(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド多型部位の特徴を示す１つまたは複数のポリヌクレオチド種であって、式−Ｘ−Ｙ−Ｚ−を有する標的領域をそれぞれが備える１つまたは複数のポリヌクレオチド種を含むＤＮＡ分析物を特徴付ける方法であって、ＸおよびＺはそれぞれ、隣接する第１特徴的オリゴヌクレオチド領域および第２特徴的オリゴヌクレオチド領域であり、Ｙは前記部位を構成するバリアントの一つであり、（ａ）リガーゼの存在下で、前記ポリヌクレオチド種の少なくとも１つに由来する標的領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを、（ｉ）−Ｘまたは−Ｘ−Ｙの配列に対し相補的な配列においてその３’末端で終端する、１００ヌクレオチドまでの長さを有する一本鎖第１オリゴヌクレオチド構成要素と、（ｉｉ）１００ヌクレオチドまでの長さを有する一つまたは複数の一本鎖第２オリゴヌクレオチド構成要素とを含む一組のプローブと反応させて、前記オリゴヌクレオチドと、第１オリゴヌクレオチド構成要素と、第２オリゴヌクレオチド構成要素の一つとを含む部分的に二本鎖のプローブを生成するステップであり、ここで、前記一つまたは複数の一本鎖第２オリゴヌクレオチド構成要素は、前記第１オリゴヌクレオチド構成要素が、−Ｘの配列に対し相補的な配列において、その３’末端で終端する場合には、−Ｚ−Ｙの配列に対し相補的な配列においてその５’末端で終端し、または、前記一つまたは複数の一本鎖第２オリゴヌクレオチド構成要素は、前記第１オリゴヌクレオチド構成要素が−Ｘ−Ｙの配列に対し相補的な配列においてその３’末端で終端する場合には、−Ｚの配列に対し相補的な配列においてその５’末端で終端し、そして、前記一つまたは複数の一本鎖第２オリゴヌクレオチド構成要素は、検出不可能な状態にある検出可能要素で標識されているステップであり、（ｂ）ステップ（ａ）で生成された前記二本鎖のプローブのみを、使用済みプローブの融点と、アニールしたが未反応の任意の生成物の融点の間の範囲の温度で、３’から５’の方向で、二本鎖エキソヌクレアーゼ活性を呈するエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼで全てまたは部分的に、選択的に消化して、少なくとも一つが目下検出可能な状態の検出可能要素を含む、それの構成要素たる単一ヌクレオチドにするステップと、（ｃ）その後、前記目下検出可能な要素に関連する検出特性を検出することにより前記Ｙバリアントの性質を特定するステップと、を含む方法。
【請求項２】
ヌクレオチド多型部位の特徴を示す１つまたは複数のポリヌクレオチド種であって、式−Ｘ−Ｙ−Ｚ−を有する標的領域をそれぞれが備える１つまたは複数のポリヌクレオチド種を含むＤＮＡ分析物を特徴付ける方法であって、ＸおよびＺはそれぞれ、隣接する第１特徴的オリゴヌクレオチド領域および第２特徴的オリゴヌクレオチド領域であり、Ｙは前記部位を構成するバリアントの一つであり、（ａ）リガーゼの存在下で、前記ポリヌクレオチド種の少なくとも１つに由来する標的領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを、（ｉ）−Ｘまたは−Ｘ−Ｙの配列に対し相補的な配列においてその３’末端で終端し、検出不可能な状態にある検出可能要素で標識された、１００ヌクレオチドまでの長さを有する一つまたは複数の一本鎖第１オリゴヌクレオチド構成要素と、（ｉｉ）１００ヌクレオチドまでの長さを有する一本鎖第２オリゴヌクレオチド構成要素とを含む一組のプローブと反応させて、前記オリゴヌクレオチドと、第１オリゴヌクレオチド構成要素の一つと、第２オリゴヌクレオチド構成要素とを含む部分的に二本鎖のプローブを生成するステップであり、ここで、前記一つまたは複数の一本鎖第１オリゴヌクレオチド構成要素は、前記第２オリゴヌクレオチド構成要素が、−Ｘの配列に対し相補的な配列において、その３’末端で終端する場合には、−Ｚ−Ｙの配列に対し相補的な配列においてその５’末端で終端し、または、前記一つまたは複数の一本鎖第１オリゴヌクレオチド構成要素は、前記第２オリゴヌクレオチド構成要素が−Ｘ−Ｙの配列に対し相補的な配列においてその３’末端で終端する場合には、−Ｚの配列に対し相補的な配列においてその５’末端で終端し、そして、前記一つまたは複数の一本鎖第１オリゴヌクレオチド構成要素は、検出不可能な状態にある検出可能要素で標識されているステップであり、（ｂ）ステップ（ａ）で生成された前記二本鎖のプローブのみを、使用済みプローブの融点と、アニールしたが未反応の任意の生成物の融点の間の範囲の温度で、５’から３’の方向で、二本鎖エキソヌクレアーゼ活性を呈するエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼで全てまたは部分的に、選択的に消化して、少なくとも一つが目下検出可能な状態の検出可能要素を含む、それの構成要素たる単一ヌクレオチドにするステップと、（ｃ）その後、前記目下検出可能な要素に関連する検出特性を検出することにより前記Ｙバリアントの性質を特定するステップと、を含む方法。
【請求項３】
ステップ（ｃ）を行う前に、ステップ（ａ）のみか、または、ステップ（ａ）かつ（ｂ）のいずれかを周期的に繰り返すことを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）の前記プローブは、第１オリゴヌクレオチド構成要素と、異なるＹバリアントに対して選択性を有する２つの標識された第２オリゴヌクレオチド構成要素とを含む３つの構成要素を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）の前記プローブは、異なるＹバリアントに対して選択性を有する２つの標識された第１オリゴヌクレオチド構成要素と、第２オリゴヌクレオチド構成要素とを含む３つの構成要素を含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記第１オリゴヌクレオチド構成要素はエキソヌクレアーゼ分解に対し耐性があることを特徴とする、請求項１、３、および４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記第１オリゴヌクレオチド構成要素は、その３’末端のヌクレオチド間に少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第２オリゴヌクレオチド構成要素に含まれる前記検出可能要素はフルオロフォアであることを特徴とする、請求項１、３、４、６、および７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記第２オリゴヌクレオチド構成要素はエキソヌクレアーゼ分解に対し耐性があることを特徴とする、請求項２、３、および５のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記第２オリゴヌクレオチド構成要素は、その５’末端のヌクレオチド間に少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１オリゴヌクレオチド構成要素に含まれる検出可能要素はフルオロフォアであることを特徴とする、請求項２、３、５、９、および１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのクエンチャが前記検出可能要素と関連することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記リガーゼは熱的に安定であり、エキソヌクレアーゼ活性を呈す前記酵素はホット・スタートするものであり、ステップ（ｂ）は６０〜１００℃の範囲の温度で行われることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
微小液滴において行われることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
個々の微小液滴から得られる結果をカウントするステップを含むことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡなどのポリヌクレオチドにおける多型を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然に存在するＤＮＡ配列の所定部位におけるヌクレオチドの変異は分子生物学において周知の現象であり、典型的に、正常つまり「野生型」の対立遺伝子と、一つまたは複数の「変異」形態とからなる多型形態を発現させる。この現象において対立遺伝子を発現させる多様体は単一ヌクレオチドであるが、該現象の一般例は一塩基多型（ＳＮＰ）の部位である。現在に至るまで、ヒトゲノムにおいて５０００を超える異なるＳＮＰが特定されたが、多くの場合において、それに関連した変異は、個々人の特定の病気へのかかりやすさ、つまり特定の感染症への耐性または特定の薬物への不耐性と強く相関することが確認されている。これらの観察結果は、その結果として医療診断の分野で重要な発展をもたらした。例えば今日では、被験者の生検において関連する既知の変異対立遺伝子の有無を検出することにより悪性腫瘍細胞をスクリーニングすることが可能である。しかしながらこのような変異対立遺伝子の検出は、該変異対立遺伝子の発生が天然の野生型と比較し往々にして少ないことを考えると、たいていの場合容易ではない。これは、往々にして複雑で、信号対雑音比の問題のある検出方法につながる。そのため、このようなスクリーニング方法およびそれを支える検出方法の、スピード、正確性、および信頼性を改善する必要がいまだ存在する。
【０００３】
遺伝物質のＳＮＰを検出するために多くのアプローチが今日用いられ、または、当技術分野で示唆されてきた。一つは、問題になっている対立遺伝子の全てを配列決定するステップを含むが、これは明らかに費用がかかり非常に時間もかかる。別のものは、リガーゼ連鎖反応を用いて対立遺伝子を増幅するステップを含む（例えば、BioTechniques (2004) 37(3) pp. 392-398を参照）。制限断片長多型法では、ＤＮＡ分析物を、ＳＮＰが発生すると知られている部位のみでポリヌクレオチド鎖を切断することが可能な、複数の部位特異的制限エンドヌクレアーゼで処置する。その後、そうして生成したオリゴヌクレオチド断片の長さおよび性質を分析することにより、ＳＮＰの有無を推測することが可能である。しかしながらこの方法は、時間のかかる多数の分離ステップを必要とするという欠点がある。それはまた、利用可能なエンドヌクレアーゼの範囲により制限される。別のアプローチでは、ＤＮＡ分析物を、一対の対立遺伝子特異的プローブ、例えば、それぞれが異なる関連フルオロフォアを有する一対の分子ビーコンで処置する。この方法では、分析物をその相補的プローブにアニールさせ、該プローブにハイブリダイズさせて、後者を引き起こすプロセスにおいてその特有の蛍光を放出させる。しかしながらこの方法は信号対雑音比の問題があり、特に、分析物において変異対立遺伝子の発生頻度が野生型と比較し非常に少ない場合は誤検出の可能性がある。
【０００４】
この第２アプローチの修正において、変異対立遺伝子を保持するＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅してから検出するステップを含めることにより、信号対雑音比の問題に対処する。例えば、Genome Res. Jan 2001, 11(1) pp.163-169およびBioTechniques (2003) 34 pp.1068-1072では、（１）２つの異なる多型を増幅するための、２つの対立遺伝子特異的プライマーおよび逆プライマーと、（２）生成した２つの種のアンプリコンの一方または他方に選択的にハイブリダイズさせるのに適応した、異なって標識された２つの分子ビーコンとを含む五成分系を用いて変異対立遺伝子が存在するポリヌクレオチドを増幅し、検出することが可能であることが示されている。
【０００５】
米国特許第５４８７９７２号明細書は、標識したヌクレオチドを用いて標的核酸を検出するプロセスであって、核酸ポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性を用いて、アニールおよび標識したオリゴヌクレオチドをハイブリダイズされた二重鎖から切断して、標識したオリゴヌクレオチド断片を検出のために解放するプロセスを教示する。それは欄２８において、フルオロフォアおよびクエンチャの両方を含むプローブの使用について言及する。しかしながら記載された方法は多型部位を識別するのに一対のプローブを共に用いるのではなく、標識された特定のプローブを用いて既知の配列の核酸標的を検出することを目的とする。
【０００６】
Molecular Biology 513 19-39 (2009)のアップルビー（Appleby）方法は、植物の一塩基多型を求める種々の方法についてのレビューを提供する。しかしながら、当社が開発した、対立遺伝子選択的消光プローブ系を用いる特定の方法は開示されていない。
【０００７】
欧州特許第１６０２７３３号明細書、国際公開第９７／４５５５９号、および国際公開第２０１３／００９１７５号は他の核酸検出方法を開示し、これにはプローブのライゲーションおよびそれに続くポリメラーゼ連鎖反応を用いた増幅を伴うものが含まれる。
【発明の概要】
【０００８】
当社はついに、ＰＣＲ増幅の使用に依拠せずに、ヌクレオチド多型の所定の部位において多様体を確実に特定できる代替方法を開発した。当社の発明の特徴は、それがリガーゼを用いて対立遺伝子を高精度で識別することである。したがって、本発明の第１態様により、ヌクレオチド多型部位の特徴を示す１つまたは複数のポリヌクレオチド種であって、式−Ｘ−Ｙ−Ｚ−を有する標的領域をそれぞれが備える１つまたは複数のポリヌクレオチド種を含むＤＮＡ分析物を特徴付ける方法であって、ＸおよびＺはそれぞれ、隣接する第１特徴的オリゴヌクレオチド領域および第２特徴的オリゴヌクレオチド領域であり、Ｙは前記部位を構成する多様体の一つであり、（ａ）リガーゼの存在下で、前記ポリヌクレオチド種の少なくとも１つに由来する標的領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを、（ｉ）−Ｘまたは−Ｘ−Ｙの配列に対し相補的な配列においてその３’末端で終端する一本鎖第１アプタマーと、（ｉｉ）−Ｚ−Ｙまたは（場合により）−Ｚの配列に対し相補的な配列においてその５’末端で終端し、検出不可能な状態にある検出可能要素で標識した一つまたは複数の一本鎖第２アプタマーとを含む一組の未使用プローブと反応させて、前記オリゴヌクレオチドと、第１アプタマーと、第２アプタマーの一つとを含む二本鎖使用済みプローブを生成するステップと、（ｂ）前記使用済みプローブを、３’から５’の方向で、二本鎖エキソヌクレアーゼ活性を呈するエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼで全てまたは部分的に消化して、少なくとも一つが目下検出可能な状態の検出可能要素を含む、それの構成要素たる単一ヌクレオチドにするステップと、（ｃ）その後、前記目下検出可能な要素に関連する検出特性を検出することにより前記Ｙ多様体の性質を特定するステップと、を含む方法を提供する。
【０００９】
加えて、本方法の鏡像バージョンおよび本発明の第２態様により、ヌクレオチド多型部位の特徴を示す１つまたは複数のポリヌクレオチド種であって、式−Ｘ−Ｙ−Ｚ−を有する標的領域をそれぞれが備える１つまたは複数のポリヌクレオチド種を含むＤＮＡ分析物を特徴付ける方法であって、ＸおよびＺはそれぞれ、隣接する第１特徴的オリゴヌクレオチド領域および第２特徴的オリゴヌクレオチド領域であり、Ｙは前記部位を構成する多様体の一つであり、（ａ）リガーゼの存在下で、前記ポリヌクレオチド種の少なくとも１つに由来する標的領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを、（ｉ）−Ｘまたは−Ｘ−Ｙの配列に対し相補的な配列においてその３’末端で終端し、検出不可能な状態にある検出可能要素で標識された一つまたは複数の一本鎖第１アプタマーと、（ｉｉ）−Ｚ−Ｙまたは（場合により）−Ｚの配列に対し相補的な配列においてその５’末端で終端する一本鎖第２アプタマーとを含む一組の未使用プローブと反応させて、前記オリゴヌクレオチドと、第１アプタマーの一つと、第２アプタマーとを含む二本鎖使用済みプローブを生成するステップと、（ｂ）前記使用済みプローブを、５’から３’の方向で二本鎖エキソヌクレアーゼ活性を呈するエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼで全てまたは部分的に消化して、少なくとも一つが目下検出可能な状態の検出可能要素を含む、それの構成要素たる単一ヌクレオチドにするステップと、（ｃ）その後、前記目下検出可能な要素に関連する検出特性を検出することにより前記Ｙ多様体の性質を特定するステップと、を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】蛍光の測定結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の方法は、生物源から得られる任意のＤＮＡ分析物に適用することが可能である。例えばＤＮＡは、微生物、ウイルス、植物または動物、特にヒトまたは他の哺乳動物から得ることが可能である。好適な一実施形態では、分析物は、組織生検、血液サンプル、皮膚、毛髪、尿および痰といった日々の医療業務で定期的に収集される試料などのヒト源に由来する。一実施形態では、ＤＮＡ分析物は血液サンプルにみられる遊離ＤＮＡを含む。この分析物は、必要な精製および前処置（例えば、細胞溶解）の後、ヌクレオチド多型部位を含むことが分かっているまたはその疑いのある、本来のＤＮＡ断片の形態をしたポリヌクレオチドを含むだろう。言い換えると、対象のポリヌクレオチドは、野生型または変異対立遺伝子を含むか否かという点でのみ異なるポリヌクレオチド種だろう。
【００１２】
本発明の一態様において、ポリヌクレオチドの多型部位は遺伝性疾患またはがんと相関することが知られるものであり、そのため変異対立遺伝子の存在は、このような疾病の存在またはそれにかかりやすい傾向を意味するものとなろう。別の態様では、この変異対立遺伝子の存在は、がん性細胞の存在と相関するまたはその存在を示唆するものであり、本方法を、患者をスクリーニングする目的で用いることを可能にしよう。さらに別の態様では、ポリヌクレオチドはウイルスまたは微生物のＤＮＡに由来し、変異対立遺伝子の存在は、１つまたは複数の薬物またはワクチンに対する親生物の耐性または影響されやすさを意味しよう。さらに別の態様では、変異対立遺伝子の存在は疾病の疫学に関する識見を提供しよう。好適な一実施形態では、ポリヌクレオチドの多型部位は１つまたは複数のＳＮＰであり、該ポリヌクレオチドは、各ＳＮＰにつき野生型ヌクレオチドまたは変異ヌクレオチドの存在にそれぞれ対応する２つのポリヌクレオチド種からなるだろう。
【００１３】
本発明の方法により特徴付けられるポリヌクレオチド種は、適宜、式−Ｘ−Ｙ−Ｚ（ＸおよびＺはそれぞれ、隣接する第１特徴的オリゴヌクレオチド領域および第２特徴的オリゴヌクレオチド領域であり、Ｙは多型を発現させる多様体の一つである）の標的領域を含む。一般に、隣接する領域−Ｘ−および−Ｚ−のヌクレオチド配列は、従来の配列決定研究から分かるだろう。この方法では、これら２つの領域の長さは２ヌクレオチド長超、好適には２〜５０ヌクレオチド長、最も好適には６〜５０ヌクレオチド長であろう。
【００１４】
本方法の一実施形態では、標的領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを、その対応する二本鎖ポリヌクレオチドから変性により得る。このような変性を行う方法は当技術分野で周知であり、これにはポリヌクレオチドをその融解温度まで加熱するステップが含まれ得る。
【００１５】
未使用の状態で（つまり、所定のプローブを、ポリヌクレオチドと選択的に反応させることにより「使用」するまで）、本発明の方法のステップ（ａ）で用いる一組のプローブは、一組の一本鎖アプタマー種を含む。本明細書で用いる場合、用語「アプタマー」は、上記ポリヌクレオチド分子の一つに結合することが可能な一本鎖核酸分子を意味する。上記の第１方法では、第１アプタマー種は、−Ｘまたは−Ｘ−Ｙの配列と相補的な配列においてその３’末端で終端するものである。このアプタマー種を第１方法では標識せず、第２方法では標識する。多型部位の３’側でオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることがこのアプタマー種の機能である。一実施形態では、第１アプタマーは最高１００ヌクレオチド長、好適には１０〜５０、より好適には１０〜２０ヌクレオチド長となろう。別の実施形態では、それは−Ｘまたは−Ｘ−Ｙの相補体である配列のみからなろう。第１方法の好適な一実施形態では、第１アプタマーの３’末端またはその近くのヌクレオチドの少なくとも１つは、エキソヌクレアーゼ分解に対し耐性のある領域を含むことをさらに特徴とする。これは、例えば、最後のヌクレオチド、好適には最後２つのヌクレオチドの間の結合を、従来のホスホジエステルの代わりにホスホロチオエートなどの耐性基を含むよう修正することにより実現可能である。このようなホスホロチオエート結合は２つの異性体の形で存在するため、本発明の一実施形態は、その２つに耐性のあるより多くの分解のみを用いるステップを含む。
【００１６】
第２アプタマー種について、これは−Ｚまたは−Ｚ−Ｙの配列に対し相補的な配列においてその５’末端で終端するものである。第２アプタマー種は第１方法では標識し、第２方法では標識しない。多型部位の５’側でオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることがこのアプタマー種の機能である。一実施形態では、第２アプタマーは最高１００ヌクレオチド長、好適には１０〜５０、最も好適には１０〜２０ヌクレオチド長である。別の実施形態では、それは−Ｚまたは−Ｚ−Ｙの相補体である配列のみからなるだろう。第２方法の好適な一実施形態では、第２アプタマーの５’末端またはその近くのヌクレオチドの少なくとも１つは、エキソヌクレアーゼ分解に対し耐性のある領域を含むことをさらに特徴とする。これは例えば、最後のヌクレオチド、好適には最後２つのヌクレオチドの間の結合を、従来のホスホジエステルの代わりにホスホロチオエートなどの耐性基を含むように修正することにより実現可能である。
【００１７】
第１方法および第２方法の一実施形態において、未使用のプローブは上記で定義した関連種の第１アプタマーおよび第２アプタマーという２つの構成要素からなり、ここでＹは多型部位を構成する対立遺伝子の一つに相当する。しかしながら、より好適な実施形態では、未使用のプローブは、３つの構成要素、（ａ）第１方法の場合は、第１アプタマー、および、多型部位を構成する２つの異なるＹ多様体に相当する一組の第２アプタマー種、または、（ｂ）（第２方法の場合は、）多型部位を構成する分析物上の２つの異なるＹ多様体に相当する一組の第１アプタマー種、および、第２アプタマーの、いずれか一方を含む。この場合、第１アプタマー種の組および（場合により）第２アプタマー種の組を、以下で述べる２つの異なる種の検出可能要素、特に、異なる波長で蛍光を発する２つの異なるフルオロフォアで標識する。最終的に、いずれの方法でも、未使用プローブ種の混合物を用いて、例えば、異なる多型を示す２つ以上のポリヌクレオチドに由来するオリゴヌクレオチドの混合物において、複数の多型部位を同時に特定することが可能であることを検討する。
【００１８】
検出可能要素自体は、原則として、容易に検出または測定することが可能である特徴的な検出特性を有する任意の要素を含むことが可能である。それらはまた、第１アプタマー種および（場合により）第２アプタマー種に配置し、その結果、それに関連する検出可能特性は、同数の検出可能要素が対応する数の遊離単一ヌクレオチドに結合する場合よりも検出しにくくなる。
【００１９】
好適な一実施形態では、検出可能要素はフルオロフォアを含み、該フルオロフォアは、第２アプタマーおよびステップ（ｂ）で消化する前の使用済みプローブが、該フルオロフォアが検出されるように設計した典型的な波長において実質的に非蛍光性であるように配置する。したがって、フルオロフォアは、電磁スペクトラムの広範部分にわたって一般的な低レベルのバックグラウンド蛍光を示し得るが、一般的には、この蛍光の強度が最大である１つまたは少数の特定の波長または波長包絡線が存在する。１つまたは複数のこれら最大値またはその近くでは、実質的に蛍光は発生すべきではない。本発明の文脈では、「実質的に蛍光を発しない」という用語または同等の言い回しは、所定のアプタマー種または使用済みプローブに付着した全フルオロフォア数より得られる蛍光の強度が、関連する特徴的な波長または波長包絡線において、同等数の遊離フルオロフォアの対応する蛍光強度の２５％未満、好適には１０％未満、より好適には１％未満、最も好適には０．１％未満であることを意味する。
【００２０】
原則として、任意の方法を用いて、プローブが未使用の状態で、フルオロフォアが、それぞれが対応する遊離単一ヌクレオチドに結合している場合よりも確実に弱く蛍光するようにすることが可能である。一つのアプローチは、クエンチャをそれにごく近接して追加で付着させることである。別のアプローチは、多数のフルオロフォアを互いにごく近接して同一のプローブに付着させる場合、それらは、前段落で記載した基準をクエンチャを必要とせずに達成できるほど十分に、互いを消光する傾向があるという観察結果に基づく。本特許の文脈では、フルオロフォア間またはフルオロフォアとクエンチャの間の「近接」を構成するものは、使用する特定のフルオロフォアおよびクエンチャ次第であり、場合によっては、オリゴヌクレオチドの構造的特徴次第であろう。従ってこの用語は、第２アプタマー上の任意の特定の構造的配置ではなく、必要な結果を参照して解釈することが意図される。しかしながら、例を提供することのみを目的として、隣接するフルオロフォア同士、または、隣接するフルオロフォアおよびクエンチャが、それらの特徴的なフェルスター距離に応じた距離（典型的には５ｎｍ未満）で離れる場合、十分な消光が達成されることが指摘される。
【００２１】
好適には、第１アプタマーまたは（場合により）第２アプタマーは、最大２０個、好適には最大１０個、最も好適には最大５個のフルオロフォアで標識する。最大限の利点を得るため、少なくとも２個、好適には少なくとも３個のフルオロフォアで標識することが好ましい。従って、これらの最大値および最小値の任意の変更により構成される範囲が具体的に想定されるため、それを本明細書で開示する。クエンチャを用いる場合は同様に、第１アプタマーまたは第２アプタマーは、最大２０個、好適には最大１０個、最も好適には最大５個のフルオロフォアで標識することが好ましい。
【００２２】
フルオロフォアそのものについて、それらは原則として当技術分野で従来用いられているもののいずれかから選択することが可能であり、それには、フルオレセイン、ローダミンなどのキサンテン部、ならびに、フルオレセインイソチオシアネートおよびローダビンＢなどのその誘導体；（ヒドロキシクマリン、メチルクマリン、およびアミノクマリンなどの）クマリン部、ならびに、Cy2、Cy3、Cy5、およびCy7などのシアニン部が含まれるが、これらに限定されない。具体例には、以下の一般に用いられる染料に由来するフルオロフォアが含まれる：Alexa染料、シアニン染料、Atto Tec染料、およびローダミン染料。例にはまた、Quasar 570などのホスホラミダイト染料と同様に、Atto 633（ATTO-TEC GmbH）、Texas Red（登録商標）、Atto 740（ATTO-TEC GmbH）、ローズベンガル、Alexa Fluor（商標）750 C5-maleimide（Invitrogen）、Alexa Fluor（商標）532 C2-maleimide（Invitrogen）、Rhodamine Red C2-maleimide、およびRhodamine Greenが含まれる。あるいは、量子ドットまたはLI-COR Biosciencesにより提供されるような近赤外染料を用いることが可能である。フルオロフォアは、典型的には、当技術分野で既知の化学的方法を用いて、ヌクレオチド塩基を介して第１アプタマーまたは第２アプタマーに付着する。
【００２３】
適切なクエンチャは、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）メカニズムにより機能するものである。上記フルオロフォアに関連して用いることができる商業的に利用可能なクエンチャの非限定的例には、DDQ-1、Dabcyl、Eclipse、Iowa Black（登録商標）FQ、Iowa Black（登録商標）RQ、IR Dye-QC1、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、QSY-7、およびQSY-21が含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
本発明の方法で用いる第１アプタマーおよび第２アプタマーは、原則として、Ｈ−ホスホナート法、ホスホジエステル合成、ホスホトリエステル合成、および亜リン酸トリエステル合成を含む、当技術分野で既知のヌクレオチド組み立て法のいずれかにより製造することが可能である。ヌクレオチドホスホラミダイト基礎的要素を用いる方法が、その反応度のため好適である。これらの方法では、非ブロック化、カップリング、キャッピング、および酸化を含む繰り返し４ステップ工程において、選択したヌクレオチドホスホラミダイトを成長するヌクレオチド鎖に５’位置で連続して追加することにより、合成が起きる。このプロセスの繰り返し性質は、それをオートメ化に特に適したものにし、これを行う機械は市場で用意に入手できる。
【００２５】
ステップ（ａ）は、１０〜１００℃、好適には１０〜６０℃の範囲の温度で、オリゴヌクレオチド、第１アプタマー、および第２アプタマーをリガーゼの存在下で反応させることにより行う。当技術分野で従来用いられている、この種の任意の酵素を用いることができる。リガーゼは、好適には熱安定的なものである。一実施形態において、ステップ（ａ）で生成した使用済みプローブは、エキソヌクレアーゼ活性が始まる点で一本鎖オーバーハングを有する、二本鎖の形をしていよう。
【００２６】
ステップ（ｂ）では、３’から５’（第１方法）または５’から３’（第２方法）のいずれかの方向で作用することができる、エキソヌクレアーゼ作用またはポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により、検出可能状態にある検出可能要素を少なくとも１つが含む単一ヌクレオチド一リン酸塩を、使用済みプローブから解放する。その際、任意の未使用の標識したアプタマーに存在する検出可能要素は同時に解放しないことが重要である。そのため、このステップで用いるエキソヌクレアーゼまたは同等物は二本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有するものであるべきであり、その結果、使用済みプローブが未使用プローブよりも長く、そのためより高い融点を有するという事実により使用済みプローブのみを消化することが可能になる。
【００２７】
ステップ（ｂ）はまた、１０〜１００℃、好適には３０〜１００℃、より好適には５０〜１００℃、さらにより好適には６０〜１００℃、最も好適には、使用済みプローブの融点と、アニールしたが未反応の任意の生成物の融点の間の範囲の温度で行う。一実施形態において、ステップ（ｂ）は５０〜９０℃、好適には５０〜８５℃の範囲で行う。このステップで用いることが可能なエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼの例には、KOD、KOD HS、KOD Xstreme Hot Start、Q5、Q5 Hot Start、Phusion、Phusion HS、Dnase I（RNase-free）、Exonuclease I(ex E.coli)、Exonuclease III (ex E.coli)、Exonuclease T、Exonuclease V（RecBCD）、Lambda Exonuclease、Micrococcal Nuclease、Mung Bean Nuclease、Nuclease BAL-31、RecJf、T5 Exonuclease、およびT7 Exonucleaseが含まれる。好適には、このステップで用いるエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼは、ホット・スタートするものであり、その結果、標的オリゴヌクレオチドにアニールしたが第１アプタマーにはライゲーションしていない任意の第２アプタマーは、このステップが起きる前に変性する。ステップ（ｂ）の１つの正味の影響は、検出可能要素で標識した遊離単一ヌクレオチド一リン酸塩のカスケードが解除され、ここにおいて、特徴的な検出特性を測定することが可能であることである。従って、使用済みプローブが多数の消光したフルオロフォアを含む場合、これは、フルオロフォアで標識した単一ヌクレオチドの「カスケード」につながり、該フルオロフォアが互いに、および／または、任意の関連するクエンチャから分離するようになることにより、今度は自由に、正常に蛍光発光する。そのため観察者は時間と共に蛍光シグナルの成長を観察する。
【００２８】
本発明の方法で用いる第１アプタマーおよび（場合により）第２アプタマーが一つの対立遺伝子種に対して選択性を有する場合、標識したアプタマー種が選択性を有する特定のＹ対立遺伝子を含むオリゴヌクレオチドが反応媒体に存在する場合にのみ検出可能要素は遊離することを、当業者は容易に理解しよう。これは、本発明の方法を、より少ない対立遺伝子を確実に検出するのに特に適したものにする。
【００２９】
本方法の好適な一実施形態では、使用済みプローブの第１アプタマー構成要素および第２アプタマー構成要素と関連する全鎖のエキソヌクレアーゼ分解が完了するまで、または、好適には、一方のアプタマーがエキソヌクレオリシスに対し耐性があるように設計した場合（上記参照）は、もう一方の標識したアプタマーと関連する鎖の一部のエキソヌクレアーゼ分解が完了するまで、ステップ（ｂ）は続く。新しい、標識したアプタマーのライゲーションがその後起き得、その結果、ステップ（ａ）のみか、または、ステップ（ａ）かつ（ｂ）のいずれかが周期性となり、各サイクルが遊離フルオロフォアのさらなる解放をまねく。このようにして、関連対立遺伝子を有する低レベルのまたは単一分子のオリゴヌクレオチドのみが反応媒体に存在する場合でも、強く特徴的なシグナルを得ることが可能である。
【００３０】
その後、ステップ（ｃ）において、単一ヌクレオチド上の検出可能要素と関連する検出特性を検出する。これを行う方法は当技術分野で周知であり、例えば、蛍光は、刺激放射線源（例えば、レーザ）および、種々のフルオロフォアの特徴的な蛍光波長または波長包絡線に同調させた光検出器または同等の装置を用いて検出することができる。これは次に、多様体ひいては存在した特定の対立遺伝子に特徴的な電気シグナルを光検出器に生成させる。
【００３１】
本発明の第３態様では、上記で定義した方法を、液滴、適切には微小液滴において全てまたは部分的に行う。このアプローチの利点は、それが多くの個々の標的分子をカウントするため、非常に少ないコピー数も検出し、正確な対立遺伝子比を得ることを可能にすることである。本発明のこの第３態様の方法では、ステップ（ｃ）はその後、各液滴を順番に照会して、遊離した検出可能要素を、ひいては元のポリヌクレオチド種に関連する対立遺伝子の性質を特定するステップを好適には含む。
【００３２】
適切には、用いる微小液滴の直径は１００ミクロン未満、好適には５０ミクロン未満、より好適には２０ミクロン未満、さらにより好適には１５ミクロン未満である。全ての直径のうち最も好適なのは２〜２０ミクロンの範囲にある。本方法の微小液滴バージョンは、例えば微小流体チップ上で行うことが可能である。
【実施例】
【００３３】
本発明の方法をここで以下の実施例により説明する。
【００３４】
全般
これらの例では、以下の構成要素を含む反応混合物を調製した：
１アリコートの緩衝剤；
それぞれ１０ｎＭのプローブアプタマー；
１ｎＭの標的分子；
８０ＵのＴａｑリガーゼ；
０．８ＵのPhusion II exonuclease。
この実験では、１アリコートの緩衝剤は、
４０ｍＭのトリス塩酸塩ｐＨ８．０；
２．７５ｍＭのＭｇＣｌ２；
１００ｍＭのＫＣｌ；
０．５ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）；
４００μＭのＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）；
０．０１％のTween-20（界面活性剤）を含んだ。
【００３５】
用いるプローブの構成要素は、以下のアプタマーを含んだ：
5'-TCGTGCCTCATCGAACATG*A-3'（第１アプタマー）
5'-PCGAGGFFQFFGGTTTGTGGT-3’（第２アプタマー）
（ここで、*はホスホロチオエート連結であり、ＦはAtto-655を標識したチミン塩基であり、ＱはBHQ-2を標識したチミン塩基であり、Ｐは５’ホスフェートである）。
【００３６】
５’末端から２６番目のヌクレオチドにあるＳＮＰに特徴的な一組の対立遺伝子を表す以下の一本鎖オリゴヌクレオチドも調製した。
5'-GTAGGTCCCACAAACCAAAAACCTCGTCATGTTCGATGAGGCACGATAA-3'（G対立遺伝子）
5'-GTAGGTCCCACAAACCAAAAACCTCTTCATGTTCGATGAGGCACGATAA-3'（T対立遺伝子)
【００３７】
２つのアプタマーを選択して完全相補的にＧ対立遺伝子にアニールさせたが、Ｔ対立遺伝子には、第２アプタマーの５’末端に対応した単一ヌクレオチドのミスマッチによりアニールしなかった。
【００３８】
（実施例１）
Ｇ対立遺伝子を標的分子として含む反応混合物を、５０℃で３０分間、続いて７０℃で１５分間という多数の温度サイクルを用いてインキュベーションした。各サイクルの終わりに、ヘリウムネオンレーザによる刺激の後、６２９ｎｍでAtto-655フルオロフォアにより放出された蛍光を測定し、その結果を図１にグラフを使って表した（実線−「ミスマッチなし」）。
【００３９】
（実施例２）
実施例１を、Ｔ対立遺伝子を標的分子として用いて繰り返した。結果を図１にグラフを使って表した（点線−「ミスマッチ」）。
【００４０】
Ｔ対立遺伝子ではなくＧ対立遺伝子における蛍光シグナルの成長はプローブの選択性を示し、それらを確実に識別するための本発明の方法の論拠を示す。
【図１】
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【配列表】
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