、プローブ＞１００ヌクレオチド長の場合は６０℃で３０分間、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で行う。定義されたサイズのポリヌクレオチドに関する上記の高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、当業者ならば、Sambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition, 2001)に記載の手順に従って、より長いまたは短いオリゴヌクレオチドに適合させることができる。
【０１４３】
本発明はまた、本発明に記載される核酸を含んでなるベクターに関する。
【０１４４】
本発明は、特に、このようなヌクレオチド配列を含むクローニングおよび／または発現ベクターを対象とする。
【０１４５】
本発明のベクターは好ましくは、所与の宿主細胞でのヌクレオチド配列の発現および／または分泌を可能とするエレメントを含む。従って、ベクターはプロモーター、翻訳開始および終結シグナル、ならびに好適な転写調節領域を含まなければならい。ベクターは宿主細胞で安定に維持できなければならず、場合により、翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特定のシグナルを有することができる。これらの種々のエレメントは、当業者により、用いる宿主細胞に従って選択および最適化される。この目的で、これらのヌクレオチド配列は選択された宿主内の自己複製ベクターに挿入することができるか、または選択された宿主の組込型ベクターであり得る。
【０１４６】
このようなベクターは当業者により一般に用いられる方法によって作製され、得られたクローンは、リポフェクション、エレクトロポレーション、熱ショックまたは化学的方法などの標準的な方法によって好適な宿主に導入することができる。
【０１４７】
これらのベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。それらは、本発明のヌクレオチド配列のクローニングまたは発現のために宿主細胞を形質転換するのに用いられる。
【０１４８】
本発明はまた、本発明に記載されるベクターにより形質転換された、または本発明に記載されるベクターを含んでなる、単離された宿主細胞を含んでなる。
【０１４９】
宿主細胞は原核生物系または真核生物系、例えば、細菌細胞、例えばまた、酵母細胞もしくは動物細胞、特に、哺乳動物細胞（ヒトを除く）、の中から選択することができる。また、昆虫細胞または植物細胞を用いることもできる。
【０１５０】
本発明はまた、本発明に従って形質転換された細胞を含む、ヒト以外の動物に関する。
【０１５１】
本発明の別の面は、本発明による抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントの生産方法に関し、上記方法が以下の工程：
ａ）本発明による宿主細胞を培地中、好適な培養条件で培養する工程；および
ｂ）このようにして生産された抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントの１つを培養培地または上記培養細胞から回収する工程
を含んでなることを特徴とする。
【０１５２】
本発明に従って形質転換された細胞は、本発明による組換え抗原結合タンパク質の作製方法で用いられる。本発明によるベクター、および／またはベクターによって形質転換された細胞を用いることを特徴とする、本発明による抗原結合タンパク質の組換え型での作製方法も本発明に含まれる。好ましくは、本発明によるベクターによって形質転換された細胞は、上記抗原結合タンパク質の発現および上記組換えタンパク質の回収を可能とする条件下で培養される。
【０１５３】
すでに述べたように、宿主細胞は原核生物系または真核生物系から選択することができる。特に、このような原核生物系または真核生物系で分泌を促進する本発明のヌクレオチド配列を同定することができる。従って、このような配列を有する本発明によるベクターは、分泌させる組換えタンパク質の生産のために有利に使用することができる。実際、目的のこれらの組換えタンパク質の精製は、それらが宿主細胞の内部よりもむしろ細胞培養の上清中に存在するということにより容易となる。
【０１５４】
また、本発明の抗原結合タンパク質は化学合成によって作製することもできる。このような作製方法の１つもまた本発明の課題である。当業者ならば、固相技術（特にSteward et al, 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed., pp 71-95参照）、または部分的固相技術、溶液中でのフラグメントの縮合もしくは慣例の合成によるなどの、化学合成法を知っている。化学合成によって得られ、対応する非天然アミノ酸を含み得るポリペプチドもまた本発明に含まれる。
【０１５５】
本発明の方法によって得ることができる抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントもまた本発明に含まれる。
【０１５６】
特定の面によれば、本発明は、細胞傷害性薬剤を宿主標的部位に送達するためのアドレッシング産物として使用するための、上記の抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関し、上記宿主標的部位は、タンパク質Ａｘｌ細胞外ドメイン、好ましくは、ヒトタンパク質Ａｘｌ細胞外ドメイン、より好ましくは、配列番号３１もしくは３２の配列、またはその天然変異体配列を有するヒトタンパク質Ａｘｌ細胞外ドメインに局在するエピトープからなる。
【０１５７】
好ましい実施態様では、上記宿主標的部位は、哺乳動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞、より好ましくは、天然にまたは遺伝子組換えの手段によりＡｘｌタンパク質を発現する細胞の標的部位である。
【０１５８】
本発明は、細胞傷害性薬剤に結合された本明細書に記載の抗原結合タンパク質を含んでなる免疫複合体に関する。
【０１５９】
本発明の意味において、「免疫複合体(“immunoconjugate” or “immune-conjugate”)」とは、一般に、１種類以上の治療薬と物理的に連結された少なくとも１種類のアドレッシング産物を含んでなる化合物を意味し、従って、標的性の高い化合物を作り出す。
【０１６０】
好ましい実施態様では、このような治療薬は細胞傷害性薬剤からなる。
【０１６１】
「細胞傷害性薬剤」または「細胞傷害性」とは、被験体に投与した際に、細胞機能を阻害もしくは妨害すること、および／または細胞死を引き起こすことにより、被験体の身体で細胞増殖の進展、好ましくは、癌の発生を治療または予防する薬剤を意図する。
【０１６２】
多くの細胞傷害性薬剤が単離または合成されており、細胞増殖を阻害すること、または、限定的でなくとも、少なくとも有意に腫瘍細胞を破壊するもしくは減少させることを可能とする。しかしながら、これらの薬剤の傷害活性は腫瘍細胞に限定されず、非腫瘍細胞も影響を受け、破壊され得る。より詳しくは、造血細胞または上皮細胞、特に粘膜の上皮細胞などの急速に更新する細胞に副作用が見られる。例として、消化管の細胞はこのような細胞傷害性薬剤の使用によって大きく影響を受ける。
【０１６３】
本発明の目的の１つはまた、腫瘍細胞に対する高い細胞傷害性を保持すると同時に正常細胞に対する副作用を制限することを可能とする細胞傷害性薬剤を提供できることである。
【０１６４】
より詳しくは、細胞傷害性薬剤は、好ましくは、限定されるものではないが、薬物（すなわち、「抗体−薬物複合体」）、毒素（すなわち、「免疫毒素」または「抗体−毒素複合体」）、放射性同位元素（すなわち、「放射性免疫複合体」または「抗体−放射性同位元素複合体」）などからなり得る。
【０１６５】
本発明の第１の好ましい実施態様では、免疫複合体は、少なくとも１種類の薬物または薬剤に連結された結合タンパク質からなる。このような免疫複合体は、結合タンパク質が抗体、またはその抗原結合フラグメントである場合には、抗体−薬物複合体（または「ＡＤＣ」）と呼ばれる。
【０１６６】
第１の実施態様では、このような薬物は、それらの作用様式に関して記載することができる。非限定例として、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード、スルホン酸アルキル(alkyle-sulfonates)、ニトロソ尿素、オキサゾホリン(oxazophorins)、アジリジンまたはイミン−エチレン）、抗代謝産物、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、クロマチン形成阻害剤、抗血管新生薬、抗エストロゲン作用薬、抗アンドロゲン作用薬、キレート剤、鉄吸収促進剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＤＮＡ阻害剤、ＤＮＡ合成阻害剤(DNA synthetis inhibitors)、アポトーシス促進剤(Apopstotis stimulants)、チミジル酸阻害剤、Ｔ細胞阻害剤、インターフェロン拮抗薬、リボヌクレオシド三リン酸レダクターゼ阻害剤、アロマターゼ阻害剤、エストロゲン受容体拮抗薬、チロシンキナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、タキサン、チューブリン阻害剤、血管新生阻害剤、マクロファージ刺激剤、ニューロキニン受容体拮抗薬、カンナビノイド受容体拮抗薬、ドーパミン受容体作動薬(Dopamine receptor agonsists)、顆粒球刺激因子作動薬、エリスロポエチン受容体作動薬、ソマトスタチン受容体作動薬、ＬＨＲＨ作動薬、カルシウム増感剤、ＶＥＧＦ受容体拮抗薬、インターロイキン受容体拮抗薬、破骨細胞阻害剤、ラジカル形成促進剤、エンドセリン受容体拮抗薬、ビンカアルカロイド、抗ホルモンもしくは免疫調節剤、または細胞傷害薬もしくは毒素の活性基準を満たす任意の他の新規な薬物が挙げられる。
【０１６７】
このような薬物は、例えば、ＶＩＤＡＬ  ２０１０の、癌腫学および血液学の段「細胞傷害薬」に付属する化合物にさかれた頁に引用されており、この文献に参照として引用されているこれらの細胞傷害性化合物が、本明細書で好ましい細胞傷害性薬剤として引用される。
【０１６８】
より詳しくは、限定されるものではないが、本発明によれば以下の薬物が好ましい：メクロレタミン、クロラムブコル(chlorambucol)、メルファレン(melphalen)、クロリドレート(chlorydrate)、ピポブロメン(pipobromen)、プレドニムスチン、リン酸二ナトリウム(disodic-phosphates)、エストラムスチン、シクロホスファミド、アルトレタミン、トロフォスファミド、スルホフォスファミド、イフォスファミド、チオテパ、トリエチルエナミン、アルテトラミン(altetramine)、カルムスチン、ストレプトゾシン、フォテムスチン、ロムスチン、ブスルファン、トレオスルファン、インプロスルファン、ダカルバジン、シスプラチナム、オキサリプラチン、ロバプラチン、ヘプタプラチン(heptaplatin)、ミリプラチン水和物、カルボプラチン、メトトレキサート、ペメトレキセド、５−フルオルウラシル、フロクスウリジン、５−フルオロデオキシウリジン、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、ネララビン、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、クロロデスオキシアデノシン(chlorodesoxyadenosine)、５−アザシチジン、ゲムシタビン、クラドリビン、デオキシコホルマイシン、テガフール、ペントスタチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、バルルビシン、塩酸アムルビシン、ピラルビシン、酢酸エリプチニウム、ゾルビシン、エピルビシン、イダルビシンおよびテニポシド、ラゾキシン、マリマスタット、バチマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、イロマスタット、ＣＧＳ−２７０２３Ａ、ハロフジノン(halofuginon)、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、サリドマイド、ＣＤＣ  ５０１、ＤＭＸＡＡ、Ｌ−６５１５８２、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、インターフェロン−α、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンギオスタチン、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、フルタミド、ニルタミド、スプリロノラクトン(sprironolactone)、酢酸シプロテロン、フィナステリド、シミチジン(cimetidine)、ボルテゾミド(bortezomid)、ベルケード、ビカルタミド、シプロテロン、フルタミド、フルベストラン(fulvestran)、エキセメスタン、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、レチノイド、レキシノイド、メトキサレン(methoxsalene)、レブリン酸メチルアミノ、アルデスロイキン(aldesleukine)、ＯＣＴ−４３、デニロイキンジフリトクス(denileukin diflitox)、インターロイキン−２、タソネルミン(tasonermine)、レンチナン、シゾフィラン、ロキニメックス、ピドチモド、ペガデマーゼ、チモペンチン(thymopentine)、ポリＩ：Ｃ、プロコダゾール(procodazol)、Ｔｉｃ  ＢＣＧ、コリネバクテリウム・パルブム（corynebacterium parvum）、ＮＯＶ−００２、ウクライン、レバミゾール、１３１１−ｃ��ＴＮＴ、Ｈ−１０１、セルモロイキン、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、インターフェロンγ１ａ、インターロイキン−２、モベナキン、レキシン−Ｇ、テセロイキン、アクラルビシン、アクチノマイシン、アルグラビン、アスパラギナーゼ、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダウノマイシン、ロイコボリン、マソプロコール、ネオカルジノスタチン、ペプロマイシン、サルコマイシン、ソラマージン、トラベクテジン、ストレプトゾシン、テストステロン、クネカテキン、シネカテキン、アリトレチノイン、塩酸ベロテカン、カルステロン、ドロモスタノロン、酢酸エリプチニウム、エチニルエストラジオール、エトポシド、フルオキシメステロン、フォルメスタン、ホスフェトロール(fosfetrol)、酢酸ゴセレリン、アミノレブリン酸ヘキシル、ヒストレリン、ヒドロキシプロゲステロン、イキサベピロン、ロイプロリド、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲステロール、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、ミルテホシン、ミトブロニトール、フェニルプロピオン酸ナドドロン、酢酸ノレシンドロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、テムシロリムス(temsirrolimus)、テストラクトン、トリアムコノロン(triamcinolone)、トリプトレリン、酢酸バプレオチド、ジノスタチンスチマラマー、アムサクリン、三酸化ヒ素、塩酸ビサントレン、クロラムブシル、クロルトリアニセン(chlortrianisene)、シス−ジアミンジクロロプラチニウム(cis-diamminedichloroplatinium)、シクロホスファミド、ジエチルスチルベストロール、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、レナリドマイド、ロニダミン、メクロレタナミン(mechlorethanamine)、ミトタン、ネダプラチン、塩酸ニムスチン、パミドロン酸塩、ピポブロマン、ポルフィマーナトリウム、ラニムスチン、ラゾキサン、セムスチン、ソブゾキサン、メシル酸塩、トリエチレンメラミン、ゾレンドロン酸、メシル酸カモスタット、ファドロゾールＨＣｌ、ナフォキシジン、アミノグルテチミド、カルモフール、クロファラビン、シトシンアラビノシド、デシタビン、ドキシフルリジン、エノシタビン、リン酸フルダラビン(fludarabne)、フルオロウラシル、フトラフール、ウラシルマスタード、アバレリクス、ベキサロテン、ラルチテルキセド(raltiterxed)、タミバロテン、テモゾロミド、ボリノスタット、メガストロール(megastrol)、クロドロネート二ナトリウム、レバミゾール、フェルモキシトール、鉄イソマルトシド、セレコキシブ、イブジラスト、ベンダムスチン、アルトレタミン、ミトラクトール、テムシロリムス、プララトレキサート、ＴＳ−１、デシタビン、ビカルタミド、フルタミド、レトロゾール、クロドロネート二ナトリウム、デガレリクス、クエン酸トレミフェン、二塩酸ヒスタミン、ＤＷ−１６６ＨＣ、ニトラクリン、デシタビン、塩酸イリノテカン(irinoteacn)、アムサクリン、ロミデプシン、トレチノイン、カバジタキセル、バンデタニブ、レナリドマイド、イバンドロン酸、ミルテホシン、ビテスペン、ミファムルチド、ナドロパリン、グラニセトロン、オンダンセトロン、トロピセトロン、アリザプリド、ラモセトロン、メシル酸ドラセトロン、ホスアプレピタントジメグルミン、ナビロン、アプレピタント、ドロナビノール、ＴＹ−１０７２１、リスリ��水素マレイン酸塩、エピセラム、デフィブロチド、ダビガトランエテキシレート、フィルグラスチム、ペグフィルグラスチム、レディタクス、エポエチン、モルグラモスチム、オプレルベキン、シプロイセル−Ｔ、Ｍ−Ｖａｘ、アセチルＬ−カルニチン、塩酸ドネペジル、５−アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、酢酸セトロレリクス、イコデキストリン、ロイプロレリン、メトビルフェニデート(metbylphenidate)、オクトレオチド、アンレキサノクス、プレリキサフォル、メナテトレノン、アネトールジチオールチオン、ドキセルカルシフェロール、塩酸シナカルセト、アレファセプト、ロミプロスチム、サイモグロブリン、チマルファシン、ウベニメクス、イミキモド、エベロリムス、シロリムス、Ｈ−１０１、ラソフォキシフェン、トリロスタン、インカドロン酸塩、ガングリオシド、ペガプタニブ八ナトリウム、ベルトポルフィン(vertoporfin)、ミノドロン酸、ゾレンドロン酸、硝酸ガリウム、アレンドロン酸ナトリウム、エチドロン酸二ナトリウム、パミドロン酸二ナトリウム、デュタステライド、スチボグルコン酸ナトリウム、アルモダフィニル、デクスラゾキサン、アミフォスチン、ＷＦ−１０、テモポルフィン、ダルベポエチンアルファ、アンセスチム、サルグラモスチム、パリフェルミン、Ｒ−７４４、ネピデルミン、オプレルベキン、デニロイキンディフチトクス、クリサンタスパーゼ、ブセレリン、デスロレリン、ランレオチド、オクトレオチド、ピロカルピン、ボセンタン、カリケアマイシン、メイタンシノイドおよびシクロニカート。
【０１６９】
より詳しくは、当業者は、“Association Francaise des Enseignants de Chimie Therapeutique”により編集された表題“traite de chimie therapeutique, vol. 6, Medicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, edition TEC & DOC, 2003”の手引き書を参照することができる。
【０１７０】
本発明の第２の好ましい実施態様では、免疫複合体は、少なくとも１種類の放射性同位元素と連結された結合タンパク質からなる。このような免疫複合体は、結合タンパク質が抗体、またはその抗原結合フラグメントである場合には、抗体−放射性同位元素複合体（または「ＡＲＣ」）と呼ばれる。
【０１７１】
腫瘍の選択的破壊のためには、抗体は、放射性の高い原子を含んでなってもよい。ＡＲＣの作製には様々な放射性同位元素が利用可能であり、例えば、限定されるものではないが、Ａｔ２１１、Ｃ１３、Ｎ１５、Ｏ１７、Ｆｌ１９、Ｉ１２３、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｉｎ１１１、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、ｔｃ９９ｍ、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、Ｌｕ、ガドリニウム、マンガンまたは鉄の放射性同位元素がある。
【０１７２】
このような放射性同位元素をＡＲＣに組み込むためには、当業者に知られているいずれの方法またはプロセスも使用することができる（例えば、“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”, Chatal, CRC Press 1989参照）。非限定例として、ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１はシステイン残基を介して結合させることができる。Ｙ９０はリシン残基を介して結合させることができる。Ｉ１２３はヨードゲン法(Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)を用いて結合させることができる。
【０１７３】
ＡＲＣ分野の当業者の知識を示すために、チオ尿素リンカー−キレーターにより結合された抗ＣＤ２０モノクローナル抗体とＩｎ１１１またはＹ９０放射性同位元素から構成されるＡＲＣであるゼヴァリン(商標）(Wiseman et at (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et at (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)、またはカリケアマイシンと連結された抗ＣＤ３３抗体から構成されるマイロターグ（商標）（米国特許第４，９７０，１９８号；同第５，０７９，２３３号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６０６，０４０号；同第５，６９３，７６２号；同第５，７３９，１１６号；同第５，７６７，２８５号；同第５，７７３，００１号）など、いくつかの例を挙げることができる。もっと最近では、ホジキンリンパ腫の治療において最近ＦＤＡにより承認されたアドセトリスと呼ばれるＡＤＣ（ブレンツキシマブベドチンに相当する）を挙げることもできる(Nature, vol. 476, pp380-381, 25 August 2011)。
【０１７４】
本発明の第３の好ましい実施態様では、免疫複合体は、少なくとも１種類の毒素と連結された結合タンパク質からなる。このような免疫複合体は、結合タンパク質が抗体、またはその抗原結合フラグメントである場合には、抗体−毒素複合体（または「ＡＴＣ」）と呼ばれる。
【０１７５】
毒素は、生きている生物によって産生される有効かつ特異的な有毒物質である。毒素は通常、数百（ペプチド）から１０万（タンパク質）の間で分子量が異なり得るアミノ酸鎖からなる。毒素はまた、低分子有機化合物であってもよい。毒素は多くの生物、例えば、細菌、真菌、藻類および植物により産生される。それらの多くは極めて有毒であり、神経薬よりも数桁高い毒性を持つ。
【０１７６】
ＡＴＣに使用される毒素としては、限定されるものではないが、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構によってそれらの細胞傷害作用を発揮し得る、あらゆる種類の毒素を含み得る。
【０１７７】
使用可能な酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ(Phytolaca Americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ(momordica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ(sapaonaria officinalis)阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン(tricothecenes)が含まれる。
【０１７８】
ドラスタチン、オーリスタチン、トリコテセン、およびＣＣ１０６５などの小分子毒素、ならびに毒素活性のあるこれらの毒素の誘導体も、本明細書において企図される。ドラスタチンおよびオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、および核・細胞分裂を妨げ、抗癌活性および抗真菌活性を有することが示されている。
【０１７９】
「リンカー」、「リンカー単位」、または「連結」とは、共有結合、または結合タンパク質を少なくとも１つの細胞傷害性薬剤に共有結合させる原子の鎖を含んでなる化学部分を意味する。
【０１８０】
リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、２，６−ジイソシアン酸トルエン）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、本アドレッシング系に細胞傷害性(cyctotoxic)薬剤を結合させるためのキレート剤の一例である。他の架橋試薬としては、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）が挙げられ、これらは市販されている（例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ill., U.S.Aから）。
【０１８１】
リンカーは、「非切断性」であっても「切断可能」であってもよい。
【０１８２】
好ましい実施態様では、それは細胞において細胞傷害性薬剤の放出を促進する「切断可能な」リンカーである。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカーが使用可能である。リンカーは、好ましい実施態様では、細胞内条件下で切断可能であり、その結果、リンカーの切断は細胞内環境で結合タンパク質から細胞傷害性薬剤を放出する。
【０１８３】
例えば、いくつかの実施態様では、リンカーは、細胞内環境中（例えば、リソソームまたはエンドソームまたは小胞内）に存在する切断因子によって切断可能である。リンカーは、例えば、限定されるものではないが、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼを含む細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーであり得る。一般に、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。切断因子としては、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンを含むことができ、これらは総て、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して標的細胞内で活性薬の放出をもたらすことが知られている。例えば、癌性組織で発現の高いチオール依存性プロテアーゼであるカテプシン−Ｂにより切断可能であるペプチジルリンカーを使用することができる（例えば、Ｐｈｅ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙリンカー）。特定の実施態様では、細胞内プロテアーゼにより切断可能であるペプチジルリンカーは、Ｖａｌ−ＣｉｔリンカーまたはＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである。細胞傷害性薬剤の細胞内タンパク質分解性放出を使用する１つの利点は、薬剤は一般に結合させると減弱され、複合体の血清安定性が一般に高いということである。
【０１８４】
他の実施態様では、切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性であり、すなわち、特定のｐＨ値で加水分解を受けやすい。一般に、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解され得る。例えば、リソソーム中で加水分解され得る酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）が使用可能である。このようなリンカーは、血液の場合のように、中性ｐＨ条件下で比較的安定であるが、ｐＨ５．５以下またはリソソームのおよそのｐＨである５．０では不安定である。特定の実施態様では、加水分解可能なリンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療薬と結合しているチオエーテル）である。
【０１８５】
さらに他の実施態様では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。様々なジスルフィドリンカーが当技術分野で公知であり、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）−、ＳＰＤＢおよびＳＭＰＴを用いて形成され得るものが含まれる。
【０１８６】
非切断性または「非還元性」リンカーの非限定例としては、トラスツズマブと、連結された化学療法薬マイタンシンとを組み合わせた免疫複合体トラスツズマブ−ＤＭ１（ＴＤＭ１）が挙げられる(Cancer Research 2008; 68: (22). November 15, 2008)。
【０１８７】
好ましい実施態様では、本発明の免疫複合体は、限定されるものではないが、ｉ）抗原結合タンパク質の求核基と二価リンカー試薬の反応と、その後の細胞傷害性薬剤との反応、またはｉｉ）細胞傷害性薬剤の求核基と二価リンカー試薬の反応と、その後の抗原結合タンパク質の求核基との反応など、当業者に公知のいずれの方法によって作製してもよい。
【０１８８】
抗原結合タンパク質上の求核基は、限定されるものではないが、Ｎ末端アミン基、側鎖アミン基、例えば、リシン、側鎖チオール基、および抗原結合タンパク質がグリコシル化されている場合には糖ヒドロキシルまたはアミノ基が含まれる。アミン、チオール、およびヒドロキシル基は求核性であり、かつ、限定されるものではないが、活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸エステルおよび酸ハロゲン化物；ハロゲン化アルキルおよびベンジル、例えば、ハロアセトアミド；アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基を含むリンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基と反応して共有結合を形成することができる。抗原結合タンパク質は、還元可能な鎖間ジスルフィド、すなわち、システイン架橋を有してもよい。抗原結合タンパク質は、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）などの還元剤で処理することにより、リンカー試薬との結合に対して反応性とすることができる。従って、各システイン架橋は、理論的には、２つの反応性チオール求核基を形成する。当業者に公知の任意の反応により、さらなる求核基を抗原結合タンパク質に導入することもできる。非限定例として、反応性チオール基は、１以上のシステイン残基を導入することにより、抗原結合タンパク質に導入することができる。
【０１８９】
免疫複合体は、リンカー試薬または細胞傷害性薬剤上の求核置換基と反応することができる求電子部分を導入するための抗原結合タンパク質の改変によって作出してもよい。グリコシル化された抗原結合タンパク質の糖を酸化して、リンカー試薬または細胞傷害性薬剤のアミン基と反応し得るアルデヒドまたはケトン基を形成することができる。生じたイミンシッフ塩基基は安定な結合を形成し得るか、または還元されて安定なアミン結合を形成し得る。一実施態様では、グリコシル化された抗原結合タンパク質の糖質部分とガラクトースオキシダーゼかまたはメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかとの反応により、タンパク質内に、薬物上の適当な基と反応することができるカルボニル（アルデヒドおよびケトン）基を得ることができる。別の実施態様では、Ｎ末端セリンまたはトレオニン残基を含有するタンパク質をメタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応させて、最初のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成することができる。
【０１９０】
特定の好ましい実施態様では、リンカー単位は以下の一般式を有し得る：
−−Ｔａ−−Ｗｗ−−Ｙｙ−−
式中、
−Ｔ−は、ストレッチャー単位であり；
ａは、０または１であり；
−Ｗ−は、アミノ酸単位であり；
ｗは独立に、１〜１２の範囲の整数であり；
−Ｙ−は、スペーサー単位であり；
ｙは、０、１または２である。
【０１９１】
存在する場合、ストレッチャー単位（−Ｔ−）は、抗原結合タンパク質とアミノ酸単位（−Ｗ−）を連結する。自然状態でまたは化学操作を介して抗原結合タンパク質上に存在し得る有用な官能基としては、スルフヒドリル、アミノ、ヒドロキシル、糖質のアノマーヒドロキシル基、およびカルボキシルが含まれる。好適な官能基は、スルフヒドリルおよびアミノである。スルフヒドリル基は、存在する場合、抗原結合タンパク質の分子内ジスルフィド結合の還元によって作出することができる。あるいは、スルフヒドリル基は、抗原結合タンパク質のリシン部分のアミノ基と２−イミノチオランまたは他のスルフヒドリル生成試薬を反応させることによって作出することができる。特定の実施態様では、抗原結合タンパク質は組換え抗体であり、かつ、１個以上のリシンを保持するように操作されている。より好ましくは、抗原結合タンパク質は、１個以上のシステインを保持するように操作することができる（ＴｈｉｏＭａｂｓ参照）。
【０１９２】
ある特定の実施態様では、ストレッチャー単位は、抗原結合タンパク質の硫黄原子と結合を形成する。この硫黄原子は、還元された抗原結合タンパク質のスルフヒドリル（−−ＳＨ）基に由来するものであり得る。
【０１９３】
他のある特定の実施態様では、ストレッチャー単位は、抗原結合タンパク質の硫黄原子とストレッチャー単位の硫黄原子の間のジスルフィド結合を介して抗原結合タンパク質と連結される。
【０１９４】
他の特定の実施態様では、ストレッチャーの反応性基は、抗原結合タンパク質のアミノ基に対して反応性であり得る反応性部位を含む。アミノ基は、アルギニンまたはリシンのものであり得る。好適なアミン反応性部位としては、限定されるものではないが、活性化エステル、例えば、スクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアネートおよびイソチオシアネートが含まれる。
【０１９５】
さらに別の面では、ストレッチャーの反応性官能基は、抗原結合タンパク質上に存在し得る修飾された糖鎖基に対して反応性である反応性部位を含む。特定の実施態様では、抗原結合タンパク質は酵素的にグリコシル化されて糖質部分を提供する（抗原結合タンパク質が抗体である場合には、上記抗体は一般に自然状態でグリコシル化されていることに留意されたい）。糖質は過ヨウ素酸ナトリウムなどの試薬で軽度に酸化され得、酸化された糖質の、結果として生じたカルボニル単位は、ヒドラジド、オキシム、反応性アミン、ヒドラジン、チオセミカルバジド、カルボン酸ヒドラジン、またはアリールヒドラジドなどの官能基を含有するストレッチャーと縮合することができる。
【０１９６】
アミノ酸単位（−Ｗ−）は、スペーサー単位が存在する場合には、ストレッチャー単位（−Ｔ−）をスペーサー単位（−Ｙ−）と連結し、スペーサー単位が存在しない場合には、ストレッチャー単位を細胞傷害性薬剤と連結する。
【０１９７】
上述のように、−Ｗｗ−は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチドまたはドデカペプチド単位であり得る。
【０１９８】
いくつかの実施態様では、アミノ酸単位は、限定されるものではないが、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、アセチルまたはホルミルで保護されたリシン、アルギニン、トシルまたはニトロ基で保護されたアルギニン、ヒスチジン、オルニチン、アセチルまたはホルミルで保護されたオルニチンおよびシトルリンなどのアミノ酸残基を含んでなり得る。例示的アミノ酸リンカー成分としては、好ましくは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドまたはペンタペプチドが含まれる。
【０１９９】
例示的ジペプチドとしては、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇが含まれる。
【０２００】
例示的トリペプチドとしては、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓが含まれる。
【０２０１】
例示的テトラペプチドとしては、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号３３）、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号３４）が含まれる。
【０２０２】
例示的ペンタペプチドとしては、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（配列番号３５）が含まれる。
【０２０３】
アミノ酸リンカー成分を含んでなるアミノ酸残基としては、天然アミノ酸、ならびに微量アミノ酸、およびシトルリンなどの非天然アミノ酸類似体が含まれる。アミノ酸リンカー成分は、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断に対するそれらの選択性において設計および最適化することができる。
【０２０４】
リンカーのアミノ酸単位は、限定されるものではないが、腫瘍関連プロテアーゼを含む酵素によって酵素的に切断されて細胞傷害性薬剤を遊離することができる。
【０２０５】
アミノ酸単位は、特定の腫瘍関連腫瘍関連プロテアーゼによる酵素的切断に対するその選択性において設計および最適化することができる。好適な単位は、その切断がプロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤ、ならびにプラスミンにより触媒されるものである。
【０２０６】
スペーサー単位（−Ｙ−）は、存在する場合、アミノ酸単位を細胞傷害性薬剤に連結する。スペーサー単位は、自壊的と非自壊的の２つの一般的なタイプのものである。非自壊的スペーサー単位は、免疫複合体からのアミノ酸単位の酵素的切断後も、スペーサー単位の一部または全部が細胞傷害性薬剤に結合したままとなるものである。非自壊的スペーサー単位の例としては、限定されるものではないが、（グリシン−グリシン）スペーサー単位およびグリシンスペーサー単位が含まれる。細胞傷害性薬剤を遊離させるためには、標的細胞内でグリシン−薬物単位結合を切断するための非依存的加水分解反応が起こらなければならない。
【０２０７】
別の実施態様では、非自壊的スペーサー単位（−Ｙ−）は、−Ｇｌｙ−である。
【０２０８】
一実施態様では、免疫複合体にスペーサー単位はない（ｙ＝０）。あるいは、自壊的スペーサー単位を含有する免疫複合体は、別途の加水分解工程の必要なく、細胞傷害性薬剤を放出することができる。これらの実施態様では、−Ｙ−は、ＰＡＢ基の窒素原子を介して−Ｗｗ−に連結され、かつ、炭酸基、カルバミン酸基またはエーテル基を介して−Ｄに直接接続されているｐ−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）単位である。
【０２０９】
自壊的スペーサーの他の例としては、限定されるものではないが、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体およびオルトまたはパラ−アミノベンジルアセタールなどのＰＡＢ基と電気的に等価な芳香族化合物が含まれる。置換および非置換４−アミノ酪酸アミド、適切に置換されたビシクロ［２．２．１］およびビシクロ［２．２．２］環系ならびに２−アミノフェニルプロピオン酸アミドなど、アミド結合の加水分解時に容易に環化を受けるスペーサーを使用することができる。
【０２１０】
別の実施態様では、スペーサー単位は、分岐型のビス（ヒドロキシメチル）スチレン（ＢＨＭＳ）単位であり、これは細胞傷害性薬剤を追加導入するために使用することができる。
【０２１１】
最後に、本発明は、癌の治療において使用するための、上記免疫複合体に関する。
【０２１２】
癌は好ましくは、それらの表面でタンパク質Ａｘｌの全部または一部を発現または過剰発現する腫瘍細胞を含む、Ａｘｌ関連癌から選択することができる。
【０２１３】
より詳しくは、上記癌は、乳癌、結腸、食道癌、肝細胞癌、胃癌、神経膠腫、肺癌、黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎臓癌、甲状腺癌、子宮内膜癌および任意の薬剤耐性現象である。本発明の別の目的は、本明細書に記載の免疫複合体を含んでなる医薬組成物である。
【０２１４】
より詳しくは、本発明は、本発明の免疫複合体を少なくとも１種類の賦形剤および／または薬学上許容されるビヒクルとともに含んでなる医薬組成物に関する。
【０２１５】
本明細書において、「薬学上許容されるビヒクル」または「賦形剤」という表現は、二次反応を引き起こすことなく、かつ、例えば、有効化合物の投与の補助、体内におけるその寿命の延長および／またはその有効性の増強、溶液中でのその溶解度の増大、あるいはまたその保存性の改善を可能とする、医薬組成物中に含まれる化合物または化合物の組合せを示すものとする。これらの薬学上許容されるビヒクルおよび賦形剤は周知であり、当業者ならば、選択される有効化合物の性質および投与様式に対して適合させることができる。
【０２１６】
好ましくは、これらの免疫複合体は、全身経路、特に、静脈内経路によるか、筋肉内、皮内、腹腔内もしくは皮下経路によるか、または経口経路によって投与される。より好ましい様式では、本発明による免疫複合体を含んでなる組成物は、一連の様式で数回投与される。
【０２１７】
それらの投与様式、用量および最適な剤形は、例えば、患者の年齢または体重、患者の健康状態の重篤度、治療に対する忍容性、および報告されている副作用などの、患者に適合した治療の確立を一般に考慮した基準に従って決定することができる。
【０２１８】
本発明の他の特徴および利点は、実施例および図面を含む本明細書の続きで明らかとなる。図面の凡例を以下に示す。
【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１Ａ−Ｃ】１１０Ｄ７（Ａ）、１００３Ａ２（Ｂ）および１０２４Ｇ１１（Ｃ）に関するＳＮ１２Ｃ細胞でのＭａｂ−ｚａｐ結合二次抗体を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイ。
【図２Ａ−２Ｉ】-ＥＬＩＳＡによる、固定化したｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質（２Ａ）、ｒｈＤｔｋ−Ｆｃ（２Ｂ）またはｒｈＭｅｒ−Ｆｃ（２Ｃ）タンパク質に対する１１０Ｄ７の、  -ＥＬＩＳＡによる、固定化したｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質（２Ｄ）、ｒｈＤｔｋ−Ｆｃ（２Ｅ）またはｒｈＭｅｒ−Ｆｃ（２Ｆ）タンパク質に対する１００３Ａ２の、  -ＥＬＩＳＡによる、固定化したｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質（２Ｇ）、ｒｈＤｔｋ−Ｆｃ（２Ｈ）またはｒｈＭｅｒ−Ｆｃ（２Ｉ）タンパク質に対する１０２４Ｇ１１の、抗Ａｘｌ結合の特異性。
【図３Ａ−Ｃ】種々のヒト腫瘍細胞株（Ｃａｌｕ−１、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ４３５Ｓ、ＮＣＩ−Ｈ１２５、Ｐａｎｃ１およびＳＮ１２Ｃ）の存在下、フローサイトメトリーにより得られた１１０Ｄ７（Ａ）、１００３Ａ２（Ｂ）および１０２４Ｇ１１（Ｃ）用量反応データ。
【図４Ａ−Ｃ】１１０Ｄ７（Ａ）、１００３Ａ２（Ｂ）および１０２４Ｇ１１（Ｃ）に関する、固定化されたｒｍＡｘｌ−Ｆｃタンパク質（「ｒｍ」はマウス組換えを表す）に対するＥＬＩＳＡ。
【図５Ａ−Ｃ】フローサイトメトリー法を用いて間接的標識プロトコールで決定されたＣＯＳ７細胞に対する１１０Ｄ７（Ａ）、１００３Ａ２（Ｂ）および１０２４Ｇ１１（Ｃ）結合。
【図６Ａ−Ｃ】抗Ａｘｌ抗体１１０Ｄ７（Ａ）、１００３Ａ２（Ｂ）および１０２４Ｇ１１（Ｃ）を用いたＧａｓ６結合の競合ＥＬＩＳＡ。
【図７Ａ−Ｃ】１１０Ｄ７（Ａ）、１００３Ａ２（Ｂ）および１０２４Ｇ１１（Ｃ）に関する、ＳＮ１２Ｃ細胞溶解液を用いたウエスタンブロットによるエピトープ結合分析。ＮＨ（非加熱）；ＮＲ（非還元）；Ｈ（加熱）；Ｒ（還元）。ＧＡＰＤＨの検出は、ゲルに適切にサンプルがロードされたことの証拠となる。
【図８Ａ−Ｆ】ウエスタンブロットによる、ＳＮ１２Ｃ細胞での１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１結合後のＡｘｌダウンレギュレーションの研究。図８Ａ（１１０Ｄ７）、８Ｃ（１００３Ａ２）および８Ｅ（１０２４Ｇ１１）は、実施した３回の独立した実験に代表的なウエスタンブロット像（ウエスタンブロット解析は、ＳＮ１２Ｃ細胞上で抗Ａｘｌ抗体を４時間および２４時間インキュベートした後に行った）であり、８Ｂ（１１０Ｄ７）、８Ｄ（１００３Ａ２）および８Ｆ（１０２４Ｇ１１）は、「ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ」ソフトウエアを用いて表示したフィルムの光学密度の定量結果である。
【図９Ａ−Ｉ】抗Ａｘｌ抗体１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１とのインキュベーション後のＳＮ１２Ｃ細胞の免疫蛍光顕微鏡像。図９Ａ（１１０Ｄ７）、９Ｄ（１００３Ａ２）および９Ｇ（１０２４Ｇ１１）は、膜染色および細胞内染色の両場合のｍＩｇＧ１アイソタイプ対照条件の写真である。図９Ｂ（１１０Ｄ７）、９Ｅ（１００３Ａ２）および９Ｈ（１０２４Ｇ１１）は、膜染色の場合である。図９Ｃ（１１０Ｄ７）、９Ｆ（１００３Ａ２）および９Ｉ（１０２４Ｇ１１）は、それぞれ１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１抗体を用いた場合のＡｘｌ受容体および初期エンドソームマーカーＥＥＡ１の両場合の細胞内染色である。画像を重ね合わせたものを下に示し、可視化した同時局在を矢印で示す。
【図１０Ａ−Ｃ】ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の効果と比較した場合のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＳＮ１２Ｃ細胞増殖に対する１１０Ｄ７（Ａ）、１００３Ａ２（Ｂ）および１０２４Ｇ１１（Ｃ）抗体の効果。
【図１１Ａ−１１Ｋ】一定の範囲の１１７Ｄ７−サポリン免疫複合体濃度で処理した（Ａ）ＳＮ１２Ｃ、（Ｂ）Ｃａｌｕ−１、（Ｃ）Ａ１７２、（Ｄ）Ａ４３１、（Ｅ）ＤＵ１４５、（Ｆ）ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、（Ｇ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、（Ｈ）ＰＣ３、（Ｉ）ＮＣＩ−Ｈ２２６、（Ｊ）ＮＣＩ−Ｈ１２５または（Ｋ）Ｐａｎｃ１腫瘍細胞を用いた異なるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイで得られた、１１０Ｄ７免疫複合体濃度の関数としての細胞傷害性パーセンテージを表す。
【図１２Ａ−１２Ｋ】一定の範囲の１００３Ａ２−サポリン免疫複合体濃度で処理した（Ａ）ＳＮ１２Ｃ、（Ｂ）Ｃａｌｕ−１、（Ｃ）Ａ１７２、（Ｄ）Ａ４３１、（Ｅ）ＤＵ１４５、（Ｆ）ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、（Ｇ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、（Ｈ）ＰＣ３、（Ｉ）ＮＣＩ−Ｈ２２６、（Ｊ）ＮＣＩ−Ｈ１２５または（Ｋ）Ｐａｎｃ１腫瘍細胞を用いた異なるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイで得られた、１００３Ａ２免疫複合体濃度の関数としての細胞傷害性パーセンテージを表す。
【図１３Ａ−１３Ｋ】一定の範囲の１０２４Ｇ１１−サポリン免疫複合体濃度で処理した（Ａ）ＳＮ１２Ｃ、（Ｂ）Ｃａｌｕ−１、（Ｃ）Ａ１７２、（Ｄ）Ａ４３１、（Ｅ）ＤＵ１４５、（Ｆ）ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、（Ｇ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、（Ｈ）ＰＣ３、（Ｉ）ＮＣＩ−Ｈ２２６、（Ｊ）ＮＣＩ−Ｈ１２５または（Ｋ）Ｐａｎｃ１腫瘍細胞を用いた異なるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイで得られた、１０２４Ｇ１１免疫複合体濃度の関数としての細胞傷害性パーセンテージを表す。
【実施例】
【０２２０】
以下の実施例では、使用するアイソタイプ対照抗体は、９Ｇ４と呼ばれるマウスＩｇＧからなる。それは、以下の実施例において、ｍＩｇＧ１、対照および９Ｇ４という表現が
同等であることを意味する。
【０２２１】
実施例１：Ａｘｌ受容体のインターナリゼーション
免疫複合体アプローチは、標的抗原がインターナライズ性のタンパク質である場合により有効となるので、ヒト腫瘍細胞株に対するＭａｂ−Ｚａｐ細胞傷害性アッセイを用いたＡｘｌ受容体のインターナリゼーションを試験した。より厳密には、Ｍａｂ−Ｚａｐ試薬は、アフィニティー精製したヤギ抗マウスＩｇＧとリボソーム不活化タンパク質サポリンの化学複合体である。免疫複合体のインターナリゼーションが起これば、サポリンは破断して標的化薬剤から離れ、リボソームを不活化し、タンパク質の阻害、最終的には細胞死をもたらす。Ａｘｌ陽性細胞においてこれらの抗体とともに７２時間インキュベートした後に細胞の生存率を決定すれば、Ａｘｌ受容体インターナリゼーションに関する結論を下すことができる。
【０２２２】
この実施例では、Ｑｉｆｉｋｉｔ試薬（Ｄａｋｏ）を用いて決定されたＡｘｌ陽性の高い細胞を使用した。データを下表５に示す。
【０２２３】
【表９】
0006445444.tif 000010
【０２２４】
以下の実施例では、ＳＮ１２Ｃ細胞を非限定例として用いた。その細胞表面で適当なレベルのＡｘｌ受容体を発現する他のいずれの細胞株も使用可能である。
【０２２５】
一定の濃度範囲の１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１抗Ａｘｌ抗体またはｍＩｇＧ１アイソタイプ対照９Ｇ４抗体をそれぞれ、細胞培養培地中、室温で３０分間、１００ｎｇのＭａｂ−Ｚａｐ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ）二次抗体とともにプレインキュベートした。これらの混合物を、白色の９６ウェルマイクロプレートに播種したサブコンフルエント状態のＳＮ１２Ｃ細胞に添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２の存在下で７２時間インキュベートした。細胞の生存率は、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ細胞増殖法を製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の説明書に従って用いて測定した。いくつかの対照実験を行う：ｉ）二次免疫複合体を含まない条件、およびｉｉ）一次抗体を含まない条件を調製する。並行して、ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照でもアッセイを行う。
【０２２６】
得られた結果を図１Ａ（１１０Ｄ７）、１Ｂ（１００３Ａ２）、１Ｃ（１０２４Ｇ１１）に示す。
【０２２７】
１１０Ｄ７抗体は、ＳＮ１２Ｃ細胞に対して約４９％の最大細胞傷害作用を示す。１００３Ａ２抗体は、ＳＮ１２Ｃ細胞に対して約３７％の最大細胞傷害作用を示す。１０２４Ｇ１１抗体は、ＳＮ１２Ｃ細胞に対して約４０％の最大細胞傷害作用を示す。
【０２２８】
この実験では、ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照と考えられる９Ｇ４抗体の存在下で細胞傷害作用は見られなかった。
【０２２９】
一次抗体のみを含有するウェルでも細胞傷害性は見られなかった（データは示されていない）。従って、Ａｘｌ−１１０Ｄ７−ＭａｂＺａｐ、Ａｘｌ−１００３Ａ２−ＭａｂＺａｐまたはＡｘｌ−１０２４Ｇ１１−ＭａｂＺａｐを含んでなる免疫複合体は標的細胞の効果的な細胞傷害性を誘発することから、Ａｘｌ受容体は、免疫複合体アプローチで標的とするのに都合のよい抗原であると思われる。
【０２３０】
実施例２：ｒｈＡｘｌ  ＥＣＤタンパク質に対する抗体の作製
２．１  １１０Ｄ７  Ａｘｌ抗体の作製
Ａｘｌ受容体のヒト細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を作製するために、５個体のＢＡＬＢ／ｃマウスを、５〜１５μｇのｒｈ  Ａｘｌ−Ｆｃタンパク質（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４−ＡＬ）で３回、皮下免疫した。初回免疫誘導は完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＤ、ＵＳＡ）の存在下で行った。その後の免疫誘導には不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）を加えた。
【０２３１】
融合３日前に、免疫マウスに、ＩＦＡを用い、１５μｇのｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質（ＣＩＰＦ）で腹腔内（ｉ．ｐ．）追加免疫を行った。
【０２３２】
脾細胞およびリンパ球を、免疫マウス５個体のうち１個体（血清滴定後に選択）から採取したそれぞれ脾臓の潅流および近位リンパ節の細断によって調製し、ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ロックヴィル、ＭＤ、ＵＳＡ）と融合した。この融合プロトコールは、Kohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975)に記載されている。次に、融合した細胞に対してＨＡＴ選択を行った。一般に、モノクローナル抗体またはそれらの機能的フラグメントの調製では、特にマウス起源の場合には、特に手引き書“Antibodies” (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)に記載されている技術を参照することができる。
【０２３３】
融合からおよそ１０日後に、ハイブリッド細胞のコロニーをスクリーニングした。一次スクリーニングでは、ＥＬＩＳＡを用い、ハイブリドーマの上清を、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質に対して生成されたＭａｂの分泌に関して評価した。並行して、ヒトＤＵ１４５前立腺腫瘍細胞（ＡＴＣＣ）の細胞表面に存在する細胞型のＡｘｌに結合することができるＭａｂを選択するためにＦＡＣＳ分析を行った。
【０２３４】
できるだけ速やかに、選択されたハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングし、その後、ヒトＡｘｌ  ＥＣＤタンパク質に対するそれらの反応性に関してスクリーニングした。次に、クローニングしたＭａｂのアイソタイプ分析を、Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇキット（カタログ番号５３００．０５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、バーミンガム、ＡＬ、ＵＳＡ）を用いて行った。各ハイブリドーマから得られた１つのクローンを選択し、拡大培養した。
【０２３５】
ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡによりアッセイし、ヒトＡｘｌ受容体のＥＣＤドメインまたはｒｈ  Ａｘｌ−Ｆｃタンパク質に対するそれらの結合能を決定した。上清中のＩｇＧ含量が決定された場合には、５μｇ／ｍｌから始めて滴定を実施した。その後、以下の１１行で１／２連続希釈を行った。そうでない場合には、上清を純粋なままで適用した。簡単に述べると、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６９０、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）をＰＢＳ中２μｇ／ｍｌのｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４−ＡＬ）を５０μｌ／ウェルで、４℃にて一晩コーティングした。次に、これらのプレートを０．５％ゼラチン（＃２２１５１、Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ）を含有するＰＢＳで３７℃にて２時間ブロッキングした。プレートを軽くたたいて飽和バッファーを排出したところで、５０μｌの純粋なハイブリドーマ細胞上清または５０μｌの５μｇ／ｍｌ溶液をＥＬＩＳＡプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、５０μｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ（＃１１５−０３５−１６４、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ウエストグローブ、ＰＡ、ＵＳＡ）を、０．１％ゼラチンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｗ：ｗ）を含有するＰＢＳ中、１／５０００希釈で、３７℃にて１時間加えた。次に、ＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ＴＭＢ（＃ＵＰ６６４７８２、Ｕｐｔｉｍａ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、フランス）基質を加えた。室温で１０分のインキュベーション時間の後、１Ｍ硫酸を用いて反応を停止させ、４５０ｎｍで光学密度を測定した。
【０２３６】
フローサイトメトリーによる選択のため、表面にＡｘｌ受容体を発現する１０００００個の前立腺癌ＤＵ１４５細胞（ＡＴＣＣ）を９６ウェルプレートの各ウェルの、１％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）中に、４℃で播種した。２０００ｒｐｍで２分の遠心分離の後、バッファーを除去し、供試するハイブリドーマ上清または精製したＭａｂ（１μｇ／ｍｌ）を加えた。４℃で２０分のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中に１／５００°希釈されたＡｌｅｘａ  ４８８結合ヤギ抗マウス抗体（＃Ａ１１０１７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｓ  Ｉｎｃ．、ユージーン、ＵＳＡ）を加え、４℃で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファーでの最終洗浄の後、ヨウ化プロピジウムを各試験管に終濃度４０μｇ／ｍｌで加えた後に細胞をＦＡＣＳ（Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。細胞のみを含有するウェルおよびＡｌｅｘａ  ４８８結合二次抗体とともにインキュベートした細胞を含有するウェルを陰性対照として含めた。アイソタイプ対照を各実験に用いた（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ  Ｍ９０３５１ＭＧ）。少なくとも５０００細胞を評価して蛍光強度（ＭＦＩ）の平均値を計算した。
【０２３７】
より厳密には、融合は、採取した３００．１０６の脾細胞と３００．１０６の骨髄腫細胞（１：１比）で行った。次に、２００細胞の、得られた細胞懸濁液を３０枚の９６ウェルプレートに２．１０６細胞／ｍｌで播種した。
【０２３８】
ｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質に対するＥＬＩＳＡおよびＤＵ１４５腫瘍細胞株を用いたＦＡＣＳ分析の両方による最初のスクリーニング（融合後１４日前後）で、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃコーティング上で約０．５の光学密度（ＯＤ）およびＤＵ１４５ヒト前立腺腫瘍細胞株で４０を上回るＭＦＩを示す５個のハイブリドーマを選択することができた。
【０２３９】
これら５個のハイブリドーマを拡大培養し、限界希釈法によりクローニングした。各コードにつき、１枚の９６ウェルプレートを調製した。播種９日後に、クローニングプレートからの上清を、まず、Ａｘｌ−Ｆｃタンパク質の細胞外ドメインに対するそれらの結合特異性に関してＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。次に、別のＥＬＩＳＡアッセイを行い、固定化ラット組換えＮｏｔｃｈ−Ｆｃタンパク質を用いて抗Ｆｃ  Ｍａｂを除去した。さらに、ハイブリドーマを、ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞株(prostate can cell line)に対する反応性に関してフローサイトメトリーにより調べた。各コードの３つのクローンを拡大培養し、アイソタイプ分析を行った。ひと度産生されれば、抗Ａｘｌ抗体を細胞表面にＡｘｌが結合した後にインターナライズされる能力に関してさらに検討した。
【０２４０】
２．２  １００３Ａ２および１０２４Ｇ１１  Ａｘｌ抗体の作製
Ａｘｌ受容体のヒト細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を作製するために、５個体のＢＡＬＢ／ｃマウスを、２０μｇのヒトモノマーＡｘｌタンパク質（自家生産品）で４回皮下（ｓ．ｃ．）免疫した。初回の免疫誘導は、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＤ、ＵＳＡ）の存在下で行った。その後の免疫誘導には、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）を加えた。
【０２４１】
融合３日前に、免疫誘導マウスに、ＩＦＡを伴う２０μｇのモノマーＡｘｌタンパク質（自家生産品）で腹腔内（ｉ．ｐ．）に追加免疫を行った。
【０２４２】
ハイブリドーマ細胞を作製するために、脾細胞とリンパ球を、免疫マウス５個体のうち１個体（血清滴定後に選択）から採取したそれぞれ脾臓の潅流および近位リンパ節の細断によって調製し、ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ロックヴィル、ＭＤ、ＵＳＡ）と融合した。この融合プロトコールは、Kohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975)に記載されている。次に、融合した細胞に対してＨＡＴ選択を行った。一般に、モノクローナル抗体またはそれらの機能的フラグメントの調製では、特にマウス起源の場合には、特に手引き書“Antibodies” (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)に記載されている技術を参照することができる。
【０２４３】
融合からおよそ１０日後に、ハイブリッド細胞のコロニーをスクリーニングした。一次スクリーニングでは、ＥＬＩＳＡを用い、ハイブリドーマの上清を、ヒトモノマーＡｘｌタンパク質（ＣＩＰＦ）に対して生成されたＭａｂの分泌に関して評価した。並行して、ヒトＤＵ１４５前立腺腫瘍細胞（ＡＴＣＣ）の細胞表面に存在する細胞型のＡｘｌに結合することができるＭａｂを選択するためにＦＡＣＳ分析を行った。
【０２４４】
できるだけ速やかに、選択されたハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングし、その後、モノマーＡｘｌ受容体に対するそれらの反応性に関してスクリーニングした。次に、クローニングしたＭａｂのアイソタイプ分析を、Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇキット（カタログ番号５３００．０５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、バーミンガム、ＡＬ、ＵＳＡ）を用いて行った。各ハイブリドーマから得られた１つのクローンを選択し、拡大培養した。
【０２４５】
ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡによりアッセイし、ヒトＡｘｌ受容体のＥＣＤドメインに対するそれらの結合能を決定した。上清中のＩｇＧ含量が決定された場合には、５μｇ／ｍｌから始めて滴定を実施した。その後、以下の１１行で１／２連続希釈を行った。そうでない場合には、上清を純粋なままで適用した。簡単に述べると、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６９０、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）をＰＢＳ中２μｇ／ｍｌのＥＣＤ  Ａｘｌ溶液（ＣＩＰＦ）５０μｌ／ウェルか、またはＰＢＳ中２μｇ／ｍｌのｒｈ  Ａｘｌ−Ｆｃタンパク質（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４−ＡＬ）５０μｌ／ウェルのいずれかで４℃にて一晩コーティングした。次に、これらのプレートを０．５％ゼラチン（＃２２１５１、Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ）を含有するＰＢＳで３７℃にて２時間ブロッキングした。プレートを軽くたたいて飽和バッファーを排出したところで、５０μｌの純粋なハイブリドーマ細胞上清または５０μｌの５μｇ／ｍｌ溶液をＥＬＩＳＡプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、５０μｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ（＃１１５−０３５−１６４、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ウエストグローブ、ＰＡ、ＵＳＡ）を、０．１％ゼラチンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｗ：ｗ）を含有するＰＢＳ中、１／５０００希釈で、３７℃にて１時間加えた。次に、ＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ＴＭＢ（＃ＵＰ６６４７８２、Ｕｐｔｉｍａ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、フランス）基質を加えた。室温で１０分のインキュベーション時間の後、１Ｍ硫酸を用いて反応を停止させ、４５０ｎｍで光学密度を測定した。
【０２４６】
フローサイトメトリーによる選択のため、表面にＡｘｌ受容体を発現する１０００００個の前立腺癌ＤＵ１４５細胞（ＡＴＣＣ）を９６ウェルプレートの各ウェルの、１％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）中に、４℃で播種した。２０００ｒｐｍで２分の遠心分離の後、バッファーを除去し、供試するハイブリドーマ上清または精製したＭａｂ（１μｇ／ｍｌ）を加えた。４℃で２０分のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中に１／５００°希釈されたＡｌｅｘａ  ４８８結合ヤギ抗マウス抗体（＃Ａ１１０１７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．、ユージーン、ＵＳＡ）を加え、４℃で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファーでの最終洗浄の後、ヨウ化プロピジウムを各試験管に終濃度４０μｇ／ｍｌで加えた後に細胞をＦＡＣＳ（Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。細胞のみを含有するウェルおよびＡｌｅｘａ  ４８８結合二次抗体とともにインキュベートした細胞を含有するウェルを陰性対照として含めた。アイソタイプ対照を各実験に用いた（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ  Ｍ９０３５１ＭＧ）。少なくとも５０００細胞を評価して蛍光強度（ＭＦＩ）の平均値を計算した。
【０２４７】
融合は、採取した２８０．１０６の脾細胞と２８０．１０６の骨髄腫細胞（１：１比）で行った。次に、得られた融合細胞懸濁液（２．１０６細胞／ｍｌ）を３０枚の９６ウェルプレートに播種した。
【０２４８】
固定化Ａｘｌ  ＥＣＤタンパク質に対するＥＬＩＳＡによる最初のスクリーニング（融合後１４日前後）で、ＥＣＤ  Ａｘｌコーティング上で１を上回る光学密度（ＯＤ）を示す６９個のハイブリドーマを選択することができた。ＤＵ１４５腫瘍細胞株を用いた補足的ＦＡＣＳ分析により、選択されるハイブリドーマの数が限定される。この工程で、ＤＵ１４５ヒト前立腺腫瘍細胞株上で１００を超えるＭＦＩを示す１７個のハイブリドーマが維持され、限界希釈法によりクローニングされた。クローニングプレートを、モノマーＡｘｌ  ＥＬＩＳＡを用いてスクリーニングし、次に、選択されたハイブリドーマを拡大培養し、さらにそれらの結合特異性およびインターナリゼーションを受ける能力に関して特性決定した。
【０２４９】
実施例３：Ａｘｌの結合特異性
この実施例では、それぞれ１１０Ｄ７、１００３Ａ２、１０２４Ｇ１１抗体のｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質に対する結合を検討する。次に、ＴＡＭファミリーの他の２つのメンバーｒｈＤｔｋ−ＦｃおよびｒｈＭｅｒ−Ｆｃにおいてその結合を検討する。
【０２５０】
簡単に述べると、組換えヒトＡｘｌ−Ｆｃ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４ＡＬ／ＣＦ）、ｒｈＤｔｋ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８５９−ＤＫ）またはｒｈ−Ｍｅｒ−Ｆｃ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８９１−ＭＲ）タンパク質をＩｍｍｕｌｏｎ  ＩＩ９６ウェルプレートに４℃で一晩コーティングし、０．５％ゼラチン溶液で１時間のブロッキング工程の後、１１０Ｄ７、１００３Ａ２、１０２４Ｇ１１精製抗体をそれぞれ、開始濃度５μｇ／ｍｌ（３．３３  １０−８Ｍ）で、３７℃にてさらに１時間加えた。次に、１／２連続希釈を１２列にわたって行った。プレートを洗浄し、ヤギ抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ）特異的ＩｇＧ−ＨＲＰを３７℃で１時間加えた。反応の現像はＴＭＢ基質溶液を用いて行った。市販の抗Ａｘｌ  Ｍａｂ  １５４抗体も並行して用いた（データは示されていない）。コーティング対照は、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリクローナル血清（Ｊａｃｋｓｏｎ、ｒｅｆ  １０９−０３５−０９８）の存在下および／またはＨＲＰ結合抗ヒスチジン抗体（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ：ＭＡＢ０５０Ｈ）の存在下で実施した。一次抗体の不在下（希釈剤(diluant)）で非特異的結合は見られない。１１０Ｄ７結果はそれぞれ図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに示す。１００３Ａ２の結果はそれぞれ図２Ｄ、２Ｅおよび２Ｆに示す。１０２４Ｇ１１の結果はそれぞれ図２Ｇ、２Ｈおよび２Ｉに示す。
【０２５１】
この実施例は、１１０Ｄ７、１００３Ａ２、１０２４Ｇ１１抗体がｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質とのみ結合し、ＴＡＭファミリーの他の２つのメンバーｒｈＤｔｋまたはｒｈＭｅｒには結合しないことを示す。ＴＡＭメンバー間で１１０Ｄ７、１００３Ａ２、１０２４Ｇ１１抗体の結合の交差特異性は見られない。
【０２５２】
実施例４：ヒト腫瘍細胞上でのＡｘｌの検出
Ａｘｌ発現レベルの定量を可能とするために、まず、較正ビーズと並行して市販のＡｘｌ抗体（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ：ＭＡＢ１５４）を用い、ヒト腫瘍細胞上の細胞表面Ａｘｌ発現レベルを確定した。次に、１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１を用いて、細胞表面Ａｘｌの結合を検討した。両場合とも、実験条件は以下に簡単に述べる通りとした。
【０２５３】
細胞表面結合の検討のため、１０μｇ／ｍｌ（６．６６  １０−８Ｍ）一次抗体溶液（１１０Ｄ７、１００３Ａ２、１０２４Ｇ１１、ＭＡＢ１５４  Ａｘｌ市販の抗体またはｍＩｇＧ１アイソタイプ対照９Ｇ４  Ｍａｂ）の２倍連続希釈液を１１点で作製し、４℃で２０分間、２．１０５細胞に適用する。１％ＢＳＡおよび０．０１％ＮａＮ３を添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で３回洗浄した後、細胞をヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  ４８８二次抗体（１／５００°希釈）とともに４℃で２０分間インキュベートした。１％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を添加したＰＢＳ中でさらに３回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳ（Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。少なくとも５０００細胞を評価して蛍光強度の平均値を計算した。
【０２５４】
ＭＡＢ１５４  Ａｘｌ抗体を用いた定量的ＡＢＣ測定のために、ＱＩＦＩＫＩＴ（商標）較正ビーズを用いる。次に、ＱＩＦＩＫＩＴ（商標）ビーズと並行し、細胞を飽和濃度のポリクローナルヤギ抗マウス免疫グロブリン／ＦＩＴＣ（ヤギＦ（ａｂ’）２）とともにインキュベートする。その後、試料細胞上の抗原性部位の数を、検量線（ビーズ上のＭａｂ分子の数に対する個々のビーズ集団の蛍光強度）の補間によって求める。
【０２５５】
４．１．細胞表面Ａｘｌ発現レベルの定量
ヒト腫瘍細胞表面のＡｘｌ発現レベルを、細胞表面抗原を評価するための定量的フローサイトメトリーキットである間接的免疫蛍光アッセイ（ＱＩＦＩＫＩＴ（商標）法（Ｄａｋｏ、デンマーク）を用いるフローサイトメトリーにより決定した。較正グラフによってビーズの既知の抗原レベルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を比較すると、細胞株の抗体結合能（ＡＢＣ）が決定できる。
【０２５６】
表６は、Ａｘｌ市販抗体ＭＡＢ１５４（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下、ＱＩＦＩＫＩＴ（商標）を用いて決定した場合の、種々のヒト腫瘍細胞株（ＳＮ１２Ｃ、Ｃａｌｕ−１、Ａ１７２、Ａ４３１、ＤＵ１４５、ＭＤＡ−ＭＢ４３５Ｓ、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＰＣ３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ１２５、ＭＣＦ７、Ｐａｎｃ１）（ＡＴＣＣ、ＮＣＩ）の表面で検出されたＡｘｌ発現レベルを示す。値を抗原結合複合体（ＡＢＣ）として示す。
【０２５７】
【表１０】
0006445444.tif 000011
【０２５８】
市販のＡｘｌモノクローナル抗体（ＭＡＢ１５４）で得られた結果は、Ａｘｌ受容体は、検討するヒト腫瘍細胞によって様々なレベルで発現されることを示した。
【０２５９】
４．２．ヒト腫瘍細胞での１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１  Ａｘｌ抗体を用いたＡｘｌの検出
より具体的には、Ａｘｌ  １１０Ｄ７、１００３Ａ２または１０２４Ｇ１１抗体を用いて、Ａｘｌの結合を調べた。Ａｘｌ抗体用量反応曲線を適用した。次に、種々のヒト腫瘍細胞を用いて得られたＭＦＩをＰｒｉｓｍソフトウエアで分析した。データを図３Ａ〜３Ｃ３に示す。
【０２６０】
データは、飽和曲線プロフィールにより示されるように、これら３つのＡｘｌ抗体は膜Ａｘｌ受容体と特異的に結合することを示す。しかしながら、標識強度の違いが見られ、ヒト腫瘍細胞上の細胞表面Ａｘｌ受容体のレベルの変動が明らかとなった。ＭＣＦ７ヒト乳房腫瘍細胞株を用いた場合には、Ａｘｌ受容体の結合は見られなかった。
【０２６１】
実施例５：１１０Ｄ７、１００３Ａ２、１０２４Ｇ１１抗体の種間交差特異性
１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１、抗Ａｘｌ抗体の種交差特異性に取り組むため、マウスとサルの２つの種を検討した。まず、組換えマウス（ｒｍ）Ａｘｌ受容体に対する結合をＥＬＩＳＡにより調べる（図４Ａ〜Ｃ）。次に、サルＣＯＳ７細胞がそれらの表面にＡｘｌ受容体を発現することから、これらの細胞を用いてフローサイトメトリー実験を行った（図５Ａ〜Ｃ）。ＣＯＳ７細胞株は、アフリカミドリザルの腎臓細胞に由来するＣＶ−１細胞株を、ラージＴ抗原を産生することができるがゲノム複製に欠陥を持つＳＶ４０ゲノムの一形態で不死化することにより得られたものである。
【０２６２】
５．１  ｒｍＡｘｌ−Ｆｃ  ＥＬＩＳＡ
簡単に述べると、組換えマウスＡｘｌ−Ｆｃ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８５４−ＡＸ／ＣＦ）タンパク質をＩｍｍｕｌｏｎ  ＩＩ  ９６ウェルプレートに４℃で一晩コーティングし、０．５％ゼラチン溶液で１時間のブロッキング工程の後、１１０Ｄ７、１００３Ａ２、１０２４Ｇ１１精製抗体をそれぞれ開始濃度５μｇ／ｍｌ（３．３３  １０−８Ｍ）で３７℃にてさらに１時間加えた。次に、１／２連続希釈を１２列にわたって行った。その後、プレートを洗浄し、ヤギ抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ）特異的ＩｇＧ  ＨＲＰを３７℃で１時間加えた。反応の現像はＴＭＢ基質溶液を用いて行った。市販のマウス抗Ａｘｌ  Ｍａｂ  １５４抗体も並行して用いる。コーティング対照は、ＨＲＰと結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリクローナル血清（Ｊａｃｋｓｏｎ、ｒｅｆ  １０９−０３５−０９８）の存在下、およびＨＲＰ結合抗ヒスチジン抗体（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ：ＭＡＢ０５０Ｈ）の存在下で実施する。一次抗体の不在下（希釈剤(diluant)）で非特異的結合は見られない。
【０２６３】
結果は図４Ａ（１１０Ｄ７）、４Ｂ（１００３Ａ２）および４Ｃ（１０２４Ｇ１１）に示す。
【０２６４】
図４Ａは、本発明の１１０Ｄ７抗体は高抗体濃度（８．３  １０−９Ｍを超える）の存在下でのみマウスＡｘｌ  ＥＣＤドメインと結合できることを示す。
【０２６５】
図４Ｂは、本発明の１００３Ａ２抗体はマウスＡｘｌ  ＥＣＤドメインと結合しないことを示す。
【０２６６】
図４Ｃは、本発明の１０２４Ｇ１１抗体はマウスＡｘｌ  ＥＣＤドメインと結合しないことを示す。
【０２６７】
５．２  ＦＡＣＳ  ＣＯＳ７
１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１それぞれについて、細胞結合目的で、２．１０５細胞を、それぞれ１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１またはｍ９Ｇ４（ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照Ｍａｂ）の１０μｇ／ｍｌ（６，６６  １０−８Ｍ）抗体溶液の１／２連続希釈（１２点）によって作製した抗体濃度範囲で、４℃にて２０分間インキュベートした。１％ＢＳＡおよび０．０１％ＮａＮ３を添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で３回洗浄した後、細胞を二次抗体ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  ４８８（１／５００希釈）とともに４℃で２０分間インキュベートした。１％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を添加したＰＢＳ中でさらに３回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳ（Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。少なくとも５０００細胞を評価し、蛍光強度の平均値を計算した。データはＰｒｉｓｍソフトウエアを用いて分析する。
【０２６８】
結果は図５Ａ（１１０Ｄ７）、５Ｂ（１００３Ａ２）および５Ｃ（１０２４Ｇ１１）に示す。
【０２６９】
それぞれ１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１抗体およびｍＩｇＧ１アイソタイプ対照を用いてＣＯＳ７細胞で確立した滴定曲線により、それぞれ１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１がＣＯＳ７細胞の表面で発現されたサル細胞型のＡｘｌ受容体を認識できることが確認される。
【０２７０】
１１０Ｄ７抗体では、１５６μｇ／ｍｌ（１０−９Ｍ）を超える濃度でプラトーに達する。１００３Ａ２抗体では、０．０７μｇ／ｍｌ（５．２  １０−１０Ｍ）を超える濃度でプラトーに達する。１０２４Ｇ１１抗体では、０．０７μｇ／ｍｌ（５．２  １０−１０Ｍ）を超える濃度でプラトーに達する。
【０２７１】
ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照の存在下では、結合は見られない。
【０２７２】
実施例６：１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１抗体の存在下で行ったＧａｓ６競合実験
抗Ａｘｌ  Ｍａｂをさらに特徴付けるために、Ｇａｓ６競合アッセイを行った。このアッセイでは、遊離ｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質および抗Ａｘｌ抗体をインキュベートして抗原−抗体複合体を形成させ、次いで、これらの複合体をアッセイプレートのＧａｓ６コーティング表面に添加する。結合していない抗体−抗原複合体を洗い流した後、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質のヒトＦｃ部分に対する、酵素結合二次抗体を加える。次に、基質を加えた後、酵素−基質反応により誘発されたシグナル強度によって抗原濃度を決定することができる。
【０２７３】
簡単に述べると、供試Ｍａｂの存在下または不在下で、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質を含んでなる反応混合物を、個別の飽和（１倍ＰＢＳ中０．５％ゼラチン）プレートで調製する。マウスＡｘｌ抗体（１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１）の連続１：２希釈（８０μｇ／ｍｌから始めて１２列）を行う。次に、ＥＬＩＳＡ希釈剤(diluant)（１倍ＰＢＳ中、０．１％ゼラチン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）のみを含有する陰性対照系を除いて、０．５μｇ／ｍｌのｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ．１５４ＡＬ／ＣＦ）を加える。ホモジナイゼーションの後、ＰＢＳ中、６μｇ／ｍｌのｒｈＧａｓ６溶液（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号８８５−ＧＳ−ＣＳ／ＣＦ）によるＧａｓ６コーティングプレートに競合サンプルを添加する。インキュベーションおよび数回の洗浄の後、結合したｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、ｒｅｆ．１０９−０３５−０９８）を用いて検出する。結合したところで、これらのプレートにＴＭＢ基質を加える。Ｈ２ＳＯ４酸溶液を加えることによって反応を停止させ、得られた光学密度を、マイクロプレートリーダー装置を用いて４５０ｎｍで読み取る。
【０２７４】
この実験（それぞれ図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃ）は、１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１がそれらの固定化リガンド上でｒｈＡｘｌ−Ｆｃ結合と競合し得ることを示す。Ｇａｓ６結合との競合は、２．５μｇ／ｍｌ（１．６７  １０−８Ｍ）を超える濃度の１１０Ｄ７抗体の存在下で起こる。Ｇａｓ６結合との競合は、２．５μｇ／ｍｌ（１．６７  １０−８Ｍ）を超える濃度の１００３Ａ２抗体の存在下で起こる。１０μｇ／ｍｌ（６．６７  １０−８Ｍ）を超える濃度の１００３Ａ２抗体の存在下では、固定化Ｇａｓ６に対するｒｈＡｘｌ−Ｆｃの結合はもはや見られない。１０μｇ／ｍｌ（６．６７  １０−８Ｍ）を超える濃度の１０２４Ｇ１１抗体の存在下では、固定化Ｇａｓ６に対するｒｈＡｘｌ−Ｆｃの結合はもはや見られない。
【０２７５】
１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１抗体は、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃに対するＧａｓ６の結合を遮断する。
【０２７６】
実施例７：ウエスタンブロットによるエピトープ認識
１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１  抗Ａｘｌ抗体が直鎖またはコンフォメーションエピトープを認識するかどうかを決定するため、ＳＮ１２Ｃ細胞溶解液を用いてウエスタンブロット解析を行った。還元条件または非還元条件となるようにサンプルに異なる処理を施した。還元型のサンプルでバンドが見られれば、その供試抗体はＥＣＤドメインの直鎖エピトープを標的とし、そうでなれば、その抗体はＡｘｌ  ＥＣＤのコンフォメーションエピトープに対して生じたものである。
【０２７７】
ＳＮ１２Ｃ細胞を、Ｔ１６２ｃｍ2フラスコにて、ＲＰＭＩ＋１０％熱失活ＦＢＳ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン中、５．１０４細胞／ｃｍ2で播種し、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で７２時間培養した。次に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１．５ｍｌの氷冷溶解バッファー［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０；０．５％デオキシコール酸塩；および完全プロテアーゼ阻害剤カクテル１錠と１％抗ホスファターゼ］で溶解させた。細胞溶解液を４℃で９０分間振盪し、１５０００ｒｐｍで１０分間、清澄化した。ＢＣＡを用いてタンパク質濃度を定量した。種々のサンプルをロードした。まず、１０μｇの全細胞溶解液（２０μｌ中、１０μｇ）を還元条件（１倍サンプルバッファー（ＢＩＯＲＡＤ）＋１倍還元剤（ＢＩＯＲＡＤ））で調製し、９６℃で２分のインキュベーション後にＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。次に、１０μｇの全細胞溶解液を別に２サンプル、非還元条件（１倍サンプルバッファー（ＢＩＯＲＡＤ）単独中）で調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードする前に、これら２つの上記サンプルのうち一方を９６℃で２分のインキュベーションで加熱し、もう一方を氷上で維持する。泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜に転写する。膜を室温にて１時間、ＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．１％（ＴＢＳＴ）、５％脱脂乳で飽和させ、４℃にて一晩、ＴＢＳＴ−５％脱脂乾燥乳中で、１０μｇ／ｍｌのそれぞれ１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１抗体でプロービングした。抗体を、１％脱脂乾燥乳を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水−０．１％ｔｗｅｅｎ  ２０（ｖ／ｖ）（ＴＢＳＴ）中に希釈した。次いで、膜をＴＢＳＴで洗浄し、ペルオキシダーゼ結合二次抗体（１／１０００希釈）とともに室温で１時間インキュベートした。免疫反応性タンパク質をＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ  ＃３２２０９）で可視化した。Ａｘｌを可視化した後、膜を再びＴＢＳＴで１回洗浄し、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（１／２０００００希釈）とともに室温で１時間インキュベートした。次いで、膜をＴＢＳＴで洗浄し、ペルオキシダーゼ結合二次抗体とともに、ＴＢＳＴ−５％脱脂乾燥乳中、室温で１時間インキュベートした。その後、膜をＴＢＳＴ中で洗浄し、ペルオキシダーゼ結合二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。膜を洗浄し、ＥＣＬを用いてＧＡＰＤＨを可視化した。
【０２７８】
結果は図７Ａ（１１０Ｄ７）、７Ｂ（１００３Ａ２）および７Ｃ（１０２４Ｇ１１）に示す。
【０２７９】
特異的バンドは非還元条件でのみ見られるので、１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１抗Ａｘｌ抗体はコンフォメーションエピトープを認識する。ＳＮ１２Ｃ細胞溶解液の変性泳動条件ではバンドは見られない。
【０２８０】
実施例８：１１０Ｄ７、１００３Ａ２、１０２４Ｇ１１抗体により誘発されたＡｘｌダウンレギュレーションの、ウエスタンブロットによる測定
以下の実施例では、Ａｘｌ受容体発現に対する抗体の活性に取り組むため、ヒト腎細胞癌細胞株ＳＮ１２Ｃ（ＡＴＣＣ）を選択した。ＳＮ１２Ｃ細胞株はＡｘｌ受容体を過剰発現する。図８Ａ〜８Ｂ（１１０Ｄ７）、８Ｃ〜８Ｄ（１００３Ａ２）、８Ｅ〜８Ｆ（１０２４Ｇ１１）の全細胞抽出液に対するウエスタンブロットにより、Ａｘｌダウンレギュレーションを検討した。
【０２８１】
ＳＮ１２Ｃ細胞を、６ウェルプレートにて、ＲＰＭＩ＋１０％熱失活ＦＢＳ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン中、６．１０４細胞／ｃｍ2で播種し、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で４８時間培養した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、細胞を、８００ｎｇ／ｍｌの組換えマウスｇａｓ６リガンド（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ：９８６−ＧＳ／ＣＦ）または１０μｇ／ｍｌのｍＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（９Ｇ４）または１０μｇ／ｍｌの本発明の抗Ａｘｌ抗体のいずれかを含有する培地中で血清飢餓状態とし、さらに４時間または２４時間インキュベートした。次に、培地を静かに除去し、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を２００μｌの氷冷溶解バッファー［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０；０．５％デオキシコール酸塩；および完全プロテアーゼ阻害剤カクテル１錠と１％抗ホスファターゼ］で溶解させた。細胞溶解液を４℃で９０分間振盪し、１５０００ｒｐｍで１０分間、清澄化した。ＢＣＡを用いてタンパク質濃度を定量した。全細胞溶解液（２０μｌ中、１０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜に転写した。膜を室温にて１時間、ＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．１％（ＴＢＳＴ）、５％脱脂乳で飽和させ、４℃にて一晩、ＴＢＳＴ−５％脱脂乾燥乳中、市販の抗Ａｘｌ抗体０．５μｇ／ｍｌ（ＡｂＮｏｖａ  Ｈ０００００５５８−Ｍ０２）でプロービングした。抗体を、１％脱脂乾燥乳を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水−０．１％ｔｗｅｅｎ  ２０（ｖ／ｖ）（ＴＢＳＴ）中に希釈した。次いで、膜をＴＢＳＴで洗浄し、ペルオキシダーゼ結合二次抗体（１／１０００希釈）とともに室温で１時間インキュベートした。免疫反応性タンパク質をＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ  ＃３２２０９）で可視化した。Ａｘｌを可視化した後、膜を再びＴＢＳＴで１回洗浄し、ＴＢＳＴ−５％脱脂乾燥乳中、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（１／２０００００希釈）とともに室温で１時間インキュベートした。次いで、膜をＴＢＳＴ中で洗浄し、ペルオキシダーゼ結合二次抗体とともに、室温で１時間インキュベートした。膜を洗浄し、ＥＣＬを用いてＧＡＰＤＨを可視化した。バンド強度を濃度計により定量した。
【０２８２】
図８Ａおよび８Ｂに示す結果は３回の独立した実験の代表例であり、１１０Ｄ７が、Ａｘｌを過剰発現するヒト腫瘍細胞株でＡｘｌをダウンレギュレートし得ることを示す。４時間の時点で、１１０Ｄ７抗体は５０％の、そして、１１０Ｄ７抗体とともに２４時間インキュベートした後には最大８４％の、Ａｘｌのダウンレギュレーションを誘発する。
【０２８３】
図８Ｃおよび８Ｄに示す結果は３回の独立した実験の代表例であり、１００３Ａ２が、Ａｘｌを過剰発現するヒト腫瘍細胞株でＡｘｌをダウンレギュレートし得ることを示す。４時間の時点で、１００３Ａ２抗体は６６％の、そして、１００３Ａ２抗体とともに２４時間インキュベートした後には最大８９％の、Ａｘｌのダウンレギュレーションを誘発する。
【０２８４】
図８Ｅおよび８Ｆに示す結果は３回の独立した実験の代表例であり、１０２４Ｇ１１が、Ａｘｌを過剰発現するヒト腫瘍細胞株でＡｘｌをダウンレギュレートし得ることを示す。４時間の時点で、１０２４Ｇ１１抗体は６８％の、そして、１０２４Ｇ１１抗体とともに２４時間インキュベートした後には最大８５％の、Ａｘｌのダウンレギュレーションを誘発する。
【０２８５】
実施例９：細胞表面Ａｘｌ発現に対する抗Ａｘｌ抗体の効果のフローサイトメトリー試験
フローサイトメトリー技術は、細胞表面のＡｘｌ受容体の標識を可能とする。この技術の使用は、膜Ａｘｌ発現に対する抗体の効果を強調することができる。本実施例では、高レベルのＡｘｌを発現するヒト腎腫瘍ＳＮ１２Ｃ細胞を用いた。
【０２８６】
ＳＮ１２Ｃ腫瘍細胞株を、１％Ｌ−グルタミンおよび１０％ＦＣＳを含むＲＭＰＩ１６４０中で、実験前に３日間培養した。次に、トリプシンを用いて細胞を解離させ、６マルチウェルプレートの、１％Ｌ−グルタミンおよび５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中に播種した。翌日、対象抗体を１０μｇ／ｍｌで加えた。非処理ウェルも含めた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、解離させ、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０１％アジ化ナトリウム）中で、同じ対象抗体とともにインキュベートした。処理細胞および非処理細胞に対して同じＭａｂで得られたシグナル強度を比較するために、非処理ウェルも同じ抗体で染色した。細胞を４℃で２０分間インキュベートし、ＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。Ａｌｅｘａ  ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を２０分間インキュベートし、細胞を３回洗浄した後、ヨウ化プロピジウム陰性細胞集団に対してＦＡＣＳ分析を行った。非処理細胞と処理細胞の間のＭａｂの同じ抗体での染色の違いは、これらの細胞の細胞表面のＡｘｌタンパク質のダウンレギュレーションを示した。
【０２８７】
（ｉ）細胞表面に残留するＡｘｌのパーセンテージ、および（ｉｉ）Ｔ２４時間にｍＩｇＧ１処理細胞に比べた場合の、それぞれ１１０Ｄ７、１００３Ａ２、１０２４Ｇ１１処理細胞の表面で検出された蛍光シグナルの違い、の２つのパラメーターを決定する。残留Ａｘｌのパーセンテージは次のように計算する。
％残留Ａｘｌ＝（本発明のＭＦＩ  Ｍａｂ  ２４時間／ＭＦＩ  ｍＩｇＧ１  ２４時間）×１００
【０２８８】
１つの代表的な実験からのデータを表７に示す。これらの結果は、３回の独立した実験で再現された。
【０２８９】
非処理細胞および処理条件において同じ抗体によるＭａｂ染色間のＭＦＩの違いは、検討下のＭａｂの結合による細胞の細胞表面でのＡｘｌタンパク質のダウンレギュレーションを反映する。抗体を含まない条件は、アイソタイプ対照抗体（ｍ９Ｇ４）の存在下の条件と同様の結果をもたらした。
【０２９０】
【表１１】
0006445444.tif 000012
【０２９１】
これらのデータは、１１０Ｄ７で２４時間処理した細胞の表面に検出された平均蛍光強度が１１０Ｄ７抗体で標識した非処理細胞で得られたＭＦＩに比べて減少する（−５８８）ことを示す。１１０Ｄ７抗体とともに２４時間インキュベートした後、２９．８％の細胞表面Ａｘｌ受容体がＳＮ１２Ｃ細胞表面に残留する。
【０２９２】
これらのデータは、１００３Ａ２で２４時間処理した細胞の表面に検出された平均蛍光強度が１００３Ａ２抗体で標識した非処理細胞で得られたＭＦＩに比べて減少する（−５０５）ことを示す。１００３Ａ２抗体とともに２４時間インキュベートした後、３５％の細胞表面Ａｘｌ受容体がＳＮ１２Ｃ細胞表面に残留する。
【０２９３】
これらのデータは、１０２４Ｇ１１で２４時間処理した細胞の表面に検出された平均蛍光強度が１０２４Ｇ１１抗体で標識した非処理細胞で得られたＭＦＩに比べて減少する（−４７８）ことを示す。１０２４Ｇ１１抗体とともに２４時間インキュベートした後、４５．５％の細胞表面Ａｘｌ受容体がＳＮ１２Ｃ細胞表面に残留する。
【０２９４】
実施例１０：蛍光免疫細胞化学標識を用いた抗Ａｘｌ抗体のインターナリゼーション試験
補足的インターナリゼーション結果を、間接的蛍光標識法を用いた共焦点顕微鏡観察により得る。
【０２９５】
簡単に述べると、ＳＮ１２Ｃ腫瘍細胞株を、１％Ｌ−グルタミンおよび１０％ＦＣＳを含むＲＭＰＩ１６４０中で、実験前に３日間培養した。次に、トリプシンを用いて細胞を解離させ、カバーガラスを含む６マルチウェルプレートの、１％Ｌ−グルタミンおよび５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中に播種した。翌日、抗体１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１をそれぞれ１０μｇ／ｍｌで加えた。無関連の抗体で処理した細胞も含めた。その後、これらの細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１時間(1h)および２時間(2h)インキュベートした。Ｔ０時間(T0h)では、細胞表面への抗体の結合を判定するために、細胞を４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。細胞をすすぎ、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ４８８抗体とともに４℃で６０分間インキュベートして、細胞表面に残留する抗体を確認した。抗体の細胞への浸透を追跡するため、細胞を固定し、サポニンで透過処理を施した。ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて膜抗体および細胞内抗体の両方を染色した。初期エンドソームを、ＥＥＡ１に対するウサギポリクローナル抗体を用いて同定し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ５５５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で可視化した。細胞を３回洗浄し、Ｄｒａｑ５を用いて核を染色した。染色後、細胞をＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ封入剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に封入し、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０共焦顕微鏡を用いて分析した。
【０２９６】
写真を図９Ａ〜９Ｃ（１１０Ｄ７）、９Ｄ〜９Ｆ（１００３Ａ２）および９Ｇ〜９Ｉ（１０２４Ｇ１１）に示す。
【０２９７】
画像を共焦点顕微鏡によって得た。ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照の存在下では、膜染色も細胞内標識も見られない（図９Ａ、９Ｄ、９Ｇ）。ＳＮ１２Ｃ細胞をそれぞれ１１０Ｄ７（図９Ｂ）、１００３Ａ２（図９Ｅ）および１０２４Ｇ１１（図９Ｈ）とともに１時間(1h)インキュベートした後すぐに膜抗Ａｘｌ標識の段階的損失が見られる（図９Ｂ）。２時間(2h)の時点では、それぞれ１１０Ｄ７（図９Ｃ）、１００３Ａ２（図９Ｆ）および１０２４Ｇ１１（図９Ｉ）抗Ａｘｌ抗体の細胞内蓄積がより顕著である。細胞内抗体は初期エンドソームマーカーであるＥＥＡ１と同時局在する。これらの写真から、ＳＮ１２Ｃ細胞への抗Ａｘｌ  ｍＡｂ１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１のインターナリゼーションが確認される。
【０２９８】
実施例１１：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗Ａｘｌ媒介抗腫瘍活性
ＳＮ１２Ｃ増殖アッセイ
ウェル当たり１００００個のＳＮ１２Ｃ細胞を９６ウェルプレートのＦＣＳ不含培地に播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で一晩培養した。翌日、細胞を１０μｇ／ｍｌの各抗体とともに３７℃で１時間プレインキュベートした。ウェルに直接リガンドを加えることにより、細胞をｒｍＧａｓ６（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９８６−ＧＳ／ＣＦ）で処理し、または処理せず、その後、７２時間放置して増殖させた。増殖は３Ｈチミジン組み込みに従って測定した
【０２９９】
データを図１０Ａ（１１０Ｄ７）、１０Ｂ（１００３Ａ２）および１０Ｃ（１０２４Ｇ１１）に示す。それぞれ１１０Ｄ７、１００３Ａ２および１０２４Ｇ１１で効果は見られず、これをＳＮ１２Ｃ細胞に加えても無変化(silent)である。
【０３００】
実施例１２：種々のヒト腫瘍細胞株におけるｍ１１０Ｄ７−サポリン、１００３Ａ２−サポリンおよび１０２４Ｇ１１−サポリン免疫複合体の細胞傷害効力
本実施例では、サポリン結合１１０Ｄ７、１００３Ａ２または１０２４Ｇ１１抗体の細胞傷害効力を記載する。この目的で、ヒト腫瘍細胞株の大パネルを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを行った（図１１Ａ〜１１Ｋ）。この液性腫瘍細胞株パネルは、種々のＡｘｌ発現を包含する。
【０３０１】
簡単に述べると、５０００個の細胞を９６ウェル培養プレートの１００μｌの５％ＦＢＳの適切な培養培地中に播種した。５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で２４時間インキュベートした後、一定の濃度範囲の免疫複合体（ｍＡｘｌ  Ａｂ−サポリンまたはｍ９Ｇ４−サポリン）を細胞に適用する。次に、培養プレートを３７℃、加湿５％ＣＯ２インキュベーター内で７２時間インキュベートする。
【０３０２】
４日目に、細胞生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、マディソン、ウィスコンシン州）（このキットは、代謝的に活性な細胞の指標としての、存在するＡＴＰの定量に基づいて培養物中の生細胞の数を決定することができる）を用いて評価する。発光を照度計により記録する。
【０３０３】
発光出力から下式を用いて細胞傷害性のパーセンテージが計算される。
細胞傷害性％＝１００−［（ＲＬＵ  Ａｂ−ｓａｐ×１００）／ＲＬＵ  Ｎｏ  Ａｂ］
【０３０４】
図１１Ａ〜１１Ｋは、１１０Ｄ７−サポリン、１００３Ａ２−サポリンおよび１０２４Ｇ１１−サポリン免疫複合体は、これらの異なるヒト腫瘍細胞株において細胞傷害性を誘発したことを示す。生じる細胞傷害性作用の効力はヒト腫瘍細胞株によって異なる。
【０３０５】
0006445444.tif 000013
0006445444.tif 000014
【図１Ａ】
0006445444.tif 000015
【図１Ｂ】
0006445444.tif 000016
【図１Ｃ】
0006445444.tif 000017
【図２Ａ】
0006445444.tif 000018
【図２Ｂ】
0006445444.tif 000019
【図２Ｃ】
0006445444.tif 000020
【図２Ｄ】
0006445444.tif 000021
【図２Ｅ】
0006445444.tif 000022
【図２Ｆ】
0006445444.tif 000023
【図２Ｇ】
0006445444.tif 000024
【図２Ｈ】
0006445444.tif 000025
【図２Ｉ】
0006445444.tif 000026
【図３Ａ】
0006445444.tif 000027
【図３Ｂ】
0006445444.tif 000028
【図３Ｃ】
0006445444.tif 000029
【図４Ａ】
0006445444.tif 000030
【図４Ｂ】
0006445444.tif 000031
【図４Ｃ】
0006445444.tif 000032
【図５Ａ】
0006445444.tif 000033
【図５Ｂ】
0006445444.tif 000034
【図５Ｃ】
0006445444.tif 000035
【図６Ａ】
0006445444.tif 000036
【図６Ｂ】
0006445444.tif 000037
【図６Ｃ】
0006445444.tif 000038
【図７Ａ】
0006445444.tif 000039
【図７Ｂ】
0006445444.tif 000040
【図７Ｃ】
0006445444.tif 000041
【図８Ａ】
0006445444.tif 000042
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
0006445444.tif 000044
【図８Ｄ】
0006445444.tif 000045
【図８Ｅ】
0006445444.tif 000046
【図８Ｆ】
0006445444.tif 000047
【図９Ａ】
0006445444.tif 000048
【図９Ｂ】
0006445444.tif 000049
【図９Ｃ】
0006445444.tif 000050
【図９Ｄ】
0006445444.tif 000051
【図９Ｅ】
0006445444.tif 000052
【図９Ｆ】
0006445444.tif 000053
【図９Ｇ】
0006445444.tif 000054
【図９Ｈ】
0006445444.tif 000055
【図９Ｉ】
0006445444.tif 000056
【図１０Ａ】
0006445444.tif 000057
【図１０Ｂ】
0006445444.tif 000058
【図１０Ｃ】
0006445444.tif 000059
【図１１Ａ】
0006445444.tif 000060
【図１１Ｂ】
0006445444.tif 000061
【図１１Ｃ】
0006445444.tif 000062
【図１１Ｄ】
0006445444.tif 000063
【図１１Ｅ】
0006445444.tif 000064
【図１１Ｆ】
0006445444.tif 000065
【図１１Ｇ】
0006445444.tif 000066
【図１１Ｈ】
0006445444.tif 000067
【図１１Ｉ】
0006445444.tif 000068
【図１１Ｊ】
0006445444.tif 000069
【図１１Ｋ】
0006445444.tif 000070
【図１２Ａ】
0006445444.tif 000071
【図１２Ｂ】
0006445444.tif 000072
【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
0006445444.tif 000074
【図１２Ｅ】
0006445444.tif 000075
【図１２Ｆ】
0006445444.tif 000076
【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１２Ｉ】
0006445444.tif 000079
【図１２Ｊ】
0006445444.tif 000080
【図１２Ｋ】
0006445444.tif 000081
【図１３Ａ】
0006445444.tif 000082
【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
0006445444.tif 000084
【図１３Ｄ】
0006445444.tif 000085
【図１３Ｅ】
0006445444.tif 000086
【図１３Ｆ】
0006445444.tif 000087
【図１３Ｇ】
0006445444.tif 000088
【図１３Ｈ】
0006445444.tif 000089
【図１３Ｉ】
0006445444.tif 000090
【図１３Ｊ】
0006445444.tif 000091
【図１３Ｋ】
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【配列表】
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