(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
ａ）配列番号１０として示される配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインを含むＶＨ、および
ｂ）配列番号１２として示される配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインを含むＶＬ
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２】
前記ＧＤ２結合ドメインが、配列番号８として示される配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
配列番号２７〜３５のいずれかとして示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するが、ｉ）ＧＤ２に結合する能力、およびｉｉ）Ｔ細胞シグナリングを誘導する能力を保持するそれらのバリアントを含む、請求項１または２に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣＡＲをコードする核酸。
【請求項５】
配列番号２５として示される配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
自殺遺伝子もコードする、請求項４または５に記載の核酸。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれかに記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載のＣＡＲを発現する、細胞。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載のＣＡＲと自殺遺伝子とを共発現する、細胞。
【請求項１０】
前記自殺遺伝子が、ｉＣａｓｐ９またはＲＱＲ８である、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれかに記載の細胞を作製するための方法であって、エクスビボでＴ細胞に、請求項４〜６のいずれかに記載の核酸を導入する工程を含む、方法。
【請求項１２】
請求項７に記載のベクターまたは請求項８〜１０のいずれかに記載の細胞と、薬学的に許容できるキャリア、希釈剤または賦形剤とを一緒に含む、薬学的組成物。
【請求項１３】
がんを処置するのに使用するための組成物であって、請求項７に記載のベクターまたは請求項８〜１０のいずれかに記載の細胞を含む、組成物。
【請求項１４】
前記がんは、神経芽腫である、請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、がん抗原ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）に結合する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。そのようなＣＡＲを発現するＴ細胞は、神経芽腫などのがん性疾患の処置において有用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ジシアロガングリオシド（ＧＤ２、ｐｕｂｃｈｅｍ：６４５０３４６）は、主として細胞表面において発現する、シアル酸を含有するスフィンゴ糖脂質である。この糖鎖抗原の機能は、完全には理解されていないが、腫瘍細胞の細胞外マトリクスタンパク質への接着において重要な役割を担うと考えられている。ＧＤ２は、神経芽腫において密に、均一でかつほぼ普遍的に発現する。正常な組織において、ＧＤ２発現は、皮膚色素細胞および末梢疼痛線維ミエリン鞘に大きく限定される。ＣＮＳ内で、ＧＤ２は、胎児性抗原であるようだが、散在したオリゴデンドロサイトにおいて、および下垂体後葉内で不明瞭に発現することが見出されている。これは、ＧＤ２を、標的抗腫瘍治療に十分に適切にさせる。
【０００３】
抗ＧＤ２抗体は、神経芽腫における治療として広く試験されている。２種のクローン（クローン３Ｆ８１４および３Ｆ８）ならびにそれらの誘導体は、現在臨床上の使用にある。別のクローンである１４．１８７は、ＩｇＧ２ａ（１４ｇ２ａ）へのアイソタイプスイッチの後、そして最終的にｃｈ１４．１８を形成するために、ヒトＩｇＧ１を用いたキメラ化の後に、マウスＩｇＧ３として試験されている。この後者の抗体は、無作為化試験においてはっきりとした効果をもたらした：米国小児腫瘍学グループは、危険性の高い神経芽腫を有する小児であって、最初の処置後、放射線学的寛解を達成した小児におけるｃｈ１４：１８の無作為化フェーズＩＩＩ試験を報告した。これらの患者において、平均２．１年の追跡調査で、ｃｈ１４：１８アームにおけるＥＦＳにおいて２０％の改善があった。重要なことに、ニューロパチーを含む慢性疼痛として最も一般的でかつ眼球麻痺としてより一般的でない神経毒性が、これらの薬剤に伴う主要な用量制限毒性である。
【０００４】
これらの治療用ｍＡｂは洗練され続けている：ｃｈ１４．１８から誘導されたＩＬ−２免疫サイトカインが記載されている。これは、微少残存病変においていくらかの効果を伴うが、巨大病変に対しては伴わないかなり毒性の薬剤である。ｃｈ１４．１８は、完全にヒト化されており、そのＦｃは、補体の活性化を阻害するために変異されている。このヒト化型のＣｈ１４．１８は臨床試験にあるが、非常に限定されたデータしか利用可能でない。３Ｆ８抗体のヒト化も記載されている。ＧＤ２血清療法由来の臨床データは励みになるものであるが、持続的完全寛解は、依然として限定されており、微少病変のセッティングにおけるものを除いて、抗体についての臨床上有用な役割についての証拠はない。
【０００５】
それゆえ、神経芽腫および他のＧＤ２発現がんを処置するための改良された治療的アプローチについての必要性が存在する。
【０００６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体は、通常の構成において、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性を、Ｔ細胞のエフェクター効果へ移植したタンパク質である。その通常の構成は、抗原認識アミノ末端、スペーサー、膜貫通ドメインが全て、Ｔ細胞生存および活性化シグナルを伝達する混成エンドドメインに連結した、Ｉ型膜貫通ドメインタンパク質の形態である（図１ａを参照）。
【０００７】
これら分子の最も一般的な形態は、標的抗原を認識するモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の融合物であり、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナリングエンドドメインに融合される。このような分子は、ｓｃＦｖによるそれらの標的の認識に応答してＴ細胞の活性化をもたらす。Ｔ細胞がこのようなＣＡＲを発現するとき、それらは標的抗原を発現する標的細胞を認識し、かつ殺傷する。腫瘍関連抗原に対する数種のＣＡＲが開発されており、このようなＣＡＲを発現するＴ細胞を使用する養子移植アプローチは、現在広範ながんの処置のための臨床試験にある。
【０００８】
抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖ  １４ｇ２ａに基づく、ＧＤ２に対するキメラ抗原受容体が記載されている（国際公開第２０１３／０４０３７１号およびＹｖｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００９、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：５８５２−５８６０））。
１４ｇ２ａ−ＣＤ２８−ＯＸ４０−ζ  ＣＡＲを発現するヒトＴ細胞は、いくらかの抗腫瘍活性を有するが、疾患を完全に根絶することができないことが示された（上記と同様にＹｖｏｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００９））。
本発明者らは、改善した性質を有する代替的なＧＤ２標的化ＣＡＲを作製しようとした。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０４０３７１号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｙｖｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００９、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：５８５２−５８６０）
【発明の概要】
【００１１】
本発明の態様の概要
本発明者らは、Ｋ６６６抗体に基づくＧＤ２結合ドメインを含む、ＧＤ２を標的とする新しいキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を構築した。
【００１２】
抗ＧＤ２抗体１４ｇ２ａは、治療用抗体として使用され、現在までにＣＡＲ研究において試験された唯一のｓｃＦｖである（ＰＭＩＤ：１８９７８７９７）ため、価値の基準として理解され得る。本発明者らは、第二世代の構成における１４ｇ２ａおよびｈｕＫ６６６に基づくＣＡＲを比較した。これは、臨床試験において使用される最も広範に使用されるＣＡＲ構成であるためである。本発明者らは、ｈｕＫ６６６  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、１４ｇ２ａ等価物よりも多くのＩＦＮ−γを放出し、より良好に増殖し、かつより完全に殺傷することを見出した。
【００１３】
したがって、第一の態様において、本発明は、
ａ）以下の配列：
ＣＤＲ１−ＳＹＮＩＨ（配列番号１）、
ＣＤＲ２−ＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹＮＳＡＬＭＳ（配列番号２）、
ＣＤＲ３−ＲＳＤＤＹＳＷＦＡＹ（配列番号３）
を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、および
ｂ）以下の配列：
ＣＤＲ１−ＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨ（配列番号４）、
ＣＤＲ２−ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５）、
ＣＤＲ３−ＱＱＹＳＧＹＰＩＴ（配列番号６）
を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【００１４】
ＧＤ２結合ドメインは、配列番号９もしくは配列番号１０として示される配列を有するＶＨドメイン、または配列番号１１もしくは配列番号１２として示される配列を有するＶＬドメイン、またはｉ）ＧＤ２に結合し、かつｉｉ）Ｔ細胞シグナリングを誘導する能力を保持し、少なくとも９０％の配列同一性を有するそれらのバリアントを含み得る。
【００１５】
ＧＤ２結合ドメインは、配列番号７もしくは配列番号８として示される配列、またはｉ）ＧＤ２に結合し、かつｉｉ）Ｔ細胞シグナリングを誘導する能力を保持し、少なくとも９０％の配列同一性を有するそれらのバリアントを含み得る。
【００１６】
膜貫通ドメインは、配列番号１３として示される配列、またはｉ）ＧＤ２に結合し、かつｉｉ）Ｔ細胞シグナリングを誘導する能力を保持し、少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。
【００１７】
ＧＤ２結合ドメインおよび膜貫通ドメインは、スペーサーによって連結され得る。
【００１８】
スペーサーは、以下：ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ−ＣＤ８ストークまたはＣＤ８ストークの１つを含み得る。
【００１９】
スペーサーは、ＩｇＧ１ヒンジ−ＣＤ８ストークまたはＣＤ８ストークを含み得る。
【００２０】
スペーサーは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインまたはそのバリアントを含み得る。
【００２１】
スペーサーは、配列番号２３もしくは配列番号２４として示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するそれらのバリアントを含む、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み得る。
【００２２】
ＣＡＲは、細胞内Ｔ細胞シグナリングドメインを含むかまたはこれと会合し得る。
【００２３】
細胞内Ｔ細胞シグナリングドメインは、以下のエンドドメイン：ＣＤ２８エンドドメイン、ＯＸ４０およびＣＤ３ゼータエンドドメインの１つまたはそれより多くを含み得る。
【００２４】
細胞内Ｔ細胞シグナリングドメインは、以下のエンドドメイン：ＣＤ２８エンドドメイン、ＯＸ４０およびＣＤ３ゼータエンドドメインのすべてを含み得る。
【００２５】
ＣＡＲは、配列番号２６〜３５のいずれかとして示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するが、ｉ）ＧＤ２に結合し、かつｉｉ）Ｔ細胞シグナリングを誘導する能力を保持する、それらのバリアントを含み得る。
【００２６】
第二の態様において、本発明は、本発明の第一の態様にしたがうＣＡＲをコードする核酸配列を提供する。
【００２７】
核酸配列は、コドン最適化され得る。
【００２８】
核酸配列は、配列番号２５として示される配列、または少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。
【００２９】
核酸は、自殺遺伝子もコードし得る。
【００３０】
第三の態様において、本発明は、本発明の第二の態様にしたがう核酸配列を含むベクターを提供する。
【００３１】
第四の態様において、本発明は、本発明の第一の態様にしたがうＣＡＲを発現する細胞を提供する。この細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの細胞溶解性免疫細胞であり得る。
【００３２】
細胞は、本発明の第一の態様にしたがうＣＡＲと自殺遺伝子とを共発現し得る。
【００３３】
自殺遺伝子は、例えば、ｉＣａｓｐ９またはＲＱＲ８であり得る。
【００３４】
第五の態様において、本発明は、細胞に本発明の第二の態様にしたがう核酸を導入する工程を含む、本発明の第四の態様にしたがう細胞を作製するための方法を提供する。
【００３５】
第六の態様において、本発明は、本発明の第三の態様にしたがうベクター、または本発明の第二の態様にしたがう細胞と、薬学的に許容できるキャリア、希釈剤、または賦形剤とを一緒に含む薬学的組成物を提供する。
【００３６】
第七の態様において、本発明は、本発明の第三の態様にしたがうベクター、または本発明の第四の態様にしたがう細胞を被験体へ投与する工程を含む、がんを処置するための方法を提供する。
【００３７】
がんは、神経芽腫であり得る。
【００３８】
第八の態様において、本発明は、がんの処置における使用のための、本発明の第三の態様にしたがうベクター、または本発明の第四の態様にしたがう細胞を提供する。
【００３９】
第九の態様において、本発明は、がんを処置するための医薬品の製造における、本発明の第三の態様にしたがう使用、または本発明の第四の態様にしたがう細胞を提供する。
【００４０】
第十の態様において、本発明は、細胞にＧＭ３シンターゼをコードする核酸およびＧＤ２シンターゼをコードする核酸を導入する工程を含む、ＧＤ２発現細胞を作製するための方法を提供する。
【００４１】
第十一の態様において、本発明は、ＧＭ３シンターゼをコードする異種の核酸およびＧＤ２シンターゼをコードする異種の核酸を含む、ＧＤ２発現細胞を提供する。
【００４２】
第十二の態様において、本発明は、インビトロで本発明の第四の態様にしたがう細胞を刺激するための方法を提供し、これは、細胞を、本発明の第十一の態様にしたがうＧＤ２発現細胞と接触させる工程を含む。
【００４３】
第十三の態様において、本発明は、足場付着領域（ＳＡＲ）を含む、ＣＡＲを発現する発現カセットを提供する。
【００４４】
発現カセットは、本発明の第一の態様にしたがうＣＡＲを発現し得る。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
ａ）以下の配列：
ＣＤＲ１−ＳＹＮＩＨ（配列番号１）、
ＣＤＲ２−ＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹＮＳＡＬＭＳ（配列番号２）、
ＣＤＲ３−ＲＳＤＤＹＳＷＦＡＹ（配列番号３）
を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、および
ｂ）以下の配列：
ＣＤＲ１−ＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨ（配列番号４）、
ＣＤＲ２−ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５）、
ＣＤＲ３−ＱＱＹＳＧＹＰＩＴ（配列番号６）
を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
（項目２）
前記ＧＤ２結合ドメインが、配列番号９もしくは配列番号１０として示される配列を有するＶＨドメイン、または配列番号１１もしくは配列番号１２として示される配列を有するＶＬドメイン、または少なくとも９０％の配列同一性を有するそれらのバリアントであって、ｉ）ＧＤ２に結合する能力、およびｉｉ）Ｔ細胞シグナリングを誘導する能力を保持するバリアントを含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目３）
前記ＧＤ２結合ドメインが、配列番号７もしくは配列番号８として示される配列、または少なくとも９０％の配列同一性を有するそれらのバリアントであって、ｉ）ＧＤ２に結合する能力、およびｉｉ）Ｔ細胞シグナリングを誘導する能力を保持するバリアントを含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目４）
配列番号１３として示される配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む膜貫通ドメインを含む、前述の項目のいずれかに記載のＣＡＲ。
（項目５）
ＧＤ２結合ドメインおよび前記膜貫通ドメインが、スペーサーによって連結されている、前述の項目のいずれかに記載のＣＡＲ。
（項目６）
前記スペーサーが、以下：ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ−ＣＤ８ストークまたはＣＤ８ストークの１つを含む、項目４に記載のＣＡＲ。
（項目７）
前記スペーサーが、ＩｇＧ１ヒンジ−ＣＤ８ストークまたはＣＤ８ストークを含む、項目６に記載のＣＡＲ。
（項目８）
前記スペーサーが、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインまたはそのバリアントを含む、項目６に記載のＣＡＲ。
（項目９）
前記スペーサーが、配列番号２３もしくは配列番号２４として示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するそれらのバリアントを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、項目８に記載のＣＡＲ。
（項目１０）
細胞内Ｔ細胞シグナリングドメインも含む、前述の項目のいずれかに記載のＣＡＲ。
（項目１１）
前記細胞内Ｔ細胞シグナリングドメインが、以下のエンドドメイン：ＣＤ２８エンドドメイン、ＯＸ４０およびＣＤ３ゼータエンドドメインの１つまたはそれより多くを含む、項目１０に記載のＣＡＲ。
（項目１２）
前記細胞内Ｔ細胞シグナリングドメインが、以下のエンドドメイン：ＣＤ２８エンドドメイン、ＯＸ４０およびＣＤ３ゼータエンドドメインの全てを含む、項目１１に記載のＣＡＲ。
（項目１３）
配列番号２６〜３５のいずれかとして示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するが、ｉ）ＧＤ２に結合する能力、およびｉｉ）Ｔ細胞シグナリングを誘導する能力を保持するそれらのバリアントを含む、前述の項目のいずれかに記載のＣＡＲ。
（項目１４）
前述の項目のいずれかに記載のＣＡＲをコードする核酸配列。
（項目１５）
コドン最適化された、項目１４に記載の核酸配列。
（項目１６）
配列番号２５として示される配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、項目１４または１５に記載の核酸配列。
（項目１７）
自殺遺伝子もコードする、項目１４〜１６のいずれかに記載の核酸。
（項目１８）
項目１４〜１７のいずれかに記載の核酸配列を含む、ベクター。
（項目１９）
項目１〜１３のいずれかに記載のＣＡＲを発現する、Ｔ細胞。
（項目２０）
項目１〜１３のいずれかに記載のＣＡＲと自殺遺伝子とを共発現する、Ｔ細胞。
（項目２１）
前記自殺遺伝子が、ｉＣａｓｐ９またはＲＱＲ８である、項目２０に記載のＴ細胞。
（項目２２）
項目１９〜２１のいずれかに記載のＴ細胞を作製するための方法であって、Ｔ細胞に、項目１４〜１７のいずれかに記載の核酸を導入する工程を含む、方法。
（項目２３）
項目１９〜２１のいずれかに記載のＴ細胞と、薬学的に許容できるキャリア、希釈剤または賦形剤とを一緒に含む、薬学的組成物。
（項目２４）
がんを処置するための方法であって、被験体に、項目１９〜２１のいずれかに記載のＴ細胞を投与する工程を含む、方法。
（項目２５）
前記がんは、神経芽腫である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
がんの処置における使用のための、項目１９〜２１のいずれかに記載のＴ細胞。
（項目２７）
がんを処置するための医薬品の製造における、項目１９〜２１のいずれかに記載のＴ細胞の使用。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）デザイン。  （ａ）ＣＡＲの一般化された構造：結合ドメインが抗原を認識し、スペーサーが、細胞表面から結合ドメインを持ち上げ、膜貫通ドメインが、タンパク質を膜へと固定し、エンドドメインがシグナルを伝達する。（ｂ）〜（ｄ）：ＣＡＲエンドドメインの異なる世代および置換：（ｂ）最初のデザインは、ＦｃεＲ１−γまたはＣＤ３エンドドメインを通じてＩＴＡＭシグナルのみを伝達したが、一方で後のデザインは、追加の（ｃ）１つまたは（ｄ）２つの共刺激性シグナルをシスで伝達した。
【図２】構築された抗ＧＤ２  ＣＡＲのバリアント  （ａ）ヒトＩｇＧ１スペーサーおよびＣＤ２８−ＯＸ４０−ゼータエンドドメインと共に、ｓｃＦｖとしてマウスＫＭ６６６抗体を使用する抗ＧＤ２  ＣＡＲ、（ｂ）（ａ）と同じ構成においてＮａｋａｍｕｒａのヒト化抗体ｈｕＫＭ６６６を使用する抗ＧＤ２  ＣＡＲ、（ｃ）Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体認識モチーフを除去するように改変されることを除き、（ｂ）と同じ構成、（ｄ）スペーサーが、ＩｇＧ１ヒンジ−ＣＤ８ストークであることを除き、（ｃ）と同じ構成、（ｅ）スペーサーが、ＣＤ８ストークのみであることを除き、（ｃ）と同じ、（ｆ）スペーサーが、ＩｇＧ１ヒンジのみであることを除き、（ｃ）と同じ。
【図３】ｍｕＫＭ６６６に基づくＣＡＲとｈｕＫＭ６６６に基づくＣＡＲとの比較。  （ａ）３種の正常ドナー由来の末梢血Ｔ細胞における発現、（ｂ）ヒストグラムとして示される、これらのｆａｃｓプロットの平均蛍光強度、（ｃ）Ａ２０４（ＧＤ２陰性）標的およびＬＡＮ−１（ＧＤ２陽性）標的に対して、形質導入していないＴ細胞、ｍｕＫＭ６６６を形質導入したＴ細胞およびｈｕＫＭ６６６を形質導入したＴ細胞をエフェクターとして使用した、クロム放出アッセイ、（ｄ）同じ負荷からのＩＬ−２産生、（ｅ）同じ負荷からのインターフェロンガンマ産生、ならびに（ｆ）同じ負荷からの増殖倍率。
【図４】（ａ）ＣＡＲとのＣＤ３４マーカー遺伝子の１：１共発現を可能にするレトロウイルスコンストラクト、（ｂ）ＣＤ３４マーカー遺伝子に対するＣＡＲ発現（ＨＡタグ）のフローサイトメトリー解析、（ｃ）ＧＤ２陽性標的（ＬＡＮ−１）およびＧＤ２陰性標的（Ａ２０４）に対する、形質導入していないＴ細胞および３種の異なるＣＡＲバリアントを形質導入したＴ細胞のクロム放出アッセイ、同じ標的およびエフェクターの（ｄ）インターフェロンガンマ放出、（ｅ）ＩＬ−２放出、ならびに（ｆ）増殖。
【図５】Ｆｃスペーサー内へのＦｃＲ結合妨害（ｄｉｓｔｒｕｐｔｉｎｇ）変異の導入  （ａ）導入された変異、（ｂ）抗Ｆｃ染色によって決定した場合のＣＡＲ（形質導入していない、ｗｔおよび変異させた）の発現、（ｃ）形質導入していない抗ＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞、ｗｔ  Ｆｃ  抗ＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞および変異させたＦｃ  抗ＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれかを用いたＧＤ２陰性標的およびＧＤ２陽性標的の殺傷、（ｄ）ＦｃＲ発現細胞株ＴＨＰ−１を用いた形質導入していない抗ＧＤ２  Ｔ細胞、ｗｔ  Ｆｃ  抗ＧＤ２  Ｔ細胞および変異させたＦｃ  抗ＧＤ２  Ｔ細胞の活性化、形質導入していないＣＡＲ  Ｔ細胞、ｗｔ  Ｆｃ  ＣＡＲ  Ｔ細胞および変異させたＦｃ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に対する応答における、ＴＨＰ−１細胞株によるＩＬ−１ベータ放出。
【図６】発現カセットの最適化  （ａ）カセット：ＳＡＲまたはＣＨＳ４に導入されたマップ最適化、（ｂ）ｗｔまたはコドン最適化したオープンリーディングフレームのいずれかを用いた異なる改変を有するＣＡＲの代表的な発現。ＳＡＲコンストラクトは、所望の急なピークの発現をもたらす。（ｃ）この３種の正常ドナーからのＦＡＣＳデータの棒グラフ表示。
【図７】異なるエンドドメインの比較  ３種の異なるキメラ抗原受容体を比較した。受容体はすべて、ｈｕＫ６６６  ｓｃＦｖ、ＦｃＲ結合を低減させるために変異させたＩｇＧ１のＦｃドメインおよびＣＤ２８膜貫通ドメインから構成される。ＣＡＲ「２８ｔｍＺ」は、ＣＤ３ゼータエンドドメインを有し、「２８Ｚ」は、混成ＣＤ２８−ＣＤ３ゼータエンドドメインを有し、「２８ＯＸＺ」は、ＣＤ２８、ＯＸ４０およびＣＤ３ゼータから構成される混成エンドドメインを有し、正常ドナー由来の末梢血Ｔ細胞に、これらのコンストラクトを同等の力価のレトロウイルスベクターを用いて形質導入した。これらの異なるＴ細胞株を、対照としての導入していないＴ細胞と一緒に比較した。Ｔ細胞に、Ａ２０４細胞（ＧＤ２陰性である横紋筋肉腫細胞株）およびＬＡＮ−１細胞（ＧＤ２陽性である神経芽腫細胞株）を負荷した。増殖およびサイトカイン放出は、受容体活性が、２８ｔｍＺ＜２８Ｚ＜２８ＯＸＺであることを示す。
【図８】ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子との共発現  （ａ）ＦＭＤ−２Ａ配列を使用した、ｉＣａｓｐ９の抗ＧＤ２ＣＡＲとの共発現、（ｂ）単独およびＣＩＤを用いた処理後の、ＮＴ  Ｔ細胞、ＧＤ２ＣＡＲを形質導入したＴ細胞およびｉＣａｓｐ９−２Ａ−ＧＤ２ＣＡＲ  Ｔ細胞における、ＣＡＲ発現、（ｃ）ＣＩＤを用いた処理を行ったまたは行っていない、形質導入していないＴ細胞、ＧＤ２ＣＡＲを形質導入したＴ細胞およびｉＣａｓｐ９−２Ａ−ＧＤ２ＣＡＲを形質導入したＴ細胞を用いたＧＤ２陽性（ＬＡＮ−１）標的および陰性（Ａ２０４）標的の殺傷。５種の正常ドナーＴ細胞の平均。
【図９】ＲＱＲ８自殺遺伝子との共発現  （ａ）ＣＡＲｈｕＫ６６６Ｆｃを、レトロウイルスベクターにおいてＲＱＲ８自殺分類遺伝子と共発現させた。（ｂ）Ｔ細胞に、このレトロウイルスベクターを用いて形質導入し、ＣＡＲとＲＱＲ８との共発現を、ポリクローナル抗Ｆｃおよびモノクローナル抗体ＱＢｅｎｄ１０を用いた形質導入Ｔ細胞の染色によって決定した。（ｃ）これらのＴ細胞由来のＣＡＲ陽性の集団は、リツキシマブおよび補体の存在下で枯渇させることができた。（ｄ）リツキシマブを用いて枯渇させたＴ細胞は、もはやＧＤ２を発現する標的を認識しなかった。
【図１０】（ａ）ＧＭ３シンターゼおよびＧＤ２シンターゼを発現するバイシストロニックベクター。（ｂ）このベクターを用いて形質導入したＳｕｐＴ１細胞は、ＧＤ２陽性となる（形質導入されていない空のプロット、形質導入された灰色のプロット）。
【図１１】以下のコホート中のマウスにおける個々の腫瘍の成長曲線：左上：抗ＧＤ２  ＣＡＲ脾細胞を受容している、ＧＤ２を発現するＣＴ２６腫瘍を有するマウス、右上：模倣物を形質導入された脾細胞を受容している、ＧＤ２を発現するＣＴ２６腫瘍を有するマウス、左下：抗ＧＤ２  ＣＡＲ脾細胞を有するＧＤ２陰性（ｗｔ）ＣＴ２６腫瘍、右下：および脾細胞を受容していないＧＤ２を発現するＣＴ２６腫瘍。
【図１２Ａ】アミノ酸配列Ａ．図２において（ａ）として示される抗ＧＤ２  ＣＡＲ（ｍｕＫＭ６６６−ＨＣＨ２ＣＨ３−ＣＤ２８ＯＸＺ−配列番号２６）Ｂ．図２において（ｂ）として示される抗ＧＤ２  ＣＡＲ（ｈｕＫＭ６６６−ＨＣＨ２ＣＨ３−ＣＤ２８ＯＸＺ−配列番号２７）Ｃ．図２において（ｃ）として示される抗ＧＤ２  ＣＡＲ（ｈｕＫＭ６６６−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−ＣＤ２８ＯＸＺ−配列番号２８）Ｄ．図２において（ｄ）として示される抗ＧＤ２  ＣＡＲ（ｈｕＫＭ６６６−ＨＳＴＫ−ＣＤ２８ＯＸＺ−配列番号２９）Ｅ．図２において（ｅ）として示される抗ＧＤ２  ＣＡＲ（ｈｕＫＭ６６６−ＳＴＫ−ＣＤ２８ＸＯＸＺ−配列番号３０）Ｆ．図２において（ｆ）として示される抗ＧＤ２  ＣＡＲ（ｈｕＫＭ６６６−ＨＮＧ−ＣＤ２８ＯＸＺ−配列番号３１）Ｇ．図２（ｃ）において示されるような抗ＧＤ２  ＣＡＲであるが、第一世代のエンドドメインを有する（ｈｕＫＭ６６６−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−ＣＤ２８ｔｍＺ−配列番号３２）Ｈ．図２（ｃ）において示されるような抗ＧＤ２  ＣＡＲであるが、第二世代のエンドドメインを有する（ｈｕＭＫ６６６−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−ＣＤ２８Ｚ−配列番号３３）Ｉ．ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子とともに共発現させた抗ＧＤ２  ＣＡＲ−配列番号３４Ｊ．ＲＱＲ８自殺遺伝子とともに共発現させた抗ＧＤ２  ＣＡＲ−配列番号３５
【図１２Ｂ】同上
【図１２Ｃ】同上
【図１３】ＧＤ２の構造
【図１４】ｈｕＫ６６６  ＣＡＲと１４ｇ２ａ  ＣＡＲとの比較。  （ａ）試験したコンストラクトのマップ：２種のコンストラクトを、初代Ｔ細胞において試験した。両方は、ＦＭＤ−２Ａ様配列とともに共発現させた、ＲＱＲ８および第二世代ＧＤ２  ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターである。コンストラクト間の唯一の差異は、一方においてｓｃＦｖがｈｕＫ６６６であり、他方において、これが１４ｇ２ａである点である。これらのコンストラクトを用いて形質導入したＴ細胞に、Ａ２０４（ＧＤ２陰性の横紋筋肉腫細胞株）およびＬＡＮ−１（ＧＤ２陽性の細胞株）のいずれかを１：１で負荷した。（ｂ）２４時間時点で、インターフェロンガンマを上清から測定した。ｈｕＫ６６６  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、より多くのＩＦ−Ｇを産生する。（ｃ）１週間後、Ｔ細胞を計数する、ｈｕＫ６６６は、より多くの増殖を示す。
【図１５】ｈｕＫ６６６または１４ｇ２ａに基づく第二世代のＣＡＲと神経芽腫細胞株ＬＡＮ１との間の共培養のフローサイトメトリー解析。  （ａ）実験のセットアップ。１週間の共培養後、細胞を採取し、フローサイトメトリーによって解析した。ＣＤ４５発現は、ＣＤ４５−細胞がＬＡＮ−１細胞であると、リンパ系細胞および非リンパ系細胞からの区別を可能にした。ＣＤ３／ＱＢＥＮＤ／１０を用いた更なる染色は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の計数を可能にした。（ｂ）Ｔ細胞単独、（ｃ）ＮＴ  Ｔ細胞およびＬＡＮ−１細胞、（ｄ）ｈｕＫ６６６−２８−Ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＬＡＮ−１細胞、（ｅ）１４ｇ２ａ−２８−Ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＬＡＮ−１細胞。ＬＡＮ−１細胞の残存物が、１４ｇ２ａ  ＣＡＲ  Ｔ細胞共培養において見られる。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
詳細な説明
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（キメラＴ細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体、およびキメラ免疫受容体としても公知）は、免疫エフェクター細胞上に任意の特異性を移植する、改変された受容体である。古典的なＣＡＲにおいて、モノクローナル抗体の特異性は、Ｔ細胞上に移植される。ＣＡＲをコードする核酸配列は、例えばレトロウイルスベクターを使用して、Ｔ細胞に転移され得る。このようにして、多数のがん特異的Ｔ細胞は、養子細胞移入のために生成させることができる。このアプローチのフェーズＩ臨床試験は、効果を示す。
【００４７】
ＣＡＲの標的抗原結合ドメインは、一般的にスペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナリングエンドドメインに融合される。ＣＡＲが標的抗原に結合するとき、これは標的抗原が発現されるＴ細胞へ活性化シグナルの伝達をもたらす。
【００４８】
本発明のＣＡＲは、ＫＭ６６６モノクローナル抗体（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：２７５−２８４）に基づくＧＤ２結合ドメインを含む。
【００４９】
本発明のＣＡＲは、
ａ）以下の配列：
ＣＤＲ１−ＳＹＮＩＨ（配列番号１）、
ＣＤＲ２−ＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹＮＳＡＬＭＳ（配列番号２）、
ＣＤＲ３−ＲＳＤＤＹＳＷＦＡＹ（配列番号３）
を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、および
ｂ）以下の配列：
ＣＤＲ１−ＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨ（配列番号４）、
ＣＤＲ２−ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５）、
ＣＤＲ３−ＱＱＹＳＧＹＰＩＴ（配列番号６）
を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ＧＤ２結合ドメインを含む。
【００５０】
ＧＤ２結合活性に負の影響を及ぼさずに、このＣＡＲまたは各ＣＡＲに１つまたはそれより多くの変異（置換、付加または欠失）を導入することが、可能であり得る。各ＣＡＲは、例えば、１つ、２つまたは３つのアミノ酸変異を有し得る。
【００５１】
本発明のＣＡＲは、以下のアミノ酸配列の１つを含み得る。
【化１】
0006422134.tif 000002
【００５２】
本発明のＣＡＲは、以下のＶＨ配列の１つを含み得る。
【化２】
0006422134.tif 000003
【００５３】
本発明のＣＡＲは、以下のＶＬ配列の１つを含み得る。
【化３】
0006422134.tif 000004
【００５４】
本発明のＣＡＲは、配列番号７、８、９、１０、１１または１２として示される配列の、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有するバリアントを含み得、ただし、このバリアント配列は、ＧＤ２に結合する能力を保持する（適切な場合、相補的ＶＬまたはＶＨドメインと結合しているとき）。
【００５５】
２つのポリペプチド配列間の同一性パーセンテージは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．において自由に入手できるＢＬＡＳＴなどのプログラムによって容易に決定され得る。
【００５６】
膜貫通ドメイン
本発明のｃａｒは、膜に跨がる（ｓｐａｎ）膜貫通ドメインも含み得る。これは、疎水性アルファヘリックスを含み得る。膜貫通ドメインは、良好な受容体安定性をもたらす、ＣＤ２８に由来し得る。
【００５７】
膜貫通ドメインは、配列番号１３として示される配列を含み得る。
配列番号１３
ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ
【００５８】
細胞内Ｔ細胞シグナリングドメイン（エンドドメイン）
エンドドメインは、ＣＡＲのシグナル伝達部である。抗原認識の後に、受容体は集合し、そしてシグナルは細胞へ伝達される。最も一般的に使用されるエンドドメイン構成要素は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３ゼータのエンドドメイン構成要素である。これは、抗原が結合した後に、Ｔ細胞に活性化シグナルを伝達する。ＣＤ３ゼータは、完全に反応力を有する活性化シグナルを提供しないことがあり、そして追加の共刺激性シグナリングが必要となり得る。例えば、キメラのＣＤ２８およびＯＸ４０は、増殖／生存シグナルを伝達するために、ＣＤ３ゼータと使用することができ、または３つ全てを一緒に使用することができる。
【００５９】
本発明のＣＡＲのエンドドメインは、ＣＤ２８エンドドメインおよびＯＸ４０およびＣＤ３ゼータエンドドメインを含み得る。
【００６０】
本発明のＣＡＲの膜貫通および細胞内Ｔ細胞シグナリングドメイン（エンドドメイン）は、配列番号１４、１５、１６、１７または１８として示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するそれらのバリアントを含み得る。
【化４】
0006422134.tif 000005
【００６１】
バリアント配列は、その配列が効果的な膜貫通ドメイン／細胞内Ｔ細胞シグナリングドメインを提供する限り、配列番号１３、１４、１５、１６、１７または１８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得る。
【００６２】
シグナルペプチド
本発明のＣＡＲは、ＣＡＲがＴ細胞などの細胞の中で発現されたときに、新生タンパク質が小胞体へと、そしてそれに続きそれが発現される細胞表面へと指向されるように、シグナルペプチドを含み得る。
【００６３】
シグナルペプチドのコアは、単一のアルファヘリックスを形成する傾向を有する、疎水性アミノ酸の長いストレッチを含み得る。シグナルペプチドは、移行の間にポリペプチドの適切なトポロジーに強制することを補助する、アミノ酸の短い正に荷電されたストレッチより開始し得る。シグナルペプチドの端部には、典型的にシグナルペプチダーゼによって認識され、かつ切断されるアミノ酸のストレッチがある。シグナルペプチダーゼは、移行間または完了の後のいずれかに切断し、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。次いで遊離シグナルペプチドは、特異的なプロテアーゼによって消化される。
【００６４】
シグナルペプチドは、分子のアミノ末端にあり得る。
【００６５】
本発明のＣＡＲは、以下の一般式を有し得る：
シグナルペプチド−ＧＤ２結合ドメイン−スペーサードメイン−膜貫通ドメイン−細胞内Ｔ細胞シグナリングドメイン。
【００６６】
シグナルペプチドは、配列番号１９を含み得るか、またはシグナルペプチドが、依然としてＣＡＲの細胞表面発現を引き起こすように機能する限り、５つ、４つ、３つ、２つもしくは１つのアミノ酸変異（挿入、置換、または付加）を有するそれらのバリアントを含み得る。
配列番号１９：ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ
【００６７】
配列番号１９のシグナルペプチドは、コンパクトでありかつ高度に効果的である。それは、末端グリシンの後ろで約９５％の切断をもたらすことが予測され、これは、シグナルペプチダーゼによる効果的な除去を生じさせる。
【００６８】
スペーサー
本発明のＣＡＲは、ＧＤ２結合ドメインと膜貫通ドメインとを連結させ、かつＧＤ２結合ドメインをエンドドメインから空間的に離すための、スペーサー配列を含み得る。柔軟なスペーサーは、ＧＤ２結合を可能にするために、ＧＤ２結合ドメインを異なる角度に配向させる。
【００６９】
スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジもしくはＣＤ８ストークまたはそれらの組み合わせを含み得る。スペーサーは、代替的にＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと同様の長さおよび／またはドメイン配置特性を有する代替的な配列を含み得る。
【００７０】
ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合モチーフを除去するように変化され得る。
【００７１】
これらのスペーサーについてのアミノ酸配列の例は、下記に挙げられる。
【化５】
0006422134.tif 000006
【００７２】
改変された残基は、下線が引かれており、＊は欠失を意味する。
【００７３】
ＧＤ２
ＧＤ２は、ヒト神経芽腫およびメラノーマを含む神経外胚葉起源の腫瘍において発現するジシアロガングリオシドであり、ヒトにおける正常な組織においては、主として小脳および末梢神経に高度に限定された発現を有する。
【００７４】
比較的腫瘍特異的なＧＤ２の発現は、ＧＤ２を免疫療法のための適切な標的にする。
【００７５】
核酸配列
本発明の第二の態様は、本発明の第一の態様のＣＡＲをコードする核酸配列に関する。
【００７６】
核酸配列は、配列番号２６〜３５のいずれかとして示されるアミノ酸配列を有するＣＡＲをコードすることが可能であり得る。
【００７７】
核酸配列は、以下の配列であり得るか、またはそれを含み得る。
【化６Ａ】
0006422134.tif 000007
【化６Ｂ】
0006422134.tif 000008
【化６Ｃ】
0006422134.tif 000009
【化６Ｄ】
0006422134.tif 000010
【化６Ｅ】
0006422134.tif 000011
【００７８】
核酸配列は、配列番号２５によってコードされるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードし得るが、遺伝暗号の縮重に起因して、異なる核酸配列を有し得る。核酸配列は、本発明の第一の態様で定義されるＣＡＲをコードする限り、配列番号２５として示される配列に対して、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の同一性を有し得る。
【００７９】
自殺遺伝子
Ｔ細胞は生着しかつ自律的であるため、抗ＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞のレシピエントにおいて選択的にＣＡＲ  Ｔ細胞を消去する手段が望まれる。自殺遺伝子は、許容可能でない毒性に直面すると、注入されたＴ細胞の選択的な破壊をもたらす、遺伝学的にコード可能なメカニズムである。自殺遺伝子を用いた最も早期の臨床経験は、Ｔ細胞をガンシクロビルに対して感受性にさせるヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を用いるものである。ＨＳＶ−ＴＫは、高度に効果的な自殺遺伝子である。しかしながら、事前に形成された免疫応答は、その使用をハプロ同一幹細胞移植などの考慮すべき免疫抑制の臨床的セッティングに限定し得る。誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）は、カスパーゼ９の活性化ドメインを改変されたＦＫＢＰ１２で置換することによって構築された自殺遺伝子である。ｉＣａｓｐ９は、それ以外には不活性の小分子二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）によって活性化される。ｉＣａｓｐ９は、ハプロ同一ＨＳＣＴのセッティングにおいて最近試験されており、ＧｖＨＤを抑えることができる。ｉＣａｓｐ９の最も大きな制約は、臨床グレード専売のＣＩＤの入手可能性に依存することである。ｉＣａｓｐ９とＨＳＶ−ＴＫとの両方は、細胞内タンパク質であり、そのため、単独の導入遺伝子として使用される場合、これらはマーカー遺伝子とともに共発現し、形質導入された細胞の選択を可能にする。
【００８０】
ｉＣａｓｐ９は、配列番号３６として示される配列、または少なくとも８０、９０、９５もしくは９８％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。
【化７】
0006422134.tif 000012
【００８１】
本発明者らは、ＲＱＲ８として公知である新規のマーカー／自殺遺伝子について最近記載し、これは、抗体ＱＢＥｎｄ１０を用いて検出することができ、かつ発現している細胞は、治療用抗体リツキシマブを用いて溶解させることができる。
【００８２】
ＲＱＲ８は、配列番号３７として示される配列、または少なくとも８０、９０、９５もしくは９８％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。
【化８】
0006422134.tif 000013
【００８３】
自殺遺伝子は、例えば、２つの配列間に自己切断ペプチドを使用することによって、ＣＡＲとともに単一のポリペプチドとして発現され得る。
【００８４】
ベクター
本発明は、本発明にしたがう核酸配列を含むベクターも提供する。このようなベクターは、本発明の第一の態様にしたがう分子を発現し、かつ産生するよう、宿主細胞に核酸配列を導入するために使用され得る。
【００８５】
ベクターは、例えばプラスミドまたはレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターであり得る。
【００８６】
ベクターは、Ｔ細胞にトランスフェクションまたは形質導入する能力を有し得る。
【００８７】
ベクターは、ｉＣａｓｐ９またはＲＱＲ８などの自殺遺伝子をコードする核酸配列も含み得る。
【００８８】
宿主細胞
本発明は、本発明にしたがう核酸を含む宿主細胞も提供する。宿主細胞は、本発明の第一の態様にしたがうＣＡＲを発現する能力を有し得る。
【００８９】
宿主細胞は、ヒトＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの細胞溶解性免疫細胞であり得る。
【００９０】
本発明にしたがうＣＡＲを発現する能力を有するＴ細胞は、Ｔ細胞にＣＡＲをコードする核酸を形質導入またはトランスフェクションすることにより作製され得る。
【００９１】
ＣＡＲ  Ｔ細胞は、エキソビボで生成され得る。Ｔ細胞は、患者またはドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプル由来であり得る。Ｔ細胞は、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体を用いた処理によって、ＣＡＲをコードする核酸を形質導入される前に活性化、および／または増加され得る。
【００９２】
薬学的組成物
本発明は、本発明のベクターまたはＣＡＲ発現Ｔ細胞を、薬学的に許容されるキャリア、希釈液、もしくは賦形剤、および任意に１つまたはそれより多くの更に薬学的に有効なポリペプチド、および／もしくは化合物を一緒に含む薬学的組成物にも関する。このような製剤は、例えば、静脈注入に適した形態であり得る。
【００９３】
処置の方法
本発明のＣＡＲ分子を発現するＴ細胞は、神経芽腫（ｎｅｕｒｏｂａｓｔｏｍａ）細胞などのがん細胞を殺傷する能力を有する。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、患者自身の末梢血由来（第一当事者）、またはドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状態において（第二当事者）、またはつながりのないドナーからの末梢血（第三当事者）のいずれかの由来から、エキソビボで創出され得る。代替的に、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のＴ細胞へのエキソビボ分化に由来し得る。これらの例として、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ウイルスベクターを用いた形質導入、ＤＮＡもしくはＲＮＡを用いたトランスフェクションを含む多くの手段の１つにより、ＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成される。
【００９４】
本発明のＣＡＲ分子を発現するＴ細胞は、がん性の疾患（特に、ＧＤ２発現に関連したがん性の疾患）の処置のために使用され得る。
【００９５】
がんは、外胚葉性腫瘍であり得る。
【００９６】
上昇したＧＤ２発現レベルに相関するがんの例は、神経芽腫、メラノーマ、髄芽腫、軟部組織肉腫、骨肉腫およびＮＳＣＬＣなどの小細胞肺がんである。
【００９７】
疾患の処置のための方法は、本発明のベクターまたはＴ細胞の治療上の使用に関係する。この点で、ベクターまたはＴ細胞は疾患に付随する少なくとも１つの症状を小さくする、減少する、もしくは改善する、および／または疾患の進行を遅延する、減少する、もしくは阻止するために、既存の疾患または状態を有する被験体に投与され得る。本発明の方法は、がん細胞などのＧＤ２発現細胞のＴ細胞媒介性の殺傷を引き起こすか、または促進し得る。
【００９８】
ＧＤ２発現細胞
本発明は、細胞にＧＭ３シンターゼをコードする核酸およびＧＤ２シンターゼをコードする核酸を導入する工程を含む、ＧＤ２発現細胞を作製するための方法も提供する。
【００９９】
核酸は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターを使用して、例えば、トランスフェクションまたは形質導入によって導入され得る。
【０１００】
本発明は、ＧＭ３シンターゼをコードする異種の核酸およびＧＤ２シンターゼをコードする異種の核酸を含む、ＧＤ２発現細胞にも関する。
【０１０１】
この核酸は、細胞内に通常存在しないという意味で、「異種」であり得る。これは、人工的に導入されたリコンビナントの核酸配列である。
【０１０２】
細胞は、細胞株由来であり得る。
【０１０３】
細胞は、培養において、本発明のＴ細胞などのＧＤ２ＣＡＲ  Ｔ細胞を刺激するために使用され得る。
【０１０４】
ここで本発明がさらに実施例によって記載されるが、これは本発明の実施において当業者を支援することに役立つことを意図しており、本発明の範囲を制限することを何ら意図しない。
【実施例】
【０１０５】
実施例１  バインダーとしてのヒト化抗体ｈｕＫ６６６の使用
ＣＡＲを、Ｎａｋａｍｕｒａら（２００１−上記と同様）によって記載されたようなマウス抗体ＫＭ６６６またはそのヒト化型のｈｕＫ６６６のいずれか（図２上部においてバリアント（ａ）および（ｂ））由来の配列を使用し、ｓｃＦｖを用いて構築した。これらの受容体を発現／安定性について比較し、両方の受容体について同等であることを見出した。次に、これらの受容体を用いて形質導入したＴ細胞の、ＧＤ２を発現しないまたはＧＤ２を発現するいずれかの標的細胞によって負荷したときの殺傷、サイトカイン放出および増殖を試験した。両方の受容体の殺傷は同様であったが、ヒト化ｓｃＦｖに基づく受容体は、優れたＩＬ２産生および増殖をもたらすことが結論付けられた（図３）。
【０１０６】
実施例２  発現および機能における異なるスペーサー構成効果の効果を試験
Ｆｃスペーサー、ヒンジ、ヒンジ−ＣＤ８ストークおよびＣｄ８ストークを有する抗ＧＤ２  ＣＡＲを生成した（それぞれ図２（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ））。これらのＣＡＲを、正確な比較を可能にするために、２Ａ口蹄疫自己切断ペプチドを用いて、絶対的な１：１様式でマーカー遺伝子、短縮型ＣＤ３４とともに共発現させた（図４ａ）。さらに、ＣＡＲに対する導入遺伝子発現の比較を可能にするために、ｈｕＫ６６６  ｓｃＦｖに、アミノ末端ＨＡタグを用いてタグ付与した。
【０１０７】
これらのコンストラクトを用いて形質導入した正常ドナーＴ細胞のフローサイトメトリー解析は、以下の順序：Ｆｃ＞ヒンジ−ストーク＝ストーク＞ヒンジでより明瞭なＣＡＲ発現を実証した（図４ｂ）。
【０１０８】
ＧＤ２陰性標的と比較したＧＤ２陽性標的の殺傷を、クロム放出アッセイを使用して比較した。これは、殺傷の有効性が、以下の順序：Ｆｃ＞ヒンジ−ストーク＝ストーク＞ヒンジにあることを示した（図４ｃ）。
【０１０９】
ＣＡＲ  Ｔ細胞をＧＤ２陽性標的または陰性標的のいずれかを負荷したときのインターフェロンガンマ放出およびＩＬ−２放出を比較した。インターフェロンガンマ放出は、Ｆｃ、ヒンジ−ストークおよびストークを有するＣＡＲにおいて同様であったが、ヒンジバリアントにおいて少量であった。ＩＬ２放出は、以下の順序：Ｆｃ、ストーク、ヒンジ−ストーク、ヒンジで検出された（図４ｄおよびｅ）。
【０１１０】
最後に、ＣＡＲ  Ｔ細胞をＧＤ２陽性標的または陰性標的のいずれかを負荷したときのＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を比較した。増殖は、以下の順序：ストーク、ヒンジ−ストーク、Ｆｃ、ヒンジで検出された（図４ｄおよびｅ）。
【０１１１】
実施例３  ＦｃＲ変異は、非特異的活性を廃する
上記の実施例からの全般的なデータは、Ｆｃスペーサーが全般的に最も良好に機能することを示唆した。しかしながら、Ｆｃドメインは、インビボで、Ｆｃ受容体を発現する細胞からの非特異的な活性化を導き得る。この効果を廃するために、図５（ａ）に示されるように、変異をＦｃ領域に導入した。これらの変異は、図５（ｂ）に示されるように、ＣＡＲ発現において有害な影響を有しなかった。
【０１１２】
加えて、これらの変異は、ＣＡＲの殺傷機能における影響を有しないことが示された（図５（ｃ））。最後に、これらの変異は、ＦｃＲ発現標的（ＴＨＰ１とよばれる単球様株）の非特異的な殺傷およびこれらの単球によるＩＬ−１ベータ放出の面において、所望の効果を有することが示された（図５ｅ）。
【０１１３】
実施例４  発現カセットの最適化
受容体の発現を最適化する観点で、以下：（ａ）カセット内への足場付着領域（ＳＡＲ）の包含、（ｂ）３’ＬＴＲ内へのニワトリベータヘモグロビンクロマチンインスレーター（ＣＨＳ４）の包含、および（ｃ）オープンリーディングフレームのコドン最適化を試験した（図６ａ）。ＳＡＲの包含は、コドン最適化したものと同様に発現の性質を改善したが、一方でＣＨＳ４は、ほとんど効果を有しないことが示された（図６ｂ）。ＳＡＲとコドン最適化との組み合わせは、発現を追加的に改善した（図６ｃ）。
【０１１４】
実施例５  異なるエンドドメインの比較
３種の異なるエンドドメインを有するコンストラクトを生成した：Ｆｃスペーサー構成におけるＣＡＲでの、ＣＤ３ゼータエンドドメインを伴うＣＤ２８膜貫通ドメイン（ＣＤ２８ｔｍＺ）、ＣＤ２８エンドドメインおよびＣＤ３ゼータエンドドメインを伴うＣＤ２８膜貫通ドメイン（ＣＤ２８Ｚ）、ならびにＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８エンドドメイン、ＯＸ３０エンドドメインおよびＣＤ３ゼータエンドドメイン（ＣＤ２８ＯＸＺ）。増殖、ＩＦＮγ放出およびＩＬ−２放出は、ＣＤ２８ｔｍＺ＜ＣＤ２８Ｚ＜ＣＤ２８ＯＸＺの順序で増大することを特筆する（図７）。
【０１１５】
実施例６  ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子との共発現
ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子を、抗ＧＤ２  ＣＡＲとともに共発現させた（図８ａ−ＣＡＲは、機能を実証するために任意に選択されたＦｃスペーサー、ＣＤ２８ＯＸＺの構成であった）。ＣＡＲは、ｉＣａｓｐ９との共発現にも拘らず、良好に発現させることができた（図８ｂ）。小分子二量体化剤を用いたｉＣａｓｐ９の活性化は、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の消去を導いた（図８ｂ）。この二量体化剤に曝露したｉＣａｓｐ９−ＧＤ２ＣＡＲ  Ｔ細胞は、二量体化剤に曝露したときに、これらのＧＤ２特異性を失った（図８ｃ）。
【０１１６】
実施例７  ＲＱＲ８自殺遺伝子との共発現
抗ＧＤ２  ＣＡＲを、ＲＱＲ８自殺分類遺伝子とともに共発現させた（図９ａ−ＣＡＲは、機能を実証するために任意に選択されたＦｃスペーサー、ＣＤ２８Ｚの構成であった）。受容体とＣＡＲとを共発現させることが可能であった（図９ｂ）。リツキシマブおよび補体を用いたＲＱＲ８の自殺遺伝子機能の活性化は、形質導入されたＴ細胞の消去およびＧＤ２認識の消失をもたらした（図９ｃおよびｄ）。
【０１１７】
実施例８  ＧＤ２シンターゼおよびＧＭ３シンターゼの発現は、任意の細胞株におけるＧＤ２発現をもたらす
培養においてＧＤ２ＣＡＲ  Ｔ細胞を刺激し、理想的なＧＤ２−またはＧＤ２＋標的を得て、小動物モデルのためのシンジェニックな細胞を生成することを可能にするために、細胞株においてトランスジェニックにＧＤ２を発現させることのできることが望ましい。ＧＤ２は、１つのタンパク質ではなく、酵素の複雑な組によって合成されることを必要とする。ここで、ちょうど２種の酵素：ＧＭ３シンターゼおよびＧＤ２シンターゼのトランスジェニック発現発現は、これまでに形質導入した全ての細胞株において、明瞭なＧＤ２発現をもたらすことが示されている（図１０）。
【０１１８】
実施例９  抗ＧＤ２  ＣＡＲのインビボ機能
ＣＴ２６細胞株を、上記に記載されるように、ＧＤ２を発現するように改変した（短縮のために、ＣＴ２６クローン＃７またはＣＴ２５＃７で示される）。２×１０５の野生型（ｗｔ）またはＧＤ２陽性のいずれかのＣＤ２６細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＣＴ２６とシンジェニック）のわき腹に接種した。腫瘍負荷の１０日後、模造物を形質導入したシンジェニック脾細胞および抗ＧＤ２  ＣＡＲを形質導入したシンジェニック脾細胞を調製した。マウスを以下の４種のコホート：抗ＧＤ２  ＣＡＲ脾細胞を受容した、ＧＤ２を発現するＣＴ２６腫瘍を有するマウス、模造品を形質導入した脾細胞を受容した、ＧＤ２を発現するＣＴ２６腫瘍を有するマウス、抗ＧＤ２  ＣＡＲ脾細胞を有する、ＧＤ２陰性（ｗｔ）ＣＴ２６腫瘍を有するマウス、および脾細胞を受容していない、ＧＤ２を発現するＣＴ２６腫瘍を有するマウス、に分けた。腫瘍を、デジタルノギスを使用して三次元で測定し、それを用いて体積を推定した。図１１は、腫瘍の成長曲線を示す。抗ＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を受容したマウスにおけるＧＤ２陽性の腫瘍のみが、ほとんどまたは全く成長しなかった。
【０１１９】
実施例１０  ｈｕＫ６６６および１４ｇ２ａに基づく抗原結合ドメインを含むＣＡＲの機能を比較
ＣＡＲの抗原結合ドメインは、その機能に影響し得る。本研究において、ＣＡＲとともにｈｕＫ６６６に基づく抗原結合ドメインを有する本発明のＣＡＲの機能を、１４ｇ２ａに基づく抗原結合ドメインを有する同等のＣＡＲと比較した。
【０１２０】
抗体１４ｇ２ａは、治療用ｍＡｂとして使用され、ＣＡＲ研究において試験された唯一のｓｃＦｖであるため、ＧＤ２に対する価値の基準の抗体として理解され得る。
【０１２１】
第二世代のＣＡＲは、ｈｕＫ６６６または１４ｇ２ａに基づいて構築し、発現させた。これらの構造は、図１４ａに示される。
【０１２２】
レトロウイルスを、ＧＤ２  ＣＡＲ、ｇａｇ／ｐｏｌおよびエンベロープタンパク質ＲＤ１１４をコードするプラスミドを用いた２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって産生した。３日後、上清を採取し、レトロネクチンコートされたプレート上で等しい力価のレトロウイルスを用いてＰＨＡ／ＩＬ−２活性化ＰＢＭＣに形質導入するために使用した。ＣＡＲは、これらの抗原結合ドメインにおいてのみ異なった。両方の場合において、結合ドメインは、ＩｇＧ  Ｆｃセグメントを用いて膜に結合され、ＣＤ２８およびＣＤ３ゼータ由来の細胞内活性化モチーフを含有した。形質導入６日後に、ＣＡＲ発現をフローサイトメトリーによって確認し、ＰＢＭＣをＧＤ２陽性Ｌａｎ１細胞（ＧＤ２陽性細胞株）またはＧＤ２陰性Ａ２０４細胞（ＧＤ２陰性横紋筋肉腫細胞株）とともに１：１の比率で培養した。１日後、これらの共培養物由来の上清を、ＥＬＩＳＡによってインターフェロンγレベルについてアッセイし、６日後に、Ｔ細胞増殖をフローサイトメトリーによって評価した。
【０１２３】
この結果は、図１４および１５に示される。２４時間時点において、インターフェロンガンマを上清から測定した。ｈｕＫ６６６  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、より多くのＩＦＮ−γを産生することが示された（図１４ｂ）。１週間後、Ｔ細胞を計数し、そしてｈｕＫ６６６  ＣＡＲは、より高い増殖を有することが示された（図１４ｃ）。
【０１２４】
神経芽腫細胞株ＬＡＮ１との共培養の１週間後、細胞を採取し、フローサイトメトリーによって解析した。ＣＤ４５発現は、ＣＤ４５−細胞がＬＡＮ−１細胞であると、リンパ系細胞および非リンパ系細胞からの区別を可能にした。ＣＤ３／ＱＢＥＮＤ／１０を用いた更なる染色は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の計数を可能にした。ｈｕＫ６６６  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、１４ｇ２ａ等価物よりも良好に増殖し、かつより完全に殺傷することが見出された（図１５）。
【０１２５】
上記の明細書の中で言及されている全ての刊行物は、本明細書中に参照により援用される。記載された方法の種々の改変および変化、ならびに本発明のシステムは、本発明の範囲および主旨から逸脱することなく、当事者に明白であろう。本発明は具体的な好ましい実施形態に関連して記載したが、特許請求の範囲に記載の発明は、そのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際に、記載された手法についての発明を遂行するための、分子生物学または関連する分野の当事者にとって明らかな、本発明を実施するための記載された態様の種々の改変は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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