(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電子的データ処理装置によって、乳癌療法レジメンに対する患者の病理学的完全奏効（ｐＣＲ）を予測する方法であって、
入力遺伝子セットに対する差次的遺伝子発現レベル情報を生成するステップであり、前記差次的遺伝子発現レベル情報は、
（ｉ）患者に対して乳癌療法レジメンを開始する前に取得された前記患者の乳腺腫瘍のベースライン試料からのベースラインの遺伝子発現レベルと、
（ｉｉ）第１の用量のベバシズマブを前記患者に投与することによって前記乳癌療法レジメンを開始した後に取得された前記乳腺腫瘍の反応試料からの反応の遺伝子発現レベルと、
の差次的発現情報を含む、ステップ、及び
前記入力遺伝子セットに対する差次的遺伝子発現レベル情報を、研究対象に対して生成されたｐＣＲ状態で注釈が付けられた差次的遺伝子発現レベル情報を用いてトレーニングされた分類を行う装置に入力することによって、前記患者に対する病理学的完全奏効（ｐＣＲ）の予測を計算するステップ、
を含み、
前記生成するステップ及び前記計算するステップは、電子的データ処理装置によって行われ、
前記入力遺伝子セットは、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＡＴＬ２、ＣＴＧＦ、ＩＮＨＢＡ、ＩＤ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＤ１Ｅ、ＴＦＤＰ１、ＡＭＩＧＯ２、ＤＤＩＴ４、ＴＧＦＢ２、ＳＰＰ１、ＣＤ２８、ＰＭＥＰＡ１、ＦＡＴ４、ＫＤＭ６Ｂ、ＭＡＰ３Ｋ４、ＦＡＭ１６２Ａ、ＭＹＨ１１、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ、ＬＴＢＰ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＹＩＰＦ５、ＶＥＧＦＡ、Ｃ１８ｏｒｆ２５、ＦＮＤＣ３Ｂ、ＭＹＢＬ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＬＡＲＰ６、ＰＡＩＰ２Ｂ、ＲＢＭＳ１、ＮＲ２Ｆ２、ＡＮＧＥＬ２、ＬＥＭＤ３、ＰＰＰ２ＣＡ、ＮＤＳＴ１、ＺＮＦ３９５、ＲＮＡＳＥ４、ＳＭＵＲＦ１、ＥＤＮ１、ＳＳＢＰ３、ＳＫＩＬ、ＴＢＰＬ１、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＪＵＮ、ＲＡＲＡ、ＬＭＣＤ１、ＳＥＲＴＡＤ２、ＥＴＳ２、ＡＢＴＢ２、ＢＥＴ１Ｌ、ＭＹＣ、ＣＤＫ１７、ＤＯＰＥＹ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＦＫＦＢ３、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＰＫＩＡ、ＢＭＰＲ２及びＮＣＯＲ２を含む、方法。
【請求項２】
塩基配列決定装置及び電子的データ処理装置を含む、乳癌療法レジメンに対する患者の病理学的完全奏効（ｐＣＲ）を予測するシステムの作動方法であって、
前記塩基配列決定装置が、患者に対して乳癌療法レジメンを開始する前に取得された前記患者の乳腺腫瘍のベースライン試料から、ベースラインの配列決定データを取得するステップ、
前記塩基配列決定装置が、第１の用量のベバシズマブを前記患者に投与することによって前記乳癌療法レジメンを開始した後に取得された前記患者の乳腺腫瘍の反応試料から、反応の配列決定データを取得するステップ、
前記電子的データ処理装置が、入力遺伝子セットに対する、それぞれ前記ベースラインの配列決定データ及び前記反応の配列決定データからのベースラインの遺伝子発現レベル及び反応の遺伝子発現レベルを取得するステップ、
前記電子的データ処理装置が、前記入力遺伝子セットに対する前記ベースラインの遺伝子発現レベルと前記反応の遺伝子発現レベルとの差次的発現情報を含む差次的遺伝子発現レベル情報を生成するステップ、及び
前記電子的データ処理装置が、前記入力遺伝子セットに対する前記差次的遺伝子発現レベル情報を、研究対象に対して生成されたｐＣＲ状態で注釈が付けられた差次的遺伝子発現レベル情報を用いてトレーニングされた分類を行う装置に入力することによって、前記患者に対する病理学的完全奏効（ｐＣＲ）の予測を計算するステップ、
を含み、
前記入力遺伝子セットは、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＡＴＬ２、ＣＴＧＦ、ＩＮＨＢＡ、ＩＤ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＤ１Ｅ、ＴＦＤＰ１、ＡＭＩＧＯ２、ＤＤＩＴ４、ＴＧＦＢ２、ＳＰＰ１、ＣＤ２８、ＰＭＥＰＡ１、ＦＡＴ４、ＫＤＭ６Ｂ、ＭＡＰ３Ｋ４、ＦＡＭ１６２Ａ、ＭＹＨ１１、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ、ＬＴＢＰ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＹＩＰＦ５、ＶＥＧＦＡ、Ｃ１８ｏｒｆ２５、ＦＮＤＣ３Ｂ、ＭＹＢＬ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＬＡＲＰ６、ＰＡＩＰ２Ｂ、ＲＢＭＳ１、ＮＲ２Ｆ２、ＡＮＧＥＬ２、ＬＥＭＤ３、ＰＰＰ２ＣＡ、ＮＤＳＴ１、ＺＮＦ３９５、ＲＮＡＳＥ４、ＳＭＵＲＦ１、ＥＤＮ１、ＳＳＢＰ３、ＳＫＩＬ、ＴＢＰＬ１、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＪＵＮ、ＲＡＲＡ、ＬＭＣＤ１、ＳＥＲＴＡＤ２、ＥＴＳ２、ＡＢＴＢ２、ＢＥＴ１Ｌ、ＭＹＣ、ＣＤＫ１７、ＤＯＰＥＹ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＦＫＦＢ３、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＰＫＩＡ、ＢＭＰＲ２及びＮＣＯＲ２を含む、方法。
【請求項３】
腫瘍学的な前記療法レジメンが、ベバシズマブに加えて少なくとも１つの化学療法薬をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記乳癌療法レジメンの開始が、前記少なくとも１つの化学療法薬を前記患者に投与することなく、前記第１の用量のベバシズマブを前記患者に投与する前記腫瘍学的な療法レジメンの開始を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記入力遺伝子セットは少なくとも６１の遺伝子を含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ベースラインの遺伝子発現レベル及び反応の遺伝子発現レベルが、リボ核酸（ＲＮＡ）配列決定、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）処理、及び、タンパク質レベルのデータを生成するマイクロアレイ処理のうち１つ又は複数の処理によって、ベースラインの遺伝子発現レベル情報及び反応の遺伝子発現レベル情報が生じるようにそれぞれ前記ベースライン試料及び前記反応試料を処理することによって得られる、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ｐＣＲの予測を計算するステップが、バイナリ分類を行う装置に前記入力遺伝子セットを入力するステップを含む、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ｐＣＲの予測を計算するステップが、トレーニングされた収縮重心分類を行う装置に前記入力遺伝子セットを入力するステップを含む、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
電子的データ処理装置によって、分類を行う装置をトレーニングする方法であって、
研究対象の集団のうち各研究対象に対して、少なくとも６１の遺伝子に対する差次的遺伝子発現レベル情報を生成するステップであり、前記差次的遺伝子発現レベル情報は、
前記研究対象に対して乳癌療法レジメンを開始する前に取得された前記研究対象の乳腺腫瘍のベースライン試料からのベースラインの遺伝子発現レベルと、
第１の用量のベバシズマブを前記研究対象に投与することによって前記乳癌療法レジメンを開始した後に取得された前記研究対象の乳腺腫瘍の反応試料からの反応の遺伝子発現レベルと、
の差次的発現情報を含む、ステップ、
前記乳癌療法レジメンの完了後、前記研究対象の病理学的完全奏効（ｐＣＲ）の状態を決定するステップ、
入力遺伝子セットに対する受信した差次的遺伝子発現レベル情報に基づき計算されたｐＣＲの予測を出力するトレーニングされた分類を行う装置を生成するために、前記集団の研究対象に対して生成された、ｐＣＲ状態で注釈が付けられた前記差次的遺伝子発現レベル情報をトレーニングデータとして使用して分類を行う装置をトレーニングするステップ、
を含み、
前記少なくとも６１の遺伝子は、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＡＴＬ２、ＣＴＧＦ、ＩＮＨＢＡ、ＩＤ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＤ１Ｅ、ＴＦＤＰ１、ＡＭＩＧＯ２、ＤＤＩＴ４、ＴＧＦＢ２、ＳＰＰ１、ＣＤ２８、ＰＭＥＰＡ１、ＦＡＴ４、ＫＤＭ６Ｂ、ＭＡＰ３Ｋ４、ＦＡＭ１６２Ａ、ＭＹＨ１１、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ、ＬＴＢＰ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＹＩＰＦ５、ＶＥＧＦＡ、Ｃ１８ｏｒｆ２５、ＦＮＤＣ３Ｂ、ＭＹＢＬ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＬＡＲＰ６、ＰＡＩＰ２Ｂ、ＲＢＭＳ１、ＮＲ２Ｆ２、ＡＮＧＥＬ２、ＬＥＭＤ３、ＰＰＰ２ＣＡ、ＮＤＳＴ１、ＺＮＦ３９５、ＲＮＡＳＥ４、ＳＭＵＲＦ１、ＥＤＮ１、ＳＳＢＰ３、ＳＫＩＬ、ＴＢＰＬ１、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＪＵＮ、ＲＡＲＡ、ＬＭＣＤ１、ＳＥＲＴＡＤ２、ＥＴＳ２、ＡＢＴＢ２、ＢＥＴ１Ｌ、ＭＹＣ、ＣＤＫ１７、ＤＯＰＥＹ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＦＫＦＢ３、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＰＫＩＡ、ＢＭＰＲ２及びＮＣＯＲ２である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
以下は、医療技術分野、腫瘍学技術分野及び関連技術分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌等の侵襲性の癌において、時宜を得た治療は好結果の可能性を大いに高め、さらに、複数の療法が同時に適用される。乳癌の場合、疑わしい乳房病変が生検され且つ悪性であると決定され、さらに、癌は分類される。（ＨＥＲ２陰性患者に対して治療の必要を示す）ベバシズマブ又は（ＨＥＲ２陽性患者に対して治療の必要を示す）トラスツズマブ等の生物学的薬剤の投与を含むネオアジュバント療法は、数週間化学療法と組み合わせて投与され、病変の外科的除去が続く。悪性腫瘍組織又は転移が患者において検出されない病理学的完全奏効（ｐＣＲ）が、所望される結果である。実際には、ｐＣＲが所与の患者において達成されたかどうかは、外科的手術及び切除した腫瘍の後の検査の後まで決定されない。
【０００３】
その療法が最終的に効果的でない場合、貴重な時間が失われ、さらに、最終的に好結果である可能性が減少する。
【０００４】
これを考慮して、種々の評価が、典型的には、可能性のある有効性を評価するためにその療法の間に行われる。腫瘍は、磁気共鳴（ＭＲ）画像法又は別の適した画像化技術を使用した療法の過程にわたって行われる一連の画像化セッションによってモニターされてもよい。陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）又は単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）等の機能的な画像化モダリティが、例えば血管新生等の機能的側面を評価するために適用されてもよい。さらなる生検が、腫瘍を周期的に評価するために治療レジメンの過程にわたって行われてもよい。
【０００５】
これらのアプローチは有用であるけれども、いくつかの欠点を有する。医用画像は高価であり、種々の解釈上の推測を要し、さらに、患者にとってストレスの多いものであり得る。生検は侵襲性である。患者の身体全体の健康及び免疫システムは、化学療法レジメンが進むに従い弱まるため、生検の間に感染が導入される可能性が、いかなるそのような感染に対する有害な患者反応の可能性も増えるように、時間の経過に伴い増える。これらの技術も、通常、治療の過程の実質的な終わりまで意味のある評価を提供せず、さらに結果は、特に治療の初期の間は不明確であり得る。例えば、腫瘍は期待するほど小さくなっていないが、治療はそれにもかかわらず最終的にｐＣＲを達成することができるということを医用画像は示すことができる。時間の経過に伴い集まった証拠が、治療は効果的ではないということをますます示唆する場合、患者の医師は、機能しないかもしれない療法レジメンを続けるか、又或いは、最終的に成功するかどうかを知ることなくその療法を終える若しくは調整するという困難な選択をしなければならない。
【０００６】
遺伝子検査の使用は、遺伝子アレイ、免疫組織化学的検査又は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して測定される特定の遺伝子又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の発現と患者の療法反応を相関させるために熟考されてきた。典型的に、これらの分子マーカーは、患者がネオアジュバント療法を受ける前にベースラインにて測定され、さらに、これらのベースライン測定は、後の療法から利益を得ることができるか又はできないグループに患者を層別化するために使用される。しかし、ベースライン乳房生検からのこれらの予測因子は、クリニックにおいて日常的に使用されるのに十分な特異性を達成しない。対照的に、短期間曝露のネオアジュバントのパラダイムは、患者の乳房生検をベースラインにて（療法前に）、及び、ネオアジュバント療法の１回の投与の数日後に採取することを含む。分子プロファイルが、次に、２つの患者生検に対して実施され、さらに、これら２つの生検間のプロファイルにおける変化が、完全なネオアジュバント治療の過程からの最終的な利益を予測するために使用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以下は、上述の制限等を克服する改善された装置及び方法を熟考している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様によると、方法は：入力遺伝子セットに対する差次的遺伝子発現レベル情報を生成するステップであり、差次的遺伝子発現レベル情報は：（ｉ）患者に対して乳癌療法レジメンを開始する前に取得された患者の乳腺腫瘍のベースライン試料からのベースラインの遺伝子発現レベル情報と、（ｉｉ）第１の用量のベバシズマブを患者に投与することによって乳癌療法レジメンを開始した後に取得された乳腺腫瘍の反応試料からの反応の遺伝子発現レベル情報とを比較する、ステップ；及び、入力遺伝子セットに対する差次的遺伝子発現レベル情報に基づき、患者に対する病理学的完全奏効（ｐＣＲ）の予測をコンピュータで計算するステップ；を含む。上記の生成するステップ及びコンピュータで計算するステップは、電子データ処理装置によって適切に行われる。
【０００９】
別の態様によると、方法は：第１の用量のベバシズマブを患者に投与することによって、少なくともベバシズマブを含む乳癌療法レジメンを開始するステップ；上記開始前に、患者の乳腺腫瘍のベースライン試料を取得するステップ；上記開始後に、患者の乳腺腫瘍の反応試料を取得するステップ；入力遺伝子セットに対する、それぞれベースライン試料及び反応試料からのベースラインの遺伝子発現レベル情報及び反応の遺伝子発現レベル情報を生成するステップ；入力遺伝子セットに対する、ベースラインの遺伝子発現レベル情報と反応の遺伝子発現レベル情報とを比較する差次的遺伝子発現レベル情報を生成するステップ；並びに、入力遺伝子セットに対する差次的遺伝子発現レベル情報に基づき、患者に対する病理学的完全奏効（ｐＣＲ）の予測をコンピュータで計算するステップ；を含む。
【００１０】
別の態様によると、直前の２つの段落のうちの１つの段落において明記された方法において、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル経路に属する入力遺伝子セットが利用される。別の態様によると、直前の２つの段落のうちの１つの段落において明記された方法において、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＡＴＬ２、ＣＴＧＦ、ＩＮＨＢＡ、ＩＤ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＤ１Ｅ、ＴＦＤＰ１、ＡＭＩＧＯ２、ＤＤＩＴ４、ＴＧＦＢ２、ＳＰＰ１、ＣＤ２８、ＰＭＥＰＡ１、ＦＡＴ４、ＫＤＭ６Ｂ、ＭＡＰ３Ｋ４、ＦＡＭ１６２Ａ、ＭＹＨ１１及びＰＰＰ２Ｒ１Ｂを含む群のうち少なくとも２つの遺伝子を含む入力遺伝子セットが利用される。入力遺伝子セットに対する他の適した選択肢も本明細書において開示され、入力遺伝子セットが６１の遺伝子を含む実例を含む。
【００１１】
別の態様によると、方法は、研究対象の集団の各研究対象に対して：第１の用量のネオアジュバント治療薬を研究対象に投与することによって、少なくともネオアジュバント治療薬を含む腫瘍学的な療法レジメンを開始するステップ；上記開始前に、研究対象における悪性腫瘍のベースライン試料を取得するステップ；上記開始後に、研究対象における悪性腫瘍の反応試料を取得するステップ；反応試料を取得した後に、研究対象に対する腫瘍学的な療法レジメンを完了するステップ；腫瘍学的な療法レジメンを完了した後に、研究対象の病理学的完全奏効（ｐＣＲ）の状態を決定するステップ；少なくとも１０００の遺伝子に対するベースラインの遺伝子発現レベル情報及び反応の遺伝子発現レベル情報を生成するために、それぞれベースライン試料及び反応試料を処理するステップ；並びに、ベースラインの遺伝子発現レベル情報と反応の遺伝子発現レベル情報とを比較する、研究対象に対する差次的遺伝子発現レベル情報を計算するステップ；を含む。分類器が、次に、トレーニングデータとして、研究対象の集団に対して計算された差次的遺伝子発現レベル情報を使用してトレーニングされ、受信した入力遺伝子セットに対する差次的遺伝子発現レベル情報に基づきコンピュータで計算されたｐＣＲの予測を出力するトレーニングされた分類器を生成する。
【００１２】
別の態様によると、方法は、直前の段落の方法によって生成されたトレーニングされた分類器を利用する。当該方法は、臨床治療を受ける患者に対して：第１の用量のネオアジュバント治療薬を患者に投与することによって、腫瘍学的な療法レジメンを開始するステップ；上記開始前に、患者における悪性腫瘍のベースライン患者試料を取得するステップ；上記開始後に、患者における悪性腫瘍の反応患者試料を取得するステップ；ベースライン患者試料及び反応患者試料に基づき、入力遺伝子セットに対する患者の差次的遺伝子発現レベル情報を生成するステップ；並びに、患者の差次的遺伝子発現レベル情報をトレーニングされた分類器に入力することによって、患者に対するｐＣＲの予測を生成するステップであり、患者に対する腫瘍学的な療法レジメンの完了に先立ち行われるステップ；を含む。
【００１３】
１つの利点は、化学療法と共にネオアジュバントベバシズマブ療法が、乳癌に対して病理学的完全奏効（ｐＣＲ）を達成する可能性があるかどうかの早期指摘を提供することにある。
【００１４】
別の利点は、ネオアジュバント療法がｐＣＲを達成する可能性があるかどうかを決定する遺伝子検査を開発するための開発方法論を提供することにある。
【００１５】
数多くのさらなる利点及び利益が、当業者には以下の詳細な説明を読んだ後に明らかになる。
【００１６】
本発明は、種々の構成要素及び構成要素の取り合わせにおいて、並びに、種々の処理作業及び処理作業の取り合わせにおいて具体化することができる。図面は、好ましい実施形態を例示する目的のためだけにあり、本発明を限定するとして解釈されることはない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ネオアジュバントベバシズマブと共に化学療法を含み、乳腺腫瘍の外科的切除が続く例示的な乳癌治療レジメンを示した概略図である。
【図２】図１の乳癌療法に対する予測結果評価テストの開発を示した概略図であり、研究集団の各研究対象に対して行われる処理を示している。
【図３】図１の乳癌療法に対する予測結果評価テストの開発を示した概略図であり、予測分類器を生成するために総計の研究集団に対して行われる処理を示している。
【図４】臨床患者のｐＣＲ結果を予測するために図２及び３おいて開発された予測結果評価テストの適用の実施形態を示した概略図である。
【図５】臨床患者のｐＣＲ結果を予測するために図２及び３おいて開発された予測結果評価テストの適用の実施形態を示した概略図である。
【図６】入力遺伝子の数の関数として、実際に開発された収縮重心分類器の誤分類エラーを示した概略図である。
【図７Ａ】本明細書において開発された６１の遺伝子シグネチャーを示した図であり、遺伝子はそのシグネチャーへの寄与レベルに従って順序づけられている。
【図７Ｂ】本明細書において開発された６１の遺伝子シグネチャーを示した図であり、遺伝子はそのシグネチャーへの寄与レベルに従って順序づけられている。
【図７Ｃ】本明細書において開発された６１の遺伝子シグネチャーを示した図であり、遺伝子はそのシグネチャーへの寄与レベルに従って順序づけられている。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ネオアジュバントベバシズマブと共に化学療法を含む乳癌療法が所与の患者において病理学的完全奏効（ｐＣＲ）をもたらす可能性を決定するための予測結果評価テストが本明細書において開示されている。リボ核酸（ＲＮＡ）配列決定が、所与の患者から２つの時点にて採取された腫瘍生検、すなわち、診断時に採取された第１の生検、及び、単一用量の術前ベバシズマブの投与後（例えば、１０〜１４日後）に採取された第２の生検に対して行われる。２つの生検の分子プロファイルが、ＴＧＦ−ベータ（すなわちＴＧＦ−β）活性に関連する遺伝子に対する差次的遺伝子発現レベルを検査するために比較される。本明細書において開示されるいくつか適した遺伝子シグネチャー（ｇｅｎｅ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ、遺伝子サイン）を、乳癌転移及びＴＧＦ−ベータ活性との関連の先の生物学的証拠に基づき開発した。これらの遺伝子を使用して、最近傍重心ベースの分類器（又は他の分類器）がトレーニングされ、該分類器は、ＴＧＦ−ベータ活性に関連するシグネチャー遺伝子を使用して、個々の患者のｐＣＲを達成する可能性を示すｐＣＲの予測を割り当てる。本明細書において使用される場合、遺伝子は、ヒト遺伝子を意味し、いかなる非ヒト遺伝子を意味せず、同様に、リボ核酸（ＲＮＡ）はヒトＲＮＡを意味し、タンパク質はヒトタンパク質を意味する等、いかなる非ヒトＲＮＡ、タンパク質等を意味しない。
【００１９】
強固な結果予測分類器を作製するテスト開発技術も本明細書において開示される。
【００２０】
図１を参照すると、例示的な乳癌療法レジメンが記載されている。時間Ｔ０にて、患者は乳癌と診断され、さらに、ベースラインを確立するために、第１の生検が行われて、患者の乳房病変から第１の生検試料１０が抽出される。第１の生検試料１０は、乳癌を分類するために分析される。図１において治療が概略的に示されている患者において、乳癌は、ＨＥＲ２陰性として同定される。ＨＥＲ２はヒト上皮増殖因子受容体２であり、Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、ＣＤ３４０（表面抗原分類３４０）又はｐ１８５としても知られ、ＥＲＢＢ２遺伝子によってコード化されるタンパク質である。このタイプの乳癌に対して、ネオアジュバントベバシズマブと共に化学療法を含む腫瘍学的な療法レジメンが処方されてもよいが、満足な結果をいつももたらすわけではない。図１の例示的な乳癌療法レジメンは、ネオアジュバントベバシズマブと共に化学療法を含む。図１に示された療法レジメンにおいて、このベバシズマブ最初の投与は、いかなる他の療法も伴わないが、他の状況において、さらなる化学療法も伴ってよい。最初の用量のベバシズマブが投与された後、及び、ベバシズマブ＋化学療法の組合せの第１の投与の前に発生する時間Ｔ１にて、第２の生検が行われて、乳房病変から第２の生検試料１２が抽出される。開示されるｐＣＲ予測のテストが、本明細書において開示される適したシグネチャーを使用して、第１及び第２の生検から抽出された差次的遺伝子発現レベル情報に基づき行われる。ｐＣＲ予測のテストは、療法レジメンがその患者において病理学的完全奏効（ｐＣＲ）を達成する可能性を示すｐＣＲ予測を生成する。ｐＣＲの予測は図１において時間Ｔ１にて概略的に示されているが、ｐＣＲ予測のコンピュータ計算は第２の生検試料１２から得られたデータに頼っているため、ｐＣＲの予測は第２の生検が行われた後のある時間に生成されることが理解されるということに留意されたい。しかし、ｐＣＲの予測は、ベバシズマブ＋化学療法の組合せが投与される前に生成され、そのようにして、医師は、図１に示された療法レジメンを進めるかどうかを決める際にｐＣＲの予測を考慮に入れることができるということが好ましい。一部の実施形態において、第１のベバシズマブ投与と組合せ療法の開始との間に三週間（２１日）の間隔があり、さらに、第２の生検手順が、第１のベバシズマブ投与の約１０〜１４日後に行われ、少なくとも１週間おいて、第１及び第２の生検試料１０、１２を分析する、及び、ｐＣＲの予測を生成する。本願において、患者は全員、第２の生検に続いて組合せ療法を受け、さらに、このレジメンの終わりにて乳腺腫瘍を外科的に除去（すなわち切除）し、悪性腫瘍組織又は転移が患者において検出されない所望の病理学的完全奏効（ｐＣＲ）を患者が達成しているかどうかを医療関係者が決定するのを外科的検査及び任意で他のテストが可能にする。本願において、組合せレジメンの終わりに計算した患者のｐＣＲ状態を使用して、予測シグネチャーを開発した。
【００２１】
図２をはじめとして、アジュバント治療薬を含む腫瘍学的治療レジメンが成功する可能性のあるものであるかどうかを決定するための予測結果の評価を開発するためのアプローチが記載される。実例において、このアプローチを使用して、開示される、ＨＥＲ２陰性乳癌を有する乳癌患者のための化学療法と組み合わせたネオアジュバントベバシズマブの有効性に対する予測テストを開発した。しかし、開示されるアプローチは、いかなるネオアジュバント療法に対してもより一般的に適用可能である。図２において概略的に描かれている処理が、研究対象の集団の各研究対象に対して行われる。所与の研究対象に対して、入力は、第１の生検２０及び第２の生検２２である。第１の生検２０は、図１において示されている第１の生検１０に相当するが、第１の生検２０は、臨床患者に対してではなく研究対象に対して行われる。第２の生検２２は、図１において示されている第２の生検１２に相当するが、ここでも第２に生検２２は、臨床患者に対してではなく研究対象に対して行われる。第１の生検試料２０は、リボ核酸（ＲＮＡ）配列決定２４を行うことによって処理され、さらに、第２の生検試料２２も、同じＲＮＡ配列決定２４を行うことによって処理される。ＲＮＡ配列決定２４は、例示的なＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩｘ等、いかなる適したＲＮＡ配列決定装置３０も利用することができる。
【００２２】
ＲＮＡ配列決定動作２４の出力は、種々のｍＲＮＡ鎖に対するそれぞれの生検試料２０、２２におけるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルである。これは電子データであるため、その後の処理は、コンピュータ３２によって適切に行われる（分離されたコンピュータ３２が例示されているけれども、一部又は全てのコンピュータ動作が、任意で、例えばＲＮＡ配列決定装置３０のマイクロプロセッサ及び付随する電子メモリ等のコンピュータ要素によって行われてもよい）。第１及び第２の生検試料２０、２２のＲＮＡ鎖は、それぞれのアライメント動作３４において並べられる。適したアプローチにおいて、ＲＮＡ配列決定鎖（すなわちＲＮＡ−ｓｅｑデータ）は、ＴｏｐＨａｔ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｒｅａｄ  ｍａｐｐｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｐｈａｔ．ｃｂｃｂ．ｕｍｄ．ｅｄｕ／（最終アクセス２０１２年１１月１３日）を参照）を使用して、基準となるヒトＲｅｆＳｅｑ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＲｅｆＳｅｑ／）と共に並べられ、遺伝子発現レベルを計算するために、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ（ｈｔｔｐ：／／ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ．ｃｂｃｂ．ｕｍｄ．ｅｄｕ／（最終アクセス２０１２年１１月２８日）を参照）が続けられる。ベースライン生検試料２０のＲＮＡ配列決定データに適用されるアライメント動作３４の出力は、ＲＮＡレベルという形のベースラインの遺伝子発現レベル情報であり、さらに、反応生検試料２２のＲＮＡ配列決定データに適用されるアライメント動作３４の出力は、ＲＮＡレベルという形の反応の遺伝子発現レベル情報である。ＲＮＡレベルは、マイクロアレイを使用する等、代わりのシステムによって測定することができるということが正しく理解されたい。開示されるテスト開発アプローチは、（経路ベースのエンリッチメントが本明細書において熟考及び記載されているけれども）実験によるものであるため、遺伝子発現レベル情報は、好ましくは、少なくとも１０００の遺伝子、より好ましくは少なくとも１０，０００の遺伝子に対するデータを含む。実例として、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩｘが、３５，７６７の遺伝子に対する遺伝子発現レベル情報を（ｍＲＮＡ転写物という形で）提供する。別の例として、（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡから入手可能な）ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  ＳＴ１．０が、３６，０７９の転写物を提供する。
【００２３】
図１を続けて参照すると、動作４０において、差次的遺伝子発現レベル情報が、研究対象に対して計算される。差次的遺伝子発現レベル情報は、ベースラインの遺伝子発現レベル情報と反応の遺伝子発現レベル情報とを比較する。適したアプローチにおいて、研究対象の各遺伝子に対する差次的発現レベルは、ベースラインの遺伝子発現レベルと反応の遺伝子発現レベルとのｌｏｇフォールドチェンジ（ｌｏｇ−ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）として計算される。例えば、ｌｏｇ２フォールドチェンジは、
【数１】
0006445451.tif 000002
としてコンピュータで計算することができ、ここで、・は、ベースライン生検試料２０に対するＲＮＡレベルであり、さらに、・．．．．．．．．は、反応生検試料２２に対するＲＮＡレベルである。ＲＮＡレベルに対するノイズレベルは遺伝子間で大きく異なるため、標準化が適切に適用される。実例において、ＲＮＡレベルは、動作４２において差次的遺伝子発現レベルの有意性を推定するために使用されるポアソン分布に従うと仮定される。動作４４において、動作４２に基づき差次的発現レベルが有意ではないと見なされる遺伝子は、任意で、後の処理におけるその効果を数学的に限定するように、例えば、１０又は１００で差次的発現レベルを割ることによって下方に調整される。（代わりのアプローチにおいて、有意ではない差次的レベルはゼロに設定することができるが、これは、例えばゼロによる分割をもたらす場合に、後の数学的処理を複雑にし得る。別の選択肢として、調整動作４２、４４を省くことができるが、これは、いくらかノイズを導入し得る。）各研究対象に対する最終的な出力は、対象に対する差次的遺伝子発現レベルベクトル４６によって実例において適切に表される差次的遺伝子発現レベル情報である。このベクトル４６において、各ベクトル要素は１つの遺伝子に対応し、さらに、その値は、（動作４２、４４により任意で調整される）その遺伝子に対する差次的ＲＮＡレベルである。３５，７６７の測定される遺伝子がある実例において、ベクトル４６は、３５，７６７の要素を有する。
【００２４】
図２の処理は、対象に対する差次的遺伝子発現レベルベクトルのセット４６を生成するように、集団のうち各研究対象に対して適用される。この差次的遺伝子発現情報は、次に、分類器をトレーニングするために使用される。
【００２５】
図３を参照すると、研究対象の集団の対象に対する差次的遺伝子発現レベルベクトルのセット４６は、データセット５０を形成する。このデータセットにおいて、各研究対象にはｐＣＲ状態の注釈が付けられる。この状態は研究対象に対して既知であり、それは、各研究対象が図１の化学療法レジメンを経験し、さらに、このレジメンの終わりに研究対象は、乳腺腫瘍の外科的切除、及び、研究対象がｐＣＲを達成したかどうかを決定するステージ分類を受けるためである。従って、データセット５０は、治療レジメンが新たな患者においてｐＣＲを達成するかどうかに関して新たな患者を分類するために設計される分類器をトレーニングするのに適した、注釈が付けられたデータセットである。しかし、分類器をトレーニングする前に、計算的に困難であり得るか又は値段がひどく高くありさえし得る差次的遺伝子発現データが利用可能である全遺伝子に対する分類器のトレーニングをするのではなく、分類器に入力するための有意な遺伝子のセットを選択することが有用であり得る。さらに、比較的小さい利用可能な遺伝子のサブセットに対して分類器が作動する場合、それらの遺伝子のみが、新たな患者を分類するために測定される必要がある。従って、動作５２において、ｐＣＲを予測するための各遺伝子の有意性が分析される。適したアプローチにおいて、スチューデントｔ検定等の他の有意性検定も代わりに使用することができるけれども、（ウィルコクソン順位和検定としても知られる）マンホイットニーの有意性検定が適用される。典型的な有意性検定において、この場合、検定下の遺伝子に対する差次的ｍＲＮＡレベルはｐＣＲに対して弁別的ではないという帰無仮説が想定され、さらに、マンホイットニーの検定が、この帰無仮説が実際に真実である場合に研究対象のｐＣＲ状態の値が集団において示される分布を有する確率を示すｐ値を生成するために行われる。ｐ値の値が小さいほど、相関性の非存在下で集団における分布を観察する可能性は低いことを示し、従って、ｐ値が小さいほど、より統計的有意性が示唆される。１つのアプローチにおいて、有意な遺伝子は、有意性レベルの閾値αを使用して選ぶことができ、ここで、ｐ＜αは統計的に有意であると考慮される。他の閾値も利用することができるけれども、典型的に、α＝０．０５又はα＝０．０１の閾値が使用されるか、又或いは、最も小さいｐ値を有する“ｔｏｐ−Ｎ”の遺伝子を選択することができる。
【００２６】
任意のフィルタリング動作５４において、例えばＫＥＧＧ経路データベースにおいて収集される既知のシグナル経路等のエンリッチメント情報に基づき、有意な遺伝子を選別することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／ｐａｔｈｗａｙ．ｈｔｍｌ（最終アクセス２０１２年１１月１３日）を参照されたい。例えば、（検定５２によって示される）統計的に有意な遺伝子のうち多くが単一経路に属している場合、任意で、フィルタリング５４は、その経路に属していないいかなる統計的に有意な遺伝子も除いてよい。或いは、経路情報は、選択閾値αに近いが選択閾値αよりも大きいｐ値を有する経路の遺伝子を加えることによってさらなる有意な遺伝子を加えるために使用されてもよい。他のエンリッチメント方法論も熟考される。エンリッチメント動作５４が（図３において概略的に示されている他の動作と共に）コンピュータ３２によって行われるとして図３において示されているけれども、エンリッチメント動作５４は手動で、例えば、適した医学訓練を有する人間に、有意性検定５２によって出力された有意な遺伝子を経路データベースと比較させることによって、行われることになると熟考されるということに留意されたい。
【００２７】
図３を続けて参照すると、有意性検定動作５２及び任意のエンリッチメント動作５４の出力は、有意な遺伝子のセット６０である。動作６２において、分類器がトレーニングされる。トレーニングされることになる分類器は、有意な遺伝子のセット６０に対する患者の差次的遺伝子発現レベル情報を受信するように、及び、受信した患者の差次的遺伝子発現レベル情報に基づきコンピュータで計算されたｐＣＲ予測を出力するように設計される。分類器は、有意な遺伝子に対するｐＣＲ状態で注釈が付けられた差次的遺伝子発現レベル情報のセット５０をトレーニングデータとして使用してトレーニングされる。実例において、研究対象に対する差次的遺伝子発現レベルベクトル４６は、３５，７６７の遺伝子を（ｍＲＮＡ転写物という形で）有する。１００の有意な遺伝子が分類器において使用されることに（ここでも実例として）なる場合、それらの１００の有意な遺伝子に対応する１００のベクトル要素のみが、トレーニングデータとして使用される。分類器は、実質的にいかなるタイプのバイナリ分類器であってもよく、さらに、確率（すなわち、患者が治療を介してｐＣＲを達成する可能性を示すソフトバイナリ分類器）か又はバイナリアンサー（すなわち、ハードバイナリ分類器）を入力するように設計することができる。本明細書における実例においては、収縮重心分類器が利用され、トレーニングの間に遺伝子選択を行い、最初の入力遺伝子セットから遺伝子を除く。分類器トレーニング動作６２の出力は、トレーニングされた分類器６４である。
【００２８】
ｐＣＲ状態で注釈が付けられた差次的遺伝子発現レベル情報のセット５０は、トレーニングデータとして使用される。この場合、結果として生じる分類器６４は、入力として、研究対象に対する差次的遺伝子発現レベルベクトル４６のタイプ及びフォーマットの差次的遺伝子発現レベルデータを受信するように設計される。実例において、これらのデータは、ＲＮＡ配列決定によって生成されたｍＲＮＡ転写物という形である。
【００２９】
しかし、代わりのアプローチにおいて、分類器は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）処理又はタンパク質レベルデータを生成するマイクロアレイ処理等によって生成されるデータ等、入力された別のタイプ又はフォーマットの有意な遺伝子のセットに対する差次的遺伝子発現レベルデータを利用するようにトレーニングすることができる。これを行うために、所望のタイプ／フォーマットのトレーニング差次的遺伝子発現データセット６６が提供される。データセット６６は、好ましくは、研究対象の集団に対するものでもあり、さらに、研究対象のｐＣＲ状態で注釈が付けられるが、例えばＲＴ−ＰＣＲ又はマイクロアレイ分析等、異なる技術を使用して取得される。この代わりのアプローチにおいて、有意な遺伝子６０に対する差次的遺伝子発現データセット６６は、分類器トレーニング動作６２に対する入力として役立ち、さらに、結果として生じるトレーニングされた分類器６４は、入力された差次的遺伝子発現データを、データセット６６のフォーマットで受信するように設計される。この代わりのアプローチは、（図２による）ＲＮＡ配列決定等の「全ゲノム」技術が使用されて、適度に包括的な遺伝子発現データセット（すなわち、研究対象に対する差次的遺伝子発現レベルベクトル４６）を生成するのを可能にし、そのデータセットは、有意な遺伝子６０を同定するために使用され、従って、最も有意な遺伝子に対する包括的な検索が行われるということを確実にしている。しかし、結果として生じるテストは、トレーニングされた分類器６６によって具体化され、この代わりの実施形態においては、トレーニングされた分類器６６は、ＲＴ−ＰＣＲ又はマイクロアレイ分析等の別の技術によって生成される患者の差次的遺伝子発現データセットを使用する。この他の技術は、有利に、より安価で、より容易に入手可能であり、同定された有意な遺伝子を標的にするか、又さもなければ、有意な遺伝子の同定に使用されるＲＮＡ配列決定若しくは他の包括的技術と比較して、臨床テストに対する利点を有し得る。
【００３０】
図４を参照すると、予測結果評価テストとしてのトレーニングされた分類器６４の適用が記載されている。ＨＥＲ２陰性乳癌と診断され、且つ、（この実例において）図１の治療レジメンが処方されてきた患者は、まず生検され、研究対象のベースライン生検試料２０に相当するベースライン患者生検７０が生成される。図４に関連して患者は、典型的には、新たな患者であり、図２及び３の動作において分析された研究対象の集団のメンバーではない。最初の生検後に、患者は、図１の例示的なレジメンにおいて示されているようにいくらかの投与される化学療法薬も有することを熟考されるけれども、典型的にはいかなる併用化学療法薬も投与されることなく、ベバシズマブの第１の投与７１を受ける。その後、例えば１０〜１４日以内に、患者は、第２の生検を受けて、研究対象の反応生検試料２２に相当する反応患者生検７２が生成される。これは、次に、図４の残りに明記された生検分析が行われて、患者の医師による考慮のためのｐＣＲ予測が生成されるように一週間以上おかれる。例示的な図４において、研究対象の生検試料を処理するために使用したもの（図２を参照）と同じＲＮＡ配列決定装置３０がここでも示されているが、例えば同じ装置モデルだが明確に同じ機器ではない装置、又は、実質的に同じＲＮＡリードを生成する異なるモデルの機器等、等価のＲＮＡ配列決定装置を使用することができるということが理解されたい。
【００３１】
図４の例において、分類器６４は、図２によるＲＮＡ配列決定によって生成される差次的遺伝子発現レベルベクトル４６を使用してトレーニングされてきたと仮定される。従って、患者のベースライン生検試料７０及び反応生検試料７２は、研究対象に対してすでに記載されたように（図２参照）、同じＲＮＡ配列決定及びアライメント動作２４、３４によって処理されて、ベースライン及び反応の患者ＲＮＡレベル情報が生成される。このＲＮＡレベル情報は、動作７４において、図２の動作４０、４２、４４に相当する処理を行うためにあるが、動作７４が任意で（必ずしもそうであるわけではないが）、トレーニングされた分類器６４に対する入力として役立つ有意な遺伝子に対するＲＮＡレベル情報に限定されるという違いを有する。動作７４による差次的遺伝子発現レベル情報の出力は、差次的ＲＮＡレベル情報という形であり、患者に対するｐＣＲ予測を生成するためのトレーニングされる分類器６４に対する入力である。動作３４、７４は、図２及び３のトレーニング処理において使用したものと同じコンピュータ３２によって行われるとして示されているが、ここでも、異なるが類似してプログラムされたコンピュータを利用することができる。トレーニングされた分類器６４によって生成された視覚的に知覚できるｐＣＲ予測の表示は、好ましくは、最初のベバシズマブ投与７１を過ぎて腫瘍学的な療法レジメンを継続する前に表示され、例えば、数として、若しくは、患者におけるｐＣＲを達成する可能性を長さが示すバーとしてビデオディスプレイユニット上に、又は、紙の印刷物等として表示される。
【００３２】
図４を続けて参照すると、決定８０において、患者の医師は、最初のベバシズマブ投与７１に続く療法レジメンを利用することによってｐＣＲ状態を患者が達成する可能性があるかどうかを考慮する。この決定を行うことにおいて、医師は、入力された患者の差次的ＲＮＡレベル情報に基づきトレーニングされた分類器６４によって計算されたｐＣＲ予測を適切に考慮する。しかし、医師は、患者に対して行われる他のテスト、医師の医学的専門知識、又は、ｐＣＲよりも最適ではない結果ではあるが、患者に対しておそらく依然として有利である結果を達成する可能性等、決定８０を行うことにおいてさらなる因子を考慮することができる。決定８０は、典型的には、患者と協議して行われる。そのレジメンが患者に対してｐＣＲ状態を達成する可能性があると医師が決定する場合、その療法レジメンは動作８２において継続される。一方、そのレジメンは患者に対してｐＣＲ状態を達成する可能性がないと医師が決定する場合、動作８４においてその療法は適切に修正されるか、又は、異なる療法が適用される。
【００３３】
図５を参照すると、予測結果評価テストとしてのトレーニングされた分類器６４の適用が別のケースにおいて記載されており、ここでは、図２の分類器トレーニング動作６２が、差次的遺伝子発現レベルベータ６６の別のデータセット、すなわち、図５の実例においてＲＴ−ＰＣＲによって生成されるデータセットを利用している。図５の実施形態において、患者生検試料７０、７２は、図４を参照して既に記載されたように、最初のベバシズマブ投与７１の前後に取得される。生検試料７０、７２は、ＲＴ−ＰＣＲ９０によって処理され、さらに、結果として生じるベースライン及び反応の遺伝子発現レベルデータが、動作９２において処理され、図３の（別の）トレーニングデータセット６６のフォーマットと同じフォーマットで入力遺伝子に対する差次的遺伝子発現レベルデータが生成される。動作９２による差次的遺伝子発現レベル情報の出力は、トレーニングデータセット６６の形と同じ形であり、患者に対するｐＣＲ予測を生成するための（この実施形態においては、トレーニングデータセット６６を使用してトレーニングした）トレーニングされた分類器６４に対する入力である。決定動作８０及び後の治療選択肢８２、８４は、図４を参照してすでに記載されている。
【００３４】
図２及び３を参照して、患者にとってネオアジュバント治療薬の投与を含む腫瘍学的な療法レジメンを受ける可能性があるかどうかをｐＣＲ結果が予測するために予測結果評価テストを開発するための開発方法及びシステムの実施形態が記載されてきた。図４及び５を参照して、所与の患者にとって可能性があるかどうかをｐＣＲ結果が予測するためにそのような予測結果評価テストを適用するための方法及びシステムの実施形態が記載されてきた。
【００３５】
以下において、例示的な実際に行われた例が記載されており、図２及び３を参照して記載されたものに匹敵する開発方法が、ネオアジュバントベバシズマブと共に化学療法（カルボプラチン及びナノ粒子アルブミン結合パクリタキセル）を含む図１において概略的に示されている乳癌療法レジメンに対する予測結果評価テストを開発するために適用されている。予測結果評価テストの開発は、乳癌患者が短期間曝露として単一投与のベバシズマブ治療を２つの腫瘍の生検と共に受ける臨床治験からのデータを要し、１つの生検が療法の前に採取され、さらに、１つの生検が単一投与の約１０〜１５日後に採取された。コア生検ＲＮＡのトランスクリプトームを、ネオアジュバント臨床治験ＢｒＵＯＧ２１１Ａ／２１１Ｂから得た１３対の乳腺腫瘍から配列決定した。乳腺腫瘍がＨＥＲ２陰性であった研究対象に、前段階のベバシズマブの投与を与え、生物学的／化学療法の組み合わせ−ベバシズマブ＋カルボプラチン＋ナノ粒子アルブミン結合パクリタキセルを続けた。前段階の単独療法への曝露の前後１０日に得た生検の対を配列決定した。ペアエンド配列決定を、７４ｂｐ（塩基対）リード長を有する増幅された全ＲＮＡを使用してＩｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡＩＩのプラットフォーム上で行い、２２，１６０の遺伝子及び３４，４４９の転写物に対する発現データを得た。ベバシズマブ単独療法への短期間曝露後のトランスクリプトームの変化を評価し、ポアソン分布のリードカウントを仮定した。これらの動作は、生検試料２０、２２に対して動作する図２の動作２４、３４に相当する。
【００３６】
図２の動作４０、４２、４４に相当する、各対象に対する差次的遺伝子発現レベルベクトル４６の計算を以下のように行った。ＦＰＫＭ、すなわち、百万のマップされたリードあたりの転写物の１キロベースあたりの断片という単位のベースライン（Ｔ０）の遺伝子発現レベル及び短期間曝露（Ｔ１）後の遺伝子発現レベルを取得した。ｌｏｇ２フォールドチェンジ（動作４０）を、ｌｏｇ２（ＦＰＫＭ（Ｔ１）／（ＦＰＫＭ（Ｔ０）））の値として計算した。動作４２を、ポアソン分布のリードを使用して行い、ｌｏｇ２フォールドチェンジ（ＦＣ）の有意性を推定した。動作４４を、有意（ｐ＜０．０５）ではないｌｏｇ２ＦＣを１００で割ることにより有意性が調整されたｌｏｇ２ＦＣをコンピュータで計算することによって行った。
【００３７】
統計的に有意な遺伝子の選択、すなわち、図３の動作５２を、有意性が調整されたｌｏｇ２ＦＣのｐＣＲとの関連をチェックするマンホイットニーの検定を使用して行った。エンリッチメント分析（図３の動作５４）を行って、ＫＥＧＧ経路のｐＣＲとの関連を同定した。多数検定補正後に、４つの経路のみがｐＣＲと有意に関連していると発見した。これら４つの経路のうち、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ又はＴＧＦ−β）シグナル経路が、ｐＣＲと関連する全８５の遺伝子のうち１０の遺伝子を有したということがわかった。有意な遺伝子のセットをさらにエンリッチするために、医学文献の情報を求めた。Ｐａｄｕａ等は、４つのヒト細胞株（ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２１３、ＨＰＬ１及びＨａＣａＴ）をＴＧＦＢ１に３時間曝露する、及び、曝露後に発現レベルが有意に変化した遺伝子を捕獲することによって、１５３の遺伝子のＴＧＦ−β反応シグネチャーを開発した（Ｐａｄｕａ，“Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＴＧＦβ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ”，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｏｌ．１９  ｐａｇｅｓ８９−１０２（２００９））。これを考慮して、有意性検定５２によって同定したＴＧＦ−βシグナル経路に属する１０の有意な遺伝子を、Ｐａｕｄａ等により同定されたＴＧＦに関連する１５３の遺伝子によってエンリッチした。１つの遺伝子の重複があったため、これは、１６２の有意な遺伝子の予備的セットをもたらし、これを次に、全試料にわたって有意性が調整されたｌｏｇｆｃ値（＜０．０１）において少ない分散を有する遺伝子を選別するため、及び、半分を超える試料において低い絶対的な有意性が調整されたｌｏｇｆｃ値を有する遺伝子、を選別するために処理し、すなわち、１３の試料のうち少なくとも７の試料において＜０．１の絶対的なｌｏｇｆｃを有する遺伝子を除いた。結果として生じる遺伝子のリストは１０７の遺伝子を含み、これは、図３の有意な遺伝子のセット６０に相当した。
【００３８】
図６を参照すると、ｐＣＲ患者と非ｐＣＲ患者とを区別する選ばれた分類器は、収縮重心分類器であり、さらに、図３の分類器のトレーニング６２を、上記１０７の遺伝子を用いて開始した。三分割交差確認を行い、それを１０回繰り返した。収縮重心分類器の能力を使用して、収縮閾値の結果を同定した。図６において見られるように、トレーニングされた分類器は、重心の「収縮」が約５０の遺伝子を除き、６１の遺伝子の分類器をもたらした後に不安定性を示し始める。図６の上部において示されている誤分類エラーは、三分割交差確認戦略を使用して計算され、ここで、患者試料のサブセットが分類器をトレーニングするために選ばれ、さらに、残りの試料は、分類器の能力をテストするために使用される。従って、より少ない数の遺伝子がシグネチャーに含まれ、誤分類エラーが増えるに従い、シグネチャーがｐＣＲを予測することにおいてより効果的ではなくなるという示唆に富んでいる。従って、上記１０７の遺伝子から少なくとも６１の遺伝子を選ぶことは道理にかなっており、さらに、図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃは、その６１の遺伝子のシグネチャーを示しており、遺伝子は、そのシグネチャーへの寄与レベルに従って順序づけられており、最も情報価値のある遺伝子が上に列挙されている。
【００３９】
このように、分類器は、好ましくは、少なくとも６１の遺伝子を有するということがわかった。６１未満の遺伝子を有する分類器は、有用であり続けるが、ｐＣＲを予測することにおいてエラーをもたらすより高い可能性を経験する。ｐＣＲと関連するほとんどの遺伝子の重心は負であり、これは、ＴＧＦ−β活性の下方制御の示唆に富んでおり、さらに、ベバシズマブへの短期間曝露後のＴＧＦ−β活性の下方制御がｐＣＲと関連しているということを示していることがわかった。
【００４０】
トレーニングされた収縮重心分類器（図３のトレーニングされた分類器６４に相当する）は、表１並びに図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃに列挙される６１の入力遺伝子のセットに対して作動し、ここで、列挙された遺伝子は、ＲｅｆＳｅｑ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＲｅｆＳｅｑ／）と呼ばれる標準的な供給源において定められている。表１において、６１の遺伝子が、「非ｐＣＲグループ」に対して及び「ｐＣＲグループ」に対して収縮重心分類器によって提供された関連のレベルと共に列挙されている。関連のレベルは、分類器におけるその遺伝子の有用性の有意性に対する測定基準である。
【００４１】
【表１】
0006445451.tif 000003
0006445451.tif 000004
【００４２】
図１において概略的に示されている乳癌療法レジメンに対する例示的な実際に開発した予測結果評価テストは、分類器トレーニング動作６２に対するトレーニングデータセットとしてＲＮＡ配列決定データを利用した。従って、この分類器の臨床的使用は、図４のアプローチと一致している。ＲＮＡ配列決定データは、ベバシズマブの単一投与７１の前後に採取した患者の腫瘍生検試料７０、７２から取得される。ネオアジュバントベバシズマブを化学療法と組み合わせて受けることになるＨＥＲ２陰性患者は、単一生検を受けて、第１の生検試料７０を生成し、次に、ベバシズマブ単独療法の単一投与７１の後で第２の生検を受けて、ベバシズマブ単独療法７１を受けて典型的には１０〜１５日後に患者の腫瘍から採取される第２の生検試料７２をもたらすことになる。ＲＮＡ配列決定は、図４の動作２４、３４に従って腫瘍生検７０に対しても腫瘍生検７２に対しても行われる。差次的遺伝子発現分析７４が、上記ＴＧＦ−βシグネチャーにおける６１の遺伝子に対して行われ、これは、図２の動作４０、４２、４４に従って（しかし、分類器への入力として役立つ６１の遺伝子のセットに対してのみ適切に行われる）ベースラインから短期間曝露後までの遺伝子のｌｏｇ２フォールドチェンジの値をコンピュータで計算すること、及び、有意性が調整されたｌｏｇ２ｆｃ値への変換を含む。６１の遺伝子の有意性が調整されたｌｏｇ２フォールドチェンジの値のベクトルは、分類器の２つの重心と比較することによるトレーニングされた最近傍重心分類器によって処理され、さらに、患者は、最近傍重心と関連するグループ、すなわち、有意なＴＧＦｂ活性の下方制御を示すグループ、又は、有意なＴＧＦｂ活性の上方制御を示すグループに割り当てられる。患者がＴＧＦｂ活性の上方制御を示す場合、その患者は、ベバシズマブネオアジュバント治療から利益を得そうになく、さらに、ｐＣＲの予測は否定的である。一方、患者がＴＧＦｂ活性の下方制御を示す場合、その患者は、ベバシズマブネオアジュバント治療から利益を得そうであり、さらに、ｐＣＲの予測は肯定的である。
【００４３】
検証フレームワークにおいて、この遺伝子のセットは、同じ試料からのＲＴ−ＰＣＲデータとの相関関係に基づきさらに洗練させることができる。ＲＴ−ＰＣＲがＲＮＡｓｅｑと同じ試料に対して行われる場合、マッピング関数が適切に利用されて、ＲＮＡｓｅｑからの値をＲＴ−ＰＣＲの値にマップする。これは、遺伝子全てに対するリニアスケーリング関数、又は、（例えば二次関数等の）高階関数であり得る。或いは、非常によく関連する、及び、ＲＮＡｓｅｑとＲＴ＿ＰＣＲとの間でリニアマッピングを得ることができる遺伝子を、ＲＴ−ＰＣＲを使用して実行される最終的なシグネチャーにおいて使用することができる。
【００４４】
記載されるように、実際に開発した分類器を、ネオアジュバント設定におけるベバシズマブから利益を得ることができる患者を同定するために使用することができる。その先にあるものとして、分類器を、ベバシズマブに対するコンパニオン診断手段として使用することができる。一部の熟考される実施形態において、実際に開発した分類器は、腫瘍学における臨床決定支援を可能にするために、患者の配列決定データを統合するためのフレームワークであるＰＡＰＡｙＡ内のモジュールとして、すなわち、「インシリコ」アッセイとして実行されるよう熟考される。Ｊａｎｅｖｓｋｉ等による“ＰＡＰＡｙＡ：ａ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ”，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｖｏｌ．１０（Ｓｕｐｐｌ  ９）：Ｓ７（２００９）（ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１０５−１０−Ｓ９−Ｓ７）を参照されたい。
【００４５】
表１並びに図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃの６１の遺伝子のシグネチャーは、表１において（又は図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃにおいて同等に）列挙された６１の遺伝子全てを含む入力遺伝子セットを利用する具体例である。数多くのバリアントが熟考される。
【００４６】
例えば、一部の実施形態において、遺伝子シグネチャーは、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＡＴＬ２、ＣＴＧＦ、ＩＮＨＢＡ、ＩＤ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＤ１Ｅ、ＴＦＤＰ１、ＡＭＩＧＯ２、ＤＤＩＴ４、ＴＧＦＢ２、ＳＰＰ１、ＣＤ２８、ＰＭＥＰＡ１、ＦＡＴ４、ＫＤＭ６Ｂ、ＭＡＰ３Ｋ４、ＦＡＭ１６２Ａ、ＭＹＨ１１及びＰＰＰ２Ｒ１Ｂを含む群のうち少なくとも２つの遺伝子（すなわち、例示的な６１の遺伝子のシグネチャーの上から２０の最も情報価値のある遺伝子のうち少なくとも２つの遺伝子）を含む入力遺伝子セットを利用する。
【００４７】
他の実施形態において、遺伝子シグネチャーは、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＡＴＬ２、ＣＴＧＦ、ＩＮＨＢＡ、ＩＤ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＤ１Ｅ、ＴＦＤＰ１、ＡＭＩＧＯ２、ＤＤＩＴ４、ＴＧＦＢ２、ＳＰＰ１、ＣＤ２８、ＰＭＥＰＡ１、ＦＡＴ４、ＫＤＭ６Ｂ、ＭＡＰ３Ｋ４、ＦＡＭ１６２Ａ、ＭＹＨ１１及びＰＰＰ２Ｒ１Ｂを含む群のうち少なくとも３つの遺伝子（すなわち、例示的な６１の遺伝子のシグネチャーの上から２０の最も情報価値のある遺伝子のうち少なくとも３つの遺伝子）を含む入力遺伝子セットを利用する。
【００４８】
他の実施形態において、遺伝子シグネチャーは、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＡＴＬ２、ＣＴＧＦ、ＩＮＨＢＡ、ＩＤ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＤ１Ｅ、ＴＦＤＰ１、ＡＭＩＧＯ２、ＤＤＩＴ４、ＴＧＦＢ２、ＳＰＰ１、ＣＤ２８、ＰＭＥＰＡ１、ＦＡＴ４、ＫＤＭ６Ｂ、ＭＡＰ３Ｋ４、ＦＡＭ１６２Ａ、ＭＹＨ１１及びＰＰＰ２Ｒ１Ｂを含む群のうち少なくとも３つの遺伝子（すなわち、例示的な６１の遺伝子のシグネチャーの上から２０の最も情報価値のある遺伝子のうち少なくとも３つの遺伝子）を含む入力遺伝子セットを利用する。
【００４９】
他の実施形態において、遺伝子シグネチャーは、少なくともＣＤＫＮ２Ｂ、ＡＴＬ２、ＣＴＧＦ、ＩＮＨＢＡ、ＩＤ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＤ１Ｅ、ＴＦＤＰ１、ＡＭＩＧＯ２及びＤＤＩＴ４（すなわち、少なくとも例示的な６１の遺伝子のシグネチャーの上から１０の最も情報価値のある遺伝子）を含む入力遺伝子セットを利用する。
【００５０】
一部の実施形態において、経路の観点が考慮され、さらに、遺伝子シグネチャーは、ＴＧＦ−βシグナル経路に属する入力遺伝子セットを利用する。そのような一部の実施形態において、ＴＧＦ−βシグナル経路に属する入力遺伝子セットは、少なくともＣＤＫＮ２Ｂ、ＩＮＨＢＡ、ＩＤ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＤ１Ｅ、ＴＦＤＰ１、ＴＧＦＢ２、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ、ＬＴＢＰ１及びＰＰＰ２ＣＡを含む。これらの遺伝子は、マンホイットニーのアプローチにおいても見られ、表１並びに図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃの例示的な６１の遺伝子のシグネチャーに属する。別の実施形態において、ＴＧＦ−βシグナル経路に属する入力遺伝子セットは、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＩＮＨＢＡ、ＩＤ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＤ１Ｅ、ＴＦＤＰ１、ＴＧＦＢ２、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ、ＬＴＢＰ１及びＰＰＰ２ＣＡの群のうち少なくとも３つの遺伝子を含む。一部の実施形態において、ＴＧＦ−βシグナル経路に属する入力遺伝子セットは、ＴＧＦ−βシグナル経路に属する少なくとも６１の遺伝子を含む。
【００５１】
実際に開発した予測結果評価テストは実例である。より一般的には、図２及び３を参照して本明細書において記載されるテスト開発のアプローチは、シスプラチン、カルボプラチン、ナノ粒子アルブミン結合パクリタキセル又はドセタキセル等のいかなる化学療法薬と組み合わせてベバシズマブ等のネオアジュバント治療薬を含むいかなる腫瘍学的な治療レジメンに対するｐＣＲも予測するために適切に適用される。本明細書において開示されるように、ベースライン生検試料及び反応生検試料が、最初の用量のネオアジュバント治療薬の投与前後に、集団の各研究対象に対して取得される。ベースライン生検試料及び反応生検試料は処理され、例えば少なくとも１０００の遺伝子、より好ましくは少なくとも１０，０００の遺伝子等、多くの数の遺伝子に対して、それぞれベースラインの遺伝子発現レベル情報及び反応の遺伝子発現レベル情報が生成され、さらに、ベースラインの遺伝子発現レベル情報と反応の遺伝子発現レベル情報とを比較する差次的遺伝子発現レベル情報が、各研究対象に対して計算される。分類器が、次に、集団の研究対象に対して計算された差次的遺伝子発現レベル情報を、トレーニングデータとして使用して適切にトレーニングされ、入力遺伝子セットに対する受信した差次的遺伝子発現レベル情報に基づきコンピュータで計算されたｐＣＲ予測を出力するトレーニングされた分類器が生成される。
【００５２】
本発明は、好ましい実施形態を参照して記載されてきた。明らかに、上述の詳細な説明を読み理解した後、修正及び変更が他の者の心に浮かぶはずである。本発明は、付随の特許請求の範囲又はその同等物内にある限りではそのような修正及び変更を全て含むとして解釈されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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