(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウム・ディフィシルの胞子発芽をインビトロで阻害する方法であって、クロストリジウム・ディフィシルの胞子をＦｅ３−δＯ４ナノ粒子（δは０〜０．３の数）の有効量と共にインキュベートすることを含む、方法。
【請求項２】
前記ナノ粒子が、切頂八面体の形状を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記切頂八面体の各辺が、約５〜２５ｎｍの長さを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記長さが約１４ｎｍである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記長さが約２２ｎｍである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ナノ粒子の前記有効量が約５〜５００μｇ／ｍＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
クロストリジウム・ディフィシル感染の処置のための医薬であって、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子（δは０〜０．３の数）の有効量を含み、前記Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子がクロストリジウム・ディフィシルの胞子発芽を阻害する、医薬。
【請求項８】
前記ナノ粒子が切頂八面体の形状を有する、請求項７に記載の医薬。
【請求項９】
前記切頂八面体の各辺が、約５〜２５ｎｍの長さを有する、請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
前記長さが約１４ｎｍである、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
前記長さが約２２ｎｍである、請求項９に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．本発明の分野
【０００２】
本開示は、クロストリジウム・ディフィシルの阻害に関する。より具体的には、本開示は、クロストリジウム・ディフィシルの胞子発芽の阻害における、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子の新規の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
【０００４】
胞子形成は、紫外線放射、乾燥、高温、極端な凍結及び化学消毒剤に耐えることを含む、過酷な環境及び栄養欠乏を、細菌が乗り切ることができるようにする。胞子は、環境が良好になると、増殖型状態に自身を再活性化することができる。それ故に、胞子を形成する病原体は、臨床的疾患の管理及び予防に対して挑戦状（例えば、バチルス及びクロストリジウムの感染）を突きつけている。クロストリジウム・ディフィシルは、医療関連感染、具体的にはＣ．ディフィシル感染（ＣＤＩ）に関連する病原体であり、抗生物質処置に関連する下痢、偽膜性大腸炎、腹痛、発熱及び死の主な原因の一つである。ＣＤＩが発見されると、疾患を封じ込めるためには、ほんのわずかの抗生物質しか利用可能でない。さらに、第一選択の抗生物質の失敗率及び再発率の両方が高い。その結果、寄与死亡率は、診断後３０日で６．９％、１年で１６．７％である。
【０００５】
Ｃ．ディフィシルの胞子は、ＣＤＩの主な原因である。酸素感受性栄養細菌と比較すると、Ｃ．ディフィシル胞子は、過酷な環境（病院の表面など）に最大数ヶ月耐える可能性がある。腸管中の正常フローラが、Ｃ．ディフィシルの増殖を抑制することができ、それ故にＣＤＩを抑制し得ることが知られている。しかしながら、ＣＤＩは通常、抗生物質の長期使用に供されている患者で起こり、それはしばしば医療従事者から獲得した胞子により開始される。胞子がヒト消化管に入ると、それらはタウロコール酸塩又はそれらの誘導体に暴露されることで発芽し、次いで結腸に定着する。Ｃ．ディフィシルの病毒性は、ｔｃｄＡがコードする毒素Ａ（エンテロトキシン）、及びｔｃｄＢがコードする毒素Ｂ（サイトトキシン）の発現にそれぞれ依存する。これらの両方が、感染した病巣での好中球の浸潤及び腸の炎症を引き起こす。
【０００６】
ＣＤＩの発症が増加しており、これが世界中の医療関連感染の主な原因になってきているという観点から、どのようにＣＤＩを効率的に制御又は処置するかは、喫緊の課題になっている。メトロニダゾール、バンコマイシン、及びフィダキソマイシンを含む、多くの様々な抗生物質が、ＣＤＩの処置に使用されてきた。これらの抗生物質は通常、ＣＤＩに関連する症候を遅延又は停止することができるが、これらはまた、Ｃ．ディフィシルの抗生物質耐性株を生じさせる可能性がある。加えて、化学薬剤に対して耐性のある胞子の出現は、ＣＤＩの臨床的管理をさらに悪化させる。いくつかの新たに設計されたコール酸塩誘導体は、ＣＤＩに対する有望な効果を示す。しかしながら、それらは今もなお前臨床研究下にある。次亜塩素酸ナトリウムは、標準的な消毒剤であり、際立った抗微生物活性を示すが、それはまた、組織への刺激及び腐食性を含む、好ましくない効果を有している。
【０００７】
既知の典型的な処置の不十分な治療的有効性に起因して、様々な新規のアプローチが、現在開発されているところであり、この医療上の悩みの種を解決しようとしている。これらのアプローチの中で、ナノ粒子は、反応性酸素種の生成、細胞膜の破壊、有毒なイオンの放出、及び／又はチオ基結合能力を含む、様々なメカニズムを介して作用するそれらの抗細菌特性のために、多くの関心が寄せられてきた。抗細菌特性を備える既知のナノ粒子は、Ａｇ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、及びゼロ価鉄ナノ粒子を含む。それにもかかわらず、最新の抗細菌ナノ粒子は、栄養細胞に対する殺生物活性を有するが、胞子に対する殺胞子活性を有しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前述の観点から、胞子の発芽を制御し、ＣＤＩを処置するために、関連分野において、有効な及び生体適合性の胞子制御戦略を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
概要
以下は、読者に基本的な理解を提供するために、本開示の簡単な概要を提示する。この概要は、本開示の広範な概説ではなく、本発明の主要な／重要な要素を特定するものではなく、又は本発明の範囲を正確に記述するものでもない。その唯一の目的は、後に提示されるより詳細な説明の前置きとして、本明細書に開示されるいくつかの概念を簡単な形で提示することである。
【００１０】
本明細書に具体化され、広く記載されているように、本明細書の開示は、Ｃ．ディフィシルの胞子発芽の阻害における、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子（δが０〜０．３の数）の新規の使用に関する。したがって、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子は、ＣＤＩを処置するための医薬品の製造に使用することができる。
【００１１】
本開示の一つの態様は、Ｃ．ディフィシルの胞子発芽をインビトロで阻害する方法に関する。この方法は、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子（δが０〜０．３の数）の有効量をＣ．ディフィシルの胞子と共にインキュベートすることを含む。
【００１２】
本開示のいくつかの実施形態によれば、ナノ粒子は切頂八面体の形状を有し、ここで切頂八面体の各辺は約５〜２５ｎｍの長さを有する。一つの実施形態において、各辺の長さは約１４ｎｍである。別の実施形態において、各辺の長さは約２２ｎｍである。
【００１３】
本開示のいくつかの実施形態によれば、ナノ粒子の有効量は、少なくとも５μｇ／ｍＬであり、好ましくは約５〜５００μｇ／ｍＬである。
【００１４】
本開示はまた、ＣＤＩを有する又は有する疑いのある被験体を処置するための組成物及び／又は方法を対象とする。したがって、この組成物は、上述のＦｅ３−δＯ４ナノ粒子（δが０〜０．３の数）の有効量及び医薬的に許容される担体を含む。ナノ粒子は切頂八面体の形状を有する。本開示のいくつかの実施形態によれば、切頂八面体の各辺は、約５〜２５ｎｍの長さを有する。本開示の一つの好ましい実施形態において、各辺の長さは約１４ｎｍである。別の特定の実施形態において、各辺の長さは約２２ｎｍである。
【００１５】
この方法は、被験体に本開示の組成物の治療的有効量を投与して、ＣＤＩの症候を緩和する又は改善することを含む。本開示のいくつかの実施形態によれば、約０．４〜４ｍｇ  Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子／Ｋｇ体重を被験体に投与してよい。好ましくは約２〜４ｍｇ  Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子／Ｋｇを被験体に投与する。
【００１６】
本開示のいくつかの実施形態によれば、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子を、経口、経鼻、又は非経口投与のいずれかの経路によって投与してよい。非経口投与は、筋肉内、静脈内、皮下、又は腹腔内注射のいずれかであってよい。
【００１７】
本開示の付随する特徴及び利点の多くが、以下の詳細な説明を参照してよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
この説明は、以下の詳細な説明を添付の図面に照らして読むことによって、よりよく理解されるだろう。
【００１９】
【図１Ａ】図１は、本開示の例１．１に係る、Ｃ．ディフィシル胞子発芽の動態を示す図表であり、ここで、胞子が、（Ａ）ＺｎＯナノ粒子、（Ｂ）Ａｇナノ粒子、（Ｃ）Ｆｅ２Ｏ３ナノ粒子、（Ｄ）Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子、（Ｅ）非酸化鉄コア−金シェルナノ粒子（以後、「Ｆｅ＠Ａｕナノ粒子」と呼ばれる）、及び（Ｆ）Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子で、それぞれ処置されている。
【図１Ｂ】図１は、本開示の例１．１に係る、Ｃ．ディフィシル胞子発芽の動態を示す図表であり、ここで、胞子が、（Ａ）ＺｎＯナノ粒子、（Ｂ）Ａｇナノ粒子、（Ｃ）Ｆｅ２Ｏ３ナノ粒子、（Ｄ）Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子、（Ｅ）非酸化鉄コア−金シェルナノ粒子（以後、「Ｆｅ＠Ａｕナノ粒子」と呼ばれる）、及び（Ｆ）Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子で、それぞれ処置されている。
【図１Ｃ】図１は、本開示の例１．１に係る、Ｃ．ディフィシル胞子発芽の動態を示す図表であり、ここで、胞子が、（Ａ）ＺｎＯナノ粒子、（Ｂ）Ａｇナノ粒子、（Ｃ）Ｆｅ２Ｏ３ナノ粒子、（Ｄ）Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子、（Ｅ）非酸化鉄コア−金シェルナノ粒子（以後、「Ｆｅ＠Ａｕナノ粒子」と呼ばれる）、及び（Ｆ）Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子で、それぞれ処置されている。
【図１Ｄ】図１は、本開示の例１．１に係る、Ｃ．ディフィシル胞子発芽の動態を示す図表であり、ここで、胞子が、（Ａ）ＺｎＯナノ粒子、（Ｂ）Ａｇナノ粒子、（Ｃ）Ｆｅ２Ｏ３ナノ粒子、（Ｄ）Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子、（Ｅ）非酸化鉄コア−金シェルナノ粒子（以後、「Ｆｅ＠Ａｕナノ粒子」と呼ばれる）、及び（Ｆ）Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子で、それぞれ処置されている。
【図１Ｅ】図１は、本開示の例１．１に係る、Ｃ．ディフィシル胞子発芽の動態を示す図表であり、ここで、胞子が、（Ａ）ＺｎＯナノ粒子、（Ｂ）Ａｇナノ粒子、（Ｃ）Ｆｅ２Ｏ３ナノ粒子、（Ｄ）Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子、（Ｅ）非酸化鉄コア−金シェルナノ粒子（以後、「Ｆｅ＠Ａｕナノ粒子」と呼ばれる）、及び（Ｆ）Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子で、それぞれ処置されている。
【図１Ｆ】図１は、本開示の例１．１に係る、Ｃ．ディフィシル胞子発芽の動態を示す図表であり、ここで、胞子が、（Ａ）ＺｎＯナノ粒子、（Ｂ）Ａｇナノ粒子、（Ｃ）Ｆｅ２Ｏ３ナノ粒子、（Ｄ）Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子、（Ｅ）非酸化鉄コア−金シェルナノ粒子（以後、「Ｆｅ＠Ａｕナノ粒子」と呼ばれる）、及び（Ｆ）Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子で、それぞれ処置されている。
【００２０】
【図２】図２は、本開示の例１．２に係る、Ｃ．ディフィシル胞子発芽の動態を示す図表であり、ここで、胞子が、５００μｇ／ｍＬの２２ｎｍ−Ｆｅ３−δＯ４（▲）、５００μｇ／ｍＬの１４ｎｍ−Ｆｅ３−δＯ４（■）、５０μｇ／ｍＬの２２ｎｍ−Ｆｅ３−δＯ４（□）、５０μｇ／ｍＬの１４ｎｍ−Ｆｅ３−δＯ４（△）、及び３％ブリーチ（●）で、それぞれ処置されている。
【００２１】
【図３Ａ】図３は、本開示の例１．３に係る、Ｃ．ディフィシル胞子発芽の動態を示す図表であり、ここで、株ＣＣＵＧ  １９１２６（Ａ）及び株ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１８０５（Ｂ）の胞子が、５００μｇ／ｍＬのＦｅ３−δＯ４（▲）、
【数１】
0006385573.tif 000002
、５μｇ／ｍＬのＦｅ３−δＯ４（△）、及び３％ブリーチ（●）で、それぞれ処置された。
【図３Ｂ】図３は、本開示の例１．３に係る、Ｃ．ディフィシル胞子発芽の動態を示す図表であり、ここで、株ＣＣＵＧ  １９１２６（Ａ）及び株ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１８０５（Ｂ）の胞子が、５００μｇ／ｍＬのＦｅ３−δＯ４（▲）、
【数１】
0006385573.tif 000003
、５μｇ／ｍＬのＦｅ３−δＯ４（△）、及び３％ブリーチ（●）で、それぞれ処置された。
【００２２】
【図４】図４は、本開示の例１．４に係る、コントロール、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子、及びブリーチでそれぞれ処置されたＣ．ディフィシル栄養細胞の生存能力を示すヒストグラムである。
【００２３】
【図５】図５は、本開示の例２に係る、ｍｏｃｋコントロール（胞子単独）、５０μｇ／ｍＬ  Ｆｅ３−δＯ４、及び５００μｇ／ｍＬ  Ｆｅ３−δＯ４でそれぞれ処置したＣ．ディフィシル胞子のＴＥＭ画像であり、この写真は、１０，０００ｘ（上側のパネル）及び３０，０００ｘ（下側のパネル）の倍率で、それぞれ撮影された。
【００２４】
【図６】図６は、本開示の例２に係る、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子処置を行った（レーン４−６）又は行っていない（レーン１−３）Ｃ．ディフィシル胞子の細胞外タンパク質（上側のパネル）及び細胞内タンパク質（下側のパネル）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析である。
【００２５】
【図７Ａ】図７Ａは、本開示の例３．１に係る、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子処置を行った（白いバー）又は行っていない（黒いバー）胞子誘導ＣＤＩマウスの平均体重減少を示すヒストグラムである。
【００２６】
【図７Ｂ】図７Ｂは、本開示の例３．１に係る、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子処置を行った（白いバー）又は行っていない（黒いバー）胞子誘導ＣＤＩマウスの盲腸重量を示すヒストグラムである。
【００２７】
【図７Ｃ】図７Ｃは、本開示の例３．１に係る、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子処置を行った又は行っていない胞子誘導ＣＤＩマウスからそれぞれ単離された盲腸の炎症状態を示している。画像は、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）によって検出し（左のパネル）、データは分析してヒストグラムとして提示している（右のパネル）。
【００２８】
【図７Ｄ】図７Ｄは、本開示の例３．１に係る、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子処置を行った（右のパネル）又は行っていない（左のパネル）胞子誘導ＣＤＩマウスからそれぞれ単離された結腸組織の組織病理学的画像を示す写真である。この写真は、顕微鏡下で、２０ｘ又は４０ｘの倍率で、それぞれ撮影されている。
【００２９】
【図７Ｅ】図７Ｅは、本開示の例３．１に係る、示されている炎症性遺伝子のＲＮＡ発現を示すヒストグラムであり、ＲＮＡは、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子処置を行った（黒いバー）又は行っていない（白いバー）胞子誘導ＣＤＩマウスの結腸からそれぞれ抽出される。
【００３０】
【図８】図８は、本開示の例３．２に係る、０、２、又は４ｍｇ  Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子／Ｋｇ体重で処置された胞子誘導ＣＤＩマウスからそれぞれ単離された盲腸の炎症状態を示しており、画像はＩＶＩＳにより検出され（上側のパネル）、データは分析されてヒストグラムとして表されている（下側のパネル）。
【００３１】
一般的な慣行にしたがい、記載されている様々な特徴／要素は、縮尺どおりに描かれていないが、代わりに、本発明に関連する特定の特徴／要素を示すのに最良に描かれている。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
好ましい実施形態の詳細な説明
添付の図面に関連して以下に提供される詳細な説明は、本実施例の説明として意図されており、本実施例を構築又は利用できる唯一の形態を表すことを意図するものではない。この説明は、実施例の機能並びに実施例を構築及び操作するための一連のステップを記載する。しかしながら、同一又は等価の機能及び一連のステップは、異なる例により達成することができる。
【００３３】
便宜上、明細書、実施例及び添付の請求項において用いられるある特定の用語がここに集められる。本明細書中で他に定義されない限り、本開示において用いられる科学技術的専門用語は、当業者によって一般に理解され使用される意味を有するものとする。また、文脈によって特に要求されない限り、単数形の用語はその複数形を含むものとし、複数形の用語は、その単数形を含むものとすることが理解されるだろう。具体的には、文脈上別段の明示がない限り、本明細書中及び請求項で使用される、単数形「ａ」及び「ａｎ」は、複数形の参照を含む。また、本明細書中及び請求項で使用される、用語「少なくとも１つ」及び「１又は複数の」は、同じ意味を有し、１、２、３、又はそれ以上を含む。
【００３４】
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターが近似値であるにもかかわらず、特定の例に示された数値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、いずれの数値も、本質的に、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる、ある特定の誤差を含む。また、本明細書中で使用される、用語「約」は、一般に、所与の値又は範囲の１０％、５％、１％、又は０．５％以内を意味する。あるいは、用語「約」は、当業者によって考慮される場合、許容される平均値の標準誤差内にあることを意味する。操作例／実施例以外において、又は特に明記しない限り、本明細書中に開示される材料の量、時間、温度、操作条件、量の比などについての、数値範囲、量、値及びパーセンテージの全てが、すべての場合において、用語「約」により修飾されているものと理解されるべきである。したがって、反対に示されない限り、本開示及び添付の請求項に記載される数値パラメーターは、所望に応じて変化することのできる近似値である。少なくとも、各数値パラメーターは、報告された有効数字の数に照らして、及び通常の丸め技法を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。
【００３５】
本明細書中で使用される、用語「非化学量論的な」は、明確に定義された自然数の比によって表現することができず、それ故に定比例の法則に反する、元素組成を有する、化学化合物を説明するために使用される。すなわち、非化学量論的な化合物は、全く同じ質量割合の元素を含有しない。
【００３６】
本明細書中で使用される、用語「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、ＣＤＩに関連する症候、二次障害又は状態を、部分的に又は完全に防止、改善、軽減及び／又は管理することを包含する。本明細書中で使用される用語「処置」は、ＣＤＩの１又は複数の症候、二次障害又は特徴の、部分的な又は完全な緩和、改善、軽減、発症の遅延、進行の阻害、重症度の軽減、及び／又は発症率の低下を目的とした、ＣＤＩに関連する症候、二次障害、又は状態を有する被験体への、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子の適用又は投与を指す。ＣＤＩに関連する症候、二次障害、及び／又は状態としては、下痢、腹痛、発熱、不快な大便臭、偽膜性大腸炎及び死が含まれるが、これらに限定されない。処置は、ＣＤＩに関連する症候、二次障害、及び／又は状態を発症するリスクを減少させる目的で、当該症候、障害、及び／又は状態の初期徴候のみを示す被験体に投与してよい。処置は、「有効」という用語が本明細書中で定義されるように、１又は複数の症候又は臨床的マーカーが減少する場合に、一般に「有効」である。あるいは、処置は、症候、障害又は状態の進行が軽減又は停止した場合に、「有効」である。
【００３７】
本明細書中で使用される用語「治療的有効量」は、所望の応答を生じるのに十分な成分（本発明のＦｅ３−δＯ４ナノ粒子など）の量を指す。特定の有効量は、処置される特定の状態、被験体の身体状態（例えば、被験体の体質量、年齢、又は性別）、処置されるほ乳類又は動物のタイプ、処置の期間、同時療法の性質（存在する場合）、及び用いられる特定の製剤などの因子で変わるだろう。治療的有効量はまた、治療的に有益な効果が、成分又は組成物のあらゆる有毒な又は有害な効果を上回る量である。有効量は、例えば、グラムで、ミリグラムで又はマイクログラムで、又はミリグラム毎体重のキログラム（ｍｇ／ｋｇ）として、表すことができる。あるいは、有効量は、モル濃度、質量濃度、体積濃度、質量モル濃度、モル分率、質量分率及び混合比などの、医薬組成物中の活性成分の濃度で表すことができる。具体的には、本明細書中に記載されるＦｅ３−δＯ４ナノ粒子に関連して使用される用語「治療的有効量」は、被験体におけるＣＤＩの症候を緩和する又は改善するのに十分な、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子の量を指す。
【００３８】
用語「被験体」は、本開示の方法で処置可能な、ヒト種を含むほ乳類を指す。用語「被験体」は、一つの性別が具体的に示されていない限り、オス及びメスの両方の性別を指すと意図される。
【００３９】
本発明の実践が、以後、Ｃ．ディフィシルの胞子発芽の阻害における、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子（δが０〜０．３の数）の新規の使用に関して詳細に説明される。したがって、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子は、ＣＤＩを処置するために使用することができる。
【００４０】
本開示の一つの態様は、Ｃ．ディフィシルの胞子発芽をインビトロで阻害する方法に関する。この方法は、Ｃ．ディフィシル胞子の発芽を抑制するために、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子の有効量をＣ．ディフィシルの胞子と共にインキュベートするステップを含む。Ｆｅ３Ｏ４（すなわち、マグネタイト）又はγ−Ｆｅ２Ｏ３（すなわち、マグへマイト）と比較すると、本開示のＦｅ３−δＯ４は、部分的に酸化されていて非化学量論的であり、ここでδは、０〜０．３の非整数である。
【００４１】
本開示のＦｅ３−δＯ４は、任意の既知の方法にしたがい、例えば、本開示の実施例に例示される方法によって、調製することができる。典型的には、この方法は以下のステップを含む。
（１）  鉄アセチルアセトナートをオレイン酸及びトリオクチルアミン中に溶解させて、混合物溶液を形成させるステップ；
（２）  ステップ（１）の前記混合物溶液を、不活性環境下で（例えば、真空又はＮ２若しくはＡｒの存在下で）約３０分間還流させるステップ；
（３）  ステップ（２）の沈殿物を磁石で回収するステップ；
（４）  ステップ（３）の前記回収された沈殿物をトルエンで洗浄するステップ；
（５）  ステップ（４）の前記洗浄された沈殿物を前記磁石で回収するステップ；
（６）  ステップ（５）の前記回収された沈殿物を、ポリ（スチレン−ａｌｔ−マレイン酸）含有クロロホルム溶液中へ添加し、前記Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子を形成させるステップ、及び
（７）  ステップ（６）の前記Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子を前記磁石で回収するステップ。
【００４２】
上述の方法にしたがい調製されたＦｅ３−δＯ４ナノ粒子は、切頂八面体の形状を有してよく、切頂八面体の各辺の長さは約５〜２５ｎｍの範囲である。例えば、切頂八面体の各辺は、長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５ｎｍであってよい。一つの例において、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子は、約１４ｎｍの辺長さを有する。別の例において、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子は、約２２ｎｍの辺長さを有する。
【００４３】
本開示のいくつかの実施形態によれば、それぞれ１４ｎｍ及び２２ｎｍの辺長さを有するＦｅ３−δＯ４ナノ粒子は、Ｃ．ディフィシル胞子の発芽を抑制することができる。一つの例において、Ｃ．ディフィシル胞子は、ＣＣＵＧ  ３７７８０株に由来する。別の例において、Ｃ．ディフィシル胞子は、ＣＣＵＧ  １９１２６株に由来する。さらに別の例において、Ｃ．ディフィシル胞子は、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１８０５株に由来する。
【００４４】
他の実施形態によれば、本開示のＦｅ３−δＯ４ナノ粒子は、栄養型正常フローラの増殖を妨げることなく、殺胞子活性を示す。
【００４５】
本開示の他の実施態様において、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子は、ＺｎＯナノ粒子、Ａｇナノ粒子、Ｆｅ２Ｏ３ナノ粒子、Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子、又はＦｅ＠Ａｕナノ粒子よりも優れたＣ．ディフィシル胞子に対する阻害活性を示す。
【００４６】
本開示の一つの実施形態によれば、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子は、Ｃ．ディフィシルの胞子表面に直接結合することができ、胞子の無傷構造を崩壊させることにより、胞子から細胞内タンパク質を漏出させることができる。
【００４７】
本開示のいくつかの実施形態によれば、Ｃ．ディフィシル胞子の発芽を抑制するために、本ナノ粒子は、Ｃ．ディフィシル胞子が存在する、意図される部位又は標的に、少なくとも５μｇ／ｍＬ、好ましくは約５〜５００μｇ／ｍＬの濃度で、投与される。ナノ粒子の典型的な有効量は５０μｇ／ｍＬである一方、ナノ粒子の別の典型的な有効量は５００μｇ／ｍＬである。
【００４８】
本開示の別の態様は、ＣＤＩを有する又は有する疑いのある被験体を処置する方法に関する。この方法は、被験体に本開示のＦｅ３−δＯ４ナノ粒子の治療的有効量を投与して、ＣＤＩの症候を緩和する又は改善するステップを含み、ここでＦｅ３−δＯ４ナノ粒子は部分的に酸化されており、δは０〜０．３の非整数である。
【００４９】
本開示のいくつかの実施形態によれば、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子の処置有効性は、特定のＣ．ディフィシル胞子、例えば、ＣＣＵＧ  ３７７８０、ＣＣＵＧ  １９１２６、又はＢＡＡ−１８０５株の胞子など、により引き起こされるＣＤＩに限定されるものではなく、むしろあらゆるＣ．ディフィシル株の胞子により引き起こされるＣＤＩにあてはまる。
【００５０】
被験体に投与するのに適切なＦｅ３−δＯ４ナノ粒子はそれぞれ、約５〜２５ｎｍの、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５ｎｍなどの、辺長さを有する切頂八面体の形状を有する。本開示の一つの実施形態において、切頂八面体は、長さが約１４ｎｍの辺を有する。一方、別の実施形態において、切頂八面体の辺長さは約２２ｎｍである。
【００５１】
本開示のいくつかの実施形態によれば、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子は、約０．４〜４ｍｇ／Ｋｇの量で、すなわち、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、又は４．０ｍｇ／Ｋｇのいずれかの量で、経口、経鼻、又は非経口投与のいずれかの経路によって、被験体に投与される。好ましくは、この量は約２〜４ｍｇ／Ｋｇである。
【００５２】
本開示のＦｅ３−δＯ４ナノ粒子は、ＣＤＩの間及び／又はＣＤＩの後に投与することができる。一つの実施形態において、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子がＣＤＩの間に投与され、２ｍｇ／ＫｇのＦｅ３−δＯ４ナノ粒子が、ＣＤＩの症候を緩和する又は改善するのに十分である。別の実施形態において、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子がＣＤＩの後に投与され、２ｍｇ／Ｋｇ及び４ｍｇ／Ｋｇの両方のＦｅ３−δＯ４ナノ粒子が、ＣＤＩに対して殺胞子有効性を示す。
【００５３】
いくつかの実施形態において、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子は被験体に非経口的に投与され、非経口的とは筋肉内、静脈内、皮下、及び腹腔内注射を含むがこれらに限定されない。他の実施態様において、ナノ粒子は経口投与を介して処置される。
【００５４】
本開示は、ＣＤＩに関連する臨床的な医療上の悩みの種を解決する解決策を提供する。以下の実施例は、Ｃ．ディフィシル胞子の発芽の阻害及び／又はＣＤＩの処置におけるＦｅ３−δＯ４ナノ粒子の使用を示す。本開示の好ましい実施形態において、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子は、Ｃ．ディフィシル胞子によって誘導される大腸炎を和らげる可能性がある。実施例は例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【００５５】
実施例
【００５６】
材料及び方法
【００５７】
細菌インキュベーション及び胞子精製
【００５８】
Ｃ．ディフィシルＣＣＵＧ３７７８０及びＣＣＵＧ１９１２６は、ヨーテボリ（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ）大学（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、Ｓｗｅｄｅｎ）の微生物保存機関から購入した。ＡＴＣＣ  ＢＡＡ１８０５は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。全ての株は、０．５％酵母エキス（２１２７５０、ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ）及び０．１％Ｌ−システイン（７０４８０４６、Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｓｏｌｏｎ、ＨＯ）を添加したブレインハートインフュージョン培地（ＢＨＩＳ；２３７５００、ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中で、３７℃で、嫌気性条件下で、インキュベートした。胞子は、以前の研究で述べられた手順にわずかな修正を加えたもの（「Ｂｉｌｅ  Ｓａｌｔｓ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ａｓ  Ｃｏｇｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｓｐｏｒｅｓ．」  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００８、１９０：２５０５−２５１２）にしたがい、調製及び精製した。簡単に言うと、ＢＨＩＳ培地中のＣ．ディフィシルに、新鮮なＢＨＩＳ培地を添加することにより、光学密度６００ｎｍ（ＯＤ６００）が０．２の値になるように希釈した。９００μＬの希釈細菌懸濁液を、ＢＨＩＳ寒天を備える６穴ディッシュに添加し、次いでこのディッシュを、３７℃で、嫌気ジャー（Ｏ−ＨＰ０１１Ａ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｏｘｏｉｄ、Ｏｘｏｉｄ  Ｌｔｄ．、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）中で、４日間インキュベートした。次いで細胞を１ｍＬ氷冷滅菌Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（ＭＱ）水で６穴ディッシュから回収し、次いで４℃で一晩置いた。氷冷滅菌水での５回の洗浄の後、細菌を３ｍＬ氷冷滅菌ＭＱ水で再懸濁した。この懸濁液を遠心チューブ中の１０ｍＬ  ５０％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロース溶液（４０９７０４、Ｊ．Ｔ．  Ｂａｋｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＰＡ）の上に広げ、次いで３，５００ｇで２０分間遠心分離して、栄養細胞から胞子を分離した。遠心分離チューブの底部にある精製された胞子を、氷冷滅菌水で５回洗浄し、スクロースを除去した。精製された胞子は、使用するまで４℃で保存した。
【００５９】
胞子発芽
【００６０】
本研究において、２〜１０ｍＭのタウロコール酸塩を使用し、Ｃ．ディフィシルの株ＣＣＵＧ  ３７７８０における胞子発芽応答を調査した。株ＣＣＵＧ  ３７７８０は、ｔｃｄＡ遺伝子及びｔｃｄＢ遺伝子を欠いており、比較的安全な株であると考えられる。胞子発芽に対するナノ粒子の阻害活性を、ＣＣＵＧ  ３７７８０株を使用して試験した。１０ｍＭタウロコール酸塩で処置したＣ．ディフィシル胞子は、他の濃度で観察されたものと比較して、最も顕著な発芽曲線を示した（ｐ＜０．０００１、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定）。それ故に、１０ｍＭタウロコール酸塩で前処置したＣ．ディフィシル胞子を以下の研究で使用した。
【００６１】
ナノ粒子調製
【００６２】
Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子を熱分解によって調製した。簡単に言うと、１．４２ｇの鉄アセチルアセトナート（５１７００３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、０．５７ｍＬのオレイン酸（２７７２６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び２０ｍＬのトリオクチルアミン（Ｔ８１０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合した。この溶液を、３２５℃で、Ａｒ環境下で、３０分間還流した。溶液を室温に冷却した後、沈殿物を磁石で回収し、トルエンで３回洗浄した。Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子を磁石で回収し、０．４ｍｇ／ｍＬポリ（スチレン−ａｌｔ−マレイン酸）（６６２６３１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するクロロホルム溶液（ＵＮ１８８８、Ｍｅｒｃｋ、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ）に移し、２時間放置した。Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子を回収し、ＭＱ水で３回洗浄した。
【００６３】
Ｆｅ＠Ａｕナノ粒子を以下のステップによって調製した。６ｇのセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ、Ｈ６２６９、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５ｇの１−ブタノール（３３０６５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び１５ｇのオクタン（２９６９８８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む、２．４ｍＬのＦｅＳＯ４（０．５Ｍ、３１２３６、Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ、Ｓｅｅｌｚｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、２．４ｍＬのＭＱ水中１．０Ｍ  ＮａＢＨ４（７１３２０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と５分間混合し、鉄ナノ粒子溶液を形成させた。１．８ｍＬのＭＱ水中０．４４Ｍ  ＨＡｕＣｌ４（１６９６１−２５−４、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ、ＭＡ）及び１．８ｍＬのＭＱ水中１．６Ｍ  ＮａＢＨ４を鉄ナノ粒子溶液中へ添加し、さらに３０分間撹拌した。Ｆｅ＠Ａｕナノ粒子を、磁石を含む９９．９％エタノール（８００６０５、Ｊ．Ｔ．  Ｂａｋｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）で、洗浄した。
【００６４】
ＺｎＯナノ粒子を、化学浴析出システムによって生成した。０．１Ｍ  硝酸亜鉛六水和物（２６３−００３３５、Ｗａｋｏ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）及び０．１Ｍ  ヘキサメチレンテトラミン（０８１−００３３２、Ｗａｋｏ）を、Ｓｉ（１００）基板（Ｗａｆｅｒ  Ｗｏｒｋｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔａｉｗａｎ）と共に、９５℃で、８時間ブレンドした。反応後、ＺｎＯナノ粒子を蒸留水で５回洗浄した。
【００６５】
銀ナノ粒子を以下のステップにしたがい合成した。簡単に言うと、３．４ｍＭの硝酸銀（ｓ６５０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び０．４６ｍＭのクエン酸ナトリウム三塩基性二水和物（ｓ４６４１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、室温で撹拌することにより混合した。次いで、８．８ｍＭの水素化ホウ素ナトリウムを混合物へ添加し、１０分間室温で撹拌を続けた。合成された銀ナノ粒子を９９．９％エタノール中で保存した。
【００６６】
６ｎｍのＦｅ３Ｏ４ナノ粒子を、Ｔａｉｗａｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｎａｎｏｔｅｃｈから購入した（ＴＡＮＢｅａｄ（登録商標）ＵＳＰＩＯ−１０１）。
【００６７】
光学密度６００ｎｍ検出による胞子発芽試験
【００６８】
栄養細胞を除去するために、発芽が起こる前に、胞子懸濁液を最初に６０℃で３０分間インキュベートした。次いで、熱処置された胞子を使用前に氷に移した。ＯＤ６００  ０．５の濃度のＣ．ディフィシル胞子を、様々なナノ粒子と共に、及び／又は様々な濃度（５〜５００μｇ／ｍＬ）で、ＢＨＩＳ中、９６穴プレート中で、２０分間、共インキュベートした。本研究において、３％ブリーチ（１９７−０２２０６、Ｗａｋｏ）で処置した胞子をポジティブコントロールとして、ＢＨＩＳのみの中にある胞子をネガティブコントロールとして使用した。粒子との共インキュベーションの後、１０ｍＭタウロコール酸塩（Ｔ４００９、Ｓｉｇｍａ）を添加して、胞子発芽を開始した。処置された胞子のＯＤ６００を、分光光度計（１６０３９４００、ＴＥＣＡＮ、Ｇｒｏｄｉｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）によって、室温で、１２分まで、１分間の時間間隔で、動態学的に測定した。胞子発芽の経時変化を、様々な時点でそれぞれ測定されたＯＤに対してプロットした。
【００６９】
発芽カイネティックアッセイ
【００７０】
精製され加熱された胞子を、Ｆｅ３−δＯ４（５０μｇ／ｍＬ）を含む又は含まないＢＨＩＳ中で、９６穴ディッシュ中で、２０分間インキュベートし、次いで２、５、１０、２０、４０、又は５０ｍＭ  タウロコール酸塩で処置した。本研究において、３％ブリーチを、発芽を阻害するポジティブコントロールとして使用した。タウロコール酸塩をアリコートに添加した後に、ＯＤ６００を測定した。
【００７１】
胞子結合アッセイ
【００７２】
ＯＤ６００  ０．５の濃度のＣ．ディフィシルＢＡＡ  １８０５胞子を、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子（５００μｇ／ｍＬ）と共に、ＢＨＩＳ中で、９６穴プレート中で、２０分間、共インキュベートした。Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子を添加していない胞子がコントロールであった。全てのサンプルを磁石の下に５分間置き、次いで全ての上清を除去した。磁石に引きつけられた部分及び上清を、１Ｘ  ＰＢＳでそれぞれ３回洗浄した。全てのサンプルを蒸留脱イオン水に再溶解させた。次いで、胞子及びナノ粒子を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＭ−１４００、ＪＥＯＬ、Ｊａｐａｎ）を用いてイメージングした。
【００７３】
タンパク質漏出アッセイ
【００７４】
ＯＤ６００  ０．５の濃度の胞子を、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子（５００μｇ／ｍＬ）と共に、ＭＱ水中で、９６穴プレート中で、２０分間、共インキュベートした。次いで、このサンプルを、３，５００ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを再懸濁及び超音波処理した。胞子内部の残存タンパク質を測定するために、各群の細菌溶解物を遠心分離（８０００ｇ、４℃、１０分間）によって回収した。回収されたタンパク質サンプルを、１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び染色キット（１７−１１５０−０１、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）での銀染色に供し、細菌胞子タンパク質の相対量を視覚化した。
【００７５】
インビボＣ．ディフィシル感染（ＣＤＩ）
【００７６】
動物は、特定病原体除去バリア施設で飼育した。動物に関係する全ての実験手順は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｎｇ  Ｋｕｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの治験動物飼育及び使用委員会（Ｉｎｓｔｒｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅ）（ＩＡＣＵＣ）によって承認された関連手順に従った。試験開始時の各マウスの体重は、約２５ｇであった。
【００７７】
結腸の炎症を直接モニターするために、ＮＦ−κＢ（ＮＦ−κＢ−ＲＥ−ルシフェラーゼ）の転写制御下にある、ルシフェラーゼ導入遺伝子を含む、ＮＦ−κＢ依存性レポーターマウスモデルを、Ｃ．ディフィシル胞子によって感染させた。マウスに胞子を与える前に、抗生物質カクテル（０．４ｍｇ／ｍＬカナマイシン、０．０３５ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、及び０．０５７ｍｇ／ｍＬコリスチン）をそれらの飲用水に４８時間添加した。新鮮なカクテルを２４時間毎に２日間交換した。このマウスを、Ｃ．ディフィシル胞子感染（ＣＤＩ）の前に、２００μＬのプロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ、２ｍｇ／ｍＬ）で、１２時間毎に２日間、強制飼養した。
【００７８】
マウスを、Ｃ．ディフィシルの株、すなわち、ＣＣＵＧ  １９１２６及びＢＡＡ−１８０５の胞子でそれぞれ感染させた。ＣＣＵＧ  １９１２６感染の群において、１００μＬの蒸留水でマウスを強制飼養する前に、２ｘ１０５ＣＦＵのＣ．ディフィシル胞子ＣＣＵＧ  １９１２６を、５００μｇ／ｍＬ  Ｆｅ３−δＯ４と共に又は５００μｇ／ｍＬ  Ｆｅ３−δＯ４なしで、２０分間、共インキュベートした（約２ｍｇ／Ｋｇ体重）。胞子及びＦｅ３−δＯ４ナノ粒子が共インキュベートされている時間の間に、全てのマウスを５０μＬ  ＰＰＩ（２ｍｇ／ｍＬ）で強制飼養し、クリンダマイシン（４ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。ＣＤＩの後、抗生物質カクテル水を普通の水に交換した。
【００７９】
ＢＡＡ−１８０５感染の群において、マウスを５０μＬ  ＰＰＩ（２ｍｇ／ｍＬ）で強制飼養し、クリンダマイシン（４ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した後、マウスにＣ．ディフィシル胞子ＢＡＡ−１８０５（２ｘ１０５ＣＦＵ）を与えた。２４時間後、マウスを、１００μＬの０、５００及び１０００μｇ／ｍＬ  Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子（約０、２及び４ｍｇ／Ｋｇ体重）で、２４時間毎に２日間、それぞれ強制飼養した。
【００８０】
全てのマウスを、下痢、体重減少、前かがみの姿勢、及び死を含む、ＣＤＩ症候についてモニターした。感染から７２時間後に、ルシフェラーゼ基質であるルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を、１５０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射し、ＮＦ−κＢ活性化媒介発光を誘導した。マウスをイソフルラン／酸素で麻酔し、ＩＶＩＳスペクトルイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）によって画像を５分間収集した。データをＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）によって分析し、ルシフェラーゼ活性を光子数／秒／ｃｍ２／ステラジアン（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）で表した。ＩＶＩＳ画像を得た後、ＴＲＩ試薬（Ｔ９４２４、Ｓｉｇｍａ）によりＲＮＡを結腸から抽出した。炎症性遺伝子発現のレベルを、リアルタイムＰＣＲ（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定した。ＣＤＩの割合を見積もるために、大便を回収し、大便中のＤＮＡを、ＤＮＡ抽出キット（１１８１４７７０００１、Ｒｏｃｈｅ）で精製した。マウス大便中のｔｃｄＢ遺伝子を、ＰＣＲによって検出した。
【００８１】
組織病理学的分析
【００８２】
組織病理学的分析を実施して、ＣＤＩによって誘導された粘膜損傷及び炎症を評価した。切除された結腸組織を、ＰＢＳで緩衝した４％ホルムアルデヒド中で固定し、次いでパラフィンに包埋した。顕微鏡を用いて実施した組織学的分析のために、脱パラフィンした６μｍ厚の切片を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。好中球数は、胞子単独群、及びＦｅ３−δＯ４で処置された胞子群について、１０視野でランダムに計数した。
【００８３】
統計的分析
【００８４】
統計的分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０１により実施した。この研究における全ての実験は、三重反復され、データは、３つの独立した実験からの平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として報告した。Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡを胞子発芽曲線分析において使用し、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を他のＣＦＵ阻害試験において使用した。両方の統計的方法において、Ｐ＜０．０５、０．０１、０．００１を有意性のレベルとみなした。
【００８５】
例１  Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子の殺胞子活性
【００８６】
Ｃ．ディフィシルの胞子発芽の阻害におけるＦｅ３−δＯ４ナノ粒子の使用を、以下の例において評価した。
【００８７】
１．１  Ｃ．ディフィシルの胞子に対するＦｅ３−δＯ４ナノ粒子の殺胞子活性
【００８８】
様々なナノ粒子が、周囲の組織に影響を与えることなく、優れた殺菌性特性を有することが知られている。しかしながら、ナノ粒子と細菌胞子発芽との間の相互作用は、まだ完全には調べられていない。胞子発芽と殺菌性ナノ粒子との間の相互作用を調査するために、ＺｎＯナノ粒子、Ａｇナノ粒子、Ｆｅ２Ｏ３ナノ粒子、Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子、Ｆｅ＠Ａｕ、及びＦｅ３−δＯ４ナノ粒子を本研究において試験した。文献報告にしたがい、２０分間ブリーチで不活性化した胞子をポジティブコントロールとして使用した。細菌胞子を、５、５０、及び５００μｇ／ｍＬの範囲の様々な濃度のナノ粒子と共に、２０分間共インキュベートした後、次いで胞子を１０ｍＭ  タウロコール酸塩の添加により刺激し、胞子発芽を誘導した。
【００８９】
図１に示された結果は、ＺｎＯ（図１Ａ）、Ａｇ（図１Ｂ）、及びＦｅ３Ｏ４ナノ粒子（図１Ｄ）を含む周知の殺菌性ナノ粒子が、それぞれ制限された胞子発芽阻害活性を有することを示した。さらに、本研究において、Ｃ．ディフィシルの株ＣＣＵＧ  ３７７８０は、完全に酸化されたＦｅ２Ｏ３ナノ粒子と反応せず（図１Ｃ）、Ｆｅ＠Ａｕナノ粒子とも反応しなかった（図１Ｅ）。５μｇ／ｍＬ  Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子は胞子発芽にわずかな影響しか与えなかったが、５０及び５００μｇ／ｍＬ  Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子は、胞子発芽に際立った阻害的効果を示した（図１Ｆ）。特に、５００μｇ／ｍＬの濃度では、胞子発芽に対するＦｅ３−δＯ４ナノ粒子の阻害的効果は、ブリーチポジティブコントロールのものと統計的に差がなかった（ｐ＞０．５、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、図１Ｆ）。
【００９０】
これらのデータは、他の既知の殺菌性ナノ粒子と比較して、本開示のＦｅ３−δＯ４ナノ粒子が、優れた殺胞子活性を有し、５０及び５００μｇ／ｍＬの両方のＦｅ３−δＯ４ナノ粒子処置が、胞子が活性栄養細胞を形成するのを有効に防止することができることを示した。
【００９１】
１．２  様々なサイズを有するＦｅ３−δＯ４ナノ粒子の殺胞子活性
【００９２】
Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子は、５〜２５ｎｍの範囲の辺長さを有する切頂八面体として合成され得るため、胞子発芽に及ぼし得るＦｅ３−δＯ４ナノ粒子のサイズ効果をさらに調査した。したがって、それぞれ異なる辺長さ（すなわち、１４ｎｍ対２２ｎｍ）を有する２つのＦｅ３−δＯ４ナノ粒子を使用して、ＣＣＵＧ  ３７７８０株の胞子を処置した。図２のデータは、胞子発芽の阻害の点で、これら２つのナノ粒子の間に有意差がなかったことを示している（５００μｇ／ｍＬ濃度ではｐ＝０．５１９５、５０μｇ／ｍＬではｐ＞０．９９、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定）。それ故に、Ｃ．ディフィシル胞子発芽の阻害活性の原因となるのは、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子のサイズではなく、濃度である。
【００９３】
１．３  Ｃ．ディフィシルの様々な株の胞子に対する、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子の殺胞子活性
【００９４】
本例において、Ｃ．ディフィシルのｔｃｄＡ及びｔｃｄＢ陽性株、すなわち、ＣＣＵＧ  １９１２６及びＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１８０５の胞子に対するＦｅ３−δＯ４の阻害活性を調査した。したがって、１０ｍＭ  タウロコール酸塩処置の前に、ＣＣＵＧ  １９１２６及びＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１８０５株を、様々な濃度のＦｅ３−δＯ４ナノ粒子（すなわち、５、５０、及び５００μｇ／ｍＬ）に２０分間暴露した。結果を図３に示す。
【００９５】
図３に示されるように、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子は、５００μｇ／ｍＬの濃度で、ＣＣＵＧ  １９１２６（図３Ａ）及びＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１８０５（図３Ｂ）株の両方に対して同様の効果を示した一方で、ＣＣＵＧ  １９１２６は、５０μｇ／ｍＬより低い濃度で、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子に比較的より耐性であった（図３Ａ）。
【００９６】
このデータは、胞子発芽に対するＦｅ３−δＯ４ナノ粒子の阻害活性が、Ｃ．ディフィシルのいずれの特定の株にも特異的ではないことを示唆した。換言すれば、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子は、Ｃ．ディフィシルの全ての株の胞子に有効である。
【００９７】
１．４  Ｃ．ディフィシルの栄養細胞に対するＦｅ３−δＯ４ナノ粒子の殺菌活性
【００９８】
優れた胞子発芽阻害活性にもかかわらず、栄養細胞に対するＦｅ３−δＯ４ナノ粒子の殺菌性特性を、Ｃ．ディフィシルの異なる株間でさらに調査した。最初に、栄養細胞を５００μｇ／ｍＬ  Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子で２０分間処置し、次いでさらなるＣＦＵ計数のために、ＢＨＩＳ寒天プレートの上に広げた。図４に示されるように、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子で処置された細胞は、ネガティブコントロール群と匹敵する同様の増殖挙動を示した。一方で、３％ブリーチで処置された細胞の増殖は、ほぼ完全に排除された。
【００９９】
まとめると、胞子発芽に対する本開示のＦｅ３−δＯ４ナノ粒子の阻害活性は、ＣＣＵＧ  ３７７８０、ＣＣＵＧ  １９１２６、及びＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１８０５を含む、Ｃ．ディフィシルの異なる株間で共通していた。しかしながら、Ｃ．ディフィシルの栄養細胞に対しては効果がなかった。
【０１００】
例２  Ｃ．ディフィシルの胞子に対するＦｅ３−δＯ４ナノ粒子の特徴付け
【０１０１】
Ｆｅ３−δＯ４と胞子との間の相互作用を明らかにするために、Ｆｅ３−δＯ４で処置された胞子を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）下で調べる。ＴＥＭ画像から明らかなように、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子は５０μｇ／ｍＬ  Ｆｅ３−δＯ４で胞子に結合し始めた。そして、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子の濃度を５００μｇ／ｍＬに増加させると、胞子は、過剰量に存在するＦｅ３−δＯ４ナノ粒子によって完全に覆われた（図５）。それ故に、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子は、用量依存的に、Ｃ．ディフィシル胞子に直接結合する。
【０１０２】
Ｆｅ３−δＯ４の直接結合が、胞子の無傷構造を損傷し、最終的に崩壊させるかどうかをさらに明らかにするために、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子で処置された胞子（又はＦｅ３−δＯ４ナノ粒子で処置されていない胞子）を、そこから漏出するタンパク質について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてさらに分析した。結果を図６に示す。
【０１０３】
処置されていない胞子と比較すると、２つの主要なタンパク質バンドが、Ｆｅ３−δＯ４で処置された胞子の上清で観察された（図６、レーン１〜３対レーン４〜６）。この結果は、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子が胞子に結合すると、これにより胞子の構造がいくらか損傷し、それ故にタンパク質が上清に漏出した可能性があることを示唆した。
【０１０４】
このデータはつまり、本開示のＦｅ３−δＯ４ナノ粒子がＣ．ディフィシルの胞子に直接結合し、続いてその損傷を引き起こす事ができることを示した。
【０１０５】
例３  Ｃ．ディフィシル感染（ＣＤＩ）の処置におけるＦｅ３−δＯ４ナノ粒子の使用
【０１０６】
本例において、「材料及び方法」のセクションで述べたステップにしたがい予め開発したＮＦ−κＢ依存性レポーターマウスモデルを用いて、ＣＤＩに対するＦｅ３−δＯ４ナノ粒子のインビボ有効性を調査した。例３．１において、このマウスをＣ．ディフィシル胞子ＣＣＵＧ  １９１２６で感染させた。Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子の治療的有効性を図７に示す。例３．２において、マウスをＣ．ディフィシル胞子ＢＡＡ−１８０５で感染させた。結果を図８に示す。
【０１０７】
３．１  ＣＣＵＧ  １９１２６感染
【０１０８】
ＣＤＩ感染を有する動物は、有意な体重減少を示し、これはＦｅ３−δＯ４ナノ粒子の処置によって大きく減衰した（２ｍｇ／Ｋｇ体重、ｐ＝０．０１１９、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）（図７Ａ）。体重減少の減衰は、盲腸重量の測定によって確認され、ここでＦｅ３−δＯ４で処置された群の盲腸は、コントロール群のものよりも重く健康であり（ｐ＝０．００２４、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、図７Ｂ）、軽度の炎症を示した（ｐ＝０．０４０６、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、図７Ｃ）。組織病理学的画像はまた、好中球浸潤が、コントロール群のものに比べて、Ｆｅ３−δＯ４で処置された群において減少したことを確認した（図７Ｄ）。さらに、分子レベルでは、定量的リアルタイムＰＣＲは、Ｆｅ３−δＯ４で処置された群において、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−１βを含む炎症性遺伝子の発現が、コントロール群のものに比べて、有意に減少したことを確認した（ＴＮＦ−αについてはｐ＝０．００８８、ＩＦＮ−γについてはｐ＝０．０２７６、ＩＬ−１βについてはｐ＝０．００９７、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、胞子単独群と比較して、図７Ｅ）。さらに、Ｆｅ３−δＯ４で処置された胞子の群のＣＤＩの割合（３３％）は、コントロール群のもの（６６％）よりも低かった（データは示されず）。
【０１０９】
まとめると、これらの結果は、２ｍｇ／Ｋｇ  Ｆｅ３−δＯ４の処置が、Ｃ．ディフィシルの胞子ＣＣＵＧ  １９１２６により引き起こされる炎症のレベルを低減することができることを示した。
【０１１０】
３．２  ＢＡＡ−１８０５感染
【０１１１】
別のＣ．ディフィシル胞子−ＢＡＡ−１８０５に対するＦｅ３−δＯ４の治療的有効性を本例において調査した。臨床状況をさらに模倣するために、マウスを胞子ＢＡＡ−１８０５で２４時間感染させ、続いて０、２、又は４ｍｇ／Ｋｇ  Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子の処置を行った。
【０１１２】
図８のデータによれば、結腸炎症シグナルは、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子処置群よりも、コントロール群（すなわち、胞子単独）において、より強かった（ｐ＜０．０５）。Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子の両方の投与量（すなわち、２及び４ｍｇ／Ｋｇ）は、Ｃ．ディフィシルの胞子ＢＡＡ−１８０５により誘導された炎症を効率的に抑制することができた。
【０１１３】
したがって、本Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子は、ＣＤＩの間に又はＣＤＩの後に投与することができ、両方の処置時点は、ＣＤＩに関連する症候を効率的に抑制することができる。
【０１１４】
全体として、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子は、Ｃ．ディフィシルの胞子発芽を阻害することができる。殺菌活性を有する他の既知のナノ粒子と比較して、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子は優れた殺胞子活性を示す。有意に、Ｆｅ３−δＯ４ナノ粒子の阻害的効果は、ある特定のＣ．ディフィシル株の胞子に限定されず、全ての株に有効である。さらに、低用量（例えば、インビトロ適用については５μｇ／ｍＬ、インビボ適用については２ｍｇ／Ｋｇ）のＦｅ３−δＯ４ナノ粒子が、Ｃ．ディフィシルの胞子発芽を抑制するのに十分である一方で、被験体のＣＤＩ感染を処置しながらも、栄養型正常フローラの増殖は影響を受けないままである。
【０１１５】
実施形態の上記の説明は、単なる例として与えられており、様々な変更が当業者によってなされ得ることが理解されるであろう。上記の明細書、実施例及びデータは、本発明の典型的な実施形態の構造及び使用の完全な説明を提供する。本発明の様々な実施形態が、ある程度特定して、又は１又は複数の個別の実施形態を参照して、上に述べられてきたが、当業者は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、開示の実施形態に数多くの変更を行うことができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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