(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体とレールタンパク質とを結合する組成物であって、
抗体結合タンパク質と、
ビオチンを介して前記抗体結合タンパク質に結合した１又は２以上のビオチン結合タンパク質と、
ビオチンを介して前記ビオチン結合タンパク質に結合した１又は２以上のレールタンパク質結合タンパク質と、を備え、
前記抗体結合タンパク質が前記抗体と結合することができ、
前記レールタンパク質結合タンパク質がレールタンパク質と選択的に結合することができることを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記抗体結合タンパク質は、プロテインＡであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記レールタンパク質は、アクチンフィラメント及び微小管を構成するタンパク質から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記レールタンパク質結合タンパク質は、ファロイジンであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ビオチン結合タンパク質は、アビジン又はストレプトアビジンあることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
抗原抗体反応を利用して担体分子が目的分子を捕集する捕集領域と、
化学平衡を利用して前記担体分子から前記目的分子を荷降ろしする荷降ろし領域と、を含み、
前記担体分子が請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物であることを特徴とするモーター蛋白デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組成物、特に抗体とレールタンパク質とを結合する組成物及びこの組成物を利用したモーター蛋白デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物の細胞内には、運動を発生する共通の機構があり、それが筋収縮、鞭毛運動、アメーバ運動、原形質流動のような運動だけでなく、物質輸送や染色体分配といった一般的機能を担っている。また、この機構には、細胞骨格と呼ばれるタンパク質繊維とその上を滑走するモータータンパク質と呼ばれるタンパク質群が関わっている。モータータンパク質は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の加水分解によって生じる化学エネルギーを運動に変換して、細胞内を移動するタンパク質の総称である。モータータンパク質としては、例えば、アクチンと相互作用して滑り運動を起こすミオシンや、微小管と相互作用して滑り運動を起こすキネシン及びダイニンが知られている。また、このようなアクチンや微小管等の細胞骨格は、レールタンパク質とも呼ばれている。
【０００３】
このようなモータータンパク質とレールタンパク質との相互作用を利用し、ＤＮＡ等の目的分子を高効率に輸送・捕集することを目的として、例えば、モータータンパク質を固定化した基板上に、目的分子との結合・分離が可能な修飾がなされたレールタンパク質を滑走させ、該レールタンパク質を輸送分子として作用させるシステムが報告されている（特許文献１〜３参照）。また、本発明者らは、以前、抗原抗体反応を利用して、目的分子を効率的に搬送して検出することができるモーター蛋白デバイスを報告している（特許文献４参照）。
【０００４】
一方、上記の抗原抗体反応を利用したシステムにおいて、目的分子の抗体とレールタンパク質であるアクチンとを結合する組成物として、ＳＭ（ＰＥＧ）１２試薬（succinimidyl-[(N-maleimidopropionamido)-dodecaethyleneglycol]  ester）が報告されている（非特許文献１参照）。ＳＭ（ＰＥＧ）１２試薬は、スペーサーアームにポリエチレングリコール（１２単位）をもち、アミノ基及びスルフヒドリル基反応性を有する二価性架橋試薬である。ＳＭ（ＰＥＧ）１２試薬は、抗体のアミノ基とＳＭ（ＰＥＧ）１２試薬のＮＨＳエステル基とをアミド結合により、また、アクチンのスルフヒドリル基とＳＭ（ＰＥＧ）１２試薬のマレイミド基とをチオエーテル結合による化学架橋を行い、抗体とアクチン間を結合させ、分子輸送ユニットとして利用することができる。
【０００５】
しかし、上記非特許文献１に記載されたＳＭ（ＰＥＧ）１２試薬は、タンパク質とポリエチレングリコールとの化学反応を行うため、反応効率が低く、また、反応時間が非常に長くなってしまったりして、高い収率が得られなかった。さらにまた、ＳＭ（ＰＥＧ）１２試薬は、上記の化学反応により、タンパク質の生理活性が損なわれることがあり、分子輸送ユニットとしての性能は十分とはいえなかった。したがって、ＳＭ（ＰＥＧ）１２試薬を利用した方法では、分子輸送ユニットとして、現実的な使用性は低いものとなっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２０４２４１号公報
【特許文献２】特開２００６−２８８３３６号公報
【特許文献３】特開２００７−１１１００４号公報
【特許文献４】ＷＯ２０１３／０８１０３５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Saroj  Kumar,  et  al.,  “Antibodies  Covalently  Immobilized  on  Actin  Filaments  for  Fast  Myosin  Driven  Analyte  Transport,”  PLoS  ONE,  vol.7,  Issue  10,  e46298,  Oct  2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記現状に鑑みてなされたものであり、反応効率が向上することが可能であり、分子輸送ユニットを効率よく合成することができる組成物及び組成物を利用したモーター蛋白デバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（１）本発明に係る１つの態様は、抗体とレールタンパク質とを結合する組成物であって、上記抗体に結合する抗体結合タンパク質と、上記抗体結合タンパク質とビオチンを介して結合する１又は２以上のビオチン結合タンパク質と、上記ビオチン結合タンパク質と上記ビオチンを介して結合し、かつ、上記レールタンパク質と選択的に結合する１又は２以上のレールタンパク質結合タンパク質とを備える組成物を提供する。
（２）上記抗体結合タンパク質は、上記（１）に記載の組成物において、プロテインＡであってもよい。
（３）上記レールタンパク質は、上記（１）又は（２）に記載の組成物において、アクチンフィラメント及び微小管を構成するタンパク質から選択される１種又は２種以上であってもよい。
（４）上記レールタンパク質結合タンパク質は、上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の組成物において、ファロイジンであってもよい。
（５）上記ビオチン結合タンパク質は、上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の組成物において、アビジン又はストレプトアビジンであってもよい。
（６）本発明に係る１つの態様は、抗原抗体反応を利用して担体分子が目的分子を捕集する捕集領域と、化学平衡を利用して上記担体分子から上記目的分子を荷降ろしする荷降ろし領域と、を含み、上記担体分子が上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の組成物であるモーター蛋白デバイスを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、反応効率が向上することが可能であり、分子輸送ユニットを効率よく合成できる組成物及びこの組成物を利用したモーター蛋白デバイスを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（ａ）本発明の一実施形態に係る組成物の構造を示す図。（ｂ）本発明の一実施形態に係る組成物を介して、抗体とレールタンパク質とが結合した一例を示す図。
【図２】本発明の一実施形態に係るモーター蛋白デバイスの基本構成を例示する図。
【図３】（ａ）本発明の一実施形態に係るがんセンサアレーとなるＳｉ半導体基板の構造を説明する図。（ｂ）モーター蛋白デバイスを備えるがんセンサアレーを例示する図。（ｃ）モーター蛋白デバイスを備えるがんセンサアレーを例示する断面図。
【図４】本発明の一実施形態に係るモーター蛋白デバイスを用いたインピーダンスの測定結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態（以下、実施形態）について詳細に説明する。なお、実施形態の説明の全体を通して同じ要素には同じ番号を付している。
【００１３】
（組成物）
図１（ａ）は、本発明の一実施形態に係る組成物の構造を示す図であり、図１（ｂ）は、本発明の一実施形態に係る組成物を介して、抗体とレールタンパク質とが結合した一例を示す図である。図１（ａ）及び図１（ｂ）に示すように、本発明の第１実施形態に係る組成物１は、抗体Ａｂ１に結合する抗体結合タンパク質１０と、抗体結合タンパク質１０とビオチン３０ａを介して結合する１又は２以上のビオチン結合タンパク質２０と、ビオチン３０ｃを介して結合し、かつ、レールタンパク質ＲＰと選択的に結合する１又は２以上のレールタンパク質結合タンパク質４０とを備え、抗体Ａｂ１とレールタンパク質ＲＰとを結合するコネクタとして作用する。
【００１４】
（抗体結合タンパク質）
抗体結合タンパク質１０は、抗体Ａｂ１と特異的に結合することができ、また、１又は２以上のビオチン結合タンパク質２０とビオチン３０（３０ａ〜３０ｄ）を介して結合することができるものであれば特に限定されない。抗体結合タンパク質１０としては、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬが挙げられる。なかでも、入手性・知見の多さの点から、プロテインＡが好ましい。また、抗体結合タンパク質１０は、タンパク質全体に限定されず、抗体結合能を持つドメイン（例えば、プロテインＡにおけるＢドメイン）のみを使用することができる。
【００１５】
（ビオチン及びビオチン結合タンパク質）
ビオチン結合タンパク質２０は、ビタミンＢ群に分類される低分子ビタミンの一種であるビオチン３０と特異的に結合することができるものであれば特に限定されず、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンが挙げられる。アビジン等のビオチン結合タンパク質２０が複数個結合した融合タンパク質であってもよく、この融合タンパク質は、リンカーで化学的に結合されたものであってもよい。
【００１６】
アビジンは、卵白中に存在する分子量約６８ｋＤａの塩基性糖タンパク質であり、４個のサブユニットから構成される。各サブユニットは、それぞれ１分子のビオチン３０（３０ａ〜３０ｄ）と結合する。ストレプトアビジンは、ストレプトマイセスの一種であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉにより作られるタンパク質であり、アビジンと同様、４個のサブユニットから構成され、各サブユニットがそれぞれ１分子のビオチン３０と結合する。ニュートラアビジンは、アビジンを脱グリコシル化することでレクチンとの非特異結合を抑えたビオチン結合タンパク質２０である。ビオチン結合タンパク質２０は、ビオチン３０に対する親和性の高さ（解離係数Ｋｄ＝１０−１５〜１０−１４ｍｏｌ／Ｌ）及び不可逆的な結合性から、アビジン又はストレプトアビジンが好ましい。
【００１７】
ビオチン３０（３０ａ〜３０ｄ）は、カルボキシル基を有しており、それ自身に化学修飾を施すことにより、タンパク質の各種官能基と共有結合をすることができる。これにより、ビオチン結合タンパク質２０は、ビオチン３０を介して抗体結合タンパク質１０及び後述するレールタンパク質結合タンパク質４０と不可逆的に強く結合することができる。また、例えば、ビオチン結合タンパク質２０がアビジンの場合、アビジン１分子あたり４分子のビオチン３０（３０ａ〜３０ｄ）と結合することができる。図１では、ビオチン結合タンパク質２０は、ビオチン３０ａを介して抗体結合タンパク質１０と結合し、ビオチン３０ｃを介して後述するレールタンパク質結合タンパク質４０と結合しているが、これに限られない。ビオチン結合タンパク質２０は、複数の抗体結合タンパク質１０と結合し、複数種類及び／または同一種類の抗体Ａｂ１を持つ分子輸送ユニットの作製が可能となる。同様に、ビオチン結合タンパク質２０は、複数のレールタンパク質結合タンパク質４０とも結合することができる。
【００１８】
（レールタンパク質結合タンパク質）
レールタンパク質結合タンパク質４０は、ビオチン３０と結合能を有し、また、レールタンパク質ＲＰと選択的に結合することができるものであれば特に限定されない。そして、レールタンパク質ＲＰは、モータータンパク質ＭＰに対して滑り運動を発現するタンパク質であれば特に限定されず、例えば、アクチン、アクチンフィラメント、チューブリン、微小管が挙げられる。アクチンは、マイクロフィラメントの１種であるアクチンフィラメントを構成する球状タンパク質として知られており、分子量が約４２０００の球形アクチンはＧ−アクチンと呼ばれている。また、アクチンフィラメントは、こうしたアクチンの重合体であって、螺旋状の多量体を形成する糸状の重合体である。アクチンフィラメントを構成するタンパク質には、必要に応じて、各種アクチンフィラメント結合タンパク質、アクチン調節タンパク質等を備えていてもよく、例えば、トロポミオシン、フィンブリン、α−アクチニン、フィラミン、ゲルゾリン、スペクトリンを挙げることができる。チューブリンは、微小管や中心体を構成するタンパク質であり、α、β及びγがあることが知られている。通常、α−チューブリンとβ−チューブリンが１個ずつ結合したヘテロ二量体を基本ユニットとして、繊維状に連結した微小管のプロトフィラメントを構成し、このプロトフィラメントが管状に１１〜１６本程度結合したものが微小管である。微小管を構成するタンパク質には、必要に応じて、微小管結合タンパク質等の微小管構成タンパク質以外のタンパク質を含んでいてもよい。
【００１９】
レールタンパク質ＲＰがアクチンフィラメントを構成するタンパク質であるとき、レールタンパク質結合物質４０は、ファロイジン、トロポミオシンを挙げることができる。なかでも、アクチンフィラメントを構成するタンパク質との結合性の高さから、ファロイジンが好ましい。また、レールタンパク質ＲＰが微小管を構成するタンパク質であるとき、レールタンパク質結合物質４０は、コルヒチン、タキソールを挙げることができる。なかでも、微小管を構成するタンパク質との結合性の高さから、タキソールが好ましい。
【００２０】
モータータンパク質ＭＰは、レールタンパク質ＲＰに対して相互作用を行い、滑り運動を発現するタンパク質であれば特に限定されない。こうしたモータータンパク質ＭＰとしては、アクチンフィラメントを構成するタンパク質に対するミオシン、ミオシンフィラメント、微小管を構成するタンパク質に対するキネシンやダイニンが挙げられる。
【００２１】
本発明の組成物１は、非特異的結合を利用し、複数種類の抗体Ａｂ１とレールタンパク質ＲＰとを結合する組成物１であり、抗体Ａｂ１に結合する抗体結合タンパク質１０と、抗体結合タンパク質１０とビオチン３０（３０ａ〜３０ｄ）を介して結合する１又は２以上のビオチン結合タンパク質２０と、ビオチン結合タンパク質２０とビオチン３０（３０ａ〜３０ｄ）を介して結合し、かつ、レールタンパク質ＲＰと選択的に結合する１又は２以上のレールタンパク質結合タンパク質４０とを備える。これらが一定の会合体を形成し、レールタンパク質ＲＰがモータータンパク質ＭＰに対して相互作用を行うとき、滑り運動が生じ、当該滑り運動に基づく抗体Ａｂ１の運動を外部に出力し、特定の抗原を搬送できる構造を有する分子輸送ユニットを形成できる。
【００２２】
（組成物の製造方法）
本発明の組成物１の製造方法は、例えば、（ａ）抗体結合タンパク質１０をビオチン化する工程と、（ｂ）レールタンパク質結合タンパク質４０をビオチン化する工程と、（ｃ）ビオチン化した抗体結合タンパク質１０とビオチン化したレールタンパク質結合タンパク質４０とを混合する工程と、（ｄ）（ｃ）工程で得られたビオチン化した抗体結合タンパク質１０とビオチン化したレールタンパク質結合タンパク質４０との混合液に、ビオチン結合タンパク質２０を添加して混和する工程と、（ｅ）さらにビオチン３０を添加して混和する工程と、を含むことができる。この製造方法によれば、従来の製造方法と比較して、効率よく合成ができ、収率の高い、抗体Ａｂ１とレールタンパク質ＲＰとを結合する組成物１を得ることができる。
【００２３】
（ａ）抗体結合タンパク質１０をビオチン化する工程は、既知の手法の利用や市販のタンパク質ビオチン化キットを用いることができ、また、市販のビオチン化された抗体結合タンパク質１０を使用してもよい。例えば、抗体結合タンパク質１０がプロテインＡの場合、以下の方法によって、ビオチン化を行うことができる。まず、プロテインＡをｐＨ＝７．４の緩衝液に１．０ｍｇ／ｍＬ以上１０．０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度にて溶解する。プロテインＡが溶解されていた溶液が以降の反応に適していない場合には、透析等による溶液置換を行う。次に、プロテインＡ  １．０モル当たり、ビオチン（またはビオチン水溶液）を２倍モル量添加し、４℃、１時間反応させる。そして、Ｌ−システインをプロテインＡと当モル量添加し、反応を停止させ、ビオチン化プロテインＡを回収する。
【００２４】
同様に、（ｂ）レールタンパク質結合タンパク質４０をビオチン化する工程は、既知の手法の利用や市販のタンパク質ビオチン化キットあるいは市販のビオチン化されたレールタンパク質結合タンパク質４０を使用してもよい。
【００２５】
（ｃ）ビオチン化した抗体結合タンパク質１０とビオチン化したレールタンパク質結合タンパク質４０とを混合する工程は、両タンパク質の変性を防止する点から、氷上で行うことが好ましい。また、両タンパク質の結合の効率化の点から、ビオチン化した抗体結合タンパク質１０とビオチン化したレールタンパク質結合物質４０との比率（モル比率）は、１：０．８以上１：３．０以下とすることが好ましい。
【００２６】
（ｄ）（ｃ）工程で得られたビオチン化した抗体結合タンパク質１０とビオチン化したレールタンパク質結合タンパク質４０との混合液に、ビオチン結合タンパク質２０を添加して混和する工程においては、ビオチン化した抗体結合タンパク質１０とビオチン結合タンパク質２０のモル比率は、例えば、ビオチン化ファロイジンとストレプトアビジンの場合、１：０．９以上１：１．５以下とすることが好ましい。
【００２７】
（ｅ）さらにビオチン３０を添加して混和する工程においては、ビオチン結合タンパク質と工程（ｄ）で得られた混和物との比率（モル比率）は、例えば、ビオチン化ファロイジンとビオチンの場合、１：０．２以上１：１以下とすることが好ましい。
【００２８】
本発明の組成物１を分子輸送ユニットとして使用する際は、作製した組成物１に対して、（ｆ）組成物１とレールタンパク質ＲＰとを結合する工程と、（ｇ）抗体Ａｂ１とビオチン化した抗体結合タンパク質１０を結合する工程と、を含むことにより、分子輸送ユニットを製造することができる。（ｆ）組成物１とレールタンパク質ＲＰとを結合する工程は、既知の手法の利用や市販のキットを用いることができる。そして、組成物１とレールタンパク質ＲＰとの比率（モル比率）を１：１００００以上１：１００以下とすることにより、効率よく結合することができる。また、（ｇ）抗体Ａｂ１とビオチン化した抗体結合タンパク質１０を結合する工程も、既知の手法や市販のキットを利用して行うことができる。（ｆ）組成物１とレールタンパク質ＲＰとを結合する工程と（ｇ）抗体Ａｂ１とビオチン化した抗体結合タンパク質１０を結合する工程は、どちらを先に行ってもよい。
【００２９】
（モーター蛋白デバイス）
本発明のモーター蛋白デバイスは、抗原抗体反応を利用して担体分子が目的分子を捕集する捕集領域と、化学平衡を利用して上記担体分子から上記目的分子を荷降ろしする荷降ろし領域とを含み、上記担体分子として組成物１を使用するものである。図２は、本発明の一実施形態に係るモーター蛋白デバイスの基本構成を例示する図である。モーター蛋白デバイス１００は、捕集領域１１０、荷降ろし領域１２０を含む。これらの領域は、例えば、タンパク質を固定化可能な基板上に設けられ、緩衝溶液等で満たされる。また、当該緩衝溶液は、必要に応じ、モータータンパク質を活性化するためのＡＴＰ（アデノシン３リン酸）やＣａｇｅｄ−ＡＴＰ等の誘導体を含有することができる。
【００３０】
捕集領域１１０は、抗原抗体反応を利用して担体分子１５０が目的分子１６０を捕集する領域である。担体分子１５０とは、いわゆる分子輸送ユニットであり、担体分子１５０には、所定抗原との結合が可能な上記組成物１を使用することができる。一例として、担体分子１５０は、組成物１により所定抗体Ａｂ１を修飾したレールタンパク質ＲＰのアクチンを含み、捕集領域１１０及び荷降ろし領域１２０は、固定化されたモータータンパク質ＭＰのミオシンを含むことができる。
【００３１】
目的分子１６０は、抗原抗体反応を利用した濃縮・検出において、濃縮・検出の目的となる分子のことをいう。目的分子１６０は、担体分子１５０に捕集されるものであれば、特に限定されない。目的分子１６０は、目的分子１６０を化学修飾した誘導体や、所定抗体との結合が可能な抗原部位を修飾したものを含むことができ。例えば、タンパク質、ペプチド、糖類、脂質類及び核酸を挙げることができる。さらに、抗原、免疫グロブリン、腫瘍マーカー、リガンド、ウイルス、細菌等を含むことができる。
【００３２】
荷降ろし領域１２０は、化学平衡を利用して担体分子１５０から目的分子１６０を荷降ろしする領域である。荷降ろし領域１２０は、単位表面積において担体分子１５０に修飾された所定抗体よりも高い補足力または高濃度の、目的分子１６０又は所定抗原との結合能を有する物質を含むことができる。一例として、荷降ろし領域１２０は、目的分子１６０と結合可能な抗体Ａｂ２を含み、この抗体Ａｂ２が担体分子１５０よりも高い補足力を有すること、または高濃度であることにより、化学平衡を利用して、目的分子１６０を担体分子１５０から荷降ろしさせることができる。
【００３３】
さらに、モーター蛋白デバイス１００は、荷降ろし領域１２０における目的分子１６０の濃度変化を検出する分析部１４０と接続し、目的分子１６０が荷降ろし領域１２０に荷降ろしされたことを検出することができる。分析部１４０は、例えば、電気的検出手段の一部としての電極１４１、１４２を備え、これらの電極１４１、１４２を介して荷降ろし領域１２０のインピーダンスまたは当該インピーダンスの変化を検出することができる。すなわち、モーター蛋白デバイス１００において、荷降ろし領域１２０のインピーダンスまたは当該インピーダンスの変化として、荷降ろし領域１２０における目的分子１６０の濃度変化を検出することができる。一例として、上記所定抗体Ａｂ２は、少なくとも１つの免疫グロブリンとの結合能を有することができる。
【００３４】
これらのように構成することにより、モーター蛋白デバイス１００の担体分子１５０は、捕集領域１１０において、抗原抗体反応を利用して、目的分子１６０としての免疫グロブリンを捕集した後、荷降ろし領域１２０まで移動できる。荷降ろし領域１２０においては、単位表面積において担体分子１５０に修飾された抗体よりも高い補足力または高濃度の抗体が含まれているため、目的分子１６０としての免疫グロブリンは、化学平衡により、荷降ろし領域１２０にある抗体Ａｂ２に結合する。すなわち、担体分子１５０は、目的分子１６０を荷降ろし領域１２０に荷降ろしすることができる。時間の経過により、担体分子１５０が次々に荷降ろし領域１２０において免疫グロブリンを荷降ろし続けることにより、荷降ろし領域１２０には免疫グロブリンが濃縮される。この免疫グロブリンの濃縮は、分析部１４０により、荷降ろし領域１２０のインピーダンスの変化として検出することができる。
【００３５】
また、本発明のモーター蛋白デバイス１００は、がんセンサアレーとして使用することができる。図３は、本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイス１００を備えるがんセンサアレーの例を示す図である。該がんセンサアレーでは、目的分子１５０は腫瘍マーカーである。図３（ａ）は、がんセンサアレーとなるＳｉ半導体基板の構造を説明する図であり、図３（ｂ）は、モーター蛋白デバイスを備えるがんセンサアレーを例示する図であり、図３（ｃ）は、モーター蛋白デバイスを備えるがんセンサアレーを例示する断面図である。
【００３６】
がんセンサアレーの荷積み領域１９０に、目的分子１６０が含まれると思われる検体をのせると、担体分子１５０のアクチンは、捕集した腫瘍マーカーを搬送し、荷降ろし領域１２０において腫瘍マーカーを荷降ろしする。荷降ろし領域１２０には、腫瘍マーカーが時間の経過とともに次々に荷降ろしされ、濃縮される。一方、参照領域１２５には腫瘍マーカーが濃縮されないため、荷降ろし領域１２０における目的分子１６０の濃度上昇は、分析部１４０に含まれる分析回路１４５が測定する荷降ろし領域１２０のインピーダンスの変化として、あるいは分析回路１４７による荷降ろし領域１２０と参照領域１２５とのインピーダンスの差分の変化として、検出することができる。
【００３７】
そして、図３（ｂ）に例示するように、該がんセンサアレーは、モーター蛋白デバイス１００を複数積載した構造をとることができ、複数の腫瘍マーカーを同時にかつ高感度に検出することが可能となる。
【００３８】
がんセンサアレーの作製方法としては、例えば、以下の方法があげられる。図３（ａ）に例示する、トラック状の流路を有する表面構造をもつＳｉ半導体基板を、標準ＣＭＯＳプロセスにより製作し、荷降ろし領域１２０と参照領域１２５の流路には、メタル配線層を利用した対向電極及び電極パッド１９１を形成する。さらに、トラック状流路以外のエリアにはリフトオフ用のレジストをコートする。
【００３９】
得られたＳｉ半導体基板を、イソプロピルアルコールで１時間超音波洗浄し、無塵中で、６０℃２時間加熱し、乾燥させ、表面コート剤をＳｉ半導体基板にスピンコーターでコーティングする。これを無塵中で、加熱して乾燥させ、Ｓｉ半導体基板の表面の疎水化処理を行った。さらに、７０℃のＮＭＰ（Ｎ‐メチルピロリドン）溶液中でリフトオフ処理を行い、レジストを除去し、トラック内だけを疎水性になるようにする。
【００４０】
そして、図３（ｃ）に示すように、半導体プラスチックパッケージ２２０内に、チップ全体を覆う粘着層付きアルミラミネートカバーフィルム２００を所定の大きさにカットし、チップ表面に張った。
【００４１】
モータータンパク質ＭＰとして、骨格筋ミオシンを、ｐＨ緩衝液で希釈して得たｐＨ＝８．０のモーター蛋白溶液に、カバー蛋白質２０μｇ／ｍＬを加えた溶液を作製し、スポッティングディスペンサーでＳｉ半導体基板２１０のトラック全面に印刷し、目的分子１５０として、腫瘍マーカーを選択し、荷降ろし領域１２０にスポッティングディスペンサーで印刷した。
【００４２】
Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を用い、１．０ｍｇ／ｍＬの腫瘍マーカーの抗体を、５０ｍＭ  リン酸緩衝液にて調整し、これに本発明の組成物１を加え、輸送ユニット蛋白を調整した。
【００４３】
（担体分子１５０の作成とＳｉ半導体基板への注入）
輸送ユニット蛋白と、骨格筋アクチン繊維を溶媒（５０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）、２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭクレアチンリン酸、１００Ｕ／ｍＬクレアチンキナーゼ）中にて混合し、担体分子１５０となるナノ輸送繊維を得る。これを、Ｓｉ半導体基板２１０上に１５μＬ滴下し、さらに、２．０μＬを滴下し、表面の溶液２．０μＬを吸引洗浄する。Ｓｉ半導体基板２１０上に、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）イオン交換膜を装着、周囲の水分を吸引する。表面処理を行ったカバーガラスを装着し、親水性接着剤を用い、加圧して接着する。
【００４４】
このがんセンサアレーに、腫瘍マーカーを含む人工血清を滴下して、センサユニットの半導体回路２３０を使い、インピーダンス計測を可能にする。
【００４５】
検体の一例として、血液、血清、血漿、尿、汗、疾、前立腺液、胃液、腸液、腎液、肺液、脳脊髄液、髄液、精子等あるいは脳、食道、胃、肺、小腸、大腸、すい臓、肝臓、腎臓、膀胱、脾臓、甲状腺、睾丸、子宮、骨等の組織から調製された試料を含むことができる。また、腫瘍マーカーの一例として、ＡＦＰ、ＢＣＡ２２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡ１２５、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ、ＤＵＰＡＮ−２、ＮＭＰ２２、ＮＳＥ、ＰＡ（ＰＳＡ）、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ＰｒｏＧＲＰ、ＳＣＣ、ＳＬＸ、ＴＰＡ、γ一Ｓｍ、抗ｐ５３抗体、エラスターゼ１等を含むことができる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明について、実施例をあげて具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００４７】
（組成物の作製）
まず、本発明の組成物１を製造した。プロテインＡをｐＨ＝７．４の緩衝液に１．０ｍｇ／ｍＬ以上１０．０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度にて溶解する。プロテインＡが溶解されていた溶液が以降の反応に適していない場合には、透析等による溶液置換を行った。次に、プロテインＡ  １．０モル当たり、ビオチンを２倍モル量添加し、４℃、１時間反応させた後、Ｌ−システインをプロテインＡと当モル量添加し、反応を停止させ、ビオチン化プロテインＡを回収した。
【００４８】
次に、市販のビオチン化ファロイジンを用意し、ビオチン化プロテインＡと、ビオチン化ファロイジンとを、１：０．８以上１：３．０以下のモル比率で氷上にて混合した。
【００４９】
先の工程で得られたビオチン化プロテインＡと、ビオチン化ファロイジンとの混合液にストレプトアビジンを混和する際、ビオチン化ファロイジンとストレプトアビジンとを、１：０．９以上１：１．５以下のモル比率となるように添加して、混和した。
【００５０】
さらに、先の工程で得られたビオチン化プロテインＡ、ビオチン化ファロイジン及びストレプトアビジンの混合液にビオチンを混和する際、ビオチン化ファロイジンとビオチンとを、１：０．２以上１：１以下のモル比率となるように添加して、混和し、組成物を得た。
【００５１】
（モーター蛋白デバイス１００とインピーダンスの測定）
抗原抗体反応を利用して担体分子が目的分子を捕集する捕集領域と、化学平衡を利用して前記担体分子から前記目的分子を荷降ろしする荷降ろし領域と、を含むモーター蛋白デバイス１００の担体分子として、作製した組成物１を使用し、アジレント・テクノロジー社のプレシジョン  インピーダンスアナライザ４２９４Ａにインピーダンス・プローブ・キット４２９４１Ａを組み付けたものを用いて、インピーダンスの測定を試みた。該プローブをパッケージングされたモーター蛋白デバイス１００のＰＩＮと接続し、インピーダンス変化を測定・評価した。代表的なタンパク質であるＢＳＡウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）をモーター蛋白デバイス１００上で輸送濃縮した結果、ＢＳＡの濃度に対するインピーダンス（３．１６ＭＨｚ）の変化を図４に示す。図４に示す通り、組成物１を用いたモーター蛋白デバイス１００は、ＢＳＡの濃度変化をインピーダンスとして出力・測定できた。
【００５２】
（がんセンサアレー）
本組成物１を用いて、がんセンサアレーを作製し、そのインピーダンスを計測した。まず、図３（ａ）に例示する、トラック状の流路を有する表面構造をもつＳｉ半導体基板を、標準ＣＭＯＳプロセスにより製作した。ここで、荷降ろし領域１２０と参照領域１２５の流路幅は１．２μｍ、荷積み領域９０の円弧の流路幅は１０μｍとした。荷降ろし領域１２０と参照領域１２５の流路には、メタル配線層を利用した対向電極及び電極パッド１９１を形成した。さらに、トラック状流路以外のエリアにはリフトオフ用のレジストをコートした。
【００５３】
（Ｓｉ半導体基板の表面処理）
得られたＳｉ半導体基板を、イソプロピルアルコールで1時間超音波洗浄し、無塵中で、６０℃２時間加熱し、乾燥させた。さらに、表面コート剤（信越化学工業製、ＫＪＣ７０２２）を０．００１ｍｇ／ｍＬに調整し、Ｓｉ半導体基板にスピンコーターでコーティングした。これを無塵中で、６０℃５時間加熱して乾燥させ、Ｓｉ半導体基板の表面の疎水化処理を行った。さらに、７０℃のＮＭＰ（Ｎ‐メチルピロリドン）溶液中でリフトオフ処理を行い、レジストを除去し、トラック内だけを疎水性になるようにした。
【００５４】
（カバーフィルム）
チップ全体を覆う粘着層付きアルミラミネートカバーフィルム所定の大きさにカット、チップ表面に張った。
【００５５】
（モーター蛋白の印刷）
２６μｇ／ｍＬの骨格筋ミオシンを、２５ｍＭ  ＫＣｌ、３．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５．０ｍＭ  ｐＨ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）で希釈して得たｐＨ＝８．０のモーター蛋白溶液に、カバー蛋白質２０μｇ／ｍＬを加えた溶液を１０作製し、スポッティングディスペンサーでＳｉ半導体基板のトラック全面に印刷した。
【００５６】
（荷降ろし領域１２０への抗体１８０の印刷）
初期肺がんの腫瘍マーカーである、抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体（１．０ｍｇ／ｍＬ）を抗体として選択し、荷降ろし領域１２０にスポッティングディスペンサーで印刷した。
【００５７】
（輸送ユニット蛋白の調整）
Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を用い、１．０ｍｇ／ｍＬの抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体０．１ｍＬを、５０ｍＭリン酸緩衝液にて調整した。これに本発明の組成物１を加え、輸送ユニット蛋白を調整した。
【００５８】
（担体分子の作成とＳｉ半導体基板への注入）
輸送ユニット蛋白と、骨格筋アクチン繊維を１:１００００の割合で、溶媒（５０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）、２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭクレアチンリン酸、１００Ｕ／ｍＬクレアチンキナーゼ）中にて混合し、担体分子５０となるナノ輸送繊維を得た。これを、Ｓｉ半導体基板上に１５μＬ滴下した。さらに、２．０μＬを滴下し、表面の溶液２．０μＬを吸引洗浄した。Ｓｉ半導体基板上に、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）イオン交換膜を装着、周囲の水分を吸引した。表面処理を行ったカバーガラスを装着し、親水性接着剤を用い、加圧して接着した。
【００５９】
１１がんセンサアレーに、腫瘍マーカーＣＥＡを０．１０ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬ含む人工血清を２．０μＬ滴下した。センサユニットの半導体回路を使い、インピーダンス計測を行った。測定は並列四端子法で行われ、流路の下に設けられた分析回路１４７で、荷降ろし領域１２０と参照領域１２５のインピーダンス変化を差動検出し、その出力値を電圧に変換した。また比較例として、化学発光免疫測定法を使い腫瘍マーカーＣＥＡを検出した。両者の結果を表１に示す。この結果から、本発明による初期ガン検出能力は従来法と同等であり、電気的に測定できるため、安価で高速に行えることが判明した。
【００６０】
【表１】
0006422075.tif 000002
【００６１】
以上、実施形態を用いて本発明を説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施形態に記載の範囲には限定されないことは言うまでもない。上記実施形態に、多様な変更または改良を加えることが可能であることが当業者に明らかである。またその様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、特許請求の範囲の記載から明らかである。
【符号の説明】
【００６２】
１      組成物
１０    抗体結合タンパク質
２０    ビオチン結合タンパク質
３０，３０ａ，３０ｂ，３０ｃ，３０ｄ    ビオチン
４０    レールタンパク質結合タンパク質
１００    モーター蛋白デバイス
１１０    捕集領域
１２０    荷降ろし領域
１４０    分析部
１５０    担体分子
１６０    目的分子
Ａｂ１，Ａｂ２    抗体
ＭＰ      モータータンパク質
ＲＰ      レールタンパク質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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