(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
撮像システムであって、
試料ホルダを有する撮像デバイスと、
前記試料ホルダに試料を置くように構成された搬送デバイスと、
前記撮像デバイス及び前記搬送デバイスと通信するプロセッサと、
該プロセッサに動作可能に接続されたメモリと
を備えており、
該メモリに、試料の画像を得るための命令が記憶されており、該命令は、前記プロセッサによって実行されると、前記プロセッサに、
前記搬送デバイスによって前記撮像デバイスの試料ホルダに試料を移動させ、
前記撮像デバイスを使用して前記試料上の参照マークを識別させ、
前記参照マークが参照画像における位置と略同一の位置にあるように前記試料ホルダを移動させ、
前記撮像デバイスを使用して前記試料の画像を取得させ、
前記試料ホルダは切抜き部分、内部斜縁部分及び内部底リップ部分を画定する少なくとも２つの壁を有しており、前記内部斜縁部分は、前記内部底リップ部分から前記試料ホルダの外側に延びていることを特徴とするシステム。
【請求項２】
前記試料はプレートを含むことを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記プレートはマルチウェルプレートであることを特徴とする請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記マルチウェルプレートは96以上のウェルを有することを特徴とする請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記プレートはプラスチックを含むことを特徴とする請求項２乃至４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６】
前記プレートは黒いことを特徴とする請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
バルク試料保管サブシステムを更に備えていることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項８】
前記搬送デバイスは、前記バルク試料保管サブシステムから前記撮像デバイスの試料ホルダに試料を移動させるように構成されていることを特徴とする請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記命令は、前記プロセッサによって実行されると、前記プロセッサにより前記搬送デバイスが前記バルク試料保管サブシステムから前記撮像デバイスの試料ホルダに試料を移動させることを特徴とする請求項７又は８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記搬送デバイスは、前記撮像デバイスの試料ホルダから前記バルク試料保管サブシステムに試料を移動させるように構成されていることを特徴とする請求項７乃至９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１１】
前記命令は、前記プロセッサによって実行されると、前記プロセッサにより前記搬送デバイスが前記撮像デバイスの試料ホルダから前記バルク試料保管サブシステムに試料を移動させることを特徴とする請求項７乃至１０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１２】
前記バルク試料保管サブシステムは５以上の試料を保管するように構成されていることを特徴とする請求項７乃至１１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１３】
前記バルク試料保管サブシステムは20以上の試料を保管するように構成されていることを特徴とする請求項７乃至１２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１４】
前記バルク試料保管サブシステムは、前記バルク試料保管サブシステムを所定の温度で維持するように構成された加熱要素を有していることを特徴とする請求項７乃至１３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１５】
前記バルク試料保管サブシステムは、前記バルク試料保管サブシステムを所定の温度で維持するように構成された冷却要素を有していることを特徴とする請求項７乃至１４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１６】
前記バルク試料保管サブシステムは、前記バルク試料保管サブシステムから前記搬送デバイスに試料を移すように構成されたロボットアームを有していることを特徴とする請求項７乃至１５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１７】
前記バルク試料保管サブシステムは、前記搬送デバイスから前記バルク試料保管サブシステムに試料を移すように構成されたロボットアームを有していることを特徴とする請求項７乃至１６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１８】
前記搬送デバイスはロボットアームであることを特徴とする請求項１乃至１７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１９】
前記ロボットアームは試料と係合するように構成された複数のグリッパを有していることを特徴とする請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記グリッパは試料に側圧をかけることを特徴とする請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記グリッパは、異なるサイズの試料と係合するための調整可能な要素を有していることを特徴とする請求項１９又は２０に記載のシステム。
【請求項２２】
前記調整可能な要素は手動で調整可能であることを特徴とする請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
試料識別サブシステムを更に備えていることを特徴とする請求項１乃至２２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２４】
前記試料識別サブシステムは、プレート上のバーコードを読み取るように構成されたバーコードリーダを有していることを特徴とする請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記試料識別サブシステムは、試料を識別するように構成されたプロセッサと電子通信することを特徴とする請求項２３又は２４に記載のシステム。
【請求項２６】
前記プロセッサは、画像取得工程を試料に適応させるように構成されていることを特徴とする請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
試料の画像を取得する際に、多波長画像をその波長成分に逆畳み込みすることを特徴とする請求項１乃至２６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２８】
前記撮像デバイスは倒立顕微鏡本体を有していることを特徴とする請求項１乃至２７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２９】
試料を下から撮像することを特徴とする請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
前記参照マークは試料の底部にあることを特徴とする請求項１乃至２９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３１】
前記試料ホルダは前記撮像デバイスの顕微鏡ステージに取り付けられていることを特徴とする請求項１乃至３０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３２】
前記試料ホルダは前記撮像デバイスに対して着脱可能であることを特徴とする請求項１乃至３１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３３】
前記内部斜縁部分は、前記試料ホルダの内部底リップ部分の面に対する角度を有し、該角度は85度から25度の範囲内であることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項３４】
前記角度は、70度から40度の範囲内であることを特徴とする請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
前記試料ホルダは、127.5 mm×85mmのフットプリントを有する試料を受けるようなサイズ及び形状を有することを特徴とする請求項１乃至３４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３６】
前記試料ホルダは、少なくとも１つの角部を有する試料受取領域と、試料を前記少なくとも１つの角部に片寄らせるように構成されたアクチュエータとを有していることを特徴とする請求項１乃至３５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３７】
前記撮像デバイスは30ミリ秒以下の露出のカメラを有していることを特徴とする請求項１乃至１７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３８】
前記撮像デバイスは、センサ領域が170mm2〜250mm2であるカメラを有していることを特徴とする請求項１乃至３７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３９】
前記プロセッサに動作可能に接続されたメモリに、命令が記憶されており、該命令は、前記プロセッサによって実行されると、前記プロセッサに、
前記撮像デバイスを使用して試料の画像を取得させ、
前記画像中の参照マークを識別させ、
該参照マークの画像を参照画像と比較させ、
前記参照マークが前記参照画像における位置と略同一の位置にあるように前記試料を移動させることを特徴とする請求項１乃至３８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４０】
前記参照マークの画像を前記参照画像と比較する際に、スケール不変特徴変換アルゴリズムを使用することを特徴とする請求項３９に記載のシステム。
【請求項４１】
前記撮像デバイスは自動焦点調節要素を有していることを特徴とする請求項１乃至４０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４２】
前記プロセッサに動作可能に接続されたメモリに、命令が記憶されており、該命令は、前記プロセッサによって実行されると、前記プロセッサに、
特定の試料に関する複数の画像を編成する、
特定の試料に関する２以上の画像をつなぎ合わせる、
特定の試料の２以上の画像を配列する、
試料の画像内の対象を識別する、
時系列の画像によって対象を追跡する、及び
画像内で識別された対象からデータを抽出する
から選ばれた少なくとも１つの動作を行わせることを特徴とする請求項１乃至４１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４３】
前記撮像デバイスと通信する第２のプロセッサと、
該第２のプロセッサに動作可能に接続されたメモリと
を更に備えており、
該メモリに、試料の画像を処理するための命令が記憶されており、該命令は、前記第２のプロセッサによって実行されると、前記第２のプロセッサに、
特定の試料に関する複数の画像を編成する、
特定の試料に関する２以上の画像をつなぎ合わせる、
特定の試料の２以上の画像を配列する、
試料の画像内の対象を識別する、
時系列の画像によって対象を追跡する、及び
画像内で識別された対象からデータを抽出する
から選ばれた少なくとも１つの動作を行わせることを特徴とする請求項１乃至４２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４４】
前記試料は生体物質を含むことを特徴とする請求項１乃至４３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４５】
前記試料は一又は複数の細胞を含むことを特徴とする請求項１乃至４４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４６】
前記一又は複数の細胞はニューロンであることを特徴とする請求項４５に記載のシステム。
【請求項４７】
コンピュータによって実行される、試料の画像を得る方法であって、
プロセッサによって制御される搬送デバイスを使用して、撮像デバイスの試料ホルダに試料を移動させ、
前記プロセッサを用いて前記試料上の参照マークを識別して、
前記プロセッサを用いて、前記参照マークが参照画像における位置と略同一の位置にあるように前記試料ホルダを配列して、
前記プロセッサによって制御される撮像デバイスを使用して、試料の画像を得て、
前記試料ホルダは切抜き部分、内部斜縁部分及び内部底リップ部分を画定する少なくとも２つの壁を有しており、前記内部斜縁部分は、前記内部底リップ部分から前記試料ホルダの外側に延びていることを特徴とする方法。
【請求項４８】
前記プロセッサによって制御される搬送デバイスを使用して、前記撮像デバイスから第１の表面に試料を移動させることを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記プロセッサを用いて、前記試料の少なくとも１つの画像を処理することを特徴とする請求項４７又は４８に記載の方法。
【請求項５０】
処理する際に、
試料の複数の画像を編成する、
試料の２以上の画像をつなぎ合わせる、
試料の２以上の画像を配列する、
試料の画像内の対象を識別する、
試料の時系列の画像によって対象を追跡する、
画像内で識別された対象からデータを抽出する、及び
画像を分析する
から選ばれた少なくとも１つの動作を行うことを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
試料の２以上の画像をつなぎ合わせる際に、フレキシブルステッチを使用することを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
試料の２以上の画像を配列する際に、基準とテストデータセットとの不偏分散強度差を最小化することを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
試料の画像内の対象を識別する際に、一又は複数の細胞を識別することを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
試料の画像内の対象を識別する際に、
プロセッサを用いて、画像コントラストを強調する、
前記プロセッサを用いて、画像ビット深度を減少させる、
前記プロセッサを用いて、画像を平滑化する、
前記プロセッサを用いて、画像内のピークを検出する、
前記プロセッサを用いて、画像のエロージョンを行う、
前記プロセッサを用いて、画像のダイレーションを行う、
前記プロセッサを用いて、モルフォロジフィルタを適用して画像内の対象を識別することを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記モルフォロジフィルタは円形フィルタ及びサイズフィルタを含むことを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
顕微鏡検査における最近の進歩により、生体試料及び系統を含む試料及び系統の分析が高い効率でもたらされている。例えば、自動焦点調節及び顕微鏡ステージの位置決めのための倒立顕微鏡の構成及びコンピュータ制御が、生体試料の繰り返される撮像を容易にするために開発されている。米国特許第4000417 号明細書には、以前用いたスライド上の以前見た細胞を見直すことを可能にするコンピュータ自動システムが記載されている。更に、米国特許第7139415 号明細書には、生体物質、特に生細胞のハイスループット解析、及び経時的な同一の視野（例えば同一の細胞）への正確な戻し及び同一の視野（例えば同一の細胞）の再撮像を可能にするロボット顕微鏡システム及び方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００２】
【特許文献１】米国特許出願公開第2003／0103662 号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示は、生細胞及び／又は生組織のような生体試料を含む試料のハイスループット解析及びハイコンテントアナリシスを容易にする自動ロボット顕微鏡検査システムを提供する。ある態様では、本システムは、既存の技術に対するユーザの介入を減らして、以前撮像された同一の視野（例えば同一の細胞）への正確な戻し及び同一の視野（例えば同一の細胞）の再撮像を可能にすべく構成されている。このような能力により、既存の技術より高い精度及び処理量で因果関係を経時的に処理する仮説の実験及び試験が可能になる。
【０００４】
例えば、本システムの実施形態は、米国特許第4920053 号明細書、米国特許第5991028 号明細書、米国特許第4705949 号明細書、米国特許第5594235 号明細書、米国特許第6005964 号明細書、米国特許第5861985 号明細書、米国特許第6049421 号明細書、米国特許第6246785 号明細書、米国特許第4958920 号明細書及び米国特許第7139415 号明細書に記載されているシステム、又は、Anal Biochem，2001年６月15日；293(2):258-63、Ultramicroscopy，2001年４月；87(3):155-64、Folia Histochem Cytobiol，2001年；39(2):75-85、Trends Cell Biol，2001年８月；11(8): 329-34、J Microbiol Methods，2000年10月；42(2):129-38、J Immunol Methods，1999年11月19日；230(l-2): l l-8、Environmental Health Perspective，1999年11月；107(11)、及びNature，2001年５月；411 : 107-110の刊行物に記載されているシステムでは不可能な一定の処理量及び分析能力を提供する。これらの開示内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００５】
ある態様では、本開示のシステムは、試料ホルダを有する撮像デバイスと、前記試料ホルダに試料を置くように構成された搬送デバイスと、前記撮像デバイス及び前記搬送デバイスと通信するプロセッサと、該プロセッサに動作可能に接続されたメモリとを備えており、該メモリに、試料の画像を得るための命令が記憶されており、該命令は、前記プロセッサによって実行されると、前記プロセッサに、前記搬送デバイスによって前記撮像デバイスの試料ホルダに試料を移動させ、前記撮像デバイスを使用して前記試料上の参照マークを識別させ、前記参照マークが参照画像における位置と略同一の位置にあるように前記試料ホルダを移動させ、前記撮像デバイスを使用して前記試料の画像を取得させる。
【０００６】
他の態様では、本開示のシステムは、撮像デバイスと、第１の表面から試料を自動的に取って、前記試料を前記撮像デバイス上に置くように構成されたロボットアームとを備えており、試料上の参照マークを自動的に識別して、前記参照マークが参照画像における位置と略同一の位置にあるように試料を移動させ、試料の画像を得るように構成されている。ロボットアームは、複数の撮像デバイスと相互に作用するように構成されてもよい（例えば、システムが、２つの撮像デバイス及び１つのロボットアームを備えている）。
【０００７】
本開示のシステムは様々なタイプの試料と共に使用されてもよい。ある態様では、試料が、生細胞（例えばニューロン）及び／又は生組織のような生体物質を含む。生体物質は、インビトロ源（例えば培養物中で成長した実験細胞からの細胞の懸濁液）又はインビボ源（例えば哺乳類の被験体、ヒト被験者など）から得られてもよい。注目する試料は、化学源又は合成源からの試料のような非生体試料を更に含む。あらゆる便利な数、組成物、色などのマルチウェルプレートを含むプレートのような、試料を含む様々な異なる手段上に試料が存在してもよい。
【０００８】
本開示のシステムはバルク試料保管サブシステムを備えてもよい。このようなシステムでは、搬送デバイスがバルク試料保管サブシステムから撮像デバイス、例えば撮像デバイスの試料ホルダなどに試料を移すように構成されてもよい。このような移動は、搬送デバイスが搬送デバイスを制御するようにプログラムされたプロセッサによって制御されるように自動化されてもよい。バルク試料保管サブシステム自体は、20以上、40以上又は80以上を含む５以上のような一又は複数の試料を保管してもよい。試料はバルク試料保管サブシステム内で所望の条件（例えば所望の温度、湿度など）で維持されてもよい。ある態様では、このような所望の状態はユーザ定義であってもよく、及び／又は閉ループ制御であってもよい。本開示のシステムの実施形態の態様は、試料が均質な状態又は異質な状態下で保管されるシステムを含んでおり、例えば、試料の第１の部分が第１の所望の条件下で保管され、試料の第２の部分が第２の所望の条件下で保管される。試料が異質な状態下で保管されるこのような実施形態では、第１の条件、第２の条件などは、温度、湿度などの一又は複数の特性によって互いに異なってもよい。
【０００９】
本開示のシステムで使用される搬送デバイスは大きく異なってもよい。ある態様では、搬送デバイスがロボットアームである。注目するロボットアームは、試料の取得又は搬送を容易にするグリッパのような一又は複数の試料係合要素を有してもよい。ある実施形態では、グリッパは試料に側圧をかけ、異なるサイズの試料と係合するように調整可能であってもよい。本態様は、２〜４、４〜６、６〜10又は10〜15のような２以上を含む複数の搬送デバイスを備えたシステムを含む。このような実施形態では、搬送デバイスは同一であっても（例えば、全ての搬送デバイスが同一のモデルのロボットアームである）、異なってもよい（例えば異なるタイプの搬送デバイス、異なるモデルのロボットアームのような同様の搬送デバイスなど）。
【００１０】
ある態様では、本開示のシステムは、試料識別サブシステムのような特定の試料を識別するための一又は複数の要素を備えてもよい。バーコード、ＱＲコード（登録商標）などのような、試料を識別するためのあらゆる便利な手段が採用されてもよい。識別された試料の処理、撮像又は画像処理は夫々、特定の試料に適合されてもよい。例えば、試料がマルチウェルプレート上に存在する場合、マルチウェルプレートの各ウェルの取扱い、撮像及び／又は画像処理はその特定のウェルに適合されてもよい。
【００１１】
倒立顕微鏡本体を有している撮像デバイスのような様々な撮像デバイスが、本開示のシステムに採用されてもよい。注目する撮像デバイスは、試料の画像を得る際に多波長画像をその波長成分に逆畳み込みする及び／又は三次元画素強度を得る撮像デバイスを含むが、これに制限されない。本明細書に記載されているような、カメラ（例えばEMCCD カメラ）、光源（例えば光ガイドを有するキセノン光源）、フィルタ、自動焦点調節要素のような多くの要素が撮像デバイスに含まれてもよい。注目するシステムは、２個の撮像デバイス、３〜５個の撮像デバイスなどを備えたシステムのような２以上の異種撮像デバイス及び／又は同種撮像デバイスを備えたシステムを含むが、これに制限されない。このような実施形態では、撮像デバイスは、対物レンズの倍率、画像の取得速度、一又は複数のフィルタのタイプ（例えば異なるフィルタホイール）、一又は複数のカメラのタイプ、一又は複数の照明源のような、少なくともある意味では少なくとも１つの他の撮像デバイスと同一又は異なるものであってもよい。
【００１２】
撮像デバイスは本開示の試料保持デバイスを備えるように構成されてもよい。本開示の試料保持デバイスの実施形態では、切抜き部分、内部斜縁部分及び内部底リップ部分を夫々画定し、対向して配置された略等しい長さの２つの第１の壁と、内部斜縁部分及び内部底リップ部分を夫々画定し、対向して配置された略等しい長さの２つの第２の壁とを備えており、前記２つの第２の壁各々の長さは、前記２つの第１の壁各々の長さより短く、前記２つの第１の壁及び前記２つの第２の壁は共に試料受取領域を画定している。ある態様では、前記デバイスは、127.5mm×85mmのフットプリントを有するマルチウェルプレートのような標準的なサイズの試料を受けるようなサイズを有する。試料保持デバイスは、試料保持デバイスに置かれた試料を固定するように構成されたアクチュエータ（例えば、受動式又は能動式のアクチュエータ）を有してもよい。
【００１３】
システムは多くの更なるタスクを行なうためのハードウェア及び／又はソフトウェアを備えてもよい。例えばある態様では、システムは、撮像デバイスを使用して試料の画像を取得させ、画像中の参照マークを識別させ、該参照マークの画像を参照画像と比較させ、前記参照マークが前記参照画像における位置と略同一の位置にあるように前記試料を移動させるようにプログラムされたプロセッサを備えている。更にある態様では、システムは、試料の複数の画像を編成する、（例えばリジッドステッチ又はフレキシブルステッチを用いて）試料の２以上の画像をつなぎ合わせる、試料の２以上の画像を配列する、試料の画像内の対象を識別する、試料の時系列の画像によって対象を追跡する、及び／又は画像内で識別された対象からデータを抽出するなどして、試料の一又は複数の画像を処理するようにプログラムされたプロセッサを備えている。
【００１４】
本開示によって、試料の画像を得る方法、及びこのような画像を編成及び／又は処理する方法を更に提供する。例えば、ある実施形態では、試料の画像を得る方法において、プロセッサによって制御される搬送デバイスを使用して撮像デバイスの試料ホルダに試料を移動させ、前記プロセッサを用いて前記試料上の参照マークを識別して、前記プロセッサを用いて、前記参照マークが参照画像における位置と略同一の位置にあるように前記試料ホルダを配列して、前記プロセッサによって制御される撮像デバイスを使用して、試料の画像を得る。更に、試料の複数の画像を編成する、（例えばリジッドステッチ及び／又はフレキシブルステッチを用いて）試料の２以上の画像をつなぎ合わせる、試料の２以上の画像を配列する、試料の画像内の対象を識別する、試料の時系列の画像によって対象を追跡する、及び／又は画像内で識別された対象からデータを抽出するなどして、一又は複数の画像を処理する方法を提供する。
【００１５】
これら及び他の特徴は、本開示を参照すると当業者にとって明らかになる。
【００１６】
定義
特に定義されていない場合、本明細書で使用されている全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。更にある要素は、明瞭さ及び参照の容易さのために以下に定義される。
【００１７】
ある態様では、本発明のシステム及び方法は、基体上に設けられた一又は複数の細胞の撮像を含んでいる。本文脈では、「基体」は、撮像のための一又は複数の試料が設けられる（例えば細胞が成長する）材料を表すことを意図されている。基体は、アレイ形で設けられ得る複数のウェル（つまり少なくとも２つのウェル）を有してもよい。「試料」という用語は、細胞及び／若しくは組織のような生体物質、並びに／又は非生体物質（例えば、合成物質、化学物質若しくは他の物質）を基体上に含むあらゆるタイプの基体（例えばマルチウェルプレート）を言及すべく本明細書で使用されてもよい。注目する非生体試料はカーボンナノチューブを含むが、これに限定されない。
【００１８】
「マルチウェルプレート」は、複数の別個の領域が設けられているためウェルがアレイ形で設けられている、ウェルを含む基体の非制限例である。別個の領域を設ける別の方法が、例えば上記のNature vol. 411 :107-110に示されており、この方法では、細胞の単層がDNA スポットの上に成長することにより、別個の画像／解析領域が設けられる。更なる例が、DNA アレイ又はタンパク質アレイにある。基体は、プラスチック（例えばポリスチレン、黒いポリスチレンなど）、ガラスなどのようなあらゆる適切な材料を含むことが可能である。プラスチックは、インビトロでの細胞の維持及び／又は成長に従来使用されており、基体の材料の例として限定することなく本明細書で言及される。
【００１９】
「ウェル」は、（例えば、基体によって画定された）基体の有界領域を一般に意味し、有界領域は、（例えば単離された試料を提供すべく）別個であってもよく、又は（例えばウェル内の一又は複数の試料間の流体連通を提供すべく）一又は複数の他の有界領域と連通してもよい。例えば、基体上で成長した細胞は、ウェル内に通常含まれており、ウェルは、生細胞のための培地を更に含むことができる。
【００２０】
上述したように、「マルチウェルプレート」は、ウェルをアレイ形で含む基体の例である。本開示の方法、システム及び／又はデバイスに関して有用なマルチウェルプレートは、様々な標準型（例えば２、４、６、24又は96個のウェルを有するプレート）の内のいずれかであってもよいが、非標準型（例えば３、５、７などのウェル）であってもよい。
【００２１】
「別個の領域」は、注目するスポット又はグループを意味し、スポット又はグループは、（ウェルのように）境界を有してもよく、又は他の隣り合うユニットと離れた画定可能な境界を単に有してもよい。アレイ形で又は別の方法で存在してもしなくても、このような別個の領域は予め設定されたパターンで設けられていることが有利である。多くの場合、必須ではないが、パターンは規則的であり、繰り返される。
【００２２】
本発明は、添付図面と共に読むと、以下の詳細な記載から最も良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本開示のある実施形態の能力を示すフローチャートである。
【図２】本開示のあるシステムの構成要素を示す概略図である。
【図３】本開示のシステムに使用されてもよい撮像デバイス（例えば光学式スキャナ又は顕微鏡）を概略的に示す図である。
【図４】本開示の自動顕微鏡と共に細胞の成長、保管及び観察に使用されてもよいマルチウェルプレートの下側を示す斜視図である。マルチウェルプレート自体は一般に使用中、表を上に向けて置かれるが、示されている側は、検査のための倒立顕微鏡の光学素子に対向する側である。
【図５】本開示のシステムでロボットアームと共に使用されてもよいグリッパアームのプレート接触部分を示す斜視図である。
【図６】本開示のシステムで使用されてもよいロボットアームに取り付けられた、図５に示されているタイプの第１及び第２のグリッパアームを示す平面図である。
【図７】本開示のシステムで使用されてもよいプレートホルダを示す平面図である。
【図８】図７のプレートホルダの底面図である。
【図９Ａ】図７のプレートホルダの４つの側部の内の１つを示す側面図である。
【図９Ｂ】図７のプレートホルダの４つの側部の内の１つを示す側面図である。
【図９Ｃ】図７のプレートホルダの４つの側部の内の１つを示す側面図である。
【図９Ｄ】図７のプレートホルダの４つの側部の内の１つを示す側面図である。
【図１０】図７のプレートホルダの上面斜視図である。
【図１１】本開示のシステムで使用されてもよい、アクチュエータのための取付ポイントを有するプレートホルダを示す平面図である。
【図１２】図１１のプレートホルダの底面図である。
【図１３】図１１のプレートホルダの上面斜視図である。
【図１４】本開示のシステムで使用されてもよい、アクチュエータを有するプレートホルダを示す平面図である。
【図１５】図１４のプレートホルダ及びアクチュエータの底面図である。
【図１６Ａ】図１４のプレートホルダ及びアクチュエータの側面図である。
【図１６Ｂ】図１４のプレートホルダ及びアクチュエータの側面図である。
【図１７】図１４のプレートホルダ及びアクチュエータの上面斜視図である。
【図１８】本開示のシステムを制御するための処理を示す構成図である。
【図１９】本開示のある実施形態に係る画像取得処理を示すフローチャートである。
【図２０Ａ】本開示のある実施形態の画像構成を示す図である。画像に、取得日、実験名、時点、時間、蛍光チャネル、ウェル、モンタージュ指標及びファイルの種類に関する情報を含むファイル名が与えられてもよい。
【図２０Ｂ】本開示のある実施形態の画像構成を示す図であって、画像ファイルの構成概要を示す図である。
【図２１Ａ】本開示のある実施形態に関するモンタージュ画像の構造を示す図である。マルチウェルプレートの個々のウェルの９つの画像が撮像されている。画像毎に、破線で示されている領域が、直接隣り合う画像の破線で示されている画像の領域と略同一の画像の領域に相当する。
【図２１Ｂ】本開示のある実施形態に関するモンタージュ画像の構造を示す図であって、結果として生じるモンタージュ画像を示す図である。破線で示されているように、図２１Ａからの９つの画像が重ね合わされて１つの画像が生成される。
【図２１Ｃ】96マルチウェルプレートからの単一のウェルのモンタージュ画像を示す図である。９つの個別の画像が本開示のシステムを使用して取得され、本明細書により詳細に記載されているようにリジッドステッチアルゴリズムを使用して共につなぎ合わされた。一次皮質ニューロンが、図２３に関して以下に記載されているようにトランスフェクトされて撮像された。モンタージュ画像は、FITC（緑）チャネルを使用したT=0 における単一のウェルを示す。
【図２２Ａ】画像内で対象（例えば細胞）を標識化及び／又は追跡するための方法を示すフローチャートである。
【図２２Ｂ】画像内で対象（例えば細胞）を標識化及び／又は追跡するための方法を示すフローチャートである。
【図２３】２つのプラスミド（EGFP及び新しいマイトファジーリポータ構築体であるMitoEOS2）でトランスフェクトされた複数の一次皮質ニューロンの内の１つの画像を示す図である。FITC（緑）チャネル（上段）が、信号強度を決定するためのマスクとして使用され得るが、ニューロンの健康状態の読出しとして神経突起の解析のような追加の画像解析ルーチンにも使用され得るニューロンのモルフォロジを示す。MitoEOS2構築体の蛍光は、青色光で照射されると不可逆的に緑から赤に変わることができる。RFP 画像（下段）は、撮像の初めに青色光のパルスへの露出によって赤に変わる画像の上段に示されているニューロンと同一のニューロンを示す。同一のニューロンは、４時間毎に得られた最初の７つの画像と24時間毎に分けられた最後の４つの画像とで11回撮像された。上段及び下段は、T1、T2、T3、T4、T5及びT6で同一のニューロンの画像であり、T2はT1の20時間後であり、T3はT1の24時間後であり、T4はT1の48時間後であり、T5はT1の72時間後であり、T6はT1の96時間後である。この図は、96時間以上のような長期間に亘る因果関係を処理する仮説の実験及び試験を可能にする本開示のシステムの能力を実証している。
【図２４】オートファジー誘導が筋萎縮性側索硬化症の疾患モデル（TDP43 M337V ）によって引き起こされる神経突起の退化をどのように軽減するかを示すグラフである。一次ニューロンは対照としてのGFP 又はTDP43 M337V でトランスフェクトされた。オートファジーが神経突起のTDP43 M337V 媒介損失を軽減し得るか否かを判断するために、疾患モデルのニューロンはフルフェナジン（0.1 μΜ ）又は媒体で処理された。画像が24時間毎にロボット顕微鏡で収集され、神経突起が本明細書に記載されているような自動解析を使用して定量化された。
【図２５Ａ】２以上の分割パイプラインからの結果を組み合わせたときの分割の改善結果を示す図である。細胞を分割すべく様々な閾値の強度を使用した強度測定のパイプラインからの偽陽性率及び偽陰性率を示す。強度閾値を増加させることによる偽陽性率の減少によって、偽陰性率が略増加する。
【図２５Ｂ】２以上の分割パイプラインからの結果を組み合わせたときの分割の改善結果を示す図である。複数の空間バンドパスの内の１つを使用して空間分割（最小領域閾値）と組み合わせた一定の強度閾値を使用した偽陽性率及び偽陰性率を示す。強度及び空間分割を使用することにより、偽陰性率を増加することなく偽陽性率を減少させることによって、示されているように感度を犠牲にせずに特異性が高められる。
【図２６Ａ】神経突起の自動検出を示す図である。距離マップが生成され、距離マップでは、画素強度が対象領域（ROI ）の２ポイント間の距離に等しい。より暗い色がより短い距離を示す。
【図２６Ｂ】神経突起の自動検出を示す図である。距離マップが神経突起を示す。ニューロンが神経突起と距離マップの中心で重ね合わされている。矢印が、距離マップにおける神経突起と対応する変化とのマッピングを示す。距離マップでは、くぼみの長さが神経突起部分の長さに等しく、画素強度が神経突起部分の幅と等しい。
【図２６Ｃ】神経突起の自動検出を示す図である。図２６Ｂに示されている最初の距離マップはニューロンの外側の距離を含んでいる。図２６Ｃでは、距離はROI の内部の距離に制限される。
【図２６Ｄ】神経突起の自動検出を示す図である。距離マップ上の閾値強度は、０〜30の画素（０〜10μｍ）間で選択された神経突起の幅のための閾値である。
【図２６Ｅ】神経突起の自動検出を示す図である。分岐部分を距離マップを使用して関連付けることができ、一致するｘ座標又はｙ座標を有する部分の端部が分岐している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
上述したように、本開示は、生細胞及び／又は生組織のような生体試料を含む試料のハイスループット解析及びハイコンテントアナリシスを容易にする自動ロボット顕微鏡検査システムを提供する。ある態様では、本システムは、既存の技術に対するユーザの介入を減らして、以前撮像された同一の視野（例えば同一の細胞）への正確な戻し及び同一の視野（例えば同一の細胞）の再撮像を可能にすべく構成されている。この能力により、従来の顕微鏡検査方法より高い精度及び処理量で因果関係を経時的に処理する仮説の実験及び試験が可能になる。
【００２５】
本発明を更に詳細に説明する前に、本発明は、言うまでも無くそれ自体が変わり得るように、説明された特定の実施形態に限定されないことを理解すべきである。更に、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書に使用されている用語は、単に特定の実施形態を説明するために用いられており、限定することを意図していないことを更に理解すべきである。
【００２６】
本発明の態様が本明細書に記載されているように又は別の方法であらゆる別個の領域の撮像を包含するので、例えば、「ウェル」又は「マルチウェルプレート」は、明瞭さ及び便宜のためだけに明細書を通して言及されており、基体に関して限定することを意図していない。更に、本発明の多くの態様が別個であろうとなかろうとあらゆる領域の撮像又は走査に適用可能であることは、本明細書の文脈から明らかとすべきである。更に、本発明が主として生体試料及び生細胞と共に使用することに関して説明されているが、特定の対象の生体物質と共にあらゆるタイプの試料の撮像に使用されてもよい。例えば、本発明は、細胞、特に生細胞のような様々な生体物質の撮像及び分析に使用されることができ、本明細書は、明瞭さ及び便宜のためだけに全体を通して「細胞」に言及しており、限定することを意図していない。更に、本発明は、様々な異なるスペクトル域、例えば反射光の蛍光放射、発光放射、化学発光放射などにより生成される色のあらゆる範囲のあらゆる適切な光学像の取得及び分析に適用可能である。本明細書全体を通して、例えば位相差画像及び蛍光画像に言及しているが、本発明はそのように限定されない。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって確立される。
【００２７】
単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられている場合、文脈が別段に明示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「画像」への言及は複数のそのような画像を含み、「対物レンズ」への言及は、一又は複数の対物レンズ及び当業者にとって公知の均等物などへの言及を含んでいる。
【００２８】
ある範囲の値が与えられる場合、その範囲の上限及び下限の間の、文脈が別段に明示しない限りは下限の単位の１０分の１までの各介在値が更に特に開示されていることを理解すべきである。その記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在する値、及びその記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在する値が本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく又は除外されてもよく、より小さい範囲内に限度のいずれか若しくは両方が含まれるか又は両方共含まれない各範囲も、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限度を条件として本発明に包含される。記載された範囲が限度の内の一方又は両方を含む場合、これらの含まれた限度の一方又は両方を除外した範囲も本発明に包含される。
【００２９】
特に定義されていない限り、本明細書に使用されている全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等であるあらゆる方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができるが、潜在的且つ典型的な方法及び材料を本明細書に記載している。本明細書に述べられているあらゆる全ての刊行物は、刊行物の引用に関連する方法及び／又は材料を開示して記載すべく参照によって本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾が生じる場合には、組み込まれた刊行物のあらゆる開示に優先するものであることを理解すべきである。
【００３０】
特許請求の範囲は、あらゆる要素を除外して作成されてもよいことを更に留意すべきである。従って、この記述は、請求項の要素の記載に関する「唯一の（solely）」、「のみの（only）」等の排他的用語の使用、又は「否定的な（negative）」限定の使用のための先行記載として機能すべく意図される。
【００３１】
本明細書に述べられている（特許を含む）刊行物は、本出願の出願日前のその開示のためだけに提供されている。本発明が先行する発明によってこのような刊行物に先行する権限がないことを認めるものであると解釈されるべきではない。更に、提供される刊行物の日付は、実際の公開日とは異なる場合があり、個別に確認する必要があるかもしれない。このような刊行物が、本開示の明示的又は間接的な定義と矛盾する用語の定義を提示する場合には、本開示の定義が主導する。
【００３２】
当業者が本開示を読むと明らかであるように、本明細書に説明され例示された個々の実施形態は夫々、別々の構成要素及び特徴を有しており、別々の構成要素及び特徴は、本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他の複数の実施形態のいずれかから容易に分離されてもよく、又はいずれかと容易に組み合わされてもよい。全ての記載された方法は、記載された事象の順序で、又は論理的に可能な任意の他の順序で実行され得る。
【００３３】
本開示の態様は、細胞又は組織のような生きた又は固定された生体物質のような試料のハイスループット解析を容易にする自動又はロボット顕微鏡検査システム及び方法に関する。本発明の一態様は、以前撮像された生細胞の同一の視野への正確な戻し及び同一の視野の再撮像を可能にする。
【００３４】
システムのハードウェアは、組織培養皿で長時間（数日間から数ヶ月間）維持され得る組織培養プラスチック上で成長する生細胞の撮像を可能にすべく構成されていることが好ましい。基体（例えば組織培養プラスチック）上で細胞を成長させることにより、細胞の位置は基体に対して相対的に固定されるため、細胞の正確な同一の視野へのその後の戻しが可能になる。
【００３５】
本発明は、任意には以下に述べられているようなハードウェア及びコンピュータプログラムにより実行される。本明細書に述べられている特徴又は方法を具体化するプログラムは、最初に自動顕微鏡にロードされてもよく、又は顕微鏡がプログラムを実行すべく予めプログラムされてもよい。このようなプログラム、ルーチン及び関連したハードウェアは、本明細書の特許請求の範囲に言及されているような様々な「手段」を構成する。例えば、本明細書で言及されているプログラムされたコンピュータは、備えられた様々な制御部の動作を指示するための手段を有する。関連したプログラムはコンピュータが読取り可能な媒体（つまり、コンピュータによって読み取られてアクセスされ得るあらゆる媒体）に記録され得る。このような媒体は、フロッピーディスク（登録商標）、ハードディスク記憶媒体及び磁気テープのような磁気記憶媒体、CD-ROM、DVD のような光学記憶媒体、RAM 、ROM 及びEPROM のような電気記憶媒体、及び磁気／光学記憶媒体のようなこれらのカテゴリの混合物を含むがこれらに限定されない。
【００３６】
本発明のシステム及び方法の様々な態様を更に詳細に説明する。このような説明の後に、本発明の更なる任意の態様を提供する実施例が続く。
【００３７】
システム
上述したように、本開示の態様は、細胞又は組織のような生きた又は固定された生体物質のような試料のハイスループット解析を容易にする自動又はロボット顕微鏡検査システム及び方法に関する。ある態様では、本開示のこのようなシステムは、バルク試料の保管、バルク試料の保管場所からの特定の試料の除去及び識別、試料の撮像デバイス上への載置、撮像デバイス上での試料の配列、試料の撮像、及び／若しくは試料のバルク試料の保管場所への戻しを容易にするハードウェア並びに／又はソフトウェアを含んでもよい（例えば図１参照）。ある実施形態では、システムは、撮像された試料の画像を処理する能力を更に有する。
【００３８】
本開示のシステムの実施形態の態様は、上述した工程を実行するための構成要素を有する一又は複数のサブシステムを備えたシステムを含んでいる。例えば、ある態様では、本開示のシステムは、バルク試料保管サブシステム、試料識別サブシステム、試料載置サブシステム、試料配列サブシステム、試料撮像サブシステム、画像処理サブシステム、及び試料搬送サブシステムの内の一又は複数を備えてもよく、夫々のサブシステムが本明細書に述べられている。
【００３９】
システム又はシステムのサブシステムは、システム及び／又はサブシステムを制御するように構成された一又は複数のプロセッサによって制御されてもよい。ある態様では、一又は複数のプロセッサは、システム又はシステムのサブシステムに、バルク試料の保管を容易にさせ、バルク試料の保管場所から特定の試料を取り除かせる及び／又は識別させ、撮像デバイス上に試料を載置させ、撮像デバイス上で試料を配列させ、試料を撮像させ、バルク試料の保管場所に試料を戻させ、及び／又は撮像された試料の一又は複数の画像を処理させるべく一又は複数のソフトウェアモジュールからの命令を実行してもよい。ソフトウェアモジュールは、RAM メモリ、フラッシュメモリ、ROM メモリ、EPROM メモリ、EEPROMメモリ、レジスタ、ハードディスク、リムーバブルディスク、CD-ROM又は本技術分野で公知のあらゆる他の形態の記憶媒体に存在してもよい。プロセッサが記憶媒体から情報を読み出して記憶媒体に情報を書き込むことができるように、記憶媒体がプロセッサに接続されてもよい。或いは、記憶媒体はプロセッサと一体化されてもよい。
【００４０】
ある態様では、一又は複数の試料（例えば細胞のような生体物質を含む一又は複数のマルチウェルプレート）が、バルク試料保管サブシステムに保管されてもよい。プロセッサが、バルク試料保管サブシステムに保管されている一又は複数の試料をバルク試料保管サブシステムに加熱させる、冷却させる及び／又は一又は複数の所与の温度で維持させるように構成されてもよい。プロセッサが、バルク試料保管サブシステム内に設けられている自動アームを使用するなどして、バルク試料保管サブシステム内に保管された試料をバルク試料保管サブシステムに除去させるように構成されてもよい。
【００４１】
バルク試料保管場所から取り除かれた試料は、例えば試料識別サブシステム又は撮像デバイスに移されてもよい。ある態様では、このような移動は、試料を移動させるためのプロセッサによって制御される一又は複数の構成要素（例えばベルト、ロボットアームなど）を含んでもよい試料搬送サブシステムを使用して行われる。
【００４２】
試料識別サブシステムは、試料上の一又は複数の判別マーク（例えばバーコード、ＱＲコードなど）を検出してもよい一又は複数のセンサ（例えばバーコードリーダ、光センサなど）を含んでもよい。試料識別サブシステムは、特定の試料を識別するように一又は複数のセンサから情報を受信するように構成されたプロセッサと電子通信してもよい。試料が識別されると、プロセッサは、その特定の試料のための処理、撮像及び／又は画像処理を調整すべく（例えばパラメータファイルからの）一又は複数の様々なパラメータを適用してもよい。
【００４３】
ある態様では、試料が、試料載置サブシステムによって撮像デバイス（例えば光学式スキャナ、顕微鏡など）上に載置されてもよい。試料載置サブシステムは、試料を撮像デバイス上の所定の位置に移動させるためのプロセッサによって制御される一又は複数の構成要素（例えばベルト、ロボットアームなど）を含んでもよい。試料載置サブシステムに含まれる特定の構成要素は、例えば特定の試料タイプ、特定の撮像デバイス、移動すべき距離などに基づいて変わってもよい。例えば、ある態様では、試料載置サブシステムは、試料（例えばその上に生体物質を含むマルチウェルプレート）がロボットアームを使用して載置されるプレートホルダ（例えば図７〜17のいずれかに示されているプレートホルダ）の使用を含んでもよい。試料が撮像デバイス上に載置されると、本開示のシステムは、撮像デバイス上に載置された試料の配列を精細化するための試料配列サブシステムを含んでもよい。このような試料配列サブシステムは、例えば、本明細書に述べられているように、撮像ステージを移動させて撮像レンズ又はカメラを移動させる構成要素、ソフトウェアモジュール及び他の構成要素を含んでもよい。
【００４４】
本開示のシステムは少なくとも１つの撮像システムを備えている。ある態様では、撮像システムは、図３に示されているような光学式スキャナ又は顕微鏡を含んでおり、図３は、試料を撮像して検体面を対物レンズから相対的に一定の距離を維持すべく使用されるステージ6 の下に置かれた対物レンズ4 を有する倒立顕微鏡本体2 を示す。図４は、試料のための個々のウェル10を有する皿又はウェルプレート8 を示す。撮像は一般に、光毒性の低下の点で以下に更に説明されるように培養皿又はウェルプレートの基材12を介して行なわれる。カメラ14（例えば、CCD （電荷結合素子）を含む）が、放射光の量を減らし得る顕微鏡本体内の余分なミラーの必要性をなくすために顕微鏡本体の真下に配置されている。強度に基づく対象の分解及び測定を可能にして、検体への照射がより少なくてすむように、広ダイナミックレンジを有する高速度高感度CCD カメラが、コンピュータ制御での高処理能力のために使用されてもよい。プログラムされたコンピュータ16は、異なる蛍光励起及び放射フィルタの組み合わせ間の（制御部18を介した）自動切換を制御し、自動切換は、光源22、例えばキセノン光源と顕微鏡（励起）に光を運ぶ光ファイバ（液状の光ガイド）24との間に１つの位置フィルタホイール10又はフィルタホイール及びシャッタの組み合わせ20を介在させ、顕微鏡本体及びカメラ（放射）間に別のフィルタホイール26を介在させることにより行われる。フィルタの自動交換（ここでも制御部18を介す）により、複数の蛍光指示薬を使用して異なる構造又は機能的な処理を分解して関連付けることが可能になる。追加のハードウェアは、プレートを手動で走査して一又は複数の接眼レンズ30を介して特徴を確認するために、「ジョイスティック」、タッチパッド、キーパッドなどの手動入力／制御デバイス28を含んでもよい。このような特徴は本発明には必要ではないが、多くのユーザが慣れている利便性を提供する。更に、テーブル48又は他の支持面と接するための防振基部46が採用されてもよいことが有利である。
【００４５】
システムの焦点調節に関して利用されてもよい追加のハードウェアを以下に説明する。このようなハードウェアは、制御部36によって作動する電子シャッタ34によって調節される白熱光源又はLED 光源32を含んでもよい。電子シャッタ34が開いているとき、対物レンズの視野を照射するために、光が光源から光学素子38を介して伝えられる。キセノン光源を使用せずに焦点調節を可能にするために、好ましくは位相差光学素子に関してプラスチックウェルプレートが使用される状態でこのような照明が利用される。二次光源を使用するこのような手法は、非常に低い強度の（略）白い光が焦点を達成するために必要な全てであるという点で望ましい場合がある。更にこのような手法は、経時的に少なくなり消えてしまう場合もある蛍光性の対象からの光への依存を回避する。対照的に、キセノン光源とキセノン光源への試料の露出に起因する蛍光との使用は、システムの焦点調節に関して使用される場合、試料の光毒性をもたらす場合があるより大きな光度を必要とする。以下に述べる焦点調節ルーチンは、焦点調節のために照明下にある時間を最小限度に抑えることによって（光源32に曝されても）光毒性の潜在的影響を更に制限する。ある実施形態では、以下に更に詳細に述べられているように、ニコン（Nikon ）のPerfect Focus System（PFS ）のような自動焦点調節システムが利用されてもよい。
【００４６】
更に、本開示のシステムは画像処理サブシステムを含んでもよい。画像処理サブシステムは、例えば特定の試料に関する画像を編成して、特定の試料に関する２以上の画像をつなぎ合わせて、画像を配列して、画像内の対象（例えばニューロンのような細胞）を識別して、時系列の画像によって対象（例えばニューロンのような細胞）を追跡して、画像内で識別された対象からデータ（例えば蛍光データ）を抽出して、及び／又はその結果の画像を分析すべく、一又は複数のソフトウェアモジュールからの命令を実行してもよい一又は複数のプロセッサを含んでもよい。
【００４７】
図２は、本開示のシステム200 の実施形態を更に示す図である。図２に示されている実施形態では、バルク試料保管サブシステムは、所定の温度で２以上の試料を保管してもよい培養器201 を含んでいる。試料が、培養器201 内に含まれているロボットアーム202 によって培養器から取り除かれ、ロボットアーム202 は、バーコードリーダ203 を有するホルダを含む試料識別システムに試料を載置する。バーコードリーダ203 は、試料を含むプレート上に置かれた特定のバーコードを読み取る。バーコードリーダ203 はプロセッサと通信し、プロセッサは、特定のバーコードの少なくとも一部に基づき特定の試料を識別するように構成されている。
【００４８】
プロセッサは、ロボットアーム204 を含む試料搬送システムに指示して、バーコードリーダ203 を有するホルダから試料をピックアップし、プレートホルダ205 （例えば図７〜17に示されているようなプレートホルダ）を含む試料載置サブシステムに試料を搬送する。試料が載置されると、プレートホルダ205 に取り付けられた電子アクチュエータを含む試料配列サブシステムが、プレートホルダ205 内に試料を配列する。更に、試料配列サブシステムは、図４に示されている一又は複数の要素44として英数字の識別子のような、プレート上に常に設けられるか又はプレート内に常に設けられるマークのようなプレート上の参照マークの識別に基づき、撮像デバイス206 の撮像ステージを特定の位置に移動させる。
【００４９】
その後、試料は撮像デバイス206 （例えば、図３に示されているような光学式スキャナ又は顕微鏡）を含む試料撮像サブシステムによって撮像される。試料が撮像されると、試料搬送サブシステムのロボットアーム204 は試料をバルク試料保管サブシステムの培養器201 に戻す。ロボットアーム204 は試料識別サブシステムに含まれているホルダに試料を戻し、ここで培養器201 のロボットアーム202 が試料をピックアップして試料を保管場所に戻してもよい。ある態様では、試料識別サブシステムのバーコードリーダ203 は、バーコードをプロセッサに伝えることにより、試料が撮像されて培養器に戻されたことを記録する。プロセッサは試料を識別してこのような情報を記録するように構成されている。
【００５０】
更に、撮像デバイス206 は、画像プロセッサ207 と通信（例えば有線通信及び／又は無線通信）する。ある実施形態では、画像プロセッサ207 は、撮像された試料の画像を編成して、画像をつなぎ合わせて、画像を配列して、画像内の対象（例えばニューロンのような細胞）を識別して、時系列の画像によって対象（例えばニューロンのような細胞）を追跡して、画像内で識別された対象からデータ（例えば蛍光データ）を抽出して、及び／又はその結果の画像を分析すべく、ソフトウェアモジュールからの命令を実行するように構成されたプロセッサを含んでいる。
【００５１】
前述の記載では、本開示のシステムのある実施形態の一般的な特徴及び構成要素について説明している。システムの特定の特徴及び構成要素を、以下に更に詳細に説明する。
【００５２】
試料の保管
上述したように、システムのハードウェアは、長時間維持され得る試料の撮像を可能にするように構成されていることが好ましい。従って、ある実施形態では、システムは、長時間（例えば数日間から数ヶ月間）試料（例えば基体上の生細胞のような生体物質）の保管を容易にするバルク試料保管サブシステムを含んでいる。
【００５３】
バルク試料保管サブシステムは、所望の温度、湿度、O2濃度、N2濃度、CO2 濃度などで一又は複数の試料を維持するための一又は複数の要素を含んでもよい。従って、バルク試料保管サブシステムは、一又は複数の加熱要素及び／又は冷却要素、加湿要素及び／又は除湿要素などを含んでもよい。このような所望のパラメータは、プロセッサと閉ループで電子通信する一又は複数のセンサ（例えば温度センサ）を使用して維持されてもよい。例えば、プロセッサは、温度センサから現在の温度を受信して加熱要素及び／又は冷却要素を作動させて温度を所望の値又は所望の範囲に上げるか又は下げることによって、バルク試料保管サブシステムに、バルク試料保管サブシステムに含まれている一又は複数の試料を加熱させる、冷却させる及び／又は一若しくは複数の所与の温度で維持させるように構成されてもよい。本開示のシステムの実施形態の態様は、試料が均質な状態又は異質な状態下で保管されるシステムを含んでいる。例えば、試料の第１の部分が第１の所望の状態下で保管され、試料の第２の部分が第２の所望の状態下で保管される。試料が異質な状態下で保管されるこのような実施形態では、第１の状態、第２の状態などは、温度、湿度などの一又は複数の特性によって互いに異なってもよい。
【００５４】
様々な生体物質が本開示のシステムを使用して撮像されてもよい。ある態様では、生体物質は細胞である。適切な細胞として、真核細胞（例えば哺乳類細胞）及び／又は原核細胞（例えば細菌細胞又は古細胞）が含まれる。生体物質は、インビトロ源（例えば培養物中で成長した実験細胞）又はインビボ源（例えば哺乳類の被験体、ヒト被験者など）から得られてもよい。ある実施形態では、生体物質はインビトロ源から得られる。インビトロ源は、原核生物（例えば、細菌、古細菌）細胞培養物、原核生物及び／又は真核生物（例えば哺乳類、プロテスト、菌類など）細胞を含む環境試料、真核細胞培養物（例えば、株化細胞系の培養物、既知の又は購入された細胞系の培養物、不死化細胞系の培養物、一次細胞の培養物、実験酵母の培養物など）、組織培養物などを含むが、これらに限定されない。
【００５５】
ある実施形態では、生体物質はインビボ源から得られ、組織から得られた物質（例えば組織生検からの細胞、組織試料からの細胞など）、及び／又は体液（例えば全血、分留された血液、血漿、血清、唾液、リンパ液、間質液など）を含むことができる。場合によっては、被験体由来の細胞、体液又は組織が、本システムを使用した撮像の前に培養、保管又は操作される。
【００５６】
本開示のシステム及び方法の実施形態は、一又は複数の試料を調製すべく、自動液体処理ワークステーション（例えば、Hamilton Robotics, Reno, NVから入手可能なMICROLAB（登録商標）STARlet ML 8 96-prep systemのようなMICROLAB（登録商標）STAR又はMICROLAB（登録商標）NIMBUS液体処理ワークステーション）の使用を含む。このような実施形態では、一又は複数の試料が調製され、（例えば、本明細書に述べられているような搬送デバイスを使用して）バルク試料保管サブシステムに移されてもよい。このような調製及び／又は移動が一又は複数のプロセッサによって制御されてもよく、調製及び／又は移動は半自動的に又は自動的に行われる。実施例が、実施例６として本明細書に記載されている。
【００５７】
ある実施形態では、試料源が「哺乳動物」又は「哺乳類」であり、これらの用語は、肉食動物目（例えばイヌ及びネコ）、齧歯動物目（例えばマウス、モルモット及びラット）並びに霊長目（例えばヒト、チンパンジ及びサル）を含む哺乳綱内にある生物体について記載すべく広く使用されている。
【００５８】
従って、様々な試料保管手段が本開示のシステムに採用されてもよい。ある実施形態では、本開示のシステムは、本明細書に述べられている搬送サブシステムの一又は複数の追加の構成要素、例えば本明細書に記載されているようなこの文脈では外部のロボットアームと称されるロボットアーム（例えばPeak Robotics, Colorado Springs, COから入手可能な第１及び第２のグリッパアームを有するプレートグリッパを備えたKiNEDx KX-300-250 ロボットアーム）と相互に作用するように構成された自動培養器を備えている。ある実施形態では、培養器はロボットアクセスゲート、内部のロボットアーム、及び外部に配置されたトランスファネスト又はドッキング位置を有しており、これらの構成要素は共に、培養器内の特定の位置から試料プレートを取り除いて特定の位置に戻すことを可能にする。トランスファネストは、培養器と外部のロボットアームとの間に接触位置を与える試料プレートプラットフォームを含んでおり、そこで、外部のロボットアームがシステムの動作中に試料プレートをピックアップして戻すことができる。トランスファネストは、正確な移動及び位置決めのために内部のロボットアーム又は外部のロボットアームから受けた試料プレートを配列し、ある実施形態では、＋／−２mmの試料プレートのずれを補正することができる。例えば、ある実施形態では、トランスファネストは、プレートネストの周りに位置して、顕微鏡及び培養器に対する移動のためにプレートを正確な位置に導くように構成されたべベルポストを含んでいる。適切な培養器は、LiCONiC Instruments, Liconic US, Inc., Woburn, MAから入手可能な培養器を含んでおり、例えばTransfer Nest（登録商標）を備えたSTX44-ICBT（70℃）培養器を含んでいる。
【００５９】
顕微鏡に対する搬送のためにプレートを正確な位置に導くように構成された、プレートネストの周りのべベルポストにもかかわらず、プレートネストの面積がプレートの面積より大きい場合、ずれが生じる可能性がある。プレートの位置の可変性を低減すべくネストの面積を物理的に変えることが不可能な場合、多くの機械的な解決法が利用可能である。例えば、ある態様では、プレートネストに対する実際の搬送移動の前にプレートを１つの縁部又は角部に最初に押し付けてプレートを下に置くために、ロボット搬送デバイス、例えばロボットアームが利用される。他の態様では、プレートネストの下側に置かれる独立したモータ、例えばサーボモータが利用される。このモータはアームに取り付けられており、このアームは、プレートを１つの縁部又は角部に押し付けるべく上に回転し、その後、アームが搬送移動に干渉し得ないように下に回転することが可能である。
【００６０】
試料の識別
上述したように、本開示のシステムは試料識別サブシステムを含んでもよく、試料識別サブシステムは、試料上の一又は複数の判別マーク（例えばバーコード、ＱＲコードなど）を検出してもよい一又は複数のセンサ（例えばバーコードリーダ、光センサなど）を含んでもよい。
【００６１】
例えば、ある実施形態では、本開示のロボット顕微鏡検査システムは、試料プレート上のバーコードを読み取るように構成されたバーコードリーダを含んでいる。ある実施形態では、バーコードリーダは試料プレートの長さに沿って位置するバーコードを読み取るように構成されている。他の実施形態では、バーコードリーダは試料プレートの幅に沿って位置するバーコードを読み取るように配置されている。バーコードリーダは試料プレート上のバーコードを読み取るように配置されてもよい一方、試料プレートは上述したようにトランスファネスト又はドッキング位置に配置されている。このような実施形態では、試料プレートがトランスファネスト又はドッキング位置に配置されている一方、バーコードリーダが試料プレート上のバーコードを例えば試料プレートの長さに沿って読み取るべく配置されているように、バーコードリーダは、試料保管場所（例えば培養器）の外面に配置されているか、又はトランスファネスト又はドッキングステーションの一部に取り付けられてもよい。本明細書に記載されているようにバーコードリーダと組み合わせて固有のバーコードを有する試料プレートを使用することにより、試料プレートがシステムの動作中に培養器及びプレートホルダに対して移送されているとき、特定の試料プレートの正確な追跡が可能になる。試料プレートは、ラベルなどの上にあるバーコード、例えばラベルなどに印刷されるか、エッチングされるか、押印されるか、設けられたバーコードと共に製造業者から提供されてもよく、又は、バーコードは、本技術分野で公知のあらゆる適切な方法、例えば印刷、エッチング、押印、粘着ラベルの接着などを用いて後で追加されてもよい。
【００６２】
ある実施形態では、バーコード以外の手段が試料を識別するために使用される。ＱＲコード、参照マーカ、幾何学的なマーカのような、試料を識別するあらゆる便利な手段が、本開示のシステムに使用されてもよい。このようなマーカは、光センサ及び本技術分野で公知の他の識別手段を使用して検出されてもよい。
【００６３】
搬送
上述したように、ある実施形態では、システムが、例えば培養器から撮像デバイスに試料を搬送するためのサブシステムを含んでもよい。
【００６４】
ある実施形態では、本開示のロボット顕微鏡検査システムは、Peak Robotics, Colorado Springs, COから入手可能な第１及び第２のグリッパアームを有するプレートグリッパを備えたKiNEDx KX-300-250 ロボットアームのようなロボットアームを備えている。ロボットアームは、培養器と、培養器に関連した（上記の）トランスファネスト又はドッキング位置と、プレートホルダと、（下記の）関連した顕微鏡ステージとの間の仲介物として機能する。ロボットアームは電気式又は空気圧式のプレートグリッパを含んでもよく、プレートグリッパは、一般的な矩形状の試料プレートに関して横長方向（２つのグリッパアームが試料プレートの短辺に沿って試料プレートと接すべく配置されている）、又は縦長方向（２つのグリッパアームが試料プレートの長辺に沿って試料プレートと接すべく配置されている）にプレートと係合するように構成されてもよい。ロボットアームは三次元で移動することができるため、ロボットアームの最大リーチを超えなければ、プレートホルダ、培養器及びロボットアームの相対位置に関する多くの可能性が存在する。
【００６５】
ある態様では、ロボットアームは、図５及び６に示されているタイプのプレートグリッパを含んでもよい。プレートグリッパは、本明細書に述べられているような試料保管デバイスのトランスファネスト若しくはドッキングステーション及びプレートホルダに対する試料の載置及び／又は回収を容易にするようなサイズ及び形状を有してもよい。図５では、グリッパアーム300 が、プレートの周囲と接する複数の延長体304 （例えばねじ）を含んでもよい。グリッパアームは、閉じるとき、プレートに破損をもたらさずにプレートの垂直面で延長体を介してプレートと接するように、延長体304 は奥行に関して調整可能であってもよいことが好ましい。ある態様では、延長体304 は、プレートの確実な保持を容易にするように、接着剤、エッチング、高摩擦材のような表面処理が施されている。ある態様では、延長体304 は手動で調整可能であってもよい。例えば、ある実施形態では、延長体304 は、ねじを回すことにより延長体の長さを長くしたり短くしたりすることを容易にし得るねじ側部を有している。他の態様では、延長体304 は自己調整可能であってもよい。自己調整可能であるということは、延長体がユーザによる更なる介入なしに様々なサイズのプレートに適合すべく調整可能であってもよいということを意味する。例えば、ある実施形態では、延長体は、サイズが僅かに変わるプレートに適合すべく延長体が水平に移動し得るように構成されたばねを使用して取り付けられている。
【００６６】
図６は、第１及び第２のプレートグリッパ301 を示す平面図である。プレートが、搬送のためにプレートを固定するようにプレートに側圧をかけるように互いに近づくプレートグリッパ301 間に置かれることによりグリッパアームによって回収されてもよい。プレートを所望の位置に移動させてプレートグリッパを互いから離すことにより、プレートを所望の位置に置くようにプレートへの側圧を解法することによって、プレートをグリッパアームにより配置してもよい。プレートグリッパは、一般的な矩形状の試料プレートに関して横長方向又は縦長方向のいずれかにプレートと係合するように構成されてもよい。
【００６７】
撮像システム
本開示のシステムは撮像システムを含んでもよい。ある実施形態では、撮像システムは、図３に示されているような光学式スキャナ又は顕微鏡を含んでいる。
【００６８】
図３に示されているように、注目する撮像システムは、株式会社ニコンから入手可能なEclipse Ti-E/B倒立研究顕微鏡のような倒立顕微鏡本体2 を含んでもよい。このような倒立顕微鏡本体2 は、対物レンズ4 のためにより長い筒長によって規定される超長作動距離レンズを利用すべく使用され得る。このため、対物レンズの先端から更に（数ミリメートル）離れている焦点面を取り込む一方、相対的に良好な開口数を依然有することが可能になる。組み立てによってもたらされる相対的に長い作動距離により、対物レンズを皿に衝突させることなく、脳切片内のトランスフェクトされたニューロンのような厚い検体に組織培養プレート8 の床面を越えて焦点調節することが可能になる。一般に、このような試料の厚さは約50〜約400 ミクロンの範囲内である。
【００６９】
ある態様では、対物レンズ4 は大きな視野及び高解像度画像を得る必要性を均衡させるように選択される。ある態様では、対物レンズ4 は、0.45の開口数(NA)及び6.9 〜8.2 mmの作動距離の20X Nikon CFI Plan Fluor ELWD 対物レンズのようなNikon Fluor Seriesの顕微鏡対物レンズである。
【００７０】
他の態様では、4X対物レンズが使用されてもよい。4X画像が、細胞の計数（例えば生存率の測定）及び全体的なモルフォロジのある測定に特によく適している。注目する4X対物レンズは、ニコンの対物レンズの光量と略同一の光量の光を伝えるオリンパス（Olympus ）のUplan SL 4X＼0.13＼PhL のようなニコン及びオリンパスから入手可能な対物レンズのような市販の対物レンズを含んでいる。しかしながら、オリンパスの対物レンズは光を更に均一に視野を通って伝え、視野の縁部から視野の中心までの伝達の差に関して、オリンパスの対物レンズはニコンの対物レンズの２倍である。
【００７１】
実施形態は、相対的に高いNAの対物レンズの使用を含んでいる。通常、相対的に高い開口数の対物レンズは、より適切な空間分解能でより多くの光の収集（つまり、より少ない信号を有する画像の形成）を可能にすることが好ましい。しかしながら、本発明の顕微鏡システムでは、相対的に低い開口数レンズは、実質的により大きな被写界深度を与えながら、画像の形成に十分な光を収集することができるため、システムがニコンのTiE Perfect Focus System（以下に述べるPFS ）を含んでいなくても、画像が広範囲の実際のＺ位置に亘って焦点が合った状態になる。このため、このようなPFS が設けられていないシステムでは、ウェル（好ましくは中心）毎に一度焦点調節して、その後、焦点が合っている同一のウェル内で一連（例えば３×３又は４×４）の隣り合う視野を取り込むことが可能になり、ウェル毎に一度のみ焦点調節することにより、24ウェルプレートの撮像又は走査に必要な時間が２分の１に削減される。この問題は、ウェルを撮像している間焦点を維持するウェルにPFS が関わっており、次のウェルに移る前だけオフされるので、PFS を含むシステムでは主に除かれる。
【００７２】
プレートホルダ
図３に示されているように、撮像システムは、試料を撮像して検体面を対物レンズ4 から相対的に一定の距離維持するために使用されるステージ6 を含んでもよい。ある実施形態では、本開示のロボット顕微鏡検査システムは、ステージ6 上にプレートホルダを備えており、プレートホルダは、本明細書に述べられているロボット顕微鏡検査システムの一又は複数の追加の構成要素と自動的に相互作用するように構成されている。具体的には、本開示は、顕微鏡ステージ（例えば、Applied Scientific Instrumentation (ASI), Eugene ORから入手可能なMS2500 XY Flat-Top Extended Travel Stage）と物理的に係合する、例えば機械的に取り付けられるように構成されたプレートホルダを提供する。プレートホルダは、本技術分野で公知のあらゆる適切な取付手段、例えばねじ、ボルト、リベット、インターロッキング機構などを用いて顕微鏡ステージに物理的に取り付けられてもよい。
【００７３】
プレートホルダは、ロボットアーム（例えばPeak Robotics, Colorado Springs, COから入手可能なKiNEDx KX-300-250 ロボットアーム）を使用して試料プレート（例えば本明細書に述べられているようなマルチウェルプレート）の載置及び除去を容易にするように更に構成されている。ロボットアームは、第１及び第２のグリッパアームを有するプレートグリッパ、例えば電気式又は空気圧式のプレートグリッパ（例えば、Peak Robotics, Colorado Springs, COから入手可能な縦長構成の電気式Side-Grip-Servo (SGS) プレートグリッパ）を備えている。
【００７４】
ある実施形態では、プレートホルダは、内部試料プレート受取領域、内部開口、外面、上面、側面及び底面を画定するように略矩形状に連結された４つの壁を有している。図７〜10は、本開示のシステムに使用されてもよいプレートホルダ400 の一実施形態を示す様々な図である。図７の平面図に示されているように、プレートホルダ400 の４つの壁は、対向して配置された略等しい長さの２つの第１の壁415 と、対向して配置された略等しい長さの２つの第２の壁420 とを含んでおり、２つの第２の壁420 の各々の長さは２つの第１の壁415 の各々の長さより短い。図１０の上面斜視図に最も良く示されているように、２つの第１の壁415 は夫々、切抜き部分416 、内部斜縁部分417 及び内部底リップ部分418 を有している。２つの第２の壁420 は夫々、内部斜縁部分421 及び内部底リップ部分422 を有している。これらの要素は、内部試料プレート受取領域の一部が底リップ部分によって画定されており、底リップ部分が第１及び第２の壁の底リップ部分から構成されるように設けられている。壁の切抜き部分と組み合わせた内部試料プレート受取領域の底リップ部分は、内部開口の周囲を画定している。
【００７５】
上述したように、例えば縦長構成で試料プレートを保持するように構成された第１及び第２のグリッパアームを有するプレートグリッパと係合すべく、切抜き部分416 は２つの第１の壁415 に設けられてもよい。しかしながら、プレートホルダは、試料プレートを横長構成で保持するように構成された第１及び第２のグリッパアームを有するプレートグリッパと係合するように、加えて又は代わりに構成されてもよいことに注目すべきである。この場合、切抜き部分は、２つの第２の壁420 、又は２つの第１の壁415 及び２つの第２の壁420 の両方に設けられる。
【００７６】
ある実施形態では、２つの第１の壁415 の切抜き部分416 は、図７に示されているように対向して設けられている。しかしながら、これらの切抜き部分416 は、プレートグリッパ400 又はプレートグリッパアーム又はその逆の構成の変化に対処すべく変更又は再配置されてもよいことに注目すべきである。一般に、切抜き部分416 は、試料プレートが内部試料プレート受取領域の底リップ部分に置かれるようにグリッパアームが切抜き部分内に垂直方向に下降し、試料プレートを解放し、その後の撮像のためにプレートホルダに置かれた試料プレートを残して垂直方向に上昇し得るようにグリッパアーム又はその逆の寸法に適合するようなサイズ及び形状を有する。切抜き部分416 は、プレートホルダからの試料プレートの除去を容易にすべくグリッパアーム又はその逆の寸法に適合するようなサイズ及び形状を更に有する。この場合、グリッパアームが試料プレートの対向する側部に置かれるように、グリッパアームは切抜き部分内に垂直方向に下降する。次に、グリッパアームが試料プレートと接して試料プレートを把持するまで、グリッパアームは互いに近づく。その後、グリッパアームは垂直方向に上昇して、プレートホルダから試料プレートを取り除く。
【００７７】
上述したように、内部試料プレート受取領域の一部は内部斜縁部分によって画定されている。内部試料プレート受取領域の内部斜縁部分は、（上記の）切抜き部分及び（下記の）任意の弓状又は曲線状の角部430 を除いて一般に連続している。プレートホルダの底リップ部分の面に対する斜縁部分の角度は、90度未満、例えば85度未満、80度未満、75度未満、70度未満、65度未満、60度未満、55度未満、50度未満、45度未満、40度未満、35度未満、30度未満、25度未満、又は20度未満である。ある実施形態では、プレートホルダの底リップ部分の面に対する斜縁部分の角度は、約90度〜約20度、例えば約85度〜約25度、約80度〜約30度、約75度〜約35度、約70度〜約40度、約65度〜約45度、約60度〜約50度、又は約55度である。
【００７８】
ある実施形態では、内部試料プレート受取領域の斜縁部分は、内部試料プレート受取領域の底リップ部分の面からプレートホルダの上面まで延びており、底リップ部分の面及びプレートホルダの上面は一般に平行である。他の実施形態では、２つの第１の壁415 及び２つの第２の壁420 は夫々、プレートホルダの底リップ部分と約90度の角度で接する第１部分と、プレートホルダの上面と接してプレートホルダの底リップ部分の面に対して上述したような斜縁部分の角度を有する第２斜縁部分とを有している。夫々の壁の第１部分及び第２部分は、プレートホルダの底リップ部分の面とプレートホルダの上面との間で略等距離である、夫々の壁のポイントで接してもよい。或いは、この接触ポイントは、プレートホルダの底リップ部分又はプレートホルダの上面の近くに設けられてもよい。
【００７９】
上述したように、内部試料プレート受取領域は、ある実施形態では各プレートホルダの壁の一部と約90度の角度で接触する底リップ部分によって画定されている。底リップ部分は、底リップ部分と約90度の角度（又は上述したような他の適切な角度）で接触する各プレートホルダの壁の一部と底リップ部分との交差部分から内部に、例えばその全長に沿って延びている。底リップ部分は、置かれた試料プレートのための安定した基部を設けるべく十分な距離延びている。ある実施形態では、底リップ部分は、底リップ部分と約90度の角度（又は上述したような他の適切な角度）で接触する各プレートホルダの壁の一部と底リップ部分との交差部分から約２mm〜約20mm、例えば約２mm〜約18mm、約２mm〜約16mm、約２mm〜約14mm、約２mm〜約12mm、約２mm〜約10mm、約２mm〜約８mm、約２mm〜約６mm又は約２mm〜約４mm延びている。上述したように、底リップ部分は、プレートグリッパのグリッパアームによるアクセスのための切抜き部分によって底リップ部分の長さの一部に沿って途切れている。ある実施形態では、底リップ部分の厚さは、約0.4 〜約0.8 mm、例えば約0.5 〜約0.7 mm又は約0.6 mmである。
【００８０】
ある実施形態では、上記の構成要素に加えて、プレートホルダは、２つの第１の壁415 及び２つの第２の壁420 の内部接合部分に弓状又は曲線状の角部430 を含むように構成されている。これらの任意の曲線状の角部430 は、例えば試料プレートの載置及び除去中のプレートの位置決めを容易にすることができる。
【００８１】
本開示に係るプレートホルダは、あらゆる適切な材料、例えばアルミニウム又はチタンから形成されてもよく、本技術分野で公知の様々な適切な方法のいずれか、例えばフライス加工又は射出成形を用いて製造されてもよい。
【００８２】
ある実施形態では、プレートホルダは、約８mmの全厚を有しており、SBS （Society for Biomolecular Sciences）規格の127.5 mm×85mmのフットプリントを有する試料プレートを受けるためのサイズ及び形状を有する。このような実施形態は、斜縁部分の内部末端によって定められる約128 mmの長さ及び約86.1mmの幅の寸法を含む内部試料プレート受取領域を設けるべく構成されてもよい。
【００８３】
プレートホルダの斜縁部分は、試料プレートをプレートホルダに置くために本明細書で述べているようにプレートグリッパを備えたロボットアームを使用するときに生じる場合があるｘ、ｙ及び／又はｚのプレート位置決め寸法の僅かな不正確さにもかかわらず、試料プレートの正確な載置を可能にするという利点を有する。斜縁部分は、その後の目視、撮像及び／又は分析のために試料プレートをプレートホルダ内の正確な位置に「導く」機能を有する。
【００８４】
ある実施形態では、本明細書に記載されているようなプレートホルダは、アームを有するアクチュエータを含むように構成されてもよい。アームは、作動すると、試料プレートが内部試料プレート受取領域に置かれる毎に内部試料プレート受取領域に置かれる試料プレートを内部試料プレート受取領域の一定の角部に押し込む機能を有する。このため、試料プレートが内部試料プレート受取領域に置かれると、試料プレートの位置を回転に対して補正することが可能になる。ある態様では、アクチュエータは受動レバーのように受動式であってもよい。他の態様では、アクチュエータは、プロセッサによって制御される電子制御式アクチュエータのように能動式であってもよい。
【００８５】
図11は、このようなアクチュエータを含むように構成されたプレートホルダ401 の平面図である。図12−13は、図11に示されているプレートホルダ401 の変形例を示す図である。図11に示されている実施形態では、プレートホルダ401 は、部分450 として示されている、アクチュエータが設けられてもよい材料の一部を除去することによって、図６に示されている実施形態から構成されている。プレートホルダ401 は、このようなアクチュエータを固定するための取付孔451 と、アクチュエータアームを収容するためのアクチュエータアーム切欠き部分440 とを更に含んでいる。
【００８６】
例えば図14は、電子制御式アクチュエータ460 が取り付けられたプレートホルダ402 の平面図である。電子アクチュエータ460 はアーム461 及び制御ユニットを含んでおり、プレートホルダは、アーム461 を置くための空間(440) 、例えば湾曲状の空間を有している。このため、試料プレートがロボットアームによって置かれる及び／又は除去されるとき、アーム461 が邪魔にならないように完全に引っ込められ得る。これらの構成要素は、図14のプレートホルダ402 及びアクチュエータ460 の上面斜視図である図17に最もよく示されている。制御ユニットはモータを含んでおり、モータは、プロセッサによって指示されるとアーム461 を時計回りに回転させる。従って、試料プレートが内部試料プレート受取領域に置かれる毎に、アーム461 は、内部試料プレート受取領域に置かれた試料プレートを内部試料プレート受取領域の一定の角部に押し込むため、試料プレートを固定する及び／又は試料プレートの自由度を低減する。プレートホルダ402 及びアクチュエータ461 が図18−19に更に示されている。
【００８７】
プレート配列アルゴリズム
本発明のプログラムは、生体試料（例えば細胞）の撮像、及びその後の同一の生体試料の任意の時間間隔での戻し及び再撮像を可能にする。このような動作によって、同一の細胞を撮像すべく戻すことにより数日間又は数週間に亘る生細胞中の因果関係を研究することが可能になる。本発明は、プレートが撮像のために顕微鏡に戻される毎に顕微鏡ステージ上のプレートホルダにプレートを迅速に置くべく、マルチウェルプレート上の一又は複数の基準マークを使用してもよい。マークは、図４に示されている一又は複数の要素44として英数字の識別子のような、ウェルプレート上に常に設けられるか又はプレート内に常に設けられるマークであってもよい。或いは、一又は複数の特注の基準点、基準マーク又は基準構造が使用されてもよい。
【００８８】
マークは、ホルダ内のプレートの位置とは無関係に、プレート上の細胞用の内部基準として機能する。ある態様では、プレートが（例えば上述したような）搬送サブシステムによってホルダに挿入されると、既に取り込まれた参照画像に示されている位置と正確に同一の位置にマークを位置決めするためにステージはユーザの介入なしで移動する。例えば、ステージは、ユーザの介入なしでコンピュータメモリ及び関連した制御アルゴリズムによってマークの概略位置に移動してもよい。更に、コンピュータメモリ及び関連した制御アルゴリズムによって、使用された基体のための基準点又は参照点を設けてもよい。基体のための基準点又は参照点を設けるべく撮像工程を行う。ある態様では、ソフトウェアモジュールが、撮像デバイスに指示してロードされたプレートをＸ空間、Ｙ空間及び／又はＺ空間における予め定められた位置に移動させるプロセッサによって実行される。この位置は、プレートを空間内に正確に置くために使用される参照マークの概略位置に相当してもよい。撮像デバイスに指示して参照マークの位置をより正確にするプロセッサによって実行されるソフトウェアモジュールを使用して、この位置をより正確にしてもよい。このような実施形態は、スケール不変特徴変換（SIFT）アルゴリズムの使用を含んでもよい。ある例では、プレート配列アルゴリズムが、Lowe D著，"Distinctive Image Features from Scale- Invariant Keypoints"，International Journal of Computer Vision，2004年，60 (2):91-110、及び米国特許第6711293 号明細書に記載されているようなアルゴリズムを組み込んでもよく、これらの開示内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００８９】
他の態様では、ユーザが更に又は代わりに、既に取り込まれた参照画像に示されている位置と正確に同一の位置にマークを得るべくステージを（例えばジョイスティック制御部28を用いて）手動で移動させてもよく、各ウェルの各画像も対応する位置にあるように、参照画像の位置と正確に同一の位置（従って、細胞が再撮像される毎に同一の位置）のマークを用いて取得プログラムを開始する。
【００９０】
基準マークに戻してその基準マークに関する位置を見つけることにより、個別の時間間隔で静止している細胞又は略静止している細胞を観察すべく同一の視野に戻す一方法が提供される。視野へのより正確な戻しが望まれているか、又は必要とされている場合、処理の更なる精細化が望ましい。本開示のシステムは、少なくとも複数の画素内で画像を配列することができ、しかも単一の画素への正確さを伴って、又は補足の数学的手法を利用する完全な位置合わせで画像を配列することができる。
【００９１】
ある態様では、得られた画像データがデジタルで記憶され、値の行列に変換されてもよい。閾値未満の信号が零として処理される一方、他の信号が数値（例えば、簡略化のための数値、この場合には行列が２値化されている）として処理される。（好ましくは、上述したように一又は複数の基準マークの使用によって一般に識別される）略同一の領域の第２又はその後の撮像が同一の処理を受ける。分析用のコンピュータソフトウェアによって重ね合わされるべき（生存性の研究などの場合における）画像のずれが生じると、数値に対して零が乗算されることになり、行列のミスマッチがより大きいとこの結果を悪化させるので、乗算された行列に関する合計値がより低い場合、位置があまり配列されていないことを表わす。逆に、ピーク又はスパイクが、完全な（又は少なくとも最適化された）配列を示す行列番号の合計の最大値を表わす。
【００９２】
ある態様では、略同一の領域の第２又はその後の画像が、画像間の相対的な移動オフセットを推定すべく位相相関を使用して先の一又は複数の画像に対して配列される。あらゆる便利な位相相関手法が採用されてもよく、Stone HS著，IEEE Transactions on Geoscience and Remote Sensing, V. 39, No. 10, 2001年10月, p.2235−2242、De Castro E等著，IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence，1987年９月、及びReddy BS等著，IEEE Transactions on Image Processing 5, no. 8，1996年，p.1266−1271に記載されているような手法を含むが、これらに限定されない。これらの開示内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００９３】
場合によっては、位置合わせ処理に行列の一部（例えば中央の80%）を利用することが好ましい。このような手法は、１つの行列の一部が他の行列に表わされない（従って、行列が既に同一である／並べられている場合を除いて極大を識別するための合計に寄与しない）状態、及びこのような状態に関連して予測できない可能性の回避を支援する。これは、部分的な重なりがあっても配列することが可能な（上記の）SIFTを組み込まない実施形態で有用であってもよい。更に、利用可能な行列値の一部を取り込むことにより、計算要件が減らされる。
【００９４】
尚、典型的な80％手法より小さな行列が、少なくとも画像を大まかに配列するために採用されてもよい。システムに関する計算要求を（より小さな行列の一部を利用することにより）更に低減することによって、より大きなサンプリングされた領域の位置合わせの試行がますます実施可能になる。更に計算要求の低減により、場合によっては、大まかに配列された（例えば、基準マーク手法を含まずに最初に配列された）画像の位置合わせが可能になる。
【００９５】
このような動作の後に、撮像工程が続く。位相差画像を作成することが好ましい。しかしながら、細胞の透視撮像が採用されてもよい。いかなる場合も、画像は、基準点に関して同様に撮像された以前の画像と最終的に重ね合わされる。画素値を表す２つの行列（又は行列の一部）の積の最大合計値を求める上述したような行列位置合わせ技術を使用して重ね合わせを行うことが好ましい。位置合わせに利用される情報が位相差画像である場合には、位置合わせのために、既に与えられた別のこのような画像と対にすべきである。位相差画像にはあるとしてもごくわずかな差異しか示されないはずであるので、蛍光性に基づく画像に関して位相差画像を使用することが望ましい。
【００９６】
位置合わせが一画像に関して行われ、次の撮像が続く場合、このような後で作成される画像も同様に配列されるか又は重ね合わされる。後の走査／撮像をこのように行って、コンピュータプロセッサがステージ移動（一般にＸ軸移動及びＹ軸移動）を指示して、後のコンピュータ処理が画像を配列するために必要ではないように画像を配列することが好ましいが、全ての撮像が完了した後（つまりオフラインで）画像の位置合わせを行なう代替の手法がある。すなわち、記憶された画像データが、記載された行列手法を使用して配列され得る。通常、基準点又は記憶された基準位置を使用することが、行列法で行われる精細な配列の前に行われる大まかな配列のために望ましい。従って、オンライン及びオフラインの両方の位置合わせ技術が本明細書により教示されている。
【００９７】
本発明の本態様の典型的な実施では、コンピュータプログラムが二対の画像の取り込みを指示する。コンピュータプログラムは、第１の位相差画像及び第１の蛍光画像の取り込みを指示し、次にシステムの蛍光放射フィルタホイールの移動及びその後の第２対の位相差画像及び蛍光画像の取り込みを指示する。フィルタホイールの移動が基準系における画像のずれの原因になり得るので、（フィルタホイールが静止している間に収集された）各対の位相差画像及び蛍光画像が配列される。しかしながら、例えばフィルタホイールの移動によって引き起こされるシステムの摂動により、第１対及び第２対の画像が他方の画像に対してずれる／位置ずれする場合がある。ずれは、存在する場合、少なくとも位置合わせの点で蛍光画像に相当するより比較可能な位相差画像由来の行列を使用した上記の行列法を採用するコンピュータ制御によって自動的に補正されてもよい。他の実施形態では、フィルタホイールの移動はシステムの摂動を引き起こさず、上述したような補正するための配列が不要である。
【００９８】
カメラ
図３に戻り、撮像システムがカメラ14を備えてもよい。ある実施形態では、放射光の量を減らし得る顕微鏡本体内の余分なミラーの必要性をなくすために、カメラが顕微鏡本体の真下に置かれていることが好ましい。
【００９９】
ある態様では、カメラはCCD カメラである。実施形態の態様は、Andor EMCCD iXon3 888 CCD カメラのようなElectron Multiplying CCD (EMCCD) カメラを含んでもよい。注目するカメラは、Andor EMCCD iXon3 860カメラ、iXon3 897カメラ及びiXon3 Ultra 897 Ultra CCD カメラを更に含むが、これらに限定されない。EMCCD が、大きな視野とスペクトルの広範な部分に亘る電子転換に対する光の高量子効率とを可能にし得る。カメラは、Andor Neo 5.5 又はZyla 5.5のようなCMOSカメラであってもよい。CMOSカメラは、より迅速な生体処理を研究すべく高周波（100fps）で撮像しながら、大きな視野の収集を可能にする。
【０１００】
本開示の撮像システムで使用されるカメラは、フルセンサを読み出すとき、30ミリ秒以下、20ミリ秒以下、10ミリ秒以下又は５ミリ秒以下を含む50ミリ秒以下のような100 ミリ秒以下の露出を有していることが好ましい。ある実施形態では、本開示の撮像システムで使用されるカメラは、100 ミリ秒〜５ミリ秒、例えば50ミリ秒〜５ミリ秒、30ミリ秒〜５ミリ秒、20ミリ秒〜５ミリ秒又は10ミリ秒〜５ミリ秒の露出を有していることが好ましい。
【０１０１】
ある態様では、本開示の撮像システムで使用されるカメラは、1.5M以上、例えば2M以上、2.5M以上又は3M以上などの1M以上の能動画素を含む。ある態様では、画素が約0.3 μｍの実際の物理寸法に相当する。更に、ある態様では、本開示の撮像システムで使用されるカメラは、150mm2以上、例えば約150mm2〜約175mm2、約175mm2〜約200mm2、約200mm2〜約225mm2、約225mm2〜約250mm2、約250mm2〜約300mm2、約300mm2〜約400mm2、約400mm2〜約500mm2、約500mm2〜約750mm2、約750mm2〜約1000mm2 、又は約1000mm2 以上のセンサ領域を有する。
【０１０２】
ある態様では、試料の画像を取得する際に、多波長画像の波長成分への逆畳み込みを行う。このような逆畳み込みを行うあらゆる便利な手段が、T Zimmerman, et al. FEBS Letters 546:87-92 (2003)、 ME Dickinson, et al. Journal of Biomedical Optics 8:329-338 (2003)、 Y Hiraoka, et al. Cell Structure and Function 27: 367-374 (2002)、 T Zimmerman. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 95: 245-265 (2005)、 JM Lerner and RM Zucker. Cytometry A 62: 8-34 (2004)、 R Lansford, et al. Journal of Biomedical Optics 6: 311-318 (2001)、 RA Neher and E Neher. Journal of Microscopy 213: 46-62 (2003)、 Y Garini, et al. Cytometry A 69: 735-747 (2006)、 RM Levnson and JR Mansfield. Cytometry A 69: 748-758 (2006)、 RH Berg. Journal of Microscopy 214: 174-181 (2004)、 C. Spriet, et al. Microscopy Research and Technique 70: 85-94 (2007)、 C. Thaler, et al. Biophysical Journal 89: 2736-2749 (2005)、 D. Megias, et al. Microscopy Research and Technique 72: 1-11 (2009)、及びY. Chen, et al. Journal of Microscopy 228: 139-152 (2007)に記載されている手法を含むがこれらに限定されない注目する手法と共に採用されてもよい。これらの開示内容は参照によって本明細書に組み込まれる。例えばある態様では、このような逆畳み込みは、CCD の水平寸法に沿って放射光を分散させるために、垂直照明スリット及び格子を使用するライン走査法によって実行される。この場合、CCD は、垂直寸法に沿った空間分解能及び水平寸法に沿ったスペクトル分解能でスリット位置毎にフル画像として読み出す。代わりに、複数のCCD が放射光を同時に取り込んでもよい。この場合、一連のフィルタを使用してある波長の放射光を異なるCCD に導く。どちらの実施でも、試料中の各プローブのスペクトルが既知である場合、リニアアンミキシングが重なるスペクトルを更に逆畳み込みするために使用され得る。
【０１０３】
光源
本開示のシステムは、広いスペクトル出力を有する光源を備えてもよい。ある態様では、光源はキセノン光源22及び光ファイバ24を有している。注目する光源は、LED ／固形光源を更に含むが、これらに限定されない。
【０１０４】
ある態様では、光源の出力が調整可能である。システムの態様は自動出力調整を含む。ある実施形態では、制御プロセッサがキセノン光源22の出力を調整するように構成されている。ある態様では、出力は特定の試料に適合される。例えば、プロセッサが、（例えば試料識別サブシステムを使用して）読まれるべき一又は複数のパラメータファイルを含む試料を識別するように構成されてもよい（例えば図18参照）。プロセッサによって読まれてもよいこのような１つのパラメータは、試料を撮像するときに適用されるべき光の出力レベルを含んでもよい。プロセッサは、このような制御を与えるべくキセノン光源22と直接的に又は撮像デバイスソフトウェアを介して通信してもよい。
【０１０５】
ある態様では、光源はフィルタホイールを含んでもよい。光源がフィルタホイールを含んでいる場合、フィルタ位置は夫々指定された強度レベルと関連付けられてもよい。フィルタが指令されるとき、指定された強度レベルが自動的に選択されてもよい。
【０１０６】
本開示のシステムの実施形態は、約300 〜700 nmを含む約200 nm〜約800 nmの出力範囲を有するキセノン光源を含んでもよい。
【０１０７】
ある態様では、キセノン光源は、フィルタホイールのための一体化された10-B制御部及びSmartshutter（Sutter Instrument Co.）を有するLambda XL 光源のようなLambda XL 光源であってもよい。
【０１０８】
光学フィルタ
撮像システムは一又は複数のフィルタを備えてもよい。ある態様では、フィルタは、フィルタホイール10又はフィルタホイール及びシャッタの組み合わせ20に存在してもよい。フィルタホイール10又はフィルタホイール及びシャッタの組み合わせ20は、光源22及びカメラ14間に置かれてもよい。
【０１０９】
本システムの態様で使用されてもよいフィルタは、単一バンドのバンドパスフィルタ、エッジフィルタ、バンドパスクリーンアップフィルタ、ノッチフィルタ、ダイクロイックビームスプリッタ、偏光フィルタなどを含む。
【０１１０】
フィルタは、試料中にあってもよい一又は複数の蛍光体に対応すべく選択されてもよい。このような蛍光体の例は、インドカルボシアニン（C3）、インドジカルボシアニン（C5）、Cy3 、Cy3.5 、Cy5 、Cy5.5 、Cy7 , Texas Red、Pacific Blue、Oregon Green 488、Alexa fluor-355、Alexa Fluor 488、 Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor-555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、JOE、Lissamine、 Rhodamine Green、BODIPY、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、カルボキシフルオレセイン（FAM ）、フィコエリトリン、ローダミン、ジクロロローダミン（dRhodamine）、カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ROX ）、LIZ 、VIC 、NED 、PET 、SYBR、PicoGreen、RiboGreenなどを含むが、これらに限定されない。
【０１１１】
ある態様では、フィルタは市販のフィルタ（例えば、Semrock Brightlineフィルタ）である。フィルタは、光源22の高出力に対応すべく特別に覆われてもよい。フィルタの特定の波長、フィルタの数及び他の変数は、例えば撮像される試料の特定のタイプ、特定の一又は複数の蛍光チャネル、及び本技術分野で当業者に公知の他の要因に基づいて変わってもよい。
【０１１２】
自動焦点調節部
ある態様では、自動焦点調節部は、対物レンズの先端から試料プレートの底面までの距離を決定すべく試料プレートの底面にLED によって生成される長波長光（例えば870 nm）の反射を利用するニコンのTiE Perfect Focus System （PFS ）によって設けられるような自動焦点調節要素を含んでいる。このため、システムは、試料プレートの位置における機械的及び熱的に引き起こされる変化を自動的に補正することが可能になる。長波長のLED を利用することにより、PFS が、340 〜750 ナノメートル間の波長帯で放射する様々な蛍光体と共に使用され得る。
【０１１３】
他の態様では、Metamorph （Universal Imaging Corporation（UIC ））又はカスタマイズされたソフトウェアからの市販の撮像ソフトウェアは、ステージ制御部40によって顕微鏡を自動的に焦点調節し得るソフトウェアドライバを備える。ドライバは、Ｘ−Ｙステージ位置及びＺ軸焦点ノブ42を制御するモータに信号を送信する。ステッピングモータ（不図示）がこのような移動を自動化するために使用されてもよい。一般に、システムの光学素子によって収集される画像を焦点調節するために、高速フーリエ解析が画像の空間周波数を測定するために行なわれ、その後、コンピュータがＺ位置を移動させて新たな深さで解析を繰り返す。焦点面に相当する空間周波数の極大値が決定される。上述したように、（光毒性を制限するために）露光間隔を短くして取得時間を短くすることが必要であるので、（エピ蛍光画像ではなく）透過光が焦点調節のために使用されることが好ましい。CCD カメラの解像度は、速度を増加させるべく焦点面を決定するための画像取得中、低下され得る。このため、取得速度が最高１００倍まで改善され、光毒性が著しく低減される。
【０１１４】
本実施形態は、上述したPerfect Focus System（PFS ）及びＺ面焦点調節の両方の使用を含んでいる。特に長焦点距離の対物レンズが使用される場合、底部が薄い試料（例えばマルチウェルプレート）を使用するときにこのような実施形態は有用であってもよい。ある実施形態では、PFS は、「ロック（lock）」を得るのが困難である及び／又は不可能である場合がある。従って、このような実施形態では、PFS の前にＺ面焦点調節を行ってもよく、これによりPFS が「ロック」を得ることが可能になり、システムをより堅牢にする。
【０１１５】
周辺機器のソフトウェア制御
上述したように、システムが、システム及び／又はサブシステムを制御するように構成された一又は複数のプロセッサを含んでもよい。ある態様では、システム又はシステムのサブシステムにバルク試料の保管を容易にさせる、バルク試料保管場所から特定の試料を取り除かせる及び／又は識別させる、撮像デバイス上に試料を置かせる、撮像デバイス上の試料を配列させる、試料を撮像させる、バルク試料保管場所に試料を置かせる、及び／又は撮像された試料の一又は複数の画像を処理させるために、一又は複数のプロセッサが一又は複数のソフトウェアモジュールからの命令を実行してもよい。
【０１１６】
図18は、本開示のシステムを制御するための処理を示す構成図である。本実施形態では、一又は複数のパラメータファイルがスケジューリングソフトウェア（例えばBioSero社からの特注ソフトウェア）により読み出される。パラメータファイルは特定の試料タイプに適合されてもよく、試料識別サブシステムが特定の試料を識別するために使用され、プロセッサがその試料のための一又は複数の特定のパラメータファイルを識別するように構成されている。
【０１１７】
従って、処理、撮像及び／又は画像処理が夫々、特定の試料に適合されてもよい。試料がマルチウェルプレート上にある場合、そのマルチウェルプレートの各ウェル自体が、一又は複数の個々のウェルに関して取扱い、撮像及び／又は画像処理を指定する一又は複数の特定のパラメータファイルを有する。例えば、マルチウェルプレートのための使用法が薬物スクリーニング及び／又は遺伝スクリーニングを含んでもよく、このようなスクリーニングでは、薬物修飾因子又は遺伝修飾因子のような単一の条件だけが、測定された結果への影響を決定するために各ウェルで変更される。各ウェルにおける実験は実際には同一であるので、この実験は測定されるウェルの各々に同一の撮像パラメータを含んでもよい。本開示のシステムによって可能になる代替の使用法は、他のウェル又は複数群のウェルに無関係な実験を行うために、各ウェル又は一群のウェルを使用することである。これらの実験は、スクリーニングが通常行うものとは測定される細胞のタイプ、包含される撮像領域、測定されるバイオセンサ又は撮像の周波数のような多くの点で異なってもよい。実験の要件に各ウェルを適合させる能力は、(i) 近くの実験の制約により準最適な撮像パラメータを選択する費用なしで実行され得る実験の数を増加させる、(ii)  所与の数の実験に必要なプレートの数を減らすことにより材料費を削減する、及び(iii) 実験が細胞への不確かで不規則なアクセスに適合され得るなどの複数の利点を有する。例えば、iPS （誘導多能性幹）細胞は、特定の細胞のタイプまで成熟させるために数週間から数ヶ月間必要とする。細胞死又は低分化により複数のウェルが失われることが一般的であるが、その数の予測は容易ではない。単一のプレートで複数の実験を実行可能なことにより、実験者が利用可能なウェルの数及び質に調査を適合させることが可能になる。
【０１１８】
更にある態様では、実験に必要な開始光学刺激がある場合、又は異なる撮像パラメータを必要とする実験中に異なるステージ／問い合わせがある場合、時点に特有の撮像パラメータが更に又は代わりに使用され得る。例えば、細胞の生存に対する細胞内のフォトスイッチ可能なタンパク質の代謝回転率を関連付ける光パルス追跡実験が、両方のポイントを十分実証している。フォトスイッチ可能なタンパク質の集団を標識化するために、短波長光のパルスが実験の第１時点で適用される。次の複数の時点では高周波で行われてもよく、細胞と細胞内のフォトスイッチされたタンパク質の量との両方を追跡するために複数のチャネルで撮像する。細胞の生存には通常十分に低い周波数で行われ、細胞死を追跡するために細胞のモルフォロジマーカのみを撮像する。
【０１１９】
本開示のシステム及び方法の実施形態は、一又は複数の試料の処理、撮像及び／又は画像処理を制御すべく使用されるランタイム解析を行うことを含む。例えば、ある実施形態では、ある数の対象が撮像されるまで領域が走査されるか、又は画像が収集され、対象の数はユーザ定義のパラメータであってもよい。実験の実行中の画像の分析は、実験の要件に応じて撮像パラメータを変更することができる対話型のランタイムを可能にする。これらの要件の例は、条件間の統計的に関連する比較のために撮像された細胞のある最小数、カメラの線形領域内にある細胞の蛍光強度のある範囲、又は、動態を研究するための数分間に亘る毎秒毎の撮像又は高解像度スペクトル撮像のような、プレート上で撮像されるあらゆる位置で実行するには非実用的な時間がかかる撮像プロトコルを含むが、これらに限定されない。ある態様では、ある対象が撮像されて検出されるとき、一又は複数のパラメータ（例えば、適用される一若しくは複数のフィルタ又は撮像の周波数のような撮像パラメータ）が変更されてもよい。
【０１２０】
図18に再度戻ると、スケジューリングソフトウェアは統合ソフトウェアとインターフェースしてもよく、統合ソフトウェアはシステムの一又は複数の要素と通信する。統合ソフトウェアは、所与の要素に関して一又は複数のドライバとのインターフェースを有してもよく、パラメータファイル及びスケジューリングソフトウェアによって決定されるような一又は複数の動作をドライバに行わせる。更に、統合ソフトウェアは、撮像デバイスを制御すべく撮像デバイスソフトウェア（例えばマイクロマネージャソフトウェア）とインターフェースしてもよい。本技術分野における当業者によって認識されるように、ソフトウェアモジュールを（例えばアプリケーションプログラミングインターフェース（API ）を介して）接続する特定の手段が、使用される特定のソフトウェアモジュールによって指示される。ある態様では、ソフトウェアモジュールを接続する手段はクライアント／サーバ関係を含んでもよく、クライアント／サーバ関係では、１つのモジュール（例えばスケジューリングソフトウェア）がサーバとして機能し、一又は複数のクライアント（例えば撮像デバイスソフトウェア）への命令を発する。
【０１２１】
ある態様では、ソフトウェア（例えばスケジューリングソフトウェア）が実行時間の競合を管理すべく使用されてもよい。例えば、システムが複数の試料、複数の撮像デバイス、複数の搬送デバイス、異なる試料タイプの混合物などを含んでいる場合に、実行時間の競合が生じる場合がある。ある実施形態では、スケジューリングソフトウェアは、開始時刻及び／又は優先度により試料のための実行時間を決定する。例えば、全ての実験が、(i) 一又は複数の開始時刻及び／又は(ii)継続時間で最初にプログラムされてもよい。実験が例えばユーザによってスケジューリングプログラムに入力されるとき、優先度が割り当てられてもよい。スケジューリングソフトウェアは、以下のアルゴリズムに基づいて実行すべく次の試料（例えばマルチウェルプレートのようなプレート）を決定してもよい。
【０１２２】
１．開始時刻の順に実行すべき試料のリストを作成する。リストは、既に過ぎているが未だ顕微鏡に送信されていない開始時刻の試料を含んでもよい。
２．各実験の継続時間を使用して、実験の開始から終了までのあらゆる時点で競合する一又は複数の実験を決定する。
３．実験がより高い優先度の別の実験と競合する場合、実行すべき次の試料としてその実験を考慮から除く。任意には、予定された開始時刻から経過した時間の量に基づいて実験の優先度を上げる機能を含める。このため、優先度が低い試料でも最終的に確実に実行される。
４．そのため、リストの第１アイテムは、より高い優先度の別の実験の開始前の時間内に適合し得る近くの実験のコンテキスト内の優先度が最も高い実験である。その第１の実験を実行する。
【０１２３】
他の態様では、スケジューリングソフトウェアが更に又は代わりに競合を決定するためにカレンダを利用してもよい。実験の開始時刻及び継続時間が、水平線として表わされるカレンダのようなカレンダにマッピングされる。実験の開始から終了までのあらゆる時点で競合する実験は、競合する実験の内の１つを標準線より下の水平線に置くことにより合図される。
【０１２４】
ある態様では、処理制御が、並列に出される一又は複数の命令を含む。図19は、命令が並列に及び／又は略同時に出される実施形態を示す。本実施形態では、統合ソフトウェア及び／又は撮像デバイスソフトウェアは、一又は複数のプロセッサに顕微鏡ステージを移動させて、励起フィルタを変更させ、放射フィルタを変更させ、ポリクロイック（polychroic）を変更させ、照射強度を変更させ、撮像デバイスの焦点面を略同時に変更させる。このような動作にかかる時間は様々であり得るので、システムは、少なくとも最も遅い動作が完了し得るために休止してもよい（例えば、同期点を有してもよい）。この同期点の後、システムはシャッタを（例えば定められた期間）開け、露出して閉じてもよい。シャッタを閉じる際に、システムは、画像を移して、顕微鏡ステージを移動させて、励起フィルタを変更し、放射フィルタを変更し、ポリクロイックを変更し、照射強度を変更して撮像デバイスの焦点面を変更することを含む複数の動作を並列に及び／又は略同時に再度行ってもよい。画像を記憶すると、以下に述べられているような更なる処理を画像に行ってもよい。
【０１２５】
本開示のシステムは通知／アラームを作成してもよく、このような通知／アラームは、ハードウェア、ソフトウェア又はこれらの組み合わせを使用して作成される。例えば、システムは、システム電源、環境制御（例えばバルク試料保管サブシステム内の温度、C02 濃度など）のような因子をモニタする（例えば連続的に又は個別にモニタする）一又は複数のセンサを含んでもよい。常時電力を確保するために、システムは、自家発電による電力をシステム（又はシステムのサブシステム）に供給して、補助発電機が開始するまで即時の電源として機能する一又は複数の無停電電源装置（UPS ）を含んでもよい。停電の場合には、システムは、テキスト及び／又は電子メールのようなあらゆる便利な手段によって担当責任者に通知を送信するように構成されてもよい。更に、システムは、システム条件（例えば環境制御）における変動が観察される実験の変化に関連付けられ得るように、システムの性能及び調子をモニタしてこのような情報を非一時的に記憶すべく構成されたハードウェア及び／又はソフトウェアを含んでもよい。
【０１２６】
画像処理
ある態様では、本開示のシステムは、上述したように取得された画像を処理するように構成された一又は複数のプロセッサを含んでもよい。以下に詳述するように、このような処理は、特定の試料に関する画像を編成する、特定の試料に関する２以上の画像を共につなぎ合わせる、画像を配列する、画像内の対象（例えばニューロンのような細胞）を識別する、時系列の画像によって対象（例えばニューロンのような細胞）を追跡する、画像内で識別された対象からデータ（例えば蛍光データ）を抽出する、及び／又はその結果の画像を分析する、の内の一又は複数を含んでもよい。
【０１２７】
本開示のシステムは単一のパイプライン手法を使用してもよく、この手法では、パイプラインにおける後の工程が夫々前の工程からの画像に作用する。システムは更に又は代わりに、複数の、例えば２以上、３以上、４以上、５以上又は10以上のパイプラインの画像解析を使用してもよい。つまり、ある態様では、複数のパイプライン全てが一又は複数の元の画像に作用して、各パイプラインからの一又は複数の画像を組み合わせて、分割領域のような結果を生成する。更に又は代わりに、１つのパイプラインから得られる情報が同じ又は別のパイプラインの前処理工程で使用されるように、これらの複数のパイプラインは反復要素又は連続要素を更に有してもよい。
【０１２８】
例えば、試料（例えばニューロンのような細胞を含む場合がある試料）が複数の撮像パイプラインによって撮像されてもよく、試料を分類すべく各々の撮像結果が組み合わせられる。例えば、ニューロンを含む試料は、第１、第２及び第３撮像システムと第１、第２及び第３パラメータファイルとを夫々使用する第１、第２及び第３パイプラインを用いて撮像されてもよく、各パイプラインは領域をニューロンとして分類するか又は分類しない。連続ではなく平行なパイプラインには、以下を含む複数の利点がある。(i) 各パイプラインは、偽陽性率を不利に増加させずに（偽陰性率を低く維持するのを支援する）あまり厳密ではないパラメータを有することができる。(ii)  分割された細胞のタイプに決して存在すべきでないか又はめったに存在すべきでない特性を検出する（領域の最小／最大のような単純な限度とは対照的な）より複雑な負フィルタが使用され得る。(iii) 特に高感度ではないが、ニューロン又は非ニューロン細胞の確実な指標であるフィルタが、以下に述べるようにファジーな組み合わせで使用され得る。図25Ａ及び図25Ｂは、強度及び空間分割を使用した分割へのこのような手法が、感度を犠牲にせずに特異性を高めた結果を示す。
【０１２９】
個々のパイプラインからの個々の結果が（例えばニューロンとして分類されるべき対象に関する全てのパイプラインによる領域のニューロンとしての確実な識別を必要とする）絶対的な分類又は（例えば個々のパイプラインの結果の採決及び／又は重み付けされた組み合わせによる）ファジーな分類のようなあらゆる便利な方法を使用して組み合わせられてもよい。このような組み合わせ及び分類は、遺伝的アルゴリズム、ニューラルネットワーク、隠れマルコフモデル、ベイジアンネットワーク、サポートベクタマシンのような一又は複数の統計的アルゴリズム又は学習機械アルゴリズムを適用することを含んでもよい。ある態様では、上記の絶対的又はファジーな組み合わせに起因する画像の分割が、最後の２値画像上の輪郭、又は、所望の細胞モルフォロジをより完全にアウトライン化する分割との最後の２値画像の重なりの少なくとも２つの方法の内の１つを使用して行われ得る。並列のパイプラインが細胞が適切な細胞のタイプであるか否かをより正確に判断し得る一方、組み合わせは、細胞の所望の全領域又はサブ領域を正確に反映し得ない。従って、強度分割内の領域が最終の組み合わせられた画像から十分な数の正の画素を含んでいる場合、強度分割のような前の又は他の分割は輪郭として使用され得る。
【０１３０】
ある態様では、画像処理は、一又は複数のマシンビジョンアルゴリズムの適用を含む。注目するマシンビジョンアルゴリズムの例は、Jain, Ramesh, Rangachar Kasturi, 及びBrian G. Schunck. Machine vision. Vol. 5. New York: McGraw-Hill, 1995年、Sonka, Milan, Vaclav Hlavac, 及びRoger Boyle. "Image processing, analysis, and machine vision." 1999年、Davies, E. Roy. Machine vision: theory, algorithms, practicalities. Morgan Kaufmann, 2004年及びHornberg, Alexander, ed. Handbook of machine vision. Wiley- VCH, 2007年に記載されているアルゴリズムを含むが、これらに限定されない。これらの開示内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１３１】
画像の編成
ある態様では、プロセッサが、所与の試料に関する一又は複数の画像ファイルを編成すべく一又は複数のソフトウェアモジュールを実行するように構成されている。ソフトウェアモジュールは、ファイル名の変更、一若しくは複数のディレクトリの作成、一ファイルタイプの異なるファイルタイプへの自動変換、一若しくは複数の画像のアップ変換又はダウン変換の編成タスクの内の一又は複数を行なってもよい。
【０１３２】
ある態様では、ソフトウェアモジュールが、ユーザ定義の接頭語及び／又は接尾語を有するユーザ定義のパスのファイルを識別する。図20Ａは、ユーザ定義の接頭語及び接尾語を有するファイル名の非制限例を示す。ここで、画像ファイルは、取得日、実験名、時点、時間、蛍光チャネル、ウェル、モンタージュ指標及びファイルタイプに関する情報を与える名前で作成されている。
【０１３３】
図20Ａからの例を使用すると、ソフトウェアモジュール（例えばPerlスクリプト、Pythonスクリプトなどのスクリプト）が、接頭語「PID 」及び／又は接尾語「.tif」を有するユーザ定義のパスのファイルタイプ全てをプロセッサに識別させるように構成されてもよい。このようなファイルの名前は、regex エンジン（例えばPerl regexエンジン）を使用するなどしてパースされてもよい。ファイルの名前がパースされると、プロセッサは、図20Ｂに示されているような複層のファイル編成構造を作成してもよい。本例では、ディレクトリが未だ作成されていない場合、実験名を有するディレクトリがユーザ定義のパスに作成される。そのディレクトリ内に、個別のサブディレクトリが、実験の蛍光チャネル（例えば「RFP 」、「GFP 」など）毎に作成されてもよい。各蛍光チャネルサブディレクトリ内に、サブディレクトリが、記録される時点（例えば、T0，T1，・・・T8）毎に作成されてもよい。サブディレクトリが時点毎に作成されてもよく、この場合、個別のサブディレクトリが試料のウェル毎に作成される。例えば、96ウェルプレートに関して、合計96のサブディレクトリが、ウェルAl，A2，・・・H10 ，H11 ，及びH12 に対応して時点毎に作成されてもよい。ウェル毎に、個別のサブディレクトリが作成されてもよく、この場合、モンタージュ指標毎の画像が記憶される。或いは、全ての画像が単一のルートディレクトリに含まれることができ、画像ファイル名が分析中にパースされて編成され得る。言い換えれば、ある実施形態では、階層的なフォルダ構造を利用する必要がない。代わりに、全ての画像が単一のルートフォルダ内に含まれ得る。
【０１３４】
上述したように、システムは、組織培養皿で長時間（数日間から数ヶ月間）維持され得る組織培養プラスチック上で成長する生細胞の撮像を可能にするように構成されてもよいことが好ましい。従って、ある態様では、多くの時点が所与の実験に採用されてもよい。図20Ｂに示されているようなファイル構造は、あらゆる便利な手段によって更新されてもよい。ある態様では、一又は複数のソフトウェアモジュールが、図20Ａに示されているタイプの所与のファイルに関して以下のタスクを行なってもよい。ファイル名が解析されると、ソフトウェアは、実験名に対応するディレクトリが存在するか否かを調べてもよい。ディレクトリが存在しない場合、ディレクトリが作成される。そうではない場合、システムは、蛍光チャネルに対応するサブディレクトリが存在するか否かを調べる。蛍光チャネルに対応するサブディレクトリが存在しない場合、サブディレクトリが作成される。そうではない場合、システムは、特定の時点に対応するサブディレクトリが存在するか否かを調べる。ほとんどの場合、このようなディレクトリは存在せず、作成されなければならない。そのサブディレクトリ内に、システムは、ファイル名（例えば「Al」）で識別される所与のウェル用のサブディレクトリと、モンタージュ指標番号に対応するそのサブディレクトリ内の対応するサブディレクトリとを作成する。その後、ファイルは、ユーザ定義のパス内に含まれるあらゆる他のファイルに関して繰り返される処理でそのサブディレクトリに移動されるかコピーされる。
【０１３５】
ディレクトリが既に生成されているか否かを調べるための手段、ディレクトリを作成するための手段、ファイル名を変更するための手段、及び／又はファイルを移動させるための手段は、本技術分野で公知である。
【０１３６】
画像のつなぎ合わせ
ある態様では、２以上の画像が特定の試料（例えば特定のウェル）に関して得られてもよい。モンタージュ画像を生成するために、個別の画像がつなぎ合わされてもよい。図21Ａ及び図21Ｂは、モンタージュ画像の構造の一般原則を示す図である。図21Ａは、撮像されたマルチウェルプレートの個々のウェルの９つの画像を示す。画像毎に、破線で示されている領域は、直接隣り合う画像の破線で示されている領域と略同一の画像の領域に相当する。その後、これらの画像は一又は複数のソフトウェアモジュールを使用してつなぎ合わせられ、図21Ｂに示されているようなモンタージュ画像が生成される。図21Ｂから明らかなように、生成されたモンタージュ画像は、２以上の個別の画像からのデータが作成されたモンタージュ画像を構成する一又は複数の領域を含む。
【０１３７】
様々なつなぎ合わせソフトウェアモジュールが本開示のシステムに使用されてもよい。ある態様では、つなぎ合わせソフトウェアモジュールは、画像を特定の座標で重ね合わせるリジッドステッチを行ってもよい。ある態様では、つなぎ合わせソフトウェアモジュールは、配列性を高めるように画像の位置を調整すべく重ね合わせ領域の画素情報を使用するフレキシブルステッチを行なってもよい。フレキシブルステッチを使用する場合、（例えばメモリに）記憶されてもよい座標を計算するために一次細胞マーカチャネル（例えばRFP ）を使用してもよい。ある態様では、その後の全てのチャネル（例えばGFP など）でこの情報を読んでもよく、そのため、異なるチャネルからの画像が完全に配列される。
【０１３８】
注目するステッチアルゴリズムの例は、S. Preibisch等著，Bioinformatics，2009年，25(11): 1463-1465に記載されているアルゴリズムを含むが、これに制限されない。この開示内容は参照によって本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、特注（例えばPilot スクリプト）又は市販のソフトウェアのようなソフトウェアが、モンタージュ内の画像の開始位置を計算するために使用される。その後、（例えば、ImageJのStitching のプラグインを使用する指令「Stitch Collection of Images」を使用して）これらの画像をつなぎ合わせてもよい。ある態様では、フュージョン法がリニアブレンディングに設定され、regression = 30；max/avg = 2.5 及びabsolute = 3.5でこのようなステッチが行われる。
【０１３９】
図21Ｃは、96マルチウェルプレートからの単一のウェルのモンタージュ画像を示しており、リジッドステッチアルゴリズムがモンタージュ画像を形成するために使用された。
【０１４０】
画像の配列
ある態様では、その後の分析が画像（例えば細胞の追跡など）に関して行われる前に、インシリコ画像配列工程を行なうためにプロセッサが使用されてもよい。ある実験では数時間以上（例えば12〜24時間以上）経過した後に夫々の画像を取得するので、プロセッサが必要な場合がある。生体試料を用いて作業するとき、細胞が各時点間で移動しているか、死んでいるか又は強度変化している場合がある。更に、追加のシフトが顕微鏡ステージヒステリシスによって導入される場合がある。
【０１４１】
ある態様では、x=u+△u によって画像座標をマッピングすべく画素強度を使用する。各時点T(t)はT(t-l)に配列される。ここでt=｛２．．．Ｎ｝である。ある実施形態では、基準と画像（二次元）又は体積（三次元）であり得るテストデータセットとの不偏分散強度差を最小化する自動的なサブ画素位置合わせアルゴリズムを使用する。ある態様では、実質的にはP. Thevenaz等著，IEEE Transactions on Image Processing, vol. 7, no. 1, p. 27-41, 1998年１月に記載されているように、画像配列が行われる。この開示内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１４２】
ある実施形態では、ImageJ（Abramoff等著，Biophotonics International 11，2004年，p.36-42に記載されている）からの一又は複数のソフトウェアモジュールを使用してもよい。この開示内容は参照によって本明細書に組み込まれる。ある態様では、画像配列を行うべくソフトウェアモジュールによってImageJのプラグインのStackReg＿.jar，MultiStackReg.jar及び／又はTurboReg＿.jarを使用する。
【０１４３】
細胞の識別
本システムの態様は、画像から特定の要素（例えば細胞）を識別すべく一又は複数のソフトウェアモジュールを含んでもよい。
【０１４４】
対象を標識化する工程の一般的な記述が、モンタージュ画像のような画像内で対象（例えば細胞）を標識化及び／又は追跡するための方法のフローチャートである図22Ａに示されている。図22Ａに示されているように、方法600 では、画像を前処理する601 。画像が一又は複数の前処理工程を受けるように、このような前処理工程601 は反復及び／又は繰り返されてもよい。その後、前処理された画像を、一又は複数の対象を検出する(602) ために分析する。フィルタリング工程603 を採用してもよく、対象を追跡してもよい604 （例えば経時的に追跡してもよい）。
【０１４５】
本方法600 を実行する際に、あらゆる便利な前処理、対象検出、フィルタリング又は追跡の方法を採用してもよい。例えば、細胞を識別するための方法のある態様では、本方法は、平坦な視野の参照画像、疑似の平坦な視野の参照画像を使用及び／又は取得する、及び／又はFFT バンドパス機能を使用するなどして平坦な視野の補正工程を有する。中央又は他の百分位数の測定基準を使用する、又は画像に対して背景のモデルを適合させて引くなどのあらゆる便利な手段を使用して平坦な視野の参照画像を計算してもよい。適切な平坦な視野の補正技術は、JA Seibert等著，Medical Imaging 1998: Physics of Medical Imaging，348 ，1998年７月24日に記載されている技術を含む。この開示内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１４６】
図22Ｂは、このような方法600 の更に具体的な実施形態を示す。この方法700 では、モンタージュ画像を生成する工程701 、コントラストを強調してビット深度を下げる工程702 、及び平滑化する工程703 が、図22Ａの例を使用した前処理工程601 に相当する。同様に、ピークを検出する工程704 が、対象を検出する工程602 に相当する。本方法700 におけるエロージョン及びダイレーションを行う工程705 、及びモルフォロジフィルタを適用する工程706 が、フィルタリング工程603 に相当する。最後に、本方法700 における対象を標識化する工程707 、及び対象を追跡する工程708 は、図22Ａの例を使用した追跡する工程604 に対応する。
【０１４７】
図22Ｂに示されているように、ある態様では、モンタージュ画像のような画像がまず、コントラストの強調及びビット深度の低下702 を受ける。平滑化する工程703 を採用してもよい。次に、ピーク検出アルゴリズム704 を使用して、画像ヒストグラム中のユーザ定義の閾値より上のピークを識別する。ある態様では、閾値は約95％である、及び／又はピーク領域が周囲領域より２倍以上大きい必要がある。ピークは、絶対ピーク及び定められた範囲内の周囲画素（例えば８つの隣接画素全て）として定められる。次に、薄い対象を除去するために画像のエロージョン及びダイレーションを行う705 。例えば、約５画素以下のような約10画素以下の半径を有する対象が除去されてもよい。
【０１４８】
ある態様では、面積、偏心性及び／又は円形度に基づいて対象を除去するモルフォロジフィルタのようなモルフォロジフィルタ706 を適用する。モルフォロジフィルタの適用706 の後、対象を標識化して707 、追跡する708 。モルフォロジフィルタは、調査される試料の特定のタイプ、特定のハードウェア及び画像取得パラメータ、並びに本技術分野の当業者に公知の他の変数に応じて変わってもよい。ある態様では、試料がニューロンのような細胞を含む場合などでは、1392×1040 px CCD 上の20X 倍率での約800 〜1000の画素より小さな対象が除去される。実施形態は更に又は代わりに、対象を含めるか除外するためにバンドパスフィルタを利用してもよい。この場合、このようなバンドパスフィルタは、フーリエ変換、ガウシアンの差又は神経突起／距離マップとして実行される。
【０１４９】
円形度は式４π（面積／周囲2 ）を使用して定義される。ここで、１.0の値が完全な円を示し、０.0の値が次第に細長くなる多角形を示す。完全な円では、この数は１に等しい。この計算が画素で行われるので、非常に小さな対象ではこの基準はあまり意味がない（例えば１つの画素のみから構成される対象が１に等しい面積及び周囲の両方を有するので、対象が相対的に円に近くても、円形度は４πになる）。対象が大きくなるにつれて、この基準は向上する。例えば半径２の円では、面積が21であり、周囲が16（境界画素の数）であり、円形度が1.03である。
【０１５０】
ある態様では、０.8以上の円形度のカットオフ値を有する対象が保持される。ある態様では、０.1（例えば０.2）を超える偏心性の値を有する対象が保持される。ある態様では、約800 未満の画素の領域を有する対象が破棄される。残りのこれらの対象が標識化されてもよい。
【０１５１】
ある態様では、経時的に追跡された対象内の動的な変化に基づく一又は複数のフィルタを使用する。例えば、フィルタに関して、設定されたカットオフ値（例えば円形度のカットオフ値）を採用するのではなく、特徴に関する現在値と一又は複数の前の値との変化を測定するためのカットオフ値又は範囲を採用する。このようなフィルタは、例えば細胞の健康状態（例えば神経突起）を示す一又は複数の特徴に基づいてもよい。動的な変化を測定することによって、静的な特徴とは対照的に、このようなフィルタは、対象（例えば個々のニューロン）を経時的に追跡する長期的な実験を容易にすることができる。
【０１５２】
本開示のシステム及び方法の実施形態は、ニューロンの撮像を含む。このような実施形態では、細胞の識別として、細胞、例えばニューロンの機能状態及び／又は健康状態に関する情報を与えるために使用されてもよい、細胞の伸展体、例えば神経突起の特徴づけを含んでもよい。このような特徴づけは、例えば状態間の神経突起パラメータの差、神経突起パラメータの経時的な変化を追跡すべく使用され得る、及び／又は非ニューロン細胞に対してニューロン細胞を識別するための分割フィルタとして使用され得る。このような実施形態は、神経突起パラメータにおける細胞特異的な変化を調べるニューロン特異的な方法、及び／又は画像上若しくは画像外の細胞のいずれからであろうと、可視の神経突起の集団がどのように変化するかを調べる画像全体の方法の使用を含んでもよい。
【０１５３】
例えば、実施形態は、ニューロン特異的な方法の使用を含んでもよい。ある態様では、このような方法は、ニューロンの分岐の数、長さ及び／又は幅のトポロジー解析を含む。トポロジーの情報は、対象の周囲を構成する点の集合から抽出される。点毎に、周囲に沿った全ての他の点への距離のリストが計算される。場合によっては、対象内に長さが完全に含まれる距離のみが計算され、そうでなければ値は空のままか零にされる。この配列は、ｘ座標又はｙ座標が周囲に沿ったｎ番目の点を表わす距離マップと称される二次元画像として表され得る。画素強度が、リスト上の点♯ｘからリスト上の点♯ｙまでの距離を表わす。距離マップは対角線に沿って対称であるため、距離の半分のみが計算されて図示されてもよい。このように、距離マップ解析はモルフォロジ解析を強度解析に変換する。20〜30の画素より大きい距離（〜６−10ミクロン）を表わす全ての画素を除去するための画像の閾値処理により、神経突起として分類するには広過ぎる細胞の一部を除去する。閾値処理後に残存する対象の数を数えることにより、ニューロンの分岐の数が得られる。神経突起部分の長さは、対角線である対称線に最も近い点から開始して最も離れた点で終了する、分割後に残存する「谷（valley）」の長さである。神経突起部分間の結合は、神経突起部分で端点が別の端点と垂直方向又は水平方向に一致する神経突起部分を見つけることにより決定され得る。この手法は、神経突起を自動的に定量化するために使用され得る（例えば図26Ａ〜図26Ｅ参照）。
【０１５４】
更に、神経培養物中の神経突起の数を計数することにより、細胞の健康状態を迅速且つ高精度に評価することができる。細胞がタンパク質をもたらす神経変性疾患と対抗しているとき、神経突起の退縮がニューロンの死滅の前に起こることが多い。計算の複雑さを低くして神経突起を検出する一方法が、画像中の神経突起の全面積を定量化することである。ライン検出器が、ラインを表わす局所構造を有する画像中の画素を識別するために使用されてもよい。決定は、局所的な強度の曲率の測定値である二次画素データ（ヘッセ行列）に基づく。ある態様では、このような手法は以下のパラメータを使用する。
１．Sigma start = 1（予想されるライン幅に近づく）
２．Sigma step = 1（予想されるライン幅に近づく）
３．Sigma count = 1 （予想されるライン幅に近づく）
４．Betal = 0.5 （ブロブ状態に対する感度）
５．Beta2 = 25 （二次構造に対する感度）
【０１５５】
ライン検出器の出力は、１の値を有するラインの一部である画素と０の値を有する他の全ての画素とを有する２値画像である。その後、この２値画像の画素を合計して神経突起の全面積を定量化する。例えば、図24は、オートファジー誘導が筋萎縮性側索硬化症の疾患モデル（TDP43 M337V ）によって引き起こされる神経突起の退化を軽減することを示すグラフである。一次ニューロンは対照としてのGFP 又はTDP43 M337V でトランスフェクトされた。オートファジーが疾患モデルの表現型を救済するか否かを判断するために、疾患モデルのニューロンがフルフェナジン（0.1 μΜ ）又は媒体で処理された。画像をロボット顕微鏡で24時間毎に収集して、神経突起を上述したような自動解析を使用して定量化した。
【０１５６】
ある態様では、上記の工程の一又は複数が、Pipeline Pilot (Accelrys)からの高度な撮像ツールボックス、ImageJ、Matlab、Perkin Elmer Velocity、Media Cybernetics ImagePro Plus、Metamorph及び／又はNikon Elementsのような市販のソフトウェアを使用して行なわれてもよい。他の態様では、処理の一又は複数の工程が特注のソフトウェアモジュールによって行なわれる。
【０１５７】
細胞の追跡
上述したように、ある態様では、本システムは、以前撮像された視野と同一の視野（例えば同一の細胞）への正確な戻し及び同一の視野の再撮像を可能にすべく構成されている。従って、ある実施形態では、一又は複数のソフトウェアモジュールを使用して様々な時点に亘って細胞を追跡してもよい。
【０１５８】
所与の時点で、上述したようなアルゴリズム及び／又はモジュールを使用して対象を識別してもよい。所与の時点毎に対象を識別すると、前の及び／又は後の時点での対象の位置、強度、サイズ、円形度などを比較することにより対象を「追跡」してもよい。
【０１５９】
細胞追跡アルゴリズムは、多くの異なるタイプに分類され得る。例えば、質量中心細胞追跡アルゴリズムは、注目する対象の質量中心（重心）を計算する。全ての対象が、対象の形状及び強度の変化に関係なく互いに対して連続するフレーム間で全く同様に移動するとき、このアルゴリズムは最もよく機能する。対照的に、ガウス細胞追跡アルゴリズムは、ガウス曲線を強度プロファイルに直接適合させ、対象の移動が互いに対してランダムであっても対象の強度が連続するフレーム間で同一であるとき、最もよく機能する。別のタイプのアルゴリズムは、画像を連続画像の（ユーザ定義の）画素の行列と比較する相互相関アルゴリズムである。行列が１画素増分毎に画像に対してシフトされてもよい。増分毎に、行列中の値が画像の値とどの程度一致するかを示す相関値を計算して、プログラムが、最大相関値を与えるシフトを決定する。このアルゴリズムは他の２つのアルゴリズムより計算集約的であり、選択される行列の大きさに応じて解析を著しく遅くする。
【０１６０】
ある態様では、細胞は厳密な重なり合いに基づいて追跡されてもよく、２つの分割された対象が連続画像で重なる場合、後の画像中の対象は前の画像中の同一の標識に再度標識化される。他の態様では、細胞は最小の質量中心間距離及び／又は最小の境界間距離によって追跡される。ある態様は、連続画像中の細胞に関する最大許容移動を指定する最大速度値の使用を含んでもよい。様々な態様では、本明細書に記載されているこのような細胞追跡アルゴリズムの内のいずれかが、本開示のシステム及び方法に採用されてもよい。
【０１６１】
ある態様では、対象は、（例えば上述したような細胞識別ソフトウェアモジュールを使用して）夫々の画像に存在する対象を識別することによって、時点T1及びその後の時点T2間で追跡される。ウェル番号、対象指標、時点、対象の位置、強度、サイズ、円形度などのような、時点T1に存在する対象毎のデータが記録されてもよい。同様に、ウェル番号、対象指標、時点、対象の位置、強度、サイズ、円形度などのような、時点T2に存在する対象毎のデータが記録されてもよい。時点T1で存在しなかったが時点T2に存在する対象が様々な方法で処理されてもよい。ある態様では、新しく現われる対象を次に最大の使用可能な数に相当する対象の数に割り当ててもよい。
【０１６２】
一若しくは複数の市販のソフトウェアモジュール又は特注のソフトウェアモジュールを用いて追跡を容易にしてもよい。ある態様では、例えばPipeline Pilot (Accelrys)及び／又はImageJを使用して細胞を追跡してもよい。
【０１６３】
データ抽出
モルフォロジ特徴、強度特徴、テクスチャ特徴、位置特徴などを含む多くの特徴を前述の画像から抽出してもよい。ある態様では、抽出される特徴は、細胞（例えばニューロン）のような特定の対象に対応する。本開示のシステム及び方法の実施形態は加えて又は代わりに、以下に更に十分に記載するように、対象の一又は複数の近隣物（例えば近隣の細胞）を考慮して一又は複数の特徴を計算することを含む。
【０１６４】
注目するモルフォロジ特徴は、面積、周囲、円形度、凸包、粗さ及びトポロジーディスクリプタを含むがこれらに制限されない。注目する強度特徴は、平均強度、強度順序統計、標準偏差、ひずみ及び尖度を含むがこれらに制限されない。注目するテクスチャ特徴は、エントロピ、近隣強度、均質性及び法則のディスクリプタ（例えばLevel 、Edge、Spot、Wave、Ripple）を含むがこれらに制限されない。注目する位置特徴は、質量中心、バウンディングボックス及びエッジタッチングを含むがこれらに制限されない。
【０１６５】
ある態様では、当量直径（同一面積の円の直径）と、凸状領域（凸包の領域）と、範囲（バウンディングボックスの面積で割った面積）と、固体性（凸包の面積で割った面積）と、オイラー数（接続されたブロブの数から引いた孔数）と、形状因子（４π（面積／周囲2 ）に等しい円形度の測定値）と、最も近い近隣物（質量中心−質量中心）と、最も近い近隣物（境界−境界）と、方向（ｘ軸と対象全体を含む最小矩形の長辺との角度）、長さ（対象全体を含む最小矩形の長辺）、幅（対象全体を含む最小矩形の短辺）及び中心（対象全体を含む最小矩形の中心のＸ座標及びＹ座標）のような最小境界矩形パラメータと、偏心性（楕円の伸びの測定値、長軸半径の長さで割った中心から一方の焦点への距離）、方向（ラジアンでのｘ軸と長軸との角度）、長軸の長さ及び短軸の長さのような適合された楕円パラメータ（占有又は輪郭）とが含まれるが、これらに制限されないこのような注目する領域形状統計値を用いて一又は複数の領域形状統計値を抽出する。
【０１６６】
ある態様では、平均値と、範囲（最大値と最小値との差）と、分散（画素値の分散）と、平均絶対偏差（画素値と平均画素値との平均絶対差）と、標準偏差（画素値の標準偏差）と、画素値のひずみと、画素値の尖度と、画素値の合計と、画素値の平方和と、画素値のエントロピと、質量中心（質量中心の位置）と、質量ずれ（幾何学的な中心と質量中心との距離）と、空間モーメント（三次までの空間モーメント）と、中心モーメント（三次までの中心モーメント）と、正規化された中心モーメント（三次までの正規化された中心モーメント）と、Huモーメント（三次までのHuモーメント）と、順序統計値のパーセンテージで指定されたパーセンテージでの強度順序統計値のような順序統計値とが含まれるが、これらに制限されないこのような注目する領域画素強度統計値を用いて一又は複数の領域画素強度統計値を抽出する。前記順序統計値は、共起行列（CM）由来であり、共起行列は、エネルギ（CMの２乗された要素の合計）、コントラスト（対象全体に亘る画素及びその近隣物間のコントラストの測定値）、相関（対象全体に亘って画素がどの程度その近隣物に関連しているかの測定値）、均質性（均質領域のCMに対するCMの密接度の測定値）及びエントロピ（CM要素のエントロピ）を含む。
【０１６７】
個々の対象及び／又は集団から注目する特徴を抽出してもよい。注目する集団は、指定された対象から一定の距離内にある全ての対象として定められる集団を含むが、これに制限されない。例えば注目する対象が細胞である場合、その細胞の一又は複数の近隣物が、注目する細胞をその一又は複数の近隣物と共に構成する集団を定めるために識別され得る。従って、このような手法は、細胞の運命を決定する際に近隣の細胞のパラメータを変数として含むことにより、細胞の非自律作用の識別を容易にする。このような非自律作用は、神経回路のような細胞間相互作用又は成長因子のような細胞からの分子の解放から生じ得る。実験に応じて、画像で可視の細胞の全て又は一部に隣接解析を適用してもよい。更に、隣接解析が適用される細胞、及び近隣物であるとみなされる細胞が同一の組又は別個の組から取り出されてもよい。２集団の差異は、封入体のような画像から計算されるパラメータ又はモルフォロジに基づいてもよく、又は、細胞特異的なリポータのような実験操作、若しくは個別の集団を標識化するための、２つの時点における異なるマーカでのトランスフェクションに基づいてもよい。
【０１６８】
隣り合うとみなされる細胞はあらゆる便利な方法を使用して決定され得る。例えば第１の方法では、画像中の他の全ての細胞が最短距離から最長距離までの距離によってランク付けされ、リストのトップから所定の数の細胞が近隣物として分類される。第２の方法では、ある最大距離内の全ての細胞、場合によってはある最小距離より離れた全ての細胞が近隣物として分類される。第３の方法では、細胞の一部が別の細胞と付着成長した物理的に結合された細胞のみが、近隣物として分類される。付着成長はモルフォロジを使用して、又は細胞の接合に局在化する蛍光マーカを使用して決定され得る。これらの方法は排他的ではないので、複数の方法が同一のデータセットに適用されてもよい。３つの全ての方法で、エッジの一定の距離内にある細胞が細胞の近隣物に関する不完全なデータにより解析から除外され得る。
【０１６９】
このような隣接解析は多くの変数を計算するために使用されてもよい。隣接解析で細胞の運命を決定する際に使用される変数は、近隣の細胞毎に通常計算される細胞パラメータと、任意の細胞パラメータの累積値、平均値又は中央値のような集合体データとを含み得る。ここで、近隣の細胞は上記の方法の内の１つを使用して定められる。細胞の中心は少なくとも３つの異なる方法を使用して決定され得る。例えば第１の方法では、細胞内の全ての画素のｘ座標及びｙ座標の平均値として中心を定める。第２の方法では、画素強度が重みとして使用される細胞の全ての画素の加重平均として中心を定める。第３の方法では、核のような細胞の細胞下の領域を使用し、平均又は加重平均のいずれかを用いて中心を計算する。
【０１７０】
抽出の最終結果は典型的には、特徴ベクトルと一般に称される広範囲な特徴である。抽出されるデータは（例えばコンマで分離された値として）マイクロソフトのエクセル又は高度解析用のＲのような統計パッケージのようなプログラムにエクスポートされてもよい。
【０１７１】
ある実施形態では、このようなデータは、一又は複数の特徴と病状のような状態との一又は複数の関係の識別を容易にすべく、一若しくは複数の機械学習アルゴリズム又は統計学習アルゴリズムを使用して分析されてもよい。注目する機械学習アルゴリズムの例は、AODE、人工ニューラルネットワーク、バックプロパゲーション、ベイズ統計、ナイーブベイズ分類器、ベイジアンネットワーク、ベイジアン知識データベース、事例ベース推論、デシジョンツリー、帰納的論理プログラミング、ガウス型過程回帰、学習ベクトル量子化、例に基づく学習、最近傍アルゴリズム、類推によるモデル、Probably approximately correct（PAC ）学習、記号機械学習アルゴリズム、サブ記号機械学習アルゴリズム、サポートベクタマシン、ランダムフォレスト、分類器集合、回帰分析、情報ファジーネットワーク（IFN ）、線形分類器、フィッシャーズの線形識別、ロジスティック回帰、二次分類器、ｋ近傍法、C4.5、隠れマルコフモデル、データクラスタリング、期待値最大化アルゴリズム、自己組織化マップ、動径基底関数ネットワーク、ベクトル量子化、生成位相写像、アプリアリアルゴリズム、Eclat アルゴリズム、FP成長アルゴリズム、階層クラスタリング、単純連結クラスタリング、概念クラスタリング、分割クラスタリング、Ｋ平均アルゴリズム、ファジークラスタリング、ダイナミックベイジアンネットワークなどを含むが、これらに制限されない。
【０１７２】
例となる実施形態
本開示の例となる非制限的な実施形態は以下の通りである。
【０１７３】
１．撮像システムであって、
試料ホルダを有する撮像デバイスと、
前記試料ホルダに試料を置くように構成された搬送デバイスと、
前記撮像デバイス及び前記搬送デバイスと通信するプロセッサと、
該プロセッサに動作可能に接続されたメモリと
を備えており、
該メモリに、試料の画像を得るための命令が記憶されており、該命令は、前記プロセッサによって実行されると、前記プロセッサに、
前記搬送デバイスによって前記撮像デバイスの試料ホルダに試料を移動させ、
前記撮像デバイスを使用して前記試料上の参照マークを識別させ、
前記参照マークが参照画像における位置と略同一の位置にあるように前記試料ホルダを移動させ、
前記撮像デバイスを使用して前記試料の画像を取得させることを特徴とするシステム。
【０１７４】
２．前記試料はプレートを含むことを特徴とする１に記載のシステム。
【０１７５】
３．前記プレートはマルチウェルプレートであることを特徴とする１に記載のシステム。
【０１７６】
４．前記マルチウェルプレートは約９６以上のウェルを含むことを特徴とする３に記載のシステム。
【０１７７】
５．前記プレートはプラスチックを有することを特徴とする２乃至４のいずれかに記載のシステム。
【０１７８】
６．前記プレートは黒いことを特徴とする５に記載のシステム。
【０１７９】
７．バルク試料保管サブシステムを更に備えていることを特徴とする１乃至６のいずれかに記載のシステム。
【０１８０】
８．前記搬送デバイスは、前記バルク試料保管サブシステムから前記撮像デバイスの試料ホルダに試料を移動させるように構成されていることを特徴とする７に記載のシステム。
【０１８１】
９．前記命令は、前記プロセッサによって実行されると、前記プロセッサにより前記搬送デバイスが前記バルク試料保管サブシステムから前記撮像デバイスの試料ホルダに試料を移動させることを特徴とする７又は８に記載のシステム。
【０１８２】
１０．前記搬送デバイスは、前記撮像デバイスの試料ホルダから前記バルク試料保管サブシステムに試料を移動させるように構成されていることを特徴とする７乃至９のいずれかに記載のシステム。
【０１８３】
１１．前記命令は、前記プロセッサによって実行されると、前記プロセッサにより前記搬送デバイスが前記撮像デバイスの試料ホルダから前記バルク試料保管サブシステムに試料を移動させることを特徴とする７乃至１０のいずれかに記載のシステム。
【０１８４】
１２．前記バルク試料保管サブシステムは５以上の試料を保管するように構成されていることを特徴とする７乃至１１のいずれかに記載のシステム。
【０１８５】
１３．前記バルク試料保管サブシステムは２０以上の試料を保管するように構成されていることを特徴とする７乃至１２のいずれかに記載のシステム。
【０１８６】
１４．前記バルク試料保管サブシステムは、前記バルク試料保管サブシステムを所定の温度で維持するように構成された加熱要素を有していることを特徴とする７乃至１３のいずれかに記載のシステム。
【０１８７】
１５．前記バルク試料保管サブシステムは、前記バルク試料保管サブシステムを所定の温度で維持するように構成された冷却要素を有していることを特徴とする７乃至１４のいずれかに記載のシステム。
【０１８８】
１６．前記バルク試料保管サブシステムは、前記バルク試料保管サブシステムから前記搬送デバイスに試料を移すように構成されたロボットアームを有していることを特徴とする７乃至１５のいずれかに記載のシステム。
【０１８９】
１７．前記バルク試料保管サブシステムは、前記搬送デバイスから前記バルク試料保管サブシステムに試料を移すように構成されたロボットアームを有していることを特徴とする７乃至１６のいずれかに記載のシステム。
【０１９０】
１８．前記搬送デバイスはロボットアームであることを特徴とする１乃至１７のいずれかに記載のシステム。
【０１９１】
１９．前記ロボットアームは試料と係合するように構成された複数のグリッパを有していることを特徴とする１８に記載のシステム。
【０１９２】
２０．前記グリッパは試料に側圧をかけることを特徴とする１９に記載のシステム。
【０１９３】
２１．前記グリッパは、異なるサイズの試料と係合するための調整可能な要素を有していることを特徴とする１８又は１９に記載のシステム。
【０１９４】
２２．前記調整可能な要素は手動で調整可能であることを特徴とする２１に記載のシステム。
【０１９５】
２３．試料識別サブシステムを更に備えていることを特徴とする１乃至２２のいずれかに記載のシステム。
【０１９６】
２４．前記試料識別サブシステムは、プレート上のバーコードを読み取るように構成されたバーコードリーダを有していることを特徴とする２３に記載のシステム。
【０１９７】
２５．前記試料識別サブシステムは、試料を識別するように構成されたプロセッサと電子通信することを特徴とする２３又は２４に記載のシステム。
【０１９８】
２６．前記プロセッサは、画像取得工程を試料に適応させるように構成されていることを特徴とする２５に記載のシステム。
【０１９９】
２７．試料の画像を取得する際に、多波長画像をその波長成分に逆畳み込みすることを特徴とする１乃至２６のいずれかに記載のシステム。
【０２００】
２８．前記撮像デバイスは倒立顕微鏡本体を有していることを特徴とする１乃至２７のいずれかに記載のシステム。
【０２０１】
２９．試料を下から撮像することを特徴とする２８に記載のシステム。
【０２０２】
３０．前記参照マークは試料の底部にあることを特徴とする１乃至２９のいずれかに記載のシステム。
【０２０３】
３１．前記試料ホルダは前記撮像デバイスの顕微鏡ステージに取り付けられていることを特徴とする１乃至３０のいずれかに記載のシステム。
【０２０４】
３２．前記試料ホルダは前記撮像デバイスに対して着脱可能であることを特徴とする１乃至３１のいずれかに記載のシステム。
【０２０５】
３３．前記試料ホルダは切抜き部分、内部斜縁部分及び内部底リップ部分を画定する少なくとも２つの壁を有していることを特徴とする１乃至３２のいずれかに記載のシステム。
【０２０６】
３４．前記内部斜縁部分は、前記試料ホルダの内部底リップ部分の面に対する角度を有し、該角度は約８５度から約２５度の範囲内であることを特徴とする３３に記載のシステム。
【０２０７】
３５．前記角度は、約７０度から約４０度の範囲内であることを特徴とする３４に記載のシステム。
【０２０８】
３６．前記試料ホルダは、127.5mm×85mmのフットプリントを有する試料を受けるようなサイズ及び形状を有することを特徴とする１乃至３５のいずれかに記載のシステム。
【０２０９】
３７．前記試料ホルダは、少なくとも１つの角部を有する試料受取領域と、試料を前記少なくとも１つの角部に片寄らせるように構成されたアクチュエータとを有していることを特徴とする１乃至３６のいずれかに記載のシステム。
【０２１０】
３８．前記撮像デバイスは３０ミリ秒以下の露出のカメラを有していることを特徴とする１乃至１７のいずれかに記載のシステム。
【０２１１】
３９．前記撮像デバイスは、センサ領域が約170mm2〜約250mm2であるカメラを有していることを特徴とする１乃至３８のいずれかに記載のシステム。
【０２１２】
４０．前記カメラはEMCCD カメラであることを特徴とする１乃至３９のいずれかに記載のシステム。
【０２１３】
４１．前記撮像デバイスはキセノン光源を有していることを特徴とする１乃至４０のいずれかに記載のシステム。
【０２１４】
４２．前記撮像デバイスはフィルタホイールを有していることを特徴とする１乃至４１のいずれかに記載のシステム。
【０２１５】
４３．前記プロセッサに動作可能に接続されたメモリに、命令が記憶されており、該命令は、前記プロセッサによって実行されると、前記プロセッサに、
前記撮像デバイスを使用して試料の画像を取得させ、
前記画像中の参照マークを識別させ、
該参照マークの画像を参照画像と比較させ、
前記参照マークが前記参照画像における位置と略同一の位置にあるように前記試料を移動させることを特徴とする１乃至４２のいずれかに記載のシステム。
【０２１６】
４４．前記参照マークの画像を前記参照画像と比較する際に、スケール不変特徴変換アルゴリズムを使用することを特徴とする４３に記載のシステム。
【０２１７】
４５．前記撮像デバイスは自動焦点調節要素を有していることを特徴とする１乃至４４のいずれかに記載のシステム。
【０２１８】
４６．前記プロセッサに動作可能に接続されたメモリに、命令が記憶されており、該命令は、前記プロセッサによって実行されると、前記プロセッサに、
特定の試料に関する複数の画像を編成する、
特定の試料に関する２以上の画像をつなぎ合わせる、
特定の試料の２以上の画像を配列する、
試料の画像内の対象を識別する、
時系列の画像によって対象を追跡する、及び
画像内で識別された対象からデータを抽出する
から選ばれた少なくとも１つの動作を行わせることを特徴とする１乃至４５のいずれかに記載のシステム。
【０２１９】
４７．前記撮像デバイスと通信する第２のプロセッサと、
該第２のプロセッサに動作可能に接続されたメモリと
を更に備えており、
該メモリに、試料の画像を処理するための命令が記憶されており、該命令は、前記第２のプロセッサによって実行されると、前記第２のプロセッサに、
特定の試料に関する複数の画像を編成する、
特定の試料に関する２以上の画像をつなぎ合わせる、
特定の試料の２以上の画像を配列する、
試料の画像内の対象を識別する、
時系列の画像によって対象を追跡する、及び
画像内で識別された対象からデータを抽出する
から選ばれた少なくとも１つの動作を行わせることを特徴とする１乃至４６のいずれかに記載のシステム。
【０２２０】
４８．前記試料は生体物質を含むことを特徴とする１乃至４７のいずれかに記載のシステム。
【０２２１】
４９．前記試料は一又は複数の細胞を含むことを特徴とする１乃至４８のいずれかに記載のシステム。
【０２２２】
５０．前記一又は複数の細胞はニューロンであることを特徴とする４９に記載のシステム。
【０２２３】
５１．撮像システムであって、
撮像デバイスと、
第１の表面から試料を自動的に取って、前記試料を前記撮像デバイス上に置くように構成されたロボットアームと
を備えており、
試料上の参照マークを自動的に識別して、前記参照マークが参照画像における位置と略同一の位置にあるように試料を移動させ、試料の画像を得るように構成されていることを特徴とするシステム。
【０２２４】
５２．前記ロボットアームは、前記撮像デバイスから試料を自動的に取って、前記試料を第２の表面に置くように構成されていることを特徴とする５１に記載のシステム。
【０２２５】
５３．前記撮像デバイスは試料ホルダを有していることを特徴とする５１又は５２に記載のシステム。
【０２２６】
５４．前記試料はプレートを含むことを特徴とする５１乃至５３のいずれかに記載のシステム。
【０２２７】
５５．前記プレートはマルチウェルプレートであることを特徴とする５４に記載のシステム。
【０２２８】
５６．前記マルチウェルプレートは約９６以上のウェルを有していることを特徴とする５５に記載のシステム。
【０２２９】
５７．前記プレートはプラスチックを含むことを特徴とする５４乃至５６のいずれかに記載のシステム。
【０２３０】
５８．前記プレートは黒いことを特徴とする５７に記載のシステム。
【０２３１】
５９．バルク試料保管サブシステムを更に備えていることを特徴とする５１乃至５８のいずれかに記載のシステム。
【０２３２】
６０．前記第１の表面は前記バルク試料保管サブシステム内に含まれていることを特徴とする５９に記載のシステム。
【０２３３】
６１．前記バルク試料保管サブシステムは、５以上の試料を保管するように構成されていることを特徴とする５９又は６０に記載のシステム。
【０２３４】
６２．前記バルク試料保管サブシステムは、２０以上の試料を保管するように構成されていることを特徴とする５９乃至６１のいずれかに記載のシステム。
【０２３５】
６３．前記バルク試料保管サブシステムは、前記バルク試料保管サブシステムを所定の温度で維持するように構成された加熱要素を有していることを特徴とする５９乃至６２のいずれかに記載のシステム。
【０２３６】
６４．前記バルク試料保管サブシステムは、前記バルク試料保管サブシステムを所定の温度で維持するように構成された冷却要素を有していることを特徴とする５９乃至６３のいずれかに記載のシステム。
【０２３７】
６５．前記バルク試料保管サブシステムは、前記バルク試料保管サブシステムから前記第１の表面に試料を移すように構成されたロボットアームを有していることを特徴とする５９乃至６４のいずれかに記載のシステム。
【０２３８】
６６．前記バルク試料保管サブシステムは、前記第２の表面から前記バルク試料保管サブシステムに試料を移すように構成されたロボットアームを有していることを特徴とする５１乃至６５のいずれかに記載のシステム。
【０２３９】
６７．前記ロボットアームは、試料と係合するように構成された複数のグリッパを有していることを特徴とする５１乃至６６のいずれかに記載のシステム。
【０２４０】
６８．前記グリッパは試料に側圧をかけることを特徴とする６７に記載のシステム。
【０２４１】
６９．前記グリッパは、異なるサイズの試料と係合するための調整可能な要素を有していることを特徴とする６７又は６８に記載のシステム。
【０２４２】
７０．前記調整可能な要素は手動で調整可能であることを特徴とする６９に記載のシステム。
【０２４３】
７１．試料識別サブシステムを更に備えていることを特徴とする５１乃至７０のいずれかに記載のシステム。
【０２４４】
７２．前記試料識別サブシステムは、プレート上のバーコードを読み取るように構成されたバーコードリーダを有していることを特徴とする７１に記載のシステム。
【０２４５】
７３．前記試料識別サブシステムは、試料を識別するように構成されたプロセッサと電子通信することを特徴とする７１又は７２に記載のシステム。
【０２４６】
７４．前記プロセッサは、画像取得工程を試料に適応させるように構成されていることを特徴とする７３に記載のシステム。
【０２４７】
７５．前記撮像デバイスは倒立顕微鏡本体を有していることを特徴とする５１乃至７４のいずれかに記載のシステム。
【０２４８】
７６．試料を下から撮像することを特徴とする７５に記載のシステム。
【０２４９】
７７．前記参照マークは試料の底部にあることを特徴とする５１乃至７６のいずれかに記載のシステム。
【０２５０】
７８．前記試料ホルダは前記撮像デバイスの顕微鏡ステージに取り付けられていることを特徴とする５３乃至７７のいずれかに記載のシステム。
【０２５１】
７９．前記試料ホルダは前記撮像デバイスに対して着脱可能であることを特徴とする５３乃至７８のいずれかに記載のシステム。
【０２５２】
８０．前記試料ホルダは切抜き部分、内部斜縁部分及び内部底リップ部分を画定する少なくとも２つの壁を有していることを特徴とする５３乃至７９のいずれかに記載のシステム。
【０２５３】
８１．前記内部斜縁部分は、前記試料ホルダの内部底リップ部分の面に対する角度を有し、該角度は約８５度から約２５度の範囲内であることを特徴とする８０に記載のシステム。
【０２５４】
８２．前記角度は約７０度から約４０度の範囲内であることを特徴とする８１に記載のシステム。
【０２５５】
８３．前記試料ホルダは、127.5 mm×85mmのフットプリントを有する試料を受けるようなサイズ及び形状を有することを特徴とする５３乃至８２のいずれかに記載のシステム。
【０２５６】
８４．前記試料ホルダは、少なくとも１つの角部を有する試料受取領域と、試料を前記少なくとも１つの角部に片寄らせるように構成されたアクチュエータとを有していることを特徴とする５３乃至８３のいずれかに記載のシステム。
【０２５７】
８５．前記撮像デバイスは３０ミリ秒以下の露出のカメラを有していることを特徴とする５１乃至８４のいずれかに記載のシステム。
【０２５８】
８６．前記カメラはEMCCD カメラであることを特徴とする５１乃至８５のいずれかに記載のシステム。
【０２５９】
８７．前記撮像デバイスはキセノン光源を有していることを特徴とする５１乃至８６のいずれかに記載のシステム。
【０２６０】
８８．試料の画像を取得する際に、多波長画像をその波長成分に逆畳み込みすることを特徴とする５１乃至８７のいずれかに記載のシステム。
【０２６１】
８９．前記撮像デバイス及び前記ロボットアームデバイスと通信するプロセッサと、
該プロセッサに動作可能に接続されたメモリと
を更に備えており、
前記プロセッサに動作可能に接続されたメモリに、命令が記憶されており、該命令は、前記プロセッサによって実行されると、前記プロセッサに、
前記撮像デバイスを使用して試料の画像を取得させ、
前記画像中の参照マークを識別させ、
該参照マークの画像を参照画像と比較させ、
前記参照マークが前記参照画像における位置と略同一の位置にあるように前記試料を移動させることを特徴とする５１乃至８８のいずれかに記載のシステム。
【０２６２】
９０．前記参照マークの画像を前記参照画像と比較する際に、スケール不変特徴変換アルゴリズムを使用することを特徴とする８９に記載のシステム。
【０２６３】
９１．前記撮像デバイスは自動焦点調節要素を有していることを特徴とする５１乃至９０のいずれかに記載のシステム。
【０２６４】
９２．前記撮像デバイスと通信するプロセッサと、
該プロセッサに動作可能に接続されたメモリと
を更に備えており、
前記プロセッサに動作可能に接続されたメモリに、命令が記憶されており、該命令は、前記プロセッサによって実行されると、前記プロセッサに、
特定の試料に関する複数の画像を編成する、
特定の試料に関する２以上の画像をつなぎ合わせる、
特定の試料の２以上の画像を配列する、
試料の画像内の対象を識別する、
時系列の画像によって対象を追跡する、及び
画像内で識別された対象からデータを抽出する
から選ばれた少なくとも１つの動作を行わせることを特徴とする５１乃至９１のいずれかに記載のシステム。
【０２６５】
９３．前記試料は生体物質を含むことを特徴とする５１乃至９２のいずれかに記載のシステム。
【０２６６】
９４．前記試料は一又は複数の細胞を含むことを特徴とする５１乃至９３のいずれかに記載のシステム。
【０２６７】
９５．前記一又は複数の細胞はニューロンであることを特徴とする９４に記載のシステム。
【０２６８】
９６．試料保持デバイスであって、
切抜き部分、内部斜縁部分及び内部底リップ部分を夫々画定し、対向して配置された略等しい長さの２つの第１の壁と、
内部斜縁部分及び内部底リップ部分を夫々画定し、対向して配置された略等しい長さの２つの第２の壁と
を備えており、
前記２つの第２の壁各々の長さは、前記２つの第１の壁各々の長さより短く、
前記２つの第１の壁及び前記２つの第２の壁は共に試料受取領域を画定していることを特徴とするデバイス。
【０２６９】
９７．127.5 mm×85mmのフットプリントを有する試料を受けるようなサイズを有することを特徴とする９６に記載のデバイス。
【０２７０】
９８．前記第１の壁の前記内部斜縁部分は、前記第１の壁の内部底リップ部分の面に対する角度を有し、該角度は約８５度から約２５度の範囲内であることを特徴とする９６又は９７に記載のデバイス。
【０２７１】
９９．前記角度は約７０度から約４０度の範囲内であることを特徴とする９８に記載のデバイス。
【０２７２】
１００．前記第２の壁の前記内部斜縁部分は、前記第２の壁の内部底リップ部分の面に対する角度を有し、該角度は約８５度から約２５度の範囲内であることを特徴とする９６乃至９９に記載のデバイス。
【０２７３】
１０１．前記角度は約７０度から約４０度の範囲内であることを特徴とする１００に記載のデバイス。
【０２７４】
１０２．撮像デバイスに取り付けられるように構成されていることを特徴とする９６乃至１０１のいずれかに記載のデバイス。
【０２７５】
１０３．前記デバイスに置かれた試料を固定するように構成されたアクチュエータを更に備えていることを特徴とする９６乃至１０２のいずれかに記載のデバイス。
【０２７６】
１０４．アルミニウムを含むことを特徴とする９６乃至１０３のいずれかに記載のデバイス。
【０２７７】
１０５．コンピュータによって実行される、試料の画像を得る方法であって、
プロセッサによって制御される搬送デバイスを使用して、撮像デバイスの試料ホルダに試料を移動させ、
前記プロセッサを用いて前記試料上の参照マークを識別して、
前記プロセッサを用いて、前記参照マークが参照画像における位置と略同一の位置にあるように前記試料ホルダを配列して、
前記プロセッサによって制御される撮像デバイスを使用して、試料の画像を得ることを特徴とする方法。
【０２７８】
１０６．前記プロセッサによって制御される搬送デバイスを使用して、前記撮像デバイスから第１の表面に試料を移動させることを特徴とする１０５に記載の方法。
【０２７９】
１０７．前記プロセッサを用いて、前記試料の少なくとも１つの画像を処理することを特徴とする１０５又は１０６に記載の方法。
【０２８０】
１０８．処理する際に、
試料の複数の画像を編成する、
試料の２以上の画像をつなぎ合わせる、
試料の２以上の画像を配列する、
試料の画像内の対象を識別する、
試料の時系列の画像によって対象を追跡する、
画像内で識別された対象からデータを抽出する、及び
画像を分析する
から選ばれた少なくとも１つの動作を行うことを特徴とする１０７に記載の方法。
【０２８１】
１０９．試料の２以上の画像をつなぎ合わせる際に、フレキシブルステッチを使用することを特徴とする１０８に記載の方法。
【０２８２】
１１０．試料の２以上の画像を配列する際に、基準とテストデータセットとの不偏分散強度差を最小化することを特徴とする１０８に記載の方法。
【０２８３】
１１１．試料の画像内の対象を識別する際に、一又は複数の細胞を識別することを特徴とする１０８に記載の方法。
【０２８４】
１１２．コンピュータによって実行される、試料の画像内の対象を識別する方法であって、
プロセッサを用いて、画像コントラストを強調する、
前記プロセッサを用いて、画像ビット深度を減少させる、
前記プロセッサを用いて、画像を平滑化する、
前記プロセッサを用いて、画像内のピークを検出する、
前記プロセッサを用いて、画像のエロージョンを行う、
前記プロセッサを用いて、画像のダイレーションを行う、
前記プロセッサを用いて、モルフォロジフィルタを適用して画像内の対象を識別することを特徴とする方法。
【０２８５】
１１３．前記モルフォロジフィルタは円形フィルタ及びサイズフィルタを含むことを特徴とする１０９に記載の方法。
【０２８６】
実施例
上述した本開示から認識され得るように、本開示は多種多様な応用性がある。従って、以下の実施例は、本発明を構成して使用する方法の完全な開示及び記載を当業者に提供するように記載されており、本発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を制限することを意図しておらず、また、以下の実験が行われた全ての実験又は唯一の実験であると示すことを意図していない。当業者は、本質的に同様の結果をもたらすために変更又は調整され得る様々な非決定的なパラメータを容易に認識する。従って、以下の実施例は、本発明を構成して使用する方法の完全な開示及び記載を当業者に提供するように記載されており、本発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を制限することを意図しておらず、また、以下の実験が行われた全ての実験又は唯一の実験であると示すことを意図していない。使用される数値（例えば量、温度など）に関して正確さを確保する努力がなされているが、多少の実験誤差及び偏差は考慮されるべきである。
【０２８７】
実施例１：自動ロボット顕微鏡システムの実施
既存の技術に対してユーザの介入を減らして、以前に撮像された同一の視野（例えば同一の細胞）への正確な戻し及び同一の視野の再撮像を可能にするように構成された自動ロボット顕微鏡システムが開発された。
【０２８８】
この特定の実施形態では、システムは、Midsciの96ウェルプレートのようなマルチウェルプレート上の細胞を撮像すべく主に構成された。生体物質（例えばニューロン）を含むプレートが、Transfer Nest（商標）を備えたSTX44-ICBT70度培養器（LiCONiC Instruments, Liconic US, Inc., Woburn, MA）を使用して保管される。Transfer Nest（商標）に隣り合って、Midsciのプレートの側に印刷されたバーコードを読み取るように構成されたMetrologic MS 7120 ORBITバーコードスキャナが配置されている。
【０２８９】
Transfer Nest（商標）に置かれたプレートは、第１及び第２のグリッパアームを有するプレートグリッパを備えたKiNEDx KX-300-250ロボットアーム（Peak Robotics, Colorado Springs, CO）を使用して撮像デバイス上のプレートホルダに移動し得る。特注の延長体が、ロボットアームがプレートと相互作用し得るように製造された（図５〜６）。
【０２９０】
KiNEDx KX-300-250ロボットアームが、プレートを特注で製造されたプレートホルダに移すべく使用された。プレートホルダは、図７〜１０に示されているような形状を有してアルミニウムから研磨された。続いて、特注のプレートホルダが、（図10〜17に示されているような）電子アクチュエータのための切抜き部分と共に、Applied Scientific Instrumentation (Eugene, OR)によって特注仕様に合わせて製造された。プレートホルダはEclipse Ti-E/B 倒立研究顕微鏡（Nikon Instruments Inc., Melville NY）のステージに固定された。顕微鏡本体に、Andor EMCCD iXon3 888 CCD カメラ（Andor Technology, Belfast, Northern Ireland）と、フィルタホイールの一体化された10-B制御部及びSmartshutter（Sutter Instrument Co.）を有するLambda XL 光源と、Nikon TiE Perfect Focus System (Nikon Instruments Inc., Melville NY)とが更に取り付けられた。光学フィルタをSemrock (Rochester, NY）から得た。
【０２９１】
システムは複数のソフトウェアモジュールを使用した。スケジューリングは、（UCSF, San Francisco, CAによって流通している）マイクロマネージャソフトウェアと相互作用すべく特注のプラグインを使用してGreen Button Go (BioSero Inc.)によって処理された。画像のつなぎ合わせモジュール及び配列モジュールには、（Abramoff等著，Biophotonics International 11，2004年，p.36-42に記載され、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる）ImageJのプラグインの（S. Preibisch等著，Bioinformatics，2009年，25(11):p.1463-1465に記載され、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる）Stitching ＿.jar、StackReg＿.jar及びTurboReg＿.jarが組み込まれた。細胞の識別及び追跡のためのソフトウェアモジュールは、Pipeline Pilot (Accelrys)、ImageJ及び特注のソフトウェアを含んでいる。
【０２９２】
このシステムにより、以前に撮像された視野と同一の視野（例えば同一の細胞）への正確な戻し及び同一の視野の再撮像が可能になる。この能力により、因果関係を経時的に処理する仮説の実験及び試験が可能になる。図23はこのような１つの実施例を示す。この実施例により、EGFP及び新しいマイトファジーリポータ構築体であるMitoEOS2の２つのプラスミドでトランスフェクトされた複数の一次皮質ニューロンの内の１つの画像が得られた。FITC（緑）チャネル（上段）は、信号強度を決定するためのマスクとして使用され得るが、ニューロンの健康状態の読出しとして神経突起の解析のような追加の画像解析ルーチンにも使用され得るニューロンのモルフォロジを示す。MitoEOS2構築体の蛍光は、青色光で照射されると不可逆的に緑から赤に変わることができる。RFP 画像（下段）は、撮像の初めに青色光のパルスへの露出によって赤に変わる画像の上段に示されているニューロンと同一のニューロンを示す。同一のニューロンは、４時間毎に得られた最初の７つの画像と24時間毎に分けられた最後の４つの画像とで11回撮像された。上段及び下段は、T1、T2、T3、T4、T5及びT6で同一のニューロンの画像であり、T2はT1の20時間後であり、T3はT1の24時間後であり、T4はT1の48時間後であり、T5はT1の72時間後であり、T6はT1の96時間後である。従って、この図は、長時間に亘る因果関係を処理する仮説の実験及び試験を可能にする本開示のシステムの能力を実証している。
【０２９３】
実施例２：マルチウェルプレートの選択
ある態様では、マルチウェルプレートは、本開示のシステムを使用して生体物質を成長、保管及び／又は観察させるために使用されてもよい。プレートのタイプの影響を以下のように分析した。
【０２９４】
Poly-D-Lysine (PDL)で予め被覆されたCorning 96-well (Cat # 3372)、PDL で予め被覆されたBD BioCoat 96-well (Cat # 354640)、PDL-Laminin (L) で予め被覆されたBD BioCoat 96-well (Cat # 354596)、PDL で予め被覆されたNunc Micro Well (Cat # 152039)、Corning Special Optics 96-well (Cat # CLS3614)、BD Optilux 96-well (Cat # 353948)、Nunc Optical Bottom 96-well (Cat # 165305)、Midsci 96-well (Cat # TP92096)、Nunc 96-well Coverglass bottom (Cat # 265300)、Matek 96-well glass bottom (Cat # PG96G-1.5-5- F - no PDL)、Matek 96-well glass bottom (Cat # PG96G-1.5-5-F - with PDL)、IBIDI 96-well u-plate (Cat # 89626)を含む一連のプレートを試験のために得た。Corning (Cat # 3596) プレートを対照プレートとして使用した。予め被覆されなかったプレートが、Poly-D-Lysine (50ug/ml - Millipore Cat #A-003-E) 及びLaminin (5ug/ml - Sigma Cat # L2020-1MG)で被覆された。プレートを被覆媒体と共に37度で一晩中そのままにしておき、その後、滅菌水によって２回洗浄した。
【０２９５】
全てのプレートを同時に試験した。プレートは同一のプールからの被覆媒体を使用して被覆され、更に同一のプールからのニューロンを使用して培養した。
【０２９６】
一次マウスニューロンの生存
一次マウスニューロンが、対照に対して各プレート上でどの程度生存しているかを調べるために、各ウェルが、DIV 3, 10, 20, 30及び40に明視野で一度撮像された。各画像中の細胞の数を平均して、プレート毎の平均値及びSDを得た。その後、この結果をプレート毎にDIV に対して図示した。対照プレートと比較したときに一次マウスニューロンに関して著しい生存の差を示したプレートは、PDL で予め被覆されたBD BioCoat 96-well (Cat # 354640)、PDL-L で予め被覆されたBD BioCoat 96-well (Cat # 354596)、Corning Special Optics 96-well (Cat # CLS3614)、Nunc 96-well Coverglass bottom (Cat # 265300)、及びMatek 96-well glass bottom (Cat # PG96G-1.5-5-F - with PDL)であった。
【０２９７】
「完全な」焦点における画像の数
プレートは、顕微鏡の光学素子に対向する底側（図４）で撮像されてもよい。どのプレートがこのように撮像されて鮮明な焦点で画像を与えるかを決定するためにプレートを検査した。鮮明な焦点の画像の数を、DIV の画像のスタック毎のプレート毎に目視によって数えた。１枚のプレート当たりの合焦画像の数をDIV に対して図示した。Corning Special Optics 96-well (Cat # CLS3614)、Nunc Optical Bottom 96-well (Cat # 165305)、Midsci 96-well (Cat # TP92096)、Nunc 96-well Coverglass bottom (Cat # 265300)、Matek 96-well glass bottom (Cat # PG96G-1.5-5-F - no PDL)及びMatek 96-well glass bottom (Cat # PG96G-1.5-5-F - with PDL)のプレートにより、夫々のプレート内に92＋（96％）の焦点が合ったウェルが得られた。
【０２９８】
96ウェルの内の95ウェルが鮮明な焦点であったプレートは、Midsci 96- well (Cat # TP92096)、Nunc 96-well Coverglass bottom (Cat # 265300)、Matek 96- well glass bottom (Cat # PG96G-1.5-5-F - no PDL)、Matek 96-well glass bottom (Cat # PG96G-1.5-5-F - with PDL)であった。
【０２９９】
40DIV での培地の損失
プレート毎に培地の損失が40DIV でどの位生じるかを測定するために、各プレートの重量をDIV0で測定し、その後DIV 40で測定した。ほとんどのプレートは同様の培地の損失を示し、どのプレートも対照プレートとは著しく異なっていなかった。
【０３００】
全体的な性能
対照プレートと同様の生存を示し、１枚のプレート当たり96％以上の合焦画像を有するプレートは、Nunc Optical Bottom 96-well (Cat # 165305)、Midsci 96-well (Cat # TP92096)、及びMatek 96-well glass bottom (Cat # PG96G-1.5-5-F - no PDL)であった。
【０３０１】
Midsciの96ウェルプレートは合焦画像を与えたので、更なる試験のために選ばれた。10個のMidsciの96ウェルプレートが、DIV4、５、６、７、８、９、10、11、12、13及び14で撮像された。１枚のプレート当たりの合焦画像の数が数えられ、DIV 毎に鮮明な焦点のウェルは95〜96個のウェルであった。
【０３０２】
実施例３：ニューロンの追跡
以下の実験を、経時的な自動ニューロン追跡を可能にする分割アルゴリズムのためのパラメータを選ぶために行った。複数の個人が、マルチウェルプレートの単一のウェルの画像中のニューロンを視覚的に識別するように訓練を受けた。その後、これらの個人は、モルフォロジチャネルのスタックの各スライス（つまり経時的に撮像された同一のウェルの複数の画像）中のニューロンを選択した。ニューロンは、ニューロンの最も明るいポイントを概略的に示すポイントを選択することにより選択された。その後、様々な分割アルゴリズムが、アルゴリズムによって検出されたニューロンの数を決定して人間の分析者によって選択されたニューロンの数に対して比較することにより比較された。この結果、分割アルゴリズムの正確さ、偽陽性率及び偽陰性率が示された。分割アルゴリズムのためのパラメータが、10％未満の偽陰性率が達成されるまで選択及び／又は調整された。例えば、ピーク検出アルゴリズムを使用して画像ヒストグラム中のピークを識別するとき、95％のユーザ定義の閾値及び／又は周囲領域より２倍以上大きいピーク領域が選択された。ピークが、絶対ピーク及び定められた範囲内の周囲画素（例えば８つの隣接画素全て）として定められた。パラメータが、約10以下の画素の半径を有する薄い対象を除去するために更に調整された。更に、0.8 以上の円形度のカットオフ値を有するモルフォロジフィルタが約800 〜1000の画素より小さな対象を除去するために適用された。
【０３０３】
実施例４：生存時間
以下の実験を、ニューロンの生存時間の自動決定を可能にするアルゴリズムのためのパラメータを選択するために行った。複数の個人が、マルチウェルプレートの単一のウェルの画像中にニューロンを視覚的に識別するように訓練を受けた。その後、これらの個人は、陽性対照及び陰性対照を用いた実験のためのモルフォロジチャネルを用いて（つまり、生存差が分かるとされる状態を用いて）ニューロンの生存時間を測った。生存統計値を使用した危険曲線を、手動で測った実験から生成した。その後、アルゴリズムがどの位機能していたかを決定するために、自動分割を使用して生成された危険曲線を手動で測った実験からの危険曲線と比較した。画像からニューロンを自動的に識別する際に偏心性フィルタ及び面積フィルタ、並びにこのようなフィルタに適した閾値を確認するためにこれらの試験を使用した。
【０３０４】
実施例５：ニューロン中のミトコンドリア分解の経時的なモニタリング
一次皮質ニューロンが、２つのプラスミドであるEGFP及び新しいマイトファジーリポータ構築体のMitoEOS2でトランスフェクトされ、96ウェルプレート内で培養された。プレートは、本明細書に述べられているようなロボット顕微鏡検査システムを使用して複数の時点で撮像された。MitoEOS2構築体の蛍光は、撮像の前に青色光のパルスへの露出によって緑から赤に不可逆的に変えられた。その後、プレートが、４時間毎に得られた最初の７つの画像、及び24時間毎に分けられた最後の４つの画像で11回撮像された。これは、数時間又は数日のような異なる時間尺度に亘って生じる生体処理を取り込むべく撮像パラメータの調整を可能にするという点で開示されたシステムの更なる利点である。
【０３０５】
図23は、上述したようにトランスフェクトされ撮像された複数の一次皮質ニューロンの内の１つの画像を示す。FITC（緑）チャネル（上段）は、信号強度を決定するためのマスクとして使用され得るが、ニューロンの健康状態の読出しとして神経突起の解析のような追加の画像解析ルーチンにも使用され得るニューロンのモルフォロジを示す。RFP 画像（下段）は、撮像の初めに青色光のパルスへの露出によって赤に変わる画像の上段に示されているニューロンと同一のニューロンを示す。同一のニューロンが、４時間毎に得られた最初の７つの画像、及び24時間毎に分けられた最後の４つの画像で11回撮像された。上段及び下段は、T1、T2、T3、T4、T5及びT6で同一のニューロンの画像であり、T2はT1の20時間後であり、T3はT1の24時間後であり、T4はT1の48時間後であり、T5はT1の72時間後であり、T6はT1の96時間後である。
【０３０６】
RFP 画像（下段）から分かるように、ミトコンドリアの分解を示すマイトファジーリポータ構築体のMitoEOS2からの信号が経時的に明白に減少している。これらの画像は、例えば細胞の正常なライフサイクル中、又は一若しくは複数の実験条件を受けたとき、個別の細胞の経時的な変化をモニタすべく本明細書に開示された本システムの能力を実証している。更に、図23に示されている画像から分かるように、開示されたシステムは、ニューロンの健康状態の読出しとしての神経突起の解析のような細胞モルフォロジにおける経時的な変化のモニタリング及び解析を可能にする。
【０３０７】
実施例６：一次ニューロンの自動リポフェクタミン2000トランスフェクション
液体処理ワークステーション（Hamilton Robotics, Reno NVから入手可能なMICROLAB（登録商標）STARlet ML 8 96-prep system）が、上記の実施例１に記載されている自動顕微鏡システムに組み込まれた。概念実証として、液体処理ワークステーションは、自動システムの一部として一次ニューロンのリポフェクタミン2000トランスフェクションを行なうように構成された。
【０３０８】
必要な試薬は、市販のソースから得られ、Opti-Mem、リポフェクタミン2000トランスフェクション試薬、DNA 、RNAi、NB＼KYを含んでいる。試薬をSeahorse Bioscience (Massachusetts, USA)から得られた貯蔵器に保管した。
【０３０９】
本システムは以下の工程を行なうように構成された。
１．96（１〜200 μl ）の先端部をピックアップする
２．細胞プレートから200 μl の成長培地を吸引して、培養された培地貯蔵器に分配する。
３．NB＼KY貯蔵器からウェル当り200 μl （全体で20ml）をピペットに移して、（細胞単層を阻害しないような側で分配された）細胞プレートに分配する。
４．先端部を変えて、96（１〜200 μl ）の先端部をピックアップする。
５．Opti-MEM貯蔵器からウェル当り50μl （全体で５ml）をピペットに移して、25μl をDNA 希釈プレートに分配して25μl をリポフェクタミン希釈プレートに分配する。
６．先端部を変えて、１列（１〜200 μl ）の先端部をピックアップする。
７．リポフェクタミン貯蔵器から36μl をピペットに移して、リポフェクタン希釈プレートの各列に連続して３μl 分配する。
８．先端部を変えて、96（１〜200 μl ）の先端部をピックアップする。
９．DNA 貯蔵プレートから３μl をピペットに移して、DNA 希釈プレートに分配する。
１０．先端部を変えて、96（１〜200 μl ）の先端部をピックアップする。
１１．RNAi貯蔵器から１μl をピペットに移して、DNA 希釈プレートに分配する。
１２．５分待機する。
１３．DNA希釈プレートから25μl をピペットに移して、リポフェクタミン希釈プレートに滴状で分配する。
１４．室温で少なくとも20分間培養する。
１５．リポフェクタミン希釈プレートから50μl をピペットに移して、細胞プレートに滴状で分配する。
１６．培養（２０分〜３時間）のために細胞プレートをデッキから培養器に移す。
【０３１０】
上記の発明は、理解の明瞭化のために、図示及び例示によりある程度詳しく説明されているが、ある変更及び調整が、本発明の趣旨又は添付の特許請求の範囲から逸脱することなく本発明になされてもよいことが、本発明の教示を考慮すると当業者に容易に明らかとなる。更に、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるので、本明細書で使用されている専門用語は特定の実施形態のみを記載するためのものであり、制限することを意図していないことを理解すべきである。
【０３１１】
従って、前述の内容は本発明の原理を単に示しているに過ぎない。本明細書に明示的に説明されていないか又は示されていないが、本発明の本質を具体化して本発明の趣旨及び範囲に含まれる様々な構成を当業者が考案することが可能であることが明らかである。更に、本明細書に述べられている全ての例及び条件的な用語は、本発明の本質と、本技術分野を進展させるために本発明者らによりもたらされた概念とを理解する際に読者を支援することを本質的に意図するものであり、このように具体的に述べられた例及び条件に限定するものではないと解釈されるべきである。更に、本発明の本質、態様及び実施形態だけでなく、本発明の具体的な例を述べている本明細書における全ての記載は、本発明の構造的且つ機能的な等価物の両方を含むことを意図するものである。加えて、このような均等物は、現時点で既知の均等物及び今後開発される均等物の両方、すなわち構造に関わらず同一の機能を有する開発された全ての要素を含むことを意図するものである。従って、本発明の範囲は、本明細書に示され説明された例示的な実施形態に制限されることを意図するものではない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は添付の特許請求の範囲により具体化される。
【０３１２】
本願は、2012年12月14日付で出願された米国仮出願第61／737,683 号明細書の利益を主張しており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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