(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
改善された活動電位のモルフォロジーをｉＰＳＣ由来の心筋細胞から生み出すためのシステムであって、
前記筋細胞の膜電圧（Ｖm）を測定するように構成された電極を有するパッチクランプと、
前記電極と電気的に通信する生成回路とを備え、
前記生成回路は、前記膜電圧に基づいて内向き整流電流（ＩK1）の電流値を算出し、改善されたモルフォロジーを有する活動電位を前記筋細胞から生み出すために、決定した前記内向き整流電流に応じて人工内向き整流電流を前記電極に供給するように構成されている
ことを特徴とするシステム。
【請求項２】
前記人工内向き整流電流の電流値は、以下の方程式にしたがって決定される
【数１】
0006445534.tif 000003
ことを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記生成回路は、サンプリング周波数で繰り返し前記電流値を算出して電流を供給するように構成されている
ことを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記生成回路は、前記膜電圧に基づく人工内向き整流電流の電流値の算出と、改善されたモルフォロジーを有する活動電位を前記筋細胞から生み出すための、決定した前記電流値に応じた人工内向き整流電流の前記電極への供給とがプログラムされたプロセッサを備える
ことを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記筋細胞の前記活動電位を測定するように構成されている
ことを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記パッチクランプはカレントクランプとして構成されている
ことを特徴とする請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
入力電流を生み出すために前記人工内向き整流電流を前記パッチクランプの刺激電流に加える加算回路をさらに備え、前記人工内向き整流電流が前記入力電流の一成分として前記電極に供給される
ことを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記生成回路は、前記加算回路の手前で前記人工内向き整流電流を減衰させるためのポテンショメータをさらに備える
ことを特徴とする請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
改善された活動電位のモルフォロジーをｉＰＳＣ由来の心筋細胞から生み出すための方法であって、
前記筋細胞の膜電圧（Ｖm）を測定するステップと、
前記筋細胞の前記膜電圧に基づいて、内向き整流電流（ＩK1）の電流値を算出するステップと、
改善されたモルフォロジーを有する活動電位を生み出すために、算出した前記内向き整流電流の電流値に応じて人工内向き整流電流を前記筋細胞に供給するステップとを備える
ことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記内向き整流電流の電流値を、以下の方程式にしたがって決定する
【数２】
0006445534.tif 000004
ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記筋細胞の活動電位として時間をかけて前記膜電圧を記録するステップをさらに備える
ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ｉＰＳＣ由来の心筋細胞が心室の特徴を示すか心房の特徴を示すかを確定するための方法であって、
サンプリング周波数で所定期間にわたって前記筋細胞の膜電圧（Ｖm）をサンプリングするステップと、
人工内向き整流電流（ＩK1）の複数の電流値を、膜電圧サンプルに基づいて以下の方程式にしたがって算出するステップと、
【数３】
0006445534.tif 000005
改善されたモルフォロジーを有する活動電位を前記筋細胞から生み出すために、算出した電流値に応じて前記筋細胞に人工内向き整流電流を供給するステップと、
生み出された規則的な前記活動電位から、前記筋細胞が心室筋細胞であるか心房筋細胞であるかを確定するステップとを備える
ことを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記筋細胞の前記活動電位が心室筋細胞の前記活動電位に一致するように、供給した前記人工内向き整流電流を調節するステップをさらに備える
ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記筋細胞の前記活動電位が心房筋細胞の前記活動電位に一致するように、供給した前記人工内向き整流電流を調節するステップをさらに備える
ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
創薬のための検査薬を確認するための方法であって、
ａ）ｉＰＳＣ由来の心筋細胞を用意するステップと、
ｂ）請求項１に記載のシステムを用意するステップと、
ｃ）ステップｂにおける前記システムを使用して、ｉＰＳＣ由来の前記筋細胞において改善されたモルフォロジーを有する活動電位のパターンを生み出すステップと、
ｄ）ｉＰＳＣ由来の前記心筋細胞を検査薬と接触させるステップと、
ｅ）個々の活動電位の特性または活動電位の規則性が変化した場合に、前記検査薬を創薬の候補薬剤として確認するステップとを備える
ことを特徴とする方法。
【請求項１６】
ｉＰＳＣ由来の前記心筋細胞が、心房筋細胞の前記活動電位の活動電位特性を示す
ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ｉＰＳＣ由来の前記心筋細胞が、心室筋細胞の前記活動電位の活動電位特性を示す
ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
個々の活動電位は、活動電位期間、三角形状の程度、不応期、回復峻度、交互脈の促進のための閾値、または、不安定もしくは無秩序な動きのための閾値が変化する
ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ステップｄにおける前記検査薬は、第１の検査薬であって、
ステップｅを経た前記ｉＰＳＣ由来の筋細胞を、変化した特性を前記第１の検査薬に接触させる前の特性に復元させることができる第２の検査薬に接触させるステップをさらに備える
ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
用意されたｉＰＳＣ由来の前記心筋細胞はヒトのものである
ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願との相互参照＞
本出願は、２０１３年５月１７日に出願の米国仮出願番号６１／８２４，５０７についての優先権を主張するものであり、その仮出願の開示内容を本明細書で援用する。
【０００２】
＜連邦政府の出資に係る記載事項＞
本発明は、アメリカ国立衛生研究所の認可（認可番号：ＨＬ０９３６３１およびＨＬ０６２４６５）により、政府の支援によってなされたものである。政府は、発明について一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
“誘導多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells）”またはｉＰＳＣｓは、非多能性細胞から人工的に作られる多能性幹細胞の一種を指す。ｉＰＳＣｓから生成された心筋細胞は、大きな可能性を有する有益な実験システムである。それにより、心臓治療、薬剤の安全設計と検査、臨床診断、および、研究のために、革新的なヒトの標本が提供される。ｉＰＳＣｓから生成された心筋細胞により、健康的なヒト心筋細胞の活動を繰り返す細胞について研究する機会が与えられ、そのような細胞については、そうでもしないと包括的な実験的試験をほとんど実施できない。ヒトｉＰＳＣ由来の心筋細胞により、心臓機能のための予測ツールの開発力が提供される。
【０００４】
ｉＰＳＣｓから生成された心筋細胞は将来性があるものの、その使用は不整脈惹起メカニズムの研究および薬剤の安全性スクリーニングにおいて深刻な懸念をもたらすため、このアプローチに伴う問題が指摘されてきた。ｉＰＳＣｓから生成されたヒト心筋細胞の活動電位（ＡＰｓ）は、しばしば“未熟表現型（immature phenotype）”といわれる。予期されるＡＰモルフォロジーの典型的なスパイクアンドドーム型の欠如は、ブルガダ症候群の遺伝的基礎または不整脈に関する他のＪ波または早期再分極を研究するために使用されるｉＰＳＣｓから生成されたヒト心筋細胞の能力について、深刻な懸念をもたらしている。また、ｉＰＳＣ心筋細胞は、一見複雑でない再分極プロファイルに加えて、自発的な収縮活動を示す。この収縮活動は、自発的なＡＰｓが結果として生じる拡張期脱分極に伴うものである。したがって、ｉＰＳＣｓを心筋細胞に似た細胞に成長するように誘導することが可能であるが、当該細胞は、心臓細胞の機能の評価において使用できる電気生理学的特性、または、心臓細胞に影響のある薬剤のスクリーニングに使用できる電気生理学的特性を示すことはできない。
【発明の概要】
【０００５】
本開示では、カレントクランプ中の心筋細胞に対してＩK1成分を電気的に付与することによって、ヒトｉＰＳＣ由来の筋細胞における減衰した内向き整流電流（ＩK1）の役割について評価する。このアプローチは、ＩK1の強い影響と、再分極および潜在的な不整脈惹起作用におけるＩK1の発現が生み出す主な生理学的相違の程度とを示す。ＩK1の人工的な置換が、新鮮分離したヒト心筋細胞のＡＰｓの動きに一層酷似したＡＰｓを伴うヒトｉＰＳＣ由来の心筋細胞を生み出すことを実証する。
【０００６】
一形態において、本開示は、ｉＰＳＣ由来の心筋細胞において活動電位のモルフォロジーを改善するためのシステムを提供するものである。改善されるＡＰモルフォロジーには、例えば、生理学的な静止膜電位と、スパイクアンドドーム活動電位とを含むことができる。そのシステムは、筋細胞の膜電圧を測定するための電極を有するパッチクランプと、電極と電気的に通信する生成回路とを備える。生成回路は、膜電圧に基づいて内向き整流電流の電流値を算出し、算出した電流値に基づいて人工内向き整流電流を筋細胞に供給するように構成されている。
【０００７】
この方法は、応用性が高く、電気生理学的なシステムの包括的な分析を可能とし、心房細胞または心室細胞の欠点に対する薬剤仕様のスクリーニングも可能とする。本開示のｉＰＳＣ心筋細胞は、チャネロパチーの解明、薬剤スクリーニング、および、潜在する不整脈原性の評価に使用できる。このツールは、自発活動および不安定な動きについての非生理学的な結果の多くを排除することによって、再分極の動態を研究するために有用なものとなる。それは、病態における再分極の遺伝子調節を見る調査研究に有用であって、薬物研究から得られるデータや安全スクリーンの不整脈惹起作用の解明の手助けにもなる。また、得られたデータに基づく治療計画の変更にも使用できる。
【０００８】
一形態において、本開示は、ｉＰＳＣ由来の心筋細胞において改善したモルフォロジーを有する活動電位を生成する方法を提供するものである。その方法は、筋細胞の膜電圧を測定するステップと、測定された膜電圧に基づいて内向き整流電流の電流値を算出するステップと、そして、改善されたモルフォロジーを有する活動電位を筋細胞が生成するために、人工内向き整流電流を筋細胞に供給するステップとを備える。
【０００９】
一形態において、本開示は、心房細胞に似た電気的特徴を有するｉＰＳＣ由来の心筋細胞と、心室細胞に似た電気的特徴を示すｉＰＳＣ由来の心筋細胞とを区別する方法を提供するものである。
【００１０】
一形態において、本開示は、心房細胞または心室細胞の電気特性に影響を与えることができる候補薬剤をスクリーニングするための方法を提供するものである。その方法は、ｉＰＳＣ由来の心筋細胞が心房の表現型を示すか心室の表現型を示すかを確認することと、心房または心室の機能に影響を与える推定薬剤の効果を検査することを含む。
【００１１】
ｉＰＳＣ心筋細胞は、チャネロパチーの解明、薬剤スクリーニング、および、潜在する不整脈原性の評価に使用することが可能となる。自発活動および不安定な動きについての非生理学的な結果の多くを排除することによって、このツールは、再分極の動態を研究するために有用なものとなる。それは、病態における再分極の遺伝子調節を見る調査研究に有用であって、薬物研究から得られるデータや安全スクリーンの不整脈惹起作用の解明の手助けにもなる。また、得られたデータに基づく治療計画の変更にも使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】電子的ＩK1電流発現システムの機構。ＩK1,Syntheticは、筋細胞膜電位に応じてリアルタイムで生成される。本研究における全細胞に対して、ポテンショメータが１５０ｐＡ−７５ｍＶの標準外向き電流を供給するように設定されている。
【００１３】
【図２】ｉＰＳＣ由来の心筋細胞による自発ＡＰｓ。（Ａ）ペースメーカー型細胞に特有の比較的遅い拡張期脱分極と、とても遅い立ち上がり（ｄＶ／ｄｔmax）とを伴う典型的な自発ＡＰｓ。（Ｂ）不規則でＤＡＤに似た動きの例。概して、カレントクランプ中の自発活動は、かなりの凹凸を示した。この凹凸は、しばしば、活動電位の開始に先立って、ノイズの多い動きと電位の突発的な上昇とを伴った概ねフラットな拡張期間隔を有していた。（Ｃ，Ｄ）同細胞におけるＥＡＤに似た動きの例。ｃでは、０ｍＶ付近での１つの拍動においてＡＰの高電圧延長部分が存在する。ｄでは、細胞は、ＥＡＤに似た振動の低電圧（−２０〜−４０ｍＶ）において長時間を過ごした。
【００１４】
【図３】ペーシング中の静止細胞および自発的な活動細胞。（Ａ）刺激を何ら受けていない静止細胞の典型的な静止電位。（Ｂ）静止細胞（（Ａ）のものと同じ）に刺激（０．５Ｈｚで４つの拍動）を与えることにより、複雑な動きおよび自動能が始動する。（Ｃ）刺激から生じたＡＰｓを示す拡張したタイムスケール。（Ｄ）周波数、拡張期電位、オーバーシュート、および形状に大きなばらつきのある自発活動。（Ｅ）自発的な活動細胞（（Ｄ）の筋細胞）をペーシング（０．２５Ｈｚで４つの拍動）することにより、さらに一定の後過分極電位が生み出され、自発活動が変化する。（Ｆ）拡張したタイムスケールにおいて、後過分極を容易に見て取ることができる。
【００１５】
【図４】人工ＩK1発現およびペーシングの前後におけるＡＰｓ。（Ａ）自発的な心室型細胞。比較的高い拡張期電位によってｄＶ／ｄｔmaxが小さくなるため区別することが困難であるが、この細胞は丸まったＡＰを示す。ＡＰの“肩”は、遅いフェーズＩＶの再分極に起因して不鮮明である。（Ｂ）ＩK1の（Ａ）における電子的発現は、ＩNa不活性化を取り除く通常の静止電位を復活させ、それによってｄＶ／ｄｔmaxが増加し他の電流がリセットされる。Ｉtoのような電流のリセットは、心室細胞の古典的な“スパイクアンドドーム”形態（morphology）を生み出す。（Ｃ）心室細胞または結節細胞と区別するのが困難なモルフォロジーを有し、自発的に拍動する心房に似た細胞。（Ｄ）ＩK1の電子的発現は、パネルｃにおける細胞の心房特性を明らかにする。心室細胞と同様に、負の静止電位は、通常のｄＶ／ｄｔを復活させ、特有のスパイクと、心房細胞特有の低くて、より三角形状の再分極相とを明らかにする。（Ｅ，Ｆ）拡張したタイムスケールにおいて、（Ｅ）心房に似たＡＰｓおよび（Ｆ）心室に似たＡＰｓの再分極の詳細。（Ｇ）ＩK1の電子的発現を伴う細胞について、ＡＰＤ30に対する比率ＡＰＤ30／ＡＰＤ90の散布図。
【００１６】
【図５】カルシウムチャンネルアゴニストBayK8644の効果。（Ａ）４ｓのサイクル長の刺激から生じたＡＰｓ。内在する自動能は幾ばくかのＡＰｓをかなり短くする原因となり、先立つ自発的な拍動から再分極中に幾ばくかの刺激が生じる。３つの軌跡が重畳されている。（Ｂ）１μＭのBayK8644を伴う同じ細胞。BayK8644は、自発活動を終わらせるカルシウムローディンの原因となった。刺激から生じたＡＰｓは、大幅に短くなった再分極を伴う異常な動きを示し、再生脱分極（regenerative depolarization）の形跡をほとんど示さなかった。３つの軌跡が重畳されている。（Ｃ）ＩK1,Synthteticの電子的発現を伴うことを除いて（Ａ，Ｂ）のものと同じ細胞である。ＡＰは、通常のスパイクアンドドーム形態、および、一定のＡＰＤ90を有する。３つの軌跡が、Ｂに先立ち記録された。（Ｄ）ＩK1,syntheticおよび１μＭのBayK8644を伴う（Ａ，Ｂ，Ｃ）のものと同じ細胞である。ＡＰＤは延長されており、交互脈の不整脈惹起現象が認められる。幾ばくかのＡＰｓは、続いて起こる刺激によって妨害される。ＩK1の時不変性にも関わらず、ＩK1の電子的発現は、交互脈の動的現象の観測を容易に観測可能なものとする。ＱＴ延長に加えて、交互脈に対する閾値における変化は、不整脈原性の潜在力についての重要な細胞の指標である。（Ｅ）ＩK1,synthetic（ｎ＝７）によりＡＰＤ90が小さく変化する。これは矛盾しているようであるが、ＩK1の追加の正味の影響は、再分極のドーム部分の期間延長、および、再分極の最終ステージ（または足）の割合の増加である。ＡＰＤ90における結果は控えめな変化のみである。（Ｆ）BayK8644を伴う／伴わないＡＰＤ90の割合は、ＩK1,synthetic発現が有るＡＰＤにおいて主に増加すること、および、それが無いＡＰＤ90において変則的に減少することを示している。
【００１７】
【図６】本発明の一実施形態に係る方法を示すフローチャートである。
【図７】本発明の他の実施形態に係る方法を示すフローチャートである。
【図８】本発明の他の実施形態に係る方法を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本開示は、ネイティブ細胞に関する生理学的な活動電位のモルフォロジーを、ｉＰＳＣ由来の心筋細胞に付与する方法を提供する。当該方法は、カレントクランプでＩK1成分を心筋細胞に電子的に加えることを含む。ＩK1の人工的な置換が、新鮮分離したヒト心筋細胞のＡＰｓの動きによく似たＡＰｓを伴うヒトｉＰＳＣ由来の心筋細胞を生み出すことを実証する。
【００１９】
ｉＰＳＣｓは、非多能性細胞、典型的には、成人の体細胞、または、繊維芽細胞、造血細胞、筋細胞、神経細胞、表皮細胞等の最終分化した細胞に、リプラグラミング因子を導入または接触させることで作ることが可能である。誘導多能性幹細胞は、心筋細胞に分化することができる。例えば、成人のヒト繊維芽細胞には、レトロウイルス導入を用いてOct4、Sox2、c-Myc、および／または、Klf4、あるいは、レンチウイルス導入を用いてOct4、Sox2、Nanog、および、Lin28の転写因子を形質導入することができる。ｉＰＳＣｓ由来の心筋細胞については、米国特許第８，４１５，１５５を参照し、本明細書は、その開示内容を援用する。
【００２０】
体細胞にリプログラミング因子を導入した後には、多能性を有する未分化状態を維持するために十分な培地で細胞を培養する。培養中のｉＰＳＣｓを維持するための培養方法および培地は周知のものである。
【００２１】
心筋系細胞は、所望の表現型の細胞のための特別な成長環境において、未分化幹細胞を培養して分化することで入手することが可能である。細胞の入手は、例えば、所望の細胞の増殖、または、他の細胞型の抑制あるいは殺滅によって実現できる。詳細は、米国特許第８，４１５，１５５に記載されている。当該特許の発明は、ｉＰＳＣ由来の心筋細胞を提供するものである。また、ＩＰＳＣ由来の心筋細胞は商業的にも入手可能である。
【００２２】
ｉＰＳＣｓ由来の心筋細胞の電気的活動を記録するためには、全細胞ボルテージクランプ法またはカレントクランプ法が使用できる。一般的に、これらの方法では従来の方法で使用しているギガシールの形成を伴う。
【００２３】
ｉＰＳＣ由来の心筋細胞は、典型的には“丸められた（rounded）”モルフォロジーを有する活動電位を発生させる。高ＭＤＰによってｄＶ／ｄｔｍａｘが小さくなると、ＡＰモルフォロジーに基づいて心室と心房との細胞を区別することは難しい。
【００２４】
図１に関して、本開示は、ｉＰＳＣ由来の心筋細胞９０における活動電位のモルフォロジーを改善するためのシステム１０として具現化されている。改善される活動電位のモルフォロジーは、例えば、安定した生理学的な静止膜電圧および／または生理学的な活動電位のモルフォロジーを含む。システム１０は、当技術分野で周知のパッチクランプ１２を備える。パッチクランプ１２は、全細胞測定用に構成された単一電極装置である。したがって、パッチクランプ１２は電極１４を備えている。電極１４は、例えば、導電性の溶液が充填されたガラスマイクロピペットとすることが可能である。そのような模範的な電極は、測定対象となる細胞に対してギガオームシールを形成するように構成することが可能である。パッチクランプ１２は、筋細胞９０の膜電圧（Ｖm）を測定するように構成されている。
【００２５】
パッチクランプ１２は、筋細胞９０の活動電位を測定するように構成されている。幾ばくかの実施形態では、パッチクランプ１２は、カレントクランプ（current clamp）として構成され、電極１４を経由して細胞９０に刺激電流（ＩSTIM）を供給する。したがって、パッチクランプ１２は、あるサンプリング周波数での膜電圧のサンプリング（測定）により、時間をかけて細胞９０の活動電位を記録するように構成することが可能である。
【００２６】
システム１０は、パッチクランプ１２の電極１４と電気的に通信する生成回路２０を備えている。生成回路２０は、電気信号を電極１４から受信するように構成されており、当該電気信号は測定された膜電圧を示す。こうして、生成回路２０は、測定された膜電圧を電極１４から受信する。生成回路２０は、電極１４からの膜電圧に基づいて、内向き整流電流（ＩK1）の電流値を算出するように構成されている。例えば、内向き整流電流は、以下の方程式（１）にしたがって膜電圧から算出することができる。
【数１】
0006445534.tif 000002
膜電圧と内向き整流電流との他の関係性は、本開示に照らして明らかであり、幾ばくかの実施形態の範囲に含まれるべきものである。
【００２７】
さらに、生成回路２０は、人工内向き整流電流（ＩSYNTHETIC）を電極１４に供給するように構成されている。生成回路２０により供給される人工内向き整流電流は、生成回路２０によって算出されたＩK1の値に対応している。幾ばくかの実施形態では、人工内向き整流電流は、算出された内向き整流電流の値と等しい（ＩSYNTHETIC＝ＩK1）。幾ばくかの実施形態では、ＩSYNTHETICをＩK1と違うものとすることができる。例えば、生成回路２０は、ポテンショメータ２２をさらに備えることができ、供給する電流（ＩSYNTHETIC）をＩSYNTHETIC＜ＩK1のように減衰させることもできる。
【００２８】
幾ばくかの実施形態では、生成回路２０はプロセッサを備え、当該プロセッサは内向き整流電流の電流値を算出するようにプログラムされている。本開示に照らして、生成回路２０が、（例えばソフトウェアを含む）プロセッサ、個別の電子部品、アプリケーション特有の集積回路、フィールドプログラマブルゲートアレー、もしくは、それらの組み合わせ、または他の構成により実現できることは明らかである。
【００２９】
システム１０は、パッチクランプ１２の刺激電流（ＩSTIM）に対して人工内向き整流電流（ＩSYNTHETIC）を加えるように構成され、入力電流（ＩINPUT）を生み出す加算回路３０を備えている。こうして、人工電流が、入力電流の成分として電極１４に供給される。
【００３０】
システム１０は、デジタルインプリメンテーションを伴う実施形態では、あるサンプリング周波数で時間をかけて膜電圧を繰り返し測定し、対応する人工内向き整流電流を細胞９０へ電極１４を経由して供給するように、継続的に使用することができる。複数の電流は、各期間に対する人工電流にしたがって時と共に変化する連続した電気電流として調整できることに留意すべきである。
【００３１】
さらに、生成回路２０は、人工内向き整流電流が電極１４に供給されないようにするために、生成回路２０を選択的に切断するためのスイッチ２４を備えている。
【００３２】
本開示は、ｉＰＳＣ由来の筋細胞から正常な活動電位を生み出すための方法（１００）として具現化されている（例えば図６参照）。方法（１００）は、筋細胞の膜電圧（Ｖm）を測定する（１０３）工程を備えている。膜電圧を測定する（１０３）ために、例えば、パッチクランプを全細胞記録（whole-cell configuration）で使用することができる。内向き整流電流（ＩK1）の電流値は、測定された膜電圧に基づいて算出される（１０６）。幾ばくかの実施形態では、算出された（１０６）値は、上記の方程式（１）にしたがって算出される。幾ばくかの実施形態では、プロセッサを使って値が算出される（１０６）。例えば、コンピュータを、測定した（１０３）膜電圧を受信するように構成し、膜電圧に基づいて内向き整流電流を算出する（１０６）ようにプログラムすることができる。内向き整流電流を算出する（１０６）ための他の手法は、本開示に照らして明らかである。
【００３３】
さらに、方法（１００）は、筋細胞が正常な活動電位を生み出す要因となる人工内向き整流電流（ＩSYNTHETIC）を筋細胞に供給する（１０９）工程を備えている。電流は、パッチクランプの電極を経由して供給する（１０９）ことができる。人工内向き整流電流は、算出した（１０６）値に対応している。幾ばくかの実施形態では、供給される（１０９）人工電流は、算出した（１０６）内向き整流電流と等しい。幾ばくかの実施形態では、供給される（１０９）人工電流は、算出した（１０６）値よりも小さく、例えば、電流を減衰させるためにポテンショメータが使用される。
【００３４】
幾ばくかの実施形態では、パッチクランプが用意され（１０９）、電極を用いて筋細胞の膜電圧を測定する（１０３）ように構成される。パッチクランプは、カレントクランプとして構成することができ、刺激電流（ＩSTIM）は筋細胞に供給される。そのような実施形態では、電極を経由して筋細胞に供給される入力電流（ＩINPUT）を生み出すために、人工内向き整流電流を刺激電流に加える（１５３）ことができる。したがって、人工電流は、入力電流の成分として筋細胞に供給される（１０９）。
【００３５】
さらに、方法は、ｉＰＳＣ由来の心筋細胞が心室の特徴を示すか心房の特徴を示すかを確定するために使用することができる。例えば、方法（２００）は、あるサンプリング周波数で所定期間にわたってｉＰＳＣ由来の筋細胞の膜電圧をサンプリングする（２０３）工程を含むことができる（例えば図７参照）。人工内向き整流電流の複数の電流値が算出され（２０６）、各電流値はサンプリングされた（２０３）膜電圧に対応する。それらの値は、方程式（１）にしたがって算出する（２０６）ことができる。方法（２００）は、算出した（２０６）内向き整流電流の電流値にしたがって、人工内向き整流電流を筋細胞に供給する（２０９）工程を備えている。筋細胞は、結果として生じる活動電位の形態に基づく活動電位に基づいて、心室の特徴または心房の特徴を示すことを確定する（２１２）ことができる。
【００３６】
筋細胞が心室の特徴を示すと確定した（２１２）場合には、方法（２００）は、筋細胞の活動電位を心室筋細胞の活動電位に一致させるために、供給した（２０９）人工内向き整流電流を調整する（２１５）工程を含むことができる。筋細胞が心房の特徴を示すと確定した（２１２）場合には、方法（２００）は、筋細胞の活動電位を心房筋細胞の活動電位に一致させるために、供給した（２０９）人工内向き整流電流を調整する（２１８）工程を含むことができる。
【００３７】
本開示は、創薬のための試験薬を確認するための方法（３００）として具現化することができる（例えば図８参照）。方法（３００）は、ｉＰＳＣ由来の心筋細胞を用意する（３０３）ステップ、および、上記に記載のシステム１０のような人工内向き整流電流を供給するためのシステムを用意する（３０６）ステップを備える。改善されたモルフォロジーを有する活動電位のパターンは、そのシステムを使って生成される（３０９）。筋細胞は、心室筋細胞または心房筋細胞の活動電位特性を示すことができる。筋細胞は、試験薬に接触させられる（３１２）。試験薬は、筋細胞の活動電位の特性に基づき、創薬のための候補薬剤として確認される（３１５）。例えば、活動電位の三角形状の程度が増減し、活動電位の期間が長くもしくは短くなり、活動電位の規則性が変化し、不応期に変化が生じ、または、回復の動きに変化が生じるように、個々の活動電位の特性が変化した場合に、試験薬を候補薬剤として確認することができる（３１５）。その他の例では、これに限定するものではないが、活動電位の期間、三角形状の程度、不応期、回復峻度、交互脈の促進のための閾値、または、不安定もしくは無秩序な動きのための閾値について、活動電位は変化する。さらに、方法（３００）は、（筋細胞を上記の（第１の）試験薬に接触させた（３１２）後に）ｉＰＳＣ由来の筋細胞を第２の試験薬に接触させる（３１８）ステップを備えることができる。第２の試験薬は、筋細胞の変化した特性を第１の試験薬に接触させる（３１２）前の特性に復元するためのものを選択することができる。
【００３８】
上記の方法は広く応用できる。例えば、当該方法により、ヒトの電気生理学的なシステムの包括的な分析が可能となる。ｉＰＳＣ心筋細胞は、チャネロパチーの解明、薬剤スクリーニング、および、潜在する不整脈原性の評価に使用できる。この方法は、ヒトｉＰＳＣ由来の心筋細胞の自発活動および不安定な動きについての潜在的に複雑で非生理学的な結果の多くを排除することによって、再分極の動態を研究するために有用なツールを提供するものである。それは、病態における再分極の遺伝子調節を見る調査研究に有用であって、薬物研究から得られるデータや安全スクリーンの不整脈惹起作用の解明の手助けにもなる。
【００３９】
本開示において記載されたシステムおよび方法は、ヒトまたは例えば哺乳動物を含む他の動物のｉＰＳＣｓに使用することができる。
【００４０】
以下の例で発明を詳細に説明する。
【実施例】
【００４１】
方法
＜細胞の用意＞
【００４２】
市販のｉＰＳＣ由来の心筋細胞（iCell Dynamics、WI）を、製造会社の指示にしたがって用意した。簡単に説明すると、iCell心筋細胞（１ｍｌの冷凍バイアルに入れられて凍結保存された単細胞縣濁液）を液体窒素中に貯蔵した。バイアルは、ウォーターバス（３７℃）で溶かした。細胞は、１ｍｌの室温の“iCell Cardiomyocyte Plating Medium”で洗ってゆすいだ。さらに８ｍｌの平板培地（plating medium）を加え、溶液をそっと逆さまにして細胞を混ぜた。１２ウェルのプレートにおける０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン溶液でコーティングされた１５ｍｍのカバースリップに心筋細胞を播種した。心筋細胞を、単細胞培養が可能となる２ｍｌの室温の平板培地において播種し（20,000〜40,000/皿）、CO2を７％とし３７℃で２日間にわたって培養した。付着性の無い細胞は、“iCell Cardiomyocyte Maintenance Medium”でゆすぐことで取り除いた。さらに、２ｍｌの維持培地（maintenance medium）を加えた。維持培地は２日ごとに変え、細胞は１週間以内に使用した。
【００４３】
＜電気生理学＞
【００４４】
ｉＰＳＣ由来の心筋細胞にボルテージクランプを行った。室温での全細胞クランプを用いて電流を記録した。記録チャンバー（３００μｌ）中の細胞は、タイロード液（Tyrode）によって連続的に灌流した。ピペットは、ホウケイ酸塩ガラス（Flaming/Brown horizontal micropipette puller）から製造され、先端が熱研磨されている（Narishige microforge）。ピペット内容物（ｍＭ）：10NaCl、125KCl、1MgSO4、5EGTA、5ATP（Mg塩）、５トリクレアチンリン酸、0.3GTP、10HEPES、pH7.2。細胞外の溶液（ｍＭ）：150NaCl、5.4KCl、0.5Na2HPO4、1MgCl2、2CaCl2、１０グルコース、10HEPES、pH7.4。１〜１０Ｇオームのシールを確立した後、パッチを裂くために吸引およびパルス電圧の印加を行った。電流を記録し（Axopatch-1D、Molecular Dynamics、CA）、Digidata 1322A（Molecular Dynamics、CA）を介してPentium(登録商標)4コンピュータとインターフェースで接続した。プロトコルの制御およびデータの取得には、PClamp 9.0（Molecular Dynamics、CA）を使用した。
【００４５】
＜インシリコ（in silico）インターフェース＞
【００４６】
Ｖm信号をＩK1電流の信号に変換するために、２つのIntel Xeon CPU E5520を備えるDell Precision T7500ワークステーションに実装されたアナログ＆デジタルＩ／ＯボードPCIe-DAS1602/16（Measurement Computing Corporation）を使用した。
【００４７】
＜データ分析＞
【００４８】
pClamp 9（Molecular Dynamics）を用いて行った。活動電位期間（ＡＰＤ）は、ミリ秒（ｍｓ）で再分極の５０％（ＡＰＤ50）および９０％（ＡＰＤ90）を計算した。ＡＰアップストロークの上昇の最大比率を、ｍＶ／ｍｓで測定した（ｄＶm／ｄｔmax）。静止膜電位は、各ＡＰに先立って記録した。自発ＡＰｓについては、完全なＡＰ再分極と続いて起こるＡＰでの脱分極の始まりとの間の期間における拡張期の特性を公表する。拡張期期間について、持続期間、および最小／平均の電位を計算した。
【００４９】
＜統計的分析＞
【００５０】
結果を平均±標準偏差（mean±s.e.m）で公表する。差異は、ｔ検定、または、必要に応じて統計的に有意であると考えられるｐ＜０．０５とした分散分析（ANOVA）により分析した。
【００５１】
結果
ｈ−ｉＰＳＣ由来の心筋細胞におけるＩK1の不足を解決するために、ＩK1の人工版を導入するためのダイナミッククランプ法の変種を開発した。システムの中核は、全細胞ボルテージクランプ法またはカレントクランプ法の下で分離されているｈ−ｉＰＳＣ由来の心筋細胞である。全細胞クランプ法は、従来のカレントクランプモードの下、ギガシールを伴って実現される。心筋細胞の膜電圧は、増幅器から出力され、膜電位に代えて内向き整流電流を図１中の方程式にしたがって算出するデジタイザを介して、コンピュータに入力される。算出されたＩK1,Syntheticの値は、ＩKを増減するための（デジタル解像度を犠牲にすることなく振幅を調整するために使われる）ポテンショメータを通過した後、pClampからの標準の刺激入力に加算される。スイッチは、従来のカレントクランプ法と加算入力法（summed input）との迅速な切り替えを可能とする。加算入力法がスイッチオンとなったとき、筋細胞は、２つの入力の総和（標準のＡＰ刺激電流+リアルタイム電流シミュレータからのＩK1,Synthetic）を受信する。標準のボルテージクランプ装置は、従来のボルテージクランプ法から変更することのない加算回路および入力／出力チャンネルの軽微なソフトウェアの選択変更のみを伴うデータ記録によって駆動することができる。その結果物は、細胞に瞬時に“導入（transfected）”されたネイティブＩK1が発現したかのように振る舞う細胞である。
【００５２】
＜ｉＰＳＣ由来の心筋細胞ＡＰｓの特性および変動性＞
【００５３】
ｉＰＳＣ由来の心筋細胞の報告の大半は、一般的にそれらが自発活動的であって少しの静止細胞を伴うものであり、それは我々の研究結果と一致している。その結果として、ｉＰＳＣ由来の心筋細胞に関する最新のＡＰ研究では、自発ＡＰの動きの解析に基づくパラメータが報告されている。細胞間多様性（cell to cell variability）が高いことを前提として、ＡＰパラメータにおける変化について統計的に有意な結果を生み出すために、多数の細胞が使用されている。ハイスループットスクリーニング法は、市販のｉＰＳＣ由来の心筋細胞の細胞特性を調べるためにも採用されている。この特性には、少なくとも部分的に、細胞型（すなわち、心室、心房、および、結節細胞）間の多様性が反映されている。しかしながら、この多様性の幾ばくかは、自発活性細胞の記録の結果から生じたものでもある。自発活性細胞の平均最大拡張期電位は−５９±２ｍＶであった（ｎ＝３３）。自発活動は、通常不規則で、数百ｍｓから８ｓ（平均：２０６８±４１５ｍｓ、ｎ＝２５）の拡張期期間の広い範囲にわたって起こり、任意の単一細胞に対して拍動間の多様性（beat to beat variability）が高いものであった（図２参照）。驚くことではないが、心拍の変動性は、ＡＰ期間および形状の高い変動性に付随するものであった。表１に示すように、自発ＡＰｓは、比較的小さい振幅とかなり遅いアップストロークとを有する傾向にあった（図２Ａ，Ｂ）。この不規則な動きは、しばしば、ＥＡＤｓおよび低閾値並びに高閾値のＤＡＤｓに似た自発的事象を付随するものであった（図２Ｃ，Ｄ）。
【００５４】
電気活動において変動を減衰させる策略は、ペーシングされた外部刺激を手段とすることである。これは、遅い自発活動を規則化することができ、静止細胞における再生式の電気的挙動を潜在的に誘導することができる。全てのｉＰＳＣ由来の心筋細胞が自発活動するものではなかった（試験を行った３３細胞の中で、８細胞が自発活動するものではなかった）。しかしながら、自発活動しない細胞であっても、働く心筋から得たヒト成人心筋細胞と関連付けられる通常のＡＰ特性を示さない。自発収縮機能の欠如は、安定した通常の静止電位（約−８５ｍＶ）、または、結果として異常な静止状態となる比較的脱分極した電位によるものかもしれない。非自発的な細胞の大半は、働く心筋特有の過分極静止膜電位を有しておらず、異常な脱分極状態であった。非自発的な８つの活性細胞の中の３つは、−６０ｍＶ超の静止電位を有し、１つのみが、−７０ｍＶ未満の静止膜電位を有していた。ＡＰｓおよび収縮活動は、刺激電流を伴うペーシングにより、静止細胞において初期化される。誘発されたＡＰｓは、自発活性細胞のそれと似ている。幾ばくかの静止細胞において、ペーシングは、自発的な動きの次の期間を誘発することができ（図３Ａ−Ｃ）、自発的な動きは、遅延した整流電流がヒトｉＰＳＣ由来の心筋細胞において拡張期電位を生み出すことを示している。自発活性組織のペーシングは、拍動間の多様性を変化させ（図３Ｄ−Ｆ）、幾ばくかのパラメータ（特にｄＶ／ｄｔmax）を改善した（表１）。
【００５５】
ＡＰｓが自発活動から生じたか刺激によるペーシングから生じたかに関係なく、ＡＰｓは、期間が延長された再分極(ＡＰＤ90は、それぞれ、９５５±１０３ｍｓ（ｎ＝３８）および９６７±１４１ｍｓ（ｎ＝３０）であった）と、小さくなった振幅と、新鮮分離したヒトの心房筋細胞または心室筋細胞のＡＰｓと比べて小さい最大アップストローク（ｄＶ／ｄｔmax)とを有していた。また、それらは、心室筋細胞および心房筋細胞特有のスパイクアンドドーム形態を欠いていた。これは、ＡＰモルフォロジーを生じさせるＩtoが堅牢であることを細胞が一様に示していたため、やや意外であった。しかしながら、Ｉtoの電流を生じさせるKv4.2/4.3介在チャンネル（mediated channels）は、かなりの閉鎖状態不活性化を含んでおり、自発ＡＰｓおよび刺激から生じたＡＰｓの脱分極状態によって大部分を不活性化することができる。同様に、ＩNaも、その電位で不活性化され、通常の急速なアップストロークまたはスパイクアンドドームの動きに十分に寄与できない。これらの動きの欠如は、非生理的機能につながり、変異チャンネルまたは候補薬剤の不整脈惹起または抗不整脈の作用についての任意のスクリーニングの予測値を大幅に低下させることになる。しかしながら、ＩK1を付与したとき、安定した静止膜電位が確立して、ＡＰ形状および規則性において著しい変化があった（図４）。スパイクアンドドーム形態が明らかに見られ、心室に似た筋細胞と心房に似た筋細胞との差異が容易に表れ、その差異は、細胞型間の効率の良い識別を可能とする方法を示唆するものである。図４Ｇは、細胞が、活動電位の形状および活動電位期間に基づいて、２つに区分できる集団に振り分けられることを示している。拍動間のＡＰｓと細胞間のＡＰｓとの相違は減少し、ＡＰの上昇段階の急速なアップストロークは、顕著で一貫性のあるものとなった（表１）。ＩK1の再構成によって、多くの重要な特性がｈ−iＰＳＣ由来の心筋細胞のものに復元されことは明らかである。
【００５６】
＜再分極の薬理的な操作＞
【００５７】
内向き整流の再構成は、ｈ−ｉＰＳＣ由来の心筋細胞ＡＰｓの多くの特性を、働く心筋細胞に酷似した形態となるように正常化する。さらに、その再構成は、フリーランで生じた（free-running）ＡＰｓまたは刺激で生じたＡＰｓと関連している多くの制御されていない特性を軽減する。この特性の機能的効果は、カルシウムチャネル作動薬BayK-8644を評価することによって見ることができ、その作動薬は、振幅を増大させるとともにＬ型カルシウムチャネルの不活性化を妨げ、結果としてＡＰＤの甚大な増加が生じる。電子的ＩK1を伴う場合と伴わない場合とで、ペーシングされたｈ−ｉＰＳＣ由来の心筋細胞における１μＭのBayK-8644の効果を調べた（図５）。１μＭのBayK-8644の使用は、双方の場合において意義深かった。しかしながらBayK-8644によるＡＰ期間延長は、ペーシングされた細胞において一様ではないことが観察された。むしろ、かなり短くなったＡＰの刺激の後に、膜脱分極によって自発的で完全な（full scale）ＡＰ活動に終わりが生じた。また、低レベルの細動に似た電気的振動の増大も観察された。対照的に、ＩK1が電気的に差し込まれたとき、細胞の活動は規則的になり、変動性が低下し、ＡＰがより生理学的なものになり、細動に似た電気的挙動が抑制された。BayK-8644の使用は、明確なＡＰの期間延長をもたらした。短いペーシング間隔で、幾ばくかのＡＰｓは、ペーシング率を超えるほど長くなった（図５Ｄ）。一対のデータを見ると、予測される不整脈惹起の潜在力に定性的な違いがはっきりと表れており（図５Ｅ）、この違いは、不整脈の分子基盤の研究または薬物安全性のためのツールとしてのヒトｉＰＳＣ由来の心筋細胞システムについて、その予測能力を改善するための電子的ＩK1発現の能力を強調している。
【００５８】
本発明の１つ以上の特定の実施形態について記載してきたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく当該発明の他の実施形態を具現化できることは理解されるであろう。よって、本発明は、添付の請求項およびその合理的解釈によってのみ限定されるものとみなされる。
【符号の説明】
【００５９】
１０  システム
１２  パッチクランプ
１４  電極
２０  生成回路
３０  加算回路
９０  細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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