(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造式（１）または構造式（２）の構造を持つ新しい形態のオリゴヌクレオチド構造体：
Ｑ−（Ａｍ−Ｊ）ｎ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ          構造式（１）
Ｑ−（Ｊ−Ａｍ）ｎ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ          構造式（２）
（前記構造式（１）および構造式（２）で、Ａは親水性物質単量体、Ｂは疎水性物質、ＸとＹはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカー媒介された共有結合で、Ｒは一本鎖または二重らせんオリゴヌクレオチド、ｍは１〜１５の整数、ｎは１〜１０の整数で、
Ｑは（Ｌｉ−Ｚｊ）またはＰ−Ｊ１−Ｊ２であり、
Ｌは受容体媒介内包作用（ＲＭＥ）を介してターゲット細胞内在化を増進させる受容体と特異的に結合する特性を持つリガンド、
Ｚは単純共有結合または親水性物質ブロック内の親水性物質単量体とリガンドの結合を媒介するリンカーで、
ｉは０〜５の整数、ｊは０または１を意味して、但しｉが０である場合、ｊも必ず０であり、
Ｐは、アミン基またはポリヒスチジン基を意味して、
Ｊ１とＪ２は、独立して単純共有結合、またはアミン基またはポリヒスチジン基と親水性物質との間の結合を媒介するリンカーであり、
前記構造式（１）におけるＪは、ｎが１である場合、ＡｍとＸとの間を連結するリンカーであり、ｎが２〜１０の整数である場合、ＡｍとＡｍとの間、またはＡｍとＸとの間を連結するリンカーであり、
前記構造式（２）におけるＪは、ｎが１である場合、ＱとＡｍとの間を連結するリンカーであり、ｎが２〜１０の整数である場合、ＡｍとＡｍとの間、またはＱとＡｍとの間を連結するリンカーである）。
【請求項２】
Ｒは二本鎖オリゴヌクレオチドであり、センス鎖またはアンチセンス鎖は、１９〜３１個のヌクレオチドで構成されることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項３】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の５’末端にリン酸基が結合されたことを特徴とする請求項２に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項４】
前記アンチセンス鎖の５’末端に結合されたリン酸基は一つ〜三つであることを特徴とする請求項３に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項５】
前記疎水性物質の分子量は、２５０〜１，０００であることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項６】
前記疎水性物質は、ステロイド誘導体、グリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン、脂肪酸、リン脂質、及びリポポリアミンで構成された群から選択されることを特徴とする請求項５に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項７】
前記ステロイド誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルマート、コレスタニルホルマートおよびコレステリルアミンで構成された群から選択されることを特徴とする請求項６に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項８】
前記グリセリド誘導体は、モノ−、ジ−およびトリ−グリセリドから選択されることを特徴とする請求項６に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項９】
前記親水性物質単量体は、下記化合物（１）の構造を持つことを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド構造体：
【化１】
0006422961.tif 000017
（前記化合物（１）でＧは、Ｏ、ＳおよびＮＨで構成された群から選択される）。
【請求項１０】
前記リンカー（Ｊ）は、ＰＯ３−、ＳＯ３およびＣＯ２で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項１１】
前記共有結合は、Ｘ、ＹおよびＺで表される非分解性結合または分解性結合であることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項１２】
前記非分解性結合は、アミド結合またはリン酸結合であることを特徴とする請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項１３】
前記分解性結合は、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンハイドライド結合、生分解性結合または酵素分解性結合であることを特徴とする請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項１４】
Ｑは（Ｌｉ−Ｚｊ）であり、Ｚは単純共有結合または親水性物質ブロック内の親水性物質単量体とリガンドの結合を媒介するリンカーであり、前記リンカーＺは、ヘキサエチレングリコールを含むことを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項１５】
前記リンカーＺは、下記化合物（４）の構造を持つことを特徴とする請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド構造体：
【化２】
0006422961.tif 000018
（前記化合物（４）で、Ｔは下記化合物（１）が１〜１５個繰り返された化合物を示し、Ｇは、ＣＨ２、Ｏ、ＳおよびＮＨで構成された群から選択される）。
【化３】
0006422961.tif 000019
【請求項１６】
Ｑは（Ｌｉ−Ｚｊ）であり、下記化合物（１９）の構造を持つことを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド構造体：
【化４】
0006422961.tif 000020
（前記構造式（１９）で、Ａ、Ｂ、Ｒ、ｍ、ｎ、ＺおよびＬは、請求項１に記載の構造式（２）での定義と同様である）。
【請求項１７】
Ｑは（Ｌｉ−Ｚｊ）であり、前記リガンドＬは、炭水化物、ペプチドおよび抗体で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のリガンドが結合されたオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項１８】
前記炭水化物は、ヘキソアミン、単糖類、二糖類および多糖類で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項１９】
ＱはＰ−Ｊ１−Ｊ２であり、Ｐは第一級〜第三級アミン基から選択されたいずれか一つまたは５〜８個のヒスチジンを含むポリヒスチジン基であることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項２０】
Ｊ１およびＪ２は独立して単純共有結合、Ｃ２−１２のアルキル、アルケニル、アルキニル、ＰＯ３−、ＳＯ３およびＣＯ２で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項２１】
下記の構造式（２０）の構造を持つ固形支持体：
【化５】
0006422961.tif 000021
（前記構造式（２０）で、Ｌは受容体媒介内包作用（ＲＭＥ）を介してターゲット細胞内在化を増進させる受容体と特異的に結合する特性を持つリガンドであり、Ｔは下記化合物（１）が１〜１５個繰り返された化合物を示し（化合物（１）で、Ｇは、ＣＨ２、Ｏ、ＳおよびＮＨで構成された群から選択される）、
【化６】
0006422961.tif 000022
ＣとＤのうち一方は固形支持体で、他方はジメトキシトリチルであり；ｉは０〜３の整数；ＥとＦはそれぞれ独立して１〜１０の整数である）
を使用して請求項１に記載の一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造する方法。
【請求項２２】
（１）構造式（２０）の固形支持体に親水性物質単量体を結合する段階をｎ回繰り返し行う段階；
（２）前記親水性物質が結合された固形支持体をベースにオリゴヌクレオチド一本鎖を合成する段階；
（３）前記親水性物質が結合されたオリゴヌクレオチド５’末端に疎水性物質を共有結合させる段階；および
（４）固形支持体からオリゴヌクレオチド構造体を分離する段階；
を含むことを特徴とする請求項２１に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド構造体の製造方法。
【請求項２３】
（１）構造式（２０）の固形支持体に親水性物質単量体を結合する段階をｎ回繰り返し行う段階；
（２）前記親水性物質が結合された固形支持体をベースにＲＮＡ一本鎖を合成する段階；（３）前記親水性物質が結合されたＲＮＡ５’末端に疎水性物質を共有結合させる段階；（４）固形支持体からＲＮＡ−高分子構造体および相補的配列のＲＮＡ一本鎖を分離する段階；および
（５）前記ＲＮＡ−高分子構造体と相補的配列のＲＮＡ一本鎖をアニーリングして二本鎖を形成する段階；
を含むことを特徴とする請求項２１に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド構造体の製造方法。
【請求項２４】
段階（２）のＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列を持つＲＮＡ一本鎖は、５’末端にリン酸基が結合されたことを特徴とする請求項２２に記載の製造方法。
【請求項２５】
請求項１から請求項２０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子。
【請求項２６】
前記ナノ粒子は、凍結乾燥された形態であることを特徴とする請求項２５に記載のナノ粒子。
【請求項２７】
請求項１から請求項２０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド構造体を含む薬剤学的組成物。
【請求項２８】
請求項２５または請求項２６に記載のナノ粒子を含む薬剤学的組成物。
【請求項２９】
請求項１から請求項２０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド構造体を利用した生体外での遺伝子発現調節方法。
【請求項３０】
請求項２５または請求項２６に記載のナノ粒子を利用した生体外での遺伝子発現調節方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌および感染性疾病などの治療に有用に使用され得る高効率オリゴヌクレオチド構造体に関する。
【０００２】
本発明に係るオリゴヌクレオチド構造体は、オリゴヌクレオチド構造体に含まれたオリゴヌクレオチドを細胞内に効率的に伝達するためにオリゴヌクレオチドの両末端に親水性物質および疎水性物質を単純共有結合またはリンカー媒介（ｌｉｎｋｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）共有結合を利用して接合された形態の構造を持ち、水溶液で前記オリゴヌクレオチド構造体の疎水性相互作用によってナノ粒子形態に転換されることができる。
【０００３】
また、本発明は、前記オリゴヌクレオチド構造体を含む薬剤学的組成物、前記オリゴヌクレオチド構造体の製造方法および前記オリゴヌクレオチド構造体を利用したオリゴヌクレオチド伝達技術に関する。
【背景技術】
【０００４】
ＡＳＯ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｅｌｅｔｉｄｅ）、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下「ＲＮＡｉ」という）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）等オリゴヌクレオチドに基づいた様々な形態の治療剤が現在活発に開発が行われている。
【０００５】
ＡＳＯ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｅｌｅｔｉｄｅ）は、一本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡの鎖を介してｍＲＮＡの中間代謝（ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）を変更することによって遺伝子からタンパク質への情報伝達を調節する機能を有するが、十分に相補的、特異的に混成化する塩基配列を選択して目標タンパク質の好ましい発現抑制ができるようにするものである。ＡＳＯは、目標遺伝子に配列特異的に結合するので、目標遺伝子以外の他の遺伝子発現に影響を与えない。したがって、ＡＳＯ技術は、特定タンパク質の生体内役割の分析において有用な道具であるだけでなく、特定疾病に対する遺伝子治療法の一つの形態として活用可能性を有する（FASEBJ. 9, 1288-1296, 1995）。
【０００６】
ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）は、個体内で自然に生産される巨大グループの小さいＲＮＡとして、少なくともこれらのうち一部は、標的遺伝子の発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、リボヌクレアーゼダイサー（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｄｉｃｅｒ）（Ambros et al. 2003. current biology 13(10):807-818）によって略７０個のヌクレオチド一本鎖ヘアピン前駆体転写体から形成されるが、前記ダイサーは、前記前駆体を切断させて２１〜２３個のヌクレオチド二本鎖ｍｉＲＮＡを形成させる。多くの場合において、前記マイクロＲＮＡは、従来機能が明らかになっていないＤＮＡ配列の一部から転写される。ｍｉＲＮＡは、タンパク質に翻訳されず、かえって、これらは翻訳を遮断する特定ｍＲＮＡと結合する。ｍｉＲＮＡは、これらの標的と不正確に塩基対をなして翻訳を抑制すると考えられる。
【０００７】
ＲＮＡｉは、その役割が発見された以後、多様な種類の哺乳動物細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ）で配列特異的にｍＲＮＡに作用することが明らかになった（Silence of the transcripts: RNA interference in medicine. J Mol Med, 2005, 83:764-773）。長い鎖のＲＮＡ二本鎖が細胞に伝達されると、伝達されたＲＮＡ二本鎖はＤｉｃｅｒというエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）によって２１〜２３塩基対（ｂａｓｅ  ｐａｉｒ，ｂｐ）でプロセッシングされた短い干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、以下「ｓｉＲＮＡ」という）に変換される。ｓｉＲＮＡは、１９〜２７塩基の短いＲＮＡ二重らせん構造としてＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）に結合してガイド（アンチセンス）鎖が、ターゲットｍＲＮＡを認識して分解する過程を介してターゲット遺伝子の発現を配列特異的に阻害する（NUCLEICACID THERAPEUTICS: BASIC PRINCIPLES AND RECENT APPLICATIONS. Nature Reviews Drug Discovery. 2002. 1, 503-514）。
【０００８】
特に、外部から伝達された長い鎖のＲＮＡ二本鎖は、哺乳動物細胞でインターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）発現を介して非配列特異的な過度に免疫反応を誘発する問題点を有するが、これは短い鎖のｓｉＲＮＡを介して克服されることが明らかになった（Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001. 411, 494-498）。
【０００９】
しかし、ｓｉＲＮＡも細胞内に存在するセンサーを介して非配列特異的内在免疫反応誘発（ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）が起きる可能性がありこれを克服するためにｓｉＲＮＡの特異的な構造を変更したり、２−メトキシ、２−フルオロ置換体が開発されている。
【００１０】
化学的に合成されたｓｉＲＮＡは、通常約１９〜２７塩基対（ｂａｓｅ  ｐａｉｒ，ｂｐ）の二本鎖であり、３’末端部位に２−ｎｔ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）構造を持つことができ、ｓｉＲＮＡ二本鎖が活性を示すためには３’水酸基（ＯＨ，ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｇｒｏｕｐ）と５’リン酸基（ＰＯ４，ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｇｒｏｕｐ）で構成された構造を持たなければならないと知られている（Effect of asymmetric terminal structures of short RNA duplexes on the RNA interference activity and strand selection. Nucleic Acids Res 1 October 2008:5812-5821）。商用化された合成ｓｉＲＮＡは、両末端に水酸基がある構造で、合成ｓｉＲＮＡが細胞内に伝達されると、リン酸化酵素（Ｋｉｎａｓｅ）によりｓｉＲＮＡ  ５’末端がリン酸化されてｓｉＲＮＡ機能を示すと知られている（siRNA function in RNAi: A chemical modification analysis. RNA 2003.9:1034-1048）。
【００１１】
ベルトラン（Ｂｅｒｔｒａｎｄ）研究グループの研究によると、同じターゲット遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＳＯ）に比べてｓｉＲＮＡが生体内／外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ）でｍＲＮＡ発現の阻害効果が優れており、該当効果が長く持続される効果を持つことが明らかになった（Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. 296:1000-1004）。
【００１２】
また、ｓｉＲＮＡの作用機序は、ターゲットｍＲＮＡと相補的に結合して配列特異的に標的遺伝子の発現を調節するので、既存の抗体ベース医薬品や化学物質（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｒｕｇ）に比べて適用できる対象が画期的に拡大する可能性がある長所を持つ（Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4):664-670）。
【００１３】
しかし、ｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドベース治療剤の優れた効果および多様な使用範囲にもかかわらず、ｓｉＲＮＡが治療剤として開発されるためには、ｓｉＲＮＡの安定性改善と細胞伝達効率改善によって、ｓｉＲＮＡがターゲット細胞に効果的に伝達されなければならない（Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development. Drug Discov Today. 2006 Jan;11(1-2):67-73）。
【００１４】
特にｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドは負電荷を帯びるので、疎水性である細胞のリン脂質二重膜を通過できないので、単純拡散による細胞内伝達が難しい。
【００１５】
そこで、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）または生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でオリゴヌクレオチドの伝達効率を上げるために多くの細胞伝達物質が開発された。リポソーム、カチオン系界面活性剤などが一般的に多く使用されリポソームに遺伝子を融合させる方法やカチオンを持つ脂質や高分子を利用した方法などの伝達体を利用したり、オリゴヌクレオチドの結合基本構造をメチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）やＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）等に化学構造を変更させたり、接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を利用する方法が知られている（Chemically modified siRNA: tools and applications. Drug Discov Today. 2008 Oct; 13(19-20):842-855; Mechanisms and strategies for effective delivery of antisense and siRNA oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 2008 Jul; 36(12):4158-71）。
【００１６】
これらのうちナノ伝達体（ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ）を利用する方法は、リポソーム、カチオン高分子複合体などの多様な高分子を使用する方法で、ナノ粒子形成を介してオリゴヌクレオチドをナノ伝達体（ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ）に捕獲して細胞にオリゴヌクレオチドを伝達するものである。ナノ伝達体を利用する方法のうち主に活用される方法は、高分子ナノ粒子（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、高分子ミセル（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｉｃｅｌｌｅ）、リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）等があるが、これらの中リポプレックスを利用した方法は、カチオン性脂質で構成されて細胞のエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）のアニオン性脂質と相互作用してエンドソームの脱安定化効果を誘発して細胞内に伝達する役割をする（Mechanism of oligonucleotide release from cationic liposomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996 Oct 15; 93(21):11493-8）。
【００１７】
特に、オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである場合、パッセンジャー（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ；センス（ｓｅｎｓｅ））鎖の末端部位に化学物質などを連結して増進された薬物動態（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）的特徴を持たせるようにして生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で高い効率を誘導できることが知られている（Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 2004 Nov 11; 432(7014):173-8）。この時ｓｉＲＮＡセンス（ｓｅｎｓｅ；パッセンジャー（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ））またはアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｃｅ；ガイド（ｇｕｉｄｅ））鎖の末端に結合された化学物質の性質によりｓｉＲＮＡの安定性が変わる。例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）のような高分子化合物が接合された形態のｓｉＲＮＡは、カチオン性物質が存在する条件でｓｉＲＮＡのアニオン性リン酸基と相互作用して複合体を形成することによって、改善されたｓｉＲＮＡ安定性を持つ伝達体となる（Local and systemic delivery of VEGF siRNA using polyelectrolyte complex micelles for effective treatment of cancer. J Control Release. 2008 Jul 14; 129(2):107-16）。特に高分子複合体で構成されたミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）は薬品伝達運搬体として使われる他のシステムである、小球体（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）またはナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）等に比べてその大きさが小さく分布が非常に一定で、自発的に形成される構造であるため、製剤の品質管理および再現性確保が容易である長所がある。
【００１８】
また、ｓｉＲＮＡの細胞内伝達効率性を向上させるために、ｓｉＲＮＡに生体適合性高分子である親水性物質（例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ））を単純共有結合またはリンカー媒介（ｌｉｎｋｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）共有結合で接合させたｓｉＲＮＡ接合体を介して、ｓｉＲＮＡの安定性確保および効率的な細胞膜透過性のための技術が開発された（大韓民国登録特許公報第８８３４７１号参照）。しかし、ｓｉＲＮＡの化学的修飾およびポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）を接合させること（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）だけでは生体内での低い安定性とターゲット組織への伝達がスムーズでない短所は依然として残る。
【００１９】
このような短所を解決するために、オリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡのような二重らせんオリゴＲＮＡに親水性および疎水性物質が結合された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が開発されたが、前記構造体は、疎水性物質の疎水性相互作用によってＳＡＭｉＲＮＡＴＭ（ｓｅｌｆ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｉｃｅｌｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＲＮＡ）と命名された自己組み立てナノ粒子を形成することになるが、ＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術は、既存の伝達技術に比べて非常にサイズが小さいながらも均一な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）ナノ粒子を収得できる長所を持つ。
【００２０】
ＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術の具体的な例として、親水性物質としてＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）が使用されるが、ＰＥＧは合成ポリマー（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ）で、よく医薬品特にタンパク質の水溶性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）増加および薬物動態（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）の調節のために使用された。ＰＥＧはすべての合成ポリマーがそうであるように、多分散系（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ）物質で、一つのバッチ（ｂａｔｃｈ）のポリマーは、他の個数の単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の総計からなり分子量がガウス曲線形態を示し、多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｖａｌｕｅ，Ｍｗ／Ｍｎ）で物質の同質性程度を表現する。すなわち、ＰＥＧが低い分子量（３〜５ｋＤａ）である時、約１．０１の多分散指数を示して高い分子量（２０ｋＤａ）である時、約１．２との高い多分散指数を示して、高い分子量であるほど物質の同質性が相対的に低い特徴を見せる（F. M. Veronese. Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions. Biomaterials (2001) 22:405-417）。
【００２１】
これにより、ＰＥＧを医薬品に結合させた場合、接合体にＰＥＧの多分散的特徴が反映されて単一物質の検証が難しくなって、最近ではこのような問題点を解決するために、ＰＥＧの合成および精製過程の改善を通して低い多分散指数を持つ物質を生産する傾向にあるが、特に分子量が小さい物質にＰＥＧを結合させた場合、結合が容易にできたか判断することが非常に難しいなど依然として物質の多分散性特徴に伴う問題点を持つ（Francesco M. Veronese and Gianfranco Pasut. PEGylation, successful approach to drug delivery. DRUG DISCOVERY TODAY(2005) 10(21):1451-1458）。
【００２２】
また、ナノ粒子の大きさが目標細胞への伝達効率に大きい影響を及ぼすが、５０ｎｍ以下なら排泄を通じて体外に早く除去され、１００ｎｍ以上なら組織内にまんべんなく伝達されず効果が低下する問題点を持つので、一定の大きさのナノ粒子形成が必要である（Wim H De Jong and Paul JA Borm. Int J Nanomedicine. 2008 June; 3(2):133-149.）。
【００２３】
したがって、既存のＳＡＭｉＲＮＡＴＭの優れた効果をそのまま維持しながらＰＥＧなどの親水性物質自体の多分散的特性を解決するための新しい概念のオリゴヌクレオチド伝達技術に対する市場の要求が切実な状況である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明の目的は、小さい大きさを持って多分散性が改善された新しい概念のナノ粒子およびそのようなナノ粒子を構成するオリゴヌクレオチド構造体を提供するところにある。
【００２５】
また、本発明の他の目的は、前記オリゴヌクレオチド構造体およびそのようなオリゴヌクレオチド構造体からなるナノ粒子の製造方法、これを含む薬剤学的組成物およびこれを利用した遺伝子発現調節技術を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、既存自己組み立てナノ粒子であるＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術において、ＳＡＭｉＲＮＡＴＭを構成するオリゴヌクレオチド構造体の親水性物質を一定の分子量を持つ均一なｍ個の単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）と必要に応じてリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含む基本単位をブロック（ｂｌｏｃｋ）化して、これを必要に応じて適切な個数を使用する場合、このようなオリゴヌクレオチド構造体によって形成されたナノ粒子が既存のＳＡＭｉＲＮＡＴＭに比べてより小さい大きさを持って、さらに多分散性が画期的に改善され得る点を確認して本発明を完成した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明でのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）またはＲＮＡ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）からなる物質で、一本鎖または相補的な結合からなる二本鎖で構成されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｅｌｏｔｉｄｅ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡインヒビター、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）等を意味するが、これに限定されるのではない。
【００２８】
特に、本発明でオリゴヌクレオチドが二本鎖のオリゴヌクレオチド（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）である場合、アンチセンス鎖（ａｎｔｉｓｅｎｓｅｓｔｒａｎｄ）は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）で目標ターゲットｍＲＮＡと相補的に結合して目標ターゲットｍＲＮＡを分解するＲＮＡｉ活性を現わす鎖であり、センス鎖（ｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｎｄ）は、アンチセンス鎖と相補的な配列を持つ鎖を意味する。本発明で相補的または相補的結合の意味は、二つの配列が互いに結合して二重らせん構造をなすことをいい、必ずしも完ぺきな相補的（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ）結合である必要はなく、一部配列が互いに異なる場合（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が含まれてもよい。
【００２９】
また、本発明でのｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）ミミック（ｍｉｍｉｃ）は、自然状態で存在するｍｉＲＮＡと同じ配列および構造の二本鎖ＲＮＡで、化学的に合成された形態のｍｉＲＮＡを意味して、ｍｉＲＮＡインヒビターは、自然状態で存在するｍｉＲＮＡと相補的に結合して該当ｍｉＲＮＡの作用を阻害させる役割を行う化学的に合成された一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
【００３０】
一つの具体例として、本発明では下記の構造式（１）または構造式（２）の構造を持つ新しい形態のオリゴヌクレオチド構造体を提供する。
Ｑ−（Ａｍ−Ｊ）ｎ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ          構造式（１）
Ｑ−（Ｊ−Ａｍ）ｎ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ          構造式（２）
【００３１】
前記構造式（１）および構造式（２）で、Ａは親水性物質単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）、Ｂは疎水性物質、Ｊはｍ個の親水性物質単量体の間またはｍ個の親水性物質単量体とオリゴヌクレオチドを互いに連結するリンカー、ＸとＹはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）が媒介された共有結合で、Ｒは一本鎖または二重らせんオリゴヌクレオチド、ｍは１〜１５の整数、ｎは１〜１０の整数で、
Ｑは（Ｌｉ−Ｚｊ）またはＰ−Ｊ１−Ｊ２であり、
Ｌは受容体媒介内包作用（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＲＭＥ）を介してターゲット細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させる受容体と特異的に結合する特性を持つリガンド（ｌｉｇａｎｄ）、
Ｚは単純共有結合または親水性物質ブロック内の親水性物質単量体とリガンドの結合を媒介するリンカーで、
ｉは０〜５の整数、好ましくは０〜３の整数、ｊは０または１を意味して、但しｉが０である場合、ｊも必ず０であり、
Ｐは、アミン基またはポリヒスチジン基を意味して、
Ｊ１とＪ２は、独立して単純共有結合、またはアミン基またはポリヒスチジン基と親水性物質との間の結合を媒介するリンカーである。
【００３２】
本発明での「親水性物質ブロック」とは、構造式（１）および構造式（２）での（Ａｍ−Ｊ）または（Ｊ−Ａｍ）からなる繰り返し単位を意味する。
【００３３】
前記構造式（１）および構造式（２）での親水性物質単量体（Ａ）は、非イオン性親水性高分子の単量体の中本発明の目的に合致するものであればいずれも制限なしに使用が可能であり、好ましくは表１に記載された化合物（１）〜化合物（３）から選択された単量体、より好ましくは化合物（１）の単量体が使用され、化合物（１）でＧは好ましくはＣＨ２、Ｏ、ＳおよびＮＨから選択され得る。
【００３４】
特に、親水性物質単量体の中でも化合物（１）で表される単量体には様々な官能基を導入することができ、生体内親和性が良く免疫反応を少なく誘導するなど生体適合性（ｂｉｏ−ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）が優れるとともに、構造式（１）および構造式（２）に係る構造体内に含まれたオリゴヌクレオチドの生体内安定性を増加させて、伝達効率を増加させることができる長所を有していて、本発明に係る構造体の製造に非常に適している。
【００３５】
【表１】
0006422961.tif 000002
【００３６】
構造式（１）および構造式（２）での親水性物質は総分子量が１，０００〜２，０００の範囲内であることが好ましい。したがって、例えば、化合物（１）に係るヘキサエチレングリコール（Ｈｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、すなわち構造式（１）および構造式（２）でのＧがＯで、ｍが６である物質が使用される場合ヘキサエチレングリコールスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）の分子量が３４４であるため、繰り返し回数（ｎ）は３〜５が好ましい。
【００３７】
特に、本発明は必要に応じて前記構造式（１）および構造式（２）で（Ａｍ−Ｊ）または（Ｊ−Ａｍ）で表される親水性基の繰り返し単位、すなわち親水性物質ブロック（ｂｌｏｃｋ）がｎと表される適切な個数で使用され得ることを特徴とする。前記各親水性物質ブロック内に含まれる親水性物質単量体であるＡとリンカーであるＪは、独立して各親水性物質ブロックの間に同じであってもよく、異なってもよい。すなわち、親水性物質ブロックが三つ使用される場合（ｎ＝３）、最初のブロックには化合物（１）に係る親水性物質単量体が、二番目のブロックには化合物（２）に係る親水性物質単量体が、三番目のブロックには化合物（３）に係る親水性物質単量体が使用されるなど、すべての親水性物質ブロック別に他の親水性物質単量体が使用されてもよく、すべての親水性物質ブロックに化合物（１）〜化合物（３）に係る親水性物質単量体で選択されたいずれか一つの親水性物質単量体が同様に使用されてもよい。同様に、親水性物質単量体の結合を媒介するリンカーも、各親水性物質ブロック別に全て同じリンカーが使用されてもよく、各親水性物質ブロック別に異なるリンカーが使用されてもよい。また、親水性物質単量体の個数であるｍも各親水性物質ブロックの間に同じであってもよく、異なってもよい。すなわち、最初の親水性物質ブロックでは、親水性物質単量体が三つ連結（ｍ＝３）され、二番目の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が五つ（ｍ＝５）、三番目の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が四つ連結（ｍ＝４）されるなど、それぞれ異なる個数の親水性物質単量体が使用されてもよく、すべての親水性物質ブロックで同じ個数の親水性物質単量体が使用されてもよい。
【００３８】
本発明で前記リンカー（Ｊ）は、ＰＯ３−、ＳＯ３およびＣＯ２で構成された群から選択されることが好ましいが、これに制限されず、使用される親水性物質の単量体などに応じて本発明の目的に合致する限りいかなるリンカーでも使用できることは当業者には自明である。
【００３９】
前記親水性物質単量体の全部または一部は、必要に応じてターゲット特異的リガンドのような他の物質との結合のために必要な官能基を持つように変更されても構わない。
【００４０】
前記親水性物質ブロックは。一本鎖オリゴの３’または、５’末端のある位置に結合されてもよく、また二本鎖オリゴのセンス鎖またはアンチセンス鎖の３’または５’末端のある位置に結合されても構わない。
【００４１】
前記構造式（１）および構造式（２）での疎水性物質（Ｂ）は、疎水性相互作用を介して構造式（１）および構造式（２）に係るオリゴヌクレオチド構造体で構成されたナノ粒子を形成する役割をする。前記疎水性物質は、分子量が２５０〜１，０００であることが好ましく、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体、グリセリド（ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）誘導体、グリセロールエーテル（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｅｔｈｅｒ）、ポリプロピレングリコール（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和炭化水素（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）、ジアシルホスファチジルコリン（ｄｉａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、脂肪酸（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ）、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）、リポポリアミン（ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ）等が使用されるが、これに制限されず、本発明の目的に合致するものであればいかなる疎水性物質も使用可能である点は、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者には自明である。
【００４２】
前記ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルマート、コレスタニルホルマートおよびコレステリルアミンからなる群で選択されてもよく、前記グリセリド誘導体は、モノ−、ジ−およびトリ−グリセリドなどから選択されるが、この時、グリセリドの脂肪酸としては、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和脂肪酸が好ましい。
【００４３】
特に、前記疎水性物質の中でも飽和または不飽和炭化水素やコレステロールが、本発明に係るオリゴヌクレオチド構造体の合成段階で容易に結合させることができる長所を有している点から好ましく、Ｃ２４炭化水素、特にジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ）を含むテトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ）が最も好ましい。
【００４４】
前記疎水性物質は、親水性物質ブロックと結合されたオリゴヌクレオチドの反対側末端（ｄｉｓｔａｌ  ｅｎｄ）に結合され、二本鎖オリゴのセンス鎖またはアンチセンス鎖のどの位置に結合されても構わない。
【００４５】
本発明でオリゴヌクレオチド（Ｒ）は、二本鎖または一本鎖のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、アンチセンスｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ  ｍｉｍｉｃ、ｍｉｃｒｏＲＮＡインヒビター、アンチセンス  オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）等が制限されず使用でき、特に二本鎖ｓｉＲＮＡが好ましい。
【００４６】
二本鎖ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどの二本鎖オリゴヌクレオチドが使用される場合、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖は、１５〜４０個、好ましくは１９〜３１個のヌクレオチドで構成されることを特徴とし、特にアンチセンス鎖の５’末端に一つ以上のリン酸基、好ましくは一つ〜三つのリン酸基が結合されていることが好ましい。
【００４７】
また、前記オリゴヌクレオチドは、生体内安定性向上のために核酸分解酵素抵抗性付与および非特異的免疫反応減少のために様々な修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が行われた形態を持っていてもよく、前記修飾は一つ以上のヌクレオチド内糖構造の２’炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ３（メチル）、−ＯＣＨ３（ｍｅｔｈｏｘｙ）、−ＮＨ２、−Ｆ（フッ素）、−Ｏ−２−メトキシエチル−Ｏ−プロピル（ｐｒｏｐｙｌ）、−Ｏ−２−メチルチオエチル（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｅｔｈｙｌ）、−Ｏ−３−アミノプロピル、−Ｏ−３−ジメチルアミノプロピル、−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミドまたは−Ｏ−ジメチルアミドオキシエチルへの置換による修飾；ヌクレオチド内糖（ｓｕｇａｒ）構造内の酸素が硫黄に置き換えられた修飾；ヌクレオチド結合のホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）またはボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ），メチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）結合への修飾などで一つまたは二以上組み合わせて使用でき、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄａｃｉｄ）またはＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）形態への修飾も使用可能である（Crooke等，Ann. Rev. Med. Vol. 55: pp61-65 2004、ＵＳ５，６６０，９８５、ＵＳ５，９５８，６９１、ＵＳ６，５３１，５８４、ＵＳ５，８０８，０２３、ＵＳ６，３２６，３５８、ＵＳ６，１７５，００１  Braasch D.A.等，Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:1139-1143, 2003; Chiu Y.L.等，RNA, 9:1034-1048, 2003; Amarzguioui M.等，Nucleic Acid Res. 31:589-595, 2003, Nucleic Acids Research, 2010, Vol. 38, No. 17 5761-5773, Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 5 1823-1832参照）。
【００４８】
一方、腫瘍（ｔｕｍｏｒ）の組織は、非常に堅固で正常組織に比べて拡散制限（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ−ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）を持つが、このような拡散制限は、腫瘍成長に必要な栄養分、酸素および二酸化炭素のような老廃物の移動に悪影響を与えるので、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｎｓｉｓ）を介して周辺に血管を形成することによって拡散制限を克服する。血管新生を介して形成された腫瘍組織内血管は、腫瘍の種類によって１００ｎｍ〜２μｍほどの隙間を持つ緩い血管構造（ｌｅａｋｙ  ａｎｄ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌ）を持つ。したがって、ナノ粒子は、正常組織の組織化された毛細血管に比べて緩い血管構造を持つ癌組織の毛細血管内皮（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）をよく通過することになり血液内循環過程中に腫瘍間質（ｔｕｍｏｒ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉｕｍ）に接近しやすくなり、また腫瘍組織の中にはリンパ管（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｄｒａｉｎａｇｅ）がなく薬物が蓄積される結果を示すが、これをＥＰＲ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果という。ナノ粒子がこのような効果によって腫瘍組織特異的に良好に伝達されることを受動的ターゲッティング（ｐａｓｓｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）という（Nanoparticles for drug delivery in cancer treatment. Urol. Oncol. 2008 Jan-Feb; 26(1):57-64）。
【００４９】
能動的ターゲッティング（ａｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）は、標的物質（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）がナノ粒子に結合された場合で、ナノ粒子をターゲット組織での蓄積を増進（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）させるか、ターゲット細胞中にナノ粒子が伝達されると内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を改善することが報告された（Does a targeting ligand influence nanoparticle tumor localization or uptake Trends Biotechnol. 2008 Oct; 26(10):552-8. Epub 2008 Aug 21）。能動的ターゲッティングは、ターゲット細胞表面特異的または過発現されている炭水化物（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）、受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）と結合できる能力を持つ物質（ターゲッティングモイエティ、ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）を利用する（Nanotechnology in cancer therapeutics:bioconjugated nanoparticles for drug delivery. Mol Cancer Ther 2006; 5(8):1909-1917）。
【００５０】
したがって、本発明に係るオリゴヌクレオチド構造体およびこれから形成されたナノ粒子にターゲッティングモイエティが備わるならば、効率的にターゲット細胞への伝達を促進して、比較的低濃度の投与量でもターゲット細胞に伝達されて高い目標遺伝子発現調節機能を示すことができ、他臓器および細胞への非特異的なオリゴヌクレオチドの伝達を阻害することができる。
【００５１】
これにより、本発明では前記構造式（１）および構造式（２）に係る構造体でＱが（Ｌｉ−Ｚｊ）である、リガンド（Ｌ）、特に受容体媒介内包作用（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＲＭＥ）を介してターゲット細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させる受容体と特異的に結合する特性を持つリガンド（ｌｉｇａｎｄ）が追加的に含まれた構造式（３）および構造式（４）のような構造体を提供する。
（Ｌｉ−Ｚｊ）−（Ａｍ−Ｊ）ｎ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ          構造式（３）
（Ｌｉ−Ｚｊ）−（Ｊ−Ａｍ）ｎ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ          構造式（４）
【００５２】
前記構造式（３）および構造式（４）でのリガンドは、好ましくはターゲット細胞特異的に細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させるＲＭＥ特性を持つターゲット受容体特異的抗体やアプタマー、ペプチド；または、葉酸（Ｆｏｌａｔｅ、一般にｆｏｌａｔｅとｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄは互いに交差使用されており、本発明での葉酸は、自然状態または人体で活性化状態であるｆｏｌａｔｅを意味する）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，ＮＡＧ）等のヘキソアミン（ｈｅｘｏａｍｉｎｅ）、ブドウ糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）をはじめとする糖や炭水化物（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）等の化学物質などで選択されるが、これに限定されるのではない。
【００５３】
特に、本発明のリガンドがＮ−アセチルガラクトサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，ＮＡＧ），マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ），グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）のような糖類の場合、該当リガンドによって本発明構造式（３）および構造式（４）に係る構造体からなるナノ粒子のターゲッティング効果だけでなく、前記親水性物質ブロック内単量体の繰り返し回数によって減少され得る親水性を補完および強化してナノ粒子の形成を容易にする役割を果たすことができる。
【００５４】
前記リガンドは、親水性物質ブロック内の親水性物質単量体と共有結合によって直接連結されるか、リガンドの結合を媒介するリンカー（Ｚ）によって親水性物質ブロック内の親水性物質単量体と結合できる。リンカー（Ｚ）によりリガンドと親水性物質ブロック内の親水性物質単量体が共有結合する場合、リンカー（Ｚ）は本発明の目的に合致するいかなるリンカーでも使用できることは当業者には自明なことであり、特に、下記の表２に記載された化合物（４）〜化合物（７）で選択されたいずれか一つの構造を持つリンカーが使用されることが好ましい。
【００５５】
【表２】
0006422961.tif 000003
【００５６】
前記化合物（４）で、Ｔは化合物（１）〜化合物（３）で選択されたいずれか一つの化合物が１〜１５個繰り返された化合物を示し、特に構造式（１）に係る化合物が、１〜１５個繰り返された化合物が好ましい。前記化合物（４）で、Ｔで表される部分が、リガンドと結合されてその反対側末端が親水性物質ブロック内の親水性物質単量体またはリンカーと結合される。
【００５７】
また、前記化合物（５）〜（７）では、左側の官能基がリガンドと結合して、右側が親水性物質ブロック内の親水性物質単量体と結合されて、前記化合物（５）でのｎは０または１を意味する。前記化合物（５）〜（７）には、リガンドと結合できる一つ以上の官能基が含まれているので、一つ以上のリガンドが結合されてターゲット組織への本発明に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の伝達効率をより向上できる長所がある。
【００５８】
前記構造式（３）および構造式（４）で、ｉおよびｊがいずれも０である場合には、リガンドが結合されなかったオリゴヌクレオチド構造体を意味して、ｉが１でｊが０である場合には、リガンドが直接親水性物質ブロック内の親水性物質単量体と結合された形態を、ｉが１以上の整数で、ｊが１である場合には、リンカーを媒介にリガンドが親水性物質ブロック内の親水性物質単量体と結合された形態を示す。
【００５９】
また、本発明は、前記構造式（１）および構造式（２）の構造体の親水性物質の末端、特にｓｉＲＮＡと結合された末端の反対側末端部位にアミン基またはポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基が追加的に導入された、すなわち構造式（１）および構造式（２）でＱがＰ−Ｊ１−Ｊ２である構造式（５）および構造式（６）に係る構造体を提供する。
Ｐ−Ｊ１−Ｊ２−（Ａｍ−Ｊ）ｎ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ          構造式（５）
Ｐ−Ｊ１−Ｊ２−（Ｊ−Ａｍ）ｎ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ          構造式（６）
前記構造式（５）および構造式（６）でＪ１とＪ２はリンカーであり、Ｊ１およびＪ２は独立して単純共有結合、Ｃ２−１２のアルキル、アルケニル、アルキニル、ＰＯ３−、ＳＯ３およびＣＯ２で構成された群から選択されることが好ましいが、これに限定されず、使用される親水性物質によって本発明の目的に合致するＪ１とＪ２はいかなるリンカーでも使用できることは当業者には自明である。
【００６０】
好ましくはアミン基が導入された場合には、構造式（５）ではＪ２はＰＯ３−、Ｊ１はＣ６アルキルであることが好ましく、構造式（６）ではＪ２は単純共有結合、Ｊ１はＣ６アルキルであることが好ましいが、これに限定されない。
【００６１】
また、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基が導入された場合には、構造式（５）ではＪ２はＰＯ３−、Ｊ１は化合物（８）が好ましく、構造式（６）ではＪ２は単純共有結合、Ｊ１は化合物（８）であることが好ましいが、これに限定されない。
【化１】
0006422961.tif 000004
【００６２】
前記構造式（５）および構造式（６）でのアミン基としては、第一級〜第三級アミン基が使用でき、１次アミン基が使用されることが特に好ましい。前記導入されたアミン基は、アミン塩として存在することもできるので、例えば１次アミン基の塩はＮＨ３＋の形態で存在することができる。また、前記構造式（５）および構造式（６）でのポリヒスチジン基は、３〜１０個のヒスチジンを含むことが好ましく、特に好ましくは５〜８個、最も好ましくは６個のヒスチジンを含むことができる。追加的に、ヒスチジン以外に一つ以上のシステインが含まれてもよい。
【００６３】
前記アミン基またはポリヒスチジン基は、オリゴヌクレオチドＲＮＡ構造体の細胞内導入とエンドソーム脱出を容易にするために導入されるもので、すでに量子ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ）、デンドリマー（Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）などの伝達体の細胞内導入とエンドソーム脱出を容易にするために、アミン基の導入とポリヒスチジン基が利用できる点およびその効果が報告された。
【００６４】
具体的に、伝達体の末端あるいは外側に修飾された１次アミン基は、生体内ｐＨでプロトン化されながら負電荷を帯びる遺伝子と静電気的相互作用によって結合体を形成して、細胞内流入後でエンドソームの低いｐＨで緩衝効果を持つ内部３次アミンによりエンドソームの脱出が容易になるにつれ、リソソームの分解から伝達体を保護することができると知られている（高分子ベースハイブリッド物質を利用した遺伝子伝達および発現抑制、Polymer Sci. Technol., Vol. 23, No. 3, pp254-259）。
【００６５】
非必須アミノ酸の一つであるヒスチジンは、残基（−Ｒ）にイミダゾリン（ｐｋａ３  ６．０４）を持つので、エンドソームとリソソームで緩衝能力（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）を増加させる効果があって、リポソームをはじめとする非ウィルス性遺伝子伝達体（ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）でエンドソーム脱出効率を上げるために、ヒスチジン修飾を利用することができる点が知られている（Novel histidine-conjugated galactosylated cationic liposomes for efficient hepatocyte selective gene trasnsfer in human hepatoma HepG2 cells. J. Controlled Release 118, pp262-270）。
【００６６】
本発明での構造式（１）〜構造式（６）で親水性物質ブロックまたは疎水性物質とオリゴヌクレオチドは単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合（ＸまたはＹ）によって結合される。前記共有結合を媒介するリンカーは、構造式（１）および構造式（２）で（Ａｍ−Ｊ）ｎまたは（Ｊ−Ａｍ）ｎで表される親水性物質ブロック、または疎水性物質とオリゴヌクレオチドの末端で共有結合して、必要に応じて特定環境で分解が可能な結合を提供する限り特に限定されるのではない。したがって、前記リンカーは、本発明に係るオリゴヌクレオチド構造体の製造過程中オリゴヌクレオチドおよび／または親水性物質（または、疎水性物質）を活性化するために結合させるいかなる化合物も使用されることができる。前記共有結合は、非分解性結合または分解性結合のうちいずれでもよい。この時、非分解性結合としては、アミド結合またはリン酸化結があり、分解性結合としては、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンハイドライド結合、生分解性結合または酵素分解性結合）などがあるが、これに限定されない。
【００６７】
本発明の構造式（１）〜構造式（６）で、二本鎖オリゴヌクレオチド、特に二本鎖オリゴＲＮＡが使用される場合、二本鎖オリゴＲＮＡと親水性物質ブロックおよび疎水性物質の結合は、例えば下記の表３に記載された通り構造式（７）〜構造式（１８）のように多様な形態からなる。
【００６８】
【表３】
0006422961.tif 000005
【００６９】
前記表３で、Ｓは二重らせんオリゴＲＮＡのセンス鎖、ＡＳはアンチセンス鎖を、ｐＡＳはリン酸基が結合されたアンチセンス鎖を意味する。残りのＡ、Ｂ、Ｘ、Ｙ、Ｌ、Ｚ、ｎおよびｍの定義は、構造式（１）および構造式（２）での定義と同様である。
【００７０】
特に、前記構造式（４）で表される本発明に係るオリゴヌクレオチド構造体は、好ましくは下記の構造式（１９）の構造を持つ。
【化２】
0006422961.tif 000006
【００７１】
前記構造式（１９）で、Ａは親水性物質単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）、Ｂは疎水性物質、Ｌは受容体媒介内包作用（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＲＭＥ）を介してターゲット細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させる受容体と特異的に結合する特性を持つリガンド（ｌｉｇａｎｄ）、Ｚは親水性物質単量体とリガンドの結合を媒介するリンカー、Ｒは一本鎖または二重らせんオリゴヌクレオチド、ｍは１〜１５の整数、ｎは１〜１０の整数を意味して、Ａ、Ｂ、Ｌ、Ｒ等は、いずれも本明細書の構造式（４）の定義と同様である。
【００７２】
特に、Ａは表１に記載された化合物（１）〜化合物（３）の中から選択されたいずれか一つの物質を意味し、Ｚは前記化合物（４）の化合物が好ましい。
【００７３】
他の観点において、本発明は、下記の構造式（２０）で表される固形支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）を提供する。
【化３】
0006422961.tif 000007
【００７４】
前記構造式（２０）で、Ｌは構造式（３）および構造式（４）での定義と同様で、Ｔは化合物（４）での定義と同様である。また、ＣとＤのうち一方は固形支持体で、他方はジメトキシトリチル（Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）であり；ＥとＦはそれぞれ独立して１〜１０の整数であり、ｉは０または１である。
【００７５】
さらに他の観点において、本発明は、構造式（２０）に係る固形支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）を使用して構造式（１）〜構造式（４）に係るオリゴヌクレオチド構造体を製造する方法を提供する。
【００７６】
前記構造式（２０）に係る固形支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）を使用して、本発明の構造式（１）〜構造式（４）に係るオリゴヌクレオチド構造体を製造する方法として、オリゴヌクレオチドが一本鎖である場合にこれを製造する過程は
（１）前記構造式（２０）の固形支持体に親水性物質ブロックをｎ回繰り返し共有結合させる段階；
（２）前記親水性物質ブロックが結合された固形支持体をベースにオリゴヌクレオチド一本鎖を合成する段階；
（３）前記親水性物質ブロックが結合されたオリゴヌクレオチド５’末端に疎水性物質を共有結合させる段階；および
（４）固形支持体からオリゴヌクレオチド構造体を分離する段階；
を含む。
【００７７】
本発明で固形支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）は、例えばＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）、ポリスチレン、シリカゲル、セルロースペーパーなどを含むが、これに制限されず；固形支持体がＣＰＧである場合、径は４０〜１８０μｍであることが好ましく、５００〜３０００Åの孔隙の大きさを持つことが好ましい。
【００７８】
また、本発明のオリゴヌクレオチド構造体のオリゴヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡである場合において、前記二重らせんオリゴヌクレオチド鎖は、１９〜３１個のヌクレオチドで構成されることが好ましい。本発明で使用可能な二重らせんオリゴヌクレオチドは遺伝子治療用または研究用で使用されるか又は使用される可能性があるいかなる遺伝子に対する二重らせんオリゴヌクレオチドも採択され得る。
【００７９】
本発明は、前記表３に記載された構造式（７）〜構造式（１０）および構造式（１３）〜構造式（１６）に係る二重らせんオリゴヌクレオチド（ＲＮＡ）構造体およびその製造方法を提供する。具体的に、前記構造式（２０）に係る固形支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）を使用して、本発明の構造式（７）〜構造式（１０）および構造式（１３）〜構造式（１６）に係るオリゴヌクレオチド構造体を製造する方法として、オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合にこれを製造する過程は
（１）前記構造式（２０）の固形支持体に親水性物質ブロックを結合する段階をｎ回繰り返す段階；
（２）前記親水性物質ブロックが結合された固形支持体をベースにＲＮＡ一本鎖を合成する段階；
（３）前記親水性物質ブロックが結合されたＲＮＡ５’末端に疎水性物質を共有結合させる段階；
（４）固形支持体からＲＮＡ−高分子構造体および相補的配列のＲＮＡ一本鎖を分離する段階；および
（５）前記ＲＮＡ−高分子構造体と相補的配列のＲＮＡ一本鎖をアニーリングして二本鎖を形成する段階；
を含む。
より好ましくは
（１）前記構造式（２０）の固形支持体をベースに親水性物質ブロックを結合させる段階；
（２）（１）段階をｎ−１回繰り返す段階；
（３）前記親水性物質ブロックが結合された固形支持体をベースにＲＮＡ一本鎖を合成する段階；
（４）前記ＲＮＡ一本鎖５’末端に疎水性物質を結合させる段階；
（５）合成が完了すると、固形支持体からＲＮＡ−高分子構造体および相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を分離精製する段階；および
（６）製造されたＲＮＡ−高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖をアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）を介して二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造する段階；
を含む。
【００８０】
前記段階（５）以後、製造が完了すると、高速液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）を利用して、前記反応物を精製した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器で分子量を測定して目的するＲＮＡ−高分子構造体およびＲＮＡ一本鎖が製造されたか否かを確認することができる。前記製造方法において、（３）段階で合成されたＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を合成する段階は（１）段階以前または（１）段階〜（５）段階のうちいずれか一つの過程中に実行されても構わない。
【００８１】
また、構造式（８）または構造式（１４）のようにアンチセンス鎖５’末端にリン酸基が結合された形態の場合は、前記製造方法の段階（６）以前または以後にアンチセンス鎖５’末端にリン酸基を結合させることができる。
【００８２】
また、本発明は、構造式（９）、構造式（１０）、構造式（１５）および構造式（１６）のようなリガンドが結合された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体およびその製造方法を提供する。具体的に、前記構造式（２０）に係る固形支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）を使用して製造する過程は
（１）構造式（２０）の固形支持体をベースに親水性物質ブロックをｎ回繰り返し共有結合させる段階；
（２）段階（１）で合成されたリガンド−親水性物質ブロックが結合された固形支持体をベースにＲＮＡ一本鎖を合成する段階；
（３）段階（２）で収得された物質に５’末端に疎水性物質を共有結合させる段階；
（４）合成が完了すると、固形支持体（ＣＰＧ）からリガンドが付着されたＲＮＡ−高分子構造体一本鎖および相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を分離精製する段階；および
（５）前記リガンドが結合されたＲＮＡ−高分子構造体と相補的配列のＲＮＡ一本鎖をアニーリングして二本鎖を形成する段階；
を含む。
【００８３】
前記段階（５）以後、製造が完了すると、高速液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）を利用して前記反応物を精製した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器で分子量を測定して目的するリガンドが結合されたＲＮＡ−高分子構造体およびＲＮＡ一本鎖が製造されたか否かを確認することができる。前記製造方法において、（２）段階で合成されたＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を合成する段階は、（１）段階以前または（１）段階〜（４）段階のうちいずれか一つの過程中に実行されても構わない。
【００８４】
構造式（１０）または構造式（１６）のようにアンチセンス５’末端にリン酸基が結合された形態の場合は、前記製造方法の段階（６）以前または以後にアンチセンス鎖５’末端にリン酸基を結合させることができる。
【００８５】
さらに他の観点において、構造式（２１）で表される物質（ｍａｔｅｒｉａｌ）およびこれを利用して構造式（１）〜構造式（４）に係るオリゴヌクレオチド構造体を製造する方法を提供する。構造式（２１）は、構造式（２０）とＣとＤに係る置換基だけが異なる。
【化４】
0006422961.tif 000008
【００８６】
前記構造式（２１）に係る物質で、ＣとＤのうち一方は、ジメトキシトリチル（Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）であり、他方は、シアノエチルホスホロアミダイト（Ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒ  ａｍｉｄｉｔｅ）である。
【００８７】
前記構造式（２１）に係る物質を利用して構造式（１）〜構造式（４）に係るオリゴヌクレオチド構造体を製造する方法として、オリゴヌクレオチドが一本鎖である場合にこれを製造する方法は
（１）官能基が結合されている固形支持体、好ましくはＣＰＧを利用してオリゴヌクレオチド一本鎖を合成する段階；
（２）前記オリゴヌクレオチドが結合された固形支持体をベースに親水性物質単量体を結合する段階をｎ回繰り返す段階；
（３）前記親水性物質が結合されたオリゴヌクレオチド５’末端に構造式（２１）に係る物質を共有結合させる段階；
（４）固形支持体からオリゴヌクレオチド高分子構造体を分離する段階；および
（５）前記段階（４）で収得されたオリゴヌクレオチド構造体３’末端に結合された官能基を介して疎水性物質を共有結合させる段階；
を含む。
【００８８】
また、前記構造式（２１）に係る物質を利用して構造式（１）〜構造式（４）に係るオリゴヌクレオチド構造体を製造する方法として、オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合に、これを製造する方法は
（１）官能基が結合されている固形支持体、好ましくはＣＰＧを利用してオリゴヌクレオチド一本鎖を合成する段階；
（２）前記オリゴヌクレオチドが結合された固形支持体をベースに親水性物質単量体を結合する段階をｎ回繰り返す段階；
（３）前記親水性物質が結合されたオリゴヌクレオチド５’末端に構造式（２１）に係る物質を共有結合させる段階；
（４）固形支持体からＲＮＡ−高分子構造体および相補的配列のＲＮＡ一本鎖を分離する段階；
（５）前記段階（４）で収得されたオリゴヌクレオチド構造体３’末端に結合された官能基を介して疎水性物質を共有結合させる段階；および
（６）前記ＲＮＡ−高分子構造体と相補的配列のＲＮＡ一本鎖をアニーリングして二本鎖を形成する段階；
を含む。
【００８９】
また、アンチセンス鎖５’末端にリン酸基が結合された形態の場合は、前記製造方法の段階（６）以前または以後にアンチセンス鎖５’末端にリン酸基を結合させることができる。
【００９０】
さらに他の観点において、本発明は、構造式（１）〜構造式（６）中いずれか一つに係るオリゴヌクレオチド構造体で構成されたナノ粒子を提供する。オリゴヌクレオチドは、疎水性および親水性物質を共に含んでいる両親媒性（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ）であり、ｎ個の親水性物質ブロックからなる親水性の部分は、体内に存在する水分子と水素結合などの相互作用を介して親和力を有しており、外側へ向かうことになって、疎水性物質はそれらの間の疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を介して内側へ向かうことになって熱力学的に安定したナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）を形成することになる。すなわち、ナノ粒子の中心に疎水性物質が位置するようになり、オリゴヌクレオチドの外側方向に親水性物質ブロックが位置して、二重らせんオリゴＲＮＡを保護する形態のナノ粒子を形成する（図１参照）。このように形成されたナノ粒子は、オリゴヌクレオチドの細胞内伝達向上およびオリゴヌクレオチドの遺伝子発現調節効能を向上させて、これを疾病の治療目的で応用することが可能である。
【００９１】
また、親水性物質ブロック内に親水性物質単量体およびその単量体の個数調節が容易で、また使用される親水性物質ブロックの個数も容易に調節することができるので、すべてのオリゴヌクレオチド構造体内のｎ個の親水性物質ブロックからなる親水性物質の部分は、全て同じであるため、このような親水性物質の部分を持つオリゴヌクレオチド構造体は、物質分析が容易で、同じ分子量を持つように追加精製過程を経た親水性物質を使用して合成されたオリゴヌクレオチド構造体に比べて合成過程が簡単で、費用を節減できる特徴を持つ。
【００９２】
また、親水性物質ブロックおよび親水性物質ブロック内親水性物質単量体の繰り返し回数調節を介してオリゴヌクレオチド構造体からなるナノ粒子の大きさを調節することができるので、このようなオリゴヌクレオチドをベースに形成されたナノ粒子は、非常に再現性のある細胞伝達能力を持つことができる。
【００９３】
また、リガンドが結合されたオリゴヌクレオチド、特にリガンドがＮ−アセチルガラクトサミン、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）のような糖類の場合、構造式（１）または構造式（２）に係るオリゴヌクレオチド構造体は、親水性物質ブロックの繰り返し回数が少なかった時減少する親水性を補完および強化する役割を同時に行うことができてナノ粒子の形成を安定化させる。このように形成されたナノ粒子およびリガンドが結合されたナノ粒子は、オリゴヌクレオチドの細胞内伝達向上およびオリゴヌクレオチドの効能を向上させて、これを疾病の治療目的に応用することが可能である。より具体的な構造体の合成とオリゴヌクレオチド構造体で構成されたナノ粒子の特徴、細胞伝達効率および効果は、後述する実施例でより詳細に説明する。
【００９４】
また、本発明は、前記オリゴヌクレオチド構造体またはこれをベースに形成されるナノ粒子を利用した治療方法を提供する。具体的に前記オリゴヌクレオチド構造体で構成されたナノ粒子を準備する段階と前記ナノ粒子を動物の体内に投入する段階を含む治療方法を提供する。
【００９５】
また、本発明は、前記オリゴヌクレオチド構造体で構成されたナノ粒子の薬学的有効量を含む薬剤学的組成物を提供する。
【００９６】
本発明の組成物は、投与のために前記記載した有効成分以外に追加で薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造してもよい。薬剤学的に許容可能な担体は、本発明の有効成分と両立可能であるべきで、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のうち一つの成分または二つ以上の成分を混合して使用でき、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形で製剤化することができる。さらには、当分野の適正な方法でまたはレミントン薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）に開示されている方法を利用して、各疾病に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化することができる。
【００９７】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる有効成分などの含有量および投与方法は、通常の患者の症候と疾病の深刻度に基づいて本技術分野の通常の専門家が決めることができる。また、散剤、精製、カプセル剤、液剤、注射剤、軟こう剤、シロップ剤などの様々な形態で製剤化することができて、単位投与量または多投与量容器、例えば密封されたアンプルおよびビンなどで提供されてもよい。
【００９８】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または、非経口投与が可能である。本発明に係る薬剤学的組成物の投与経路は、これらに限定されず、例えば、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下または局所投与が可能である。
【００９９】
このような臨床投与のために、本発明の薬剤学的組成物は、公知の技術を利用して適した剤形で製剤化することができる。本発明の組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、方法、排泄率および疾病の重症度等によりその範囲が多様であり、本技術分野の通常の専門家が容易に決めることができる。
【０１００】
本発明は、前記オリゴヌクレオチド構造体を利用した生体内または生体外での遺伝子発現調節方法を提供する。尚、本発明は、前記オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を利用した生体内または生体外で遺伝子発現調節方法を提供する。
【０１０１】
《発明の効果》
本発明に係るオリゴヌクレオチド構造体は、いずれも同じ親水性物質の部分を持つことができて、オリゴヌクレオチドに結合される親水性物質が合成ポリマーである時発生する多分散的特性による品質管理（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）等の問題を画期的に改善することができ、多分散性親水性物質を利用した既存精製工程に比べて簡単かつ合成費用を節減することができて、オリゴヌクレオチド構造体の物質分析が容易である長所がある。また、親水性物質ブロックの繰り返し回数および各親水性物質ブロック内の親水性物質単量体の繰り返し回数調節を介してナノ粒子の大きさ調節が可能である。
【０１０２】
特に、本発明に係るオリゴヌクレオチド構造体に受容体媒介内包作用（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＲＭＥ）を介してターゲット細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させる受容体と結合できるリガンドを追加的に結合させる場合、目的する細胞内へのより効率的な伝達が可能で、また、前記リガンドが糖である場合、ナノ粒子のターゲッティング効果と共に、親水性物質ブロックの繰り返し回数に応じて減少する親水性を補完する役割をして、オリゴヌクレオチドの細胞内伝達向上およびオリゴヌクレオチドの遺伝子発現調節効能を向上させることができる長所がある。
【０１０３】
また、親水性物質ブロックにアミン基またはポリヒスチジン基を導入することによって、細胞内に吸収された後、エンドソームからの脱出を容易にして、リソソームによる分解を抑制する効果があって、より高い治療効果を得ることができる長所がある。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】本発明に係る同じ分子量の親水性物質が結合されたオリゴヌクレオチド構造体で構成されたナノ粒子の模式図。
【図２】３，４，６−トリアセチル−１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン−ＣＰＧ（１−Ｈｅｘａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ  Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−ＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ））の全体合成経路を示す図面。
【図３】２，３，４，６−テトラアセチル−１−ヘキサ（エチレングリコール）−マンノース−ＣＰＧ（１−Ｈｅｘａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）−Ｍａｎｎｏｓｅ−ＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ））の全体合成経路を示す図面。
【図４】２，３，４，６−テトラアセチル−１−ヘキサ（エチレングリコール）−グルコース−ＣＰＧ（１−Ｈｅｘａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）−Ｇｌｕｃｏｓｅ−ＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ））の全体合成経路を示す図面。
【図５】１，３，４，６−テトラアセチル−Ｎ−アセチルガラクトサミン（１，３，４，６−Ｔｅｔｒａａｃｅｔｙｌ−ＮＡＧ）（図２の化合物１）のＮＭＲ分析結果を示す図面。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）；７．９１〜７．８６（ｄ，１Ｈ），５．６６〜５．６１（ｄ，１Ｈ），５．２８〜５．２５（ｄ，１Ｈ），５．１０〜５．０３（ｄ，１Ｈ），４．２５〜４．１９（ｔ，１Ｈ），４．１５〜３．９４（ｍ，３Ｈ），２．１２〜２．１０（ｓ，３Ｈ），２．０４〜２．０２（ｓ，３Ｈ），２．００〜１．９８（ｓ，３Ｈ），１．９１〜１．８９（ｓ，３Ｈ），１．７８〜１．７６（ｓ，３Ｈ）。
【図６】３，４，６−トリアセチル−１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン（３，４，６−Ｔｒｉａｃｅｔｙｌ−１−ｈｅｘａ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ＮＡＧ）（図２の化合物２）のＮＭＲ分析結果を示す図面。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）；６．６６〜６．６１（ｄ，１Ｈ），５．３３〜５．２９（ｄ，１Ｈ），５．０２〜４．９６（ｄ，１Ｈ），４．８０〜４．７５（ｄ，１Ｈ），４．２５〜４．０７（ｍ，２Ｈ），３．９３〜３．７９（ｍ，２Ｈ），３．７３〜３．５４（ｍ，２４Ｈ），２．１６〜２．１４（ｓ，３Ｈ），２．０５〜２．０３（ｓ，３Ｈ），１．９９〜１．９７（ｓ，６Ｈ）。
【図７】３，４，６−トリアセチル−１−［ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ’−１’，２’−プロパンジオール］−Ｎ−アセチルガラクトサミン（図２の化合物３）のＮＭＲ分析結果を示す図面。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）；６．８３〜６．７８（ｄ，１Ｈ），６．１０〜６．０８（ｓ，１Ｈ），５．３３〜５．２９（ｄ，１Ｈ），５．００〜４．９４（ｄ，１Ｈ），４．８２〜４．７７（ｄ，１Ｈ），４．２２〜４．０８（ｍ，４Ｈ），３．９４〜３．８５（ｍ，２Ｈ），３．８３〜３．７４（ｍ，１Ｈ），３．６６〜３．５２（ｍ，２４Ｈ），３．４０〜３．２４（ｍ，２Ｈ），２．１８〜２．１６（ｓ，６Ｈ），２．０５〜２．０３（ｓ，３Ｈ），２．００〜１．９８（ｓ，３Ｈ）。
【図８】３，４，６−トリアセチル−１−［ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ’−１’−メトキシ（ジメトキシトリチル）−２’−プロパノール］−Ｎ−アセチルガラクトサミン（図２の化合物４）のＮＭＲ分析結果を示す図面。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）；７．８０〜７．７５（ｄ，１Ｈ），７．４０〜７．２０（ｍ，９Ｈ），７．００〜６．９８（ｓ，１Ｈ），６．９０〜６．８５（ｄ，４Ｈ），５．２２〜５．２０（ｓ，１Ｈ），５．００〜４．８７（ｍ，２Ｈ），４．５８〜４．５５（ｄ，１Ｈ），４．０４〜４．０２（ｓ，４Ｈ），３．９４〜３．８２（ｍ，１Ｈ），３．７４〜３．７２（ｓ，６Ｈ），３．５１〜３．４９（ｓ，２４Ｈ），３．１８〜３．１２（ｍ，１Ｈ），２．９４〜２．８５（ｍ，２Ｈ），２．１１〜２．０９（ｓ，３Ｈ），２．００〜１．９８（ｓ，３Ｈ），１．９０〜１．８８（ｓ，３Ｈ），１．７８〜１．７６（ｓ，３Ｈ）。
【図９】３，４，６−トリアセチル−１−［ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ’−１’−メトキシ（ジメトキシトリチル）−２’−プロポキシ（サクシニックアシッド）］−Ｎ−アセチルガラクトサミン（図２の化合物５）のＮＭＲ分析結果を示す図面。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）；７．４３〜．３８（ｄ，２Ｈ），７．３１〜７．１９（ｍ，７Ｈ），６．８４〜６．７９（ｄ，４Ｈ），６．７５〜６．６７（ｔ，１Ｈ），５．５２〜４．８９（ｍ，１Ｈ），５．３２〜５．３０（ｓ，１Ｈ），５．２１〜５．１９（ｓ，１Ｈ），５．０１〜４．９５（ｄ，１Ｈ），４．８１〜４．７６（ｄ，１Ｈ），４．３０〜４．０８（ｍ，３Ｈ），３．９３〜３．８６（ｍ，２Ｈ），３．７９〜３．７７（ｓ，６Ｈ），３．６６〜３．５２（ｍ，２４Ｈ），３．３６〜３．３２（ｍ，１Ｈ），３．２１〜３．１７（ｄ，２Ｈ），２．７５〜２．５６（ｍ，４Ｈ），２．１８〜２．１６（ｓ，３Ｈ），２．０４〜２．０１（ｍ，６Ｈ），１．９８〜１．９６（ｓ，３Ｈ）。
【図１０】リガンドが結合されたオリゴヌクレオチド構造体の構造およびその一例で、ｍｏｎｏ−ＮＡＧ−（Ｈｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｎ−Ｏｌｉｇｏ−Ｌｉｐｉｄ構造と導入されたＬｉｐｉｄの構造を示す図面。（Ａ）リガンドが結合されたオリゴヌクレオチド構造体の構造。（Ｂ）ｍｏｎｏ−ＮＡＧ−（Ｈｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｎ−Ｏｌｉｇｏ−Ｌｉｐｉｄ構造。
【図１１】ｍｏｎｏ−ＮＡＧ−（ＨｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅＧｌｙｃｏｌ）１−Ｏｌｉｇｏ−Ｌｉｐｉｄ質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）結果を示す図面。（ｍｏｎｏ−ＮＡＧ−（Ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）１−Ｏｌｉｇｏ−Ｌｉｐｉｄの分子量（ＭＷ  ７８０７．４））。
【図１２】ｍｏｎｏ−ＮＡＧ−（ＨｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅＧｌｙｃｏｌ）２−Ｏｌｉｇｏ−Ｌｉｐｉｄ構造と質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）結果を示す図面。（ｍｏｎｏ−ＮＡＧ−（Ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）２−Ｏｌｉｇｏ−Ｌｉｐｉｄの分子量（ＭＷ  ８１５２．７））。
【図１３】ｍｏｎｏ−ＮＡＧ−（ＨｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅＧｌｙｃｏｌ）３−Ｏｌｉｇｏ−Ｌｉｐｉｄ構造と質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）結果を示す図面。（ｍｏｎｏ−ＮＡＧ−（Ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）３−Ｏｌｉｇｏ−Ｌｉｐｉｄの分子量（ＭＷ  ８４９８．０））。
【図１４】ｍｏｎｏ−ＮＡＧ−（ＨｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅＧｌｙｃｏｌ）４−Ｏｌｉｇｏ−Ｌｉｐｉｄ構造と質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）結果を示す図面。（ｍｏｎｏ−ＮＡＧ−（Ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）４−Ｏｌｉｇｏ−Ｌｉｐｉｄの分子量（ＭＷ  ８８４３．３））。
【図１５】本発明に係る同じ分子量の親水性物質が結合された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体のナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）の臨界ミセル濃度を測定したグラフ。
【図１６】本発明に係る同じ分子量の親水性物質が結合された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体のナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）の大きさおよび多分散指数を示す図面（ｎは、親水性物質単量体の繰り返し回数を示して該当構造からなった二重らせんオリゴＲＮＡ構造体のナノ粒子を意味する）。
【図１７】本発明に係る同じ分子量の親水性物質が結合された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体のナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）が処理された細胞株で目標遺伝子の発現阻害程度を示す図面（ｎは、親水性物質単量体の繰り返し回数を示して該当構造からなった二重らせんオリゴＲＮＡ構造体のナノ粒子を意味する）。
【実施例】
【０１０５】
以下、添付された実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、このような実施例は本発明の技術的思想の内容と範囲を簡単に説明するための例示するものであって、これによって本発明の技術的範囲が限定されたり変更されるのではない。また、このような例示に基づいて本発明の技術的思想の範囲の中で様々な変形と変更が可能であることは当業者には当然である。
【０１０６】
≪実施例１：３’Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）ＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）の製造≫
リガンドが結合された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造するために二重らせんオリゴＲＮＡ構造体に結合が可能なリガンド物質であるＮ−アセチルガラクトサミンＣＰＧを製造した。
【０１０７】
実施例１−１：１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン−ＣＰＧ（１−Ｈｅｘａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ  Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−ＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ））試薬の製造
Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ  Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，ＮＡＧ）を二重らせんオリゴＲＮＡ構造体に結合するために、図２に示した通り１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン−ＣＰＧ（１−Ｈｅｘａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ  Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−ＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ））を製造した。
【０１０８】
実施例１−１−１：１，３，４，６−テトラアセチル−ＮＡＧ（１，３，４，６−Ｔｅｔｒａａｃｅｔｙｌ−ＮＡＧ）（図２の化合物１）の製造
出発物質塩酸ガラクトサミン（Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，米国）（１０ｇ，４６．３７ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（１５０ｍＬ）、トリエチルアミン（５５６．４８ｍＬ）を混合して１時間還流する。ゆっくり常温で冷却して、氷水を利用して０℃に冷却した後、無水酢酸（４３．８３ｍＬ、４６３．７０ｍｍｏｌ）を滴加した。滴加が終わった後、氷水を除去して、２４時間常温で撹はんした。反応が完了すると、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でｐＨが中性になる時までゆっくり投入した。ｐＨが中性になった後２時間常温で撹はんして生成された固体をろ過して、ろ過物をエチルアセテート、蒸溜水、エチルアセテートの順に洗浄した。固体を真空乾燥して１，３，４，６−テトラアセチル−Ｎ−アセチルガラクトサミン（９．７９２ｇ，５６％）を得た（図２参照）。
【０１０９】
実施例１−１−２：３，４，６−トリアセチル−１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン（３，４，６−Ｔｒｉａｃｅｔｙｌ−１−ｈｅｘａ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ＮＡＧ）（図２の化合物２）の製造
前記実施例１−１−１で得られた１，３，４，６−テトラアセチル−Ｎ−アセチルガラクトサミン（６．７７ｇ、１８．０４ｍｍｏｌ）、塩化鉄ＩＩＩ（３．８０ｇ、２３．４５ｍｍｏｌ）、メチレンクロライド（２００ｍＬ）を混合して常温で撹はんした。１０分間撹はんした後、ヘキサ（エチレングリコール）（５．９０ｍＬ、４．８２ｍｍｏｌ）を投入して２時間還流した。反応が完了すると、セライトを使用してろ過し、ろ過物をメチレンクロライドで洗浄した。ろ過液を減圧濃縮して、エチルアセテートと蒸溜水を入れて水層を抽出した。獲得された水層をメチレンクロライドで抽出して有機層を集めて無水硫酸マグネシウムで乾燥してろ過した。ろ過液を減圧濃縮して、真空乾燥して３，４，６−トリアセチル−１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン（２．２４ｇ、７４．９％）を得た（図３参照）。
【０１１０】
実施例１−１−３：３，４，６−トリアセチル−１−［ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ’−１’，２’−プロパンジオール］−Ｎ−アセチルガラクトサミン（３，４，６−Ｔｒｉａｃｅｔｙｌ−１−［ｈｅｘａ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−Ｎ’−１’，２’−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ］−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ＮＡＧ）（図２の化合物３）の製造
前記実施例１−１−２で得られた３，４，６−トリアセチル−１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン（１３．６６ｇ、２２．３３ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２２０ｍＬ）に投入して撹はんする。Ｎ，Ｎ’−ジサクシミジルカルボネート（９．１５ｇ、３５．７３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（９．９０ｍＬ、７１．４６ｍｍｏｌ）を投入して、２４時間撹はんする。３−アミノ−１，２−プロパンジオール（３．２６ｇ、３５．７３ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド６０ｍＬに希釈して、トリエチルアミン（４．９５ｍＬ、３５．７３ｍｍｏｌ）を投入した後、反応溶液に入れて２４時間撹はんする。減圧濃縮して、真空乾燥する。カラムで分離して、溶液を減圧濃縮する。真空乾燥して３，４，６−トリアセチル−１−［ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ’−１’，２’−プロパンジオール］−Ｎ−アセチルガラクトサミン（９．２３ｇ、５６．７％）を得る（図４参照）。
【０１１１】
実施例１−１−４：３，４，６−トリアセチル−１−［ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ’−１’−メトキシ（ジメトキシトリチル）−２’−プロパノール］−Ｎ−アセチルガラクトサミン（３，４，６−Ｔｒｉａｃｅｔｙｌ−１−［ｈｅｘａ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−Ｎ’−１’−ｍｅｔｈｏｘｙ（ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）−２’−ｐｒｏｐａｎｏｌ］−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ＮＡＧ）（図２の化合物４）の製造
前記実施例１−１−３で得られた３，４，６−トリアセチル−１−［ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ’−１’，２’−プロパンジオール］−Ｎ−アセチルガラクトサミン（９．２３ｇ（１２．６７ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をメチレンクロライド（１２０ｍＬ）に投入して撹はんする。トリエチルアミン５．２７ｍＬ（３８．００ｍｍｏｌ、３ｅｑ）を投入する。ディエムティクロライド（４．７２ｇ、１３．９３ｍｍｏｌ）をメチレンクロライド（２０ｍＬ）に希釈して投入して、２４時間の間撹はんする。減圧濃縮する。エチルアセテートで抽出する。無水硫酸ナトリウムで乾燥して、ろ過する。ろ過液を減圧濃縮する。カラムで分離して、溶液を減圧濃縮する。真空乾燥して望む３，４，６−トリアセチル−１−［ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ’−１’−メトキシ−ジメトキシトリチル−２’−プロパノール］−Ｎ−アセチルガラクトサミン（７．７７ｇ、５９．５％）を得る。
【０１１２】
実施例１−１−５：３，４，６−トリアセチル−１−［ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ’−１’−メトキシ（ジメトキシトリチル）−２’−プロポキシ（サクシニックアシッド）］−Ｎ−アセチルガラクトサミン（３，４，６−Ｔｒｉａｃｅｔｙｌ−１−［ｈｅｘａ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−Ｎ’−１’−ｍｅｔｈｏｘｙ（ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）−２’−ｐｒｏｐｏｘｙ（ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）］−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ＮＡＧ）（図２の化合物５）の製造
前記実施例１−１−４で得られた３，４，６−トリアセチル−１−［ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ’−１’−メトキシ（ジメトキシトリチル）−２’−プロパノール］−Ｎ−アセチルガラクトサミン（７．７２ｇ、７．４８７ｍｍｏｌ）、ピリジン（７０ｍＬ）を投入して撹はんする。無水酢酸（３．７５ｇ、３７．４８６ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．４６ｇ、３．７４５ｍｍｏｌ）を投入して、６０〜７０℃で２４時間撹はんする。減圧濃縮して、真空乾燥する。エチルアセテートで抽出する。無水硫酸ナトリウムで乾燥して、ろ過する。ろ過液を減圧濃縮する。カラムで分離して、溶液を減圧濃縮する。真空乾燥して望む３，４，６−トリアセチル−１−［ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ’−１’−メトキシ（ジメトキシトリチル）−２’−プロポキシ（サクシニックアシッド］−Ｎ−アセチルガラクトサミン（７．６１ｇ、８９．９％）を得る。
【０１１３】
実施例１−１−６：３，４，６−トリアセチル−１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン−ＣＰＧのＣａｐｐｉｎｇ前ＣＰＧ化合物（１−Ｈｅｘａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ  Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−ＣＰＧのＣａｐｐｉｎｇ前ＣＰＧ化合物）（図２の化合物６）の製造
前記実施例１−１−５で得られた３，４，６−トリアセチル−１−［ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ’−１’−メトキシ（ジメトキシトリチル）−２’−プロポキシ（サクシニックアシッド）］−Ｎ−アセチルガラクトサミン（０．３４ｇ、０．３０ｍｍｏｌ）、ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（１０００Å）（５ｇ）、ビス−２−ヨウ素−３−オキサゾリジニルホスホリッククロライド（０．２ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．０６ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、メチレンクロライド（５０ｍＬ）を投入する。トリエチルアミン（０．０３ｍＬ、２．２５ｍｍｏｌ）を投入する。２４時間反応させる。ろ過してメタノールで洗浄する。乾燥して望む３，４，６−トリアセチル−１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン−ＣＰＧのＣａｐｐｉｎｇ前ＣＰＧ化合物（４．９１ｇ）を得る。
【０１１４】
実施例１−１−７：３，４，６−トリアセチル−１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン−ＣＰＧ（１−Ｈｅｘａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ  Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−ＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ））（図２の化合物７）の製造
前記実施例１−１−６で得られた３，４，６−トリアセチル−１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン−ＣＰＧのＣａｐｐｉｎｇ前ＣＰＧ化合物（４．８６ｇ）、ピリジン（３０ｍＬ）、無水酢酸（６．０２ｍＬ、６３．７０ｍｍｏｌ）、１−メチルイミダゾール（５．０８ｍＬ、６３．７０ｍｍｏｌ）を投入した後、２４時間反応する。ろ過して、メタノールで洗浄する。ろ過物を真空乾燥して望む化合物３，４，６−トリアセチル−１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン−ＣＰＧ（１−Ｈｅｘａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ  Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−ＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ）（２．８ｇ）を得る。
【０１１５】
≪実施例２：二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の製造≫
以下、実施例ではサバイビンを抑制するために、サバイビンに対する二重らせんオリゴＲＮＡを使った。サバイビンは今までテストされた多くの新生腫瘍や形質転換された細胞株で共通して発現するタンパク質であり、抗癌治療において重要なターゲットになると予測されている（Survivin: a new target for anti-cancer therapy. Cancer Treat Rev. 2009 Nov; 35(7):553-62）。
【０１１６】
本発明のサバイビンに対する二重らせんオリゴＲＮＡは、配列番号１番と記載されるセンス鎖とこれに相補的な配列であるアンチセンス鎖で構成されて、対照群として使用される二重らせんオリゴＲＮＡは、配列番号２番と記載されるセンス鎖とこれに相補的な配列であるアンチセンス鎖で構成されている。本実施例に使用された二重らせんオリゴＲＮＡの塩基配列は下記のとおりである。
（配列番号１）５’−ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＡＵＣ  ＡＡＣ  ＡＵＵ  ＵＵＣ  Ａ−３’
（配列番号２）５’−ＣＵＵ  ＡＣＧ  ＣＵＧ  ＡＧＵ  ＡＣＵ  ＵＣＧ  Ａ−３’
【０１１７】
前記二重らせんオリゴＲＮＡは、β−シアノエチルホスホロアミダイト（β−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）を利用してＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）結合を連結していく方法を使用して、前記二重らせんオリゴＲＮＡ一本鎖を合成した（Polymer support oligonucleotide synthesis XVIII: use of beta-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholinophosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucleic Acids Res. 1984 Jun 11; 12(11):4539-57）。
【０１１８】
合成過程は、ヌクレオシド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）が結合された固形支持体（ＣＰＧ）上から始まって遮断除去（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）、結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）、キャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）および酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）からなるサイクル（ｃｙｃｌｅ）を繰り返すことによって、望む配列のＲＮＡ一本鎖が得られる。該当一連の二重らせんオリゴＲＮＡの合成過程は、ＲＮＡ合成器（３８４  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ，ＢＩＯＮＥＥＲ，韓国）を使用した。
【０１１９】
二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を構成する親水性物質単量体の繰り返し回数に応じた二重らせんオリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子の特性分析のために、次のような構造の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造した。
【０１２０】
本発明で製造されたリガンドが結合された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、表４のような構造を持つ。
【０１２１】
【表４】
0006422961.tif 000009
【０１２２】
前記表４で、Ｓは二重らせんオリゴＲＮＡのセンス鎖；ＡＳは二重らせんオリゴＲＮＡのアンチセンス鎖；ＰＯ４はリン酸基；ＮＡＧはリガンドでＮ−アセチルガラクトサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）；ＰＥＧは、多分散系親水性物質でポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）；ヘキサエチレングリコール−ＰＯ３−は、親水性物質単量体でヘキサエチルレングリコール（ｈｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）がリン酸基（ＰＯ３−）を介して結合される；下付き文字は、親水性物質単量体の繰り返し回数（ｎ）；Ｃ２４は疎水性物質でジスルフィド結合が含まれているテトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ）；５’および３’は二重らせんオリゴＲＮＡの末端方向を意味する。
【０１２３】
二重らせんオリゴＲＮＡ構造体のアンチセンス鎖は、全て同じ構造で、先述した方式のとおりβ−シアノエチルホスホロアミダイトを利用してＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結していく方法を使用して製造した後に５’末端にリン酸基を結合するために化学的リン酸化試薬（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ，ＣＰＲ）である［３−（４，４’ジメトキシトリチルオキシ）−２，２−ジカルボキシエチル］プロピル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイト（［３−（４，４’Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ）−２，２−ｄｉｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ］ｐｒｏｐｙｌ−（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）を利用して５’末端にリン酸基が結合されたＳ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ＰＯ４のアンチセンス鎖を製造した。または、ＲＮＡ一本鎖をＣＰＧから回収した後、リン酸化酵素を処理して５’末端にリン酸基を結合させる方法を使用してリン酸基が結合されたアンチセンス鎖を製造した。
【０１２４】
ＳＡＭｉＲＮＡ二重らせんオリゴＲＮＡ構造体のセンス鎖の場合、実施例１で製造された３，４，６−トリアセチル−１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン−ＣＰＧ（１−Ｈｅｘａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ  Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−ＣＰＧ）を支持体として親水性物質であるＰＥＧ−ホスホロアミダイト（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ、この時、使用されたＰＥＧのＭｎは２，０００である）を前記反応で結合させた後、ＲＮＡを合成を進行した後、ジスルフィド結合が含まれているテトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ）（Ｃ２４）を５’末端に結合して、３’末端部位にＮＡＧ−ＰＥＧが結合されていて、５’末端にテトラドコサンが結合されているＳＡＭｉＲＮＡのセンス鎖を製造した。
【０１２５】
ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝１）二重らせんオリゴＲＮＡ構造体のセンス鎖は、実施例１で製造された３，４，６−トリアセチル−１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン−ＣＰＧ（１−Ｈｅｘａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ  Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−ＣＰＧ）を支持体として前記反応を介してＲＮＡを合成した後、追加的に５’末端部位に疎水性物質であるジスルフィド結合が含まれているテトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ，Ｃ２４）を結合させて、３’末端にＮＡＧ−ヘキサエチレングリコールが結合されていて、５’末端にテトラドコサンが結合されているｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝１）のセンス鎖を作った。
【０１２６】
ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝２）二重らせんオリゴＲＮＡ構造体のセンス鎖は、実施例１で製造された３，４，６−トリアセチル−１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン−ＣＰＧ（１−Ｈｅｘａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ  Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−ＣＰＧ）を支持体として、親水性物質単量体であるＤＭＴヘキサエチレングリコールホスホロアミダイト（Ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ  ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）を前記反応を介して結合した後、ＲＮＡを合成を進行した後、追加的に５’末端部位に疎水性物質であるジスルフィド結合が含まれているテトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ，Ｃ２４）を結合させて、３’末端にＮＡＧ−ヘキサエチレングリコール−（−ＰＯ４−ヘキサエチレングリコール）１が結合されていて、５’末端にテトラドコサンが結合されているｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝２）のセンス鎖を作った。
【０１２７】
ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝３）二重らせんオリゴＲＮＡ構造体のセンス鎖は、実施例１で製造された３，４，６−トリアセチル−１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン−ＣＰＧ（１−Ｈｅｘａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ  Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−ＣＰＧ）を支持体として、親水性物質単量体であるＤＭＴヘキサエチレングリコールホスホロアミダイト（Ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ  ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）二つを前記反応を介して連続して結合した後、ＲＮＡを合成を進行した後、追加的に５’末端部位に疎水性物質であるジスルフィド結合が含まれているテトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ，Ｃ２４）を結合させて、３’末端にＮＡＧ−ヘキサエチレングリコール−（−ＰＯ４−ヘキサエチレングリコール）２が結合されていて、５’末端にテトラドコサンが結合されているｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝３）のセンス鎖を作った。
【０１２８】
ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝４）二重らせんオリゴＲＮＡ構造体のセンス鎖は、実施例１で製造された３，４，６−トリアセチル−１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン−ＣＰＧ（１−Ｈｅｘａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ  Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−ＣＰＧ）を支持体として、親水性物質単量体であるＤＭＴヘキサエチレングリコールホスホロアミダイト（Ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ  ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）三つを前記反応を介して連続して結合した後、ＲＮＡを合成を進行した後、追加的に５’末端部位に疎水性物質であるジスルフィド結合が含まれているテトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ，Ｃ２４）を結合させて、３’末端にＮＡＧ−ヘキサエチレングリコール−（−ＰＯ３−ヘキサエチレングリコール）３が結合されていて、５’末端にテトラドコサンが結合されているｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝４）のセンス鎖を作った。
【０１２９】
合成が完了すると、６０℃の温湯器（ｗａｔｅｒ  ｂａｔｈ）で２８％（ｖ／ｖ）アンモニア（ａｍｍｏｎｉａ）を処理して合成されたＲＮＡ一本鎖およびＲＮＡ−高分子構造体をＣＰＧから引き離した後、脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）反応を介して保護残基を除去した。保護残基が除去されたＲＮＡ一本鎖およびＲＮＡ−高分子構造体は、７０℃のオーブンでＮ−メチルピロリドン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎ）、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）およびトリエチルアミントリハイドロフルオリド（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｔｒｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｄｅ）を体積比１０：３：４の割合で処理して、２’ＴＢＤＭＳ（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）を除去した。前記反応物から高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）でＲＮＡ一本鎖、ＲＮＡ−高分子構造体およびリガンドが結合されたＲＮＡ−高分子構造体を分離して、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ，ＳＨＩＭＡＤＺＵ，日本）で分子量を測定して、合成しようとする塩基配列およびＲＮＡ−高分子構造体と合致するのか確認した（図１１〜１４）。その後、それぞれの二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造するために、センス鎖とアンチセンス鎖を同量混合して１Ｘアニーリングバッファー（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  カリウムアセテート（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、２ｍＭ  マグネシウムアセテート（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、ｐＨ７．０〜７．５）に入れて、９０℃恒温水槽で３分反応させた後、再び３７℃で反応させて、目的するＳＡＭｉＲＮＡ、ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝１）、ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝２）、ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝３）およびｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝４）をそれぞれ製造した。製造された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、電気泳動を介してアニーリングを確認した。
【０１３０】
≪実施例３：ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡからなるナノ粒子の物性分析≫
前記実施例２で製造されたｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ二重らせんオリゴＲＮＡの末端に結合された疎水性物質の間の疎水性相互作用によってナノ粒子、すなわちミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）を形成するようになる（図１参照）。
【０１３１】
ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡの親水性物質単量体繰り返し回数に応じたナノ粒子の大きさおよび臨界ミセル濃度（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｍｉｃｅｌｌｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＣＭＣ）値と透過電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＴＥＭ）分析を介して該当ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡで構成されたナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）の形成を確認した。
【０１３２】
実施例３−１：ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡからなるナノ粒子の臨界ミセル濃度測定
単一分子に疎水性基と親水性基が共に入っている両親媒性物質（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ）は、界面活性剤になれるが、界面活性剤は、水溶液に溶解すると、疎水性基は水との接触を避けるために中心に集まって、親水性基は外側へ向かってミセルを形成するようになる。この時、最初にミセルを形成するようになる濃度を臨界ミセル濃度（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｍｉｃｅｌｌｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＣＭＣ）という。蛍光染料を利用してＣＭＣを測定する方法は、ミセルが形成される前／後に蛍光染料の蛍光値（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）グラフ曲線の傾きが急激に変わる特性に基づいたものである。ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡで構成されたナノ粒子の臨界ミセル濃度測定のために、蛍光染料である０．０４ｍＭ  ＤＰＨ（１，６−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−１，３，５−ｈｅｘａｔｒｉｅｎｅ，ＳＩＧＭＡ，ＵＳＡ）を準備する。ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝１）１ｎｍｏｌｅ／μＬを０．０９７７μｇ／ｍＬで最高５０μｇ／ｍＬの濃度でＤＰＢＳで段階別に希釈して、合計１８０μＬのｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝１）試料を準備する。準備された試料に０．０４ｍＭ  ＤＰＨと対照群として使用されるＤＰＨの溶媒であるメタノールをそれぞれ２０μＬずつ添加してよく混合した後、超音波分散器（Ｗｉｓｅｃｌｅａｎ，ＤＡＩＨＡＮ，韓国）を介してナノ粒子の大きさを均質化（７００Ｗ；振幅２０％）した。均質化された試料は、光を遮断した常温条件で約２４時間反応させた後、蛍光値（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：３５５ｎｍ，ｅｍｉｓｓｉｏｎ：４２８ｎｍ，ｔｏｐ  ｒｅａｄ）を測定した。測定された蛍光値は、相対的な蛍光値を確認するものであるため、同じ濃度でＤＰＨ含まれた試料の蛍光値−メタノールだけ含まれた試料の蛍光値を求めて（Ｙ軸）処理したｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝１）濃度のｌｏｇ値（Ｘ軸）に対するグラフで図示した。前記ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝２）、ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝３）も同じ方法で測定した。
【０１３３】
各濃度別測定された蛍光値は、低濃度区間から高濃度区間に移動すると急激に増加するが、このように急激に増加する地点の濃度がＣＭＣ濃度となる。したがって、蛍光量が増加しない低濃度区間と蛍光量が増加した高濃度区間をいくつかの地点に区分して傾向線を描いて、二つの傾向線が会う交差点のＸ値がＣＭＣ濃度となる。測定されたｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝１）からなるナノ粒子のＣＭＣは０．８３μｇ／ｍＬと比較的高く形成されることが観察され、ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝２）からなるナノ粒子のＣＭＣは０．３３μｇ／ｍＬと非常に低く形成されることが観察された。ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝３）からなるナノ粒子のＣＭＣは０．５８μｇ／ｍＬ、ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝４）からなるナノ粒子のＣＭＣは０．４４μｇ／ｍＬと観察された（図１５）。これにより、ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡからなるナノ粒子が非常に低い濃度でもミセルをよく形成できることを確認した。
【０１３４】
実施例３−２：ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡからなるナノ粒子の製造
均質なナノ粒子の製造のために、前記ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝１）を１．５ｍＬ  ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）に５０μｇ／ｍＬの濃度で溶解した後、−７５℃、５ｍＴｏｒｒ条件で４８時間凍結乾燥した。前記ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝２）、ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝３）、ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝４）も同じ方法で製造された。
【０１３５】
実施例３−３：ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡからなるナノ粒子の大きさおよび多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ、以下「ＰＤＩ」という）測定
ゼータ−電位測定器（ｚｅｔａ−ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）を介して前記ナノ粒子の大きさを測定した。具体的に実施例３−２で製造された均質化されたナノ粒子は、ゼータ−電位測定器（Ｎａｎｏ−ＺＳ，ＭＡＬＶＥＲＮ，イギリス）で大きさを測定したが、物質に対する屈折率（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）は、１．４５９、吸収率（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）は０．００１として、溶媒であるＤＰＢＳの温度２５℃およびそれによる粘度（ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）は１．０２００、および屈折率は１．３３５の値を入力して測定した。１回の測定は、１５回反復構成された大きさ測定からなり、これを６回繰り返した。前記ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝１）、ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝２）、ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝３）、ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝４）も同じ方法で測定した。
【０１３６】
ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝１）で構成されたナノ粒子の場合、１１１ｎｍの大きさと０．１９のＰＤＩを持つことが確認された。ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝２）で構成されたナノ粒子の場合、約８６ｎｍの大きさと０．２５のＰＤＩ値を持ち、ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝３）で構成されたナノ粒子の場合、約８０ｎｍの大きさと０．３０のＰＤＩ値を持ち、ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝４）で構成されたナノ粒子の場合、約８３ｎｍの大きさと０．２６のＰＤＩ値を持つことが確認された（図１６）。ＰＤＩ値が低いほど該当粒子が均等に分布していることを示す数値で、本発明のナノ粒子は、非常に均一な大きさで形成されることが分かった。
【０１３７】
実施例３−４：ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡからなるナノ粒子の透過電子顕微鏡観察
ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡからなるナノ粒子が形成された形態を確認するために、透過電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＴＥＭ）を介して観察した。具体的にＳ−ＳＡＭｉＲＮＡをＤＰＢＳに最終１００μｇ／ｍＬの濃度で溶解した後、超音波分散器（Ｗｉｓｅｃｌｅａｎ，ＤＡＩＨＡＮ，韓国）でナノ粒子の大きさを均質化（７００Ｗ；振幅（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）２０％）した。Ｓ−ＳＡＭｉＲＮＡからなるナノ粒子は、電子密度が高い物質でネガティブ染色（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）法を介して観察された。ＴＥＭを介して観察されたナノ粒子は、実施例３−２で測定されたナノ粒子の大きさと類似する程度でナノ粒子が良好に形成されたことが確認された。
【０１３８】
≪実施例４：ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡからなるナノ粒子を利用した腫瘍細胞株でのターゲット遺伝子の発現抑制≫
前記実施例３−２で製造したｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡからなるナノ粒子を利用して、形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）された腫瘍細胞株のサバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）遺伝子の発現様子を分析した。
【０１３９】
実施例４−１：腫瘍細胞株の培養
米国種菌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）から取得したヒト子宮癌細胞（ＨｅＬａ）はＥＭＥＭ培養培地（ＡＴＣＣ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ，米国）に１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを添加して、３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下に培養した。
【０１４０】
実施例４−２：ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡからなるナノ粒子を利用した腫瘍細胞株の形質転換
前記実施例４−１で培養された１×１０５繊維母細胞細胞株を３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下に１２−ウェルプレートで１８時間ＥＭＥＭで培養した後、培地を除去した後、各ウェル当たり同量のＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、米国）を分株した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地１００μＬと前記実施例３−２で製造したＳＡＭｉＲＮＡおよびｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡを５０μｇ／ｍＬの濃度でＤＰＢＳに添加して、実施例３−１と同じ方法で−７５℃、５ｍＴｏｒｒ条件で４８時間凍結乾燥して均一なナノ粒子を製造した。その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分株された腫瘍細胞株の各ウェルに形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）用溶液を２００ｎＭの濃度で処理して、３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で合計４８時間培養した。
【０１４１】
実施例４−３：サバイビン遺伝子のｍＲＮＡ相対的定量分析
前記実施例４−２で形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）された細胞株から全体ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成した後、リアルタイム重合酵素連鎖反応（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を介してサバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）ｍＲＮＡ発現量を大韓民国公開特許公報第２００９−００４２２９７号の方法に従って相対定量した（図１７）。Ｓｕｒ５８４は、ＳＡＭｉＲＮＡの構造別にターゲット遺伝子であるサバイビンに特異的な二重らせんオリゴＲＮＡ配列（配列番号１）を持つＳＡＭｉＲＮＡを意味して、ＣＯＮＴは、ターゲット遺伝子の発現に影響を及ぼすことができない対照群配列（配列番号２）を含むＳＡＭｉＲＮＡを意味する。ターゲット遺伝子のｍＲＮＡ発現阻害程度は、ＣＯＮを処理した試料のターゲット遺伝子発現量に対するＳｕｒ５８４を処理した試料のターゲット遺伝子発現量で相対的な定量法（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）を介して計算された。サバイビン特異的二重らせんオリゴＲＮＡが含まれたｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝１〜４）は、いずれも目標遺伝子の発現阻害効果を示したが、親水性物質ブロックが二つ以上であるｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝２）から目標遺伝子の高い発現阻害効果（約７５％以上発現阻害）が維持されることが観察された。
【０１４２】
≪実施例５：アミン基および／または、ヒスチジン基が親水性物質に導入された二重らせんオリゴ構造体の製造≫
５．１：エチレングリコールを親水性物質単量体として含むＳＡＭｉＲＮＡの製造
本発明でのエチレングリコール、特にヘキサエチレングリコール（ｈｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）を親水性物質単量体として含み、疎水性物質としてＣ２４テトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ）を含む場合の二重らせんオリゴ構造体は、次のような構造体（２２）の構造で示すことができる。
【化５】
0006422961.tif 000010
【０１４３】
前記構造式（２２）でのＣ２４は、疎水性物質であるテトラドコサンを、ｎはヘキサエチレングリコールの繰り返し単位を示し、前記構造式（１）または構造式（２）でのｎと同じ値を持つ。
本実施例ではｎが４である下記の構造式（２３）のような二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（［ｈｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ］４−ＳＡＭｉＲＮＡ）を製造した。
【化６】
0006422961.tif 000011
前記構造式（２３）をさらに具体的に示すと、次の構造式（２４）の通りである。
【化７】
0006422961.tif 000012
【０１４４】
前記構造式（２３）および（２４）で、ＳはｓｉＲＮＡのセンス鎖；ＡＳはｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖；Ｈｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌは親水性物質；Ｃ２４は疎水性物質でジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ）が含まれたテトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ）；５’および３’は、二重らせんオリゴＲＮＡ末端の方向性を意味する。
【０１４５】
前記構造式（２３）および（２４）でのｓｉＲＮＡのセンス鎖は、大韓民国公開特許公報第２０１２−０１１９２１２号の実施例１に記載された方法により製造された３’Ｕｎｙ−ＣＰＧを支持体としてβ−シアノエチルホスホロアミダイト形態のＨｅｘａ  Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ｎ個を合成後、先に述べた方式のとおりＲＮＡβ−シアノエチルホスホロアミダイトを利用してＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結していく方法を介して３’末端部位にヘキサエチレングリコール（Ｈｅｘａ  Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）が結合されたセンス鎖のオリゴＲＮＡ−親水性物質構造体を合成した後、ジスルフィド結合が含まれているテトラドコサンを５’末端に結合して望むＲＮＡ−高分子構造体のセンス鎖を製造した。前記鎖とアニーリングを行うアンチセンス鎖の場合、先に述べた反応を介してセンス鎖と相補的な配列のアンチセンス鎖を製造した。
【０１４６】
合成が完了すると、６０℃の温湯器（ｗａｔｅｒ  ｂａｔｈ）で２８％（ｖ／ｖ）アンモニア（ａｍｍｏｎｉａ）を処理して合成されたＲＮＡ一本鎖とＲＮＡ高分子構造体をＣＰＧから引き離した後、脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）反応を介して保護残基を除去した。保護残基が除去されたＲＮＡ一本鎖およびＲＮＡ−高分子構造体は７０℃のオーブンでＮ−メチルピロリドン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎ）、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）およびトリエチルアミントリハイドロフルオリド（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｔｒｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｄｅ）を体積比１０：３：４の割合で処理して、２’ＴＢＤＭＳ（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｕｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）を除去した。
【０１４７】
前記反応物をＤａｉｓｏｇｅｌ  Ｃ１８（Ｄａｉｓｏ，Ｊａｐａｎ）カラムが取り付けられたＨＰＬＣ  ＬＣ９１８（Ｊａｐａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｊａｐａｎ）でＲＮＡを分離および精製して、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｊａｐａｎ）を利用して目標塩基配列と合致するか否かを確認した。以後、それぞれの二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造するために、センス鎖とアンチセンス鎖を同量混合して１Ｘアニーリングバッファー（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭカリウムアセテート（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、２ｍＭマグネシウムアセテート（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、ｐＨ７．０〜７．５）に入れて、９０℃恒温水槽で３分反応させた後、再び３７℃で反応させて、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体をそれぞれ製造した。製造された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、電気泳動を介してアニーリングされたことを確認した。
【０１４８】
５．２：アミン基が導入されたエチレングリコールを親水性物質単量体で含むＳＡＭｉＲＮＡの製造
親水性物質にアミン基が導入された下記の構造式（２５）のような二重らせんオリゴ構造体を製造した。
【化８】
0006422961.tif 000013
前記構造式（２５）をさらに具体的に示すと次の構造式（２６）の通りである。
【化９】
0006422961.tif 000014
【０１４９】
前記構造式（２５）および（２６）で、ＳはｓｉＲＮＡのセンス鎖；ＡＳはｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖；Ｈｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌは、親水性物質；Ｃ６は［Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ］４とＡｍｉｎｅを連結する炭素六つが連結されているリンカーで、Ｃ２４は疎水性物質でジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）が含まれたテトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ）；５’および３’は二重らせんオリゴＲＮＡ内のセンス鎖末端の方向性を意味する。
【０１５０】
また、前記親水性物質ブロックは、ｓｉＲＮＡセンス鎖の３’末端のホスフェート基と連結された形態である。
【０１５１】
前記構造式（２５）および（２６）でのｓｉＲＮＡのセンス鎖は、３’Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ誘導体が含まれているＣＰＧを支持体として、β−シアノエチルホスホロアミダイト形態のＨｅｘａ  Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ四つを合成後、先に述べた方式のとおりＲＮＡβ−シアノエチルホスホロアミダイトを利用してＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結していく方法を介して３’末端部位にヘキサエチレングリコール（Ｈｅｘａ  Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）が結合されたセンス鎖のオリゴＲＮＡ−親水性物質構造体を合成した後、ジスルフィド結合が含まれているテトラドコサンを５’末端に結合して望むＲＮＡ−高分子構造体のセンス鎖を製造した。前記鎖とアニーリングを行うアンチセンス鎖の場合、先に述べた反応を介してセンス鎖と相補的な配列のアンチセンス鎖を製造した。
【０１５２】
合成が完了すると、６０℃の温湯器（ｗａｔｅｒ  ｂａｔｈ）で２８％（ｖ／ｖ）アンモニア（ａｍｍｏｎｉａ）を処理して合成されたＲＮＡ一本鎖とＲＮＡ高分子構造体をＣＰＧから引き離した後、脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）反応を介して保護残基を除去した。保護残基が除去されたＲＮＡ一本鎖およびＲＮＡ−高分子構造体は、７０℃のオーブンでＮ−メチルピロリドン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎ）、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）およびトリエチルアミントリハイドロフルオリド（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｔｒｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｄｅ）を体積比１０：３：４の割合で処理して、２’ＴＢＤＭＳ（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｕｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）を除去した。
【０１５３】
前記反応物をＤａｉｓｏｇｅｌ  Ｃ１８（Ｄａｉｓｏ，Ｊａｐａｎ）カラムが取り付けられたＨＰＬＣ  ＬＣ９１８（Ｊａｐａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｊａｐａｎ）でＲＮＡを分離および精製して、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｊａｐａｎ）を利用して目標塩基配列と合致するか否かを確認した。以後、それぞれの二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造するために、センス鎖とアンチセンス鎖を同量混合して１Ｘアニーリングバッファー（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭカリウムアセテート（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、２ｍＭマグネシウムアセテート（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、ｐＨ７．０〜７．５）に入れて、９０℃恒温水槽で３分反応させた後、再び３７℃で反応させて、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（以下、それぞれＳＡＭｉＲＮＡ−Ｓｕｒｖｉｖｉｎという）をそれぞれ製造した。製造された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、電気泳動を介してアニーリングされたことを確認した。
【０１５４】
５．３：ポリヒスチジン基が導入されたエチレングリコールを親水性物質単量体として含むＳＡＭｉＲＮＡの製造
親水性物質にペプチドが導入された下記の構造式（２７）のような二重らせんオリゴ構造体を製造した。
【化１０】
0006422961.tif 000015
前記構造式（２７）で、Ｈはヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）を、Ｃはシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎ）を意味する。
前記構造式（２７）をさらに具体的に示すと、次の構造式（２８）の通りである。
【化１１】
0006422961.tif 000016
【０１５５】
前記構造式（２７）および（２８）で、ＳはｓｉＲＮＡのセンス鎖；ＡＳはｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖；［Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ］４は親水性物質であり；ｌｉｎｋｅｒはｐｅｐｔｉｄｅとＳＡＭｉＲＮＡを連結する役割をして、ＰｅｐｔｉｄｅはＨＨＨＨＨＨＣ配列からなるＰｅｐｔｉｄｅ；Ｃ２４は疎水性物質でジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ）が含まれたテトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ）；５’および３’は二重らせんオリゴＲＮＡ末端の方向性を意味する。
【０１５６】
また、前記親水性物質ブロックは、ｓｉＲＮＡセンス鎖の３’末端のホスフェート基と連結された形態である。前記構造式（２７）および（２８）でのｓｉＲＮＡのセンス鎖は、実施例５−２の構造式（２５）および（２６）のオリゴにアミン類と結合する官能基（例：ＮＨＳｅｓｔｅｒ）とペプチドのチオール（−ＳＨ）と結合する官能基（例：Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）を持つリンカーで連結させて製造した。具体的に、構造式（２５）および（２６）の構造を持つオリゴに前記リンカーを結合させた後、ＨＰＬＣやレジンで精製する。精製されたオリゴにペプチドを結合した後、ＨＰＬＣで精製してｓｉＲＮＡのセンス鎖を製造した。前記鎖とアニーリングを行うアンチセンス鎖の場合、先に述べた反応を介してセンス鎖と相補的な配列のアンチセンス鎖を製造した。前記反応物をＤａｉｓｏｇｅｌ  Ｃ１８（Ｄａｉｓｏ，Ｊａｐａｎ）カラムが取り付けられたＨＰＬＣ  ＬＣ９１８（Ｊａｐａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｊａｐａｎ）でＲＮＡを分離および精製して、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｊａｐａｎ）を利用して目標塩基配列と合致するか否かを確認した。以後、それぞれの二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造するために、センス鎖とアンチセンス鎖を同量混合して１Ｘアニーリングバッファー（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭカリウムアセテート（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、２ｍＭマグネシウムアセテート（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、ｐＨ７．０〜７．５）に入れて、９０℃恒温水槽で３分反応させた後、再び３７℃で反応させて、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（以下、それぞれＳＡＭｉＲＮＡ−Ｓｕｒｖｉｖｉｎという）をそれぞれ製造した。製造された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、電気泳動を介してアニーリングされたことを確認した。
【０１５７】
≪実施例６：二重らせんオリゴ高分子構造体（Ｈｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ＳＡＭｉＲＮＡ）からなるナノ粒子によるヒト子宮頸部癌細胞（ＨｅＬａ）細胞株でターゲット遺伝子の発現阻害≫
サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）発現量を減らすことができるｓｉＲＮＡ配列を含むＨｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ＳＡＭｉＲＮＡからなるナノ粒子を利用して子宮頸部癌細胞（ＨｅＬａ）を形質転換させて、このように形質転換した子宮頸部癌細胞（ＨｅＬａ）細胞株で目標遺伝子の発現様子をＲＮＡレベルで分析した。
【０１５８】
実施例６−１：ヒト子宮頸部癌細胞細胞株の培養
米合衆国種菌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）から入手したヒト子宮頸部癌細胞（ＨｅＬａ）細胞株は、実施例５−１と同じ条件で培養した。
【０１５９】
実施例６−２：ヒト子宮頸部癌細胞細胞株へのアミン基が導入されたＨｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ＳＡＭｉＲＮＡの形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
前記実施例６−１で培養された０．８×１０５子宮頸部癌細胞（ＨｅＬａ）細胞株を３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下１２−ｗｅｌｌプレートで１８時間ＥＭＥＭで培養した後、培地を除去した後、各ｗｅｌｌ当たり同量のＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ，ＵＳＡ）を分株した。ナノ粒子の製造は、実施例５−１と同じ方法で−７５℃、５ｍＴｏｒｒ条件で４８時間凍結乾燥して均一に製造した。前記実施例３−２で製造したＨｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ＳＡＭｉＲＮＡを５０μｇ／ｍＬの濃度でＤＰＢＳに添加して溶解した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地１ｍＬ中に５０、１００、２００ｎＭに合わせて処理する。Ｈｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ＳＡＭｉＲＮＡが含まれたＯｐｔｉ−ＭＥＭを分株後、腫瘍細胞株の各ｗｅｌｌに濃度に合わせて処理して、３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下、合計２４時間と４８時間培養した。
【０１６０】
実施例６−３：ターゲット遺伝子のｍＲＮＡの相対的定量分析
前記実施例６−２で形質注入された細胞株から前記実施例４−３と同じ方法で全体ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を利用してターゲット遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。アミン基が導入されたＨｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ＳＡＭｉＲＮＡの処理に応じたターゲット遺伝子発現阻害量観察を介して対照群であるＨｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ＳＡＭｉＲＮＡに対してアミン基が導入されたＨｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ＳＡＭｉＲＮＡの効能を明確に確認した（図１８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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