(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（I）の修飾核酸の残基を含む核酸アプタマーであって、配列番号９、１０、１１お
よび１８のいずれかの塩基番号２１〜５０の配列（これらの配列におけるＴは当該（I）
で表される化合物の残基を示す）を含む血管内皮細胞増殖因子結合剤。
【化１】
0006442941.tif 000011
【請求項２】
核酸アプタマーが一本鎖ＤＮＡである、請求項１に記載の血管内皮細胞増殖因子結合剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な血管内皮細胞増殖因子（VEGF）結合性核酸アプタマー及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
VEGFは血管の内皮細胞に存在する受容体に結合し、内皮細胞の増殖を促すことで、血管新生を促進するタンパク質である。VEGFを標的とした薬剤は、血管新生を阻害して腫瘍の成長を抑制する抗癌剤や加齢黄斑変性症の治療薬として実用化されている。また、固形腫瘍患者の血清中でのVEGFの濃度上昇が報告されている。このため、VEGFに結合する物質が得られれば、血管新生を伴うさまざまな疾患の診断や治療を行う上で有効である。
【０００３】
VEGFに結合するアプタマーが報告されている（特許文献１）。しかし、これらは天然の塩基（ATGC）からなる配列であり、安定性等の面で十分とは言えなかった。また、本発明者は修飾核酸を含んだ核酸アプタマーを合成し、SELEX法により、カンプトテシン類に特
異的に結合するアプタマーを取得している（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−９２１３８号公報
【特許文献２】特開２０１３−４０１１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、VEGFを特異的に認識し結合する核酸アプタマーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、特定の修飾核酸残基を含む核酸アプタマーがVEGFに特異的に結合することを見出し、それにより、VEGFの測定やVEGFを標的とした医薬に利用できることを見出して、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の発明を提供する。
［１］下記（I）の修飾核酸の残基を含む核酸アプタマーを含むVEGF結合剤。
［２］核酸アプタマーが一本鎖ＤＮＡである、［１］に記載のVEGF結合剤。
［３］核酸アプタマーの長さが１５〜１００塩基である、［１］または［２］に記載のVEGF結合剤。
［４］核酸アプタマーの配列が配列番号４〜２０のいずれかの塩基番号２１〜５０の配列、配列番号２１〜２３のいずれかの塩基番号２１〜４９の配列、または配列番号２４の塩基番号２１〜５１の配列（これらの配列におけるＴは下記の式（I）で表される化合物の
残基を示す）を含む、［１］〜［３］のいずれかに記載のVEGF結合剤。
［５］下記（I）の修飾核酸の残基を含む核酸アプタマーのライブラリーを用意する工程
、およびライブラリーをVEGFと反応させる工程、およびVEGFと結合した核酸アプタマーを選択して増幅する工程を含む、VEGF結合剤のセレクション方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明において新たに開発した核酸アプタマーは、血液系標的であるVEGFを特異的に認識し結合することができるため、癌の診断マーカーおよび抗癌剤の分子標的として有力な
候補である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−１】KS9を含むVEGF結合核酸アプタマーの配列を示す図（両端の配列（下線部）はプライマー配列を示し、二重下線部以外のTはKS9残基を示す）。
【図１−２】KS9を含むVEGF結合核酸アプタマーの配列を示す図（両端の配列（下線部）はプライマー配列を示し、二重下線部以外のTはKS9残基を示す）。
【図２】アプタマーKS9#18についてのKd値測定の結果を示す図。
【図３】アプタマーKS9#63についてのKd値測定の結果を示す図。
【図４】アプタマーKS9#66についてのKd値測定の結果を示す図。
【図５】アプタマーKS9#72についてのKd値測定の結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に本発明を詳しく説明する。
本発明のVEGF結合剤は、下記（I）の修飾核酸の残基（ヌクレオチド残基）を含む核酸アプタマーである。
【化１】
0006442941.tif 000002
【００１１】
（I）の修飾核酸は特開２０１３−４０１１８に記載の方法によって合成することがで
きる。
【００１２】
核酸アプタマーとは好ましくはDNA（ポリヌクレオチド）であり、より好ましくは一本
鎖DNA（ポリヌクレオチド）である。
核酸アプタマーの長さは、好ましくは１５〜１００塩基であり、より好ましくは２０〜６０塩基である。
核酸アプタマーはさらに修飾されたものであってもよい。例えば、核酸アプタマーの安定性を増加させるために、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート修飾することも可能である。また、蛍光物質等で標識されたものでもよい。
【００１３】
（I）の修飾核酸の残基を含む核酸アプタマーとは、アデニン（A）、チミン（T）、グ
アニン（G）、シトシン（C）の４種類の天然の塩基のうちの１種類以上とともに、（I）
の修飾核酸の残基を含む核酸アプタマーを意味するが、（I）の修飾核酸はチミジン5’-
三リン酸（dTTP）の誘導体であるため、チミン（T）の代わりに（I）の修飾核酸の残基が含まれる核酸アプタマーであることは好ましい。すなわち、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）の３種類の天然の塩基のうちの１種類以上とともに、（I）の修飾核酸の残基を含む核酸アプタマーであることが好ましい。核酸アプタマー全長における（I）
の修飾核酸の残基の割合は１０〜５０％であることが好ましい。
本発明の核酸アプタマーは、（I）の修飾核酸残基に加えて、他の修飾核酸残基が含ま
れてもよい。
【００１４】
本発明の核酸アプタマーは、DNA合成機などを使用して得ることができる。例えば、DNA合成機に、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）と、（I）の修飾核酸の3’-ホスホロアミダイトを用いて目的の配列の核酸アプタマーを合成することができる。
【００１５】
本発明の核酸アプタマーの具体的な態様としては、VEGF結合能を有する限り特に限定はされないが、核酸アプタマーの配列が配列番号４〜２０のいずれかの塩基番号２１〜５０の配列、配列番号２１〜２３のいずれかの塩基番号２１〜４９の配列、または配列番号２４の塩基番号２１〜５１の配列を含む核酸アプタマーが挙げられる。これらの配列において、Tは上記（I）の修飾核酸残基を意味する。
なお、VEGFに結合する能力が維持される限り、これらの配列において１〜数個、例えば、１、２または３個の塩基が置換、欠失、挿入等されてよい。また、VEGF結合能が維持される限り、５’側および／または３’側に任意の長さの任意の配列が付加されてよい。
【００１６】
VEGF結合能としては、ヒトVEGFとKd（解離定数）が１０ｎＭ以下の親和性を示すことが好ましい。
【００１７】
本発明のVEGF結合剤は、アデニン（A）、チミン（T）、グアニン（G）、シトシン（C）の４種類の天然の塩基のうちの１種類以上とともに、（I）の修飾核酸の残基を含む核酸
アプタマーのライブラリーを用意し、それとVEGFを接触させ、VEGFと結合する核酸アプタマーを選択し、増幅することを繰り返すことによって核酸アプタマーのライブラリーからセレクションすることもできる。
【００１８】
本発明のVEGF結合剤は、VEGF検出のための分子プローブとして使用することができる。例えば、核酸アプタマーを蛍光色素などで標識し、VEGFの体内動態などをトレースすることができる。VEGFは癌や、糖尿病性網膜症などの異常血管新生、関節リウマチなどの炎症性疾患などで高発現することが知られているので、本発明のVEGF結合剤はこれらの疾患の診断試薬として使用することができる。
【００１９】
また、腫瘍組織では血管新生が亢進しており、腫瘍組織にはVEGFが集積するため、本発明の核酸アプタマーは、抗癌剤のDDS（薬剤伝達システム）のために使用することができ
る。アプタマーに抗癌剤の有効成分を結合させ、投与することで、抗癌剤を腫瘍組織に効率よく送達することができる。
例えば、本発明の核酸アプタマーと特開２０１３−４０１１８に開示されたカンプトテシン類との結合に関与する核酸アプタマーを連結し、これに、カンプトテシン類を結合させることで、カンプトテシン類を腫瘍組織に到達させるための医薬を作製することができる。
【実施例】
【００２０】
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２１】
核酸誘導体（I）は特開２０１３−４０１１８に記載の方法に従って合成した（以下、KS9とも呼ぶ）。
【００２２】
実施例１
CE-SELEXの実験方法
・用いたDNA
GOL#P1P:5’-TCG CTC GGC AGG ATC GCA AG-3’(5’リン酸化)（配列番号１）
GOL#P1F:5’-TCG CTC GGC AGG ATC GCA AG-3’(5’FITC化(6-FAM)) （配列番号１）
GOL#P2P:5’-TGC TGC CAC TGC TCC GTC CA-3’(5’リン酸化) （配列番号２）
GOL#P2H:5’-TGC TGC CAC TGC TCC GTC CA-3’（配列番号２）
GOL#T2H:5’-TGC TGC CAC TGC TCC GTC CAN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN
NNN NNC TTG CGA TCC TGC CGA GCG A-3’（配列番号３）
【００２３】
[修飾DNAライブラリーの酵素的調製]
1.5mLマイクロチューブに反応液を以下のように調製した。これを500μLマイクロチュ
ーブに100μLずつ8本に小分けし、遺伝子増幅装置にセットして以下の温度条件でPCRを行った。PCR産物の確認は10%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（TBE Buffer、200V、45℃、35分）の後、外部レーザー（488nm）照射によって行った。確認後、反応液を10%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（TB Buffer、300V、4℃、200-240分）により目的の70merのDNAバンドを外部レーザー（488nm）照射で検出し、ゲルから切り出した。切り出したゲルを、透析チューブを用いて透析（TB Buffer、100V、4℃、80分）を行った。抽出したDNA溶出液を遠心フィルターユニットにより脱塩し、凍結乾燥後、適量の蒸留水で溶解さ
せて濃度を測定することでライブラリーを得た。
【００２４】
【表１】
0006442941.tif 000003
【００２５】
【表２】
0006442941.tif 000004
【００２６】
[NECEEMによる修飾DNAライブラリーのセレクション]
500μLマイクロチューブに上記で合成したライブラリーを緩衝液中で1μMになるように調製した。緩衝液にはTris-HCl buffer（20mM Tris-HCl（pH 7.4）、1mM MgCl2、10mM NaCl）を用いた。これを遺伝子増幅装置にセットして、94℃で0.5分熱変性し2.5hかけて25℃まで下げてアニーリングを行った。その後、標的分子であるヒトVEGFタンパク質がファイナル0.5μM(1ラウンド目のみ)もしくは0.2μM(2ラウンド目以降)になるように加えて37
℃で30分インキュベートした。ネガティブコントロールにはバッファーを加えた。この際、DNAの濃度は0.5μMとなるようにした。インキュベート後、非平衡キャピラリー電気泳動法（NECEEM）によって測定した。測定条件には下記の条件を用いた。ネガティブコントロールと比べて蛍光強度の増加がみられる部分を分取した。また、キャピラリー内壁へのDNAの吸着を確認するために、反応液をインジェクトする前にも分取している。
【００２７】
＜泳動条件＞
Capillary length: 80cm
Running buffer: 100mM Boric acid buffer (pH 8.4)
Temperature
Cartridge : 25℃
Sample storage : 15℃
Dynamic range: 1000RFU
Excitation wavelength: 488nm
Emission wavelength: 520nm
【００２８】
【表３】
0006442941.tif 000005
【００２９】
[分取液のPCR (1st PCR)による修飾DNAライブラリー濃縮の確認]
500μLマイクロチューブに反応液を以下のように調製した。これを遺伝子増幅装置にセットし、上記セレクションで濃縮された画分を鋳型にし、以下の温度条件で1st PCRを行
った。PCR産物の確認は10％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（TBE Buffer、200V、45℃、35分）の後、外部レーザー（488nm）照射によって行った。反応液を酢酸ナトリウムでエタノール沈殿し、凍結乾燥した後、残渣を200μLの蒸留水に溶解した。この溶液を2nd PCRの鋳型とした。
【００３０】
【表４】
0006442941.tif 000006
【００３１】
【表５】
0006442941.tif 000007
【００３２】
[2nd PCRおよび鋳型鎖の調製]
1.5mLマイクロチューブに反応液を以下のように調製した。これを500μLマイクロチュ
ーブに100μLずつ8本に小分けし、遺伝子増幅装置にセットして、上記で得られた1stPCR
産物を鋳型とし、以下の温度条件で対称PCRを行った。PCR産物の確認は10％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（TBE Buffer、200V、45℃、35分）の後、外部レーザー（488nm
）照射によって行った。反応液を酢酸ナトリウムでエタノール沈殿し、凍結乾燥した後、残渣を80μLの蒸留水に溶解した。定法に従って、GOL#P1P伸長鎖を、λ-exonucleaseを用いて選択的に分解し、次のラウンドの修飾DNAライブラリー調製のための鋳型鎖を得た。
【００３３】
【表６】
0006442941.tif 000008
【００３４】
【表７】
0006442941.tif 000009
【００３５】
【表８】
0006442941.tif 000010
上記の、NECEEMによるセレクションとPCRの操作を繰り返すことにより、VEGF結合アプ
タマーを選択した。KS9を含むライブラリーから得られたVEGF結合アプタマーの配列を図
１に示す。
【００３６】
Kd測定の結果
上記で得られたVEGF結合アプタマーのうち、一部のアプタマーの活性評価をCE（キャピラリー電気泳動）により行った。また、キャピラリーの長さは30.2cmのものを使用し、injection時間は12secとった。他の条件は同じである。複合体平均と標準偏差は3回測定に
より算出してある。結果を図２〜図５に示した。
いずれのアプタマーもVEGFと高親和性を示すことが分かった。
【図１−１】
0006442941.tif 000012
【図１−２】
0006442941.tif 000013
【図２】
0006442941.tif 000014
【図３】
0006442941.tif 000015
【図４】
0006442941.tif 000016
【図５】
0006442941.tif 000017
【配列表】
0006442941000001.app