(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子。
（ａ）パルボウイルスであるイヌパルボウイルスまたはネコパルボウイルスのカプシドタンパク質ＶＰ−２の３８９位のアミノ酸がアスパラギンに置換されているアミノ酸配列（ａ）からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であり、かつパルボウイルスの弱毒化作用を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項２】
さらに、前記カプシドタンパク質ＶＰ−２の３００位のアミノ酸がバリンに置換されている請求項１に記載の弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子。
【請求項３】
請求項１または２に記載の弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子を有することを特徴とする感染性分子クローン。
【請求項４】
請求項１または２に記載の弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子を有することを特徴とする弱毒化パルボウイルス。
【請求項５】
請求項４に記載の弱毒化パルボウイルスを含む、パルボウイルスの感染に対して非ヒト動物を予防するためのワクチン。
【請求項６】
請求項５に記載のワクチンを非ヒト動物に投与することを特徴とする、非ヒト動物におけるパルボウイルス関連疾患の予防または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、弱毒マーカーを有するパルボウイルスおよびその用途に関する。詳しくは、弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子、該弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子から得られる感染性分子クローン、弱毒化パルボウイルス、ワクチンおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）は主にイヌに感染する病原体である。パルボウイルス感染症は、イヌ、特に仔犬における急性の下痢、発熱および白血球減少症、ならびに心筋疾患を特徴とする。ワクチンを接種していない仔犬ではこの疾患による致死率が約８０％ときわめて高い。ＣＰＶは、一本鎖ＤＮＡの約５，０００塩基のＤＮＡゲノムを有する自律性パルボウイルスである。ＣＰＶのゲノムは２個の構造遺伝子（ＶＰ−１およびＶＰ−２）および２個の非構造遺伝子（ＮＳ−１およびＮＳ−２）を特徴とする。そして、構造遺伝子ＶＰ−２は、イヌパルボウイルスのカプシドタンパク質ＶＰ−２をコードするカプシド遺伝子であることがわかっている。
【０００３】
現在ＣＰＶに対するワクチンは、弱毒化されたＣＰＶである生ワクチンを投与する方法が広く普及している。ＣＰＶ弱毒生ワクチンのワクチン株はイヌに接種すると糞便中に一過性に排泄される。そのため、イヌがＣＰＶの感染を疑う下痢等の症状を示し、そのイヌからＣＰＶが検出された場合に、発症の原因を特定するために弱毒ワクチン株と強毒株を区別する必要があるが、技術的に困難な場合がある。従って、ワクチン株と強毒株を区別する弱毒化を証明するマーカー（すなわち弱毒化をもたらすことが明らかな突然変異箇所）を有するワクチン株の開発が望まれている。
【０００４】
これまでに強毒株とワクチン株の生物学的性状や遺伝子学的性状の違いが明らかにされ、それらの特徴がマーカーとされてきた。しかし、いずれの特徴も区別がつくというだけで、必ずしも弱毒化に直接関係する特徴ではなく、弱毒化を証明するマーカーではない。
【０００５】
例えば、特許文献１には、ＣＰＶのゲノムの３´末端および５´末端領域に位置する非翻訳領域に突然変異を有する弱毒のＣＰＶ突然変異体が記載されており、この突然変異箇所を含むＣＰＶ突然変異体が弱毒であることも記載されている。しかしながら、突然変異箇所の導入がＣＰＶの引き起こす症状（下痢および白血球の減少）を弱毒させたことは証明されておらず、前記突然変異箇所を導入することで弱毒化したパルボウイルスが作製されることについての論証は不十分である。また、特許文献１に記載の突然変異箇所は、ＣＰＶのゲノムのヘアピンループ内にあり、ＰＣＲによる遺伝子の増幅が困難なため、遺伝子の塩基配列を決定することは容易ではなく、マーカーとしての利便性も低い。
【０００６】
また、特許文献２は、ＣＰＶのゲノムのカプシド（ＶＰ−２）領域に位置する突然変異を有する弱毒のＣＰＶ突然変異体を開示している。この突然変異箇所は、特許文献１の場合と比べるとＰＣＲによりＤＮＡを増幅しやすい位置である。そして、特許文献２でも、前記突然変異箇所を含むＣＰＶ突然変異体が弱毒であることは証明しているが、この突然変異箇所の導入がＣＰＶの引き起こす症状（下痢および白血球の減少）を弱毒させたことは証明されておらず、前記突然変異箇所を導入することで弱毒化したパルボウイルスが作製されることについての論証は不十分である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３７６２４３５号公報
【特許文献２】特表２０１３−５３５１８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記のように、イヌパルボウイルスの弱毒化と関連させた遺伝子の突然変異箇所の報告はいくつかあるが、突然変異箇所の導入によりイヌパルボウイルスの引き起こす症状（下痢および白血球の減少）を弱毒させたことはいずれも証明されていない。
【０００９】
そこで、本発明の目的は、非ヒト動物に対するワクチンとして好適な弱毒マーカーを有するパルボウイルスを作製することができる弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子、該弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子から得られる感染性分子クローン、弱毒化パルボウイルス、ワクチンおよび前記ワクチンを使用した非ヒト動物の予防または治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、パルボウイルスのカプシドタンパク質ＶＰ−２について、前記特許文献２に記載の箇所とは異なる領域の２箇所のアミノ酸（３００位のグリシンまたはアラニンと、３８９位のトレオニン）に着目し、これらの２つの部位がウイルスの弱毒化において重要な役割を果たしていることを見出すとともに、前記２つの部位に変異を起こすことで強毒ＣＰＶが弱毒ＣＰＶに改変されることを初めて証明し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子、
（ａ）パルボウイルスのカプシドタンパク質ＶＰ−２の３００位のアミノ酸がグリシンおよびアラニン以外のアミノ酸に置換され、および／または前記カプシドタンパク質ＶＰ−２の３８９位のアミノ酸がトレオニン以外のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列（ａ）からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であり、かつパルボウイルスの弱毒化作用を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
〔２〕パルボウイルスのカプシドタンパク質ＶＰ−２の３００位のアミノ酸が分岐鎖アミノ酸、カプシドタンパク質ＶＰ−２の３８９位のアミノ酸がアミド基含有アミノ酸である前記〔１〕に記載の弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子、
〔３〕前記分岐鎖アミノ酸がバリンであり、前記アミド基含有アミノ酸がアスパラギンである前記〔２〕に記載の弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子、
〔４〕前記パルボウイルスがイヌパルボウイルスまたはネコパルボウイルスである前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子、
〔５〕前記〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子を有することを特徴とする感染性分子クローン、
〔６〕前記〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子を有することを特徴とする弱毒化パルボウイルス、
〔７〕前記〔６〕に記載の弱毒化パルボウイルスを含む、パルボウイルスの感染に対して非ヒト動物を予防するためのワクチン、
〔８〕前記〔７〕に記載のワクチンを非ヒト動物に投与することを特徴とする、非ヒト動物におけるパルボウイルス関連疾患の予防または治療方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のパルボウイルスは、弱毒であることが保証されるので、このパルボウイルスを含むワクチンは、強毒株との区別が容易になり、かつ弱毒化が担保される安全性の高いワクチンとなる。
また、本発明で変異させているパルボウイルスのカプシドタンパク質ＶＰ−２のアミノ酸配列におけるアミノ酸３００位とアミノ酸３８９位とをコードする遺伝子の突然変異箇所は、弱毒を担保するマーカーとなり、そのようなマーカーを有するウイルスは安全なワクチンのための基礎を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例１で作製したプラスミドｐＡＢの構築の手順を示す概略図である。
【図２】図２は、実施例１で作製したプラスミドｐＡＢの線状化の手順を示す概略図である。
【図３】図３は、実施例１で作製した感染性分子クローンｐＫＢ９の構築の手順を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．弱毒化パルボウイルスのカプシド遺伝子
本発明の弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子は、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）パルボウイルスのカプシドタンパク質ＶＰ−２の３００位のアミノ酸がグリシンおよびアラニン以外のアミノ酸に置換され、および／または前記カプシドタンパク質ＶＰ−２の３８９位のアミノ酸がトレオニン以外のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列（以下、アミノ酸配列（ａ）という）からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であり、かつパルボウイルスの弱毒化作用を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
なお、前記アミノ酸配列の順番は、Ｎ末端からの順番とする。
【００１５】
「パルボウイルスのカプシドタンパク質ＶＰ−２」については、公知のデータベースでそのアミノ酸配列や該アミノ酸配列をコードする塩基配列を確認することができる。例えば、イヌパルボウイルスのカプシドタンパク質については、アミノ酸配列をＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＢＡＤ０５０１５、塩基配列をＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＡＢ１２８９２３などの公知のデータベースでそのアミノ酸配列や該アミノ酸配列をコードする塩基配列を確認することができる。
【００１６】
「パルボウイルス」としては、イヌパルボウイルスおよびネコパルボウイルスが含まれる。
例えば、イヌパルボウイルスのカプシドタンパク質ＶＰ−２は、全長５８４個のアミノ酸配列から構成されるタンパク質であり、このカプシドタンパク質ＶＰ−２をコードするカプシド遺伝子ＶＰ−２は、全長１７５５個の塩基配列から構成される。
また、ネコパルボウイルスは、イヌパルボウイルスと比べて、カプシドタンパク質ＶＰ−２のアミノ酸配列の相同性が９９％以上ある。
いずれのパルボウイルスのカプシドタンパク質ＶＰ−２でも構成するアミノ酸３００位はグリシンまたはアラニン、アミノ酸３８９位はトレオニンである。
【００１７】
本発明の弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子としては、
１）前記カプシドタンパク質ＶＰ−２の３００位のアミノ酸が置換されている組み換えタンパク質をコードする弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子、
２）前記カプシドタンパク質ＶＰ−２の３８９位のアミノ酸が置換されている弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子、
３）前記カプシドタンパク質ＶＰ−２の３００位および３８９位のアミノ酸が置換されている弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子、
が含まれる。
【００１８】
例えば、前記カプシドタンパク質ＶＰ−２の３００位のアミノ酸が置換されている組み換えタンパク質をコードする弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子は、パルボウイルスカプシド遺伝子ＶＰ−２の５’末端から８９８位〜９００位の３塩基配列ＧＧＴが所望のアミノ酸をコードするコドンに置換されている塩基配列からなる遺伝子である。
また、前記カプシドタンパク質ＶＰ−２の３８９位のアミノ酸が置換されている弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子とは、パルボウイルスカプシド遺伝子ＶＰ−２の５’末端から１１６５位〜１１６７位の３塩基配列ＡＣＣが所望のアミノ酸をコードするコドンに置換されている塩基配列からなる遺伝子である。
また、パルボウイルスカプシド遺伝子ＶＰ−２の８９８位〜９００位の３塩基配列ＧＧＴと、１１６５位〜１１６７位の３塩基配列ＡＣＣがともに所望のアミノ酸をコードするコドンに置換されている塩基配列からなる遺伝子も本発明の弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子に含まれる。
【００１９】
本発明の弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子において、前記カプシドタンパク質ＶＰ−２の３００位のアミノ酸をコードするコドンとしては、バリン、ロイシン、イソロイシンなどの分岐鎖アミノ酸をコードするコドンが挙げられ、中でも、変異を導入することが容易でありかつワクチン作用が高い観点から、バリンをコードするコドンが好ましい。
また、前記カプシドタンパク質ＶＰ−２の３８９位のアミノ酸をコードするコドンとしては、アスパラギン、グルタミンなどのアミド基含有アミノ酸をコードするコドンが挙げられ、中でも変異を導入することが容易でありかつワクチン作用が高い観点から、アスパラギンをコードするコドンが好ましい。
【００２０】
前記アミノ酸配列（ａ）のようにカプシドタンパク質ＶＰ−２の３００位や３８９位のアミノ酸を所望のアミノ酸に置換する手法としては、前記カプシドタンパク質ＶＰ−２をコードするカプシド遺伝子ＶＰ−２を材料としてこれに遺伝子工学における公知の手法を用いればよい。例えば、後述の実施例に記載のように、塩基配列の所望の位置にＰＣＲを利用して変異を導入できるサイトダイレクティドミュータジェネシス（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法を使用することができる。実際には、本技術を応用した市販のキットを用い添付のプロトコールに従って行えばよい。
また、他の手法としては、オリゴヌクレオチドダイレクティドミュータジェネシス（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）などが挙げられる。
【００２１】
また、前記アミノ酸配列（ａ）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列も本発明に含まれるが、このアミノ酸配列は、パルボウイルスの弱毒化作用を有するアミノ酸配列である必要がある。
【００２２】
前記欠失、置換もしくは付加などの変異を導入する配列の位置は、特に限定はないが、カプシド遺伝子から作製されたパルボウイルスが前記のような弱毒化作用を失わない位置であればよい。
【００２３】
本発明において「パルボウイルスの弱毒化作用」とは、野生型のパルボウイルスが有する毒性を弱毒化できる作用をいい、「パルボウイルスの弱毒化作用を有するアミノ酸配列からなるタンパク質」とは、具体的には、後述の実施例に記載のような手法により、目的のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするカプシド遺伝子を有する生ウイルスをイヌに経口投与して感染させた場合に、強毒のウイルスを感染させたイヌに比べて、イヌパルボウイルス感染で顕著に見られる下痢および白血球の減少が低減されている作用を発現できるタンパク質をいう。
したがって、前記アミノ酸配列（ａ）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつパルボウイルスの弱毒化作用を有するアミノ酸配列も本発明の弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子に含まれる。
【００２４】
２.感染性分子クローン
本発明の感染性分子クローンは、前記弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子を有することを特徴とする。
【００２５】
本発明の感染性分子クローンは、前記弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子を含むパルボウイルスの全ゲノムを組み込んだプラスミドであり、トランスフェクション法によりウイルス感受性細胞に導入すると、感染性ウイルスを人工的に産生させることができる。
したがって、本発明の感染性分子クローンが含むゲノムでは、前記弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子以外の部分のゲノムは、野生型のパルボウイルス遺伝子と同じ塩基配列になっている。
【００２６】
本発明の感染性分子クローンが有する遺伝子としては、例えば、後述の実施例で作製されている３種類の塩基配列が挙げられる。
１）ｐＫＢ９−Ｇ３００Ｖ：パルボウイルスカプシドタンパク質ＶＰ−２の３００番目のアミノ酸をバリンに置換させるために、３６８２番目の塩基がチミンに置換された塩基配列（配列番号１）
２）ｐＫＢ９−Ｔ３８９Ｎ：パルボウイルスカプシドタンパク質ＶＰ−２の３８９番目のアミノ酸をアスパラギンに置換させるために、３９４９番目の塩基がアデニンに置換された塩基配列（配列番号２）
３）ｐＫＢ９−Ｇ３００Ｖ／Ｔ３８９Ｎ：パルボウイルスカプシドタンパク質ＶＰ−２の３００番目のアミノ酸をバリンに置換させるために、３６８２番目の塩基がチミンに置換され、前記タンパク質の３８９番目のアミノ酸をアスパラギンに置換させるために、３９４９番目の塩基がアデニンに置換された塩基配列（配列番号３）
【００２７】
前記３種類の感染性分子クローンは、いずれも野生型のパルボウイルスの全ゲノムを組み込んだ感染性分子クローンｐＫＢ９において、パルボウイルスカプシドタンパク質ＶＰ−２をコードしている所定の位置の塩基を目的の塩基に置換することで作製される。
【００２８】
また、前記パルボウイルスカプシドタンパク質ＶＰ−２の３００番目のアミノ酸をロイシンまたはイソロイシンに置換されていてもよい。これらの場合、例えば、後述の実施例１で作製した感染性分子クローンｐＫＢ９において、５’末端から３６８１位〜３６８３位の３塩基配列ＧＧＴを、ロイシンにするためにはＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡまたはＣＴＧに、イソロイシンにするためにはＡＴＴ、ＡＴＣまたはＡＴＡにそれぞれ置換すればよい。
【００２９】
また、前記パルボウイルスカプシドタンパク質ＶＰ−２の３８９番目のアミノ酸はグルタミンに置換されていてもよい。
この場合、例えば、後述の実施例１で作製した感染性分子クローンｐＫＢ９において、５’末端から３９４８位〜３９５０位の３塩基配列ＡＣＣを、グルタミンにするためにはＧＡＡまたはＧＡＧにそれぞれ置換すればよい。
【００３０】
感染性分子クローンの作製に使用されるプラスミドとしては、前記の導入する塩基配列の大きさに応じた市販のクローニング用ベクターを用いればよく、例えば、ｐＢＭＨ、ｐＵＣ１１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＭなどが挙げられる。
なお、各プラスミドにおける目的の遺伝子の組み込みには、それぞれ適当な制限酵素を用いて行えばよく、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）を使用してもよい。
【００３１】
前記感染性分子クローンを導入するウイルス感受性細胞としては、ネコ腎由来株化細胞(ＣＲＦＫ細胞)、イヌ腫瘍由来株化細胞（Ａ−７２細胞）などが挙げられる。
【００３２】
３．弱毒化パルボウイルス
本発明の弱毒化パルボウイルスは、前記弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子を有することを特徴とする。
具体的には、弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子をゲノムに有する組み換えパルボウイルスであり、前記パルボウイルスのカプシドタンパク質ＶＰ−２の３００位のアミノ酸がグリシンおよびアラニン以外のアミノ酸に置換され、および／または前記カプシドタンパク質ＶＰ−２の３８９位のアミノ酸がトレオニン以外のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列（ａ）をコードする遺伝子を有する。
【００３３】
前記アミノ酸配列（ａ）において前記３００位のアミノ酸としては、分岐鎖アミノ酸が挙げられる。分岐鎖アミノ酸としては、バリン、ロイシン、イソロイシンが挙げられ、中でも、変異を導入することが容易でありかつパルボウイルスの弱毒化作用が高い観点から、バリンが好ましい。
【００３４】
前記３８９位のアミノ酸としては、アミド基含有アミノ酸が挙げられる。アミド基含有アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミンが挙げられ、変異を導入することが容易でありかつパルボウイルスの弱毒化作用が高い観点から、アスパラギンが好ましい。
【００３５】
また、本発明の弱毒化パルボウイルスとしては、前記アミノ酸配列（ａ）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつパルボウイルスの弱毒化作用を有するアミノ酸を含むパルボウイルスも含まれる。
【００３６】
本発明の弱毒化パルボウイルスは、野生型パルボウイルスに比べて、パルボウイルスカプシドタンパク質ＶＰ−２の３００位および／または３８９位のアミノ酸が置換されているが、これらのアミノ酸の置換が他の増殖特性をつかさどる遺伝子および免疫原をコードする遺伝子等を変異させることなく、ウイルス増殖能を保持し、かつイヌなどの非ヒト動物に対する弱毒化が安定的かつ充分に発揮される点で安全に利用できるという利点がある。
また、本発明の弱毒化パルボウイルスは、前記ワクチン株としての遺伝学的マーカーとなる前記弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子を有することで、野外株と区別することができる。
【００３７】
本発明の弱毒化パルボウイルスは、例えば、前記感染性分子クローンを所定のウイルス感受性細胞に接種して培養し、細胞の培養上清を回収することで得ることができる。
【００３８】
前記ウイルス感受性細胞としては、ネコ腎由来株化細胞(ＣＲＦＫ細胞)、イヌ腫瘍由来株化細胞（Ａ−７２細胞）などが挙げられる。
【００３９】
ウイルス感受性細胞に接種する方法としては、市販のトランスフェクション試薬を用いてウイルス感受性細胞に前記弱毒化パルボウイルスカプシド遺伝子をトランスフェクションすること、エレクトロポレーション法でトランスフェクションすることなどが挙げられる。
トランスフェクション試薬としては、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス（株）製）、  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００トランスフェクション試薬（ライフテクノロジーズ（株）製）などが挙げられる。
【００４０】
また、前記ウイルス感受性細胞の培養方法およびウイルスの回収方法については、ウイルス感受性細胞の種類に応じて、いずれも公知の手法であればよく特に限定はない。
【００４１】
４．ワクチン
本発明のワクチンは、パルボウイルスの感染に対して非ヒト動物を予防するためのワクチンであり、前記弱毒化パルボウイルスを含む。
【００４２】
また、前記弱毒化パルボウイルスは、生ワクチンとして使用してもよい。
本発明にいう生ワクチンでは、前記弱毒化パルボウイルスを水や緩衝液で懸濁したものが挙げられ、必要に応じて安定剤を添加することができる。安定剤としては、サッカロース、ポリビニルピロリドン、ラクトアルブミン、ラクトース一水和物、などが挙げられるが、特に限定はない。
本発明のワクチンにおける弱毒化パルボウイルスおよび安定剤等の含有量については、目的のワクチン作用が得られればよく、特に限定はない。
【００４３】
５．予防または治療方法
本発明の予防または治療方法は、前記ワクチンを非ヒト動物に投与することで、非ヒト動物におけるパルボウイルス関連疾患の予防または治療を行う方法である。
【００４４】
本発明のワクチンの非ヒト動物への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、動物の体重や年齢、投与方法、使用目的などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。例えば、予防方法として、一般にイヌやネコのワクチンは、生後４週以降に４週間隔で２回接種される。本発明のワクチンにおいても、生後４週以降に少なくとも１回、より好ましくは４週間隔で２回接種することにより、イヌ科またはネコ科動物におけるパルボウイルス関連疾患の予防を達成できる。
【００４５】
本発明が予防または治療の対象とする非ヒト動物としては、イヌ科、ネコ科等の哺乳動物が挙げられる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例により本発明を詳しく説明する。
【００４７】
（実施例１）イヌパルボウイルス感染性分子クローンの作製
既知のイヌパルボウイルスＤＮＡ（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＤ２６０７９）の１〜４００番目（断片Ａ）と４，６０７〜５，０７５番目（断片Ｂ）のＤＮＡを連結させた８６９塩基のＤＮＡ（断片ＡＢ）を人工的に合成し、ｐＢＭＨのマルチクローニングサイトに挿入したプラスミド（ｐＡＢ）を作製した（Ｂｉｏｍａｔｉｃ社に受託）（図１を参照。）。連結させた断片ＡとＢの境界線を端とするようにＰＣＲ法でプラスミドを直鎖状にした（図２を参照。）。
一方、野外から分離した強毒イヌパルボウイルスＫＢ９株から抽出したＤＮＡを鋳型として、２本のオリゴＤＮＡプライマー（５´−ＴＧＴＧＡＣＡＡＣＧＴＣＣＡＡＣＴＡＡＡＴＧＧＡＡＡＧＧＡＴＧＴＴＣＧＣＴＧＧＡＡ−３´（配列番号５）と５´−ＡＡＡＴＡＣＡＡＧＴＡＣＡＡＴＡＴＴＴＣＴＡＴＧＣＴＧＴＡＡＴＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＴＴＡＡＡＡＴ−３´（配列番号６））を用いて翻訳領域のＤＮＡをＰＣＲ法で増幅（断片Ｃ）し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）とＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）で、前述の直鎖状プラスミド（ｐＡＢ）にイヌパルボウイルスゲノムを構築させるようにクローニングし、完全長イヌパルボウイルスゲノムを構築したプラスミドすなわちイヌパルボウイルス感染性分子クローンを作製した（図３を参照。）。得られた感染性分子クローンをｐＫＢ９と命名した（配列番号４）。
【００４８】
前記ｐＫＢ９（全長５１１６塩基）のうち、１〜４００番目および４６４８〜５１１６番目の塩基配列はＧｅｎｂａｎｋＤ２６０７９由来の塩基配列であり、４０１〜４６４７番目の塩基配列は強毒イヌパルボウイルスＫＢ９株由来の塩基配列であり、両者を合わせて完全長イヌパルボウイルスＤＮＡである。また、イヌパルボウイルスカプシド遺伝子ＶＰ−２は２７８４〜４５３７番目に配置されている。
【００４９】
また、イヌパルボウイルスカプシドタンパク質ＶＰ−２の３００番目のアミノ酸をグリシンからバリンに置換させるために、ｐＫＢ９の３，６８２番目の塩基グアニンをチミンにＰＣＲによるｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法により置換させた以外は、前記と同様にして感染性分子クローンを得て、ｐＫＢ−Ｇ３００Ｖ（配列番号１）と命名した。
【００５０】
なお、ＰＣＲによるｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法には、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（商標登録）  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用い、添付のマニュアルに基づいて塩基の置換を行った。また、塩基の置換が正しく行われていることについては、プラスミド上に構築しているイヌパルボウイルスゲノムの全塩基配列を解析して確認した（なお、以下の感染性クローンも同様にした）。
【００５１】
イヌパルボウイルスカプシドタンパク質ＶＰ−２の３８９番目のアミノ酸をトレオニンからアスパラギンに置換させるために、ｐＫＢ９の３，９４９番目のシトシンをアデニンにＰＣＲによるｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法により置換させた以外は、前記と同様にして感染性分子クローンを得て、ｐＫＢ９−Ｔ３８９Ｎ（配列番号２）と命名した。
【００５２】
前記イヌパルボウイルスカプシドタンパク質ＶＰ−２の３００番目のアミノ酸をグリシンからバリン、３８９番目のアミノ酸をトレオニンからアスパラギンに置換させるために、ｐＫＢ９の３，６８２番目の塩基グアニンをチミン、ｐＫＢ９の３，９４９番目のシトシンをアデニンにＰＣＲによるｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法により置換させた以外は、前記と同様にして感染性クローンを得て、ｐＫＢ９−Ｇ３００Ｖ／Ｔ３８９Ｎ（配列番号３）と命名した。
【００５３】
（実施例２）イヌパルボウイルス感染性分子クローンを基にした組み換えイヌパルボウイルスの作製
ｐＫＢ９、ｐＫＢ９−Ｇ３００Ｖ、ｐＫＢ９−Ｔ３８９ＮおよびｐＫＢ９−Ｇ３００Ｖ／Ｔ３８９Ｎをネコ腎由来株化細胞（ＣＲＦＫ細胞）にＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス（株）製）でトランスフェクションし、７日後に細胞の培養上清を回収して、さらにＣＲＦＫ細胞に接種して培養した。接種後７日目に細胞の培養上清を回収してそれぞれ組み換えイヌパルボウイルスｖＫＢ９、ｖＫＢ９−Ｇ３００Ｖ、ｖＫＢ９−Ｔ３８９Ｎ、ｖＫＢ９−Ｇ３００Ｖ／Ｔ３８９Ｎを作製した。
【００５４】
次いで、組み換えイヌパルボウイルスｖＫＢ９、ｖＫＢ９−Ｇ３００Ｖ、ｖＫＢ９−Ｔ３８９Ｎ、ｖＫＢ９−Ｇ３００Ｖ／Ｔ３８９Ｎについて、ウイルス感染価（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）をＣＲＦＫ細胞で測って調べたところ、それぞれ１０６．７５０、１０７．３７５、１０６．７５０、１０７．７５０であった。
この結果から、本組み換えイヌパルボウイルスｖＫＢ９−Ｇ３００Ｖ、ｖＫＢ９−Ｔ３８９Ｎ、ｖＫＢ９−Ｇ３００Ｖ／Ｔ３８９は、いずれもｖＫＢ９と比べて、ＣＲＦＫ細胞に対する親和性が増加していることがわかる。
なお、前記ウイルス感染価は、ＣＲＦＫ細胞を用いたローラーチューブ法で測定した。
【００５５】
（実施例３）組み換えイヌパルボウイルスの犬への感染試験
実施例２で作製した組み換えイヌパルボウイルスｖＫＢ９、ｖＫＢ９−Ｇ３００Ｖ、ｖＫＢ９−Ｔ３８９Ｎ、ｖＫＢ９−Ｇ３００Ｖ／Ｔ３８９Ｎを１０６．５ＴＣＩＤ５０／ｍｌになるように調整し、イヌパルボウイルスに対する抗体を持たない３５〜５０日齢のビーグル犬の仔犬それぞれ４、４、３、７頭に５ｍｌ経口投与した。投与後２週間臨床症状の観察をし、１日おきに採血して白血球数を測定し、７日おきに採血して抗体価を測定した。臨床症状の異常と白血球の減少の結果を表１に、抗体価の結果を表２に示す。
【００５６】
表１、２の結果より、組み換えイヌパルボウイルスｖＫＢ９は、全頭の仔犬に下痢および白血球の減少を引き起こしており、イヌパルボウイルスによる典型的な重篤例を引き起こした。
これに対して、組み換えイヌパルボウイルスｖＫＢ９−Ｇ３００Ｖは、仔犬４頭中２頭に下痢、１頭に白血球の減少を引き起こしたものの、ｖＫＢ９よりも病原性の程度が弱まった。
また、組み換えイヌパルボウイルスｖＫＢ９−Ｔ３８９Ｎは、仔犬に下痢および白血球の減少を起こさず、発熱が認められただけであり、ｖＫＢ９よりも病原性の程度が弱まった。
さらに組み換えイヌパルボウイルスｖＫＢ９−Ｇ３００Ｖ／Ｔ３８９Ｎは、全頭の仔犬に臨床症状が認められず、ｖＫＢ９−Ｇ３００ＶおよびｖＫＢ９−Ｔ３８９Ｎよりもさらに病原性が弱まった。
また、抗体価はいずれの組み換えイヌパルボウイルスでも差は認められず、すべての組み換えイヌパルボウイルスで良好な免疫誘導能が確認された。
したがって、本発明のイヌパルボウイルスであるｖＫＢ９−Ｇ３００Ｖ、ｖＫＢ９−Ｔ３８９Ｎ、ｖＫＢ９−Ｇ３００Ｖ／Ｔ３８９Ｎはいずれも弱毒化されたイヌパルボウイルスであり、弱毒生ワクチンとして有用であることが確認された。
【００５７】
【表１】
0006414409.tif 000002
【００５８】
【表２】
0006414409.tif 000003
【００５９】
従来においては、前記特許文献１、２のように、イヌパルボウイルス感染症の典型的な症状（下痢および白血球の減少）を起こす強毒イヌパルボウイルスがそのアミノ酸置換により弱毒化することが詳細には報告されておらず、アミノ酸置換が弱毒化に関係するかどうか疑問が残っていた。
これに対して、本発明においては、アミノ酸を置換させる前の組み換えイヌパルボウイルスｖＫＢ９がイヌに対して下痢および白血球の減少を引き起こしたのに対し、ＶＰ−２遺伝子領域内の３００位または３８９位のどちらか一方のアミノ酸を置換させた組み換えイヌパルボウイルスｖＫＢ９−Ｇ３００Ｖ、ｖＫＢ９−Ｔ３８９Ｎは、アミノ酸を置換させる前の組み換えイヌパルボウイルスよりも弱い病原性を示した。さらに３００位と３８９位の両方のアミノ酸を置換させた組み換えイヌパルボウイルスｖＫＢ９−Ｇ３００Ｖ／Ｔ３８９Ｎは、イヌに症状を全く引き起こさなかった。したがって、強毒イヌパルボウイルスが引き起こす典型的な症状（下痢および白血球の減少）は、ＶＰ−２遺伝子内の３００位と３８９位のいずれかまたは両方のアミノ酸を置換させることにより、程度が弱くなるまたは起こさなくなることが明確に実証された。
【００６０】
以上のように、本発明のイヌパルボウイルスは、イヌパルボウイルス感染症の典型的な症状である下痢および白血球の減少を強毒ウイルスに比べて弱い程度または明らかに引き起こさないことが示されていることから、本発明はアミノ酸置換の明らかな弱毒化への関与を証明し、弱毒マーカーを有する弱毒イヌパルボウイルスを作製できるものである。
【００６１】
なお、前記実施例では、パルボウイルスとしてイヌパルボウイルスＤＮＡを用いているが、ネコパルボウイルスＤＮＡを公知のデータベースを参考に用いることで、感染性分子クローンおよび弱毒化パルボウイルスを作製することができる。
【図１】
0006414409.tif 000004
【図２】
0006414409.tif 000005
【図３】
0006414409.tif 000006
【配列表】
0006414409000001.app