(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を成熟したプロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）へ分化させる方法であって、
ｈＥＳＣから骨髄系共通前駆細胞への分化を誘導し；
骨髄系前駆細胞から未成熟樹状細胞への分化を誘導し；
ペプチドリンカーを介してＨＬＡ−ＤＲＡα鎖ペプチドに結合した単一のペプチド抗原を含む融合タンパク質をコードする核酸を、未成熟樹状細胞に導入し；そして、
未成熟樹状細胞から成熟樹状細胞への分化を誘導することを含み、ここで、成熟樹状細胞とは、前記単一のペプチド抗原を提示する成熟したプロフェッショナルな抗原提示細胞である、方法。
【請求項２】
ペプチド抗原拘束性ＣＤ４+Ｔ細胞集団を拡大（ｅｘｐａｎｄ）する方法であって、
対象の全血からＣＤ４+Ｔ細胞の集団を単離し；そして、
ＣＤ４+Ｔ細胞の細胞分裂が少なくとも３サイクルできるよう十分な時間をかけてＣＤ４+Ｔ細胞を請求項１に記載の方法により生成された成熟樹状細胞と共に培養する工程を含み、ここで成熟樹状細胞により提示される単一のペプチド抗原は、少なくとも１つのＣＤ４+Ｔ細胞のＴ細胞受容体と特異的に相互作用する方法。
【請求項３】
前記ＨＬＡ−ＤＲＡα鎖ペプチドは、配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のｈＥＳＣを成熟したプロフェッショナルなＡＰＣへ分化させる方法。
【請求項４】
成熟したプロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製する方法であって、
ペプチドリンカーを介してＨＬＡ−ＤＲＡα鎖ペプチドに結合した単一のペプチド抗原を含む融合タンパク質をコードする核酸を、未成熟樹状細胞の集団に導入し；そして、
未成熟樹状細胞から成熟樹状細胞への分化を誘導することを含み、ここで、成熟樹状細胞とは、前記単一のペプチド抗原を提示する成熟したプロフェッショナルな抗原提示細胞である、方法。
【請求項５】
成熟したプロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製する方法であって、
ペプチドリンカーを介してＨＬＡ−ＤＲＡα鎖ペプチドに結合した単一のペプチド抗原を含む融合タンパク質をコードする核酸を、成熟樹状細胞の集団に導入することを含み、ここで、成熟樹状細胞とは、前記単一のペプチド抗原を提示する成熟したプロフェッショナルな抗原提示細胞である、方法。
【請求項６】
前記ＨＬＡ−ＤＲＡα鎖ペプチドは、配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
ペプチドリンカーを介してヒトＨＬＡ−ＤＲＡα鎖ペプチドに結合した単一のペプチド抗原を含む融合タンパク質をコードする核酸であって、
ここで、前記ＨＬＡ−ＤＲＡα鎖ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲＡα鎖ペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み；
前記融合タンパク質は、主要組織適合性複合体（MHC）β鎖ペプチドを含まず；かつ
前記ペプチド抗原は、ペプチド抗原特異的なＣＤ４+Ｔ細胞の応答を惹起する、核酸。
【請求項８】
ペプチドリンカーを介してヒトＨＬＡ−ＤＲＡα鎖ペプチドに結合した単一のペプチド抗原を含む融合タンパク質であって、
ここで、前記ＨＬＡ−ＤＲＡα鎖ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲＡα鎖ペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み；
前記融合タンパク質は、主要組織適合性複合体（MHC）β鎖ペプチドを含まず；
前記ペプチド抗原は、前記ＨＬＡ−ＤＲＡα鎖ペプチドの結合ポケットに結合し；かつ
前記ＨＬＡ−ＤＲＡα鎖ペプチドは、配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
【請求項９】
単一のペプチド抗原を樹状細胞の表面に提示して含む該樹状細胞であって、
ここで、前記単一のペプチド抗原は請求項８に記載の融合タンパク質に由来する、樹状細胞。
【請求項１０】
前記ＨＬＡ−ＤＲＡα鎖ペプチドは、配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１２年５月８日に出願された米国特許出願第６１／６４４，２６５号の優先権を主張し、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、免疫診断または治療目的のために、抗原特異的な方法でヒトＴ細胞集団を単離および拡大（ｅｘｐａｎｄ）させるために使用する方法、ペプチド、核酸、および細胞に関する。また、本発明は、多能性ヒト幹細胞由来のプロフェッショナルな抗原提示細胞、および当該抗原提示細胞によるカスタマイズ可能な抗原提示に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ４+Ｔ細胞は、炎症のメディエーター、耐性、そしてＢ細胞成熟の促進因子として適応免疫において重要な役割を果たす（Ｐａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１０）。ヒトＣＤ４+Ｔ細胞のレパートリーとして、自身が発現するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が異なる数百万もの様々な細胞がある。実際、多くのヒトの疾患は、高度に特異的な抗原に応答して増殖するＣＤ４+Ｔ細胞のサブセットが別個に関与しているので、特定の状態に関連し得る少ない割合のＣＤ４+細胞を単離するのは困難である。その結果、特異的なペプチドに反応するＴＣＲを有するＣＤ４+Ｔ細胞を臨床または治療の状況で日常的に単離または特徴付けすることができない。
【０００４】
Ｔ細胞集団によって提示されるＴＣＲのレパートリーが膨大なのは、発生中の胸腺に存在する未成熟Ｔ細胞のアルファ（α）およびベータ（β）、またはガンマ（γ）およびデルタ（δ）ＴＣＲ遺伝子の体細胞組換えの結果である（Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｈａｙｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。この組換えプロセスにより、数百万の異なるＴＣＲの組み合わせを有するＴ細胞のレパートリーが生成され、これらは全ての可能なアミノ酸配列にまとめて結合する（Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｈａｙｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。このレパートリーは、Ｔ細胞が、例えば、適切な親和性を持ってそのＴＣＲに結合するペプチドを提示する組織適合性複合体（ＨＬＡクラスＩＩ）となる樹状細胞（ＤＣ）のような、プロフェッショナルなＡＰＣに遭遇するまで、休止状態で血管およびリンパ系を循環する（Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。細胞間で免疫シナプスを形成し、ＣＤ４+Ｔ細胞が刺激されて増殖し、数十〜数千のクローンが産生される。新たに産生されたＴ細胞は、二次リンパ器官を出て、体中に循環し、抗原が存在する部位に蓄積する。活性化されたＣＤ４+Ｔ細胞は、サイトカインを放出する。サイトカインは、近くの細胞に作用し、適応免疫応答を調整する。抗原源が弱まってから何日か後、クローンの大部分は、活性化が誘導した細胞死によって除去され、少数はその抗原（病原体）が再び現れたときに迅速な応答を誘発する準備ができているメモリセルとして残る（Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｖｉｌｌａｄａｎｇｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【０００５】
新鮮な全血から単離された多くのＣＤ４+Ｔ細胞は、１回または２回分裂するが、臨床的に有用な目的を果たすにはもっと多くの増殖サイクルが必要である。例えば、アッセイ期間中、比較的ロバストに分裂する（例えば、５回以上）ある割合のＣＤ４+Ｔ細胞は、問題のペプチドに対する応答性の指標として使用できる。単一のタンパク質またはペプチドの異なる断片を含むパネルを、その抗原に応答するＣＤ４+Ｔ細胞と相関する可能性がある増殖プロファイルを作成するために使用できる。これらの結果から得られた情報は、その後、ヒトの様々な状態およびそれに対しとれる可能性のある一連のアクションを決定するために使用できる。しかし、ＣＤ４+Ｔ細胞の臨床的特徴付けは、抗原特異的なＣＤ４+Ｔ細胞集団の拡大を成功させるのに必要である適切なＡＰＣ調製物の利用可能性および多様性によって制限されている。
【０００６】
さらに、抗原特異的なＣＤ４+Ｔ細胞集団を単離または特徴付ける診断および治療法の開発を複雑にするのは、ヒト集団におけるヒトＨＬＡ−ＤＲ受容体の不均一性である。簡単に言えば、クラスＩＩＨＬＡ複合体は、ペプチドを含む結合ポケットを形成するＨＬＡ−ＤＲＢおよびＨＬＡ−ＤＲＡ受容体のヘテロ二量体を含む。ヒトの集団は、何十、おそらく何百もの異なるＨＬＡ−ＤＲＢアレルを含む。したがって、ヒト集団におけるＨＬＡクラスＩＩアレルは多数あり、これが数百万もの可能性のあるＴＣＲの組み合わせと組み合わさると、病原性Ｔ細胞により惹起される自己免疫疾患における抗原特異的なＣＤ４+Ｔ細胞を単離するのが技術的に困難となる（Ｖｉｌｌｄａｎｇｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。このような自己免疫疾患としては、Ｉ型糖尿病糖尿病（Ｈａｓｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｇｏｊａｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｄｅｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、リウマチ性関節炎（Ｎｉｋｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ａｌｂａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、および多発性硬化症（ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｃｏｄａｒｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｓａｌｌｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）が挙げられる。簡単に言えば、個人により異なるＨＬＡ−ＤＲＢアレルを発現するので、ある者ではあるペプチドに結合するＴＣＲが、別の人においては同一のペプチドに結合せず、これによりユニバーサルプローブの開発が複雑になりやや再現性がなくなってしまうからである。しかしながら、ＨＬＡ−ＤＲＡアレルは２つだけ存在し、その内の１つは人口の９８％に見られる。このように、広く発現されるＨＬＡ−ＤＲＡアレルを利用する特定のＣＤ４+Ｔ細胞の応答を評価する方法は、ヒト集団の大部分に適用できるであろう。
【０００７】
従って、上述の事情を考慮して、ＣＤ４+Ｔ細胞の応答分析を標準化するプラットフォームを提供するための組成物および方法を本明細書に記載する。これらの方法および組成物は、全血から単離した抗原特異的なＣＤ４+Ｔ細胞を刺激するのに用いることができるヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から骨髄樹状細胞（ＤＣ）を効率的に産生する分化プロトコルを含む。要するに、初代樹状細胞（ＤＣ）の調製物は多岐にわたるのでＣＤ４+Ｔ細胞を臨床的に特徴付けすることが制限されるが、幹細胞由来のＤＣを使用すれば、十分な特徴付けがされ、任意のある抗原に対するＴ細胞の応答の分析用に機能改変が可能なＡＰＣ集団を設けることによってこの問題を回避できる。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、抗原特異的な方法でＣＤ４+Ｔ細胞集団をｅｘ  ｖｉｖｏで刺激および増殖させるためにヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来の樹状細胞を使用する組成物および方法を提供する。本発明の樹状細胞は、抗原特異的なＣＤ４+Ｔ細胞の応答を惹起すると考えられる任意のペプチド抗原を樹状細胞の表面に提示でき特異的なＣＤ４+Ｔ細胞の応答を特徴付するのに使用できるという点でカスタマイズ可能である。このように、本発明は、複数の対象個体間、または同じ対象の異なる時点での、特定の抗原に対する免疫応答を比較するために標準化された任意のアプローチを包含する。同様に、本発明は、様々な他の目的のために抗原特異的なＣＤ４+Ｔ細胞集団を拡大するための方法を提供する。様々な他の目的としては、細胞ワクチンとしての使用、または特定のペプチド標的に対する免疫応答を増強することによって軽減できる疾患の治療のため患者に再び戻すことができる活性化ＣＤ４+Ｔ細胞集団としての使用などが挙げられる。例えば、特定の抗原特異的なＣＤ４+Ｔ細胞集団が有益であると考えられるがその数が不十分な場合、それらの細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大させて対象に戻すことができる。また、ＣＤ４+Ｔ細胞が高度に増殖するのが有害であると考えられる自己免疫などの場合、それらの細胞を、インビトロで拡大させて、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）へと再プログラムできる。調節性Ｔ細胞は、対象に戻されるとそれら特定のＴ細胞の応答を抑制するだろう。
【０００９】
本発明の利点としては、これに限定されないが、比較的少量の血液を使用して、任意のヒト由来のヒトＣＤ４+Ｔ細胞のサブセットを同定して単離することができるということがある。本発明の使用には、これらに限定されないが、ワクチンに対する応答を特徴付けること、ならびにＣＤ４+Ｔ細胞の応答および／またはレパートリーが異なるヒトの疾患の診断および／または治療が含まれる。例えば、本発明は、以下の疾患の診断および治療するための方法および組成物を提供する：アルツハイマー病、多発性硬化症、狼瘡、乾癬、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、重症筋無力症、関節リウマチ、糖尿病Ｉ型、グレーブス病、橋本甲状腺炎、橋本脳炎、多発性筋炎、シェーグレン症候群、クローン病、横断性脊髄炎、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、パーキンソン病、筋ジストロフィー、白斑、自己免疫心臓病、セリアック病、ギラン・バレー症候群、ナルコレプシー、未知の病因の自己免疫疾患、自閉症、およびアレルギー。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１−１】図１は、ｈＥＳＣから骨髄系共通前駆細胞への分化を示す。（Ａ）なめらかな縁を示す多能性ｈＥＳＣ（Ｈ９）コロニーの顕微鏡写真。（Ｂ）Ｈ９細胞の多能性を示すＳＳＥＡ４免疫染色のフローサイトメトリーヒストグラム。（Ｃ）プレーティング直後のＯＰ９細胞に付着した３０〜５０個のｈＥＳＣ細胞の小塊。（Ｄ）ｈＥＳＣ／ＯＰ９の共培養４日後の分化コロニー。スケールバー＝１０μｍ。
【図１−２】図１は、ｈＥＳＣから骨髄系共通前駆細胞への分化を示す。（Ｅ）共培養８日後の大きい分化コロニー。（Ｆ）共培養８日後にコロニーから単離されたＣＤ３４+細胞（赤）およびアイソタイプ対照（黒）を示すフローサイトメトリーヒストグラム。（Ｇ）ｐＨＥＭＡでコーティングしたフラスコにプレーティングしてから１日後に凝集体に再形成した単一細胞の懸濁液。（Ｈ）（Ｇ）の挿入図を拡大したもの。カボチャ形の無顆粒形態を有する骨髄細胞の大きな凝集体。ＯＰ９細胞は、コーティングしたフラスコに付着せずアポトーシスが起こっていたことを示す。（Ｉ）ＧＭ−ＣＳＦ含有培地において３日後、ほとんどの骨髄細胞は、培養中に出現した単一のＣＭＰとともに、凝集体から解離し始めた。スケールバー＝１０μｍ。
【図１−３】図１は、ｈＥＳＣから骨髄系共通前駆細胞への分化を示す。（Ｊ〜Ｌ）相対的なＣＤ３４とＣＤ４５の発現を示すフローサイトメトリーのドットプロット。ＣＤ３４lo／ＣＤ４５hi集団が、（Ｊ）１日目には２〜４％、（Ｋ）３日目には２０〜３０％、（Ｌ）１２日目には６０〜７０％まで増加した。（Ｍ）Ｊ〜Ｌのアイソタイプ対照。スケールバー＝１０μｍ。
【図１−４】図１は、ｈＥＳＣから骨髄系共通前駆細胞への分化を示す。（Ｎ）ＣＭＰの分化および拡大から１２日後のＣＤ４５+染色のヒストグラム、および（Ｏ）１２日後のＣＤ４３+免疫染色のヒストグラム。スケールバー＝１０μｍ。
【００１１】
【図２−１】図２は、図１に示すようなＨＳＣが骨髄系共通前駆細胞へ分化する１２日間にわたる幹細胞マーカー（ＨＳＣ）の発現の減少、および骨髄マーカーの発現の増加を示す。ヒストグラムでは、抗原およびアイソタイプ対照をそれぞれ赤および黒で表す。
【図２−２】図２は、図１に示すようなＨＳＣが骨髄系共通前駆細胞へ分化する１２日間にわたる幹細胞マーカー（ＨＳＣ）の発現の減少、および骨髄マーカーの発現の増加を示す。ヒストグラムでは、抗原およびアイソタイプ対照をそれぞれ赤および黒で表す。
【００１２】
【図３−１】図３は、ｈＥＳＣ由来樹状細胞（ＤＣ）の形態的および機能的な活性を示す。（Ａ）ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を用いた培養１０日後には、かなりの割合の細胞が未成熟（ｉ）ＤＣに分化し、それれは未分化ＣＭＰ（矢頭）よりも大きく明るかった（矢印）。（Ｂ）ｉＤＣによるカルボン酸修飾赤色蛍光ラテックスビーズ（２μｍサイズ）のファゴサイトーシスを示す顕微鏡写真、およびｉＤＣ内の蛍光ビーズ（矢印）を示す明視野像の蛍光オーバーレイ。（Ｃ）ビーズを取り込んだｉＤＣを示す前方散乱および側面散乱（ＦＳＣ／ＳＳＣ）のドットプロット。（Ｄ）ｉＤＣにより取り込まれた赤色蛍光ビーズを示すフローサイトメトリーのヒストグラム（ＦＬ４チャネル）。
【図３−２】図３は、ｈＥＳＣ由来樹状細胞（ＤＣ）の形態的および機能的な活性を示す。（Ｅ）ＴＮＦ−αおよびＬＰＳで７２時間刺激したｉＤＣの画像。（Ｆ）Ｅの細胞部分の挿入図を拡大したもの。矢印は長い突起および成熟ＤＣの形態を示す。（Ｇ）ホフマン光学系を使用して示す成熟ＤＣのＤＩＣ画像。（Ｈ）長い樹状突起（矢印）および濃い紫色の核を示す成熟ＤＣのヘマトキシリン染色。
【図３−３】図３は、ｈＥＳＣ由来樹状細胞（ＤＣ）の形態的および機能的な活性を示す。（Ｉ）ＴＮＦ−αおよびＬＰＳで誘導した成熟あり（赤）およびなし（青）のＤＣｓｉｇｎ免疫染色を示すフローサイトメトリー。（Ｊ）ＤＣの成熟後にＣＤ８０+免疫染色の増加を示すフローサイトメトリー。（Ｋ）ＴＮＦ−αおよびＬＰＳで誘発した成熟後のＣＤ８６+免疫染色。（Ｌ）成熟ＤＣ上のＨＬＡ−ＤＲの表面発現。
【００１３】
【図４−１】図４は、８日、１２日、および１４日目のＣＭＰからＤＣへの分化中におけるＤＣマーカーの発現を示すフローサイトメトリーの結果を示す。ＤＣ成熟因子は、１２日目に投与した。ヒストグラムでは、抗原およびアイソタイプ対照を、それぞれ、赤と黒で表す。
【図４−２】図４は、８日、１２日、および１４日目のＣＭＰからＤＣへの分化中におけるＤＣマーカーの発現を示すフローサイトメトリーの結果を示す。ＤＣ成熟因子は、１２日目に投与した。ヒストグラムでは、抗原およびアイソタイプ対照を、それぞれ、赤と黒で表す。
【００１４】
【図５−１】図５は、ｈＥＳＣ由来ＤＣは、活性化島（ｉｓｌａｎｄｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ＩＯＡ）を形成するのに２つの集団を必要とすることを示す。（Ａ）Ｔ細胞との共培養用にＤＣを処理するのに使用するプロトコルの概略図。（Ｂ）ＦＳＣ／ＳＳＣドットプロットにゲーティングしたＴ集団を示すｉＤＣのフローサイトメトリーのドットプロット。（Ｃ）（Ｂ）の集団のＤＣｓｉｇｎ／ＦＳＣプロット、Ｑ１−ＵＲ（４２．８％）がＤＣｓｉｇｎ+細胞である。（Ｄ）（Ｂ）の集団のＣＤ１４+／ＦＳＣドットプロット、Ｑ５−ＵＲ（５１．３％）。
【図５−２】図５は、ｈＥＳＣ由来ＤＣは、活性化島を形成するのに２つの集団を必要とすることを示す。（Ｅ）ＤＣｓｉｇｎ：ＣＤ１４のドットプロット。比例的に均衡をとったＤＣによる決定ではＣＤ１４lo／ＤＣｓｉｇｎhi対ＣＤ１４hi／ＤＣｓｉｇｎloの比が１：１．５であることを示す。（Ｆ）成熟因子と混合したＤＣの顕微鏡写真。活性化島を示す。（Ｇ）ＩＯＡの高倍率明視野像。（Ｈ）ＩＯＡの位相差画像、周縁が細いことに注目。
【図５−３】図５は、ｈＥＳＣ由来ＤＣは、活性化島を形成するのに２つの集団を必要とすることを示す。（Ｉ）抗ＣＤ１４磁気マイクロビーズで精製したＤＣはＤＣｓｉｇｎhi／ＣＤ１４lo集団を含んでおらず、（Ｊ）ＩＯＡを形成していなかった。（Ｋ）抗ＤＣｓｉｇｎ  ＭＡＣＳマイクロビーズで精製したＤＣはＤＣｓｉｇｎlo／ＣＤ１４hi集団を含んでおらず、（Ｌ）ＩＯＡを形成していなかった。
【００１５】
【図６−１】図６は、ＣＤ４+Ｔ細胞の精製および成熟ＤＣを用いた刺激を示す。（Ａ）全血からＴ細胞の精製の概要を示す概略図。（Ｂ）ゲーティングしたＴ細胞集団を示すフローサイトメトリーのドットプロット（ＦＳＣ／ＳＳＣ）。（Ｃ）ゲーティングした集団の抗ＣＤ４免疫染色を示すヒストグラム。
【図６−２】図６は、ＣＤ４+Ｔ細胞の精製および成熟ＤＣを用いた刺激を示す。（Ｄ）均一な形態を示す精製Ｔ細胞の低倍率顕微鏡写真。（Ｅ）０日目におけるＣＤ４+Ｔ細胞のＣＦＳＥ免疫染色を示すヒストグラム。（Ｆ）ＤＣおよびＩＬ−２との共培養から１０日後。１から７までの赤く示した番号により示される各細胞分裂で見られるように、娘細胞の蛍光は細胞分裂毎に半分になることがわかる。
【図６−３】図６は、ＣＤ４+Ｔ細胞の精製および成熟ＤＣを用いた刺激を示す。（Ｇ）Ｄｉｌ標識Ｔ細胞およびＤＣからなる活性島の写真。（Ｈ）ＤＡＰＩによる細胞の核染色。コントラストをつけるため疑似的に赤色にした。周辺の中程度〜小さなＴ細胞核中に大きなＤＣ核が示される。（Ｉ）（Ｇ）および（Ｈ）をマージした画像。
【図６−４】図６は、ＣＤ４+Ｔ細胞の精製および成熟ＤＣを用いた刺激を示す。（Ｊ）標準調製物をＩＬ−２およびＤＣと共にインキュベートしたＣＤ４+Ｔ細胞におけるＣＦＳＥ蛍光のヒストグラム。（Ｋ）ＤＣｓｉｇｎ精製調製物。（Ｌ）ＣＤ１４精製調製物。
【００１６】
【図７−１】図７は、ＤＣ誘導性Ｔ細胞増殖の分析を示す。（Ａ）ワクチン接種前のヒト被験者（被験者１〜３）から単離し、ｈＥＳＣ由来ＤＣと共培養したＣＤ４+Ｔ細胞のＣＦＳＥ蛍光を示す３つのヒストグラム。ｈＥＳＣ由来ＤＣは、前もってインフルエンザペプチドを負荷し（ＩＮＦ、青）、または負荷しなかった（ｃｔｒｌ、赤）。（Ｂ）インフルエンザワクチン接種から１週間後の同じ被験者から単離し、ＤＣと共培養したＣＤ４+Ｔ細胞のＣＦＳＥ蛍光を示す３つのヒストグラム。ＤＣは、前もってインフルエンザペプチドを負荷し（ＩＮＦ、青）、または負荷しなかった（ｃｔｒｌ、赤）。
【図７−２】図７は、ＤＣ誘導性Ｔ細胞増殖の分析を示す。（Ｃ）ワクチン後対照ＤＣ（対照）と共培養したＣＤ４+Ｔ細胞のＣＦＳＥ蛍光を示す３つのヒストグラム。破線は、ＩＬ−２を含む共培養から計算した５回目の細胞分裂を示す。（Ｄ）ワクチン後対照ＤＣと共培養したＣＤ４+Ｔ細胞のＣＦＳＥ蛍光を示す３つのヒストグラム。ＤＣは、前もってインフルエンザペプチドを負荷した（ＩＮＦ）。
【図７−３】図７は、ＤＣ誘導性Ｔ細胞増殖の分析を示す。（Ｅ）インフルエンザワクチンを接種前（ｐｒｅ−）および後（ｐｏｓｔ−）の３人のヒト被験者におけるＣＤ４+Ｔ細胞の相対的な増殖（５〜７分裂）を示す棒グラフ。白棒は、前もってインフルエンザペプチドを負荷したＤＣを含有する培養物におけるＣＤ４+Ｔ細胞の増殖を示す（ＩＮＦ）。黒棒は、ペプチドを負荷していないＤＣを含有する培養物におけるＣＤ４+Ｔ細胞の増殖を示す（ｃｔｒｌ）。（Ｆ）対照被験者（ｃ１〜３）およびアルツハイマー病と推定診断された６人の被験者（ＡＤ１−６）におけるＣＤ４+Ｔ細胞の相対的な増殖（５〜７分裂）を示す棒グラフ。白棒は、前もってヒトＡβ１−４２ペプチドを負荷したＤＣを含有する培養物におけるＣＤ４+Ｔ細胞の増殖（５〜７分裂）を示す。黒棒は、ペプチドを負荷していないＤＣを含有する培養物におけるＣＤ４+Ｔ細胞の増殖（５〜７分裂）を示す。
【００１７】
【図８】図８は、ｐＣＲ８／ＧＷ−ＴＯＰＯ−ＨＬＡＤＲＡ＋リンカーベクターのプラスミドマップを示す。
【００１８】
【図９】図９は、ＨＬＡ−ＤＲＡの完全長ＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【００１９】
【図１０】図１０は、［Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＩ１８４７７．１］（ヒトアミロイド）の完全長ＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【００２０】
【図１１】図１１は、ＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ１−１３融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。シグナルペプチド（Ｎｏ．１）、シグナルペプチド切断部位（Ｎｏ．２）、Ａβ１−１３（Ｎｏ．３）、リンカー（Ｎｏ．４）、およびＨＬＡ−ＤＲＡ（Ｎｏ．５）を含む。
【００２１】
【図１２】図１２は、ＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ７−１３融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。シグナルペプチド（Ｎｏ．１）、シグナルペプチド切断部位（Ｎｏ．２）、Ａβ７−１３（Ｎｏ．３）、リンカー（Ｎｏ．４）、およびＨＬＡ−ＤＲＡ（Ｎｏ．５）を含む。
【００２２】
【図１３】図１３は、ＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ１６−３０融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。シグナルペプチド（Ｎｏ．１）、シグナルペプチド切断部位（Ｎｏ．２）、Ａβ１６−３０（Ｎｏ．３）、リンカー（Ｎｏ．４）、およびＨＬＡ−ＤＲＡ（Ｎｏ．５）を含む。
【００２３】
【図１４】図１４は、ＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ２４−３５融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。シグナルペプチド（Ｎｏ．１）、シグナルペプチド切断部位（Ｎｏ．２）、Ａβ２４−３５（Ｎｏ．３）、リンカー（Ｎｏ．４）、およびＨＬＡ−ＤＲＡ（Ｎｏ．５）を含む。
【００２４】
【図１５】図１５は、ＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ３１−４２融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。シグナルペプチド（Ｎｏ．１）、シグナルペプチド切断部位（Ｎｏ．２）、Ａβ３１−４２（Ｎｏ．３）、リンカー（Ｎｏ．４）、およびＨＬＡ−ＤＲＡ（Ｎｏ．５）を含む。Ａβ３１−４２は、Ｔ４１Ｉの置換を含む。
【００２５】
【図１６】図１６は、ＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ７−２３融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。シグナルペプチド（Ｎｏ．１）、シグナルペプチド切断部位（Ｎｏ．２）、Ａβ７−２３（Ｎｏ．３）、リンカー（Ｎｏ．４）、およびＨＬＡ−ＤＲＡ（Ｎｏ．５）を含む。
【００２６】
【図１７】図１７は、ＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ１−１３融合構築物のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【００２７】
【図１８】図１８は、ＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ７−１３融合構築物のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【００２８】
【図１９】図１９は、ＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ１６−３０融合構築物のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【００２９】
【図２０】図２０は、ＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ２４−３５融合構築物のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【００３０】
【図２１】図２１は、ＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ３１−４２融合構築物のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【００３１】
【図２２】図２２は、ＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ７−２３融合構築物のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【００３２】
【図２３】図２３は、ベクター対照としての緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（レーン１）またはそれぞれ以下のＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ融合タンパク質：ＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ１−１３（レーン２）；ＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ７−１３（レーン３）ｐ；ＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ１６−３０（レーン４）；ＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ２４−３５（レーン５）、およびＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ３１−４２（レーン６）のいずれかを発現するように操作したレンチウイルスで感染させた２９３細胞からの細胞溶解物のウェスタンブロットを示す。
【００３３】
【図２４−１】図２４は、ヒト樹状細胞株ＫＧ−１において発現する組換えＨＬＡ−ＤＲＡ構築物の表面発現を示す。左は、図示のようにゲーティングしたＫＧ−１細胞のＦＤＣ／ＳＳＣ散乱プロットを示す。下パネルは、刺激をしないＫＧ−１細胞の抗ＨＬＡ−ＤＲＡ免疫染色を示す。右パネルは、ＬＰＳ刺激後のＫＧ−１細胞の抗ＨＬＡ−ＤＲＡ免疫染色を示す。対照細胞（赤）は、ＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ７−１３（青）を発現するレンチウイルスを感染させた細胞よりも少ないＨＬＡ−ＤＲＡ染色を示した。アイソタイプ対照染色は、すべてのプロットについて黒色で示す。
【図２４−２】図２４は、ヒト樹状細胞株ＫＧ−１において発現する組換えＨＬＡ−ＤＲＡ構築物の表面発現を示す。４つのプロットは、ＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ７−１３、ＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ１６−３０、ＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ２４−３５、およびＨＬＡ−ＤＲＡ／Ａβ３１−４２を含むレンチウイルスベクターを感染させたＫＧ−１細胞のＨＬＡ−ＤＲＡ免疫染色の増加が類似していることを示す。
【００３４】
【図２５−１】（Ａ）新鮮な血液試料から単離したｈＥＳＣ由来骨髄樹状細胞（ＤＣ）およびＴ細胞を示すＦＳＣ／ＳＳＣ散乱プロット。これらの細胞の混合物から検出。フローサイトメーターで分析する前に、Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、その後ＤＣと混合し、次いで混合物中のすべての細胞を蛍光標識抗ＣＤ４で染色した。この工程でのｆｓｃ／ｓｓｃは、ＤＣおよび非ＤＣを含む他の集団から潜在的なＴ細胞を分離することである。これらはゲーティングを行ったがＤＣであると証明しきれてはいない。蛍光標識したＣＤ４+細胞を、より小さなサブセットからゲーティングした。当該ＤＣ集団における検出事象が全て実際のＤＣによるものというわけではない。（Ｂ）（Ａ）に示すＣＤ４+Ｔ細胞集団のみをゲーティングしたＴ細胞のＦＳＣ／ＳＳＣ散乱プロット。（Ｃ）（Ｂ）に示すＣＤ４+Ｔ細胞集団についてｘ軸上にＣＦＳＥ蛍光、ｙ軸上に抗ＣＤ４をとった散乱プロット。分裂（すなわち、増殖）し、ＣＦＳＥが少ない、従ってプロットの左側に示されるＴ細胞を示す。実験開始時には、測定可能な増殖がなく、従って左側の細胞はなかった。（Ｄ）（Ｃ）に示す散乱プロットをＴ細胞およびＤＣを一緒に培養した混合物を除いて示す。対照条件（ＨＬＡ−ＤＲＡ（Ａｂ）構築物を発現しなかったＤＣとともに培養したＴ細胞）、または検査条件（ＨＬＡ−ＤＲＡ（Ａｂ）構築物を発現したＤＣとともに培養したＴ細胞）のいずれかで分析する１０日前。緑色で表される対照細胞集団は、プロットの左側（すなわち、分裂細胞を示す側のプロット）に示すようにＣＤ４+Ｔ細胞の集団全体の２．６％であった。赤色で表される試験細胞集団は、プロットの左側に示すようにＣＤ４+Ｔ細胞の集団全体の２．６％であった。３．８と２．６の間の差はΑβ特異的なＴ細胞集団を示す。
【図２５−２】（Ｅ）ＨＬＡ−ＤＲＡ構築物を発現するように操作したレンチウイルスを感染させたＣＤ４+Ｔ細胞集団について、ｘ軸上にＣＦＳＥ蛍光、ｙ軸上に抗ＣＤ４をとったＦＳＣ／ＳＳＣ散乱プロットを示す。ＨＬＡ−ＤＲＡ構築物は、それぞれ完全長Ａ、Ａ１（Ａβ１−１３）、Ｂ２（Ａβ７−１３）、Ｃ３（Ａβ１６−３０）、Ｄ４（Ａβ２４−３５）、またはＥ５（Ａβ１−４２）を有する。
【図２５−３】（Ｅ）ＨＬＡ−ＤＲＡ構築物を発現するように操作したレンチウイルスを感染させたＣＤ４+Ｔ細胞集団について、ｘ軸上にＣＦＳＥ蛍光、ｙ軸上に抗ＣＤ４をとったＦＳＣ／ＳＳＣ散乱プロットを示す。ＨＬＡ−ＤＲＡ構築物は、それぞれ完全長Ａ、Ａ１（Ａβ１−１３）、Ｂ２（Ａβ７−１３）、Ｃ３（Ａβ１６−３０）、Ｄ４（Ａβ２４−３５）、またはＥ５（Ａβ１−４２）を有する。
【００３５】
【図２６】図２６は、ＡｐｏＥ３／Ｅ３遺伝型を有し、認知症の兆候がない４７歳の男性の血液から単離したＣＤ４+Ｔ細胞の細胞増殖応答の棒グラフを示す。ＣＤ４+Ｔ細胞は、ＨＬＡ−ＤＲＡ構築物を発現するように操作したレンチウイルスを感染させたｈＥＳＣ由来ＤＣと共に共培養した。ＨＬＡ−ＤＲＡ構築物は、それぞれＨＬＡ−ＤＲＡのみ（対照）、Ａ１（Ａβ１−１３）、Ｂ２（Ａβ７−１３）、Ｃ３（Ａβ１６−３０）、Ｄ４（Ａβ２４−３５）、またはＥ５（Ａβ１−４２）を有する。棒は、５回以上細胞分裂をした細胞の割合、すなわち、持続的かつ特異的な増殖反応の指標を示す。
【００３６】
【図２７】図２７は、血液提供者が、ＡｐｏＥ３／Ｅ３遺伝型を有し，アルツハイマー病の兆候がない８８歳の男性である点を除き、図２６で示したのと同じタイプのデータを示す。
【００３７】
【図２８】図２８は、血液提供者が、ＡｐｏＥ４／Ｅ４遺伝型を有し、１４年間アルツハイマー病と診断されている８６歳の女性である点を除き、図２６で示したのと同じタイプのデータを示す。
【００３８】
【図２９】図２９は、血液提供者が、ＡｐｏＥ３／Ｅ４遺伝型を有し、母親が進行アルツハイマー病である５８歳の女性である点を除き、図２６で示したのと同じタイプのデータを示す。提供者は、図３０および図３１の提供者の姉妹である。
【００３９】
【図３０】図３０は、血液提供者が、図２９および図３１の提供者の姉妹である５６歳の女性で同様にＡｐｏＥ３／Ｅ４遺伝型を有している点を除き、図２６で示したのと同じタイプのデータを示す。
【００４０】
【図３１】図３１は、血液提供者が、図２９および図３０の提供者の姉妹である６１歳の女性で同様にＡｐｏＥ３／Ｅ４遺伝型を有している点を除き、図２６で示したのと同じタイプのデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本明細書に開示する本発明の方法および組成物は、種々のペプチド抗原に対するヒト対象の免疫応答の評価に関する。別の言い方をすると、本発明は、複数の対象個体間、または同じ被験体の異なる時点での、特定の抗原に対する免疫応答を比較するために標準化されたアプローチに関する。本発明は、ヒト白血球（ＨＬＡ）クラスＩＩのコンテクストにおいて抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示され得る任意のペプチド抗原に対する免疫応答の分析を包含する。また、本発明は、特に免疫応答におけるＣＤ４+Ｔ細胞の構成成分の評価に関する。
【００４２】
様々な実施形態において、本発明の方法は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を成熟したプロフェッショナルなＡＰＣに分化させる。例えば、本発明の方法は、ｈＥＳＣから骨髄系共通前駆細胞への分化を誘導し、未成熟樹状細胞に分化させることを可能にし、その後、成熟樹状細胞へさらに分化させる。様々な実施形態において、本発明は、Ｈ９  ｈＥＳＣを分化させるが、当業者は、当技術分野で公知の任意のヒト多能性幹細胞を選択して使用することもできる。例えば、胚性幹細胞を複数の胚性幹細胞の株から選択してもよいし、または初代胚組織から直接得てもよい。確立された胚性幹細胞株として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、およびＨ１４（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）；ｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．，Ａｔｈｅｎｓ，Ｇａ．）；ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、ＨＥＳ−６（ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）；ＨＳＦ−１、ＨＳＦ−６（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｔ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）；１３、１４、１６（Ｔｅｃｈｎｉｏｎ−Ｉｓｒａｅｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｉｆａ，Ｉｓｒａｅｌ）；ＵＣＳＦ−１およびＵＣＳＦ−２（Ｇｅｎｂａｃｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．８３（５）：１５１７−２９，２００５）；ＨＵＥＳ１〜１７株（Ｃｏｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＥＪＭ３５０（１３）：１３５３−５６，２００４）；およびＡＣＴ−１４株（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３６５（９４７１）：１６３６−４１，２００５）。
【００４３】
上述したように、本発明のｈＥＳＣ由来成熟樹状細胞は主にＨＬＡクラスＩＩ分子のコンテクストにおいて単一のペプチド抗原の断片を提示する。本発明のＡＰＣ上に提示されるペプチドは、そのペプチドを含む抗原に特異的なＣＤ４+Ｔ細胞の応答を評価する目的のために当業者によって選択される任意のペプチドであり得る。様々な実施形態では、ペプチドを含む抗原は、ワクチン組成物の成分である。例えば、種々の実施形態において、抗原性ペプチドは、インフルエンザＨＡのアミノ酸１２６−１３８（すなわち、ＮＨ2−ＨＮＴＮＧＶＴＡＡＣＳＨＥ−ＯＨ）を含み、これを使用してＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、ＰＬＣにより販売されるインフルエンザウイルスワクチンであるＦＬＵＬＡＶＡＬ（登録商標）を投与した対象のＣＤ４+Ｔ細胞の応答を本発明の方法により評価できる。
【００４４】
しかし、本発明の方法は、ＣＤ４+Ｔ細胞の応答を生じさせ得る任意のペプチドに対する免疫応答を評価するのに使用できる標準プラットフォームに関するため、当業者は、本発明の方法を使用して被験体における応答を惹起可能な任意のワクチンに対するＣＤ４+Ｔ細胞の応答を評価できる。従って、本発明に包含し得る当技術分野で公知のワクチンの例として、以下が挙げられる：炭疽菌に対するＡＶＡ（ＢｉｏＴｈｒａｘ）；水痘に対するＶＡＲ（Ｖａｒｉｖａｘ）およびＭＭＲＶ（ＰｒｏＱｕａｄ）；ジフテリアに対するＤＴａＰ（Ｄａｐｔａｃｅｌ，Ｉｎｆａｎｒｉｘ，Ｔｒｉｐｅｄｉａ）、Ｔｄ（Ｄｅｃａｖａｃａ，ｇｅｎｅｒｉｃ）、ＤＴ（−ｇｅｎｅｒｉｃ−）、Ｔｄａｐ（Ｂｏｏｓｔｒｉｘ，Ａｄａｃｅｌ）、ＤＴａＰ−ＩＰＶ（Ｋｉｎｒｉｘ）、ＤＴａＰ−ＨｅｐＢ−ＩＰＶ（Ｐｅｄｉａｒｉｘ）、ＤＴａＰ−ＩＰＶ／Ｈｉｂ（Ｐｅｎｔａｃｅｌ）、およびＤＴａＰ／Ｈｉｂ（ＴｒｉＨＩＢｉｔ）；Ａ型肝炎に対するＨｅｐＡ（Ｈａｖｒｉｘ，Ｖａｑｔａ）およびＨｅｐＡ−ＨｅｐＢ（Ｔｗｉｎｒｉｘ）；Ｂ型肝炎に対するＨｅｐＢ（Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ，Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ  ＨＢ）、Ｈｉｂ−ＨｅｐＢ（Ｃｏｍｖａｘ）、ＤＴａＰ−ＨｅｐＢ−ＩＰＶ（Ｐｅｄｉａｒｉｘ）、およびＨｅｐＡ−ＨｅｐＢ（Ｔｗｉｎｒｉｘ）；ｂ型インフルエンザ菌に対するＨｉｂ（ＡｃｔＨＩＢ，ＰｅｄｖａｘＨＩＢ，Ｈｉｂｅｒｉｘ）、Ｈｉｂ−ＨｅｐＢ（Ｃｏｍｖａｘ）、ＤＴａＰ／Ｈｉｂ（ＴｒｉＨＩＢｉｔ）、およびＤＴａＰ−ＩＰＶ／Ｈｉｂ（Ｐｅｎｔａｃｅｌ）；ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対するＨＰＶ４（Ｇａｒｄａｓｉｌ）およびＨＰＶ２（Ｃｅｒｖａｒｉｘ）；インフルエンザに対するＴＩＶ（Ａｆｌｕｒｉａ，Ａｇｒｉｆｌｕ，Ｆｌｕａｒｉｘ，Ｆｌｕｖｉｒｉｎ，Ｆｌｕｚｏｎｅ）およびＬＡＩＶ（ＦｌｕＭｉｓｔ）；日本脳炎（ＪＥ）に対するＪＥ（ＩｘｉａｒｏおよびＪＥ−Ｖａｘ）；麻疹に対するＭＭＲ（Ｍ−Ｍ−ＲＩＩ）およびＭＭＲＶ（ＰｒｏＱｕａｄ）；髄膜炎に対するＭＣＶ４（Ｍｅｎａｃｔｒａ）、ＭＰＳＶ４（Ｍｅｎｏｍｕｎｅ）、およびＭＯＤＣ（Ｍｅｎｖｅｏ）；おたふく風邪に対するＭＭＲ（Ｍ−Ｍ−ＲＩＩ）およびＭＭＲＶ（ＰｒｏＱｕａｄ）；百日咳に対するＤＴａＰ（Ｄａｐｔａｃｅｌ，Ｉｎｆａｎｒｉｘ，Ｔｒｉｐｅｄｉａ）、Ｔｄａｐ（Ａｄａｃｅｌ，Ｂｏｏｓｔｒｉｘ）、ＤＴａＰ−ＩＰＶ（Ｋｉｎｒｉｘ）、ＤＴａＰ−ＨｅｐＢ−ＩＰＶ（Ｐｅｄｉａｒｉｘ）、ＤＴａＰ−ＩＰＶ／Ｈｉｂ（Ｐｅｎｔａｃｅｌ）、およびＤＴａＰ／Ｈｉｂ（ＴｒｉＨＩＢｉｔ）；細菌肺炎に対するＰＣＶ７（Ｐｒｅｖｎａｒ）、ＰＣＶ１３（Ｐｒｅｖｎａｒ１３）、およびＰＰＳＶ２３（Ｐｎｅｕｍｏｖａｘ２３）；ポリオに対するＰｏｌｉｏ（Ｉｐｏｌ）、ＤＴａＰ−ＩＰＶ（Ｋｉｎｒｉｘ）、ＤＴａＰ−ＨｅｐＢ−ＩＰＶ（Ｐｅｄｉａｒｉｘ）、およびＤＴａＰ−ＩＰＶ／Ｈｉｂ（Ｐｅｎｔａｃｅｌ）；ロタウイルスに対するＲａｂｉｅｓ（Ｉｍｏｖａｘ  ＲａｂｉｅｓおよびＲａｂＡｖｅｒｔ）；ＲＶ１（Ｒｏｔａｒｉｘ）およびＲＶ５（ＲｏｔａＴｅｑ）；風疹に対するＭＭＲ（Ｍ−Ｍ−ＲＩＩ）およびＭＭＲＶ（ＰｒｏＱｕａｄ）；帯状疱疹に対するＺＯＳ（Ｚｏｓｔａｖａｘ）；サル痘および天然痘に対するＶａｃｃｉｎｉａ（ＡＣＡＭ２０００，Ｄｒｙｖａｘ）；破傷風に対するＤＴａＰ（Ｄａｐｔａｃｅｌ，Ｉｎｆａｎｒｉｘ，Ｔｒｉｐｅｄｉａ）、Ｔｄ（Ｄｅｃａｖａｃ，ｇｅｎｅｒｉｃ）、ＤＴ（−ｇｅｎｅｒｉｃ−）、ＴＴ（−ｇｅｎｅｒｉｃ−）、Ｔｄａｐ（Ｂｏｏｓｔｒｉｘ，Ａｄａｃｅｌ）、ＤＴａＰ−ＩＰＶ（Ｋｉｎｒｉｘ）、ＤＴａＰ−ＨｅｐＢ−ＩＰＶ（Ｐｅｄｉａｒｉｘ）、ＤＴａＰ−ＩＰＶ／Ｈｉｂ（Ｐｅｎｔａｃｅｌ）、およびＤＴａＰ／Ｈｉｂ（ＴｒｉＨＩＢｉｔ）；結核（ＴＢ）に対するＢＣＧ（ＴＩＣＥ  ＢＣＧ，Ｍｙｃｏｂａｘ）；腸チフスに対するＴｙｐｈｏｉｄ  Ｏｒａｌ（Ｖｉｖｏｔｉｆ）およびＴｙｐｈｏｉｄ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（Ｔｙｐｈｉｍ  Ｖｉ）；ならびに黄熱病に対するＹＦ（ＹＦ−Ｖａｘ）。
【００４５】
ワクチンに関連したペプチドに加え、本発明の方法はまた、特定の自己免疫疾患状態に関連する特定のペプチドに対するＣＤ４+Ｔ細胞の応答に基づいて種々の自己免疫疾患の治療の進行を診断し追跡する。本明細書で理解されるように、「自己免疫疾患」とは、個体自身の組織に起因しそれに対し攻撃する疾患または障害のことである。自己免疫疾患または障害の例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎）、カプラン症候群、フェルティ症候群、乾癬、皮膚炎、シェーグレン症候群、スティル病、多発性筋炎／皮膚筋炎、中毒性表皮壊死症、全身性強皮症および硬化症、炎症性腸疾患に関する応答、クローン病、潰瘍性大腸炎、呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、アレルギー状態、湿疹、喘息、Ｔ細胞の浸潤および慢性炎症反応に関連する状態、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎、白血球接着欠損症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、若年発症糖尿病、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、サイトカインおよびＴリンパ球が介在する急性および遅延型過敏症に関連する免疫応答、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、例えばウェゲナー肉芽腫症、無顆粒球症、（ＡＮＣＡを含む）血管炎、再生不良性貧血、ダイアモンドブラックファン貧血、免疫性溶血性貧血、例えば、自己免疫性溶血性貧血（ＭＢＡ）、悪性貧血、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球漏出を伴う疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害、多臓器損傷症候群、重症筋無力症、抗原抗体複合体媒介疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、ランバート・イートン症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、固形臓器移植拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、水疱性類天疱瘡、天然瘡、自己免疫性多腺性内分泌不全症、ライター病、スティッフマン症候群、巨細胞性動脈炎、免疫複合体腎炎、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性ニューロパチーまたはＩｇＭ介在性ニューロパチー、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ），自己免疫性血小板減少症、精巣および卵巣の自己免疫性疾患、例えば、自己免疫性精巣炎および卵巣炎、原発性甲状腺機能低下症、自己免疫性内分泌疾患、例えば、自  己免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、アジソン病、グレーブス病、多腺性自己免疫症候群（または多腺性内分泌障害症候群）、インスリン依存糖尿病（ＩＤＤＭ）とも呼ばれる糖尿病Ｉ型糖尿病、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、リンパ間質性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非移植）、ＮＳＩＰ、ギラン・バレー症候群、大血管血管炎（リウマチ性多発筋痛及び巨細胞（高安）動脈炎を含む）、中血管血管炎（川崎病および結節性多発動脈炎を含む）、強直性脊椎炎、ベルガー病（ＩｇＡ腎症）、急速進行性糸球体腎炎、原発性胆汁性肝硬変、セリアックスプルー（グルテン性腸症）、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、冠動脈疾患、等。
【００４６】
様々な実施形態において、本発明の組成物および方法は、アルツハイマー病のペプチドアミロイド−ベータ（Ａβ）に対するＣＤ４+Ｔ細胞の応答のレパートリーを評価するのに使用できる。簡単に述べると、Αβは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に由来しタンパク質分解処理により産生される４２個のアミノ酸を有するポリペプチドである。本明細書で理解されるように、Αβタンパク質には、アミノ酸置換による突然変異体およびアレル変異体も含まれる。様々な実施形態において、本発明の方法は、完全長Ａβの代替として、以下を含み得るペプチドを使用する：Ａβ１−１３、Ａβ７−１３、Ａβ１６−３０、Ａβ２４−３５、Ａβ３１−４２、およびＡβ７−２３。
【００４７】
様々な実施形態において、すべてのΑβペプチドに対する広範かつ強力な応答とは、ΑβおよびΑβのすべての断片に対する継続的な免疫応答のことを指す。当業者は、このような応答をΑβが蓄積する病理に対する継続的な応答の指標として解釈できる。Αβの蓄積は、アネルギーが始まるとロバストでなくなり、よって最終的なアルツハイマー病後期になるほどＣＤ４+応答がロバストでなくなる。つまり、Αβまたは特定のΑβ断片に対し比較的ロバストなＣＤ４+応答があれば、認知や行動の変化が認められなくとも、前アルツハイマー病であると考えられるだろう。
【００４８】
好ましくは特定の単一のペプチド断片をＡＰＣに提示させる任意の方法が、一般的に、本発明の方法に使用できる。例えば、様々な実施形態において、本発明の方法は、ＡＰＣのＨＬＡクラスＩＩ分子にペプチドまたはその断片を提示させるのに十分な量のペプチドを培養物内のＡＰＣに直接添加することによりＡＰＣを負荷（ｌｏａｄ）する。本発明の様々な他の方法では、ペプチド抗原は、ペプチドをコードする核酸が導入されたＡＰＣの表面上に提示される。例えば、ペプチドは、ウイルスまたはプラスミドベクター内にコードされてもよい。
【００４９】
本発明の様々な実施形態において、ＡＰＣによって提示されるペプチドは、ＨＬＡ−ＩＩタンパク質の少なくとも一部を含む融合タンパク質のペプチド成分として提示される。例えば、本発明の融合タンパク質は、ＨＬＡクラスＩＩα鎖のパラログであるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ−ＤＲＡから誘導される核酸およびアミノ酸配列を含み得る。様々な他の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Αβの断片を含むＨＬＡ−ＤＲＡ融合構築物を包含する。例えば、完全長Αβの代替として、当該融合タンパク質はＡβ１−１３、Ａβ７−１３、Ａβ１６−３０、Ａβ２４−３５、Ａβ３１−４２、およびＡβ７−２３を含んでもよい。
【００５０】
ＨＬＡ−ＤＲＡα鎖は、約３３〜３５ｋＤａであり、その遺伝子には５つのエクソンが含まれる。エクソン１はリーダーペプチドをコードし、エクソン２および３は２つの細胞外ドメインをコードし、エクソン４は膜貫通ドメインおよび細胞質尾部をコードする。ＨＬＡ−ＤＲＡは、ペプチド結合部分において多型を有さず、β鎖ＤＲＢ１、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、及びＤＲＢ５に対する唯一のα鎖として機能する。ＨＬＡ−ＤＲＡ配列は公衆に利用可能である。例えば、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は以下で見つけることができる：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＩ１８４７７．１（アミノ酸配列）、Ｍ６０３３４．１（ＤＮＡ配列）、ＮＰ＿０６１９８４．２（アミノ酸配列）、ＡＡＡ３６２７５．１（アミノ酸配列）、ＡＡＡ５９７８５．１（アミノ酸配列）、ＡＡＡ３６３０２．１（アミノ酸配列）、ＡＡＡＨ７１６５９．１、ＣＡＩ１８４７６．１（アミノ酸配列）、およびＧＩ３１２２（遺伝子配列）；ＥＭＢＬアクセッション番号ＡＬ９３５０３２．１３（ＤＮＡ配列）、ＣＡＧ３３２９４．１（アミノ酸配列）、ＣＡＱ０８８１１．１（ＤＮＡ配列）、およびＥＡＸ０３６２９．１（ＤＮＡ配列）。当業者は、ＨＬＡ−ＤＲＡ核酸およびタンパク質分子が、ＨＬＡ−ＤＲＡの生物学的活性を保持しつつ、１つまたは複数の置換、欠失、挿入、またはこれらの組み合わせをもたらす多型などとして、公衆に利用可能なものから多岐にわたることを理解するであろう。したがって、本発明の種々な実施形態において、本発明の融合タンパク質のＨＬＡ−ＤＲＡ成分のアミノ酸配列は、図２に示すＨＬＡ−ＤＲＡ配列と約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％相同であるか、あるいはそれらの断片であってもよい。
【００５１】
様々な実施形態において、本発明の融合タンパク質は、リンカーを含む。一般に、リンカーとは、ＨＬＡ−ＤＲＡと融合タンパク質の所望の融合ペプチド成分との間に位置する柔軟なペプチドリンカー要素のことである。リンカー要素は、好ましくは２５アミノ酸以下の長さを有する。特定の実施形態において、リンカー要素は、３〜３０個のアミノ酸長、特に３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２〜１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または３０個のアミノ酸長を有する。一実施形態では、リンカー要素の長さは、５〜２５個のアミノ酸、８〜２０個のアミノ酸、または１０〜２０個のアミノ酸である。より好ましくは、リンカーの長さが９〜１５個のアミノ酸である。一般に、本明細書中で使用されるリンカー要素は、任意の既知のアミノ酸または人工アミノ酸誘導体から構成され得る。特定の実施形態において、リンカー要素は、小さな親水性の非荷電アミノ酸から成る。一般に、本発明に係るリンカー要素は、Ｇ、Ｓ、Ａ、およびＴから選択されるアミノ酸から成ることがある。リンカー要素は、好ましくは、グリシン／セリンリンカー、すなわち、ポリグリシン等のアミノ酸が実質的にグリシンおよびセリンからなるペプチドリンカーである。本発明の特定の実施形態において、リンカー配列はＩＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである。
【００５２】
上述したように、本発明はまた、ペプチド抗原拘束性ＣＤ４+Ｔ細胞集団の拡大方法にも関する。上記のように様々な実施形態において、本発明の方法は、免疫応答、例えば、ワクチン、自己免疫疾患、およびΑβ沈着に関連する認知障害に対するＣＤ４+Ｔ細胞集団の抗原特異的な拡大に関する。
【００５３】
一般に、本発明の方法は、標準的な静脈切開法を用いて単離することができる全血からヒトＣＤ４+Ｔ細胞を得る。初期精製により、骨髄細胞およびＢ細胞の大部分を除去し、Ｔ細胞集団を濃縮する。Ｔ細胞を、その後カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で染色してから、ＨＬＡ−Αβ融合タンパク質を発現するＡＰＣのパネルと混合し、７〜１０日間共培養する。このインキュベーション期間の後、細胞混合物を、ＣＤ４特異的な蛍光抗体で染色し、蛍光活性化細胞スキャナまたはソーターといったフローサイトメーターに通す。ＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）蛍光を使用してＣＤ４+Ｔ細胞を同定し、ＣＦＳＥ強度を用いてそれらの細胞が試験初期からどのくらいの増殖したのかを決定する。
【００５４】
上述したように、本発明の方法は、ＡＰＣにおいてＨＬＡ−ＤＲＡ融合タンパク質を発現させる。したがって、本発明の方法および組成物は、ＡＰＣにおいて本発明の融合構築物を発現することができるＤＮＡまたはＲＮＡベクターを含む。一般に、ベクターは、プロモーター、そして発現されるべきヌクレオチド配列の下流にターミネーターを含む。本発明の様々な実施形態において、ベクターは、組換えウイルス用にコードされる。例えば、本発明の特定の実施形態において、ベクターは、ＦＵＷレンチウイルスベクターなどのレンチウイルスゲノム由来の配列を含む（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００２Ｆｅｂ１．２９５（５５５６）：８６８−７２．Ｅｐｕｂ２００２Ｊａｎ１０に記載）。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、直接免疫化プロトコルの一部として用いることができる。例えば、ウイルスベクター、リポソーム、または他の送達方法を用いて、リンパ節に直接ＨＬＡ−ＤＲＡ融合タンパク質構築物を送達できる。このアプローチにより、内因性ＡＰＣのＨＬＡクラスＩＩ複合体に問題のペプチドを迅速に提示させることができるであろう。したがって、本発明は、３〜７日間かかりうるプロセスであるＡＰＣによる処理およびリンパ節への移動を伴うアジュバント複合体としてペプチドを導入する従来のワクチン方法に代わる望ましい代替手段を提供する。問題のペプチドを結合したＨＬＡ−ＤＲＡ融合タンパク質の直接送達および迅速な発現は、エボラウイルスなど急速な殺傷性病原体に対する免疫応答を生じさせるのに特に役立つだろう。
【実施例】
【００５６】
実施例１．インフルエンザ抗原を負荷したｈＥＳＣ由来ＤＣを用いてＣＤ４+Ｔ細胞の応答を評価する方法
ｈＥＳＣから造血幹細胞（ＨＳＣ）への分化。
Ｈ９（ＮＳＣＢ  ｃｏｄｅ  ＷＡ０９、２３継代）ｈＥＳＣ株を、追加のｂＦＧＦ（４μｇ／ｍｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した５×サプリメント（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むｍＴｅＳＲ培地中で保持した。多能性Ｈ９  ｈＥＳＣのコロニー（図１Ａ）を、標準的な方法を用いてマトリゲル上で維持し、５継代全ての多能性についてＳＳＥＡ４免疫染色を用いて検査した。ＳＳＥＡ４免疫染色は、顕微鏡およびフローサイトメトリー（図１Ｂ）により評価した。コロニーを穏やかに３０〜６０個の細胞塊へ掻き取り、１５ｍｌチューブへ回収し、その後５分間３００×ｇで遠心分離し、ＨＳＣ分化培地（ＨＤＭ：α−ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１００μＭモノチオグリセロール）中に再懸濁した。
【００５７】
Ｈ９細胞を採取して分化させる前に、約７０％コンフルエントなＯＰ９マウス間質細胞（ＡＴＣＣ）のフラスコをすすぎ、ＨＤＭと共にプレインキュベートした。ＯＰ９細胞を、ゼラチン（Ｇ１３９３、Ｓｉｇｍａ）で覆ったＯＰ９増殖培地（ＯＰ９Ｍ：２０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）入りのα−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を含むＴ７５フラスコ内で培養した。ｈＥＳＣ細胞塊を含むＨＤＭをフラスコに直接加えた。４日目に、全てのＨＤＭを新鮮なＨＤＭに交換し、６〜８日目に、ＨＤＭ培地の半分を新鮮なＨＤＭに交換した。
【００５８】
ＨＤＭにおける共培養の２日後、ＨＳＣを含有するＨ９コロニー塊が造血分化し初め、ＯＰ９フィーダー層およびビーカーに付着していた（図１Ｃ）。共培養の４日後、コロニーの形態は、ｈＥＳＣコロニーに類似していたが、細胞サイズはより多様であった（図ＩＤ）。８日後、ＨＳＣを含むコロニーの形態は非常に多様になっており、多能性ｈＥＳＣコロニーの有するなめらかな縁および均一な外観とは明らかに異なっていた（図１Ｅ）。共培養の８日後にコロニーから単離した細胞の発現解析により、ＣＤ３４の免疫染色が示された（図１Ｆ）。
【００５９】
骨髄系共通前駆細胞の分化。
骨髄細胞はｐＨＥＭＡ（Ｓｉｇｍａ）でコーティングしたＴ２５フラスコ内で維持した。ＨＳＣから骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）への分化を誘導するために、細胞を３７℃で２０分間、コラゲナーゼＩＶ（１ｍｇ／ｍｌ）を含むノックアウトＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理してから、３７℃で１５分間０．０５％％トリプシン−ＥＤＴＡで処理した。トリプシン活性を１０％ＦＢＳでクエンチし、ペレット化し（３００×ｇ）、骨髄分化培地（ＭＤＭ）に再懸濁し、そしてｐＨＥＭＡをコーティングしたフラスコにプレーティングした。骨髄の拡大は１０〜１２日間行った。ＭＤＭは、α−ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、１００μΜのモノチオグリセロールを含んでいた。ＭＤＭは、骨髄細胞数を拡大するのにも使用した。再プレーティングから１日以内に、分化ＣＭＰ前駆体がカボチャ形の核を有する塊に再形成した（図１Ｇ、Ｈ）。３日後に、塊が破壊し始め単一の細胞が出現した（図１Ｉ）。ＨＳＣマーカーの表面発現では、ＣＭＰマーカーが増加した一方、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ（ＳＩ２）、ＣＤ４５（図１Ｊ〜Ｎ）、およびＣＤ４３は減少していた（図１Ｏ、図２）。
【００６０】
未成熟樹状細胞（ＩＤＣ）の産生。
骨髄の拡大後、骨髄ＤＣを産生するために、細胞を７０μｍストレーナーによって濾過し、２５％Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）で分画し死細胞および細胞凝集体を除去した（図５Ａ）。細胞を、５％ＦＢＳを含むＰＢＳでリンスし、８〜１０日間ＤＣ分化培地（ＤＤＭ）中に再プレーティングした。ＤＤＭは、Ｅｘ−ｃｙｔｅ（登録商標）成長サプリメント（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、および１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（Ｅｎｄｏｇｅｎ）を補充したＳｔｅｍ  Ｓｐａｎ（登録商標）ＳＦＥＭ培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。ｉＤＣ培養物の半量のＤＤＭを、４日ごとに新鮮なＤＤＭで交換した。ｉＤＣの数を拡大するために、それらを分注し同条件で維持した。ＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＬＰＳ（２５０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＤＤＭ中で３日間ＤＣの成熟を誘導した。ＤＣ分化条件において８日後には、ｉＤＣはしわのある形態（図３Ａ）を有し、ＤＣｓｉｇｎ、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の表面発現を示した（図３Ｉ〜Ｋ）。ｉＤＣの特徴的な挙動は、病原体および細胞断片のファゴサイトーシスである。これは、ヒトＩｇでコーティングした蛍光ラテックスビーズを用いてアッセイした（Ｄａｇｅｎａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。具体的には、２μｍの平均直径を有するカルボン酸で修飾した赤色蛍光ラテックスビーズ（Ｌ３０３０、Ｓｉｇｍａ）を３７℃で３０分間、ＰＢＳを含む５０％ヒトＡＢ血清中でオプソニン化した。そのインキュベーション後、これらのオプソニン化されたラテックスビーズをＤＣ培養物に添加し、３７℃３０分間穏やかに振盪しながらインキュベートした。同一の対照は４℃でインキュベートした。３０分後、２ｍｌの氷冷ＰＢＳを加えることによりファゴサイトーシスを停止してから、氷冷ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。ＤＣを１ｍｌの冷ＰＢＳに再懸濁し、等容量の４％パラホルムアルデヒドを添加することにより固定し、撮影まで４℃で暗所に保存した。ｉＤＣはこれらのビーズを取り込んだ（図３Ｂ）。フローサイトメトリーによりｉＤＣの大部分はビーズを取り込んでいたことが示された（図３Ｃ、Ｄ）。
【００６１】
樹状細胞の成熟。
未成熟ＤＣは、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）および２５０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）を補充したＤＤＭを用いて成熟を誘導する前にあらかじめ目的のペプチドを負荷した。成熟ＤＣは、分枝した樹状突起を有していた。これは、位相差顕微鏡（図３Ｅ、Ｆ）、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色による光学顕微鏡（図３Ｇ）、およびＤＩＣ顕微鏡（図３Ｈ）で観察された。Ｈ＆Ｅ染色は、サイトスピンによりガラススライド上に広げた細胞を固定して（２％パラホルムアルデヒド）行った。ｉＤＣおよび成熟したＤＣのスライドをＨ＆Ｅ溶液で覆い、１５分間インキュベートし、その後酸およびブルーイング溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処理した。スライドを水ですすぎ、一連のアルコール（５０％、７０％、９５％、１００％エタノール）に浸し、カバースリップをＰｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ）でマウントした。Ｈ＆Ｅ染色の画像は、Ｎｉｋｏｎ（登録商標）顕微鏡に搭載したカラーＣＣＤカメラで撮影した。
【００６２】
フローサイトメトリーによりｉＤＣおよび成熟ＤＣの両方がＤＣｓｉｇｎを発現していたことが確認された（図３Ｉ）。より具体的には、Ｐｅｒｃｏｌｌ分離（図５Ａ）を用いて精製したｉＤＣの培養物は、ＤＣｓｉｇｎ（図５Ｂ、Ｃ）またはＣＤ１４（図５Ｄ）を高レベルで発現した集団を含有していた。１つの集団はＤＣｓｉｇｎhi／ＣＤ１４loであり、もう１つの集団はＤＣｓｉｇｎlo／ＣＤ１４hiであった（図５Ｅ）。これらの集団は、それぞれ典型的に約１：１．５の割合であった。比例的に均衡をとって検査するため、ｉＤＣを、抗ＣＤ１４または抗ＤＣｓｉｇｎ磁気ビーズを用いて精製した。簡単にいうと、ＤＣを、７０μｍストレーナーで濾過して凝集体を除去し、骨髄樹状細胞キットで精製し、ＣＤ１４を発現する細胞を分離してからＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で精製をした。単離した細胞は、ＤＤＭ中で４週間培養した。ＤＣｓｉｇｎhi細胞を濃縮して単離するため、我々は、ヒトＤＣｓｉｇｎキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して細胞を精製し、ＤＤＭ中でさらに４週間拡大させた。
【００６３】
成熟ＤＣを、初代Ｔ細胞と混合したところ、培養物は、３日〜５日以内に、「活性化島（Ｉｓｌａｎｄｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、ＩＯＡ）」と呼ばれる細胞凝集体へと成長した（図５Ｆ〜Ｈ）。ＩＯＡは、３７℃で２０分間、Ｄｉｌ（２μΜ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する予め温めた無血清培地中でインキュベートすることによりＤＣを第１蛍光標識して画像化し、そして単離Ｔ細胞を同様にＤｉＯ（１μΜ）で標識した。インキュベーション後、１０倍容量のＴ細胞培地を添加し、細胞を３００×ｇで５分間ペレット化した。次いで、細胞を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２回洗浄した。蛍光標識したＤＣ（赤）およびＴ細胞（緑）を混合し、ｐＨＥＭＡをコーティングしたフラスコ中で一晩（１６時間）培養した後、等容量の４％パラホルムアルデヒドを添加することにより固定し、３０分間放置した。固定液に直接添加することにより、核をＤＡＰＩで標識した（２０μΜ最終濃度）。遠心分離および再懸濁はＩＯＡを破壊する恐れがあるので、細胞を洗浄しなかった。ＩＯＡは顕微鏡上で採取し、カバーガラス底のチャンバー中に載せて撮影した。ＩＯＡの画像は、Ｎｉｋｏｎ（登録商標）Ｃ１共焦点顕微鏡で撮影した。
【００６４】
抗ＤＣｓｉｇｎ磁気ビーズを用いたｉＤＣの精製によりＤＣｓｉｇｎhi／ＣＤ１４lo集団が濃縮され、ＤＣｓｉｇｎlo／ＣＤ１４hi集団のほとんどが除去された（図５Ｉ）が、ＩＯＡの形成は阻害された（図５Ｊ）。補完的な研究では、抗ＣＤ１４磁気ビーズを用いたＤＣｓｉｇｎlo／ＣＤ１４hi細胞の濃縮により、ＤＣｓｉｇｎhi／ＣＤ１４lo集団が減少し（図５Ｋ）、ＩＯＡの形成も阻害された（図５Ｌ）。
【００６５】
フローサイトメトリーによりｉＤＣおよび成熟ＤＣの両方がＣＤ８０（図３Ｊ）、ＣＤ８６（図３Ｋ）、およびＣＤ１１ｃ（図３）を発現していたことも確認された。ＨＬＡクラスＩＩ複合体は、ｉＤＣのエンドソーム内に隔絶されており、ＤＣが成熟するにつれて表面に現れる（図３Ｌ）。
【００６６】
ｈＥＳＣ由来ＤＣがＴ細胞の増殖を刺激できるか否かを決定するために、ヒトＴ細胞を全血から単離し（図６Ａ）、ＣＦＳＥで標識し、そして抗原を負荷した成熟ＤＣと共に７〜１０日間共培養した。その後、ＣＤ４+Ｔ細胞を、抗ＣＤ４で免疫染色し、増殖をＣＤ４+集団のＣＦＳＥ蛍光により評価した（図６Ｂ、Ｃ）。ＤＣおよびＩＬ−２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共にインキュベートしたＴ細胞（図６Ｄ）を陽性対照として使用して、一連の細胞分裂のＣＦＳＥ蛍光を決定した（図６Ｅ、Ｆ）。ＩＯＡを調べるために、我々は、成熟ＤＣと混合する前に、親油性ＤｉｌでＴ細胞を蛍光標識した。翌日、ＩＯＡは、より大きなＤＣ（図６Ｇ〜Ｉ）をとり囲むＴ細胞で見られた。成熟ＤＣおよびＩＬ−２と混合したＴ細胞は、７世代（図６Ｊ）まで増殖するが、抗ＤＣｓｉｇｎ（図６Ｋ）または抗ＣＤ１４（図６Ｌ）磁気ビーズを用いて精製したＤＣでは５世代までしか増殖しなかった。
【００６７】
ｈＥＳＣ由来ＤＣは、インフルエンザＨＡペプチド特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖を刺激する。
Ｔ細胞は、市販のインフルエンザワクチン（ＦＬＵＬＡＶＡＬ（登録商標），ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅにより提供）を筋肉内注射による接種前および接種から１週間後のヒト被験体から採取した２０ｍＬの全血試料から回収した。全血は、ＥＤＴＡを含有する血液チューブ（＃３６６６４３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて被験者から採取した。滅菌条件下で血液試料をＰＢＳで１：１に希釈し、４０ｍＬの希釈試料を３０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）の上に重層し、３０分間４００×ｇで遠心した。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）層を回収し（図６Ａ）、ＰＢＳで希釈し（１：７）、１０分間３００×ｇで遠心分離した。ＰＢＳ中でペレットを再懸濁することによってさらに２回細胞をリンスした。生細胞をトリパンブルー排除により計数した。ナイロンウールカラムを用いて接着細胞を除去してＴ細胞を濃縮した。簡単にいうと、ナイロンウールカラムをＴ細胞培地（１０％ＦＢＳを含有する１６４０ＰＭＩ）で洗浄し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、１ｍｌのＰＢＬ当たり１０7個の細胞をあらかじめ温めたカラムに加え、３７℃で１時間インキュベートし、その後カラムのストップコックを開いて、非接着細胞を収集した。カラムは、５ｍｌのＴ細胞培地で２回洗浄し、流出物を全部回収した。Ｔ細胞を濃縮した画分を３７℃の水浴で８分間、ＣＦＳＥ溶液（ＰＢＳ中４μΜ）と共にインキュベートした。インキュベーション後、溶液を１０倍量のＴ細胞培地で希釈し、遠心分離によりペレット化し（３００×ｇで１０分間）、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで二回洗浄した。ＣＦＳＥ標識細胞を再懸濁および計数し、画分を使用してフローサイトメトリー（Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりＣＦＳＥ蛍光を評価した。フローサイトメトリーの前に、細胞をＡｌｅｘａ（登録商標）６４７結合抗ＣＤ４抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で免疫染色し、ＣＤ４+集団におけるＣＦＳＥ蛍光を分析した。さらに、ＦＣＳ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ４フローサイトメトリーソフトウェア（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてフローサイトメトリーデータおよびヒストグラムを解析した。
【００６８】
ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞は、前もってインフルエンザＨＡ免疫原性ペプチド（アミノ酸１２６−１３８、Ｈ−ＨＮＴＮＧＶＴＡＡＣＳＨＥ−ＯＨ，Ａｎａｓｐｅｃ）を負荷した成熟ＤＣと共に共培養した（Ｌｅ  Ｎｏｕｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＤＣのペプチド負荷には、水中に凍結乾燥インフルエンザＨＡペプチド再懸濁すること、および１０分の１容量の１０×ＰＢＳを用いてｐＨを中和することが含まれていた。インフルエンザペプチドを用い、加湿５％ＣＯ2インキュベーター内で４日間、培養培地１ｍＬ当たり１０マイクログラムの最終濃度で未成熟ＤＣを負荷した。その後、未成熟ＤＣをＴＮＦ−αおよびＬＰＳで成熟させた。
【００６９】
ＣＤ４+Ｔ細胞増殖の解析により、ワクチン前試料の対照ＤＣに対する応答は低いが（図７Ａ）、ワクチン後試料はＣＤ４+Ｔ細胞増殖が顕著に増加したことが示された（図７Ｂ、Ｃ）。これは、ワクチンにおけるアジュバントの非特異的な効果によるものである可能性が高い（Ｆｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｔｅｔｓｕｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｃａｐｒｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。インフルエンザペプチドであらかじめ負荷した成熟ＤＣは、ワクチン前ＣＤ４+Ｔ細胞に対しほとんど刺激効果がなかった（図７Ａ）が、ワクチン後Ｔ細胞は、増殖が増加する応答をし、この増加は対照ＤＣの応答をかなり超えていた（図７Ｂ〜Ｅ）。ワクチン後アッセイにおける対照ＤＣおよびインフルエンザＤＣとの間の唯一の違いは、インフルエンザペプチドにより前負荷をしたか否かであるので、この増加はインフルエンザ特異的ＣＤ４+Ｔ細胞によるものであることが示唆される。
【００７０】
簡単に説明すると、ヒト被験者が関与するすべての手順は、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｏｍｏｎａ，ＣＡ），Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｃｏｌｔｏｎ，ＣＡ）、およびＣａｓａ  Ｃｏｌｉｎａ（Ｐｏｍｏｎａ，ＣＡ）から承認された治験審査委員会のプロトコルの下で行われた。インフォームドコンセントフォームは、全被験者および／または法的保護者に説明し彼らの署名を受けた。
【００７１】
実施例２．アルツハイマー病患者のＡβ特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の応答の分析
ｈＥＳＣ由来ＤＣが慢性状態においてＣＤ４+Ｔ細胞の応答を検出できるかどうかを評価するために、我々は、アルツハイマー病（ＡＤ）と推定診断された６人の被験者および３人の同年齢の対照を採用した。実施例１に記載したのと同じ方法に従って、全血を採取し、処理し、そしてＴ細胞を単離した。ＣＤ４+Ｔ細胞増殖を、インフルエンザＨＡペプチドを負荷したＤＣについて前述したのと同じ方法で、１０ｍｇ／ｍｌのＡβ１−４２ペプチド（ＢｉｏＭｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をあらかじめ負荷した成熟ＤＣに対する応答について評価した。
【００７２】
このペプチドの不溶性沈着物は、脳内の老人斑に蓄積するアルツハイマー病の決定的な病理特徴である（Ｂｒａａｋ  ａｎｄ  Ｂｒａａｋ，１９９７）。Αβ特異的ＣＤ４+Ｔ細胞は、疾患マウスモデルのアルツハイマー病の病理および挙動を軽減する（Ｅｔｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。Αβ１−４２によるワクチン接種が、アルツハイマー病の治療法として試みられ有望であったものの、この試みは、被験者の何人か（６％）の脳髄膜に炎症が生じたので中止した（Ｏｒｇｏｇｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。未だ依然として不明なのは、Ａβ特異的なＴ細胞の応答はＡＤの病因が発生している間に起こるのか否か、そしてＡβ特異的なＴ細胞の応答は、早期には有益な効果をもたらすものの病気が進むにつれて過剰になってしまわないかということである（Ｅｔｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｅｔｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｂｕｈｌｅｒ，２００３；Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。Ｔ細胞を、実施例１で記載したように調製し、Αβ１−４２であらかじめ負荷した成熟ＤＣと共培養した。６人のＡＤ被験者のうち５人が対照ＤＣよりΑβ提示ＤＣ応答性のＣＤ４+Ｔ細胞増殖が３倍超増加し、一方対照被験者は対照ＤＣの２倍超の応答を示した（図７Ｆ）。ＡＤ被験者の１人（ＡＤ４）では、Αβを負荷したＤＣに対する増殖応答がなかったが、これはＡＤの確定診断が不正確であったからという可能性があり、死後脳の病理で診断したからだという可能性がある（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ，１９０７；Ｆｉｓｃｈｅｒ，１９０７）。
【００７３】
実施例３．ＣＤ４+Ｔ細胞の応答を評価するために、ＨＬＡ−ＤＲＡ−Αβ融合タンパク質を発現するように操作されたレンチウイルス構築物を形質導入したｈＥＳＣ由来ＤＣの使用方法
３６人のヒト被験者に本発明の組成物および方法を使用して、アルツハイマー病のペプチドであるアミロイド−β（Ａβ）に応答するＣＤ４+Ｔ細胞のレパートリーを評価した。ＣＤ４+Ｔ細胞は、標準的な静脈切開法を用いて得た全血から得られた。最初のナイロンウールに基づく精製方法により、大部分の骨髄細胞およびＢ細胞を除去してＴ細胞集団を濃縮した。その後Ｔ細胞を、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で染色してから、ＨＬＡ−ＤＲＡ−Αβ融合タンパク質を発現するＡＰＣのパネルと混合し、７〜１０日間培養した。融合タンパク質のパネルには、完全長Ａβ：Ａβ１−１３；Ａβ７−１３；Ａβ１６−３０；Ａβ２４−３５；Ａβ３１−４２；およびＡβ７−２３が含まれていた。インキュベーション期間後、細胞混合物をＣＤ４特異的な蛍光抗体で染色し、フローサイトメーターにかけた。ＣＤ４特異的な蛍光を使用してＣＤ４+Ｔ細胞を同定し、ＣＦＳＥ強度を使用して、Ｔ細胞を初めてＣＦＳＥ染色してからＣＤ４+Ｔ細胞がどのくらい増殖するのかを決定した。Ｔ細胞は主にＣＦＳＥで染色されるからである。以下の実施例は、本発明の様々な工程を例示するものである。
【００７４】
ＨＬＡ−ＤＲＡ／アミロイドβ融合構築物。
ヒトＨＬＡクラスＩＩα鎖（ＨＬＡ−ＤＲＡ，ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ  ｅｎｔｒｙより提供）をクローニングした。クローニングは、１ｍＬの全血由来のヒト血液末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から標準的な方法を用いてＲＮＡを単離し、その後、標準的な逆転写法を用いてＨＬＡ−ＤＲＡ  ｃＤＮＡ鋳型を作成して行った。その後、ＨＬＡ−ＤＲＡ  ｃＤＮＡ鋳型を加えてＨＬＡ−ＤＲＡヌクレオチド配列を標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した（プライマーは、ＨＬＡ−ＤＲＡＦ（フォワード）：５’−ＴＴＡＴＴＣＴＴＧＴＣＴＧＴＴＣＴＧＣＣＴＣ；ＨＬＡ−ＤＲＡＲ（リバース）５’−ＣＴＴＣＴＣＴＣＴＡＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣであり、これらは本発明者であるＤｏｕｇ  Ｅｔｈｅｌｌが設計した）。プルーフリーディング用のＤＮＡポリメラーゼ酵素、「Ｐｈｕｓｉｏｎ」（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）も用いた。ＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離し、正しいサイズ（約２ｋｂ）の単一のバンドをゲルから単離してから製造元の説明書に従ってｐＣＲ（登録商標）８／ＧＷ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にライゲーションした。正確な配列を有し突然変異をしていないＨＬＡ−ＤＲＡクローンを含むｐＣＲ（登録商標）８ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡプラスミドを選択した。部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）によりＨＬＡ−ＤＲＡ配列の５’末端にポリグリシン／セリンリンカーをコードするヌクレオチド配列を導入した。ＳＤＭによるクローンに標準的なＤＮＡ配列決定を用いて、正しい配列を有するクローンを同定した。図９は、得られたｐＣＲ（登録商標）８／ＧＷ  ＴＯＰＯ（登録商標）−ＨＬＡ−ＤＲＡ＋リンカープラスミドのプラスミドマップを示す。このプラスミドを用いてＳＤＭにより各々のアミロイドβ（Ａβ）融合構築物を生成し、これらの実験で使用した。具体的には、以下のＡβ断片を含むＡβ＋リンカー＋ＨＬＡ−ＤＲＡ融合構築物を作成した：Ａβ１−１３（図１１）；Ａβ７−１３（図１２）；Ａβ１６−３０（図１３）；Ａβ２４−３５（図１４）；Ａβ３１−４２（図１５）；およびＡβ７−２３（図１６）。
【００７５】
上記のＡβ＋リンカー＋ＨＬＡ−ＤＲＡ融合構築物のそれぞれを、各ｐＣＲ（登録商標）８／ＧＷ  ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターからＦＵＷレンチウイルスベクターへサブクローニングした。サブクローニングは、標準的な分子生物学的クローニングの手法を用いてＦＵＷベクターのマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩ部位で行った。各Αβ＋リンカー＋ＨＬＡ−ＤＲＡ融合制限断片をゲル精製してからＦＵＷベクターに挿入した。Αβ＋リンカー＋ＨＬＡ−ＤＲＡ挿入の向きは、制限消化によって確認した。具体的には、ヌクレアーゼＸｂａＩおよびＰｓｔＩを用いて、挿入物の向きを確認した。
【００７６】
Αβ＋リンカー＋ＨＬＡ−ＤＲＡ融合タンパク質のタンパク質発現は、ＦＵＷプラスミド上に存在するユビキチンプロモーターによって開始した。ウェスタンブロット分析により、ＦＵＷ構築物を２９３細胞に導入するとΑβ＋リンカー＋ＨＬＡ−ＤＲＡの融合タンパク質を発現したことが示された。図１５を参照。細胞溶解物のウエスタンブロット分析はブロットをプローブするためにＨＬＡ−ＤＲＡ特異的抗体（Ａｂｎｏｖａカタログ番号ＭＡＢ７１３４、クローンＬ２４３）を用いて行った。
【００７７】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来樹状細胞。
ｈＥＳＣのＨ９株（ＷｉＣｅｌｌ／国立幹細胞銀行）の凍結バイアルを、凍結ペレットが残りわずかになるまで連続的にクライオバイアルを穏やかに振とうすることにより、３７℃の水浴中で素早く解凍した。クライオバイアルを水浴から取り出し、イソプロピルアルコールで拭いた。１ｍｌピペットチップを使用して、クリオバイアルの内容物を１５ｍｌコニカルチューブに移した。予め温めておいた９ｍＬの幹細胞培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａより得た完全ｍＴｅＳＲ）をチューブに滴下し、培地を添加しながら穏やかに混合した。次いで、細胞を室温（２５℃）で５分間、３００×ｇで遠心分離した。培地は、細胞ペレットを無傷のまま残し吸引した。細胞を凝集体として維持するよう注意しながら１ｍｌピペットチップを用いて、細胞ペレットを穏やかに再懸濁した。塊が均一に分布していることを確認して、１ｍｌの細胞凝集体をマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、製造元の説明書に従って調整した）でコーティングしたＴ２５フラスコに移した。次いで、細胞凝集体が均等に培地内に分配されるまで、フラスコを素早く前後左右に動かした。細胞を３７℃で５％ＣＯ2の加湿インキュベーター内で培養した。ｈＥＳＣ培養物は、１日おきにＴ２５フラスコあたり新鮮なｍＴｅＳＲ培地で１００％交換した（４ｍｌ）。解凍から約５〜７日後に、ｈＥＳＣ培養物をチェックして継代の準備ができたｈＥＳＣコロニーがあるか否か（すなわち、緻密な中心となめらかな縁があるか）を確認した。
【００７８】
未分化ｈＥＳＣの継代。
前述のような継代の準備ができたｈＥＳＣのコロニーを顕微鏡で検査し、未分化コロニーの場所を同定した。未分化コロニーの場所は、ピペットチップでマトリゲル表面を掻き取ることによって除去した。この段階で各フラスコの表面積の２０％以下を掻き取った。掻き取った細胞を、４ｍＬのｍＴｅＳＲ培地を含有しマトリゲルでコーティングしたＴ２５フラスコに移した。未分化細胞を新しいＴ２５フラスコへ移した後に存在する比較的大きなコロニーは、１ｍＬのピペットチップでコロニーを上下に穏やかにピペッティングすることで壊した。Ｔ２５フラスコを揺動することにより未分化細胞を穏やかに混合した後、フラスコをインキュベーターに入れた。コロニーの粗い縁が欠如していることにより同定した未分化ｈＥＳＣコロニーは、１日おきに４ｍＬのｍＴｅＳＲ培地を培養物に供給することによって維持した。未分化のｈＥＳＣは、継代から５〜６日後に実験に使用した。
【００７９】
ＯＰ９細胞の培養。
ＯＰ９骨髄間質細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−２７４９）を使用して、ｈＥＳＣの造血幹細胞（ＨＳＣ）系統への分化を刺激したが、この手順において代わりに他の骨髄間質細胞を用いてもよい。ＯＰ９細胞をＯＰ９培地、つまり２０％ＦＢＳ（熱による不活化をしない）およびＬ−グルタミンで補充した１×α−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地中で維持した。ＯＰ９培養物は、ＡＴＣＣプロトコルに記載のように３７℃で５％ＣＯ2の加湿インキュベーター内で、Ｔ７５フラスコ中に維持した。簡単に言うと、ＯＰ９培養物を２日ごとに給餌し、４日間毎日継代した。ＯＰ９培養物を継代するために、培養培地をフラスコから吸引し、ＯＰ９細胞単層を８ｍＬのＰＢＳで洗浄した。フラスコ表面からＯＰ９細胞を分離するために、ＴＲＹＰＬＥ  ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）溶液（４ｍＬ）をフラスコに加え、フラスコを３７℃のインキュベーターに５分間入れた。ＴＲＹＰＬＥ処理は、０．５％ＢＳＡを含有する４ｍＬのＰＢＳを添加することによって停止させた。処理した細胞および溶液を１５ｍｌチューブに移し、チューブを３００×ｇで５分間遠心分離した。遠心分離後、上清を吸引し、細胞を１ｍＬのＯＰ９培地中に再懸濁した。細胞溶液を３０ｍＬのＯＰ９培地に再懸濁し、１０ｍＬの再懸濁細胞を３つの新しいＴ７５フラスコにそれぞれ加えた。上記のように、ＯＰ９細胞を再度分注すると、約４日後には８５％コンフルエンスまで増殖した。
【００８０】
ＯＰ９間質細胞を用いた共培養によるｈＥＳＣの造血細胞への分化。
ｈＥＳＣが分化するにはＯＰ９細胞はＴ７５フラスコ内で育ちすぎていた（すなわち、分注から４〜５日後）。培養培地を吸引し、１０ｍＬのｈＥＳＣ−ＨＳＣ分化培地（１０％ＦＢＳ（熱活性していない）および１００μＭのモノチオグリセロール（ＭＴＧ，Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｍ６１４５）を補充した１×α−ＭＥＭ）をフラスコに添加し、培養物を２０分間インキュベートした。ＯＰ９細胞をｈＥＳＣ−ＨＳＣ分化培地でインキュベートしながら、ｍＴｅＳＲ培地をｈＥＳＣコロニーのＴ２５フラスコ（分注から５〜６日後）から除去し、ｈＥＳＣ培養物を５ｍＬのＰＢＳでリンスした。細胞は、５％ＦＢＳを補充した３ｍＬのＰＢＳでカバーし、その後ｈＥＳＣコロニーをＴ２５フラスコの表面から剥離し、細胞スクレーパー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎカタログ番号３５３０８５）を用いて破壊した。剥離したｈＥＳＣコロニーをピペットで１５ｍＬのコニカルチューブに移した。その後フラスコを別の３ｍＬのＰＢＳ／５％ＦＢＳでリンスし、これを掻き取ることによってコロニーを含む同じ１５ｍＬのチューブに加えた。破壊されたｈＥＳＣコロニーを含む１５ｍＬチューブを、３００×ｇで５分間遠心分離した。上清を吸引し、ペレットを１ｍＬのピペットで穏やかに粉砕しながらフラスコをタッピングすることによって１ｍＬのｈＥＳＣ分化培地に再懸濁した。このとき細胞塊を壊さないように注意した。細胞懸濁液の体積は１．５ｍＬ〜２ｍＬであり、典型的には約１０6個の細胞／ｍｌを含んでいた。さらに９ｍＬのｈＥＳＣ−ＨＳＣの分化培地を穏やかにｈＥＳＣ細胞懸濁液に添加した。このとき、ｈＥＳＣ細胞塊を無傷で維持するよう注意した。その後ｈＥＳＣを含有するｈＥＳＣ−ＨＳＣ培地１０ｍＬを均等にＯＰ９フラスコに分注し、上記のように、１０ｍＬのｈＥＳＣ−ＨＳＣ分化培地とともにインキュベートした。次いで、フラスコを３７℃で５％ＣＯ2の加湿インキュベーター内に入れた。インキュベーションの１日後、すべての培地を吸引して取り除いた。２０ｍＬの新鮮なｈＥＳＣ−ＨＳＣ分化培地をフラスコに加え、フラスコをインキュベーターに戻した。合わせたｈＥＳＣ／ＯＰ９培養物に、それぞれ培地（１０ｍｌ）の５０％を新鮮なｈＥＳＣ−ＨＳＣ分化培地で置換することによって最初のプレーティングから４〜６日間供給した。４日目から、共培養物を顕微鏡下で検査しｈＥＳＣコロニーの分化を観察した。ＨＳＣ分化が良いものは、未分化ｈＥＳＣコロニーと対比して形態が異なるコロニーによって示される。培養物は、脂肪生成（大きな液胞を含有する）ＯＰ９細胞を含んでいなかった。ＨＳＣコロニーは、最初のプレーティングから７〜８日後に採取した。
【００８１】
ＧＭ−ＣＳＦのバルク培養における骨髄前駆細胞の拡大。
ｐＨＥＭＡによるプラスチック表面のコーティング。
５０ｍＬチューブ内で、１０ｍＭのＮａＯＨを含む１０ｍＬの９５％エタノールへ４ｇのｐＨＥＭＡを添加して、これを一晩３７℃のインキュベーター内で回転させて、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）／ｐＨＥＭＡ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ３９３２）コーティング溶液を調製した。２ｍＬのｐＨＥＭＡコーティング溶液を使用し、底面全体が覆われるまでフラスコを傾斜回転させＴ２５フラスコをコーティングした。フラスコを横にして、過剰のｐＨＥＭＡコーティング溶液を角に排出し吸引して除去した。キャップを外してフラスコを直ちに水平位置に置き、組織培養フード（ＵＶなし）内で一晩乾燥させた。次の日に蓋をフラスコの上に載せて使用時まで室温で保存した。８日目のｈＥＳＣ／ＯＰ９共培養物の単一細胞懸濁液を、以下のようなコラゲナーゼ−トリプシン溶液を用いて連続的な酵素処理をすることによって調製した。まず、ｈＥＳＣ／ＯＰ９共培養の培地を吸引し、１０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。その後Ｔ７５フラスコあたり５ｍｌのコラゲナーゼ溶液（無菌濾過されたＩＶ型コラゲナーゼ（ＬＭＧ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１ｍｇ／ｍｌ），Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｎｏ．１７１０４−０１９）を加え、フラスコを３７℃で２０分間インキュベートした。コラゲナーゼ溶液をフラスコから除去し、５０ｍｌのコニカルチューブに移した。５ｍｌのトリプシンＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシンを含む０．５ｍＭのＥＤＴＡ溶液、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃２５３００−０５４）を、同じｈＥＳＣ／ＯＰ９共培養フラスコに加え、フラスコを３７℃で２０分間インキュベートした。５ｍｌのＰＢＳ−５％ＦＢＳを、トリプシンＥＤＴＡ溶液を含むフラスコに添加し、剥離した細胞を、１０ｍｌの血清学的ピペットでピペッティングすることにより再懸濁した。次いで、細胞を、回収したコラゲナーゼ溶液を含有する同じ５０ｍｌコレクションチューブに移し、チューブを密封してから反転させることにより細胞を混合した。同じチューブ内で細胞を４００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去し、細胞をＰＢＳ−５％ＦＢＳで洗浄し、４００×ｇで１０分間再び遠心分離した。この洗浄工程をさらに２回繰り返し、最後の洗浄後に上清を除去した。細胞を、１０ｍｌの骨髄細胞拡大培地（ＭＣＥＭ）に再懸濁した。ＭＣＥＭには、１０％非加熱不活化ｈｙｃｌｏｎｅ  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１×ＭＴＧ（１００μＭ）、および１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを補充したα−ＭＥＭが含まれる（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２１５−ＧＭ）。ＧＭ−ＣＳＦは、使用直前に添加した。ＭＣＥＭで細胞を再懸濁した後、細胞懸濁液を５０ｍｌチューブに取り付けた７０μΜナイロンフィルタに通して濾過した。濾過工程の後、総細胞数を血球計およびトリパンブルーを用いて計算した。細胞は、最終的に２〜３×１０6個の細胞／ｍｌの濃度で懸濁した。ｈＥＳＣ由来骨髄系共通前駆細胞を含む懸濁細胞を、ｐＨＥＭＡコーティングされたＴ２５フラスコに分注し（５ｍｌ／Ｔ２５フラスコ）、３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。プレーティングから４、８および１２日目に、各フラスコ内の培地の５０％を新鮮ＭＣＥＭに置換することによ��て、培養物に新たなＭＣＥＭを供給した。各供給後、２．５ｍＬの培地を除去し、３００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を完全に除去し、細胞ペレットを新鮮なＭＣＥＭに再懸濁し、フラスコに戻した。共培養を確立してから１１または１２日目に、細胞を採取した。
【００８２】
骨髄前駆細胞からＤＣへの分化。
上記の手順で説明した骨髄前駆細胞をＴ２５フラスコから直接回収し、７０μｍナイロンの篩で濾過し、１５ｍｌコニカルチューブに移し、４００×ｇで１０分間遠心分離した。ピペットを用いて上清を除去し、次に細胞を５ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。細胞懸濁液を５ｍｌの２５％Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ１６４４）に載置してから４００×ｇで１５分間遠心分離した。細胞をＰＢＳ−５％ＦＢＳで２回洗浄し、４５０×ｇで１０分間遠心分離した。このとき、細胞ペレットを無傷に保つように注意した。最後の洗浄後、細胞を８ｍＬの樹状細胞分化培地（ＤＣＤＭ）に再懸濁した。ＤＣＤＭは、ＥＸ−ＣＹＴＥ成長促進サプリメントの１／５００希釈物（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号８１−１２９−Ｎ）、１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｓｉｇｍａ）、および１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ無血清拡大培地（ＳＦＥＭ）（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈカタログ番号０９６５０）から成る。細胞含有溶液を半分ずつ２つのＴ２５フラスコにそれぞれ加えた。各フラスコ中の細胞懸濁液の最終濃度は、１ｍＬのＤＣＤＭ当たり２×１０5〜１×１０6個の細胞／ｍＬであった。プレーティング後４および８日目に、５０％のＤＣＤＭを置換することによって、細胞に供給した。２ｍＬの培地を各フラスコから除去し、４００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を２ｍＬの新鮮なＤＣＤＭに再懸濁し、溶液をフラスコに加えて戻し、これをインキュベーターに戻した。
【００８３】
樹状細胞（ＤＣ）の成熟（一般的な成熟過程）。
標準的なトリプシン溶液による細胞剥離法を用いて、樹状細胞の１０〜１２日間培養物を１５ｍｌのコニカルチューブに収集し、４００×ｇで１０分間遠心分離した。上清をピペッティングにより除去し、ペレットを再懸濁し、新たに調製したＤＣ成熟培地（ＥＸ−ＣＹＴＥ成長サプリメント（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号８１−１２９−Ｎ）を補充したＳＦＥＭ）４ｍｌと穏やかに混合した。再懸濁したＤＣを、ｐＨＥＭＡでコーティングしたＴ２５フラスコに移し、３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。細胞をプレーティングしてから２〜３日後までに、ＤＣが樹状突起を形成し始めた。
【００８４】
感染および樹状細胞への成熟。
レンチウイルスの調製。
プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトすることによってレンチウイルスを調製した。ヒト胚腎臓２９３細胞／ＨＥＫ２９３（以下、単純に２９３と呼ぶ）細胞を、２９３培地（１０％ＦＢＳおよびＬ-グルタミンを補充したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ））に入れ、３７℃で５％ＣＯ2の加湿インキュベー内で維持した。培地を吸引して除去し、細胞をＰＢＳ（直径１０ｃｍのディッシュにつき５ｍＬ）でリンスし、細胞にトリプシンＥＤＴＡ（直径１０ｃｍのディッシュにつき５ｍＬ）を加えて３〜４分置くことにより細胞を８０％のコンフルエンスで分取した。トリプシンＥＤＴＡ処理後、５ｍＬの２９３培地をディッシュに加え、溶液を上下にピペッティングすることによって細胞を穏やかに取り出した。再懸濁した２９３細胞および培地を１５ｍＬのチューブに移し、５００×ｇで５分間遠心分離した。上清を吸引により除去し、細胞ペレットを１ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、血球計を用いて細胞を計数した。細胞を２９３培地で希釈し、２ｍＬ中５×１０5個の細胞を各６ウェルプレートにプレーティングした。プレートを一晩インキュベーター内に置き、翌日に細胞をプラスミドでトランスフェクトした。リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてプラスミドを２９３細胞にトランスフェクトした。すべての融合タンパク質を発現するレンチウイルスを異なるウェルで別々に次のように作成した。５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を２つの１．５ｍＬ微小遠心管に入れ、組織培養フード内で１０分かけて室温に温めた。プラスミドを添加した後、１つのチューブに、２ｇのレンチウイルス発現ΑβＨＬＡ−ＤＲＡ融合タンパク質構築物、２μｇのＶＳＶＧ、２μｇのΔ８．９２を加えた。全てのプラスミドは、Ｅｎｄｏ−Ｆｒｅｅ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてアンピシリン耐性大腸菌培養物から調製した。２つめのチューブには、１０ｍＬのリポフェクタミン２０００を添加した。両チューブの内容物を一緒に加え、混合し、２０分間組織培養フード中に静置した。この時間の後、製造業者のリポフェクタミンプロトコル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い溶液を２９３細胞のウェルに滴下した。リポフェクタミンを含有する溶液を各ウェルに加えた後、プレートをインキュベーターに戻した。翌日、培地を２９３細胞から除去し、１ｍＬのＤＣＤＭに置換した。細胞を２日間再びインキュベートした。このとき、ウイルス含有培地を除去し、未成熟ＤＣに感染する準備ができた。ＤＣＤＭ内においてから１０日後、樹状細胞を回収し、１５ｍＬのコニカルチューブ内に入れ４００×ｇでペレット化した。上清をピペットで除去し、ＤＣを含有するペレットを１ｍＬのＤＣＤＭで再懸濁し、細胞を血球計で計数した。一般的に、５×１０5個の細胞を使用して、各Αβ融合レンチウイルスおよび実験対照（すなわち、ＩＬ−２、Ａβペプチド、未処理対照）に感染させた。ｐＨＥＭＡでコーティングした２４ウェルプレートの１０ウェルの合計を感染および対照用に調製した。ｐＨＥＭＡのコーティングは、５００μＬのｐＨＥＭＡコーティング溶液を各ウェルに使用した以外は、上記のように行った。融合タンパク質ベ��ターでトランスフェクトした２９３からレンチウイルス含有培地（６００μＬ）を７つのウェルに添加した。空のＦＵＧＷレンチウイルスベクターまたはΑβ融合タンパク質のＤＮＡ配列（Ａβ１−１３、Ａβ７−１３、Ａβ１６−３０、Ａβ２４−３５、およびＡβ３１−４２）を含むＦＵＧＷベクターでトランスフェクトした２９３細胞から得た馴化培地をそれぞれ、６個のウェルに加えた。残りの３つのウェルは、１）１０μｇ／ｍｌのΑβ１−４２ポリペプチドを含むＤＣ分化培地（Ｂｉｏｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ  ＣＡ）；２）ＩＬ−２を含有するＤＣ分化培地；３）ＤＣ分化培地のみ、を用いて処理した。次に、５×１０5個の分化ＤＣを、各ウェルに添加した。分化ＤＣを加えた後、プレートを左右に動かしてから、３７℃、５％ＣＯ2で２日間インキュベートした。感染開始から２日目に、培地を各ウェルから除去し、１ｍｌのＤＣ成熟培地（ＤＣＭＭ）に置換した。ＤＣＭＭは、１００μｇ／ｍＬの組換えヒトＴＮＦ−α、および２５０ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）を補充したＤＣＤＭから成る。感染ＤＣを、さらに３日間ＤＣＭＭでインキュベートした。
【００８５】
Ｔ細胞の単離。
全血を、標準的な静脈切開法を使用して、被験者から収集した。約２０ｍＬの全血をｐｕｒｐｌｅ  ｔｏｐ  ＥＤＴＡでコーティングした静脈切開チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて各被験者から採取した。血液をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１４０４０）で１：１に希釈し、２４ｍＬの希釈血液を５０ｍＬのコニカルチューブ内で１８ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ上に重層した（１：１．４の割合、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｓａｌａ，ＳＥ，カタログ番号１７−１４４０−０２）。希釈血液およびＦｉｃｏｌｌ溶液を含むチューブを室温、４００×ｇで３０分間、遠心分離した。上清（すなわち、黄色の血漿成分）を吸引して廃棄した。血漿成分およびフィコール層との間の界面層を慎重に取り、新しいチューブに移した。この界面層は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）および単球を含んでいた。ＰＢＬを含むチューブに２５ｍＬの１×ＰＢＳを投入し、混合してから１５００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を吸引除去し、ペレットを１０ｍＬのＰＢＳで再懸濁した。１５００×ｇで１０分の洗浄工程をさらに２回繰り返した。最後のすすぎの後、細胞を１ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、血球計数器を用いて計数した。次いで、細胞をＲＰＭＩに再懸濁し２０〜５０×１０6個の細胞／ｍＬの細胞濃度にした。
【００８６】
無菌ナイロンウールカラム（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．カタログ番号２１７５９）内でインキュベートしたＰＢＬを通過させることによって、Ｔ細胞をＢ細胞および単球などの接着細胞から精製した。簡単に言うと、１０ｍＬのナイロンウールカラムの上部に５ｍＬのＲＰＭＩ培地を添加することによりカラムを湿らせて、カラム底部のストップコックを開いて培地をカラムに通過させた。５ｍＬのＲＰＭＩ培地を用いて２回洗浄した後、ストップコックを閉じてから５ｍＬのＲＰＭＩ培地をカラム上部に添加してカラム内で静置した。次いで、カラムの上部をシリンジプランジャーで密閉してから、ＲＰＭＩ培地を含有するカラムを３７℃で１時間インキュベートした。このインキュベーションの後、カラムを垂直に固定し、ストップコックを開いてＲＰＭＩ培地をカラムに流した。次にストップコックを開いて別の５ｍＬのＲＰＭＩでリンスした。４ｍＬの細胞懸濁液（２〜５×１０6個の細胞／ｍＬ）をカラムの上部に添加し（ＰＢＬの合計４ｍＬ）、ストップコックを閉じて溶液をカラムに通過させた。１ｍＬのＲＰＭＩをカラム上部に重層し、ナイロンウールに通過させた。ストップコックを閉じ、カラムの上部をシリンジプランジャーで密閉し、３７℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、カラムを組織培養フード内で垂直に取り付けて、プランジャを除去した。ストップコックを開けて、重力によりカラムを通過して流れた流出液を回収した。この流出液は、Ｔ細胞の濃縮画分から成っていた。カラムを、１０ｍＬのＲＰＭＩ培地でもう一度洗浄し、重力により流れた流出液を回収した。２つの流出物を５０ｍＬコニカルチューブ中で混合し、１５００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を吸引し、Ｔ細胞濃縮調製物を１ｍＬのＰＢＳで再懸濁した。細胞を、血球計を用いて計数した。細胞懸濁液中の比較的大きな細胞のみを、目的のＴ細胞として計数した。
【００８７】
Ｔ細胞のカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）染色。
ナイロンカラムから回収したＴ細胞懸濁液を計数した後、懸濁液を１５００×ｇで１０分間遠心分離し、０．１％ＢＳＡを含む４ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、３７℃に予め温めておいた。その後８μΜのＣＦＳＥを含有する４ｍＬのＰＢＳ／ＢＳＡ（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４ｍＬの細胞懸濁液に添加し、混合物を３７℃の水浴中で８分間インキュベートした。インキュベーション直後に、細胞溶液を１０％ｈｙｃｌｏｎｅウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する１０ｍＬのＲＰＭＩで希釈した。次いで、細胞懸濁液を２５℃、１５００×ｇで１０分間遠心分離した。ＣＦＳＥ染色したＴ細胞を、０．１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン画分Ｖ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号２９３０）を含む１０ｍＬのＰＢＳと共に２５℃、１５００×ｇで５分間遠心して２回洗浄した。最後の洗浄の後、Ｔ細胞を、１ｍＬのＲＰＭＩに再懸濁し、計数した。ＣＦＳＥ染色は、フローサイトメトリー（Ａｃｃｕｒｉ／ＢＤ）によりＣＦＳＥで染色した再懸濁Ｔ細胞のアリコートを分析することによって確認した。フローサイトメトリー（ＦＬ１チャネル）によって分析をすることでＣＦＳＥ染色の強度が均一なことを確認した。３日前に感染した成熟ＤＣから成熟分化培地を除去した。
【００８８】
成熟ＨＬＡ−ＤＲＡ−Ａβを提示する樹状細胞とＡＤと診断された被験者由来のＣＦＳＥ標識Ｔ細胞との共培養。
Αβ１−４２ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）を前負荷したＨＬＡ−ＤＲＡ−Αβ融合タンパク質を発現するレンチウイルスを感染させた成熟樹状細胞の各ウェル、または２つの未処理ウェルに、１００万（１×１０6）個のＣＦＳＥ染色Ｔ細胞を添加した。２４ウェルプレートを前後左右に動かして細胞を混合しＴ細胞がウェル内でに均等に分布するようにした。プレートをインキュベーターに戻した。翌日、１μｌのヒトＩＬ−２（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号ＰＨＣ００２６）を各ウェルに添加した。ＩＬ−２の最終濃度は２００ｎｇ／ｍｌであった。プレートを穏やかに左右に動かすことによりＩＬ−２を分布させた後、細胞を、３７℃で９日間インキュベートした。１０日目に、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団を、ＡＣＣＵＲＩ（商標）フローサイトメトリーによって後述のように決定した。
【００８９】
抗ＣＤ４による免疫染色。
Ｔ細胞と遺伝子操作したＤＣとの共培養の１０日目に、各ウェル毎に新しい１ｍＬピペットチップを用いて各ウェル内の培地を回収し別々の１５ｍＬコニカルチューブに移した。プレートのウェルの表面を１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、洗浄液を対応するウェル由来の先の洗浄液と共にプールした。すべてのウェルから細胞を回収した後、チューブを４５０×ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を５ｍＬのＰＢＳで１回洗浄し、次いで４５０×ｇで１０分間再び遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを回収した。細胞を蛍光結合抗ＣＤ４抗体で免疫染色（生）し、フローサイトメトリーによって分析した。インキュベーション後、５０μｌの各細胞懸濁液（すなわち、１×１０6個の細胞）を新鮮なフローサイトメトリーチューブに移した。１μｌの蛍光Ａｌｅｘａ６４７結合抗ＣＤ４抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７マウス抗ヒトＣＤ４抗体、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号５５７７０７）を各チューブに加えた。残りの５０μｌのＮＭＳブロックＴ細胞をアイソタイプ対照抗体に使用した。１μｌのアイソタイプ対照抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７マウスＩｇＧ１ｋアイソタイプ対照、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号５５７７１４）を細胞に加え、各実験条件のアイソタイプ対照に使用した。抗ＣＤ４標識およびアイソタイプ対照細胞の両方を、４℃暗所で１時間インキュベートした。インキュベーション後、０．５％ＢＳＡを含む１ｍＬの冷ＰＢＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍカタログ番号２９３０）を各チューブに添加し、チューブを２００×ｇで５分間遠心分離した。上清を捨て、洗浄工程を２回繰り返した。最後の洗浄液は、０．５％ＢＳＡを含まずＰＢＳのみを含んでいた。各チューブ内の細胞を２００μｌの氷冷１×ＰＢＳで再懸濁した。
【００９０】
ＡＣＣＵＲＩ（商標）フローサイトメトリーによるＣＤ４+Ｔ細胞の増殖測定。
細胞はＡｃｃｕｒｉフローサイトメーターを使用してアッセイした。前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）ドットプロットを使用してＴ細胞を含む集団辺りにゲートを作成し、これを予備実験で測定した。そのゲート内の細胞事象を、Ａｌｅｘａ６４７蛍光（赤色）を示すＦＬ２のヒストグラムにプロットした。抗ＣＤ４抗体によって標識された細胞は、ヒストグラムで有意な蛍光量があったので、ゲーティングしてその集団を単離した。ＦＬ１（緑色）蛍光ヒストグラムは、ＣＤ４+細胞内のＣＦＳＥ標識を示す。最も強い標識が非分裂細胞で見られた（右端）。細胞分裂した細胞のＣＦＳＥ蛍光は徐々に低くなった。ＩＬ−２処理条件でのＣＦＳＥプロットを使用して、各工程（すなわち分裂）についての蛍光の程度を決定した。これらのマーカーを各実験条件のＣＦＳＥプロットに移し、ＣＤ４+Ｔ細胞が実験中に５回を超えて分裂したかを決定した。各条件でのＴ細胞増殖プロファイルを比較して、各血液試料におけるΑβ特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の相対的な存在量および応答性を決定した。
【００９１】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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