(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路形成部材の流路内において、少なくとも第１液と複数の分子が混合された第２液とが接触した状態で当該第１液および当該第２液を液送させる液送ステップと、
前記流路内で接触された前記第１液と前記第２液とが互いに拡散したときの当該第２液の合計濃度分布を測定する測定ステップと、
前記測定ステップで測定された前記合計濃度分布に基づいて前記第２液を構成する前記複数の分子の分子量分布を算出する分子量分布算出ステップと
を有することを特徴とする分子量分布測定方法。
【請求項２】
請求項１記載の分子量分布測定方法において、
前記測定ステップは、前記流路形成部材の流路壁面近傍の前記合計濃度分布を測定する
ことを特徴とする分子量分布測定方法。
【請求項３】
請求項１記載の分子量分布測定方法において、
前記流路形成部材は、液送方向とは直交する断面のアスペクト比が１よりも大きい
ことを特徴とする分子量分布測定方法。
【請求項４】
流路が形成された流路形成部材と、
前記流路内において、少なくとも第１液と複数の分子が混合された第２液とを接触させた状態で当該第１液および当該第２液を液送させる液送部と、
前記流路内で接触された前記第１液と前記第２液とが互いに拡散したときの当該第２液の合計濃度分布を測定する測定部と、
前記測定部で測定された前記合計濃度分布に基づいて前記第２液を構成する前記複数の分子の分子量分布を算出する分子量分布算出部と
を備えることを特徴とする分子量分布測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子量分布測定方法および分子量分布測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子量の測定は、化学分析、有機合成、工業的化合物生産、生化学実験操作で基本的に重要である。有機合成や工業的化合物生産では、分子量が合成物の評価の指標である。生化学実験操作では、基本的には直鎖ポリペプチドであるタンパク質、直鎖ポリデオキシリボ核酸であるＤＮＡ分子の切断、連結操作に伴う分子量の変化を確認することによって、多段階操作の各段階の成功を確認するためにも分子量は重要である。
【０００３】
また、化学反応による生成物から目的分子を単離するにはクロマトグラフィーを使うことが主流である。クロマトグラフィーでは、分子の大きさとカラム充填剤の網目との相互作用でカラム中を分子が移動する速度が異なる。この結果、保持時間（Retention）が分子量に応じて異なり、インジェクションから溶出までの時間の差に基づいて分子を分離することができる。
【０００４】
一般にクロマトグラフィーでは、分離される分子と、カラム（容器）の壁または充填剤との相互作用によって分子が分離される。例えば、ゲルクロマトグラフィーでは、ゲル（充填剤）の網目の大きさと分離される分子のサイズとによる相互作用によって、小さな分子ほど自由区間体積が大きいために滞留時間が長くなる。その結果、分子量が大きな分子ほど早くカラムを通過するために、分子量による分子の分離を行うことができる（例えば非特許文献１を参照）。
【０００５】
また、ゲル電気泳動法では、電場によって荷電した分子が泳動し、アクリルアミド高分子（充填剤）のマトリクスを分子が通過するときに、大きな分子はマトリクスに阻害されて移動度が小さくなり、小さな分子は移動度が大きくなる。
【０００６】
分子量の異なる複数の分子が混合した混合物のサンプルを、ゲルの一点から泳動させた場合、分子の分子量に応じて移動速度が異なるので、一定の時間だけ電気泳動させると、分子量に応じた位置に分子が停止する。その停止した分子を染色や蛍光法で検出すれば、泳動開始点からの分子の移動距離に基づいて分子量を測定することができる。
【０００７】
分子量を決定するには、分子量が既知のサンプル（以下、これを「分子量マーカー」と呼ぶ。）を同時に泳動させ、その停止位置と、測定対象の分子の停止位置とを比較する。この場合、分子量マーカーおよび測定対象の分子を同じ条件で泳動させ、泳動停止後に停止位置をそれぞれ測定する必要がある。
【０００８】
このように、従来のクロマトグラフィーによる分子の分離では、分離すべき分子（以下、これを「被分離分子」と呼ぶ場合がある。）を含む混合物のサンプルをカラムまたはカラム状の流路に上流から流し、被分離分子と、カラム内に固定された固定相（充填剤）との相互作用による移動速度の差を利用して分子を分離している。
【０００９】
この相互作用が続く限り、分子の移動速度の差が継続するため、長距離または長時間カラム中を移動させると、その分だけ分子量に応じた分子の移動距離の差が長くなるため、その移動距離の差に基づいて分子量差の小さな分子であっても分離できるようになる。その一方で、分子ごとの拡散と移動速度の分散による効果で時間が経過すると同じ分子量であっても溶出時間の分布が広がる。
【００１０】
このため、複数の分子が混合したサンプルをクロマトグラフィーで分離して、複数の分子それぞれの分子量を決定するためには、カラムの長さ、移動速度の分散の効果を考慮して実験条件を決定する必要がある。
【００１１】
クロマトグラフィーにおいては、カラムで生じた分子の濃度分布をカラムの出口に設置したセンサーで検出する。このセンサーには、吸光度、蛍光強度、化学発光強度、屈折率、電気化学活性、電導度を測定する方式がある。
【００１２】
それぞれ被測定分子の性質や、分子に予め標識分子を結合させることによって分子が測定される。標識分子を使うと高感度に分子の濃度分布を測定できるが、被測定分子が未知または標識反応の効率が不明の場合には、標識による測定は困難になる。
【００１３】
吸光による方法では、被測定分子に吸収がある波長を選択する必要があるが、被測定分子によって適する波長が異なるため、広帯域の分光光度計が必要になる。被測定分子によって吸光係数が大きく異なるので、吸光度から濃度を求めるには、あらかじめ目的分子の吸光係数が既知である必要がある。
【００１４】
また、吸光度で感度を上げるためには、光路長を長くする必要があるが、光路長を長くすると、その分だけ体積が必要となり、また長くした光路長分だけ濃度が平均化されるために、カラム中では分離されているが、カラムの出口の検出器の信号ではこれより低い分解能で測定されてしまう。
【００１５】
電気化学的検出方法では、電気化学活性の高い分子は高い感度で検出できるが、それ以外の電気化学活性の低い分子は検出できないため、被測定分子が制限されてしまう。
【００１６】
屈折率測定では、屈折率が溶液の濃度にほぼ比例するために、被測定分子の種類に制限することなく分子の濃度を測定できる。このために、未知の分子を含んで混合したサンプルの分子量分布を測定するために適当である。また、全反射光学系を使った測定では、反射点ごとに濃度を測定できるため、カラム中で分離された分子の情報を欠落させることなく分子量分布を測定できる。
【００１７】
クロマトグラフィーでは、カラムの途中部分で分子の分離が進行するが、その過程は測定されず、出口の一点で溶出した分子の濃度の時間変化を測定し、その波形（クロマトグラム）から分子量分布を測定する。
【００１８】
サンプルが単一の分子であったり、分離の結果、他の分子と十分に分離して溶出時には単一の分子が順に検出器に流れるような場合には、検出器で計測される被測定分子の濃度の時間変化（クロマトグラム）はピーク状になる。電気泳動では、泳動パターンによりピーク状の結果が得られるので、クロマトグラムの場合と同様である。
【００１９】
分子量が近い二つの分子が十分に分離されずにカラムを通過し、検出器に到達する場合には、検出器で記録される濃度パターンは、ピークが重畳したようなクロマトグラムが得られる。
【００２０】
重なりのあるピークでは、分子量の決定が困難になるので、カラムの充填剤、流速、サンプルの体積などを最適化して、ピークが重ならないように、分離操作を行う必要がある。ゲル電気泳動の場合でも、ゲルの組成を変えることで、同様に分離性能を上げる操作が必要となる。
【００２１】
クロマトグラフィーにおいても、ゲル電気泳動においても、充填剤の充填された空間をサンプルが流れる間に分子の分離が行われるため、分解能を上げるにはカラム中の滞留時間を長くする必要があり、分析時間を短縮することができない。
【００２２】
そのため、クロマトグラフィーでは、液送のための圧力を上げることによって流速を上げている。このために、高圧を発生できるポンプとその圧力に耐えられるカラム、液送用接続部品が必要になる。
【００２３】
電気泳動では、電圧を上げることによって泳動速度を上げることができるが、同時に電流も増え、そのため温度が上昇したり、電極での反応が激しくなり、安定した泳動が困難になる。このように、クロマトグラフィーや電気泳動などにおいては、混合物や未知の試料の分子を分子量で分離したり、その分子の分子量を測定するには多くの時間を要する。
【００２４】
そこで、キャピラリーカラムの内部を充填剤で充填することなく、流路を流し去るフロースルー型の流路で分子量による分子の分離を行う方法が提案されている（非特許文献２を参照。）。
【００２５】
この非特許文献２では、高さ1[um]、幅0.5[mm]、69[mm]長のマイクロ流路を作製し、 直径が155[nm]以下の粒子（分子）と安息香酸とを混合した混合物のサンプルをインジェクターからマイクロ流路に注入し、マイクロ流路の出口に設置した紫外線吸収検出器（ＵＶ検出器）で溶出パターンを測定した結果、直径の大きな粒子（分子）から順に流出し、安息香酸が最後に検出されることを示している。
【００２６】
これは、直径の大きな粒子（分子）は壁面に近づけず、線流速の速い、より中心部分を流れるために、先に溶出されるからである。このような、フロースルー型の方法はハイドロダイナミッククロマトグラフィー（HDC）と呼ばれる。
【００２７】
また、非特許文献３では、流路の断面のアスペクト比が１に近いＨＤＣで粒子（分子）を分けるには、粒子（分子）のサイズは、流路高さ、あるいは、ＨＤＣのカラムの直径の数パーセントより大きい必要がある。
【００２８】
その一方、アスペクト比が大きい流路では、流路高さや動径方向の拡散の方が粒子（分子）のサイズよりも支配的に働き、外部との化学的な相互作用なしに、拡散と流れの効果だけで分子の分離が起きる。
【００２９】
その結果、単純な理論通りに分子の分離が実際に起こり、例えば内径 150[um]、長さ0.3[m]のキャピラリーカラムで、220[nm]の光吸収検出器を用いてヨウ素イオン（分子量１２７）と硝酸イオン（分子量６２）の分離が１００秒程度でできるとしている。また、アスペクト比の大きなＨＤＣでは化学的な相互作用を使わないので、その反応にかかる時間が必要なく、流速を上げることができ、短時間、短距離で分子を分離できるとしている。
【００３０】
このように、ＨＤＣを用いて高速な分子の分離が期待されるが、充填カラムを用いる液体クロマトグラフィーと比較すると分離性能が低く、それに比べると実現されたＨＤＣの高速性や簡便性はその分離性能が低いというデメリットをカバーできなかった。
【００３１】
このＨＤＣはいわゆるTaylor dispersionを基本とする測定法である。一方、本出願による特願2014-090269では、流路の壁面での濃度を測定することにより、短時間かつ短い流路で分子量（または拡散係数）を測定できる技術を開示している。
【００３２】
この技術では、拡散係数を測定する従来のTaylor dispersion法が、溶質が平均流速で移動する状態になった後の流れ方向の溶質の空間分散を指標にして測定していたのに対して、流路壁面近傍での溶質の移動速度から拡散係数を測定することができる。
【００３３】
具体的には、溶媒で満たされた流路に溶液を注入すると、流路の中心付近では、溶質は流れにのって移動するので流路断面の中で最も高速に移動する。その後、拡散によって減速し、最終的には中心線流速の２／３の速度で移動する。
【００３４】
一方、流路壁面付近では、ゼロスリップコンディションにより流れの速度がゼロなので、溶質は移動しない。しかし、先行する流路中心部分からの拡散によって濃度が変化するため、溶質が進行し始める。したがって、壁面では溶質の速度は０から加速し、最終的には流路中心と同じ中心線流速の２／３まで加速する。
【００３５】
この濃度変化の過程は拡散に依存するので、壁面で溶質が移動するときの加速度から溶質の拡散係数を求めることができる。また、流路出口には、拡散係数に依存する時間で溶質が到達する。
【００３６】
ここで、拡散係数は、分子量と単純な傾向の相関があり、分子量が小さく拡散係数が大きいと速く拡散し、分子量が大きく拡散係数が小さいと遅く拡散するように、分子量によって流路を流れ去る時間が異なるため、分子量に応じてサンプルの溶出時間が異なると言える。したがってこの技術で、拡散係数を求めれば、ＨＤＣの高速性・簡便性を上回る性能を持ちながら、求めた拡散係数に基づいて分子を分子量ごとに分離できる可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００３７】
【非特許文献１】Giddings, J. C., Unified Separation Science. John Wiley and Sons: 1991.
【非特許文献２】Blom, M. T.; Chmela, E.; Oosterbroek, R. E.; Tijssen, R.; van den Berg, A., On-Chip Hydrodynamic Chromatography Separation and Detection of Nanoparticles and Biomolecules. Analytical Chemistry 2003, 75 (24), 6761-6768.Chmela, E.; Tijssen, R.; Blom, M. T.; Gardeniers, H. J. G. E.; van den Berg, A., A Chip System for Size Separation of Macromolecules and Particles by  Hydrodynamic Chromatography. Analytical Chemistry 2002, 74 (14), 3470-3475.
【非特許文献３】非特許文献Okada, T., HYDRODYNAMIC CHROMATOGRAPHY IN NARROW AND WIDE-BORES; WHETHER RADIAL DIFFUSION IS ESSENTIAL OR NOT. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 2010, 33 (9-12), 1116-1129.
【非特許文献４】Taylor, G., Dispersion of Soluble Matter in Solvent Flowing Slowly through a Tube. Proceedings of the Royal Society of London. Series A. Mathematical and Physical Sciences 1953, 219 (1137), 186-203.）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３８】
しかしながら、特願2014-090269による技術では、純粋なサンプルを構成する１種類の分子の分子量（拡散係数）を測定するものであり、混合物を構成する複数の分子の分子量分布を測定することはできなかった。
【００３９】
本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、短時間でサンプル（第２液）を構成する複数の分子の分子量分布を測定する分子量分布測定方法および分子量分布測定装置を提案することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００４０】
本発明に係る請求項１の分子量分布測定方法は、流路形成部材（１０１）の流路（１１３）内において、少なくとも第１液と複数の分子（j）が混合された第２液とを接触させた状態で当該第１液および当該第２液を液送させる液液ステップと、前記流路（１１３）内で接触された前記第１液と前記第２液とが互いに拡散したときの当該第２液の合計濃度分布（Call）を測定する測定ステップと、前記測定ステップで測定された前記合計濃度分布（Call）に基づいて前記第２液を構成する複数の分子（j）の分子量分布（A(Q)）算出する分子量分布算出ステップとを有するようにする。
【００４１】
請求項１記載の分子量分布測定方法において、前記測定ステップは、前記流路形成部材（１０１）の流路壁面近傍の前記合計濃度分布（Call）を測定するようにする。
【００４２】
請求項１記載の分子量分布測定方法において、前記流路形成部材（１０１）は、液送方向とは直交する断面のアスペクト比が１よりも大きいようにする。
【００４３】
本発明に係る請求項４の分子量分布測定装置は、流路（１１３）が形成された流路形成部材（１０１）と、前記流路（１１３）内において、少なくとも第１液と複数の分子（j）が混合された第２液とを接触させた状態で当該第１液および当該第２液を液送させる液送部（１０６）と、前記流路（１１３）内で接触された前記第１液と前記第２液とが互いに拡散したときの当該第２液の合計濃度分布（Call）を測定する測定部（１０２）と、前記測定部（１０２）で測定された前記合計濃度（Call）に基づいて前記第２液を構成する複数の分子（j）の分子量分布（A(Q)）を算出する分子量分布算出部（１０２）とを備えるようにする。
【発明の効果】
【００４４】
請求項１および４の本発明によれば、微小な短い流路（１１３）を用い、少ない手順かつ短時間のうちに、第２液を構成する複数の分子の分子量分布（A(Q)）を算出することができる。
【００４５】
請求項２の発明によれば、流路壁面近傍の合計濃度（Call）を測定するので、流れによる影響を最も受けない部分の安定した濃度変化を測定することができる。
【００４６】
請求項３の発明によれば、流路（１１３）は、その流路断面のアスペクト比が１よりも大きいことにより、第２液が外部との相互作用なしに拡散と流れの効果だけで分子の分離を生じさせることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の実施の形態におけるＨＤＣ装置の構成を示す斜視図である。
【図２】マイクロ流路チップの構成を示す斜視図である。
【図３】屈折率Ａから屈折率Ｂへ流路の中が切り替わる状態の測定結果を示すグラフである。
【図４】マイクロ流路の主流路をモデル化したモデル図である。
【図５】第１液から第２液へ切り替わるときの初期状態を示すモデル図である。
【図６】所定時間経過後における第１液から第２液へ切り替わるときの濃度分布を示すモデル図である。
【図７】３種類の相互拡散係数Ｑで第１液（純物質の液体）と第２液（複数の分子の混合溶液）とが接触し流路を流れていく状態をそれぞれ示す時空間濃度分布を示すモデル図である。
【図８】図７の時空間濃度分布を時間微分したときの図である。
【図９】図７の時空間濃度分布を空間微分したときの図である。
【図１０】６個の個別分子を溶解した６種類のサンプル、および、３分子を混合したサンプルの時空間濃度分布を空間微分したときの図、および、３分子を混合したサンプルの分子検出結果を示す図である。
【図１１】６個の個別分子を溶解した６種類のサンプルの拡散係数分布および分子量分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
以下、本発明の実施の形態における分子量分布測定装置としてのＨＤＣ(Hydrodynamic chromatography)装置の概要について説明する。本実施の形態においては、「濃度」を「屈折率」に置き換えて測定するため、「濃度」と「屈折率」との間には一定の比例関係を有するものとして考える。また、「拡散係数」と「分子量」とは、単調で単純な関係であり、所定の関係式に基づいて互いに換算できるものとする。
【００４９】
＜ＨＤＣ装置の概要＞
このＨＤＣ装置は、流路形成部材に形成された流路の少なくとも一部を満たした第１液に対して、２種類以上の複数の分子を混合した第２液が接触された後、当該第１液および当該第２液が流路を液送されながら互いに拡散したときの第２液に含まれている複数の分子の合計の濃度（以下、これを「合計濃度」と呼ぶ。）を測定し、非負最小二乗法等の所定の成分濃度計算方法によって、第２液に含まれている複数の分子の分子量ごとの濃度の分布（分子量分布）を算出するものである。
【００５０】
＜ＨＤＣ装置の構成＞
図１に示すように、拡散係数の測定を行うＨＤＣ装置１００は、流路形成部材としてのマイクロ流路チップ１０１と、当該マイクロ流路チップ１０１を載置した状態で接続された屈折率測定装置１０２と、ＦＥＰ（フッ素樹脂）チューブ１０３によりマイクロ流路チップ１０１の大気解放された液体導入穴１１０と接続される注入装置としての液体分注装置１０４と、当該ＦＥＰチューブ１０３によりマイクロ流路チップ１０１の液体排出穴１１１と気密状態のまま接続された気液分離装置１０５と、当該気液分離装置１０５とＦＥＰチューブ１０３により接続された液送開始装置としての圧力制御ポンプ１０６とによって構成されている。
【００５１】
図２に示すように、マイクロ流路チップ１０１は、主流路１１３の一端に液体導入穴１１０が形成されるとともに主流路１１３の他端に液体排出穴１１１が形成されている。なお、液体導入穴１１０、主流路１１３、および、液体排出穴１１１により、全体として非常に微小な流路（以下、これを「マイクロ流路」と呼ぶ。）１１２が構成されている。
【００５２】
主流路１１３の流路形状は、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を使った鋳型法で作成されている。具体的には、主流路１１３は、アスペクト比が１よりも大きい100[μm]×1[mm]程度の単純な直方体形状で、かつ、その流路長は5[mm]程度である。ただし、これに限るものではない。なお、このマイクロ流路チップ１０１は、ガラス（ＢＫ７）の基板とマイクロ流路１１２とを接着して構成されている。
【００５３】
屈折率測定装置１０２は、全反射光学系の屈折率測定装置であり、イメージセンサ等のカメラ部１２０を主流路１１３の鉛直方向下方に備えている。したがって屈折率測定装置１０２では、マイクロ流路１１２の主流路１１３の中心線に沿った壁面近傍位置の屈折率（濃度）を測定部としてのカメラ部１２０により測定する。なお、屈折率測定装置１０２は、主流路１１３の壁面近傍位置の屈折率（濃度）を測定するため、主流路１１３の流れによる影響を最も受けない部分の安定した濃度変化を測定することができる。
【００５４】
屈折率測定装置１０２は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）型または臨界角あるいはブリュースター角測定型の装置を用いることができる。ＳＰＲ型の場合には、マイクロ流路１１２の屈折率測定装置１０２側の壁面に金属膜が必要である。
【００５５】
また、気液分離装置１０５は、気体と液体とを分離する装置である。液体分注装置１０４は、液体導入穴１１０に対して液体を所定のタイミングで供給する装置である。
【００５６】
なお、屈折率測定装置１０２は、ＣＰＵ(Central Processing Unit)、メモリ、インタフェース等からなるコンピュータ（ハードウェア）にコンピュータプログラム（ソフトウェア）をインストールすることによって実現され、当該屈折率測定装置１０２における拡散係数の算出部等の機能部については、コンピュータの各種ハードウェア資源とコンピュータプログラムとが協働することによって実現される。また、コンピュータプログラムは、コンピュータ読取可能な記録媒体や記憶装置に格納された状態で提供されても良く、或いは電気通信回線を介して提供されても良い。
【００５７】
＜インジェクション＞
このような構成のＨＤＣ装置１００において、第１液と第２液とを接触させる方法について説明する。ＨＤＣ装置１００では、マイクロ流路１１２における主流路１１３の体積の１０倍となる水を液体分注装置１０４により液体導入穴１１０に滴下し、圧力制御ポンプ１０６により一定の圧力で吸引すると、主流路１１３内を所定の圧力状態にすることができ、その圧力状態に応じた液速で液体（水）が主流路１１３の中を流れ、主流路１１３を満たした後、気液分離装置１０５に達する。液体は気液分離装置１０５の底に溜まり、圧力の制御に必要な気体が圧力制御ポンプ１０６に達する。
【００５８】
なお、ＨＤＣ装置１００では、気液分離装置１０５と圧力制御ポンプ１０６とが分離された状態で用いられているが、これに限るものではなく、液体の圧力も制御可能な圧力制御ポンプが液送開始装置として用いられるようにしても良い。
【００５９】
主流路１１３を液体（水）が満たした状態で、液体分注装置１０４によりマイクロ流路１１２における液体導入穴１１０に屈折率Ａの第１液（溶媒）を滴下する。第１液は、純物質の液体である。ただし、これに限るものではなく、第１液は、混合物、ブロッキング剤を含む溶液であってもよい。
【００６０】
第１液を滴下すると、先にマイクロ流路１１２の入口まで満たしていた液体（水）と接触し、このため著しく表面張力が低下し、圧力制御ポンプ１０６の圧力により液送され始める。
【００６１】
液体導入穴１１０のサンプル（第１液）の体積が徐々に減り、その水面がマイクロ流路１１２の入り口（液体導入穴１１０と主流路１１３との接続点）まで下がると、第１液の表面張力と圧力制御ポンプ１０６の圧力とがバランスし、それ以上は第１液が動かなくなる。
【００６２】
このときに屈折率測定装置１０２のカメラ部１２０により主流路１１３の屈折率を測定すると、第１液の屈折率Ａに相当する値が当該主流路１１３と平行な測定軸Ｚに沿って均一に測定される。これは主流路１１３が第１液で満たされているからである。
【００６３】
＜第１液および第２液の接触および液送＞
次に、屈折率測定装置１０２において、１/１５０秒毎に屈折率の時間変化を測定できるようにカメラ部１２０を設定する。この設定において、液体分注装置１０４により液体導入孔１１０に屈折率Ｂの第２液を滴下すると、このときも、圧力制御ポンプ１０６の圧力により第２液の送液が開始される。すなわち、第１液および第２液を接触させた後に当該第１液および第２液を主流路１１３内で液送させる。なお、主流路１１３において、第１液を液送している最中に、その主流路１１３に第２液を滴下し、第１液と第２液とを接触させた状態で液送させるようにしてもよい。
【００６４】
ここで、第２液は、第１液を同じ組成比で含んでいる必要がある。この場合、第２液は、第１液に塩化ナトリウム(Nacl)、アプロチニン(Aprotinin)、免疫グロブリンG(IgG)の３分子を含んだ屈折率Ｂの溶液とする。
【００６５】
このとき屈折率測定装置１０２では、図３（Ａ）に示すように、屈折率Ａから屈折率Ｂに主流路１１３の中が切り替わる状態を観測することができる。この場合、屈折率Ａ、Ｂについては、屈折率Ａよりも屈折率Ｂの方が高い。図３（Ａ）では時間をＸ軸に、主流路１１３中での上流から下流への位置をＹ軸に、屈折率の時間変化をＺ軸に表示している。
【００６６】
また屈折率測定装置１０２では、図３（Ｂ）に示すように、主流路１１３の屈折率観測範囲（Ｙ軸）の中心では、最初に第１液の屈折率Ａを観測し、屈折率Ｂの第２液の流れの到着から時間経過とともに屈折率Ｂを観測するという変化の状態を観測することができる。なお、図３（Ｂ）では、屈折率を屈折率に比例するSPR angleと記述する。
【００６７】
＜拡散係数と合計濃度時空間分布との関係＞
ここで、拡散係数と合計濃度時空間分布との一般的な関係について説明する。この場合、１種類の分子が含まれた第２液を対象とし、図１に示されたようなＨＤＣ装置１００と同じ形状の流路モデルを構築し、OpenFOAMのInter Mixing Foam（例えば、非特許文献４を参照）を用いて、合計濃度分布（時空間分布）を計算した。
【００６８】
図４に示すように、ＨＤＣ装置１００の主流路１１３をモデル化した流路２００を用い、この流路２００の両端に一定の圧力をかけ、かつ、第１液と第２液の相互拡散係数を設定し、溶質濃度の時空間分布を計算した。
【００６９】
初期状態として、流路２００に第１液が充填された後に第２液が注入され、当該流路２００において停止していた流れが再開した時点から計算を開始し、流路２００内で第１液が第２液に切り替わる状態を計算した。ここで、計算対象の形状を簡素化するために、第２液は同じ形の流路に予め入っているものとし、流路入口面２０１は単一の断面形状の直方体型流路の途中にあるものとする。
【００７０】
計算は効率化のために二次元で行い、流路２００の幅が無限大の平行平板であると設定し、流路２００の下面での物質濃度勾配が「０」であり、壁面の滑りもない（non slip ）境界条件を設定した。また、流路２００の上方向では対称性を設定し、当該流路２００の半分の厚さ（高さ）で計算するものとする。以下の図では、この半分の厚さの計算結果を示す。
【００７１】
図５（Ａ）に示すように、初期状態では、第１液が流路２００の大半を占め、第２液が流路入口面２０１の上流に配置されている。この場合、第２液と第１液とが流路長手方向（液送方向）に対して垂直な境界面で接していることが分かる。また図５（Ｂ）では、屈折率の測定対象となる流路２００の下面での第２液の分率（濃度）が示されている。
【００７２】
図６（Ａ）に示すように、時間が経過すると、流路２００の両端にかけられた圧力によって第１液と第２液とが流路２００の下流方向へ流れていく。その際、相互拡散係数Dmによって溶媒の第１液と溶液の第２液が混合しながら流れていく。この計算では、第１液および第２液しかないので、第１液から第２液への相互拡散係数Dm1と、第２液から第１液への相互拡散係数Dm2とは一致しているものとする。
【００７３】
この計算では、流路２００が全長500[μm]と短いとすると、時間についても開始から0.1[s]までの間に流路２００を流れ切るので、流路２００の断面では第１液と第２液とが均一にはなり切らずに下流方向へ流れていくことが分かる。また、拡散による混合と断面内流速分布のために、流速が最大である流路中心（図６（Ａ）の上方）で先に境界面が下流方向へ移動していることが分かる。
【００７４】
この場合、流路２００の下面では、壁面での流速が「０」で滑りがない境界条件を仮定しているので（ゼロスリップを仮定しているので）、図６（Ａ）の下方の流路２００の下面（壁面）では液体の移動速度である流速が「０」である。
【００７５】
しかし、流路２００の下面でも、液液境界が下流方向へ移動している。これは、流路２００の流れ方向とは垂直な方向にも第１液と第２液とが拡散によって混ざりながら流れるからである。図６（Ｂ）のグラフでは、流路２００の壁面における第２液の濃度分布が広範囲に広がっていることが分かる。
【００７６】
この流路２００の流路モデルでは、粘性係数が共通な第１液と第２液とが接触し、その粘性が変化することなく混合され、層流で流路２００の下流方向へ流れながら混ざる。
【００７７】
計算では、単純化するために、第１液および第２液は両方とも純粋な溶媒で単一の相互拡散係数Dm（第１液の拡散係数Dm1＝第２液の拡散係数Dm2）で混合されるものであるとし、計算により、その混合割合を濃度と読み替えて、その混合割合（濃度）を流路２００内の流れ方向の各位置と時間とに基づいて求める。
【００７８】
なお、層流での流速は粘度に依存するが、拡散係数には依存しない。また、この計算では、粘性は不変であるとし、層流で流れるような流路形状を仮定しているので、流速の分布は相互拡散係数Dmの設定にかかわらず同じになる。
【００７９】
粘度は、溶液の濃度を下げることにより、無視できるようになる。また、混合溶媒としての第１液の成分を調整し、第２液の溶質を第１液に溶解させれば、粘度の差を小さくすることができる。さらに、粘度が既知の場合には、数値計算によって、その粘度の場合の濃度分布を求めることができる。
【００８０】
＜第２液の合計濃度分布の測定＞
一方、同一濃度(f)を有する複数の分子が混合された第２液を対象とした場合に、屈折率測定装置１０２のカメラ部１２０により測定される第２液の合計濃度分布について説明する。
【００８１】
ここで、第１液の濃度分布について、第１液の相互拡散係数「Dm1」を用いると、主流路１１３の各地点（y,z）および各時間(t)での第１液の濃度分布は「c(y,z,t,Dm1)」で表すことができる。
【００８２】
また、第２液が同一濃度(f)を有する複数の分子の混合溶液であるため、第２液を構成する各分子(j)の第１液との相互拡散係数を「Dm(j)」とし、この「Dm(j)」が各々独立であるとすると、第２液の合計濃度分布Callは、次の（式１）で表すことができる。なお、各分子(j)において、j=1〜n、nは２以上の整数である。
【００８３】
Call＝Σjf*c(y,z,t,Dm(j))……………………………………………………………（式１）
【００８４】
ここで、「f」は分子(j)に依存しない同一の濃度値（固定値）、「y」は主流路１１３の流れ方向の位置、「z」は主流路１１３の高さ方向の位置、「ｔ」は時間である。また、c(y,z,t,Dm(j))は、第２液を最高濃度で規格化したときの各地点（y,z）および各時間(t)での各分子(j)の濃度分布である。すなわち、濃度分布c(y,z,t,Dm(j))で表される濃度値は、０〜１までの値となる。
【００８５】
つまり、第２液の合計濃度分布Callは、単一の分子(j)の相互拡散係数Dm(j)で計算した第２液の各分子(j)の濃度分布c(y,z,t,Dm(j))の総和なる。第１液および第２液の相互拡散係数Dm(j)が異なる溶質間では、相互に拡散係数が影響するので、第２液が高濃度では厳密には成立しない場合があるが、その他の場合の低濃度ではより良く成立する場合が多い。
【００８６】
＜分子量分離＞
さらに、第２液が濃度の異なる複数の分子(j)（ここで、j=1〜n）の混合物であったり、複数の分子(j)の分子量分布を持ったポリマーであった場合には、単一な分子量の各分子(j)の濃度をA(j)とすると、第２液の合計濃度分布Callは、次の（式２）で表すことができる。なお、分子(j)の濃度A(j)は、非負の値である。この場合、分子（j）の濃度A(j)は、分子の種類(j)によって変化するものとする。
【００８７】
Call＝ΣjA(j)*c(y,z,t,Dm(j))…………………………………………………………（式２）
この場合、屈折率測定装置１０２のカメラ部１２０により取得される第２液の合計濃度分布Callの測定値と、屈折率測定装置１０２の算出部により計算される第２液の濃度分布c(y,z,t,Dm(j))の値とに基づいて、非負最小二乗法等の成分濃度計算方法により、分子(j)の濃度A(j)を求めることができる。
【００８８】
ここで、第２液の濃度分布c(y,z,t,Dm(j))が求められると、第２液に含まれている各分子(j)の種類とその分子量は既知なので、各分子(j)を分子量と濃度A(j)との時空間濃度分布で表すことが可能となる。すなわち、第２液の濃度分布c(y,z,t,Dm(j))に基づいて分子(j)を分子量で分離できたことになる。
【００８９】
＜分子量分布＞
次に、第２液の分子量分布A(Q)を算出する方法について説明する。分子(j)の濃度A(j)は、連続的に分布していると考えてもよく、各分子(j)の種類とその分子量が既知であり、各分子(j)の分子量に基づいて連続的に表すことができるので、第２液の合計濃度分布Callは、次の（式３）で表すことができる。
【００９０】
Call＝∫A(Q)*c(y,z,t,Q)dQ…………………………………………………………（式３）
ここで、A(Q)は、第２液の分子量分布であり、非負の値である。また、「Q」は、第２液の分子(j)の相互拡散係数を表す積分変数である。
【００９１】
この（式３）による積分は、第２液に含まれている複数の分子(j)の相互拡散係数Qを用いて行う。（式３）における第２液の各分子(j)の濃度分布c(y,z,t,Q)は、任意の分子(j)の拡散係数Qに基づいて屈折率測定装置１０２の算出部による数値計算により求めることが可能である。
【００９２】
第２液の合計濃度分布Callは、上述したように全反射光学系の屈折率測定装置１０２のカメラ部１２０によって測定可能な測定値である。（式３）において、第２液の各分子(j)の濃度分布c(y,z,t,Q)は、主流路１１３の流路壁面の値であるため、z=0であり、濃度分布c(y,0,t,Q)となる。
【００９３】
この場合、第２液の合計濃度分布Callは、屈折率測定装置１０２のカメラ部１２０により２次元の配列（画像）として測定される。その際、各地点（y,z）において測定された１つ１つの画像は、その地点における第２液の各分子(j)の濃度分布c(y,z,t,Q)である。
【００９４】
したがって、屈折率測定装置１０２において、カメラ部１２０による測定時間間隔と主流路１１３の被測定部分の長さとを調節することにより、第２液の合計濃度分布Callを表す時空間濃度分布（画像）を高分解能で取得することができる。
【００９５】
第２液の各分子(j)の濃度分布c(y,0,t,Q)と、屈折率測定装置１０２により取得される第２液の合計濃度分布Callとが既知なので、非負最小二乗法等を用いた所定の成分濃度計算方法（数学的計算手法）により、第２液の分子量分布A(Q)を推定することが可能である。このようにして、第２液の分子量分布A(Q)を算出することができるのである。
【００９６】
具体的には、図７（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、縦軸ｙの４００の位置で第１液と第２液とが接触し、その後、主流路１１３を流れていく様子が、拡散係数Qが1e-8[m2/s]、1e-9[m2/s]、1e-10[m2/s]ごとに示されている。
【００９７】
すなわち、図７では、濃淡が濃度の違いを表しており、拡散係数Qが大きいほど第２液の合計濃度分布Callの空間濃度勾配が緩くなり、拡散係数Qが小さいほど第２液の合計濃度分布Callの空間濃度勾配が急峻になることが分かる。
【００９８】
このように、1e-8[m2/s]、1e-9[m2/s]、1e-10[m2/s]の拡散係数Qごとに、第２液の各分子(j)の濃度分布c(y,0,t,Q)を計算により求めることが可能である。この場合、第２液の各分子(j)の全拡散係数範囲で拡散係数Qを設定して濃度分布c(y,0,t,Q)を幾らでも細かく計算することができ、事実上、濃度分布c(y,0,t,Q)は拡散係数Qに関して連続な関数として計算できる。これにより、第２液の分子量分布A(Q)を高い分解能で求めることができる。
【００９９】
なお、上述したように、（式３）から第２液の分子量分布A(Q)を求める際には、その前に、（式３）を時間変数ｔまたは主流路１１３の流路方向の位置変数ｙ、あるいは、その両方で、１階微分しても高階微分（時間変数ｔでｎ（ｎは２以上の整数）階微分、位置変数ｙでｎ階微分等）してもよい。これにより、第１液と第２液とが接触する境界面を協調することができる。
【０１００】
図８（Ａ）〜（Ｃ）は、（式３）の濃度分布c(y,0,t,Q)を時間微分した第２液の時空間濃度分布であり、濃淡は濃度の時間微分の結果を表している。図９（Ａ）〜（Ｃ）は、（式３）の濃度分布c(y,0,t,Q)を、時間変数ｔおよび主流路１１３の流路方向の位置変数ｙで空間微分した結果の第２液の時空間濃度分布である。
【０１０１】
このように、濃度分布c(y,0,t,Q)を時間微分または空間微分した場合、第１液と第２液とが接触する境界面を協調するとともに、計算処理量を低減しながら第２液の分子量分布A(Q)を高い分解能で測定することができる。
【０１０２】
＜３分子の混合物に対する分子量分布の推定＞
次に、計算によるのではなく、実験的により得た第２液の各分子(j)の濃度分布c(y,0,t,Q)を使って３分子の混合物の第２液からそれぞれの分子(j)の濃度A(j)の分子量分布を算出（推定）した実験の結果について説明する。
【０１０３】
この場合、例えば、ブロックエース溶液を第１液とし、塩化ナトリウム、グルコース、フルクトース、アプロチニン、ヒトアルブミン(HSA)、ヒトIgG(hIgG)の６分子をそれぞれ個別にブロックエース溶液に溶解した６種類の溶液を第２液とした場合の第２液の屈折率（濃度）の変化をそれぞれ測定した。また、上記の６分子のうち、塩化ナトリウム、アプロチニン、ヒトIgGの３分子を混合したサンプルの屈折率（濃度）の変化を同様に測定した。
【０１０４】
この６個の個別分子におけるそれぞれの屈折率（濃度）の変化を空間微分した結果と、３分子を混合したサンプルにおける屈折率（濃度）の変化を空間微分した結果とを図１０（Ａ）に示す。この図１０（Ａ）では、第１液と第２液との接触前０．１秒の時点から、接触後０．６７秒の時点までの測定データを用いた。すなわち、この場合の分子量分布の測定に必要な時間は、０．７７秒になる。
【０１０５】
３分子を混合したサンプルの屈折率（濃度）の変化は、相当する３個の個別分子の屈折率（濃度）の変化の和となっている。ここで、非負最小二乗法により、（式３）の右辺と左辺の差の２乗和が最小となる第２液の分子量分布A(Q)を計算すると、図１０（Ｂ）に示す結果が得られた。
【０１０６】
実際に、サンプルに混合されているとおり、塩化ナトリウム、アプロチニン、ヒトIgGが検出され、サンプルには混合されていないグルコース、スクロース、ヒトアルブミン(HSA)は検出されなかった。この場合、検出された３分子の濃度比は、本来１：１：１になるはずであるが、この例では、第２液の合計濃度分布Callの測定値に含まれるノイズと、測定中に主流路１１３の両端の圧力差を一定に保持できなかったため、高精度に濃度比を決められていない。
【０１０７】
しかしながら、サンプルに混合されている分子（塩化ナトリウム、アプロチニン、ヒトIgG）が、サンプルに混合されていない分子（グルコース、スクロース、ヒトアルブミン(HSA)）から正確に分離できていることが分かる。
【０１０８】
６分子の拡散係数Qと６分子の分子量とは、既知なので、この値を使って図１０（Ｂ）を拡散係数、分子量に対応させてグラフにすると、図１１（Ａ）、（Ｂ）に示すように、サンプルの拡散係数分布および分子量分布を得ることができる。すなわち、この方法でクロマトグラフィーを行うことができることが分かる。
【０１０９】
このように、屈折率測定装置１０２では、例えば塩化ナトリウム(Nacl)から免疫グロブリンG(IgG)までの分子量範囲（５０〜１５万）の無機塩、糖、タンパク質の混合物を１回の操作で約０．７７秒という短時間の間に分離することができる。
【０１１０】
この場合、ＨＤＣ装置１００は、特別な充填カラム、ゲル、流路内部の特別な構造は必要なく、単に中空の長さ５ｍｍ程度の主流路１１３があればよく、また、送液のための高圧なポンプ類が不要で、１００[Pa］以下の極めて小規模なポンプだけで実現することができる。
【０１１１】
＜効果＞
ＨＤＣ装置１００は、第２液を構成する複数の分子の分子量分布を、微小な主流路１１３からなる極めて単純な装置、手順により、短時間のうちに高速かつ高精度に測定することができる。
【０１１２】
また、このＨＤＣ装置１００において実現する主流路１１３は、背圧の低い短流路であり、そこに液送する圧力は、表面張力で実現されるほど極めて低くて済むため、低圧のポンプでよく、かつシールも容易である。サンプルを主流路１１３にインジェクションする際も、液送する圧力が低いため、特別なインジェクターは不要であり、液体導入穴１１０と主流路１１３との接続点からサンプルを単に供給するだけでよい。
【０１１３】
さらに、ＨＤＣ装置１００は、マイクロ流路１１２の主流路１１３の液送方向に対して直交する流路断面のアスペクト比が１よりも大きいことにより、第２液が外部との相互作用なしに拡散と流れの効果だけで分子の分離を生じさせることが可能となる。
【０１１４】
さらに、ＨＤＣ装置１００は、主流路１１３に溶質と相互作用する物質は全く存在せず、単なる中空でありながら、混合物のサンプルにおける５０以下の分子量から１６万を超える分子量までの範囲内で分離することができる。
【０１１５】
なお、ＨＤＣ装置１００では、第２液の合計濃度Callの測定には、全反射光学系からなる屈折率測定装置１０２を用い、光源からの反射光をマイクロ流路１１２の下方からカメラ部１２０により撮像する構成であるため、カメラ部１２０を移動させる可動部品が不要であり、全体の構成を簡素化できると共に低コストで実現することができる。
【０１１６】
＜他の実施の形態＞
なお上述した実施の形態においては、非負最小二乗法等の成分濃度測定方法により第２液の分子量分布A(Q)を求めるようにした場合について述べたが、本発明はこれに限らず、屈折率測定装置１０２により測定された第２液の合計濃度Callの時空間分布と、既に過去に求めておいた合計濃度Callの時空間分布（教師データ）とを照合することにより、教師有り学習法で第２液の分子量分布を求めるようにしてもよい。
【０１１７】
また、上述した実施の形態においては、非負最小二乗法等の成分濃度測定方法（計算手法）により第２液の分子量分布A(Q)を求めるようにした場合について述べたが、本発明はこれに限らず、その他の疑似逆行列やスペクトル分解、一般調和解析等の成分濃度測定方法（計算手法）を用いて、第２液の分子量分布A(Q)を求めるようにしてもよい。
【０１１８】
さらに、上述した実施の形態においては、分子の拡散係数Qが一定であることを前提として第２液の分子量分布A(Q)を求めるようにした場合について述べたが、本発明はこれに限らず、分子の拡散係数Qが第１液と第２液との混合過程で変化するような場合であっても適用することができる。この場合、ＨＤＣ装置１００では、非常に短い主流路１１３で短時間のうちに流れ切るので、分子の拡散係数Qが変化する前に第２液の分子量分布A(Q)を求めることができる。
【０１１９】
さらに、上述した実施の形態においては、第２液の液送に定圧の圧力制御ポンプ１０６を用いるようにした場合について述べたが、本発明はこれに限らず、ろ紙、または、ピラー構造を使った表面張力により第２液を液送するようにしても良い。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本願の分子量分布測定方法および分子量分布測定装置は、測定の自動化も容易であり、測定時間の短さを利用した連続測定などに適する。特に、拡散係数が大きくなる化学反応の初期過程を測定することができるという特徴を有するため、化学反応の反応時間の長い測定の時間短縮化を図るのに適する。したがって、このような生化学、医療、食品、化学工学分野での利用価値が高い。
【符号の説明】
【０１２１】
１００…ＨＤＣ測定装置（分子量分布測定装置）、１０１…マイクロ流路チップ、１０２…屈折率測定装置（算出部）、１０３…ＦＥＰチューブ、１０４…液体分注装置（注入装置）、１０５…気液分離装置、１０６…圧力制御ポンプ（液送部）、１１０…液体導入穴、１１１…液体排出穴、１１２…マイクロ流路チップ、１１３…主流路（流路）、１２０……カメラ部、２００…流路、２０１…流路入口面、２０２…流路出口。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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