(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホジエステラーゼ３Ａ酵素及び／又はホスホジエステラーゼ３Ｂ酵素を発現するヒト患者の固形腫瘍の治療に用いるための、アナグレリド又はその塩を含む組成物であって、該固形腫瘍が消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）又は脂肪肉腫であることを特徴とする組成物。
【請求項２】
該固形腫瘍が、ホスホジエステラーゼ３Ａ酵素ｍＲＮＡ若しくはタンパク質及び／又はホスホジエステラーゼ３Ｂ酵素ｍＲＮＡ若しくはタンパク質を健康な対照組織よりも高度に発現する細胞を含むことが検出される請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
アナグレリド塩酸塩を含む請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
更にチロシンキナーゼ阻害剤を含む請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
該チロシンキナーゼ阻害剤が、ＫＩＴと血小板由来成長因子受容体とに特異的であり、ニロチニブ、スニチニブ、レゴラフェニブ、イマチニブ、メシル酸イマチニブ、マシチニブ、ドビチニブ、ポナチニブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、バタラニブ、及びクレノラニブからなる群より選ばれる請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
該組成物の患者への投与を、チロシンキナーゼ阻害剤を含む他の組成物と組み合わせて、同時投与又は順次投与の形で行う請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項７】
薬学的に許容されるバッファー、担体又はアジュバントを含む医薬組成物である請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
該医薬組成物が、徐放性、遅延放出性、又は持効性のための処方がなされているか、又は、該医薬組成物が徐放性処方と即時放出性処方との混合物である請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
アナグレリド又はその塩の、ホスホジエステラーゼ３Ａ酵素及び／又はホスホジエステラーゼ３Ｂ酵素を発現するヒト患者の固形腫瘍の治療用薬剤の製造のための使用であって、該固形腫瘍が消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）又は脂肪肉腫であることを特徴とする使用。
【請求項１０】
該固形腫瘍が、ホスホジエステラーゼ３Ａ酵素ｍＲＮＡ若しくはタンパク質及び／又はホスホジエステラーゼ３Ｂ酵素ｍＲＮＡ若しくはタンパク質を健康な対照組織よりも高度に発現する細胞を含むことが検出される請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野は、癌生物学に関する。本発明は更に、癌治療に用いるための組成物と複数薬剤併用技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
全てのヒト癌の約１％が軟部肉腫であり、軟部肉腫としては５０種類を超える異なる腫瘍が存在する。軟部肉腫はしばしば悪性腫瘍であり、５０％までが発症後に再発又は転移する（Wibmer, C. 2010）。脂肪肉腫は２番目に多い種類の軟部腫瘍であり、脂肪肉腫のサブタイプ（脱分化型脂肪肉腫など）によっては、非常に侵攻的な疾病経過を示すものもある（Dalal, K.M. 2006）。現在、局所疾患の治療には、腫瘍の外科的切除や放射線療法が用いられている。転移性疾患の治療には化学療法が含まれるが、応答は稀にしか得られない（D'Angelo, S.P. 2014）。
【０００３】
消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）は、消化管（ＧＩ）の最も一般的な間葉系腫瘍であり、カハール介在細胞の前駆細胞に由来すると考えられている（Sircar,K. 1999）。ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の強い発現がＧＩＳＴには典型的であり、これら腫瘍の約８０％がＫＩＴ癌原遺伝子に機能獲得型変異を有している（Hirota,S. 1998）。ＫＩＴ変異を欠く多くのＧＩＳＴが血小板由来成長因子受容体α（ＰＤＧＦＲＡ）に活性化変異を有している（Heinrich,M.C. 2003）。ＰＤＧＦＲＡはＫＩＴと構造的に関連しており、これらの受容体はいずれも同じＲＴＫファミリーに属している（Yarden,Y. 1987）。キナーゼ阻害剤であるメシル酸イマチニブは、おそらくＫＩＴとＰＤＧＦＲＡの阻害を通じて、ＧＩＳＴを有意に阻害することが知られている（Heinrich,M.C. 2003）。ＧＩＳＴの治療に用いられる他の有効なキナーゼ阻害剤は多種キナーゼ阻害剤であるスニチニブとレゴラフェニブであり、これらはイマチニブが効果を示さない患者やイマチニブに応答しなくなった患者の治療に用いられている（Demetri,G.D. 2006; Demetri,G.D. 2013）。ＧＩＳＴの中には、キナーゼ阻害剤に応答しないものや、経時的に耐性を獲得したものがあり、したがって、ＧＩＳＴの患者を治療するための新たな薬剤を開発することが必要である（Heinrich, M.C. 2006; Maleddu,A. 2009）。
【０００４】
免疫組織化学的マーカーはＧＩＳＴの診断に非常に重要である。ＫＩＴ受容体中の抗原を標的とするＣＤ１１７抗体は、ＧＩＳＴの最も伝統的な診断マーカーである（Kindblom,L.G. 1998）。ＫＩＴを高度に発現していることは、エクソン９、１１、１３又は１７におけるＫＩＴ遺伝子の変異を共通に有するＧＩＳＴに典型的である（Heinrich,M.C. 2002）。ＧＩＳＴの最も高感度なマーカーの１つがアノクタミン１であり（ＡＮＯ１、「ＤＯＧ１」とも呼ばれる)、これはＫＩＴよりも特異的なＧＩＳＴのマーカーと考えられている（West, R.B., 2004; Espinosa,I. 2008;Liegl,B. 2009）。プロテインキナーゼＣシータ（ＰＫＣθ）は大方のＧＩＳＴにおいて提示され、ＧＩＳＴの有用なマーカーであると示唆されている（Duensing,A. 2004）。しかし、ＧＩＳＴに対するＰＫＣθの特異性は比較的に低い（Novelli,M. 2010）。ＧＩＳＴの評価に用いられる他のマーカーは、造血前駆細胞抗原ＣＤ３４であり、一方、平滑筋アクチン、デスミン、胚ミオシン、ヘビーカルデスモン（heavy caldesmon）などの平滑筋抗原は、ＧＩＳＴでは高頻度に発現しない（Miettinen,M. 1995; Miettinen,M. 2006）。
【０００５】
ホスホジエステラーゼ類（ＰＤＥ）は、３'，５'−プリンリボースサイクリックモノホスフェートであるｃＡＭＰとｃＧＭＰの３'−ホスホエステル結合の加水分解を選択的に触媒する。ＰＤＥは、ｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰの分解を制御することにより、ｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰの細胞内レベル、局在化及びシグナル伝達を制御する（Beavo,J.A. 1995）。合計１１種の異なるＰＤＥファミリーがあり、これらファミリーの中には複数の転写変異体を有するものが少なくない（Conti,M. 2007）。ＰＤＥ３ファミリーには、ＰＤＥ３ＡとＰＤＥ３Ｂという２種のタンパク質が含まれ、これらは構造的類似性を有する（Degerman,E. 1997）。ＰＤＥ３Ａは、心筋細胞、血管平滑筋細胞及び血小板に豊富に存在する（Shakur,Y. 2001）。ＰＤＥ３阻害剤は、心筋収縮性を増進すること、及び血管や気道の平滑筋弛緩を誘導することが知られている（Halpin,D.M. 2008）。複数種のＰＤＥ３阻害剤が心不全と間欠性跛行の治療に用いられてきた（Dawson,D.L. 1998; Liu,Y. 2001）。ＰＤＥ３Ｂは膵臓β細胞、肝臓細胞及び脂肪細胞で発現し、β細胞のインスリン分泌、肝臓細胞のグリコーゲン分解及び脂肪細胞の脂肪分解などの代謝プロセスを制御する（Resjo, S. 1999）。肥満糖尿病マウスにおいて、ＰＤＥ３阻害剤のシロスタゾールが、マクロファージが分泌したＴＮＦαにより誘導された脂肪組織の炎症を抑制することにより、グルコース不耐性とインスリン抵抗性を改善することが示されている（Wada, T. 2013）。
【０００６】
ＰＤＥ３Ａは、哺乳類卵母細胞の成熟過程でＡＫＴによりリン酸化・活性化される（Han,S.J. 2006）。同様に、ＰＤＥ３Ｂは、脂肪細胞でのインスリン刺激後にＡＫＴによりリン酸化・活性化されることが示されている（Degerman, E. 1998）。ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）／ＡＫＴ経路も、ＧＩＳＴにおける変異ＫＩＴ受容体及び変異ＰＤＧＦＲＡ受容体によって活性化される（Duensing,A. 2004）。血小板ではＰＫＣがＰＤＥ３Ａ活性の制御に関与する（Hunter,R.W. 2009）。ＰＤＥ３Ａは胃平滑筋で発現することが示されており、胃平滑筋でＰＤＥ３ＡはプロテインキナーゼＡによってリン酸化される（Murthy,K.S. 2002）。更に、ＰＤＥ３ＡはネズミＧＩＳＴモデル（KITK641Eマウス）の胃幽門洞で強く発現することが示され、ＰＤＥ３Ａはカハール介在細胞の遺伝子発現プロファイルと関連付けられた（Gromova,P. 2009）。
【０００７】
アナグレリド塩酸塩は、ＰＤＥ３酵素を標的とする分子であり、血小板の量を減少させることができる。アナグレリド塩酸塩は、骨髄増殖性疾患の患者、特に本態性血小板増加症の患者の治療に用いられている（Fruchtman,S.M. 2005; Harrison,C.N. 2005）。アナグレリド塩酸塩は、血小板のサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性を阻害し、それにより、血小板中のｃＡＭＰレベルを更に上昇させる（Gillespie,E. 1988; Seiler,S. 1987）。
【０００８】
本発明において、ＰＤＥ３ＡとＰＤＥ３ＢがＧＩＳＴの特異的マーカーであることを示す。ＰＤＥ３タンパク質は脂肪肉腫においてもしばしば発現され、他の種類の癌においてはそれより発現頻度が低い。ＰＤＥ３活性をアナグレリド塩酸塩で阻害するとＧＩＳＴ細胞系の細胞増殖が停止し、脂肪肉腫細胞系の細胞増殖が有意に減少する。ＰＤＥ３の特異的阻害剤であるアナグレリド塩酸塩をＧＩＳＴ細胞系においてメシル酸イマチニブと組み合わせて使用したところ、相乗効果が得られた。ＧＩＳＴ細胞はよりアポトーシス様になり、これらの薬剤のいずれかを単独で使用するよりも細胞増殖が減少した。我々の知見によると、ＰＤＥ３ＡとＰＤＥ３Ｂは新たな免疫マーカー及び薬剤標的であると考えることができ、ＰＤＥ３阻害剤のアナグレリド塩酸塩は、ＰＤＥ３を発現する固形腫瘍を治療するための強力な治療能力を有する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の１つの目的は、ＰＤＥ３Ａ及び／又はＰＤＥ３Ｂを発現するヒト患者の固形腫瘍の治療に用いるための、アナグレリド又はその塩あるいは他のホスホジエステラーゼ３阻害剤を含む組成物を提供することである。
【００１０】
本発明はまた、以下の方法を提供する。
試験サンプル中のＰＤＥ３タンパク質発現に関連する悪性腫瘍を検出する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む方法。
（ａ）サンプルを、ＰＤＥ３Ａ酵素又はＰＤＥ３Ｂ酵素に特異的に結合する抗体と接触させ、但し該サンプルは、ＰＤＥ３Ａ酵素及び／又はＰＤＥ３Ｂ酵素を発現する腫瘍を含む疑いのある組織から採取したものであり、
（ｂ）サンプルと抗体とを、免疫複合体形成に十分な時間と条件下でインキュベートし、
（ｃ）抗原と抗体の間の免疫複合体形成の有無を検出し、そして
（ｄ）免疫複合体形成の存在を悪性腫瘍の指標として、悪性腫瘍の有無を検出する。
【００１１】
更に本発明は以下の方法を提供する。
ＰＤＥ３Ａ酵素及び／又はＰＤＥ３Ｂ酵素を発現する腫瘍を有するヒト患者がホスホジエステラーゼ３酵素類の阻害剤による治療に応答するか否かを検出・分析するための方法であって、以下の工程を含む方法。
−該患者から得た腫瘍サンプル中のホスホジエステラーゼ３Ａ酵素及びホスホジエステラーゼ３Ｂ酵素の発現レベルを定量し、そして、
−該患者の腫瘍サンプルが、健康な対照組織サンプルよりもホスホジエステラーゼ３Ａ酵素及び／又はホスホジエステラーゼ３Ｂ酵素の高い発現レベルを示す場合には、該患者をホスホジエステラーゼ３酵素類の阻害剤による治療のために選抜する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＰＤＥ３阻害剤、アナグレリド塩酸塩、アムリノン、ミルリノン、及びシロスタゾールがＧＩＳＴと脂肪肉腫の細胞増殖に与える影響を、ＤＭＳＯによる治療と比較して示す。（Ａ）ＧＩＳＴ８８２、（Ｂ）ＧＩＳＴ４８、（Ｃ）ＬＰＳ１４１。ＤＭＳＯを薬剤応答に関する負の対照として用いた。ニロチニブをＧＩＳＴ細胞系における薬剤応答に関する正の対照として用いた。
【図２】アナグレリド塩酸塩、イマチニブ、及びアナグレリド塩酸塩とイマチニブの組み合わせがＧＩＳＴの細胞増殖に与える影響を示す。（Ａ）ＧＩＳＴ８８２、（Ｂ）ＧＩＳＴ４８。ＤＭＳＯを薬剤応答に関する負の対照として用いた。
【００１３】
発明の詳細な説明
アナグレリドの化学名は、６，７−ジクロロ−１，５−ジヒドロイミダゾ［２，１−ｂ］キナゾリン−２（３Ｈ）−オンである。しかし、本願明細書では、「アナグレリド」という用語を、アナグレリドの非毒性で薬学的に許容される酸付加塩を包含する意味で用いる。したがって、「アナグレリド」という用語は、親化合物のみならず、全てのそのような塩を包含するものである。アナグレリドの好ましい塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、（低級）アルキル硫酸塩、（低級）アルキルスルホン酸塩、（低級）アリールスルホン酸塩、リン酸塩、硫酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、及びクエン酸塩が挙げられる。本発明においてアナグレリド塩酸塩は特に好ましい酸付加塩である。アナグレリドの調製方法は、たとえば、米国特許第５，３９１，７３７号に記載されている。
【００１４】
消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）の大半が、受容体チロシンキナーゼ遺伝子であるＫＩＴ又はＰＤＧＦＲＡに活性化変異を有することで特徴づけられる。ＫＩＴ受容体とＰＤＧＦＲＡ受容体の阻害剤は臨床での有効性が示されているが、腫瘍の中には、治療に応答しないものや、治療への耐性を生じるものがある。本発明において、我々は、ＧＩＳＴにおけるホスホジエステラーゼ３Ａとホスホジエステラーゼ３Ｂ（PDE3A, Gene ID: 5139; PDE3B, Gene ID: 5140）の役割を調査し、また、他のＰＤＥ３酵素類を発現する腫瘍を新たな治療標的の候補として調査した。
【００１５】
GeneSapiensデータベースによると、ＰＤＥ３Ａ遺伝子はＧＩＳＴ、平滑筋肉腫及び脂肪肉腫において異常に高い発現を示し、また、頻繁にではないが、他の種類の癌よりも、他の種類の腫瘍においても異常に高い発現を示した。ＰＤＥ３Ｂの発現は脂肪肉腫とＧＩＳＴにおいて異常に高く、また、稀に他の腫瘍でも異常に高かった。癌におけるＰＤＥ３ＡとＰＤＥ３Ｂの発現を、３６種類の癌からなる８０５個のヒト腫瘍組織サンプルについて免疫組織化学で更に調査した。免疫組織化学の特異性を、腫瘍組織でのＰＤＥ３ＡとＰＤＥ３Ｂの発現レベルを定量的ＰＣＲで測定して確認した。腫瘍細胞の増殖と生存におけるＰＤＥ３酵素類の重要性を、ヒト脂肪肉腫細胞系ＬＰＳ１４１とヒトＧＩＳＴ４８細胞系及びヒトＧＩＳＴ８８２細胞系において、ＰＤＥ３酵素類の活性を何種類かの阻害剤で阻害することにより調査した。ＧＩＳＴの大半（９３％）がＰＤＥ３Ａを発現し（表１）、一方、他の種類の腫瘍での発現は稀であった。また、ＰＤＥ３Ｂの発現はＧＩＳＴにおいて最も多く見られた（６６％）。実施例に示すように、アナグレリド塩酸塩はＧＩＳＴと脂肪肉腫の細胞増殖を効果的に阻害した（図１）。アナグレリド塩酸塩はまた、ＧＩＳＴ細胞のアポトーシスを増加させた。更に、アナグレリド塩酸塩は、ＫＩＴとＰＤＧＦＲＡの阻害剤であるメシル酸イマチニブと共に投与すると、ＧＩＳＴ細胞系に対して相乗的抗腫瘍効果を示す。
【００１６】
このように、アナグレリド塩酸塩は、ヒトＰＤＥ３タンパク質を発現する細胞系において細胞死を誘導し、細胞増殖を停止させる能力を有する。加えて、ＧＩＳＴの治療薬として臨床的に用いられているメシル酸イマチニブと組み合わせて用いると、いずれかの薬剤を単独で用いるよりも、アナグレリドはＧＩＳＴ細胞系において高いレベルの細胞死を誘導する。したがって、アナグレリドとその塩はＧＩＳＴ患者を治療するための新規な薬剤である。アナグレリドは、ＰＤＥ３Ａ及び／又はＰＤＥ３Ｂを発現するがチロシンキナーゼ阻害剤に応答しないか経時的に耐性を獲得した腫瘍を有する患者の治療にも有効な可能性がある。アナグレリドがヒト固形腫瘍に対して有効であることを示したのは本発明が最初である。
【００１７】
したがって、本発明は、ＰＤＥ３Ａ及び／又はＰＤＥ３Ｂを発現するヒト患者の固形腫瘍の治療に用いるための、アナグレリドを含む組成物に関するものである。好ましくは、該固形腫瘍は、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、脂肪肉腫、又はＰＤＥ３Ａ及び／又はＰＤＥ３Ｂを発現する他の腫瘍である。こうして、本発明においては、アナグレリドを、ホスホジエステラーゼ３Ａ酵素（ＰＤＥ３Ａ）ｍＲＮＡ若しくはタンパク質又はホスホジエステラーゼ３Ｂ酵素（ＰＤＥ３Ｂ）ｍＲＮＡ若しくはタンパク質を健康な対照組織よりも高度に発現する細胞を含むことが検出される固形腫瘍の治療に用いることができる。本願明細書における「固形腫瘍」という用語は、細胞の異常な増殖又は分裂の結果としての組織の異常な塊、すなわち新生物、を意味する。
【００１８】
最も好ましい組成物は、アナグレリド塩酸塩を含む組成物である。本発明の他の好ましい態様においては、本発明の組成物の処方に際してアナグレリドの他の塩を用いることができる。
【００１９】
本発明はまた、多剤併用療法用の組成物に関するものである。本発明の多剤併用組成物は、アナグレリドとイマチニブ又はメシル酸イマチニブとを含む。本発明の１つの多剤併用の態様においては、アナグレリドを含む組成物を、イマチニブ又はメシル酸イマチニブを含む他の組成物と組み合わせて、同時投与又は順次投与の形で癌患者に投与することができる。また、ＫＩＴとＰＤＧＦＲとを標的とするチロシンキナーゼ阻害剤として、イマチニブとメシル酸イマチニブ以外のもの（たとえば、ニロチニブ、スニチニブ、マシチニブ、ドビチニブ、ポナチニブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、クレノラニブ、及びレゴラフェニブ）を本発明の多剤併用組成物において用いることも好ましい。
【００２０】
ホスホジエステラーゼ阻害剤（アナグレリドなど）を含む組成物は、薬学的に許容されるバッファー、担体又はアジュバントを含んでよく、また、そのような組成物を経口投与又は非経口投与してよい。このように本発明は、アナグレリドに加えて、薬学的に許容されるバッファー、担体又はアジュバントを含む医薬組成物を提供する。１つの多剤併用の態様においては、該医薬組成物は更にチロシンキナーゼ阻害剤、たとえばイマチニブ又はメシル酸イマチニブを含む。本願明細書における「薬学的に許容される」という用語は、患者に投与した際に、生理学的に許容可能で、典型的にはアレルギー又は類似の反応を生じない組成物を意味する。医薬組成物は、徐放性、遅延放出性、又は持効性のための処方がなされていてもよく、又は、医薬組成物は徐放性処方と即時放出性処方との混合物である。
【００２１】
組成物又は医薬組成物は、固形製剤（たとえば錠剤、顆粒、粉末又はカプセル剤）の剤形で経口投与することができる。そのような固形製剤を調製するためには、ホスホジエステラーゼ阻害剤（アナグレリドなど）を適当な添加剤、たとえば賦形剤（たとえばラクトース、マンニトール、コーンスターチ、又は結晶化セルロース）、結合剤（たとえばセルロース誘導体、アカシアガム又はゼラチン）、崩壊剤（たとえばカルボキシメチルセルロースカルシウム）、又は潤滑剤（たとえばタルク又はステアリン酸マグネシウム）と混合すればよい。
【００２２】
そのような固形製剤は、制御放出製剤として調製してもよく、そのためには、コーティング基剤（たとえばヒドロキシメチルセルロースフタレート、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、又はメタクリル酸エステル共重合体）を用いる。請求項に記載される組成物はまた、液体製剤（溶液、懸濁液又は乳化液など）として調製してもよい。
【００２３】
ホスホジエステラーゼ阻害剤（アナグレリドなど）を含む組成物は、注射剤の形で非経口投与してもよい。注射剤を調製するためには、組成物を、たとえば水、エタノール、グリセリン、又は公知の界面活性剤と混合すればよい。組成物はまた、適当な基剤を用いて座薬として調製してもよい。
【００２４】
ホスホジエステラーゼ阻害剤（アナグレリドなど）を含む組成物は、多剤併用療法で用いられる抗腫瘍剤や、放射線療法と組み合わせて投与してもよい。抗腫瘍剤と組み合わせる場合は、組成物と抗腫瘍剤の投与は、同時に、又は同じ投与頻度又は異なる投与頻度で別々に、同じ投与方法又は異なる投与方法で、行うことができる。このように、ホスホジエステラーゼ阻害剤は、多剤併用療法や放射線療法と組み合わせて癌患者の治療に用いることができる。多剤併用における好ましい抗腫瘍剤は、イマチニブ又はメシル酸イマチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤である。４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル)−Ｎ−［４−メチル−３−（４−（ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］ベンズアミド（イマチニブとも呼ばれる）の調製と使用（特に抗腫瘍剤としての）はＥＰ０ ５６４ ４０９に記載されている。４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル)−Ｎ−［４−メチル−３−（４−（ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］ベンズアミド メシル酸塩（メシル酸イマチニブ又はＳＴＩ５７１とも呼ばれる）とその医薬品としての使用は、米国特許第６，８９４，０５１号に記載されている。
【００２５】
アナグレリドのヒトへの１回当たりの好ましい投与量は０．０２５〜２．５ｍｇ、好ましくは０．１〜１．０ｍｇ、最も好ましくは０．５ｍｇである。イマチニブ又はメシル酸イマチニブの１日当たりの好ましい投与量は約１００〜１０００ｍｇ、より好ましくは３００〜８００ｍｇである。しかし、最適な投与間隔と投与量は、経験的に決定することができ、公知技術の範囲内である。
【００２６】
本発明はまた、ホスホジエステラーゼ３Ａ及び／又はホスホジエステラーゼ３Ｂを発現するヒト患者の腫瘍の治療に用いるための、ホスホジエステラーゼ阻害剤を含む組成物を提供する（この態様の組成物も、更なる上記成分を含む医薬組成物であってもよい）。好ましくは、ホスホジエステラーゼ阻害剤はホスホジエステラーゼ３酵素類の阻害剤である。ホスホジエステラーゼ阻害剤は、アナグレリド、ミルリノン、アムリノン、及びシロスタゾールなどの阻害剤からなる群より選ぶことができる。最も好ましくは、ホスホジエステラーゼ阻害剤はアナグレリド塩酸塩である。本発明のこの態様はまた、多剤併用療法用の組成物にも関するものである。本発明の多剤併用組成物は、ホスホジエステラーゼ阻害剤に加えて、イマチニブ、メシル酸イマチニブ、ニロチニブ、スニチニブ、マシチニブ、ドビチニブ、ポナチニブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、クレノラニブ、バタラニブ、及びレゴラフェニブなどの阻害剤からなる群より選ばれるチロシンキナーゼ阻害剤を含む。本発明の１つの態様の多剤併用組成物においては、ホスホジエステラーゼ阻害剤を含む組成物を、チロシンキナーゼ阻害剤、好ましくはイマチニブ又はメシル酸イマチニブを含む他の組成物と組み合わせて、同時投与又は順次投与の形で癌患者に投与することができる。
【００２７】
本発明はアナグレリド及びその他のホスホジエステラーゼ３阻害剤の更なる医療適用を開示するものである。したがって、本発明は、ヒト患者の固形腫瘍の治療用薬剤の製造のためのアナグレリド又はその塩の使用をも請求する。本発明は更に、ホスホジエステラーゼ阻害剤の、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、脂肪肉腫、及びＰＤＥ３タンパク質を発現する他の腫瘍の治療用薬剤の製造のための使用に関する。
【００２８】
本発明はまた、ホスホジエステラーゼ３タンパク質を発現するヒト患者の固形腫瘍の治療方法を教示し、該方法は、アナグレリド又はその塩を含む組成物の薬学的有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含むものである。他の態様において、本発明は、ＰＤＥ３Ａ及び／又はＰＤＥ３Ｂを発現するヒト患者の腫瘍の治療方法を教示し、該方法は、ホスホジエステラーゼ阻害剤を含む組成物の薬学的有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含むものである。本願明細書における「薬学的有効量」という用語は、ヒトにおける腫瘍（特にＰＤＥ３酵素類を発現する、ＧＩＳＴや脂肪肉腫などの腫瘍）の成長を有益程度抑制、具体的には好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは少なくとも５０％減少させるのに十分な量を意味する。
【００２９】
更なる態様において、本発明は、試験サンプル中のＰＤＥ３酵素類を発現する腫瘍に関連する悪性腫瘍を検出する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む方法を提供する。
（ａ）サンプルを、ＰＤＥ３Ａ酵素又はＰＤＥ３Ｂ酵素に特異的に結合する抗体と接触させ、但し該サンプルは、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、脂肪肉腫、又はＰＤＥ３Ａ及び／又はＰＤＥ３Ｂ酵素を発現する他の腫瘍を含む疑いのある組織から採取したものであり、
（ｂ）サンプルと抗体とを、免疫複合体形成に十分な時間と条件下でインキュベートし、
（ｃ）抗原と抗体の間の免疫複合体形成の有無を検出し、そして
（ｄ）免疫複合体形成の存在を悪性腫瘍の指標として、悪性腫瘍の有無を検出する。
【００３０】
タンパク質抗原（酵素など）の検出は公知技術の範囲内であり、以下の実施例や、たとえば、米国特許第８，４４９，８８５号を参照できる。
【００３１】
他の１つの態様において、本発明は、ＰＤＥ３Ａ酵素及び／又はＰＤＥ３Ｂ酵素を発現する腫瘍を有する患者がホスホジエステラーゼ３酵素類の阻害剤による治療に応答するか否かを検出・分析するための方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。
−該患者から得た腫瘍サンプル中のＰＤＥ３Ａ酵素及び／又はＰＤＥ３Ｂ酵素の発現レベルを定量し、そして、
−該患者の腫瘍サンプルが、組織学的に正常な対照組織サンプルよりもホスホジエステラーゼ３Ａ酵素及び／又はホスホジエステラーゼ３Ｂ酵素の高い発現レベルを示す場合には、該患者をホスホジエステラーゼ３酵素類の阻害剤による治療のために選抜する。
【００３２】
ＰＤＥ３Ａ酵素及び／又はＰＤＥ３Ｂ酵素の発現レベルは、以下の実施例や、たとえば、米国特許第８，５４６，５５２号を参照して定量することができる。
【００３３】
また、固形腫瘍（たとえば、ＧＩＳＴ、脂肪肉腫、又はＰＤＥ３Ａ及び／又はＰＤＥ３Ｂを発現する他の腫瘍）を有する疑いのある患者から得た組織サンプル中のＰＤＥ３Ａ ｍＲＮＡ及び／又はＰＤＥ３Ｂ ｍＲＮＡの発現レベルを、たとえばＰＣＲ法で定量し、そして、定量した発現レベルを、対応する健康なサンプル中の発現レベルと比較し、但し、ＰＤＥ３Ａ及び／又はＰＤＥ３Ｂの高い発現レベルの存在は悪性腫瘍の存在を示す、ことを含む方法を用いて、サンプル中の悪性腫瘍細胞を検出できることは明らかである。
【００３４】
本願明細書中に参照される刊行物及びその他の資料は、本発明の背景を説明するためのものであり、特に本発明の実施に関しての追加詳細を提供するためのものであり、参照により本願明細書に組み込まれるものである。以下に本発明を実施例により更に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３５】
材料と方法
組織材料
ホルマリンで固定されパラフィンに包埋された腫瘍組織サンプルを回収し同定した。組織サンプルの使用と分析についての許可は、フィンランド国立法医学局（the National Authority for Medico legal Affairs of Finland）と研究倫理審査委員会（Institutional Review Board）から得た。本研究においては、２００個を超えるＧＩＳＴを含めて、合計３６種類の組織学的癌及び７００個を超える腫瘍を分析した。
【００３６】
GeneSapiensデータベース
GeneSapiensデータベース（http://ist.genesapiens.org/）は、組織学的に正常なヒト組織サンプルと癌組織サンプルの両方からなる９７８３個の組織サンプルからの遺伝子発現データを含む（Kilpinen,S. 2008）。
【００３７】
免疫組織化学と組織マイクロアレイ
ホルマリンで固定されパラフィンに包埋された組織サンプルを、ＰＤＥ３ＡとＰＤＥ３Ｂの発現について分析した。５μｍの切片を切り出してSuperFrost（登録商標）+ スライド（Menzel-Glaser）に乗せた。切片からキシレンでパラフィンを取り除き、アルコールシリーズで水和した。１％過酸化水素を用いて内在性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。免疫組織化学のための抗原の回収を、オートクレーブを用いてクエン酸ナトリウム（０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ ６．０）中で行った（１２０℃で２分間）。ＰＤＥ３Ａ免疫染色のための第１抗体はポリクローナル ウサギ抗ＰＤＥ３Ａ抗体（希釈倍率  １：１００；米国、ミズーリ州、セントルイス、SIGMA製）を用い、ＰＤＥ３Ｂ免疫染色のための第１抗体はポリクローナル ウサギ抗ＰＤＥ３Ｂ抗体（希釈倍率  １：２０；米国、ミズーリ州、セントルイス、SIGMA製）を用いた。第１抗体を PowerVision 前抗体ブロッキング溶液で希釈して、室温で３０分間インキュベートした。第１抗体の結合は、BrightVision+ Histostaining キット（オランダ国、ダイフェン、Immunologic BV製）を製造者の使用説明書に従って用いて検出した。腫瘍細胞中の調べたタンパク質の発現を以下のように評価した。陰性（染色した腫瘍細胞中の１０％未満）又は陽性［弱い染色強度（＋）、中程度の染色強度（＋＋）、又は強い染色強度（＋＋＋）］。
【００３８】
ＰＤＥ３ＡとＰＤＥ３Ｂの遺伝子発現の定量
ｍＲＮＡを、High Pure RNA Paraffin kit（ドイツ国、マンハイム、Roche Diagnostics GmbH製）を用いてホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックから抽出するか、または、High Pure RNA Isolation Kit （Roche Diagnostics GmbH製）を用いてＧＩＳＴ細胞系から抽出した。ｍＲＮＡを、SuperScript（登録商標）VILO（商標）cDNA Synthesis Kit（アメリカ合衆国、カルフォルニア州、カールスバッド、Invitrogen製）を製造者の使用説明書に従って用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。
【００３９】
ＰＤＥ３ＡとＰＤＥ３Ｂの発現レベルを、７個のＧＩＳＴ、３２個の平滑筋肉腫組織サンプル、及びＧＩＳＴ細胞系から採取したサンプルから、加水分解プローブ（即ち、レポーター色素と消光色素で標識したハイブリダイゼーションプローブ）を用いるリアルタイムＰＣＲをLightCycler 480 instrument（Roche Diagnostics GmbH製）の中で行うことにより、定量した。ｃＤＮＡ（５０ｎｇ）を、LightCycler 480 Probes Master reagents（Roche Diagnostics GmbH製）と、Universal ProbeLibrary Set（Roche Diagnostics GmbH製）から取ったフルオレセイン標識ロックド核酸（ＬＮＡ）加水分解プローブ（ＰＤＥ３Ａ用にプローブ７９、及びＰＤＥ３Ｂ用にプローブ１０）又はLightCycler（登録商標）Yellow 555標識ＬＮＡ加水分解プローブ（ＰＤＥ３Ａ用にプローブＴＢＰ、及びＰＤＥ３Ｂ用にプローブＧ６ＰＤ）とを用いて、２０μＬのＰＣＲ混合物の中で増幅した。当該ＰＣＲ混合物は、１×ＰＣＲバッファー、１００ｎｍｏｌ／Ｌのプローブ、及び２００ｎｍｏｌ／Ｌの各プライマーを含んでいた。プライマーは、ＰＤＥ３Ａのコード領域に特異的なもの（フォワードプライマー: 5′-AAAGACAAGCTTGCTATTCCAAA-3′、配列番号１;リバースプライマー: 5′-GTGGAAGAAACTCGTCTCAACA-3′、配列番号２）、ＰＤＥ３Ｂのコード領域に特異的なもの（フォワードプライマー: 5′-AACAATGGTATAAGCCTCATTATCAA-3′、配列番号５;リバースプライマー: 5′-CGAGCCTCATTTAGCACTGA-3′、配列番号６）、参照ＤＮＡであるＴＢＰに特異的なもの（フォワードプライマー: 5′-TGAATCTTGGTTGTAAACTTGACC-3′、配列番号３;リバースプライマー: 5′-CTCATGATTACCGCAGCAAA-3′、配列番号４）、及び参照ＤＮＡであるＧ６ＰＤに特異的なもの（フォワードプライマー: 5′-GAGCCAGATGCACTTCGTG -3′、配列番号７;リバースプライマー: 5′-GGGCTTCTCCAGCTCAATC-3′、配列番号８）であった。プライマーとプローブとは、Universal ProbeLibrary（Roche Diagnostics GmbH製）のAssay Design CenterのProbeFinderプログラムを用いて設計した。
【００４０】
ＰＣＲのサイクルに関するパラメーターとしては、最初の変性を９５℃で１０分間行い、次に、９５℃で１５秒間の変性、６０℃で４５秒間のアニーリング、及び７２℃で４５秒間の伸長を６０サイクル行った。
【００４１】
細胞系
ＧＩＳＴ８８２は、Ｋ６４２Ｅ変異体ＫＩＴオンコプロテイン（Tuveson,D.A. 2001）をコードするＫＩＴエクソン１３にホモ接合型ミスセンス変異を有する主要ヒトＧＩＳＴ細胞系である。ＧＩＳＴ４８は、イマチニブ療法における最初の臨床応答の後に進行するＧＩＳＴから産生されるＧＩＳＴ細胞系である。ＧＩＳＴ４８は、主要なエクソン１１ミスセンス変異と二次的なエクソン１７ミスセンス変異とを有する（Bauer,S. 2006）。ＬＰＳ１４１は、患者由来の脱分化型脂肪肉腫から確立された脂肪肉腫細胞系である（Snyder, E.L. 2009）。細胞系は、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）と２％のペニシリン／ストレプトマイシンとを補ったRPMI 1640 培地（アメリカ合衆国、カルフォルニア州、GIBCO製）で培養した。
【００４２】
ＰＤＥ３阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＴＵＮＥＬアッセイ
４つの異なるＰＤＥ３阻害剤を、ＰＤＥ３酵素の活動を封止するために用い、２つの異なるキナーゼ阻害剤を、ＫＩＴ及びＰＤＧＦＲＡの活動を封止するために用いた。シロスタゾール、ミルリノン及びアムリノンをSigma（アメリカ合衆国、ミズーリ州、セントルイス）から購入し、アナグレリド塩酸塩をTocris Bioscience（英国、ブリストル）から購入した。イマチニブ及びニロチニブ（ＫＩＴ特異的阻害剤、Novartis製)をCayman Chemical Company（アメリカ合衆国、ミシガン州、アナーバー）から購入した。イマチニブは、水中で再構成した。他のすべての阻害剤は、ＤＭＳＯ中で再構成した。事前分析において、多数の異なる薬剤濃度（０〜１００μｍｏｌ／Ｌ）を用いて、ＧＩＳＴ細胞系におけるＰＤＥ３阻害剤の有効投与量を同定した。増殖への効果をxCELLigence System 及び RTCA DP instrument（アメリカ合衆国、カルフォルニア州、サンディエゴ、Acea Biosciences製）を用いて分析した。さらなる分析に用いた最終的な阻害剤濃度は、イマチニブ及びニロチニブについては０．５μｍｏｌ／Ｌであり、ＰＤＥ３阻害剤については１０μｍｏｌ／Ｌであった。アナグレリド塩酸塩による処理の後の細胞のアポトーシスへの進行を、Click-iT TUNEL Alexa Fluor 488 Imaging Assay（アメリカ合衆国、カルフォルニア州、カールスバッド、Invitrogen製）を製造者の使用説明書に従って用いて、８個のデュープリケート ウェルにおいて分析した。アポトーシスへの進行は、当該薬剤処理の４８時間後及び９６時間後に測定した。
【００４３】
細胞増殖
細胞増殖をＭＴＴアッセイ（アメリカ合衆国、インディアナ州、インディアナポリス、Roche Diagnostics製）と、RTCA DP instrumentを用いるxCELLigence System（Acea Biosciences製）によって調べた。ＭＴＴアッセイのために、ＧＩＳＴ８８２細胞を１．５×１０４個の細胞／ウェルの密度で植え付け、ＧＩＳＴ４８細胞を２．０×１０４個の細胞／ウェルの密度で植え付け、ＬＰＳ１４１細胞を５．０×１０３個の細胞／ウェルの密度で植え付けた。インキュベーションの最後に、８個のデュープリケート ウェルについて、各ウェルに１０μＬのＭＴＴ試薬を加えて３７℃で４時間インキュベートして、細胞増殖を分析した。プレートを、Multiscan EX Microplate photometer（アメリカ合衆国、イリノイ州、ロックフォード、Thermo Scientific製）を用いて波長５４０ｎｍで読み取った。xCELLigence増殖アッセイのために、ＧＩＳＴ４８細胞とＧＩＳＴ８８２細胞を２．５×１０４個の細胞／ウェルの密度で植え付けた。ＧＩＳＴ８８２細胞を植え付ける前に、Collagen I Rat Tail（アメリカ合衆国、カルフォルニア州、カールスバッド、Invitrogen製）を製造者の使用説明書に従って用いて、ウェルにコラーゲンの薄膜を形成し、最終コラーゲン濃度７．５μｇ／ｍＬとした。
【００４４】
統計解析
グループ間の差をクラスカル−ウォリス検定又はマン−ホイットニーのＵ検定により解析した。Ｐ値は両側検定したものである。
【００４５】
結果
GeneSapiensデータベース
GeneSapiensデータベース（http://ist.genesapiens.org/）を用いて、ホスホジエステラーゼ３Ａ酵素ｍＲＮＡとホスホジエステラーゼ３Ｂ酵素ｍＲＮＡは、他の種類の腫瘍よりもＧＩＳＴと脂肪肉腫において強く発現することを突きとめた。
【００４６】
癌組織におけるＰＤＥ３ＡとＰＤＥ３Ｂの発現
癌組織におけるＰＤＥ３の発現を８０５個の患者サンプルにおいて腫瘍組織マイクロアレイを用いて調べた。ＰＤＥ３Ａの発現を、ＧＩＳＴの９３％において検出し、脂肪肉腫の３３％において検出し、他の種類の腫瘍においても、しばしばではないが、検出した（表１）。ＧＩＳＴの大半においてＰＤＥ３Ａの免疫染色の強度は中度又は高度であった。ＧＩＳＴ以外の腫瘍の１１％未満がＰＤＥ３Ａの発現を示した。ＰＤＥ３Ｂの発現は、ＧＩＳＴの６６％及び脂肪肉腫の１９％で検出された。ＧＩＳＴ以外の腫瘍の４％がＰＤＥ３Ｂの発現を示した。調査したうちのＧＩＳＴ以外の腫瘍の内訳は、乳房の癌腫、前立腺の癌腫、卵巣の癌腫、結腸の癌腫、子宮の癌腫、膵臓の癌腫、肝臓の癌腫、膀胱の癌腫、腎臓の癌腫、肺の癌腫、及び胆管の癌腫；及び、神経膠腫、胚細胞腫瘍、肉腫、黒色腫、神経鞘腫、髄膜腫、リンパ上皮腫、神経芽細胞腫、及び膨大細胞腫である。
【００４７】
ＰＤＥ３の免疫染色の特異性は、ＰＤＥ３Ａ ｍＲＮＡとＰＤＥ３Ｂ ｍＲＮＡの発現をｑＰＣＲで測定して確認した。ＰＤＥ３Ａ ｍＲＮＡとＰＤＥ３Ｂ ｍＲＮＡは、７個の全てのＧＩＳＴ（１００％）において大量に発現していたが、平滑筋肉腫の組織サンプルの場合は少数のもののみにおいて大量に発現しており、免疫組織化学染色の結果を裏付けた。タンパク質の発現とｍＲＮＡの発現は統計的に有意な相関を示した（Ｐ＜０．００１）。
【００４８】
ＰＤＥ３阻害剤による処理
xCELLigence System 及び RTCA DP instrument（Acea Biosciences製）を用いて行った分析では、１０μｍｏｌ／Ｌ以上の濃度のアナグレリドとアムリノンは、ＧＩＳＴ細胞培養に対してはいくらかの抗増殖効果を示したが、シロスタゾールとミルリノンは細胞増殖に影響しなかった。ＰＤＥ３阻害剤の、ＬＰＳ１４１細胞系、ＧＩＳＴ８８２細胞系、及びＧＩＳＴ４８細胞系への効果をより詳細に調べるために、ＰＤＥ３阻害剤の最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌで細胞を９６時間培養し、増殖への薬剤効果をＭＴＴアッセイで測定し、ニロチニブ（０．５μｍｏｌ／Ｌ）の抗増殖効果と比較した。４日間の培養により、アナグレリド塩酸塩は、ＤＭＳＯと比較して、ＧＩＳＴ８８２細胞とＬＰＳ１４１細胞の増殖に影響する唯一のＰＤＥ３阻害剤であることが分かった。ＧＩＳＴ４８細胞の増殖に有意に影響するＰＤＥ３阻害剤はなかった（図１）。次に、アナグレリド塩酸塩（１０μｍｏｌ／Ｌ）をイマチニブ（０．５μｍｏｌ／Ｌ）による処理と組み合わせた場合の効果を、ＧＩＳＴ細胞系を用いて調べた。再び、４日間の培養により、ＧＩＳＴ８８２細胞系のみが影響を受け、薬剤の組み合わせは、細胞への相乗的な抗増殖効果を示した（図２）。
【００４９】
アナグレリド塩酸塩及びアナグレリド塩酸塩とイマチニブの組み合わせが腫瘍細胞のアポトーシスに与える効果を、ＴＵＮＥＬアッセイ（細胞核中の断片化ＤＮＡを検出する）により調べた。アナグレリド塩酸塩で処理したＧＩＳＴ８８２細胞の２２％が４８時間後にアポトーシスを示し、同４７％が９６時間後にアポトーシスを示した。ＧＩＳＴ４８細胞をアナグレリド塩酸塩で処理した場合は、細胞中にわずかなＤＮＡ断片化のみが観察された。アナグレリド塩酸塩による処理を開始して４８時間後にＧＩＳＴ４８細胞の０．６％がアポトーシスを示し、同１％が９６時間後にアポトーシスを示した。イマチニブによる処理を開始した４８時間後と９６時間後に、それぞれ、ＧＩＳＴ８８２細胞の２２％と１％がアポトーシスを示した。イマチニブにより処理したＧＩＳＴ４８細胞の４８時間後と９６時間後のアポトーシス率は、それぞれ、３４％と４０％であった。アナグレリド塩酸塩とイマチニブを組み合わせて用いると、両方のＧＩＳＴ細胞系において相乗効果が検出された。４８時間後と９６時間後に、それぞれ、ＧＩＳＴ８８２細胞の３２％と８６％、及び、ＧＩＳＴ４８細胞の３９％と４７％が、このアッセイにおいてアポトーシスを示した。
【００５０】
考察
現在の治療法の場合、多くのＧＩＳＴ患者の病状は進行する。いくつかのＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼの阻害剤であるメシル酸イマチニブは、進行したＧＩＳＴの進行を阻害する（Demetri,G.D. 2002）。大半のＧＩＳＴはＫＩＴ又はＰＤＧＦＲＡに発癌性の変異を有しており（Hirota,S. 1998; Heinrich,M.C. 2003）、これらがイマチニブ療法の主要なターゲットとされる。ＧＩＳＴの一部には、チロシンキナーゼ阻害剤への応答を欠くものや、しばしば二次変異によりチロシンキナーゼ阻害剤への耐性を生じるものがある。本発明においては、ＰＤＥ３ＡとＰＤＥ３Ｂが新たな有望な免疫マーカーであり、また、ＧＩＳＴ、脂肪肉腫、及びＰＤＥ３酵素類を発現する他の腫瘍の新たな治療ターゲットであることを示す。
【００５１】
GeneSapiensデータベースでのサーチによると、ＰＤＥ３Ａ ｍＲＮＡとＰＤＥ３Ｂ ｍＲＮＡの発現は、他の種類のヒト癌と比べて、ＧＩＳＴと脂肪肉腫において高い。同様に、臨床腫瘍組織サンプルにおいては、大半のＧＩＳＴがＰＤＥ３Ａタンパク質とＰＤＥ３Ｂタンパク質を発現し、一方、他の種類の腫瘍においてはそれよりも発現頻度が低い。ＰＤＥ３ＡはネズミＧＩＳＴモデル（KITK641Eマウス）の胃幽門洞で発現し、ＰＤＥ３Ａは、カハール介在細胞の遺伝子発現プロファイルとも関連付けられた（Gromova,P. 2009）（なお、カハール介在細胞はＧＩＳＴと前駆細胞が同じ可能性がある（Sircar,K. 1999）。）したがって、ＰＤＥ３Ａはカハール介在細胞とＧＩＳＴ細胞の両方の機能に重要な可能性がある。
【００５２】
ＰＤＥ３ＡとＰＤＥ３Ｂの大量発現は主にＧＩＳＴに見られたので、我々は、これらのタンパク質の発現と活性がＧＩＳＴ腫瘍細胞の生存に必須なのではないかとの仮説を立てた。アナグレリド塩酸塩でＰＤＥ３を阻害した結果、ＧＩＳＴ細胞の増殖はブロックされ、腫瘍細胞はアポトーシスを起こした。同様に、ＰＤＥ３の阻害により脂肪肉腫細胞の増殖は減少し、こうして、ＰＤＥ３Ａ及び／又はＰＤＥ３Ｂを発現する腫瘍は一般にＰＤＥ３阻害療法に適することが示された。
【００５３】
ＰＤＥ３ＡとＰＤＥ３Ｂは、ｃＡＭＰとｃＧＭＰの３'−ホスホエステル結合の加水分解を触媒して、ＡＭＰとＧＭＰを産生する酵素である（Beavo,J.A. 1995）。環状ヌクレオチド、特にｃＡＭＰは、多くの生理学的過程を制御する。ｃＡＭＰの最も重要な標的の１つがＰＫＡであり、ＰＫＡは、更に遺伝子発現を制御し、細胞中の多くの生理学的過程を制御する（Beavo,J.A. 2002）。適当な細胞内位置でのＰＤＥ４を触媒とする加水分解を通じてｃＡＭＰを恒常的に低レベルに維持していることが、化学耐性結腸直腸癌細胞系における細胞増殖率と細胞生存に関連付けられた（McEwan,D.G. 2007）。一部の腫瘍が恒常的にＰＤＥ３シグナル伝達をしており、細胞を恒常的に低いｃＡＭＰレベルにしておくことが細胞生存の制御に重要な因子の１つであり、この伝達経路への薬理学的影響が臨床的利点をもたらす、という可能性がある。細胞系におけるアナグレリド塩酸塩による処理の間に、ｃＡＭＰ特異的な他のホスホジエステラーゼ類の発現がＰＤＥ３ＡとＰＤＥ３Ｂの機能の喪失を補償する可能性がある。８つのホスホジエステラーゼ酵素ファミリーが細胞内でｃＡＭＰの活性を制御することが知られており、ｃＡＭＰに対する加水分解活性の大部分がＰＤＥ３ファミリーとＰＤＥ４ファミリーに起因する（Conti,M. 2007; McEwan,D.G. 2007）。アナグレリド塩酸塩は、両方のＧＩＳＴ細胞系においてイマチニブの効果を増強した。これは、阻害剤が標的細胞によって異なる細胞内シグナル伝達経路を標的とすることによるのかも知れない。したがって、アナグレリド塩酸塩と受容体チロシンキナーゼ阻害剤のＧＩＳＴへの相乗効果は、臨床においても見られることが期待される。
【００５４】
アナグレリドはＰＤＥ３を発現する腫瘍を治療するための有望な新規な方法である。アナグレリドはまた、チロシンキナーゼ阻害剤に応答しなくなったＧＩＳＴ患者又はＫＩＴやＰＤＧＦＲＡの遺伝子変異のないＧＩＳＴ患者を治療するための選択肢ともなる可能性がある。アナグレリドはまた、キナーゼ阻害剤との併用療法のための有望な薬剤である。
【００５５】
結論として、ＰＤＥ３ＡとＰＤＥ３ＢはＧＩＳＴの大半において発現しており、しばしば脂肪肉腫においても発現するが、他のヒト固形腫瘍においてはまれにしか発現しない。したがって、ＰＤＥ３ＡとＰＤＥ３ＢはＧＩＳＴと脂肪肉腫の新たなバイオマーカーであると考えられ、ＰＤＥ３を発現する腫瘍を、たとえば、免疫組織化学又は核酸増幅法により同定できる。ＰＤＥ３陽性の腫瘍は、ＰＤＥ３阻害剤の標的として機能し、特に、アポトーシスを誘導して腫瘍細胞の増殖を防止できるアナグレリドの標的として機能する。アナグレリドは、単独で又は他の薬剤と組み合わせて用いてＧＩＳＴを治療するための有望な新たな薬剤である。
【００５６】
【表１】
0006445573.tif 000002
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００５７】
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【図２】
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