(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
頭蓋骨の穴を介して動物被検体の脳の外皮上に頭蓋窓として取り付けられるように構成されるシート状部材であって、前記動物被検体の脳の光学撮影を可能にする光透過性の窓を有する又はそれが全ての前記シート状部材と、
鋭い先端を有したアクセス部材の無菌な挿入及び取り外しを可能にする、前記シート状部材のアクセスポートであって、前記アクセス部材が取り外された際に自己的に封止するように構成され、透明又は不透明なシリコーン製であり前記シート状部材の前記窓に形成された開口を封止する膜を含む前記アクセスポートと、
を備え、
前記膜は前記窓のうち前記開口の縁のみに接する医学研究又は医療用のアクセスポートを有する頭蓋窓。
【請求項２】
前記アクセス部材が挿入された際に、少なくとも前記アクセス部材の前記先端が前記窓を介して視認可能となるように、前記アクセスポートが構成されている、請求項１に記載の頭蓋窓。
【請求項３】
前記窓はガラス窓である、請求項１に記載の頭蓋窓。
【請求項４】
前記開口は丸穴である、請求項３に記載の頭蓋窓。
【請求項５】
前記開口はスリットである、請求項３に記載の頭蓋窓。
【請求項６】
前記開口は半リング状の穴である、請求項３に記載の頭蓋窓。
【請求項７】
前記アクセス部材は、前記脳に物質を注射するピペットである、請求項１に記載の頭蓋窓。
【請求項８】
前記アクセス部材は、電気プローブである、請求項１に記載の頭蓋窓。
【請求項９】
前記アクセスポートは、前記シート状部材の前記窓内に位置する、請求項１に記載の頭蓋窓。
【請求項１０】
１又はそれ以上追加された前記アクセスポートを更に備えた、請求項１に記載の頭蓋窓。
【請求項１１】
透明又は不透明なシリコーン製であり前記シート状部材の前記窓に形成された開口を封止する膜をそれぞれ含む１又はそれ以上追加された前記アクセスポートを更に備えた、請求項１に記載の頭蓋窓。
【請求項１２】
前記シート状部材に埋め込まれた又は取り付けられた電子部品を更に備えた、請求項１に記載の頭蓋窓。
【請求項１３】
前記電子部品は電極を含む、請求項１２に記載の頭蓋窓。
【請求項１４】
頭蓋骨の穴を介して動物被検体の脳の外皮上に設置されるように構成されたシート状部材と、
鋭い先端を有したアクセス部材の無菌な挿入及び取り外しを可能にする、前記シート状部材にあるアクセスポートであり、前記アクセス部材が取り外された際に自己的に封止するように構成され、透明又は不透明なシリコーン製であり前記シート状部材に形成された開口を封止する膜を含む前記アクセスポートと、
を備え、
前記膜は前記シート状部材のうち前記開口の縁のみに接する医学研究又は医療用の頭蓋カバー部材。
【請求項１５】
前記シート状部材はガラス窓を有する、請求項１４に記載の頭蓋カバー部材。
【請求項１６】
前記シート状部材に埋め込まれた又は取り付けられた電子部品を更に備えた、請求項１４に記載の頭蓋カバー部材。
【請求項１７】
前記電子部品は槽電極を含む、請求項１６に記載の頭蓋カバー部材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内の神経障害のための神経科学および製薬テストの研究に関する。これは、複数の標的とされた脳の操作と結合される長期間の光学撮影を可能にする。本出願は、２０１３年１２月１９日に出願された米国仮出願番号第６１／９１８，１９３と、非特許文献５としてリストされた、C. J. Roome and B. Kuhn の"Chronic Window with Access Port for Repeated Cellular manipulations, drug application, and electrophysiology", Frontiers in Cellular Neuroscience, Vol. 8, November 2014を引用して組み込んでいる。
【背景技術】
【０００２】
神経科学及び製薬研究において、覚醒している動物のニューロン及びニューロン活動を研究のための、汎用性と費用対効果のある技術は、長期間にわたって求められている。特に、生体内での細胞レベルの脳疾患を研究し、脳疾患に対する薬の作用を評価するための、信頼性の高い経済的な技術は、長く望まれている。
【０００３】
例えば、マウス用の慢性型の頭蓋窓を介しての二光子顕微鏡法が行われている。非特許文献１を参照。しかしながらその技術では、脳が無菌に保たれるが、局所的薬剤の塗布又は電気生理からは、脳の関心領域にアクセスしにくい。撮影や急性薬／染料の塗布をするための、種々の異なるタイプの窓も開発されている。非特許文献３を参照。更に現在、サルやネズミのような大型動物に対して、非常に複雑で高度な頭蓋窓技術を利用できる。非特許文献４を参照。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】"Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window": A. Holtmaat, et al. (2009) Nature Protocols 4, 1128 -1144
【非特許文献２】M.J. Lopez-Martinez and E.M. Campo (2011). "Micro-Nano Technologies for Cell Manipulation and Subcellular Monitoring, Biomedical Engineering" - From Theory to Applications, Prof. Reza Fazel (Ed.), ISBN: 978-953-307-637-9, InTech, Available from: http://www.intechopen.com/books/biomedical-engineering-from-theory-toapplications/micro-nano-technologies-for-cell-manipulation-and-subcellular-monitoring
【非特許文献３】F. Helmchen & W. Denk (2005), Nature Methods 2, 932-940
【非特許文献４】A. Arieli et al. (2002) J.Neurosci.Meth. 114, 119-133
【非特許文献５】C. J. Roome and B. Kuhn, "Chronic Cranial Window with Access Port for Repeated Cellular manipulations, drug application, and electrophysiology," Frontiers in Cellular Neuroscience, Vol. 8, November 2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献４に記載されているシステムでは、窓はいくつかのパーツにより成形され、感染症の危険の増加を伴う時間のかかる手術を要する。しかしながら大型動物は、非常に高価で取扱いが非常に困難であるため、多くの研究プロジェクトや薬剤研究に必ずしも役立つわけではない。しかし、マウスのような小動物には、これらの複雑で高度な窓は適していない。
【０００６】
したがって本発明は、神経科学の研究ツール及び生体内の神経障害のための医薬品検査に関する。
【０００７】
本発明の目的は、複数の標的脳の操作と結合される長期の光学撮影を可能にするシステムを提供することにある。
【０００８】
本発明の別の目的は、撮影及び操作のために、マウス等の小動物の脳領域へのアクセスを可能にする、安価で、簡易で、信頼性のある、無菌の窓を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
これら及び他の利点の達成と本発明の目的によれば、具現化され広く記載されているが、一つの態様では、本発明は、頭蓋骨の穴を介して動物被検体の脳の外皮上に頭蓋窓として取り付けられるように構成されるシート状部材であって、前記動物被検体の脳の光学撮影を可能にする光透過性の窓を有する又はそれが全ての前記シート状部材と、鋭い先端を有したアクセス部材の無菌な挿入及び取り外しを可能にする、前記シート状部材のアクセスポートであって、前記アクセス部材が取り外された際に自己的に封止するように構成された前記アクセスポートと、を備えた医学研究又は医療用のアクセスポートを有する頭蓋窓を提供する。
【００１０】
上記態様において、前記アクセス部材が挿入された際に、少なくとも前記アクセス部材の前記先端が前記光透過窓を介して視認可能となるように、前記アクセスポートが構成されていてもよい。
【００１１】
上記態様において、前記アクセスポートは、透明又は不透明なシリコーン製であり前記シート状部材の前記光透過窓に形成された開口を封止する膜を含んでもよい。
【００１２】
上記態様において、前記開口は丸穴、スリット、又は半リング状の穴であってもよい。
【００１３】
上記態様において、前記アクセス部材は、前記脳に物質を注射するピペット又は電気プローブであってもよい。
【００１４】
上記態様において、前記アクセスポートは、前記シート状部材の前記光透過窓内に位置してもよい。
【００１５】
上記の本発明の態様の頭蓋窓は、１又はそれ以上追加された前記アクセスポートを更に備えてもよい。
【００１６】
本発明の上記態様の頭蓋窓は、透明又は不透明なシリコーン製であり前記シート状部材の前記光透過窓に形成された開口を封止する膜をそれぞれ含む１又はそれ以上追加された前記アクセスポートを更に備えてもよい。
【００１７】
上記の本発明の態様の頭蓋窓は、前記シート状部材に埋め込まれた又は取り付けられた電子部品を更に備えてもよい。前記電子部品は、槽電極を含んでもよい。
【００１８】
別の態様においては、本発明は、頭蓋骨の穴を介して動物被検体の脳の外皮上に設置されるように構成されたシート状部材と、鋭い先端を有したアクセス部材の無菌な挿入及び取り外しを可能にする、前記シート状部材にあるアクセスポートであり、前記アクセス部材が取り外された際に自己的に封止するように構成された前記アクセスポートと、を備えた医学研究又は医療用の頭蓋カバーシートを提供する。
【００１９】
上記態様において、前記アクセスポートは、透明又は不透明なシリコーン製であり前記シート状部材に形成された開口を封止する膜を含んでもよい。
【００２０】
上記態様の頭蓋カバー部材は、前記シート状部材に埋めこまれた又は取り付けられた電子部品を更に含んでもよい。前記電子部品は、槽電極を含んでもよい。
【発明の効果】
【００２１】
一以上の本発明の態様によれば、光学撮影と共に生体内の脳の操作を繰り返し実行でき、費用対効果が優れた態様で長期にわたり一匹の動物でこれらの実験が今日容易に繰り返される。種々の本発明の態様により、今日の実験を大いに簡易化でき、さらに重要なのは、以前には不可能であった生体内での薬剤スクリーニングに関する多くの新しい実験ができる。この技術は、追加的であり再生さえする、脳のシールとして機能する硬膜を介しての撮影が行われるマウスのような小動物に特に役立つ。窓の生体適合性により、動物は急速に手術から回復し数週間又は数ヶ月間（およそ１年又はそれ以上）使用できる。この技術によれば、一匹の動物から得られる情報を劇的に増大できると共に、研究に使用される動物の数を大幅に削減できる。例えば、このような期間内で薬の作用を繰り返し監視しつつ、数ヶ月にわたる脳への局所薬剤の塗布の時間経過を一匹の動物で実行できる。本発明の以前は、類似の結果を達成するために多くの動物が異なる時間で犠牲となっていた。アクセスポート（一例としてのシリコーン膜）の数、形状、サイズと同様に、ガラス窓の形状、サイズは、実験又は治療の特定の要求を満たすように適宜決定できる。
【００２２】
本発明の付加的又は個別の利点及び効果は、以下の説明または部分的に明らかである説明に記載されるか、または本発明の実施によって学ばれる。本発明の目的及び他の利点は、添付の図面と同様に特に記載された説明及びその請求項で指摘される構造によって理解、達成される。
【００２３】
前述の一般説明と以下の詳細説明は典型的で説明的であり、請求される本発明の更なる説明を提供することを意図したものと理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明の実施例において、ガラス窓の概略平面図（左）と概略断面図（右）を示す。
【図２】図２は、開頭実行後のマウスの外側の脳皮膚上に取り付けられた、本発明の実施例の頭蓋窓を介して撮影された顕微鏡画像である。
【図３】図３は、歯をカバーするシリコーン管を有するワニ口クリップによりガラス片が固定されることを示している。
【図４】図４は、穴開け後での図３のガラス片を示す。
【図５】図５は、シリコーン膜を有する図３のガラス片を示す。
【図６】図６は、深く麻酔されたマウスの開頭を示す。硬膜は露出するが、脳はしない。
【図７】図７は、本発明の実施例の窓が硬膜上に設置され、強粘着剤で骨に封止されたことを示す。これにより、長期的な頭蓋の撮影と膜を介した脳へのアクセスを同時に可能にする。
【図８】図８は、ヘッドプレートが歯科用アクリルにより頭蓋骨に取り付けられていることを示し、これにより手術を履行できる。
【図９】図９は、本発明の実施例の頭蓋窓の典型例である、球状の踏み車上で頭が固定されて覚醒したマウスの脳活動が撮影された生体内実験を示している。マイクロピペットにより、シリコーン膜を介して脳に薬が注射できる。又は電極により、シリコーン膜を介して電気信号が記録できる。
【図１０】図１０は、上側に示した金属ヘッドプレートの平面図と、追加された詳細と共に図９の配列を描いた側面図である。
【図１１】図１１は、記録又は他の目的のための微小電極と、追加されたシリコーン膜と、図９の配列を描いた側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
直径５ｍｍのガラス頭蓋窓は、マウスの生体内の光学撮影のために共用される。しながら従来技術では、開頭後に窓でマウスの頭蓋骨を再封止し、いかなる脳の操作も、最初の手術中又はその後において頭蓋窓を取り外して再度取り付けて行わなければならない。この方法は困難であり、最終的には一匹の動物に対してこのような実験を実行できる期間中に操作可能な回数（1又は２のみ）を制限する。例えば、非特許文献１〜３を参照。
【００２６】
本発明の実施例では、５ｍｍの直径ガラスカバーグラス（厚さ１７０ミクロン）を使用し、ダイヤモンドドリルビット又は円錐形研磨石ビットを使用して１．５ｍｍの穴をガラスに開けた。次に、気密性があり生物学的適合性のある「膜」を形成するために、シリコーン接着剤（透明又は不透明）で穴に封をした。
【００２７】
図１は、本発明の実施例のガラス窓の概略平面図（左）と概略断面図（右）を示す。図示のように、ガラス窓１０（カバーグラス）は、シリコーン膜１２が充填された開口を有する。この例では、ガラス窓の直径は５ｍｍであり、シリコーン膜の直径は１ｍｍである。
【００２８】
シリコーン接着剤の硬化後、ガラスが手術に使用されるまで殺菌して保管できる。開頭の実行後、この改変されたガラス窓は、直接硬膜（外側の脳皮膚）に設置でき、強粘着剤で頭蓋骨に対して封止する。シリコーンが充填された窓穴は、ガラス又は石英マイクロピペットを介して薬又は他の合成物の塗布のための、脳への反復的な標的となるアクセスを今日可能にする。図２は、開頭実行後のマウスの外側の脳皮膚上に取り付けられた、本発明の実施例の頭蓋窓を介して撮影された顕微鏡画像である。図示のようにこの例では、アクセスポートは、観測窓内で直ちに利用できる。
【００２９】
薬／合成物の塗布用のピペットを脳からの取り外した後、シリコーン膜は再封止する。従って、シリコーン膜は脳の無菌状態を維持できる。無菌状態と最低限の免疫反応は、薬品検査と最適な光学撮影のために必要である。
【００３０】
本発明の最も重要な利点は、生体内での脳の操作が光学撮影と共に繰り返し実行できることであり、これらの実験は、より長期間にわたって一匹の動物に対して今日容易に繰り返される。種々の本発明の態様により、今日の実験を大いに簡易化でき、さらに重要なのは、以前には不可能であった生体内での薬剤スクリーニングに関する多くの新規な実験をできることである。この技術は、追加的で再生さえする、脳のシールとして機能する硬膜を介して撮影が行われる、マウスのような小動物に特に役立つ。窓の生体適合性により、動物が急速に手術から回復して、数週間又は数ヶ月間（およそ１年又はそれ以上）使用できる。この技術によれば、一匹の動物から得られる情報を劇的に増大できると共に、研究に使用される動物の数を大幅に削減できる。例えば、このような期間内で薬の作用を繰り返し監視しつつ、数ヶ月にわたる脳への局所薬剤の塗布の時間経過を一匹の動物で実行できる。本発明の以前は、類似の結果を得るために多くの動物が異なる時間で犠牲となっていた。アクセスポート（一例としてのシリコーン膜）の数、形状、サイズと同様に、ガラス窓の形状、サイズは、実験又は治療の特定の要求を満たすように適宜決定できる。
【００３１】
本発明によって達成できる撮影及び操作の主な対象は、神経細胞、神経膠細胞、及び脳血管系である。また、槽電極又は他の検出装置、又は電子部品のようなものは、公知の方法及び技術によって本発明の窓に恒久的に一体化されていてもよい。
【００３２】
本発明の実施例のアクセスポートを有するガラス窓は、本発明者らによって開発された以下の方法により製作できる。直径５ｍｍのガラスカバーグラス（窓）は、穴あけのために最初は固定される。これは、ガラスの破損を防止するために（図３）シリコーン管まで突出した歯を有する電気ワニ口クリップを使用して、ガラスカバーグラスを固定することによって達成できる。一旦窓を固定すると、１．５ｍｍの穴をガラスカバーグラスに開けるために（図４）、市販の利用可能なダイヤモンドドリルビット（例えば、０．９ｍｍのｄｉａｍ．）又は円錐形研磨石ビットが使用できる。ガラスカバーグラスへの穴開けの後、１滴のシリコーン接着剤（例えばKwik-Cast （商標）（不透明）、又はKwik-Sil（商標）（透明）、双方ともにWorld Precision Instruments, Inc.から市販）を、鋭い物（例えば使い古したビット（又は楊枝））を使用して、穴の中心に塗布し、接着剤が孔の縁のみに接しガラスと共に気密封止されたシリコーン膜を形成できる（図５）。シリコーン接着剤の硬化後（約１０分）、窓を殺菌してから開頭に用いることができる。
【００３３】
図６は、深く麻酔されたマウスの開頭を示す。硬膜は、露出している。開頭の間、頭蓋骨をカバーしている皮膚は切られ、例えば歯科用ドリルによる穴開けにより、脳を覆う頭蓋骨の円形部分（直径約３ｍｍ）を除去する（図６）。本発明の実施例のシリコーン膜を有するガラス窓を露出した脳に乗せ、脳の上に無菌の気密封止を形成しながら、強粘着剤（下記の図１０の１０１）により窓の外縁に沿って頭蓋骨に固定する。図７は、硬膜に取り付けられて強粘着剤で骨を封止する本発明の実施例の窓を示す。これにより、長期的な頭蓋の撮影と同時に膜を介して脳へアクセスできる。
【００３４】
次に、図８に示すように、金属のヘッドプレート（長さ２０ｍｍ、幅８ｍｍ、厚さｔは１ｍｍ）は窓上に配置されて、手術が完了するように、ネジ１０８（図１０）を用い歯科用膜アクリル（下記の図１０の１０７）を用いて頭蓋骨の下（下記の図１０の１１４）に取り付けられる。
【００３５】
図９は、本発明の実施例の頭蓋窓の典型例である、球状の踏み車上で頭が固定されて覚醒したマウスの脳活動が撮影された生体内実験を示している。マイクロピペットにより、薬はシリコーン膜を介して脳に注射できる。又は、電極により、シリコーン膜を介して電気信号を記録できる。
【００３６】
図１０は、上側に示した金属ヘッドプレートの平面図と、追加された詳細と共に図９の配列を描いた側面図である。図１１は、記録又は他の目的のための微小電極と、追加されたシリコーン膜と、図９の配列を描いた側面図である。実験の間、金属ヘッドプレート１０４は、マウスを顕微鏡ステージ１１０（図１０）に固定するために用いられる。顕微鏡対物レンズ１０５は、マウスの脳１０６への神経光学撮影のためのガラス窓１０２よりも上に配置される。石英（又はホウケイ酸塩）ガラスピペット１１２は、神経細胞標識法のための薬、ウイルス、又は蛍光色素を注入するために、シリコーン膜１０３を介して脳１０６へ挿入できる。注入が完了すると、ピペット１１２はシリコーン膜１０３が脳１０６に再封止して無菌の封止を維持できるように引き抜くことができる。標的となる単細胞薬又は蛍光色素の注入は、光学撮影と同時に実行できる。あるいは、図１１に示すように、微小電極１１２（又は１１３）は、単細胞の電気記録のために脳１０６にシリコーン膜１０３を介して挿入でき、又は窓製作の間に第２の窓穴（シリコーン膜を有する）１０３ａを含むことによって、局所的な薬剤の塗布と共に使用できる。この窓は、マウスやゼブラフィッシュのような小動物にも利用できる。
【００３７】
本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく本発明に対して様々な修正及び変形を行えることは当業者には自明である。すなわち、本発明は添付の特許請求の範囲とその均等物の範囲内で生じるさまざまな修正及び変形を包含することが意図されている。特に、上述したいずれか２以上の実施例及びその変形例のいずれかの一部又は全てが結合されて本発明の範囲内でみなされることは明示的に熟慮される。
【符号の説明】
【００３８】
１０、１０２  ガラス窓
１２、１０３  シリコーン膜
１０１  強粘着剤
１０４  金属ヘッドプレート
１０５  顕微鏡対物
１０６  マウスの脳
１０７  歯科用アクリル
１０８  ネジ
１１０  顕微鏡ステージ
１１２  注入ピペット又は微小電極
１１３  微小電極
【図１】
0006308570.tif 000002
【図２】
0006308570.tif 000003
【図３】
0006308570.tif 000004
【図４】
0006308570.tif 000005
【図５】
0006308570.tif 000006
【図６】
0006308570.tif 000007
【図７】
0006308570.tif 000008
【図８】
0006308570.tif 000009
【図９】
0006308570.tif 000010
【図１０】
0006308570.tif 000011
【図１１】
0006308570.tif 000012