(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血単核球中の、ヒト免疫不全ウイルスＲＮＡの転写開始点から１１０塩基までの転写産物を検出する検出工程と、
前記転写産物の検出の有無を指標として、患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化された状態であるか否かを評価する評価工程とを含み、
前記評価工程は、前記検出工程で前記ヒト免疫不全ウイルスＲＮＡの転写開始点から１１０塩基までの転写産物が検出された場合は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化された状態にあると評価する工程であることを特徴とする抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化状態の判定方法。
【請求項２】
患者が、血漿中のヒト免疫不全ウイルスＲＮＡ、及びヒト免疫不全ウイルス抗原が検出限界以下の患者である請求項１に記載のＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化状態の判定方法。
【請求項３】
検出工程が、配列番号：１で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを用いる請求項１から２のいずれかに記載のＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化状態の判定方法。
【請求項４】
末梢血単核球中の、ヒト免疫不全ウイルスＲＮＡの転写開始点から１１０塩基までの転写産物を検出する検出工程と、
前記転写産物の検出の有無を指標として、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が増加するか否かを評価する工程とを含むことを特徴とする抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加予測方法。
【請求項５】
患者が、血漿中のヒト免疫不全ウイルスＲＮＡ、及びヒト免疫不全ウイルス抗原が検出限界以下の患者である請求項４に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加予測方法。
【請求項６】
検出工程が、配列番号：１で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを用いる請求項４から５のいずれかに記載のＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加予測方法。
【請求項７】
末梢血単核球中の、ヒト免疫不全ウイルスＲＮＡの転写開始点から１１０塩基までの転写産物を検出する検出工程と、
前記転写産物の検出の有無を指標として、ＣＤ４＋Ｔ細胞が減少するか否かを評価する工程とを含むことを特徴とする抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始していない患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少予測方法。
【請求項８】
検出工程が、配列番号：１で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを用いる請求項７に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少予測方法。
【請求項９】
配列番号：１で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化状態の判定方法、請求項４から６のいずれかに記載の抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加予測方法、又は請求項７から８のいずれかに記載の抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始していない患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少予測方法に用いるためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者における免疫状態の判定方法、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加予測方法、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始していない患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少予測方法、及び抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者における免疫状態の判定のためのキット、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加を予測するためのキット、又は抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始していない患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少を予測するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
後天性免疫不全症候群（Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；以下、「エイズ」と称することがある）の原因であるヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ；以下、「ＨＩＶ」と称することがある）感染に対しては、ＨＩＶ感染の根本的な予防をすることと共に、万一感染した疑いが生じた場合に、感染の有無を早期に診断できる技術を確立することが重要である。
【０００３】
現在、ＨＩＶ感染の診断は、感染者の血漿中のＨＩＶ  ＲＮＡやＨＩＶ抗原を測定することにより行われている。
【０００４】
ＨＩＶに対する治療としては、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療が行われている。前記治療としては、例えば、多剤併用療法（Ｈｉｇｈｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｎｔｉ−Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ；以下、「ＨＡＡＲＴ療法」と称することがある）が一般的である。前記治療によれば、感染者の血漿中のＨＩＶ  ＲＮＡやＨＩＶ抗原の量を検出限界以下にまで抑えることができる。
しかしながら、ＨＡＡＲＴ療法による治療過程で、抗ヒト免疫不全ウイルス薬が組織の深部まで届きにくい理由から一部の感染細胞は前記ＨＡＡＲＴ療法から逃避する（以下、「残存感染細胞」と称することがある）ことが知られている。ＨＡＡＲＴ療法は、ウイルス増殖の各ステップを阻害するものであるため、ＨＡＡＲＴ療法により残存感染細胞からウイルスを除くことは困難である。
そのため、感染者の血漿中のＨＩＶ  ＲＮＡやＨＩＶ抗原の量を検出限界以下にまで抑えた場合であっても、ＨＡＡＲＴ療法を中断すると、残存感染細胞におけるウイルスの生活環が再始動してしまうという問題がある。
【０００５】
そこで、ＨＩＶ  ＲＮＡやＨＩＶ抗原の量が検出限界以下であってもＨＩＶを検出する方法として、残存感染細胞が産生するヒト免疫不全ウイルスの転写産物を検出する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。前記提案によれば、高精度かつ高感度にＨＩＶを検出することができる。
【０００６】
一方、前記ＨＡＡＲＴ療法により、ＨＩＶ感染は致死の病では無くなってきているものの、前記残存感染細胞が存在することにより、低レベルでのウイルスの複製、慢性的な炎症の惹起、免疫力の低下が生じ、種々の長期合併症を引き起こすリスクが問題となってきている。前記合併症としては、非エイズ関連悪性腫瘍、心血管疾患、慢性腎臓病、肝臓疾患、骨関連疾患、ＨＩＶ関連神経認知疾患などが挙げられる。
【０００７】
そのため、血漿中のＨＩＶ  ＲＮＡやＨＩＶ抗原の量が検出限界以下となった場合であっても、ＨＩＶの活動を予測したり、ＨＩＶ感染者の免疫力を判定したりすることができる方法の速やかな提供が強く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１１１８００号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者における免疫状態を簡便、かつ高精度に判定することができる免疫状態の判定方法、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加を簡便、かつ高精度に予測することができるＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加予測方法、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始していない患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少を簡便、かつ高精度に予測することができるＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少予測方法、並びにそれらのためのキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  末梢血単核球中の、ヒト免疫不全ウイルスＲＮＡの転写開始点から２００塩基までの転写産物を検出する検出工程と、
前記転写産物の検出の有無を指標として、患者における免疫が活性化された状態であるか否かを評価する工程とを含むことを特徴とする抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者における免疫状態の判定方法である。
＜２＞  末梢血単核球中の、ヒト免疫不全ウイルスＲＮＡの転写開始点から２００塩基までの転写産物を検出する検出工程と、
前記転写産物の検出の有無を指標として、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が増加するか否かを評価する工程とを含むことを特徴とする抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加予測方法である。
＜３＞  末梢血単核球中の、ヒト免疫不全ウイルスＲＮＡの転写開始点から２００塩基までの転写産物を検出する検出工程と、
前記転写産物の検出の有無を指標として、ＣＤ４＋Ｔ細胞が減少するか否かを評価する工程とを含むことを特徴とする抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始していない患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少予測方法である。
＜４＞  配列番号：１で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者における免疫状態の判定のためのキット、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加を予測するためのキット、又は抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始していない患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少を予測するためのキットである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者における免疫状態を簡便、かつ高精度に判定することができる免疫状態の判定方法、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加を簡便、かつ高精度に予測することができるＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加予測方法、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始していない患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少を簡便、かつ高精度に予測することができるＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少予測方法、並びにそれらのためのキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、試験例１の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、試験例２の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、試験例３の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、試験例４の結果を示すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、試験例５における治療開始患者における末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出の有無と、ＣＤ４＋Ｔ細胞数との関係を解析した結果を示すグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、試験例５における治療開始患者における末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出の有無と、ＣＤ４＋Ｔ細胞数の増減との関係を解析した結果を示すグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、試験例６のＨＩＶ短鎖ＲＮＡの量と総ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ＋  ＣＤ３８＋細胞の割合との関係を示すグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、試験例６のＨＩＶ短鎖ＲＮＡの量と総ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ  ＭＦＩの量との関係を示すグラフである。
【図７】図７は、試験例７の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、試験例８の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（免疫状態の判定方法）
本発明の抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者における免疫状態の判定方法は、検出工程と、評価工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００１４】
＜検出工程＞
前記免疫状態の判定方法における検出工程は、末梢血単核球中の、ヒト免疫不全ウイルスＲＮＡの転写開始点から２００塩基までの転写産物（以下、「ＨＩＶ短鎖ＲＮＡ」と称することがある）を検出する工程である。
【００１５】
−ＨＩＶ短鎖ＲＮＡ−
前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの長さとしては、ヒト免疫不全ウイルスＲＮＡの転写開始点から２００塩基までの転写産物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述する試験例８で示されている、転写開始点から約３０塩基程度、約５０塩基〜約７０塩基程度、約９０塩基〜約１１０塩基程度のものなどが挙げられる。
【００１６】
−ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出方法−
前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡを検出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐｏｌｙＡ付加処理と、ｃＤＮＡ合成処理と、増幅処理と、検出処理とを含む方法が挙げられる。
【００１７】
−−ｐｏｌｙＡ付加処理−−
前記ｐｏｌｙＡ付加処理は、ｐｏｌｙＡポリメラーゼを用いて、末梢血単核球画分から分離、精製された２００塩基以下のＲＮＡの３’末端にｐｏｌｙＡを付加する処理である。
前記ｐｏｌｙＡ付加処理は、例えば、ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行うことができる。
前記ｐｏｌｙＡの長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０塩基〜４０塩基が好ましく、２０塩基〜３０塩基がより好ましい。
【００１８】
−−ｃＤＮＡ合成処理−−
前記ｃＤＮＡ合成処理は、ｐｏｌｙＴと、該ｐｏｌｙＴの５’側にアダプター配列とを有するオリゴヌクレオチド（以下、「ｐｏｌｙＴ含有オリゴヌクレオチド」と称することがある）を用いて、逆転写反応により、前記ｐｏｌｙＡを付加したＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを合成する処理である。
前記ｃＤＮＡ合成処理は、例えば、ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行うことができる。
前記ｐｏｌｙＴの長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０塩基〜４０塩基が好ましく、２０塩基〜３０塩基がより好ましい。前記ｐｏｌｙＴは、前記ｐｏｌｙＡにアニールする。
前記ｐｏｌｙＴ含有オリゴヌクレオチドは、３’末端に縮重配列を有していてもよい。
前記ｐｏｌｙＴ含有オリゴヌクレオチドの３’末端を起点とした逆転写反応により、前記ｐｏｌｙＡを付加したＲＮＡに相補的なｃＤＮＡが合成される。
前記逆転写反応に用いられる逆転写酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ由来の逆転写酵素などが挙げられる。
前記アダプター配列としては、逆転写反応を阻害しないものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、生体内の既知の遺伝子に相補的でないものが好ましく、ＨＩＶ遺伝子に相補的でないことがより好ましい。
前記ｐｏｌｙＡ付加処理と、前記ｃＤＮＡ合成処理とは、同時に行ってもよいし、別々に行ってもよい。
【００１９】
前記ｃＤＮＡは、鋳型として用いたＲＮＡとハイブリッドを形成しているため、ＲＮａｓｅを用いて、ＲＮＡを分解しておくことが好ましい。
前記ＲＮａｓｅとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＲＮａｓｅＨなどが挙げられる。
【００２０】
−−増幅処理−−
前記増幅処理は、ＨＩＶ  ＲＮＡの転写産物に対応する塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（以下、「フォワードプライマー」と称することがある）と、前記アダプター配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド（以下、「リバースプライマー」と称することがある）とを用いて、前記ｃＤＮＡから、ＨＩＶのｃＤＮＡの配列を有する標的塩基配列を増幅する処理である。
【００２１】
−−−フォワードプライマー−−−
前記フォワードプライマーとしては、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡを検出することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号：１で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（以下、「フォワードプライマー用オリゴヌクレオチド」と称することがある）が好ましい。
前記フォワードプライマー用オリゴヌクレオチドは、配列番号：１で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列以外の配列（以下、「その他の配列」と称することがある）を含んでいてもよい。
なお、前記配列番号：１で表される塩基配列は、ＨＩＶ−１のＲＮＡの転写開始点から２００塩基までの転写産物の塩基配列をＤＮＡ表記したものである。
【００２２】
前記フォワードプライマー用オリゴヌクレオチドにおける前記配列番号：１で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列部分の配列同一性としては、少なくとも８０％であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が特に好ましい。
前記フォワードプライマー用オリゴヌクレオチドの前記配列番号：１で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列部分は、前記配列番号：１で表される塩基配列に対して、１個若しくは複数個の塩基が、置換、欠失、挿入、付加されていてもよい。
前記フォワードプライマー用オリゴヌクレオチドの前記配列番号：１で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列部分の長さとしては、１０塩基以上であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２３】
前記フォワードプライマー用オリゴヌクレオチドにおける前記その他の配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記その他の配列の長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５塩基〜２０塩基が好ましい。
前記その他の配列は、前記配列番号：１で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列の５’末端に付加していることが好ましい。
【００２４】
前記その他の配列の具体例としては、前記フォワードプライマー用オリゴヌクレオチドの５’末端に付加される配列（以下、「Ｆｌａｐ配列」と称することがある）が好ましく挙げられる。
前記Ｆｌａｐ配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＡＴリッチなＦｌａｐ配列が好ましい。前記Ｆｌａｐ配列中のＡＴ含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、８０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が特に好ましい。
前記ＡＴリッチな配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号：１０で表されるＦｌａｐ配列が好ましい。
５’−ＡＡＴＡＡＡＴＣＡＴＡＡ−３’（配列番号：１０）
【００２５】
前記フォワードプライマーの長さとしては、１０塩基以上であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０塩基〜４０塩基が好ましく、２０塩基〜４０塩基がより好ましい。
【００２６】
前記フォワードプライマー用オリゴヌクレオチドの好ましい具体例としては、配列番号：２で表されるオリゴヌクレオチド、配列番号：６で表されるオリゴヌクレオチド、配列番号：８で表されるオリゴヌクレオチド、配列番号：９で表されるオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。これらの中でも、配列番号：２で表されるオリゴヌクレオチド、配列番号：６で表されるオリゴヌクレオチドが好ましく、配列番号：２で表されるオリゴヌクレオチドがより好ましい。
５’−ＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧ−３’（配列番号：２）
５’−ＡＡＴＡＡＡＴＣＡＴＡＡＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧ−３’（配列番号：６）
下線部は、Ｆｌａｐ配列を示す。
５’−ＧＧＧＴＣＴＣＴＣＴＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧ−３’（配列番号：８）
５’−ＣＴＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣ−３’（配列番号：９）
【００２７】
−−−リバースプライマー−−−
前記リバースプライマーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、アダプター配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドが好ましい。
前記リバースプライマーは、アダプター配列に相補的な配列以外の配列（以下、「その他の配列」と称することがある）を含んでいてもよい。
【００２８】
前記リバースプライマーにおける前記その他の配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記その他の配列の長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５塩基〜２０塩基が好ましい。
前記その他の配列は、前記アダプター配列に相補的な配列の５’末端に付加していることが好ましい。
【００２９】
前記その他の配列の具体例としては、前記アダプター配列に相補的な配列の５’末端に付加される配列（以下、「Ｆｌａｐ配列」と称することがある）が好ましく挙げられる。
前記Ｆｌａｐ配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＡＴリッチなＦｌａｐ配列が好ましい。前記Ｆｌａｐ配列中のＡＴ含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、８０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が特に好ましい。
前記ＡＴリッチな配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号：１０で表されるＦｌａｐ配列が好ましい。
５’−ＡＡＴＡＡＡＴＣＡＴＡＡ−３’（配列番号：１０）
【００３０】
前記リバースプライマーの長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０塩基〜４０塩基が好ましく、１５塩基〜３０塩基がより好ましい。
【００３１】
前記リバースプライマーの好ましい具体例としては、配列番号：３で表されるオリゴヌクレオチド、配列番号：７で表されるオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。これらの中でも、配列番号：７で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい。
５’−ＣＡＧＴＴＡＣＧＣＡＴＧＣＣＧ−３’（配列番号：３）
５’−ＡＡＴＡＡＡＴＣＡＴＡＡＣＡＧＴＴＡＣＧＣＡＴＧＣＣＧ−３’（配列番号：７）
下線部は、Ｆｌａｐ配列を示す。
【００３２】
前記フォワードプライマーとリバースプライマーとの組合せとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、リバースプライマーのみがＦｌａｐ配列を含む態様が好ましく、前記配列番号：２で表されるオリゴヌクレオチドと前記配列番号：７で表されるオリゴヌクレオチドとの組合せがより好ましい。
【００３３】
−−−増幅−−−
前記標的塩基配列を増幅する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃａｌ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＭＡＰ（Ｓｍａｒｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）法、ＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＨＡＤ（Ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などが挙げられる。
【００３４】
前記標的塩基配列の増幅に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限はなく、公知のＤＮＡポリメラーゼを適宜選択することができ、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。これらの中でも、リアルタイムＰＣＲ法を行う場合には、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
【００３５】
前記増幅の方法として、ＰＣＲ法を用いる場合は、以下のようにして標的塩基配列が増幅される。
前記ｃＤＮＡの３’末端側に前記フォワードプライマーがアニールし、伸長反応が行われ、前記ｃＤＮＡの相補鎖（以下、「伸長産物Ａ」と称することがある）が合成される。次いで、前記伸長産物Ａの３’末端側に前記リバースプライマーがアニールし、伸長反応が行われ、前記伸長産物Ａの相補鎖（以下、「伸長産物Ｂ」と称することがある）が合成される。次いで、前記伸長産物Ｂの３’末端側に前記フォワードプライマーがアニールし、伸長反応が行われ、前記伸長産物Ｂの相補鎖（以下、「伸長産物Ｃ」と称することがある）が合成される。以後、伸長産物Ｂが合成される処理と、伸長産物Ｃが合成される処理とを繰り返すことにより、標的塩基配列が増幅される。
前記ＰＣＲの条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、９５℃  ３０秒間の反応を１サイクル行い、その後、９５℃  ５秒間、６０℃  １０秒間の２ステップ反応を５０サイクル行う、などが挙げられる。
【００３６】
−−検出処理−−
前記検出処理は、前記標的塩基配列の増幅産物を検出する処理である。
前記検出の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エンドポイントアッセイ、リアルタイムアッセイなどが挙げられる。これらの中でもリアルタイムアッセイが好ましい。
【００３７】
前記エンドポイントアッセイは、反応後に標的塩基配列が増幅したか否かを評価する方法である。
前記エンドポイントアッセイの具体例としては、電気泳動により評価する方法が挙げられる。
前記電気泳動は、標的塩基配列の増幅産物と、核酸分子量マーカーとについて電気泳動を行い、両者の泳動度を対比することにより、所定の分子量を有する標的塩基配列が増幅されたか否かを評価する方法である。
前記電気泳動に用いる試薬としては、特に制限はなく、公知の試薬を適宜選択することができ、例えば、臭化エチジウム、サイバーグリーンなどが挙げられる。
【００３８】
前記リアルタイムアッセイは、標的塩基配列の増幅を経時的（リアルタイム）に測定する方法である。
前記リアルタイムアッセイの具体例としては、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて評価する方法が挙げられる。
前記リアルタイムＰＣＲは、段階希釈した既知の量のＤＮＡを標準として用い、ＰＣＲによる前記標準ＤＮＡ、及び標的塩基配列の増幅を経時的に測定し、前記標準ＤＮＡの増幅が指数関数的に起きる分子数の範囲内で、前記標的塩基配列の分子数を定量する方法である。
【００３９】
前記リアルタイムＰＣＲにおける定量方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光色素を用いる方法などが挙げられる。
前記蛍光色素を用いる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖ＤＮＡに特異的にインターカレートして蛍光を発する色素を用いる方法、増幅するＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させたプローブを用いる方法などが挙げられる。これらの中でも、標的塩基配列をより特異的に検出することができる点で、増幅するＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させたプローブを用いる方法が好ましい。
【００４０】
前記二本鎖ＤＮＡに特異的にインターカレートして蛍光を発する色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、サイバーグリーンなどが挙げられる。
【００４１】
前記プローブとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、標的配列の少なくとも一部にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドの一方の端部が蛍光物質で修飾されており、他方の端部が消光物質で修飾されているものが好ましい。前記好ましいプローブでは、蛍光物質と消光物質とが近接しているため、蛍光物質の有する蛍光シグナルと発する機能が、消光物質によって妨げられている。
前記増幅処理において、前記フォワードプライマーが標的塩基配列にアニールする条件下で、前記プローブは標的塩基配列にハイブリダイズする。続いて、伸長反応の過程で、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの有する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって、前記プローブは分解される。その結果、前記プローブに修飾されていた蛍光物質及び消光物質は、相互に空間的に分離され、蛍光物質は、蛍光シグナルを発することができる。前記蛍光シグナルは、増幅された標的塩基配列の分子数に比例する。
【００４２】
前記蛍光物質としては、特に制限はなく、公知の蛍光物質を適宜選択することができ、例えば、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５’−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８などが挙げられる。これらの中でも、ＦＡＭが好ましい。
【００４３】
前記消光物質としては、特に制限はなく、公知の消光物質を適宜選択することができ、例えば、ＢＨＱ、ＴＡＭＲＡ（テトラメチル−ローダミン）、ＤＡＢＣＹＬ（４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）などが挙げられる。これらの中でも、ＢＨＱ、ＴＡＭＲＡが好ましく、ＢＨＱがより好ましい。
【００４４】
前記プローブとして用いられるオリゴヌクレオチドとしては、前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡを検出することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号：４で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい。前記配列番号：４で表されるオリゴヌクレオチドを用いることにより、標的塩基配列の増幅をより特異的に検出することができる。
５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧ−３’（配列番号：４）
【００４５】
前記検出のその他の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、標識物質により標識したオリゴヌクレオチドを用いる方法、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法、マススペクトルを用いる方法、融解曲線分析を用いる方法、増殖曲線分析を用いる方法などが挙げられる。
【００４６】
前記標識物質により標識したオリゴヌクレオチドを用いる方法としては、例えば、前記フォワードプライマー、又はリバースプライマーを標識物質により標識しておく方法が挙げられる。前記方法によれば、前記標識物質を指標として、標的塩基配列の増幅を検出することができる。
前記標識物質としては、特に制限はなく、公知の標識物質を適宜選択することができ、例えば、蛍光色素、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素、抗体などが挙げられる。前記オリゴヌクレオチドにおける標識部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４７】
＜評価工程＞
前記免疫状態の判定方法における評価工程は、前記転写産物の検出の有無を指標として、患者における免疫が活性化された状態であるか否かを評価する工程である。
【００４８】
−患者−
前記免疫状態の判定方法における患者としては、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、血漿中のヒト免疫不全ウイルスＲＮＡ、及びヒト免疫不全ウイルス抗原が検出限界以下の患者であることが好ましい。
【００４９】
後述する試験例６に記載したように、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの量は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化マーカーの発現と正の相関があることが示された。
したがって、前記検出工程で前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出された場合には、その患者では、免疫が活性化された状態にあると評価することができる。
【００５０】
また、前記検出工程で前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出された場合には、その患者は、慢性的な免疫活性化状態であり、そのため、免疫の老化や疲弊により、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が回復しない可能性が高い患者と考えられ、日和見感染症の罹患、悪性腫瘍の出現、認知機能の低下などを引き起こすリスクがある患者であると評価することもできる。
そのため、本発明の免疫状態の判定方法は、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療の効果が認められた患者の中で、予後の観察が必要な患者の情報を提供するために用いることも可能である。
【００５１】
＜その他の工程＞
前記免疫状態の判定方法におけるその他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、末梢血単核球画分調製工程、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡ（以下、「２００塩基以下のスモールＲＮＡ」と称することがある）調製工程などが挙げられる。
【００５２】
−末梢血単核球調製工程−
前記末梢血単核球画分調製工程は、血液から末梢血単核球（以下、「リンパ球」と称することがある）画分を分離する工程である。
血液から末梢血単核球画分を分離する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、遠心比重法により分離する方法などが挙げられる。
【００５３】
−ＨＩＶ短鎖ＲＮＡ調製工程−
前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡ調製工程は、前記末梢血単核球画分から２００塩基以下のＲＮＡを分離、精製する工程である。
末梢血単核球画分から２００塩基以下のＲＮＡを分離、精製する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＲＮＡ抽出試薬（ＩｓｏｇｅｎＩＩ（株式会社ニッポンジーン製））、ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いる方法などが挙げられる。
【００５４】
（ＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加予測方法）
本発明の抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加予測方法は、検出工程と、評価工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００５５】
＜検出工程＞
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加予測方法における検出工程は、末梢血単核球中の、ヒト免疫不全ウイルスＲＮＡの転写開始点から２００塩基までの転写産物を検出する工程である。
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加予測方法における検出工程は、前記免疫状態の判定方法における検出工程と同様にして行うことができる。
【００５６】
＜評価工程＞
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加予測方法における評価工程は、前記転写産物の検出の有無を指標として、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が増加するか否かを評価する工程である。
【００５７】
−患者−
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加予測方法における患者としては、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、血漿中のヒト免疫不全ウイルスＲＮＡ、及びヒト免疫不全ウイルス抗原が検出限界以下の患者であることが好ましい。
【００５８】
後述する試験例５に記載したように、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出されなかった患者は、その１年間後において、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出された患者と比較して、有意にＣＤ４＋Ｔ細胞数が増加していることが示された。
したがって、前記検出工程で前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出されなかった場合には、その患者では、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が増加（回復）すると評価することができる。一方、前記検出工程で前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出された場合には、その患者では、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が増加（回復）しないと評価することができる。
【００５９】
また、前記検出工程で前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出された場合には、その患者では、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が増加（回復）しないことから、前記患者は、免疫力が回復しない可能性が高い患者と考えられ、日和見感染症の罹患、悪性腫瘍の出現、認知機能の低下などを引き起こすリスクがある患者であると評価することもできる。
そのため、本発明のＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加予測方法は、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療の効果が認められた患者の中で、免疫力が回復しない可能性がある患者の情報を提供するために用いることも可能である。
【００６０】
＜その他の工程＞
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加予測方法におけるその他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記免疫状態の判定方法におけるその他の工程の項目に記載した工程と同様の工程が挙げられる。
【００６１】
（ＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少予測方法）
本発明の抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始していない患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少予測方法は、検出工程と、評価工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００６２】
＜検出工程＞
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少予測方法における検出工程は、末梢血単核球中の、ヒト免疫不全ウイルスＲＮＡの転写開始点から２００塩基までの転写産物を検出する工程である。
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少予測方法における検出工程は、前記免疫状態の判定方法における検出工程と同様にして行うことができる。
【００６３】
＜評価工程＞
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少予測方法における評価工程は、前記転写産物の検出の有無を指標として、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が減少するか否かを評価する工程である。
【００６４】
−患者−
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少予測方法における患者としては、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始していない患者であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６５】
後述する試験例４に記載したように、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出された患者は、その１年間後において、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出されなかった患者と比較して、有意にＣＤ４＋Ｔ細胞数が減少していることが示された。
したがって、前記検出工程で前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出された場合には、その患者では、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が減少すると評価することができる。
また、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞数が減少する時期としては、例えば、遅くとも１年後に減少すると評価することができる。
【００６６】
また、後述する試験例１及び２で記載したように、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出の有無と、ＨＩＶ粒子数又はＣＤ４＋Ｔ細胞数とは相関があることも示された。また、後述する試験例３に記載したように、ＨＩＶ感染者の病態の進行に伴って、末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出されやすくなることも示された。
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞数は免疫力の指標であり、ＨＩＶに感染するとＣＤ４＋Ｔ細胞数が減り、後天性免疫不全症候群を発症する。そのため、本発明のＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少予測方法は、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始する時期を判断するための情報を提供したり、ＨＩＶ感染者の病態の進行を把握するための情報を提供したりするために用いることも可能である。
【００６７】
＜その他の工程＞
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少予測方法におけるその他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記免疫状態の判定方法におけるその他の工程の項目に記載した工程と同様の工程が挙げられる。
【００６８】
（キット）
本発明のキットは、配列番号：１で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
本発明のキットは、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者における免疫状態の判定のため、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加を予測するため、又は抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始していない患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少を予測するために用いられる。
【００６９】
＜オリゴヌクレオチド＞
前記配列番号：１で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドは、本発明の免疫状態の判定方法に記載のフォワードプライマー用オリゴヌクレオチドである。
【００７０】
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、本発明の免疫状態の判定方法に記載のリバースプライマー、プローブ、ｐｏｌｙＡ付加処理用試薬、ｃＤＮＡ合成処理用試薬、ＰＣＲ用試薬などが挙げられる。
【実施例】
【００７１】
以下に試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの試験例に何ら限定されるものではない。
【００７２】
（試験例１：抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始していない患者（以下、「未治療患者」と称することがある）における末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出の有無と血漿中のＨＩＶ  ＲＮＡ量との関係）
＜ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出＞
未治療患者（東京大学医科学研究所付属病院、１４４名）から採取した血液  約３．５ｍＬを使用した。前記血液から、遠心比重法により末梢血単核球画分を分離した。前記末梢血単核球画分（１×１０６細胞）から、ＲＮＡ抽出試薬（ＩｓｏｇｅｎＩＩ（株式会社ニッポンジーン製））を用い、２００塩基以下のスモールＲＮＡを分離後、更に前記スモールＲＮＡに混入してくる可能性がある染色体ＤＮＡをＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ社製）にて消化し、精製した。
【００７３】
前記スモールＲＮＡにｐｏｌｙＡを付加したＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを、ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて合成した。
【００７４】
前記ｃＤＮＡと、以下のプライマー及びプローブとを用いて、以下のＰＣＲ条件で、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を行った。なお、定量的ＲＴ−ＰＣＲの試薬には、Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用い、定量的ＲＴ−ＰＣＲの装置には、ＣＦＸ９６（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）を用いた。
［プライマー及びプローブ］
・フォワードプライマー
５’−ＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧ−３’（配列番号：２）
フォワードプライマーは、前記ｃＤＮＡにおけるＨＩＶ  ＲＮＡの転写産物に対応する。
・リバースプライマー
５’−ＣＡＧＴＴＡＣＧＣＡＴＧＣＣＧ−３’（配列番号：３）
リバースプライマーは、前記ｃＤＮＡ合成時に付加されたアダプター配列を認識する。
・プローブ（Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ）
５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧ−３’（配列番号：４）
プローブは、オリゴヌクレオチドの５’末端がＦＡＭ、３’末端がＢＨＱで修飾されている。
［ＰＣＲ条件］
９５℃  ３０秒間の反応を１サイクル行い、その後、９５℃  ５秒間、６０℃  １０秒間の２ステップ反応を５０サイクル行った。
【００７５】
前記測定の結果、未治療患者のうち、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出されたのは６７人であり、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出されなかったのは７７人であった。
【００７６】
＜血漿中のＨＩＶ  ＲＮＡ＞
前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出を行った患者から採取した血液から、一部を東京大学医科学研究所附属病院より受託検査会社にて血液生化学検査を依頼し、前記血漿画分中のＨＩＶ  ＲＮＡ量を測定した。
【００７７】
＜解析＞
ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出の有無と、血漿中のＨＩＶ  ＲＮＡとの関係を解析した結果を図１に示す。図１中、縦軸は、血漿中のＨＩＶ  ＲＮＡ量を示し、横軸は、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出された患者（ＳＴ＋）と検出されなかった患者（ＳＴ−）を示す。また、図１中の点線は、５０コピー／ｍＬを示し、エラーバーは、平均値の９５％信頼区間を示す。
図１に示すように、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出された患者では、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出されなかった患者と比較して、有意（＊＊＊：０．０００７（マンホイットニー検定（Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔｅｓｔ））に血漿中のＨＩＶ  ＲＮＡ量が多い傾向が観察された。
【００７８】
（試験例２：未治療患者における末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出の有無とＣＤ４＋Ｔ細胞数との関係）
＜ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出＞
試験例１におけるＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出結果を本試験例の解析に用いた。
【００７９】
＜ＣＤ４＋Ｔ細胞数＞
前記試験例１において、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出を行った患者から採取した血液から、一部を東京大学医科学研究所附属病院より受託検査会社にて血液生化学検査を依頼し、前記血漿画分中のＣＤ４＋Ｔ細胞数を測定した。
【００８０】
＜解析＞
ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出の有無と、ＣＤ４＋Ｔ細胞数との関係を解析した結果を図２に示す。図２中、縦軸は、ＣＤ４＋Ｔ細胞数を示し、横軸は、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出された患者（ＳＴ＋）と検出されなかった患者（ＳＴ−）を示す。また、図２中のエラーバーは、平均値の９５％信頼区間を示す。
図２に示すように、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出された患者では、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出されなかった患者と比較して、有意（＊＊：０．００９３（マンホイットニー検定））に、免疫力の指標であるＣＤ４＋Ｔ細胞数が少ない傾向が観察された。
【００８１】
試験例１及び２の結果から、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出の有無と、ＨＩＶ粒子数又はＣＤ４＋Ｔ細胞数とは相関があることが示された。したがって、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡは、ＨＩＶ感染者の病態を反映するバイオマーカーであることが示唆された。
【００８２】
（試験例３：未治療患者における末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出の有無と治療開始までの時間との関係）
＜ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出＞
末梢血中単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出されなかった患者であって、その後、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した患者（１０４人）の血液を用いた以外は、試験例１と同様にして、末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出を行った。
【００８３】
＜解析＞
未治療患者における末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出の有無と治療開始までの時間との関係を解析した結果を図３に示す。図３中、縦軸は、治療開始までの時間を示し、横軸は、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出された患者（ＳＴ＋）と検出されなかった患者（ＳＴ−）の割合を示す。
図３の結果から、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始する２週間未満〜１年間前に、約半数の患者で末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出されることがわかった。そのため、ＨＩＶ感染者の病態の進行に伴って、末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出されやすくなることが示された。
【００８４】
（試験例４：未治療患者における末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出の有無とＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少との関係）
＜ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出＞
試験例２において、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が２５０ｃｅｌｌｓ／μＬより多かった患者の１年間後の血液を用いた以外は、試験例１と同様にして、末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出を行った。
【００８５】
＜ＣＤ４＋Ｔ細胞数＞
試験例２において、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が２５０ｃｅｌｌｓ／μＬより多かった患者の１年間後の血液を用いた以外は、試験例２と同様にして、ＣＤ４＋Ｔ細胞数を測定した。
【００８６】
＜解析＞
未治療患者における末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出の有無とＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少との関係を解析した結果を図４に示す。図４中、縦軸は、ＣＤ４＋Ｔ細胞数を示し、横軸は、試験例２の時点で末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出された患者（６人）の血液（解析時にＳＴ＋）、前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出された患者（６人）の１年間後の血液（１年後）、試験例２の時点で末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出されなかった患者（３５人）の血液（解析時にＳＴ−）、前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出されなかった患者（３５人）の１年間後の血液（１年後）を示す。また、図４中のエラーバーは、平均値の９５％信頼区間を示す。
図４に示すように、試験例２の時点では、末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出された患者と末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出されなかった患者との間で、ＣＤ４＋Ｔ細胞数に有意差はなかった（ＮＳ  ｐ＝０．９３５４（マンホイットニー検定））。しかしながら、１年間後は、末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出された患者では、有意（＊  ｐ＝０．０１１２（マンホイットニー検定））にＣＤ４＋Ｔ細胞数が減少していた。
【００８７】
（試験例５：抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療開始後の患者（以下、「治療開始患者」と称することがある）における末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出の有無と、ＣＤ４＋Ｔ細胞数又はＣＤ４＋Ｔ細胞数の増減との関係）
＜ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出−１＞
血漿中のＨＩＶ  ＲＮＡ量が検出限界以下となった治療開始患者（５７人）の血液を用いた以外は、試験例１と同様にして、末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出を行った。
【００８８】
＜ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出−２＞
前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出−１を行った患者の１年間後の血液を用いた以外は、試験例１と同様にして、末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出を行った。
【００８９】
＜ＣＤ４＋Ｔ細胞数＞
前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出−１又はＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出−２を行った血液を用いた以外は、試験例２と同様にして、ＣＤ４＋Ｔ細胞数を測定した。
【００９０】
＜解析−１＞
治療開始患者における末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出の有無と、ＣＤ４＋Ｔ細胞数との関係を解析した結果を図５Ａに示す。図５Ａ中、縦軸は、前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出−１の血液におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数（ＳＴ解析時のＣＤ４＋Ｔ細胞数）を示し、横軸は、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出された患者（ＳＴ＋）と検出されなかった患者（ＳＴ−）を示す。
図５Ａに示すように、前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出−１の血液では、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出された患者（１６人）と、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出されなかった患者（４１人）との間で、ＣＤ４＋Ｔ細胞数に有意差がなかった（ｎｓ  ０．６５０７（マンホイットニー検定））。
【００９１】
＜解析−２＞
治療開始患者における末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出の有無と、ＣＤ４＋Ｔ細胞数の増減との関係を解析した結果を図５Ｂに示す。図５Ｂ中、縦軸は、前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出−１の血液におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数からの前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出−２の血液におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の増減（１年後のＣＤ４＋Ｔ細胞数の増減）を示し、横軸は、前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出−１の血液で、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出された患者（ＳＴ＋）と、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出されなかった患者（ＳＴ−）とを示す。
図５Ｂに示すように、前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出−１の血液でＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出されなかった患者（ＳＴ−）では、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出された患者（ＳＴ＋）と比較して、有意にＣＤ４＋Ｔ細胞数が増加（回復）していた（（＊  ０．０１３０（マンホイットニー検定））。
したがって、治療開始患者で、末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡが検出され続ける患者は、ＣＤ４＋Ｔ細胞数の回復が鈍いことが示された。このような患者は、免疫学的失敗（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎｏｎ−Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）により、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が低値であることによる免疫不全状態であることが考えられ、日和見感染症の罹患、悪性腫瘍の出現、認知機能の低下などを引き起こすリスクがあると考えられる。
【００９２】
（試験例６：治療開始患者における末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡの量とＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化マーカーの発現量との関係）
＜ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出＞
血漿中のＨＩＶ  ＲＮＡ量が検出限界以下となった治療開始患者（３４人）の血液を用いた以外は、試験例１と同様にして、末梢血単核球中のＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出を行った。
【００９３】
＜ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化マーカーの発現＞
前記ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの検出を行った治療開始患者から採取した血液から調製したリンパ球の免疫染色を行い、ＣＤ３＋及びＣＤ８＋を満たすＣＤ８陽性Ｔ細胞のＨＬＡ−ＤＲの発現量（総ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ＋  ＣＤ３８＋細胞の割合、発現強度）をＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ社製）により測定した。
【００９４】
＜解析−１＞
ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの量と総ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ＋  ＣＤ３８＋細胞の割合との関係を解析した結果を図６Ａに示す。図６Ａ中、縦軸は、総ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ＋  ＣＤ３８＋細胞の割合（％）を示し、横軸は、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの量を示す（ｒｈｏ＝０．５６６８、ｐ＝０．０００４）。
【００９５】
＜解析−２＞
ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの量と総ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ  ＭＦＩの量との関係を解析した結果を図６Ｂに示す。図６Ｂ中、縦軸は、総ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ  ＭＦＩの量（蛍光強度）を示し、横軸は、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの量を示す（ｒｈｏ＝０．６５３９、ｐ＜０．０００１）。
【００９６】
図６Ａ及び図６Ｂの結果から、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの量は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化マーカーの発現と正の相関があることが示された。したがって、血漿中のＨＩＶ  ＲＮＡ量が検出限界以下となった治療開始患者において、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの量が多いほど免疫が強く活性化されている傾向があることがわかった。そのため、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡを検出することにより、免疫が慢性的に活性化した状態の患者の発見が可能となると考えられる。
【００９７】
（試験例７：検出用プライマーの検討）
スタンダードＲＮＡとして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成した以下のＲＮＡを用い、試験例１と同様にしてｃＤＮＡを合成した。
前記ｃＤＮＡを１０７（１．Ｅ＋０７）コピー〜１０２（１．Ｅ＋０２）コピーまで１０倍希釈の希釈系列を作製し、以下のようにして定量的ＰＣＲを行い、検量線を作成した。結果を図７に示す。
−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成したＲＮＡ（配列番号：５）−
５’−ＧＧＵＣＵＣＵＣＵＧＧＵＵＡＧＡＣＣＡＧＡＵＵＣＧＡＧＣＣＵＧＧＧＡＧＣＵＣＵＣＵＧＧＣＵＡＧＣＵＡＧＧＧＡＡＣＣＣ−３’
【００９８】
−定量的ＰＣＲ−
以下のプライマー及びプローブを用いた以外は、試験例１と同様にして、定量的ＰＣＲを行った。
［試験群１：Ｆｌａｐ配列の付加なし］
・フォワードプライマー
５’−ＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧ−３’（配列番号：２）
・リバースプライマー
５’−ＣＡＧＴＴＡＣＧＣＡＴＧＣＣＧ−３’（配列番号：３）
・プローブ（Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ）
５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧ−３’（配列番号：４）
プローブは、オリゴヌクレオチドの５’末端がＦＡＭ、３’末端がＢＨＱで修飾されている。
［試験群２：フォワードプライマーのみＦｌａｐ配列の付加あり］
・フォワードプライマー
５’−ＡＡＴＡＡＡＴＣＡＴＡＡＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧ−３’（配列番号：６）
下線部は、Ｆｌａｐ配列を示す。
・リバースプライマー
５’−ＣＡＧＴＴＡＣＧＣＡＴＧＣＣＧ−３’（配列番号：３）
・プローブ（Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ）
５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧ−３’（配列番号：４）
プローブは、オリゴヌクレオチドの５’末端がＦＡＭ、３’末端がＢＨＱで修飾されている。
［試験群３：リバースプライマーのみＦｌａｐ配列の付加あり］
・フォワードプライマー
５’−ＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧ−３’（配列番号：２）
・リバースプライマー
５’−ＡＡＴＡＡＡＴＣＡＴＡＡＣＡＧＴＴＡＣＧＣＡＴＧＣＣＧ−３’（配列番号：７）
下線部は、Ｆｌａｐ配列を示す。
・プローブ（Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ）
５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧ−３’（配列番号：４）
プローブは、オリゴヌクレオチドの５’末端がＦＡＭ、３’末端がＢＨＱで修飾されている。
［試験群４：フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方にＦｌａｐ配列の付加あり］
・フォワードプライマー
５’−ＡＡＴＡＡＡＴＣＡＴＡＡＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧ−３’（配列番号：６）
下線部は、Ｆｌａｐ配列を示す。
・リバースプライマー
５’−ＡＡＴＡＡＡＴＣＡＴＡＡＣＡＧＴＴＡＣＧＣＡＴＧＣＣＧ−３’（配列番号：７）
下線部は、Ｆｌａｐ配列を示す。
・プローブ（Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ）
５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧ−３’（配列番号：４）
プローブは、オリゴヌクレオチドの５’末端がＦＡＭ、３’末端がＢＨＱで修飾されている。
【００９９】
図７の結果から、試験群３（リバースプライマーのみＦｌａｐ配列の付加あり）では、他の試験群よりも１０倍低い濃度でも検量線にのることが判明した。
【０１００】
（試験例８：ＨＩＶ短鎖ＲＮＡの転写停止位置）
Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．、第７２巻、第１，６６６頁〜１，６７０頁、１９９８年に公表されている残存感染細胞のモデル細胞として、野生型のＨＩＶ−１を有するＵ１細胞株から、試験例１と同様の方法にてｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲを実施後、そのＰＣＲ産物を用いて、ＧＳ  ＦＬＸ＋／ＪＵＮＩＯＲ（Ｒｏｓｃｈ社製）によるディープシークエンス（Ｄｅｅｐ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）解析を行った結果を図８に示す。
図８に示されるように、ＨＩＶ短鎖ＲＮＡは、ＨＩＶ−１のＲＮＡの転写開始点から、約３０塩基程度、約５０塩基〜約７０塩基程度、約９０塩基〜約１１０塩基程度の位置で転写が停止しているものが含まれていることが判明した。
【０１０１】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞  末梢血単核球中の、ヒト免疫不全ウイルスＲＮＡの転写開始点から２００塩基までの転写産物を検出する検出工程と、
前記転写産物の検出の有無を指標として、患者における免疫が活性化された状態であるか否かを評価する工程とを含むことを特徴とする抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者における免疫状態の判定方法である。
＜２＞  患者が、血漿中のヒト免疫不全ウイルスＲＮＡ、及びヒト免疫不全ウイルス抗原が検出限界以下の患者である前記＜１＞に記載の免疫状態の判定方法である。
＜３＞  検出工程が、配列番号：１で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを用いる前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の免疫状態の判定方法である。
＜４＞  末梢血単核球中の、ヒト免疫不全ウイルスＲＮＡの転写開始点から２００塩基までの転写産物を検出する検出工程と、
前記転写産物の検出の有無を指標として、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が増加するか否かを評価する工程とを含むことを特徴とする抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加予測方法である。
＜５＞  患者が、血漿中のヒト免疫不全ウイルスＲＮＡ、及びヒト免疫不全ウイルス抗原が検出限界以下の患者である前記＜４＞に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加予測方法である。
＜６＞  検出工程が、配列番号：１で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを用いる前記＜４＞から＜５＞のいずれかに記載のＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加予測方法である。
＜７＞  末梢血単核球中の、ヒト免疫不全ウイルスＲＮＡの転写開始点から２００塩基までの転写産物を検出する検出工程と、
前記転写産物の検出の有無を指標として、ＣＤ４＋Ｔ細胞が減少するか否かを評価する工程とを含むことを特徴とする抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始していない患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少予測方法である。
＜８＞  検出工程が、配列番号：１で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを用いる前記＜７＞に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少予測方法である。
＜９＞  配列番号：１で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者における免疫状態の判定のためのキット、抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始した後の患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加を予測するためのキット、又は抗ヒト免疫不全ウイルス薬による治療を開始していない患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少を予測するためのキットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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