(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非修飾ＰＨ２０ポリペプチド中に１つ以上のアミノ酸置換を含む修飾ＰＨ２０ポリペプチドであって、
該非修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、配列番号３、７または３２〜６６に示されるアミノ酸の配列からなり；
該修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、アミノ酸置換を含有しない非修飾ＰＨ２０ポリペプチドと比較して、少なくとも１２０％のヒアルロニダーゼ活性である増大したヒアルロニダーゼ活性を示し、
増大したヒアルロニダーゼ活性を付与する少なくとも１つのアミノ酸置換が、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して１、１５、２４、２７、２９、３０、３１、３２、３３、３７、３９、４８、６３、６７、６９、７１、７２、７３、７５、８７、９２、９３、９４、１１８、１２０、１３５、１４１、１４７、１４８、１５０、１５１、１５２、１５５、１５６、１６３、１６４、１６５、１７０、１９８、２０４、２０９、２１２、２１５、２１９、２３３、２３６、２４７、２５７、２５９、２６０、２６３、２６９、２７１、２７２、２７６、２７８、２８２、２９３、３０５、３０８、３１３、３２０、３２４、３２５、３２６、３２８、３５３、３５９、３７１、３７７、３８０、３８９、３９２、３９５、４０５、４０９、４１０、４１８、４２５、４３６、４３７、４３８、４４１、４４２、４４６または４４７の中から選択される位置に対応する位置であり、
ただし、修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、単一のアミノ酸置換のみを含む場合には、置換は、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、アミノ酸置換Ｎ２１９Ａに対応せず、
該修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、アミノ酸置換を含有しない非修飾ＰＨ２０ポリペプチドと比較して最大１０個のアミノ酸置換を含む、
修飾ＰＨ２０ポリペプチド。
【請求項２】
増大したヒアルロニダーゼ活性を付与する少なくとも１つのアミノ酸置換が、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、位置１に対応する位置におけるヒスチジン（Ｈ）；位置１に対応する位置におけるＱ；位置１５に対応する位置におけるＶ；位置２４に対応する位置におけるＥ；位置２４に対応する位置におけるＨ；位置２７に対応する位置におけるＫ；位置２７に対応する位置におけるＲ；位置２９に対応する位置におけるＥ；位置２９に対応する位置におけるＩ；位置２９に対応する位置におけるＬ；位置２９に対応する位置におけるＭ；位置２９に対応する位置におけるＰ；位置２９に対応する位置におけるＳ；位置２９に対応する位置におけるＶ；位置３０に対応する位置におけるＧ；位置３０に対応する位置におけるＨ；位置３０に対応する位置におけるＫ；位置３０に対応する位置におけるＭ；位置３０に対応する位置におけるＲ；位置３０に対応する位置におけるＳ；位置３１に対応する位置におけるＡ；位置３１に対応する位置におけるＣ；位置３１に対応する位置におけるＨ；位置３１に対応する位置におけるＩ；位置３１に対応する位置におけるＫ；位置３１に対応する位置におけるＬ；位置３１に対応する位置におけるＰ；位置３１に対応する位置におけるＲ；位置３１に対応する位置におけるＳ；位置３１に対応する位置におけるＴ；位置３１に対応する位置におけるＶ；位置３２に対応する位置におけるＦ；位置３２に対応する位置におけるＧ；位置３２に対応する位置におけるＨ；位置３３に対応する位置におけるＷ；位置３７に対応する位置におけるＦ；位置３９に対応する位置におけるＮ；位置３９に対応する位置におけるＴ；位置４８に対応する位置におけるＦ；位置４８に対応する位置におけるＨ；位置４８に対応する位置におけるＮ；位置６３に対応する位置におけるＷ；位置６７に対応する位置におけるＶ；位置６９に対応する位置におけるＡ；位置６９に対応する位置におけるＣ；位置６９に対応する位置におけるＦ；位置６９に対応する位置におけるＧ；位置６９に対応する位置におけるＩ；位置６９に対応する位置におけるＬ；位置６９に対応する位置におけるＭ；位置６９に対応する位置におけるＰ；位置６９に対応する位置におけるＲ；位置６９に対応する位置におけるＷ；位置６９に対応する位置におけるＹ；位置７１に対応する位置におけるＲ；位置７１に対応する位置におけるＳ；位置７２に対応する位置におけるＭ；位置７２に対応する位置におけるＱ；位置７３に対応する位置におけるＨ；位置７３に対応する位置におけるＬ；位置７３に対応する位置におけるＷ；位置７５に対応する位置におけるＦ；位置７５に対応する位置におけるＬ；位置７５に対応する位置におけるＲ；位置７５に対応する位置におけるＴ；位置８７に対応する位置におけるＣ；位置８７に対応する位置におけるＴ；位置８７に対応する位置におけるＹ；位置９２に対応する位置におけるＣ；位置９３に対応する位置におけるＩ；位置９３に対応する位置におけるＬ；位置９３に対応する位置におけるＲ；位置９３に対応する位置におけるＴ；位置９４に対応する位置におけるＲ；位置１１８に対応する位置におけるＱ；位置１２０に対応する位置におけるＦ；位置１２０に対応する位置におけるＶ；位置１２０に対応する位置におけるＹ；位置１３５に対応する位置におけるＤ；位置１３５に対応する位置におけるＧ；位置１３５に対応する位置におけるＲ；位置１４１に対応する位置におけるＨ；位置１４１に対応する位置におけるＹ；位置１４７に対応する位置におけるＲ；位置１４７に対応する位置におけるＶ；位置１４８に対応する位置におけるＫ；位置１５０に対応する位置におけるＧ；位置１５１に対応する位置におけるＫ；位置１５１に対応する位置におけるＬ；位置１５１に対応する位置におけるＭ；位置１５１に対応する位置におけるＱ；位置１５１に対応する位置におけるＲ；位置１５２に対応する位置におけるＲ；位置１５５に対応する位置におけるＧ；位置１５５に対応する位置におけるＫ；位置１５６に対応する位置におけるＤ；位置１６３に対応する位置におけるＡ；位置１６３に対応する位置におけるＥ；位置１６３に対応する位置におけるＫ；位置１６３に対応する位置におけるＲ；位置１６４に対応する位置におけるＭ；位置１６５に対応する位置におけるＤ；位置１６５に対応する位置におけるＮ；位置１７０に対応する位置におけるＲ；位置１９８に対応する位置におけるＤ；位置２１２に対応する位置におけるＮ；位置２１５に対応する位置におけるＭ；位置２１９に対応する位置におけるＳ；位置２３３に対応する位置におけるＫ；位置２３３に対応する位置におけるＲ；位置２３６に対応する位置におけるＲ；位置２４７に対応する位置におけるＩ；位置２５７に対応する位置におけるＴ；位置２５９に対応する位置におけるＰ；位置２６０に対応する位置におけるＹ；位置２６３に対応する位置におけるＫ；位置２６３に対応する位置におけるＲ；位置２６９に対応する位置におけるＡ；位置２７１に対応する位置におけるＬ；位置２７１に対応する位置におけるＭ；位置２７２に対応する位置におけるＴ；位置２７６に対応する位置におけるＤ；位置２７６に対応する位置におけるＳ；位置２７６に対応する位置におけるＹ；位置２７８に対応する位置におけるＨ；位置２７８に対応する位置におけるＫ；位置２７８に対応する位置におけるＮ；位置２７８に対応する位置におけるＲ；位置２７８に対応する位置におけるＳ；位置２７８に対応する位置におけるＴ；位置２７８に対応する位置におけるＹ；位置２８２に対応する位置におけるＭ；位置２９３に対応する位置におけるＡ；位置２９３に対応する位置におけるＣ；位置２９３に対応する位置におけるＦ；位置２９３に対応する位置におけるＭ；位置２９３に対応する位置におけるＰ；位置２９３に対応する位置におけるＱ；位置２９３に対応する位置におけるＶ；位置３０５に対応する位置におけるＥ；位置３０８に対応する位置におけるＧ；位置３０８に対応する位置におけるＮ；位置３１３に対応する位置におけるＫ；位置３１３に対応する位置におけるＲ；位置３２０に対応する位置におけるＨ；位置３２０に対応する位置におけるＫ；位置３２０に対応する位置におけるＲ；位置３２４に対応する位置におけるＲ；位置３２５に対応する位置におけるＡ；位置３２５に対応する位置におけるＤ；位置３２５に対応する位置におけるＥ；位置３２５に対応する位置におけるＧ；位置３２５に対応する位置におけるＨ；位置３２５に対応する位置におけるＫ；位置３２５に対応する位置におけるＭ；位置３２５に対応する位置におけるＮ；位置３２５に対応する位置におけるＱ；位置３２５に対応する位置におけるＳ；位置３２６に対応する位置におけるＶ；位置３２８に対応する位置におけるＩ；位置３２８に対応する位置におけるＫ；位置３２８に対応する位置におけるＬ；位置３２８に対応する位置におけるＳ；位置３２８に対応する位置におけるＹ；位置３５３に対応する位置におけるＶ；位置３５９に対応する位置におけるＴ；位置３７１に対応する位置におけるＲ；位置３７７に対応する位置におけるＰ；位置３７７に対応する位置におけるＴ；位置３８０に対応する位置におけるＷ；位置３８０に対応する位置におけるＹ；位置３８９に対応する位置におけるＫ；位置３９２に対応する位置におけるＭ；位置３９５に対応する位置におけるＲ；位置４０５に対応する位置におけるＧ；位置４０９に対応する位置におけるＡ；位置４０９に対応する位置におけるＱ；位置４１０に対応する位置におけるＴ；位置４１８に対応する位置におけるＰ；位置４２５に対応する位置におけるＫ；位置４３６に対応する位置におけるＫ；位置４３７に対応する位置におけるＩ；位置４３７に対応する位置におけるＭ；位置４３８に対応する位置におけるＴ；位置４４１に対応する位置におけるＦ；位置４４２に対応する位置におけるＲ；位置４４６に対応する位置におけるＡ；位置４４７に対応する位置におけるＤ；位置４４７に対応する位置におけるＮ；および／または位置４４７に対応する位置におけるＱの中から選択される、請求項１に記載の修飾ＰＨ２０ポリペプチド。
【請求項３】
非修飾ＰＨ２０ポリペプチド中に１つ以上のアミノ酸置換を含む修飾ＰＨ２０ポリペプチドであって、
該非修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、配列番号３、７または３２〜６６に示されるアミノ酸の配列からなり、
該修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、アミノ酸置換を含有しない非修飾ＰＨ２０ポリペプチドと比較して、少なくとも１２０％のヒアルロニダーゼ活性である増大したヒアルロニダーゼ活性を示し、
該アミノ酸置換が、増大したヒアルロニダーゼ活性を付与し、
該修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、アミノ酸置換を含有しない非修飾ＰＨ２０ポリペプチドと比較して最大１０個のアミノ酸置換を含み、
増大したヒアルロニダーゼ活性を付与する少なくとも１つのアミノ酸置換が、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、位置１２に対応する位置におけるＥ；位置２６に対応する位置におけるＥ；位置２６に対応する位置におけるＫ；位置４６に対応する位置におけるＲ；位置５２に対応する位置におけるＱ；位置５８に対応する位置におけるＱ；位置６８に対応する位置におけるＨ；位置６８に対応する位置におけるＱ；位置７０に対応する位置におけるＡ；位置７０に対応する位置におけるＣ；位置７０に対応する位置におけるＦ；位置７０に対応する位置におけるＧ；位置７０に対応する位置におけるＨ；位置７０に対応する位置におけるＫ；位置７０に対応する位置におけるＬ；位置７０に対応する位置におけるＮ；位置７０に対応する位置におけるＰ；位置７０に対応する位置におけるＲ；位置７０に対応する位置におけるＳ；位置７０に対応する位置におけるＴ；位置７４に対応する位置におけるＡ；位置７４に対応する位置におけるＣ；位置７４に対応する位置におけるＧ；位置７４に対応する位置におけるＮ；位置７４に対応する位置におけるＰ；位置７４に対応する位置におけるＲ；位置７４に対応する位置におけるＳ；位置７４に対応する位置におけるＶ；位置７４に対応する位置におけるＷ；位置８４に対応する位置におけるＧ；位置８４に対応する位置におけるＲ；位置９７に対応する位置におけるＧ；位置１２７に対応する位置におけるＨ；位置１２７に対応する位置におけるＮ；位置１３１に対応する位置におけるＧ；位置１３１に対応する位置におけるＶ；位置１４２に対応する位置におけるＲ；位置１６６に対応する位置におけるＡ；位置１６６に対応する位置におけるＦ；位置１６６に対応する位置におけるＨ；位置１６６に対応する位置におけるＬ；位置１６６に対応する位置におけるＲ；位置１６６に対応する位置におけるＹ；位置１７４に対応する位置におけるＫ；位置２０６に対応する位置におけるＫ；位置２１３に対応する位置におけるＭ；位置２１３に対応する位置におけるＮ；位置２３７に対応する位置におけるＥ；位置２３８に対応する位置におけるＳ；位置２６１に対応する位置におけるＮ；位置２７７に対応する位置におけるＲ；位置２７７に対応する位置におけるＴ；位置３０９に対応する位置におけるＬ；位置３０９に対応する位置におけるＮ；位置３０９に対応する位置におけるＱ；位置３０９に対応する位置におけるＲ；位置３０９に対応する位置におけるＴ；位置３１０に対応する位置におけるＡ；位置３１０に対応する位置におけるＧ；位置３１５に対応する位置におけるＨ；位置３１７に対応する位置におけるＩ；位置３１７に対応する位置におけるＫ；位置３１７に対応する位置におけるＲ；位置３１８に対応する位置におけるＭ；位置３４７に対応する位置におけるＧ；位置３４７に対応する位置におけるＳ；位置３９９に対応する位置におけるＭ；位置３９９に対応する位置におけるＴ；位置３９９に対応する位置におけるＷ；位置４０７に対応する位置におけるＤ；位置４０７に対応する位置におけるＱ；位置４１９に対応する位置におけるＦ；位置４１９に対応する位置におけるＩ；位置４１９に対応する位置におけるＲ；位置４１９に対応する位置におけるＳ；位置４２１に対応する位置におけるＫ；位置４２１に対応する位置におけるＮ；位置４２１に対応する位置におけるＱ；位置４２１に対応する位置におけるＲ；位置４２１に対応する位置におけるＳ；位置４３１に対応する位置におけるＡ；位置４３１に対応する位置におけるＨ；位置４３１に対応する位置におけるＫ；位置４３１に対応する位置におけるＱ；位置４３１に対応する位置におけるＲ；位置４３１に対応する位置におけるＳ；位置４３１に対応する位置におけるＶ；位置４３３に対応する位置におけるＬ；位置４３３に対応する位置におけるＲ；位置４３９に対応する位置におけるＶ；位置４４０に対応する位置におけるＨ；位置４４０に対応する位置におけるＲ；位置４４３に対応する位置におけるＡ；位置４４３に対応する位置におけるＭ；位置４４５に対応する位置におけるＭ；および／または位置４４５に対応する位置におけるＰの中から選択される、修飾ＰＨ２０ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号７３、７８、９１、９５、９６、１０５、１０６、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１７、１１８、１１９、１２０、１２３〜１２６、１２８〜１３６、１３９〜１４１、１４９、１５４、１５５、１６４、１６５、１６７、１９１、１９２、１９６、１９７、１９９〜２０５、２０７、２０８、２２５、２２６、２２８、２２９、２３１、２３３、２３７、２５３、２５４、２５６、２５７、２７７、２８３、２９３、２９５、２９６、２９８、３００、３０３、３１６、３１８、３２１、３２２、３３８〜３４０、３４４、３４８、３６７、３６９、３７１、３７７、３８４〜３８８、３９４、３９８、３９９、４０１、４０６〜４０８、４１０、４１２、４１４、４１６、４３１、４４８、４５９、４６５、４６９、４７８、４７９、４８２、４９３、４９７、５０１、５０３、５０７、５０８、５１０〜５１２、５１４、５１８、５２２、５２３、５３７〜５４３、５４５、５５８、５５９、５６１、５６３〜５６６、５６９、５７２、５７４、５９４、５９６、６１８〜６２０、６２４〜６３４、６３７、６４０〜６４４、６５２、６５７、６７５、６９５、６９８、６９９、７００、７１２、７１７、７２５、７３８、７４８〜７５０、７５７、７７５、７９９〜８０１、８０７、８２２、８２５、８４４、８４７、８５１および８５３のいずれかに示されるアミノ酸の配列、または、配列番号７３、７８、９１、９５、９６、１０５、１０６、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１７、１１８、１１９、１２０、１２３〜１２６、１２８〜１３６、１３９〜１４１、１４９、１５４、１５５、１６４、１６５、１６７、１９１、１９２、１９６、１９７、１９９〜２０５、２０７、２０８、２２５、２２６、２２８、２２９、２３１、２３３、２３７、２５３、２５４、２５６、２５７、２７７、２８３、２９３、２９５、２９６、２９８、３００、３０３、３１６、３１８、３２１、３２２、３３８〜３４０、３４４、３４８、３６７、３６９、３７１、３７７、３８４〜３８８、３９４、３９８、３９９、４０１、４０６〜４０８、４１０、４１２、４１４、４１６、４３１、４４８、４５９、４６５、４６９、４７８、４７９、４８２、４９３、４９７、５０１、５０３、５０７、５０８、５１０〜５１２、５１４、５１８、５２２、５２３、５３７〜５４３、５４５、５５８、５５９、５６１、５６３〜５６６、５６９、５７２、５７４、５９４、５９６、６１８〜６２０、６２４〜６３４、６３７、６４０〜６４４、６５２、６５７、６７５、６９５、６９８、６９９、７００、７１２、７１７、７２５、７３８、７４８〜７５０、７５７、７７５、７９９〜８０１、８０７、８２２、８２５、８４４、８４７、８５１および８５３のいずれかに示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも９８％配列同一性を示し、配列番号３、７および３２〜６６のいずれかのポリペプチドにおける対応する位置と比較してアミノ酸置換を含むアミノ酸の配列を含む、請求項１に記載の修飾ＰＨ２０ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号８６、８９、９９、１００、１５９、１７３、１８１、１９３、１９５、２０９〜２２０、２３８、２３９、２４２、２４７〜２５２、２６７、２６９、２７７、３０８、３２４、３２５、３３０、３３５、３５５、４１９、４２１〜４２３、４２５、４２８、４３５、４５５、４５６、４６２、４６３、４８４、４９０、５０６、５３１、５３３、５７９、５８１〜５８３、５８５、５８７、５８８、６０２、６０５、６０６、６０９、６１３、６４８、７３１、７３２、７３４、７４２、７４６、７６０、７６２、７６４、７６５、７６９〜７７３、７７９、７８２、７８３、７８６〜７８９、７９４、７９５、８１４、８１６、８１９、８２６、８３０、８３６および８３８のいずれかに示されるアミノ酸の配列、または、配列番号８６、８９、９９、１００、１５９、１７３、１８１、１９３、１９５、２０９〜２２０、２３８、２３９、２４２、２４７〜２５２、２６７、２６９、２７７、３０８、３２４、３２５、３３０、３３５、３５５、４１９、４２１〜４２３、４２５、４２８、４３５、４５５、４５６、４６２、４６３、４８４、４９０、５０６、５３１、５３３、５７９、５８１〜５８３、５８５、５８７、５８８、６０２、６０５、６０６、６０９、６１３、６４８、７３１、７３２、７３４、７４２、７４６、７６０、７６２、７６４、７６５、７６９〜７７３、７７９、７８２、７８３、７８６〜７８９、７９４、７９５、８１４、８１６、８１９、８２６、８３０、８３６および８３８のいずれかに示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも９８％配列同一性を示し、配列番号３、７および３２〜６６のいずれかのポリペプチドにおける対応する位置と比較してアミノ酸置換を含むアミノ酸の配列を含む、請求項３に記載の修飾ＰＨ２０ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号３に示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を示し、置換を含有する、請求項１から３のいずれかに記載の修飾ＰＨ２０ポリペプチド。
【請求項７】
アミノ酸置換が、配列番号３に示されるアミノ酸の配列からなる非修飾ＰＨ２０ポリペプチド中にある、請求項１に記載の修飾ＰＨ２０ポリペプチド。
【請求項８】
アミノ酸置換を含有しないＰＨ２０ポリペプチドと比較して少なくとも２．０倍のヒアルロニダーゼ活性を示す、請求項１から７のいずれかに記載の修飾ＰＨ２０ポリペプチド。
【請求項９】
修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、アミノ酸置換を含有しない非修飾ＰＨ２０ポリペプチドの少なくとも１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、１５００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％またはそれ以上のヒアルロニダーゼ活性を示す、請求項１から８のいずれかに記載の修飾ＰＨ２０ポリペプチド。
【請求項１０】
実質的に精製または単離されている、請求項１から９のいずれかに記載の修飾ＰＨ２０ポリペプチド。
【請求項１１】
グリコシル化、シアル化、アルブミン化、ファルニシル化、カルボキシル化、水酸化およびリン酸化の中から選択される１つ以上の修飾を含む、請求項１から１０のいずれかに記載の修飾ＰＨ２０ポリペプチド。
【請求項１２】
修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、グリコシル化されており、それによって、該ポリペプチドが、少なくとも３つのアスパラギン（Ｎ）残基の各々と連結している、少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミン部分を含む、請求項１１に記載の修飾ＰＨ２０ポリペプチド。
【請求項１３】
３個のアスパラギン残基が、配列番号３のアミノ酸残基２００、３３３および３５８に対応する、請求項１２に記載の修飾ＰＨ２０ポリペプチド。
【請求項１４】
ポリマーとコンジュゲートしている、請求項１から１３のいずれかに記載の修飾ＰＨ２０ポリペプチド。
【請求項１５】
ポリマーが、デキストランまたはＰＥＧである、請求項１４に記載の修飾ＰＨ２０ポリペプチド。
【請求項１６】
多量体化ドメイン、毒素、検出可能な標識または薬物の中から選択される部分とコンジュゲートしている、請求項１から１５のいずれかに記載の修飾ＰＨ２０ポリペプチド。
【請求項１７】
Ｆｃドメインとコンジュゲートしている、請求項１６に記載の修飾ＰＨ２０ポリペプチド。
【請求項１８】
アミノ酸置換、挿入および欠失の中から選択される最大１０個のアミノ酸修飾を含む、請求項１から１７のいずれかに記載の修飾ＰＨ２０ポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１から１３のいずれかに記載の修飾ＰＨ２０ポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２１】
請求項１９に記載の核酸分子または請求項２０に記載のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項２２】
哺乳類細胞である、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
修飾ＰＨ２０ポリペプチドを産生する方法であって、
請求項１９に記載の核酸または請求項２０に記載のベクターを、Ｎ結合型糖部分をポリペプチド中に組み込むことができる細胞中に導入すること、
細胞を、コードされる修飾ＰＨ２０ポリペプチドが細胞によって産生され、分泌される条件下で培養すること、および
発現されたポリペプチドを回収すること
を含む、方法。
【請求項２５】
修飾ＰＨ２０ポリペプチドを産生する方法であって、
請求項２１から２３のいずれかに記載の細胞を、コードされる修飾ＰＨ２０ポリペプチドが細胞によって産生され、分泌される条件下で培養すること、および
発現されたポリペプチドを回収すること
を含む、方法。
【請求項２６】
請求項１から１８のいずれかに記載の修飾ＰＨ２０ポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２７】
治療上活性な薬剤をさらに含む、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
医薬組成物の組合せであって、
第１組成物は請求項２７に記載の医薬組成物であり、
第２組成物は治療上活性な薬剤を含み、
これらの組成物は逐次、断続的に、または一緒に投与するためである、
組合せ。
【請求項２９】
治療薬が、ポリペプチド、タンパク質、核酸、薬物、小分子または有機分子である、請求項２７に記載の医薬組成物または請求項２８に記載の組合せ。
【請求項３０】
治療上活性な薬剤が、化学療法薬、鎮痛剤、抗炎症剤、抗菌剤、殺アメーバ剤、殺トリコモナス剤（ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｃｉｄａｌ  ａｇｅｎｔ）、抗パーキンソン病薬、抗マラリア薬、抗痙攣薬、抗うつ薬および抗関節炎薬、抗真菌剤、抗高血圧薬、解熱剤、抗寄生虫剤、抗ヒスタミン剤、α−アドレナリン作動薬、α遮断薬、麻酔剤、気管支拡張剤、殺生物剤、殺菌剤、静菌剤、βアドレナリン遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、心血管治療薬、避妊薬、鬱血除去薬、利尿薬、降下薬、診断薬、電解質剤、催眠薬、ホルモン剤、高血糖薬、筋弛緩薬、筋肉収縮薬、眼部薬、副交感神経作動薬、精神賦活剤、鎮静剤、交感神経作用薬、トランキライザー薬、泌尿器薬、膣薬、抗ウイルス剤、ビタミン剤、非ステロイド系抗炎症薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤または睡眠誘導物質の中から選択される、請求項２６、２７および２９のいずれかに記載の医薬組成物または請求項２８または２９に記載の組合せ。
【請求項３１】
治療上活性な薬剤が、抗体、免疫グロブリン、サイトカイン、化学療法薬、血液凝固因子およびインスリンの中から選択される、請求項２６、２７、２９および３０のいずれかに記載の医薬組成物または請求項２８から３０のいずれかに記載の組合せ。
【請求項３２】
過剰のグリコサミノグリカンと関連している疾患または状態を治療するため；腫瘍を治療するため；脳におけるグリコサミノグリカン蓄積を治療するため；心血管障害を治療するため；眼部障害を治療するため；肺の疾患を治療するため；化学療法薬の固形腫瘍への浸透を増大させるため；セルライトを治療するため；増殖性障害を治療するため；または薬物およびその他の治療薬のバイオアベイラビリティを高めるための、請求項１から１８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３３】
疾患または障害が固形腫瘍の腫瘍である、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
治療薬のデリバリーにおいて使用するための、請求項１から１８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３５】
修飾ＰＨ２０ポリペプチドがペグ化されている、請求項１から１８、３２および３３のいずれかに記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
各々「ＰＨ２０  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｖａｒｉａｎｔｓ，Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題された、２０１１年１２月３０日に出願された米国仮出願第６１／６３１，３１３号および２０１２年１１月１日に出願された米国仮出願第６１／７９６，２０８号の優先権の利益が主張される。
【０００２】
本願は、米国仮出願第６１／６３１，３１３号および米国仮出願第６１／７９６，２０８号の優先権を主張する、「ＰＨ２０  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｖａｒｉａｎｔｓ，Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題された本明細書と同日に出願された米国出願番号第１３／６８４，７３１号と関連する。
【０００３】
許可される場合には、上記の関連出願各々の主題は、参照によりその全体が組み込まれる。
【０００４】
電子的に提供される配列表の参照による組込
配列表の電子版が、本明細書とともに出願されており、その内容は、参照によりその全体が組み込まれる。電子ファイルは、２０１２年１２月２８日に作製され、３．４８メガバイトの大きさであり、３０８７ｓｅｑＰＣ１．ｔｘｔとタイトルがついている。
【０００５】
発明の分野
増大した安定性および／または増大した活性を示す修飾ポリペプチドを含めた修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼポリペプチドが提供される。また、その組成物および製剤および使用も提供される。
【背景技術】
【０００６】
ヒアルロナン（ヒアルロン酸；ＨＡ）は、多数の細胞の細胞外マトリックス中に、特に、軟部結合組織中に見られるポリペプチドである。ＨＡはまた、主に、皮膚、軟骨において、また哺乳類では滑液において見られる。ヒアルロナンはまた、眼の硝子体の主な構成物である。ＨＡは、種々の生理学的プロセスにおいて、例えば、水および血漿タンパク質ホメオスタシスにおいて役割を有する（Laurent TC et al.(1992)FASEB J 6:2397-2404）。特定の疾患は、ヒアルロナンの発現および／または産生と関連している。ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナンを分解する酵素である。ヒアルロナン分解酵素（例えば、ヒアルロニダーゼ）は、ＨＡ分解を触媒することによって、ＨＡまたはその他のグリコサミノグリカンの蓄積と関連している疾患または障害を治療するために使用できる。また、ＨＡは、間質バリアの主要な成分であるので、ヒアルロナン分解酵素（例えば、ヒアルロニダーゼ）は、組織透過性を高め、したがって、治療薬の分散およびデリバリーを増大するために使用できる。種々のヒアルロニダーゼが、通常、その他の治療薬と組み合わせて分散剤および拡延剤として治療上使用されてきた（例えば、Ｈｙｄａｓｅ（商標）、Ｖｉｔｒａｓｅ（商標）およびＷｙｄａｓｅ（商標））。これらの多くは、ヒツジまたはウシ型であり、ヒトの治療にとって免疫原性であり得る。治療のために使用できる、ヒアルロニダーゼなどの改善されたヒアルロナン分解酵素およびその組成物が必要である。
【発明の概要】
【０００７】
修飾（複数可）を有さないＰＨ２０ポリペプチドと比較して、変更された特性（単数または複数）を有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドが提供される。修飾は、アミノ酸置換、欠失および／または挿入を含む。ＰＨ２０ポリペプチド中の事実上各アミノ酸の詳細な構造／機能が、本明細書において提供され、ならびに特定の条件における安定性などの特性の変更に寄与する残基および遺伝子座の同定が提供される。したがって、種々の条件下で、活性を保持するか、および／または増大した安定性もしくは変更された安定性を示すＰＨ２０ポリペプチドをもたらす、１つまたは複数のアミノ酸置換を含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドが提供される。保持される活性は、例えば、置換を含まないＰＨ２０ポリペプチドの少なくとも約４０％またはそれ以上であるヒアルロニダーゼ活性であり得る。例示的修飾として、アミノ酸置換がある。本明細書における目的上、アミノ酸置換は、アミノ酸１文字と、それに続く置換が起こる配列番号３中の対応するアミノ酸位置によって示される。アミノ酸残基の１文字アミノ酸略語は、当業者に周知であり（例えば、表１を参照のこと）、説明および例を通じて本明細書において使用される。例えば、配列番号３中に示されるアミノ酸残基位置に関して、ＰＨ２０ポリペプチド中の位置２０４に対応する位置におけるＰでの置換は、置換が、配列番号３に示されるＰＨ２０ポリペプチド中のＦ２０４Ｐまたは別のＰＨ２０ポリペプチド中の対応する位置の同一置換を包含することを意味する。
【０００８】
ＰＨ２０ポリペプチド中に少なくとも１つのアミノ酸置換を含有し、それによって、修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、アミノ酸置換を含有しないＰＨ２０ポリペプチドと比較して増大した安定性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドが提供される。増大した安定性は、タンパク質に対して変性である１種または複数種のタンパク質条件に対する増大した耐性として現れ得る。修飾および非修飾ＰＨ２０の安定性は、同一条件下で比較される。例示的タンパク質変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）（または、本明細書において同義的に使用される、変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ））条件として、それだけには限らないが、３０℃または約３０℃を超える高温、撹拌、本質的にもしくは実質的にまたは無塩を含めた低塩およびタンパク質を変性する傾向がある賦形剤の存在が挙げられる。このような賦形剤の例示的なものとして、抗付着剤（複数可）、結合剤（複数可）、コーティング（複数可）、増量剤（複数可）および希釈剤（複数可）、香料（複数可）、色(color)（複数可）、滑沢剤（複数可）、流動促進剤（複数可）、防腐剤(preservative)（複数可）、洗浄剤（複数可）、吸着剤（複数可）およびそれらの組み合わせがある。
【０００９】
修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、非修飾形態が配列番号３に対して少なくとも約６８％の配列同一性を有し、安定性を変更する修飾をさらに含有するものであり得るか、および／またはＰＨ２０から最大約１００、１１０、１２０、１３０、１５０個ものアミノ酸の相違を含むが、酵素活性、特に、非修飾ＰＨ２０ポリペプチドの活性の少なくとも約４０％を保持し、変性条件下での安定性などの増大した安定性を示すＰＨ２０ポリペプチドであり得る。したがって、配列番号３に示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも６８％または約６８％のアミノ酸配列同一性を有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドが含まれる。配列番号３に示されるアミノ酸の配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドが含まれる。このような修飾ＰＨ２０ポリペプチドの例示的なものとして、配列番号３、７、１０、１２、１４、２４、３２〜６６、６９、７２、８５７、８５９、８６１、８７０のいずれかに示されるようなアミノ酸残基の配列または配列番号３、７、１０、１２、１４、２４、３２〜６６、６９、７２、８５７、８５９、８６１もしくは８７０のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸の配列を含むＰＨ２０ポリペプチド中にアミノ酸置換（複数可）を含有するポリペプチドがある。
【００１０】
例えば、増大した安定性を付与するＰＨ２０ポリペプチド中のアミノ酸置換を含有する増大した安定性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、本明細書において提供され、増大した安定性は、１種または複数種のタンパク質変性条件の存在下での変性に対する増大した抵抗性として現れ、安定性は、アミノ酸置換を含有しないＰＨ２０ポリペプチドと比較して増大し、非修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号７に示されるアミノ酸の配列からなるか、または可溶性ＰＨ２０ポリペプチドであるそのＣ末端切断断片であるか、またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。上記のように、増大した安定性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、３０℃超または約３０℃の温度、撹拌、塩が低いこともしくはないこと、または抗付着剤（複数可）、結合剤（複数可）、コーティング（複数可）、増量剤（複数可）および希釈剤（複数可）、香料（複数可）、色（複数可）、滑沢剤（複数可）、流動促進剤（複数可）、防腐剤（複数可）、洗浄剤（複数可）、吸着剤（複数可）もしくは甘味料（複数可）およびそれらの組合せ、特に、防腐剤などの賦形剤もしく変性剤の存在である変性条件に対する増大した安定性を示す。増大した安定性を示すこのような修飾ＰＨ２０ポリペプチドのいくつかの例では、変性条件は、３０℃超の温度であり、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、アミノ酸置換（複数可）を含有しない非修飾ＰＨ２０ポリペプチドと比較して、その温度でヒアルロニダーゼ活性の増大を示し、活性は、同一条件下で比較される。その他の例では、タンパク質変性条件は、１００ｍＭ未満の低濃度の塩の存在であり、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、アミノ酸置換（複数可）を含有しない非修飾ＰＨ２０ポリペプチドと比較して、低濃度の塩の存在下でのヒアルロニダーゼ活性の増大を示し、活性は、同一条件下で比較される。
【００１１】
増大した安定性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドの上記の例のいずれかにおいて、安定性は、ヒアルロニダーゼ活性、溶解度、凝集および／または結晶化を含めた種々のパラメータに基づいて評価され得る。安定性は、変性条件の存在下で評価され得る。２種以上のポリペプチドの安定性が比較される場合には、安定性は、同一条件下で評価される。いくつかの例では、本明細書において提供されたＰＨ２０ポリペプチドの中で、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、アミノ酸置換（複数可）を含有しないＰＨ２０ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の少なくとも１２０％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、１５００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％またはそれ以上を示す。
【００１２】
増大した安定性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドの上記の例のいずれにおいても、変性条件は、タンパク質を変性する賦形剤の存在を含む。このような条件の例示的なものとして、フェノール系防腐剤などの防腐剤の存在がある。抗菌上有効な量の１種または複数種のフェノール系防腐剤の存在下で増大した安定性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドが提供される。抗菌上有効な量は、境界も含めて、０．０５％〜０．６％、０．１％〜０．４％、０．１％〜０．３％、０．１５％〜０．３２５％、０．１５％〜０．２５％、０．１％〜０．２％、０．２％〜０．３％もしくは０．３％〜０．４％であるか、またはその間（または少なくとも約もしくはおよそ）である質量濃度（ｗ／ｖ）のパーセンテージ（％）として表され得る１種または複数種のフェノール系防腐剤の総量である。例示的フェノール系防腐剤として、それだけには限らないが、メチルパラベンプロピルパラベン、ｍ−クレゾール、フェノールまたはｍ−クレゾールおよびフェノールなどのフェノール、メタクレゾール（ｍ−クレゾール）、ベンジルアルコールおよびパラベンが挙げられる。提供される修飾ＰＨ２０ポリペプチドによって達成される安定性の例示的なものとして、防腐剤の不在下での修飾ＰＨ２０ポリペプチドと比較して、防腐剤（複数可）の存在下で少なくとも１５％または約１５％のヒアルロニダーゼ活性を少なくとも４時間示すものがある。活性は、防腐剤（複数可）の存在を除いて同一条件下で比較される。例えば、フェノール系防腐剤（複数可）の存在下で、同一防腐剤（複数可）の不在下と比較して、ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも（または少なくとも約）１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドが提供される。したがって、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドの中でも、アミノ酸置換（複数可）によって、このような置換を有さないＰＨ２０ポリペプチドと比較してフェノール親和性（ｐｈｅｎｏｐｈｉｌｉｃ）であるＰＨ２０ポリペプチドが提供される。同一期間の防腐剤の不在下で、防腐剤（複数可）の存在を除いて同一条件下での修飾ＰＨ２０ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性と比較して、防腐剤（複数可）の存在下で、ヒアルロニダーゼ活性が、少なくとも５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、３週間、４週間またはそれ以上後に示される修飾ＰＨ２０ポリペプチドが含まれる。
【００１３】
フェノール系防腐剤に対して増大した安定性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドの例では、フェノール系防腐剤における増大した安定性は、例えば、０℃〜４０℃、２℃〜６℃、２４℃〜３２℃および３５℃〜４０℃の間または約０℃〜４０℃、２℃〜６℃、２４℃〜３２℃および３５℃〜４０℃の間などの０℃から４０℃の間の温度条件下で示され得る。例示的ポリペプチドは、各々両端を含めて、３０℃〜４５℃、３５℃〜４５℃、３０℃〜３７℃、３５℃〜３７℃もしくは３７℃〜４２℃の間または約３０℃〜４５℃、３５℃〜４５℃、３０℃〜３７℃、３５℃〜３７℃もしくは３７℃〜４２℃の間の温度で増大した安定性を示す。特定の修飾ＰＨ２０ポリペプチドおよび条件は、意図される製剤、製剤が曝露される条件および／または意図される適用に応じて変わる。
【００１４】
フェノール系防腐剤に対する増大した安定性などの増大した安定性を示す特定の、例示的修飾ＰＨ２０ポリペプチドとして、置換などの単一アミノ酸修飾および少なくとも、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００およびそれ以上の修飾などの修飾の組合せを含有するものが挙げられる。これらとして、少なくとも１つの置換が、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して10、12、20、22、26、34、36、46、50、52、58、68、70、74、82、83、84、86、97、127、131、138、142、143、144、166、169、174、193、195、196、204、205、206、213、219、234、237、238、240、249、261、267、277、279、291、309、310、314、315、317、318、347、367、375、376、399、401、407、416、419、421、431、433、439、440、443または445の中から選択される位置に対応する（すなわち、アラインメントによって）アミノ酸位置にある、１つまたは複数のアミノ酸置換を含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドが挙げられ、対応するアミノ酸位置は、ＰＨ２０ポリペプチドの、配列番号３に示されるポリペプチドとのアラインメントによって同定される。このような修飾の例示的なものとして、配列番号３に示されるアミノ酸残基位置に関して、位置１０に対応する位置におけるグリシン（Ｇ）、位置１２に対応する位置におけるＫ、位置２０に対応する位置におけるＳ、位置２２に対応する位置におけるＴ、位置２６に対応する位置におけるＭ、位置３４に対応する位置におけるＷ、位置３６に対応する位置におけるＮ、位置４６に対応する位置におけるＬ、位置５０に対応する位置におけるＭ、位置５２に対応する位置におけるＴ、位置５２に対応する位置におけるＳ、位置５８に対応する位置におけるＣ、位置５８に対応する位置におけるＫ、位置５８に対応する位置におけるＲ、位置５８に対応する位置におけるＮ、位置５８に対応する位置におけるＹ、位置５８に対応する位置におけるＰ、位置５８に対応する位置におけるＨ、位置６８に対応する位置におけるＰ、位置７０に対応する位置におけるＶ、位置７４に対応する位置におけるＥ、位置８２に対応する位置におけるＬ、位置８２に対応する位置におけるＮ、位置８３に対応する位置におけるＶ、位置８３に対応する位置におけるＱ、位置８３に対応する位置におけるＳ、位置８３に対応する位置におけるＧ、位置８４に対応する位置におけるＮ、位置８６に対応する位置におけるＡ、位置８６に対応する位置におけるＫ、位置９７に対応する位置におけるＥ、位置９７に対応する位置におけるＬ、位置１２７に対応する位置におけるＲ、位置１３１に対応する位置におけるＲ、位置１３８に対応する位置におけるＬ、位置１４２に対応する位置におけるＫ、位置１４２に対応する位置におけるＮ、位置１４２に対応する位置におけるＰ、位置１４２に対応する位置におけるＳ、位置１４２に対応する位置におけるＴ、位置１４３に対応する位置におけるＧ、位置１４３に対応する位置におけるＫ、位置１４４に対応する位置におけるＴ、位置１６６に対応する位置におけるＱ、位置１６６に対応する位置におけるＴ、位置１６９に対応する位置におけるＬ、位置１７４に対応する位置におけるＧ、位置１７４に対���する位置におけるＮ、位置１９３に対応する位置におけるＱ、位置１９５に対応する位置におけるＴ、位置１９５に対応する位置におけるＮ、位置１９６に対応する位置におけるＥ、位置１９６に対応する位置におけるＲ、位置２０４に対応する位置におけるＰ、位置２０５に対応する位置におけるＡ、位置２０５に対応する位置におけるＥ、位置２０６に対応する位置におけるＩ、位置２１３に対応する位置におけるＡ、位置２１９に対応する位置におけるＩ、位置２３４に対応する位置におけるＭ、位置２３７に対応する位置におけるＴ、位置２３８に対応する位置におけるＨ、位置２４０に対応する位置におけるＱ、位置２４９に対応する位置におけるＶ、位置２６１に対応する位置におけるＡ、位置２６１に対応する位置におけるＫ、位置２６７に対応する位置におけるＴ、位置２７７に対応する位置におけるＫ、位置２７９に対応する位置におけるＨ、位置２７９に対応する位置におけるＶ、位置２９１に対応する位置におけるＶ、位置３０９に対応する位置におけるＥ、位置３１０に対応する位置におけるＱ、位置３１４に対応する位置におけるＹ、位置３１５に対応する位置におけるＹ、位置３１７に対応する位置におけるＮ、位置３１７に対応する位置におけるＷ、位置３１８に対応する位置におけるＤ、位置３４７に対応する位置におけるＧ、位置３６７に対応する位置におけるＡ、位置３７５に対応する位置におけるＲ、位置３７６に対応する位置におけるＲ、位置３９９に対応する位置におけるＶ、位置４０１に対応する位置におけるＥ、位置４０７に対応する位置におけるＡ、位置４１６に対応する位置におけるＬ、位置４１９に対応する位置におけるＫ、位置４２１に対応する位置におけるＨ、位置４３１に対応する位置におけるＥ、位置４３３に対応する位置におけるＴ、位置４３３に対応する位置におけるＶ、位置４３９に対応する位置におけるＣ、位置４４０に対応する位置におけるＰ、位置４４３に対応する位置におけるＧ、位置４４５に対応する位置におけるＮでの置換の中から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換がある。例えば、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸残基位置に関して、位置５２に対応する位置におけるＴ、位置５８に対応する位置におけるＫ、位置５８に対応する位置におけるＲ、位置６８に対応する位置におけるＰ、位置８３に対応する位置におけるＶ、位置２０４に対応する位置におけるＰ、位置２６１に対応する位置におけるＡ、位置２６７に対応する位置におけるＴ、位置２７７に対応する位置におけるＫおよび位置４２１に対応する位置におけるＨでの置換の中から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含有し得る。例示的修飾ＰＨ２０ポリペプチドとは、配列番号３に示されるアミノ酸残基位置に関して、ＰＨ２０ポリペプチド中の位置２０４に対応する位置にＰ（またはそれに対する保存的アミノ酸）を含むものである。
【００１５】
したがって、増大した安定性を付与するＰＨ２０ポリペプチド中のアミノ酸置換を含有する、フェノール系防腐剤の存在下で増大した安定性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドが本明細書において提供され、安定性は、アミノ酸置換を有さない非修飾ポリペプチドと比較して増大され、非修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号７に示されるアミノ酸の配列を有するか、または可溶性ＰＨ２０ポリペプチドであるそのＣ末端切断断片であるか、またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。例えば、非修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号３または３２〜６６のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有する可溶性ＰＨ２０ポリペプチドである。特定の例では、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。修飾ＰＨ２０ポリペプチドのこのような例のいずれにおいても、ポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75またはそれ以上のアミノ酸置換を含有する。本明細書における例では、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、ヒトＰＨ２０である。修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、防腐剤（複数可）の存在下で、フェノール系防腐剤（複数可）の不在下でのヒアルロニダーゼ活性と比較して、少なくとも１５％のヒアルロニダーゼ活性を少なくとも４時間示す場合に、フェノール系防腐剤の存在下で安定性を示し、活性は、フェノール系防腐剤（複数可）の存在を除いて同一条件下で比較される。上記の例のいずれにおいても、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、両端を含めて、０．０５％〜０．６％、０．１％〜０．４％、０．１％〜０．３％、０．１５％〜０．３２５％、０．１５％〜０．２５％、０．１％〜０．２％、０．２％〜０．３％もしくは０．３％〜０．４％または約０．０５％〜０．６％、０．１％〜０．４％、０．１％〜０．３％、０．１５％〜０．３２５％、０．１５％〜０．２５％、０．１％〜０．２％、０．２％〜０．３％もしくは０．３％〜０．４％である質量濃度（ｗ／ｖ）のパーセンテージ（％）としての１種または複数種のフェノール系防腐剤の総量などの抗菌上有効な量の１種または複数種のフェノール系防腐剤の存在下で安定である。フェノール系防腐剤は、ｍ−クレゾール、フェノールまたはｍ−クレゾールおよびフェノールなどのフェノール、メタクレゾール（ｍ−クレゾール）、ベンジルアルコールまたはパラベンであり得る。アミノ酸置換は、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関してアミノ酸残基204、58、10、12、20、22、26、34、36、46、50、52、68、70、74、82、83、84、86、97、127、131、138、142、143、144、166、169、174、193、195、196、205、206、213、219、234、237、238、240、249、261、267、277、279、291、309、310、314、315、317、318、347、367、375、376、399、401、407、416、419、421、431、433、439、440、443または445であり得、対応するアミノ酸位置は、ＰＨ２０ポリペプチドの、配列番号３に示されるポリペプチドとのアラインメントによって同定される。例えば、アミノ酸置換は、配列番号３に示されるアミノ酸残基���置に関して、位置１０に対応する位置におけるＧ、位置１２に対応する位置におけるＫ、位置２０に対応する位置におけるＳ、位置２２に対応する位置におけるＴ、位置２６に対応する位置におけるＭ、位置３４に対応する位置におけるＷ、位置３６に対応する位置におけるＮ、位置４６に対応する位置におけるＬ、位置５０に対応する位置におけるＭ、位置５２に対応する位置におけるＴ、位置５２に対応する位置におけるＳ、位置５８に対応する位置におけるＣ、位置５８に対応する位置におけるＫ、位置５８に対応する位置におけるＲ、位置５８に対応する位置におけるＮ、位置５８に対応する位置におけるＹ、位置５８に対応する位置におけるＰ、位置５８に対応する位置におけるＨ、位置６８に対応する位置におけるＰ、位置７０に対応する位置におけるＶ、位置７４に対応する位置におけるＥ、位置８２に対応する位置におけるＬ、位置８２に対応する位置におけるＮ、位置８３に対応する位置におけるＶ、位置８３に対応する位置におけるＱ、位置８３に対応する位置におけるＳ、位置８３に対応する位置におけるＧ、位置８４に対応する位置におけるＮ、位置８６に対応する位置におけるＡ、位置８６に対応する位置におけるＫ、位置９７に対応する位置におけるＥ、位置９７に対応する位置におけるＬ、位置１２７に対応する位置におけるＲ、位置１３１に対応する位置におけるＲ、位置１３８に対応する位置におけるＬ、位置１４２に対応する位置におけるＫ、位置１４２に対応する位置におけるＮ、位置１４２に対応する位置におけるＰ、位置１４２に対応する位置におけるＳ、位置１４２に対応する位置におけるＴ、位置１４３に対応する位置におけるＧ、位置１４３に対応する位置におけるＫ、位置１４４に対応する位置におけるＴ、位置１６６に対応する位置におけるＱ、位置１６６に対応する位置におけるＴ、位置１６９に対応する位置におけるＬ、位置１７４に対応する位置におけるＧ、位置１７４に対応する位置におけるＮ、位置１９３に対応する位置におけるＱ、位置１９５に対応する位置におけるＴ、位置１９５に対応する位置におけるＮ、位置１９６に対応する位置におけるＥ、位置１９６に対応する位置におけるＲ、位置２０４に対応する位置におけるＰ、位置２０５に対応する位置におけるＡ、位置２０５に対応する位置におけるＥ、位置２０６に対応する位置におけるＩ、位置２１３に対応する位置におけるＡ、位置２１９に対応する位置におけるＩ、位置２３４に対応する位置におけるＭ、位置２３７に対応する位置におけるＴ、位置２３８に対応する位置におけるＨ、位置２４０に対応する位置におけるＱ、位置２４９に対応する位置におけるＶ、位置２６１に対応する位置におけるＡ、位置２６１に対応する位置におけるＫ、位置２６７に対応する位置におけるＴ、位置２７７に対応する位置におけるＫ、位置２７９に対応する位置におけるＨ、位置２７９に対応する位置におけるＶ、位置２９１に対応する位置におけるＶ、位置３０９に対応する位置におけるＥ、位置３１０に対応する位置におけるＱ、位置３１４に対応する位置におけるＹ、位置３１５に対応する位置におけるＹ、位置３１７に対応する位置におけるＮ、位置３１７に対応する位置におけるＷ、位置３１���に対応する位置におけるＤ、位置３４７に対応する位置におけるＧ、位置３６７に対応する位置におけるＡ、位置３７５に対応する位置におけるＲ、位置３７６に対応する位置におけるＲ、位置３９９に対応する位置におけるＶ、位置４０１に対応する位置におけるＥ、位置４０７に対応する位置におけるＡ、位置４１６に対応する位置におけるＬ、位置４１９に対応する位置におけるＫ、位置４２１に対応する位置におけるＨ、位置４３１に対応する位置におけるＥ、位置４３３に対応する位置におけるＴ、位置４３３に対応する位置におけるＶ、位置４３９に対応する位置におけるＣ、位置４４０に対応する位置におけるＰ、位置４４３に対応する位置におけるＧ、または位置４４５に対応する位置におけるＮである。特に、アミノ酸置換は、配列番号３に示されるアミノ酸残基位置に関して、位置５２に対応する位置におけるＴ、位置５８に対応する位置におけるＫ、位置５８に対応する位置におけるＲ、位置６８に対応する位置におけるＰ、位置８３に対応する位置におけるＶ、位置２０４に対応する位置におけるＰ、位置２６１に対応する位置におけるＡ、位置２６７に対応する位置におけるＴ、位置２７７に対応する位置におけるＫまたは位置４２１に対応する位置におけるＨ、例えば、位置２０４に対応する位置におけるＰまたは位置５８に対応する位置におけるＲでの置換である。フェノール系防腐剤に対する増大した安定性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、実質的に精製または単離され得る。フェノール系防腐剤に対する増大した安定性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、グリコシル化、シアル化（ｓｉａｌａｔｉｏｎ）、アルブミン化（ａｌｂｕｍｉｎａｔｉｏｎ）、ファルニシル化（ｆａｒｎｙｓｙｌａｔｉｏｎ）、カルボキシル化、水酸化およびリン酸化によって修飾され得、通常、グリコシル化され、それによって、ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸残基２００、３３３および３５８に対応するアミノ酸残基でなど、少なくとも３つのアスパラギン（Ｎ）残基の各々と連結している少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミン部分を含む。フェノール系防腐剤に対する増大した安定性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、ＰＥＧもしくはデキストランなどのポリマーとコンジュゲートされる場合もあり、および／または多量体化ドメイン、毒素、検出可能な標識または薬物である部分とコンジュゲートされる場合もある。
【００１６】
増大した安定性を示す、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドの中には、アミノ酸置換（複数可）を含有しないＰＨ２０ポリペプチドと比較して、高温でヒアルロニダーゼ活性の増大を示すもの、例えば、アミノ酸置換（複数可）を含有しないＰＨ２０ポリペプチドと比較して、少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上のヒアルロニダーゼ活性を、少なくとも４時間示すものがある。また、ポリペプチドの中には、高温下で、活性を示し、通常、増大した安定性またはその他の特性も示すもの、例えば、２℃〜８℃の間または約２℃〜８℃の間の温度での修飾ＰＨ２０ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性と比較して、３２℃〜３７℃の間または約３２℃〜３７℃の間の温度でヒアルロニダーゼ活性の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％を、少なくとも４時間示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドがあり、これでは、活性は、温度の相違を除いて同一条件下で比較される。ヒアルロニダーゼ活性は、同一期間の２℃〜８℃の間または約２℃〜８℃の間の温度で温度の相違を除いて同一条件下での修飾ＰＨ２０ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性と比較して、３２℃〜３７℃の間または約３２℃〜３７℃の間の高温下で、少なくとも５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、３週間、４週間またはそれ以上後に示され得る。このような修飾ポリペプチドの例示的なものとして、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、1、11、12、14、20、26、29、34、50、58、70、82、83、84、86、87、140、142、143、147、152、166、167、172、174、178、193、195、206、212、213、219、233、237、240、267、277、291、292、309、313、314、317、318、347、367、368、371、374、389、392、395、396、406、419、421、439および443の中から選択される位置に対応するアミノ酸位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含有するものがあり、対応するアミノ酸位置は、ＰＨ２０ポリペプチドの、配列番号３に示されるポリペプチドとのアラインメントによって同定される。例示的突然変異として、例えば、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、位置１に対応する位置におけるＲ、位置１１に対応する位置におけるＳ、位置１２に対応する位置におけるＩ、位置１４に対応する位置におけるＶ、位置２０に対応する位置におけるＳ、位置２６に対応する位置におけるＭでの、位置２９に対応する位置におけるＲ、位置３４に対応する位置におけるＷ、位置５０に対応する位置におけるＭ、位置５８に対応する位置におけるＫ、位置５８に対応する位置におけるＱ、位置５８に対応する位置におけるＱ、位置７０に対応する位置におけるＶ、位置８２に対応する位置におけるＬ、位置８３に対応する位置におけるＱ、位置８４に対応する位置におけるＲ、位置８６に対応する位置におけるＡ、位置８７に対応する位置におけるＳ、位置��４０に対応する位置におけるＫ、位置１４２に対応する位置におけるＳ、位置１４２に対応する位置におけるＴ、位置１４３に対応する位置におけるＫ、位置１４７に対応する位置におけるＳ、位置１５２に対応する位置におけるＴ、位置１６６に対応する位置におけるＴ、位置１６７に対応する位置におけるＤ、位置１７２に対応する位置におけるＡ、位置１７４に対応する位置におけるＧ、位置１７４に対応する位置におけるＮ、位置１７８に対応する位置におけるＲ、位置１９３に対応する位置におけるＱ、位置１９５に対応する位置におけるＴ、位置２０６に対応する位置におけるＩ、位置２１２に対応する位置におけるＳ、位置２１３に対応する位置におけるＡ、位置２１９に対応する位置におけるＩ、位置２３３に対応する位置におけるＧ、位置２３７に対応する位置におけるＴ、位置２４０に対応する位置におけるＡ、位置２４０に対応する位置におけるＱ、位置２６７に対応する位置におけるＴ、位置２７７に対応する位置におけるＥ、位置２９１に対応する位置におけるＳ、位置２９２に対応する位置におけるＨ、位置２９２に対応する位置におけるＶ、位置３０９に対応する位置におけるＳ、位置３１３に対応する位置におけるＨ、位置３１４に対応する位置におけるＳ、位置３１７に対応する位置におけるＩ、位置３１７に対応する位置におけるＴ、位置３１７に対応する位置におけるＷ、位置３１８に対応する位置におけるＲ、位置３４７に対応する位置におけるＧ、位置３６７に対応する位置におけるＡ、位置３６８に対応する位置におけるＲ、位置３７１に対応する位置におけるＳ、位置３７４に対応する位置におけるＰ、位置３８９に対応する位置におけるＡ、位置３９２に対応する位置におけるＶ、位置３９５に対応する位置におけるＡ、位置３９６に対応する位置におけるＨ、位置４０６に対応する位置におけるＮ、位置４１９に対応する位置におけるＨ、位置４１９に対応する位置におけるＫ、位置４２１に対応する位置におけるＲ、位置４２１に対応する位置におけるＳ、位置４３９に対応する位置におけるＡ、位置４３９に対応する位置におけるＣ、および位置４４３に対応する位置におけるＧでの置換が挙げられる。本明細書において提供された特定の例では、このような修飾ＰＨ２０ポリペプチドのいずれも、置換などの単一アミノ酸修飾および少なくとも、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００およびそれ以上の修飾などの修飾の組合せを含有する。置換などの修飾は、配列番号７に示されるアミノ酸の配列を有するか、または例えば、配列番号３もしくは３２〜６６のいずれかに示されるものなどの可溶性ＰＨ２０ポリペプチドであるそのＣ末端切断断片であるか、またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する非修飾ＰＨ２０ポリペプチド中であり得る。例えば、このような修飾ＰＨ２０ポリペプチドのいずれも、配列番号３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【００１７】
また、低塩条件、例えば、１００ｍＭ未満のＮａＣｌの濃度、例えば、それだけには限らないが、９０ｍＭ、８０ｍＭ、７０ｍＭ、６０ｍＭ、５０ｍＭ、４０ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ未満またはそれより低いＮａＣｌの濃度で増大した安定性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドも提供される。修飾ＰＨ２０ポリペプチドの中には、アミノ酸置換（複数可）を含有しないＰＨ２０ポリペプチドと比較して、低濃度の塩でヒアルロニダーゼ活性の増大を示すものがある。このような活性は、アミノ酸置換（複数可）を含有しないＰＨ２０ポリペプチドと比較して、例えば、少なくとも１００％超または少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれより高いヒアルロニダーゼ活性を含む。このような修飾ＰＨ２０ポリペプチドの例示的なものとして、両端を含めて、１０ｍＭ  ＮａＣｌから１００ｍＭ  ＮａＣｌの間または約１０ｍＭ  ＮａＣｌから１００ｍＭ  ＮａＣｌの間などの低濃度の塩（またはその他の塩もしくは塩の混合物の匹敵する濃度）において、１５０ｍＭ  ＮａＣｌにおける修飾ＰＨ２０ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性と比較して、ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも６０％を示すものがあり、これでは、活性は、塩濃度の相違を除いて同一条件下で比較される。本明細書において提供された特定の例では、このような修飾ＰＨ２０ポリペプチドのいずれも、置換などの単一アミノ酸修飾および少なくとも、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００およびそれ以上の修飾などの修飾の組合せを含有する。置換などの修飾は、配列番号７に示されるアミノ酸の配列を有するか、または、例えば、配列番号３もしくは３２〜６６のいずれかに示される可溶性ＰＨ２０ポリペプチドであるＣ末端切断断片であるか、またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する非修飾ＰＨ２０ポリペプチド中であり得る。例えば、このような修飾ＰＨ２０ポリペプチドのいずれも、配列番号３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【００１８】
また、ＰＨ２０ポリペプチド中に少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドも提供され、これでは、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、アミノ酸置換を含有しないＰＨ２０ポリペプチドと比較して、ヒアルロニダーゼ活性の増大を示す。ポリペプチド間で活性を比較する場合には、活性は、同一条件下で比較される。これらの中には、非修飾ＰＨ２０が、配列番号３に示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を示すか、または得られた修飾ＰＨ２０が、配列番号３に示されるアミノ酸の配列に対してこのような配列同一性を示すポリペプチドがある。このような修飾ＰＨ２０ポリペプチドの例示的なものとして、配列番号３、７、１０、１２、１４、２４、３２〜６６、６９もしくは７２のいずれかに示されるアミノ酸の配列または配列番号３、７、１０、１２、１４、２４、３２〜６６、６９もしくは７２のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸の配列中にアミノ酸置換（複数可）を含有する任意のものがある。アミノ酸置換（複数可）はまた、配列番号８５７、８５９、８６１もしくは８７０のいずれかに示されるアミノ酸の配列または配列番号８５７、８５９、８６１もしくは８７０のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸の配列中で行われてもよい。特に、配列番号３、７、３２〜６６、６９または７２に示されるアミノ酸の配列中にアミノ酸置換を含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドが提供される。修飾ＰＨ２０ポリペプチドの中には、アミノ酸置換を含有しないＰＨ２０ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の少なくとも１２０％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、１５００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％またはそれ以上を示すものがある。活性は、任意の温度で評価され得、特に、このような活性は、ヒアルロニダーゼが、２℃から８℃の間または約２℃から８℃の間の温度である温度に曝される場合に存在する。これらの修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、1、12、15、24、26、27、29、30、31、32、33、37、39、46、48、52、58、63、67、68、69、70、71、72、73、74、75、84、86、87、92、93、94、97、118、120、127、131、135、141、142、147、148、150、151、152、155、156、163、164、165、166、169、170、174、198、206、209、212、213、215、219、233、234、236、238、247、257、259、260、261、263、269、271、272、276、277、278、282、291、293、305、308、309、310、313、315、317、318、320、324、325、326、328、347、353、359、371、377、380、389、392、395、399、405、407、409、410、418、419、421、425、431、433、436、437、438、439、440、441、442、443、445、446および447の中から選択さ��る位置に対応するアミノ酸位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含有し、対応するアミノ酸位置は、ＰＨ２０ポリペプチドの、配列番号３に示されるポリペプチドとのアラインメントによって同定される。例示的修飾は、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、位置１に対応する位置におけるヒスチジン（Ｈ）、位置１に対応する位置におけるＱ、位置１２に対応する位置におけるＥ、位置１２に対応する位置におけるＴ、位置１５に対応する位置におけるＶ、位置２４に対応する位置におけるＥ、位置２４に対応する位置におけるＨ、位置２６に対応する位置におけるＥ、位置２６に対応する位置におけるＫ、位置２７に対応する位置におけるＫ、位置２７に対応する位置におけるＲ、位置２９に対応する位置におけるＥ、位置２９に対応する位置におけるＩ、位置２９に対応する位置におけるＬ、位置２９に対応する位置におけるＭ、位置２９に対応する位置におけるＰ、位置２９に対応する位置におけるＳ、位置２９に対応する位置におけるＶ、位置３０に対応する位置におけるＧ、位置３０に対応する位置におけるＨ、位置３０に対応する位置におけるＫ、位置３０に対応する位置におけるＭ、位置３０に対応する位置におけるＲ、位置３０に対応する位置におけるＳ、位置３１に対応する位置におけるＡ、位置３１に対応する位置におけるＣ、位置３１に対応する位置におけるＨ、位置３１に対応する位置におけるＩ、位置３１に対応する位置におけるＫ、位置３１に対応する位置におけるＬ、位置３１に対応する位置におけるＰ、位置３１に対応する位置におけるＲ、位置３１に対応する位置におけるＳ、位置３１に対応する位置におけるＴ、位置３１に対応する位置におけるＶ、位置３２に対応する位置におけるＦ、位置３２に対応する位置におけるＧ、位置３２に対応する位置におけるＨ、位置３３に対応する位置におけるＷ、位置３７に対応する位置におけるＦ、位置３９に対応する位置におけるＮ、位置３９に対応する位置におけるＴ、位置４６に対応する位置におけるＲ、位置４８に対応する位置におけるＦ、位置４８に対応する位置におけるＨ、位置４８に対応する位置におけるＮ、位置５２に対応する位置におけるＱ、位置５８に対応する位置におけるＫ、位置５８に対応する位置におけるＱ、位置６３に対応する位置におけるＷ、位置６７に対応する位置におけるＶ、位置６８に対応する位置におけるＨ、位置６８に対応する位置におけるＱ、位置６９に対応する位置におけるＡ、位置６９に対応する位置におけるＣ、位置６９に対応する位置におけるＦ、位置６９に対応する位置におけるＧ、位置６９に対応する位置におけるＩ、位置６９に対応する位置におけるＬ、位置６９に対応する位置におけるＭ、位置６９に対応する位置におけるＰ、位置６９に対応する位置におけるＲ、位置６９に対応する位置におけるＷ、位置６９に対応する位置におけるＹ、位置７０に対応する位置におけるＡ、位置７０に対応する位置におけるＣ、位置７０に対応する位置におけるＦ、位置７０に対応する位置におけるＧ、位置７０に対応する位置におけるＨ、位置７０に対応する位置におけるＫ、位置７０に対応する位置におけるＬ、位置７０に対応する位置におけるＮ、位置７０に対応する位置におけ��Ｐ、位置７０に対応する位置におけるＲ、位置７０に対応する位置におけるＳ、位置７０に対応する位置におけるＴ、位置７０に対応する位置におけるＶ、位置７１に対応する位置におけるＲ、位置７１に対応する位置におけるＳ、位置７２に対応する位置におけるＭ、位置７２に対応する位置におけるＱ、位置７３に対応する位置におけるＨ、位置７３に対応する位置におけるＬ、位置７３に対応する位置におけるＷ、位置７４に対応する位置におけるＡ、位置７４に対応する位置におけるＣ、位置７４に対応する位置におけるＧ、位置７４に対応する位置におけるＮ、位置７４に対応する位置におけるＰ、位置７４に対応する位置におけるＲ、位置７４に対応する位置におけるＳ、位置７４に対応する位置におけるＶ、位置７４に対応する位置におけるＷ、位置７５に対応する位置におけるＦ、位置７５に対応する位置におけるＬ、位置７５に対応する位置におけるＲ、位置７５に対応する位置におけるＴ、位置８４に対応する位置におけるＧ、位置８４に対応する位置におけるＲ、位置８６に対応する位置におけるＡ、位置８７に対応する位置におけるＣ、位置８７に対応する位置におけるＴ、位置８７に対応する位置におけるＹ、位置９２に対応する位置におけるＣ、位置９３に対応する位置におけるＩ、位置９３に対応する位置におけるＬ、位置９３に対応する位置におけるＲ、位置９３に対応する位置におけるＴ、位置９４に対応する位置におけるＲ、位置９７に対応する位置におけるＧ、位置１１８に対応する位置におけるＱ、位置１２０に対応する位置におけるＦ、位置１２０に対応する位置におけるＶ、位置１２０に対応する位置におけるＹ、位置１２７に対応する位置におけるＨ、位置１２７に対応する位置におけるＮ、位置１３１に対応する位置におけるＧ、位置１３１に対応する位置におけるＲ、位置１３１に対応する位置におけるＶ、位置１３５に対応する位置におけるＤ、位置１３５に対応する位置におけるＧ、位置１３５に対応する位置におけるＲでの、位置１４１に対応する位置におけるＨ、位置１４１に対応する位置におけるＹ、位置１４２に対応する位置におけるＲ、位置１４７に対応する位置におけるＲ、位置１４７に対応する位置におけるＶ、位置１４８に対応する位置におけるＫ、位置１５０に対応する位置におけるＧ、位置１５１に対応する位置におけるＫ、位置１５１に対応する位置におけるＬ、位置１５１に対応する位置におけるＭ、位置１５１に対応する位置におけるＱ、位置１５１に対応する位置におけるＲ、位置１５２に対応する位置におけるＲ、位置１５５に対応する位置におけるＧ、位置１５５に対応する位置におけるＫ、位置１５６に対応する位置におけるＤ、位置１６３に対応する位置におけるＡ、位置１６３に対応する位置におけるＥ、位置１６３に対応する位置におけるＫ、位置１６３に対応する位置におけるＲ、位置１６４に対応する位置におけるＭ、位置１６５に対応する位置におけるＤ、位置１６５に対応する位置におけるＮ、位置１６６に対応する位置におけるＡ、位置１６６に対応する位置におけるＦ、位置１６６に対応する位置におけるＨ、位置１６６に対応する位置におけるＬ、位置１６６に対応する位置におけるＱ、位置１６６に対応する位��におけるＲ、位置１６６に対応する位置におけるＴ、位置１６６に対応する位置におけるＹ、位置１６９に対応する位置におけるＬ、位置１７０に対応する位置におけるＲ、位置１７４に対応する位置におけるＫ、位置１９８に対応する位置におけるＤ、位置２０６に対応する位置におけるＫ、位置２０６に対応する位置におけるＬ、位置２１２に対応する位置におけるＮ、位置２１３に対応する位置におけるＭ、位置２１３に対応する位置におけるＮ、位置２１５に対応する位置におけるＭ、位置２１９に対応する位置におけるＳ、位置２３３に対応する位置におけるＫ、位置２３３に対応する位置におけるＲ、位置２３４に対応する位置におけるＭ、位置２３６に対応する位置におけるＲ、位置２３７に対応する位置におけるＥ、位置２３８に対応する位置におけるＳ、位置２４７に対応する位置におけるＩ、位置２５７に対応する位置におけるＴ、位置２５９に対応する位置におけるＰ、位置２６０に対応する位置におけるＹ、位置２６１に対応する位置におけるＫ、位置２６１に対応する位置におけるＮ、位置２６３に対応する位置におけるＫ、位置２６３に対応する位置におけるＲ、位置２６９に対応する位置におけるＡ、位置２７１に対応する位置におけるＬ、位置２７１に対応する位置におけるＭ、位置２７２に対応する位置におけるＴ、位置２７６に対応する位置におけるＤ、位置２７６に対応する位置におけるＳ、位置２７６に対応する位置におけるＹ、位置２７７に対応する位置におけるＫ、位置２７７に対応する位置におけるＲ、位置２７７に対応する位置におけるＴ、位置２７８に対応する位置におけるＨ、位置２７８に対応する位置におけるＫ、位置２７８に対応する位置におけるＮ、位置２７８に対応する位置におけるＲ、位置２７８に対応する位置におけるＳ、位置２７８に対応する位置におけるＴ、位置２７８に対応する位置におけるＹ、位置２８２に対応する位置におけるＭ、位置２９１に対応する位置におけるＶ、位置２９３に対応する位置におけるＡ、位置２９３に対応する位置におけるＣ、位置２９３に対応する位置におけるＦ、位置２９３に対応する位置におけるＭ、位置２９３に対応する位置におけるＰ、位置２９３に対応する位置におけるＱ、位置２９３に対応する位置におけるＶ、位置３０５に対応
する位置におけるＥ、位置３０８に対応する位置におけるＧ、位置３０８に対応する位置におけるＮ、位置３０９に対応する位置におけるＥ、位置３０９に対応する位置におけるＬ、位置３０９に対応する位置におけるＮ、位置３０９に対応する位置におけるＱ、位置３０９に対応する位置におけるＲ、位置３０９に対応する位置におけるＴ、位置３１０に対応する位置におけるＡ、位置３１０に対応する位置におけるＧ、位置３１３に対応する位置におけるＫ、位置３１３に対応する位置におけるＲ、位置３１５に対応する位置におけるＨ、位置３１７に対応する位置におけるＩ、位置３１７に対応する位置におけるＫ、位置３１７に対応する位置におけるＲ、位置３１８に対応する位置におけるＭ、位置３２０に対応する位置におけるＨ、位置３２０に対応する位置におけるＫ、位置３２０に対応する位置におけるＲ、位置３２４に対応する位置におけるＲ、位置３２５に対応する位置におけるＡ、位置３２５に対応する位置におけるＤ、位置３２５に対応する位置におけるＥ、位置３２５に対応する位置におけるＧ、位置３２５に対応する位置におけるＨ、位置３２５に対応する位置におけるＫ、位置３２５に対応する位置におけるＭ、位置３２５に対応する位置におけるＮ、位置３２５に対応する位置におけるＱ、位置３２５に対応する位置におけるＳ、位置３２６に対応する位置におけるＶ、位置３２８に対応する位置におけるＩ、位置３２８に対応する位置におけるＫ、位置３２８に対応する位置におけるＬ、位置３２８に対応する位置におけるＳ、位置３２８に対応する位置におけるＹ、位置３４７に対応する位置におけるＧ、位置３４７に対応する位置におけるＳ、位置３５３に対応する位置におけるＶでの、位置３５９に対応する位置におけるＴ、位置３７１に対応する位置におけるＲ、位置３７７に対応する位置におけるＰ、位置３７７に対応する位置におけるＴ、位置３８０に対応する位置におけるＷ、位置３８０に対応する位置におけるＹ、位置３８９に対応する位置におけるＫ、位置３９２に対応する位置におけるＭ、位置３９５に対応する位置におけるＲ、位置３９９に対応する位置におけるＭ、位置３９９に対応する位置におけるＴ、位置３９９に対応する位置におけるＷ、位置４０５に対応する位置におけるＧ、位置４０７に対応する位置におけるＤ、位置４０７に対応する位置におけるＱ、位置４０９に対応する位置におけるＡ、位置４０９に対応する位置におけるＱ、位置４１０に対応する位置におけるＴ、位置４１８に対応する位置におけるＰ、位置４１９に対応する位置におけるＦ、位置４１９に対応する位置におけるＩ、位置４１９に対応する位置におけるＫ、位置４１９に対応する位置におけるＲ、位置４１９に対応する位置におけるＳ、位置４２１に対応する位置におけるＨ、位置４２１に対応する位置におけるＫ、位置４２１に対応する位置におけるＮ、位置４２１に対応する位置におけるＱ、位置４２１に対応する位置におけるＲ、位置４２１に対応する位置におけるＳ、位置４２５に対応する位置におけるＫ、位置４３１に対応する位置におけるＡ、位置４３１に対応する位置におけるＨ、位置４３１に対応する位置におけるＫ、位置４３１に対応する位置におけるＱ、位置４３１に対応する位置におけるＲ、位置４３１に対応する位置におけるＳ、位置４３１に対応する位置におけるＶ、位置４３３に対応する位置におけるＬ、位置４３３に対応する位置におけるＲ、位置４３３に対応する位置におけるＴ、位置４３３に対応する位置におけるＶ、位置４３６に対応する位置におけるＫ、位置４３７に対応する位置におけるＩ、位置４３７に対応する位置におけるＭ、位置４３８に対応する位置におけるＴ、位置４３９に対応する位置におけるＶ、位置４４０に対応する位置におけるＨ、位置４４０に対応する位置におけるＲ、位置４４１に対応する位置におけるＦ、位置４４２に対応する位置におけるＲ、位置４４３に対応する位置におけるＡ、位置４４３に対応する位置におけるＭ、位置４４５に対応する位置におけるＭ、位置４４５に対応する位置におけるＰ、位置４４６に対応する位置におけるＡ、位置４４７に対応する位置におけるＤ、位置４４７に対応する位置におけるＮでの、および／または位置４４７に対応する位置におけるＱでの置換の中から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【００１９】
ヒアルロニダーゼ活性の増大を示すポリペプチドの中には、アミノ酸置換を含有しないＰＨ２０ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の少なくとも２．０倍を示すものがある。例えば、これらの中には、配列番号３に示される位置に関して、２４、２９、３１、４８、５８、６９、７０、７５、８４、９７、１６５、１６６、２７１、２７８、３１７、３２０、３２５および３２６の中から選択される位置に対応するアミノ酸位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、位置２４に対応する位置におけるＥ、位置２９に対応する位置におけるＥ、位置３１に対応する位置におけるＶ、位置４８に対応する位置におけるＮ、位置５８に対応する位置におけるＫ、位置５８に対応する位置におけるＱ、位置６９に対応する位置におけるＡ、位置６９に対応する位置におけるＦ、位置６９に対応する位置におけるＧ、位置６９に対応する位置におけるＰ、位置６９に対応する位置におけるＲ、位置７０に対応する位置におけるＡ、位置７０に対応する位置におけるＦ、位置７０に対応する位置におけるＧ、位置７０に対応する位置におけるＨ、位置７０に対応する位置におけるＨ、位置７０に対応する位置におけるＮ、位置７０に対応する位置におけるＲ、位置７０に対応する位置におけるＴ、位置７０に対応する位置におけるＶ、位置７５に対応する位置におけるＬ、位置７５に対応する位置におけるＴ、位置８４に対応する位置におけるＧ、位置９７に対応する位置におけるＧ、位置１６５に対応する位置におけるＤ、位置１６６に対応する位置におけるＬ、位置１６６に対応する位置におけるＲ、位置１６６に対応する位置におけるＴ、位置２７１に対応する位置におけるＬ、位置２７８に対応する位置におけるＨ、位置２７８に対応する位置におけるＲ、位置３１７に対応する位置におけるＫ、位置３２０に対応する位置におけるＫ、位置３２５に対応する位置におけるＥでの、位置３２５に対応する位置におけるＧ、位置３２５に対応する位置におけるＫ、位置３２５に対応する位置におけるＮ、位置３２５に対応する位置におけるＱ、および位置３２６に対応する位置におけるＶでの置換の中から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドがあり、対応するアミノ酸位置は、ＰＨ２０ポリペプチドの、配列番号３に示されるポリペプチドとのアラインメントによって同定される。
【００２０】
ヒアルロニダーゼ活性の増大を示す本明細書において提供されたポリペプチドのいずれの中でも、このような修飾ＰＨ２０ポリペプチドのいずれも、置換などの単一アミノ酸修飾ならびに少なくとも、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００およびそれ以上の修飾などの修飾の組合せを含有する。置換などの修飾は、配列番号７に示されるアミノ酸の配列を有するか、または例えば、配列番号３もしくは３２〜６６のいずれかに示される可溶性ＰＨ２０ポリペプチドであるＣ末端切断断片であるか、またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する非修飾ＰＨ２０ポリペプチド中であってもよい。例えば、このような修飾ＰＨ２０ポリペプチドのいずれも、配列番号３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【００２１】
また、その配列が、配列番号７に示されるＰＨ２０ポリペプチド、そのＣ末端で切断された断片、その可溶性断片中に、または配列番号７に示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも９１％同一であるアミノ酸の配列を有するＰＨ２０ポリペプチド中に少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドが提供され、これでは、少なくとも１つのアミノ置換は、配列番号３または７に示されるアミノ酸位置に関して、1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、20、22、23、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、54、58、59、60、61、63、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、77、79、81、82、83、84、85、86、87、89、90、91、92、93、94、96、97、98、99、102、103、104、105、106、107、108、110、114、117、118、119、120、122、124、125、127、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、186、192、193、195、196、197、198、200、202、204、205、206、208、209、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、224、226、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、245、247、248、251、253、255、256、257、258、259、260、261、263、264、265、266、267、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、297、298、300、301、302、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、320、321、323、324、325、326、327、328、331、334、335、338、339、342、343、347、348、349、351、353、356、357、358、359、360、361、367、368、369、371、373、374、375、376、377、378、379、380、381、383、385、387、388、389、391、392、393、394、395、396、397、398、399、401、403、404、405、406、407、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、425、426、427、428、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446および447の中から選択される位置に対応するアミノ酸位置にあり、対応するアミノ酸位置は、ＰＨ２０ポリペプチドの、配列番号３に示されるポリペプチドとのアラインメントによって同定され、ただし、修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、位置１３、４７、１３１または２１９に対応する位置にアミノ酸置換を含有するならば、置換は、アラニン（Ａ）との置換ではない。これらの修飾ＰＨ２０ポリペプチドの中に、アミノ酸置換を含有しないＰＨ２０ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の少なくとも４０％を示すものがあり、活性は、本明細書におけるすべての例においてと同様、同一条件下で比較される。
【００２２】
これらのポリペプチドの中に、配列番号３、７、３２〜６６、６９および７２のいずれかに示されるアミノ酸の配列中に、または配列番号３、７、３２〜６６、６９もしくは７２のいずれかに対して少なくとも９１％の配列同一性を示すアミノ酸の配列中にアミノ酸置換を含有するものが含まれる。特に、配列番号７のＣ末端で切断された断片であるポリペプチドまたは配列番号７に示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも９１％同一であるアミノ酸の配列を有するＰＨ２０ポリペプチドである修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号３、７、３２〜６６、６９もしくは７２中にアミノ酸置換を含有する。特に、本明細書において提供されたこのような修飾ＰＨ２０ポリペプチドのいずれかの中に、アミノ酸置換が、以下の表３に示されるアミノ酸置換であるものを含むいずれかがある。例えば、このような修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、1、6、8、9、10、11、12、14、15、20、22、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、46、47、48、49、50、52、58、59、63、67、68、69、70、71、72、73、74、75、79、82、83、84、86、87、89、90、92、93、94、97、102、104、107、114、118、120、127、128、130、131、132、135、138、139、140、141、142、143、144、146、147、148、149、150、151、152、155、156、158、160、162、163、164、165、166、167、169、170、172、173、174、175、178、179、193、195、196、198、204、205、206、209、212、213、215、219、220、221、222、232、233、234、235、236、237、238、240、247、248、249、257、258、259、260、261、263、267、269、271、272、273、274、276、277、278、279、282、283、285、287、289、291、292、293、298、305、307、308、309、310、313、314、315、317、318、320、321、324、325、326、328、335、347、349、351、353、356、359、367、368、369、371、373、374、375、376、377、380、381、383、385、389、392、393、395、396、399、401、404、405、406、407、409、410、412、416、418、419、421、425、427、428、431、433、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446または447の中から選択される位置に対応するアミノ酸位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を有するものを含む。このような置換の例示的なものとして、各々、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、位置１に対応する位置におけるヒスチジン（Ｈ）、位置１に対応する位置におけるＡ、位置１に対応する位置におけるＥ、位置１に対応する位置におけるＧ、位置１に対応する位置におけるＫ、位置１に対応する位置におけるＱ、位置１に対応する位置におけるＲ、位置６に対応する位置におけるＡ、位置８に対応する位置におけるＭ、位置９に対応する位置におけるＱ、位置１０に対応する位置におけるＧ、位置１０に対応する位置におけるＨ、位置１１に対応する位置におけるＳ、位置１２に対応する位置におけるＥ、位置１２に対応する位置におけるＩ、位置１２に対応する位置におけるＫ、位置１２に対応する位置におけるＴ、位置１４に対応する位置におけるＶ、位置１５に対応する位置におけるＶ、位置１５に対応する位置におけるＭ、位置２０に対応する位置におけるＳ、位置２２に対応する位置におけるＴ、位置２４に対応する位置におけるＥ、位置２４に対応する位置におけるＨ、位置２４に対応する位置におけるＲ、位置２６に対応する位置におけるＡ、位置２６に対応す��位置におけるＥ、位置２６に対応する位置におけるＫ、位置２６に対応する位置におけるＭ、位置２６に対応する位置におけるＱ、位置２６に対応する位置におけるＲ、位置２７に対応する位置におけるＤ、位置２７に対応する位置におけるＫ、位置２７に対応する位置におけるＲ、位置２８に対応する位置におけるＲ、位置２９に対応する位置におけるＥ、位置２９に対応する位置におけるＩ、位置２９に対応する位置におけるＫ、位置２９に対応する位置におけるＬ、位置２９に対応する位置におけるＭ、位置２９に対応する位置におけるＰ、位置２９に対応する位置におけるＲ、位置２９に対応する位置におけるＳ、位置２９に対応する位置におけるＴ、位置２９に対応する位置におけるＶ、位置３０に対応する位置におけるＧ、位置３０に対応する位置におけるＨ、位置３０に対応する位置におけるＫ、位置３０に対応する位置におけるＬ、位置３０に対応する位置におけるＭ、位置３０に対応する位置におけるＲ、位置３０に対応する位置におけるＳ、位置３１に対応する位置におけるＡ、位置３１に対応する位置におけるＣ、位置３１に対応する位置におけるＧ、位置３１に対応する位置におけるＨ、位置３１に対応する位置におけるＩ、位置３１に対応する位置におけるＫ、位置３１に対応する位置におけるＬ、位置３１に対応する位置におけるＰ、位置３１に対応する位置におけるＲ、位置３１に対応する位置におけるＳ、位置３１に対応する位置におけるＴ、位置３１に対応する位置におけるＶ、位置３１に対応する位置におけるＷ、位置３２に対応する位置におけるＣ、位置３２に対応する位置におけるＦ、位置３２に対応する位置におけるＧ、位置３２に対応する位置におけるＨ、位置３３に対応する位置におけるＷ、位置３３に対応する位置におけるＧ、位置３４に対応する位置におけるＷ、位置３５に対応する位置におけるＱ、位置３５に対応する位置におけるＶ、位置３６に対応する位置におけるＨ、位置３６に対応する位置におけるＮ、位置３７に対応する位置におけるＦ、位置３７に対応する位置におけるＭ、位置３８に対応する位置におけるＹ、位置３９に対応する位置におけるＡ、位置３９に対応する位置におけるＬ、位置３９に対応する位置におけるＮ、位置３９に対応する位置におけるＴ、位置４０に対応する位置におけるＬ、位置４１に対応する位置におけるＴ、位置４６に対応する位置におけるＬ、位置４６に対応する位置におけるＲ、位置４７に対応する位置におけるＤ、位置４７に対応する位置におけるＦ、位置４７に対応する位置におけるＴ、位置４７に対応する位置におけるＷでの、位置４８に対応する位置におけるＦ、位置４８に対応する位置におけるＨ、位置４８に対応する位置におけるＫ、位置４８に対応する位置におけるＮ、位置４９に対応する位置におけるＲ、位置５０に対応する位置におけるＤ、位置５０に対応する位置におけるＳ、位置５０に対応する位置におけるＭ、位置５２に対応する位置におけるＮ、位置５２に対応する位置におけるＱ、位置５２に対応する位置におけるＲ、位置５２に対応する位置におけるＳ、位置５２に対応する位置におけるＴ、位置５８に対応する位置におけるＣ、位置５８に対応する位置におけるＫ、位置５８に対応する位置��おけるＬ、位置５８に対応する位置におけるＰ、位置５８に対応する位置におけるＱ、位置５８に対応する位置におけるＲ、位置５８に対応する位置におけるＨ、位置５８に対応する位置におけるＮ、位置５８に対応する位置におけるＹ、位置５９に対応する位置におけるＮ、位置６３に対応する位置におけるＫ、位置６３に対応する位置におけるＬ、位置６３に対応する位置におけるＭ、位置６３に対応する位置におけるＲ、位置６３に対応する位置におけるＷ、位置６７に対応する位置におけるＶ、位置６８に対応する位置におけるＨ、位置６８に対応する位置におけるＰ、位置６８に対応する位置におけるＱ、位置６９に対応する位置におけるＡ、位置６９に対応する位置におけるＣ、位置６９に対応する位置におけるＥ、位置６９に対応する位置におけるＦ、位置６９に対応する位置におけるＧ、位置６９に対応する位置におけるＩ、位置６９に対応する位置におけるＬ、位置６９に対応する位置におけるＭ、位置６９に対応する位置におけるＰ、位置６９に対応する位置におけるＲ、位置６９に対応する位置におけるＴ、位置６９に対応する位置におけるＷ、位置６９に対応する位置におけるＹ、位置７０に対応する位置におけるＡ、位置７０に対応する位置におけるＣ、位置７０に対応する位置におけるＦ、位置７０に対応する位置におけるＧ、位置７０に対応する位置におけるＨ、位置７０に対応する位置におけるＫ、位置７０に対応する位置におけるＬ、位置７０に対応する位置におけるＮ、位置７０に対応する位置におけるＰ、位置７０に対応する位置におけるＲ、位置７０に対応する位置におけるＳ、位置７０に対応する位置におけるＴ、位置７０に対応する位置におけるＶ、位置７０に対応する位置におけるＹ、位置７１に対応する位置におけるＧ、位置７１に対応する位置におけるＮ、位置７１に対応する位置におけるＲ、位置７１に対応する位置におけるＳ、位置７２に対応する位置におけるＫ、位置７２に対応する位置におけるＭ、位置７２に対応する位置におけるＱ、位置７３に対応する位置におけるＡ、位置７３に対応する位置におけるＨ、位置７３に対応する位置におけるＫ、位置７３に対応する位置におけるＬ、位置７３に対応する位置におけるＱ、位置７３に対応する位置におけるＲ、位置７３に対応する位置におけるＴ、位置７３に対応する位置におけるＷ、位置７４に対応する位置におけるＡ、位置７４に対応する位置におけるＣ、位置７４に対応する位置におけるＥ、位置７４に対応する位置におけるＦ、位置７４に対応する位置におけるＧ、位置７４に対応する位置におけるＨ、位置７４に対応する位置におけるＫ、位置７４に対応する位置におけるＬ、位置７４に対応する位置におけるＭ、位置７４に対応する位置におけるＮ、位置７４に対応する位置におけるＰ、位置７４に対応する位置におけるＲ、位置７４に対応する位置におけるＳ、位置７４に対応する位置におけるＶ、位置７４に対応する位置におけるＷ、位置７５に対応する位置におけるＦ、位置７５に対応する位置におけるＬ、位置７５に対応する位置におけるＭ、位置７５に対応する位置におけるＲ、位置７５に対応する位置におけるＴ、位置７９に対応する位置におけるＬ、位置８２に対応する位置におけるＬ��位置８２に対応する位置におけるＮ、位置８３に対応する位置におけるＶ、位置８３に対応する位置におけるＱ、位置８３に対応する位置におけるＳ、位置８３に対応する位置におけるＧ、位置８４に対応する位置におけるＥ、位置８４に対応する位置におけるＦ、位置８４に対応する位置におけるＧ、位置８４に対応する位置におけるＮ、位置８４に対応する位置におけるＲ、位置８６に対応する位置におけるＡ、位置８６に対応する位置におけるＨ、位置８６に対応する位置におけるＫ、位置８６に対応する位置におけるＮ、位置８６に対応する位置におけるＳ、位置８６に対応する位置におけるＴ、位置８６に対応する位置におけるＷ、位置８７に対応する位置におけるＣ、位置８７に対応する位置におけるＧ、位置８７に対応する位置におけるＬ、位置８７に対応する位置におけるＭ、位置８７に対応する位置におけるＲ、位置８７に対応する位置におけるＳ、位置８７に対応する位置におけるＴ、位置８７に対応する位置におけるＶ、位置８７に対応する位置におけるＹ、位置８９に対応する位置におけるＣ、位置９０に対応する位置におけるＡ、位置９０に対応する位置におけるＥ、位置９０に対応する位置におけるＨ、位置９０に対応する位置におけるＫ、位置９０に対応する位置におけるＮ、位置９０に対応する位置におけるＲ、位置９２に対応する位置におけるＣ、位置９２に対応する位置におけるＬ、位置９３に対応する位置におけるＩ、位置９３に対応する位置におけるＬ、位置９３に対応する位置におけるＱ、位置９３に対応する位置におけるＲ、位置９３に対応する位置におけるＳ、位置９３に対応する位置におけるＴ、位置９４に対応する位置におけるＤ、位置９４に対応する位置におけるＱ、位置９４に対応する位置におけるＲ、位置９７に対応する位置におけるＡ、位置９７に対応するアミノ酸残基でのＣ、位置９７に対応する位置におけるＤ、位置９７に対応する位置におけるＥ、位置９７に対応する位置におけるＧ、位置９７に対応する位置におけるＬ、位置９７に対応する位置におけるＳ、位置１０２に対応する位置におけるＳ、位置１０２に対応する位置におけるＴ、位置１０４に対応する位置におけるＲ、
位置１０７に対応する位置におけるＬ、位置１１４に対応する位置におけるＡ、位置１１８に対応する位置におけるＱ、位置１２０に対応する位置におけるＨ、位置１２０に対応する位置におけるＦ、位置１２０に対応する位置におけるＩ、位置１２０に対応する位置におけるＳ、位置１２０に対応する位置におけるＶ、位置１２０に対応する位置におけるＹ、位置１２７に対応する位置におけるＥ、位置１２７に対応する位置におけるＨ、位置１２７に対応する位置におけるＮ、位置１２７に対応する位置におけるＱ、位置１２７に対応する位置におけるＲ、位置１２８に対応する位置におけるＩ、位置１３０に対応する位置におけるＲ、位置１３１に対応する位置におけるＧ、位置１３１に対応する位置におけるＩ、位置１３１に対応する位置におけるＭ、位置１３１に対応する位置におけるＱ、位置１３１に対応する位置におけるＲ、位置１３１に対応する位置におけるＶ、位置１３２に対応する位置におけるＮ、位置１３２に対応する位置におけるＬ、位置１３５に対応する位置におけるＤ、位置１３５に対応する位置におけるＧ、位置１３５に対応する位置におけるＲでの、位置１３８に対応する位置におけるＬ、位置１３９に対応する位置におけるＴ、位置１４０に対応する位置におけるＫ、位置１４１に対応する位置におけるＨ、位置１４１に対応する位置におけるＲ、位置１４１に対応する位置におけるＳ、位置１４１に対応する位置におけるＷ、位置１４１に対応する位置におけるＹ、位置１４２に対応する位置におけるＤ、位置１４２に対応する位置におけるＧ、位置１４２に対応する位置におけるＫ、位置１４２に対応する位置におけるＮ、位置１４２に対応する位置におけるＰ、位置１４２に対応する位置におけるＱ、位置１４２に対応する位置におけるＲ、位置１４２に対応する位置におけるＳ、位置１４２に対応する位置におけるＴ、位置１４３に対応する位置におけるＧ、位置１４３に対応する位置におけるＫ、位置１４４に対応する位置におけるＲ、位置１４４に対応する位置におけるＴ、位置１４６に対応する位置におけるＰ、位置１４６に対応する位置におけるＲ、位置１４７に対応する位置におけるＡ、位置１４７に対応する位置におけるＦ、位置１４７に対応する位置におけるＬ、位置１４７に対応する位置におけるＲ、位置１４７に対応する位置におけるＳ、位置１４７に対応する位置におけるＶ、位置１４８に対応する位置におけるＨ、位置１４８に対応する位置におけるＫ、位置１４８に対応する位置におけるＱ、位置１４９に対応する位置におけるＴ、位置１４９に対応する位置におけるＶ、位置１５０に対応する位置におけるＡ、位置１５０に対応する位置におけるＤ、位置１５０に対応する位置におけるＧ、位置１５０に対応する位置におけるＮ、位置１５０に対応する位置におけるＳ、位置１５０に対応する位置におけるＷ、位置１５０に対応する位置におけるＹ、位置１５１に対応する位置におけるＡ、位置１５１に対応する位置におけるＨ、位置１５１に対応する位置におけるＫ、位置１５１に対応する位置におけるＬ、位置１５１に対応する位置におけるＭ、位置１５１に対応する位置におけるＱ、位置１５１に対応する位置におけるＲ、位置１５１に対応する位置におけるＳ、位置１５１に対応する位置におけるＴ、位置１５１に対応する位置におけるＶ、位置１５１に対応する位置におけるＷ、位置１５１に対応する位置におけるＹ、位置１５２に対応する位置におけるＲ、位置１５２に対応する位置におけるＴ、位置１５２に対応する位置におけるＷ、位置１５５に対応する位置におけるＤ、位置１５５に対応する位置におけるＧ、位置１５５に対応する位置におけるＫ、位置１５５に対応する位置におけるＲ、位置１５６に対応する位置におけるＤ、位置１５８に対応する位置におけるＱ、位置１５８に対応する位置におけるＳ、位置１６０に対応する位置におけるＳ、位置１６２に対応する位置におけるＥ、位置１６３に対応する位置におけるＡ、位置１６３に対応する位置におけるＥ、位置１６３に対応する位置におけるＫ、位置１６３に対応する位置におけるＱ、位置１６３に対応する位置におけるＲ、位置１６３に対応する位置におけるＳ、位置１６４に対応する位置におけるＭ、位置１６４に対応する位置におけるＶ、位置１６５に対応する位置におけるＤ、位置１６５に対応する位置におけるＦ、位置１６５に対応する位置におけるＮ、位置１６５に対応する位置におけるＳ、位置１６５に対応する位置におけるＶ、位置１６６に対応する位置におけるＡ、位置１６６に対応する位置におけるＥ、位置１６６に対応する位置におけるＦ、位置１６６に対応する位置におけるＨ、位置１６６に対応する位置におけるＬ、位置１６６に対応する位置におけるＱ、位置１６６に対応する位置におけるＲ、位置１６６に対応する位置におけるＴ、位置１６６に対応する位置におけるＷ、位置１６６に対応する位置におけるＹ、位置１６７に対応する位置におけるＤ、位置１６９に対応する位置におけるＬ、位置１７０に対応する位置におけるＲ、位置１７２に対応する位置におけるＡ、位置１７３に対応する位置におけるＲ、位置１７４に対応する位置におけるＧ、位置１７４に対応する位置におけるＫ、位置１７４に対応する位置におけるＮ、位置１７４に対応する位置におけるＲ、位置１７４に対応する位置におけるＴ、位置１７５に対応する位置におけるＴ、位置１７８に対応する位置におけるＫ、位置１７８に対応する位置におけるＲ、位置１７９に対応する位置におけるＫ、位置１９３に対応する位置におけるＱ、位置１９５に対応する位置におけるＴ、位置１９５に対応する位置におけるＮでの、位置１９６に対応する位置におけるＥ、位置１９６に対応する位置におけるＲでの、位置１９８に対応する位置におけるＤ、位置２０４に対応する位置におけるＰ、位置２０５に対応する位置におけるＡ、位置２０５に対応する位置におけるＥ、位置２０５に対応する位置におけるＬ、位置２０５に対応する位置におけるＴ、位置２０６に対応する位置におけるＩ、位置２０６に対応する位置におけるＫ、位置２０６に対応する位置におけるＬ、位置２０６に対応する位置におけるＲ、位置２０９に対応する位置におけるＲ、位置２１２に対応する位置におけるＮ、位置２１２に対応する位置におけるＳ、位置２１３に対応する位置におけるＡ、位置２１３に対応する位置におけるＭ、位置２１３に対応する位置におけるＮ、位置２１５に対応する位置におけるＨ、位置２１５に対応する位置におけるＭ、位置２１９に対応する位置におけるＩ、位置２１９に対応する位置におけるＫ、位置２１９に対応する位置におけるＳ、位置２２０に対応する位置におけるＨ、位置２２０に対応する位置におけるＩ、位置２２０に対応する位置におけるＬ、位置２２０に対応する位置におけるＶ、位置２２１に対応する位置におけるＱ、位置２２２に対応する位置におけるＧ、位置２３２に対応する位置におけるＦ、位置２３３に対応する位置におけるＧ、位置２３３に対応する位置におけるＫ、位置２３３に対応する位置におけるＲ、位置２３４に対応する位置におけるＭ、位置２３５に対応する位置におけるＡ、位置２３６に対応する位置におけるＲ、位置２３７に対応する位置におけるＣ、位置２３７に対応する位置におけるＥ、位置２３７に対応する位置におけるＨ、位置２３７に対応する位置におけるＱ、位置２３７に対応する位置におけるＴ、位置２３８に対応する位置におけるＥ、アミノ酸位置２３８に対応する位置におけるＨ、位置２３８に対応する位置におけるＳ、位置２４０に対応する位置におけるＡ、位置２４０に対応する位置におけるＱ、位置２４７に対応する位置におけるＩ、位置２４８に対応する位置におけるＡ、位置２４９に対応する位置におけるＶ、位置２５７に対応する位置におけるＧ、位置２５７に対応する位置におけるＴ、位置２５７に対応する位置におけるＲ、位置２５８に対応する位置におけるＮ、位置２５８に対応する位置におけるＳ、位置２５９に対応する位置におけるＰ、位置２６０に対応する位置におけるＭ、位置２６０に対応する位置におけるＹ、位置２６１に対応する位置におけるＡ、位置２６１に対応する位置におけるＫ、位置２６１に対応する位置におけるＮ、位置２６３に対応する位置におけるＫ、位置２６３に対応する位置におけるＲ、位置２６７に対応する位置におけるＴ、位置２６９に対応する位置におけるＡ、位置２７１に対応する位置におけるＬ、位置２７１に対応する位置におけるＭ、位置２７２に対応する位置におけるＤ、位置２７２に対応する位置におけるＴ、位置２７３に対応する位置におけるＨ、位置２７３に対応する位置におけるＹ、位置２７４に対応する位置におけるＦ、位置２７６に対応する位置におけるＤ、位置２７６に対応する位置におけるＨ、位置２７６に対応する位置におけるＭ、位置２７６に対応する位置におけるＲ、位置２７６に対応する位置におけるＳ、位置２７６に対応する位置におけるＹ、位置２７７に対応する位置におけるＡ、位置２７７に対応する位置におけるＥ、位置２７７に対応する位置におけるＨ、位置２７７に対応する位置におけるＫ、位置２７７に対応する位置におけるＭ、位置２７７に対応する位置におけるＮ、位置２７７に対応する位置におけるＱ、位置２７７に対応する位置におけるＲ、位置２７７に対応する位置におけるＳ、位置２７７に対応する位置におけるＴ、位置２７８に対応する位置におけるＥ、位置２７８に対応する位置におけるＦ、位置２７８に対応する位置におけるＧ、位置２７８に対応する位置におけるＨ、位置２７８に対応する位置におけるＫ、位置２７８に対応する位置におけるＮ、位置２７８に対応する位置におけるＲ、位置２７８に対応する位置におけるＳ、位置２７８に対応する位置におけるＴ、位置２７８に対応する位置におけるＹ、位置２７９に対応する位置におけるＨ、位置２８２に対応する位置におけるＭ、位置２８３に対応する位置におけるＳ、位置２８５に対応する位置におけるＨ、位置２８７に対応する位置におけるＴ、位置２８９に対応する位置におけるＳ、位置２９１に対応する位置におけるＳ、位置２９１に対応する位置におけるＶ、位置２９２に対応する位置におけるＣ、位置２９２に対応する位置におけるＦ、位置２９２に対応する位置におけるＨ、位置２９２に対応する位置におけるＫ、位置２９２に対応する位置におけるＲ、位置２９２に対応する位置におけるＶ、位置２９３に対応する位置におけるＡ、位置２９３に対応する位置におけるＣ、位置２９３に対応する位置におけるＤ、位置２９３に対応する位置におけるＦ、位置２９３に対応する位置におけるＫ、位置２９３に対応する位置におけるＭ、位置２９３に対応する位置におけるＰ、位置２９３に対応する位置におけるＱ、位置２９３に対応する位置におけるＶ、位置２９３に対応する位置におけるＹ、位置２９８に対応する位置におけるＧ、位置３０５に対応する位置におけるＥ、位置３０７に対応する位置におけるＧ、位置３０８に対応する位置におけるＤ、位置３０８に対応する位置におけるＧ、位置３０８に対応する位置におけるＫ、位置３０８に対応する位置におけるＮ、位置３０８に対応する位置におけるＲ、位置３０９に対応する位置におけるＥ、位置３０９に対応する位置におけるＧ、位置３０９に対応する位置におけるＨ、位置３０９に対応する位置におけるＬ、位置３０９に対応する位置におけるＭ、位置３０９に対応する位置におけるＮ、位置３０９に対応する位置におけるＱ、位置３０９に対応する位置におけるＲ、位置３０９に対応する位置におけるＳ、位置３０９に対応する位置におけるＴ、位置３０９に対応する位置におけるＶ、位置３１０に対応する位置におけるＡ、位置３１０に対応する位置におけるＧ、位置３１０に対応する位置におけるＱ、位置３１０に対応する位置におけるＳ、位置３１３に対応する位置におけるＡ、位置３１３に対応する位置におけるＧ、位置３１３に対応する位置におけるＨ、位置３１３に対応する位置におけるＫ、位置３１３に対応する位置におけるＰ、位置３１３に対応する位置におけるＲ、位置３１３に対応する位置におけるＴ、位置３１３に対応する位置におけるＹ
での、位置３１４に対応する位置におけるＳ、位置３１４に対応する位置におけるＹ、位置３１５に対応する位置におけるＡ、位置３１５に対応する位置におけるＨ、位置３１５に対応する位置におけるＹ、位置３１７に対応する位置におけるＡ、位置３１７に対応する位置におけるＩ、位置３１７に対応する位置におけるＫ、位置３１７に対応する位置におけるＮ、位置３１７に対応する位置におけるＱ、位置３１７に対応する位置におけるＲ、位置３１７に対応する位置におけるＳ、位置３１７に対応する位置におけるＴ、位置３１７に対応する位置におけるＷ、位置３１８に対応する位置におけるＤ、位置３１８に対応する位置におけるＨ、位置３１８に対応する位置におけるＫ、位置３１８に対応する位置におけるＭ、位置３１８に対応する位置におけるＲ、位置３２０に対応する位置におけるＨ、位置３２０に対応する位置におけるＫ、位置３２０に対応する位置におけるＲ、位置３２１に対応する位置におけるＲ、位置３２１に対応する位置におけるＳ、位置３２４に対応する位置におけるＮ、位置３２４に対応する位置におけるＲ、位置３２５に対応する位置におけるＡ、位置３２５に対応する位置におけるＤ、位置３２５に対応する位置におけるＥ、位置３２５に対応する位置におけるＧ、位置３２５に対応する位置におけるＨ、位置３２５に対応する位置におけるＫ、位置３２５に対応する位置におけるＭ、位置３２５に対応する位置におけるＮ、位置３２５に対応する位置におけるＱ、位置３２５に対応する位置におけるＳ、位置３２５に対応する位置におけるＶ、位置３２６に対応する位置におけるＬ、位置３２６に対応する位置におけるＶ、位置３２８に対応する位置におけるＣ、位置３２８に対応する位置におけるＧ、位置３２８に対応する位置におけるＩ、位置３２８に対応する位置におけるＫ、位置３２８に対応する位置におけるＬ、位置３２８に対応する位置におけるＳ、位置３２８に対応する位置におけるＹ、位置３３５に対応する位置におけるＳ、位置３４７に対応する位置におけるＡ、位置３４７に対応する位置におけるＧ、位置３４７に対応する位置におけるＳ、位置３４９に対応する位置におけるＭ、位置３４９に対応する位置におけるＲ、位置３５１に対応する位置におけるＳ、位置３５３に対応する位置におけるＶでの、位置３５６に対応する位置におけるＨ、位置３５６に対応する位置におけるＳ、位置３５９に対応する位置におけるＥ、位置３５９に対応する位置におけるＨ、位置３５９に対応する位置におけるＴ、位置３６７に対応する位置におけるＡ、位置３６７に対応する位置におけるＧ、位置３６７に対応する位置におけるＫ、位置３６７に対応する位置におけるＳ、位置３６８に対応する位置におけるＡ、位置３６８に対応する位置におけるＥ、位置３６８に対応する位置におけるＫ、アミノ酸位置３６８に対応する位置におけるＬ、アミノ酸位置３６８に対応する位置におけるＭ、位置３６８に対応する位置におけるＲ、アミノ酸位置３６８に対応する位置におけるＴ、位置３６９に対応する位置におけるＨ、位置３６９に対応する位置におけるＲ、位置３７１に対応する位置におけるＦ、位置３７１に対応する位置におけるＨ、位置３７１に対応する位置におけるＫ、位置３７１に対応する位置におけるＬ、位置３７１に対応する位置におけるＲ、位置３７１に対応する位置におけるＳ、位置３７３に対応する位置におけるＭ、位置３７４に対応する位置におけるＨ、位置３７４に対応する位置におけるＰ、位置３７５に対応する位置におけるＡ、位置３７５に対応する位置におけるＧ、位置３７５に対応する位置におけるＫ、位置３７５に対応する位置におけるＲ、位置３７６に対応する位置におけるＤ、位置３７６に対応する位置におけるＥ、位置３７６に対応する位置におけるＱ、位置３７６に対応する位置におけるＲ、位置３７６に対応する位置におけるＴ、位置３７６に対応する位置におけるＶ、位置３７６に対応する位置におけるＹ、位置３７７に対応する位置におけるＤ、位置３７７に対応する位置におけるＥ、位置３７７に対応する位置におけるＨ、位置３７７に対応する位置におけるＫ、位置３７７に対応する位置におけるＰ、位置３７７に対応する位置におけるＲ、位置３７７に対応する位置におけるＳ、位置３７７に対応する位置におけるＴ、位置３８０に対応する位置におけるＷ、位置３８０に対応する位置におけるＹ、位置３８１に対応する位置におけるＳ、位置３８３に対応する位置におけるＩ、位置３８３に対応する位置におけるＫ、位置３８３に対応する位置におけるＬ、位置３８３に対応する位置におけるＳ、位置３８５に対応する位置におけるＡ、位置３８５に対応する位置におけるＱ、位置３８５に対応する位置におけるＶ、位置３８９に対応する位置におけるＡ、位置３８９に対応する位置におけるＧ、位置３８９に対応する位置におけるＬ、位置３８９に対応する位置におけるＫ、位置３８９に対応する位置におけるＱ、位置３８９に対応する位置におけるＳ、位置３９２に対応する位置におけるＡ、位置３９２に対応する位置におけるＦ、位置３９２に対応する位置におけるＭ、位置３９２に対応する位置におけるＱ、位置３９２に対応する位置におけるＲ、位置３９２に対応する位置におけるＶ、位置３９３に対応する位置におけるＦ、位置３９３に対応する位置におけるＭ、位置３９５に対応する位置におけるＡ、位置３９５に対応する位置におけるＨ、位置３９５に対応する位置におけるＲ、位置３９６に対応する位置におけるＡ、位置３９６に対応する位置におけるＨ、位置３９６に対応する位置におけるＱ、位置３９６に対応する位置におけるＳ、位置３９９に対応する位置におけるＫ、位置３９９に対応する位置におけるＭ、位置３９９に対応する位置におけるＴ、位置３９９に対応する位置におけるＶ、位置３９９に対応する位置におけるＷ、位置４０１に対応する位置におけるＡ、位置４０１に対応する位置におけるＥ、位置４０４に対応する位置におけるＡ、位置４０５に対応する位置におけるＧ、位置４０６に対応する位置におけるＦ、位置４０６に対応する位置におけるＮ、位置４０７に対応する位置におけるＡ、位置４０７に対応する位置におけるＤ、位置４０７に対応する位置におけるＥ、位置４０７に対応する位置におけるＦ、位置４０７に対応する位置におけるＨ、位置４０７に対応する位置におけるＱ、位置４０７に対応する位置におけるＰ、位置４０９に対応する位置におけるＡ、位置４０９に対応する位置におけるＱ、位置４１０に対応する位置におけるＴ、位置４１２に対応する位置におけるＱ、位置４１２に対応する位置におけるＲ、位置４１２に対応する位置におけるＶ、位置４１６に対応する位置におけるＬ、位置４１８に対応する位置におけるＥ、位置４１８に対応する位置におけるＬ、位置４１８に対応する位置におけるＰ、位置４１８に対応する位置におけるＲ、位置４１８に対応する位置におけるＶ、位置４１９に対応する位置におけるＦ、位置４１９に対応する位置におけるＨ、位置４１９に対応する位置におけるＩ、位置４１９に対応する位置におけるＫ、位置４１９に対応する位置におけるＲ、位置４１９に対応する位置におけるＳ、位置４１９に対応する位置におけるＹ、位置４２１に対応する位置におけるＡ、位置４２１に対応する位置におけるＨ、位置４２１に対応する位置におけるＫ、位置４２１に対応する位置におけるＮ、位置４２１に対応する位置におけるＱ、位置４２１に対応する位置におけるＲ、位置４２１に対応する位置におけるＳ、位置４２５に対応する位置におけるＧ、位置４２５に対応する位置におけるＫ、位置４２７に対応する位置におけるＱ、位置４２７に対応する位置におけるＴ、位置４２８に対応する位置におけるＬ、位置４３１に対応する位置におけるＡ、位置４３１に対応する位置におけるＧ、位置４３１に対応する位置におけるＥ、位置４３１に対応する位置におけるＨ、位置４３１に対応する位置におけるＫ、位置４３１に対応する位置におけるＬ、位置４３１に対応する位置におけるＮ、位置４３１に対応する位置におけるＱ、位置４３１に対応する位置におけるＲ、位置４３１に対応する位置におけるＳ、位置４３１に対応する位置におけるＶ、位置４３３に対応する位置におけるＡ、位置４３３に対応する位置におけるＨ、位置４３３に対応する位置におけるＩ、位置４３３に対応する位置におけるＫ、位置４３３に対応する位置におけるＬ、位置４３３に対応する位置におけるＲ、位置４３３に対応する位置におけるＴ、位置４３３に対応する位置におけるＶ、位置４３３に対応する位置におけるＷ、位置４３６に対応する位置におけるＫ、位置４３７に対応する位置におけるＩ、位置４３７に対応する位置におけるＭ、位置４３８に対応する位置におけるＡ、位置４３８に対応する位置におけるＤ、位置４３８に対応する位置におけるＥ、位置４３８に対応する位置におけるＬ、位置４３８に対応する位置におけるＮ、位置４３８に対応する位置におけるＴ、位置４３９に対応する位置におけるＡ、位置４３９に対応する位置におけるＣ、位置４３９に対応する位置におけるＫ、位置４３９に対応する位置におけるＰ、位置４３９に対応する位置におけるＱ、位置４３９に対応する位置におけるＴ、位置４３９に対応する位置におけるＶ、位置４４０に対応する位置におけるＤ、位置４４０に対応する位置におけるＨ、位置４４０に対応する位置におけるＭ、位置４４０に対応する位置におけるＰ、位置４４０に対応する位置におけるＲ、位置４４０に対応する位置におけるＳ、位置４４１に対応する位置におけるＡ、位置４４１に対応する位置におけるＦ、位置４４２に対応する位置におけるＣ、位置４４２に対応する位置におけるＧ、位置４４２に対応する位置におけるＲ、位置４４３に対応する位置におけるＡ、位置４４３に対応する位置におけるＥ、位置４４３に対応する位置におけるＦ、位置４４３に対応する位置におけるＧ、位置４４３に対応する位置におけるＭ、位置４４３に対応する位置におけるＮ、位置４４４に対応する位置におけるＥ、位置４４４に対応する位置におけるＨ、位置４４４に対応する位置におけるＶ、位置４４５に対応する位置におけるＨ、位置４４５に対応する位置におけるＭ、位置４４５に対応する位置におけるＮ、位置４４５に対応する位置におけるＰ、位置４４５に対応する位置におけるＱ、位置４４５に対応する位置におけるＳ、位置４４５に対応する位置におけるＴ、位置４４５に対応する位置におけるＶ、位置４４５に対応する位置におけるＷ、位置４４６に対応する位置におけるＡ、位置４４６に対応する位置におけるＭ、位置４４６に対応する位置におけるＷ、位置４４７に対応する位置におけるＤ、位置４４７に対応する位置におけるＥ、位置４４７に対応する位置におけるＧ、位置４４７に対応する位置におけるＩ、位置４４７に対応する位置におけるＮ、位置４４７に対応する位置におけるＰ、位置４４７に対応する位置におけるＱは、位置４４７に対応する位置におけるＴでの置換、および／または位置４４７に対応する位置におけるＶでの置換の中から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含有するものがある。これらの修飾ＰＨ２０ポリペプチドの中には、特定のアミノ酸置換を含有しないＰＨ２０の活性の少なくとも４０％を示すものがある。活性は、アミノ酸置換を含有しないＰＨ２０ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の例えば、４０％〜５０００％、４０％〜２０００％、４０％〜１０００％、４０％〜５００％、４０％〜１００％、８０％〜２０００％、８０％〜６００％、８０％〜２００％、８０％〜３００％の間で変わり得る。このような活性は、アミノ酸置換を含有しないＰＨ２０ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、３０００％またはそれ以上を含み、活性は、本明細書におけるすべての例においてと同様、同一条件下で比較される。
【００２３】
特に、配列番号７に示されるＰＨ２０ポリペプチドもしくはそのＣ末端で切断された断片中、または配列番号７に示されるアミノ酸の配列もしくはその対応する切断断片に対して少なくとも９１％同一であるアミノ酸の配列を有するＰＨ２０ポリペプチド中に少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドが提供され、これでは、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、アミノ酸置換を含有しないＰＨ２０ポリペプチドの２０％未満のヒアルロニダーゼ活性を示し、活性は、同一条件下で比較され、アミノ酸置換（複数可）は、配列番号３または７に示されるアミノ酸位置に関して2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、25、27、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、94、95、96、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、143、144、145、149、150、152、153、154、155、156、157、158、159、161、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、197、198、199、200、201、202、203、204、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、331、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、408、410、411、412、413、414、415、416、417、419、420、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、434、437、438、439、440、441、442、443、444、または447の中から選択される位置に対応するアミノ酸位置にあり、対応するアミノ酸位置は、ＰＨ２０ポリペプチドの、配列番号３に示されるポリペプチドとのアラインメントによって同定され、ただし、
（ｉ）修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、位置２００、３３３、３５８または３９３に対応する位置にアミノ酸置換を含有するならば、置換は、アラニン（Ａ）での置換ではなく、
（ｉｉ）修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、位置１１１または２４９に対応する位置にアミノ酸置換を含有するならば、置換は、アスパラギン（Ｎ）での置換ではなく、
（ｉｉｉ）修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、位置１１３に対応する位置にアミノ酸置換を含有するならば、置換は、グルタミン（Ｑ）での置換ではなく、
（ｉｖ）修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、位置１７６に対応する位置にアミノ酸置換を含有するならば、置換は、グリシン（Ｇ）での置換ではなく、
（ｖ）修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、位置２５２に対応する位置にアミノ酸置換を含有するならば、置換は、トレオニン（Ｔ）での置換ではない。
【００２４】
このような修飾ＰＨ２０ポリペプチドの例示的なものとして、配列番号３、７、３２〜６６、６９もしくは７２のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有するＰＨ２０ポリペプチド中に、または配列番号３、７、３２〜６６、６９もしくは７２のいずれかに対して少なくとも９１％の配列同一性を示すアミノ酸の配列中にアミノ酸置換（複数可）を含有するいずれかがある。例えば、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号３、７、３２〜６６、６９または７２中にアミノ酸置換（複数可）を含有する。配列番号７のＣ末端で切断された断片であるポリペプチドまたは配列番号７に示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも９１％同一であるアミノ酸の配列を有するＰＨ２０ポリペプチドである。本明細書において提供されたこのような修飾ＰＨ２０ポリペプチドの例では、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、修飾を含まないＰＨ２０と同様または同一の活性を示し得るか、または活性の増大もしくはアミノ酸置換を含有しないＰＨ２０ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％未満もしくはそれ以下である活性を示し得る。このような修飾ＰＨ２０ポリペプチドの例示的なものとして、表５に示されるいずれかがある。
【００２５】
本明細書および上記において提供されたありとあらゆる修飾ＰＨ２０ポリペプチドの中では、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号３、６〜６６、６９〜７２、８５６〜８６１、８６９または８７０のいずれかに示されるアミノ酸の配列からならないものがある。特に、本明細書において上記で、または本明細書において他の場所に提供された任意の修飾ＰＨ２０ポリペプチドの中に、配列番号３、７、６９または７２のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有するＰＨ２０ポリペプチド中にアミノ酸置換（複数可）を含有するいずれかのものがあり、ただし、（ｉ）修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、単一のアミノ酸置換のみを含む場合には、置換は、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、アミノ酸置換Ｖ１２Ａ、Ｎ４７Ａ、Ｄ１１１Ｎ、Ｅ１１３Ｑ、Ｎ１３１Ａ、Ｒ１７６Ｇ、Ｎ２００Ａ、Ｎ２１９Ａ、Ｅ２４９Ｑ、Ｒ２５２Ｔ、Ｎ３３３ＡまたはＮ３５８Ａに対応せず、（ｉｉ）修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、２つのアミノ酸置換のみを含む場合には、置換は、配列番号３に示される位置に関して、アミノ酸置換Ｐ１３Ａ／Ｌ４６４Ｗ、Ｎ４７Ａ／Ｎ１３１Ａ、Ｎ４７Ａ／Ｎ２１９Ａ、Ｎ１３１Ａ／Ｎ２１９ＡまたはＮ３３３Ａ／Ｎ３５８Ａに対応せず、（ｉｉｉ）修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、３つのアミノ酸置換のみを含む場合には、置換は、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、アミノ酸置換Ｎ４７Ａ／Ｎ１３１Ａ／Ｎ２１９Ａに対応しない。
【００２６】
上記の修飾ＰＨ２０ポリペプチドのいずれかも、および本明細書において提供された、上記の、以下のいずれも、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、またはそれ以上のアミノ酸置換を含有し得る。修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、天然配列または異種配列または修飾配列を含めたシグナル配列を含む場合もあり、また、シグナル配列を欠く成熟ＰＨ２０ポリペプチドも含む。
【００２７】
本明細書において上記で提供されたまたは以下に記載された修飾ＰＨ２０ポリペプチドのいずれかの中に、配列番号３に示されるアミノ酸の配列に対して比較される位置に関して、配列番号７３〜８５５のいずれかに示されたアミノ酸の配列または配列番号７３〜８５５のいずれかに示されたアミノ酸の配列に対して少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を示し、上記でもしくは本明細書において他の場所で記載されるいずれかなどの少なくとも１つのアミノ酸置換を含有するアミノ酸の配列を含有するか、または有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドがある。本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドの例のいずれでも、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号８〜３１、６９〜７２、８５６〜８６１、８６９または８７０のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有さないか、または含有しない。
【００２８】
本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、実質的に精製または単離され得、中性ｐＨで触媒活性を示し得、発現時に細胞から分泌され得、上清中に可溶性であり、および／またはグリコシル化、シアル化（ｓｉａｌａｔｉｏｎ）、アルブミン化（ａｌｂｕｍｉｎａｔｉｏｎ）、ファルニシル化（ｆａｒｎｙｓｙｌａｔｉｏｎ）、カルボキシル化、水酸化、ペグ化などのポリマーとのコンジュゲーションまたはデキストランとのコンジュゲーション、多量体化ドメイン、毒素、検出可能な標識もしくは薬物などの別の部分とのコンジュゲーションおよびリン酸化の中から選択される修飾などの修飾アミノ酸を含み得る。修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、少なくとも３個のアスパラギン（Ｎ）残基の各々と連結している少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミン部分を含有することなどによってグリコシル化され得、これでは、例えば、３個のアスパラギン残基は、配列番号３のアミノ酸残基２００、３３３および３５８に相当する。多量体化ドメインは、Ｆｃドメインを含む。
【００２９】
また、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子も提供される。核酸分子を含有する真核生物および原核生物のベクターが提供される。ベクターは、発現ベクターを含み、ウイルスベクターを含めた哺乳類ベクターを含む。ウイルスベクターとして、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスベクターおよびその他のこのようなウイルスベクターが挙げられる。腫瘍に蓄積するか、または腫瘍にターゲッティングされる腫瘍退縮性ベクターが注目される。また、核酸分子を含有する細胞およびベクターを含有する細胞が提供される。細胞は、原核生物のものであっても、真核生物のものであっても、特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞であってもよい。
【００３０】
また、提供された細胞のいずれかによって産生される修飾ＰＨ２０ポリペプチドが本明細書において提供される。したがって、本明細書において提供された細胞のいずれかを、コードされる修飾ＰＨ２０ポリペプチドが細胞によって産生または分泌される条件下で培養することおよび発現されたポリペプチドを回収することによって修飾ＰＨ２０ポリペプチドを産生する方法が、本明細書において提供される。また、本明細書において提供された核酸のいずれかまたは本明細書において提供されたベクターのいずれかを、Ｎ結合型糖部分をポリペプチドに導入できる細胞に導入することおよびコードされた修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、細胞によって産生および分泌される条件下で細胞を培養することおよび発現されたポリペプチドを回収することによって修飾ＰＨ２０ポリペプチドを産生する方法が、本明細書において提供される。このような例では、核酸は、プロモーターと作動可能に連結している。培養される細胞は、哺乳類細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの真核細胞であり得る。
【００３１】
また、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドのいずれかまたは本明細書において提供された核酸またはベクターのいずれかを含有する医薬組成物が提供される。組成物は、その他の薬剤とともに、および／または保存料などのその他の成分とともに製剤され得る。組成物は、成分、特に、ＰＨ２０および任意のその他の活性薬剤が、予め選択された条件下で活性のままであるか、または安定であるように製剤され得る。さらに、本明細書において記載されたように、ＰＨ２０ポリペプチドは、種々の条件下で増大した安定性を示すように修飾される。例えば、修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、両端を含めて２℃〜８℃または約２℃〜８℃の温度で、少なくとも１カ月間安定である（すなわち、本明細書において記載されるような活性を保持する）か、または両端を含めて３０℃〜４２℃または約３０℃〜４２℃の温度で少なくとも３日間安定である組成物が提供される。組成物中の修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、両端を含めて２℃〜８℃または約２℃〜８℃の温度で、少なくとも２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、少なくとも８カ月、少なくとも９カ月、少なくとも１０カ月、少なくとも１１カ月、少なくとも１２カ月、１３カ月、１４カ月、１５カ月、１６カ月、１７カ月、１８カ月、１９カ月、２０カ月、２１カ月、２２カ月、２３カ月、２４カ月、２５カ月、２６カ月、２７カ月、２８カ月、２９カ月または３０カ月間安定である組成物が提供される。また、組成物中の修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、両端を含めて３０℃〜４２℃または約３０℃〜４２℃の温度で少なくとも３日、少なくとも４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、６０日間またはそれ以上安定である組成物が提供される。医薬組成物は、医薬上許容される賦形剤を含有し得る。
【００３２】
条件、製剤、成分および修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、所望の安定性を達成するために選択される。医薬組成物は、直接投与のために製剤され得、希釈を必要とし得る。それらは、複数回または単回投与量投与用に製剤され得る。例示的組成物は、０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬまたは１０Ｕ／ｍＬ〜５０００Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬ〜４０００Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬ〜２０００Ｕ／ｍＬ、３００Ｕ／ｍＬ〜２０００Ｕ／ｍＬ、６００Ｕ／ｍＬ〜２０００Ｕ／ｍＬもしくは１００Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬの間または約０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬまたは１０Ｕ／ｍＬ〜５０００Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬ〜４０００Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬ〜２０００Ｕ／ｍＬ、３００Ｕ／ｍＬ〜２０００Ｕ／ｍＬ、６００Ｕ／ｍＬ〜２０００Ｕ／ｍＬもしくは１００Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬの間の修飾ＰＨ２０の濃度を含む。例示的塩として、２００ｍＭ、１８０ｍＭ、１５０ｍＭ、１４０ｍＭ、１３０ｍＭ、１２０ｍＭ、１１０ｍＭ、１００ｍＭ、９０ｍＭ、８０ｍＭ、７０ｍＭ、６０ｍＭ、５０ｍＭ、４０ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ未満または約２００ｍＭ、１８０ｍＭ、１５０ｍＭ、１４０ｍＭ、１３０ｍＭ、１２０ｍＭ、１１０ｍＭ、１００ｍＭ、９０ｍＭ、８０ｍＭ、７０ｍＭ、６０ｍＭ、５０ｍＭ、４０ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭまたは２００ｍＭ、１８０ｍＭ、１５０ｍＭ、１４０ｍＭ、１３０ｍＭ、１２０ｍＭ、１１０ｍＭ、１００ｍＭ、９０ｍＭ、８０ｍＭ、７０ｍＭ、６０ｍＭ、５０ｍＭ、４０ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭもしくはそれ以下、または０．１ｍＭ〜２００ｍＭ、０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、１２０ｍＭ〜２００ｍＭ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ、１０ｍＭ〜９０ｍＭ、８０ｍＭ〜２００ｍＭ、８０ｍＭ〜１４０ｍＭ、５０ｍＭ〜１００ｍＭ、８０ｍＭ〜１００ｍＭ、５０ｍＭ〜８０ｍＭ、１００ｍＭ〜１４０ｍＭもしくは１２０ｍＭ〜１４０ｍＭの間または約０．１ｍＭ〜２００ｍＭ、０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、１２０ｍＭ〜２００ｍＭ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ、１０ｍＭ〜９０ｍＭ、８０ｍＭ〜２００ｍＭ、８０ｍＭ〜１４０ｍＭ、５０ｍＭ〜１００ｍＭ、８０ｍＭ〜１００ｍＭ、５０ｍＭ〜８０ｍＭ、１００ｍＭ〜１４０ｍＭもしくは１２０ｍＭ〜１４０ｍＭの間の濃度のＮａＣｌが挙げられる。
【００３３】
医薬組成物は、それだけには限らないが、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、ベンジルアルコール、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、４−クロロ−１−ブタノール、クロルヘキシジン二塩酸塩、クロルヘキシジンジグルコン酸塩、Ｌ−フェニルアラニン、ＥＤＴＡ、ブロノポール、酢酸フェニル水銀、グリセロール、イミドウレア（ｉｍｉｄｕｒｅａ）、クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、セトリミド、塩化ベンゼトニウム、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンおよびそれらの任意の組合せなどの抗菌的に有効な量のフェノール系防腐剤（複数可）、非フェノール系防腐剤（複数可）またはフェノール系防腐剤（複数可）および非フェノール系防腐剤（複数可）の１、２、３、４種またはそれ以上などの防腐剤または防腐剤の混合物を含有し得る。フェノールとして、例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのフェノール、メタクレゾール（ｍ−クレゾール）、ベンジルアルコールおよびパラベンが挙げられる。１種または複数種の防腐剤の抗菌上有効な濃度（質量濃度（ｗ／ｖ）のパーセンテージ（％）として）は、両端を含めて、０．０５％〜０．６％、０．１％〜０．４％、０．１％〜０．３％、０．１５％〜０．３２５％、０．１５％〜０．２５％、０．１％〜０．２％、０．２％〜０．３％または０．３％〜０．４％の間であり得る。その例として、防腐剤が、フェノール、ｍ−クレゾールまたはフェノールおよびｍ−クレゾールである医薬組成物があり、製剤中の質量濃度（ｗ／ｖ）の％としての量は、０．１％〜０．２５％もしくは約０．１％〜０．２５％の間のフェノールおよび０．０５％〜０．２％もしくは約０．０５％〜０．２％の間のｍ−クレゾールであり、０．１０％〜０．２％もしくは約０．１０％〜０．２％の間のフェノールおよび０．６％〜０１．８％もしくは約０．６％〜０１．８％の間のｍ−クレゾール、０．１％〜０．１５％もしくは約０．１％〜０．１５％の間のフェノールおよび０．８％〜０．１５％のｍ−クレゾールであり、０．１０％〜０．１５％もしくは約０．１０％〜０．１５％の間のフェノールおよび０．０６〜０．０９％もしくは約０．０６〜０．０９％の間のｍ−クレゾールであるか、または０．１２％〜０．１８％もしくは約０．１２％〜０．１８％の間のフェノールおよび０．１４〜０．２２％もしくは約０．１４〜０．２２％の間のｍ−クレゾールである。
【００３４】
医薬組成物は、治療上活性な薬剤をさらに含有し得る。活性薬剤は、組成物に製剤され得るか、またはＰＨ２０含有組成物との組合せであるが、別個に、逐次、断続的に、同時にまたは一緒に投与するための別個の組成物として提供される場合もある。治療上活性な薬剤として、例えば、化学療法薬、鎮痛剤、抗炎症剤、抗菌剤、殺アメーバ剤、殺トリコモナス剤（ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｃｉｄａｌ  ａｇｅｎｔ）、抗パーキンソン病薬、抗マラリア薬、抗痙攣薬、抗うつ薬および抗関節炎薬、抗真菌剤、抗高血圧薬、解熱剤、抗寄生虫剤、抗ヒスタミン剤、α−アドレナリン作動性アゴニスト剤、α遮断薬、麻酔剤、気管支拡張剤、殺生物剤、殺菌剤、静菌剤、βアドレナリン遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、心血管治療薬、避妊薬、鬱血除去薬、利尿薬、降下薬、診断薬、電解質剤、催眠薬、ホルモン剤、高血糖薬、筋弛緩薬、筋肉収縮薬、眼部薬、副交感神経作動薬、精神賦活剤、鎮静剤、交感神経作用薬、トランキライザー薬、泌尿器薬、膣薬、抗ウイルス剤、ビタミン剤、非ステロイド系抗炎症薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤の中から選択される薬剤、ポリペプチド、タンパク質、核酸、薬物、有機分子および睡眠誘導物質が挙げられる。このような薬剤の例示的なものとして、抗体、特に、モノクローナル抗体、免疫グロブリン調製物、ビスホスホネート、サイトカイン、化学療法薬、血液凝固因子およびインスリンがある。インスリンとして、例えば、基礎インスリンおよびレギュラーインスリンなどの速効型インスリン、特に、組換えヒトインスリンおよびインスリンリスプロ、インスリンアスパルトまたはインスリングルリジンなどのインスリン類似体が挙げられる。特定の速効型インスリンとして、配列番号８６２に示されるアミノ酸の配列を有するＡ鎖および配列番号８６３に示されるアミノ酸の配列を有するＢ鎖を有するものまたは配列番号８６４のアミノ酸残基位置８８〜１０８として示されるアミノ酸の配列を有するＡ鎖および配列番号８６４のアミノ酸残基位置２５〜５４として示されるアミノ酸の配列を有するＢ鎖を有するインスリンまたは配列番号８６２に示されるアミノ酸の配列を有するＡ鎖および配列番号８６５〜８６７のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有するＢ鎖を有するインスリンの中から選択されるインスリン類似体がある。組成物中の速効型インスリンの量は、経験的に決定され得るが、通常、両端を含めて、１０Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬ〜５００Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬまたは５００Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬであり得る。
【００３５】
特定の例では、フェノール系防腐剤に対して増大した安定性を示す本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドのいずれかおよび速効型インスリンなどのインスリンを含有する医薬組成物が本明細書において提供される。修飾ＰＨ２０ポリペプチドおよびインスリンは、治療上有効な量で提供され得る。例えば、フェノール系防腐剤に対して増大した安定性を示す本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドのいずれかを、１００Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬまたは約１００Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬである量で、および速効型インスリンを１０Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬまたは約１０Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬである量で含有する医薬組成物が、本明細書において提供される。例えば、速効型インスリンは、インスリンリスプロ、インスリンアスパルトまたはインスリングルリジンなどのインスリン類似体またはその他の類似体であり得る。このような医薬組成物のいずれも、７．０〜７．６または約７．０〜７．６であるｐＨで製剤され得る。このような医薬組成物のいずれも、０．１ｍＭ〜２００ｍＭまたは約０．１ｍＭ〜２００ｍＭである濃度のＮａＣｌなどの塩および／または抗菌上有効な量の少なくとも１種の防腐剤を含有するよう製剤され得、これでは、組成物は、一般に、少なくとも１種のフェノール系防腐剤を含有する。抗菌上有効な量は、０．０５％〜０．６％であるか、またはその間である質量濃度（ｗ／ｖ）のパーセンテージ（％）としての１種または複数種の防腐剤の総量である。フェノール系防腐剤（複数可）は、フェノール、メタクレゾール（ｍ−クレゾール）、ベンジルアルコールまたはパラベンであり得る。医薬組成物の上記の例のいずれにおいても、組成物はまた、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、ソルビトール、ポロキサマーまたはポリソルベートなどの界面活性物質を、少なくとも０．００１％または少なくとも約０．００１％である製剤中の質量濃度（ｗ／ｖ）の％としての量で；Ｔｒｉｓ、ヒスチジン、リン酸塩またはクエン酸塩などの非金属性結合剤であるか、または金属性結合剤である緩衝剤を含有し得、緩衝剤の濃度は、１ｍＭ〜１００ｍＭまたは約１ｍＭ〜１００ｍＭの間であり；６０ｍＭ未満の濃度のグリセリン；両端を含めて、２ｍＭ〜５０ｍＭまたは約２ｍＭ〜５０ｍＭの間の濃度のシステイン、トリプトファンまたはメチオニンなどの抗酸化薬および／またはインスリン１００単位あたり０．００１〜０．１ｍｇまたは約０．００１〜０．１ｍｇの間の濃度（ｍｇ／１００Ｕ）の亜鉛を含有し得る。また、閉ループシステム、医薬組成物のいずれかを含有する連続皮下注入インスリン（ＣＳＩＩ）ポンプを含めたインスリンポンプおよびインスリンペンが本明細書において提供される。医薬組成物は、１型真性糖尿病、２型真性糖尿病または妊娠糖尿病などの糖尿病を治療するための方法または使用において使用され得る。
【００３６】
本明細書において提供された医薬組成物のいずれか中のその他の治療薬として、それだけには限らないがアダリムマブ、アガルシダーゼベータ、アレファセプト、アンピシリン、アナキンラ、抗ポリオワクチン、抗胸腺細胞、アジスロマイシン、ベカプレルミン、カスポファンギン、セファゾリン、セフェピム、セフォテタン、セフタジジム、セフトリアキソン、セツキシマブ、シラスタチン、クラブラン酸、クリンダマイシン、ダルベポエチンアルファ、ダクリズマブ、ジフテリア、ジフテリア抗毒素、ジフテリアトキソイド、エファリズマブ、エピネフリン、エリスロポエチンアルファ、エタネルセプト、フィルグラスチム、フルコナゾール、卵胞刺激ホルモン、フォリトロピンアルファ、フォリトロピンベータ、ホスフェニトイン、ガドジアミド、ガドペンテト酸、ガチフロキサシン、グラチラマー、ＧＭ−ＣＳＦ、ゴセレリン、酢酸ゴセレリン、グラニセトロン、ヘモフィルスインフルエンザｂ菌、ハロペリドール、肝炎ワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、イブリツモマブチウキセタン、イブリツモマブ、チウキセタン、免疫グロブリン、インフルエンザワクチン、インフルエンザウイルスワクチン、インフリキシマブ、インスリンリスプロ、７５％中性プロタミンリスプロ（ＮＰＬ）／２５％インスリンリスプロ、５０％中性プロタミンハーゲドルン（ＮＰＨ）／５０％レギュラーインスリン、７０％ＮＰＨ／３０％レギュラーインスリン、レギュラーインスリン、ＮＰＨインスリン、ウルトラインスリン、ウルトラレンテインスリンおよびインスリングラルギン、インターフェロン、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ２−ｂ、インターフェロンアルファコン、インターフェロンアルファ−ｎ、インターフェロンベータ、インターフェロンベータ−１ａ、インターフェロンガンマ、インターフェロンアルファ−コン、イオジキサノール、イオヘキソール、イオパミドール、イオベルソール、ケトロラク、ラロニダーゼ、レボフロキサシン、リドカイン、リネゾリド、ロラゼパム、麻疹ワクチン、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹−ムンプス−風疹ウイルスワクチン、風疹ワクチン、メドロキシプロゲステロン、メロペネム、メチルプレドニゾロン、ミダゾラム、モルヒネ、オクトレオチド、オマリズマブ、オンダンセトロン、パリビズマブ、パントプラゾール、ペグアスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペグ−インターフェロンアルファ−２ａ、ペグ−インターフェロンアルファ−２ｂ、ペグビソマント、百日咳ワクチン、ピペラシリン、肺炎球菌ワクチンおよび肺炎球菌コンジュゲートワクチン、プロメタジン、レテプラーゼ、ソマトロピン、スルバクタム、スマトリプタン、タゾバクタム、テネクテプラーゼ、テタヌス精製毒素、チカルシリン、トシツモマブ、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンヘキサアセトニド、バンコマイシン、水痘帯状疱疹免疫グロブリン、水痘ワクチン、その他のワクチン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、ヒ素、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン、ＢＣＧ生、ベキサロテン、ブレオマイシン、ブスルファン、静脈内ブスルファン、経口ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、ポリフェプロサンを伴うカルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、シタラビンリポソーマル、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンリポソーマル、ダウノルビシン、ダウノマイシン、デニロイキンジフチトクス、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシンリポソーマル、プロピオン酸ドロモスタノロン、エリオットＢ溶液、エピルビシン、エポエチンアルファ、エストラムスチン、エトポシド、リン酸エトポシド、エトポシドＶＰ−１６、エキセメスタン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、フルベストラント、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミソール、ロムスチン、ＣＣＮＵ、メクロレタミン、ナイトロジェンマスタード、メゲストロール、酢酸メゲストロール、メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、マイトマイシン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ナンドロロンフェンプロピオネート（Ｎａｎｄｒｏｌｏｎｅ  Ｐｈｅｎｐｒｏｐｉｏｎａｔｅｓ）、ノフェツモマブ（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂｓ）、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ミトラマイシン、ポルフィマー、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タルク、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、６−チオグアニン、トリエチレンチオホスホラミド（チオテパ）、トポテカン、トレミフェン、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ゾレドロネート、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、レチノイン酸、アリトレチノイン、９−シス−レチノイン酸、アルボシジブ、アンバゾン、アンボマイシン（Ａｍｂｏｍｙｃｉｎｓ）、アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナキシロン（Ａｎａｘｉｒｏｎｅｓ）、アンシタビン、アントラマイシン、アパジコン、アルギメスナ（Ａｒｇｉｍｅｓｎａｓ）、アスペルリン（Ａｓｐｅｒｌｉｎｓ）、アトリムスチン（Ａｔｒｉｍｕｓｔｉｎｅｓ）、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン（Ａｚｏｔｏｍｙｃｉｎｓ）、バノキサントロン（Ｂａｎｏｘａｎｔｒｏｎｅｓ）、バタブリン（Ｂａｔａｂｕｌｉｎｓ）、バチマスタット、ベナキシビン（Ｂｅｎａｘｉｂｉｎｅｓ）、ベンダムスチン、ベンゾデパ（Ｂｅｎｚｏｄｅｐａｓ）、ビカルタミド、ビエタセルピン、ビリコダール���Ｂｉｒｉｃｏｄａｒｓ）、ビサントレン、ビスナフィドジメシレート、ビゼレシン、ボルテゾミブ、ブレキナル、ブロピリミン、ブドチタン（Ｂｕｄｏｔｉｔａｎｅｓ）、カクチノマイシン（Ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎｓ）、カネルチニブ、カラセミド（Ｃａｒａｃｅｍｉｄｅｓ）、カルベチマー（Ｃａｒｂｅｔｉｍｅｒｓ）、カルボコン、カルモフール、カルビシン、カルゼレシン（Ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎｓ）、セデフィンゴール（Ｃｅｄｅｆｉｎｇｏｌｓ）、セマドチン、クロラムブシル、シオテロネル（Ｃｉｏｔｅｒｏｎｅｌｓ）、シロレマイシン（Ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎｓ）、クランフェヌル（Ｃｌａｎｆｅｎｕｒｓ）、クロファラビン、クリスナトール（Ｃｒｉｓｎａｔｏｌｓ）デシタビン、デクスニグルジピン（Ｄｅｘｎｉｇｕｌｄｉｐｉｎｅｓ）、デキソルマプラチン（Ｄｅｘｏｒｍａｐｌａｔｉｎｓ）、デザグアニン（Ｄｅｚａｇｕａｎｉｎｅｓ）、ジアジキオン（Ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅｓ）、ジブロスピジウム（Ｄｉｂｒｏｓｐｉｄｉｕｍｓ）、ジエノゲスト、ジナリン（Ｄｉｎａｌｉｎｓ）、ジセルモリド（Ｄｉｓｅｒｍｏｌｉｄｅｓ）、ドフェキダル（Ｄｏｆｅｑｕｉｄａｒｓ）、ドキシフルリジン、ドロロキシフェン、デュアゾマイシン、エコムスチン（Ｅｃｏｍｕｓｔｉｎｅｓ）、エダトレキサート、エドテカリン（Ｅｄｏｔｅｃａｒｉｎｓ）、エフロルニチン（Ｅｆｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅｓ）、エラクリダール（Ｅｌａｃｒｉｄａｒｓ）、エリナフィド（Ｅｌｉｎａｆｉｄｅｓ）、エルサミトルシン（Ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎｓ）、エミテフール（Ｅｍｉｔｅｆｕｒｓ）、エンロプラチン（Ｅｎｌｏｐｌａｔｉｎｓ）、エンプロメート（Ｅｎｐｒｏｍａｔｅｓ）、エンザスタウリン、エピプロピジン（Ｅｐｉｐｒｏｐｉｄｉｎｅｓ）、エプタロプロスト（Ｅｐｔａｌｏｐｒｏｓｔｓ）、エルブロゾール（Ｅｒｂｕｌｏｚｏｌｅｓ）、エソルビシン（Ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎｓ）、エタニダゾール、エトグルシド、エトプリン、エクシスリンド、ファドロゾール、ファザラビン（Ｆａｚａｒａｂｉｎｅｓ）、フェンレチニド、フルオキシメステロン、フルオロシタビン（Ｆｌｕｒｏｃｉｔａｂｉｎｅｓ）、フォスキドン（Ｆｏｓｑｕｉｄｏｎｅｓ）、フォストリエシン、ホトレタミン（Ｆｏｔｒｅｔａｍｉｎｅｓ）、ガラルビシン（Ｇａｌａｒｕｂｉｃｉｎｓ）、ガロシタビン（Ｇａｌｏｃｉｔａｂｉｎｅｓ）、ゲロキノール（Ｇｅｒｏｑｕｉｎｏｌｓ）、ギマテカン（Ｇｉｍａｔｅｃａｎｓ）、ギメラシル、グロキサゾン（Ｇｌｏｘａｚｏｎｅｓ）、グルフォスファミド（Ｇｌｕｆｏｓｆａｍｉｄｅｓ）、イルモホシン（Ｉｌｍｏｆｏｓｉｎｅｓ）、イロマスタット、イメキソン（Ｉｍｅｘｏｎｓ）、インプロスルファン、インジスラム、インプロクオン、インターロイキン、インターロイキン−２ｓ、組換えインターロイキン、イントプリシン（Ｉｎｔｏｐｌｉｃｉｎｅｓ）、ヨーベングアン（Ｉｏｂｅｎｇｕａｎｅｓ）、イプロプラチン（Ｉｐｒｏｐｌａｔｉｎｓ）、イルソグラジン、イクサベピロン、ケトトレキサート（Ｋｅｔｏｔｒｅｘａｔｅｓ）、Ｌ−アラノシン、ランレオチド、ラパチニブ、レドキサントロン（Ｌｅｄｏｘａｎｔｒｏｎｅｓ）、リュープロリド、リュープロレリン、レ���サカルシトール（Ｌｅｘａｃａｌｃｉｔｏｌｓ）、リアロゾール（Ｌｉａｒｏｚｏｌｅｓ）、ロバプラチン（Ｌｏｂａｐｌａｔｉｎｓ）、ロメトレキソール（Ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌｓ）、ロナファーニブ、ロソキサントロン（Ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅｓ）、ルルトテカン（Ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎｓ）、マホスファミド、マンノスルファン、マリマスタット、マソプロコール、マイタンシン、メクロレタミン、メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メピチオスタン、メテシンド（Ｍｅｔｅｓｉｎｄｓ）、メトミデート（Ｍｅｔｏｍｉｄａｔｅｓ）、メトプリン（Ｍｅｔｏｐｒｉｎｅｓ）、メツレデパ（Ｍｅｔｕｒｅｄｅｐａｓ）、ミボプラチン（Ｍｉｂｏｐｌａｔｉｎｓ）、ミプロキシフェン（Ｍｉｐｒｏｘｉｆｅｎｅｓ）、ミソニダゾール、ミチンドミド（Ｍｉｔｉｎｄｏｍｉｄｅｓ）、ミトカルシン（Ｍｉｔｏｃａｒｃｉｎｓ）、ミトクロミン（Ｍｉｔｏｃｒｏｍｉｎｓ）、ミトフラキソン（Ｍｉｔｏｆｌａｘｏｎｅｓ）、ミトギリン（Ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎｓ）、ミトグアゾン、ミトマルシン（Ｍｉｔｏｍａｌｃｉｎｓ）、ミトナフィド（Ｍｉｔｏｎａｆｉｄｅｓ）、ミトキドン（Ｍｉｔｏｑｕｉｄｏｎｅｓ）、ミトスペル（Ｍｉｔｏｓｐｅｒｓ）、ミトゾロミド（Ｍｉｔｏｚｏｌｏｍｉｄｅｓ）、ミボブリン（Ｍｉｖｏｂｕｌｉｎｓ）、ミゾリビン、モファロテン（Ｍｏｆａｒｏｔｅｎｅｓ）、モピダモール、ムブリチニブ（Ｍｕｂｒｉｔｉｎｉｂｓ）、ミコフェノール酸、ネダプラチン、ネイザラビン（Ｎｅｉｚａｒａｂｉｎｅｓ）、ネモルビシン（Ｎｅｍｏｒｕｂｉｃｉｎｓ）、ニトラクリン、ノコダゾール、ノガラマイシン、ノラトレキセド（Ｎｏｌａｔｒｅｘｅｄｓ）、ノルトピキサントロン（Ｎｏｒｔｏｐｉｘａｎｔｒｏｎｅｓ）、オルマプラチン（Ｏｒｍａｐｌａｔｉｎｓ）、オルタタキセル（Ｏｒｔａｔａｘｅｌｓ）、オテラシル、オキシスラン（Ｏｘｉｓｕｒａｎｓ）、オキソフェナルシン（Ｏｘｏｐｈｅｎａｒｓｉｎｅｓ）、パツピロン（Ｐａｔｕｐｉｌｏｎｅｓ）、ペルデシン（Ｐｅｌｄｅｓｉｎｅｓ）、ペリオマイシン（Ｐｅｌｉｏｍｙｃｉｎｓ）、ペリトレキソール（Ｐｅｌｉｔｒｅｘｏｌｓ）、ペメトレキセド（Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄｓ）、ペンタムスチン（Ｐｅｎｔａｍｕｓｔｉｎｅｓ）、ペプロマイシン、ペルホスファミド（Ｐｅｒｆｏｓｆａｍｉｄｅｓ）、ペリフォシン、ピコプラチン、ピナフィド（Ｐｉｎａｆｉｄｅ
ｓ）、ピポスルファン（Ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎｓ）、ピルフェニドン、ピロキサントロン（Ｐｉｒｏｘａｎｔｒｏｎｅｓ）、ピクサントロン、プレビトレキセド（Ｐｌｅｖｉｔｒｅｘｅｄｓ）、プロメスタン（Ｐｌｏｍｅｓｔａｎｅｓ）、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロパミジン、プロスピジウム、プミテパ（Ｐｕｍｉｔｅｐａｓ）、ピューロマイシン、ピラゾフリン（Ｐｙｒａｚｏｆｕｒｉｎｓ）、ラニムスチン、リボプリン（Ｒｉｂｏｐｒｉｎｅｓ）、リトロスルファン（Ｒｉｔｒｏｓｕｌｆａｎｓ）、ログレチミド（Ｒｏｇｌｅｔｉｍｉｄｅｓ）、ロキニメックス、ルフォクロモマイシン（Ｒｕｆｏｃｒｏｍｏｍｙｃｉｎｓ）、サバルビシン（Ｓａｂａｒｕｂｉｃｉｎｓ）、サフィンゴール、サトラプラチン、セブリプラチン（Ｓｅｂｒｉｐｌａｔｉｎｓ）、セムスチン、シムトラゼン（Ｓｉｍｔｒａｚｅｎｅｓ）、シゾフィラン、ソブゾキサン、ソラフェニブ、スパルフォセート（Ｓｐａｒｆｏｓａｔｅｓ）、スパルフォス酸（Ｓｐａｒｆｏｓｉｃ  Ａｃｉｄｓ）、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、スクアラミン、ストレプトニグリン、ストレプトバリシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｖａｒｙｃｉｎｓ）、スホスファミド（ｓｕｆｏｓｆａｍｉｄｅｓ）、スロフェヌル（Ｓｕｌｏｆｅｎｕｒｓ）、タセジナリン（Ｔａｃｅｄｉｎａｌｉｎｅｓ）、タリソマイシン（Ｔａｌｉｓｏｍｙｃｉｎｓ）、タリムスチン（Ｔａｌｌｉｍｕｓｔｉｎｅｓ）、タリキダル（Ｔａｒｉｑｕｉｄａｒｓ）、タウロムスチン（Ｔａｕｒｏｍｕｓｔｉｎｅｓ）、テコガラン（Ｔｅｃｏｇａｌａｎｓ）、テガフール、テロキサントロン（Ｔｅｌｏｘａｎｔｒｏｎｅｓ）、テモポルフィン、テロキシロン（Ｔｅｒｏｘｉｒｏｎｅｓ）チアミプリン（Ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅｓ）、チアミプリン（Ｔｉａｍｉｐｒｉｎｅｓ）、チアゾフリン、チロミソール（Ｔｉｌｏｍｉｓｏｌｅｓ）、チロロン、チムコダル（Ｔｉｍｃｏｄａｒｓ）、チモナシック（Ｔｉｍｏｎａｃｉｃｓ）、チラパザミン、トピクサントロン、トラベクテジン、エクチナサイジン７４３、トレストロン（Ｔｒｅｓｔｏｌｏｎｅｓ）、トリシリビン（Ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅｓ）、トリロスタン、トリメトレキサート、トリプラチンテトラニトレート（Ｔｒｉｐｌａｔｉｎ  Ｔｅｔｒａｎｉｔｒａｔｅｓ）トリプトレリン、トロホスファミド、ツブロゾール（Ｔｕｂｕｌｏｚｏｌｅｓ）、ウベニメクス、ウレデパ（Ｕｒｅｄｅｐａｓ）、バルスポダール（Ｖａｌｓｐｏｄａｒｓ）、バプレオチド（Ｖａｐｒｅｏｔｉｄｅｓ）、ベルテポルフィン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンピジン（Ｖｉｎｅｐｉｄｉｎｅｓ）、ビンフルニン、ビンホルミド（Ｖｉｎｆｏｒｍｉｄｅｓ）、ビングリシネート（Ｖｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅｓ）、ビンロイシノール（Ｖｉｎｌｅｕｃｉｎｏｌｓ）、ビンロイロシン（Ｖｉｎｌｅｕｒｏｓｉｎｅｓ）、ビンロシジン（Ｖｉｎｒｏｓｉｄｉｎｅｓ）、ビントリプトール（Ｖｉｎｔｒｉｐｔｏｌｓ）、ビンゾリジン（Ｖｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅｓ）、ボロゾール、キサントマイシンＡ（Ｘａｎｔｈｏｍｙｃｉｎ  Ａ）、グアメシクリン（Ｇｕａｍｅｃｙｃｌｉｎｅｓ）、ゼニプラチン（Ｚｅｎｉｐｌａｔｉｎｓ）、ジラスコルブ（Ｚｉｌａｓｃｏｒｂｓ）［２−Ｈ］、ジノスタチン、ゾルビシン、ゾスキダル（Ｚｏｓｕｑｕｉｄａｒｓ）、アセタゾラミド、アシクロビル、アジピオドン、アラトロフロキサシン（Ａｌａｔｒｏｆｌｏｘａｃｉｎｓ）、アルフェンタニル、アレルゲン性抽出物、アルファ１−プロテイナーゼ阻害剤、アルプロスタジル、アミカシン、アミノ酸、アミノカプロン酸、アミノフィリン、アミトリプチリン、アモバルビタール、アムリノン、鎮痛薬、抗ポリオワクチン、抗狂犬病血清、抗テタヌス免疫グロブリン、テタヌスワクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、抗毒素(antivenom)血清、アルガトロバン、アルギニン、アスコルビン酸、アテノロール、アトラクリウム、アトロピン、オーロチオグルコース、アザチオプリン、アズトレオナム、バシトラシン、バクロフェン、バシリキシマブ、安息香酸、ベンズトロピン、ベタメタゾン、ビオチン、ビバリルジン、ボツリヌス抗毒素、ブレチリウム、ブメタニド、ブピバカイン、ブプレノルフィン、ブトルファノール、カルシトニン、カルシトリオール、カルシウム、カプレオマイシン、カルボプロスト、カルニチン、セファマンドール、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフチゾキシム、セフロキシム、クロラムフェニコール、クロロプロカイン、クロロキン、クロロチアジド、クロルプロマジン、コンドロイチン硫酸、絨毛性ゴナドトロピンアルファ、クロム、シドホビル、シメチジン、シプロフロキサシン、シサトラクリウム、クロニジン、コデイン、コルヒチン、コリスチン、コラーゲン、コルチコレリンオーバイントリフルテート、コルチコトロピン、コシントロピン、シアノコバラミン、シクロスポリン、システイン、ダクリキシマブ（Ｄａｃｌｉｘｉｍａｂｓ）、ダルホプリスチン、ダルテパリン、ダナパロイド、ダントロレン、デフェロキサミン、デスモプレシン、デキサメタゾン、デクスメデトミジン、デクスパンテノール、デキストラン、鉄デキストラン、ジアトリゾ酸、ジアゼパム、ジアゾキシド、ジサイクロミン、ジギバインド（Ｄｉｇｉｂｉｎｄｓ）、ジゴキシン、ジヒドロエルゴタミン、ジルチアゼム、ジフェンヒドラミン、ジピリダモール、ドブタミン、ドパミン、ドキサクリウム、ドキサプラム、ドキセルカルシフェロール、ドキシサイクリン、ドロペリドール、ジフィリン、エデト酸、エドロホニウム、エナラプリラート、エフェドリン、エポプロステノール、エルゴカルシフェロール、エルゴノビン、エルタペネム、エリスロマイシン、エスモロール、エストラジオール、エストロゲニック（Ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃｓ）、エタクリン酸、エタノールアミン、エタノール、ヨード化ケシ油エチルエステル(Ethiodized oil)、エチドロン酸、エトミデート、ファモチジン、フェノルドパム、フェンタニル、フルマゼニル、フルオレセイン、フルフェナジン、葉酸、フォメピゾール、ホミビルセン、フォンダパリヌクス、ホスカルネット、ホスフェニトイン、フロセミド、ガドテリドール、ガドベルセタミド、ガンシクロビル、ゲンタマイシン、グルカゴン、グルコース、グリシン、グリコピロレート、ゴナドレリン、ゴナドトロピン絨毛性、ヘモフィルスＢ型多糖、ヘミン、ハーバル（Ｈｅｒｂａｌｓ）、ヒスタミン、ヒドララジン、ヒドロコルチゾン、ヒドロモルホン、ヒドロキソコバラミン、ヒドロキシジン、ヒヨスチアミン、イブチリド、イミグルセラーゼ、インジゴカルミン、インドメタシン、ヨウ化物、イオプロミド、イオタラム酸、イオキサグル酸、イオキシラン、イソニアジド、イソプロテレノール、日本脳炎ワクチン、カナマイシン、ケタミン、ラベタロール、レピルジン、レボブピバカイン、レボチロキシン、リンコマイシン、リオチロニン、黄体形成ホルモン、ライム病ワクチン、マンガホジピール、マンストール（Ｍａｎｔｈｔｏｌｓ）、髄膜炎菌多糖体ワクチン、メペリジン、メピバカイン、メソリダジン、メタラミノール、メサドン、メトカルバモール、メトヘキシタール、メチルドーペート(Methyldopate)、メチルエルゴノビン、メトクロプラミド、メトプロロール、メトロニダゾール、ミノサイクリン、ミバクリウム、モルルイック酸（Ｍｏｒｒｈｕｉｃ  ａｃｉｄｓ）、モキシフロキサシン、ムロモナブ−ＣＤ３、ミコフェノール酸モフェチル、ナフシリン、ナルブフィン、ナルメフェン、ナロキソン、ネオスチグミン、ナイアシンアミド、ニカルジピン、ニトログリセリン、ニトロプルシド、ノルエピネフリン、オルフェナドリン、オキサシリン、オキシモルフォン、オキシテトラサイクリン、オキシトシン、パンクロニウム、パンテノール、パントテン酸、パパベリン、ペグインターフェロンアルファ−２Ａ、ペニシリンＧ、ペンタミジン、ペンタゾシン、ペントバルビタール、パーフルトレン、ペルフェナジン、フェノバルビタール、フェントラミン、フェニレフリン、フェニトイン、フィゾスチグミン、フィトナジオン、ポリミキシン、プラリドキシム、プリロカイン、プロカインアミド、プロカイン、プロクロルペラジン、プロゲステロン、プロプラノロール、水酸化ピリドスチグミン、ピリドキシン、キニジン、キヌプリスチン、狂犬病免疫グロブリン、狂犬病ワクチン、ラニチジン、レミフェンタニル、リボフラビン、リファンピン、ロピバカイン、サマリウム、スコポラミン、セレン、セルモレリン、シンカリド、ソマトレム、スペクチノマイシン、ストレプトキナーゼ、ストレプトマイシン、スクシニルコリン、スフェンタニル、スルファメトキサゾール、タクロリムス、テルブタリン、テリパラチド、テストステロン、テタヌス抗毒素、テトラカイン、硫酸テトラデシル、テオフィリン、チアミン、チエチルペラジン、チオペンタール、甲状腺刺激ホルモン、チンザパリン、チロフィバン、トブラマイシン、トラゾリン、トルブタミド、トルセミド、トラネキサム酸、トレプロスチニル、トリフルオペラジン、トリメトベンズアミド、トリメトプリム、トロメタミン、ツベルクリン、腸チフスワクチン、ウロフォリトロピン、ウロキナーゼ、バルプロ酸、バソプレシン、ベクロニウム、ベラパミル、ボリコナゾール、ワーファリン、黄熱ワクチン、ジドブジン、亜鉛、塩酸ジプラシドン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アドリアマイシン、アザセリン、６−アザウリジン、カルジノフィリン（Ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎｓ）、クロモマイシン、デノプテリン（Ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎｓ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、エノシタビン、フロクスウリジン、オリボマイシン、ピラルビ��ン、ピリトレキシム、プテロプテリン（Ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎｓ）、テガフール、ツベルシジン、アルテプラーゼ、アルシツモマブ、ベバシズマブ、ボツリヌス毒素Ａ型、ボツリヌス毒素Ｂ型、カプロマブペンデチド、ダクリズマブ、ドルナーゼアルファ、ドロトレコギンアルファ、イムシロマブペンテテート、ヨウ素−１３１、抗生物質剤；血管新生阻害剤；抗白内障および抗糖尿病性網膜症物質；炭酸脱水酵素阻害剤；散瞳薬；光線力学的療法剤；プロスタグランジン類似体；増殖因子；抗新生物薬；代謝拮抗剤；抗ウイルス薬；抗アメーバ薬および抗原虫薬；抗結核および抗ハンセン病剤；抗毒素およびアンチベニン(antivenin)；抗血友病因子、抗インヒビター血液凝固複合体、アンチトロンビンＩＩＩ、血液凝固因子Ｖ、血液凝固因子ＩＸ、血漿タンパク質画分、フォンヴィルブランド因子；抗血小板薬、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）；赤血球新生刺激物質；止血剤およびアルブミン；免疫グロブリン；トロンビン阻害剤；抗凝固剤；アルクロメタゾン、アルゲストン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、クロベタゾール、クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコート、デソニド、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルアザコルト（ｆｌｕａｚａｃｏｒｔｓ）、フルクロロニド（ｆｌｕｃｌｏｒｏｎｉｄｅｓ）、フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノロン、フルオシノニド、フルオコルチン、フルオコルトロン、フルオロメトロン、フルペロロン、フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルランドレノリド、フルチカゾン、ホルモコータル、ハルシノニド、ハロベタゾール、ハロメタゾン、ハロプレドン、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、エタボン酸ロテプレドノール、マジプレドン（ｍａｚｉｐｒｅｄｏｎｅｓ）、メドリゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、フロ酸モメタゾン、パラメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニバール（ｐｒｅｄｎｉｖａｌｓ）、プレドニリデン、リメキソロン、チキソコルトールおよびトリアムシノロンの中から選択されるステロイド性抗炎症薬；ドコサノール（Ｄｏｃｏｓａｎｏｌｓ）、プロスタグランジン、プロスタグランジン類似体、抗プロスタグランジンおよびプロスタグラン
ジン前駆体；縮瞳薬、コリン作動薬および抗コリンエステラーゼ；ならびに抗アレルギー物質が挙げられる。
【００３７】
組成物および修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、ＰＨ２０ポリペプチドまたは治療上活性な薬剤によって普通治療される任意の状態を治療するために使用してもよい。これらとして、例えば、ヒアルロナンが、例えば、ヒアルロナンの蓄積または過剰産生によって、役割を果たすか、または、疾患の病因論と関連している状態が挙げられる。したがって、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドまたは組成物のいずれかを投与することによってヒアルロナン関連疾患または状態を治療するための組成物および修飾ＰＨ２０ポリペプチドの方法、使用が提供される。ヒアルロナン関連疾患および状態として、例えば、炎症性疾患および腫瘍または卵巣癌、上皮内癌（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＩＳＣ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、前立腺癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、乳癌および結腸癌などの、末期癌、転移性癌および未分化癌を含めた癌が挙げられる。ＰＨ２０ポリペプチドは、このような治療の半減期の増大を示すよう修飾され得る。例えば、ＰＨ２０ポリペプチドは、このような治療のために、ＰＥＧ部分などのポリマーを用いて修飾され得る。
【００３８】
また、対象に本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドまたは組成物のいずれかを投与することおよび治療薬を投与することによって、対象への治療薬のデリバリーを増大する方法が提供される。治療薬は、同一組成物中で投与されても、別個に投与されてもよく、ＰＨ２０ポリペプチド（複数可）の投与の前または後に、同時に、または断続的に(intermittently with)投与されてもよい。投与は、治療薬の投与と同時に、断続的にまたはその後になど、静脈内および皮下投与を含めた任意の経路を含む。治療薬は、本明細書において上記、他の場所に記載されたものおよび／または当技術分野で公知のもののいずれかを含む。
【００３９】
また、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドまたは組成物の投与によって、過剰のグリコサミノグリカンを治療するため；腫瘍を治療するため；脳においてグリコサミノグリカン蓄積を治療するため；心血管障害を治療するため；眼部障害を治療するため；肺の疾患を治療するため；固形腫瘍への化学療法薬の浸透を増大するため；セルライトを治療するため；増殖性障害を治療するため；または薬物およびその他の治療薬のバイオアベイラビリティを高めるための方法が提供される。
【００４０】
また、ヒアルロナン関連疾患または障害の治療において使用するため；対象への治療薬のデリバリーにおいて使用するため；過剰のグリコサミノグリカンを治療するため；腫瘍を治療するため；脳においてグリコサミノグリカン蓄積を治療するため；心血管障害を治療するため；眼部障害を治療するため；肺の疾患を治療するため；固形腫瘍への化学療法薬の浸透を増大するため；セルライトを治療するため；増殖性障害を治療するため；または薬物およびその他の治療薬のバイオアベイラビリティを高めるため；およびＰＨ２０ポリペプチドを含有する組成物の任意のその他の使用のための医薬組成物が提供される。
【００４１】
変性条件下で安定性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を同定または選択するための方法であって、ａ）変性剤を含有する組成物中および／または変性条件下で修飾ヒアルロナン分解酵素の活性を試験する工程と、ｂ）変性剤または条件の不在を除いてａ）と同一組成物中および／または同一条件下で修飾ヒアルロナン分解酵素の活性を試験する工程と、ｃ）ｂ）における活性の少なくとも５％であるａ）における活性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を選択または同定する工程とを含む方法が本明細書において提供される。このような例では、活性は、ヒアルロニダーゼ活性である。いくつかの方法の例では、ａ）における活性が、ｂ）における活性の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上である場合に、修飾ヒアルロナン分解酵素が、選択または同定され、例えば、ａ）における活性が、ｂ）における活性の少なくとも４０％またはそれ以上である場合に、修飾ヒアルロナン分解酵素が選択または同定される。方法はまた、ｄ）ａ）における修飾ヒアルロナン分解酵素の活性を、同一条件下で試験された非修飾ヒアルロナン分解酵素の活性に対して比較する工程と、ｅ）非修飾ヒアルロナン分解酵素と比較して少なくとも１２０％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、１５００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％またはそれ以上のヒアルロニダーゼ活性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を同定または選択する工程とを含み得る。
【００４２】
また、変性条件下で増大した安定性などの安定性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を同定または選択するための方法であって、ａ）変性剤を含有する組成物中および／または変性条件下で修飾ヒアルロナン分解酵素の活性を試験する工程と、ｂ）ａ）と同一の変性剤を含有する組成物中および／または同一の変性条件下で、対応する非修飾ヒアルロナン分解酵素の活性を試験し、それによって活性がａ）と同一の条件下で試験される工程と、ｃ）非修飾ヒアルロナン分解酵素よりも大きな活性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を選択または同定し、それによって、変性条件下で増大した安定性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を同定または選択する工程とを含む方法が、本明細書において提供される。このような例では、活性は、ヒアルロニダーゼ活性であり得る。方法の例では、修飾ヒアルロナン分解酵素は、活性が、非修飾ヒアルロナン分解酵素と比較される活性の少なくとも１２０％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、１５００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％またはそれ以上である場合に選択または同定される。このような例では、方法はまた、ｄ）変性剤を含有する組成物中および／または変性条件下で、選択または同定された修飾ヒアルロナン分解酵素の活性を試験する工程と、ｅ）変性剤または条件がないことを除いてｄ）と同一組成物中および／または同一条件下で同一の選択または同定された修飾ヒアルロナン分解酵素の活性を試験する工程と、ｆ）ｅ）における活性の少なくとも５％であるｄ）において活性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を選択または同定する工程のさらなる工程を含み得る。このような例では、活性は、ヒアルロニダーゼ活性である。いくつかの方法の例では、修飾ヒアルロナン分解酵素は、ｄ）における活性が、ｅ）における活性の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上である場合に選択または同定され、例えば、修飾ヒアルロナン分解酵素は、ｄ）における活性が、ｅ）における活性の少なくとも４０％またはそれ以上である場合に選択または同定される。
【００４３】
修飾ヒアルロナン分解酵素を同定または選択するための本明細書において提供された方法のいずれにおいても、変性剤または状態は、温度、撹拌、無塩もしくは低塩または賦形剤の存在によって引き起こされる。例えば、変性剤または条件は、３０℃〜４２℃または約３０℃〜４２℃である、例えば、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃もしくは４２℃より高いまたは約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃もしくは４２℃より高い高温によって引き起こされる。その他の例では、変性剤または条件は、塩の不在または１００ｍＭ未満の低塩、例えば、９０ｍＭ、８０ｍＭ、７０ｍＭ、６０ｍＭ、５０ｍＭ、４０ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ未満の低塩である。さらなる例では、変性剤または条件は、抗付着剤、結合剤、コーティング、増量剤および希釈剤、香料、色、滑沢剤、流動促進剤、防腐剤、吸着剤および甘味料の中から選択される変性性賦形剤である。
【００４４】
修飾ヒアルロナン分解酵素を同定または選択するための本明細書において提供された方法のいずれかの特定の例では、変性剤または条件は、防腐剤（複数可）、例えば、フェノール系防腐剤（複数可）である。フェノール系防腐剤（複数可）は、フェノール、メタクレゾール（ｍ−クレゾール）、ベンジルアルコールまたはパラベンであり得る。例えば、変性剤または条件は、フェノールおよび／またはｍ−クレゾールである防腐剤（複数可）である。このような例では、質量濃度（ｗ／ｖ）のパーセンテージ（％）としての組成物中のフェノール系防腐剤の総量は、両端を含めて０．０５％〜０．６％、０．１％〜０．４％、０．１％〜０．３％、０．１５％〜０．３２５％、０．１５％〜０．２５％、０．１％〜０．２％、０．２％〜０．３％もしくは０．３％〜０．４％または約０．０５％〜０．６％、０．１％〜０．４％、０．１％〜０．３％、０．１５％〜０．３２５％、０．１５％〜０．２５％、０．１％〜０．２％、０．２％〜０．３％もしくは０．３％〜０．４％である。
【００４５】
修飾ヒアルロナン分解酵素を同定または選択するための本明細書において提供された方法のいずれにおいても、ａ）および／またはｂ）におけるヒアルロナン分解酵素組成物の活性の試験に先立って、ヒアルロナン分解酵素は、所定の時間の間変性条件または変性剤に曝露される。所定の時間は、進化または選択されている特定のヒアルロナン分解酵素、特定の変性条件または変性剤、変性条件または変性剤の量または程度、ヒアルロナン分解酵素およびその他の同様の因子の適用または使用に応じてユーザーによって選択される期間である。例えば、所定の時間は、１分〜１カ月、１分〜３週間、１分〜２週間、１分〜１週間、１分〜２４時間、１分〜１２時間、３０分〜６時間または１時間〜４時間または約１分〜１カ月、１分〜３週間、１分〜２週間、１分〜１週間、１分〜２４時間、１分〜１２時間、３０分〜６時間または１時間〜４時間、例えば、少なくともまたはおよそ少なくとも３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、２週間または１カ月であり得る。
【００４６】
修飾ヒアルロナン分解酵素を同定または選択するための本明細書において提供された方法のいずれにおいても、修飾ヒアルロナン分解酵素は、非修飾ヒアルロナン分解酵素と比較して、アミノ酸のアミノ酸置換、挿入または欠失を含有するものである。例えば、修飾ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナン分解酵素の非修飾形態と比較して単一アミノ酸置換または２、３、４、５、６、７、８、９またはそれ以上のアミノ酸置換などのアミノ酸置換を含有する。本方法の特定の態様では、変性条件下で増大した安定性などの安定性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を進化させるまたは同定するまたは選択するために、修飾ヒアルロナン分解酵素のライブラリーまたは収集物がスクリーニングされる。したがって、本明細書における方法の例では、複数の修飾ヒアルロナン分解酵素が、ａ）および／またはｂ）において試験される。このような例では、複数の修飾ヒアルロナン分解酵素が、対応する非修飾ヒアルロナン分解酵素と比較して修飾されて、修飾ヒアルロナン分解酵素の収集物を作製し、それによって、収集物中の各修飾タンパク質は、ａ）および／またはｂ）の各々において試験される。収集物またはライブラリーでは、各修飾ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナン分解酵素の非修飾形態と比較して単一のアミノ酸置換を含有し、その結果、複数の修飾酵素は、各修飾位置のアミノ酸が、その位置の元のアミノ酸以外の最大１〜１９種のその他のアミノ酸によって置換されるようなものであり、それによって、各修飾ヒアルロナン分解酵素は、種々のアミノ酸置換を含有し、ヒアルロナン分解酵素またはその選択され他一部の長さに沿ってどのアミノ酸も置換される。
【００４７】
本明細書において提供された方法のいずれかにおいて、修飾ヒアルロナン分解酵素は、アミノ酸（複数可）の挿入、欠失または置換によって非修飾ヒアルロナン分解酵素と比較して修飾されている。非修飾ヒアルロナン分解酵素は、コンドロイチナーゼであり得るか、またはヒアルロニダーゼであり得る。本明細書における例では、非修飾ヒアルロニダーゼは、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼまたはＣ末端グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー結合部位もしくはＧＰＩアンカー結合部位の一部を欠くその切断型であり、それによって、切断形態は、ヒアルロニダーゼ活性を示す。ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ラット、キツネ、マウスまたはモルモットＰＨ２０であり得る。特定の例では、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、ヒトＰＨ２０またはそのＣ末端切断形態である。例えば、非修飾ヒアルロナン分解酵素は、配列番号３、７、１０、１２、１４、２４、３２〜６６、６９、７２、８５７、８５９、８６１、８７０のいずれかに示されるアミノ酸の配列または配列番号３、７、１０、１２、１４、２４、３２〜６６、６９、７２、８５７、８５９、８６１、８７０のいずれかに対して少なくとも８０％の配列同一性である、例えば、配列番号３、７、１０、１２、１４、２４、３２〜６６、６９、７２、８５７、８５９、８６１もしくは８７０のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性であるアミノ酸の配列を有するものである。特定の例では、非修飾ヒアルロナン分解酵素は、配列番号３、７、３２〜６６、６９もしくは７２のいずれかに示されるアミノ酸の配列または配列番号３、７、３２〜６６、６９もしくは７２のいずれかに対して少なくとも８５％の配列同一性を示すアミノ酸の配列、例えば、配列番号３、７、３２〜６６、６９または７２のいずれかに対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有するＰＨ２０ヒアルロニダーゼである。
【００４８】
安定性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を同定または選択するための本明細書において提供された方法のいずれにおいても、方法は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で実施される。また、反復性であり、それによって方法の工程が複数回反復される任意の方法も提供され、各反復では、選択された修飾ヒアルロナン分解酵素のさらなる修飾ヒアルロナン分解酵素が作製および試験され、それによって、修飾ヒアルロナン分解酵素は、変性条件下で増大した安定性を示すように進化する。また、本明細書において提供される方法のいずれかによって同定された修飾ヒアルロナン分解酵素が本明細書において提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、全長ヒトＰＨ２０（配列番号７に示される）およびその可溶性Ｃ末端切断変異体のアミノ酸配列を表す。全長ＰＨ２０の例示的Ｃ末端切断変異体のＣ末端アミノ酸残基は、太字で示される。全長ＰＨ２０の例示的Ｃ末端切断変異体の完全アミノ酸配列も、配列番号３および３２〜６６に提供される。完全配列が、配列番号３に示されている、例示的可溶性ＰＨ２０のＣ末端アミノ酸残基も下線によって示されている。アミノ酸置換の例示的な、制限するものではない位置は、強調することによって示されている。対応する位置は、対象とする配列の、配列番号３、７または３２〜６６のいずれかとの、特に、配列番号３とのアラインメントによって同定され得る。
【図２Ａ】図２は、配列番号３に示されるヒト可溶性ＰＨ２０の、その他のＰＨ２０ポリペプチドとの例示的アラインメントを表す。「＊」は、アラインされた残基が同一であることを意味し、「：」は、アラインされた残基が同一ではないが、類似しており、アラインされた位置に保存的アミノ酸残基を含有することを意味し、「．」は、アラインされた残基が類似しており、アラインされた位置に半保存的アミノ酸残基を含有することを意味する。アミノ酸置換の例示的な、制限するものではない対応する位置は、強調することによって示されている。例えば、図２Ａは、配列番号３に示されるヒト可溶性ＰＨ２０の、配列番号１０に示されるチンパンジーＰＨ２０とのアラインメントを表す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、配列番号３に示されるヒト可溶性ＰＨ２０の、配列番号１２に示されるアカゲザルＰＨ２０とのアラインメントを表す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、配列番号３に示されるヒト可溶性ＰＨ２０の、配列番号１４に示されるカニクイザルＰＨ２０とのアラインメントを表す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、配列番号３に示されるヒト可溶性ＰＨ２０の、配列番号１６に示されるウシＰＨ２０とのアラインメントを表す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、配列番号３に示されるヒト可溶性ＰＨ２０の、配列番号２０に示されるマウスＰＨ２０とのアラインメントを表す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、配列番号３に示されるヒト可溶性ＰＨ２０の、配列番号２２に示されるラットＰＨ２０とのアラインメントを表す。
【図２Ｇ】図２Ｇは、配列番号３に示されるヒト可溶性ＰＨ２０の、配列番号２４に示されるウサギＰＨ２０とのアラインメントを表す。
【図２Ｈ】図２Ｈは、配列番号３に示されるヒト可溶性ＰＨ２０の、配列番号２９に示されるモルモットＰＨ２０とのアラインメントを表す。
【図２Ｉ】図２Ｉは、配列番号３に示されるヒト可溶性ＰＨ２０の、配列番号３１に示されるキツネＰＨ２０とのアラインメントを表す。
【図２Ｊ】図２Ｊは、配列番号３に示されるヒト可溶性ＰＨ２０の、配列番号８５７に示されるテナガザルＰＨ２０とのアラインメントを表す。
【図２Ｋ】図２Ｋは、配列番号３に示されるヒト可溶性ＰＨ２０の、配列番号８５９に示されるマーモセットＰＨ２０とのアラインメントを表す。
【図２Ｌ】図２Ｌは、配列番号３に示されるヒト可溶性ＰＨ２０の、配列番号８６１に示されるオランウータンＰＨ２０とのアラインメントを表す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
概要
Ａ．定義
Ｂ．ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ
１．構造
２．機能
３．可溶性ＰＨ２０ポリペプチド
Ｃ．修飾ＰＨ２０ポリペプチド
１．活性突然変異体
ａ．増大した活性
ｂ．増大した安定性
ｉ．フェノール親和性（Ｐｈｅｎｏｐｈｉｌｅｓ）
ｉｉ．好熱性
ｉｉｉ．塩の不在
２．不活性突然変異体
３．さらなる修飾
ａ．低減された免疫原性
ｂ．ポリマーとのコンジュゲーション
Ｄ．変更された特性または活性を有する修飾ヒアルロナン分解酵素を同定するための方法
１．ヒアルロナン分解酵素および修飾ヒアルロナン分解酵素のライブラリー
２．所望の活性または特性についてのスクリーニングまたは試験
３．選択または同定
４．反復性方法
Ｅ．修飾ポリペプチドおよびコードする核酸分子の産生
１．ＰＨ２０ポリペプチドをコードする核酸の単離または調製
２．突然変異体または修飾核酸およびコードするポリペプチドの作製
３．ベクターおよび細胞
４．発現
ａ．原核細胞
ｂ．酵母細胞
ｃ．昆虫および昆虫細胞
ｄ．哺乳類発現
ｅ．植物および植物細胞
５．精製
６．ペグ化によるポリペプチドの修飾
Ｆ．医薬組成物および製剤、投与量および投与
１．製剤（液体、注射用、溶液およびエマルジョン）
ａ．凍結乾燥した
ｂ．例示的製剤
ｉ．ＮａＣｌ
ｉｉ．ｐＨおよびバッファー
ｉｉｉ．防腐剤
ｉｖ．安定剤
２．  投与のその他の経路のための組成物
３．投与量および投与
４．例示的ＰＨ２０−インスリン共製剤（Ｃｏ−Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）
５．パッケージング、製造品およびキット
Ｇ．ヒアルロニダーゼ活性を評価する方法
１．ヒアルロニダーゼ活性
２．溶解度
３．純度、結晶化または凝集
４．薬動力学／薬物動態学
Ｈ．治療および併用療法の方法
１．治療薬を送達する方法
インスリンのデリバリー
２．ヒアルロナン関連疾患および状態を治療する方法
３．その他の使用
４．避妊
Ｉ．実施例
【００５１】
Ａ．定義
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明（複数可）が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。すべての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、ＧｅｎＢａｎｋ配列、データベース、ウェブサイトおよび本明細書において全開示内容を通じて参照されるその他の公開された材料は、別に記載されない限り、その全体が参照により組み込まれる。本明細書における用語について複数の定義がある場合には、この節におけるものが通用する。ＵＲＬまたはその他のこのような識別子もしくはアドレスが言及される場合には、このような識別子は、変更する場合があり、インターネットでの特定の情報は行き来し得るが、同等の情報は、インターネットを検索することによって見出すことができると理解される。それに対する言及は、このような情報のアベイラビリティーおよび公的な普及を証明する。
【００５２】
本明細書において、ヒアルロナン分解酵素とは、ヒアルロナンポリマー（ヒアルロン酸またはＨＡとも呼ばれる）をより小さい分子量の断片に切断するのを触媒する酵素を指す。例示的ヒアルロナン分解酵素として、ヒアルロニダーゼならびにヒアルロナンを脱重合する能力を有する特定のコンドロイチナーゼおよびリアーゼがある。ヒアルロナン分解酵素である例示的コンドロイチナーゼとして、それだけには限らないが、コンドロイチンＡＢＣリアーゼ（コンドロイチナーゼＡＢＣとしても知られる）、コンドロイチンＡＣリアーゼ（コンドロイチン硫酸リアーゼまたはコンドロイチン硫酸エリミナーゼとしても知られる）およびコンドロイチンＣリアーゼが挙げられる。コンドロイチンＡＢＣリアーゼは、２種の酵素、コンドロイチン硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼ（ＥＣ４．２．２．２０）およびコンドロイチン硫酸−ＡＢＣエキソリアーゼ（ＥＣ４．２．２．２１）を含有する。例示的コンドロイチン硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼおよびコンドロイチン硫酸−ＡＢＣエキソリアーゼとして、それだけには限らないが、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）およびペドバクター・ヘパリヌス（Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ  ｈｅｐａｒｉｎｕｓ）に由来するものが挙げられる（プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）コンドロイチン硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼは、配列番号９２２に示されている；Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46）。細菌由来の例示的コンドロイチナーゼＡＣ酵素として、それだけには限らないが、配列番号９２３に示されるペドバクター・ヘパリヌス（Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ  ｈｅｐａｒｉｎｕｓ）、配列番号９２４に示されるビクチバリス・バデンシス（Ｖｉｃｔｉｖａｌｌｉｓ  ｖａｄｅｎｓｉｓ）およびアースロバクター・オーレセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）（Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444）に由来するものが挙げられる。細菌由来の例示的コンドロイチナーゼＣ酵素として、それだけには限らないが、ストレプトコッカスおよびフラボバクテリウムに由来するもの（Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133）が挙げられる。
【００５３】
本明細書において、ヒアルロニダーゼとは、ヒアルロナンを分解する酵素のクラスを指す。ヒアルロニダーゼとして、それだけには限らないが、細菌ヒアルロニダーゼ（ＥＣ４．２．２．１またはＥＣ４．２．９９．１）、ヒル、その他の寄生虫および甲殻類由来のヒアルロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３６）および哺乳類型ヒアルロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３５）が挙げられる。ヒアルロニダーゼとして、それだけには限らないが、ネズミ、イヌ、ネコ、ウサギ、鳥類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、魚、カエル、細菌およびヒル、その他の寄生虫および甲殻類由来の任意のものを含めた非ヒト起源のいずれかのものが挙げられる。例示的ヒトヒアルロニダーゼとして、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＨＹＡＬ３、ＨＹＡＬ４およびＰＨ２０が挙げられる。また、ヒアルロニダーゼの中には、ヒツジおよびウシＰＨ２０を含めた可溶性ヒアルロニダーゼおよび可溶性ＰＨ２０も含まれる。例示的ヒアルロニダーゼとして、配列番号６、７〜３１、６９、７０、７１、７２、８５６〜８６１、８６９〜９２１に示されるいずれかのもの、その成熟した形態（シグナル配列を欠く）またはその対立遺伝子もしくは種変異体が挙げられる。ヒアルロニダーゼはまた、可溶性であるＣ末端切断変異体を含めた、ヒアルロニダーゼ活性を示すその切断形態も含む。
【００５４】
本明細書において、ＰＨ２０とは、精子中に生じ、中性で活性であるヒアルロニダーゼの種類を指す。ＰＨ−２０は、精子表面に、リソソーム由来の先体中に生じ、ここでは、内先体膜と結合している。ＰＨ２０として、それだけには限らないが、ヒト、チンパンジー、カニクイザル、アカゲザル、ネズミ、ウシ、ヒツジ、モルモット、ウサギおよびラット起源を含めた任意の起源のものが挙げられる。前駆体および成熟形態を含めた例示的ＰＨ２０ポリペプチドとして、ヒト（配列番号６および７）、チンパンジー（配列番号８、９、１０、８６９および８７０）、アカゲザル（配列番号１１および１２）、カニクイザル（配列番号１３および１４）、ウシ（例えば、配列番号１５〜１８）、マウス（配列番号１９および２０）、ラット（配列番号２１および２２）、ウサギ（配列番号２３および２４）、ヒツジ（配列番号２５〜２７）、モルモット（配列番号２８および２９）、キツネ（配列番号３０および３１）、テナガザル（配列番号８５６および８５７）、マーモセット（配列番号８５８および８５９）およびオランウータン（配列番号８６０および８６１）に由来するものが挙げられる。ＰＨ２０への言及は、前駆体ＰＨ２０ポリペプチドおよび成熟ＰＨ２０ポリペプチド（シグナル配列が除去されているものなど）、活性を有するその切断形態を含み、対立遺伝子変異体および種変異体、スプライシング変異体によってコードされる変異体および配列番号７に示される前駆体ポリペプチドに対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを含めたその他の変異体またはその成熟形態を含む。ＰＨ２０ポリペプチドはまた、化学的修飾または翻訳後修飾を含有するものおよび化学的修飾または翻訳後修飾を含有しないものも含む。このような修飾として、それだけには限らないが、ペグ化、アルブミン化（ａｌｂｕｍｉｎａｔｉｏｎ）、グリコシル化、ファルニシル化（ｆａｒｎｙｓｙｌａｔｉｏｎ）、カルボキシル化、水酸化、リン酸化および当技術分野で公知のその他のペプチド修飾が挙げられる。市販のウシまたはヒツジ可溶性ヒアルロニダーゼの例として、ビトラーゼ（Ｖｉｔｒａｓｅ）（登録商標）ヒアルロニダーゼ（ヒツジヒアルロニダーゼ）およびアンファダーゼ（Ａｍｐｈａｄａｓｅ）（登録商標）ヒアルロニダーゼ（ウシヒアルロニダーゼ）が挙げられる。
【００５５】
本明細書において、可溶性ＰＨ２０とは、生理学的条件下でのその溶解性を特徴とするポリペプチドを指す。一般に、可溶性ＰＨ２０は、グリコホスファチジルアンカー（ＧＰＩ）結合配列のすべてまたは一部を欠くか、そうでなければ、細胞膜に十分に固定しない。例えば、可溶性ＰＨ２０は、グリコホスファチジルアンカー（ＧＰＩ）結合配列のすべてまたは一部に対応する連続アミノ酸の配列を欠くＰＨ２０のＣ末端で切断された変異体であり得る。したがって、細胞からの発現の際に、可溶性ＰＨ２０は、培地中に分泌される。可溶性ＰＨ２０タンパク質は、例えば、３７℃に加温したＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４溶液の水相へ分配することによって区別され得る（Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7）。膜固定型、例えば、脂質固定型ヒアルロニダーゼは、洗浄剤が豊富な相に分配するが、ホスホリパーゼ−Ｃでの処理後に、洗浄剤が乏しい相または水相に分配する。可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼの中には、ヒアルロニダーゼの膜への固定と関連している１つまたは複数の領域が除去または修飾されている膜固定型ヒアルロニダーゼが含まれ、これでは、可溶性形態は、ヒアルロニダーゼ活性を保持する。可溶性ヒアルロニダーゼは、組換え可溶性ヒアルロニダーゼおよび天然供給源、例えば、ヒツジまたはウシ由来の精巣抽出物に含有されるものまたはそれから精製されたものを含む。このような可溶性ヒアルロニダーゼの例示的なものとして、可溶性ヒトＰＨ２０（配列番号３または３２〜６６）が挙げられる。その他の可溶性ヒアルロニダーゼとして、ヒツジ（配列番号２５〜２７）およびウシ（配列番号１６または１８）ＰＨ２０が挙げられる。
【００５６】
本明細書において、可溶性ヒトＰＨ２０（ｓＨｕＰＨ２０）は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー配列（Ｃ末端で切断されたＰＨ２０ポリペプチド）のすべてまたは一部を含むヒトＰＨ２０のＣ末端からのアミノ酸の連続配列を欠くヒトＰＨ２０ポリペプチドを含み、その結果、発現時に、ポリペプチドは、生理学的条件下で可溶性である。例えば、可溶性ヒトＰＨ２０ポリペプチドは、その前駆体形態で配列番号６として、またはシグナル配列を欠くその成熟形態でした配列番号７に示されるヒトＰＨ２０のＣ末端で切断されたポリペプチドまたはその対立遺伝子変異体（例えば、配列番号６８〜７２のいずれかに示される）である。溶解度は、生理学的条件下での溶解性を実証する任意の適した方法によって評価され得る。このような方法の例示的なものとして、水相への分配を評価し、上記に記載されるＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４アッセイがある。さらに、可溶性ヒトＰＨ２０ポリペプチドは、ＣＨＯ−Ｓ細胞などのＣＨＯ細胞において産生される場合には、発現され、細胞培養培地中に分泌されるポリペプチドである。しかし、可溶性ヒトＰＨ２０ポリペプチドは、ＣＨＯ細胞において産生されるものに限定されず、任意の細胞において、または組換え発現およびポリペプチド合成を含めた任意の方法によって産生され得る。ＣＨＯ細胞における分泌への言及は、定義的なものである。したがって、ポリペプチドは、ＣＨＯ細胞において発現および分泌され得、培地に可溶性であり、すなわち、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４を用いて抽出されると水相に分配する場合、そのように産生されるかどうかにかかわらず可溶性ＰＨ２０ポリペプチドである。ｓＨｕＰＨ２０ポリペプチドの前駆体ポリペプチドは、異種または非異種（すなわち、天然）シグナル配列などのシグナル配列を含み得る。前駆体の例示的なものとして、アミノ酸位置１〜３５の天然の３５個のアミノ酸シグナル配列（例えば、配列番号６のアミノ酸１〜３５を参照のこと）などのシグナル配列を含むものがある。
【００５７】
本明細書において、ＰＨ２０ポリペプチドに関連して「天然の」または「野生型」とは、自然に、ヒトおよびその他の動物を含めた生物中に存在する対立遺伝子変異体を含めた、天然の、または天然に存在するＰＨ２０遺伝子によってコードされるＰＨ２０ポリペプチドを指す。野生型ＰＨ２０への言及は、種に関係なく、任意の種の野生型ＰＨ２０を包含するものとする。野生型ＰＨ２０ポリペプチドの中には、コードされる前駆体ポリペプチド、その断片およびそのプロセシングされた形態、例えば、シグナルペプチドを欠く成熟形態、ならびにその任意の翻訳前または翻訳後プロセシングまたは修飾された形態が含まれる。また、天然ＰＨ２０ポリペプチドの中に、それだけには限らないが、グリコシル化、カルボキシル化および／または水酸化によって修飾されるものを含めた翻訳後修飾されるものも含まれる。例示的野生型ヒトＰＨ２０のアミノ酸配列は、配列番号６および７に示されており、その成熟形態を含めた対立遺伝子変異体のものは、配列番号６８〜７２に示されている。その他の動物は、それだけには限らないが、配列番号８〜３１、８５６〜８６１、８６９または８７０のいずれかに示される天然または野生型配列を含めた天然ＰＨ２０を産生する。
【００５８】
本明細書において、修飾は、ポリペプチドのアミノ酸の配列または核酸分子中のヌクレオチドの配列の修飾に関連しており、それぞれ、アミノ酸およびヌクレオチドの欠失、挿入および置換を含む。修飾はまた、翻訳後修飾または別の部分との直接的または間接的なコンジュゲーションまたは連結によって起こり得る分子へのその他の変更も含み得る。ポリペプチドを修飾する方法は、組換えＤＮＡ方法論を使用することによってなど、当業者には日常的なものである。
【００５９】
本明細書において、「修飾ヒアルロナン分解酵素」とは、参照または非修飾ヒアルロナン分解酵素と比較して修飾を含有するヒアルロナン分解酵素を指す。修飾は、１個または複数のアミノ酸残基のアミノ酸置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ））、挿入（付加）または欠失であり得る。アミノ酸残基は、天然または非天然アミノ酸であり得る。いくつかの場合には、修飾は、翻訳後修飾であり得る。修飾ヒアルロナン分解酵素は、得られる修飾ヒアルロナン分解酵素が、ヒアルロニダーゼ活性を示す限り、参照または非修飾ヒアルロナン分解酵素と比較して最大１５０個のアミノ酸の相違を有し得る。通常、修飾ヒアルロナン分解酵素は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０のアミノ酸修飾を含有する。
【００６０】
本明細書において、非修飾ヒアルロナン分解酵素とは、本明細書において提供されるような修飾のために選択される出発ポリペプチドを指す。出発ポリペプチドは、ポリペプチドの天然に存在する、野生型形態であり得る。さらに、出発ポリペプチドは、天然の野生型アイソフォームとは異なるが、それにもかかわらず、本明細書において産生されるその後に修飾されるポリペプチドに対して、出発非修飾ポリペプチドと本明細書において呼ばれるように変更または突然変異されてもよい。したがって、非修飾参照タンパク質と比較して、特定の活性または特性の所望の増大または減少を有するよう修飾されている当技術分野で公知の既存のタンパク質は、出発非修飾ポリペプチドとして選択および使用され得る。例えば、グリコシル化を変更するためのアミノ酸残基（単数または複数）の変更など、その天然形態から、１つまたは複数の単一アミノ酸変更によって修飾されており、所望の特性の増大または減少のいずれかを有するタンパク質が修飾のために選択され得、したがって、本明細書において、さらなる修飾のために非修飾と呼ばれる。非修飾ヒアルロナン分解酵素として、非ヒト哺乳類および細菌由来のヒアルロナン分解酵素を含めたヒトおよび非ヒトヒアルロナン分解酵素が挙げられる。例示的非修飾ヒアルロナン分解酵素として、ヒアルロニダーゼ活性を示す配列番号２、３、６、７〜６６、６８〜７２、８５６〜８６１、８６９〜９２４に示されたいずれかのものまたはその成熟した、Ｃ末端で切断された形態または配列番号２、３、６、７〜６６、６８〜７２、８５６〜８６１、８６９〜９２４のいずれかに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示すヒアルロナン分解酵素がある。非修飾ヒアルロナン分解酵素は、一般に、修飾ヒアルロナン分解酵素のアミノ酸置換（複数可）などの修飾（複数可）を含有しないものであると理解される。
【００６１】
本明細書において、「修飾ＰＨ２０ポリペプチド」または「変異体ＰＨ２０ポリペプチド」とは、参照非修飾ＰＨ２０ポリペプチドと比較して、そのアミノ酸の配列中に、本明細書において記載されたような少なくとも１つのアミノ酸置換などの少なくとも１つのアミノ酸修飾を含有するＰＨ２０ポリペプチドを指す。修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、得られる修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、ヒアルロニダーゼ活性を示す限り、最大１５０のアミノ酸置換を有し得る。通常、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０のアミノ酸置換を含有する。修飾ＰＨ２０ポリペプチドはまた、本明細書において記載されたような少なくとも１つのアミノ酸置換に加えて、任意の１つまたは複数のその他の修飾を含み得ると理解される。
【００６２】
本明細書において、非修飾ＰＨ２０ポリペプチドとは、本明細書において提供されるような修飾のために選択された出発ＰＨ２０ポリペプチドを指す。出発ポリペプチドは、ポリペプチドの天然に生じる、野生型形態であり得る。さらに、出発ポリペプチドは、天然の野生型アイソフォームとは異なるが、それにもかかわらず、本明細書において産生されるその後に修飾されるポリペプチドに対して、出発非修飾ポリペプチドと本明細書において呼ばれるように変更または突然変異されてもよい。したがって、非修飾参照タンパク質と比較して、特定の活性または特性の所望の増大または減少を有するよう修飾されている当技術分野で公知の既存のタンパク質は、出発非修飾ポリペプチドとして選択および使用され得る。例えば、グリコシル化を変更するためのアミノ酸残基（単数または複数）の変更など、その天然形態から、１つまたは複数の単一アミノ酸変更によって修飾されており、所望の特性の増大または減少のいずれかを有するタンパク質が修飾のために選択され得、したがって、本明細書において、さらなる修飾のために非修飾と呼ばれる。例示的非修飾ＰＨ２０ポリペプチドとして、ヒトＰＨ２０ポリペプチドまたはその対立遺伝子もしくは種変異体または成熟および前駆体ポリペプチドを含めたその他の変異体がある。例えば、例示的参照ＰＨ２０ポリペプチドとして、配列番号７、６９または７２に示される成熟全長ＰＨ２０ポリペプチドまたは配列番号３および３２〜６６のいずれかに示されるものなどのそのＣ末端で切断された形態または配列番号３、７、３２〜６６、６９または７２のいずれかに対して少なくとも６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を示すＰＨ２０ポリペプチドがある。参照ＰＨ２０ポリペプチドはまた、配列番号２、６、６８、７０、７１のいずれかに示される対応する前駆体形態またはその他の前駆体形態または配列番号２、６、６８、７０、７１のいずれかに対して少なくとも６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を示すＰＨ２０ポリペプチドを含み得る。非修飾ヒアルロナン分解酵素は、一般に、修飾ヒアルロナン分解酵素のアミノ酸置換（複数可）などの修飾（複数可）を含有しないものであると理解される。
【００６３】
本明細書において、Ｎ結合型部分とは、ポリペプチドの翻訳後修飾によってグリコシル化され得るポリペプチドのアスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基を指す。ヒトＰＨ２０の例示的Ｎ結合型部分として、配列番号３または７に示されるアミノ酸の配列のアミノ酸Ｎ４７、Ｎ１３１、Ｎ２００、Ｎ２１９、Ｎ３３３、Ｎ３５８およびＮ３６５（配列番号６に示されるヒトＰＨ２０のアミノ酸残基Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８、Ｎ３９３およびＮ４９０に対応する）が挙げられる。
【００６４】
本明細書において、Ｎ−グリコシル化ポリペプチドとは、少なくとも３個のＮ結合型アミノ酸残基、例えば、配列番号３または７のアミノ酸残基Ｎ２００、Ｎ３３３およびＮ３５８に対応するＮ結合型部分のオリゴ糖結合を含有するＰＨ２０ポリペプチドを指す。Ｎ−グリコシル化ポリペプチドは、Ｎ結合型部分のうち３、４、５および最大すべてが、オリゴ糖と連結しているポリペプチドを含み得る。Ｎ結合型オリゴ糖は、オリゴマンノース、複合体、ハイブリッドまたは硫酸化オリゴ糖またはその他のオリゴ糖および単糖を含み得る。
【００６５】
本明細書において、Ｎ−部分グリコシル化ポリペプチドとは、少なくとも３つのＮ結合型部分と結合しているＮ−アセチルグルコサミングリカンを最小に含有するポリペプチドを指す。部分グリコシル化ポリペプチドは、ポリペプチドのＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２および／またはＥｎｄｏＦ３を用いる処理によって形成されるものを含めた、単糖、オリゴ糖および分岐糖形態を含めた種々のグリカン形態を含み得る。
【００６６】
本明細書において、「条件」とは、タンパク質または薬剤の活性または特性に影響を及ぼし得る任意のパラメータを指す。本明細書における目的上、条件は、一般に、活性薬剤（例えば、修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ）以外の製剤中の賦形剤、担体またはその他の成分の量を含めた存在、温度、時間（例えば、保存または曝露の時間）、保存容器、保存の特性（例えば、撹拌）および／または曝露もしくは使用と関連するその他の条件を指す。
【００６７】
本明細書において、タンパク質に関連して「変性」または「変性する」またはその文法上の変動は、タンパク質の特性または活性が、低減または排除されるようなタンパク質における生化学的変化を指す。生化学的変化は、フォールディングされないためのタンパク質の三次構造における変化であり得る。特性または活性は、完全に無効にされ得るか、または１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくはそれ以上低減され得る。
【００６８】
本明細書において、特性とは、三次元構造、ｐＩ、半減期、コンホメーションおよびその他のこのような物理的特徴などの物理的または構造的特性を指す。例えば、特性の変化は、タンパク質の溶解度、凝集または結晶化として現れ得る。
【００６９】
本明細書において、活性とは、全長（完全）タンパク質と関連するポリペプチドまたはその一部の機能的活性（単数または複数）を指す。機能的活性として、それだけには限らないが、生物活性、触媒または酵素活性、抗原性（抗ポリペプチド抗体と結合するか、それとの結合についてポリペプチドと競合する能力）、免疫原性、多量体を形成する能力およびポリペプチドの受容体またはリガンドと特異的に結合する能力を指す。
【００７０】
本明細書において、ヒアルロニダーゼ活性とは、ヒアルロン酸の切断を酵素によって触媒する能力を指す。ヒアルロニダーゼの米国薬局方（ＵＳＰ）ＸＸＩＩアッセイによって、酵素を３７℃で３０分間ＨＡと反応させた後に残存する高分子量ヒアルロン酸またはヒアルロナン（ＨＡ）基質の量を測定することによって、ヒアルロニダーゼ活性を間接的に決定する（ＵＳＰ  ＸＸＩＩ−ＮＦ  ＸＶＩＩ（１９９０年）６４４〜６４５頁  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ、Ｉｎｃ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）。任意のヒアルロニダーゼの単位での相対活性を確認するために、アッセイにおいて参照標準溶液を使用してもよい。修飾ＰＨ２０ポリペプチドを含めたＰＨ２０などのヒアルロニダーゼのヒアルロニダーゼ活性を調べるためのインビトロアッセイは、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。例示的アッセイとして、切断されていないヒアルロン酸が血清アルブミンと結合する場合に形成される不溶性沈殿物を検出することによって、ヒアルロニダーゼによるヒアルロン酸の切断を間接的に測定する本明細書に記載されたマイクロ濁度アッセイが挙げられる。例えば、標準曲線を作製して、試験されているヒアルロニダーゼの単位での活性を決定するために参照標準を使用してもよい。
【００７１】
本明細書において、中性活性とは、ｐＨ６．０からｐＨ７．８の間または約ｐＨ６．０からｐＨ７．８の間などの中性ｐＨでヒアルロン酸の切断を酵素によって触媒するＰＨ２０ポリペプチドの能力を指す。
【００７２】
本明細書において、修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼに関連して「増大した活性」とは、同一条件下で試験された場合に、修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼが、アミノ酸置換（複数可）を含有しない非修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼと比較して大きなヒアルロニダーゼ活性を示すことを意味する。例えば、修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、非修飾または参照ＰＨ２０ヒアルロニダーゼの活性の少なくともまたはおよそ少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％もしくはそれ以上を示す。
【００７３】
本明細書において、タンパク質に関連して「溶解度」とは、水溶液中で均質である、それによって、タンパク質分子が拡散し、自発的に沈降しないタンパク質を指す。したがって、可溶性タンパク質溶液は、タンパク質を含有する溶液中に、粒子が容易に濾過され得ないような可視の、または別個の粒子がないものである。一般に、タンパク質は、溶液中に可視の、または別個の粒子がない場合には可溶性である。例えば、タンパク質は、０．２２μｍの孔サイズを有するフィルターによって除去され得る粒子を含有しないか、またはわずかな粒子しか含有しない場合に可溶性である。
【００７４】
本明細書において、タンパク質に関連して、凝集または結晶化とは、タンパク質を含有する溶液中の、可視の、または別個の粒子の存在を指す。一般に、粒子の大きさは、１０μｍより大きい、例えば、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍまたはそれ以上より大きい。凝集または結晶化は、溶解度の低下、タンパク質の変性の増大または共有結合の形成によって起こり得る。
【００７５】
本明細書において、「変性条件（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」または「変性条件（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、タンパク質に曝露される場合に、一般に、タンパク質の三次または二次構造の喪失または部分的喪失の結果として、タンパク質の分解または変性に影響を与えるか、または影響を及ぼす任意の条件または薬剤を指す。変性条件は、活性の喪失または低減、溶解度の喪失または低減、凝集および／または結晶化などの効果をもたらし得る。変性条件は、タンパク質に対して完全に致命的であるものである必要はないが、それにもかかわらず、経時的なタンパク質の活性の低減につながるものである。したがって、条件は、その不在においてよりも条件の存在において、タンパク質の活性が、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上低減される場合に変性する。変性条件は、外部ストレスまたは物理的条件（例えば、撹拌、温度、保存時間、安定剤の不在）によるものである場合も、変性剤の存在による場合もある。例えば、変性条件は、熱、酸または化学変性剤によって引き起こされ得る。例示的変性条件として、それだけには限らないが、強酸または塩基の存在、濃無機塩、有機溶媒（例えば、アルコールまたはクロロホルム）、尿素、高または低ｐＨ（極端なｐＨ）、高温（例えば、熱）、変性し得る賦形剤の存在（例えば、フェノール系防腐剤または洗浄剤）、およびそうでなければタンパク質の安定性に必要である分解防止剤（例えば、ＮａＣｌ）が低いまたは実質的にないことが挙げられる。
【００７６】
本明細書において、「変性剤（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」または「変性剤（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ）」とは、変性を引き起こす任意の物質、分子または化合物を指す。例えば、変性剤として、強酸または塩基、濃無機塩、有機溶媒（例えば、アルコールまたはクロロホルム）、防腐剤、洗浄剤またはその他の賦形剤を挙げることができる。
【００７７】
本明細書において、「変性条件に対する耐性」とは、変性と関連しているか、それによって引き起こされるタンパク質の特性または活性の低減または排除の任意の量の減少を指す。例えば、変性は、結晶化または凝集の増大、溶解度の減少または活性の低下と関連しているか、それを引き起こす。したがって、変性に対する耐性とは、参照タンパク質（例えば、非修飾酵素）と比較して、変性条件に曝露された場合に、タンパク質が凝集または結晶化の減少、溶解度の増大または活性（例えば、ヒアルロニダーゼ活性）の増加を示すことを意味する。変性条件に対する耐性は、絶対的なものまたは永久的なものである必要はないが、変性条件において修飾ヒアルロナン分解酵素の変性は、非修飾酵素よりもゆっくりと起こり、その結果、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性または特性がより長く達成されるので達成され得る。例えば、修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼなどの修飾ヒアルロナン分解酵素は、例えば、非修飾ポリペプチドよりも変性条件または変性剤の存在下で、変性に対して１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、…２０％、…３０％、…４０％、…５０％、…６０％、…、７０％、…８０％、…９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％より耐性を示す場合に、変性条件に対する耐性を示す。いくつかの例では、修飾ポリペプチドは、非修飾ポリペプチドと比較して、変性に対して１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上増大した耐性を示す。
【００７８】
本明細書において、修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼの安定性とは、変性条件または変性剤によって引き起こされる変性に対する耐性を示すことを意味する。修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、変性条件（複数可）に対する曝露の前の元のまたは最初のヒアルロニダーゼ活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上など、変性条件または変性剤の存在下で幾分かの活性を保持する場合に安定性を示す。一般に、修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、変性条件の不在下と比較して、変性条件下でヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％またはそれ以上を保持する場合に安定である。ヒアルロニダーゼ活性を評価するためのアッセイは、当業者に公知であり、本明細書に記載されている。酵素の安定性は、永久的または長期である必要ではないが、活性が望まれる期間現れると理解される。例えば、修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、１種または複数種の変性条件または変性剤に対する曝露の際、または曝露の期間（例えば、防腐剤などの変性性賦形剤の存在下）、少なくとも２時間、３時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、１カ月、６カ月または１年間活性を示す場合に安定である。例えば、修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、１種または複数種の変性条件または変性剤に対する曝露の際、または曝露の期間（例えば、防腐剤などの変性性賦形剤の存在下）、両端を含めて２℃〜８℃もしくは約２℃〜８℃の温度で少なくとも１カ月間または両端を含めて３０℃〜４２℃もしくは約３０℃〜４２℃の温度で少なくとも３日間活性を示す場合に安定である。
【００７９】
したがって、本明細書において提供された製剤または共製剤に関連して「安定な」または「安定性」とは、その中の修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼなどの修飾ヒアルロナン分解酵素が、その中での、１種または複数種の変性条件または変性剤に対する曝露の際に（例えば、防腐剤などの変性性賦形剤の存在下で）、両端を含めて２℃〜８℃もしくは約２℃〜８℃の温度で少なくとも１カ月間または両端を含めて３０℃〜４２℃もしくは約３０℃〜４２℃の温度で少なくとも３日間安定であるものを指す。
【００８０】
本明細書において、修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼに関連して「増大した安定性」とは、同一変性性または変性条件（複数可）の存在下で（例えば、防腐剤などの変性性賦形剤の存在下で）、修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼが、アミノ酸置換（複数可）を含有しない非修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼと比較してより大きなヒアルロニダーゼ活性を示すことを意味する。例えば、修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、変性性または変性条件（複数可）の存在下で（例えば、防腐剤などの変性性賦形剤の存在下で）非修飾または参照ＰＨ２０ヒアルロニダーゼの活性の少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％もしくはそれ以上またはおよそ少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％もしくはそれ以上を示す場合に、増大した安定性を示す。
【００８１】
本明細書において、「高温」とは、室温または周囲温度より高い温度を指す。一般に、高温とは、３０℃〜４２℃などの少なくとも３０℃、３０℃より高いまたは約３０℃であり、一般に、両端を含めて３２℃〜３７℃または３５℃〜３７℃である温度である。
【００８２】
本明細書において、室温とは、一般に、約１８℃または１８℃〜約３２℃または３２℃の範囲を指す。当業者ならば、室温は、位置および支配的な条件によって変わるということは理解されよう。例えば、室温は、イタリアまたはテキサスなどの温暖化した気候では高いものであり得る。
【００８３】
本明細書において、タンパク質は、「同一条件下で比較される」という記載は、タンパク質または薬剤の活性または特性に影響を及ぼし得る任意の１種または複数種の条件が、試験薬剤間で変わらないか、または実質的に変わらないように、異なるタンパク質が、同一にまたは実質的に同一に処理されることを意味する。例えば、修飾ＰＨ２０ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性が、非修飾ＰＨ２０ポリペプチドに対して比較される場合には、ポリペプチドの量または濃度；活性薬剤（例えば、修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ）以外の製剤中の賦形剤、担体またはその他の成分の量を含めた存在；温度；保存時間；保存容器；保存の特性（例えば、撹拌）および／または曝露もしくは使用と関連するその他の条件などの任意の１種または複数種の条件が、比較されるポリペプチド間およびそれらの間で同一または実質的に同一である。
【００８４】
本明細書において、「所定の時間」とは、予め確立または決定された時間を指す。例えば、所定の時間は、タンパク質の所望の適用または使用に応じて、ヒアルロナン分解酵素の活性の所望の期間と関連している予め選択された時間であり得る。所定の時間は、数時間、数日、数カ月または数年であり得る。例えば、所定の時間は、少なくともおよそまたは約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１カ月、６カ月または１年またはそれ以上であり得る。
【００８５】
本明細書において、「保存」とは、製剤が、調製された時点で対象に直ちに投与されず、使用前に特定の条件（例えば、特定の温度、時間および／または形態（例えば、液体または凍結乾燥形態））下で一定期間維持されることを意味する。例えば、液体製剤は、冷蔵された（０℃〜１０℃、例えば、２℃〜８℃）、室温（例えば、最大３２℃の温度、例えば、１８℃〜約３２℃または３２℃）または高温（例えば、３０℃〜４２℃、例えば、３２℃〜３７℃または３５℃〜３７℃）などの変更された温度下で、対象への投与の前に数日、数週間、数カ月または数年維持され得る。
【００８６】
本明細書において、「賦形剤」とは、活性薬剤の不在下で投与された場合に、活性薬剤の生物学的効果を提供しない活性薬剤の製剤中の化合物を指す。例示的賦形剤として、それだけには限らないが、塩、バッファー、安定剤、浸透圧調節因子、金属、ポリマー、界面活性物質、防腐剤、アミノ酸および糖が挙げられる。
【００８７】
本明細書において、分解防止剤とは、必要に応じて、修飾ＰＨ２０ポリペプチドまたはその他の活性薬剤を、製剤が、取り扱い、保存または使用される際に曝露される変性条件などによる分解から保護するために製剤に添加される化合物を指す。したがって、タンパク質が、組成物中のその他の成分から分解するのを防ぐ薬剤が含まれる。このような薬剤の例示的なものとして、アミノ酸、アミノ酸誘導体、アミン、糖、ポリオール、塩およびバッファー、界面活性物質、阻害剤または基質および本明細書において記載されたその他の薬剤がある。
【００８８】
本明細書において、抗菌有効性試験または防腐剤有効性試験（ＰＥＴ）は、製品中の防腐剤システムの有効性を実証する。製品は、制御された量の特定の生物とともに播種される。次いで、試験は、対照サンプル対試験サンプルで見られる微生物のレベルを２８日間にわたって比較する。一般に、目標市場は、異なるＰＥＴ必要条件を有する。例えば、米国薬局方（ＵＳＰ）および欧州薬局方（ＥＰ）のＰＥＴ必要条件は異なる。異なる市場を含めた、抗菌有効性試験を実施するためのパラメータは、本明細書において記載されたように当業者には公知である。
【００８９】
本明細書において、防腐剤の抗菌的または抗菌上有効な量とは、保存または使用から導入され得るサンプル中の微生物を死滅させるか、またはその増殖を阻害する防腐剤の量を指す。例えば、複数回用量容器については、防腐剤の抗菌的に有効な量が、個々の用量を反復して引き出すことから導入され得る微生物の増殖を阻害する。ＵＳＰおよびＥＰ（ＥＰＡおよびＥＰＢ）は、防腐剤有効性を決定し、ストリンジェンシーが異なる抗菌必要条件を有する。例えば、防腐剤の抗菌上有効な量は、抗菌防腐剤有効性試験（ＡＰＥＴ）において播種後７日で細菌生物の少なくとも１．０ｌｏｇ１０単位低減が起こるような量である。特定の例では、防腐剤の抗菌上有効な量は、播種後７日で細菌生物の少なくとも１．０ｌｏｇ１０単位低減が起こる、播種後１４日で細菌生物の少なくとも３．０ｌｏｇ１０単位低減が起こる、播種後２８日で細菌生物の少なくともさらなる増加は起こらない、および播種後７日で少なくとも真菌生物の増加は起こらないような量である。さらなる例では、防腐剤の抗菌上有効な量とは、播種後２４時間で細菌生物の少なくとも１．０ｌｏｇ１０単位低減が起こる、播種後７日で細菌生物の少なくとも３．０ｌｏｇ１０単位低減が起こる、播種後２８日で細菌生物のさらなる増加が起こらない、播種後１４日で真菌生物の少なくとも１．０ｌｏｇ１０単位低減が起こる、および播種後２８日で少なくとも真菌生物のさらなる増加が起こらないような量である。追加の例では、防腐剤の抗菌上有効な量とは、播種後６時間で細菌生物の少なくとも２．０ｌｏｇ１０単位低減が起こる、播種後２４時間で細菌生物の少なくとも３．０ｌｏｇ１０単位低減が起こる、微生物播種菌液を伴う組成物の播種後２８日で細菌生物の回復が起こらない、播種後７日で真菌生物の少なくとも２．０ｌｏｇ１０単位低減が起こる、および播種後２８日で少なくとも真菌生物のさらなる増加が起こらないような量である。
【００９０】
本明細書において、「防腐剤」とは、分子またはタンパク質組成物に添加された場合に、組成物中での細菌または真菌増殖を含めた微生物の増殖を防ぐ、天然に存在するか、合成によってか、または組換えによって産生された物質を指す。
【００９１】
本明細書において、「フェノール系防腐剤」とは、ベンゼン環などの芳香族炭素環と結合している１つのヒドロキシル基を含有する防腐剤を指す。例示的フェノール系防腐剤として、それだけには限らないが、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、メチルパラベン、エチルパラベンおよびプロピルパラベンが挙げられる。例えば、メタ−クレゾール（ｍ−クレゾール）を含めたクレゾールは、フェノール分子のベンゼン環上に置換されたメチル基を有する。
【００９２】
本明細書において、「フェノール親和性（ｐｈｅｎｏｐｈｉｌｅ）」とは、抗菌的に有効な量の防腐剤（複数可）の存在下で安定性を示す、修飾ＰＨ２０ポリペプチドなどのタンパク質を指す。用語「フェノール親和性（ｐｈｅｎｏｌｐｈｉｌｅ）」は、本明細書において「フェノール親和性（ｐｈｅｎｏｐｈｉｌｅ）」と同義的に使用され得、同一の意味を有する。例えば、フェノール親和性（ｐｈｅｎｏｐｈｉｌｅ）またはフェノール親和性（ｐｈｅｎｏｌｐｈｉｌｅ）である修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、通常、フェノール系防腐剤（複数可）を含有する同一変性条件（複数可）下で試験された場合に、アミノ酸置換（複数可）を含有しない非修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼと比較して増大した安定性を示す。例えば、修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、フェノール系防腐剤（複数可）の存在下で非修飾または参照ＰＨ２０ヒアルロニダーゼの活性の少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％もしくはそれ以上またはおよそ少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％もしくはそれ以上を示す。
【００９３】
本明細書において、「好熱性」とは、３０℃または約３０℃よりも高い高温、例えば、３０℃〜４２℃、一般に、３２℃〜３７℃または３５℃〜３７℃下で安定性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドなどのタンパク質を指す。例えば、好熱性である修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、通常、同一高温変性条件（複数可）下で試験された場合に、アミノ酸置換（複数可）を含有しない非修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼと比較して増大した安定性を示す。例えば、修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、高温下で非修飾または参照ＰＨ２０ヒアルロニダーゼの活性の少なくとも少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％もしくはそれ以上またはおよそ少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％もしくはそれ以上を示す。
【００９４】
本明細書において、用語「洗浄剤」は、用語「界面活性物質」または「表面活性化剤」と同義的に使用される。界面活性物質は、通常、両親媒性である、すなわち、界面活性物質を、有機溶媒および水の両方において可溶性にする、疎水基（「テイル」）および親水基（「ヘッド」）の両方を含有する有機化合物である。界面活性物質は、そのヘッドにおける形式的な荷電基の存在によって分類され得る。非イオン性界面活性物質は、そのヘッドに荷電基がないのに対し、イオン性界面活性物質は、そのヘッドに正味電荷を保持する。双性イオン性界面活性物質は、２つの反対に帯電した基を有するヘッドを含有する。一般的な界面活性物質のいくつかの例として、陰イオン性（硫酸、スルホン酸またはカルボン酸陰イオンをベースとする）：パーフルオロオクタノエート（ＰＦＯＡまたはＰＦＯ）、パーフルオロオクタンスルホネート（ＰＦＯＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸アンモニウムおよびその他のアルキル硫酸塩、ラウレス（ｌａｕｒｅｔｈ）硫酸ナトリウム（ラウリルエーテル硫酸ナトリウムまたはＳＬＥＳとしても知られる）、アルキルベンゼンスルホネート；陽イオン性（第四級アンモニウム陽イオンをベースとする）：セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）ａ．ｋ．ａ．ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドおよびその他のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、ポリエトキシル化獣脂アミン（ＰＯＥＡ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）；双性イオン性（両性）：ドデシルベタイン；コカミドプロピルベタイン；ココアンホ（ｃｏｃｏ  ａｍｐｈｏ）グリシネート；非イオン性：アルキルポリ（エチレンオキシド）、アルキルフェノールポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（プロピレンオキシド）のコポリマー（ポロキサマーまたはポロキサミンとして商業的に知られる）、オクチルグルコシドを含めたアルキルポリグルコシド、デシルマルトシド、脂肪アルコール（例えば、セチルアルコールおよびオレイルアルコール）、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０など）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤およびドデシルジメチルアミンオキシドが挙げられる。
【００９５】
本明細書において、「バッファー」とは、強酸または強塩基の添加および温度、圧力、容量または酸化還元電位の外的影響にもかかわらず、そのｐＨを一定に維持できる物質、一般に、溶液を指す。バッファーは、水素イオン濃度（ｐＨ）の著しい変化を防ぐ別の化学物質、例えば、プロトン供与体およびアクセプターシステムの濃度の変化を防ぐ。すべてのバッファーのｐＨ値は、温度および濃度依存的である。ｐＨ値または範囲を維持するためのバッファーの選択は、既知バッファーの既知緩衝能に基づいて、当業者によって経験的に決定され得る。例示的バッファーとして、それだけには限らないが、重炭酸バッファー、カコジル酸バッファー、リン酸バッファーまたはＴｒｉｓバッファーが挙げられる。例えば、Ｔｒｉｓバッファー（トロメタミン）は、８．０６のｐＫａを有し、７．９から９．２の間の有効ｐＨ範囲を有するアミンベースのバッファーである。Ｔｒｉｓバッファーについて、ｐＨは、℃温度低下あたり約０．０３単位増大し、１０倍希釈あたり０．０３〜０．０５単位減少する。
【００９６】
本明細書において、天然に存在するα−アミノ酸の残基は、ヒトにおける同族ｍＲＮＡコドンを有する帯電したｔＲＮＡ分子の特異的認識によってタンパク質中に組み込まれる天然に見られる２０種のα−アミノ酸の残基である。
【００９７】
本明細書において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）を含めたその類似体ならびにそれらの混合物を含む。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。適宜蛍光または放射標識などの検出可能な標識などを用いて標識されるローブまたはプライマーを指す場合には、一本鎖分子が考慮される。このような分子は、通常、ライブラリーのプロービングまたは誘導に対して、その標的が統計的に独特であるような長さのものであるか、低コピー数（通常、５未満、一般に、３未満）のものである。一般に、プローブまたはプライマーは、対照とする遺伝子と相補的であるか、または同一である配列の少なくとも１４、１６または３０の連続するヌクレオチドを含有する。プローブおよびプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００またはそれ以上の核酸長であり得る。
【００９８】
本明細書において、ペプチドとは、２〜４０のアミノ酸長であるポリペプチドを指す。
【００９９】
本明細書において、本明細書に提供されたアミノ酸の種々の配列中に生じるアミノ酸は、その公知の３文字または１文字略語に従って同定される（表１）。種々の核酸断片中に生じるヌクレオチドは、当技術分野で日常的に使用される標準の１文字名で指定される。
【０１００】
本明細書において、「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは、２個以上のアミノ酸を含有する。本明細書における目的上、アミノ酸は、２０種の天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸類似体（すなわち、α-炭素が側鎖を有するアミノ酸）を含む。
【０１０１】
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、ポリペプチドのそのペプチド結合での化学消化（加水分解）の際に形成されるアミノ酸を指す。本明細書において記載されたアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体形態であると推定される。そのように命名される「Ｄ」異性体形態の残基は、ポリペプチドによって所望の機能特性が保持される限り、任意のＬ−アミノ酸残基と置換され得る。ＮＨ２とは、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨとは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。アミノ酸残基の略語は、J. Biol. Chem., 243: 3557-3559 (1968)に記載され、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２２に採用された標準ポリペプチド命名法を踏まえて、表１に示されている。
【０１０２】
【表１】
0006422933.tif 000002
【０１０３】
式によって本明細書において表されるすべてのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の従来の方向で、左から右の配向を有するということは留意されなければならない。さらに、語句「アミノ酸残基」は、対応表（表１）中に列挙されるアミノ酸ならびに３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２２において参照され、参照により本明細書に組み込まれるものなどの修飾されたアミノ酸および普通でないアミノ酸を含むよう広く定義される。さらに、アミノ酸残基配列の始めまたは最後のダッシュ記号は、１個または複数のアミノ酸残基のさらなる配列との、ＮＨ２などのアミノ末端基との、またはＣＯＯＨなどのカルボキシル末端とのペプチド結合を示すことは留意されなければならない。
【０１０４】
本明細書において、「天然に存在するα−アミノ酸」とは、ポリペプチド中に生じる２０種のＬ−アミノ酸を指す。
【０１０５】
本明細書において、「非天然アミノ酸」とは、天然アミノ酸と同様の構造を有するが、天然アミノ酸の構造および反応性を摸倣するよう構造的に修飾されている有機化合物を指す。したがって、天然に存在しないアミノ酸は、例えば、２０種の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸の類似体を含み、それだけには限らないが、アミノ酸のＤ−立体異性体を含む。例示的非天然アミノ酸は、本明細書に記載され、当業者に公知である。
【０１０６】
本明細書において、等速性混合物とは、アミノ酸のモル比が、その報告された反応速度に基づいて調整されているものである（例えば、Ostresh et al., (1994) Biopolymers 34:1681を参照のこと）。
【０１０７】
本明細書において、アミノ酸の適した保存的置換は、当業者に公知であり、一般に、得られる分子の生物活性を変更することなく行うことができる。当業者ならば、一般に、ポリペプチドの非必須領域中の単一アミノ酸置換は、生物活性を実質的に変更しないということは認識している（例えば、Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224を参照のこと）。このような置換は、以下の表２に示されるものに従って行うことができる。
【０１０８】
【表２】
0006422933.tif 000003
【０１０９】
本明細書において、ＤＮＡコンストラクトは、天然には見られない方法で組み合わされた、および並置されたＤＮＡのセグメントを含有する一本鎖または二本鎖、直鎖または環状ＤＮＡ分子である。ＤＮＡコンストラクトは、ヒトの操作の結果として存在し、操作された分子のクローンおよびその他のコピーを含む。
【０１１０】
本明細書において、ＤＮＡセグメントとは、特定の特質を有する大きなＤＮＡ分子の一部である。例えば、特定のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、プラスミドまたはプラスミド断片などのより長いＤＮＡ分子の一部であり、５’から３’方向に読まれる場合に、特定のポリペプチドのアミノ酸の配列をコードする。
【０１１１】
本明細書において、用語ポリヌクレオチドとは、５’から３’末端に読まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み、天然の供給源から単離される場合も、インビトロ合成される場合も、天然および合成分子の組合せから調製される場合もある。ポリヌクレオチド分子の長さは、ヌクレオチドを単位として（「ｎｔ」と略される）または塩基対を単位として（「ｂｐ」と略される）本明細書では与えられている。用語ヌクレオチドは、文脈が許す場合には、一本鎖および二本鎖分子のために使用される。この用語が二本鎖分子に適用される場合には、長さ全体を表すよう使用され、用語塩基対と同等であると理解される。当業者ならば、二本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖が、長さがわずかに異なっている場合もあることおよびその末端がねじれ型である場合もあり、したがって、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドが対を形成していない場合もあるということは認識されよう。このような対を形成していない末端は、一般に、２０ヌクレオチドの長さを超えない。
【０１１２】
本明細書において、「に対応する位置の」またはヌクレオチドまたはアミノ酸位置が、配列表に示されるものなどの開示された配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸位置「と対応する」という記載は、ＧＡＰアルゴリズムなどの標準アラインメントアルゴリズムを使用する同一性を最大にするための開示された配列とのアラインメントの際に同定されたヌクレオチドまたはアミノ酸位置を指す。本明細書における目的上、ＰＨ２０配列のアラインメントは、配列番号３、７または３２〜６６のいずれか、特に、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対してである。したがって、本明細書における配列は、配列番号３に示される対応する残基と同一であるので、位置またはアミノ酸置換が、配列番号３に関連した位置に対応するという本明細書における言及はまた、位置またはアミノ酸置換が、配列番号７または３２〜６６のいずれかに関連する位置に対応するということも意味する。配列をアラインすることによって、当業者ならば、ガイドとして保存されたアミノ酸残基および同一のアミノ酸残基を使用して対応する残基を同定できる。一般に、対応する位置を同定するために、アミノ酸の配列が最高次のマッチが得られるようアラインされる（例えば： Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987;およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073を参照のこと）。図２は、例示的アラインメントおよび置換のための例示的な対応する残基の同定を例示する。
【０１１３】
本明細書において、「配列同一性」とは、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較における、同一または同様のアミノ酸またはヌクレオチド塩基の数を指す。配列同一性は、類似または同一の領域を同定するための核酸またはタンパク質配列の配列アラインメントによって決定できる。本明細書における目的上、配列同一性は、一般に、同一残基を同定するためのアラインメントによって決定される。アラインメントはローカルであってもグローバルであってもよいが、本明細書における目的上、アラインメントは、一般に、各配列の全長が比較されるグローバルアラインメントである。マッチ、ミスマッチおよびギャップが、比較される配列間で同定され得る。ギャップは、同一または同様の特徴がアラインされるようにアラインされた配列の残基間に挿入された無効なアミノ酸またはヌクレオチドである。一般に、内部および末端のギャップがあり得る。配列同一性は、同一残基の数／最短の配列の長さ×１００としてギャップを考慮することによって決定されてもよい。ギャップペナルティーを使用する場合には、配列同一性は、末端ギャップについてはペナルティーを用いずに決定され得る（例えば、末端ギャップにはペナルティーは課されない）。あるいは、配列同一性は、同一位置の数／アラインされた総配列の長さ×１００としてギャップを考慮せずに決定されてもよい。
【０１１４】
本明細書において、「グローバルアラインメント」とは、２種の配列を最初から最後までアラインし、各配列中の各文字を１回だけアラインするアラインメントである。アラインメントは、配列間に類似性または同一性があるか否かにかかわらず作製される。例えば、「グローバルアラインメント」に基づいた５０％の配列同一性とは、各々１００ヌクレオチドの長さの２種の比較される配列の全配列のアラインメントにおいて、残基の５０％が同一であることを意味する。グローバルアラインメントはまた、アラインされる配列の長さが同一ではない場合でさえ、配列同一性の決定において使用され得るということは理解される。「末端ギャップについてペナルティーなし」が選択されない限り、配列の末端の相違は、配列同一性の決定において考慮される。一般に、グローバルアラインメントは、その長さのほとんどにわたって相当な類似性を共有する配列で使用される。グローバルアラインメントを実施するための例示的アルゴリズムとして、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Needleman et al. J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)が挙げられる。グローバルアラインメントを実施するための例示的プログラムは、公的に利用可能であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で入手可能なグローバル配列アラインメントツールおよびｄｅｅｐｃ２．ｐｓｉ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ａａｔ／ａｌｉｇｎ／ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌで入手可能なプログラムが挙げられる。
【０１１５】
本明細書において、「ローカルアラインメント」とは、２種の配列をアラインするが、類似性または同一性を共有する配列の部分のみをアラインするアラインメントである。したがって、ローカルアラインメントは、一方の配列のサブセグメントが、もう一方の配列中に存在するかどうかを決定する。類似性がない場合には、アラインメントは戻されない。ローカルアラインメントアルゴリズムとして、ＢＬＡＳＴまたはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)）が挙げられる。例えば、「ローカルアラインメント」に基づく５０％の配列同一性とは、任意の長さの２種の比較される配列の全配列のアラインメントでは、１００ヌクレオチドの長さの類似性または同一性の領域は、類似性または同一性の領域において同一である残基の５０％を有することを意味する。
【０１１６】
本明細書における目的上、配列同一性は、各供給業者によって確立されたデフォルトギャップペナルティーを用いて使用される標準アラインメントアルゴリズムプログラムによって決定され得る。ＧＡＰプログラムのデフォルトパラメータは、（１）単項比較マトリックス（同一性に対して１および非同一性に対して０の値を含有する）およびSchwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)によって記載される、Gribskov et al. Nucl. Acids Res. 14:6745 (1986)の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対して３．０のペナルティーおよび各ギャップ中の各記号に対してさらなる０．１０のペナルティーおよび（３）末端ギャップに対するペナルティーなしを含み得る。任意の２種の核酸分子が、ヌクレオチド配列を有するかどうか、または、任意の２種のポリペプチドが、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％「同一」であるアミノ酸配列を有するかどうか、またはパーセント同一性を物語るその他の同様の変動は、ローカルまたはグローバルアラインメントに基づいて既知コンピュータアルゴリズムを使用して決定され得る（例えば、数十の公知の公的に利用可能なアラインメントデータベースおよびプログラムとのリンクを提供するｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＿ｓｏｆｔｗａｒｅを参照のこと）。一般に、本明細書における目的上、配列同一性は、ＮＣＢＩ／ＢＬＡＳＴから入手可能なＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバル配列アラインメントツール（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＣＭＤ＝Ｗｅｂ＆Ｐａｇｅ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＨｏｍｅ）；ＬＡｌｉｇｎ（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｐｅａｒｓｏｎが実行するＨｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒアルゴリズム（Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357)）；およびｄｅｅｐｃ2．ｐｓｉ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ａａｔ／ａｌｉｇｎ／ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌで入手可能なＸｉａｏｑｕｉ  Ｈｕａｎｇ製のプログラムなどのグローバルアラインメントに基づくコンピュータアルゴリズムを使用して決定される。一般に、本明細書においてヌクレオチド配列を比較する場合には、末端ギャップについてペナルティーを用いるアラインメントが使用される。ローカルアラインメントはまた、比較されている配列が、実質的に同じ長さである場合に使用され得る。
【０１１７】
したがって、本明細書において、用語「同一性」とは、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較またはアラインメントを表す。１つの限定されない例では、「と少なくとも９０％同一である」とは、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する９０〜１００％のパーセント同一性を指す。９０％またはそれ以上のレベルの同一性は、例示目的で、１００アミノ酸またはヌクレオチドの試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド長を仮定すると、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチド中の１０％（すなわち、１００のうち１０）以下のアミノ酸またはヌクレオチドが、参照ポリペプチドのものと異なるという事実を示す。同様の比較を、試験および参照ポリヌクレオチド間で行うことができる。このような相違は、アミノ酸配列の全長にわたって無作為に分配された点突然変異として表され得るか、または許容可能な最大までの種々の長さの１つまたは複数の位置に密集している場合もあり、例えば、１０／１００アミノ酸の相違（およそ９０％の同一性）。相違はまた、アミノ酸残基の欠失または切断によるものであり得る。相違は、核酸またはアミノ酸置換、挿入または欠失として定義される。比較される配列の長さに応じて、約８５〜９０％を上回る相同性または同一性のレベルでは、結果は、プログラムおよびギャップパラメータセットと独立したものであり得、このような高レベルの同一性は、ソフトウェアに頼ることなく容易に評価され得ることが多い。
【０１１８】
本明細書において、対立遺伝子変異体または対立遺伝子変異とは、同一染色体遺伝子座を占める遺伝子の任意の２種以上の代替形態を言及する。対立遺伝子変異は、突然変異によって天然に起こり、集団内に表現型多型をもたらし得る。遺伝子突然変異は、サイレントである（コードされるポリペプチドに変化なし）場合も、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする場合もある。用語「対立遺伝子変異体」はまた、本明細書において、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるタンパク質を示すために使用される。通常、遺伝子の参照形態は、集団に由来するポリペプチドの野生型形態および／または支配的な形態または種の単一の参照メンバーをコードする。通常、種の間の変異体を含む対立遺伝子変異体は、通常、同一種に由来する野生型および／または支配的な形態との少なくとも８０％、９０％またはそれ以上のアミノ酸同一性を有し、同一性の程度は、比較が種間であるか種内であるかにかかわらず、遺伝子に応じて変わる。一般に、種内対立遺伝子変異体は、ポリペプチドの野生型および／または支配的な形態との９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を含めた、野生型および／または支配的な形態との少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％の同一性またはそれ以上を有する。本明細書において、対立遺伝子変異体への言及は、一般に、同一種のメンバー間のタンパク質の変動を指す。
【０１１９】
本明細書において、本明細書において「対立遺伝子変異体」と同義的に使用される「対立遺伝子」とは、遺伝子またはその一部の代替形態を指す。対立遺伝子は、相同染色体上の同一遺伝子座または位置を占有する。対象が遺伝子の２種の同一の対立遺伝子を有する場合には、対象は、その遺伝子または対立遺伝子についてホモ接合性であるといわれる。対象が、遺伝子の２種の異なる対立遺伝子を有する場合には、対象は、その遺伝子についてヘテロ接合性であるといわれる。特定の遺伝子の対立遺伝子は、互いに、単一ヌクレオチドまたはいくつかのヌクレオチドで異なり得、ヌクレオチドの置換、欠失、挿入などの修飾を含み得る。遺伝子の対立遺伝子はまた、突然変異を含有する遺伝子の形態であり得る。
【０１２０】
本明細書において、種変異体とは、マウスおよびヒトなどの異なる哺乳類種を含めた異なる種の間のポリペプチドにおける変異体を指す。本明細書において提供される種変異体の例示的なものとして、それだけには限らないが、ヒト、チンパンジー、マカクザル、カニクイザル、テナガザル、オランウータンまたはマーモセットなどの霊長類ＰＨ２０がある。一般に、種変異体は、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９８％の配列同一性を有する。種変異体間の対応する残基は、マッチするヌクレオチドまたは残基の数を最大にするよう配列を比較およびアラインすることによって決定でき、その結果、例えば、配列間の同一性は、９５％と等しいかそれより高い、９６％と等しいかそれより高い、９７％と等しいかそれより高い、９８％と等しいかそれより高い、または９９％と等しいかそれより高い。次いで、対象とする位置に、参照核酸分子において割り当てられた数を与える。アラインメントは、特に、配列同一性が８０％より高い場合には、手作業で、または目視によって達成され得る。
【０１２１】
本明細書において、実質的に純粋なとは、このような純度を評価するために当業者によって使用される、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの標準的な分析法によって決定されるような、容易に検出可能な不純物を含まないと思われるほど十分に均一であることまたはさらなる精製が、物質の酵素活性および生物活性などの物理的および化学的特性を検出可能に変更しないように十分に純粋であることを意味する。実質的に化学的に純粋な化合物を産生するための化合物の精製方法は、当業者に公知である。しかし、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体または異性体の混合物であり得る。このような例では、さらなる精製は、化合物の特定の活性を増大し得る。
【０１２２】
本明細書において、単離または精製ポリペプチドまたはタンパク質またはその生物学的に活性な部分は、細胞物質またはタンパク質が由来する細胞もしくは組織に由来するその他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成された場合には、化学的前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まない。調製物は、このような純度を評価するために当業者によって使用される、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの標準的な分析法によって決定されるような、容易に検出可能な不純物を含まないと思われる場合に、実質的に含まないか、またはさらなる精製が、物質の酵素活性および生物活性などの物理的および化学的特性を検出可能に変更しないように十分に純粋であると決定され得る。実質的に化学的に純粋な化合物を産生するための化合物の精製方法は、当業者に公知である。しかし、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物であり得る。このような例では、さらなる精製は、化合物の特定の活性を増大し得る。
【０１２３】
したがって、実質的に精製されたＰＨ２０ポリペプチドなどの実質的に精製されたポリペプチドへの言及は、細胞物質を実質的に含まないＰＨ２０タンパク質の調製物を指し、タンパク質が、それから単離または組換え産生された細胞の細胞成分から分離されているタンパク質の調製物を含む。一実施形態では、用語、細胞物質を実質的に含まないは、約３０％（乾重で）未満の非酵素タンパク質（本明細書において、夾雑タンパク質とも呼ばれる）、一般に、約２０％未満の非酵素タンパク質または１０％の非酵素タンパク質または約５％未満の非酵素タンパク質を有する酵素タンパク質の調製物を含む。酵素タンパク質が組換え産生される場合には、培養培地も実質的に含まない、すなわち、培養培地は、酵素タンパク質調製物の容量の約２０％、１０％もしくは５％未満または２０％、１０％または５％に相当する。
【０１２４】
本明細書において、用語、化学前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まないは、タンパク質が、タンパク質の合成に関与している化学前駆体またはその他の化学物質から分離されている酵素タンパク質の調製物を含む。この用語は、約３０％（乾重で）、２０％、１０％、５％未満またはそれ以下の化学前駆体または非酵素化学物質または成分を有する酵素タンパク質の調製物を含む。
【０１２５】
本明細書において、例えば、合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドに関連して合成とは、組換え法によって、および／または化学合成法によって産生される核酸分子またはポリペプチド分子を指す。
【０１２６】
本明細書において、組換え手段による、または組換えＤＮＡ法を使用する産生は、クローニングされたＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現するための分子生物学の周知の方法の使用を意味する。
【０１２７】
本明細書において、ベクター（またはプラスミド）とは、異種核酸を、その発現または複製のいずれかのために細胞に導入するために使用される別個の要素を指す。ベクターは、通常、エピソームのままであるが、遺伝子またはその一部の、ゲノムの染色体中への組込みを達成するよう設計され得る。また、酵母人工染色体および哺乳類人工染色体などの人工染色体であるベクターも考慮される。このような媒体の選択および使用は、当業者に周知である。
【０１２８】
本明細書において、発現ベクターとして、作動可能に連結しているＤＮＡ断片の発現を達成できるプロモーター領域などの調節配列と作動可能に連結しているＤＮＡを発現できるベクターが挙げられる。このようなさらなるセグメントとして、プロモーターおよびターミネーター配列を挙げることができ、適宜、１つまたは複数の複製起点、１つまたは複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを挙げることができる。発現ベクターは、一般に、プラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来するか、または両方のエレメントを含有する場合もある。したがって、発現ベクターとは、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは適当な宿主細胞に導入されると、クローニングされたＤＮＡの発現をもたらすその他のベクターなどの組換えＤＮＡまたはＲＮＡコンストラクトを指す。適当な発現ベクターは、当業者に周知であり、真核細胞および／または原核細胞において複製可能であるものおよびエピソームのままであるものまたは宿主細胞ゲノムに組み込まれるものが挙げられる。
【０１２９】
本明細書において、ベクターはまた、「ウイルスベクター」または「ウイルス性ベクター」を含む。ウイルス性ベクターは、外因性遺伝子を細胞に移す（媒体またはシャトルとして）ために外因性遺伝子と作動可能に連結している操作されたウイルスである。ウイルス性ベクターとして、それだけには限らないが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターが挙げられる。
【０１３０】
本明細書において、「作動可能に」または「作動可能に連結している」とは、ＤＮＡセグメントに言及する場合には、セグメントが、その意図される目的のために協力して機能するよう配置されていることを意味し、例えば、転写が、プロモーターの下流および任意の転写された配列の上流に開始する。プロモーターは、普通、転写装置が結合し、転写を開始し、コーディングセグメントをとおってターミネーターまで進行するドメインである。
【０１３１】
本明細書において、コンジュゲートとは、１種または複数種のその他のポリペプチドまたは化学部分と直接的または間接的に連結している修飾ＰＨ２０ポリペプチドを指す。このようなコンジュゲートとして、融合タンパク質、化学コンジュゲートによって産生されるものおよび少なくとも１種の修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、コンジュゲートがヒアルロニダーゼ活性を保持する限り、別のポリペプチドまたは化学部分と直接的または間接的に連結される任意のその他の方法によって産生されるものが挙げられる。本明細書において提供されたコンジュゲートの例示的なものとして、多量体化ドメイン（例えば、Ｆｃ部分）、毒素、標識または薬物と直接的または間接的に連結しているＰＨ２０ポリペプチドが挙げられる。
【０１３２】
本明細書において、融合タンパク質とは、一方の核酸分子に由来するコード配列およびもう一方の核酸分子に由来するコード配列を含有する核酸配列によってコードされるポリペプチドを指し、これでは、融合コンストラクトが、宿主細胞において転写および翻訳されると、２種のタンパク質を含有するタンパク質が産生されるよう、コード配列は同一リーディングフレームにある。２種の分子は、コンストラクトで隣接していても、１、２、３またはそれ以上であるが、通常、１０、９、８、７または６個より少ないアミノ酸を含有するリンカーポリペプチドによって分かれていてもよい。融合コンストラクトによってコードされるタンパク質産物は、融合ポリペプチドと呼ばれる。融合ポリペプチドの例として、Ｆｃ融合物が挙げられる。
【０１３３】
本明細書において、修飾ＰＨ２０ポリペプチドとコンジュゲートしているポリマーとは、このようなポリペプチドと直接的にか、またはリンカーを介して、共有結合によって、またはそうでなく安定に連結された任意のポリマーを指す。このようなポリマーは、通常、血清半減期を増大させ、それだけには限らないが、シアル部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、デキストランならびに糖およびグリコシル化のためなどのその他の部分を含む。
【０１３４】
本明細書において、用語、評価または決定とは、産物の活性について絶対値を得る、また活性のレベルを示す、指数、比、パーセンテージ、視覚的値またはその他の値を得るという意味での定量的および定性的決定を含むものとする。評価は、直接であっても間接であってもよい。
【０１３５】
本明細書において、「組成物」とは、２種以上の産物または化合物の任意の混合物を指す。溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性物、非水性物またはそれらの任意の組合せであり得る。
【０１３６】
本明細書において、製剤とは、少なくとも１種の活性医薬品または治療薬および１種または複数種の賦形剤を含有する組成物を指す。
【０１３７】
本明細書において、共製剤とは、２種以上の活性薬剤または医薬品または治療薬および１種または複数種の賦形剤を含有する組成物を指す。例えば、速効型インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の共製剤は、速効型インスリン、ヒアルロナン分解酵素および１種または複数種の賦形剤を含有する。
【０１３８】
本明細書において、「組合せ」とは、２種またはそれ以上の項目またはエレメント間の任意の関係を指す。例示的組合せとして、それだけには限らないが、２種またはそれ以上の医薬組成物、２種の修飾ＰＨ２０ポリペプチド；修飾ＰＨ２０ポリペプチドと化学療法薬化合物などの抗癌剤；修飾ＰＨ２０ポリペプチドと治療薬（例えば、インスリン）；修飾ＰＨ２０ポリペプチドと複数の治療薬および／または造影剤またはそれらの任意の関係などの２種以上の有効成分を含有する組成物が挙げられる。このような組合せは、キットとしてパッケージングされ得る。
【０１３９】
本明細書において、キットは、適宜、組合せの使用のための説明書ならびに／またはこのような使用のためのその他の反応物および成分を含むパッケージングされた組合せである。
【０１４０】
本明細書において、「疾患または障害」とは、それだけには限らないが、感染、後天性の状態、遺伝子状態を含めた原因または状態に起因し、同定可能な症状を特徴とする生物における病状を指す。
【０１４１】
本明細書において、ヒアルロナン関連疾患、障害または状態とは、疾患または状態において、原因、結果としてヒアルロナンレベルが上がるか、そうでなければ観察される任意の疾患または状態を指す。ヒアルロナン関連疾患および状態は、組織または細胞におけるヒアルロナン発現の上昇、間質液圧の上昇、血管容量の減少および／または組織における水分含量の増大と関連している。ヒアルロナン関連疾患、障害または状態は、ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素を、単独で、または別の治療および／または薬剤と組み合わせて、または別の治療および／または薬剤に加えて含有する組成物の投与によって治療され得る。例示的疾患および状態として、それだけには限らないが、ヒアルロナンが豊富な癌、例えば、末期癌、転移性癌、未分化癌、卵巣癌、上皮内癌（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、前立腺癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌およびその他の癌などの固形腫瘍を含めた腫瘍が挙げられる。例示的ヒアルロナン関連疾患および状態としてまた、椎間板圧と関連している疾患などの間質液圧の上昇と関連している疾患および浮腫、例えば、臓器移植、卒中、脳外傷またはその他の損傷によって引き起こされる浮腫がある。例示的ヒアルロナン関連疾患および状態として、癌、椎間板圧および浮腫を含めた、間質液圧の上昇、血管容量の減少および／または組織における水分含量の増大と関連している疾患および状態が挙げられる。一例では、ヒアルロナン関連状態、疾患または障害の治療は、寛解、低減または間質液圧（ＩＦＰ）の上昇、血管容量の減少および組織における水分含量の増大のうち１つ以上に対するその他の有益な効果を含む。
【０１４２】
本明細書において、疾患または状態を有する対象を「治療すること」は、対象の症状が部分的または完全に軽減されること、または治療後に変化がないままであることを意味する。したがって、治療は、予防、療法および／または治癒を包含する。予防とは、可能性ある疾患の防止および／または症状の悪化もしくは疾患の進行の防止を指す。治療はまた、修飾インターフェロンおよび本明細書において提供された組成物の任意の医薬使用も包含する。
【０１４３】
本明細書において、医薬上有効な薬剤または治療薬は、疾患または障害を治療するための治療効果を示し得る任意の生物活性薬剤を含む。例示的治療薬は、本明細書に記載されている。治療薬として、それだけには限らないが、麻酔薬、血管収縮薬、分散剤、それだけには限らないが、ビスホスホネートを含めた小分子薬物を含めた従来の治療薬物ならびにそれだけには限らないが、インスリン、ＩｇＧ分子、抗体、サイトカインおよび血液凝固因子を含めた治療用タンパク質が挙げられる。
【０１４４】
本明細書において、「インスリン」とは、グルコース取り込みおよび保存を増大し、および／または内因性グルコース産生を低減するよう作用するホルモン、前駆体またはその合成もしくは組換え類似体を指す。インスリンおよびその類似体は、ヒトにおいて、およびその対立遺伝子および種変異体を含めて、当業者に周知である。インスリンは、タンパク質を小胞体（ＥＲ）に向かわせるシグナルペプチドを含有するプレプロインスリン（ヒトインスリンについては１１０個のアミノ酸）と名づけられた前駆体ポリペプチドとして翻訳され、小胞体でシグナル配列が切断され、その結果、プロインスリンとなる。プロインスリンは、さらにプロセシングされて、Ｃ−鎖または連結鎖ペプチド（ヒトインスリンにおける３１個のアミノ酸のＣ−鎖）を放出する。得られたインスリンは、ジスルフィド結合によって架橋しているＡ鎖（ヒトインスリンでは２１個のアミノ酸長；配列番号８６２に示される）およびＢ鎖（ヒトインスリンでは３０個のアミノ酸長；配列番号８６３に示される）を含有する。十分に架橋したヒトインスリンは、３つのジスルフィド橋：Ａ鎖の位置７とＢ鎖の位置７の間の１つ、Ａ鎖の位置２０とＢ鎖の位置１９の間の２番目のものおよびＡ鎖の位置６と１１の間の３番目のものを含有する。インスリンへの言及は、六量体インスリンならびにヒト化インスリンを含めた、単量体および多量体のインスリンを含む。例示的インスリンポリペプチドとして、ヒトを含めた哺乳類起源のものがある。インスリンへの言及は、一本鎖または二本鎖形態、活性を有するその切断形態のプレプロインスリン、プロインスリンおよびインスリンポリペプチドを含み、ヒトインスリンの対立遺伝子変異体および種変異体、スプライシング変異体によってコードされる変異体およびインスリン類似体などのその他の変異体を含む。例示的インスリンとして、それぞれ、配列番号８６２および８６３に示されるヒトインスリンのＡ鎖およびＢ鎖のアミノ酸の配列を有するヒトインスリンおよびＡ鎖またはＢ鎖の一方または両方に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示し、グルコース取り込みおよび保存を増大し、および／または内因性グルコース産生を低減するよう作用するその変異体または類似体がある。さらなる例示的インスリンとして、配列番号８６４に示されるようなプレプロインスリンのアミノ酸の配列を有し、それによって、Ａ鎖がアミノ酸残基位置８８〜１０８に対応し、Ｂ鎖がアミノ酸に対応するブタインスリンならびにＡ鎖またはＢ鎖の一方または両方に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示し、グルコース取り込みおよび保存を増大し、および／または内因性グルコース産生を低減するよう作用するその変異体または類似体がある。
【０１４５】
本明細書において、「速効型インスリン」とは、対象への皮下投与のわずか４時間後に、またはわずか約４時間後にピークインスリンレベルを示す任意のインスリンを指す。速効型インスリンは、速効型インスリンの投与後、約４時間の時点で、または４時間内に生じる対象における、実際の、認知された、または予測された高血糖性状態（食物の消費に起因するか、または起因すると予測される食事性高血糖状態など）に応じた、糖尿病の対象への急性投与のための任意のインスリンまたは任意の速効型インスリン組成物を含み、それによって、速効型インスリンは、急性高血糖性状態を防ぎ、制御し、または寛解する。速効型インスリンは、組換えインスリンならびにヒトインスリン、ブタインスリンおよびウシインスリンとして販売されているインスリンなどの単離インスリン（「レギュラー」インスリンとも呼ばれる）、ならびにアミノ酸変更によって迅速に作用するよう設計された速効型（ｒａｐｉｄ  ａｃｔｉｎｇ）インスリン類似体（本明細書において、速効型（ｆａｓｔ−ａｃｔｉｎｇ）インスリン類似体とも呼ばれる）を含む。例示的レギュラーインスリン調製物として、それだけには限らないが、商標Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）Ｒ、Ｎｏｖｏｌｉｎ（登録商標）ＲおよびＶｅｌｏｓｕｌｉｎ（登録商標）の下で販売されるものなどのヒトレギュラーインスリン、インスリンヒト、ＵＳＰおよびインスリンヒト注射液、ＵＳＰ、ならびに例えば、トロントインスリン（Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｉｎｓｕｌｉｎ）、オールドインスリン（Ｏｌｄ  Ｉｎｓｕｌｉｎ）およびクリアーインスリン（Ｃｌｅａｒ  ｉｎｓｕｌｉｎ）などのインスリンの酸性製剤ならびにＩｌｅｔｉｎ  ＩＩ（登録商標）（ブタインスリン）などのレギュラーブタインスリンが挙げられる。レギュラーインスリンは、通常、３０分から１時間の間の作用の開始および投与後２〜５時間のピークインスリンレベルを有する。
【０１４６】
本明細書において、速効型（ｒａｐｉｄ  ａｃｔｉｎｇ）インスリン類似体（速効型（ｆａｓｔ−ａｃｔｉｎｇ）インスリン類似体とも呼ばれる）は、作用の迅速な開始を有するインスリンである。迅速なインスリンは、通常、レギュラーインスリンよりも迅速に作用するための１つまたは複数のアミノ酸置換の導入などによって操作されているインスリン類似体である。速効型（ｒａｐｉｄ  ａｃｔｉｎｇ）インスリン類似体は、通常、注射後１０〜３０分の作用の開始を有し、注射後３０〜９０分でピークインスリンレベルが観察される。例示的な速効型（ｒａｐｉｄ  ａｃｔｉｎｇ）インスリン類似体として、それぞれ、配列番号８６２または８６３に示されるヒトインスリンのＡ鎖および／またはＢ鎖中に１つまたは複数のアミノ酸変更を含有し、注射後１０〜３０分で作用の開始を示し、注射後３０〜９０分でピークインスリンレベルが観察されるヒトインスリンの類似体がある。例示的な速効型（ｒａｐｉｄ  ａｃｔｉｎｇ）インスリン類似体として、それだけには限らないが、例えば、インスリンリスプロ（例えば、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）インスリン）、インスリンアスパルト（例えば、ＮｏｖｏＬｏｇ（登録商標）インスリン）およびインスリングルリジン（例えば、Ａｐｉｄｒａ（登録商標）インスリン）、ＶＩＡｊｅｃｔ（登録商標）およびＶＩＡｔａｂ（登録商標）として販売される速効型（ｆａｓｔ−ａｃｔｉｎｇ）インスリン組成物が挙げられる（例えば、米国特許第７，２７９，４５７号を参照のこと）。例示的な速効型（ｒａｐｉｄ−ａｃｔｉｎｇ）インスリン類似体のアミノ酸配列は、配列番号８６２に示されるアミノ酸の配列を有するＡ鎖および配列番号８６５〜８６７のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有するＢ鎖を有する。また。注射後、３０分以下の作用の開始および９０分より以前の、通常３０〜９０分のピークレベルを有する任意のその他のインスリンも含まれる。
【０１４７】
本明細書において、ヒトインスリンとは、その対立遺伝子変異体および類似体を含めたヒトポリペプチドに基づく、合成物であるか、または組換えによって産生されるインスリンを指す。
【０１４８】
本明細書において、速効型（ｆａｓｔ−ａｃｔｉｎｇ）ヒトインスリンまたはヒト速効型（ｆａｓｔ−ａｃｔｉｎｇ）インスリン組成物は、速効型（ｆａｓｔ−ａｃｔｉｎｇ）である任意のヒトインスリンまたはヒトインスリンの組成物を含むが、レギュラーブタインスリンなどの非ヒトインスリンは含まない。
【０１４９】
本明細書において、用語「基礎作用性インスリン」または「基礎インスリン」とは、糖尿病のような慢性状態を治療するための全治療計画の一部として、基礎インスリンレベルを維持するために投与されるインスリンを指す。一般に、基礎作用性インスリンは、周期的に（例えば、１日に１回または２回）投与される場合のインスリンの制御された放出によって、ほぼ定常状態のインスリンレベルを維持するよう処方される。基礎作用性インスリンとして、結晶性インスリン（例えば、ＮＰＨおよびＬｅｎｔｅ（登録商標）、プロタミンインスリン、スルフェン（ｓｕｒｆｅｎ）インスリン）、基礎インスリン類似体（インスリングラルギン、ＨＯＥ  ９０１、ＮｏｖｏＳｏｌ  Ｂａｓａｌ）およびレギュラーインスリンの吸収速度を遅らせるその他のインスリンの化学製剤（例えば、アラビアガム、レシチンまたはオイル懸濁液）が挙げられる。本明細書において、基礎作用性インスリンは、通常、長時間作用性（一般に、比較的低いピーク濃度に到達するが、約２０〜３０時間を超える最大作用期間を有する）または中間作用性（通常、投与後約４〜１２時間でピークインスリン濃度を引き起こす）と理解されるインスリンを含み得る。
【０１５０】
本明細書において、治療とは、状態、障害または疾患またはその他の適応症の症状が、寛解されるか、そうでなければ有益に変更される任意の方法を意味する。
【０１５１】
本明細書において、治療効果とは、疾患または状態の症状を変更、通常、改善もしくは寛解させるか、または疾患または状態を治癒する、対象の治療に起因する効果を意味する。治療上有効な量とは、対象への投与後に治療効果をもたらす組成物、分子または化合物の量を指す。
【０１５２】
本明細書において、用語「対象」とは、ヒトなどの哺乳類を含めた動物を指す。
【０１５３】
本明細書において、患者とは、疾患または障害の症状を示すヒト対象を指す。
【０１５４】
本明細書において、医薬組成物またはその他の治療薬の投与によるなどの治療による特定の疾患または障害の症状の寛解とは、組成物または治療薬の投与に起因するか、それと関連し得る、永久的であるか、一時的であるか、持続性であるか、一過性であるかにかかわらない、症状の任意の減少を指す。
【０１５５】
本明細書において、防止または予防とは、疾患または状態を発生するリスクが低減される方法を指す。
【０１５６】
本明細書において、「治療上有効な量」または「治療上有効な用量」とは、治療効果をもたらすのに少なくとも十分である、薬剤、化合物、物質または化合物を含有する組成物の量を指す。したがって、疾患または障害の症状を防ぐ、治癒する、寛解させる、停止するまたは部分的に停止するのに必要な量である。
【０１５７】
本明細書において、単位用量形態とは、当技術分野で公知であるように、ヒトおよび動物対象に適した、個別にパッケージングされた物理的に別個の単位を指す。
【０１５８】
本明細書において、単回投与形製剤とは、直接投与用の治療薬の単回用量を含有する製剤を指す。単回投与形製剤は、一般に、任意の防腐剤を含有しない。
【０１５９】
本明細書において、複数回用量製剤とは、治療薬の複数回用量を含有し、治療薬の数回の単回用量を提供するよう直接投与され得る製剤を指す。用量は、数分、数時間、数週間、数日または数カ月にわたって投与され得る。複数回用量製剤は、用量調整、用量をプールすることおよび／または用量分割を可能にし得る。複数回用量製剤は、経時的に使用されるので、それらは、一般に、微生物の増殖を防ぐために１種または複数種の防腐剤を含有する。
【０１６０】
本明細書において、「製造品」は、製造され、販売されている製品である。本願を通じて使用されるように、この用語は、同一または別個のパッケージング品に含有される、ｅｓＰＨ２０などの可溶性ＰＨ２０とともに治療薬を、またはｅｓＰＨ２０を単独で包含するものとする。
【０１６１】
本明細書において、流体とは、流動し得る任意の組成物を指す。したがって、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームの形態にある組成物およびその他のこのような組成物を包含する。
【０１６２】
本明細書において、「対照」または「標準」とは、試験パラメータで処理されない点を除いて、試験サンプルと実質的に同一であるサンプルを指すか、血漿サンプルである場合には、対象の状態を患っていない正常なボランティアに由来するものであり得る。対照はまた、内部対照であり得る。例えば、対照は、既知特性または活性を有するウイルスなどのサンプルであり得る。
【０１６３】
本明細書において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、明確に別に示さない限り、複数の参照対照を含む。したがって、例えば、「１つの（ａｎ）」薬剤への言及は、１種または複数種の薬剤を含む。
【０１６４】
本明細書において、用語「または」は、代替物のみを指すまたは代替物が相互排他的であると明確に示されない限り、「および／または」を意味するよう使用される。
【０１６５】
本明細書において、範囲および量は、「約」特定の値または範囲として表され得る。約はまた、正確な量も含む。したがって、「約５個の塩基」とは、「約５個の塩基」および「５個の塩基」も意味する。
【０１６６】
本明細書において、「適宜の」または「適宜に」とは、続いて記載される事象または状況が起こるか、または起こらないことおよび記載は前記事象または状況が起こる場合およびそれが起こらない場合を含むことを意味する。例えば、適宜置換されている基とは、基が置換されていないか、または置換されていることを意味する。
【０１６７】
本明細書において、任意の保護基、アミノ酸およびその他の化合物の略語は、別に示されない限り、その一般的な利用、認識される略語または生化学命名法に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）（(1972) Biochem. 11:1726を参照のこと）に一致する。
【０１６８】
開示内容を明確にするために、制限としてではないが、詳細な説明は以下の小区分に分けられている。
【０１６９】
Ｂ．ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ
修飾ＰＨ２０ポリペプチドが本明細書において提供される。ＰＨ２０（精子表面タンパク質、精子接着分子１またはＳＰＡＭ１としても知られる）は、細胞外マトリックスなどの結合組織中に見られるヒアルロナン（ヒアルロン酸、ヒアルロネートまたはＨＡとも呼ばれる）を加水分解するヒアルロニダーゼである。ヒアルロナンポリマーは、交互のβ−１→４およびβ−１→３グリコシド結合によって一緒に連結している、反復する二糖単位、Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）から構成される。ヒアルロナン鎖は、約２５，０００の二糖反復またはそれ以上の長さに達し得、ヒアルロナンのポリマーは、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で約５，０００〜２０，０００，０００Ｄａの大きさの範囲であり得る。ヒアルロナンはまた、ヒアルロン酸またはヒアルロネートとも呼ばれ、結合組織、上皮組織および神経組織中に広く分布している非硫酸化グリコサミノグリカンである。ヒアルロナンは、細胞外マトリックスの必須成分であり、間質バリアの主要な構成物である。ＰＨ２０は、ヒアルロン酸のβ１→４グリコシド結合を四糖類および六糖類などの種々のオリゴ糖の長さに加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼである。ＰＨ２０は、加水分解活性およびトランスグリコシダーゼ活性の両方を有する。ヒアルロン酸を分解することに加えて、ＰＨ２０はまた、Ｃ４−ＳおよびＣ６−Ｓなどのコンドロイチン硫酸も分解し得る。ＰＨ２０は、酸性ｐＨおよび中性ｐＨでヒアルロニダーゼ活性を示し得る。
【０１７０】
１．構造
ＰＨ２０  ｃＤＮＡは、多数の哺乳類種からクローニングされている。例示的ＰＨ２０前駆体ポリペプチドとして、それだけには限らないが、ヒト（配列番号６）、ウシ（配列番号１５または１７）、ウサギ（配列番号２３）、カニクイザル（配列番号１３）、モルモット（配列番号２８）、ラット（配列番号２１）、マウス（配列番号１９）、チンパンジー（配列番号８、配列番号９または配列番号８６９）アカゲザル（配列番号１１）、キツネ（配列番号３０）、テナガザル（配列番号８５６）、マーモセット（配列番号８５８）またはオランウータン（配列番号８６０）ＰＨ２０ポリペプチドが挙げられる。ｍＲＮＡ転写物は、通常、翻訳されて、Ｎ末端に３５個のアミノ酸シグナル配列を含有する前駆体タンパク質を作製する。ＥＲへの輸送後、シグナルペプチドが除去されて、成熟したＰＨ２０ポリペプチドが得られる。例示的な成熟ＰＨ２０ポリペプチドとして、それだけには限らないが、ヒト（配列番号７）、ウシ（配列番号１６または１８）、ウサギ（配列番号２４）、カニクイザル（配列番号１４）、モルモット（配列番号２９）、ラット（配列番号２２）、マウス（配列番号２０）、チンパンジー（配列番号１０または配列番号８７０）、アカゲザル（配列番号１２）、キツネ（配列番号３１）、テナガザル（配列番号８５７）、マーモセット（配列番号８５９）またはオランウータン（配列番号８６１）ＰＨ２０ポリペプチドが挙げられる。例えば、ヒトＰＨ２０  ｍＲＮＡ転写物は、普通、翻訳されて、Ｎ末端（配列番号６のアミノ酸残基位置１〜３５）に３５個のアミノ酸のシグナル配列を含有する５０９個のアミノ酸の前駆体タンパク質（配列番号６）を作製する。したがって、ＥＲへの輸送およびシグナルペプチドの除去後、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する４７４個のアミノ酸の成熟したポリペプチドが得られる。ヒツジ由来のＰＨ２０の配列も知られている（例えば、配列番号２５〜２７を参照のこと）。
【０１７１】
特に、ヒトＰＨ２０は、配列番号６に示されるアミノ酸の配列を有する。シグナル配列を欠く成熟ヒトＰＨ２０は、配列番号７に示されている。ＰＨ２０対立遺伝子変異体およびその他の変異体が知られている。ＰＨ２０のその他の配列が報告されている。例えば、ＰＨ２０変異体は、配列番号７に示される配列と比較して、位置４８にＡｌａおよび位置４９９にＴｒｐを含有する配列番号６８に示される前駆体配列またはそれぞれ、位置１３および４６４に対応する相違を含有する配列番号６９に示されるその成熟配列において示されるように知られている（例えば、Gmachl et al. (1993) FEBS Lett., 336:545-548；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ６０６０７を参照のこと）。さらに、配列番号６に示されるアミノ酸の前駆体配列と比較して、位置５にグルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）を含有するＰＨ２０の天然変異体が同定されている（例えば、配列番号７０を参照のこと、Varela et al. (2011) Nature, 469:539-542も参照のこと）。別の天然変異体は、配列番号６に示されるアミノ酸の配列と比較して位置４７に（配列番号７１に示されるように）、配列番号３または７に示されるアミノ酸の配列と比較して位置１２に対応して（配列番号７２に示されるように）、アラニン（Ａｌａ；Ａ）を含有する。
【０１７２】
ＰＨ２０ポリペプチドの配列および構造は、高度に保存されている。種々の種に由来するＰＨ２０タンパク質間の配列同一性は、約５０％〜９０％である。３５個のアミノ酸長の疎水性Ｎ末端シグナル配列は、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼポリペプチドの間で全般的に保存されている。ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、配列番号６に示される前駆体ヒトＰＨ２０配列のアミノ酸残基３８〜３７４に対応する約３４０個のアミノ酸長の共通のコアヒアルロニダーゼドメイン領域を含有する。シグナル配列を欠き、配列番号６のアミノ酸残基４６４に対応するＣ末端アミノ酸残基を有する連続するアミノ酸の配列（例えば、配列番号６に示されるアミノ酸配列の位置３６〜４６４に対応するアミノ酸残基）を含有する成熟ＰＨ２０ポリペプチドが、ヒアルロニダーゼ活性に必要な最小配列である（例えば、米国特許第７，７６７，４２９号として発行される米国特許出願第１０／７９５，０９５号を参照のこと；米国公開番号ＵＳ２０１００１４３４５７も参照のこと）。
【０１７３】
共通ヒアルロニダーゼドメイン領域内で、種間で少なくとも５７個のアミノ酸が保存されている（例えば、Arming et al. (1997) Eur. J. Biochem., 247:810-814; ten Have et al. (1998) Reprod. Fertil. Dev., 10:165-72; Chowpongpang et al. (2004) Biotechnology Letters, 26:1247-1252を参照のこと）。例えば、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、配列番号３または７に示されるものなどのシグナル配列を欠く成熟ＰＨ２０のアミノ酸の配列のアミノ酸残基２５、１８９、２０３、３１６、３４１、３４６、３５２、４００、４０２、４０８、４２３および４２９に対応する（配列番号６に示される全長ヒトＰＨ２０のアミノ酸残基６０、２２４、２３８、３５１、３７６、３８１、３８７、４３５、４３７、４４３、４５８または４６４に対応する）１２個の保存されたシステイン残基を含有する。２５および３１６に対応するシステイン残基ならびに１８９および２０３に対応するシステイン残基が、ジスルフィド橋を形成する。その他のシステイン残基も、ジスルフィド橋を形成し、翻訳後タンパク質成熟および／または活性調節に関与している。例えば、さらなる４つのジスルフィド結合が、配列番号６に例示されるポリペプチドのシステイン残基Ｃ３７６およびＣ３８７間；Ｃ３８１およびＣ４３５間；Ｃ４３７およびＣ４４３間；ならびにＣ４５８およびＣ４６４間（それぞれ、配列番号３または７に示される成熟ポリペプチドの位置Ｃ３４１およびＣ３５２；Ｃ３４６およびＣ４００間；Ｃ４０２およびＣ４０８間；ならびにＣ４２３およびＣ４２９間に対応する）で形成される。
【０１７４】
配列番号３または７に示されるアミノ酸の配列のアミノ酸残基Ｄ１１１、Ｅ１１３およびＥ２４９に対応するアミノ酸残基は、酵素活性部位の酸性残基部分であり、ＰＨ２０種間で保存されている。配列番号３または７に示されるアミノ酸の配列のアミノ酸残基Ｒ１７６、Ｒ２４６、Ｒ２５２もまた、種間で保存されており、基質結合および／またはヒアルロニダーゼ活性に貢献している。アミノ酸突然変異Ｄ１１１Ｎ、Ｅ１１３Ｑ、Ｒ１７６Ｇ、Ｅ２４９ＮおよびＲ２５２Ｔは、検出可能な酵素活性または残存する酵素活性を有さない酵素をもたらす（例えば、Arming et al. (1997) Eur. J. Biochem., 247:810-814を参照のこと）。
【０１７５】
本明細書における結果によって、ヒアルロニダーゼ活性にとっての、配列番号３または７に示されるものなどのシグナル配列を欠く成熟ＰＨ２０に示されるアミノ酸の配列の位置２５、１１１、１１３、１７６、１８９、２０３、２４６、２４９、２５２、３１６、３４１、３４６、３５２、４００、４０２、４０８、４２３および４２９に対応するＰＨ２０アミノ酸残基の必要性が確認されるが、これは、これらの残基の突然変異誘発が、活性ではない酵素（例えば、発現されないか、または発現された場合に不活性である、例えば、表５および１０を参照のこと）をもたらすからである。Ｒ１７６ＫおよびＣ３１６Ｄに対応するアミノ酸置換が、幾分かの残存するヒアルロニダーゼ活性を生じた突然変異体をもたらしたことは例外である。
【０１７６】
グリコシル化もまた、認識モチーフＮｘＳまたはＮｘＴに基づくＰＨ２０ヒアルロニダーゼ活性にとって必要である。配列番号３または７に示されるアミノ酸の配列の位置Ｎ４７、Ｎ１３１、Ｎ２００、Ｎ２１９、Ｎ３３３およびＮ３５８に対応する（配列番号６に示されるヒトＰＨ２０のアミノ酸残基Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応する）アミノ酸残基に６つのＮ結合型オリゴ糖がある。特に、少なくとも、アミノ酸残基Ｎ２００、Ｎ３３３およびＮ３５８に対応するＮ結合型グリコシル化部位は、酵素の分泌および／または活性にとって必要である（例えば、米国公開番号ＵＳ２０１００１４３４５７を参照のこと）。例えば、アミノ酸突然変異Ｎ２００Ａ、Ｎ３３３Ａ、Ｎ３５８ＡまたはＮ３３３Ａ／Ｎ３９３Ａを含有するＰＨ２０ポリペプチドは、不活性タンパク質をもたらす。グリコシル化部位Ｎ４７Ａ、Ｎ１３１Ａ、Ｎ２１９Ａ、Ｎ４７Ａ／Ｎ１３１Ａ、Ｎ４７Ａ／Ｎ２１９Ａ、Ｎ１３１Ａ／Ｎ２９１Ａの単一突然変異は、活性を保持する。配列番号６に示されるヒトＰＨ２０のアミノ酸残基Ｎ３６８に対応するＮ結合型グリコシル化部位は、種間で保存されている（例えば、Chowpongpang et al. (2004) Biotechnology Letters, 26:1247-1252を参照のこと）。ＰＨ２０ヒアルロニダーゼはまた、Ｏ結合型グリコシル化部位も含有する。例えば、ヒトＰＨ２０は、配列番号３または７に示されるアミノ酸の配列のアミノ酸Ｔ４４０に対応する（配列番号６中のアミノ酸残基Ｔ４７５に対応する）アミノ酸残基で１つのＯ結合型オリゴ糖を有する。
【０１７７】
ＰＨ２０はまた、触媒部位に加えて、ヒアルロナン結合部位も含有する。この部位は、ペプチド２領域中に位置し、配列番号６に示される前駆体ポリペプチドのアミノ酸位置２０５〜２３５および配列番号３または７に示される成熟ポリペプチドの位置１７０〜２００に対応する。この領域は、ヒアルロニダーゼ間で高度に保存されており、ヘパリン結合モチーフと類似している。位置１７６のアルギニン残基（配列番号３または７に示される成熟ＰＨ２０ポリペプチドに対応する）のグリシンへの突然変異は、野生型ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の約１％のみを有するポリペプチドをもたらす（Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814）。
【０１７８】
ＰＨ２０ポリペプチドは、細胞の細胞膜の細胞外リーフレットにタンパク質を固定するタンパク質のＣ末端と結合しているグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを含有する。少なくともヒト、サル、マウスおよびモルモットＰＨ２０は、ＧＰＩアンカーによって細胞膜と強力に結合しており、これはホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ；例えば、Lin et al. (1994) Journal of Cell Biology, 125:1157-1163;Lin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., 90:10071-10075を参照のこと）を用いて処理することによって放出され得る。ウシＰＨ２０などのその他のＰＨ２０酵素は、細胞膜と緩く結合しており、ホスホリパーゼ感受性アンカーによって固定されていない。下記で論じられるように、発現された場合に、膜と結合していないが、分泌される可溶性活性形態は、ＧＰＩアンカー結合シグナル部位部分のすべての除去によって生成され得ない（米国特許第７，７６７，４２９号；米国公開番号ＵＳ２０１００１４３４５７も参照のこと）。これらとして、例えば、配列番号３または３２〜６６のいずれかに示される可溶性ＰＨ２０ポリペプチドまたはシグナル配列を含有するその前駆体形態が挙げられる。
【０１７９】
ＧＰＩ固定されるタンパク質、例えば、ヒトＰＨ２０は、タンパク質を小胞体（ＥＲ）に向かわせる切断可能なＮ末端シグナルペプチドとともに翻訳される。これらのタンパク質のＣ末端には、ＥＲの内腔内のポリペプチドへの予め形成されたＧＰＩアンカーの付加を指示する別のシグナル配列がある。ＧＰＩアンカーの付加は、ω−部位と呼ばれる特定のアミノ酸位置（通常、Ｃ末端からおよそ２０〜３０個のアミノ酸に位置する）でのＣ末端部分の切断後に起こる。ω−部位の位置を同定するためのコンセンサス配列はないと思われるが、ＧＰＩ固定されるタンパク質は、通常、ω−部位のすぐ下流に８〜１２個のアミノ酸の親水性スペーサー領域が先行し、８〜２０個のアミノ酸の主に疎水性領域を含有するＣ末端ＧＰＩアンカー結合シグナル配列またはドメインを含有する。この親水性スペーサー領域は、荷電アミノ酸およびプロリンが豊富であることが多い（White et al. (2000) J. Cell Sci. 113(Pt.4):721-727）。一般に、予想される二次構造の量が少ないことを特徴とするω−１位置の前のおよそ１１個のアミノ酸の領域、小さい側鎖残基の存在を特徴とする切断部位（ω−部位）ω−１からω＋２の周辺の領域、位置ω＋３からω＋９の間のスペーサー領域、ω＋１０からＣ末端までの疎水性テールがある（Pierleoni et al., (2008) BMC Bioinformatics 9:392）。
【０１８０】
ＧＰＩアンカー結合シグナルコンセンサス配列はないが、ＥｘＰＡＳｙプロテオミクスツールサイト（ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）などの生物情報学のウェブサイトで容易に入手可能であるものを含め、ポリペプチド中のこのような配列を同定するために使用され得る種々のコンピュータによる方法およびアルゴリズムが開発されている（例えば、Udenfriend et al. (1995) Methods Enzymol. 250:571-582; Eisenhaber et al. (1999) J. Mol. Chem. 292: 741-758; Kronegg and Buloz, (1999), 「Detection/prediction of GPI cleavage site (GPI-anchor) in a protein (DGPI)」, 129.194.185.165/dgpi/; Fankhauser et al. (2005) Bioinformatics 21:1846-1852; Omaetxebarria et al. (2007) Proteomics 7:1951-1960; Pierleoni et al. (2008) BMC Bioinformatics 9:392を参照のこと）。したがって、当業者ならば、ＰＨ２０ポリペプチドが、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列を含有する可能性があるかどうか、したがって、ＰＨ２０ポリペプチドが、ＧＰＩ固定されるタンパク質であるかどうかを決定できる。
【０１８１】
ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）加水分解研究を使用して、ＧＰＩアンカーのヒトＰＨ２０のＣ末端との共有結合、したがって、ＰＨ２０の膜結合性が確認された（例えば、Lin et al., (1994) J. Biol. Chem. 125:1157-1163を参照のこと）。ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）およびＤ（ＰＩ−ＰＬＤ）は、ＧＰＩアンカーを加水分解し、ＰＨ２０ポリペプチドを細胞膜から放出する。先行技術文献は、ヒトＰＨ２０のω−部位切断部位が、Ｓｅｒ−４９０からＡｌａ−４９１の間で同定され、サルＰＨ２０については、Ｓｅｒ４９１からＴｈｒ４９２の間で同定されることを報告する（Lin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci, (1993) 90:10071-10075）。したがって、文献は、ヒトＰＨ２０のＧＰＩアンカー結合シグナル配列は、配列番号６に示される前駆体ポリペプチドのアミノ酸位置４９１〜５０９に位置し、ω−部位は、アミノ酸位置４９０であることを報告する。したがって、ヒトＰＨ２０のこのモデリングでは、アミノ酸４９１〜５０９は、ＥＲへの輸送後に切断され、ＧＰＩアンカーは、位置４９０のセリン残基と共有結合している。
【０１８２】
２．機能
ＰＨ２０は、単一の精巣特異的遺伝子から精子において正常に発現される。ＰＨ２０は、受精に関与している精子関連タンパク質である。ＰＨ２０は、普通、精子表面に、およびリソソーム由来先体中に局在し、そこでは、内先体膜と結合している。ＰＨ２０は、多機能性であり、ヒアルロニダーゼ活性、ヒアルロナン（ＨＡ）媒介性細胞シグナル伝達活性を示し、先体反応した（ＡＲ）精子上に存在する場合に卵母細胞の周囲の透明帯の精子受容体として作用する。例えば、ＰＨ２０は、天然に、精子−卵子接着に関与しており、ヒアルロン酸を消化することによって卵丘細胞の層の精子による浸透を補助する。ＰＨ２０は、ヒアルロニダーゼであることに加えて、ＨＡ誘導性細胞シグナル伝達の受容体、卵母細胞の周囲の透明帯の受容体でもあると思われる。ＰＨ２０は、受精におけるＰＨ２０の役割のために、免疫避妊の抗原として使用できる。
【０１８３】
ＰＨ２０は、いくつかの場合には酸性活性活性を示し得るが、中性活性ヒアルロニダーゼである。ＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性は、細胞膜結合性および内先体膜結合性ＰＨ２０によって示される。細胞膜ＰＨ２０は、中性ｐＨでヒアルロニダーゼ活性のみを示すのに対し、内先体膜結合性ＰＨ２０は、酸性活性酵素活性を示す。これらの相違の構造的基礎は、ＰＨ２０中の２つの触媒部位の存在によるものである。第１の触媒部位は、ペプチド１領域と命名され、配列番号６のアミノ酸残基１４２〜１７２に対応し、中性ｐＨでのＰＨ２０の酵素活性に関与している。第２の触媒部位は、ペプチド３領域と命名され、配列番号６のアミノ酸残基２７７〜２９７に対応し、低ｐＨでの酵素活性に関与している。内先体膜結合性ＰＨ２０の構造の変化は、先体反応後に起こり、それによって、ＰＨ２０は、細胞内タンパク質分解によって切断されるが、ジスルフィド結合によって一緒に保たれる。細胞内タンパク質分解の結果は、ペプチド３領域が活性化され、したがって、ＰＨ２０の中性および酸性活性を達成し得るということである（例えば、Cherr et al. (2001) Matrix Biology, 20:515-525を参照のこと。また、先体反応後に、内先体膜からの放出によって低分子量形態が生じる（例えば、サルでは、ＰＨ２０の５３ｋＤａの可溶性形態が生じる）。低分子量形態（複数可）もまた酸性活性である。
【０１８４】
ＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性は、薬物の分散および吸収を高めるために数十年間臨床的に使用されてきた動物精巣抽出物において観察される拡延活性の主要因となっている（例えば、Bookbinder et al. (2006) J Controlled Release, 114:230-241を参照のこと）。例えば、ヒアルロニダーゼを含有する医薬品が、拡延剤として、またその他の適用において治療的使用するために、ウシ精巣から分画抽出物として開発された（Schwartzman (1951) J. Pediat., 39:491-502）。元のウシ精巣抽出物調製物は、例えば、商標Ｗｙｄａｓｅ（登録商標）、Ｈｙｌａｓｅ（登録商標）、「Ｄｅｓｓａｕ」、Ｎｅｏｐｅｒｍｅａｓｅ（登録商標）、Ａｌｉｄａｓｅ（登録商標）およびＨｙａｚｙｍｅ（登録商標）の下で販売される抽出物を含んでいた。今では、精巣抽出物調製物の拡延活性が、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ活性によるものであるということは公知である。例えば、２００１年に、雄ウシにおける精子ヒアルロニダーゼが、ヒアルロニダーゼＰＨ２０として同定された（Lalancette et al. (2001) Biol. Reprod., 65:628-36）。ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸の加水分解を触媒することによって、ヒアルロン酸の粘度を低下させ、それによって、組織透過性を高める。したがって、ＰＨ２０の可溶性形態は、その他の薬剤、薬物およびタンパク質とともに、その分散およびデリバリーを増強するために、また同時に投与される薬剤、薬物またはタンパク質の薬物動態および薬力学的プロフィールを改善するために拡延剤または分散剤として使用される（例えば、米国特許第７，７６７，４２９号；Bookbinder et al. (2006) J Controlled Release, 114:230-241を参照のこと）。
【０１８５】
３．可溶性ＰＨ２０ポリペプチド
ＰＨ２０は、膜結合性形態または膜会合性形態で存在する場合も、細胞から発現されるときに培地中に分泌される場合もあり、それによって、可溶性形態で存在する場合もある。可溶性ＰＨ２０は、それだけには限らないが、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４アッセイを使用するものを含めた、当技術分野で周知の方法を使用して、不溶性の、膜結合性ＰＨ２０から検出および識別され得る。このアッセイでは、可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、３７℃に加温したＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４溶液の水相に分配される（Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7）、一方、膜に固定されたＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、洗浄剤が豊富な相へ分配される。したがって、ＰＨ２０ポリペプチドが天然にＧＰＩによって固定される、したがって、膜結合性であるかどうかを評価するためのアルゴリズムを使用することに加えて、溶解度実験も実施され得る。
【０１８６】
可溶性ＰＨ２０酵素は、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列を含有するが、膜と緩く結合しているヒアルロニダーゼを含み、その結果、ホスホリパーゼ感受性アンカーを含有しない。例えば、可溶性ＰＨ２０ポリペプチドとして、ヒツジまたはウシＰＨ２０が挙げられる。このような可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼの種々の形態は、ヒトを含めた対象において治療的に使用するために調製され、承認されている。例えば、動物由来ヒアルロニダーゼ調製物として、Ｖｉｔｒａｓｅ（登録商標）（ＩＳＴＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、精製ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼおよびＡｍｐｈａｄａｓｅ（登録商標）（Ａｍｐｈａｓｔａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ウシ精巣ヒアルロニダーゼが挙げられる。可溶性ＰＨ２０酵素はまた、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー結合シグナル配列の１個または複数のアミノ酸残基を欠くが、ヒアルロニダーゼ活性は保持する、非ヒトまたはヒト膜会合性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼの切断形態を含む（例えば、米国特許第７，７６７，４２９号；米国公開番号ＵＳ２０１００１４３４５７を参照のこと）。したがって、これらのポリペプチドは、ＥＲにおいてタンパク質のＣ末端と共有結合しているＧＰＩアンカーを有する、および細胞膜の細胞外リーフレットに固定される代わりに、細胞から発現されるときに分泌され、可溶性である。ポリペプチドが、可溶性であり（すなわち、細胞から発現されるときに分泌される）、活性であるという条件で、可溶性ヒアルロナン分解酵素が、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列の一部を保持する事例では、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸残基を保持し得る。
【０１８７】
Ｃ末端切断型であり、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列のすべてまたは一部を欠く例示的可溶性ヒアルロニダーゼとして、それだけには限らないが、霊長類起源のＰＨ２０ポリペプチド、例えば、ヒトおよびチンパンジーＰＨ２０ポリペプチドなどが挙げられる。例えば、可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号７、１０、１２、１４、６９、７２、８５７、８５９、８６１もしくは８７０に示されるポリペプチドまたは配列番号７、１０、１２、１４、６９、７２、８５７、８５９、８６１もしくは８７０のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の配列同一性を示すその変異体のＣ末端の切断によって製造され得、これでは得られたポリペプチドは、活性であり、可溶性であり、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列に由来するアミノ酸残基のすべてまたは一部を欠く。
【０１８８】
例示的可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、成熟している（シグナル配列を欠く）、可溶性であり、天然活性を示し、配列番号６に示されるアミノ酸の配列のアミノ酸残基４６４で、またはその後で、Ｃ末端切断されたアミノ酸残基を最小に有する配列番号６または配列番号７に示されるアミノ酸の配列の連続配列を含有する、Ｃ末端切断型ヒトＰＨ２０ポリペプチドである。例えば、可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸３６〜４６４の連続配列を最小に含有するか、または配列番号６のアミノ酸４６４後のＣ末端アミノ酸残基を有するアミノ酸の連続配列に対して少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、ヒアルロニダーゼ活性を保持するＣ末端切断型ポリペプチドを含む。例示的Ｃ末端切断型ヒトＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸の配列の４６４後、例えば、アミノ酸位置４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９または５００後のＣ末端残基を有する配列番号６に示されるアミノ酸の連続配列を含む、成熟しているポリペプチド（シグナル配列を欠く）またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列同一性を示し、ヒアルロニダーゼ活性を保持するその変異体である。例えば、例示的Ｃ末端ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸の配列のアミノ酸３６〜４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９もしくは５００の配列またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列同一性を示し、ヒアルロニダーゼ活性を保持するその変異体を有する。可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号３もしくは３２〜６６に示されるアミノ酸の配列または配列番号３もしくは３２〜６６に示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する任意のものを含む。
【０１８９】
特に、可溶性ヒトＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号６に示される配列のアミノ酸４８２後で切断されたポリペプチドである。このようなポリペプチドは、例えば、配列番号１（ＩｇＧκシグナル配列を含有する）または配列番号６７（天然のシグナル配列を含有する）に示されるような、シグナル配列およびコードするアミノ酸３６〜４８２を含有する核酸分子から作製され得る。翻訳後プロセシングによって、シグナル配列が除去され、４４７個のアミノ酸の可溶性組換えヒトＰＨ２０（配列番号３）が残る。配列番号４または５に示され、配列番号６７に示される核酸分子を含有するベクターの発現の際に生じる生成物は、Ｃ末端に不均一性を示す、培養培地中にｒＨｕＰＨ２０と命名された分泌生成物をもたらし、その結果、生成物は、種々の存在量で配列番号３および４４〜４８のうち任意の１種または複数を含み得る種の混合物を含む。通常、ｒＨｕＰＨ２０は、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ細胞（例えば、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞）などの、正しいＮ−グリコシル化を促進し、活性を保持する細胞において産生される。Ｈｙｌｅｎｅｘ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ）は、切断型ヒトＰＨ２０ポリペプチド（ｒＨｕＰＨ２０と命名された）をコードする核酸を含有する遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生されるヒト組換えヒアルロニダーゼである。
【０１９０】
Ｃ．修飾ＰＨ２０ポリペプチド
修飾または変異体ＰＨ２０ポリペプチドが本明細書において提供される。本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、野生型、天然または参照ＰＨ２０ポリペプチドと比較して変更された活性または特性を示す。本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドの中に、活性突然変異体であり、それによって、アミノ酸修飾（例えば、アミノ酸置換）を含有しない対応するＰＨ２０ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の少なくとも４０％を示すＰＨ２０ポリペプチドが含まれる。特に、ヒアルロニダーゼ活性を示し、アミノ酸修飾を含有しないＰＨ２０と比較して増大した安定性を示す、ＰＨ２０ポリペプチドが、本明細書において提供される。また、不活性であり、例えば、避妊ワクチンにおいて抗原として使用され得る修飾ＰＨ２０ポリペプチドも提供される。
【０１９１】
修飾は、単一アミノ酸置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ）（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ））、挿入または欠失などの単一アミノ酸修飾である場合も、複数のアミノ酸置換、挿入または欠失などの複数アミノ酸修飾である場合もある。例示的修飾として、単一または複数のアミノ酸置換を含めたアミノ酸置換がある。アミノ酸置換は、表２に示されるものなどの保存的置換である場合も、本明細書に記載される任意のものなどの非保存的置換である場合もある。本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、修飾を含有しないＰＨ２０ポリペプチドと比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくはそれ以上または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくはそれ以上の修飾位置を含有し得る。
【０１９２】
本明細書に記載された修飾は、修飾形態がヒアルロニダーゼ活性を示す限り、前駆体、成熟した、またはＣ末端切断形態を含めた任意のＰＨ２０ポリペプチド中にあり得る。例えば、ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号２、３、６〜６６、６８〜７２、８５６〜８６１、８６９もしくは８７０のいずれかに示される野生型、天然または参照ＰＨ２０ポリペプチドと比較して、または配列番号３、６〜６６、６８〜７２、８５６〜８６１、８６９もしくは８７０のいずれかに対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸の配列を有するポリペプチド中に修飾を含有する。例えば、修飾は、配列番号７、配列番号６９または配列番号７２を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するヒトＰＨ２０ポリペプチド；配列番号１６もしくは１８を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するウシＰＨ２０ポリペプチド；配列番号２４を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するウサギＰＨ２０ポリペプチド；配列番号１４を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するカニクイザルＰＨ２０ポリペプチド；配列番号２９を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するモルモットＰＨ２０ポリペプチド；配列番号２２を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するラットＰＨ２０ポリペプチド；配列番号２０を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するマウスＰＨ２０ポリペプチド；配列番号１０もしくは８７０を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するチンパンジーＰＨ２０ポリペプチド；配列番号１２を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するアカゲザルＰＨ２０ポリペプチド；配列番号３１を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するキツネＰＨ２０ポリペプチド；配列番号８５７を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するテナガザルＰＨ２０ポリペプチド；配列番号８５９を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するマーモセットＰＨ２０ポリペプチド；配列番号８６１を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するオランウータンＰＨ２０ポリペプチド；または配列番号２５〜２７を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するヒツジＰＨ２０ポリペプチドにおいて；または配列番号７、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４〜２７、２９、３１、６９、７２、８５７、８５９、８６１もしくは８７０のいずれかに対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列変異体もしくは切断型変異体において行われる。
【０１９３】
特に、配列番号３、７、３２〜６６、６９もしくは７２に示されるＰＨ２０ポリペプチドまたは配列番号３、７、３２〜６６、６９もしくは７２のいずれかに対して少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸の配列を有するポリペプチドと比較して修飾を含有するＰＨ２０ポリペプチドが、本明細書において提供される。例えば、本明細書において提供された修飾は、配列番号１０、１２、１４、２４、８５７、８５９、８６１または８７０として示されるＰＨ２０ポリペプチドにおいて行われ得る。
【０１９４】
特に、本明細書において提供された修飾を含有するＰＨ２０ポリペプチドであり、細胞から発現されると、可溶性タンパク質として培地中に分泌される修飾された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドが、本明細書において提供される。例えば、修飾は、ＧＰＩアンカーシグナル配列を含有するＰＨ２０ポリペプチドのＧＰＩアンカーシグナル配列を含有するＣ末端部分内またはその付近でＣ末端で切断されている可溶性ＰＨ２０ポリペプチドにおいて行われる。Ｃ末端の切断は、得られるＣ末端で切断されたポリペプチドが、ヒアルロニダーゼ活性を示し、発現された場合に細胞から分泌される（例えば、培地中に）限り、Ｃ末端での８個の連続するアミノ酸の、Ｃ末端での９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個またはそれ以上のアミノ酸の切断または欠失であり得る。いくつかの例では、本明細書において提供された修飾は、配列番号７、１０、１２、１４、６９、７２、８５７、８５９、８６１もしくは８７０のいずれかに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す、配列番号７、１０、１２、１４、６９、７２、８５７、８５９、８６１もしくは８７０のＣ末端で切断されたポリペプチドまたはその変異体である可溶性ＰＨ２０ポリペプチドにおいて行われる。特に、本明細書において提供された修飾は、配列番号３もしくは３２〜６６に示されるアミノ酸の配列または配列番号３もしくは３２〜６６のいずれかに示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する、可溶性またはＣ末端で切断されたヒトＰＨ２０ポリペプチドにおいて行われる。例えば、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号３に示されるＰＨ２０ポリペプチドに関連して、アミノ酸置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ）または置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）、付加または欠失、切断およびそれらの組合せを含有する。
【０１９５】
修飾はまた、配列番号３、７、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４〜２７、２９、３１、３２〜６６、６９、７２、８５７、８５９、８６１または８７０のいずれかのシグナルペプチドを含有する対応する前駆体形態において行われ得る。例えば、本明細書において提供された修飾は、配列番号２、６、８、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２８、３０、８５６、８５８、８６０もしくは８６９のいずれかまたは配列番号２、６、８、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２８、３０、８５６、８５８、８６０もしくは８６９のいずれかに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すその変異体において示される前駆体形態において行われ得る。
【０１９６】
本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドの例では、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号３〜６６、６８〜７２、８５６〜８６１、８６９または８７０のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有しない。通常、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、ヒトＰＨ２０ポリペプチドであり、配列番号８〜３１、８５６〜８６１、８６９または８７０のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有しない。
【０１９７】
一般に、ＰＨ２０ポリペプチドでは、アミノ酸置換、欠失または置換などの任意の修飾が行われ得るが、ただし、修飾は、唯一の修飾が、Ｖ１２Ａ、Ｎ４７Ａ、Ｄ１１１Ｎ、Ｅ１１３Ｑ、Ｎ１３１Ａ、Ｒ１７６Ｇ、Ｎ２００Ａ、Ｎ２１９Ａ、Ｅ２４９Ｑ、Ｒ２５２Ｔ、Ｎ３３３ＡまたはＮ３５８Ａである単一のアミノ酸置換であるアミノ酸置換ではない。また、修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、２つのみのアミノ酸置換を含有する場合には、アミノ酸置換は、Ｐ１３Ａ／Ｌ４６４Ｗ、Ｎ４７Ａ／Ｎ１３１Ａ、Ｎ４７Ａ／Ｎ２１９Ａ、Ｎ１３１Ａ／Ｎ２１９ＡまたはＮ３３３Ａ／Ｎ３５８Ａではない。さらなる例では、修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、３つのみのアミノ酸置換を含有する場合には、アミノ酸置換は、Ｎ４７Ａ／Ｎ１３１Ａ／Ｎ２１９Ａではない。本明細書において提供される例示的修飾を、以下に詳細に記載する。
【０１９８】
本明細書における目的上、アミノ酸置換または置換を含めた本明細書における修飾の位置およびアミノ酸への言及は、配列番号３に示されるＰＨ２０ポリペプチドに関連してである。配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４〜２７、２８、２９、３０、３１、３２〜６６、６８〜７２、８５６、８５７、８５８、８５９、８６０、８６１、８６９もしくは８７０に示されるいずれか、または配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４〜２７、２８、２９、３０、３１、３２〜６６、６８〜７２、８５６、８５７、８５８、８５９、８６０、８６１、８６９もしくは８７０のいずれかに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すその変異体など、別のＰＨ２０ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基を同定することによって別のＰＨ２０ポリペプチドにおいて本明細書において提供された修飾のいずれかを作製することは当業者のレベルの範囲内である。別のＰＨ２０ポリペプチド中の対応する位置は、ＰＨ２０ポリペプチドの、配列番号３に示されるＰＨ２０ポリペプチドに関するアラインメントによって同定され得る。例えば、図２は、例示的ＰＨ２０ポリペプチドの、配列番号３とのアラインメントおよび例示的な対応する位置の同定を表す。また、配列番号３、７、３２〜６６、６９および７２は、異なるＣ末端アミノ酸残基を有する成熟ヒトＰＨ２０のすべての形態であり、配列番号７、３２〜６６、６９および７２のいずれかにおけるアミノ酸残基の番号付けは、配列番号３と同一であり、したがって、各々の対応する残基は、配列番号３に示されるものと同一である（例えば、図１参照のこと）。さらに、配列番号２、６、７０または７１のいずれかに示される配列番号は、シグナル配列の存在のみによって異なるその前駆体形態である。修飾（例えば、アミノ酸置換）の目的上、対応するアミノ酸残基は、任意のアミノ酸残基であり得、配列番号３に示される残基と同一である必要はない。通常、配列番号３中の残基とのアラインメントによって同定される対応するアミノ酸残基は、配列番号３と同一であるアミノ酸残基か、それに対する保存的もしくは半保存的アミノ酸残基である（例えば、図２参照のこと）。また、本明細書において提供された例示的置換は、置換が、ＰＨ２０ポリペプチドの非修飾形態において存在するのと異なる限り、ＰＨ２０ポリペプチド中の対応する残基で行われ得ると理解される。この説明および本明細書中の他の場所での説明に基づいて、記載された突然変異の任意の１種または複数を含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドを作製することおよび本明細書において記載されたような特性または活性について各々を試験することは、当業者のレベル内にある。
【０１９９】
ＰＨ２０ポリペプチドにおける修飾はまた、一次配列の修飾およびポリペプチドの一次配列にはない修飾を含めたその他の修飾も含有するＰＨ２０ポリペプチドに行われ得る。例えば、本明細書に記載された修飾は、融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドであるＰＨ２０ポリペプチドにおいてであり得る。本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドはまた、ＰＥＧ試薬などのポリマーとコンジュゲートしているポリペプチドも含む。
【０２００】
また、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子が、本明細書において提供される。特定の例では、核酸配列は、例えば、コードされた配列の発現レベルを高めるようコドン最適化され得る。特定のコドン使用は、修飾ポリペプチドが発現される宿主生物に依存している。当業者ならば、哺乳類またはヒト細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含めた細菌または酵母における発現にとっての最適コドンに精通している。例えば、コドン使用情報は、kazusa.or.jp.codon（データベースの説明についてはRichmond (2000) Genome Biology, 1:reports241を参照のこと）で入手可能なコドン使用データベース（Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）から入手可能である。Forsburg (1994) Yeast, 10:1045-1047; Brown et al. (1991) Nucleic Acids Research, 19:4298; Sharp et al. (1988) Nucleic Acids Res., 12:8207-8211; Sharp et al. (1991) Yeast, 657-78も参照のこと）。いくつかの例では、コードする核酸分子は、ポリペプチドの発現および分泌を変更する（例えば、高める）ために異種シグナル配列を含有するよう修飾され得る。異種シグナル配列の例示的なものとして、ＩｇＧκシグナル配列をコードする核酸（配列番号８６８に示される）がある。
【０２０１】
本明細書において提供された修飾ポリペプチドおよびコードする核酸分子は、当業者公知の標準組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。標的タンパク質中の任意の１種または複数種のアミノ酸の突然変異を達成するための当技術分野で公知の任意の方法が使用され得る。方法として、コードする核酸分子の標準的な部位指定またはランダム突然変異誘発または固相ポリペプチド合成法が挙げられる。例えば、ＰＨ２０ポリペプチドをコードする核酸分子は、コードする核酸のランダム突然変異誘発などの突然変異誘発、エラープローンＰＣＲ、位置指定突然変異誘発、オーバーラップＰＣＲ、遺伝子シャッフリングまたはその他の組換え法に付され得る。次いで、ポリペプチドをコードする核酸は、異種性に発現されるよう宿主細胞に導入され得る。したがって、本明細書において提供された修飾ポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子もまた本明細書において提供される。いくつかの例では、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、固相または液相ペプチド合成を使用してなど、合成によって産生される。
【０２０２】
以下の小区分では、本明細書において提供される、特性および活性の変更を示す例示的修飾ＰＨ２０ポリペプチドおよびコードする核酸分子を記載する。
【０２０３】
１．活性突然変異体
ＰＨ２０ポリペプチド中に１種または複数種のアミノ酸置換を含有し、ヒアルロニダーゼ活性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、本明細書において提供される。修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号３または７に示されるポリペプチドなど、野生型または参照ＰＨ２０ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の４０％〜５０００％を示し得る。例えば、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、野生型または参照ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、アミノ酸修飾（例えば、アミノ酸置換）を含有しない対応するポリペプチド、例えば、配列番号３または７に示されるポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の少なくとも４０％、例えば、ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、３０００％またはそれ以上を示す。例えば、例えば、アミノ酸置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）または置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）によって、修飾され得る例示的位置として、それだけには限らないが、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して位置1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、20、22、23、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、54、58、59、60、61、63、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、77、79、81、82、83、84、85、86、87、89、90、91、92、93、94、96、97、98、99、102、103、104、105、106、107、108、110、114、117、118、119、120、122、124、125、127、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、186、192、193、195、196、197、198、200、202、204、205、206、208、209、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、224、226、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、245、247、248、251、253、255、256、257、258、259、260、261、263、264、265、266、267、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、297、298、300、301、302、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、320、321、323、324、325、326、327、328、331、334、335、338、339、342、343、347、348、349、351、353、356、357、358、359、360、361、367、368、369、371、373、374、375、376、377、378、379、380、381、383、385、387、388、389、391、392、393、394、395、396、397、398、399、401、403、404、405、406、407、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、425、426、427、428、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446または447に対応する位置のいずれかが挙げられる。通常、ＰＨ２０ポリペプチド中の上記の位置のいずれかに対応する位置で修飾される（例えば、別のアミノ酸で置換される）アミノ酸残基は、配列番号３に示されるアミノ酸残基の同一残基、保存的残基または半保存的アミノ酸残基である。
【０２０４】
ヒアルロニダーゼ活性を保持するために、修飾は、通常、変化に対してあまり寛容でない、ヒアルロニダーゼ活性に必要な位置では行われない。例えば、一般に、修飾は、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して位置7、16、17、18、19、21、25、53、55、56、57、62、64、76、78、80、88、95、100、101、109、111、112、113、115、116、121、123、126、129、185、187、188、189、190、191、194、199、201、203、207、210、223、225、227、228、229、241、243、244、246、249、250、252、254、262、268、282、295、296、298、299、303、319、322、329、330、332、333、336、337、340、341、344、345、346、350、352、354、355、362、363、364、365、366、370、372、382、384、386、390、400、402、408、423、424、429、430、431に対応する位置では行われない。また、修飾が、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して位置2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、20、22、23、27、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、54、58、59、60、61、63、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、77、79、81、82、83、84、85、86、87、89、90、91、92、94、96、98、99、102、103、104、105、106、107、108、110、114、117、118、119、122、124、125、127、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、143、144、145、149、150、152、153、154、155、156、157、158、159、161、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、186、192、193、195、197、198、200、202、204、206、208、209、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、224、226、230、231、232、233、234、235、236、238、239、240、242、245、247、248、251、253、255、256、257、258、260、261、263、264、265、266、267、269、270、271、272、273、274、275、276、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、297、298、300、301、302、304、305、306、307、308、310、311、312、313、314、315、316、317、318、320、321、323、324、325、326、327、331、334、335、338、339、342、343、347、348、349、351、353、356、357、358、359、360、361、367、368、369、371、373、374、375、376、377、378、379、380、381、383、385、387、388、389、391、392、393、394、395、396、397、398、399、401、403、404、405、406、410、411、412、413、414、415、416、417、419、420、422、425、426、427、428、431、432、434、437、438、439、440、441、442、443、444、または447のいずれかで行われる例では、修飾（複数可）は、不活性ポリペプチドをもたらすアミノ酸置換である、本明細書において表５または１０に示される対応するアミノ酸置換（複数可）ではない。例えば、修飾が、配列番号３に関連して位置２に対応する位置における修飾である場合には、修飾は、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、トリプトファン（Ｗ）またはチロシン（Ｙ）への置換ではない。
【０２０５】
上記の対応する位置のいずれかでの例示的アミノ酸置換は、表３に示される。表３中の対応するアミノ酸位置への言及は、配列番号３に示される位置に関してである。置換は、配列番号３に示される配列とのアラインメントによって別のＰＨ２０ポリペプチド中の対応する位置で行われ得（例えば、図１および２参照のこと）、それによって、対応する位置は、アラインされた位置であると理解される。特定の例では、アミノ酸置換（複数可）は、得られる修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、アミノ酸置換を含有しない対応するＰＨ２０ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の少なくとも４０％を示す限り、配列番号２、３、６〜６６、６８〜７２、８５６〜８６１、８６９または８７０のいずれかに示されるようなＰＨ２０ポリペプチドまたはそれに対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体中の対応する位置であり得る。特に、置換（複数可）は、ヒトＰＨ２０ポリペプチド、例えば、配列番号３、７、３２〜６６、６９または７２のいずれかに示されるいずれか、または配列番号３、７、３２〜６６、６９または７２のいずれかに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すその変異体中の対応する位置においてであり得る。一例では、置換のうち任意の１種または複数は、得られる修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、配列番号３に示されるＰＨ２０ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の少なくとも４０％を示す限り、配列番号３においてである。
【０２０６】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
0006422933.tif 000007
【０２０７】
特定の例では、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して1、6、8、9、10、11、12、14、15、20、22、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、46、47、48、49、50、52、58、59、63、67、68、69、70、71、72、73、74、75、79、82、83、84、86、87、89、90、92、93、94、97、102、104、107、114、118、120、127、128、130、131、132、135、138、139、140、141、142、143、144、146、147、148、149、150、151、152、155、156、158、160、162、163、164、165、166、167、169、170、172、173、174、175、178、179、193、195、196、198、204、205、206、209、212、213、215、219、220、221、222、232、233、234、235、236、237、238、240、247、248、249、257、258、259、260、261、263、267、269、271、272、273、274、276、277、278、279、282、283、285、287、289、291、292、293、298、305、307、308、309、310、313、314、315、317、318、320、321、324、325、326、328、335、347、349、351、353、356、359、367、368、369、371、373、374、375、376、377、380、381、383、385、389、392、393、395、396、399、401、404、405、406、407、409、410、412、416、418、419、421、425、427、428、431、433、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446または447に対応する位置（単数または複数）にアミノ酸置換（単数または複数）を含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、本明細書において提供される。例えば、アミノ酸位置は、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、位置１（Ｌ１）、P6、V8、I9、P10、N11、V12、F14、L15、A20、S22、F24、L26、G27、K28、F29、D30、E31、P32、L33、D34、M35、S36、L37、F38、S39、F40、I41、I46、N47、A48、T49、G50、G52、V58、D59、Y63、I67、D68、S69、I70、T71、G72、V73、T74、V75、I79、K82、I83、S84、G86、D87、L89、D90、A92、K93、K94、T97、V102、N104、M107、E114、T118、A120、D127、V128、K130、N131、R132、E135、Q138、Q139、Q140、N141、V142、Q143、L144、L146、T147、E148、A149、T150、E151、K152、Q155、E156、E158、A160、K162、D163、F164、L165、V166、E167、I169、K170、G172、K173、L174、L175、N178、H179、H193、K195、K196、G198、F204、N205、V206、K209、D212、D213、S215、N219、E220、S221、T222、T232、Q233、Q234、S235、P236、V237、A238、T240、V247、R248、E249、P257、D258、A259、K260、S261、L263、A267、T269、I271、V272、F273、T274、Q276、V277、L278、K279、S282、Q283、E285、V287、T289、G291、E292、T293、A298、G305、L307、S308、I309、M310、M313、K314、S315、L317、L318、D320、N321、E324、T325、I326、N328、T335、Q347、Q349、V351、I353、N356、S359、P367、D368、N369、A371、Q373、L374、E375、K376、G377、F380、T381、R383、K385、E389、E392、Q393、S395、E396、Y399、S401、S404、T405、L406、S407、K409、E410、A412、D416、D418、A419、D421、A425、G427、A428、D431、F433、P436、P437、M438、E439、T440、E441、E442、P443、Q444、I445、F446またはY447のロイシン（Ｌ）の置換に対応する位置の置換であり得る。
【０２０８】
本明細書において提供される修飾ＰＨ２０ポリペプチド中の例示的アミノ酸置換として、それだけには限らないが、各々、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、位置１に対応する位置におけるヒスチジン（Ｈ）、位置１に対応する位置におけるＡ、位置１に対応する位置におけるＥ、位置１に対応する位置におけるＧ、位置１に対応する位置におけるＫ、位置１に対応する位置におけるＱ、位置１に対応する位置におけるＲ、位置６に対応する位置におけるＡ、位置８に対応する位置におけるＭ、位置９に対応する位置におけるＱ、位置１０に対応する位置におけるＧ、位置１０に対応する位置におけるＨ、位置１１に対応する位置におけるＳ、位置１２に対応する位置におけるＥ、位置１２に対応する位置におけるＩ、位置１２に対応する位置におけるＫ、位置１２に対応する位置におけるＴ、位置１４に対応する位置におけるＶ、位置１５に対応する位置におけるＶ、位置１５に対応する位置におけるＭ、位置２０に対応する位置におけるＳ、位置２２に対応する位置におけるＴ、位置２４に対応する位置におけるＥ、位置２４に対応する位置におけるＨ、位置２４に対応する位置におけるＲ、位置２６に対応する位置におけるＡ、位置２６に対応する位置におけるＥ、位置２６に対応する位置におけるＫ、位置２６に対応する位置におけるＭ、位置２６に対応する位置におけるＱ、位置２６に対応する位置におけるＲ、位置２７に対応する位置におけるＤ、位置２７に対応する位置におけるＫ、位置２７に対応する位置におけるＲ、位置２８に対応する位置におけるＲ、位置２９に対応する位置におけるＥ、位置２９に対応する位置におけるＩ、位置２９に対応する位置におけるＫ、位置２９に対応する位置におけるＬ、位置２９に対応する位置におけるＭ、位置２９に対応する位置におけるＰ、位置２９に対応する位置におけるＲ、位置２９に対応する位置におけるＳ、位置２９に対応する位置におけるＴ、位置２９に対応する位置におけるＶ、位置３０に対応する位置におけるＧ、位置３０に対応する位置におけるＨ、位置３０に対応する位置におけるＫ、位置３０に対応する位置におけるＬ、位置３０に対応する位置におけるＭ、位置３０に対応する位置におけるＲ、位置３０に対応する位置におけるＳ、位置３１に対応する位置におけるＡ、位置３１に対応する位置におけるＣ、位置３１に対応する位置におけるＧ、位置３１に対応する位置におけるＨ、位置３１に対応する位置におけるＩ、位置３１に対応する位置におけるＫ、位置３１に対応する位置におけるＬ、位置３１に対応する位置におけるＰ、位置３１に対応する位置におけるＲ、位置３１に対応する位置におけるＳ、位置３１に対応する位置におけるＴ、位置３１に対応する位置におけるＶ、位置３１に対応する位置におけるＷ、位置３２に対応する位置におけるＣ、位置３２に対応する位置におけるＦ、位置３２に対応する位置におけるＧ、位置３２に対応する位置におけるＨ、位置３３に対応する位置におけるＷ、位置３３に対応する位置におけるＧ、位置３４に対応する位置におけるＷ、位置３５に対応する位置におけるＱ、位置３５に対応する位置におけるＶ、位置３６に対応する位置におけるＨ、位置３６に対応する位置におけるＮ、位置３７に対応する位置におけるＦ、位置３７に対応する位置におけるＭ、位置３８に対応する位置におけるＹ、位置３９に対応する位置におけるＡ、位置３９に対応する位置におけるＬ、位置３９に対応する位置におけるＮ、位置３９に対応する位置におけるＴ、位置４０に対応する位置におけるＬ、位置４１に対応する位置におけるＴ、位置４６に対応する位置におけるＬ、位置４６に対応する位置におけるＲ、位置４７に対応する位置におけるＤ、位置４７に対応する位置におけるＦ、位置４７に対応する位置におけるＴ、位置４７に対応する位置におけるＷでの、位置４８に対応する位置におけるＦ、位置４８に対応する位置におけるＨ、位置４８に対応する位置におけるＫ、位置４８に対応する位置におけるＮ、位置４９に対応する位置におけるＲ、位置５０に対応する位置におけるＤ、位置５０に対応する位置におけるＳ、位置５０に対応する位置におけるＭ、位置５２に対応する位置におけるＮ、位置５２に対応する位置におけるＱ、位置５２に対応する位置におけるＲ、位置５２に対応する位置におけるＳ、位置５２に対応する位置におけるＴ、位置５８に対応する位置におけるＣ、位置５８に対応する位置におけるＫ、位置５８に対応する位置におけるＬ、位置５８に対応する位置におけるＰ、位置５８に対応する位置におけるＱ、位置５８に対応する位置におけるＲ、位置５８に対応する位置におけるＨ、位置５８に対応する位置におけるＮ、位置５８に対応する位置におけるＹ、位置５９に対応する位置におけるＮ、位置６３に対応する位置におけるＫ、位置６３に対応する位置におけるＬ、位置６３に対応する位置におけるＭ、位置６３に対応する位置におけるＲ、位置６３に対応する位置におけるＷ、位置６７に対応する位置におけるＶ、位置６８に対応する位置におけるＨ、位置６８に対応する位置におけるＰ、位置６８に対応する位置におけるＱ、位置６９に対応する位置におけるＡ、位置６９に対応する位置におけるＣ、位置６９に対応する位置におけるＥ、位置６９に対応する位置におけるＦ、位置６９に対応する位置におけるＧ、位置６９に対応する位置におけるＩ、位置６９に対応する位置におけるＬ、位置６９に対応する位置におけるＭ、位置６９に対応する位置におけるＰ、位置６９に対応する位置におけるＲ、位置６９に対応する位置におけるＴ、位置６９に対応する位置におけるＷ、位置６９に対応する位置におけるＹ、位置７０に対応する位置におけるＡ、位置７０に対応する位置におけるＣ、位置７０に対応する位置におけるＦ、位置７０に対応する位置におけるＧ、位置７０に対応する位置におけるＨ、位置７０に対応する位置におけるＫ、位置７０に対応する位置におけるＬ、位置７０に対応する位置におけるＮ、位置７０に対応する位置におけるＰ、位置７０に対応する位置におけるＲ、位置７０に対応する位置におけるＳ、位置７０に対応する位置におけるＴ、位置７０に対応する位置におけるＶ、位置７０に対応する位置におけるＹ、位置７１に対応する位置におけるＧ、位置７１に対応する位置におけるＮ、位置７１に対応する位置におけるＲ、位置７１に対応する位置におけるＳ、位置７２に対応する位置におけるＫ、位置７２に対応する位置におけるＭ、位置７２に対応する位置におけるＱ、位置７３に対応する位置におけるＡ、位置７３に対応する位置におけるＨ、位置７３に対応する位置におけるＫ、位置７３に対応する位置におけるＬ、位置７３に対応する位置におけるＱ、位置７３に対応する位置におけるＲ、位置７３に対応する位置におけるＴ、位置７３に対応する位置におけるＷ、位置７４に対応する位置におけるＡ、位置７４に対応する位置におけるＣ、位置７４に対応する位置におけるＥ、位置７４に対応する位置におけるＦ、位置７４に対応する位置におけるＧ、位置７４に対応する位置におけるＨ、位置７４に対応する位置におけるＫ、位置７４に対応する位置におけるＬ、位置７４に対応する位置におけるＭ、位置７４に対応する位置におけるＮ、位置７４に対応する位置におけるＰ、位置７４に対応する位置におけるＲ、位置７４に対応する位置におけるＳ、位置７４に対応する位置におけるＶ、位置７４に対応する位置におけるＷ、位置７５に対応する位置におけるＦ、位置７５に対応する位置におけるＬ、位置７５に対応する位置におけるＭ、位置７５に対応する位置におけるＲ、位置７５に対応する位置におけるＴ、位置７９に対応する位置におけるＬ、位置８２に対応する位置におけるＬ、位置８２に対応する位置におけるＮ、位置８３に対応する位置におけるＶ、位置８３に対応する位置におけるＱ、位置８３に対応する位置におけるＳ、位置８３に対応する位置におけるＧ、位置８４に対応する位置におけるＥ、位置８４に対応する位置におけるＦ、位置８４に対応する位置におけるＧ、位置８４に対応する位置におけるＮ、位置８４に対応する位置におけるＲ、位置８６に対応する位置におけるＡ、位置８６に対応する位置におけるＨ、位置８６に対応する位置におけるＫ、位置８６に対応する位置におけるＮ、位置８６に対応する位置におけるＳ、位置８６に対応する位置におけるＴ、位置８６に対応する位置におけるＷ、位置８７に対応する位置におけるＣ、位置８７に対応する位置におけるＧ、位置８７に対応する位置におけるＬ、位置８７に対応する位置におけるＭ、位置８７に対応する位置におけるＲ、位置８７に対応する位置におけるＳ、位置８７に対応する位置におけるＴ、位置８７に対応する位置におけるＶ、位置８７に対応する位置におけるＹ、位置８９に対応する位置におけるＣ、位置９０に対応する位置におけるＡ、位置９０に対応する位置におけるＥ、位置９０に対応する位置におけるＨ、位置９０に対応する位置におけるＫ、位置９０に対応する位置におけるＮ、位置９０に対応する位置におけるＲ、位置９２に対応する位置におけるＣ、位置９２に対応する位置におけるＬ、位置９３に対応する位置におけるＩ、位置９３に対応する位置におけるＬ、位置９３に対応する位置におけるＱ、位置９３に対応する位置におけるＲ、位置９３に対応する位置におけるＳ、位置９３に対応する位置におけるＴ、位置９４に対応する位置におけるＤ、位置９４に対応する位置におけるＱ、位置９４に対応する位置におけるＲ、位置９７に対応する位置におけるＡ、位置９７に対応するアミノ酸残基でのＣ、位置９７に対応する位置におけるＤ、位置９７に対応する位置におけるＥ、位置９７に対応する位置におけるＧ、位置９７に対応する位置におけるＬ、位置９７に対応する位置におけるＳ、位置１０２に対応する位置におけるＳ、位置１０２に対応する位置におけるＴ、位置１０４に対応する位置におけるＲ、位置１０７に対応する位置におけるＬ、位置１１４に対応する位置におけるＡ、位置１１８に対応する位置におけるＱ、位置１２０に対応する位置におけるＨ、位置１２０に対応する位置におけるＦ、位置１２０に対応する位置におけるＩ、位置１２０に対応する位置におけるＳ、位置１２０に対応する位置におけるＶ、位置１２０に対応する位置におけるＹ、位置１２７に対応する位置におけるＥ、位置１２７に対応する位置におけるＨ、位置１２７に対応する位置におけるＮ、位置１２７に対応する位置におけるＱ、位置１２７に対応する位置におけるＲ、位置１２８に対応する位置におけるＩ、位置１３０に対応する位置におけるＲ、位置１３１に対応する位置におけるＧ、位置１３１に対応する位置におけるＩ、位置１３１に対応する位置におけるＭ、位置１３１に対応する位置におけるＱ、位置１３１に対応する位置におけるＲ、位置１３１に対応する位置におけるＶ、位置１３２に対応する位置におけるＮ、位置１３２に対応する位置におけるＬ、位置１３５に対応する位置におけるＤ、位置１３５に対応する位置におけるＧ、位置１３５に対応する位置におけるＲでの、位置１３８に対応する位置におけるＬ、位置１３９に対応する位置におけるＴ、位置１４０に対応する位置におけるＫ、位置１４１に対応する位置におけるＨ、位置１４１に対応する位置におけるＲ、位置１４１に対応する位置におけるＳ、位置１４１に対応する位置におけるＷ、位置１４１に対応する位置におけるＹ、位置１４２に対応する位置におけるＤ、位置１４２に対応する位置におけるＧ、位置１４２に対応する位置におけるＫ、位置１４２に対応する位置におけるＮ、位置１４２に対応する位置におけるＰ、位置１４２に対応する位置におけるＱ、位置１４２に対応する位置におけるＲ、位置１４２に対応する位置におけるＳ、位置１４２に対応する位置におけるＴ、位置１４３に対応する位置におけるＧ、位置１４３に対応する位置におけるＫ、位置１４４に対応する位置におけるＲ、位置１４４に対応する位置におけるＴ、位置１４６に対応する位置におけるＰ、位置１４６に対応する位置におけるＲ、位置１４７に対応する位置におけるＡ、位置１４７に対応する位置におけるＦ、位置１４７
に対応する位置におけるＬ、位置１４７に対応する位置におけるＲ、位置１４７に対応する位置におけるＳ、位置１４７に対応する位置におけるＶ、位置１４８に対応する位置におけるＨ、位置１４８に対応する位置におけるＫ、位置１４８に対応する位置におけるＱ、位置１４９に対応する位置におけるＴ、位置１４９に対応する位置におけるＶ、位置１５０に対応する位置におけるＡ、位置１５０に対応する位置におけるＤ、位置１５０に対応する位置におけるＧ、位置１５０に対応する位置におけるＮ、位置１５０に対応する位置におけるＳ、位置１５０に対応する位置におけるＷ、位置１５０に対応する位置におけるＹ、位置１５１に対応する位置におけるＡ、位置１５１に対応する位置におけるＨ、位置１５１に対応する位置におけるＫ、位置１５１に対応する位置におけるＬ、位置１５１に対応する位置におけるＭ、位置１５１に対応する位置におけるＱ、位置１５１に対応する位置におけるＲ、位置１５１に対応する位置におけるＳ、位置１５１に対応する位置におけるＴ、位置１５１に対応する位置におけるＶ、位置１５１に対応する位置におけるＷ、位置１５１に対応する位置におけるＹ、位置１５２に対応する位置におけるＲ、位置１５２に対応する位置におけるＴ、位置１５２に対応する位置におけるＷ、位置１５５に対応する位置におけるＤ、位置１５５に対応する位置におけるＧ、位置１５５に対応する位置におけるＫ、位置１５５に対応する位置におけるＲ、位置１５６に対応する位置におけるＤ、位置１５８に対応する位置におけるＱ、位置１５８に対応する位置におけるＳ、位置１６０に対応する位置におけるＳ、位置１６２に対応する位置におけるＥ、位置１６３に対応する位置におけるＡ、位置１６３に対応する位置におけるＥ、位置１６３に対応する位置におけるＫ、位置１６３に対応する位置におけるＱ、位置１６３に対応する位置におけるＲ、位置１６３に対応する位置におけるＳ、位置１６４に対応する位置におけるＭ、位置１６４に対応する位置におけるＶ、位置１６５に対応する位置におけるＤ、位置１６５に対応する位置におけるＦ、位置１６５に対応する位置におけるＮ、位置１６５に対応する位置におけるＳ、位置１６５に対応する位置におけるＶ、位置１６６に対応する位置におけるＡ、位置１６６に対応する位置におけるＥ、位置１６６に対応する位置におけるＦ、位置１６６に対応する位置におけるＨ、位置１６６に対応する位置におけるＬ、位置１６６に対応する位置におけるＱ、位置１６６に対応する位置におけるＲ、位置１６６に対応する位置におけるＴ、位置１６６に対応する位置におけるＷ、位置１６６に対応する位置におけるＹ、位置１６７に対応する位置におけるＤ、位置１６９に対応する位置におけるＬ、位置１７０に対応する位置におけるＲ、位置１７２に対応する位置におけるＡ、位置１７３に対応する位置におけるＲ、位置１７４に対応する位置におけるＧ、位置１７４に対応する位置におけるＫ、位置１７４に対応する位置におけるＮ、位置１７４に対応する位置におけるＲ、位置１７４に対応する位置におけるＴ、位置１７５に対応する位置におけるＴ、位置１７８に対応する位置におけるＫ、位置１７８に対応する位置におけるＲ、位置１７９に対応する位置におけるＫ、位置１９３に対応する位置におけるＱ、位置１９５に対応する位置におけるＴ、位置１９５に対応する位置におけるＮでの、位置１９６に対応する位置におけるＥ、位置１９６に対応する位置におけるＲでの、位置１９８に対応する位置におけるＤ、位置２０４に対応する位置におけるＰ、位置２０５に対応する位置におけるＡ、位置２０５に対応する位置におけるＥ、位置２０５に対応する位置におけるＬ、位置２０５に対応する位置におけるＴ、位置２０６に対応する位置におけるＩ、位置２０６に対応する位置におけるＫ、位置２０６に対応する位置におけるＬ、位置２０６に対応する位置におけるＲ、位置２０９に対応する位置におけるＲ、位置２１２に対応する位置におけるＮ、位置２１２に対応する位置におけるＳ、位置２１３に対応する位置におけるＡ、位置２１３に対応する位置におけるＭ、位置２１３に対応する位置におけるＮ、位置２１５に対応する位置におけるＨ、位置２１５に対応する位置におけるＭ、位置２１９に対応する位置におけるＡ、位置２１９に対応する位置におけるＩ、位置２１９に対応する位置におけるＫ、位置２１９に対応する位置におけるＳ、位置２２０に対応する位置におけるＨ、位置２２０に対応する位置におけるＩ、位置２２０に対応する位置におけるＬ、位置２２０に対応する位置におけるＶ、位置２２１に対応する位置におけるＱ、位置２２２に対応する位置におけるＧ、位置２３２に対応する位置におけるＦ、位置２３３に対応する位置におけるＧ、位置２３３に対応する位置におけるＫ、位置２３３に対応する位置におけるＲ、位置２３４に対応する位置におけるＭ、位置２３５に対応する位置におけるＡ、位置２３６に対応する位置におけるＲ、位置２３７に対応する位置におけるＣ、位置２３７に対応する位置におけるＥ、位置２３７に対応する位置におけるＨ、位置２３７に対応する位置におけるＱ、位置２３７に対応する位置におけるＴ、位置２３８に対応する位置におけるＥ、アミノ酸位置２３８に対応する位置におけるＨ、位置２３８に対応する位置におけるＳ、位置２４０に対応する位置におけるＡ、位置２４０に対応する位置におけるＱ、位置２４７に対応する位置におけるＩ、位置２４８に対応する位置におけるＡ、位置２４９に対応する位置におけるＶ、位置２５７に対応する位置におけるＧ、位置２５７に対応する位置におけるＴ、位置２５７に対応する位置におけるＲ、位置２５８に対応する位置におけるＮ、位置２５８に対応する位置におけるＳ、位置２５９に対応する位置におけるＰ、位置２６０に対応する位置におけるＭ、位置２６０に対応する位置におけるＹ、位置２６１に対応する位置におけるＡ、位置２６１に対応する位置におけるＫ、位置２６１に対応する位置におけるＮ、位置２６３に対応する位置におけるＫ、位置２６３に対応する位置におけるＲ、位置２６７に対応する位置におけるＴ、位置２６９に対応する位置におけるＡ、位置２７１に対応する位置におけるＬ、位置２７１に対応する位置におけるＭ、位置２７２に対応する位置におけるＤ、位置２７２に対応する位置におけるＴ、位置２７３に対応する位置におけるＨ、位置２７３に対応する位置におけるＹ、位置２７４に対応する位置におけるＦ、位置２７６に対応する位置におけるＤ、位置２７６に対応する位置におけるＨ、位置２７６に対応する位置におけるＭ、位置２７６に対応する位置におけるＲ、位置２７６に対応する位置におけるＳ、位置２７６に対応する位置におけるＹ、位置２７７に対応する位置におけるＡ、位置２７７に対応する位置におけるＥ、位置２７７に対応する位置におけるＨ、位置２７７に対応する位置におけるＫ、位置２７７に対応する位置におけるＭ、位置２７７に対応する位置におけるＮ、位置２７７に対応する位置におけるＱ、位置２７７に対応する位置におけるＲ、位置２７７に対応する位置におけるＳ、位置２７７に対応する位置におけるＴ、位置２７８に対応する位置におけるＥ、位置２７８に対応する位置におけるＦ、位置２７８に対応する位置におけるＧ、位置２７８に対応する位置におけるＨ、位置２７８に対応する位置におけるＫ、位置２７８に対応する位置におけるＮ、位置２７８に対応する位置におけるＲ、位置２７８に対応する位置におけるＳ、位置２７８に対応する位置におけるＴ、位置２７８に対応する位置におけるＹ、位置２７９に対応する位置におけるＨ、位置２８２に対応する位置におけるＭ、位置２８３に対応する位置におけるＳ、位置２８５に対応する位置におけるＨ、位置２８７に対応する位置におけるＴ、位置２８９に対応する位置におけるＳ、位置２９１に対応する位置におけるＳ、位置２９１に対応する位置におけるＶ、位置２９２に対応する位置におけるＣ、位置２９２に対応する位置におけるＦ、位置２９２に対応する位置におけるＨ、位置２９２に対応する位置におけるＫ、位置２９２に対応する位置におけるＲ、位置２９２に対応する位置におけるＶ、位置２９３に対応する位置におけるＡ、位置２９３に対応する位置におけるＣ、位置２９３に対応する位置におけるＤ、位置２９３に対応する位置におけるＦ、位置２９３に対応する位置におけるＫ、位置２９３に対応する位置におけるＭ、位置２９３に対応する位置におけるＰ、位置２９３に対応する位置におけるＱ、位置２９３に対応する位置におけるＶ、位置２９３に対応する位置におけるＹ、位置２９８に対応する位置におけるＧ、位置３０５に対応する位置におけるＥ、位置３０７に対応する位置におけるＧ、位置３０８に対応する位置におけるＤ、位置３０８に対応する位置におけるＧ、位置３０８に対応する位置におけるＫ、位置３０８に対応する位置におけるＮ、位置３０８に対応する位置におけるＲ、位置３０９に対応する位置におけるＥ、位置３０９に対応する位置におけるＧ、位置３０９に対応する位置におけるＨ、位置３０９に対応する位置におけるＬ、位置３０９に対応する位置におけるＭ、位置３０９に対応する位置におけるＮ、位置３０９に対応する位置におけるＱ、位置３０９に対応する位置におけるＲ、位置３０９に対応する位置におけるＳ、位置３０９に対応する位置におけるＴ、位置３０９に対応する位置におけるＶ、位置３１０に対応する位置におけるＡ、位置３１０に対応する位置におけるＧ、位置３１０に対応する位置におけるＱ、位置３１０に対応する位置におけるＳ、位置３１３に対応する位置におけるＡ、位置３１３に対応する位置におけるＧ、位置３１３に対応する位置におけるＨ、位置３１３に対応する位置におけるＫ、位置３１３に対応する位置におけるＰ、位置３１３に対応する位置におけるＲ、位置３１３に対応する位置におけるＴ、位置３１３に対応する位置におけるＹでの、位置３１４に対応する位置におけるＳ、位置３１４に対応する位置におけるＹ、位置３１５に対応する位置におけるＡ、位置３１５に対応する位置におけるＨ、位置３１５に対応する位置におけるＹ、位置３１７に対応する位置におけるＡ、位置３１７に対応する位置におけるＩ、位置３１７に対応する位置におけるＫ、位置３１７に対応する位置におけるＮ、位置３１７に対応する位置におけるＱ、位置３１７に対応する位置におけるＲ、位置３１７に対応する位置におけるＳ、位置３１７に対応する位置におけるＴ、位置３１７に対応する位置におけるＷ、位置３１８に対応する位置におけるＤ、位置３１８に対応する位置におけるＨ、位置３１８に対応する位置におけるＫ、位置３１８に対応する位置におけるＭ、位置３１８に対応する位置におけるＲ、位置３２０に対応する位置におけるＨ、位置３２０に対応する位置におけるＫ、位置３２０に対応する位置におけるＲ、位置３２１に対応する位置におけるＲ、位置３２１に対応する位置におけるＳ、位置３２４に対応する位置におけるＮ、位置３２４に対応する位置におけるＲ、位置３２５に対応する位置におけるＡ、位置３２５に対応する位置におけるＤ、位置３２５に対応する位置におけるＥ、位置３２５に対応する位置におけるＧ、位置３２５に対応する位置におけるＨ、位置３２５に対応する位置におけるＫ、位置３２５に対応する位置におけるＭ、位置３２５に対応する位置におけるＮ、位置３２５に対応する位置におけるＱ、位置３２５に対応する位置におけるＳ、位置３２５に対応する位置におけるＶ、位置３２６に対応する位置におけるＬ、位置３２６に対応する位置におけるＶ、位置３２８に対応する位置におけるＣ、位置３２８に対応する位置におけるＧ、位置３２８に対応する位置におけるＩ、位置３２８に対応する位置におけるＫ、位置３２８に対応する位置におけるＬ、位置３２８に対応する位置におけるＳ、位置３２８に対応する位置におけるＹ、位置３３５に対応する位置におけるＳ、位置３４７に対応する位置におけるＡ、位置３４７に対応する位置におけるＧ、位置３４７に対応する位置におけるＳ、位置３４９に対応する位置におけるＭ、位置３４
９に対応する位置におけるＲ、位置３５１に対応する位置におけるＳ、位置３５３に対応する位置におけるＶでの、位置３５６に対応する位置におけるＨ、位置３５６に対応する位置におけるＳ、位置３５９に対応する位置におけるＥ、位置３５９に対応する位置におけるＨ、位置３５９に対応する位置におけるＴ、位置３６７に対応する位置におけるＡ、位置３６７に対応する位置におけるＧ、位置３６７に対応する位置におけるＫ、位置３６７に対応する位置におけるＳ、位置３６８に対応する位置におけるＡ、位置３６８に対応する位置におけるＥ、位置３６８に対応する位置におけるＫ、アミノ酸位置３６８に対応する位置におけるＬ、アミノ酸位置３６８に対応する位置におけるＭ、位置３６８に対応する位置におけるＲ、アミノ酸位置３６８に対応する位置におけるＴ、位置３６９に対応する位置におけるＨ、位置３６９に対応する位置におけるＲ、位置３７１に対応する位置におけるＦ、位置３７１に対応する位置におけるＨ、位置３７１に対応する位置におけるＫ、位置３７１に対応する位置におけるＬ、位置３７１に対応する位置におけるＲ、位置３７１に対応する位置におけるＳ、位置３７３に対応する位置におけるＭ、位置３７４に対応する位置におけるＨ、位置３７４に対応する位置におけるＰ、位置３７５に対応する位置におけるＡ、位置３７５に対応する位置におけるＧ、位置３７５に対応する位置におけるＫ、位置３７５に対応する位置におけるＲ、位置３７６に対応する位置におけるＤ、位置３７６に対応する位置におけるＥ、位置３７６に対応する位置におけるＱ、位置３７６に対応する位置におけるＲ、位置３７６に対応する位置におけるＴ、位置３７６に対応する位置におけるＶ、位置３７６に対応する位置におけるＹ、位置３７７に対応する位置におけるＤ、位置３７７に対応する位置におけるＥ、位置３７７に対応する位置におけるＨ、位置３７７に対応する位置におけるＫ、位置３７７に対応する位置におけるＰ、位置３７７に対応する位置におけるＲ、位置３７７に対応する位置におけるＳ、位置３７７に対応する位置におけるＴ、位置３８０に対応する位置におけるＷ、位置３８０に対応する位置におけるＹ、位置３８１に対応する位置におけるＳ、位置３８３に対応する位置におけるＩ、位置３８３に対応する位置におけるＫ、位置３８３に対応する位置におけるＬ、位置３８３に対応する位置におけるＳ、位置３８５に対応する位置におけるＡ、位置３８５に対応する位置におけるＱ、位置３８５に対応する位置におけるＶ、位置３８９に対応する位置におけるＡ、位置３８９に対応する位置におけるＧ、位置３８９に対応する位置におけるＬ、位置３８９に対応する位置におけるＫ、位置３８９に対応する位置におけるＱ、位置３８９に対応する位置におけるＳ、位置３９２に対応する位置におけるＡ、位置３９２に対応する位置におけるＦ、位置３９２に対応する位置におけるＭ、位置３９２に対応する位置におけるＱ、位置３９２に対応する位置におけるＲ、位置３９２に対応する位置におけるＶ、位置３９３に対応する位置におけるＦ、位置３９３に対応する位置におけるＭ、位置３９５に対応する位置におけるＡ、位置３９５に対応する位置におけるＨ、位置３９５に対応する位置におけるＲ、位置３９６に対応する位置におけるＡ、位置３９６に対応する位置におけるＨ、位置３９６に対応する位置におけるＱ、位置３９６に対応する位置におけるＳ、位置３９９に対応する位置におけるＫ、位置３９９に対応する位置におけるＭ、位置３９９に対応する位置におけるＴ、位置３９９に対応する位置におけるＶ、位置３９９に対応する位置におけるＷ、位置４０１に対応する位置におけるＡ、位置４０１に対応する位置におけるＥ、位置４０４に対応する位置におけるＡ、位置４０５に対応する位置におけるＧ、位置４０６に対応する位置におけるＦ、位置４０６に対応する位置におけるＮ、位置４０７に対応する位置におけるＡ、位置４０７に対応する位置におけるＤ、位置４０７に対応する位置におけるＥ、位置４０７に対応する位置におけるＦ、位置４０７に対応する位置におけるＨ、位置４０７に対応する位置におけるＱ、位置４０７に対応する位置におけるＰ、位置４０９に対応する位置におけるＡ、位置４０９に対応する位置におけるＱ、位置４１０に対応する位置におけるＴ、位置４１２に対応する位置におけるＱ、位置４１２に対応する位置におけるＲ、位置４１２に対応する位置におけるＶ、位置４１６に対応する位置におけるＬ、位置４１８に対応する位置におけるＥ、位置４１８に対応する位置におけるＬ、位置４１８に対応する位置におけるＰ、位置４１８に対応する位置におけるＲ、位置４１８に対応する位置におけるＶ、位置４１９に対応する位置におけるＦ、位置４１９に対応する位置におけるＨ、位置４１９に対応する位置におけるＩ、位置４１９に対応する位置におけるＫ、位置４１９に対応する位置におけるＲ、位置４１９に対応する位置におけるＳ、位置４１９に対応する位置におけるＹ、位置４２１に対応する位置におけるＡ、位置４２１に対応する位置におけるＨ、位置４２１に対応する位置におけるＫ、位置４２１に対応する位置におけるＮ、位置４２１に対応する位置におけるＱ、位置４２１に対応する位置におけるＲ、位置４２１に対応する位置におけるＳ、位置４２５に対応する位置におけるＧ、位置４２５に対応する位置におけるＫ、位置４２７に対応する位置におけるＱ、位置４２７に対応する位置におけるＴ、位置４２８に対応する位置におけるＬ、位置４３１に対応する位置におけるＡ、位置４３１に対応する位置におけるＧ、位置４３１に対応する位置におけるＥ、位置４３１に対応する位置におけるＨ、位置４３１に対応する位置におけるＫ、位置４３１に対応する位置におけるＬ、位置４３１に対応する位置におけるＮ、位置４３１に対応する位置におけるＱ、位置４３１に対応する位置におけるＲ、位置４３１に対応する位置におけるＳ、位置４３１に対応する位置におけるＶ、位置４３３に対応する位置におけるＡ、位置４３３に対応する位置におけるＨ、位置４３３に対応する位置におけるＩ、位置４３３に対応する位置におけるＫ、位置４３３に対応する位置におけるＬ、位置４３３に対応する位置におけるＲ、位置４３３に対応する位置におけるＴ、位置４３３に対応する位置におけるＶ、位置４３３に対応する位置におけるＷ、位置４３６に対応する位置におけるＫ、位置４３７に対応する位置におけるＩ、位置４３７に対応する位置におけるＭ、位置４３８に対応する位置におけるＡ、位置４３８に対応する位置におけるＤ、位置４３８に対応する位置におけるＥ、位置４３８に対応する位置におけるＬ、位置４３８に対応する位置におけるＮ、位置４３８に対応する位置におけるＴ、位置４３９に対応する位置におけるＡ、位置４３９に対応する位置におけるＣ、位置４３９に対応する位置におけるＫ、位置４３９に対応する位置におけるＰ、位置４３９に対応する位置におけるＱ、位置４３９に対応する位置におけるＴ、位置４３９に対応する位置におけるＶ、位置４４０に対応する位置におけるＤ、位置４４０に対応する位置におけるＨ、位置４４０に対応する位置におけるＭ、位置４４０に対応する位置におけるＰ、位置４４０に対応する位置におけるＲ、位置４４０に対応する位置におけるＳ、位置４４１に対応する位置におけるＡ、位置４４１に対応する位置におけるＦ、位置４４２に対応する位置におけるＣ、位置４４２に対応する位置におけるＧ、位置４４２に対応する位置におけるＲ、位置４４３に対応する位置におけるＡ、位置４４３に対応する位置におけるＥ、位置４４３に対応する位置におけるＦ、位置４４３に対応する位置におけるＧ、位置４４３に対応する位置におけるＭ、位置４４３に対応する位置におけるＮ、位置４４４に対応する位置におけるＥ、位置４４４に対応する位置におけるＨ、位置４４４に対応する位置におけるＶ、位置４４５に対応する位置におけるＨ、位置４４５に対応する位置におけるＭ、位置４４５に対応する位置におけるＮ、位置４４５に対応する位置におけるＰ、位置４４５に対応する位置におけるＱ、位置４４５に対応する位置におけるＳ、位置４４５に対応する位置におけるＴ、位置４４５に対応する位置におけるＶ、位置４４５に対応する位置におけるＷ、位置４４６に対応する位置におけるＡ、位置４４６に対応する位置におけるＭ、位置４４６に対応する位置におけるＷ、位置４４７に対応する位置におけるＤ、位置４４７に対応する位置におけるＥ、位置４４７に対応する位置におけるＧ、位置４４７に対応する位置におけるＩ、位置４４７に対応する位置におけるＮ、位置４４７に対応する位置におけるＰ、位置４４７に対応する位置におけるＱ、位置４４７に対応する位置におけるＴを用いた置換および／または位置４４７に対応する位置におけるＶを用いた置換が挙げられる。
【０２０９】
このような修飾ＰＨ２０ポリペプチドの例示的なものとして、配列番号７４〜８５５のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有するか、または配列番号７４〜８５５のいずれかに対して少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し、アミノ酸置換を含有し、ヒアルロニダーゼ活性を示すアミノ酸の配列を有するいずれかがある。
【０２１０】
本明細書において提供される上記の修飾ＰＨ２０ポリペプチドのいずれも、アミノ酸修飾（例えば、アミノ酸置換）を含有しない対応するＰＨ２０ポリペプチドと比較して、変更された、例えば、改善または増大した特性または活性を示し得る。例えば、変更された活性または特性は、変性条件下で、増大した触媒活性および／または増大した安定性であり得る。
【０２１１】
ａ．増大した活性
ＰＨ２０ポリペプチド中に１つまたは複数のアミノ酸置換を含有し、アミノ酸置換（複数可）を含有しない対応するＰＨ２０ポリペプチドと比較して増大したヒアルロニダーゼ活性を示す修飾または変異体ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、配列番号２、３、６〜６６、６８〜７２、８５６〜８６１、８６９もしくは８７０のいずれかに示されるＰＨ２０ポリペプチドまたはそれに対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体が、本明細書において提供される。特に、本明細書において提供される修飾または変異体ＰＨ２０ポリペプチドは、アミノ酸置換を含有しない対応するＰＨ２０ポリペプチド、例えば、配列番号３、７、３２〜６６、６９または７２のいずれかに示されるＰＨ２０ポリペプチド、特に、配列番号３に示されるＰＨ２０ポリペプチドと比較して増大したヒアルロニダーゼ活性を示す。
【０２１２】
修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、同一条件下で、アミノ酸置換（複数可）を含有しない対応するＰＨ２０ポリペプチド、例えば、配列番号２、３、６〜６６、６８〜７２、８５６〜８６１、８６９もしくは８７０のいずれかに示されるＰＨ２０ポリペプチドまたはその変異体のヒアルロニダーゼ活性の少なくとも１２０％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、１５００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％またはおよそ少なくとも１２０％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、１５００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％であるヒアルロニダーゼ活性を示し得る。例えば、ヒアルロニダーゼ活性は、少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍もしくはそれ以上またはおよそ少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍もしくはそれ以上増大される。
【０２１３】
特定の例では、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、増大したヒアルロニダーゼ活性と関連していると同定された１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含有する。本明細書において記載されたように、このような位置は、増大したヒアルロニダーゼ活性をもたらす位置を同定するための突然変異誘発および選択またはスクリーニング法を使用して同定されている。ＰＨ２０ポリペプチドはまた、得られる修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、アミノ酸置換（複数可）などのアミノ酸修飾（複数可）を含有しないＰＨ２０と比較して増大したヒアルロニダーゼ活性を示す限り、単独で活性の増大と関連していないその他のアミノ酸置換などのその他の修飾を含有し得る。本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、またはそれ以上のアミノ酸置換を含有し得る。挿入または欠失などのさらなる修飾も含まれ得る。アミノ酸置換は、配列番号２，３、６〜６６、６８〜７２、８５６〜８６１、８６９もしくは８７０のいずれかに示されるようなＰＨ２０ポリペプチドまたはそれに対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を有するその変異体においてであり得る。例えば、置換（複数可）は、ヒトＰＨ２０ポリペプチド、例えば、配列番号３、７、３２〜６６、６９もしくは７２のいずれかに示されるいずれか、またはその変異体においてであり得る。
【０２１４】
例えば、本明細書において提供される修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して位置1、12、15、24、26、27、29、30、31、32、33、37、39、46、48、52、58、63、67、68、69、70、71、72、73、74、75、84、86、87、92、93、94、97、118、120、127、131、135、141、142、147、148、150、151、152、155、156、163、164、165、166、169、170、174、198、206、209、212、213、215、219、233、234、236、238、247、257、259、260、261、263、269、271、272、276、277、278、282、291、293、305、308、309、310、313、315、317、318、320、324、325、326、328、347、353、359、371、377、380、389、392、395、399、405、407、409、410、418、419、421、425、431、433、436、437、438、439、440、441、442、443、445、446または447に対応する１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ））を含有する。例えば、アミノ酸位置は、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、位置１でのロイシン（Ｌ）の置換（Ｌ１）、V12、L15、F24、L26、G27、F29、D30、E31、P32、L33、L37、S39、I46、A48、G52、V58、Y63、I67、D68、S69、I70、T71、G72、V73、T74、V75、S84、G86、D87、A92、K93、K94、T97、T118、A120、D127、N131、E135、N141、V142、T147、E148、T150、E151、K152、Q155、E156、D163、F164、L165、V166、I169、K170、L174、G198、V206、K209、D212、D213、S215、N219、Q233、Q234、P236、A238、V247、P257、A259、K260、S261、L263、T269、I271、V272、Q276、V277、L278、S282、G291、T293、G305、S308、I309、M310、M313、S315、L317、L318、D320、E324、T325、I326、N328、Q347、I353、S359、A371、G377、F380、E389、E392、S395、Y399、T405、S407、K409、E410、D418、A419、D421、A425、D431、F433、P436、P437、M438、E439、T440、E441、E442、P443、I445、F446またはY447に対応する位置における置換であり得る。このような修飾ＰＨ２０ポリペプチドの例示的なものとして、アミノ酸置換を含有しない対応するＰＨ２０ポリペプチドの少なくとも１．５倍またはそれ以上の活性を示すポリペプチドがある。
【０２１５】
本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチド中のアミノ酸置換の例示的なものとして、それだけには限らないが、各々、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、位置１に対応する位置におけるヒスチジン（Ｈ）；位置１に対応する位置におけるＱ、位置１２に対応する位置におけるＥ、位置１２に対応する位置におけるＴ、位置１５に対応する位置におけるＶ、位置２４に対応する位置におけるＥ、位置２４に対応する位置におけるＨ、位置２６に対応する位置におけるＥ、位置２６に対応する位置におけるＫ、位置２７に対応する位置におけるＫ、位置２７に対応する位置におけるＲ、位置２９に対応する位置におけるＥ、位置２９に対応する位置におけるＩ、位置２９に対応する位置におけるＬ、位置２９に対応する位置におけるＭ、位置２９に対応する位置におけるＰ、位置２９に対応する位置におけるＳ、位置２９に対応する位置におけるＶ、位置３０に対応する位置におけるＧ、位置３０に対応する位置におけるＨ、位置３０に対応する位置におけるＫ、位置３０に対応する位置におけるＭ、位置３０に対応する位置におけるＲ、位置３０に対応する位置におけるＳ、位置３１に対応する位置におけるＡ、位置３１に対応する位置におけるＣ、位置３１に対応する位置におけるＨ、位置３１に対応する位置におけるＩ、位置３１に対応する位置におけるＫ、位置３１に対応する位置におけるＬ、位置３１に対応する位置におけるＰ、位置３１に対応する位置におけるＲ、位置３１に対応する位置におけるＳ、位置３１に対応する位置におけるＴ、位置３１に対応する位置におけるＶ、位置３２に対応する位置におけるＦ、位置３２に対応する位置におけるＧ、位置３２に対応する位置におけるＨ、位置３３に対応する位置におけるＷ、位置３７に対応する位置におけるＦ、位置３９に対応する位置におけるＮ、位置３９に対応する位置におけるＴ、位置４６に対応する位置におけるＲ、位置４８に対応する位置におけるＦ、位置４８に対応する位置におけるＨ、位置４８に対応する位置におけるＮ、位置５２に対応する位置におけるＱ、位置５８に対応する位置におけるＫ、位置５８に対応する位置におけるＱ、位置６３に対応する位置におけるＷ、位置６７に対応する位置におけるＶ、位置６８に対応する位置におけるＨ、位置６８に対応する位置におけるＱ、位置６９に対応する位置におけるＡ、位置６９に対応する位置におけるＣ、位置６９に対応する位置におけるＦ、位置６９に対応する位置におけるＧ、位置６９に対応する位置におけるＩ、位置６９に対応する位置におけるＬ、位置６９に対応する位置におけるＭ、位置６９に対応する位置におけるＰ、位置６９に対応する位置におけるＲ、位置６９に対応する位置におけるＷ、位置６９に対応する位置におけるＹ、位置７０に対応する位置におけるＡ、位置７０に対応する位置におけるＣ、位置７０に対応する位置におけるＦ、位置７０に対応する位置におけるＧ、位置７０に対応する位置におけるＨ、位置７０に対応する位置におけるＫ、位置７０に対応する位置におけるＬ、位置７０に対応する位置におけるＮ、位置７０に対応する位置におけるＰ、位置７０に対応する位置におけるＲ、位置７０に対応する位置におけるＳ、位置７０に対応する位置におけるＴ、位置７０に対応する位置におけるＶ、位置７１に対応する位置におけるＲ、位置７１に対応する位置におけるＳ、位置７２に対応する位置におけるＭ、位置７２に対応する位置におけるＱ、位置７３に対応する位置におけるＨ、位置７３に対応する位置におけるＬ、位置７３に対応する位置におけるＷ、位置７４に対応する位置におけるＡ、位置７４に対応する位置におけるＣ、位置７４に対応する位置におけるＧ、位置７４に対応する位置におけるＮ、位置７４に対応する位置におけるＰ、位置７４に対応する位置におけるＲ、位置７４に対応する位置におけるＳ、位置７４に対応する位置におけるＶ、位置７４に対応する位置におけるＷ、位置７５に対応する位置におけるＦ、位置７５に対応する位置におけるＬ、位置７５に対応する位置におけるＲ、位置７５に対応する位置におけるＴ、位置８４に対応する位置におけるＧ、位置８４に対応する位置におけるＲ、位置８６に対応する位置におけるＡ、位置８７に対応する位置におけるＣ、位置８７に対応する位置におけるＴ、位置８７に対応する位置におけるＹ、位置９２に対応する位置におけるＣ、位置９３に対応する位置におけるＩ、位置９３に対応する位置におけるＬ、位置９３に対応する位置におけるＲ、位置９３に対応する位置におけるＴ、位置９４に対応する位置におけるＲ、位置９７に対応する位置におけるＧ、位置１１８に対応する位置におけるＱ、位置１２０に対応する位置におけるＦ、位置１２０に対応する位置におけるＶ、位置１２０に対応する位置におけるＹ、位置１２７に対応する位置におけるＨ、位置１２７に対応する位置におけるＮ、位置１３１に対応する位置におけるＧ、位置１３１に対応する位置におけるＲ、位置１３１に対応する位置におけるＶ、位置１３５に対応する位置におけるＤ、位置１３５に対応する位置におけるＧ、位置１３５に対応する位置におけるＲでの、位置１４１に対応する位置におけるＨ、位置１４１に対応する位置におけるＹ、位置１４２に対応する位置におけるＲ、位置１４７に対応する位置におけるＲ、位置１４７に対応する位置におけるＶ、位置１４８に対応する位置におけるＫ、位置１５０に対応する位置におけるＧ、位置１５１に対応する位置におけるＫ、位置１５１に対応する位置におけるＬ、位置１５１に対応する位置におけるＭ、位置１５１に対応する位置におけるＱ、位置１５１に対応する位置におけるＲ、位置１５２に対応する位置におけるＲ、位置１５５に対応する位置におけるＧ、位置１５５に対応する位置におけるＫ、位置１５６に対応する位置におけるＤ、位置１６３に対応する位置におけるＡ、位置１６３に対応する位置におけるＥ、位置１６３に対応する位置におけるＫ、位置１６３に対応する位置におけるＲ、位置１６４に対応する位置におけるＭ、位置１６５に対応する位置におけるＤ、位置１６５に対応する位置におけるＮ、位置１６６に対応する位置におけるＡ、位置１６６に対応する位置におけるＦ、位置１６６に対応する位置におけるＨ、位置１６６に対応する位置におけるＬ、位置１６６に対応する位置におけるＱ、位置１６６に対応する位置におけるＲ、位置１６６に対応する位置におけるＴ、位置１６６に対応する位置におけるＹ、位置１６９に対応する位置におけるＬ、位置１７０に対応する位置におけるＲ、位置１７４に対応する位置におけるＫ、位置１９８に対応する位置におけるＤ、位置２０６に対応する位置におけるＫ、位置２０６に対応する位置におけるＬ、位置２１２に対応する位置におけるＮ、位置２１３に対応する位置におけるＭ、位置２１３に対応する位置におけるＮ、位置２１５に対応する位置におけるＭ、位置２１９に対応する位置におけるＳ、位置２３３に対応する位置におけるＫ、位置２３３に対応する位置におけるＲ、位置２３４に対応する位置におけるＭ、位置２３６に対応する位置におけるＲ、位置２３７に対応する位置におけるＥ、位置２３８に対応する位置におけるＳ、位置２４７に対応する位置におけるＩ、位置２５７に対応する位置におけるＴ、位置２５９に対応する位置におけるＰ、位置２６０に対応する位置におけるＹ、位置２６１に対応する位置におけるＫ、位置２６１に対応する位置におけるＮ、位置２６３に対応する位置におけるＫ、位置２６３に対応する位置におけるＲ、位置２６９に対応する位置におけるＡ、位置２７１に対応する位置におけるＬ、位置２７１に対応する位置におけるＭ、位置２７２に対応する位置におけるＴ、位置２７６に対応する位置におけるＤ、位置２７６に対応する位置におけるＳ、位置２７６に対応する位置におけるＹ、位置２７７に対応する位置におけるＫ、位置２７７に対応する位置におけるＲ、位置２７７に対応する位置におけるＴ、位置２７８に対応する位置におけるＨ、位置２７８に対応する位置におけるＫ、位置２７８に対応する位置におけるＮ、位置２７８に対応する位置におけるＲ、位置２７８に対応する位置におけるＳ、位置２７８に対応する位置におけるＴ、位置２７８に対応する位置におけるＹ、位置２８２に対応する位置におけるＭ、位置２９１に対応する位置におけるＶ、位置２９３に対応する位置におけるＡ、位置２９３に対応する位置におけるＣ、位置２９３に対応する位置におけるＦ、位置２９３に対応する位置におけるＭ、位置２９３に対応する位置におけるＰ、位置２９３に対応する位置におけるＱ、位置２９３に対応する位置におけるＶ、位置３０５に対応する位置におけるＥ、位置３０８に対応する位置におけるＧ、位置３０８に対応する位置におけるＮ、位置３０９に対応する位置におけるＥ、位置３０９に対応する位置におけるＬ、位置３０９に対応する位置におけるＮ、位置３０９に対応する位置におけるＱ、位置３０９に対応する位置におけるＲ、位置３０９に対応する位置におけるＴ、位置３１０に対応する位置におけるＡ、位置３１０に対応する位置におけるＧ、位置３１３に対応する位置におけるＫ、位置３１３に対応する位置におけるＲ、位置３１５に対応する位置におけるＨ、位置３１７に対応する位置におけるＩ、位置３１７に対応する位置におけるＫ、位置３１７に対応する位置におけるＲ、位置３１８に対応する位置におけるＭ、位置３２０に対応する位置におけるＨ、位置３２０に対応する位置におけるＫ、位置３２０に対応する位置におけるＲ、位置３２４に対応する位置におけるＲ、位置３２５に対応する位置におけるＡ、位置３２５に対応する位置におけるＤ、位置３２５に対応する位置におけるＥ、位置３２５に対応する位置におけるＧ、位置３２５に対応する位置におけるＨ、位置３２５に対応する位置におけるＫ、位置３２５に対応する位置におけるＭ、位置３２５に対応する位置におけるＮ、位置３２５に対応する位置におけるＱ、位置３２５に対応する位置におけるＳ、位置３２６に対応する位置におけるＶ、位置３２８に対応する位置におけるＩ、位置３２８に対応する位置におけるＫ、位置３２８に対応する位置におけるＬ、位置３２８に対応する位置におけるＳ、位置３２８に対応する位置におけるＹ、位置３４７に対応する位置におけるＧ、位置３４７に対応する位置におけるＳ、位置３５３に対応する位置におけるＶでの、位置３５９に対応する位置におけるＴ、位置３７１に対応する位置におけるＲ、位置３７７に対応する位置におけるＰ、位置３７７に対応する位置におけるＴ、位置３８０に対応する位置におけるＷ、位置３８０に対応する位置におけるＹ、位置３８９に対応する位置におけるＫ、位置３９２に対応する位置におけるＭ、位置３９５に対応する位置におけるＲ、位置３９９に対応する位置におけるＭ、位置３９９に対応する位置におけるＴ、位置３９９に対応する位置におけるＷ、位置４０５に対応する位置におけるＧ、位置４０７に対応する位置におけるＤ、位置４０７に対応する位置におけるＱ、位置４０９に対応する位置におけるＡ、位置４０９に対応する位置におけるＱ、位置４１０に対応する位置におけるＴ、位置４１８に対応する位置におけるＰ、位置４１９に対応する位置におけるＦ、位置４１９に対応する位置におけるＩ、位置４１９に対応する位置におけるＫ、位置４１９に対応する位置におけるＲ、位置４１９に対応する位置におけるＳ、位置４２１に対応する位置におけるＨ、位置４２１に対応する位置におけるＫ、位置４２１に対応する位置におけるＮ、位置４２１に対応する位置におけるＱ、位置４２１に対応する位置におけるＲ、位置４２１に対応する位置におけるＳ、位置４２５に対応する位置におけるＫ、位置４３１に対応する位置におけるＡ、位置４３１に対応する位置におけるＨ、位置４３１に対応する位置におけるＫ、位置４３１に対応する位置におけるＱ、位置４３１に対応する位置におけるＲ、位置４３１に対応する位置におけるＳ、位置４３１に対応する位置におけるＶ、位置４３３に対応する位置におけるＬ、位置４３３に対応する位置におけるＲ、位置４３３に対応する位
置におけるＴ、位置４３３に対応する位置におけるＶ、位置４３６に対応する位置におけるＫ、位置４３７に対応する位置におけるＩ、位置４３７に対応する位置におけるＭ、位置４３８に対応する位置におけるＴ、位置４３９に対応する位置におけるＶ、位置４４０に対応する位置におけるＨ、位置４４０に対応する位置におけるＲ、位置４４１に対応する位置におけるＦ、位置４４２に対応する位置におけるＲ、位置４４３に対応する位置におけるＡ、位置４４３に対応する位置におけるＭ、位置４４５に対応する位置におけるＭ、位置４４５に対応する位置におけるＰ、位置４４６に対応する位置におけるＡ、位置４４７に対応する位置におけるＤ、位置４４７に対応する位置におけるＮを用いた、および／または位置４４７に対応する位置におけるＱを用いた置換が挙げられる。修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、ＰＨ２０ポリペプチドが、修飾（複数可）を含有しないＰＨ２０ポリペプチドと比較して増大したヒアルロニダーゼ活性、例えば、少なくとも１．５倍増大したヒアルロニダーゼ活性などのヒアルロニダーゼ活性を示す限り、列挙されたアミノ酸置換のうち任意の１つまたは複数を、さらなる修飾とともにか、または伴わずに任意の組合せで含有し得る。
【０２１６】
いくつかの例では、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号３に示される位置に関して、位置（複数可）２４、２９、３１、４８、５８、６９、７０、７５、８４、９７、１６５、１６６、２７１、２７８、３１７、３２０、３２５および／または３２６に対応する位置（複数可）に１つまたは複数のアミノ酸置換（複数可）を含有する。例えば、例示的アミノ酸置換として、それだけには限らないが、各々、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、位置２４に対応する位置におけるＥ、位置２９に対応する位置におけるＥ、位置３１に対応する位置におけるＶ、位置４８に対応する位置におけるＮ、位置５８に対応する位置におけるＫ、位置５８に対応する位置におけるＱ、位置６９に対応する位置におけるＡ、位置６９に対応する位置におけるＦ、位置６９に対応する位置におけるＧ、位置６９に対応する位置におけるＰ、位置６９に対応する位置におけるＲ、位置７０に対応する位置におけるＡ、位置７０に対応する位置におけるＦ、位置７０に対応する位置におけるＧ、位置７０に対応する位置におけるＨ、位置７０に対応する位置におけるＨ、位置７０に対応する位置におけるＮ、位置７０に対応する位置におけるＲ、位置７０に対応する位置におけるＴ、位置７０に対応する位置におけるＶ、位置７５に対応する位置におけるＬ、位置７５に対応する位置におけるＴ、位置８４に対応する位置におけるＧ、位置９７に対応する位置におけるＧ、位置１６５に対応する位置におけるＤ、位置１６６に対応する位置におけるＬ、位置１６６に対応する位置におけるＲ、位置１６６に対応する位置におけるＴ、位置２７１に対応する位置におけるＬ、位置２７８に対応する位置におけるＨ、位置２７８に対応する位置におけるＲ、位置３１７に対応する位置におけるＫ、位置３２０に対応する位置におけるＫ、位置３２５に対応する位置におけるＥでの、位置３２５に対応する位置におけるＧ、位置３２５に対応する位置におけるＫ、位置３２５に対応する位置におけるＮ、位置３２５に対応する位置におけるＱ、位置３２６に対応する位置におけるＶを用いる置換が挙げられる。修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、ＰＨ２０ポリペプチドが、ヒアルロニダーゼ活性、例えば、修飾（複数可）を含有しないＰＨ２０ポリペプチドと比較して増大したヒアルロニダーゼ活性、例えば、少なくとも２．０倍増大したヒアルロニダーゼ活性を示す限り、列挙されたアミノ酸置換のうち任意の１つまたは複数を、さらなる修飾とともにか、または伴わずに、任意の組合せで含有し得る。
【０２１７】
非修飾ＰＨ２０ポリペプチド（例えば、配列番号３に示される）と比較して増大した活性を示す例示的修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号73、78、86、89、91、95、96、99、100、105、106、108、109、111、112、113、115、117、118、119、120、123-126、128-136、139-141、149、154、155、159、164、165、167、173、178、181、191-193、195-197、199-205、207-221、225、226、228、229、231、233、237-239、242、247-254、256、257、267、269、270、277、283、293、295、296、298、300、303、308、316、318、321、322、324、325、330、334、335、338-340、344、348、355、367、369、371、377、384-388、394、398、399、401、406-408、410、412、414、416、419、421-426、428、430、431、435、448、455、456、459、462、463、465、469、478-480、482、484、490、493、497、501、503、505、506-508、510-512、514、518、522、523、527、531、533、537-543、545、551、558、559、561、563-566、569、572、574、576、579、581-583、585、587、588、594、596、602、605、606、609、613、618-620、624-634、637、640-644、647、648、652、657、675、695、698、699、700、712、717、725、731、732、734、738、742、746、748-750、757、760、762-765、768-773、775、779、782、783、786-789、794-797、799-801、807、814、816、819、822、825、826、830、836、838、844、847、851、853のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有するか、または配列番号73、78、86、89、91、95、96、99、100、105、106、108、109、111、112、113、115、117、118、119、120、123-126、128-136、139-141、149、154、155、159、164、165、167、173、178、181、191-193、195-197、199-205、207-221、225、226、228、229、231、233、237-239、242、247-254、256、257、267、269、270、277、283、293、295、296、298、300、303、308、316、318、321、322、324、325、330、334、335、338-340、344、348、355、367、369、371、377、384-388、394、398、399、401、406-408、410、412、414、416、419、421-426、428、430、431、435、448、455、456、459、462、463、465、469、478-480、482、484、490、493、497、501、503、505、506-508、510-512、514、518、522、523、527、531、533、537-543、545、551、558、559、561、563-566、569、572、574、576、579、581-583、585、587、588、594、596、602、605、606、609、613、618-620、624-634、637、640-644、647、648、652、657、675、695、698、699、700、712、717、725、731、732、734、738、742、746、748-750、757、760、762-765、768-773、775、779、782、783、786-789、794-797、799-801、807、814、816、819、822、825、826、830、836、838、844、847、851、853のいずれかに対して少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し、アミノ酸置換を含有し、対応する非修飾ポリペプチドと比較して増大したヒアルロニダーゼ活性を示すアミノ酸の配列を有する任意のものである。
【０２１８】
ｂ．増大した安定性
増大した安定性を示すＰＨ２０ポリペプチドが、本明細書において提供される。特に、ＰＨ２０ポリペプチドは、インビボおよび／またはインビトロで増大した安定性を示す。例えば、ＰＨ２０ポリペプチドは、種々の保存条件下で増大した安定性を示し得る。増大した安定性を示す、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、その他のパラメータの中でも、それだけには限らないが、温度（例えば、熱などの高温）、撹拌、無塩もしくは低塩および／または賦形剤の存在によって引き起こされる変性条件を含めた変性条件に対する増大した耐性を示す。例示的賦形剤として、それだけには限らないが、抗付着剤、結合剤、コーティング、増量剤および希釈剤、香料、色、滑沢剤、流動促進剤、防腐剤、吸着剤または甘味料が挙げられる。例えば、防腐剤などの種々の賦形剤は、タンパク質変性剤として作用し得る。増大したタンパク質安定性を示す本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、変性条件に曝露された場合に、アミノ酸置換を含有しない対応するＰＨ２０と比較して、凝集の減少、沈殿の減少および／または活性の増大を示す。例えば、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、変性条件に曝露された場合に、同一変性条件に曝露された場合にアミノ酸置換を含有しない対応するＰＨ２０ポリペプチドと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％もしくはそれ以上または少なくともおよそ１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％もしくはそれ以上または１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％もしくはそれ以上増大した活性を示す。
【０２１９】
増大した安定性を示す、本明細書において提供されたＰＨ２０ポリペプチドとして、アミノ酸置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ））、欠失または挿入またはその他の修飾を含有する修飾または変異体ＰＨ２０ポリペプチドがある。通常、増大した安定性を示す、本明細書において提供されたＰＨ２０ポリペプチドは、アミノ酸置換（複数可）を含有しない対応するＰＨ２０ポリペプチド、例えば、配列番号２、３、６〜６６、６８〜７２、８５６〜８６１、８６９もしくは８７０のいずれかに示されるＰＨ２０ポリペプチドまたはそれに対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を有するその変異体と比較してＰＨ２０ポリペプチド中に１つまたは複数のアミノ酸置換を含有する。特に、本明細書において提供された修飾または変異体ＰＨ２０ポリペプチドは、アミノ酸置換を含有しないＰＨ２０ポリペプチド、例えば、配列番号３、７、３２〜６６、６９または７２のいずれかに示されるＰＨ２０ポリペプチド、特に、配列番号３に示されるＰＨ２０ポリペプチドと比較して増大した安定性を示す。
【０２２０】
特定の例では、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、増大した安定性と関連していると同定された１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含有する。本明細書において記載されたように、このような位置は、１つまたは複数の変性条件に曝露される際に修飾を含有しない対応するＰＨ２０と比較してポリペプチドの安定性（例えば、増大した活性）をもたらす位置を同定するための突然変異誘発および選択またはスクリーニング法を使用して同定され得る。ＰＨ２０ポリペプチドはまた、得られる修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、アミノ酸置換（複数可）などのアミノ酸修飾（複数可）を含有しないＰＨ２０と比較して、１つまたは複数の変性条件下で増大した安定性を示し、ヒアルロニダーゼ活性を示す限り、単独では、安定性の付与と関連しないその他のアミノ酸置換などのその他の修飾を含有し得る。本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、またはそれ以上のアミノ酸置換を含有し得る。挿入または欠失などのさらなる修飾も、含まれ得る。アミノ酸置換は、配列番号２、３、６〜６６、６８〜７２、８５６〜８６１、８６９もしくは８７０のいずれかにおいて示されるようなＰＨ２０ポリペプチドまたはそれに対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体中であり得る。例えば、置換は、ヒトＰＨ２０ポリペプチド、例えば、配列番号３、７、３２〜６６、６９もしくは７２のいずれかに示されるいずれかまたはその変異体中であり得る。
【０２２１】
本明細書において提供される修飾ＰＨ２０ポリペプチドの例示的なものとして、フェノール化合物、高温（熱）および／またはＮａＣｌの欠如に曝露された際に増大した安定性を示すＰＨ２０ポリペプチドがある。
【０２２２】
ｉ．フェノール親和性（Ｐｈｅｎｏｐｈｉｌｅｓ）
フェノール化合物の存在下で増大した安定性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチド本明細書において提供される。複数回用量製剤は、微生物汚染からそれらを保護するために抗菌防腐剤を含有しなくてはならない。インスリンおよびその他の治療薬を含めた非経口薬物製剤については、最も一般的な防腐剤として、フェノール、メタクレゾール（ｍ−クレゾール）、ベンジルアルコールおよびメチルパラベンおよびプロピルパラベンを含めたパラベンなどのフェノール化合物がある。防腐剤は、通常、取締規則を満たすのに十分な濃度で存在しなくてはならない。例えば、規制上の要件は、製剤の抗菌有効性は、標的マーカーの防腐剤有効性試験（ＰＥＴ）必要要件を満たさなくてはならないと主張する。現在異なる規制当局が、複数回投薬用に設計された医薬製剤の抗菌有効性について異なる薬局方収載の判定基準を有する。米国薬局方（ＵＳＰ）および欧州薬局方（ＥＰ）のＰＥＴ必要条件は、相当に異なり、複数回用量製剤の開発において更なる制約を課す。表４は、ＵＳＰおよびＥＰ判定基準に満たす注射可能物質薬物の判定基準を示す。通常、ＥＰ（ＥＰＡまたはＥＰＢ）抗菌必要要件を満たす製剤は、ＵＳＰ抗菌必要要件を満たすだけのために処方されたものよりも多くの防腐剤を含有する。
【０２２３】
【表４】
0006422933.tif 000008
【０２２４】
抗菌防腐剤は、タンパク質と相互作用し、凝集および安定性に対する負の効果をもたらし得る。したがって、防腐剤は、必要な成分であるが、通常、水溶液中でタンパク質の凝集を誘導するので、タンパク質の安定な複数回用量製剤の開発において大きな問題を引き起こす。特に、防腐剤を増加することまたは多量の防腐剤は、タンパク質活性に影響を及ぼし得る物理的安定性（凝集または沈殿）に対する効果を含め、タンパク質の安定性に負に影響を与え得る。例えば、ＥＰ防腐剤有効性必要条件を満たすために、比較的多量の、フェノールまたはｍ−クレゾールなどのフェノール化合物が必要であり得、これは、タンパク質製剤の安定性に影響を及ぼし得る。例えば、フェノール、ｍ−クレゾールおよびベンジルアルコールなどの防腐剤は、ヒト成長ホルモン（Maa and Hsu (1996) Int. J. Pharm.140:155−168）、組換えインターロイキン−１受容体（Remmele (1998) Pharm. Res.15:200−208）、ヒトインスリン様成長因子Ｉ（Fransson (1997) Pharm. Res. 14:606−612）、ｒｈＩＦＮ−γ（Lam (1997) Pharm. Res. 14:725−729）およびシトクロムｃ（Singh et al. (2011) J. Pharm Sci., 100:1679-89）の凝集を誘導するとわかっている。防腐剤が溶液中のタンパク質に対して有する不安定化効果は、複数回用量製剤の開発における制限因子であり、今まで、ほとんどのタンパク質治療薬は、単回使用だけのために製剤されてきた。
【０２２５】
ｒＨｕＰＨ２０などのＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、恐らくは、タンパク質のアンフォールディングおよびその後の凝集体形成のために、防腐剤の存在下で活性を迅速に失う。例えば、本明細書における実施例で示されるように、防腐剤は、特に、高温下でＰＨ２０酵素活性を低下させる（米国仮出願第６１／５２０，９６２号；および米国出願第１３／５０７，２６３号および同１３／５０７，２６２号も参照のこと）。例えば、０．４％  ｍ−クレゾールとともに４時間インキュベーションした後、ＰＨ２０（例えば、ｒＨｕＰＨ２０）は、その活性の約１０％しか保持しない（例えば、実施例５を参照のこと）。０．１％フェノールおよび０．１５％または０．３１５％  ｍ−クレゾールの存在下、３７℃で６日間インキュベートした場合には、ＰＨ２０（例えば、ｒＨｕＰＨ２０）は、製剤中のその他の賦形剤の存在またはその他の賦形剤の量に応じて約０％〜１５％の活性を保持する（例えば、実施例９および１０を参照のこと）。例えば、高濃度の塩の存在は、一般に、ＰＨ２０の安定性を高める。特に、ｒＨｕＰＨ２０などのＰＨ２０の融解温度は、製剤にｍ−クレゾールなどのフェノール系防腐剤が添加された場合には大きく低下する。例えば、ｒＨｕＰＨ２０のアンフォールディング温度は、４４℃から２４℃に低下する。低いＰＨ２０アンフォールディング温度は、特に、高温下でのＰＨ２０凝集の増大および酵素活性の低下につながる。不安定化効果は、恐らくは、フェノール系防腐剤の疎水性によるものである。フェノール化合物の疎水性は、タンパク質との非特異的結合によるｒＨｕＰＨ２０との相互作用につながり得、最終的に、ｒＨｕＰＨ２０の構造完全性を乱す。これは、防腐剤の存在下でのｒＨｕＰＨ２０酵素活性の大幅な喪失に変換される。
【０２２６】
フェノール系防腐剤の存在下で増大した安定性を示す、本明細書において提供される修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、少なくとも１種のフェノール系防腐剤の存在下で、同一期間および同一条件下（防腐剤の存在を除いて）の防腐剤の不在下での修飾ＰＨ２０ポリペプチドの酵素活性と比較して、１５％超の酵素活性を、少なくとも４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、３週間、４週間またはそれ以上示す。いくつかの例では、本明細書において提供される修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、フェノール系防腐剤の存在下で、防腐剤の不在下と比較して、少なくとも１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の酵素活性を示す。例えば、フェノール系防腐剤化合物は、フェノール、メタクレゾール（ｍ−クレゾール）、ベンジルアルコールおよび／またはメチルパラベンもしくはプロピルパラベンを含めたパラベンであり得る。
【０２２７】
特定の例では、防腐剤の存在下で増大した安定性は、２℃〜６℃、２４℃〜３２℃もしくは３５℃〜４０℃の間または約２℃〜６℃、２４℃〜３２℃もしくは３５℃〜４０℃の間などの０℃〜４０℃の間もしくは約０℃〜４０℃の間、一般に、４℃または５℃、３０℃もしくは３７℃または約４℃または５℃、３０℃もしくは３７℃の温度条件下で示される。高温も、ＰＨ２０活性に対して不安定化効果を有し得るので（以下を参照）、防腐剤の存在下での本明細書において提供される修飾ＰＨ２０ポリペプチドの酵素活性のパーセンテージは、高温よりも低温で高いということは理解される。
【０２２８】
一般に、本明細書において提供される修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、組成物のサンプルにおいて微生物を死滅させるか、またはその増殖を阻害する防腐剤の抗菌上有効な量の存在下で、増大した安定性および記載された酵素活性を示す。例えば、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、細菌生物の少なくとも１．０  ｌｏｇ１０単位減少が、播種後７日で起こるような、微生物を死滅させるか、またはその増殖を阻害する防腐剤の抗菌上有効な量の存在下で、増大した安定性を示す。いくつかの例では、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、抗菌防腐剤有効性試験（ＡＰＥＴ）において試験された場合に、微生物播種菌液とともに組成物が播種された後に、播種後７日での細菌生物の少なくとも１．０  ｌｏｇ１０単位減少、播種後１４日での細菌生物の少なくとも３．０  ｌｏｇ１０単位減少があるような、播種後２８日での細菌生物の少なくともさらなる増大がない、播種後７日での真菌生物の少なくとも増加がないような、微生物を死滅させるか、またはその増殖を阻害する防腐剤の抗菌上有効な量の存在下で、増大した安定性を示す。その他の例では、本明細書において提供される修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、抗菌防腐剤有効性試験（ＡＰＥＴ）において試験された場合に、微生物播種菌液とともに組成物が播種された後に、播種後２４時間での細菌生物の少なくとも１．０  ｌｏｇ１０単位減少、播種後７日での細菌生物の少なくとも３．０  ｌｏｇ１０単位減少があり、播種後２８日での細菌生物のさらなる増大がない、播種後１４日での真菌生物の少なくとも１．０  ｌｏｇ１０単位減少があり、播種後２８日での真菌生物の少なくともさらなる増大がないような、微生物を死滅させるか、またはその増殖を阻害する防腐剤の抗菌上有効な量の存在下で、増大した安定性を示す。さらに別の例では、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、抗菌防腐剤有効性試験（ＡＰＥＴ）において試験された場合に、微生物播種菌液とともに組成物が播種された後に、播種後６時間での細菌生物の少なくとも２．０  ｌｏｇ１０単位減少、播種後２４時間での細菌生物の少なくとも３．０  ｌｏｇ１０単位減少があり、微生物播種菌液を伴う組成物の播種後２８日での細菌生物の回復がなく、播種後７日での真菌生物の少なくとも２．０  ｌｏｇ１０単位減少があり、播種後２８日での真菌生物の少なくともさらなる増大がないような、微生物を死滅させるか、またはその増殖を阻害する防腐剤の抗菌上有効な量の存在下で、増大した安定性を示す。
【０２２９】
例えば、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、両端を含めて、０．０５％〜０．６％、０．１％〜０．４％、０．１％〜０．３％、０．１５％〜０．３２５％、０．１５％〜０．２５％、０．１％〜０．２％、０．２％〜０．３％もしくは０．３％〜０．４％であるか、またはその間である、質量濃度（ｗ／ｖ）のパーセンテージ（％）としての１種または複数種のフェノール系防腐剤の総量の存在下で、増大した安定性および上記で列挙された酵素活性を示す。
【０２３０】
一般に、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、ｍ−クレゾールおよび／またはフェノールの存在下で増大した安定性を示す。例えば、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、０．０５％〜０．６％、０．１％〜０．４％、０．１％〜０．３％、０．１５％〜０．３２５％、０．１５％〜０．２５％、０．１％〜０．２％、０．２％〜０．３％もしくは０．３％〜０．４％の間または約０．０５％〜０．６％、０．１％〜０．４％、０．１％〜０．３％、０．１５％〜０．３２５％、０．１５％〜０．２５％、０．１％〜０．２％、０．２％〜０．３％もしくは０．３％〜０．４％の間の、修飾ＰＨ２０ポリペプチドを含有する製剤中の質量濃度（ｗ／ｖ）の％としての量でのｍ−クレゾールの存在下で、増大した安定性を示す。その他の例では、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、０．０５％〜０．６％、０．１％〜０．４％、０．１％〜０．３％、０．１５％〜０．３２５％、０．１５％〜０．２５％、０．１％〜０．２％、０．２％〜０．３％もしくは０．３％〜０．４％  ｍ−クレゾールの間または約０．０５％〜０．６％、０．１％〜０．４％、０．１％〜０．３％、０．１５％〜０．３２５％、０．１５％〜０．２５％、０．１％〜０．２％、０．２％〜０．３％もしくは０．３％〜０．４％  ｍ−クレゾールの間の、修飾ＰＨ２０ポリペプチドを含有する製剤中の質量濃度（ｗ／ｖ）の％としての量でのフェノールの存在下で、増大した安定性を示す。さらなる例では、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、０．０５％〜０．２５％の間または約０．０５％〜０．２５％の間のフェノールおよび０．０５％〜０．３％の間または約０．０５％〜０．３％の間のｍ−クレゾール、０．１０％〜０．２％の間または約０．１０％〜０．２％の間のフェノールおよび０．６％〜０．１８％の間または約０．６％〜０．１８％の間のｍ−クレゾール、０．１％〜０．１５％の間または約０．１％〜０．１５％の間のフェノールおよび０．８％〜０．１５％のｍ−クレゾール、０．１０％〜０．１５％の間または約０．１０％〜０．１５％の間のフェノールおよび０．０６％〜０．０９％の間または約０．０６％〜０．０９％の間のｍ−クレゾール、または０．１２％〜０．１８％の間または約０．１２％〜０．１８％の間のフェノールおよび０．１４％〜０．２２％の間または約０．１４％〜０．２２％の間のｍ−クレゾールの、修飾ＰＨ２０ポリペプチドを含有する製剤中の質量濃度（ｗ／ｖ）の％としての量でのフェノールおよびｍ−クレゾールの存在下で、増大した安定性を示す。
【０２３１】
本明細書における例では、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、両端を含めて、０．３％〜０．４％の間または約０．３％〜０．４％の間のｍ−クレゾールおよび／またはフェノールの存在下、３７℃で、同一期間および同一条件下（防腐剤の存在を除いて）の防腐剤の不在下での修飾ＰＨ２０ポリペプチドの酵素活性と比較して、少なくとも４時間、少なくとも１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上など、１５％超の酵素活性を示す。例えば、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、約０．４％または０．４％のｍ−クレゾールの存在下、３７℃で、同一期間および同一条件下（防腐剤の存在を除いて）の防腐剤の不在下での修飾ＰＨ２０ポリペプチドの酵素活性と比較して、少なくとも４時間、少なくとも１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上など、１５％超の酵素活性を示す。本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドはまた、両端を含めて、少なくとも約０．２％〜０．４％の間または０．２％〜０．４％の間のｍ−クレゾールおよび／またはフェノールの存在下で、３７℃で、同一期間および同一条件下（防腐剤の存在を除いて）の防腐剤の不在下での修飾ＰＨ２０ポリペプチドの酵素活性と比較して、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日または６日間、少なくとも１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上など、１５％超の酵素活性を示す。例えば、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、約０．１０％または０．１０％のフェノールおよび約０．１５％または０．１５％のｍ−クレゾールの存在下で、３７℃で、同一期間および同一条件下（防腐剤の存在を除いて）の防腐剤の不在下での修飾ＰＨ２０ポリペプチドの酵素活性と比較して、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日または６日間、少なくとも１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上など、１５％超の酵素活性を示す。その他の例では、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、約０．３１５％または０．３１５％のｍ−クレゾールの存在下で、３７℃で、同一期間および同一条件下（防腐剤の存在を除いて）の防腐剤の不在下での修飾ＰＨ２０ポリペプチドの酵素活性と比較して、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日または６日間、一般に、少なくとも６日間、少なくとも１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上など、１５％超の酵素活性を示す。
【０２３２】
例えば、フェノール化合物に対して増大した安定性を示す、本明細書において提供されたこのような修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、位置10、12、20、22、26、34、36、46、50、52、58、68、70、74、82、83、84、86、97、127、131、138、142、143、144、166、169、174、193、195、196、204、205、206、213、219、234、237、238、240、249、261、267、277、279、291、309、310、314、315、317、318、347、367、375、376、399、401、407、416、419、421、431、433、439、440、443または445に対応する１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換（ｒｅｐｌａｓｅｍｅｎｔ）（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ））を含有する。例えば、アミノ酸位置は、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、位置１０の（Ｐ）（Ｐ１０）、V12、A20、S22、L26、D34、S36、I46、G50、G52、V58、D68、I70、T74、K82、I83、S84、Q86、T97、D127、N131、Q138、V142、Q143、L144、V166、I169、L174、H193、K195、K196、F204、N205、V206、D213、N219、Q234、V237、A238、T240、E249、S261、A267、V277K279、G291、I309、M310、K314、S315、L317、Q347、P367、E375、K376、Y399、S401、S407、D416、A419、D421、D431、F433、E439、T440、P443またはI445の置換に対応する１つまたは複数の位置で置換され得る。
【０２３３】
本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチド中のアミノ酸置換の例示的なものとして、それだけには限らないが、各々配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、位置１０に対応する位置におけるグリシン（Ｇ）、位置１２に対応する位置におけるＫ、位置２０に対応する位置におけるＳ、位置２２に対応する位置におけるＴ、位置２６に対応する位置におけるＭ、位置３４に対応する位置におけるＷ、位置３６に対応する位置におけるＮ、位置４６に対応する位置におけるＬ、位置５０に対応する位置におけるＭ、位置５２に対応する位置におけるＴ、位置５２に対応する位置におけるＳ、位置５８に対応する位置におけるＣ、位置５８に対応する位置におけるＫ、位置５８に対応する位置におけるＲ、位置５８に対応する位置におけるＮ、位置５８に対応する位置におけるＹ、位置５８に対応する位置におけるＰ、位置５８に対応する位置におけるＨ、位置６８に対応する位置におけるＰ、位置７０に対応する位置におけるＶ、位置７４に対応する位置におけるＥ、位置８２に対応する位置におけるＬ、位置８２に対応する位置におけるＮ、位置８３に対応する位置におけるＶ、位置８３に対応する位置におけるＱ、位置８３に対応する位置におけるＳ、位置８３に対応する位置におけるＧ、位置８４に対応する位置におけるＮ、位置８６に対応する位置におけるＡ、位置８６に対応する位置におけるＫ、位置９７に対応する位置におけるＥ、位置９７に対応する位置におけるＬ、位置１２７に対応する位置におけるＲ、位置１３１に対応する位置におけるＲ、位置１３８に対応する位置におけるＬ、位置１４２に対応する位置におけるＫ、位置１４２に対応する位置におけるＮ、位置１４２に対応する位置におけるＰ、位置１４２に対応する位置におけるＳ、位置１４２に対応する位置におけるＴ、位置１４３に対応する位置におけるＧ、位置１４３に対応する位置におけるＫ、位置１４４に対応する位置におけるＴ、位置１６６に対応する位置におけるＱ、位置１６６に対応する位置におけるＴ、位置１６９に対応する位置におけるＬ、位置１７４に対応する位置におけるＧ、位置１７４に対応する位置におけるＮ、位置１９３に対応する位置におけるＱ、位置１９５に対応する位置におけるＴ、位置１９５に対応する位置におけるＮ、位置１９６に対応する位置におけるＥ、位置１９６に対応する位置におけるＲ、位置２０４に対応する位置におけるＰ、位置２０５に対応する位置におけるＡ、位置２０５に対応する位置におけるＥ、位置２０６に対応する位置におけるＩ、位置２１３に対応する位置におけるＡ、位置２１９に対応する位置におけるＩ、位置２３４に対応する位置におけるＭ、位置２３７に対応する位置におけるＴ、位置２３８に対応する位置におけるＨ、位置２４０に対応する位置におけるＱ、位置２４９に対応する位置におけるＶ、位置２６１に対応する位置におけるＡ、位置２６１に対応する位置におけるＫ、位置２６７に対応する位置におけるＴ、位置２７７に対応する位置におけるＫ、位置２７９に対応する位置におけるＨ、位置２７９に対応する位置におけるＶ、位置２９１に対応する位置におけるＶ、位置３０９に対応する位置におけるＥ、位置３１０に対応する位置におけるＱ、位置３１４に対応する位置におけるＹ、位置３１５に対応する位置におけるＹ、位置３１７に対応する位置におけるＮ、位置３１７に対応する位置におけるＷ、位置３１８に対応する位置におけるＤ、位置３４７に対応する位置におけるＧ、位置３６７に対応する位置におけるＡ、位置３７５に対応する位置におけるＲ、位置３７６に対応する位置におけるＲ、位置３９９に対応する位置におけるＶ、位置４０１に対応する位置におけるＥ、位置４０７に対応する位置におけるＡ、位置４１６に対応する位置におけるＬ、位置４１９に対応する位置におけるＫ、位置４２１に対応する位置におけるＨ、位置４３１に対応する位置におけるＥ、位置４３３に対応する位置におけるＴ、位置４３３に対応する位置におけるＶ、位置４３９に対応する位置におけるＣ、位置４４０に対応する位置におけるＰ、位置４４３に対応する位置におけるＧ、位置４４５に対応する位置におけるＮでの置換が挙げられる。
【０２３４】
アミノ酸置換（複数可）は、配列番号２、３、６〜６６、６８〜７２、８５６〜８６１、８６９または８７０のいずれかに示されるＰＨ２０ポリペプチドまたはそれに対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を有するその変異体中であり得る。例えば、置換（複数可）は、ヒトＰＨ２０ポリペプチド、例えば、配列番号３、７、３２〜６６、６９または７２のいずれかに示されるまたはそのいずれかまたはその変異体中であり得る。
【０２３５】
非修飾ＰＨ２０ポリペプチド（例えば、配列番号３に示される）と比較して、フェノール化合物に対して増大した安定性を示す例示的修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号83、88、93、94、101、144、148、158、171、176、175、177、178、180、182、183、184、185、194、221、240、259、260、261、262、263、264、268、270、272、307、309、327、334、341、351、352、353、356、357、358、359、361、424、426、430、434、436、443、444、445、446、447、449、450、451、454、461、467、480、487、489、492、495、504、505、509、527、544、576、589、600、603、607、612、614、647、658、683、687、733、736、741、754、763、768、781、796、797、809、818、829または837のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有するか、または配列番号83、88、93、94、101、144、148、158、171、176、175、177、178、180、182、183、184、185、194、221、240、259、260、261、262、263、264、268、270、272、307、309、327、334、341、351、352、353、356、357、358、359、361、424、426、430、434、436、443、444、445、446、447、449、450、451、454、461、467、480、487、489、492、495、504、505、509、527、544、576、589、600、603、607、612、614、647、658、683、687、733、736、741、754、763、768、781、796、797、809、818、829または837のいずれかに対して少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を示し、アミノ酸置換を含有するアミノ酸の配列を有するいずれかであり、ヒアルロニダーゼ活性を示し、対応する非修飾ポリペプチドと比較してフェノール化合物の存在下で増大した安定性を示す。
【０２３６】
特に、配列番号３に関連してアミノ酸残基２０４に対応する位置にＰでのアミノ酸置換を含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、本明細書において提供される。通常、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、ヒトポリペプチドである。例えば、配列番号３、７、６９、７２または３２〜６６のいずれかに示されるアミノ酸の配列または修飾ポリペプチドが、Ｆ２０４Ｐに対応するアミノ酸置換を含有する限り、配列番号３、７、６９、７２または３２〜６６のいずれかに対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列中にアミノ酸置換Ｆ２０４Ｐを含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、本明細書において提供される。その他の場合には、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、非ヒトポリペプチドである。例えば、配列番号１０、１２、１４、８５７、８５９、８６１または８７０に示されるアミノ酸の配列または修飾ポリペプチドが、Ｆ２０４Ｐに対応するアミノ酸置換を含有する限り、配列番号１０、１２、１４、８５７、８５９、８６１もしくは８７０のいずれかに対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列中にアミノ酸置換Ｆ２０４Ｐを含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、本明細書において提供される。さらなる例では、アミノ酸置換、配列番号２４に示されるアミノ酸の配列中のＦ２０５Ｐまたは配列番号３１中のＹ２０４Ｐ、または配列番号２４または３１に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列を含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、本明細書において提供される。このような修飾ＰＨ２０ポリペプチドの例示的なものとして、配列番号４４９に示されるアミノ酸の配列を有するか、または配列番号４４９に対して少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有し、アミノ酸置換Ｆ２０４Ｐ含有し、対応する非修飾ポリペプチド（例えば、配列番号３）と比較して、増大したヒアルロニダーゼ活性を示し、フェノール化合物に対して増大した安定性を示すポリペプチドがある。上記の例のいずれにおいても、配列番号３に関連してアミノ酸残基２０４に対応する位置にＰでのアミノ酸置換を含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号１５〜２２、２８または２９に示されるアミノ酸の配列を有さない。
【０２３７】
別の例では、配列番号３に関連してアミノ酸残基５８に対応する位置にアミノ酸置換を含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、本明細書において提供される。アミノ酸置換の例示的なものとして、配列番号３に関連してアミノ酸残基５８に対応する位置におけるリシン（Ｋ）での、またはアルギニン（Ｒ）での置換がある。通常、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、ヒトポリペプチドである。例えば、配列番号３、７、６９、７２もしくは３２〜６６のいずれかに示されるアミノ酸の配列または配列番号３、７、６９、７２もしくは３２〜６６のいずれかに対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列中にアミノ酸置換Ｖ５８ＫまたはＶ５８Ｒを含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、本明細書において提供される。その他の場合には、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、非ヒトポリペプチドである。例えば、配列番号１０、１２、１４、２０、２２、２４、２９、８５７、８５９、８６１もしくは８７０に示されるアミノ酸の配列または配列番号１０、１２、１４、２０、２２、２４、２９、８５７、８５９、８６１もしくは８７０のいずれかに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列中にアミノ酸置換Ｖ５８ＫまたはＶ５８Ｒを含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、本明細書において提供される。さらなる例では、配列番号１６もしくは３１に示されるアミノ酸の配列または配列番号１６もしくは３１に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列中に、アミノ酸置換Ａ５８Ｒを含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、本明細書において提供される。このような修飾ＰＨ２０ポリペプチドの例示的なものとして、配列番号１８２に示されるアミノ酸の配列を有するか、または配列番号１８２に対して、少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有し、アミノ酸置換Ｖ５８Ｒを含有し、対応する非修飾ポリペプチド（例えば、配列番号３）と比較して、増大したヒアルロニダーゼ活性を示し、フェノール化合物の存在下で増大した安定性を示すポリペプチドがある。
【０２３８】
ｉｉ．好熱性
高温下で、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、活性を失い得る。両端を含めて、３０℃〜４５℃の間または約３０℃〜４５℃の間、例えば、３５℃〜４２℃の間または約３５℃〜４２℃の間、特に、３７℃または約３７℃の高温下で増大した安定性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、本明細書において提供される。例えば、３２℃を超える、例えば、３５℃〜４５℃、３７℃〜４２℃、特に、３７℃または約３７℃の高温下で、少なくとも３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、少なくとも５日、少なくとも６日または少なくとも７日安定である修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、本明細書において提供される。高温下で安定性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、温度が高い、変動し得る、増大し得る適用において使用され得る。これは、例えば、ポンプまたはその他の連続注入デバイスを利用する投与法において起こり得る。
【０２３９】
特に、高温下で安定性を示す本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、修飾、例えば、アミノ酸置換を含有しない対応するＰＨ２０ポリペプチドと比較して、高温下で増大したヒアルロニダーゼ活性を示す。ＰＨ２０ポリペプチドは、３２℃を超える、例えば、３５℃〜４５℃または３７℃〜４２℃、特に、３７℃または約３７℃の高温下でのインキュベーションの際に、同一条件下でインキュベートされた、修飾を含有しない対応するＰＨ２０ポリペプチドと比較して、増大したヒアルロニダーゼ活性を少なくとも４時間、５時間、６時間、１２時間、１日、２日、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、少なくとも５日、少なくとも６日または少なくとも７日示し得る。例えば、ヒアルロニダーゼ活性は、同一条件下でインキュベートされた、修飾を含有しない対応するＰＨ２０ポリペプチドと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上増大され得る。例えば、ヒアルロニダーゼ活性は、同一条件下でインキュベートされた、修飾を含有しない対応するＰＨ２０ポリペプチドと比較して、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍またはそれ以上増大され得る。
【０２４０】
その他の例では、高温下で安定性を示す、本明細書において提供される修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、同一条件下で（温度の相違を除いて）非高温でインキュベートされた修飾ＰＨ２０ポリペプチドの活性と比較して、高温下でヒアルロニダーゼ活性を保持する。例えば、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、２℃〜８℃の間または約２℃〜８℃の間の非高温でのＰＨ２０の活性と比較して、５０％または約５０％を超える、例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％を超える、または少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の活性を、３２℃を超える高温、例えば、３５℃〜４５℃または３７℃〜４２℃、特に、３７℃または約３７℃で示す。いくつかの例では、高温下で安定性を示す本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、同一条件下で（温度の相違を除いて）非高温でインキュベートされた修飾ＰＨ２０ポリペプチドの活性と比較して、高温下で増大した活性を示す。例えば、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、２℃〜８℃の間または約２℃〜８℃の間の非高温でのＰＨ２０の活性と比較して、１０％を超えるまたは約１０％の活性、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％もしくはそれ以上を超える、または少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％もしくはそれ以上の活性を、３２℃を超える高温、例えば、３５℃〜４５℃または３７℃〜４２℃、特に、３７℃または約３７℃で示す。例えば、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、２℃〜８℃の間または約２℃〜８℃の間の非高温でのＰＨ２０の活性と比較して、約１．１倍を超える、または少なくとも約１．１倍のヒアルロニダーゼ活性、例えば、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍もしくはそれ以上を超える、または少なくとも１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍もしくはそれ以上の活性を、３２℃を超える高温、例えば、３５℃〜４５℃または３７℃〜４２℃、特に、３７℃または約３７℃で示す。
【０２４１】
例えば、高温下で増大した安定性を示す、本明細書において提供されたこのような修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して位置1、11、12、14、20、26、29、34、50、58、70、82、83、84、86、87、140、142、143、147、152、166、167、172、174、178、193、195、206、212、213、219、233、237、240、267、277、291、292、309、313、314、317、318、347、367、368、371、374、389、392、395、396、406、419、421、439または443に対応する１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ））を含有する。例えば、アミノ酸位置は、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、位置１の（Ｌ）の置換（Ｌ１）、N11、V12、F14、A20、L26、F29、D34、G50、V58、I70、K82、I83、S84、Q86、D87、Q140、V142、Q143、T147、K152、V166、E167、G172、L174、N178、H193、K195、V206、D212、D213、N219、Q233、V237、T240、A267、V277、G291、E292、I309、M313、K314、L317、L318、Q347、P367、D368、A371、L374、E389、E392、S395、E396、L406、A419、D421、E439またはP443に対応する１つまたは複数の位置で置換され得る。得られる修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、３２℃を超える高温、例えば、３５℃〜４５℃、３７℃〜４２℃、特に、３７℃または約３７℃で、少なくとも３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日またはそれ以上、増大した安定性を示す。
【０２４２】
本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチド中の例示的アミノ酸置換として、それだけには限らないが、各々、配列番号３に示されるアミノ酸残基位置に関して、位置１に対応する位置におけるＲ、位置１１に対応する位置におけるＳ、位置１２に対応する位置におけるＩ、位置１４に対応する位置におけるＶ、位置２０に対応する位置におけるＳ、位置２６に対応する位置におけるＭでの、位置２９に対応する位置におけるＲ、位置３４に対応する位置におけるＷ、位置５０に対応する位置におけるＭ、位置５８に対応する位置におけるＫ、位置５８に対応する位置におけるＱ、位置５８に対応する位置におけるＱ、位置７０に対応する位置におけるＶ、位置８２に対応する位置におけるＬ、位置８３に対応する位置におけるＱ、位置８４に対応する位置におけるＲ、位置８６に対応する位置におけるＡ、位置８７に対応する位置におけるＳ、位置１４０に対応する位置におけるＫ、位置１４２に対応する位置におけるＳ、位置１４２に対応する位置におけるＴ、位置１４３に対応する位置におけるＫ、位置１４７に対応する位置におけるＳ、位置１５２に対応する位置におけるＴ、位置１６６に対応する位置におけるＴ、位置１６７に対応する位置におけるＤ、位置１７２に対応する位置におけるＡ、位置１７４に対応する位置におけるＧ、位置１７４に対応する位置におけるＮ、位置１７８に対応する位置におけるＲ、位置１９３に対応する位置におけるＱ、位置１９５に対応する位置におけるＴ、位置２０６に対応する位置におけるＩ、位置２１２に対応する位置におけるＳ、位置２１３に対応する位置におけるＡ、位置２１９に対応する位置におけるＩ、位置２３３に対応する位置におけるＧ、位置２３７に対応する位置におけるＴ、位置２４０に対応する位置におけるＡ、位置２４０に対応する位置におけるＱ、位置２６７に対応する位置におけるＴ、位置２７７に対応する位置におけるＥ、位置２９１に対応する位置におけるＳ、位置２９２に対応する位置におけるＨ、位置２９２に対応する位置におけるＶ、位置３０９に対応する位置におけるＳ、位置３１３に対応する位置におけるＨ、位置３１４に対応する位置におけるＳ、位置３１７に対応する位置におけるＩ、位置３１７に対応する位置におけるＴ、位置３１７に対応する位置におけるＷ、位置３１８に対応する位置におけるＲ、位置３４７に対応する位置におけるＧ、位置３６７に対応する位置におけるＡ、位置３６８に対応する位置におけるＲ、位置３７１に対応する位置におけるＳ、位置３７４に対応する位置におけるＰ、位置３８９に対応する位置におけるＡ、位置３９２に対応する位置におけるＶ、位置３９５に対応する位置におけるＡ、位置３９６に対応する位置におけるＨ、位置４０６に対応する位置におけるＮ、位置４１９に対応する位置におけるＨ、位置４１９に対応する位置におけるＫ、位置４２１に対応する位置におけるＲ、位置４２１に対応する位置におけるＳ、位置４３９に対応する位置におけるＡ、位置４３９に対応する位置におけるＣ、または位置４４３に対応する位置におけるＧでの置換が挙げられる。
【０２４３】
アミノ酸置換（複数可）は、配列番号２、３、６〜６６、６８〜７２、８５６〜８６１、８６９または８７０のいずれかに示されるＰＨ２０ポリペプチドまたはそれに対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体中にあり得る。例えば、置換（複数可）は、ヒトＰＨ２０ポリペプチド、例えば、配列番号３、７、３２〜６６、６９もしくは７２のいずれかに示されるいずれかまたはその変異体中にあり得る。
【０２４４】
非修飾ＰＨ２０ポリペプチド（例えば、配列番号３に示される）と比較して、フェノール化合物に対して増大した安定性を示す例示的修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号79、85、87、90、93、101、114、144、171、178、181、221、259、262、269、270、282、343、356、357、359、368、395、426、429、432、434、436、441、443、444、454、460、461、467、477、487、491、492、509、525、550、554、557、584、593、599、605、611、612、617、647、658、667、676、679、709、720、723、727、740、761、763、772、773、808、809、または829のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有するか、または配列番号79、85、87、90、93、101、114、144、171、178、181、221、259、262、269、270、282、343、356、357、359、368、395、426、429、432、434、436、441、443、444、454、460、461、467、477、487、491、492、509、525、550、554、557、584、593、599、605、611、612、617、647、658、667、676、679、709、720、723、727、740、761、763、772、773、808、809、または829のいずれかに対して、少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を示し、アミノ酸置換を含有し、ヒアルロニダーゼ活性を示し、対応する非修飾ポリペプチドと比較して高温に対して増大した安定性を示すアミノ酸の配列を有するいずれかである。
【０２４５】
ｉｉｉ．塩の不在
ＰＨ２０は、低塩の存在下または塩の不在において変性する。したがって、ＰＨ２０は、安定性を維持するために、１４０ｍＭ〜２００ｍＭの間または約１４０ｍＭ〜２００ｍＭの間の高塩濃度を必要とする。その他の治療薬、例えば、インスリンは、高塩の存在下で溶解度の低下および結晶化／凝集の増大を示す。したがって、ＰＨ２０の高塩必要条件は、共製剤される治療薬の溶解度および／または活性に影響を及ぼし得、一方で、低塩の存在は、ＰＨ２０の活性を低下させ得る。これは、ＰＨ２０共製剤の作製について問題を引き起こし得る。
【０２４６】
１００ｍＭ未満、例えば、９０ｍＭ、８０ｍＭ、７０ｍＭ、６０ｍＭ、５０ｍＭ、４０ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ未満またはそれ以下の低濃度の塩（例えばＮａＣｌ）の存在下で増大した安定性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、本明細書において提供される。一般に、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、低濃度の塩、例えば、１０ｍＭ  ＮａＣｌ〜１００ｍＭ  ＮａＣｌの間または約１０ｍＭ  ＮａＣｌ〜１００ｍＭ  ＮａＣｌの間、例えば、１５ｍＭ〜８０ｍＭ  ＮａＣｌの間または約１５ｍＭ〜８０ｍＭ  ＮａＣｌの間の低濃度のＮａＣｌの存在下で安定性を示す。低濃度の塩、例えば、低濃度のＮａＣｌ（すなわち、１００ｍＭ未満またはそれ以下）で安定性を示す本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、修飾（複数可）（例えば、アミノ酸置換）を含有しない対応するＰＨ２０と比較して増大したヒアルロニダーゼ活性を示す。例えば、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、低濃度の塩、例えば、低濃度のＮａＣｌ（すなわち、１００ｍＭ未満）で、同一条件下でアミノ酸修飾（複数可）（例えば、アミノ酸置換（複数可）を含有しない対応するＰＨ２０の活性と比較して、１０％を超えて、または約１０％増大した活性、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％もしくはそれ以上を超えて、または少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％もしくはそれ以上の活性を示す。例えば、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、１００ｍＭ未満の低濃度のＮａＣｌで、同一条件下で、アミノ酸修飾（複数可）（例えば、アミノ酸置換（複数可）を含有しない対応するＰＨ２０の活性と比較して、約１．１倍を超える、または少なくとも約１．１倍のヒアルロニダーゼ活性、例えば、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍もしくはそれ以上を超える、または少なくとも１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍もしくはそれ以上の活性を示す。
【０２４７】
２．不活性突然変異体
ＰＨ２０ポリペプチド中に１種または複数種のアミノ酸置換を含有し、不活性であり、それによってポリペプチドが、ヒアルロニダーゼ活性を示さないか、または低いもしくは減少したヒアルロニダーゼ活性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、本明細書において提供される。不活性である本発明において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、一般に、野生型または参照ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、配列番号３または７に示されるポリペプチドの２０％未満、例えば、１０％未満のヒアルロニダーゼ活性を示す。例えば、不活性である本明細書において提供される修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、野生型または参照ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、アミノ酸修飾（例えば、アミノ酸置換）を含有しない対応するポリペプチド、例えば、配列番号３または７に示されるポリペプチドの９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％未満またはそれ以下のヒアルロニダーゼ活性を示す。
【０２４８】
例えば、野生型または参照ＰＨ２０ポリペプチドと比較して、不活性であり、例えば、アミノ酸置換（ｒｅｐｌａｓｅｍｅｎｔ）または置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）によって修飾されているＰＨ２０ポリペプチドが、本明細書において提供される。例えば、不活性である、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、得られた修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、不活性であり、アミノ酸置換を含有しない対応するＰＨ２０ポリペプチドの２０％未満、一般に、１０％未満のヒアルロニダーゼ活性を示す限り、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、位置2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、25、27、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、94、95、96、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、143、144、145、149、150、152、153、154、155、156、157、158、159、161、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、197、198、199、200、201、202、203、204、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、331、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、408、410、411、412、413、414、415、416、417、419、420、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、434、437、438、439、440、441、442、443、444、または447に対応する位置（複数可）に１つまたは複数のアミノ酸置換を含有する。通常、ＰＨ２０ポリペプチド中の上記の位置のいずれかに対応する位置で修飾されている（例えば、置換されている）アミノ酸残基は、配列番号３に示されるアミノ酸残基に対して同一残基、保存的残基または半保存的アミノ酸残基である。
【０２４９】
上記の対応する位置のいずれかの例示的アミノ酸置換は、表５に示されている。表５中の対応する位置への言及は、配列番号３に示される位置に関してである。置換は、配列番号３に示される配列とのアラインメントによって別のＰＨ２０ポリペプチド中の対応する位置でなされ得（例えば、図１および２を参照のこと）、それによって対応する位置は、アラインされた位置であるということは理解される。アミノ酸置換（複数可）は、得られた修飾ＰＨ２０ポリペプチドが、不活性である限り、配列番号２、３、６〜６６、６８〜７２、８５６〜８６１、８６９または８７０のいずれかに示されるＰＨ２０ポリペプチドまたはそれに対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を有するその変異体中の対応する位置であり得る。例えば、置換（複数可）は、ヒトＰＨ２０ポリペプチド中の対応する位置、例えば、配列番号３、７、３２〜６６、６９または７２のいずれかに示されるいずれかまたはその変異体中であり得る。特に、置換のうち任意の１種または複数は、得られた修飾ＰＨ２０ポリペプチドが不活性であるか、配列番号３に示されるＰＨ２０ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の２０％未満、一般に、１０％未満を示す限り、配列番号３中である。
【０２５０】
【表５−１】
0006422933.tif 000009
【表５−２】
0006422933.tif 000010
【表５−３】
0006422933.tif 000011
【表５−４】
0006422933.tif 000012
【表５−５】
0006422933.tif 000013
【０２５１】
３．さらなる修飾およびコンジュゲート
修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、化学修飾または翻訳後修飾を含有するものを含む。いくつかの例では、本明細書において提供される修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、化学修飾または翻訳後修飾を含有しない。化学修飾および翻訳後修飾として、それだけには限らないが、ペグ化、シアル化（ｓｉａｌａｔｉｏｎ）、アルブミン化（ａｌｂｕｍｉｎａｔｉｏｎ）、グリコシル化、ファルニシル化（ｆａｒｎｙｓｙｌａｔｉｏｎ）、カルボキシル化、水酸化、リン酸化および当技術分野で公知のその他のポリペプチド修飾が挙げられる。
【０２５２】
また、本明細書において提供されたアミノ酸置換などの任意の１種または複数種のアミノ酸修飾に加えて、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、得られたポリペプチドが、ヒアルロニダーゼ活性を保持する限り、化学法および組換え法を含めた当技術分野で公知の任意の方法を使用して任意の部分とコンジュゲートまたは融合され得る。例えば、本明細書において提供されたアミノ酸置換などの任意の１種または複数種のアミノ酸修飾に加えて、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドはまた、それだけには限らないが、炭水化物部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、シアル酸部分、免疫グロブリンＧ由来のＦｃドメインまたは任意のその他のドメインもしくは部分を用いる修飾を含めた、ポリペプチドの一次配列中であるか、一次配列中ではないその他の修飾を含有し得る。例えば、このようなさらなる修飾は、タンパク質の安定性または血清半減期を高めるためになされ得る。
【０２５３】
いくつかの例では、ドメインまたはその他の部分は、細胞表面受容体またはその他の細胞表面部分と選択的に結合することによる１種または複数種の細胞種とのコンジュゲートをターゲッティングする任意の薬剤を含めた標的剤である。例えば、ドメインまたはその他の部分は、腫瘍細胞とのコンジュゲートをターゲッティングする標的剤である。このような例において、修飾ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、本明細書において提供された任意のものは、標的剤と直接的または間接的に連結される。このような標的化薬剤として、標的化薬剤が、細胞表面受容体によってインターナリゼーションされる限り、それだけには限らないが、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体およびホルモンまたは対立遺伝子変異体、ムテインまたはその断片が挙げられる。例示的な、制限するものではない、さらなる修飾は、以下に記載される。
【０２５４】
ａ．低減された免疫原性
本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、低減された免疫原性を有するよう製造され得る。低減された免疫原性は、ポリペプチドから抗原性エピトープを排除する配列変更によって、または翻訳後修飾を変更することによって達成され得る。当業者ならば、ポリペプチド中の抗原性エピトープを同定する方法に精通している（例えば、Liang et al. (2009) BMC Bioinformatics, 10:302;Yang et al. (2009) Rev. Med. Virol., 19:77-96を参照のこと）。いくつかの例では、１種または複数種のアミノ酸は、抗原性エピトープを除去または変更するよう修飾され得る。
【０２５５】
別の例では、タンパク質のグリコシル化を変更することも、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｃｉｔｙ）をもたらし得る。例えば、ポリペプチドが、配列番号３または７のＮ２００、Ｎ３３３およびＮ３５８として示されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基で少なくともＮ−アセチルグルコサミンを最小に含有する限り、ペプチドのグリコシル化を変更することが考慮される。
【０２５６】
例えば、ＰＨ２０ポリペプチドは、フコース、特に、ビフコシル化（ｂｉｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を欠くように修飾され得る。特に、本明細書において提供されるＰＨ２０ポリペプチドは、ビフコシル化されない。これは、ビフコシル化を達成しない宿主細胞においてＰＨ２０ポリペプチドを発現させ、産生することによって達成され得る。フコースは、哺乳類、昆虫および植物を含めた広範な生物中に存在するデオキシヘキソースである。フコシル化グリカンは、フコシルトランスフェラーゼによって合成される；例えば、Ma et al., Glycobiology、16(12):158R-184R, (2006); Nakayama et al., J. Biol. Chem., 276:16100-16106 (2001);およびSturla et al., Glycobiology, 15(10):924-935 (2005)を参照のこと。ヒトでは、フコースは、グリカン構造の末端修飾として存在することが多く、Ｎ−アセチルグルコサミンとα１，６連結されたフコースの存在が、糖タンパク質プロセシングおよび認識において重要であるとわかっている。昆虫では、Ｎ−グリカンコア構造は、α１，６−およびα１，３−連結を有するビフコシル化を示す。α１，３−連結を有する昆虫細胞コアフコシル化は、ヒトでは免疫原性である炭水化物エピトープを生成する（例えば、米国公開第２００７００６７８５５号を参照のこと）。例えば、本明細書において提供されたＰＨ２０ポリペプチドは、ポリペプチドをビフコシル化できない宿主細胞において作製され得る。したがって、ビフコシル化する昆虫細胞またはその他の細胞は、ポリペプチドの発現のために使用され得るが、通常、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞が使用される。
【０２５７】
いくつかの例では、真核細胞のオリゴ糖プロセシング遺伝子を含有するバキュロウイルス発現ベクターを使用し、それによって、「哺乳類化された（ｍａｍｍａｌｉａｎｉｚｅｄ）」昆虫細胞発現系を作製することによって、修飾グリコシル化経路を有する昆虫細胞において、脱フコシル化された、またはフコースに欠陥のあるＰＨ２０ポリペプチドが作製され得る（例えば、米国特許第６，４６１，８６３号を参照のこと）。あるいは、抗原性は、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ｆｕｃｏｓｙｌａｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＦＴ３）（例えば、米国公開第２００７００６７８５５号）を欠く昆虫細胞におけるＰＨ２０ポリペプチドの発現によって排除され得る。その他の例では、脱フコシル化された、またはフコースに欠陥のあるＰＨ２０ポリペプチドが、例えば、タンパク質フコシル化に欠陥のあるＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986);米国特許公開第２００３／０１５７１０８号；およびＷＯ２００４／０５６３１２）およびノックアウト細胞株、例えば、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)）を含めた、脱フコシル化タンパク質を産生する細胞株において作製され得る。
【０２５８】
ｂ．ポリマーとのコンジュゲーション
いくつかの例では、本明細書において提供される修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、ポリマーとコンジュゲートされる。ＰＨ２０ポリペプチドとコンジュゲートされ得る例示的ポリマーとして、天然および合成ホモポリマー、例えば、ポリオール（すなわち、ポリ−ＯＨ）、ポリアミン（すなわち、ポリ−ＮＨ２）およびポリカルボン酸（すなわち、ポリ−ＣＯＯＨ）ならびにさらなるヘテロポリマー、すなわち、１種または複数種の異なるカップリング基、例えば、ヒドロキシル基およびアミン基を含有するポリマーが挙げられる。適したポリマー分子の例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）およびポリプロピレングリコールを含めたポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）などのポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ＰＥＧ−グリシジルエーテル（Ｅｐｏｘ−ＰＥＧ）、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ−ＰＥＧ）、分岐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリ−Ｄ，Ｌ−アミノ酸、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、カルボキシメチル−デキストランを含めたデキストラン、ヘパリン、同種アルブミン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースを含めたセルロース、キトサンの加水分解物、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンなどのデンプン、グリコーゲン、アガロースおよびその誘導体、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラゲナン、ペクチン、アルギン酸加水分解物およびバイオポリマーの中から選択されるポリマー分子が挙げられる。
【０２５９】
通常、ポリマーは、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、例えば、ポリエチレンオキシド、例えば、ＰＥＧ、通常、２、３の架橋できる反応性基しか有さないｍＰＥＧである。通常、ポリマーは、（メトキシ）ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）などの非毒性ポリマー分子であり、これは、比較的簡単な化学を使用してＰＨ２０ポリペプチドと（例えば、タンパク質表面上の結合基と）共有結合によってコンジュゲートされ得る。
【０２６０】
ＰＨ２０ポリペプチドとの結合に適したポリマー分子として、それだけには限らないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＥＧ−グリシジルエーテル（Ｅｐｏｘ−ＰＥＧ）、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ−ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧおよびポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）などのＰＥＧ誘導体（例えば、Roberts et al.,Advanced Drug Delivery Review 2002, 54:459-476;Harris and Zalipsky (eds.) 「Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications」ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000;Harris and Chess (2003) Nat Rev Drug Discov. 2(3):214-21;およびTsubery, J Biol. Chem 279(37):38118-24, 2004を参照のこと）。ポリマー分子は、通常、約３ｋＤａ〜約６０ｋＤａの範囲の分子量のものであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書において提供されたＰＨ２０ポリペプチドとコンジュゲートされるポリマー分子は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｋＤａまたは６０ｋＤａを超える分子量を有する。
【０２６１】
ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を共有結合によって結合すること（コンジュゲートすること）（すなわち「ペグ化」）によってポリペプチドを修飾する種々の方法が、当技術分野で公知である（例えば、Ｕ．Ｓ．２００６／０１０４９６８；Ｕ．Ｓ．５，６７２，６６２；Ｕ．Ｓ．６，７３７，５０５；およびＵ．Ｓ．２００４／０２３５７３４を参照のこと）。ペグ化のための技術として、それだけには限らないが、特殊化されたリンカーおよびカップリング化学（例えば、Roberts， Adv.Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002を参照のこと）、複数のＰＥＧ部分の単一コンジュゲーション部位との結合（分岐ＰＥＧの使用などによる；例えば、Guiotto et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002を参照のこと）、部位特異的ペグ化および／またはモノペグ化（例えば、Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999を参照のこと）および部位指定酵素的ペグ化（例えば、Sato, Adv.Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002参照のこと）が挙げられる（例えば、Lu and Felix (1994) Int. J. Peptide Protein Res. 43:127-138; Lu and Felix (1993) Peptide Res. 6:140-6, 1993; Felix et al. (1995) Int. J. Peptide Res. 46:253-64; Benhar et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13398-404; Brumeanu et al. (1995) J Immunol. 154:3088-95も参照のこと;Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77およびMolineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8Sも参照のこと）。当技術分野において記載される方法および技術は、単一タンパク質分子と結合している１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０を超えるＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を有するタンパク質を産生し得る（例えば、Ｕ．Ｓ．２００６／０１０４９６８を参照のこと）。
【０２６２】
ペグ化のための多数の試薬が、当技術分野で記載されている。このような試薬として、それだけには限らないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）活性化ＰＥＧ、スクシンイミジルｍＰＥＧ、ｍＰＥＧ２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｍＰＥＧスクシンイミジルα−メチルブタノエート、ｍＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート、ｍＰＥＧスクシンイミジルブタノエート、ｍＰＥＧカルボキシメチル３−ヒドロキシブタン酸スクシンイミジルエステル、ホモ二機能性ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート、ホモ二機能性ＰＥＧプロピンアルデヒド、ホモ二機能性ＰＥＧブチルアルデヒド、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヒドラジド、ｐ−ニトロフェニル−カルボネートＰＥＧ、ｍＰＥＧ−ベンゾトリアゾールカルボネート、プロピオンアルデヒドＰＥＧ、ｍＰＥＧブチルアルデヒド（ｂｕｔｒｙａｌｄｅｈｙｄｅ）、分岐ｍＰＥＧ２ブチルアルデヒド、ｍＰＥＧアセチル、ｍＰＥＧピペリドン、ｍＰＥＧメチルケトン、ｍＰＥＧ「リンカーレス」マレイミド、ｍＰＥＧビニルスルホン、ｍＰＥＧチオール、ｍＰＥＧオルトピリジルチオエステル、ｍＰＥＧオルトピリジルジスルフィド、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、ビニルスルホンＰＥＧ−ＮＨＳ、アクリレートＰＥＧ−ＮＨＳ、フルオレセインＰＥＧ−ＮＨＳおよびビオチンＰＥＧ−ＮＨＳが挙げられる（例えば、Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995;Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997;Ｕ．Ｓ．５，６７２，６６２；Ｕ．Ｓ．５，９３２，４６２；Ｕ．Ｓ．６，４９５，６５９；Ｕ．Ｓ．６，７３７，５０５；Ｕ．Ｓ．４，００２，５３１；Ｕ．Ｓ．４，１７９，３３７；５，１２２，６１４；５，３２４，８４４；Ｕ．Ｓ．５，４４６，０９０；Ｕ．Ｓ．５，６１２，４６０；Ｕ．Ｓ．５，６４３，５７５；Ｕ．Ｓ．５，７６６，５８１；Ｕ．Ｓ．５，７９５，５６９；Ｕ．Ｓ．５，８０８，０９６；Ｕ．Ｓ．５，９００，４６１；Ｕ．Ｓ．５，９１９，４５５；Ｕ．Ｓ．５，９８５，２６３；Ｕ．Ｓ．５，９９０，２３７；Ｕ．Ｓ．６，１１３，９０６；Ｕ．Ｓ．６，２１４，９６６；Ｕ．Ｓ．６，２５８，３５１；Ｕ．Ｓ．６，３４０，７４２；Ｕ．Ｓ．６，４１３，５０７；Ｕ．Ｓ．６，４２０，３３９；Ｕ．Ｓ．６，４３７，０２５；Ｕ．Ｓ．６，４４８，３６９；Ｕ．Ｓ．６，４６１，８０２；Ｕ．Ｓ．６，８２８，４０１；Ｕ．Ｓ．６，８５８，７３６；Ｕ．Ｓ．２００１／００２１７６３；Ｕ．Ｓ．２００１／００４４５２６；Ｕ．Ｓ．２００１／００４６４８１；Ｕ．Ｓ．２００２／００５２４３０；Ｕ．Ｓ．２００２／００７２５７３；Ｕ．Ｓ．２００２／０１５６０４７；Ｕ．Ｓ．２００３／０１１４６４７；Ｕ．Ｓ．２００３／０１４３５９６；Ｕ．Ｓ．２００３／０１５８３３３；Ｕ．Ｓ．２００３／０２２０４４７；Ｕ．Ｓ．２００４／００１３６３７；ＵＳ２００４／０２３５７３４；；Ｕ．Ｓ．２００５／０１１４０３７；Ｕ．Ｓ．２００５／０１７１３２８；Ｕ．Ｓ．２００５／０２０９４１６；ＥＰ１０６４９５１；ＥＰ０８２２１９９；ＷＯ０１０７６６４０；ＷＯ０００２０１７；ＷＯ０２４９６７３；ＷＯ９４２８０２４；ＷＯ０１８７９２５；およびＷＯ２００５０００３��０を参照のこと）。
【０２６３】
Ｄ．変更された特性または活性を有する修飾ヒアルロナン分解酵素を同定する方法
非修飾ヒアルロナン分解酵素と比較して、変更された活性または特性を示す修飾ヒアルロニダーゼまたは修飾ＰＨ２０ポリペプチドなどの修飾または変異体ヒアルロナン分解酵素を同定する方法が、本明細書において提供される。特に、本明細書において提供される方法は、変性剤または変性条件の存在下で、増大した活性および／または増大した安定性を示す１種または複数種の修飾ヒアルロニダーゼまたはＰＨ２０ポリペプチドなどの１種または複数種の修飾ヒアルロナン分解酵素をスクリーニングするために使用され得る。例えば、本方法は、それだけには限らないが、温度によって引き起こされる変性条件（例えば、熱などの高温）、撹拌、無塩または低塩、賦形剤および／または変性剤の存在を含めた変性条件に対する増大した耐性によって増大した安定性を示す修飾もしくは変異体ヒアルロニダーゼまたは修飾もしくは変異体ＰＨ２０ポリペプチドなどの修飾または変異体ヒアルロナン分解酵素を同定するために使用される。例示的変性剤または賦形剤として、それだけには限らないが、抗付着剤、結合剤、コーティング、増量剤および希釈剤、香料、色、滑沢剤、流動促進剤、防腐剤、吸着剤または甘味料が挙げられる。例えば、防腐剤などの種々の賦形剤が、タンパク質変性剤として作用し得る。本方法では、活性はまた、同一変性条件下で非修飾ヒアルロナン分解酵素に対して比較され得、対応する非修飾ヒアルロナン分解酵素よりも大きな活性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素が同定または選択される。
【０２６４】
本方法では、１種または複数種の修飾ヒアルロナン分解酵素が提供される。いくつかの例では、修飾分子のライブラリーが調製される。標準組換えＤＮＡ技術を使用して、突然変異誘発する方法および変異体分子のライブラリーまたは収集物を作製する方法は、本明細書において記載されており、当業者に公知である。一例では、試験される酵素は、プールされ、スクリーニングされ得、それによって、本方法によって、所望の活性を示す酵素のみを選択することが可能になる。別の例では、試験される酵素は、アドレス可能なアレイなどのアレイに形式をあわせることなどによって物理的に分離され、個別にスクリーニングされ得る。
【０２６５】
本方法の一態様では、修飾ヒアルロナン分解酵素は、１種または複数種の変性条件または変性剤の存在下および不在下でヒアルロニダーゼ活性について試験またはスクリーニングされる。条件の両設定下で試験した後、変性条件の存在下で活性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を同定するために活性が評価される。本方法においてカットオフとして選択される活性の所望のレベルまたは量は、使用者によって経験的に決定され得、特定のヒアルロナン分解酵素、ヒアルロナン分解酵素の所望の適用または使用、特定の変性条件または変性剤などの因子およびその他の同様の因子に応じて変わる。通常、変性剤または条件の存在下で、その不在下と比較して、活性の少なくとも５％または１０％、一般に、活性の少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上、例えば、少なくとも４０％を示す修飾ヒアルロナン分解酵素が同定される。
【０２６６】
さらにまたはあるいは、１種または複数種の変性条件または変性剤の存在下での修飾ヒアルロナン分解酵素の活性が、同一変性剤（複数可）または条件（複数可）の存在下での対応する非修飾ヒアルロナン分解酵素の活性に対して比較される。このような例では、修飾および非修飾酵素の活性が、試験される特定の酵素における相違（未修飾対修飾）を除いて同一条件下で（例えば、時間、温度、組成物）試験されるということは理解される。非修飾ヒアルロナン分解酵素の活性の少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上など、大きな活性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素が同定される。
【０２６７】
本方法は、複数回実施され得、それによって、方法の工程が１、２、３、４または５回反復される。本明細書において提供される方法はまた、反復性である。一例では、方法が実施された後、任意の同定された修飾ヒアルロナン分解酵素が、活性を高める、または最適化するために、修飾またはさらに修飾され得る。
【０２６８】
本方法の工程および本方法の成分の説明は、以下の小区分において提供される。
【０２６９】
１．ヒアルロナン分解酵素および修飾ヒアルロナン分解酵素のライブラリー
本明細書における方法において、ヒアルロニダーゼまたはＰＨ２０ポリペプチドなどの１種または複数種の修飾ヒアルロナン分解酵素は、増大した安定性（例えば、変性条件に対する増大した耐性）などの所望の活性または特性について試験される。修飾ヒアルロナン分解酵素は、当技術分野で公知の任意のヒアルロナン分解酵素などの非修飾ヒアルロナン分解酵素と比較して修飾され得る。ヒアルロナン分解酵素は、細胞外マトリックスの必須成分であり、間質バリアの主要な構成物であるヒアルロン酸を分解する酵素のファミリーである。ヒアルロナン分解酵素は、反復する二糖類単位：交互のβ−１→４およびβ−１→３グリコシド結合によって一緒に連結しているＤ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）から構成されているヒアルロナンポリマーを切断することによってヒアルロナンを分解するよう作用する。ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロン酸、間質バリアの主要な構成物の加水分解を触媒することによって、ヒアルロン酸の粘度を低下させ、それによって、組織透過性を高める。したがって、本明細書において提供された使用および方法のためのヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナン二糖鎖またはポリマーの切断を触媒する能力を有する任意の酵素を含む。いくつかの例では、ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナン鎖またはポリマー中のβ−１→４グリコシド結合を切断する。その他の例では、ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナン鎖またはポリマー中のβ−１→３グリコシド結合の切断を触媒する。
【０２７０】
ヒアルロナン分解酵素は、膜結合型である、または細胞から分泌される可溶性形態である酵素を含む。したがって、ヒアルロナン分解酵素が、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーシグナル配列を含むおよび／または、そうではなく、膜固定型もしくは不溶性である場合には、酵素が分泌され、可溶性であるようにするために、このようなヒアルロナン分解酵素は、Ｃ末端切断またはＧＰＩアンカーシグナル配列のすべてもしくは一部の欠失によって可溶性形態で提供され得る。したがって、ヒアルロナン分解酵素は、Ｃ末端で切断された、例えば、ＧＰＩアンカーシグナル配列のすべてもしくは一部を除去するために切断された変異体を含む。このような可溶性ヒアルロニダーゼの例として、米国特許第７，７６７，４２９号、米国公開番号ＵＳ２００４／０２６８４２５および同ＵＳ２０１０／０１４３４５７に示される任意のものなどの可溶性ＰＨ２０ヒアルロニド（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄｅｓ）がある。
【０２７１】
例示的ヒアルロナン分解酵素として、活性であるその可溶性形態または切断形態を含めた、非ヒト動物またはヒトヒアルロニダーゼ、細菌ヒアルロニダーゼ、ヒル由来ヒアルロニダーゼまたはヒアルロナン分解活性を示すコンドロイチナーゼがある。例示的非ヒト動物ヒアルロニダーゼとして、配列番号８〜３１、８５６〜８６１、８６９、８７０、８７１〜８８６のいずれかに示される任意のものまたは可溶性であり、活性である、成熟したＣ末端で切断された変異体またはその活性形態がある。例示的ヒトヒアルロニダーゼとして、配列番号２、３、６、７、３２〜６６、６８〜７２または８８７〜８９０のいずれかに示される任意のもの、または可溶性であり、活性である、成熟したＣ末端で切断された変異体またはその活性形態、特に、配列番号３、７、３２〜６６、６９または７２のいずれかがある。例示的細菌ヒアルロニダーゼとして、配列番号８９１〜９１９のいずれかに示される任意のものまたは可溶性であり、活性である、成熟した、Ｃ末端で切断された変異体またはその活性形態がある。ヒル由来の例示的ヒアルロニダーゼ、または可溶性であり、活性である、成熟した、Ｃ末端で切断された変異体またはその活性形態は、配列番号９２０または９２１に示されている。ヒアルロナン分解酵素活性を有する例示的コンドロイチナーゼ、または可溶性であり、活性である、成熟した、Ｃ末端で切断された変異体またはその活性形態は、配列番号９２２〜９２４に示されている。
【０２７２】
例えば、１種または複数種の修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、増大した安定性（例えば、変性条件に対する増大した耐性）などの所望の活性または特性について試験される。修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、任意の公知のＰＨ２０ポリペプチド、天然の、野生型または参照ポリペプチドなどの非修飾ＰＨ２０ポリペプチドと比較して修飾され得る。例えば、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号３、７、３２〜６６、６９もしくは７２のいずれかに示される任意のものまたは配列番号３、７、３２〜６６、６９もしくは７２のいずれかに対して、少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を示す任意のものなどの、ＰＨ２０ポリペプチドの全長、可溶性形態または活性形態と比較して修飾される。本明細書における方法の特定の例では、出発または非修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸の配列を有する。
【０２７３】
修飾ヒアルロナン分解酵素のライブラリーまたは収集物は、スクリーニングされ得る。ヒアルロナン分解酵素は、タンパク質の構造を変更し得る当業者に公知の任意のプロセスによって修飾され得る。修飾の例として、修飾ヒアルロナン分解酵素のライブラリーまたは収集物を形成するための、タンパク質の１個または複数のアミノ酸の置換、付加および欠失が挙げられる。本明細書における方法において使用するために修飾または変異体タンパク質を作製することは、当業者のレベルの範囲内にある。突然変異誘発の方法は、当技術分野で周知であり、例えば、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの位置指定突然変異誘発または飽和突然変異誘発が挙げられる。突然変異誘発法として、それだけには限らないが、部位媒介性（ｓｉｔｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、カセット突然変異誘発、位置指定突然変異誘発、ランダムポイント突然変異誘発、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップド二本鎖ＤＮＡを使用する突然変異誘発、点ミスマッチ修復、修復するに欠陥のある宿主株を使用する突然変異誘発、制限選択および制限精製、欠失突然変異誘発、総遺伝子合成による突然変異誘発、二本鎖切断修復および当業者に公知の多数のその他のものが挙げられる。本明細書における方法では、突然変異誘発は、タンパク質の全長にわたって、またはタンパク質の一定領域内で達成され得る。突然変異は、合理的にまたは無作為に行われ得る。
【０２７４】
いくつかの例では、本明細書において提供された方法は、各突然変異株タンパク質の同一性が、タンパク質が試験される前に事前に知られているように実施される。例えば、本明細書において提供される方法は、取り組み可能である突然変異誘発およびスクリーニングまたは試験方法を促進し得る。これは、同定されるタンパク質の配列決定を必要とせず、試験されるタンパク質の活性間の比較の容易性を可能にし得る。例えば、位置指定突然変異誘発法は、突然変異株タンパク質を個々に作製するよう使用され得る。突然変異誘発は、作製される各個々の突然変異株が、各単一突然変異誘発反応の単一生成物であるように、特定の標的位置における１つずつの単一アミノ酸残基の置換によって実施され得る。突然変異株ＤＮＡ分子は、突然変異誘発によって設計され、作製され、互いに物理的に分離されてり、各々が独立した突然変異誘発反応の単一生成物であるようなアドレス可能なアレイなどにおいて個々にクローニングされ得る。最適化されている、特定のタンパク質上の標的位置を置換するよう選択されたアミノ酸が、残りの１９種のアミノ酸のすべて、または選択されたアミノ酸のみを含有するより制限された群のいずれかであり得る。本明細書において提供されたいくつかの方法では、置換される各アミノ酸は、残りのアミノ酸の１９種によって、または残りのアミノ酸のうち１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７もしくは１８などの、残りのアミノ酸のうち１９種未満によって独立に置換される。
【０２７５】
２．所望の活性または特性についてのスクリーニングまたは試験
修飾ヒアルロナン分解酵素を含有する組成物のヒアルロニダーゼ活性またはその他の活性は、ヒアルロナン分解酵素を変性条件または変性剤に曝露する条件下でスクリーニングまたは試験される（変性条件または変性剤の存在）。変性条件または変性剤は、酵素に対して完全に致命的である条件または薬剤である必要はないが、一般に、酵素活性を経時的に不安定化する任意の条件または薬剤である。例えば、変性条件は、温度（例えば、３０℃を超える、または約３０℃または３０℃などの高温、例えば、３０℃〜４２℃、例えば、３７℃または約３７℃）、撹拌、無塩または低塩（例えば、ＮａＣｌ）によって引き起こされる、および／または変性剤の存在、例えば、賦形剤の存在（例えば、防腐剤の存在）によって引き起こされる条件であり得る。
【０２７６】
変性条件下で安定性または増大した安定性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を選択または同定する方法のために、活性は、変性条件の不在下での修飾ヒアルロナン分解酵素の活性および／または変性条件の存在下での対応する非修飾ヒアルロナン分解酵素の活性に対して比較され得る。例えば、修飾ヒアルロナン分解酵素はまた、変性条件または変性剤を含むことを除いて同一条件下で（変性条件または変性剤の不在）スクリーニングまたは試験され得る。必要に応じて、対応する非修飾ヒアルロナン分解酵素（例えば、アミノ酸置換（複数可）を含有しないヒアルロナン分解酵素）の活性もまた、ヒアルロナン分解酵素を同一変性条件または変性剤に曝露する同一条件下で試験され得る。
【０２７７】
例えば、修飾ヒアルロナン分解酵素のライブラリーまたは収集物の各メンバーは、１種または複数種の変性条件下でインキュベートされるか、それに対して曝露される。インキュベーションまたは曝露は、インビボまたはインビトロで起こり得る。通常、アッセイは、インビトロで実施される。同一修飾酵素はまた、変性条件を含有しない参照または対照条件に曝露またはインキュベートされる。両条件下での活性が、変性条件または条件に対する曝露の際に安定性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を同定するために比較される。さらに、条件の２つの異なるセットの下での酵素の活性のスクリーニングまたは同定では、一般に、アッセイにおいて変更される唯一の条件は、１種または複数種の変性条件の存在または不在と関連する。それだけには限らないが、時間、温度および／またはその他のインキュベーション条件を含めたアッセイのその他の条件は、条件の両セットについて同一であり得る。
【０２７８】
例えば、曝露は、賦形剤などの変性剤または低塩もしくは無塩を含有するよう修飾または調整されているアッセイバッファーまたは組成物中で修飾ヒアルロナン分解酵素をインキュベーションすることによって達成され得る。例示的変性剤または賦形剤として、それだけには限らないが、抗付着剤、結合剤、コーティング、増量剤および希釈剤、香料、色、滑沢剤、流動促進剤、防腐剤、吸着剤または甘味料が挙げられる。使用されるバッファーの選択は、修飾される特定のパラメータ（単数または複数）に応じて当業者によって経験的に決定され得る。例示的アッセイバッファーとして、グッドバッファー（例えば、Good et al. (1966) Biochemistry， 5:467-477を参照のこと）がある。このようなバッファーの例として、それだけには限らないが、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ＣＡＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＲＩＳまたはＴｒｉｚｍａ（登録商標）バッファーが挙げられる。さらに、賦形剤または塩の量または濃度は、賦形剤または塩の選択および修飾ヒアルロナン分解酵素の所望のレベルまたは活性に応じて、当業者によって経験的に決定され得る。
【０２７９】
一例では、アッセイバッファーまたは組成物は、一定量の変性剤または防腐剤、例えば、フェノール系防腐剤である変性性賦形剤を含めることによって修飾される。フェノール系防腐剤は、フェノール、メタクレゾール（ｍ−クレゾール）、ベンジルアルコールおよびメチルパラベンおよびプロピルパラベンを含めたパラベンであり得る。特に、フェノール系防腐剤は、フェノールおよび／またはｍ−クレゾールである。質量濃度（ｗ／ｖ）のパーセンテージ（％）としての１種または複数種のフェノール系防腐剤の総量は、両端を含めて、０．０５％〜０．６％、０．１％〜０．４％、０．１％〜０．３％、０．１５％〜０．３２５％、０．１５％〜０．２５％、０．１％〜０．２％、０．２％〜０．３％または０．３％〜０．４％の間であり得る。このような例では、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性は、１種または複数種の防腐剤、例えば、１種または複数種のフェノール系防腐剤のこのような総量（例えば、０．０５％〜０．６％の間または約０．０５％〜０．６％の間）の存在下で試験または評価され得る。いくつかの例では、修飾ヒアルロナン分解酵素はまた、アッセイバッファーまたは組成物が、防腐剤を含有するよう修飾されていない、対照または参照条件下で試験または評価され得る。特定の例では、対照として、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性はまた、防腐剤を含有する条件下および／または防腐剤を含有しない条件下で、修飾（複数可）を含有しない対応する非修飾ヒアルロナン分解酵素に対して比較され得る。
【０２８０】
別の例では、アッセイバッファーは、低塩または無塩である変性条件の存在によって修飾される。本明細書において別の場所で論じられるように、ＰＨ２０などのヒアルロナン分解酵素は、一般に、活性のために塩（例えば、ＮａＣｌ、Ｌｙｓ−ＬｙｓまたはＭｇＣｌ２）を必要とする。したがって、塩の不在または低塩は、酵素に対して変性性である。一例では、アッセイバッファーは、１００ｍＭ未満、例えば、９０ｍＭ、８０ｍＭ、７０ｍＭ、６０ｍＭ、５０ｍＭ、４０ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ未満またはそれ以下である塩の量を含むことによって修飾される。このような一例では、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性は、塩の不在下で、または１００ｍＭ未満である塩の存在下で試験され得る。いくつかの例では、修飾ヒアルロナン分解酵素はまた、アッセイバッファーが、高塩濃度、一般に、１４０ｍＭ〜２００ｍＭの間または約１４０ｍＭ〜２００ｍＭの間を含有する対照または参照条件下で試験または評価され得る。特定の例では、対照として、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性は、１００ｍＭ未満などの低塩を含有するか、もしくは塩を含有しない条件下および／または１４０ｍＭ〜２００ｍＭの間もしくは約１４０ｍＭ〜２００ｍＭの間である量の塩を含有する条件下で、修飾（複数可）を含有しない対応する非修飾ヒアルロナン分解酵素に対して比較され得る。
【０２８１】
ヒアルロナン分解酵素の変性条件に対する曝露はまた、変性性であるとわかっている条件下、例えば、３０℃を超える、または約３０℃または３０℃の温度などの高温（例えば、３０℃〜４２℃、例えば３７℃または約３７℃）または撹拌の条件下での修飾ヒアルロナン分解酵素のインキュベーションによって達成され得る。例えば、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性は、３０℃〜４２℃を超える、または約３０℃〜４２℃または３０℃〜４２℃の高温下で試験される。いくつかの例では、修飾ヒアルロナン分解酵素はまた、温度が、３０℃未満、例えば、０℃〜２５℃の間もしくは約０℃〜２５℃、例えば、０℃〜５℃または１８℃〜２５℃である、対照または参照条件下で試験または評価され得る。特定の例では、対照として、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性はまた、３０℃〜４２℃を超える、または約３０℃〜４２℃または３０℃〜４２℃の高温下および／または温度が３０℃未満、例えば、０℃〜２５℃の間もしくは約０℃〜２５℃、例えば、０℃〜５℃または１８℃〜２５℃である下で、修飾（複数可）を含有しない対応する非修飾ヒアルロナン分解酵素に対して比較され得る。
【０２８２】
修飾ヒアルロナン分解酵素は、１種または２種以上の条件に対して曝露され得る。１種の条件に対する曝露は、１種または複数種のその他の条件に対する曝露に対して同時に、逐次、断続的にまたは周期的に起こり得る。
【０２８３】
一例では、本明細書における方法において、修飾ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロニダーゼ活性についてのアッセイを実施する前に変性条件または変性剤に対してインキュベートまたは曝露される。例えば、修飾ヒアルロナン分解酵素は、変性剤の存在下でインキュベートされるか、または１種もしくは複数の変性条件もしくは対照条件、例えば、上記の１種または複数種の変性条件もしくは対照条件に対して曝露される。インキュベーションまたは曝露は、任意の所望の期間であり得、当業者によって経験的に決定され得る。例えば、修飾ヒアルロナン分解酵素は、１種または複数種の変性条件、変性剤または対照条件に対して、１分〜１カ月、例えば、１分〜３週間、１分〜２週間、１分〜１週間、１分〜２４時間、１分〜１２時間、例えば、３０分〜６時間もしくは１時間〜４時間または約１分〜１カ月、例えば、１分〜３週間、１分〜２週間、１分〜１週間、１分〜２４時間、１分〜１２時間、例えば、３０分〜６時間もしくは１時間〜４時間、一般に、少なくとも３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間もしくは１２時間またはおよそ少なくとも３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間もしくは１２時間インキュベートまたは曝露され得る。インキュベーションまたは曝露時間の後、修飾ヒアルロナン分解酵素（または対照非修飾酵素）を含有するサンプルまたは組成物は、ヒアルロニダーゼアッセイについて評価される。別の例では、修飾ヒアルロナン分解酵素は、１種または複数種の変性条件下で曝露またはインキュベートされ、ヒアルロニダーゼ活性について同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、または同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）評価される。修飾ヒアルロナン分解酵素が評価される任意の例では、修飾（複数可）を含有しない非修飾ヒアルロナン分解酵素も比較のために同様のアッセイ条件下で評価され得るということは理解される。
【０２８４】
ヒアルロニダーゼ活性を評価するためのアッセイは、当技術分野で周知である。このようなアッセイの例は、節Ｇに記載されている。一例では、ヒアルロニダーゼ活性は、分解されていないＨＡの量が、酵素をＨＡと反応させた後、ＨＡを沈殿させる試薬（例えば、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）または酸性化血清）の添加によって測定されるマイクロ濁度アッセイにおいて評価され得る。別の例では、ヒアルロニダーゼ活性は、残存するビオチン化ヒアルロン酸が、ヒアルロニダーゼとともにインキュベートした後に測定されるマイクロタイターアッセイを使用して評価され得る（例えば、Frost and Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269、米国特許公開第２００５０２６０１８６号を参照のこと）。試験された条件の各々の下で得られた活性が、決定され、比較される。
【０２８５】
３．選択または同定
本方法では、１種または複数種の変性条件下で修飾ヒアルロナン分解酵素をスクリーニングした後、試験された酵素のヒアルロニダーゼ活性が比較される。本方法は、条件または変性剤による変性に対してより耐性である修飾ヒアルロナン分解酵素を同定するために実施され、それによって、酵素の活性が、変性に対するその耐性の尺度として酵素の安定性を示す。変性の結果としての酵素活性の幾分かの低下は、種々の適用において許容され得、したがって、本方法は、その使用または適用を可能にする、変性条件に対する曝露の際に必要な活性（例えば、治療活性）を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を選択するために実施され得るということは理解される。例えば、対応する非修飾または参照ヒアルロナン分解酵素よりも遅く活性を失うが、その保持された活性が特定の適用または目的にとって十分である修飾酵素が選択され得る。
【０２８６】
本明細書における方法の例では、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性は、第１の変性条件に対する曝露の際に評価され、また対照または非変性条件である第２の条件に対する曝露の際に評価され、得られたヒアルロニダーゼ活性が比較される。比較のために、いくつかの例では、活性は、対照または非変性条件下と比較された変性条件下の活性の比または活性のパーセンテージとして表され得る。例えば、第１および第２の条件間で異なるパラメータが、防腐剤（例えば、フェノール系防腐剤）の存在である場合には、活性は、防腐剤（例えば、フェノール系防腐剤）の不在下での活性に対する防腐剤（例えば、フェノール系防腐剤）の存在下で観察される活性の比または活性のパーセンテージとして表され得る。別の例では、第１および第２の条件間で異なるパラメータが、温度である場合には、活性は、０℃〜２５℃、例えば、０℃〜５℃または１８℃〜２５℃などの低温の存在下での活性と比較した、高温（例えば、３０℃〜４２℃）の存在下で観察される活性の比または活性のパーセンテージとして表され得る。
【０２８７】
変性条件の存在下で、その不在下においてと比較して、任意の所望の活性を保持または示す修飾ヒアルロナン分解酵素が、選択または同定される。本明細書における酵素の選択のための活性の個々のカットオフは、個々のユーザーおよび／または方法の実施に応じて異なり、個々の変性条件または変性剤、個々の修飾ヒアルロナン分解酵素、同定または選択されたヒアルロナン分解酵素の所望の適用などの因子およびその他の同様の因子に応じて経験的に決定され得る。一般に、選択または同定された修飾ヒアルロナン分解酵素は、任意の検出可能な活性が、変性条件または変性剤を用いる曝露またはインキュベーションの際に測定または評価される場合に安定性を示す。例えば、選択または同定された修飾ヒアルロナン分解酵素は、変性条件または変性剤の不在下での同一酵素の活性の少なくとも５％または１０％を示す場合に、一般に、修飾ヒアルロナン分解酵素が、変性条件の存在下でのインキュベーションの前の最初のヒアルロニダーゼ活性の少なくとも１５％である活性を示す場合に、安定性または変性条件もしくは変性剤に対する耐性を示す。例えば、対照または非変性条件下で試験される修飾ヒアルロナン分解酵素の最初のヒアルロニダーゼ活性の少なくとも（または少なくとも約）１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上を示す修飾ヒアルロナン分解酵素が、選択または同定される。
【０２８８】
本明細書における方法のその他の例では、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性は、変性条件に対する曝露の際に評価され、非修飾または参照ヒアルロナン分解酵素の活性もまた、同一変性条件に対する曝露の際に評価される。このような例では、活性は、酵素が同一条件に対して曝露される場合に比較される。比較のために、変性条件下での活性は、非修飾または参照ヒアルロナン分解酵素に対して比較された、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性の比または活性のパーセンテージとして表され得る。このような例では、非修飾または参照ヒアルロナン分解酵素よりも変性条件下で大きな活性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素が、選択される。したがって、修飾ヒアルロナン分解酵素は、条件に対してより耐性であるものである。例えば、変性条件が、防腐剤（例えば、フェノール系防腐剤）の存在である場合には、防腐剤（例えば、フェノール系防腐剤）の存在下で観察された活性は、非修飾または参照ヒアルロナン分解酵素と比較された、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性の比または活性のパーセンテージとして表され得る。別の例では、変性条件が高温である場合には、高温（例えば、３０℃〜４２℃）の存在下で観察される活性は、非修飾または参照ヒアルロナン分解酵素と比較された、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性の比または活性のパーセンテージとして表され得る。
【０２８９】
このような例では、酵素が、変性条件下で非修飾または参照ヒアルロナン分解酵素より大きな活性を示すような、１．１を超えるか、または少なくとも１．１である活性の比を示す、修飾ＰＨ２０などの修飾ヒアルロナン分解酵素が、同定または選択される。例えば、比は、少なくとも１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０またはそれ以上であるか、または少なくとも約１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０またはそれ以上である。修飾ヒアルロナン分解酵素（例えば、修飾ＰＨ２０）は、その活性が、同一条件下で試験された場合に非修飾または参照ヒアルロナン分解酵素の活性の、少なくとも１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上である場合に選択され得る。したがって、変性条件または変性剤に対する増大した耐性によって表されるような、非修飾ヒアルロナン分解酵素または参照ヒアルロナン分解酵素と比較して、大きな、または改善された安定性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素が同定される。
【０２９０】
４．反復性方法
本明細書において提供される方法はまた、反復性である。一例では、方法が実施された後に、変性条件下で増大した安定性などの安定性を示すと同定された任意の修飾ヒアルロナン分解酵素は、安定性を高め、または最適化するよう修飾またはさらに修飾され得る。第２のライブラリーは、第１の同定された修飾ヒアルロナン分解酵素中にさらなる修飾を導入することによって作製され得る。例えば、増大する安定性などの安定性を付与すると同定された修飾は、コンビナトリアルライブラリーを作製するために組み合わされ得る。第２のライブラリーは、本明細書において記載されたアッセイおよび方法を使用して試験され得る。
【０２９１】
本方法の反復性態様の別の例では、増大した安定性などの安定性を示さない（例えば、変性条件下で活性でないか、または増大した活性を有さないような）と同定される修飾ヒアルロナン分解酵素は、さらに修飾され、変性条件下での安定性について再試験され得る。さらなる修飾は、分子の活性および／または安定性と関連している特定の領域（例えば、特定のアミノ酸残基）付近にターゲッティングされ得る。例えば、分子の活性および／または安定性と関連している残基は、一般に、分子の構造フォールディングまたはその他の活性に関与している重大な残基である。したがって、このような残基は、一般に、任意の条件下で活性にとって必要である。重大な残基は、突然変異されると、タンパク質の正常な活性が消失するか、または低減されるので同定され得る。例えば、ヒアルロナン分解酵素において突然変異された場合に、正常または対照アッセイ条件下で、低減または消失したヒアルロニダーゼ活性を示す重大な残基が同定され得る。修飾タンパク質のさらなるライブラリーは、同定された重大なアミノ酸残基またはその付近、例えば、同定された重大なアミノ酸残基に隣接するものにターゲッティングされるアミノ酸突然変異を用いて作製され得る。いくつかの例では、突然変異は、最大１９種のその他のアミノ酸残基の任意の他のものへのアミノ酸置換であり得る。第２のライブラリーは、本明細書において記載されたアッセイおよび方法を使用して試験され得る。
【０２９２】
Ｅ．核酸分子をコードする修飾ＰＨ２０ポリペプチドの産生
本明細書において示される修飾ＰＨ２０ポリペプチドのポリペプチドは、タンパク質精製および組換えタンパク質発現のための当技術分野で周知の方法によって得ることができる。ポリペプチドはまた、化学合成され得る。切断形態を含めた修飾形態または変異体形態は、標準組換えＤＮＡ法を使用して野生型ポリペプチドから操作され得る。例えば、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、位置指定突然変異誘発などによって野生型ポリペプチドから操作され得る。
【０２９３】
１．ＰＨ２０ポリペプチドをコードする核酸の単離または調製
ポリペプチドは、核酸分子をクローニングおよび単離するための当技術分野で公知の任意の利用可能な方法を使用してクローニングまたは単離され得る。このような方法は、核酸のＰＣＲ増幅および核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体ベースのスクリーニングおよび活性ベースのスクリーニングを含めたライブラリーのスクリーニングを含む。
例えば、ポリペプチドが、組換え手段によって産生される場合には、所望の遺伝子をコードする核酸の同定のための当業者に公知の任意の方法が使用され得る。細胞または組織供給源などからＰＨ２０をコードする全長または部分（すなわち、全コーディング領域を包含する）ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡクローンを得るために当技術分野で利用可能な任意の方法が使用され得る。
【０２９４】
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を含めた核酸の増幅方法は、所望のポリペプチドをコードする核酸分子を単離するために使用され得る。このような方法の例として、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＣｅｔｕｓサーマルサイクラーおよびＴａｑポリメラーゼ（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ）の使用が挙げられる。核酸含有材料が、所望のポリペプチドをコードする核酸分子が単離され得る出発材料として使用され得る。例えば、健常および／または罹患対象から得た、ＤＮＡおよびｍＲＮＡ調製物、細胞抽出物、組織抽出物、流体サンプル（例えば、血液、血清、唾液）、サンプルが、増幅方法において使用され得る。供給源は、それだけには限らないが、脊椎動物、哺乳類、ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、鳥類、ウマ、イヌおよびその他の霊長類供給源を含めた任意の真核細胞種から得られ得る。核酸ライブラリーはまた、出発材料の供給源として使用され得る。プライマーは、所望のポリペプチドを増幅するよう設計され得る。例えば、プライマーは、所望のポリペプチドが作製される、発現された配列に基づいて設計され得る。プライマーは、ポリペプチドアミノ酸配列の逆翻訳に基づいて設計され得る。必要に応じて、増幅のために縮重プライマーが使用され得る。所望の配列の３’および５’末端で配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーが、ＰＣＲによって核酸サンプルから得られた配列を増幅するためのプライマーとして使用され得る。プライマーは、全長ＰＨ２０全体または本明細書において提供される可溶性ＰＨ２０ポリペプチドのいずれかをコードする核酸などのその切断配列を増幅するために使用され得る。増幅によって作製された核酸分子は、配列決定され、所望のポリペプチドをコードすると確認され得る。
【０２９５】
合成遺伝子をベクター、例えば、タンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質コーディングＤＮＡ配列の増幅のために設計されたベクター中にクローニングする目的で、制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するリンカー配列を含めたさらなる核酸配列が、ポリペプチドをコードする核酸分子と結合され得る。さらに、機能的ＤＮＡエレメントを特定するさらなるヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードする核酸分子と機能し得る形で連結され得る。このような配列の例として、それだけには限らないが、細胞内タンパク質発現を促進するよう設計されたプロモーター配列および分泌配列、例えば、タンパク質分泌を促進するよう設計された異種シグナル配列が挙げられる。このような配列は、当業者に公知である。例えば、例示的異種シグナル配列として、それだけには限らないが、配列番号８６８に示されるヒトおよびマウスκＩｇＧ異種シグナル配列が挙げられる。タンパク質結合領域を特定する塩基の配列などのさらなるヌクレオチド残基配列も、酵素をコードする核酸分子に連結され得る。このような領域として、それだけには限らないが、特定の標的細胞中への酵素の取り込みを促進するタンパク質を促進またはコードする残基の配列または、そうではなく、合成遺伝子の産物の薬物動態を変更する残基の配列が挙げられる。
【０２９６】
さらに、例えば、ポリペプチドの検出またはアフィニティー精製を補助するために、タグまたはその他の部分が付加され得る。例えば、エピトープタグまたはその他の検出可能なマーカーを特定する塩基の配列などのさらなるヌクレオチド残基配列もまた、酵素をコードする核酸分子と連結され得る。このような配列の例として、ＨｉｓタグまたはＦｌａｇタグをコードする核酸配列が挙げられる。
【０２９７】
同定および単離された核酸は、次いで、適当なクローニングベクター中に挿入され得る。当技術分野で公知の多数のベクター−宿主系が使用され得る。可能性あるベクターとして、それだけには限らないが、プラスミドまたは修飾ウイルスが挙げられるが、ベクター系は、使用される宿主細胞と適合しなくてはならない。このようなベクターとして、それだけには限らないが、λ誘導体などのバクテリオファージまたはｐＣＭＶ４、ｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド誘導体などのプラスミドまたはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）が挙げられる。その他の発現ベクターとして、本明細書において例示されるＨＺ２４発現ベクターが挙げられる（例えば、配列番号４および５を参照のこと）。クローニングベクターへの挿入は、例えば、ＤＮＡ断片を、完全付着末端を有するクローニングベクター中にライゲーションすることによって達成され得る。挿入は、ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して達成され得る。
【０２９８】
ＤＮＡを断片化するために使用される相補的制限部位が、クローニングベクター中に存在しない場合には、ＤＮＡ分子の末端は、酵素的に修飾され得る。あるいは、所望の任意の部位は、ヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端にライゲーションすることによって産生され得、これらのライゲーションされたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを含有し得る。代替法では、切断されたベクターベクターおよびタンパク質遺伝子は、ホモポリマーテーリングによって修飾され得る。
【０２９９】
組換え分子は、遺伝子配列の多数のコピーが作製されるように、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションおよびソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によって宿主細胞中に導入され得る。特定の実施形態では、単離タンパク質遺伝子、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ配列を組み込む組換えＤＮＡ分子での、宿主細胞の形質転換によって、遺伝子の複数のコピーの作製が可能となる。したがって、形質転換体を増殖させること、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離することおよび、必要な場合には、単離された組換えＤＮＡから挿入された遺伝子を取り出すことによって、遺伝子を多量に得ることができる。
【０３００】
組換え産生に加えて、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、固相技術を使用する直接ペプチド合成によって産生され得る（例えば、Stewart et al. (1969) Solid-Phase Peptide synthesis,WH Freeman Co., San Francisco; Merrifield J (1963) J Am Chem Soc., 85:2149-2154を参照のこと）。インビトロタンパク質合成は、手作業による技術を使用して、または自動化によって実施され得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）を使用して、製造業者によって提供された使用説明書にしたがって達成できる。ポリペプチドの種々の断片を、別個に化学合成し、化学法を使用して組み合わせてもよい。
【０３０１】
２．突然変異株または修飾核酸およびコーディングポリペプチドの作製
本明細書において提供された修飾は、当業者には日常的であるものなどの標準組換えＤＮＡ技術によって行われ得る。標的タンパク質中の任意の１個または複数のアミノ酸の突然変異を達成するために、当技術分野で公知の任意の方法が使用され得る。方法として、コーディング核酸分子の標準位置指定突然変異誘発（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なＱｕｉｋＣｈａｎｇｅなどのキットを使用して）、または固相ポリペプチド合成法によってが挙げられる。
【０３０２】
３．ベクターおよび細胞
本明細書において記載された任意の修飾ＰＨ２０ポリペプチドなどの１種または複数種の所望のタンパク質の組換え発現のために、タンパク質をコードするヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含有する核酸は、適当な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳のための必須エレメントを含有するベクター中に挿入され得る。必須転写および翻訳シグナルは、酵素遺伝子の天然のプロモーターおよび／またはそのそれぞれの両端に位置する領域によって供給され得る。
【０３０３】
酵素をコードする核酸を含有するベクターも提供される。ベクターを含有する細胞もまた提供される。細胞は、真核細胞および原核細胞を含み、ベクターは、それにおいて使用するための任意の適したものである。一般に、細胞は、コードされるタンパク質のグリコシル化（ｇｌｙｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を達成できる細胞である。
【０３０４】
ベクターを含有する原核細胞および真核細胞が提供される。このような細胞として、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞が挙げられる。細胞は、上記の細胞を、コードされたタンパク質が細胞によって発現される条件下で増殖させることおよび発現されたタンパク質を回収することによってそのタンパク質を産生するために使用される。本明細書においてにおける目的上、例えば、酵素は、培地中に分泌され得る。
【０３０５】
宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節し、発現されたタンパク質を所望の方法でプロセシングする能力について選択され得る。ポリペプチドのこのような修飾として、それだけには限らないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられる。翻訳後プロセシングは、ポリペプチドのフォールディングおよび／または機能に影響を及ぼし得る。それだけには限らないが、ＣＨＯ（ＤＧ４４、ＤＸＢ１１、ＣＨＯ−Ｋ１）、ＨｅＬａ、ＭＣＤＫ、２９３およびＷＩ３８などの種々の宿主細胞は、このような翻訳後活性のための特定の細胞機構および特徴的な機構を有し、導入されたタンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするよう選択され得る。一般に、細胞の選択は、発現されたポリペプチド中にＮ結合型グリコシル化を導入できるものである。したがって、ベクターを含有する真核細胞が提供される。例示的真核細胞として、哺乳類チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞がある。例えば、ジヒドロホレートレダクターゼ（例えば、ＤＧ４４細胞）に欠陥のあるＣＨＯ細胞が、本明細書において提供されるポリペプチドを産生するために使用される。本明細書において提供されたＰＨ２０ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｙｉｄｅ）の細菌発現は、触媒的に活性なポリペプチドをもたらさず、適切なグリコシル化機構と組み合わせた場合に、ＰＨ２０は、人工的にグリコシル化され得ることに留意されたい。
【０３０６】
天然または異種シグナル配列と結合している修飾ＰＨ２０ポリペプチド、ならびにその複数のコピーをコードするヌクレオチドの配列を含有するベクターが提供される。ベクターは、細胞における酵素タンパク質の発現のために、または酵素タンパク質が分泌タンパク質として発現されるように選択され得る。
【０３０７】
種々の宿主−ベクター系が、タンパク質コード配列を発現するために使用され得る。これらとして、これだけには限らないが、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよびその他のウイルス）に感染した哺乳類細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母などの微生物；またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が挙げられる。ベクターの発現エレメントは、その強度および特異性が変わる。使用される宿主−ベクター系に応じて、いくつかの適した転写および翻訳エレメントのいずれか１種が使用され得る。
【０３０８】
適当な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列を含有するキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築するために、ベクターへのＤＮＡ断片の挿入のための当業者に公知の任意の方法が使用され得る。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技術およびインビボ組換え体（遺伝子組換え）を含み得る。タンパク質またはそのドメイン、誘導体、断片または相同体をコードする核酸配列の発現は、遺伝子またはその断片が、組換えＤＮＡ分子（複数可）で形質転換された宿主において発現されるよう、第２の核酸配列によって調節され得る。例えば、タンパク質の発現は、当技術分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサーによって制御され得る。特定の実施形態では、プロモーターは、所望のタンパク質の遺伝子にとって天然ではない。使用され得るプロモーターとして、それだけには限らないが、ＳＶ４０初期プロモーター（Bernoist and Chambon， Nature 290:304-310 (1981)）、ラウス肉腫ウイルスの３’長い末端反復配列中に含有されるプロモーター（Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980)）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981)）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)）；β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物の発現ベクタープロモーター（Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543）またはｔａｃプロモーター（DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983);Gilbert and Villa-Komaroff,「Useful Proteins from Recombinant Bacteria」, Scientific American 242:74-94 (1980)も参照のこと）；ノパリンシンセターゼプロモーターなどの植物発現ベクタープロモーター（Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984)）またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター（Gardner et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)）および光合成酵素リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼのプロモーター（Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984)）；酵母およびＧａｌ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターなどのその他の真菌由来のプロモーターエレメントならびに組織特異性を示し、トランスジェニック動物において使用されてきた以下の動物転写制御領域：膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swift et al.,Cell 38:639-646 (1984);Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986);MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)）；膵臓β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985)）、リンパ球細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984);Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)）、精巣、乳房、リンパ球および肥満細胞において活性であるマウス乳癌ウイルス制御領域（Leder et al., Cell 45:485-495 (1986)）、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Pinkert et al.、Genes and Devel. 1:268-276 (1987)）、肝臓において活性であるα-フェトタンパク質遺伝子制御領域（Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985);Hammer et al., Science 235:53-58 1987)）、肝臓において活性であるα-１アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171 (1987)）、骨髄系細胞に��いて活性であるβグロビン遺伝子制御領域（Magram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)）、脳の乏突起神経膠細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987)）、骨格筋において活性であるミオシン軽鎖-２遺伝子制御領域（Shani, Nature 314:283-286 (1985)）、および視床下部のゴナドトロピン分泌細胞において活性である性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986)）が挙げられる。
【０３０９】
特定の実施形態では、所望のタンパク質またはそのドメイン、断片、誘導体または同族体をコードする核酸と作動可能に連結しているプロモーター、１種または複数種の複製起点および適宜、１種または複数種の選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含有するベクターが使用される。発現系に応じて、ＰＨ２０配列の効率的な翻訳にとって特定の開始シグナルも必要である。これらのシグナルとして、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列が挙げられる。ＰＨ２０またはその可溶性形態の開始コドンおよび上流配列が、適当な発現ベクターに挿入される場合には、さらなる翻訳制御シグナルは必要ではない。コード配列またはその一部のみが、挿入される場合には、ＡＴＧ開始コドンを含めた外因性転写制御シグナルが提供されなくてはならない。さらに、開始コドンは、全挿入物の転写を確実にするよう正しいリーディングフレーム中になくてはならない。外因性転写エレメントおよび開始コドンは、天然および合成両方の種々の起源のものであり得る。発現の効率は、使用中の細胞系にとって適当なエンハンサーを含めることによって増強され得る（Scharf et al. (1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62;Bittner et al. (1987) Methods in Enzymol, 153:516-544）。
【０３１０】
大腸菌の形質転換のための例示的プラスミドベクターとして、例えば、ｐＱＥ発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡから入手可能；この系を説明するＱｉａｇｅｎによって公開された文献も参照のこと）が挙げられる。ｐＱＥベクターは、大腸菌における組換えタンパク質の堅固に調節された、高レベル発現を提供するための、ファージＴ５プロモーター（大腸菌ＲＮＡポリメラーゼによって認識される）および二重ｌａｃオペレーター抑制モジュール、効率的な翻訳のための合成リボソーム結合部位（ＲＢＳ  ＩＩ）、６×Ｈｉｓタグコード配列、ｔ０およびＴ１転写ターミネーター、ＣｏｌＥ１複製起点およびアンピシリン耐性を付与するためのβ−ラクタマーゼ遺伝子を有する。ｐＱＥベクターは、組換えタンパク質のＮ−またはＣ−末端のいずれかに６×Ｈｉｓタグを配置できる。このようなプラスミドとして、３つすべてのリーディングフレームに多重クローニング部位を提供し、Ｎ末端に６×Ｈｉｓタグをつけたタンパク質の発現を提供する、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ３０およびｐＱＥ３１が挙げられる。大腸菌細胞の形質転換のためのその他の例示的プラスミドベクターとして、例えば、ｐＥＴ発現ベクター（米国特許第４，９５２，４９６号；Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能を参照のこと；この系を説明するＮｏｖａｇｅｎによって公開された文献も参照のこと）が挙げられる。このようなプラスミドとして、Ｔ７ｌａｃプロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導可能な大腸菌ｌａｃオペレーターおよびｌａｃレプレッサー遺伝子を含有するｐＥＴ  １１ａ；Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーターおよび大腸菌ｏｍｐＴ分泌シグナルを含有するｐＥＴ  １２ａ−ｃ；ならびにＨｉｓカラムを用いる精製において使用するためのＨｉｓ−Ｔａｇ（商標）リーダー配列およびカラムでの精製後の切断を可能にするトロンビン切断部位、Ｔ７−ｌａｃプロモーター領域およびＴ７ターミネーターを含有するｐＥＴ  １５ｂおよびｐＥＴ１９ｂ  （Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）が挙げられる。
【０３１１】
通常、ベクターは、インビボまたはインビトロでの修飾ＰＨ２０ポリペプチドの発現のために使用される、プラスミド、ウイルスベクターまたは当技術分野で公知のその他のものであり得る。例えば、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含めた哺乳類細胞において発現される。哺乳類細胞発現のための例示的ベクターとして、ＨＺ２４発現ベクターがある。ＨＺ２４発現ベクターは、ｐＣＩベクター骨格（Ｐｒｏｍｅｇａ）から誘導された。Β−ラクタマーゼ耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）、Ｆ１複製起点、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー／プロモーター領域（ＣＭＶ）およびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０）をコードするＤＮＡを含有する。発現ベクターはまた、ＥＣＭＶウイルス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）およびマウスジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を有する。
【０３１２】
アデノウイルス、レトロウイルスまたはワクシニアウイルスベクターなどのウイルスベクターが使用され得る。いくつかの例では、ベクターは、欠陥のある、または弱毒化レトロウイルスまたはその他のウイルスベクターである（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）。例えば、レトロウイルスベクターは、使用され得る（Miller et al., Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993)を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組込みに必要ではないレトロウイルス配列を欠失するよう修飾されている。
【０３１３】
いくつかの例では、修飾ＰＨ２０ポリペプチドをコードする核酸を備えたウイルスは、例えば、その複製および標的組織内での蔓延を促進し得る。標的組織は、癌性組織であり得、それによって、ウイルスは、腫瘍内で選択的に複製可能である。ウイルスはまた、ウイルスが、組織特異的プロモーターの下で選択的に複製する非溶解性ウイルスであり得る。ウイルスが複製するので、ＰＨ２０ポリペプチドのウイルス遺伝子との同時発現は、インビボでのウイルスの蔓延を促進する。
【０３１４】
４．発現
修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、インビボおよびインビトロ法を含めた当業者に公知の任意の方法によって産生され得る。所望のタンパク質は、例えば、投与および治療にとって必要とされるものなどのタンパク質の必要な量および形態を産生するのに適した任意の生物において発現され得る。発現宿主として、大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞株およびトランスジェニック動物を含めた哺乳類細胞などの原核および真核細胞の生物が挙げられる。発現宿主は、そのタンパク質産生レベルならびに発現されたタンパク質上に存在する翻訳後修飾の種類が異なり得る。発現宿主の選択は、これらおよび規制上および安全上の検討事項、産生費用および必要性および精製方法などのその他の因子に基づいて行われ得る。
【０３１５】
多数の発現ベクターが利用可能であり、当業者に公知であり、タンパク質の発現のために使用され得る。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択によって影響を受ける。一般に、発現ベクターは、転写プロモーターおよび適宜、エンハンサー、翻訳シグナルならびに転写および翻訳終結シグナルを含み得る。安定な形質転換のために使用される発現ベクターは、通常、形質転換された細胞の選択および維持を可能にする選択マーカーを有する。いくつかの場合には、複製起点は、ベクターのコピー数を増幅するために使用され得る。
【０３１６】
修飾ＰＨ２０ポリペプチドはまた、タンパク質融合物として利用または発現され得る。例えば、酵素融合物は、酵素にさらなる機能性を付加するために作製され得る。酵素融合タンパク質の例として、それだけには限らないが、シグナル配列、局在性などのためのタグ、例えば、６×ＨｉｓもしくはＨｉｓ６タグもしくはｍｙｃタグまたは精製のためのタグ、例えば、ＧＳＴ融合物およびタンパク質分泌および／または膜結合に向かわせるための配列の融合物が挙げられる。
【０３１７】
組換えタンパク質の長期の高収率の産生のために、安定な発現が望まれる。例えば、修飾ＰＨ２０ポリペプチドを安定に発現する細胞株は、ウイルス複製起点または内因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を含有する発現ベクターを使用して形質転換され得る。ベクターの導入後、細胞を栄養強化された培地中で１〜２日間増殖させることができ、その後、それを選択培地に切り換える。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在によって、導入された配列を成功裏に発現する細胞の増殖および回収が可能となる。安定に形質転換された細胞の耐性細胞は、細胞種にとって適当な組織培養技術を使用して増殖させることができる。
【０３１８】
形質転換された細胞株を回収するために任意の数の選択系が使用され得る。これらとして、それだけには限らないが、それぞれ、ＴＫ−またはＡＰＲＴ−細胞において使用され得る、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler, M et al. (1977) Cell, 11:223-32）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy, I et al. (1980) Cell, 22:817-23）遺伝子が挙げられる。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤耐性が、選択の根拠として使用され得る。例えば、メトトレキサートに対する耐性を付与するＤＨＦＲ（Wigler, M et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci, 77:3567-70）；アミノグリコシドネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｐｔ（Colbere-Garapin, F et al. (1981) J. Mol. Biol.、150:1-14）；およびそれぞれ、クロルスルフロンおよびホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｒｉｃｉｎ）アセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与するａｌｓまたはｐａｔが使用され得る。さらなる選択可能な遺伝子、例えば、細胞がトリプトファン（ｔｙｐｔｏｐｈａｎ）の代わりにインドールを利用するのを可能にするｔｒｐＢまたは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（ｈｉｓｔｉｎｏｌ）を利用するのを可能にするｈｉｓＤが記載されている（Hartman SC and RC Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci、85:8047-51）。それだけには限らないが、アントシアニン、βグルクロニダーゼおよびその基質、ＧＵＳおよびルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンなどの可視マーカーも、形質転換体を同定するために、また、特定のベクター系に起因し得る一時的または安定なタンパク質発現の量を定量化するために使用され得る（Rhodes CA et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131）。
【０３１９】
ＰＨ２０ポリペプチドの存在および発現は、モニタリングされ得る。例えば、機能的ポリペプチドの検出は、適当な条件下でヒアルロニダーゼ酵素活性についてコンディショニング培地を試験することによって決定され得る。発現されたタンパク質の溶解度および活性を評価するための例示的アッセイは、本明細書において提供される。
【０３２０】
ａ．原核細胞
原核生物、特に、大腸菌は、多量のタンパク質を産生するための系を提供する。大腸菌の形質転換は、当業者に周知の簡単な迅速な技術である。大腸菌の発現ベクターは、誘導プロモーターを含有し得る。このようなプロモーターは、高レベルのタンパク質発現を誘導するのに、また宿主細胞に対して幾分かの毒性を示すタンパク質を発現させるのに有用である。誘導プロモーターの例として、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７およびＳＰ６  ＲＮＡプロモーターおよび温度調節性λＰＬプロモーターが挙げられる。
【０３２１】
本明細書において提供されるいずれかのものなどのタンパク質は、大腸菌の細胞質環境において発現され得る。細胞質は、還元性環境であり、一部の分子にとっては、これは、不溶性封入体の形成をもたらし得る。ジチオスレオトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｏｔｏｌ）およびβ-メルカプトエタノールなどの還元剤ならびにグアニジン−ＨＣｌおよび尿素などの変性剤がタンパク質を再可溶化するために使用され得る。代替アプローチは、酸化環境ならびにシャペロン様およびジスルフィドイソメラーゼを提供する細菌の細胞膜周辺腔におけるタンパク質発現を達成し、これは、可溶性タンパク質の産生に役立ち得る。通常、タンパク質を周辺質に向かわせるリーダー配列が、発現されるべきタンパク質に融合される。次いで、周辺質内のシグナルペプチダーゼによってリーダーが除去される。周辺質をターゲッティングするリーダー配列の例として、ペクチン酸リアーゼ遺伝子に由来するｐｅｌＢリーダーおよびアルカリホスファターゼ遺伝子に由来するリーダーが挙げられる。いくつかの場合には、原形質周辺の発現によって、発現されたタンパク質の培養培地への漏出が可能となる。タンパク質の分泌によって、培養上清からの迅速な、簡単な精製が可能となる。分泌されないタンパク質は、浸透圧溶解によって周辺質から得ることができる。細胞質発現同様、いくつかの場合には、タンパク質は、不溶性となり得、可溶化および再折りたたみを促進するために変性剤および還元剤が使用され得る。誘導および増殖の温度も、発現レベルおよび溶解度に影響を及ぼし得る。通常、２５℃から３７℃の間の温度が使用される。一般に、細菌は、グリコシル化タンパク質を産生する。したがって、タンパク質が機能のためにグリコシル化を必要とする場合にはグリコシル化は、宿主細胞からの精製後にインビトロで付加され得る。
【０３２２】
ｂ.酵母細胞
サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母は、本明細書において記載される任意のものなどのタンパク質の産生のために使用され得る周知の酵母発現宿主である。酵母は、エピソーム複製性ベクターを用いて、または相同組換えによる安定な染色体組込みによって形質転換され得る。通常、誘導プロモーターは、遺伝子発現を調節するために使用される。このようなプロモーターの例として、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ５およびメタロチオネインプロモーター、例えば、ＣＵＰ１、ＡＯＸ１またはその他のピキア（Ｐｉｃｈｉａ）またはその他の酵母プロモーターが挙げられる。発現ベクターは、形質転換されたＤＮＡの選択および維持のために、選択マーカー、例えば、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＵＲＡ３を含むことが多い。酵母において発現されるタンパク質は、可溶性であることが多い。Ｂｉｐなどのシャペロンおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの同時発現は、発現レベルおよび溶解度を改善し得る。さらに、酵母において発現されるタンパク質は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）由来の酵母接合型α因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合物およびＡｇａ２ｐ接合接着受容体またはアルクスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）グルコアミラーゼなどの酵母細胞表面タンパク質との融合物を使用して分泌に向かわせることができる。Ｋｅｘ−２プロテアーゼなどのプロテアーゼ切断部位を、分泌経路を出るときに発現されたポリペプチドから融合された配列を除去するよう操作してもよい。酵母はまた、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフでグリコシル化できる。
【０３２３】
ｃ．昆虫および昆虫細胞
特に、バキュロウイルス発現を使用する昆虫細胞は、ＰＨ２０ポリペプチドなどのポリペプチドを発現させるのに有用である。昆虫細胞は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物によって使用される翻訳後修飾のほとんどを行うことができる。バキュロウイルスは、真核細胞発現の安全性を改善し、規制上の検討事項を減少する、制限的宿主域を有する。通常の発現ベクターは、高レベル発現のためにバキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターを使用する。よく使用されるバキュロウイルス系として、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）またはボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）核多核体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）などのバキュロウイルスならびにスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来Ｓｆ９、ヨトウガ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）（Ａ７Ｓ）およびオオカバマダラ（Ｄａｎａｕｓ  ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ）（ＤｐＮ１）などの昆虫細胞株が挙げられる。高レベル発現のためには、発現される分子のヌクレオチド配列を、ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合する。哺乳動物分泌シグナルは、昆虫細胞において正確にプロセシングされ、発現されたタンパク質を培養培地中に分泌するために使用できる。さらに、細胞株ヨトウガ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）（Ａ７Ｓ）およびオオカバマダラ（Ｄａｎａｕｓ  ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ）（ＤｐＮ１）は、哺乳動物細胞系と同様のグリコシル化パターンを有するタンパク質を産生する。例示的昆虫細胞は、「哺乳類化（ｍａｍｍａｌｉａｎｉｚｅｄ）」バキュロウイルス発現ベクターを有するものおよび酵素ＦＴ３を欠くものを含めた免疫原性を低減するよう変更されているものである。
【０３２４】
昆虫細胞における代替発現系は、安定に形質転換された細胞の使用である。シュナイダー（Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ）２（Ｓ２）およびＫｃ細胞（キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））およびＣ７細胞（ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ））などの細胞株を発現のために使用できる。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）メタロチオネインプロモーターを使用して、カドミウムまたは銅を用いる重金属誘導の存在下で高レベルの発現を誘導できる。発現ベクターは、通常、ネオマイシンおよびハイグロマイシンなどの選択マーカーの使用によって維持される。
【０３２５】
ｄ．哺乳類発現
哺乳類発現系を使用して、ＰＨ２０ポリペプチドを含めたタンパク質を発現させることができる。発現コンストラクトを、アデノウイルスなどのウイルス感染によって、またはリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランなどの直接ＤＮＡトランスファーによって、またエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションなどの物理的手段によって哺乳類細胞に移すことができる。哺乳類細胞の発現ベクターは、通常、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（コザックコンセンサス配列）およびポリアデニル化エレメントを含む。ＩＲＥＳエレメントも、別の遺伝子を用いるバイシストロニック発現を可能にするために付加され得る。このようなベクターは、高レベル発現のための転写プロモーター−エンハンサー、例えば、ＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長い末端反復配列を含むことが多い。これらのプロモーター−エンハンサーは、多数の細胞種において活性である。組織および細胞種プロモーターおよびエンハンサー領域も、発現のために使用できる。例示的プロモーター／エンハンサー領域として、それだけには限らないが、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳癌ウイルス、アルブミン、αフェトプロテイン、α１アンチトリプシン、βグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２および性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御などの遺伝子に由来するものが挙げられる。選択マーカーを使用して、発現コンストラクトを有する細胞を選択および維持できる。選択マーカー遺伝子の例として、それだけには限らないが、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびチミジンキナーゼが挙げられる。例えば、発現は、ＤＨＦＲ遺伝子を発現する細胞のみを選択するためにメトトレキサートの存在下で実施され得る、ＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γなどの細胞表面シグナル伝達分子との融合によって、細胞表面で活性な状態でタンパク質の発現を指示できる。
【０３２６】
哺乳類発現には、マウス、ラット  ヒト、サルおよびニワトリおよびハムスター細胞を含めて多数の細胞株が利用可能である。例示的細胞株として、それだけには限らないが、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分泌性）およびその他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２９３Ｔ、２Ｂ８およびＨＫＢ細胞が挙げられる。細胞培養培地からの分泌タンパク質の精製を促進する血清不含培地に適応した細胞株もまた、利用可能である。例として、ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、カタログ番号１１６１９−０１２）および血清不含ＥＢＮＡ−１細胞株（Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42.）が挙げられる。最大発現のために最適化された特定の培地で増殖するよう適応した細胞株もまた、利用可能である。例えば、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞は、化学的に定義された、動物生成物を含まない培地における懸濁培養において増殖するよう適応している。
【０３２７】
ｅ．植物
本明細書において記載された任意のものなどのタンパク質を発現させるために、トランスジェニック植物細胞および植物を使用できる。発現コンストラクトは、通常、微粒子銃およびプロトプラストへのＰＥＧ媒介性移入などの直接ＤＮＡトランスファーを使用して、またアグロバクテリウム媒介性形質転換を用いて植物に移される。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結エレメントおよび翻訳制御エレメントを含み得る。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびタバコなどの双子葉植物宿主と、トウモロコシおよびコメなどの単子葉植物宿主間で分かれている。発現のために使用される植物プロモーターの例として、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボースビスホスフェートカルボキシラーゼプロモーターならびにユビキチンおよびＵＢＱ３プロモーターが挙げられる。形質転換された細胞の選択および維持を容易にするために、ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択マーカーが使用されることが多い。形質転換された植物細胞は、細胞、凝集体（カルス組織）として培養で維持される場合も、全植物体に再生される場合もある。トランスジェニック植物細胞としてまた、ヒアルロニダーゼポリペプチドを産生するよう操作された藻類を挙げることができる。植物は、哺乳類細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、これは、これらの宿主において産生されたタンパク質の選択に影響を及ぼし得る。
【０３２８】
５．精製
修飾ＰＨ２０ポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養物からのコードされたタンパク質の発現および回収に適した条件下で培養され得る。組換え細胞によって産生されたタンパク質は、一般に、分泌されるが、配列および／または使用されるベクターに応じて細胞内に含有される場合もある。当業者には理解されるであろうが、ＰＨ２０をコードする核酸を含有する発現ベクターは、原核細胞または真核細胞膜を通るＰＨ２０の直接分泌を容易にするシグナル配列を用いて設計され得る。
【０３２９】
したがって、宿主細胞からポリペプチドを精製するための方法は、選択される宿主細胞および発現系に応じて異なる。分泌された分子については、タンパク質は、一般に、細胞を除去した後に、培養培地から精製される。細胞内発現については、細胞を溶解させ、抽出物からタンパク質を精製できる。トランスジェニック植物および動物などのトランスジェニック生物が、発現に使用される場合には、組織または臓器を、溶解された細胞抽出物を製造するための出発材料として使用できる。さらに、トランスジェニック動物産生は、乳または卵におけるポリペプチドの産生を含む場合があり、これは集めることができ、必要に応じて、当技術分野における標準方法を使用して、タンパク質を抽出し、さらに精製できる。
【０３３０】
修飾ＰＨ２０ポリペプチドなどのタンパク質は、それだけには限らないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィーなどのイオン交換クロマトグラフィーを含めた当技術分野で公知の標準タンパク質精製技術を使用して精製できる。調製物の効率および純度を改善するためにアフィニティー精製技術を利用してもよい。例えば、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ酵素と結合する抗体、受容体およびその他の分子をアフィニティー精製において使用してもよい。例えば、可溶性ＰＨ２０を、コンディショニング培地から精製できる。
【０３３１】
また、発現コンストラクトを、タンパク質に、ｍｙｃエピトープ、ＧＳＴ融合物またはＨｉｓ６などのアフィニティータグを加えるよう操作し、それぞれ、ｍｙｃ抗体、グルタチオン樹脂およびＮｉ樹脂を用いてアフィニティー精製してもよい。このようなタグが、本明細書において別の場所に記載されるような可溶性ＰＨ２０をコードするヌクレオチド配列と結合され得、これによって、可溶性タンパク質の精製が容易になり得る。例えば、修飾ＰＨ２０ポリペプチドを、１種または複数種のさらなるポリペプチドドメインがタンパク質精製を容易にするために付加された組換えタンパク質として発現させてもよい。このような精製を容易にするドメインとして、それだけには限らないが、固定化された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレート化ペプチド、固定化された免疫グロブリンでの精製を可能にするプロテインＡドメインおよびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｗａｓｈ．）において利用されるドメインが挙げられる。精製ドメインおよび発現されるＰＨ２０ポリペプチドの間に因子ＸＡまたはエンテロキナーゼなどの切断可能なリンカー配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含めることは、精製を容易にするために有用である。１つのこのような発現ベクターは、ＰＨ２０ポリペプチドおよびエンテロキナーゼ切断部位を含有する融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）での精製を容易にし、一方で、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質からポリペプチドを精製するための手段を提供する。
【０３３２】
純度は、ゲル電気泳動、直交型ＨＰＬＣ法、染色および分光光度的技術を含めた当技術分野で公知の任意の方法によって評価できる。発現され、精製されたタンパク質は、当業者に公知の任意のアッセイまたは方法、例えば、節Ｇにおいて記載される任意のものを使用して分析され得る。これらとして、それだけには限らないが、ゲル電気泳動による分析、イムノアッセイおよびヒアルロニダーゼ活性のアッセイを含めた、タンパク質の物理的および／または機能的特性に基づくアッセイが挙げられる。
【０３３３】
使用される発現系および宿主細胞に応じて、得られるポリペプチドは、産生および精製の際に培養培地中に存在するペプチダーゼのために不均一であり得る。例えば、ＣＨＯ細胞における可溶性ＰＨ２０の培養は、不均一ポリペプチドの混合物をもたらし得る。
【０３３４】
６．ペグ化によるポリペプチドの修飾
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ＰＥＧが、一般に、非免疫原性である、生体適合性で、非毒性の水溶性ポリマーであるので（Zhao and Harris, ACS Symposium Series 680: 458-72, 1997）、主に、生体材料、バイオテクノロジーおよび医薬において広く使用されている。薬物デリバリーの領域では、ＰＥＧ誘導体は、免疫原性、タンパク質分解および腎臓クリアランスを低減し、溶解度を高めるためにタンパク質との共有結合において広く使用されている（すなわち「ペグ化」）（Zalipsky, Adv.Drug Del. Rev. 16:157-82、1995）。同様に、ＰＥＧは、溶解度を高め、毒性を低下させ、体内分布を変更するために、低分子量の、比較的疎水性の薬物と結合されてきた。通常、ＰＥＧ化薬物は、溶液として注射される。
【０３３５】
分解可能な、可溶性薬物担体の設計において使用される同化学の多くが、分解性ゲルの設計においても使用できるので、密接に関連する適用は、架橋された分解可能なＰＥＧネットワークまたは薬物デリバリーにおいて使用するための製剤の合成である（Sawhney et al., Macromolecules 26: 581-87, 1993）。２種の相補的ポリマーの溶液を混合することによって、高分子間錯体が形成され得るということは公知である。このような錯体は、一般に、関与するポリマー間の静電相互作用（ポリアニオン−ポリカチオン）および／または水素結合（ポリ酸−ポリ塩基）によって、および／または水性の周囲中のポリマー間の疎水性相互作用によって安定化される（Krupers et al., Eur. Polym J. 32:785-790, 1996）。例えば、適当な条件下でポリアクリル酸（ＰＡＡｃ）およびポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）の溶液を混合することは、主に水素結合に基づく錯体の形成をもたらす。生理学的条件でのこれらの複合体の解離は、遊離薬物（すなわち、非ＰＥＧ化された）のデリバリーのために使用されてきた。さらに、相補的ポリマーの錯体は、ホモポリマーおよびコポリマーの両方から形成された。
【０３３６】
ペグ化のための多数の試薬が、当技術分野で記載されてきた。このような試薬として、それだけには限らないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）活性化ＰＥＧ、スクシンイミジルｍＰＥＧ、ｍＰＥＧ２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｍＰＥＧスクシンイミジルα−メチルブタノエート、ｍＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート、ｍＰＥＧスクシンイミジルブタノエート、ｍＰＥＧカルボキシメチル３−ヒドロキシブタン酸スクシンイミジルエステル、ホモ二機能性ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート、ホモ二機能性ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ホモ二機能性ＰＥＧブチルアルデヒド、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヒドラジド、ｐ−ニトロフェニル−カルボネートＰＥＧ、ｍＰＥＧ−ベンゾトリアゾールカルボネート、プロピオンアルデヒドＰＥＧ、ｍＰＥＧブチルアルデヒド、分岐ｍＰＥＧ２ブチルアルデヒド、ｍＰＥＧアセチル、ｍＰＥＧピペリドン、ｍＰＥＧメチルケトン、ｍＰＥＧ「リンカーレス」マレイミド、ｍＰＥＧビニルスルホン、ｍＰＥＧチオール、ｍＰＥＧオルトピリジルチオエステル、ｍＰＥＧオルトピリジルジスルフィド、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、ビニルスルホンＰＥＧ−ＮＨＳ、アクリレートＰＥＧ−ＮＨＳ、フルオレセインＰＥＧ−ＮＨＳおよびビオチンＰＥＧ−ＮＨＳとのポリペプチドの反応物が挙げられる（例えば、Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995;Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997;Ｕ．Ｓ．５，６７２，６６２；Ｕ．Ｓ．５，９３２，４６２；Ｕ．Ｓ．６，４９５，６５９；Ｕ．Ｓ．６，７３７，５０５；Ｕ．Ｓ．４，００２，５３１；Ｕ．Ｓ．４，１７９，３３７；Ｕ．Ｓ．５，１２２，６１４；Ｕ．Ｓ．５，３２４，８４４；Ｕ．Ｓ．５，４４６，０９０；Ｕ．Ｓ．５，６１２，４６０；Ｕ．Ｓ．５，６４３，５７５；Ｕ．Ｓ．５，７６６，５８１；Ｕ．Ｓ．５，７９５，５６９；Ｕ．Ｓ．５，８０８，０９６；Ｕ．Ｓ．５，９００，４６１；Ｕ．Ｓ．５，９１９，４５５；Ｕ．Ｓ．５，９８５，２６３；Ｕ．Ｓ．５，９９０，２３７；Ｕ．Ｓ．６，１１３，９０６；Ｕ．Ｓ．６，２１４，９６６；Ｕ．Ｓ．６，２５８，３５１；Ｕ．Ｓ．６，３４０，７４２；Ｕ．Ｓ．６，４１３，５０７；Ｕ．Ｓ．６，４２０，３３９；Ｕ．Ｓ．６，４３７，０２５；Ｕ．Ｓ．６，４４８，３６９；Ｕ．Ｓ．６，４６１，８０２；Ｕ．Ｓ．６，８２８，４０１；Ｕ．Ｓ．６，８５８，７３６；Ｕ．Ｓ．２００１／００２１７６３；Ｕ．Ｓ．２００１／００４４５２６；Ｕ．Ｓ．２００１／００４６４８１；Ｕ．Ｓ．２００２／００５２４３０；Ｕ．Ｓ．２００２／００７２５７３；Ｕ．Ｓ．２００２／０１５６０４７；Ｕ．Ｓ．２００３／０１１４６４７；Ｕ．Ｓ．２００３／０１４３５９６；Ｕ．Ｓ．２００３／０１５８３３３；Ｕ．Ｓ．２００３／０２２０４４７；Ｕ．Ｓ．２００４／００１３６３７；ＵＳ２００４／０２３５７３４；ＷＯ０５０００３６０；Ｕ．Ｓ．２００５／０１１４０３７；Ｕ．Ｓ．２００５／０１７１３２８；Ｕ．Ｓ．２００５／０２０９４１６；ＥＰ１０６４９５１；ＥＰ０８２２１９９；ＷＯ０１０７６６４０；ＷＯ０００２０１７；ＷＯ０２４９６７３；ＷＯ９４２８０２４；およびＷＯ０１��７９２５を参照のこと）。
【０３３７】
一例では、ポリエチレングリコールは、約３ｋＤ〜約５０ｋＤの間、通常、約５ｋＤ〜約３０ｋＤの範囲の分子量を有する。ＰＥＧの薬物との共有結合（「ペグ化」として知られる）は、既知化学合成技術によって達成され得る。例えば、タンパク質のペグ化は、適した反応条件下でＮＨＳ活性化ＰＥＧをタンパク質と反応させることによって達成され得る。
【０３３８】
ペグ化について多数の反応が記載されているが、最も一般的に適用可能なものは、方向性を付与し、穏やかな反応条件を利用し、毒性触媒または副生成物を除去するための大規模な下流処理を必要としない。例えば、モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）は、１つのみの反応性末端ヒドロキシルを有し、したがって、その使用は、得られるＰＥＧ−タンパク質生成物混合物の不均一性を幾分か制限する。末端メトキシ基の反対側のポリマーの末端のヒドロキシル基の活性化は、一般に、誘導体化ＰＥＧを求核攻撃に対してより感受性にすることを目的とした、効率的なタンパク質ペグ化を達成するために必要である。攻撃性求核試薬は、普通、リシル残基のε−アミノ基であるが、局所条件が好都合である場合には、その他のアミンもまた、反応し得る（例えば、Ｎ末端α−アミンまたはヒスチジンの環アミン）。単一のリシンまたはシステインを含有するタンパク質では、より方向性のある結合があり得る。後者の残基が、チオール特異的修飾のためのＰＥＧ−マレイミドによって標的とされ得る。あるいは、ＰＥＧヒドラジドは、過ヨウ素酸酸化されたヒアルロナン分解酵素と反応され、ＮａＣＮＢＨ３の存在下で還元され得る。より詳しくは、ＰＥＧ化ＣＭＰ糖は、適当なグリコシル−トランスフェラーゼの存在下でヒアルロナン分解酵素と反応され得る。１つの技術として、いくつかのポリマー分子が、問題のポリペプチドと結合される「ペグ化」技術がある。この技術を使用する場合には、免疫系は、抗体の形成に関与するポリペプチドの表面上のエピトープの認識が困難となり、それによって、免疫応答が低下する。特定の生理学的効果をもたらすよう、ヒト身体の循環器系に直接導入されるポリペプチド（すなわち、医薬品）については、通常の潜在的免疫応答として、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ反応があるが、呼吸系によって吸入されたポリペプチド（すなわち、産業用ポリペプチド）は、ＩｇＥ反応（すなわち、アレルギー反応）を引き起こす可能性がある。免疫応答の低下を説明する理論の１つは、ポリマー分子（複数可）が、抗体の形成につながる免疫応答に関与するポリペプチドの表面上のエピトープ（複数可）を遮断するということである。別の理論または少なくとも部分的な因子は、コンジュゲートが重いほど、得られる免疫応答はより低減されるということである。
【０３３９】
通常、本明細書において提供されたＰＥＧ化ＰＨ２０ポリペプチドを作製するために、ＰＥＧ部分は、共有結合によってポリペプチドにコンジュゲートされる。ペグ化のための技術として、それだけには限らないが、特殊化されたリンカーおよびカップリング化学（例えば、Roberts、Adv.Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002）、複数のＰＥＧ部分の単一コンジュゲーション部位との結合（分岐ＰＥＧの使用などによる；例えば、Guiotto et al.、Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180、2002）、部位特異的ペグ化および／またはモノペグ化（例えば、Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999）および部位指定酵素的ペグ化（例えば、Sato, Adv.Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002参照のこと）が挙げられる。当技術分野で記載される方法および技術は、単一タンパク質分子と結合している１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０を超えるＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を有するタンパク質を産生し得る（例えば、Ｕ．Ｓ．２００６／０１０４９６８を参照のこと）。
【０３４０】
ＰＥＧ化ＰＨ２０ポリペプチドを作製するための代表的な例示的方法として、ＰＥＧアルデヒド、スクシンイミドおよびカルボネートは、各々、ＰＥＧ部分、通常、スクシンイミジルＰＥＧをｒＨｕＰＨ２０とコンジュゲートするために適用されている。例えば、ｒＨｕＰＨ２０は、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）および（「分岐」ＰＥＧを結合するための）ｍＰＥＧ２−Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミドを含めた例示的スクシンイミジルモノＰＥＧ（ｍＰＥＧ）試薬を用いてコンジュゲートされている。これらのＰＥＧ化スクシンイミジルエステルは、ＰＥＧ基と活性化されるクロスリンカーの間に種々の長さの炭素骨格、単一または分岐ＰＥＧ基のいずれかを含有する。これらの相違は、例えば、異なる反応速度論を提供するために、コンジュゲーションプロセスの間にｒＨｕＰＨ２０とのＰＥＧ結合に利用可能な部位を潜在的に制限するために使用され得る。
【０３４１】
直鎖または分岐ＰＥＧのいずれかを含有するスクシンイミジルＰＥＧ（上記のとおり）は、ＰＨ２０にコンジュゲートされ得る。ＰＥＧは、平均して、ヒアルロニダーゼあたり約３〜６または３〜６のＰＥＧ分子を有する分子を含有するＰＨ２０を再現性よく作製するために使用され得る。このようなＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０組成物は、容易に精製され得、およそ２５，０００または３０，０００単位／タンパク質１ｍｇの比活性のヒアルロニダーゼ活性を有し、非ＰＥＧ化ＰＨ２０を実質的に含まない（５％未満の非ＰＥＧ化）組成物をもたらす。
【０３４２】
種々のＰＥＧ試薬を使用して、例えば、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ（３０ｋＤ）、ｍＰＥＧ−ＳＭＢ（３０ｋＤ）を使用して、ＰＥＧ化ＰＨ２０ポリペプチドの例示的なものならびにｍＰＥＧ２−ＮＨＳ（４０ｋＤ）およびｍＰＥＧ２−ＮＨＳ（６０ｋＤ）に基づいて分岐したものが調製され得る。ＰＨ２０のＰＥＧ化されたものは、ＮＨＳ化学ならびにカルボネートおよびアルデヒドを使用して、以下の試薬：ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ−４０Ｋ分岐、ｍＰＥＧ−ＮＨＳ−１０Ｋ分岐、ｍＰＥＧ−ＮＨＳ−２０Ｋ分岐、ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ−６０Ｋ分岐；ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−５Ｋ、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−２０Ｋ、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋ；ｍＰＥＧ−ＳＭＢ−２０Ｋ、ｍＰＥＧ−ＳＭＢ−３０Ｋ；ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド（ｂｕｔｙｒｌｄｅｈｙｄｅ）；ｍＰＥＧ−ＳＰＡ−２０Ｋ、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ−３０Ｋ；およびＰＥＧ−ＮＨＳ−５Ｋ−ビオチンの各々を使用して作製され得る。Ｄｏｗｐｈａｒｍａのｐ−ニトロフェニル−カルボネートＰＥＧ（３０ｋＤａ）を用い、プロピオンアルデヒドＰＥＧ（３０ｋＤａ）を用いてＰＥＧ化されたＰＨ２０ポリペプチドを含め、ＰＥＧ化ＰＨ２０はまた、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの一部門であるＤｏｗｐｈａｒｍａから入手可能なＰＥＧ試薬を使用して調製され得る。
【０３４３】
一例では、ペグ化は、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ、例えば、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋ（約３０ｋＤａの分子量を有する）またはＰＥＧブタン酸誘導体の別のスクシンイミジルエステルの、ＰＨ２０ポリペプチドとのコンジュゲーションを含む。ＰＥＧブタン酸誘導体、例えば、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋのスクシンイミジルエステルは、タンパク質のアミノ基と容易にカップリングする。例えば、ｍ−ＰＥＧ−ＳＢＡ−３０ＫおよびｒＨｕＰＨ２０の共有結合コンジュゲーション（およそ６０ＫＤａの大きさである）は、以下のスキーム１に示されるようにｒＨｕＰＨ２０およびｍＰＥＧの間に安定なアミド結合を提供する。
【０３４４】
【化１】
0006422933.tif 000014
【０３４５】
通常、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋまたはその他のＰＥＧは、適したバッファー、例えば、滅菌法、例えば、滅菌濾過を続けた、ｐＨ６．８の１３０ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳまたは７０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７中、１０：１のＰＥＧ：ポリペプチドモル比でＰＨ２０ポリペプチドに付加され、例えば、低温室中４℃で、撹拌しながら、一晩コンジュゲーションを継続した。一例では、コンジュゲートされたＰＥＧ−ＰＨ２０は、濃縮され、バッファー交換される。
【０３４６】
ＰＥＧブタン酸誘導体のスクシンイミジル、例えば、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋをカップリングするその他の方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｕ．Ｓ．５，６７２，６６２；Ｕ．Ｓ．６，７３７，５０５；およびＵ．Ｓ．２００４／０２３５７３４）。例えば、ＰＨ２０ポリペプチドなどのポリペプチドは、４℃で１時間のホウ酸バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）中の反応によってＮＨＳ活性化ＰＥＧ誘導体とカップリングされ得る。得られたＰＥＧ化タンパク質は、限外濾過によって精製され得る。別の方法は、脱イオン水中でポリペプチドをｍＰＥＧ−ＳＢＡと反応させ、それに、ｐＨを７．２〜９に高めるためにトリエチルアミンが添加される。得られた混合物を、室温で数時間撹拌し、ペグ化を完了する。
【０３４７】
例えば、動物由来ヒアルロニダーゼおよび細菌ヒアルロナン分解酵素を含めたＰＨ２０ポリペプチドをペグ化する方法は、当技術分野で公知である。例えば、ウシ精巣ヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｏｒｉｎｄａｓｅ）およびコンドロイチンＡＢＣリアーゼのペグ化を記載する欧州特許番号ＥＰ０４００４７２を参照のこと。また、米国公開第２００６０１４９６８号には、ヒトＰＨ２０に由来するヒトヒアルロニダーゼのペグ化が記載されている。例えば、ＰＥＧ化ヒアルロナン分解酵素は、一般に、分子あたり少なくとも３つのＰＥＧ部分を含有する。いくつかの例では、ＰＨ２０ポリペプチドは、３〜６つのＰＥＧ分子を含有する。その他の例では、酵素は、５：１から９：１の間、例えば、７：１のＰＥＧ対タンパク質分子比を有し得る。
【０３４８】
Ｆ．医薬組成物および製剤、投与量および投与
修飾ＰＨ２０ポリペプチドのいずれかの医薬組成物が、投与のために本明細書において提供される。医薬上許容される組成物は、動物において、およびヒトにおいて一般に認識される薬局方に一致して準備された、規制当局およびその他の機関の承認を考慮して調製される。一般に、化合物は、当技術分野で周知の技術および手順を使用して医薬組成物に製剤される（例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126を参照のこと）。
【０３４９】
特に、液体製剤として、両端を含めて、２℃〜８℃もしくは約２℃〜８℃の温度で、少なくとも１カ月間または両端を含めて、３０℃〜４２℃もしくは約３０℃〜４２℃の温度で少なくとも３日間という長期間安定である医薬組成物が本明細書において提供される。特定の液体製剤中の医薬組成物は、保存条件（保存時間または保存の長さ、温度および／または撹拌）および／または組成物中に含有される製剤成分の効果に対して感受性であり得る活性薬剤の安定性によって制限され得る。したがって、安定な医薬組成物は、一般に、１種または複数種のタンパク質変性条件に対する増大した耐性として表れる、増大した安定性を示す、節Ｃ．１．ｂに記載される修飾ＰＨ２０ポリペプチドを含有する。このようなタンパク質変性条件として、それだけには限らないが、３０℃を超える、３０℃に等しい、または約３０℃の高温、撹拌、低塩または無塩および賦形剤の存在を挙げることができる。増大した安定性は、活性薬剤（複数可）、例えば、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼの活性を依然として保持しながらの、改善された保存時間、減少した断片化および／または減少した凝集体形成を特徴とする。このような製剤は、さらなる再構築を伴わないおよび／またはさらなる希釈のための任意の必要条件を伴わない「使用準備済み」液体製剤として提供され得る。いくつかの例では、製剤はまた、凍結乾燥形態または濃縮形態で調製され得る。
【０３５０】
修飾ＰＨ２０ポリペプチドを含有する医薬組成物は、別の治療薬と同時投与されてもよい。このような例では、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、医薬組成物として別個に製剤され、活性治療薬を含有する第２の組成物の前に、それと同時に、それと断続的にまたはその後に投与され得る。その他の例では、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、その他の治療薬の医薬製剤と共製剤され得る。
【０３５１】
特に、本明細書において記載されたような修飾ＰＨ２０ポリペプチドと化学療法薬、鎮痛剤、抗炎症剤、抗菌剤、殺アメーバ剤、殺トリコモナス剤、抗パーキンソン病薬、抗マラリア薬、抗痙攣薬、抗うつ薬および抗関節炎薬、抗真菌剤、抗高血圧薬、解熱剤、抗寄生虫剤、抗ヒスタミン剤、α−アドレナリン作動性アゴニスト剤、α遮断薬、麻酔剤、気管支拡張剤、殺生物剤、殺菌剤、静菌剤、βアドレナリン遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、心血管治療薬、避妊薬、鬱血除去薬、利尿薬、降下薬、診断薬、電解質剤、催眠薬、ホルモン剤、高血糖薬、筋弛緩薬、筋肉収縮薬、眼部薬、副交感神経作動薬、精神賦活剤、鎮静剤、交感神経作用薬、トランキライザー薬、泌尿器薬、膣薬、抗ウイルス剤、ビタミン剤、非ステロイド系抗炎症薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、ポリペプチド、タンパク質、核酸、薬物、有機分子または睡眠誘導物質である治療薬とを含有する共製剤が本明細書において提供される。例えば、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、モノクローナル抗体、免疫グロブリン、抗生物質、ビスホスホネート、サイトカイン、化学療法薬、血液凝固因子またはインスリンなどの抗体と共製剤され得る。修飾ＰＨ２０ポリペプチドと共製剤され得る例示的治療薬が、節Ｈに記載されている。特に、修飾ＰＨ２０ポリペプチドおよび速効型（ｆａｓｔ−ａｃｔｉｎｇ）インスリン、例えば、レギュラーインスリンまたは速効型（ｒａｐｉｄ−ａｃｔｉｎｇ）インスリン類似体などのインスリンを含有する共製剤が、本明細書において提供される。本明細書において提供される共製剤として、活性薬剤、すなわち、修飾ＰＨ２０ポリペプチドおよび治療薬が、本明細書において記載されたように増大した安定性を示し、活性を長期間保持する安定な共製剤が挙げられる。
【０３５２】
別個の製剤を含めた本明細書において提供されたＰＨ２０を含有する製剤および共製剤は、変動する温度で、また撹拌などの変動する保存または使用条件下でを含めて、長期間安定である。例えば、本明細書において提供された製剤は、安定であり、活性薬剤（複数可）（例えば、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ）の活性を、「冷蔵庫」条件、例えば、２℃〜８℃、例えば、４℃または約４℃で、少なくとも少なくとも２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、少なくとも８カ月、少なくとも９カ月、少なくとも１０カ月、少なくとも１１カ月、少なくとも１２カ月、１３カ月、１４カ月、１５カ月、１６カ月、１７カ月、１８カ月、１９カ月、２０カ月、２１カ月、２２カ月、２３カ月、２４カ月、２５カ月、２６カ月、２７カ月、２８カ月、２９カ月または３０カ月またはそれ以上保持する。別の例では、本明細書において提供された製剤は、安定であり、活性薬剤（複数可）（例えば、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ）の活性を、室温で、例えば、１８℃〜３２℃、一般に、２０℃〜３２℃、例えば、２８℃〜３２℃で、少なくとも２週間〜１年、例えば、少なくとも３週間、４週間、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、少なくとも７カ月、少なくとも８カ月、少なくとも９カ月または少なくとも１年またはそれ以上の間保持する。さらなる例では、本明細書において提供された製剤は、安定であり、活性薬剤（複数可）（例えば、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ）の活性を、約３０℃または３０℃を超える、一般に、３０℃〜４２℃または約３０℃〜４２℃、例えば、３２℃〜３７℃または３５℃〜３７℃または約３７℃もしくは３７℃の高温下で、少なくとも４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、６０日間またはそれ以上保持する。
【０３５３】
組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤および持続放出製剤の形態をとり得る。組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドなどの担体を用いて坐剤として製剤されてもよい。経口製剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準担体およびその他のこのような薬剤を含み得る。局所製剤もまた考慮される。製剤は、投与様式に適合しなくてはならない。
【０３５４】
１．製剤−液体、注射用、エマルジョン
製剤は、一般に、投与経路に適合するよう製造される。一般に、皮下に、筋肉内に、静脈内にまたは皮内にのいずれかでの注射または注入を特徴とする非経口投与が、本明細書において考慮される。非経口投与用調製物として、注射準備のできた滅菌溶液、滅菌乾燥可溶性製剤、例えば、皮下錠剤を含めた使用の直前に溶媒とあわせられる準備のできた凍結乾燥した散剤、注射準備のできた滅菌懸濁液、使用の直前に媒体とあわせられる準備のできた滅菌乾燥不溶性製剤および滅菌エマルジョンを含めたが挙げられる。注射用物質は、液体溶液または懸濁液のいずれか、注射に先立って液体での溶液または懸濁液に適した固体形態として、またはエマルジョンとして従来の形態に調製され得る。例えば、別の治療薬と別個に製剤された、または共製剤された修飾ＰＨ２０ポリペプチドを含有する組成物は、溶液、シロップまたは懸濁液として液体形態の医薬品として提供され得る。液体形態では、医薬品は、使用前に治療上有効な濃度に希釈される濃縮調製物として提供され得る。一般に、調製物は、使用前に希釈を必要としない剤形で提供される。別の例では、医薬品は、使用前に水またはその他の適した媒体で再構成するための凍結乾燥形態で提示され得る。
【０３５５】
注射用物質は、局所および全身投与のために設計される。本明細書における目的上、罹患した間質への直接投与のために局所投与が望まれる。溶液は、水性または非水性のいずれかであり得る。静脈内に投与される場合には、適した担体として、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびグルコース、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールおよびそれらの混合物などの増粘剤および可溶化剤を含有する溶液が挙げられる。
【０３５６】
医薬上活性な化合物の濃度は、注射または注入が、所望の薬理効果をもたらすのに有効な量を提供するよう調整される。当技術分野で公知であるように、正確な用量は、患者または動物の年齢、体重および状態に応じて変わる。単位用量非経口調製物は、例えば、アンプル、カートリッジ、バイアルまたはニードルを有するシリンジ中にパッケージングされ得る。医薬上活性な化合物を含有する液体溶液または再構成された散剤調製物の容量は、治療される疾患およびパッケージングのために選択される特定の製造品の関数である。非経口投与用のすべての調製物は、当技術分野で公知であり、実施されるように、無菌でなくてはならない。このような非経口組成物中に含有される活性化合物のパーセンテージは、その特定の性質ならびに化合物の活性および対象の必要性に高度に依存している。
【０３５７】
医薬組成物は、担体またはその他の賦形剤を含み得る。例えば、本明細書において提供された医薬組成物は、希釈剤（複数可）、アジュバント（複数可）、抗付着剤（複数可）、結合剤（複数可）、コーティング（複数可）、増量剤（複数可）、香料（複数可）、色（複数可）、滑沢剤（複数可）、流動促進剤（複数可）、防腐剤（複数可）、洗浄剤（複数可）、吸着剤（複数可）または甘味料（複数可）およびそれらの組合せまたは修飾ＰＨ２０ポリペプチドがともに投与される媒体のうち任意の１種または複数を含有し得る。例えば、非経口調製物において使用される医薬上許容される担体または賦形剤として、水性媒体、非水性媒体、抗菌剤、等張剤、バッファー、抗酸化薬、局所麻酔、懸濁剤および分散剤、乳化剤、封鎖剤またはキレート化剤およびその他の医薬上許容される物質が挙げられる。液体調製物を含めた製剤は、医薬上許容される添加剤または賦形剤を用いて従来手段によって調製され得る。
【０３５８】
適した医薬品担体の例は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。このような組成物は、治療上有効な量の化合物を、一般に精製形態で、患者への適切な投与のための形態を提供するよう適した量の担体と一緒に含有する。このような医薬品担体は、滅菌液体、例えば、水または石油、動物、植物もしくは合成起源のもの、例えば、ピーナッツオイル、大豆オイル、鉱物油およびゴマ油を含めたオイルであり得る。水は、医薬組成物が静脈内に投与される場合の通常の担体である。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、特に、注射用溶液のための液体担体として使用され得る。水性媒体の例として、塩化ナトリウム注射溶液、Ｒｉｎｇｅｒｓ注射溶液、等張性デキストロース注射溶液、滅菌水注射溶液、デキストロースおよび乳酸加リンゲル注射溶液が挙げられる。非水性非経口媒体として、植物起源の硬化油、綿実油、コーンオイル、ゴマ油およびピーナッツオイルが挙げられる。懸濁剤および分散剤として、それだけには限らないが、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンが挙げられる。乳化剤として、それだけには限らないが、レシチンまたはアラビアガムが挙げられる。洗浄剤として、それだけには限らないが、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ  ８０）が挙げられる。非水性媒体として、それだけには限らないが、アーモンドオイル、油性エステルまたは精留植物油が挙げられる。抗菌剤または防腐剤として、それだけには限らないが、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸、ｍ−クレゾール、フェノールが挙げられる。希釈液として、それだけには限らないが、ラクトース、スクロース、二リン酸カルシウムまたはカルボキシメチルセルロースが挙げられる。滑沢剤として、それだけには限らないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたはタルクが挙げられる。結合剤として、それだけには限らないが、デンプン、アラビアガムなどの中性ゴム、ゼラチン、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリジン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドンおよび当業者に公知のその他のこのような結合剤が挙げられる。等張剤として、それだけには限らないが、塩化ナトリウムおよびデキストロースが挙げられる。バッファーとして、それだけには限らないが、リン酸塩およびクエン酸塩が挙げられる。抗酸化薬として、重硫酸ナトリウムが挙げられる。局所麻酔として、塩酸プロカインが挙げられる。金属イオンの封鎖剤またはキレート化剤として、ＥＤＴＡがあげられる。その他の適した医薬品賦形剤として、それだけには限らないが、デンプン、グルコース、ラクトース、デキストロース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、生理食塩水、水およびエタノールが挙げられる。医薬品担体としてまた、水混和性媒体のためのエチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレング��コールおよびｐＨ調整のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸が挙げられる。組成物はまた、必要に応じて、微量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン、安定化剤、溶解度エンハンサーおよび例えば、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンおよびシクロデキストリンなどのその他のこのような薬剤を含有し得る。
【０３５９】
特に、静菌性または静真菌性濃度（例えば、抗菌有効量）の抗菌剤（例えば、防腐剤）が、複数回用量容器中にパッケージングされた非経口調製物に添加され得、これとして、フェノールまたはクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムが挙げられる。
【０３６０】
別個に製剤された、または共製剤された本明細書において提供されたＰＨ２０含有製剤を含めた製剤の容量は、その中に提供される容器に適した任意の容量であり得る。いくつかの例では、製剤は、バイアル、シリンジ、ペン、ポンプのリザーバーまたは閉ループ系中で提供される。例えば、本明細書において提供される製剤は、０．１ｍＬ〜５００ｍＬの間または約０．１ｍＬ〜５００ｍＬの間、例えば、０．１ｍＬ〜１００ｍＬ、１ｍＬ〜１００ｍＬ、０．１ｍＬ〜５０ｍＬ、例えば、少なくとも０．１ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、１５ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬもしくはそれ以上、またはおよそ少なくとも０．１ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、１５ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬもしくはそれ以上または約０．１ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、１５ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬもしくはそれ以上または０．１ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、１５ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬもしくはそれ以上である。
【０３６１】
ａ．凍結乾燥散剤
溶液、エマルジョンおよびその他の混合物として投与のために再構成され得る凍結乾燥散剤が、本明細書において注目される。それらはまた、固体またはゲルとして再構成および製剤され得る。
【０３６２】
滅菌、凍結乾燥散剤は、バッファー溶液に酵素の化合物を溶解することによって調製される。バッファー溶液は、散剤または散剤から調製された再構成された溶液の安定性またはその他の薬理成分を改善する賦形剤を含有し得る。溶液のその後の滅菌濾過と、それに続く、当業者に公知の標準条件下での凍結乾燥によって、所望の製剤が提供される。本明細書において上記に記載されたような液体製剤は、調製され得る。得られた混合物は、粒子を除去し、無菌性を保証するよう滅菌濾過または処理され、凍結乾燥のためのバイアル中に配分される。例えば、凍結乾燥散剤は、デキストロース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロースまたはその他の適した薬剤などの賦形剤を、クエン酸、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムまたは当業者に公知のその他のこのようなバッファーなどの適したバッファーに溶解することによって調製され得る。次いで、選択された酵素が得られた混合物に添加され、溶解するまで撹拌される。
【０３６３】
各バイアルは、化合物の単回投与量または複数回投与量を含有するよう製造される。凍結乾燥散剤は、約４℃〜室温などの適当な条件下で保存され得る。この凍結乾燥散剤の、適当なバッファー溶液での再構成は、非経口投与において使用するための製剤を提供する。
【０３６４】
ｂ．例示的製剤
ＰＨ２０の単回用量製剤は、当技術分野で公知である。例えば、Ｈｙｌｅｎｅｘ（登録商標）組換え体（ヒアルロニダーゼヒト注射溶液）は、ｍＬあたり、８．５ｍｇ  ＮａＣｌ（１４５ｍＭ）、１．４ｍｇ二塩基性リン酸ナトリウム（９．９ｍＭ）、１．０ｍｇヒトアルブミン、０．９ｍｇエデト酸二ナトリウム（２．４ｍＭ）、０．３ｍｇ  ＣａＣｌ２（２．７ｍＭ）および７．４にｐＨを調整するためのＮａＯＨを含有する。米国特許公開第２０１１／００５３２４７号に記載されるｒＨｕＰＨ２０製剤などのヒト可溶性ヒアルロニダーゼのその他の製剤は、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０；または１０ｍＭヒスチジン、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０を含む。本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドのいずれかは同様に製剤され得る。
【０３６５】
治療上有効な量の修飾ＰＨ２０ポリペプチドおよび／またはその他の治療薬に加えて、別個に製剤された、または共製剤されたＰＨ２０含有製剤を含めた本明細書において提供された例示的医薬組成物は、一定濃度のＮａＣｌを含有し得、活性薬剤（複数可）（例えば、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼおよび／またはその他の共製剤された治療薬）の安定性を維持するのに必要なｐＨで調製される。複数回用量製剤および長期間保存されるその他の製剤については、組成物はまた、一般に、１種または複数種の防腐剤を含有する。さらなる分解防止剤およびその他の賦形剤もまた含まれ得る。例示的成分は以下に記載される。
【０３６６】
ｉ．塩（例えば、ＮａＣｌ）
本明細書における例では、本明細書において提供された医薬組成物は、活性薬剤（複数可）（例えば、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ）の安定性を維持するために一定濃度の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）などの塩を含有する。ＮａＣｌなどの塩は、一般に、ＰＨ２０安定性および活性を保持するために必要である。一般に、１２０ｍＭ未満の低塩濃度は、ＰＨ２０活性に対して有害な効果を経時的に、また温度条件に応じて有し得る。したがって、塩（例えば、ＮａＣｌ）がないことまたは低濃度の塩（例えば、ＮａＣｌ）は、タンパク質の不安定性をもたらし得る。しかし、本明細書におけるいくつかの例では、低塩または無塩、例えば、低ＮａＣｌまたはＮａＣｌがないことの不在下で増大した安定性を示す（例えば、節Ｃ．１．ｂ．ｉｉｉを参照のこと）修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、変性に対して感受性ではない。また、塩（例えば、ＮａＣｌ）の存在は、その他の治療薬に対して異なる効果を有し得る。例えば、インスリンおよびインスリン類似体の溶解度は、塩濃度が低いほど増大する傾向があり（例えば、＜１４０ｍＭ）、高塩濃度は、特に、低温でインスリンの結晶化／凝集をもたらし得る（例えば、米国仮出願第６１／５２０，９６２号；米国出願番号第１３／５０７，２６３号および同１３／５０７，２６２号；および国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４２８１６を参照のこと）。したがって、本明細書において提供された医薬組成物は、活性薬剤（複数可）の必要条件に一致して調製される。製剤中の、種々の保存条件下での活性薬剤（複数可）の安定性を評価することは、当業者のレベル内にある（例えば、節Ｇ参照のこと）。本明細書における特定の例では、別個に製剤された、または共製剤された本明細書において提供されたＰＨ２０含有製剤を含めた医薬組成物は、１０ｍＭ〜２００ｍＭ、例えば、１０ｍＭ〜５０ｍＭ、５０ｍＭ〜２００ｍＭ、５０ｍＭ〜１２０ｍＭ、５０ｍＭ〜１００ｍＭ、５０ｍＭ〜９０ｍＭ、１２０ｍＭ〜１６０ｍＭ、１３０ｍＭ〜１５０ｍＭ、  ８０ｍＭ〜１４０ｍＭ、８０ｍＭ〜１２０ｍＭ、８０ｍＭ〜１００ｍＭ、８０ｍＭ〜１６０ｍＭ、１００ｍＭ〜１４０ｍＭ、１２０ｍＭ〜１２０ｍＭもしくは１４０ｍＭ〜１８０ｍＭの間または約１０ｍＭ〜２００ｍＭ、例えば、１０ｍＭ〜５０ｍＭ、５０ｍＭ〜２００ｍＭ、５０ｍＭ〜１２０ｍＭ、５０ｍＭ〜１００ｍＭ、５０ｍＭ〜９０ｍＭ、１２０ｍＭ〜１６０ｍＭ、１３０ｍＭ〜１５０ｍＭ、  ８０ｍＭ〜１４０ｍＭ、８０ｍＭ〜１２０ｍＭ、８０ｍＭ〜１００ｍＭ、８０ｍＭ〜１６０ｍＭ、１００ｍＭ〜１４０ｍＭ、１２０ｍＭ〜１２０ｍＭもしくは１４０ｍＭ〜１８０ｍＭの間の濃度のＮａＣｌを含有する。
【０３６７】
ｉｉ．ｐＨおよびバッファー
本明細書における例では、本明細書において提供される医薬組成物は、活性薬剤（複数可）（例えば、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ）の安定性を維持するためのｐＨで調製される。例えば、本明細書において提供された医薬組成物は、６．５〜７．８の間または約６．５〜７．８の間、例えば、６．５〜７．２、７．０〜７．８、７．０〜７．６もしくは７．２〜７．４の間または約６．５〜７．２、７．０〜７．８、７．０〜７．６もしくは７．２〜７．４の間のｐＨで調製される。本明細書におけるｐＨへの言及は、室温でのｐＨの測定に基づいている。ｐＨは、保存の間、経時的に変更し得るが、通常、６．５〜７．８の間または約６．５〜７．８の間を保持する。例えば、ｐＨは、±０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．３、１．４、１．５またはそれ以上変わり得るということは理解される。本明細書において提供される例示的共製剤は、調製される際に、約７．０±０．２、７．１±０．２、７．２±０．２、７．３±０．２、７．４±０．２、７．５±０．２もしくは７．６±０．２のｐＨまたは約７．０±０．２、７．１±０．２、７．２±０．２、７．３±０．２、７．４±０．２、７．５±０．２もしくは７．６±０．２を有する。必要に応じて、ｐＨは、ｐＨを低下させる酸性化剤またはｐＨを高めるアルカリ化剤を使用して調整され得る。例示的酸性化剤として、それだけには限らないが、酢酸、クエン酸、硫酸、塩酸、リン酸二水素ナトリウム溶液およびリン酸が挙げられる。例示的アルカリ化剤として、それだけには限らないが、リン酸水素ナトリウム溶液、炭酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムが挙げられる。
【０３６８】
組成物は、一般に、ｐＨ範囲を維持する緩衝剤を使用して調製される。任意のバッファーが、活性薬剤（複数可）（例えば、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ）の安定性に悪影響を及ぼさず、必要とされる必要なｐＨ範囲を支持する限り、本明細書において提供される製剤中で使用され得る。特に適したバッファーの例として、Ｔｒｉｓ、コハク酸、酢酸、リン酸バッファー、クエン酸、アコニット酸、リンゴ酸およびカルボン酸が挙げられる。しかし、当業者ならば、本明細書において提供された製剤は、バッファーが、許容可能な程度のｐＨ安定性または示される範囲において「緩衝能」を提供する限り、特定のバッファーに制限されないことを認識するであろう。一般に、バッファーは、そのｐＫの約１ｐＨ単位内の適切な緩衝能を有する（Lachman et al. In: The Theory and Practice of Industrial Pharmacy 3rd Edn. (Lachman, L., Lieberman, HA. and Kanig, J.L., Eds.),Lea and Febiger, Philadelphia, p. 458-460, 1986）。バッファー適合性は、公開されたｐＫ表に基づいて推定され得るか、または当技術分野で周知の方法によって経験的に決定され得る。溶液のｐＨは、例えば、任意の許容される酸または塩基を使用して上記のような範囲内の所望のエンドポイントに調整され得る。
【０３６９】
本明細書において提供された共製剤中に含まれ得るバッファーとして、それだけには限らないが、Ｔｒｉｓ（トロメタミン）、ヒスチジン、リン酸バッファー、例えば、リン酸水素ナトリウムおよびクエン酸バッファーが挙げられる。このような緩衝剤として、１ｍＭ〜１００ｍＭの間または約１ｍＭ〜１００ｍＭの間、例えば、１０ｍＭ〜５０ｍＭまたは２０ｍＭ〜４０ｍＭ、例えば、３０ｎＭまたは約３０ｍＭの濃度で共製剤中に存在し得る。例えば、このような緩衝剤は、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭもしくはそれ以上のまたは約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭもしくはそれ以上の濃度で共製剤中に存在し得る。
【０３７０】
ｉｉｉ．防腐剤（複数可）
本明細書における例では、複数回用量製剤または長期間保存された製剤は、抗菌的に有効な量の防腐剤または防腐剤の混合物を、静菌性または静真菌性効果を有するための量で含有する。特定の例では、防腐剤は、ＥＰの抗菌の必要条件（ＥＰＡ）および望ましいＥＰ抗菌の必要条件（ＥＰＢ）（表４を参照のこと）を含めた、例えば、米国薬局方（ＵＳＰ）および欧州薬局方（ＥＰ）の抗菌の必要条件を提供するのに十分な濃度で存在する。防腐剤、特に、フェノール系防腐剤の存在は、ＰＨ２０の安定性に対して有害な効果を有し得るので、このような製剤は、通常、本明細書において節Ｃ．１．ｂ．ｉに記載される任意のものなどの防腐剤の存在下で増大した安定性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチドを含有する。一般に、量は、活性薬剤（複数可）（例えば、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ）の安定性を維持する。
【０３７１】
防腐剤の抗菌上有効な量とは、抗菌防腐剤有効性試験（ＡＰＥＴ）において評価されるように、組成物のサンプル中の微生物を死滅させるか、またはその増殖を阻害することによって抗菌活性を示す量である。当業者ならば、抗菌防腐剤有効性試験および最小必要条件を満たすためにＵＳＰおよびＥＰＡまたはＥＰＢの下で、満たされるべき標準に精通している。一般に、抗菌防腐剤有効性試験は、適した微生物、すなわち、細菌、酵母および真菌の規定の播種を用いて組成物に負荷すること、播種された調製物を規定の温度で保存すること、指定の時間間隔でサンプルをとることおよびサンプル中の生物をカウントすること含む（Sutton and Porter, (2002) PDA Journal of Pharmaceutica Science and Technology 56(4):300-311; The United States Pharmacopeial Convention, Inc., (effective January 1,2002),The United States Pharmacopeia 25th Revision, Rockville, MD, Chapter <51> Antimicrobial Effectiveness Testing;およびEuropean Pharmacopoeia, Chapter 5.1.3, Efficacy of Antimicrobial Preservationを参照のこと）。負荷に使用される微生物は、一般に、３種の細菌株、すなわち、大腸菌（ＡＴＣＣ番号８７３９）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ番号９０２７）および黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＡＴＣＣ番号６５３８）、酵母（カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）ＡＴＣＣ番号１０２３１）および真菌（クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＡＴＣＣ番号１６４０４）を含み、そのすべてが、播種された組成物が、組成物１ｍＬあたり１０５または１０６コロニー形成単位（ｃｆｕ）の微生物を含有するよう添加される。組成物の防腐剤特性は、試験の条件下で、播種された組成物中の微生物の数において表３において特定されるように、一定時間後に、規定の温度で相当な低下があるか、または増加がない場合に適当であると考えられる。評価の判定基準は、最初のサンプルまたは過去の時と比較された、生存微生物の数のｌｏｇ低下の点で示される。
【０３７２】
本明細書において提供される共製剤中に含まれ得る防腐剤の限定されない例として、それだけには限らないが、フェノール、メタ−クレゾール（ｍ−クレゾール）、メチルパラベン、ベンジルアルコール、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、４−クロロ−１−ブタノール、クロルヘキシジンジヒドロクロリド、クロルヘキシジンジグルコネート、Ｌ−フェニルアラニン、ＥＤＴＡ、ブロノポール（２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール）、酢酸フェニル水銀、グリセロール（グリセリン）、イミドウレア（ｉｍｉｄｕｒｅａ）、クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、オルト−クレゾール（ｏ−クレゾール）、パラ−クレゾール（ｐ−クレゾール）、クロロクレゾール、セトリミド、塩化ベンゼトニウム、エチルパラベン、プロピルパラベンまたはブチルパラベンおよびそれらの任意の組合せが挙げられる。例えば、本明細書において提供される製剤は、単一防腐剤を含有し得る。その他の例では、製剤は、少なくとも２種の異なる防腐剤または少なくとも３種の異なる防腐剤を含有する。例えば、本明細書において提供された製剤は、Ｌ−フェニルアラニンおよびｍ−クレゾール、Ｌ−フェニルアラニンおよびメチルパラベン、Ｌ−フェニルアラニンおよびフェノール、ｍ−クレゾールおよびメチルパラベン、フェノールおよびメチルパラベン、ｍ−クレゾールおよびフェノールまたはその他の同様の組合せなどの２種の防腐剤を含有し得る。一例では、製剤中の防腐剤は、少なくとも１種のフェノール系防腐剤を含有する。例えば、製剤は、フェノール、ｍ−クレゾールまたはフェノールおよびｍ−クレゾールを含有する。
【０３７３】
本明細書において提供された製剤では、製剤中の質量濃度（ｗ／ｖ）のパーセンテージ（％）としての１種または複数種の防腐剤の総量は、例えば、０．１％〜０．４％、例えば、０．１％〜０．３％、０．１５％〜０．３２５％、０．１５％〜０．２５％、０．１％〜０．２％、０．２％〜０．３％もしくは０．３％〜０．４％の間または約０．１％〜０．４％、例えば、０．１％〜０．３％、０．１５％〜０．３２５％、０．１５％〜０．２５％、０．１％〜０．２％、０．２％〜０．３％もしくは０．３％〜０．４％の間であり得る。一般に、製剤は、０．４％（ｗ／ｖ）未満の防腐剤を含有する。例えば、本明細書において提供される共製剤は、少なくとも０．１％、０．１２％、０．１２５％、０．１３％、０．１４％、０．１５％、０．１６％  ０．１７％、０．１７５％、０．１８％、０．１９％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３２５％、０．３５％またはおよそ少なくとも０．１％、０．１２％、０．１２５％、０．１３％、０．１４％、０．１５％、０．１６％  ０．１７％、０．１７５％、０．１８％、０．１９％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３２５％、０．３５％であるが、０．４％未満である総防腐剤を含有する。
【０３７４】
いくつかの例では、本明細書において提供される製剤は、０．１％〜０．２５％の間または約０．１％〜０．２５％の間のフェノールおよび０．０５％〜０．２％の間または約０．０５％〜０．２％の間のｍ−クレゾール、例えば、０．１０％〜０．２％の間または約０．１０％〜０．２％の間のフェノールおよび０．０６％〜０．１８％の間または約０．０６％〜０．１８％の間のｍ−クレゾールまたは０．１％〜０．１５％の間または約０．１％〜０．１５％のフェノールおよび０．０８％〜０．１５％の間または約０．０８％〜０．１５％の間のｍ−クレゾールを含有する。例えば、本明細書において提供される製剤は、０．１％のフェノールおよび０．０７５％のｍ−クレゾール；０．１％のフェノールおよび０．１５％のｍ−クレゾール；０．１２５％のフェノールおよび０．０７５％のｍ−クレゾール；０．１３％のフェノールおよび０．０７５％のｍ−クレゾール；０．１３％のフェノールおよび０．０８％のｍ−クレゾール；０．１５％のフェノールおよび０．１７５％のｍ−クレゾール；または０．１７％のフェノールおよび０．１３％のｍ−クレゾールを含有するか、またはおよそ０．１％のフェノールおよび０．０７５％のｍ−クレゾール；０．１％のフェノールおよび０．１５％のｍ−クレゾール；０．１２５％のフェノールおよび０．０７５％のｍ−クレゾール；０．１３％のフェノールおよび０．０７５％のｍ−クレゾール；０．１３％のフェノールおよび０．０８％のｍ−クレゾール；０．１５％のフェノールおよび０．１７５％のｍ−クレゾール；または０．１７％のフェノールおよび０．１３％のｍ−クレゾールを含有する。
【０３７５】
ｉｖ．安定化剤
本明細書における例では、本明細書において提供される医薬組成物は、適宜、活性薬剤（複数可）（例えば、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ）の安定性を維持するために、１種または複数種のその他の分解防止剤を含有し得る。本明細書において提供される製剤中に含有され得る安定化剤の種類の中に、アミノ酸、アミノ酸誘導体、アミン、糖、ポリオール、塩およびバッファー、界面活性物質およびその他の薬剤が含まれる。本明細書において提供される製剤は、少なくとも１種の安定剤を含有する。例えば、本明細書において提供される製剤は、少なくとも１、２、３、４、５、６種またはそれ以上の安定化剤を含有する。したがって、任意の１種または複数種のアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミン、糖、ポリオール、塩およびバッファー、界面活性物質およびその他の薬剤が、本明細書において製剤中に含まれ得る。一般に、本明細書における製剤は、少なくとも界面活性物質および適当なバッファーを含有する。適宜、本明細書において提供される製剤は、その他のさらなる安定化剤を含有し得る。その他の成分として、例えば、１種または複数種の張力モディファイヤー、１種または複数種の抗酸化剤またはその他の安定剤が挙げられる。
【０３７６】
例示的アミノ酸安定化剤、アミノ酸誘導体またはアミンとして、それだけには限らないが、Ｌ−アルギニン、グルタミン、グリシン、リシン、メチオニン、プロリン、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｔｒｉメチルアミンオキシド（ＴＭＡＯ）またはベタインが挙げられる。例示的糖およびポリオールとして、それだけには限らないが、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、イノシトール、スクロースまたはトレハロースが挙げられる。例示的塩およびバッファーとして、それだけには限らないが、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ（１００ｍＭ）などのＴｒｉｓまたは安息香酸ナトリウムが挙げられる。例示的界面活性物質として、それだけには限らないが、ポロキサマー１８８（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８）、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）が挙げられる。その他の安定化剤として、それだけには限らないが、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、フェニル酪酸、タウロコール酸、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）または亜鉛が挙げられる。
【０３７７】
本明細書において特定の例では、製剤は、活性薬剤（複数可）（例えば、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ）の安定性を維持するために、１種または複数種の、界面活性物質などの洗浄剤を含有する。例えば、界面活性物質は、ＰＨ２０の凝集を阻害し、吸収性喪失を最小化し得る。界面活性物質は、一般に、非イオン性界面活性物質である。本明細書において製剤中に含まれ得る界面活性物質として、それだけには限らないが、グリセロールまたはソルビトールなどの多価アルコールの部分および脂肪酸エステルおよびエーテル、ポロキサマーおよびポリソルベートが挙げられる。例えば、本明細書において製剤中の例示的界面活性物質として、ポロキサマー１８８（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８などのＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標））、ＴＥＴＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ３０００、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ＳＰＡＮ（登録商標）、ＭＹＲＪ（登録商標）、ＢＲＩＪ（登録商標）、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、ポリプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのうち任意の１種または複数が挙げられる。いくつかの例では、本明細書における製剤は、ポロキサマー１８８、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、一般に、ポロキサマー１８８（プルロニックＦ６８）を含有する。本明細書において提供される製剤は、一般に、少なくとも１種の界面活性物質、例えば、１、２または３種の界面活性物質を含有する。
【０３７８】
本明細書において提供される製剤では、製剤中の質量濃度（ｗ／ｖ）のパーセンテージ（％）としての１種または複数種の界面活性物質の総量は、例えば、０．００５％〜１．０％の間または約０．００５％〜１．０％の間、例えば、０．００５％〜１．０％の間、例えば、０．０１％〜０．５％の間または約０．０１％〜０．５％の間、例えば、０．０１％〜０．１％または０．０１％〜０．０２％であり得る。一般に、製剤は、少なくとも０．０１％の界面活性物質を含有し、１．０％未満、例えば、０．５％未満または０．１％未満の界面活性物質を含有する。例えば、本明細書において提供される製剤は、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０１５％、０．０２％、０．０２５％、０．０３％、０．０３５％、０．０４％、０．０４５％、０．０５％、０．０５５％、０．０６％、０．０６５％、０．０７％、０．０８％もしくは０．０９％または約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０１５％、０．０２％、０．０２５％、０．０３％、０．０３５％、０．０４％、０．０４５％、０．０５％、０．０５５％、０．０６％、０．０６５％、０．０７％、０．０８％もしくは０．０９％の界面活性物質を含有し得る。特定の例では、本明細書において提供された製剤は、０．０１％〜０．０５％または約０．０１％〜約０．０５％の界面活性物質を含有する。
【０３７９】
所望の浸透圧を有する溶液を製造するために、張力モディファイヤーが、本明細書において提供された製剤中に含まれ得る。本明細書において提供された製剤は、２４５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３０５ｍＯｓｍ／ｋｇの間または約２４５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３０５ｍＯｓｍ／ｋｇの間の浸透圧を有する。例えば、浸透圧は、２４５ｍＯｓｍ／ｋｇ、２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２５５ｍＯｓｍ／ｋｇ、２６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２６５ｍＯｓｍ／ｋｇ、２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ、２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２８５ｍＯｓｍ／ｋｇ、２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２９５ｍＯｓｍ／ｋｇ、３００ｍＯｓｍ／ｋｇもしくは３０５ｍＯｓｍ／ｋｇまたは約２４５ｍＯｓｍ／ｋｇ、２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２５５ｍＯｓｍ／ｋｇ、２６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２６５ｍＯｓｍ／ｋｇ、２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ、２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２８５ｍＯｓｍ／ｋｇ、２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２９５ｍＯｓｍ／ｋｇ、３００ｍＯｓｍ／ｋｇもしくは３０５ｍＯｓｍ／ｋｇである。いくつかの例では、製剤は、２７５ｍＯｓｍ／ｋｇまたは約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。張力モディファイヤーとして、それだけには限らないが、グリセリン、ＮａＣｌ、アミノ酸、ポリアルコール、トレハロースおよびその他の塩および／または糖が挙げられる。酵素活性および／または浸透圧を保持するための特定の量は、経験的に決定され得る。
【０３８０】
その他の例では、グリセリン（グリセロール）が、製剤中に含まれる。例えば、本明細書において提供される製剤は、通常、６０ｍＭ未満のグリセリン、例えば、５５ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４５ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３５ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２５ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、１５ｍＭ未満、１０ｍＭまたはそれ以下を含有する。グリセリンの量は、通常、存在するＮａＣｌの量に応じて変わり：製剤中により多くのＮａＣｌが存在するほど、所望の浸透圧または浸透圧を達成するためにより少ないグリセリンが必要である。したがって、例えば、高ＮａＣｌ濃度を含有する製剤中に、製剤中にグリセリンが含まれる必要がほとんどないか、全くない。対照的に、わずかに低いＮａＣｌ濃度を含有する製剤中には、グリセリンが含まれ得る。例えば、本明細書において提供された製剤は、４０ｍＭ〜６０ｍＭ、例えば、５０ｍＭ未満、例えば、２０ｍＭ〜５０ｍＭ、例えば、５０ｍＭまたは約５０ｍＭの濃度のグリセリンを含有し得る。
【０３８１】
本明細書において提供された製剤はまた、酸化、特に、ＰＨ２０ポリペプチドの酸化を低減または防ぐために抗酸化薬を含有し得る。例えば、酸化は、高濃度の界面活性物質またはヒアルロナンオリゴマーによって達成する。例示的酸化物質として、それだけには限らないが、システイン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。特定の例では、抗酸化薬は、メチオニンである。本明細書において提供された製剤は、５ｍＭ〜５０ｍＭの間または約５ｍＭ〜約５０ｍＭの間、例えば、５ｍＭ〜４０ｍＭ、５ｍＭ〜２０ｍＭまたは１０ｍＭ〜２０ｍＭの濃度の抗酸化薬を含み得る。例えば、メチオニンは、５ｍＭ〜５０ｍＭの間または約５ｍＭ〜５０ｍＭの間、例えば、５ｍＭ〜４０ｍＭ、５ｍＭ〜２０ｍＭまたは１０ｍＭ〜２０ｍＭの濃度で本明細書における製剤中に提供され得る。例えば、抗酸化薬、例えば、メチオニンは、５ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭもしくは５０ｍＭまたは約５ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭもしくは５０ｍＭである濃度で含まれ得る。いくつかの例では、製剤は、１０ｍＭ〜２０ｍＭのメチオニン、例えば、１０ｍＭもしくは２０ｍＭまたは約１０ｍＭもしくは２０ｍＭのメチオニンを含有する。
【０３８２】
本明細書において提供される製剤はまた、調製物の安定性に寄与するアミノ酸安定剤を含有し得る。安定剤は、非極性または塩基性アミノ酸であり得る。例示的非極性および塩基性アミノ酸として、それだけには限らないが、アラニン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、オルニチン、イソロイシン、バリン、メチオニン、グリシンおよびプロリンが挙げられる。例えば、アミノ酸安定剤は、グリシンまたはプロリン、通常、グリシンである。安定剤は、単一アミノ酸であり得るか、または２個以上のこのようなアミノ酸の組合せであり得る。アミノ酸安定化剤は、天然アミノ酸、アミノ酸類似体、修飾アミノ酸またはアミノ酸同等物であり得る。一般に、アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。例えば、プロリンが安定剤として使用される場合には、一般に、Ｌ−プロリンである。アミノ酸同等物、例えば、プロリン類似体を使用することも可能である。製剤中に含まれるアミノ酸安定剤、例えば、グリシンの濃度は、０．１Ｍ〜１Ｍアミノ酸、通常、０．１Ｍ〜０．７５Ｍ、一般に、０．２Ｍ〜０．５Ｍ、例えば、少なくとも０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．２５Ｍ、０．３Ｍ、０．３５Ｍ、０．４Ｍ、０．４５Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．７５Ｍまたはそれ以上のアミノ酸または約０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．２５Ｍ、０．３Ｍ、０．３５Ｍ、０．４Ｍ、０．４５Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．７５Ｍまたはそれ以上のアミノ酸の範囲である。アミノ酸、例えば、グリシンは、医薬上許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、酢酸塩などの形態で使用され得る。アミノ酸、例えば、グリシンの純度は、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％またはそれ以上でなくてはならない。
【０３８３】
本明細書における例では、必要に応じて、ＰＨ２０を安定化するため、特に、例えば、製剤中に存在する、低塩、高ｐＨ、防腐剤の存在および高温などの他の不安定化剤および状態の効果を低減するために、ヒアルロニダーゼ阻害剤が製剤中に含まれる。このような成分は、一般に、このような条件下で増大した安定性を示す本明細書において提供されるような修飾ＰＨ２０ポリペプチドを含有する医薬組成物には必要ではない。提供される場合には、ヒアルロニダーゼ阻害剤は、少なくともその平衡濃度で提供される。当業者ならば、種々のクラスのヒアルロニダーゼ阻害剤に精通している（例えば、Girish et al. (2009) Current Medicinal Chemistry, 16:2261-2288およびそれに引用される参考文献を参照のこと）。当業者ならば、反応物中のヒアルロニダーゼ阻害剤の平衡濃度または本明細書における安定な組成物を承知しており、当技術分野における標準方法によって決定することができる。
【０３８４】
本明細書における組成物において使用するための例示的ヒアルロニダーゼ阻害剤は、ヒアルロナン（ＨＡ）である。ヒアルロン酸（ＨＡ、ヒアルロナンおよびヒアルロネートとしても知られる）は、ＰＨ２０の天然基質である。ＨＡは、結合組織、上皮組織および神経組織中に広く分布している非硫酸化グリコサミノグリカンである。それ自体がＤ−グルクロン酸およびＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンから構成される、最大２５，０００の二糖単位のポリマーである。ＨＡの分子量は、約５ｋＤａ〜２００，０００ｋＤａの範囲である。任意の大きさＨＡが、安定剤として組成物中に使用され得る。いくつかの例では、ＨＡは、Ｄ−グルクロン酸およびＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンから構成される二糖である。その他の例では、ＨＡは、２つの反復する二糖単位を含有する四糖類などのオリゴ糖であるか、あるいは、本明細書において提供される共製剤中に使用されるＨＡは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０またはそれ以上の二糖単位などの、複数の反復性二糖単位を含有し得る。別の例では、本明細書において提供される製剤中に使用されるＨＡは、５ｋＤａ〜５，０００ｋＤａまたは約５ｋＤａ〜約５，０００ｋＤａ；５ｋＤａ〜１，０００ｋＤａまたは約５ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａ；５ｋＤａ〜５００ｋＤａまたは約５ｋＤａ〜約５００ｋＤａ；または５ｋＤａ〜２００ｋＤａまたは約５ｋＤａ〜約２００ｋＤａである分子量を有する。本明細書において製剤中で使用するための例示的ＨＡオリゴ糖は、６．４ｋＤａ、７４．０ｋＤａもしくは２３４．４ｋＤａまたは約６．４ｋＤａ、７４．０ｋＤａもしくは２３４．４ｋＤａの分子量を有する。製剤は、１ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ  ＨＡ、８ｍｇ／ｍＬ〜１２ｍｇ／ｍＬ、例えば、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１７ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１９ｍｇ／ｍＬもしくは２０ｍｇ／ｍＬまたは約１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１７ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１９ｍｇ／ｍＬもしくは２０ｍｇ／ｍＬもしくはそれ以上のＨＡを含有し得る。いくつかの例では、ＨＡ対ＰＨ２０のモル比は、１００，０００：１、９５，０００：１、９０，０００：１、８５，０００：１、８０，０００：１、７５，０００：１、７０，０００：１、６５，０００：１、６０，０００：１、５５，０００：１、５０，０００：１、４５，０００：１、４０，０００：１、３５，０００：１、３０，０００：１、２５，０００：１、２０，０００：１、１５，０００：１、１０，０００：１、５，０００：１、１，０００：１、９００：１、８００：１、７００：１、６００：１、５００：１、４００：１、３００：１���２００：１もしくは１００：１または約１００，０００：１、９５，０００：１、９０，０００：１、８５，０００：１、８０，０００：１、７５，０００：１、７０，０００：１、６５，０００：１、６０，０００：１、５５，０００：１、５０，０００：１、４５，０００：１、４０，０００：１、３５，０００：１、３０，０００：１、２５，０００：１、２０，０００：１、１５，０００：１、１０，０００：１、５，０００：１、１，０００：１、９００：１、８００：１、７００：１、６００：１、５００：１、４００：１、３００：１、２００：１もしくは１００：１またはそれ以下である。
【０３８５】
いくつかの例では、ニコチン性化合物は、分解防止剤として使用される。ニコチン性化合物として、それだけには限らないが、ニコチンアミド、ニコチン酸、ナイアシン、ナイアシンアミド、ビタミンＢ３および／またはその塩および／またはその任意の組合せが挙げられる。特定の適用では、分解防止剤は、ニコチン性化合物アミノ酸（単数または複数）を含み得る（例えば、国際公開番号ＷＯ２０１０１４９７７２を参照のこと）。例えば、アミノ酸は、アルギニン、グルタミン酸および／またはその塩またはそれらの組合せであり得る。
【０３８６】
２．その他の投与経路のための組成物
治療される状態に応じて、局所適用、経皮パッチ、経口および直腸投与などのその他の投与経路が本明細書において考慮される。
【０３８７】
例えば、直腸投与のための医薬品剤形は、全身効果のための直腸の剤、カプセル剤および錠剤である。直腸の坐剤は、体温で融解または軟化し、１種または複数種の薬理学的にまたは治療上有効な成分を放出する、直腸への挿入のための固形物を含む。直腸坐剤において利用される医薬上許容される物質として、融点を上げるための基剤または媒体および薬剤が挙げられる。基剤の例として、ココアバター（カカオオイル）、グリセリン−ゼラチン、カーボワックス（ポリオキシエチレングリコール）および脂肪酸のモノ−、ジ−、トリグリセリドの適当な混合物が挙げられる。種々の基剤の組合せが使用され得る。坐剤の融点を上げる薬剤として、鯨蝋およびワックスが挙げられる。直腸坐剤は、圧縮法によって、または成形によって調製され得る。直腸坐剤の通常の重量は、約２〜３ｇｍである。直腸投与のための錠剤およびカプセル剤は、経口投与用の製剤と同一の医薬上許容される物質を使用して、同一の方法によって製造される。直腸投与に適した製剤が、単位用量坐剤として提供され得る。これらは、活性化合物を１種または複数種の従来の固体担体、例えば、ココアバターと混合すること、ついで、得られた混合物を成形することによって調製され得る。
【０３８８】
経口投与用には、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、ラクトース、微晶質セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリウムデンプン）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの医薬上許容される賦形剤を用いて、従来手段によって調製された錠剤またはカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は、技術分野で周知の方法によってコーティングされ得る。
【０３８９】
頬側（舌下）投与に適した製剤として、例えば、香味付けた基剤、普通、スクロースおよびアラビアガムまたはトラガカント中に活性化合物を含有するトローチ剤；およびゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアガムなどの不活性の基剤中に化合物を含有する芳香錠が挙げられる。
【０３９０】
局所混合物は、局所および全身投与のために記載されるように調製される。得られた混合物は、溶液、懸濁液、エマルジョンなどであり得、クリーム、ゲル、軟膏、エマルジョン、溶液、エリキシル、ローション、懸濁液、チンキ、ペースト、泡状物質、エアロゾル、洗浄物、スプレー、坐剤、救急絆、皮膚パッチまたは局所投与に適した任意のその他の製剤として製剤される。
【０３９１】
本化合物またはその医薬上許容される誘導体は、吸入などによる局所適用用のエアロゾルとして製剤され得る（例えば、炎症性疾患、特に、喘息の治療にとって有用なステロイドのデリバリーのためのエアロゾルを記載する、米国特許第４，０４４，１２６号、同４，４１４，２０９号および同４，３６４，９２３号を参照のこと）。気道へ投与するためのこれらの製剤は、単独またはラクトースなどの不活性担体と組み合わせた、噴霧器用のエアゾールまたは溶液または吹送用の超微粒散剤としての形態であり得る。このような場合には、製剤の粒子は、一般に、５０ミクロン未満または１０ミクロン未満の直径を有する。
【０３９２】
本化合物は、局所（ｌｏｃａｌ）または局所（ｔｏｐｉｃａｌ）適用用に、例えば、皮膚および粘膜への、例えば、眼中への局所適用用に、また眼中または大槽内または脊髄内適用用に、ゲル、クリームおよびローションの形態で製剤され得る。局所投与は、経皮デリバリーのために、また眼もしくは粘膜への投与のために、または吸入治療のために考慮される。活性化合物の鼻腔溶液は、単独で、またはその他の医薬上許容される賦形剤と組み合わせて、投与され得る。
【０３９３】
経皮投与に適した製剤が提供される。それらは、レシピエントの表皮と長期間、密接に接触したままであるよう適応された個別のパッチなど、任意の適した形態で提供され得る。このようなパッチは、活性化合物を、例えば、活性化合物に関して０．１〜０．２Ｍの濃度の適宜緩衝された水溶液で含有する。経皮投与に適した製剤はまた、イオン導入法（例えば、Tyle, P, Pharmaceutical Research 3(6):318-326 (1986)を参照のこと）によって送達され得、通常、活性化合物の、適宜緩衝された水溶液の形態をとる。
【０３９４】
医薬組成物はまた、制御放出製剤および／またはデリバリー装置によって投与され得る（例えば、米国特許第３，５３６，８０９号；同３，５９８，１２３号；同３，６３０，２００号；同３，８４５，７７０号；；同３，９１６，８９９号；同４，００８，７１９号；；同４，７６９，０２７号；同５，０５９，５９５号；同５，０７３，５４３号；同５，１２０，５４８号；同５，５９１，７６７号；同５，６３９，４７６号；同５，６７４，５３３号および同５，７３３，５６６号を参照のこと）。
【０３９５】
３．投与量および投与
本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、単回投与量または複数回投与量投与用の医薬組成物として製剤され得る。ＰＨ２０ポリペプチドは、治療される患者に対して望ましくない副作用の不在下で治療上有用な効果を発揮するのに十分な量で含まれる。治療上有効な濃度は、既知インビトロおよびインビボ系においてポリペプチドを試験することによって、例えば、本明細書において提供された、もしくは当技術分野で公知のアッセイを使用することによって経験的に決定され得る（例えば、Taliani et al. (1996) Anal. Biochem., 240: 60-67; Filocamo et al. (1997) J Virology, 71: 1417-1427; Sudo et al. (1996) Antiviral Res. 32: 9-18; Bouffard et al. (1995) Virology, 209:52-59; Bianchi et al. (1996) Anal. Biochem., 237: 239-244; Hamatake et al. (1996) Intervirology 39:249-258; Steinkuhler et al. (1998) Biochem., 37:8899-8905; D’Souza et al. (1995) J Gen. Virol., 76:1729-1736; Takeshita et al. (1997) Anal. Biochem., 247:242-246を参照のこと；また、例えば、Shimizu et al. (1994) J. Virol. 68:8406-8408; Mizutani et al. (1996) J. Virol. 70:7219-7223; Mizutani et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun., 227:822-826; Lu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 93:1412-1417; Hahm et al., (1996) Virology, 226:318-326; Ito et al. (1996) J. Gen. Virol., 77:1043-1054; Mizutani et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun., 212:906-911; Cho et al. (1997) J. Virol. Meth. 65:201-207も参照のこと、次いで、ヒトのための投与量についてそれから推定される。
【０３９６】
疾患または状態を治療するために投与されるべき修飾ＰＨ２０の量は、標準臨床技術によって決定され得る。さらに、最適投与量範囲を同定するのに役立つよう、インビトロアッセイおよび動物モデルが使用され得る。経験的に決定され得る正確な投与量は、個々の酵素、投与経路、治療される疾患の種類および疾患の重篤度に応じて異なり得る。
【０３９７】
したがって、正確な投与量および治療期間は、治療されている疾患の関数であり、公知の試験プロトコールを使用して、またはインビボまたはインビトロ試験データからの推定によって経験に決定され得るということは理解される。濃度および投与量の値は、軽減されるべき状態の重篤度によって変わりうるということは留意されたい。任意の特定の対象について、特定の投与計画は、個々の必要性および組成物の投与を投与し、または監督する人の専門家の判断にしたがって経時的に調整されなければならないことおよび示される濃度範囲は、単に例示的なものであって、組成物およびそれを含有する組合せの範囲または使用を制限しようとするものではないということはさらに理解される。組成物は、時間毎、毎日、毎週、毎月、毎年または一度投与され得る。一般に、投与計画は、毒性を制限するよう選択される。毒性または骨髄、肝臓もしくは腎臓もしくはその他の組織機能障害のために療法を終了、中断または投与量を低下させるよう調整する方法および時間を主治医は承知しているということは留意されなくてはならない。逆に、主治医はまた、臨床反応が適切ではない場合に、治療を高レベルに調整する（毒性副作用を防ぎながら）方法および時間も承知している。
【０３９８】
通常、修飾ＰＨ２０酵素の治療上有効な用量は、安定化された溶液または懸濁液または凍結乾燥形中で、１０単位（Ｕ）〜５００，０００単位、１００単位〜１００，０００単位、５００単位〜５０，０００単位、１０００単位〜１０，０００単位、５０００単位〜７５００単位、５０００単位〜５０，０００単位もしくは１，０００単位〜１０，０００単位または約１０単位（Ｕ）〜５００，０００単位、１００単位〜１００，０００単位、５００単位〜５０，０００単位、１０００単位〜１０，０００単位、５０００単位〜７５００単位、５０００単位〜５０，０００単位もしくは１，０００単位〜１０，０００単位、一般に、１，０００〜５０，０００単位である。例えば、ＰＨ２０ポリペプチドは、少なくとも１０Ｕ、２０Ｕ、３０Ｕ、４０Ｕ、５０Ｕ、１００Ｕ、１５０Ｕ、２００Ｕ、２５０Ｕ、３００Ｕ、３５０Ｕ、４００Ｕ、４５０Ｕ、５００Ｕ、６００Ｕ、７００Ｕ、８００Ｕ、９００Ｕ、１０００Ｕ、２，０００Ｕ、３，０００Ｕ、４，０００単位、５，０００Ｕもしくはそれ以上またはおよそ少なくとも１０Ｕ、２０Ｕ、３０Ｕ、４０Ｕ、５０Ｕ、１００Ｕ、１５０Ｕ、２００Ｕ、２５０Ｕ、３００Ｕ、３５０Ｕ、４００Ｕ、４５０Ｕ、５００Ｕ、６００Ｕ、７００Ｕ、８００Ｕ、９００Ｕ、１０００Ｕ、２，０００Ｕ、３，０００Ｕ、４，０００単位、５，０００Ｕもしくはそれ以上の用量で投与され得る。製剤は、単位用量形態、例えば、それだけには限らないが、アンプル、シリンジおよび個々にパッケージングされた錠剤またはカプセル剤で提供され得る。
【０３９９】
ＰＨ２０酵素は、単独で、またはその他の薬理学的に有効な薬剤（複数可）または治療薬（複数可）とともに、０．１〜１００ｍＬ、１〜５０ｍＬ、１０〜５０ｍＬ、１０〜３０ｍＬ、１〜２０ｍＬまたは１〜−１０ｍＬ、通常、１０〜５０ｍＬの総容量で投与され得る。通常、ＰＨ２０含有組成物の注射または注入の容量は、少なくとも０．０１ｍＬ、０．０５ｍＬ、０．１ｍＬ、０．２ｍＬ、０．３ｍＬ、０．４ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、７ｍＬ、８ｍＬ、９ｍＬ、１０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬもしくはそれ以上または少なくとも約０．０１ｍＬ、０．０５ｍＬ、０．１ｍＬ、０．２ｍＬ、０．３ｍＬ、０．４ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、７ｍＬ、８ｍＬ、９ｍＬ、１０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬもしくはそれ以上である。本明細書において提供される製剤は、修飾ＰＨ２０ポリペプチドを、３０単位／ｍＬ〜３０００Ｕ／ｍＬ、３００Ｕ／ｍＬ〜２０００Ｕ／ｍＬもしくは６００Ｕ／ｍＬ〜２０００Ｕ／ｍＬもしくは６００Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬの間または約３０単位／ｍＬ〜３０００Ｕ／ｍＬ、３００Ｕ／ｍＬ〜２０００Ｕ／ｍＬもしくは６００Ｕ／ｍＬ〜２０００Ｕ／ｍＬもしくは６００Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬの間、例えば、少なくとも３０Ｕ／ｍＬ、３５Ｕ／ｍＬ、４０Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬ、３００Ｕ／ｍＬ、４００Ｕ／ｍＬ、５００Ｕ／ｍＬ、６００Ｕ／ｍＬ、７００Ｕ／ｍＬ、８００Ｕ／ｍＬ、９００Ｕ／ｍＬ、１０００Ｕ／ｍＬ、２０００Ｕ／ｍＬもしくは３０００Ｕ／ｍＬまたはおよそ少なくとも３０Ｕ／ｍＬ、３５Ｕ／ｍＬ、４０Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬ、３００Ｕ／ｍＬ、４００Ｕ／ｍＬ、５００Ｕ／ｍＬ、６００Ｕ／ｍＬ、７００Ｕ／ｍＬ、８００Ｕ／ｍＬ、９００Ｕ／ｍＬ、１０００Ｕ／ｍＬ、２０００Ｕ／ｍＬもしくは３０００Ｕ／ｍＬの量で含有する。例えば、本明細書において提供される製剤は、少なくとも１００Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬ、例えば、少なくとも６００Ｕ／ｍＬまたはおよそ少なくとも６００Ｕ／ｍＬまたは約６００Ｕ／ｍＬまたは６００Ｕ／ｍＬである量のＰＨ２０を含有する。
【０４００】
ＰＨ２０ポリペプチドは、少なくとも１００Ｕ／ｍＬ、１５０Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬ、３００Ｕ／ｍＬ、４００Ｕ／ｍＬ、５００Ｕ／ｍＬ、６００Ｕ／ｍＬ、８００Ｕ／ｍＬもしくは１０００Ｕ／ｍＬまたは約１００Ｕ／ｍＬ、１５０Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬ、３００Ｕ／ｍＬ、４００Ｕ／ｍＬ、５００Ｕ／ｍＬ、６００Ｕ／ｍＬ、８００Ｕ／ｍＬもしくは１０００Ｕ／ｍＬまたは１００Ｕ／ｍＬ、１５０Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬ、３００Ｕ／ｍＬ、４００Ｕ／ｍＬ、５００Ｕ／ｍＬ、６００Ｕ／ｍＬ、８００Ｕ／ｍＬもしくは１０００Ｕ／ｍＬである量で溶液として提供され得るか、またはより濃縮した形態で、例えば、直接使用するための、または使用前に有効な濃度へ希釈のための、少なくとも２０００Ｕ／ｍＬ、３０００単位／ｍＬ、４０００Ｕ／ｍＬ、５０００Ｕ／ｍＬ、８０００Ｕ／ｍＬ、１０，０００Ｕ／ｍＬもしくは２０，０００Ｕ／ｍＬまたは約２０００Ｕ／ｍＬ、３０００単位／ｍＬ、４０００Ｕ／ｍＬ、５０００Ｕ／ｍＬ、８０００Ｕ／ｍＬ、１０，０００Ｕ／ｍＬもしくは２０，０００Ｕ／ｍＬである量で提供され得る。ＰＨ２０ポリペプチド組成物は、液体または凍結乾燥製剤として提供され得る。
【０４０１】
ＰＨ２０が治療薬共製剤される場合には、投与量は投与される、ＰＨ２０ポリペプチドの量対治療薬の量の比として提供され得る。例えば、ＰＨ２０ポリペプチドは、１ヒアルロニダーゼＵ／治療薬Ｕ（１：１）〜５０：１またはそれ以上で、例えば、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１もしくはそれ以上で、または約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１もしくはそれ以上で投与され得る。
【０４０２】
共製剤および／または安定な製剤を含めた本明細書において提供される製剤は、単回用量投与、複数回用量投与または連続注入投与用に調製され得る。一定レベルの投与量が維持されるような徐放または持続放出システムの移植（例えば、米国特許第３，７１０，７９５号を参照のこと）も本明細書において考慮される。
【０４０３】
例えば、医薬上治療上活性な化合物およびその誘導体の製剤は、単位剤形または複数回剤形で、ヒトおよび動物への投与のために提供される。例えば、化合物は、適した量の化合物または医薬上許容される誘導体を含有する、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、滅菌非経口溶液または懸濁液、経口溶液または懸濁液またはオイル−水エマルジョンとして製剤され得る。各単位用量は、必要な医薬品担体、媒体または希釈液と関連して、十分な所定の量の治療上活性な化合物（複数可）を含有する。単位用量形態の例として、アンプルおよびシリンジおよび個々にパッケージングされた錠剤またはカプセル剤が挙げられる。単位用量形態は、画分またはその複数で投与され得る。複数回用量形態は、分離された単位用量形態で投与される、単一容器にパッケージングされた複数の同一の単位剤形である。複数回用量形態の例として、バイアル、錠剤またはカプセル剤のボトルまたはピンのボトルまたはガロン瓶が挙げられる。したがって、複数回用量形態は、パッケージングにおいて分離されない複数の単位用量である。一般に、剤形または非毒性担体から構成されるバランスをとって、０．００５％〜１００％の範囲で有効成分を含有する組成物は、調製され得る。
【０４０４】
本明細書において提供される組成物は、通常、皮下経路による投与のために製剤されるが、筋肉内、腹腔内、静脈内の、皮内、病巣内、腹膜内注射、硬膜外、膣内、直腸、局所、耳、経皮投与または任意の投与経路を含めた、当業者に公知の任意の経路など、その他の投与経路が考慮される。このような経路に適した製剤は、当業者には公知である。投与は、治療の部位に応じて局所（ｌｃａｌ）、局所（ｔｏｐｉｃａｌ） または全身であり得る。治療を必要とする領域への局所投与は、例えば、それだけには限らないが、手術の際の局所注入、局所適用、例えば、術後の創傷包帯とともに、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、または埋込錠によって達成され得る。組成物はまた、その他の生物学的に活性な薬剤とともに逐次、断続的に、または同一組成物中のいずれかで投与され得る。
【０４０５】
任意の所与の場合における最も適した経路は、疾患の性質、個々の投与経路に対する対象の耐性、疾患の重篤度および使用される個々の組成物などの種々の因子に応じて変わる。通常、本明細書において提供される組成物は、非経口的に投与される。いくつかの例では、修飾ＰＨ２０ポリペプチド組成物は、皮膚または組織の間質に到達し、それによって、治療薬のその後のデリバリーのために間質空間を分解するよう投与される。したがって、いくつかの例では、皮下投与法などの皮膚下への直接投与が考慮される。したがって、一例では、局所投与は、シリンジまたはニードルなどの注射装置を含有するその他の製造品などからの注射によって達成され得る。別の例では、局所投与は、注入によって達成され得、これは、ポンプまたはその他の同様の装置の使用によって容易にされ得る。その他の投与様式も考慮される。例えば、ＰＥＧ化形態などの増大した半減期を有するコンジュゲートしている形態に含まれる修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、静脈内に投与され得る。医薬組成物は、各投与経路にとって適当な剤形に製剤され得る。
【０４０６】
投与法は、選択された修飾ＰＨ２０ポリペプチドの、タンパク質分解ならびに抗原性および免疫原性反応による免疫学的介入などの分解性プロセスへの曝露を低減するために使用され得る。このような方法の例示的なものとして、治療部位での局所投与が挙げられる。治療薬のペグ化は、タンパク質分解に対する耐性を増大し、血漿半減期を増大し、抗原性および免疫原性を低減する。ペグ化法の例は、当技術分野で公知である（例えば、 Lu and Felix, Int. J. Peptide Protein Res., 43: 127-138、1994; Lu and Felix, Peptide Res., 6: 140-6, 1993; Felix et al., Int. J. Peptide Res., 46 : 253-64, 1995; Benhar et al., J. Biol. Chem., 269: 13398-404, 1994; Brumeanu et al., J Immunol., 154: 3088-95, 1995を参照のこと；Caliceti et al. (2003) Adv.Druf Deliv. Rev. 55(10):1261-77およびMolineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8Sも参照のこと）。ペグ化はまた、インビボでの核酸分子のデリバリーにおいて使用され得る。例えば、アデノウイルスのペグ化は、安定性および遺伝子導入を増大し得る（例えば、Cheng et al. (2003) Pharm. Res. 20(9): 1444-51を参照のこと）。
【０４０７】
それだけには限らないが、リポソームへのカプセル封入、微粒子、マイクロカプセル剤、化合物を発現できる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスおよびレトロウイルスデリバリー系などの選択されたＰＨ２０ポリペプチドをコードする核酸分子のデリバリーなどの種々のその他のデリバリー系が公知であり、選択されたＰＨ２０ポリペプチドを投与するために使用され得る。
【０４０８】
したがって、特定の実施形態では、リポソームおよび／またはナノ粒子もまた、可溶性ＰＨ２０ポリペプチドの投与とともに使用され得る。リポソームは、水性培地において分散され、自発的に多重膜同心性二層小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ  ｂｉｌａｙｅｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）（多重膜小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは、一般に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、２００〜５００オングストロームの直径を有し、コアに水溶液を含有する小さい単層膜リポソーム（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）（ＳＵＶ）の形成をもたらす。
【０４０９】
リン脂質は、水に分散されると、脂質対水のモル比に応じてリポソーム以外の種々の構造を形成し得る。脂質対水の低い比では、リポソームが形成する。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に応じて変わる。リポソームは、イオン性および極性物質に対して低い透過性を示し得るが、高温下では相転移を受け、これはその透過性を著しく変更する。相転移は、ゲル状態としても知られる、ぎっしりと詰まった、正しく並んだ構造から、流体状態としても知られる、緩く詰まった、あまり並んでいない構造への変化を含む。これは、特徴的な相転移温度で起こり、イオン、糖および薬物に対する透過性の増大をもたらす。
【０４１０】
リポソームは、種々の機序：細網内皮系の食細胞、例えば、マクロファージおよび好中球によるエンドサイトーシス；非特異的弱疎水性力または静電力による、または細胞表面成分との特異的相互作用による細胞表面への吸着；リポソームの脂質二重層の細胞膜への挿入による細胞膜との融合、細胞質へのリポソーム内容物の同時放出を伴う；リポソーム内容物の何らかの結合を伴わない、細胞膜または細胞内膜へのリポソーム脂質の移動による、逆もまた同様によって細胞と相互作用する。リポソーム製剤を変えることは、どの機序が働くかを変更し得るが、２種以上が同時に働き得る。ナノカプセル剤は、一般に、安定な、再現性のある方法で化合物を封入し得る。細胞内ポリマー過負荷による副作用を避けるために、このような超微細粒子（およそ０．１μｍの大きさ）は、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計されなければならない。これらの必要条件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、本明細書において使用するために考慮され、このような粒子は、容易に製造され得る。
【０４１１】
４．例示的ＰＨ２０-インスリン共製剤
速効型（ｒａｐｉｄ  ａｃｔｉｎｇ）（速効型（ｆａｓｔ−ａｃｔｉｎｇ））インスリン類似体および修飾ＰＨ２０ポリペプチドなどの速効型（ｆａｓｔ−ａｃｔｉｎｇ）インスリンの安定な共製剤が、本明細書において提供される。本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドのいずれかが、インスリンとの共製剤、例えば、米国出願番号第１３／５０７，２６３号または同１３／５０７，２６２号に、または国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４２８１６に記載される共製剤のいずれか中に含まれ得る。
【０４１２】
特に、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、変性条件下で増大した安定性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、節Ｃ．１．ｂに示される任意のものである。特に、ＰＨ２０ポリペプチドは、１種または複数種のフェノール系防腐剤に対して増大した安定性を示す修飾ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、節Ｃ．１．ｂ．ｉに示される任意のものである。例えば、ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して位置２０４に対応する位置にＰでのアミノ酸置換を含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、配列番号３、７または３２〜６６のいずれかに関連してＦ２０４Ｐである。その他の例では、ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して位置５８に対応する位置にＲでのアミノ酸置換を含有する修飾ＰＨ２０ポリペプチド、例えば、配列番号３、７または３２〜６６のいずれかに関連してＶ５８Ｒである。
【０４１３】
速効型（ｆａｓｔ  ａｃｔｉｎｇ）インスリンは、レギュラーインスリンまたは速効型（ｒａｐｉｄ  ａｃｔｉｎｇ）（速効型（ｆａｓｔ−ａｃｔｉｎｇ））インスリン類似体であり得る。インスリンは、プロセシングされると、Ａ鎖およびＢ鎖を含有する５１個のアミノ酸から構成されるポリペプチドである。一般に、インスリンは、約２１個のアミノ酸のＡ鎖と、約３０個のアミノ酸のＢ鎖とを含有する。Ａ鎖およびＢ鎖は、ジスルフィド橋によって連結している。例示的レギュラーインスリンとして、例えば、ヒトインスリン（配列番号８６２に示されるアミノ酸の配列を有するＡ鎖および配列番号８６３に示されるアミノ酸の配列を有するＢ鎖を有する）またはブタインスリン（配列番号８６４のアミノ酸残基位置８８〜１０８として示されるアミノ酸の配列を有するＡ鎖と、配列番号８６４のアミノ酸残基位置２５〜５４として示されるアミノ酸の配列を有するＢ鎖とを有する）が挙げられる。例示的速効型インスリン類似体として、配列番号８６２および８６３（ＡおよびＢ鎖）に示されるヒトインスリンと比較して、１つまたは複数のアミノ酸修飾を含有するインスリン変異体がある。例えば、例示的インスリン類似体は、当業者に公知であり、それだけには限らないが、配列番号８６２に示されるＡ鎖および配列番号８６３の変異体であるＢ鎖（Ｂ鎖；ＬｙｓＢ３、ＧｌｕＢ２９）を有するグルリシン（ｆａｓｔ−ａｃｔｉｎｇ）、配列番号８６２に示されるＡ鎖および配列番号８６３の変異体であるＢ鎖（Ｂ鎖；ＬｙｓＢ３、ＩｌｅＢ２８）を有するＨＭＲ−１  １５３、配列番号８６２に示されるＡ鎖および配列番号８６３の変異体であるＢ鎖（Ｂ鎖；ＡｓｐＢ２８）を有するインスリンアスパルトおよび配列番号８６２に示されるＡ鎖および配列番号８６３の変異体であるＢ鎖（Ｂ鎖；ＬｙｓＢ２８、ＰｒｏＢ２９）を有するインスリンリスプロが挙げられる。上記のどの例においても、類似体の命名法は、鎖のＮ末端から番号付けられた、インスリンのＡまたはＢ鎖上での特定の位置におけるアミノ酸置換の記載に基づいて折り、これでは、配列の残りの部分は、天然ヒトインスリンのものである。このような類似体形態の例示的なものは、配列番号８６２（Ａ鎖）に示され、配列番号８６５〜８６７のいずれかに示されるＢ鎖を有する。
【０４１４】
共製剤は、液体製剤として、長期間、両端を含めて、２℃〜８℃もしくは約２℃〜８℃の温度で少なくとも１カ月間または両端を含めて、３０℃〜４２℃もしくは約３０℃〜４２℃の温度で少なくとも３日間安定である。例えば、共製剤は、安定であり、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼおよびインスリンの活性を、「冷蔵庫」条件、例えば、２℃〜８℃、例えば、４℃または約４℃で、少なくとも少なくとも２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、少なくとも８カ月、少なくとも９カ月、少なくとも１０カ月、少なくとも１１カ月、少なくとも１２カ月、１３カ月、１４カ月、１５カ月、１６カ月、１７カ月、１８カ月、１９カ月、２０カ月、２１カ月、２２カ月、２３カ月、２４カ月、２５カ月、２６カ月、２７カ月、２８カ月、２９カ月または３０カ月またはそれ以上保持する。別の例では、本明細書において提供された製剤は、安定であり、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼおよびインスリンの活性を、室温で、例えば、１８℃〜３２℃、一般に、２０℃〜３２℃、例えば、２８℃〜３２℃で、少なくとも２週間〜１年、例えば、少なくとも３週間、４週間、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、少なくとも７カ月、少なくとも８カ月、少なくとも９カ月または少なくとも１年またはそれ以上の間保持する。さらなる例では、本明細書において提供された製剤は、安定であり、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼおよびインスリンの活性を、約３０℃または３０℃を超える、一般に、３０℃〜４２℃または約３０℃〜４２℃、例えば、３２℃〜３７℃または３５℃〜３７℃または約３７℃もしくは３７℃の高温下で、少なくとも４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、６０日またはそれ以上保持する。
【０４１５】
活性薬剤の安定性を評価するためのアッセイは、当業者にとって周知である。節Ｇは、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼの安定性を評価するための例示的アッセイを提供する。インスリンの安定性は、当業者に周知の同様の方法を使用して評価され得る。例えば、インスリン安定性および溶解度は、視覚的評価（例えば、色の変化、透明性、凝集体または凝集塊の存在および材料接着またはつや消しを含めた）、酸性清澄化、光学顕微鏡、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、インビトロまたはインビボバイオアッセイおよび変性および非変性サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価され得る。インスリン活性のインビトロまたはインビボバイオアッセイとして、それだけには限らないが、インスリン受容体を発現する細胞（例えば、ヒト胎盤細胞膜）および放射標識インスリンを使用する競合結合実験（例えば、Weiss et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:40018-40024; Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54:251-258を参照のこと）；インスリン刺激性グルコース取り込み（Louveau et al., (2004) J Endocrin. 181:271-280、Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54:251-258）；インスリンの存在下でのグルコース産生を評価するアッセイ（Wang et al., (2000) J. Biochem., 275:14717-14721、Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54:251-258）；および糖尿病および／または健常動物モデルを使用する研究（Atkinson et al., (1999) Nature Med. 5:601-604; Nagoya-Shibata-Yasuda (NSY) mice, Zucker diabetic fatty (ZDF) rats and Gato-Katazaki (GK) rats (Cefalu (2006) ILAR Journal 47:186-198）が挙げられる。
【０４１６】
このような製剤の例示的なものは、１００Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬの修飾ＰＨ２０ポリペプチド、特に、約６００Ｕ／ｍＬ；１０Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬまたは少なくとも６００Ｕ／ｍＬ；１０Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬの、特に、１００Ｕ／ｍＬまたは少なくとも１００Ｕ／ｍＬまたは約１００Ｕ／ｍＬ速効型インスリン；８０〜１４０ｍＭの間または約８０〜１４０ｍＭの間の濃度のＮａＣｌ；７．０〜７．８の間または約７．０〜７．８の間のｐＨ；７．０〜７．８の間または約７．０〜７．８の間のｐＨ範囲を維持する緩衝剤質量濃度（ｗ／ｖ）として０．１％〜０．４％の防腐剤を含有する。適宜、さらなる分解防止剤が含まれ得る。例えば、本明細書において提供される共製剤は、１ｍＭ〜１００ｍＭの緩衝剤を含有する。例えば、本明細書において提供された共製剤は、０．００５％〜０．５％の界面活性物質を含有する。本明細書において提供された例示的共製剤はまた、６０ｍＭ未満のグリセリン（グリセロール）および２ｍＭ〜５０ｍＭまたは約５０ｍＭの抗酸化薬を含有する。
【０４１７】
以下の安定な製剤は、単に例示的なものであって、微調整が行われ得るプラットフォームを提供する。インスリン溶解度および安定性ならびにＰＨ２０安定性のすべてではなくとも幾分かを保持しながら、種々の賦形剤およびその他の成分の濃度の極めてわずかな変化（例えば、記載された濃度の±１５％）またはｐＨの小さな変化がなされ得るということは理解される。賦形剤を付加または除去することによってさらなる変化もなされ得る。例えば、安定化界面活性物質の種類も変更され得る。
【０４１８】
例えば、本明細書における例示的共製剤は、１００Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬの修飾ＰＨ２０ポリペプチド、特に、少なくとも６００Ｕ／ｍＬまたはおよそ少なくとも６００Ｕ／ｍＬまたは約６００Ｕ／ｍＬの修飾ＰＨ２０ポリペプチド；１０Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬの速効型インスリン、特に、少なくとも１００Ｕ／ｍＬまたはおよそ少なくとも１００Ｕ／ｍＬまたは約１００Ｕ／ｍＬの速効型インスリン；１０ｍＭ〜５０ｍＭまたは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのＴｒｉｓ（例えば、２０ｍＭ〜４０ｍＭまたは約２０ｍＭ〜４０ｍＭのＴｒｉｓ、例えば、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭもしくは４０ｍＭまたは約２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭもしくは４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ）；８０ｍＭ〜約１６０ｍまたは約８０ｍＭ〜約１６０ｍＭ  ＮａＣｌ（例えば、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ  １２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭもしくは１６０ｍＭまたは約８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ  １２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭもしくは１６０ｍＭ  ＮａＣｌ）；２ｍＭ〜５０ｍＭまたは約２ｍＭ〜約５０ｍＭメチオニン（例えば、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭもしくは５０ｍＭまたは約５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭもしくは５０ｍＭメチオニン）；０ｍＭ〜５０ｍＭまたは約０ｍＭ〜約５０ｍＭグリセリン（例えば、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭもしくは５０ｍＭまたは約５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭもしくは５０ｍＭグリセリン）；０．００５％〜０．５％または約０．００５％〜約０．５％ポロキサマー１８８、例えば、０．０１％〜０．０５％（例えば、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％もしくは０．０５％または約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％もしくは０．０５％ポロキサマー１８８）；０．０５％〜０．２５％または約０．０５％〜約０．２５％フェノール（例えば、０．１％、０．１２％、０．１２５％、０．１３％、０．１４％、０．１５％、０．１６％もしくは０．１７％または約０．１％、０．１２％、０．１２５％、０．１３％、０．１４％、０．１５％、０．１６％もしくは０．１７％フェノール）；０．０５％〜０．４％または約０．０５％〜約０．４％  ｍ−クレゾール（例えば、０．０７５％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１２％、０．１３％、０．１４％、０．１５％、０．１６％もしくは０．１７％または約０．０７５％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１２％、０．１３％、０．１４％、０．１５％、０．１６％もしくは０．１７％  ｍ−クレゾール）を含有する。製剤は、７．０〜７．６または約７．０〜約７．６（例えば、ｐＨ７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５もしくは７．６または約ｐＨ７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５もしくは７．６）のｐＨで調製される。さらなる例では、亜鉛は、０．０１ｍｇ／１００Ｕ、０．０１８ｍｇ／１００Ｕ、０．０２ｍｇ／１００Ｕ、０．０２２ｍｇ／１００Ｕまたは０．０２４ｍｇ／１００Ｕまたは約０．０１ｍｇ／１００Ｕ、０．０１８ｍｇ／１００Ｕ、０．０２ｍｇ／１００Ｕ���０．０２２ｍｇ／１００Ｕまたは０．０２４ｍｇ／１００Ｕのインスリンの濃度でインキュベートされる。
【０４１９】
特定の例では、速効型インスリンとして、インスリンアスパルト、インスリンリスプロまたはインスリングルリジンがある。修飾ＰＨ２０ポリペプチドおよびインスリンリスプロを含有する本明細書において提供される例示的共製剤は、２５ｍＭ〜３５ｍＭまたは約２５ｍＭ〜約３５ｍＭのＴｒｉｓ（例えば、約３０ｍＭ  Ｔｒｉｓまたは約３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ）；７０ｍＭ〜１００ｍＭまたは約７０ｍＭ〜約１００ｍＭ  ＮａＣｌ（例えば、８０ｍＭもしくは１００ｍＭまたは約８０ｍＭもしくは約１００ｍＭ  ＮａＣｌ）；１０ｍＭ〜３０ｍＭまたは約１０ｍＭ〜約３０ｍＭメチオニン２０ｍＭメチオニン）；４０ｍＭ〜６０ｍＭまたは約４０ｍＭ〜約６０ｍＭのグリセリン（例えば、５０ｍＭまたは約５０ｍＭグリセリン）；０．００５％〜０．０５％または約０．００５％〜約０．０５％のポロキサマー１８８（例えば、０．０１％または約０．０１％ポロキサマー１８８）；０．０１７ｍｇまたは約０．０１７ｍｇ亜鉛／１００Ｕインスリン〜０．０２４ｍｇまたは約０．０２４ｍｇ亜鉛／１００Ｕインスリン（例えば、０．０１７ｍｇ亜鉛／１００Ｕインスリン、０．０１８ｍｇ／１００Ｕ、０．０２ｍｇ／１００Ｕ、０．０２２ｍｇ／１００Ｕまたは０．０２４ｍｇ亜鉛／１００Ｕインスリン）；０．０８％または約０．０８％〜０．１７％または約０．１７％フェノール（例えば、０．１％、０．１２５％または０．１３％フェノール）；０．０７％または約０．０７％〜０．１７％または約０．１７％  ｍ−クレゾール（例えば、０．０７５％、０．０８％、０．１３％もしくは０．１５％  ｍ-クレゾール）を含有するものである。例えば、共製剤は、０．１％または約０．１％のフェノールおよび０．０１５％  ｍ−クレゾール；０．１２５％または約０．１２５％のフェノールおよび０．０７５％  ｍ−クレゾール；  ０．１３％または約０．１３％のフェノールおよび０．０７５％  ｍ−クレゾール；０．１３％または約０．１３％のフェノールおよび０．０８％  ｍ−クレゾール；または０．１７％または約０．１７％のフェノールおよび０．１３％  ｍ−クレゾールを含有し得る。インスリンリスプロおよび修飾ＰＨ２０ポリペプチドのこのような製剤は、７．０または約７．０〜７．５または約７．５（一般に、ｐＨ７．２または約ｐＨ７．２のｐＨ）のｐＨで調製される。
【０４２０】
修飾ＰＨ２０ポリペプチドおよびインスリンアスパルトを含有する本明細書において提供された例示的共製剤は、２５ｍＭまたは約２５ｍＭ〜３５ｍＭまたは約３５ｍＭのＴｒｉｓ（例えば、３０ｍＭまたは約３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ）；７０ｍＭまたは約７０ｍＭ〜１２０ｍＭまたは約１２０ｍＭ  ＮａＣｌ（例えば、８０ｍＭもしくは１００ｍＭまたは約８０ｍＭもしくは１００ｍＭ  ＮａＣｌ）；２ｍＭまたは約２ｍＭ〜３０ｍＭまたは約３０ｍＭメチオニン、例えば、２ｍＭ〜１０ｍＭまたは５ｍＭ〜３０ｍＭメチオニン（例えば、５ｍＭ、１０ｍＭもしくは２０ｍＭまたは約５ｍＭ、１０ｍＭもしくは２０ｍＭ  メチオニン）；０．００５％または約０．００５％〜０．０５％または約０．０５％ポロキサマー１８８（例えば、０．０１％または約０．０１％ポロキサマー１８８）；０．０８％または約０．０８％〜０．１７％または約０．１７％フェノール（例えば、０．１％、０．１２５％または０．１３％フェノール）；および０．０７％または約０．０７％〜０．１７％または約０．１７％  ｍ−クレゾール（例えば、０．０７５％、０．０８％、０．１３％または０．１５％  ｍ−クレゾール）を含有するものである。例えば、共製剤は、０．１％または約０．１％フェノールおよび０．０１５％  ｍ−クレゾール；０．１２５％または約０．１２５％フェノールおよび０．０７５％  ｍ−クレゾール；０．１３％または約０．１３％フェノールおよび０．０７５％  ｍ−クレゾール；０．１３％または約０．１３％フェノールおよび０．０８％  ｍ−クレゾール；または０．１７％または約０．１７％フェノールおよび０．１３％  ｍ-クレゾールを含有し得る。インスリンアスパルトおよび修飾ＰＨ２０ポリペプチドのこのような製剤は、７．０または約７．０〜７．６または約７．６のｐＨ（通常、ｐＨ７．４もしくは７．３または約ｐＨ７．４もしくは７．３）で調製される。
【０４２１】
修飾ＰＨ２０ポリペプチドおよびインスリンアスパルトを含有する本明細書において提供されるさらなる例示的製剤は、フェノールを含有しないものである。このような例示的製剤は、２５ｍＭまたは約２５ｍＭ〜３５ｍＭまたは約３５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（例えば、３０ｍＭまたは約３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ）；７０ｍＭまたは約７０ｍＭ〜１２０ｍＭまたは約１２０ｍＭ  ＮａＣｌ（例えば、８０ｍＭもしくは１００ｍＭまたは約８０ｍＭもしくは１００ｍＭ  ＮａＣｌ）；２ｍＭまたは約２ｍＭ〜３０ｍＭまたは約３０ｍＭメチオニン、例えば、２ｍＭ〜１０ｍＭまたは５ｍＭ〜３０ｍＭメチオニン（例えば、５ｍＭ、１０ｍＭもしくは２０ｍＭまたは約５ｍＭ、１０ｍＭもしくは２０ｍＭメチオニン）；０．００５％または約０．００５％〜０．０５％または約０．０５％ポロキサマー１８８（例えば、０．０１％または約０．０１％ポロキサマー１８８）；および０．０７％または約０．０７％〜０．４％または約０．４％  ｍ−クレゾール、例えば、０．２％または約０．２％〜０．４％  ｍ−クレゾール（例えば、０．３％、０．３１５％、０．３５％、０．４％  ｍ−クレゾール）を含有する。インスリンアスパルトおよび修飾ＰＨ２０ポリペプチドのこのような製剤は、７．０または約７．０〜７．６または約７．６のｐＨ（通常、ｐＨ７．４もしくは７．３または約ｐＨ７．４もしくは７．３）で調製される。
【０４２２】
修飾ＰＨ２０ポリペプチドおよびインスリングルリジンを含有する本明細書において提供される例示的共製剤は、２５ｍＭまたは約２５ｍＭ〜３５ｍＭまたは約３５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（例えば、３０ｍＭまたは約３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ）；１００ｍＭまたは約１００ｍＭ〜１５０ｍＭまたは約１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（例えば、１００ｍＭもしくは約１００ｍＭまたは１４０ｍＭ  ＮａＣｌ）；１０ｍＭまたは約１０ｍＭ〜３０ｍＭまたは約３０ｍＭメチオニン（例えば、１０ｍＭもしくは２０ｍＭまたは約１０ｍＭもしくは２０ｍＭメチオニン）；４０ｍＭまたは約４０ｍＭ〜６０ｍＭまたは約６０ｍＭグリセリン（例えば、５０ｍＭまたは約５０ｍＭグリセリン）；０．００５％または約０．００５％〜０．０５％または約０．０５％ポロキサマー１８８（例えば、０．０１％または約０．０１％  ポロキサマー１８８）；０．０８％または約０．０８％〜０．１７％または約０．１７％フェノール（例えば、０．１％、０．１２５％または０．１３％フェノール）；０．０７％または約０．０７％〜０．１７％または約０．１７％  ｍ−クレゾール（例えば、０．０７５％、０．０８％、０．１３％または０．１５％  ｍ−クレゾール）を含有するものである。例えば、共製剤は、０．１％または約０．１％フェノールおよび０．０１５％  ｍ−クレゾール；０．１２５％または約０．１２５％フェノールおよび０．０７５％  ｍ−クレゾール；０．１３％または約０．１３％フェノールおよび０．０７５％  ｍ−クレゾール；０．１３％または約０．１３％フェノールおよび０．０８％  ｍ−クレゾール；または０．１７％もしくは約０．１７％フェノールおよび０．１３％  ｍ−クレゾールを含有し得る。インスリングルリジンおよび修飾ＰＨ２０ポリペプチドのこのような製剤は、７．０または約７．０〜７．６または約７．６のｐＨ（通常、７．４または約ｐＨ７．４のｐＨ）で調製される。
【０４２３】
５．パッケージング、製造品およびキット
修飾ＰＨ２０ポリペプチドまたはこのようなポリペプチドをコードする核酸またはその誘導体もしくは変異体の医薬品化合物は、パッケージング材料、疾患または障害を治療するのに有効である医薬組成物および医薬組成物または治療分子が、疾患もしくは障害を治療するために使用されることを示す標識を含有する製造品としてパッケージングされ得る。選択された修飾ＰＨ２０ポリペプチドまたはその誘導体もしくは変異体および治療薬の組合せは、製造品にパッケージングされ得る。
【０４２４】
本明細書において提供される製造品は、パッケージング材料を含有する。パッケージング医薬製剤において使用するためのパッケージング材料は、当業者に周知である。例えば、その全体が各々本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３２３，９０７号、同５，０５２，５５８号および同５，０３３，２５２号を参照のこと。医薬品パッケージング材料の例として、それだけには限らないが、ブリスターパック、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、ボトルおよび選択された製剤および意図される投与様式および治療に適した任意のパッケージング材料が挙げられる。製造品は、局所注射目的で投与（例えば、表皮下投与）を容易にするためのニードルまたはその他の注射装置を含み得る。修飾ＰＨ２０ポリペプチドおよび特定の疾患または障害を治療するとわかっている速効型インスリンなどの治療薬を含めた、本明細書において提供される化合物および組成物の幅広い製剤が考慮される。パッケージの選択は、ＰＨ２０および／または治療薬ならびにこのような組成物が、一緒にパッケージングされるか、別個にパッケージングされるかに応じて変わる。一例では、ＰＨ２０は、治療薬との混合物としてパッケージングされ得る。別の例では、成分は、別個の組成物としてパッケージングされ得る。
【０４２５】
修飾ＰＨ２０ポリペプチド、治療薬および／またはその製造品はまた、キットとして提供され得る。キットは、本明細書に記載された医薬組成物および製造品として提供される投与のための項目を含み得る。例えば、ＰＨ２０ポリペプチドは、シリンジ、吸入器、投与量カップ、ドロッパーまたはアプリケーターなどの投与のための装置を用いて供給され得る。組成物は、投与のための項目中に含有され得、後に添加されるよう別個に提供され得る。キットは、適宜、投与量、投薬計画および投与様式についての使用説明書を含めた、適用のための使用説明書を含み得る。キットはまた、本明細書に記載された医薬組成物および診断のための項目を含み得る。例えば、このようなキットは、対象において選択されたプロテアーゼの濃度、量または活性を測定するための項目を含み得る。
【０４２６】
Ｇ．ＰＨ２０活性および安定性を評価する方法
アッセイを使用して、本明細書において提供されたＰＨ２０ポリペプチドの安定性および活性を評価できる。アッセイを使用して、特定の条件、温度下で、および／または経時的にＰＨ２０ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性を評価できる。このようなアッセイを使用して、例えば、それだけには限らないが、３０℃を超える、または約３０℃または３０℃の高温（例えば、３０℃〜４２℃、例えば、３７℃または約３７℃）、撹拌、賦形剤（例えば、防腐剤）の存在または低ＮａＣｌ（塩）もしくはＮａＣｌがないことを含めた特定の変性条件下で、ＰＨ２０ポリペプチドの安定性を決定できる。例えば、特定の条件下での安定性は、変性条件への曝露の不在下で、次いで、条件の存在下でその後の種々の時点で活性、溶解度および安定性（例えば、凝集の形成など）を評価することによってモニタリングできる。したがって、安定性は、経時的に評価され得る。安定性はまた、天然の、野生型または参照ＰＨ２０ポリペプチドと比較して、１種または複数種の変性条件の存在下での、活性、溶解度または凝集のうち任意の１種または複数を比較することによって評価され得る。アッセイはまた、両活性薬剤の安定性を保持したまま本明細書において提供される製剤に微調整を行うために使用され得る。
【０４２７】
１．ヒアルロニダーゼ活性
修飾ＰＨ２０ポリペプチドの活性は、当技術分野で周知の方法を使用して評価され得る。例えば、ヒアルロニダーゼのＵＳＰ  ＸＸＩＩアッセイによって、分解されていないヒアルロン酸またはヒアルロナン、酵素をＨＡと３７℃で３０分間反応させた後に残存する（ＨＡ）基質の量を測定することによって間接的に活性が決定される（USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD）。ヒアルロニダーゼ参照標準（ＵＳＰ）またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  （ＮＦ）標準ヒアルロニダーゼ溶液が、任意のヒアルロニダーゼの単位での活性を確認するためにアッセイにおいて使用され得る。一例では、活性は、マイクロ濁度アッセイを使用して測定される。これは、ヒアルロン酸が、酸性化血清または塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）などの沈殿させる試薬と結合する場合の不溶性沈殿物の形成に基づいている。活性は、ヒアルロニダーゼをヒアルロン酸ナトリウム（ヒアルロン酸）とともに一定期間（例えば、１０分）インキュベートすること、次いで、消化されていないヒアルロン酸ナトリウムを、酸性化血清またはＣＰＣの添加によって沈殿させることによって測定される。得られたサンプルの濁度は、さらなる展開期間の後に６４０ｎｍで測定される。ヒアルロン酸ナトリウム基質に対するヒアルロニダーゼ活性に起因する濁度の低下が、ヒアルロニダーゼ酵素活性の尺度である。
【０４２８】
別の例では、ヒアルロニダーゼ活性は、ヒアルロニダーゼとともにインキュベートした後に残存するビオチン化ヒアルロン酸が測定されるマイクロタイターアッセイを使用して測定される（例えば、Frost and Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269、米国特許公開第２００５０２６０１８６号を参照のこと）。ヒアルロン酸のグルクロン酸残基上の遊離カルボキシル基はビオチン化され、ビオチン化ヒアルロン酸基質は、マイクロタイタープレートと共有結合される。ヒアルロニダーゼとともにインキュベーションした後、残存するビオチン化ヒアルロン酸基質がアビジン−ペルオキシダーゼ反応を使用して検出され、公知の活性のヒアルロニダーゼ標準を用いる反応後に得られたものと比較される。
【０４２９】
ヒアルロニダーゼ活性を測定するためのその他のアッセイもまた、当技術分野で公知であり、本明細書における方法において使用され得る（例えば、Delpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322:257-263を参照のこと）。
【０４３０】
多数のヒアルロニダーゼアッセイは、新規還元性Ｎ−アセチルアミノ基の生成（Bonner and Cantey, Clin. Chim. Acta 13:746-752, 1966）、または粘度の喪失（De Salegui et al., Arch. Biochem. Biophys.121:548-554, 1967）または濁度（Dorfman and Ott, J. Biol. Chem. 172:367, 1948）の測定に基づいていた。精製された基質を用いた場合、これらの方法のすべてが、エンドグリコシダーゼ活性の有無の決定には十分である。
【０４３１】
実質的に精製されたグリコサミノグリカン基質はまた、ゲルシフトアッセイにおいて使用され得る。グリコサミノグリカンは、ゲル内の基質移動度のシフトをもたらすエンドグリコシダーゼ活性について試験するために、組換えＰＨ２０、例えば、可溶性ＰＨ２０と混合される。このような基質の例として、それだけには限らないが、コンドロイチン−４および６硫酸塩、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸が挙げられ、これらは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから入手できる。ヒト臍帯ヒアルロナンは、ＩＣＮから入手できる。例えば、各試験基質は、ｐＨ３．５〜７．５のバッファー範囲で０．ｌｍｇ／ｍＬまたは約０．ｌｍｇ／ｍＬに希釈され得る。このような一例示的アッセイでは、精製可溶性ＰＨ２０の１０μｌまたは約１０μｌのサンプルまたはＰＨ２０発現細胞から得たコンディショニング培地は、所望のバッファー中の９０μｌまたは約９０μｌの試験基質と混合され、３７℃で３時間インキュベーションされ得る。インキュベーションした後、サンプルをサンプルバッファー（Ｔｒｉｓ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、ブロモフェノールブルーおよびグリセロール）を用いて中和し、続いて、電気泳動した。グリコサミノグリカンは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して検出され得、例えば、グリコサミノグリカンは、３％氷酢酸中０．５％アルシアンブルーを使用して一晩ゲルを染色することと、続いて、７％氷酢酸中で脱染することによって検出され得る。分解は、酵素の存在下および不在下での基質移動度の比較によって決定される。
【０４３２】
ヒアルロニダーゼ活性はまた、基質ゲルザイモグラフィ（Guentenhoner et al. (1992) Matrix 12:388-396）によって検出され得る。このアッセイでは、サンプルは、ヒアルロン酸を含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適用され、サンプル中のタンパク質が、電気泳動によって分離される。次いで、ゲルを、酵素アッセイバッファー中でインキュベートし、続いて、ゲル中のヒアルロン酸を検出するために染色する。ヒアルロニダーゼ活性は、基質ゲル中の透明化された領域として可視化される。
【０４３３】
本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドを含めたＰＨ２０ポリペプチドの、拡延剤または拡散剤として作用する能力も評価され得る。例えば、トリパンブルーダイをＰＨ２０ポリペプチドとともにか、または伴わずに、ヌードマウスの各側の側面皮膚中に皮下注入してもよい。次いで、マイクロキャリパーなどを用いてダイ領域を測定して、ＰＨ２０ポリペプチドの、拡延剤として作用する能力を決定する（米国特許公開第２００６０１０４９６８号）。
【０４３４】
ＰＨ２０ポリペプチドの機能活性、これらのアッセイのいずれかを使用して参照標準に対して比較および／または正規化され得る。これは、ＰＨ２０ポリペプチドの官能性当量を決定するために行われ得る。例えば、ＰＨ２０ポリペプチドの、拡延剤または拡散剤として作用する能力は、トリパンブルーとともに、マウスの側面皮膚中に注射することによって評価され得る。例えば、ヒアルロニダーゼ参照標準１００単位と同量の拡散を達成するのに必要な量が決定され得る。したがって、必要なＰＨ２０ポリペプチドの量は、１００ヒアルロニダーゼ単位と官能的に同等である。
【０４３５】
２．溶解度
ＰＨ２０ポリペプチドの溶解度は、当業者に公知の任意の方法によって決定され得る。溶解度を決定するための１つの方法は、洗浄剤分配である。例えば、可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、例えば、３７℃のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４溶液の水相へのその分配によって区別され得る（Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-1607）。ＧＰＩ固定されたヒアルロニダーゼを含めた脂質に固定されたヒアルロニダーゼなどの膜に固定されたポリペプチドは、洗浄剤の豊富な相に分配するが、ホスホリパーゼＣを用いる処理後に洗浄剤の乏しい相または水相に分配する。ホスホリパーゼＣは、ＧＰＩ固定されたタンパク質中に見られるホスホ−グリセロール結合を切断する酵素である。ＰＬＣを用いる処理は、外細胞膜からのＧＰＩが連結されたタンパク質の放出を引き起こす。
【０４３６】
３．純度、結晶化または凝集
本明細書において提供されたポリペプチドの安定性は、その他の方法および当技術分野で公知のアッセイを使用して評価され得る。ヒアルロニダーゼ活性に基づいて安定性を評価することに加え、安定性は、目視検査、回収パーセント、タンパク質純度および見かけの融解温度によって評価され得る。
【０４３７】
例えば、タンパク質純度は、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって測定され得る。ＲＰ−ＨＰＬＣによって決定されるようなタンパク質純度は、存在するタンパク質種すべてに対して比較される、存在する主なＰＨ２０タンパク質ピークのパーセントである。したがって、ＲＰ−ＨＰＬＣおよび当業者に公知の類似の方法は、酵素の分解を評価し得る。タンパク質純度は、経時的に評価され得る。タンパク質純度はまた、１種または複数種の変性条件の存在下で、またその変動する量で評価され得る。回収パーセントもまた、参照サンプルと比較される、種々の条件下（変性条件、保存時間、容器（ｖｅｓｓｅｌ）または容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）などの保存様式または変更され得るその他の同様のパラメータ）下でのポリペプチドの相対パーセンテージとして決定され得る。ＰＨ２０ポリペプチド安定性はまた、ＲＰ−ＨＰＬＣによってヒアルロニダーゼの酸化を測定することによって決定され得る。酸化パーセントは、主要な（ｏｘ−１）および微量な（ｏｘ−２）ピークのピーク面積の合計の尺度である。
【０４３８】
一例では、修飾ＰＨ２０ポリペプチドなどのＰＨ２０ポリペプチドの融解温度は、種々の条件（例えば、変性条件またはその他の保存条件）下で、動的光散乱による粒子の水力学的半径を測定することによって決定され得る。粒子の大きさの増大および融解温度の低下は、ヒアルロニダーゼの変性およびその後の凝集を示す。
【０４３９】
本明細書において提供された共製剤中のヒアルロニダーゼの安定性を決定するために使用され得る当業者公知のその他の方法として、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、免疫ブロット法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、質量分析、円偏光二色性（ＣＤ）およびダイベースの蛍光アッセイが挙げられる。
【０４４０】
４．薬動力学／薬物動態学
単独または別の治療薬と組み合わせた、修飾ＰＨ２０ポリペプチドなどのＰＨ２０ポリペプチドの投与の、任意の投与された薬剤の薬物動態および薬力学的特性に対する効果はまた、臨床試験の設定などにおいて動物モデルおよび／またはヒト対象を使用してインビボで評価され得る。薬物動態または薬力学的研究は、動物モデルを使用して実施され得るか、またはＰＨ２０ポリペプチドまたは修飾ＰＨ２０ポリペプチドを用いて投与された患者についての研究の際に実施され得る。
【０４４１】
動物モデルとして、それだけには限らないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、モルモットおよびカニクイザルまたはアカゲザルなどの非ヒト霊長類モデルが挙げられる。いくつかの例では、薬物動態または薬力学的研究は、健常動物を使用して実施される。その他の例では、研究は、任意のヒアルロナン関連疾患または障害、例えば、腫瘍モデルの動物モデルなどの、ヒアルロナンを用いる療法が考慮される疾患の動物モデルを使用して実施される。
【０４４２】
修飾ＰＨ２０ポリペプチドなどのＰＨ２０ポリペプチドの薬物動態特性は、投与後の、最大（ピーク）濃度（Ｃｍａｘ）、ピーク時間（すなわち、最大濃度が生じるとき；Ｔｍａｘ）、最小濃度（すなわち、用量の間の最小濃度；Ｃｍｉｎ）、消失半減期（Ｔ１／２）および曲線下面積（すなわち、時間対濃度をプロットすることによって作製される曲線下面積；ＡＵＣ）のようなパラメータを測定することによって評価され得る。ヒアルロニダーゼの絶対バイオアベイラビリティは、皮下デリバリー後のヒアルロニダーゼの曲線下面積（ＡＵＣｓｃ）を、静脈内デリバリー後のヒアルロニダーゼのＡＵＣ（ＡＵＣｉｖ）と比較することによって決定され得る。絶対バイオアベイラビリティ（Ｆ）は、式：Ｆ＝（［ＡＵＣ］ｓｃ×ｄｏｓｅｓｃ）／（［ＡＵＣ］ｉｖ×ｄｏｓｅｉｖ）を使用して算出され得る。薬物動態研究において、用量中の、漸増または漸減濃度の修飾ＰＨ２０ポリペプチドなどの酵素の効果を評価するために、投薬のさまざまな用量および種々の投薬頻度が投与され得る。
【０４４３】
Ｈ．治療方法および併用療法
ヒアルロナンなどのグリコサミノグリカン（複数化）を分解する能力に基づいてヒアルロニダーゼ活性を示す、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドのうちいずれかの方法および使用が本明細書において提供される。このような活性のために、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、皮下投与された治療薬のデリバリーおよび／またはバイオアベイラビリティを増大するための拡延因子として使用され得る。それだけには限らないが、ペプチド、タンパク質、小分子薬物、核酸またはウイルスを含めた任意の治療薬のデリバリーが、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドとの同時投与によって促進または増強され得る。例えば、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、化学療法薬の固形腫瘍への浸透を増大することなどによって、抗体（例えば、モノクローナル抗体）、サイトカイン、免疫グロブリン、インスリンまたは血液凝固因子などの治療薬の、所望の位置へのデリバリーを高めるために使用され得る。修飾ＰＨ２０ポリペプチドはまた、ヒアルロナンの過剰の蓄積を特徴とするヒアルロナン疾患または障害を治療するために使用され得る。例えば、本明細書において提供される修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、腫瘍を治療するため；脳におけるグリコサミノグリカン蓄積を治療するため；心血管障害を治療するため；眼部障害を治療するため；肺の疾患を治療するため；セルライトを治療するため；および／または増殖性障害を治療するために使用され得る
【０４４４】
修飾ＰＨ２０ポリペプチドのその他の方法および使用は、当業者に公知である任意のものを含む。例えば、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼの種々の形態が調製され、ヒトにおける治療的使用のために承認されている。例えば、動物由来ヒアルロニダーゼ調製物として、ビトラーゼ（Ｖｉｔｒａｓｅ）（登録商標）（ＩＳＴＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、精製ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼおよびアンファダーゼ（Ａｍｐｈａｄａｓｅ）（登録商標）（Ａｍｐｈａｓｔａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ウシ精巣ヒアルロニダーゼが挙げられる。ハイレネックス（Ｈｙｌｅｎｅｘ）（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）は、可溶性ｒＨｕＰＨ２０をコードする核酸を含有する、遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生されたヒト組換えヒアルロニダーゼである（例えば、米国特許第７，７６７，４２９号を参照のこと）。ヒアルロニダーゼの承認された治療的使用として、皮下点滴療法（皮下流体投与）のためのその他の治療薬の吸収および分散を高めるためのアジュバントとしての使用および放射不透過性薬剤の再吸収を改善するための皮下尿路造影における補助剤としての使用が挙げられる。ヒアルロニダーゼは、これらの適応症に加えて、さらなる疾患および状態の治療のための治療薬または化粧剤として使用され得る。例えば、ヒアルロニダーゼは、眼部手術に先立つ局所麻酔における眼球周囲ブロックのためによく使用される。酵素の存在が、さらなるブロックの必要性を防ぎ、無動（眼の運動の喪失）の発生までの時間を低減する。眼球周囲およびテノン嚢下ブロックは、眼部手順のためのヒアルロニダーゼの最も一般的な適用である。ヒアルロニダーゼはまた、眼瞼形成およびフェースリフトなどの美容整形においても無動を促進し得る。ＰＨ２０ヒアルロニダーゼを含めて本明細書において提供された可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、治療またはＰＨ２０ヒアルロニダーゼが使用される併用療法の任意の方法において使用され得るということは理解される（例えば、その全体が参照により各々組み込まれる、米国公開番号ＵＳ２００４０２６８４２５；ＵＳ２００５０２６０１８６；ＵＳ２００６０１０４９６８；および米国公開番号ＵＳ２０１０００７４８８５として公開された米国出願番号第１２／３８１，８４４号；米国公開番号ＵＳ２００９０３１１２３７として公開された同１２／３８６，２４９号；米国公開番号ＵＳ２００９０３０４６６５として公開された同１２／３８７，２２５号；米国公開番号ＵＳ２０１０００３２３８として公開された同１２／３８６，２２２号を参照のこと）。
【０４４５】
例示的な、制限するものではない方法および使用が、以下の小区分に記載されている。
【０４４６】
１．治療薬を送達する方法
上記のように、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸、結合組織の細胞内基底質にみられる多糖の、また特定の特殊化した組織、例えば、臍帯および硝子体液の加水分解によって結合組織の透過性を変更する拡延物質または拡散物質である。拡延因子が存在しない場合には、薬物、タンパク質、ペプチドおよび核酸などの皮下に注射される材料は、極めて遅く広がる。しかし、ヒアルロニダーゼとの同時注射は、迅速な拡延を引き起こし得る。拡散速度は酵素の量に比例し、拡散の程度は、溶液の容量に比例する。
【０４４７】
本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、インビボで種々の哺乳類組織のいずれかへのデリバリー物質および分子を促進または増強するために使用され得る。小分子薬理作用物質ならびに大きな分子の薬理作用物質、例えば、タンパク質、核酸およびリボ核酸ならびにそれだけには限らないが、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、脂質ベースの分子および薬物を含めた成分の組み合わせを含有し得る高分子組成物の拡散を促進し、したがって、デリバリーを促進するために使用され得る（例えば、米国公開番号ＵＳ２００４０２６８４２５；ＵＳ２００５０２６０１８６；およびＵＳ２００６０１０４９６８）。修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、共製剤または同時投与される薬剤のバイオアベイラビリティならびに薬物動態（ＰＫ）および／または薬力学的（ＰＤ）特徴を改善するために、治療薬と、同時投与および／または共製剤され得る。ｅｓＰＨ２０などの可溶性ＰＨ２０を使用することによって改善され得るＰＫ／ＰＤパラメータとして、Ｃｍａｘ（例えば、血流中への吸収後に達成される最大濃度）、Ｔｍａｘ（最大濃度を達成するのに必要な時間）、Ｔ１／２（濃度が半分まで低下するのに必要な時間）、Ｃｍｉｎ（代謝および排泄後の薬剤の最小濃度）、ＡＵＣ（濃度対時間の曲線下面積、バイオアベイラビリティの全体量の尺度）、対象とする種々の組織の濃度（および例えば、所望の濃度、全体レベルを達成する速度、所望のレベルを維持する期間を含む）およびＥｍａｘ（達成される最大効果）のような尺度が挙げられる。
【０４４８】
本明細書において提供された治療の方法は、治療薬が治療する疾患または障害の治療のための治療薬を用いる併用療法を含む。疾患または状態を寛解させるか、そうでなければその重篤度を和らげる任意の治療薬が、このような治療薬のバイオアベイラビリティを増大するために、本明細書において提供される修飾ＰＨ２０ポリペプチドと組み合され得る。特に、本明細書において提供される修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、出願に記載される組み合わせの各々すべてにおいて、開示されたヒアルロニダーゼまたはヒアルロニダーゼ分解酵素の代わりに使用され得る。例えば、米国公開番号ＵＳ２００４０２６８４２５；ＵＳ２００５０２６０１８６；ＵＳ２００６０１０４９６８および米国公開番号ＵＳ２０１０００７４８８５として公開された米国出願番号第１２／３８１，８４４号；米国公開番号ＵＳ２００９０３１１２３７として公開された同１２／３８６，２４９号；米国公開番号ＵＳ２００９０３０４６６５として公開された同１２／３８７，２２５号および米国公開番号ＵＳ２０１０００３２３８として公開された同１２／３８６，２２２号を参照のこと。
【０４４９】
修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、治療薬調製物の前に、その後に、それと断続的に、または同時に投与され得る。一般に、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、ＰＨ２０が、間質空間中のヒアルロン酸を分解するのを可能にするよう、治療薬調製物の投与に先立って、または同時に投与される。ＰＨ２０は、治療分子の投与部位とは異なる部位に投与されてもよく、可溶性ＰＨ２０は、治療分子の投与部位と同一部位で投与されてもよい。
【０４５０】
ヒアルロニダーゼとともに投与され得る医薬品、治療薬および化粧剤および分子の例として、それだけには限らないが、化学療法薬または抗癌剤、鎮痛薬、抗生物質、抗炎症薬、抗菌剤、殺アメーバ剤、殺トリコモナス剤（ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｃｉｄａｌ  ａｇｅｎｔ）、抗パーキンソン病薬、抗マラリア薬、抗痙攣薬、抗うつ薬および抗関節炎薬、抗真菌剤、抗高血圧薬、解熱剤、抗寄生虫剤、抗ヒスタミン剤、α−アドレナリン作動性アゴニスト剤、α遮断薬、麻酔剤、気管支拡張剤、殺生物剤、殺菌剤、静菌剤、βアドレナリン遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、心血管治療薬、避妊薬、化粧剤または審美性物質、鬱血除去薬、利尿薬、降下薬、診断薬、電解質剤、催眠薬、ホルモン剤、高血糖薬、筋弛緩薬、筋肉収縮薬、眼部薬、副交感神経作動薬、精神賦活剤、鎮静剤、睡眠誘導物質、交感神経作用薬、トランキライザー薬、泌尿器薬、膣薬、抗ウイルス剤、ビタミン剤、非ステロイド系抗炎症薬またはアンジオテンシン変換酵素およびその.任意の組合せが挙げられる。特に、治療薬として、モノクローナル抗体を含めた抗体、ビスホスホネート、インスリン、血液凝固因子、サイトカインおよび免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎ  Ｇｌｏｂｕｌｉｎｓ）が挙げられる。
【０４５１】
例えば、本明細書において提供されたＰＨ２０ポリペプチドは、化学療法薬のデリバリーを増大するために使用され得る。ヒアルロニダーゼはまた、化学療法薬の活性および／または化学療法薬に対する腫瘍の接触性を増強するために使用されてきた（Schuller et al., 1991, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 32:173, abstract no. 1034; Czejka et al., 1990, Pharmazie 45:H.9; Baumgartner et al. (1988) Reg. Cancer Treat. 1:55-58; Zanker et al. (1986) Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 27:390）。ヒアルロニダーゼとの組合せ化学療法は、膀胱癌（Horn et al., 1985、J. Surg. Oncol. 28:304-307）、扁平上皮癌（Kohno et al., 94、J. Cancre Res. Oncol. 120:293-297）、乳癌（Beckenlehner et al., 1992, J. Cancer Res. Oncol. 118:591-596）および胃腸癌（Scheithauer et al., 1988, Res. 8:391-396）を含めた種々の癌の治療において有効である。この例では、修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、化学療法薬またはその他の抗癌剤の固形腫瘍への浸透を増強し、それによって、疾患を治療する。
【０４５２】
可溶性ＰＨ２０を含有する組成物は、抗癌剤とともに腫瘍内に注射され得る。播種性癌または到達するのが困難な腫瘍については静脈内に注射されてもよい。抗癌剤は、化学療法薬、抗体、ペプチドまたは遺伝子療法ベクター、ウイルスまたはＤＮＡであり得る。さらに、ヒアルロニダーゼは、多剤耐性を獲得してしまったこれまでの化学療法抵抗性腫瘍において、腫瘍細胞を感作のためのサイクリングプールに補充するために使用され得る（St Croix et al., (1998) Cancer Lett September 131(1): 35-44）。
【０４５３】
ＰＨ２０などの可溶性ＰＨ２０の投与の後に、それと同時にまたはそれ以前に投与され得る例示的抗癌剤として、それだけには限らないが、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン；アレムツズマブ、アリトレチノイン（９−シス−レチノイン酸）、アロプリノール、アルトレタミン、アルボシジブ、アンバゾン、アンボマイシン（Ａｍｂｏｍｙｃｉｎｓ）、アメタントロン、アミホスチン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾールアナキシロン（Ａｎａｘｉｒｏｎｅｓ）、アンシタビン、アントラマイシン、アパジコン、アルギメスナ（Ａｒｇｉｍｅｓｎａｓ）、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アスペルリン（Ａｓｐｅｒｌｉｎｓ）、アトリムスチン（Ａｔｒｉｍｕｓｔｉｎｅｓ）、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン（Ａｚｏｔｏｍｙｃｉｎｓ）、バノキサントロン（Ｂａｎｏｘａｎｔｒｏｎｅｓ）、バタブリン（Ｂａｔａｂｕｌｉｎｓ）、バチマスタット；ＢＣＧ生、ベナキシビン（Ｂｅｎａｘｉｂｉｎｅｓ）、ベンダムスチン、ベンゾデパ（Ｂｅｎｚｏｄｅｐａｓ）、ベキサロテン、ベバシズマブ、ビカルタミド、ビエタセルピン、ビリコダール（Ｂｉｒｉｃｏｄａｒｓ）、ビサントレン、ビサントレン、ビスナフィドジメシレート、ビゼレシン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブレキナル、ブロピリミン、ブドチタン（Ｂｕｄｏｔｉｔａｎｅｓ）、ブスルファン、カクチノマイシン（Ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎｓ）、カルステロン、カネルチニブ、カペシタビン、カラセミド、カルベチマー（Ｃａｒｂｅｔｉｍｅｒｓ）、カルボプラチン、カルボコン、カルモフール、ポリフェプロサンを伴うカルムスチン、カルムスチン、カルビシン、カルゼレシン（Ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎｓ）、セデフィンゴール（Ｃｅｄｅｆｉｎｇｏｌｓ）、セレコキシブ、セマドチン、クロラムブシル、シオテロネル（Ｃｉｏｔｅｒｏｎｅｌｓ）、シプラクチン（Ｃｉｐｌａｃｔｉｎ）、シロレマイシン（Ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎｓ）、シスプラチン、クラドリビン、クランフェヌル（Ｃｌａｎｆｅｎｕｒｓ）、クロファラビン、クリスナトール（Ｃｒｉｓｎａｔｏｌｓ）、シクロホスファミド、シタラビンリポソーマル、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダルベポエチンアルファ、ダウノルビシンリポソーマル、ダウノルビシン／ダウノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、デニロイキンジフチトクス、デクスニグルジピン（Ｄｅｘｎｉｇｕｌｄｉｐｉｎｅｓ）、デキソナ（Ｄｅｘｏｎａｓ）、デクスラゾキサン、デザグアニン（Ｄｅｚａｇｕａｎｉｎｅｓ）、ジアジキオン（Ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅｓ）、ジブロスピジウム（Ｄｉｂｒｏｓｐｉｄｉｕｍｓ）、ジエノゲスト、ジナリン（Ｄｉｎａｌｉｎｓ）、ジセルモリド（Ｄｉｓｅｒｍｏｌｉｄｅｓ）、ドセタキセル、ドフェキダル（Ｄｏｆｅｑｕｉｄａｒｓ）、ドキシフルリジン、ドキソルビシンリポソーマル、ドキソルビシンＨＣＬ、ドキソルビシンＨＣＬリポソーム注射、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エコムスチン（Ｅｃｏｍｕｓｔｉｎｅｓ）、エダトレキサート、エドテカリン（Ｅｄｏｔｅｃａｒｉｎｓ）、エフロミチン（Ｅｆｌｏｍｉｔｈｉｎｅｓ）、エラクリダール（Ｅｌａｃｒｉｄａｒｓ）、エリナフィド（Ｅｌｉｎａｆｉｄｅｓ）、エリオットＢ溶液、エルサミトルシン（Ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎｓ）、エミテフール（Ｅｍｉｔｅｆｕｒｓ）、エンロプラチン（Ｅｎｌｏｐｌａｔｉｎｓ）、エンプロメート（Ｅｎｐｒｏｍａｔｅｓ）、エンザスタウリン、エピプロピジン（Ｅｐｉｐｒｏｐｉｄｉｎｅｓ）、エピルビシン、エポエチンアルファ、エプタロプロスト（Ｅｐｔａｌｏｐｒｏｓｔｓ）、エルブロゾール（Ｅｒｂｕｌｏｚｏｌｅｓ）、 エソルビシン（Ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎｓ）、エストラムスチン、エタニダゾール、エトグルシド、リン酸エトポシド、エトポシドＶＰ−１６、エトポシド、エトプリン、エキセメスタン、エクシスリンド、ファドロゾール、ファザラビン（Ｆａｚａｒａｂｉｎｅｓ）、フェンレチニド、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルオロシタビン（Ｆｌｕｒｏｃｉｔａｂｉｎｅｓ）、フォスキドン（Ｆｏｓｑｕｉｄｏｎｅｓ）、フォストリエシン、フォストリエシン、ホトレタミン（Ｆｏｔｒｅｔａｍｉｎｓ）、フルベストラント、ガラルビシン（Ｇａｌａｒｕｂｉｃｉｎｓ）、ガロシタビン（Ｇａｌｏｃｉｔａｂｉｎｅｓ）、ゲムシタビン、ゲムツズマブ/オゾガマイシン、ゲロキノール（Ｇｅｒｏｑｕｉｎｏｌｓ）、ギマテカン（Ｇｉｍａｔｅｃａｎｓ）、ギメラシル、グロキサゾン（Ｇｌｏｘａｚｏｎｅｓ）、グルフォスファミド（Ｇｌｕｆｏｓｆａｍｉｄｅｓ）、酢酸ゴセレリン、ヒロキシ尿素、イブリツモマブ/チウキセタン、イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン（Ｉｌｍｏｆｏｓｉｎｅｓ）、イロマスタット、メシル酸イマチニブ、イメキソン（Ｉｍｅｘｏｎｓ）；インプロスルファン、インジスラム、インプロクオン、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インタフェロン、インターロイキン−２ｓおよびその他のインターロイキン（組換えインターロイキンを含む）、イントプリシン（Ｉｎｔｏｐｌｉｃｉｎｅｓ）、ヨーベングアン（Ｉｏｂｅｎｇｕａｎｅｓ）［１３１−Ｉ］、イプロプラチン（Ｉｐｒｏｐｌａｔｉｎｓ）、イリノテカン、イルソグラジン、イクサベピロン、ケトトレキサート（Ｋｅｔｏｔｒｅｘａｔｅｓ）、Ｌ-アラノシン、ランレオチド、ラパチニブ、レドキサントロン（Ｌｅｄｏｘａｎｔｒｏｎｅｓ）、レトロゾール、ロイコボリン、リュープロリド、リュープロレリン、（リュープロリド）、レバミソール、レクサカルシトール（Ｌｅｘａｃａｌｃｉｔｏｌｓ）、リアロゾール（Ｌｉａｒｏｚｏｌｅｓ）、ロバプラチン（Ｌｏｂａｐｌａｔｉｎｓ）、ロメトレキソール（Ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌｓ）、ロムスチン／ＣＣＮＵ、ロムスチン、ロナファーニブ、ロソキサントロン（Ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅｓ）、ルルトテカン（Ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎｓ）、マホスファミド、マンノスルファン、マリマスタット、マソプロコール、マイタンシン、メクロレタミン、メクロレタミン/ナイトロジェンマスタード；酢酸メゲストロール；メゲストロール、メレンゲスト���ール、メルファラン、メルファランＬ−ＰＡＭ、メノガリル、メピチオスタン、メルカプトプリン、６-メカプトプリン（Ｍｅｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、メスナ、メテシンド（Ｍｅｔｅｓｉｎｄｓ）、メトトレキサート、メトキサレン、メトミデート（Ｍｅｔｏｍｉｄａｔｅｓ）、エトプリン、メツレデパ（Ｍｅｔｕｒｅｄｅｐａｓ）、ミドプラチン（Ｍｉｂｏｐｌａｔｉｎｓ）、ミプロキシフェン（Ｍｉｐｒｏｘｉｆｅｎｅｓ）、ミソニダゾール、ミチンドミド（Ｍｉｔｉｎｄｏｍｉｄｅｓ）、ミトカルシン（Ｍｉｔｏｃａｒｃｉｎｓ）、ミトクロミン（Ｍｉｔｏｃｒｏｍｉｎｓ）、ミトフラキソン（Ｍｉｔｏｆｌａｘｏｎｅｓ）、ミトギリン（Ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎｓ）、ミトグアゾン、ミトマルシン（Ｍｉｔｏｍａｌｃｉｎｓ）、マイトマイシンC、マイトマイシン、ミトナフィド（Ｍｉｔｏｎａｆｉｄｅｓ）、ミトキドン（Ｍｉｔｏｑｕｉｄｏｎｅｓ）、ミトスペル（Ｍｉｔｏｓｐｅｒｓ）、ミトタン、ミトキサントロン、ミトゾロミド（Ｍｉｔｏｚｏｌｏｍｉｄｅｓ）、ミボブリン（Ｍｉｖｏｂｕｌｉｎｓ）、ミゾリビン、モファロテン（Ｍｏｆａｒｏｔｅｎｅｓ）、モピダモール、ムブリチニブ（Ｍｕｂｒｉｔｉｎｉｂｓ）、ミコフェノール酸、ナンドロロンフェンプロピオネート、ネダプラチン、ネララビン、ネモルビシン（Ｎｅｍｏｒｕｂｉｃｉｎｓ）、ニトラクリン、ノコダゾール、ノフェツモマブ（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂｓ）、ノガラマイシン、ノラトレキセド（Ｎｏｌａｔｒｅｘｅｄｓ）、ノルトピキサントロン（Ｎｏｒｔｏｐｉｘａｎｔｒｏｎｅｓ）、オクトレオチド、オプレルベキン、オルマプラチン（Ｏｒｍａｐｌａｔｉｎｓ）、オルタタキセル（Ｏｒｔａｔａｘｅｌｓ）、オテラシル、オキサリプラチン、オキシスラン、オキソフェナルシン（Ｏｘｏｐｈｅｎａｒｓｉｎｅｓ）、パクリタキセル、パミドロネート、、パツピロン（Ｐａｔｕｐｉｌｏｎｅｓ）、ペガデマーゼ、ペグアスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペルデシン（Ｐｅｌｄｅｓｉｎｅｓ）、ペリオマイシン（Ｐｅｌｉｏｍｙｃｉｎｓ）、ペリトレキソール（Ｐｅｌｉｔｒｅｘｏｌｓ）、ペメトレキセド（Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄｓ）、ペンタムスチン（Ｐｅｎｔａｍｕｓｔｉｎｅｓ）、ペントスタチン、ペプロマイシン、ペルホスファミド（Ｐｅｒｆｏｓｆａｍｉｄｅｓ）、ペリフォシン、ピコプラチン、ピナフィド（Ｐｉｎａｆｉｄｅｓ）、ピポブロマン、ピポスルファン（Ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎｓ）、ピルフェニドン、ピロキサントロン（Ｐｉｒｏｘａｎｔｒｏｎｅｓ）、ピクサントロン、プレビトレキセド（Ｐｌｅｖｉｔｒｅｘｅｄｓ）、プリカマイシンミトラマイシン、プリカマイシン、プロメスタン（Ｐｌｏｍｅｓｔａｎｅｓ）、ポルフィマーナトリウム、ポルフィマー、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン、プロパミジン、プロスピジウム、プミテパ（Ｐｕｍｉｔｅｐａｓ）、ピューロマイシン、ピラゾフリン（Ｐｙｒａｚｏｆｕｒｉｎｓ）、キナクリン、ラニムスチン、ラスブリカーゼ、リボプリン（Ｒｉｂｏｐｒｉｎｅｓ）、リトロスルファン（Ｒｉｔｒｏｓｕｌｆａｎｓ）、リツキシマブ、ログレチミド（Ｒｏｇｌｅｔｉｍｉｄｅｓ）、ロキニメックス、ルフォクロモマイシン（Ｒｕｆ��ｃｒｏｍｏｍｙｃｉｎｓ）、サバルビシン（Ｓａｂａｒｕｂｉｃｉｎｓ）、サフィンゴール、サルグラモスチム、サトラプラチン、セブリプラチン（Ｓｅｂｒｉｐｌａｔｉｎｓ）、セムスチン、シムトラゼン（Ｓｉｍｔｒａｚｅｎｅｓ）、シゾフィラン、ソブゾキサン、ソラフェニブ、スパルフォセート（Ｓｐａｒｆｏｓａｔｅｓ）、スパルフォス酸（Ｓｐａｒｆｏｓｉｃ  Ａｃｉｄｓ）、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、スクアラミン、ストレプトニグリン、ストレプトバリシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｖａｒｙｃｉｎｓ）、ストレプトゾシン、スホスファミド（ｓｕｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、スロフェヌル（Ｓｕｌｏｆｅｎｕｒｓ）、リンゴ酸スニチニブ、６−ＴＧタセジナリン（Ｔａｃｅｄｉｎａｌｉｎｅｓ）、タリソマイシン（Ｔａｌｉｓｏｍｙｃｉｎｓ）、タリスムチン（Ｔａｌｌｉｍｕｓｔｉｎｅｓ）、タモキシフェン、タリキダル（Ｔａｒｉｑｕｉｄａｒｓ）、タウロムスチン（Ｔａｕｒｏｍｕｓｔｉｎｅｓ）、テコガラン（Ｔｅｃｏｇａｌａｎｓ）、テガフール、テロキサントロン（Ｔｅｌｏｘａｎｔｒｏｎｅｓ）、テモポルフィン、テモゾロミド、テニポシド／ＶＭ−２６、テニポシド、テロキシロン（Ｔｅｒｏｘｉｒｏｎｅｓ）、テストラクトン、チアミプリン（Ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅｓ）、チオグアニン、チオテパ、チアミプリン（Ｔｉａｍｉｐｒｉｎｅｓ）、チアゾフリン、チロミソール（Ｔｉｌｏｍｉｓｏｌｅｓ）、チロロン、チムコダル（Ｔｉｍｃｏｄａｒｓ）、チモナシック（Ｔｉｍｏｎａｃｉｃｓ）、チラパザミン、トピクサントロン、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラベクテジン（エクチナサイジン７４３）、トラスツズマブ、トレストロン（Ｔｒｅｓｔｏｌｏｎｅｓ）、トレチノイン／ＡＴＲＡ、トリシリビン（Ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅｓ）、トリロスタン、トリメトレキサート、トリプラチンテトラニトレート（Ｔｒｉｐｌａｔｉｎ  Ｔｅｔｒａｎｉｔｒａｔｅｓ）、トリプトレリン、トロホスファミド、ツブロゾール（Ｔｕｂｕｌｏｚｏｌｅｓ）、ウベニメクス、ウラシルマスタード、ウレデパ（Ｕｒｅｄｅｐａｓ）、バルルビシン、バルスポダール（Ｖａｌｓｐｏｄａｒｓ）、バプレオチド（Ｖａｐｒｅｏｔｉｄｅｓ）、ベルテポルフィン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンピジン（Ｖｉｎｅｐｉｄｉｎｅｓ）、ビンフルニン、ビンホルミド（Ｖｉｎｆｏ
ｒｍｉｄｅｓ）、ビングリシネート（Ｖｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅｓ）、ビンロイシノール（Ｖｉｎｌｅｕｃｉｎｏｌｓ）、ビンロイロシン（Ｖｉｎｌｅｕｒｏｓｉｎｅｓ）、ビノレルビン、ビンロシジン（Ｖｉｎｒｏｓｉｄｉｎｅｓ）、ビントリプトール（Ｖｉｎｔｒｉｐｔｏｌｓ）、ビンゾリジン（Ｖｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅｓ）、ボロゾール、キサントマイシン（Ｘａｎｔｈｏｍｙｃｉｎ  Ａ）、グアメシクリン（Ｇｕａｍｅｃｙｃｌｉｎｅｓ）、ゼニプラチン（Ｚｅｎｉｐｌａｔｉｎｓ）、ジラスコルブ（Ｚｉｌａｓｃｏｒｂｓ）［２−Ｈ］、ジノスタチン、ゾレドロネート、ゾルビシン、および、ゾスキダル、例えば、
アルデスロイキン（例えば、プロロイキン（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ）（登録商標））；アレムツズマブ（例えば、キャンパス（登録商標））；アリトレチノイン（例えば、パンレチン（ＰＡＮＲＥＴＩＮ）（登録商標））；アロプリノール（例えば、ジロプリム（ＺＹＬＯＰＲＩＭ）（登録商標））；アルトレタミン（例えば、ヘキサレン（ＨＥＸＡＬＥＮ）（登録商標））；アミホスチン（例えば、エチオール（ＥＴＨＹＯＬ）（登録商標））；アナストロゾール（例えば、アリミデックス（登録商標））；三酸化ヒ素（例えば、トリセノックス（登録商標））；アスパラギナーゼ（例えば、エルスパール（ＥＬＳＰＡＲ）（登録商標））；ＢＣＧ生（例えば、ＴＩＣＥ（登録商標）ＢＣＧ）；ベキサロテン（例えば、タルグレチン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ）（登録商標））；ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））；ブレオマイシン（例えば、ブレノキサン（ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ）（登録商標））；静脈内ブスルファン（例えば、ブスルフェクス（登録商標））；経口ブスルファン（例えば、ミレラン（商標））；カルステロン（例えば、メトサーブ（ＭＥＴＨＯＳＡＲＢ）（登録商標））；カペシタビン（例えば、ゼローダ（登録商標））；カルボプラチン（例えば、パラプラチン（登録商標））；カルムスチン（例えば、ＢＣＮＵ（登録商標）、ＢｉＣＮＵ（登録商標））；ポリフェプロサンを伴うカルムスチン（例えば、ギリアデル（登録商標）ウエハー）；セレコキシブ（例えば、セレブレックス（ＣＥＬＥＢＲＥＸ）（登録商標））；クロラムブシル（例えば、ロイケラン（登録商標））；シスプラチン（例えば、プラチノール（ＰＬＡＴＩＮＯＬ）（登録商標））；クラドリビン（例えば、ロイスタチン（登録商標）、２−ＣｄＡ（登録商標））；シクロホスファミド（例えば、シトキサン（登録商標）、ネオサール（ＮＥＯＳＡＲ）（登録商標））；シタラビン（例えば、シトサール（ＣＹＴＯＳＡＲ）−Ｕ（登録商標））；シタラビンリポソーマル（例えば、デポサイト（登録商標））；ダカルバジン（例えば、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅυ）：ダクチノマイシン（例えば、コスメゲン（登録商標））；ダルベポエチンアルファ（例えば、アパネスプ（ＡＲＡＮＥＳＰ）（登録商標））；ダウノルビシンリポソーマル（例えば、ダウノキソン（ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ）（登録商標））；ダウノルビシン／ダウノマイシン（例えば、セルビジン（登録商標））；デニロイキンジフチトクス（例えば、オンタック（ＯＮＴＡＫ）（登録商標））；デクスラゾキサン（例えば、ジンカード（ＺＩＮＥＣＡＲＤ）（登録商標））；ドセタキセル（例えば、タキソテール（登録商標））；ドキソルビシン（例えば、アドリアマイシン（登録商標）、ルベックス（ＲＵＢＥＸ）（登録商標））；ドキソルビシンＨＣＬリポソーム注射用（例えば、ドキシル（登録商標））を含むドキソルビシンリポソーマル；プロピオン酸ドロモスタノロン（例えば、ドロモスタノロン（登録商標）およびマステロン（ＭＡＳＴＥＲＯＮＥ）（登録商標）注射用）；エリオットＢ溶液（例えば、エリオットＢ溶液（登録商標））；エピルビシン（例えば、エレンス（ＥＬＬＥＮＣＥ）（登録商標））；エポエチンアルファ（例えば、ＥＰＯＧＥＮ（登録商���））；エストラムスチン（例えば、ＥＭＣＹＴ（登録商標））；リン酸エトポシド（例えば、エトポフォス（ＥＴＯＰＯＰＨＯＳ）（登録商標））；エトポシドＶＰ−１６（例えば、ベプシド（登録商標））；エキセメスタン（例えば、アロマシン（登録商標））；フィルグラスチム（例えば、ニューポジェン（登録商標））；フロクスウリジン（例えば、ＦＵＤＲ（登録商標））；フルダラビン（例えば、フルダラ（登録商標））；フルオロウラシルｉｎｃｌ．５−ＦＵ（例えば、ＡＤＲＵＣＩＬ（登録商標））；フルベストラント（例えば、フェソロデックス（登録商標））；ゲムシタビン（例えば、ジェムザール（登録商標））；ゲムツズマブ／オゾガマイシン（例えば、マイロターグ（登録商標））；酢酸ゴセレリン（例えば、ゾラデックス（登録商標））；ヒドロキシ尿素（例えば、ハイドレア（登録商標））；イブリツモマブ／チウキセタン（例えば、ゼバリン（登録商標））；イダルビシン（例えば、イダマイシン（登録商標））；イホスファミド（例えば、ＩＦＥＸ（登録商標））；メシル酸イマチニブ（例えば、グリベック（登録商標））；インターフェロンアルファ−２ａ（例えば、ロフェロン（ＲＯＦＥＲＯＮ）−Ａ（登録商標））；インターフェロンアルファ−２ｂ（例えば、イントロンＡ（登録商標））；イリノテカン（例えば、カンプトサール（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ）（登録商標））；レトロゾール（例えば、フェマーラ（登録商標））；ロイコボリン（例えば、ウェルコボリン（ＷＥＬＬＣＯＶＯＲＩＮ）（登録商標）、ロイコボリン（登録商標））；レバミソール（例えば、エルガミソール（ＥＲＧＡＭＩＳＯＬ）（登録商標））；ロムスチン／ＣＣＮＵ（例えば、ＣｅｅＮＵ（登録商標））；メクロレタミン／ナイトロジェンマスタード（例えば、ムスタルゲン（ＭＵＳＴＡＲＧＥＮ）（登録商標））；酢酸メゲストロール（例えば、メゲース（ＭＥＧＡＣＥ）（登録商標））；メルファラン／Ｌ−ＰＡＭ（例えば、アルケラン（登録商標））；メルカプトプリンｉｎｃｌ．６−ＭＰ（例えば、プリネトール（ＰＵＲＩＮＥＴＨＯＬ）（登録商標））；メスナ（例えば、メスネックス（ＭＥＳＮＥＸ）（登録商標））；メトトレキサート；メトキサレン（例えば、ウバデックス（ＵＶＡＤＥＸ）（登録商標））；マイトマイシンＣ（例えば、ムタマイシン（ＭＵＴＡＭＹＣＩＮ）（登録商標）、ミトザイトレックス（ＭＩＴＯＺＹＴＲＥＸ）（登録商標））；ミトタン（例えば、リソドレン（ＬＹＳＯＤＲＥＮ）（登録商標））；ミトキサントロン（例えば、ノバントロン（ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ）（登録商標））；ナンドロロンフェンプロピオネート（例えば、デュラボリン（ＤＵＲＡＢＯＬＩＮ）−５０（登録商標））；ノフェツモマブ（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂｓ）（えば、ベルマ（ＶＥＲＬＵＭＡ）（登録商標））；オプレルベキン（例えば、ニューメガ（ＮＥＵＭＥＧＡ）（登録商標））；オキサリプラチン（例えば、エロキサチン（登録商標））；パクリタキセル（例えば、パキセン（ＰＡＸＥＮＥ）（登録商標）、タキソール（登録商標））；パミドロネート（例えば、アレディア（登録商標））；ペガデマーゼ（例えば、アダゲン（ＡＤＡＧＥＮ）（登録商標））；ペグアスパ���ガーゼ（例えば、オンカスパール（ＯＮＣＡＳＰＡＲ）（登録商標））；ペグフィルグラスチム（例えば、ニューラスタ（ＮＥＵＬＡＳＴＡ）（登録商標））；ペントスタチン（例えば、ニペントＮＩＰＥＮＴ（登録商標））；ピポブロマン（例えば、ＶＥＲＣＹＴＥ（登録商標））；プリカマイシン／ミトラマイシン（例えば、ＭＩＴＨＲＡＣＩＮ（登録商標））；ポルフィマーナトリウム（例えば、フォトフリン（登録商標））；プロカルバジン（例えば、マツラン（ＭＡＴＵＬＡＮＥ）（登録商標））；キナクリン（例えば、アタブリン（ＡＴＡＢＲＩＮＥ）（登録商標））；ラスブリカーゼ（例えば、エリテック（ＥＬＩＴＥＫ）（登録商標））；リツキシマブ（例えば、リツキサン（登録商標））；サルグラモスチム（例えば、プロカイン（ＰＲＯＫＩＮＥ）（登録商標））；ストレプトゾシン（例えば、ザノソール（ＺＡＮＯＳＡＲ）（登録商標））；  リンゴ酸スニチニブ（例えば、スーテント（登録商標））；タルク（例えば、スクレロソール（ＳＣＬＥＲＯＳＯＬ）（登録商標））；タモキシフェン（例えば、ノルバデックス（登録商標））；テモゾロミド（例えば、テモダール（ＴＥＭＯＤＡＲ）（登録商標））；テニポシド／ＶＭ−２６（例えば、ブモン（ＶＵＭＯＮ）（登録商標））；テストラクトン（例えば、テスラック（ＴＥＳＬＡＣ）（登録商標））；チオグアニンｉｎｃｌ．６−ＴＧ；チオテパ（例えば、チオプレックス（ＴＨＩＯＰＬＥＸ）（登録商標））；トポテカン（例えば、ハイカムチン（登録商標））；トレミフェン（例えば、フェアストン（登録商標））；トシツモマブ（例えば、ベキサール（登録商標））；トラスツズマブ（例えば、ヘルセプチン（登録商標））；トレチノイン／ＡＴＲＡ（例えば、ベサノイド（登録商標））；ウラシルマスタード；バルルビシン（例えば、バルスタール（ＶＡＬＳＴＡＲ）（登録商標））；ビンブラスチン（例えば、ベルバン（ＶＥＬＢＡＮ）（登録商標））；ビンクリスチン（例えば、オンコビン（登録商標））；ビノレルビン（例えば、ナベルビン（登録商標））；およびゾレドロネート（例えば、ゾメタ（登録商標））が挙げられる。
【０４５４】
例えば、例示的抗生物質として、それだけには限らないが、アミノグリコシド；アンフェニコール（Ａｍｐｈｅｎｉｃｏｌｓ）；アンサマイシン；カルバセフェム（Ｃａｒｂａｃｅｐｈｅｍｓ）；カルバペネム；セファロスポリンまたはセフェム；セファマイシン；クラバム（Ｃｌａｖａｍｓ）；環状リポペプチド；ジアミノピリミジン；ケトライド；リンコサミド；マクロライド；モノバクタム；ニトロフラン；オキサセファム（Ｏｘａｃｅｐｈｅｍｓ）；オキサゾリジノン；ペネム、チエナマイシンおよび種々のβ−ラクタム；ペニシリン；ポリペプチド抗生物質；キノロン；スルホンアミド；スルホン；テトラサイクリン；およびその他の抗生物質（例えば、クロホクトール、フシジン酸、ヘキセジン、メテナミン、ニトロフラントインニトロキソリン、リチペネム（Ｒｉｔｉｐｅｎｅｍｓ）、タウロリジン、キシボモール（Ｘｉｂｏｍｏｌｓ））が挙げられる。
【０４５５】
また、例示的治療薬の中には、血液凝固因子またはその他の抗血友病因子、抗阻害剤血液凝固薬複合体、アンチトロンビンＩＩＩ、血液凝固因子Ｖ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血漿タンパク質画分、フォンヴィルブランド因子などのその他の血液モディファイヤー；抗血小板薬（例えば、アブシキシマブ、アナグレリド、シロスタゾール、重硫酸クロピドグレル、ジピリダモール、エポプロステノール、エプチフィバチド、チロフィバンを含む；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、顆粒球ＣＳＦおよび顆粒球マクロファージＣＳＦを含む）；赤血球新生刺激物質（例えば、ダルベポエチンアルファなどのエリスロポエチンを含む）およびエポエチンアルファ；止血剤およびアルブミン（例えば、アプロチニン、抗血友病因子および血漿、酢酸デスモプレシンおよびアルブミンの組み合わせを含む）；免疫グロブリンならびにＢ型肝炎免疫グロブリン；トロンビン阻害剤（例えば、直接トロンビン阻害剤およびレピルジンを含む）およびドロトレコギンアルファ；抗凝固薬（例えば、ダルテパリン、エノキサパリンおよびその他のヘパリンおよびワーファリンを含む）も含まれる。
【０４５６】
例示的抗体またはその他の治療薬として、それだけには限らないが、セツキシマブ（ＩＭＣ−Ｃ２２５；アービタックス（登録商標））；トラスツズマブ（ヘルセプチン（登録商標））；リツキシマブ（リツキサン（登録商標）；マブセラ（登録商標））；ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））；アレムツズマブ（キャンパス（登録商標）；キャンパス−１Ｈ（登録商標）；マブキャンパス（登録商標））；パニツムマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ；ベクティビックス（登録商標））；ラニビズマブ（ルセンティス（登録商標））；イブリツモマブ；イブリツモマブ・ティウキセタン（ゼバリン（登録商標））；トシツモマブ；ヨウ素Ｉ  １３１トシツモマブ（ベキサール（登録商標））；カツマキソマブ（レモバブ（登録商標））；ゲムツズマブ；ゲムツズマブオゾガマイシン（マイロターグ（登録商標））；アバタセプト（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ；オレンシア（登録商標））；ベラタセプト（Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ；ＬＥＡ２９Ｙ；ＬＥＡ）；イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０；ＭＤＸ−１０１）；トレメリムマブ（チシリムマブ；ＣＰ−６７５，２０６）；ＰＲＳ−０１０（例えば、ＵＳ２００９００４２７８５を参照のこと）；ＰＲＳ−０５０（ＵＳ７５８５９４０；ＵＳ２００９０３０５９８２）；アフリベルセプト（ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ、ＡＶＥ００５；Holash et al., (2002) PNAS 99:11393-11398）；ボロシキシマブ（Ｍ２００）；ボロシキシマブ（Ｍ２００）のＦ２００（キメラ（ヒト／ネズミ）ＩｇＧ４  Ｆａｂ断片）；ＭＯＲＡｂ−００９マウス／ヒトキメラＩｇＧ１（ＵＳ２００５００５４０４８）；可溶性融合タンパク質：切断型シュードモナス外毒素Ａと連結している抗メソテリンＦｖ（ＳＳ１Ｐ（ＣＡＴ−５００１）；ＵＳ２００７０１８９９６２）；シクスツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）（ＩＭＣ−Ａ１２）；ニモツズマブ（Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）（ｈ−Ｒ３）（Spicer(2005) Curr Opin Mol Ther 7:182-191）；ザルツムマブ（ＨｕＭａｘ−ＥＧＦＲ；Lammerts van Bueren et al. (2008) PNAS 105:6109-14）；ネシツムマブＩＭＣ−１１Ｆ８（Li et al. (2008) Structure 16:216-227）；Ｓｙｍ００４（Pedersen et al. 2010 Cancer Res 70:588-597）；およびｍＡｂ−４２５も挙げられる。
【０４５７】
特に、治療薬として、それだけには限らないが、免疫グロブリン、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−１、インターフェロンアルファ−ｎ３、インターフェロンベータ−１、インターフェロンベータ−１ａ、インターフェロンガンマ−１ｂ、Ｐｅｇ−インターフェロンアルファ−２およびペグインターフェロンアルファ−２ｂ、インスリン、ビスホスフェート（例えば、パミドロネートまたはゾレドロネート）、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシンリポソーマルおよびベバシズマブが挙げられる。
【０４５８】
本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドとの同時投与および／または共製剤によって組み合され得るその他の例示的治療薬として、それだけには限らないが、アダリムマブ、アガルシダーゼベータ、アレファセプト、アンピシリン、アナキンラ、抗ポリオワクチン、抗胸腺細胞、アジスロマイシン、ベカプレルミン、カスポファンギン、セファゾリン、セフェピム、セフォテタン、セフタジジム、セフトリアキソン、セツキシマブ、シラスタチン、クラブラン酸、クリンダマイシン、ダルベポエチンアルファ、ダクリズマブ、ジフテリア、ジフテリア抗毒素、ジフテリアトキソイド、エファリズマブ、エピネフリン、エリスロポエチンアルファ、エタネルセプト、フィルグラスチム、フルコナゾール、卵胞刺激ホルモン、フォリトロピンアルファ、フォリトロピンベータ、ホスフェニトイン、ガドジアミド、ガドペンテト酸、ガチフロキサシン、グラチラマー、ＧＭ−ＣＳＦ、ゴセレリン、酢酸ゴセレリン、グラニセトロン、ヘモフィルスインフルエンザｂ菌、ハロペリドール、肝炎ワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、イブリツモマブチウキセタン、イブリツモマブ、チウキセタン、免疫グロブリン、インフルエンザワクチン、インフルエンザウイルスワクチン、インフリキシマブ、インスリン、インスリングラルギン、インターフェロン、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−１、インターフェロンアルファ−ｎ３、インターフェロンベータ、インターフェロンベータ−１ａ、インターフェロンガンマ、インターフェロンアルファ−コンセンサス、イオジキサノール、イオヘキソール、イオパミドール、イオベルソール、ケトロラク、ラロニダーゼ、レボフロキサシン、リドカイン、リネゾリド、ロラゼパム、麻疹ワクチン、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹−ムンプス−風疹ウイルスワクチン、風疹ワクチン、メドロキシプロゲステロン、メロペネム、メチルプレドニゾロン、ミダゾラム、モルヒネ、オクトレオチド、オマリズマブ、オンダンセトロン、パリビズマブ、パントプラゾール、ペグアスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペグ−インターフェロンアルファ−２ａ、ペグ−インターフェロンアルファ−２ｂ、ペグビソマント、百日咳ワクチン、ピペラシリン、肺炎球菌ワクチンおよび肺炎球菌コンジュゲートワクチン、プロメタジン、レテプラーゼ、ソマトロピン、スルバクタム、スマトリプタン、タゾバクタム、テネクテプラーゼ、テタヌス精製毒素、チカルシリン、トシツモマブ、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンヘキサアセトニド、バンコマイシン、水痘帯状疱疹免疫グロブリン、水痘ワクチン、その他のワクチン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、ヒ素、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン、ＢＣＧ生、ベキサロテン、ブレオマイシン、ブスルファン、静脈内ブスルファン、経口ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、ポリフェプロサンを伴うカルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、シタラビンリポソーマル、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンリポソーマル、ダウノルビシン、ダウノマイシン、デニロイキンジフチトクス、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシンリポソーマル、プロピオン酸ドロモスタノロン、エリオットＢ溶液、エピルビシン、エポエチンアルファ、エストラムスチン、エトポシド、リン酸エトポシド、エトポシドＶＰ−１６、エキセメスタン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、フルベストラント、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミソール、ロムスチン、ＣＣＮＵ、メクロレタミン、ナイトロジェンマスタード、メゲストロール、酢酸メゲストロール、メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、マイトマイシン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ナンドロロンフェンプロピオネート、ノフェツモマブ、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ミトラマイシン、ポルフィマー、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タルク、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、６−チオグアニン、トリエチレンチオホスホラミド（チオテパ）、トポテカン、トレミフェン、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ゾレドロネート、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、レチノイン酸、アリトレチノイン、９−シス−レチノイン酸、アルボシジブ、アンバゾン、アンボマイシン、アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナキシロン、アンシタビン、アントラマイシン、アパジコン、アルギメスナ、アスペルリン、アトリムスチン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バノキサントロン、バタブリン、バチマスタット、ベナキシビン、ベンダムスチン、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビエタセルピン、ビリコダール、ビサントレン、ビスナフィドジメシレート、ビゼレシン、ボルテゾミブ、ブレキナル、ブロピリミン、ブドチタン、カクチノマイシン、カネルチニブ、カラセミド、カルベチマー、カルボコン、カルモフール、カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール、セマドチン、クロラムブシル、シオテロネル、シロレマイシン、クランフェヌル、クロファラビン、クリスナトール、デシタビン、デクスニグルジピン、デキソルマプラチン、デザグアニン、ジアジキオン、ジブロスピジウム、ジエノゲスト、ジナリン、ジセルモリド、ドフェキダル、ドキシフルリジン、ドロロキシフェン、デュアゾマイシン、エコムスチン、エダトレキサート、エドテカリン、エフロミチン（Eflomithines）、エラクリダール、エリナフィド、エルサミトルシン、エミテフール、エンロプラチン、エンプロメート、エンザスタウリン、エピプロピジン、エプタロプロスト、エルブロゾール、エソルビシン、エタニダゾール、エトグルシド、エトプリン、エクシスリンド、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フルオキシメステロン、フルオロシタビン、フォスキドン、フォストリエシン、ホトレタミン、ガラルビシン、ガロシタビン、ゲロキノール、ギマテカン、ギメラシル、グロキサゾン、グルフォスファミド、イルモホシン、イロマスタット、イメキソン、インプロスルファン、インジスラム、インプロクオン、インターロイキン、インターロイキン−２ｓ、組換えインターロイキン、イントプリシン、ヨーベングアン、イプロプラチン、イルソグラジン、イクサベピロン、ケトトレキサート、Ｌ−アラノシン、ランレオチド、ラパチニブ、レドキサントロン、リュープロリド、リュープロレリン、レクサカルシトール、リアロゾール、ロバプラチン、ロメトレキソール、ロナファーニブ、ロソキサントロン、ルルトテカン、マホスファミド、マンノスルファン、マリマスタット、マソプロコール、マイタンシン、メクロレタミン、メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メピチオスタン、メテシンド、メトミデート、メトプリン、メツレデパ、ミボプラチン、ミプロキシフェン、ミソニダゾール、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトフラキソン、ミトギリン、ミトグアゾン、ミトマルシン、ミトナフィド、ミトキドン、ミトスペル、ミトゾロミド、ミボブリン、ミゾリビン、モファロテン、モピダモール、ムブリチニブ、ミコフェノール酸、ネダプラチン、ネイザラビン、ネモルビシン、ニトラクリン、ノコダゾール、ノガラマイシン、ノラトレキセド、ノルトピキサントロン、オルマプラチン、オルタタキセル、オテラシル、オキシスラン、オキソフェナルシン、パツピロン、ペルデシン、ペリオマイシン、ペリトレキソール、ペメトレキセド、ペンタムスチン、ペプロマイシン、ペルホスファミド、ペリフォシン、ピコプラチン、ピナフィド、ピポスルファン、ピルフェニドン、ピロキサントロン、ピクサントロン、プレビトレキセド、プロメスタン、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロパミジン、プロスピジウム、プミテパ、ピューロマイシン、ピラゾフリン、ラニムスチン、リボプリン、リトロスルファン、ログレチミド、ロキニメックス、ルフォクロモマイシン、サバルビシン、サフィンゴール、サトラプラチン、セブリプラチン、セムスチン、シムトラゼン、シゾフィラン、ソブゾキサン、ソラフェニブ、スパルフォセート、スパルフォス酸、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、スクアラミン、ストレプトニグリン、ストレプトバリシン、スホスファミド、スロフェヌル、タセジナリン、タリソマイシン、タリムスチン、タリキダル、タウロムスチン、テコガラン、テガフール、テロキサントロン、テモポルフィン、テロキシロン、チアミプリン（Ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅｓ）、チアミプリン（Ｔｉａｍｉｐｒｉｎｅｓ）、チアゾフリン、チロミソール、チロロン、チムコダル、チモナシック、チラパザミン、トピクサントロン、トラベクテジン、エクチナサイジン７４３、トレストロン、トリシリビン、トリロスタン、トリメトレキサート、トリプラチンテトラニトレート、トリプトレリン、トロホスファミド、ツブロゾール、ウベニメクス、ウレデパ、バルスポダール、バプレオチド、ベルテポルフィン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンピジン、ビンフルニン、ビンホルミド、ビングリシネート、ビンロイシノール、ビンロイロシン、ビンロシジン、ビントリプトール、ビンゾリジン、ボロゾール、キサントマイシンＡ、グアメシクリン、ゼニプラチン、ジラスコルブ［２−Ｈ］、ジノスタチン、ゾルビシン、ゾスキダル、アセタゾラミド、アシクロビル、アジピオドン、アラトロフロキサシン、アルフェンタニル、アレルゲン性抽出物、アルファ１−プロテイナーゼ阻害剤、アルプロスタジル、アミカシン、アミノ酸、アミノカプロン酸、アミノフィリン、アミトリプチリン、アモバルビタール、アムリノン、鎮痛薬、抗ポリオワクチン、抗狂犬病血清、抗テタヌス免疫グロブリン、テタヌスワクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、抗毒素血清、アルガトロバン、アルギニン、アスコルビン酸、アテノロール、アトラクリウム、アトロピン、オーロチオグルコース、アザチオプリン、アズトレオナム、バシトラシン、バクロフェン、バシリキシマブ、安息香酸、ベンズトロピン、ベタメタゾン、ビオチン、ビバリルジン、ボツリヌス抗毒素、ブレチリウム、ブメタニド、ブピバカイン、ブプレノルフィン、ブトルファノール、カルシトニン、カルシトリオール、カルシウム、カプレオマイシン、カルボプロスト、カルニチン、セファマンドール、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフチゾキシム、セフロキシム、クロラムフェニコール、クロロプロカイン、クロロキン、クロロチアジド、クロルプロマジン、コンドロイチン硫酸、絨毛性ゴナドトロピンアルファ、クロム、シドホビル、シメチジン、シプロフロキサシン、シサトラクリウム、クロニジン、コデイン、コルヒチン、コリスチン、コラーゲン、コルチコレリンオーバイントリフルテート、コルチコトロピン、コシントロピン、シアノコバラミン、シクロスポリン、システイン、ダクリキシマブ、ダルホプリスチン、ダルテパリン、ダナパロイド、ダントロレン、デフェロキサミン、デスモプレシン、デキサメタゾン、デクスメデト
ミジン、デクスパンテノール、デキストラン、鉄デキストラン、ジアトリゾ酸、ジアゼパム、ジアゾキシド、ジサイクロミン、ジギバインド、ジゴキシン、ジヒドロエルゴタミン、ジルチアゼム、ジフェンヒドラミン、ジピリダモール、ドブタミン、ドパミン、ドキサクリウム、ドキサプラム、ドキセルカルシフェロール、ドキシサイクリン、ドロペリドール、ジフィリン、エデト酸、エドロホニウム、エナラプリラート、エフェドリン、エポプロステノール、エルゴカルシフェロール、エルゴノビン、エルタペネム、エリスロマイシン、エスモロール、エストラジオール、エストロゲニック、エタクリン酸、エタノールアミン、エタノール、ヨード化ケシ油エチルエステル、エチドロン酸、エトミデート、第ＶＩＩＩ因子、ファモチジン、フェノルドパム、フェンタニル、フルマゼニル、フルオレセイン、フルフェナジン、葉酸、フォメピゾール、ホミビルセン、フォンダパリヌクス、ホスカルネット、ホスフェニトイン、フロセミド、ガドテリドール、ガドベルセタミド、ガンシクロビル、ゲンタマイシン、グルカゴン、グルコース、グリシン、グリコピロレート、ゴナドレリン、ゴナドトロピン絨毛性、ヘモフィルスＢ型多糖、ヘミン、ハーバル、ヒスタミン、ヒドララジン、ヒドロコルチゾン、ヒドロモルホン、ヒドロキソコバラミン、ヒドロキシジン、ヒヨスチアミン、イブチリド、イミグルセラーゼ、インジゴカルミン、インドメタシン、ヨウ化物、イオプロミド、イオタラム酸、イオキサグル酸、イオキシラン、イソニアジド、イソプロテレノール、日本脳炎ワクチン、カナマイシン、ケタミン、ラベタロール、レピルジン、レボブピバカイン、レボチロキシン、リンコマイシン、リオチロニン、黄体形成ホルモン、ライム病ワクチン、マンガホジピール、マンストール、髄膜炎菌多糖体ワクチン、メペリジン、メピバカイン、メソリダジン、メタラミノール、メサドン、メトカルバモール、メトヘキシタール、メチルドーペート、メチルエルゴノビン、メトクロプラミド、メトプロロール、メトロニダゾール、ミノサイクリン、ミバクリウム、モルルイック酸、モキシフロキサシン、ムロモナブ−ＣＤ３、ミコフェノール酸モフェチル、ナフシリン、ナルブフィン、ナルメフェン、ナロキソン、ネオスチグミン、ナイアシンアミド、ニカルジピン、ニトログリセリン、ニトロプルシド、ノルエピネフリン、オルフェナドリン、オキサシリン、オキシモルフォン、オキシテトラサイクリン、オキシトシン、パンクロニウム、パンテノール、パントテン酸、パパベリン、ペグインターフェロン−アルファ（例えば、インターフェロンアルファ２ａまたは２ｂ）、ペニシリンＧ、ペンタミジン、ペンタゾシン、ペントバルビタール、パーフルトレン、ペルフェナジン、フェノバルビタール、フェントラミン、フェニレフリン、フェニトイン、フィゾスチグミン、フィトナジオン、ポリミキシンｂ、プラリドキシム、プリロカイン、プロカインアミド、プロカイン、プロクロルペラジン、プロゲステロン、プロプラノロール、水酸化ピリドスチグミン、ピリドキシン、キニジン、キヌプリスチン、狂犬病免疫グロブリン、狂犬病ワクチン、ラニチジン、レミフェンタニル、リボフラビン、リファンピン、ロピバカイン、サマリウム、スコポラミン、セレン、セルモレリン、シンカリド、ソマトレム、スペクチノマイシン、ストレプトキナーゼ、ストレプトマイシン、スクシニルコリン、スフェンタニル、スルファメトキサゾール、タクロリムス、テルブタリン、テリパラチド、テストステロン、テタヌス抗毒素、テトラカイン、硫酸テトラデシル、テオフィリン、チアミン、チエチルペラジン、チオペンタール、甲状腺刺激ホルモン、チンザパリン、チロフィバン、トブラマイシン、トラゾリン、トルブタミド、トルセミド、トラネキサム酸、トレプロスチニル、トリフルオペラジン、トリメトベンズアミド、トリメトプリム、トロメタミン、ツベルクリン、腸チフスワクチン、ウロフォリトロピン、ウロキナーゼ、バルプロ酸、バソプレシン、ベクロニウム、ベラパミル、ボリコナゾール、ワーファリン、黄熱ワクチン、ジドブジン、亜鉛、塩酸ジプラシドン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アドリアマイシン、アザセリン、６−アザウリジン、カルジノフィリン、クロモマイシン、デノプテリン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、エノシタビン、フロクスウリジン、オリボマイシン、ピラルビシン、ピリトレキシム、プテロプテリン、テガフール、ツベルシジン、アルテプラーゼ、アルシツモマブ、ベバシズマブ、ボツリヌス毒素Ａ型、ボツリヌス毒素Ｂ型、カプロマブペンデチド、ダクリズマブ、ドルナーゼアルファ、ドロトレコギンアルファ、イムシロマブペンテテート、およびヨウ素−１３１が挙げられる。
【０４５９】
インスリンのデリバリー
本明細書において提供される方法は、速効型インスリンなどのインスリンの皮下デリバリーを増大するために、修飾ＰＨ２０ポリペプチドおよびインスリンを同時投与する方法を含む。（例えば、米国特許第７，７６７，４２９号；同７，８４６，４３１号；米国公開番号ＵＳ２００９０３０４６６５；米国出願番号第１３／５０７，２６３号；同１３／５０７，２６２号および同１３／５０７，２６１号を参照のこと）。このような方法は、直接投与する方法および開および閉ポンプシステムを含むポンプおよび連続注入方法を含む。例えば、本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ヒアルロニダーゼとともに投与され得る例示的インスリンは、速効型インスリンまたはインスリン類似体である。例えば、同時投与されるインスリンとして、レギュラーインスリン、インスリンアスパルト、インスリンリスプロ、インスリングルリジンまたはその他の同様の類似体変異体が挙げられる。例示的インスリンとは、配列番号８６２に示されるＡ鎖および配列番号８６３に示されるＢ鎖を含有するインスリンまたは配列番号８６２および８６３（ＡおよびＢ鎖）に示されるヒトインスリンと比較して１つまたは複数のアミノ酸修飾を含有する変異体である。例えば、例示的インスリン類似体は、当業者に公知であり、それだけには限らないが、配列番号８６２（Ａ鎖）に示され、配列番号８６５〜８６７のいずれかに示されるＢ鎖を有するものが挙げられる。
【０４６０】
共製剤は、インスリンを用いる治療を受け入れられる任意の状態を治療するために皮下投与され得る。治療的使用は、それだけには限らないが、１型真性糖尿病、２型真性糖尿病、妊娠糖尿病の治療および危篤状態の患者における血糖コントロールのための治療を含む。例えば、速効型インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の共製剤は、血糖コントロールを達成するために、糖尿病を有する対象における食事のインスリン療法として、食事の前にシリンジまたはインスリンペンなどによって、別個の用量で皮下投与され得る。共製剤はまた、昼夜を通じて血糖レベルを継続的にコントロールするために、および／または食事後血糖変動をコントロールするために、インスリンポンプを使用して、または閉ループシステムに関連して投与され得る。このような疾患または状態を同定することは、治療医師の技術の範囲内である。
【０４６１】
速効型インスリンが示されるか、使用されてきた、その他の薬剤および治療が利用可能である、上記で例示されたものすべてを含めた任意の疾患または状態について、共製剤が、それと組み合わせて使用され得る。治療される疾患または状態に応じて、例示的組み合わせとして、それだけには限らないが、抗糖尿病薬、例えば、それだけには限らないが、スルホンル尿素、ビグアナイド、メグリチニド、チアゾリジンジオン、αグルコシダーゼ阻害剤、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）類似体を含めたペプチド類似体および胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）類似体およびＤＰＰ−４阻害剤との組み合わせが挙げられる。別の例では、速効型インスリンおよび本明細書において記載された修飾ＰＨ２０ポリペプチドの共製剤は、１種または複数種の、速効型インスリンおよび基礎作用インスリンを含めたその他のインスリンと組み合わせて、その前に、それと断続的に、またはその後に、投与され得る。
【０４６２】
２．ヒアルロナン関連疾患および状態（例えば、腫瘍）の方法
特に、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナン関連疾患または状態を治療するために使用され得る。一般に、ヒアルロナン関連疾患および状態は、対照、例えば、別の組織、細胞または体液と比較した、組織、細胞または体液（例えば、腫瘍組織または腫瘍関連組織、血液または間質性空間）におけるヒアルロナン発現の上昇と関連している。ヒアルロナン発現の上昇は、正常組織、細胞または体液、例えば、試験されているサンプルと類似しているが、正常である（すなわち、疾患もしくは状態を有さないか、または対象が試験されている疾患もしくは状態の種類を有さない）対象、例えば、ヒアルロナン関連疾患または状態を有さない対象などの異なる対象から単離された組織、細胞または体液と比較して上昇され得る。ヒアルロナン発現の上昇は、同様の疾患または状態を有するが、その疾患が重篤ではない、および／またはヒアルロナン関連ではない、または比較的少ないヒアルロナンを発現し、したがって、少ない程度にヒアルロナンと関連している別の対象から得た類似の組織と比較して上昇され得る。例えば、試験されている対象は、ヒアルロナン関連癌を有する対象であり得、これでは、組織、細胞または流体中のＨＡ量が、あまり重篤ではない癌、例えば、早期の、分化した、またはその他の種類の癌を有する対象と比較して比較的に高い。別の例では、細胞、組織または流体は、比較的低いレベルのＨＡを発現するとわかっているサンプル、例えば、腫瘍細胞株などの、既知量または相対量のＨＡを有する、流体、組織、抽出物（例えば、細胞抽出物または核抽出物）、核酸またはペプチド調製物、細胞株、生検、標準またはその他のサンプル、例えば、低レベルのＨＡを発現する、本明細書において記載された例示的腫瘍細胞株、例えば、ＨＣＴ１１６細胞株、ＨＴ２９細胞株、ＮＣＩ  Ｈ４６０細胞株、ＤＵ１４５細胞株、Ｃａｐａｎ−１細胞株およびこのような細胞株を使用して作製された腫瘍モデルから得た腫瘍などの対照サンプルと比較して上昇したレベルのヒアルロナンを含有する。
【０４６３】
ヒアルロナン関連疾患および状態は、高い間質液圧、例えば、椎間板圧、増殖性障害と関連しているもの、例えば、癌および良性前立腺肥大および浮腫を含む。浮腫は、例えば、臓器移植、卒中または脳外傷に起因し得るか、そこで現れ得る。増殖性障害として、それだけには限らないが、癌、平滑筋細胞増殖、全身性硬化症、肝臓の硬変、成人性呼吸窮迫症候群、特発性心筋症、紅斑性狼瘡、網膜症、例えば、糖尿病性網膜症またはその他の網膜症、心肥大（ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、生殖器系関連障害、例えば、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）および卵巣嚢胞、肺線維症、子宮内膜症、線維腫症、過誤腫、リンパ管筋腫症、サルコイドーシス、デスモイド腫瘍が挙げられる。癌として、固形腫瘍およびリンパ／血液腫瘍および転移性疾患および未分化腫瘍が挙げられる。治療を受け入れられる腫瘍は、通常、同一組織種の非癌性組織と比較して、または同一腫瘍種の非転移性腫瘍と比較して、ヒアルロナンの細胞性および／または間質性の発現を示す。癌は、卵巣癌、上皮内癌（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、前立腺癌、膵臓癌、その他の胃癌、非小細胞肺癌、乳癌、脳癌および結腸癌を含む。
【０４６４】
本明細書において提供される修飾ＰＨ２０ポリペプチド、そのＰＥＧ化形態などを使用して、腫瘍を治療できる。したがって、ヒアルロニダーゼはまた、その間接的な抗癌薬効果に加えて、直接的な抗癌効果を有する。ヒアルロニダーゼは、マウスに移植された腫瘍の増殖を妨げ（De Maeyer et al., 1992, Int. J. Cancer 51:657-660）、発癌物質に曝露された際に腫瘍形成を阻害する（Pawlowski et al., 1979, Int. J. Cancer 23:105-109; Haberman et al., 1981, Proceedings of the 17th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, Washington, D.C., 22:105, abstract no. 415）。ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、種々の腫瘍を治療するとわかっている（例えば、米国公開番号ＵＳ２０１０／０００３２３８および米国公開番号ＵＳ２０１２００２０９５１として公開された米国出願番号第１３／１３５，８１７号）。
【０４６５】
ヒアルロナンリッチな癌は、癌細胞がＨＡＬＯを産生する癌、ヒアルロナンの上昇した発現を有する（免疫染色、例えば、腫瘍から得た切片の組織学的染色によって決定されるような）癌、上昇したＨＡＳ２（ヒアルロナンシンターゼ２）を有する癌、インビトロでヒアルロニダーゼ（ＨＹＡＬ１）を産生しない癌であり得る。ヒアルロナンリッチな癌は、ヒアルロナン発現を評価する任意の方法およびタンパク質／ｍＲＮＡ発現をアッセイするためのその他の公知の方法によって同定され得る。
【０４６６】
いくつかのヒアルロナンリッチな癌が同定されている。いくつかの場合には、ヒアルロナン発現は、予後不良、例えば、生存率の低下および／または再発のない生存率、血管新生、その他の組織／領域への癌細胞浸潤、予後不良のその他の指標と相関がある。このような相関は、例えば、卵巣癌、ＳＣＣ、ＩＳＣ、前立腺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含めた肺癌、乳癌、結腸癌および膵臓癌を含めたヒアルロナンリッチな腫瘍において観察された（例えば、Anttila et al, Cancer Research, 60:150-155 (2000); Karvinen et al., British Journal of Dermatology, 148:86-94 (2003); Lipponen et al., Eur. Journal of Cancer, 849-856 (2001); Pirinen et al., Int. J. Cancer: 95: 12-17 (2001); Auvinen et al., American Journal of Pathology, 156(2):529-536 (2000); Ropponen et al., Cancer Research, 58: 342-347 (1998)を参照のこと）。したがって、ヒアルロナンリッチな癌は、癌の１種または複数種の症状を治療するための、可溶性ＰＨ２０などのヒアルロニダーゼの投与によって治療され得る。ヒアルロナン−リッチな腫瘍として、それだけには限らないが、前立腺、乳房、結腸、卵巣、胃、頭頸部のものおよびその他の腫瘍および癌が挙げられる。
【０４６７】
過剰のグリコサミノグリカンと関連しており、本明細書において提供される修飾ＰＨ２０ポリペプチドを用いて治療され得る、その他のヒアルロナン関連疾患または状態として、それだけには限らないが、心血管疾患（例えば、虚血後再潅流；動脈硬化症における）；硝子体切除術および眼部障害および状態（例えば、眼の硝子体液液化する；術後圧を低減する方法における；緑内障、硝子体および網膜手術などのその他の眼の手術における、角膜移植における）；皮下点滴療法における（すなわち、皮膚の皮下組織への流体および電解質の注入）；美容的適用（例えば、セルライト、「ピッグスキン」浮腫または「オレンジピール」浮腫の治療における）；臓器移植（例えば、臓器の移植と関連する間質浮腫と関連する）；肺の疾患が挙げられる。
【０４６８】
３．その他の使用
その治療的使用のさらなる例では、本明細書において提供される修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、ビンカアルカロイドなどの壊死性物質の静脈傍注射からの局所壊死の解毒薬（Few et al. (1987) Amer. J. Matern. Child Nurs. 12、23-26）、神経節嚢胞の治療（Paul et al. (1997) J Hand Surg. 22 (2): 219-21）および静脈不全による組織壊死の治療（Elder et al. (1980) Lancet 648-649）のような目的で使用され得る。修飾ＰＨ２０ポリペプチドはまた、手の最もよくある軟部組織塊であり、皮膚の下に感じることができる流体が詰まった嚢である、神経節嚢胞（手首嚢胞、聖書嚢胞または背側腱嚢胞としても知られる）を治療するために使用され得る。
【０４６９】
修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）を分解することによって脊髄損傷の治療において使用され得る。脊髄損傷後に、ＣＳＰＧを含有する神経膠瘢痕が、星状細胞によって産生される。ＣＳＰＧは、軸索成長の阻害において重大な役割を果たす。さらに、ＣＳＰＧの発現は、中枢神経系（ＣＮＳ）の損傷後に増大するとわかっている。可溶性ＰＨ２０はまた、化学的髄核融解術として知られるプロセスにおける椎間板ヘルニアの治療に利用され得る。コンドロイチナーゼＡＢＣ、ヒアルロニダーゼと同様の基質を切断する酵素は、腰椎中の椎間板内圧の低下を誘導し得る。３種の椎間板損傷がある。突出した椎間板は、無傷であるが、隆起しているものである。押し出された椎間板では、線維輪（ｆｉｂｒｏｕｓ  ｗｒａｐｐｅｒ）は断裂を有し、ＮＰが漏出しているが、まだ椎間板とつながっている。隔絶された椎間板では、ＮＰの断片が壊れて椎間板から離れており、脊柱管中で自由になっている。化学的髄核融解術は、通常、突出した、押し出された椎間板に対して有効であるが、隔絶された椎間板損傷に対しては有効でない。
【０４７０】
４．避妊
本明細書において提供された修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、避妊薬適用においてワクチンとして使用され得る。ＰＨ２０は、男性生殖器系に存在し、精巣および精巣上体の両方において発現され、精子中に存在する。ＰＨ２０は、未授精卵の周囲の卵丘層を通る精子の侵入を容易にすることによって受精において役割を果たす。ＰＨ２０はまた、受精の初期相の間に透明帯上のヒアルロン酸（ＨＡ）と結合できる。この結合はまた、先体反応に役立つ細胞内シグナル伝達を開始する。ＰＨ２０を用いる免疫化は、雄のモルモットにおいて有効な避妊薬であるとわかっている（Primakoff et al. (1988) Nature 335:543-546, Tung et al. (1997) Biol. Reprod. 56:1133-1141）。精子および卵子の結合を妨げる抗ＰＨ２０抗体の生成のために、雌のモルモットにおいても有効な避妊薬であるとわかっている。本明細書における例では、修飾ＰＨ２０ポリペプチドは、節Ｃ．２に記載される任意のものなど不活性の酵素であり得る。ポリペプチドは、直接的に投与される場合も、抗原を送達するための組換えウイルスとして投与される場合もある。
【実施例】
【０４７１】
Ｉ．実施例
以下の実施例は、単に例示目的で含まれており、本発明の範囲を制限しようとするものではない。
【０４７２】
実施例１
組換えヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼ（ｒＨｕＰＨ２０）の作製
Ａ．可溶性ｒＨｕＰＨ２０を発現する細胞株の作製
公開された米国公開番号ＵＳ２０１１００５３２４７に記載されるように、ｒＨｕＰＨ２０と名付けられた組換えヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼを作製した。手短には、ｐＣＩ−ＰＨ２０−ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲ−ＳＶ４０ｐａ（ＨＺ２４）プラスミド（配列番号５に示される）を使用して、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）をトランスフェクトした（例えば、米国特許第７，７６７，４２９号および同７，７８１，６０７号米国公開第２００６−０１０４９６８号を参照のこと）。可溶性ｒＨｕＰＨ２０の発現のためのＨＺ２４プラスミドベクターは、ｐＣＩベクター骨格（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼ（配列番号２）のアミノ酸１〜４８２をコードするＤＮＡ、ＥＣＭＶウイルス由来の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびマウスジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を含有していた。ｐＣＩベクター骨格はまた、Β−ラクタマーゼ耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）をコードするＤＮＡ、ｆ１複製起点、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー／プロモーター領域（ＣＭＶ）、キメライントロンおよびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０）を含む。可溶性ｒＨｕＰＨ２０コンストラクトをコードするＤＮＡは、ヒトＰＨ２０の天然の３５アミノ酸シグナル配列のアミノ酸位置１のメチオニンをコードするＤＮＡの前にＮｈｅＩ部位およびＫｏｚａｋコンセンサス配列、停止コドンとそれに続く、配列番号２に示されるヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのアミノ酸位置４８２に対応するチロシンをコードするＤＮＡと、それに続く、ＢａｍＨＩ制限部位を含有する。
【０４７３】
４ｍＭグルタミンおよび１８ｍＬ／Ｌ  Ｐｌｕｒｉｏｎｉｃ  Ｆ６８／Ｌ（Ｇｉｂｃｏ）を補給した、ＤＨＦＲ（−）細胞のためのＧＩＢＣＯ修飾ＣＤ−ＣＨＯ培地で増殖しているトランスフェクトされたＤＧ４４  ＣＨＯ細胞を、０．５×１０６個細胞／ｍＬで、トランスフェクションのための準備したシェーカーフラスコ中に播種した。細胞を、１２０ｒｐｍで振盪しながら、加湿インキュベーター中５％  ＣＯ２中、３７℃で増殖させた。指数関数的に増殖するトランスフェクトされていないＤＧ４４  ＣＨＯ細胞を、トランスフェクション前の生存力について試験した。
【０４７４】
トランスフェクトされていないＤＧ４４  ＣＨＯ細胞培養物の６０００万個の生存細胞をペレットにし、２×トランスフェクションバッファー（２×ＨｅＢＳ：４０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０、２７４ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１２ｍＭデキストロース）０．７ｍＬ中、２×１０７個細胞の密度に再懸濁した。再懸濁された各アリコートに、直鎖ＨＺ２４プラスミド（Ｃｌａ  Ｉでの一晩消化によって直線化された（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）０．０９ｍＬ（２５０μｇ）を加え、室温で、細胞／ＤＮＡ溶液を、０．４ｃｍ  ｇａｐ  ＢＴＸ（Ｇｅｎｔｒｏｎｉｃｓ）エレクトロポレーションキュベット中に移した。陰性対照エレクトロポレーションは、細胞と混合されるプラスミドＤＮＡを用いずに実施した。細胞／プラスミド混合物を、３３０Ｖおよび９６０μＦまたは３５０Ｖおよび９６０μＦのコンデンサ放電を用いてエレクトロポレーションした。
【０４７５】
エレクトロポレーション後に細胞をキュベットから回収し、４ｍＭグルタミンおよび１８ｍＬ／Ｌプルリオニック（Ｐｌｕｒｉｏｎｉｃ）Ｆ６８／Ｌ（Ｇｉｂｃｏ）を補給した、ＤＨＦＲ（−）細胞のための修飾ＣＤ−ＣＨＯ培地５ｍＬ中に移し、６ウェル組織培養プレートのウェル中で、選択せずに２日間、加湿インキュベーター中５％  ＣＯ２中、３７℃で増殖させた。
【０４７６】
エレクトロポレーションの２日後、各ウェルから０．５ｍＬの組織培養培地を採取し、実施例８に記載されたマイクロ濁度アッセイを使用してヒアルロニダーゼ活性の存在について試験した。結果は、表６に示されている。
【０４７７】
【表６】
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【０４７８】
トランスフェクション２（３５０Ｖ）から得られた細胞を、組織培養ウェルから集め、カウントし、ｍＬあたり１×１０４〜２×１０４個生存細胞に希釈した。細胞懸濁液の０．１ｍＬアリコートを、５つの９６ウェル丸底組織培養プレートの各ウェルに移した。４ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−１栄養補助剤（ＧＩＢＣＯ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含有し、ヒポキサンチンおよびチミジン栄養補助剤を含まない、１００マイクロリットルのＣＤ−ＣＨＯ培地（ＧＩＢＣＯ）を、細胞を含有するウェルに加えた（最終容量０．２ｍＬ）。５枚のプレートから１０のクローンを同定し、メトトレキサートを含まずに増殖させた（表７）。
【０４７９】
【表７】
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【０４８０】
６つのＨＺ２４クローンを培養で増やし、単細胞懸濁液としてシェーカーフラスコに移した。クローン３Ｄ３、３Ｅ５、２Ｇ８、２Ｄ９、１Ｅ１１および４Ｄ１０を、最上部の左側のウェルで５０００個細胞で出発し、細胞を下に１：２希釈し、横に１：３希釈する２次元無限希釈戦略を使用して９６ウェル丸底組織培養プレート中にプレーティングした。希釈したクローンを、ウェルあたり５００個のトランスフェクトされていないＤＧ４４  ＣＨＯ細胞バックグラウンドで増殖させ、培養の初日に必要な増殖因子を提供した。サブクローンあたり１０枚のプレートを作製し、５枚のプレートが５０ｎＭメトトレキサートを含有しており、５枚のプレートがメトトレキサートを含んでいなかった。
【０４８１】
クローン３Ｄ３から、２４の視覚的サブクローンが得られた（１３が、メトトレキサート不含処理から、１１が５０ｎＭメトトレキサート治療から）。２４のサブクローンのうち８から、上清において相当なヒアルロニダーゼ活性が測定された（＞５０単位／ｍＬ）、これら８つのサブクローンをＴ−２５組織培養フラスコ中で増やした。メトトレキサート処理プロトコールから単離されたクローンを、５０ｎＭメトトレキサートの存在下で増やした。クローン３Ｄ３５Ｍを、５００ｎＭメトトレキサートでさらに増やし、シェーカーフラスコ中、１，０００単位／ｍＬを超えるヒアルロニダーゼ活性をもたらすクローンを生じさせた（クローン３Ｄ３５Ｍ；またはＧｅｎ１  ３Ｄ３５Ｍ）。次いで、３Ｄ３５Ｍ細胞のマスター細胞バンク（ＭＣＢ）を調製した。
【０４８２】
Ｂ．可溶性ヒトＰＨ２０（ｒＨｕＰＨ２０）を含有するＧｅｎ２細胞の産生
実施例１．Ａに記載されたＧｅｎ１  ３Ｄ３５Ｍ細胞株を、より高いメトトレキサートレベルに適応させ、世代２（Ｇｅｎ２）クローンが得られた。３Ｄ３５Ｍ細胞を、４ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ−１（商標）および１．０μＭメトトレキサートを含有するＣＤ  ＣＨＯ  培地中の確立されたメトトレキサート含有培養物から播種した。細胞を、加湿インキュベーター中７％  ＣＯ２中、３７℃で増殖させ、４６日の期間にわたって９回継代することによって、より高いメトトレキサートレベルに適応させた。細胞の増幅させた集団を、２．０μＭメトトレキサートを有する培地を含有する９６ウェル組織培養プレートにおける制限希釈によってクローニングした。およそ４週間後、クローンを同定し、増やすためにクローン３Ｅ１０Ｂを選択した。３Ｅ１０Ｂ細胞を、４ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ−１（商標）および２．０μＭメトトレキサートを含有するＣＤ  ＣＨＯ培地で、２０継代間増殖させた。３Ｅ１０Ｂ細胞株のマスター細胞バンク（ＭＣＢ）を作製し、凍結し、その後の研究に使用した。
【０４８３】
細胞株の増幅は、３Ｅ１０Ｂ細胞を、４ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ−１（商標）および４．０μＭメトトレキサートを含有するＣＤ  ＣＨＯ培地で培養することによって継続した。１２回継代した後、研究細胞バンク（ＲＣＢ）として細胞をバイアル中で凍結した。ＲＣＢの１つのバイアルを解凍し、８．０μＭメトトレキサートを含有する培地で培養した。５日後、培地中のメトトレキサート濃度を１６．０μＭに増大させ、次いで、１８日後に２０．０μＭに増大した。２０．０μＭメトトレキサートを含有する培地での８回目の継代から得た細胞を、４ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ−１（商標）および２０．０μＭメトトレキサートを含有するＣＤ  ＣＨＯ培地を含有する９６ウェル組織培養プレートにおける制限希釈によってクローニングした。５〜６週間後にクローンを同定し、２０．０μＭメトトレキサートを含有する培地で増やすためにクローン２Ｂ２を選択した。１１回目の継代後、研究細胞バンク（ＲＣＢ）として２Ｂ２細胞をバイアル中で凍結した。
【０４８４】
得られた２Ｂ２細胞は、可溶性組換えヒトＰＨ２０（ｒＨｕＰＨ２０）を発現する、ジヒドロホレートレダクターゼに欠陥のある（ｄｈｆｒ−）ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞である。可溶性ＰＨ２０は、およそ２０６コピー／細胞のコピー数で２Ｂ２細胞中に存在する。ｒＨｕＰＨ２０特異的プローブを使用する、Ｓｐｅ  Ｉ−、Ｘｂａ  Ｉ−およびＢａｍＨ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ消化されたゲノム２Ｂ２細胞ＤＮＡのサザンブロット解析によって、以下の制限消化プロフィールが示された：Ｓｐｅ  Ｉで消化されたＤＮＡを用いて、約７．７ｋｂの１つの主要な加水分解バンドおよび４つの微量の加水分解バンド（約１３．９、約６．６、約５．７および約４．６ｋｂ）；Ｘｂａ  Ｉで消化されたＤＮＡを用いて、約５．０ｋｂの１つの主要な加水分解バンドおよび２つの微量の加水分解バンド（約１３．９および約６．５ｋｂ）；およびＢａｍＨ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩを用いて消化された２Ｂ２  ＤＮＡを使用して観察された、約１．４の１つの単一加水分解バンド。
【０４８５】
Ｃ．３００Ｌバイオリアクター細胞培養における、Ｇｅｎ２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の産生
ＨＺ２４−２Ｂ２のバイアルを解凍し、２０μＭメトトレキサートおよびＧｌｕｔａＭＡＸ−１（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補給したＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で、シェーカーフラスコから３６Ｌスピナーフラスコを通して増やした。手短には、細胞のバイアルを、３７℃の水浴中で解凍し、培地を加え、細胞を遠心分離した。細胞を、２０ｍＬの新鮮培地を有する１２５ｍＬの振盪フラスコ中に再懸濁し、３７℃、７％  ＣＯ２インキュベーター中に入れた。細胞を１２５ｍＬ振盪フラスコ中で最大４０ｍＬに増やした。細胞密度が、１．５×１０６個細胞／ｍＬ超に達した時点で、培養物を、１２５ｍＬスピナーフラスコ中の１００ｍＬ培養容量で増やした。フラスコを、３７℃、７％  ＣＯ２でインキュベートした。細胞密度が１．５×１００６個細胞／ｍＬ超に達した時点で、培養物を、２５０ｍＬスピナーフラスコ中の２００ｍＬ培養容量で増やした。フラスコを、３７℃、７％  ＣＯ２でインキュベートした。細胞密度が、１．５×１０６個細胞／ｍＬ超に達した時点で、培養物を、１Ｌスピナーフラスコ中の８００ｍＬ培養容量で増やし、３７℃、７％  ＣＯ２でインキュベートした。細胞密度が、１．５×１０６個細胞／ｍＬ超に達した時点で、培養物を、６Ｌスピナーフラスコ中の５０００ｍＬ培養容量で増やし、３７℃、７％  ＣＯ２でインキュベートした。細胞密度が、１．５×１０６個細胞／ｍＬ超に達した時点で、培養物を、３６Ｌスピナーフラスコ中の３２Ｌ培養容量で増やし、３７℃、７％  ＣＯ２でインキュベートした。
【０４８６】
４００Ｌのリアクターを滅菌し、２３０ｍＬのＣＤ−ＣＨＯ培地を加えた。使用する前に、リアクターを、汚染についてチェックした。３６Ｌのスピナーフラスコから４００Ｌのバイオリアクター（Ｂｒａｕｎ）におよそ３０Ｌの細胞を、ｍＬあたり４．０×１０５個生存細胞の播種密度および２６０Ｌの総容量で移した。パラメータは：温度設定、３７℃；Ｉｍｐｅｌｌｅｒ  Ｓｐｅｅｄ  ４０−５５  ＲＰＭ；容器圧：３ｐｓｉ；空気スパージ  ０．５〜１．５Ｌ／Ｍｉｎ．；空気オーバーレイ：３Ｌ／分であった。リアクターを、細胞数、ｐＨ確認、培地分析、タンパク質産生および保持時間について毎日サンプリングした。また実施の間に、栄養供給物を加えた。１２０時間（５日目）で、１０．４Ｌの供給物１培地（４×  ＣＤ−ＣＨＯ＋３３ｇ／Ｌ  グルコース＋１６０ｍＬ／Ｌ  Ｇｌｕｔａｍａｘ−１（商標）＋８３ｍＬ／Ｌ  Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ＋３３ｍｇ／Ｌ  ｒＨｕインスリン）を加えた。１６８時間（７日目）で、１０．８Ｌの供給物２（２×  ＣＤ−ＣＨＯ＋３３ｇ／Ｌグルコース＋８０ｍＬ／Ｌ  Ｇｌｕｔａｍａｘ−１（商標）＋１６７ｍＬ／Ｌ  Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ＋０．９２ｇ／Ｌ酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を３６．５℃変更した。２１６時間（９日目）で、１０．８Ｌの供給物３（１×ＣＤ−ＣＨＯ＋５０ｇ／Ｌ＋グルコース＋５０ｍＬ／Ｌ  Ｇｌｕｔａｍａｘ−１（商標）＋２５０ｍＬ／Ｌ  Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ＋１．８０ｇ／Ｌ酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を３６℃に変更した。２６４時間（１１日目）に、１０．８Ｌの供給物４（１×ＣＤ−ＣＨＯ＋３３ｇ／Ｌグルコース＋３３ｍＬ／Ｌ  Ｇｌｕｔａｍａｘ−１（商標）＋２５０ｍＬ／Ｌ  Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ＋０．９２ｇ／Ｌ酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を３５．５℃に変更した。供給培地の添加が産生の最終段階で可溶性ｒＨｕＰＨ２０の産生を著しく増強することが観察された。１４もしくは１５日で、または細胞の生存力が４０％未満に低下した時点で、リアクターを回収した。このプロセスの結果、ｍＬあたり１７，０００単位の最終生産性が得られ、１２００万個細胞／ｍＬの最大細胞密度を有していた。回収時に、培養物を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）および酵素活性によって、インビトロおよびインビボで、マイコプラズマ、バイオバーデン、エンドトキシンおよびウイルスについてサンプリングした。
【０４８７】
培養物は、蠕動ポンプによって、各々４〜８μｍに段階づけされた珪藻土の層および１．４〜１．１μｍに段階づけされた珪藻土の層と、それに続く、セルロースメンブレンを含有する、並行した、４つのＭｉｌｌｉｓｔａｋ濾過システムモジュール（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通って、次いで、０．４〜０．１１μｍに段階づけされた珪藻土の層および＜０．１μｍに段階づけされた珪藻土の層と、それに続く、セルロースメンブレンを含有する第２の単一Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ  濾過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通って、次いで、０．２２μｍの最終フィルターを通って、３５０Ｌの用量を有する滅菌単回使用フレキシブルバッグに、ポンプで送った。回収された細胞培養液に、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ  Ｔｒｉｓを補給し、７．５のｐＨとした。４つのＳａｒｔｏｓｌｉｃｅ  ＴＦＦ  ３０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ）を用いる、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）装置を用いて、培養物を１０×濃縮し、それに続いて、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、ｐＨ７．５を用いて１０×バッファー交換、０．２２μｍ最終フィルターに入れ、５０Ｌ滅菌保存バッグ中に入れた。
【０４８８】
濃縮され、ダイアフィルトレーションされた回収物をウイルスについて不活化した。ウイルス不活性化の前に、１０％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、３％  トリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）の溶液を調製した。濃縮され、ダイアフィルトレーションされた回収物を、３６Ｌガラス反応容器中で１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、０．３％  ＴＮＢＰに１時間曝露し、直後に、Ｑカラムで精製した。
【０４８９】
Ｄ．Ｇｅｎ２  可溶性ｒＨｕＰＨ２０の精製
Ｑセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）イオン交換カラム（９Ｌ樹脂、Ｈ＝２９ｃｍ、Ｄ＝２０ｃｍ）を調製した。ｐＨ、伝導率およびエンドトキシン（ＬＡＬアッセイ）を決定するために、洗浄サンプルを集めた。５カラム容積の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、ｐＨ７．５を用いてカラムを平衡化した。ウイルス不活性化後、濃縮され、ダイアフィルトレーションされた回収物を、１００ｃｍ／時間の流速でＱカラムにロードした。カラムを、５カラム容積の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、ｐＨ７．５および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いて洗浄した。１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いて、滅菌バッグ中の０．２２μｍ最終フィルター中にタンパク質を溶出した。溶出液サンプルをバイオバーデン、タンパク質濃度およびヒアルロニダーゼ活性について試験した。Ａ２８０吸光度読み取り値を、交換の最初と最後にとった。
【０４９０】
フェニル−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）疎水性相互作用クロマトグラフィーを次いで実施した。フェニル−セファロース（ＰＳ）カラム（１９−２１Ｌ樹脂、Ｈ＝２９ｃｍ、Ｄ＝３０ｍ）を調製した。洗浄物を回収し、ｐＨ、伝導率およびエンドトキシン（ＬＡＬアッセイ）のためにサンプリングした。５カラム容積の５ｍＭリン酸カリウム、０．５Ｍ硫酸アンモニウム、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を用いて、カラムを平衡化した。Ｑセファロースカラムからのタンパク質溶出液に、２Ｍ硫酸アンモニウム、１Ｍリン酸カリウムおよび１Ｍ  ＣａＣｌ２保存溶液を補給し、それぞれ、５ｍＭ、０．５Ｍおよび０．１ｍＭの終濃度とした。タンパク質を、１００ｃｍ／時間の流速でＰＳカラムにロードし、カラムフロースルーを集めた。カラムを、１００ｃｍ／時間で、５ｍＭリン酸カリウム、０．５Ｍ硫酸アンモニウムおよび０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ７．０を用いて洗浄し、洗浄物を、集められたフロースルーに加えた。カラム洗浄物と合わされたフロースルーを、０．２２μｍ最終フィルターに通して、滅菌バッグ中に入れた。フロースルーを、バイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性についてサンプリングした。
【０４９１】
アミノフェニルボロネートカラム（Ｐｒｏｍｅｔｉｃｓ）を調製した。洗浄物を集め、ｐＨ、伝導率およびエンドトキシン（ＬＡＬアッセイ）についてサンプリングした。５カラム容積の５ｍＭリン酸カリウム、０．５Ｍ硫酸アンモニウムを用いてカラムを平衡化した。精製タンパク質を含有するＰＳフロースルーを、アミノフェニルボロネートカラムに１００ｃｍ／時間の流速でロードした。５ｍＭリン酸カリウム、０．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０を用いてカラムを洗浄した。カラムを２０ｍＭビシン、０．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ９．０を用いて洗浄した。カラムを、２０ｍＭビシン、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ９．０を用いて洗浄した。タンパク質を５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．９を用いて溶出し、滅菌フィルターを通して、滅菌バッグ中に入れた。溶出したサンプルは、バイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性について試験した。
【０４９２】
ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）カラム（Ｂｉｏｒａｄ）を調製した。洗浄物を集め、ｐＨ、伝導率およびエンドトキシン（ＬＡＬアッセイ）について試験する。カラムを５ｍＭリン酸カリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を用いて平衡化した。アミノフェニルボロネート精製タンパク質を、５ｍＭリン酸カリウムおよび０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２の終濃度に補い、１００ｃｍ／時間の流速でＨＡＰカラムにロードした。カラムを、５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２を用いて洗浄した。次いで、カラムを、１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２を用いて洗浄した。タンパク質を、７０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０を用いて溶出し、０．２２μｍの滅菌フィルターを通して、滅菌バッグに入れた。溶出されたサンプルをバイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性について試験した。
【０４９３】
次いで、ＨＡＰ精製したタンパク質をウイルス除去フィルターに通した。滅菌２Ｌの７０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０を用いて洗浄することによって、Ｖｉｏｓａｒｔフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）をまず調製した。使用前に、ｐＨおよび伝導率のために濾過されたバッファーをサンプリングした。ＨＡＰ精製したタンパク質を、蠕動ポンプによって、ウイルス除去フィルターを通してポンプで送った。７０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０で濾過されたタンパク質を０．２２μｍの最終フィルターに通して、滅菌バッグ中に入れた。濾過されたサンプルを、タンパク質濃度、酵素活性、オリゴ糖、単糖およびシアル酸プロフィーリングについて試験した。サンプルはまた、不純物と関連するプロセスについて試験した。
【０４９４】
次いで、濾液中のタンパク質を、１０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｓｌｉｃｅタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。フィルターを、１０ｍＭヒスチジン、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０を用いて洗浄することによってまず調製した。透過物を、ｐＨおよび伝導率についてサンプリングした。濃縮後、濃縮されたタンパク質をサンプリングしタンパク質濃度および酵素活性について試験した。濃縮されたタンパク質で６×バッファー交換を実施し、最終バッファー：１０ｍＭヒスチジン、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０とした。バッファー交換後、濃縮されたタンパク質を、０．２２μｍフィルターに通して、２０Ｌ滅菌保存バッグ中に入れた。タンパク質をサンプリングし、タンパク質濃度、酵素活性、遊離スルフィドリル基、オリゴ糖プロファイリングおよび浸透圧について試験した。ロット番号ＷＲＳ２を、以下に記載されるアッセイにおいて標準として使用した。結果は、外観についての試験説明は、透明で、無色であり：ｐＨは、７．４であり；エンドトキシンレベルは＜０．０１ＥＵ／ｍＬであり；浸透圧は、３０ｍＯｓｍ／Ｋｇであり；密度が１．００５ｇ／ｍＬであり；ｒＨｕＰＨ２０含量は、１．３ｐｐｍであり；ヒアルロニダーゼ活性は、１４５ＵＳＰ  Ｕ／ｍＬであったと示した。
【０４９５】
滅菌濾過されたバルクタンパク質を、２０ｍＬで３０ｍＬ滅菌テフロン(登録商標)バイアル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に無菌的に（ａｓｃｅｐｔｉｃａｌｌｙ）分配した。次いで、バイアルを瞬間凍結し、−２０±５℃で保存した。
【０４９６】
実施例２
ＰＨ２０変異株ライブラリーの作製
Ａ．クローニングおよび突然変異誘発
この実施例では、ヒトＰＨ２０をコードするＤＮＡを、プラスミドにクローニングし、続いて、トランスフェクションし、タンパク質を発現させることによって、ヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０ライブラリーを作製した。
ライブラリーは、Ｉｇ  κリーダー配列を含まない、ＰＨ２０のコドン最適化されたものであるＰＨ２０鋳型の突然変異誘発によって作製した。具体的には、変異体のライブラリーを作製するために、ＨＺ２４−ＰＨ２０（ＯＨＯ）−ＩＲＥＳ−ＳＥＡＰ発現ベクター（配列番号４に示される）を鋳型として使用し、これは、配列番号１に示されるＰＨ２０をコードするヌクレオチドの配列を含有し、配列番号２に示される前駆体ＰＨ２０またはＩｇＫシグナル配列に対応する残基１〜２２を欠く配列番号３に示される成熟ＰＨ２０をコードする。ベクター骨格は、ＤＨＦＲ選択マーカーを含有する元のＨＺ２４ベクターから導き（実施例１および配列番号５を参照のこと）、ＩｇＫリーダー配列を加え、コドン最適化を行った。発現ベクターはまた、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の遺伝子を含有するよう修飾された。したがって、ＨＺ２４−ＰＨ２０（ＯＨＯ）−ＩＲＥＳ−ＳＥＡＰ発現ベクターは、ＰＨ２０をコードする配列に加えて、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の遺伝子のコード配列と連結している配列内リボソーム進入部位（ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ）およびコンストラクトにおいてＰＨ２０およびＳＥＡＰの発現を駆動する単一ＣＭＶプロモーターも含有する。また、アンピシリン耐性のための遺伝子も含有する。配列番号４に示されるヌクレオチドに関連して、ＰＨ２０をコードするヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド１０５８から２４６４に対応し（ＩｇＫリーダー配列を含む）、ＳＥＡＰをコードするヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド２９７０〜４５２９に対応し、アンピシリン耐性遺伝子は、ヌクレオチド５７７８〜６６３５に対応する。
【０４９７】
第１のライブラリーは、配列番号２の残基２３〜４６９（配列番号３の残基１〜４４７または配列番号６の残基３６〜４８２に対応する）の各々が、約１５種のアミノ酸残基のうち１種に変更され、その結果、各メンバーが単一のアミノ変更を含有する、コードされる変異体タンパク質が生じるよう作製した。得られたライブラリーは、各々が、配列番号２の残基２３〜４６９（配列番号３の残基１〜４４７または配列番号６表の残基３６〜４８２に対応する）と比較して、単一のアミノ酸突然変異を含有する、６７５３の変異体メンバーを含有する。得られたライブラリーのグリセロールストックを、調製し、−８０℃で保存した。各メンバー中のアミノ酸置換（ｍｕｔ）が、以下の表８に列挙されており、配列番号３（ＰＨ２０の成熟した配列またはその他のＣ末端で切断された断片である、配列番号７または３２〜６６）に示されるＰＨ２０のアミノ酸の配列に関連してアミノ酸置換に対応する。ライブラリー中の各ＰＨ２０変異体の対応する突然変異されたコドン（ｃｏｄ）もまた、表８に列挙されており、配列番号４の１０５８〜２４６４として示されるＰＨ２０の対応するコーディングヌクレオチド中のヌクレオチド残基変更にも対応する。各メンバーは、以下に記載されるようにヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｏｒｉｄａｓｅ）活性について表され、スクリーニングされた。
【０４９８】
【表８−１】
0006422933.tif 000017
【表８−２】
0006422933.tif 000018
【表８−３】
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【表８−４】
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【表８−５】
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【表８−６】
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【表８−７】
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【表８−８】
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【表８−９】
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【表８−１０】
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【表８−１１】
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【表８−１２】
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【表８−１３】
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【表８−１４】
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【表８−１５】
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【表８−１６】
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【表８−１７】
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【表８−１８】
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【表８−１９】
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【表８−２０】
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【表８−２１】
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【表８−２２】
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【表８−２３】
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【表８−２４】
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【表８−２５】
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【０４９９】
２．発現
各変異株の発現のために、変異体ＰＨ２０の１種をコードするか、または野生型ＰＨ２０をコードするｃＤＮＡを含有するＨＺ２４−ＰＨ２０−ＩＲＥＳ−ＳＥＡＰプラスミドＤＮＡを、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１６６８−０２７）を、製造業者によって示唆されるプロトコールに従って使用して、単層ＣＨＯ−Ｓ細胞（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１６１９−０１２）にトランスフェクトした。ＣＨＯ−Ｓ細胞は、トランスフェクションの前夜に播種し、１０％  ＦＢＳを有するＤＭＥＭ中で、翌日、８０％コンフルエントとなるまで増殖させた。次いで、ＣＨＯ−Ｓ細胞の培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭと交換した。プラスミドＤＮＡおよびリポフェクタミンの混合物を作製した（０．２μｇ  ＤＮＡおよび０．５μＬリポフェクタミン）。ＣＨＯ−Ｓ細胞にリポフェクタミン／ＤＮＡ混合物を加え、一晩インキュベートした。翌日、細胞にＣＤ−ＣＨＯ血清不含培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０７４３−０２９）を補給した。トランスフェクション後種々の時点、一般に、トランスフェクション後９６時間で、トランスフェクトされた細胞から上清を集めた。変異体ＰＨ２０タンパク質または配列番号３に示されるアミノ酸の配列を有する野生型ＰＨ２０を含有する上清を、−２０℃で保存した。上清の活性を、以下の実施例に記載されるようにスクリーニングした。
【０５００】
実施例３
活性な突然変異体を同定するための、ヒアルロニダーゼ活性測定法を用いるライブラリーのスクリーニング
この実施例では、各変異株の活性を評価するためにヒアルロニダーゼ活性測定法を使用して、実施例２において作製された発現されたＰＨ２０変異体の上清をスクリーニングした。さらに、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の活性も、測定して、発現された突然変異体のＰＨ２０活性の、ＰＨ２０野生型に対する標準化を可能にした。活性および不活性突然変異体が同定された。
【０５０１】
１．ビオチン化ＨＡ（ｂＨＡ）基質の作製
１．２−ＭＤａ  ＨＡ（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ）を、ヒアルロニダーゼ活性測定法において基質として使用するためにビオチン化した。まず、１．２グラム（ｇ）の１．２ＭＤａ  ＨＡを４℃で６００ｍＬのｄｄＨ２０に、２ｍｇ／ｍＬの濃度で、撹拌しながら１週間溶解した。次いで、６４５．７１ｍｇのビオチンヒドラジドを、１００ｍＬのＤＭＳＯに、２５ｍＭ（６．４５８ｍｇ／ｍＬ、３８．３７ｍＬ  ＤＭＳ  中、２４７．８ｍｇ）の濃度で溶解した。ビオチン溶液を３７℃で、溶液が透明になるまで短時間加温した。また、２０ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏ中、３６８．６１ｍｇ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳを溶解して、１００Ｘ溶液（１８．４ｍｇ／ｍＬ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）を作製した。３ｍＬのｄｄＨ２０に１７．６３ｍｇ  ＥＤＣを、反応が開始した直前に５．７５１３ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解することによって、３０ｍＭ（１０００Ｘ）水溶性カルボジイミドＥＤＣ溶液を作製した。
【０５０２】
４本の１０００ｍＬ滅菌キャップ付きボトルに、室温（ＲＴ）で、以下の成分を、撹拌しながら以下の順序で加えた：１）２００ｍＬの２ｍｇ／ｍＬ  ＨＡ溶液；穏やかに混合しながら、２）８０ｍＬの０．５Ｍ  ＭＥＳ、ｐＨ５．０；および穏やかに混合しながら、３）９１．６ｍＬのｄｄＨ２０。次いで、２４ｍＬの２５ｍＭビオチン−ヒドラジドおよび４ｍＬの１００Ｘ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ溶液を逐次加え、直後に５００μＬのＥＤＣを加えた。各成分を加えた後、３回反転させることによって溶液を混合し、撹拌した。最後の成分を加えた後、溶液を４℃で一晩撹拌することによって混合した。次いで、グアニジン塩酸塩を、１００ｍＬあたり３８．２ｇを加えることによって４Ｍの終濃度に加え、完全に溶解させ、その後、溶液容量をｄｄＨ２Ｏを用いて６００ｍＬに調整した。
【０５０３】
透析のために、コンジュゲートしているＨＡグアニジン塩酸塩溶液の各バッチから２００ｍＬを、透析膜中に移した。３日にわたって、溶液をｄｄＨ２Ｏに対して透析し、ｄｄＨ２Ｏで少なくとも６回変更した。約８４０ｍＬの得られた容量をｄｄＨ２Ｏを用いて、１０００ｍＬの最終容量に調整した。ビオチン化ヒアルロナン（ｂＨＡ）の終濃度は、０．４ｍｇ／ｍＬとした。
【０５０４】
２．ヒアルロニダーゼ活性測定法
酵素アッセイは、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ活性の尺度を提供する、Frost et al. (1997) (A Microtiter-Based Assay for Hyauronidase Activity Not Requiring Specialized Reagents. Analytical Biochemistry (1997) 251:263-269)に記載される方法の修飾とした。
【０５０５】
第１に、ビオチン化ＨＡ（ｂＨＡ）基質を、プラスチックマイクロタイタープレートと結合させて、アッセイプレートを作製した。手短には、０．５Ｍカルボネートバッファー（ｐＨ９．６）中、１ｍｇ／ｍＬのｂ−ＨＡ  １００μｌを、ハイバインドマイクロプレート（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ  ４  ＨＢＸ  ｅｘｔｒａ  ｈｉｇｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに分配した。プレートをプレートシーラーで覆い、２〜８℃で２４〜４８時間保存した。
【０５０６】
次いで、アッセイプレートを、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）を含有する１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）洗浄バッファーを用いて洗浄した。ＰＢＳＴは、１×ＰＢＳ（カタログ番号Ｐ５３６８、Ｓｉｇｍａ（１０ｍＭリン酸バッファー、２．７ｍＭ塩化カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）から、ＰＢＳの１つのパケットの内容物を、８００ｍＬの脱イオン水を入れた１Ｌのメスシリンダー中に入れ、撹拌または振盪し、１Ｌまでの十分な量の水を加えることによって溶解して作製した）から、１×ＰＢＳ  ９００ｍＬに５００μｌのＴｗｅｅｎ  ２０（カタログ番号６５０５；ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を加え、１Ｌまでの十分な量の水を加えることによって作製した。洗浄は、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬｘ４０５  Ｓｅｌｅｃｔ  ＣＷプレートウォッシャー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用し、各洗浄に、ウェルあたり３００μｌのＰＢＳＴ洗浄バッファーを用いて５回洗浄することによって行った。各洗浄の最後に、プレートをペーパータオルの上で指でたたいて、各ウェルから過剰の液体を除去した。サンプルととものインキュベーションの前に、各ウェルに２００μｌブロッキングバッファー（ＰＢＳ中、１．０％ｗ／ｖウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を加え、アッセイプレートを３７℃で事前におよそ１時間にインキュベートした。ブロッキングバッファーは、２００ｍＬ  １×ＰＢＳに、撹拌しながら、２．５ｇのＢＳＡ（カタログ番号００１−０００−１６２；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を加え、２５０ｍＬまで１×ＰＢＳの十分な量を加えることおよび０．２μＭ  ＰＥＳフィルターユニットを通して濾過することによって作製した。
【０５０７】
実施例１に記載の通り作製されたトランスフェクトされた変異体または野生型ＰＨ２０上清を、コーティングされていない４ＸＨＢハイバウンドマイクロプレートにおいて、２連で、アッセイ希釈バッファー（ｐＨ７．４  ＨＥＰＥＳ  バッファー；１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１：２５希釈した。標準曲線のために、ｒＨｕＰＨ２０の１：３段階希釈（１４５Ｕ／ｍＬの比活性を有する実施例１に記載の通り作製した）を、２連で、アッセイ希釈バッファーで、標準の３Ｕ／ｍＬから出発して、以下の通り：３Ｕ／ｍＬ、１Ｕ／ｍＬ、１／３Ｕ／ｍＬ、１／９Ｕ／ｍＬ、１／２７Ｕ／ｍＬ、１／８１Ｕ／ｍＬおよび１／２４３Ｕ／ｍＬに作製した。１００マイクロリットル（１００μｌ）の各標準およびサンプルを、アッセイプレートに移し、３７℃でおよそ１．５時間インキュベートした。
【０５０８】
インキュベートした後、プレートを、ＰＢＳＴを用い、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬｘ４０５  Ｓｅｌｅｃｔ  ＣＷプレートウォッシャーを使用し、各洗浄に、ウェルあたり３００μｌのＰＢＳＴ洗浄バッファーを用いて５回洗浄した。各洗浄の最後に、プレートをペーパータオルの上で指でたたいて、各ウェルから過剰の液体を除去した。次いで、プレートの各ウェルに、１００μｌの１：５０００希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＳＡ−ＨＲＰ）を加え、周囲温度でおよそ１時間インキュベートした。希釈のために、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（カタログ番号２１１２６；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１ｍｇ／ｍＬのストックを、希釈バッファー（１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５）で１：５０００希釈した。インキュベートした後、プレートを、ＰＢＳＴを用い、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬｘ４０５  Ｓｅｌｅｃｔ  ＣＷプレートウォッシャーを使用して、各洗浄のためにウェルあたり３００μｌのＰＢＳＴ洗浄バッファーを用いて５回洗浄した。各洗浄の最後に、プレートを、ペーパータオルの上で指でたたいて、各ウェルから過剰の液体を除去した。次いで、１００μｌのＴＭＢ溶液（カタログ番号５２−００−０３、ＫＰＬ；周囲温度および光からの保護）を各ウェルに、室温でおよそ５分間、または最適な色の発色が得られるまで加えた。反応を停止するために、１００μｌの１．０Ｎ硫酸またはＴＭＢ停止溶液（カタログ番号５０−８５−０６）を各ウェルに加え、プレートを指でたたいて混合した。停止溶液を加えた３０分以内に４５０ｎｍで光学濃度を測定した。標準またはサンプル中に多くのＰＨ２０があるほど、少ない、ＳＡ−ＨＲＰを結合するのに利用可能なｂＨＡにつながるので、光学濃度（４５０ｎｍ）値は、各試料におけるヒアルロニダーゼ活性の濃度に反比例した。
【０５０９】
３．ＳＥＡＰ活性
細胞培養上清における分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の活性を、ホスファターゼ基質としてｐＮＰＰを使用し、胎盤アルカリホスファターゼの比色アッセイを（Ａｎａｓｐｅｃ  ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ  ｐＮＰＰ  ＳＥＡＰキット；カタログ番号７２１４４、Ａｎａｓｐｅｃ）、製造業者の使用説明書に従って使用して測定した。吸光度シグナルは、４０５ｎｍの光学濃度（ＯＤ）で測定した。
【０５１０】
ハイスループット（ＨＴＰ）スクリーニングの判定基準は、トランスフェクトされた上清が≧０．１のＳＥＡＰシグナルをもたらし、ｒＨｕＰＨ２０野生型対照のシグナルが≧１Ｕ／ｍＬのシグナルをもたらすということとした。また、各スクリーニングの判定基準は、標準曲線が、≧５の、ＯＤ４０５での０Ｕ／ｍＬ標準対３ｕ／ｍＬ標準のシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を有し、≧１０％の変動係数（ＣＶ）を有する３未満の標準を有し、少なくとも４の標準が直線範囲にあるということとした。
【０５１１】
実施例４
ヒアルロニダーゼ活性の変更された選択されたＰＨ２０変異体
各作製された変異体を、実施例３に記載されるようにヒアルロニダーゼ活性についてスクリーニングした。ＳＥＡＰ発現を使用して、各変異体のＰＨ２０活性をＰＨ２０野生型に対して正規化した。野生型と比較して変更されたヒアルロニダーゼ活性を示した突然変異体を同定した。
【０５１２】
１．活性突然変異体
少なくとも１つの二連サンプルが、ＳＥＡＰ活性に対して正規化された場合に野生型活性の４０％超を示した活性突然変異体を選択した。同定された活性突然変異体は、表９に示されている。表は、配列番号３に示されるＰＨ２０のアミノ酸の配列と比較した、アミノ酸置換を示す。例示的突然変異体のアミノ酸配列も、配列番号に対する参照によって示されている。表はまた、その自身のＳＥＡＰ値によって同様に正規化された、各プレートにおける野生型ＰＨ２０活性の平均と比較された、ＳＥＡＰ値によって正規化された、試験された二連の平均ヒアルロニダーゼ活性を示す。例えば、０．４０の値は、変異体が、野生型ＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性の４０％を示すことを示し、１の値は、変異体が、野生型の同様のヒアルロニダーゼ活性を示すことを示し、３．００の値は、変異体が、野生型ＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性の３００％または野生型と比較して３倍増大した活性を示すことを示す。
【０５１３】
表９の結果は、６００を超える試験された突然変異体が、野生型と比較して増大している活性を示すことを示す。例えば、約５３６種の突然変異体は、野生型ＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性の１２０％以上を示し、約７５種の突然変異体が、野生型ＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性の３００％以上を示す。特に、表９における結果は、変異株Ｓ６９Ａの野生型と比較したヒアルロニダーゼ活性が、約２２倍であり；変異株Ｓ６９Ｒが、約１４倍であり；変異株Ｉ７０Ａが、約２７倍であり；変異株Ｉ７０Ｋが、約１４倍であり；変異株Ｉ７０Ｒが約１４倍であり；変異株Ｉ２７１Ｌが約１０倍であることを示す。
【０５１４】
【表９−１】
0006422933.tif 000042
【表９−２】
0006422933.tif 000043
【表９−３】
0006422933.tif 000044
【表９−４】
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【表９−５】
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【表９−６】
0006422933.tif 000047
【表９−７】
0006422933.tif 000048
【表９−８】
0006422933.tif 000049
【表９−９】
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【表９−１０】
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【表９−１１】
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【表９−１２】
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【表９−１３】
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【表９−１４】
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【表９−１５】
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【表９−１６】
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【表９−１７】
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【表９−１８】
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【表９−１９】
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【表９−２０】
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【０５１５】
２．不活性突然変異体
二連のうち少なくとも一方において、野生型ＰＨ２０の２０％未満のヒアルロニダーゼ活性を示すその他の突然変異体を、再スクリーニングして、死滅した突然変異体が不活性であることを確認した。不活性突然変異体を確認するために、実施例３に記載されたヒアルロニダーゼ活性測定法を、酵素活性の測定の前に、一晩の３７℃での基質−サンプルインキュベーション工程を組み込むよう修飾した。修飾アッセイは、０．２Ｕ／ｍＬ未満のＰＨ２０活性を検出するよう意図される。
【０５１６】
トランスフェクトされた変異体上清または野生型ＰＨ２０の添加に先立つ、ｂＨＡでコーティングされたプレートの調製およびプレートのブロッキングは、実施例３に記載されるものと同一とした。アッセイは、以下の通りに修飾した。まず、実施例２に記載されたように作製された、トランスフェクトされた変異体上清または突然変異を含有しない野生型ＰＨ２０を、二連で、アッセイ希釈液で１：２５希釈した。標準曲線のために、０．１Ｕ／ｍＬから出発して、０．０００１４Ｕ／ｍＬまで下がる、ｒＨｕＰＨ２０の１：３段階希釈（実施例１に記載されるように作製された）を二連で、アッセイ希釈液で作製した。ブランクウェルもインキュベートした。次いで、ｂＨＡコーティングされたプレートおよびブロッキングされたプレートの予め設計されたウェルに、希釈されたサンプルまたは標準１００μｌを加え、３７℃で一晩インキュベートさせた。インキュベートした後、プレートを洗浄し、上記の実施例３に記載されるようにｂＨＡとの結合を検出した。停止溶液を加えた３０分以内に４５０ｎｍで光学濃度を測定した。
【０５１７】
同定され再確認された不活性突然変異体が、表１０に示されている。表は、配列番号３に示されるＰＨ２０のアミノ酸の配列と比較したアミノ酸置換を示す。
【０５１８】
【表１０−１】
0006422933.tif 000062
【表１０−２】
0006422933.tif 000063
【表１０−３】
0006422933.tif 000064
【表１０−４】
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【表１０−５】
0006422933.tif 000066
【表１０−６】
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【表１０−７】
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【表１０−８】
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【表１０−９】
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【表１０−１０】
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【０５１９】
実施例５
温度およびフェノール親和性（ＰＨＥＮＯＰＨＩＬＩＣ）条件下でのヒアルロニダーゼ活性のアッセイ
実施例４において同定されるような、表９に示されるＰＨ２０活性変異体から得た上清を、好熱性および／またはフェノール親和性（ｐｈｅｎｏｐｈｉｌｉｃ）条件下での安定性について試験した。ヒアルロニダーゼ活性を測定するための基質としてビオチン化ＨＡ（ｂＨＡ）を使用する、温度およびフェノール親和性（ｐｈｅｎｏｐｈｉｌｅ）条件下でのヒアルロニダーゼ活性を測定するアッセイは、酵素活性の測定の前に４時間の、３７℃での、ｍ−クレゾールを伴うか伴わないサンプルのインキュベーションを組み込むという点で、実施例３に記載される元のアッセイから修飾された。アッセイは、好熱特性（３７℃条件での４℃でより大きい活性）を有する、および／またはフェノール親和性特性（野生型ＰＨ２０よりもｍ−クレゾールの存在下で大きい活性）を有するＰＨ２０突然変異体を同定するために使用された。
【０５２０】
一次スクリーニング
ｂＨＡとともにサンプルをインキュベートする前に、変異体ＰＨ２０サンプルを、以下の条件下で、３７℃で４時間のプレインキュベーションのためにコーティングされていない４ＸＨＢプレートの設計されたウェル中に希釈した：１）０．４％ｍ−クレゾールとともに３７℃でのプレインキュベーション；および２）０．４％ｍ−クレゾールを伴わない３７℃でのプレインキュベーション。０．４％ｍ−クレゾールを伴う３７℃でのプレインキュベーションのために、１％ｍ−クレゾール中間体ストックを、５０％（ｖ／ｖ）ｍ−クレゾール保存溶液から調製した。手短には、２ｍＬ  Ｗｈｅａｔｏｎガラスバイアル中で、ｍ−クレゾール（Ｆｌｕｋａ、カタログ番号６５９９６；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、カタログ番号Ｃ２７７３）の５０％ストックを、密度（Ｄ＝１．０３４ｇ／Ｌ）に基づいて、メタノールで作製した。バイアルを密閉し、光から保護しながら小さいアリコートで−２０℃で保存した。次いで、毎日、使用の直前に、ドラフト中で、ボルテックス処理し、ＨＥＰＥＳアッセイバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で希釈することによって、１％中間体ストックを作製した。
【０５２１】
次いで、実施例２において上記のように作製された、表９に示されるトランスフェクトされた変異体上清サンプルの二連を、ＨＥＰＥＳアッセイバッファー／トランスフェクトされた上清での１％ｍ−クレゾールの１：２．５希釈に各々別個に付し、０．４％の最終濃度のｍ−クレゾールを得た。０．４％ｍ−クレゾールを伴わない３７℃でのプレインキュベーションのために、トランスフェクトされた変異体上清サンプルを、ＨＥＰＥＳアッセイバッファー／トランスフェクトされた上清での１：２．５希釈に付した。さらに、各条件について、トランスフェクトされたサンプルについて上記と同様に希釈された（実施例１に記載されるように作製した）、ｐＨ７．４  ＨＥＰＥＳバッファーでのｒＨｕＰＨ２０の３Ｕ／ｍＬで添加することによって内部死滅制御も試験した。プレートをプレートシーラーを用いて密閉し、３７℃で４時間インキュベートした。
【０５２２】
トランスフェクトされた変異体上清または野生型ＰＨ２０の添加に先立つ、ｂＨＡでコーティングされたプレートの調製およびプレートのブロッキングは、実施例３に記載したものと同一であった。アッセイは、以下の通りにさらに修飾された。まず、サンプルを、４ＸＨＢプレートにおいて、二連で、ＨＥＰＥＳアッセイバッファーで１：１０希釈した。各変異体について、試験サンプルされたサンプルは、１）プレインキュベートされていない、トランスフェクトされた変異体上清（インキュベーションなし；４℃）；２）０．４％ｍ−クレゾールとともに３７℃で４時間プレインキュベートされた、プレインキュベートされ、トランスフェクトされた変異体上清（クレゾール）；または３）０．４％ｍ−クレゾールを伴わずに３７℃で４時間プレインキュベートされた、プレインキュベートされ、トランスフェクトされた変異体上清（クレゾールなし；３７℃）とした。さらに、添加されたサンプルも試験した。ｍ−クレゾールを用いずに、実施例３に記載されるように、ｒＨｕＰＨ２０を使用して標準曲線を作製した。各標準およびサンプルの１００マイクロリットル（１００μｌ）を、ｂＨＡコーティングされたプレートおよびブロッキングされたプレートの予め設計されたウェルに移し、３７℃でおよそ１．５時間インキュベートした。したがって、プレインキュベーション工程における、各トランスフェクトされた変異体上清の二連のサンプルのプレインキュベーションおよびｂＨＡアッセイにおける各サンプルのさらなる二連のために、各変異体の各サンプルを四連で試験した。
【０５２３】
インキュベートした後、実施例３において上記のように、プレートを洗浄し、ｂＨＡとの結合を検出した。停止溶液を添加した３０分以内に、４５０ｎｍでの光学濃度を測定した。
【０５２４】
標準曲線からＵ／ｍＬ活性を算出し、比較した。結果は、以下のパラメータの各々の下で残存するパーセント（％）活性として表された：１）ｍ−クレゾール／４℃を伴わない、３７℃プレインキュベーション；２）ｍ−クレゾール／４℃を伴う３７℃でのプレインキュベーション後；および３）ｍ−クレゾールを伴う３７℃でのプレインキュベーション後／ｍ−クレゾールを伴わない３７℃でのプレインキュベーション後での活性の比。再確認のために最初のフェノール親和性（ｐｈｅｎｏｐｈｉｌｅ）ヒットを、二連でアッセイが、条件３）下で、３７℃での元の活性の≧２０％の残存する活性のパーセンテージを示したものとして同定した。
【０５２５】
最初のヒットを、６ウェルプレート再スクリニングアッセイを使用して再スクリーニングした。再スクリーニングのために、可能性あるヒットに対応するプラスミドＤＮＡを、大腸菌細菌に移し、ＭａｘｉＰｒｅｐを製造業者の使用説明書に従って、プラスミドＤＮＡを調製し、精製した。ＤＮＡ配列を確認した。
【０５２６】
プラスミドＤＮＡを、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１６６８−０２７）を製造業者によって示唆されるプロトコールに従って使用して、約５０〜８０％コンフルエンシーの密度で６ウェルプレートで増殖させた単層ＣＨＯ−Ｓ細胞（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１６１９−０１２）にトランスフェクトした。トランスフェクションは二連で実施した。細胞を、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で、トランスフェクション後、アッセイのための上清の収集の前に９６時間インキュベートした。対照として、細胞をまた、コドン最適化された野生型ＰＨ２０配列（ＯＨＯ）を含有する、ＨＺ２４−ＰＨ２０（ＯＨＯ）−ＩＲＥＳ−ＳＥＡＰ発現ベクター（配列番号４）を用いてトランスフェクトした。対照としてニセ細胞をインキュベートした。
【０５２７】
トランスフェクションの９６時間後、ＯＨＯおよびニセ対照を含めた各サンプルから上清を集め、上記の種々の条件下でヒアルロニダーゼ活性をアッセイした：１）プレインキュベートされていない、トランスフェクトされた変異体上清（インキュベーションなし；４℃）；２）０．４％ｍ−クレゾールとともに３７℃で４時間プレインキュベートされた、プレインキュベートされ、トランスフェクトされた変異体上清（クレゾール；３７℃）；または３）０．４％ｍ−クレゾールを伴わずに３７℃で４時間プレインキュベートされた、プレインキュベートされ、トランスフェクトされた変異体上清（クレゾールなし；３７℃）。ヒアルロニダーゼ活性は、ｂＨＡアッセイを使用して、上記のように決定した。
【０５２８】
結果は、上記のように評価した。絶対ヒアルロニダーゼ活性（Ｕ／ｍＬ）は、標準曲線から作製した。さらに、パーセント活性は、３７℃／４℃、３７℃およびｍ−クレゾール／４℃ならびに３７℃およびｍ−クレゾール／３７℃の活性の比として決定した。結果は、以下の表１１および１２に示されている。
【０５２９】
【表１１−１】
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【表１１−２】
0006422933.tif 000073
【表１１−３】
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【表１１−４】
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【表１１−５】
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【表１１−６】
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【表１１−７】
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【表１１−８】
0006422933.tif 000079
【表１１−９】
0006422933.tif 000080
【０５３０】
【表１２−１】
0006422933.tif 000081
【表１２−２】
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【表１２−３】
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【表１２−４】
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【表１２−５】
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【表１２−６】
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【表１２−７】
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【表１２−８】
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【表１２−９】
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【０５３１】
２．Ｆ２０４Ｐの結果のまとめ
変異株Ｆ２０４Ｐについて、ｂＨＡ酵素活性測定法においてｍ−クレゾールの存在下でインキュベートされたＣＨＯ−Ｓ細胞の一時的トランスフェクションから得られた試験された上清の上記の結果は、Ｆ２０４Ｐ突然変異体タンパク質が、０．４％ｍ−クレゾール処理に対して高度に耐性であったことを示した。結果は、３７℃で０．４％ｍ−クレゾールとともに４時間インキュベートした後に残存した活性が、酵素が、ｍ−クレゾールの不在下で４℃または３７℃のいずれかでインキュベートされた場合に観察された活性にほぼ等しいことを示した。陽性対照（ＷＴ  ＰＨ２０−ＯＨＯ）は、アッセイの当日に７５％および８３％の活性の低下を示した（２つの異なるＯＨＯトランスフェクションからアッセイされるように）。これは、Ｆ２０４Ｐフェノール親和性（ｐｈｅｎｏｐｈｉｌｅ）が、野生型ＰＨ２０対照酵素の残存活性を上回る、その活性の６０％〜９０％またはそれ以上を保持できることを実証した。
【０５３２】
ｍ−クレゾール処理または高温に対する曝露の際のＦ２０４Ｐの安定性を確認するために、Ｆ２０４Ｐの第２のトランスフェクションをＣＨＯ−Ｓ細胞を使用して二連で実施し、清澄化した上清を、４℃での、３７℃で０．４％ｍ−クレゾールとともの４時間および３７℃で０．４％ｍ−クレゾールを伴わない４時間のその安定性について再度試験した。結果から、Ｆ２０４Ｐ突然変異体酵素は、ｍ−クレゾール中、３７℃で４時間インキュベートした後に、多量のヒアルロニダーゼ活性を保持したことが確認された。結果は、突然変異体の第１のスクリーニングにおいて見られた結果と同様であり、Ｆ２０４Ｐは、４時間インキュベーションした後に、野生型ＰＨ２０対照酵素の残存活性を上回る、その活性の５７％から９０％を超えるどこかを保持していた。
【０５３３】
野生型対照と比較したＦ２０４Ｐの酵素活性のまとめが、表１３に示されている。
【０５３４】
【表１３】
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【０５３５】
実施例６
ＰＨ２０  ＨＩＴ変異体の大規模発現および精製
１．発現および精製
変異体ＰＨ２０の１種をコードするｃＤＮＡを含有するＨＺ２４−ＰＨ２０−ＩＲＥＳ−ＳＥＡＰプラスミドＤＮＡを、全般的に実施例２に記載されるように、単層ＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトした。ＣＨＯ−Ｓ細胞を、ＧｌｕｔａＭＡＸ（８ｍＭ）を補給したＣＤ−ＣＨＯ培地を使用してシェーカーフラスコ中で培養した。トランスフェクションの当日、およそ１．０×１０６個細胞／ｍＬの密度でＣＨＯ−Ｓ細胞を含有するおよそ３００ｍＬの容量の１５本のフラスコを準備した。３００ｍＬのフラスコを各々、３７５μＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ＭＡＸトランスフェクション試薬と組み合わせた３７５μｇのＦ２０４Ｐ突然変異体をコードするプラスミドＤＮＡを使用してトランスフェクトした。トランスフェクトされたプラスミドＤＮＡは、ヌクレオチド位置１７３３〜１７３５でＴＴＣのＣＣＴへのコドン変更を含有し、それによってＦ２０４Ｐ突然変異体をコードする配列番号４に示されるヌクレオチドの配列を有していた。次いで、トランスフェクトされた細胞を９６時間培養中にし、そこで、細胞および培地を回収し、プールした。細胞を遠心分離（４０００×ｇ、２０秒）によってペレットにし、上清をＦ２０４Ｐタンパク質の精製のために保持した（およそ４．５リットル）。
【０５３６】
粗上清を、３０ｋＤａのタンジェンシャルフローフィルター（ＴＦＦ）システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ、Ｂｉｍａｘ  ３０、２００ｍＬボイド容量；５０ｃｍ２フィルター表面積）を使用し、容量がおよそ４５０ｍＬとなるまで１０×濃縮した。透過物を、Ｆ２０４Ｐタンパク質のフロースルーを検出するアッセイのために保存した。次いで、４リットルのバッファー（１０ｍＭ  ＮａＰＯ４；２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を使用して保持液のフリーフローバッファー交換を実施した。保持液の容量を、およそ２００ｍＬに再度低減し、次いで、システム中の残存する透過物をパージし（ボイド容量約２００ｍＬ）、およそ５０ｍＬのバッファーを使用してシステムをフラッシュし、およそ４５０ｍＬの最終濃縮生成物を得た。
【０５３７】
抗ｒＨｕＰＨ２０親和性カラムを、抗原親和性精製したウサギ抗ｒＨｕＰＨ２０  ＩｇＧを、ＣＮＢｒ活性化セファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  （ＧＥＨｅａｌｔｈカタログ番号１７−０９８１−０１）にカップリングすることによって調製した。手短には、０．７ｇの予備活性化セファロース４粉末を、１０ｍＬガラスカラム中で１ｍＭ  ＨＣｌに３０分間懸濁し、粉末を膨潤させた。カラムから溶液を流し出し、１５ゲル容積（約３０ｍＬ）の冷１ｍＭ  ＨＣｌを用いて重力によって洗浄した。５ゲル容積のカップリングバッファー（ｐＨ８．３の０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）を用いてカラムを洗浄した。次いで、カップリングバッファー中、＞１．０ｍｇ／ｍＬの、５ｍｇのウサギ抗ｒＨｕＰＨ２０  ＩｇＧを、２〜３ｍｇ／ゲル１ｍＬのタンパク質／ゲル比でカラムに加えた。カラムを４℃で一晩ぐるぐる回転させた。カップリング効率決定のためにフロースルーを集めた。ゲルを、２ゲル容積のカップリングバッファーを用いて洗浄し、次いで、１Ｍエタノールアミニン（ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｉｎｅ）ｐＨ９．５で洗浄し、室温で２時間再懸濁し、使用されていない活性化部位をブロックした。ゲルを、洗浄あたり、５ゲル容積の代替カップリングバッファーおよび０．１  ＮａＡｃ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５を用いて６回洗浄した。次いで、ゲルを１０ゲル容積のＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて洗浄した。カップリング効率を決定した（１−カップリング後タンパク質濃度／カプリング前タンパク質濃度×１００％）。抗体がカップリングしたゲルは、４℃で０．０２％ＮａＮ３を有するＴＢＳ中で保存した。
【０５３８】
続いて、濃縮上清生成物を、５ｍＬ／分のおおよその速度で抗ｒＨｕＰＨ２０親和性カラムにロードした。溶出は、ＧＥ（商標）ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ精製システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、製品番号１８−１９００−２６）を使用し、標準手順に従って実施し、それによって、タンパク質を低ｐＨグリシン洗浄（０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５）によって、１ｍＬの画分で溶出した。各画分を、１００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５の添加によって直ちに中和した。
【０５３９】
溶出したタンパク質を、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  勾配Ｔｒｉｓ−グリシンゲルでタンパク質バンドを分離することによってアッセイした。ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２  Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ  ＭＷ標準（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号ＬＣ５９２５）を、分子量標準として使用し、５０ｎｇのｒＨｕＰＨ２０（実施例１に記載されるように）陽性対照として使用した。各画分からの総タンパク質を示すために、ポリアクリルアミドゲルをＩｎｓｔａｎｔ  Ｂｌｕｅを用いて染色した。ゲル上のバンドがＰＨ２０であることを確認するために、ゲルをＰＶＤＦメンブレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスファーし、これを、ｒＨｕＰＨ２０を用いてウサギを免疫処置することによって作製したウサギ抗ＰＨ２０一次抗体およびＨＲＰ−ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号ＤＣ０３Ｌ）を使用するウエスタンブロットに付した。
【０５４０】
次いで、親和性カラムの低い能力のために、親和性カラムの最初のローディングから得たフロースルーを、カラムに２回再ロードした。次いで、タンパク質を含有するすべての画分を合わせ、その結果、およそ１３ｍＬである総容量となった。次いで、この生成物を、１５ｍＬの能力を有するＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセットＧ２（２０，０００  ＭＷＣＯ）を使用し、４リットルのバッファー（１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に対して一晩透析した。次いで、バッファーを変更し、生成物を、第２の新鮮な４リットルの同一バッファーに対して透析した。次いで、Ｆ２０４Ｐタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心分離カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；１０，０００  ＭＷＣＯ）を使用して濃縮し、およそ４５０μＬの最終容量とした（４０００ｘｇで１０分）。
【０５４１】
２．タンパク質の特性決定
精製タンパク質を、そのタンパク質濃度、活性および純度について特性決定した。
【０５４２】
精製タンパク質のタンパク質濃度を決定するために、実施例７に記載されるように定量ＥＬＩＳＡを実施した。また、ヒアルロニダーゼ活性を、実施例３に記載されるように決定した。遠心分離後のタンパク質濃度を、およそ４００μｇ／ｍＬであると推定した。精製タンパク質をまた、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配Ｔｒｉｓ−グリシンゲルで分離し、これを、次いで、Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｂｌｕｅを用いて染色した。染色結果は、タンパク質が、ｒＨｕＰＨ２０対照と同様のおよそ６３ｋＤａの本質的に単一分子量タンパク質であることを実証した。この方法によって、かなり分解性の生成物は検出されなかった。種々の時点でのタンパク質のおよその収率および精製の間の活性が、表１４に記載されている。
【０５４３】
【表１４】
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【０５４４】
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって精製タンパク質の純度を決定した。逆相カラムからの溶出時間は、組換えヒトヒアルロニダーゼ（ＨＵＢ）を用いて観察されたものと本質的に同一であリ、およそ８０〜９０％のサンプルの純度の粗推定の基礎を提供する。
【０５４５】
実施例７
ＥＬＩＳＡを使用する定量化
モノクローナル抗ｒＨｕＰＨ２０捕獲抗体を使用して、タンパク質を捕獲するＥＬＩＳＡを使用して、ＰＨ２０または変異体の定量化を実施した。具体的には、ＥＬＩＳＡを実施する１日前に、９６ウェル４ＨＢＸプレートを、捕獲抗体（ウサギをｒＨｕＰＨ２０；１ｍｇ／ｍＬストックを用いて免疫処置することによって作製したプロテインＧ精製ウサギポリクローナル抗ＰＨ２０抗体）を１００ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．２）中、１μｇ／ｍＬで、ウェルあたり１００μＬの総容量で用いてコーティングした。プレートは、４℃で一晩保存した。翌日、プレートをプレートウォッシャーを用い、１ｘＰＢＳを、３００μＬ／ウェルで用いて５回洗浄した。各洗浄後、プレートをペーパータオル上でパットドライした。次いで、プレートを、ウェルあたり、Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ（１ｘＰＢＳＴ）  ２００μＬを用いて室温で１時間ブロッキングした。
【０５４６】
プレートに標準およびサンプルを加えた。標準を作製するために、ｒＨｕＰＨ２０の１ｍｇ／ｍＬストック（実施例１）を、ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４アッセイバッファーで、中間ストックとして５０μｇ／ｍＬに新たに希釈した。次いで、標準のために、５０μｇ／ｍＬストックを二連で、第１の標準のために、３００ｎｇ／ｍＬの０．５ｘＰＢＳＴ  ３６０μＬに希釈した（第１の列）。その他の標準列のために、２４０μＬの０．５ｘＰＢＳＴを、各ウェルに加え、１：３段階希釈を行った。トランスフェクトされた上清サンプルのために、ウェルあたり３６０μＬを、二連で第１の列に加え、各々を同様に上記のように、０．５×ＰＢＳＴに段階希釈した。精製サンプルのために、ウェルあたり１００μＬを加えた。プレートを室温で２時間インキュベートした。インキュベートした後、プレートを、プレートウォッシャーを使用し、１ｘＰＢＳＴを３００μＬ／ウェルで用いて５回洗浄した。各洗浄後、プレートをペーパータオル上でパットドライした。
【０５４７】
ＨＲＰコンジュゲーションキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号３１４８９）を使用する検出のために、ＨＲＰがコンジュゲートしている抗ＰＨ２０抗体を調製した。ウサギをｒＨｕＰＨ２０を用いて免疫処置することによって作製した１ｍｇのプロテインＧ精製ウサギポリクローナル抗体を、１ｍＬ  ＰＢＳおよび２ｘカルボネートキットバッファーの１ｍＬで希釈した。次いで、上記の抗体溶液１ｍＬに、１００μＬのペルオキシダーゼを加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、ドラフト中で１０μＬ  ＮａＢＨ４ストックを加え、サンプルを室温で２０分間インキュベートした。反応をクエンチするために２０μＬのエタノールアミンを加え、室温で１５分間インキュベートした。これに、１／２５容量の５％ヒト血清アルブミン（０．１ｍＬシリンジ）を加え、２ｍｇ／ｍＬアルブミンストック反応物を得た。２５０μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４を添加することによって、ｐＨを約７．９に調整した。ストックの濃度は、４００μｇ／ｍＬとした。保存溶液を、０．５％ヒト血清アルブミンおよび防腐剤を含有するＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で１／１０にさらに希釈し、次いで、滅菌濾過した。ストックを４℃で保存し、−２０℃で凍結した。
【０５４８】
抗体は、０．５ｘ  ＰＢＳＴに１０００ｘ希釈された、ＨＲＰがコンジュゲートしている抗ＰＨ２０抗体を使用して検出性であった。プレートのすべてのウェルに１００μＬの希釈された抗体を加え、プレートを室温でさらに２時間インキュベートした。インキュベートした後、プレートを、プレートウォッシャーを使用し、１ｘＰＢＳＴを３００μＬ／ウェルで用いて５回洗浄した。各洗浄後、プレートをペーパータオル上でパットドライした。次いで、各ウェルに、１００μＬのＴＭＢ基質を加え、ウェルあたり１００μＬの停止溶液を加えることによって、５〜１０分後、反応を停止した。ＯＤ４５０でプレートを読み取った。
【０５４９】
実施例８
ＰＨ２０の酵素活性の決定
細胞培養物、精製画分および精製溶液などのサンプル中のＰＨ２０の酵素活性を、ヒアルロン酸が塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）と結合する場合の不溶性沈殿物の形成に基づく比濁法アッセイを使用して決定した。活性は、ＰＨ２０をヒアルロナンとともに、一定期間（３０分）インキュベートすること、次いで、消化されていないヒアルロナンをＣＤＣの添加で沈殿させることによって測定される。得られたサンプルの濁度は、６４０ｎｍで測定される。ヒアルロナン基質に対する酵素活性に起因する濁度の低下は、ＰＨ２０酵素活性の尺度である。方法は、ＰＨ２０アッセイ作業参照標準（実施例１に記載のように作製されたｒＨｕＰＨ２０標準）の希釈を用いて作製された較正曲線を使用して実施され、サンプル活性測定は、この較正曲線に対して行われる。
【０５５０】
サンプルおよび標準の希釈は、酵素希釈溶液（７０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ヒト血清アルブミン［ＨＳＡ］、２５ｍＭ  ＰＩＰＥＳバッファー、ｐＨ５．５中、０．６７ｇ／Ｌゼラチン加水分解物）で調製した。サンプルは、適当な濃度に希釈した。Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（Ｃｈａｓｋａ、ＭＮ）製のヒアルロン酸（ＨＡ、２０〜５０ｋＤａの平均ＭＷ）はまた、ｐＨ５．５の２５ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、７０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する基質溶液中、１ｍｇ／ｍＬで調製した。上記２種の溶液の等量を混合して、１ｍＬの反応混合物を調製し、３７℃で３０分間インキュベートした。反応は、４ｍＬの塩化セチルピリジニウム溶液（ＣＰＣ、５．０ｍｇ／ｍＬ）を添加することによって停止した。短時間ボルテックス処理した後、サンプル混合物の濁度を、６４０ｎｍで読み取り、標準曲線に対してフィッティングすることによって活性を決定した。比活性（単位／ｍｇ）は、タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）によって酵素活性（Ｕ／ｍＬ）を除することによって算出した。
【０５５１】
実施例９
防腐剤におけるＦ２０４Ｐ−ＰＨ２０変異体の安定性
スクリーニング結果を確認するために、実施例６に記載されるような精製Ｆ２０４Ｐタンパク質の約４５０Ｕ／ｍＬであると推定される量を、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭメチオニン、０．０１％プルロニックＦ−６８、０．１％フェノールおよび０．１５％ｍ−クレゾールで製剤した。同一製剤中の、約４５０Ｕ／ｍＬの野生型ｒＨｕＰＨ２０（実施例１に記載される通りに作製された）であると推定される量を含有する試験品も、対照として働くよう調製した。各製剤溶液を０．５ｍＬにアリコートに分け、クロロブチルゴム栓およびアルミニウムシールを備えた、２ｍＬ  ＵＳＰ  Ｉ型ホウケイ酸ガラス中に入れた。バイアルを、５℃、３０℃または３７℃でインキュベートした。種々の時点でインキュベーターからサンプルを取り出し、実施例８に記載の通りに酵素活性を測定した。
【０５５２】
酵素活性測定の結果は、表１５に示されている。わかるように、ｒＨｕＰＨ２０野生型対照は、フェノール系防腐剤の存在下、３７℃でインキュベートした場合に活性の迅速な減少を示した。対照的に、Ｆ２０４Ｐ突然変異体は、研究を通じて活性の大幅な低下を示さなかった。結果はまた、突然変異を含有しないｒＨｕＰＨ２０野生型対照の活性と比較して、ＰＨ２０の活性が、５℃および３０℃での最大４週間のインキュベーション後に保持されることを示す。これらの結果から、Ｆ２０４Ｐが、防腐剤のＥＰＢレベル（０．１％フェノールおよび０．１５％ｍ−クレゾール）に耐容性を示し、３７℃で、少なくとも最大６日、５℃および３０℃で１カ月超安定であることが確認される。
【０５５３】
【表１５】
0006422933.tif 000092
【０５５４】
実施例１０
インスリン共製剤中のＦ２０４Ｐ−ＰＨ２０変異体の安定性
ＰＨ２０変異体Ｆ２０４Ｐを、インスリン類似体（インスリンアスパルトまたはインスリンリスプロ）を含有する共製剤におけるその安定性について試験した。
【０５５５】
試験された共製剤では、インスリンリスプロは、市販の製品（インスリンリスプロ：Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙヒューマログ（登録商標）（インスリンリスプロ）１００Ｕ／ｍＬ、ロットＡ５７２３６４）であった。
【０５５６】
試験された共製剤では、インスリンアスパルト類似体は、市販の製品（インスリンアスパルト：Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、ＮｏｖｏＲａｐｉｄ（登録商標）（インスリンアスパルト）、ロットＸＳ６０１９５）の１２バイアル（各１０ｍＬ）をプールし、次いで、終濃度が元濃度の約５倍となるまで、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０  Ｋカラム濃縮器を使用して濃縮することによって調製された再生アスパルトとした。インスリン類似体は、１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．３および３０ｍＭ塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２、ＥＭＤ、カタログ番号ＺＸ００６５−１）を、タンパク質溶液容量の１／１０で添加することによって沈殿させた。溶液を氷上に３０分間置き、続いて、ＪＳ−５．３スインギングバケットローター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を備えたＡｖａｎｔｉ  Ｊ−Ｅ遠心機において５６００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレットを再懸濁し、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍＭ塩化亜鉛、ｐＨ５．５溶液を用い洗浄した。再懸濁した溶液を、上記のように遠心分離した。洗浄工程を合計５回反復した。最終洗浄は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５を用いて実施し、塩化亜鉛のすべてのトレーサーを除去した。得られたタンパク質ペーストを、２０ｍＭ  ＨＣｌを含有する水で溶解した。完全に溶解した後、２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ１０．７を、２０ｍＭの最終Ｔｒｉｓ濃度に加えた。得られた溶液のｐＨを、インスリン類似体が、以下に記載されるように製剤され、タンパク質濃度が約１５〜２０ｍｇ／ｍＬに調整されるように調整した。この方法で調製されたインスリン類似体は、通常、約９０％の収率を有しており、残存する防腐剤濃度は、出発材料の１００倍未満である。
【０５５７】
手短には、表１６に示されるような合計６種の製剤について、各々６００単位（Ｕ）のＰＨ２０−Ｆ２０４Ｐまたは野生型ｒＨｕＰＨ２０（実施例１に記載の通りに作製した）を含有する３種の製剤を作製した。
【０５５８】
【表１６】
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【０５５９】
各製剤溶液を、０．５ｍＬアリコートに分配し、クロロブチルゴム栓およびアルミニウムシールを備えた、２ｍＬ  ＵＳＰ  Ｉ型ホウケイ酸ガラスバイアル中に入れた。バイアルを、５℃、３０℃および３７℃でインキュベートした。実施例８に記載される酵素活性測定のために、予定された時点でインキュベーターからサンプルを取り出した。
【０５６０】
３７℃、３０℃および５℃でインキュベートされたサンプルの酵素活性測定の結果は、それぞれ表１７から１９に示されている。３７℃では、野生型ｒＨｕＰＨ２０を含有するサンプルの酵素活性（Ｆ２、Ｆ４およびＦ６）は、２日のインキュベーション内にほとんど完全に失われていた。対照的に、３７℃で６日インキュベートした後、ＰＨ２０−Ｆ２０４Ｐを含有する製剤Ｆ３およびＦ５は、それぞれ約１０％および３０％のみを失った。市販のヒューマログ（Ｆ１）に製剤されたＰＨ２０−Ｆ２０４Ｐは、おそらくは製剤中にＮａＣｌが不足しているために、その活性のほとんどを３７℃で２日内に失った。
【０５６１】
ＰＨ２０−Ｆ２０４ＰおよびｒＨｕＰＨ２０間で３０℃でインキュベートされたアンプルの酵素活性について同様の傾向が記載される。ＥＰＡ防腐剤レベルを含有する製剤について、野生型およびＦ２０４Ｐ間の相違は著しかった（表１７；Ｆ１およびＦ５対Ｆ２およびＦ６）。防腐剤濃度が、ＥＰＢレベルに低減された場合には（Ｆ３およびＦ４）、Ｆ２０４Ｐは、依然として野生型ｒＨｕＰＨ２０より優れていたが、ＥＰＡ条件と比較してわずかに高いｒＨｕＰＨ２０安定性があった。ＥＰＡおよびＥＰＢ防腐剤レベルの両方において、ＰＨ２０−Ｆ２０４Ｐは、製剤中に１００ｍＭのＮａＣｌが含まれる場合に３０℃で活性を最大１４日間維持できた。
【０５６２】
【表１７】
0006422933.tif 000094
【０５６３】
【表１８】
0006422933.tif 000095
【０５６４】
【表１９】
0006422933.tif 000096
【０５６５】
実施例１１
インスリン共製剤中のＶ５８Ｒ−ＰＨ２０の安定性
Ａ．Ｖ５８Ｒ−ＰＨ２０の安定性
ＰＨ２０変異体Ｖ５８Ｒを、実施例２または実施例３または実施例６に記載の通りＣＨＯ−Ｓ細胞において発現させた。トランスフェクトされたプラスミドＤＮＡは、ヌクレオチド位置１２９５〜１２９７でＧＴＧのＣＧＧへのコドン変更を含有し、それによって、Ｖ５８Ｒ突然変異体をコードする配列番号４に示されるヌクレオチドの配列を有していた。Ｖ５８Ｒ突然変異体を、インスリンアスパルト（実施例１０に記載の通りに調製したインスリンアスパルト類似体）を含有する共製剤における、またＥＰＡもしくはＥＰＢ防腐剤レベル下でのその安定性について試験した。手短には、表２０に示されるような、各々、６００単位（Ｕ）のＰＨ２０−Ｖ５８Ｒまたは野生型ｒＨｕＰＨ２０（実施例１に記載の通りに作製した）を含有する４種の製剤を作製した。製剤Ｆ１およびＦ２は、ＥＰＢ防腐剤レベルに相当し、一方、製剤Ｆ３およびＦ４は、ＥＰＡ防腐剤レベルに相当する。
【０５６６】
【表２０】
0006422933.tif 000097
【０５６７】
各製剤溶液を０．５ｍＬアリコートに分配し、クロロブチルゴム栓およびアルミニウムシールを備えた、２ｍＬ  ＵＳＰ  Ｉ型ホウケイ酸ガラスバイアル中に入れた。バイアルは、３０℃および３７℃でインキュベートした。実施例８に記載される酵素活性測定のために、予定された時点でインキュベーターからサンプルを取り出した。
【０５６８】
３７℃および３０℃でインキュベートされたサンプルの酵素活性測定の結果は、表２１および表２２に示されている。３７℃では、野生型ｒＨｕＰＨ２０を含有するサンプルの酵素活性（Ｆ２およびＦ４）は、２日のインキュベーション内にほとんど完全に失われていた。対照的に、３７℃で６日インキュベートした後、Ｖ５８Ｒ−ＰＨ２０を含有する製剤Ｆ１（ＥＰＢ）およびＦ３（ＥＰＡ）は、それぞれ約２５％および４０％の活性しか失わなかった。３０℃では、野生型ｒＨｕＰＨ２０を含有するサンプルの酵素活性は、１カ月のインキュベーション以内に、ＥＰＡまたはＥＰＢ防腐剤レベルの存在下で著しく低下したが、ＥＰＢ防腐剤レベルの存在下で活性のわずかに少ない著しい喪失があった。対照的に、Ｖ５８Ｒ−ＰＨ２０について、試験された製剤の酵素活性の喪失が最大１カ月なかった。
【０５６９】
【表２１】
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【０５７０】
【表２２】
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【０５７１】
Ｂ．Ｆ２０４ＰおよびＶ５８Ｒの安定性の比較
ＰＨ２０変異体Ｖ５８Ｒ−ＰＨ２０を、Ｆ２０４Ｐと、インスリンアスパルト（実施例１０に記載の通りに調製したインスリンアスパルト類似体）を含有する共製剤における、またＥＰＡもしくはＥＰＢ防腐剤レベル下でのその安定性について比較した。手短かには、表２３に示されるように８種の製剤を作製した。製剤Ｆ１〜Ｆ４は、ＥＰＢ防腐剤レベルに相当し、一方、製剤Ｆ５〜Ｆ８は、ＥＰＡ防腐剤レベルに相当する。製剤Ｆ３およびＦ４ならびに製剤Ｆ７およびＦ８は同一であり、野生型対照製剤、それぞれＥＰＢまたはＥＰＡ研究に使用される製剤に相当する。
【０５７２】
【表２３】
0006422933.tif 000100
【０５７３】
各製剤溶液を、０．５ｍＬアリコートに分配し、クロロブチルゴム栓およびアルミニウムシールを備えた、２ｍＬ  ＵＳＰ  Ｉ型ホウケイ酸ガラスバイアル中に入れた。バイアルは、３０℃および３７℃でインキュベートした。実施例８に記載される酵素活性測定のために、予定された時点でインキュベーターからサンプルを取り出した。
【０５７４】
結果は、３７℃でのプレインキュベーション後の試験された製剤におけるパーセンテージヒアルロニダーゼ活性は、ＥＰＡ防腐剤レベルではなくＥＰＢ防腐剤にレベル製剤された場合に、両ＰＨ２０突然変異体についてわずかに多かったことを示す。ＥＰＢ防腐剤レベルを含有する製剤中で６日インキュベートした後に、残存する活性のパーセントは、試験された両突然変異体について８０％よりも大きかったが、ＥＰＡ防腐剤レベルの存在下では少なかった。例えば、ＥＰＡ防腐剤レベルにおいて６日で残存する活性は、Ｆ２０４Ｐ−ＰＨ２０について６日後に、８０％よりもわずかに少なかったが、Ｖ５８Ｒ−ＰＨ２０についてはわずか約４０％であった。したがって、結果はまた、３７℃では、Ｖ５８Ｒ−ＰＨ２０は、特に、ＥＰＡ防腐剤レベルを有さない製剤では、Ｆ２０４Ｐ−ＰＨ２０よりも幾分かあまり安定ではないということを示す。３０℃で少なくとも１週間インキュベートした後に、Ｆ２０４Ｐ−ＰＨ２０およびＶ５８Ｒ−ＰＨ２０は、ＥＰＡおよびＥＰＢ両防腐剤レベルの存在下で安定であり、ほぼ１００％の最初の活性を示した。対照的にｒＨｕＰＨ２０は、ＥＰＢ防腐剤レベルの存在下、３０℃で４週間後、その最初の活性の約４０％しか示さなかったが、ＥＰＡ防腐剤レベルの存在下では、３０℃で４週間後、検出可能な活性を示さなかった。
【０５７５】
実施例１２
レンチウイルス発現ベクターを使用するＦ２０４Ｐ−ＰＨ２０の発現
Ｆ２０４Ｐ−ＰＨ２０をコードするコドン最適化突然変異体ヒアルロニダーゼｃＤＮＡを含有するレンチウイルス発現ベクター、ｐＬＶ−ＥＦ１ａ−ＰＨ２０（Ｆ２０４Ｐ）−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−Ｂｓｄを作製した。ｐＬＶ−ＥＦ１ａ−ＰＨ２０（Ｆ２０４Ｐ）−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−Ｂｓｄの配列は、配列番号９２５に示されている。ｐＬＶ−ＥＦ１ａ−ＰＨ２０（Ｆ２０４Ｐ）−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−Ｂｓｄベクターは、ヌクレオチド８６１１〜９４７１に位置するアンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）、残基１９３３〜２３２７のＥＦ１ａプロモーター、残基４７８６〜５３７０のＩＲＥＳ、残基５３９４〜６５２７のＧＦＰ−Ｂｓｄおよび残基３３６９〜４７８１にＦ２０４Ｐ−ＰＨ２０をコードするヌクレオチドを含有する。
【０５７６】
レンチウイルスは、Bandaranayake et al. ((2011) Nucleic Acids Research, 39:e143)に記載されるように産生した。手短には、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０ｃｍ組織培養プレート上に６×１０６個細胞でプレーティングした。２４時間後、６μｇのｐｓＰＡＸ２（配列番号９２６；Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号１２２６０）、３μｇのＰＭＤ２．Ｇ（配列番号９２７；Ａｄｄｇｅｎｅ  プラスミド番号１２２５９）および９μｇのレンチウイルスベクタープラスミドｐＬＶ−ＥＦ１ａ−ＰＨ２０（Ｆ２０４Ｐ）−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−Ｂｓｄを、１．５ｍＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で混合した。４５μＬのリポフェクタミン２０００（ＬＦ２０００；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１．５ｍＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に希釈した。ＤＮＡおよびＬＦ２０００を、穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートし、ＤＮＡおよび脂質に複合体を形成させた。合間に、一晩培養培地を５．０ｍＬの抗生物質を含まないＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳと置換した。ＤＮＡ−ＬＦ２０００複合体を含有する３．０ｍＬの容量を２９３Ｔ細胞に加えた。トランスフェクション後１２〜１６時間で、ＤＮＡ−ＬＦ２０００複合体を含有する培地を、１０ｍＬの完全培地と置換した。トランスフェクションの４８時間後に、上清を集め、培地をポリプロピレン保存チューブに移した。ウイルスを含有する培地を、１３００ｒｐｍで５分間遠心分離して、収集の際に持ち越された任意の２９３Ｔ細胞をペレットにした。上清を、滅菌ポリプロピレン保存チューブに注意深く移した。
【０５７７】
ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、有孔１２５−ｍＬ振盪フラスコ（Ｎａｌｇｅｎｅ）中、３７℃および５％ＣＯ２で、１２０ｒｐｍで振盪しながらＣＨＯ−Ｓ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖させた。形質導入のために、６ウェルプレートのウェルに、ウェルあたり、４μｇ／ｍＬの終濃度の４μｇ／ｍＬ臭化ヘキサジメトリン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；ＳＩＧＭＡ）を含有するＣＨＯ−Ｓ培地２ｍｌ中、２×１０６個細胞でＣＨＯ−Ｓ細胞を加えた。各ウェルに、１０の多重感染度（ＭＯＩ）でウイルスを加え、細胞を振盪しながら（１２０ｒｐｍ）、３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。次いで、細胞を回収し、低速遠心分離（５００ｘｇ、５分）によってペレットにした。形質導入培地を除去し、ＧｌｕｔａＭａｘ（５０ｍＬ／リットル）を補給した新鮮なＣＨＯ−Ｓ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０ｍＬで置換し、Ｔ−２５フラスコに移した。感染後３日で、増殖培地に、１μｇ／ｍＬの濃度でブラストサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。培地を３〜４日間隔で定期的に交換し、細胞を拡大のためにＴ７５フラスコに移した。最初の感染の２週間後、細胞を、シェーカーフラスコに拡大し、１μｇ／ｍＬブラストサイジンを含有する培地を使用して培養物で維持した。ＣＨＯ−Ｓ培地中に分泌されたＦ２０４Ｐ−ＰＨ２０タンパク質を集め、実施例６に記載されたように、抗ｒＨｕＰＨ２０親和性カラムを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。タンパク質は、標準ＡＰＩバッファー（１０ｍＭヒスチジン、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）中で調製した。
【０５７８】
実施例１３
二次構造および融解温度の解析
ＰＨ２０変異体Ｆ２０４Ｐの二次構造および融解温度を試験し、野生型ｒＨｕＰＨ２０（実施例１に記載されるように作製した）と比較して、変異体の安定性をさらに評価した。二次構造は、円偏光二色性によって試験した。ＣＤスペクトル測定には、ＰＴＣ−４２４Ｓを備えたＪａｓｃｏ  Ｊ−８１０−１５０Ｓを使用し、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｎａｇｅｒ（バージョン１．５、Ｊａｓｃｏ）によってＣＤスペクトルを集めた。機器設定およびデータ収集の手順は、表２４に記載されている。
【０５７９】
【表２４】
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【０５８０】
１．サンプル調製および測定
２００μＬの０．１ｍｇ．ｍＬの、ｐＨ６．５に調整したマッキルヴェインバッファー（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ（１９２１）ＪＢＣ  ４９：１８３）で希釈したタンパク質サンプルを調製した。表２５に示されるように、５．０〜７．５のｐＨ範囲へのマッキルヴェインバッファーを使用する調整によってｐＨで変わるＦ２０４Ｐ変異体の一連のサンプルもまた作製した。さらに、表２６に示されるように、ＮａＣｌ濃度を１７．５ｍＭ〜１４０ｍＭに調整することによってサンプルも作製した。サンプルを、測定の前に０．２μｍシリンジフィルターを使用して濾過した。同様のサンプルを、ｒＨｕＰＨ２０について作製した。次いで、２００μＬのサンプルを、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１０分光偏光計の上におかれた１ｍｍ幅を有する長方形のキュベットに移した。表２０に記載された条件下でサンプルのＣＤスペクトルを集めた。Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｎａｇｅｒ（ｖ  １．５、Ｊａｓｃｏ）を使用して、温度範囲３０℃〜７５℃で測定されたＣＤスペクトル強度から融解温度（Ｔｍ）を算出した。個々のサンプルローディングの間および実施後に、キュベットを、Ｃｈｒｏｍｅｒｇｅ（登録商標）クリーナー（Ｃ５７７−１２、Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって清浄にした。
【０５８１】
【表２５】
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【０５８２】
【表２６】
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【０５８３】
２．結果
結果は、Ｆ２０４Ｐの二次構造が、ｒＨｕＰＨ２０と同様であることを示す。温度の関数として、円偏光二色性は、吸収の変化が、温度が高まるにつれ測定されたことを示した。ｐＨの関数として、Ｔｍ分布は、Ｆ２０４ＰおよびｒＨｕＰＨ２０両方について密接に匹敵しており、各々の最高Ｔｍが、ｐＨ５．５からｐＨ６．０の間で得られた。しかし、結果は、Ｆ２０４Ｐ変異体のＴｍは、すべての試験された範囲で野生型ｒＨｕＰＨ２０よりもおよそ９℃高かったことを示した。この結果は、Ｆ２０４Ｐ突然変異体が、熱ストレス条件に対してより安定であることを示した。塩の関数として、結果は、Ｆ２０４Ｐおよび野生型ｒＨｕＰＨ２０両方が、高塩濃度を用いると増大するＴｍを示すことを示し、これは、両方が、塩濃度に対して比例した傾きを有することを示す。
【０５８４】
実施例１４
皮内トリパンブルー分散アッセイにおける酵素活性の評価
ＰＨ２０変異体Ｆ２０４Ｐの拡延活性を、ダイ分散インビボアッセイを使用して評価した。手短かには、精製ＰＨ２０変異体Ｆ２０４Ｐ（実施例１２に記載の通りに調製した）および野生型ｒＨｕＰＨ２０（実施例１に記載の通りに調製した）を、両方とも、ＡＰＩバッファー（１０ｍＭヒスチジン、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）に１０，０００Ｕ／ｍＬの濃度で製剤した。ストックを、ＡＰＩバッファーでの連続１：１０希釈によって、３つの標的濃度１０００、１００および１０Ｕ／ｍＬにさらに希釈した。精製タンパク質（ｒＨｕＰＨ２０またはＦ２０４Ｐ−ＰＨ２０のいずれか）を、０．４％トリパンブルー（０．４％液体溶液；カタログ番号１５２５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１：１希釈し、各々０．２％トリパンブルーを含有する５、５０および５００Ｕ／ｍＬタンパク質の終濃度を得た。媒体対照（ＡＰＩバッファー）も調製した。表２７に示されるように、研究には４２匹の雌のＮＣｒ  ｎｕ／ｎｕホモ接合型マウスを使用し、群あたり６匹のマウスを使用した。
【０５８５】
【表２７】
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【０５８６】
４０μＬのサンプルを、単回皮内注射によって投与した。注射後２．５、５、１０、１５および２０分でダイ分散の面積を測定し、６０ｍＭプライムマイクロレンズを備えたＮｉｋｏｎ  Ｄ９０デジタルカメラを用いて、注射部位の写真の写真画像処理によって記録した。レーザー測距儀（ライカＤ３）を使用して、動物上のトリパンブルーダイ面積から所定の距離にカメラを正確に配置した。Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ７．０（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ）を使用してダイの面積を決定した。算出した面積は、ｍｍ２として表した。
【０５８７】
結果は、表２８に示されている。結果は、ＰＨ２０変異体Ｆ２０４Ｐの分散活性は、ｒＨｕＰＨ２０の分散活性と実質的に同一であるということを示した。ダイ分散の面積を増大する能力は、用量依存性であり、両タンパク質とも５００Ｕ／ｍＬの最大活性を有する。結果はまた、ダイ分散の面積は、皮内注射後の時間につれて増大することを示した。ｒＨｕＰＨ２０およびＦ２０４Ｐ−ＰＨ２０のダイ分散の面積は、最低濃度（５Ｕ／ｍＬ）のｒＨｕＰＨ２０を除いてすべての濃度（５、５０および５００Ｕ／ｍＬ）で製剤された場合に、すべての時点で対照のダイ分散の面積よりも大幅に大きかった（ｐ＜０．０５）。互いに比較すると、ｒＨｕＰＨ２０およびＦ２０４Ｐ−ＰＨ２０は、同様の分散効果を示したが、５Ｕ／ｍＬおよび５００Ｕ／ｍＬでは２つの群の間の分散には有意差があったが、５０Ｕ／ｍＬではなかった。要するに、結果は、ｒＨｕＰＨ２０およびＦ２０４Ｐ−ＰＨ２０は両方とも、媒体対照と比較してダイ分散の面積の統計上有意な増大を提供したことを示す。
【０５８８】
【表２８】
0006422933.tif 000105
【０５８９】
実施例１５
皮膚のバリアの再構築による酵素活性の評価
Ｆ２０４Ｐ−ＰＨ２０の活性を評価し、ｒＨｕＰＨ２０を比較して、皮内ヒアルロニダーゼ投与後に皮膚のバリアが自身で再構築するのに必要な時間量を決定した。０．４％トリパンブルーの拡散の面積を経時的にモニタリングすることによって評価されるような、ヒアルロニダーゼ拡延活性の期間を比較することによって皮膚の再構築を評価した。研究に使用したタンパク質は、両方とも、ＡＰＩバッファー（１０ｍＭヒスチジン、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）に製剤された、精製ＰＨ２０変異体Ｆ２０４Ｐ（実施例１２に記載されるように調製された）および野生型ｒＨｕＰＨ２０（実施例１に記載されるように調製された）であった。媒体（ＡＰＩバッファー）を、対照として使用した。雄のＮＣｒ  ｎｕ／ｎｕホモ接合型マウスを研究に使用し、表２９に示されるように群あたり使用された合計１５匹のマウスについて、時点あたり３匹の動物を用いた。
【０５９０】
【表２９】
0006422933.tif 000106
【０５９１】
すべてのマウスに、研究時間０で、０．０４ｍＬ中、１００Ｕ／ｍＬで、媒体対照またはｒＨｕＰＨ２０またはＦ２０４Ｐ−ＰＨ２０の２回の皮内用量を与えた。同一対照または試験品を各動物の対立する側面（右、Ｒ；左、Ｌ）に注射した。注射部位は、油性マーカーペンで印をつけた。トリパンブルー染色（０．４％液体溶液；１５２５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、０．０４ｍＬの容量で、試験品または対照の注射後０．５、１、４、２４および４８時間で同一注射部位での皮内注射によって投与した。トリパンブルー染色の注射後５および２０分で、実施例１４に記載されるように領域のデジタル画像処理によって注射部位のダイの面積を測定した。
【０５９２】
結果は、表３０に示されている。結果は、ダイ分散の領域が、試験品または対照の投与後種々の時点で測定される場合には、ｒＨｕＰＨ２０またはＦ２０４Ｐ−ＰＨ２０の注射後３０分および１時間でダイ分散の面積の統計的に有意な増大があることを示す。しかし、酵素の投与後４時間までには、対照と比較して、ダイ分散の面積の統計的に有意な増大がなかった。さらに、ダイ分散の面積の統計的に有意な差は、ｒＨｕＰＨ２０およびＦ２０４Ｐ−ＰＨ２０処理群の間で観察されなかった。したがって、ｒＨｕＰＨ２０およびＦ２０４Ｐの拡延活性の期間は同様であり、ｒＨｕＰＨ２０およびＦ２０４Ｐ−ＰＨ２０は匹敵するインビボ性能を有することを示す。
【０５９３】
【表３０】
0006422933.tif 000107
【０５９４】
実施例１６
ｒＨｕＰＨ２０と比較される、Ｆ２０４Ｐ−ＰＨ２０のインビボ薬物動態学
投与後に血漿ヒアルロニダーゼレベルを経時的に測定することによって静脈内尾静脈投与後にｒＨｕＰＨ２０およびＦ２０４Ｐ−ＰＨ２０の薬物動態学（ＰＫ）を比較した。この研究に使用されるタンパク質は、ＡＰＩバッファー（１０ｍＭヒスチジン、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で製剤した、精製ＰＨ２０変異体Ｆ２０４Ｐ（実施例１２に記載されるように調製した；バッチ濃度１．０２ｍｇ／ｍＬ）および野生型ｒＨｕＰＨ２０（実施例１に記載されるように調製した；バッチ濃度０．９５ｍｇ／ｍＬ）とした。タンパク質を、約５ｍＬの用量容量のためにＡＰＩバッファー中、０．０８７ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。タンパク質を投与されなかった動物を対照として使用した（用量前対照）。４２匹の雄のＣＤ−１マウス（約２０〜３０グラム）を試験において使用し、表３１に示されるように処理群あたり６匹の動物を用いた。
【０５９５】
【表３１】
0006422933.tif 000108
【０５９６】
マウスに、尾静脈注射によって０．４３３ｍｇ／ｋｇのｒＨｕＰＨ２０またはＦ２０４Ｐ−ＰＨ２０を静脈内投与した。投与後、１分、５分および１０分で動物から血液サンプルを得た。血液サンプルは、末端出血（心臓穿刺）から得、血漿の調製物のために抗血液凝固ＥＤＴＡを含有する血液収集チューブ中に集めた。血液サンプルを５００ｇで１０分間遠心分離し、血漿を採取し、実施例８に記載されたマイクロ濁度アッセイを使用するヒアルロニダーゼ活性の評価まで−８０℃で凍結した。
【０５９７】
結果は、表３２に示されている。結果は、ヒアルロニダーゼ活性は、ヒアルロニダーゼを用いる処理の前には血漿において検出されないことを示す。ｒＨｕＰＨ２０またはＦ２０４Ｐ−ＰＨ２０ヒアルロニダーゼのいずれかでの処理後１分以内には、血漿中に存在する検出可能な高量のヒアルロニダーゼ活性があり、これは両処理群間で同様である。経時的に、ヒアルロニダーゼ活性は、両処理群について急速に減少するが、投与後１０分で血漿中に存在する検出可能なヒアルロニダーゼ活性がある。投与後５分および１０分の時点で、Ｆ２０４Ｐ−ＰＨ２０で処理した動物における血漿における活性は、ｒＨｕＰＨ２０で処理した動物においてよりも大きい。これは、Ｆ２０４Ｐ−ＰＨ２０が幾分か大きい活性を長期間示し、したがって、ｒＨｕＰＨ２０よりも大きなインビボ半減期を示すことを示す。
【０５９８】
【表３２】
0006422933.tif 000109
【０５９９】
修飾は、当業者には明らかであるので、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものとする。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
0006422933.tif 000117
【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
0006422933.tif 000120
【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
0006422933.tif 000122
【配列表】
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