(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された細網線維芽細胞（ＦＲＣ）を含む医薬組成物であって、それを必要とする対象における免疫応答の抑制に用いるためのものであり、ＦＲＣが継代培養されている、前記医薬組成物。
【請求項２】
ＦＲＣが、ex vivo増幅細胞である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＦＲＣが、非ＦＲＣを実質的に含まない、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
対象の体重１ｋｇあたり、少なくとも１０万個のＦＲＣを含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
対象の体重１ｋｇあたり、少なくとも１００万個のＦＲＣを含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＦＲＣが、リンパ節、脾臓、胸腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺および／またはパイエル板由来である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＦＲＣが、対象に埋め込まれる二次元または三次元フレームワークの上または中にあるように投与される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
単離されたＦＲＣが、ＰＤ−Ｌ１、Ｔｈｙ−１、ＭＡＤＣＡＭ−１、ＭＹＨ１１、ＩＬ−７ＲまたはＩＴＧＡ７からなる群から選択される少なくとも１つのリンパ球マーカーを発現する、あるいは、単離されたＦＲＣが、ＣＤ１４０ａとＬＴＢＲとを共発現する、あるいは、単離されたＦＲＣが、ＣＤ１４０ａとＰＤ−Ｌ２とＬＴＢＲとを共発現する、あるいは、単離されたＦＲＣが、ＩＬ−６、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１およびＶＥＧＦの少なくとも１つを発現する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
対象が、自己免疫疾患または炎症性疾患を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
自己免疫疾患または炎症性疾患が、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、移植片対宿主病および敗血症からなる群から選択される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
単離されたＦＲＣが、ＣＤ１４０ａとＰＤ−Ｌ２とＬＴＢＲとを共発現し、対象が、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、移植片対宿主病および敗血症からなる群から選択される自己免疫疾患または炎症性疾患を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
体重１ｋｇあたり少なくとも１００万個のＦＲＣが対象に投与され、対象が、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、移植片対宿主病および敗血症からなる群から選択される自己免疫疾患または炎症性疾患を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
炎症性腸疾患が大腸炎またはクローン病である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ＦＲＣが、対象に対して自己または同種である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
細網線維芽細胞（ＦＲＣ）を単離するin vitro方法であって、それを必要とする対象における免疫応答の抑制に用いるための、ＦＲＣを継代培養することを含む、前記方法。
【請求項１６】
化学的、機械的、および電気的細胞分離プロセスの１つ以上を使用してリンパ組織断片を処置することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
単離されたＦＲＣを、成長因子、血清、血小板溶解物および抗生物質の１つ以上を添加した基底細胞培地を含む培地で増殖する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
単離されたＦＲＣを、１〜１０，０００個の細胞／ｃｍ２の密度に増殖する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
単離されたＦＲＣを、０．１〜２１％分圧の酸素で増殖する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ＦＲＣを、実質的に非ＦＲＣがなくなるまで増殖する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ＦＲＣを、ストローマ細胞の数が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、または２００％増えるまで増殖する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ＦＲＣが、リンパ節、脾臓、胸腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺またはパイエル板由来である、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
単離された細網線維芽細胞（ＦＲＣ）の組成物を含む、医薬組成物であって、それを必要とする対象における免疫応答の抑制に用いるためのものであり、ＦＲＣが継代培養されている、前記医薬組成物。
【請求項２４】
ＦＲＣが、化学的、機械的、電気的細胞分離プロセスの１つ以上を使用してリンパ組織断片を処置し、その後ＦＲＣを収集することにより単離される、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
単離されたＦＲＣが、細胞培養により増幅される、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
単離されたＦＲＣが、ex vivo増幅細胞である、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
単離されたＦＲＣが、ＦＲＣが実質的に非ＦＲＣを含まなくなるまで収集した細胞を増殖して増幅される、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
単離されたＦＲＣが、ＣＤ１４０ａとＰＤ−Ｌ２とを共発現する、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
単離されたＦＲＣが、ＣＤ１４０ａとＬＴＢＲとを共発現する、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
単離されたＦＲＣが、ＣＤ１４０ａとＰＤ−Ｌ２とＬＴＢＲとを共発現する、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
単離されたＦＲＣが、ＰＤ−Ｌ１、Ｔｈｙ−１、ＭＡＤＣＡＭ−１、ＭＹＨ１１、ＩＬ−７ＲまたはＩＴＧＡ７からなる群から選択される少なくとも１つの他のリンパ球マーカーを発現する、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
単離されたＦＲＣが、ＩＬ−６、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１またはＶＥＧＦからなる群から選択される少なくとも１つの因子を発現する、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
細胞が、ヒトから単離される、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
細胞が、in vitroでＴ細胞の増殖を抑制する、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
ＦＲＣが、リンパ節、脾臓、胸腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺またはパイエル板から単離される、請求項２３〜３４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
対象における免疫応答の抑制のための医薬の製造のための、請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３７】
対象が、自己免疫疾患または炎症性疾患を有する、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
自己免疫疾患または炎症性疾患が、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、大腸炎、クローン病、および敗血症からなる群から選択される、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
炎症性腸疾患が大腸炎またはクローン病である、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
単離されたＦＲＣが、ＰＤ−Ｌ１、Ｔｈｙ−１、ＭＡＤＣＡＭ−１、ＩＬ−７ＲまたはＩＴＧＡ７からなる群から選択される少なくとも１つのリンパ球マーカーを発現する、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
単離されたＦＲＣが、ＣＤ１４０ａとＬＴＢＲとを共発現する、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
単離されたＦＲＣが、ＣＤ１４０ａとＰＤ−Ｌ２とＬＴＢＲとを共発現する、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
単離されたＦＲＣが、ＩＬ−６およびＶＥＧＦの少なくとも１つを発現する、請求項１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年３月２１日に出願された米国特許仮出願第６１／６１３，６９７号に対して、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張し、その全開示を参照により本明細書に組み込むものである。
政府支援
本発明は、ＮＩＨグラントＤＫ０７４５００、Ｋ０１ＤＫ０８７７７０およびＡＩ０４５７５７の米国政府支援を得てなされたものである。従って、発明の一定の権利は米国政府が有するものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
免疫抑制薬は、特定の疾患の処置のために免疫系の活性を阻害または防止するために使用される。臨床的には、例えば、移植された臓器および組織（例えば、骨髄、心臓、腎臓、肝臓等）の拒絶反応を防止するため、および関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬および炎症性腸疾患などの炎症性疾患または自己免疫疾患の処置などの多数の病状を処置または防止するために使用される。慢性炎症性疾患の処置に現在認可されている免疫抑制薬は、頻繁に投与する必要があり、腎毒性や罹病のリスクなどの重要な副作用がある。
【０００３】
免疫抑制性ストローマ細胞タイプは既に記載されているが（例えば、間葉系ストローマ細胞）、それらは十分に定義されておらず、治験では有効性の主要エンドポイントを満たすことができなかった。更に、ストローマ細胞の単離は、これらの細胞をうまく単離することが困難であるために、解決すべき課題となっている。自己免疫または炎症性疾患など、望ましくない免疫活性に起因する病状は重症であり広範囲に及ぶため、そのような疾患の効果的な処置を開発することは大いに必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、いくつかの側面では、リンパ節から単離されたストローマ細胞が免疫応答を抑制可能であるという発見に関するものである。リンパ節由来のストローマ細胞の免疫応答抑制能力は、免疫細胞を誘引するそれらの公知の能力と組合わせることで、それらを対象における免疫応答を抑制する効果的なツールとする。従って、本発明のいくつかの側面は、免疫応答を抑制する方法であって、そのような処置を必要とする対象に、単離されたリンパ組織由来抑制性ストローマ細胞（ＬＳＳＣ）を該対象における免疫応答を抑制する効果のある量で投与することによる、前記方法に関する。いくつかの態様において、対象に投与されるＬＳＳＣが、ex vivo増幅細胞である。いくつかの態様において、対象に投与されるＬＳＳＣが、非ＬＳＳＣを実質的に含まない。いくつかの態様において、少なくとも１０万個のＬＳＳＣ／ｋｇが、対象に投与される。いくつかの態様において、少なくとも１００万個のＬＳＳＣ／ｋｇが、対象に投与される。
【０００５】
ＬＳＳＣは、以下の組織のいずれかの一つまたは組合わせから得てよい：リンパ節、脾臓、胸腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺および／またはパイエル板。ＬＳＳＣは、対象に対して自己、同種または異種であってもよい。
いくつかの態様において、ＬＳＳＣが対象に埋め込まれる二次元または三次元フレームワークの上または中にある。いくつかの態様において、ＬＳＳＣが、静脈内、腹腔内、動脈内、皮下または筋肉内注射により、または病変部、臓器、臓器皮膜、脂肪またはリンパ節への局所投与により、対象に投与される。
【０００６】
処置を必要とする対象とは、例えば自己免疫または炎症性疾患を有する対象である。例えば、自己免疫または炎症性疾患には、限定されるものではないが、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、移植片対宿主病および敗血症が含まれる。
本発明の一つの側面によれば、ＬＳＳＣを単離する方法が提供される。この方法は、酵素混合物および攪拌の組み合わせを使用してリンパ組織断片を消化すること、その後、ＬＳＳＣを収集することを含む。
【０００７】
リンパ組織断片の消化は、以下の一連の工程により行ってもよい；
（ｉ）酵素混合物とともに、リンパ組織断片をインキュベートすること；
（ｉｉ）ピペットを使用して組織を攪拌した後、インキュベーションして大きな断片を沈降させること；
（ｉｉｉ）上清を取り除き、すべての断片が消化されるまで工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すこと；
ここで、ＬＳＳＣは、すべての上清画分をプールした後、遠心分離により細胞ペレットを得ることにより収集する。
【０００８】
いくつかの態様において、単離されたＬＳＳＣを、成長因子、血清、血小板溶解物および抗生物質の１つ以上を添加した基底細胞培地を含む培地で増殖する。いくつかの態様において、単離されたＬＳＳＣを、１〜１０，０００個の細胞／ｃｍ２の密度に生育することができる。いくつかの態様において、単離されたＬＳＳＣを、０．１〜２１％の酸素分圧で増殖する。いくつかの実施態様では、ＬＳＳＣを、実質的に非ＬＳＳＣがなくなるまで増殖することができる。いくつかの実施態様では、ＬＳＳＣを、ストローマ細胞の数が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、２００％またはそれ以上増えるまで増殖する。いくつかの態様において、ＬＳＳＣを含有する集団は、造血細胞または他の非ストローマ細胞を除去することにより、または非ストローマ細胞の増殖よりもストローマ細胞の増殖が好まれる条件化で細胞集団を増殖することにより、ＬＳＳＣが濃縮されている。そのような条件は、本明細書で記載される。
【０００９】
一つの態様において、酵素混合物が、培地、ディスパーゼ、コラーゲナーゼおよびＤＮａｓｅＩを含む。ＬＳＳＣが、リンパ節、脾臓、胸腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺またはパイエル板由来であってもよい。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の方法を使用して単離されたＬＳＳＣを使用して、対象における免疫応答を抑制してもよい。
本発明の一つの側面によれば、単離されたリンパ組織由来抑制性ストローマ細胞（ＬＳＳＣ）を含む組成物が提供される。ＬＳＳＣは、上記の方法を使用して単離することができる。
【００１０】
本発明の一つの側面によれば、単離されたリンパ組織由来抑制性ストローマ細胞（ＬＳＳＣ）の組成物を含む医薬製剤が提供される。ＬＳＳＣは、化学的、機械的、および電気的細胞分離プロセスの１つ以上を使用してリンパ組織断片を処置することにより、ならびにその後ＬＳＳＣを収集することにより単離してもよい。
いくつかの実施態様では、単離されたＬＳＳＣが、細胞培養により増幅される。いくつかの実施態様では、単離されたＬＳＳＣが、ex vivo増幅細胞である。いくつかの実施態様では、単離されたＬＳＳＣは、収集細胞をＬＳＳＣが実質的に非ＬＳＳＣを含まなくなるまで生育することにより増幅される。
【００１１】
いくつかの実施態様では、単離されたＬＳＳＣが、ＣＤ１４０ａとＰＤ−Ｌ２とを共発現する。いくつかの実施態様では、単離されたＬＳＳＣが、ＣＤ１４０ａとＬＴＢＲとを共発現する。いくつかの実施態様では、単離されたＬＳＳＣが、ＣＤ１４０ａとＰＤ−Ｌ２とＬＴＢＲとを共発現する。いくつかの実施態様では、単離されたＬＳＳＣが、ＰＤ−Ｌ１、Ｔｈｙ−１、ＭＡＤＣＡＭ−１、ＭＹＨ１１、ＩＬ−７ＲまたはＩＴＧＡ７からなる群から選択される少なくとも１つの他のリンパ球マーカーを発現する。いくつかの実施態様では、単離されたＬＳＳＣが、ＩＬ−６、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１またはＶＥＧＦからなる群から選択される少なくとも１つの因子を発現する。
【００１２】
ＬＳＳＣは、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシおよび齧歯類からなる群から選択される種から単離されてもよい。ＬＳＳＣが、in vivoまたはin vitroでＴ細胞の増殖を抑制することができる。
本発明の実施態様および側面の各々は、独立してまたは組み合わせて実施することが可能である。また、本明細書で使用される表現および用語は、記載の目的であって、限定するものとみなされるべきではない。本明細書で使用される「含む」、「備える」、「有する」、「含有する」、「関与する」およびその語尾変化形は、その後に挙げられた項目およびその均等物ならびに追加の項目を含むことを意図するものである。
【００１３】
本発明の上記および他の側面、ならびに様々な利点および有用性は、詳細な説明の項を参照して明らかになるであろう。本発明の各側面は、理解されるであろうように様々な実施態様を含むことが可能である。
本明細書で特定されたすべての文献は、その全開示を参照により本明細書に組み込むものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、セルソーティングのためのプールしたマウスのリンパ節ストローマ細胞の消化および調製の模式図を示す。１．酵素混合物（０．８ｍｇ／ｍＬのディスパーゼ、０．２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＰ、０．１ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ入りＲＰＭＩ−１６４０）を組織に添加し、３７℃の水浴中でインキュベートする。２．１０〜２０分後（方法の項を参照）、１ｍＬピペットを使用してリンパ節断片を攪拌し、その後断片が沈降するまでインキュベートする。３．遊離した細胞を含有する上清を取り除き、遠心分離し、氷上で保管する。４．すべての断片が十分に消化されるまで（６０分以内）工程１〜３を繰り返す。５．すべての上清画分をプールし、遠心分離し、フィルターし、カウントする。６．抗ＣＤ４５ミクロビーズを添加し、回転ホイール上で、４℃でインキュベートする。７．ＭＡＣＳまたはＡｕｔｏＭＡＣＳを使用しＣＤ４５＋細胞を枯渇させ、カウントする。８．濃縮したＣＤ４５−ストローマを抗体で染色する；１００ｕｍチップを使用して２０ｐｓｉで高純度にソーティングする。
【００１５】
【図２】図２は、リンパ節ストローマサブセットを単離するための低死亡率方法の妥当性を示す。図２Ａは、低死亡率酵素消化方法を使用して調製した単一細胞懸濁液の生存率を示す。ｎ＝６、平均値＋標準偏差。図２Ｂは、個々のマウスの皮膚流入領域（skin-draining）または腸間膜リンパ節から新たに単離されたリンパ節ストローマサブセットの典型的なフローサイトメトリープロファイルを示す。図２Ｃは、マウスのリンパ節の凍結切片上にin situで同定されたリンパ節ストローマサブセットを示す。トップパネル：Ｔ細胞領域ＦＲＣ（ポドプラニン＋ＣＤ３１−）および高内皮細静脈（ポドプラニン−ＣＤ３１＋立方形態）。高内皮細静脈の２つの例を矢印で示してある。ミドルパネルは、髄質ＬＥＣ（ポドプラニン＋ＣＤ３１＋）および大髄質血管（ポドプラニン−ＣＤ３１＋）を示す。髄質リンパ管を矢印で示してある。ボトムパネル：皮膜輸入管ＬＥＣ（Ｌｙｖｅ１＋ＭａｄＣＡＭ＋）、ＭＲＣ（皮膜下、Ｌｙｖｅ１−ＭａｄＣＡＭ＋）およびＦＤＣ（濾胞、Ｌｙｖｅ１−、ＭａｄＣＡＭ＋）。共存オーバーレイは、重ね合わせた画像上白色で示される。元の倍率：２００ｘ。図２Ｄは、フローサイトメトリー分析用に消化、染色したヒトリンパ節（非腸間膜由来）を示す。ドットプロットは、ｎ＝４の独立した実験の代表値である。
【００１６】
【図３】図３は、リンパ節がストローマ組成において部位特異的な変化を示すことを実証している。個々のＣ５７Ｂｌ／６マウスのリンパ節を、フローサイトメトリー用に消化、染色した。図３Ａは、リンパ節の細胞率を示す。図３Ｂは、ＣＤ４５陰性リンパ節ストローマサブセットの割合を示す。図３Ｃは、リンパ節ストローマサブセットの数を示す。図３Ｄは、ＭａｄＣＡＭ＋細胞を全ＦＲＣまたはＬＥＣの割合として示す。図３Ｅは、ＭａｄＣＡＭ＋ＦＲＣまたはＬＥＣの総数を示す。図３Ｆは、同年齢Ｒａｇ−／−またはＷＴ（Ｂ６）マウスから単離された皮膚流入領域リンパ節の細胞率を示す。図３Ｇは、同年齢Ｒａｇ−／−またはＷＴマウスのリンパ節ストローマの数を示す。図３Ｇは、同年齢Ｒａｇ−／−またはＷＴマウスのリンパ節ストローマの数を示す。図３Ｈは、同年齢Ｒａｇ−／−またはＷＴマウスのＳＬＮ中のＭａｄＣＡＭ＋ＦＲＣ（ＭＲＣ）またはＬＥＣの割合を、図３Ｉはその数を示す。プロットは、ｎ＝５匹のマウスの代表値である。図３Ｊは、ＭＲＣまたはＭａｄＣＡＭ＋ＬＥＣにおけるＭａｄＣＡＭ染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。ＷＴ＝野生型。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１  Mann-Whitney Ｕ検定。２〜３つの独立した実験のｎ＝５〜１０匹のマウス。
【００１７】
【図４】図４は、リンパ節ストローマ細胞の濃縮およびソーティングを示す。図４Ａでは、６〜１０匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスの皮膚流入領域リンパ節を酵素消化し、オートＭＡＣＳを使用してＣＤ４５−ストローマ細胞を濃縮する。カラム（インプット）へ添加およびカラム（アウトプット）から回収したＣＤ４５−ストローマの数を図に示した。データは、ｎ＝５の独立した実験を示す。図４Ｂにおいて、ストローマのオートＭＡＣＳ濃縮でのストローマ細胞収率を算出した。図４Ｃは、オートＭＡＣＳ濃縮前後のストローマ細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。図４は、主要なリンパ節ストローマ細胞サブセットのソーティング法およびソーティング後の純度を示す。ドットプロットは、ＣＤ４５−ヨウ化プロピジウム−ストローマにゲートをかけた。
【００１８】
【図５】図５は、皮膚流入領域リンパ節からのマウスＦＲＣにおけるサイトカインの部位特異的な転写上方制御を示す。図５Ａは、皮膚流入領域（ＳＬＮ）または腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）からソーティングしたＦＲＣを比較するマイクロアレイ解析を示す。ドットプロットは、１５，４８６個の選択されたプローブのＳＬＮ対ＭＬＮの倍率変化に対するＰ値を示す。ＳＬＮで上方制御されたプローブは赤色で示し、ＭＬＮで上方制御されたプローブは青色で示す（Ｐ＜０．０５および倍率変化＞２；ｔ検定）。ｎ＝４−５の独立したレプリカ。図５Ｂは、ＳＬＮに濃縮された、サイトカインおよびサイトカインレセプターをコードする遺伝子を示す（ＫＥＧＧパスウェイｍｍｕ０４０６０；Ｐ＜０．０１５； Benjamini 補正あり改良フィッシャーの正確確率検定）。ＭＬＮに比較してＳＬＮにおける平均発現における倍率増加を示す。
【００１９】
【図６】図６は、マウスのＦＲＣの３次元（３Ｄ）培養がin vivoの機能を模倣することを示す。図６Ａでは、リンパ節を消化し、単一細胞懸濁液を５日間培養し、その後フローサイトメトリープロファイリング用にトリプシン処理し染色した。ストローマ細胞は、ＣＤ４５を使用して同定し（左パネル）、その後ＣＤ３１およびポドプラニンで染色した（右パネル、ＣＤ４５−ストローマにゲートをかけた）。特に、ＣＤ４５は造血細胞のマーカーであり、ストローマ細胞上には存在しない。図６Ｂにおいて、培養したストローマ細胞をＦＤＣ−Ｍ１または関連するアイソタイプ対照について染色した。図３Ｃは、高濃度トリプシンまたは低濃度トリプシンプロトコールを使用して回収した培養ストローマ細胞におけるＣＤ３１染色を示す。ドットプロットは、ｎ＝３の独立した実験を示す。図６Ｄでは、培養ストローマ細胞を回収後、オートＭＡＣＳを使用して精製した。ＦＲＣ、ＬＥＣまたはＦＲＣとＬＥＣとの混合物を、２Ｄ（プラスチック組織培養プレート）または３Ｄ（マトリゲルおよびコラーゲンゲル）に播種し、イメージング前に更に３日間培養した。元の倍率１０ｘ。画像は、ｎ＝２の独立した実験を示す。図６Ｅでは、ＦアクチンおよびＤＡＰＩを使用して２Ｄまたは３Ｄの精製ＦＲＣを染色し、ネットワークを強調した。画像は、ｎ＝３の独立した実験を示す。（Ｆ）精製したＦＲＣを、ＰＰ２添加ありまたは添加無しで、９６穴プレートの３Ｄ培養に配置した。２４〜３６時間後、ゲル収縮を数量化した。画像は、ｎ＝３の独立した実験の代表である。棒グラフは、平均値＋標準偏差、Ｐ＜０．０５、ｔ検定を示す。図６Ｇでは、精製したＦＲＣを精製した樹状細胞（ＤＣ）またはＢ細胞とともに３Ｄ培養に配置し、その後画像を９０秒毎に逐次取り込んだ。上部パネルは、取り込んだ画像の静止画像を示す（元の倍率：２０ｘ）。下部パネルは、画像化したストローマ細胞および関連する遊走白血球のスケッチを示す。図６Ｈでは、ヒトリンパ節を消化し、単一細胞懸濁液を７日間培養し、その後フローサイトメトリープロファイリング用にトリプシン処理、染色した。
【００２０】
【図７】図７は、ヒトリンパ組織由来サプレッサー細胞が活性化同種脾細胞の増殖を抑制することを示す。未分画のＬＳＳＣを、血縁でないドナーから新たに単離したヒト脾細胞とともに培養した。脾細胞は、細胞が分裂すると希釈される蛍光染料であるＣＦＳＥで標識した。脾細胞集団内のＴ細胞は、ＰＨＡおよびＩＬ−２を使用して活性化した。ヒストグラムは、Ｔ細胞抗原レセプターの発現により同定したＴ細胞を示す。比率は、ストローマに対する脾細胞の割合を示す。
【００２１】
【図８】図８は、ヒトＬＳＳＣが、活性化された異種Ｔ細胞の増殖を抑制することを示す。未分画のＬＳＳＣを、新たに単離されたマウス脾細胞とともに培養した。脾細胞は、細胞が分裂すると希釈されるＣＦＳＥで標識した。Ｔ細胞は、その後抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を使用して活性化した。ヒストグラムは、Ｔ細胞抗原レセプターの発現により同定したＴ細胞を示す。比率は、ストローマに対する脾細胞の割合を示す。
【００２２】
【図９】図９は、ＬＳＳＣが、新規機序によりＴ細胞増殖を抑制することを示す。図９Ａでは、未分画のヒトＬＳＳＣを、野生型またはＩＦＮγ−／−マウス由来の新たに単離された脾細胞とともに培養した。脾細胞は、細胞が分裂すると希釈されるＣＦＳＥで標識した。Ｔ細胞は、その後、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を使用して活性化した。ヒストグラムは、Ｔ細胞抗原レセプターの発現により同定したＴ細胞を示す。比率は、ストローマに対する脾細胞の割合を示す。図９Ｂでは、ＰＤＰＮ＋、ＰＤＰＮ−および未分画のＬＳＳＣを、血縁でないドナーから新たに単離、精製したヒト血液由来のＴ細胞とともに培養した。Ｔ細胞は、細胞が分裂すると希釈されるＣＦＳＥで標識した。Ｔ細胞は、ＰＨＡおよびＩＬ−２を使用して活性化した。ヒストグラムは、Ｔ細胞抗原レセプターの発現により同定されたＴ細胞を示す。上清を収集し、一酸化窒素の転化生成物である亜硝酸塩が存在するかどうかテストした。
【００２３】
【図１０】図１０は、ヒトリンパ組織由来サプレッサー細胞の２つの主要な亜集団がそれぞれ活性化同種Ｔ細胞の増殖を抑制することを示す。図１０Ａにおいて、ＬＳＳＣの２つの亜集団は、糖タンパク質−３６（ＰＤＰＮとしても知られている）の発現または欠如に基づいて精製した。両亜集団は、非内皮（ＣＤ３１陰性）および非造血（ＣＤ４５陰性）であった。図１０Ｂでは、ＰＤＰＮ＋ＬＳＳＣ、ＰＤＰＮ−ＬＳＳＣまたは未分画のＬＳＳＣを、血縁でないドナーから新たに単離、精製したヒト血液由来のＴ細胞と１：５（ＬＳＳＣ：Ｔ細胞）の比率で培養した。Ｔ細胞は、細胞が分裂すると希釈されるＣＦＳＥで標識した。Ｔ細胞は、ＰＨＡおよびＩＬ−２を使用して活性化した。ヒストグラムは、Ｔ細胞抗原レセプターの発現により同定されたＴ細胞を表す。比率は、ストローマに対する脾細胞の割合を示す。
【００２４】
【図１１】図１１は、ヒトＬＳＳＣが、予め活性化した同種Ｔ細胞の分裂を停止させることを示す。ＰＤＰＮ＋ＬＳＳＣ、ＰＤＰＮ−ＬＳＳＣまたは未分画のＬＳＳＣを、血縁でないドナーから新たに単離、精製したヒト血液由来のＴ細胞と培養した。Ｔ細胞は、細胞が分裂すると希釈されるＣＦＳＥで標識した。Ｔ細胞は、ＰＨＡおよびＩＬ−２を使用して活性化し、２日間分裂させ、その後一部のＴ細胞をＬＳＳＣ上に再播種し再刺激するか、ＬＳＳＣなしで再播種し再刺激するか、再刺激せずに再播種した。ヒストグラムは、Ｔ細胞抗原レセプターの発現により同定されたＴ細胞を表す。比率は、Ｔ細胞に対するＬＳＳＣの割合を示す。
【００２５】
【図１２】図１２は、ヒトＬＳＳＣが、重度の移植片対宿主病に罹患したマウスにおいて早期死亡率を有意に低減することを示す。レシピエントマウスは、同種骨髄移植（分割致死線量照射の後、全骨髄の静脈注射）を受けた。重度のＧＶＨＤを、アロ反応性Ｔ細胞を含有するドナー由来脾細胞を同時注射することにより、移植時に誘発した。１ｘ１０６個のヒトＬＳＳＣを、ＧＶＨＤ誘発後の時点で腹腔内に注射し、一方、対照マウスは生理食塩水（媒体）を受けた。生存をモニターした。
【００２６】
【図１３】図１３は、ＬＳＳＣの転写特性を示す。ヒトＬＳＳＣの転写特性は、表面マーカーをフローサイトメトリーにより、分泌された因子をＲＴ−ＰＣＲにより（図１３Ａ）およびｍＲＮＡトランスクリプトームを得るために Affymetrix Hu Gene ST1.0 遺伝子配列（図１３Ｂ）を使用した。
【図１４】図１４は、ヒトＬＳＳＣの形態的特徴を示す。ウシ胎児血清を添加したαＭＥＭ中で増殖した培養ＬＳＳＣは、線維芽細胞様形態を示した。それらはしばしば、長い突起、葉状仮足、糸状仮足、波状のリーディングエッジおよび接着点を示した。元の倍率：１００ｘ。
【図１５】図１５は、ex vivo増幅したマウスリンパ節ストローマが急性敗血症性ショックの死亡率を低減することを示す。
【００２７】
【図１６】図１６は、２つの異なるマウスモデルにおいて、マウスのＦＲＣが治療時に投与されることで敗血症を防ぐことを示す。図１６Ａでは、３〜６週齢の若年Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスを、細菌細胞壁の一部を形成し強力な全身免疫応答を誘発する多糖類であるＬＰＳのＬＤ１００用量で処置した。このモデルには活性な感染症がないので、このモデルは「無菌性敗血症」として知られている。マウスがＬＰＳを受けた４時間後に、それらを生理食塩水中のＦＲＣまたは対照として生理食塩水のどちらかで処置した。グラフは、経時の生存率％を示す。図１６Ｂでは、無菌性敗血症を、図１６Ａで詳細に述べたのと同様に老齢マウス（１８〜２４ヶ月）に誘発した後、４時間後にＦＲＣか生理食塩水のどちらかで処置した。生存率をモニターした。図１６Ｃでは、糞便を腹膜腔の中に溢流させるように針で２度腸を穿刺し、２４時間以内に血液敗血症に進行する重度の感染症をおこすことにより、若年マウスに腸管穿孔（ＣＬＰ）敗血症を誘発した。このモデルは、虫垂破裂、銃創または他の腸への外傷を模倣する。自己ＦＲＣを、ＣＬＰの４時間後に投与した。図１６Ｄでは、若年マウスに、ＣＬＰ敗血症を発症させ、抗生物質で処置した。ＣＬＰの４時間後に、マウスに、表示したように生理食塩水、同種ＦＲＣまたは同種ＭＳＣを与えた。ＭＳＣ（間葉系ストローマ細胞）を、細胞ベースの陰性対照として使用した。ＭＳＣは抑制性ストローマ細胞タイプであるが、数名の著者が、それらを同種治療として治療時（敗血症発作後６０分以内）で投与すると、敗血症に対する効果が最小または全くないことを示している（Nemeth et al. 2010; Mei et al. 2010）。我々の結果も同様に、全体としてＭＳＣ投与の延命効果は示さなかったが、一方、同種ＦＲＣは有意な延命効果を付与した。図１６Ｅでは、図１６ＤのマウスをＣＬＰの１６時間後に評価した。血漿中の重要なサイトカインの濃度を測定し、生理食塩水または同種ＦＲＣで処置したマウスと未処理（非敗血症性）のマウスとを比較した。点線は、信頼区間の下限および上限を示している。
【００２８】
【図１７】図１７は、マウスのＦＲＣが、大腸炎による死亡を防ぐことを示している。大腸炎は、精製したナイーブＴ細胞を免疫不全マウスに注射することで誘発した。マウスは、未知の抗原に対してＴ細胞介在性の炎症を発症し（ヒトの疾患と同様に）、重度の体重減少と、結腸の肥大および死亡となった。これは、ヒト慢性大腸炎またはクローン病のモデルである。同種ＦＲＣは、マウスが病気の徴候と重度の体重減少を示した後の、２週間の時点で投与した（治療時間経過）。生理食塩水で処置した対照と比較して、ＦＲＣを２週目から６週目まで週２回注射した。生存率をモニターした。
【００２９】
【図１８】図１８は、ヒトＬＳＳＣが可溶性サイトカインレセプターを分泌することを示す。ヒトＬＳＳＣは、刺激または外来因子の添加無しに、ＢＳＡ入りＤＭＥＭ中で培養した。可溶性サイトカインレセプタータンパク質は、 Luminex Corporation のＭＡＧＰＩＸシステムを使用説明書通りに使用して、播種の２３時間後培地から検出した。可溶性サイトカインレセプターは、遊離のサイトカインに結合し、in vivoでそれらの炎症促進性機能を防止することが可能である。
【００３０】
【図１９】図１９は、リンパ節および扁桃腺から単離したＬＳＳＣが、表現型的に類似していることを示している。リンパ節または扁桃腺由来のヒトＬＳＳＣは、識別子の表面発現をフローサイトメトリーで評価した。すべての細胞は、ＣＤ４５陰性およびＣＤ３１陰性である。
【００３１】
【図２０】図２０は、リンパ節（図２０Ａおよび図２０Ｂ）および扁桃腺（図２０Ｃおよび図２０Ｄ）から単離したＬＳＳＣの可溶性因子によるＴ細胞抑制率が、同等のレベルであることを示している。ヒト血液由来の同種Ｔ細胞を、細胞が分裂するたびに希釈されるＣＦＳＥで標識した。その後、Ｔ細胞は、リンパ節または扁桃腺から単離したｈＬＳＳＣの存在下または非存在下に、ＰＨＡおよびｈＩＬ−２を使用して活性化した。ｈＬＳＳＣは、ウェル中に存在しているか、あるいは可溶性因子は通過させるが細胞は通過させない０．４μｍトランスウェル膜によりＴ細胞から物理的に分離された。トランスウェル有りまたは無しで、Ｔ細胞に対するｈＬＳＳＣを異なる比率でインキュベートしたとき、一度、二度、三度分裂、または全く分裂しなかったＴ細胞の％を示す。可溶性因子による抑制率％を、トランスウェルありで分裂したＴ細胞／トランスウェルなしで分裂したＴ細胞ｘ１００として算出した。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
ある側面では、本発明は、単離されたリンパ組織由来抑制性ストローマ細胞（ＬＳＳＣ）に関する。本明細書には、商業上実用可能な様式でＬＳＳＣを単離しex vivo増幅するおよび方法、ＬＳＳＣを含む新規組成物およびＬＳＳＣの使用、特に自己、同種および異種免疫応答を抑制するための治療への応用が記載される。
本発明者等は、リンパ節のストローマ細胞が免疫系の活性を抑制可能であることを発見した。更に、リンパ組織由来ストローマ細胞は免疫細胞を誘引するが、これは、他の免疫抑制性ストローマ細胞集団の特徴としては知られていない。リンパ組織由来ストローマ細胞がＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞などの免疫細胞を誘引する能力は、それらの免疫抑制機能と組合わせて、対象における免疫応答を抑制するための驚くべきほど効果的な治療ツールとなるであろう。ＬＳＳＣは、単独であるいは他の免疫抑制薬と組合わせて、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞およびマクロファージの活性を抑制するために使用可能である。
【００３３】
リンパ節は、身体のリンパ管の交差点にある重要な二次的なリンパ器官であり、抗原提示細胞とナイーブＴおよびＢ細胞との間の効率的な相互作用を可能とし、免疫応答の効果的な開始を促進する（Warnocket al., 1998, Mebius, 2003, Katakai et al., 2004a, Katakai et al., 2004b, Sixt et al., 2005, Bajenoff et al., 2006, Junt et al., 2008)。リンパ節ストローマ細胞は、ナイーブＴ細胞の維持を促進することに重大な役割を有するが、それは正当に評価されているとはいえないであろう（Link et al., 2007）。
【００３４】
リンパ節は分離可能であり、得られた細胞は培養で増殖する。「リンパ組織由来の抑制性ストローマ細胞」とは、組織培養皿に接着し、ある期間維持可能なリンパ組織中に存在するすべての細胞タイプを意味する。培養細胞は異種集団であってもよく、細網線維芽細胞（ＦＲＣ）、濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）、リンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）、血管内皮細胞（ＢＥＣ）および辺縁細網細胞（ＭＲＣ）などのリンパ節内に常在するほとんどの細胞からなる。また、培養細胞は、同種集団であっても、ＦＲＣ、ＦＤＣ、ＬＥＣ、ＢＥＣおよび／またはＭＲＣから任意に選択した組み合わせであってもよい。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法を使用して、ＬＳＳＣを単離し、ex vivo増幅する。ＬＳＳＣは、皮膚または腸間膜リンパ節、脾臓、胸腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺および／またはパイエル板由来であってもよい。ＬＳＳＣは、造血ＬＳＳＣを含まないまたはそれが枯渇させてある。いくつかの態様において、ＬＳＳＣは、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、イノシシ科、ウシ科および齧歯類からなる群から選択される種由来である。
【００３５】
特徴的なストローマサブタイプ細胞がリンパ節に構造を付与し、各微小ニッチを維持する。Ｔ細胞領域細網線維芽細胞（ＦＲＣ）はケモカインＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１を発現してＴ細胞および樹状細胞（ＤＣ）を誘引し、これらの細胞が動き回るためのコラーゲンおよび細胞外マトリクスの複雑な網目構造を構成する（Ansel et al., 2000, Luther et al., 2000, Katakai et al., 2004b, Bajenoff et al., 2006, Link et al., 2007, Woolf et al., 2007）。ＦＲＣと類似しているがＢ細胞を誘引することに特化して、濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）は、Ｂ細胞を誘引することと抗原呈示とに特化した希少なストローマサブセットである。ＦＤＣは、Ｂ細胞性濾胞内にのみ見つかっており、ＣＸＣＬ１３の分泌により作られる（Cyster et al., 2000）。リンパ節皮膜は、基本的にはリンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）から構築された肥大したリンパ管であり、間質液をリンパ節に運び、実質の中へ注ぐ。それは、傍皮質および皮質を通ってろ過され、最終的に髄質における輸出リンパ管に達し、リンパ液はそこから更に上流に運ばれる（Mebius, 2003, Willard-Mack, 2006）。血管内皮細胞（ＢＥＣ）は、ナイーブＴ細胞を血流から誘引することに特化した高内皮細静脈を含む、皮質血管および毛細血管を構築する（Mebius, 2003, Willard-Mack, 2006）。
【００３６】
他の数種のストローマサブセットが文献で報告されているが、十分に研究されておらず、それらの分化系列および主要な機能は明らかとなっていない（（Fletcher et al., 2011）の概説参照）。辺縁細網細胞（ＭＲＣ）は、皮膜下洞の皮質面で増殖するＣＸＣＬ１３産出ストローマのサブセットである（Katakai et al., 2008)。この細胞は、ポドプラニン発現など、ＦＲＣと類似しているがその起源は不明である（Katakai et al., 2008）。脾臓において、類似ストローマサブセットは、未熟Ｂ細胞の濾胞への移動にとって重要である（Ansel et al., 2000）。ＭＲＣは、リンパ節器官形成を担う（Coles et al., 2010）リンパ組織形成体（ＬＴｏ）サブセットと生後均等物であると仮定される（Katakai et al., 2008）。実際、生後ポドプラニン＋脾臓ストローマが、造血リンパ組織誘導細胞との相互作用により再生可能であることが十分に示されている（Scandella et al., 2008）。
【００３７】
本発明にしたがって、ＬＳＳＣを免疫応答の抑制のために使用する。したがって、本発明の側面は、そのような処置を必要とする対象に、単離されたリンパ組織由来抑制性ストローマ細胞（ＬＳＳＣ）を、該対象における免疫応答を抑制する効果のある量で投与することにより免疫応答を抑制する方法に関する。
本明細書で使用される「単離された」とは、非ストローマ細胞の他の集団からストローマ細胞の集団を分離することを意味する。単離は、細胞を分離する任意の手順、例えば、増殖条件、磁気ビーズの使用などの精製法、セルソーティングまたは他の同様の方法により行うことが可能である。いくつかの態様において、ＬＳＳＣは、本明細書に記載される方法を使用して単離される。
【００３８】
本明細書において使用される「抑制する」とは、例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞の活性低減や体液性および細胞性応答の低減などの、免疫応答の顕在化の程度または重症度または範囲または持続期間を低減することを意味する。「抑制」は、例えば、ＬＳＳＣの存在下または非存在下にＴ細胞またはＢ細胞分裂の存在または速度を調べること、ＬＳＳＣの存在下または非存在下に免疫細胞によるサイトカインの放出を調べること、ＬＳＳＣの存在下または非存在下に抗体産生を測定すること、またはＬＳＳＣの存在下または非存在下にＣＴＬ機能を測定することによって測定可能である。同様に、免疫応答の抑制は、処置すべき疾患に関連する炎症または他の症状の低減を判定することによるなど、症候に基づいて測定可能である。免疫応答の「抑制」には、これらの免疫応答の徴候のいかなるものも完全な消失または防止を必要とするものではなく、むしろ、臨床上または他の実際上重要である、程度または重症度または範囲または持続期間の低減を必要とする。いくつかの態様において、抑制は、ＬＳＳＣの存在下または非存在下に予め活性化した同種Ｔ細胞の細胞分裂の速度を調べることで測定される。いくつかの態様において、抑制は、ＬＳＳＣの存在下または非存在下に、移植片対宿主病に罹患したマウスにおける死亡率を調べることで測定する。いくつかの態様において、抑制は、マウスにおける急性敗血症性ショックの死亡率を調べることで測定する。
【００３９】
いくつかの態様において、かかる処置を必要とする対象は、自己免疫または炎症性疾患を有する。
「自己免疫または炎症性疾患」という用語は、患者の免疫応答が患者自身の構成物に向けられ、望ましくない、しばしば極度に衰弱する病状をもたらす病態および病状を意味する。本明細書において使用される「自己免疫または炎症性疾患」は、自己免疫病状、症候群などを更に含むことを意図している。自己免疫または炎症性疾患の例としては、それに限定するものではないが、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、移植片対宿主病および敗血症が挙げられる。
【００４０】
いくつかの態様において、処置を必要とする対象が、上記の病状を１つ以上有すると同定された対象、すなわち、医師に（例えば、当業分野で公知の方法を使用して）上記の疾病又は病状を有すると診断された対象である。いくつかの態様において、処置を必要とする対象が、上記の疾病又は病状を示唆する１つ以上の症状（例えば、極度の疲労や関節痛）を呈する対象などの、上記の疾病又は病状を有するか発症することが疑われる対象である。いくつかの態様において、処置を必要とする対象が、自己免疫または炎症性疾患を発症する１つ以上の危険因子を有する対象である。危険因子としては、限定されるものではないが、性別、年齢、遺伝的素因、自己免疫または慢性炎症性疾患の既往および生活習慣などが挙げられる。「処置を必要とする対象」という用語には、更に、上記の疾病又は病状をかつて有していたがその症状が寛解している人も含まれる。
【００４１】
いくつかの態様において、処置を必要とする対象が、自己免疫または炎症性疾患を有するか、有すると疑われる。対象は、例えば、異常な自己抗体価を呈していてもよい。
対象は動物であり、典型的には哺乳類である。ある側面では、対象はイヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシまたは齧歯類である。重要な実施態様では、対象はヒトである。
ＬＳＳＣは、有効量が投与される。有効量は、医療的に望ましい結果を得るのに十分な用量であり、通常の方法を使用して当業者により決定可能である。いくつかの態様において、有効量は、処置すべき病状に改良をもたらす量である。いくつかの態様において、有効量は、処置すべき疾病又は病状の種類および範囲および／または１つ以上の追加の治療薬剤の使用に依存するであろう。しかしながら、当業者は、例えばin vitroおよび／またはin vivo試験および／または化合物用量の他の知識に基づいて、使用する治療薬剤の適切な用量および範囲を決定可能である。
【００４２】
対象に投与するときは、治療薬の有効量は、もちろん、処置すべき具体的な疾患；疾患の重症度；年齢、身体的条件、大きさおよび体重などの個々の患者のパラメーター、併用する処置、処置の頻度、投与の形態に依存するであろう。これらの因子は、当業者には周知であり、通常の実験によって対処できるであろう。いくつかの態様において、最大用量、すなわち健全な医療的判断によって安全な最高用量が使用される。
自己免疫または炎症性疾患の処置においては、有効量は、疾患の進行を遅延する量、疾患の進行を停止する量、または疾患の進行を逆行させる量である。有効量には、自己免疫または炎症性疾患と関連する１つ以上の症状を遅延、低減、阻害、寛解、または逆行させる量も含まれる。いくつかの態様において、そのような用語は、１つ以上の関節の腫脹の低減、または自己免疫または炎症性疾患に関連する疼痛、疲労および／または発熱の低減を意味する。いくつかの態様において、そのような用語は、自己免疫または炎症性疾患と関連する循環自己抗体のレベルの低減を意味する。いくつかの態様において、そのような用語は、ヒトのＰＡＳＩスコアの低減を意味する。いくつかの態様において、そのような用語は、ヒトのグローバル・アセスメント・スコアの改善を意味する。
【００４３】
いくつかの態様において、対象のキログラム基準で少なくとも１０万個のＬＳＳＣが、１回以上の用量投与で１日または数日間（もちろん、投与形態および上記の因子に依存する）、対象に投与される。いくつかの態様において、対象のキログラム基準で少なくとも１００万個のＬＳＳＣが対象に投与される。いくつかの態様において、対象のキログラム基準で少なくとも１，０００万個のＬＳＳＣが対象に投与される。治療薬の実際の投与量は、特定の患者、組成および投与の形態において望ましい治療応答を達成する効果のある量を得るために変化可能である。選択した投与量は、特定の化合物の活性、投与経路、処置する組織、処置する患者の前病歴に依存する。しかしながら、所望の効果を達成するのに必要とされるよりも少ない量で化合物を投与することから始め、所望の効果を達成するまで用量を徐々に増加することは、当業者の技能の範囲内である。
【００４４】
いくつかの態様において、対象に投与されるＬＳＳＣは、ex vivo増幅細胞である。ＬＳＳＣは、培地中で細胞を増殖することで、ex vivo増幅される。単離したＬＳＳＣは、例えば、成長因子、血清、血小板溶解物および抗生物質の１つ以上を添加した基底細胞培地を含む培地で増殖することができる。いくつかの態様において、単離したＬＳＳＣを、例えば、ウシ胎仔血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを添加した最小必須培地（ＭＥＭ）アルファ培地中で増殖する。いくつかの態様において、対象に投与されるＬＳＳＣは、非ＬＳＳＣを実質的に含まない。いくつかの態様において、ＬＳＳＣは、対象に対して自己、同種または異種である。
【００４５】
ＬＳＳＣを含む医薬製剤は、任意の適切な経路から対象に投与される。例えば、組成物は、静脈内、腹腔内、動脈内、皮下または筋肉内注射により、または病変部、臓器、臓器皮膜、脂肪またはリンパ節への局所投与により、対象に投与可能である。
いくつかの態様において、ＬＳＳＣは、対象に埋め込まれる二次元または三次元フレームワーク上または中に存在する。インプラントまたはマトリックスとしては、繊維またはハイドロゲルに基づいたデバイスなどの高分子マトリックスが挙げられる。インプラントは、生分解性であっても生分解性でなくてもよい。繊維またはハイドロゲルインプラントは、市販の材料を使用して製造または構築可能である。インプラントは通常は、天然または合成高分子から生成される。ＬＳＳＣは、細胞懸濁液をインプラントへ塗布することでインプラントに播種される。これは、インプラントを細胞培養容器に浸漬すること、または細胞の注射、他にはインプラントへの直接塗布により達成可能である。細胞を播種したインプラントは、標準的な外科技術を使用して埋め込まれる。インプラントは、移植の前にin vitroで播種・培養すること、播種しすぐに埋め込むこと、または埋め込んだ後に細胞を播種することが可能である。好ましい実施態様では、細胞をインプラント上または中に播種し、約１０時間から２週間の間in vitroで培養する。
【００４６】
本発明のいくつかの側面では、リンパ組織由来抑制性ストローマ細胞（ＬＳＳＣ）を単離する方法に関する。この方法は、酵素混合物および攪拌を併用してリンパ組織断片を消化すること、その後ＬＳＳＣを収集することを含む。いくつかの態様において、リンパ組織断片の消化は、以下を含む一連の工程で行われる：（ｉ）リンパ組織断片を酵素混合物とともにインキュベートする；（ｉｉ）組織を、ピペットを使用して攪拌し、その後インキュベーションして大きな断片を沈降させる；（ｉｉｉ）上清を取り除き、すべての断片が消化されるまで工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返す。その後、すべての上清画分をプールしてＬＳＳＣを収集した後、遠心分離により細胞ペレットを得る。いくつかの態様において、酵素混合物は、培地、ディスパーゼ、コラゲナーゼおよびＤＮａｓｅＩを含む。ＬＳＳＣは、皮膚または腸間膜リンパ節、脾臓、胸腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺および／またはパイエル板由来であってもよい。単離した細胞は、上記したように免疫応答を抑制するために使用できる。
【００４７】
単離したＬＳＳＣは、成長因子、血清、血小板溶解物および抗生物質の１つ以上を添加した基底細胞培地を含む培地中で増殖することが可能である。いくつかの態様において、ＬＳＳＣを、ウシ胎仔血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを添加した最小必須培地（ＭＥＭ）アルファ培地中で増殖する。いくつかの態様において、単離したＬＳＳＣを、０．１〜２１％の酸素分圧で増殖する。いくつかの態様において、単離したＬＳＳＣを、２．５〜２１％の酸素分圧で増殖する。
いくつかの態様において、ＬＳＳＣが非ＬＳＳＣを実質的に含まなくなるまで、ＬＳＳＣを増殖する。いくつかの態様において、ストローマ細胞の数が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、２００％またはそれ以上増加するまで、ＬＳＳＣを増殖する。いくつかの態様において、単離したＬＳＳＣを１〜１０，０００個／ｃｍ２の密度で増殖する。いくつかの態様において、単離したＬＳＳＣを１０〜５００個／ｃｍ２の密度で増殖する。
【００４８】
本発明のいくつかの側面によれば、組成物が提供される。この組成物は、単離されたリンパ組織由来抑制性ストローマ細胞（ＬＳＳＣ）を含み、ＬＳＳＣは本明細書に記載される方法により単離される。例えば、ＬＳＳＣは、酵素混合物および攪拌を併用してリンパ組織断片を消化した後ＬＳＳＣを収集することにより単離される。
本発明のいくつかの側面によれば、医薬製剤が提供される。この医薬製剤は、単離したリンパ組織由来抑制性ストローマ細胞（ＬＳＳＣ）の組成物を含む。ＬＳＳＣは、化学的、機械的、および電気的細胞分離プロセスの１つ以上を使用してリンパ組織断片を処置した後、ＬＳＳＣを収集することにより単離することができる。例えば、細胞は、酵素的または化学的消化、物理的破壊および攪拌、および／または電場の使用により分離できる。
【００４９】
単離したＬＳＳＣは、細胞培養により増幅できる。いくつかの態様において、単離したＬＳＳＣはex vivo増幅細胞である。いくつかの態様において、単離したＬＳＳＣは、ＬＳＳＣが非ＬＳＳＣを実質的に含まなくなるまで、収集した細胞を増殖することにより増幅される。これらの細胞は、成長因子、血清、血小板溶解物および抗生物質の１つ以上を添加した基底細胞培地を含む培地中で増殖できる。
【００５０】
いくつかの態様において、単離したＬＳＳＣは、血小板由来の成長因子レセプター、アルファポリペプチド（ＰＤＧＦＲαまたはＣＤ１４０ａ）およびプログラム細胞死１リガンド２（ＰＤ−Ｌ２またはＣＤ２７３）を共発現する。いくつかの態様において、単離したＬＳＳＣは、ＣＤ１４０ａおよびリンホトキシンβレセプター（ＬＴＢＲ）を共発現する。いくつかの態様において、単離したＬＳＳＣは、ＣＤ１４０ａ、ＰＤ−Ｌ２およびＬＴＢＲを共発現する。単離したＬＳＳＣは、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、Ｔｈｙ−１細胞表面抗原（Ｔｈｙ−１）、粘膜血管アドレシン細胞接着分子１（ＭＡＤＣＡＭ−１）、ミオシン重鎖１１（ＭＹＨ１１）、インターロイキン７レセプター（ＩＬ−７Ｒ）またはインテグリンアルファ７（ＩＴＧＡ７）からなる群から選択される他のリンパ球マーカーの１つ以上を発現してもよい。いくつかの態様において、単離したＬＳＳＣは、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２１（ＣＣＬ２１）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの因子を発現する。
【００５１】
ＬＳＳＣは、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、イノシシ科、ウシ科および齧歯類の動物からなる群から選択される種から単離することができ、in vitroでＴ細胞増殖を抑制する。
本発明の医薬製剤は、医薬的に許容される担体を含むか、またはそれで希釈されてもよい。本明細書において使用される「医薬的に許容される担体」という用語は、ヒトまたはイヌ、ネコまたはウマなどの他の哺乳類への投与に好適である、適合性のある充填剤、希釈剤または他の同様の物質の１つ以上を意味する。「担体」という用語は、有効成分が混合されて投与を容易にする有機または無機、天然または合成の成分を意味する。担体は、所望の医薬的効能や安定性を実質的に損うような相互作用がない仕方で、本発明の調製物と、および相互に混合可能である。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの製剤に好適な担体は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Paが参照できる。
【００５２】
本発明を、以下の例により更に説明するが、それによって更に限定されるものではない。本明細書で言及したすべての文献（参考文献、発行された特許、公開特許申請書および同時申請中の特許申請書など）は、その全体が参照により組み込まれるものである。
【００５３】
例
材料および方法
マウス
４〜６週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、 Jackson Laboratory から入手した。 ImmGen 選別に使用したマウスは、正確に６週齢とした。雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｒａｇ−／−マウスは、 Taconic から入手した。すべてのマウスは輸送後５日間休息させ、特定の病原体を有さず、研究所のガイドラインおよびアメリカ国立衛生研究所のガイドラインに則って世話をした。実験手順は、 Dana-Farber Cancer Instutute のリサーチ・アニマル・ケア小委員会の承認を得て行った。
【００５４】
ヒトリンパ節
ヒトリンパ節は、National Disease Resarch Interchagne (NDRI) のリソースセンター（Philadelphia, USA）を介して死体ドナーから調達した。無傷のリンパ節を、氷上ＤＭＥＭ中で輸送し、２４時間以内にフローサイトメトリーまたは細胞培養用に処理した。
【００５５】
抗体
マウスリンパ節ストローマのフローサイトメトリー、セルソーティングセルソーティングおよび凍結切片染色のために、以下の抗体を使用した。抗ＣＤ４５（クローン４０−Ｆ１１、 BD Biosciences）、抗ポドプラニン（クローン８．１．１、Developmental Studies Hybridoma Bank）、抗ＣＤ３１（クローンＭＥＣ１３．３、Biolegend）、抗Ｌｙｖｅ１（クローン１０．１．１、 Dr. Andrew Farr の厚意により入手）および抗ＭａｄＣＡＭ（クローンＭＥＣＡ−３６７、eBioscience）。ヨウ化プロピジウムおよびクローンＴＥＲ１１９（Biolegend）を適宜使用し、死んだ細胞および赤血球を排除した。ヒト細胞の染色のために、抗体として、抗ＣＤ４５（クローンＨＩ３０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗ＣＤ３１（クローンＷＭ５９、 BD Biosciences）および抗ポドプラニン（クローンＮＺ−１、  AngioBio  Co）を使用し、高度にクロス吸着した抗ｒａｔＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ−４８８（Invitrogen）で検出した。
【００５６】
個々のマウスからのリンパ節の酵素消化
フローサイトメトリー分析または細胞培養のために、個々のマウスからのリンパ節を切断、細いピンセットで一度貫通し、氷上で５ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０中に配置した。皮膚流入領域リンパ節の使用が特定されている場合は、腋窩、上腕および鼠径リンパ節を切断した。すべてのリンパ節を切断した後、ＲＰＭＩ−１６４０を除去し、０．８ｍｇ／ｍＬのディスパーゼおよび０．２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＰ（ともに Roche）および０．１ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Invitrogen）を含むＲＰＭＩ−１６４０からなる新たに調製した酵素混合物２ｍＬで置換した。試験管を水浴中３７℃でインキュベートし、内容物が十分に混合するよう５分の間隔でゆっくりと反転した。２０分後、１ｍＬのピペットを使用して、リンパ節を大変ゆっくりと吸引し吐出して、皮膜を破壊し、ほとんどの白血球を遊離した。混合物を水浴中に配置し、大きな断片を３０秒間沈降させ、その後、酵素混合物を除去し、１０ｍＬの氷冷ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＣＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ入りＰＢＳ）を添加し、遠心分離した（３００ｇ、４分、４℃）。２ｍＬの新鮮な酵素混合物を消化用試験管に添加し、内容物を１ｍＬのピペットを使用してゆっくり混合し、１ｍＬのピペットを使用して定期的にゆっくり混合しながらインキュベートした。１０分後、細胞を、１ｍＬのピペットを使用して３０秒間激しく混合した。断片を再び沈降させ、上清を取り出し、予めスピンした細胞ペレットに添加し、２ｍＬの新鮮な酵素混合物を消化用試験管に添加した。ここから、消化用ミックスを、光を透過させたときにすべての残存するリンパ節断片が完全に消化されたことが明らかになるまで、１ｍＬのピペットを使用して５分毎に激しく混合した。最初のインキュベーション時から完全な消化までのこの手順は、通常５０分かかったが、６０分を超えることはなかった。最終的に各採取用試験管が個々のマウスの回収したリンパ節の全細胞内容物を含むまで、取り出す度に上清を遠心分離した（３００ｇ、４分、４℃）。細胞を、８０μｍのナイロンメッシュで濾過し、血球計数器を使用してカウントし、トリパンブルーを使用して生存率を評価した。生存率は９５％を超えた。その後、染色毎に５ｘ１０６個の細胞を、５０μＬの希釈した抗体とともに、氷冷したＦＡＣＳバッファー（２％ＦＣＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ入りＰＢＳ）中４℃で２０分間インキュベートし、FACSCaliburまたはFACSAria IIu（BD Biosciences）上で取得した。
【００５７】
セルソーティングセルソーティングおよび大量単離用のプールしたマウスのリンパ節の酵素消化およびストローマ濃縮
多数のプールしたマウスの消化は、大概は２．１項に記載したように進行したが、以下のように変更した（図１にグラフで示す）：４〜１０匹のマウスからのリンパ節を、単一の試験管にプールし、一回の消化工程につき５ｍＬの酵素混合物を使用して消化した。リンパ節が十分に消化され、細胞を遠心分離し、カウントした後で、ＣＤ４５ミクロビーズおよびオートＭＡＣＳシステム（ともに Miltenyi）を使用して単一細胞調製物中の非造血ストローマ細胞を濃縮した。１０７個の細胞につき７μＬのビーズを使用し、４℃の回転ホイール上でＦＡＣＳバッファー中２０分間インキュベートした。標識した画分を、使用説明書に従ってディプリートプログラムを使用して枯渇させた。その後、濃縮したストローマをカウントし、セルソーティングセルソーティング用の抗体を多量（１０６個の細胞につき１００μＬの希釈抗体カクテル）使用して染色した。
【００５８】
ヒトリンパ節の酵素消化
ヒトリンパ節から、脂肪と結合組織を注意深く除去し、その後細いハサミを使用して小片に切り刻んだ（＜０．５ｃｍ）。２．４項にしたがって消化が進行したが、酵素濃度を、ＲＰＭＩ−１６４０中、２．４ｍｇ／ｍＬのディスパーゼおよび０．６ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＰ（ともにロシュ社）および０．３ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に増加した。いくつかのケースでは、臓器全体を消化する代わりに、リンパ節のすべての領域を代表する約２０個の断片混合物の一部をランダムに選択した。６０分後、詳細を上記したようにリンパ節断片を完全に消化後、濾過、カウントし、必要に応じて染色した。
【００５９】
低圧フローサイトメトリーによるストローマセルソーティング
ストローマ細胞のフローサイトメトリーによる選別は、専用の低圧、大開口構成を使用することにより改良される；しかしながら、非標準的な仕様にソーターを再設定し、その後純粋な集団を首尾よく選別することには、固有の技術的な課題がある。ここでは、２０ｐｓｉにセットし、１００μｍのチップを装着した、FACSDivaソフトウェア（すべてBD Bioscience）を利用したFACSAriaまたは改良型FACSAria IIu装置を使用した。装置によって異なるが、以下の仕様概略が、ストローマ選別用に設定した少なくとも４台の異なるFACSAria装置に適用されたことを見出した。これらは、製造会社により特定された設定提案とは異なるものである。
【００６０】
ストリーム覗き窓から可視となる液滴は、例えば７０ｐｓｉでは１０〜１２滴であるが、２０ｐｓｉでは５〜６滴ほどになるように、流圧を低下させると液滴サイズが増加する。液滴ブレークオフポイントは選別の成功に直接影響を与え、常時視認可能であるべきであるが、滴の頻度を増加した後でも、低圧での選別の間にサテライトの分解点が視界の下に起こる可能性がある。これは、選別の成功を妨げるものではないが、サテライト分解が確実にスクリーンの下１〜２滴以内に起こることが重要である。これは、２つの方法によって合理的に確立することが可能である：１つめは、サテライト分解点が視認可能となるように液滴ブレークオフポイントを視界上かつ視界外に一時的に調整し、下側へ再調整する前にブレークオフと分解の間で滴の数をカウントする；２つめは、サテライトと滴間の距離の減少を観察し、分解が起こるまで液滴の数を推定する。サテライトは、画面上で分解しない場合でも、分解寸前であるべきである。
【００６１】
重要なことであるが、減衰制御（滴の大きさを減じる）を適用するかどうかにより、その後の仕様が相当に変化する。減衰ありおよび減衰なしの両方のサンプル設定選別リポートを、参照として提供する（表１）。 BD Biosciences の使用説明書は、２０ｐｓｉでの選別時は減衰を適用しないことを推奨しているが、FACSAria（FACSAria IIuではそうではない）では良好なストリームを生成するために時として必要であった。１００μｍチップの手作業での調整が、FACSAriaを使用した良好なストリームの生成のために必要とされたが、Ｏリングが永久的に装着されたFACSAria IIuシステムでは、チップの移動または減衰の利用は必要ではなかった。
【００６２】
最後に、低圧で使用すると、６３３ｎｍのレーザー遅延が突然変化する可能性があることに気がついた。その理由は明らかではないが、遅延の設定にＣＳＴビーズを使用するか、または SPHERO Rainbow パーティクル（BD Bioscience）（または任意の同様な較正点検）を使用してレーザー機能をテストすることを推奨する。６３３ｎｍのレーザーからのシグナルがないことは、レーザー遅延を再較正する必要があるかもしれないことに留意されたい。
ストローマセルソーティングのための補正は、濃縮ストローマ細胞を使用して厳密に行われるべきである。ストローマは、ある程度の自己蛍光を伴う大きな細胞である。白血球を使用して補正した装置は、ストローマをソーティングするときは、集団の解像度が最適以下となる。未濃縮集団では、ストローマは稀であり、自己補正ソフトウェアは、消化された単一細胞懸濁液中の自己蛍光の正常なレベルと真のストローマ染色とを区別することができないので、濃縮ストローマを補正に使用すべきである。
【００６３】
装置が最適に較正されているときは、ソーティングストリームの優れた解像度と良好な効率でソーティングは進行する。ソーティングストリームは、ソーティング窓において明るい分離した点として良好に分離されるべきである；ソーティングストリームの「噴霧状態」は明らかであるべきではない。
オートＭＡＣＳ濃縮ストローマを、ＴＲＩｚｏｌ（Invitrogen）中へ高純度（＞９５％）に機械的にソーティングした。ＣＤ４５−ヨウ化プロピジウム−ストローマにゲートをかけた後、サブセットを以下のようにソーティングした：細網線維芽細胞（ＦＲＣ）、ポドプラニン＋ＣＤ３１−；リンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）、ポドプラニン＋ＣＤ３１−；血管内皮細胞（ＢＥＣ）、ポドプラニン−ＣＤ３１＋；二重陰性ストローマ細胞（ＤＮ）、ポドプラニン−ＣＤ３１−。
【００６４】
マイクロアレイ法および解析
１０，０００〜１５，０００個のソーティングした細胞からのＲＮＡを、既述の方法（Yamagata et al., 2004）で単離した後、使用説明書に従ってGeneChip Whole Transcript Sense Target Labeling Assayを使用して増幅し、Affymetrix GeneChip Mouse Gene 1.0 ST Arrays（Santa Clara, CA, USA）とハイブリッド形成した。これにより、各遺伝子の複数の位置に結合するよう設計されたプローブを使用して全転写情報を得た。生データを、GenePattern の Expression File Creator モジュールで、ロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）処理アルゴリズム（バックグラウンド調整、分位標準化および要約を行う）（Irizarry et al., 2003）を使用して標準化した。プローブリストを、少なくとも１つのサブセット（すべてのサブセットを通して平均発現値＜１２０の場合除外）における発現、およびレプリカ中の変動の少なさ（いずれかの集団において変動係数＞０．５の場合除外）に関して解析した。GenePattern の Multiplot モジュールを使用して、皮膚リンパ節ＦＲＣと腸間膜リンパ節ＦＲＣの差を算出した。差は、発現における倍率変化が＞２かつＰ＜０．０５（スチューデントのｔ検定）の場合、更なる解析が検討された。アウトプットされたデータのリストは、マイクロソフトエクセルを使用して順位付けし、遺伝子リストは、ＤＡＶＩＤプログラムの Functional Annootation ツール（NIAID, david.abcc.ncifcrf.gov（Dennis et al., 2003））を使用し、MoGene-1_0-st-v-1チップに設定した Affymetrix のエクソンバックグラウンドで、ＫＥＧＧパスウェイ全体を濃縮に関して解析した。複数の仮説（Benjamini）間の相関後のｔ検定Ｐ値＜０．０５でのＫＥＧＧパスウェイ解析は有意であると考えられた。データシリーズのＮＣＢＩＧＥＯアクセッション番号はＧＳＥ１５９０７である。
【００６５】
リンパ節ストローマ細胞培養技術
リンパ節を、詳細を上記したように、消化後カウントし、５ｘ１０５個／ｃｍ２の濃度で播種した。細胞培地として、１０％のバッチテストしたＩｇ低量ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン添加αＭＥＭを使用した。プレートは、２４時間後に洗浄し、非接着細胞を除去した。５日後、マウス細胞培養物は主にＬＥＣとＦＲＣを含んでいた。ヒト細胞培養物はよりゆっくりと増殖し、７日後に回収した。ヒトリンパ節ストローマ細胞培養物には、主にＦＲＣとＤＮが含まれていた。重要な細胞表面マーカーのトリプシンによる切断を最小とするためにＥＤＴＡ入り低濃度のトリプシン中での短時間のインキュベーションからなる非標準回収プロトコールを、通常通りに使用した（表２）。細胞をＰＢＳで洗浄し、残存するタンパク質を除去し、収集用バッファー（ＰＢＳ中５ｍＭ ＥＤＴＡ入り０．２％トリプシン）を培養プレートに添加した。細胞を収集用バッファー中３７℃で２分間インキュベートした。この時点で、それらの形態は丸くなり、同容積の完全培地をウェルにすぐに添加した。細胞を、１ｍＬピペットを使用して軽く撹拌しながらプレートから洗浄し、遠心分離（３００ｇ、３分、４℃）のために上清を他の同容積の完全培地に添加した。ＦＲＣおよびＬＥＣを再播種し、ソーティングまたは必要に応じてこの調製物からＭＡＣＳ精製した。
【００６６】
３次元培養およびネットワーク解析のために、細胞を、３．２ｍｇ／ｍＬの高濃度ラット尾部コラーゲンＩ（BD Biosciences）、１．８ｍｇ／ｍＬの Matrigel 基底膜マトリックス（BD Bioscience）、αＭＥＭ粉末（Invitrogen）から自家で調製した８．３％（ｖ／ｖ）の５ｘαＭＥＭストック、および播種すべき細胞を含む３０％（ｖ／ｖ）培地からなる変形可能マトリックス中で培養した。ゲル成分を氷上で混合し、２００μＬをイメージング用のプラスチックまたはガラス底の培養皿（MatTek）に播種した。ゲルは３７℃で１０分間放置して固化してから、培地で被覆した。収縮解析のために、ゲルは、平底の９６穴培養プレート中に作成し、１５時間後に写真撮影した。収縮は以下の式を使用して測定した：収縮したゲルの面積（ｃｍ２）／ウェルの面積（ｃｍ２）＊１００＝収縮％。微速度ライブ細胞イメージングのために、骨髄由来の樹状細胞またはＢ細胞を５：１の比率で精製培養ＦＲＣと混合した。イメージングの間、ゲルを、１０％ＦＣＳを含むαＭＥＭ中で１０％ＣＯ２とともに３７℃でインキュベートした。動画は、９０秒毎に１つのフレームを得る微速度イメージングを示す。
【００６７】
免疫組織学および共焦点顕微鏡法
リンパ節を新たに切断し、１０％パラホルムアルデヒド中で４時間固定し、１０％ショ糖溶液中に一晩放置した。その後、ブロックをＯＣＴ化合物（VWR）中に包埋し、急速冷凍し、その後、−８０℃で保管した。リンパ節は、 Leica 製クリオスタットを使用して凍結切片（７μｍ）し、アセトン固定後、２％ＢＳＡを使用して３０分間ブロッキングした。ＰＢＳ中で洗浄後、切片を一次抗体で６０分間染色後、洗浄し、二次抗体で６０分間染色した。スライドには、蛍光染色用マウンティングメディウム（DAKO）を使用してカバーガラスを載せ、４℃で保管した。画像は、Leica Sp5 共焦点顕微鏡を使用して取得した。
【００６８】
統計解析
GenePatternのMultiplotプログラムを使用して、任意のサンプルのレプリカ間の変動係数が０．５未満である標準化した配列データについてｔ検定Ｐ値を算出した。観察された倍率変化が２未満である場合、０．０５未満のＰ値を有意とみなした。遺伝子は、改良フィッシャーの正確確率検定およびBenjamini の多重仮説相関によるｔ検定を使用してデータを比較するＤＡＶＩＤプログラム（david.abcc.ncifcrf.gov）を使用して、ＫＥＧＧパスウェイ関連に対して解析し、特定のリストにおける２つ以上の遺伝子の濃縮を示した。ノンパラメトリックMann-Whitney Ｕ検定を使用して、フローサイトメトリーのデータを比較した（Prism）。
【００６９】
リンパ節ストローマ細胞の単離および培養
３〜６週齢のＣ５７Ｂｌ６／ＪマウスをＦＲＣドナーとして使用した。皮膚および腸間膜リンパ節を切断し、酵素的および機械的手段で消化した。１０匹のマウスからのリンパ節を、０．８ｍｇ／ｍＬのディスパーゼ、０．２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＰおよび０．１ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅを含むＲＰＭＩ−１６４０中３７℃で６０分間定期的に攪拌し、酵素混合物を交換しながらインキュベートした。消化した細胞は遠心分離により回収した。消化が完了したら、細胞をＲＰＭＩ−１６４０中に再懸濁し、８０μｍのメッシュで濾過し、血球計数器およびトリパンブルーを使用してカウントした。細胞は、５ｘ１０５個／ｃｍ２で培養フラスコに播種した。培地は、αＭＥＭ中に１％ペニシリン／ストレプトマイシンと１０％のバッチテストした低量ＩｇＦＣＳを含有した。２４時間後、細胞を洗浄し、更に６日間増殖後、ＰＢＳ中の０．２％トリプシンおよび５ｍＭ ＥＤＴＡを使用して一度継代培養し、使用前に更に５〜６日間増殖のために１：１０の比率でスプリットした。
【００７０】
ＭＳＣの単離および培養
ＭＳＣは、上記したＦＲＣドナーマウスの骨髄から収集した。大腿骨と脛骨を、１０匹のマウスから取り出した。骨髄を遠心分離により回収し、ピペットを使用して無菌のＲＰＭＩ−１６４０中に再懸濁した。細胞は、５ｘ１０５個／ｃｍ２で培養フラスコに播種した。培地は、αＭＥＭ中に１％ペニシリン／ストレプトマイシンと１０％のバッチテストした低量ＩｇＦＣＳを含有した。細胞は、２４時間後洗浄し、更に６日間増殖後、ＰＢＳ中の０．２％トリプシンおよび５ｍＭ ＥＤＴＡを使用して一度継代培養し、使用前に更に５〜６日間増殖のために１：１０の比率でスプリットした。
【００７１】
ＦＲＣおよびＭＳＣの精製
細胞は、ＰＢＳ中０．２％トリプシンおよび５ｍＭ ＥＤＴＡを使用して収集後、血球計数器およびトリパンブルーを使用してカウントし（生存率は９５％を超えた）、１０７個の細胞につき１０ｕＬの抗ＣＤ３１ビオチンおよび１０ｕＬの抗ＣＤ４５ビオチンとともに、１ｍＬのＦＡＣＳバッファー（２％ＦＣＳおよび５ｍＭ ＥＤＴＡ添加ＰＢＳ）中に再懸濁した。１５分後、細胞を洗浄し、抗ビオチンミクロビーズとともにインキュベートし、使用説明書（Miltenyi Biotec）に従ってＭＡＣＳＬＳカラムを通過させた。ＭＡＣＳ精製ＦＲＣを、すべての試験で使用した。
【００７２】
敗血症誘発：ＬＰＳモデル
３〜６週齢（若年）または１８〜２４月齢（老齢）のＣ５７Ｂｌ６／ＪマウスにＬＰＳを１回注射し、無菌性敗血症を生じさせた。若年マウスには、１００ｕＬの生理食塩水中に３００μｇのＬＰＳを腹腔内投与し、老齢マウスには、１００ｕＬの生理食塩水中に１５０μｇのＬＰＳを腹腔内投与した。記載の時点で生理食塩水中１ｘ１０６ＦＲＣを１回の注射で腹腔内に投与した。以下の終点のいずれかに到達した場合、マウスを安楽死させた：意識喪失、覚醒不可能、起立不可能または呼吸速度が２０呼気／１０秒以下に持続的に低下。
【００７３】
敗血症誘発：ＣＬＰモデル
Ｂａｌｂ／ｃマウスに腸管穿孔（ＣＬＰ）を施して、多微生物性敗血症を誘発した。簡潔に言えば、マウスに麻酔をかけ、皮膚および腹腔筋を通る正中線切開を行った。盲腸の位置をみつけ、無菌の外科環境で外に取り出した後、盲腸の８０％を、６．０縫合糸を使用して結紮し、盲腸を２３ｇ針を使用して２度穿刺した。糞便の小滴を浸出させた後、盲腸を再配置し、筋肉と皮膚を閉じた。マウスに、１ｍＬの生理食塩水を皮下注射により投与した。記載の時点で、マウスに、生理食塩水または生理食塩水中１ｘ１０６個の同種ＦＲＣのいずれかを１回の腹腔内注射により投与した。この時点で、抗生物質処置も、すべてのマウスに開始した（生理食塩水中１５ｍｇアンピシリンを腹腔内注射した）。抗生物質は、１２時間毎に投与した。以下の終点のいずれかに到達した場合、マウスを安楽死させた：意識喪失、覚醒不可能、起立不可能または呼吸速度が２０呼気／１０秒以下に持続的に低下。
【００７４】
サイトカインアレイ
詳細を上記したように血液を取得し、血漿を遠心分離により収集した。分析物の濃度は、使用説明書に従ってｘＰＯＮＥＮＴソフトウェア搭載のＬｕｍｉｎｅｘＭＡＧＰＩＸ解析・リーダーを使用して求めた。
【００７５】
大腸炎モデルの誘発
８週齢の雌Ｃ／Ｂ１７ｓｃｉｄマウスを大腸炎レシピエントとして使用した。７週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃドナーを、大腸炎を誘発するための細胞ドナーとして使用した。脾臓と皮膚および腸間膜リンパ節を２０匹のＢａｌｂ／ｃマウスから切断し、機械的破壊によりＲＰＭＩ−１６４０中へ懸濁した。細胞を濾過、カウントした後、使用説明書に従ってＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４ｌｏｗ単離キット（R&D Systems）を使用してナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮した。その後、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉ＋Ｔ細胞を、ＦＡＣＳを使用してソーティングし、無菌ＲＰＭＩ−１６４０中に再懸濁した。１５匹のＣ／Ｂ１７ｓｃｉｄマウスに、１００ｕＬのＲＰＭＩ−１６４０中５ｘ１０５個の細胞を静脈内投与した。マウスは、大腸炎誘発後２週間して体重が減少し始め、疾患の発症を示唆した。その後、研究の期間中、マウスに１ｘ１０６個の同種ＦＲＣを週に２回腹腔内注射により投与した。以下の終点のいずれかに到達した場合、マウスを安楽死させた：初期体重から２０％を超える減少または後肢麻痺。
【００７６】
結果
マウスおよびヒトリンパ節ストローマ細胞の酵素単離
リンパ節ストローマ細胞の研究は、近年活発化しており、ナイーブＴ細胞の維持（Link et al., 2007）および除去（Lee et al., 2007, Nichols et al., 2007, Gardner et al., 2008, Magnusson et al., 2008, Yip et al., 2009, Cohen et al., 2010, Fletcher et al., 2010）における新たに発見された役割を精査するインパクトの大きいいくつかの論文が発表されている。しかしながら、方法論的な能力が、制約因子となっている。
【００７７】
従って、変動が小さく再現性の高いリンパ節ストローマ細胞の単離を可能とする低死亡率酵素消化プロトコールの開発を目的とした。酵素的および物理的分離を組み合わせて使用することで（図１）、単離の直後に全リンパ節懸濁液（１．５％ストローマ）にトリパンブルーを使用して、常に９５％を超える生存率でストローマ細胞を単離した（図２Ａ）。単離およびストローマ濃縮の６時間後、ヨウ化プロピジウムを使用したストローマの平均生存率は、８７．８％±０．８（平均値±標準偏差、実験数ｎ＝３）であった。この高い生存率は、また、個々のマウスに存在する各ストローマサブセットの数をキャラクタリゼーションし比較することを可能とし、これらの細胞のソーティングおよび培養の成功において重要な因子であった。ＣＤ４５、ポドプラニン、ＣＤ３１およびＭａｄＣＡＭ（図２Ｂ）を使用して、リンパ節ストローマの５つの主要なサブセットを試験した。特にＭａｄＣＡＭ＋ＭＲＣサブセットは、フローサイトメトリー分析用に単離されたのは初めてである。
【００７８】
まず、我々のフローサイトメトリー方法を、従来定義されているストローマサブセットの組織学的in situ解析と直接比較した（図２Ｃ）。我々の目的は、ｍＲＮＡプロファイル、細胞タイプの数および比率の変化と平行してストローマ構造の変化をモニター可能とする方法、および細胞単離を必要とする他の手法を確立することであった。
【００７９】
従って、フローサイトメトリーにより定義されるように、ＦＲＣが予想通りＴ細胞領域全体において細網ネットワークを形成することを見出だした（トップパネル）。ＢＥＣは、ＣＤ３１を発現したがポドプラニンは発現せず、主に皮質に存在し（トップパネル）、高内皮細静脈はその小さなサイズとおよび立方形態により識別可能であった。ポドプラニンおよびＣＤ３１の同時発現により定義されるＬＥＣは、髄質の門部の大きなリンパ管（ミドルパネル）および皮膜下（データ示さず）を裏打ちしていた。この門部は、大きな血管（ＣＤ３１＋ポドプラニン−）も含んでいた。ＭａｄＣＡＭ＋細網細胞は、皮膜下（下部パネル）を裏打ちし、ＭａｄＣＡＭ染色が、既に報告されているように、Ｂ細胞領域内にも存在していた。我々は、皮膜下ＬＥＣ（ここではＬｙｖｅ−１を発現していることが示されている）がＭａｄＣＡＭも発現しており（ボトムパネル）、皮膜下をリンパ節のＭａｄＣＡＭに富む領域としていることを見出した。表現型的に、ＭＲＣは、フローサイトメトリーによりポドプラニン＋ＣＤ３１−ＦＲＣゲート内にサブセットを形成した（図２Ｂ）。
【００８０】
我々の単離方法が、ヒトリンパ節ストローマを単離することに適用でき、有益なex vivo実験システの構築を可能とするであろうと仮定した。ヒトリンパ節ストローマ構造は、組織学により詳細に記述されている（Linket al., 2011)が、サブセットは、フローサイトメトリーや他の免疫学研究用に単離されていない。
死体ドナーからの非腸間膜由来のヒトリンパ節を入手した。このリンパ節を消化するためには高い酵素濃度が必要とされたが（方法の項参照）、消化されたストローマ組成物はマウスのものと著しく類似していた（図２Ｄと２Ｂを比較）。これらの結果は、マウスのリンパ節ストローマ細胞技法は、ヒトの研究にも同等に適用できるかもしれないことを示唆している。
【００８１】
腸間膜リンパ節のＦＲＣ含有量は、皮膚流入領域リンパ節よりも少ない
消化を更に検証するために、リンパ節ストローマ細胞サブセットの構成比率が同年齢マウス間でどの程異なっているかを評価することにより、再現性を試験した。また、皮膚流入領域および腸間膜リンパ節のストローマ組成を比較した。これらのリンパ節は、組織学により構造的に類似していることは十分に確立され、研究されているが、それらの個体発生は異なる時期におこり、異なるシグナル経路に依存している（Mebius, 2003）。更に、腸間膜リンパ節は絶えず腸や胃粘膜由来の抗原に曝されているが、皮膚流入領域リンパ節はそうではない。
【００８２】
驚くべきことに、同程度の数の細胞が皮膚流入領域または腸間膜リンパ節のそれぞれから単離されたが（図３Ａ）、ストローマ組成物は有意に異なることを見出した（図３Ｂ）。Ｔ細胞領域全体で増殖するＦＲＣは、腸間膜リンパ節よりも皮膚流入領域リンパ節において、より高い頻度で存在し（図３Ｂ、図２Ｂ）、数もより多かった（図３Ｃ）。ＬＥＣ、ＢＥＣ、ＤＮおよびＭＲＣは両サイトに同程度の数で存在し（図３Ｃ）、相違をＦＲＣ特異的としている。
我々は、この相違がＦＲＣゲート内にあることを見出し（図２Ｂ）、ＭＲＣサブセットの割合の変化によるのかどうかを調べた（Katakai et al., 2008）。ＦＲＣゲート内の細胞の１０〜２０％は、５週齢の雄マウスでは、皮膚流入領域リンパ節よりも腸間膜リンパ節においてより高い割合でＭａｄＣＡＭを発現した（図２Ｂ、３Ｄ）。しかしながら、ＭＲＣの割合は、ＬＥＣと同様にサイト間で有意に変化しているが、それらの総数はそうではなかった（図３Ｅ）。これは、ＭＲＣの数とＦＲＣ数が別々に調整されていることを示唆している。なぜなら、他のストローマサブセットのように、ＭＲＣは数的にはサイト間で類似しており、ＦＲＣは腸間膜リンパ節で減少しているからである。
【００８３】
胸腺などのいくつかのリンパ器官では、最も多いストローマ細胞サブセットの数は、発達中のＴ細胞に対応して増減する。これがＦＲＣ集団にも適応できるかどうかを、Ｔ細胞およびＢ細胞が欠損したＲａｇ−／−マウスを使用してテストした。ＦＲＣはＲａｇ−／−リンパ節で発達するが、それがリンパ球の数に応答して増減するかどうかは知られていない。この質問は、特に感染と関連している。なぜなら、リンパ節は、増殖するリンパ球を含有するために短時間で劇的に膨張しなくてはならないからである。
Ｒａｇ−／−マウスのリンパ節はより小型であるが（図３Ｆ）、同年齢の野生型対照と同等に正常な数のＦＲＣを処理していた（図３Ｇ）。しかしながら、ＬＥＣの数は有意に減少しており、それらの数の恒常性は成熟リンパ球の存在と関連付けられることを示唆している。Ｒａｇ−／−ＦＲＣの細胞代謝回転速度は、ＷＴと異なっておらず（データ示さず）、マウスにＬＰＳを注射した後、ＦＲＣの数はＴ細胞およびＢ細胞と一緒に増加しなかった（データ示さず）。従って、ＦＲＣの数は、リンパ球減少性の定常状態および炎症性条件下で、成熟リンパ球とは完全に独立して維持されていた。
【００８４】
驚くべきことに、ＭＲＣサブセットは、Ｒａｇ−／−マウスでは十分に発達しなかったことがわかった（図３Ｈ〜Ｊ）。組織学によりＭａｄＣＡＭ＋ＭＲＣがＲａｇ−／−マウスに存在することは報告されているが（Katakai et al., 2008）、我々の実験では、ＭａｄＣＡＭ＋ＭＲＣの数およびＭＲＣに対するＭａｄＣＡＭタンパク質の数の両者が有意に減少した（図２Ｈ〜Ｊ）。これは、ＭａｄＣＡＭ＋ＬＥＣにも当てはまり（図３Ｈ〜Ｊ）、両細胞タイプにおけるＭａｄＣＡＭ発現の上方制御は、リンパ球の存在を必要とする発生段階を示すが、タンパク質それ自身の発現はそれらが不在でも起こりうることを示唆した。ＭａｄＣＡＭ＋ＬＥＣの割合はＷＴとＲａｇ−／−との間で同様であったが（図３Ｈ）、全ＬＥＣの有意な低減（図３Ｇ）は、ＭａｄＣＡＭ＋ＬＥＣの数が減少したと考えられる（図３Ｉ）。
【００８５】
リンパ節ストローマ細胞サブセットの濃縮およびソーティング
リンパ節の消化に成功した後、ストローマ細胞のソーティングおよび培養のために、この手段を適応した。ストローマ細胞のソーティングは技術的に困難であり得（方法の項参照）、ソーティング時間を短縮し、得られる純度を高めるために、造血細胞のＭＡＣＳに基づく枯渇を使用した。この追加の工程は、ストローマの損失を最小限とし（図４Ａ、Ｂ）、ストローマの組成に検出可能な変化はなかった；ストローマサブセットのＭＡＣＳ後の選択的損失は観察されず（図４Ｃ）、ソーティング後、良好な純度を達成した（図４Ｄ）。
この方法を使用して、多施設ＩｍｍＧｅｎ共同事業体の一環として、皮膚流入領域および腸間膜リンパ節からＦＲＣをソーティングした。これには、厳しく制御された変動を最小とした条件下でソーティングされた細胞のトランスクリプトーム解析が含まれ、総合的な目的は、免疫学的ゲノムの包括的な相互参照されたマップを提供する公共データベースを作成することである。
【００８６】
皮膚流入領域および腸間膜リンパ節からのＦＲＣを、２５，１９４個のプローブの発現に関して解析し、皮膚流入領域または腸間膜リンパ節のいずれかにおいて、任意の閾値（平均発現値＞１２０）以上で発現された１１，１６２個のプローブのリストを生成した。これらのプローブは、レプリカ間の変動係数が低い（＜０．５）ものについてもフィルターした。
我々は、これらの異なる場所からのＦＲＣが、ＣＤ１４０ａ、ＣＣＬ１９、ＩＬ−７などの既に公表されているＦＲＣ特異的マーカーの発現を共有すること（データ示さず）をまず確認し、その後相違に関してデータを解析した。皮膚流入領域対腸間膜リンパ節ＦＲＣを比較し、倍率変化とＰ値を表す火山型プロットは、１３０個のプローブが腸間膜リンパ節に比較して皮膚流入領域からのＦＲＣにおいて有意に発現上昇していることを示し、９７個のプローブの発現は皮膚流入領域に比較して腸間膜リンパ節ＦＲＣで有意に高かった（倍率変化＞２、Ｐ＜０．０５）（図５Ａ）。プローブを固有の遺伝子に対してマッピングした後、これらのデータは、皮膚流入領域リンパ節ＦＲＣにおける１２６個の遺伝子（データ示さず）および腸間膜リンパ節ＦＲＣの５４個の遺伝子（データ示さず）の上方制御に対応していた。
【００８７】
我々は、なんらかの部位特異的な分化の手がかりとして、これらのリストが特定の遺伝子経路すなわちどちからの細胞タイプで固有に機能している遺伝子ネットワークの活性化の証拠を含むかどうかに興味があった。無料のオンラインプログラムであるＤＡＶＩＤ（バージョン６．７；National Institute of Allergy and Infectious Diseases）を利用し、ネットワーク解析ツール（ＫＥＧＧ）を使用してこれらの遺伝子間の公知の生物学的関連のリストを精査し、その後統計解析ツールを使用して関連する遺伝子が、偶然で期待される以上の頻度で一緒に現れるかどうかを評価した。サイトカイン−サイトカインレセプター相互作用を網羅するＫＥＧＧパスウェイｍｍｕ０４０６０は、腸間膜と比較して皮膚流入領域リンパ節からのＦＲＣに有意に濃縮していた（遺伝子は、偶然で期待されるよりも４．８倍の頻度で現れた、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ補正Ｐ値＝０．００５５）。このリストは、皮膚流入領域リンパ節ＦＲＣで少なくとも２倍上方制御された免疫学的関連の１０個の遺伝子を含んでいた（図５Ｂ）。腸間膜リンパ節において上方制御された遺伝子は、特定可能なＫＥＧＧパスウェイにおいて有意に濃縮していなかったが、線維芽細胞の成長を制御に関連する遺伝子、レチノイン酸代謝またはＭａｄＣＡＭ発現、内皮細胞クロストーク、細胞外マトリクス分泌および末梢神経細胞の成長（表３）に関与するものなど腸の微小環境に関連する遺伝子を明らかに含んでいた。
【００８８】
培養されたＦＲＣは、in vivo機能を模倣し、白血球の移動を支援する
次に、リンパ節ストローマが培養で増殖する能力をテストした。よく消化されたリンパ節細胞懸濁液からのストローマが播種後２時間以内に組織培養プレートへ容易に接着し、ＣＤ４５＋白血球の犠牲で増幅し始め、この白血球は５日後には培養物の１０％未満となっていることを見出した（図６Ａ）。ＦＲＣおよびＬＥＣは培養で容易に増殖する一方、ＢＥＣおよびＤＮ細胞は増殖しなかった（図６Ａ）。ＦＤＣは培養で増殖しなかった（図６Ｂ）。重要なことは、我々の低量トリプシン、高量ＥＤＴＡ収集プロトコールは、ＣＤ３１（図６Ｃ）およびＣＤ１４０ａ（図示せず；表２参照）などの重要な表面マーカーの保持を可能としたことである。約５ｘ１０３個のストローマ細胞を含む５ｘ１０５個／ｃｍ２の細胞が、５日間の培養の後で約１．５〜２ｘ１０４個／ｃｍ２のストローマを常に生成したことがわかった。この培養システムは、ＦＲＣ、ＬＥＣおよびＭＲＣの増殖および操作を容易にした。
【００８９】
特にＦＲＣは２次元（２Ｄ）培養で高度に偏り（図６Ｄ）、強力なＦアクチンストレスファイバーを示した（図６Ｅ）。これは、in vivoでの形態を模倣したものではなかった；そのため、我々は、コラーゲンＩ、マトリゲルおよび濃縮αＭＥＭの最適化した混合物を使用して、in vivoでのように可能な場合に３次元で増幅および結合が許容されたときの機能を検討するためのツールとして、ＦＲＣおよびＬＥＣの３次元（３Ｄ）培養も考察した。ＦＲＣは３Ｄに増殖するときに伸展し、広範なネットワークを形成したが（図６Ｄ、Ｅ）、ＬＥＣは平坦な表面を好み、２Ｄ培養においてより順調に増殖した（図６Ｄ）。興味深いことに、どちらの細胞タイプも３Ｄ条件下ではオーバーコンフルエントに増殖せず（データ示さず）、２Ｄ培養では起こらなかった細胞密度の先天的制御を示唆している。このin vitroＦＲＣネットワークの生物学的重要性を実証するために、２つの実験を行った。１つ目として、多数のＦＲＣを小型マトリゲルプラグに配置し、ゲルを収縮する能力をモニターした（図６Ｆ）。ＦＲＣは高レベルのアルファ平滑筋アクチンを発現し、高度に収縮性である（Link et al., 2007）。ＦＲＣが高い効率でゲルを収縮し、この収縮がＳｒｃチロシンキナーゼ阻害剤ＰＰ２をゲルに添加すると防止されることを見出した。２つ目は、骨髄由来の樹状細胞（ＤＣ）または脾臓由来のリンパ球を、ＦＲＣを含むゲルに添加し、ライブイメージング法を使用して、in vivoで報告されているように、ＤＣおよびリンパ球がＦＲＣネットワークに沿って（写真を図６Ｇに、微速度撮影の全映像を補足映像１および２に示す）効率的および優先的に移動することを見出した。
【００９０】
同様の方法を用いて、ヒトリンパ節ストローマ細胞サブセットの培養に成功した。マウスの細胞と異なり、ＢＥＣおよびＤＮ細胞は、ＬＥＣおよびＦＲＣとともにin vitroで増殖した（図６Ｈ）。
これらの結果をまとめると、マウスのリンパ節ストローマがフローサイトメトリーおよびソーティング用に容易に単離され、白血球の不在下で培養可能であり、にもかかわらず、in vivoでの報告のように白血球が容易に移動する広範な３Ｄネットワークを形成したことを示した。我々のデータは、ヒトリンパ節ストローマがマウス用技術を使用した研究に同様に適用できることを示唆した。
これらの結果はともに、様々なex vivoおよびin vitro条件下でのマウスおよびヒトにおけるリンパ節ストローマ細胞の研究に適用可能である一連の技術を確認するものである。
【００９１】
リンパ組織由来のサプレッサー細胞が活性化同種脾細胞の増殖を抑制する
未分画のＬＳＳＣを、血縁でないドナーから新たに単離されたヒト脾細胞とともに培養した。脾細胞を、細胞分裂時に希釈される蛍光染料であるＣＦＳＥで標識した。脾細胞集団内のＴ細胞を、ＰＨＡおよびＩＬ−２を使用して活性化した。図７は、Ｔ細胞抗原レセプターの発現により同定したＴ細胞を示すヒストグラムである。比率は、ストローマに対する脾細胞の割合を示す。培養ストローマ細胞なしに刺激されたＴ細胞は、ＬＳＳＣとともに培養した細胞よりも、そのＣＦＳＥを希釈し、ＬＳＳＣは用量依存的にＴ増殖を抑制する（図７）。
【００９２】
ＬＳＳＣは活性化異種Ｔ細胞の増殖を抑制する
未分画のＬＳＳＣを新たに単離したマウス脾細胞とともに培養した。脾細胞を、細胞分裂時に希釈されるＣＦＳＥで標識した。その後、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を使用してＴ細胞を活性化した。図８は、Ｔ細胞抗原レセプターの発現により同定したＴ細胞を示すヒストグラムである。比率は、ストローマに対する脾細胞の割合を示す。培養ストローマ細胞なしに刺激された血液由来のＴ細胞は、ＬＳＳＣとともに培養した細胞よりも、そのＣＦＳＥを希釈した。ＰＤＰＮ＋およびＰＤＰＮ−ＬＳＳＣ亜集団の両者は、等しくＴ細胞を抑制することが可能である。ＬＳＳＣは異種応答の強力なサプレッサーである（図７に示す同種抑制と比較して）。
【００９３】
ＬＳＳＣは新規機序によりＴ細胞増殖を抑制する
マウスにおいて、リンパ節由来のＰＤＰＮ＋ストローマ細胞は、Ｔ細胞由来のＩＦＮｇおよびストローマ細胞由来の一酸化窒素を必要不可欠とする機序により自己Ｔ細胞増殖を抑制する（Lukacs-Kornek et al., Nature Immunology, 2011）。我々のＬＳＳＣが同様の機序でＴ細胞応答を抑制するかどうかをテストした。
未分画のＬＳＳＣを、野生型またはＩＦＮｇ−／−マウス由来の新たに単離された脾細胞とともに培養した。脾細胞を、細胞分裂時に希釈されるＣＦＳＥで標識した。その後、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を使用してＴ細胞を活性化した。図９Ａは、Ｔ細胞抗原レセプターの発現により同定したＴ細胞を示すヒストグラムである。比率は、ストローマに対する脾細胞の割合を示す。
【００９４】
ＰＤＰＮ＋、ＰＤＰＮ−および未分画のＬＳＳＣを、血縁でないドナーからの新たに単離、精製したヒト血液由来のＴ細胞とともに培養した。Ｔ細胞を、細胞分裂時に希釈されるＣＦＳＥで標識した。ＰＨＡおよびＩＬ−２を使用して、Ｔ細胞を活性化した。図９Ｂは、Ｔ細胞抗原レセプターの発現により同定したＴ細胞を示すヒストグラムである。上清を収集し、一酸化窒素の転化生成物である亜硝酸塩が存在するかどうかテストした。
ＬＳＳＣは、野生型Ｔ細胞と等しく良好にＩＦＮｇ−／−Ｔ細胞を抑制したことがわかった。ＰＤＰＮ＋またはＰＤＰＮ−ＬＳＳＣ亜集団あるいは未分画のＬＳＳＣのどれも、抑制解析において検出可能な一酸化窒素／亜硝酸塩を産出しなかった。ＬＳＳＣは、新規のＩＦＮｇおよび一酸化窒素非依存性機序によりＴ細胞増殖を抑制し、従ってマウスＰＤＰＮ＋リンパ節ストローマ集団とは有意に異なっている。
【００９５】
リンパ組織由来サプレッサー細胞の２つの主要な亜集団は、それぞれ活性化同種Ｔ細胞の増殖を抑制する
図１０Ａにおいて、ＬＳＳＣの２つの亜集団を、糖タンパク質−３６（ＰＤＰＮとしても知られる）の発現または欠損に基づいて精製した。両亜集団とも、非内皮性（ＣＤ３１陰性）および非造血性（ＣＤ４５陰性）であった。
ＰＤＰＮ＋ＬＳＳＣ、ＰＤＰＮ−ＬＳＳＣまたは未分画のＬＳＳＣを血縁でないドナーから新たに単離、精製したヒト血液由来のＴ細胞とともに、１：５比率（ＬＳＳＣ対Ｔ細胞）で培養した。Ｔ細胞を、細胞分裂時に希釈されるＣＦＳＥで標識した。ＰＨＡおよびＩＬ−２を使用して、Ｔ細胞を活性化した。図１０Ｂは、Ｔ細胞抗原レセプターの発現により同定したＴ細胞を示すヒストグラムである。比率は、ストローマに対する脾細胞の割合を示す。
培養ストローマ細胞なしに刺激された血液由来のＴ細胞は、ＬＳＳＣとともに培養した細胞よりも、ＣＦＳＥを希釈することが観察された。ＰＤＰＮ＋およびＰＤＰＮ−ＬＳＳＣ亜集団の両者は等しくＴ細胞を抑制することが可能である。
【００９６】
ＬＳＳＣは、予め活性化した同種Ｔ細胞の分裂を停止する
ＬＳＳＣのいくつかの治療応用は、進行中の免疫応答を有する個体への輸血または移植を必要とするであろう。従って、ＬＳＳＣが予め活性化したＴ細胞を抑制することができるかどうかを調べた。
ＰＤＰＮ＋ＬＳＳＣ、ＰＤＰＮ−ＬＳＳＣまたは未分画のＬＳＳＣは、血縁でないドナーから新たに単離、精製したヒト血液由来のＴ細胞とともに培養した。Ｔ細胞を、細胞分裂時に希釈されるＣＦＳＥで標識した。Ｔ細胞をＰＨＡおよびＩＬ−２を使用して活性化し、２日間分裂させた後、一部のＴ細胞をＬＳＳＣに再播種して再刺激、または再播種しＬＳＳＣなしに再刺激し、または再刺激なしに再播種した。図１１は、Ｔ細胞抗原レセプターの発現により同定したＴ細胞を示すヒストグラムである。比率は、Ｔ細胞に対するＬＳＳＣの割合を示す。
２日間刺激し、その後、再播種し、ＬＳＳＣとともに再刺激したＴ細胞は、十分に活性化され再播種の前に数回の細胞分裂を行っているという事実にもかかわらず、細胞分裂を終止することがわかった（「再播種したが、再刺激していない」対照とともに示す）。ＰＤＰＮ＋およびＰＤＰＮ−ＬＳＳＣ亜集団の両者は、予め活性化された同種Ｔ細胞を抑制することが等しく可能である。
【００９７】
ＬＳＳＣは、重度の移植片対宿主病を有するマウスにおいて早期死亡率を有意に低減させる
レシピエントマウスは、同種骨髄移植を受けた（分割致死線量照射後、全骨髄の静脈内注射）。アロ反応性Ｔ細胞を含有するドナー由来の脾細胞を同時注入することによって、移植時に重度のＧＶＨＤを誘発した。１ｘ１０６個のヒトＬＳＳＣを、ＧＶＨＤ誘発後の時点で腹腔内に注射し、一方対照マウスには、生理食塩水（媒体）を与えた。生存をモニターした。
すべてのマウスが同様の時点でＧＶＨＤを発症したが、ＬＳＳＣを与えたマウスは、早期時点でのＧＶＨＤ関連死亡率が有意に減少し、ＬＳＳＣが免疫攻撃を低減することを示唆した。早期ＬＳＳＣ投与の効果は、注入後３週間持続し、その時点で保護は無効となり、再投与の必要が示唆された。重度に発症したマウスへの注射投与が遅延した場合（２４日目）、罹患率または死亡率は逆行しなかった。
図１５に示すように、ex vivo増幅したマウスリンパ節ストローマは、マウスにおける急性敗血症性ショックの死亡率を低減した。
【００９８】
ＬＳＳＣの転写特性
表面マーカーのフローサイトメトリーおよび分泌された因子のＲＴ−ＰＣＲ（図１３Ａ）、およびｍＲＮＡトランスクリプトームを得るための Affymetrix HuGene ST 1.0 遺伝子配列（図１３Ｂ）を使用してヒトＬＳＳＣの転写特性を得た。
ＬＳＳＣ（黒色ライン）の代表的なフローサイトメトリープロファイル（図１３Ａ）を、間葉系マーカーＰＤＧＦＲａ、耐性関連タンパク質ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２、筋関連タンパク質ＩＴＧＡ７およびリンパ器官ストローマに特徴的なタンパク質ＴＢＲ、ＩＬ７ＲおよびＰＤＰＮの発現を示す適切な陰性染色対照（灰色）と比較した。ＰＤＰＮおよびＩＴＧＡ７は、おそらくバルクＬＳＳＣのサブセットにより発現された。別名または遺伝子名を括弧内に示す。ＲＴ−ＰＣＲは、ＬＳＳＣがケモカインＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１のための転写物を発現することを示した（陽性対照としてのＬＴｂＲに対して示した）。
【００９９】
遺伝子配列を使用し、３つのヒト骨髄間葉系幹細胞サンプル（アクセッションコードＧＭ２４１１９９、ＧＭ２４１２０１、ＧＭ２４１２０３）の公開されているデータと比較して、３つのＬＳＳＣサンプルからの選択された遺伝子の転写も評価した。データ（図１３Ｂ）は、ＢＭ−ＭＳＣと比較してＬＳＳＣがＰＤ−Ｌ２、ＬＴｂＲ、Ｉｔｇａ７、Ｍｙｈ１１を高いレベルで発現したことを示した。ＬＳＳＣおよびＭＳＣは、ＣＸＣＬ１２、Ｔｈｙ１、ＩＬ７Ｒを同等のレベルで発現し、ＬＹＶＥ１、ＣＤ３Ｇ、ＰＥＣＡＭ１（ＣＤ３１）、ＣＤ３４、ＦＣＧＲ２ＢおよびＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）などの細胞系列特異的マーカーには同様に陰性であった。ＭＳＣがＰＤ−Ｌ２を発現せず、またこのタンパク質が炎症性サイトカインＩＦＮｇへの暴露により誘発できないことは、既に報告されている。
【０１００】
ＬＳＳＣの形態的特徴
ウシ胎仔血清添加アルファＭＥＭ中で増殖した培養ＬＳＳＣは、線維芽細胞様形態を示した（図１４）。それらは、多くの場合に、長い突起、葉状仮足、糸状仮足、波状のリーディングエッジおよび接着点を示した。更に、リンパ節および扁桃腺から単離されたＬＳＳＣは、表現型的に類似している（図１９）。
【０１０１】
ＦＲＣは、治療時点で投与されたとき、２つの異なるマウスモデルにおける敗血症から保護する
無菌性敗血症モデルおよび腸管穿孔（ＣＬＰ）敗血症モデルの両者において、ＦＲＣは、顕著な延命効果を付与した（図１６）。図１６Ｅは、ＦＲＣで処置したマウスの血液中の炎症性サイトカインのレベルが減少したことを示す。これらの炎症性サイトカインは、通常は自然免疫系に関連している。従って、ＦＲＣは敗血症において自然免疫系と相互作用する。
【０１０２】
ＦＲＣは大腸炎死亡を防ぐ
精製したナイーブＴ細胞を免疫不全マウスに注射することにより大腸炎を誘発した。同種ＦＲＣを、マウスが病気の徴候を示し、顕著な体重減少を示し始めた、２週間目に投与した（治療時間経過）。生理食塩水で処置した対照と比較し、ＦＲＣを２週目から６週目まで週２回注射し、生存時間をモニターした。ＦＲＣは顕著な延命効果を付与した（図１７）。
【０１０３】
ヒトＬＳＳＣは、可溶性サイトカイン因子を分泌し、リンパ節および扁桃腺から単離された細胞は、可溶性因子による同等レベルのＴ細胞抑制を示す
培養したヒトＬＳＳＣが、多数の可溶性サイトカイン因子を分泌することが示された（図１８）。リンパ節および扁桃腺から単離されたＬＳＳＣは、可溶性因子による同等レベルのＴ細胞抑制を示した（図２０）。
【０１０４】
考察
一次組織から再現性のある組成で生存単一細胞懸濁液を作成するなどの免疫学や細胞生物学で通常用いている技法をリンパ節ストローマに適用することは困難である。従って、組織学および全臓器ＰＣＲまたはリンパ球の読み取りを含むin vivoシステムがこの分野の標準であった。これらは、定常状態の寛容や免疫性におけるリンパ節ストローマ細胞サブセットの役割に関していくつかの重要な進歩をもたらした。しかしながら、直接的な生物学的および医学的関連性の探求されていない疑問が多数ある。これらの希少で繊細な細胞タイプに使用するよう改良、適応した現代の免疫学的および細胞生物学的技法が、これらの疑問に答えるために要求されるであろうと考える。
【０１０５】
この未だ満たされていない必要性を象徴するものとして、特にＤＮストローマが、ほぼ完全に未定義のまま残っている。現在、いくつかのグループによって、この非造血ストローマ細胞サブセット（均質であるかまたはそうでないかの可能性がある）の存在が報告されている（Link et al., 2007, Cohen et al., 2010, Fletcher et al., 2010）が、＞１０％のリンパ節ストローマニッチを構成し、Aire 発現型細胞タイプを持つにもかかわらず（Cohen et al., 2010, Fletcher et al., 2010）、それはほぼ完全にキャラクタリゼーションされていない。形態、分化系列、表面表現型および機能などの基本的な特性は報告されていない。これらの報告が無いことは、リンパ節ストローマ細胞の研究に固有の困難を明白に示している。
【０１０６】
ＤＮ細胞の研究におけるそのような困難の一つは、死んでいるまたはよく染色されていないリンパ球が、ＣＤ４５が低いまたは陰性として現れ、ＤＮストローマと同じ表現型（ＣＤ３１−ポドプラニン−）でストローマ細胞ゲートに現れることである。これは、本当のストローマサブセットの割合を大幅に歪め、リンパ節ストローマニッチの最も基本的な割合の組成を同定することさえ困難としている。実際、ストローマは、リンパ節細胞の１−２％だけを構成するので、非生存なリンパ球が、通常、生存率の高い（生存率＞９５％）単一細胞懸濁液中ですらストローマの数よりも多くなっている。我々の経験では、ヨウ化プロピジウムなどの死んだ細胞の染色を含むことは、消化後ＣＤ４５が低い細胞を適切に除去するものではない。
【０１０７】
この理由のため、ストローマの再現性のある単離への手掛かりは、低死亡率酵素消化プロトコールを開発することにあると考えた。ディスパーゼ、ＤＮａｓｅＩおよびコラゲナーゼＰの組み合わせを使用することで、９５％を超える生存率で多数のストローマ細胞を一定の手順で単離した。これは、また、個々のマウスおよびヒトに渡って各ストローマサブセットの比較を可能とし、更なる研究の対象であろうＤＮ細胞およびＭＲＣを含む希少なサブセットをソーティング可能とした。組織学によってＤＮストローマを特定することは未だ不可能であるが、これは、ユニークなあるいは発現の異なる表面マーカーが報告されていないからである。しかしながら、本明細書に記載されるソーティング法は、この希少なサブセットを明らかにするのに要する偏りの無い配列に基づくアプローチを実行するために使用できるかもしれない。
【０１０８】
同様に、これらの方法は、一次組織から直接ヒトリンパ節ストローマ細胞の４つの主要な集団を単離することを可能とし、洗練された臨床および前臨床研究への道を開いた。マウスリンパ節ストローマ細胞が多数の臨床的に重要な自己抗原を発現し、これらをＴ細胞へ直接提示してそれらを寛容化することは、現在確立している（Lee et al., 2007, Nichols et al., 2007, Gardner et al., 2008, Magnusson et al., 2008, Cohen et al., 2010, Fletcher et al., 2010）。同様の機序がヒトにおいて働いている可能性があるだろう。培養中、ＦＲＣおよびＬＥＣが、in vivoで見られた相互作用を模倣したＰＴＡをナイーブＴ細胞に提示する能力を保持していることが研究で示されている（Cohen et al., 2010, Fletcher et al., 2010）。これが、問題のＰＴＡの連続する転写によるのか、またはペプチド−ＭＨＣの保持によるかは不明である。これらの技術は、ヒトリンパ節生物学に関するこの問題および他の多くの未解決の問題に取り組ために使用できるかもしれない。
【０１０９】
更に、リンパ節用の３Ｄ培養システムの開発は、in vivoでの条件や相互作用を模倣した、高度に制御された実験システムの作成を可能とするであろう。ＤＣおよびリンパ球が、in vivoで観察されたと同様に、in vitroで、ＦＲＣネットワーク上で容易におよび優先的に移動することを見出した。そのような技術は、特にヒト細胞の研究に適用可能である。
我々は、同年齢若年雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウス間でストローマ細胞サブセットの差異が驚くべきほど小さいことを見出した。また、リンパ球とストローマとの間のクロストークが特定のストローマサブセットの増殖に必要であるかどうかのテストでは、ＦＲＣ、ＬＥＣ、ＢＥＣおよびＤＮストローマがＲａｇ−／−マウスにおいて通常の割合で存在し、それらの発達または増殖にＴ細胞またはＢ細胞が必要とされないことを見出した。ＭＲＣ（ＭａｄＣＡＭ−１＋）ストローマサブセットはフローサイトメトリー分析用に未だ単離されておらず、我々は、ＭＲＣがポドプラニン＋ＣＤ３１−ＦＲＣゲート内にサブセットを形成することを見出した。ＭＲＣはＦＲＣとの類似点を示し、ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１を発現し、ラミニンなどのＥＣＭ成分を分泌するが、ＭＲＣは更に、多量のＣＸＣＬ１３を産出し、ＭａｄＣＡＭ−１の発現により同定可能である（Katakai et al., 2008）。
【０１１０】
ここで顕著なことには、ＭＲＣの数が、Ｒａｇ−／−マウスにおいて有意に減少した。細胞ごとのＭａｄＣＡＭタンパク質のレベルもより低かった。組織学により、ＭａｄＣＡＭ＋ＭＲＣは、皮膚流入領域Ｒａｇ−／−リンパ節において観察されるが（Katakai et al., 2008）、ＭａｄＣＡＭ発現およびＭＲＣ数の数値・定量フローサイトメトリー分析は今までは不可能であった。これらのデータは、リンパ球が実際にＭＲＣの正常な発達に必要であることを示唆している。興味深いことに、Ｒａｇ−／−マウスからのＬＥＣも、より少ない割合でＭａｄＣＡＭ＋細胞に発達し、細胞毎のタンパク質量もより少なかった。ＭＲＣおよびＭａｄＣＡＭ＋ＬＥＣがＲａｇ−／−マウスにおいて正常に増幅できないのかどうか、あるは単にＭａｄＣＡＭを上方制御できないのかは未だ不明である。ＭａｄＣＡＭ＋ＬＥＣに対する役割も、未だ記載されていない。
【０１１１】
ＭＲＣは、リンホトキシンのシグナル伝達のリンパ節下流およびＮＦ−κＢ２転写プログラムを構築するＬＴｏ細胞（Mebius, 2003, Coles et al., 2010）と同じ表現型を示すので（Katakai et al., 2008）、リンパ節ストローマの生後メインテナンスまたは再生において役割を果たすと仮定されている（Katakai et al., 2008）。我々の結果は、ＭａｄＣＡＭ＋ＭＲＣの正常な増殖および／または成熟がＦＲＣ、ＢＥＣおよびＤＮストローマの正常な増殖に必要ではないことを示している。しかしながら、ＭＲＣ機能（例えば、ケモカインの発現）とＭａｄＣＡＭの発現が不可欠に関連しているかどうかを決定するためには、更なる機能的な研究が必要とされるであろう。
【０１１２】
予期せぬ発見は、皮膚流入領域および腸間膜リンパ節のＦＲＣが、割合、数および転写プロファイルに関して有意に異なっていることであった。我々は、腸間膜リンパ節におけるＦＲＣが有意に少なく、ＩＬ６、ＩＬ７、ＢＡＦＦ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ１レセプターアクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）、ＡｃｔｉｖｉｎレセプターＩＩＡ、ＶＥＧＦａ、ＬＩＦおよびｃＫＩＴ−リガンドなど数種の重要なサイトカインおよびケモカインの発現が減少していることを見出した。統計的に、パスウェイ解析は、これらの遺伝子が偶然クラスターを形成したとはありえないことを示した。これらの変化が、先天性の発達の相違の結果なのか、または抗原暴露頻度や用量の違いなど異なる炎症の手掛かりへの暴露の後に起こるかどうかを決定することは興味深いであろう。皮膚流入領域および腸間膜リンパ節は、顕著に異なる微小環境刺激物へ暴露される。皮膚のバリアが破損されない限り、この研究からの皮膚流入領域リンパ節に存在するＦＲＣは、大量の微生物源の抗原に曝されることは比較的稀であろう。しかしながら、腸間膜ＦＲＣは、Ｔｒｅｇ誘発および経口寛容に重要な定常状態の役割を持って腸の正常な機能を介して病原体関連の分子パターンに常に暴露され続ける（Hadis et al., 2011）。これらの日常の因子は、発現プロファイルを変化させ、未知の効果を呈すると予期することは妥当である。
【０１１３】
皮膚流入領域リンパ節および腸間膜リンパ節間の発達上の相違は既に報告されている。Ｃｘｃｌ１３−／−およびＣｘｃｒ５−／−マウスにおいては腸間膜リンパ節の全部が存在する一方、多くの皮膚流入領域リンパ節は欠損しているか、あるいは特定の場所によって異なって発達する（Ansel et al., 2000）。同様に、Ｌｔｂ−／−マウスは腸間膜リンパ節を発達させるが（たとえ異常であっても）、多くの皮膚流入領域リンパ節を欠損している（Koni et al., 1997）。リンパ節の発達は胚形成の間に開始されるので、これらの結果は、ＣＸＣＬ１３またはＬＴsを補償可能であるサイトカインが、皮膚流入領域リンパ節よりも胎児期の腸間膜リンパ節中でより多量に入手可能であることを示唆している。同様に、腸間膜リンパ節と比較して、新生児の皮膚流入領域リンパ節に存在する予定リンパ節形成体細胞の割合はより低い（Cupedo et al。J Imm 2004）。最後に、皮膚流入領域リンパ節を腸間膜に移植した後、ＭａｄＣＡＭ−ＢＥＣは腸間膜ＭａｄＣＡＭ＋表現型を採用せず、差異は発生上のものであり、腸由来の抗原への暴露の結果ではないことを示唆していることがわかった（Ahrendt et al., 2008）。最近の研究も、興味深いことに、移植された末梢および腸間膜リンパ節のストローマが、経口寛容を誘発する能力が異なることを示唆し、移植後ドナー細胞により進行的に置換される持ち越し造血細胞が影響されないことが想定される（Buettner et al., 2011）。
【０１１４】
６週齢のマウスの皮膚流入領域リンパ節においては、リンパ節における役割が公知である数種のサイトカインがより高量で発現しているのが見つかった。皮膚流入領域リンパ節からのＦＲＣで６倍に上方制御されたＩＬ６は、複雑な制御の対象となるサイトカインである。炎症促進性ＩＬ１へ暴露後の免疫応答において早期に産出されると、ＩＬ６は強力な免疫賦活性であるが、ＴＮＦαおよびＩＬ−１シグナル伝達の抑制およびＩＬ１０の上方制御を介して抗炎症性機能を発揮することも可能である。ＩＬ１０は、ストローマにより発現されなかった（データ示さず）。その代わりに、皮膚流入領域リンパ節におけるＩＬ１レセプターアクセサリータンパク質（ＩＬ１Ｒａｐ）の３倍を超える上方制御を見出し、皮膚流入領域リンパ節ＦＲＣが感染症の初期にＩＬ６産生を増加させる能力を有することを示唆している。従って、定常状態の間は、皮膚流入領域リンパ節からのＦＲＣは、ＩＬ１Ｒａｐの高親和性結合相手であるＩＬ１Ｒ１も高いレベルで発現したが、デコイ類似物ＩＬ１−ＲＮを発現しなかった（Dinarello, 1996）（データ示さず）。これらの知見を支持するために、我々は、ＦＲＣがある時間内にＴＬＲ３シグナル伝達に応答し（Fletcher et al., 2010）、ＦＲＣが感染症に迅速に応答することを示唆していることを既に報告した。ＰＤＧＦ−レセプターをリン酸化し、細胞収縮を刺激する手段として（Hu et al., 1998, Zampetaki et al., 2005）、ＩＬ６がストレッチ後の平滑筋細胞による抗炎症性能力において産出されることも注目に値する（Pedersen, 2006）。同様に、経皮筋線維芽細胞中で、ＩＬ６は、収縮と創傷閉鎖を高めるためにアルファ平滑筋アクチンを調節する（Gallucci et al., 2006）。筋線維芽細胞のように、ＦＲＣは、アルファ平滑筋アクチンを大量に発現する高収縮性の細胞である（（Link et al., 2007）およびデータ示さず）。ＩＬ６は、同様に皮膚流入領域リンパ節からのＦＲＣ中で上方制御されたＬＩＦとレセプターを共有する。ＩＬ６のように、ＬＩＦは、自己分泌またはパラ分泌筋肉細胞増殖を誘発する手段として、収縮している筋細胞において上方制御される。ＩＬ６、ＩＬ１ＲａｐおよびＬＩＦは、同定したネットワーク中で皮膚流入領域リンパ節からのＦＲＣにより最も上方制御された３つの遺伝子に対応する。
【０１１５】
リンパ球の機能に直接関連して、ＩＬ７およびＢＡＦＦが、皮膚流入領域ＦＲＣにおいて２倍以上に上方制御されたことを見出した。ＩＬ７はＦＲＣの公知の産物であり、ナイーブＴ細胞を維持するよう機能する（Link et al., 2007）。ＢＡＦＦは、強力な生存因子であり、Ｂ細胞にとっての同時刺激性の活性化因子である。二次リンパ器官では、それは、非造血ＦＤＣにより産出されることが知られているが、ＦＲＣ中では未だ報告されていない。しかしながら、リンパ節外のストローマ細胞によるＢＡＦＦの発現は、よく報告されているが、これは慢性炎症を必要とするようであり、これまで定常状態ストローマと関連付けられていない（Mackay et al., 2009）。我々のセルソーティング物は、ＦＤＣの混入物を含まなかった。なぜなら、転写解析の間、Ｆｃγレセプターの発現の証拠は見出せず、１％未満のリンパ節ストローマ細胞がＦＤＣ−Ｍ１またはＣＤ３５で陽性に染色されたからである（データ示さず）。ＦＤＣはＢ細胞濾胞に限定されている一方、ＦＲＣはＢ細胞濾胞を包囲し、かつ場合によってはその中へ延びている。しかしながら、両細胞タイプは、共通の前駆体から発達したと考えられる（Mebius, 2003）。この結果は、これら細胞タイプ間の顕著な類似点のリストを支持し拡張する。
【０１１６】
驚くべきことに、我々の結果は、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０が、皮膚流入領域および腸間膜リンパ節においてＦＲＣにより発現されることを示した。これらのケモカインは、ともに活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞により発現され、ＣＸＣＲ３を介してシグナルを伝達する。それらの転写は、ＩＦＮγ、ＩＦＮαおよび他の炎症促進性刺激物により上方制御される（Muller et al., 2010）。定常状態中のリンパ節におけるＣＸＣＬ１０の役割は記載されていないが、いくつかの感染では、ＣＸＣＬ１０は、リンパ節中のＴｈ１リンパ球の維持に重要な役割を有し、それは新たに活性化されたＴ細胞がＴｈ１になることを促進する機序であり、微生物に適した偏った応答をする（Yoneyama et al., 2002）。しかしながら、今日まで、ＣＸＣＬ１０産生は、リンパ節内の成熟ＤＣにおいてのみ同定されている（Yoneyama et al., 2002）。これらのデータは、未知の機能により、ＣＸＣＬ１０のｍＲＮＡは定常状態ＦＲＣによっても発現されることを示している。
【０１１７】
ＣＸＣＬ９は、よく研究されていないが、癌関連リンパ組織および所属リンパ節からの樹状細胞において観察されている（Ohtani et al., 2009）。リンパ節中の細胞移動の定常状態制御におけるいかなる役割も報告されていない。
興味深いことに、腸間膜および皮膚流入領域リンパ節の両者からのＦＲＣは、内皮細胞へのシグナル伝達に関与する遺伝子を発現した。ＦＲＣが、定常状態条件下での皮膚流入領域リンパ節中のＶＥＧＦの主要な産出者であることは知られている（Chyou et al., 2008）。驚くべきことに、皮膚流入領域リンパ節からのＦＲＣは、腸間膜リンパ節からのものよりも高いレベルでＶＥＧＦａを発現したことを見出した。実際、腸間膜リンパ節は、皮膚流入領域リンパ節と比較して比較的少ないリストの遺伝子の上方制御を示し、多重仮説ロバスト統計相関を行ったとき、それらの結果は、機能的なパスウェイに位置づけられなかった。しかしながら、Ｌｒａｔ、Ｔｇｍ２、Ｍｅｉｓ１およびＰｌｔｐの上方制御と同様に、腸間膜リンパ節中でのＭａｄＣＡＭ発現およびリンパ球分離に必要なＮｋｘ２−３などの公知の腸関連遺伝子の上方制御が観察された（Pabst et al., 2000）。これらの遺伝子は、レチノイン酸の代謝サイクルに関与するか、またはレチノイン酸により上方制御された（Matsuura et al., 1993, Cao et al., 2002, Galdones et al., 2006, Rebe et al., 2009）。レチノイン酸は、腸間膜リンパ節で処理されて腸特異的ホーミング表現型をＴ細胞に付与する（Iwata, 2009）。また、数種の血管拡張剤（Ｖｉｐｒ２、Ｉｔｉｈ４、Ｎｐｒ１）および血管収縮剤（Ａｇｔ）の発現も観察され、ＦＲＣがリンパ節血管と活発に情報交換していることを示唆した。同様に、神経突起伸長を誘発する遺伝子（Ｅｆｎａ５、ｇｐｒ１２６、Ｔｍｅｍ３５およびＮｇｆ）の上方制御は、リンパ節の正常な交感神経支配を維持する役割の可能性を示唆する（Panuncio et al., 1999）。これらの結果を確認するための更なる研究が必要とされるであろう。
【０１１８】
まとめると、皮膚流入領域リンパ節におけるサイトカインおよびケモカインの発現の変化は、ＦＲＣによる微小環境制御の新たな像を示唆する。ＢＡＦＦおよびＣＸＣＲ３リガンドの発現は、造血システムとのクロストークの機序を意味するが、これは以前に報告されていない。同様に、ＩＬ−６、ＩＬ１ＲａｐおよびＬＩＦの上方制御は、皮膚流入領域リンパ節ＦＲＣが、より収縮性であり、および／またはそれらの腸間膜リンパ節の対応物よりも速く活発に分裂していることを示唆しており、同様に、より多量のＶＥＧＦαの転写により、内皮細胞がペースを保つよう影響している。
【０１１９】
しかしながら、これらの転写現象は、すべてのＦＲＣにおいて等しく起こっているのではないかもしれない。リンパ節は、多数のよく理解されていないＦＲＣ微小ニッチを含む。これらの中で最もよく研究されているのは、皮質Ｔ細胞領域ＦＲＣ（ＴＲＣと呼ばれることもある）であり、それはＩＬ−７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１を産出し、コンジットシステムを維持し、ＤＣ、Ｔ細胞およびＢ細胞の移動用の足場として使用される。しかしながら、線維芽細胞のｇｐ３８＋ＣＤ３１−細胞は、リンパ節の全体；Ｂ細胞性濾胞に隣接する皮膜下領域；周皮細胞として；および髄質の全体に存在する。これらの異なるＦＲＣタイプ間を区別することは未だ不可能であり、もしこれらが、同定されたサイトカインおよびケモカインを異なって発現するのなら、皮膚流入領域リンパ節と腸間膜リンパ節との差異は、それらの割合の変化に関与するかもしれない。
共に、これらのデータは、リンパ節ストローマ細胞に適応される技術を網羅する目録を象徴するものである。
【０１２０】
【表１】
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【０１２１】
【表２】
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【０１２２】
【表３】
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【０１２３】
本発明の応用は、上記の説明または図面に例示した構造および成分の構成の詳細に限定されるものではない。本発明は、他の実施態様が可能であり、様々な方法で実施または実行可能である。また、本明細書で使用される表現および用語は、記載の目的であって、限定するものとみなされるべきではない。本明細書で使用される「含む」、「備える」、「有する」、「含有する」、「関与する」およびその語尾変化形は、その後に挙げられた項目およびその均等物ならびに追加の項目を含むことを意図するものである。
【０１２４】
参考文献
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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