(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の胎盤をプラセンタ原料とし、前記プラセンタ原料を、抽出剤として水を用い、１ＭＰａ、１６０〜１８０℃、３０〜６０分の条件で亜臨界処理して、全固形分中の遊離チロシン含有量が０．３０質量％以下であるプラセンタ抽出物を得ることを特徴とするプラセンタ抽出物の製造方法。
【請求項２】
前記遊離チロシン含有量が０．２７質量％以下である請求項１記載のプラセンタ抽出物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプラセンタを原料とするプラセンタ抽出物に関する。特に、遊離チロシン含有量が所定量以下のプラセンタ抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラセンタとは哺乳類の胎盤のことであり、近年、美白作用などの優れた機能性から、その抽出物が健康食品、化粧品素材、医薬品などとして使用されている。これらの使用において、プラセンタの優れた機能性を発揮するためには、プラセンタ中の蛋白質を、吸収性や機能性に優れたペプチドまで低分子化、可溶化する必要がある。
【０００３】
従来、プラセンタを低分子化および可溶化したプラセンタ抽出物を得る方法として酵素処理による方法が知られている。例えば、特許文献１には、人胎盤組織から水溶性プロテインなどの高分子蛋白質を抽出する際に除去される残渣物を蛋白質分解酵素で加水分解させた上清に酵母抽出物を加えることを含むメラニン生成抑制剤の製造方法が開示されている。また、特許文献２には、ブタおよび／またはウマの胎盤を酵素処理により加水分解して得られる水溶性成分、およびフェノール誘導体を含有する化粧料組成物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭５３−１４２５１５号公報
【特許文献２】特開２００２−２１２０４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
プラセンタ抽出物による美白効果メカニズムの１つとしてチロシナーゼ活性の阻害が挙げられる。チロシナーゼはチロシンを出発物質としてメラニンを生成する反応を担う酸化酵素である。しかしながら、従来の酵素処理により抽出されたプラセンタ抽出物は、該反応の基質である遊離チロシンを多く含有していること、およびチロシナーゼ阻害活性が低いことを本発明者らは確認した。
【０００６】
チロシナーゼによるメラニン色素の生成は、基質であるチロシンからＬ−ＤＯＰＡが生成され、さらに複数の反応を経ることで行われるが、酵素処理により抽出されたプラセンタ抽出物のチロシナーゼ阻害活性が低い一因として、基質となるチロシンを多く含むため、仮にチロシナーゼ阻害活性を有していても、同時に基質を供与することになるためチロシナーゼ阻害活性が低く、ひいては美白効果が低いことが考えられる。
【０００７】
また、酵素処理により抽出されたプラセンタ抽出物のように基質となるチロシンを多く含有するサンプルでは、チロシナーゼ酵素濃度が高い（例：９０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）チロシナーゼ阻害活性試験系においては、擬似的な陽性を示す場合があることも確認された。なお、一般的なチロシナーゼ阻害活性試験系では、サンプルおよびチロシナーゼを含む混合液に、基質としてＬ−ＤＯＰＡを添加して反応させ、反応液の吸光度から生成されたメラニン色素の量を測定する。
【０００８】
しかしながら、チロシナーゼの基質となるチロシンを多く含有するサンプルの場合、チロシンとチロシナーゼが反応することで多くの酸素が消費され、その後のメラニンを生成する反応で酸素不足となり、メラニン生成反応の活性が低くなりメラニンが生成されずに反応液の吸光度が高くならず、阻害活性が擬似的な陽性を示すことを確認した。すなわち、従来の酵素処理によるプラセンタ抽出物がチロシナーゼ阻害活性が高いという報告があるが、擬似的にチロシナーゼ阻害活性が高いという結果が得られている可能性がある。
このようなチロシナーゼ反応により酸素が消費され、メラニン生成反応の活性が低くなる挙動は文献にも紹介されている（東洋食品研究所研究報告書，ｖｏｌ．２８，ｐｐ５５−５８，２０１０）。
【０００９】
また、従来の酵素処理による抽出方法では、酵素の添加は当然のことであるがその他の補助剤も添加することが必要となる。具体的には、酵素に加え、ｐＨ調整剤や酵素安定化剤などの酵素反応の補助剤がプラセンタ原料に添加される。これらの添加剤の含有により有効成分の濃度が希釈されるという問題や、非プラセンタ由来の成分が混入するという問題もある。
【００１０】
本発明はこれらの問題に鑑みてなされたものであり、遊離チロシン含有量が少なく、チロシナーゼ阻害活性に優れたプラセンタ抽出物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、全固形分中の遊離チロシン含有量が０．３０質量％以下であるプラセンタ抽出物に関する。
【００１２】
全固形分中の遊離チロシン含有量が０．２７質量％以下であることが好ましい。
【００１３】
プラセンタ原料の亜臨界処理を経て抽出されたプラセンタ抽出物であることが好ましい。
【００１４】
亜臨界処理の温度が１７５〜２００℃であり、圧力が飽和蒸気圧以上であることが好ましい。
【００１５】
亜臨界処理の時間が５〜６０分であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のプラセンタ抽出物によれば、メラニン合成反応の出発物質となる遊離チロシンの全固形分中の含有量が所定量以下であり、従来の酵素処理によるプラセンタ抽出物に比べて高いチロシナーゼ阻害活性を有し、塗布や服用により美白効果が得られるプラセンタ抽出物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例、比較例および参考例のチロシナーゼ阻害活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
＜プラセンタ抽出物＞
本発明のプラセンタ抽出物はプラセンタを原料とする抽出物であり、全固形分中の遊離チロシン含有量が所定量以下であることを特徴とし、プラセンタ抽出物が有するチロシナーゼ阻害活性を効率的に発揮し得るプラセンタ抽出物である。
【００１９】
プラセンタ抽出物の抽出成分は、遊離アミノ酸、分子量３０００以下の低分子ペプチド、分子量３０００超のペプチド、その他成分の４つに大別される。
【００２０】
なお、本明細書中の遊離アミノ酸、ペプチドおよびその他の成分の含有量は、プラセンタ抽出物の全固形分に対する各成分の質量％で示す。プラセンタ抽出物が水分などの液体成分を含む場合、プラセンタ抽出物を乾燥もしくは凍結乾燥させて液体成分を除去した状態のものを、プラセンタ抽出物の全固形分とする。
【００２１】
遊離アミノ酸とは、アルギニン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、グルタミン酸（グルタミン含む）、セリン、スレオニン、アスパラギン酸（アスパラギン含む）、シスチン、トリプトファンの１８種類からなるアミノ酸が単独で存在するアミノ酸を指す。
【００２２】
遊離アミノ酸は機能性ペプチドの体内への吸収を阻害し、機能性ペプチドの吸収性や機能性を低下させる恐れがある、また遊離アミノ酸の含有率が高い場合は相対的にペプチドの含有率が低くなり、プラセンタ抽出物の機能性が低下する恐れがある。よって、プラセンタ抽出物の全固形分中の遊離アミノ酸の含有量は、少なければ少ないほど好ましく、０質量％が最も好ましい。プラセンタ抽出物の機能性を十分に発揮できるという理由から、１０質量％以下が好ましく、５質量％以下がより好ましい。
【００２３】
前述のように、遊離アミノ酸のなかでも、チロシンはチロシナーゼによるメラニン合成の出発物質であり、多く含有することでチロシナーゼ阻害活性が悪化することから、本発明のプラセンタ抽出物は、遊離チロシンの含有量を所定量以下とする。
【００２４】
全固形分中の遊離チロシンの含有量は、０．３０質量％以下であり、０．２７質量％以下が好ましく、０．２５質量％以下がより好ましく、０．２０質量％以下がさらに好ましい。遊離チロシンの含有量が０．３０質量％を超える場合は、チロシナーゼ阻害活性が低下する傾向がある。また、遊離チロシンの含有量は少なければ少ないほど好ましく、実質的に測定できないほど少なく、限りなく０質量％に近いことが最も好ましい。
【００２５】
分子量３０００以下の低分子ペプチドとは、前記１８種類のアミノ酸のうち少なくとも１種が２分子以上結合したペプチドの内、分子量３０００以下のすべてのペプチドを指す。これらの分子量３０００以下の低分子ペプチドは、人体への吸収性がよく、吸収された成分が美白効果などのプラセンタ抽出物の優れた機能性を発揮しやすい成分である。
【００２６】
全固形分中の分子量３０００以下の低分子ペプチドの含有量は、４０質量％以上が好ましく、５０質量％以上がより好ましい。該低分子ペプチドの含有量が４０質量％未満の場合は、チロシナーゼ阻害活性が不十分となる傾向がある。また、該低分子ペプチドの含有量の上限は、多ければ多いほど好ましく、１００質量％が最も好ましいが、９９．５質量％が上限であると推測される。
【００２７】
分子量３０００超のペプチドとは、前記１８種類のアミノ酸のうち少なくとも１種が２分子以上結合したペプチドの内、分子量３０００超のすべてのペプチドを指す。
【００２８】
全固形分中の分子量３０００超のペプチドは、人体への吸収性が悪くプラセンタ抽出物の機能性を有さないため、少ないほど好ましく、実質的に測定できないほど少なく、限りなく０質量％に近いことが最も好ましい。また、該ペプチドの含有量が６０質量％を超える場合は、相対的に分子量３０００以下のペプチドが４０質量％未満となってしまいチロシナーゼ阻害活性が不十分となる傾向があるため、該ペプチドの含有量は、６０質量％以下が好ましく、５０質量％以下がより好ましい。
【００２９】
人体への吸収性がよく、吸収された成分がプラセンタ抽出物の優れた機能性を発揮しやすい成分であることから、プラセンタ抽出物の全固形分中の分子量３０００以下の成分（遊離アミノ酸、分子量３０００以下の低分子ペプチドおよび分子量３０００以下のその他成分の合計）の含有量は１００質量％が好ましく、分子量３０００超の成分は含有していないことが好ましい。
【００３０】
その他成分とは、ミネラルに代表される無機成分や脂質、炭水化物などでペプチド、アミノ酸以外のすべての成分を指す。これらのその他の成分は、分離、抽出で全てを取り除くことが困難であり、プラセンタ抽出物の全固形分中に０．５質量％以上含まれる。
【００３１】
＜製造方法＞
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法の一例として、原料のプラセンタを亜臨界処理により抽出する抽出工程、および抽出液と原料残渣とを分離する固液分離工程を説明する。当該製造方法によれば、遊離チロシン含有量が少なく、チロシナーゼ阻害活性に優れたプラセンタ抽出物を製造することができる。
【００３２】
原料
本発明のプラセンタ抽出物の原料となるプラセンタは、哺乳類の胎盤であれば特に限定されず、入手容易性の観点からは、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イノシシ等のプラセンタが好ましい。原料となるプラセンタは、血液やその他の部位が混在していることがあるため、抽出工程の前に洗浄などの精製工程を行うことが好ましい。
【００３３】
抽出工程
抽出工程は、プラセンタ原料を亜臨界処理することで、亜臨界処理物を得る工程である。亜臨界処理とは、所定温度および圧力の条件下で亜臨界状態にした抽出剤としての亜臨界流体と抽出対象の原料（本発明ではプラセンタ）とを接触させることにより、抽出原料から所定の成分を抽出するものである。例えば、水は、圧力２２．１２ＭＰａ、温度３７４．１５℃まで上げると液体でも気体でもない状態を示す。この点を水の臨界点といい、臨界点より低い温度および圧力の熱水を亜臨界水という。この亜臨界水は、誘電率低下とイオン積の向上により、優れた成分抽出作用と加水分解作用を有する。
【００３４】
本発明における亜臨界処理に用いる抽出剤として水を用いる場合、高温の水処理であれば液体状態でも気体状態でも利用することができる。即ち、亜臨界処理の処理槽へは、水蒸気を供給してもよく、水を供給してもよく、あるいはその両者を供給してもよい。水または水蒸気の温度は望ましくは１００℃以上であり、望まれる反応場としては気体よりも液体状態の方が反応は進みやすいので、密閉に近い容器で強制的に液体の状態にした、いわゆる亜臨界の状態の水の使用が好ましい。より具体的には、金属やセラミックスなどの耐圧容器にプラセンタと抽出剤である水を入れて、密閉状態に近い状態にし、水の亜臨界状態（温度：１００℃以上、圧力：飽和蒸気圧以上）で、両者の接触を一定時間以上行うことで得られる抽出物を亜臨界処理物とすることができる。
【００３５】
亜臨界処理に用いる抽出剤は、水以外に、例えばエチレン、エタン、プロパン、二酸化炭素、メタノール、エタノールおよびそれらの混合物が挙げられる。これらの中で、安全性の観点から水を用いるのが最も好ましい。抽出剤が水の場合の処理条件について次に説明する。
【００３６】
プラセンタの亜臨界処理温度は、１６０〜２００℃の間が好ましい。この温度範囲にすることにより、遊離チロシン量が少なく、機能性成分である分子量３０００以下の低分子ペプチド量が多いプラセンタ抽出物が得られる。分子量分布は、高速液体クロマトグラフィーによる分子量分布測定にて測定可能である。亜臨界処理の温度が１６０℃未満の場合は、分子量３０００以下の低分子ペプチドを生成させることが難しくなる傾向がある。また、亜臨界処理の温度が２００℃を超える場合は、生成された低分子ペプチドがさらに亜臨界反応を起こしてしまい、遊離アミノ酸の生成量が増え、遊離チロシン量の増加および分子量３０００以下の低分子ペプチド量の減少が起こる傾向がある。
【００３７】
さらに、亜臨界処理温度は、１７５〜２００℃の間がより好ましく、１８０〜１９５℃の間がさらに好ましい。この範囲にすることで、より遊離チロシンの含有量が少なく、分子量３０００以下の低分子ペプチド量が多く、チロシナーゼ阻害活性に優れたプラセンタ抽出物を得ることができる。
【００３８】
プラセンタの亜臨界処理圧力は、各温度の飽和蒸気圧以上（その一例としては、１６０℃のときには０．６１ＭＰａ以上、２００℃以上のときには１．５５ＭＰａ以上）で行うことが好ましい。この圧力にすることにより、分子量３０００以下の低分子ペプチドを生成しやすく、チロシナーゼ阻害活性に優れたプラセンタ抽出物を得ることができる傾向がある。亜臨界処理の圧力の上限は特に定められないが、高圧装置の仕様上、２０〜３０ＭＰａあたりに抑えることが好ましい。
【００３９】
プラセンタの亜臨界処理時間は、５〜６０分の間で行うことが好ましい。この処理時間の範囲にすることにより、低分子ペプチドを生成しやすく、チロシナーゼ阻害活性に優れたプラセンタ抽出物を得やすくなる。亜臨界処理時間が５分未満の場合は、低分子ペプチドを生成させることが困難となる傾向がある。亜臨界の処理時間が６０分を超える場合は、生成された低分子ペプチドがさらに過分解してしまい、遊離アミノ酸の生成量が増え、遊離チロシン量の増加および分子量３０００以下の低分子ペプチド量の減少が起こる傾向がある。
【００４０】
さらに、処理時間は１０〜６０分の間がより好ましく、１０〜３０分の間がさらに好ましい。この範囲にすることで、より遊離チロシンの含有量が少なく、分子量３０００以下の低分子ペプチド量が多く、チロシナーゼ阻害活性に優れたプラセンタ抽出物を得ることができる。
【００４１】
すなわち、抽出剤を水とした場合におけるプラセンタの亜臨界処理による加水分解条件としては、処理温度は１６０〜２００℃、処理圧力は各温度の飽和蒸気圧以上、処理時間は５〜６０分で行うことが好ましい。この条件で行うことで、遊離チロシンの含有量が少なく、チロシナーゼ阻害活性に優れたプラセンタ抽出物を得ることができる。さらに、処理温度は１８０〜１９５℃、処理圧力は各温度の飽和蒸気圧以上、処理時間は１０〜３０分で行うことが、遊離チロシンの含有量が少なく、チロシナーゼ阻害活性に優れたプラセンタ抽出物を最大限の効率で得ることができるという理由から好ましい。
【００４２】
固液分離工程および乾燥工程
固液分離工程は、亜臨界処理物を抽出液と原料残渣（固体物）とを分離する工程である。具体的な固液分離工程としては、ろ紙を用いたろ過、遠心分離、デカンテーション、スクリュープレス、ローラープレス、ロータリードラムスクリーン、ベルトスクリーン、振動スクリーン、多重板振動フィルター、真空脱水、加圧脱水、ベルトプレス、遠心濃縮脱水、多重円板脱水などが挙げられる。なかでも、操作が簡便であり、分離効率に優れるという理由から、ろ過が好ましい。
【００４３】
固液分離工程により得られた抽出液を乾燥させることにより固形状のプラセンタ抽出物が得られる。乾燥方法としては一般的な乾燥方法を用いることができ、自然放置はもちろんのこと、加熱系である箱型乾燥や噴霧乾燥などの伝熱乾燥、マイクロ波乾燥などの内部発熱乾燥、非加熱系である凍結乾燥、真空乾燥、吸引乾燥、加圧乾燥、超音波乾燥等が可能である。一般的で簡便なオーブン、恒温槽を用いて乾燥することももちろん許容される。また、適宜、活性炭、イオン交換樹脂等の吸着剤を用いた脱色を乾燥工程の前に行ってもよい。
【００４４】
亜臨界処理により得られるプラセンタ抽出物
従来の抽出方法である酵素処理により得られたプラセンタ抽出物は、遊離チロシンを多く含有し、チロシナーゼ阻害活性が低い。一方、亜臨界処理により得られるプラセンタ抽出物は、遊離チロシン含有量が少なく、チロシナーゼ阻害活性に優れたプラセンタ抽出物である。
【実施例】
【００４５】
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
【００４６】
＜試験用プラセンタ抽出物の調製＞
各実施例、比較例および参考例における試験用プラセンタ抽出物の調製工程を説明する。また、実施例および比較例の主な条件を表１に示す。
【００４７】
実施例１
容積２Ｌの耐圧容器に、ブタ胎盤Ａ（東京芝浦臓器株式会社  脱血、洗浄済）２００ｇ、蒸留水２００ｇを入れて、処理温度：１８０℃、処理圧力：１．０ＭＰａ、処理時間１０分間で亜臨界処理を行った。
亜臨界処理を終了後、耐圧容器内の処理物を回収し、セルロース製ろ紙（孔径：１μｍ、Ａｄｖａｎｔｅｃ製の５Ｃ）で吸引ろ過し、ろ液を凍結乾燥させることで試験用プラセンタ抽出物Ａ１を得た。
【００４８】
実施例２
処理温度：１８０℃、処理圧力：１．０ＭＰａ、処理時間３０分間で亜臨界処理を行ったこと以外は、実施例１と同じ条件で試験用プラセンタ抽出物Ａ２を得た。
【００４９】
実施例３
処理温度：１８８℃、処理圧力：１．２ＭＰａ、処理時間２０分間で亜臨界処理を行ったこと以外は、実施例１と同じ条件で試験用プラセンタ抽出物Ａ３を得た。
【００５０】
実施例４
処理温度：１９５℃、処理圧力：１．６ＭＰａ、処理時間１０分間で亜臨界処理を行ったこと以外は、実施例１と同じ条件で試験用プラセンタ抽出物Ａ４を得た。
【００５１】
実施例５
処理温度：１９５℃、処理圧力：１．６ＭＰａ、処理時間３０分間で亜臨界処理を行ったこと以外は、実施例１と同じ条件で試験用プラセンタ抽出物Ａ５を得た。
【００５２】
実施例６
プラセンタ原料として別ロットのブタ胎盤Ｂ（東京芝浦臓器株式会社  脱血、洗浄済）を用いたこと以外は実施例５と同じ条件で試験用プラセンタ抽出物Ａ６を得た。
【００５３】
比較例１
ブタ胎盤Ａ２００ｇ、蒸留水５０ｇ、蛋白質分解酵素（Ａｌｃａｌａｓｅ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）４ｍｌ、２５質量％水酸化ナトリウム２ｍｌを混合し、６０℃で３時間静置することで、酵素分解処理を行った。その後、９０℃で１時間静置することで蛋白質分解酵素を失活させた。酵素の失活後、処理液をセルロース製ろ紙（孔径：１μｍ、Ａｄｖａｎｔｅｃ製の５Ｃ）で吸引ろ過し、ろ液を凍結乾燥させることで試験用プラセンタ抽出物Ｂ１を得た。
【００５４】
比較例２および３
市販のプラセンタ抽出物Ａおよび市販のプラセンタ抽出物Ｂ（プラセンタ抽出物Ａおよびプラセンタ抽出物Ｂのいずれも、ブタ胎盤由来、抽出工程：酵素処理）を、それぞれ比較例２の試験用プラセンタ抽出物Ｂ２および比較例３の試験用プラセンタ抽出物Ｂ３とした。
【００５５】
参考例１
実施例５の試験用プラセンタ抽出物Ａ５に対し、遊離チロシンを終濃度が１．２２質量％となるよう添加し、試験用プラセンタ抽出物Ｃ１を得た。
【００５６】
＜評価＞
得られた試験用プラセンタ抽出物Ａ１〜Ａ６および試験用プラセンタ抽出物Ｂ１〜Ｂ３に対して、次の評価を行った。結果を表１に示す。
【００５７】
分子量分布測定
各試験用プラセンタ抽出物を蒸留水に溶解させて４質量％の溶液を作成し、これを０．４５μｍメンブランフィルターによりろ過し、高速液体クロマトグラフィー（アジレントテクノロジー社製ＨＰ１１００シリーズ）による測定を行った。
【００５８】
分析条件については、カラム（東ソー社製  品番：ＴＳＫ  ｇｕａｒｄ  ｃｏｌｕｍｎ  ＳＷＸＬ（６．０ｍｍ  Ｉ.Ｄ.×４０ｍｍ）およびＴＳＫｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷＸＬ（７．８ｍｍ  Ｉ.Ｄ.×３００ｍｍ）を用い、溶離液を０．１ｗ／ｖ％  ＴＦＡ  ｉｎ  ＭｅＣＮ／Ｈ2Ｏ＝４５／５５、カラム温度３５℃、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出ＵＶ２２０ｎｍ、導入量２０μＬ、分析時間３０ｍｉｎにて分子量分布測定用の標準試薬としてＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ（和光純薬工業）分子量１２５００、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ（ＣＡＬＢＯＣＨＥＭ）分子量６５１２、Ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ（Ｄｒ.  Ｅｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ）分子量１４２３、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  II（ペプチド研究所）分子量１０２６、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ（ペプチド研究所）分子量４５１、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ペプチド研究所）分子量１８９により同様な測定で検量線を作成し、溶離時間に対する分子量位置を決め、分子量分布、および分子量分画範囲におけるピーク面積を求め、分子量比率を求めた。
【００５９】
チロシン含有量、構成アミノ酸量の測定
各試験用プラセンタ抽出物の構成アミノ酸と遊離アミノ酸の分析を行った（なお、分析は一般財団法人食品分析開発センターＳＵＮＡＴＥＣにて依頼し行った。）。
【００６０】
各試験用プラセンタ抽出物を過ギ酸酸化処理後、塩酸加水分解を実施した。アルギニン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、グルタミン酸（グルタミン含む）、セリン、スレオニン、アスパラギン酸（アスパラギン含む）、シスチン、トリプトファンの計１８種類を測定した。なお、トリプトファン以外の分析は、アミノ酸自動分析機にて測定し、トリプトファンについては高速クロマトグラフ法にて測定した。
【００６１】
遊離アミノ酸については各試験用プラセンタ抽出物を酸化処理および加水分解処理せずに、そのままアミノ酸自動分析機および高速クロマトグラフ法による測定を行った。これらの結果より、１８種の遊離アミノ酸量および構成アミノ酸量を各々合計し、その結果より、抽出物の固形分中遊離アミノ酸量、構成アミノ酸量を求めた。さらに、前記分子量分布測定結果より、各ペプチド（分子量３０００以下のペプチド、分子量３０００超のペプチド）の量を求めた。遊離アミノ酸についてはチロシン量のみ表１に示す。
【００６２】
ペプチド量＝構成アミノ酸量−遊離アミノ酸量
分子量３０００以下のペプチドの量＝（構成アミノ酸量）×（分子量３０００以下の分子量分布割合）−遊離アミノ酸量
分子量３０００超のペプチドの量＝（ペプチド量−分子量３０００以下のペプチドの量）
【００６３】
チロシナーゼ阻害活性
次の試薬を調製し、使用した。なお、全てのリン酸緩衝液はｐＨ＝６．７の同じものを使用した。
酵素溶液：チロシナーゼを３０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ含有するリン酸緩衝液
基質溶液：Ｌ−ＤＯＰＡを０．２ｍｇ／ｍＬ含有するリン酸緩衝液
サンプル溶液：各試験用プラセンタ抽出物の濃度が１００ｍｇ／ｍＬとなるように蒸留水に溶解させ、０．４５μｍメンブランフィルターによりろ過した溶液
［サンプル（Ｓ）］
マイクロプレートの各ウェルに２５μＬの各サンプル溶液および１００μＬの酵素溶液を順に入れ、３７℃で１０分静置させた。その後、各ウェルに１２５μＬの基質溶液を加え、全量を２５０μＬとし、さらに３７℃で１０分静置させた。その後、吸光プレートリーダーマルチスキャンＪＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用し、４９２ｎｍの吸光度（Ｓ）を測定した。
［コントロール（Ｃ）］
２５μＬのサンプル溶液に替えて２５μＬの蒸留水を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（Ｃ）を測定した。
［サンプルブランク（ＳＢ）］
１００μＬの酵素溶液に替えて１００μＬのリン酸緩衝液を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（ＳＢ）を測定した。
［コントロールブランク（ＣＢ）］
２５μＬのサンプル溶液に替えて２５μＬの蒸留水を使用したこと、および１００μＬの酵素溶液に替えて１００μＬのリン酸緩衝液を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（ＣＢ）を測定した。
［チロシナーゼ阻害率の算出］
各吸光度測定結果を用いて、下記の式により各試験用プラセンタ抽出物のチロシナーゼ阻害率（％）を算出した。
式：（（Ｃ−ＣＢ）−（Ｓ−ＳＢ））／（Ｃ−ＣＢ）×１００
【００６４】
なお、試験用プラセンタ抽出物Ｃ１のチロシナーゼ阻害率を測定したところ、１１．１％であった。試験用プラセンタ抽出物Ａ１〜Ａ６、Ｂ１〜Ｂ３およびＣ１のチロシナーゼ阻害率の結果を図１に示した。
【００６５】
【表１】
0006346828.tif 000002
【００６６】
表１の結果より、本発明のプラセンタ抽出物は、遊離チロシン含有量が少なく、チロシナーゼ阻害活性に優れたプラセンタ抽出物であることがわかる。比較例１〜３の結果が検出限界以下であったことから、酵素処理により得られたプラセンタ抽出物では、チロシナーゼ阻害活性がほとんど確認できないことがわかる。また、任意に遊離チロシンを添加した参考例１の結果と元の抽出物（実施例５）の結果を比較すると、チロシナーゼ阻害活性が低下していることからも、遊離チロシン含有量がチロシナーゼ阻害活性に影響を与えているといえる。
【図１】
0006346828.tif 000003