(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドが２’−Ｏアルキルリボースヌクレオチドである、生細胞による該オリゴヌクレオチドの取り込みを許容する条件下で一本鎖オリゴヌクレオチドを生細胞に提供することによるヒトまたは動物の体の嚢胞性線維症の治療における使用のための一本鎖オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡ分子に少なくとも部分的に相補的な配列を含み、それによりオリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡ、またはその前駆体、もしくはそのための鋳型のハイブリダイゼーションが該生細胞内で起こり、標的ＲＮＡがヒトＣＦＴＲタンパク質をコードし、かつＣＦＴＲタンパク質の５０８位のアミノ酸のフェニルアラニンをコードしているヌクレオシドトリプレットの欠失を含み、オリゴヌクレオチドが配列番号６のヌクレオチド１６〜３０および３４〜４８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列相同性を有する配列に相補的である、一本鎖オリゴヌクレオチド
を含む、医薬組成物。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドが１５〜１００ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドがイノシンを含み、ならびに／または、５−メチル−ｄＣ、２−アミノ−ｄＡ、およびＣ５−ピリミジンからなる群から選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート結合およびメチルホスホネート結合からなる群から選択される修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドが２’−Ｏメチルリボースヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドが配列番号１または配列番号３のヌクレオチド７〜２９を含み、または該ヌクレオチドからなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドが配列番号１または配列番号３のヌクレオチド１〜３３を含み、または該ヌクレオチドからなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドがリポソーム、ポリソーム、もしくはナノ粒子で提供され、ならびに／またはオリゴヌクレオチドがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と複合体を形成し、および／もしくはステロールと結合している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドが、乾燥製剤またはエアロゾルで、ネブライザーを用いて気道または肺に提供される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドが２％〜９％の食塩水濃度の高張食塩組成物で提供され、高張食塩水が生理的および医薬的に許容される溶液である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドが粘液透過性粒子、または粘液透過性ナノ粒子で提供される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
（ｉ）オリゴヌクレオチドの投与が細菌感染ならびに粘液増粘および／またはバイオフィルム形成などの症状を減少させるために抗生物質治療と併用される；および／または（ｉｉ）本発明のオリゴヌクレオチドの投与前に気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）が適用される、請求項１０または請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドが持続放出カプセル剤で投与される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
医薬的に許容される担体、ならびに／または高張性の生理的および医薬的に許容される２％〜９％の食塩水濃度の食塩水をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
トランスフェクションメディエーターをさらに含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
デオキシリボヌクレアーゼ、マンニトール、カリデコ（アイバカフトール；ＶＸ−７７０）、ＶＸ−８０９（ルマカフトル）およびＶＸ−６６１からなる群から選択される当業者に周知の嚢胞性線維症治療薬をさらに含む、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
一本鎖の形態でオリゴヌクレオチドを生細胞に提供することを含む方法における使用のための医薬組成物であって、下記からなる群から選択される一本鎖オリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物：
（ａ）配列番号６のヌクレオチド１６〜３０および３４〜４８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列相同性を有する配列に相補的である、一本鎖オリゴリボヌクレオチドであって、オリゴリボヌクレオチドの全ヌクレオチドが２’−Ｏアルキルリボースヌクレオチドである、一本鎖オリゴリボヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１または配列番号３のヌクレオチド７〜２９を含む、一本鎖オリゴリボヌクレオチドであって、オリゴリボヌクレオチドの全ヌクレオチドが２’−Ｏアルキルリボースヌクレオチドである、一本鎖オリゴリボヌクレオチド；および
（ｃ）配列番号１または配列番号３のヌクレオチド１〜３３を含む、一本鎖オリゴリボヌクレオチドであって、オリゴリボヌクレオチドの全ヌクレオチドが２’−Ｏアルキルリボースヌクレオチドである、一本鎖オリゴリボヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は遺伝子治療の分野、より具体的には生細胞に存在する標的ＲＮＡ分子の配列を変化させるためのオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多数の遺伝性疾患がゲノムの変異によって引き起こされる。数種類の修飾がゲノムで変異していることがわかっている：１個もしくは数個の塩基対の欠失、遺伝子配列の１個もしくは数個のミスマッチ、１個もしくは数個のヌクレオチドの挿入、またはトリプレット反復、および遺伝子の全部または一部の欠損または重複などである。
【０００３】
１個または数個の塩基対のミスマッチ、欠失または挿入によって引き起こされる遺伝性疾患は、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、鎌状赤血球貧血、血友病、β−サラセミア、および脆弱Ｘ症候群を含む。
【０００４】
ＲＮＡ修復はＲＮＡレベルで遺伝的欠陥を修復するために利用することができる。
オリゴヌクレオチドおよびその複合体は、ＤＮＡ修飾を修復するための治療用分子として利用される（I Papaioannou, JP Simons, JS Owen Oligonucleotide-directed gene-editing technology: mechanisms and future prospects Expert Opin. Biol. Ther. (2012) 12(3):329-342）。これらのオリゴマーは、ＲＮＡおよび／もしくはＤＮＡヌクレオチド、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡヌクレオチドを含有しうる。それらは欠陥ＤＮＡの部位特異的修復を得るために利用される。修復は、導入されたミスマッチの認識後に、内在性ＤＮＡ修復メカニズムの活性化を通じて生じると予測されていた。
【０００５】
三本鎖形成オリゴヌクレオチドは、遺伝子ターゲティングのための配列特異的手段としても利用される。三本鎖形成オリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡの主溝に高親和性で結合する。この特徴のために、三本鎖形成オリゴヌクレオチドは標的遺伝子の部位特異的補正手段として提案されている（Knauert et al., Hum Mol Genet. (2001) 10, 2243-2251; Richardson et al, Drug Target (2002) 10, 133-134; Thoung et al., (1993) Angewandte Chemie. Intl. Ed. Eng., 32, 666-690.）。現在の標的遺伝子修復法はあまり効率的ではなく、および／または、インサイツの生細胞内で働くことは立証されておらず、遺伝子欠陥を修復する別のメカニズムが存在する余地が残されている。
【０００６】
ＲＮＡレベルの欠陥遺伝子の修復が報告されている。二本鎖オリゴヌクレオチドの複合体によるｍＲＮＡの特異的修復は、例えばインビトロでΔＦ５０８  ＣＦＴＲ  ｍＲＮＡにヌクレオチドを挿入するために利用されていた。これを媒介するメカニズムは、リボヌクレアーゼＨ媒介性の分解、続くＲＮＡ修復であると推定されている。（PC Zamecnik, MK Raychowdhury, DR Tabatadze, HF Cantiello Reversal of cystic fibrosis phenotype in a cultured ΔF508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator cell line by oligonucleotide insertion Proc Natl Acad Sci 2004 101(21) 8150-8155; WO2005094370, oligonucleotide complex compositions and methods of use as gene alteration tools）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の記載
本発明は、生細胞、より好ましくは多細胞生物の生細胞（インビボ）内の標的遺伝子修復の方法に向けられている。より具体的には、本発明は多細胞生物、より具体的には動物、より具体的には哺乳類、さらに具体的にはヒトにおいて、インビボで生細胞内の標的ＲＮＡを変化させることに関する。生細胞内の遺伝子修復についてこれまでに報告されているが、本発明は、オリゴヌクレオチド、好ましくは一本鎖オリゴヌクレオチド、より好ましくは一本鎖オリゴリボヌクレオチド、さらに具体的には化学的に修飾された一本鎖オリゴリボヌクレオチドを用いてインビボで生細胞内の標的ＲＮＡ分子を変化させ、それによってその生物の表現型を変化させる可能性を初めて開示するものであると考えられる。驚くべきことに、本発明のオリゴヌクレオチドは、活性を失うことなく、対象生物の病気の表現型を実質的に回復する量で、インビボで投与することができる。本発明は、嚢胞性線維症を患っている生物の肺にＣＦＴＲをコードしているＲＮＡ配列を回復することができる化学的に修飾されたオリゴリボヌクレオチドを投与し、それによってＣＦＴＲタンパク質機能を回復し、ＣＦ表現型を回復し、または少なくとも該生物の状態を改善することによって説明することができる。それゆえ、本発明は、オリゴヌクレオチド、好ましくは一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド；該オリゴヌクレオチドを含む組成物；該オリゴヌクレオチドおよび医薬的に許容される担体を含む医薬組成物；インビボまたはインビトロＲＮＡ修復および／または標的ＲＮＡ分子の配列変化のための該オリゴヌクレオチドまたは組成物の使用および方法；対象、好ましくはヒト対象への該オリゴヌクレオチドまたは組成物の投与を含む、（遺伝性）障害または遺伝子変異と関連している疾患の治療または予防における使用のための該オリゴヌクレオチドまたは組成物；ならびに対象、好ましくはヒト対象への該オリゴヌクレオチドまたは組成物の投与を含む、（遺伝性）障害または遺伝子変異と関連している疾患の治療または予防方法に関する。そのような、好ましくは一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞、好ましくは哺乳類細胞、より好ましくはヒト細胞に導入する場合、ＲＮＡの修復を要し、おそらくＲＮＡ修復のためのガイド鎖として作用する場所におけるＲＮＡ、またはその前駆体もしくは鋳型に向けられる。修復の特異的メカニズムは未知であるが、本発明のオリゴヌクレオチド、好ましくは、一本鎖修復分子は、好ましくは修復プロセスにおいてリボヌクレアーゼＨの役割を許容しない。標的ＲＮＡで媒介される変化は、直接的にＲＮＡレベルであってもよく、または間接的にＤＮＡを介し、引き続きＲＮＡ分子またはその前駆体に転写されるものであってもよい。本明細書で記載されているオリゴヌクレオチドは概して本発明のオリゴヌクレオチドと称され、本発明の全ての実施態様に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】欠失部位周辺の野生型（ＷＴ）およびΔＦ５０８（変異体（Ｍｕｔ））ＣＦＴＲ  ＲＮＡの部分配列。変異体で欠失している３つのヌクレオチドは、ＷＴ配列において太字で示している。
【０００９】
【図２】配列番号１を有するオリゴヌクレオチドを用いた変異体ΔＦ５０８  ＣＦＴＲ  ＲＮＡのＲＮＡ編集の略図。修復されたＲＮＡ分子（ＲＳ）は３個のヌクレオチドが挿入されており、ＲＮＡ配列が野生型ＣＦＴＲと同一になっている。
【００１０】
【図３】野生型、変異体および修復された分子の部分ＲＮＡおよびタンパク質配列。変異体は５０８位のフェニルアラニンが欠損している。修復されたＲＮＡにはフェニルアラニンが挿入され、野生型タンパク質配列をもたらしている。
【００１１】
【図４】内在性ΔＦ５０８変異体ＣＦＴＲ発現培養細胞における一本鎖オリゴヌクレオチドの活性。一本鎖オリゴヌクレオチドおよび前記二本鎖オリゴヌクレオチドを比較している。活性は、ＣＦＴＲ塩素イオン輸送体活性の検出によって測定している。
【００１２】
【図５】野生型マウス（ＷＴ）、ＣＦマウス（ＣＦ）、およびＱＲ−０１０で治療されたＣＦマウス（ＣＦ−治療）についての、電位（ｍＶ）で示したＥＮａＣ活性。＊＊  Ｐ＜０．０１；ｎｓ＝有意ではない。横棒は平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示している；ｐ値は対応がないＴ検定によって得た。
【００１３】
【図６】野生型マウス（野生型）、非治療ＣＦマウス（ＣＦ）、ＱＲ−０１０を３回投与して治療されたＣＦマウス（ＣＦ３Ｄ）、およびＱＲ−０１０を６回投与して治療されたＣＦマウス（ＣＦ６Ｄ）について、相対的パーセンテージとして示したフォルスコリン誘導性ＣＦＴＲ応答。野生型マウスを１００％として示している。
【００１４】
【図７Ａ】０１０ｇオリゴヌクレオチド（配列番号１）による標的ＲＮＡにおけるＣＦＴＲ  ΔＦ５０８変異の修復を示している；欠失部位周辺のＲＮＡの一部を示している。５０８位にフェニルアラニン（Ｆ）の出現をもたらす挿入したトリヌクレオシドＣＵＵ（ＵＵＵ）を太字で強調している。
【００１５】
【図７Ｂ】配列番号１６の配列を有するオリゴヌクレオチドによるΔＦ５０８ＣＦＴＲ標的ＲＮＡの５０８位での２つのヌクレオシドの挿入を示している；欠失部位周辺のＲＮＡの一部を示している。５０８位での２つのヌクレオシドＣＵの挿入を示しており、コード配列においてフレームシフトをもたらしている。
【００１６】
【図７Ｃ】配列番号１７の配列を有するオリゴヌクレオチドによるΔＦ５０８ＣＦＴＲ標的ＲＮＡの５０８位での１つのヌクレオシドの挿入を示している；欠失部位周辺のＲＮＡの一部を示している。５０８位でのヌクレオシドＣの挿入を示しており、コード配列においてフレームシフトをもたらし、最終的に５１２位でストップコドンを作成している。
【００１７】
【図７Ｄ】配列番号１８の配列を有するオリゴヌクレオチドによるΔＦ５０８ＣＦＴＲ標的ＲＮＡの５０８位での１つのヌクレオシドの挿入を示している；欠失部位周辺のＲＮＡの一部を示している。５０８位でのヌクレオシドＣの挿入を示しており、コード配列においてフレームシフトをもたらし、最終的に５１２位でストップコドンを作成している。
【００１８】
図８は、ＷＴ  ＣＦＴＲ標的ＲＮＡの５０８位での様々な挿入を示している。
【図８Ａ】配列番号１９の配列を有するオリゴヌクレオチドによるＷＴ  ＣＦＴＲ標的ＲＮＡの５０８位でのストップコドンの挿入（ＡＴＣＡＴＣＴＧＡＴＴＴＧＧＴＧＴＴ）；配列番号３３）を示している；５０８位周辺のＲＮＡの一部を示している。ストップコドンの挿入はＩ５０７後に翻訳ストップを引き起こしている。
【００１９】
【図８Ｂ】配列番号２０の配列を有するオリゴヌクレオチドによるＷＴ  ＣＦＴＲ標的ＲＮＡの５０８位での２つのヌクレオシドの挿入を示している；５０８位周辺のＲＮＡの一部を示している。５０８位での２つのヌクレオシドＧＡの挿入を示しており、コード配列においてフレームシフトをもたらしている。
【００２０】
【図８Ｃ】配列番号２１の配列を有するオリゴヌクレオチドによるＷＴ  ＣＦＴＲ標的ＲＮＡの５０８位での１つのヌクレオシドの挿入を示している；５０８位周辺のＲＮＡの一部を示している。５０８位でのヌクレオシドＡの挿入を示しており、コード配列においてフレームシフトをもたらし、最終的に５１３位でストップコドンを作成している。
【００２１】
【図８Ｄ】配列番号２２の配列を有するオリゴヌクレオチドによるＷＴ  ＣＦＴＲ標的ＲＮＡの５０８位でのロイシンコドンの挿入（ＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＴＴＧＧＴＧＴＴ；配列番号４０）を示している；５０８位周辺のＲＮＡの一部を示している。ロイシンコドンの挿入および得られたポリペプチドを示している。
【００２２】
【図８Ｅ】配列番号２３の配列を有するオリゴヌクレオチドによるＷＴ  ＣＦＴＲ標的ＲＮＡのエクソン１０の中間におけるストップコドンの挿入を示している；５０８位周辺のＲＮＡの一部を示している。ストップコドンの挿入はアミノ酸Ｆ４９４位の後で翻訳ストップを引き起こす。
【００２３】
【図８Ｆ】配列番号２４の配列を有するオリゴヌクレオチドによるＷＴ  ＣＦＴＲ標的ＲＮＡのエクソン１０におけるロイシンコドン（ＣＵＵ）の導入を示している。ロイシンコドンの導入および得られたポリペプチドを示している。
【００２４】
【図９Ａ】ＣＦＴＲ−Ｒ１１７オリゴヌクレオチド（配列番号５１）による標的ＲＮＡのＣＦＴＲ  Ｒ１１７Ｈ変異の修復を示している；変異部位周辺のＲＮＡの一部を示している。「Ａ」を「Ｇ」へ置換するとＣＡＣコドン（Ｈｉｓ）がＣＧＣコドン（Ａｒｇ）に変換される（太字で強調している）。
【００２５】
【図９Ｂ】ＣＦＴＲ−Ｇ５４２オリゴヌクレオチド（配列番号５６）による標的ＲＮＡのＣＦＴＲ  Ｇ５４２Ｘ変異の修復を示している；変異部位周辺のＲＮＡの一部を示している。「Ｕ」を「Ｇ」に置換するとＵＧＡコドン（ストップ）がＧＧＡコドン（Ｇｌｙ）に変換される（太字で強調している）。
【００２６】
【図９Ｃ】ＣＦＴＲ−Ｗ１２８２オリゴヌクレオチド（配列番号６１）による標的ＲＮＡのＣＦＴＲ  Ｗ１２８２Ｘ変異の修復を示している；変異部位周辺のＲＮＡの一部を示している。「Ａ」を「Ｇ」に置換するとＵＧＡコドン（ストップ）がＵＧＧコドン（Ｔｒｙｐ）に変換される（太字で強調している）。
【００２７】
【図９Ｄ】ＣＦＴＲ−Ｎ１３０３オリゴヌクレオチド（配列番号６６）による標的ＲＮＡのＣＦＴＲ  Ｎ１３０３Ｋ変異の修復を示している；変異部位周辺のＲＮＡの一部を示している。「Ｇ」を「Ｃ」で置換するとＡＡＧコドン（Ｌｙｓ）がＡＡＣコドン（Ａｓｎ）に変換される（太字で強調している）。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の全ての実施態様は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで実施することができ（方法もしくは使用の場合）、または使用することができる（化合物もしくは組成物の場合）。
【００２９】
本発明は好ましくはＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）のエクソン１０のΔＦ５０８変異の修復によって、嚢胞性線維症の治療に都合よく使用することができる。本発明の代表的なオリゴヌクレオチド、すなわち配列番号１に示されている分子の作用様式は、図１〜３および７Ａに示されている。前記二本鎖（上記Zamecnik et al）と比較した本発明の代表的なオリゴヌクレオチド、すなわち配列番号１に示されている分子の活性は、図４に示されている。該図は本明細書に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）が、ＣＦＴＲの修復において、前記二本鎖分子（PC Zamecnik, MK Raychowdhury, DR Tabatadze, HF Cantiello Reversal of cystic fibrosis phenotype in a cultured ΔF508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator cell line by oligonucleotide insertion Proc Natl Acad Sci 2004 101(21) 8150-8155; WO2005094370, oligonucleotide complex compositions and methods of use as gene alteration tools）と比較して、少なくとも同程度の活性があり、むしろより活性が高いと解されることを示している。配列番号１の活性は、上記Zamecnik et al（特に８１５３頁の図４参照）に記載されている比較アッセイを用いて決定した。
【００３０】
本発明は、別の標的ＲＮＡ分子を変化させること、ならびに／または（遺伝性）障害と関連している他の疾患、例えば限定されるものではないが、白皮症、α−１−アンチトリプシン欠乏症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β−サラセミア、カダシル（Cadasil）症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位型脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症（Epidormylosis bullosa）、ファブリー病、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス（Hereditary Hematochromatosis）、ハンター症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集反応症候群（Inherited polyagglutination syndrome）、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＩ型およびＩＩ型、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ＮＹ−ｅｓｏ１関連癌、パーキンソン病、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛機能不全（Primary Ciliary Disease）、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、シュタルガルト病、テイ・サックス病、Ｘ連鎖免疫不全、ならびに様々な形態の癌（例えばＢＲＣＡ１および２関連乳癌および卵巣癌）などの治療にも都合よく使用することができる。
【００３１】
本発明の１つの好ましい実施態様では、標的ＲＮＡ配列の変化は標的ＲＮＡへの１つ以上のヌクレオチドの挿入を含む。より好ましい実施態様では、１つ以上のヌクレオチドの挿入は標的ＲＮＡ配列によってコードされているポリペプチド配列において少なくとも１つのアミノ酸配列の挿入をもたらす。最も好ましい実施態様では、アミノ酸配列の挿入は、コードされているポリペプチドを多細胞生物において正常に機能するポリペプチドに回復させる。従って、本発明の最も好ましい実施態様は、多細胞生物の標的ＲＮＡ配列が標的ＲＮＡ配列の機能不全によって引き起こされる障害と関連しており、遺伝性障害が正常に機能する標的ＲＮＡ配列と比較して１つ以上のヌクレオチドを欠く標的ＲＮＡ配列によって引き起こされる障害の群から選択される実施態様である。本発明の好ましい実施態様は、標的ＲＮＡ配列がコドンの少なくとも一部を欠き、それが本発明のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ配列を変化させることによって回復する実施態様である。
【００３２】
本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドの全身投与でＲＮＡ修復をインビボで確立することができることを示している。障害に関連する組織もしくは器官、またはより一般的に標的ＲＮＡの変化が達成される組織もしくは器官に依存して、本発明のオリゴヌクレオチドの送達を最適化するよう投与様式を調整してよい。肺の障害および他の呼吸器疾患について、本発明のオリゴヌクレオチドは都合よく、例えば吸入により肺に直接的に投与されてよい。あるいは、障害および／または標的組織に依存して、投与は局所投与（例えば経皮投与）または全身投与、例えば皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経口投与、直腸投与、および頭蓋内投与などであってよい。
【００３３】
本発明のオリゴヌクレオチドはＤＮＡヌクレオチドまたはＲＮＡヌクレオチドを含有することができる；本明細書の別の箇所に記載されているように、安定性を高めるために修飾ＤＮＡヌクレオチドまたはＲＮＡヌクレオチドが存在してもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは例えばイノシンを含んでよく、ならびに／または、好ましくは２’−Ｏ−アルキルリボース、２’−Ｏ−メチルリボース、２’フルオロリボース、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ＰＭＯ、５−メチル−ｄＣ、２−アミノ−ｄＡ、Ｃ５−ピリミジンからなる群から選択される修飾ヌクレオチドを含んでよい。安定化ヌクレオチドの１つの好ましい例は２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、別の例はロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドおよび／またはペプチド核酸（ＰＮＡ）である。安定性を高める他の手段は、例えばヌクレオチド間のホスホロチオエート結合であってよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で周知のいずれかの方法に従って製造することができる。当業者であれば、本発明のオリゴヌクレオチドを合成する方法を知っているであろう。
【００３４】
従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくはエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼＨに耐性を有し、（ＲＮＡ）結合および二本鎖安定性を促進するように化学的に修飾されている。選択された化学の特徴は、標的への本発明のオリゴヌクレオチドの送達に少なくとも部分的に影響する：投与経路、生体内安定性、生体内分布、組織内分布、ならびに細胞取り込みおよび輸送などである。さらに、結合親和性および安定性を高め、活性を高め、安全性を改善し、および／または長さを減少させ、もしくは合成および／もしくは精製手順を改善することによって商品原価を減少させるために、オリゴヌクレオチド化学のさらなる最適化が適用されてよい。複数の化学的修飾が一般的および／または商業的に、当業者が利用できる（例えば２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、５−置換ピリミジン、および２，６−ジアミノプリン）。
【００３５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの主鎖、ならびに／または糖修飾および／もしくは少なくとも１つの塩基修飾を有してよい。
【００３６】
塩基修飾は天然プリンおよびピリミジン塩基（例えばアデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、およびチミン）の修飾型、例えばヒポキサンチン、オロチン酸、アグマチジン（agmatidine）、ライシジン、２−チオピリミジン（例えば２−チオウラシル、２−チオチミン）、Ｇクランプおよびその誘導体、５−置換ピリミジン（例えば５−ハロウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−アミノメチルウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−アミノメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｓｕｐｅｒ  Ｔ）、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、７−アザ−２，６−ジアミノプリン、８−アザ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザアデニン、８−アザ−７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、Ｓｕｐｅｒ  Ｇ、Ｓｕｐｅｒ  Ａ、およびＮ４−エチルシトシン、もしくはその誘導体；Ｎ２−シクロペンチルグアニン（ｃＰｅｎｔ−Ｇ）、Ｎ２−シクロペンチル−２−アミノプリン（ｃＰｅｎｔ−ＡＰ）、およびＮ２−プロピル−２−アミノプリン（Ｐｒ−ＡＰ）、もしくはその誘導体；ならびに縮重またはユニバーサル塩基、例えば２，６−ジフルオロトルエンもしくは脱塩基部位などの非存在塩基（absent bases）（例えば１−デオキシリボース、１，２−ジデオキシリボース、１−デオキシ−２−Ｏ−メチルリボース；または環酸素が窒素に置き換わった（アザリボース））ピロリジン誘導体を含む。Ｓｕｐｅｒ  Ａ、Ｓｕｐｅｒ  ＧおよびＳｕｐｅｒ  Ｔの誘導体の例は、米国特許第６，６８３，１７３号（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に見ることができ、その内容は全体として参照することによって本明細書に組み込まれる。ｃＰｅｎｔ−Ｇ、ｃＰｅｎｔ−ＡＰおよびＰｒ−ＡＰは、ｓｉＲＮＡに組み込まれた時に免疫活性化作用を減少させることが示されている（Peacock H. et al. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 9200）。
【００３７】
糖修飾はリボシル部分の修飾型、例えば２’−Ｏ−修飾ＲＮＡ、例えば２’−Ｏ−アルキルまたは２’−Ｏ−（置換）アルキル、例えば２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−（２−シアノエチル）、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル（２’−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−（２−チオメチル）エチル、２’−Ｏ−ブチリル、２’−Ｏ−プロパルギル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−（２−アミノ）プロピル、２’−Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）プロピル）、２’−Ｏ−（２−アミノ）エチル、および２’−Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）；２’−デオキシ（ＤＮＡ）；２’−Ｏ−（ハロアルコキシ）メチル（Arai K. et al. Bioorg. Med. Chem. 2011, 21, 6285）、例えば２’−Ｏ−（２−クロロエトキシ）メチル（ＭＣＥＭ）、および２’−Ｏ−（２，２−ジクロロエトキシ）メチル（ＤＣＥＭ）；２’−Ｏ−アルコキシカルボニル、例えば２’−Ｏ−［２−（メトキシカルボニル）エチル］（ＭＯＣＥ）、２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］（ＭＣＥ）、および２’−Ｏ−［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル）エチル］（ＤＣＭＥ）；２’−ハロ、例えば２’−Ｆ、ＦＡＮＡ（２’−Ｆアラビノシル核酸）；カルバ糖およびアザ糖修飾；３’−Ｏ−アルキル、例えば３’−Ｏ−メチル、および３’−Ｏ−ブチリル、３’−Ｏ−プロパルギル；ならびにそれらの誘導体を含む。別の修飾は、「架橋」または「二環式」核酸（ＢＮＡ）、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）、キシロ−ＬＮＡ、α−Ｌ−ＬＮＡ、β−Ｄ−ＬＮＡ、ｃＥｔ（２’−Ｏ，４’−Ｃ拘束エチル）ＬＮＡ、ｃＭＯＥｔ（２’−Ｏ，４’−Ｃ拘束メトキシエチル）ＬＮＡ、エチレン−架橋核酸（ＥＮＡ）、トリシクロＤＮＡ；アンロックド核酸（ＵＮＡ）；シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、アルトリオール（altriol）核酸（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、フッ素化ＨＮＡ（Ｆ−ＨＮＡ）、ピラノシル−ＲＮＡ（ｐ−ＲＮＡ）、３’−デオキシピラノシル−ＤＮＡ（ｐ−ＤＮＡ）；モルホリノ（ＰＭＯ）、カチオン性モルホリノ（ＰＭＯプラス）、およびＰＭＯ−Ｘ；ならびにそれらの誘導体を含む。本発明のオリゴヌクレオチドに２つ以上の異なる糖修飾導入することも本発明に包含される。ＢＮＡ誘導体は、例えばＷＯ２０１１／０９７６４１に記載されており、その内容は参照することによってその全体において本明細書に組み込まれる。ＰＭＯ−Ｘの例はＷＯ２０１１１５０４０８に記載されており、その内容は参照することによってその全体において本明細書に組み込まれる。
【００３８】
主鎖修飾はホスホジエステルの修飾型、例えばホスホロチオエート（ＰＳ）、キラル純粋ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート（ＰＳ２）、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、ホスホノアセトアミド（ＰＡＣＡ）、チオホスホノアセテート、チオホスホノアセトアミド、ホスホロチオエートプロドラッグ、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、メチルホスフェート、メチルホスホロチオエート、エチルホスフェート、エチルホスホロチオエート、ボラノホスフェート、ボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスフェート、メチルボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスホネート、メチルボラノホスホノチオエート、およびそれらの誘導体を含む。別の修飾はホスホラミダイト、ホスホロアミデート、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロチオジアミデート、スルファメート、ジメチレンスルホキシド、スルフォネート、トリアゾール、オキサリル、カルバメート、メチレンイミノ（ＭＭＩ）、およびチオアセトアミド核酸（ＴＡＮＡ）；ならびにそれらの誘導体を含む。本発明のオリゴヌクレオチドに２つ以上の異なる主鎖修飾を導入することも本発明に包含される。
【００３９】
本発明のオリゴヌクレオチドの他の化学的修飾は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ボロンクラスター修飾ＰＮＡ、ピロリジンオキシペプチド核酸（ＰＯＰＮＡ）、グリコールまたはグリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、非環式スレオニノール核酸（ａＴＮＡ）、モルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ、ＰＭＯ−Ｘ）、カチオン性モルホリノオリゴマー（ＰＭＯ＋）、塩基および主鎖組み込みオリゴヌクレオチド（ＯＮＩＢｓ）、ピロリジン−アミドオリゴヌクレオチド（ＰＯＭｓ）、ならびにそれらの誘導体を含む。
【００４０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、修復対象で、好ましくは野生型ポリペプチド配列をコードする標的ＲＮＡに相補的な配列を含有する。従って、コドンの縮重のために、オリゴヌクレオチドは１つ以上の縮重した相補的コドンを含んでよい。相補的なヌクレオチドは修復される部位のいずれかの側に存在してよく、すなわち変化させる配列と隣接する配列は好ましくは変化させる配列の３’側、５’側、または３’側および５’側の両方にあってよい。これらの相補的配列が塩基対形成すると、ＲＮＡ修復が活性化される。
【００４１】
標的ＲＮＡの配列は、好ましくは修復された配列または野生型配列と異なる。修復されない標的ＲＮＡは好ましくは変異している配列である。好ましくは、変異は正常な野生型配列の置換、欠失、または挿入である。修復された標的ＲＮＡは、好ましくは遺伝子の野生型配列または別の所望の参照配列である。
【００４２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは１５〜１００ヌクレオチドの長さを有し、好ましくは少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または少なくとも４０ヌクレオチドの長さを有し、そのうち少なくとも１０個が標的ＲＮＡ配列に相補的である。修復のための鋳型（または誘導物質）としていくつかの他のヌクレオチドを使用することができる。標的ｍＲＮＡ配列との塩基対形成は、細胞内で選択的に生じる。細胞は哺乳類細胞であってよく、培養細胞（インビトロ）または体内（インビボ）に存在してよい。
【００４３】
本発明は好ましくは嚢胞性線維症を治療する方法であって、該遺伝性障害が好ましくはΔＦ５０８変異であり、変化させる配列が好ましくはΔＦ５０８変異を持つＣＦＴＲの（プレ）ｍＲＮＡである嚢胞性線維症を治療する方法に向けられている。本発明は、好ましくは嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）変異ΔＦ５０８を有する患者のＲＮＡを修復するために使用される。３つの欠失したヌクレオチドの代わりに５’−ＵＵＵ−３’または５’−ＣＵＵ−３’を導入すると、タンパク質配列に欠損したフェニルアラニンアミノ酸（ＦまたはＰｈｅ）を回復するＲＮＡの修復をもたらし、それゆえ野生型タンパク質の形成をもたらす。
【００４４】
ＣＦＴＲ  ΔＦ５０８  ＲＮＡは、例えば細胞、好ましくは哺乳類細胞、より好ましくはヒト細胞を、インビトロまたはインビボで本発明のオリゴヌクレオチドに接触および／またはトランスフェクトすることによって修復することができる。
【００４５】
本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号６のヌクレオチド１６〜３０および３４〜４８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列相同性を有する配列に相補的であり、変化させる配列は好ましくは５’−ＵＵＵ−３’および５’−ＣＵＵ−３’から選択され、好ましくは５’−ＣＵＵ−３’である。本発明のより好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１もしくは配列番号３、好ましくは配列番号１を含むオリゴヌクレオチドであり、もしくは該オリゴヌクレオチドからなり；または配列番号１または配列番号３、好ましくは配列番号１の短縮変異体を含むオリゴヌクレオチドであり、または該オリゴヌクレオチドからなる。該短縮変異体はいくつかの、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のヌクレオチドが配列番号１または配列番号３の３’および／または５’末端から除去されている。本発明の好ましい変異体オリゴヌクレオチドは、配列番号１または配列番号３、好ましくは配列番号１のヌクレオチド７〜２９を含む。
【００４６】
配列番号１；５’−ＡＵＣＡＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＵＧＡＵＡＵＵＵＵＣＵＵＵ−３’（ＣＡＰＳヌクレオチドは好ましくは２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ＲＮＡである）。
配列番号３；５’−ＡＵＣＡＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＡＡＵＧＡＵＡＵＵＵＵＣＵＵＵ−３’（ＣＡＰＳヌクレオチドは好ましくは２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ＲＮＡである）。
【００４７】
本発明のさらに好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号１６〜配列番号２４の群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、もしくは該オリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含み、または配列番号１６〜配列番号２４の群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの短縮変異体を含むか、もしくは該短縮変異体からなるオリゴヌクレオチドを含む。該短縮変異体はいくつか、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のヌクレオチドが配列番号１６〜配列番号２４の３’および／または５’末端から除去されている。該オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡ分子の配列を変化させるために、例えばフェニルアラニン（説明目的のため）用の欠失したコドンにおける１または２個の塩基対のフレームシフト挿入、ＣＦＴＲタンパク質のアミノ酸５０８位にフェニルアラニン用のコドンを作成するヌクレオシドトリプレットのインフレーム挿入、ＣＦＴＲタンパク質のアミノ酸５０８位もしくは別のアミノ酸位置にロイシン用のコドンを作成するヌクレオシドトリプレットのインフレーム挿入、またたＣＦＴＲコード配列へのストップコドンの挿入により都合よく使用することができる。本発明のこれらの代表的なオリゴヌクレオチド、すなわち配列番号１６〜２４に示されている分子の作用様式は、図７Ｂ〜８Ｆに示されている。
【００４８】
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、いくつか、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個のヌクレオチドは本明細書に前記した修飾またはその組み合わせを含み、好ましくはヌクレオチド２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む。本明細書に前記した他の安定性を増強する特徴を配列に加えてよく、例えばＬＮＡもしくはＰＮＡヌクレオチドまたはいくつかもしくは全てのヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を使用してよい。あるいは、ＲＮＡヌクレオチドの代わりにＤＮＡヌクレオチドを使用してよい。１つのアンチセンス分子に記載されている修飾の全てまたはいくつかを組み合わせてよい。
【００４９】
上記の修飾は上皮細胞における取り込みを高めうる。あるいは、細胞における取り込みを高めるために、いくつか、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のヌクレオチドを３’および／または５’末端から除去することによって分子は短縮されうる。
【００５０】
インビボでの適用のために、本発明のオリゴヌクレオチドは送達（投与）用にリポソーム、ポリソーム、もしくはナノ粒子、または他の適切な粒子、例えばウイルス粒子にパッケージされてよい。あるいは、または送達ビヒクルと組み合わせて、修復分子はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と複合体を形成しうる。本発明のオリゴヌクレオチドは、インビボでさえ、例えば細胞を、オリゴヌクレオチドをコードするウイルスまたはウイルス様粒子に感染させることによって、細胞内で合成されうる。あるいは、生細胞は（インビトロまたはインビボで）（ウイルス）ＤＮＡまたはプラスミドなどでトランスフェクトされうる。生細胞の感染またはトランスフェクションの際、本発明のオリゴヌクレオチドは正常な転写および／または複製を通じて生細胞内で合成される。
【００５１】
従って、本発明のオリゴヌクレオチドはそれ自体、多細胞生物の細胞、組織、または器官に直接的に送達されうる。本発明のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で周知のいずれかの適切な方法を用いて間接的にも投与されうる。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えばベクターまたは発現ベクターがオリゴヌクレオチドをコードする核酸分子を含むベクターまたは発現ベクターの形態で多細胞生物の細胞、組織、または器官に提供されてよい。発現ベクターは好ましくは遺伝子送達ビヒクルを介して多細胞生物の細胞、組織、または器官に導入される。１つの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドの発現または転写を促進する発現カセットまたは転写カセットを含むウイルスベクターを提供する。好ましい送達ビヒクルはウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、またはレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターなどである。
【００５２】
本発明の１つの実施態様は、ベクターが遺伝子治療に適切なベクターである、上で定義した核酸分子を含むベクターの使用に関する。遺伝子治療に適切なベクターは、Anderson 1998, Nature 392: 25-30; Walther and Stein, 2000, Drugs 60: 249-71; Kay et al, 2001, Nat. Med. 7: 33-40; Russell, 2000, J. Gen. Virol. 81: 2573-604; Amado and Chen, 1999, Science 285: 674-6; Federico, 1999, Curr. Opin. Biotechnol.10: 448-53; Vigna and Naldini, 2000, J. Gene Med. 2: 308-16; Marin et al, 1997, Mol. Med. Today 3: 396- 403; Peng and Russell, 1999, Curr. Opin. Biotechnol. 10: 454-7; Sommerfelt, 1999, J. Gen. Virol. 80: 3049-64; Reiser, 2000, Gene Ther. 7: 910-3；およびそれらの中で引用されている参考文献に記載されている。
【００５３】
特に適切な遺伝子治療ベクターはアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。これらのベクターは多数の分裂および非分裂細胞型に感染する。さらに、アデノウイルスベクターは、高レベルの導入遺伝子発現を可能にする。しかしながら、細胞内移行後のアデノウイルスおよびＡＡＶベクターのエピソーム性のために、これらのウイルスベクターは導入遺伝子の一過性発現のみを要する治療適用に最も適している（上記のRussell, 2000, J. Gen. Virol. 81: 2573-2604; Goncalves, 2005, Virol J. 2(1):43）。好ましいアデノウイルスベクターはRussell（2000、上記）に概説されているように、宿主応答を減少させるために修飾されている。
【００５４】
本発明に適用する好ましいレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベースの発現コンストラクトである。レンチウイルスベクターは非分裂細胞に感染する特有の能力を有する（Amado and Chen, 1999 Science 285: 674-6）。レンチウイルスベースの発現コンストラクトの構築および使用方法は、米国特許第６，１６５，７８２号、第６，２０７，４５５号、第６，２１８，１８１号、第６，２７７，６３３号、および第６，３２３，０３１号、ならびにFederico（1999, Curr Opin Biotechnol 10: 448-53）およびVigna et al.（2000, J Gene Med 2000; 2: 308-16）に記載されている。
【００５５】
一般的に、遺伝子治療ベクターは、発現される本発明のオリゴヌクレオチドをコードする核酸分子を含み、それによって該核酸分子が適切な制御配列と作動可能に連結されているという意味で、上記の発現ベクターであると考えられる。該制御配列は少なくともプロモーター配列を含む。遺伝子治療ベクターからポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するための適切なプロモーターは、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中間体初期プロモーター、ウイルス末端反復配列プロモーター（ＬＴＲｓ）、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ラウス肉腫ウイルス、またはＨＴＬＶ−１由来のもの、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターを含む。
【００５６】
肺を対象とした多くの医薬は、気道を経由して適用することができる。１つのそのような医薬は、ＲＮＡ修復分子、すなわち本発明のオリゴヌクレオチドからなりうる。ネブライザーは、本発明のオリゴヌクレオチドをエアロゾルで気道上皮細胞に送達するために好ましくは使用される。あるいは、乾燥粉末吸入製剤を使用することもできる。気道送達系における本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドの使用は、投与の間に剪断力による分子の分解の機会を減少させる。
【００５７】
多くの疾患において、粘液層は粘度増加を示しており、肺を経由した医薬の吸収の減少をもたらす。１つのそのような疾患は慢性気管支炎であり、別の例は嚢胞性線維症である。様々な形態の粘液ノーマライザーが利用でき、例えばデオキシリボヌクレアーゼ、またはブロンキトール（Ｂｒｏｎｃｈｉｔｏｌ）の商品名で市販されているマンニトールの高張食塩水が利用できる。ＲＮＡ修復化合物、例えば本発明のオリゴヌクレオチドと組み合わせて粘液ノーマライザーを使用する場合、それらは該医薬の有効性を増加させうる。従って、対象、好ましくはヒト対象への本発明のオリゴヌクレオチドの投与は、好ましくは粘液ノーマライザー、好ましくは本明細書で記載されている粘液ノーマライザーと併用される。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドの投与は、ＣＦ治療用の小分子、例えば増強剤化合物、例えばカリデコ（Ｋａｌｙｄｅｃｏ）（アイバカフトール；ＶＸ−７７０）、またはコレクター化合物、例えばＶＸ−８０９（ルマカフトル（Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ））および／もしくはＶＸ−６６１の投与と併用することができる。
【００５８】
あるいは、または粘液ノーマライザーと組み合わせて、粘液透過性粒子またはナノ粒子での送達は、例えば肺および腸の上皮細胞へのＲＮＡ修復分子の効率的送達に適用することができる。従って、対象、好ましくはヒト対象への本発明のオリゴヌクレオチドの投与は、好ましくは粘液透過性粒子またはナノ粒子での送達を使用する。
【００５９】
慢性および急性肺感染は、疾患、例えば嚢胞性線維症を有する患者にしばしば存在する。抗生物質治療は、細菌感染ならびに粘液増粘（mucus thickening）および／またはバイオフィルム形成などの症状を減少させる。ＲＮＡ修復分子と組み合わせた抗生物質の使用は、標的細胞への修復分子のアクセスをより容易にするため、ＲＮＡ修復の有効性を増加させうる。従って、対象、好ましくはヒト対象への本発明のオリゴヌクレオチドの投与は、好ましくは細菌感染ならびに粘液増粘および／またはバイオフィルム形成などの症状を減少させるために抗生物質治療と併用される。抗生物質は全身的に、局所的に、またはその両方で投与することができる。
【００６０】
例えば嚢胞性線維症患者に適用するために、本発明のオリゴヌクレオチド、または本発明のパッケージされ、または複合体形成したオリゴヌクレオチドは、いずれかの粘液ノーマライザー、例えばデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、マンニトール、もしくは高張食塩水、および／もしくは抗生物質および／もしくはＣＦの治療のための小分子、例えば増強剤化合物、例えばカリデコ（アイバカフトール；ＶＸ−７７０）、またはコレクター化合物、例えばＶＸ−８０９（ルマカフトル）および／もしくはＶＸ−６６１と併用してよい。
【００６１】
標的細胞へのアクセスを増加させるために、本発明のオリゴヌクレオチドの投与前に気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を適用して肺を浄化してよい。
【００６２】
腸上皮細胞への本発明のオリゴヌクレオチドの送達のために、持続放出カプセル剤を使用することができる。これらの細胞内でのＣＦＴＲ修復は、栄養取り込みを高めうる。これは生物または合成起源の膵臓酵素製剤、例えば市販され、消化を助けるためにＣＦ患者に一般的に使用されているパンクレリパーゼまたはクレオン（Ｃｒｅｏｎ）の使用と併用することができる。
【００６３】
本発明の全ての実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは高張食塩水組成物、すなわち本発明のオリゴヌクレオチドを含み、２％〜９％の食塩水、好ましくは３％〜８％の食塩水、より好ましくは４％〜８％の食塩水、より好ましくは５％〜８％の食塩水、より好ましくは６％〜８％の食塩水（例えば６．１％、６．２％、６．３％、６．４％、６．５％、６．６％、６．７％、６．８％、６．９％、７．０％、７．１％、７．２％、７．３％、７．４％、７．５％、７．６％、７．７％、７．８％、７．９％、または８．０％）、より好ましくは６％〜７％の食塩水、さらに好ましくは約７％の食塩水、最も好ましくは７％の食塩水をさらに含む組成物中に存在してよい。本明細書における食塩水のパーセンテージは、食塩水の重量／組成物の総体積として定義され、すなわち７％の食塩水は７０グラムの食塩水／１リットルの組成物に対応する。高張食塩水は好ましくは本質的にＮａＣｌ溶液である。
【００６４】
本発明のいずれかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドおよび／または組成物は、当業者に周知のいずれかの方法に従って投与されてよく、例えば限定されるものではないが、好ましくは気道を経由した肺への投与、および全身投与、好ましくは静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、または皮下投与で投与されてよい。
【００６５】
当業者であれば、本明細書で上記した送達方法、ビヒクル、および投与の組み合わせは、本発明の方法および使用でさらに組み合わせることができ、例えば本発明のオリゴヌクレオチドおよび／または該オリゴヌクレオチドを含む組成物は、本明細書で記載されている送達化合物と複合体を形成していてよく、本明細書で記載されている送達ビヒクルにパッケージされてよく、および／または持続放出カプセル剤にパッケージされてよいことを理解できるであろう。
【００６６】
１つの好ましい送達方法はウイルス粒子または本発明のオリゴヌクレオチドをコードするウイルス核酸配列の形態での送達であり、好ましくは本明細書に前記されているように、該オリゴヌクレオチドは生細胞へのウイルス粒子の感染または生細胞へのウイルス核酸配列のトランスフェクションで発現される。
【００６７】
本発明のオリゴヌクレオチドの送達は、好ましくは気道を経由した肺への送達、および／または腸への送達であってよい。投与は好ましくは本明細書に記載されている粘液ノーマライザーおよび／もしくは好ましくは本明細書に記載されている抗生物質治療と併用してよく、ならびに／または好ましくは本明細書に記載されている膵臓酵素製剤の投与と併用してよく、ならびに／または標的細胞へのアクセスを高めるために気管支肺胞洗浄と併用してよい。
【００６８】
当業者であれば、２つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドを組み合わせてよいことを理解できるであろう。当業者であれば、本明細書で本発明のオリゴヌクレオチドに言及する場合、本発明の方法および使用に本発明の組成物または医薬組成物が好ましくは互換的に使用することができることを理解できるであろう。
【００６９】
１つの態様において、本発明は生細胞に存在する標的ＲＮＡ分子の配列を変化させるためのオリゴヌクレオチドの使用であって、生細胞による該オリゴヌクレオチドの取り込みを許容する条件下でオリゴヌクレオチドを生細胞に提供する工程を含む使用であり、該オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡ分子に少なくとも部分的に相補的な配列を含み、それによりオリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡ、またはその前駆体、もしくはそのための鋳型のハイブリダイゼーションが該生細胞内で起こり、直接的に、またはその前駆体もしくはそのための鋳型を介して、該生細胞に存在する生化学的機構が標的ＲＮＡ分子の配列と比較したオリゴヌクレオチドの配列の相違をＲＮＡ分子にコピーすることを許容し、それにより該標的ＲＮＡの配列の変化をもたらす使用を提供する。
【００７０】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドは本明細書に前記されているオリゴヌクレオチドである。
【００７１】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドはオリゴリボヌクレオチドである。
【００７２】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドは一本鎖の形態で生細胞に提供される。
【００７３】
好ましくは、この態様の実施態様において、生細胞は多細胞生物の一部である。
【００７４】
好ましくは、この態様の実施態様において、生細胞は動物細胞、より好ましくはヒト細胞である。
【００７５】
好ましくは、この態様の実施態様において、標的ＲＮＡの配列の変化は細胞の表現型を変化させる。
【００７６】
好ましくは、この態様の実施態様において、該標的ＲＮＡの変化は該標的ＲＮＡ、またはその前駆体、もしくはそのための鋳型の配列を決定することによって確認される。
【００７７】
好ましくは、この態様の実施態様において、該標的ＲＮＡの変化はポリペプチド産物または該標的ＲＮＡによってコードされている該ポリペプチドをコードしている核酸配列の配列を決定することによって確認される。
【００７８】
好ましくは、この態様の実施態様において、該標的ＲＮＡの変化は該生細胞、または該細胞を含む生物の表現型の変化を決定することによって確認される。
【００７９】
好ましくは、この態様の実施態様において、該変化は変化前の標的ＲＮＡの配列が原因として関係している障害の改善である。
【００８０】
好ましくは、この態様の実施態様において、障害は遺伝性障害である。
【００８１】
好ましくは、この態様の実施態様において、この態様のオリゴヌクレオチドは１５〜１００ヌクレオチドの長さを有する。より好ましくは、オリゴヌクレオチドの長さは２０〜５０、より好ましくは２５〜４５ヌクレオチド、より好ましくは２７〜３５ヌクレオチドである。
【００８２】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドはイノシンを含み、ならびに／または、好ましくは２’−Ｏアルキルリボース、２’フルオロリボース、ＰＭＯ、５−メチル−ｄＣ、２−アミノ−ｄＡ、およびＣ５−ピリミジンからなる群から選択される修飾ヌクレオチド、ならびに／またはホスホロチオエート結合およびメチルホスホネート結合からなる群から選択される修飾ヌクレオシド間結合を含む。
【００８３】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドはＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、および／またはＬＮＡを含む。
【００８４】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオシドは２’−Ｏアルキルリボースヌクレオシド、より好ましくは、２’−Ｏメチルリボースヌクレオシドである。
【００８５】
好ましくは、この態様の実施態様において、全ヌクレオシドはリボヌクレオシドである。
【００８６】
好ましくは、この態様の実施態様において、標的ＲＮＡ分子の配列の変化は１つ以上のヌクレオシドの挿入または置換を含む。
【００８７】
好ましくは、この態様の実施態様において、標的ＲＮＡはヒトＣＦＴＲをコードし、該変化はＣＦＴＲタンパク質の５０８位のアミノ酸のフェニルアラニンをコードしているヌクレオシドトリプレットの生成または回復をもたらす。
【００８８】
好ましくは、この態様の実施態様において、該変化は５’−ＵＵＵ−３’および５’−ＣＵＵ−３’からなる群から選択されるヌクレオシドトリプレットの挿入を含む。
【００８９】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドは配列番号６のヌクレオチド１６〜３０および３４〜４８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列相同性を有する配列に相補的であり、該変化は５’−ＵＵＵ−３’および５’−ＣＵＵ−３’からなる群から選択されるヌクレオシドトリプレットの挿入を含む。
【００９０】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドは配列番号１または配列番号３、好ましくは配列番号１のヌクレオチド７〜２９、好ましくはヌクレオチド１〜３３を含み、または該ヌクレオチドからなる。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号１６〜配列番号２４の群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、もしくは該オリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含み、または配列番号１６〜配列番号２４の群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの短縮変異体を含むか、もしくは該短縮変異体からなるオリゴヌクレオチドを含む。該短縮変異体は、いくつか、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のヌクレオチドが配列番号１６〜配列番号２４の３’および／または５’末端から除去されている。
【００９１】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドはビヒクル、好ましくはリポソーム、ポリソーム、もしくはナノ粒子で提供され、および／またはオリゴヌクレオチドは送達化合物、好ましくはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と複合体を形成し、および／もしくはステロール、好ましくはコレステロールと結合している。
【００９２】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドは好ましくは気道を経由して、乾燥製剤またはエアロゾルで、好ましくはネブライザーを用いて肺に提供され、好ましくは、オリゴヌクレオチドは当業者に周知のトランスフェクションメディエーターおよび／もしくは嚢胞性線維症治療薬、好ましくはデオキシリボヌクレアーゼもしくはマンニトール（好ましくはブロンキトール）、ならびに／またはＣＦの治療のための小分子、好ましくはカリデコ（アイバカフトール；ＶＸ−７７０）、ＶＸ−８０９（ルマカフトル）および／もしくはＶＸ−６６１と共に提供される。
【００９３】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドは高張食塩水で提供され、好ましくは２％〜９％の食塩水濃度、好ましくは３％〜８％、より好ましくは４％〜８％、より好ましくは５％〜８％、より好ましくは６％〜８％、より好ましくは６％〜７％、さらに好ましくは約７％の食塩水濃度の高張食塩水で提供され、高張食塩水は好ましくは生理的および医薬的に許容される溶液である。
【００９４】
好ましくは、この態様の実施態様において、高張食塩水は本質的にＮａＣｌ溶液である。
【００９５】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドは粘液透過性粒子、好ましくは粘液透過性ナノ粒子で投与される。
【００９６】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドの投与は細菌感染ならびに粘液増粘および／またはバイオフィルム形成などの症状を減少させるために抗生物質治療と併用される。
【００９７】
好ましくは、この態様の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドの投与前に気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）が適用される。
【００９８】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドは腸細胞への送達を促進するために持続放出カプセル剤で投与される。
【００９９】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドの投与はパンクレリパーゼまたはクレオンなどの生物学的または合成膵臓酵素組成物の投与と併用される。
【０１００】
さらなる態様において、本発明はヒトまたは動物の体の治療における使用のためのオリゴヌクレオチドであって、生細胞による該オリゴヌクレオチドの取り込みを許容する条件下でオリゴヌクレオチドを生細胞に提供することによって、該オリゴヌクレオチドが該ヒトまたは動物の体の生細胞に存在する標的ＲＮＡ分子の配列を変化させることができ、該オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡ分子に少なくとも部分的に相補的な配列を含み、それによりオリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡ、またはその前駆体、もしくはそのための鋳型のハイブリダイゼーションが該生細胞内で起こり、直接的に、またはその前駆体もしくはそのための鋳型を介して、該生細胞に存在する生化学的機構が標的ＲＮＡ分子と比較したオリゴヌクレオチドの配列の相違をＲＮＡ分子にコピーすることを許容し、それにより該標的ＲＮＡの変化をもたらすオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１０１】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドは本明細書に前記されているオリゴヌクレオチドである。
【０１０２】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドはオリゴリボヌクレオチドである。
【０１０３】
好ましくは、この態様の実施態様において、標的ＲＮＡの配列の変化は細胞の表現型を変化させる。
【０１０４】
好ましくは、この態様の実施態様において、該標的ＲＮＡの配列の変化は該標的ＲＮＡ、またはその前駆体、もしくはそのための鋳型の配列を決定することによって確認される。
【０１０５】
好ましくは、この態様の実施態様において、該標的ＲＮＡの配列の変化は該標的ＲＮＡによってコードされているポリペプチド産物の配列を決定することによって確認される。
【０１０６】
好ましくは、この態様の実施態様において、該標的ＲＮＡの配列の変化は該生細胞、または該細胞を含む生物の表現型の変化を決定することによって確認される。
【０１０７】
好ましくは、この態様の実施態様において、表現型の変化は変化前の標的ＲＮＡの配列が原因として関係している障害の改善である。
【０１０８】
好ましくは、この態様の実施態様において、障害は遺伝性障害である。
【０１０９】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドは１５〜１００ヌクレオチドの長さを有する。
【０１１０】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドの長さは２０〜５０、より好ましくは２５〜４５ヌクレオチド、より好ましくは２７〜３５ヌクレオチドである。
【０１１１】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴリボヌクレオチドはイノシンを含み、ならびに／または、好ましくは２’−Ｏアルキルリボース、２’フルオロリボース、ＰＭＯ、５−メチル−ｄＣ、２−アミノ−ｄＡ、およびＣ５−ピリミジンからなる群から選択される修飾ヌクレオチド、ならびに／またはホスホロチオエート結合およびメチルホスホネート結合からなる群から選択される修飾ヌクレオシド間結合を含む。
【０１１２】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオシドは２’−Ｏアルキルリボースヌクレオシド、より好ましくは、２’−Ｏメチルリボースヌクレオシドである。
【０１１３】
好ましくは、この態様の実施態様において、全ヌクレオシドはリボヌクレオシドである。
【０１１４】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドはＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、および／またはＬＮＡを含む。
【０１１５】
本発明の全ての実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは治療される細胞（組織）、生物の重量、投与の様式および／または部位（局所対全身、投与部位（腹腔内、筋肉内、または肺など）、治療される障害、および適用される治療計画（単回もしくは反復のボーラスまたは持続投与）などに依存して、典型的には１μｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは１０μｇ〜１００ｍｇ、さらに好ましくは１００μｇ〜１０ｍｇ、最も好ましくは５００μｇ〜５ｍｇの範囲の用量で投与される。当業者であれば、多少の試行錯誤によって最適な用量を確立することができるであろう。
【０１１６】
好ましくは、この態様の実施態様において、標的ＲＮＡ分子の配列の変化は１つ以上のヌクレオシドの挿入または置換を含む。
【０１１７】
好ましくは、この態様の実施態様において、標的ＲＮＡはヒトＣＦＴＲをコードし、該変化はＣＦＴＲタンパク質の５０８位のアミノ酸のフェニルアラニンをコードしているヌクレオシドトリプレットの生成または回復をもたらす。
【０１１８】
好ましくは、この態様の実施態様において、該変化は５’−ＵＵＵ−３’および５’−ＣＵＵ−３’からなる群から選択されるヌクレオシドトリプレットの挿入を含む。
【０１１９】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドは配列番号６のヌクレオチド１６〜３０および３４〜４８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列相同性を有する配列に相補的であり、該変化は５’−ＵＵＵ−３’および５’−ＣＵＵ−３’からなる群から選択されるヌクレオシドトリプレットの挿入を含む。
【０１２０】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドは配列番号１または配列番号３、好ましくは配列番号１のヌクレオチド７〜２９、好ましくはヌクレオチド１〜３３を含み、または該ヌクレオチドからなる。別の好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号１６〜配列番号２４の群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、もしくは該オリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含み、または配列番号１６〜配列番号２４の群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの短縮変異体を含むか、もしくは該短縮変異体からなるオリゴヌクレオチドを含む。該短縮変異体はいくつか、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のヌクレオチドが配列番号１６〜配列番号２４の３’および／または５’末端から除去されている。
【０１２１】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドはビヒクル、好ましくはリポソーム、ポリソーム、もしくはナノ粒子で提供され、および／またはオリゴヌクレオチドは送達化合物、好ましくはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と複合体を形成し、および／もしくはステロール、好ましくはコレステロールと結合している。
【０１２２】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドは好ましくは気道を経由して、乾燥製剤またはエアロゾルで、好ましくはネブライザーを用いて呼吸器または肺に提供され、好ましくは、オリゴヌクレオチドは当業者に周知のトランスフェクションメディエーターおよび／もしくは嚢胞性線維症治療薬、好ましくはデオキシリボヌクレアーゼもしくはマンニトール（好ましくはブロンキトール）、ならびに／またはＣＦの治療のための小分子、好ましくはカリデコ（アイバカフトール；ＶＸ−７７０）、ＶＸ−８０９（ルマカフトル）および／もしくはＶＸ−６６１と共に提供される。
【０１２３】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドは高張食塩水組成物で提供され、好ましくは２％〜９％の食塩水濃度、好ましくは３％〜８％、より好ましくは４％〜８％、より好ましくは５％〜８％、より好ましくは６％〜８％、より好ましくは６％〜７％、さらに好ましくは約７％の食塩水濃度の高張食塩水組成物で提供され、高張食塩水は好ましくは生理的および医薬的に許容される溶液である。
【０１２４】
好ましくは、この態様の実施態様において、高張食塩水は本質的にＮａＣｌ溶液である。
【０１２５】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドは粘液透過性粒子、好ましくは粘液透過性ナノ粒子で提供される。
【０１２６】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドの投与は細菌感染ならびに粘液増粘および／またはバイオフィルム形成などの症状を減少させるために抗生物質治療と併用される。
【０１２７】
好ましくは、この態様の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドの投与前に気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）が適用される。
【０１２８】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドは腸細胞への送達を促進するために持続放出カプセル剤で投与される。
【０１２９】
好ましくは、この態様の実施態様において、オリゴヌクレオチドの投与はパンクレリパーゼまたはクレオンなどの生物学的または合成膵臓酵素組成物の投与と併用される。
【０１３０】
さらなる態様において、本発明は本発明の前述の態様で定義されているオリゴヌクレオチド、医薬的に許容される担体、ならびに／または高張性の生理的および医薬的に許容される食塩水、好ましくは２％〜９％の食塩水濃度、好ましくは３％〜８％、より好ましくは４％〜８％、より好ましくは５％〜８％、より好ましくは６％〜８％、より好ましくは６％〜７％、さらに好ましくは約７％の食塩水濃度の食塩水を含む医薬組成物を提供する。
【０１３１】
好ましくは、この態様の実施態様において、高張食塩水は本質的にＮａＣｌ溶液である。
【０１３２】
好ましくは、この態様の実施態様において、医薬組成物はトランスフェクションメディエーターをさらに含む。
【０１３３】
好ましくは、この態様の実施態様において、医薬組成物は当業者に周知の嚢胞性線維症治療薬、好ましくはデオキシリボヌクレアーゼもしくはマンニトール、ならびに／またはＣＦの治療のための小分子、好ましくはカリデコ（アイバカフトール；ＶＸＶＸ−７７０）、ＶＸ−８０９（ルマカフトル）および／もしくはＶＸ６６１をさらに含む。
【０１３４】
さらなる態様において、本発明は本明細書の様々な態様および実施態様で定義されている本発明のオリゴヌクレオチドおよび／または該オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。好ましくは、本発明の該オリゴヌクレオチドまたは組成物は、配列番号６のヌクレオチド１６〜３０および３４〜４８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列相同性を有する配列に相補的である一本鎖オリゴリボヌクレオチドまたは一本鎖オリゴリボヌクレオチドを含む医薬組成物である。より好ましくは、本発明の該オリゴヌクレオチドまたは組成物は、配列番号１または配列番号３、好ましくは配列番号１のヌクレオチド７〜２９、好ましくはヌクレオチド１〜３３を含む一本鎖オリゴリボヌクレオチドまたは一本鎖オリゴリボヌクレオチドを含む医薬組成物である。別の好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号１６〜配列番号２４の群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、もしくは該オリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含み、または配列番号１６〜配列番号２４の群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの短縮変異体を含むか、もしくは該短縮変異体からなるオリゴヌクレオチドを含む。該短縮変異体はいくつか、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のヌクレオチドが配列番号１６〜配列番号２４の３’および／または５’末端から除去されている。
【０１３５】
本発明の全ての実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドの安定性、溶解度、吸収、バイオアベイラビリティ、活性、薬物動態、薬物動力学、ならびに細胞および細胞内への送達の増強を（さらに）助ける賦形剤が使用されてよく、具体的には細胞膜を通じて小胞またはリポソームと複合体を形成し、またはトラップされる化合物、物質、ならびに／またはオリゴヌクレオチドを送達する、複合体、小胞、ナノ粒子、微粒子、ナノチューブ、ナノゲル、ヒドロゲル、ポロクサマーもしくはプルロニック、ポリマーソーム、コロイド、微小気泡、小胞、ミセル、リポプレックスおよび／またはリポソームを形成することができる賦形剤が使用されてよい。ナノ粒子の例は金ナノ粒子、磁気ナノ粒子、シリカナノ粒子、脂質ナノ粒子、糖粒子、タンパク質ナノ粒子、およびペプチドナノ粒子を含む。別のナノ粒子の群は、ポリマーナノ粒子である。これらのポリマー物質の多くは当該技術分野で周知である。適切な物質は、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ＥｘＧｅｎ  ５００、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）、ポリ（２−ヒドロキシプロピレンイミン（ｐＨＰ））、デキストラン誘導体（例えばＤＮＡトランスフェクション試薬として周知であるジエチルアミノエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストランなどのポリカチオンであり、ブチルシアノアクリレート（ＰＢＣＡ）およびヘキシルシアノアクリレート（ＰＨＣＡ）と併用してカチオン性ナノ粒子を製剤化することができ、細胞膜を透過して細胞内へ該化合物を送達することができる）、ブチルシアノアクリレート（ＰＢＣＡ）、ヘキシルシアノアクリレート（ＰＨＣＡ）、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリアミン（例えばスペルミン、スペルミジン、プトレシン、またはカダベリン）、キトサン、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（エステルアミン）、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）  シクロデキストリン、ヒアルロン酸、コロミン酸、およびその誘導体）、デンドリマー（例えばポリ（アミドアミン）、脂質｛例えばｌ，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、ジオレオイルジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＡＣ）、フォスファチジルコリン誘導体［例えば１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）］、リゾ−フォスファチジルコリン誘導体［例えばｌ−ステアロイル−２−リゾ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｓ−ＬｙｓｏＰＣ）］、スフィンゴミエリン、２−｛３−［ビス−（３−アミノ−プロピル）−アミノ］−プロピルアミノ｝−Ｎ−ジテトラセジルカルバモイルメチルアセトアミド（ＲＰＲ２０９１２０）、ホスホグリセロール誘導体［例えばｌ，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール，ナトリウム塩（ＤＰＰＧ−Ｎａ）、ホスファチジン酸誘導体［ｌ，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸、ナトリウム塩（ＤＳＰＡ）、フォスファチジルエタノールアミン誘導体［例えばジオレオイル−Ｊ−Ｒ−フォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ｌ，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミ��（ＤＳＰＥ）、２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）］、ＪＶ−［ｌ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）、ｌ，３−ジ−オレオイルオキシ−２−（６−カルボキシ−スペルミル）−プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）、（ｌ，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、（Ｎｌ−コレステリルオキシカルボニル−３，７−ジアザノナン−ｌ，９−ジアミン（ＣＤＡＮ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、ｌ−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、（ｂ−Ｌ−アルギニル−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレリル−アミドトリハイドロクロライド（ＡｔｕＦＥＣＴＯｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン誘導体［例えばｌ，２−ジステアロイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、ｌ，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤｏＤＭＡ）、ｌ，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル［ｌ，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、フォスファチジルセリン誘導体［ｌ，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン、ナトリウム塩（ＤＯＰＳ）］、コレステロール｝、合成両親媒性物質（ＳＡＩＮＴ−１８）、リポフェクチン、タンパク質（例えばアルブミン、ゼラチン、アテロコラーゲン）、ペプチド（例えばＰｅｐＦｅｃｔｓ、ＮｉｃｋＦｅｃｔｓ、ポリアルギニン、ポリリジン、ＣＡＤＹ、ＭＰＧ）、その組み合わせ、ならびに／または該化合物またはオリゴヌクレオチドを細胞に送達することができる粒子に自己組織化することができるウイルスカプシドタンパク質を含む。リポフェクチンは、リポソームトランスフェクション剤の例を表す。それは、少なくとも２つの脂質成分、カチオン性脂質Ｎ−［ｌ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）（ｃｐ．ＤＯＴＡＰはメチル硫酸塩）および中性脂質ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる。中性成分は細胞内放出を媒介する。これらのナノ粒子材料に加えて、カチオン性ペプチドプロタミンはオリゴヌクレオチドをコロイドとして製剤化する代替的アプローチを提供する。このコロイド状ナノ粒子系は、いわゆるプロティクル（proticles）を形成することができるが、これは、パッケージングのための単純な自己組織化プロセスによって製造することができ、本明細書で定義している化合物の細胞内放出を媒介する。当業者であれば、上記の、または他の市販の、もしくは市販されていない代替的賦形剤および送達系のいずれかを選択および適合させることができるであろう。
【０１３６】
本発明は対象、好ましくはヒト対象へ本発明のオリゴヌクレオチドまたは本発明の組成物を投与することを含む、対象の（遺伝性）障害または（遺伝子）変異と関連している疾患の予防または治療方法も提供する。
【０１３７】
（遺伝性）障害、（遺伝子）変異、オリゴヌクレオチド、組成物、および投与は、好ましくは本明細書に前記したものである。
【０１３８】
本発明の記載において、用語「遺伝性（または遺伝子）」は、標的ＲＮＡ分子の変異が必ずしも遺伝的にコードされていなければならないわけではないことを示すよう括弧内に示されている。それらは（誤った）ＲＮＡ編集、異常なプレＲＮＡスプライシングもしくはプロセシング、またはいずれかの他の（未知の）メカニズムに起因しうる。
【０１３９】
本明細書および特許請求の範囲において、動詞「〜を含む」およびその活用は、該用語の後に記載されている事項が含まれているが、具体的に記載されていない事項が排除されていないことを意味するその非限定的意味で使用されている。さらに、文脈が１つの要素のみが存在すること明確に要求していない限り、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素への参照は、２つ以上の要素が存在する可能性を排除しない。それゆえ不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。
【０１４０】
用語「約」または「およそ」が数値と関連して使用されている場合（例えば約１０）、好ましくは、該値は示された値（例えば１０）または該値よりも０．１％小さな値から０．１％大きな値の範囲であってもよいことを意味する。
【０１４１】
本明細書で提供される配列情報は、誤って同定されたヌクレオチドの包含を要するほど狭義に解釈されるべきではない。当業者であれば、そのような誤って同定されたヌクレオチド同定することができるであろうし、そのような誤りを修正する方法を知っているであろう。配列エラーがある場合、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびポリヌクレオチド配列が優先すべきである。
【０１４２】
本明細書で引用されている全ての特許および参考文献は、それらの全体において参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０１４３】
本発明は以下の実施例によってさらに記載されるが、実施例は本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１４４】
特段の記載がない限り、本発明の実施には分子生物学、微生物学、および／または生化学の標準的な従来の方法が利用される。該技術は、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press; in Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA; and in Volumes I and II of Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (UK); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait editor); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins, eds.)に記載されている。
【実施例】
【０１４５】
実施例１
ＱＲ−０１０のインビボ評価
嚢胞性線維症（ＣＦ）の表現型は、機能性ＣＦＴＲタンパク質の欠損によって引き起こされ、塩素イオン流出の減少をもたらす。ＣＦＴＲはナトリウムチャネルＥＮａＣの負の調節因子でもある。ＣＦＴＲの欠損はＥＮａＣを誘導し、ナトリウムの過吸収、浸透圧バランスのさらなる不均衡化、およびＣＦ表現型の悪化をもたらす。ＣＦＴＲの修復は塩素イオン輸送を増加させ、ナトリウム過吸収が減少するという付加的効果を有する。
【０１４６】
ＣＦＴＲを治療する薬剤の有効性は、嚢胞性線維症マウスモデルで鼻電位差（ＮＰＤ）を決定することによって測定することができる（Leal et al, 2006, Lab animals 40: 43-52）。ＮＰＤ測定は、動物およびヒトの鼻上皮の電流を測定する方法である。ここで、測定の間に発生するトレースにおいて、ナトリウム輸送は開始時とＥＮａＣ遮断薬の添加後の間の電流差を計算することによって決定する。ＣＦＴＲ活性については、塩素イオンマイナスバッファーおよび／またはフォルスコリン適用の前後の間の差を決定する。
【０１４７】
電位の減少は、ＣＦに観察されるＥＮａＣ機能亢進の減少による効果的な治療を示す。ナトリウムはＣＦＴＲによって制御されるＥＮａＣにより輸送される。ＣＦにおける機能性ＣＦＴＲの欠損のために、ＥＮａＣは下方制御されず、ナトリウムの過吸収をもたらし、その後ＣＦ表現型を悪化させる。
【０１４８】
フォルスコリン誘導による電位の増加も効果的な治療を示す。典型的には、ＣＦマウスにおいて、塩素イオンマイナスＣＦＴＲ応答はなく、フォルスコリン誘導性ＣＦＴＲ応答もない；治療後に、統計学的に有意なフォルスコリン誘導性ＣＦＴＲ応答の補正を観察することができれば、これは効果的な治療であることを示す。
【０１４９】
要約すると、８匹のＣＦ−ｄＦ５０８マウスをＰｒｏＱＲ社のＱＲ−０１０分子（配列番号１に示されている配列を有するオリゴヌクレオチド）で治療した。マウスに複数回にわたって２μＬの水に溶解した４０μｇのＱＲ−０１０を鼻腔内投与した。マウスに対し、０日目に治療前ＮＰＤ測定を行い、２、４および７日目に該分子の投与を行い、９日目に治療後ＮＰＤ測定を行った。３匹のマウスに対しては、１０、１３および１５日目に引き続き投与を行い、１７日目に治療後測定を行った。
【０１５０】
ＮＰＤ測定は、Leal et al, 2006, Lab animals 40: 43-52に従って、一部修正し、データメモリー高インピーダンス（＞１．０Ｅ＋１２Ω）電圧計（Knick Portamesss 913, Elektronische Mebgerate, ベルリン, ドイツ）を用いて以下のように実施した。要約すると、マウスをそれらの背中が加温パッドに接するように置き、足と尾を邪魔にならないようにテープで固定した。羽根付き静脈内カテーテル（０．７１９ｍｍ、Ｉｎｓｙｔｅ−Ｗｔ、ベクトンディッキンソン社、ユタ州、米国）に希釈電極クリーム（Ｓｉｇｎａ［パーカーラボラトリーズ、フェアフィールド、ニュージャージー州、米国］クリーム／ＫＣｌ  １ｍｏｌ／Ｌ  １：１  ｖｏｌ／ｖｏｌ）を満たし、後肢の皮下に挿入し、基準Ａｇ／ＡｇＣｌ電極（ＳＬＥインストラメンツ、サウスクロイドン、英国）を結合する架橋として用いた。ダブルルーメンカテーテル（外径［ＯＤ］  ｒ０．３ｍｍ）を鼻腔に設置し、１つのルーメンを等張食塩水緩衝液の灌流に使用し、もう一方を電極の測定に使用した。そのインピーダンスは＜１．０Ｅ＋６Ωであった。動物の舌を動かして横向きにし、口腔から過剰な液体を吸収するために、濾紙のとがった芯を咽頭に向かって約１ｃｍの口内に挿入した。灌流した鼻孔から流れ出る過剰な液体を鼻先で保持した濾紙で吸収し、反対の鼻孔に溶液が入らないようにした。通常、薬物注射の５分後、加温パッドを穏やかに約３０度傾け、動物の頭部を下向きにし、ペリスタルティックポンプ（Ｐ１、アマシャムバイオサイエンシズ、ローセンダール、オランダ）を用いて１５ｍＬ／ｍｉｎの速度で経鼻灌流を開始した。灌流を開始する前に、安定な値が得られるまでベースライン経鼻ＰＤを測定した。溶液は電位が安定化した後にのみ交換した。基礎等張食塩水は、以下の成分で構成した（ｍｍｏｌ／Ｌ）：Ｎａ＋  １４０、Ｃｌ−  １２０、Ｋ＋  ５．２、ＨＣＯ３−  ２５、ＨＰＯ４２−  ２．４、Ｈ２ＰＯ４−  ０．４、Ｃａ２＋  １．２、およびＭｇ２＋  １．２。鼻上皮からの塩素イオン流出を検出するために使用される塩素イオンを含まない溶液は、ＮａＣｌおよびＣａＣｌ２を等モルのグルコネートと置き換え、ＭｇＣｌ２をＭｇＳＯ４と置き換えることによって製造した。モル浸透圧濃度は２７５ｍＯｓｍ／Ｌであり、ｐＨは７．４であった。開始ＮＰＤ値は、主にＥＮａＣによって発生したナトリウム電流に起因する。このチャネルはアミロライドで遮断され、電位がゼロまで減少した。塩素イオンを含まないバッファーを加えてＣＦＴＲによって輸送される塩素イオンを測定し、フォルスコリンを使用してＣＦＴＲを活性化する。実験の終わりに、一定用量のナロキソン（４ｍｇ）、競合的モルヒネ（morphinic）アンタゴニスト、アチパメゾール、およびメデトミジン特異的解毒剤（メデトミジンの用量の５倍）を投与し、動物を完全に回復するまで（通常３〜４時間後）、暗室内で加温パッド上に置いた。
ＮＰＤ測定の結果は図５および６に示している。
【０１５１】
図５には、ＱＲ−０１０による治療でＣＦマウスにおけるナトリウム輸送が変化し（ｐ＝０．０００２；ｎ＝８）、野生型レベルに近づくことが明確に示されている。これはＱＲ−０１０による治療でＣＦＴＲ活性が回復することの明確な証拠である。
【０１５２】
図６には、ＱＲ−０１０の３回投与後にフォルスコリン誘導性ＣＦＴＲ応答が改善され（ｐ＝０．０１９；ｎ＝８）、ＱＲ−０１０の６回投与後にさらに改善される（ｐ＝０．１１、ｎ＝３）ことが明確に示されている。典型的には、ＣＦマウスにおいて、フォルスコリン誘導性ＣＦＴＲ応答はない；しかしながら、治療後、フォルスコリン誘導性ＣＦＴＲ応答の補正が観察される。これは、ＣＦＴＲ活性がＱＲ−０１０による治療で回復することの明確な証拠である。
【０１５３】
すなわち、本実験は本発明のオリゴヌクレオチド、例えばＱＲ−０１０が遺伝子欠陥の修復に効果的であることを明確に立証するものである。
【０１５４】
実施例２
野生型ＣＦＴＲをコードしているＲＮＡ配列の回復における、配列番号５１、５６、６１および６６に示されているオリゴヌクレオチドの活性
配列番号５１、５６、６１および６６に示されているオリゴヌクレオチドについて、少なくとも１つのアレルに標的変異を有する患者から得た原発性肺上皮細胞において、野生型ＣＦＴＲをコードしているＲＮＡ配列を回復するそれらの活性を試験する。適切な培地中で当業者に周知の方法に従って細胞を培養する。トランスフェクションによって細胞に本発明のオリゴヌクレオチドを導入する。トランスフェクションは、トランスフェクション試薬リポフェクタミンを１〜５００ｎＭの範囲の濃度で用いて、当業者に周知の方法に従って実施される。オリゴトランスフェクション試薬複合体を適切な培地中の細胞に加え、２４時間インキュベーション後に細胞から除去する。
【０１５５】
野生型ＣＦＴＲをコードしているＲＮＡ配列を回復するオリゴヌクレオチドの活性は、トランスフェクション後、細胞培養の１〜４日後に決定される。細胞を収集し、ＲＮＡ修復を一次読み出し情報として用いてオリゴヌクレオチドの活性を分子レベルで評価する。ＲＮＡ修復はシークエンシングおよび／またはＱ−ＰＣＲ法によって決定する。ＲＮＡは当業者に周知の方法を用いて細胞から精製される。続いて、標的変異が存在しているＣＦＴＲ  ＲＮＡの部分をＲＴ−ＰＣＲによって増幅する。ＲＴ−ＰＣＲ産物を配列決定し、図９Ａ〜Ｄに示されているように変異が修復されたことを決定する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【配列表】
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