(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２型糖尿病、並びに、糖尿病性神経障害、筋ジストロフィーおよび血管内皮炎から選択される２型糖尿病の合併症の治療および予防に対して治療活性を有する、下記式で表される化合物:
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、以下の式、H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH、
を有する新規のエキセナチド類似体に関し、糖尿病の他、糖尿病性神経障害、筋ジストロフィーおよび血管内皮炎などの2型糖尿病合併症の治療および予防のために使用することができる。
【０００２】
本発明は、医薬および薬学に関するものであり、2型糖尿病の他、糖尿病性神経障害、筋ジストロフィーおよび血管内皮炎などの合併症の予防および治療のための医薬品として使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
2型糖尿病（DM2またはインスリン非依存性糖尿病）は、糖質代謝障害において主に現れる慢性の多臓器疾患である。高血糖症は異常な変化の結果として発症する。さらに、インスリン産生に関与する特異的な膵臓腺細胞の機能不全が現れる。2型糖尿病患者の死亡の主な原因は、第1に、大血管合併症（冠状、大脳および末梢動脈の傷害）の発症である。また、DM2は、メタボリックシンドローム（インスリン抵抗性またはシンドロームX）の発症の主要な要素の1つである（非特許文献１）。近年、DM2がアルツハイマー型認知症発症の病理学的マーカーであることを示す所見がますます増加している（非特許文献２）。
【０００４】
2013年末のWHOデータによると、世界で糖尿病に罹患している人は3億4700万人いる（非特許文献３）。2004年には、高血糖のため340万人が死亡した（非特許文献４）。糖尿病の合併症による致死症例数は、2010年に同じ水準に維持された（非特許文献５）。WHOの予測によると、糖尿病は2030年までに7番目の重要な致死原因になる（非特許文献４）。1型糖尿病は先進国の患者の10〜15％に認められ、2型糖尿病は85〜90％の患者に認められると考えられている。しかし近年、先進国における2型糖尿病の発症頻度は非常に急速に増加する一方、1型糖尿病患者の数は大きく変化していない。最新のWHOデータによると、世界で1型と2型の糖尿病の割合は、2型糖尿病の発症頻度の増加に向かって変化している（非特許文献５）。
【０００５】
糖尿病の最も初期かつ最もよく見られる合併症は、糖尿病性神経障害であり(非特許文献６)、これは小血管(血管栄養血管、神経栄養血管）の傷害に伴う神経系障害を特徴とする。この合併症は、仕事の低下をもたらすだけでなく、しばしば患者の重大な機能障害を惹起する傷害の発症や死亡を引き起こす。病理学的プロセスはすべての神経線維:知覚、運動および植物的な神経、に影響を与える。
【０００６】
異なる著者のデータによると、糖尿病患者の90〜100％の間で糖尿病性神経障害が見られる。糖尿病に因る神経系傷害の発症頻度は、罹病期間に正比例し、場合によっては、糖尿病の主要な臨床兆候の出現に先行する。従って、糖尿病発症患者の5％は、すでに神経系傷害の症状を有し、それは糖尿病罹患期間が25年間になるまでに60％に達する。神経系のすべての部分：中枢神経系（脳症、脊髄症）、末梢神経系（多発および単神経障害）および末梢性の植物的神経系（自律神経障害）は、糖尿病による影響を受ける。
【０００７】
以上のことを考慮すると、2型糖尿病自体とその合併症の治療薬を日々の臨床業務において開発、推進していくことが有望であることは明らかである。
【０００８】
2型糖尿病およびその合併症の治療法は、現在、いくつかのグループにまとめられた抗高血糖薬に基づいている：
【０００９】
第1グループには、PPARγアゴニスト、核内ガンマ受容体刺激剤であるチアゾリジンジオン（ロシグリタゾンおよびピオグリタゾン）、およびビグアニド（メトホルミン（Metformin）、シオフォール（Siofor）、アバンダメット（Avandamet）、バゴメット（Bagomet）、グルコファージ（Glucophage）、メトホガンマ（Metfogamma））、という2種類の医薬品が含まれる。このグループの医薬品は、インスリンに対する細胞の感受性を高め、インスリン抵抗性および腸管細胞によるグルコース吸収性を低下させるため、過体重のヒトに処方されることが多い。
【００１０】
第2グループの抗高血糖薬にも、自己インスリンの産生を促進してその効率を高める第2世代のスルホニルウレア（マニニル（Maninil）、ダイアベトン（Diabeton）、アマリール（Amaril）、グルレノルム（Glurenorm）、グリビネス遅延型（Glibinese-retard））と、膵腺によるインスリン合成を促進し、また食後のピーク（食事後の糖値レベルの上昇）を減少させるメグリチニド（レパグリニド（Repaglinide（Novonorm））およびナテグリニド（Nateglinide （Starlix）））、の2種類の医薬品が含まれる。
【００１１】
第3グループの抗高血糖薬には、食事で摂取される多糖を分解するアルファグルコシダーゼ酵素をブロックすることにより、腸管細胞によるグルコースの吸収性を減少させるアカルボース（Acarbose（Glucobay））が含まれる。
【００１２】
DM2合併症の治療および予防における新たな開発としては、グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）受容体のアゴニストである直接のインクレチン模倣薬、および4型ジペプチジルペプチダーゼの間接的な遮断剤が挙げられる。直接的なインクレチン模倣薬には、エキセナチド（例えば、バイエッタ）、リラグルチド（Viktoza）、アルビグルチドおよびフルグルチドを含む。間接的なものには、シタグリプチン（Januvia）、サクサグリプチン（Onglyza）、リナグリプチン（Trajenta）およびヴィルダグリプチン（Galvus）が含まれる。
【００１３】
インクレチンなどの医薬品グループは特別な関心を呼んでいる。
【００１４】
GLP-1などのインクレチンはベータ細胞の機能を改善し、不適切に増加したグルカゴンの分泌を阻害し、インスリンのグルコース依存性分泌の増加を惹起する。インクレチン受容体（GLP-1R）の模倣薬であるエキセナチド（exenatide）エキセンディン-4は、インスリン非依存性糖尿病およびその合併症の効能および予防的治療がヒトに対する臨床試験によって証明された医薬品の1つである。
【００１５】
エキセナチドは、当初は、エキセンディン-4として知られていたポリペプチドであり、アメリカ毒トカゲの毒からの抽出方法と、そのアミノ酸配列（HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGG-PSSGAPPPS-NH2）が1992年4月に初めて公開された。（非特許文献７）。インクレチンペプチドの代表例として、エキセンディン-4は、インスリン分泌のグルコース依存性増加、グルコース処理の改善、食欲の抑制、胃からの食物移動の減速など、効果の範囲が広い。
【００１６】
高血糖症を伴う2型糖尿病の患者に対するエクセナチドの使用は、グルカゴンの過剰分泌を抑制するが、エクセナチドは低血糖に対する通常のグルカゴン応答に影響しない
【００１７】
メトホルミンおよび/またはスルホニルウレアに基づく医薬品と組み合わせたエクセナチド療法は、絶食状態の血中グルコース含量、食後の血中グルコース含量、ならびにグリコシル化ヘモグロビン値（HbA1c）の減少をもたらし、これらの患者に対する血糖コントロールを改善する。
【００１８】
エキセナチドをGLP-1内因性ホルモンの効果を超える効果を伴ったインスリン分泌促進に対するエクセナチドの使用が米国特許に開示されている（特許文献１）。本発明の説明で提供される実施例は、エクセナチドが糖尿病の治療に有効であることを証明する。
【００１９】
エクセナチドに関して、減量（特許文献２）、胃運動活性の低下および胃排出の減速（特許文献３、４）ならびに変力作用および利尿作用（特許文献５、６、７）が、後に明らかにされている。エキセナチドの使用に対して、多嚢胞性卵巣の治療（特許文献８、９、１０）、腎症の治療および予防(特許文献１１、１２）、不整脈の予防および治療（特許文献１３）、骨髄細胞分化（特許文献１４）、妊婦の糖尿病の治療（特許文献１５、１６）、トリグリセリドレベルの調節および異常脂質血症の治療（特許文献１７、１８）、グルカゴン分泌の抑制（特許文献１９、２０）、インスリン非産生細胞のインスリン産生への分化（特許文献２１）が説明されている。特許文献２２には、中枢神経系に作用するエクセナチド、そのアゴニストおよびアンタゴニストの使用が記載されている。特許文献２３、２４は、食物摂取を減少させるためのインクレナチドおよび他のインクレチン受容体アンタゴニストの使用を記載している。特許文献２５は、安定化されたエクセナチド組成物を記載している。特許文献２６、２７には、エクセナチド（エキセンディンおよびそのアゴニスト）の新規適用が記載されている。
【００２０】
上記の全ての態様は、DM2に対する高い予防及び治療効果を示している。しかしながら、糖尿病性神経障害、筋ジストロフィーおよび血管内皮炎などの2型糖尿病で起こる合併症は、エクセナチドおよび他のすべての上記の抗高血糖薬の両方による治療の間では解消されない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】US 5424286 Exendin-3 and exendin-4 polypeptides, and pharmaceutical compositions comprising same
【特許文献２】US 2005043238 Exendin formulations for weight reduction
【特許文献３】US 6858576 Method for regulating gastrointestinal motility
【特許文献４】US 9800449 Use of exendins and agonists thereof for the reduction of food intake
【特許文献５】US 2005037958 Inotropic and diuretic effects of GLP-1 and GLP-1 agonists
【特許文献６】US 6703359 Inotropic and diuretic effects of exendin
【特許文献７】JP 2002509078 Inotropic and diuretic effects of exendin and GLP- 1
【特許文献８】US 2004266678 Methods and compositions for treating polycystic ovary syndrome
【特許文献９】MX 2008015640 Compounds for treatment of metabolic disorders
【特許文献１０】US 2009291 100 Therapeutic agent for polycystic ovary syndrome (PCOS)
【特許文献１１】JP 2006520747 Methods and compositions for treating polycystic ovary syndrome 19.
【特許文献１２】US 2004209803 Compositions for the treatment and prevention of nephropathy
【特許文献１３】AU 2003297356 Prevention and treatment of cardiac arrhythmias
【特許文献１４】AU 2003262628 Bone marrow cell differentiation
【特許文献１５】US 2004092443 Long-acting exendins and exendin agonists
【特許文献１６】US 2004023871 Use of exendins and agonists thereof for the treatment of gestational diabetes mellitus
【特許文献１７】JP 2003519667 Use of exendins and agonists thereof for modulation of triglyceride levels and treatment of dyslipidemia
【特許文献１８】US 2003036504 Use of exendins and agonists thereof for modulation of triglyceride levels and treatment of dyslipidemia
【特許文献１９】US 9410225 Method for regulating gastrointestinal motility
【特許文献２０】RU 2247575 Method for inhibiting glucagon
【特許文献２１】US 2007041951 Differentiation of non-insulin producing cells into insulin producing cells by GLP-1 or exendin-4 and uses thereof
【特許文献２２】PT 1019077 Novel exendin agonist compounds
【特許文献２３】LU 91342 Use of exendins and agonists thereof for the reduction of food intake
【特許文献２４】US 2002137666 Use of exendins and agonists thereof for the reduction of food intake
【特許文献２５】US 2006194719 Stabilized exendin-4 compounds
【特許文献２６】US 2003087821 Exendins, exendin agonists, and methods for their use
【特許文献２７】EP 1419783 Use of a composition comprising an exendin or a compound derived therefrom and a pharmaceutical carrier
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Stern, M.P., Williams, K., Gonzalez- Villalpando, C, Hunt, K.J., Haffner, S.M., 2004. Does the metabolic syndrome improve identification of individuals at risk of type 2 diabetes and/or cardiovascular disease? Diabetes Care 27, 2676-2681.
【非特許文献２】Fu, W., Patel, A., Jhamandas, J.H., 2013. Amylin receptor: a common pathophysiological target in Alzheimer's disease and diabetes mellitus. Front Aging Neurosci. 5, 42.
【非特許文献３】Danaei, G., Finucane, M.M., Lu, Y., Singh, G.M., Cowan, M.J., Paciorek C.J., Lin, J.K., Farzadfar, F., Khang, Y.H., Stevens, G.A., Rao, M., Ali, M.K., Riley, L.M., Robinson, C.A., Ezzati, M., 2011. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants. Lancet 378, 31-40.
【非特許文献４】Global health risks. Mortality and burden of disease attributable to selected major risks. Geneva, World Health Organization, 2009.
【非特許文献５】Mathers, CD., Loncar, D., 2006. Projections of global mortality and burden of disease from 2002 to 2030. PLoS. Med. 3, e442.
【非特許文献６】Nedosugova, L.V. Pathogenesis, clinical aspects, approaches to treatment of diabetic polyneuropathy // Meditsinsky Sovet, 12. 2013. P. 43-49.
【非特許文献７】Eng., J. et al., Isolation and Characterization of Exendin-4, an Exendin-3 Analogue, from Heloderma suspectum Venom. J. Biol. Chem., Vol. 267, Issue 11, 7402-7405, Apr, 1992.
【非特許文献８】Szkudelski T. Streptozotocin-nicotinamide-induced diabetes in the rat //Characteristics of the experimental model. Exp Biol Med (Maywood). 2012; 237(5):481-90.
【非特許文献９】Altman D.G. Bland J.M. How to randomize // BMJ. 1999. Vol. 11. p. 319 (7211)
【非特許文献１０】Guidance on non-clinical studies of drug products //Federal State Budgetary Institution "Scientific Center for Evaluation of Medical Products". Under the editorship of A.N. Mironov. Vol. 1. 2012. 695 p.
【非特許文献１１】Chaplan, S.R., et al. "Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw". // J.Neurosci.Methods 53.1 (1994): 55-63.
【非特許文献１２】Dixon W.J. Efficient analysis of experimental observations // Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. - 1980. - Vol. 20. - P.441-462.
【非特許文献１３】Weiss, F., and Koob, G.F. The neuropharmacology of ethanol self-administration. //In: Meyer, R.E.; Koob, G.F.; Lewis, M.J.; and Paul, S.M., eds. Neuropharmacology of Ethanol: New Approaches. / Boston: Birkhauser, 1991. pp. 125-162.
【非特許文献１４】Kozyrev, K.M., Marzaganova, Z.A., Dzitstsoeva, P.A. Comparative clinicopathologic characteristics of Pick's disease and Alzheimer's disease // Bulletin of New Medical Technologies. 2013. No.1, 7 p.
【非特許文献１５】Makhmutov, O.K. Reactive changes in nerves at early stages of conduction anesthesia // Veterinarny Doktor, 2007. P.23-25.
【非特許文献１６】Chumasov, E.I. Methodological developments on diagnosis of human and animal demyelinating diseases. 1993. P.1-16
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
したがって、糖尿病性神経障害、筋ジストロフィーおよび血管内皮炎などの2型糖尿病の経過中に生じる合併症の治療に有効なエクセナチドの新規類似体を創製する課題がある。
【００２４】
特許請求された発明に最も近似する類縁体は、プロトタイプとして選択される米国特許第5424286号（特許文献１）であり、該文献において、インスリン産生の促進のためのインクレチン模倣物の使用が特許請求された発明に類似する。
【００２５】
公知発明の主な欠点は、糖尿病性神経障害、筋ジストロフィーおよび血管内皮炎などの糖尿病の合併症の予防および治療を可能にするインクレチン模倣薬（エクセナチド）の治療効果がないことである。
【００２６】
このように、本発明の技術的結果は、糖尿病性神経障害、筋ジストロフィー及び血管内皮炎などの糖尿病合併症の予防及び治療である。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明の技術的結果は、式：
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OHにより表され、糖尿病性神経障害、筋ジストロフィーおよび血管内皮炎の予防および治療を可能にする治療効果を有する組成物の使用によって達成される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本発明は、以下の図面に具体化される。
【図１】図１は、試験生成物の影響下における末梢血中のグルコース濃度である（M±m、mmol/l）。最初の列は生成物注射の開始前であり、第2列は治療の最終日（80日目）である。*：試験生成物を投与した群と対照群での統計的に有意な差、ボンフェローニ検定でp<0.05。#：基準値と治療の最終日（生成物注射の80日目）間の群における統計的に有意な差、t検定でp<0.05。
【図２】図２は、アルコール性神経障害を有するラットの触覚異痛に対する10ppbの用量におけるD-ペプチドの影響である。研究計画に従って動物にD-ペプチドを100日間注射した。触覚異痛を、生成物注射の1日目のアルコール性神経障害のモデル化の前、および毎日の注射の50日目および100日目に、評価した。データは足引っ込め（g）の平均閾値として与えられる（M±m）。
【図３】図３は、試験生成物の80日間の注射後の腸間膜動脈内膜の厚さ（μm）である。#：インタクト群との差（p<0.05)。*：対照群との差（p<0.05、ボンフェローニ検定）。**：対照群との差（p<0.001、ボンフェローニ検定）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
特許請求された化合物の合成は、実施例１〜５に記載されている。
【実施例１】
【００３０】
Fmoc-Gly-Pro-Ser（tBu）-Ser（tBu）-Gly-OHの合成
固相合成反応装置において、6.0gの2-クロロトリチルレジン（1.5mM/g限度容量）を45mlのDCMに懸濁し、5分間保持した。レジンを濾過し、2×30mlのDCMで洗浄した。30mlのDCMに溶解した2.95g（9.9mM）のFmoc-Gly-OHおよび6ml（36mM）のDIPEAの溶液をレジンに加え、室温で60分間撹拌した。レジンを濾過し、2×30mlのDCMで洗浄し、2×30mlのDCM/メタノール/DIPEA混合物（17：2：1）で10分間処理し、2×30mlのDCMおよび3×30mlのDMFで洗浄した。DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを反応装置に加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００３１】
DMF 30mlに溶解した7.67g（20.0mM）のFmoc-Ser（tBu）-OH、2.98g（22.0mM）のHOBtおよび3.42ml（22.0mM）のDICの冷却した溶液（4℃）を、反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、20％ジエチルアミン溶液30mlをDMFに加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、20％ジエチルアミン溶液30mlをDMFに加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００３２】
DMF 30mlに溶解した7.67g（20.0mM）のFmoc-Ser（tBu）-OH、2.98g（22.0mM）のHOBtおよび3.42ml（22.0mM）のDICの冷却した溶液（4℃）を、反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、20％ジエチルアミン溶液30mlをDMFに加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、20％ジエチルアミン溶液30mlをDMFに加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００３３】
DMF 30mlに溶解した6.75g（20.0mM）のFmoc-Pro-OH、2.98g（22.0mM）のHOBtおよび3.42ml（22.0mM）のDICの冷却した溶液（4℃）を反応装置に入れ、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、20％ジエチルアミン溶液30mlをDMFに加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、20％ジエチルアミン溶液30mlをDMFに加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００３４】
3.5mol（20.0mM）のFmoc-Gly-OH、2.98g（22.0mM）のHOBtおよび3.42ml（22.0mM）のDMFを30mlのDMFに溶解した冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、6×30mlのDMFおよび3×30mlのDCMで洗浄した。その後、レジンをDCMに溶解したトリフルオロ酢酸の1％溶液 10×30mlで処理し、得られた溶液をメタノール中ピリジンの10％溶液30mlを入れたフラスコ中で混合した。混合物を-50mlまで煮沸し、200mlの水を残渣に添加した。得られた沈降物を濾過し、水で洗浄し、乾燥させた。HELCによる純度97％の生成物6.4g（91％）が得られた。
【実施例２】
【００３５】
Fmoc-Glu（OtBu）-Glu（OtBu）-Glu（OtBu）-Ala-Val-Arg（CF3COOH）-Leu-Phe-Ile-Glu（OtBu）-Trp（Boc）-Leu-Lys（Boc）-Asn（Trt）-Gly-OHの合成
固相合成反応装置において、6.0gの2-クロロトリチルレジン（1.5mM/g容量）を45mlのDCMに懸濁し、5分間保持した。レジンを濾過し、2×30mlのDCMで洗浄した。Fmoc-Gly-OHの2.95g（9.9mM）溶液および30mlのDCMに溶解した6ml（36mM）のDIPEAをレジンに加え、室温で60分間撹拌した。レジンを濾過し、2×30mlのDCMで洗浄し、2×30mlのDCM/メタノール/DIPEA混合物（17：2：1）で10分間処理し、2×30mlのDCMおよび3×30mlのDMFで洗浄した。DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを反応装置に装填し、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００３６】
30mlのDMFに溶解した11.93g（20.0mM）のFmoc-Asn（Trt）-OH、DIC 2.98g（22.0mM）の冷却溶液（4℃）を反応装置に装填し、2時間、室温で撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、20％ジエチルアミン溶液30mlをDMFに加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００３７】
30mlのDMFに溶解した9.37g（20.0mM）のFmoc-Lys（Boc）-OH、2.98g（22.0mM）のHOBtおよび3.42ml（22.0mM）のDICの冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００３８】
DMF 30mLに溶解したFmoc-Leu-OH 7.07g（20.0mM）、HOBt 2.98g（22.0mM）およびDIC 3.42mL（22.0mM）の冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００３９】
30mlのDMFに溶解した10.53g（20.0mM）のFmoc-Trp（Boc）-OH、2.98g（22.0mM）のHOBtおよび3.42ml（22.0mM）のDICの冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００４０】
30mlのDMFに溶解したFmoc-Glu（OtBu）-OH 8.51g（20.0mM）、HOBt 2.98g（22.0mM）およびDIC 3.42ml（22.0mM）の冷却した溶液（4℃）を、反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００４１】
30mlのDMFに溶解したFmoc-Ile-OH 7.07g（20.0mM）、HOBt 2.98g（22.0mM）およびDIC 3.42ml（22.0mM）の冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００４２】
30mlのDMFに溶解した7.75g（20.0mM）のFmoc-Phe-OH、2.98g（22.0mM）のHOBtおよび3.42ml（22.0mM）のDMFの冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００４３】
DMF 30mLに溶解したFmoc-Leu-OH 7.07g（20.0mM）、HOBt 2.98g（22.0mM）およびDIC 3.42mL（22.0mM）の冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００４４】
DMF 30mlに溶解した8.66g（20.0mM）のFmoc-Arg-OH・HCl、2.98g（22.0mM）のHOBtおよび3.42ml（22.0mM）のDICの冷却した溶液（4℃）を、反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００４５】
DMF 30mlに溶解したFmoc-Val-OH 6.79g（20.0mM）、HOBt 2.98g（22.0mM）およびDIC 3.42ml（22.0mM）の冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００４６】
DMF 30mlに溶解した6.23グラム（20.0ミリモル）のFmoc-Ala-OH、HOBt 2.98g（22.0mM）およびDIC 3.42ml（22.0mM）の冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF中の6x30 mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 30mLで3回洗浄し、DMFに溶解した20％のジエチルアミン溶液の30mLを加え、20分間保持し、濾過し、そしてDMFの5×30mlで洗浄した。
【００４７】
DMF 30mlに溶解した8.51g(20.0mM)のFmoc-Glu(OtBu)-OH、2.98グラム（22.0ミリモル）のHOBt、3.42ml(22.0mM)のDICの冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF中の6×30mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 30mLで3回洗浄し、DMFに溶解した20％のジエチルアミン溶液の30mLを加え、20分間保持し、濾過し、そしてDMFの5×30mlで洗浄した。
【００４８】
DMF 30mlに溶解したFmoc-Glu（OtBu）-OH 8.51g（20.0mM）、HOBt 2.98g（22.0mM）およびDIC 3.42ml（22.0mM）の冷却した溶液（4℃）を、反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００４９】
DMF 30mlに溶解したFmoc-Glu（OtBu）-OH 8.51g（20.0mM）、HOBt 2.98g（22.0mM）およびDIC 3.42ml（22.0mM）の冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。その後、レジンをDCMに溶解したトリフルオロ酢酸の1％溶液10×30mlで処理し、得られた溶液をメタノール中ピリジンの10％溶液30mlを入れたフラスコ中で混合した。混合物を-50mlまで煮沸し、200mlの水を残渣に添加した。得られた沈降物を濾過し、水で洗浄し、乾燥させた。HELCによる純度95％の生成物21.8g（80％）が得られた。
【実施例３】
【００５０】
Boc-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Gly-OHの合成
固相合成反応装置において6.0gの2-クロロトリチルレジン（1.5mM/g限度容量）を45mlのDCMに懸濁し、5分間保持した。レジンを濾過し、2×30mlのDCMで洗浄した。Fmoc-Gly-OH 2.95g（9.9mM）およびDIPEA 6ml（36mM）を30mlのDCMに溶解した溶液をレジンに加え、室温で60分間撹拌した。レジンを濾過し、2×30mlのDCMで洗浄し、2×30mlのDCM/メタノール/DIPEA混合物（17：2：1）で10分間処理し、2×30mlのDCMおよび3×30mlのDMFで洗浄した。DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを反応装置に装填し、5分間撹拌し、濾過し、3×30mlのDMFで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００５１】
30mlのDMFに溶解した12.21g（20.0mM）のFmoc-Gln（Trt）-OH、2.98g（22.0mM）のHOBtおよび3.42ml（22.0mM）のDICの冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００５２】
30mlのDMFに溶解した9.37g（20.0mM）のFmoc-Lys（Boc）-OH、2.98g（22.0mM）のHOBtおよび3.42ml（22.0mM）のDICの冷却した溶液（4℃）を、反応装置に加え装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlで洗浄したを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００５３】
DMF 30mlに溶解した7.67g (20.0mM)のFmoc-Ser(tBu)-OH、2.98g(22.0mM)のHOBtおよび3.42ml(22.0mM)のDICの冷却（4℃）した溶液を反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００５４】
DMF 30mLに溶解したFmoc-Leu-OH 7.07g（20.0mM）、HOBt 2.98g（22.0mM）およびDIC 3.42mL（22.0mM）の冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００５５】
DMF 30mlに溶解した8.23g（20.0mM）のFmoc-Asp（OtBu）-OH、2.98g（22.0mM）のHOBtおよび3.42ml（22.0mM）のDICの冷却した溶液（4℃）を、反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００５６】
DMF 30mlに溶解した7.67 g(20.0mM)のFmoc-Ser(tBu)-OH、2.98g(22.0mM)のHOBtおよび3.42ml(22.0mM)のDICの冷却（4℃）した溶液を反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlでを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００５７】
30mlのDMFに溶解した7.95g（20.0mM）のFmoc-Thr(tBu)-OH、2.98g（22.0mM）のHOBtおよび3.42ml（22.0mM）のDMFの冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００５８】
DMF 30mlに溶解した7.75g（20.0mM）のFmoc-Phe-OH、2.98g（22.0mM）のHOBtおよび3.42ml（22.0mM）のDICの冷却した溶液（4℃）を、反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００５９】
30mlのDMFに溶解した7.95g（20.0mM）のFmoc-Thr(tBu)-OH、2.98g（22.0mM）のHOBtおよび3.42ml（22.0mM）のDMFの冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００６０】
30mlのDMFに溶解した5.95g（20.0mM）のFmoc-Gly-OH、2.98g（22.0mM）のHOBtおよび3.42ml（22.0mM）のDICの冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００６１】
DMF 30mlに溶解したFmoc-Glu（OtBu）-OH 8.51g（20.0mM）、HOBt 2.98g（22.0mM）およびDIC 3.42ml（22.0mM）の冷却した溶液（4℃）を、反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００６２】
30mlのDMFに溶解した5.95g（20.0mM）のFmoc-Gly-OH、2.98g（22.0mM）のHOBtおよび3.42ml（22.0mM）のDMFの冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×30mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液30mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×30mlで洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液30mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×30mlのDMFで洗浄した。
【００６３】
DMF 30mlに溶解したBoc-His（Trt）-OH 9.95g（20.0mM）、HOBt 2.98g（22.0mM）およびDIC 3.42ml（22.0mM）の冷却した溶液（4℃）を、反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、6×30mlのDMFおよび3×30mlのDCMで洗浄した。その後、レジンをDCMに溶解したトリフルオロ酢酸の1％溶液10×30mlで処理し、得られた溶液をメタノール中のピリジン10％溶液30mlを入れたフラスコ中で混合した。混合物を約50mlまで煮沸し、200mlの水を残渣に添加した。得られた沈降物を濾過し、水で洗浄し、乾燥させた。HELCによる95％純度の生成物20.9g（85％）が得られた。
【実施例４】
【００６４】
14-グリシン-エキセンディン-4（ヘロデルマ  サスペクタム）-（1-39）-ペプチヂル-オクタ-Ｄ-アルギニル-グリシン
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OHの合成
固相合成反応装置において、2.0gの2-クロロトリチルレジン（1.5mM/g限度容量）を15mlのDCMに懸濁し、5分間保持した。レジンを濾過し、2×10mlのDCMで洗浄した。10mlのDCMに溶解した0.98g（3.3mM）のFmoc-Gly-OHおよび2ml（12mM）のDIPEA溶液をレジンに加え、室温で60分間撹拌した。レジンを濾過し、2×30mlのDCMで洗浄し、2×10mlのDCM/メタノール/DIPEA混合物（17：2：1）で10分間処理し、2×10mlのDCMおよび3×10mlのDMFで洗浄した。DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液10mlを反応装置に添加し、5分間撹拌し、濾過し、DMF 3×10mlで洗浄し、20％DMF溶液10mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×10mlのDMFで洗浄した。
【００６５】
DMF 10mlに溶解したFmoc-D-Arg-OH・HCl 2.60g（6.0mM）、HOBt 0.98g（7.2mM）およびDIC 1.12ml（7.2mM）の冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で2時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×10mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％ジエチルアミン溶液10mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 10mlで3回洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液10mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×10mlのDMFで洗浄した。
【００６６】
DMF 10mlに溶解したFmoc-D-Arg-OH・HCl 2.60g（6.0mM）、HOBt 0.98g（7.2mM）およびDIC 1.12ml（7.2mM）の冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で4時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×10mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液10mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 10mlで3回洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液10mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×10mlのDMFで洗浄した。
【００６７】
DMF10mlに溶解したFmoc-D-Arg-OH・HCl 3.46g（8.0mM）、HOBt 1.35g（10.0mM）およびDIC 1.56ml（10.0mM）の冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で3時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×10mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液10mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 10mlで3回洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液10mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×10mlのDMFで洗浄した。
【００６８】
DMF 10mlに溶解したFmoc-D-Arg-OH・HCl 3.46g（8.0mM）、HOBt 1.35g（10.0mM）およびDIC 1.56ml（10.0mM）の冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で4時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×10mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液10mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 10mlで3回洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液10mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×10mlのDMFで洗浄した。
【００６９】
DMF10mlに溶解したFmoc-D-Arg-OH・HCl 3.46g（8.0mM）、HOBt 1.35g（10.0mM）およびDIC 1.56ml（10.0mM）の冷却した溶液（4℃）を加え、室温で10時間攪拌した。レジンを濾過し、DMF 6×10mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液10mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 10mlで3回洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液10mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×10mlのDMFで洗浄した。
【００７０】
DMF10mlに溶解した4.33g（10.0mM）のFmoc-D-Arg-OH・HCl、1.62g（12.0mM）のHOBtおよび1.88ml（12.0mM）のDICの冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で12時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×10mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液10mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 10mlで3回洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液10mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×10mlのDMFで洗浄した。
【００７１】
DMF 10mlに溶解した4.33g（10.0mM）のFmoc-D-Arg-OH・HCl、1.62g（12.0mM）のHOBtおよび1.88ml（12.0mM）のDICの冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で12時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×10mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液10mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 10mlで3回洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液10mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×10mlのDMFで洗浄した。
【００７２】
DMF 10mlに溶解した4.33g（10.0mM）のFmoc-D-Arg-OH・HCl、1.62g（12.0mM）のHOBtおよび1.88ml（12.0mM）のDICの冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で12時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×10mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液10mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 10mlで3回洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液10mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×10mlのDMFで洗浄した。
【００７３】
DMF 30mlに溶解したFmoc-Ser（tBu）-OH 3.07g（8.0mM）、HOBt1.35g（10.0mM）およびDIC 1.56ml（10.0mM）の冷却溶液（4℃）を、反応装置に装填し、室温で12時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×10mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液10mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 10mlで3回洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液10mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×10mlのDMFで洗浄した。
【００７４】
DMF 30mlに溶解した2.70g（8.0mM）のFmoc-Pro-OH、1.35g（10.0mM）のHOBtおよび1.56ml（10.0mM）のDICの冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で12時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×10mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液10mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 10mlで3回洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液10mlに溶解し、20分間保持し、濾過し、5×10mlのDMFで洗浄した。
【００７５】
DMF 30mlに溶解した2.70g（8.0mM）のFmoc-Pro-OH、1.35g（10.0mM）のHOBtおよび1.56ml（10.0mM）のDICの冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で12時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×10mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液10mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 10mlで3回洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液10mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×10mlのDMFで洗浄した。
【００７６】
DMF 30mlに溶解した2.70g（8.0mM）のFmoc-Pro-OH、1.35g（10.0mM）のHOBtおよび1.56ml（10.0mM）のDICの冷却した溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で12時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×10mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液10mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 10mlで3回洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液10mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×10mlのDMFで洗浄した。
【００７７】
30mlのDMFに溶解したFmoc-Ala-OH 2.49g（8.0mM）、HOBt 1.35g（10.0mM）およびDIC 1.56ml（10.0mM）の冷却溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で12時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×10mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液10mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 10mlで3回洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液10mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×10mlのDMFで洗浄した。
【００７８】
30mlのDMFに溶解した5.90g(8.0mM)のFmoc-GlyProSer（tBu）Ser（tBu）Gly-OH（実施例１からの生成物）、1.62g（12.0mM）のHOBtおよび1.88ml（12.0mM）のDICの冷却溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で12時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×10mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液10mlを加え、5分間撹拌し、濾過し、DMF 10mlで3回洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液10mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×10mlのDMFで洗浄した。
【００７９】
30mlのDMFに溶解した11.35g（4.0mM）のFmoc-Glu（OtBu）-Glu（OtBu）-Glu（OtBu）Glu（OtBu）AlaValArg（HCl）LeuPheIleGlu（OtBu）Trp（Boc）LeuLys（Boc）Asn（Trt）Gly-OH（実施例２からの生成物）、0.81g（6.0mM）のHOBtおよび0.95ml（6.0mM）のDICの冷却溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で24時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF 6×10mlで洗浄し、DMFに溶解したジエチルアミンの20％溶液10mlを添加し、5分間撹拌し、濾過し、DMF10mlで３回洗浄し、DMFに溶解した20％ジエチルアミン溶液10mlを加え、20分間保持し、濾過し、5×10mlのDMFで洗浄した。
【００８０】
30mlのDMFに溶解した9.94g（4.0mM）のBoc-His（Trt）Gly-Glu（OtBu）GlyThr（tBu）PheThr（tBu）Ser（tBu）Asp（OtBu）LeuSer（tBu）Lys（Boc）Gln（Trt）Gly-OH（実施例３からの生成物）、0.81g（6.0mM）のHOBtおよび0.95ml（6.0mM）のDICの冷却溶液（4℃）を反応装置に装填し、室温で24時間撹拌した。レジンを濾過し、DMF20mlで６回、DCM 20mlで4回洗浄し、乾燥し、50mlのTFA/TIS/EDT/H2O（97：1：1：1）混合液を加え、室温で4時間保持し、濾過し、3×20mlのトリフルオロ酢酸で洗浄し、合わせた濾液を-20mlまで煮沸し、60mlの乾燥エーテルを残渣に添加した。得られた沈降物を濾過し、フィルター上でエーテルで洗浄し、乾燥させた。得られた生成物を水50mlで溶解し、凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥物を40mlの水で溶解し、Amberlite IRA-400（CI型）イオン交換樹脂カラムに適用した。カラムを水で洗浄し、生成物を含む画分を-50mlまで煮沸し、Water X-ブリッジCI8逆相カラム、10μm、127オングストローム、50×250mmに適用した。溶出は50ml/分の溶出流量で行った。A相：0.1％HCl/H2O、B相：アセトニトリル。勾配：0％（B）-70％（B）、70分間。主生成物を含む画分を合わせ、-50mlまで煮沸し、凍結し、凍結乾燥した。純度97.5％の生成物（HELC）3.9g（20％）を得た。質量スペクトル：C231H374N82O70として計算値MH+ 5420.98、MH+5420.80を得た。アミノ酸分析：アラニン2.02（2）、アルギニン9.0（9）、アスパラギン酸+アスパラギン2.05（2）、グルタミン酸+グルタミン5.80（6）、グリシン7.25（7）、ヒスチジン1.02（1）、イソロイシン1.03(1）、ロイシン2.96（3）、リジン2.07（2）、フェニルアラニン2.05（2）、プロリン4.10（4）、セリン4.85（5）、スレオニン1.90（2）およびバリン1.02（1）。
【実施例５】
【００８１】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム株を使用するH-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OHの合成
1.1  PBP1aをコードするCgl0278遺伝子の欠失のためのpBSACgl0278ベクターの設計
C.アセトアシドフィラムATCC13032のゲノム配列およびPBPlaペニシリン結合タンパク質をコードするCgl278遺伝子のヌクレオチド配列は既知である（GenBank、インベントリー番号BA000036（バージョンBA000036.3、GI：42602314、locus_tag=<<NCG10274>>））。この配列を参照して、P1、P2、P3およびP4プライマーを合成した。従来の方法（Saito H.およびMiura KI、Biochim.Biophys.Acta、1963,72：619-629）およびプライマーP1、P2、P3、P4で調製したC.アセトアシドフィラムATCC 13869株のマトリックスとして染色体DNAを使用したPCRの助けを借りて、PBP1aをそれぞれコードするCgl0278より5'側からの断片（約1tpn）および3'側からの断片（約1tpn）を得た。次に、PCRの助けを借りて、両方のDNA断片をマトリックスとして使用し、P1およびP4プライマーを用いて、両方の断片を組み合わせたDNA断片（約2tpn）を得た。制限酵素BamH IおよびXba Iそれぞれに対する認識部位を適用した。Pyrobest DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製）および製造業者の推奨条件がPCRに用いられた。このDNA断片をBamHI及びXbaI制限酵素で処理し、Cg0278遺伝子を欠失させるためのpBSΔCgl0278ベクターを取得する目的で、WO2005/113744に記載のBamH I-XbaI pBS4部位に付加した。DNAライゲーションキットVer.2.1（タカラバイオ社製）を用い、製造者の推奨条件でライゲーションを行った。
【００８２】
1.2 PBP1aレス株の設計
設計されたpBSACgl0278ベクターを用いて、国際公開第2004/029254号パンフレットに記載されたC.アセトアシドフィラムYDK010株を形質転換した。C.アセトアシドフィルムYDK010株は、C.アセトアシドフィラムAJ12036（FERM BP-734）（国際公開第2004/029254号パンフレット）のPS2細胞最上層タンパク質を欠損する株である。該株は、Cgl278遺伝子を欠損するYDKO10APBPla株を得る目的で、国際公開第2005/113744号パンフレットおよび国際公開第2006/057450号パンフレットの記載に従って得られた形質転換体から選択された。
【００８３】
以下に示される実施例は、得られたペプチドの薬理試験に関する。
【００８４】
研究の目的は、ストレプトゾシン（STZ）およびニコチンアミドの雄性ラット単回注射によって誘発される化学的実験的糖尿病のモデルに基づいて合併症における特許請求された化合物（以下、「D-ペプチド」という）の抗高血糖活性および予防および治療効果のに関する新知見である（非特許文献８）。
【００８５】
比較のために以下の医薬品を使用した：
1. バイエッタR（DM2合併症の予防および治療用の参照医薬品）は、皮下注射用の透明な溶液（250μg/1mL)である。150ml：BAXTER Pharmaceutical Solutionsのプレフィルドシリンジ1.2ml。
2. 合成エキセナチド物質
3. メトホルミン（SioforR 500）（従来のビグアニドの抗高血糖製品として）。
【００８６】
適用される試薬および材料
グリコシル化ヘモグロビンレベルを測定するための試薬キット（「Phosphosorb」LLC、ロシア）。
【００８７】
適用機器
1. 実験用の医療用投与装置、10-100μL
2. 実験用の医療用投与装置、100-1,000μL
3. マイクロ遠心機Z216MK（Hermle Laboitechnik GmbH、ドイツ）。
4. グルコース測定器OneTouch UltraEasyR（LifeScan、USA）。
5. ディップスティックOneTouch UltraR（LifeScan、USA）。
6．フォン  フレイ  ヘア（Stoelting、USA）。
【００８８】
【表１】
0006442729.tif 000002
【００８９】
動物の馴化と選択
研究の開始前に、実験動物を、ケージ内での群管理で7日間保持し、馴化させた。この期間中、動物を肉眼検査により臨床症状に対して毎日検査した。検査で異常が検出された動物は実験群に含まれなかった。研究が開始される前に、実験に含める基準に合致した動物をグループ化した。
【００９０】
グルーピング
動物の選択は、改変ブロックランダム化法（非特許文献９）を用いて行った。この目的のために、ファームから供給された全ての動物をランダム化ブロックセルに無作為に入れた（無作為化ブロックのセル数は、実験におけるグループの数で割り切れる）。次いで、乱数発生器（統計学プログラムStatistica 6.0）を用いて、動物のセル数およびそれらの対応する群番号を含むデータのリストを取得し、動物をその後セルに入れた（非特許文献９）。
【００９１】
動物の特定
ケージラベルには、性別、動物数、実験開始日、グループ名が含まれた。研究のために選択された各動物には、尾部に印を付けることによって個別の数字が割り当てられた。
【００９２】
動物は、実験的および生物学的診療所（動物施設）およびGOST R 53434-2009の配置、設備および管理に関する1973年7月6日付のソ連の保健省によって定められた規則に従って標準的な条件下で維持された。
【００９３】
動物は、床敷上で１群5匹で標準透明プラスチックケージに入れられた。ケージを、給餌穴を有するスティールスクリーンで覆った。1匹当たりの動物の床面積は440cm2（最小許容面積は250cm2）であった。
【００９４】
1977年8月12日付けのUSSR No.755の保健省令で承認された規制に従った、GOST R 50258-92に従って調製された"動物管理のための飼料"ΠΚ-120-Ιが、スチールケージスクリーンの給餌穴に不断に付与された（グルコース濃度を測定する場合、動物は18時間飼料を与えなかった）。獣医証明書第247号第0294922号（Aller Petfood LLC、ロシア）、適合証明書番号POCRU.riP98.H00093/0051289、2011年5月7日から2014年5月16日までの有効期間。
【００９５】
動物にSOP 02K-OC-4に従って精製した水を供給し、SOP AE-38 GOST 51232-98「飲料用水。組織と品質管理に対する一般的な要件」に従った、感覚刺激特性、pH値、乾燥残留物、還元物質、二酸化炭素、硝酸塩および亜硝酸塩、アンモニア、塩化物、硫酸塩、カルシウムおよび重金属によって割り当てられた。スチールハンドリフトカバー付きの標準的な飲料水槽の水を不断に供給した。
【００９６】
床敷として6mmの木質ペレット（「ZooSPb」LLC、ロシア）を使用した。動物は、制御された環境条件（19.5〜21℃の温度および61〜75％の相対湿度）で維持された。照明の管理は、12時間の明時間と12時間の暗時間で構成された。換気管理は、1時間当たり施設の約15容積を提供し、0.15容積以下のCO2濃度、0.001mg/l以下のアンモニアが調整された。気温と湿度を毎日記録した。維持期間中および実験中にこれらのパラメータの有意な変化は観察されなかった。
【００９７】
研究デザイン
試験群、試験物質の投与経路および期間の特徴
【表２】
0006442729.tif 000003
【００９８】
実験スケジュールに従って、0日目にクエン酸緩衝液（pH=6.5）の予め希釈した65ppmの用量のストレプトゾトシン（STZ）の腹腔内への単回注射を用いて、動物に実験的糖尿病の誘発させた。その2時間前に全ての動物に230ppm（5％溶液）の用量でニコチノマイドを腹腔内投与した（非特許文献8、１０）。
【００９９】
病態の誘導の前、そして病態の誘導の１、３および９日後に、絶食ラット（動物は一夜絶食させた）で末梢血中のグルコース濃度を測定した。試験物質の注入開始後、10日ごとおよび安楽死の日にグルコース濃度を測定した。体重記録は、グルコース濃度測定と同じ日に実施した。異痛検査は、実験期間中の医薬品の注射の60日目、70日目および80日目に行われた。アルコール性神経障害の場合、触覚応答性試験は、医薬品の注射の1日目、50日目および100日目に実施した。
【０１００】
安楽死の日に、静脈血試料を採取し、動物のグリコシル化ヘモグロビン濃度を測定した。病理形態学的研究のために以下の臓器を採取した：坐骨神経、腸間膜動脈の一部、網膜動脈の一部、腓腹筋および膵臓腺の一部。
【０１０１】
【表３】
0006442729.tif 000004
【実施例６】
【０１０２】
実験動物の血液中のグルコースの測定。
グルコースオキシダーゼ試験により、グルコース測定装置OneTouchRおよびOneTouchRディップスティックを用いてラットの末梢血におけるグルコース濃度測定を行った。グルコース濃度測定前の夜は、ラットには水が与えられていたが、飼料は与えられなかった。測定工程は以下の通りである：必要な標識のついた動物をケージから取り出し、その尾部を殺菌剤で処理し、注射針を用いて静脈を穿刺し、血液の滴下のときに、ディップスティックを伴う血糖値測定装置を使用した。取得したデータを最初のカードに入力した。
【０１０３】
試験生成物の適用の背景として、グルコース濃度低下の一般的な傾向が、観察されたことが図1からわかる。繰り返し測定を用いた二元配置分散分析（ANOVA）は、末梢血におけるグルコース濃度に対する試験生成物の統計的に有意な影響を示した（F4.25=3.49、p=0.02）。さらに、群間比較は、生成物注射の20日目から開始したメトホルミン注射群（p<0.05、ボンフェローニ検定）ならびに生成物注射の40日目から開始した、特許請求されたペプチド（D-ペプチド）を注射した群（p<0.05、ボンフェローニ検定）で有意な差を示した。
【０１０４】
治療前のグルコースベースライン（ポイント「0」）と治療の最終日（80日目）との比較は、メトホルミン（p=0.017、t検定）およびD-ペプチド（p=0.011、t検定）の対応のある比較では統計学的有意な差を示した（図1）。
【０１０５】
最終的に、特許請求されたD-ペプチドは、注射の40日目から開始して80日間の持続期間で抗高血糖効果を有すると結論することができる。インクレチン様生成物であるエクセナチドも注射後50日目から抗高血糖効果を示したが、その強度はD-ペプチドよりも低かった。バイエッタRの注射は、末梢血中のグルコース濃度に影響を与えなかったが、参照製品メトホルミンは、予想されたように、治療の20日目から抗血糖活性を示した。
【実施例７】
【０１０６】
末梢血中のグリコシル化ヘモグロビンの測定
静脈血中のグリコシル化ヘモグロビンの測定は、ラット血液溶血液中のグリコシル化および非グリコシル化ヘモグロビン画分のアフィニティークロマトグラフィーによる「Diabetes Test、HbA1c」（ロシア、「Phosphosorb」LLC）試薬キットを用いて行った。
【０１０７】
動物の赤血球の溶血液中のグリコシル化ヘモグロビンを測定するための血液試料を、試験生成物の毎日の注射の81日目に実験動物の尾静脈から採取した。得られたデータをテーブル１に示す。
【０１０８】
【表４】
0006442729.tif 000005
【０１０９】
テーブル１のデータでは、対照群動物において、4倍のHbAlc濃度の統計的に有意な増加がインタクト群と比較して観察されたことが分かる（p=0.0002、Mest）。測定データは、実験的な病態の明らかな発症を特徴付ける。
【０１１０】
統計的に有意なHbAlc濃度の減少が、試験生成物の適用の背景にとして証明された（F4.17=11.83、p<0.0001）。特許請求されたD-ペプチド（p<0.0001）およびメトホルミン（p<0.0001）が投与された群において最大の治療効果を示した。一方、バイエッタRおよびエキセナチドRで治療した群ではこの効果はそれほど顕著ではなかった（各p=0.0018およびp=0.0015）。
【実施例８】
【０１１１】
糖尿病性ニューロパチーを有するラットの触覚異痛の評価
ラットを、金属ワイヤ製の格子床を備えたプラスチックケージに入れ、このケージに5分間放置して適応応答を消失させた。触覚応答の平均有効閾値の決定は、ホン・フレイ・ヘア（von Frey hair）（Stoelting、USA）からなるキットを用いてChaplanら（特許文献１）の方法によって行った。ヘアの曲げに必要な最小の力として表されるヘアの粗さは対数的に増加し、絶対値0.692から28.840gへ対数的に増加した。
【０１１２】
各ラットの閾値は、最初に左肢で決定され、次に右肢で決定された。ヘアの先端は、ヘアの曲げに必要な力で足の足底表面の中央に触れ、この位置に6〜8秒間置かれた。接触している間に動物が急に足を撤回した場合、またはヘアの除去後に鋭い足屈曲が続く場合に、陽性応答が記録された。
【０１１３】
試験は、3.630gの力に対応するヘアの適用から開始した。次に、刺激（ヘア）を増加および減少の順序で使用した。正の応答の場合には、最も粗度の低いヘアを使用し、負の応答の場合には、最も粗いヘアを使用した。感度閾値の最初の決定の後、同じ原理に従って4本のヘアをさらに使用した。
【０１１４】
触覚応答性の心理生理学的平均有効閾値は、Dixon（非特許文献１２）によって記載された方法によって計算された。
【０１１５】
テーブル２は、触覚異痛の進展程度に対する試験生成物の80日間の注射の影響の検討に関する実験結果を示す。
【０１１６】
医薬品の注射の60日目まで完了した実験では、対照群において触覚異痛の発現が最大であり（F1;14=669.8、p<0.0001)、明らかな疼痛症候群を有する糖尿病性神経障害の確立されたモデルを示す。
【０１１７】
得られた結果のさらなる評価のために、触覚異痛の発現に対する因子「薬剤の注射」の重要性の決定を可能にする繰り返し測定に対して二元配置分散分析による統計処理を、得られた結果のさらなる評価のために行った（F4.43=10.93;p<0.0001）。さらに群間比較（ボンフェローニ検定）は、注射の60日目から開始したD-ペプチド投与群の触覚異痛強度の減少を示した。テーブル３は、すべての使用された物質のF-基準値を示す。その後の群間比較（Bonferroni試験）は、特許請求されたD-ペプチドを投与した群においてのみ有意な影響を確認した。
【０１１８】
【表５】
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【０１１９】
【表６】
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【０１２０】
従って、試験生成物の効果の研究により、以下のことが示された。バイエッタR、エキセナチドおよびメトホルミンは、指標の個々の比較において異痛の兆候の強度を僅かに減少させたが、さらに行った群間比較では統計的に有意な影響を確認しなかった。60日目から特許請求したD-ペプチドの注射を開始すると、糖尿病性神経障害に罹患したラットにおいて触覚異痛の兆候が有意に減少した（テーブル２乃至３）。この観察から、（60日目から注射を開始する）長期治療の場合には、おそらく特許請求したD-ペプチドの神経保護作用によって調節され、２型糖尿病の最も多い合併症の1つである糖尿病性末梢神経障害に関し、一定の治療効果がある、と結論付けることができる。
【実施例９】
【０１２１】
アルコール性神経障害に罹患したラットに対する触覚異痛の評価
触覚異痛の評価は、実施例７と同じ方法で行った。ラットに30％アルコールを強制摂取させて8週目（56〜60日）から、アルコール性神経障害（触覚異痛）の症状が観察され[40](F1;12=26.25;p=0.0003;図２)、これは、明らかな疼痛症候群を伴うアルコール性神経障害の確立されたモデルを示す。
【０１２２】
得られた結果のさらなる評価のため、触覚異痛の進行にどの程度「医薬品の注入」というファクターが影響を及ぼすかを判定する繰り返し測定による二元分散分析による統計処理を行った（F1.10=8.79;p<0.014）。さらに、群間比較（事後的）では、対応する測定点における対照群と比較して、特許請求したD-ペプチドで処置した群の触覚異痛強度が注射の100日目に減少したことが示された（p<0.05;ボンフェローニ検定;図2）。
【０１２３】
上記の全てを要約すると、特許請求したD-ペプチドは、アルコールおよび糖尿病性末梢ニューロパシーに罹患中に発生する神経変性過程に関して神経保護特性を有すると結論付けることができる。
【０１２４】
病理形態学的研究
すべての実験動物は、研究終了時に病理形態学的研究の対象となった。
【０１２５】
病理形態学的研究は、以下の内臓、即ち、坐骨神経の中心部、網膜動脈、腸間膜動脈の一部、腓腹筋の一部、膵臓腺、の剖検、肉眼検査、組織学的検査から構成された。病理学者の直接監督下で剖検を実施した。特定の組織の試料を切り出し、中性ホルマリンの10％溶液に入れ、眼球をデイヴィッドソンロックで24時間固定した後、5〜7μmの連続パラフィン片の厚さを有する組織学的および組織化学的試料の作製のため標準的な処理を材料に施した。顕微鏡検査用の組織および臓器切片を、ヘマトキシリン・エオジンで染色した。神経組織試料を、ニッスル染色法により、ヘマトキシリン・エオジン、トルイジンブルーで染色し、ワンギーソン染色法により、ピクロフクシンで染色した。ミエリン線維およびミエリン崩壊生成物を明らかにするために、凍結ミクロトーム上で得られた神経の横断切片および縦断切片を、スダンブラックでリーソン（Lieson）染色法（非特許文献１４、１５、１６）によって染色した。核はヘマトキシリン溶液（hemalum)で対比染色された。腓腹筋試料を、ワンギーソン染色法により、ヘマトキシリン・エオジンおよびピクロフクシンで染色した。
【０１２６】
組織学的標本の形態学的検査は、倍率100、200および400倍のカールツァイス光学顕微鏡（ドイツ）を用いて行った。顕微鏡写真は、デジタルカメラAxio Scope Al（ドイツ）を用いて撮影した。形態計測はソフトウェアAxio Vision Rel.4.8.と画像編集ソフトPhotoM 1.21を用いて半自動的かつ手動で行った。
【０１２７】
試験物質の作用を評価するために、それらが以下に及ぼす影響について組織学的な比較評価を行った：
１．膵腺島状器官：膵島面積の測定が行われた；
２．腸間膜動脈：性動脈と網膜の（細動脈および毛細血管）微小循環血流、毛細管直径および動脈内膜厚の形態計測測定が行われた;
３．坐骨神経の病的状態；
４．体性筋の病的状態。
【実施例１０】
【０１２８】
ラットの腸間膜動脈内膜の病的状態の評価
図３は、ラットの腸間膜動脈内膜の病的状態への試験物質の影響に関するデータを示す。インタクト群と対照群との対応のある比較において、対照群で血管内膜厚の有意な増加が起こることが示された（p<0.0001、t検定）。この厚さの増加および血管の内膜の腫脹は、血管内皮炎のプロセスの進行を証明する。さらに一元配置分散分析（ANOVA）は、試験物質の長期注射により、ラットの腸間膜動脈の血管内膜厚の増加を抑制することを示した（F4.25=12.87;p=0.0001）。群間比較では、対照群と比較してすべての群において血管内膜厚の有意な減少を示した（p<0.05、ボンフェローニ試験）。特許請求したD-ペプチドを投与した群において最大の効果が観察された（p<0.0001、ボンフェローニ試験）。
【実施例１１】
【０１２９】
坐骨神経組織の病的状態の評価
確立された病理形態学的神経組織変化に基づき、STZ誘発2型糖尿病のモデル作製は、神経幹の厚さおよび直径の減少、ミエリン鞘の変形および腫脹、侵襲された神経線維、間質組織浮腫、上皮および髄膜における脂質の異常蓄積、ならびに神経内膜結合組織の成長によって特徴付けられる糖尿病性神経障害の明らかな病的状態を伴うと結論付けることができる。
【０１３０】
個々の線維は水腫性変性の病的状態にあった。継続的なミエリン崩壊を示す小さなスダン親和性顆粒の凝集物が脱髄巣に観察された。
【０１３１】
メトホルミンの注射は、神経組織に対して治療効果はなかった。ミエリン鞘の局所的変性を伴う明らかな多形核白血球浸潤で明示される、神経幹と線維、神経周膜と神経上膜の重篤な病変、ならびに線維の腫脹および変形、更に、未変性ミエリン線維の基底膜に隣接してスダン親和性顆粒たるミエリン崩壊生成物の発生が、この実験群の組織試料で観察された。
【０１３２】
バイエッタRおよびエキセナチドが注射された場合は、経周膜と神経上膜における脂質のわずかな蓄積しか観察されなかった。この実験群における変性現象は、実質的に低かったか、全く起こらなかったことは明らかである。反対に、特許請求されたD-ペプチドの注射は、明らかな治療効果を示したが、インタクトな動物群からの坐骨神経の構造における明らかな形態学的相違は表れなかった。
【０１３３】
神経組織指標の病理形態学的分析において、神経幹の太さが、組織の変性変化が起きた可能性を示すインタクトな動物と比較した対照群での有意な減少が確認され（p<0.0001;t検定）、また、病態進展の病理形態学的な状態によって証明されることが決定された（テーブル４）。
【０１３４】
【表７】
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【０１３５】
上記のように、メトホルミンを投与した群の神経組織試料の病理学的状態は、神経幹浮腫およびその太さの過剰な増加を示したが、これは病態の病的状態が強まり、治療効果はないことを意味する。これに関連して、上述の群を含まない統計解析を行った。一元配置分散分析（ANOVA）では、神経幹の太さに対する試験物質の注射の有意な影響を示した（F3.34=4.83；p=0.007）。さらに群間比較（post hoc解析）では、対照群と比較して、D-ペプチドを投与した群における神経幹の太さの有意な増加を確認した（p<0.01;ボンフェローニ検定）。
【０１３６】
神経内膜結合組織領域のような病態形成指標の解析において、神経内膜の結合組織の著しい成長が病態モデルで発生したことが確定され（p<0.0018;t検定）、これは、修復性兆候に対する退行性兆候の優位性を示す可能性がある（Karpova and Krishtop、2013）。一元配置分散分析（ANOVA）を実行し、試験物質の注射が神経内膜性結合組織領域（F4.25=8.58;p=0.0002）に有意な影響を及ぼすことが示された。さらに群間比較（post hoc解析）により、すべての群において神経内膜性結合組織領域の有意な減少が確認された（p<0.01;Bonferroni検定）。最大の効果は、特許請求されたD-ペプチド（p=0.0002;Bonferroni検定）（テーブル４）が投与された実験群で記録され、これは、神経組織における修復プロセスの増強の結果として治癒する可能性がある。
【実施例１２】
【０１３７】
筋組織（腓腹筋）の病的状態の評価
腓腹筋の横紋筋組織の確立された病態形態変化に基づき、実験的2型糖尿病の進行に伴って、筋線維の薄化および変形、萎縮線維が膠原性結合組織で置換されている場合もある周囲結合組織の緩やかな成長、並びに、筋細胞核（筋核）の量的増加を特徴とする筋ジストロフィーの明らかな病的状態が現れたと結論付けることがきる。中程度の炎症性浸潤が、線維萎縮を有する動物の内膜および周膜の結合組織において見出された。
【０１３８】
バイエッタRおよびエキセナチドを投与した群では、侵襲した筋線維の置換を伴う結合組織の局所的増殖および中程度のリンパ球浸潤が観察された。筋核比の増加を背景としてメトホルミンを投与した群では、線維および間質組織の最小局所炎症性浸潤が観察された。
【０１３９】
確立された病態を背景に、特許請求されたD-ペプチドの注射は、筋組織に対する明らかな治療効果があった。病理学的変化は、これらの群では単発症例で認められ、対照群と比較して軽度であった。
【０１４０】
筋線維の断面積の解析の際は、実験的2型糖尿病の進行に伴い、筋肉組織の線維の断面積が有意に減少し（p<0.0001;t検定）、同時に、筋ジストロフィーの徴候として扱われる場合もある線維内の筋核量の減少（約70％）が起きることが確認された。一元配置分散分析（ANOVA）を行い、試験物質の注射による筋肉線維の断面積に対する有意な影響が示された（F4.22=13.67;p=0.0001）。さらに群間比較（post hoc解析）では、バイエッタRを投与した群（p=0.051;Bonferroni検定）を除いて、すべての群において筋線維の断面積の有意な増加（p<0.01;Bonferroni検定）を確認した。エキセナチド（p<0.0001;ボンフェローニ検定）および特許請求されたD-ペプチド（p=0.0004;ボンフェローニ検定）を投与した群（テーブル５）で最大効果が記録された。
【０１４１】
【表８】
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【実施例１３】
【０１４２】
膵腺島器官
テーブル６は、実験動物の膵腺島器官に対する試験物質の影響に関する概要のデータを示す。インタクト群と対照群との対応のある比較において、対照群でランゲルハンス島の有意な減少が起こることが示された（p<0.0001、t検定）。この島状器官領域の減少は、末梢血におけるグルコース濃度の増加にも相関する病態の発症を意味する。対照群と実験群との対応のある比較において、膵腺島器官領域に対する、全ての試験物質の注射による統計的に有意な影響が明らかになった（テーブル７）。この観察から、試験物質の長期注射が膵島面積の増加を惹起し、したがって膵腺島器官領域の修復プロセスを促進することが示される。
【０１４３】
【表９】
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【０１４４】
【表１０】
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【０１４５】
従って、臓器および組織の病理形態学的解析において、ストレプトゾトシン誘発2型糖尿病のモデル化では、血管内皮炎、膵腺島器官領域の減少、ならびに糖尿病性末梢神経障害および大腿部横紋筋の筋委縮性変化の発生の明らかな病的状態を伴うことが明らかになった。
【０１４６】
特許請求されたD-ペプチドを80日間注射した後に、最大にして明らかな治療効果が観察された。この化合物の注射は、糖尿病性神経障害、筋ジストロフィー、血管内皮炎などの2型糖尿病の合併症に関して明らかなポジティブな治癒作用を有し、膵腺島器官の修復過程に好影響を及ぼした。組織学的試料の解析は、臨床データと相関する。特に、実験動物の異痛徴候の発現および赤血球におけるグリコシル化ヘモグロビン含量の減少に、明らかな治癒効果が観察された。メトホルミンと比較できる程の、この化合物の明らかな抗高血糖作用も分かった。
【０１４７】
以上のことから、特許請求の範囲に記載のD-ペプチドは、2型糖尿病合併症、特に糖尿病性神経障害の治療及び予防のための有効な薬剤であり、アルコール性神経障害に対する神経保護作用を有すると結論付けることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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