(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗菌薬を含有しているディスク試験片と、試料中の検出対象菌が増殖可能な固体培地とを組み合わせて用いる多剤耐性菌の検出方法であって、
前記抗菌薬は、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなり、
（ａ）カルバペネム系抗菌薬
（ｂ）フルオロキノロン系抗菌薬
（ｃ）アミノグリコシド系抗菌薬
前記ディスク試験片が（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の３種の前記抗菌薬全てを含み、
前記固体培地が血液寒天培地、チョコレート寒天培地、ハートインフュジョン寒天培地、ブレインハートインフュジョン寒天培地、トリプトソイ寒天培地（SCD寒天培地）、普通寒天培地、および標準寒天培地から選択され、
前記方法は、３種の前記抗菌薬全てに耐性を示す前記多剤耐性菌と、当該多剤耐性菌と同種であって多剤耐性を示さない細菌とを含み得る前記試料から、前記多剤耐性菌を検出することを特徴とする方法。
【請求項２】
抗菌薬を含有しているディスク試験片と、試料中の検出対象菌が増殖可能な固体培地とを組み合わせて用いる多剤耐性菌の検出方法であって、
前記抗菌薬は、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなり、
（ａ）カルバペネム系抗菌薬
（ｂ）フルオロキノロン系抗菌薬
（ｃ）アミノグリコシド系抗菌薬
前記ディスク試験片が（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の３種の前記抗菌薬を全て含み、
前記固体培地が検出対象菌以外の菌を抑制する選択剤を含まない培地であり、
前記方法は、３種の前記抗菌薬全てに耐性を示す前記多剤耐性菌と、当該多剤耐性菌と同種であって多剤耐性を示さない細菌とを含み得る前記試料から、前記多剤耐性菌を検出することを特徴とする方法。
【請求項３】
前記ディスク試験片が、前記抗菌薬のみ、または前記抗菌薬およびpH緩衝剤のみを含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
１ディスク当たりの含有量がそれぞれ、
カルバペネム系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇ、
フルオロキノロン系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇ、
アミノグリコシド系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇであり、
（ａ）カルバペネム系抗菌薬が、メロペネムまたはイミペネムであり、
（ｂ）フルオロキノロン系抗菌薬が、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、またはオフロキサシンであり、
（ｃ）アミノグリコシド系抗菌薬が、アミカシンまたはゲンタマイシンであることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗菌薬が、以下の薬剤の組み合わせ（１）ないし（４）のいずれかであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
（１）メロペネム、シプロフロキサシン、アミカシン
（２）メロペネム、ノルフロキサシン、アミカシン
（３）イミペネム、ノルフロキサシン、ゲンタマイシン
（４）イミペネム、オフロキサシン、ゲンタマイシン
【請求項６】
前記検出対象菌が多剤耐性緑膿菌および／または多剤耐性アシネトバクターであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤耐性菌の検出方法に関する。より詳細には、多剤耐性緑膿菌（multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa：MDRP）、多剤耐性アシネトバクター（multidrug-resistant Acinetobacter species）、バンコマイシン耐性腸球菌（vancomycin-resistant enterococci：VRE）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（vancomycin-resistant Staphylococcus aureus：VRSA）、バンコマイシン中程度耐性黄色ブドウ球菌（vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus：VISA）などの薬剤耐性菌の検出方法およびそれに用いる検出用ディスク試験片に関する。
【背景技術】
【０００２】
シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）（以下、緑膿菌という。）やアシネトバクター（Acinetobacter）属菌、エンテロコッカス（Enterococcus）属菌（以下、腸球菌という。）は弱毒性であるため、健常者の体内に入っても感染症を発症することはほとんどないが、癌、免疫不全などの疾患、あるいは術後の抵抗力の低下した患者などでは感染症を発症しやすい日和見感染菌である。一方、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus、以下、黄色ブドウ球菌という。）は、ヒトに対する病原性が強い菌である。
【０００３】
近年、多剤耐性緑膿菌や多剤耐性アシネトバクターなどの多剤耐性菌による院内感染が急増し、国内外の臨床現場で深刻な問題となっている（非特許文献１、２）。そのため、国内の感染症法に基づいて薬剤感受性試験が実施され、イミペネムなどのカルバペネム系、シプロフロキサシンなどのフルオロキノロン系、アミカシンなどのアミノグリコシド系の３系統の薬剤に耐性を示す緑膿菌は多剤耐性緑膿菌と判定されている（非特許文献３）。また、多剤耐性アシネトバクターは、国内において、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）などのアシネトバクター属菌のうち、カルバペネム、フルオロキノロン、アミノグリコシドの３系統の抗菌薬に耐性を示すものを多剤耐性アシネトバクターと判定している（非特許文献４）。
【０００４】
バンコマイシン耐性腸球菌は、院内感染の重要な原因菌として世界的に問題視されている薬剤耐性菌である（非特許文献５）。感染症法に基づいて、腸球菌（コリスチンなどのポリペプチド系薬剤、ナリジクス酸などのキノロン系薬剤によって抑制されない）のうち、バンコマイシン耐性の特性を示すものをバンコマイシン耐性腸球菌と判定している。一方、バンコマイシンに耐性を示す黄色ブドウ球菌であるバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌やバンコマイシン中程度耐性黄色ブドウ球菌も、また、世界的に注目されている薬剤耐性菌である（非特許文献６）。国内の感染症法に基づいて、黄色ブドウ球菌（コリスチンなどのポリペプチド系薬剤、ナリジクス酸などのキノロン系薬剤によって抑制されない）のうち、バンコマイシン耐性の特性を示すものを、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌と判定しているが、国際的な基準である臨床・検査標準協会（Clinical and Laboratory Standards Institute：CLSI）の方法では、バンコマイシン耐性の程度により、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン中程度耐性黄色ブドウ球菌を判別している。
【０００５】
薬剤感受性試験法の一方法として、抗菌薬を含浸させたディスク試験片を用いるディスク拡散法が、従来から実施されている。緑膿菌の薬剤感受性試験では、被検菌を塗布した寒天培地上にイミペネム、シプロフロキサシン、アミカシンを単剤ずつ含浸させた３枚のディスク試験片を置いて培養した後、ディスク試験片の周辺に形成される阻止円を計測することにより多剤耐性菌か否かの判定が行われる（非特許文献３）。一方、腸球菌の薬剤感受性試験では、被検菌を塗布した寒天培地上にバンコマイシンを含浸させたディスク試験片を置いて培養した後、ディスク試験片の周辺に形成される阻止円を計測することにより耐性菌か否かの判定が行われる。
【０００６】
薬剤耐性菌の検出は、従来、血液寒天培地などの選択性の無い培地を用いて試料を培養後、発育した菌の中から検出対象菌であると推定されるコロニーを釣菌し、検出対象菌の培養に適した培地を用いて純粋培養し、その後、確認試験、薬剤感受性試験（微量液体希釈法、ディスク拡散法など）を行うことにより実施されてきた。しかし、この方法は、結果が得られるまでに約７２時間以上という長時間がかかる上、分離培養後に数十〜数千コロニーの中から検出対象菌を疑うコロニー全てを釣菌して各コロニーを別のシャーレの培地で培養するため、煩雑な作業、熟練した技術および数多くの枚数の培地を要する方法である。更に、コロニーを釣菌する際には検出対象の薬剤耐性菌を釣菌し逃す可能性もある。そのため、短時間に簡便かつ正確に薬剤耐性菌を検出できる方法が望まれている。
【０００７】
多剤耐性緑膿菌の簡便な検出方法として、培地にイミペネム、シプロフロキサシン、アミカシンの３種の抗菌薬を添加したスクリーニング培地が開示されている（特許文献１）。しかし、一般的に、選択剤として抗菌薬を添加した培地は、作製後、抗菌薬の力価が経時的に低下するため、有効期限が短いという問題がある。特許文献１は、培地にイミペネム、シプロフロキサシン、アミカシンを添加した多剤耐性緑膿菌スクリーニング培地が、４℃、４週間保存後まで安定であることを開示しているが、それより長い期間保存した場合においても安定であることは記載していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−０９８９５０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】浅利誠志ら，臨床と微生物，３４（２），１１９−１２３，２００７
【非特許文献２】高田  徹，病原体微生物検出情報（IASR），３１，１９７−１９８，２０１０
【非特許文献３】松本哲哉，モダンメディア，５３（３），７４−７９，２００７
【非特許文献４】山根一和ら，病原体微生物検出情報（IASR），３１，２０１−２０２，２０１０
【非特許文献５】谷本弘一ら，モダンメディア，５３（６），１４０−１４７，２００７
【非特許文献６】網中眞由美ら，順天堂医学，５４（３），３２８−３３６，２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記の現状に鑑みてなされたものであり、抗菌薬の安定性を損なわずに、短時間で容易かつ正確に薬剤耐性菌の検出が可能な方法およびそれに用いるディスク試験片を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、カルバペネム系抗菌薬、フルオロキノロン系抗菌薬およびアミノグリコシド系抗菌薬からなる少なくとも３種の抗菌薬を含有しているディスク試験片と緑膿菌、アシネトバクター属菌などが増殖可能な固体培地を組み合わせて用い、培地上の薬剤拡散領域内のコロニーの有無を目視で観察するのみで、短時間で容易かつ正確に多剤耐性緑膿菌、多剤耐性アシネトバクターなどの多剤耐性菌を検出できることを見出した。更に、本発明者らは、（ａ）ポリペプチド系抗菌薬、モノバクタム系抗菌薬、キノロン系抗菌薬から選択される２種以上の系統の抗菌薬および（ｂ）グリコペプチド系抗菌薬からなる少なくとも３種の抗菌薬を含有しているディスク試験片と腸球菌、黄色ブドウ球菌などが増殖可能な固体培地を組み合わせて用い、培地上の薬剤拡散領域内のコロニーの有無を目視で観察するのみで、短時間で容易かつ正確にバンコマイシン耐性腸球菌、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン中程度耐性黄色ブドウ球菌などのバンコマイシン耐性菌を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のような構成からなるものである。
（１）抗菌薬を含有しているディスク試験片と検出対象菌が増殖可能な固体培地を組み合わせて用いる薬剤耐性菌検出方法であって、前記ディスク試験片が３種以上の系統の抗菌薬を含有していることを特徴とする方法。
（２）抗菌薬が、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる少なくとも３種を含むことを特徴とする（１）に記載の方法。
（ａ）カルバペネム系抗菌薬
（ｂ）フルオロキノロン系抗菌薬
（ｃ）アミノグリコシド系抗菌薬
（３）１ディスク当たりの含有量がそれぞれ、カルバペネム系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇ、フルオロキノロン系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇ、アミノグリコシド系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇであることを特徴とする（２）に記載の方法。
（４）検出対象菌が多剤耐性菌であることを特徴とする（１）から（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）固体培地が血液寒天培地、チョコレート寒天培地、ドリガルスキー改良培地（BTB乳糖寒天培地）、ハートインフュジョン寒天培地、ブレインハートインフュジョン寒天培地、トリプトソイ寒天培地（SCD寒天培地）、普通寒天培地、標準寒天培地、マッコンキー寒天培地、DHL寒天培地およびNAC寒天培地から選択されることを特徴とする（４）に記載の方法。
（６）抗菌薬が、以下の（ａ）および（ｂ）からなる少なくとも３種を含むことを特徴とする（１）に記載の方法。
（ａ）ポリペプチド系抗菌薬、モノバクタム系抗菌薬およびキノロン系抗菌薬から選択される２種以上の系統の抗菌薬
（ｂ）グリコペプチド系抗菌薬
（７）１ディスク当たりの含有量がそれぞれ、ポリペプチド系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇ、モノバクタム系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇ、キノロン系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇ、グリコペプチド系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇであることを特徴とする（６）に記載の方法。
（８）検出対象菌がバンコマイシン耐性菌であることを特徴とする（１）、（６）または（７）に記載の方法。
（９）固体培地が血液寒天培地、チョコレート寒天培地、ドリガルスキー改良培地（BTB乳糖寒天培地）、ハートインフュジョン寒天培地、ブレインハートインフュジョン寒天培地、トリプトソイ寒天培地（SCD寒天培地）、普通寒天培地、標準寒天培地、胆汁-エスクリン-アジド寒天培地、KF連鎖球菌寒天培地、マンニット食塩培地、卵黄加マンニット食塩培地、エッグヨーク食塩培地、スタフィロコッカスNo.110培地およびベアード・パーカー寒天培地から選択されることを特徴とする（８）に記載の方法。
（１０）３種以上の系統の抗菌薬を含有していることを特徴とする薬剤耐性菌検出用のディスク試験片。
（１１）抗菌薬が、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる少なくとも３種を含むことを特徴とする（１０）に記載のディスク試験片。
（ａ）カルバペネム系抗菌薬
（ｂ）フルオロキノロン系抗菌薬
（ｃ）アミノグリコシド系抗菌薬
（１２）１ディスク当たりの含有量がそれぞれ、カルバペネム系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇ、フルオロキノロン系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇ、アミノグリコシド系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇであることを特徴とする（１１）に記載のディスク試験片。
（１３）薬剤耐性菌が多剤耐性菌であることを特徴とする（１０）から（１２）のいずれか１項に記載のディスク試験片。
（１４）抗菌薬が、以下の（ａ）および（ｂ）からなる少なくとも３種を含むことを特徴とする（１０）に記載のディスク試験片。
（ａ）ポリペプチド系抗菌薬、モノバクタム系抗菌薬およびキノロン系抗菌薬から選択される２種以上の系統の抗菌薬
（ｂ）グリコペプチド系抗菌薬
（１５）１ディスク当たりの含有量がそれぞれ、ポリペプチド系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇ、モノバクタム系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇ、キノロン系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇ、グリコペプチド系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇであることを特徴とする（１４）に記載のディスク試験片。
（１６）薬剤耐性菌がバンコマイシン耐性菌であることを特徴とする（１０）、（１４）または（１５）に記載のディスク試験片。
（１７）試料を塗布した固体培地に、（１１）〜（１３）のいずれか１項に記載のディスク試験片を載せ、２０〜４０℃で１５〜４８時間培養後、ディスク試験片の周囲の薬剤拡散領域内に菌が生育したとき、その試料に多剤耐性菌が含まれると判定する方法。
（１８）試料を塗布した固体培地に、（１４）〜（１６）のいずれか１項に記載のディスク試験片を載せ、２０〜４０℃で１５〜４８時間培養後、ディスク試験片の周囲の薬剤拡散領域内に菌が生育したとき、その試料にバンコマイシン耐性菌が含まれると判定する方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のディスク試験片を検出対象菌が増殖可能な固体培地と組み合わせて用いることにより、培地上の薬剤拡散領域内のコロニーの有無を目視で観察するのみで、効率的、容易かつ正確な多剤耐性菌またはバンコマイシン耐性菌の検出が可能となる。分離培養後に大量のコロニーの釣菌を行う必要がないため、従来の分離培養法に比べて検出に要する時間、操作上の手間および培地にかかる試薬コストを大幅に削減でき、釣菌し逃しによる偽陰性を無くすことができる。さらに本発明のディスク試験片は、抗菌薬の安定性を損なわずに長期保存でき、経済性に優れるという効果も有する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明のディスク試験片を羊血液寒天培地上に置いて、３剤耐性緑膿菌（３Ｒ）、２剤耐性緑膿菌（２Ｒ）または感受性の緑膿菌（Ｓ）を培養した後のディスク試験片周囲における菌の発育有無（阻止円の状態）を示す写真である。（実施例２．Ａ）
【図２】図２は、本発明のディスク試験片を羊血液寒天培地上に置いて、３剤耐性緑膿菌（３Ｒ）または感受性の緑膿菌（Ｓ）と、大腸菌およびクレブシエラ・ニューモニエを混合培養した後のディスク試験片周囲における菌の発育有無（阻止円の状態）を示す写真である。（実施例２．Ｂ）
【図３】図３は、本発明のディスク試験片を羊血液寒天培地上に置いて、３剤耐性緑膿菌（３Ｒ）または感受性の緑膿菌（Ｓ）と、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエおよびエンテロコッカス・フェカリスを混合培養した後のディスク試験片周囲における菌の発育有無（阻止円の状態）を示す写真である。（実施例２．Ｂ）
【図４】図４は、本発明のディスク試験片を羊血液寒天培地上に置いて、バンコマイシン耐性の腸球菌（エンテロコッカス・フェカリス（VRE））またはバンコマイシン感受性の腸球菌（エンテロコッカス・フェカリス）と、大腸菌および緑膿菌を混合培養した後のディスク試験片周囲における菌の発育有無（阻止円の状態）を示す写真である。（実施例７）
【００１５】
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１０−２４１６６３号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明では、１枚の試験片に３種以上の系統の抗菌薬が含浸されているディスク試験片を、試験菌含有試料が塗布された固体培地上に置いて培養することにより、短時間で効率よく簡易、正確な薬剤耐性菌検出が可能になる。
【００１７】
本発明の検出対象菌は、３系統以上の抗菌薬に耐性を示す（抑制されない）薬剤耐性菌であれば特に限定されない。例えば、多剤耐性緑膿菌、多剤耐性アシネトバクター、バンコマイシン耐性腸球菌、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン中程度耐性黄色ブドウ球菌などが例として挙げられる。なお、本発明において、バンコマイシン耐性腸球菌、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン中程度耐性黄色ブドウ球菌などのバンコマイシンに耐性を示す菌を「バンコマイシン耐性菌」という。
【００１８】
本発明では、少なくとも３種類の系統の抗菌薬をディスク試験片に含浸させるが、抗菌薬の系統は、検出対象とする薬剤耐性菌ごとに設定することができる。また、抗菌薬は各系統に属するものであれば特に限定されるものでなく、治療薬または試薬から適宜選択することができる。更に、原末の場合は適当な溶媒に溶解して使用することができる。例えば、検出対象が多剤耐性緑膿菌、多剤耐性アシネトバクターなどの多剤耐性菌である場合は、少なくともカルバペネム系抗菌薬、フルオロキノロン系抗菌薬およびアミノグリコシド系抗菌薬をディスク試験片に含浸させる。一方、検出対象がバンコマイシン耐性腸球菌、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン中程度耐性黄色ブドウ球菌などのバンコマイシン耐性菌である場合は、少なくともポリペプチド系抗菌薬、キノロン系抗菌薬およびグリコペプチド系抗菌薬をディスク試験片に含浸させるか、少なくともモノバクタム系抗菌薬、キノロン系抗菌薬およびグリコペプチド系抗菌薬をディスク試験片に含浸させるか、または少なくともポリペプチド系抗菌薬、モノバクタム系抗菌薬およびグリコペプチド系抗菌薬をディスク試験片に含浸させる。使用できるカルバペネム系抗菌薬、フルオロキノロン系抗菌薬およびアミノグリコシド系抗菌薬の具体例を以下の表１、ポリペプチド系抗菌薬、モノバクタム系抗菌薬、キノロン系抗菌薬およびグリコペプチド系抗菌薬の具体例を表２に示す。これらの薬剤は通常は塩として流通している。
【００１９】
【表１】
0006346637.tif 000002
【００２０】
【表２】
0006346637.tif 000003
【００２１】
本発明のディスク試験片の抗菌薬含有量は、固体培地に載せて培養した後に前記ディスク試験片の周囲の薬剤拡散領域内において抗菌薬に感受性の菌は生育せず、検出対象菌（抗菌薬に耐性）のみが生育する量とする。そのような量は、固体培地上からの各薬剤の拡散性や培養時間（拡散時間）および検出対象菌に対する抗菌効果の強度などを考慮して適量に設定する。例えば、多剤耐性緑膿菌、多剤耐性アシネトバクターなどの多剤耐性菌を検出する場合、１ディスク当たりの含有量をそれぞれ、カルバペネム系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇ、フルオロキノロン系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇ、アミノグリコシド系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇの範囲とすることが好ましく、カルバペネム系抗菌薬  １〜１，５００μｇ、フルオロキノロン系抗菌薬  １〜１，５００μｇ、アミノグリコシド系抗菌薬  １〜１，５００μｇの範囲とすることがより好ましい。一方、バンコマイシン耐性腸球菌、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン中程度耐性黄色ブドウ球菌などのバンコマイシン耐性菌を検出する場合は、１ディスク当たりの含有量をそれぞれ、ポリペプチド系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇ、モノバクタム系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇ、キノロン系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇ、グリコペプチド系抗菌薬  ０．００１〜１，５００μｇとすることが好ましく、ポリペプチド系抗菌薬  １〜１，５００μｇ、モノバクタム系抗菌薬  １〜１，５００μｇ、キノロン系抗菌薬  １〜１，５００μｇ、グリコペプチド系抗菌薬  １〜１，５００μｇとすることがより好ましい。
【００２２】
本発明のディスク試験片は、必要に応じて、抗菌薬以外にpH緩衝剤、その他の成分を更に含浸させることも可能である。
【００２３】
本発明のディスク試験片は、試験菌を含む試料が塗布された固体培地表面上に置いて培養する。試料の塗布方法や条件などは、通常の分離培養などで採用されている方法で行うことができる。一方、培養温度と時間は、検出対象菌および抗菌薬の拡散性に応じて適宜決定可能である。培養温度は、通常、細菌が発育可能な温度とすることができ、具体的には、２０〜４０℃とすることが好ましく、２５〜３７℃とすることがより好ましく、３５〜３７℃とすることが更に好ましい。また、培養時間は、１５〜４８時間とすることが好ましく、１８時間〜２４時間とすることが更に好ましい。
【００２４】
上記培養により、固体培地表面に置かれた各抗菌薬は、固体培地表面および内部を拡散する。試料に含まれる試験菌が多剤耐性緑膿菌、多剤耐性アシネトバクターなどの多剤耐性菌であれば、カルバペネム系抗菌薬、フルオロキノロン系抗菌薬およびアミノグリコシド系抗菌薬を含有している本発明のディスク試験片を載せた固体培地上のディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内に生育し、コロニーを生成する。一方、試料に含まれる試験菌がバンコマイシン耐性腸球菌、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン中程度耐性黄色ブドウ球菌などのバンコマイシン耐性菌であれば、ポリペプチド系抗菌薬、キノロン系抗菌薬およびグリコペプチド系抗菌薬を含有している本発明のディスク試験片を載せた固体培地上のディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内に生育し、コロニーを生成する。また、試料に含まれる試験菌がバンコマイシン耐性腸球菌、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン中程度耐性黄色ブドウ球菌などのバンコマイシン耐性菌である場合は、モノバクタム系抗菌薬、キノロン系抗菌薬およびグリコペプチド系抗菌薬を含有している本発明のディスク試験片を載せた固体培地上のディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内においても生育し、コロニーを生成する。更に、試料に含まれる試験菌がバンコマイシン耐性腸球菌、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン中程度耐性黄色ブドウ球菌などのバンコマイシン耐性菌である場合は、ポリペプチド系抗菌薬、モノバクタム系抗菌薬およびグリコペプチド系抗菌薬を含有している本発明のディスク試験片を載せた固体培地上のディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内においても生育し、コロニーを生成する。
【００２５】
本発明で用いられる固体培地は、炭素源、窒素源などの栄養分を含み、検出対象菌の増殖が可能な固体培地であれば、特に限定されない。通常の分離培養に使用される培地を用いることができ、血液寒天培地、チョコレート寒天培地、ドリガルスキー改良培地（BTB乳糖寒天培地）、ハートインフュジョン寒天培地、ブレインハートインフュジョン寒天培地、トリプトソイ寒天培地（SCD寒天培地）、普通寒天培地、標準寒天培地などが例として挙げられる。固体培地は、更に、検出対象菌以外の菌を抑制する選択剤を含んでいてもよい。例えば、検出対象が多剤耐性緑膿菌、多剤耐性アシネトバクターなどの多剤耐性菌である場合、マッコンキー寒天培地、DHL寒天培地、NAC寒天培地などを使用することもできる。一方、検出対象がバンコマイシン耐性腸球菌である場合、胆汁-エスクリン-アジド寒天培地、KF連鎖球菌寒天培地などを使用することもできる。また、検出対象がバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン中程度耐性黄色ブドウ球菌である場合、マンニット食塩培地、卵黄加マンニット食塩培地、エッグヨーク食塩培地、スタフィロコッカスNo.110培地、ベアード・パーカー寒天培地などを使用することもできる。
【００２６】
培地に用いられる固化剤としては、寒天、アガロースなど通常使用されているものを使用できる。固体培地には、更に、酵素基質が含まれていても本発明の作用が影響されることはない。
【００２７】
本発明のディスク試験片の材質は、適当な厚みがあり、抗菌薬を含浸、乾燥させ、固体培地上で抗菌薬を拡散させることができる材質であれば特に限定されない。また、形状はどのようなものでも使用可能であるが、円盤状、短冊状、矩形、もしくは更に、それを支持体上に貼付して用いることもできる。ディスクとして市販されているものもあるが、濾紙などを適当な形状および大きさに切断して使用することもできる。ディスク試験片の大きさは特に限定されないが、通常使用されている細菌培養用の直径９ｃｍ前後のシャーレ内の固体培地上に置いて使用することを考慮して、直径５〜１３ｍｍの円盤状とするか、幅３〜１２ｍｍ、長さ１５〜８０ｍｍの短冊状とするか、または、一辺５〜１３ｍｍの矩形状とすることが好ましい。
【００２８】
本発明で固体培地に塗布される試料は、薬剤耐性菌を含む可能性のある試料であれば特に限定されない。ヒト、他の動物の生体由来、環境、食品由来の検体、それらの培養液などが試料として挙げられる。
【００２９】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
なお、実施例２Ａおよび２Ｂで使用した供試菌株一覧を以下の表３に、実施例３〜９で使用した供試菌株一覧を表４に示す。
【００３０】
【表３】
0006346637.tif 000004
【００３１】
【表４】
0006346637.tif 000005
【実施例１】
【００３２】
（多剤耐性緑膿菌検出用ディスク試験片の作製）
カルバペネム系抗菌薬としてメロペネム、フルオロキノロン系抗菌薬としてシプロフロキサシン、アミノグリコシド系抗菌薬としてアミカシンを含浸させたディスク試験片を作製した。
【００３３】
（１）１ディスク当りの抗菌薬含有量
１ディスク当たりの各抗菌薬含有量は、以下に示したとおりである。
【００３４】
【表５】
0006346637.tif 000006
【００３５】
（２）抗菌薬溶液の調製
各抗菌薬を精製水に溶解し、メロペネムを５００μｇ／ｍＬ、アミカシンを１，５００μｇ／ｍＬ、シプロフロキサシンを５００μｇ／ｍＬ含む溶液（溶液Ａ）とした。更に、溶液Ａを８０％に希釈して溶液Ｂ、溶液Ａを５０％に希釈して溶液Ｃとした。
【００３６】
（３）抗菌薬含有ディスク試験片の作製
（２）で調製した溶液Ａ、Ｂ、Ｃを直径６．３５ｍｍの濾紙ディスクに２０μＬずつ含浸させた。その後、ディスクを５０℃で６０分間乾燥させた。
【実施例２】
【００３７】
（Ａ．多剤耐性緑膿菌の検出）
実施例１で作製したディスク試験片を羊血液寒天培地上に置いて、３剤耐性緑膿菌、２剤耐性緑膿菌または感受性の緑膿菌を培養し、多剤耐性緑膿菌（３剤耐性緑膿菌）検出の効果を調べた。
【００３８】
（１）固体培地の準備
以下に示した培地成分を用い、１２１℃で１５分間高圧滅菌し、５０℃に冷却した後に羊血液を添加した。その後、培地を２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
【００３９】
【表６】
0006346637.tif 000007
【００４０】
（２）菌の接種と培養
前培養した菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の１０倍希釈液を作製し、（１）で準備した羊血液寒天培地に一白金耳画線した。画線した培地に実施例１で作製したディスク試験片を置いた後、３７℃で１８時間培養し、判定を行った。
【００４１】
（３）結果
培養後の写真を結果として図１に示す。図１（１）〜（３）はそれぞれディスク試験片Ａ〜Ｃを用いて３剤耐性緑膿菌（３Ｒ）を培養したもの、図１（４）〜（６）はそれぞれディスク試験片Ａ〜Ｃを用いて２剤耐性緑膿菌（２Ｒ）を培養したもの、図１（７）〜（９）はそれぞれディスク試験片Ａ〜Ｃを用いて感受性の緑膿菌（Ｓ）を培養したものである。ディスク試験片Ａ〜Ｃいずれにおいても、３剤耐性緑膿菌はディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内に生育し、コロニーを生成したが、２剤耐性緑膿菌および感受性の緑膿菌はディスク試験片の周囲に発育阻止が認められた。このことから、本発明のディスク試験片周囲に生成されるコロニーの有無を観察することにより、多剤耐性緑膿菌の検出が可能であることが示された。
【００４２】
（Ｂ．混合培養における多剤耐性緑膿菌の検出）
実施例１で作製したディスク試験片を羊血液寒天培地上に置いて、３剤耐性緑膿菌または感受性の緑膿菌をエシェリキア・コリ（Escherichia coli）（以下、大腸菌という。）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）と混合培養し、多剤耐性緑膿菌（３剤耐性緑膿菌）検出の効果を調べた。
【００４３】
（１）固体培地の準備
実施例２．Ａと同様とした。
【００４４】
（２）菌の接種と培養
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の１０倍希釈液を作製した後、等量混合し、（１）で準備した羊血液寒天培地に一白金耳画線した。画線した培地に実施例１で作製したディスク試験片を置いた後、３７℃で１８時間培養し、判定を行った。
【００４５】
（３）結果
培養後の写真を結果として図２および３に示す。図２（１）〜（３）はそれぞれディスク試験片Ａ〜Ｃを用いて３剤耐性緑膿菌（３Ｒ）、大腸菌およびクレブシエラ・ニューモニエを混合培養したもの、図２（４）〜（６）はそれぞれディスク試験片Ａ〜Ｃを用いて感受性の緑膿菌（Ｓ）、大腸菌およびクレブシエラ・ニューモニエを混合培養したものである。ディスク試験片Ａ〜Ｃいずれにおいても、３剤耐性緑膿菌との混合培養ではディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内に緑膿菌のコロニーが認められたが、感受性の緑膿菌との混合培養ではディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内にいずれの菌の発育も認められなかった。
【００４６】
一方、図３（１）〜（３）はそれぞれディスク試験片Ａ〜Ｃを用いて３剤耐性緑膿菌（３Ｒ）、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエおよびエンテロコッカス・フェカリスを混合培養したもの、図３（４）〜（６）はそれぞれディスク試験片Ａ〜Ｃを用いて感受性の緑膿菌（Ｓ）、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエおよびエンテロコッカス・フェカリスを混合培養したものである。ディスク試験片Ａ〜Ｃいずれにおいても、３剤耐性緑膿菌との混合培養ではディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内に緑膿菌のコロニーが認められたが、感受性の緑膿菌との混合培養ではディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内にいずれの菌の発育も認められなかった。以上の結果から、本発明のディスク試験片周囲に生成されるコロニーの有無を観察することにより、複数の菌が含まれる試料から多剤耐性緑膿菌を検出することが可能であることが示された。
【実施例３】
【００４７】
（多剤耐性緑膿菌の検出における抗菌薬の種類および含有量の検討）
ディスク試験片に含浸させるカルバペネム系抗菌薬、フルオロキノロン系抗菌薬およびアミノグリコシド系抗菌薬の種類および含有量を変化させ、多剤耐性緑膿菌（３剤耐性緑膿菌）EKN8118株またはEKN8093株を大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエと混合培養し、検出効果を調べた。
【００４８】
（１）ディスク試験片の作製
各抗菌薬の溶液を調製した後に混合し、１ディスク当たりの含有量が表７に示したとおりになるように、直径６．３５ｍｍの濾紙ディスクに含浸させ、その後、ディスクを５０℃で６０分間乾燥させ、ディスク３−１〜３−１６とした。
【００４９】
【表７】
0006346637.tif 000008
【００５０】
（２）固体培地の準備
以下に示した培地成分を用い、１２１℃で１５分間高圧滅菌し、５０℃に冷却した後に羊血液を添加した。その後、培地を２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
【００５１】
【表８】
0006346637.tif 000009
【００５２】
（３）菌の接種と培養
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁した後に混合してMcFarland No. 0.5の１００〜１０，０００倍希釈の混合菌液とし、（２）で準備した羊血液寒天培地に綿棒にて塗抹した。塗抹した培地に（１）で作製したディスク試験片を置いた後、３７℃で１８時間培養し、判定を行った。
【００５３】
（４）結果
表７に示した様に、いずれのディスク試験片においても、多剤耐性緑膿菌はディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内に生育し、コロニーを生成したが、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエはディスク試験片の周囲に発育阻止が認められた。これらの結果から、カルバペネム系抗菌薬、フルオロキノロン系抗菌薬、アミノグリコシド系抗菌薬ともに、１ディスク当たりの含有量として０．００１〜１，５００μｇの範囲において本発明による多剤耐性緑膿菌の検出が可能であることが示された。
【実施例４】
【００５４】
（Ａ．多剤耐性緑膿菌の検出における培地の種類の検討）
ディスク試験片を置く培地の種類を変えて、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエとの混合培養における多剤耐性緑膿菌（３剤耐性緑膿菌）の検出の効果を調べた。
以下に示す実施例４Ａ、４Ｂおよび実施例５における菌の接種操作と培養は、実施例３と同様に行った。
【００５５】
（１）ディスク試験片の作製
各抗菌薬の溶液を調製した後、１ディスク当たりの含有量が表９に示したとおりになるように、直径６．３５ｍｍの濾紙ディスクに含浸させ、その後、ディスクを５０℃で６０分間乾燥させた。
【００５６】
【表９】
0006346637.tif 000010
【００５７】
（２）固体培地の準備
以下に示した培地成分を用い、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。８０℃まで冷却した後、ウマ脱線維素血液を５％添加し、撹拌しながらチョコレート色を呈するまで加熱した。その後、５０℃に冷却し、２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
【００５８】
【表１０】
0006346637.tif 000011
【００５９】
以下の各表に示した培地成分を用い、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。その後、５０℃に冷却し、２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
【００６０】
【表１１】
0006346637.tif 000012
【００６１】
【表１２】
0006346637.tif 000013
【００６２】
【表１３】
0006346637.tif 000014
【００６３】
【表１４】
0006346637.tif 000015
【００６４】
【表１５】
0006346637.tif 000016
【００６５】
以下の各表に示した培地成分を加温溶解した。その後、５０℃に冷却し、２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
【００６６】
【表１６】
0006346637.tif 000017
【００６７】
【表１７】
0006346637.tif 000018
【００６８】
（３）結果
表９に示した様に、検討したすべての培地において、多剤耐性緑膿菌はディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内に生育し、コロニーを生成したが、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエはディスク試験片の周囲に発育阻止が認められた。
【００６９】
（Ｂ．NAC寒天培地を使用した多剤耐性緑膿菌の検出）
NAC寒天培地を使用し、カルバペネム系、フルオロキノロン系、アミノグリコシド系の薬剤すべてに感受性の緑膿菌との混合培養における多剤耐性緑膿菌（３剤耐性緑膿菌）の検出の効果を調べた。
【００７０】
（１）ディスク試験片の作製
各抗菌薬の溶液を調製した後、１ディスク当たりの含有量が以下の表に示したとおりになるように、直径６．３５ｍｍの濾紙ディスクに含浸させ、その後、ディスクを５０℃で６０分間乾燥させた。
【００７１】
【表１８】
0006346637.tif 000019
【００７２】
（２）固体培地の準備
以下に示した培地成分を加温溶解した。その後、５０℃に冷却し、２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
【００７３】
【表１９】
0006346637.tif 000020
【００７４】
（３）結果
以下の表２０に示した様に、多剤耐性緑膿菌はディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内に生育し、コロニーを生成したが、カルバペネム系、フルオロキノロン系、アミノグリコシド系の薬剤すべてに感受性の緑膿菌はディスク試験片の周囲に発育阻止が認められた。
【００７５】
【表２０】
0006346637.tif 000021
【実施例５】
【００７６】
（多剤耐性緑膿菌検出用ディスクの保存安定性の検討）
作製後４℃にて９ヶ月間保存した後の多剤耐性緑膿菌検出用ディスク試験片を羊血液寒天培地上に置いて、多剤耐性緑膿菌（３剤耐性緑膿菌）を大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエと混合培養し、検出効果を調べた。
【００７７】
（１）ディスク試験片の作製と保存
実施例４．Ｂと同様にしてディスク試験片を作製した後、４℃にて９ヶ月間保存した。なお、同時に作製したディスク試験片に対し、作製時に多剤耐性緑膿菌（３剤耐性緑膿菌）を用いて多剤耐性緑膿菌を検出可能であることを確認した。
【００７８】
（２）固体培地の準備
実施例３と同様とした。
【００７９】
（３）結果
以下の表２１に示した様に、多剤耐性緑膿菌はディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内に生育し、コロニーを生成したが、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエはディスク試験片の周囲に発育阻止が認められた。この結果から、本発明のディスク試験片は、４℃において少なくとも９ヶ月間保存した後も多剤耐性緑膿菌の検出効果を保っていることが示された。
【００８０】
【表２１】
0006346637.tif 000022
【実施例６】
【００８１】
（バンコマイシン耐性腸球菌検出用ディスク試験片の作製）
ポリペプチド系抗菌薬としてコリスチン、キノロン系抗菌薬としてナリジクス酸、グリコペプチド系抗菌薬としてバンコマイシンを含浸させたディスク試験片を作製した。
【００８２】
（１）１ディスク当りの抗菌薬含有量
１ディスク当たりの各抗菌薬含有量は、以下に示したとおりである。
【００８３】
【表２２】
0006346637.tif 000023
【００８４】
（２）抗菌薬溶液の調製
各抗菌薬を精製水に溶解し、コリスチンを１，７５０μｇ／ｍＬ、ナリジクス酸を３，０００μｇ／ｍＬ、バンコマイシンを１，５００μｇ／ｍＬ含む溶液とした。
【００８５】
（３）抗菌薬含有ディスク試験片の作製
（２）で調製した溶液２０μＬを直径６．３５ｍｍの濾紙ディスクに含浸させた。その後、ディスクを５０℃で６０分間乾燥させた。
【実施例７】
【００８６】
（混合培養におけるバンコマイシン耐性腸球菌の検出）
実施例６で作製したディスク試験片を羊血液寒天培地上に置いて、バンコマイシン耐性の腸球菌（エンテロコッカス・フェカリス）またはバンコマイシン感受性の腸球菌（エンテロコッカス・フェカリス）を大腸菌、緑膿菌と混合培養し、バンコマイシン耐性腸球菌検出の効果を調べた。
【００８７】
（１）固体培地の準備
実施例３と同様とした。
【００８８】
（２）菌の接種と培養
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁した後に混合してMcFarland No. 0.5の１００〜１０，０００倍希釈の混合菌液を作製し、（１）で準備した羊血液寒天培地に綿棒にて塗抹した。塗抹した培地に実施例６で作製したディスク試験片を置いた後、３７℃で１８時間培養し、判定を行った。
【００８９】
（３）結果
培養後の写真を結果として図４（１）および（２）に示す。図４（１）はバンコマイシン耐性のエンテロコッカス・フェカリス（VRE）、大腸菌および緑膿菌を混合培養したもの、図４（２）はバンコマイシン感受性のエンテロコッカス・フェカリス、大腸菌および緑膿菌を混合培養したものである。バンコマイシン耐性のエンテロコッカス・フェカリスとの混合培養ではディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内にエンテロコッカス・フェカリスのコロニーが認められたが、バンコマイシン感受性のエンテロコッカス・フェカリスとの混合培養ではディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内にいずれの菌の発育も認められなかった。以上の結果から、本発明のディスク試験片周囲に生成されるコロニーの有無を観察することにより、複数の菌が含まれる試料からバンコマイシン耐性腸球菌を検出することが可能であることが示された。
【実施例８】
【００９０】
（バンコマイシン耐性腸球菌の検出における抗菌薬の種類および含有量の検討）
ディスク試験片に含浸させるポリペプチド系抗菌薬、モノバクタム系抗菌薬、キノロン系抗菌薬およびグリコペプチド系抗菌薬の種類および含有量を変化させ、大腸菌、緑膿菌との混合培養におけるバンコマイシン耐性腸球菌（エンテロコッカス・フェカリス）検出の効果を調べた。
以下に示す実施例８および実施例９における菌の接種操作と培養は、実施例７と同様に行った。
【００９１】
（１）ディスク試験片の作製
各抗菌薬の溶液を調製した後に混合し、１ディスク当たりの含有量が表２３に示したとおりになるように、直径６．３５ｍｍの濾紙ディスクに含浸させ、その後、ディスクを５０℃で６０分間乾燥させ、ディスク８−１〜８−２０とした。
【００９２】
【表２３】
0006346637.tif 000024
【００９３】
（２）固体培地の準備
実施例３と同様とした。
【００９４】
（３）結果
表２３に示した様に、いずれのディスク試験片においても、VRE（バンコマイシン耐性のエンテロコッカス・フェカリス）はディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内に生育し、コロニーを生成したが、大腸菌、緑膿菌はディスク試験片の周囲に発育阻止が認められた。これらの結果から、ポリペプチド系抗菌薬、モノバクタム系抗菌薬、キノロン系抗菌薬、グリコペプチド系抗菌薬ともに、１ディスク当たりの含有量として０．００１〜１，５００μｇの範囲において本発明によるバンコマイシン耐性腸球菌の検出が可能であることが示された。
【実施例９】
【００９５】
（バンコマイシン耐性腸球菌の検出における培地の種類の検討）
ディスク試験片を置く培地の種類を変えて、大腸菌、緑膿菌との混合培養におけるバンコマイシン耐性腸球菌（エンテロコッカス・フェカリス）の検出の効果を調べた。
【００９６】
（１）ディスク試験片の作製
各抗菌薬の溶液を調製した後、１ディスク当たりの含有量が表２４に示したとおりになるように、直径６．３５ｍｍの濾紙ディスクに含浸させ、その後、ディスクを５０℃で６０分間乾燥させた。
【００９７】
【表２４】
0006346637.tif 000025
【００９８】
（２）固体培地の準備
実施例４と同様にして、チョコレート寒天培地、ドリガルスキー改良培地（BTB乳糖寒天培地）、ハートインフュジョン寒天培地、ブレインハートインフュジョン寒天培地、トリプトソイ寒天培地（SCD寒天培地）を準備した。
【００９９】
（３）結果
表２４に示した様に、検討したすべての培地において、VRE（バンコマイシン耐性のエンテロコッカス・フェカリス）はディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内に生育し、コロニーを生成したが、大腸菌、緑膿菌はディスク試験片の周囲に発育阻止が認められた。
【０１００】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明のディスク試験片は、検出対象菌が増殖可能な固体培地と組み合わせて用いることにより、培地上の薬剤拡散領域内のコロニーの有無を目視で観察するのみで、容易かつ正確に多剤耐性菌またはバンコマイシン耐性菌を検出でき、かつ、抗菌薬の安定性を損なわずに長期保存できるため、従来の分離培養法に比べて検出に要する時間、コロニーの釣菌にかかる操作上の手間および培地にかかる試薬コストを大幅に削減することが可能である。そのため、本発明の薬剤耐性菌の検出方法およびそれに用いる検出用ディスク試験片は、臨床、疫学研究その他の幅広い領域において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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