(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシロースイソメラーゼ活性と、配列番号１のアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％を超えるアミノ酸配列とを有するポリペプチドをコードする異種核酸分子を含む組み換え酵母細胞であって、前記ポリペプチドが前記酵母細胞中においてキシロースイソメラーゼ活性をもたらす、組み換え酵母細胞。
【請求項２】
キシロースイソメラーゼ活性を有する酵母細胞を産生する方法であって、
ａ）酵母細胞を準備すること、
ｂ）キシロースイソメラーゼ活性と、配列番号１のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％であるアミノ酸配列とを有するポリペプチドをコードする異種核酸分子を導入すること
を含み、
キシロースイソメラーゼ活性を有する酵母細胞を産生する
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月１１日に出願された米国国内出願第１３／７９２３０８号明細書の利益を主張するものであり、この米国国内出願第１３／７９２３０８号明細書はその全体が参照により援用される。
【０００２】
本発明は、酵母の遺伝子改変の分野に関する。より具体的には、酵母細胞中において活性である一群のキシロースイソメラーゼが同定されており、この酵母細胞は、これらのキシロースイソメラーゼを発現させるために改変されている。
【背景技術】
【０００３】
エタノールの現在の発酵的製造は典型的には、炭水化物源としての穀物または麦芽汁から得た六炭糖を使用する、酵母、特にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるものである。セルロース系バイオマスから調製した加水分解物を発酵用の炭水化物源として使用することが望ましい。なぜならば、セルロース系バイオマスは、食糧供給と競合しない容易に再生可能な資源だからである。グルコースの次に、セルロース系バイオマスにおいて２番目に豊富な糖は、五単糖であるキシロースである。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は本来、キシロースを代謝することができないが、キシロースをキシルロースに変換するためのキシロースイソメラーゼ活性の発現および更なる経路の改変により、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を、キシロースを代謝するように改変することができる。
【０００４】
酵母中において活性である異種キシロースイソメラーゼ酵素、特に細菌源に由来する異種キシロースイソメラーゼ酵素の発現の成功は限られている。いくつかの特定の細菌性キシロースイソメラーゼ配列が、酵母中においてキシロース利用経路にキシロースイソメラーゼ活性を付与すると報告されている。例えば、特許文献１には、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）種から単離されたキシロースイソメラーゼを発現する酵母細胞が開示されており、この酵母細胞は、キシロースを基質として使用することができる。特許文献２には、ルミノコッカス・フラヴェファシエンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ）から単離されたキシロースイソメラーゼを発現する真核細胞が開示されている。特許文献３には、レティキュリテルメス・スペラタス（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ  ｓｐｅｒａｔｕｓ）およびマストテルメス・ダルウィニエンシス（Ｍａｓｔｏｔｅｒｍｅｓ  ｄａｒｗｉｎｉｅｎｓｉｓ）それぞれ由来の数種のキシロースイソメラーゼと、これらのキシロースイソメラーゼに対する配列同一性が高いタンパク質と、これらのキシロースイソメラーゼおよびタンパク質の真核細胞中における発現とが開示されている。特許文献４には、アビオトロフィア・デフェクティバ（Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ  ｄｅｆｅｃｔｉｖａ）由来のキシロースイソメラーゼを含有する構築物および真菌細胞が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７，６２２，２８４号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１２／０１８４０２０号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１１０７８２６２号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２１２００９２７２号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
キシロースの利用を成功させるためにキシロースイソメラーゼ活性を発現し、それにより発酵中にセルロース系バイオマスから得た糖の効率的な使用を可能にする新たな改変酵母細胞が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、キシロースイソメラーゼ活性を有するポリペプチドを発現するように改変されている組み換え酵母細胞を提供する。
【０００８】
従って、本発明は、キシロースイソメラーゼ活性と、配列番号１のアミノ酸配列に対して８５％を超える配列同一性または配列番号３のアミノ酸配列に対して８６％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドをコードする異種核酸分子を含む組み換え酵母細胞であって、ポリペプチドが酵母細胞中においてキシロースイソメラーゼ活性を有する、組み換え酵母細胞を提供する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵母細胞を産生する方法であって、
ａ）酵母細胞を準備すること、
ｂ）キシロースイソメラーゼ活性と、配列番号１のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％であるまたは配列番号３のアミノ酸配列に対する配列同一性が８６％を超えるアミノ酸配列とを有するポリペプチドをコードする異種核酸分子を導入すること
を含み、
キシロースイソメラーゼ活性を有する酵母細胞を産生する
方法を提供する。
【００１０】
配列の説明
下記の詳細な説明および本出願の一部をなす添付の配列の説明から、本発明をより完全に理解することができる。
【００１１】
下記の配列は米国特許施行規則（３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．）第１．８２１条〜第１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則（「Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ  −  ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に適合しており、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（２００９）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）および実施細則第２０８号および付随書Ｃ）に整合している。ヌクレオチド配列データおよびアミノ酸配列データに使用した記号およびフォーマットは、米国特許施行規則（３７Ｃ．Ｆ．Ｒ）第１．８２２条に記載の規則に従う。
【００１２】
【表１】
0006422478.tif 000002
【００１３】
配列番号１３は、ＩＬＶｐ−ｘｙｌＡ（Ｒｕ２）−ＩＬＶ５ｔキメラ遺伝子を含有するｐＨＲ８１ベクターのヌクレオチド配列である。
【００１４】
配列番号１４は、Ｐ５組み込み型ベクターのヌクレオチド配列である。
【００１５】
配列番号１５は、ＵＲＡ３欠失跡（ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｓｃａｒ）のヌクレオチド配列である。
【００１６】
配列番号１６は、上流のｕｒａ３Δ欠失後領域のヌクレオチド配列である。
【００１７】
配列番号１７は、下流のｕｒａ３Δ欠失後領域のヌクレオチド配列である。
【００１８】
配列番号１８は、上流のｈｉｓ３Δ欠失後領域のヌクレオチド配列である。
【００１９】
配列番号１９は、下流のｈｉｓ３Δ欠失後領域のヌクレオチド配列である。
【００２０】
配列番号２０は、ｐＪＴ２５４のヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
特許請求の範囲および本明細書の解釈に下記の定義を使用することができる。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」もしくは「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」またはこれらのあらゆるその他の変化形は、非排他的な包含を網羅することを意図している。例えば、要素の一覧を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品または装置は必ずしもこれらの要素のみに限定されず、明示的に列挙されないその他の要素またはそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品もしくは装置に固有のその他の要素を含むことができる。さらに、明示的に反対に述べられていない限り、「または（ｏｒ）」は包括的なまたは（ｏｒ）を指しており、排他的なまたは（ｏｒ）を指していない。例えば、条件ＡまたはＢは、下記の内のいずれか１つにより満たされる：Ａが真であり（または存在し）Ｂが偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在せず）Ｂが真である（または存在する）、ならびにＡおよびＢの両方が真である（または存在する）。
【００２３】
また、本発明の要素または構成要素に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、要素または構成要素の事例（即ち出現）の数に関して非限定的であることを意図している。従って、「ａ」または「ａｎ」は１つまたは少なくとも１つを含むと読み取るべきであり、要素または構成要素の単数語形はまた、数が明らかに単数であることを意味していない限り複数も含む。
【００２４】
用語「発明」または「本発明」は本明細書で使用する場合、非限定的な用語であり、特定の発明の任意の単一の実施形態を指すこと意図しておらず、本明細書および特許請求の範囲に記載した全ての可能な実施形態を包含する。
【００２５】
本明細書で使用する場合、用いる本発明の成分または反応物質の量を修飾する用語「約」は、例えば、現実世界で濃縮物または使用溶液を作るために使用する典型的な測定手順および液体取り扱い手順により、これらの手順における不注意による誤りにより、組成物を作るためにまたは方法を実施するために用いる成分の製造、供給源または純度の差異等により起こり得る数量の変動を指す。用語「約」または、特定の初期混合物から生じる組成物の異なる平衡条件に起因して異なる量も包含する。用語「約」で修飾されているかどうかに関わらず、特許請求の範囲は量に対する均等物を含む。一実施形態では、用語「約」は、報告した数値の１０％以内を意味しており、好ましくは報告した数値の５％以内を意味している。
【００２６】
用語「キシロースイソメラーゼ」は、Ｄ−キシロースとＤ−キシルロースとの相互変換を触媒する酵素を指す。キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）は、ＥＣ５．３．１．５と分類される酵素の群に属する。
【００２７】
用語「キシロース利用経路」は、キシロースを標的化学物質に変換するのに十分な酵素をコードする遺伝子を含む代謝経路を指す。標的化学物質がエタノールである場合、そのような経路は、下記の酵素をコードする遺伝子を典型的には含む：キシルロキナーゼ（ＸＫＳ１）、トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ１）、トランスケトラーゼ１（ＴＫＬ１）、Ｄ−リブロース−５−ホスフェート３−エピメラーゼ（ＲＰＥ１）およびリボース５−ホスフェートケトール−イソメラーゼ（ＲＫＩ１）。この経路の要素は、宿主細胞に固有であることができる、または宿主細胞に対して異種であることができる。
【００２８】
用語「遺伝子」は、特定のタンパク質または機能性ＲＮＡ分子を発現する核酸フラグメントを指しており、コード領域に先行する制御配列（５’非コード配列）とコード配列に続く制御配列（３’非コード配列）とを任意選択的に含むことができる。「天然遺伝子」または「野生型遺伝子」は、それ自体の制御配列と共に天然で見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然では一緒に見られない制御配列とコード配列とを含む、天然遺伝子ではないあらゆる遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列およびコード配列を含むことができる、または同じ起源に由来するが天然で見られるものとは異なる様式で配列されている制御配列およびコード配列を含むことができる。「内在性遺伝子」は、生物のゲノム中における天然の位置での天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子は、通常は宿主生物中に見られないが遺伝子導入により宿主生物中に導入されている遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然の生物に挿入された天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含むことができる。
【００２９】
用語「プロモーター」または「開始制御領域」は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来することができる、または天然で見られる様々なプロモーターに由来する様々な要素で構成され得る、または合成ＤＮＡ部分を更に含むことができる。様々な組織もしくは細胞型において、または様々な発達段階で、または様々な環境条件に応じて、様々なプロモーターが遺伝子の発現を方向付けることができることを当業者は理解する。ほとんどの場合にほとんどの細胞型中で遺伝子を発現させるプロモーターは、「構成的プロモーター」と一般に称される。
【００３０】
用語「発現」は本明細書で使用する場合、遺伝子に由来するコーディングＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または機能性ＲＮＡの転写と安定した蓄積とを指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指す場合もある。「過剰発現」は、通常の生物中でのまたは非形質転換生物中での産生レベルを超える、遺伝子導入生物中での遺伝子産物の産生を指す。
【００３１】
用語「形質転換」は本明細書で使用する場合、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物中への核酸フラグメントの転移を指す。転移された核酸は、宿主細胞中で保持されるプラスミドの形態であることができる、またはいくつかの転移された核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物は、「遺伝子導入」生物または「組み換え」生物または「形質転換」生物と称される。
【００３２】
用語「プラスミド」および「ベクター」は本明細書で使用する場合、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多く、通常は環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外要素を指す。そのような要素は、あらゆる起源に由来する一本鎖のまたは二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの直鎖のまたは環状の、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ配列またはヌクレオチド配列であることができ、これらの配列では、いくつかのヌクレオチド配列が、選択された遺伝子産物のためのプロモーターフラグメントおよびＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞中に導入することができる独特の構築物に連結されている、またはこの構築物に組み換えられている。
【００３３】
用語「作動可能に連結されている」は、一方の機能が他方の影響を受けるような単一の核酸フラグメント上での核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、このプロモーターはコード配列に作動可能に連結されている（即ち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列を、センス方向でまたはアンチセンス方向で制御配列に作動可能に連結することができる。
【００３４】
用語「選択マーカー」は、マーカー遺伝子の効果、即ち抗生物質に対する耐性に基づいて選択することができる同定因子、通常は抗生物質耐性遺伝子または化学物質耐性遺伝子を意味しており、この効果を使用して、目的の核酸の遺伝形質が追跡されるおよび／または目的の核酸が受け継がれている細胞もしくは生物が同定される。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「コドン縮重」は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくヌクレオチド配列の多様性を可能にする遺伝子コードの性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞により示される「コドンバイアス」を十分理解している。従って、宿主細胞中での発現の改善のために遺伝子を合成する場合、この遺伝子のコドンの使用頻度が宿主細胞の好ましいコドンの使用頻度に近づくように遺伝子を設計することが望ましい。
【００３６】
用語「コドン最適化」は様々な宿主の形質転換のための遺伝子または核酸分子のコード領域に言及する場合、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを変更することなく宿主生物の典型的なコドン使用を反映するための、遺伝子中におけるまたは核酸分子のコード領域中におけるコドンの変更を指す。
【００３７】
用語「炭素基質」または「発酵性炭素基質」は、微生物が代謝することができる炭素源を指す。炭素基質の一種は、発酵プロセス中に微生物により炭素源として使用され得るオリゴ糖および単糖を指す「発酵性糖」である。
【００３８】
用語「リグノセルロース系」は、リグニンおよびセルロースの両方を含む組成物を指す。リグノセルロース系材料はまた、ヘミセルロースも含むことができる。
【００３９】
用語「セルロース系」は、セルロースと、ヘミセルロースおよびリグニンを挙げることができる更なる成分とを含む組成物を指す。
【００４０】
用語「糖化」は、多糖からの発酵性糖の産生を指す。
【００４１】
用語「前処理バイオマス」は、熱的な、物理的なおよび／または化学的な前処理にかけられて、バイオマス中の多糖の糖化酵素による利用可能性が増大しているバイオマスを意味する。
【００４２】
「バイオマス」は、あらゆるセルロース系材料またはリグノセルロース系材料を指しており、「バイオマス」として、セルロースを含み、任意選択的にヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖および／または単糖を更に含む材料が挙げられる。バイオマスはまた、タンパク質および／または脂質等の更なる成分も含むことができる。バイオマスは単一の起源に由来することができる、またはバイオマスは２種以上の起源に由来する混合物を含むことができる。例えば、バイオマスは、トウモロコシの穂軸とトウモロコシの茎葉との混合物または草と葉との混合物を含む可能性がある。バイオマスとして、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙業からの汚泥、庭ゴミ、木材および林業廃棄物が挙げられるがこれらに限定されない。バイオマスの例として、トウモロコシの穂軸、作物残渣、例えばトウモロコシの穀皮、トウモロコシの茎葉、トウモロコシの穀粒繊維、草、ビートパルプ、コムギの藁、コムギの籾殻、オートムギの藁、オオムギの藁、オオムギの殻、干し草、イネの藁、イネの殻、スイッチグラス、ススキ、コードグラス、リードカナリーグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、モロコシの絞りかす、モロコシの茎葉、ダイズの茎葉、穀物の製粉から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木片、おがくず、パーム廃棄物、灌木および低木、野菜、果実、花ならびに家畜糞尿が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４３】
「バイオマス加水分解物」は、バイオマスの糖化によって生じる産物を指す。また、糖化の前にバイオマスを前処理するまたは前加工することもできる。
【００４４】
用語「異種」は、天然では目的の位置に見られないことを意味する。例えば、異種遺伝子は、天然では宿主生物中に見られないが遺伝子導入によって宿主生物中に導入されている遺伝子を指す。例えば、キメラ遺伝子中に存在する異種核酸分子は、天然ではキメラ遺伝子のその他の部分との関連が見られない核酸分子であり、例えば天然では互いに関連付けられていないコード領域部分およびプロモーター部分を有する核酸分子である。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「単離核酸分子」は、合成の、非天然のまたは改変されたヌクレオチド塩基を任意選択的に含有する、一本鎖また二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態である単離核酸分子を、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数の一部で構成することができる。
【００４６】
用語「パーセント同一性」とは、当分野で既知であるように、配列の比較により判定される２つ以上のポリペプチド配列間のまたは２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係のことである。当分野では、「同一性」は、場合によってはそのような配列の鎖間の一致により判定される、ポリペプチド配列間のまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」を、下記に記載するものが挙げられるがこれらに限定されない既知の方法によって容易に算出することができる：１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）、２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）、３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）、４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）および５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）。
【００４７】
同一性を判定するための好ましい方法は、試験する配列間に最良の一致を与えるように設計されている。同一性および類似性を判定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに体系化されている。ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州、マディソン）のＭｅｇＡｌｉｇｎプログラムを使用して、配列アラインメントおよびパーセント同一性の算出を実施することができる。
【００４８】
Ｃｌｕｓｔａｌ  ＶとラベルされているおよびＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ  ｖ８．０プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）に見られるアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２）に記載されている）に相当する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法」等のアルゴリズムのいくつかの変種を包含する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法」を使用して、配列の多重アラインメントを実施する。多重アラインメントの場合、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用するタンパク質配列のペアワイズアラインメントおよびパーセント同一性の算出のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸の場合、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを使用する配列のアラインメント後に同じプログラム中の「配列距離」表を見ることにより、「パーセント同一性」を得ることができる。
【００４９】
さらに、「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法」が入手可能であり、この「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ  ＷとラベルされているおよびＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ  ｖ８．０プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）に見られるアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２）：４６７３−４６８０，１９９４に記載されている）に相当する。多重アラインメントのデフォルトパラメータ（タンパク質／核酸で表される（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０／１５、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２／６．６６、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０／３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを使用する配列のアラインメント後に同じプログラム中の「配列距離」表を見ることにより、「パーセント同一性」を得ることができる。本明細書で言及する配列同一性は、特記しない限り、上記に記載のパラメータに従って判定されていると常に考えるべきである。
【００５０】
用語「配列解析ソフトウェア」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の解析に有用であるあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトフェアプログラムを指す。「配列解析ソフトウェア」は、市販されていてもよいし独自に開発されていてもよい。典型的な配列解析ソフトウェアとして、１．）プログラムのＧＣＧスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州、マディソン）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））、３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．ウィスコンシン州、マディソン）、４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミシガン州、アンアーバー、）および５．）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが組み込まれているＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．編者：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：ニューヨーク州、ニューヨーク）を挙げることができるがこれらに限定されない。本明細書の文脈内では、配列解析ソフトウェアを解析に使用する場合、特に指定しない限り、解析結果は、参照するプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解され得る。本明細書で使用する場合、「デフォルト値」は、最初に初期化した場合にソフトウェアにより初めにロードされるあらゆるセットの値またはパラメータを意味することができる。
【００５１】
用語「標的化合物」または「標的化学物質」は、発酵性炭素源を代謝して標的化合物を産生することができる内因性生合成経路または組み換え生合成経路によって微生物により作られる化合物を指す。
【００５２】
本明細書で使用する標準的な組み換えＤＮＡクローニング技法および分子クローニング技法は当分野で公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第５版．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，２００２に記載されている。本明細書で使用する更なる方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ  Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｌｄ  Ｒ．Ｆｉｎｋ（編），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，カリフォルニア州、サンディエゴ）に記載されている。
【００５３】
本発明は、キシロースイソメラーゼ酵素活性を有する改変酵母株に関する。セルロース系バイオマスから得た２番目に主要な糖であるキシロースを利用するように酵母を改変する上での課題は、酵母細胞中において十分なキシロースイソメラーゼ活性をもたらすことである。キシロースイソメラーゼはキシロースのキシルロースへの変換を触媒しており、この変換はキシロース利用経路中での最初の工程である。出願人らは、特定のキシロースイソメラーゼポリペプチドの発現により酵母細胞中においてキシロースイソメラーゼ活性がもたらされるが、その他のキシロースイソメラーゼポリペプチドの発現では活性がもたらされないことを発見している。キシロースイソメラーゼ活性を発現する酵母細胞により、宿主細胞が完全なキシロース利用経路を発現することが可能となり、その結果、リグノセルロース系バイオマス由来のキシロースを炭素源として使用して、エタノール、ブタノールまたは１，３−プロパンジオール等の標的化合物を産生することができる酵母細胞が遺伝子工学的に作られる。
【００５４】
酵母宿主細胞
本発明の酵母細胞は、機能的な細菌性キシロースイソメラーゼと、標的化合物を産生する能力とを含むものである。好ましい標的化合物は商業的価値を有するものであり、この商業的価値を有するものとして、エタノール、ブタノールまたは１，３−プロパンジオールが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５５】
本明細書では、標的化学物質を産生するまたは標的化学物質を産生するように改変され得るあらゆる酵母細胞を宿主細胞として使用することができる。そのような酵母の例として、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の酵母、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属の酵母、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属の酵母、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）属の酵母、シュワミオミセス（Ｓｃｈｗａｍｍｉｏｍｙｃｅｓ）属の酵母、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の酵母およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５６】
活性な細菌性キシロースイソメラーゼを含む本発明の酵母細胞を、当分野で公知の方法に従って遺伝子工学的に作ることができる。例えば、Ｃ６糖からエタノールを産生する先天的な能力を有する酵母細胞に、本発明の細菌性キシロースイソメラーゼを含むＣ５代謝経路を含む遺伝子を導入することができる。そのような細胞は、好気的なまたは嫌気的な発酵性エタノール産生を行うことができる。
【００５７】
その他の実施形態では、酵母細胞を、ブタノールまたは１，３−プロパンジオールの合成用の経路を発現するように改変することができる。ブタノール（イソブタノール、１−ブタノールおよび２−ブタノール等）を合成用の経路の改変は、例えば米国特許第８，２０６，９７０号明細書、米国特許出願公開第２００７０２９２９２７号明細書、米国特許出願公開第２００９０１５５８７０号明細書、米国特許第７，８５１，１８８号明細書および米国特許出願公開第２００８０１８２３０８号明細書に開示されており、これらは参照により本明細書に援用される。１，３−プロパンジオール用の経路の改変は、米国特許第６，５１４，７３３号明細書、米国特許第５，６８６，２７６号明細書、米国特許第７，００５，２９１号明細書、米国特許第６，０１３，４９４号明細書および米国特許第７，６２９，１５１号明細書に開示されており、これらは参照により本明細書に援用される。
【００５８】
キシロースを炭素源として利用する場合、酵母細胞を、完全なキシロース利用経路を発現するために改変する。キシロースからエタノールを産生するためのＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母の改変は、Ｍａｔｓｕｓｈｉｋａ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００９）８４：３７−５３）およびＫｕｙｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．（２００５）５：３９９−４０９）に記載されている。一実施形態では、キシロースイソメラーゼ活性を有するための本明細書に開示した酵母細胞の改変に加えて、キシロースを唯一の炭素源として使用して増殖する能力を付与するために、この酵母細胞中におけるその他の経路の酵素の活性を高める。典型的には、下記の５種のペントース経路の酵素の活性レベルを高める：キシルロキシナーゼ（ＸＫＳ１）、トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ１）、トランスケトラーゼ１（ＴＫＬ１）、Ｄ−リブロース−５−ホスフェート３−エピメラーゼ（ＲＰＥ１）およびリボース５−ホスフェートケトールイソメラーゼ（ＲＫＩ１）。遺伝子の発現を増大させるために、当業者に既知のあらゆる方法を使用することができる。例えば、本明細書の実施例１に記載しているように、高活性なプロモーターを使用して各タンパク質に関する宿主のコード領域を発現させることにより、これらの酵素の活性を高めることができる。発現用のキメラ遺伝子を構築して酵母のゲノム中に組み込む。あるいは、これらの酵素に関する異種コード領域を宿主細胞中で発現させて、活性が高い酵素を得ることができる。キシロースを代謝することができる酵母を遺伝子工学的に作るための更なる方法に関して、例えば米国特許第７６２２２８４Ｂ２号明細書、米国特許第８０５８０４０Ｂ２号明細書、米国特許第７，９４３，３６６Ｂ２号明細書、国際公開第２０１１１５３５１６Ａ２号パンフレット、国際公開第２０１１１４９３５３Ａ１号パンフレット、国際公開第２０１１０７９３８８Ａ１号パンフレット、米国特許出願公開第２０１００１１２６５８Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１０００２８９７５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９００６１５０２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７０１５５０００Ａ１号明細書、国際公開第２００６１１５４５５Ａ１号パンフレット、米国特許出願公開第２００６０２１６８０４Ａ１号明細書および米国特許第８１２９１７１Ｂ２号明細書を参照されたい。
【００５９】
一実施形態では、本酵母細胞は、下記に記載するキシロースイソメラーゼ活性と、上記に記載した完全なキシロース利用経路を実現するための更なる遺伝子改変とを有する。この細胞は、キシロースを唯一の炭素源として含有する培地中で増殖することができる。より典型的には、この細胞を、キシロースと、グルコースおよびアラビノース等のその他の糖とを含有する培地中で増殖させる。これにより、前処理および糖化によりセルロース系バイオマスから調製される加水分解物培地中に見られる糖を効率的に使用することが可能になる。
【００６０】
キシロースイソメラーゼ
酵母細胞中におけるキシロースイソメラーゼの発現には問題があり、具体的には、多くの細菌性キシロースイソメラーゼは酵母細胞中で発現された場合にほとんどまたは全く活性を有しないことが分かっている。本組み換え酵母細胞中では、雌ウシの第一胃のメタゲノムデータベース（Ｍａｔｔｈｉａｓ  Ｈｅｓｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３１：４６３−４６７（２０１１））の翻訳されたオープンリーディングフレームの中で同定されたアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％を超えるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子の発現により、キシロースイソメラーゼ活性がもたらされる。この同定されたアミノ酸配列を本明細書ではＲｕ４（配列番号１）と称する。この配列を、ルミノコッカス・フラヴェファシエンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ＦＤ−１由来のキシロースイソメラーゼ配列（配列番号１１）およびルミノコッカス・チャンパネレンシス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）１８Ｐ１３由来のキシロースイソメラーゼ配列（配列番号９）を使用するＢＬＡＳＴ検索により同定した。この配列は、雌ウシの第一胃からの未培養細菌に由来する。これらの２種の配列に対するＲＵ４アミノ酸配列の同一性はそれぞれ６４．１％および６７．５％である（表２を参照されたい）。配列番号１１は、米国特許出願公開第２０１２／０１８４０２０号明細書における配列番号３１のルミノコッカス・フラヴェファシエンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ）のキシロースイソメラーゼと同一である。
【００６１】
Ｒｕ４をコードする核酸分子のＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現により、キシロース利用経路を含有するがキシロースイソメラーゼ活性を欠くＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株の、キシロースを唯一の糖として含有する培地中での増殖が可能になることが本明細書（実施例３）中で発見された。この酵母細胞により、キシロースが利用されてエタノールが産生された。そのため、Ｒｕ４の発現によりキシロースイソメラーゼ活性がもたらされ、酵母細胞中においてキシロース利用経路が完成した。公知のアミノ酸配列の内、Ｒｕ４に対して最も高い配列同一性を有するものは、同一性が８１．５％である、アビオトロフィス・デフェクティバ（Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉｓ  ｄｅｆｅｃｔｉｖａ）ＡＴＣＣ４９１７６（受託番号ＺＰ  ０４４５３７６７）由来の仮想タンパク質（配列番号１２）であった。配列番号１２は国際公開第２１０２／００９２７２号パンフレットの配列番号２と同一であり、この配列番号１２は、本明細書においてアビオトロフィア・デフェクティバ（Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ  ｄｅｆｅｃｔｉｖａ）のキシロースイソメラーゼと同定されている。既知であったまたは本明細書で同定したその他のアミノ酸配列に対するＲｕ４の配列同一性を表２に示す。
【００６２】
キシロースイソメラーゼ活性を有するおよび配列番号１に対して８５％を超える配列同一性を有するあらゆるポリペプチドを、本酵母細胞中で発現させることができる。様々な実施形態では、このポリペプチドは、配列番号１に対して８５％を超える、８６％を超える、８７％を超える、８８％を超える、８９％を超える、９０％を超える、９１％を超える、９２％を超える、９３％を超える、９４％を超える、９５％を超える、９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、９９％を超えるまたは１００％以下のアミノ酸配列同一性を有することができる。
【００６３】
Ｒｕ４のアミノ酸配列に対する同一性が８６．１％であるアミノ酸配列を有する更なるポリペプチドを同じＢＬＡＳＴ検索で同定しており、本明細書においてＲｕ１（配列番号３）と称する。このＲｕ１も、雌ウシの第一胃からの未培養細菌に由来する。ルミノコッカス・フラヴェファシエンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ＦＤ−１由来のキシロースイソメラーゼ配列（配列番号１１）およびルミノコッカス・チャンパネレンシス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）１８Ｐ１３由来のキシロースイソメラーゼ配列（配列番号９）に対するＲＵ１アミノ酸配列の同一性はそれぞれ６４．４％および６４．３％である（表２を参照されたい）。
【００６４】
Ｒｕ１をコードする核酸分子のＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現により、キシロースを唯一の糖として含有する培地中での、キシロース利用経路を含有するがキシロースイソメラーゼ活性を欠くＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株による増殖、キシロース利用およびエタノール産生が可能になることが本明細書（実施例３）中で発見された。そのため、Ｒｕ１の発現によりキシロースイソメラーゼ活性がもたらされ、酵母細胞中においてキシロース利用経路が完成した。公知のアミノ酸配列の内、Ｒｕ１に対して最も高い配列同一性を有するものは、同一性が８４．０％である、アビオトロフィス・デフェクティバ（Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉｓ  ｄｅｆｅｃｔｉｖａ）ＡＴＣＣ４９１７６（受託番号ＺＰ  ０４４５３７６７）由来の仮想タンパク質（配列番号１２）であった。配列番号１２は国際公開第２１０２／００９２７２号パンフレットの配列番号２と同一であり、この配列番号１２は、本明細書においてアビオトロフィア・デフェクティバ（Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ  ｄｅｆｅｃｔｉｖａ）のキシロースイソメラーゼと同定されている。既知であったまたは本明細書で同定したその他のアミノ酸配列に対するＲｕ１の配列同一性を表２に示す。
【００６５】
キシロースイソメラーゼ活性を有するおよび配列番号３に対して８５％を超える配列同一性を有するあらゆるポリペプチドを、本酵母細胞中で発現させることができる。様々な実施形態では、このポリペプチドは、配列番号３に対して８５％を超える、８６％を超える、８７％を超える、８８％を超える、８９％を超える、９０％を超える、９１％を超える、９２％を超える、９３％を超える、９４％を超える、９５％を超える、９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、９９％を超えるまたは１００％以下のアミノ酸配列同一性を有することができる。
【００６６】
そのため、一実施形態では、配列番号１または配列番号３のどちらかに対して８６％を超える同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを、本酵母細胞中で発現させる。様々な実施形態では、このポリペプチドは、配列番号１または配列番号３のどちらかに対して約８７％の、約８８％の、約８９％の、約９０％の、約９１％の、約９２％の、約９３％の、約９４％の、約９５％の、約９６％の、約９７％の、約９８％の、約９９％のまたは１００％以下のアミノ酸配列同一性を有することができる。
【００６７】
本発明のキシロースイソメラーゼで形質転換させた場合、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、キシロース含有培地中で増殖させた際に増殖、キシロース利用およびエタノール産生量の増加を示した。配列番号１または配列番号３に対して８３％と同程度の同一性を有するキシロースイソメラーゼタンパク質は同じ効果を有しておらず、酵素の酵母宿主中で活性化される能力は配列依存性ではない可能性を示唆する。具体的には、本明細書においてＲｕ２（配列番号５）およびＲｕ３（配列番号７）と命名した配列は、７５％〜８３％の範囲でＲｕ１およびＲｕ４に対するアミノ酸配列同一性を有する（表２を参照されたい）。そのため、酵母細胞中で活性を生じるキシロースイソメラーゼに対して８３％と同程度の高さである配列同一性は、キシロースイソメラーゼタンパク質が酵母細胞中においてキシロースイソメラーゼ活性をもたらすことができることを予測するのに十分ではない。
【００６８】
【表２】
0006422478.tif 000003
【００６９】
本アミノ酸配列は酵母細胞に固有ではなく、そのため、このアミノ酸配列をコードする核酸配列は酵母細胞に対して異種である。当業者に公知であるように、発現させるために、所望の酵母細胞のためのコドン最適化を使用して、本ポリペプチドをコードする核酸分子を設計することができる。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中でＲｕ４およびＲｕ１を発現させるために、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の発現のためのコドン最適化を使用して、ｘｙｌＡ（Ｒｕ４）と命名した核酸分子（配列番号２）およびｘｙｌＡ（Ｒｕ１）と命名した核酸分子（配列番号４）を設計した。
【００７０】
酵母中での遺伝子発現の方法は当分野で既知である（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ  Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｌｄ  Ｒ．Ｆｉｎｋ（編），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，カリフォルニア州、サンディエゴを参照されたい）。酵母中での遺伝子の発現には典型的には、目的のコード領域に作動可能に連結されているプロモーターと、転写ターミネーターとが必要である。所望のタンパク質をコードする遺伝子用の発現カセットの構築において多くの酵母プロモーターを使用することができ、このプロモーターとして、構成的プロモーターＦＢＡ１、ＧＰＤ１、ＡＤＨ１、ＧＰＭ、ＴＰＩ１、ＴＤＨ３、ＰＧＫ１、ＩＬＶ５ｐならびに誘導プロモーターＧＡＬ１、ＧＡＬ１０およびＣＵＰ１が挙げられるがこれらに限定されない。適切な転写ターミネーターとして、ＦＢＡｔ、ＧＰＤｔ、ＧＰＭｔ、ＥＲＧ１０ｔ、ＧＡＬ１ｔ、ＣＹＣ１ｔ、ＡＤＨ１ｔ、ＴＡＬ１ｔ、ＴＫＬ１ｔ、ＩＬＶ５ｔおよびＡＤＨｔが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７１】
適切なプロモーター、転写ターミネーターおよびコード領域を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクター中にクローニングして酵母細胞中に形質転換させることができる。このベクターにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株および酵母株の両方の株増殖が可能になる。
【００７２】
典型的には、このベクターは、選択マーカーと、所望の宿主中での自己複製または染色体組み込みを可能にする配列とを含有する。典型的には、酵母中で使用するプラスミドは、シャトルベクターｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５およびｐＲＳ４２６（アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、メリーランド州、ロックビル）であり、これらのシャトルベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製起点（例えばｐＭＢ１）、複製の酵母２μ起点および栄養選択用のマーカーを含有する。これら４種のベクター用の選択マーカーは、Ｈｉｓ３（ベクターｐＲＳ４２３）、Ｔｒｐ１（ベクターｐＲＳ４２４）、Ｌｅｕ２（ベクターｐＲＳ４２５）およびＵｒａ３（ベクターｐＲＳ４２６）である。使用することができる更なるベクターとして、ｐＨＲ８１（ＡＴＣＣ番号８７５４１）およびｐＲＳ３１３（ＡＴＣＣ番号７７１４２）が挙げられる。所望のタンパク質をコードするキメラ遺伝子を有する発現ベクターの構築を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での標準的な分子クローニング技法または酵母中でのギャップ修復組み換え法のどちらかにより実施することができる。
【００７３】
ギャップ修復クローニング手法は、酵母中での高効率の相同組み換えを利用する。典型的には、酵母ベクターＤＮＡが（例えばその多重クローニング部位で）消化され、この酵母ベクターＤＮＡの配列中に「ギャップ」が生じる。次いで、「ギャップが生じた」ベクターと、順次重複する末端（所望の挿入順で互いにおよびギャップが生じたベクターの末端と重複する）を有する挿入ＤＮＡとを、プラスミド上で栄養選択マーカーの相補を可能にする適切な化合物の混合物を含有する培地上に蒔かれている酵母細胞中に共形質転換させる。正しい挿入の組み合わせの存在を、選択した細胞から調製したプラスミドＤＮＡを使用するＰＣＲマッピングにより確認することができる。次いで、酵母から単離したプラスミドＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、例えばＴＯＰ１０中に形質転換させ、その後ミニプレプおよび制限マッピングによりプラスミド構築物を更に検証する。最後に、構築物を配列解析により検証することができる。
【００７４】
ギャップ修復技法と同様に、酵母ゲノム中への組み込みも酵母中の相同組み換えシステムを利用する。典型的には、コード領域および制御因子（プロモーターおよびターミネーター）と栄養要求性マーカーとを含有するカセットを、カセットにハイブリダイズするならびに挿入が所望されるゲノム領域の５’領域および３’領域に対して配列相同性の４０〜７０塩基対を含有するプライマーを使用する高忠実度ＤＮＡポリメラーゼによりＰＣＲ増幅させる。次いで、ＰＣＲ産物を、組み込まれた栄養要求性マーカーの選択を可能にする適切な化合物の混合物を含有する培地上に蒔かれている酵母細胞中に形質転換させる。コロニーＰＣＲまたは染色体ＤＮＡの直接シークエンシングのどちらかにより、形質転換体を検証することができる。
【００７５】
本発明は、上記の教示後にキシロースイソメラーゼ活性を有する酵母細胞を産生する方法を提供する。一実施形態では、キシロースイソメラーゼ活性と、配列番号１のアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％を超えるアミノ酸配列とを有するポリペプチドをコードする異種核酸分子を酵母株中に導入する。様々な実施形態では、このポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号３のどちらかに対して少なくとも約８６％の同一性を有する。導入することができる核酸分子にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列の更なる説明は上記に開示した通りである。
【００７６】
一実施形態では、上記に記載したように、導入される核酸分子は、発現のために酵母細胞中に導入されるキメラ遺伝子の一部である。
【００７７】
一実施形態では、酵母宿主細胞に関して上記で説明したように、説明した核酸分子を、キシロースイソメラーゼ活性が導入されると完全なキシロース利用経路がもたらされるその他の遺伝的改変を有する酵母細胞中に導入する。キシロースイソメラーゼ活性および更なる遺伝的改変の導入を、任意の順序でおよび／または同時に実施する導入／改変の内の２種以上と共に実施することができる。この細胞は、キシロースを唯一の素源として含有する培地中で増殖することができる。より典型的には、この細胞を、キシロースと、グルコースおよびアラビノース等のその他の糖とを含有する培地中で増殖させる。これにより、前処理および糖化によりセルロース系バイオマスから調製される加水分解物培地中に見られる糖の効率的な使用が可能になる。
【００７８】
更なる実施形態では、説明した核酸分子を、標的化学物質を産生する代謝経路を有する酵母細胞中に導入する。キシロースイソメラーゼ活性および代謝経路の導入を、任意の順序でおよび／または同時に実施する２種以上の遺伝的改変と共に実施することができる。標的化合物の例として、エタノール、ブタノールおよび１，３−プロパンジオールが挙げられる。標的化学物質の産生のための代謝経路を含有する酵母細胞を上記で説明している。
【実施例】
【００７９】
本発明を下記の実施例で更に定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すが、例示のみを目的として提示されていることを理解しなくてはならない。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特徴を確認することができると共に、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明を様々な用途および条件に適合させるために本発明の様々な変更および改変を行うことができる。
【００８０】
一般的方法
略語の意味は下記の通りである：「ｋｂ」はキロベースを意味しており、「ｂｐ」は塩基対を意味しており、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味しており、「ｈｒ」は時間を意味しており、「ｍｉｎ」は分を意味しており、「ｓｅｃ」は秒を意味しており、「ｄ」は日を意味しており、「Ｌ」はリットルを意味しており、「ｍｌ」または「ｍＬ」はミリリットルを意味しており、「μＬ」はマイクロリットルを意味しており、「μｇ」はマイクログラムを意味しており、「ｎｇ」はナノグラムを意味しており、「ｍｇ」はミリグラムを意味しており、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味しており、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味しており、「ｎｍ」はナノメートルを意味しており、「μｍｏｌ」マイクロモルを意味しており、「ｐｍｏｌ」はピコモルを意味しており、「ＸＩ」はキシロースイソメラーゼのことであり、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味している。
【００８１】
本明細書で使用する標準的な組み換えＤＮＡ技法および分子クローニング技法は当分野で公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以降「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）、およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，出版元Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）、およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている。
【００８２】
ＨＰＬＣ分析
定めた時間間隔で細胞培養サンプルを採取し、Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣシステム（Ａｌｌｉａｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州、ミルフォールド）またはＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＬＣのどちらかを使用して、条件＝０．６ｍＬ／ｍｉｎの０．０１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４、注入容積＝１０μＬ、オートサンプラー温度＝１０oＣ、カラム温度＝６５oＣ、稼働時間＝２５ｍｉｎ、（４０℃で保持した）屈折率による検出でＥｔＯＨおよびキシロースに関して分析した。ＨＰＬＣカラムを、ＢｉｏＲａｄ（Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ、ＢｉｏＲａｄ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）から購入した。分析物を屈折率の検出により定量化し、既知の標準物質と比較した。
【００８３】
実施例１
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中における天然のペントース経路の上方制御
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中における酸素制限条件下でのキシロースの効率的な使用およびエタノール産生には、活性なキシロースイソメラーゼ酵素の発現に加えて、頑強なペントース経路が必要である。このペントース経路は５種の酵素からなる。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、これらのタンパク質は、キシルロキナーゼ（ＸＫＳ１）、トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ１）、トランスケトラーゼ１（ＴＫＬ１）、Ｄ−リブロース−５−ホスフェート３−エピメラーゼ（ＲＰＥ１）およびリボース５−ホスフェートケトール−イソメラーゼ（ＲＫＩ１）である。これらのタンパク質の発現を増加させるために、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノム由来の、これらのタンパク質をコードする領域を様々なプロモーター下で発現させるためにクローニングし、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の染色体に組み込んだ。組み込むために、アルドースレダクターゼをコードするＧＲＥ３遺伝子座を選択した。そのようなこの株を構築するために、最初の工程は、ＧＲＥ３中での、Ｐ５組み込み型ベクターと称する組み込み型ベクターの構築であった。
【００８４】
ＧＲＥ３中におけるＰ５組み込み型ベクターの配列を配列番号１４に示し、下記の数は、このベクター配列におけるヌクレオチド位置を指す。示したｎｔ数間の間隔は、制限部位を含有する配列領域を含む。ＴＡＬ１コード領域（１５２１０から１６２１７）をＴＰＩ１プロモーター（１４６１５から１５１９７）により発現させ、このＴＡＬ１コード領域はＴＡＬ１ｔターミネーターを使用する。ＲＰＥ１（１３８９３から１４６０９）コード領域をＦＢＡ１プロモーター（１３２９０から１３８７９）により発現させ、このＲＰＥ１コード領域はＴＰＩ１プロモーターの上流端部でターミネーターを使用する。ＲＫＩ１コード領域（ｎｔ１１９０７から１２６８０）をＴＤＨ３プロモーター（１１２２９から１１９００）により発現させ、このＲＫＩ１コード領域はＧＰＤｔ（以前はＴＤＨ３ｔと呼ばれていた）ターミネーターを使用する。ＴＫＬ１コード領域（ｎｔ８８３０から１０８７２）をＰＧＫ１プロモーター（ｎｔ８０１８から８８１７）により発現させ、このＴＫＬ１コード領域はＴＫＬ１ｔターミネーターを使用する。ＸＫＳ１コード領域（ｎｔ７２９７から５４９５）をＩｌｖ５プロモーター（ｎｔ８００９から７３１０）により発現させ、このＸＫＳ１コード領域はＡＤＨターミネーターを使用する。この組み込み型ベ
クターでは、ＵＲＡ３マーカー（ｎｔ３３２から１１３５）を、このマーカーを再利用するためにｌｏｘＰ部位（ｎｔ４２から７５およびｎｔ１５１３から１５４６）に隣接させた。このベクターは、ＧＲＥ３遺伝子座の組み込み用の腕（ｎｔ１５４９から２０８９およびｎｔ４５６６から５１３７）を含有する。ＧＲＥ３中におけるこのＰ５組み込み型ベクターを、組み込み前にＫａｓＩ酵素で消化することにより線形状にすることができる。
【００８５】
この研究のために選択した酵母株は、原栄養二倍体株ＣＢＳ８２７２（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）菌類多様性センター（Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ）、オランダ）由来の半数体株であるＢＰ１５４８であった。この株は、ＣＥＮ．ＰＫ系列のサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株に属する。ＢＰ１５４８は、ＭＡＴα接合型とＵＲＡ３遺伝子およびＨＩＳ３遺伝子の欠失とを含有する。
【００８６】
ＢＰ１５４８を産生するために、最初にＣＢＳ８２７２を胞子形成させ、標準的な手法（Ａｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５）を使用して四分染色体を切断し、４つの半数体株を得た。ＭＡＴα半数体の内の１つであるＰＮＹ０８９９をその後の修飾用に選択した。ｌｏｘＰ部位、プライマー結合部位、および欠失させるＵＲＡ３領域外の相同配列に隣接するＫａｎＭＸ欠失カセットを使用する相同組み換えにより、ＵＲＡ３コード配列（ＡＴＧからストップコドン）およびＵＲＡ３コード配列の１３０ｂｐの配列上流を欠失させた。ｃｒｅリコンビナーゼを使用するＫａｎＭＸマーカーの除去後、プライマー結合部位に隣接するｌｏｘＰからなる９５ｂｐの配列が、ゲノム中においてＵＲＡ３欠失跡として残った（配列番号１５）。この配列は、ゲノム中においてＵＲＡ３上流配列（配列番号１６）とＵＲＡ３下流配列（配列番号１７）との間に位置する。傷跡を残さない方法（ｓｃａｒｌｅｓｓ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用する相同組み換えにより、ＨＩＳ３コード配列（ＡＴＧからストップコドン）を欠失させた。この欠失により、ＨＩＳ３コード配列のもともとは上流であったゲノム配列（配列番号１８）とＨＩＳ３コード配列のもともとは下流であったゲノム配列（配列番号１９）とが連結される。Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（カリフォルニア州、アーバイン）のＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ  Ｋｉｔを使用して、ＧＲＥ３中におけるベクターＰ５組み込み型ベクター中の５種のペントース経路遺伝子全てを含有するＫａｓＩ組み込みフラグメントを、ＢＰ１５４８株中に形質転換させた。形質転換体を、ウラシルを欠く合成ドロップアウト（ＳＤ）培地上で選択した。ＵＲＡ３マーカーを再利用するために、ＣＲＥリコンビナーゼベクターｐＪＴ２５４（配列番号２０）をこの組み込み株中に形質転換させた。このベクターはｐＲＳ４１３に由来しており、ｃｒｅコード領域（ｎｔ２５６２から３５９３）はＧＡＬ１プロモーター（ｎｔ２１１９から２５６１）の制御下にあった。ＳＤ（ウラシルを欠いている）培地上でもはや増殖することができない株を選択した。ＹＰＤ培地上での更なる継代を使用して、プラスミドｐＪＴ２５７を取り除いた。結果として生じた株をＣ５２−７９と命名した。
【００８７】
実施例２
細菌性キシロースイソメラーゼの選択および発現
酵母中で発現された場合に活性であることができる候補細菌性キシロースイソメラーゼを同定するために、発明者らは、雌ウシの第一胃から作成したメタゲノムデータベース（Ｍａｔｔｈｉａｓ  Ｈｅｓｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３１：４６３−４６７（２０１１））の翻訳されたオープンリーディングフレームに対するＢＬＡＳＴ検索で、ルミノコッカス・フラヴェファシエンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ＦＤ−１由来のキシロースイソメラーゼのアミノ酸配列（配列番号１１）およびルミノコッカス・チャンパネレンシス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）１８Ｐ１３由来のキシロースイソメラーゼのアミノ酸配列（配列番号９）を使用した。これら２種のタンパク質は互いに７７％のアミノ酸同一性を有する。これらの配列のどちらに対しても、７０％を超える同一性を有するタンパク質配列は見つからなかった。この検索に基づいて、更なる研究のために、同一性が最も近い配列の中から４種の推定キシロースイソメラーゼを選び、Ｒｕ１（配列番号３）、Ｒｕ２（配列番号５）、Ｒｕ３（配列番号７）およびＲｕ４（配列番号１）と命名した。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で発現させるためのコドン最適化を使用して、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を設計し、それぞれｘｙｌＡ（Ｒｕ１）（配列番号４）、ｘｙｌＡ（Ｒｕ２）（配列番号６）、ｘｙｌＡ（Ｒｕ３）（配列番号８）およびｘｙｌＡ（Ｒｕ４）（配列番号２）の名称を付与し、これらの設計した核酸分子を合成した。コード領域の合成中に、５’ＰｍｅＩ部位および３’ＳｆｉＩ部位を追加した。さらに、ルミノコッカス・チャンパネレンシス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）１８Ｐ１３のキシロースイソメラーゼのためのコドン最適化コード領域を合成し、ｘｙｌ（Ａ−１０）（配列番号１０）と命名した。
【００８８】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子の１，１８４個のｎｔのプロモーター（ＩＬＶ５ｐ）およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子の６３５個のｎｔのターミネーター（ＩＬＶ５ｔ）を使用して、合成したｘｙｌＡコード領域ｘｙｌＡ（Ｒｕ２）、ｘｙｌＡ（Ｒｕ３）、ｘｙｌＡ（Ｒｕ４）およびｘｙｌＡ−１０を発現させた。キメラ遺伝子は、ｐＨＲ８１ベースのシャトルベクターにおけるＮｏｔＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に位置しており、コード領域はＰｍｅＩ部位とＳｆｉＩ部位と間であった。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのプラスミドの増殖および選択をそれぞれ可能とするために、ｐＨＲ８１ベクター（ＡＴＣＣ番号８７５４１）は、ｐＭＢ１起点とアンピシリン耐性（ａｍｐＲ）マーカーとを含有する。さらに、ｐＨＲ８１は、酵母での増殖および選択用に、２ミクロン複製起点、ＵＲＡ３選択マーカーおよびＬＥＵ２−ｄを有しており、これらにより、ロイシンを欠く培地中で増殖させた場合にＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で高コピー数が生じる。ＩＬＶｐ−ｘｙｌＡ（Ｒｕ２）−ＩＬＶ５ｔキメラ遺伝子を含有するｐＨＲ８１ベクターの配列は配列番号１３である。その他のコード領域を含有するベクターは、ＩＬＶ５ｐ部位とＩＬＶ５ｔ部位との間のコード領域、ＰｍｅＩ部位とＳｆｉＩ部位との間のコード領域それぞれの置換を除いて同一である。ｘｙｌＡ（Ｒｕ２）ベクターをｐＨＲ８１  ｉｌｖ５ｐ  ｘｙｌＡ（Ｒｕ２）と命名し、具体的なｘｙｌＡコード領域の名称の置換を除いてその他のベクターも同じ名称を有する。これらの構築物をＣ５２−７９株（実施例１）中に形質転換させ、下記のウラシルを欠く合成グルコース培地が入ったプレート上で形質転換体を選択した：アミノ酸を含まない６．７ｇ／Ｌの酵母窒素塩基（Ａｍｒｅｓｃｏ、オハイオ州、ソロン）、０．７７ｇ／ＬのマイナスｕｒａＤｒｏｐ  Ｏｕｔサプリメント（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州、マウンテンビュー）、２０ｇ／Ｌのグルコース。次いで、増殖およびエタノール産生に関して形質転換体を試験した。
【００８９】
実施例３
様々な細菌性キシロースイソメラーゼを含有するＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の増殖およびエタノール産生
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ｃ５２−７９（実施例１）は、キシロースをエネルギー源および炭素源として使用する能力を欠いている。なぜならば、この株はキシロースイソメラーゼ活性を欠いているからである。ＹＰＸ培地（１０ｇ／ｌの酵母抽出物、２０ｇ／ｌのペプトンおよび４０ｇ／ｌのキシロース）中で、ｘｙｌＡ（Ｒｕ２）キメラ遺伝子を発現する酵母株、ｘｙｌＡ（Ｒｕ３）キメラ遺伝子を発現する酵母株、ｘｙｌＡ（Ｒｕ４）キメラ遺伝子を発現する酵母株およびｘｙｌＡ−１０キメラ遺伝子を発現する酵母株を試験した。この試験を実施するために、これらの株を、０．５の開始ＯＤ６００で、５０ｍｌの組織培養管中の１０ｍｌのＹＰＸ培地に播種した。蓋を堅く閉じて、管を、２２５ｒｐの速度に設定した３０℃のロータリーシェーカー中に置いた。様々な時間間隔（２４ｈｒ、４４ｈｒおよび７２ｈｒ）でサンプルを採取し、一般的方法に記載したＨＰＬＣ分析によりキシロース濃度およびエタノール濃度を測定すると共に、ＯＤ６００を記録した。各株用に３つの個々の培養物を増殖させて分析した。各セットに関して３回の反復実験の結果を平均化し、表３に示す。
【００９０】
【表３】
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【００９１】
表３に示すように、２４時間で測定した場合に、Ｒｕ４の発現用のキメラ遺伝子を含有する酵母株はキシロースを消費し、同時にエタノールを産生した。インキュベーションの４４時間後に、この株により、本質的に全てのキシロースが消費されて１５ｇ／Ｌを超えるエタノールが産生された。これらの結果は、Ｒｕ４がＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中において活性なキシロースイソメラーゼ酵素として発現されたことを示す。一方、その他のｘｙｌＡを発現する株は、７２時間後であってもキシロースをほとんど消費せず、エタノールを産生しなかった。キシロースイソメラーゼ活性をもたらさなかった、試験したアミノ酸配列のＲｕ４と比較した最高の配列同一性は、Ｒｕ３に対するものである８０％である。
【００９２】
実施例４
更なるキシロースイソメラーゼの発現
実施例２および３で説明したように、合成したｘｙｌＡ（Ｒｕ１）コード領域（実施例２）をクローニングして株Ｃ５２−７９中に形質転換させ、結果として生じた株をアッセイした。結果を表４に示す。
【００９３】
【表４】
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表４に示すように、２４時間で測定した場合に、Ｒｕ１の発現用のキメラ遺伝子を含有する酵母株はキシロースを消費し、同時にエタノールを産生した。インキュベーションの４４時間後に、この株により、本質的に全てのキシロースが消費されて１６ｇ／Ｌを超えるエタノールが産生された。これらの結果は、Ｒｕ１がＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中において活性なキシロースイソメラーゼ酵素として発現されたことを示す。
【００９４】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．キシロースイソメラーゼ活性と、配列番号１のアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％を超えるアミノ酸配列とを有するポリペプチドをコードする異種核酸分子を含む組み換え酵母細胞であって、前記ポリペプチドが前記酵母細胞中においてキシロースイソメラーゼ活性をもたらす、組み換え酵母細胞。
２．前記アミノ酸配列が、配列番号１または配列番号３のどちらかに対して少なくとも約８６％の同一性を有する、上記１に記載の組み換え酵母細胞。
３．完全なキシロース利用経路を更に含み、キシロースを唯一の炭素源として増殖する能力を有する上記１または２に記載の組み換え酵母細胞。
４．標的化合物を更に含む上記３に記載の組み換え酵母細胞。
５．前記標的化合物が、エタノール、ブタノールおよび１，３−プロパンジオールからなる群から選択される、上記４に記載の組み換え酵母細胞。
６．キシロースイソメラーゼ活性を有する酵母細胞を産生する方法であって、
ａ）酵母細胞を準備すること、
ｂ）キシロースイソメラーゼ活性と、配列番号１のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％であるアミノ酸配列とを有するポリペプチドをコードする異種核酸分子を導入すること
を含み、
キシロースイソメラーゼ活性を有する酵母細胞を産生する
方法。
７．前記異種核酸分子がキメラ遺伝子の一部である、上記６に記載の方法。
８．前記アミノ酸配列が配列番号１または配列番号３のどちらかに対して少なくとも約８６％の同一性を有する、上記６または７に記載の方法。
９．前記キシロースイソメラーゼ活性を有する酵母細胞が、完全なキシロース利用経路を有し、キシロースを炭素源として含む培地中で増殖され、キシロースが利用される、上記６に記載の方法。
１０．前記酵母細胞が、標的化合物を産生する代謝経路を含む、上記９に記載の方法。
１１．前記標的化合物が、エタノール、ブタノールおよび１，３−プロパンジオールからなる群から選択される、上記１０に記載の方法。
【配列表】
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