(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査しようとする試料を配置することのできる試料面と、
照明光を放出するための光源と、
前記照明光を前記試料面内に伝達するための光学結像手段と、
前記照明光の光路および前記試料を互いに相対的に移動させて、前記試料に対する前記照明光の相対的な照明走査移動を生じさせる第１の走査手段と、
前記試料から到来する試料光を検出するための検出器手段と、
前記検出器手段によって検出された前記試料光に基づいて、前記試料の像を求める電子的手段と
を備える光学顕微鏡であって、
前記検出器手段を構成する特定の検出器要素および前記試料光を互いに相対的に移動させて、前記試料光に対する前記検出器要素の相対的な検出走査移動を生じさせる第２の走査手段が存在し、
前記電子的手段は、前記検出走査移動の移動方向が前記照明走査移動の移動方向と正反対になるように、前記第１および前記第２の走査手段を連動して制御する
ことを特徴とする光学顕微鏡。
【請求項２】
請求項１に記載の光学顕微鏡であって、
前記照明光のビーム偏光を、前記第１の走査手段を用いて調整して、前記照明走査移動を生み出すことができることを特徴とする光学顕微鏡。
【請求項３】
請求項１または２に記載の光学顕微鏡であって、
前記第１の走査手段を用いて、試料ホルダが前記照明光の光路に対して相対的に移動して、前記照明走査移動を生み出すことができることを特徴とする光学顕微鏡。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の光学顕微鏡であって、
前記試料光のビーム偏光を、前記第２の走査手段を用いて調整して、試料領域の像を前記検出器手段全体にわたって移動させることができることを特徴とする光学顕微鏡。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の光学顕微鏡であって、
前記第１および前記第２の走査手段が、合同走査手段を用いて形成され、
前記合同走査手段が走査ミラーを有し、照明光を前記走査ミラーの表側に伝達することができ、
前記照明走査移動と前記検出走査移動の間の方向を反対向きにするために、ビーム誘導手段が設けられ、それらが前記試料光を前記走査ミラーの裏側に誘導することができることを特徴とする光学顕微鏡。
【請求項６】
請求項５に記載の光学顕微鏡であって、
前記ビーム誘導手段を用いて、試料光を最初に前記走査ミラーの前記表側に伝達し、そこから前記走査ミラーの前記裏側に伝達することができ、
前記照明走査移動と前記検出走査移動の間の方向を逆にするために、前記走査ミラーの前記裏側によって反射された試料光を再度、前記走査ミラーの前記裏側に伝達することができることを特徴とする光学顕微鏡。
【請求項７】
請求項１、２、および４のいずれか一項に記載の光学顕微鏡であって、
ある特定の試料領域の像を前記検出器手段全体にわたって移動させるために、前記第２の走査手段が、試料ホルダを移動させるように適合されたことを特徴とする光学顕微鏡。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の光学顕微鏡であって、
ある特定の試料領域の像を前記検出器手段全体にわたって移動させるために、前記第２の走査手段が、前記検出器手段を移動させるように適合されたことを特徴とする光学顕微鏡。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の光学顕微鏡であって、
前記電子的手段は、前記第１及び前記第２の走査手段を、同一ステップ幅および／または同一速度値で制御することを特徴とする光学顕微鏡。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の光学顕微鏡であって、
前記検出器手段の隣接する検出器要素が、互いからある距離を隔てたところにあり、その距離が、前記試料面内の一点によって前記検出器手段上にもたらされるエアリーディスクよりも小さいことを特徴とする光学顕微鏡。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の光学顕微鏡であって、
試料の像を、前記光学的手段を用いて前記検出器手段の検出面上にもたらすことができ、前記像の寸法が、前記光学的手段の倍率によって与えられ、
前記検出面の長さおよび幅が、前記像の寸法の少なくとも２倍の大きさであることを特徴とする光学顕微鏡。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の光学顕微鏡であって、
前記顕微鏡が広視野顕微鏡であることを特徴とする光学顕微鏡。
【請求項１３】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の光学顕微鏡であって、
前記試料と前記第２走査手段の間に、共焦点絞りが配置されることを特徴とする光学顕微鏡。
【請求項１４】
顕微鏡の試料面内に配置された試料を検査するための顕微鏡観察方法において、
照明光が前記試料面内に伝達され、
前記照明光の光路および前記試料が互いに相対的に移動して、前記試料に対する前記照明光の相対的な照明走査移動を生じさせ、
前記試料から到来する試料光が検出器手段を用いて検出され、
前記試料の像が、前記検出された試料光に基づいて、電子的手段を用いて求められる
顕微鏡観察方法であって、
前記検出器手段を構成する特定の検出器要素および前記試料光を互いに相対的に移動させて、前記試料光に対する前記検出器要素の相対的な検出走査移動を生じさせ、
前記検出走査移動の移動方向が前記照明走査移動の移動方向と正反対になるように、前記照明走査移動および前記検出走査移動が連動して制御される
ことを特徴とする顕微鏡観察方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の顕微鏡観察方法であって、
照明走査移動および検出走査移動が、前記検出器手段の検出器要素の積分時間中に実施されることを特徴とする顕微鏡観察方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の顕微鏡観察方法であって、
試料像を記録するために、前記検出器要素が、受領した試料光信号を途切れることなく積分することを特徴とする顕微鏡観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１の前提部に記載の光学顕微鏡に関する。さらに、本発明は、光学顕微鏡において像を記録する方法と呼ぶこともできる、請求項１４の前提部に記載の顕微鏡観察方法に基づく。
【背景技術】
【０００２】
一般的な光学顕微鏡の目的は、試料面内に配置され、少なくとも１つの光源からの光によって照明された試料の像を記録することである。試料から到来する光が、検出手段を用いて記録されて、試料像を生成する。
【０００３】
この目的のために、一般的な光学顕微鏡は、検査しようとする試料を配置することのできる試料面と、照明光を放出するための光源と、照明光を試料面内に伝達するための光学結像手段と、照明光の光路および試料を互いに相対的に移動させて、試料に対する照明光の相対的な照明走査移動を生み出すことのできる、第１の走査手段と、試料から到来する試料光を検出するための検出器手段と、検出器手段によって試料のさまざまな領域で検出された試料光に基づいて、試料の像を生成するための電子的手段とを有する。試料のさまざまな領域の像を検出器手段のさまざまな領域上に形成するために、光学的手段を有用に設けることができる。
【０００４】
顕微鏡の試料面内に配置された試料を検査するための一般的な顕微鏡観察方法によれば、照明光が試料面内に伝達されること、照明光の光路および試料が互いに相対的に移動して、試料に対する照明光の相対的な照明走査移動を生み出すこと、ならびに試料から到来する試料光が検出器手段を用いて検出されることが実現される。それによって、さまざまな試料領域を、検出器手段のさまざまな検出器領域上に結像することができる。最後に、検出された試料光に基づく試料の像が、電子的手段を用いて生成される。
【０００５】
そのような光学顕微鏡および顕微鏡観察方法を用いて、可能な最高の解像度および良好な信号対雑音比を有する試料像を生成することが、基本的な目的である。
【０００６】
より高い解像度で試料を検査するために、構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）を使用することが十分に確立されている。それによって、照明光が構造化照明光として試料面内に伝達される。しかし、一般には、照明スポットまたは任意に形成された照明パターンを、試料面内にもたらすことができる。構造化照明光は、ビーム断面全体にわたって空間的に可変な強度分布を有する任意の光であると理解することができる。これには、断面全体にわたって周期的な強度分布、例えば照明されたラインと無照明のラインのある１次元ラインパターンを有する光が含まれる。
【０００７】
前述のタイプの光学顕微鏡が、レーザ走査顕微鏡として形成される場合、照明スポットまたはドットが照明パターンとしてもたらされる。これは、実質的に回折限界とすることができ、本開示では、構造化照明光の一形態と見なすこともできる。
【０００８】
構造化照明光を発生させるために、構造化照明光をもたらす光学構成要素が通常、光学顕微鏡の光路の、試料と光源の間に組み込まれる。一般に、構造化照明光の必要とされる柔軟性を達成するために、複数の光学構成要素が使用される。
【０００９】
光学構成要素は、多くの場合、格子である。それに関して、異なる格子配列および周期を有する格子が、概ね連続した試料像記録中に使用される。後続の像データの処理に従って、試料の像がより高い解像度を伴って生成される。より高い解像度とは、広視野解像度と比較してという意味で言っているものである。
【００１０】
本方法を用いて達成することのできるより高い解像度は、従来の広視野像の記録に比べてかなり大きな利点となるが、レーザ走査顕微鏡像に比べてもかなり大きな利点となる。
【００１１】
前述の照明スポットの形をとる構造化照明の変形形態は、レーザ走査顕微鏡で使用される。この形式の光学顕微鏡では、より高い解像度が、いわゆるピンホールを検出器の上流に配置することによって達成される。ピンホールは、回折限界よりも明らかに小さな、例えば１／４エアリーユニット（ＡＵ）以下の大きさを有する。これは、共焦点レーザ走査顕微鏡（ＬＳＭ：ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）と呼ばれる。ＬＳＭでは、ピンホール空間フィルタリングによって、良好な共焦性がもたらされる。
【００１２】
エアリーユニットは、回折限界の照明スポットの最初の零点によって定義され、光学文献において確立された用語である。したがって、エアリーは、試料面内の一点によって生じる回折ディスクの、像面内での広がりである。この広がりは、回折ディスクの最初の零点相互間の部分と定義することができる。
【００１３】
より高い解像度を達成するための本方法では、乏しい信号対雑音比が、レーザ走査顕微鏡にとって大いに不都合となる。乏しい信号対雑音比は、試料から到来する検出光子の数が少ないことから生じる。これにより、実際には、解像度の向上が不可能となる。
【００１４】
レーザ走査顕微鏡において解像度を高める方法は、「Ｏｐｔｉｋ  ８０」、第２号、５３（１９８８）に掲載された、コリン  シェパードらによる「Ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ」という文献に遡る。これによって、レーザ走査顕微鏡の解像度は高まり、それと同時に信号対雑音比もより良好になる。これに関連して、約１エアリーユニットの、より大きなピンホール径が使用されている。それにより、より多数の検出可能な光子がもたらされる。さらに、サブエアリーの空間分解検出が使用されている。像の記録後、データの仕分けおよび計算が、特別なアルゴリズムを用いて実施される。それにより、試料像のより高い解像度がもたらされる。
【００１５】
この方法を、図１を参照してより詳細に説明する。図１は、試料面のＸ軸に沿った試料を概略的に示す。試料は、蛍光物体４２を含む。さらに、照明スポット４４が示されている。Ｙ軸上には、照明スポット４４の強度Ｉが示されている。照明スポット４４の寸法は、回折限界とすることができ、Ｘ方向において物体４２よりも大きい。照明スポット４４が物体４２と接触する場合、物体４２は刺激されて蛍光を発し、試料光を放出し、それを検出器手段によって検出することができる。
【００１６】
図１はさらに、試料面内のそのような検出器手段６０の像を示す。検出器手段６０は、複数の検出器要素６１を備える。試料面が全体的に照明される場合、それに応じて、物体４２からの試料光は主として検出器要素６１Ａによって測定される。
【００１７】
しかし、検出器要素６１は、試料面の一点から到来する試料光を受領するだけではない。そうではなく、広がった受領領域が各検出器要素上に結像され、前記受領領域は、像のＰＳＦ（点広がり関数：Ｐｏｉｎｔ  Ｓｐｒｅａｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）によって決まる。ある検出器要素６１に関するＰＳＦは、例えば、図示の照明スポットの形をとることができ、対応する検出器要素６１を中心とするものである。照明スポット４４の寸法も、点光源のＰＳＦによって決まり得る。
【００１８】
ある特定の検出器要素について測定される光強度は、照明スポット４４に関係するＰＳＦとその検出器要素に関係するＰＳＦとの積である、総ＰＳＦによって決まる。総ＰＳＦの最大値は、照明スポット４４とそれぞれの検出器要素のほぼ中間に位置し得る。図示の実施形態では、照明スポット４４は、位置４４Ｄを中心とする。検出器要素６１Ｄは、この場合には主として４４Ｄと６１Ｄの中間にある位置から、光を受領する。これは位置６１Ａであり、そこには物体４２がある。一方、検出器要素６１Ｄは、位置６１Ｄからの光をほとんど測定しない。
【００１９】
試料を走査するために、照明スポットが４４Ｄから例えば位置４４Ｂに変位する。検出器要素６１Ｄはこのとき、主として位置６１Ａからの光をもはや測定せず、その代わりに６１Ｂからの光を測定する。
【００２０】
この事実を使用して、解像度を高めることができる。これに関連して、検出器要素６１は、照明スポット４４の各位置で読み取られる。それによって測定される試料光信号が、照明スポット４４の位置に応じて、さまざまな試料領域に割り当てられる。すなわち、全く同一の検出器要素によって測定された試料光信号が、照明スポット４４の位置に応じて仕分けられることになる。
【００２１】
この仕分けは、曲線矢印によって示されている。したがって、照明スポットが地点４４Ｄにある場合、検出器要素６１Ｄの信号が物体４２の位置に割り当てられる。同様に、照明スポットが地点４４Ｃにあるとき、検出器要素６１Ｃの信号が物体４２の位置に割り当てられ、照明スポットが地点４４Ｂにあるとき、検出器要素６１Ｂの信号が物体４２の位置に割り当てられる。
【００２２】
このようにして、解像度の向上を達成することが確かに可能である。しかし、この仕分けを達成するには、高水準の装置が必要になる。さらに、仕分けを計算するのに必要な時間が比較的長い。
【００２３】
時間の使用は、例えばＣＣＤチップなどの高感度の広視野検出器が使用される場合に、特に多くなる。その読取り速度が比較的小さいことにより、試料を検査するのに必要な時間が増加する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】「Ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ」，コリン  シェパード等，「Ｏｐｔｉｋ  ８０」，第２号，５３（１９８８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
短い測定時間で可能な最大の測定解像度をコスト効果の高い形で達成できるようにする、光学顕微鏡および顕微鏡観察方法を提供することを、本発明の目的と見なすことができる。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
この目的は、請求項１に記載の特徴を有する光学顕微鏡、および請求項１４に記載の特徴を有する顕微鏡観察方法によって達成される。
【００２７】
本発明による方法および本発明による光学顕微鏡の好ましい諸実施形態は、従属クレームの主題であり、以下の記載の中で、特に図面と関連付けてこれを説明する。
【００２８】
前述のタイプの光学顕微鏡は、本発明によれば、ある特定の検出器要素上に結像することのできる試料領域を調整して、検出器要素の受領領域の検出走査移動を試料面内で試料に対して相対的に生み出すことのできる、第２の走査手段が存在すること、ならびに電子的手段が、第１および第２の走査手段を、互いに応じた形で、かつ検出走査移動の瞬間的な方向が照明走査移動の瞬間的な方向とは逆向きになるように、制御するように適合されたことを特徴とする。
【００２９】
前述のタイプの顕微鏡観察方法は、本発明によれば、ある特定の検出器要素上に結像される試料領域が調整される限りにおいて、検出器要素の受領領域の検出走査移動が、試料面内で試料に対して相対的に生み出されること、ならびに照明走査移動および検出走査移動が、互いに応じた形で、かつ検出走査移動の瞬間的な方向および照明走査移動の瞬間的な方向が互いに逆向き（ｃｏｕｎｔｅｒ）、すなわち反対向き（ｏｐｐｏｓｉｔｅ）になるように、制御されることを特徴とする。本発明による顕微鏡観察方法は、好ましくは、本発明による顕微鏡を用いて実施される。
【００３０】
本発明の中心となる思想は、照明走査移動中に、検出器手段に対して試料像の固定位置を維持しないことと考えることができる。その代わりに、第２の走査手段を用いて検出走査移動、すなわち検出器手段と検出器手段上への試料領域の結像との間の相対移動が実施される。この相対移動について、原理上は、試料の移動、検出器手段の移動、または検出器手段上に試料の像をもたらす結像手段の移動を行うことができる。
【００３１】
ある特定の検出器領域が主としてそこから光を受領する試料領域は、試料に対する照明パターンまたは照明スポットの位置によって変わる。これについては、図１を参照してより詳細に説明した。照明走査移動によって、試料に対して照明パターンが変位する。それによって、ある特定の検出器要素が主としてそこから光を受領する試料領域も変位する。
【００３２】
基本的な利点として、検出走査移動によって、ある特定の検出器要素が主として常に同じ試料領域から光を受領することを確実にすることができる。この目的のために、検出走査移動は、照明走査移動と同時に実施される。
【００３３】
さらに、検出走査移動の方向が重要である。一般には、初めに照明パターンが第１の試料領域上に放射され、第３の試料領域が、ある特定の検出器要素上に結像される。それによって、第１および第３の試料領域は、互いに異なっても、部分的に重なり合っても、同一でもよい。照明走査移動によって、次に、照明パターンが第１の試料領域から第２の試料領域に移動する。検出走査移動に基づいて、第４の試料領域が前述の検出器要素上に結像される。本発明によれば、第３の試料領域から第４の試料領域に向かう方向は、第１の試料領域から第２の試料領域に向かう方向とは逆向きである。
【００３４】
図１を参照して説明したように、ある特定の検出器要素によって受領される光強度は、その受領領域、すなわち検出器要素上に結像される試料領域、だけによって変わるのではない。そうではなく、光強度は、照明試料の位置によっても変わる。検出器要素がそれに基づいて光を受領する総ＰＳＦは、照明のＰＳＦ、および像面と検出器の間のＰＳＦによって変わる。逆方向の検出走査移動によって、ある特定の検出器要素に関する総ＰＳＦの位置が、試料に対して変わらないままとなることを確実にすることができる。したがって、検出器要素は、常に同じ試料領域から光を受領する。
【００３５】
これによって、特定の利点は、もはや、全く同一の検出器要素の測定信号を、照明パターンの位置に応じてさまざまな試料領域に割り当てる必要がないということである。それによって、試料像を記録するのに必要な装置要件および時間が低減される。
【００３６】
本発明の別の基本的な利点は、単一の生の像がより高い解像度を、良好な信号対雑音比によって、焦点外の試料光の低減によって、また必要な計算なしで、すでに有していることである。
【００３７】
光源は、原理上は、どんなタイプのものでもよく、好ましくは、１つ以上のレーザを備える。照明光は、例えば、照明スポットとして試料面内に透過させることができる。例えば格子パターンや複数の照明スポットからなるパターンなど、他の照明パターンも可能である。照明光によって、試料は、試料光と呼ばれる光を放出することができる。試料光は、反射照明光でもよく、発光光、すなわち蛍光または燐光でもよい。試料光は、空間分解能を得るために隣合せに配列された複数の検出器要素を有する検出器手段によって検出される。検出器領域は、複数の隣接する検出器要素と見なすことができる。それらは、１つ以上のカメラチップによって形成することができる。検出された光信号から、制御ユニットまたは制御手段の一部であってよい電子的手段を用いて、試料像を求めることができる。
【００３８】
照明走査移動は、試料面内の照明パターンと試料の間の相対移動である。照明走査移動の方向指示は、照明パターンが試料に対して移動する方向によって定めることができる。それに関して、照明走査移動は、連続または不連続に行うことができる。不連続照明走査移動の場合、異なるように次々に配置される格子を試料面内に結像することができる。
【００３９】
検出走査移動は、試料面内のある特定の検出器要素の受領領域と試料との間の相対移動である。受領領域は、関連する検出器要素がそこから光を受領する試料面内の領域である。受領領域は、試料面と像面の間の像のＰＳＦによって、また関連する検出器要素の寸法によって決まる。受領領域は、試料面内の関連する検出器要素の像と解釈することもできる。検出走査移動の方向指示は、ある特定の検出器要素の受領領域が試料に対して相対的に移動する方向によって定めることができる。
【００４０】
試料面内で検出器要素の受領領域が照明パターンとは逆向きに移動するとき、照明走査移動と検出走査移動は互いに逆向きである。
【００４１】
連続照明走査移動および連続検出走査移動の場合、それらは、互いに相対的な逆向きの移動を達成するために同時に行われる。しかし、照明走査移動は不連続に行われてもよい。それによって、照明パターンが試料面内に所定の時間にわたってもたらされる。その直後、または照明中断期間後に、異なるまたは類似の照明パターンが、試料面内の異なる地点に所定の時間にわたってもたらされる。このようにして、全ての試料領域を次々に走査することができる。これによって、検出走査移動は、照明パターンの空間的再配置と同時に行うことができる。しかし、別法として、検出走査移動は、照明中断期間中に実施される限り、第１の走査手段による再配置後に行うこともできる。
【００４２】
照明走査移動の推移は、どんな所与の形状を有してもよい。照明スポットの場合、例えば、ジグザグ移動を行うことができる。例えば格子によってもたらすことのできる、照明パターンとしてのラインの場合、照明走査移動は、ラインの方向に対して横方向に、特に垂直方向に、直線的な移動とすることができる。したがって、検出走査移動は、照明走査移動の瞬間的な方向に応じて選択され、やはりジグザグ形状のまたは直線的な推移を有することができる。
【００４３】
第１の走査手段による相対移動は、原理上は、光源を移動させることによって、照明光の経路を変更することによって、または試料を変位させることによって、行うことができる。好ましくは、照明光のビーム偏光を、第１の走査手段を用いて設定して、照明走査移動を生み出すことができる。これに対する時間的な要求は、有利なことには特に少ない。ビーム偏光は、好ましくは、例えば検流計または微小電気機械システム（ＭＥＭＳ：ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍ）によって駆動される走査ミラーを介して行われる。あるいは、圧電アクチュエータも調整に適している。走査ミラーの代わりに、光透過性板の傾斜または屈折くさびの位置を変更してもよい。さらに、ビーム偏光は、音響光学デバイスによって短時間に変更することもできる。
【００４４】
好ましい一代替手段によれば、第１の走査手段を用いて、試料ホルダが照明光の光路に対して相対的に移動して、照明走査移動を生み出すことができる。必要な導入資源は、有利なことには少なく、光源と試料面の間の光路内への介在は不要である。
【００４５】
検出走査移動は相対移動であり、これに関しては、試料の検出器に対して相対的な移動、検出器の試料に対して相対的な移動、または試料光の調整可能なビーム偏光が可能である。
【００４６】
試料光のビーム偏光を、好ましくは、第２の走査手段を用いて調整して、試料領域の像を検出器手段全体にわたって移動させることができる。それに関して、ビーム偏光は、照明光のビーム偏光に関して説明した方法のうちの１つで行うことができる。
【００４７】
あるいは、ある特定の試料領域の像を検出器手段全体にわたって移動させるために、第２の走査手段を、試料ホルダおよび／または検出器手段を移動させるように適合することもできる。検出器手段を変位させる場合、光源から試料面に至る光路は、有利なことには、そのような移動によって影響を受けないことが可能である。
【００４８】
第１および第２の走査手段が、合同走査手段を用いて形成される場合、特に好ましい。合同走査手段は、走査ミラーを有することができ、照明光を走査ミラーの表側に伝達することができる。照明走査移動と検出走査移動の間の方向を逆にするために、ビーム誘導手段を設けることができ、それを用いて、試料光を走査ミラーの裏側に伝達することができる。走査ミラーが回転すると、表側の反射方向の変化が、裏側の反射方向の変化とは逆になる。これによって、それほどコストのかからない構成要素が、有利なことには必要となる。さらに、省スペースの実施形態が原理上可能である。
【００４９】
前述の変形形態では、ビーム誘導手段を用いて、試料光を最初に走査ミラーの表側に伝達し、そこから走査ミラーの裏側に伝達することができる場合、比較的単純なビーム誘導が可能である。照明走査移動と検出走査移動の間の方向を逆にするために、走査ミラーの裏側から反射された試料光を再度、走査ミラーの裏側に伝達することができる。
【００５０】
原理上は、照明走査移動および検出走査移動が互いに逆向きになり次第、像の品質の向上はすでに達成することができている。しかし、電子的手段が、照明走査移動および検出走査移動を、一致する刻み幅および／または速度で実施するように適合される場合、特に著しい向上が達成される。これらは、試料面内での観察に基づいて一致すべきである。すなわち、試料面内での照明パターンの移動は、試料面内での検出器要素の受領領域の移動と等しい大きさまたは速度のものとすべきである。不連続照明の場合、刻み幅は、相次ぐ２つの照明パターン間のオフセットを表す。連続照明の場合、照明の変化を速度と言い表すのが便利である。
【００５１】
検出走査移動のために検出器手段が移動する場合、その速度または刻み幅は、試料領域を検出器手段上に結像することのできる倍率の分だけより大きい。
【００５２】
電子的手段は、両刻み幅および／または両速度を、互いに異なるように、かつ光源と試料面の間のＰＳＦおよび試料面と検出器手段の間のＰＳＦに応じて、選択するように適合することもできる。
【００５３】
本発明による光学顕微鏡、および本発明による顕微鏡観察方法によって、特に高い解像度を達成することができる。この目的のために、隣接する検出器要素が、試料面内の一点によって検出器手段上にもたらされるエアリーディスクよりも小さな、互いからの距離を有すべきであることが特に好ましい。それに関して、エアリーディスクは、前述のように、像面内の試料点の像の最初の強度最小値相互間の部分と定義することができる。したがって、本発明による解像度の増加は、試料面内で少なくとも４つの検出器要素の受領領域が互いに一部重なり合う場合に、特に確実である。この場合、検出器要素は、サブエアリー検出器要素と呼ぶこともできる。
【００５４】
試料の像は、光学的手段を用いて検出器手段の検出面上にもたらすことができ、像の寸法は、光学的手段の倍率によって与えられる。それに関して、試料の像は、ある時点で光学的手段によって結像することのできる試料面内の領域全体の像であると理解されたい。検出器走査移動がない場合、検出面は十分であり、検出面は、試料面の再現可能な領域に比べて、試料面と像面の間の倍率の分だけ大きい。しかし、検出器走査移動によって、必要な検出面はより大きくなる。検出面の長さおよび／または幅は、好ましくは、像の寸法の少なくとも２倍の大きさ、すなわち、検査しようとする試料領域の少なくとも２倍の大きさに倍率を乗じた積とすることができる。この２倍の大きさから、試料および検出器走査移動の刻み幅および／または速度が、好ましくは、等しい値であり、互いに逆向きであることが考慮される。
【００５５】
顕微鏡が広視野顕微鏡である場合に、特定の利点が達成される。この場合、特に、照明走査移動によって一部分ずつ照明される検査しようとする試料領域全体を、検出器手段上に常に結像することが可能である。
【００５６】
あるいは、光検出経路内、すなわち試料面と検出器手段の間の光路内に、共焦点または準共焦点フィルタリング用の絞りがあってよい。準共焦点フィルタリングの場合、絞りは、１エアリーユニットから２エアリーユニットの間の大きさのある開口を有することができる。
【００５７】
本発明による顕微鏡観察方法の好ましい一変形形態によれば、照明走査移動および検出走査移動が、検出器手段の検出器要素の積分時間中に実施される。したがって、照明パターンおよび検出器要素の受領領域を試料面内で位置変更する場合、検出器要素の積分の中断はない。中断は、説明した逆向きの移動に基づいて省くことができる。検出器要素の測定も、照明パターンおよび検出器要素の受領領域の位置変更の間に継続される。これによって、所要時間および／または信号対雑音比を改善することができる。
【００５８】
試料像を記録するために、検出器要素は、受領した試料光信号を連続して積分することができる。すなわち、各検出器要素は、試料像を生成するために１回だけ読み取られる必要がある。図１に関して上述した、照明スポットの各位置について検出器要素を読み取る必要がある方法に比べて大幅な単純化が、これに関連して起こる。
【００５９】
本発明による方法のさらに有利な変形形態は、本発明による光学顕微鏡の実施形態の動作を完全に遂行する。さらに、電子的手段は、好ましくは、上述した方法の変形形態を自動実行するように適合される。
【００６０】
本発明は、像生成方法と呼ぶこともでき、その方法では、試料の構造化照明（スポット、ライン）と検出の間で相対移動が行われ、その方式は、第１の相対移動が構造化照明と試料の間で行われ、第２の相対移動が検出と試料の間で行われ、第１の相対移動が、第２の相対移動と同時に、かつ好ましくは第２の相対移動とは逆向きに行われるようなものである。
【００６１】
したがって、試料に対する照明スポットの相対的な第１の相対移動、および試料に対するサブエアリー検出器要素から構成される検出手段の相対的な第２の相対移動が、第１の相対移動および第２の相対移動が互いに逆向きに、かつ互いに同時に起こるように行われることを実現することができる（特に図２を参照されたい）。
【００６２】
本方法の一実施形態によれば、この相対移動により、試料が光学顕微鏡の試料面内で照明スポットと同様に移動することが可能になる。それによって、試料の移動は、試料面内の照明スポットの方向と同じ方向に、ただし、好ましくは、移動中の試料面内の照明スポットの単に半分の刻み幅および／または半分の速度で行われる。試料面内の検出手段およびその像は、好ましくは、本実施形態では移動しない。
【００６３】
したがって、この場合、検出手段が試料面内に留まり、試料および構造化照明の移動が行われ、試料面内の試料は常に、試料面内の構造化照明と同じ方向に移動する、ということが実現される。試料は、好ましくは、構造化照明の半分の刻み幅および／または半分の速度、あるいは構造化照明の刻み幅および／または速度で移動する。
【００６４】
本方法の別の実施形態によれば、照明スポットが試料面内に留まり、試料および検出手段またはその像が、試料面内で移動する。それによって、試料の移動は、試料面内の検出手段の像の方向と同じ方向に、ただし、好ましくは、移動中の試料面内の検出手段の像の単に半分の刻み幅および／または半分の速度で行われる。
【００６５】
したがって、本実施形態では、構造化照明が試料面内に留まること、ならびに試料および検出の移動が行われることが実現される。それによって、試料は常に、試料面内の検出手段と同じ方向に、すなわち試料面内の検出手段の像のように、移動する。試料は、好ましくは、試料面内の検出器または検出手段の像の半分の刻み幅および／または半分の速度、あるいは試料面内の検出器または検出手段の像の刻み幅および／または速度で移動する。
【００６６】
本方法の技術的に好ましい一実施形態によれば、試料が光学顕微鏡の試料面内に留まり、試料面内の検出手段またはその像が反対方向に、好ましくは、照明スポットが試料面内で移動する刻み幅および／または速度に等しい刻み幅および／または等しい速度で移動する。検出手段が移動する場合、検出手段は、検出面内での試料面の倍率に比例した距離だけ実際に移動する。
【００６７】
したがって、特に、試料が試料面内に留まり、検出および構造化照明の移動が行われることが実現される。試料面内の検出手段の像が、試料面内の構造化照明とは常に逆向きの、かつ試料面内の構造化照明と同時の移動を実施することが好ましく、その刻み幅および／または速度は、好ましくは等しい値である。
【００６８】
構造化照明に対する試料面内の検出手段またはその像の相対的な正反対の、すなわち逆向きの移動は、検出手段自体が移動すること（すでに述べてある）によって実施することができる。
【００６９】
あるいは、別の１Ｄまたは２Ｄ走査手段を設けることもできる。構造化照明に対する試料面内の検出手段のまたはその像の相対的な正反対の相対移動を、光検出経路内の別の検流計および／またはＭＥＭＳ走査手段によって実施することができる。
【００７０】
さらに、少なくとも１つの軸を中心に傾動させることのできる平行平面（ガラス）板、または少なくとも１つの変位可能なくさび形（ガラス）基体を、検出手段の上流のカラービームスプリッタによって色分割した後の光検出経路に、追加で導入することもできる。
【００７１】
したがって、構造化照明に対する試料面内の検出手段またはその像の相対的な正反対の移動が、光検出経路内の、少なくとも１つの軸を中心に傾動させることのできる平行平面ガラス板、または少なくとも１つの変位可能なくさび形ガラス基体によって実施されることを実現することができる。
【００７２】
本方法は、従来どおりの意味の照明スポットでだけ機能するわけではなく、任意のタイプの構造化照明で解像度の向上をもたらすこともできる。構造化照明の別の形態は、例えば、マルチスポット照明構成、ライン、マルチライン（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｌｉｎｅ）照明構成である。ライン照明の場合、ラインに対して垂直方向に解像度が向上する。しかし、構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）と同じように、後にラインを試料に対して回転させ、したがって別の方向において解像度の向上を得ることも可能である。
【００７３】
本方法の好ましい一実施形態に関する必要要件は、制御ユニットが、構造化照明、試料、および検出手段の必要な相対移動の同期を、本発明に従った形で実施するということである。
【００７４】
構造化照明に対する像面内の検出手段またはその像の相対的な正反対の移動は、本発明によれば、図中で参照番号２０が与えられた走査手段を、試料光が３回、すなわちカラービームスプリッタによって色分割する前に１回、また色分割した後に検出手段の方向に２回通過するという点において構成することもできる。それによって、試料光は照明光よりも２回多く走査手段を通る。その結果、色分割の前に走査手段によって導入される光軸の角度変化が、走査手段を単純に通る場合のように単に補償されるのではなく、その代わりに過補償される。したがって、光軸は、検出手段上で静止するのではなく、その代わりに検出手段の上を半分の長さだけ移動し、それにより、照明スポットによってもたらされた試料光が移動する。したがって、本方法に必要な、試料と、構造化照明と、検出手段との間の前述の相対移動が達成される。図中に参照番号５０で示す第２の走査手段は、本実施形態では省くことができる。それによって、追加の走査手段の移動の同期が、有利なことには不要になる。
【００７５】
試料光が走査手段２０を１回だけ通り、その後検出される場合、これはデスキャン（ｄｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ）検出と呼ばれる。試料光が走査手段２０を１回通り、少なくとももう１つの走査手段５０を１回通る場合、いわゆるリスキャン（ｒｅ−ｓｃａｎ）を指す。走査手段５０が走査手段２０である場合、本方法が機能するために、試料光は、走査手段２０を最初に通過した後に、走査手段２０を２回通らなければならない。
【００７６】
好ましい一実施形態によれば、顕微鏡は、走査手段２０および／または第２の走査手段５０によって試料光をリスキャンするための手段を備える。
【００７７】
走査手段は、試料光の検出中に移動する格子であってもよく、結果として得られる、試料面内で移動する構造化ライン照明であってもよい。
【００７８】
例えば光検出経路内の平行平面板や走査手段５０など、本発明による検出手段の相対移動に関する前述の実施形態は、走査手段５０の実施形態と解釈することができる。
【００７９】
本発明による方法の特定の一変形形態によれば、検出手段、例えばカメラチップが、走査時間または露出時間中ずっと積分される。検出手段またはその一部の中間的な読取りも、構造化照明パターンの生成も必要ない。
【００８０】
したがって、本発明による方法の別の一実施形態は、検出器要素に割り当てられた試料の各試料点が、試料の走査中ずっと、照明スポットと検出器要素の中間に位置付けられるという点において提供される。割当ては、走査過程の開始時に行われる。ある検出器要素に割り当てられた試料点は、照明スポットとその検出器要素の間にある。
【００８１】
本発明による方法が使用できるのは、光学顕微鏡観察の分野においてだけではない。試料の走査が、回折の影響を受ける結像系内で、波の特性を有するプローブを用いて構造化された形で実施され、また試料応答、したがって試料信号の部分構造（ｓｕｂ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）が、回折限界未満で明確に空間分解されて検出される場合、本方法は常に、より高い解像度を伴う像をもたらす。すなわち、本方法は、例えば電子顕微鏡観察で使用することもできる。
【００８２】
材料顕微鏡観察、特に形状測定においては、試料の位相関数が求められるという点について触れておく。したがって、本方法が応用される場合、位相敏感検波を実施しなければならない。これには、例えば干渉計測法が特に適しており、本発明に従って必要とされる検出のタイプにこれを統合しなければならない。干渉計測法の単独の実施は、ミロー対物レンズによって行うことができる。参照波は、対物レンズ自体において生成される。
【００８３】
説明した方法は、特に有利なことには、以下の超解像法のうちの１つ以上と組み合わせることができる。
【００８４】
１．ＳＴＥＤ／ＲＥＳＯＬＦＴ
ＳＴＥＤ（誘導放出抑制）やＲＥＳＯＬＦＴ（可逆的飽和性光学蛍光遷移）などの方法に、その最も多様な構成（ｇ−ＳＴＥＤ、ｃｗ−ＳＴＥＤなど）で適用されるＰＳＦの操作は、検出器の走査周波数が適切（最終的な解像度に対してナイキスト）である場合、大幅に変更せずに、説明した方法と直接組み合わせることができる。説明した相対移動、および検出器の積分時間との同期が、それに応じて適合されるにすぎない。ここで説明した方法に勝る解像度の増加が、さらなる光子バジェット（ｐｈｏｔｏｎ  ｂｕｄｇｅｔ）なしで大幅にもたらされるため、この組合せは生細胞のイメージングに特に有利である。さまざまな検出器要素のさらなる暗雑音および読出し雑音が、これに追加されるにすぎない。しかし、検出器を適切に選択する場合、この追加は、例えば光子計数モードにおいて大いに低減することができる。
【００８５】
２．ＳＯＦＩ
その内容を本願に、それを引用して完全に援用するＤＥ  １０  ２０１１  ０７７  ２６９に記載されているように、ＳＲ法は、ＳＯＦＩ（超解像光ゆらぎイメージング：ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ）と効率的に組み合わせることができる。この場合、すでに論じた利点の他に、計算がもっぱらＳＯＦＩに基づいたままであり続けるという点がさらに加わる。すなわち、単純であることに加えて、計算時間が大幅に低減される。
【００８６】
３．ＮＳＩＭ
ここで説明した方法は、ＮＳＩＭに関連する非線形モードも許容し、この非線形モードは、スイッチング色分子（ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｃｏｌｏｕｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）または色の飽和によって、より高い周波数の構造化照明を効率的に形成するものである。
【００８７】
像記録速度を上げるために、本発明による方法は、マルチスポット照明を用いて構成することができる。その場合、試料点と検出器要素の間の明確な割当てが、検出器要素が１つ以上の別の照明スポットの影響範囲に入ることによって失われないことを確実にすべきである。すなわち、その場合、像領域内にギャップを作り出さなければならず、そうしたギャップに接近する試料の別の像は、後で記録しなければならない。そうしないと、試料の互いに離れた（ｄｉｓｐｌａｃｅｄ）複数の像が合計されて像を形成する。この特徴は、他のタイプの構造化照明にも、したがって例えばマルチライン照明にも、当てはまる。
【００８８】
本方法の好ましい一実施形態によれば、準共焦点フィルタリングを、少なくとも、色分割した後の光検出経路内に追加することが実現される。共焦点絞り径は、好ましくは、１〜２エアリーユニットである。径が１エアリーユニット未満の共焦点絞りの場合、信号対雑音比が下がる。共焦点絞りの径が大きいと（＞２エアリーユニット）、厚い試料の場合には、検出信号に含まれる焦点外の試料光の割合が高くなり、像の品質に悪影響が及ぶ。
【００８９】
本方法の一実施形態は、マルチスポット照明および準共焦点検出と組み合わされた方法を含むこともできる。
【００９０】
本発明は、特に本発明による方法を実施するために、検査しようとする試料を配置することのできる試料面と、試料面の方向に照明光を放出するための少なくとも１つの光源と、試料上に構造化照明をもたらすためのビーム形成ユニットと、特に複数のサブエアリー検出器要素から構成される少なくとも１つの検出手段を備えた検出ユニットとを有する顕微鏡も備える。さらに、この顕微鏡は、試料面内で構造化照明を変位させるための第１の走査手段、および／または検出手段上で試料光を変位させるための第２の走査手段、および／または検出手段を移動させるための手段、および／または試料面内の試料を変位させるための変位ユニット４５も備える。さらに、この光学顕微鏡は、第１の走査手段、および／または第２の走査手段、および／または検出手段を直接移動させるための手段、および／または移動のための変位ユニットを制御する、少なくとも１つの制御ユニットも備える。それによって、制御ユニットが、第１の走査手段、および／または第２の走査手段、および／または検出手段を直接移動させるための手段、および／または変位ユニットを、構造化照明と、試料と、検出との間で相対移動が行われるように制御し、その相対移動の方式は、第１の相対移動が構造化照明と試料の間で行われ、第２の相対移動が検出と試料の間で行われ、第１の相対移動が、第２の相対移動と同時に、かつ好ましくは第２の相対移動とは逆向きに実施されるようなものであることが実現される。
【００９１】
本発明の好ましい一変形形態によれば、制御ユニットが、第１の走査手段、第２の走査手段、および／または検出手段を変位させるための手段、ならびに変位ユニットを、像記録中に試料が試料面内に留まり、検出および構造化照明の移動が行われ、試料面内の検出手段の像が、試料面内の構造化照明とは常に逆向きの、かつ試料面内の構造化照明と同時の、また好ましくは等しい刻み幅値および／または等しい速度値を有する移動を実施するように、制御することが実現される。
【００９２】
別の好ましい一変形形態によれば、制御ユニットが、第１の走査手段、第２の走査手段、および／または検出手段を変位させるための手段、ならびに変位ユニットを、像記録中に検出手段およびその像が試料面内に留まり、試料および構造化照明の移動が行われ、試料が試料面内で常に、試料面内の構造化照明と同じ方向に移動するように制御することが実現される。試料は、好ましくは、構造化照明の半分の刻み幅および／または半分の速度で移動する。
【００９３】
その代わりにまたはそれに加えて、制御ユニットが、第１の走査手段、第２の走査手段、および／または検出手段を変位させるための手段、および／または変位ユニットを、構造化照明が試料面内に留まり、試料および検出の移動が行われ、試料が常に、試料面内の検出手段と同じ方向に移動するように制御することを実現することもできる。試料は、好ましくは、試料面内の検出手段の像の半分の刻み幅および／または半分の速度で移動する。
【００９４】
顕微鏡が広視野顕微鏡であり、試料光が、照明光を偏光する走査手段を経由して伝搬しないことを実現することができる。
【００９５】
最後に、本発明は、検査しようとする試料を配置することのできる試料面を備え、試料面の方向に照明光を放出するための少なくとも１つの光源を有し、試料上に構造化照明をもたらすためのビーム形成ユニット、試料上で構造化照明を変位させるための走査手段、複数のサブエアリー検出器要素から構成される少なくとも１つの検出手段を備えた検出ユニットを有し、第１の走査手段および検出ユニットを制御する少なくとも１つの制御ユニットを有する、顕微鏡も備える。この顕微鏡の場合、像記録中に試料が試料面内に留まること、検出手段の上流の走査手段を通じて二重のリスキャンを受けるために、試料光が走査手段を経由し、その後少なくとも１つの準共焦点絞りを通って伝搬すること、ならびにその結果として、試料面内の検出手段の像が、好ましくは試料面内の構造化照明とは逆向きの同時移動を、好ましくは等しい刻み幅値および／または速度値で実施することが実現される。
【００９６】
本発明のさらなる特徴および利点を以下に、添付の概略図に関連して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】信号形成の原理、具体的には、変位した検出器要素の信号が蓄積する形での信号形成の原理を示す図である。
【図２】ある時点における試料面内の照明スポットおよび検出手段を示す図である。
【図３】照明スポットが試料面内で変位し、検出手段が試料面内でそれとは正反対に変位している、別の時点における試料面内の照明スポットおよび検出手段を示す図である。
【図４】隣合せに配列された３つのサブエアリー蛍光カラービーズと照明スポットが相互作用した直後の、検出手段が照明スポットとは正反対に走査する場合のシミュレーション測定結果と、通常のインコヒーレントな広視野照明の場合のシミュレーション測定結果とを比較して示す図である。
【図５】本発明による光学顕微鏡の第１の実施形態を示す図である。
【図６】光検出経路内で準焦点フィルタリングおよびリスキャンが行われる、本発明による光学顕微鏡の第２の実施形態を示す図である。
【図７】光検出経路内で準共焦点フィルタリングが行われ、かつ光検出経路内に２つのリスキャン角がある、本発明による光学顕微鏡の第３の実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００９８】
同様の構成要素および同様に機能するものには全体的に、図中で同じ参照符号が与えられている。
【００９９】
本発明の中心となる思想の起源は、図１を参照することにより理解することができる。試料位置および照明ＰＳＦ４４の中心と一致するサブエアリー検出器要素６１Ａだけが、試料点または像点に割り当てられた蛍光カラービーズ４２の共焦点信号に寄与するのではなく、その代わりに、試料点から観察して照明スポット４４とは反対に位置する側にある検出器要素も、その信号に寄与する。照明スポット４４が移動すると、照明スポット４４の時間的に異なる地点、すなわち異なる位置も、それらの検出器要素に関連付けられる。「位置」という語は、この場合、対称的な照明スポット４４の中心を意味するものである。
【０１００】
前述の仕分けは、有利なことには、本発明によって回避することができ、そのような仕分けは、ある特定の検出器要素の受領信号が、照明スポットの位置に応じて異なる試料位置に割り当てられるものである。
【０１０１】
本発明によれば、移動は、０番目の検出器要素が、照明スポット４４の移動中に、これまではデータの仕分けにおいて使用されていた検出器要素６１の位置に常に位置付けられるように行われる。これを行うことができるように、構造化照明４４と全体がピクセル化された検出手段６０との間で、逆向きの移動を行うことができる。
【０１０２】
照明スポットは、照明走査移動７０に従って、カラービーズまたは試料４２の上で移動する。検出器手段６０は、これとは逆向きに、検出走査移動７１に従って移動する。
【０１０３】
図２および図３は、試料面４０内での照明スポット４４および検出手段６０の試料４１に対する２つの別々の位置を示す。検出手段６０に対して任意に定められた序数は、検出手段６０の検出器要素６１を指し、図２および図３を参照して明らかとなるように、照明スポット４４の対応する位置も指している。
【０１０４】
２つの矢印は、試料４１に対する検出手段６０の相対的な、検出走査移動７１と呼ぶ第１の相対移動、およびそれとは逆向きの、試料４１に対する照明スポット４４の相対的な、照明走査移動７０と呼ぶ第２の相対移動を示す。
【０１０５】
図２および図３では、試料点がＸおよび点線Ｘによって強調表示されている。２つの関連する検出器要素６１が図２に、０番目または１１番目の検出器要素として任意に識別表示されている。照明スポット４４がそれらの検出器要素とは逆向きに移動した直後、それらの検出器要素は、関連する試料点（Ｘおよび点線Ｘ）から遠ざかり、それぞれ図３で、変位後にアポストロフィが付けられている。像点が照明スポット４４および関連するサブエアリー検出器要素６１に対して中心に位置付けられているような形で、依然として対称性がある。換言すれば、試料点に属するサブエアリー検出器要素６１は、照明点４４とは反対側にある状態で位置付けられ、このことは、試料点に属する各サブエアリー検出器要素６１について当てはまる。
【０１０６】
図２および図３は、試料４１の上で照明スポット４４を走査している間、検出器６０が停止する必要がないことを示す。試料４１の、解像度が向上した途切れのない像が生成される。
【０１０７】
本発明による方法を用いるとき、結像される試料４１の試料領域は、そのｘ／ｙの広がりにおいて、検出手段６０の半分の大きさである。
【０１０８】
図４は、本発明による方法の場合のシミュレーション結果と、インコヒーレントな広視野照明の場合のシミュレーション結果とを比較して示す。光強度Ｉが、試料面内の位置Ｐｏｓに対して示されている。単位は任意である。試料面内には、隣合せに位置する３つの蛍光カラービーズが、位置−１０、０、および＋１０のところにある。最初に、照明スポット４４の強度パターンが示してある。この目的のために、照明スポット４４が３つのカラービーズと相互作用した後の（雑音のない）空間信号パターンが、複数の検出要素から構成される検出手段上に示される。この信号パターンが、従来のインコヒーレントな広視野蛍光顕微鏡については曲線４７で示されており、本発明による光学顕微鏡については曲線４８で示されている。
【０１０９】
インコヒーレントな広視野蛍光顕微鏡観察と比較した解像度の向上は、数学的に計算しなくても、すでに明確に見て取れる。インコヒーレントな広視野蛍光顕微鏡観察で達成することのできる解像度は、検出器より前で１エアリーユニットのピンホール径が使用される場合に、レーザ走査顕微鏡観察の解像度にほぼ一致する。
【０１１０】
図５は、本発明による光学顕微鏡１００および本発明による方法の一実施形態を示す。光源１０から到来する照明光１５が、「ミラー階段（ｍｉｒｒｏｒ  ｓｔａｉｒｃａｓｅ）」１２、音響光学デバイス１４、および複数の光学構成要素１６、１７、１８、１９を経由して伝搬して、走査手段２０に至る。これにより、試料４１の上で照明スポット４４を移動させることが容易になる。光学系２１が照明スポット４４を、光学系２１と光学系２２の間の中間像としてもたらす。その後、照明光１５は対物レンズ３０に入射し、次いで、対物レンズ３０が試料面４０内に回折限界の照明スポット４４をもたらす。
【０１１１】
照明スポット４４との相互作用の後に、試料４１内で試料光５３が生み出される。この試料光５３は、カラービームスプリッタ２３によって検出手段６０の方向に偏光される。カラービームスプリッタ２３は、光を波長に応じて透過または反射することができる。試料光５３は、走査手段５０およびミラー５１を経由して誘導された後に、合焦光学系５２を通じて検出手段６０上に結像される。したがって、さまざまな試料領域を検出器手段のさまざまな検出器領域上に結像するための光学的手段はこの場合、構成要素３０、２３、５１、および５２を含む。
【０１１２】
図５に示す第２の走査手段５０が必要なのは、試料４１が静止している場合に、本方法に必要な、照明スポット４４に対する検出手段６０の相対的な正反対の相対移動を生み出すことができるようにするためである。すなわち、検出手段６０自体はこの場合、移動しない。本実施形態は、より大きな走査速度が達成できるという利点をもたらす。このスキャナ技術は、大幅に高度化された技術である。
【０１１３】
しかし、原理上は、試料面４０内に試料４４を保持する試料ホルダ４５も調整することができる。これによって、試料４４を、照明光１５に対して相対的に、または検出手段６０に対して相対的に移動させることができる。試料ホルダ４５を変位させることによって、照明走査移動または検出走査移動を行うことができる。試料ホルダは、変位ユニット４５と呼ぶこともできる。
【０１１４】
構造化照明光４４用の走査手段２０と試料光５３用の走査手段５０との間の同期を実施する制御ユニットは、図中に示していない。制御ユニットは、確実に２つの走査手段２０および５０が試料４１内に正反対の相対移動を引き起こすようにするという役割を有する。制御ユニットは、検出手段６０の積分時間または読取りも制御する（図示せず）。このようにして、本発明による解像度の高化が促進される。
【０１１５】
図６は、本発明による光学顕微鏡１００および本発明による方法の別の実施形態を示す。図５とは異なり、試料光５３は、第１の走査手段２０を経由して、検出手段６０がある検出面６２の方向に進む。
【０１１６】
試料光５３は初めに、照明光の偏光もする、走査手段２０の走査ミラーの表側に到達することができる。走査手段２０の後に、試料光５３は、カラービームスプリッタ２３を通過し、光学系５４によって合焦されて、ミラー５５を経由し像面に入る。この像面内には、共焦点絞り５６がある。本方法を実施するために、絞り５６は、≧１エアリーユニットの径に調整される。より小さな絞り径は、より高い解像度を得るのに不要であり、信号対雑音比を下げる。１〜２エアリーユニットの絞り径の場合、焦点外光がすでに効率的に除去されている。
【０１１７】
試料光５３は、絞り５６を通過してから、ミラー５７を経由して送られ、光学系５８によって平行化される。試料光５３は、走査手段２０の走査ミラーの裏側に伝達し、そこから走査手段５０に至ることができる。次いで、試料光５３は、走査手段５０によって検出手段６０の方向に誘導され、走査手段５０によって試料面４０内での照明スポット４４の移動と同期して移動する。したがって、試料４１の像が検出手段６０上にもたらされる。
【０１１８】
試料光の光路内で後に続く第２の走査手段５０は、試料４１が静止している場合に、照明スポット４４に対する検出手段６０の相対的な正反対の相対移動を引き起こす。走査手段５０は、検出手段６０に対する光軸の変位を引き起こし、この変位は、本実施形態では走査手段２０によって引き起こすことができないものである。
【０１１９】
検出手段６０に対する光軸の変位は、試料４１と検出手段６０の間の相対変位を引き起こす。
【０１２０】
２つの走査手段２０および５０は、それらの移動が制御ユニットによって適切に同期されなければならない。この目的のために必要とされる制御ユニットまたは必要とされる電子的手段は、図示していない。
【０１２１】
光学系５８から検出手段６０までの試料光５３の光路は、図６に示すように、２つの走査手段２０および５０を経由して実施することができる。あるいは、試料光５３の移動を、検出手段６０上に試料光５３の２倍の大きさのオフセットをもたらす単一の走査手段によって実現することも可能である。このようにして、本発明による、照明光１５と検出手段６０上の試料光５３との間の正反対の変位が、試料４１に対して相対的に実現される。
【０１２２】
図７は、本発明による光学顕微鏡の一実施形態の光検出経路を示す。図６とは対照的に、検出手段６０に至る試料光５３の経路内に、第２の走査手段５０がない。さらに、図７では、試料光５３が、ミラー５９．１の助けを借りて２回走査手段２０を経由し、ミラー５９．２を経由して、検出手段６０に向かって誘導される。それによって、走査手段２０によって導入される光軸の角度変化は、例えば裏側への反射による走査手段２０との第２の相互作用によって補償されるのではなく、その代わりに過補償される。したがって、光軸は検出手段６０上で静止しない。そうではなく、光軸は、検出手段６０上で半分の長さだけ移動し、それにより、照明スポット４４によってもたらされた試料光５３が移動する。したがって、本方法に必要な、試料４１と、構造化照明４４と、検出手段６０との間の前述の相対移動が達成される。
【０１２３】
有利なことには、本発明による光学顕微鏡および本発明による方法を用いて、確実に、特に高い解像度を有する試料像を迅速にかつ比較的単純な手段で記録できるようにすることができる。より高い解像度を得るために、エアリーディスクよりも小さな、すなわち検出手段上の試料点が結像される領域よりも小さな検出器要素を使用することができる。これによって、複数の隣接する検出器要素が、同じ試料点から光を受領する。そのような隣接する検出器要素が、隣合せに接近して位置する試料点同士を引き続き識別することができるように、本発明に従って、照明走査移動および検出走査移動が同時に実施される。それによって、それらの方向は互いに逆向きである。
【符号の説明】
【０１２４】
１０  光源、１２  部分透過性ミラー／カラービームスプリッタを備えたミラー階段、１４  音響光学チューナブルフィルター（ＡＯＴＦ）、１５  照明光、１６，１８，１９  ミラー、１７  平行化光学系、２０  走査手段、偏光手段、スキャナ、２１，２２  光学系、２３  カラービームスプリッタ、ビームスプリッタ、３０  対物レンズ、４０  試料面、４１  試料、４２  サブエアリー蛍光カラービーズ、Ｘ  注目された選択試料点、４４  照明スポット、４４Ａ〜４４Ｄ  試料面内の各照明スポットのそれぞれに対応する中心点の位置、４５  試料変位ユニット、試料ホルダ、４７  従来の広視野照明の場合の検出信号、４８  本発明による光学顕微鏡の場合の検出信号、５０  走査手段、偏光手段、スキャナ、５１，５５，５７  ミラー、５２  合焦光学系、５３  試料光、５４，５８  光学系、５６  ピンホール、共焦点絞り、空間フィルタ、５９．１，５９．２  ミラー、６０  複数のサブエアリー検出器要素（例えば２Ｄチップカメラ）を備える検出手段、６１，６１Ａ〜６１Ｄ  検出器要素、検出器画素、６２  検出面、７０  照明走査移動、７１  検出走査移動、１００  光学顕微鏡。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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