(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリオウイルスを含む粗細胞培養収穫物からポリオウイルスを精製する方法であって：
ａ）陽イオン洗浄剤を前記粗細胞培養収穫物に加えて混合物を得る工程と；
ｂ）前記工程ａ）で得られた混合物を浄化して上澄みまたはろ液を回収し、ポリオウイルス粒子を有する浄化済み収穫物を得る工程と
を含む方法。
【請求項２】
ポリオウイルスを含む粗細胞培養収穫物からのポリオウイルスの放出を促進する方法であって：
ａ）陽イオン洗浄剤を前記粗細胞培養収穫物に加えて混合物を得る工程と；
ｂ）前記工程ａ）で得られた混合物を浄化して上澄みまたはろ液を回収し、ポリオウイルス粒子を有する浄化済み収穫物を得る工程と
を含む方法。
【請求項３】
ポリオウイルスを含む粗細胞培養収穫物からポリオウイルスを精製する方法であって：
ａ）陽イオン洗浄剤を前記粗細胞培養収穫物に加えて混合物を得る工程と；
ｂ）前記工程ａ）で得られた混合物を浄化して上澄みまたはろ液を回収し、ポリオウイルス粒子を有する浄化済み収穫物を得る工程と；
ｃ）工程ｂ）において得られた前記浄化済み収穫物を捕捉工程にかけて、ポリオウイルス含有懸濁液を得る工程と
を含む方法。
【請求項４】
前記捕捉工程は、陽イオン交換クロマトグラフィ工程である、請求項３に記載の粗細胞培養収穫物からポリオウイルスを精製する方法。
【請求項５】
工程ｃ）において得られた前記ポリオウイルスは、サイズ排除によって前記ポリオウイルス含有懸濁液からさらに分離される、請求項３または４に記載の粗細胞培養収穫物からポリオウイルスを精製する方法。
【請求項６】
前記サイズ排除は、サイズ排除クロマトグラフィによって実行される、請求項５に記載の粗細胞培養収穫物からポリオウイルスを精製する方法。
【請求項７】
ポリオウイルスを含む粗細胞培養収穫物からポリオウイルスを精製する方法であって：
ａ）陽イオン洗浄剤を前記粗細胞培養収穫物に加えて混合物を得る工程と；
ｂ）前記工程ａ）で得られた混合物を浄化して上澄みまたはろ液を回収し、ポリオウイルス粒子を有する浄化済み収穫物を得る工程と；
ｃ）工程ｂ）において得られた前記浄化済み収穫物を陽イオン交換クロマトグラフィ工程にかけて、ポリオウイルス含有懸濁液を得る工程と；
ｄ）サイズ排除クロマトグラフィによって、前記ポリオウイルス含有懸濁液から前記ポリオウイルスをさらに精製分離する工程と
を含む方法。
【請求項８】
前記陽イオン洗浄剤は、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ヘキサデシルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＴＣ）、および臭化ドミフェン（ＤＢ）の群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記陽イオン洗浄剤は、臭化ドミフェン（ＤＢ）である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス生産の分野に関する。より詳細には、本発明は、細胞懸濁液からのポリオウイルス粒子の向上した精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン生産の分野での最近の開発により、大規模製造の必要性が生じた。ポリオ等の感染症に対処するのに十分な量の（組換え）ワクチンで世界を支援するには、ロバストで高い収率のプロセスが必要とされる。
【０００３】
ポリオウイルスは、ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科のエンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）属のメンバーである。ポリオウイルスは、カプシドが単鎖プラスセンスＲＮＡゲノムを取り囲む、小型の非エンベロープウイルスである。３タイプのポリオウイルス：１型、２型および３型が存在する。感受性個体がポリオウイルスに感染すると、麻痺性灰白髄炎が生じるおそれがある。灰白髄炎は、高度に伝染性である。２つの異なるポリオワクチンであるＳａｌｋの不活化ポリオウイルスワクチン（ＩＰＶ）およびＳａｂｉｎの生弱毒化経口ポリオウイルスワクチン（ＯＰＶ）が、長い期間をかけて開発された。両方のワクチンとも安全かつ効果的である。それぞれに特有の利点および不利点があり、両方とも、灰白髄炎の制御において重要な役割を果たしてきた。ポリオウイルスおよびポリオワクチンについての総説に関して、例えばＫｅｗ  ｅｔ  ａｌ，２００５を参照されたい。
【０００４】
ワクチン、特にＩＰＶに用いられ得るバルクポリオウイルス材料を生産する培養精製系が、比較的高いコストの大きい一因となる。
【０００５】
そのため、ワクチンに用いるポリオウイルスを生産する効率的な培養精製系の必要性が、当該技術分野において依然として存在する。特に、高収率のポリオウイルス精製プロセスの必要性が依然として存在する。
【０００６】
典型的なポリオウイルス生産プロセスにおいて、細胞が特定の培地中で増殖し、続いてポリオウイルスが細胞と接触して、ウイルスは前記細胞に感染して増殖することができる。前記細胞中でのポリオウイルスの増殖後、ウイルスまたはその成分は、細胞培養体から収穫される。
【０００７】
１つの好ましい現在用いられているＩＰＶ製造プロセスは、マイクロキャリア上で増殖し、かつ血清補充培地中で培養される、付着依存性のサル由来ＶＥＲＯ細胞を用いるものである。
【０００８】
細胞培地中に生産かつ放出されるウイルスは、従来の方法、例えば深層濾過、遠心分離によって細胞バイオマスから分離され得る。そのような場合、濾過または遠心分離は、収穫工程である。濾過された収穫物は、典型的には限外濾過されて、ウイルス懸濁液が濃縮され、続いてポリオウイルスは、例えばゲル濾過および／またはイオン交換クロマトグラフィを用いて、精製され得る。ポリオウイルスまたはウイルスの成分を収穫かつ精製する方法、およびそこからのワクチンの生産は、当該技術分野において既に数十年間用いられているため、周知であり、例えば、Ｖａｎ  Ｗｅｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ，１９７８；Ｍｏｎｔａｇｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８４；国際公開第２００７／００７３４４号パンフレット、および米国特許第４５２５３４９号明細書（全てが参照によって本明細書中に組み込まれる）において詳しく記載されている。結果として生じた濃縮ウイルス懸濁液は、任意選択的に希釈されてもよく、ＩＰＶを調製するためにその中のポリオウイルスは不活化されることとなり、これには従来の方法が用いられ得る。
【０００９】
現在使用されているポリオウイルス生産プロセスの生産性は、世界規模でのポリオ根絶に必要とされるＩＰＶ生産量を準備するのに十分でない。そのため、世界的な生産能力の限界がある。また、現在用いられている生産プロセスは、その低い生産性のために、単位操作コストが高い。これは、施設の土地専有面積が大きく、それに応じて培地およびバッファの消費が高く、同時に（生物活性）廃棄物の排出も高いためである。ワクチン製造プロセスと関連するコストは別として、産物バッチの制御および放出コストもまた、生産性と比例する。すなわち、高い生産性のバッチは、ワクチン用量あたりのコストをかなり下げる。
【００１０】
ポリオウイルスの生産収率を向上させる一方法が、上流の生産プロセスを向上させることである。生産培養の細胞密度を上げることによって、高収率でのポリオウイルスの生産プロセスが達成された（例えば国際公開第２０１１／０６８２３号パンフレット参照）。しかしながら、これは、ダウンストリームプロセシングにおいて、付加的なチャレンジをもたらすおそれがある。ポリオウイルス精製プロセスを向上させる開発は、より低い密度での培養についても高い密度での培養についても、これまで記載されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、ポリオウイルスの精製プロセスの収率をさらに増大させるための、ダウンストリームプロセスを向上させる必要性が当業界に存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、粗細胞収穫物からのポリオウイルス粒子の向上した精製方法に関し、細胞密度が高い収穫物にも適している。ある例示的な実施形態において、本発明の方法は、例えば、全体的な生産性が、ポリオウイルス１型、２型および３型についてのホルムアルデヒド不活化後、それぞれ１５〜２５；６〜１２および１０〜１６ＩＰＶ用量／ウイルス培養体ｍｌに及び得る。これは、これまで知られている方法よりも実質的に高い容量収率である。実際に、Ｋｒｅｅｆｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）は、従来のＶＥＲＯ細胞プラットホームベースのＩＰＶプロセスの全体的な収率が、ポリオウイルス１〜３型についてそれぞれ４０：８：３２のＤ−抗原ユニット／用量に基づいて、かつ不活化後の全体的なＤ−抗原回収率を４０％と仮定して、０．６４、１．０４および０．３４用量／ウイルス培養体ｍｌとなると推定した。生産性の顕著な増大は、施設の土地専有面積を顕著に引き下げ、それに伴い製造コストを下げることとなる一方で、ＩＰＶ用量の世界的需要を供給するのに必要とされる能力を最大にする。
【００１３】
既知のプロセスを用いる、高い細胞密度の懸濁液のダウンストリームプロセシングは一般的に、多数の工程を必要とするであろう。第１の濾過工程は、細胞全体を取り除くためのコース濾過に続いて、残留細胞残渣を取り除いて材料を沈殿させるための、より小さいサイズの一連のメンブランフィルタからなるであろう。続いて、濃縮工程の後に、２つ以上の選択的クロマトグラフィ工程が、調節要件（ＷＨＯ／ＥＰ）に従う十分に精製されたポリオウイルス懸濁液を得るために必要とされる。
【００１４】
本発明者らは、本明細書中において、細胞培養においてポリオウイルスを増殖させた直後に、ポリオウイルスを含有する得られた粗細胞培養収穫物が、陽イオン洗浄剤、陰イオン洗浄剤、非イオン洗浄剤、および双極性イオン洗浄剤の群から好ましくは選択される洗浄剤で処理されて、収穫物懸濁液中へのポリオウイルスの放出が向上し得ることを見出し、かつこのことを開示した。そうして得られた全体的な精製収率は、前例のないものであった。実際に、ある実施形態において、本発明のプロセスは、これまでに開示されているプロセスを用いて得られた０．３〜１ＩＰＶ用量／細胞懸濁液ｍｌの従来のＶｅｒｏ細胞ベースのプラットホーム収率に対して、６〜２５ＩＰＶ用量／細胞懸濁液ｍｌの収率に達した。
【００１５】
本発明は、粗細胞培養収穫物からポリオウイルスを精製する方法を提供し、前記方法は：ａ）洗浄剤を粗細胞培養収穫物に加える工程と；ｂ）前記ポリオウイルス含有細胞培養収穫物を浄化して、ポリオウイルス粒子を有する浄化済み収穫物を得る工程とを含む。
【００１６】
本発明はまた、粗細胞培養収穫物からのポリオウイルスの放出を促進する方法を提供し、前記方法は：ａ）洗浄剤を粗細胞培養収穫物に加える工程と；ｂ）前記ポリオウイルス含有細胞培養収穫物を浄化して、ポリオウイルス粒子を有する浄化済み収穫物を得る工程とを含む。
【００１７】
浄化工程は、浄化済み収穫物をもたらし、これは、粗細胞培養収穫物と比較して、宿主細胞ＤＮＡおよび細胞残渣が大幅に引き下げられた内容物を含む。
【００１８】
驚くべきことに、浄化後、高度に選択的な陽イオン交換捕捉工程に続く、サイズ分離ベースの仕上げ工程、すなわちサイズ排除クロマトグラフィまたは透析濾過プロセス工程が、浄化済み収穫物からの高いレベルの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物を除去することができた。
【００１９】
したがって、本発明はまた、細胞培養体からポリオウイルスを精製する方法を提供し、前記方法は：ａ）洗浄剤を細胞培養体に加える工程と；ｂ）前記ポリオウイルス含有細胞培養体を浄化して、ポリオウイルス粒子を有する浄化済み収穫物を得る工程と；ｃ）工程ｂ）において得られた浄化済み収穫物を捕捉工程にかけて、ポリオウイルス含有懸濁液を得る工程とを含む。好ましくは前記捕捉工程は、陽イオン交換クロマトグラフィ工程である。
【００２０】
好ましい実施形態において、先の方法の工程ｃ）において得られたポリオウイルスは、サイズ排除によってポリオウイルス含有懸濁液からさらに分離される。好ましくは、前記サイズ排除は、サイズ排除クロマトグラフィによって実行される。
【００２１】
好ましい実施形態において、本発明はまた、細胞培養体からポリオウイルスを精製する方法を提供し、前記方法は：ａ）洗浄剤を細胞培養体に加える工程と；ｂ）前記ポリオウイルス含有細胞培養体を浄化して、ポリオウイルス粒子を有する浄化済み収穫物を得る工程と；ｃ）工程ｂ）において得られた浄化済み収穫物を陽イオン交換クロマトグラフィ工程にかけて、ポリオウイルス含有懸濁液を得る工程と；ｄ）サイズ排除クロマトグラフィによって、ポリオウイルス含有懸濁液からポリオウイルスをさらに精製する工程とを含む。
【００２２】
本発明において用いられる洗浄剤は好ましくは、陽イオン洗浄剤、陰イオン洗浄剤、非イオン洗浄剤、および双極性イオン洗浄剤の群から選択される。さらにより好ましい実施形態において、前記洗浄剤は、陽イオン洗浄剤であり、好ましくは前記陽イオン洗浄剤は、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ヘキサデシルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＴＣ）、および臭化ドミフェン（ＤＢ）の群から選択される。より好ましい実施形態において、前記洗浄剤は、臭化ドミフェン（ＤＢ）である。
【００２３】
さらに別の実施形態において、前記洗浄剤は好ましくは、陰イオン洗浄剤である。好ましくは、前記陰イオン洗浄剤は、タウロデオキシコール酸ナトリウム水和物（ＳＴＨ）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の群から選択される。
【００２４】
さらに別の実施形態において、前記洗浄剤は好ましくは、非イオン洗浄剤である。好ましくは、前記非イオン洗浄剤は、４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）およびデシル−β−Ｄ−１−チオマルトピラノシド（ＤＴＰ）の群から選択される。
【００２５】
別の実施形態において、前記洗浄剤は好ましくは、双極性イオン洗浄剤である。好ましくは、前記双極性イオン洗浄剤は、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネート（ＳＢ３−１４）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）の群から選択される。
【００２６】
本発明はまた、粗細胞培養収穫物からのポリオウイルスの放出を促進するための洗浄剤の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａ−Ｃは、洗浄剤（臭化ドミフェン）による処理の結果としての、ポリオウイルス含有粗細胞培養収穫物からのＤ−抗原の放出。細胞密度が異なり、それぞれが異なるポリオ株（Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１、またはＳａｕｋｅｔｔ）を含有するいくつかの収穫物が、洗浄剤で処理されてから遠心分離された。上澄み中のＤ−抗原濃度が、洗浄剤濃度の関数として開示されている。
【図２】図２Ａ−Ｃは、洗浄剤（臭化ドミフェン）による処理の結果としての、ポリオウイルス含有粗細胞培養収穫物における宿主細胞ＤＮＡの析出。細胞密度が異なり、それぞれが異なるポリオ株（Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１、またはＳａｕｋｅｔｔ）を含有するいくつかの収穫物が、洗浄剤で処理されてから遠心分離された。上澄み中の宿主細胞ＤＮＡ濃度が、洗浄剤濃度の関数として開示されている。
【図３】洗浄剤による処理前後の、上澄み中のＤ−抗原濃度／粗製物中のＤ−抗原濃度の比率。細胞密度が異なり、異なるポリオ株（Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１、またはＳａｕｋｅｔｔ）を含有するいくつかの収穫物について比率が測定された。
【図４】ポリオウイルス精製フローチャート。
【図５】ポリオウイルス株（Ａ）Ｍａｈｏｎｅｙ、（Ｂ）ＭＥＦ−１、（Ｃ）Ｓａｕｋｅｔｔの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる産物特徴描写。１＝マーカー、２＝系適合コントロール、３＝ＣＥＸ溶出液、４＝ＳＥＣ溶出液。
【図６】図６Ａは、様々な陽イオン洗浄剤；それぞれＣＴＡＢ、ＣＰＣ、およびＢＴＣによる処理の結果としての、ポリオウイルス含有粗細胞培養収穫物からのＤ−抗原の放出。図６（Ｂ）は、様々な陽イオン洗浄剤；それぞれＣＴＡＢ、ＣＰＣ、およびＢＴＣによる処理の結果としての、ポリオウイルス含有粗細胞培養収穫物における宿主細胞ＤＮＡの析出。
【図７】図７Ａ−Ｃは、様々なタイプの洗浄剤（陰イオン洗浄剤、双極性イオン洗浄剤、および非イオン洗浄剤）による処理の結果としての、ポリオウイルス含有粗細胞培養収穫物からのＤ−抗原の放出。
【図８】８Ａ−Ｃは、様々なタイプの洗浄剤（陰イオン洗浄剤、双極性イオン洗浄剤、および非イオン洗浄剤）による処理の結果としての、ポリオウイルス含有粗細胞培養収穫物における宿主細胞ＤＮＡの析出。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、ポリオウイルスを含有する粗細胞培養収穫物からポリオウイルス粒子を精製する、向上した方法に関する。本発明において定義される粗細胞培養収穫物は、細胞培養の直後に得られる。これは、洗浄剤で処理される前に、いかなる形態であれ処理も浄化もされなかったために、粗製物と呼ばれる。細胞培養収穫物の上澄みとは対照的に、粗細胞培養収穫物は、ポリオウイルス粒子と共に細胞および細胞残渣を含有する。
【００２９】
例えばＨｅｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．における、先に開示されるポリオウイルス精製プロセスでは、浄化済み収穫物が、本出願に記載される粗細胞培養収穫物とは全く異なって処理される。この差異として、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．における収穫物は、細胞残渣を取り除くために収穫物が遠心分離される浄化工程を既に受けていたということがある。Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎにおいて、陽イオン洗浄剤は、粗細胞培養収穫物に加えられるのではなく、その代わりとして、細胞残渣が先に取り除かれた浄化済み収穫物に加えられる。
【００３０】
本発明のある実施形態において、ポリオウイルス粒子は、高い細胞密度の粗細胞収穫物から精製されるため、これが精製ポリオウイルスの高収率の原因となる。この高い細胞密度の粗細胞培養収穫物は、細胞を高い細胞密度に培養することによって得られる。このような培養は、例えば、バッチモード、流加モード、または潅流モードで実行されてよい。細胞を高い細胞密度に培養する方法が、当業者に知られている。高い細胞密度の培養体を得る具体的な方法が、例えば国際公開第２００４／０９９３９６号パンフレット、国際公開第２００５／０９５５７８号パンフレット、国際公開第２００８／００６４９４号パンフレットに開示されている。
【００３１】
本発明に従えば、高い細胞密度の粗細胞培養収穫物は、約５×１０６〜１５０×１０６細胞／ｍＬ、例えば約８×１０６〜１２０×１０６細胞／ｍＬ、例えば約１２×１０６〜１００×１０６細胞／ｍＬ、例えば約２０×１０６〜８０×１０６細胞／ｍＬ、例えば約１０×１０６〜６０×１０６細胞／ｍＬに相当する。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、前記粗細胞培養収穫物中の細胞密度は、約１０×１０６〜５０×１０６細胞／ｍＬに及び、例えば少なくとも約１５×１０６細胞／ｍＬ、例えば少なくとも約２０×１０６細胞／ｍＬ、例えば少なくとも約２５×１０６／ｍＬ、例えば最大約３０×１０６細胞／ｍＬ、例えば最大約３５×１０６細胞／ｍＬ、例えば最大約４０×１０６細胞／ｍＬ、例えば最大約４５×１０６細胞／ｍＬである。
【００３３】
しかしながら、本発明に従う方法はまた、細胞密度がより低い、例えば約０．５×１０６〜１０×１０６細胞／ｍＬ、例えば約１×１０６〜５×１０６細胞／ｍＬである細胞培養体からの収穫物にも有効である。
【００３４】
典型的には、細胞培養体がポリオウイルス粒子で感染されて、前記ポリオウイルスが細胞中で増殖することができる。これにより、高濃度のポリオウイルスを含有する粗細胞培養収穫物が、単一のバイオリアクタにおいて得られる。細胞培養体に感染させる方法が、当業者に知られている。ウイルス濃度が高い高細胞密度培養体を得る具体的な方法が、例えば国際公開第２０１１／００６８２３号パンフレットに開示されている。この引用文献は、大量の組換えポリオウイルスの生産プロセスを記載している。このプロセスは、高い細胞密度の培養体に、細胞あたりのポリオウイルス生産性が高い保存体（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）が感染する能力に依存する。これにより、ポリオウイルス濃度が高い高細胞密度の粗細胞培養収穫物を単一のバイオリアクタにおいて得る方法が与えられる。例えば１２５０万個／ｍｌの細胞密度で感染し、感染から２２〜２４時間後に収穫される組換え野生型ポリオウイルスの現在のプロセスの典型的な収率は、５．０×１０９〜３．２×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌの範囲である。
【００３５】
ポリオウイルスが細胞培養体中で増殖して、殆どの細胞（溶解物）を殺すと、ポリオウイルス粒子は、本発明に従って、粗細胞培養収穫物から精製される。
【００３６】
現在記載されるポリオウイルス生産プロセスは、細胞から培地中へのポリオウイルスの自己放出に完全に依存しており、これは、ポリオウイルスについて非常に効率的なプロセスである。驚くべきことに、本発明者らは、細胞培養体（放出されたポリオウイルス、細胞残渣、宿主細胞ＤＮＡ、および宿主細胞タンパク質を既に含有する）が、陽イオン洗浄剤、陰イオン洗浄剤、非イオン洗浄剤、および双極性イオン洗浄剤の群から好ましくは選択される洗浄剤で処理されると、有意な収率増大が得られ得ることを見出した。また、この工程は、宿主細胞ＤＮＡおよびタンパク質が強く引き下げられた、かなり澄明な浄化済み収穫物をもたらした。
【００３７】
プロセス中に宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、およびポリオウイルス粒子を定量化するために用いられるアッセイ
残留宿主細胞ＤＮＡは、Ｔａｑｍａｎプローブによる定量リアルタイムＰＣＲを用いるリアルタイム定量ＰＣＲによって判定されてよい。プライマーおよびプローブは、リボソーム１８Ｓ  ＤＮＡについて設計される。サンプルＤＮＡの量は、プロデューサ細胞ＤＮＡから作成される既知の量のＤＮＡ標準曲線との比較によって判定される。標準曲線のＤＮＡストックが、制限酵素ＡｐａＩで消化されて、剪断され、かつ部分的に分解したＤＮＡが模倣される。
【００３８】
サンプルのＤＮＡが、デオキシコール酸およびプロテイナーゼＫによる処理によって単離される。リアルタイムＰＣＲ反応が、Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７５００）を用いて実行される。ＤＮＡ量は、サンプルの二重反復測定値に由来する。
【００３９】
残留宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の濃度は、ＨＣＰに特異的な、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆ５３０）において判定された。濃度は、キット中に含まれる標準曲線サンプルを参照して判定された。アッセイの範囲は、２５〜２００ｎｇ／ｍｌである。
【００４０】
ポリオワクチンは、生ウイルスまたは不活化ウイルスに基づく。これらは、重要な防御抗原であるポリオウイルスＤ−抗原を含有する。ウイルス収率は、標準的なウイルス滴定技術によって測定されてよいが、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１、およびＳａｕｋｅｔｔポリオウイルス株について、力価としてのＤ−抗原濃度の判定は、Ｄ−抗原酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって実行されてよい。アッセイは、Ｄ抗原の、血清型特異的抗体への結合に基づき、これらの混合物にペルオキシダーゼ試薬が加えられる。その後、ペルオキシダーゼ活性が光学密度によって定量される。Ｄ−抗原濃度は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒａｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ＆ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ（ＥＤＱＭ）の国際ＩＰＶ基準を参照して判定される。Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。アッセイ範囲は、Ｍａｈｏｎｅｙについて４０〜１６０ＤＵ／ｍｌ、ＭＥＦ−１について８〜３２ＤＵ／ｍｌ、およびＳａｕｋｅｔｔについて３２〜１２８ＤＵ／ｍｌである。
【００４１】
免疫原性は、例えば、動物におけるインビボ試験によって判定されてよい。力価は、Ｄ−抗原ＥＬＩＳＡを用いて、かつ先に免疫化されたラット由来の血清でのポリオウイルス中和細胞培養アッセイによって判定されてよい。
【００４２】
Ｄ−抗原の増大した放出および宿主細胞ＤＮＡの選択的析出
本発明者らは、ポリオウイルス含有粗細胞培養収穫物への洗浄剤の添加が、収穫物の液相中のＤ−抗原濃度のかなりの増大をもたらすことを見出した。同時にそれは、宿主細胞ＤＮＡを析出させる。本明細書中に例示されるように、この析出工程は、液相中への粗細胞収穫物からのＤ−抗原の放出の約１００％の増大をもたらし、浄化の後、およそ少なくとも５ｌｏｇ１０の宿主細胞ＤＮＡの減少をもたらした。
【００４３】
そのため、本発明は、粗細胞培養収穫物からポリオウイルス粒子を精製するのに適した方法を提供し、また、細胞密度が高い培養物からの収穫にも適している。本発明を実行するのに有用であり得る洗浄剤として、限定されないが、陽イオン洗浄剤、陰イオン洗浄剤、非イオン洗浄剤、および双極性イオン洗浄剤が挙げられる。
【００４４】
好ましい実施形態において、本発明を実行するのに有用であり得る洗浄剤は、アミンコポリマー、四級アンモニウム化合物、例えば臭化ドミフェン（ＤＢ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ヘキサデシルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）、および塩化ベンゼトニウム（ＢＴＣ）、ならびにそれらの各々のあらゆる混合物が挙げられるがこれらに限定されない陽イオン洗浄剤である。より詳細には、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の多くの形態が、過剰陰イオン電荷（ＤＮＡ不純物）の中和に非常に有効であることが示された。本発明に用いられる適切な陽イオン洗浄剤として、以下のクラスおよび例の市販の製品が挙げられるが、それらに限定されない：モノアルキルトリメチルアンモニウム塩（市販の製品の例として、セチルトリメチルアンモニウムクロリドまたは（ＣＴＡＢとして）ブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドまたはクロリド（ＴＴＡ）、アルキルトリメチルアンモニウムクロリド、アルキルアリールトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミドまたはクロリド、ドデシルジメチル−２−フェノキシエチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルアミン：塩化物塩または臭化物塩、ドデシルアミンまたは塩化物塩、およびセチルジメチルエチルアンモニウムブロミドまたはクロリドが挙げられる）、モノアルキルジメチルベンジルアンモニウム塩（例として、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリドおよび（ＢＴＣとして）塩化ベンゼトニウムが挙げられる）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩（市販の製品として、臭化ドミフェン（ＤＢ）、ハロゲン化ジデシルジメチルアンモニウム、およびオクチルドデシルジメチルアンモニウムクロリドまたはブロミドが挙げられる）、複素環式芳香族アンモニウム塩（市販の製品として、ハロゲン化セチルピリジウム（ＣＰＣまたは臭化塩およびヘキサデシルピリジニウムブロミドまたはクロリドが挙げられる）、シス異性体１−［３−クロロアリル］−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマンタン、アルキル−イソキノリニウムブロミド、およびアルキルジメチルナフチル−メチルアンモニウムクロリド（ＢＴＣ  １１１０）、多置換四級アンモニウム塩（市販の製品として、限定されないが、アルキルジメチルベンジルアンモニウムサッカリネートおよびアルキルジメチルエチルベンジルアンモニウムシクロヘキシルスルファメートが挙げられる）、ビス四級アンモニウム塩（製品例として、１，１０−ビス（２−メチル−４−アミノキノリニウムクロリド）−デカン、１，６−ビス｛１−メチル−３−（２，２，６−トリメチルシクロヘキシル）−プロピルジメチルアンモニウムクロリド］ヘキサンまたは塩化トリクロビソニウム、およびＢｕｃｋｍａｎ  ＢｒｏｃｈｕｒｅｓによってＣＤＱと呼ばれるｂｉｓ−ｑｕａｔ）、ならびにポリマー四級アンモニウム塩（ポリイオネン、例えばポリ［オキシエチレン（ジメチルイミニオ）エチレン（ジメチルイミニオ）−エチレンジクロリド］、ポリ［Ｎ−３−ジメチルアンモニオ）プロピル］Ｎ−［３−エチレンオキシエチレンジメチルアンモニオ）プロピル］ウレアジクロリド、およびアルファ−４−［１−トリス（２−��ドロキシエチル）アンモニウムクロリド）。
【００４５】
当業者は、これらが陽イオン洗浄剤の例であり、また、本発明の開示に基づいて、本発明において適切であろうことが明らかであることを理解するであろう。
【００４６】
さらにより好ましい実施形態において、臭化ドミフェン（ＤＢ）等のジアルキルジメチルアンモニウム塩が本発明において用いられる。考えられ得る多数の陽イオン洗浄剤が、本発明を実行するのに用いられてよいが、臭化ドミフェンが、主にそのＧＭＰグレードの原料としての利用可能性、およびヒトが用いることが意図される他の製品での現在の使用によって特に注目される。より詳細には、臭化ドミフェンが、口腔衛生製品および局所用抗生物質クリーム中で活性成分として大量に用いられるため、この分子は、ｃＧＭＰ条件下で大量に生産されて放出される。
【００４７】
別の好ましい実施形態において、本発明を実行するのに有用であり得る洗浄剤は、アルキルスルホネート、例えばタウロデオキシコール酸ナトリウム水和物（ＳＴＨ）、１−オクタンスルホン酸ナトリウム塩、１−デカンスルホン酸ナトリウム、１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム、およびヘキサンスルホン酸ナトリウム；ならびにアルキルサルフェート、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム、およびオクチル硫酸ナトリウム；ならびにそれらの各々のあらゆる混合物が挙げられるがこれらに限定されない陰イオン洗浄剤である。
【００４８】
さらに別の好ましい実施形態において、本発明を実行するのに有用であり得る洗浄剤は、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネート（ＳＢ３−１４）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−（［３−コラミドプロピル］ジメチルアンモニオ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホネート分子内塩（ＳＢ３−８）、３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル（３−パルミトイルアミノプロピル）アンモニオ］−プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデシルアンモニオ）プロパンスルホネート（ＳＢ３−１８）、アミドスルホベタイン−１４；３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル（３−ミリストイルアミノプロピル）アンモニオ］プロパンスルホネート（ＡＳＢ−１４）、およびＮ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド（ＤＤＡＯ）；ならびにそれらの各々のあらゆる混合物が挙げられるがこれらに限定されない双極性イオン洗浄剤である。別の好ましい実施形態において、本発明を実行するのに有用であり得る洗浄剤は、ポリ（オキシエチレン）エーテル、例えば４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）５８）、ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）、（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、ポリエチレングリコールドデシルエーテル（Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標））；グリコシド洗浄剤、例えばデシル−β−Ｄ−１−チオマルトピラノシド（ＤＴＰ）、６−シクロヘキシルヘキシルβ−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−６）、デシル−β−Ｄ−１−チオグルコピラノシド、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）、オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧＰ）、オクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシド）；胆汁酸、例えばＮ，Ｎ−ビス［３−（Ｄ−グルコナミド）プロピル］デオキシコラミド（Ｄｅｏｘｙ−ＢｉｇＣＨＡＰ）；ならびにそれらの各々のあらゆる混合物が挙げられるがこれらに限定されない非イオン洗浄剤である。
【００４９】
細胞密度が１０×１０６〜１５０×１０６細胞／ｍＬに及ぶポリオウイルス含有高細胞密度懸濁液を処理する洗浄剤の適切な濃度は、約１ｍＭ〜１２ｍＭに及ぶ。細胞密度が１０×１０６〜５０×１０６細胞／ｍＬに及ぶポリオウイルス含有高細胞密度懸濁液を処理するＤＢの適切な濃度は、約１ｍＭ〜４ｍＭに及ぶ。細胞密度が１０×１０６〜３０×１０６細胞／ｍＬに及ぶポリオウイルス含有高細胞密度懸濁収穫物を処理するＤＢの適切な濃度は、約１〜３ｍＭに及ぶ。
【００５０】
本明細書中に開示される洗浄剤の考えられ得る代替物を試験して、細胞からのポリオウイルスの放出を効果的に増大させる化合物を同定することは、当業者の範囲内であろう一方で、これはさらに、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ヘキサデシルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＴＣ）、および臭化ドミフェン（ＤＢ）について本明細書中で例示されるように、ポリオウイルス粒子から核酸分子および他の細胞残渣を析出させ得、同時に、ポリオウイルス粒子から核酸分子および他の細胞残渣を効果的に析出させる。
【００５１】
したがって、本発明は部分的に、高い細胞密度の懸濁液からポリオウイルス粒子を精製するのと同時に、ウイルス回収率を高める方法に関する。前記方法は、洗浄剤を粗細胞培養収穫物に加えることによって、ポリオウイルス粒子の放出を促進すると同時に、ポリオウイルス粒子から宿主細胞核酸分子を選択的に析出させる。
【００５２】
浄化法
洗浄剤で処理された粗細胞培養収穫物は続いて、全細胞、析出した宿主細胞ＤＮＡ、細胞残渣、および他の不純物を取り除くように浄化される。前記浄化は、深層濾過によって実行されてよい。遠心分離もまた、仕上げ（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）深層濾過の有無に拘らず、実行可能である。したがって、洗浄剤処理済み収穫物の浄化は、遠心分離のみを用いて、または深層濾過等の仕上げ浄化工程と同時に遠心分離を用いて達成され得る。
【００５３】
フィルタまたはフィルタスキームを選択する際に、上流で変化または変動が生じる場合にロバストな性能を確実にすることが好ましい。良好な浄化性能と工程の収率とのバランスの維持は、内部媒体が様々である種々のフィルタタイプを試験することによって、調査され得る。適切なフィルタが、セルロースフィルタ、再生セルロース繊維、無機フィルタ助剤（例えば珪藻土、パーライト、ヒュームドシリカ）と組み合わされたセルロース繊維、無機助剤および有機樹脂と組み合わされたセルロース繊維、またはそれらのあらゆる組合せ、ならびにポリマーフィルタ（例として、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホンが挙げられるが、これらに限定されない）を利用して、有効な除去および許容可能なウイルス回収率を達成することができる。一般に、多段階プロセスが好ましいが、必須ではない。例示的な２段階プロセスまたは３段階プロセスは、大きい析出物および細胞破片を取り除くための粗フィルタに続いて、名目上の孔サイズが０．２μｍよりも大きいが１μｍよりも小さい第２の仕上げステージフィルタからなるであろう。最適な組合せは、析出物のサイズ分布および他の変数に応じることとなる。また、比較的隙間のないフィルタまたは遠心分離を利用する一段階操作もまた、品質の良い産物をもたらし得る。より一般的には、デッドエンド濾過、微量濾過、遠心分離、またはデッドエンドもしくは深層濾過と組み合わされたフィルタ助剤（例えば珪藻土）のボディフィードが挙げられるあらゆる浄化アプローチが、以降の工程において膜および／または樹脂を汚染しないように適切な透明度の濾液を提供し、本発明内で実行するのに許容可能となろう。深層濾過が、本発明にとってロバストな主たる浄化法を示す。
【００５４】
本発明に従う別の好ましい実施形態において、一列に並ぶ陰イオン交換膜が、浄化フィルタトレイン中に一体化されてよく、残留ＤＮＡまたは負に帯電する不純物、例えば宿主細胞タンパク質のレベルが、生理的条件下で、ポリオウイルスが失われることなく更に取り除かれる。孔が大きい（＞３μｍ）これらの高容量膜は、残留ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、および／または外来ウイルスのような負に帯電する汚染物質を効果的に取り除くことが、例えばモノクローナル抗体生産分野において周知である。適切な膜は、とりわけ、正に帯電したリガンド、典型的には四級アンモニウムが、例えば架橋セルロースマトリックスにすり砕かれた強陰イオン交換膜である。驚くべきことに、ウイルスは典型的に、生理的条件（ｐＨ７〜８、導電率１５〜１８ｍＳ／ｃｍ）下でこれらの膜に結合するにも拘らず、ポリオウイルスは、正味の等電点が幾分高いと、これらの膜中を流れ、これにより、負に帯電する不純物の除去に適した選択がなされることが見出された。ある実施形態において、クロマトグラフィビーズベース樹脂が用いられてよいが、対流が大きいという利点のため、膜が好ましい選択である。
【００５５】
洗浄剤処理および浄化工程の組合せは、少なくとも４ｌｏｇ１０の、好ましくは少なくとも５ｌｏｇ１０の、さらにより好ましくは少なくとも５．５ｌｏｇ１０の宿主細胞ＤＮＡの引下げをもたらす。完全なフィルタセットアップにかかる全圧力ビルドアップは０．８バー未満のままであった。このことは当業者に、フィルタタイプが適切に選択されてサイズ設定されたことを示す。
【００５６】
好ましい実施形態において、陰イオン交換膜が、浄化フィルタトレイン中に一体化されてよく、現在知られている全てのポリオウイルス製造プロセスに存在する専用の陰イオン交換工程の必要が除外される。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態において、収穫されたウイルス粒子は、以下を（以降の順に）含む多段階浄化プロセスフローによって処理される；帯電フィルタユニット（例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ  ＤＯＨＣフィルタ）、二重膜フィルタ０．８μｍ／０．４５μｍ（例えばＳａｒｔｏｐｏｒｅ  ２）、強陰イオン交換吸着膜（例えばＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｅｐ  Ｑ）、および孔サイズが比較的小さい滅菌膜濾過（例えば０．２２μｍフィルタユニット）を介した深層濾過。
【００５８】
更なる精製工程
浄化の後、浄化済みウイルス粒子懸濁液の濃縮が、本発明に従う方法における更なる工程として考えられてもよいが、決して必須ではない。ウイルス粒子懸濁液の濃縮が、限外濾過によって実行されてよい。懸濁液は、５〜２０倍に濃縮されてよい（および場合により、本明細書中で以下に言及されるようにヌクレアーゼで処理されてよい）。選択される特定の限外濾過膜は、ウイルス粒子を保持する程十分に小さいが、不純物を効果的に取り除く程十分に大きいサイズとなるであろう。メーカーおよび膜型に応じて、１０〜１０００ｋＤａの名目上の分子量カットオフが適切であり得る。分子サイズカットオフの選択は、収率と不純物クリアランスとのトレードオフによって決定される。タンジェンシャルフローモードを用いる限外濾過が好ましい。前記モードにおいて、工程は、固定されたクロスフローを保留物への背圧の有無に拘らずセットすることによって、固定された膜貫通圧をセットすることによって、またはクロスフローおよび透過流束の両方を固定することによって制御され得る。
【００５９】
プロセスのこの段階に含まれてよいが、決して必須ではない別のプロセス工程が、透析濾過を介したバッファ交換プロセス工程の以降の導入である。限外濾過ユニットを用いる透析濾過またはバッファ交換が、塩、糖等の除去および交換に用いられる。当業者は、どのような条件下でバッファ交換が起こるはずであるか、およびいずれのバッファが工程に適切であるかを知っている。
【００６０】
ヌクレアーゼ処理が、プロセスのこの段階にてプロセスに含められることが考えられてもよいが、決して必須ではない。ヌクレアーゼ処理は、広い範囲のヌクレアーゼ、例えばＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（商標）、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、またはそのあらゆる組合せの使用を含んでよい。ＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅの両方の活性を備えるヌクレアーゼまたはカクテルが、多くの場合用いられる。ヌクレアーゼ処理工程が、プロセス中のいかなる点で意図されてもよいが、最終産物中の残留ヌクレアーゼ含有量が用途に対して許容可能である限りにおいてである。ヌクレアーゼ処理は、浄化単独の後に、または浄化濃縮工程の後に、かつ更なる精製工程、例えば捕捉もしくは仕上げ工程の前に起こってよい。
【００６１】
不純物の引下げに用いられ得る付加的な単位操作として、例えば、プロセスに決して必須ではないが、クロマトグラフィユニットがあり得る。樹脂、膜吸着体およびモノリス等の様々なフォーマットのクロマトグラフィ媒体からなるクロマトグラフィユニットが用いられてよい。クロマトグラフィ単位操作は、陽性モードで運転されても陰性モードで運転されてもよい（以下で説明される）。本発明のある実施形態において、クロマトグラフィユニットにフィードされるウイルス粒子懸濁液は、あるフィード条件、例えば溶液のｐＨおよび／またはイオン強度に調整されてよい。前記工程中に、残存する不純物、例えば宿主細胞核酸および宿主細胞タンパク質からウイルス粒子を分離することによって、ウイルス粒子はさらに精製される。前記工程中のウイルス粒子の精製は、例えば、親和性クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、混合モードクロマトグラフィ、および／もしくはハイドロキシアパタイトクロマトグラフィを、独立したプロセス工程として、またはいくつかのプロセス工程と組み合わせて用いることによって、達成され得る。
【００６２】
本発明のある実施形態において、クロマトグラフィ単位操作が用いられる場合、ウイルス粒子は、ウイルス粒子懸濁液中に残存する不純物から分離されることによって、精製され得る。ウイルス粒子は、ウイルス粒子をある条件でクロマトグラフィ媒体に結合させる一方で、殆どとまではいかないが一部の不純物がクロマトグラフィ媒体に結合しないことによって、分離され得る。別の方法で、ウイルス粒子は、殆どとまではいかないが一部の不純物をクロマトグラフィ媒体に結合させ、殆どのウイルス粒子をクロマトグラフィ媒体に結合させないままにすることによって、分離され得る。先に言及された操作モードは、陽性結合モードおよび陰性結合モードとしてそれぞれ、当該技術分野において知られている。
【００６３】
いかなる結合相互作用もないあるクロマトグラフィ単位操作を、用いられるクロマトグラフィ媒体に応じて運転することも可能である。例示的なクロマトグラフィ媒体として、決して限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィ媒体（例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ）があり得る。当業者は、不純物からウイルス粒子を分離するのに必要とされる条件をどのように決定すべきかを知っている。先の高度に精製されたポリオウイルス溶液を達成するための異なる単位操作の連続的使用の例が、文献、例えばＢａｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１およびＴｈｏｍａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３に記載されている。
【００６４】
本発明のある実施形態において、クロマトグラフィ単位操作は、捕捉工程として用いられてよく、これは本質的に、濃縮工程および精製工程の組合せである。これにより、先に記載される独立した濃縮工程（例えば限外濾過工程）の必要が除外される。様々なフォーマットのクロマトグラフィ媒体が捕捉工程に用いられてよい。クロマトグラフィ媒体フォーマットの例として、ａ．ｏ．樹脂、膜吸着体およびモノリスがある。当業者は、特定のプロセス工程に用いられるべき最適なクロマトグラフィ媒体フォーマットを容易に決定することができる。
【００６５】
本発明のある実施形態において、クロマトグラフィ単位操作が捕捉工程として用いられる場合、ウイルス粒子は、ウイルス粒子懸濁液中に残存する不純物から分離されることによって精製され得る。ウイルス粒子は、ウイルス粒子をある条件でクロマトグラフィ媒体に結合させる一方で、殆どとまではいかないが一部の不純物がクロマトグラフィ媒体に結合しないことによって、分離され得る。
【００６６】
本発明のある実施形態において、クロマトグラフィ単位操作が捕捉工程として用いられる場合、フィード材料とも呼ばれるウイルス粒子懸濁液が、不純物からの最適な分離のためのある条件に調整される必要がある。調整されるべきフィード材料の例示的な条件が、例えば、ウイルス粒子懸濁液のｐＨおよびイオン強度である。ウイルス粒子は、以降の溶出工程によってさらに精製されてよく、この工程は、例えばクロマトグラフィ媒体の液相のｐＨおよび／またはイオン強度を変えることによって達成され得る。
【００６７】
本発明の特定の実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィ媒体が、捕捉工程として用いられる。フィード材料の条件は、所望のｐＨに達するような酸または塩基（例えばクエン酸、ＮａＯＨ）の添加によって、および所望のイオン強度に達するような塩溶液または脱イオン水（例えば、ＮａＣｌまたはＭｉｌｌｉＱ）の添加によって調整されてよい。指針として、および当然ながら限定としてではなく、ｐＨは潜在的に約４．５〜７．０に及んでよく、イオン強度は潜在的に約１０ｍＳ／ｃｍ〜２５ｍＳ／ｃｍに及んでよい。フィード材料調整後の追加の浄化工程（例えば、０．４５μｍまたは０．２２μｍの濾過）が、以下のクロマトグラフィ工程への負荷を引き下げるために、プロセスに含められることが考えられてよいが、決して必須ではない。当業者は、どのような溶液および濾過ユニットを、特定のプロセス工程に用いるべきか、容易に決定することができる。
【００６８】
本発明の特定の実施形態において、クロマトグラフィ単位操作が捕捉工程として用いられる場合、およびウイルス粒子が分離用の強陽イオン交換クロマトグラフィ媒体に選択的に結合する場合、更なるウイルス粒子精製が、単位操作内の液相の条件を変えることによるウイルス粒子の以降の選択的溶出によって達成される。指針として、および当然ながら限定としてではなく、ウイルス粒子の溶出は、液相のｐＨを酸性のｐＨ価から塩基性のｐＨ価（例えば、ｐＨ４〜１０の範囲）に変えることによって達成され得る。指針として、および当然ながら限定としてではなく、ウイルス粒子の溶出はまた、液相のイオン強度をより低いイオン強度からより高いイオン強度（例えば、１０ｍＳ／ｃｍ〜３５ｍＳ／ｃｍの範囲）に変えることによって達成され得る。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態において、フィード材料とも呼ばれるポリオウイルス粒子懸濁液が、４．４〜５．６に及ぶ酸性ｐＨに、１４ｍＳ／ｃｍ〜２２ｍＳ／ｃｍに及ぶイオン強度に調整される。続いて、調整されたフィード材料は、ウイルスが膜に選択的に結合する陽イオン交換クロマトグラフィ膜吸着体（例えばＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ）にロードされる。ウイルス粒子はさらに、溶出バッファのイオン強度を２５ｍＳ／ｃｍ〜４０ｍＳ／ｃｍの範囲に増大させる一方で、ｐＨ範囲を４．４〜５．６で一定に維持することによって、以下の溶出工程において不純物から精製される。溶出されたウイルス粒子懸濁液は続いて、バイオバーデンおよび沈殿剤を引き下げるために、例えば０．２２μｍ濾過ユニットで濾過されてよい。
【００７０】
本発明に従えば、ある産物純度を達成するのに必須であれば、「仕上げ」工程と呼ばれる付加的な精製工程が、プロセスに組み込まれてよい。「仕上げ」工程は、精製プロセスフロー全体において決して必須ではないが、精製プロセスフロー全体においてロバスト性を達成する好ましいプロセス工程である。
【００７１】
前記工程の間、微量の不純物、例えば、限定されないが、宿主細胞核酸（例えばＤＮＡ）および宿主細胞タンパク質をウイルス粒子懸濁液から取り除くことが所望される。「仕上げ」工程は、当然ながら限定されないが、独立したプロセス工程として、またはいくつかのプロセス工程と組み合わされて用いられる、親和性クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、混合モードクロマトグラフィ、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ、および／または限外濾過によって達成され得る。前記工程の間、ウイルス懸濁液のバッファ交換がプロセスフローに含められることが考えられてよいが、決して必須ではない。
【００７２】
本発明のある実施形態において、クロマトグラフィ単位操作が仕上げ工程として用いられる場合、様々なフォーマットのクロマトグラフィ媒体、例えば樹脂、膜吸着体、およびモノリスが用いられてよい。クロマトグラフィ単位操作は、陽性モードで運転されても陰性モードで運転されてもよい。本発明のある実施形態において、仕上げ工程にフィードされるウイルス粒子懸濁液は、特定のフィード条件、例えば溶液の特定のｐＨおよび／またはイオン強度に調整されてよい。ウイルス粒子は、以降の溶出工程によって精製されてよく、この工程は、例えばクロマトグラフィ媒体の液相のｐＨおよび／またはイオン強度を変えることによって達成され得る。
【００７３】
本発明の特定の実施形態において、ウイルス粒子精製はまた、ウイルス粒子と不純物とのサイズ差異を利用して達成され得る。例示的なプロセス工程として、サイズ排除クロマトグラフィおよび／または限外濾過があり得る。
【００７４】
本発明の特定の実施形態において、仕上げ工程は、ウイルス粒子の精製に加えて、バッファ交換工程として用いられてよい。例示的なプロセス工程は、決して限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィおよび／または透析濾過であってよい。
【００７５】
本発明の特定の実施形態において、限外濾過工程／透析濾過工程が組み込まれる場合、残留不純物（例えば、宿主細胞タンパク質、宿主細胞核酸）の除去、およびバッファの、所望のバッファ（例えば調合バッファ）への交換が達成され得る。タンジェンシャルフロー限外濾過が、残留タンパク質および核酸を取り除くのに、かつウイルス粒子を調合バッファ中に交換するのに有用である。選択された限外濾過膜は、ウイルス粒子を保持するのに十分に小さいが、しかし不純物を効果的に一掃するのに十分に大きいサイズを有することとなる。メーカーおよび膜型に応じて、１００〜１０００ｋＤａの名目上の分子量カットオフが適切であり得る。
【００７６】
本発明の好ましい実施形態において、ウイルス粒子は、サイズ排除クロマトグラフィ（例えばセファロース（商標）６ＦＦ）によって残留不純物から分離され得ると同時に、バッファは、調合バッファに交換される。ウイルス粒子純度およびバッファ交換品質の所望のレベルが、サイズ排除クロマトグラフィユニットのいくつかの変数を変更することによって達成され得る。当業者は、必要とされる純度およびプロセス性能仕様を達成するのに最適な操作条件を決定することができる。
【００７７】
本発明に従って細胞培養体から精製ポリオウイルスを得る特に好ましい方法が、以下の工程を含む：ａ）洗浄剤を細胞培養に加える工程；ｂ）前記ポリオウイルス含有細胞培養体を浄化して、ポリオウイルス粒子を有する浄化済み収穫物を得る工程；ｃ）工程ｂ）において得られた浄化済み収穫物を、陽イオン交換クロマトグラフィ工程にかけて、ポリオウイルス含有懸濁液を得る工程；およびｄ）サイズ排除クロマトグラフィによってポリオウイルス含有懸濁液からポリオウイルスをさらに精製する工程。
【００７８】
滅菌濾過工程が、バイオバーデンを引き下げるために、プロセスの終わりに含まれてよいが、この工程は決して必須ではない。製品は、０．２２μｍ修飾ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｐａｋ）で濾過されてよい。
【００７９】
細胞培養系およびダウンストリームプロセシング系のスケール
本発明のプロセスは、スケーラブルである。本発明が用いられ得る細胞培養は、小規模培養（例えば１〜１０リットルのラン）から中規模培養（例えば２０〜１０００Ｌのラン）、および商業的な大規模調製（例えば１０００〜５００００Ｌの生産ラン）に及ぶ。深層濾過等の初期のプロセス工程は、培養容量に比例するが、陽イオン交換クロマトグラフィまたは代わりの捕捉工程および以降の工程は、ポリオウイルス粒子量に比例する。したがって、後者の工程のバッチサイズは、少なくとも５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌの、かつ最大約１×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌのバイオリアクタ生産性推定値に基づくこととなる。これらの高いポリオウイルス収率は、例えば、高い細胞密度の培養体を感染させることによって得られ得る（例えば国際公開第２０１１／００６８２３号パンフレットに記載されている）。高い濃度のポリオウイルス粒子を含有するこの高い密度の細胞懸濁液の更なる精製は、本発明によって可能となる。大量の細胞残渣および宿主細胞不純物を含有するこの懸濁液を処理することができることで、懸濁液の容量あたりで大量のポリオウイルス粒子の精製が可能となる。細胞密度が高く、高濃度のポリオウイルス粒子を含有する細胞培養体バッチを処理することにより、処理済み容量あたりの非常に高いウイルス収率が可能となる方法を提供することが、本発明の利点である。本方法は、大規模細胞培養に適用可能であるが、細胞を小規模で、しかしより高い細胞密度に培養することができ、なおも効率的にさらに処理され得る高いポリオウイルス収率に至らせることとなる。本方法は、高度に濃縮されたポリオウイルスバッチを処理することを可能にし、これは、ポリオウイルス精製産業全体に大きい影響を与えるであろう。
【００８０】
ポリオウイルスおよびプロデューサ細胞
ポリオワクチンは、一価（１タイプ（１型、２型、または３型）のポリオウイルスを含有する）であってもよく、二価（２タイプ（例えば１型および２型、１型および３型、または２型および３型）のポリオウイルスを含有する）であってもよく、三価（３タイプのポリオウイルス、すなわち１型、２型および３型を含有する）であってもよい。
【００８１】
野生型ポリオウイルスからＩＰＶを生産することができる。これ以外にも、ＩＰＶは、非病原性の生ポリオウイルスから、例えばＳａｂｉｎ株から生産されてよく、これにより、ＩＰＶ製造から野生型ポリオウイルスを再導入するリスク（例えば国際公開第２００７／００７３４４号パンフレット、およびＤｏｉ  ｅｔ  ａｌ，２００１参照）がさらに引き下げられるであろう。本発明は、野生型ポリオウイルス（１型、２型および３型、例えば１型のＭａｈｏｎｅｙ株、２型のＭＥＦ−１株、または３型のＳａｕｋｅｔｔ株）の、および非病原型のポリオウイルス（例えばＳａｂｉｎ株）の精製に適している。ＩＰＶを生産するために適用される、本発明に従うプロセスは、ＩＰＶが後発発展途上国に入手可能となり得る程度にまで、コストを低減するように機能し得る。一般にＯＰＶは、従来の方法に従って調製される場合、ＩＰＶよりも安価であるが、本発明の高度に効率的なプロセスは、ＯＰＶ用のバルク材料のコストをさらに引き下げることができ、そのためにＯＰＶのコストも同様に引き下げることができる。
【００８２】
一般に、ポリオウイルス株はそれぞれ、別々のバッチで培養され、例えば３タイプのポリオウイルスを含有する三価ワクチンが調製されるのであれば、（ＩＰＶについて不活化された）ウイルスは、個々の投薬量が調製されるように混合かつ調合される。例えばある実施形態において、用量（例えば０．５ｍｌ）あたりの最終ワクチンが、例えば、対照調製物との比較によって判定されて、４０Ｄ−抗原ユニット（ＤＵ）の１型ポリオウイルス、８ＤＵの２型ポリオウイルス、および３２ＤＵの３型ポリオウイルスで構成されてよい。
【００８３】
本発明に従う方法は、様々な細胞型からの細胞培養収穫物に適用され得る。本発明の方法に用いられ得る細胞の一タイプが、ＰＥＲ．Ｃ６細胞である。この細胞は、不死化細胞であり、また、当該技術分野において継代細胞系統としても知られているため、寿命が無限であるという潜在性を有する（例えばＢａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ，２００９参照）。ＰＥＲ．Ｃ６細胞とは、本出願の目的で、１９９６年２月２９日にＥＣＡＣＣ  ｎｏ．９６０２２４０として寄託された細胞を意味するものとする。この定義は、この寄託された細胞の上流もしくは下流の継代由来の、または上流もしくは下流の継代の後代由来の細胞を含むこととなることが、当業者に明らかであろう。ＰＥＲ．Ｃ６細胞は、米国特許第５９９４１２８号明細書に、および（Ｆａｌｌａｕｘ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）に記載されている。この細胞は、細胞ベースのポリオウイルスワクチンを生産するためのポリオウイルス生産に非常に適している。なぜなら、例えば国際公開第２０１１／００６８２３号パンフレットに記載されるように、高い効率で感染され得、かつウイルスを増殖させ得るからである。この細胞はまた、無血清懸濁培養においてポリオウイルスを高いレベルで生産するのに非常に適していることが本明細書中で実証される。
【００８４】
他の細胞型がポリオウイルスを増殖させるのに用いられてもよいため、本発明の方法は、他の細胞型を含むポリオウイルス含有粗細胞収穫物を処理するのにも適用可能である。本明細書中で例示されるように、Ｖｅｒｏ細胞およびＭＲＣ−５細胞からの収穫物が、本発明の方法で処理された。
【００８５】
不活化ポリオワクチンの大規模製造のために、ポリオウイルスは通常、サル由来の付着性Ｖｅｒｏ細胞上で増殖させられる。Ｖｅｒｏ細胞は、マイクロキャリア上で培養され、不活化ポリオワクチンおよび生弱毒化ポリオワクチンが挙げられるワクチンの生産に広く用いられ、これまでのところ、ウイルスワクチンの製造に関する規制当局によって最も広く受け入れられている継代細胞系統であり、ワクチン生産へのこの細胞の使用が、当分野の当業者によって増すと予想される（Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。不活化ポリオウイルスワクチン用のＶｅｒｏ細胞の大規模マイクロキャリア培養が、Ｍｏｎｔａｇｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８２  ａｎｄ  １９８４によって記載された。Ｖｅｒｏ細胞を用いたポリオワクチンの大規模生産用プロセス、および結果として生じるワクチンが、米国特許第４５２５３４９号明細書にも記載されている。
【００８６】
高い力価のポリオウイルス（Ｓａｂｉｎ１型）産物（ほぼ２×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）が、無血清培地において生じるウイルス生産相の前に、血清含有培地中のマイクロキャリア上で培養されたＶｅｒｏ細胞中で得られた（Ｍｅｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）。血清を用いる不利点を鑑みて、著者らは、完全に無血清のプロセスが所望されることを示唆した。無血清条件下で、著者らは６．３×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌのポリオウイルス生産力価を得ることができた。本発明の方法によって得られる、ＰＥＲ．Ｃ６細胞上でのポリオウイルス生産力価は、５．０×１０９〜３．２×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌに及んでいた（感染時の細胞密度は１２５０万個／ｍｌ）。
【００８７】
一般にワクチン生産、特にＩＰＶ生産に通常用いられる従来の代わりの細胞プラットホームが、Ｊ．Ｂ．Ｊａｃｏｂｓ，１９６６によって始められたヒト胎児肺線維芽細胞（ＭＲＣ−５細胞）である。宿主細胞系統の比較研究（Ｖｌｅｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）により、付着性のＭＲＣ−５細胞系統およびＶＥＲＯ細胞系統は、広範な宿主細胞パネルの中で最も高いプロデューサであり、ウイルスワクチン生産に適した候補とされることが示された。フラスコ表面付着培養体を用いて、達成されたウイルス力価は、ＭＲＣ−５細胞培養体およびＶｅｒｏ細胞培養体についてそれぞれ（０．７〜２．６）×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌおよび（１．４〜５．８）×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【００８８】
本発明の精製法は、ポリオウイルス増殖に適用可能なあらゆる細胞型において増殖するポリオウイルスに適している。すなわち、本発明の方法は、ポリオウイルスを増殖させるのに用いられる細胞型から独立している。
【００８９】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明される。実施例は、本発明を決して限定せず、単に本発明を明らかにする役割を果たすのみである。
【実施例】
【００９０】
実施例１：陽イオン洗浄剤の添加によるポリオウイルス含有粗細胞培養収穫物からのポリオウイルス精製収率の増大
ＰＥＲ．Ｃ６細胞系統由来の細胞を、潅流モードで運転する１０Ｌバイオリアクタ中の無血清培地において増殖させて、およそ５０×１０６個の生存細胞／ｍｌ（ｖｃ／ｍｌ）の細胞密度にした。ポリオウイルス１型（Ｍａｈｏｎｅｙ）、２型（ＭＥＦ−１）、または３型（Ｓａｕｋｅｔｔ）による感染の前に、フレッシュな培地で培養体を１２．５×１０６〜５０×１０６ｖｃ／ｍＬの範囲の生存細胞密度に希釈した。バッチ感染プロセスを、１０Ｌバイオリアクタにおいて３５℃にて、感染多重度１で行なった。感染から２０〜２４時間後の収穫時に、５０ｍｌのサンプルを採ってから、４ｍＬの１１アリコートに分配した。
【００９１】
ポリオウイルス含有細胞培養収穫物に及ぼす洗浄剤の影響を判定するために、臭化ドミフェン（ＤＢ）による滴定実験を実行した。不連続量のＤＢストック溶液をサンプルアリコートに標的ＤＢ濃度（０〜４ｍＭ）で加えた。サンプルを混合し、３５℃で１時間インキュベートした。続いて、サンプルを３０００ｇにて５分間遠心分離して、析出ＤＮＡをスピンダウンさせた。上澄みサンプルを、Ｄ−抗原ＥＬＩＳＡによってウイルス量について、およびＱ−ＰＣＲを用いて宿主細胞ＤＮＡについて分析した。
【００９２】
図１（Ａ、ＢおよびＣ）は、洗浄剤（ＤＢ）による処理の結果としての、ポリオウイルス含有細胞培養収穫物からのＤ−抗原の放出を示している。細胞密度が異なり、それぞれが異なるポリオ株（Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１、またはＳａｕｋｅｔｔ）を含有するいくつかの収穫物を、洗浄剤で処理してから遠心分離した。上澄み中のＤ−抗原濃度を、洗浄剤の添加による希釈について補正して、洗浄剤濃度の関数として与える。図１は、洗浄剤（ＤＢ）の添加後に、ウイルス力価は、洗浄剤（ＤＢ）の添加前と比較して、実質的に増大していることを示している。各株について、および各生存細胞密度について、同じパターンを観察することができる。すなわち、洗浄剤（ＤＢ）の濃度を増大させるにつれ、液相中への粗細胞収穫物からのウイルスの放出が増大する。
【００９３】
図２（Ａ、ＢおよびＣ）は、洗浄剤（臭化ドミフェン）による処理の結果としての、ポリオウイルス含有粗細胞培養収穫物における宿主細胞ＤＮＡの析出を示している。ｙ軸上の濃度は、洗浄剤希釈因子について補正したものである。各株について、および各生存細胞密度について、宿主細胞ＤＮＡが、粗細胞培養収穫物から析出している。図２は、１．３ｍＭを超える洗浄剤（ＤＢ）濃度について、有効なＤＮＡクリアランスがアリコート中で起こったことを明らかに示している。
【００９４】
また、最小のＤＢ濃度を、個々の曲線から判定することもできる（図１および図２）。これは、プラトーレベルのＤ−抗原が得られ、同時に最大ＤＮＡクリアランスが得られるものである。この最小量の洗浄剤は、細胞密度と共に増大して、培地中の細胞量の高まりおよび可溶性宿主細胞ＤＮＡの増大に対処する。
【００９５】
洗浄剤が増大してもポリオウイルスが沈殿しなかったため、当業者であれば、この結果を、細胞密度がはるかに高い、例えば約７０×１０６細胞／ｍＬ、例えば約９０×１０６細胞／ｍＬ、例えば最大約１２０×１０６細胞／ｍＬ、例えば最大約１５０×１０６細胞／ｍＬのポリオウイルス含有細胞懸濁液に当てはめるであろう。当業者であれば、そのような高い細胞密度の粗細胞培養収穫物からポリオウイルスを、本発明の方法によって精製することができると結論するであろう。
【００９６】
実施例２：ＶＥＲＯおよびＭＲＣ５の粗細胞培養収穫物からのポリオウイルスの放出に及ぼす洗浄剤処理の効力
付着性ＶＥＲＯ細胞培養体由来の粗ポリオウイルス収穫物の処理
Ｖｅｒｏ細胞をＴ−１７５フラスコ内で前培養して、ＶＥＲＯスピナー培地（ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋６ｍＭグルタミン＋４．６ｇ／Ｌグルコース）中３０×１０３細胞／ｃｍ２にて１ＬスピナーフラスコＣｙｔｏｄｅｘ３に、および５ｇ／ＬマイクロキャリアＣｙｔｏｄｅｘ３に接種するようにスケールアップした。細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートして、最初の２４時間は６０ｒｐｍにて、および以降は一日中９０ｒｐｍにて撹拌した。（マイクロキャリア上への）播種後３日目に、細胞を、予め温めたＰＢＳで洗浄して、培地交換を感染培地（ＭＥＭ＋４ｍＭグルタミン）で実行した。補充した細胞培養体を、１×１０６細胞／ｍＬにて播種した２０ｍｌ細胞培養体を含有する５０ｍｌ  ｔｕｂｅｓｐｉｎ上に分配した。ＭＯＩが１である３ウイルス株（Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１、Ｓａｕｋｅｔｔ）のそれぞれについて、ｔｕｂｅｓｐｉｎを感染させた。感染を３５℃、１７０ｒｐｍ、５％ＣＯ２で実行し、感染の７２時間後にウイルスを収穫した。マイクロキャリア上で増殖したポリオウイルス含有粗ＶＥＲＯ細胞収穫物に及ぼす洗浄剤の影響を判定するために、ＤＢストック溶液を、１．６ｍＭの最終濃度になるように収穫物に加えた。この実験のために、ＤＢストック溶液（１．０５ｗ／ｖ％、４０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いた。サンプルを混合し、３５℃で１時間インキュベートした。続いて、サンプルを３０００ｇにて５分間遠心分離して、析出ＤＮＡをスピンダウンさせた。上澄みサンプルを、Ｄ−抗原ＥＬＩＳＡによってウイルス量について、およびＱ−ＰＣＲを用いて宿主細胞ＤＮＡについて分析した。
【００９７】
付着性ＭＲＣ５細胞培養体由来の粗ポリオウイルス収穫物の処理
ＭＲＣ−５細胞を、ＢＭＥ＋１０％ＦＢ（ｎＨＩ）＋４ｍＭグルタミン中で培養し、Ｔ７５フラスコ内で、３７℃および１０％ＣＯ２でインキュベートした。３〜４日毎に、培養体がおよそ８０〜９０％のコンフルエントとなった場合に、ＭＲＣ−５培養体をＴ−１７５フラスコ中に通して広げた。細胞が約８０〜９０％の密度に達したときに（４日目）、細胞をＰＢＳで洗浄して、培地交換をＢＭＥ＋４ｍＭグルタミンで実行した。ＭＯＩが１である３ウイルス株（Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１、Ｓａｕｋｅｔｔ）のそれぞれについて、Ｔ−１７５フラスコを感染させた。フラスコあたりの総容量は２５ｍｌであった。感染を３５℃、１０％ＣＯ２で実行し、感染の７２時間後にウイルスを収穫した。ポリオウイルス含有粗ＭＲＣ５付着性細胞収穫物に及ぼす洗浄剤の影響を判定するために、ＤＢストック溶液を、０．６ｍＭの最終濃度になるように収穫物に加えた。サンプルを混合し、３５℃で１時間インキュベートした。続いて、サンプルを３０００ｇにて５分間遠心分離して、析出ＤＮＡをスピンダウンさせた。上澄みサンプルを、Ｄ−抗原ＥＬＩＳＡによってウイルス量について、およびＱ−ＰＣＲを用いて宿主細胞ＤＮＡについて分析した。
【００９８】
【表１】
0006385559.tif 000002
【００９９】
表１は、ＤＢ処理直後のＤ−抗原の濃度を示し、ＤＢ濃度は、ＶＥＲＯ細胞ポリオウイルス収穫物について１．６ｍＭ、およびＭＲＣ−５細胞ポリオウイルス収穫物について０．６ｍＭである。表中のＤ−抗原濃度は、洗浄剤添加によって生じる希釈について補正されている。
【０１００】
結果は、洗浄剤（ＤＢ）の添加により、付加的なウイルスが、ＶＥＲＯおよびＭＲＣ５の細胞培養収穫物の液相中に放出された一方で、ＤＮＡがウイルスから離れて析出していることを示す。実際に、１．６ｍＭ  ＤＢでのＤＮＡクリアランスは、ＶＥＲＯ細胞培養体において２ｌｏｇ１０を超えた。０．６ｍＭ  ＤＢでのＤＮＡクリアランスは、ＭＲＣ５細胞培養体において３ｌｏｇ１０を超えた（データ示さず）。このことは、本発明が、ポリオウイルス生産に用いられる種々の細胞型に適用可能であることを実証している。
【０１０１】
実施例３：細胞浄化前のバイオリアクタにおけるポリオウイルスの放出およびＤＮＡクリアランスに及ぼす洗浄剤処理の影響
ＰＥＲ．Ｃ６細胞を、潅流モードで運転する１０Ｌガラスバイオリアクタ中の無血清培地において増殖させて、およそ５０×１０６ｖｃ／ｍｌの細胞密度にした。ポリオウイルス１型（Ｍａｈｏｎｅｙ）、２型（ＭＥＦ−１）、または３型（Ｓａｕｋｅｔｔ）による感染の前に、フレッシュな培地で培養体を１２．５×１０６ｖｃ／ｍＬの生存細胞密度に希釈した。バッチ感染プロセスを、１０Ｌバイオリアクタにおいて３５℃にて、感染多重度１で行なった。感染から２０〜２４時間後の収穫時に、２．２ｍＭ  ＤＢの最終ＤＢ濃度に達するまで、臭化ドミフェン（ＤＢ）ストック溶液を、撹拌しながら３０分で加えた。洗浄剤の添加後、バイオリアクタを、常に撹拌しながら、３５℃で１時間インキュベートしたままにした。
【０１０２】
（ＤＢ処理なしおよびＤＢ処理後の）粗細胞収穫物のサンプルを遠心分離（３０００ｇ、５分）して、細胞を沈殿させた。粗サンプル（ＤＢ処理前に遠心分離されなかったため、細胞を含有する）および上澄みサンプルを、ポリオウイルスおよび宿主細胞ＤＮＡ定量化について、それぞれＤ−抗原ＥＬＩＳＡおよびＱ−ＰＣＲを用いて分析した。
【０１０３】
図３中に表される結果は、（全３株についての）全てのランにおいて、洗浄剤処理により、粗ポリオウイルス収穫物からの液相中へのＤ−抗原の放出が２倍増大したことを示している。また、ＤＮＡは、ＤＢによる処理によって効果的に析出した。全てのランにおいて、粗収穫物に関するＤＮＡクリアランスは、洗浄剤処理前の２ｌｏｇに対して、洗浄剤処理後に５ｌｏｇを超えた（データ示さず）。このことは、本発明がバイオリアクタ規模でも用いられ得ることを実証している。
【０１０４】
洗浄剤の添加は、例えば米国特許第７３２６５５５号明細書および国際公開第２０１１／０４５３７８号パンフレットに開示されるように、アデノウイルス精製プロセスの分野において宿主細胞ＤＮＡを取り除くために以前に用いられていた。しかしながら、選択的なＤＮＡの析出は、ポリオウイルス精製の分野において、これまで開示されていなかった。ポリオウイルスとアデノウイルスは、非常に異なるウイルスである。実際に、ポリオウイルスは、タンパク質カプシドで封入される単鎖ＲＮＡゲノムで構成され、ウイルス粒子は、直径約３０ナノメートルである。対照的に、アデノウイルスは、最も大きい非エンベロープウイルスを代表し、直径が約９０〜１００ｎｍである。アデノウイルスのタンパク質カプシドは、二本鎖ＤＮＡらせんを含有し、および宿主細胞への付着の一助となる繊維またはスパイクが独自に存在しており、これらはポリオウイルスに存在しない。アデノウイルスの等電点はおよそｐＨ５．５であり、これは、ウイルスが生理的条件下で負に帯電することを意味する。ポリオウイルスの等電点についての総説は、その値が、アデノウイルスのｐＨ５．８〜７．５よりも高いことを示唆している（Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）。サイズおよび電荷が、クロマトグラフィおよび析出プロセスにおける重要な決定因子であるため、洗浄剤による処理が、アデノウイルス含有粗細胞培養収穫物に及ぼす効果と類似した効果を、ポリオウイルス含有粗細胞培養収穫物に及ぼすであろうことは予測され得なかった。
【０１０５】
より重要なことに、粗細胞培養収穫物からの、収穫物の液相中へのポリオウイルス粒子の放出に及ぼす洗浄剤処理の予想外の効果は、アデノウイルスの精製法において観察されなかった。そのため、この驚くべき効果は、以前に用いられていたウイルス精製法に基づいて予見され得なかった。
【０１０６】
実施例４：洗浄剤処理を伴う、および洗浄剤処理を伴わないポリオウイルス精製プロセス、ならびにＤ−抗原回収率およびＤＮＡクリアランスに及ぼす影響
ＰＥＲ．Ｃ６細胞を、潅流モードで運転する１０Ｌバイオリアクタ中の無血清培地において増殖させて、およそ５０×１０６ｖｃ／ｍｌの細胞密度にした。ポリオウイルス血清１型（Ｍａｈｏｎｅｙ）または３型（Ｓａｕｋｅｔｔ）による感染の前に、フレッシュな培地で培養体をそれぞれ１１×１０６ｖｃ／ｍｌおよび９．５×１０６ｖｃ／ｍｌの生存細胞密度に希釈した。バッチ感染プロセスを、１０Ｌバイオリアクタにおいて３５℃にて、感染多重度１で行なった。感染から２２時間後の収穫時に、２つの１．５Ｌバルクサンプルをバイオリアクタから採って、２Ｌボトルに移した。一方のボトルは直接濾過を実行し、他方は洗浄剤（ＤＢ）で処理してから濾過にかけた。
【０１０７】
ＤＢ処理を、２Ｌボトル内で室温にて実行した。ＤＢストック溶液を、２．１ｍＭの最終ＤＢ濃度に達するように、ピペットを介して３０等分に、撹拌しながら３０分で加えた。洗浄剤の添加後、ボトルを、混合しながら２時間インキュベートしたままにした。未処理の粗収穫物またはＤＢ処理済み収穫物を、一連のフィルタ、すなわち正に帯電した、気孔サイズ分布が４〜８／０．６〜１．５μｍである深層フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｓｔａｋ＋ＨＣ  ＰＯＤ  Ｄ０ＨＣ）に続く、０．８／０．４５μｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ  ２）および０．２２μｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｉｌｌｉｐａｋ）の縮小サイズの２つの連続ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルタに通すことによって、細胞浄化を実行した。濾過の間に、最初に受けた濾液を破棄してから、フィードボトルが空になるまで、濾液を製品ボトル内に収集した。ウイルスの回収は、収集した濾液への、１系容量のＰＢＳの添加によって完了した。浄化済み収穫物を、ウイルス量、宿主細胞ＤＮＡ、およびＨＣＰについて、それぞれＤ−抗原ＥＬＩＳＡ、Ｑ−ＰＣＲ、および宿主細胞特異的タンパク質ＥＬＩＳＡを用いて分析した。収穫プロセスの性能に及ぼすＤＢ処理の影響を、表２に表す。回収率を、収穫時に、粗収穫物からとったブロスサンプル全体について算出する。
【０１０８】
先の実施例と一致して、洗浄剤（臭化ドミフェン）による処理後のＤ−抗原回収率は、臭化ドミフェンなしのプロセスと比較して、有意に増大した。結果として、プロセスの容量生産性は、有意に増大した。実際に、浄化済み収穫物中のＤ−抗原の濃度は、洗浄剤（ＤＢ）処理後に２倍になった。
【０１０９】
さらに、洗浄剤処理工程によるＨＣ−ＤＮＡのクリアランスを観察した。これは、先の実施例に記載される結果に従った。表２に従えば、ポリオウイルスを含有する粗細胞収穫物の、洗浄剤（ＤＢ）による処理は、ＤＮＡを１０００倍一掃する一助となった。さらに、洗浄剤を用いて宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が部分的に取り除かれたことが示される。
【０１１０】
【表２】
0006385559.tif 000003
【０１１１】
実施例５：薬物製造不活化ポリオウイルスワクチン（ＩＰＶ）プロセスの一部としてのＤＢ処理
本実施例は、２０Ｌ規模での粗細胞培養収穫物からの野生型ポリオウイルス血清型（Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１、およびＳａｕｋｅｔｔ）の精製を示す。関連するダウンストリームプロセス工程を図３に表す。
【０１１２】
ＰＥＲ．Ｃ６細胞を、潅流モードで運転する１０Ｌバイオリアクタ中の無血清培地において増殖させて、およそ５０×１０６ｖｃ／ｍｌの細胞密度にした。ポリオウイルス血清１型（Ｍａｈｏｎｅｙ）、２型（ＭＥＦ−１）、または３型（Ｓａｕｋｅｔｔ）による感染の前に、培養体を３つのバイオリアクタに分割して、フレッシュな培地で１２×１０６ｖｃ／ｍｌ、１１×１０６ｖｃ／ｍｌ、および１３×１０６ｖｃ／ｍｌの生存細胞密度にそれぞれ希釈した。バッチ感染プロセスを、１０Ｌバイオリアクタにおいて３５℃にて、感染多重度１で行なった。
【０１１３】
感染から２３時間後の収穫時に、２．２ｍＭ  ＤＢの最終ＤＢ濃度になるまで、ＤＢストック溶液を３０分間にわたってバイオリアクタに加えた。洗浄剤の添加後、ＤＢ処理する収穫物を６０分間混合した。続いて、ＤＢ処理済み収穫物を、一連のフィルタ、すなわち、並列する２つの８〜４／１．５〜０．６μｍ  Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ  ＤＯＨＣ  ＰＯＤフィルタに続く、０．８／０．４５μｍ  Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ  ２フィルタ、Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｅｐ  Ｑフィルタ、最後に０．２２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐａｋフィルタに通すことによって、浄化を実行した。
【０１１４】
２つの濾過の浄化済み収穫物をプールして、ｐＨ５．０に酸性化して、導電率１１ｍＳ／ｃｍに希釈して、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ  ０．８／０．４５μｍフィルタで濾過してから、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ膜にローディングした。ＰＢＳを用いる溶出工程によって、ウイルスを膜から回収した。最終工程において、陽イオン交換（ＣＥＸ）ウイルス画分を、分画範囲が１０〜４０００ｋＤａであるＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦサイズ排除クロマトグラフィ樹脂を充填したカラム上にロードした。無勾配溶出中に、残留ＨＣＰをウイルス画分プールから分離し、また、ポリオウイルスのマトリックスを、ＮａＣｌを含有するリン酸バッファに完全に交換した。
【０１１５】
精製後、精製済みウイルス溶液を、予めセットした吸光度単位（ＯＤ２６０ｎｍ）にＳＥＣ溶出バッファでさらに希釈してから、Ｍ１９９およびグリシン（最終濃度５ｇ／Ｌ）を加えて、流体を０．２２μｍ細孔サイズフィルタで濾過してから、ホルムアルデヒドで不活化した。
【０１１６】
世界保健機構（ＷＨＯ）および欧州薬局方（ＥＰ）の要件に従って、０．０２５％ホルマリンを用いて、３７℃で１３日間（間に０．２２μｍ濾過があった）不活化を実行した。
【０１１７】
先に記載のプロセスでは、主な産物中間体、粗収穫物、浄化済み収穫物、ＳＥＣ溶出液、および不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）を、ウイルス量、宿主細胞ＤＮＡ、および総タンパク質（ＴＰ）について、それぞれＤ−抗原ＥＬＩＳＡ、Ｑ−ＰＣＲ、およびＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて分析した。
【０１１８】
結果および考察
表３は、血清型あたりの精製済みポリオウイルスの品質属性および収率を要約している。残留した具体的なタンパク質およびＤＮＡの濃度は、調節要件（ＷＨＯ／ＥＰ）を満たす。また、吸光度比ＯＤ２６０／ＯＤ２８０は、高度に精製されたウイルスを示すものである（Ｗｅｓｔｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。最後に、異なる血清型のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、ポリオウイルスの表面タンパク質に相当する４つのタンパク質主要バンドを示している（図５）。そのため、本明細書中に記載される精製プロセスは、血清型の表面特性および収穫時のウイルス力価の差異に拘りなく、３つ全ての血清型の精製について、ロバストである。
【０１１９】
【表３】
0006385559.tif 000004
【０１２０】
宿主細胞不純物、ＤＮＡ、およびＨＣＰのクリアランス、ならびに様々な生産ステージについての工程収率に基づいて、プロセスの性能を評価する。結果を表４に表す。
【０１２１】
【表４】
0006385559.tif 000005
【０１２２】
３つ全ての血清型について、浄化工程後の残留ＨＣ−ＤＮＡレベルは、定量化の限界値未満である。表５は、等価用量／細胞培養ｍｌで表したポリオウイルスの全体的な生産性を示している。この計算は、ポリオウイルス１〜３型について、４０：８：３２の比率のＤ−抗原ユニット／用量に基づく。不活化後の最終の生産性の比較により、このプロセスは、１〜３型のそれぞれについて、０．６４、１．０４、および０．３４用量／ウイルス培養体ｍｌを与える現在の世界的なＩＰＶ製造ＶＥＲＯ細胞プロセスプラットホームを上回ることを示す（Ｋｒｅｅｆｔｅｎｂｅｒｇ，２００７）。そのため、高い細胞密度の収穫物に由来するフィードの高い初期不純物レベルにも拘らず、高い分離度および高い回収率のプロセスが開発されて、ＩＰＶワクチン製造の不可欠な部分としての、一価の不活化ポリオウイルスのバルク生産について、非常に優れた高い生産性がもたらされたと結論することができる。
【０１２３】
【表５】
0006385559.tif 000006
【０１２４】
実施例６：様々な陽イオン洗浄剤の添加による粗細胞培養収穫物からのポリオウイルス精製収率の増大
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を、潅流モードで運転する１０Ｌバイオリアクタ中の無血清培地において増殖させて、およそ５０×１０６ｖｃ／ｍｌの細胞密度にした。ポリオウイルス２型（ＭＥＦ−１）による感染の前に、フレッシュな培地で培養体を約１２．５×１０６ｖｃ／ｍＬの生存細胞密度に希釈した。バッチ感染プロセスを、１０Ｌバイオリアクタにおいて３５℃にて、感染多重度１で行なった。感染から２０〜２４時間後の収穫時に、１２０ｍｌのサンプルを採ってから、５ｍＬの１８アリコートに分配した。
【０１２５】
ポリオウイルス含有粗細胞収穫物に及ぼす洗浄剤の影響を判定するために、いくつかの陽イオン洗浄剤；ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ヘキサデシルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）、および塩化ベンゼトニウム（ＢＴＣ）による滴定実験を実行した。固定量のＣＴＡＢ、ＣＰＣ、およびＢＴＣストック溶液（それぞれ６９、７０、５６ｍＭ、全て４０ｍＭ  ＮａＣｌを含む）を収穫アリコートに標的洗浄剤濃度（０〜４ｍＭ）で加えた。サンプルを徹底的に混合して、３５℃で１時間インキュベートした。続いて、サンプルを３０００ｇにて５分間遠心分離して、析出ＤＮＡをスピンダウンさせた。上澄みサンプルを、Ｄ−抗原ＥＬＩＳＡによってウイルス量について、およびＱ−ＰＣＲを用いて宿主細胞ＤＮＡについて分析した。
【０１２６】
図６（Ａ）は、様々な陽イオン洗浄剤；それぞれＣＴＡＢ、ＣＰＣ、およびＢＴＣによる処理の結果としての、ポリオウイルス含有粗細胞培養収穫物からのＤ−抗原の放出を示している。上澄み中のＤ−抗原濃度を、洗浄剤添加の希釈について補正して、洗浄剤濃度の関数として開示する。図６（Ａ）は、洗浄剤（ＣＴＡＢ、ＣＰＣ、およびＢＴＣ）の添加後、ウイルス力価が、洗浄剤（ＣＴＡＢ、ＣＰＣ、およびＢＴＣ）の添加前と比較して、実質的に増大したことを開示している。各陽イオン洗浄剤について、同じパターンを観察することができる。すなわち、洗浄剤（ＣＴＡＢ、ＣＰＣ、およびＢＴＣ）の濃度を増大させるにつれ、液相中への粗細胞収穫物からのウイルスの放出が増大する。
【０１２７】
図６（Ｂ）は、洗浄剤（ＣＴＡＢ、ＣＰＣ、およびＢＴＣ）による処理の結果としての、ポリオウイルス含有粗細胞培養収穫物における宿主細胞ＤＮＡの析出を示している。ｙ軸上の濃度は、洗浄剤希釈因子について補正したものである。各陽イオン洗浄剤について、同じパターンを観察することができる。すなわち、宿主細胞ＤＮＡは、粗細胞培養収穫物から析出する。図６（Ｂ）は、有効なＤＮＡクリアランスが、０．５ｍＭを上回る洗浄剤（ＣＴＡＢ、ＣＰＣ、またはＢＴＣ）濃度について、アリコート中で起こったことを明らかに示している。
【０１２８】
洗浄剤を増大させてもポリオウイルスが沈殿しなかったため、当業者であれば、この結果を、さらに高い細胞密度、例えば約７０×１０６細胞／ｍＬ、例えば約９０×１０６細胞／ｍＬ、例えば最大約１２０×１０６細胞／ｍＬ、例えば最大約１５０×１０６細胞／ｍＬのポリオウイルス含有細胞懸濁液に当てはめるであろう。当業者であれば、そのような高い細胞密度の粗細胞培養収穫物からポリオウイルスを、本発明の方法によって精製することができると結論するであろう。
【０１２９】
実施例７：様々なタイプの洗浄剤（陰イオン、双極性イオン、および非イオン）の添加による粗細胞培養収穫物からのポリオウイルス精製収率の増大
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を、潅流モードで運転する１０Ｌバイオリアクタ中の無血清培地において増殖させて、およそ５０×１０６ｖｃ／ｍｌの細胞密度にした。ポリオウイルス２型（ＭＥＦ−１）による感染の前に、フレッシュな培地で培養体を約１２．５×１０６ｖｃ／ｍＬの生存細胞密度に希釈した。バッチ感染プロセスを、１０Ｌバイオリアクタにおいて３５℃にて、感染多重度１で行なった。感染から２０〜２４時間後の収穫時に、２４０ｍｌのサンプルを採ってから、５ｍＬの４２アリコートに分配した。
【０１３０】
ポリオウイルス含有粗細胞収穫物に及ぼす洗浄剤の影響を判定するために、いくつかの異なるタイプの洗浄剤による滴定実験を実行した。陰イオン洗浄剤（タウロデオキシコール酸ナトリウム水和物（ＳＴＨ）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））、双極性イオン洗浄剤（３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネート（ＳＢ３−１４）および３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ））、ならびに非イオン洗浄剤（４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）およびデシル−β−Ｄ−１−チオマルトピラノシド（ＤＴＰ））を、それらの洗浄剤クラスについての例示的な洗浄剤として用いた。固定量の洗浄剤ストック溶液を収穫アリコートに標的洗浄剤濃度で加えた。陰イオン洗浄剤（ＳＴＨおよびＳＤＳ）、双極性イオン洗浄剤（ＳＢ３−１４およびＣＨＡＰＳ）、および非イオン洗浄剤（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００およびＤＴＰ）の標的洗浄剤濃度は、０〜４ｍＭであった。全ての洗浄剤のタイプ（陰イオン、双極性イオン、非イオン）のサンプルを徹底的に混合して、３５℃で１時間インキュベートした。続いて、サンプルを３０００ｇにて５分間遠心分離して、析出ＤＮＡをスピンダウンさせた。上澄みサンプルを、Ｄ−抗原ＥＬＩＳＡによってウイルス量について、およびＱ−ＰＣＲを用いて宿主細胞ＤＮＡについて分析した。
【０１３１】
図７（Ａ、Ｂ、およびＣ）は、様々なタイプの洗浄剤；それぞれ陰イオン洗浄剤（ＳＴＨおよびＳＤＳ）、双極性イオン洗浄剤（ＳＢ３−１４およびＣＨＡＰＳ）、および非イオン洗浄剤（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００およびＤＴＰ）による処理の結果としての、ポリオウイルス含有粗細胞培養収穫物からのＤ−抗原の放出を示している。上澄み中のＤ−抗原濃度を、洗浄剤添加の希釈について補正して、洗浄剤濃度の関数として開示する。図７（Ａ、Ｂ、およびＣ）は、洗浄剤（ＳＴＨ、ＳＤＳ、ＳＢ３−１４、ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、およびＤＴＰ）の添加後、ウイルス力価が、洗浄剤（ＳＴＨ、ＳＤＳ、ＳＢ３−１４、ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、およびＤＴＰ）の添加前と比較して、実質的に増大したことを開示している。各タイプの洗浄剤（陰イオン、双極性イオン、または非イオン）について、同じパターンを観察することができる。すなわち、洗浄剤（ＳＴＨ、ＳＤＳ、ＳＢ３−１４、ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、およびＤＴＰ）の濃度を増大させるにつれ、液相中への粗細胞収穫物からのウイルスの放出が増大する。図８（Ａ、Ｂ、およびＣ）は、洗浄剤（ＳＴＨ、ＳＤＳ、ＳＢ３−１４、ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、およびＤＴＰ）による処理の結果としての、ポリオウイルス含有粗細胞培養収穫物からの宿主細胞ＤＮＡの放出を示している。ｙ軸上の濃度は、洗浄剤希釈因子について補正したものである。各タイプの洗浄剤（陰イオン、双極性イオン、または非イオン）について、同じパターンを観察することができる。すなわち、洗浄剤（ＳＴＨ、ＳＤＳ、ＳＢ３−１４、ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、およびＤＴＰ）の濃度を増大させるにつれ、液相中への粗細胞収穫物からの宿主細胞ＤＮＡの放出が増大する。
【０１３２】
洗浄剤タイプ（陰イオン、双極性イオン、または非イオン）の濃度を増大させてもポリオウイルスが沈殿しなかったため、当業者は、この結果を、さらに高い細胞密度、例えば約７０×１０６細胞／ｍＬ、例えば約９０×１０６細胞／ｍＬ、例えば最大約１２０×１０６細胞／ｍＬ、例えば最大約１５０×１０６細胞／ｍＬのポリオウイルス含有細胞懸濁液に当てはめることができる。当業者であれば、そのような高い細胞密度の粗細胞培養収穫物からポリオウイルスを、本発明の方法によって精製することができると結論するであろう。
【０１３３】
実施例８：Ｓａｂｉｎ  ＩＰＶ精製トレインの一部としてのＤＢ処理および浄化
本実施例は、粗細胞培養収穫物からの弱毒化ポリオウイルス血清型（Ｓａｂｉｎ１型、Ｓａｂｉｎ２型、およびＳａｂｉｎ３型）の精製プロセスの一部としての収穫プロセス（ＤＢ処理に続く細胞浄化）の適用を記載する。
【０１３４】
ＰＥＲ．Ｃ６細胞系統由来の細胞を、潅流モードで運転する１０Ｌバイオリアクタ中の無血清培地において増殖させて、およそ５０×１０６ｖｃ／ｍｌの細胞密度にした。ポリオウイルス血清１型（Ｓａｂｉｎ１型）、２型（Ｓａｂｉｎ２型）、または３型（Ｓａｂｉｎ３型）による感染の前に、フレッシュな培地で培養体を１２．５×１０６ｖｃ／ｍＬまたは２５×１０６ｖｃ／ｍＬの生存細胞密度に希釈した。感染多重度１および０．１を、１２．５×１０６ｖｃ／ｍｌおよび２５×１０６ｖｃ／ｍｌの細胞培養体にそれぞれ用いた。両方の場合において、バッチ感染プロセスを、１０Ｌバイオリアクタにおいて３２．５℃で行なった。
【０１３５】
収穫時（Ｓａｂｉｎ１型またはＳａｂｉｎ３型について感染後４８時間、およびＳａｂｉｎ２型について感染後７２時間）に、２．２ｍＭ  ＤＢの最終ＤＢ濃度になるまで、ＤＢストック溶液を３０分間にわたってバイオリアクタに加えた。洗浄剤の添加後、ＤＢ処理する収穫物（約１１Ｌ）を６０分間混合した。最後に、ＤＢ処理済み収穫物を、図４および実施例５においてＳａｌｋ  ＩＰＶについて記載したのと同様に、浄化かつ精製した。
【０１３６】
表６は、ＤＢ処理工程に続く連続濾過の全体的なＤ−抗原回収率およびＨＣ−ＤＮＡ除去を示している。表７は、精製済みＳａｂｉｎポリオウイルスの品質属性を要約している。
【０１３７】
【表６】
0006385559.tif 000007
【０１３８】
【表７】
0006385559.tif 000008
【０１３９】
Ｓａｂｉｎポリオウイルスのプロセスの結果は、野生型株について達成される結果と大きい類似性を示す。Ｓａｂｉｎポリオウイルス株についても、組み合わせたＤＢ処理および浄化収穫プロセスは、ＨＣ−ＤＮＡが完全に除去された、高いウイルス回収率を達成する（表６）。表７は、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ベースのＳａｂｉｎポリオウイルス細胞培養収穫物が、本発明に記載される収穫精製プロセスを用いて、十分に精製され得たことを示している。残留した具体的なタンパク質およびＤＮＡの濃度は、調節要件（ＷＨＯ／ＥＰ）を満たす。また、吸光度比ＯＤ２６０／ＯＤ２８０は、高度に精製されたウイルスを示すものである（Ｗｅｓｔｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。全体的な純度は、野生型ポリオウイルス株について得られた純度（実施例５における表３参照）と同じである。
【０１４０】
とりわけ、２つのタイプのウイルス、野生型およびＳａｂｉｎ株が正味の表面電荷の点で異なることを考えると（Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、結果は非常に有望である。このことは重ねて、開発された包括的な高い生産性のポリオウイルスワクチン製造プロセスのロバスト性を実証している。
【０１４１】
参考文献
Ｂａｋｋｅｒ  ＷＡＭ，Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ  ＹＥ，ｖａｎ’ｔ  Ｏｅｖｅｒ  ＡＧ，Ｗｅｓｔｄｉｊｋ  Ｊ，ｖａｎ  Ｏｉｊｅｎ
ＭＧＣＴ，Ｓｕｎｄｅｒｍａｎｎ  ＬＣ，ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｌｄ  Ｐ，Ｓｌｅｅｍａｎ
Ｅ，ｖａｎ  Ｎｉｍｗｅｇｅｎ  ＦＷ，Ｈａｍｉｄｉ  Ａ，Ｋｅｒｓｔｅｎ  ＧＦＡ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｅｕｖｅｌ  Ｎ，Ｈｅｎｄｒｉｋｓ  ＪＴ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌ
ＬＡ．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｓａｂｉｎ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｔｏ  ｓｈｉｆｔ  ｆｒｏｍ  Ｓａｌｋ−ＩＰＶ  ｔｏ  Ｓａｂｉｎ−ＩＰＶ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１１；２９（４１）：７１８８−９６
Ｃｏｒｔｉｎ  Ｖ，Ｔｈｉｂａｕｌｔ  Ｊ，Ｊａｃｏｂ  Ｄ，Ｇａｒｎｉｅｒ  Ａ．Ｈｉｇｈ−Ｔｉｔｅｒ  Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ２９３Ｓ  Ｃｅｌｌ  Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００４．
Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ７．０，Ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）．０４／２０１０：０２１４
Ｆｕｃｈｓ  Ｆ，Ｍｉｎｏｒ  Ｐ，Ｄａａｓ  Ａ，Ｍｉｌｎｅ  Ｃ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ＢＲＰ  ｂａｔｃｈ  ２  ｆｏｒ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｄ−ａｎｔｉｇｅｎ  ａｓｓａｙ．Ｐｈａｒｍｅｕｒｏｐａ  Ｂｉｏ  ２００３−１，２３−５０，２００３．
Ｇｏｅｒｋｅ  Ａ，Ｔｏ  Ｂ，Ｌｅｅ  Ａ，Ｓａｇａｒ  Ｓ，Ｋｏｎｚ  Ｋ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＤＮＡ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．９１，Ｎｏ．１，Ｊｕｌｙ  ５，２００５．
Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  Ｍ，Ｗａｌｌｉｓ  Ｃ，Ｍｅｌｎｉｃｋ  Ｊ．Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖ．１９７６，ｐ．６８９−６９３．
Ｋｒｅｅｆｔｅｎｂｅｒｇ  Ｈ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｅｌｄｅｎ  Ｔ，Ｋｅｒｓｔｅｎ
Ｇ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｕｖｅｌ  Ｎ，ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎ  Ｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  Ｓａｂｉｎ−ＩＰＶ  ｔｏ  ｎｅｗ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｎｔｒｙ  ｍａｒｋｅｔｓ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２００６；３４（２）：１５５−８
Ｓａｎｄｅｒｓ  ＢＡ，Ｅｄｏ−Ｍａｔａｓ  Ｄ，Ｃｕｓｔｅｒｓ  ＪＨＨＶ，Ｋｏｌｄｉｊｋ  ＭＨ，Ｋｌａｒｅｎ  Ｖ，Ｔｕｒｋ  Ｍ，Ｌｕｉｔｊｅｎｓ  Ａ，Ｂａｋｋｅｒ  ＷＡＭ，ＵｙｔｄｅＨａａｇ  Ｆ，Ｇｏｕｄｓｍｉｔ  Ｊ，Ｌｅｗｉｓ  ＪＡ，Ｓｃｈｕｉｔｅｍａｋｅｒ  Ｈ，ＰＥＲ．Ｃ６  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｅｌｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｔｉｔｅｒ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ：ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｌｏｗ  ｃｏｓｔ  ｏｆ  ｇｏｏｄｓ  ｏｐｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｗｏｒｌｄ  ｓｕｐｐｌｙ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１３；３１（５）：８５０−６
Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ  ＹＥ，ｖａｎ’ｔ  Ｏｅｖｅｒ  ＡＧ，Ｖｉｎｋｅ  Ｍ，Ｓｐｉｅｋｓｔｒａ  Ａ，Ｗｉｊｆｆｅｌｓ  ＲＨ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌ  ＬＡ，Ｂａｋｋｅｒ  ＷＡＭ．Ｓｃａｌｅ  ｄｏｗｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１１０（５）：１３５４−１３６５，Ｍａｙ  ２０１３．
Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ  ＹＥ，ｖａｎ  Ｅｉｋｅｎｈｏｒｓｔ  Ｇ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌ  ＬＡ，Ｂａｋｋｅｒ  ＷＡＭ．Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｕｓｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｗｈｏｌｅ  ｃｏｌｍｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８５：６０８９−６０９４（２０１３）．
Ｖｌｅｃｋｅｎ  ＤＨＷ，Ｐｅｌｇｒｉｍ  ＲＰＭ，Ｒｕｍｉｎｓｋｉ  Ｓ，Ｂａｋｋｅｒ  ＷＡＭ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌ  ＬＡ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｖｉｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３  １９３（２）：２７８−２８３
Ｗｅｓｔｄｉｊｋ  Ｊ，Ｂｒｕｇｍａｎｓ  Ｄ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ，ｖａｎ’ｔ  Ｏｅｖｅｒ  Ａ，Ｂａｋｋｅｒ  ＷＡＭ，Ｌｅｖｅｌｓ  Ｌ，Ｋｅｒｓｔｅｎ，Ｇ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｂｉｎ  ｂａｓｅｄ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏ  ｖａｃｃｉｎｅ：Ｐｒｏｐｏｓａｌ  ｆｏｒ  ａ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｕｎｉｔ  ｆｏｒ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１１；２９：３３９０-３３９７
ＷＨＯ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｒｅｐｏｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ．９１０，２００２．Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ（ｉｎａｃｔｉｖｅｄ）．
Ｙｕｋ  ＩＨＹ，Ｏｌｓｅｎ  ＭＭ，Ｇｅｙｅｒ  Ｓ，Ｆｏｒｅｓｔｅｌｌ  ＳＰ．Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ
Ｓｃａｌａｂｌｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．８６：６３７−６４１（２００４）．
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］  粗細胞培養収穫物からポリオウイルスを精製する方法であって：
ａ）洗浄剤を前記粗細胞培養収穫物に加える工程と；
ｂ）前記ポリオウイルス含有細胞培養収穫物を浄化して、ポリオウイルス粒子を有する浄化済み収穫物を得る工程と
を含む方法。
［２］  粗細胞培養収穫物からのポリオウイルスの放出を促進する方法であって：
ａ）洗浄剤を前記粗細胞培養収穫物に加える工程と；
ｂ）前記ポリオウイルス含有細胞培養収穫物を浄化して、ポリオウイルス粒子を有する浄化済み収穫物を得る工程と
を含む方法。
［３］  細胞培養体からポリオウイルスを精製する方法であって：
ａ）洗浄剤を前記細胞培養体に加える工程と；
ｂ）前記ポリオウイルス含有細胞培養体を浄化して、ポリオウイルス粒子を有する浄化済み収穫物を得る工程と；
ｃ）工程ｂ）において得られた前記浄化済み収穫物を捕捉工程にかけて、ポリオウイルス含有懸濁液を得る工程と
を含む方法。
［４］  前記捕捉工程は、陽イオン交換クロマトグラフィ工程である、［３］に記載の細胞培養体からポリオウイルスを精製する方法。
［５］  工程ｃ）において得られた前記ポリオウイルスは、サイズ排除によって前記ポリオウイルス含有懸濁液からさらに分離される、［３］または［４］に記載の細胞培養体からポリオウイルスを精製する方法。
［６］  前記サイズ排除は、サイズ排除クロマトグラフィによって実行される、［５］に記載の細胞培養体からポリオウイルスを精製する方法。
［７］  細胞培養体からポリオウイルスを精製する方法であって：
ａ）洗浄剤を前記細胞培養体に加える工程と；
ｂ）前記ポリオウイルス含有細胞培養体を浄化して、ポリオウイルス粒子を有する浄化済み収穫物を得る工程と；
ｃ）工程ｂ）において得られた前記浄化済み収穫物を陽イオン交換クロマトグラフィ工程にかけて、ポリオウイルス含有懸濁液を得る工程と；
ｄ）サイズ排除クロマトグラフィによって、前記ポリオウイルス含有懸濁液から前記ポリオウイルスをさらに精製分離する工程と
を含む方法。
［８］  前記洗浄剤は、陽イオン洗浄剤、陰イオン洗浄剤、非イオン洗浄剤、および双極性イオン洗浄剤の群から選択される、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］  前記洗浄剤は、陽イオン洗浄剤である、［８］に記載の方法。
［１０］  前記陽イオン洗浄剤は、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ヘキサデシルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＴＣ）、および臭化ドミフェン（ＤＢ）の群から選択される、［９］に記載の方法。
［１１］  前記陽イオン洗浄剤は、臭化ドミフェン（ＤＢ）である、［１０］に記載の方法。
［１２］  前記洗浄剤は、陰イオン洗浄剤である、［８］に記載の方法。
［１３］  前記陰イオン洗浄剤は、タウロデオキシコール酸ナトリウム水和物（ＳＴＨ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の群から選択される、［１２］に記載の方法。
［１４］  前記洗浄剤は、非イオン洗浄剤である、［８］に記載の方法。
［１５］  前記非イオン洗浄剤は、４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）およびデシル−β−Ｄ−１−チオマルトピラノシド（ＤＴＰ）の群から選択される、［１４］に記載の方法。
［１６］  前記洗浄剤は、双極性イオン洗浄剤である、［８］に記載の方法。
［１７］  前記双極性イオン洗浄剤は、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネート（ＳＢ３−１４）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）の群から選択される、［１６］に記載の方法。
［１８］  粗細胞培養収穫物からのポリオウイルスの放出を促進するための洗浄剤の使用。
【図１】
0006385559.tif 000009
【図２】
0006385559.tif 000010
【図３】
0006385559.tif 000011
【図４】
0006385559.tif 000012
【図５】
0006385559.tif 000013
【図６】
0006385559.tif 000014
【図７】
0006385559.tif 000015
【図８】
0006385559.tif 000016