(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルからターゲット配列を検出するための方法であって、該方法は、
不混和性キャリア流体中の複数の水性液滴を提供する工程であって、各液滴は、単一の核酸分子と、複数の異なるプライマー対を含む増幅反応のための試薬と、各々が異なる波長を有し、かつ各々が異なるターゲット配列に特異的な複数の光学的に標識されたプローブとを含み、該複数の異なるプライマー対は、各々が異なるターゲット配列を増幅するために特異的である、工程；
各液滴中の該核酸分子から単一のターゲット配列を増幅する工程；および
該液滴中の該増幅されたターゲット配列に特異的な光学的に標識されたプローブから放出される光を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
さらに、
前記検出された光の波長および強度の組み合わせを用いて、前記液滴中の前記増幅されたターゲット配列を同定する工程
を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記同定する工程が、増幅されたターゲット配列を含まない１つ以上の液滴を同定することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記同定する工程が、前記検出された光の第一の波長、第二の波長および強度の組み合わせを用いて、前記液滴中の最大９つの増幅されたターゲット配列を同定することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記同定する工程が、前記増幅されたターゲット配列の発現分析を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸分子がサンプル由来であり、第一の光学的に標識されたプローブが参照ターゲット配列に特異的であり、第二の光学的に標識されたプローブがコピー数変異体ターゲット配列に特異的であり；そして、前記同定する工程が、該参照ターゲット配列を含む該同定された液滴の数と、該コピー数変異体ターゲット配列を含む該同定された液滴の数を決定することを含み、ここで、該参照液滴の数と、該コピー数変異体液滴の数の比率は、該コピー数変異体の配列の遺伝子コピー数を決定する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが患者由来のサンプルであり、前記コピー数変異体の配列がＳＭＮ１またはＳＭＮ２を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記光学的に標識されたプローブが各々、蛍光標識種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記光学的に標識されたプローブが加水分解プローブを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルがヒトの組織または体液である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の液滴が各々、１つ以下の核酸分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ターゲット配列に特異的な前記光学的に標識されたプローブの少なくとも１つが、第一の蛍光標識を含む第一のサブタイプと、該第一のものとは異なる第二の蛍光標識を含む第二のサブタイプを含み、該第一のサブタイプと該第二のサブタイプとが同じターゲット配列に特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ターゲット配列に特異的な前記光学的に標識されたプローブの少なくとも１つが、第一の蛍光標識を含む第一のサブタイプと、蛍光標識のない第二のサブタイプを含み、該第一のサブタイプと該第二のサブタイプとが同じターゲット配列に特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記増幅のための試薬が、前記液滴中にポリメラーゼ種と複数のデオキシヌクレオチド種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
サンプルからターゲット配列を検出するための方法であって、該方法は、
不混和性キャリア流体中の複数の水性液滴を提供する工程であって、各液滴は、複数の異なるプライマー対を含む増幅反応のための試薬と、各々が異なる波長を有し、かつ各々が異なるターゲット配列に特異的な複数の異なる光学的に標識されたプローブとを含み、該複数の異なるプライマー対は、各々が異なるターゲット配列を増幅するために特異的である、工程；
各液滴に単一の核酸分子を導入する工程；
該液滴中の該核酸分子から単一のターゲット配列を増幅する工程；ならびに
該液滴中の該増幅されたターゲット配列に特異的な光学的に標識されたプローブから放出される光を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記導入する工程が、前記増幅反応のための試薬と、前記複数の異なる光学的に標識されたプローブとを含む前記液滴の各々を、前記核酸分子を含む第二の液滴と融合させることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記導入する工程が、前記核酸分子を含む流体ストリームの一部を、前記液滴の各々と統合させることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、
前記検出された光の波長および強度の組み合わせを用いて液滴中の前記増幅されたターゲット配列を同定する工程
を包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記同定する工程が、増幅されたターゲット配列を含まない１つ以上の液滴を同定することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記同定する工程が、前記検出された光の第一の波長、第二の波長および強度の組み合わせを用いて、前記液滴中の最大９つの増幅されたターゲット配列を同定することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記光学的に標識されたプローブが各々、蛍光標識種を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記光学的に標識されたプローブが加水分解プローブを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記導入する工程がさらに、前記液滴中にポリメラーゼ種と複数のデオキシヌクレオチド種を導入することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
ターゲット配列に特異的な前記光学的に標識されたプローブの少なくとも１つが、第一の蛍光標識を含む第一のサブタイプと、該第一のものとは異なる第二の蛍光標識を含む第二のサブタイプを含み、該第一のサブタイプと該第二のサブタイプとが同じターゲット配列に特異的である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
ターゲット配列に特異的な前記光学的に標識されたプローブの少なくとも１つが、第一の蛍光標識を含む第一のサブタイプと、蛍光標識のない第二のサブタイプを含み、該第一のサブタイプと該第二のサブタイプとが同じターゲット配列に特異的である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への参照
この本出願は、２０１０年１０月１日に出願された米国仮出願第６１／３８８，９３７
号、２０１０年５月２１日に出願された米国仮出願第６１／３４７，１５８号、２０１０
年５月５日に出願された米国仮出願第６１／３３１，４９０号、および２０１０年２月１
２日に出願された米国仮出願第６１／３０４，１６３号（これらの内容は、各々それらの
全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、液滴ベースのデジタルＰＣＲ、およびそれを使用してターゲット核
酸を分析するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
体液からの核酸分子を突然変異の存在について分析することに依存するアッセイが開発
され、このようにして癌などの一定の疾患の早期診断に至ってきた。しかし、典型的な体
液サンプルの場合、関心のある突然変異を含有するいずれの異常核酸も、その体液サンプ
ル中の核酸の総量に対して少量（例えば１％未満）で存在することが多い。この結果、確
率的サンプリングバイアスのため、その少量の異常核酸の検出に失敗することとなり得る
。
【０００４】
ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲ方法論の登場は、スループットの見地からも、定量的
な見地からも、核酸の分析を大きく改善した。伝統的なＰＣＲ技術が、概して、アガロー
スゲル電気泳動法による増幅ＤＮＡターゲットのエンドポイント、および時として半定量
的、分析に依存するが、リアルタイムＰＣＲ（またはｑＰＣＲ）法は、反応進行につれて
の指数関数的増幅の正確な定量に適合している。ｑＰＣＲ反応は、様々な高配列特異的蛍
光プローブ技術を用いて、または非特異的ＤＮＡ挿入蛍光発生色素を使用することにより
、モニターされる。
【０００５】
複数のターゲットを並行して分析する際のより高いスループットの必要性がゲノムおよ
び遺伝学の分野において漸増し続けているので、ならびにサンプルのより効率的な使用の
必要性が診断などの医学関連分野において増しているので、同じ反応体積の中で複数の増
幅を同時に実施および定量できること（多重化）が、ＰＣＲにとってもｑＰＣＲにとって
も最重要である。エンドポイントＰＣＲは、高いレベルのアンプリコン多重化に対応する
ことができるが、プローブベースのｑＰＣＲ反応の多重化についてのそのような十二分な
能力は、多くの理由のため依然として達成困難である。例えば、殆どの市販用リアルタイ
ム・サーマル・サイクラーは、一般的な蛍光体の限られたスペクトル分解能の結果として
４色までの異なる色の検出用蛍光体にしか対応しておらず、言い換えると４×の多重化能
力ということになる。加えて、単一ターゲットプライマー／プローブ反応の最適化は今や
標準作業であるが、複数の反応のためのプライマーとプローブの併用は、熱力学的効率お
よび／または化学的動態を変えるので、大々的な不具合対策および最適化を余儀なくさせ
る可能性を秘めている。１００×より大きい非常に高度な多重化は、「スラッピー（ｓｌ
ｏｐｐｙ）」分子ビーコンおよび融点をフィンガープリントとして使用する病原体同定の
ための「ワン・オブ・メニー（ｏｎｅ  ｏｆ  ｍａｎｙ）」検出形式で実証されているが
、このアプローチは、複数の同時に存在するターゲットの存在尤度がほんのわずかである
用途に限られる。半多重化法は、第一工程での一般的な多重化プレ増幅、続いて第二工程
での別のシングルプレックス定量的ＰＣＲを用いる２工程反応で、１９×を達成した。し
かし、ｑＰＣＲ多重化に対する汎用シングルポットでの解決策は、まだ存在しない。
【０００６】
デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）は、希薄サンプルを多くの別の反応に分割する代替定量法
である。例えば、Ｂｒｏｗｎら（特許文献１および特許文献２）およびＶｏｇｅｌｓｔｅ
ｉｎら（特許文献３、特許文献４および特許文献５）を参照のこと；これらのそれぞれの
内容は、その全体が参照により本明細書に援用されている。反応間のターゲットＤＮＡ分
子のバックグラウンドからの分布はポアソン統計学に従い、いわゆる「終点希釈（ｔｅｒ
ｍｉｎａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）」では反応の大多数が実際には１つかゼロのターゲット
ＤＮＡ分子を含有する。別の場合、いわゆる「限界希釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔ
ｉｏｎ）」ではポアソン分布に従って、ゼロのＤＮＡ分子を含有する反応もあり、１つの
分子を含有する反応もあり、および多数の分子を含有する反応もしばしばある。終点希釈
および限界希釈は、反応容器へのＤＮＡ負荷量を説明するために有用な概念であるが、そ
れらは正式な数学的定義を有さず、必ずしも相互に排他的でないことは理解される。理想
的には、終点希釈でのＰＣＲポジティブ反応（ＰＣＲ（＋））の数は、元々存在するテン
プレート分子の数と等しい。限界希釈では、ＤＮＡの根本的な量を明らかにするためにポ
アソン統計学を用いられる。ｑＰＣＲと比較されるデジタルの原則利点は、初期サイクル
中の非指数関数的増幅の主な根本的不確実性に加えて蛍光強度−アナログシグナル−の時
間依存性を解釈する一切の必要を回避する点である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，１４３，４９６号明細書
【特許文献２】米国特許第６，３９１，５５９号明細書
【特許文献３】米国特許第６，４４０，７０６号明細書
【特許文献４】米国特許第６，７５３，１４７号明細書
【特許文献５】米国特許第７，８２４，８８９号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、一般に液滴内の核酸の操作、ならびに詳細には核酸増幅および検出に関する
。１つの態様において、本発明は、単一の核酸テンプレートと該テンプレート上の複数の
ターゲット部位に特異的な複数のプライマー対とを含有する液滴を提供する。前記単一の
核酸テンプレートは、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなど）である場合もあり
、またはＲＮＡである場合もある。前記テンプレートを検出のために前記液滴内で増幅す
る；および好ましくは、本明細書に記載するように複数のプライマー対を使用して増幅す
ることができる。
【０００９】
液滴内の単一の核酸を増幅および検出できることで、デジタルＰＣＲ、検出、カウント
、および核酸、とりわけ不均一サンプル中に存在するもの、の間の差別化が可能になる。
従って、本発明は、デジタル増幅技術に適用され、および特定の実施形態では、液滴内で
のマルチプレックスＰＣＲを可能にする。例えば、液滴内の多重化プライマーは、インプ
ットＤＮＡの量を同じにまたはより少なく保ち、同じまたはより大きなアンプリコン収量
を生じさせながら、同時にＰＣＲ液滴数を増加させることを可能にする。これは、結果と
して、より多くのＤＮＡを消費することなくＰＣＲポジティブ液滴の量およびアンプリコ
ン収量の総合的増加をもたらす。１液滴あたりのＰＣＲプライマー対の数がたとえ１より
多くても、１液滴あたり１つのテンプレート分子しかなく、それ故、一部の実行では、１
滴あたり１つのプライマー対しか１度に利用されることとならない。従って、対立遺伝子
特異的ＰＣＲからのまたは異なるアンプリコン間の競合からのバイアスを無くすことにつ
いての液滴ＰＣＲの利点は維持される。しかし、ハプロタイプの検出に関して下で説明す
るように、他の実行は、好ましくはバイアスを最少にするように設計されたものである複
数のプライマー対を使用して、単一のテンプレート上の複数の遺伝子座の検出を有利に可
能にする。
【００１０】
本発明によるマルチプレックス分析のためのマイクロ流体液滴は、該液滴内で生産され
るアンプリコンにハイブリダイズする複数のプローブを含有する。好ましくは、前記液滴
は、２つ以上のプローブ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４
、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６０、
７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１
６０、１７０、１８０、１９０、２００、５００、またはそれ以上のプローブを含有する
。前記複数のプローブの一定の構成員（ｍｅｍｂｅｒ）は、検出可能標識を含む。前記複
数のプローブの構成員は、それぞれ、同じ検出可能標識を含むことがあり、または異なる
検出可能標識を含むことがある。前記検出可能標識は、好ましくは蛍光標識である。前記
複数のプローブは、様々な濃度のプローブの１つ以上の群を含むことがある。前記プロー
ブの１つ以上の群は、同じ検出可能標識を含むことがあり、これらのプローブは、それら
の様々なプローブ濃度のため、検出時に強度が様々であるだろう。本発明の液滴は、ポリ
メラーゼ連鎖反応を行うための１つ以上の試薬、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラー
ゼおよび／またはｄＮＴＰ、をさらに含有することができる。
【００１１】
本発明は、マイクロ流体液滴内でデジタルＰＣＲを用いて生体サンプル中の複数のター
ゲットを検出するための方法にさらに関する。前記サンプルは、ヒト組織または体液であ
り得る。例示的体液：膿、痰、精液、尿、血液、唾液、および脳脊髄液。
【００１２】
単一の核酸テンプレート、およびそれぞれが該テンプレート上の複数のターゲット部位
に特異的なプライマー対とプローブの不均一混合物をそれぞれが含む、１つ以上の液滴を
形成する。例えば、単一の核酸テンプレート（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含有する第一の流
体（連続的、または液滴の場合のように不連続的）を、それぞれが該核酸テンプレートの
複数のターゲット部位に特異的な複数のプライマー対および複数のプローブを含有する第
二の流体（同じく、連続的、または液滴の場合のように不連続的）と合体させて、単一の
核酸テンプレートおよびプライマー対とプローブの不均一混合物を含有する液滴を形成す
る。前記第二の流体は、ＰＣＲ反応を行うための試薬、例えばポリメラーゼおよびｄＮＴ
Ｐ、も含むことができる。
【００１３】
前記複数のプローブの一定の構成員は、検出可能標識を含む。前記複数のプローブの構
成員は、それぞれ、同じ検出可能標識を含むことがあり、または異なる検出可能標識を含
むことがある。前記検出可能標識は、好ましくは蛍光標識である。前記複数のプローブは
、様々な濃度のプローブの１つ以上の群を含むことがある。前記プローブの１つ以上の群
は、同じ検出可能標識を含むことがあり、これらのプローブは、それらの様々なプローブ
濃度のため、検出時に強度の点で様々である。
【００１４】
前記第一の流体および第二の流体は、それぞれ、液滴形態であってもよい。液滴の形成
について当該技術分野において公知の任意の技術を本発明の方法と共に用いることができ
る。例示的方法は、核酸テンプレートを含有するサンプル流体のストリームを、流れてい
るキャリア流体の２つの対向するストリームを交差するように流すことを含む。前記キャ
リア流体は、前記サンプル流体と不混和性である。前記サンプル流体と前記流れているキ
ャリア流体の２つの対向するストリームとの交差の結果、該サンプル流体は区画化されて
、第一の流体を含有する個々のサンプル液滴となる。前記キャリア流体は、前記サンプル
流体と不混和性であるいずれの流体であってもよい。例示的キャリア流体は油である。一
定の実施形態において、前記キャリア流体は、フッ素系界面活性剤などの界面活性剤を含
む。同じ方法を利用して、プライマー対（および、一部の実行では、増幅試薬）を含有す
る第二の流体から個々の液滴を作ることができる。第一の流体を含有する液滴もしくは第
二の流体を含有する液滴のいずれか、または両方を形成して、後のマージのためにライブ
ラリーに保管してもよく、その一定の実行の態様は米国特許第出願第１２／５０４，７６
４号に記載されており、この出願は、あらゆる意味でその全体が参照により本明細書に援
用されている。形成したら、第一の流体を含有する液滴と第二の流体を含有する液滴を合
体させて、単一の核酸テンプレートおよびプライマー対とプローブの不均一混合物を含有
する、単一の液滴を形成することができる。例えば電場の存在下で、マージを果たすこと
ができる。さらに、マージを行うときに両方の流体が液滴の形態である必要はない。流体
部分と液滴を合体させるための１つの例示的方法は、例えば、本願と同日に出願された同
時係属米国特許出願第６１／４４１，９８５号に教示されている。
【００１５】
合体された／形成された液滴のそれぞれの中の核酸テンプレートを、例えばＰＣＲ反応
を行うために十分な温度／条件下でのそれらの液滴の熱サイクリングによって、増幅する
。その後、前記液滴内の結果として生じたアンプリコンを分析することができる。例えば
、１つ以上の液滴内の複数のターゲットの存在または不在を光学的に、例えば複数のプロ
ーブ上の検出可能標識によって、検出する。
【００１６】
本発明は、ターゲット核酸を分析するための方法にさらに関する。より詳細には、本発
明の方法は、ＰＣＲ反応中に発生するポリメラーゼエラーを検出することができ、および
ポリメラーゼエラーの結果である増幅産物を分析から排除することができる。本発明の方
法は、ポリメラーゼエラーが、突然変異体対立遺伝子を含有すると間違って同定される、
すなわち偽ポジティブである、サンプルの区分セクションをもたらすことがあるデジタル
ＰＣＲにおいて特に有用である。そのような偽ポジティブは、一般に、デジタルＰＣＲ結
果の妥当性および精度に大きな影響を及ぼす。本発明の方法は、同じ光色を有する複数の
ターゲットを一意的に検出することができる。本発明の方法は、出発試験流体中に存在し
得る複数の異なるターゲット分子を同定することが望ましいデジタルＰＣＲにおいて、特
に有用である。
【００１７】
本発明の方法は、ターゲット核酸を含有するサンプル液滴の形成を含む。理想的には、
本発明の方法は、デジタルＰＣＲ用の液滴の形成を含む。好ましいデジタルＰＣＲ液滴は
、増幅すべき核酸の１つのコピーを含有するが、同じ核酸配列の複数のコピーを含有する
こともある。サンプル液滴を形成するための当該技術分野において公知の任意の技術を本
発明の方法と共に用いることができる。１つの例示的方法は、核酸を含むサンプル流体の
ストリームを、流れているキャリア流体の２つの対向するストリームを交差するように流
すことを含む。前記キャリア流体は、前記サンプル流体と不混和性である。前記サンプル
流体と前記流れているキャリア流体の２つの対向するストリームとの交差の結果、該サン
プル流体は区画化されて個々のサンプル液滴になる。前記キャリア流体は、前記サンプル
流体と不混和性であるいずれの流体であってもよい。例示的キャリア流体は油である。一
定の実施形態において、前記キャリア流体は、フッ素系界面活性剤などの界面活性剤を含
む。
【００１８】
次に、前記ターゲットを前記液滴内で増幅する。当該技術分野において公知の任意の方
法を用いて、ターゲット核酸を線形にまたは指数関数的に増幅することができる。好まし
い方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。本発明のために、当該技術分野にお
いて一般に公知の任意の増幅技術、例えば、ローリングサークル増幅、等温増幅、または
遺伝子座特異的プライマー、ネステッドプライマーもしくはランダムプライマーを使用す
る増幅法の任意の組み合わせ、を実行することができる（前述のプライマー、および／ま
たはＰＣＲに使用されるプライマーは、用語「増幅試薬」に含まれる）。増幅したら、前
記ターゲットからのアンプリコンおよび前記ターゲットの変異体からのアンプリコンを含
有する液滴を排除する。アンプリコンの均一集団を含有する液滴からアンプリコンの不均
一集団を含有する液滴を排除する１つの方法は、検出可能に標識されたプローブをアンプ
リコンにハイブリダイズさせること、前記液滴を、マイクロ流体チャネルを通して流すこ
と、および前記ターゲットからのアンプリコンと前記ターゲットの変異体からのアンプリ
コンの両方が検出される液滴を排除することを含む。
【００１９】
アンプリコンの不均一集団を含有する液滴を排除したら、アンプリコンの均一集団を含
有する液滴を分析する。当該技術分野において公知の任意の分析技術を用いることができ
る。一定の実施形態において、前記液滴の分析は、野生型ターゲットのみを含有する液滴
の数を決定すること、および該ターゲットの変異体のみを含有する液滴の数を決定するこ
とを含む。一般に、変異体のみを含有する液滴の存在は、癌などの疾患の指標となる。前
記変異体は、対立遺伝子変異体であることがある。例示的対立遺伝子変異体は、一塩基多
型である。前記変異体は特異的ハプロタイプである場合もある。ハプロタイプは、同じ核
酸鎖上の２つ以上の変異体の存在を指す。ハプロタイプは、疾患の存在もしくは重症度、
薬物療法への応答または細菌もしくはウイルス感染症の薬物耐性といったことを決定する
ために用いたとき、遺伝子型より多くの情報をもたらすまたは予測に役立つことができる
。各液滴は１本のテンプレート鎖しか含有しないので、それはハプロタイプの決定にとっ
て理想的な器である。１本の無損傷核酸鎖を含有する単一の液滴内の２つ以上の変異体の
検出により、その鎖上の変異体のハプロタイプが同定される。同じ液滴内の２つ以上のマ
ーカーの存在は、多色の色素の存在、または単一色素の強度の増加、または両方の組み合
わせといった手段によって同定することができる。単一の液滴内の多数の変異体の同定を
可能にする任意の方法によって、サンプルのハプロタイプを決定することができる。
【００２０】
本発明の一部の実行に従って、ターゲット核酸を分析するための方法を提供し、この方
法は、それぞれの部分が単一のターゲット核酸を含有する複数の部分に第一の流体を区画
化すること；前記部分の中の前記ターゲットを増幅すること；前記ターゲットからのアン
プリコンおよび前記ターゲットの変異体からのアンプリコンを含有する部分を排除するこ
と；およびターゲットアンプリコンを分析することを含む。
【００２１】
他の態様において、本発明は、一般に、患者における癌の再発を検出するための方法を提供する。これらの方法は、患者のサンプルから採取した単一のターゲット核酸を含有するサンプル液滴を形成すること、前記サンプル液滴を、チャネルを通して流すこと、前記液滴内の前記ターゲットを増幅すること、前記液滴内の増幅されたターゲットを検出すること、アンプリコンの不均一集団を含む液滴を排除すること、および排除されなかった液滴を分析して再発の指標となる突然変異体対立遺伝子を決定することを含み得る。一定の実施形態において、前記分析工程は、標識された捕捉プローブを使用して前記液滴から得られたアンプリコンを捕捉することを含む。前記サンプルは、ヒト組織または体液であり得る。例示的体液は、膿、痰、精液、尿、血液、唾液、糞便および脳脊髄液である。本発明の他の態様では、低レベルのターゲット核酸を多数の他の核酸源を有する環境で法医学的に同定する方法を一般に提供する。そのような方法を、液滴以外にまたは液滴に加えて容器内で区画された流体を使用して実施することもできる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
単一の核酸テンプレートと前記テンプレート上の複数のターゲット部位に特異的な複数のプライマー対とを含む微小液滴。
（項目２）
前記液滴内で生産されたアンプリコンにハイブリダイズする複数のプローブをさらに含む、項目１に記載の微小液滴。
（項目３）
前記単一の核酸テンプレートがＤＮＡまたはＲＮＡである、項目１に記載の微小液滴
。
（項目４）
ポリメラーゼ連鎖反応を行うための試薬をさらに含む、項目１に記載の微小液滴。
（項目５）
前記複数のプローブの構成員が検出可能標識を含有する、項目２に記載の微小液滴。
（項目６）
前記複数のプローブが、様々な濃度のプローブの１つ以上の群を含む、項目６に記載
の微小液滴。
（項目７）
前記プローブの１つ以上の群の構成員それぞれが、同じ検出可能標識を含む、項目６
に記載の微小液滴。
（項目８）
前記複数のプローブの構成員それぞれが、異なる検出可能標識を含む、項目５に記載
の微小液滴。
（項目９）
前記検出可能標識が蛍光標識である、項目５に記載の微小液滴。
（項目１０）
生体サンプル中の複数のターゲットを検出するための方法であって、
ａ）単一の核酸テンプレート、およびそれぞれが前記テンプレート上の複数のターゲット部位に特異的なプライマー対とプローブの不均一混合物をそれぞれが含む、１つ以上の微小液滴を形成する工程；
ｂ）前記１つ以上の微小液滴内の前記核酸テンプレートを増幅する工程；および
ｃ）前記１つ以上の微小液滴を分析する工程
を含む方法。
（項目１１）
前記形成工程が、
ａ）単一の核酸テンプレートを含む第一の流体を供給すること；
ｂ）それぞれが前記テンプレート上の複数のターゲット部位に特異的な複数のプライマーおよび複数のプローブを含む第二の流体を供給すること；
ｃ）前記第一の流体と前記第二の流体を合体させて、前記単一の核酸テンプレートおよびプライマー対とプローブの不均一混合物を含む液滴を形成すること
を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記第一の流体および前記第二の流体が、前記流体に対する電場の存在下で合体される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記第一の流体および前記第二の流体が微小液滴である、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記第二の流体が、ポリメラーゼ連鎖反応を行うための試薬をさらに含む、項目１１
に記載の方法。
（項目１５）
前記単一の核酸テンプレートがＤＮＡまたはＲＮＡである、項目１０に記載の方法。
（項目１６）
前記分析工程が、前記１つ以上の微小液滴内の前記複数のターゲットの存在または不在を検出することを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１７）
前記複数のプローブの構成員が、検出可能標識を含有する、項目１０に記載の方法。
（項目１８）
前記複数のプローブが、様々な濃度のプローブの１つ以上の群を含む、項目１７に記
載の微小液滴。
（項目１９）
前記プローブの１つ以上の群の構成員それぞれが、同じ検出可能標識を含む、項目１
８に記載の微小液滴。
（項目２０）
前記複数のプローブの構成員それぞれが、異なる検出可能標識を含む、項目１７に記
載の微小液滴。
（項目２１）
前記検出可能標識が蛍光標識である、項目１７に記載の微小液滴。
（項目２２）
ターゲット核酸を分析するための方法であって、
単一ターゲット核酸と１つ以上の増幅試薬とを含有する液滴を形成する工程；
前記液滴内の前記ターゲットを増幅する工程；
前記ターゲットからのアンプリコンおよび前記ターゲットの変異体からのアンプリコンとを含有する液滴を排除する工程；および
ターゲットアンプリコンを分析する工程
を含む方法。
（項目２３）
前記増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応であり、および前記１つ以上の増幅試薬が、１つ以上のプライマー対を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記排除工程が、前記液滴をマイクロ流体チャネル内に流すことを含む、項目２２に
記載の方法。
（項目２５）
前記分析工程が、検出可能に標識されたプローブへのハイブリダイゼーションにより前記アンプリコンを検出することを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
前記分析工程が、前記排除工程で排除されなかった液滴からのアンプリコンに対して行われる、項目２２に記載の方法。
（項目２７）
前記形成工程が、
核酸を含む第一のサンプル流体のストリームを、流れているキャリア流体の２つの対向するストリームを交差するように流し、それによって、前記第一のサンプル流体を含む複数の第一の液滴を形成することであって、前記キャリア流体は前記サンプル流体と不混和性である、形成すること；および
前記第一のサンプル流体を含む複数の第一の液滴のそれぞれと、１つ以上の増幅試薬を含む第二の流体の部分とを合体させることであって、前記第二の流体の部分は場合により液滴である、合体させること
を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２８）
前記キャリア流体が油である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記油が界面活性剤を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記界面活性剤がフッ素系界面活性剤である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記分析工程が、
野生型ターゲットのみを含有する液滴の数を決定すること；
前記ターゲットの変異体のみを含有する液滴の数を決定すること
を含む、項目２２に記載の方法。
（項目３２）
前記変異体のみを含有する液滴の存在が疾患の指標となる、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記疾患が癌である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記変異体が対立遺伝子変異体である、項目３１に記載の方法。
（項目３５）
前記対立遺伝子変異体が一塩基多型である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
核酸サンプルを加工するための方法であって、
１つの核酸ターゲットを含む液滴を得る工程；
前記液滴内の前記核酸を増幅する工程；および
アンプリコンの不均一集団を含む液滴を、アンプリコンの均一集団を含有する液滴から分離する工程
を含む方法。
（項目３７）
患者における癌の再発を検出するための方法であって、
平均して各液滴が患者サンプルから採取された単一ターゲット核酸を含む、サンプル液滴を形成する工程；
前記サンプル液滴を、チャネルを通して流す工程；
前記液滴内のターゲットを増幅する工程；
前記液滴内の増幅されたターゲットを検出する工程；
アンプリコンの不均一集団を含む液滴を排除する工程；および
排除されなかった液滴を分析して、再発の指標となる突然変異体対立遺伝子の存在を決定する工程
を含む方法。
（項目３８）
前記形成工程が、
核酸を含むサンプル流体のストリームを、流れているキャリア流体の２つの対向するストリームを直行するように流すことであって、前記キャリア流体は前記サンプル流体と不混和性である、流すこと
を含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記サンプルがヒト組織または体液である、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記体液が、膿、痰、精液、尿、血液、唾液および脳脊髄液から成る群より選択される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記分析工程が、標識された捕捉プローブを使用して前記液滴から得られたアンプリコンを捕捉することを含む、項目３７に記載の方法。
（項目４２）
ターゲット核酸を分析するための方法であって、
各部分が単一ターゲット核酸を含有する複数の部分に第一の流体を区画化する工程；
前記部分中のターゲットを増幅する工程；
前記ターゲットからのアンプリコンおよび前記ターゲットの変異体からのアンプリコンを含有する部分を排除する工程；および
ターゲットアンプリコンを分析する工程
を含む、方法。
（項目４３）
区画が、マイクロ流体デバイス内のチャンバを含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
ターゲット核酸を分析するための方法であって、
単一ターゲット核酸を含有するサンプル液滴を形成する工程；
前記液滴内のターゲットを増幅する工程；
前記ターゲットからのアンプリコンおよび前記ターゲットの変異体からのアンプリコンを含有する液滴を排除する工程；および
ターゲットアンプリコンを分析する工程
を含む、方法。
（項目４５）
前記第一の流体が第一の液滴内に含有され、および前記第二の流体がストリームの第一の部分であり、ならびにさらに、工程（ｃ）が、前記第一の液滴を前記第一の部分と合体させることを含む、項目１１に記載の方法。
（項目４６）
前記第二の流体が第一の液滴内に含有され、および前記第一の流体がストリームの第一の部分であり、ならびにさらに、工程（ｃ）が、前記第一の液滴を前記第一の部分と合体させることを含む、項目１１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、液滴形成デバイスを図示するものである。
【図２】図２は、図１の液滴形成デバイスの一部分を図示するものである。
【図３】図３は、液滴生成用の例示的マイクロ流体システムおよび読み出しを図示するものである。図３ａは、液体生成チップを図示するものである；図３ｂは、読み出しのための液滴間隔どりを図示するものである；および図３ｃは、蛍光による液滴読み出しの漫画を描いたものである。
【図４】図４は、ｄＰＣＲによって定量したテンプレートＤＮＡの系列希釈を図示するものである。図４ａは、最高濃度のサンプルについての読み出し中の液滴蛍光を示すものである。別個の蛍光バーストそれぞれが個々の液滴に対応する。液滴の２つの異なる群：〜０．８Ｖでピークに達するＰＣＲ（＋）液滴、および〜０．１Ｖでピークに達するＰＣＲ（−）液滴、がはっきりとわかる；図４ｂは、（ａ）における完全データトレースからの液滴のピーク蛍光強度のヒストグラムを示すものである。ＰＣＲ（＋）およびＰＣＲ（−）液滴は、それぞれ０．７８および０．１０Ｖに中心を置く２つの非常に異なる集団として現れる；図４ｃは、テンプレートＤＮＡの系列希釈を示すものである。白丸：実測占有率；実線：Ｅｑｎ２への最良適合（Ａ＝０．１５、ｆ＝４．８、Ｒ２−０．９９９９）。
【図５】図５Ａは、テンプレート配列のＰＣＲ増幅のための５セットのプライマーと、それぞれが蛍光色素で標識されており、増幅配列に特異的に結合するものである５つのプローブとを有する液滴の略図である；図５Ｂは、ＰＣＲ増幅後の液滴から検出された蛍光強度のタイムトレースである；図５Ｃは、特異的増幅配列（ＴＥＲＴ、ＲＮａｓｅＰ、Ｅ１ａ、ＳＭＮ１およびＳＭＮ２）を含有する液滴を表すクラスタを示す散布図である。
【図６】図６Ａは、テンプレート配列のＰＣＲ増幅のための５セットのプライマーと、それぞれが蛍光色素で標識されており、増幅配列に特異的に結合するものである５つのプローブとを有する液滴の略図である；図６Ｂは、特異的増幅配列（ＴＥＲＴ、８１５Ａ、ＲＮａｓｅＰ、Ｅ１ａ、および８１５Ｇ）を含有する液滴を表すクラスタを示す散布図である；図６Ｃは、図６Ｂに示す特異的配列のコピー数を示す表である。
【図７】図７は、マイクロ流体デバイスでの１遺伝子配列の一色検出を図示する概略図である。
【図８】図８は、マイクロ流体デバイスでの２遺伝子配列の二色検出を図示する概略図である。
【図９】図９は、マイクロ流体デバイスでの３遺伝子配列の二色検出を図示する概略図である。
【図１０】図１０は、蛍光強度によって検出された遺伝子配列のクラスタを図示する２つのドットプロットを示すものである。左のパネルは、４つのクラスタを示すドットプロットである。ＳＭＮ１配列のブロックが存在した。上部左：参照配列（ＳＭＡＲＣＣ１）を含有する微小液滴；下部左：いずれの配列も含有しない微小液滴；下部中央：ＳＭＮ１の配列を含有する微小液滴；および下部右：ＳＭＮ２の配列を含有する微小液滴。右パネルは、４つのクラスタを示すドットプロットである。ＳＭＮ１配列のブロックは存在しなかった。上部左：参照配列（ＳＭＡＲＣＣ１）を含有する微小液滴；下部左：いずれの配列も含有しない微小液滴；下部中央：ＳＭＮ１の配列を含有する微小液滴；および下部右：ＳＭＮ２の配列を含有する微小液滴。左のパネルと比較して右のパネルにおける下部中央クラスタのシフトは、蛍光強度により配列の存在についての非常に高感度の測定がもたらされることを確証する。
【図１１】図１１は、デジタルＰＣＲによる１タイプのみの蛍光体を使用するデュプレックス遺伝子コピー数アッセイのヒストグラムを図示するものである；図１１ａは、液滴ピーク蛍光強度のヒストグラムを図示するものである；図１１ｂは、単色ｄＰＣＲによって測定された遺伝子コピー数の比較を示すものである。
【図１２】図１２は、マイクロ流体デバイスでの特定のターゲットに対する検出可能標識の強度のチューニングについて概略図である。
【図１３】図１３は、プローブ濃度への液滴蛍光強度の直線的依存性を図示する線グラフである（直線、最良直線適合（ｙ＝−０．０９２ｘ＋０．０８２、Ｒ２＝０．９９５）。
【図１４】図１４は、２つだけの蛍光体を用いる棘筋萎縮症についての５プレックスｄＰＣＲアッセイを図示するものである。図１４ａは、検証のための合成モデル染色体に対する５プレックスアッセイについての、ヒートマップとして示す、液滴蛍光強度の２Ｄヒストグラムである。６つのよく分解されている液滴集団は、５つの個々のアッセイ物と空の液滴に対応する；図１４ｂは、ＳＭＡパイロット研究の結果を示すものである。
【図１５】図１５は、２つだけの蛍光体を用いる棘筋萎縮症についての９プレックスｄＰＣＲアッセイを図示するものであり、液滴強度を最適化するプロセスを示している。図１５ａおよび１５ｂは、合成モデル染色体に対する９プレックスアッセイについてのヒートマップとして示す、液滴蛍光強度の２Ｄヒストグラムであり、暖色ほど高い液滴数を表す（（ａ）＝最適化前；（ｂ）＝最適化後）。
【図１６】図１６は、光学的標識と多重化の併用についての光学的概略図を図示するものである。
【図１７】図１７は、コ・フロー（ｃｏ−ｆｌｏｗ）・マイクロフルイディクスを用いる、多重化と光学的標識を併用するｄＰＣＲアッセイを図示するものである。すべての液滴からの、すなわち３回の異なるトリプレックスアッセイ物からの、寄与を示す。（両方のパネル）暖色ほど高い液滴数を表す、ヒートマップとして示す２−Ｄヒストグラム。（左のパネル）光学的標識のヒストグラム、すなわち、該光学的標識を含む２つの蛍光体についての波長で測定した液滴の蛍光強度。（右のパネル）アッセイヒストグラム、すなわち、ＦＡＭ検出（ｘ軸）およびＶＩＣ検出（ｙ軸）に適する波長で測定した液滴の蛍光強度。両方のヒストグラムを標準的な技術によってスペクトルオーバーラップについて補正した。
【図１８】図１８は、光学的標識を使用する単一アッセイ物選択を示すものである。選択は、図１７からの液滴のすべてから行った。パネルＡ〜Ｃにおける３回の異なる選択のそれぞれが、同じアッセイ物（ＴＥＲＴ、ＳＭＮ１、およびＳＭＮ２）をコードする光学的標識についてのものであった。ヒストグラムは、図１７に記載したとおりである。（左のヒストグラム、光学的標識）重畳された線が、単一の光学的標識を選択するためのバウンディングボックスの境界を画定する。（右のヒストグラム、アッセイ物）選択された光学的標識を含有する液滴のみが表示される。
【図１９】図１９は、光学的標識を使用する単一アッセイ物選択を示すものである。選択は、図１７からの液滴のすべてから行った。パネルＡ〜Ｃにおける３回の異なる選択のそれぞれが、同じアッセイ物（ＴＥＲＴ、ＳＭＮ１からのｃ．５Ｃ、およびＢＣＫＤＨＡ）をコードする光学的標識についてのものであった。ヒストグラムは、図１７に記載したとおりである。（左のヒストグラム、光学的標識）重畳された線が、単一の光学的標識を選択するためのバウンディングボックスの境界を画定する。（右のヒストグラム、アッセイ物）選択された光学的標識を含有する液滴のみが表示される。
【図２０】図２０は、光学的標識を使用する単一アッセイ物選択を示すものである。選択は、図１７からの液滴のすべてから行った。パネルＡ〜Ｃにおける３回の異なる選択のそれぞれが、同じアッセイ物（ＴＥＲＴ、ＳＭＮ１からのｃ．８８Ｇ、およびＲＮａｓｅＰ）をコードする光学的標識についてのものであった。ヒストグラムは、図１７に記載したとおりである。（左のヒストグラム、光学的標識）重畳された線が、単一の光学的標識を選択するためのバウンディングボックスの境界を画定する。（右のヒストグラム、アッセイ物）選択された光学的標識を含有する液滴のみが表示される。
【図２１】図２１は、液滴マージを用いる、多重化と光学的標識を併用するｄＰＣＲアッセイを図示するものある。
【図２２】図２２は、液滴内のハプロタイプ検出を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、生体分子の分析のための材料および方法を提供する。１つの態様において、
本発明は、マイクロ流体液滴などの液滴におけるデジタル分析に備えるものである。本発
明は、デジタルＰＣＲの実施を可能にし、およびエラーの有意な低減または排除に備えて
いる。
【００２４】
理想的には、デジタルＰＣＲの感度は、分析することができる独立した増幅の数によっ
てのみ制限され、これが、（他の箇所で詳細に論ずる）何百万もの単一分子ＰＣＲ反応を
並行して行うことができる、幾つかの超高スループットの小型化された方法の開発の動機
となった。本発明の好ましい実施形態では、マイクロフルイディクス・システムを使用し
て油によって分離された水性液滴においてデジタルＰＣＲを行う。もう１つの好ましい実
施形態において、前記油は、Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔオイル（３Ｍ）などのフッ素化油であ
る。なおさらに好ましい実施形態において、前記フッ素化油は、液滴を増幅工程中にまた
はそれらが互いに接触する任意の時点で合体しないように安定させるために、ＰＦＰＥ−
ＰＥＧ−ＰＦＰＥトリブロックコポリマーなどの界面活性剤を含有する。マイクロ流体ア
プローチは、ピコリットル容積の反応容器として機能する多数（例えば１０６以上）の非
常に均一なサイズの液滴の迅速な生成を可能にする（液滴ベースのマイクロフルイディク
スの総説を参照のこと）。しかし、説明するように、本発明は、油中水型エマルジョンに
おいて行われるｄＰＣＲに限定されず、むしろｄＰＣＲのためのすべての反応区画化法に
対して一般的である。後に続く説明の中で、本発明は、区画化のための液滴の使用に関し
て説明するが、説明のこの選択は本発明にとって限定的なものでないと、および本発明の
方法をｄＰＣＲのためのすべての他の反応区画化法と両立できると考える。
【００２５】
本発明の方法は、「多重化」として当業者に一般に知られている、複数の異なるＤＮＡ
ターゲットの存在度を定量するための同じサンプルでの複数の異なる増幅反応の同時実施
についての新規戦略を含む。多重化ｄＰＣＲアッセイのための本発明の方法は、既存のｑ
ＰＣＲまたはｄＰＣＲ技術で可能なものより大きなプレキシティー（ｐｌｅｘｉｔｙ）−
同時反応数−を約束する。それは、異なる対立遺伝子をターゲットにする複数のプライマ
ー／プローブが存在するときでさえ、最も多くの場合、いずれの１液滴内にも単一のター
ゲット対立遺伝子しか決して存在しないために生ずる、終点または限界希釈での特異な性
質の増幅に基づく。これは、指数関数期への様々な到達時間およびプライマー間の意図さ
れたものでない反応などの同時に存在する競争反応をそうでなければもたらす厄介な問題
を軽減する。
【００２６】
１つの態様において、本発明は、液滴ベースのデジタルＰＣＲにおいて感度および特異
性を維持しながらアンプリコン収量を向上させるための材料および方法を提供する。より
具体的には、本発明は、単一の核酸テンプレートと多重化ＰＣＲプライマーとを含有する
液滴を提供し、ならびにそのような液滴を形成することおよび液滴ベースのデジタルＰＣ
Ｒを用いて核酸テンプレートを増幅することによる生体サンプル中の複数のターゲットを
検出するための方法を提供する。
【００２７】
マイクロ流体液滴内での反応は、終点で非常に均一な蛍光強度を生じさせ、結局、その
強度は、プローブ加水分解効率に依存する。従って、本発明の方法のもう１つの態様では
、異なる効率を有する異なる反応を、たとえそれらが同じ色を有したとしても、終点蛍光
強度のみに基づいて識別することができる。さらに、本発明のもう１つの方法では、単に
プローブ濃度を調整することによって効率をチューニングすることができ、その結果、使
用が容易な汎用多重化法が得られる。本発明の１つの実証実験において、５プレックスＴ
ａｑＭａｎ（登録商標）ｄＰＣＲアッセイは、この程度に多重化するｑＰＣＲを象徴する
冗長な最適化とは対照的に、「すぐに（ｒｉｇｈｔ  ｏｕｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｘ）」
機能した。本発明のもう１つの態様において、複数の色の追加は、個々の反応を複数の蛍
光体で標識できるため、ｑＰＣＲのように直線的にではなく幾何級数的に可能な反応の数
を増加させる。一例として、２つの蛍光体（ＶＩＣおよびＦＡＭ）を使用して、本発明の
１回の実行で５つの異なる反応を区別した。
【００２８】
本発明の方法は、増幅反応中に発生するポリメラーゼエラーを検出することができ、お
よびポリメラーゼエラーの結果である産物を分析から排除することができる。本質的に、
本発明の方法は、偽ポジティブである増幅産物を同定することおよび分析からそれらの産
物を排除することによって、デジタルＰＣＲの感度を増大させる。
【００２９】
本発明の方法は、単一のターゲット核酸を含有するサンプル液滴を形成すること、該液
滴内の該ターゲットを増幅すること、該ターゲットからのアンプリコンおよび該ターゲッ
トの変異体からのアンプリコンを含有する液滴を排除すること、およびターゲットアンプ
リコンを分析することを含む。
【００３０】
核酸ターゲット分子
核酸分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）を包含す
る。核酸分子を合成することができ、または自然に存在する源から採取することができる
。１つの実施形態では、様々な他の成分、例えばタンパク質、脂質および非テンプレート
核酸、を含有する生体サンプルから核酸分子を単離する。動物、植物、細菌、真菌または
任意の他の細胞性生物から得られる、任意の細胞性材料から核酸テンプレート分子を得る
ことができる。一定の実施形態では、単個細胞から核酸分子を得る。本発明において使用
するための生体サンプルは、ウイルス粒子または調製物を含む。核酸分子を生物から直接
得ることができ、または生物から得た生体サンプルから、例えば血液、尿、脳脊髄液、精
液、唾液、痰、糞便および組織から、得ることができる。任意の組織または体液検体を本
発明において使用するための核酸の源として使用することができる。培養細胞、例えば一
次細胞培養物または細胞株、から核酸を単離することもできる。テンプレート核酸を得る
細胞または組織は、ウイルスまたは他の細胞内病原体に感染している場合がある。サンプ
ルは、生物検体、ｃＤＮＡライブラリー、ウイルスまたはゲノムＤＮＡから抽出された全
ＲＮＡである場合もある。一定の実施形態において、核酸分子は、他のターゲット分子、
例えばタンパク質、酵素、基質、抗体、結合剤、ビーズ、小分子、ペプチドまたは任意の
他の分子、に応じて確定され、ターゲット分子を定量および／もしくは検出するための代
用物として役立つ。
【００３１】
一般に、核酸は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．
、ｐｐ．２８０−２８１（１９８２）によって記載されたものなどの様々な技術によって
生体サンプルから抽出することができる。核酸分子は、一本鎖であってもよく、二本鎖で
あってもよく、または一本鎖領域を有する二本鎖（例えば、幹−およびループ−構造）で
あってもよい。
【００３２】
液滴形成
本発明の方法は、サンプル液滴を形成することを含み、この場合、ゼロのターゲット核
酸分子を含有する液滴もあり、１つのターゲット核酸分子を含有する液滴もあり、および
複数の核酸分子を含有することがあるまたはしないことがある液滴もある（上で定義した
とおりの限界または終点希釈にそれぞれ対応する）。好ましい実施形態において、液滴内
の分子の分布は、ポアソン分布に従う。しかし、液滴の非ポアソン負荷のための方法は当
業者に公知であり、それらの方法としては、液滴の能動的選別、例えばレーザー誘導蛍光
によるもの、または受動的な１対１負荷（ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）によ
るものが挙げられるが、これに限定されない。後に続く説明は液滴のポアソン負荷を想定
しているが、本発明は限界または終点希釈に準拠するＤＮＡ負荷量のすべての分布と両立
できるので、そのような説明は非ポアソン負荷を排除することを意図したものではない。
【００３３】
前記液滴は、不混和性キャリア流体によって包囲されている水性液滴である。そのよう
な液滴を形成する方法は、例えば、Ｌｉｎｋら（米国特許出願第２００８／００１４５８
９号、同第２００８／０００３１４２号、および同第２０１０／０１３７１６３号）、Ｓ
ｔｏｎｅら（米国特許第７，７０８，９４９号および米国特許出願第２０１０／０１７２
８０３号）、Ａｎｄｅｒｓｏｎら（米国特許第７，０４１，４８１号および再発行番号４
１，７８０として再発行されたもの）およびＲａｉｎｄａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ  Ｉｎｃ．の欧州特許出願公開第２０４７９１０号に示されている。これらのそれぞ
れの内容は、その全体が参照により本明細書に援用されている。
【００３４】
図１は、液滴形成のためのデバイス１００の例示的実施形態を示すものである。デバイ
ス１００は、流入チャネル１０１と、流出チャネル１０２と、２つのキャリア流体チャネ
ル１０３および１０４とを備えている。チャネル１０１、１０２、１０３、および１０４
は、接合部１０５で出会う。流入チャネル１０１は、サンプル流体を接合部１０５に流す
。キャリア流体チャネル１０３および１０４は、サンプル流体と不混和性であるキャリア
流体を接合部１０５に流す。流入チャネル１０１は、接合部１０５に接続するその先端部
が狭くなっている（図２参照）。流入チャネル１０１は、キャリア流体チャネル１０３お
よび１０４に垂直になるような向きになっている。サンプル流体が流入チャネル１０１か
ら接合部１０５へと流れ、そこでサンプル流体が、キャリア流体チャネル１０３および１
０４によって接合部１０５に供給される流れているキャリア流体と交差すると、液滴が形
成される。流出チャネル１０２は、キャリア流体によって包囲されたサンプル流体の液滴
を受け取る。
【００３５】
前記サンプル流体は、概して水性緩衝溶液、例えば超純水（例えばカラムクロマトグラ
フィーによって得られる、例えば１８メガオームの抵抗率）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣ
ｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または酢酸緩衝
液、である。核酸分子と生理的に適合性である任意の液体または緩衝液を使用することが
できる。前記キャリア流体は、前記サンプル流体と不混和性であるものである。前記キャ
リア流体は、非極性溶剤、デカン（例えば、テトラデカンもしくはヘキサデカン）、フル
オロカーボン油、シリコーン油または他の油（例えば、鉱物油）であり得る。
【００３６】
一定の実施形態において、前記キャリア流体は、１つ以上の添加剤、例えば、非ニュー
トン表面張力を増加させる、低減するもしくは別様に作る作用物質（界面活性剤）および
／または接触時に自然に合体しないように液滴を安定させる作用物質、を含有する。界面
活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、フッ素系界面活性剤、および水に比べて油に溶
ける他の作用物質を挙げることができる。幾つかの用途では、第二の界面活性剤または他
の作用物質、例えばポリマーもしくは他の添加剤、をサンプル流体に添加することによっ
て性能を向上させる。界面活性剤は、例えば交差チャネルに液滴を押し出すまたは注入す
るために必要な剪断力を低減することにより、液滴サイズ、流量および均一性の制御また
は最適化を助けることができる。これは、液滴体積および周期性、または液滴が交差チャ
ネルへと離脱する率または頻度に影響を及ぼすことができる。さらに、界面活性剤は、フ
ッ素化油中の水性エマルジョンが合体しないように安定させることに役立つことができる
。
【００３７】
一定の実施形態では、液滴を界面活性剤または界面活性剤の混合物で被覆することがで
きる。キャリア流体に添加することができる好ましい界面活性剤としては、ソルビタンモ
ノラウレート（Ｓｐａｎ  ２０）、ソルビタンモノパルミテート（Ｓｐａｎ  ４０）、ソ
ルビタンモノステアレート（Ｓｐａｎ  ６０）およびソルビタンモノオレエート（Ｓｐａ
ｎ  ８０）をはじめとするソルビタン系カルボン酸エステル（例えば、「Ｓｐａｎ」界面
活性剤、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｋａ）ならびに過フッ素化ポリエーテル（例えば、Ｄｕ
Ｐｏｎｔ  Ｋｒｙｔｏｘ  １５７  ＦＳＬ、ＦＳＭおよび／またはＦＳＨ）などの界面活
性剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる非イオン性界面活性
剤の他の非限定的な例としては、ポリオキシエチレン化アルキルフェノール（例えば、ノ
ニル−、ｐ−ドデシル−、およびジノニルフェノール）、ポリオキシエチレン化直鎖アル
コール、ポリオキシエチレン化ポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化
メルカプタン、長鎖カルボン酸エステル（例えば、天然脂肪酸のグリセリルおよびポリグ
リセリルエステル、プロピレングリコール、ソルビトール、ポリオキシエチレン化ソルビ
トールエステル、ポリオキシエチレングリコールエステルなど）ならびにアルカノールア
ミン（例えば、ジエタノールアミン−脂肪酸縮合物およびイソプロパノールアミン−脂肪
酸縮合物）が挙げられる。
【００３８】
一定の実施形態では、キャリア流体中の界面活性剤がチャネル壁を被覆するように、キ
ャリア流体を、流出チャネルを通して流れさせることができる。１つの実施形態では、過
フッ素化ポリエーテルＤｕＰｏｎｔ  Ｋｒｙｔｏｘ  １５７  ＦＳＬ、ＦＳＭまたはＦＳ
Ｈと水酸化アンモニウム水溶液とを揮発性フッ素化溶剤中で反応させることによって、フ
ッ素系界面活性剤を調製することができる。溶剤ならびに残留水およびアンモニアをロー
タリーエバポレータで除去することができる。その後、その界面活性剤をフッ素化油（例
えば、Ｆｌｏｕｒｉｎｅｒｔ（３Ｍ））に溶解することができ（例えば、２．５重量％）
、すると担体液として役立つ。
【００３９】
ラムダインジェクタと呼ばれるデバイスを使用して、サンプル流体を合体させることへ
の１つのアプローチは、液滴を形成すること、および該液滴と流体ストリームを接触させ
ることを含み、この場合、該流体ストリームの一部分が該液滴と一体化して混合液滴を形
成する。このアプローチでは、１つの形態の液滴内のマージエリアに１つの相しか到達す
る必要がない。そのような方法のさらなる説明は、Ｙｕｒｋｏｖｅｔｓｋｙらの共同所有
および同時係属米国特許出願（米国特許出願第６１／４４１，９８５号）に示されており
、前記出願の内容は、その全体が参照により本明細書に援用されている。
【００４０】
ラムダインジェクタの動作方法に従って、上で説明したように液滴を形成する。第一の
サンプル流体からのサンプル液滴の形成後、その液滴を第二のサンプル流体ストリームの
フローと接触させる。前記液滴と前記流体ストリームの接触の結果、該流体ストリームの
一部分が該液滴と一体化して混合液滴を形成することとなる。
【００４１】
不混和性キャリア流体によって互いに隔てられており、その不混和性キャリア流体に懸
濁している第一のサンプル流体の液滴が、第一のチャネルを通って流れる。液滴は、容積
式ポンプによって生成される圧力駆動フローによりマージエリア、すなわち第一のチャネ
ルと第二のチャネルの接合部、に送達される。液滴がそのマージエリアに到着すると、第
二のサンプル流体のボーラスが、第二のチャネルの開口部から第一のチャネルに押し出さ
れることとなる。好ましくは、これらのチャネルは、互いに垂直な向きである。しかし、
これらのチャネルを直行させる結果となる任意の角度を用いることができる。
【００４２】
前記第二のサンプル流体ストリームのボーラスは、チャネルに接続された容積式ポンプ
のポンピング作用のためサイズを増しつづけ、それがマージエリアへの第二のサンプル流
体の定常ストリーム流を産出する。第一のサンプル流体を含有する流れている液滴は、そ
の第一のチャネルの中に押し出されている第二のサンプル流体のボーラスと最終的に接触
する。これら２つのサンプル流体間の接触の結果、第二のサンプル流体の一部分が、該第
二のサンプル流体ストリームから分けられ、第一のサンプル流体液滴と合流して混合液滴
を形成することとなる。一定の実施形態では、第一のサンプル流体の入って来る液滴それ
ぞれを同量の第二のサンプル流体と合体させる。
【００４３】
一定の実施形態では、第一および第二サンプル流体に電荷を印加する。サンプル流体へ
の電荷の印加についての説明は、Ｌｉｎｋら（米国特許出願第２００７／０００３４４２
号）およびＲａｉｎｄａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃの欧州特許第２００
４３１６号に提供されており、これらのそれぞれの内容はその全体が参照により本明細書
に援用されている。任意の適する技術を用いて、例えば、第一および第二のサンプル流体
を電場（ＡＣ、ＤＣなどであり得る）の中に置くことにより、ならびに／または第一およ
び第二のサンプル流体に電荷を持たせる反応、例えば化学反応、イオン反応、光触媒反応
など、を起こさせることにより、キャリア流体内の第一および第二のサンプル流体内で電
荷を作り出すことができる。
【００４４】
幾つかの実施形態において、電場は、電場発生器、すなわち、流体に印加することがで
きる電場を作り出すことができるデバイスまたはシステム、から発生される。電場発生器
は、ＡＣ場（すなわち、時間に対して周期的に、例えば正弦波的に、変動するもの、鋸歯
、方形など）、ＤＣ場（すなわち、時間に対して一定しているもの）、パルス場などを生
じさせることができる。チャネルまたはマイクロ流体チャネル内に収容された流体の中で
電場を作り出すように、電場発生器を構築および配置することができる。幾つかの実施形
態によると、電場発生器は、チャネルまたはマイクロ流体チャネルを含む流体システムと
一体型であることもあり、または別個であることもある。
【００４５】
適する電場（ＡＣ、ＤＣなどであり得る）を生じさせる技術は、当業者に公知である。
例えば、１つの実施形態では、１対の電極の両端に電圧を印加することによって電場を生
じさせ、それらの電極を流体システム上に配置してもよく、もしくは流体システム内に（
例えば、チャネルもしくはマイクロ流体チャネルを規定する基板内に）埋め込んでもよく
、および／または電場の少なくとも一部分が流体と相互作用するように流体の近位に配置
してもよい。前記電極は、銀、金、銅、炭素、白金、銅、タングステン、スズ、カドミウ
ム、ニッケル、酸化インジウムスズ（「ＩＴＯ」）など、ならびにこれらの組み合わせを
はじめとする（しかしそれらに限定されない）、当業者に公知の任意の適する電極材料（
単数または複数）から作ることができる。場合によっては、透明または実質的に透明な電
極を使用することができる。
【００４６】
電場は、第二のサンプル流体と液滴を隔てる界面の破断を助長する。界面の破断は、第
二のサンプル流体のボーラスと第一のサンプル流体液滴のマージを助長する。形成混合液
滴は、第一のサンプル流体を含有する次の液滴の到着およびマージ前に第二のサンプル流
体の一部分が第二のサンプル流体ストリームから解放されるまたは分割するまで、大きく
なり続ける。第二のサンプル流体ストリームからの第二のサンプル流体の前記部分の分割
は、混和性キャリア流体によって形成混合液滴に及ぼされる剪断力が表面張力（この作用
は、第二のサンプル流体の分割部分を第二のサンプル流体ストリームとつながったままに
することである）に打ち勝つやいなや発生する。今や完全に形成された混合液滴が、第一
のチャネルを通って流れ続ける。
【００４７】
他の実施形態において、界面の破断は自然発生的である場合があり、または表面化学に
よって破断を助長することができる。任意の手段によって破断を生じさせることができる
ので、本発明は、界面での破断方法に関して限定されない。
【００４８】
ＰＣＲに関連して、好ましい実施形態では、第一のサンプル流体は核酸テンプレートを
含有する。前記第一のサンプル流体の液滴は、上で説明したように形成される。これらの
液滴は、核酸テンプレートを含むであろう。一定の実施形態において、前記液滴は、単一
の核酸テンプレートのみを含むこととなり、従って、デジタルＰＣＲを行うことができる
。第二のサンプル流体は、ＰＣＲ反応のための試薬を含有する。そのような試薬としては
、一般に、Ｔａｑポリメラーゼ、タイプＡ、Ｃ、ＧおよびＴのデオキシヌクレオチド、塩
化マグネシウム、ならびにフォワードおよびリバースプライマーが挙げられ、これらのす
べてが水性緩衝液に懸濁されている。前記第二の流体は、増幅されたターゲット核酸を検
出するための検出可能に標識されたプローブも含み、これらの詳細は下で論ずる。次に、
核酸を含有する液滴を、上で説明したような第二の流体中のＰＣＲ試薬と合体させて、Ｔ
ａｑポリメラーゼ、タイプＡ、Ｃ、ＧおよびＴのデオキシヌクレオチド、塩化マグネシウ
ム、フォワードおよびリバースプライマー、検出可能に標識されたプローブならびにター
ゲット核酸を含む液滴を生じさせる。もう１つの実施形態において、前記第一の流体は、
テンプレートＤＮＡおよびＰＣＲマスターミックス（下で定義する）を含有することがで
き、ならびに前記第二の流体は、フォワードおよびリバースプライマーならびにプローブ
を含有することができる。本発明は、ＰＣＲまたはデジタルＰＣＲのための第一および第
二のフルイディクスの要素構成に関して如何なる点においても制限されない。例えば、幾
つかの実施形態において、前記テンプレートＤＮＡは、液滴内部の第二の流体に含有され
る。
【００４９】
ターゲット増幅
本発明の方法は、各液滴内のターゲット核酸を増幅することをさらに含む。増幅は、核
酸配列の追加のコピーの生産を指し、一般に、ポリメラーゼ連鎖反応または当該技術分野
において周知の他の技術を用いて行われる（例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  
Ｄｖｅｋｓｌｅｒ、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ、ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、
Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．［
１９９５］）。増幅反応は、核酸分子を増幅する当該技術分野において公知の任意の増幅
反応、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖
反応（Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：１８９−１９３；Ｂａｒａｎｙ
Ｆ．（１９９１）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：
５−１６）、リガーゼ検出反応（Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：１８
９−１９３）、鎖置換増幅、転写ベースの増幅システム、核酸配列ベースの増幅、ローリ
ングサークル増幅および超分岐ローリングサークル増幅であり得る。
【００５０】
一定の実施形態において、前記増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応である。ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、クローニングまたは精製なしでゲノムＤＮＡの混合物中のター
ゲット配列のセグメントの濃度を増加させるためのＫ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓによる方法（参
照により本明細書に援用されている、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６
８３，２０２号）を指す。ターゲット配列を増幅するためのプロセスは、所望のターゲッ
ト配列を含有するＤＮＡ混合物への過剰なオリゴヌクレオチドプライマーの導入、続いて
のＤＮＡポリメラーゼの存在下での的確な順序の熱サイクリングを含む。前記プライマー
は、二本鎖ターゲット配列のそれらそれぞれの鎖に相補的である。
【００５１】
増幅を果たすために、プライマーをターゲット分子内のそれらの相補配列にアニールす
る。アニーリング後、それらのプライマーをポリメラーゼで伸長して、新たな相補鎖対を
形成する。変性、プライマーアニーリングおよびポリメラーゼ伸長の工程を何度も繰り返
して（すなわち、変性、アニーリングおよび伸長が１サイクルを構成する；非常に多くの
サイクルがあり得る）、所望のターゲット配列の高濃度の増幅セグメントを得ることがで
きる。所望のターゲット配列の増幅セグメントの長さは、プライマーの互いに対する相対
的位置によっておよびサイクリングパラメータによって決定され、従って、この長さは、
制御可能なパラメータである。
【００５２】
液滴内でＰＣＲを行うための方法は、例えば、Ｌｉｎｋら（米国特許出願第２００８／
００１４５８９号、同第２００８／０００３１４２号、および同第２０１０／０１３７１
６３号）、Ａｎｄｅｒｓｏｎら（米国特許第７，０４１，４８１号および再発行番号４１
，７８０として再発行されたもの）およびＲａｉｎｄａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ  Ｉｎｃ．の欧州特許出願公開第２０４７９１０号に示されており、これらのそれぞれ
の内容はその全体が参照により本明細書に援用されている。
【００５３】
サンプル液滴をプライマー（単数もしくは複数）と予混してもよいし、またはプライマ
ー（単数もしくは複数）を前記液滴に添加してもよい。幾つかの実施形態では、出発サン
プルを分割することによって作られた液滴を、ターゲット核酸のための１つ以上のプライ
マーを含む第二のセットの液滴と合体させて、最終液滴を生じさせる。液滴のマージは、
例えば、Ｌｉｎｋら（米国特許出願第２００８／００１４５８９号、同第２００８／００
０３１４２号、および同第２０１０／０１３７１６３号）およびＲａｉｎｄａｎｃｅ  Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．の欧州特許出願公開第２０４７９１０号に記載されて
いる１つ以上の液滴マージ技術を用いて遂行することができる。
【００５４】
液滴のマージを含む実施形態では、２つの液滴形成モジュールを使用する。１つの実施
形態において、第一の液滴形成モジュールは、ターゲット核酸の限界または終点希釈に見
合ったサンプル液滴を生じさせる。第二の液滴形成または再注入モジュールは、ＰＣＲ反
応用の試薬を含有する液滴を挿入する。そのような液滴は、一般に、「ＰＣＲマスターミ
ックス」（少なくともＴａｑポリメラーゼと、タイプＡ、Ｃ、ＧおよびＴのデオキシヌク
レオチドと、塩化マグネシウムとを含有する混合物として当業者に公知）ならびにフォワ
ードおよびリバースプライマー（ひとまとめにして「プライマー」として当業者に公知）
を含み、これらのすべてが水性緩衝液に懸濁されている。前記第二の液滴は、増幅された
ターゲット核酸を検出するための検出可能に標識されたプローブも含み、これらの詳細は
下で論ずる。２つの液滴タイプ間での試薬の異なる取り合わせが考えられる。例えば、別
の実施形態では、テンプレート液滴もＰＣＲマスターミックスを含有するが、プライマー
およびプローブは第二の液滴内に残存する。試薬およびテンプレートＤＮＡの任意の取り
合わせを本発明に従って用いることができる。
【００５５】
プライマーは、当該技術分野において周知の方法（Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  
Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：９０（１９７９）；Ｂｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．、６８：１０９（１９７９））を用いる適切な配列のクローニングおよび直接化
学合成をはじめとする（しかしこれらに限定されない）様々な方法によって調製すること
ができる。プライマーを商業的供給源、例えばＯｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＳｉｇｍａおよびＬｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、から得ることもできる。前記プライマーは、同一融解温度
を有することができる。前記プライマーの長さを５’末端または３’末端で伸長または短
縮して、所望の融解温度を有するプライマーを生成させることができる。また、プライマ
ー対の配列および長さが所望の融解温度を生じさせるように、各プライマー対のアニーリ
ング位置を設計することができる。２５塩基対より小さいプライマーの融解温度を決定す
るための最も単純な方程式は、ウォーレスの法則（Ｗａｌｌａｃｅ  Ｒｕｌｅ）（Ｔｄ＝
２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ））である。プライマーの融解温度を決定するためのもう１つ
の方法は、ニアレストネーバー法である。Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｓｏｆｔｗａ
ｒｅ（Ａｒｒａｙｉｔ  Ｉｎｃ．）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ．）、ＮｅｔＰｒｉｍｅｒ、およびＨ
ｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇからのＤＮＡｓｉｓをはじめ
とする（しかしこれらに限定されない）コンピュータプログラムを使用してプライマーを
設計することもできる。各プライマーのＴＭ（融解またはアニーリング温度）は、Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．から入手できるＯｌｉｇｏ  Ｄｅｓｉｇｎなどのソフトウェ
アプログラムを使用して計算する。
【００５６】
１つの実施形態では、チャネルを通って流れるサンプル液滴とＰＣＲ試薬液滴の相互嵌
合（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｉｏｎ）を生じさせるように液滴形成モジュールを配置お
よび制御する。そのような配置は、例えば、Ｌｉｎｋら（米国特許出願第２００８／００
１４５８９号、同第２００８／０００３１４２号、および同第２０１０／０１３７１６３
号）およびＲａｉｎｄａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．の欧州特許出願公
開第２０４７９１０号に記載されている。
【００５７】
次に、サンプル液滴をＰＣＲ試薬液滴と合体させて、ＰＣＲマスターミックスとプライ
マーと検出可能に標識されたプローブとターゲット核酸とを含む液滴を生成させる。例え
ば、電場勾配を用いて液滴に対する誘電泳動力を生じさせて、液滴を合体させるようにそ
の力を制御すること；異なるサイズの液滴であって、それ故、異なる速度で移動する液滴
を生成し、それによって液滴を合体させること；および異なる粘度を有する液滴であって
、それ故、異なる速度で移動する液滴を生成させ、それによって液滴を互いに合体させる
ことにより、液滴を合体することができる。これらの技術のそれぞれが、Ｌｉｎｋら（米
国特許出願第２００８／００１４５８９号、同第２００８／０００３１４２号、および同
第２０１０／０１３７１６３号）およびＲａｉｎｄａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｉｎｃ．の欧州特許出願公開第２０４７９１０号にさらに記載されている。液滴を合体
させるための液滴に対する誘電泳動力の生成および制御についてのさらなる説明は、Ｌｉ
ｎｋら（米国特許出願第２００７／０００３４４２号）およびＲａｉｎｄａｎｃｅ  Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．の欧州特許出願公開第２００４３１６号に記載されてい
る。
【００５８】
単純液滴生成と呼ばれる、もう１つの実施形態では、テンプレートＤＮＡとＰＣＲマス
ターミックスとプライマーと検出可能に標識されたプローブとを既に含有する混合物から
液滴を生成させるように単一の液滴形成モジュールまたは多数の液滴形成モジュールを配
置する。コ・フローと呼ばれるさらにもう１つの実施形態では、単一の液滴形成モジュー
ルの上流で２つのチャネルが交差し、それによって２つのフローストリームを収束させる
。一方のフローストリームは、１セットの試薬とテンプレートＤＮＡを含有し、他方は、
残りの試薬を含有する。コ・フローについての好ましい実施形態では、テンプレートＤＮ
ＡおよびＰＣＲマスターミックスが一方のフローストリームの中にあり、プライマーおよ
びプローブが他方の中にある。しかし、本発明は、いずれのフローストリームの要素構成
に関しても限定されない。例えば、もう１つの実施形態では、一方のフローストリームが
テンプレートＤＮＡのみを含有し、他方はＰＣＲマスターミックス、プライマーおよびプ
ローブを含有する。流体交差部においてフローストリームが収束するとき、該フロースト
リームは、液滴生成ノズルの前で混ざることもあり、または混ざらないこともある。いず
れの実施形態においても、第一のストリームからの多少の量の流体、および第二のストリ
ームからの多少の量の流体が単一の液滴内に封入される。封入後に完全混合が起こる。
【００５９】
上の液滴形成実施形態のいずれかにより、または任意の他の実施形態により、最終液滴
を生成されたら、それらの液滴を熱サイクルに付して、各液滴内のターゲット核酸の増幅
を生じさせる。一定の実施形態では、液滴をＰＣＲ熱サイクリングチューブにエマルジョ
ンとしてオフチップで回収し、その後、従来の熱サイクラーでの熱サイクルに付す。熱サ
イクリングについての温度プロフィールは、ＰＣＲによる任意の従来のＤＮＡ増幅と同様
に調整および最適化することができる。
【００６０】
一定の実施形態では、加熱ラインと冷却ラインの間の蛇行通路内のチャネルを通して液
滴を流して、該液滴内の核酸を増幅する。前記チャネルの幅および深さを調整して各温度
での滞留時間を設定してもよく、１秒未満と数分の間のどのような程度にも滞留時間を制
御することができる。
【００６１】
一定の実施形態では、３つの温度ゾーンを増幅反応に用いる。二本鎖核酸の変性（高温
ゾーン）、プライマーのアニーリング（低温ゾーン）および二本鎖核酸を生産するための
一本鎖核酸の増幅（中温ゾーン）を生じさせるように、前記３つの温度ゾーンを制御する
。これらのゾーン内の温度は、ＰＣＲ反応を行うための当該技術分野において周知の範囲
内に入る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  
Ｙｏｒｋ、２００１）を参照のこと。
【００６２】
一定の実施形態では、前記３つの温度ゾーンを次のような温度を有するように制御する
：９５℃（ＴＨ）、５５℃（ＴＬ）、７２℃（ＴＭ）。調製されたサンプル液滴は、制御
された速度でチャネルを通って流れる。サンプル液滴は、熱サイクリング前に初期変性ゾ
ーン（ＴＨ）を先ず通過する。初期予熱は、サンプル液滴内の核酸が熱サイクリング前に
首尾よく変性してしまうための拡張ゾーンである。予熱ゾーンの必要条件、および必要と
される変性時間の長さは、その反応において用いられることとなる化学に依存する。サン
プルは、おおよそ９５℃の高温ゾーンを通過し、そこでサンプルは、変性と呼ばれるプロ
セスで先ず一本鎖ＤＮＡへと分離される。次に、サンプルは、おおよそ５５℃の低温へと
流れ、そこでハイブリダイゼーションプロセスが発生し、その間にプライマーがサンプル
の相補配列にアニールする。最後に、サンプルがおおよそ７２℃の第三の中温を通って流
れると、ポリメラーゼプロセスが発生し、このときプライマーは熱安定性酵素でＤＮＡの
一本鎖に沿って伸長される。各ゾーンにおける温度を制御するための方法としては、電気
抵抗、ペルチェ接合、マイクロ波照射、および赤外線での照明を挙げることができるが、
これらに限定されない。
【００６３】
核酸は、チャネルを通って流れるにつれて液滴が各熱サイクルを通過するのと同じ熱サ
イクリングおよび化学反応を受ける。そのデバイスにおけるサイクルの総数は、熱ゾーン
の拡張によって、または連続ループ構造を作ることによって、容易に改変される。サンプ
ルは、それが完全熱デバイスのＮ回の増幅サイクルを通過するのと同じ熱サイクリングお
よび化学反応を受ける。
【００６４】
他の実施形態では、ＰＣＲ反応のための２つの個々の温度ゾーンを実現するように温度
ゾーンを制御する。一定の実施形態では、前記２つの温度ゾーンを、次のような温度を有
するように制御する：９５℃（ＴＨ）および６０℃（ＴＬ）。サンプル液滴は、場合によ
り、熱サイクリングに入る前に初期予熱ゾーンを通って流れる。この予熱ゾーンは、活性
化のための、およびまた、熱サイクリング反応が始まる前に液滴内の二本鎖核酸を確実に
十分に変性させるための、何らかの化学にとって重要であり得る。例示的実施形態では、
その予熱ドウェル長が、より高温での液滴のおおよそ１０分の予熱をもたらす。
【００６５】
サンプル液滴は、おおよそ９５℃の高温ゾーンへと続き、そこでこのサンプルは変性と
呼ばれるプロセスで先ず一本鎖ＤＮＡに分離される。次に、そのサンプルは、そのデバイ
スを通っておおよそ６０℃の低温ゾーンへと流れ、そこでハイブリダイゼーションプロセ
スが起こり、その間にプライマーがそのサンプルの相補配列にアニールする。最後に、ポ
リメラーゼプロセスが発生し、このときプライマーは熱安定性酵素でＤＮＡの一本鎖に沿
って伸長される。サンプルは、完全デバイスの各熱サイクルを通過するのと同じ熱サイク
リングおよび化学反応を受ける。そのデバイスにおけるサイクルの総数は、ブロック長お
よび配管によって容易に改変される。
【００６６】
もう１つの実施形態では、液滴をオンチップで作成および／またはマージし、その後、
ＰＣＲチューブなどの何らかのタイプの保管容器内に同じチップ若しくは別のチップ上ま
たはオフチップで保管する。その後、液滴を収容しているチップまたは保管容器全体をサ
イクルに付して、所望のＰＣＲ加熱および冷却サイクルを達成する。
【００６７】
もう１つの実施形態では、液滴を除去することなく液滴と周囲の油の間の密度差によっ
て油を迅速に交換することができるチャンバに、液滴を回収する。このとき、容器内の油
を異なる温度の油と交換することによって、液滴の温度を容易に変えることができる。こ
の技術は、大まかに、２および３工程温度サイクリングまたは任意の他の温度順序で有用
である。
【００６８】
本発明は、液滴を熱サイクルに付す方法によって限定されない。任意の液滴熱サイクリ
ング法を用いることができる。
【００６９】
ターゲット検出
増幅後、増幅産物の検出のための検出モジュールに液滴を流す。液滴をオフチップで熱
サイクルに付す実施形態については、液滴は、読み出しのために第二の流体回路−液滴生
成のための流体回路（単数もしくは複数）と同じチップ上にあってもよいし、なくてもよ
い−への再注入を必要とし、または一定の実施形態では読み出しのために液滴を液滴生成
に使用した元の流体回路に戻って再注入してもよい。当該技術分野において公知の任意の
方法、例えばレポーターの存在または量の検出、を用いて、それらの液滴を個々に分析お
よび検出することができる。一般に、前記検出モジュールは、１つ以上の検出装置と連通
している。前記検出装置は、光学的もしくは電気的検出器またはこれらの組み合わせであ
り得る。適する検出装置の例としては、光導波路、顕微鏡、ダイオード、光刺激デバイス
（例えば、レーザー）、光電子倍増管およびプロセッサ（例えば、コンピュータおよびソ
フトウェア）、ならびに特性、マーカーまたはレポーターのシグナル表示を検出するため
におよび選別モジュールでの測定または選別動作を決定および命令するために共働するこ
れらの組み合わせが挙げられる。検出モジュールおよび液滴中の増幅産物の検出方法につ
いてのさらなる説明は、Ｌｉｎｋら（米国特許出願第２００８／００１４５８９号、同第
２００８／０００３１４２号、および同第２０１０／０１３７１６３号）およびＲａｉｎ
ｄａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．の欧州特許出願公開第２０４７９１０
号に示されている。
【００７０】
一定の実施形態では、増幅されたターゲットを、検出可能に標識されたプローブを使用
して検出する。特定の実施形態において、前記検出可能に標識されたプローブは、蛍光標
識されたプローブなどの光学的に標識されたプローブである。蛍光標識の例としては、Ａ
ｔｔｏ色素、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホ
ン酸；アクリジンおよび誘導体；アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；５−（２
’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ
−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（
４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリ
アント・イエロー；クマリンおよび誘導体；クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン
（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ｔｒｉｆ
ｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（クマラン１５１）；シアニン色素；シア
ノシン；４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５’’ジ
ブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ｓｕｌｆｏｎａｐｈｔｈａｌｅｉｎ）（ブロ
モピロガロール・レッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニ
ル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソ
チオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシ
アナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−
スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフ
ェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体；エオシン
、エオシンイソチオシアネート、エリトロシンおよび誘導体；エリトロシンＢ、エリトロ
シン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体；５−カルボキシ
フルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフル
オレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキ
シフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、
（ＸＲＩＴＣ）；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイ
ソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチ
ロシン；パラローズアニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジ
アルデヒド；ピレンおよび誘導体；ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピ
レン；ブチレート量子ドット；リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（商標）ブリリ
アント・レッド  ３Ｂ−Ａ）ローダミンおよび誘導体；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン
（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルク
ロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチ
オシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１
のスルホニルクロリド誘導体（テキサス・レッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−
６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルロー
ダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレ
ート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ  ７００；ＩＲＤ  ８００；
ラホーヤブルー（Ｌａ  Ｊｏｌｔａ  Ｂｌｕｅ）；フタロシアニン；ならびにナフタロシ
アニンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい蛍光標識は、ＦＡＭおよびＶＩ
Ｃ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから）である。他の光学的に検出可
能な標識を含めて、蛍光標識以外の標識が本発明により考えられる。
【００７１】
一定の態様において、本発明の液滴は、液滴内で生産されるアンプリコンにハイブリダ
イズする多数の検出可能プローブを含有する。前記複数のプローブの構成員は、それぞれ
、同じ検出可能標識を含むことがあり、または異なる検出可能標識を含むことがある。前
記複数のプローブは、様々な濃度のプローブの１つ以上の群を含むこともある。様々な濃
度のプローブの前記群は、様々なプローブ濃度のため強度の点で様々である、同じ検出可
能標識を含むことができる。
【００７２】
別の実施形態において、方法または検出のための波長に対して透明である保管デバイス
内の単層に閉じ込められた液滴のスキャンによって、検出を行うことができる。この仕方
で保管された液滴は、スキャナーによる保管デバイスの移動または保管デバイスの上での
スキャナー移動のいずれかによってスキャンすることができる。
【００７３】
本発明は、上で説明したようなＴａｑＭａｎアッセイに限定されず、むしろ本発明は、
すべての蛍光発生性ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブ、例えば分子ビーコン、Ｓｏ
ｌａｒｉｓプローブ、スコーピオンプローブ、およびハイブリダイゼーションによるター
ゲットＤＮＡの配列特異的認識によって機能し、そのターゲット配列の増幅により蛍光増
加を生じさせる任意の他のプローブ、の使用を包含する。
【００７４】
液滴内でのデジタルＰＣＲ性能
エマルジョン形式でのデジタルＰＣＲ性能を、参照遺伝子、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナ
ーゼＥ１（ＢＣＫＤＨＡ）、の系列希釈物を測定することによって検証した。液滴生成マ
イクロ流体チップを使用して、ＰＣＲマスターミックスと、１×プライマーと、ＢＣＫＤ
ＨＡ用のプローブと、様々な濃度のヒトゲノムＤＮＡ混合物（１：１  ＮＡ１４０９１と
ＮＡ１３７０５）との混合物を、フッ素化油中水型エマルジョン中の１００万個を超える
５．３ｐＬ液滴に区画化した。そのエマルジョンをオフチップで熱サイクルに付し、その
後、各液滴の蛍光を読み出しチップにおいて蛍光によって分析した（図３参照）。
【００７５】
液滴生成および読み出しのための例示的マイクロ流体システムを、図３に図示する。液
滴生成および読み出しのためのマイクロ流体システム。図３ａ（液滴生成チップ）に示す
ように、ＰＣＲマスターミックスとプライマーとプローブとテンプレートＤＮＡとを含有
する連続水性相が左から流体交差部へと流れ、キャリア油が上部および下部から入った。
水性液の新生ボーラスを、交差部内で、流体の張力が水性液の表面張力を超えはじめて耐
えきれなくなって別個の４ｐＬ液滴になる直前に撮像した。交差部を出て右へと向かう液
滴の定常的つらなりを熱サイクリング用の安定したエマルジョンとしてオフチップで回収
した。図３ｂは、読み出しのための液滴間隔どりを図示するものである。連続相の代わり
に（ａ）からのエマルジョンを熱サイクリング後に左から交差部に注入したことを除き、
３ａの場合と同様にフローを準備した。オフチップ処理中にエマルジョンから油が排液さ
れる故、エマルジョンは、この画像では交差部の前は密充填されているように見えた。交
差部に導入された油によって液滴は分離され、矢印によってしるしをつけた位置で各液滴
の蛍光を測定した。図３ｃは、蛍光による液滴読み出しの漫画を描いたものである。比較
的頻度の低いＰＣＲ（＋）液滴（薄灰色）が大多数のＰＣＲ（−）液滴（濃灰色）と一緒
に検出器のほうに流れる。液滴は、検出領域を通過している間にレーザー誘導蛍光による
問い合わせを逐次的に受ける。
【００７６】
系列希釈の場合、１液滴あたりのターゲットＤＮＡ分子の平均数−この時点以降「占有
率」と呼ぶ−は、ＤＮＡ濃度に正比例して増加するはずである。この占有率は、当業者に
周知の次の方程式を用いてポアソン統計から計算した：
【００７７】
【数１】
0006263225.tif 000002
（この式中、ＰおよびＮは、それぞれ、ＰＣＲ（＋）およびＰＣＲ（−）液滴の数である
）。
【００７８】
読み出しチップを通って流れているときに蛍光によって液滴を分析して、ＰＣＲ（＋）
およびＰＣＲ（−）液滴の数をカウントした（図３ｃ参照）。各液滴が（図３ｂにおいて
矢印でしるしをつけた）検出ゾーンを通過すると、蛍光のバーストが観察された。異なる
チップ配置などのために起こり得る蛍光強度のラン間の小さな差を説明するために、各デ
ータセットを、空の液滴の平均蛍光強度が０．１Ｖになるように拡大縮小した。図４ａは
、その系列の中で最高ＤＮＡ濃度を有するサンプルについての個々の液滴からの蛍光バー
ストの典型的トレースの非常に短い継続時間を示している。ＰＣＲ（＋）およびＰＣＲ（
−）液滴は、蛍光強度によって容易に識別された。〜０．８Ｖでピークに達する２つの大
きな蛍光バーストがＰＣＲ（＋）液滴から発生し、これに対してＰＣＲ（−）液滴では不
完全な蛍光消光に起因するより小さいバーストが〜０．１Ｖでピークに達した。完全デー
タセットからのピーク強度のヒストグラムは、０．１０および０．７８Ｖに中心を有する
２つの明確な集団を明示した（図４ｂ）。これは、図４ａにおける短いトレースにおいて
明白な傾向が、はるかに長い期間にわたって安定していたことの証拠となる。図４ｂにお
ける２つの集団の統合により、合計１９７，５０７個のＰＣＲ（＋）および１，２４０，
１２６個のＰＣＲ（−）液滴を得た。従って、Ｅｑｎ．１によりこのサンプルについての
占有率は０．１５であり、これは、１１０ｎｇ／μＬの測定ＤＮＡ濃度に基づく０．１８
の期待占有率に対応した。系列希釈での各サンプルについての占有率を測定し、希釈方程
式：
【００７９】
【数２】
0006263225.tif 000003
に当てはめた。この直線当てはめは、データと非常によく一致しており、Ｒ２値は０．９
９９９であり、および当てはめられた希釈係数は５．０の期待値とほぼ一致して４．８で
あった。
【００８０】
デジタルＰＣＲ反応における多重化プライマー
Ｌｉｎｋら（米国特許出願第２００８／００１４５８９号、同第２００８／０００３１
４２号、および同第２０１０／０１３７１６３号）、Ａｎｄｅｒｓｏｎら（米国特許第７
，０４１，４８１号および再発行番号４１，７８０として再発行されたもの）およびＲａ
ｉｎｄａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃの欧州特許出願公開第２０４７９１
０号（これらのそれぞれの内容は、それら全体が参照により本明細書に援用されている）
に記載されているような液滴ベースのデジタルＰＣＲ技術は、１ライブラリー液滴あたり
単一のプライマー対を用いる。このライブラリー液滴を、プライマーを除いてゲノムＤＮ
Ａを含むすべてのＰＣＲ試薬を含有するテンプレート液滴と合体させる。テンプレート液
滴とプライマーライブラリー液滴のマージ後、その新たな液滴は今やＰＣＲを行うために
必要なすべての試薬を含有する。その後、その液滴を熱サイクルに付してアンプリコンを
生産する。１つの実施形態では、平均して１液滴あたり１未満の半数体が存在するように
テンプレートＤＮＡをテンプレートミックスで希釈する。
【００８１】
１液滴あたり１つの半数体ゲノム（すなわち、１つの対立遺伝子）しか有さないことは
、チューブまたはマイクロウエルにおける標準的なシングルプレックスまたはマルチプレ
ックスＰＣＲに勝る液滴ＰＣＲの利点をもたらす。例えば、伝統的なＰＣＲでは、両方の
対立遺伝子が反応ミックス中に存在するので、対立遺伝子間のＰＣＲ効率に差がある場合
、最高効率を有する対立遺伝子が過剰に示されることとなる。加えて、注意深いプライマ
ー設計にもかかわらず、ＰＣＲプライマーがハイブリダイズする配列に不一致がある場合
がある。プライマーハイブリダイゼーション配列の不一致は、野生型配列を有する対立遺
伝子と比較してこの不一致を有する対立遺伝子についてのほうが低いハイブリダイゼーシ
ョン効率をプライマーが有する原因となり得る。これは、両方の対立遺伝子が同じ反応ミ
ックス中に存在する場合、一方の対立遺伝子が他方の対立遺伝子より優先的に増幅される
原因にもなり得る。
【００８２】
液滴ベースのＰＣＲでは、１液滴あたり１つのテンプレート分子、従って１液滴あたり
１つの対立遺伝子、しか存在しないため、これらの問題は回避される。従って、１つの対
立遺伝子についてのＰＣＲ効率を低減するプライマー不一致がたとえ存在したとしても、
対立遺伝子は分離されるおよび従って均一に増幅されるため、対立遺伝子間の競合がない
。
【００８３】
チューブまたはウエルにおける標準的なＰＣＲプライマーの伝統的多重化の最適化が難
しいことは公知である。同じ反応で産生される複数のＰＣＲアンプリコンは、配列または
長さの違いのために異なる効率を有するアンプリコン間での競合をもたらすことがある。
これは、競合するアンプリコン間での収量の変動をもたらし、その結果、不均一なアンプ
リコン収量となり得る。しかし、液滴ベースのデジタルＰＣＲは、１液滴あたり１つのテ
ンプレート分子しか利用しないため、液滴内に複数のＰＣＲプライマー対がたとえ存在し
たとしても、１つのプライマー対しか活性にならない。１液滴あたり１つのアンプリコン
しか生成されることとならないので、アンプリコン間に競合はなく、その結果、異なるア
ンプリコン間でより均一なアンプリコン収量が得られる。
【００８４】
１塩基あたりの十分なシークエンシング網羅を達成するための特定の量のＤＮＡおよび
／または特定の数のＰＣＲポジティブ液滴のいずれかを生成させるために、一定の量のＤ
ＮＡが必要とされる。液滴のわずかな割合、標準的な手順でおおよそ３分の１、しかＰＣ
Ｒポジティブでないため、テンプレートＤＮＡ分子あたりの当量ＰＣＲ収率を達成するに
は、より多くのＤＮＡがかかる。より多くのゲノムＤＮＡを加えることにより、ＰＣＲポ
ジティブ液滴の数および従ってアンプリコン収量を増加させることができる。例えば、液
滴の数を一定に維持しながらのゲノムＤＮＡの量を２倍増加させると、アンプリコン収量
は２倍になるだろう。しかし、同じ液滴内の遺伝子が両方の対立遺伝子を有する有意な機
会が存在する前に加えることができるゲノムＤＮＡの量には限界があり、その結果、対立
遺伝子特異的ＰＣＲに打ち勝つことおよび対立遺伝子ドロップアウトをもたらすことにつ
いての液滴ＰＣＲの利点は無くなる。
【００８５】
より多くのゲノムＤＮＡのインプットを可能にする１つの方法は、より多くの液滴を生
成させて液滴あたりの半数体分子の比率を一定に保つことによる。例えば、ＤＮＡの量を
２倍にすることおよび液滴の量を２倍にすることで、同じ液滴あたりの半数体ゲノム比を
維持しながらアンプリコン収量を２Ｘ増加させる。しかし、液滴の数を２倍にすることは
問題が多い上、ＤＮＡの量を増加させることは、限られた量のＤＮＡを有する使用者には
難しい。
【００８６】
液滴内でのＰＣＲプライマーの多重化は、インプットＤＮＡ量を同じにまたはより少な
く保って同等のまたはより大きいアンプリコン収量を生じさせながら、同時にＰＣＲ液滴
数を増加させることができる。これは、より多くのＤＮＡを消費することなく、ＰＣＲポ
ジティブ液滴の量とアンプリコン収量の総合的増加をもたらす。
【００８７】
例として、４液滴ごとに平均１つの半数体ゲノムまたは１液滴あたり平均１／４の半数
体ゲノムおよび１液滴あたり１つのＰＣＲプライマーがある場合、液滴内にＰＣＲプライ
マーにとって適正なテンプレートが存在する機会は、４分の１である。しかし、１液滴あ
たり２つのＰＣＲプライマーがある場合には、液滴内に適切なテンプレートが存在するこ
ととなる機会は２倍になる。この結果、２個のうち１個の液滴がＰＣＲポジティブとなり
、これは、インプットＤＮＡを２倍にすることなくアンプリコン収量を２倍にする。２ｘ
多重化プライマーを含有する液滴の数を２倍にし、ＤＮＡを一定に保った場合には、ＰＣ
Ｒポジティブ液滴の数は落ちて４分の１に戻るが、液滴数が倍増されているためＰＣＲ液
滴の総数は同じままである。各液滴内の多重化レベルを４ｘに増加させ、インプットＤＮ
Ａが同じである場合、各液滴内に適正なテンプレート分子が存在する機会は２倍になる。
この結果、ＰＣＲポジティブ液滴の数は２分の１に増加することとなり、これは、インプ
ットＤＮＡの量を増加させることなくアンプリコン収量の量を２倍にする。このように、
各液滴内のＰＣＲプライマーの多重化を増すことにより、および全体的に液滴の数を増加
させることにより、インプットＤＮＡの量を増加させることなくアンプリコン収量を４倍
増加させることができる。
【００８８】
あるいは、アンプリコン収量がすでに十分である場合、各液滴内のＰＣＲプライマーに
ついての多重化レベルを増すことにより、アンプリコン収量を犠牲にすることなくインプ
ットゲノムＤＮＡの量を低下させることができる。例えば、ＰＣＲプライマーの多重化レ
ベルが１ｘから２ｘになると、同じ総アンプリコン収量をなお維持しながらインプットゲ
ノムＤＮＡの量を２ｘ減少させることができる。
【００８９】
１液滴あたりのＰＣＲプライマー対の数が、たとえ１より多かったとしても、やはり１
液滴あたり１つのテンプレート分子しかなく、従って、１液滴あたり１つのプライマー対
しか一度に利用されることとならない。これは、対立遺伝子特異的ＰＣＲまたは異なるア
ンプリコン間の競合のいずれかからのバイアスを無くすことについての液滴ＰＣＲの利点
が維持されることを意味する。
【００９０】
液滴ベースの増幅および単一液滴内の複数のターゲット配列の検出についての例示的実
証実験をここに示す。５セットのプライマー（ＴＥＲＴ、ＲＮａｓｅＰ、Ｅ１ａ、ＳＭＮ
１およびＳＭＮ２についてのプライマー）の複数のコピーを、テンプレートＤＮＡおよび
ＰＣＲマスターミックスと一緒に、様々な濃度で単一の液滴に封入した。ＴＥＲＴ、ＲＮ
ａｓｅＰ、Ｅ１ａ、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２に特異的に結合するプローブも、それらのプ
ライマーを含有する液滴に封入した。ＴＥＲＴ、ＲＮａｓｅＰおよびＥ１ａについてのプ
ローブをＶＩＣ色素で標識し、ＳＭＮ１およびＳＭＮ２についてのプローブをＦＡＭ色素
で標識した。ＴＥＲＴ、ＲＮａｓｅＰ、Ｅ１ａ、ＳＭＮ１およびＳＭＮ２の配列をＰＣＲ
によって増幅した。標準的な熱サイクリング設定でＰＣＲを行った。例えば：
１０分間９５℃
３１サイクル
１５秒間９２℃
６０秒間６０℃  。
【００９１】
ＰＣＲ終了時、各液滴からの蛍光放射を決定し、その波長および強度に基づいて散布図
にプロットした。対応する蛍光波長を有する液滴をそれぞれが表す６つのクラスタを示し
た。ＴＥＲＴ、ＲＮａｓｅＰおよびＥ１ａクラスタは、３つの別個の強度でＶＩＣ色素の
蛍光を示し、ＳＭＮ１およびＳＭＮ１クラスタは、２つの別個の強度でＦＡＭ色素の蛍光
を示した（図５）。ＴＥＲＴ、ＲＮａｓｅＰ、Ｅ１ａ、ＳＭＮ１およびＳＭＮ２から選択
される１つ以上の配列をそれぞれが有する液滴の数をその散布図から決定することができ
る。
【００９２】
液滴ベースの増幅および単一液滴内の複数のターゲット配列の検出についてのもう１つ
の実証実験では、５セットのプライマー（ＴＥＲＴ、ＲＮａｓｅＰ、Ｅ１ａ、８１５Ａお
よび８１５Ｇについてのプライマー）を、テンプレートＤＮＡ、ＰＣＲマスターミックス
およびプローブと一緒に、様々な濃度で単一の液滴に封入した。５つの異なるプローブＴ
ＥＲＴ、ＲＮａｓｅＰ、Ｅ１ａ、８１５Ａおよび８１５Ｇも、それらのプライマーを含有
する液滴に封入した。ＴＥＲＴおよび８１５ＡについてのプローブをＶＩＣ色素で標識し
、８１５ＧについてのプローブをＦＡＭ色素で標識した。ＲＮａｓｅＰおよびＥ１ａのそ
れぞれについては、一方をＶＩＣ色素で標識し、他方をＦＡＭ色素で標識した、２つのプ
ローブを封入した。
【００９３】
プライマーとプローブの両方を含有する液滴を、テンプレートを含有する液滴と融合さ
せた。それらの融合液滴でＰＣＲ反応を行って、ＴＥＲＴ、ＲＮａｓｅＰ、Ｅ１ａ、８１
５Ａおよび８１５Ｇの配列を増幅した。標準的な熱サイクリング設定でＰＣＲを行った。
【００９４】
ＰＣＲ終了時、各融合液滴からの蛍光放射を決定し、その波長および強度に基づいて散
布図にプロットした。対応する蛍光波長および強度を有する液滴をそれぞれが表す６つの
クラスタを示した。ＴＥＲＴおよび８１５Ａクラスタは、２つの別個の強度でＶＩＣ色素
の蛍光を示し；８１５Ｇクラスタは、ＦＡＭ色素の蛍光を示し；ならびにＲＮａｓｅＰお
よびＥ１ａクラスタは、別個の強度でＦＡＭおよびＶＩＣ両方の色素の蛍光を示した（図
６）。ＴＥＲＴ、ＲＮａｓｅＰ、Ｅ１ａ、８１５Ａおよび８１５Ｇから選択される１つ以
上の配列をそれぞれが有する液滴の数をその散布図から決定することができる。ＲＮａｓ
ｅＰ、Ｅ１ａ、８１５Ａおよび／または８１５Ｇ配列を有する液滴の数とＴＥＲＴ配列を
有する液滴の数の間の比によって、テンプレート内のＲＮａｓｅＰ、Ｅ１ａ、８１５Ａお
よび８１５Ｇのコピー数を決定した（図６）。
【００９５】
液滴ベースのデジタルＰＣＲ反応における多重化プライマー対のもう１つの例示的実証
実験では、２つの液滴ライブラリーを生成させた：各液滴が１つのプライマー対しか含有
しない、液滴ライブラリーＡを生成させ；およびプライマー対が各液滴内で５ｘレベルで
多重化された、液滴ライブラリーＢを生成させた。標準的な手順を用いて液滴ライブラリ
ーＡおよびＢでＨａｐＭａｐサンプルＮＡ１８８５８を二重反復で処理した。液滴ライブ
ラリーＡには２μｇのサンプルＤＮＡを使用し、５ｘマルチプレックス液滴ライブラリー
Ｂには１μｇのサンプルＤＮＡを使用した。ＰＣＲ増幅後、両方の液滴ライブラリーをば
らし、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムで精製し、その後、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉ
ｏａｎａｌｙｚｅｒにかけた。サンプルは、ＩｌｌｕｍｉｎａによりＩｌｌｕｍｉｎａ  
ＧＡＩＩを用いて５０ヌクレオチド読み取りでシークエンシングされ、標準的なシークエ
ンシング測定基準を用いてそれらのシークエンシング結果を分析した。下の表に示す標準
的な測定基準を用いて、５ｘ多重化液滴ライブラリーＢからの結果をシングルプレックス
液滴ライブラリーＡと比較した。
【００９６】
５ｘ多重化液滴ライブラリーＢから得た結果は、液滴ライブラリーＡから得たものと等
価またはそれより良好であった。プライマーの多重化は、インプットＤＮＡ低減の追加の
利点と共に、塩基網羅（ｂａｓｅ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）、特異性および均一性について一
重化（ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ）が成すものと同じシークエンシング結果をもたらす。
【００９７】
【化１】
0006263225.tif 000004
全読み取り：与えられたサンプルデータの中で見いだされたシークエンシング読み取りの
総数
位置づけられた読み取り（％）：ヒトゲノムにマップされた全読み取りの百分率。
特異性：ターゲットを含むマップされた読み取りの百分率。前記ターゲットはすべてのア
ンプリコン配列を含むが、プライマー配列を含まない。
平均塩基網羅：ターゲット内の平均塩基網羅。前記ターゲットはすべてのアンプリコン配
列を含むが、プライマー配列を含まない。
Ｃ１：少なくとも１ｘ塩基網羅を有するターゲットの％。注記：非一意的シークエンシン
グ読み取りがランダムにマップされる。
Ｃ２０：少なくとも２０ｘ塩基網羅を有するターゲットの％。
Ｃ１００：少なくとも１００ｘ塩基網羅を有するターゲットの％
塩基網羅（平均の０．２ｘ）：平均塩基網羅の少なくとも２０％を有するターゲットの％
。
【００９８】
単色遺伝子コピー数アッセイ
伝統的なデジタルＰＣＲ法は、個々のターゲットに特異的な単一標識プローブの使用を
含む。図７は、液滴ベースのデジタルＰＣＲを用いるターゲット配列の一色検出を図示す
る概略図である。図７のパネルＡに示すように、テンプレートＤＮＡをフォワードプライ
マー（Ｆ１）およびリバースプライマー（Ｒ１）で増幅する。カラー１の蛍光体で標識さ
れたプローブ（Ｐ１）は、ターゲット遺伝子配列（ターゲット１）に結合する。限界また
は終点希釈条件下でテンプレートＤＮＡの希釈溶液で微小液滴を作製する。ターゲット配
列を含有する液滴は蛍光を放射し、レーザによって検出される（パネルＢおよびＣ）。タ
ーゲット配列を含有するまたは含有しないマイクロカプセルの数を、ヒストグラムで示し
（Ｄ）、定量した（Ｅ）。
【００９９】
図８は、マイクロ流体デバイスでの２つの遺伝子配列の二色検出を図示する概略図であ
る。図８のパネルＡに示すように、テンプレートＤＮＡを２セットのプライマー：フォワ
ードプライマー（Ｆ１）とリバースプライマー（Ｒ１）、およびフォワードプライマー（
Ｆ２）とリバースプライマー（Ｒ２）、で増幅する。カラー１の蛍光体で標識されたプロ
ーブ（Ｐ１）は、ターゲット１に結合し、カラー２の蛍光体で標識されたプローブ（Ｐ２
）は、ターゲット２に結合する（パネルＢおよびＣ）。限界または終点希釈条件下でテン
プレートＤＮＡの希釈溶液で微小液滴を作製する。ターゲット配列１または２を含有する
液滴は、カラー１または２の蛍光をそれぞれ放射し、レーザによって光学的に検出される
（パネルＢおよびＣ）。ターゲット１または２を含有するマイクロカプセルの数を、ヒス
トグラムによってパネル（Ｄ）に示す。
【０１００】
本発明の方法は、同じ蛍光体を有するプローブを使用してｄＰＣＲにより複数の異なる
ＤＮＡターゲットの正確な定量を行うことを含む。図９は、マイクロ流体デバイスでの３
つの遺伝子配列の二色検出を図示する概略図である。図９のパネルＡに示すように、テン
プレートＤＮＡを３セットのプライマー：フォワードプライマー（Ｆ１、Ｆ２およびＦ３
）とリバースプライマー（Ｒ１、Ｒ２およびＲ３）、で増幅する。プローブ（Ｐ１、Ｐ２
およびＰ３）は、蛍光体（カラー１、カラー２およびカラー１）で標識されており、ター
ゲット遺伝子配列（ターゲット１、ターゲット２およびターゲット３）に結合する（パネ
ルＢおよびＣ）。限界または終点希釈条件下でテンプレートＤＮＡの希釈溶液で微小液滴
を作製する。ターゲット配列１または３を含有する微小液滴は、２つの異なる強度でカラ
ー１の蛍光を放射し；ならびにターゲット配列２を含有する微小液滴は、カラー２の蛍光
を放射する。ターゲット１、２または３を含有する微小液滴の数を、ヒストグラムにより
パネルＤに示す。
【０１０１】
液滴デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）からの先程の結果は、同じ蛍光体を使用して複数の独
立したＰＣＲ反応をランでき、別々に定量できることを示している。とりわけ、ＳＭＮ２
アッセイは、ＦＡＭ検出チャネルにおいて有意に高いシグナルを有する予期せぬ液滴集団
を生じさせる。
【０１０２】
結果を図１０に図示する。図１０における左側のドットプロットは、反応に存在するＳ
ＭＮ１ブロッカーを有することの効果を図示している。左側のドットプロットに図示され
ている４つのクラスタは、次のとおりである：上部左クラスタは、参照配列（ＳＭＡＲＣ
Ｃ１）を含有する微小液滴を含み；下部左クラスタは、いずれの配列も含有しない微小液
滴を含み；下部中央クラスタは、ＳＭＮ１の配列を含有する微小液滴を含み；および下部
右クラスタは、ＳＭＮ２の配列を含有する微小液滴を含む。図１０の右側のドットプロッ
トは、ＳＭＮ１ブロッカーが反応に存在しなかった４つのクラスタを図示しており；上部
左クラスタは、参照配列（ＳＭＡＲＣＣ１）を含有する微小液滴を含み；下部左クラスタ
は、いずれの配列も含有しない微小液滴を含み；下部中央クラスタは、ＳＭＮ１の配列を
含有する微小液滴を含み；および下部右クラスタは、ＳＭＮ２の配列を含有する微小液滴
を含む。左のパネルと比較して右のパネルにおける下部中央クラスタのシフトは、蛍光強
度により配列の存在についての非常に感度の高い測定がもたらされることを確証する。
【０１０３】
いずれの理論によっても拘束されることを意図しないが、ＳＭＮ１遺伝子へのＳＭＮ２
プローブへの弱い会合から、その遺伝子に対するブロッカー（ＳＭＮ１遺伝子に対する非
蛍光相補的プローブ）の存在にもかかわらず、クラスターが発生することが、その最も簡
単な説明である。
【０１０４】
予期せぬクラスタ源としてのＳＭＮ１の１つの決定的確証は、ＳＭＮ１ブロッカーの存
在への、この特徴の強度について観察される依存であった。より高いＦＡＭ蛍光強度への
明確なシフトが、ブロッカー不在下で観察された（図１０）。もう１つの決定的確証では
、予想と完全に一致して０．９６の参照サイズに対するＳＭＮ１（推定）集団サイズの比
（それぞれの２つのコピー）（Ｓ＿１３１サンプル）。同数のＳＭＮ１コピーを有するも
う１つのサンプル、Ｓ＿１２２、は、あるランでは０．８８および別のランでは０．９３
の比を生じさせ、これも予期せぬクラスタについて提案した説明と一致した。
【０１０５】
いずれの理論によっても拘束されることを意図しないが、これらの観察は、ＳＭＮ１  
ＤＮＡへのＳＭＮ２プローブの結合が高い蛍光シグナルを生じさせることを示している。
この現象を説明する単純な動態モデルは、ポリメラーゼが相補鎖をふさぐより速い速度で
ＳＭＮ２プローブのＳＭＮ１  ＤＮＡへのハイブリダイゼーションが平衡に達することを
想定している。従って、各熱サイクルの際に放出されるプローブ蛍光体の量は、結合して
いるプローブの数に比例する（または等しいことさえある）。それ故、結合親和性が低い
ほど、放出されるプローブ蛍光体の数は少ない。ＳＭＮ２プローブとＳＭＮ１配列のミス
マッチ（単数または複数）のため、プローブの親和性は、ＳＭＮ２よりＳＭＮ１に対する
ほうが低いと確かに予想される。このモデルは、ｓＭＮ１ブロッカーへのシグナル依存性
も説明する：該ブロッカーは、ポリメラーゼエキソヌクレアーゼ活性によるＳＭＮ２プロ
ーブ加水分解を競合的に阻害する。
【０１０６】
しかし、プローブハイブリダイゼーションがエキソヌクレアーゼ活性の前に平衡に達し
ない場合もある。この場合、会合速度がより支配的な役割を果たすであろう。同様の理論
が適用される。マッチング部位への結合速度は、ミスマッチ部位へより速い可能性が高く
、ブロッカーは、ミスマッチ部位へのプローブ結合を減速させるように作用するであろう
。ＳＭＮ１  ＤＮＡへのＳＭＮ２プローブの結合は、従来のバルクｑＰＣＲによって、と
りわけＳＭＮ２の不在下で、検出可能であり得るが、ここで示すもののような高定量的結
果は、非常に見込み薄である。確かに、同じ色の蛍光体で２つの異なるＤＮＡ配列モチー
フを定量するｑＰＣＲまたは任意の他の技術についての報告はない。液滴内での単一分子
増幅による個々の反応の隔離は、シグナルへの種々雑多な寄与に関する一切の混乱を無く
す。
【０１０７】
同じ色の蛍光体の複数のプローブでＤＮＡを定量することの利点は、ここに示す２つの
高相同性配列の実施例を超えて広がる。むしろ、いかなる類似度または非類似度のいかに
多数の配列も、異なるプローブがそれらのそれぞれのＤＮＡ結合部位への有意に異なる結
合占有率を有する限り、定量することができる。
【０１０８】
多重化反応のためのｄＰＣＲアプローチのもう１つの利点は、異なる反応が、バルクｑ
ＰＣＲアッセイでのように試薬について互いに競合しない点である。しかし、予期せぬ交
差反応性についての可能性は残存する。マルチプレクセスアッセイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ
ｅｓ  ａｓｓａｙ）は、より希薄なサンプルを必要とし得る。例えば、１０％占有率で、
デュプレックス反応は、その時の２倍の占有率１％を有するであろう。それ故、１０個の
ＰＣＲ＋液滴のうちの１つは２倍となり、その結果、２つのプローブの増白剤と少なくと
も同様の高さのおよびことによるとそれより高い最終強度をもたらす。単純なデュプレッ
クス系については、各プローブからの寄与を回収することができた。この実施例では、プ
ローブ１に対するＰＣＲ＋液滴の総数は、（プローブ１）＋（プローブ１＋プローブ２）
となるだろう。多重度が高いほど、大きな希釈を必要とする。例えば、１％占有率での４
プレックスについては、他の３つのいずれかとオーバーラップする１つのプローブの確率
は、〜３％であり、その誤差は、一部の用途にとっては高すぎる。大きな希釈の必要は、
数の多いｄＰＣＲ反応に好都合に働く。
【０１０９】
本発明のもう１つの実施例では、参照ＤＮＡとターゲットＤＮＡの両方についての遺伝
子コピー数アッセイにおいて単一の蛍光体（ＦＡＭ）を使用した。１細胞あたりターゲッ
ト遺伝子の０〜１６コピーに相当する、参照遺伝子に対するターゲット遺伝子コピー数の
変化を表すために、様々な濃度のプラスミドＤＮＡを有するモデルシステムを使用した。
ＢＣＫＤＨＡおよびＳＭＮ２プラスミドＤＮＡは、それぞれ１×および０．５×プライマ
ーおよびプローブと共に参照およびターゲットとして役立った。８：１  ＳＭＮ２対ＢＣ
ＫＤＨＡの出発比率で、サンプルを同じ濃度のＢＡＣＤＨＡの溶液で２×系列希釈して、
ＳＭＮ２の量だけを変動させた。得られたサンプルを乳化させ、熱サイクルに付し、１０
５個を超える液滴を、前のセクションで説明したように各サンプルについて分析した。こ
のプロセスを三重反復で繰り返した。
【０１１０】
本発明の方法は、各プローブに一意的な蛍光シグネチャの同定のための分析技術も含む
。本発明のこの実施例では、３つの異なるテンプレートＤＮＡサンプルについての液滴蛍
光強度のヒストグラムを図１１ａに示す：無テンプレート対照（点線）、ＢＣＫＤＨＡの
み（実線）、および１：１  ＢＣＫＤＨＡ対ＳＭＮ２（一点鎖線）。明瞭さのために、一
定のピークについての類似性を強調するためにオーバーラップさせたヒストグラム、およ
び特徴のすべてを明らかにするために互いに並置したヒストグラム、両方を示す。１：１
ＢＣＫＤＨＡ対ＳＭＮ２の場合、３つの集団が容易に認められる：最も有力な特徴が０
．０８Ｖに現れ、ならびに０．２７および０．７１Ｖでの２つの小さなピークがはっきり
わかった。無テンプレート対照では両方の小さいピークが消失したが、大きいものは残存
したので、０．０８Ｖでの最も有力な特徴をＰＣＲ（−）液滴に割り当てた。０．７１Ｖ
でのピークは、ＢＣＫＤＨＡだけの添加に伴って生ずる唯一の特徴であるので、ＢＣＫＤ
ＨＡに割り当て、そしてその後、ＳＭＮ２を添加すると０．２７Ｖでのピークが現れ、割
当てを終えた。図１１ａのスケールでは見えない非常に小さいピークが〜０．９Ｖに現れ
、これは、両方の遺伝子によって占有された液滴に対応する。本発明のもう１つの方法と
して、異なるピークが同定されたら、各ピーク内の液滴をそれぞれの可能な状態（ＢＣＫ
ＤＨＡもしくはＳＭＮ２または両方についてはＰＣＲ（＋）、あるいはＰＣＲ（−））に
応じてカウントし、その後、遺伝子コピー数を占有の比率から決定した。系列希釈での各
サンプルについての遺伝子コピー数を期待値に対して図１１ｂにプロットし（ＳＭＮ２の
ＢＳＫＤＨＡに対する期待比率に対するＳＭＮ２のＢＣＫＤＨＡに対する観察比率）、十
分な範囲にわたって非常によく直線（ｙ＝１．０１ｘ）に当てはまった（Ｒ２＝０．９９
９７、勾配１．０１）。これは、１細胞あたり０から１６のＳＭＮ２コピーの等価物の正
確で的確な測定を確証している。
【０１１１】
選択的にスプライスされた転写産物の検出
同じ原理を用いて、選択的にスプライスされた転写産物を検出し、カウントした。ＲＮ
Ａ転写産物内のそれぞれのエキソンに特異的であるＴａｑＭａｎアッセイ物を設計するこ
とができる。ＲＮＡをｃＤＮＡにした後、それを液滴に１液滴あたり１コピー以下で封入
することができる。この液滴は、それぞれのエキソンについての多重化ＴａｑＭａｎアッ
セイ物も含有するであろう。それぞれのＴａｑＭａｎアッセイ物は、異なるプローブを含
有するが、すべてのプローブに同じ蛍光色素が付いているだろう。それらの液滴を熱サイ
クルに付して、それぞれのＴａｑＭａｎアッセイ物についてのシグナルを生成させること
となる。サンプル中に多数のスプライス変異体がある場合、それらは、スプライシング事
象に依存して異なる数のエキソンを含有するだろう。各液滴の蛍光強度は、存在するエキ
ソンの数に依存して異なるだろう。異なる強度を有する液滴の数をカウントすることによ
り、サンプル中の異なるスプライス変異体の存在および存在度を同定することが可能であ
ろう。
【０１１２】
不均一サンプル中のコピー数変異体
不均一サンプルが異なるコピーレベル数を有する成分を含有するかどうかを決定するこ
とが可能だろう。アッセイすべきコピー数変異体を染色体に沿って十分近い間隔で配置し
た場合、サンプルからのＤＮＡをフラグメント化し、１液滴あたり１半数体ゲノム当量以
下のレベルで液滴に封入することができよう。この液滴は、そのコピー数変異体に特異的
なＴａｑＭａｎアッセイ物も含有するだろう。各液滴におけるシグナルの強度は、そのサ
ンプルについての存在するコピー数変異体の数に依存するであろう。異なる強度の液滴の
数のカウントは、特定のサンプル中の幾つの細胞が如何なるレベルのコピー数変異体を有
するかというようなことを示すだろう。
【０１１３】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ蛍光強度のチューニング
蛍光強度によるプローブの同定は、プローブ、特に、密なプローブパタンを有するより
高プレックスの（ｈｉｇｈｅｒ−ｐｌｅｘ）アッセイのためのプローブ、の輝度の調整を
必要とすることが多い。前のセクションにおいて、遺伝子コピー数アッセイ用のプローブ
は、非常によく分解されたピークを生じさせた（図１１ａ）。明らかに、測定値の分解に
コピー数アッセイにおける１つまたは多数のさらなるプローブを適応させる余地が存在す
るが、既存のアッセイ物への干渉を避けるために新たなプローブの蛍光強度を調整するた
めの方法が求められる。本発明の１つの方法は、より高プレックスの反応における相対強
度を最適化するための非常に単純な技術としてプローブおよびプライマー濃度を共に変化
させることを含む。
【０１１４】
図１２は、マイクロ流体デバイスでの特定のターゲットに対する検出可能標識の強度の
チューニングについての概略図である。図１２のパネルＡに示すように、テンプレートＤ
ＮＡを２セットのプライマー：フォワードプライマー（Ｆ１およびＦ２）およびリバース
プライマー（Ｒ１およびＲ２）、で増幅する。プローブ（Ｐ１およびＰ２）は、カラー１
の蛍光体で標識されており、ターゲット１およびターゲット２にそれぞれ結合する。ター
ゲット２からの蛍光は、Ｐ２とターゲット２の間の一塩基ミスマッチのため、ターゲット
１からのものより強度が低い。パネルＢに示すように、テンプレートＤＮＡを２セットの
プライマー：フォワードプライマー（Ｆ１およびＦ２）およびリバースプライマー（Ｒ１
およびＲ２）、で増幅する（パネルＢ）。ターゲット２からの蛍光は、蛍光体で標識され
ていない競合プローブ２の存在のため、ターゲット１からのものより強度が低い。パネル
Ｃに示すように、テンプレートＤＮＡを２セットのプライマー：フォワードプライマー（
Ｆ１およびＦ２）およびリバースプライマー（Ｒ１およびＲ２）、で増幅する。プローブ
（Ｐ１およびＰ２）は、カラー１の蛍光体で標識されており、ターゲット１およびターゲ
ット２にそれぞれ結合する。ターゲット２からの蛍光は、異なる蛍光体で標識されている
競合プローブ２の存在のため、ターゲット１からのものより強度が低い。
【０１１５】
図１３は、異なる参照遺伝子、リボヌクレアーゼＰ（ＲＮａｓｅＰ）、についてのプロ
ーブおよびプライマーの系列希釈全体を通してのプローブ蛍光強度を、１液滴あたり０．
０２のターゲットＤＮＡ分子の占有率でＣｏｒｉｅｌｌ細胞株ＮＡ３８１４からの一定量
のゲノムＤＮＡに対して示すものである。プローブ蛍光強度は、希釈誤差および他のラン
間の差についての補正、例えば、ＰＣＲ（−）液滴を参照として使用する光学的再アライ
ンメントの後、〜０．１５から０．４μＭにわたる狭い濃度範囲−大体、０．２μＭの典
型的なプローブ濃度あたりが中心−にわたってプローブ濃度に正比例して変動した（Ｒ２
＝０．９９５）。要約すると、増幅それ自体に影響を及ぼすことなく多重化アッセイのチ
ューニングのために小さいが適正な範囲にわたって希釈によりプローブ強度を変えること
ができる。
【０１１６】
プローブ蛍光強度を調整するための上の実施例は、プローブおよびプライマー濃度を共
に同じ率で変えることを含むが、本発明は、プローブ強度を変えるためにこの方法のみに
限定されない。プローブ強度を変えるための当業者に公知の他の方法も考えられる。その
ような方法としては、プローブ濃度のみを変えること；プライマー濃度のみを変えること
；フォワードプライマー濃度のみを変えること；リバースプライマー濃度のみを変えるこ
と；プローブ、フォワードおよびリバースプライマー濃度を任意の方法で変えること；熱
サイクリングプログラムを変えること；ＰＣＲマスターミックスを変えること；蛍光体を
欠くプローブの何らかの部分をアッセイ物に組み込むこと；またはプローブ結合に対する
任意のハイブリダイゼーションベースの競合阻害剤、例えばブロッキングオリゴマーヌク
レオチド、ペプチド核酸およびロックド核酸、をアッセイ物に組み込むことが挙げられる
。本発明は、単独でまたは任意の組み合わせで用いられる、プローブ蛍光強度を調整する
これらの方法、またはプローブ蛍光強度を調整するための任意の他の方法の使用を援用す
る。
【０１１７】
より高プレックスの反応
本発明の１つの方法は、単一プローブカラー（すなわち蛍光体）を用いてより高プレッ
クスのアッセイを行うことを含む。上で説明したように、様々な手段により、各強度レベ
ルがＤＮＡターゲットを一意的に同定するようにプローブ蛍光強度を調整することができ
る。例えば、ターゲットＴ１、Ｔ２、Ｔ３およびＴ４は、強度レベルＩ１、Ｉ２、Ｉ３お
よびＩ４によって一意的に同定され得る。理論により拘束されることを意図しないが、タ
ーゲットの一意的同定のために可能な強度レベルの最大数は、異なる強度レベルの分解−
すなわち、プローブの平均強度間の隔たりと比較した特定のプローブそれぞれについての
強度の幅−に関連づけられ、ならびにプローブの数が増加するにつれて増す傾向がある空
の液滴の強度にも関係づけられる。強度レベル数は、０、または１、または２、または３
、または４、または１０以下、または２０以下、または５０以下、または１００以下であ
り得る。強度レベル数は、１００より上であることもある。下に示す実施例においては、
３ほどもの多さの強度レベルを実証する。
【０１１８】
本発明のもう１つの方法は、多数の異なるプローブカラー（すなわち蛍光体）を用いて
より高プレックスのアッセイを行うことを含む。上の単色多重化アッセイについてと同様
に、各カラープローブについて、強度に基づき複数のターゲットを同定することができる
。加えて、スペクトル的に分離可能である多数の色を同時に使用することができる。例え
ば、単一の液滴が、４つの異なるターゲットのための４つの異なるプローブを含有しても
よい。２つのプローブが、異なる強度のカラーＡのもの（例えば、Ａ１およびＡ２）であ
ってもよく、他の２つのプローブが異なる強度を有するカラーＢのもの（例えば、Ｂ１お
よびＢ２）であってもよい。対応するターゲットは、Ａ１、Ａ２、Ｂ１およびＢ２につい
てそれぞれＴ１、Ｔ２、Ｔ３およびＴ４である。液滴がカラーＡの蛍光の増加を示す場合
には、その液滴はターゲットＴ１またはＴ２のいずれかを含有した。このとき、カラーＡ
の蛍光強度に基づき、ターゲットがＴ１と同定されることもあり、またはターゲットがＴ
２と同定されることもあった。しかし、液滴が、カラーＢの蛍光の増加を示す場合には、
その液滴はターゲットＴ３またはＴ４のいずれかを含有した。このとき、カラーＢの蛍光
強度に基づき、ターゲットがＴ３と同定されることもあり、またはターゲットがＴ４と同
定されることもあった。理論により拘束されることを意図しないが、可能な異なる色の最
大数は、異なる蛍光体の蛍光放射間のスペクトルのオーバーラップによって限定される。
色の最大数は、１、または２、または３、または４、または１０以下、または２０以下で
あり得る。色の最大数は、２０より高いこともある。後続の実証実験において、色の最大
数は２である。
【０１１９】
本発明のもう１つの方法は、多数の異なるプローブカラー（すなわち、蛍光体）を用い
てより高プレックスのアッセイを行うことを含むが、一意的な色および強度を有する単一
のタイプのプローブで各ターゲットを同定する上記戦略とは異なり、代わりにこの方法で
は色と強度の両方の一意的シグネチャを構成する複数のプローブによって単一のターゲッ
トを同定することができる。例えば、単一の液滴が、３つの異なるターゲット（例えば、
Ｔ１、Ｔ２およびＴ３）を測定するために４つの異なるプローブを含有してもよい。２つ
のプローブがカラーＡのもの（例えば、Ａ１およびＡ２）であってもよく、２つのプロー
ブがカラーＢのもの（例えば、Ｂ１およびＢ２）であってもよい。Ｔ１をプローブＡ１に
よって測定し、Ｔ２をプローブＢ１によって測定するが、Ｔ３は、プローブＡ２とＢ２の
両方によって測定する。従って、液滴がＴ１のみを含有するとき、カラーＡの蛍光増加が
現れる。液滴がＴ２のみを含有するとき、カラーＢの蛍光増加が現れる。しかし、液滴が
Ｔ３を含有するとき、カラーＡとＢの両方の蛍光増加が現れる。
【０１２０】
一般に、理論により拘束されることを望まないが、より高プレックスのｄＰＣＲについ
ての上記３つの方法は、終点希釈の条件下で、すなわち、複数の異なるターゲット分子が
同じサンプルを共に占有する確率が、任意の単一のターゲットが液滴を占有する確率に比
べて非常に低いとき、実行が最も簡単である。多重占有により、同じ反応液滴内で競合す
る同時に存在するアッセイ物の複雑さ、およびまた、個々の反応生成物の２つの蛍光強度
の合計に等しいこともあり等しくないこともある２つの異なる反応生成物からの蛍光の組
み合わせを含む得られる蛍光強度の割り当ての複雑さが生ずる。しかし、本発明の方法は
、多重占有から生ずるこれらの複雑化に対応することができる。
【０１２１】
より高プレックスの反応のための本発明の方法は、プライマーおよびプローブを対にす
る方法も含む。最も単純な場合、例えば、ターゲットが異なる細胞からのものであるとき
；またはターゲットが単一の細胞タイプの中の異なる染色体からのものであるとき；また
はターゲットが、単一の染色体の中で互いに遠く離れているので、ＤＮＡフラグメント化
中に物理的に分離した状態になるとき；またはターゲットが、染色体の中で互いに非常に
接近しているが、それにもかかわらず、ＤＮＡのターゲッティングされた切断により、例
えば制限酵素消化により、分離した状態になるとき；または任意の他の理由のため、ター
ゲットは同じＤＮＡフラグメント上にある可能性が低い。そのような場合、各プローブを
単一のプライマー（フォワードおよびリバース）セットと対にすることができる。しかし
、他の場合、例えば、ターゲットが同じコドン内にあるとき、または任意の他の理由のた
め、ターゲット領域は、しばしば、同じＤＮＡフラグメント上にあり得る。そのような場
合、単一のプライマーセットが複数のプローブのために役立つだろう（一例として、Ｐｅ
ｋｉｎら参照）。
【０１２２】
より高マルチプレックスの反応を行って、２つのＳＮＰのハプロタイプを区別すること
ができる。例えば、位置１に遺伝子型ＡまたはＡ’があり得、位置２にＢまたはＢ’の遺
伝子型があり得ると仮定する。二倍体ゲノムでは、４つの特有のハプロタイプが可能であ
る（Ａ、Ｂ；Ａ、Ｂ’；Ａ’、Ｂ；およびＡ’、Ｂ’）。例えば、Ａ’およびＢ’が感染
に対する薬物耐性突然変異を表す場合、Ａ’ＢおよびＡＢ’は、細心の注意を払って処置
しなければならない有意な薬物耐性を表すＡ’Ｂ’より重症でなく、Ａ’Ｂ’とは異なっ
て処置される場合が多い。強度識別を伴うデジタルＰＣＲは、他の３つのハプロタイプの
混合物のバックグラウンドの中での低い頻度のＡ’Ｂ’の同定に理想的に適する。ハプロ
タイピング情報は、ＨＬＡにおけるハプロタイプの構築にも重要である。本実施例を構築
できる１つの方法は、カラー１をＡのために用い、カラー１が、対立遺伝子ＡまたはＡ’
を示すそれぞれ高いまたは低い強度のものであり、およびカラー２をＢのために用い、カ
ラー２が、ＢまたはＢ’を示すそれぞれ高いまたは低い強度のものであるようなアッセイ
設計による。［低、低］に対応する［カラー１、カラー２］の集団は、ＡＢの対立遺伝子
の測度であり、［高、低］対立遺伝子Ａ’Ｂおよび［Ａ’Ｂ’］の対立遺伝子は、主にＡ
’ＢとＡＢ’の混合物であるバックグラウンドにおいても［高、高］と容易に区別可能で
あろう。図２２参照。ある場合には、Ａ  ＳＮＰ位置とＢ  ＳＮＰ位置の両方を含有する
核酸の長い単一分子を液滴に封入することによって開始することが有利であろうし、別の
場合には、単個細胞、細菌または他の生物を液滴に封入することによって開始して、その
後、生物から核酸を放出させることが望ましいであろう。さらに他の実施形態では、ター
ゲット材料の結合相互作用または標識の複数のタイプについての代用マーカーとして、複
数の同時に存在するターゲットのマルチプレックス強度検出を用いることができる。この
技術もまた、単一分子検出に限定されず、および単個細胞（例えば、細菌、体細胞など）
におけるハプロタイプ検出に使用することができる。単個細胞分析の場合、選別工程をハ
プロタイピングの前に適用してもよい。
【０１２３】
棘筋萎縮症についての５プレックスアッセイ
本発明の１つの態様を、棘筋萎縮症（ＳＭＡ）についての幾つかの遺伝マーカーの定量
の実例実証実験の実施にまとめた。ＳＭＡは、その重要な臨床的有用性とその複雑な遺伝
的特質の両方のため、実例実証実験の１つに選択した。それは二番目に高頻度の致命的神
経変性疾患であり、１０，０００のうち〜１の出生を襲う。ＳＭＡは、生存運動ニューロ
ン１遺伝子（ＳＭＮ１、Ｗｉｒｔｈらにより総説されている）内のエキソン７のホモ接合
不在に、最も多くの場合、起因するが、この容態の重症度は、ＳＭＮ２の遺伝子コピーの
数によって変調され、１〜５コピー数で致死性から無症候性にわたる予後となる（Ｅｌｓ
ｈｅｉｋｈらにより総説されている）。従って、ＳＭＮ２コピー数の正確な定量は、臨床
的予後および遺伝学カウンセリングに重量である。ＳＭＮ１の大きな欠失とは別に、同じ
遺伝子内の点突然変異または短い欠失／重複の数もＳＭＡの症例の〜４％の原因である。
総合ＳＭＡアッセイへの有意な工程において、ここで実証実験する多重化ｄＰＣＲアッセ
イは、（ＳＭＮ１および２についての）コピー数アッセイと高頻度ＳＮＰのもの（ｃ．８
１５Ａ＞Ｇ）についてのアッセイの両方を含む。
【０１２４】
本発明の１つの実施形態は、ＳＭＡ診断のための５プレックスアッセイである。この５
プレックスアッセイは、ＳＭＡに影響を与える共通の遺伝子変異体を定量するものであり
、参照としてＢＣＫＤＨＡを用いるＳＭＮ１およびＳＭＮ２遺伝子についての２つのコピ
ー数アッセイおよびとｃ．８１５Ａ＞Ｇ突然変異についてのＳＮＰアッセイを含む。２つ
の異なる色の蛍光体、ＦＡＭおよびＶＩＣ、を使用して、アッセイ物のそれぞれを一意的
に定量した。ＳＭＮ１およびＳＭＮ２についてのプローブは、ＦＡＭのみを含有し、ｃ．
８１５Ａについてのプローブは、ＶＩＣのみを含有した。しかし、ＢＣＫＤＨＡおよびｃ
．８１５ＧにはＶＩＣ標識プローブとＦＡＭ標識プローブの混合物を使用した。この実施
例におけるＶＩＣおよびＦＡＭ蛍光体の使用は、本発明を限定せず、むしろ、ＴａｑＭａ
ｎアッセイと適合性の任意のスペクトル分離可能蛍光体での、または任意の他の蛍光発生
性ハイブリダイゼーションベースのプローブ化学での、５プレックスアッセイを用いるこ
とができる。アッセイを検証するために、異なるプライマー／プローブ対のそれぞれにつ
いての単一のターゲット領域を含有するモデル染色体を合成した。ＥｃｏＲＶ制限部位が
各ターゲットに隣接しており、それによってフラグメントを分離することができた。
【０１２５】
本発明のもう１つの方法として、１つのプローブシグネチャ（色および強度）から生ず
る液滴の統計的に類似した集団の同定および特性付けのために、ならびに１つの液滴集団
と他のものとを識別するために、ヒストグラムベースのデータ提示および分析を本発明に
組み込む。図１４ａは、液滴蛍光強度の２次元ヒストグラムを等高線付きヒートマップ（
ｃｏｎｔｏｕｒｅｄ  ｈｅａｔ  ｍａｐ）として示すものであり、暖色ほど高い出現率を
表す。標準的な技術を用いて、ＦＡＭおよびＶＩＣシグナルのスペクトルのオーバーラッ
プを補正した。サンプルを１ターゲットあたり０．００６占有率でランした。６集団、ア
ッセイ物について５およびＰＣＲ（−）液滴について１、が明瞭にはっきりと見える。本
発明の１つの方法として、前記集団をアッセイ成分の選択的排除によって割当てた。例え
ば、ＳＭＮ２プライマーおよびプローブの排除は、前記ヒストグラムの下部右の集団を消
去したが、他の点では分布は、不変のままであった。図１４ａにおいて割り当てを標識し
た。本発明者らは、この多重化方法が一般に当てはまることを発見したので、各ターゲッ
トの十分分解されたまたは少なくとも区別可能な集団を対象に直ちにアッセイを行った。
次に、本発明のもう１つの方法として、前のセクションにおいて説明したようにプローブ
濃度をチューニングすることによって前記ヒストグラム中の異なる集団の相対的位置を調
整して規則正しい間隔の長方形アレイにした。通常、２回以下の反復が最適化に必要であ
る。
【０１２６】
本発明のもう１つの方法では、異なる集団を十分によく分解して、長方形の境界を越え
て統合することによって各集団内の液滴のカウントを可能にした。境界は、隣接ピーク間
の中間部に位置する。本発明の方法は、長方形の境界、およびピーク間の特定の境界位置
に拘束されない。むしろ、いずれの閉または開境界条件でも十分である。境界条件は、液
滴数に到達するために境界を越えて重み付け統合を行うこともできるという意味で、「バ
イナリ」である必要がない。各クラスタのピーク位置は、検出効率の変動を説明するため
の空の液滴の強度に対する正規化後、ラン間で２％より大きく変動しない（データを示さ
ない）。従って、一旦同定されると、統合のために同じ境界をサンプル間で再利用するこ
とができた。本発明の方法は、固定された境界位置に限定されない。サンプルまたは研究
間での動的集団同定および境界選択を前もって処理する。Ｃｏｒｉｅｌｌ細胞レポジトリ
ーからの２０の異なる患者サンプルをこのアッセイで分析した：ＳＭＡに罹患している４
つ、１つのＳＭＡ保因者、および１５のネガティブ対照。アッセイ結果を図１４ｂに示す
。遺伝子コピー数を、前のように、ターゲット液滴対参照液滴の数から誘導した占有率の
比として計算した。図１１におけるコピー数測定と同様に、各アッセイによって期待整数
値に非常に近い比を得たが、患者データのすべてを期待整数比に対する実際の比としてプ
ロットしたとき、１の理想勾配から小さな系統的偏差が観察された。実測勾配は、ＳＭＮ
１、ＳＭＮ２およびｃ．８１５Ａについてそれぞれ０．９２、０．９２および０．９９で
あった。明瞭さのために、図１４ｂにおけるデータを１の理想勾配に応じて拡大縮小した
。
【０１２７】
異なる患者についての観察された遺伝子型は、彼らの疾病状態（罹患していない、保因
者、または罹患している）と一致した。ＳＭＡに罹患している患者は、それぞれ、ＳＭＮ
１のゼロ個のコピーを有し（図１４ｂ中の番号ＳＭＡ１〜４）、保因者は、ちょうど１個
のコピーを有し、およびネガティブ対照すべてが、２個または３個のコピーを有した（番
号１〜１５）。３人の無関係な個体（番号６、８および９）がＳＭＮ１の３個のコピーを
有し、これは、健常個体についての以前の報告と同様である２０％の率で生じた。ＳＭＮ
１コピー数のばらつきは、それが染色体５ｑ１３の不安定な領域内に存するので、驚くべ
きことではない。より多種多様なＳＭＮ２コピー数が観察された。１から２個のコピーが
対照群では最も一般的であったが、１人の個体は、ゼロ個のコピー（正常個体についての
期待値と一致する分布）を有した。ＳＭＡ保因者および罹患患者は、平均してＳＭＮ２の
高いコピー数を有した：保因者は５；罹患している２人は３個のコピーを有し、その他は
２個のコピーを有した。罹患患者はすべて、Ｃｏｒｉｅｌｌレポジトリーによる臨床観察
に基づき、ＳＭＡ  タイプＩ、最重症形態、と診断された。ＳＭＮ２コピー数と疾患重症
度の間の強い遺伝子型／表現型相関関係は、ＳＭＮ２の３個のコピーを有する２人の個体
が、とりわけ、２年のＳＭＡタイプＩについての典型的な最大余命をはるかに超えてサン
プリング時点で３年より長く生きていた患者ＳＭＡ１に関して、改善されたタイプＩＩ予
後を有し得ることを示唆している。しかし、他のあまり十分に特性づけされていないまた
は未知の修飾遺伝子が予後に影響を及ぼすかもしれないので、またすべてのＳＭＮ２コピ
ーが完全遺伝子であることができるとは限らないため、ＳＭＮ２コピーのみに基づいて疾
患の結果を予測することは、依然としてためらわれる。さらに、一部のタイプＩ患者は、
より新しい臨床環境でより長く生存し始めている。従って、本発明者らが入手できる患者
に関するわずかな臨床情報で、本発明者らのＳＭＮ２アッセイ結果は、疾患重症度につい
ての広い期待値と一致した。
【０１２８】
前記ＳＮＰアッセイは、すべての患者が正常なｃ．８１５Ａ遺伝子型を保有することを
示し、ｃ．８１５Ｇの事例は観察されなかった。突然変異は比較的稀であり、従って、小
さな患者パネルにおいて現れると予想されなかった。しかし、ＳＮＰアッセイでカバーさ
れなかった２人の無関係な個体における明らかな余分な遺伝子フラグメントの存在は、興
味深かった。ｃ．８１５Ａ＞Ｇアッセイは、ＳＭＮ１とＳＭＮ２とを、それらの高配列類
似性のため、識別せず、それ故、ｃ８．１５ＡおよびＧの全コピーは、ＳＭＮ１およびＳ
ＭＮ２のコピーの合計に等しいだろう。これは、健常患者、番号１および２（両方ともｃ
．８１５Ａの１個の余分コピーを有した）を除いてすべての患者に当てはまった。ｃ．８
１５は、エキソン６上に存し、ＳＭＮ１遺伝子とＳＭＮ２遺伝子とを識別するＳＮＰは、
エキソン７上に存する故、前記余分な遺伝子は、エキソン７を欠くＳＭＮ１のフラグメン
トであり得る。これは、エキソン７の欠失がＳＭＡの症例の９５％の原因となる共通の突
然変異であり、１／４０から１／６０の成人がそれを保有するため、妥当と思われる。従
って、これらの患者は、同じ染色体上のＳＭＮ１の健常コピーを補償する少なくとも１個
の獲得がなかったなら、ＳＭＡの典型的保因者であっただろう。
【０１２９】
棘筋萎縮症についての９プレックスアッセイ
一定のＳＭＡ関連ターゲットについての９プレックスアッセイも、２色（ＦＡＭおよび
ＶＩＣ蛍光体を含有するプローブ）だけで実証した。最適化プライマーおよびプローブ濃
度を除いて、アッセイ条件および実験手順は、上記５プレックスアッセイと同一であった
。図１５ａは、プローブ濃度の最適化前の様々な液滴集団を２Ｄヒストグラムに示すもの
である。異なるターゲットの素性をその図自体に示す。本発明の１つの方法として、異な
る集団の同定を、前のように、１つ以上のアッセイ物の選択的排除および／または追加に
よって行った。空の液滴に対応するクラスタと極めて近接していたｃ．８１５Ａ遺伝子型
についてのプローブを除き、集団の大部分は既に十分に分解されていた。プローブ濃度の
最適化を３回繰り返した後、すべてのターゲット集団は互いに十分に分解され、空の液滴
からも十分に分解され（図１５ｂ）。この実証実験では本発明の３つの方法に光を当てた
：（１）９つのＤＮＡターゲットを、従来のｑＰＣＲの能力をはるかに超えて、二次元ヒ
ストグラムで一意的に同定した；（２）同じターゲットに対する１つまたは複数のプロー
ブから生ずる色と強度の両方の何らかの組み合わせに基づいてターゲットＤＮＡ分子を区
別した；および（３）様々な液滴集団間で増加された分解についての色および強度のパタ
ーンを最適化するようにプローブ濃度を変えることによって、ヒストグラム内のターゲッ
ト分子の相対位置を調整した。
【０１３０】
本発明の１つの方法として、上の実施例におけるアッセイ物の選択的追加または排除に
よって、異なる液滴集団を同定した。しかし、本発明はこの方法のみに限定されない。む
しろ、当業者に公知の任意の集団割り当て方法が考えられる。本発明の方法は、プローブ
およびプライマーを共に同じ率または異なる率で変えること；プローブ濃度のみを変える
こと；プライマー濃度のみを変えること；熱サイクリング条件を変えること；ならびにマ
スターミックス組成を変えることを含めて、ヒストグラム内の１つ以上の集団の同定可能
な置換、出現または消失を生じさせることができる任意の方法を含む。本発明のもう１つ
の方法は、割り当てを支援するためにヒストグラム内のアッセイ物の位置についての以前
の知識を利用する。
【０１３１】
多重化能力
前記ＳＭＡ実施例において実証した多重化のレベルは、ｑＰＣＲでの最大実行可能数を
有意に超える９×であった。理論により拘束されることを望まないが、２つの主な制限は
、アッセイ間の分解と、プローブの負荷量がより多い空の液滴の漸増蛍光強度とである。
本発明の方法は、最大多重化のために異なるプローブの色および強度のパターンを最適化
する上に、尚、個々の反応それぞれに対する適切な特異性を実現することを含む。液滴集
団の長方形アレイを５および９プレックス反応について実証したが、もう１つの望ましい
パターンは、密充填六角形アレイである。しかし、本発明はいずれの特定のアレイ戦略に
も拘束されない。
【０１３２】
余分な色を加えることは、さらにいっそうその可能性を増大させるだろうが、空の液滴
の蛍光が強まり続けるため、リターンは多少減少する。この能力は、より大きな差分シグ
ナルを生じさせるより良好なプローブ、例えば、接触消光によってバックグラウンドを低
減するが、遊離未消光蛍光体に特有の明るいシグナルを呈示するハイブリッド５’−ヌク
レアーゼ／分子ビーコンプローブを用いて、さらにいっそう増加させることができる。そ
のような改善により、５０×を超える多重化能力を構想することができる。
【０１３３】
光学的標識づけとの併用多重化
液滴ベースのマイクロフルイディクスを用いて、複数のターゲットを異なる方法により
同時に測定することもできる。代替方法によると、アッセイ物を一意的に同定するための
光学的標識と共に、プライマーおよびプローブを液滴に個々に負荷することができる。典
型的に、前記光学的標識は、１つの蛍光体であるか、プローブ蛍光体とはスペクトル的に
違う異なる蛍光体の組み合わせである。異なる光学的標識によって一意的に同定される異
なるアッセイ物をそれぞれが含有する様々な異なるタイプの液滴を混合して液滴の「ライ
ブラリー」にすることができる。次に、上の本発明の方法に従って、テンプレートＤＮＡ
を含有する液滴とライブラリー液滴を１個ずつ合体させる。熱サイクリング後、テンプレ
ートＤＮＡを含有する幾つかの液滴は、プローブの放射波長でより明るい蛍光を呈示する
。その後、これらのＰＣＲ（＋）シグナルを生じさせる特異的ターゲットＤＮＡ分子を、
光学的プローブによって同定する。１つの研究では、異なるＫＲＡＳ突然変異または野生
型ＫＲＡＳに特異的なＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよび光学コードをそれぞれが
含有する７つの異なるタイプの液滴（７員ライブラリー）のいずれか１つとゲノムＤＮＡ
を含有する液滴とを１個ずつ融合させることによって、ＫＲＡＳコドン１２における６つ
の共通突然変異を１回の実験で並行してスクリーニングした。
【０１３４】
本発明の１つの方法では、本発明に既に組み込まれているｄＰＣＲの様々な多重化方法
と光学的標識づけを併用することができる。例えば、単一の光学的標識は、上のＫＲＡＳ
実施例の場合のように単一アッセイ物だけでなく、５プレックスＳＭＡアッセイ物全体を
コードし得る。この要領で、他の光学的標識は、新生児についての種々のスクリーニング
アッセイ物をコードし得る。上の本発明の他の方法に従って、このとき、乳児からの単一
のＤＮＡサンプルとすべてのアッセイ物とを、そのＤＮＡを含有する液滴と光学的にコー
ドされたアッセイ物を含有するライブラリー液滴とを１個ずつ合体させることによって、
同時に分析することができるだろう。
【０１３５】
多重化を光学的標識と併用する一例として、いわゆる３×３×３の組み合わせのマルチ
プレックス反応と光学的標識づけを実証した（トリプレックスアッセイ物をそれぞれがコ
ードする、２つの蛍光体での３×３光学的標識づけ、合計で２７プレックス）。それぞれ
が合計９つの光学的標識を生じさせる３つの強度レベルを有する２つの蛍光体、（６４０
ｎｍレーザーによって励起される）Ａｌｅｘａ６３３およびＣＦ６８０、を光学的標識づ
けに利用した。前のＳＭＡについての５および９プレックスアッセイでのように、Ｔａｑ
Ｍａｎアッセイ物を（４８８ｎｍレーザーによって励起する）ＦＡＭおよびＶＩＣ蛍光体
と共に使用した。ＦＡＭおよびＶＩＣ蛍光体からの蛍光を光学的標識からの蛍光と同時に
記録し、これは、ＳＭＡアッセイについて説明した器械使用の光学的レイアウトへの変更
を必要とした（２レーザー励起および４色検出についての光学的概略図を全体として図１
６に示す）。また、この実施例ではコ・フロー・マイクロフルイディクスを用いた（本出
願のためのコ・フロー・ベースのマイクロフルイディクスの使用は、上で説明した本発明
の方法の１つである）。この場合、一方のフローにおいてチップにテンプレートＤＮＡを
導入し、もう一方のフローにおいてチップに１回のトリプレックスアッセイのためのＰＣ
Ｒマスターミックス、プライマーおよびプローブと光学的標識のための蛍光体の一意的組
成とを同時に導入した。それらの２つのフローストリームは、液滴形成モジュールの上流
の流体交差部で収束し、このようにして形成された各液滴は、両方のフローストリームの
内容物を含有した。コ・フロー・マイクロフルイディクスを実行する方法は当業者に周知
である。液滴を回収し、その後、次のトリプレックスアッセイ物および光学的標識を用い
てその手順を繰り返す。その手順を、アッセイ物と光学的標識のそれぞれの対について１
回、合計９回繰り返した。すべての液滴を１本のＰＣＲチューブに回収し、オフチップで
熱サイクルに付した。熱サイクルに付した液滴の混合物を、上でＳＭＡアッセイのために
使用したものと同じ読み出しチップに再注入し、４つすべての蛍光体からのアッセイ物の
蛍光強度を記録した。
【０１３６】
図１７は、コ・フロー・マイクロフルイディクスを用いる３×３×３アッセイにおける
すべての液滴からの累積結果を示すものである。この図は、液滴蛍光強度の２Ｄヒストグ
ラムを、すべての光学的標識からのヒストグラムを左に、およびアッセイ物からのヒスト
グラムを右に示すものである。標準的な方法を用いて、光学的標識のヒストグラムにおい
てスペクトルのオーバーラップを補正した。これらのヒストグラムをヒートマップとして
示し、暖色であるほど大きな液滴数を表す。液滴の９つの異なるクラスタが光学的標識の
ヒストグラムに明瞭にはっきりと見えた。これら９つのそれぞれが異なる光学的標識に対
応する：最低蛍光強度を有する光学的標識に対応する４つクラスタの小さな群がヒストグ
ラムの下部左隅にあり；ならびにより高い強度で直線状のすじのように見える５つのクラ
スタがある。アッセイ物についてのヒストグラムでは液滴クラスタがあまり明確でなかっ
たが、これは、示されている液滴がトリプレックスアッセイ物のすべてを含有するためと
予想された。下記のように、光学的標識を使用することによって単一のタイプアッセイ物
を選択すると、個々のアッセイ物が明瞭に明確になった。
【０１３７】
本発明の方法は、すべてが同じ光学的標識、または光学的標識の群、を含有するもので
ある液滴の、個々の集団を選択することを含む。本発明の幾つかの方法では、蛍光強度の
境界を用いて集団を特定した。ここに示す実施例では、長方形の境界を用いて、各蛍光体
についての最小および最大蛍光強度を特定した。しかし、本発明の方法は、長方形の境界
に拘束されない。閉じているまたは開いている任意の境界を用いることができる。さらに
、本発明の方法によると、液滴集団の選択は、任意の方法によって行うことができ、境界
選択などの閾値ベースの方法に拘束されない。
【０１３８】
図１８Ａは、１つだけの光学的標識を選択したとき（左ヒストグラム）のアッセイ物の
液滴蛍光強度（右ヒストグラム）を示すものである。光学的標識のヒストグラム上の重っ
た線により、両方の蛍光体に対して最低蛍光を有する光学的標識のみを選択するために使
用した長方形の境界が確認される。両方のヒストグラムが、選択された液滴のみを示した
。選択後、液滴の４つの別個のクラスタ、異なるアッセイ（この場合、ＳＭＮ１、ＳＭＮ
２およびＴＥＲＴについてのアッセイ（ＴＥＲＴはもう１つの共通参照遺伝子である））
について３つおよび空の液滴に付いて１つ、が、アッセイヒストグラムに現れた。ＳＭＮ
１およびＳＭＮ２についてのコピー数を、５プレックスＳＭＡアッセイについて上で説明
したのと同じ本発明の方法によって測定し、それぞれ、２および１の期待値に近い１．８
および０．９４の値であった。同じアッセイ物を２つの他の光学的標識と共にコード化し
た。それらの選択を図１８ＢおよびＣに示す。同様の結果が達成され、それぞれＳＭＮ１
およびＳＭＮ２の１．９±０．１および０．９±０．１コピーの総合測定値であり、実験
不確実性の範囲内の正確な測定値を示した。
【０１３９】
図１９Ａ、ＢおよびＣは、異なるアッセイ（ＴＥＲＴ、ＳＭＮ１遺伝子中のｃ．５Ｃ、
およびＢＣＫＤＨＡ（この図ではＥ１ａと標識した））のための光学的標識選択を示すも
のである。各場合、４つの異なるクラスタも現れ、上と同じ本発明の方法により、３およ
び２と比較してそれぞれ２．９±０．１および２．０±０．２の、ＴＥＲＴを参照にして
ｃ．５ＣおよびＢＣＫＤＨＡについての遺伝子コピー数の正確な測定を行った。図２０Ａ
、ＢおよびＣは、第三のアッセイ（ＴＥＲＴ、ＳＭＮ１遺伝子中のｃ．８８Ｇ、およびＲ
ＮａｓｅＰ（ＲＮａｓｅＰは、共通参照遺伝子である））のための光学的標識選択を示す
ものである。２の期待値と比較して２．１±０．１の正確な遺伝子コピー数が、ＴＥＲＴ
を参照してｃ．８８ＧおよびＲＮａｓｅＰの両方について測定された。
【０１４０】
要約すると、ここでの実証実験は、単一の実験において３つのトリプレックスアッセイ
物の独立した測定を可能にする９つの異なる光学的標識の使用を示す。この実施例では前
記光学的標識のうちの幾つかが重複するアッセイ物をコードした（９つの光学的標識を有
するにもかかわらず３つの異なるアッセイ物しかない）が、本発明は、アッセイ物および
光学的標識のいずれの特定の形式設定にも限定されない。本発明の実施形態は、アッセイ
物のすべてが、光学的標識のすべてにわたって同じである形式；光学的標識のすべてにわ
たって同じであるアッセイ物がない形式；アッセイ物の幾つかが、光学的標識のすべてに
わたって同じである形式；アッセイ物の幾つかが、光学的標識のすべてにわたって他の物
より大きいプレキシティーを有する形式；アッセイ物のすべてが、光学的標識のすべてに
わたって同じプレキシティーを有する形式；および光学的標識のすべてにわたってアッセ
イ物の任意の他の取り合わせが考えられる形式を含む。
【０１４１】
この実施例では光学的標識を作成するために２つの異なる蛍光体を使用したが、本発明
は、それらの光学的標識を含む蛍光体のいずれの特定の数にも限定されない。本発明の実
施形態は、１つの蛍光体、または２つの蛍光体、３つの蛍光体、または４つの蛍光体、ま
たは１０以下の蛍光体、または２０以下の蛍光体から成る光学的標識を含む。光学的標識
は、２０より多い蛍光体を含むこともある。
【０１４２】
ここで実証する実施例ではトリプレックスアッセイ物のみを使用したが、本発明は、ト
リプレックスアッセイ物と光学的標識の使用に拘束されない。本発明の実施形態は、光学
的標識と共に使用するとき、次の量のプレキシティーを含む：シングルプレックス、デュ
プレックス、トリプレックス、４プレックス、１０プレックス以下、２０プレックス以下
、５０プレックス以下、および１００プレックス以下。本発明の実施形態は、光学的標識
と共に使用するとき、１００を超えるプレキシティーも含む。
【０１４３】
本発明のもう１つの方法は、多重化と光学的標識を併用するために、コ・フローではな
く液滴マージの使用を含む。コ・フローでの前記実施例の場合と同じ３×３×３アッセイ
で、液滴マージを使用する実証実験を行った。先ず、それらの一意的光学標識と併用され
るアッセイ物（プローブおよびプライマー）をＰＣＲマスターミックスと共に液滴に封入
した。その後、上で説明した本発明の方法に従って、９つすべての光学的に標識されたア
ッセイ物からの液滴の混合物を含有するライブラリーを、同じ患者からのテンプレートＤ
ＮＡを含有する液滴と、前の実施例の場合と同様に１つずつ合体させた。本発明のもう１
つの方法は、参照により本明細書に援用されている米国特許仮出願第６１／４４１，９８
５号に記載されているようなラムダ・インジェクタ型マージモジュールを使用して、液滴
マージを行った。コ・フローとマージとの違いを別にすれば、アッセイ物および実験手順
は上のコ・フロー実験のものと同一であった。図２１は、図１７〜２０におけるものに類
似している光学的標識およびアッセイ物についての液滴蛍光強度の２Ｄヒストグラムを示
すものである。コ・フローについての場合と同様に、個々の光学的標識を含有する液滴の
選択に基づき、各アッセイ物に対応する液滴の予想された別個のクラスタが明確にはっき
りと見えた。さらに、各アッセイ物について、実測遺伝子コピー数は、実験不確実性の範
囲内の期待値と合致したまたは非常に近しく合致した（表１参照）。
【０１４４】
【表１】
0006263225.tif 000005
本発明の方法は、コ・フローでのマイクロフルイディクスまたは液滴マージでのマイク
ロフルイディクスのいずれかの使用を含むが、本発明は、これに関して限定されない。蛍
光発生性ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブも含有する光学的に標識された液滴を生
成させることができる任意の流体工学的方法が考えられる。例えば、当該技術分野におい
て周知の他の実施形態は、液滴生成チップへの注入前にマイクロ流体環境で光学的標識と
アッセイ物を混合すること；およびサーペンタインミキサーなどで、専用混合モジュール
内の液滴形成モジュールの上流で光学的標識とアッセイ物を入念に混合することである。
【０１４５】
データ分析
本発明の１つの方法は、一意的プローブシグネチャ（色および強度）から生ずる統計的
に類似した液滴の集団を同定および特性づけするための、ならびに他のものからの液滴の
１つの集団を識別するための、ヒストグラムベースのデータ提示および分析を含む。本発
明のもう１つの方法は、光学的標識からの一意的シグネチャに基づいて液滴の集団を同定
および選択するための、ヒストグラムベースのデータ提示および分析を含む。これらの方
法についての一および二次元ヒストグラムの例を提供したが、本発明は、これに関して限
定されない。上で説明したように、より多くの色を多重化にも光学的標識にも使用するこ
ととなることが予想される。従って、本発明の実施形態は、２より大きい、例えば３、ま
たは４、または１０以下、または２０以下の次元数のヒストグラムを含む。２０より大き
い次元数のヒストグラムも本発明に組み込まれる。
【０１４６】
本発明のもう１つの方法は、カウントのための、または光学的標識の場合のようなアッ
セイ物選択のための、または任意の他の目的のための、ヒストグラム内の液滴の選択を含
む。本発明の方法は、任意の可能な形状および次元の、閉じたまたは開いた、境界による
選択を含む。本発明の方法は、単一のタイプの蛍光体からの、または多数のタイプの蛍光
体からの、例えば共通のＤＮＡターゲットに対して複数のプローブから生ずる、蛍光を呈
示する液滴の選択も含む。
【０１４７】
ポリメラーゼエラー訂正
超高感度を必要とする用途、例えば豊富な野生型ＤＮＡの中での稀な突然変異について
の検索、については、偽ポジティブ結果がＤＮＡポリメラーゼ自体からのエラーから生ず
ることがある。例えば、初期熱サイクルうちの１つのサイクルの間に、ポリメラーゼは、
野生型テンプレートからＤＮＡの突然変異体鎖を合成することがあるだろう。このタイプ
のエラーは、突然変異体と野生型の間の差が非常に小さいとき、例えば一塩基多型（ＳＮ
Ｐ）のとき、発生する可能性が最も高い。本発明のこの方法において、各液滴は、あった
としても単一のターゲット核酸しか含有しない。好ましい実施形態において、これは、終
点希釈条件下で遂行される。野生型のターゲットである増幅産物を含有する液滴を、その
野生型のターゲットにハイブリダイズするプローブから放出される蛍光体からの放射に基
づいて検出する。変異体のターゲットを含有する液滴を、その変異体のターゲットにハイ
ブリダイズするプローブから放出される蛍光体の放射に基づいて検出する。各液滴は、単
一の核酸分子のみで出発するので、各液滴内の結果として生ずる増幅産物は、ターゲット
について均一であるか、ターゲットの変異体について均一である。
【０１４８】
しかし、一定の液滴は、ＰＣＲ反応中のポリメラーゼエラーのため、ターゲットおよび
ターゲット変異体両方の不均一混合物を含有するであろう。ＰＣＲのエラー率は、正確な
核酸配列、使用される熱安定性酵素、およびインビトロでのＤＮＡ合成条件に従って変動
する。例えば、熱安定性Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラ
ーゼによって触媒されるＰＣＲ中のエラー頻度（１サイクルあたりの１ヌクレオチドあた
りの突然変異）は、−２×１０−４から＜１×１０−５まで、１０倍より大きく変動する
。Ｅｃｋｅｒｔら（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１：１７−２４、１９９１）、この内容はそ
の全体が参照により本明細書に援用されている。１サイクルあたり１０，０００ヌクレオ
チドにつき１の突然変異の頻度でのポリメラーゼ媒介エラーは、少量の出発原料（例えば
、合計１０，０００ヌクレオチド未満のターゲットＤＮＡ）で始まる、または最終ＰＣＲ
集団中の個々のＤＮＡ分子に焦点を合わせている、いずれのＰＣＲ用途にとっても重要な
考慮事項である。
【０１４９】
配列変化を含有するＤＮＡ分子の比率は、１サイクルあたりの１ヌクレオチドあたりの
エラー率、増幅サイクル数、および出発集団サイズの関数である。改変ＤＮＡ分子の集団
が、ＰＣＲ中に２つの原因：（１）各ＰＣＲサイクルでの新たなエラー；および（２）前
のサイクルからのエラーを含有するＤＮＡ分子の増幅、から発生する。式
【数３】
0006263225.tif 000006
は、ｐを各サイクルにおいて一定であると仮定して、ＰＣＲ増幅についての平均突然変異
頻度
【数４】
0006263225.tif 000007
を、１サイクルあたりの１ヌクレオチドあたりのポリメラーゼエラー率（ｐ）およびサイ
クル数（ｎ）の関数として示す。ＰＣＲの指数関数的性質のため、初期エラーの発生は、
【数５】
0006263225.tif 000008
によって示される平均より上に最終エラー頻度を増加させ得る。なぜなら、変異体ＤＮＡ
分子は各サイクルで増幅されることとなり、その結果、平均数より多い変異体を有する集
団となるからである。
【０１５０】
初期増幅ラウンド中に野生型ターゲットを変異体ターゲットに変換するポリメラーゼエ
ラーは、液滴内のターゲットおよびターゲット変異体の不均一集団を生じさせる結果とな
り、ならびに液滴がターゲットの変異体を含有すると不正確に同定されること（すなわち
、偽ポジティブ）に至ることがある。そのような偽ポジティブは、デジタルＰＣＲ結果の
妥当性および精度に大きな影響を及ぼす。
【０１５１】
本発明の方法は、どの液滴が分子の不均一集団を含有するかを検出することができ、そ
れらの液滴を分析から排除することができる。増幅産物を含有する液滴が検出モジュール
を通ってチャネル内を流れると、そのモジュールは、各液滴における蛍光放出を検出する
ことができる。単一のシグナルのみを生じさせる液滴を、ターゲットの均一集団を含有す
る液滴として分類する。野生型のターゲットにハイブリダイズするプローブは、野生型タ
ーゲットの変異体にハイブリダイズするプローブとは異なる蛍光体が付いているので、本
発明の方法は、それぞれの液滴を、ターゲットのアンプリコンの均一集団またはターゲッ
トの変異体のアンプリコンの均一集団のいずれかを含有するものとして分類することがで
きる。
【０１５２】
２つのシグナルを生じさせる液滴を、分子の不均一集団を含有する液滴として分類する
。各液滴は、多くても単一のターゲット核酸で出発するので、ターゲットのアンプリコン
とターゲットの変異体のアンプリコンの両方である増幅産物を含む液滴は、ターゲットの
変異体がＰＣＲ反応中のポリメラーゼエラー、大抵の場合、ＰＣＲ反応の初期サイクル中
のポリメラーゼエラー、によって生産された。そのような液滴を検出し、分析から排除す
る。
【０１５３】
分析
次に、分子の均一集団を含有する液滴のみに関して分析を行った。この分析は、カウン
ティング、すなわち、野生型ターゲットのみを含有する液滴の数の決定、および該ターゲ
ットの変異体のみを含有する液滴の数の決定、に基づくものであり得る。そのような方法
は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｌａｐｉｄｕｓら（米国特許第５，６７
０，３２５号および同第５，９２８，８７０号）ならびにＳｈｕｂｅｒら（米国特許第６
，２０３，９９３号および同第６，２１４，５５８号）（これらのそれぞれの内容は、そ
の全体が参照により本明細書に援用されている）を参照のこと。
【０１５４】
一般に、変異体のみを含有する液滴の存在は、癌などの疾患の指標となる。一定の実施
形態において、前記変異体は、対立遺伝子変異体、例えば挿入、欠失、置換、転座、また
は一塩基多型（ＳＮＰ）、である。
【０１５５】
癌に関連づけられるバイオマーカーは、当該技術分野において公知である。乳癌の発達
に関連づけられるバイオマーカーは、Ｅｒｌａｎｄｅｒら（ＵＳ  ７，５０４，２１４）
、Ｄａｉら（ＵＳ  ７，５１４，２０９および７，１７１，３１１）、Ｂａｋｅｒら（Ｕ
Ｓ  ７，０５６，６７４およびＵＳ  ７，０８１，３４０）、Ｅｒｌａｎｄｅｒら（ＵＳ
２００９／００９２９７３）に示されている。前記特許出願およびこれらの特許のそれ
ぞれの内容はそれら全体が参照により本明細書に援用されている。子宮頚癌の発達に関連
づけられるバイオマーカーは、Ｐａｔｅｌ（ＵＳ  ７，３００，７６５）、Ｐａｒｄｅｅ
ら（ＵＳ  ７，１５３，７００）、Ｋｉｍ（ＵＳ  ６，９０５，８４４）、Ｒｏｂｅｒｔ
ｓら（ＵＳ  ６，３１６，２０８）、Ｓｃｈｌｅｇｅｌ（ＵＳ  ２００８／０１１３３４
０）、Ｋｗｏｋら（ＵＳ  ２００８／００４４８２８）、Ｆｉｓｈｅｒら（ＵＳ  ２００
５／０２６０５６６）、Ｓａｓｔｒｙら（ＵＳ  ２００５／００４８４６７）、Ｌａｉ（
ＵＳ  ２００８／０３１１５７０）およびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｚｅｅら（ＵＳ  ２００９／
００２３１３７）に示されている。膣癌の発達に関連づけられるバイオマーカーは、Ｇｉ
ｏｒｄａｎｏ（ＵＳ  ５，８４０，５０６）、Ｋｒｕｋ（ＵＳ  ２００８／０００９００
５）、Ｈｅｌｌｍａｎら（Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１００（８）：１３０３−１３１４
、２００９）に示されている。脳の癌（例えば、神経膠腫、小脳、髄芽腫、星状細胞腫、
上衣腫、膠芽腫）の発達に関連づけられるバイオマーカーは、Ｄ’Ａｎｄｒｅａ（ＵＳ  
２００９／００８１２３７）、Ｍｕｒｐｈｙら（ＵＳ  ２００６／０２６９５５８）、Ｇ
ｉｂｓｏｎら（ＵＳ  ２００６／０２８１０８９）、およびＺｅｔｔｅｒら（ＵＳ  ２０
０６／０１６０７６２）に示されている。腎癌の発達に関連づけられるバイオマーカーは
、Ｐａｔｅｌ（ＵＳ  ７，３００，７６５）、Ｓｏｙｕｐａｋら（ＵＳ  ７，４８２，１
２９）、Ｓａｈｉｎら（ＵＳ  ７，５２７，９３３）、Ｐｒｉｃｅら（ＵＳ  ７，２２９
，７７０）、Ｒａｉｔａｎｏ（ＵＳ  ７，５０７，５４１）、およびＢｅｃｋｅｒら（Ｕ
Ｓ  ２００７／０２９２８６９）に示されている。肝癌（例えば、肝細胞癌腫）の発達に
関連づけられるバイオマーカーは、Ｈｏｒｎｅら（ＵＳ  ６，９７４，６６７）、Ｙｕａ
ｎら（ＵＳ  ６，８９７，０１８）、Ｈａｎａｕｓｅｋ−Ｗａｌａｓｚｅｋら（ＵＳ  ５
，３１０，６５３）、およびＬｉｅｗら（ＵＳ  ２００５／０１５２９０８）に示されて
いる。胃、胃腸および／または食道癌の発達に関連づけられるバイオマーカーは、Ｃｈａ
ｎｇら（ＵＳ  ７，５０７，５３２）、Ｂａｅら（ＵＳ  ７，３６８，２５５）、Ｍｕｒ
ａｍａｔｓｕら（ＵＳ  ７，０９０，９８３）、Ｓａｈｉｎら（ＵＳ  ７，５２７，９３
３）、Ｃｈｏｗら（ＵＳ  ２００８／０１３８８０６）、Ｗａｌｄｍａｎら（ＵＳ  ２０
０５／０１００８９５）、Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ（ＵＳ  ２００８／００５７５１４）、
Ａｎら（ＵＳ  ２００７／０２５９３６８）、Ｇｕｉｌｆｏｒｄら（ＵＳ  ２００７／０
１８４４３９）、Ｗｉｒｔｚら（ＵＳ  ２００４／００１８５２５）、Ｆｉｌｅｌｌａら
（Ａｃｔａ  Ｏｎｃｏｌ．３３（７）：７４７−７５１、１９９４）、Ｗａｌｄｍａｎら
（ＵＳ  ６，７６７，７０４）、およびＬｉｐｋｉｎら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ、４８：２３５−２４５、１９８８）に示されている。卵巣癌の発達に関連づけられる
バイオマーカーは、Ｐｏｄｕｓｔら（ＵＳ  ７，５１０，８４２）、Ｗａｎｇ（ＵＳ  ７
，３４８，１４２）、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら（ＵＳ  ７，２９１，４６２、６，９４２，９７
８、６，３１６，２１３、６，２９４，３４４、および６，２６８，１６５）、Ｇａｎｅ
ｔｔａ（ＵＳ  ７，０７８，１８０）、Ｍａｌｉｎｏｗｓｋｉら（ＵＳ  ２００９／００
８７８４９）、Ｂｅｙｅｒら（ＵＳ  ２００９／００８１６８５）、Ｆｉｓｃｈｅｒら（
ＵＳ  ２００９／００７５３０７）、Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら（ＵＳ  ２００９／０００４
６８７）、Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら（ＵＳ  ２００８／０２８６１９９）、Ｆａｒｉａｓ
−Ｅｉｓｎｅｒら（ＵＳ  ２００８／００３８７５４）、Ａｈｍｅｄら（ＵＳ  ２００７
／００５３８９６）、Ｇｉｏｒｄａｎｏ（ＵＳ  ５，８４０，５０６）、およびＴｃｈａ
ｇａｎｇら（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ、７：２７−３７、２００８）に示されて
いる。頭頸部および甲状腺癌の発達に関連づけられるバイオマーカーは、Ｓｉｄｒａｎｓ
ｋｙら（ＵＳ  ７，３７８，２３３）、Ｓｋｏｌｎｉｃｋら（ＵＳ  ５，９８９，８１５
）、Ｂｕｄｉｍａｎら（ＵＳ  ２００９／００７５２６５）、Ｈａｓｉｎａら（Ｃａｎｃ
ｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６３：５５５−５５９、２００３）、Ｋｅｂｅｂｅｗら（ＵＳ
２００８／０２８０３０２）、およびＲａｌｈａｎ（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏ
ｍｉｃｓ、７（６）：１１６２−１１７３、２００８）に示されている。前記論文、特許
および特許出願のそれぞれについての内容はそれら全体が参照により本明細書に援用され
ている。結腸直腸癌の発達に関連づけられるバイオマーカーは、Ｒａｉｔａｎｏら（ＵＳ
７，５０７，５４１）、Ｒｅｉｎｈａｒｄら（ＵＳ  ７，５０１，２４４）、Ｗａｌｄ
ｍａｎら（ＵＳ  ７，４７９，３７６）；Ｓｃｈｌｅｙｅｒら（ＵＳ  ７，１９８，８９
９）；Ｒｅｅｄ（ＵＳ  ７，１６３，８０１）、Ｒｏｂｂｉｎｓら（ＵＳ  ７，０２２，
４７２）、Ｍａｃｋら（ＵＳ  ６，６８２，８９０）、Ｔａｂｉｔｉら（ＵＳ  ５，８８
８，７４６）、Ｂｕｄｉｍａｎら（ＵＳ  ２００９／００９８５４２）、Ｋａｒｌ（ＵＳ
２００９／００７５３１１）、Ａｒｊｏｌら（ＵＳ  ２００８／０２８６８０１）、Ｌ
ｅｅら（ＵＳ  ２００８／０２０６７５６）、Ｍｏｒｉら（ＵＳ  ２００８／００８１３
３３）、Ｗａｎｇら（ＵＳ  ２００８／００５８４３２）、Ｂｅｌａｃｅｌら（ＵＳ  ２
００８／００５０７２３）、Ｓｔｅｄｒｏｎｓｋｙら（ＵＳ  ２００８／００２０９４０
）、Ａｎら（ＵＳ  ２００６／０２３４２５４）、Ｅｖｅｌｅｉｇｈら（ＵＳ  ２００４
／０１４６９２１）、およびＹｅａｔｍａｎら（ＵＳ  ２００６／０１９５２６９）に示
されている。前立腺癌の発達に関連づけられるバイオマーカーは、Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ（
ＵＳ  ７，５２４，６３３）、Ｐｌａｔｉｃａ（ＵＳ  ７，５１０，７０７）、Ｓａｌｃ
ｅｄａら（ＵＳ  ７，４３２，０６４およびＵＳ  ７，３６４，８６２）、Ｓｉｅｇｌｅ
ｒら（ＵＳ  ７，３６１，４７４）、Ｗａｎｇ（ＵＳ  ７，３４８，１４２）、Ａｌｉら
（ＵＳ  ７，３２６，５２９）、Ｐｒｉｃｅら（ＵＳ  ７，２２９，７７０）、Ｏ’Ｂｒ
ｉｅｎら（ＵＳ  ７，２９１，４６２）、Ｇｏｌｕｂら（ＵＳ  ６，９４９，３４２）、
Ｏｇｄｅｎら（ＵＳ  ６，８４１，３５０）、Ａｎら（ＵＳ  ６，１７１，７９６）、Ｂ
ｅｒｇａｎら（ＵＳ  ２００９／０１２４５６９）、Ｂｈｏｗｍｉｃｋ（ＵＳ  ２００９
／００１７４６３）、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（ＵＳ  ２００８／０２６９１５７）、Ｃ
ｈｉｎｎａｉｙａｎら（ＵＳ  ２００８／０２２２７４１）、Ｔｈａｘｔｏｎら（ＵＳ  
２００８／０１８１８５０）、Ｄａｈａｒｙら（ＵＳ  ２００８／００１４５９０）、Ｄ
ｉａｍａｎｄｉｓら（ＵＳ  ２００６／０２６９９７１）、Ｒｕｂｉｎら（ＵＳ  ２００
６／０２３４２５９）、Ｅｉｎｓｔｅｉｎら（ＵＳ  ２００６／０１１５８２１）、Ｐａ
ｒｉｓら（ＵＳ  ２００６／０１１０７５９）、Ｃｏｎｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ（ＵＳ  ２０
０４／００５３２４７）、およびＲｉｔｃｈｉｅら（ＵＳ  ２００９／０１２７４５４）
に示されている。膵臓癌の発達に関連づけられるバイオマーカーは、Ｓａｈｉｎら（ＵＳ
７，５２７，９３３）、Ｒａｔａｉｎｏら（ＵＳ  ７，５０７，５４１）、Ｓｃｈｌｅ
ｙｅｒら（ＵＳ  ７，４７６，５０６）、Ｄｏｍｏｎら（ＵＳ  ７，４７３，５３１）、
ＭｃＣａｆｆｅｙら（ＵＳ  ７，３５８，２３１）、Ｐｒｉｃｅら（ＵＳ  ７，２２９，
７７０）、Ｃｈａｎら（ＵＳ  ２００５／００９５６１１）、Ｍｉｔｃｈｌら（ＵＳ  ２
００６／０２５８８４１）、およびＦａｃａら（ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ５（６）：ｅ１２３
、２００８）に示されている。肺癌の発達に関連づけられるバイオマーカーは、Ｓａｈｉ
ｎら（ＵＳ  ７，５２７，９３３）、Ｈｕｔｔｅｍａｎ（ＵＳ  ７，４７３，５３０）、
Ｂａｅら（ＵＳ  ７，３６８，２５５）、Ｗａｎｇ（ＵＳ  ７，３４８，１４２）、Ｎａ
ｃｈｔら（ＵＳ  ７，３３２，５９０）、Ｇｕｒｅら（ＵＳ  ７，３１４，７２１）、Ｐ
ａｔｅｌ（ＵＳ  ７，３００，７６５）、Ｐｒｉｃｅら（ＵＳ  ７，２２９，７７０）、
Ｏ’Ｂｒｉｅｎら（ＵＳ  ７，２９１，４６２およびＵＳ  ６，３１６，２１３）、Ｍｕ
ｒａｍａｔｓｕら（ＵＳ  ７，０９０，９８３）、Ｃａｒｓｏｎら（ＵＳ  ６，５７６，
４２０）、Ｇｉｏｒｄａｎｏ（ＵＳ  ５，８４０，５０６）、Ｇｕｏ（ＵＳ  ２００９／
００６２１４４）、Ｔｓａｏら（ＵＳ  ２００８／０１７６２３６）、Ｎａｋａｍｕｒａ
ら（ＵＳ  ２００８／００５０３７８）、Ｒａｐｏｎｉら（ＵＳ  ２００６／０２５２０
５７）、Ｙｉｐら（ＵＳ  ２００６／０２２３１２７）、Ｐｏｌｌｏｃｋら（ＵＳ  ２０
０６／００４６２５７）、Ｍｏｏｎら（ＵＳ  ２００３／０２２４５０９）、およびＢｕ
ｄｉｍａｎら（ＵＳ  ２００９／００９８５４３）に示されている。皮膚癌（例えば、基
底細胞癌腫、扁平上皮癌腫、および黒色腫）の発達に関連づけられるバイオマーカーは、
Ｒｏｂｅｒｔｓら（ＵＳ  ６，３１６，２０８）、Ｐｏｌｓｋｙ（ＵＳ  ７，４４２，５
０７）、Ｐｒｉｃｅら（ＵＳ  ７，２２９，７７０）、Ｇｅｎｅｔｔａ（ＵＳ  ７，０７
８，１８０）、Ｃａｒｓｏｎら（ＵＳ  ６，５７６，４２０）、Ｍｏｓｅｓら（ＵＳ  ２
００８／０２８６８１１）、Ｍｏｓｅｓら（ＵＳ  ２００８／０２６８４７３）、Ｄｏｏ
ｌｅｙら（ＵＳ  ２００３／０２３２３５６）、Ｃｈａｎｇら（ＵＳ  ２００８／０２７
４９０８）、Ａｌａｎｉら（ＵＳ  ２００８／０１１８４６２）、Ｗａｎｇ（ＵＳ  ２０
０７／０１５４８８９）、およびＺｅｔｔｅｒら（ＵＳ  ２００８／００６４０４７）に
示されている。多発性骨髄腫の発達に関連づけられるバイオマーカーは、Ｃｏｉｇｎｅｔ
（ＵＳ  ７，４４９，３０３）、Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙら（ＵＳ  ７，３０８，３６４
）、Ｓｅｓｈｉ（ＵＳ  ７，０４９，０７２）、およびＳｈａｕｇｈｎｅｓｓｙら（ＵＳ
２００８／０２９３５７８、ＵＳ  ２００８／０２３４１３９、およびＵＳ  ２００８
／０２３４１３８）に示されている。白血病の発達に関連づけられるバイオマーカーは、
Ａｎｄｏら（ＵＳ  ７，４７９，３７１）、Ｃｏｉｇｎｅｔ（ＵＳ  ７，４７９，３７０
およびＵＳ  ７，４４９，３０３）、Ｄａｖｉら（ＵＳ  ７，４１６，８５１）、Ｃｈｉ
ｏｒａｚｚｉ（ＵＳ  ７，３１６，９０６）、Ｓｅｓｈｉ（ＵＳ  ７，０４９，０７２）
、Ｖａｎ  Ｂａｒｅｎら（ＵＳ  ６，１３０，０５２）、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ（ＵＳ  ５
，６４３，７２９）、Ｉｎｓｅｌら（ＵＳ  ２００９／０１３１３５３）、およびＶａｎ
Ｂｏｃｋｓｔａｅｌｅら（Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ．２３（１）：２５−４７、２００９）
に示されている。リンパ腫の発達に関連づけられるバイオマーカーは、Ａｎｄｏら（ＵＳ
７，４７９，３７１）、Ｌｅｖｙら（ＵＳ  ７，３３２，２８０）、およびＡｒｎｏｌ
ｄ（ＵＳ  ５，８５８，６５５）に示されている。膀胱癌の発達に関連づけられるバイオ
マーカーは、Ｐｒｉｃｅら（ＵＳ  ７，２２９，７７０）、Ｏｒｎｔｏｆｔ（ＵＳ  ６，
９３６，４１７）、Ｈａａｋ−Ｆｒｅｎｄｓｃｈｏら（ＵＳ  ６，００８，００３）、Ｆ
ｅｉｎｓｔｅｉｎら（ＵＳ  ６，９９８，２３２）、Ｅｌｔｉｎｇら（ＵＳ  ２００８／
０３１１６０４）、およびＷｅｗｅｒら（２００９／００２９３７２）に示されている。
上記参考文献のそれぞれについての内容はその全体が参照により本明細書に援用されてい
る。
【０１５６】
一定の実施形態において、本発明の方法は、癌の再発について患者をモニターするため
に用いることができる。患者は、既に癌の処置を受けているので、その患者の癌に関連づ
けられる遺伝子プロファイルおよび特定の突然変異（単数または複数）は既にわかってい
る。患者が以前に治療を受けた癌の指標となる突然変異（単数または複数）を含有する核
酸の領域に特異的にハイブリダイズするプローブを設計することができる。その後、患者
のサンプル（例えば、膿、痰、精液、尿、血液、唾液、糞便、または脳脊髄液）を上で説
明したように分析して、突然変異体対立遺伝子（単数または複数）がサンプル中で検出さ
れるかどうかを決定することができ、その突然変異体対立遺伝子（単数または複数）が癌
の再発の指標となる。
【０１５７】
液滴選別
本発明の方法は、液滴が分子の均一な集団を含有するかまたは分子の不均一な集団を含
有するかに基づく液滴の選別を含む。選別モジュールは、検出モジュール内での液滴問い
合わせに関連して受け取るシグナルに依存して液滴のフローが１つ以上の他のチャネル、
例えば枝チャネル、に入るように方向を変えることができるチャネルの接合部であり得る
。典型的に、選別モジュールはモニターされ、および／または検出モジュールの制御下に
あり、従って、選別モジュールは検出モジュールに応答することができる。選別領域は１
つ以上の選別装置と連通しており、それらによる影響を受ける。
【０１５８】
選別装置は、技術または制御システム、例えば、誘電性、電気的、電気浸透性、（マイ
クロ−）バルブなどを含む。制御システムは、様々な選別技術を用いて、分子、細胞、小
分子または粒子のフローを所定の枝チャネルに変えるまたは向けることができる。枝チャ
ネルは、選別領域および主チャネルと連通しているチャネルである。主チャネルは、例え
ばＴ形またはＹ形を形成するように、選別モジュールまたは分岐点で２つ以上の枝チャネ
ルと連通し得る。他の形およびチャネル幾何形状を望みどおりに用いることができる。典
型的に、枝チャネルは、検出モジュールにより検出され、選別モジュールで選別されると
、関心のある液滴を受け取る。枝チャネルは、流出モジュールを有することができ、およ
び／または分子、細胞、小分子もしくは粒子の回収または廃棄を可能にするウエルもしく
はレザバー（それぞれ、回収モジュールもしくは廃棄モジュール）を末端に有することが
できる。あるいは、枝チャネルは、追加の選別を可能にするために他のチャネルと連通し
ていることがある。
【０１５９】
流体液滴の特性を、何らかの仕方で、例えば本明細書に記載するように、感知および／
もしくは決定することができ（例えば、流体液滴の蛍光を決定することができ）、および
、呼応して、流体液滴を特定の領域（例えば、チャネル）に向けるために電場を印加する
または除去することができる。一定の実施形態では、非荷電流体液滴（最初は、荷電され
ていることもあり、または非荷電であることもある）内に双極子を誘導すること、および
印加された電場を用いてその液滴を選別するまたは指向させることにより、流体液滴を選
別するまたは指向させる。前記電場は、ＡＣ場、ＤＣ場などであり得る。例えば、流体液
滴とキャリア流体とを含有するチャネルは、分岐点で第一および第二のチャネルに分かれ
る。一般に、前記流体液滴は、非荷電である。分岐点の後に、第一の電極を第一のチャネ
ル付近に配置し、第二の電極を第二のチャネルの付近に配置する。第三の電極は、第一チ
ャネルと第二チャネルの分岐点の付近に配置する。その後、これらの電極の組み合わせを
用いて、流体液滴内に双極子を誘導する。このように、適当な電場を印加することにより
、液滴を望みどおりに第一または第二のチャネルのいずれかに向けることができる。液滴
選別についてのさらなる説明は、例えば、Ｌｉｎｋら（米国特許出願第２００８／００１
４５８９号、同第２００８／０００３１４２号、および同第２０１０／０１３７１６３号
）およびＲａｉｎｄａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．の欧州特許出願公開
第２０４７９１０号に示されている。
【０１６０】
検出モジュールで検出されたシグナルに基づいて、分子の不均一集団を含有する液滴を
、分子の均一集団を含有する液滴から選別除去する。液滴をさらに選別して、ターゲット
のアンプリコンの均一集団を含有する液滴を、ターゲットの変異体のアンプリコンの均一
集団を含有する液滴から分離することができる。
【０１６１】
液滴からのターゲットの放出
本発明の方法は、さらなる分析のために液滴から増幅ターゲット分子を放出させること
をさらに含むことができる。液滴から増幅ターゲット分子を放出させる方法は、例えば、
Ｌｉｎｋら（米国特許出願第２００８／００１４５８９号、同第２００８／０００３１４
２号、および同第２０１０／０１３７１６３号）およびＲａｉｎｄａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．の欧州特許出願公開第２０４７９１０号に示されている。
【０１６２】
一定の実施形態では、サンプル液滴をキャリア流体の上にクリーム状に固まらせる。非
限定的な例として、前記キャリア流体には、１つ以上の安定化界面活性剤を有することが
できるパーフルオロカーボン油を挙げることができる。液滴は、その液滴を構成する水性
相のものより大きいキャリア流体の密度によって、キャリア流体から上に上昇するまたは
分離する。例えば、本発明の方法の１つの実施形態において使用するパーフルオロカーボ
ン油は、１．０である液滴の水性相の密度と比較して、１．８である。
【０１６３】
その後、それらのクリーム状の液を、脱不安定化界面活性剤、例えば過フッ素化アルコ
ール（例えば、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロ−１−オクタノール）、を含有す
る第二のキャリア流体上に置く。前記第二のキャリア流体もパーフルオロカーボン油であ
ることがある。混合すると、水性液滴は合体し始め、合体を低速での短い遠心分離（例え
ば、遠心分離器において２０００ｒｐｍで１分）によって完了させる。合体した水性相を
今や除去し、さらに分析することができる。
【０１６４】
放出された増幅材料を、テイルドプライマーおよび第二のＰＣＲプライマーの使用によ
り、さらなる増幅に付すこともできる。この実施形態において、液滴内のプライマーは、
該プライマーの配列特異的部分の５’末端に付加された追加の配列またはテイルを含有す
る。これらのテイル付き領域についての配列は、各プライマー対と同じであり、ＰＣＲサ
イクリング中にアンプリコンの５’部分に組み込まれる。アンプリコンを液滴から除去し
たら、そのアンプリコンのテイル領域にハイブリダイズすることができるもう１セットの
ＰＣＲプライマーを使用して、追加のＰＣＲラウンドにより産物をさらに増幅することが
できる。前記第二のプライマーは、前記テイル付き領域と長さおよび配列の点で厳密に合
致することがあり、またはそれら自体、該プライマーのテイル部分の５’末端に追加の配
列を含有することがある。第二のＰＣＲサイクリング中、これらの追加の領域もアンプリ
コンに組み込まれた状態になる。これらの追加の配列としては、ライブラリー調製および
シークエンシングのためのシークエンシングプラットホームによって用いられるアダプタ
ー領域、同じ反応に多重化されたサンプルの同定のためにバーコード化機能として用いら
れる配列、ビオチン、ジゴキシン、ペプチドまたは抗体などの反応材料の残部からのアン
プリコンの分離のための分子、およびフラグメントを同定するために使用することができ
る蛍光マーカーなどの分子を挙げることができるが、それらに限定されない。
【０１６５】
一定の実施形態では、それらの増幅されたターゲット分子をシークエンシングする。特
定の実施形態において、前記シークエンシングは、合成ごとの単一分子シークエンシング
（ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
）である。単一分子シークエンシングは、例えば、Ｌａｐｉｄｕｓら（米国特許第７，１
６９，５６０号）、Ｑｕａｋｅら（米国特許第６，８１８，３９５号）、Ｈａｒｒｉｓ（
米国特許第７，２８２，３３７号）、Ｑｕａｋｅら（米国特許出願第２００２／０１６４
６２９号）、およびＢｒａｓｌａｖｓｋｙら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、１００：３９６０−
３９６４（２００３）に示されており、これらの参考文献のそれぞれの内容はその全体が
参照により本明細書に援用されている。
【０１６６】
簡単に言うと、フローセルの表面に付着させたオリゴヌクレオチドに一本鎖核酸（例え
ば、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ）をハイブリダイズさせる。それらの一本鎖核酸を、当該技術
分野において公知の方法、例えばＬａｐｉｄｕｓ（米国特許第７，６６６，５９３号）に
示されているもの、によって捕捉することができる。前記オリゴヌクレオチドは、前記表
面に共有結合で付着させることができ、または当業者に公知であるような共有結合以外の
様々な付着を用いることができる。さらに、この付着は、間接的であってもよく、例えば
、前記表面に直接または間接的に付着された本発明のポリメラーゼによるものであっても
よい。前記表面は、平面であってもよいし、そうでなくてもよく、および／または多孔性
もしくは無孔性、または付着に適することが当業者に知られている任意の他のタイプであ
ってもよい。次に、成長鎖表面オリゴヌクレオチドに組み込まれた蛍光標識されたヌクレ
オチドのポリメラーゼ媒介付加を単一分子分解で撮像することにより、核酸をシークエン
シングする。
【実施例】
【０１６７】
実験の詳細
次に続くのは、上で詳述した様々な実験についての実験の詳細である。
【０１６８】
プライマーおよびプローブ
ここで使用したすべてのＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマーおよびプローブを表２に
リストする。表中に参考文献による別の注記がない限り、プライマーおよびプローブは、
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（ＡＢＩ）からの「Ｃｕｓｔｏｍ  Ｔ
ａｑＭａｎ（登録商標）Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｔｏｏｌ」で設計し、ＡＢＩ（カリ
フォルニア州カールズバッド）を通じて調達した。プローブを６−カルボキシフルオレセ
イン（ＦＡＭ、λ励起４９４ｎｍ＼λ放射４９４ｎｍ）またはＶＩＣ（商標）（ＡＢＩか
ら、λ励起５３８ｎｍ＼λ放射５５４ｎｍ）で標識した。
【０１６９】
【表２】
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ターゲットＤＮＡ
幾つかの遺伝子ターゲット、ＢＣＫＤＨＡおよびＳＭＮ２、について、プライマー対の
間にわたる配列（表２参照）を含有するプラスミドＤＮＡを合成し（ドイツ、レーゲンス
ブルクのＧｅｎｅＡｒｔ）、ＧｅｎｅＡｒｔ標準ベクター（２．５ｋｂ）にクローニング
した。アッセイに影響を及ぼし得る一切のＤＮＡスーパーコイル化を回避するために、Ｓ
ｆｉＩでの制限消化によってターゲットフラグメントをクローニングベクターから放出さ
せた。簡略化のために、本文全体を通してこれらの遺伝子フラグメントを「プラスミドＤ
ＮＡ」と呼ぶ。多重化反応の実証実験のために異なる遺伝子フラグメントのストリングも
合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ）、ＧｅｎｅＡｒｔ標準ベクターにクローニングした。それを本
文では「人工染色体」と呼ぶ。この場合はフラグメントを隣接ＥｃｏＲＶ部位での制限消
化によって互いに分離した。細胞株（表３参照；ニュージャージー州カムデンのＣｏｒｉ
ｅｌｌ）から既に精製された形態でヒトＤＮＡを得、使用前に製造業者（カリフォルニア
州カールズバッドのＩｎｖｔｒｏｇｅｎ）の説示に従ってＫ７０２５−０５ネブライザー
でフラグメント化した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００分光光度計（デラウェア州ウィルミ
ントンのＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２６０ｎｍでの吸収を測定する
ことにより、ＤＮＡ濃度を定量した。
【０１７０】
【表３】
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マイクロフルイディクス
従来のソフトリソグラフィーによってマイクロ流体チップを製造した。６インチシリコ
ンウェハ上にＳＵ−８ネガティブフォトレジスト（マサチューセッツ州ニュートンのＭｉ
ｃｒｏＣｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．）をスピンコートし、ＯＡＩ  Ｈｙｂｒａｌｉｇｎ  Ｓｅｒ
ｉｅｓ  ２００アライナー（カリフォルニア州サンホゼのＯＡＩ）でのコンタクトリソグ
ラフィーによりフォトマスク（オレゴン州バンドンのＣＡＤ／Ａｒｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ
）から流体形状を転写することによって、成形用マスターを作製した。チップは、そのチ
ップの外部ポートから機能領域に流体を移送するための低い流体力学的抵抗を有する深い
チャネル（１００±１０ｕｍ）と液滴操作および検出のための浅いチャネル（２０±１ｕ
ｍ）である、２つの深度を有するチャネルを含有した。ＳＵ−８フォトレジスト２１００
および２０２５を深いおよび浅いチャネルにそれぞれ使用した。ポリジメチルシロキサン
（ＰＤＭＡ）（Ｓｙｌｇａｒｄ（登録商標）１８４、ミシガン州ミッドランドのＤｏｗ  
Ｃｏｒｎｉｎｇ）チップを注文設計の金型ハウジング内でネガティブマスターから成形し
た。ＡｕｔｏＧｌｏｗ（商標）酸素プラズマシステム（アリゾナ州フェニックスのＧｌｏ
ｗ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）での表面活性化、続いて即座の圧着により、それらのチップの流
体側にガラス・カバー・スライドを永久接着した。疎水性表面を作るために、１００ｕＬ
の溶剤中の１８ｇのシランの混合物として調製したＦＣ−３２８３（ミネソタ州セントポ
ールの３Ｍ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）に溶解した１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，
２Ｈ−パーフルオロデシルトリクロロシラン（マサチューセッツ州ワードヒルのＡｌｆａ
Ａｅｓａｒ）に〜２分間、それらのマイクロ流体チャネルを暴露した。
一方は液滴生成用および他方は熱サイクリング後の蛍光読み出し用である２つの異なるマ
イクロ流体デバイスを使用した。液滴生成チップは、この時点以降「キャリア油」と呼ぶ
、エマルジョン安定化界面活性剤を伴う不活性フッ素化油（ＲＥＢキャリア油；マサチュ
ーセッツ州レキシントンのＲａｉｎＤａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に懸濁され
たテンプレートＤＮＡおよびＰＣＲマスターミックスの均一なサイズの水性液滴のエマル
ジョンを生じさせた。十字形のマイクロ流体交差部、すなわち「ノズル」、内で液滴を生
成させた。図３ａに示すように、典型的な動作のもとで、水性相は、右からノズルに流れ
込み（１６０ｕＬ／時）、上部および下部からのキャリア油のフロー（７５０ｕＬ／時の
全油）に合流し、１１ｋＨｚの速度で４ｐＬの液滴を生じさせた。交差部でのチャネル幅
は、水溶液流入口については１５ｕｍ、油流入口については１２．５の測定値であり、お
よび流出口では１５ｕｍが４０ｕｍに広がっていた。特注ＯＥＭポンプ（イリノイ州ノー
スブルックのＩＤＥＸ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によってフローを駆動した。
【０１７１】
おおよそ２５ｕＬのＰＣＲ反応混合物を液滴生成チップからエマルジョンとして回収し
、ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（カリフォルニア州ハーキュリーズのＢｉｏ−Ｒａｄ）での熱サ
イクルに付した。その反応混合物は、１×ＴａｑＭａｎ（登録商標）汎用ＰＣＲマスター
ミックス（カリフォルニア州カールズバッドのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ（ウィスコンシン州マディソンのＴａｋａｒａ  Ｂｉｏ）ならび
に結果の中で説明するような様々な量のプライマー対およびプローブを含有した。すべて
の場合、１×濃度から変動させるとき、プライマーおよびプローブを同じ量、変動させた
。サイクルプログラムは、９５℃での１０分のホットスタート、ならびに９５℃で１５秒
および６０℃で６０秒の４５サイクルを含んだ。
【０１７２】
キャリア油が水性相より高濃度になり、エマルジョンから流れ落ちるため、オフチップ
処理中に液滴が濃縮されてきた。それ故、一方の液滴を他方と正しく区別するために読み
出し前に希釈を必要とする密充填エマルジョンとして、液滴を読み出しチップに再注入し
た。上の液滴生成ノズルに類似した「スペーサー」ノズルを使用して、余分なキャリア油
の均一なプラグを読み出し直前に液滴間に注入した。図３ｂに示すように、ノズルへの液
滴入口は、ほぼ個々の液滴サイズのくびれに先細になっていて、液滴を単一の列で、それ
故、安定した速度でノズルに入らせた。上部および下部チャネルからのキャリア油の対向
フローがそれらの液滴を均一に分離した。スペーサーノズルから出て行くノズルは、フロ
ー方向に沿って幅が増大し、液滴は、その幅が液滴径より小さいまたは液滴径に等しいそ
のチャネルに沿った位置（図３ｂに矢印でしるしをつけた）でレーザー誘導蛍光による問
い合わせを受けた。前記ノズルの寸法は、液滴入口および出口については１５ｕｍ、およ
び油ラインについては２０ｕｍであった。
【０１７３】
器械使用
特注の顕微鏡での従来の落射蛍光顕微鏡法により、蛍光読み出しを行った。２０ｍＷ、
４８８ｎｍレーザー源（Ｃｙａｎ；カリフォルニア州サニーヴェールのＰｉｃａｒｒｏ）
を２×拡大し、対物レンズ（２０×／０．４５ＮＡ；日本の株式会社ニコン（Ｎｉｋｏｎ
）によってマイクロ流体チャネルに焦点を合わせた。２つのバンド・パス・フィルターが
、対物レンズによって集められた蛍光を識別した：ＦＡＭおよびＶＩＣ蛍光体についてそ
れぞれ５１２／２５ｎｍおよび５２９／２８ｎｍ（ニューヨーク州ロチェスターのＳｅｍ
ｒｏｃｋ）。２つのＨ５７８４−２０光電子倍増管（Ｈａｍａｍａｔｓｕ、日本）により
蛍光を検出し、ＵＳＢ−６２５９データ取得カード（テキサス州オースチンのＮａｔｉｏ
ｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて２００ｋＨｚのサンプリング速度で概して記
録した。後の分析の前に７点二次Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙアルゴリズムによりデー
タトレースを平滑化した。蛍光読み出しと当時に、８５０ｎｍ  ＬＥＤ（ＴＳＨＧ６２０
０；コネチカット州シェルトンのＶｉｓｈａｙ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒｓ）からの
背面照明で同じ対物レンズと、蛍光検出および撮像のために光路を分離するためのショー
ト・パス・フィルタと、Ｇｕｐｐｙ  ＣＣＤカメラ（マサチューセッツ州ニューベリーポ
ートのＡｌｌｉｅｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とによって、液滴を撮
像した。画像にすじが入らないように短い照明パルス（５〜２０マイクロ秒）で液滴を撮
像した。
【０１７４】
データ分析
液滴事象を閾値より上の蛍光強度の継続的バーストと解釈する特注ＬａｂＶｉｅｗソフ
トウェア（テキサス州オースチンのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）でデー
タを分析した。シグナル対ノイズ比は一般に相当高く、シグナルレベルは日ごとに一致し
ており、従って、５０ｍＶの固定閾値を主として用い、他の状況では閾値を目視によって
設定した。ＶＩＣ蛍光体とＦＡＭ蛍光体の両方について液滴事象ごとにピーク蛍光強度を
記録した。熱サイクリング中に液滴の多少の合体が、概して２個の無損傷液滴間の孤立し
た事象として発生して、「ダブレット」を形成した。ダブレットおよび稀なより大きい合
体事象を蛍光バーストの継続期間に基づいてデータセットから容易に濾過した。
【０１７５】
参照による援用
他の文献、例えば特許、特許出願、特許公開公報、ジャーナル、本、論文、ウェブコン
テンツ、の参照および引用を本開示全体を通して行った。すべてのそのような文献は、あ
らゆる意味でそれら全体が参照により本明細書に援用されている。
【０１７６】
等価物
本発明の精神または本質的特徴を逸脱することなく他の特定の形態で本発明を具現する
ことができる。従って、上述の実施形態は、すべての点で、本明細書に記載する本発明を
制限するものではなく例証するためのものであると解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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