(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
−水を米糠に添加するステップと；
−固体画分から液体を分離して、洗浄固体画分を得るステップと；
−酵素または酵素組成物を５〜３０重量％の濃度を有する前記洗浄固体画分懸濁液に添加するステップと；
−６〜８のｐＨで酵素インキュベーションを実施するステップと；
−前記酵素インキュベーションを１０〜１６％ＤＨ（加水分解度）の加水分解度まで実施するステップと；
−前記酵素インキュベーションを３０〜８０℃の温度で実施するステップと；
−任意選択的に前記液体を前記固体画分から分離するステップと
を含んでなる、米糠タンパク質加水分解物組成物を製造する方法であって、前記酵素または酵素組成物が、バシロリシン（ＥＣ３．４．２４．２８）を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記米糠が、脱脂米糠である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記水を米糠に添加するステップと前記洗浄固体画分を得るステップの間に、前記米糠が、前記水と共にｐＨ４〜８でインキュベートされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記水を米糠に添加するステップと前記洗浄固体画分を得るステップの間に、前記米糠が、前記水と共に４〜８０℃の温度でインキュベートされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記水を米糠に添加するステップと前記洗浄固体画分を得るステップの間に、前記米糠が、前記水と共に少なくとも０．５分間インキュベートされる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、限定タンパク質分解で、（好ましくは脱脂）米糠からタンパク質を穏やかに抽出する方法に関する。米糠は、限定タンパク質分解を受ける前に洗浄される。
【０００２】
［背景技術］
農作物原料のタンパク質抽出は、タンパク質それ自体の溶解度、またはそれらとマトリックス中のその他の構成物との相互作用によって妨げられ得る。次に溶解度それ自体も、タンパク質収集前の加工段階によって影響を受ける。例えば、材料の脱脂は、タンパク質の溶解度を大幅に低下させる。そのため、タンパク質分解技術が適用されて、タンパク質の溶解度を増大させ、ひいてはタンパク質抽出収率を増大させる。タンパク質分解酵素の使用は、ほとんどが、高度な加水分解のために苦味のある製品をもたらし、食品中の用途が限定される。
【０００３】
米糠は、精米工程の副産物である。通常、精米は、約１５重量％（ｗｔ％）の砕け米、約１０重量％の米糠、約２０重量％の籾殻、および約５５重量％の全粒米をもたらす。米糠の典型的なタンパク質含有量は、約１４重量％である。米糠の他の成分は、水分（約１０重量％）、粗製油（約２０重量％）、総食物繊維（約１８重量％）、デンプン（約２２重量％）、灰分（約８重量％）、およびその他の成分（約８重量％）である。米糠から得られる有価製品は米糠油であり、これは胚芽および米糠層から抽出される油である。油の除去後、脱脂製品が残り、これは通常飼料用途で使用される。脱脂米糠の脂肪含量は、典型的に、５重量％未満である。毎年、７千万トンを超える米糠が生産されると推定され、それは依然としてタンパク質のようないくつかの有価成分を含有する。
【０００４】
糠タンパク質の抽出は、文献で公開されている。抽出法としては、時に酵素フィターゼと組み合わされる、アルカリ性条件での水の使用、および／またはいくつかのカルボヒドラーゼ（アミラーゼなど）の使用が挙げられる。無処理米糠からのタンパク質抽出は、困難であることが知られている。しかし脱脂米糠の場合、タンパク質抽出は、油抽出における、特に残留ヘキサンを除去するための焙煎における、タンパク質変性をもたらす加熱処理のために、さらにより厳しいタスクである。
【０００５】
米国特許第２０１１／０１５２１８０号明細書は、加熱安定化脱脂米糠に由来する生理活性ペンタペプチドを記載する。米国特許第２０１１／０１５２１８０号明細書は、非常に活性が高い酵素Ａｌｃａｌａｓｅを使用して、その結果、異なる米糠原料と共にインキュベートした際に、強力なタンパク質分解がもたらされる。米国特許第２０１１／０１５２１８０号明細書の実施例１によると、最適加水分解度は２３．４％である。
【０００６】
Ｓｉｌｐｒａｄｉｔ  ｅｔ  ａｌ（Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｃｅ  ｂｒａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  Ａｌｃａｌａｓｅ，２０１０，Ａｓ  Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ａｇ−ｌｎｄ  ３（０２），２２１−２３１）は、Ａｌｃａｌａｓｅを使用した、米糠加水分解物製造の条件を記載する。
【０００７】
［発明の概要］
本発明は、５０重量％（乾物基準）を超える（ポリ）ペプチドを含んでなり、少なくとも１０％、好ましくは１０〜１６％のＤＨ（加水分解度）を有し、９０％を超える、好ましくは９５％を超える（ポリ）ペプチドが、５００Ｄａを超える分子量（ＭＷ）を有する、（好ましくは脱脂）米糠加水分解組成物を提供する。
【０００８】
本発明はまた、５０重量％（乾物基準）を超える（ポリ）ペプチドを含んでなり、１０〜１６％のＤＨ（加水分解度）を有し、９０％を超える、好ましくは９５％を超える（ポリ）ペプチドが、５００Ｄａを超える分子量（ＭＷ）を有する、（好ましくは脱脂）米糠加水分解組成物を提供する。
【０００９】
本発明の別の態様によると、
−好ましくは水である水性液体を（好ましくは脱脂）米糠に添加するステップと；
−固体画分から液体を分離して、洗浄固体画分を得るステップと；
−酵素または酵素組成物を５〜３０重量％、好ましくは１２〜３０重量％の濃度を有する洗浄固体画分懸濁液に添加するステップと；
−好ましくは６〜８のｐＨで酵素インキュベーションを実施するステップと；
−酵素インキュベーションを１０〜１６％ＤＨ（加水分解度）の加水分解度まで実施するステップと；
−酵素インキュベーションを３０〜８０℃、好ましくは４５〜６５℃の温度で実施するステップと；
−任意選択的に液体を固体画分から分離するステップと
を含んでなる、（好ましくは脱脂）米糠加水分解組成物を製造する方法が提供され、酵素または酵素組成物は、エンドプロテアーゼを含んでなる。
【００１０】
本発明はまた、
−好ましくは水である水性液体を（好ましくは脱脂）米糠に添加するステップと；
−固体画分から液体を分離して、洗浄固体画分を得るステップと；
−酵素または酵素組成物を５〜３０重量％、好ましくは１２〜３０重量％の濃度を有する洗浄固体画分懸濁液に添加するステップと；
−好ましくは６〜８のｐＨで酵素インキュベーションを実施するステップと；
−酵素インキュベーションを１０〜１６％ＤＨ（加水分解度）の加水分解度まで実施するステップと；
−酵素インキュベーションを３０〜８０℃、好ましくは４５〜６５℃の温度で実施するステップと；
−任意選択的に液体を固体画分から分離するステップと
を含んでなる、５０重量％（乾物基準）を超えるタンパク質含有量を有する、（好ましくは脱脂）米糠加水分解組成物を製造する方法を提供し、酵素または酵素組成物は、エンドプロテアーゼを含んでなる。
【００１１】
本明細書および添付の特許請求の範囲全体を通じて「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」と言う語、および「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などのバリエーションは、包括的に解釈される。すなわち、これらの語は、文脈が許せば、特に列挙されないその他の構成要素または整数の可能な包含を伝えることが意図される。
【００１２】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の１つまたは２つ以上（すなわち１つまたは少なくとも１つ）の文法的目的に言及するために、本明細書で使用される。一例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味してもよい。
【００１３】
本発明では、原材料（すなわち米糠、好ましくは脱脂米糠）の洗浄は、その少量が５００Ｄａ未満の分子量（ＭＷ）を有する、５０重量％（乾物基準）を超える（ポリ）ペプチドを含んでなる、米糠タンパク質加水分解物が得られるような条件下における、プロテアアーゼの加水分解と組み合わされる。
【００１４】
洗浄および穏和な加水分解の技術は、好ましくは脱脂米糠に適用される。しかし記載される方法はまた、未加工米糠および加熱安定化米糠などの他の米糠原料にも有効であり、応用できる。
【００１５】
（好ましくは脱脂）米糠または別の農作物材料を価格設定する（ｖａｌｏｒｉｚｅ）ために、限定的または穏和な加水分解に基づく方法が提供され、好ましくは固体／液体分離がそれに続く。液体および不溶性の双方のストリームをさらに乾燥させてもよい。このプロテアーゼ処理とそれに続く分離の利点は、総食物繊維量が高い固体画分（ペレット）が得られることであり、それはまた、様々な食品用途で使用し得る。
【００１６】
米糠とは、糊粉および果皮の組み合わせからなる、米の硬質外層を意味する。胚芽と共に、これは、全粒米の一体部分であり、精白米製造における製粉の副産物として製造されることが多い。未加工米糠は、製粉後に得られたそのままの米糠である。脱脂米糠とは、例えば抽出によって、存在する油の少なくとも一部が除去された米糠を意味する。油抽出が、例えば、およそ６０〜６５℃のヘキサンによって実施される一方で、ヘキサン除去のための焙煎は、典型的に１１０℃で実施される。安定化米糠とは、精米後に、典型的に、＜１０秒間、１３０℃で安定化された米糠を意味する。
【００１７】
様々な農作物原料からタンパク質を抽出するための加水分解は、良く知られている方法である。米糠では、より広範に応用されるアルカリ抽出技術に加えて、酵素を使用してタンパク質画分を得るためのいくつかの研究が存在し、例えば米国特許第２０１１０３０５８１７号明細書を参照されたい。プロテアーゼの使用は、通常、カルボヒドラーゼの使用と比較して、より好結果を与える（例えば、酵素的方法を要約する、Ｆａｂｉａｎ  ａｎｄ  Ｊｕ（Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ｒｉｃｅ  ｂｒａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ：  ｉｔｓ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１１，ｖｏｌ．５１，８１６−８２７）のレビューを参照されたい）。（カルボヒドラーゼと比較して）より高いタンパク質抽出収率を得るための、いくつかのプロテアーゼが文献で調査されている。これらの加水分解産物は、通常は、食品には広範に応用し得ない、苦味のある加水分解組成物である。
【００１８】
本発明では、（好ましくは脱脂）米糠の洗浄と、この洗浄米糠に対する軽度タンパク質分解技術の使用が、非洗浄（好ましくは脱脂）米糠加水分解物と比較して、タンパク質の重量％（乾物基準）が増大した米糠タンパク質加水分解物をもたらす。本発明の米加水分解物組成物は、飲料、製パン、および乳製品用途などの様々な食品用途で、広範に応用可能である。
【００１９】
本発明はまた、
−好ましくは水である水性液体を（好ましくは脱脂）米糠に添加するステップと；−固体画分から液体を分離して、洗浄固体画分を得るステップと；
−酵素または酵素組成物を５〜３０重量％、好ましくは１２〜３０重量％の濃度を有する洗浄固体画分懸濁液に添加するステップと；
−好ましくは６〜８のｐＨで酵素インキュベーションを実施するステップと；
−酵素インキュベーションを１０〜１６％ＤＨ（加水分解度）の加水分解度まで実施するステップと；
−酵素インキュベーションを３０〜８０℃、好ましくは４５〜６５℃の温度で実施するステップと；
−任意選択的に液体を固体画分から分離するステップと
を含んでなる（好ましくは５０重量％（乾物基準）を超えるタンパク質含有量を有する）（好ましくは脱脂）米糠加水分解組成物を製造する方法にも関し、酵素または酵素組成物は、エンドプロテアーゼを含んでなる。
【００２０】
本発明はまた、少なくとも１０％、好ましくは１０〜１６％の加水分解度と組み合わされた、分子量（ＭＷ）が５００Ｄａを超える、９０％を超える（ポリ）ペプチドを含有する（好ましくは脱脂）米糠加水分解組成物にも関する。好ましくは、（好ましくは脱脂）米糠加水分解組成物は、分子量が５００Ｄａを超える、９５％を超える（ポリ）ペプチドを含有する。
【００２１】
本発明はまた、５０重量％（乾物基準）を超える（ポリ）ペプチドを含んでなり、１０〜１６％のＤＨ（加水分解度）を有し、９０％を超える、好ましくは９５％を超える（ポリ）ペプチドが、５００Ｄａを超える分子量（ＭＷ）を有する、（好ましくは脱脂）米糠加水分解組成物を提供する。
【００２２】
（ポリ）ペプチドの他に、脱脂米糠加水分解組成物は、炭水化物、脂肪、およびミネラル（灰分画分として測定されることが多い）を含んでなってもよい。
【００２３】
好ましくは、（好ましくは脱脂）米糠加水分解組成物は、本発明の方法によって入手可能であり、または得られる。好ましくは、本発明の加水分解組成物中に存在するジおよびトリ−ペプチド含有量は、５重量％未満である。好ましくは、本発明の加水分解組成物中に存在する遊離アミノ酸含有量は、２重量％未満である。有利には、本発明の方法で使用される米糠は、脱脂米糠であり、得られる加水分解組成物は、脱脂米糠加水分解組成物である。
【００２４】
本明細書では「ペプチド」は、ペプチド結合を介して連結する少なくとも２つのアミノ酸の鎖と定義される。「ポリペプチド」は、本明細書で、３０を超えるアミノ酸残基を含んでなる鎖として定義されて、タンパク質を含む。本明細書の用法では、タンパク質加水分解物は、プロテアーゼの作用によって加水分解されているタンパク質である。プロテアーゼは、アミノ酸の間のペプチド結合を加水分解する酵素である。タンパク質は、１つまたは複数のポリペプチドからなり、それはペプチド結合によって共に連結するアミノ酸からなる。タンパク質加水分解物は、例えば、切断されたペプチド結合／最初に存在したペプチド結合の総数×１００％として表される、加水分解度（ＤＨ）が、８〜２５％または１０〜１６％などの、５〜３５％に加水分解されているタンパク質であってもよい。
【００２５】
（好ましくは脱脂）米糠加水分解組成物は、少なくとも５０重量％、好ましくは少なくとも５５重量％、より好ましくは少なくとも６０重量％（乾物基準）の（ポリ）ペプチドおよび遊離アミノ酸などのタンパク質を含んでなり、（好ましくは脱脂）米糠から製造される組成物である。
【００２６】
本発明によれば、好ましくは水である水性液体が、（好ましくは脱脂）米糠に添加され、引き続いて洗浄固体画分から液体が分離される。水の添加後、分離は、即座に行い得て、または好ましくは分離は、例えば少なくとも０．５分間、少なくとも１分間、少なくとも２分間、少なくとも５分間、少なくとも２０分間、少なくとも６０分間、または０．５分間〜５時間後など、いくらか時間がたった後に行われる。この時間間隔中に、水が、有利には脱脂米糠と混合される。この後、水相、溶液または画分は、濾過および／または遠心分離の使用などによる、任意の都合良い様式で、固相または画分から分離されてもよい。液体画分は、一般に、炭水化物およびミネラル（灰分）のような化合物を含んでなる。
【００２７】
したがって本発明は、
−好ましくは水である水性液体を米糠に添加するステップと；
−前記米糠を前記水性液体と共に、少なくとも０．５分間、少なくとも１分間、少なくとも２分間、少なくとも５分間、好ましくは少なくとも２０分間、より好ましくは少なくとも６０分間インキュベートするステップと；
−固体画分から液体を分離して、洗浄固体画分を得るステップと；
−酵素または酵素組成物を５〜３０重量％、好ましくは１２〜３０重量％の濃度を有する洗浄固体画分懸濁液に添加するステップと；
−好ましくは６〜８のｐＨで酵素インキュベーションを実施するステップと；
−酵素インキュベーションを１０〜１６％ＤＨ（加水分解度）の加水分解度まで実施するステップと；
−酵素インキュベーションを３０〜８０℃、好ましくは４５〜６５℃の温度で実施するステップと；
−任意選択的に液体を固体画分から分離するステップと
を含んでなる、米糠タンパク質加水分解物組成物（好ましくは５０重量％（乾物基準）を超えるタンパク質含有量を有する）を製造する方法を提供し、酵素または酵素組成物は、エンドプロテアーゼを含んでなる。
【００２８】
本発明はまた、
−好ましくは水である水性液体を米糠に添加するステップと；
−前記米糠を前記水性液体と共に、４〜８０℃の温度、好ましくは室温で、少なくとも０．５分間、少なくとも１分間、少なくとも２分間、少なくとも５分間、好ましくは少なくとも２０分間、より好ましくは少なくとも６０分間インキュベートするステップと；
−固体画分から液体を分離して、洗浄固体画分を得るステップと；
−酵素または酵素組成物を５〜３０重量％、好ましくは１２〜３０重量％の濃度を有する洗浄固体画分懸濁液に添加するステップと；
−好ましくは６〜８のｐＨで酵素インキュベーションを実施するステップと；
−酵素インキュベーションを１０〜１６％ＤＨ（加水分解度）の加水分解度まで実施するステップと；
−酵素インキュベーションを３０〜８０℃、好ましくは４５〜６５℃の温度で実施するステップと；
−任意選択的に液体を固体画分から分離するステップと
を含んでなる、米糠タンパク質加水分解物組成物（好ましくは５０重量％（乾物基準）を超えるタンパク質含有量を有する）を製造する方法を提供し、酵素または酵素組成物は、エンドプロテアーゼを含んでなる。
【００２９】
本発明はまた、
−好ましくは水である水性液体を米糠に添加するステップと；
−前記米糠を前記水性液体と共に、４〜８０℃の温度、好ましくは室温で、少なくとも０．５分間、少なくとも１分間、少なくとも２分間、少なくとも５分間、好ましくは少なくとも２０分間、より好ましくは少なくとも６０分間混合するステップと；
−固体画分から液体を分離して、洗浄固体画分を得るステップと；
−酵素または酵素組成物を５〜３０重量％、好ましくは１２〜３０重量％の濃度を有する洗浄固体画分懸濁液に添加するステップと；
−好ましくは６〜８のｐＨで酵素インキュベーションを実施するステップと；
−酵素インキュベーションを１０〜１６％ＤＨ（加水分解度）の加水分解度まで実施するステップと；
−酵素インキュベーションを３０〜８０℃、好ましくは４５〜６５℃の温度で実施するステップと；
−任意選択的に液体を固体画分から分離するステップと
を含んでなる、米糠タンパク質加水分解物組成物（好ましくは５０重量％（乾物基準）を超えるタンパク質含有量を有する）を製造する方法を提供し、
酵素または酵素組成物は、エンドプロテアーゼを含んでなる。
【００３０】
本発明は、
−好ましくは水である水性液体を米糠に添加するステップと；
−前記米糠を前記水性液体と共に、４〜８０℃の温度、好ましくは室温で、および４〜８のｐＨ範囲で、少なくとも０．５分間、少なくとも１分間、少なくとも２分間、少なくとも５分間、好ましくは少なくとも２０分間、より好ましくは少なくとも６０分間インキュベートし、好ましくは混合するステップと；
−固体画分から液体を分離して、洗浄固体画分を得るステップと；
−酵素または酵素組成物を５〜３０重量％、好ましくは１２〜３０重量％の濃度を有する洗浄固体画分懸濁液に添加するステップと；
−好ましくは６〜８のｐＨで酵素インキュベーションを実施するステップと；
−酵素インキュベーションを１０〜１６％ＤＨ（加水分解度）の加水分解度まで実施するステップと；
−酵素インキュベーションを３０〜８０℃、好ましくは４５〜６５℃の温度で実施するステップと；
−任意選択的に液体を固体画分から分離するステップと
を含んでなる、米糠タンパク質加水分解物組成物（好ましくは５０重量％（乾物基準）を超えるタンパク質含有量を有する）を製造する方法をさらに提供し、酵素または酵素組成物は、エンドプロテアーゼを含んでなる。
【００３１】
より好ましいｐＨ範囲は、４〜７、５〜７または６〜７である。
【００３２】
さらに好ましい実施形態では、前記米糠は、脱脂米糠である。
【００３３】
使用される水性液体は、好ましくは水である。飲料水、水道水、精製水（蒸留水、再蒸留水、脱イオン水または逆浸透水）などの任意の種類の水を本発明の方法で使用し得る。さらに、使用される水は、ＥＤＴＡまたはクエン酸などの少なくとも１つの添加された成分を含んでなってもよい。このような成分は、好ましくは低濃度で添加される。
【００３４】
水の添加と、それに続く分離によって、これらのステップがない方法と比較して、最終米糠加水分解組成物中のタンパク質含有量の増大が得られ得る。有利なことに、本発明の（好ましくは脱脂）米糠加水分解物は、５０重量％（乾物基準）を超える（ポリ）ペプチドを含んでなる。これらのステップがない（好ましくは脱脂）米糠加水分解物は、一般に、３５〜４２重量％（乾物基準）の（ポリ）ペプチドを含んでなる。
【００３５】
本発明者らの発明の重要な側面は、（脱脂）米糠のタンパク質画分が、部分的にのみ加水分解されることに関する。これは、例えば１０〜１６％の比較的低い加水分解度で表される。より高い加水分解度が、通常、苦味のある製品をもたらす一方で、低い加水分解度は、低いタンパク質抽出収率をもたらす。本発明者らの発明では、本発明者らは、許容できる味覚を有するように容易に調合し得て、同時に許容できるタンパク質抽出収率を有する製品をもたらす、加水分解度を適用する。
【００３６】
プロテアーゼをはじめとする酵素は、ＩＵＭＢからの国際的に認められる、全酵素の分類および命名法スキーム中で分類される。プロテアーゼＥＣ番号の更新されたＩＵＭＢテキストは、インターネットサイトにある：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ。この体系では、酵素は、単一反応を触媒するという事実によって定義される。これは、数種の異なるタンパク質が、全て同一酵素として記載され、２つ以上の反応物を触媒するタンパク質は、２つ以上の酵素として処理されるという、重要な含意を有する。体系は、プロテアーゼをエンド−およびエキソプロテアーゼに分類する。エンドプロテアーゼは、内部ペプチド結合を加水分解する酵素であり、エキソプロテアーゼは、末端α−アミノ基に隣接するペプチド結合を加水分解し（「アミノペプチダーゼ」）、または末端カルボキシル基と最後から２番目のアミノ酸との間のペプチド結合を加水分解する（「カルボキシペプチダーゼ」）。エンドプロテアーゼは、触媒機序に基づいてサブサブクラスに分類される。セリンエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１）のサブサブクラスは、システインエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２２）、アスパラギン酸エンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２３）、メタロエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４）、およびスレオニンエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２５）である。
【００３７】
米糠タンパク質加水分解物組成物を得るために本発明の方法で使用されるエンドプロテアーゼは、有利には、Ｎｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）などのメタロエンドプロテアーゼ（ＥＣ．３．４．２４）、Ｍａｘａｚｙｍｅ  ＮＮＰ  ＤＳ（登録商標）（ＥＣ．３．４．２４．２８；バシロリシン）、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）またはＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｐ（登録商標）などのセリンエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１）、またはパパインまたはブロメラインなどのシステインエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２２）である。好ましくは、エンドプロテアーゼは、メタロエンドプロテアーゼであり、より好ましくはバシロリシン（ＥＣ３．４．２４．２８）である。好ましくは、本発明の方法は、Ｍａｘａｚｙｍｅ  ＮＮＰ  ＤＳなどのメタロエンドプロテアーゼを使用する。
【００３８】
任意選択的に、エンドプロテアーゼに加えて、Ｃｏｒｏｌａｓｅ  ＬＡＰ（登録商標）などのアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１）を利用して、米糠タンパク質加水分解物組成物の味覚プロファイルをなおさらに最適化し得る。
【００３９】
前述のように、本発明の方法で使用される懸濁液の（好ましくは脱脂）米糠濃度は、５〜３０重量％、またはより好ましくは１２〜３０重量％である。好ましくは、脱脂米糠濃度は１５〜２５重量％であり、より好ましくは脱脂米糠濃度は１５〜２２重量％である。文献では、典型的な脱脂米糠濃度は、１０重量％以下である。しかしこれらの低い値は、最終製品を得るために除去しなくてはならない比較的多量の水のために、工業的妥当性がほとんどない。前述のように、本発明の酵素インキュベーションステップで使用されるインキュベーションｐＨは、６〜８である。好ましくは、インキュベーションｐＨは、６．５〜７．５である。なおもより好ましくは、インキュベーションｐＨは、７〜７．５である。
【００４０】
本発明の酵素インキュベーションステップで使用されるインキュベーション時間は、一般に１〜６時間である。好ましくは、インキュベーションは１〜４時間である。なおもより好ましくは、インキュベーション時間は、１〜２時間である。
【００４１】
前述のように、酵素インキュベーションステップのインキュベーション温度は、４５〜６５℃である。好ましくは、インキュベーション温度は、４５〜５５℃である。より好ましくは、インキュベーション温度は、４８〜５５℃である。
【００４２】
本発明の別の態様によると、本発明の方法で製造される加水分解組成物は、固体／液体分離器を用いて固体および液体画分に分離される。水相、溶液または画分は、濾過および／または遠心分離の使用などによる、任意の都合良い様式で、固相または画分から分離されてもよい。得られた液体および／または固体画分は、任意の都合良い様式で乾燥させてもよい。可溶性画分の乾燥は、例えば、特に、噴霧乾燥機、ドラム乾燥機内で行い得る。固体または繊維画分は、例えば、高い固体投入量を処理し得る、ドラム乾燥機、ベルト乾燥機、およびその他の装置上で乾燥させ得る。
【００４３】
本発明の加水分解後、酵素または酵素組成物を不活性化させ得る。例えば、熱ショックを適用し得る。
【００４４】
本発明の方法は、小規模で実施し得るが、特許請求される方法は、少なくとも２リットルの懸濁液、より好ましくは少なくとも４または６リットルの懸濁液、最も好ましくは少なくとも８または１０リットルの懸濁液の大規模で実行することが好ましい。
【００４５】
本発明の方法の製品は、一般に、乾物基準で５０重量％〜６５重量％のタンパク質含有量を含んでなる。（好ましくは脱脂）米糠加水分解組成物の加水分解度は、有利には、例えば８〜２５％または１０〜２０％などの５〜３５％である。より好ましくは、加水分解度は、少なくとも１０％、最も好ましくは１０〜１６％である。
【００４６】
窒素溶解度または起泡能力および安定性のような機能性は、本明細書の実験部分で概説される方法によって判定し得る。
【００４７】
本発明をここで、これに限定されるものではない、以下の実施例を参照して説明する。
【００４８】
［方法および材料］
［材料］
脱脂米糠（ＤＲＢ）は市販され、最初に５５〜６５℃の高温で１時間以内にヘキサン抽出し、それに続いて１０５〜１１０℃で残留ヘキサンを除去する、いわゆる焙煎ステップによって、未加工米糠から得られ得る。酵素Ｍａｘａｚｙｍｅ  ＮＮＰ  ＤＳ（登録商標）はＤＳＭ（Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）製の市販品であり、メタロプロテアーゼである。
ＥＤＴＡ：分析用（＞純度９９．７％）、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ。
クエン酸：分析用（純度９９％）、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ。
【００４９】
［タンパク質含有量］
タンパク質含有量は、ＡＯＡＣ公定法９９１．２０ミルク中（総）窒素、に記載されるケルダール法によって判定した。６．２５の換算係数を使用して、タンパク質の量（％（ｗ／ｗ））を判定した。
【００５０】
［炭水化物含有量］
総炭水化物は、ＮＲＥＬ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６１８法の修正法によって定量化した。この方法とは対照的に、加水分解後の遊離単糖類の検出は、内標準としてマレイン酸を使用する、定量ＮＭＲ（ＱＮＭＲ）の手段によって得た。ＮＭＲスペクトルは、５ｍｍ凍結探針を装着したＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅｌｌｌ  ６００ＭＨｚ  ＮＭＲシステム上で記録した。探針の温度は２８０Ｋに設定した。
【００５１】
［ＳＤＳ−ＰＡＧＥ］
ペプチドパターンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって視覚化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび染色のために使用した全ての材料は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳ）から購入された。製造会社の使用説明書に従ってＳＤＳ緩衝液を用いて、試料を調製し、製造会社の使用説明書に従ってＭＥＳ−ＳＤＳ緩衝系を用いて、１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分離した。Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ（Ｃｏｌｌｏｄｉａｌ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｇ２５０を用いて、染色を実施した。
【００５２】
［窒素溶解度（ＮＳ％）］
２％（ｗ／ｗ）のタンパク質濃度でタンパク質粉末を溶解し、タンパク質溶液を調製した。４Ｍ  ＨＣｌまたは４Ｍ  ＮａＯＨで、ｐＨを４、６．８または８．０に調節した（追加的な塩の添加はなかった）。
【００５３】
溶液を激しく振盪しながら、５０℃で２時間インキュベートした。引き続いて、試料を２０，０００ｇで５分間遠心分離し、上清を収集した。上清およびタンパク質粉末試料のタンパク質含有量は、ケルダール法によって分析した。窒素溶解度（ＮＳ％）は、次のように定義される：
【数１】
0006409190.tif 000002
【００５４】
［起泡能力および安定性］
２％（ｗ／ｗ）のタンパク質濃度でタンパク質粉末を溶解し、タンパク質溶液を調製した。４Ｍ  ＨＣｌまたは４Ｍ  ＮａＯＨで、ｐＨを４、６．８または８に調節した。気泡は、１００ｇタンパク質溶液を１分間激しく泡立てることで、生じさせた（１Ｌビーカー内、１８，０００ｒｐｍの４枚の回転羽根付きＷａｒｎｉｎｇブレンダー）。気泡生成後、気泡／液体内容物を２５０ｍｌシリンダーに移し入れた。タンパク質の起泡能力は、気泡調製の３０秒後に、気泡容積を測定することで判定した。気泡安定性は、気泡調製の３０分後の気泡容積と定義された。
【００５５】
［乾物含量］
乾物含量は、赤外線法を用いて１０５℃で判定した。
【００５６】
［加水分解度］
加水分解度は、迅速ＯＰＡ試験によって判定した（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｍ．，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｄ．，Ｄａｍｂｍａｎｎ，Ｃ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１，６６，６４２−６４６）。使用されたケルダール係数は、６．２５であった。
【００５７】
［遊離アミノ酸含有量の判定］
試料を既知量の０．１Ｎ  ＨＣＬ溶液に溶解した。この溶液の１００μＬをアミノ酸の同位体標識アナログを含有する内標準（ＩＳ）溶液と混合し、共溶出ペプチドからのイオン抑制効果について補正した。この試料／ＩＳ溶液の１０μＬを７０μＬのＷａｔｅｒｓホウ酸塩緩衝液および２０μＬのＷａｔｅｒｓ誘導体化試薬と混合した。混合後、溶液を５５℃で１０分間加熱した。１μＬをＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム上に注入した。
ＷａｔｅｒｓからのａＸｅｖｏＴＱ質量分光計と組み合わされた、超高圧液体クロマトグラフ上で、分析を実施した。カラムは、４３℃で０．４ｍｌ／分の流速で作動する、Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨＣ１８カラム（１５０×２．１ｍｍ、１．７μ）であった。ｗａｔｅｒｓからの移動は、ＡｃｃＱ−Ｔａｇ溶出剤ＡおよびＡｃｃＱ−Ｔａｇ溶出剤Ｂと称される。表１に記載の勾配を適用した。
【００５８】
【表１】
0006409190.tif 000003
【００５９】
アミノ酸誘導体は、エレクトロスプレーイオン化を用いて、ポジティブモードでイオン化した。遊離アミノ酸の量は、アミノ酸と、前述のように誘導体化された同位体標識アミノ酸とを含有する、外部検量線を通じて判定された。
【００６０】
［ジおよびトリペプチド量の判定］
ジおよびトリペプチド量は、以下の方法に従って判定した。
−既知濃度の１０種の異なるジペプチドと１０種の異なるトリペプチドとの混合物の質量分析法（ＭＳ）による分析
−提供された試料のＭＳによる分析：１ｍｌの試料溶液（２ｍｇ／ｍｌ）を３ｋＤスピンカラム上で遠心分離して、濾液を分析した。
−ブランク試料（ＭＱ）の分析
ジおよびトリペプチドの混合物は、以下のペプチドを含有した：
ジペプチド：
ＧＣ、ＡＧ、ＦＧ、ＧＰ、ＲＷ、ＷＬ、ＶＰ、ＫＫ、ＡＡ、ＦＬ
トリペプチド：
ＷＧＰ、ＧＧＰ、ＹＰＰ、ＬＡＬ、ＬＡＶ、ＥＧＰ、ＬＡＫ、ＬＡＷ、ＶＰＬ、ＮＰＩ
（アミノ酸については１文字略号を使用した）
【００６１】
最小ジペプチド（ＧＧ）から最大トリペプチド（ＷＷＷ）までの質量範囲は、１３３〜５７５Ｄａである。この質量範囲を用いて、試料の総ピーク面積を判定した。空試料注入のピーク面積を試料注入から差し引いて、バックグラウンドイオンを除外した。
【００６２】
［分子量分布の判定］
２００ｍｇの米糠加水分解組成物試料を１０ｍＬのメスフラスコに二連で量り入れ、ＭＱ水で最大容積にした。磁気撹拌機によって、この懸濁液を室温で３０分間、９００ｒｐｍで混合した。
【００６３】
引き続いて、５００μＬの懸濁液を１００ｋＤａカットオフフィルター（Ｐａｌｌ  ｎａｎｏｓｅｐ  １００  ｋ  Ｏｍｅｇａ）上に装入し、２０，０００ｇで５分間遠心分離した。引き続いて、濾液を３０ｋＤａカットオフフィルター（Ｐａｌｌ  ｎａｎｏｓｅｐ  ３０  Ｋ  Ｏｍｅｇａ）上に装入して、２０，０００ｇで８分間遠心分離した。引き続いて、濾液を３ｋＤａカットオフフィルター（Ｐａｌｌ  ｎａｎｏｓｅｐ  ３  Ｋ  Ｏｍｅｇａ）上に装入し、２０，０００ｇで１５分間遠心分離した。
【００６４】
全ての３枚のフィルター上の残渣は、５００μＬのＭＱ水に再溶解した。したがって合計４つの試料が収集された：１００ｋＤａ残渣（＞１００ｋＤａ）、３０ｋＤａ残渣（３０〜１００ｋＤａ）、３ｋＤａ残渣（３〜３０ｋＤａ）、および全ての３枚のフィルターを通過した（＜３ｋＤａ）濾液（約４５０μＬ）。タンパク質含有量をケルダールによって判定し、全ての試料間の相対的タンパク質濃度を計算して、分子量分布を得た。
【００６５】
［タンパク質抽出収率］
タンパク質抽出収率は、次のように定義される：
【数２】
0006409190.tif 000004
【００６６】
代案としては、ペレット中の水を含むタンパク質抽出収率は、次によって計算し得る：
【数３】
0006409190.tif 000005
【００６７】
［実施例］
［実施例１］
１５℃の１５３０グラムの飲料水（１５重量％）中の２７０グラムのＤＲＢ（脱脂米糠）を、１５℃で１時間のインキュベーション中に十分に混合した。１時間のインキュベーション後、遠心分離によって、Ｓ／Ｌ分離を実施した（スイングローター付きＳｏｒｖａｌｌ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ＲＣ遠心分離機を５０００ＲＣＦで５分間使用した）。１１８７グラムの上清が除去された。６１３グラムの固体を１１４０グラムの飲料水に５０℃で溶解した。０．７５ｍｌのＭａｘａｚｙｍｅ  ＮＮＰ  ＤＳ（登録商標）（４ｍｌ／ｋｇの乾燥ＤＲＢ）を添加して、ｐＨ７．２、５０℃で２時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、０．３８ｍｌのＭａｘａｚｙｍｅ  ＮＮＰ  ＤＳ（２ｍｌ／ｋｇの乾燥ＤＲＢ）をもう一度添加した。合計で２時間のインキュベーション後、Ｓ／Ｌ分離を再度実施した。１２５８グラムの上清を収集し、タンパク質含有量、乾物含量、および加水分解度について分析した。結果：
【００６８】
【表２】
0006409190.tif 000006
【００６９】
最初のＳ／Ｌ分離中に、上清の排出によって、総タンパク質含量の８．２重量％が除去された。
【００７０】
５００Ｄａを超える分子量（ＭＷ）がある（ポリ）ペプチドの量は、９０重量％を超えることが分かった。
【００７１】
参照として、十分な混合インキュベーションステップなしで実験を実施し、ＤＲＢを上述の加水分解条件下で直接加水分解した。参照加水分解組成物は、３５〜４２％のタンパク質乾物含量を有した。
【００７２】
［実施例２］
５０℃の１５３０グラムの飲料水（１５重量％）中の２７０グラムのＤＲＢ（脱脂米糠）を、５０℃で１時間のインキュベーション中に十分に混合した。１時間のインキュベーション後、遠心分離によって、Ｓ／Ｌ分離を実施した（スイングローター付きＳｏｒｖａｌｌ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ＲＣ遠心分離機を５０００ＲＣＦで５分間使用した）。１１３３グラムの上清が除去された。５７２グラムの固体の内、５２３グラムを１０５６グラムの飲料水に５０℃で溶解した。０．７５ｍｌのＭａｘａｚｙｍｅ  ＮＮＰ  ＤＳ（４ｍｌ／ｋｇの乾燥ＤＲＢ）を添加して、ｐＨ７．２、５０℃で２時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、０．３８ｍｌのＭａｘａｚｙｍｅ  ＮＮＰ  ＤＳ（２ｍｌ／ｋｇの乾燥ＤＲＢ）をもう一度添加した。合計で２時間のインキュベーション後、Ｓ／Ｌ分離を再度実施した。９９１グラムの上清を収集し、タンパク質含有量、乾物含量、および加水分解度について分析した。結果：
【００７３】
【表３】
0006409190.tif 000007
【００７４】
最初のＳ／Ｌ分離中に、上清の排出によって、総タンパク質含量の１５．２重量％が除去された。
【００７５】
５００Ｄａを超える分子量（ＭＷ）がある（ポリ）ペプチドの量は、９０重量％を超えることが分かった。
【００７６】
［実施例３］
１０℃の１５３０グラムの飲料水（１５重量％）中の２７０グラムのＤＲＢ（脱脂米糠）を、１０℃で１時間のインキュベーション中に十分に混合した。１時間のインキュベーション後、遠心分離によって、Ｓ／Ｌ分離を実施した（スイングローター付きＳｏｒｖａｌｌ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ＲＣ遠心分離機を５０００ＲＣＦで５分間使用した）。１１４２グラムの上清が除去された。６１６グラムの固体の内、５７９グラムを７７２グラムの飲料水に５０℃で溶解した。０．７９ｍｌのＭａｘａｚｙｍｅ  ＮＮＰ  ＤＳ（４ｍｌ／ｋｇの乾燥ＤＲＢ）を添加して、ｐＨ７．２、５０℃で２時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、０．４ｍｌのＭａｘａｚｙｍｅ  ＮＮＰ  ＤＳ（２ｍｌ／ｋｇの乾燥ＤＲＢ）をもう一度添加した。合計で２時間のインキュベーション後、Ｓ／Ｌ分離を再度実施した。７９７グラムの上清を収集し、タンパク質含有量、乾物含量、および加水分解度について分析した。結果：
【００７７】
【表４】
0006409190.tif 000008
【００７８】
最初のＳ／Ｌ分離中に、上清の排出によって、総タンパク質含量の１２．６重量％が除去された。
【００７９】
５００Ｄａを超える分子量（ＭＷ）がある（ポリ）ペプチドの量は、９０重量％を超えることが分かった。
【００８０】
［実施例４］
さらなる実施例では、分析を実施して、異なる構成物に関して、洗出し材料を分析した。
【００８１】
この実験では、１５℃の６９８グラムの飲料水（２２ｗｔ％）中で２０２グラムのＤＲＢ（脱脂米糠）を十分に混合して、この１５℃の温度で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、遠心分離によって、Ｓ／Ｌ分離を実施した（スイングローター付きＳｏｒｖａｌｌ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ＲＣ遠心分離機を５０００ＲＣＦで５分間使用した）。５１３グラムの上清が除去されて、３８５グラムの固体が収集された。上清と共に、１７％の全糖および７％のＮ−ケルダールが除去された。
【００８２】
【表５】
0006409190.tif 000009
【００８３】
［実施例５］
本実施例では、次の水溶液による脱脂米糠の洗浄が示された。１重量％のＴｉｔｒｉｐｌｅｘ  ＩＩＩ．２ａｑ（ＥＤＴＡ、Ｍｅｒｃｋ）１重量％クエン酸ナトリウム．２ａｑ（Ｍｅｒｃｋ）、ｐＨ補正なし（ｐＨ６．５の懸濁液を生じた）、ｐＨ４（ＨＣｌ補正）、およびｐＨ２（ＨＣｌ補正）。
【００８４】
各添加は、次の様式で実施した。良好な混合条件下で、１３５グラムの脱脂米糠を７６５グラムの水に周囲温度で１時間にわたり懸濁した。別々の実験で、この懸濁液に次の添加を行った。９グラムのＥＤＴＡ、９グラムのクエン酸塩（クエン酸三ナトリウム二水和物）、添加なし、２５ｇの４Ｎ  ＨＣｌ、４５ｇの４  ＮＨＣｌ。
【００８５】
（実施例４に記載されるような）遠心分離後、上清相に対して次の乾物および窒素収率が観察された：
【００８６】
【表６】
0006409190.tif 000010