(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のステップを含む、対象における、良性病変から悪性腫瘍へのトランスフォーメーションを検出するためのデータを取得する方法。
（ａ）前記対象由来の試料由来のタンパク質を電気泳動でタンパク質分離にかけるステップ；
（ｂ）電気泳動で分離されたＥＮＯＸ２転写物バリアントをＥＮＯＸ２電子供与体で活性化するステップ；及び
（ｃ）活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントを検出可能な結合試薬を用いて１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの存在を検出するステップであって、前記試料中の１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの存在が、前記対象における、良性病変から悪性腫瘍へのトランスフォーメーションを示し、それにより、同等の非活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントと比較したとき、前記１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントについて、検出感度の１０〜１００倍の増大が得られる、ステップ；
【請求項２】
ＥＮＯＸ２転写物バリアントを活性化するために必要とされるＥＮＯＸ２電子供与体が、還元ピリジンヌクレオチド、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、又はＥＮＯＸ２電子供与体である合成基質の少なくとも１つから選択され、２Ｄブロット上で１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントを検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＮＡＤＨ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの最終濃度が、１０μＭ〜５０μＭの範囲内である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
対象由来の試料由来のタンパク質が、１又は２以上のＥＮＯＸ２転写物バリアントを結合し、濃縮するためのニッケル−アガロース基質を用いて、血液、血清、又は血漿試料から濃縮されたタンパク質であり、
工程（ａ）において、２次元（２Ｄ）電気泳動によりタンパク質分離を行い、フィルム若しくはペーパー上でブロットする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
（ｉ）活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントを検出可能な結合試薬が、抗ＥＮＯＸ２  ｓｃＦｖ融合タンパク質を含み、当該タンパク質が、
４℃から４０℃の間において凝集せず、
ＣＸＸＸＸＣ又はＣＸＸＸＸＸＣのいずれかとして間隔を空けられた２つのシステイン（Ｃ）を含有するアミノ酸残基の小さな側鎖（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）を含み、
ＥＮＯＸ２のタンパク質ジスルフィド−チオール相互変換機能モチーフと鎖間ジスルフィド結合を形成する能力があるか、又は、
（ii）活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントを検出可能な結合試薬が、配列番号１１のｓｃＦｖを含み、配列番号１１のｓｃＦｖの安定性、結合効率、及び保存可能期間が、凝集を防ぐために５０％グリセロール中で保存することにより改善される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
試料が、
臨床症状より少なくとも１年前のがんを含む試料、
家族性がん病歴、環境曝露を有する集団、又は一般的な集団における早期がんを含む試料、
原発不明がん（ＣＵＰ）を含む試料、
ステージ０及びステージ１のがんを含む試料、又は
再出現したがんを含む試料
である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
以下の表１に記載のＥＮＯＸ２転写物バリアントの存在に基づき、１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの原発組織を決定するためのデータを取得するステップをさらに含み、
前記原発組織が、膀胱、血液細胞、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫及び骨髄腫、乳房、頸部、結腸直腸、食道、胃、肝細胞、肺、非小細胞、メラノーマ、中皮腫、卵巣、膵臓、前立腺、腎細胞（腎臓）、肉腫、扁平細胞、精巣胚細胞、甲状腺濾胞、甲状腺乳頭、若しくは子宮の少なくとも１つから選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【表１】
0006442440.tif 000029
0006442440.tif 000030
【請求項８】
１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの存在に基づき、遠隔転移と複数の原発がんとを区別するためのデータを取得するステップをさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
以下のステップを含む、ウエスタンブロット上のＥＮＯＸ２転写物バリアントの定量の較正された方法。
対象由来の試料由来のタンパク質を電気泳動でタンパク質分離にかけるステップ；
電気泳動で分離されたタンパク質をタンパク質捕獲フィルム又はペーパー上にウエスタンブロットするステップ；
前記タンパク質捕獲フィルム又はペーパー上の１又は２以上のＥＮＯＸ２転写物バリアントを、還元ＥＮＯＸ２基質で活性化するステップ；及び
活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントを検出可能な結合試薬を用いて、前記１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの存在を検出するステップであって、前記試料中の１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの存在は、がんの悪性トランスフォーメーションを示し、非活性化ＥＮＯＸ２と比較して、ＥＮＯＸ２についての検出感度の１０〜１００倍の増大が得られ、１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの量が、前記１又は２以上のＥＮＯＸ２転写物バリアントの公知の量と比較して、前記タンパク質捕獲フィルム又はペーパー上のＥＮＯＸ２転写物バリアントのスポット径及び強度に基づき較正される、ステップ；
【請求項１０】
試料が、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、又は体液である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＥＮＯＸ２転写物バリアントのスポット径が、組換えＥＮＯＸ２の標準曲線と比較される、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＥＮＯＸ２転写物バリアントのスポット径の対数と、ＥＮＯＸ２転写物バリアントの量の対数とが線形的に相関する、請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
定量が、
（１）ＥＮＯＸ２転写物バリアントのスポット径と、ＥＮＯＸ２活性との組合せにより達成されるか、或いは
（２）ＥＮＯＸ２転写物バリアントのスポットを切り出すステップ、及び溶出及び銀ナノ粒子を形成するための四酸化銀との反応を用いてＥＮＯＸ２の量を定量するステップ、並びにＥＮＯＸ２のない対応するスポットと比較することにより、紫外−可視分光光度計又は光散乱分光光度計を用いた光散乱によって、前記ナノ粒子を定量するステップにより達成される、
請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
（２）の定量において、７％より高い、バックグラウンドより上のスポットのパーセンテージが、前記スポットにおけるＥＮＯＸ２転写物バリアントの存在を確認する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
試料が、臨床症状より少なくとも１年前のヒトがんを含む試料であり、
ＥＮＯＸ２転写物バリアントの存在に基づき、１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの原発組織を決定するためのデータを取得するステップをさらに含む、請求項９〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントを検出可能な結合試薬が、配列番号１１のｓｃＦｖを含み、前記配列番号１１のｓｃＦｖの安定性、結合効率、及び保存可能期間が、凝集を防ぐために５０％グリセロール中で保存することにより改善される、請求項９〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
対象由来の試料由来のタンパク質が、１又は２以上のＥＮＯＸ２転写物バリアントを結合し、濃縮するためのニッケル−アガロース基質を用いて、血液、血清、又は血漿試料から濃縮されたタンパク質である、請求項９〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
以下のステップを含む、対象における、良性病変から悪性腫瘍へのトランスフォーメーションを検出するためのデータを取得する方法。
前記対象由来の試料由来のタンパク質を、分子量による分離を行う電気泳動と、等電点電気泳動とによる２次元電気泳動により、タンパク質分離にかけるステップ；
前記タンパク質をタンパク質捕獲フィルム又はペーパーに移すステップ；
前記タンパク質捕獲フィルム又はペーパー上で、電気泳動で分離されたＥＮＯＸ２転写物バリアントをＥＮＯＸ２電子供与体で活性化するステップ；
活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントを検出可能な結合試薬を用いて１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントを検出するステップ；及び
以下の表１由来の試料中の１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの存在に基づき、前記がんの原発組織を決定するためのデータを取得するステップであって、インサイチュの前記１又は２以上のＥＮＯＸ２転写物バリアントの活性化が、非活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントと比較したとき、検出感度を１０〜１００倍増大させる、ステップ；
【表１】
0006442440.tif 000031
0006442440.tif 000032
【請求項１９】
対象由来の濃縮された試料由来の１又は２以上の電気泳動で分離されたタンパク質を含むブロットを含むフィルム又はペーパーであって、活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントを検出する試薬と、前記ブロット上のＥＮＯＸ２転写物バリアントを活性化するＥＮＯＸ２の還元基質とに曝露され、以下の表１由来の１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの存在について分析され、前記１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの存在を用いて、臨床症状より少なくとも１年前にヒトがんの原発組織が検出、決定され、非活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントと比較したとき、インサイチュの前記１又は２以上のＥＮＯＸ２転写物バリアントの活性化が、検出感度を１０〜１００倍増大する、前記フィルム又はペーパー。    
【表１】
0006442440.tif 000033
0006442440.tif 000034
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
なし。
【０００２】
技術分野
本発明は、がん検出及び診断の分野、より詳細には、ＮＡＤＨを標的とした検出に基づく機能性１本鎖可変領域組換えＥＮＯＸ２抗体に一般的に関する。
【０００３】
連邦政府資金による研究の陳述
なし。
【０００４】
コンパクトディスクの事項分野の参照による組み込み
本出願は、EFS-Webを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、全体として参照により本明細書に組み込まれる。２０１６年５月３０日付けで作製された、前記ＡＳＣＩＩコピーは、MNCE1002.txtと名付けられ、サイズ１８キロバイトである。
【背景技術】
【０００５】
本発明の範囲を制限することなく、その背景が、がんタンパク質生化学と関連して記載される。
【０００６】
細胞表面ハイドロキノン又は（細胞表面ＮＡＤＨオキシダーゼについて）ＥＣＴＯ−ＮＯＸタンパク質として言及されるタンパク質ジスルフィド−チオール相互変換活性を有するＮＡＤＨオキシダーゼの固有の増殖関連ファミリーが存在する（Morre, 1998. Plasma Membrane Redox Systems and Their Role in Biological Stress and Disease (Asard, H., Berczi, A. and Caubergs, R. J., Eds) pp. 121-156, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands、Morre and Morre, 2003. Free Radical Res. 37: 795-805）。（関連する腫瘍について）ＥＮＯＸ２と命名されるＥＣＴＯ−ＮＯＸファミリーの１員は、がん細胞の表面及びがん患者の血清に特異的である（Morre et al., 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 1831-1835、Bruno et al., 1992. Biochem. J. 284: 625-628）。ＥＮＯＸ２タンパク質の存在は、複数のヒト腫瘍組織（乳癌、前立腺がん、ニューロブラストーマ、結腸癌、及びメラノーマ）について実証され（Cho et al., 2002. Cancer Immunol. Immunother. 51: 121-129）、血清分析は、ヒトがんとのずっと広範な関連性を示唆する（Morre, et al., 1997. Arch. Biochem. Biophys. 342: 224-230、Morre and Reust, 1997. J. Bioenerg. Biomemb. 29: 281-289）。
【０００７】
ＥＮＯＸタンパク質は、細胞膜の外葉に固定されたエクトプロテインである（Morre, 1965. Biochim. Biophys. Acta 1240: 201-208、図１）。エクトプロテインの他の例（シアリルトランスフェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼIVなど）の特徴である通り、ＥＮＯＸタンパク質は排出される。それらは、培養細胞の条件培地において（Cho et al., 2002. Cancer Immunol. Immunother. 51: 121-129）、及び患者血清において（Morre, et al., 1997. Arch. Biochem. Biophys. 342: 224-230、Morre and Reust, 1997. J. Bioenerg. Biomemb. 29: 281-289）可溶性形態で出現する。がん患者由来の血清形態のＥＮＯＸ２は、膜結合形態を投与するのと同じ程度の薬物応答性を提示する。薬物応答性ＥＮＯＸ２活性は、白血病、リンパ腫、又は固形腫瘍（前立腺、乳房、結腸、肺、膵臓、卵巣、及び肝臓）を有する患者を含む、様々なヒトがん患者の血清において見られる（Morre, et al., 1997. Arch. Biochem. Biophys. 342: 224-230、Morre and Reust, 1997. J. Bioenerg. Biomemb. 29: 281-289）。ＥＮＯＸ２タンパク質の極端な安定性及びタンパク質分解酵素抵抗性（del Castillo-Olivares et al., 1998. Arch. Biochem. Biophys. 385: 125-140）は、がん患者の血清において容易に検出可能なレベルまで蓄積する能力を説明する助けとなり得る。対照的に、薬物応答性ＮＯＸ活性は、健常なボランティアの血清において、又は新生物以外の障害を有する患者の血清においては見出されていない（Morre, et al., 1997. Arch. Biochem. Biophys. 342: 224-230、Morre and Reust, 1997. J. Bioenerg. Biomemb. 29: 281-289）。
【０００８】
細胞表面ＥＮＯＸ２のがん特異性の根拠はこれまでに決定されていない一方、概念は、複数の方向からの証拠により支持された。薬物応答性ＥＮＯＸ２活性は、がん化していないヒト細胞及び動物細胞並びに組織の細胞膜には存在していないことが厳密に決定された（Morre et al., 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 1831-1835）。ＥＮＯＸ２タンパク質は、膜貫通型結合ドメインを欠き（Morre, et al., 2001. Arch. Biochem. Biophys. 392: 251-256）、低ｐＨでの簡単な処理により細胞表面から放出される（del Castillo-Olivares et al., 1998. Arch. Biochem. Biophys. 358: 125-140）。薬物応答性ＥＮＯＸ２活性は、健常なボランティア、又はがん以外の疾患を有する患者由来の血清では検出されていない（Morre, et al., 1997. Arch. Biochem. Biophys. 342: 224-230、Morre and Reust, 1997. J. Bioenerg. Biomemb. 29: 281-289）。複数のＥＮＯＸ２抗血清は、がん患者のがん化した細胞及び組織又は血清を抗原供給源として用いたときのウエスタンブロット分析又は免疫沈降により、３４ｋＤａ（ＥＮＯＸ２の細胞表面形態の１つの処理分子量）の免疫反応性バンドを同定した（Cho et al., 2002. Cancer Immunol. Immunother. 51: 121-129、Morre, et al., 2001. Arch. Biochem. Biophys. 392: 251-256、Chueh et al., 2002. Biochemistry 44: 3732-3741）。３４ｋＤａの免疫反応性バンドは、健常なボランティア、又はがん以外の障害を有する患者由来のがん化した細胞及び組織又は血清を用いたときのウエスタンブロット分析又は免疫沈降は存在しない（Cho et al., 2002. Cancer Immunol. Immunother. 51: 121-129、Morre, et al., 2001. Arch. Biochem. Biophys. 392: 251-256、Chueh et al., 2002. Biochemistry 44: 3732-374）。これらの抗血清は、モノクローナル抗体（Cho et al., 2002. Cancer Immunol. Immunother. 51: 121-129）、正常細胞及び新生物細胞由来の細胞表面ＮＡＤＨオキシダーゼと反応する１本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、発現したＥＮＯＸ２に応答して生成されるポリクローナル抗血清（Chueh et al., 2002. Biochemistry 44: 3732-374）、及びＥＮＯＸ２の保存アデニンヌクレオチド結合領域に対するポリクローナルペプチド抗血清（Chueh et al., 2002. Biochemistry 44: 3732-374）を含む。
【０００９】
ＥＮＯＸ２  ｃＤＮＡがクローン化された（GenBank受託番号ＡＦ２０７８８１、１１、米国特許出願公開第２００３／０２０７３４０（Ａ１）号）。オープンリーディングフレームに由来する分子量は、７０．１ｋＤａである。機能モチーフは、キノン結合部位、アデニンヌクレオチド結合部位、及び部位定方向突然変異誘発に基づく可能性のあるタンパク質ジスルフィド−チオール相互変換部位としてのＣＸＸＸＸＣシステイン対を含む（Chueh et al., 2002. Biochemistry 44: 3732-374）。入手可能なゲノム情報（Bird、１９９９年、ＮＣＢＩのGenBankデータベースにクローン８７５Ｈ３（ＡＰＫ１抗原の一部）由来のヒトＤＮＡ配列の直接提出）に基づき、ＥＮＯＸ２遺伝子は染色体Ｘに位置し、そしてそれは、複数のエクソン（１３）を含む。多数のスプライスバリアントｍＲＮＡ及び発現したタンパク質が存在することは公知である。
【００１０】
腫瘍ＮＡＤＨオキシダーゼ−特異的モノクローナル抗体ＭＡＢ  １２．１を産生するハイブリドーマ細胞株は、ブダペスト条約の条項の下、２００２年４月４日付けでAmerican Type Culture Collection, Manassas、Va.、20108に寄託された。この寄託物は、受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４２０６により同定される。寄託物は、寄託日から３０年、若しくは最も新しい請求後５年の期間、又は特許の有効期間のうちのより長い期間、ＡＴＣＣ寄託機関における制限によって維持され、寄託物がその期間中に生存能力がなくなれば、交換される。このモノクローナル抗体は、２００６年５月３０日付けで発行された米国特許第７，０５３，１８８号に記載され、それは、参照により本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０２０７３４０（Ａ１）号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Morre, 1998. Plasma Membrane Redox Systems and Their Role in Biological Stress and Disease (Asard, H., Berczi, A. and Caubergs, R. J., Eds) pp. 121-156, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands
【非特許文献２】Morre and Morre, 2003. Free Radical Res. 37: 795-805
【非特許文献３】Morre et al., 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 1831-1835
【非特許文献４】Bruno et al., 1992. Biochem. J. 284: 625-628
【非特許文献５】Cho et al., 2002. Cancer Immunol. Immunother. 51: 121-129
【非特許文献６】Morre, et al., 1997. Arch. Biochem. Biophys. 342: 224-230
【非特許文献７】Morre and Reust, 1997. J. Bioenerg. Biomemb. 29: 281-289
【非特許文献８】Morre, 1965. Biochim. Biophys. Acta 1240: 201-208
【非特許文献９】del Castillo-Olivares et al., 1998. Arch. Biochem. Biophys. 385: 125-140
【非特許文献１０】Morre, et al., 2001. Arch. Biochem. Biophys. 392: 251-256
【非特許文献１１】del Castillo-Olivares et al., 1998. Arch. Biochem. Biophys. 358: 125-140
【非特許文献１２】Chueh et al., 2002. Biochemistry 44: 3732-3741
【非特許文献１３】Chueh et al., 2002. Biochemistry 44: 3732-374
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
がんがヒト健常者に対して有意な脅威を引き起こすことを理由に、及びがんが有意な経済的コストをもたらすことを理由に、当技術分野においては、がんの存在及び器官部位についてアッセイするための有効な、経済的かつ技術的に単純なシステムに対して長年の切実な必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、（腫瘍特異的ＮＡＤＨオキシダーゼについて）ＥＮＯＸ２として公知の全てのがん抗原の特定の転写物バリアントの存在についての生物学的試料の分析の方法を含む。本方法は、例えば、全てのがんのＥＮＯＸ２抗原、及び特定のタイプのがんを特徴付ける、種々のアイソフォームに特異的な抗体を用いた２次元ゲル電気泳動及び免疫ブロットを含む。本発明の方法はまた、首尾よい処置を反映するＥＮＯＸ２アイソフォームの量が減少することで、治療への応答を評価するために適用することができ、並びに再発性疾患の早期検出（ＥＮＯＸ２特異的アイソフォームの増大又は再発を反映した）に適用することができる。
【００１５】
１つの実施形態において、本発明は、電気泳動タンパク質分離の前に対象から試料を採取するステップ、電気泳動で分離されたＥＮＯＸ２転写物バリアントをＥＮＯＸ２電子供与体で活性化するステップ、及び全てのＥＮＯＸ２を検出可能な結合試薬を用いて１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの存在を検出するステップを含む、対象におけるがんの良性から悪性へのトランスフォーメーションを検出する方法を含み、試料中の１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの存在は、がんの悪性トランスフォーメーションを示し、それにより、同等な非活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントと比較したとき、１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントについて、検出感度の１０〜１００倍の増大が得られる。１つの態様において、ＥＮＯＸ２転写物バリアントを活性化するのに必要とされるＥＮＯＸ２電子供与体は、還元ピリジンヌクレオチド、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、又はＥＮＯＸ２電子供与体である合成基質の少なくとも１つから選択され、ＮＡＤＨ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの最終濃度が１０μＭ〜５０μＭの範囲内である、２Ｄブロット上で１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントを検出する。別の態様において、方法は、フィルム又はペーパー上で２次元（２Ｄ）電気泳動タンパク質分離及びブロットを行うステップをさらに含む。別の態様において、全てのＥＮＯＸ２を検出可能な結合試薬は、配列番号１を含む。別の態様において、試料は、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、又は他の体液である。別の態様において、全てのＥＮＯＸ２を検出可能な結合試薬は、４℃から４０℃の間において凝集しない抗ＥＮＯＸ２  ｓｃＦｖ融合タンパク質を含み、加えて、ＣＸＸＸＸＣ又はＣＸＸＸＸＸＣのいずれかとして間隔を空けられた２つのシステイン残基（Ｃ）を含有する小さな側鎖（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）を有するアミノ酸を主に含むＳｃＦｖ融合タンパク質の重鎖と軽鎖の間の機能的リンカーを含み、ＥＮＯＸ２のタンパク質ジスルフィド−チオール相互変換機能モチーフと鎖間ジスルフィド結合を形成する能力がある。別の態様において、全てのＥＮＯＸ２を検出可能な結合試薬は、配列番号１１のｓｃＦｖを含み、ここで、配列番号１のｓｃＦｖの安定性、結合効率、及び保存可能期間が、凝集を防ぐように−７０℃において５０％グリセロール中で保存することにより、改善される。別の態様において、血液、血清、又は血漿試料を濃縮するステップは、１又は２以上のＥＮＯＸ２転写物バリアントを結合し、濃縮するためのニッケル−アガロース基質を用いて、１又は２以上のＥＮＯＸ２転写物バリアントを濃縮するステップとしてさらに定義される。別の態様において、方法は、がんを検出するステップ、及び／又は臨床症状より少なくとも１年前にヒトがんの原発組織を決定するステップをさらに含む。別の態様において、方法は、がんを検出するステップ、及び／又は臨床症状より少なくとも１年（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は２０年）前にヒトがんの原発組織を決定するステップをさらに含む。別の態様において、方法は、１又は２以上の原発不明がん（ＣＵＰ）の原発組織を決定するステップをさらに含む。別の態様において、方法は、家族性がん病歴、環境曝露を有する集団において、又は一般的な集団において早期がんの少なくとも１つについてスクリーニングするステップをさらに含む。別の態様において、方法は、次の表１に記載のＥＮＯＸ２転写物バリアントの存在に基づき、１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの原発組織を決定するステップをさらに含む。
【００１６】
【表１】
0006442440.tif 000002
0006442440.tif 000003
【００１７】
別の態様において、方法は、全タンパク質ローディングコントロールとしてタンパク質を５３及び／又は７９〜８５ｋＤａで分割するステップをさらに含む。別の態様において、方法は、１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの存在に基づき、遠隔転移と複数の原発がんを区別するステップをさらに含む。別の態様において、方法は、ステージ０及びステージ１のがんを検出するステップ、並びにがんの原発組織を決定するステップをさらに含む。別の態様において、予測されるがんの偽陽性及び確認された偽陰性の発生率は１％未満である。別の態様において、がんを検出する方法の感度は、９５％より高い。別の態様において、方法の感度は、２００万個以下のがん細胞の存在を検出する。別の態様において、方法は、がんの再出現をモニタリングするステップをさらに含み、そこでは、１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの再出現に基づき２００万個以下のがん細胞の存在が検出可能である。別の態様において、方法は、悪性早期新生物病変と良性早期新生物病変とを決定するステップをさらに含み、良性病変が検出されるなら、外科手術、化学療法、又は放射線療法を行うステップが回避され得る。別の態様において、方法は、前立腺がんの早期兆候を決定するステップをさらに含む。別の態様において、方法は、乳管癌の発展前に、外科手術を潜在的に回避するために根治的早期介入、放射線又は化学療法を必要とする非浸潤性乳管癌を決定するステップをさらに含む。別の態様において、がんの良性から悪性へのトランスフォーメーションは、臨床症状の発生の少なくとも１年前に検出される。別の態様において、検出されたがんの原発組織は、膀胱、血液細胞、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫及び骨髄腫、乳房、頸部、結腸直腸、食道、胃、肝細胞、肺、非小細胞、メラノーマ、中皮腫、卵巣、膵臓、前立腺、腎細胞（腎臓）、肉腫、扁平細胞、精巣胚細胞、甲状腺濾胞、甲状腺乳頭、又は子宮（子宮内膜）の少なくとも１つから選択される。
【００１８】
本発明のなお別の実施形態は、対象由来の濃縮された試料を電気泳動でタンパク質分離にかけるステップ、電気泳動で分離されたタンパク質をタンパク質捕獲フィルム又はペーパー上にウエスタンブロットするステップ、タンパク質捕獲フィルム又はペーパー上の１又は２以上のＥＮＯＸ２転写物バリアントを還元ＥＮＯＸ２基質で活性化するステップ、及び全てのＥＮＯＸ２を検出可能な結合試薬を用いて、１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの存在を検出するステップを含む、ウエスタンブロット上のＥＮＯＸ２転写物バリアントの定量の較正された方法を含み、血液、血清、又は血漿試料中の１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの存在が、がんの悪性トランスフォーメーションを示し、非活性化ＥＮＯＸ２と比較して、ＥＮＯＸ２についての検出感度の１０〜１００倍の増大が得られ、１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの量は、１又は２以上のＥＮＯＸ２転写物バリアントの公知の量と比較して、タンパク質捕獲フィルム又はペーパー上のＥＮＯＸ２転写物バリアントのスポット径及び強度に基づき較正される。１つの態様において、スポット径は、組換えＥＮＯＸ２の標準曲線と比較される。別の態様において、ＥＮＯＸ２の塊のスポット径及び対数は、線形的に相関する。
【００１９】
本発明のなお別の実施形態は、対象由来の試料中のタンパク質を２次元（２Ｄ）分子量及び等電点電気泳動でのタンパク質分離にかけるステップ、タンパク質をタンパク質捕獲フィルム又はペーパーに移すステップ、タンパク質捕獲フィルム又はペーパー上でのＥＮＯＸ２電子供与体とのインキュベーションにより、電気泳動で分離されたＥＮＯＸ２転写物バリアントを活性化するステップ、活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントを検出するステップ、及び表１由来の試料中の１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの存在に基づき、がんの原発組織を決定するステップを含む、対象におけるがんの原発組織を決定する方法を含み、１又は２以上のインサイチュのＥＮＯＸ２転写物バリアントの活性化は、非活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントと比較したとき、検出感度を１０〜１００倍増大する。別の態様において、ＥＮＯＸ２転写物バリアントを活性化するのに必要とされるＥＮＯＸ２電子供与体は、還元ピリジンヌクレオチド、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、又はＥＮＯＸ２電子供与体である合成基質の少なくとも１つから選択され、ＮＡＤＨ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの最終濃度が１０μＭ〜５０μＭの範囲内である、２Ｄブロット上で１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントを検出する。別の態様において、方法は、２次元（２Ｄ）電気泳動タンパク質分離を行うステップ、及びフィルム又はペーパー上にブロットするステップをさらに含み、ＥＮＯＸ２電子供与体は、還元ピリジンヌクレオチド、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、又はＥＮＯＸ２電子供与体である合成基質の少なくとも１つから選択され、ＮＡＤＨ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの最終濃度が１０μＭ〜５０μＭの範囲内である、２Ｄブロット上で１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントを検出する。別の態様において、全てのＥＮＯＸ２を検出可能な結合試薬は、配列番号１１を含む。別の態様において、全てのＥＮＯＸ２を検出可能な結合試薬は、４℃から４０℃の間において凝集しない抗ＥＮＯＸ２  ｓｃＦｖ融合タンパク質を含み、ＣＸＸＸＸＣ又はＣＸＸＸＸＸＣのいずれかとして間隔を空けられた２つのシステイン残基（Ｃ）を含有する小さな側鎖（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）アミノ酸残基を含み、ＥＮＯＸ２のタンパク質ジスルフィド−チオール相互変換機能モチーフと鎖間ジスルフィド結合を形成する能力がある。別の態様において、全てのＥＮＯＸ２を検出可能な結合試薬は、配列番号１１のｓｃＦｖを含み、ここで、配列番号１１のｓｃＦｖの安定性、結合効率、及び保存可能期間は、凝集を防ぐように−７０℃において５０％グリセロール中で保存することにより、改善される。別の態様において、試料を濃縮するステップは、１又は２以上のＥＮＯＸ２転写物バリアントを結合させ、濃縮するためのニッケル−アガロース基質を用いて、１又は２以上のＥＮＯＸ２転写物バリアントを濃縮するステップとしてさらに定義される。別の態様において、方法は、臨床症状より少なくとも１年前に、がんを検出するステップ及び／又はヒトがんの原発組織を決定するステップをさらに含む。別の態様において、試料は、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、又は体液である。
【００２０】
本発明のなお別の実施形態は、対象由来の濃縮された試料由来の１又は２以上の電気泳動で分離されたタンパク質を含むブロットを含み、
ブロットは、全てのＥＮＯＸ２検出する試薬、及びブロット上のＥＮＯＸ２転写物バリアントを活性化するＥＮＯＸ２の還元基質に曝露され、ブロットは、表１由来の１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの存在について分析され、
１又は２以上の活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントの存在を用いて、臨床症状より少なくとも１年前にヒトがんの原発組織が検出され、決定され、１又は２以上のインサイチュＥＮＯＸ２転写物バリアントの活性化は、非活性化ＥＮＯＸ２転写物バリアントと比較したとき、検出感度を１０〜１００倍増大する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本発明の特性及び利点のより完全な理解のため、発明の詳細な説明が添付の図面と共にここで参照される。
【図１】ＮＡＤＨなしと比較したアッセイにおいて１５μＭ  ＮＡＤＨの存在下でのインキュベーションを含む２−Ｄゲル電気泳動／ウエスタンブロット分析により決定される通り、アッセイにおいてＥＮＯＸ２の異なる量のスポットサイズ及び密度の２倍の増大を明示するグラフである。
【図２】ＥＮＯＸ２活性とＮＡＤＨの濃度との関係を描写するグラフである。最大活性は、およそ０．８μＭのｋＭを有する約５００μＭ  ＮＡＤＨにおいて達成された（ｋＭの決定については図３を参照）。
【図３】ＥＮＯＸ２活性（タンパク質１ｍｇ当たりナノモル／分）Ｖ対およそ０．８ｍＭのｋＭを生じるｍＭの基質濃度Ｓの２重逆数Lineweaver-Burkeプロットを示すグラフである。抗体あり及び抗体なしについて同一又は類似する縦軸切片は、抗体が、ＥＮＯＸ２配列の同一領域にある基質と抗体結合部位についての証拠をもたらす、活性部位のＮＡＤＨ基質と競合することを明示する。
【図４】プールされたがん血清のＥＮＯＸ２活性サイクルの５つの最大値を説明するための時間の関数としてＥＮＯＸ２活性の表示を示すグラフである。表１において定量される通り、阻害は、２２分の活性サイクル内において最大値４にて生じる。従って、最大値５は阻害されるべき最初の最大値であるので、抗体結合は、最大値４中に独占的に生じなければならない。最大値５における抗体添加は作用を有さず、最大値４より前の抗体添加も作用を有さなかった。
【図５】臨床症状より最大１０年前に、アスベスト作業者における悪性中皮腫の早期検出を描写するグラフである。７人の男性対象、診断の中央値年齢６７歳、アスベストにより誘導される悪性中皮腫の診断の１６８〜９６カ月前に開始した一連のアッセイが表される。閉じた記号は、悪性中皮腫の特徴である両方のタンパク質１もタンパク質２もあることは明白である。開いた記号は、タンパク質１もタンパク質２もないことは明白である。網掛け記号は、タンパク質１のみであることは明白である。
【図６】がんの早期診断及び早期介入のため、がん特異的細胞表面タンパク質のＥＮＯＸ２のファミリーの有用性の図解表示の図である。ＥＮＯＸ２のがん部位特異的転写物バリアントは血清に流されて、早期検出及び診断が可能になる。細胞表面における発端のＥＮＯＸ２タンパク質は、がんの制御されていない増殖に必須の細胞膜電子伝達機能の終末のオキシダーゼとして作用する。ＥＮＯＸ２タンパク質が、例えば、ＥＧＣｇ／トウガラシ（Capsicum）相乗作用を通じて阻害されるとき、制御されていない増殖が終わり、がん細胞はプログラム化された細胞死（アポトーシス）を経験する。
【図７】プールされた非がん（左パネル）、及び主要な癌プラス白血病及びリンパ腫（右パネル）患者血清を表すプールされたがんを含む、ＥＮＯＸ２転写物バリアントの２次元ゲル／ウエスタンブロットを提供する図である。未反応（バックグラウンドにおける）アルブミンのおよその位置が、比較のため標識される。ＥＮＯＸ２反応性タンパク質は、四分円Ｉ及びIVに限定される。検出は、アルカリホスファターゼと結合した組換えｓｃＦｖ−Ｓ（Ｓ−タグペプチド：Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ）抗体を用いる。プールされたがん血清のおよそ１０種のＥＮＯＸ２転写物バリアントは、非がんに存在せず（Ａ）、がん部位特異的である。
【図８Ａ−８Ｊ】個々に分析されたがん患者由来の血清の２−Ｄゲル電気泳動のウエスタンブロット／ウエスタンブロットを示す図である。がん部位は、存在する主要な転写物バリアントの分子量の低減する順で示される。図８Ａ．頸部がん。図８Ｂ．卵巣がん。図８Ｃ．前立腺がん。図８Ｄ．乳がん。図８Ｅ．非小細胞肺がん。図８Ｆ．小細胞肺がん。図８Ｇ．膵臓がん。図８Ｈ．大腸がん。図８Ｉ．非ホジキンリンパ腫。図８Ｊ．メラノーマ。未反応（バックグラウンドにおける）アルブミン（Ａｂ）のおよその位置が、比較のため標識される。およそ１８０種の非がん患者血清が、陽性コントロールとしての比較のため、特異的転写物バリアントを示すタンパク質であるとの証拠なく、並行して分析された。
【図９Ａ−９Ｂ】患者血清の分析的ゲル電気泳動及び免疫ブロットを示す図である。図９Ａ．非小細胞肺がんを有する患者由来の血清は、５４ｋＤａ、等電点ｐＨ５．１の転写物バリアント（矢印）を含有する。図９Ｂ．小細胞肺がんを有する患者由来の血清は、５２ｋＤａ、等電点４．３の転写物バリアント（矢印）を含有する。右のＭＷ  ５２ｋＤａ及び等電点ｐＨ４．１のリファレンススポットは、α１−アンチトリプシン阻害剤である。アルブミン及び他の血清タンパク質は未反応である。
【図１０】患者血清のウエスタンブロットによる乳がんに特異的なＥＮＯＸ２転写物バリアントの２−Ｄゲル電気泳動分離及び検出を示す図である。矢印＝６６〜６８ｋＤａの乳がん特異的転写物バリアント。Ｒ＝５２ｋＤａ、等電点ｐＨ４．１のα−フェチュイン（fetuin）リファレンススポット。
【図１１】２−ＤゲルにロードされたＥＮＯＸ２タンパク質のスポット径と量との間の対数と対数の関係を説明する図である。変動する量の組換えＥＮＯＸ２が、免疫ブロットにより分析された。次に、検出されたＥＮＯＸ２スポットの直径の対数が、ロードされたＥＮＯＸ２の量の対数の関数としてプロットされた。
【図１２】従来のＸＸＸＸＸＸＸリンカー（図１２Ｂ）と比較した、−ＣＸＸＣ−ＸＸ−Ｃリンカー（図１２Ａ）を有するＳｃＦＶの有効性を実証するための混合実験のウエスタンブロットを示す図である。（Ｓ−Ｓ結合を保存するために）両方について非還元条件下、機能的システインリンカーを有するＳｃＦＶ組換え抗体は、組換えＥＮＯＸ２とインキュベーションされたとき、５３ｋＤａ  ＳｃＦＶ（ａ）、及び結合した分子量約１７６ｋＤａについて、１つのＥＮＯＸ２分子と２つのＳｃＦＶ分子の比（ＥＮＯＸ２の２つのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ結合部位のそれぞれに対して１つ）において全長ＳｃＦＶと７２ｋＤａ全長ＥＮＯＸ２との間のジスルフィド結合形成による主に下流開始部位由来の４６ｋＤａ切断型ＳｃＦＶ（ｂ）のレベルの低減を示した。図１２Ｂにおいて、システインを欠く従来のリンカーで、同一の反応条件下で架橋結合の証拠は観察されなかった。
【図１３】−７０℃において５０％グリセロール中で保存されたとき凝集されない抗体の主要な寄与を主に示す、光散乱（Agilent 7080 Particle Size Spectrophotometer）により決定されたサイズ（ｎｍ）に基づく抗体の濃度（％）としての粒子分布の図である。
【図１４】ＥＮＯＸ２転写物バリアント検出の感度の１０倍の増大を立証する、Hostetler et al. 2009（Clin. Proteomics 5: 46-51）により記載される従来の２次元ウエスタンブロット分析と比較して、本明細書に記載されるＮＡＤＨ−標的化２次元ウエスタンブロット分析の比較の図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の種々の実施形態の作製及び使用が、以下で詳細に考察される一方、本発明が、多種多様な特定の文脈において具体化され得る多くの適用可能な発明概念を提供することは、理解されるべきである。本明細書において考察される特定の実施形態は、本発明を作製し、使用するための特定の方法の単なる説明であり、本発明の範囲を区切らない。
【００２３】
本発明の理解を促進するために、多数の用語が以下で定義される。本明細書において定義される用語は、本発明に関する範囲内の当業者により通常理解される意味を有する。「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」のような用語は、単数形の実体のみを指すことは意図されず、説明のため用いられ得る特定の例の一般的な種類を含む。本明細書における専門用語を用いて、本発明の特定の実施形態が記載されるが、それらの使用は、請求項で説明される場合を除き、本発明を区切らない。
【００２４】
本発明の分野は、がん特異的ファミリーの細胞表面ＥＮＯＸ２タンパク質に標的化された特異的機能性１本鎖可変領域組換え抗体、これにより、既に開発されたプロトコールに渡り１０〜１００倍の感度の増強をもたらすＮＡＤＨ−標的化テクノロジーと組み合わされたＥＮＯＸ２−特異的組換えｓｃＦｖ抗体での２次元ゲル電気泳動を用いることにより決定される発端特異的転写物バリアントの組織の分子量及び等電点に基づき、悪性疾患の臨床症状より最大１０年前にがんの検出を可能にするがんの早期全がん診断（pan-cancer diagnosis）のための血清ベースのアッセイである。
【００２５】
腫瘍関連ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドオキシダーゼ（ＥＮＯＸ２）としても公知のエクト−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドオキシダーゼジスルフィドチオール交換体２（ＥＮＯＸ２）（GenBank受託番号ＡＦ２０７８８１、Chueh et al., 2002）は、早期診断のため並びに早期予防介入のための標的として理想的に適合する（図６）。タンパク質は、悪性腫瘍の細胞表面上で発現され、がんを有する患者の血清において検出可能である（Cho et al., 2002）。ＥＮＯＸ２タンパク質は、細胞膜電子伝達の終末のハイドロキノンオキシダーゼである。早期介入の観点から、それらは、腫瘍細胞の増殖及び拡大において重要である（Morre and Morre, 2003、Tang et al., 2007. Biochemistry 46:12337-12346、2008. Oncol. Res. 16:557-567）。両方の早期検出のため及び早期介入のため標的としてＥＮＯＸ２を用いる本発明者らのアプローチは、これらの特性に基づく（Cho et al., 2002、Morre and Morre, 2003、Davies and Bozzo, 2005. Drug News Perspect 19: 223-225により概説される）。ＥＮＸＯ２の存在は、がん部位特異的ＥＮＯＸ２形態を同定するための方法論なしで、がんの検出への非侵襲性アプローチをもたらす一方、がんのタイプ又は位置についての指示は提供しなかった。
【００２６】
本発明は、（腫瘍特異的ＮＡＤＨオキシダーゼについて）ＥＮＯＸ２として公知の全てのがん抗原の特定のアイソフォームの存在についての生物学的試料の分析の方法を提供する。本方法は、全てのがんＥＮＯＸ２抗原、及び特定のタイプのがんを特徴付ける種々のアイソフォームに特異的な抗体を用いた２次元ゲル電気泳動及び免疫ブロットを必要とする。具体的に例示される通り、血清約３０μＬが、分析のためロードされる。
【００２７】
ＥＮＯＸ２転写物バリアントは、ＥＮＯＸ２−特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ）（米国特許第７，０５３，１８８号）を用いた、全ての細胞表面ＮＯＸタンパク質（年齢と関連する正常細胞及び新生物特異的ＮＡＤＨオキシダーゼ両方）を認識する１本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）フラグメントを用いた、又はＥＮＯＸ２に対して生じたポリクローナル血清を用いた検出で、それらの分子量及び等電点に基づき同定される。ＥＣＴＯ−ＮＯＸタンパク質は、ニッケル−アガロースに結合させ、次に溶出させることにより、生物学的試料、望ましくは、血清試料からまず強化され、濃縮される。ボルテックスすることによりニッケルアガロースからタンパク質を放出させた後、タンパク質は、等電点電気泳動により１次元で、及びポリアクリルアミドゲル電気泳動により２次元で分離される。本明細書において具体的に例示される通り、等電点電気泳動ステップは、ｐＨ範囲３〜１０に渡り、サイズ分離は、１０％ポリアクリルアミドゲルに渡る。大抵のがん特異的ＥＮＯＸ２アイソフォームは、非常に狭い範囲ｐＨ３．９と６．３との間の等電点を提示するが、分子量３４〜１３６ｋＤａで異なる。具体的に例示される２Ｄゲルシステムにおいて、がん特異的アイソフォームは、四分円Ｉ（比較的高分子量の材料）、及びIV（低分子量の材料、特に、３０〜５０ｋＤａの範囲）に位置する。ＩｇＧ重鎖（四分円II）及びＩｇＧ軽鎖（四分円III）は、ｓｃＦｖ抗体と交差反応し、５３及び７９〜８５ｋＤａのリファレンスタンパク質と共に、ローディングコントロールとして作用する。全てのＥＮＯＸ２アイソフォームの非存在は、がんの非存在、又はアッセイにおける検出の限界未満の累積のがんサイズを示す。ＥＮＯＸ２アイソフォームの存在は、がんの存在を示す。血清試料に存在する特定の分子量、又はアイソフォームの特定の組み合わせは、がんの細胞タイプ又は原発組織を示す。方法は、がんの存在を決定するだけでなく、本発明の方法は、原発組織に関する診断情報も提供する。現在、これらの特定の性能を有する全てのがん（全ての形態のヒトがん）の検査は存在しない。６４〜６９ｋＤａの範囲内の見かけの分子量、４．２〜４．９の範囲内のｐＨを有するＥＮＯＸ２転写物バリアントは、乳がんと関連付けられる。５２〜５３ｋＤａ、ｐＨ４．１〜４．６のＥＮＯＸ２転写物バリアントは、小細胞肺がんと関連付けられる。５４〜５６ｋＤａ、ｐＨ４．６〜５．３のＥＮＯＸ２転写物バリアントは、非小細胞肺がんと関連付けられる。約７２〜９０ｋＤａ及び３７〜４７ｋＤａ、両方について等電点ｐＨ３．７〜５．０の２つのＥＮＯＸ２転写物バリアントは、卵巣がんを特徴付ける。７１〜８８ｋＤａ、ｐＨ５．１〜６．５のＥＮＯＸ２転写物バリアントは、前立腺がんと関連付けられる。約９０〜１００ｋＤａ、ｐＨ４．２〜５．４のＥＮＯＸ２転写物バリアントは、頸部がんを示唆する。約８０〜９６ｋＤａ、ｐＨ４．４〜５．４、５０〜６５ｋＤａ、ｐＨ４．２〜５．３、及び３３〜４６ｋＤａ、ｐＨ３．８〜５．２の３つのＥＮＯＸ２転写物バリアントは、大腸がんの特徴である。患者ががんを有すると疑われる場合、生物学的試料、有利には、血清試料の２Ｄゲル電気泳動／免疫学的分析は、本発明で��がんの存在及び器官部位両方を明らかにする。
【００２８】
方法１−  ウエスタンブロット検出プロトコールの感度及び特異性の１０〜１００倍の増大。
本発明を用いることで、ウエスタンブロット検出プロトコールの感度及び特異性の１０〜１００倍の増大は、抗体結合部位阻害性リガンドへの血清ＥＮＯＸ２の曝露後、ＮＡＤＨ酸化の阻害の遅延時間が存在したという知見からもたらされた。阻害は、３０分のインキュベーション中０から２２分の間の種々の時間（２２分はＥＮＯＸ２活性サイクルの長さである（Wang et al., 2001. Biochim. Biophys. Acta 1539:192-204））において生じることが観察された。従って、ＥＥＭＴＥ抗体結合部位が抗体との結合に使用可能である、それぞれの２２分の活性サイクル中の時間は、比較的短く、５分未満程度である。また、ＥＮＯＸ２タンパク質は、抗体が、この比較的短い枠の機会中に結合部位へのアクセスに到達させるために活性でなければならない。
【００２９】
表２は、抗体添加後５回の連続する２２分の活性サイクル中、５つの活性最大値におけるＥＮＯＸ２の活性を示す。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
阻害は、２２分の活性サイクル内で最大値４において生じる。従って、最大値５は阻害されるべき最初の最大値であるので、抗体結合は、最大値４中に独占的に生じなければならない。最大値５における抗体添加は作用を有さず、最大値４より前の抗体添加も作用を有さなかった。上の結果の推論は、抗体が、不活性なＥＮＯＸ２転写物バリアントに結合しないか、又は不十分にのみ結合することである。それ故、ステップは、抗体とのインキュベーション中にウエスタンブロット上のＥＮＯＸ２を活性な状態にするよう開始された。
【００３２】
抗体でのウエスタンブロット中に活性なＥＮＯＸ２を維持するために、１％ミルクでの１０分間のブロッキング、及び過剰なミルクを除去するためのＴＢＳＴで２回すすいだ後、還元ピリジンヌクレオチド［ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ］が、１次ｓｃＦｖ抗体とのインキュベーション中に１５μＭの濃度で添加された。１０μＭの範囲内の最終濃度のＮＡＤＨが好ましい。ＮＡＤＨの濃度、温度、及び抗体タイターに依存した、振盪あり又は振盪なしで、４℃から４０℃の間のいかなる温度における、１〜１６時間の時間、抗体とのブロットのインキュベーションは、好ましくは、振盪ありで４℃において一晩（およそ１６時間）のインキュベーションである。
【００３３】
本発明のがん診断システムは、ヒト血清中のタンパク質の分離のための２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動技術を利用して、がんの存在、腫瘍タイプ、疾患重症度、及び治療応答を示すがん特異的アイソフォームパターン及び組成を生じさせる。プロトコールは、ＥＮＯＸ２転写物バリアントの少なくとも２６種のがん特異的パターンの検出のため設計され、それぞれが、がんの発端の２０種の異なる組織を表す異なる腫瘍タイプを表示し、がんの存在及び原発がんの発端を示すよう決定される。本明細書は、特定のがんを反映するＥＮＯＸ２転写物バリアントを検出するための、転写物を決定する２次元ゲル電気泳動プロトコール及びその後の免疫分析のプロセスを説明する。
【００３４】
２次元ゲル電気泳動は、互いに直角の２次元の置換により分離し、免疫ブロットは、ＥＮＯＸ２アイソフォームを同定する。１次元において、バリアントは、等電点電気泳動（ＩＥＦ）による電荷に従い、等電点（ｐＩ）により分離される。次に、バリアントは、２次元のＳＤＳ−ＰＡＧＥによるキロダルトン（ｋＤａ）の分子量に従い、分離される。次に、アイソフォームは、転写物バリアントへの抗体結合を安定化する機能的リンカーを含有する全てのがん特異的抗体調製物を用いたさらなる分析のため、ニトロセルロース膜にブロットされる。
【００３５】
がんの存在及び発端のがん組織両方を同時に決定するための機会は、Ｓタグを有する全てのＥＮＯＸ２組換え１本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）抗体（図７）でのウエスタンブロットが検出のため利用される、２次元ゲル電気泳動分離の結果として出現する（Hostetler et al., 2009. Clin. Proteomics 5: 46-51）。抗体は、ヒト起源の血液腫瘍及び固形腫瘍由来の全ての公知のＥＮＯＸ２転写物バリアントと交差反応したが、それ自体は異なる種類のがんを区別しなかった。この抗体を用いた分析は、２次元ゲル電気泳動分離と合わせたとき、それぞれが特定の形態のがんの特徴的な分子量及び等電点を示す、転写物バリアントとしてその後に同定されるＥＮＯＸ２タンパク質の特定の種を明らかにした（表１）。
【００３６】
方法２−  特定の分子量及び等電点のＥＮＯＸ転写物バリアントは、がん患者により特有に産生される。
転写物バリアントは、がん細胞により特異的に産生される分子署名分子であり、非がん細胞に非存在であるので、それらは、循環中に流れ出し、偽陽性と偽陰性のいずれの発生率も低い、リスク集団における原発がん及び再発がんの両方の早期検出のための決定的な非侵襲性及び感受性血清マーカーとして作用する可能性を有する。
【００３７】
２−Ｄ−ウエスタンブロットプロトコールは、臨床症状より十分早く早期にがんを検出するので、がんの可能性のある根治的予防ストラテジーとしての早期介入と早期検出を合わせる機会がもたらされ、これにより、その最も早期のステージの疾患の消去が独自に可能である。
【００３８】
図２は、ＥＮＯＸ２活性とＮＡＤＨの濃度との関係を描写するグラフである。最大活性は、およそ０．８μＭのｋＭを有する約５００μＭ  ＮＡＤＨにおいて達成された（ｋＭの決定については図３を参照）。
【００３９】
図３は、ＥＮＯＸ２活性（タンパク質１ｍｇ当たりナノモル／分）Ｖ対およそ０．８ｍＭのｋＭを生じるｍＭ基質濃度Ｓの２重逆数Lineweaver-Burkeプロットを示すグラフである。抗体あり及び抗体なしについて同一又は類似する縦軸切片は、抗体が、ＥＮＯＸ２配列の同一領域にある基質と抗体結合部位についての証拠をもたらす、活性部位のＮＡＤＨ基質と競合することを明示する。
【００４０】
図４は、プールされたがん血清のＥＮＯＸ２活性サイクルの５つの最大値を説明するための時間の関数としてＥＮＯＸ２活性の表示を示すグラフである。表１において定量される通り、阻害は、２２分の活性サイクル内において最大値４にて生じる。従って、最大値５は阻害されるべき最初の最大値であるので、抗体結合は、最大値４中に独占的に生じなければならない。最大値５における抗体添加は作用を有さず、最大値４より前の抗体添加も作用を有さなかった。
【００４１】
図５は、臨床症状より最大１０年前の、アスベスト作業者における悪性中皮腫の早期検出を描写するグラフである。７人の男性対象、診断の中央値年齢６７歳、アスベストにより誘導される悪性中皮腫の診断の１６８〜９６カ月前に開始した一連のアッセイが表される。閉じた記号は、悪性中皮腫の特徴である両方のタンパク質１もタンパク質２もあることは明白である。開いた記号は、タンパク質１もタンパク質２もないことは明白である。網掛け記号は、タンパク質１のみであることは明白である。
【００４２】
がん患者（膀胱、血液細胞（白血病、リンパ腫、及び骨髄腫）、乳房、頸部、結腸直腸、食道、胃、肝細胞、肺、メラノーマ、卵巣、膵臓、前立腺、腎細胞（腎臓）、肉腫、扁平細胞、精巣胚細胞、甲状腺、及び子宮（子宮内膜））の混合集団由来のＥＮＯＸタンパク質の分析的２−Ｄゲル電気泳動及び免疫ブロットは、四分円Ｉ及びIVにおける３４から１００ｋＤａの間の分子量の酸性タンパク質の複数の種を明らかにし（図７、右パネル）、そのうちいずれも、非がん患者の血清に存在しなかった（図７、左パネル）。１次元における分離は、３〜１０のｐＨ範囲に渡る等電点電気泳動によるものであり、２次元における分離は、１０パーセントＳＤＳ−ＰＡＧＥによるものであった。ＥＮＯＸ２転写物バリアントの等電点は、３．２〜６．３の範囲内であった。ＥＮＯＸ２形態以外の主な反応性タンパク質は、好都合なローディングコントロール及び等電点リファレンスとして作用した、５３ｋＤａ、等電点ｐＨ４．１の大部分がリン酸化されたアルファ−フェチュイン（図８における標識された「Ｒ」）、並びにローディングリファレンスの第２の点及び等電点リファレンスとして作用した、７９〜８５ｋＤａ、等電点ｐＨ６．８のセロトランスフェリンであった。２つの交差反応性リファレンスタンパク質は、がん及び非がん対象両方の血清及び血漿の大部分に存在する。アルブミン及び他の血清タンパク質は、少量で存在するとき、通常反応しない。いくつかのブロットにおいて、組換えｓｃＦｖは、免疫グロブリン重鎖タンパク質（約５２ｋＤａ）及び免疫グロブリン軽鎖タンパク質（約２５ｋＤａ）と弱い交差反応性であった。
【００４３】
図８Ａ〜８Ｊは、個々に分析されたがん患者由来の血清の２−Ｄゲル電気泳動のウエスタンブロット／ウエスタンブロットを示す。がん部位は、存在する主要な転写物バリアントの分子量の低減する順で示される。図８Ａ．頸部がん。図８Ｂ．卵巣がん。図８Ｃ．前立腺がん。図８Ｄ．乳がん。図８Ｅ．非小細胞肺がん。図８Ｆ．小細胞肺がん。図８Ｇ．膵臓がん。図８Ｈ．大腸がん。図８Ｉ．非ホジキンリンパ腫。図８Ｊ．メラノーマ。未反応（バックグラウンドにおける）アルブミン（Ａｂ）のおよその位置が、比較のため標識される。およそ１８０種の非がん患者血清が、陽性コントロールとしての比較のため、特異的転写物バリアントを示すタンパク質であるとの証拠なく、並行して分析された。
【００４４】
図９Ａ及び９Ｂは、患者血清の分析的ゲル電気泳動及び免疫ブロットを示す。図９Ａ．非小細胞肺がんを有する患者由来の血清は、５４ｋＤａ、等電点ｐＨ５．１の転写物バリアント（矢印）を含有する。図９Ｂ．小細胞肺がんを有する患者由来の血清は、５２ｋＤａ、等電点４．３の転写物バリアント（矢印）を含有する。右のＭＷ５２ｋＤａ及び等電点ｐＨ４．１のリファレンススポットは、α１−アンチトリプシン阻害剤である。アルブミン及び他の血清タンパク質は未反応である。
【００４５】
図１０は、患者血清のウエスタンブロットによる乳がんに特異的なＥＮＯＸ２転写物バリアントの２−Ｄゲル電気泳動分離及び検出を示す。矢印＝６６〜６８ｋＤａの乳がん特異的転写物バリアント。Ｒ＝５２ｋＤａ、等電点ｐＨ４．１のα−フェチュインリファレンススポット。
【００４６】
種々の形態のがんを有する個々の患者由来の血清は、２−Ｄゲル電気泳動及び免疫ブロットにより分析されて、図７のＥＮＯＸ２アイソフォームのそれぞれを特定の原発組織のがんに割り当てた（表３を参照）。６４〜６９ｋＤａの範囲内の見かけの分子量、４．２〜４．９の範囲内のｐＨを有するＥＮＯＸ２転写物バリアントは、乳がんと関連付けられる。５２〜５３ｋＤａ、ｐＨ４．１〜４．６のＥＮＯＸ２転写物バリアントは、小細胞肺がんと関連付けられる。５４〜５６ｋＤａ、ｐＨ４．６〜５．３のＥＮＯＸ２転写物バリアントは、非小細胞肺がんと関連付けられる。約７２〜９０ｋＤａ及び３７〜４７ｋＤａ、両方について等電点ｐＨ３．７〜５．０の２つのＥＮＯＸ２転写物バリアントは、卵巣がんを特徴付ける。７１〜８８ｋＤａ、ｐＨ５．１〜６．５のＥＮＯＸ２転写物バリアントは、前立腺がんと関連付けられる。約９０〜１００ｋＤａ、ｐＨ４．２〜５．４のＥＮＯＸ２転写物バリアントは、頸部がんを示唆する。約８０〜９６ｋＤａ、ｐＨ４．４〜５．４、５０〜６５ｋＤａ、ｐＨ４．２〜５．３、及び３３〜４６ｋＤａ、ｐＨ３．８〜５．２の３つのＥＮＯＸ２転写物バリアントは、大腸がんの特徴である。患者ががんを有すると疑われる場合、生物学的試料、有利には、血清試料の２Ｄゲル電気泳動／免疫学的分析は、本発明で両方の、がんの存在及び器官部位を明らかにする。
【００４７】
ＥＮＯＸ２のタンパク質配列は、全てのＥＮＯＸ２  ｓｃＦｖ組換え抗体と反応性の２つのリファレンスタンパク質アルファ−フェチュイン及びセロトランスフェリンとの類似性を提示する。Ｅ３９４ＥＭＴＥ３９８キノン阻害剤結合部位に対する類似性の領域は、ＥＮＯＸ２における隣接する７個のアミノ酸配列（下線が引かれた）に限定され、特異的ｓｃＦｖ抗体が結合する抗原配列として作用する。
ＥＮＯＸ２    ＥＥＭＴＥＴＫＥＴＥＥＳＡＬＶＳ    （配列番号１）下線が引かれたアミノ酸３９９〜４０６
アルファ−フェチュイン    ＧＴＤＣＶＡＫＥＡＴＥＡＡＫＣＮ    （配列番号２）下線が引かれたアミノ酸２１０〜２１６
セロトランスフェリン    ＣＬＤＧＴＲＫＰＶＥＥＹＡＮＣＨ    （配列番号３）下線が引かれたアミノ酸５８８〜５９５
【００４８】
Ａ．試料調製
１．再水和溶液を調製／解凍する（−２０、ＲＢと標識した１．５ｍＬのチューブ）。
ａ．使用前に１％ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を溶液に加える（０．０１ｇ／１．０ｍＬ）。
２．再水和バッファー１２０μＬを１．７ｍｌのチューブに加える。
３．血清  ３０μＬをチューブに加える。
４．完全に混合されるまで溶液をボルテックスする。
５．冷凍庫（−２０℃、ｐＨ３〜１０）からImmobiline DryStripを取り出し、ストリップをＲＴまで５分間平衡化する。
ａ．ストリップをＲＴにおいて１０分より長く置かない。
６．ストリップ由来のＩＤ番号を記録する。
７．７ｃｍのDryStrip毎にトレイに試料１３０μＬをロードする。トレイは同じ高さであることを確実にする。
８．DryStripゲルを下にして試料上に置く。
９．必要とされれば、試料の中及び外へストリップを数回注意深く持ち上げることにより、試料がストリップを通じてむらなく広がっていることを確実にする。
１０．試料がストリップの１つの領域において濃縮されるなら、ピペッティングすることにより試料を再分配する。
１１．DryStrip上においてピペットチップで優しく押し下げることにより、気泡を取り除く。
１２．トレイ上に蓋を置き、ｄｄｉ−Ｈ２Ｏに浸したペーパータオルを有するプラスチックバック内にトレイを置く。
１３．バッグを密封する。
１４．ストリップに試料を１２〜２４時間吸収させるレベル表面上で、一晩ＲＴにおいて試料を再水和物させる。
【００４９】
Ｂ．等電点電気泳動（１次元）
１．IPGphorをオンにする（機械の正確な立ち上げを確実にする）。
２．次の通り、Manifold電気泳動トレイ上にストリップを置く。
ａ．ゲルを上にする。
ｂ．陽性（酸性）終末まで元に戻す。
ｃ．ストリップを並べる。
ｄ．金属ストリップ間（つまり電極をフィットさせ、金属ストリップを接触させる）。
３．１つのストリップ当たり２つのPaper Wickを得る。
４．１つの芯当たりｄｉ−Ｈ２Ｏ  １５０μＬで芯を湿らせる。
５．ゲル（およそ０．３ｃｍ）の陽極端と陰極端に渡り芯を置く。
６．芯上に電極を置くが、ゲルから離し（極が金属プレート上にあることを確認する）、所定位置に固定する。
７．DryStrip Cover液でストリップをカバーする。
ａ．ストリップ全部のレーンをオイルで満たす。
ｂ．ストリップが完全にカバーされていることを確実にする。
８．蓋を閉める。
９．IPGphor IIでＩＥＦ実行する。
ａ．最大アンペア数：５０μＡｍｐｓ。
ｂ．温度：２０℃。
ｃ．初期電圧をチェックすることにより、正確なアセンブリーを確実にする。
ｄ．必要に応じて、実行を中止し、芯を置き換え、乾燥した前面が見えなくなるまで実行を継続する。
【００５０】
【表３】
0006442440.tif 000005
【００５１】
Ｃ．ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルを調製する（２次元のため）
１．使用前に、石鹸及び温水中で十分にプレートを洗浄し、ごしごし洗う。
２．ｄｉ−Ｈ２Ｏにおいてすすぐ。
３．プレートをそのまま空気乾燥させるか、又はエタノールに浸したKimwipeで拭く。
４．マニュアルの通り、Protean-plus Multi-Gel casting Chamber（Bio-Rad社）において（それぞれのプレートとブロックとの間の空間で）プレートを整える。
５．スクリューが完全に締め付けられていることを確実にする。
６．ゲル溶液を加える。
７．ゲルがガラスプレートの上部から約１〜１．５ｃｍであるとき、注入を止める。
８．エタノールでゲルを優しく覆う。
９．Saran Wrapでカバーする。
１０．ゲルを少なくとも１時間（なるべく一晩）重合させる。
【００５２】
Ｄ．平衡化（１次元）
１．トレイからストリップを取り出し、Kimwipe上に置いて、過剰のオイルを取り除く。
１．ストリップのゲルを上にしてKimwipe上に置く。
２．第２のKimwipeでストリップを覆い、優しく拭き取って、オイルを取り除く。
２．ストリップを平衡プレート中にゲルを上にして置き、凍結するか、又は平衡化する。
１．凍結：プレートをプラスチックラップにおいて包み、−８０℃において保存する。
ａ．平衡前にストリップを解凍する（解凍されたとき、透明）。
２．平衡化：次のステップまで継続する。
３．１つのストリップ当たり平衡バッファー約１．５ｍＬでストリップをカバーする。
４．液化されるまで、アガロースを加熱する。
５．２０分、ＲＴにおいて振盪する。
【００５３】
Ｅ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２次元）
１．約３ｃｍ×０．７５ｃｍに切断したWhatman 3MMクロマトグラフィー紙に標準液８μＬを加えることにより、左（ｐＨ１０側）マーカーを調製する。標準液は、紙の底部、高さ約１ｃｍに加えられなければならない。
２．約３ｃｍ×０．７５ｃｍに切断したWhatman 3MMクロマトグラフィー紙に標準液８μＬを約３ｃｍ×０．７５ｃｍに加えることにより、右（ｐＨ３側）マーカーを調製する。標準液は、紙の底部、高さ約１ｃｍに加えられなければならない。
３．平衡バッファーを捨てる。
４．ＳＤＳランニングバッファーにおいてストリップをカバーし、過剰の平衡バッファーをすすぎだす。
５．ＳＤＳランニングバッファーをストリップから取り除く。
６．ＳＤＳランニングバッファーのすすぎを繰り返す。
７．ゲルを外にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの後ろプレート上にストリップを注意深く置く。
８．皮膚に触れるのに十分なほど冷却したら、１％低融点アガロースでストリップを覆う。
１．ゲルの下に気泡が形成されていないことを確実にする。
２．定規を用いてゲルを軽くたたき、気泡を取り除く。
９．マーカーがストリップ上のゲルまで平らであることを確実にしながら、ＩＥＦストリップの適当な端にマーカーの次のものを挿入する。
１０．アガロースの重合作用を可能にする。
１１．２次元においてロードされるべきそれぞれのストリップについて継続する。
１２．Dodecaタンクにおいてヒンジ側を下にゲルを置く。
１３．全てのゲルがタンクに入れられた後、ゲルが、全体としてＳＤＳランニングバッファーによりカバーされていることを確実にする。
１４．２次元実行が１３℃において行われる。
１．２５０Ｖ。
２．１〜１．５時間（ゲルの前面がタンクの蓋の管類に近づくまで、ゲルを実行させる）。
【００５４】
Ｆ．タンパク質トランスファー（ウエスタンブロットのため）
１．Dodecaタンクからゲルを取り出す。
２．ゲルを所望のサイズに切る。
３．トレイ（ゲルをフィットさせるのに十分な大きさ）をトランスファーバッファーで満たす。
４．トランスブロット細胞においてスポンジを、１つのゲル当たり２つのスポンジを置いた。
５．トランスファーバッファーでタンクを満たして、スポンジにトランスファーバッファーを染み込ませる。
６．予め切断したトランスファー膜を浸す。
７．アセンブリートランスファーカセットは次の通り。
１．黒色側が下。
２．トランスファーバッファーにおいて浸されたスポンジ。
３．濾紙。
４．ゲル。
５．ニトロセルロース膜−一旦ゲル上に置いたら膜を動かしてはいけない。
６．濾紙。
７．スポンジ。
８．ゲルと膜との間で全ての気泡が取り除かれていることを確実にする。
９．トレイをトランスブロットタンクに置いて、トレイの黒色側（ゲル側）を黒色タンク側に置く。
１０．４℃及び次の条件においてトランスファーする（必要とされるなら、トランスファーは氷浴中で成され得る）。
１．５０分間９０Ｖ。
２．膜は、トランスファーの後、一晩４℃においてタンク内にそのままにすることができる。
【００５５】
Ｇ．シグナルを増幅するために、アルカリホスファターゼが結合したＳ−タグ、又は抗Ｓ−タグが結合したアルカリホスファターゼを有するｓｃＦｖを用いたウエスタンブロットについての免疫学的分析。
１．膜をトランスファーから取り出す。
２．膜を（膜をカバーするのに十分な）１％ミルクにおいてすすぎ、１０分、ＲＴにおいてブロッキングする。
３．（Ａｂの抗体価指示に従い）抗体溶液を調製する。
４．ブロッキング溶液を取り除く（４℃において保存する）。
５．膜を抗体溶液を含む容器内に置く。
６．４℃において一晩（通常、８〜１２時間）インキュベーションする。
【００５６】
Ｈ．ウエスタンブロット及びスキャンの展開
１．１次抗体を取り除く。
２．膜を４回洗浄する。
１．ＴＢＳＴで膜をカバーする。
２．ＲＴにおいて５分間優しく振盪する。
３．Western Blueで膜をカバーする。
４．リファレンススポットが最大強度に達するまで、展開させる。
５．ｄｉ−Ｈ２Ｏですすぐことにより、展開を停止させる。
６．膜を乾燥させる。
７．膜をスキャンする。
【００５７】
１次元のため用いられた溶液
【００５８】
【表４】
0006442440.tif 000006
【００５９】
２次元のため用いられた溶液
【００６０】
【表５】
0006442440.tif 000007
【００６１】
【表６】
0006442440.tif 000008
【００６２】
【表７】
0006442440.tif 000009
【００６３】
【表８】
0006442440.tif 000010
【００６４】
【表９】
0006442440.tif 000011
【００６５】
【表１０】
0006442440.tif 000012
【００６６】
ウエスタンブロットのための溶液
【００６７】
【表１１】
0006442440.tif 000013
【００６８】
【表１２】
0006442440.tif 000014
【００６９】
【表１３】
0006442440.tif 000015
【００７０】
方法３−  ２−Ｄゲル電気泳動ウエスタンブロット早期検出プロトコール。
血清は、hemoguard closureを有するか、又は有しない標準B & D 13×100(7ml) vacutainer clot tube（又は同等物）において、（止血帯での）静脈穿刺により採取した血液５ｍｌから調製された。凝固を可能にさせるためおよそ３０分室温において後、血餅は、５〜１０分間、２，５００〜３，０００ｒｐｍでの遠心分離によりペレット化された。血餅を含まない血清は、清潔なチューブにデカントされ、標識され、新鮮分析されるか、又は凍結保存された。
【００７１】
ウエスタンブロット分析のために、血清３０μＬを、再水和バッファー（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ［（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン−スルホネート）、非変性両性イオン界面活性剤］、０．５％（ｗ／ｖ）ＡＳＢ−１４（アミドスルホベタイン−１４、両性イオン界面活性剤）、０．５％（ｖ／ｖ）両性電解質、ｐＨ３〜１０（Bio-Rad社）、０．５％（ｖ／ｖ）固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）バッファー、ｐＨ３〜１０（Amersham-Pharmacia Biotech社）、及び６５ｍＭジチオスレイトール）１２０μＬに加えた。試料を直ちにボルテックスして、血清を再水和バッファーと混合した。タンパク質４〜６ｍｇが分析のためロードされた。試料は、IPG dry strip（Amersham社）での市販の平台電気泳動システム（Ettan IPGphor 3、Amersham-Pharmacia Biotech社）を用いることにより、１次元において電気泳動された。７ｃｍのIPG strip上で３〜１０の線形ｐＨ範囲が用いられた。IPG stripは、試料で一晩室温において再水和された。次に、ストリップは、１つのストリップ当たり５０ｍＡにおいて、並びに２５０Ｖｈｒｓについて２５０Ｖ、５００Ｖｈｒｓについて５００Ｖ、１，０００Ｖｈｒｓについて１，０００Ｖ、及び３時間について４，０００Ｖの増大する電圧において焦点を合わされた。次に、試料は、２８，０００ボルト−時間について一定の４，０００Ｖにおいて焦点を合わせた。等電点電気泳動後、IPG stripは、２０分間、２．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、６Ｍ尿素、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）において再平衡化された。ストリップは、線形ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミド）上に置かれ、一定の２５０Ｖにおいて７５分間電気泳動された。次に、試料は、Bio-Rad Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cellを用いた電気ブロットにより、ニトロセルロース膜に移された。膜は、ミルクタンパク質（１％低脂肪乾燥ミルク）を用いて、室温において１０分間ブロッキングされた。検出は、アルカリホスファターゼ結合された、抗体の組換え抗ＥＮＯＸ２  １本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）を用いて、一晩４℃においてであった。洗浄後、検出は、Western Blue nitrotetrazolium（ＮＢＴ）substrate（Promega社、Madison、Wis.、カタログ番号５３８４１）で室温において行われた。画像がスキャンされ、Adobe Photoshopを用いて処理された。定量は、この目的のため開発されたアルゴリズムを利用した。反応性タンパク質は、赤みがかった青色に見えた。解釈の目的のため、ブロットは、中心の未反応性血清アルブミンを含む四分円Ｉ〜IVに分けられた（図７）。
［実施例］
【実施例１】
【００７２】
ＮＡＤＨを含まないものと比較したアッセイにおける１５μＭ  ＮＡＤＨの存在下でのインキュベーションを含む２−Ｄゲル電気泳動／ウエスタンブロット分析により決定される、アッセイにおける異なる量のＥＮＯＸ２のスポットサイズ及び密度の２倍の増大（図１）。
【実施例２】
【００７３】
転写物バリアント（タンパク質１〜タンパク質３）の数の非ラッピングパターン、２６種の異なるがん及び２０種の原発組織を区別する分子量及び等電点を示す、がんの確認された診断を有する１，６２６人のがん患者由来の血清の分析（表１、発明の概要から繰り返される）。
【００７４】
【表１４】
0006442440.tif 000016
0006442440.tif 000017
【実施例３】
【００７５】
ONCOblot試験は、状態０及びステージＩ両方のがんを有する原発組織に関してがんを正確に同定した（表３）。ステージ０及びステージＩのがんについてしばしば言及されインサイチュのがんでは、疾患は、原発組織を超えて広がっていない。従って、ONCOblot Cancer試験は、血中のがん細胞のみを検出するCirculating Tumor Cell試験より早期にがんを示唆する。
【００７６】
【表１５】
0006442440.tif 000018
【実施例４】
【００７７】
保管した血清試料を用いることにより、６４歳の男性を１６年間長期的に追跡した。開始時ＰＳＡは０．８ｎｇ／ｍＬであった。前立腺がんが生検により確認されたとき、１６年目まで臨床症状は記録されなかった。臨床症状より８年前に４ｎｇ／ｍｌ  ＰＳＡで、８年目に最初にＥＮＯＸ２が検出された。
【実施例５】
【００７８】
悪性中皮腫は、アスベストへの曝露により主として引き起こされる、悪性の、ほぼ一様に致命的ながんである。明らかな中皮腫の発症前にアスベストに曝露された個人から採取した連続の血清試料を２−Ｄゲル−免疫ブロット分析によりＥＮＯＸ２の存在についてアッセイし、臨床症状よりどのくらい前に中皮腫特異的転写物バリアントが検出され得るかを決定した。悪性中皮腫の臨床診断の４〜１０年（平均６．２年）前に、アスベストに曝露した個人の血清において２種の中皮腫特異的転写物バリアントが検出された。悪性中皮腫を示す一方又は両方のＥＮＯＸ２タンパク質転写物バリアントは、石綿症を伴う又は伴わない、良性胸膜斑と診断された１４〜１５人の対象においては存在しなかった。
【実施例６】
【００７９】
原発不明がん（ＣＵＰ）を有する患者血清の分析。原発腫瘍が不明であったがんを有する患者由来の２−Ｄゲルは、等電点ｐＨ４．２及び４．１の転写物バリアントを共に有する、８０及び４２．５ｋＤａの存在を明らかにして、原発がんが卵巣がんであったことを示し、このことは生検により後に確認した。
【実施例７】
【００８０】
２０種の異なる原発組織を比較する１，５８７種のONCOblot分析におけるＥＮＯＸ２の存在の首尾よい確認及び定量（表１）。
【実施例８】
【００８１】
臨床症状より前の若年成人の健常な集団におけるがんの早期検出。年齢２０歳から３９歳の間の１００人の対象（男性５０人、及び女性５０人）由来の血清を、本明細書に記載するテクノロジーによりＥＮＯＸ２の存在について分析した。年齢群２０〜２９歳において、２５人の女性のいずれもがんの存在であるＥＮＯＸ２タンパク質の指示を提示せず、２５人のうち１人（結腸直腸の）のみの男性が、がんの存在であるＥＮＯＸ２タンパク質の指示を提示した。同様に、年齢群３０〜３９歳において、２５人のうち１人（血液細胞）の女性、及び２５人のうち１人（前立腺）の男性が、ＥＮＯＸ２タンパク質を提示した。それ故、全１００種の血清試料内のＥＮＯＸ２の存在の全体的出現率は３％であった。２０歳から２９歳の間の男性及び女性の集団内の新たな診断がんの全体的出現率はおよそ２％である（Howlander et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2012, National Cancer Institute, Bethesda, Md）。
【００８２】
方法４−  リンカーにおいて表されるタンパク質ジスルフィド−チオール相互変換機能モチーフを有する機能性組換え抗体の創出。
ウエスタンブロット上での組換え抗体のＥＮＯＸ２への結合の親和性及び特異性をさらに増強するために、ＥＮＯＸ２ファミリーのタンパク質のタンパク質ジスルフィド−チオール相互変換機能モチーフを具体的に模倣するようにリンカーを設計した。
【００８３】
腫瘍細胞特異的なＥＮＯＸ２  ＮＡＤＨオキシダーゼに対して生成したモノクローナル抗体をｓｐ−２骨髄腫細胞において産生させた。しかし、７２時間後、モノクローナル抗体は、脾細胞との融合のため用いたｓｐ−２骨髄腫細胞の増殖を遅延させた。この現象は、大量の抗体の産生を困難にした。この問題を解決するために、抗体ｃＤＮＡの重鎖及び軽鎖の抗原結合可変領域（Ｆｖ領域）のコード配列をクローン化し、Ｓ−タグコード配列の上流の１つのキメラ遺伝子に結合させた。可変重（ＶＨ）及び可変軽（ＶＬ）ドメインからなる抗体のＦｖ部分は、本来の抗体の結合特異性及び親和性を維持することができる（Glockshuber et al. 1990. Biochemistry 29:1262-1367）。
【００８４】
組換え抗体について、変性プライマーを用いて、免疫グロブリン重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＩ）の可変領域をコードするｃＤＮＡをクローン化した。軽鎖及び重鎖の哺乳類免疫グロブリンは、高頻度可変性相補性決定領域（ＣＤＲ）に隣接する保存領域を含有する。変性したオリゴプライマーセットにより、これらの領域をＰＣＲを用いて増幅することが可能になる（Jones et al. 1991. Bio/Technology 9:88-89;Daugherty et al. 1991. Nucleic Acids Research 19:2471-2476）。組換えＤＮＡ技術は、ポリペプチドリンカーにより２つのフラグメントを共有結合することにより、可変フラグメントの安定化を促進した（Huston et al. 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883）。いずれかのＶＬ又はＶＨは、１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のＮＨ２末端ドメインをもたらすことができる。リンカーを、タンパク質分解に抵抗し、タンパク質凝集を最小にするよう設計するべきである。リンカーの長さ及び配列は、柔軟性及びｓｃＦｖと抗原との相互作用に寄与し、制御する。好ましいリンカーは、ＥＮＯＸ２のタンパク質ジスルフィド−チオール相互変換機能モチーフとの鎖間ジスルフィド結合を形成する、加えて、ＣＸＸＸＸＣ又はＣＸＸＸＸＸＣのいずれかとして間隔を空けられた２つのシステイン残基（Ｃ）を含有する小さな側鎖（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）を有するアミノ酸を主に含むＳｃＦｖ融合タンパク質の重鎖と軽鎖との間の機能的リンカーを一様に含んだ。
【００８５】
Chomczynski et al. (1987) Anal. Biochem. 162:156-159、及びGough (1988) Anal. Biochem 176:93-95から改変した次の手順により、ＥＮＯＸ２特異的モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、全ＲＮＡを単離した。細胞を培地から採取し、４５０×ｇにおいて１０分間の遠心分離によりペレット化した。ペレットを氷冷ＰＢＳ  １０容量で優しく再懸濁し、再度遠心分離した。上清を廃棄し、細胞をＰＢＳ当量で再懸濁した。使用前に、細胞ペレット１ｇ当たり変性溶液（２−メルカプトエタノ−ル０．３６ｍｌ／グアニジウムストック溶液−４Ｍ  グアニジウムチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．５％サルコシル５０ｍｌ）１０ｍｌを加え、優しく混合した。酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０、２Ｍ  １ｍｌ）、飽和フェノール水１０ｍｌ、及びクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）混合物２ｍｌを、それぞれの添加後、連続的に添加した。転倒により、溶液を完全に混合した。１０秒間溶液を激しく振盪し、１５分間氷の上で冷やし、次に、１２，０００×ｇ、３０分間遠心分離した。上清を移し、２−プロパノール当量を添加し、−２０℃において一晩置いて、ＲＮＡを沈殿させた。ＲＮＡを、１５分間１２，０００×ｇにおいてペレット化し、ペレットを、変性溶液２〜３ｍｌ、及びエタノール２容量と再懸濁した。溶液を−２０℃において２時間置き、次に、１２，０００×ｇにおいて１５分間遠心分離した。ＲＮＡペレットを、７０％エタノール、次に１００％エタノールで洗浄した。１２，０００×ｇにおいて５分間遠心分離後、ペレットを、ＲＮａｓｅを含まない水（ＤＥＰＣで処理した水）で再懸濁した。単離したＲＮＡの量を分光光度法で測定し、２８０ｎｍ及び２６０ｎｍにおける吸光度から計算した。
【００８６】
ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ単離キットは、Stratagene社から購入した。全ＲＮＡを６５℃において５分間加熱した後、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに適用した。適用前に、ＲＮＡ試料を、１０×試料バッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５Ｍ  ＮａＣｌ）５００μＬと混合した。ＲＮＡ試料を、２秒毎に１滴の速度でカラムに通した。溶出液をプールし、カラムに再適用し、再度精製した。予め加熱した溶出バッファー（６５℃）を適用し、ｍＲＮＡを溶出し、氷上の１．５ｍｌの遠心チューブにおいて採取した。ｍＲＮＡの量をＯＤ２６０（１ＯＤ  ｕｎｉｔ＝ＲＮＡ  ４０μｇ）において決定した。４×１０ｅ８細胞から得た全ＲＮＡ及びｍＲＮＡの量は、それぞれ、１３２８μｇ及び２８μｇであった。
【００８７】
次に、ＤＥＰＣで処理した水に溶解したｍＲＮＡ（１〜２μｇ）を、ｃＤＮＡ合成のために用いた。３つの異なる日付に単離したｍＲＮＡを、第１の鎖のｃＤＮＡ合成のためプールした。ｃＤＮＡ合成キットは、Pharmacia Biotech社から購入した。ｍＲＮＡ（ＤＥＰＣで処理した水５μＬ当たり１．５μｇ）を６５℃において１０分間加熱し、直ちに氷上で冷却した。反応のため、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）逆転写酵素（１１μＬ）、及び適当なバッファーを含有する刺激した第１の鎖の混合物を、ｍＲＮＡ試料と混合した。ＤＴＴ溶液（０．１Ｍ  １μＬ）及びＲＮａｓｅを含まない水（１６μＬ）も溶液に加えた。混合物を、１時間３７℃においてインキュベーションした。
【００８８】
軽鎖及び重鎖（Novagen社、Madison、Wis.）のための変性したプライマーをＰＣＲのために用いた。Robocycler（Stratagene社、La Jolla、Calif.）を用いることにより、０．５ｍｌの微量遠心機チューブにて反応容量１００μＬにおいて、ＰＣＲ合成を行った。全てのＰＣＲ合成は、センス及びアンチセンスプライマー（２０ピコモル／μＬ）２μＬ、鋳型として第１の鎖ｃＤＮＡ  １μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ２μＬ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（２ｕｎｉｔ／μＬ）１μｌ、１０×ＰＣＲバッファー（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、２５℃においてｐＨ８．８、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）１０μＬ、Ｈ２Ｏ  ８２μＬを含んでいた。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールである。全てのＰＣＲプロファイルは、９４℃における変性１分、５５℃におけるアニーリング１分、及び７２℃における伸長１分からなった。この順序を、最終サイクルにおいて７２℃における伸長６分を伴い、３０回繰り返した。ＰＣＲ産物を、Qiagen社、Valencia、CaliforniaのQIAEX II gel extraction kitで精製した。重鎖及び軽鎖コード配列についてのＰＣＲ増幅産物を、アガロースゲル電気泳動により分析し、それぞれ、約３４０塩基対（ｂｐ）長、及び３２５ｂｐ長であった。
【００８９】
全ＲＮＡ又はＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動（１％アガロースゲル）により分析した。アガロース（トリス−酢酸−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）バッファー５０ｍｌ中の０．５ｇ、４０ｍＭトリス−酢酸塩、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を、２分間マイクロ波において加熱して融解し、アガロースを均等に分散させた。溶液を室温において冷却し、臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍｌ）を加え、装置に注いだ。それぞれの試料を、６×ゲルローディングバッファー（０．２５％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノールＦＦ、水中４０％（ｗ／ｖ）スクロース）と混合した。ＴＡＥバッファーをランニングバッファーとして用いた。電圧（１０ｖ／ｃｍ）を６０〜９０分間印加した。
【００９０】
重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡについての適切なサイズにより、ＵＶ照明下でバンドをゲルから切り出し、切り出したゲルを１８ゲージの針を取り付けた１ｍｌのシリンジに置いた。ゲルを１．５ｍｌのEppendorf tubeに粉砕した。それぞれのシリンジのシリンダーを、バッファー−飽和フェノール（ｐＨ７．９±０．２）２００μＬで洗浄した。混合物を完全に遠心分離し、−７０℃において１０分間凍結した。混合物を５分間遠心分離し、上部の水相を新たなチューブに移した。水相をフェノール／クロロホルム（１：１）で再度抽出した。５分間遠心分離後、上部の水相を清潔なチューブに移し、クロロホルム抽出を行った。酢酸ナトリウム（３Ｍ  １０容量）、及び氷冷したエタノール２．５容量を、上部の水相に加えて、−２０℃において一晩ＤＮＡを沈殿させた。
【００９１】
精製した重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡを、プラスミドpSTBlue-1ベクターにライゲーションし、NovaBlueコンピテント細胞（Stratagene社）にトランスフェクトした。重鎖及び軽鎖ＤＮＡを含有するコロニーを、青色と白色のコロニー選択によりスクリーニングし、ＰＣＲ分析により確認した。重鎖及び軽鎖ＤＮＡを単離し、標準的技術を用いて配列決定した。
【００９２】
１つのｓｃＦｖ遺伝子のＰＣＲ増幅及びアセンブリーは、Davis et al. (1991) Bio/Technology 9:165-169に従った。ＶＨ及びＶＬ遺伝子を有するプラスミドpSTBlue-1を、１回のＰＣＲ合成において全４種のオリゴヌクレオチドプライマーと合わせた。第１のＰＣＲ合成後、第１のＰＣＲ産物の１０分の１を取り出し、プライマーａ（ＶＨセンスプライマー）及びプライマーｄ（ＶＬアンチセンスプライマー）のみを含有する第２のＰＣＲ反応混合物に加えた。第２のＰＣＲ合成の産物は、１つのｓｃＦｖ遺伝子を得た。１つのｓｃＦｖ遺伝子をプラスミドpT-Adv（Clontech社、Palo Alto、Calif.）にライゲーションした。ｓｃＦｖ遺伝子を有するpT-Advを、ＤＮＡ配列決定のため用いた。
【００９３】
完全な機能性ｓｃＦｖ遺伝子を、ＶＨ、ＶＬ、及びリンカー配列からアセンブリーし、高度な有効性及び感度を有するｓｃＦｖ  ｃＤＮＡを得た。
【００９４】
全ＲＮＡ又はＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動（１％アガロースゲル）により分析した。アガロース（ＴＡＥバッファー、４０ｍＭトリス−酢酸塩、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ５０ｍｌ中の０．５ｇ）を、２分間マイクロ波において加熱して融解し、アガロースを均等に分散させた。溶液を室温において冷却し、臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍｌ）を加え、装置に注いだ。それぞれの試料を、６×ゲルローディングバッファー（０．２５％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノールＦＦ、水中の４０％（ｗ／ｖ）スクロース）と混合した。ＴＡＥバッファーをランニングバッファーとして用いた。電圧（１０ｖ／ｃｍ）を６０〜９０分間印加した。
【００９５】
重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡについての適切なサイズにより、ＵＶ照明下でバンドをゲルから切り出し、切り出したゲルを１８ゲージの針を取り付けた１ｍｌのシリンジに置いた。ゲルを１．５ｍｌのEppendorf tubeに粉砕した。それぞれのシリンジのシリンダーを、バッファー−飽和フェノール（ｐＨ７．９．＋／−．０．２）２００μＬで洗浄した。混合物を完全に遠心分離し、−７０℃において１０分間凍結した。混合物を５分間遠心分離し、上部の水相を新たなチューブに移した。水相をフェノール／クロロホルム（１：１）で再度抽出した。５分間遠心分離後、上部の水相を清潔なチューブに移し、クロロホルム抽出を行った。酢酸ナトリウム（３Ｍ  １０容量）、及び氷冷したエタノール２．５容量を、上部の水相に加えて、−２０℃において一晩ＤＮＡを沈殿させた。
【００９６】
精製した重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡを、プラスミドpSTBlue-1ベクターにライゲーションし、NovaBlueコンピテント細胞（Stratagene社）にトランスフェクトした。重鎖及び軽鎖ＤＮＡを含有するコロニーを、青色と白色のコロニー選択によりスクリーニングし、ＰＣＲ分析により確認した。重鎖及び軽鎖ＤＮＡを単離し、標準的技術を用いて配列決定した。
【００９７】
１つのｓｃＦｖ遺伝子のＰＣＲ増幅及びアセンブリーは、Davis et al. (1991) Bio/Technology 9:165-169に従った。ＶＨ及びＶＬ遺伝子を有するプラスミドpSTBlue-1を、１回のＰＣＲ合成において全４種のオリゴヌクレオチドプライマーと合わせた。第１のＰＣＲ合成後、第１のＰＣＲ産物の１０分の１を取り出し、プライマーａ（ＶＨセンスプライマー）及びプライマーｄ（ＶＬアンチセンスプライマー）のみを含有する第２のＰＣＲ反応混合物に加えた。第２のＰＣＲ合成の産物は、１つのｓｃＦｖ遺伝子を得た。１つのｓｃＦｖ遺伝子をプラスミドpT-Adv（Clontech社、Palo Alto、Calif.）にライゲーションした。ｓｃＦｖ遺伝子を有するpT-Advを、ＤＮＡ配列決定のために用いた。
【００９８】
完全な機能性ｓｃＦｖ遺伝子を、ＶＨ、ＶＬ、及びリンカー配列からアセンブリーし、次のＰＣＲによりｓｃＦｖ  ｃＤＮＡを得た。
【００９９】
Ｇｌｙ．Ｓｅｒ．Ｃｙｓリンカーを有するｓｃＦｖ（Ｓ）（ＧＳＴ）のＤＮＡ及びアミノ酸配列［ｓｃＦｖ（ＳＣ）］
【０１００】
リンカー配列
ＤＮＡ：５‘  GGCGGGGGTG GTAGCTGCGG CGGTGGATCG TGTGGCGGTG GCAGT  ３‘  配列番号４。
アミノ酸：ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＣｙｔＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＣｙｔＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ  配列番号５。
【０１０１】
ｓｃＦｖ（ＧＳＴ）のＤＮＡ及びアミノ酸配列
【０１０２】
ＧＳＴ−タグ
1 ATGTCCCCTA TACTAGGTTA TTGGAAAATT AAGGGCCTTG TGCAACCCAC
51 TCGACTTCTT TTGGAATATC TTGAAGAAAA ATATGAAGAG CATTTGTATG
101 AGCGCGATGA AGGTGATAAA TGGCGAAACA AAAAGTTTGA ATTGGGTTTG
151 GAGTTTCCCA ATCTTCCTTA TTATATTGAT GGTGATGTTA AATTAACACA
201 GTCTATGGCC ATCATACGTT ATATAGCTGA CAAGCACAAC ATGTTGGGTG
251 GTTGTCCAAA AGAGCGTGCA GAGATTTCAA TGCTTGAAGG AGCGGTTTTG
301 GATATTAGAT ACGGTGTTTC GAGAATTGCA TATAGTAAAG ACTTTGAAAC
351 TCTCAAAGTT GATTTTCTTA GCAAGCTACC TGAAATGCTG AAAATGTTCG
401 AAGATCGTTT ATGTCATAAA ACATATTTAA ATGGTGATCA TGTAACCCAT
451 CCTGACTTCA TGTTGTATGA CGCTCTTGAT GTTGTTTTAT ACATGGACCC
501 AATGTGCCTG GATGCGTTCC CAAAATTAGT TTGTTTTAAA AAACGTATTG
551 AAGCTATCCC ACAAATTGAT AAGTACTTGA AATCCAGCAA GTATATAGCA
601 TGGCCTTTGC AGGGCTGGCA AGCCACGTTT GGTGGTGGCG ACCATCCTCC
651 AAAATCGGAT CTGGTTCCGC GTGGATCCCC AGGAATTCCC 配列番号６
【０１０３】
ｓｃＦｖ重鎖（ＶＨ）
691 GAGGTCAAGC TGCAGGAGTC AGGAACTGAA GTGGTAAAGC CTGGGGCTTC
741 AGTGAAGTTG TCCTGCAAGG CTTCTGGCTA CATCTTCACA AGTTATGATA
791 TAGACTGGGT GAGGCAGACG CCTGAACAGG GACTTGAGTG GATTGGATGG
841 ATTTTTCCTG GAGAGGGGAG TACTGAATAC AATGAGAAGT TCAAGGGCAG
891 GGCCACACTG AGTGTAGACA AGTCCTCCAG CACAGCCTAT ATGGAGCTCA
941 CTAGGCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCTGTCT ATTTCTGTGC TAGAGGGGAC
991 TACTATAGGC GCTACTTTGA CTTGTGGGGC CAAGGGACCA CGGTCACCGT
1041 CTCCTCA    配列番号７
【０１０４】
リンカー配列
ＤＮＡ：５‘  GGCGGGGGTG GTAGCTGCGG CGGTGGATCG TGTGGCGGTG GCAGT  ３‘  配列番号４。
アミノ酸：ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＣｙｔＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＣｙｔＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ  配列番号５。
【０１０５】
ｓｃＦｖ軽鎖（ＶＬ）
1093 GAAAATGTGC TCACCCAGTC TCCAGCAATC ATGTCTGCAT CTCCAGGGGA
1143 GAGGGTCACC ATGACCTGCA GTGCCAGCTC AAGTATACGT TACATATATT
1193 GGTACCAACA GAAGCCTGGA TCCTCCCCCA GACTCCTGAT TTATGACACA
1243 TCCAACGTGG CTCCTGGAGT CCCTTTTCGC TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG
1293 GACCTCTTAT TCTCTCACAA TCAACCGAAT GGAGGCTGAG GATGCTGCCA
1343 CTTATTACTG CCAGGAGTGG AGTGGTTATC CGTACACGTT CGGAGGGGGG
1393 ACCAAGCTGG AGCTGAAAGC G  配列番号８
【０１０６】
ＧＳＴタグを有するｓｃＦｖ（ＳＣ）のＤＮＡ配列
1 ATGTCCCCTA TACTAGGTTA TTGGAAAATT AAGGGCCTTG TGCAACCCAC
51 TCGACTTCTT TTGGAATATC TTGAAGAAAA ATATGAAGAG CATTTGTATG
101 AGCGCGATGA AGGTGATAAA TGGCGAAACA AAAAGTTTGA ATTGGGTTTG
151 GAGTTTCCCA ATCTTCCTTA TTATATTGAT GGTGATGTTA AATTAACACA
201 GTCTATGGCC ATCATACGTT ATATAGCTGA CAAGCACAAC ATGTTGGGTG
251 GTTGTCCAAA AGAGCGTGCA GAGATTTCAA TGCTTGAAGG AGCGGTTTTG
301 GATATTAGAT ACGGTGTTTC GAGAATTGCA TATAGTAAAG ACTTTGAAAC
351 TCTCAAAGTT GATTTTCTTA GCAAGCTACC TGAAATGCTG AAAATGTTCG
401 AAGATCGTTT ATGTCATAAA ACATATTTAA ATGGTGATCA TGTAACCCAT
451 CCTGACTTCA TGTTGTATGA CGCTCTTGAT GTTGTTTTAT ACATGGACCC
501 AATGTGCCTG GATGCGTTCC CAAAATTAGT TTGTTTTAAA AAACGTATTG
551 AAGCTATCCC ACAAATTGAT AAGTACTTGA AATCCAGCAA GTATATAGCA
601 TGGCCTTTGC AGGGCTGGCA AGCCACGTTT GGTGGTGGCG ACCATCCTCC
651 AAAATCGGAT CTGGTTCCGC GTGGATCCCC AGGAATTCCC GAGGTCAAGC
701 TGCAGGAGTC AGGAACTGAA GTGGTAAAGC CTGGGGCTTC AGTGAAGTTG
751 TCCTGCAAGG CTTCTGGCTA CATCTTCACA AGTTATGATA TAGACTGGGT
801 GAGGCAGACG CCTGAACAGG GACTTGAGTG GATTGGATGG ATTTTTCCTG
851 GAGAGGGGAG TACTGAATAC AATGAGAAGT TCAAGGGCAG GGCCACACTG
901 AGTGTAGACA AGTCCTCCAG CACAGCCTAT ATGGAGCTCA CTAGGCTGAC
951 ATCTGAGGAC TCTGCTGTCT ATTTCTGTGC TAGAGGGGAC TACTATAGGC
1001 GCTACTTTGA CTTGTGGGGC CAAGGGACCA CGGTCACCGT CTCCTCAGGC
1051 GGGGGTGGTA GCTGCGGCGG TGGATCGTGT GGCGGTGGCA GTGAAAATGT
1101 GCTCACCCAG TCTCCAGCAA TCATGTCTGC ATCTCCAGGG GAGAGGGTCA
1151 CCATGACCTG CAGTGCCAGC TCAAGTATAC GTTACATATA TTGGTACCAA
1201 CAGAAGCCTG GATCCTCCCC CAGACTCCTG ATTTATGACA CATCCAACGT
1251 GGCTCCTGGA GTCCCTTTTC GCTTCAGTGG CAGTGGGTCT GGGACCTCTT
1301 ATTCTCTCAC AATCAACCGA ATGGAGGCTG AGGATGCTGC CACTTATTAC
1351 TGCCAGGAGT GGAGTGGTTA TCCGTACACG TTCGGAGGGG GGACCAAGCT
1401 GGAGCTGAAA GCG   配列番号９
【０１０７】
Ｇｌｙ．Ｓｅｒ．Ｃｙｓリンカー、ＤＮＡ配列、配列番号１０、及びアミノ酸配列、配列番号１１を有するｓｃＦｖ（Ｓ）（ＧＳＴ）の翻訳：
1 atgtcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaacccactcgacttctt
1  M  S  P  I  L  G  Y  W  K  I  K  G  L  V  Q  P  T  R  L  L
61 ttggaatatcttgaagaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcgatgaaggtgataaa
21  L  E  Y  L  E  E  K  Y  E  E  H  L  Y  E  R  D  E  G  D  K 
121 tggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttggagtttcccaatcttccttattatattgat
41  W  R  N  K  K  F  E  L  G  L  E  F  P  N  L  P  Y  Y  I  D 
181 ggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatatagctgacaagcacaac
61  G  D  V  K  L  T  Q  S  M  A  I  I  R  Y  I  A  D  K  H  N 
241 atgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttgaaggagcggttttg
81  M  L  G  G  C  P  K  E  R  A  E  I  S  M  L  E  G  A  V  L 
301 gatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttgaaactctcaaagtt
101  D  I  R  Y  G  V  S  R  I  A  Y  S  K  D  F  E  T  L  K  V 
361 gattttcttagcaagctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatcgtttatgtcataaa
121  D  F  L  S  K  L  P  E  M  L  K  M  F  E  D  R  L  C  H  K 
421 acatatttaaatggtgatcatgtaacccatcctgacttcatgttgtatgacgctcttgat
141  T  Y  L  N  G  D  H  V  T  H  P  D  F  M  L  Y  D  A  L  D 
481 gttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaattagtttgttttaaa
161  V  V  L  Y  M  D  P  M  C  L  D  A  F  P  K  L  V  C  F  K 
541 aaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaatccagcaagtatatagca
181  K  R  I  E  A  I  P  Q  I  D  K  Y  L  K  S  S  K  Y  I  A 
601 tggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgaccatcctccaaaatcggat
201  W  P  L  Q  G  W  Q  A  T  F  G  G  G  D  H  P  P  K  S  D 
661 ctggttccgcgtggatccccaggaattcccgaggtcaagctgcaggagtcaggaactgaa
221  L  V  P  R  G  S  P  G  I  P  E  V  K  L  Q  E  S  G  T  E 
721 gtggtaaagcctggggcttcagtgaagttgtcctgcaaggcttctggctacatcttcaca
241  V  V  K  P  G  A  S  V  K  L  S  C  K A  S  G  Y  I  F  T 
781 agttatgatatagactgggtgaggcagacgcctgaacagggacttgagtggattggatgg
261  S  Y  D  I  D  W  V  R  Q  T  P  E  Q  G  L  E  W  I  G  W 
841 atttttcctggagaggggagtactgaatacaatgagaagttcaagggcagggccacactg
281  I  F  P  G  E  G  S  T  E  Y  N  E  K  F  K  G  R  A  T  L 
901 agtgtagacaagtcctccagcacagcctatatggagctcactaggctgacatctgaggac
301  S  V  D  K  S  S  S  T  A  Y  M  E  L  T  R  L  T  S  E  D 
961 tctgctgtctatttctgtgctagaggggactactataggcgctactttgacttgtggggc
321  S  A  V  Y  F  C  A  R  G  D  Y  Y  R  R  Y  F  D  L  W  G 
1021 caagggaccacggtcaccgtctcctcaggcgggggtggtagctgcggcggtggatcgtgt
341  Q  G  T  T  V  T  V  S  S  G  G  G  G  S  C  G  G  G  S  C 
1081 ggcggtggcagtgaaaatgtgctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggg
361  G  G  G S  E  N  V  L  T  Q  S  P  A  I  M  S  A  S  P  G 
1141 gagagggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtatacgttacatatattggtaccaa
381  E  R  V  T  M  T  C  S  A  S  S  S  I  R  Y  I  Y  W  Y  Q 
1201 cagaagcctggatcctcccccagactcctgatttatgacacatccaacgtggctcctgga
401  Q  K  P  G  S  S  P  R  L  L  I  Y  D  T  S  N  V  A  P  G 
1261 gtcccttttcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttattctctcacaatcaaccga
421  V  P  F  R  F  S  G  S  G  S  G  T  S  Y  S  L  T  I  N  R 
1321 atggaggctgaggatgctgccacttattactgccaggagtggagtggttatccgtacacg
441  M  E  A  E  D  A  A  T  Y  Y  C  Q  E  W  S  G  Y  P  Y  T 
1381 ttcggaggggggaccaagctggagctgaaagcg
461  F  G  G  G  T  K  L  E  L  K  A
【０１０８】
翻訳されたタンパク質配列：
1 MSPILGYWKI KGLVQPTRLL LEYLEEKYEE HLYERDEGDK WRNKKFELGL EFPNLPYYID
61 GDVKLTQSMA IIRYIADKHN MLGGCPKERA EISMLEGAVL DIRYGVSRIA YSKDFETLKV
121 DFLSKLPEML KMFEDRLCHK TYLNGDHVTH PDFMLYDALD VVLYMDPMCL DAFPKLVCFK
181 KRIEAIPQID KYLKSSKYIA WPLQGWQATF GGGDHPPKSD LVPRGSPGIP EVKLQESGTE
241 VVKPGASVKL SCKASGYIFT SYDIDWVRQT PEQGLEWIGW IFPGEGSTEY NEKFKGRATL
301 SVDKSSSTAY MELTRLTSED SAVYFCARGD YYRRYFDLWG QGTTVTVSSG GGGSCGGGSC
リンカー
361 GGGSENVLTQ SPAIMSASPG ERVTMTCSAS SSIRYIYWYQ QKPGSSPRLL IYDTSNVAPG
421 VPFRFSGSGS GTSYSLTINR MEAEDAATYY CQEWSGYPYT FGGGTKLELK A 配列番号１１
【０１０９】
タンパク質配列の分析：
アミノ酸長：４７７
分子量（ｋＤ）：５３．５２
等電点（ＩＰ）：５．８７
モル吸光係数（Ｌ／ｍｏｌ／ｃｍ）；ジスルフィド結合としての全てのシステイン残基：１．０２Ｅ＋０５
モル吸光係数（Ｌ／ｍｏｌ／ｃｍ）；ジスルフィド結合としての５０％システイン残基：１．０２Ｅ＋０５
モル吸光係数（Ｌ／ｍｏｌ／ｃｍ）；ジスルフィド結合なし：１．０１Ｅ＋０５
【０１１０】
１．プライマー設計
Ｇｌｙ．Ｓｅｒ．Ｃｙｓを有するリンカー
アミノ酸配列：ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＣｙｔＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＣｙｔＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ  配列番号５
ＤＮＡ配列：５’−GGCGGGGGTG GTAGCTGCGG CGGTGGATCG TGTGGCGGTG GCAGT−３’  配列番号４
【０１１１】
プライマーについての設計
【０１１２】
１．ＰＣＲ増幅のためのｓｃＦｖ（Ｓ）重鎖についてのフォワードプライマー
ｓｃＦｖ（Ｓ）重鎖Ｎ末端（プライマー１５）配列番号１２
５’  GGA TCC CCA GGA ATT C（EcoRI）CC GAG GTC AAG CTG CAG GAG TCA GGA  ３’
【０１１３】
２．ＰＣＲ増幅のためのｓｃＦｖ（Ｓ）重鎖についてのリバースプライマー
ｓｃＦｖ（Ｓ）重鎖Ｃ末端プラスリンカー１
アミノ酸配列：GTTVTVSS（重鎖Ｃ末端）配列番号１３  GGGGSCGGGSCGGGS（リンカー）配列番号１４
1 GGGACCACGG TCACCGTCTC CTCAGGCGGG GGTGGTAGCT GCGGCGGTGG
51 ATCGTGTGGC GGTGGCAGT   配列番号１５
1 GGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGGGGTGGTAGCTGCGGCGGTGGATCGTGTGGC
1  G  T  T  V  T  V  S  S  G  G  G  G  S  C  G  G  G  S  C  G 
61 GGTGGCAGT
21  G  G  S 配列番号１６
【０１１４】
ＰＣＲ増幅のためのｓｃＦｖ（Ｓ）重鎖についてのリバースプライマー（プライマー１８）：
５’ACC GCC ACA CGA TCC ACC GCC GCA GCT ACC ACC CCC GCC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC  ３’  配列番号１７
【０１１５】
３．ＰＣＲ増幅のためのｓｃＦｖ（Ｓ）軽鎖についてのフォワードプライマー
リンカープラスｓｃＦｖ（Ｓ）軽Ｎ末端  配列番号１８
アミノ酸配列：G GSC GGG SCG GGS（リンカー）  ENV LTQ SP（軽鎖Ｎ末端）
1 
GGTGGTAGCTGCGGCGGTGGATCGTGTGGCGGTGGCAGTGAAAATGTGCTCACCCAGTCT
1  G  G  S  C  G  G  G  S  C  G  G  G  S  E  N  V  L  T  Q  S 
61 CCA  配列番号１９
21  P   配列番号２０
ＰＣＲ増幅のためのｓｃＦｖ（Ｓ）軽鎖についてのフォワードプライマー（プライマー１９）
５‘  GGT GGT AGC TGC GGC GGT GGA TCG TGT GGC GGT GGC AGT GAA AAT GTG CTC ACC CAG TCT CCA  ３‘  配列番号２１
【０１１６】
４．ＰＣＲ増幅のためのｓｃＦｖ（Ｓ）軽鎖についてのリバースプライマー（プライマー１７）
センスＤＮＡ配列：５‘  GAACGCCAGCACATGGACAGCTGACTCGAGCGGCCGGTG  ３’  配列番号２２
アンチセンスＤＮＡ配列：５‘  CACCGGCCGCTCGA（XhoI）GTCAGCTGTCCATGTGCTGGCGTTC  ３’  配列番号２３
【０１１７】
プライマーをIntegrated DNA Technologies社（Coralville、Iowa）にオーダーした。ｓｃＦｖ（ＳＣ）の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）のＰＣＲ増幅。ｓｃＦｖ（ＳＣ）の重鎖及び軽鎖をポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。
【０１１８】
【表１６】
0006442440.tif 000019
【０１１９】
【表１７】
0006442440.tif 000020
【０１２０】
ｓｃＦｖ（ＳＣ）の重鎖及び軽鎖ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動（０．９％）により分析した。ＤＮＡバンドを切り出し、凍結し、解凍し、遠心分離した。ｓｃＦｖ（ＳＣ）ＤＮＡを、ＰＣＲにより重鎖及び軽鎖ＤＮＡを伸長することにより増幅した。
【０１２１】
【表１８】
0006442440.tif 000021
【０１２２】
増幅したｓｃＦｖ（ＳＣ）ＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動（０．９％）により分析された。ＤＮＡバンドを切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社）により精製し、ＴＥバッファー３０μｌ中に溶解した。
【０１２３】
【表１９】
0006442440.tif 000022
【０１２４】
ｓｃＦｖ（ＳＣ）のpGEX-4T2へのライゲーション［pGEX4T-scFv(SC)］。ｓｃＦｖ（ＳＣ）のpGEXT-4T2へのライゲーション。ライゲーション反応は次の通りであった。
【０１２５】
【表２０】
0006442440.tif 000023
【０１２６】
ライゲーションは、１５℃において１６時間５０分であった。ライゲーション後、大腸菌（E.coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞にpGEX4T-scFv(SC)をトランスフェクトし、ＬＢ／アンピシリンプレート上に播種した。細胞を３７℃、２０時間増殖させた。プラスミドpGEX4T-scFv(SC)を有することについてのコロニーのスクリーニング。ＰＣＲにより、プラスミドpGEX4T-scFv(SC)を有することについて７つのコロニーをスクリーニングした。
【０１２７】
【表２１】
0006442440.tif 000024
【０１２８】
ＬＢ／アンピシリン培地１００ｍｌにおいて増殖させたコロニー１から細胞を拾い、プラスミド精製キット（Plasmid Midi Kit、Qiagen社）を用いて精製した。ｓｃＦｖ（ＳＣ）ＤＮＡ配列をPudue大学により行った。配列決定したＤＮＡを、Alignment algorithm（NCBI社）により分析し、これは変異を示さなかった。
プライマー１５及び１７で配列決定したｓｃＦｖ（ＳＣ）ＤＮＡ
>L_132420_プライマー15_025.ab1   1464     21    860  ABI
AAAAAACAATGCAAAGTGGTAAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCT
GCAAGGCTTCTGGCTACATCTTCACAAGTTATGATATAGACTGGGTGAGG
CAGACGCCTGAACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTTTCCTGGAGA
GGGGAGTACTGAATACAATGAGAAGTTCAAGGGCAGGGCCACACTGAGTG
TAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTATATGGAGCTCACTAGGCTGACATCT
GAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCTAGAGGGGACTACTACAGGCGCTA
CTTTGACTTGTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGGG
GTGGTAGCTGCGGCGGTGGATCGTGTGGCGGTGGCAGTGAAAATGTGCTC
ACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAGGGTCACCAT
GACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATACGTTACATATATTGGTACCAACAGA
AGCCTGGATCCTCCCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACGTGGCT
CCTGGAGTCCCTTTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTATTC
TCTCACAATCAACCGAATGGAGGCTGAGGATGCTGCCACTTATTACTGCC
AGGAGTGGAGTGGTTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAG
CTGAAAGCGAAAGAAACTGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGA
CAGCTGACTCGAGCGGCCGCATCGTGACTGACTGACGATCTGCCTCGCGC
GTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACG
GTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGG
CGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCCGGGCCCCGCCATGACCCAGTCAC
GTAGCGATAGCGGAGTGTATAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGAAT
CGCCTATTTTTATAGGGTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAAACGTC
AAGGGGGCACTTTTTCGGGAAATGTGCGCCGAAACCCCTAATTTGTTTTA
TTTTTCAAAATCCATTTCAATTAAGTTTCCCCCTCATGGAAACAATAACC
CCTGGAAAAAAGGCTTTCATTAAATATTGAAAAAAAGGAAAAAAGTTAAA
AATTATTTCAAAATTTTCCCTGTGTTCCCCCCTTTATTTTCCCCTTTTTT
TTGCGGGCCATTTTTTGCCCTTTTCCCTGGTTTTTTTTGCCCCCCCCCCC
CAAAAAAACCCCCCTGGGGTGAAAAAAAAATAAAAAAAAAAAATGTCTTT
AAAAAAAAATTTCCAATTTTTGTGGGGGGGGGGCCCCCCCAAAAGAGTTG
GGGGGGTTTTTTAAACCACTTCTCCCAAAACAACATTGGGTGGAGATATT
TCTTCTTCACAAAA  配列番号２４
>L_132420_プライマー17_026.ab1   1492     22    854  ABI
GGTGGGTAAATTTAGCAGCAGCAGTTTCTTTCGCTTTCAGCTCCAGCTTG
GTCCCCCCTCCGAACGTGTCCGGATAACCACTCCACTCCTGGCAGTAATA
AGTGGCAGCATCCTCAGCCTCCATTCGGTTGATTGTGAGAGAATAAGAGG
TCCCAGACCCACTGCCACTGAAGCGAAAAGGGACTCCAGGAGCCACGTTG
GATGTGTCATAAATCAGGAGTCTGGGGGAGGATCCAGGCTTCTGTTGGTA
CCAATATATGTAACGTATACTTGAGCTGGCACTGCAGGTCATGGTGACCC
TCTCCCCTGGAGATGCAGACATGATTGCTGGAGACTGGGTGAGCACATTT
TCACTGCCACCGCCACACGATCCACCGCCGCAGCTACCACCCCCGCCTGA
GGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCACAAGTCAAAGTAGCGCCTGT
AGTAGTCCCCTCTAGCACAGAAATAGACAGCAGAGTCCTCAGATGTCAGC
CTAGTGAGCTCCATATAGGCTGTGCTGGAGGACTTGTCTACACTCAGTGT
GGCCCTGCCCTTGAACTTCTCATTGTATTCAGTACTCCCCTCTCCAGGAA
AAATCCATCCAATCCACTCAAGTCCCTGTTCAGGCGTCTGCCTCACCCAG
TCTATATCATAACTTGTGAAGATGTAGCCAGAAGCCTTGCAGGACAACTT
CACTGAAGCCCCAGGCTTTACCACTTCAGTTCCTGACTCCTGCAGCTTGA
CCTCGGGAATTCCAGAAAGGGCCTGCTTGAACTTCTCCTTTGCTTCTTCC
ATATCTTTCTCATGGGCGGATCCACGCGGAACCAGATCCGATTTTGGAGG
ATGGTCGCCACCACCAAACGTGGCTTGCCAGCCCTGGCAAGGCCATGCTA
TATACTTGCTGGATTTCAAGTACTTATCAATTTGTGGGAATAGCTTCCTT
ACGTTTTTTTAAAACAAACTAATTTTGGGAACGCATCCAGGCCCATTTGG
TCCATGTATTAAAACACCATCAAAAACCTCCTACAACATGAAATTCCGGA
AGGGGTTTACATAATCCCCCATTTTAAATATTGTTTTTATGACATAAAAC
CAATCTTTCCAAACTTTTTTTCACATTTTCCAGGTAACCTTGGTAAAAAA
AAAACCACTTTTGAAAAGTTTTTCAAAATTCTTTTTATTAAAATGCAAAT
TTTCCCGAAAAAAACCCCTTATTTCTAAAAATTCCCAAAAACCCGCTCCC
CTTTCCAAGCCCTTTGAAAAATTTCTTTGCCCCCCCCCTCTTTTTTGGGG
AACAAAACCCCCCCCCACAAACTTGGGTTGGGGGTGGTTTTTGTGTCCAC
GCCCAAATATAAAAAAACAGTATAAATTAAGATGGGGCCCCCACATATAA
AAAACTGGGGGGGGTTTTTTTATATAATTTTTTAAAACACAACATCCCCC
CCCCCCCCCCACATCCCACACAAAATAAAATATATAATAAAA  配列番号２５
【０１２９】
配列決定したＤＮＡでのｓｃＦｖ（ＳＣ）のアライメント
ｓｃＦｖ（ＳＣ）の発現
プラスミドpGEX4T-scFv(SC)を有するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、ＬＢ／カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）１０ｍｌにおいて接種した。細胞を６時間増殖させ、６，０００ｒｐｍ（３，７００×ｇ）において６分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを、新たなＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）２ｍｌにおいて再懸濁し、２５０ｍｌのErlenmyerフラスコにおける２つのＬＢ／ａｍｐ培地１００ｍｌに移した。細胞を、３時間、３７℃において２５０ｒｐｍにて増殖させた。温度を２５℃まで下げ、ＩＰＴＧを加えた（最終濃度０．１５ｍＭ）。細胞をさらに１５時間増殖させ、採取し、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０バッファー２０ｍｌにおいて再懸濁した。タンパク質を、French Pressureにより抽出した（２０，０００ｐｓｉにおいて３継代）。ｓｃＦｖ（ＳＣ）の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてPonceau S染色、及びウエスタンブロットにより分析した。
【０１３０】
ｓｃＦｖ（ＳＣ）を、可溶性タンパク質として、及び不溶性封入体として共に発現した。
【０１３１】
ｓｃＦｖＳＣの１Ｄウエスタンブロット分析。組換えＥＮＯＸ２に対するｓｃＦｖ（ＳＣ）の反応性を、１次元ウエスタンブロットにより分析した。組換えＥＮＯＸ２をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロース膜を、ｓｃＦｖ（ＳＣ）と共に１７時間、及びＳ−タンパク質が結合したアルカリホスファターゼと共に２時間インキュベーションした。Western Blue（Promega社）での検出。ｓｃＦｖ（ＳＣ）は、組換えＥＮＯＸ２に対して反応した。比較のため、ウエスタンブロット分析においてｓｃＦｖ（Ｓ）を含めた。
【０１３２】
図１２は、従来のＸＸＸＸＸＸＸリンカー（図１２Ｂ）と比較した、−ＣＸＸＣ−ＸＸ−Ｃリンカー（図１２Ａ）を有するＳｃＦＶの有効性を実証するための混合実験のウエスタンブロットを示す。（Ｓ−Ｓ結合を保存するために）両方について非還元条件下、機能的システインリンカーを有するＳｃＦＶ組換え抗体は、組換えＥＮＯＸ２とインキュベーションしたとき、５３ｋＤａ  ＳｃＦＶ（ａ）、及び結合した分子量約１７６ｋＤａについて、１つのＥＮＯＸ２分子と２つのＳｃＦＶ分子の比（ＥＮＯＸ２の２つのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ結合部位のそれぞれに対して１つ）において全長ＳｃＦＶと７２ｋＤａ全長ＥＮＯＸ２との間のジスルフィド結合形成による主に下流開始部位由来の４６ｋＤａ切断型ＳｃＦＶ（ｂ）のレベルの低減を示した。図１２Ｂにおいて、システインを欠く従来のリンカーで、同一の反応条件下で架橋結合の証拠は観察されなかった。
【０１３３】
ｓｃＦｖＳＣの２Ｄウエスタンブロット分析。組換えＥＮＯＸ２及び前立腺がん患者の血清の転写物バリアントに対するｓｃＦｖ（ＳＣ）の反応性を、２次元ウエスタンブロットにより分析した。組換え体６μｇを添加した正常血清、及び前立腺がん患者由来の血清を、等電点電気泳動によりまず分離し、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、次に、ニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロース膜を、ｓｃＦｖ（ＳＣ）と共に１７時間、及びＳ−タンパク質が結合したアルカリホスファターゼと共に２時間インキュベーションした。検出はWestern Blue（Promega社）でであった。
【０１３４】
方法５−  濃縮した抗体溶液の物理的安定性の増強
本発明の重要な実施形態は、化学的安定性及び生物学的効力を維持しながら、濃縮した溶液の物理的安定性を増強することである。本発明は、配列番号１１と少なくとも９９％同一であり、７×ｌ０−７ＭのＥＮＯＸ２タンパク質についてのｋＤａ、及び純度少なくとも９５％を有する、ｓｃＦｖ抗体を提供する。
【０１３５】
しかしながら、ｓｃＦｖの有効性を決定する際の主要な因子は、その凝集傾向である。−７０℃又は４℃のいずれかにおいて１０日間のみ保存した後、精製したｓｃＦｖの組換えＥＮＯＸ２タンパク質への結合は、９０％超低減された。多大な研究後、有効性のこの喪失は、タンパク質凝集にもっぱら端を発していた。凝集した抗体は、ウエスタンブロット中にＥＮＯＸ２タンパク質と特異的に結合しない。光散乱測定値から決定する機能性ｓｃＦｖ抗体の凝集を、所望のレベルの感度及び特異性を達成するために全般的なプロトコールにおいて必須の成分である、５０％グリセロール及び−７０℃における保存により達成する。活性は、グリセロールの非存在下での保存により急速に失われる。
【０１３６】
【表２２】
0006442440.tif 000025
【０１３７】
５０％グリセロールの存在下（右）での保存で、全３つのリファレンスタンパク質は、グリセロールの非存在下（左）でのものよりおよそ２倍強かった。転写物バリアント（スポット）は、非存在下（左）でのものより５０％グリセロール（右）における保存でより明確であった。
【０１３８】
図１３は、−７０℃において５０％グリセロール中で保存されたとき凝集されない抗体の主要な寄与を主に示す、光散乱（Agilent 7080 Particle Size Spectrophotometer）により決定されたサイズ（ｎｍ）に基づく抗体の濃度（％）としての粒子分布である。
【０１３９】
これら３つの構成要素、抗体結合中のＮＡＤＨの添加、ＥＮＯＸ２タンパク質ジスルフィド−チオール相互変換機能モチーフに似せるためのｓｃＦｖリンカーペプチドの改変、及びｓｃＦｖ凝集を防ぐための５０％グリセロールの使用を合わせて、臨床症状より１０年以上前にがんの検出を可能にする、ONCOblot試験の前例のない感度をもたらす。
【０１４０】
方法６−  ＮＡＤＨの存在下での機能性抗体の検出の感度及び限度の決定。
確認された偽陽性及び確認された偽陰性の発生率は、それぞれ１％未満と低い（D. J. Morre and D. S. Gilmartin. 2015 ONCOblot Reports 1 (1):1-2）。複数のがんについて、２又は３以上のＥＮＯＸ２転写物バリアントは、原発組織の正確な同定を可能にするためにOrigin Cancer TestのONCOblot組織内に存在しなければならない。これらは、膀胱がん、結腸直腸がん、胃がん、中皮腫、卵巣がん、腎細胞がん、及び子宮がんを含む。１又は２以上のＥＮＯＸ２転写物バリアントが、非存在であるか、又は検出の限度未満であるなら、がんの原発組織を誤って同定するかもしれない。現在のプロトコール下で分析した最も新しいONCOblotのうち、誤った同定率は２．８％である。従って、臨床的に診断されたがんでの試験の全般的な正確さは、少なくとも９５％である。
【０１４１】
タンパク質を２次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動により分離し、免疫ブロットにより検出するとき、視覚化されたタンパク質は、「スポット」と呼ばれる小さな球状又は楕円形の免疫反応性領域として出現する。ＥＮＯＸ２タンパク質により産生されるスポットの平均直径は、存在するＥＮＯＸ２タンパク質の量に比例する。ONCOblotによるＥＮＯＸ２検出の限度を決定するために、スポット径の標準曲線を作成した。この目的のため、ヒトＥＮＯＸ２の機能的４６ｋＤａの形態を、大腸菌においてまず産生させ、ほぼ均一に精製した。次に、種々の量のこの組換えＥＮＯＸ２タンパク質を、ONCOblotによりアッセイした。次に、得られたスポット径の対数を、アッセイしたＥＮＯＸ２タンパク質の量の対数に対してプロットし（図１１）、値の中から、強い線形相関（ｒ２＝０．９５）を見出した。ONCOblotによりアッセイしたＥＮＯＸ２タンパク質の検出の実質的な下限は、約０．２５ｍｍのスポットであり、図１１との比較により、１回のアッセイ当たり１２０フェムトモル（１．２×１０１１個の分子）ＥＮＯＸ２の検出と相関する。この値は、１回のアッセイ当たり１００フェムトモルＥＮＯＸ２の下限とおよそ同等である。
【０１４２】
図１１は、２−ＤゲルにロードしたＥＮＯＸ２タンパク質のスポット径と量との間の対数と対数の関係を説明する。組換えＥＮＯＸ２の変動する量を、免疫ブロットにより分析した。次に、検出したＥＮＯＸ２スポットの直径の対数を、ロードしたＥＮＯＸ２の量の対数の関数としてプロットした。
【０１４３】
図１２は、従来のＸＸＸＸＸＸＸリンカー（図１２Ｂ）と比較した、−ＣＸＸＣ−ＸＸ−Ｃリンカー（図１２Ａ）を有するＳｃＦＶの有効性を実証するための混合実験のウエスタンブロットを示す。（Ｓ−Ｓ結合を保存するために）両方について非還元条件下、機能的システインリンカーを有するＳｃＦＶ組換え抗体は、組換えＥＮＯＸ２とインキュベーションしたとき、５３ｋＤａ  ＳｃＦＶ（ａ）、及び結合した分子量約１７６ｋＤａについて、１つのＥＮＯＸ２分子と２つのＳｃＦＶ分子の比（ＥＮＯＸ２の２つのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ結合部位のそれぞれに対して１つ）において全長ＳｃＦＶと７２ｋＤａ全長ＥＮＯＸ２との間のジスルフィド結合形成による主に下流開始部位由来の４６ｋＤａ切断型ＳｃＦＶ（ｂ）のレベルの低減を示した。図１２Ｂにおいて、システインを欠く従来のリンカーで、同一の反応条件下で架橋結合の証拠を観察しなかった。
【０１４４】
図１３は、−７０℃において５０％グリセロール中で保存したとき凝集しない抗体の主要な寄与を主に示す、光散乱（Agilent 7080 Particle Size Spectrophotometer）により決定したサイズ（ｎｍ）に基づく抗体の濃度（％）としての粒子分布である。
【０１４５】
２５人のステージ０及びステージＩのがん患者の血清内のＥＮＯＸ２タンパク質を、ONCOblotにより検出した（Morre, D. J and Taggart, D. J. 2015. ONCOblot Reports 1(4):1-2）。これらの血清試料内のＥＮＯＸ２の平均濃度は、図１１の標準曲線との比較により、アッセイ１５０μＬ当たりおよそ９９０フェムトモル（６×１０１１個の分子）であった。定義により、ステージ０及びステージＩのがんは、典型的には、直径２０ｍｍ未満である（Cancer Facts and Figures. 2014. Amer Can Soc 2-3）。しかしながら、ステージ０又はステージＩのがんの平均サイズとしては、直径５〜１０ｍｍである可能性が高いので、ＥＮＯＸ２の検出の下限は、直径０．８ｍｍ〜１．６ｍｍ（平均１．２ｍｍ）の腫瘍により産生されるべきであると予測される。ONCOblot試験の従前のバージョン（Hostetler et al., 2009. Clinical Proteomics 5: 46-51）とＮＡＤＨ及び機能性ｓｃＦｖ抗体での試験の現在のバージョンとの間の組換えＥＮＯＸ２の検出の下限の比較を図１４において提供する。ＮＡＤＨ及び機能性ｓｃＦｖ抗体で、プロトコールにおける組換えＥＮＯＸ２の検出の下限は約５μｇである。ＮＡＤＨ及び改変されたリンカーを用いた機能性試験で、検出の限度は、およそ１０倍低い（右の曲線）。
【０１４６】
腫瘍細胞を球状として処理するなら、次に、固形腫瘍における細胞数を、方程式１（式中、Ｖｔｕｍｏｒは、腫瘍の体積であり、Ｖｃｅｌｌは、がん細胞の平均体積であり、Ｄは、腫瘍径であり、及びｄは、１０μｍであると推定されるがん細胞の平均直径である）を用いることにより計算し、次に、直径１．２ｍｍのがんは、およそ２００万個の細胞を含有すると計算される。
【０１４７】
【数１】
0006442440.tif 000026
【０１４８】
方法７−  ＮＡＤＨ及び改変されたリンカーでの機能性検査がいかに早く臨床症状より前にがんを検出するか。
本明細書に要約する証拠は、その現在の構成の試験の能力が、提供した感度の１０倍の増大と一致する、臨床症状より１０〜２０年前に、がんを検出することであることを確認した。
【０１４９】
臨床症状よりいかに前に、現在の機能性バージョンの試験によりがんの存在を検出することが可能であるかを推定するために、NCI Seer Cancer Statistics Review（Howlander, N. et al. SEER Cancer Statistics Review, 1875-2912、National Cancer Institute、Bethesda、MD）との比較により、いかに密接に、現在の試験結果が、同等数の男性及び女性の参加者からなる６つの年齢群を比較する、がんと診断される全般的リスクと相関したかの推定を決定するよう試験を設計した。実際の診断を、年齢が増すにつれがんと診断されると予測されるリスクのSeer Cancer Statistics Reviewにより推定されるものと比較した。
【０１５０】
がんの臨床的証拠のない計３００人の健常なボランティア、６つの年齢群のそれぞれにおいて２５人の男性及び２５人の女性を、ＮＡＤＨ及び機能性リンカーでの現在の２−Ｄゲル−ウエスタンブロット試験によりがんの存在について分析した。血清を静脈穿刺により採取し、ＩＲＢ承認プロトコール及びインフォームドコンセントを用いて分析した。表５において要約する知見は、臨床症状より１０〜２０年前のがんの検出と一致する正常な健常集団での早期がんの検出の比較的高い出現を明らかにする（図５も参照）。
【０１５１】
【表２３】
0006442440.tif 000027
【０１５２】
陽性試験の全般的出現率は、２１〜２９歳の年齢群において１０％であり、５０から７９歳の間で約２２％において安定化した。４０〜４９歳の男性における陽性ONCOblotの顕著な増大は、この集団内の早期前立腺の兆候の不釣り合いな数、明白な疾患において決して発生しそうにない数に起因した。そうでなければ、全ての年齢群について、がんの観察した出現率は、元々の試験のものより試験の感度の２〜３倍の増大と一致する、本発明のＮＡＤＨ／機能性リンカー改変バージョンのない２−Ｄゲル−ウエスタンブロットプロトコールにより提供されるべき７〜１０年の従前の推定よりむしろ１０から２０年の間について、National Cancer Institute Seer Cancer Statistics Reviewから推定される出現率と密接に一致した（表６）。
【０１５３】
【表２４】
0006442440.tif 000028
【０１５４】
知見は、本発明に記載される２−Ｄゲル−ウエスタンブロット試験が、従前に報告されたいかなる試験より早期にがんを検出する可能性を有することを示す。確かに、早期に検出されるがんの全てが、臨床的に診断される疾患へと発展することが予測されるわけではないが、提供される比較に基づき、約５０％が、そのようになるという高い可能性を有する。少なくとも前立腺がんで、陽性ONCOblotの結果は、機能性ONCOblot試験により示されるがんの例外的に高い出現率についての１つの説明として、４０〜４９歳の男性の年齢群において０．５ｎｇ／ｍｌと同じ位低いＰＳＡ値を有する対象について記録された。
【０１５５】
本明細書において考察されるいかなる実施形態を、本発明のいかなる方法、キット、試薬、又は組成物に関して実施することができることが考慮され、及び逆も然りである。さらに、本発明の組成物を用いて、本発明の方法を達成することができる。
【０１５６】
本明細書において記載される特定の実施形態は、説明の目的で示され、本発明の制限として示されないことは理解されるだろう。本発明の原理的特性を、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の実施形態において用いることができる。当業者は、日常的実験以下の、本明細書において記載される具体的な手法に対する多数の同等物を用いて認識するか、又は確かめることができる。かかる同等物は、本発明の範囲内であるとみなされ、請求項によりカバーされる。
【０１５７】
明細書で言及される全ての刊行物及び特許出願は、本発明が関連する分野の当業者のレベルを示す。全ての刊行物及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物又は特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたように、同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５８】
請求項及び／又は明細書において、用語「含んでいる」と共に用いられるときの語句「１つの（ａ）」、又は「１つの（ａｎ）」の使用は、「１」を意味し得るが、「１又は２以上の」、「少なくとも１つ」、及び「１又は１より多い」の意味とも一致する。請求項における用語「又は」の使用は、代替物のみを指すことが明白に示されない限り、又は代替物が互いに独占的でない限り、「及び／又は」を意味するよう用いられるが、開示は、代替物のみと、「及び／又は」とを指す定義を支持する。本出願を通じて、用語「約」は、値が、機器のエラーの固有のバリエーション、値を決定するために用いられる方法の固有のバリエーション、又は研究対象内に存在するバリエーションを含むことを示すために用いられる。
【０１５９】
本明細書及び請求項において用いられる通り、語句「含んでいる（comprising）」（並びに「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」のような、含むのいかなる形態）、「有している（having）」（並びに「有する（have）」及び「有する（has）」のような、有しているのいかなる形態）、「含んでいる（including）」（並びに「含む（includes）」及び「含む（include）」のような、含んでいるのいかなる形態）、若しくは「含有している（containing）」（並びに「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」のような、含有しているのいかなる形態）は、包括的若しくはオープンエンドであるか、又はさらなる限定されていない構成要素若しくは方法のステップを排除しない。本明細書において提供される組成物及び方法のいかなるものの実施形態において、「含んでいる」は、「本質的になる」又は「からなる」と置き換えられてもよい。本明細書において用いられる通り、表現「本質的にからなる」は、特定された完全体又はステップ、並びに請求される本発明の特徴又は機能に物質的に影響しないものを要求する。本明細書において用いられる通り、用語「なる（consisting）」は、列挙される完全体の存在（例えば、特性、構成要素、特徴、性質、方法／プロセスステップ、又は制限）、又は完全体（複数）の群（例えば、特性（複数可）、構成要素（複数可）、特徴（複数可）、性質（複数可）、方法／方法ステップ（複数）、又は制限（複数可））のみを示すために用いられる。
【０１６０】
本明細書で用いられる用語「又はそれらの組み合わせ」は、用語に先行する、挙げられた事項の全ての交換及び組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣの少なくとも１つを含むことが意図され、特定の文脈において順序が重要であるなら、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢも含むことが意図される。この例と共に、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどのような１又は２以上の事項又は用語の繰り返しを含有する組み合わせが表現上含まれる。当業者は、典型的には、特に文脈から明らかでないなら、いかなる組み合わせにおける事項又は用語の数に対する制限が存在しないことを理解するだろう。
【０１６１】
本明細書で用いられる、制限しない、「約」、「実質的」、又は「実質的に」のような概算の語句は、改変が必ずしも絶対又は完全ではないが、考慮されるとき、当業者が、存在している条件を指定することを許可するのに十分に近い条件を指す。記載が変動し得る範囲は、いかに大きな変化が設けられ得るか、並びに依然、当業者が、改変されていない特性の必要とされる特徴及び能力を依然有する、改変された特性を認識することに依存する。一般に、だが先行する考察を対象に、「約」のような概算の語句により改変される本明細書における数値は、所定の値から少なくとも±１、２、３、４、５、６、７、１０、１２、又は１５％変動してもよい。
【０１６２】
本明細書において開示され、請求される組成物及び／又は方法の全ては、過度の実験なしに本開示に照らして成され、実施され得る。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して記載される一方、バリエーションが、本明細書において記載される、組成物及び／又は方法、並びに方法のステップにおいて若しくは方法のステップの順序において、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱することなく、適用され得ることは、当業者に明らかであろう。当業者に明らかな全てのかかる類似の置換及び改変は、添付の請求項により定義される本発明の精神、範囲、及び概念内であるとみなされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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