(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステップ１）ナノセレンゲルの調製ステップであって、２５〜５０℃の水浴条件下で、セレン含有液にアスコルビン酸溶液を添加し、２〜５時間反応させ、生成物を単離及び精製し、ナノセレンゲルを得ること、
ステップ２）ナノセレンゲルの解膠ステップであって、乳化剤を、ステップ１）で得られた前記ナノセレンゲルに攪拌しながら添加し、ｐＨ４．５〜６．５に調整し、水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現をコントロールする葉面ブロッキング剤を得ること、
とを含むことを特徴とする水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現をコントロールする葉面ブロッキング剤の調製方法。
【請求項２】
ステップ１）におけるセレン含有液の中のセレン含有化合物は、亜セレン酸、亜セレン酸ナトリウム、及び亜セレン酸カリウムのうち、少なくとも１種を含有する、
ことを特徴とする請求項１に記載の水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現をコントロールする葉面ブロッキング剤の調製方法。
【請求項３】
ステップ１）における前記アスコルビン酸溶液に含有されるアスコルビン酸と、前記セレン含有液に含有されるセレンとのモル比は、（１：１）〜（１：３）である、
ことを特徴とする請求項１に記載の水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現をコントロールする葉面ブロッキング剤の調製方法。
【請求項４】
ステップ２）における乳化剤の最終的な含有量は、０．０５〜５質量％であって、
ステップ２）で得られる葉面ブロッキング剤におけるセレンの含有量は、０．１５〜２質量％である、
ことを特徴とする請求項１に記載の水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現をコントロールする葉面ブロッキング剤の調製方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の調製方法で調製された葉面ブロッキング剤に、シリカゾルを含有させることを特徴とする水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現をコントロールするセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤の調製方法。
【請求項６】
前記セレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤におけるシリカの含有量を、３〜１０質量％とし、
前記セレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤におけるセレンとシリカの質量比を、（１：１０）〜（１：５５）とする、
ことを特徴とする請求項５に記載の水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現をコントロールするセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤の調製方法。
【請求項７】
前記シリカゾルは、酸性シリカゾルであり、
前記酸性シリカゾルのｐＨ値は、４．５〜６．５であり、シリカの質量含有量は１５％〜２０％であり、
前記酸性シリカゾルの調製方法は、
４０〜６０℃の水浴と０．５〜５ｍ/ｓの攪拌条件下で、シリコン金属粉末または金属ケイ酸塩をアルカリ性溶液にゆっくりと添加し、アルカリ性ケイ素含有溶液を得ることと、
得られたアルカリ性ケイ素含有溶液を１〜１０ｍＬ／ｍｉｎのスピードで水素型弱酸性カチオン交換樹脂交換カラムを通し、カラム出口の収集液のｐＨは４．５〜６．５となるように調整し、活性酸性シリカゾルの前駆体を得ることと、
前記活性酸性シリカゾルの前駆体をマイクロ波または水浴で４０〜６０℃に加熱し、そして、当該温度で１０〜３０分間攪拌後に、静止冷却し３０〜６０分間エイジングし、前記酸性シリカゾルを得ることと、
を含むこと、を特徴とする請求項５又は６に記載の水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現をコントロールするセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤の調製方法。
【請求項８】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の調製方法で調製された水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現をコントロールする葉面ブロッキング剤、及び／又は請求項５乃至７のいずれか１項に記載の水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現をコントロールするセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤の使用。
【請求項９】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の調製方法で調製された葉面ブロッキング剤、請求項５乃至７のいずれか１項に記載の調製方法で調製されたセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤またはシリカゾルを水で希釈した後に、水稲の分げつ盛期乃至茎伸長期の間、または出穂期乃至登熟期の間で、水稲の葉面に一回霧化散布する、又は両タイミングに各一回霧化散布し、
散布のタイミングとして、晴れ又は曇りの天気で午後４〜６時の間で選択し行い、
希釈後の前記葉面ブロッキング剤におけるセレンの含有量は、０．０１質量％〜０．１質量％にコントロールし、
希釈後の前記シリカゾル又はセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤におけるシリカの含有量を、０．１質量％〜１質量％にコントロールし、
前記分げつ盛期乃至茎伸長期の間の散布量として、６６６．７ｍ２（１ムー）あたり希釈後の前記葉面ブロッキング剤、前記シリカゾル又はセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤８０〜１２０Ｌを散布し、
前記出穂期乃至登熟期の間の散布量として、６６６．７ｍ２（１ムー）あたり希釈後の前記葉面ブロッキング剤、前記シリカゾル又はセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤１００〜１５０Ｌを散布する、ことを特徴とする水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現をコントロールする葉面ブロッキング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境保護の分野に関連し、具体的に、水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールする葉面ブロッキング剤及びその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境保護部と国土資源部とによって、２０１４年に発表された＜全国土壌汚染状況調査広報＞によれば、全国の土壌のうち約７．０％は、カドミウム標準を超えて、土壌のカドミウム汚染の治理は、我が国が直面している主要な環境問題であり、稲田のカドミウム汚染が特に顕著である。
【０００３】
稲田のカドミウム汚染の処理技術として、その目標によって、土壌の質が環境基準を満たすことを目標とする土壌中の重金属の除去技術と、農産品の安全を保証することを目的とする汚染コントロール技術とに大きく分けた。
【０００４】
現在、既に確認できたカドミウム超蓄積植物は、シナマンネングサ、随伴鉱物マンネングサ（sedum plumbizincicola）、ウシホウズキ、グンバイナズナ等であり、カドミウム濃縮植物は、アマランサス等である。植物修復技術では、農地と耕作期を占めなければならないため、大量の資金を投入する必要があり、大面積での実施の難度が高い。現在、植物修復技術は、乾燥した土地にのみに適用され、浸水された稲田での植物修復技術の適用はまだ報告されていない。また、土壌中の重金属含有量と農作物中の重金属含有量とは必ず対応しているわけではないため、土壌中の重金属含有量の低減が基準を満たしても、農作物の安全性が基準を満たすことを保証することはできない。
【０００５】
明らかに、稲田のカドミウム汚染の修復は、難しく、多くの技術的なボトルネックがあり、除去技術によって、地域の稲田におけるカドミウム汚染問題を解決しにくい。カドミウムの生物学的利用能を下げ、水稲がカドミウムの吸収及び集積を抑制し、特に水稲の葉から穀粒へのカドミウムの輸送を抑制することが、農作物の品質の向上に適切で実行可能な技術ルートである。
【０００６】
特許文献１、特許文献２、特許文献３及び特許文献４等で、農地の重金属汚染の制御に関する新たな技術の構想が公開されており、即ち、土地ではなく、複合二酸化シリカゾルを水稲の葉面に直接散布することによって、農作物における重金属含有量を効率的に下げることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】中国特許出願公開第１９０７０２９号明細書
【特許文献２】中国特許出願公開第１０１８３０７３５号明細書
【特許文献３】中国特許出願公開第１０１８５１１３３号明細書
【特許文献４】中国特許出願公開第１０３７８９１１４号明細書
【０００８】
技術原理の面で分析すると、カドミウムは水稲に必須な元素ではなく、Ｓｉ、Ｚｎ、Ｆｅ、Ｍｎ等の必須又は有益な元素との間で輸送タンパク質を奪い合い、根部に入り、上に向かって穀粒中まで輸送されてしまう（Ｕｒａｇｕｃｈｉ & Ｆｕｊｉｗａｒａ,２０１３）。水稲の穀粒におけるカドミウムの蓄積は、主に下記の４つの過程：根部の吸収、木部での輸送、維管束を渡る輸送、及び篩部から穀粒への移動を含む。（Ｕｒａｇｕｃｈｉ & Ｆｕｊｉｗａｒａ,２０１２）。現在、水稲におけるカドミウム吸収に関連する重要な遺伝子とその発現産物、輸送タンパク質、はいくつかが確認されている。水稲の根部におけるカドミウム吸収過程において、構成遺伝子ＯｓＮｒａｍｐ５の発現によって生成される鉄輸送タンパク質が、Ｍｎ、Ｆｅを吸収するとともにカドミウムを効率よく輸送し（Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．,２０１２）、遺伝子ＯｓＺＩＰ１及びＯｓＺＩＰ３の発現によって生成される亜鉛、鉄輸送タンパク質が、Ｚｎ及びＦｅを輸送するとともに、カドミウムも輸送し（Ｒａｍｅｓｈ ｅｔ ａｌ．,２００３）、また、Ｆｅ欠乏誘導遺伝子ＯｓＮｒａｍｐ１、ＯｓＩＲＴ１及びＯｓＩＲＴ２の発現によって生成される鉄輸送タンパク質が、Ｆｅの吸収を促進させるとともに、カドミウムの吸収も増進させる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．,２０１１;Ｎａｇａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．,２００６; Ｌｅｅ & Ａｎ, ２００９）。木部でのロードおよび上方への輸送過程において、遺伝子ＯｓＨＭＡ２の発現によって生成される輸送タンパク質は、木部にＺｎをロードするとともに、カドミウムもロードし（Ｎｏｃｉｔｏ ｅｔ ａｌ．,２０１１;Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．,２０１２）、遺伝子ＯｓＨＭＡ３、ＯｓＭＴＰ１及びＯｓＡＢＣＧ４３/ＯｓＰＤＲ５などの発現によって生成される輸送タンパク質は、亜鉛、カドミウム等の元素を液泡中へ輸送し、それにより細胞中における各元素のバランス状態を維持し、かつ木部への輸送を抑制する（Ｕｅｎｏ ｅｔ ａｌ．,２０１０;Ｍｉｙａｄａｔｅ ｅｔ ａｌ．,２０１１;Ｍｅｎｇｕｅｒ ｅｔ ａｌ．,２０１３;Ｏｄａ ｅｔ ａｌ．,２０１１）。篩部でのロードおよび穀粒への輸送過程中に、おもにＯｓＬＣＴ１などの輸送タンパク質が、マンガン、カドミウムなどの重金属元素の篩部から穀粒への輸送をコントロールする（Ｕｒａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．,２０１１）。
【０００９】
上記分析によれば、カドミウムなどの非必須元素の吸収及び輸送は、水稲体内において、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｓｉなどの類似の構成を持っている必須元素の輸送タンパク質のルートが利用される。現在、重金属カドミウムを専門的に輸送する特異輸送タンパク質は、まだ発見されていない。よって、重金属元素と必要な元素の間で同じ輸送タンパク質を奪い合う特徴を利用して、外部から必須元素を与えることによって、重金属の吸収および体内における輸送を防ぐことができる。
【００１０】
また、水稲は、典型的なケイ素親和性（silicon-philic）の植物であり、現在までに、ケイ素が植物の成長に必須な元素であることはまだ確定されていないが、ケイ素が安定かつ高い収率で水稲を生産するのに必要な元素であることは、十分なエビデンスによって示されている。ケイ素は、植物の木部における汁液に存在し、主に単珪酸[Ｓｉ(ＯＨ)４]の形態で存在し、イオン形態のＳｉ(Ｈ３ＳｉＯ４−)の比率は少ない。イオン状のケイ素は、水稲の根部においては、やや大きな比率であり、３％〜８％に達するが、やはり主にＳｉ(ＯＨ)４の形態で存在する。水稲体内において、ケイ素はほとんどが水和アモルファスシリカまたは重合ケイ酸の形態で存在し、全ケイ素含有量の約９０％〜９５％であり、わずか一部が、ケイ酸、コロイド状ケイ酸およびケイ酸イオンの形態で存在する。
【００１１】
水稲のケイ素吸収過程は、典型的な能動的吸収過程であり、水稲の根においてケイ酸形態でケイ素を吸収し、このような能動的輸送の輸送方式によって、水稲木部の溶液中のケイ酸の含有量は、根の外の溶液中のケイ酸の含有量と比べて、何倍も高くなる。現在、水稲のケイ素吸収欠損変異体から、３つのＳｉ輸送遺伝子（ＯｓＬｓｉ１、ＯｓＬｓｉ２及びＯｓＬｓｉ６）をクローン化させることに既に成功している。ＯｓＬｓｉ１とＯｓＬｓｉ２遺伝子は、それぞれ第２と第３の染色体に位置し、主に根部で発現し、ＯｓＬｓｉ６遺伝子は第６の染色体に位置し、主に鞘と葉に発現し、根部における発現量は少ない（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．, ２００６; ２００７; Ｙａｍａｊｉ  ｅｔ  ａｌ．, ２００８）。水稲において、ケイ素の吸収と輸送は、下記の４つのステップを含む。第１のステップでは、外皮中の輸送タンパク質ＯｓＬｓｉ１によって外部溶液中にあるケイ酸を細胞中に輸送し、輸送タンパク質ＯｓＬｓｉ２によってケイ酸を通気組織のアポプラストに放出する。第２のステップでは、内皮中の輸送タンパク質ＯｓＬｓｉ１によって、ケイ酸をアポプラスト溶液から内皮細胞中に輸送し、輸送タンパク質ＯｓＬｓｉ２によってケイ酸を内鞘へと輸送する。第３の工程では、内鞘にあるケイ素を、非重合式の単ケイ酸の形態で、木部導管を通じて蒸散流とともに地上部に輸送する。第４の工程では、葉鞘と葉身との導管の側部に近接する木部柔組織細胞中にある輸送タンパク質ＯｓＬｓｉ６が、木部において、ケイ素をアンロードし、配布して、そして、蒸散効果によって脱水及び重合してシリカゲル（ＳｉＯ２・ｎＨ２Ｏ）となり、地上部にある異なる組織及び器官における細胞壁と細胞間隙とに堆積する。水稲においては、９０％以上のケイ素は、シリカゲルの形態で存在する。
【００１２】
ケイ素は、水稲体内の重要な組成元素であり、水稲の細胞壁の主要成分でもある。ケイ素は、細胞のアポプラスト（細胞壁と細胞の空隙）に堆積されると、細胞の空隙率を低減させることができるとともに、カドミウムと共沈殿してそれを細胞壁に拘束することができ、カドミウムがアポプラストから細胞内に輸送されることを低減する（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２００５；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。また、ケイ素は、水稲の酸化ストレス耐性を改善し、カドミウムのストレスによる毒害を和らげることができ、生物量の増加を促進することができ（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．,２００７）、よって、外的なケイ素の添加は、水稲の生物量を上昇させるとともに、穀粒中のカドミウム含有量を下げることができる。
【００１３】
上記のケイ素の作用メカニズムによれば、ケイ素は、穀粒におけるカドミウムの蓄積を抑制することができることが明らかであり、よって、ケイ素を水稲の穀粒中にあるカドミウムを抑制する主な外的調節剤として使用する。上記の権利化された４つの特許発明は、シリカゾルを外的な調節剤として使用し、水稲の穀粒中のカドミウム蓄積を抑制する技術であり、また、シリカゾル、希土類複合シリカゾル、二酸化セレン複合シリカゾルを調製する方法を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかし、上記４つの特許発明では、ケイ素及びセレンがどのようにして、水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の活性的発現に影響を与えるか、また、それらの葉面ブロッキング剤が、どのようにして水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールすることができるか、それにより、水稲中のカドミウムの蓄積を抑制できること、を含んでいない。それらの特許発明は、正確なコントロール技術をいまだ提供していない。
【００１５】
上記従来技術における不足と欠点とを克服するため、本発明の第１の目的は、水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールする葉面ブロッキング剤の調製方法を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、上記の調製方法によって調製した葉面ブロッキング剤を提供することである。
【００１７】
本発明の更に他の目的は、水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールするセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤を提供することである。
【００１８】
本発明の第４の目的は、上記の葉面ブロッキング剤及び／又はセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤の応用を提供することである。
【００１９】
本発明の第５の目的は、水稲の葉から穀粒へのカドミウム輸送を正確にコントロールすることができる、水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールするセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の目的は、下記の実施態様によって実現できる。
【００２１】
水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールする葉面ブロッキング剤の調製方法は、
ステップ１）ナノセレンゲルの調製ステップであって、２５〜５０℃の水浴下で、アスコルビン酸溶液をセレン含有溶液に添加し、２〜５時間反応させ、生成物を単離及び精製し、ナノセレンゲルを得ること、
ステップ２）ナノセレンゲルの解膠ステップであって、乳化剤を、ステップ１）で得られた前記ナノセレンゲルに攪拌しながら添加し、ｐＨ４．５〜６．５に調整し、水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールする葉面ブロッキング剤を得ること、
を含むことを特徴とする。
【００２２】
ステップ１）におけるセレン含有溶液中のセレン含有化合物は、亜セレン酸、亜セレン酸ナトリウム、及び亜セレン酸カリウムのうち少なくとも１種を含有することが好ましい。
【００２３】
ステップ１）におけるセレン含有溶液中のセレンの質量％は、０．１〜５％であり、０．５〜１．５％であることがより好ましい。
【００２４】
ステップ１）におけるアスコルビン酸溶液中のアスコルビン酸の質量％は、０．５〜１０％であり、１〜３％であることがより好ましい。
【００２５】
ステップ１）における前記アスコルビン酸溶液に含有されるアスコルビン酸の前記セレン含有液に含有されるセレンに対するモル比は、（１：１）〜（１：３）である。
【００２６】
ステップ１）における生成物の単離は、遠心分離方式で生成物を単離することが好ましく、遠心分離の条件として、遠心力を４０００〜１００００ｇとし、１０〜４０分遠心分離する。
【００２７】
ステップ１）における精製は、生成物を水で２〜５回洗浄し、沈殿させることが好ましい。
【００２８】
ステップ２）における乳化剤の最終的な質量％は、０．０５〜５％であることが好ましい。
【００２９】
ステップ２）における乳化剤は、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、Ｔｗｅｅｎシリーズ、及びＳｐａｎシリーズの少なくとも１種であることが好ましい。
【００３０】
ステップ２）で得られる葉面ブロッキング剤におけるセレンの質量％は、０．１５〜２％であることが好ましい。
【００３１】
上記の調製方法によって調製し得る水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールする葉面ブロッキング剤。
【００３２】
上記葉面ブロッキング剤とシリカゾルを含有する水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールするセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤。
【００３３】
水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールするためのセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤の調製方法は、下記のステップを含む：
上記葉面ブロッキング剤とシリカゾルを均一に混合し、水稲におけるカドミウム吸収輸送関連遺伝子の発現を正確にコントロールするセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤を得る、
前記葉面ブロッキング剤とシリカゾルとの体積比は（１:１）〜（１:４）であり、
前記セレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤におけるシリカの含有量は、３〜１０質量％であり、
前記セレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤におけるセレンとシリカとの質量比は、（１：１０）〜（１：５５）であり、
前記シリカゾルは、酸性シリカゾルであることが好ましく、
前記酸性シリカゾルのｐＨは４．５〜６．５であり、シリコンの含有量は１５〜２０質量％である、
ステップを含む。
【００３４】
前記酸性シリカゾルの調製方法は、
４０〜６０℃の水浴下、０．５〜５ｍ/ｓの攪拌速度下で、シリコン金属粉末又は金属ケイ酸塩をアルカリ性溶液にゆっくりと添加し、アルカリ性ケイ素含有溶液を得ることと、
得られたアルカリ性ケイ素含有溶液を、１〜１０ｍＬ／ｍｉｎの速さで水素型弱酸性カチオン交換樹脂交換カラムを通し、カラム出口の回収液のｐＨは４．５〜６．５となるように調整し、活性酸性シリカゾルの前駆体を得ることと、
前記活性酸性シリカゾルの前駆体をマイクロ波又は水浴で４０〜６０℃に加熱し、そして、当該温度を維持して１０〜３０分間攪拌後に、静置、冷却し、３０〜６０分間エイジングし、前記酸性シリカゾルを得ることと、を含む。
【００３５】
前記金属ケイ酸塩は、Ｎａ２ＳｉＯ３、Ｋ２ＳｉＯ３、またはＬｉ２ＳｉＯ３であり、その中、好ましくは、Ｎａ２ＳｉＯ３である。
【００３６】
前記アルカリ性シリカ含有溶液の濃度は、５質量％から飽和であり、ｐＨ値は１０〜１３である。
【００３７】
前記シリコン金属粉末または金属ケイ酸塩について、不純物の含有量が低いことが好ましい。
【００３８】
前記アルカリ性溶液は、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液又はアンモニア水であり、好ましくは、アンモニア水である。
【００３９】
前記アルカリ性溶液の濃度は、０．１〜５Ｍであり、好ましくは０．２〜２Ｍである。
【００４０】
上記調製方法によって調製し得るセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤。
【００４１】
植物における重金属を抑制する技術分野における、前記葉面ブロッキング剤及び／又はセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤の応用。
【００４２】
水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールする葉面ブロッキング方法は、
上記葉面ブロッキング剤、シリカゾル又はセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤を水で希釈後、水稲の分げつ盛期乃至茎伸長期の間、または出穂期乃至登熟期の間で、水稲の葉面に一回霧化散布するか、または両タイミングに各一回霧化散布し、散布のタイミングは、晴れまたは曇りの天気で午後４〜６時の間であり、
希釈後の前記葉面ブロッキング剤におけるセレンの含有量は、０．０１質量％〜０．１質量％にコントロールし、最も適切な濃度は、０．０５質量％であり、
希釈後の前記シリカゾルまたはセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤におけるシリカの含有量は、０．１質量％〜１質量％にコントロールし、最も適切な濃度は、０．５質量％であり、
前記分げつ盛期乃至茎伸長期の間の散布量として、希釈後の前記葉面ブロッキング剤、前記シリカゾルまたはセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤を、ムーあたり８０〜１２０Ｌ散布し、
前記出穂期乃至登熟期の間の散布量として、希釈後の前記葉面ブロッキング剤、前記シリカゾルまたはセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤を、ムーあたり１００〜１５０Ｌ散布し、
前記散布の好ましい条件として、霧化水滴が１０００μｍ未満となるようにコントロールし、水稲葉面の両面に均一に散布する、
ステップを含む。
【００４３】
本発明の原理は、以下である。
水稲におけるシリコン、セレンなどの有意な元素の輸送メカニズム、及び水稲における重金属カドミウムの輸送メカニズムに基づき、茎と葉との配分の調整、輸送タンパク質の活性の調整や、輸送チャンネルの競合等の面から始め、ＯｓＬｓｉ１、ＯｓＬｓｉ２、ＯｓＨＭＡ３、ＯｓＮｒａｍｐ５及びＯｓＬＣＴ１を含む、カドミウムの水稲の葉面から穀粒への輸送をコントロールしている重要な遺伝子が分析された。シリカゾル、セレンゾル及びセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤を調製して、それらのブロッキング剤は、いずれも、上記重要な遺伝子の活性を効果的かつ正確にコントロールすることができ、水のみを散布した対照群と比較すると、葉面に上記ゾル材料を散布することによって何れも水稲におけるカドミウム含有量を下げることができた。そして、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｉｃｅＸＰｒｏデータベースによって、カドミウム／ケイ素／セレン関連の輸送タンパク質における発現のデータを照会及び抽出して分析した結果、水稲穀粒におけるカドミウムの蓄積において重要なステップは、カドミウムの篩部から穀粒へのカドミウムの輸送にある点が示された。現在、水稲の穀粒中のカドミウムの蓄積に関連する篩部における輸送タンパク質は、主にＯｓＬＣＴ１である。バイオインフォマティクスの発現モデル解析に基づくと、ジャポニカ種日本晴において、ＯｓＬＣＴ１遺伝子は主に葉面に集中して発現し、根における発現は極めて少ない。また、ＯｓＬＣＴ１遺伝子は、生育期にともなって発現量も異なり、栄養成長期から生殖成長期に変換（分げつ期―出穂期）する時に、発現量は顕著に上昇し、登熟期では最も高くなり、また、一日において、その発現量も一定的な周期性を持ち、毎日の午後４〜６時から発現量が上昇し、午後８〜１０時に最も高くなり、その他の時間帯においては、いずれも発現量が低い。上記のように分析した各輸送タンパク質の時間的及び空間的な特異的発現モデル、及びその発現の時間的及び空間的な特異性に基づいて、上記ブロッキング材料の最適な技術と散布方法を確定し、水稲の葉面から穀粒へのカドミウムの輸送を正確にコントロールすることを実現した。
【発明の効果】
【００４４】
従来技術と比べて、本発明は、下記の利点と効果とを有する。
【００４５】
（１）本発明は、水稲におけるカドミウム吸収及び輸送に関連する遺伝子の活性を正確にコントロールし、水稲中のカドミウムの蓄積を抑制することを特徴とする、水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールする葉面ブロッキング方法を提供する。セレン、ケイ素等の材料を葉面上に散布することによって、水稲中のカドミウムの蓄積を高い効率でブロックする生理学的メカニズムが、技術的な原理から説明することができるとともに、本発明によれば、ブロッキング材料の稲田への散布も示すことができる。本発明は、カドミウム／シリカ／セレンに関連する輸送遺伝子の時間的及び空間的な発現データの分析によって確定される葉面ブロッキング方法は、効率よく水稲におけるカドミウムの蓄積を抑制することができる。
【００４６】
（２）本発明は、水稲中のカドミウム含有量の安全性と、カドミウムに汚染された稲田の安全性と、を基準に適合させることを目的とする。物理的な除去や化学的な浸出等の処理方法を用いて、カドミウムに汚染された大面積の稲田の土壌中のカドミウムを除去することは難しい。水稲中のケイ素、セレンなど有益な元素及び重金属カドミウムの輸送メカニズムといった基礎理論に基づいて、本発明は、適用可能な主力製品である葉面ブロッキング剤（セレンゾル）及びセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤並びにその散布方法を提供することができ、水稲の葉から穀粒へのカドミウムの輸送を低減し、水稲の安全性を高めることができる。これは、我が国における中軽度のカドミウム汚染稲田に適用できる一連のコントロール技術であり、我が国のカドミウムに汚染された大面積の稲田の処理の技術的サポートを提供することができる。
【００４７】
（３）本発明によって提供されるセレンゾル及びセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤、並びに葉面ブロッキング方法は、低コスト及び高効率という特徴を備える。
【００４８】
（４）本発明によって提供されるシリカゾル、セレンゾル葉面ブロッキング剤、セレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤では、葉面にそれらブロッキング剤を散布するためのコストは、わずか５００〜１５００人民元／ヘクタールであり、土壌不動態化剤を散布する場合の１０％となり、水稲中のカドミウムを低減する効果は、同等又はよりよくなる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、酸性シリカゾルの透過型電子顕微鏡写真を示す図である。
【図２】図２は、葉面ブロッキング剤（セレンゾル）の粒子径分布図である。
【図３】図３は、葉面ブロッキング剤（セレンゾル）の透過型電子顕微鏡写真を示す図である。
【図４】図４は、セレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤の透過型電子顕微鏡写真を示す図である。
【図５】図５は、セレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤の粒子径分布図である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
以下、実施例及び図面により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、下記の実施形態に限定されるものではない。
【００５１】
水稲（Oryza sativa L. Japonica）の懸濁細胞を培養する方法：成熟かつしっかりした日本晴の種子を選択して、７０体積％のアルコール又は３０質量％の次亜塩素酸ナトリウムを用いて消毒した。ピンセットで種子を固形培地を有するプレート上に均等に播いて、インキュベーターに入れ、暗所で培養温度を２５℃で一定時間培養し、ピンセットで胚軸を取り出して、他の固形培地上で培養して、カルス組織を得た。１０ｇのカルス組織を破砕し、液体培地（５０ｍＬ）を有する三角フラスコに入れて、振とう機において２８℃の温度下で約１ヶ月培養して、水稲の懸濁細胞を得た。
【００５２】
実施例１：酸性シリカゾルの調製
（１）水２００ｍＬを量り、その中に水酸化ナトリウム０．８ｇを添加して、０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を調製した。攪拌機を起動して攪拌スピードを０．５ｍ／ｓとし、温度を４０℃まで上昇させた後、ゆっくりとＮａ２ＳｉＯ３  １１６ｇを添加した。十分に溶解させた後に室温まで冷却して、ｐＨ１０のアルカリ性シリコン溶液を得た。上記アルカリ性シリコン溶液を、スピードで、１００ｍＬ（湿体積）の水素型弱酸性カチオン交換樹脂交換カラム中を１ｍＬ／ｍｉｎの均一なスピードで通し、カラム出口の回収液のｐＨが４．５となるように調整し、活性酸性シリカゾルの前駆体を得た。活性酸性シリカゾルの前駆体を水浴で４０℃に加熱して、その温度を維持して３０分間攪拌してから、静置し、冷却し、６０分間エイジングして、使用するための酸性シリカゾルを得た。該酸性シリカゾルのｐＨ値は４．５であって、ケイ素含有量は、１８質量％であった。
【００５３】
（２）水２００ｍＬを量って、その中に水酸化カリウム５６ｇを添加し、５Ｍの水酸化カリウム溶液を調製した。攪拌機を起動して攪拌スピードを５ｍ／ｓとし、温度を６０℃まで上昇させた後に、ゆっくりとＬｉ２ＳｉＯ３  １１０ｇを添加した。十分に溶解させた後に室温まで冷却して、ｐＨ１２．５のアルカリ性シリコン溶液を得た。上記アルカリ性シリコン溶液１００ｍＬ（湿体積）を、水素型弱酸性カチオン交換樹脂交換カラム中を１０ｍＬ／ｍｉｎの均一なスピードで通し、カラム出口の回収液のｐＨが６．５となるように調整し、活性酸性シリカゾルの前駆体を得た。活性酸性シリカゾルの前駆体を水浴で６０℃まで加熱し、その温度を維持して１０分間攪拌してから、静置し、冷却し、３０分間エイジングし、酸性シリカゾルを得た。該酸性シリカゾルのｐＨ値は６．５であって、ケイ素含有量は、２０質量％であった。
【００５４】
（３）水２００ｍＬを量って、その中にアンモニア水７ｇを添加して、１Ｍのアンモニア溶液を調製した。攪拌機を起動して攪拌スピードを２ｍ/ｓとし、温度４５℃まで上昇させた後に、ゆっくりとＮａ２ＳｉＯ３  ９０ｇを添加した。十分に溶解させた後に室温までに冷却して、ｐＨ１１のアルカリ性シリコン溶液を得た。上記アルカリ性シリコン溶液１００ｍＬ（湿体積）を、水素型弱酸性カチオン交換樹脂交換カラム中を５ｍＬ/ｍｉｎの均一なスピードで通して、カラム出口の回収液のｐＨが５．５となるように調整して、活性酸性シリカゾルの前駆体を得た。活性酸性シリカゾルの前駆体を水浴で４５℃まで加熱して、その温度を維持して２０分間攪拌してから、静置し、冷却し、４５分間エイジングして、酸性シリカゾルを得た。該酸性シリカゾルのｐＨ値は５．５であって、ケイ素含有量は、１５質量％であった。そのＴＥＭ写真を、図１に示す。
【００５５】
実施例２：セレンゾル葉面ブロッキング剤の調製
（１）セレンの含有量が０．１質量％となるように、亜セレン酸溶液を調製した。
【００５６】
（２）水浴２５℃条件下で、（１）で調製した亜セレン酸溶液に、アスコルビン酸とセレンとのモル比が１：１となるように、０．５質量％のアスコルビン酸溶液を添加して、２時間反応させ、その後、遠心分離機によって、１００００ｇの条件下で遠心分離を１０分間行い、遠心分離後に、沈殿物を超純水で３回洗浄し、ナノセレンゲルを得た。
【００５７】
（３）乳化剤であるポリビニルピロリドンを、乳化剤の最終含有量が０．０５質量％となるように、（２）で得られたナノセレンゲル中に、攪拌しながら添加して、ｐＨ値４．５に調整して、水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールする葉面ブロッキング剤（セレンゾル葉面ブロッキング剤）を得た。該セレンゾル葉面ブロッキング剤におけるセレンの含有量は、０．１５質量％であった。
【００５８】
実施例３：セレンゾル葉面ブロッキング剤の調製
（１）セレンの含有量が５質量％となるように、亜セレン酸溶液を調製した。
【００５９】
（２）５０℃の水浴下で、１０質量％のアスコルビン酸溶液を、アスコルビン酸とセレンのモル比が１：３となるように、（１）で調製した亜セレン酸溶液中に添加し、５時間反応させた。その後、遠心分離機により、４０００ｇの条件下で遠心分離を４０分間行い、遠心分離後に、沈殿物を超純水で３回洗浄し、ナノセレンゲルを得た。
【００６０】
（３）乳化剤であるＳｐａｎ−８０を、乳化剤の最終含有量が５質量％となるように、（２）で得られたナノセレンゲル中に、攪拌しながら添加して、ｐＨ値６．５に調整し、水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールする葉面ブロッキング剤（セレンゾル葉面ブロッキング剤）を得た。該セレンゾル葉面ブロッキング剤におけるセレンの含有量は、２質量％であった。
【００６１】
実施例４：セレンゾル葉面ブロッキング剤の調製
（１）セレンの含有量が１．５質量％となるように、亜セレン酸溶液を調製した。
【００６２】
（２）５０℃の水浴下で、２．５質量％のアスコルビン酸溶液を、アスコルビン酸とセレンのモル比が１：１．５となるように、（１）で調製した亜セレン酸溶液中に添加して、３時間反応させた。その後、遠心分離機で、５０００ｇの条件下で遠心分離を３０分間行い、遠心分離後に、沈殿物を純水で３回洗浄し、ナノセレンゲルを得た。
【００６３】
（３）乳化剤であるＴｗｅｅｎ−８０を、乳化剤の最終含有量が１．５質量％となるように、（２）で得られたナノセレンゲル中に、攪拌しながら添加して、ｐＨ値５．５に調整して、水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールする葉面ブロッキング剤（セレンゾル葉面ブロッキング剤）を得た。該セレンゾル葉面ブロッキング剤におけるセレンの含有量は、１．５質量％であった。
【００６４】
（４）（３）で得たセレンゾル葉面ブロッキング剤サンプルについて粒径分布の分析を行ったところ、結果は、図２に示すように、平均粒子径は１７．３５±１．４ｎｍであった。得られたセレンゾル葉面ブロッキング剤のサンプルについて、ＴＥＭを用いて形態を観測し分析すると、該反応システムによって形成したナノセレンは、図３に示すように、球状粒子であり、そして均一に分散されており、平均粒径は約１５ｎｍであった。
【００６５】
実施例５：セレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤の調製
実施例４で調製したセレンゾル葉面ブロッキング剤を、それぞれ実施例１で調製したｐＨ５．５且つシリカ含有量１５質量％の酸性シリカゾル、ｐＨ４．５且つシリカ含有量１８質量％の酸性シリカゾル、及びｐＨ６．５且つシリカ含有量２０質量％の酸性シリカゾルと混合した。セレンゾル葉面ブロッキング剤とシリカゾルとの体積比は、それぞれ１：１、１：２、及び１：４であった。３０分間攪拌した後、水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールする葉面ブロッキング剤を得た。得られたセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤におけるシリカの含有量は、それぞれ７．５質量％、６質量％及び４質量％であって、セレンとシリカの質量比は、それぞれ１:１０、１:２４及び１:５３であった。調製したシリカの含有量が７．５質量％であるセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤サンプルについて、ＴＥＭを用いて形態を観測し分析したところ、図４に示す、該反応システムで形成したナノセレンは、ナノシリカの球面上にロードされており、粒子径は４５〜５５ｎｍ（図５）であった。
【００６６】
実施例６：水稲懸濁細胞中のカドミウム輸送遺伝子の発現における酸性シリカゾルの正確なコントロール及びカドミウム吸収の抑制
実施例１で調製したｐＨ５．５且つシリカ含有量１５質量％のシリカゾルを用いて、シリカ含有量が０．５質量％となるように希釈して、水稲細胞（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．  Ｊａｐｏｎｉｃａ）を処理し、２４時間後に、異なる濃度のカドミウムを添加し、更に２４時間培養した。その後、水稲懸濁細胞のＲＮＡを抽出して、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析（関係プライマーについて、表１４を参照）を行った。結果に示されるように、ブランク（ＣＫ、シリカゾルを添加せず）と比べると、同じカドミウム濃度の場合、シリカゾル処理後に、水稲細胞中のＯｓＬｓｉ１、ＯｓＮｒａｍｐ５及びＯｓＬＣＴ１遺伝子の発現量は、著しく下がっており（表１、表２、表３）一方、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現量は、明らかに上昇した（表４）。ＯｓＬｓｉ１、ＯｓＮｒａｍｐ５遺伝子によって発現されるタンパク質は、カドミウムの吸収に関連し、ＯｓＬｓｉ１遺伝子によって発現される発現のタンパク質は、カドミウムの篩部から穀粒への輸送に関連することがあり、それらの３つの遺伝子の発現の低下は、水稲におけるカドミウムに対する吸収を低減させ、及びカドミウムが穀粒へ輸送されることを低減するのに有利である。その一方、ＯｓＨＭＡ３遺伝子によって発現されるタンパク質は、カドミウムの液胞への輸送に関係する可能性のある機能を有し、それによりカドミウムの篩部への輸送が低下し、よって、カドミウムの根から地上部への輸送が低下される。セレンゾル葉面ブロッキング剤の使用によって、上記遺伝子が正確にコントロールされるので、カドミウムの蓄積量が著しく下がり、対照群と比べると、１０、２０、４０μＭのＣｄの場合、シリカゾルを使用した処理では、水稲細胞内のカドミウム濃度が、それぞれ７２．８％、７５．５％及び８１．３％（表５）下がった。
【００６７】
表１：シリカゾル処理による水稲懸濁細胞における輸送遺伝子ＯｓＬｓｉ１の発現量に対する影響
【表１】
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【００６８】
表２：シリカゾル処理による水稲懸濁細胞におけるカドミウム輸送遺伝子ＯｓＮｒａｍｐ５の発現量に対する影響
【表２】
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【００６９】
表３：シリカゾル処理による水稲懸濁細胞におけるカドミウム輸送遺伝子ＯｓＬＣＴ１の発現量に対する影響
【表３】
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【００７０】
表４：シリカゾル処理による水稲懸濁細胞におけるカドミウム輸送遺伝子ＯｓＨＭＡ３の発現量に対する影響
【表４】
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【００７１】
表５：シリカゾル処理による水稲細胞におけるカドミウム含有量に対する影響（μｇ／ｋｇ）
【表５】
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【００７２】
実施例７：セレンゾル葉面ブロッキング剤の、水稲懸濁細胞のカドミウム輸送遺伝子の発現に対する正確なコントロールおよびカドミウム吸収に対する抑制
実施例４で調製したセレンゾル葉面ブロッキング剤をそれぞれ異なる濃度（０．０１％、０．０５％、０．１％）に希釈して、水稲懸濁細胞（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．  Ｊａｐｏｎｉｃａ）を２４時間培養した後に、異なる濃度のカドミウム（１０μＭ、２０μＭ及び４０μＭ）を添加し、さらに２４時間培養して、水稲細胞ＲＮＡを抽出して、それに対して逆転写を行って、ＯｓＮｒａｍｐ５とＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現レベル（関係プライマーについて、表１４を参照）を測定した。結果に表明されるように（表６、表７）、ブランク（ＣＫ、セレンゾル葉面ブロッキング剤を添加せず）と比べると、水稲懸濁細胞のＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現量は、倍に増加して、その一方、水稲懸濁細胞のＯｓＮｒａｍｐ５の発現量は、明らかに抑制された。比較的高いカドミウム濃度条件下（４０μＭ）で、０．０５％のセレンゾル葉面ブロッキング剤処理後に、ＯｓＮｒａｍｐ５遺伝子の発現に対する抑制効果が、最もよかった。ＯｓＮｒａｍｐ５遺伝子発現のタンパク質は、カドミウムの吸収に関係する可能性があり、また、ＯｓＨＭＡ３遺伝子によって発現されるタンパク質は、カドミウムの液胞への輸送に関係する可能性のある機能を有し、それによりカドミウムの篩部への輸送が低下し、よって、カドミウムの根から地上部への輸送が低下される。セレンゾル葉面ブロッキング剤の使用によって、上記遺伝子が正確にコントロールされるので、カドミウムの集積量が著しく下げられ、対照群と比べると、１０、２０、４０μＭのＣｄの場合、０.０５％のセレンゾル葉面ブロッキング剤を使用して処理したところ、水稲細胞内のカドミウム濃度は、それぞれ４７．１％、５５．３％及び６１．７％（表８）下がった。
【００７３】
表６：セレンゾル葉面ブロッキング剤の、水稲懸濁細胞のカドミウム輸送タンパク質ＯｓＮｒａｍｐ５の発現量に対する影響
【表６】
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【００７４】
表７：セレンゾル葉面ブロッキング剤の、水稲懸濁細胞のカドミウム輸送タンパク質ＯｓＨＭＡ３の発現量に対する影響
【表７】
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【００７５】
表８：０．０５％のセレンゾル葉面ブロッキング剤の処理による水稲細胞のカドミウム含有量への影響（μｇｋｇ−１）
【表８】
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【００７６】
実施例８：鉢植え条件下における、セレンゾル葉面ブロッキング剤、シリカゾル、及びセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤の、水稲におけるカドミウム輸送遺伝子発現に対する正確なコントロール及びカドミウム吸収に対する抑制
水稲（品種：優優１２８）を木村氏培養液において３週間培養した後に、５μＭのＣｄを含有する栄養液に移して、同時に下記の処理を行った（１）対照群（ＣＫ）：鉢あたりに２００ｍＬの脱イオン水を散布した；（２）葉面へのシリカゾル葉面ブロッキング剤の散布処理：鉢あたり２００ｍＬの希釈後のシリカゾル（実施例１で調製したものであって、ｐＨは５．５であって、シリカ含有量は１５質量％であるシリカゾル、希釈後に０．０５％のケイ素を含有）を散布した；（３）葉面へのセレンゾル葉面ブロッキング剤の散布処理：鉢あたり、２００ｍＬの希釈後のセレンゾル葉面ブロッキング剤（実施例４で調製したものであって、希釈後に０．０５％のセレンを含有）を散布した；（４）葉面へのセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤の散布処理：鉢あたり２００ｍＬの希釈後のセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤（実施例５で調製したものであって、希釈後に０．５％のシリカと、０．０５％のセレンを含有）を散布した。１週間後に、サンプリングして、根部におけるＯｓＬｓｉ１及びＯｓＬｓｉ２の相対発現量（関係プライマーについて、表１４を参照）を測定して、また、茎と葉のカドミウム含有量も測定した。結果に表明されるように、３種の葉面ブロッキング剤の何れも、ＯｓＬｓｉ１及びＯｓＬｓｉ２の相対発現量（表９）を抑制することができ、水稲の茎と葉のカドミウム含有量を低下することができた。対照群と比較して、葉面にシリカゾル、セレンゾル及びセレン複合シリカゾルによる処理後の水稲の地上部のカドミウム集積量は、それぞれ、６３．８％、５１．６％と６６．１％と低下して、セレン複合シリカゾルの水稲の地上部のカドミウム集積量に対する抑制効果が一番よかった（表１０を参照）。
【００７７】
表９：異なる葉面ブロッキング材料の、水稲の根部におけるＯｓＬｓｉ１及びＯｓＬｓｉ２の相対発現量に対する影響
【表９】
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【００７８】
表１０：異なる葉面ブロッキング材料の、水稲の茎と葉中のカドミウム蓄積量に対する影響
【表１０】
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【００７９】
実施例９：フィールド条件下で、セレンゾル葉面ブロッキング剤、シリカゾル、及びセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤による水稲穀粒中のカドミウム蓄積量の低下
試験期間は、２０１４年４月〜１１月の間であって、試験地は、広東省韶関市仁化県董塘鎮紅星村にあるＣｄ汚染稲田であった。該稲田の表層土（０〜３０ｃｍ）を採取し分析したところ、その土のｐＨは約５．８６であって、Ｃｄの含有量は約１．８５ｍｇ/ｋｇであって、Ａｓ含有量は１８．２０ｍｇ／ｋｇであった。試験された水稲の品種は、２０１４年における早生種である「五優６１３」と、晩生種である「五豊優６１５」である。
【００８０】
試験において、下記の４つの処理をそれぞれ設けた：（１）ブランク対照群、（ＣＫ）では、同量の水を散布した；（２）葉面へシリカゾル葉面ブロッキング剤（実施例１で調製したものであり、ｐＨは５．５、シリコンの含有量は１５質量％である）を散布した；（３）葉面へセレンゾル葉面ブロッキング剤（実施例４で調製したもの）を散布した；（４）葉面へセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤（実施例５で調製したもの）を散布した。各処理について、ランダムに配置した３箇所で実施した。合計１２個試験エリアがあり、各エリアの面積は５*６４=３２ｍ２であり、各エリアについて独立灌漑及び排水を確保した。
【００８１】
散布技術：
早生種の水稲において、ぞれぞれ分げつ盛期乃至茎伸長期の間で１回と、出穂期乃至登熟期の間で１回、合わせて２回ブロッキング剤を散布する処理をした。分げつ盛期乃至茎伸長期の間で散布したシリカゾルのシリカ含有量は０．１％であって、セレンゾルのセレン含有量は０．０１％であって、セレン複合シリカゾルのシリカ含有量は０．１％（実施例５で調製した。シリカの含有量は７．５質量％であって、シリカ：セレンの質量比は１０：１であった。）であって、上記出穂期乃至登熟期の間で散布したシリカゾルのシリカ含有量は０．５％であって、セレンゾルのセレン含有量は０．０５％であって、セレン複合シリカゾルのシリカ含有量は０．５％（実施例５で調製した。シリカの含有量は質量７．５％であって、シリカ：セレンの質量比は１０：１であった。）であった。分げつ盛期乃至茎伸長期の間で散布した各ブロッキング材料の量は、１００Ｌ／ムーであり、散布のタイミングは、晴れの天気の午後４時を選択して行い、出穂期乃至登熟期の間で散布した各ブロッキング材料の量は、１５０Ｌ／ムーであり、散布のタイミングは、曇りの日の午後６時を選択して行った。散布の際に、霧化された水滴を１０００μｍ以下にコントロールし、水稲の葉面の両面に均一に散布した。
【００８２】
晩生種の水稲において、出穂期乃至登熟期の間で各１回、散布処理をした。散布したシリカゾルのシリカ含有量は１％であって、セレンゾルのセレン含有量は０．１％であって、セレン複合シリカゾルのシリカ含有量は１％（実施例５で調製した。シリカの含有量は７．５質量％であって、シリカ：セレンの質量比は１０：１であった。）であった。散布した各ブロッキング材料の量は、１２０Ｌ／ムーであり、散布のタイミングは、晴れの天気の午後５時を選択して行った。散布の際、霧化した水滴を１０００μｍ以下にコントロールし、水稲葉面の両面に均一に散布した。
【００８３】
表１１〜１２に示すように、２０１４年の早生水稲と晩生水稲に異なる葉面ブロッキングを散布処理することによって、稲米の生産量は、何れも増加して、その中、早生水稲の増産幅は、晩生水稲より多く、そして、希釈した複合シリカゾルによって処理した早生及び晩生水稲は、ともに明らかに高い増産率を達成し、対照群と比べて、それぞれ７．３２％と４．８５％増産された。
【００８４】
表１１：２０１４年の早生水稲の生産量の統計結果
【表１１】
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【００８５】
表１２：２０１４年の晩生水稲の生産量の統計結果
【表１２】
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【００８６】
表１３に示すように、葉面ブロッキング剤を用いた処理によって、水稲中のカドミウム含有量を著しく下げることができた。対照群と比較して、シリカゾル、セレンゾル、及びセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤による処理後に、２０１４年の早生水稲におけるカドミウム含有量がそれぞれ６４．３、４９．０、及び８５．９％に減少し、晩生水稲におけるカドミウム含有量がそれぞれ３４．２、２８．８、及び４６．４％に減少した。
【００８７】
セレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤による水稲におけるカドミウムの減少に対する効果は、シリカゾル、セレンゾル葉面ブロッキング剤より著しく優れており、また、水稲の成長期に２回葉面ブロッキング剤を散布した場合、一回のみの場合と比べて、水稲におけるカドミウムの減少に対する効果が著しく優れている。２０１４年の早造水稲に対して、分げつ盛期乃至茎伸長期の間、及び出穂期乃至登熟期の間で各１回セレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤を散布することによって、水稲のカドミウム含有量は、対照群における１．５１ｍｇ／ｋｇから０．１６２ｍｇ／ｋｇまで下がり、食品衛生基準を満たした。よって、水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールする葉面ブロッキング技術によって、中軽度汚染の稲田で、水稲を安全に生産することができる。
【００８８】
表１３：異なる葉面ブロッキング材料による水稲におけるカドミウムの蓄積量に対する影響
【表１３】
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【００８９】
表１４：水稲におけるカドミウム、ケイ素及びヒ素の輸送に関連する遺伝子の同定プライマー
【表１４】
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【００９０】
上述の実施例は本発明の好適な実施態様ではあるが、本発明の実施態様は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲における種々の変形、修正、置換、組み合わせ、簡略化は、等価な置換であって、本発明の範囲内に含むものとする。
【００９１】
（付記）
（付記１）
ステップ１）ナノセレンゲルの調製ステップであって、２５〜５０℃の水浴条件下で、セレン含有液にアスコルビン酸溶液を添加し、２〜５時間反応させ、生成物を単離及び精製し、ナノセレンゲルを得ること、
ステップ２）ナノセレンゲルの解膠ステップであって、乳化剤を、ステップ１）で得られた前記ナノセレンゲルに攪拌しながら添加し、ｐＨ４．５〜６．５に調整し、水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールする葉面ブロッキング剤を得ること、
とを含むことを特徴とする水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールする葉面ブロッキング剤の調製方法。
【００９２】
（付記２）
ステップ１）におけるセレン含有液の中のセレン含有化合物は、亜セレン酸、亜セレン酸ナトリウム、及び亜セレン酸カリウムのうち、少なくとも１種を含有する、
ことを特徴とする付記１に記載の水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールする葉面ブロッキング剤の調製方法。
【００９３】
（付記３）
ステップ１）における前記アスコルビン酸溶液に含有されるアスコルビン酸と、前記セレン含有液に含有されるセレンとのモル比は、（１：１）〜（１：３）である、
ことを特徴とする付記１に記載の水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールする葉面ブロッキング剤の調製方法。
【００９４】
（付記４）
ステップ２）における乳化剤の最終的な含有量は、０．０５〜５質量％であって、
ステップ２）で得られる葉面ブロッキング剤におけるセレンの含有量は、０．１５〜２質量％である、
ことを特徴とする付記１に記載の水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールする葉面ブロッキング剤の調製方法。
【００９５】
（付記５）
付記１乃至４のいずれか１つに記載の調製方法によって調製される水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールする葉面ブロッキング剤。
【００９６】
（付記６）
付記５に記載の葉面ブロッキング剤とシリカゾルを含有することを特徴とする水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールするセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤。
【００９７】
（付記７）
前記セレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤におけるシリカの含有量は、３〜１０質量％であり、
前記セレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤におけるセレンとシリカの質量比は（１：１０）〜（１：５５）である、
ことを特徴とする付記６に記載の水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールするセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤。
【００９８】
（付記８）
前記シリカゾルは、酸性シリカゾルであり、
前記酸性シリカゾルのｐＨ値は、４．５〜６．５であり、シリカの質量含有量は１５％〜２０％であり、
前記酸性シリカゾルの調製方法は、
４０〜６０℃の水浴と０．５〜５ｍ/ｓの攪拌条件下で、シリコン金属粉末または金属ケイ酸塩をアルカリ性溶液にゆっくりと添加し、アルカリ性ケイ素含有溶液を得ることと、
得られたアルカリ性ケイ素含有溶液を１〜１０ｍＬ／ｍｉｎのスピードで水素型弱酸性カチオン交換樹脂交換カラムを通し、カラム出口の収集液のｐＨは４．５〜６．５となるように調整し、活性酸性シリカゾルの前駆体を得ることと、
前記活性酸性シリカゾルの前駆体をマイクロ波または水浴で４０〜６０℃に加熱し、そして、当該温度で１０〜３０分間攪拌後に、静止冷却し３０〜６０分間エイジングし、  前記酸性シリカゾルを得ることと、
を含むこと、を特徴とする付記６又は７に記載の水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールするセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤。
【００９９】
（付記９）
付記５に記載の水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールする葉面ブロッキング剤、及び／又は付記６乃至８のいずれか１つに記載の水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールするセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤の、植物の重金属ブロッキング技術分野における応用。
【０１００】
（付記１０）
付記５に記載の葉面ブロッキング剤、付記６乃至８のいずれか１つに記載のセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤またはシリカゾルを水で希釈した後に、水稲の分げつ盛期乃至茎伸長期の間、または出穂期乃至登熟期の間で、水稲の葉面に一回霧化散布する、又は両タイミングに各一回霧化散布し、
散布のタイミングとして、晴れ又は曇りの天気で午後４〜６時の間で選択し行い、
希釈後の前記葉面ブロッキング剤におけるセレンの含有量は、０．０１質量％〜０．１質量％にコントロールし、
希釈後の前記シリカゾル又はセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤におけるシリカの含有量を、０．１質量％〜１質量％にコントロールし、
前記分げつ盛期乃至茎伸長期の間の散布量として、ムーあたり希釈後の前記葉面ブロッキング剤、前記シリカゾル又はセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤８０〜１２０Ｌを散布し、
前記出穂期乃至登熟期の間の散布量として、ムーあたり希釈後の前記葉面ブロッキング剤、前記シリカゾル又はセレン複合シリカゾル葉面ブロッキング剤１００〜１５０Ｌを散布する、ことを特徴とする水稲におけるカドミウムの吸収及び輸送に関連する遺伝子の発現を正確にコントロールする葉面ブロッキング方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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