(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の粒子を非侵襲的に追跡するためのシステムであって、
前記サンプルをスキャンするように構成され、複数のスキャニングミラーと複数の検出器を備えた、二光子又は共焦点のレーザスキャニング顕微鏡（ＬＳＭ）と、
粒子保持デバイスに結合された粒子を有する、Ｘ−Ｙ及びＺの位置制御を有するステージに結合された、粒子保持デバイスと、
追跡励起レーザと、Ｘ−Ｙ方向における前記粒子の偏移を検出するように構成されたＸ−Ｙ放射収集構成要素と、Ｚ方向における前記粒子の偏移を検出するように構成されたＺ放射収集構成要素と、前記Ｘ−Ｙ及びＺの放射収集構成要素に結合され、前記粒子の運動を追跡するために前記ステージのＸ−Ｙ及びＺの位置制御を駆動するための制御信号を生成するように構成されたプロセッサとを備える、追跡モジュールと、
現在のスキャニングミラー位置とレーザスキャニング顕微鏡（ＬＳＭ）からの検出器読出しとを受信し、前記追跡モジュールからの現在のステージ位置を受信し、そしてステージ位置が刻まれたＬＳＭピクセルを生成することによって、前記レーザスキャニング顕微鏡（ＬＳＭ）と前記追跡モジュールを同期するように構成された同期モジュールと、を備えたシステム。
【請求項２】
前記ステージ位置が刻まれた前記ＬＳＭピクセルを使用して粒子の３Ｄ軌跡を示す３Ｄ画像を生成するように構成された処理モジュールをさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
ＬＳＭシステムの知られている倍率及び前記サンプルの前記スキャンの間の各時点における圧電ステージ位置に基づいて、前記ＬＳＭシステムからの各検出器読出し（ピクセル）を、ラボフレームからサンプルフレーム内の３次元ボクセルに変換するように構成されたピクセルからボクセルへの変換モジュールをさらに備える、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
複数回のサンプリングを平均したボクセル及び補間された未サンプリングボクセルを含む補間データを生成するように構成された補間モジュールをさらに備える、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記補間データを平滑化するように構成された平滑化モジュールをさらに備える、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
前記補間データに基づいて前記粒子の運動を示す３Ｄ画像を生成するように構成された画像生成モジュールをさらに備える、請求項４に記載のシステム。
【請求項７】
前記追跡励起レーザが光学テーブル平面に平行に搭載され、前記Ｘ−Ｙ放射収集構成要素が前記光学テーブル平面に垂直に搭載される、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
各Ｘ−Ｙ放射収集構成要素が、前記光学テーブル平面から垂直方向に光を反射するように構成されたミラーを有する、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
一方の面に搭載されたＸ放射収集構成要素と、反対面に搭載されたＹ放射収集構成要素とを有する垂直搭載面をさらに備える、請求項７に記載のシステム。
【請求項１０】
サンプル中の粒子を非侵襲的に追跡するための方法であって、
前記サンプルをスキャンするように構成され、複数のスキャニングミラーと複数の検出器を備えた、二光子又は共焦点のレーザスキャニング顕微鏡（ＬＳＭ）を提供することと、
粒子保持デバイスに結合された前記粒子を有する、Ｘ−Ｙ及びＺの位置制御を有するステージに結合された、粒子保持デバイスを提供することと、 
追跡励起レーザと、Ｘ−Ｙ方向における前記粒子の偏移を検出するように構成されたＸ−Ｙ放射収集構成要素と、Ｚ方向における前記粒子の偏移を検出するように構成されたＺ放射収集構成要素と、前記Ｘ−Ｙ及びＺの放射収集構成要素に結合されたプロセッサとを備える、追跡モジュールを提供することと、
前記レーザスキャニング顕微鏡（ＬＳＭ）及び前記追跡モジュールと同期するように構成された同期モジュールを提供し、前記追跡励起レーザによって追跡励起レーザビームを生成し、Ｘ−Ｙ方向及びＺ方向において前記粒子の偏移を検出することと、
前記粒子の運動を追跡するために前記ステージのＸ−Ｙ及びＺの位置制御を駆動するように構成された制御信号を前記プロセッサによって生成することと、
現在のスキャニングミラー位置と、レーザスキャニング顕微鏡（ＬＳＭ）からの検出器読出しを受信することと、
前記追跡モジュールからの現在のステージ位置を受信することと、
前記現在のスキャニングミラー位置と検出器読出しを、前記現在のステージ位置と同期させることと、
ステージ位置が刻まれたＬＳＭピクセルを生成することと、を備える方法。
【請求項１１】
ステージ位置が刻まれた前記ＬＳＭピクセルを使用して粒子の３Ｄ軌跡を示す３Ｄ画像を生成することとをさらに備える、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＬＳＭシステムの知られている倍率及び前記サンプルの前記スキャンの間の各時点における圧電ステージ位置に基づいて、前記ＬＳＭシステムからの各検出器読出し（ピクセル）を、ラボフレームからサンプルフレーム内の３次元ボクセルに変換することをさらに備える、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
複数回のサンプリングを平均したボクセル及び補間された未サンプリングボクセルを含む補間データを生成することをさらに備える、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記補間データを平滑化することをさらに備える、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記補間データに基づいて前記粒子の運動を示す３Ｄ画像を生成することをさらに備える、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記追跡励起レーザビームが光学テーブル平面に平行に配向され、Ｘ−Ｙ放射収集構成要素が前記光学テーブル平面に垂直に搭載される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
各Ｘ−Ｙ放射収集構成要素が、前記光学テーブル平面から垂直方向に光を反射するように構成されたミラーを有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
一方の面に搭載されたＸ放射収集構成要素と、反対面に搭載されたＹ放射収集構成要素とを有する垂直搭載面を提供することをさらに備える、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明における政府の権利
本発明は、エネルギー局によって承認された許可番号第ＤＥ−ＳＣ０００６８３８号の下に政府支援によって作製された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
前出願に対する相互参照
本出願は、両出願の全体が本明細書に組み込まれる、２０１２年７月１８日に出願された米国仮出願第６１／６７２，８３７号及び２０１３年３月５日に出願された米国仮出願第６１／７７２，６１７号の優先権を主張するものである。
【０００３】
本発明は、一般に、単一粒子を追跡するためのシステム及び方法に関し、より詳細には、単一粒子を撮像して分析するためのシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
本開示は、マルチスケールスペクトルナノスコピー（ＭＳＮ：Multiscale Spectral Nanoscopy）に関し、一般に、その全体が本明細書に組み込まれる「単一ナノ粒子追跡分光顕微鏡（ＳＮＴＳＭ：Single Nanoparticle Tracking Spectroscopic Microscope）」と題する米国特許第７，９８２，１９４号における開示に関する。生物系における分子間相互作用の研究は、分子現象を、それらの本来の（１ｎｍ以下に至る）長さスケール及び分子力学に関連する（ミリ秒以下の）時間スケールで観測しながら、同時にこれらの相互作用及び力学をそれらの高分子生物学的コンテキストの中で確認する（place）ことは不可能であることによって、長期間阻まれてきた。コンテキストの中で分子的生態（molecular biology）を観測する伝統的な方法は、最も顕著に使用される市販の方法：共焦点顕微鏡法をはじめとする、光撮像法である。
【０００５】
伝統的撮像方法
現代のレーザスキャニング共焦点顕微鏡は、最高８Ｈｚでオプティカルセクションを提供する能力を有する。残念ながら、これらの速度は、３次元においてリアルタイムで発生する生物学的プロセスを評価するためには十分ではない。共焦点顕微鏡は、近共焦点性能によって最高１Ｈｚで３Ｄ体積を捕捉することを可能にするＮｉｐｋｏｗスピニングディスクの実装によってさらに改善されている。しかしながら、これらの時間スケール（１秒以上）は、依然として、細胞レベル又は細胞内レベル（subcellular level）における化学力学をモニタするにはあまりにも遅すぎる。
【０００６】
高速大規模３Ｄ撮像方法
大容量を高い時間分解能で撮像する問題を解決するために、選択的平面照明顕微鏡法（ＳＰＩＭ）は、円柱レンズによって展開され、採集対物レンズ（collection objective）に直角なサンプルに送出する励起ビームを使用して、オプティカルセクショニングを可能にする被照面を作成する。６秒ごとにニューロン活動電位の４００×４００×２００μｍの体積の高速撮像が実現されているが、軸方向分解能（axial resolution）は約５ミクロンである。この方法は、レーザビームを急速にスキャニングして照明面（illumination plane）を作成し、より強い照明とより速い捕捉時間とを可能にし、６０〜９０秒で１０００×１０００×６００μｍの体積を３００ｎｍの横方向分解能と５００ｎｍの軸方向分解能で捕捉することによって改善されている。
【０００７】
超分解能法
上記の方法は、発生生物学におけるより大きい力学の研究への扉を開いたが、それらは、依然として、伝搬する光線の回折的性質によって制限され、横寸法で約２００ｎｍ及び次軸方向寸法で約６００ｎｍの究極的分解能限界を有する。この限界を回避するために、いわゆる「超分解能」法が開発されてきた。誘導放射抑制顕微鏡法（ＳＴＥＤ：stimulated emission depletion microscopy）は、高出力レーザパルスを使用して一定のエリア内で蛍光放射を効果的に曲げる。レーザパルスを慎重に整形して焦点周りの球形エリアを画定することで、焦点サイズが、周囲の放射の枯渇によって効率的にサイズが低減され得る。３０ｎｍまでの分解能を有する等方性焦点が、生細胞内のミトコンドリアクリステを撮像するために使用されてきた。残念ながら、これは、依然として点スキャン技法であり、より大きい空間規模における時間分解能を制限している。 
他の方法は、単一のフォトスイッチング可能な蛍光体（photoswitchable fluorophore）の局在性に依存している。これらの方法（確率的光学再構築顕微鏡法、ＳＴＯＲＭ：stochastic optical reconstruction microscopy；光活性化局在性顕微鏡法、ＰＡＬＭ：photoactivated localization microscopy）が、初期に、２次元の現象を究明するために実施されたが、非点収差イメージング（ＳＴＯＲＭ、横方向２０〜３０ｎｍ、軸方向６０ｎｍ）、二重平面イメージング（biplane imaging）（ＢＰ−ＰＡＬＭ、横方向３０ｎｍ、軸方向７５ｎｍ）、干渉法（interferometry）（ｉＰＡＬＭ、横方向２０ｎｍ、軸方向１０ｎｍ）の使用によって、又は二重らせんＰＳＦ（ＤＨ−ＰＳＦ、横方向１０ｎｍ、軸方向１０ｎｍ）を実施することによって最高数ミクロンまでの３次元に展開されてきた。残念ながら、これらの方法はすべて、それらの軸方向の広がり（通常わずか１〜２ミクロン）又は時間分解能（ＰＡＬＭ及びＳＴＯＲＭは多くのフォトスイッチング事象の観測が必要であり、単一画像を捕捉するために数十秒を必要とする）によって制限される。
【０００８】
いくつかの方法は、二光子励起ビームが、光学スライスの小さいサブセクションをスキャンする１６〜６４のビームレットに分割される、多焦点多光子４Ｐｉ−共焦点顕微鏡法（ＭＭＭ−４Ｐｉ）をスキャンすることなど、超分解能を有する組み合わされた高速３Ｄイメージングに対する努力を行ってきた。これらの小領域をつなぎ合わせ、標本を通して軸方向にスキャンすることによって、１０×１０×５μｍの体積が、１５０秒以内に１００〜１４０ｎｍの等方性分解能で観測され得る。超分解能の利点をより大規模な観測と組み合わせることを狙いとする別の方法は、構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）である。サンプルの空間周波数に近い周波数で励起場を実施することによって、伝統的な顕微鏡対物レンズによって観測可能な、より低いうなり周波数が作成され得る。この方法は、横方向分解能を約１１０ｎｍまで改善する能力を示した。同じく、この方法は、２５×２５×２．７２μｍの体積に対して０．２０Ｈｚの体積イメージング速度で３次元（３Ｄ−ＳＩＭ）に拡張されている。
【０００９】
これらのより速い超分解能法にもかかわらず、観測されないままである巨大な長さ範囲及び時間スケールが依然として存在する。たとえば、ＤＨ−ＰＳＦ及びｉＰＡＬＭなどの単分子法は顕著な空間分解能を示すが、それらは、小さい軸方向の広がりのために、比較的短い長さスケールをカバーする。１ｍｓｅｃ未満の時間スケールに十分に対処する方法は、非常に少ない。既存のシステムのこれら及び他の欠点に対処するシステム及び方法を提供することが望ましい。
【発明の概要】
【００１０】
サンプル中の粒子を非侵襲的に追跡するためのシステム及び方法が開示される。本システムは、サンプルをスキャンするように構成された、二光子又は共焦点のレーザスキャニング顕微鏡（ＬＳＭ）を含む。同じく、本システムは、粒子保持デバイスに結合された粒子を有する、Ｘ−Ｙ及びＺの位置制御を有するステージに結合された、粒子保持デバイスを含む。同じく、本システムは、追跡励起レーザと、Ｘ−Ｙ方向における粒子の偏移を検出するように構成されたＸ−Ｙ放射収集構成要素と、Ｚ方向における粒子の偏移を検出するように構成されたＺ放射収集構成要素とを有する追跡モジュールを含む。同じく、本システムは、Ｘ−Ｙ及びＺの放射収集構成要素に結合され、粒子の運動を追跡するためにステージのＸ−Ｙ及びＺの位置制御を駆動するように構成された制御信号を生成するプロセッサを含む。
【００１１】
同じく、本システムは、現在のＬＳＭスキャニングミラー位置とＬＳＭ検出器読出しとを受信し、それらを現在のステージ位置と同期させて、ステージ位置でスタンプされたＬＳＭピクセルを生成するように構成された同期モジュールと、ステージ位置でスタンプされたＬＳＭピクセルを使用して粒子の３Ｄ軌跡を示す３Ｄ画像を生成するように構成された処理モジュールとを含み得る。同期モジュールは、現在のＬＳＭスキャニングミラー位置とＬＳＭ検出器読出しとを受信し、それらを現在のステージ位置と同期させてステージ位置でスタンプされたＬＳＭピクセルを生成するように構成され得る。ピクセルからボクセルへの変換モジュールは、ＬＳＭシステム（実空間のピクセルサイズ）の知られている倍率及びサンプルのスキャンの間の各時点における圧電ステージ位置に基づいて、ＬＳＭシステムからの各検出器読出し（ピクセル）を、ラボフレーム（lab frame）からサンプルフレーム内の３次元ボクセルに変換するように構成され得る。補間モジュールは、オーバーサンプリングを平均した（average oversampled）ボクセルと補間された未サンプリングボクセルとを含む補間データを生成するように構成され得る。平滑化モジュールは、補間データを平滑化するように構成され得る。画像生成モジュールは、補間データに基づいて粒子の運動を示す３Ｄ画像を生成するように構成され得る。
【００１２】
追跡励起レーザは、光学テーブル平面に平行に搭載され、Ｘ−Ｙ放射収集構成要素は、光学テーブル平面に垂直に搭載され得る。各Ｘ−Ｙ放射収集構成要素は、光学テーブルの平面から垂直方向に光を反射するように構成されたミラーを有し得る。垂直搭載面は、一方の面に搭載されたＸ放射収集構成要素と、反対面に搭載されたＹ放射収集構成要素とを有し得る。
【００１３】
サンプル中の粒子を非侵襲的に追跡するための方法もまた開示される。本方法は、サンプルをスキャンするように構成された、二光子又は共焦点のレーザスキャニング顕微鏡（ＬＳＭ）を提供することを含む。同じく、本方法は、粒子保持デバイスに結合された粒子を有する、Ｘ−Ｙ及びＺの位置制御を有するステージに結合された、粒子保持デバイスを提供することを含む。同じく、本方法は、追跡励起レーザビームを生成し、Ｘ−Ｙ方向及びＺ方向において粒子の偏移を検出することを含む。同じく、本方法は、粒子の運動を追跡するためにステージのＸ−Ｙ及びＺの位置制御を駆動するように構成された制御信号を生成することを含む。
【００１４】
同じく、本方法は、現在のＬＳＭスキャニングミラー位置とＬＳＭ検出器読出しとを受信することと、それらを現在のステージ位置と同期させて、ステージ位置でスタンプされたＬＳＭピクセルを生成することと、ステージ位置でスタンプされたＬＳＭピクセルを使用して粒子の３Ｄ軌跡を示す３Ｄ画像を生成することとを含み得る。同じく、本方法は、現在のＬＳＭスキャニングミラー位置とＬＳＭ検出器読出しとを受信することと、それらを現在のステージ位置と同期させて、ステージ位置でスタンプされたＬＳＭピクセルを生成することとを含み得る。同じく、本方法は、ＬＳＭシステム（実空間のピクセルサイズ）の知られている倍率及びサンプルのスキャンの間の各時点における圧電ステージ位置に基づいて、ＬＳＭシステムからの各検出器読出し（ピクセル）を、ラボフレームからサンプルフレーム内の３次元ボクセルに変換することを含み得る。同じく、本方法は、オーバーサンプリングを平均したボクセル及び補間された未サンプリングボクセルを含む補間データを生成することを含み得る。同じく、本方法は、補間データを平滑化することを含み得る。同じく、本方法は、補間データに基づいて粒子の運動を示す３Ｄ画像を生成することを含み得る。
【００１５】
追跡励起レーザビームは、光学テーブル平面に平行に配向され、Ｘ−Ｙ放射収集構成要素は、光学テーブル平面に垂直に搭載され得る。各Ｘ−Ｙ放射収集構成要素は、光学テーブルの平面から垂直方向に光を反射するように構成されたミラーを有し得る。同じく、方法は、一方の面に搭載されたＸ放射収集構成要素と、反対面に搭載されたＹ放射収集構成要素とを有する垂直搭載面を提供することを含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＭＳＮシステムのブロック図。
【図２】ＭＳＮシステムとともに使用するように構成された顕微鏡スタンドのブロック図。
【図３Ａ】例示的なＭＳＮシステムの励起波長及び放射波長の一例を示すグラフ。
【図３Ｂ】２Ｐ−ＬＳＭのブロック図。
【図４】追跡モジュールのブロック図。
【図５】Ｚ追跡モジュールのブロック図。
【図６】Ｘ−Ｙ追跡モジュールのブロック図。
【図７】Ｘ−Ｙコンパクト垂直ＡＰＤ搭載台（正面図）のブロック図。
【図８】Ｘ−Ｙコンパクト垂直ＡＰＤ搭載台（側面図）のブロック図。
【図９Ａ】Ｘ−Ｙ追跡検出のためのコンパクト３Ｄ構成を示す図。
【図９Ｂ】Ｘ−Ｙ追跡検出のためのコンパクト３Ｄ構成を示す図。
【図１０】ＭＳＮシステムに対するデータフローを示すブロック図。
【図１１】粒子の３Ｄ軌跡を示す３Ｄ画像。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
マルチスケールスペクトルナノスコピー
本開示は、単一ナノ粒子追跡分光顕微鏡（ＳＮＴＳＭ）によって使用可能になる３Ｄ単一粒子追跡分光法であるマルチスケールスペクトルナノスコピー（ＭＳＮ）を対象とする。本技法は、極めて高い空間分解能及び時間分解能を可能にする。重要なことには、時間依存性分光能力（time-dependent spectroscopic capability）は、分子レベルの構造的変化（量子力学的領域）の研究を可能にし、空間的情報をサブｎｍスケールまで押し下げている。ＭＳＮシステムは、二光子レーザスキャニング顕微鏡（ＬＳＭ）又は共焦点ＬＳＭなどのＬＳＭの大規模コンテキスト情報をＳＮＴＳＭの時間分解能及び空間分解能に追加して、多重スケール（multiple scales）が関連する実験に取り組むための理想的なシステムを作成する。いずれのタイプのＬＳＭも、本明細書の開示に関連する使用に好適であることを理解されたい。
【００１８】
一般に、ＭＳＮは、元のＳＮＴＳＭ設計によって付与された高い空間分解能及び時間分解能と、ＬＳＭ、たとえば二光子スキャニング蛍光顕微鏡によって与えられた大規模コンテキスト情報とを組み合わせる。これは、粒子追跡用超分解能（約１０ｎｍ）から二光子スキャニング蛍光顕微鏡法を用いて実現され得る多細胞スケールまでの長さスケール、並びにマイクロ秒から数分及び数時間に及ぶ時間スケールをカバーすることが可能な、真のマルチスケール能力の最初の顕微鏡システムである。
【００１９】
元のＳＮＴＳＭシステムは、高速３Ｄ圧電ステージと、ナノ粒子の運動を相殺する（counteract）するためにサンプル全体を移動させる光フィードバックループとを使用することによって、リアルタイム３次元単一ナノ粒子追跡を実行することを可能にする。これは、ナノ粒子がその局所環境を依然として自由にプローブしているという事実にもかかわらず、ナノ粒子が、顕微鏡の対物レンズの焦点内に効率的に「保持」されるという結果をもたらす。この元の実施態様は、高い空間分解能（約１０ｎｍ）と時間分解能（１０μｓまで）とをもたらした。加えて、ＳＮＴＳＭシステムの最も重要な一面である高い時空間分解能は、ナノ粒子が常時対物レンズの焦点内に保持されるという事実による、ナノ粒子プローブに対する高感度分光技法を実行するための能力である。これは、ユーザが、単一移動ナノ粒子又はその環境の特性をプローブすることを可能にし、溶液中で自由に拡散している単一の金のナノ粒子のスペクトル特性をプローブするためにすでに使用されている。
【００２０】
ＳＮＴＳＭシステムは、その多くの強みにもかかわらず、ナノ粒子追跡プローブの大規模環境を評価することはできない。ＳＮＴＳＭは、対物レンズの焦点体積だけを評価する変形共焦点顕微鏡（modified confocal microscope）に基づいている。これは、次には、比較的遅い電荷結合ディスプレイイメージングデバイスに依存するのではなく、フィードバックループを実行するために高速のシングルポイント光検出器（single-point photodetector）をＳＮＴＳＭシステムが使用することを可能にする。しかしながら、この速度は、大規模コンテキスト情報を犠牲にして生じる。この大規模コンテキストの欠如を克服するために、ＭＳＮシステムは、ＳＮＴＳＭの能力とスキャニング二光子顕微鏡とを組み合わせる。ＳＮＴＳＭは、ナノ粒子プローブから高精度の空間データ、時間データ及びスペクトルデータの捕捉を可能にし、一方で、二光子スキャニング顕微鏡は、環境についての大規模情報を提供する。二光子蛍光の使用は、顕微鏡が、高分解能のオプティカルセクションを取ることを可能にし、一方で、ナノ粒子プローブは、サンプル内の異なる深さをサンプリングする。同じく、ＭＳＮは、オプティカルセクショニング能力をも有する共焦点ＬＳＭとともに実施され得る。
【００２１】
ＭＳＮは、生物系における使用に好適なシステムである。生物学的な問題は、本質的にマルチスケールにあり、ナノメートルスケールにおけるタンパク質及びそれらの生化学反応の運動から、サブミクロンスケールにおける細胞小器官の運動まで、さらに１００μｍスケールにおける細胞間シグナリングまでに及ぶ。ＭＳＮシステムは、すべてのこれらの現象を同時に観測することができる。同時に、ＭＳＮシステムは、元のＳＮＴＳＭ設計の分光学的能力を持っており、量子力学的効果が支配する長さスケール（約１Å）までプローブするためにユーザが最新技術の単一分子分光法を使用することを可能にする。
【００２２】
図１は、ＭＳＮシステム２０の基本的ブロック図である。この例では、システムは、一般に、顕微鏡スタンド５０及び追跡モジュール７０と相互接続された二光子又は共焦点のレーザスキャニング顕微鏡（ＬＳＭ）３０を含む。ＬＳＭの能力とＳＮＴＳＭシステムとを組み合わせることにおいて実施される重要な原理は、各システムからの信号のスペクトル分離である。粒子追跡モジュールは、スキャニング二光子ビームによって又は環境によって生成される任意の蛍光によって、影響を受けてはならない。単一粒子追跡は、細胞の自己蛍光が最小化される６００〜７５０ｎｍの近赤外（ＮＩＲ）において実施され得る。一実施形態では、二光子ＬＳＭは、市販の（commercial）ＬＳＭシステム（たとえば、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ４１０）に結合された８００〜１０００ｎｍで動作するフェムト秒パルスレーザ（たとえば、Ｔｓｕｎａｍｉ、Ｎｅｗｐｏｒｔ）を使用する。共焦点ＬＳＭのために構成されるとき、連続波（ＣＷ）レーザ励起が使用され得る。
【００２３】
図２は、ＭＳＮシステムとともに使用するように構成された顕微鏡スタンド５０のブロック図である。顕微鏡スタンド５０は、サンプルホルダ５２（すなわち、粒子保持デバイスに結合された粒子を有する粒子保持デバイス）と、Ｘ−Ｙ及びＺの位置制御をもたらすように構成されたステージ５４とを含む。この例では、ステージ５４は、３Ｄ圧電ステージ５４ａと粗調整ステージ５４ｂとを含む。他のステージ構成が本明細書で開示する構成とともに使用するのに好適であることを、理解されたい。たとえば、ＭＳＮシステムとともに使用するのに好適なステージが、０．１ｎｍの分解能で７５×７５×５０μｍ３の体積サイズを有してもよい。ステージ５４は、対物レンズ５６に対してサンプルホルダ（及びサンプル又は粒子）を移動させるように構成される。一例では、対物レンズはＺｅｉｓｓ  １００倍ＰｌａｎＡｐｏであるが、広範囲にわたる対物レンズが、本明細書で開示する構成とともに使用するのに好適である。同じく、顕微鏡スタンド５０は、２Ｐ−ＬＳＭ  ３０への／からの二光子励起及び放射（４００〜６００ｎｍ）を完全に反射し、同時に、追跡モジュールに関連するすべての光を追跡モジュール７０に伝達するように構成された組合せダイクロイックフィルタ（combining dichroic filter）５８を含む。組合せダイクロイックフィルタの選択は、追跡のために選択された波長とＬＳＭとによって決定され、用途に応じて変化することがあることを理解されたい。 
図３ａは、例示的なＭＳＮシステムの励起波長及び放射波長の一例を示すグラフである。   上述のように、単一粒子追跡は、細胞の自己蛍光が最小化される６００〜７５０ｎｍの近赤外（ＮＩＲ）において実施され得る。一実施形態では、二光子ＬＳＭは、市販のＬＳＭシステム（たとえば、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ４１０）に結合された８００〜１０００ｎｍで動作するフェムト秒パルスレーザ（たとえば、Ｔｓｕｎａｍｉ、Ｎｅｗｐｏｒｔ）を使用する。上述のように、いくつかの波長の組合せは、ＬＳＭ並びに追跡励起及び放射が重複しないという要件の下で可能である。
【００２４】
図３ｂは、２Ｐ−ＬＳＭ  ３０のブロック図である。２Ｐ−ＬＳＭ  ３０は、一般に、レーザスキャニング顕微鏡３４（たとえば、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ４１０、ＬＳＭ  Ｔｅｃｈ）に結合され、所望の周波数（たとえば、９００ｎｍ）に同調された超高速パルスレーザ源（たとえば、Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｔｓｕｎａｍｉ）を含む。ＬＳＭユニットの内側のスキャニングミラー３４ａは、１００倍の対物レンズ（たとえば、Ｚｅｉｓｓ）を通してサンプルにわたってパルスレーザをラスタスキャンする。収集された二光子励起蛍光は、同じミラーのセットを通してデスキャンされ、３つの光電子増倍管（ＰＭＴ）検出器３４ｂ上に合焦され、検出器３４ｂは、多重スペクトル窓からの同時信号を読み出すことができる。一般に、ＬＳＭモジュールは、所望の実験に応じて任意の数の検出チャネルを用いて実施され得る。
【００２５】
図４は、追跡モジュール７０のブロック図である。追跡モジュール７０は、一般に、追跡励起レーザ７１と、モニタＣＣＤ  ７２と、分光モジュール７３と、Ｘ−Ｙ追跡モジュール７４と、Ｚ追跡モジュール７５とを含み、すべては、図４に示すビーム分割器７０ａ〜７０ｄを介して２Ｐ−ＬＳＭ  ３０からの光路に結合される。追跡モジュールのための光学素子は、チューブレンズを取り外して対物レンズの無限遠経路（infinity path）にアクセス可能な２Ｐ−ＬＳＭ  ３０の側面入口ポート（side entrance port）内に結合され得る。一例では、追跡励起レーザは、６４２ｎｍのダイオード（Coherent Cube）であり、そのダイオードは、６５５ｎｍのロングパスダイクロイック７１ａによる追跡放射から分離される。粒子放射は、元のＳＮＴＳＭ設計からから導出される追跡光学素子に送られる。この実施態様は、追跡システムの全占有面積を３’×１．５’の面積まで縮小するように修正される。
【００２６】
図５は、Ｚ追跡モジュール７５のブロック図である。Ｚ（光軸）方向における粒子偏移は、Ｚにおける偏移においてほぼ線形の屈折率を与えるアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）７５ｃ上の２つの対物レンズ７５ｂ（たとえば、６０倍の対物レンズ）を介して撮像されるわずかにオフセットするピンホール７５ａを使用してモニタされる。Ｚ  ＡＰＤ出力は、以下で説明する４つのＸ−Ｙ  ＡＰＤに対して正規化され得る。 
図６は、Ｘ−Ｙ追跡モジュール７４のブロック図である。Ｘ方向及びＹ方向における粒子偏移を検出するために、放射スポットがビーム分割器７４ｇによって分割され、２つの直交するプリズムミラー、すなわちＸプリズムミラー７４ａ及びＹプリズムミラー７４ｂ上に投影される。Ｘプリズムミラー７４ａは、分割された信号を、２つの単一光子計数アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、すなわち左ＡＰＤ  ７４ｃ及び右ＡＰＤ  ７４ｄの上に分割する。Ｙプリズムミラー７４ｂは、分割された信号を、上のＡＰＤ  ７４ｅ及び下のＡＰＤ  ７４ｆの上に分割する。好適なＡＰＤが、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒを含む多様な製造業者から入手可能である。
【００２７】
図６に示すように、多様な収束レンズが使用され得る。ＸＹＺビーム分割器７０ｄ（図４）からの出力は、ビーム分割器７４ｇに対する信号を与えるために、再帰反射器７４ｉを含むコンパクトな折り畳み光カンチレバー（compact folded light cantilever）７４ｈに案内される。同じく、ＸＹＺビーム分割器７０ｄからの出力は、空間フィルタ７４ｋ及び様々な収束レンズを通して案内され得る。
【００２８】
粒子が、Ｘ軸又はＹ軸に関してセンタリングされると、左と右又は上と下のＡＰＤは、等しい読取りを有する。粒子はこのセンター位置から偏移するので、ＡＰＤのうちの一方は他方に対して増強された信号を示すことになり、この（両検出器の強度の合計で正規化された）差が、フィードバック制御に対する誤差読出しとして使用される。
【００２９】
一実施形態では、Ｘ、Ｙ及びＺ追跡ＡＰＤからの信号は、図１０に示すフィールドプログラマブルゲートアレイ（たとえば、ＦＰＧＡ、ＮＩ  ＰＣＩｅ−７８５２Ｒ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）内に供給され、そこで、ＡＰＤカウントがフィルタ処理され、比例、積分及び微分（ＰＩＤ）アルゴリズムを使用して制御信号に変換される。これらの制御は、アナログ電圧としてＦＰＧＡによって出力され、アナログ電圧は、フィードバックループを完了するために３Ｄ圧電ステージに送られる。ループは１００ｋＨｚ（１０μｓｅｃ）で動作することができ、それにより高速運動が追跡され得、ステージによって補正され得る。一実施形態では、固定粒子の定位精度（localization precision）は、Ｘで約１０ｎｍ、Ｙ及びＺで約１３ｎｍである。追跡データと２Ｐ−ＬＳＭデータとの位置合わせ（coregistration）は、ＦＰＧＡ上で実行され得る。２Ｐ−ＬＳＭ  ３０のブレークアウトケーブルは、ピクセルクロック及び光電子倍増管（ＰＭＴ）電圧の直接測定値を可能にし、測定値は、次に、各ボクセルの読出し時間におけるステージ位置と相関付けられ、各ボクセルがラボフレームからサンプルフレームに変換されることを可能にする。 
図７は、Ｘ−Ｙコンパクト垂直ＡＰＤ搭載台８０の正面図を示すブロック図である。本明細書で使用する垂直という用語は、光学テーブルの平面に対して９０°の方向を指す。図６の概略ブロック図など、従来の実施形態では、Ｘ−Ｙ  ＡＰＤのすべては、光学テーブルの平面に平行に配向されている。本実施形態では、Ｘ−Ｙ追跡に必要な４つのアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）は、できるだけ空間を節約し、位置合わせの容易さを提供するために、垂直のブレッドボード８１の両側に垂直に搭載されている。各ＡＰＤは、光学テーブルの平面から垂直方向に光を反射するように構成された連携ミラー８２を有する。分光法は、ビーム分割器を使用して追跡モジュールからの光を分割すること、及び分割された光をダイクロイックによって、又は分光計を使用することによって分離されたＡＰＤのペアに案内することによって実行される。この例では、８／９２反射／透過ペリクルビーム分割器が、追跡信号のうちの小部分を、追跡中に粒子をモニタするためのカメラ（Ｃａｓｃａｄｅ  ５１２ｂ、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）に向けて分割するために使用される。図７では、４つのＸ−Ｙ  ＡＰＤのうちの２つだけを示していることを理解されたい。各ＡＰＤは、キネマティックミラーを介して光を合焦する連携平行移動可能な収束レンズを有する。キネマティックミラー及びプリズムミラーは、それぞれ、連携平行移動ステージを有する。図８は、Ｘ−Ｙコンパクト垂直ＡＰＤ搭載台８０の側面図を示すブロック図である。図９ａ及び図９ｂは、ＡＰＤ搭載台８０に対するコンパクト３Ｄ構成を示す図である。
【００３０】
図１０は、ＭＳＮシステムに対するデータフローを示すブロック図である。追跡モジュール７０は、追跡モジュールＡＰＤを使用して粒子のＸ、Ｙ及びＺの位置における偏移を検出する。追跡モジュールＡＰＤ出力は、プロセッサ１００に結合される。この例では、プロセッサは、ＦＰＧＡとして実装される。ＦＰＧＡ又はプロセッサは、追跡モジュールからの検出器信号を、粒子の位置における、対物レンズの焦点からの偏移を記述する誤差関数に変換する。誤差信号は、ブロック１０２によって概略的に示す比例、積分及び微分（ＰＩＤ）手法を使用して処理される。これらの制御信号は、アナログ電圧としてＦＰＧＡによって出力され、アナログ電圧は、フィードバックループを完了するためにステージ５４ａに送られる。ステージ５４ａは、サンプルを移動させて粒子の運動を相殺し、誤差関数を最小化する。フィードバック生成回路は、アナログ回路、デジタル信号プロセッサ、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、又はコンピュータ若しくはマイクロコントローラ上で動作するソフトウェアを含む多様な方法で実施され得ることを理解されたい。ループは１００ｋＨｚ（１０μｓｅｃ）で動作することができ、それにより高速運動が追跡され得、ステージによって補正され得る。一実施形態では、固定粒子の定位精度は、Ｘにおいて約１０ｎｍであり、Ｙ及びＺにおいて約１３ｎｍである。
【００３１】
粒子が対物レンズの焦点内に保持されている間に、二光子又は共焦点のレーザスキャニング顕微鏡３０は、現在のオプティカルセクションをスキャンする。ＬＳＭ励起ビームがサンプル（たとえば、蛍光染色した細胞）を通して移動するときに、サンプルもまた、追跡システムによって移動させられ、二光子又は共焦点のＬＳＭによって収集された画像は、サンプルの運動によって崩れることになる。真の局所３次元画像を抽出するために、ＬＳＭスキャニングミラーの現在位置（すなわち、ＬＳＭオプティカルセクション内のライン及びピクセルの位置）及びＬＳＭ検出器の読出しが、ＦＰＧＡ又はプロセッサに送られ、そこで、ブロック１０４によって概略的に示すように、現在のステージ位置と同期させられる。これは、ピクセル、ライン及びフレームの値、検出器の読取り、並びに圧電ステージの読出しを含む、ＬＳＭからの各ピクセルの読出しを含むデータセットを作成することによって実現される。これは、オンボードのＦＰＧＡ又はプロセッサで実施され、すべての後続の処理は、後処理において実施され、この実施態様における後処理はＭＡＴＬＡＢにおいて実行される。
【００３２】
スキャンミラー位置と、二光子又は共焦点のＬＳＭシステム（実空間のピクセルサイズ）の知られている倍率と、実験中の各時点における圧電ステージ位置とを使用して、ＬＳＭシステムからの各検出器の読出し（ピクセル）が、サンプルが移動しており粒子が固定であるラボフレームから、ブロック１１０で示すようにサンプルが今や固定されているサンプルフレーム内の３次元ボクセルに変換される。これを実現するために、粒子が追跡モジュールによって保持されているスポットが、ＬＳＭ上の特定のライン及びピクセルの値と照合される。この実施態様では、追跡ユニット及びＬＳＭユニットは、粒子がＬＳＭ画像の中央で保持されるように位置合わせされた。この例では、収集された画像は、５１２ピクセル及び５１２ラインを有し（任意の組合せが可能ではあるが）、追跡スポットはピクセル２５６及びライン２５６において配置された。次に、これは、ＬＳＭスキャナ及び任意の所与の点における追跡される粒子の位置を測定するための基準点として使用される。所与のピクセルＰ及びラインＬにおいて、位置は、基準点（ここではピクセル２５６、ライン２５６）によってオフセットされる。次に、ピクセル／ラインにおける距離が、ＬＳＭシステムにおける知られているサイズのピクセルを使用して実際の距離に変換され、知られているサイズのピクセルは、光学素子の選択によって決定される。この実施態様では、ピクセルサイズは８３．１ｎｍであるが、ある範囲の値を取ることができる。この値を使用して、我々は、ピクセル及びラインの値を、各ＬＳＭの読取りに対する実空間のＸ及びＹの値に変換する。Ｚ値は、圧電ステージ上の現在のＺの読取りによって決定される。これは、追跡される粒子周りの３Ｄ環境を記述する３Ｄボクセルのセットを与える。
【００３３】
３Ｄボクセルのこのセットは、粒子がサンプルの異なるエリアをランダムに通過するので、不均等にサンプリングされることになる。その結果、複数のボクセルが複数回サンプリングされる一方で、他のボクセルがサンプリングされないままとなることがある。３Ｄ画像を作成するために、これらのオーバーサンプリングされたボクセルが平均化される一方で、未サンプリングボクセルに対する値を推定するために、補間アルゴリズムが使用される。ここから、３Ｄ画像は、ブロック１１２で概略的に示す平滑化など、一般的な画像処理技法に依存することができる。この３Ｄ画像は、３Ｄマルチスケール、多分解能データセットを作成するために、追跡の間の粒子の軌跡（圧電ステージ読出しを介して観測される）と組み合わされ得る。粒子の奇跡の小規模で高分解能（約１０ｎｍ、約１０μｓｅｃ）のデータが、３Ｄ画像の大規模で低分解能の情報で補完され、情報は、ＬＳＭシステムに対する倍率の選択に応じて最高で約１００ミクロンであり得る。図１１は、上記で説明した粒子の３Ｄ軌跡を示す３Ｄ画像である。この例では、画像は、マクロファージ細胞に付着して（land on）自由に拡散する９３ｎｍの近赤外蛍光ナノ粒子を示す。 
この例では、３Ｄ画像の生成は、オフライン処理モジュール１０６を使用して示されている。多様な実施態様が、デジタル信号プロセッサ、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、又はコンピュータ若しくはマイクロコントローラ上で動作するソフトウェアを含む同期モジュール１０４によって生成されたデータに基づいて３Ｄ画像を生成するために使用され得ることを理解されたい。
【００３４】
一実施形態では、すべての機器に対するインターフェースが、ＬａｂＶＩＥＷ内で実行される。制御は、カルマンフィルタ、ＰＩＤ制御、及び共焦点データとのシンキング（synching）を実施する。共焦点データは、ＬＳＭ内部のＰＭＴの電圧を直接読み取ることによって実現される。次に、データは、ピクセルロケーションに対するステージの運動の影響を補正するために、オフラインで調整される。
【００３５】
追跡モジュールに対して、重要な制限は、圧電ステージの速度及び蛍光プローブの光安定性である。現在の圧電技術の状態では、追跡は、純水溶液中の６０ｎｍのナノ粒子が限界である。これは、光子の欠如ではなく、単に、ステージが追跡システムからの信号に応答するのにかかる時間の関数である。以前のＳＮＴＳＭシステムは、単一の量子ドットが粘性媒質内で追跡されるのに十分な光子を供給することを示した。この障害は、細胞内環境の稠密な性質が拡散を著しく遅くする生物系において軽減される。
【００３６】
蛍光プローブの光安定性及び寿命もまた、機器を制限する。追跡プローブの連続照明によって、ロバストな放出器が必要とされ、誘起蛍光体又は蛍光タンパク質の使用が排除される。量子ドットは極めてロバストであるが、それらの放射において間欠性を表示し、追跡を困難にする。この問題は、複数の量子ドットからなるプローブを使用して、プローブが常時放射している確率を高めることによって解決され得る。同じく、最近の研究は、量子ドット構造を綿密に制御することによって間欠性が緩和又は排除され得ることを示している。
【００３７】
ＭＳＮシステムは、生物学を専門分野とする研究グループ及び会社のための業務用グレードの顕微鏡として実装され得る。システムは、オールインワンシステムとして大量に包装されてよく、又は追跡モジュールが、多くの生物学のグループがすでに保有している任意の共焦点顕微鏡システムへのアドオンとして販売されてもよい。新しい追跡モジュールのより小さい占有面積が、より容易な実装を可能にする。既存の共焦点顕微鏡は、圧電ステージを追加することと、追跡モジュールを増設して完全に機能するＭＳＮシステムを作製するために対物レンズの無限遠経路へのアクセスを有することとを必要とするのみである。ＭＳＮシステムは、限定はしないが、本明細書に記載する用途を含む、多様な用途において使用され得ることを理解されたい。
【００３８】
細胞力学の解明
高い空間分解能及び時間分解能と大きい空間規模とのユニークなその組合せによって、ＭＳＮシステムは、微小管ベースの細胞骨格ネットワークに沿った細胞小器官追跡の動的挙動を研究するために、ユニークに適している。微小管は、細胞内で細胞小器官の移送を可能にする細胞内構造であり、同じく、細胞分裂において基本的な役割を果たす。しかしながら、生体内の微小管ベースの移送の研究は、細胞小器官が３次元らせん構造に沿って１〜２μｍ／ｓｅｃの速度で進むので、困難であった。微小管直径（２５ｎｍ）は、我々のシステムの空間分解能（約１０ｎｍ）の範囲内で十分であることを考えれば、ＭＳＮシステムは、細胞小器官のこの高速３Ｄ運動をリアルタイムで追跡することができることになる。その上、チューブリンサブユニットを蛍光標識化すること、及び大規模環境を評価するためにＭＳＮの能力を活用することによって、我々は、全プロセスをその完全な３Ｄコンテキストにおいて可視化することができる。ＭＳＮプロトタイプは、すでに、生体細胞内のナノ粒子の運動を検出することが可能になっている。 
高分解能分光法による環境検知
ＭＳＮシステムの主要な強みは、対象の粒子を常時対物レンズの焦点体積内に効果的に留める、その能力にある。粒子自体は、依然として、サンプル内を自由に移動し得る一方で、実験者は、粒子がラボフレームの中で固定されているかのように粒子及びその環境をプローブする能力を有する。これは、ナノ粒子の３Ｄ運動にもかかわらず、高精度で時間依存性の分光法が焦点体積内で実行されることを可能にする。ＭＳＮシステムは、ｐＨ、温度、並びに多種多様な化学物質及び生体高分子に反応するように設計され得る半導体量子ドットを追跡しモニタすることができる。量子ドットセンサのスペクトル読出しを分析することによって、ＭＳＮシステムは、細胞内温度、ｐＨ、及び電場など、細胞生物学のこれまで未開拓の領域に適用され得る。重要なことには、ＭＳＮシステムは、生物環境及びその機能的結果における局所的動的不均一性を検知するために必須である、高い空間分解能及び時間分解能を有するスペクトル読出しを提供することになる。たとえば、温度を検知する量子ドットは、ミトコンドリア標的化ペプチドによって不動態化され得、細胞内温度勾配を記録するために細胞質ゾル内のミトコンドリア及び制御エリアにおける高度に局所化された温度測定が可能になる。次に、細胞は、局所温度勾配が細胞の状態にいかに依存するかを確かめるために、化学的に刺激され得る。最後に、カルボニルシアニド-p-（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）など、酸化的リン酸化を脱共役化するために化学薬剤を添加することが、局所温度が細胞代謝の無効性に依存するかどうかを判断することを助けることがある。ミトコンドリア温度の直接測定が、癌生物学及び神経生物学に広範囲にわたる影響を与えることができた。
【００３９】
生体内単一分子力学
タンパク質の分子配座及び反応性が細胞小器官レベル又は細胞レベルの機能に影響を与える様相を解明するためには、単に空間ロケーションを追跡するだけでは不十分である。量子力学が考慮されなければならない長さスケールにおいて発生する分子内力学を追求するために、ＭＳＮシステムは、フェルスター型共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ：Forster-type Resonance Energy Transfer）分光法、ドナーの相対強度を測定することによって研究者がタンパク質の構造及び力学を観測することを可能にした分子スケールルーラー、及び２つのアミノ酸残基の間の距離を抽出するためのアクセプタ蛍光体（acceptor fluorophore）など、敏感な分光法を使用することができる。時間依存性のＦＲＥＴ軌跡は、単一タンパク質レベル（単一分子ＦＲＥＴ又はｓｍＦＲＥＴと呼ばれる）においてさえ、フォールディング／アンフォールディング及び基質の存在における配座変化など、タンパク質の力学についての情報をもたらす。単一分子レベルのタンパク質の研究は、可観測量（the observable）が一般に母平均である伝統的なアンサンブル測定を介して観測され得ない分子状態を解明する能力を有する。しかしながら、この種の高分解能単一分子測定は、タンパク質を３Ｄ細胞環境内で追跡して観測することができないため、生体内で実現されていない。ＭＳＮシステムを細胞内環境に適用することは、単一分子測定が生物系の中でいかにして実施されるかにおける完全なパラダイムシフトを提示している。単一ＦＲＥＴで標識化されたタンパク質を、追跡されるナノ粒子に添付することによって、単一分子ＦＲＥＴ測定が、細胞の外で自由に拡散することから、タンパク質がその自然状態で機能し得る細胞の内側に向かって細胞膜内の脂質ラフト上で浮遊することまで、無数の生物環境におけるタンパク質の力学を観測するために実行され得る。過渡的なタンパク質間相互作用を補足することは、多くの実験のうちの、それ以外では実施され得ない唯一の実験である。その上、これらの単一分子測定値は、ＭＳＮシステムの二光子蛍光スキャナを使用して、細胞又は多細胞生物のより大きいコンテキストの中で確認され得る。
【００４０】
細胞環境における変化に影響を与えること
同じく、ＭＳＮは、細胞環境における高度に局所化された変化に影響を与えるために使用され得る。金属ナノ粒子を添加することが、熱を感知する細道（thermally sensitive pathway）を活性化するための局所加熱を可能にし、又はナノスケールの光熱セラピー（photothermal therapy）を可能にする。光活性化アンケージング（photoactivated uncaging）又は光分解性リンカが、小分子、ペプチド、ＲＮＡ、及びタンパク質を細胞に、高精度で送達するために使用され得る。これらのカーゴ（cargo）の送達は、ナノ粒子が生物系内の所望のロケーションに到達すると、ＵＶ光のパルスで光分解性ボンドを破壊することで実現されることになる。
【００４１】
本明細書に記載する参照もまた、出願の一部であり、参照によりそれらの全体を、本明細書で完全に説明されたかのように組み込まれる。多くの変形形態が、本明細書における開示に基づいて可能であることを理解されたい。特徴及び要素が特定の組合せで上記で説明されているが、各特徴若しくは要素は、他の特徴及び要素なしに単独で使用されてよく、又は他の特徴及び要素とともに若しくはなしに様々な組合せで使用されてもよい。本明細書で提供する方法又はフローチャートは、汎用コンピュータ又はプロセッサによる実行のために、非一時的コンピュータ可読記憶媒体内に組み込まれたコンピュータプログラム、ソフトウェア、又はファームウェアにおいて実施され得る。コンピュータ可読記憶媒体の例は、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、レジスタ、キャッシュメモリ、半導体メモリデバイス、内臓ハードディスク及びリムーバブルディスクなどの磁気媒体、光磁気記録媒体、並びにＣＤ−ＲＯＭディスク及びデジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）などの光媒体を含む。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載の事項を、そのまま、付記しておく。
［１］  サンプル中の粒子を非侵襲的に追跡するためのシステムであって、
前記サンプルをスキャンするように構成された、二光子又は共焦点のレーザスキャニング顕微鏡（ＬＳＭ）と、
粒子保持デバイスに結合された粒子を有する、Ｘ−Ｙ及びＺの位置制御を有するステージに結合された、粒子保持デバイスと、
追跡励起レーザと、Ｘ−Ｙ方向における前記粒子の偏移を検出するように構成されたＸ−Ｙ放射収集構成要素と、Ｚ方向における前記粒子の偏移を検出するように構成されたＺ放射収集構成要素とを有する追跡モジュールと、
前記Ｘ−Ｙ及びＺの放射収集構成要素に結合され、前記粒子の運動を追跡するために前記ステージのＸ−Ｙ及びＺの位置制御を駆動するように構成された制御信号を生成するプロセッサとを備える、システム。
［２］  現在のＬＳＭスキャニングミラー位置とＬＳＭ検出器読出しとを受信し、それらを現在のステージ位置と同期させて、ステージ位置でスタンプされたＬＳＭピクセルを生成するように構成された同期モジュールと、ステージ位置でスタンプされた前記ＬＳＭピクセルを使用して粒子の３Ｄ軌跡を示す３Ｄ画像を生成するように構成された処理モジュールとをさらに備える、［１］に記載のシステム。
［３］  現在のＬＳＭスキャニングミラー位置とＬＳＭ検出器読出しとを受信し、それらを現在のステージ位置と同期させて、ステージ位置でスタンプされたＬＳＭピクセルを生成するように構成された同期モジュールをさらに備える、［１］に記載のシステム。
［４］  前記ＬＳＭシステム（実空間のピクセルサイズ）の知られている倍率及び前記サンプルの前記スキャンの間の各時点における圧電ステージ位置に基づいて、前記ＬＳＭシステムからの各検出器読出し（ピクセル）を、ラボフレームからサンプルフレーム内の３次元ボクセルに変換するように構成されたピクセルからボクセルへの変換モジュールをさらに備える、［２］に記載のシステム。
［５］  オーバーサンプリングを平均したボクセル及び補間された未サンプリングボクセルを含む補間データを生成するように構成された補間モジュールをさらに備える、［４］に記載のシステム。
［６］  前記補間データを平滑化するように構成された平滑化モジュールをさらに備える、［５］に記載のシステム。
［７］  前記補間データに基づいて前記粒子の運動を示す３Ｄ画像を生成するように構成された画像生成モジュールをさらに備える、［５］に記載のシステム。
［８］  前記追跡励起レーザが光学テーブル平面に平行に搭載され、前記Ｘ−Ｙ放射収集構成要素が前記光学テーブル平面に垂直に搭載される、［１］に記載のシステム。
［９］  各Ｘ−Ｙ放射収集構成要素が、前記光学テーブルの前記平面から垂直方向に光を反射するように構成されたミラーを有する、［８］に記載のシステム。
［１０］  一方の面に搭載されたＸ放射収集構成要素と、反対面に搭載されたＹ放射収集構成要素とを有する垂直搭載面をさらに備える、［８］に記載のシステム。
［１１］  サンプル中の粒子を非侵襲的に追跡するための方法であって、
前記サンプルをスキャンするように構成された、二光子又は共焦点のレーザスキャニング顕微鏡（ＬＳＭ）を提供することと、
粒子保持デバイスに結合された前記粒子を有する、Ｘ−Ｙ及びＺの位置制御を有するステージに結合された、粒子保持デバイスを提供することと、 
追跡励起レーザビームを生成し、Ｘ−Ｙ方向及びＺ方向において前記粒子の偏移を検出することと、
前記粒子の運動を追跡するために前記ステージのＸ−Ｙ及びＺの位置制御を駆動するように構成された制御信号を生成することとを備える、方法。
［１２］  現在のＬＳＭスキャニングミラー位置とＬＳＭ検出器読出しとを受信することと、それらを現在のステージ位置と同期させて、ステージ位置でスタンプされたＬＳＭピクセルを生成することと、ステージ位置でスタンプされた前記ＬＳＭピクセルを使用して粒子の３Ｄ軌跡を示す３Ｄ画像を生成することとをさらに備える、［１１］に記載の方法。
［１３］  現在のＬＳＭスキャニングミラー位置とＬＳＭ検出器読出しとを受信することと、それらを現在のステージ位置と同期させて、ステージ位置でスタンプされたＬＳＭピクセルを生成することとをさらに備える、［１１］に記載の方法。
［１４］  前記ＬＳＭシステム（実空間のピクセルサイズ）の知られている倍率及び前記サンプルの前記スキャンの間の各時点における圧電ステージ位置に基づいて、前記ＬＳＭシステムからの各検出器読出し（ピクセル）を、ラボフレームからサンプルフレーム内の３次元ボクセルに変換することをさらに備える、［１２］に記載の方法。
［１５］  オーバーサンプリングを平均したボクセル及び補間された未サンプリングボクセルを含む補間データを生成することをさらに備える、［１４］に記載の方法。
［１６］  前記補間データを平滑化することをさらに備える、［１５］に記載の方法。
［１７］  前記補間データに基づいて前記粒子の運動を示す３Ｄ画像を生成することをさらに備える、［１５］に記載の方法。
［１８］  前記追跡励起レーザビームが光学テーブル平面に平行に配向され、Ｘ−Ｙ放射収集構成要素が前記光学テーブル平面に垂直に搭載される、［１１］に記載の方法。
［１９］  各Ｘ−Ｙ放射収集構成要素が、前記光学テーブルの前記平面から垂直方向に光を反射するように構成されたミラーを有する、［１８］に記載の方法。
［２０］  一方の面に搭載されたＸ放射収集構成要素と、反対面に搭載されたＹ放射収集構成要素とを有する垂直搭載面を提供することをさらに備える、［１８］に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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