(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粉砕したサケの頭部を６０℃より高く９０℃以下で加熱する工程を備えることを特徴とするサケ成長ホルモン含有飼料の製造方法。
【請求項２】
さらに、前記加熱したサケの頭部の固体成分と液体成分とを分離する工程と、
前記固体成分と前記液体成分とを乾燥する工程と、
をこの順に備える請求項１に記載のサケ成長ホルモン含有飼料の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の製造方法によって得られることを特徴とするサケ成長ホルモン含有飼料。
【請求項４】
前記サケ成長ホルモンが、サケ脳下垂体由来成長ホルモンである請求項３に記載のサケ成長ホルモン含有飼料。
【請求項５】
粉砕したサケの頭部を６０℃より高く９０℃以下で加熱し、前記加熱したサケの頭部の固体成分と液体成分を分離することで得られたことを特徴とするサケ成長ホルモン含有液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サケ成長ホルモン含有飼料の製造方法、該製造方法により得られるサケ成長ホルモン含有飼料及びサケ成長ホルモン含有液に関する。
【背景技術】
【０００２】
サケなど魚類由来の成長ホルモンが魚介類の成長を顕著に促進することが知られている。ニジマス、ウナギや錦鯉などの魚類、また、アワビなどの貝類の養殖産業等に有効であり、前記成長ホルモンを含有する飼料を魚介類に与え、成長を早める試みがなされている。
【０００３】
特許文献１には、サケ由来の成長ホルモンを含有する海洋無脊椎動物用飼料について開示されており、特に貝類等の成長を簡便且つ短期間で効率的に促進できることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−９５１０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１において、サケ成長ホルモンを得るために、４℃で酢酸アンモニウム（ｐＨ９）などの塩基性緩衝液を用いて抽出している。サケ成長ホルモンの熱変性を避け、生物活性を保つ為には低温で作業を行うことが望ましいが、低温で抽出したサケ成長ホルモンを室温以上の温度で保存することにより活性が失活することや保存のためにサケ成長ホルモンを含む溶液を凍結乾燥する必要があるなど、製造効率が悪い。
また、飼料の製造方法において、サケ等の冷凍した魚を粉砕し、１００℃で煮沸するのが一般的である。煮沸により水分を蒸発させ、効率的に製造することができるが、成長ホルモンが熱変性するため、飼料中にほとんど残存せず、成長ホルモンの生物活性は失われる。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、簡便で効率的な生物活性を有するサケ成長ホルモン含有飼料の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下のとおりである。
（１）粉砕したサケの頭部を６０℃より高く９０℃以下で加熱する工程を備えることを特徴とするサケ成長ホルモン含有飼料の製造方法。
（２）さらに、前記加熱したサケの頭部の固体成分と液体成分とを分離する工程と、前記固体成分と前記液体成分とを乾燥する工程と、をこの順に備える（１）に記載のサケ成長ホルモン含有飼料の製造方法。
（３）（１）又は（２）に記載の製造方法によって得られることを特徴とするサケ成長ホルモン含有飼料。
（４）前記サケ成長ホルモンが、サケ脳下垂体由来成長ホルモンである（３）に記載のサ
ケ成長ホルモン含有飼料。
（５）粉砕したサケの頭部を６０℃より高く９０℃以下で加熱し、前記加熱したサケの頭部の固体成分と液体成分とを分離することで得られたことを特徴とするサケ成長ホルモン含有液。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、生物活性を有するサケ成長ホルモンが高含有率である飼料を高効率で製造することができる。また、本発明によれば、魚介類の成長を簡便且つ短期間で効率的に促進させ、それらの生産性の向上を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の第一実施形態に係るサケ成長ホルモン含有飼料の製造方法の概略構成を示す図である。
【図２】本発明の第二実施形態に係るサケ成長ホルモン含有飼料の製造方法の概略構成を示す図である。
【図３】本発明の第三実施形態に係るサケ成長ホルモン含有飼料の製造方法の概略構成を示す図である。
【図４】実施例１における５０℃で加熱した飼料中のサケ成長ホルモンのＨＰＬＣによる検出結果を示したグラフである。
【図５】実施例２における６０℃で加熱した飼料中のサケ成長ホルモンのＨＰＬＣによる検出結果を示したグラフである。
【図６】（Ａ）実施例３における液体成分中のサケ成長ホルモンのＨＰＬＣによる検出結果を示したグラフである。（Ｂ）実施例３における固体成分中のサケ成長ホルモンのＨＰＬＣによる検出結果を示したグラフである。
【図７】（Ａ）実施例４における液体成分中のサケ成長ホルモンのＨＰＬＣによる検出結果を示したグラフである。（Ｂ）実施例４における固体成分中のサケ成長ホルモンのＨＰＬＣによる検出結果を示したグラフである。
【図８】（Ａ）〜（Ｄ）試験例１における精製されたサケ成長ホルモンの熱耐性試験のＨＰＬＣによる検出結果を示したグラフである。
【図９】（Ａ）〜（Ｄ）試験例１における脳下垂体抽出液中のサケ成長ホルモンの熱耐性試験のＨＰＬＣによる検出結果を示したグラフである。
【図１０】（Ａ）〜（Ｃ）試験例１におけるサケ成長ホルモンのｐＨ安定性試験のＨＰＬＣによる検出結果を示したグラフである。
【図１１】試験例３におけるサケ成長ホルモンを添加したニジマス肝臓由来細胞のＩＧＦ−Ｉの発現量の定量試験について定量ＰＣＲによる検出結果を示したグラフである。
【図１２】試験例４におけるサケ成長ホルモン含有飼料を与えたニジマス稚魚の体重の変化を表したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、必要に応じて図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明は省略する。
【００１１】
＜サケ成長ホルモン含有飼料の製造方法＞
（第一実施形態）
一実施形態において、本発明は、粉砕したサケの頭部を３０〜９０℃で加熱する工程を備えるサケ成長ホルモン含有飼料の製造方法を提供する。
【００１２】
本実施形態の製造方法によれば、生物活性を有するサケ成長ホルモンが高含有率である飼料を高効率で製造することができる。
【００１３】
本明細書において、「サケ成長ホルモン」とは、サケ脳下垂体で産生及び分泌される成長ホルモンを意味している。「サケ成長ホルモン」の構造は当業界で既知であり、例えば、Ｋａｗａｕｃｈｉｅｔａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９８６，２４４：５４２−５５２に記載されている。
飼料に使用可能な「サケ成長ホルモン」は、特に限定されるものではなく、サケ脳下垂体で産生及び分泌される成長ホルモンを抽出したサケ脳下垂体由来成長ホルモン（粗抽出物、精製物などを含む）、遺伝子組み換えにより製造された組換えサケ成長ホルモン等が挙げられる。
サケの加工工程で頭部の未利用部位が大量に廃棄されていることから、本発明では、サケ頭部の未利用部位由来の脳下垂体から調製した成長ホルモンを活用することが好ましい。また、サケ成長ホルモンの抽出及び精製しやすさの観点から、脂質の含有率が少ないサケが好ましく、脂質の含有率が０．１％以下であるサケがより好ましい。
【００１４】
図１は、本発明の第一実施形態に係るサケ成長ホルモン含有飼料の製造方法の概略構成を示す図である。各工程の詳細について、以下に説明する。
材料としては、上述のサケの加工工程で大量に廃棄されるサケ頭部の未使用部位を回収し、冷凍保存したものを使用する。まず、サケ頭部を冷凍状態のまま、水とともに粉砕装置１に添加し、粉砕及び摩砕する。サケ頭部の重量に対して、１／４〜１／３倍量の水を添加することが好ましい。また、粉砕装置としては、特に限定はなく、ミクロカッター等が挙げられる。
次に、粉砕したサケ頭部を加熱装置２に添加し加熱することで、サケ成長ホルモンを溶出し、余分な水分を蒸発して濃縮する。通常、ホルモンは熱に弱く変性しやすいが、発明者らは、サケ成長ホルモンが優れた熱耐性を有することを発見し、本発明を見出した。詳細については不明であるが、サケ成長ホルモンは疎水性が高く、難溶性の物質であることが知られており、そのため、その他のホルモン類と比較して、優れた熱耐性を有すると推察できる。
加熱温度は、３０〜９０℃が好ましく、５０〜７０℃がより好ましい。３０℃未満でサケ成長ホルモンの溶出工程を行うと、サケ成長ホルモンの熱変性を避け、生物活性を保つことができるが、低温ではサケ成長ホルモンが溶出しにくく、製造効率が悪い。一方、９０℃以上でサケ成長ホルモンの溶出工程を行うと、水分の蒸発が速く、効率的に製造することができるが、成長ホルモンが熱変性するため、成長ホルモンの生物活性が失われる。加熱時間は、粉砕したサケ頭部の重量により適宜調整することができるが、効率的な製造とエネルギーコストの観点から１〜２時間が好ましい。
また、加熱装置に特に限定はなく、熱湯や蒸気等により材料を加熱及び保温することができるタンク等が挙げられる。
【００１５】
（第二実施形態）
また、一実施形態において、本発明は、さらに、加熱したサケの頭部を乾燥する工程を備えるサケ成長ホルモン含有飼料の製造方法を提供する。
【００１６】
本実施形態の製造方法によれば、余分な水分を取り除くことができ、乾燥状態のサケ成長ホルモン含有飼料を得ることができる。
【００１７】
図２は、本発明の第二実施形態に係るサケ成長ホルモン含有飼料の製造方法の概略構成を示す図である。各工程の詳細について、以下に説明する。
粉砕工程、加熱工程までは、第一実施形態と同様に行う。加熱工程後のサケ頭部を乾燥装置３に入れて、乾燥する。乾燥温度は、５０〜７０℃が好ましく、乾燥時間は、加熱したサケ頭部の重量により適宜調整することができるが、５〜１２時間が好ましい。
また、乾燥装置としては、特に限定はなく、減圧乾燥機、真空乾燥機、脱湿乾燥機、凍結乾燥機、熱風乾燥機等が挙げられる。
【００１８】
（第三実施形態）
また、一実施形態において、本発明は、さらに、前記加熱工程後であって前記乾燥工程前に、前記加熱したサケの頭部の固体成分と液体成分を分離する工程を備えるサケ成長ホルモン含有飼料の製造方法を提供する。
【００１９】
本実施形態の製造方法によれば、固体成分と液体成分とを飼料の加工形態に応じて適宜使い分けることができる。また、液体成分により多くのサケ成長ホルモンが溶出しているため、サケ成長ホルモンの濃度の高い液を得ることができる。
【００２０】
図２は、本発明の第三実施形態に係るサケ成長ホルモン含有飼料の製造方法の概略構成を示す図である。各工程の詳細について、以下に説明する。
粉砕工程、加熱工程までは、第一実施形態と同様に行う。加熱工程後のサケ頭部を固形分離装置４に入れて、固体成分と液体成分とを分離する。固液分離装置としては、特に限定はなく、三相分離が可能な遠心分離機等が挙げられる。
図２においては、固液分離工程後の固体成分及び液体成分をそれぞれ乾燥装置３により乾燥する工程を有しているが、使用用途に応じて、乾燥せずにそのまま用いることもできる。
【００２１】
＜サケ成長ホルモン含有飼料＞
一実施形態において、本発明は、上述の第一実施形態〜第三実施形態のいずれかの製造方法によって得られるサケ成長ホルモン含有飼料を提供する。
【００２２】
本実施形態のサケ成長ホルモン含有飼料によれば、魚介類の成長を簡便且つ短期間で効率的に促進させ、それらの生産性の向上を図ることができる。
【００２３】
本発明のサケ成長ホルモン含有飼料は、液体、固体（ゲル等）形態のいずれであってもよい。液体形態の場合には、サケ成長ホルモン含有飼料を、適当な溶媒、例えば、真水、海水等に溶解させて用いることができる。その際の溶液の濃度は、対象とする魚介類やその個体重量や体積等によって異なるため、適宜決定すればよい。好ましくは０ ． ０ １ 〜 １ ｇ ／ ｍｌ である。
【００２４】
また、液体形態のサケ成長ホルモン含有飼料は、特に貝類において液浴や筋肉注射により投与することができる。液浴を行う場合には、所定濃度のサケ成長ホルモン含有飼料を調製し、この溶液に所定時間および頻度で対象とする貝類を浸漬する。これにより、サケ成長ホルモンが貝類の体内に取り込まれ、その結果、成長が促進される。液浴に使用するサケ成長ホルモンの濃度は、例えば、魚類の場合、又は、アワビの場合、ともに、１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌであることが好ましい。
また、筋肉注射の場合には、所定濃度のサケ成長ホルモン含有飼料を貝類の所定部位に筋肉注射する。筋肉注射に使用するサケ成長ホルモンの濃度は、例えば、魚類の場合には、１０ｎｇ／ｇ体重〜１０００ｎｇ／ｇ体重であることが好ましく、アワビの場合には、１ｎｇ／ｇ体重〜１００ｎｇ／ｇ体重であることが好ましい。筋肉注射を行う部位は、貝殻筋が好ましい。
液体形態のサケ成長ホルモン含有飼料は、モノマーとしての生物活性を保つために、ｐＨを７〜９に調製したものが好ましい。ｐＨを調製するためには、水酸化ナトリウムや酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ７〜９ ）等を使用することが好ましい。
【００２５】
また、固体形態のサケ成長ホルモン含有飼料は、経口用飼料として使用することができる。特に、貝類では、固体形態の中でもゲル形態、特にサケ成長ホルモンの他に海藻成分等を含み、ゲル内にサケ成長ホルモンを保持したゲル形態であることが好ましい。
経口用飼料の投与方法としては、魚介類と同一の環境下において、魚介類に所定期間および回数で摂餌させる。固体形態のサケ成長ホルモン含有飼料中のサケ成長ホルモン濃度は、対象とする魚介類やその個体重量や体積等によって異なるため、適宜決定すればよい。例えば、アワビ（体重約２ｇ〜３ｇ、殻長約３〜５ｃｍ）の場合、０．５ｍｇ／８ｇ〜 ５ｍｇ／８ｇの濃度範囲であることが好ましい。前記濃度範囲外であると、アワビを短期間で効率的に成長促進させることが困難になる。投与する間隔および回数は、目的や状況に応じて決定すればよく、例えば、７〜１４日間毎で、２０〜６０回である。また、例えば、魚類の場合には、１００ｎｇ／ｇ〜５０００ｎｇ／ｇの濃度範囲であることが好ましい。
固体形態のサケ成長ホルモン含有飼料は、ハンドリングストレスの影響を魚介類に与えずに、また、サケ成長ホルモンの失活を抑えて、魚介類の体内へ取り込むことができる。
【００２６】
本発明のサケ成長ホルモン含有飼料は、飼料成分として通常用いられる飼料添加物を含んでもよく、例えば、抗生物質、ビタミン、ミネラル類等が挙げられる。
【００２７】
本発明において、魚介類の種類としては、特に限定されず、例えば、アユ、コイ、マス等、養殖業が盛んに行われている魚類、アワビ、サザエ、フジツボ、カキ、ホタテガイ等の貝類、エビ、カニなどの甲殻類、ウニ類等が挙げられる。ただし、これらに限定されるものではなく、淡水に生息するタニシ、カワニナ等の無脊椎動物にも適用することができる。なお、カキ、ホタテガイは液浴に適している。
【００２８】
＜サケ成長ホルモン含有液＞
一実施形態において、本発明は、粉砕したサケの頭部を３０〜９０℃で加熱し、前記加熱したサケの頭部の固体成分と液体成分を分離することで得られたサケ成長ホルモン含有液を提供する。
【００２９】
本実施形態のサケ成長ホルモン含有液によれば、魚介類の成長を簡便且つ短期間で効率的に促進させ、それらの生産性の向上を図ることができる。また、サケ成長ホルモン含有液はサケ成長ホルモンの濃度が高く、そのまま液体飼料として使用することができ、さらに、その他の栄養成分等と混合し自由にカスタマイズした加工を施すことができる。
【００３０】
本実施形態のサケ成長ホルモン含有液の製造方法は、上述のサケ成長ホルモン含有飼料の製造方法の第三実施形態と同様である。粉砕工程及び加熱工程後のサケ頭部を固液分離装置により分離することで得られる。固形分離工程後の液体成分をそのまま使用してもよいが、液体成分中にはコラーゲンが溶解している。よって、液体成分を冷凍し再解凍することで、コラーゲンがゲル化沈殿し、液体中のサケ成長ホルモンを簡単に精製することができる。
【実施例】
【００３１】
［実施例１］サケ成長ホルモン含有飼料の製造（５０℃加熱）
（１）粉砕工程
冷凍保存していたサケ頭部（６００ｋｇ）に対して、合計１８０ｋｇの水を添加した後、ミクロカッター（〜１．５ｍｍ）にて粉砕及び摩砕した。
（２）加熱工程
粉砕したサケ頭部を加温タンクに投入し、３０分間解凍するために撹拌した後、５０℃に達してから約３０分間、加熱しながら加温した。
（３）乾燥工程
得られた液体成分及び固体成分を７０℃に設定した真空乾燥機で乾燥した。
【００３２】
（４）サケ成長ホルモンの検出
得られた乾燥固形物に３５０ｍｌの蒸留水を添加し、４℃で２４時間撹拌した。懸濁液を遠心分離（６，０００回転、３０分間、４℃）した後、上清を採取した。得られた上清を、再度、遠心分離（１４５，０００回転、１０分間、４℃）した後、上清を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（日本分光社製）に添加して、サケ成長ホルモンの溶出位置及び含有量を算出した。流速は１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃とした。ＨＰＬＣの結果を図４に示した。サケ成長ホルモン含有飼料中のサケ成長ホルモンの濃度は、７７．１μｇ/ｇ（７７．１ｍｇ／ｋｇ）であった。従来のサケ成長ホルモン含有飼料（サケ成長ホルモン濃度が２μｇ／ｇである。）に換算すると、３８．５５ｋｇの飼料に相当する量のサケ成長ホルモンが含まれていた。
【００３３】
［実施例２］サケ成長ホルモン含有飼料の製造（６０℃加熱）
加熱工程での温度を６０℃にした以外は、実施例１と同様の方法で、サケ成長ホルモン含有飼料を製造し、飼料中のサケ成長ホルモンの溶出位置及び含有量を算出した。ＨＰＬＣの結果を図５に示した。サケ成長ホルモン含有飼料中のサケ成長ホルモンの濃度は、８５．２μｇ/ｇ（８５．２ｍｇ／ｋｇ）であった。従来のサケ成長ホルモン含有飼料（サケ成長ホルモン濃度が２μｇ／ｇである。）に換算すると、４２．６０ｋｇの飼料に相当する量のサケ成長ホルモンが含まれていた。
【００３４】
［実施例３］サケ成長ホルモン含有飼料の製造（５０℃加熱・固液分離）
（１）粉砕工程
実施例１の（１）と同様の方法にて行った。
（２）加熱工程
実施例１の（２）と同様の方法にて行った。
（３）固液分離工程
加熱されたサケ頭部を、三相分離機により液体成分と固体成分に分離した。
（４）乾燥工程
得られた液体成分及び固体成分を５０℃に設定した真空乾燥機で、それぞれ固体成分は７時間３０分、液体成分は１１時間１５分乾燥させた。
【００３５】
（５）サケ成長ホルモンの検出
（ｉ）サケ成長ホルモンの抽出
真空乾燥機後の固形物（０．５ｇ）を２ｍｌの０．２Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ９）に加え、ポリトロンホモジナイザー（ポリトロン社製）で摩砕した。その後、２ｍＬの０．２Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ９）を加えて、４℃で１時間抽出した。遠心分離した後、サケ成長ホルモンを含む上清３ｍｌを得た。
（ｉｉ）サケ成長ホルモンの濃縮
次に、サケ成長ホルモンを濃縮するために、上清１ｍｌを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（９．１％）で平衡化したＳｅｐ−ＰａｋＣ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製）に添加した。０．１％ＴＦＡ  ５ｍｌで洗浄した後、２０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）４ｍｌ、次いで６０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）４ｍｌを添加して、カートリッジに吸着しているタンパク質を溶出し、凍結乾燥した。
（ｉｉｉ）ＨＰＬＣでの検出
凍結乾燥した固形分０．６ｇを０．１％ＴＦＡ  ５００μｌに溶解し、ＯＤＳ−１２０Ｔカラム（東ソー社製）を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（日本分光社製）に添加した。０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルを用いて、３０％から６０％まで６０分間で上昇させる直線濃度勾配法で、サケ成長ホルモンの溶出位置及び含有量を算出した。流速は１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃とした。ＨＰＬＣの結果を図６（Ａ）及び（Ｂ）に示した。サケ成長ホルモン含有液体成分由来の乾燥物中のサケ成長ホルモンの濃度は、１５μｇ/ｇであり、サケ成長ホルモン含有固形成分由来の乾燥物中のサケ成長ホルモンの濃度は、３μｇ/ｇであった。
【００３６】
［実施例４］サケ成長ホルモン含有飼料の製造（７０℃加熱・固液分離）
（１）粉砕工程
実施例１の（１）と同様の方法にて行った。
（２）加熱工程
実施例１の（２）と同様の方法にて行った。
（３）固液分離工程
加熱されたサケ頭部を、三相分離機により液体成分と固体成分に分離した。
（４）乾燥工程
得られた液体成分及び固体成分を７０℃に設定した真空乾燥機で、それぞれ固体成分は５時間、液体成分は１０時間１５分乾燥させた。
【００３７】
（５）サケ成長ホルモンの検出
（ｉ）サケ成長ホルモンの抽出
実施例３の（５）（ｉ）と同様の方法にて行った。
（ｉｉ）サケ成長ホルモンの濃縮
実施例３の（５）（ｉｉ）と同様の方法にて行った。
（ｉｉｉ）ＨＰＬＣでの検出
実施例３の（５）（ｉｉｉ）と同様の方法にて行った。ＨＰＬＣの結果を図７（Ａ）及び（Ｂ）に示した。サケ成長ホルモン含有液体成分由来の乾燥物中のサケ成長ホルモンの濃度は、１１μｇ/ｇであり、サケ成長ホルモン含有固形成分由来の乾燥物中のサケ成長ホルモンの濃度は、１．５μｇ/ｇであった。
【００３８】
［試験例１］サケ成長ホルモンの熱耐性試験
（１）試料の調製
サケ脳下垂体から精製された成長ホルモンを０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ９．０）に入れて、４℃、５０℃、６０℃及び７０℃の温度条件下で、それぞれ１０分間保持した（こちらを精製されたサケ成長ホルモンとした）。
また、サケ脳室内内臓物を４００μｌの０．２Ｍ酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ９．０）に入れた後、４℃、５０℃、６０℃及び７０℃の温度条件下で、それぞれ１０分間保持したものも用意した（こちらを脳下垂体抽出液中のサケ成長ホルモンとした）。脳下垂体抽出液中のサケ成長ホルモンについては、１０分経過後、ペッスルを用いて脳室内内臓物を摩砕し、サケ成長ホルモンを４℃で１０分間抽出した。  抽出液を遠心分離し、上清（３５０μｌ）を採取した。
（２）サケ成長ホルモンの検出
精製されたサケ成長ホルモン及び脳下垂体抽出液中のサケ成長ホルモンについて、４℃、５０℃、６０℃及び７０℃の温度条件下で処理した試料（３５０μｌ）について、それぞれ５００μｌの０．１％ＴＦＡを加えて希釈した。そのうち、５００μｌをＨＰＬＣに添加し、サケ成長ホルモンの溶出位置及び含有量を検証した。精製された成長ホルモンのＨＰＬＣの結果を図８（Ａ）〜（Ｄ）に示した。また、脳下垂体抽出液中のサケ成長ホルモンのＨＰＬＣの結果を図９（Ａ）〜（Ｄ）に示した。
【００３９】
精製された成長ホルモン及び脳下垂体抽出液中のサケ成長ホルモンの両方において、４℃の温度条件下で処理した試料中の成長ホルモンの含有量に対して、温度の上昇に伴い、試料中の成長ホルモンの含有量は減少したが、７０℃の試料においてもサケ成長ホルモンが残存することが明らかとなった。サケ成長ホルモンは疎水性が高いことが知られており、そのため、その他のホルモンと比較して高い耐熱性を有すると推察できる。
【００４０】
［試験例２］サケ成長ホルモンのｐＨ安定性試験
（１）試料の調製
サケ脳下垂体から精製されたサケ成長ホルモンを溶解した溶液を、ｐＨ調整剤を用いて、ｐＨ７．０、ｐＨ９．０及びｐＨ１１．０となるように調製し、室温で６０分間保持した。
（２）サケ成長ホルモンの検出
試験例１の（２）と同様の方法にて行った。結果を図１０（Ａ）〜（Ｃ）に示した。
【００４１】
ｐＨが塩基性になるについて、サケ成長ホルモンの検出量は減っていくが、ｐＨ１１においても十分量のサケ成長ホルモンが得られることが明らかとなった。このことから、サケ成長ホルモンは、高い耐塩基性を有すると推察できる。
【００４２】
［試験例３］サケ成長ホルモンを添加したニジマス肝臓由来細胞のＩＧＦ−Ｉの発現量の定量試験
（１）試料の調製
実施例１及び実施例２で得られたサケ成長ホルモン含有飼料、並びにコントロールとして精製サケ成長ホルモンを、それぞれサケ成長ホルモンの含有量が０、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌとなるようにイーグル最小必須培地（シグマアルドリッチ）に添加した。事前に播種し培養しておいたニジマス肝臓由来細胞に、上述の濃度のサケ成長ホルモンを含有したイーグル最小必須培地（シグマアルドリッチ）０．５ｍｌをそれぞれ添加し、１０℃で２４時間培養した。
（２）定量ＰＣＲによるニジマス肝臓由来細胞のＩＧＦ−Ｉの発現量の定量
培養した細胞を回収し、ｍＲＮＡを抽出し、定量ＰＣＲによりＩＧＦ−Ｉ（Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ）の発現量を定量した。結果を図１１に示した。図１１では、実施例１及び実施例２で得られたサケ成長ホルモン含有飼料、並びにコントロールとして精製サケ成長ホルモンそれぞれにおいて、サケ成長ホルモンを含んでいない培養液のＩＧＦ−Ｉの発現量を１としたときの相対比を示している。
ＩＧＦ−Ｉとは、７０個のアミノ酸からなる単鎖ポリペプチドで、骨及び体細胞における成長ホルモン（Ｇｌｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ；ＧＨ）の成長促進作用を仲介する因子のひとつである。ＩＧＦ−Ｉの分泌は、成長ホルモン（ＧＨ）に依存し、種々の器官で産生される。よって、ＩＧＦ−Ｉの発現量は、サケ成長ホルモンによる成長効果の指標として用いることができる。
【００４３】
図１１より、実施例１及び実施例２で得られたサケ成長ホルモン含有飼料、並びに精製サケ成長ホルモンにおいて、濃度依存的にＩＧＦ−Ｉの発現量が増加していた。よって、実施例１及び実施例２において、５０℃及び６０℃にて加熱処理して得られた飼料中のサケ成長ホルモンは、十分な生物活性を有することが明らかとなった。
【００４４】
［試験例４］サケ成長ホルモン含有飼料を与えたニジマス稚魚の成長についての評価
（１）ニジマス稚魚用飼料の調製
実施例１及び実施例２で得られたサケ成長ホルモン含有飼料から調製した成長ホルモン溶液を用いて、それぞれサケ成長ホルモンの含有量が２．５μｇ／ｇとなるように添加したニジマス稚魚用飼料を調製した。コントロールとして、サケ成長ホルモンを含有しない飼料も調製した。
【００４５】
（２）ニジマス稚魚の飼育
ニジマス稚魚（ｎ＝１５尾）に１日に全体重の１％量を２回与えて、５６日間飼育した。１４日ごとに稚魚の体重を計測し、結果を図１２に示した。
【００４６】
コントロールの飼料を与えた稚魚と比較して、実施例１及び実施例２で得られたサケ成長ホルモン含有飼料を与えた稚魚では、飼育から１４日後から体重の増加量について有意な差が見られた。さらに、５６日後にはコントロールの飼料を与えた稚魚と比較して、実施例１及び実施例２で得られたサケ成長ホルモン含有飼料を与えた稚魚では、約１．５ｇ程度多く、体重が増加していた。よって、実施例１及び実施例２で得られたサケ成長ホルモン含有飼料は、ニジマス稚魚の成長促進効果を有することが明らかとなった。
【００４７】
以上の結果から、本発明によれば、生物活性を有するサケ成長ホルモンが高含有率である飼料を高効率で製造することができることが明らかとなった。また、本発明によれば、魚介類の成長を簡便且つ短期間で効率的に促進させ、それらの生産性の向上を図ることができることが明らかとなった。
【符号の説明】
【００４８】
１…粉砕装置、２…加熱装置、３…乾燥装置、４…固液分離装置、１０，２０，３０…サケ成長ホルモン含有飼料の製造装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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