(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式１の化合物であって、
【化１】
0006422452.tif 000016
化学式１
Ｒ１およびＲ３は各々、非置換または置換された（Ｃ１−Ｃ３）アルキルで、且つ、Ｒ２およびＲ４はＨである化合物。
【請求項２】
前記化合物が単離精製された（（Ｒ）‐４‐（２‐ヒドロキシ‐５‐メチルフェニル）‐５‐メチルヘキサン酸）である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物が（（Ｓ）‐４‐（２‐ヒドロキシ‐５‐メチルフェニル）‐５‐メチルヘキサン酸）または（４‐（２‐ヒドロキシ‐５‐メチルフェニル）‐５‐メチルヘキサン酸）である請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１に記載の前記化合物を有する組成物および薬学的に許容される塩または担体。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物を含む、神経障害を防ぐための薬。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物を含む、神経変性疾患の治療薬。
【請求項７】
前記神経変性疾患がパーキンソン病である請求項６に記載の治療薬。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物を含む、神経細胞損失の予防のための薬。
【請求項９】
ヒト患者の神経変性疾患を治療する薬剤組成物であって、
請求項１に記載の化合物およびクリシンを有し、
神経保護のために、前記化合物と前記クリシンが相乗効果を示す薬剤組成物。
【請求項１０】
（４‐（２‐ヒドロキシ‐５‐メチルフェニル）‐５‐メチルヘキサン酸）およびその立体異性体を調整する方法であって、
a)  １‐（２‐メトキシ‐５‐メチルフェニル）‐２‐メチルプロパン‐１‐ワンを得るために、４‐メチルアニソールとイソブチリルクロリドを反応させる工程、
b)  エチル‐(２Ｅ）‐３‐(２‐メチルオキシ‐５‐メチルフェニル）‐４‐メチルペンテ‐２‐エノアートを得るために、前記１‐（２‐メトキシ‐５‐メチルフェニル）‐２‐メチルプロパン‐１‐ワンとホスホノ酢酸トリエチルを反応させる工程、
c)  エチル‐３‐(２‐メチルオキシ‐５‐メチルフェニル）‐４‐ペンテン酸メチルを得るために、エチル‐(２Ｅ）‐３‐(２‐メチルオキシ‐５‐メチルフェニル）‐４‐メチルペンテ‐２‐エノアートとＰｄ／Ｃをエタノール中、Ｈ２雰囲気下で反応させる工程、
d)  ３‐(２‐メチルオキシ‐５‐メチルフェニル）‐４‐メチルペンタン‐１‐オールを得るために、前記エチル‐３‐(２‐メチルオキシ‐５‐メチルフェニル）‐４‐ペンテン酸メチルおよびＬＡＨをＴＨＦ中で反応させる工程、
e)  ３‐(２‐メチルオキシ‐５‐メチルフェニル）‐４‐メチルペンチルメチルスルホン酸を得るために、前記３‐(２‐メチルオキシ‐５‐メチルフェニル）‐４‐メチルペンタン‐１‐オールおよびＭｓＣｌを反応させる工程、
f)  ４‐(２‐メチルオキシ‐５‐メチルフェニル) ‐４‐メチルヘキサンニトリルを得るために、前記３‐(２‐メチルオキシ‐５‐メチルフェニル）‐４‐メチルペンチル‐メチルスルホン酸およびＮａＣＮをＤＭＦ中で反応させる工程、
g)  ４‐(２‐メチルオキシ‐５‐メチルフェニル) ‐５‐メチルヘキサンアミドを得るために、前記４‐(２‐メチルオキシ‐５‐メチルフェニル) ‐５‐メチルヘキサンニトリルの懸濁液およびＫ２ＣＯ３とＨ２Ｏ２とをＤＭＳＯ中で反応させる工程、
h)  ４‐(２‐メチルオキシ‐５‐メチルフェニル) ‐５‐メチルヘキサン酸を得るために、前記４‐(２‐メチルオキシ‐５‐メチルフェニル) ‐５‐メチルヘキサンアミドおよびＮａＯＨを反応させる工程、
i)  ４‐(２‐ヒドロキシ‐５‐メチルフェニル) ‐５‐メチルヘキサン酸を得るために、前記４‐(２‐メチルオキシ‐５‐メチルフェニル) ‐５‐メチルヘキサン酸およびＨＢｒを反応させる工程、
j)  前記立体異性体を得るために、前記４‐(２‐ヒドロキシ‐５‐メチルフェニル) ‐５‐メチルヘキサン酸をキラル前駆体−ＨＰＬＣにより分離する工程、
を有し、前記立体異性体が、（（Ｓ）‐４‐（２‐ヒドロキシ‐５‐メチルフェニル）‐５‐メチルヘキサン酸）または（（Ｒ）４‐（２‐ヒドロキシ‐５‐メチルフェニル）‐５‐メチルヘキサン酸）である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１３年３月１４日に出願した米国特許出願番号６１／７８２，８７０の優先権を主張し、本明細書全体において米国特許出願番号６１／７８２，８７０を援用する。
【０００２】
本発明は神経変性疾患の治療に用いる新規な化合物に関する。特に、本発明は、単離および合成化合物、前記化合物の単離または準備方法、前記化合物を神経変性疾患の治療に用いる使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
神経変性疾患は、人間の脳内の神経細胞に主に作用する状態に関する。パーキンソン病（ＰＤ）は、神経変性疾患の中で２番目に多く生理学的な徴候を伴い、振戦、動作緩慢、異常姿勢反射、固縮および無動を含む。ＰＤは主に黒質のドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンの死に起因する。ＰＤの現行療法は主に、神経伝達物質を交換または神経伝達物質の代謝を制御し、異常から回復させることにより、症状改善を促す。これらの療法は、基礎疾患過程を改変するものではないので、通常は、疾患の悪化に少しあるいは全く影響が無い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、神経変性疾患を治療するための新規な化合物、前記化合物の準備方法、前記化合物の組成物およびその使用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一態様は、化学式１の化合物を有する。
【化１】
0006422452.tif 000002
化学式１
Ｒ１およびＲ３は各々、Ｈ、非置換または置換アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリル、ヘテロアリル、カルボキシ、アルキルオキシ、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、アルキルチオ、アシル、シアノ、アシルアミノ、ハロおよびエステルからなる群から選択する。またＲ２およびＲ４は各々、Ｈ、非置換または置換アルキル、シクロアルキル、アリル、ヘテロアリル、アルキルオキシ、アシル、アシルアミノおよびハロからなる群から選択する。
【０００６】
１つの典型体な実施形態において化学式１の化合物のＲ１およびＲ３は、各々、非置換または置換された（Ｃ１−Ｃ３）アルキルで、Ｒ２およびＲ４はＨである。
【０００７】
他の典型体な実施形態において、化学式１の化合物は単離精製された（（Ｒ）-４-（２−ヒドロキシ‐５-メチルフェニル）−５−メチルヘキサン酸）（(R)-4-(2-hydroxy-5-methylphenyl)-5-methylhexanoic acid）である。前記化合物（（Ｒ）-４-（２−ヒドロキシ‐５-メチルフェニル）−５−メチルヘキサン酸）は、下記式に代表される（化合物１）。
【化２】
0006422452.tif 000003
化合物１
【０００８】
他の典型体な実施形態において、化学式１の化合物は（（Ｓ）-４-（２−ヒドロキシ‐５-メチルフェニル）−５−メチルヘキサン酸）((S)-4-(2-hydroxy-5-methylphenyl)-5-methylhexanoic acid)または（４-（２−ヒドロキシ‐５-メチルフェニル）−５−メチルヘキサン酸）(4-(2-hydroxy-5-methylphenyl)-5-methylhexanoic acid)である。前記化合物（（Ｓ）-４-（２−ヒドロキシ‐５-メチルフェニル）−５−メチルヘキサン酸）（化合物４）および（４-（２−ヒドロキシ‐５-メチルフェニル）−５−メチルヘキサン酸）（化合物５）は各々、下記式に代表される。
【化３】
0006422452.tif 000004
化合物４
【化４】
0006422452.tif 000005
化合物５
【０００９】
他の態様において、本願は、化学式１の化合物を有する組成物および薬学的に許容される塩または担体を提供する。
【００１０】
他の態様において、本願は、化学式１の化合物を神経障害の予防に使用する。
【００１１】
他の態様において、本願は、化学式１の化合物を神経変性疾患の治療に使用する。
【００１２】
１つの典型体な実施形態において、前記神経変性疾患はパーキンソン病である。
【００１３】
他の態様において、本願は、化学式１の化合物を必要な場所に届ける工程を有する、パーキンソン病の治療方法または神経障害もしくは神経細胞損失の予防方法を提供する。
【００１４】
他の態様において、本願は、治療的有効量の化学式１の化合物およびクリシンを患者に投与する工程を有する、ヒト患者の神経変性疾患を治療する方法であって、神経保護のために、前記化合物とクリシンが相乗効果をもたらす方法を提供する。
【００１５】
他の態様において、本願は化学式２の化合物を提供する。
【化５】
0006422452.tif 000006
化学式２
【００１６】
Ｒ１およびＲ３は各々、Ｈ、非置換または置換アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリル、ヘテロアリル、カルボキシ、アルキルオキシ、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、アルキルチオ、アシル、シアノ、アシルアミノ、ハロおよびエステルからなる群から選択する。またＲ２およびＲ４は各々、Ｈ、非置換または置換アルキル、シクロアルキル、アリル、ヘテロアリル、アルキルオキシ、アシル、アシルアミノおよびハロからなる群から選択する。
【００１７】
１つの典型体な実施形態において化学式２の化合物のＲ１およびＲ３は、各々、非置換または置換された（Ｃ１−Ｃ３）アルキルで、Ｒ２およびＲ４はＨである。
【００１８】
他の典型体な実施形態において、化学式２の化合物は単離精製された（（４Ｓ）-４-（３−ヒドロキシ‐３-メチル‐６-オキソシクロヘックス‐１−エニル）−５−メチルヘキサン酸）((4S)-4-(3-hydroxy-3-methyl-6-oxocyclohex-l-enyl)-5-methylhexanoic acid)または（（４Ｒ）-４-（３−ヒドロキシ‐３-メチル‐６-オキソシクロヘックス‐１−エニル）−５−メチルヘキサン酸）((4R)-4-(3-hydroxy-3-methyl-6-oxocyclohex-l-enyl)-5-methylhexanoic acid)である。前記化合物（（４Ｓ）-４-（３−ヒドロキシ‐３-メチル‐６-オキソシクロヘックス‐１−エニル）−５−メチルヘキサン酸）（化合物２）および（（４Ｒ）-４-（３−ヒドロキシ‐３-メチル‐６-オキソシクロヘックス‐１−エニル）−５−メチルヘキサン酸）（化合物３）は、各々、下記式に代表される。
【化６】
0006422452.tif 000007
化合物２
【化７】
0006422452.tif 000008
化合物３
【００１９】
他の態様において、本願は、化学式２の化合物を有する組成物および薬学的に許容される塩または担体を提供する。
【００２０】
他の態様において、本願は、化学式２の化合物を神経障害の予防に使用する。
【００２１】
他の態様において、本願は、化学式２の化合物の神経変性疾患の治療に使用する。
【００２２】
１つの典型体な実施形態において、前記神経変性疾患はパーキンソン病である。
【００２３】
他の態様において、本願は、化学式２の化合物を必要な場所に届ける工程を有する、パーキンソン病の治療方法または神経障害または神経細胞損失を防ぐ方法を提供する。
【００２４】
他の態様において、本願は、ヤクチ(益智(A. oxyphyllae fructus))から単離精製される化合物の調整方法であって、以下の工程を有する方法を提供する。
【００２５】
(a)ヤクチのサンプルを水性アルコール溶液により低圧、熱還流の下、抽出し、溶媒を除去して粗抽出液を得る工程。
【００２６】
(b)前記(a)の粗抽出液をエタノールにより再構成し、エタノール抽出液を得る工程。
【００２７】
(c)前記エタノール抽出液をシリカゲルに取り入れ、エタノールを除去してシリカゲル抽出物を得る工程。
【００２８】
(d)前記シリカゲル抽出物を順に、有機溶媒により低圧、熱還流の下、抽出し、生体活性切片を得る工程。
【００２９】
(e)前記生体活性切片を分別し、極性が高くなる溶媒混合液により溶出し、第１生体活性画分（a first bioactive fraction）を得る工程。
【００３０】
(f) 前記(e)の第１生体活性画分を精製し、化合物を得る工程。
【００３１】
前記化合物は、（（Ｒ）−４−（２−ヒドロキシ‐５-メチルフェニル）−５−メチルヘキサン酸）、（（４Ｓ）−４−（３−ヒドロキシ‐３-メチル‐６-オキソシクロヘックス‐１−エニル）−５−メチルヘキサン酸）および（（４Ｒ）-４-（３−ヒドロキシ‐３-メチル‐６-オキソシクロヘックス‐１−エニル）−５−メチルヘキサン酸）からなる群から選択される。
【００３２】
１つの典型体な実施形態において、前記（f）はさらに以下の工程を含む。
【００３３】
(g)前記(e)の第１生体活性画分を分画し、極性が高くなる溶媒混合液により溶出し、第２生体活性画分（a second bioactive fraction）を得る工程。
【００３４】
(h)前記第２生体活性画分をイソクラティック溶出により精製し、（（Ｒ）−４−（２−ヒドロキシ‐５-メチルフェニル）−５−メチルヘキサン酸）を得る工程。
【００３５】
１つの典型体な実施形態において前記工程（f）は更に、イソクラティック溶出で、分取高速液体クロマトグラフィーにより工程（e）の第１生体活性画分を精製し、化合物（（４Ｓ）-４-（３−ヒドロキシ‐３-メチル‐６-オキソシクロヘックス‐１−エニル）−５−メチルヘキサン酸）および（（４Ｒ）-４-（３−ヒドロキシ‐３-メチル‐６-オキソシクロヘックス‐１−エニル）−５−メチルヘキサン酸）を得る。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、化合物１〜５の神経保護効果を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、化合物１の保護効果を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、化合物１の保護効果を示す。
【図３】図３は、化合物１の保護効果を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、化合物１の効果を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、化合物１の効果を示す。
【図５】図５は、化合物１およびクリシンの相乗神経保護効果を示す。
【図６】図６は、薬物療法および行動試験のワークフローを示す。
【図７Ａ】図７Ａは、化合物１がＭＰＴＰ投与マウスの運動障害を改善する様子をポールテストにより示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、化合物１がＭＰＴＰ投与マウスの運動障害を改善する様子をフットプリント耐久テストにより示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、化合物１がＭＰＴＰ投与マウスの運動障害を改善する様子をロータロッドテストにより示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、化合物１がＭＰＴＰ投与マウスの運動障害を改善する様子を歩幅テストにより示す。
【図８Ａ】図８Ａは、化合物１の保護効果をＴＨ免疫染色により示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、化合物１の保護効果をＴＨ陽性細胞の標準誤差により示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、化合物１の保護効果を統計的分析により示す。
【００３７】
図１は、MPP+ 誘発性初代小脳顆粒神経細胞（primary CGNｓ）損傷への、化合物１〜５の神経保護効果を示す。「＊」はＭＰＰ+療法のみの群と比較してｐ＜0.05。  
図２Ａおよび図２Ｂは、６−ＯＨＤＡ誘発性ＰＣ１２細胞損傷への、化合物１の効果を示す。「＃＃」はコントロール群と比較してｐ＜0.0１。「＊＊」はビヒクル群と比較してｐ＜0.0１。
【００３８】
図３Ａ〜図３Ｇは、化合物１が、ＭＰＴＰ誘発性ドーパミン作動性神経細胞損失からゼブラフィッシュを保護する効果を示す。「＃＃」はコントロール群と比較してｐ＜0.0１。「＊」はビヒクル群と比較してｐ＜0.0５。「＊＊」はビヒクル群と比較してｐ＜0.0１。
【００３９】
図４Ａおよび図４Ｂはゼブラフィッシュにおいて、化合物１が、MPTPに誘発される全移動距離の減少を食い止めることを示している。「＃＃」はコントロール群と比較してｐ＜0.0１（ＭＰＴＰ治療無）。「＊」はＭＰＴＰ治療群と比較してｐ＜0.0５。
【００４０】
図５は、MPP+ 誘発性初代小脳顆粒神経細胞（primary CGNｓ）損傷への、化合物１およびクリシンの相乗神経保護効果を示す。「＊」はＭＰＰ+療法のみの群と比較してｐ＜0.05。「＃」は、３μＭクリシンおよびＭＰＰ+療法群と比較してｐ＜0.05。「＄」は６μＭクリシンおよびＭＰＰ+療法群と比較してｐ＜0.05。
【００４１】
図６は、薬物療法および行動試験のワークフローを示す。
【００４２】
図７Ａ〜図７Ｄは、化合物１がＭＰＴＰ投与マウスの運動障害を改善する様子を示す。（Ａ）ポールテスト、（Ｂ）フットプリント耐久テスト、（Ｃ）ロータロッドテスト、（Ｄ）フットプリントの歩幅テスト結果は３回繰り返しテストの標準誤差（mean±S.E.M.(n=8)）とする。コントロール（Ctrl）群と比較して「＃」はｐ＜0.05、「＃＃＃」はｐ＜0.001。ビヒクル（Veh）療法群と比較して「＊」はｐ＜0.05、「＊＊」はｐ＜0.01、「＊＊＊」はｐ＜0.001。
【００４３】
図８Ａ〜図８Ｃは、化合物１が、ＭＰＴＰ投与マウスのＴＨ陽性ドーパミン作動性ニューロン損失を保護する様子を示す。（Ａ）吻側から尾側までの代表的な中脳部におけるＴＨ免疫染色。（Ｂ）ＴＨ陽性細胞が、８の整合隣接切片の標準誤差（mean±S.E.M.(n=8)）を計測したグラフ。（Ｃ）異なる療法群の切片の平均データの統計的分析。結果は標準誤差（mean±S.E.M.(n=8)）で示す。コントロール（Ctrl）群と比較して「＃」はｐ＜0.05。ビヒクル（Veh）療法群と比較して「＊」はｐ＜0.05。ラサ（Rasa）はラサギリン。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
特許請求の範囲を含む本明細書内で「有する」とは、次に続く要素を含むが、他を排除するものではない。
【００４５】
下記例は本願の実施例として挙げられているが、本発明の範囲を限定するものではない。相応な当業者によって理解されるであろう相応の変更は、本発明の範囲を逸脱しない範囲で行われても良い。
【実施例】
【００４６】
実施例１：化合物１〜５の物理化学的性質
１.  化合物１の物理化学的性質
【００４７】
（（Ｒ）-４-（２−ヒドロキシ‐５-メチルフェニル）−５−メチルヘキサン酸）
【００４８】
【化２】
0006422452.tif 000009
化合物１
【００４９】
物理的性質：白色粉末
【００５０】
比旋光度：[α]D26 2 = -11.3 (c 3.0, MeOH), [a]D25 0 = -19.4 (c 0.72, CH2C12)
【００５１】
UV (メタノール) λ max: 222 nm, 282 nm
【００５２】
1H NMR スペクトル(600 MHz, CDCI3, 5TMs = 0.00 ppm): δ (ppm) 2.18, 2.11 (2H, m, Η-2α, 2β), 1.80, 2.17 (2H, m, H-3a, 3β), 2.67 (1H, m, H-4), 1.85 (1H, m, H-5), 1.01 (3H, d, = 6.58 Hz, H-6), 0.74 (3H, d, = 6.65 Hz, H-7), 6.66 (1H, d, = 8.52 Hz, H-3'), 6.85 (1H, d, = 8.52 Hz, H-4'), 6.85 (1H, s, H-6'), 2.27 (3H, s, H-7')
【００５３】
13C NMR スペクトル(125 MHz, CDCl3, 5TMs = 0.00 ppm): δ (ppm) 178.2 (C-1), 31.7 (C-2), 27.6 (C-3), 44.1 (C-4), 32.7 (C-5), 20.8 (C-6), 21.1 (C-7), 130.1 (C-1'), 151.9 (C-2'), 115.4 (C-3'), 127.4 (C-4'), 129.5 (C-5'), 128.2 (C-6'), 20.6 (C-7')
【００５４】
マススペクトル (HR-ESI-MS): mlz 235.1369 [M-H]" (calcd for Ci4H1903, 235.1339)
【００５５】
２.  化合物２の物理化学的性質
【００５６】
（（４Ｓ）-４-（３−ヒドロキシ‐３-メチル‐６-オキソシクロヘックス‐１−エニル）−５−メチルヘキサン酸）
【００５７】
【化６】
0006422452.tif 000010
化合物２
【００５８】
物理的性質：黄色い油
【００５９】
比旋光度：[α]D 26 2 = -22.5 (c 3.0, MeOH)
【００６０】
UV (メタノール) λ max: 238 nm
【００６１】
1H NMR スペクトル (600 MHz, CDCI3, 5TMS = 0.00 ppm): δ (ppm) 2.18, 2.16 (2H, m, H-2), 1.97, 1.74 (2H, m, Η-3α, 3β), 2.25 (IH, m, H-4), 1.79 (IH, m, H-5), 0.76 (3H, d, / = 6.68 Hz, H-6), 0.89 (3H, d, = 6.65 Hz, H-7), 6.40 (IH, s, H-2'), 2.65, 2.64 (2H, m, H-4'a, 4'β), 2.09 (2H, m, H-5'), 1.45 (3H, s, H-7')
【００６２】
13C NMR スペクトル (125 MHz, CDCI3, 6TMs = 0.00 ppm): δ (ppm) 178.3 (C-1), 45.5 (C-2), 25.6 (C-3), 45.3 (C-4), 31.2 (C-5), 20.4 (C-6), 21.0 (C-7), 139.0 (C-1'), 150.6 (C-2'), 69.0 (C-3'), 35.4 (C-4'), 37.1 (C-5'), 198.6 (C-6'), 27.6 (C-7')
【００６３】
マススペクトル (HR-ESI-MS): mlz 253.1468 [M-H]" (calcd for C14H21O4, 253.1445)
【００６４】
３.  化合物３の物理化学的性質
【００６５】
（（４Ｒ）-４-（３−ヒドロキシ‐３-メチル‐６-オキソシクロヘックス‐１−エニル）−５−メチルヘキサン酸）
【００６６】
【化７】
0006422452.tif 000011
化合物３
【００６７】
物理的性質：黄色い油
【００６８】
比旋光度：[α]D 26 2 = -31.5 (c 3.0, MeOH)
【００６９】
UV (メタノール) λ max: 238 nm
【００７０】
1H NMR スペクトル (600 MHz, CDC13, 5TMs = 0.00 ppm): δ (ppm) 2.16 (2H, m, H-2), 1.95, 1.65 (2H, m, Η-3α, 3β), 2.53 (IH, m, H-4), 1.79 (IH, m, H-5), 0.77 (3H, d, = 6.68 Hz, H-6), 0.86 (3H, d, = 6.65 Hz, H-7), 6.44 (IH, s, H-2'), 2.66, 2.44 (2H, m, H-4'a, 4'β), 2.10 (2H, m, H-5'), 1.46 (3H, s, H-7')
【００７１】
1JC NMR スペクトル (125 MHz, CDCl3, 5TMs = 0.00 ppm): δ (ppm) 178.2 (C-1), 32.1 (C-2), 25.7 (C-3), 42.1 (C-4), 31.9 (C-5), 20.4 (C-6), 20.4 (C-7), 139.1 (C-1'), 149.6 (C-2'), 69.1 (C-3'), 37.0 (C-4'), 35.2 (C-5'), 198.7 (C-6'), 27.5 (C-7')
【００７２】
マススペクトル (HR-ESI-MS): mlz 253.1480 [M-H]" (calcd for Ci4H2i04, 253.1445)
【００７３】
４.  化合物４の物理化学的性質
【００７４】
（（Ｓ）-４-（２−ヒドロキシ‐５-メチルフェニル）−５−メチルヘキサン酸）
【００７５】
【化３】
0006422452.tif 000012
化合物４
【００７６】
物理的性質：白色粉末
【００７７】
比旋光度：[α]n = +20.0 (c, 0.72, CH2C12)
【００７８】
1H NMR スペクトル (600 MHz, CDCI3, 5TMs = 0.00 ppm): δ (ppm) 2.20, 2.13 (2H, m, Η-2α, 2β), 1.81, 2.18 (2H, m, H-3a, 3β), 2.67 (1H, m, H-4), 1.86 (1H, m, H-5), 1.02 (3H, d, = 6.5 Hz, H-6), 0.74 (3H, d, = 6.5 Hz, H-7), 6.65 (1H, d, = 8.5 Hz, H-3'), 6.84 (2H, d, = 8.5 Hz, H-4'), 6.84 (1H, s, H-6'), 2.24 (3H, s, H-7')
【００７９】
13C NMR スペクトル (125 MHz, CDCl3, 5TMs = 0.00 ppm): δ (ppm) 180.2 (C-1), 32.2 (C-2), 27.6 (C-3), 44.3 (C-4), 32.9 (C-5), 20.9 (C-6), 21.3 (C-7), 130.1 (C-1 '), 151.8 (C-2'), 115.6 (C-3'), 127.4 (C-4'), 129.4 (C-5'), 128.6 (C-6'), 20.8 (C-7')
【００８０】
マススペクトル (HR-ESI-MS): mlz 235.1358 [M-H]" (calcd for Ci4Hi903, 235.1339)
【００８１】
５.  化合物５の物理化学的性質
【００８２】
（４-（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）−５−メチルヘキサン酸）
【００８３】
【化４】
0006422452.tif 000013
化合物５
【００８４】
物理的性質：白色粉末
【００８５】
1H NMR スペクトル (600 MHz, CDCI3, 5TMs = 0.00 ppm): δ (ppm) 2.20, 2.13 (2H, m, Η-2α, 2β), 1.82, 2.18 (2H, m, H-3a, 3β), 2.66 (1H, m, H-4), 1.87 (1H, m, H-5), 1.02 (3H, d, / = 6.5 Hz, H-6), 0.74 (3H, d, / = 6.5 Hz, H-7), 6.65 (1H, d, = 8.5 Hz, H-3'), 6.85 (1H, d, = 8.5 Hz, H-4'), 6.85 (1H, s, H-6'), 2.24 (3H, s, H-7')
【００８６】
13C NMR スペクトル (125 MHz, CDCl3, 5TMs = 0.00 ppm): δ (ppm) 180.2 (C-l), 32.2 (C-2), 27.6 (C-3), 44.3 (C-4), 32.9 (C-5), 20.7 (C-6), 21.3 (C-7), 130.1 (C-l'), 151.8 (C-2'), 115.6 (C-3'), 127.4 (C-4'), 129.4 (C-5'), 128.6 (C-6'), 20.9 (C-7')
実施例２：ヤクチから化合物１を単離する方法
【００８７】
粗粉砕したのち自然乾燥したヤクチの実を９５％水性アルコール溶液により還流の下３回抽出し、抽出溶液はウォーターバス内でロータリーエバポレータによって乾燥した。ヤクチの乾燥粗抽出液はエタノールに懸濁させ、シリカゲルに吸収させた。前記エタノールを除去したのち、乾燥したシリカゲルを石油エーテル、酢酸エチル、エタノールにより順次抽出し、各々、石油エーテル部、酢酸エチル部、エタノール部を得た。バイオアッセイによると酢酸エチル部が最も生体活性が高いため、詳細解析に選択した。０％から２０％に増量するメタノールと混合するクロロホルムを用いて、順相系シリカゲルカラムクロマトグラフィにより、前記酢酸エチルはさらに分離されて、１３画分（画分Ａ〜Ｍ）を得た。バイオアッセイによると画分Ｇが最も高い生物活性を示した。フラクションＧは、０％から２％に増量するメタノールと混合するクロロホルムを溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィにより画分し、５つの主要な副画分ＧＳ１、ＧＳ２、ＧＳ３、ＧＳ４、ＧＳ５を得た。副画分ＧＳ２は、セファデックスＬＨ−２０により更に画分した。化合物１は１００％メタノールを用いた溶出により得た。化合物１の純度は、指示薬としてヨー素を用いて、薄層クロマトグラフィーでモニターした。
実施例３：ヤクチから化合物２および３を単離する方法
【００８８】
実施例２に示すように、最も高い生物活性を示す画分Ｇは分取高速液体クロマトグラフィーにより画分し、化合物２及び３は２５％アセトニトリルへの溶出により得た。化合物２および３の純度は２５４ｎｍの紫外線によりモニターした。
【００８９】
本願は、ヤクチの質をコントロールする基準化学マーカとして化合物１、２および３を使用する証拠を提供する。
実施例４：化合物１、４、５の合成方法
【００９０】
化合物１、そのキラル異性体である化合物４、ラセミ体化合物５は以下のスキーム（１）により合成する。
0006422452.tif 000014
【式１】
【００９１】
0006422452.tif 000015
スキーム（１）
１）１-（２-メトキシ‐５-メチルフェニル）-２-メチルプロパン-１-ワン（l-(2-methoxy-5-methylphenyl)-2-methypropan-l-one）（ｂ）の合成
【００９２】
化合物a：４−メチルアニソール（76.4g、625mmol、1.0eq）をDCM (1000 mL) 内のA1C13 (100 g, 750 mmol, 1.2 eq)溶液に0 °Cで滴下し、イソブチリルクロリド（isobutyryl chloride） (80.0 g, 750 mmol, 1.2 eq) を、温度を５℃未満に保ちながら、前記溶液に滴下した。混合溶液は一晩常温で撹拌した。その後前記混合溶液をクラッシュアイス（２．０ｋｇ）に注いだ。有機層はH20および飽和NaCl水溶液で洗浄し、Na2S04により乾燥し、ろ過し、最後に乾燥して、茶色の油分である化合物ｂ(110 g, 92%)を得た。
【００９３】
1H NMR (400 MHz, CDC13): δ 1.14 (d, = 6.8 Hz, 6H), 2.05 (s, 3H), 3.44-3.51 (m, 1H), 3.85 (s, 3H), 6.85 (d, = 8.4 Hz, 1H), 7.22 (d, = 8.4 Hz, 1H), 7.31 (s, 1H).
【００９４】
２）エチル-(２Ｅ）−３-(２-メチルオキシ-５-メチルフェニル）-４-メチルペンテ２-エノアート（ethyl-(2E)-3-(2-methyloxy-5-methylphenyl)-4-methypent-2-enoate）（ｃ）の合成
【００９５】
ホスホノ酢酸トリエチル（triethylphosphonoacetate）（192 g, 858 mmol, 1.5 eq)をTHF (1000 mL)中のＮａＨ懸濁液(34.3 g, 858 mmol, 1.5 eq, 60% in鉱油)  に、４０分間１０°C未満を保ちながら滴下した。その後３０分、０°Cで前記溶液を撹拌した。２０分間１０°C未満を保ちながら化合物ｂ(110 g, 572 mmol, 1.0 eq)  を１滴毎に滴下した。１晩、混合液を還流した。反応はNH4CI溶液により冷却し、得られた有機層はH20および飽和NaCl水溶液で洗浄し、Na2S04により乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残留物はシリカゲル(PE/EtOAc = 100/1 -30/1)上のカラムクロマトグラフィーにより精製し、粗化合物Ｃ(150 g)で、化合物ｂおよび化合物ｃを含む無色の油を得た。
【００９６】
1H NMR (400 MHz, CDC13): δ 0.81-1.18 (m, 9H), 2.20 (s, 3H), 2.53-2.59 (m, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.89 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 5.83 (s, 1H), 6.67 (s, 1H), 6.71 (d, = 8.4 Hz, 1H), 6.98 (d, = 8.4 Hz, 1H)
【００９７】
３）エチル-３-(２-メチルオキシ-５-メチルフェニル）-４-ペンテン酸メチル（ethyl 3-(2-methyloxy-5-methylphenyl)-4-methypentanoate）（ｄ）の合成
【００９８】
エタノール（500ｍｌ）中の化合物Ｃ（150 g, 粗製）およびＰｄ／Ｃ（15g, １０％）の混合物を１晩、Ｈ２雰囲気の下、常温で撹拌し、ろ過した。ろ過液は、粗化合物ｄ(110 g、２回で６１%の収率) で、化合物ｄ（８４％、ｗ／ｗ）および化合物ｂ（１６％、ｗ／ｗ）を含む無色の油を得た。
【００９９】
H NMR (400 MHz, CDC13): δ 0.76 (d, = 6.8 Hz, 3H), 0.79 (d, = 6.8 Hz, 3H), 1.06 (t, = 7.2 Hz, 3H), 1.92-1.97 (m, IH), 2.25 (s, 3H), 2.61-2.75 (m, 2H), 3.22-3.28 (m, IH), 3.77 (s, 3H), 3.95 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 6.72 (d, = 8.4 Hz, IH), 6.88 (s, IH), 6.94 (d, = 8.4 Hz, IH)
【０１００】
４）3-(2-メチルオキシ-５-メチルフェニル)-４-メチルペンタノール-1-オール（3-(2-methyloxy-5-methylphenyl)-4-methypentanl-l-ol）（e）の合成
【０１０１】
化合物ｄ（80.0 g, 255 mmol, 1.0 eq, 84% w/w）をTHF (500 mL)中のＬＡＨ(13.8 g, 363 mmol, 1.43 eq)の懸濁液中に、３０分を超えて、０°Cで滴下したのち、１．５時間常温で撹拌した。反応は連続してH20 (13.8 g)、ＮａＯＨ溶液(13.8 mL, 15%)、H20 (41.4 g)により冷却され、セライトを介してろ過し、濃縮した。残留物はシリカゲル上(PE/EtOAc = 50/1 ~ 20/1)のカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物e(41.4 g, 73%)の無色の油を得た。
【０１０２】
1H NMR (300 MHz, CDC13): δ 0.73 (d, = 6.6 Hz, 3H), 1.03 (d, = 6.6 Hz, 3H), 1.27-1.65 (m, IH), 1.87-1.94 (m, 2H), 2.10-2.17 (m, IH), 2.29 (s, 3H), 2.86-2.93 (m, IH), 3.21-3.24 (m, IH), 3.26-3.50 (m, IH), 3.80 (s, 3H), 6.78 (d, = 8.1 Hz, IH), 6.93 (s, IH), 6.97 (d, 7 = 8.1 Hz, IH)
【０１０３】
５）3-(2-メチルオキシ-５-メチルフェニル)-４-メチルペンチルメチルスルホン酸（3-(2-methyloxy-5-methylphenyl)-4-methypentyl methylsulfonate）（f）の合成
【０１０４】
MsCL (42.6 g, 558 mmol, 2.0 eq)をDCM (750 mL)中の化合物ｅ(41.4 g, 186 mmol, 1.0 eq)およびＴＥＡ(56.5 g, 558 mmol, 3.0 eq)の溶液に、０°Cで滴下したのち、２時間常温で撹拌した。２時間後、混合物をH20およびNaCl水溶液で洗浄し、Na2S04により乾燥し、ろ過し、蒸発し、茶色の油である化合物ｆ（55.8 g, 100%）を得た。
【０１０５】
1H NMR (400 MHz, CDC13): δ 0.72 (d, = 6.4 Hz, 3H), 0.97 (d, = 6.4 Hz, 3H), 1.84-1.91 (m, 1H), 1.97-2.06 (m, 1H), 2.18-2.26 (m, 4H), 2.83-3.14 (m, 4H), 3.75 (s, 3H), 3.88-3.94 (m, 1H), 4.00-4.05 (m, 1H), 6.74 (d, = 8.4 Hz, 1H), 6.86 (s, 1H), 6.96 (d, = 8.4 Hz, 1H)
【０１０６】
６）4-(2-メチルオキシ-５-メチルフェニル)-４-メチルヘキサンニトリル（4-(2-methyloxy-5-methylphenyl)-5-methylhexanenitrile）（g）の合成
【０１０７】
DMF (300 mL)中の化合物f (55.8 g, 186 mmol, 1.0 eq)およびNaCN (18.2 g, 372 mmol, 2.0 eq)の混合物を７５℃で一晩撹拌し、酢酸エチルおよびH20により分離した。有機層はH20およびNaCl水溶液で洗浄し、Na2S04により乾燥し、ろ過し、蒸発し、無色の油である化合物g（38.5 g, 90%）を得た。
【０１０８】
1H NMR (400 MHz, CDC13): δ 0.71 (d, = 6.8 Hz, 3H), 0.99 (d, = 6.8 Hz, 3H), 1.85-2.17 (m, 5H), 2.28 (s, 3H), 2.75-2.81 (m, 1H), 3.76 (s, 3H), 6.75 (d, = 8.4 Hz, 1H), 6.84 (s, 1H), 6.98 (d, = 8.4 Hz, 1H)
【０１０９】
７）4-(2-メチルオキシ-５-メチルフェニル)-５-メチルヘキサンアミド（4-(2-methyloxy-5-methylphenyl)-5-methylhexanamide）(h)の合成
【０１１０】
H202 (32.0 g, 282 mmol, 1.5 eq, 30% in H20)を、DMSO (220 mL)中の化合物ｇ（43.5 g, 188 mmol, 1.0 eq）およびK2C03 (10.4 g, 75.2 mmol, 0.4 eq)の懸濁液中に常温で滴下したのち、溶液を３時間常温で撹拌した。追加のH202 (32.0 g, 282 mmol, 1.5 eq, 30% in H20)を常温で１時間滴下した。混合溶液を酢酸エチルおよびH20に分離した。有機層はH20により洗浄したのち、NaCl水溶液で洗浄し、Na2S04により乾燥し、ろ過し、蒸発し、白色粉末である化合物ｈ(46.9 g, 100%）を得た。
【０１１１】
1H NMR (300 MHz, CDC13): δ 0.72 (d, = 6.6 Hz, 3H), 1.00 (d, = 6.6 Hz3H), 1.73-2.21 (m, 5H), 2.28 (s, 3H), 2.79-2.84 (m, 1H), 3.79 (s, 3H),
5.38 (brs, 2H), 6.76 (d, = 8.4 Hz, 1H), 6.85 (s, 1H), 6.97 (d, = 8.4 Hz, 1H)
【０１１２】
８）4-(2-メチルオキシ-５-メチルフェニル)-５-メチルヘキサン酸（4-(2-methyloxy-5-methylphenyl)-5-methylhexanoic acid）(i)の合成
【０１１３】
エタノール(400 mL)中の化合物ｈ(46.9 g, 188 mmol, 1.0 eq)とNaOH (30.1 g, 752 mmol, 4.0 eq)とH20 (100 mL)との混合物は、一晩還流させ、濃縮した。残留物のpHは1N HClと調整して２とした。その後、残留物は酢酸エチルにより抽出した。有機層はNaCl水溶液で洗浄し、Na2S04により乾燥し、ろ過し、蒸発し、茶色の油である化合物i(47.1 g, 100%）を得た。
【０１１４】
1H NMR (300 MHz, CDC13): δ 0.74 (d, = 6.6 Hz, 3H), 1.01 (d, = 6.6 Hz, 3H), 1.78-1.94 (m, 2H), 2.04-2.20 (m, 3H), 2.28 (s, 3H), 2.76-2.82 (m, 1H), 3.76 (s, 3H), 6.76 (d, = 8.4 Hz, 1H), 6.89 (s, 1H), 6.97 (d, = 8.4 Hz, 1H)
【０１１５】
９）（Ｒ）-４-（２−ヒドロキシ‐５-メチルフェニル）−５−メチルヘキサン酸（化合物１）および（Ｓ）-４-（２−ヒドロキシ‐５-メチルフェニル）−５−メチルヘキサン酸（化合物４）の合成
【０１１６】
HBr (235 mL, 33% in AcOH)溶液を、酢酸（235 mL）中の化合物i（47.1 g, 188 mmol）の溶液に常温で滴下し、１晩還流した。混合物を酢酸エチルおよび水により希釈した。有機層はH20および飽和NaCl水溶液で洗浄した後、濃縮した。残留物をエタノール (400 ml) およびH20 (40 mL)により LiOHと共に希釈した。H20 (31.6 g, 752 mmol)を添加し、混合物を１．５時間常温で撹拌し、濃縮した。残留物を希釈し、IN HClにより酸化し、pH を２〜３にした。有機層はH20により洗浄したのち、NaCl水溶液で洗浄し、Na2S04により乾燥し、ろ過し、蒸発した。残留物はシリカゲル上(PE/EtOAc = 100/1 から 10/1)のカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物５((22.2 g, 50%)の白色固体を得た。11.0 g の化合物５をChiral Prep-HPLCにより分離し、4.5 gの化合物１および3.8 gの化合物４を得た。
【０１１７】
化合物１：1H NMR (400 MHz, DMSO-J6) : δ 0.68 (d, = 6.4 Hz, 3H), 0.92 (d, = 6.4 Hz, 3H), 1.68-1.97 (m, 5H), 2.17 (s, 3H), 2.65-2.68 (m, 1H), 6.66 (d, = 7.6 Hz, 1H), 6.76-6.79 (m, 2H), 8.83 (s, 1H), 11.84 (s, 1H); 1H NMR (600 MHz, CDC13, 5TMS = 0.00 ppm): δ 6.66 (d, = 8.52 Hz, 2H), 6.85 (d, = 8.52 Hz, 2H), 6.85 (s, 1H), 2.67 (m, 1H), 1.80, 2.17 (m, 2H), 2.18, 2.11 (m, 2H), 1.85 (m, 1H), 1.01 (d, = 6.58 Hz, 3H), 0.74 (d, = 6.65 Hz, 3H), 2.27 (s, 3H);LCMS [移動相: 95% 水 (0.01% NH4Ac) および 5% CH3CN から 5% 水 (0.01% NH4Ac) および 95% CH3CN を６分, 最終的にはこれらの条件下で0.5分]純度は >95%, Rt = 3.847分; MS Calcd.: 236; MS Found: 237 ([M+H]+); Chiral HPLC (Chiralcel OJ-H column): Rt = 7.16 min (Hex/t-ButOH/TFA = 95:5:0.3), ee = 100%; [a]D25 = -19.4 (c 0.72, CH2C12).
【０１１８】
化合物４：1H NMR (400 MHz, DMSO-J6) : δ 0.68 (d, = 6.4 Hz, 3H), 0.92 (d, = 6.4 Hz, 3H), 1.66-2.01 (m, 5H), 2.17 (s, 3H), 2.65-2.67 (m, IH), 6.66 (d, = 8.4 Hz, IH), 6.76-6.79 (m, 2H), 8.79-8.84 (brs, IH), 11.79-11.86 (brs, IH); XH NMR (600 MHz, CDC13, 5TMS = 0.00 ppm): δ 6.65 (d, = 8.5 Hz, 2H), 6.84 (d, = 8.5 Hz, 2H), 6.84 (IH, s, H-5), 2.67 (m, IH), 1.81, 2.18 (m, 2H), 2.20, 2.13 (m, 2H), 1.86 (m, IH), 1.02 (d, = 6.5 Hz, 3H), 0.74 (d, = 6.5 Hz, 3H), 2.24 (s, 3H); LCMS [移動相95% 水 (0.01% NH4Ac) および 5% CH3CN から 5% 水 (0.01% NH4Ac) および 95% CH3CNを６分, 最終的にはこれらの条件下で0.5分] 純度は >95%, Rt = 3.849分; MS Calcd.: 236; MS Found: 237 ([M+H]+); Chiral HPLC (Chiralcel OJ-H column): rt = 10.24 min (Hex/t-ButOH/TFA = 95:5:0.3; enantiomer: Rt = 7.31分), ee = 98%; [a]D25 = +20.0 (c 0.72, CH2C12)
【０１１９】
化合物５：1H NMR spectrum (600 MHz, CDC13, 5TMs = 0.00 ppm): δ 6.65 (d, = 8.5 Hz, 2H), 6.85 (d, = 8.5 Hz, 2H), 6.85 (s, IH), 2.66 (m, IH), 1.82, 2.18 (m, 2H), 2.20, 2.13 (m, 2H), 1.87 (m, IH), 1.02 (d, = 6.5 Hz, 3H), 0.74 (d, = 6.5 Hz, 3H), 2.24 (s, 3H)
実施例５  MPP+ 誘発性CGNｓ損傷を防ぐ効果を検討
【０１２０】
1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン（MPTP）は(1-メチル-4-フェニル-ピリジニウム（MPP＋）の前駆体である。前記MPP＋は、ドーパミン作動性の分解酵素モノアミンオキシダーゼB によりMPTPから合成し、ミトコンドリアの電子伝達系(ETC)複合体Iを抑制する。ドーパミン作動性ニューロンにMPP＋が蓄積すると、ATP不足になり、ミトコンドリア膜電位が低下し、ミトコンドリア膜透過性遷移孔(mPTP)が開口し、ROSが生産され、アポトーシマに至る。MPTP/MPP＋は、パーキンソン病のドーパミン作動性神経変性の特性モデルの神経損傷にインビトロおよびインビボで広く使用されている。
【０１２１】
初代小脳顆粒神経細胞（CGNｓ）は、先の出願（Du, Bales等、1997年）に記されているように、８日齢のSDラットから生成した。インビトロで７日間培養したCGNｓは、化合物１〜５のシリアル濃度６μΜから50μΜにより各々、２時間前処理をした。ビヒクル群は0.1% DMSOにより培養した。セルは、150 μΜのMPP+に３６時間接触した。セルの生存率を査定するために、5 mg/ml の15 μl MTT溶液を各々の100 μｌの培地内で十分に満たされたセルに添加し、プレートを加湿されたインキュベータにより３７°Cで４時間培養した。培養後、絶対値が100 μｌのＤＭＳＯを添加し、１０分間培養した。各々のウェルの５７０ｎｍでの吸収量をマイクロプレートリーダーにより測定した。
【０１２２】
図１はMPP+ 誘発性CGNｓ損傷を化合物１〜５が防いだことを示す。化合物１は、Emaxが 50μΜ濃度で、容量依存的に、MPP+ 誘発性初代SDラットCGNｓ損傷に対して神経保護効果を示した。化合物２は、Emaxが 50μΜ濃度で、MPP+ 誘発性初代SDラットCGNｓ損傷に対して神経保護効果を示した。化合物３は、Emaxが 25μΜ濃度で、MPP+ 誘発性初代SDラットCGNｓ損傷に対して神経保護効果を示した。化合物４は、Emaxが 12μΜ濃度で、MPP+ 誘発性初代SDラットCGNｓ損傷に対して神経保護効果を示した。化合物５は、Emaxが 50μΜ濃度で、MPP+ 誘発性初代SDラットCGNｓ損傷に対して神経保護効果を示した。
【０１２３】
図１に示すように、異なる濃度の化合物１〜５により前処理することにより、CGNｓの細胞生存率は著しく上昇した。以上より図１は、化合物１〜５がMPP+によって誘発される神経障害を防ぎ、神経変性疾患の治療に用いることができることを示した。
実施例６：6-OHDA誘発性ニューロン損傷からPC12を保護する効果を検討
【０１２４】
ラットの褐色細胞腫セル（PC12）は、ψ100ｃｍの皿に、密度１．５〜２×１０６セル／皿となるように播種した。血清が少ない培地(F-12K 培地 with 0.5% FBS)において２４時間培養した後、セルは化合物１のシリアル濃度６μΜから50μΜにより各々、１２時間前処理をした。セルはその後、1ｍΜの６−OHDAに２時間接触させた。セルの細胞生存率は実施例５と同様にして査定した。図２Ａに示すように、化合物１により前処理したPC12セルは、査定した全ての濃度において細胞毒性を示さなかった。6−OHDAはPC12セルに対して細胞毒性を示すが、図２Ｂに示すように、化合物１は容量依存的に細胞毒性の影響を緩和することができた。化合物１は、50μΜで、6−OHDAで処理されたPC12に対して著しく、且つ、最大の神経保護効果を示した。コガネバナ（Scutellaria baicalensis Georgi (SBG)）から抽出する主なフラボノイドの１つであるバイカレインは、パーキンソン病のインビトロおよびインビボモデルの6−OHDAまたはMPTP誘発性ニューロン損傷を防ぐことを示している(Im, Joo 等 2005; Lee, Noh等2005; Cheng, He 等2008; Mu, He 等2009; Mu, He 等2011)。ここでバイカレインはポジティブコントロールのために用いられ、100 μΜの濃度においてPC 12 セルの6−OHDA誘発性ニューロン損傷を明らかに防いだ。
【０１２５】
したがって図２Ａおよび図２Ｂは、化合物１が6−OHDAで処理されたPC 12に対して神経保護効果を有することを示している。さらに化合物１は、Emaxが 50μΜ濃度で、容量依存的に、6−OHDA誘発性PC 12セル損傷に対して神経保護効果を示した。
実施例７：MPTP誘発性DAニューロン損傷を弱める効果を検討。
【０１２６】
受精１日後（dpf）のゼブラフィッシュ胚のコリオン除去を行った後、200 μΜのMPTPおよび様々な濃度の化合物１により４８時間、同時処置の下、培養した。その後ゼブラフィッシュを、PBS内の４％のパラホルムアルデヒド内に５時間固定し、-20 °C にて、100％エタノールですすぎ、貯蔵した。ホールマウントの免疫染色は標準的な方法(Bitzur, Kam等  1994年)で行われた。図３Ｄ〜Ｆに示すように、化合物１はMPTP誘発性DAニューロン損傷を容量依存的に弱めた。さらに化合物１は、図３Ｇに示すように、ゼブラフィッシュ内のMPTP誘発性ドーパミン作動性神経細胞損失を、Emaxが 5μΜ濃度で用量依存的に保護した。結果は、未処理群と比較したＴＨ陽性セルの面積を量的な比率で表した。したがって図３Ｇは、化合物１がＴＨ陽性細胞損失を防ぐことを示した。
実施例８：MPTPに誘発され、ゼブラフィッシュ幼虫の全移動距離が減少することを弱める効果を検討
【０１２７】
受精３日後（dpf）ゼブラフィッシュの幼虫を、200 μΜのMPTPおよび様々な濃度の化合物１により４時間、同時に処置をした。受精７日後、200 μlの胚培地で満たされた９６ウェルプレート（1匹の魚／ウェルおよび一つのグループに１２の幼虫で）を用いて、幼虫の移動距離を記録した。データ取得前に１時間、幼虫をシステムに順応させた。各々の幼虫の遊泳パターンを１０分、３回記録した。各々の回は１０分、離した。全移動距離は、1回（１０分）の間に幼虫が移動した距離（ｍｍ）と推定した。図４Ａおよび図４Ｂに示すように、化合物１は、容量依存的にMPTPに誘発され幼虫の全移動距離が減少することを弱めた。
実施例９：化合物１およびクリシンの神経保護に対する相乗効果を検討
【０１２８】
初代小脳顆粒神経細胞（CGNｓ）は、前記（Zhang等、2012年）により８日齢のSprague-Dawleyラットから生成された。７日間、インビトロで培養されたCGNｓは、化合物１のシリアル濃度3 μg/mlから50 μg/mlにより各々２時間、または0.1% DMSO（ビヒクル群）により、前処理をした。細胞生存率は、実施例５と同様に査定した。
【０１２９】
図５に示すように、化合物１およびクリシンは共に、容量依存的に、CGNｓ内のMPP+誘発性細胞損傷を保護する。ＭＰＰ+単独で処理されたコントロール群と比較して、細胞が２５および５０μＭの化合物１により、同様にして、１２および２５μＭのクリシンにより処理されたとき、細胞生存率は著しく高められた。CGNｓはまた、２つの化合物の薬理学的相互作用を調査するために、化合物１およびクリシンにより同時に処理された。２５および５０μＭなどの高濃度時は、同時処理は何ら神経保護効果を示さず、CGNｓに対して毒性を与えた（データ非表示）。一方、３および６μＭなどの低濃度時は、ＭＰＰ+単独、ＭＰＰ+／化合物１、ＭＰＰ+／クリシンで各々処理した細胞と比較して、化合物１およびクリシンが著しい相乗神経保護効果を示した。
実施例１０：ＭＰＴＰ投与マウスに対する化合物１の神経保護効果を検討
【０１３０】
動物および薬物治療
【０１３１】
雄性成体C57BL/6Jマウス（８〜１０週齢、１８から２２ｇ）を用いて検討した。マウスは１２／１２時間の明暗サイクル内で飼育し、自由接触・自由飲水とした。治療前の順応期間を７日間設けた。図６に示すように、全てのマウスに対してＭＰＴＰ投与前に、行動訓練（ポール登り、ロータロッドランニング、フットプリント）を全４日間行った。その後マウスの腹腔内（i.p.）へ、20 mg/kgのMPTP塩酸塩(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)を２時間間隔で計４回投与した。標準コントロール群は食塩水（0.1 mL/10 g）をi.p.に投与した。各ＭＰＴＰ投与の１時間前に化合物１（5, 10、 20 mg/kg）、ラサギリン（1 mg/kg）および同量のビヒクル（オリーブオイル、0.1 mL/10 g）をi.g.に投与した。さらに、化合物１、ラサギリン、ビヒクルの何れかをi.g.に、１日１回、全７日間（１〜７日目）投与した。６グループは各々、１０匹のマウスからなる。
【０１３２】
行動テスト
【０１３３】
薬物の最終量を投与してから２４時間後（図６に示す８日目）、ポールテスト、ロータロッドテスト、フットプリントテストにより、マウスの神経行動変化を観察した。全てのテストは午前９時から午後２時までの標準動物室内照明の下で行った。
【０１３４】
ポールテストは四肢運動の障害を発見するために行った。ピンポンボール（直径５ｃｍ）を垂直ポール（長さ５５ｃｍおよび直径１ｃｍ）の上部に備えた。ポールは２層のガーゼにより包み、滑りを防いだ。マウスは頭部を上に向けてピンポンボールの上に置いた。マウスが床に降りるまでにかかった時間を、行動を起こす時間とした。各々のマウスに対して３回テストを繰り返し、その平均値を統計分析に用いた。
【０１３５】
ロータロッドテストは動作能力を明らかにした。ロータロッドテスト装置（YLS-4C, Academy of Medical Sciences、山東省、中国）に、始動速度５rpmから最終速度４０rpmとなるよう、高速化プログラムを設定した。マウスは、スピード加速時に回転するロッド上でバランスを保つことができるよう、姿勢を調整することができた。マウスがロータロッドの下のベースグリッド上に落下した時を検知するために紫外線を用いた。装置は、マウスの落下潜時を前記マウスの実験終了とし、ロータロッド上の総時間を記録した。同時に５匹のマウスをテストした。ロッド上の平均滞留時間を計算した。
【０１３６】
フットプリントテストでは、前肢と後肢を赤いインクで着色したマウスが幅５ｃｍ、長さ１００ｃｍの廊下を歩くよう訓練した。足跡を白い吸収紙上に記録した。
【０１３７】
組織標本
【０１３８】
図６に示すように、組織標本のために９日目にマウスを犠牲にした。各グループのマウスには麻酔をかけ、ヘパリンを含む０．９％の塩化ナトリウムを心臓内に灌流後、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）により固定した。各々の脳を摘出し、変性アルコール（degraded alclhol）により乾燥し、固形パラフィンに埋め込み、５μΜとなるよう冠状面で分離した。脳の吻側部および尾側部を、黒質緻密部（SNpc）の免疫組織化学染色のために分離した。
【０１３９】
抗チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫組織化学染色
【０１４０】
以前に説明されている方法（Lee, Kim等、２０１１年；Levites, Weinreb等、２００１年）で免疫組織化学染色を行った。端的には、切片をキシレン中で脱パラフィンし、変性アルコールシリーズ内で再水和した。切片を常温で１０分間、３％の過酸化水素（H2O2）で培養し、内因性ペルオキシダーゼ活性を不活性化した後、クエン酸緩衝液内で抗原検索を１５分間、９５°Cの電子レンジ内で行った。非特異的蛋白質の結合は、ＰＢＳ（0.01 M, pH 7.4）内の１０％ウシ血清により防がれた。各処置の間、スライドを少なくとも３回、脱イオン水で５分間洗浄した。切片は常温で１時間、Immunol Staining Primary Antibody Dilution Bufferに希釈したウサギ抗マウスＴＨポリクローナル抗体（1: 1000; Millipore、米国）で培養した。その後切片は、ビチオン化したＨＰＲ複合二次抗体により、常温で３０分間培養した。ＴＨ陽性ニューロンはその後、製造者（Shanghai, Gene Company、中国）の指示によりＤＡＢキットを用いて可視化された。ペルオキシダーゼ反応は３分後に止まった。最後に、切片は中性バルサムによりスリップしてカバーされた。結果は、ＴＨ陽性細胞の数を×１０の倍率で立体顕微鏡（BX51, Olympus Corp. 日本）により数えて分析した。ＴＨ陽性細胞内の各マウスの8 position-matched sections は、薬物治療の知識が無い操作員により手作業で数えられた。各切片のＴＨ陽性細胞の平均数は、ドーパミン作動性ニューロン生存率を表すとして用いられた。
【０１４１】
結果
【０１４２】
化合物１はＭＰＴＰ投与マウスの運動障害を改善した。
【０１４３】
SNpc DA ニューロンの欠損は、ＰＤ内で観察される運動異常を引き起こす。ＭＰＴＰ投与マウスの運動を評価した。図７Ａ〜７Ｄは、ＭＰＴＰマウスがポールからはい降りる時間が著しくかかり（図７Ａ）、廊下を渡る時間が遅くなり（図７Ｂ）、回転するロータロッド上にマウスがいる時間が軽減され（図７Ｃ）、マウスの通常の足取りが失われ、歩幅が短縮された（図７Ｄ）示した。以上より図７Ａ〜図７Ｄは、化合物１の投与は容量依存的に運動障害を大きく修正したことを示す。
【０１４４】
ＭＰＴＰ投与マウスのSNpcＤＡニューロンの欠損に対する化合物１の影響
【０１４５】
ＭＰＴＰ（20 mg/kg）を２時間毎に全４回、８時間に渡って１日目（１ｄ）に注入すると、注入７日後には、SNpc内で４０％のＴＨ陽性ＤＡニューロンが失われた。ＴＨ陽性細胞の損失は、吻側や尾側よりもやや中央に見られた（図８Ａおよび８Ｂ）。化合物１で前および後処理することにより、容量依存的に、ＭＰＴＰ誘発性ＴＨ陽性細胞体の損失が著しく減少した（図８Ａ〜図８Ｃ）。同様のスケジュールをラサギリンにも適用した。ラサギリンは、選択的ＭＡＯ−Ｂ阻害剤でＰＤ患者の治療への使用に認められているが、同様にＭＰＴＰ誘発性ＴＨ陽性細胞体の損失を防いだ。
【０１４６】
結果
【０１４７】
本発明は３つの単離精製化合物、（化合物１）（（Ｒ）-４-（２−ヒドロキシ‐５-メチルフェニル）−５−メチルヘキサン酸）、（化合物２）（（４Ｓ）-４-（３−ヒドロキシ‐３-メチル‐６-オキソシクロヘックス‐１−エニル）−５−メチルヘキサン酸）、（化合物３）（（４Ｒ）-４-（３−ヒドロキシ‐３-メチル‐６-オキソシクロヘックス‐１−エニル）−５−メチルヘキサン酸）を提供する。前記３つの化合物はヤクチから分離され、前記実施例に示すように、神経保護効果を示す。本発明はまた神経保護効果を示す２つの合成化合物、（化合物４）（（Ｓ）-４-（２−ヒドロキシ‐５-メチルフェニル）−５−メチルヘキサン酸）および（化合物５）（４-（２−ヒドロキシ‐５-メチルフェニル）−５−メチルヘキサン酸）を提供する。これらの先進的な５つの化合物は神経保護効果を示すので、神経変性疾患（例えばパーキンソン病など）の治療薬となり得る。さらに本発明は、ヤクチから新規な前記化合物１〜３を抽出し精製する手軽で容易な方法および化合物１、４、５を合成するための精巧な製造方法を提供する。インビトロでの化合物１〜５のＣＧＮｓに対する神経保護活性も提供する。さらに本発明は、化合物１がインビボおよびインビトロで、ＰＣ１２セルおよびゼブラフィッシュに対して神経保護活性を有することを示す。
【０１４８】
本願に示すデータは、ＭＰＰ+誘発性初代小脳顆粒神経細胞（ＣＧＮｓ）損傷に対して化合物１〜５が、6-50 μΜの濃度で、濃度依存の神経保護効果を示すことを表した。さらに化合物１が、６−ＯＨＤＡ誘発性神経毒性からＰＣ１２セルを保護し、ＭＰＴＰ誘発性ドーパミン作動性神経細胞損失からゼブラフィッシュを保護し、ゼブラフィッシュ内のＭＰＴＰに起因する遊泳行動障害を改善することを示した。化合物１はＭＰＴＰ治療マウスの運動障害を改善し、ＭＰＴＰ誘発性ＴＨ陽性細胞損失を減らすことができる。さらに、化合物１およびクリシン（ヤクチから単離する、知られたフラボノイド化合物）は、MPP+ 誘発性ＣＧＮｓ損傷に対して相乗神経保護効果を示す。以上の結果は、化合物１〜５単独または前記化合物１〜５および他の神経刺激性化合物の組み合わせは、パーキンソン病などの神経変性疾患の治療薬として使用できることを示す。
【０１４９】
前記１つの化合物の治療方法に加えて、化合物１およびクリシンの組み合わせは相乗効果を示す。用量を開発中の当業者であれば、前記のうちの１つの化合物またはその組み合わせを用いて、不当な実験をすることなく、患者に最適な服用量を決めることができる。
【０１５０】
本願の実施形態は、全て示された。本明細書は特定の実施形態に言及しているが、当業者にとってこれら特定の詳細が改変可能であることは明確である。したがって本発明は、本明細書に記載された実施形態に限定されない。
【０１５１】
特段に記載のない限り、本明細書で使用された全ての技術用語および化学用語は、当技術分野における当業者が一般的に理解している意味と同じである。本明細書の記載と類似または同等の、あらゆる方法およびモノを、本発明の実施および検査に使用することができるが、好ましい方法およびモノを以下に説明する。本明細書に記載されている全ての刊行物は、関連した参考文献の詳細な情報を説明し、開示するために、引用されている。
【０１５２】
上記および下記の説明で引用された文献は、本明細書内で参考文献として引用する。本発明の実施形態は、下記の限定されない例に実施される。本発明の範囲は添付の請求項によってのみ説明され、決して例示された内容および範囲に限定されない。
【０１５３】
参考文献
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
0006422452.tif 000025
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
0006422452.tif 000027
【図７Ｄ】
0006422452.tif 000028
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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