(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非動物ベースの濃縮タンパク質を生産する方法であって、
ａ．室温よりも上の温度で植物材料を押し出してマッシュを形成し、前記マッシュをバイオリアクタに移送することと、
ｂ．前記バイオリアクタ内で、１種以上のセルロース分解酵素を添加して、前記マッシュ中に糖を放出することと、
ｃ．前記酵素処理を行ったマッシュに少なくとも１種の微生物を接種することであって、前記微生物が、放出された糖をタンパク質およびエキソポリサッカライドに変換する、ことと、
ｄ．結果として得られるタンパク質、微生物、およびエキソポリサッカライドをエタノール、綿状沈殿剤、またはこれらの組合せで沈殿させることと、
ｅ．前記沈殿した材料を流体力により回収することと、
ｆ．前記沈殿した材料を乾燥させることと、
ｇ．前記酵素処理を行ったマッシュの温度を３０℃〜３７℃に下げることと、
ｈ．前記冷却したマッシュに、前記少なくとも１種の微生物の２４時間培養物を２％（ｖ／ｖ）接種することであって、前記少なくとも１種の微生物が、ＮＲＲＬ番号５０７９２、ＮＲＲＬ番号５０７９３、ＮＲＲＬ番号５０７９４、ＮＲＲＬ番号５０７９５、およびこれらの組合せからなる群から選択されるオーレオバシディウム・プルランス株である、ことと、
ｉ．任意選択で、前記接種を行ったマッシュに０．０５Ｌ／Ｌ／分で空気を供給することと、
ｊ．（ｉ）糖の利用が終わるまで、または、（ｉｉ）前記少なくとも１種の微生物を用いたインキュベーションが９６〜１２０時間経過するまで、インキュベーションをおこなうことと、
を含む方法。
【請求項２】
前記押し出しが、５０℃〜１７０℃で、かつ、圧縮比３：１で、かつ、バレルの両側でリッジ状チャネルに対するせん断効果をもたらすのに十分なスクリュー回転数で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バイオリアクタ内で少なくとも５％の固体負荷率（solid loading rate）を実現するように、前記押し出した材料を水と混合することと、
任意選択で、前記希釈した押し出した材料にオートクレーブ処理および冷却を行うことと、
を更に含み、
前記１種以上のセルロース分解酵素が、エンド-キシラナーゼおよびβ-キシロシダーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ、ヘミセルラーゼ活性、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
マッシュ１Ｌにつきエタノールを０．６Ｌ添加することと、
前記エタノール処理を行ったマッシュを遠心分離することと、
を更に含み、
前記エタノールを上澄み液から回収することと、
前記上澄み液中に懸濁する微粒子を回収することと、
前記回収した微粒子を乾燥させることと、
前記回収した微粒子を、前記乾燥させた沈殿した材料に統合することと、
を任意選択で更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＮＲＲＬ番号５０７９２、ＮＲＲＬ番号５０７９３、ＮＲＲＬ番号５０７９４、及びＮＲＲＬ番号５０７９５からなる群から選択されるオーレオバシディウム・プルランス株の生物学上純粋な培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本研究は、コントラクトＤＢＩ-１００５０６８に基づき、ＮＦＳ（アメリカ国立科学
財団）からの行政機関支援を伴いなされたものである。米国政府は、本発明の一定の権利を有する。
【０００２】
本願は、出願日２０１１年１２月２日の米国仮出願第６１／５６６，４８７号および出願日２０１１年１２月２日の米国仮出願第６１／５６６，５７７号への、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張する。これら仮出願その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０００３】
本発明は、一般にはインキュベーション・プロセスに関し、詳細には、高品質濃縮タンパク質を生成するための微生物ベース好気性インキュベーション・プロセス、ならびに、そのタンパク質から作られる生産物、および栄養分を含んだ食餌の調合物内でのこうした生産物の用途に関する。
【背景技術】
【０００４】
２００８年には、人口の増加とともに１人当たりの魚介類消費の需要が増加する中で、世界の野生海水魚資源の約２８％が乱獲され、５２％がフルに活用された。野生漁業資源が減少するのに伴い、この需要の増加を満たすために、商業水産養殖生産がめざましく増大している。しかし、水産養殖のための食餌調合物の主要成分の１つであるフィッシュミールタンパク質も、野生捕獲漁場由来のものである。商業水産養殖生産を支持するためには、２０１２年までに少なくとも６．７ｍｍｔのフィッシュミールが必要であると見積もられている。これは明らかに維持不可能なトレンドである。
【０００５】
水産養殖餌のフィッシュミールの一部分を代用するために、よりコストを抑え、より維持可能な植物由来資源のタンパク質が使用されてきている。いくつかの生物種の育成食餌中の総タンパク質の最大２０％の代用となるように、脱脂大豆ミール（ＳＢＭ、タンパク質４２〜４８％）が一般に使用されており、それよりも高い総タンパク質代用レベルでの濃縮大豆タンパク質（ＳＰＣ、タンパク質６５％）のテストが成功しているが、これは、その生物種の栄養状態に大きく左右される。これらの大豆生産物は、高タンパクおよび相対的に良好なアミノ酸プロファイルをもたらすが、肉食の海水魚が必要とするいくつかの極めて重要なアミノ酸（例、タウリン）が不足している。ＳＰＣを生産するために使用する溶媒抽出プロセスで、栄養分吸収阻止要素（例、オリゴ糖）が除去され、これによりタンパク質の生物学的利用能が上昇することが主な理由で、大豆ミールよりも高いレベルでＳＰＣを使用することが可能である。さらに、熱不安定性の抗原性要素を不活性化するために、熱工程を使用している。現在の溶媒抽出プロセスの主な制限は、そのコスト、プロセス内で取り出されるオリゴ糖が不使用になること、および、食餌中の総タンパク質の５０％に含有がしばしば限定されるという品質の問題である。さらに、大豆材料の大豆ミールまたは濃縮大豆タンパク質への加工は、環境的に問題があることもある（例、ヘキサン抽出に関連する化学廃棄物の廃棄の問題）。
【０００６】
ＤＤＧＳ（ｄｒｉｅｄ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｒ’ｓ  ｇｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌｕｂｌｅｓ）を含めたトウモロコシ副産物もまた、最高で２０％のフィッシュミール代用レベルでの水産養殖餌で評価されている。ＤＤＧＳは、大豆生産物よりも低タンパク（２８〜３２％）で、より多くの繊維質を有するが、一般に、脱脂大豆ミールの値の５０％以下の価格である。いくつかのエタノール工場は、変換プロセスの前に繊維質および油の一部分を除去するためのドライ分別プロセスを組み込んでおり、この結果、タンパク質が最高
で４２％のドライ分別ＤＤＧＳがもたらされている。この生産物は、水産養殖の食餌中のフィッシュミールの２０〜４０％を代用するのに使用されているが、より高タンパクで、より消化のしやすいＤＤＧＳ水産食餌生産物のニーズが依然存在する。こうした生産物は、タウリン、リジン、メチオニン、システインなどの極めて重要なアミノ酸をより高レベルでタンパク質成分が有する場合に、特に魅力的なはずである。
【０００７】
したがって、費用効果が高く、環境に優しく、水産養殖餌中のフィッシュミールのより多くを完全にまたは実質的に代用するのに十分に高品質の植物由来のタンパク源が必要である。
【発明の概要】
【０００８】
本開示内容は、微生物ガム（エキソポリサッカライド）結合剤を含有した、消化のしやすい濃縮タンパク源に、植物材料を変換する有機微生物ベースのシステム、ならびに、人に消費される動物の食餌としての使用に適した、このような濃縮原料に関する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、非動物ベースの濃縮タンパク質を含有する組成物を開示するが、この組成物は、乾燥物質基準では、少なくとも５５％のタンパク含有量を含み、検出可能なスタキオースまたはラフィノースを含まない。一態様では、この組成物は、オーレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）寄託株、ＮＲＲＬ番号５０７
９２、ＮＲＲＬ番号５０７９３、ＮＲＲＬ番号５０７９４、ＮＲＲＬ番号５０７９５、またはこれらの組合せを含有する。
【００１０】
一態様では、非動物ベースの濃縮タンパク質が、穀物および脂肪種子植物材料から分離されるが、これらには、大豆、ピーナツ、アブラナ、キャノーラ、ゴマ種子、大麦、綿実、パーム核、ブドウ種子、オリーブ、ベニバナ、ヒマワリ、コプラ、トウモロコシ、ココナツ、アマニ、ヘイゼルナッツ、小麦、米、ジャガイモ、キャッサバ、豆果、カメリナ種子、カラシ種子、胚芽ミール、トウモロコシグルテンミール、蒸留所／醸造所副産物、これらの一部分および組合せが含まれるが、それらに限定されない。
【００１１】
他の態様では、組成物のタンパク含有量が、あるプロセスにて作られる乾燥物質基準で約５６％〜約９０％の範囲ある。このプロセスは、マッシュを形成するように、室温より上の温度で植物材料を押し出すことと、マッシュ中に糖を放出するために、１つまたは複数のセルロース分解酵素を添加することと、酵素処理を行ったマッシュに少なくとも１つの微生物を接種することであって、この微生物が、放出された糖をタンパク質およびエキソポリサッカライドに変換することと、結果として得られるタンパク質、微生物、およびエキソポリサッカライドをエタノールまたは綿状沈殿剤で沈殿させることと、沈殿した材料を流体力により回収することと、その沈殿した材料を乾燥させることと、を含む。
【００１２】
一関連態様では、少なくとも１つの微生物が、オーレオバシディウム・プルランス、スクレロチウム・グルカニカム（Sclerotium glucanicum）、スフィンゴモナス・パウシモ
ビリス（Sphingomonas paucimobilis）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、ロドスピリラム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）、クルイウェロマイセス属（Kluyveromyces spp）、ピチア族（Pichia spp）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）、リゾープス属（Rhizopus spp）、およびこれらの組合せを含むが、それらに限定されない。
【００１３】
一態様では、植物材料が、脱脂大豆フレークまたは大豆ミールの形をした大豆由来のものである。他の態様では、植物材料が、油糧種子またはその脱油ミール由来のものである。他の態様では、植物材料が、ＤＤＧＳ由来のものである。
【００１４】
一態様では、濃縮タンパク質が、１００ｇにつきヒドロキシリジンを少なくとも０．１ｇ含む。
【００１５】
一実施形態では、非動物ベースの濃縮タンパク質を含む動物食餌を開示するが、組成物が、１００ｇにつき少なくとも約１．２５ｇの脂質を含み、また、この組成物は、乾燥物質基準では、検出されるスタキオースまたはラフィノースを含まず、少なくとも５５％のタンパク含有量を含み、かつ、この組成物は、重量でこの動物食餌を少なくとも３５％含む。
【００１６】
一関連態様では、組成物が、魚食餌中の動物ベースのフィッシュミールの完全代替物になる。更なる関連態様では、魚食餌は下記の魚類について調合される。その魚類には、以下の魚類およびその組合せが含まれるが、これらに限定されない。シベリアチョウザメ、スターレットチョウザメ、シロチョウザメ、ピラルク、日本ウナギ、アメリカウナギ、ショートフィンウナギ、ロングフィンウナギ、ヨーロッパウナギ、サバヒー（Chanos chanos）、ミルクフィッシュ、ブルーギルサンフィッシュ、グリーンサンフィッシュ、ホワイ
トクラッピー、ブラッククラッピー、Ａｓｐ、カトラ、金魚、ヨーロッパフナ（Crucian carp）、ケンヒー（Mud carp）、ムリガルカープ（Mrigal carp）、草魚（Grass carp）
、コイ（Common carp）、シルバーカープ（Silver carp）、コクレン（Bighead carp）、オレンジフィンラベオ（Orangefin labeo）、ロホラベオ（Roho labeo）、ホベンスカー
プ（Hoven's carp）、ウーチャンブリーム（Wuchang bream）、真鯉、ゴールデンシャイ
ナー、ニレムカープ（Nilem carp）、ホワイトアムールブリーム（White amur bream）、タイシルバーバルブ（Thai silver barb）、ジャワ（Java）、ローチ（Roach）、テンチ
（Tench）、ポンドローチ（Pond loach）、ボカチコ（Bocachico）、ドラダ（Dorada）、カチャマ（Cachama）、カチャマブランカ（Cachama Blanca）、パコ（Paco）、ブラック
ブルヘッド（Black bullhead）、ブチナマズ、バグリッドナマズ（Bagrid catfish）、ブルーキャットフィッシュ、ヨーロッパオオナマズ（Wels catfish）、パンガシウス(Swai
、Tra、Basa)キャットフィッシュ、ゴンズイ（Striped catfish）、泥魚、フィリピンキ
ャットフィッシュ（Philippine catfish）、ホンコンキャットフィッシュ（Hong Kong catfish）、北アフリカキャットフィッシュ（North African catfish）、ビッグヘッドキャットフィッシュ、サンパ（Sampa）、南アメリカキャットフィッシュ（South American catfish）、アティパ（Atipa）、ノーザンパイク、アユスィートフィッシュ（Ayu sweetfish）、シロマス、ホワイトフィッシュ、ピンクサーモン、シロサケ、ギンザケ、サクラマ
ス、ニジマス、ベニマス、キングサーモン、大西洋サケ、シートラウト（Sea trout）、
アルプスイワナ、ブラウントラウト、レイクトラウト、大西洋タラ、ペヘレイ、レイ（Lai）、カモンスヌーク（Common snook）、バラマンディ／アジアシーバス、ナイルアカメ
、マーレーコッド、ゴールデンパーチ、シマスズキ、ホワイトバス、ヨーロピアンシーバス、ホンコンハタ、オオモンハタ、グリーシーハタ（Greasy grouper）、スポッテドコラルグルーパ（Spotted coralgrouper）、シルバーパーチ、ニシスズキ、ジェイドパーチ（Jade perch）、オオクチバス、コクチバス、ヨーロピアンパーチ、ザンダー（カワカマス）、イエローパーチ、ソーガー（Sauger）、ウォールアイ、アミキリ、カンパチ、ブリ、スナッブノーズポンパノ（Snubnose pompano）、フロリダポンパノ（Florida pompano）
、パロメータポンパノ（Palometa pompano）、マアジ、スギ、ゴマフエダイ、イエローテイルスナッパー（Yellowtail snapper）、ダークシーブリーム（Dark seabream）、ホワ
イトシーブリーム（White seabream）、レッドシーブリーム（Red seabream）、レッドポーギー、ヘダイ、ゴウシュウマダイ、レッドドラム、グリーンテラー（Green terror）、ブラックベルトカワスズメ（Blackbelt cichlid）、ジャガーガポーテ（Jaguar guapote
）、メキシコクロサギ（Mexican mojarra）、パールスポット（Pearlspot）、スリースポッテドテラピア（Three spotted tilapia）、ブルーテラピア（Blue tilapia）、ロング
フィンテラピア（Longfin tilapia）、モザンビークテラピア（Mozambique tilapia）、
ナイルテラピア（Nile tilapia）、テラピア、ワミテラピア（Wami tilapia）、ブラック
チンテラピア（Blackchin tilapia）、レッドブレストテラピア（Redbreast tilapia）、レッドベリーテラピア（Redbelly tilapia）、ゴールデングレイマレット（Golden grey mullet）、ラージスケールマレット（Largescale mullet）、ゴールドスポットマレット
（Gold-spot mullet）、シンリップグレイマレット（Thinlip grey mullet）、リーピン
グマレット（Leaping mullet）、テードマレット（Tade mullet）、フラットヘッドグレ
イマレット（Flathead grey mullet）、ホワイトマレット（White mullet）、レブランシュマレット（Lebranche mullet）、パシフィックファットスリーパー（Pacific fat sleeper）、マーブルゴビー、ホワイトスポッテドスピンフット（White-spotted spinefoot）、ゴールドラインドスピンフット（Goldlined spinefoot）、マーブルドスピンフット（Marbled spinefoot）、ミナミマグロ、タイセイヨウクロマグロ、キノボリウオ、スネークスキングラミー、キッシンググラミー、ジャイアントグラミー、スネークヘッド、インドネシアンスネークヘッド（Indonesian snakehead）、スポッテドスネークヘッド（Spotted snakehead）、ストライプトスネークヘッド（Striped snakehead）、ターボット、ヒラメ（Bastard halibut、Japanese flounder）、サマーフラウンダー、サザンフラウンダー（Southern flounder）、フユヒラメ、タイセイヨウオヒョウ、グリーンバックフラウン
ダー（Greenback flounder）、コモンソール（Common sole）。
【００１７】
一態様では、本魚食餌は、動物ベースのフィッシュミールまたは濃縮大豆タンパク質を含む同等の魚食餌と比較して、１つまたは複数の性能側面にてより優れた性能をもたらすが、これら性能側面には、成長、体重増加、タンパク効率、食餌転換率、総消費量、生存率、およびフルトンの条件因子（Fulton's condition factor）が含まれるが、これらに
限定されない。
【００１８】
他の態様では、本魚食餌は、動物ベースのフィッシュミールまたは濃縮大豆タンパク質を含む同等の魚食餌のタンパク含有量以下の粗タンパク質含有量でその性能側面をもたらす。
【００１９】
一態様では、本食餌には、リジン、メチオニン、脂質、ビオチン、コリン、ナイアシン、アスコルビン酸、イノシトール、パントテン酸、葉酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＡ、ビタミンＢ１２、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、アルミニウム、ヨウ素、コバルト、亜鉛、鉄、セレニウム、またはこれらの要素の組合せが補充される。
【００２０】
他の実施形態では、非動物ベースの濃縮タンパク質を生産する方法を開示するが、この方法は、マッシュを形成するように、室温より上の温度で植物材料を押し出し、マッシュをバイオリアクタに移送することと、バイオリアクタ内で、マッシュ中に糖を放出するために１つまたは複数のセルロース分解酵素を添加することと、酵素処理を行ったマッシュに少なくとも１つの微生物を接種することであって、この微生物が、放出された糖をタンパク質およびエキソポリサッカライドに変換することと、結果として得られるタンパク質、微生物、およびエキソポリサッカライドをエタノール、綿状沈殿剤、またはこれらの組合せで沈殿させることと、沈殿した材料を流体力により回収することと、その沈殿した材料を乾燥させることと、を含む。
【００２１】
一関連態様では、押出しが、約５０℃〜約１７０℃、圧縮比約３：１、押出しバレルの両側でリッジ状チャネルに対するせん断効果をもたらすのに十分なスクリュー回転数で行われる。
【００２２】
他の関連態様では、本方法は、バイオリアクタ内で少なくとも５％の固体負荷率（solid loading rate）を実現するように、押出した材料を水と混合することを含み、希釈した押し出した材料にオートクレーブ処理を行い、またそれを冷却することを任意選択で含む
が、１つまたは複数のセルロース分解酵素が、エンド-キシラナーゼおよびβ-キシロシダーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ、ヘミセルラーゼ活性、ならびにこ
れらの組合せからなる群から選択される。
【００２３】
一関連態様では、本方法は、酵素処理を行ったマッシュの温度を約３０℃〜約３７℃に下げることと、冷却したマッシュに、少なくとも１つの微生物の２４時間培養物を２％（ｖ／ｖ）接種することであって、少なくとも１つの微生物が、オーレオバシディウム・プルランス、スクレロチウム・グルカニカム、スフィンゴモナス・パウシモビリス、ラルストニア・ユートロファ、ロドスピリラム・ラブラム、クルイウェロマイセス属、ピチア族、トリコデルマ・リーセイ、ヒラタケ、リゾープス属、およびこれらの組合せを含むが、それらに限定されないことと、任意選択で、接種を行ったマッシュに約０．０５Ｌ／Ｌ／分で空気を供給することと、糖の利用が終わるまでインキュベーションを行うか、または、少なくとも１つの微生物の存在下でのインキュベーションが約９６〜１２０時間経過するまでインキュベーションを行うことと、を含む。
【００２４】
一態様では、本方法は、マッシュ１Ｌにつきエタノールを約０．６Ｌ添加することと、エタノール処理を行ったマッシュを遠心分離することと、エタノールを回収することと、任意選択で、懸濁微粒子を回収して、遠心分離を行った固体を回収することと、回収した遠心分離を行った固体を乾燥させることと、を含む。他の態様では、上澄み液を乾燥することもあり、乾燥した固体を回収し、次いで、遠心分離固体と混合する。
【００２５】
一実施形態では、ＮＲＲＬ番号５０７９２、ＮＲＲＬ番号５０７９３、ＮＲＲＬ番号５０７９４、ＮＲＲＬ番号５０７９５からなる群から選択されるオーレオバシディウム・プルランス株の生物学上純粋な培養物を開示する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＨＱＳＰＣ変換プロセスのフローチャートである。
【図２】水産食餌のためのＨＱＳＰＣ変換プロセスのフローチャートである。
【図３】ＨＱＳＰＣ組成および歩留まりを評価するためのベンチスケール長期インキュベーション試験を示す。
【図４】水産食餌についてのＨＰ-ＤＤＧＳ変換プロセスのフローチャートである。
【図５】１００℃でのＨＰ-ＤＤＧＳの押出しに続くグルコース回収への、含水率および押出速度の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本組成物、方法、方法論について記載する前に、本発明は、説明する特定の組成物、方法、および実験条件に限定されないことを理解されたい。これは、こうした組成物、方法、および条件が多様でありうるからである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲内でのみ限定されることとなるので、本明細書で使用する用語が特定の実施形態のみを説明する目的のものであり、限定を行う意図はないことも理解されたい。
【００２８】
本明細書および添付の特許請求の範囲内で使用される場合、「a」、「an」、および「the」といった単数形は、コンテキストが明確に示していない限り、複数への言及を含む。したがって、たとえば、「a nucleic acid」との言及は、１つもしくは複数の核酸、および／または、本開示内容などを読めば当業者には明らかになる、本明細書に記載の種類の組成物を含む。
【００２９】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。修正形態および変形形態が本開示内容の趣旨および範囲に包含されることは理解されるので、本明細書に
記載する方法および材料と同様であるか、またはそれらに相当するどんな方法および材料でも、本発明の実施またはテストにおいて使用するこが可能である。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「about（約）」、「approximately（約）」、「substantially（実質的に）」および「significantly（著しく）」といった語は、当業者には理解されるであろうし、それらが使用されるコンテキストによっては、ある程度変化することとなる。こうした用語を使用したコンテキストが与えられ、当業者にとってその用語の使用が不明確であれば、「about（約）」および「approximately（約）」は、特定の語の１０％よりも誤差が小さいことを意味し、「approximately（約）」、「substantially（実質的に）」および「significantly（著しく）」は、特定の語の１０％よりも誤差が大きい
ことを意味する。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「動物」という用語は、動物界に属する任意の生物を意味し、これには、ヒト、鳥類（例、家禽）、哺乳類（例、ウシ、ブタ、ゴール、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、ウマ）、ならびに、魚（例、トラウト、サーモン、パーチ）、軟体動物（例、クラム）、甲殻類（例、ロブスター、エビ）などの水産養殖生物が含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「魚」という用語の使用は、脊椎のある魚全てを含み、これは、硬骨魚または軟骨魚であってもよい。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「非動物ベースのタンパク質」は、濃縮タンパク質が組成１００ｇにつき少なくとも０．８１ｇの粗繊維を含む（乾燥物質基準）ことを意味するが、この粗繊維は主に、植物性物質の化学分析にて残留物として得られるセルロースおよびリグニン材料である。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「インキュベーション・プロセス」は、バクテリアまたは細胞の成長および発育のための適切な条件の提供を意味するが、こうしたバクテリアまたは細胞は、生合成経路を使用して様々な供給原料を代謝させる。いくつかの実施形態では、インキュベーション・プロセスは、たとえば、好気条件で実施することもある。他の実施形態では、インキュベーション・プロセスは、発酵を含むこともある。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「インキュベーション生産物」という用語は、インキュベーション・プロセス／反応から直接生じる任意の残留物質を意味する。いくつかの例では、インキュベーション生産物は微生物を含有するが、これにより、このインキュベーション生産物は、こうした微生物の欠けたインキュベーション生産物と比較して栄養要素含有量が高まっている。インキュベーション生産物は、インキュベーション・ブロスからの適当な成分を含有することもある。たとえば、インキュベーション生産物は、インキュベーション・ブロスからの溶解および／または懸濁した成分を含むこともある。懸濁した成分は、未溶解の可溶性成分（たとえば、溶液が１つまたは複数の成分で過飽和にされている）および／またはインキュベーション・ブロス内に存在する不溶性材料を含むこともある。インキュベーション生産物は、（たとえば、インキュベーション・ブロスと、インキュベーションにより生産されるバイオマスをスプレードライすることにより）インキュベーションの終わりに存在する乾燥固体材料の実質的に全てを含んでいても、その一部分を含んでいてもよい。インキュベーション生産物は、インキュベーションからの粗材料を含むこともあるが、この材料の栄養素量を増大させるために、微生物の分別および／または部分的浄化を行ってもよい。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「変換培養物」は、たとえば水や栄養素など、微生物の成長に十分な材料を含む培地に含まれる微生物の培養物を意味する。「栄養素」という用語は
、栄養価を有する任意の物質を意味する。これは、動物食餌または動物への食物補助剤の一部分となることもある。栄養素の例には、タンパク質、ペプチド、脂肪、脂肪酸、脂質、水溶性ビタミン、脂溶性ビタミン、必須アミノ酸、炭水化物、ステロール、酵素が含まれ、また、リン、鉄、銅、亜鉛、マンガン、マグネシウム、コバルト、ヨウ素、セレニウム、モリブデン、ニッケル、フッ素、バナジウム、スズ、ケイ素などのトレースミネラルが含まれる。
【００３７】
変換は、たとえば大豆材料を高品質の濃縮タンパク質に変換するなど、タンパク質／炭水化物／多糖類材料を変換するのに適した条件で、変換培養物内の微生物を培養するプロセスである。適切な変換とは、指定の炭水化物の９０％以上を利用して、微生物細胞塊および／またはエキソポリサッカライドを生産することを意味する。いくつかの実施形態では、変換は、好気的または嫌気的であることがある。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「綿状沈殿剤」または「清澄剤」は、凝集によりコロイドが懸濁液から出てくることを促進する化学物質であり、これは、多価イオンおよびポリマーを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、こうした綿状沈殿剤／清澄剤が、エキソポリサッカライドなどのバイオフロキュレント（bioflocculents）を含むこともある。
【００３９】
変換用の供給原料として、多数の植物タンパク源を本開示内容と関連して使用することができる。食餌業界で植物タンパク質を使用する主な理由は、動物タンパク源など、より高価なタンパク源の代用とするためである。他の重要な要素は、動物タンパク質を同一または関連種族の動物に与えることを通して病気が伝播する危険である。植物タンパク源の例には、大豆やピーナツなどのマメ科からのタンパク質、キャノーラや綿実などのアブラナ科からのタンパク質、ヒマワリを含めた（ただしこれに限られない）キク科からのタンパク質、コプラを含めたヤシ科からのタンパク源が含まれるが、これらに限定されない。一般に油料種子タンパク質とも定義されるこれらのタンパク源は、全て食餌として供給することができるが、より一般には、油を除去した後の副産物として供給される。他の植物タンパク源には、特にトウモロコシ、小麦、米といった穀物や穀類などのイネ科（Poaceae、Gramineae）からの植物タンパク源、ジャガイモ、キャッサバ、豆類（エンドウ、ビーン）などの他の主要作物からの植物タンパク源、胚芽ミールもしくはトウモロコシグルテンミールを含めたいくつかの製粉副産物からの植物タンパク源、または、蒸留所／醸造所副産物からの植物タンパク質が含まれる。いくつかの実施形態では、タンパク質の供給原料には、大豆、ピーナツ、アブラナ、大麦、キャノーラ、ゴマ種子、綿実、パーム核、ブドウ種子、オリーブ、ベニバナ、ヒマワリ、コプラ、トウモロコシ、ココナツ、アマニ、ヘイゼルナッツ、小麦、米、ジャガイモ、キャッサバ、豆果、カメリナ種子、カラシ種子、胚芽ミール、トウモロコシグルテンミール、蒸留所／醸造所副産物からの植物材料、およびこれらの組合せからの植物材料が含まれるが、それらに限定されない。
【００４０】
養魚業では、使用されていると伝えられる植物由来の主な魚粉代用品には、大豆ミール（ＳＢＭ）、メイズグルテンミール、アブラナ／キャノーラ（アブラナ属種）ミール、ルピナス（果皮を取ったホワイトルピナス（白花ルピナス）、スイートルピナス（青花ルピナス）、イエロールピナス（黄花ルピナス）などの核ミール中のタンパク質などのハウチワマメ種）、ヒマワリ（Helianthus annuus）種子ミール、結晶性アミノ酸、ならびに、
エンドウミール（エンドウマメ）、綿実（綿種）ミール、ピーナツ（落花生類、Arachis hypogaea）ミールおよび油粕、濃縮大豆タンパク質、トウモロコシ（Zea mays）グルテンミールおよび小麦（Triticum aestivum）グルテン、濃縮ジャガイモ（Solanum tuberosum
L.）タンパク質、ならびに、ワサビノキ属（ワサビノキ）などの他の植物食餌原料、さ
らに、これらを様々な濃度にしたもの、種々に組み合わせたものが含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
本タンパク源は、未処置の植物材料、ならびに、処置を施した植物タンパク質、および／または、抽出した植物タンパク質の形とすることもできる。１つの例では、熱処理を行った大豆生産物が、より高いタンパク消化率を有する。
【００４２】
タンパク質材料は、任意の種類のタンパク質またはペプチドを含む。いくつかの実施形態では、丸大豆などの大豆材料などを使用することもできる。丸大豆は、標準的な商用大豆、何らかの形で遺伝子が組み替えられた（ＧＭ）大豆、または非ＧＭに維持された大豆である場合がある。ＧＭ大豆の例には、たとえば、スタキオースおよびラフィノース以外の炭水化物を作るように操作された大豆が含まれる。非ＧＭの大豆の例には、たとえば、低油、低炭水化物、低トリプシン阻害とするために系統育種を行ったシリンジャー（Schillinger）品種が含まれる。
【００４３】
他の種類の大豆材料には、大豆タンパク質粉、濃縮大豆タンパク質、大豆ミール、大豆タンパク質分離物、またはこれらの混合物が含まれる。従前からの丸大豆の大豆タンパク質粉、濃縮大豆タンパク質、大豆ミール、大豆タンパク質分離物などの他の形の大豆タンパク質への加工は、浄化した未加工の丸大豆をいくつかの断片（一般には、６〜８個）に砕いて、大豆チップおよび大豆粉を生産し、次いでこれら大豆チップおよび大豆粉を取り出すことを含む。次いで、大豆チップに約６０℃の条件を設定し、厚さ約０．２５ｍｍのフレーク状にする。次いで、結果として得られるフレークを、いくつかの種類の向流抽出システムのうちの１つの中で、一般にはヘキサンである炭化水素溶剤などの不活性溶媒で抽出して、大豆油を取り除く。大豆タンパク質粉、濃縮大豆タンパク質、大豆タンパク質分離物については、高含有量の水溶性大豆タンパク質を維持するために、大豆タンパク質の加熱または焼きの量を最小限に抑えるように、フレークを脱溶媒することが重要である。これは一般に、蒸気デソルベンタイザ（vapour desolventizer）またはフラッシュ・デソルベンタイザ（flash desolventizer）を使用して実現される。このプロセスから得ら
れるフレークは、一般に「食用脱脂フレーク」または「白大豆（ビーン）フレーク」と称される。
【００４４】
白大豆ビーンフレークは、大豆タンパク質粉、濃縮大豆タンパク質、大豆タンパク質分離物の出発原料であり、約５０％のタンパク含有量を有する。次いで、通常は開ループの粉砕システム内で、ハンマー・ミル、クラシファイヤ・ミル、ローラ・ミル、またはインパクト・ピン・ミルで白大豆フレークを製粉して、まず粗粒にし、更なる粉砕により、所望の粒子サイズの大豆粉にする。一般には、スクリーニングにより、均一な粒子サイズ範囲になるように生産物のサイズ設定を行うが、これは、シェイカ・スクリーンまたは円筒状遠心分離スクリーナを用いて実現することができる。他の油糧種子を同様に加工することもできる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ＤＤＧＳを使用することもできる。ＤＤＧＳは現在、トウモロコシ・エタノール業界で製造されている。従前からのＤＤＧＳは、乾燥粉砕施設から来るが、そこでは、トウモロコシ穀粒全体が、粉砕および加工される。これらの施設のＤＤＧＳは、一般に２８〜３２％のタンパク質を含有する。
【００４６】
本タンパク源は、未処置の植物材料、ならびに、処置を施した植物タンパク質、および／または、抽出した植物タンパク質の形とすることもできる。１つの例では、熱処理を行った大豆生産物が、高いタンパク消化率を有する。依然として、熱に不安定な栄養分吸収阻止物質を除去したとしても、肉食性魚類の食餌中の未脱脂の大豆ミール含有または脱脂大豆ミール含有についての上位含有レベルは、２０〜３０％の含有レベルである。魚の場合、大豆タンパク質は、濃縮タンパク質含有レベルが３０％を超えて食餌を与えると、腸損傷を引き起こし、一般に、様々な魚類の成長能力が低減されることを示している。実際
に、これらの影響に起因して、ほとんどの養魚場経営者が、総餌中に１０％を超える植物タンパク質を使用することに気が進んでいない。
【００４７】
本発明は、この課題を解決し、最大４０％の植物タンパク質含有レベル、または、とりわけ、食餌を与える動物種、植物タンパク源の起源、異なる植物タンパク源の割合、タンパク質濃度、ならびに、グルカンおよび／またはマンナンの量、起源、分子構造および濃度によっては、５０％の植物タンパク質含有レベルを可能にする。いくつかの実施形態では、植物タンパク質含有レベルは、最大４０％であり、好ましくは、最大２０または３０％である。一般に、食餌中に存在する植物タンパク質は、５〜４０％であり、好ましくは、１０〜３０％または１５〜３０％である。これらのパーセンテージは、動物の食餌または餌中の総植物タンパク源のパーセンテージ量を規定し、これは、脂肪、灰などを含む。いくつかの実施形態では、純粋なタンパク質のレベルは、最大で５０％であり、一般には最大４５％であり、いくつかの実施形態では５〜９５％である。
【００４８】
総食餌または餌中の他のタンパク質に対する植物タンパク質の割合は、５：９５〜９５：５、１５：８５〜５０：５０、または２５：７５〜４５：５５であってもよい。
【００４９】
[微生物]
開示する微生物は、炭水化物および他の栄養素を変換培養物中で高品質の濃縮タンパク質に変換することが可能でなければならない。いくつかの実施形態では、本微生物は、イースト状菌である。イースト状菌の例の１つは、オーレオバシディウム・プルランスである。他の微生物の例には、クルイウェロマイセス属、ピチア族、乳酸菌、トリコデルマ・リーセイ、ヒラタケ、リゾープス属などのイースト、および、多くの種類のリグノセルロース分解微生物が含まれる。一般に、微生物の例には、スタキオース、ラフィノース、キシロースおよび他の糖を代謝させることの可能な微生物が含まれる。ただし、当業者には、過度の実験なしに、開示している方法に基づいて他の適当な微生物を選択することが可能である。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本プロセスで使用することのできる微生物には、オーレオバシディウム・プルランス、スクレロチウム・グルカニカム、スフィンゴモナス・パウシモビリス、ラルストニア・ユートロファ、ロドスピリラム・ラブラム、クルイウェロマイセス属、ピチア族、トリコデルマ・リーセイ、ヒラタケ、リゾープス属、およびこれらの組合せを含むが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、本微生物はオーレオバシディウム・プルランスである。
【００５１】
いくつかの実施形態では、オーレオバシディウム・プルランスは、変換中に遭遇する様々な環境／ストレッサに適合する。いくつかの実施形態では、ＮＲＲＬ番号５０７９３で表されるオーレオバシディウム・プルランス株（２０１２年１１月３０日にブタペスト条約のもとで、米国イリノイ州、ピオリアのＮＲＲＬ（the Agricultural Research Culture Collection）に預託）が、より低いガム生成を示し、ＤＤＧＳに適合する。いくつかの実施形態では、ＮＲＲＬ番号５０７９２で表されるオーレオバシディウム・プルランス株（２０１２年１１月３０日にブタペスト条約のもとで、米国イリノイ州、ピオリアのＮＲＲＬ（the Agricultural Research Culture Collection）に預託）が、高レベルの抗菌性テトラサイクリン（例、テトラサイクリン約７５μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌ）に適合する。いくつかの実施形態では、ＮＲＲＬ番号５０７９４で表されるオーレオバシディウム・プルランス株（２０１２年１１月３０日にブタペスト条約のもとで、米国イリノイ州、ピオリアのＮＲＲＬ（the Agricultural Research Culture Collection）に預託）が、高レベルの抗菌性ＬＡＣＴＲＯＬ（登録商標）（例、バージニアマイシン約２μｇ／ｍｌ〜約６μｇ／ｍｌ）に適合する。いくつかの実施形態では、ＮＲＲＬ番号５０７９５で表されるオーレオバシディウム・プルランス株（２０１２年１１月３０日にブタペスト条
約のもとで、米国イリノイ州、ピオリアのＮＲＲＬ（the Agricultural Research Culture Collection）に預託）が、凝縮トウモロコシ可溶分に順応する。
【００５２】
[変換培養物]
いくつかの例示的実施形態では、前処置の後、タンパク質材料（押し出した大豆白フレークなど）を、少なくとも５％の固体負荷率で水とブレンドすることもあるが、ｐＨは、４．５〜５．５に調整される。次いで、適当な用量の加水分解酵素を添加し、３〜２４時間、５０℃、１５０〜２５０ｒｐｍでの攪拌によりスラリーインキュベーション（slurry
incubation）を行うことができる。３５℃に冷却した後、オーレオバシディウム・プル
ランスからなる接種材料を添加し、更に７２〜１２０時間、または炭水化物か消費されるまで、培養物のインキュベーションを行ってもよい。インキュベーション中、無菌空気を０．５〜１Ｌ／Ｌ／ｈの速度でリアクタ内に噴霧してもよい。いくつかの実施形態では、変換培養物が、大豆材料を用いたインキュベーションによる約９６時間未満の変換を経る。いくつかの実施形態では、変換培養物は、約９６時間〜約１２０時間インキュベーションされることとなる。いくつかの実施形態では、変換培養物が、約１２０時間を超える変換を経る。変換培養物は、約３５℃でインキュベーションを行うこともある。
【００５３】
いくつかの実施形態では、変換を経る間、変換培養物のｐＨを約４．５〜約５．５とすることがある。いくつかの実施形態では、変換培養物のｐＨを、４．５未満（例、ｐＨ３）としてもよい。いくつかの実施形態では、Deshpandeらの、「Aureobasidiumpullulans in applied microbiology」: A status report, Enzyme and Microbial Technology (1992), 14(7):514に開示されるように、変換培養物に能動的に通気を行うこともある。
【００５４】
任意選択のアルコール沈殿および遠心分離での変換プロセスの後に、高品質濃縮タンパク質（ＨＱＰＣ）ならびにプルランおよびシデロホアを変換培養物から回収することができる。アルコールの一例はエタノールであるが、当業者は、他のアルコールも機能するはずであることを理解する。いくつかの実施形態では、沈殿を行うために塩を使用することもある。塩の例は、カリウムの塩、ナトリウムの塩、塩化マグネシウムの塩であってもよい。いくつかの実施形態では、ポリマーまたは多価イオンを単独で、またはアルコールと組み合わせて使用することもある。
【００５５】
いくつかの実施形態では、インキュベーション時間を変えることにより、最終的な濃縮タンパク質の固体回収率を調節することもできる。たとえば、１４日間のインキュベーションで、約７５％のタンパク質を達成することができ、ただし、固体回収率は約１６〜２０％である。いくつかの実施形態では、２〜２．５日間のインキュベーションで、固体回収率が約６０〜６４％に上昇し、ＨＱＰＣ中のタンパク質レベルは５８〜６０％となる。いくつかの実施形態では、４〜５日間のインキュベーションで、タンパク含有量と固体回収率との両方が最大になる（たとえば、タンパク含有量は約７０％を超えるが、これに限られず、固体回収率は約６０％を超えるが、これに限られない）ことがある。供給原料に応じて、数字は、これらよりも大きくも小さくもなる。いくつかの実施形態では、濃縮タンパク質（すなわち、ＨＱＳＰＣまたはＨＰ‐ＤＤＧＳ）は、特定の脂質：タンパク質比を有することがあり、たとえば、約０．０１０：１〜約０．０３：１、約０．０２０：１〜約０．０２５：１、または、約０．０２１：１〜約０．０２３：１である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、バレル長：スクリュー直径が１：２０で、圧縮比が３：１の単一スクリュー押出し機（例、米国ニュージャージー州、ハッケンサック、Brabender Plasti-corder Extruder Model PL2000）内で供給原料を押し出してもよいが、他のジオメ
トリーおよび比率を使用することもできる。供給原料は、湿りが約１０％〜約１５％、約１５％、または約２５％になるように調整してもよい。食餌、バレル、および押出し機の出口部分の温度を、約４０℃〜約５０℃、約５０℃〜約１００℃、約１００℃〜約１５０
℃、または約１５０℃〜約１７０℃に維持してもよく、スクリュー回転数を、約５０ｒｐｍ〜約７５ｒｐｍ、約７５ｒｐｍ〜約１００ｒｐｍ、約１００ｒｐｍ〜約２００ｒｐｍ、または２５０ｒｐｍに設定してもよい。いくつかの実施形態では、スクリュー回転数は、バレルの両側でリッジ状チャネルに対するせん断効果をもたらすのに十分な回転数である。いくつかの実施形態では、スクリュー回転数は、糖の放出を最大限にするように選択される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、押し出した供給原材料（例、植物タンパク質またはＤＤＧＳ）を、リアクタ（例、5 L New Brunswick Bioflo 3 bioreactor、ワーキング・ボリュー
ム３〜４Ｌ）内で固体負荷率が少なくとも５％になるように、水と混ぜ合わせることもある。そのスラリーにオートクレーブ処理を行い、冷却し、次いで、酵素の反応混液を使用した酵素加水分解により糖化を行ってもよいが、この酵素には、エンド-キシラナーゼお
よびβ-キシロシダーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ、ヘミセルラーゼ活性が含まれるが、これらに限定されない。一態様では、酵素の反応混液には、ＮＯＶＯＺＹＭＥ（登録商標）酵素が含まれる。使用する用量には、ＣＥＬＬＩＣＣＴＥＫ（登録商標）６％（グルカン１ｇ当たり）、ＣＥＬＬＩＣＣＴＥＫ（登録商標）０．３％（全固形分１ｇ当たり）、ＮＯＶＯＺＹＭＥ  ９６０（登録商標）０．１５％（全固形分１ｇ当たり）が含まれることもある。糖化は、約１２時間〜約２４時間、４０℃〜約５０℃、約１５０ｒｐｍ〜約２００ｒｐｍで実施して、繊維およびオリゴ糖を単糖に可溶化してもよい。次いで、温度を約３０℃〜約３７℃に、いくつかの実施形態では約３５℃に下げてもよく、スラリーに、本微生物の２４時間培養物を２％（ｖ／ｖ）接種してもよい。スラリーに０．５Ｌ／Ｌ／分で通気を行ってもよく、インキュベーションは、糖利用が終了するまでか、または約９６時間〜約１２０時間継続してもよい。フェドバッチ変換では、糖化および／または微生物変換局面中に、押し出した供給原料をより多く添加してもよい。
【００５８】
いくつかの実施形態では、たとえば、不必要な菌株の混入を避けるために、変換微生物の接種の前に、供給原料および／または押出し物を１つまたは複数の抗生物質（たとえば、テトラサイクリン、ペニシリン、エリスロマイシン、チロシン、バージニアマイシン、およびこれらの組合せであるが、これらに限定されない）を用いて処置することもある。
【００５９】
インキュベーション中、サンプルを６〜１２時間の間隔で取り出してもよい。ＨＰＬＣ分析用のサンプルは、沸騰させ、遠心分離し、フィルタ（例、０．２２μｍのフィルタ）に通し、オートサンプラ・バイアルに入れ、分析を行うまで凍結させてもよい。いくつかの実施形態では、ＷＡＴＥＲＳ  ＨＰＬＣシステムを使用することにより、炭水化物および有機溶媒についてサンプルをアッセイすることがあるが、他のＨＰＬＣシステムを使用することもできる。微生物群を評価するために、サンプルの平板計数または血球計数器計数を行ってもよい。国立再生可能エネルギー研究所（ＮＲＥＬ）の手順を使用することにより、セルロース、ヘミセルロース、およびペクチンのレベルについてサンプルをアッセイすることもできる。
【００６０】
[食餌調合物]
いくつかの例示的実施形態では、変換を経た変換培養物から回収した高品質濃縮タンパク質を、食餌調合物中で使用する。いくつかの実施形態では、回収した高品質濃縮タンパク質（ＨＱＰＣ）が、食餌調合物中の主要なタンパク源になる。食餌調合物中のタンパク源の割合は限定されず、２４〜８０％のタンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、高品質濃縮タンパク質（ＨＱＰＣ）は、総食餌調合物タンパク源の約５０％超、約６０％超、または約７０％超である。回収したＨＱＰＣは、フィッシュミール、大豆ミール、小麦粉、小麦グルテン、濃縮小麦、トウモロコシ粉、トウモロコシグルテン、濃縮トウモロコシなどのタンパク源、および、血粉、家禽ミール、羽毛粉などの動物性副産物の代用とすることができる。回収したＨＱＰＣを使用する食餌調合物は、残りの栄養素要件
を適宜満たすように、ミネラル・プレミックスやビタミン・プレミックスなどの補助剤を含んでもよい。
【００６１】
特定の実施形態では、高品質濃縮タンパク質食餌調合物に依存する動物の成長、食餌転換、タンパク効率、生存率を、フィッシュミールなどの対照食餌調合物での食餌による動物のものと比較することにより、高品質濃縮大豆タンパク質（ＨＱＳＰＣ）や高品質ＤＤＧＳ（ＨＰ‐ＤＤＧＳ）などのＨＱＰＣの性能を測定することができる。いくつかの実施形態では、それぞれのテスト調合物が、均一なタンパク含有量、脂質含有量、およびエネルギー含有量を有する。たとえば、動物が魚である場合、内蔵（脂肪沈着）特性、臓器（肝臓、脾臓）特性、ドレスアウト割合（dress-out percentage）、および身の近似分析、ならびに、腸組織構造（腸炎）を測定して、食餌反応を評価することができる。
【００６２】
理解されるであろうが、回収したＨＱＰＣを含有する個々の食餌調合物は、様々な種類の動物について最適化することができる。いくつかの実施形態では、動物が、商業水産養殖で成育された魚である。食餌調合物を最適化する方法は、周知のものであり、当業者には、過度の実験なく容易に確認可能である。
【００６３】
様々な動物種についての既知の栄養素要件に従って、ＨＱＰＣを使用して完全な育成食餌を調合することができる。いくつかの実施形態では、本調合物をイエローパーチに使用することもできる（例、タンパク質４２％、脂質８％）。いくつかの実施形態では、本調合物をニジマスに使用することもできる（例、タンパク質４５％、脂質１６％）。いくつかの実施形態では、本調合物を先に述べた動物のうちのいずれか１つに使用することもできる。
【００６４】
微量栄養素の要件が満たされることを確実にするために、植物ベースの餌のための基礎ミネラル・プレミックスおよび基礎ビタミン・プレミックスを使用することもできる。（分析により必要とみなされた）任意の補助剤を、補助剤なしの同一の調合物との比較を行うことにより評価することもでき、こうすることで、補助剤効果を考慮に入れるために、食餌供給試験を要因分析にて行うこともできる。いくつかの実施形態では、食餌供給試験は、フィッシュミールをベースとした対照餌ならびにＥＳＰＣベースの基準餌およびＬＳＰＣベースの基準餌を含んでもよい［従前のＳＰＣ（ＴＳＰＣ）を溶媒洗浄大豆フレークから生産して、水溶性炭水化物を取り出し、ＴＳＰＣを高温多湿下で押し出すことで組織化ＳＰＣ（ＥＳＰＣ）を生産し、処理中に溶媒洗浄液および温度を変化させることにより、ＴＳＰＣから低抗原性ＳＰＣ（ＬＳＰＣ）を生産する］。食餌供給試験用のペレットを、実験室規模の単一スクリュー押出し機（例、Brabender Plasti-corder Extruder Model
PL2000）を使用して生産してもよい。
【００６５】
[食餌供給試験]
いくつかの実施形態では、処置ごとの（すなわち、実験用食餌と対照食餌とのブレンド物）４つの実験単位の複製を使用することもある（たとえば、それぞれ約６０〜１２０日ごと）。試験は、固体サンプ（solids sump）、バイオリアクタ、ならびにフィルタ（１
００μｍバッグ・フィルタ、炭素フィルタ、および紫外線フィルタ）からなり、遠心ポンプにより駆動される閉ループ再循環システムに並列に接続した１１０Ｌ円形タンク（タンクごとに２０匹の魚）内で実施してもよい。生物種特有の成長に最適な温度を維持するために、必要に応じてヒート・ポンプを使用してもよい。全てのシステムにおいて、水質（例、溶存酸素、ｐＨ、温度、アンモニア、および窒素）をモニタしてもよい。
【００６６】
いくつかの実施形態では、実験餌を魚のサイズに応じて供給し、１日に２〜５回の食餌供給に分けてもよい。１〜４週間（魚のサイズおよび試験期間による）で行う全質量測定で、成長性能を求めてもよい。飽和食餌供給を可能にするために、また、廃物の流れを低
減するために、増加に応じて分配量を調整してもよい。個々のタンクから得られる残った食餌を集めたものから、隔週で消費量を評価してもよい。残った食餌を常温に乾燥し、冷却し、重さを量って、食餌転換率を見積もることができる。タンパク質消化率およびエネルギー消化率を、各実験の中間時点に手で取り除いた糞便物質、または１度の食餌試験の終わりに検剖により下部腸管から手で取り除いた糞便物質から求めることもできる。生存率、体重増加、成長速度、健康指標、食餌転換、タンパク質消化率、エネルギー消化率、およびタンパク効率を処置群間で比較することができる。剖検を行った魚の近似分析を行って、食餌処置間で身の組成を比較することもできる。食餌供給試験の対象次第では、アミノ酸および脂肪酸の分析を身成分について必要に応じて行ってもよい。食餌処置の食餌供給試験の反応を、対照（例、フィッシュミール）餌反応と比較して、ＨＱＰＣ餌の性能が対照の反応と合致しているかどうか、またはそれを超えているかどうかを確認することができる。
【００６７】
餌反応および食餌供給試験反応の統計分析は、「ａ  ｐｒｉｏｒｉ  α＝０．０５」を用いて完成させることもできる。処置間での性能パラメータの分析は、必要に応じて、分散または共分散の適切な分析（Ｐｒｏｃ  Ｍｉｘｅｄ）および事後多重比較（post hoc multiple comparisons）で実施することもできる。魚性能および組織反応の分析を、非線
形モデルで評価することもできる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本開示内容は、たとえばＧＲＡＳステータスの微生物を使用することにより、大豆フレーク／大豆ミールまたはＤＤＧＳ中の繊維および他の炭水化物を更なる炭水化物に変換することを提案する。押し出した食餌ペレットの調整を容易にすることのできる微生物エキソポリサッカライド（すなわち、ガム）を生産することもでき、これにより、結合剤が必要なくなる。この微生物ガムは、免疫促進活性をもはたして、ストレッサ由来の一般的な病原体から魚を防御する先天的防御メカニズムを活性化することもできる。伝染病による経済的損失を軽減し、抗生物質の使用を最小限に抑えるために、βグルカン、細菌産物、植物成分などの免疫予防物質の商業食餌での使用が増加している。本開示内容の微生物は、細胞外ペプチダーゼも生産するが、これにより、代謝中のトウモロコシ・タンパク質の消化率および吸収率が増加するはずであり、したがって、より高い食餌効率および歩留まりが実現される。本明細書で開示するように、本微生物インキュベーション・プロセスは、ＳＰＣおよびフィッシュミールよりも廉価な単位当たりタンパク質であり、価値のある、維持可能な水産養殖食餌を提供する。
【００６９】
開示しているように、本微生物は、大豆フレーク／大豆ミールまたはＤＤＧＳ中の個々の炭水化物を代謝させて、細胞塊（タンパク質）と微生物ガムとの両方を生産することができる。これらの微生物の様々な株は、繊維分解を増進する。本発明の微生物は、大豆タンパク質およびトウモロコシ・タンパク質をより消化しやすいペプチドおよびアミノ酸に変換することもできる。いくつかの実施形態では、以下の行為を行うこともある。１）前処置を施した大豆タンパク質、油糧種子タンパク質、ＤＤＧＳなどを変換するときの本開示内容の選択微生物の使用効率を求め、タンパク質濃度が少なくとも４５％である高品質濃縮タンパク質（ＨＱＰＣ）を生産し、２）フィッシュミールに代用する際のＨＱＰＣの有効度を評価する。いくつかの実施形態では、大豆、油糧種子、およびＤＤＧＳの前処置および変換条件を最適化して、微生物の性能および頑健性を改善し、特定範囲の商業的に重要な魚類について、結果として得られる育成食餌をテストし、プロセス・コストおよびエネルギー要件を検証し、スケールアップおよび商業化のためのステップを完成させることもできる。いくつかの実施形態では、本開示内容のＨＱＰＣは、フィッシュミールの少なくとも５０％と入れ換えることが可能であり、成長速度および変換効率を増大させる。生産コストは、商用濃縮大豆タンパク質（ＳＰＣ）よりも小さいはずであり、（水揚げを含めた）フィッシュミールよりも実質的に小さいはずである。
【００７０】
図１および図２は、植物ベースの生産物の前処置における本開示内容の手法を示し、糖を細胞塊（タンパク質）およびガムに変換することと、ＨＱＳＰＣを回収し、水産食餌を生成することと、結果として得られた水産食餌を魚食餌供給試験にてテストすることとを示す。
【００７１】
押出し前処置の後、糖を生成するために、セルロース分解酵素を評価することもあるが、本開示内容の微生物は、タンパク質およびガムに変換することができる。いくつかの実施形態では、これらの酵素の逐次的省略およびセルロース分解性微生物との共培養の評価を使用することもある。ガムを沈殿させ、ＨＱＰＣの遠心回収率を改善するために、エタノールを評価してもよい。乾燥の後、ＨＱＰＣを、実際の餌調合物に組み入れてもよい。いくつかの実施形態では、テスト育成餌を（ミネラル・プレミックスおよびビタミン・プレミックスと）調合し、たとえばイエローパーチまたはニジマスなどの商業的に重要な魚を用いた食餌供給試験において、フィッシュミール対照餌および商用ＳＰＣ（ＳＰＣは、オリゴポリサッカライドならびに抗原物質のグリシンおよびβコングリシンの痕跡を含有するので、大豆ミールとは明らかに異なる）餌との比較を行うこともできる。性能（例、成長、食餌転換、タンパク効率）、内蔵特性、および腸組織構造を調べて、魚の反応を評価してもよい。
【００７２】
他の実施形態では、プロセス投入量を最小限に抑えながら最適な前処置および変換条件を求め、微生物の性能および頑健性を改善し、特定範囲の商業的に重要な魚類について、結果として得られる育成食餌をテストし、プロセス・コストおよびエネルギー要件を検証し、スケールアップおよび商業化のための初期ステップを完成させることにより、ＨＱＰＣ生産プロセスの最適化を実施することもできる。
【００７３】
ここ何年かに、いくらかの設備が、エタノール生産プロセスの前にトウモロコシの外皮および胚芽を取り除く乾式製粉機能を設置した。このドライ分別プロセスでは、タンパク質が最大で４２％のＤＤＧＳ（以降、ドライ分別ＤＤＧＳと称する）がもたらされる。いくつかの実施形態では、パーチへの食餌供給試験での使用のための十分な量の高タンパクＤＤＧＳ（ＨＰ‐ＤＤＧＳ）を急速に生成するように予め求めた条件の下で、従前のＤＤＧＳとドライ分別ＤＤＧＳとを比較することもできる。いくつかの実施形態では、（化学組成の変化による）この変換の性能の慎重な監視を行い、ＨＰ‐ＤＤＧＳの品質に最も優れた影響を与えるパラメータを特定する。いくつかの実施形態では、低油ＤＤＧＳを変換のための基質として使用することもできるが、こうした低油ＤＤＧＳは、従前のＤＤＧＳよりも高いタンパク質レベルを有する。一関連態様では、低油ＤＤＧＳは、従前のＤＤＧＳと比較して、オーレオバシディウム・プルランスの成長速度を増大させる。
【００７４】
いくつかの団体が、大豆ミールやＤＤＧＳなどの植物由来タンパク質とのフィッシュミールの部分的な置換えを評価している。しかし、タンパク含有量がより低く、アミノ酸バランスが不適当であり、栄養分吸収阻止要素が存在することで、置換えレベルが２０〜４０％に限定されている。予備的な成長試験では、現在のＤＤＧＳまたはＳＰＣベースの餌で、フィッシュミール対照餌と同様の性能をもたらすもなはないことが示されている。商用生産されたＤＤＧＳおよびＳＰＣにはいくつかの不足が特定されており、これは主として、タンパク質およびアミノ酸組成の点においてであるが、これにより、成長性能および魚の組成に多様性が与えられる。しかし、栄養補助剤を含有する（全ての要件を満たすかまたは超えるように調合した）本明細書に開示するＨＰ‐ＤＤＧＳおよびＨＱＳＰＣ餌は、フィッシュミール対照と同様であるか、またはそれを超える成長結果を示している。したがって、本明細書に開示するプロセス、およびそれから発展させた生産物は、（栄養要件に対して）より高品質のＨＱＳＰＣまたはＨＰ−ＤＤＧＳをもたらし、フィッシュミールを含有する餌と同等か、またはそれよりも良好な成長性能を支持する。
【００７５】
本開示内容の魚食餌組成物を与えることのできる魚には、以下の魚およびその組合せが含まれるが、これらに限定されない。シベリアチョウザメ、スターレットチョウザメ、シロチョウザメ、ピラルク、日本ウナギ、アメリカウナギ、ショートフィンウナギ、ロングフィンウナギ、ヨーロッパウナギ、サバヒー（Chanos chanos）、ミルクフィッシュ、ブ
ルーギルサンフィッシュ、グリーンサンフィッシュ、ホワイトクラッピー、ブラッククラッピー、Ａｓｐ、カトラ、金魚、ヨーロッパフナ（Crucian carp）、ケンヒー（Mud carp）、ムリガルカープ（Mrigal carp）、草魚（Grass carp）、コイ（Common carp）、シルバーカープ（Silver carp）、コクレン（Bighead carp）、オレンジフィンラベオ（Orangefin labeo）、ロホラベオ（Roho labeo）、ホベンスカープ（Hoven's carp）、ウーチャンブリーム（Wuchang bream）、真鯉、ゴールデンシャイナー、ニレムカープ（Nilem carp）、ホワイトアムールブリーム（White amur bream）、タイシルバーバルブ（Thai silver barb）、ジャワ（Java）、ローチ（Roach）、テンチ（Tench）、ポンドローチ（Pond loach）、ボカチコ（Bocachico）、ドラダ（Dorada）、カチャマ（Cachama）、カチャマ
ブランカ（Cachama Blanca）、パコ（Paco）、ブラックブルヘッド（Black bullhead）、ブチナマズ、バグリッドナマズ（Bagrid catfish）、ブルーキャットフィッシュ、ヨーロッパオオナマズ（Wels catfish）、パンガシウス(Swai、Tra、Basa)キャットフィッシュ
、ゴンズイ（Striped catfish）、泥魚、フィリピンキャットフィッシュ（Philippine catfish）、ホンコンキャットフィッシュ（Hong Kong catfish）、北アフリカキャットフィッシュ（North African catfish）、ビッグヘッドキャットフィッシュ、サンパ（Sampa）、南アメリカキャットフィッシュ（South American catfish）、アティパ（Atipa）、ノ
ーザンパイク、アユスィートフィッシュ（Ayu sweetfish）、シロマス、ホワイトフィッ
シュ、ピンクサーモン、シロサケ、ギンザケ、サクラマス、ニジマス、ベニマス、キングサーモン、大西洋サケ、シートラウト（Sea trout）、アルプスイワナ、ブラウントラウ
ト、レイクトラウト、大西洋タラ、ペヘレイ、レイ（Lai）、カモンスヌーク（Common snook）、バラマンディ／アジアシーバス、ナイルアカメ、マーレーコッド、ゴールデンパ
ーチ、シマスズキ、ホワイトバス、ヨーロピアンシーバス、ホンコンハタ、オオモンハタ、グリーシーハタ（Greasy grouper）、スポッテドコラルグルーパ（Spotted coralgrouper）、シルバーパーチ、ニシスズキ、ジェイドパーチ（Jade perch）、オオクチバス、コクチバス、ヨーロピアンパーチ、ザンダー（カワカマス）、イエローパーチ、ソーガー（Sauger）、ウォールアイ、アミキリ、カンパチ、ブリ、スナッブノーズポンパノ（Snubnose pompano）、フロリダポンパノ（Florida pompano）、パロメータポンパノ（Palometa pompano）、マアジ、スギ、ゴマフエダイ、イエローテイルスナッパー（Yellowtail snapper）、ダークシーブリーム（Dark seabream）、ホワイトシーブリーム（White seabream）、レッドシーブリーム（Red seabream）、レッドポーギー、ヘダイ、ゴウシュウマダイ、レッドドラム、グリーンテラー（Green terror）、ブラックベルトカワスズメ（Blackbelt cichlid）、ジャガーガポーテ（Jaguar guapote）、メキシコクロサギ（Mexican mojarra）、パールスポット（Pearlspot）、スリースポッテドテラピア（Three spotted tilapia）、ブルーテラピア（Blue tilapia）、ロングフィンテラピア（Longfin tilapia）
、モザンビークテラピア（Mozambique tilapia）、ナイルテラピア（Nile tilapia）、テラピア、ワミテラピア（Wami tilapia）、ブラックチンテラピア（Blackchin tilapia）
、レッドブレストテラピア（Redbreast tilapia）、レッドベリーテラピア（Redbelly tilapia）、ゴールデングレイマレット（Golden grey mullet）、ラージスケールマレット
（Largescale mullet）、ゴールドスポットマレット（Gold-spot mullet）、シンリップ
グレイマレット（Thinlip grey mullet）、リーピングマレット（Leaping mullet）、テ
ードマレット（Tade mullet）、フラットヘッドグレイマレット（Flathead grey mullet
）、ホワイトマレット（White mullet）、レブランシュマレット（Lebranche mullet）、パシフィックファットスリーパー（Pacific fat sleeper）、マーブルゴビー、ホワイト
スポッテドスピンフット（White-spotted spinefoot）、ゴールドラインドスピンフット
（Goldlined spinefoot）、マーブルドスピンフット（Marbled spinefoot）、ミナミマグロ、タイセイヨウクロマグロ、キノボリウオ、スネークスキングラミー、キッシンググラ
ミー、ジャイアントグラミー、スネークヘッド、インドネシアンスネークヘッド（Indonesian snakehead）、スポッテドスネークヘッド（Spotted snakehead）、ストライプトス
ネークヘッド（Striped snakehead）、ターボット、ヒラメ（Bastard halibut、Japanese
flounder）、サマーフラウンダー、サザンフラウンダー（Southern flounder）、フユヒラメ、タイセイヨウオヒョウ、グリーンバックフラウンダー（Greenback flounder）、コモンソール（Common sole）。
【００７６】
当業者は、たとえば抗菌剤などの薬学上活動的な物質、細菌汚染またはウイルス感染に対するワクチンを含めた免疫学上活動的な物質、およびこれらの物質の任意の組合せのための好都合な担体として本開示内容の魚食餌組成物を使用することができることを理解するであろう。
【００７７】
本開示内容による魚食餌組成物は、液体もしくは注ぐことのできるエマルジョンとして、または、ペーストの形、もしくは、たとえば粒状体、ペレット、パウダー、フレークなど乾燥させた形で提供することもできる。魚食餌組成物をエマルジョン、水中脂質型エマルジョンとして提供する場合、それは相対的に濃縮された形であることもある。こうした濃縮エマルジョンの形は、１つまたは複数の工程において水性媒体中で希釈して、生体のための最終的な強化培地を提供することもあるので、プレエマルジョン（pre-emulsion）と称することもある。
【００７８】
いくつかの実施形態では、開示する微生物ベースのプロセス用のセルロース含有出発物質はトウモロコシである。トウモロコシは、約３分の２のスターチであり、これを、発酵および蒸留のプロセス中にエタノールおよび二酸化炭素に変換する。残留する栄養物または発酵産物は、ＤＤＧＳなどの濃縮された蒸留器可溶物または蒸留器グレインをもたらすことがあり、これは食餌生産物中で使用可能である。一般には、本プロセスは、トウモロコシを乾式製粉または粉砕する初期準備工程を含む。次いで、糖化工程で、処理を行ったトウモロコシを加水分解し、酵素を添加して主要なスターチ成分を壊す。次の発酵工程は、二酸化炭素などの気体生成物を生成するために本開示内容の一実施形態に従って提供される微生物（例、イースト）を添加することで進めることが可能である。発酵は、発酵ブロスから蒸留することの可能なエタノールの生成のために行う。次いで、発酵培地の残りを乾燥させて、ＤＤＧＳを含んだ発酵生産物を生産することが可能である。この工程は通常、固相成分を収集することが可能である遠心分離による固体／液体分離プロセスを含む。こうした分離を成し遂げるために、濾過技法およびスプレードライ技法を含んだ他の方法を用いることもできる。その後、更に液相成分を蒸発工程にかけることができるが、この蒸発工程では、糖、グリセロール、アミノ酸などの可溶性副産物を、シロップまたは濃縮トウモロコシ可溶物（ＣＣＳ）と呼ばれる材料に濃縮することが可能である。次いで、ＣＣＳを固相成分と再結合させて、インキュベーション生産物（ＤＤＧＳ）として乾燥させることが可能である。乾式製粉に基づく新規のまたは既存のエタノール工場に本組成物を適用して、価値の高まった発酵産物を生成する統合エタノール生産プロセスを提供することが可能であることが理解されるはずである。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本開示内容に従って生産されたインキュベーション生産物は、従前の発酵産物よりも高い商業的価値を有する。たとえば、本インキュベーション生産物は、アミノ酸および微量栄養素含有量が改善された強化した乾燥固体を含むことができる。したがって、暗色のＨＱＳＰよりも高いアミノ酸消化率を概ね示す「黄金色」の生産物を提供することが可能である。たとえば、一般に栄養価がより低くなっている相対的に暗い色をした生産物と比較して、本明細書に記載の実施形態によれば、リジン濃度が増大した明るい色のＨＱＳＰを生産することができる。生産物の色は、発酵産物またはＨＱＳＰの品質および栄養物消化率を評価する際に、重要な要素または指標になることがある。色は、乾燥中の過剰な熱へのさらしの指標として使用されるが、過剰な熱にさらすと、遊
離アミノ基および糖のカラメル化反応およびメイラード反応が引き起こされ、これにより、一部のアミノ酸の品質が低下する。
【００８０】
乾式製粉または粉砕エタノール作製プロセスの基礎的な工程は、トウモロコシまたは他の穀物生産物の製粉または粉砕、糖化、発酵、および蒸留と言うこともできる。たとえば、選択したホールコーンの穀粒を、一般にはハンマー・ミルまたはローラ・ミルで製粉または粉砕することができる。粒子の寸法は、加熱時の加水反応および後の酵素変換に影響を与える可能性がある。次いで、製粉または粉砕したトウモロコシを水と混ぜて、加熱および冷却を行うマッシュを作ることも可能である。この糊化スターチの粘度を低減するために、この変換の初期工程中に酵素を含めることが有効である場合もある。次いで、混合物を糖化リアクタに移送し、１４０°Ｆなど選択した温度で維持してもよいが、ここで、スターチは、糖化酵素の添加によりグルコースやマルトースなどの発酵性糖に変換される。変換したマッシュを８４°Ｆなどの所望の温度に冷却し、発酵リアクタに供給することができるが、この発酵リアクタにて、発酵性糖は、本開示内容に従って提供される微生物の選択株を使用することで二酸化炭素に変換され、これにより、サッカロミセス・イースト（Saccharomyces yeast）など、より従前の成分と比較して、より栄養的な発酵産物が
もたらされる。結果として得られる生産物を蒸発させて二酸化炭素を分離し、この結果得られる液体を、蒸留塔およびストリップ塔からなる回収システムに供給することが可能である。エタノールの流れをモレキュラーシーブに向けることも可能であるが、ここで、残っている水が、吸着技術を使用することで取り除かれる。精製エタノールを少量のガソリンで変性させたものにより、燃料グレードエタノールを生産することが可能である。初期の蒸留エタノールを更に浄化して不純物を除去することにより他の生産物を生産することも可能であり、これにより、燃料以外の使用向けの約９９．９５％のエタノールが得られる。
【００８１】
蒸留廃液全体を蒸留ユニットの底から取り出し、遠心分離して、蒸留器ウェット・グレイン（ＤＷＧ）および希薄蒸留廃液(液体)を作ることも可能である。ＤＷＧは、湿分５５〜５６％で遠心分離を終了させてもよく、家畜の餌として湿った状態で販売すること、または、本開示内容に従って提供される強化した発酵産物として乾燥させることができる。これらの生産物は、本明細書で蒸留器ドライド・グレイン（ＤＤＧ）と称することもある強化した最終生産物を含む。蒸発器を使用することにより、希薄蒸留廃液（液体）を濃縮して、蒸留器可溶物を形成することも可能であり、この可溶物を、蒸留器グレイン・プロセスの流れに戻して、プロセスと組み合わせ、乾燥させることが可能である。本開示内容の実施形態によるこうした組み合わせた生産物を、アミノ酸および微量栄養素含有量の増大した強化発酵産物とみなすこともできる。本明細書に示すもの以外の当技術分野で知られる他の発酵プロセスに、本開示内容の様々な概念を適用することができることを理解されたい。
【００８２】
本発明の他の態様は、以下に示す栄養分の濃度が高まったことを特徴とする微生物を含んだ栄養分の濃度が高まった完全なフィッシュミール組成物を対象とする。その栄養分とは、脂肪、脂肪酸、リン脂質などの脂質、ビタミン、必須アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ステロール、酵素、および、鉄、銅、亜鉛、マンガン、コバルト、ヨウ素、セレニウム、モリブデン、ニッケル、フッ素、バナジウム、スズ、ケイ素などのトレースミネラル、ならびにこれらの組合せなどであるが、これらに限定されない。
【００８３】
本開示内容のインキュベーション・プロセスでは、微生物を用いて炭素源を加水分解して成分糖にして、アルコールおよび他の気体生成物を作ることもできる。気体生成物は二酸化炭素を含み、アルコールはエタノールを含む。本インキュベーション・プロセスの後に得られるインキュベーション生産物には、一般的により高い商業的価値がある。いくつかの実施形態では、本インキュベーション生産物は微生物を含有しており、この微生物は
、こうした微生物を欠いた生産物よりも高い栄養素量を有する。この微生物は、インキュベーション・システムであるインキュベーション・ブロスおよび／またはインキュベーション・バイオマス中に存在することもある。このインキュベーション・ブロスおよび／またはインキュベーション・バイオマスを乾燥（例、スプレードライ）させて、栄養素量の高まったインキュベーション生産物を作ることもできる。
【００８４】
たとえば、インキュベーション・プロセスの後に回収される乾燥した使用済み固体を、本開示内容に従って強化する。これらのインキュベーション生産物は、概ね、無毒性で、生物分解可能であり、容易に入手可能であり、廉価で、栄養分が豊富である。食餌または栄養分補助剤としての使用向けの低毒性または無毒性のインキュベーション生産物を作るためには、微生物およびインキュベーション条件の選択が重要である。グルコースは、穀類からのスターチの加水分解から生産される主要な糖であるが、炭水化物中で通常作られる唯一の糖というわけではない。多量の非スターチの炭水化物を含有する（たとえば、中性デタージェント繊維として測定されるセルロースおよびアラビノキシンを乾燥重量で３５％も含有する）、従前の乾式製粉エタノール生産プロセスから作られるＳＰＣまたはＤＤＧとは異なり、非スターチの炭水化物の酵素加水分解で生産され、栄養素を濃縮した本インキュベーション生産物は、非反芻動物にとって、より味が好ましく、消化がしやすい。
【００８５】
本開示内容の栄養分濃縮インキュベーション生産物は、重量で少なくとも約１％〜約９５％の栄養素量を有することがある。好ましくは、栄養素量は、重量で少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、および７０％〜８０％の範囲である。利用可能な栄養素量は、食餌を与える動物、食餌の残りの成分の状況、および動物寿命における段階に依存することがある。たとえば、肉牛が必要とするヒスチジンは、泌乳牛よりも少ない。動物への食餌供給のための適当な栄養素量の選択は、当業者にとって周知のことである。
【００８６】
本インキュベーション生産物は、スプレードライを行ったバイオマス生産物として調製することもできる。任意選択で、本バイオマスは、遠心分離、濾過、セパレーション、デキャンティング、セパレーションとデキャンティングとの組合せ、限外濾過、精密濾過などの周知の方法で分離することができる。本バイオマス・インキュベーション生産物は、ルーメン・バイパスを容易にするように更に処置することができる。いくつかの実施形態では、バイオマス生産物を、インキュベーション培地から分離し、スプレードライを行い、ルーメン・バイパスを調整するように任意選択で処置し、栄養源として供給するために添加してもよい。栄養的に濃縮したインキュベーション生産物を、微生物を含むインキュベーション・プロセスにて生産するのに加えて、この栄養的に濃縮したインキュベーション生産物を、遺伝子導入植物システムにて生産することもできる。遺伝子導入植物システムを作る方法は、当技術分野では周知のものである。あるいは、微生物宿主が栄養性含有物を排出する場合、本インキュベーションで生産したバイオマスから栄養的に濃縮したブロスを分離し、浄化ブロスを、たとえば液体またはスプレードライした形の動物食餌原料として使用することもできる。
【００８７】
微生物を使用した本インキュベーション・プロセスの後に得られるインキュベーション生産物を、動物食餌または人間への食品補助剤として使用することができる。このインキュベーション生産物は、非動物源（例、バクテリア、イースト、および／または植物）由来の強化栄養性含有物を有する少なくとも１つの原料を含む。具体的には、本インキュベーション生産物は、脂肪、脂肪酸、リン脂質などの脂質、ビタミン、必須アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ステロール、酵素、および、鉄、銅、亜鉛、マンガン、コバルト、ヨウ素、セレニウム、モリブデン、ニッケル、フッ素、バナジウム、スズ、ケイ素などのトレースミネラルのうちの少なくとも１つまたは複数が豊富である。いくつかの
実施形態では、ペプチドが少なくとも１つの必須アミノ酸を含有する。他の実施形態では、必須アミノ酸を、インキュベーション反応で使用する主体操作を行った微生物中に封入する。いくつかの実施形態では、必須アミノ酸が、微生物により発現される異種ポリペプチドに含有される。必要に応じて、異種ポリペプチドを発現させ、適当な微生物（例、真菌）中の封入体の中に蓄える。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本インキュベーション生産物は、高い栄養素含有量を有する。したがって、より高い割合の本インキュベーション生産物を、完成した動物食餌中で使用することができる。いくつかの実施形態では、食餌組成物が、インキュベーション生産物を重量で少なくとも約１５％含む。ある完成した食餌または餌では、この材料が、他の材料とともに供給されることとなる。この他の材料の栄養素含有量、および／または、食餌を提供する動物の栄養要件次第では、その改変型インキュベーション生産物の範囲が、食餌の１５％〜１００％になることもある。いくつかの実施形態では、高い栄養素含有量に起因して、本インキュベーション生産物のブレンドの割合がより低くなることもある。他の実施形態では、本インキュベーション生産物は、たとえば７５％を越える、食餌供給の非常に高い割合を提供することもある。いくつかの適当な実施形態では、本食餌組成物が、本インキュベーション生産物を少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または、少なくとも約７５％含む。一般には、本食餌組成物は、インキュベーション生産物を重量で少なくとも約２０％含む。より一般には、本食餌組成物は、インキュベーション生産物を重量で少なくとも約１５〜２５％、２５〜２０％、２０〜２５％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、または６０％〜７０％含む。必要に応じて、本インキュベーション生産物を、食餌の唯一の原料として使用することもできる。
【００８９】
完成したフィッシュミール組成物は、たとえば体重増加および動物の健康の全般的な改善などの様々な目的のために、１つまたは複数の必須アミノ酸について高まったアミノ酸含有量を有することがある。完成したフィッシュミール組成物は、インキュベーション生産物中の遊離アミノ酸の存在、および／または必須アミノ酸を含んだタンパク質もしくはペプチドの存在に起因して、高まったアミノ含有量を有することもある。必須アミノ酸は、アルギニン、システイン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、タウリン、トリプトファン、および／またはバリンを含むことがあり、これらは、遊離アミノ酸として、または、選択したアミノ酸が豊富であるタンパク質もしくはペプチドの一部分として完成した動物食餌中に存在することもある。必須アミノ酸が豊富な少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質が、このペプチドもしくはタンパク質中の全アミノ酸残基につき少なくとも１％の必須アミノ酸残基、このペプチドもしくタンパク質中の全アミノ酸残基につき少なくとも５％の必須アミノ酸残基、または、このタンパク質中の全アミノ酸残基につき少なくとも１０％の必須アミノ酸残基を有することがある。栄養素のバランスの取れた餌を動物に与えることにより、栄養性含有物が最大限に使用され、これにより、同等の成長速度、産乳量を達成するのに必要な餌の量が低減され、すなわち、排出物中に存在する栄養物が減少して、老廃物のバイオバーデンが低減される。
【００９０】
必須アミノ酸の含有量が高まった完成したフィッシュミール組成物が、粗タンパク質の重量および全アミノ酸含有量に対して、少なくとも２．０ｗｔ％の必須アミノ酸含有量（タンパク質またはペプチド中に存在する遊離必須アミノ酸および必須アミノ酸を含む）を有することがあり、より適切には、粗タンパク質の重量および全アミノ酸含有量に対して、少なくとも５．０ｗｔ％の必須アミノ酸含有量を有することがある。この完成したフィッシュミール組成物は、脂肪、脂肪酸、リン脂質などの脂質、ビタミン、炭水化物、ステロール、酵素、およびトレースミネラルを含む（ただしこれらに限定されない）微生物に
由来する他の栄養素を含む。
【００９１】
完成したフィッシュミール組成物には、完成した食餌形状の組成物、濃縮物形状の組成物、ブレンダ形状の組成物、基礎形状の組成物が含まれることがある。組成物が、完成した食餌の形状である場合、栄養素がインキュベーション生産物中の微生物から得られる場合の百分率で表した栄養素レベルは、約１０％〜約２５％であることがあり、より適切には、約１４％〜約２４％であることがある。一方、組成物が、濃縮物の形状である場合、栄養素レベルは、約３０％〜約５０％であることがあり、より適切には、約３２％〜約４８％であることがある。組成物が、ブレンダの形状である場合、組成物中の栄養素レベルは、約２０％〜約３０％であることがあり、より適切には、約２４％〜約２６％であることがある。組成物が、基礎混合物の形状である場合、組成物中の栄養素レベルは、約５０％〜約６５％であることがある。本明細書中で特に言及しない限り、百分率は、重量パーセントに基づき記載している。ＨＱＰＣは、たとえばＬｙｓなどの単一の栄養素が高ければ、補助剤として使用される割合は低い。ＨＱＰＣは、たとえばビタミンＡやビタミンＢなどのビタミンとアミノ酸とのバランスが取れていれば、より完璧な食餌となり、より高い割合で食餌として供給され、トウモロコシの茎や葉などの低タンパクで、栄養素の低い供給原料を補充される。
【００９２】
本フィッシュミール組成物は、少なくとも約２％の必須アミノ酸含有量を有するインキュベーション生産物中に存在するペプチドまたは粗タンパク分画を含むこともある。いくつかの実施形態では、ペプチドまたは粗タンパク分画が、必須アミノ酸含有量を少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％有することがあり、いくつかの実施形態では、少なくとも約５０％有することがある。いくつかの実施形態では、ペプチドが、１００％必須アミノ酸であることもある。一般には、本フィッシュミール組成物は、必須アミノ酸含有量が最大で約１０％であるインキュベーション生産物中に存在するペプチドまたは粗タンパク分画を含むことがある。より一般には、本フィッシュミール組成物は、必須アミノ酸含有量が約２〜１０％、３．０〜８．０％、または４．０〜６．０％であるインキュベーション生産物中に存在するペプチドまたは粗タンパク分画を含むこともある。
【００９３】
本フィッシュミール組成物は、少なくとも約２％のリジン含有量を有するインキュベーション生産物中に存在するペプチドまたは粗タンパク分画を含むこともある。いくつかの実施形態では、ペプチドまたは粗タンパク分画が、リジン含有量を少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％有することがあり、いくつかの実施形態では、少なくとも約５０％有することがある。一般には、本フィッシュミール組成物は、リジン含有率が最大で約１０％であるペプチドまたは粗タンパク分画を含むことがある。必要に応じて、本フィッシュミール組成物は、リジン含有量が約２〜１０％、３．０〜８．０％、または４．０〜６．０％であるペプチドまたは粗タンパク分画を含むこともある。
【００９４】
本フィッシュミール組成物は、インキュベーション生産物中に栄養素を、乾燥固体で約１ｇ／Ｋｇ〜９００ｇ／Ｋｇ含むことがある。いくつかの実施形態では、フィッシュミール組成物中の栄養素が、乾燥固体で少なくとも約２ｇ／Ｋｇ、乾燥固体で５ｇ／Ｋｇ、乾燥固体で１０ｇ／Ｋｇ、乾燥固体で５０ｇ／Ｋｇ、乾燥固体で１００ｇ／Ｋｇ、乾燥固体で２００ｇ／Ｋｇ、および、乾燥固体で約３００ｇ／Ｋｇだけ存在することがある。いくつかの実施形態では、栄養素が、乾燥固体で少なくとも約４００ｇ／Ｋｇ、乾燥固体で少なくとも約５００ｇ／Ｋｇ、乾燥固体で少なくとも約６００ｇ／Ｋｇ、乾燥固体で少なくとも約７００ｇ／Ｋｇ、乾燥固体で少なくとも約８００ｇ／Ｋｇ、および／または、乾燥固体で少なくとも約９００ｇ／Ｋｇだけ存在することがある。
【００９５】
本フィッシュミール組成物は、必須アミノ酸、または、乾燥固体で約１ｇ／ｋｇ〜９００ｇ／ｋｇの含有量を有するインキュベーション生産物中に存在する少なくとも１つの必須アミノ酸を含有するペプチドを含むことがある。いくつかの実施形態では、必須アミノ酸、または、少なくとも１つの必須アミノ酸を含有するペプチドが、フィッシュミール組成物中に、乾燥固体で少なくとも約２ｇ／Ｋｇ、乾燥固体で５ｇ／Ｋｇ、乾燥固体で１０ｇ／Ｋｇ、乾燥固体で５０ｇ／Ｋｇ、乾燥固体で１００ｇ／Ｋｇ、乾燥固体で２００ｇ／Ｋｇ、および、乾燥固体で約３００ｇ／Ｋｇだけ存在することがある。いくつかの実施形態では、必須アミノ酸、または、少なくとも１つの必須アミノ酸を含有するペプチドが、乾燥固体で少なくとも約４００ｇ／Ｋｇ、乾燥固体で少なくとも約５００ｇ／Ｋｇ、乾燥固体で少なくとも約６００ｇ／Ｋｇ、乾燥固体で少なくとも約７００ｇ／Ｋｇ、乾燥固体で少なくとも約８００ｇ／Ｋｇ、および／または、乾燥固体で少なくとも約９００ｇ／Ｋｇだけ存在することがある。
【００９６】
完成した本フィッシュミール組成物は、インキュベーション中に形成されたバイオマス形状の栄養素濃縮インキュベーション生産物と、少なくとも１つの追加の栄養成分とを含有することもある。他の例では、本フィッシュミール組成物は、溶解され、インキュベーション中に形成されたインキュベーション・ブロスから懸濁された栄養素濃縮インキュベーション生産物と、少なくとも１つの追加の栄養成分とを含有する。更なる実施形態では、本フィッシュミール組成物が、必須アミノ酸の豊富な少なくとも１つのタンパク質を含む粗タンパク分画を有する。本フィッシュミール組成物は、必須アミノ酸のバランスを改善するように調合することもできる。
【００９７】
ＤＤＧＳを含む組成物については、完成した組成物形態は、小麦ミドリング（「小麦ミッド」）、トウモロコシ、大豆ミール、トウモロコシグルテンミール、蒸留器グレインまたはＤＧＳ、塩、マクロミネラル、トレースミネラル、およびビタミンなどの１つまたは複数の材料を含有することがある。考えられる他の材料は一般に、ヒマワリミール、麦芽および大豆皮を含むこともある、これらに限定されない。ブレンダ形状組成物は、小麦ミドリング、トウモロコシグルテンミール、蒸留器グレインまたはＤＧＳ、塩、マクロミネラル、トレースミネラル、およびビタミンを含有することがある。他に使用可能な材料は一般に、トウモロコシ、大豆ミール、ヒマワリミール、綿実ミール、麦芽、および大豆皮を含むが、これらに限定されない。基礎形状の組成物は、小麦ミドリング、トウモロコシグルテンミール、および蒸留器グレインまたはＤＧＳを含有することがある。他に使用可能な材料は一般に、大豆ミール、ヒマワリミール、麦芽、マクロミネラル、トレースミネラル、およびビタミンを含むが、これらに限定されない。
【００９８】
微生物中の高不飽和脂肪酸（ＨＵＦＡ）を酸化性条件にさらすと、あまり望ましくない不飽和脂肪酸に、または飽和脂肪酸に変換されることがある。しかし、合成抗酸化剤、または、βカロチン、ビタミンＥ、ビタミンＣなどの天然起源の抗酸化剤を食餌中に導入することで、ω-３ＨＵＦＡの飽和を減少させるか、または阻止することができる。ＢＨＴ
、ＢＨＡ，ＴＢＨＱ、エトキシンなどの合成抗酸化剤またはトコフェロールなどの天然抗酸化剤を、生産物に添加することにより、食物または食餌生産物中に組み込むことも、本来の場所での（ｉｎ  ｓｉｔｕ）生産で適当な生物中に組み込むこともできる。このようにして組み込む抗酸化剤の量は、たとえば、生産物調合、パッケージング方法、所望の有効期間など、その後の使用要件に依存する。
【００９９】
本プロセスを人間向けの投入材料で開始した場合、インキュベーション生産物、または本開示内容のインキュベーション生産物を含有する完成したフィッシュミールを、人間用の栄養補助剤として利用することもでき、プロセスを通して、人間の食物の品質基準が観察される。インキュベーション生産物または本明細書に開示する完成食餌は、栄養素含有
量が高い。タンパク質や繊維などの栄養素は、健康的な食生活に関連する。シリアル、クラッカー、パイ、クッキー、ケーキ、ピザクラスト、サマーソーセージ、ミートボール、シェイクなどの食物中、または、任意の形態の食用品中で、インキュベーション生産物または本開示内容の完成した食餌を利用するためにレシピを作成してもよい。インキュベーション生産物または本開示内容の完成した食餌を、スナック、または、容易に食べることができ、配布に便利なグラノーラバーのようなスナックバーに発展させることもできる。スナックバーは、穀類からのタンパク質、繊維、胚芽、ビタミン、ミネラル、ならびに、グルコサミンなどの機能性食品、ＨＵＦＡ、または、ビタミンＱ-１０などのコファクタ
ーを含むこともある。
【０１００】
本インキュベーション生産物を含むフィッシュミールに、更に風味を補うこともできる。具体的な風味の選択は、食餌を提供する動物に依存する。風味および香りは、天然のものも、人口のものも、食餌をより受け入れやすく、好ましい味にする際に使用することができる。これらの補助剤は、全ての原料と十分にブレンドし、液体または乾燥生産物形態として入手してもよい。動物食餌中に補充する適当な風味、誘引物質、および香りには、魚フェロモン、コロハ、バナナ、チェリー、ローズマリー、クミン、ニンジン、ペパーミント・オレガノ、バニラ、アニス、プラスラム（plus rum）、カエデ、キャラメル、カンキツ油、酪酸エチル、メンソール、リンゴ、シナモン、これら要素の天然または人工の任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。風味および香りは、異なる動物間で入れ替えることもできる。同様に、人間向けの本インキュベーション生産物を含む食物補助剤に、人工または天然の様々な果実風味を加えることもできる。
【０１０１】
本インキュベーション生産物または本開示内容の完成した食餌の有効期間は、本微生物を欠いたインキュベーション生産物の有効期間よりも、通常は長くすることができる。有効期間は、生産物の含水率、食餌マス中にどのくらいの空気が流れる可能性があるか、環境条件、および防腐剤の使用などの要因に依存することもある。有効期間を数週間、数ヶ月を増やすために、完成した食餌に防腐剤を添加することもできる。有効期限を増やすための他の方法には、他の食餌との混合、パッキング、プラスチックを用いたカバーリング、バッギングなどのサイレージ管理に類似した管理が含まれる。低温条件、防腐剤、食餌マスからの空気の除去の全てにより、湿性の副産物の有効寿命が増える。完成した食餌は、バンカー（bunker）またはサイロバッグ中で貯蔵することが可能である。湿性のインキュベーション生産物または完成した食餌を乾燥させることにより、生産物の有効期間を増やし、均一性および品質を改善することもできる。
【０１０２】
本開示内容の完成した食餌は、長期間貯蔵することができる。有効期間は、サイロ貯蔵、有機酸などの防腐剤の添加、または、大豆皮などの他の食餌とのブレンドにより延ばすこともできる。完成した食餌を貯蔵するために、一般に売られる貯蔵箱または大容量の貯蔵庫を使用してもよい。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、「室温」とは、標準圧力下で約２５℃である。
【０１０４】
以下の実施例は、説明であり、開示する主題の範囲を限定する意図はない。
【０１０５】
実施例
[実施例１：高品質濃縮大豆タンパク質（ＨＱＳＰＣ）]
図１は、白フレークに前処置を行うための全体的な手法である、糖を細胞塊（タンパク質）およびガムに変換することと、ＨＱＳＰＣを回収し、水産食餌を生成すること（図２）と、結果として得られる水産食餌を魚食餌供給試験にてテストすることとを示す。まず、白フレークを、含水率１５％、５０℃、７５ｒｐｍで押出し前処置（例、米国、ニュージャージー州、ハッケンサック、Brabender Plasti-corder SINGLE SCREW Extruder Mode
l PL2000）にかけて、構造を破壊し、後の糖化中の加水分解酵素の注入を増やすことを可能にした。これらの条件により、バレルの両側でリッジ状チャネルに対するせん断効果がもたらされたが、これにより、酵素加水分解後の糖の放出が５０〜７０％増加することが前もって観察されていた。次いで、押し出した白フレークを、３ｍｍハンマーミル・スクリーンを通過させて粉砕し、固体負荷率が１０％になるように水とブレンドし、ｐＨ５に調整した。マッシュを滅菌または殺菌するために加熱した後、約５０℃に冷却し、セルロース分解酵素およびオリゴ糖分解酵素（白フレーク１ｋｇにつき、合計で１５ｍｌ）を添加して、ポリマーを単糖に加水分解した（４〜２４時間の加水分解）。具体的な用量には、ＣＥＬＬＩＣ  ＨＴＥＫ、６％（グルカン１ｇ当たり）、ＣＥＬＬＩＣ  ＨＴＥＫ、０．３％（全固形分１ｇ当たり）、ＮＯＶＯＺＹＭＥ  ９６０、０．０１５％（固体１ｇ当たり）が含まれた。次いで、結果として得られるマッシュを３０℃に冷却し、ｐＨを３〜５に調整し、オーレオバシディウム・プルランスを接種し（１％ｖ／ｖ）、５０〜２００ｒｐｍでの混合および通気速度０．５Ｌ／Ｌ／分にて４〜５日間インキュベーションを行って、糖をタンパク質およびガムに変換した。インキュベーション中、サンプルを定期的に取り出して、糖、細胞数およびガム生産について分析した。インキュベーションの後、ｐＨを６．５に上昇させ、エタノール（０．６Ｌ／Ｌブロス）を添加して、ガムを沈殿させた。タンパク質、プルランおよび微生物塊（ＨＱＳＰＣ）を遠心分離で回収し、乾燥させ、上澄み液を蒸留して、エタノールを回収し、今後の本プロセスの開始時の再利用のために残液を化学的にアッセイした。次いで、ＨＱＳＰＣを、地方市場で重要な魚の１つであるイエローパーチでの食餌供給試験にてテストした。フィッシュミールおよび競合する植物ベースの材料と比較するＨＱＳＰＣを用いて、テスト育成餌を調合した。性能（例、成長、食餌転換、タンパク効率）、内蔵特性、および腸組織構造を調べて、魚の反応を評価した。
【０１０６】
[大豆白フレークおよびオーレオバシディウム・プルランスを用いた微生物変換を使用
したＨＱＳＰＣ、ＨＱＳＰＣ生産用のパイロット規模システム]
本システムは、６７５Ｌバイオリアクタ、可変速度プログレッシブ空洞ポンプ（variable speed progressive cavity pump）、連続流遠心分離機、および１×４ｍ乾燥テーブルを含んだ。６７５Ｌバイオリアクタ中で使用する接種物を、２台の５Ｌ  ＮＥＷ  ＢＲＵＮＳＷＩＣＫ  ＢＩＯＦＬＯ  ３  ＢＩＯＲＥＡＣＴＯＲ内で調製した。試験ごとに、先に記載したようにオーレオバシディウム・プルランスを２〜３日間成長させることにより、量が８〜１０Ｌの接種物を調製した。この材料を使用して、６７５Ｌバイオリアクタ内で調製し、押出し、糖化を行ったより多量の白フレークに接種を行った。インキュベーションの後に、 エタノールを添加し、マッシュを遠心分離にかけて、湿り気を帯びた固体
を回収し、次いで、この固体を乾燥し、魚食餌供給試験にて使用した。本変換プロセスの性能をモニタすることにより、ＨＱＳＰＣの歩留まりや組成といった、固体回収率に大きく影響するいくつかのパラメータが観察された。大規模試験では、パラメータは、表１に示すように多様であった。
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【０１０７】
ＨＱＳＰＣの歩留りおよびタンパク質レベルから、以下のことが分かった。１）インキュベーションｐＨ３〜３．５、温度３０〜３２℃、および高い通気で、オーレオバシディウム・プルランスの発育が最大になり、プルランの生成が最小限に抑えられた。２）インキュベーション時間４〜５日間が、タンパク含有量および固体回収率について最適であった。３）インキュベーション時間が長いほど、タンパク含有量は増大したが、固体回収率は実質的に減少した。４）インキュベーション時間が短いほど、高い固体回収率が維持されたが、タンパク含有量は制限された。５）最終生産物中でスタキオースおよびラフィノースが欠けているので、押出し、および／または、酵素糖化の軽減（省略）を可能にすることができる。
【０１０８】
プロセス条件を最適化するために、５Ｌバイオリアクタ内で予備的なベンチ規模試験を行った。固体負荷率が１０％の押出し白フレークを使用し、２４時間の糖化を行い、次いで、オーレオバシディウム・プルランスを接種し、ｐＨ５、０．５Ｌ／Ｌ／分の通気、２００ｒｐｍの攪拌で１０日間のインキュベーションを行った。固体回収率と固体中のタンパク含有量との両方を最大にする最適な採取期間を確立するために、延長したインキュベーション時間をテストした。サンプル（１００ｍｌ）を日ごとに取り出し、隔日で、以下を施した。
−エタノールで固体の全てを沈殿させ、遠心分離を行い、固体を乾燥させ、結果得られる上澄み液中の残留固体を測定する。
−まずブロスに遠心分離を行って、固体を回収し、固体を乾燥させ、結果得られる上澄み液からプルランを沈殿させ、乾燥を行う。
【０１０９】
エタノール沈殿を初めに行う方法では、研究室遠心分離機（１０,０００ｇ）を使用す
ることにより、固体（大豆の固体、細胞およびガム）の約９７％が回収され、約３％の固体が液相に残った。遠心分離を初めに行う方法では、固体（大豆の固体およびガム）の約８１．７％が回収され、上澄み液のエタノール沈殿で、約１４．８％の固体（エキソポリサッカライド）が回収され、約３．５％の固体が液体中に残った。
【０１１０】
これらのベンチ規模試験を通して、日ごとに回収することのできたタンパク質、プルラン、および全固形分のレベルを測定した。インキュベーションが進むにつれて、タンパク質レベルおよびプルラン・レベルは上昇するが、いくらかの栄養素が水およびＣＯ２に異化されるので、回収される全固形分は減少することが予想された。３度の再現実験からの固体の平均タンパク質レベルを図３に示す。タンパク質レベルは、３〜５日目で７０％に達し、回収される全固形分は、５〜６日目で減少し始めた。したがって、４〜５日間のインキュベーション時間を最適としてもよいと考えられる。
【０１１１】
[パーチフィッシュにおけるフィッシュミール代替物としてのＨＱＳＰＣの性能評価]
市販のＳＰＣ間のいくつかの違いを、主にタンパク質およびアミノ酸の組成ならびに栄養分吸収阻止特性について、前もって特定したが、これらの要素は、成長性能および魚の組成に多様性をもたらす。それらの実験により、フィッシュミールを含有する餌と同等であるか、またはそれよりも良好な成長性能をサポートする、より高品質なＳＰＣ生産物を開発する必要性が正当化された。商用ＳＰＣおよびメンハーデン・フィッシュミール対照と比較して、２つのＨＱＳＰＣ大豆生産物（発酵試験５および６）の評価を行うために、イエローパーチを利用して食餌供給試験を行った。
【０１１２】
食餌調製：７つの餌を以下のように定めた。
餌１＝フィッシュミール対照
餌２＝商用ＳＰＣ
餌３＝商用ＳＰＣ（リジン＋メチオニンを補充）
餌４＝ＨＱＳＰＣ試験５
餌５＝ＨＱＳＰＣ試験５（リジン＋メチオニンを補充）
餌６＝ＨＱＳＰＣ試験６
餌７＝ＨＱＳＰＣ試験７（リジン＋メチオニンを補充）
【０１１３】
消化率測定用の１ｇ／１００ｇの酸化クロムを含有する２ｋｇを含めて、それぞれの餌を約１２ｋｇ調製した。適当なタンパク質：脂質目標を４２：１０として、各試験用餌を、等量のＳＰＣを含有するように調合した。焼きを行っていない脱脂白フレークの水性アルコール抽出により、最小タンパク含有量を６９％とした濃縮大豆タンパク質（ＳＰＣ、たとえば、イスラエル、レホヴォトのＮｅｔｚｃｏｎ  Ｌｔｄ．）を作った。ＳＰＣは、オリゴポリサッカライドならびに抗原物質のグリシンおよびβコングリシニンの痕跡を含有するので、大豆ミールとは明らかに異なる。
【０１１４】
乾燥ブレンディングの前に、０．５１ｍｍスクリーンを有するＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ粉砕機（米国、イリノイ州、Elhurst）を用いて大きな粒の材料を粉砕した。増強バー（intensifier bar）を有するＶＩ-１０ミキサ（米国、テキサス州、スプリング、Ｖａｎｇ
ｕａｒｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ社）を使用して、乾燥した材料を２０分間ブレンドした。次いで、乾燥ブレンドを行った食餌原料を、Ｈｏｂａｒ
ｔ  ＨＬ２００ミキサ（米国、オハイオ州、トロイ）に移送し、ここで、油および水を添加し、約５分間ブレンドした。次いで、３／１６"ダイのＨｏｂａｒｔ４１４６グライン
ダを使用して、餌をスクリュープレスし、低温、強制空気条件下で乾燥させた。乾燥の後、フードプロセッサを使用して、餌を製粉してペレットにし、均一のペレット・サイズになるようにふるいに通し、−２０℃で冷凍貯蔵に入れた。主なタンパク源の化学分析は、表２に見ることができる。
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*全ての材料は、含水率を除き、乾燥物質基準で（現状どおりに）表している。
粗タンパク質（ＡＯＡＣ２００６、メソッド９９０．０３）、粗脂肪（ＡＯＡＣ２００６、メソッド９９０３）、粗繊維（ＡＯＡＣ２００６、メソッド９７８．１０）、含水率（ＡＯＡＣ２００６、メソッド９３４．０１）、酸化クロム（ＡＯＡＣ２００６、メソッド９９０．０８）、灰（ＡＯＡＣ２００６、メソッド９４２．０５）、およびアミノ酸（ＡＯＡＣ２００６、メソッド９８２．３０Ｅ（ａ、ｂ、ｃ））についての分析を行った。
【０１１５】
[ペレット特性]
含水率（％）、水分活性（ａｗ）、単位密度（ｋｇ／ｍ３）、ペレット耐久性指標（％）、水安定度（分）、および色（Ｌ、ａ、ｂ）について、それぞれの餌のサンプルを３回分析し、ｎ＝１０の反復で、耐圧強度（ｇ）および直径（ｍｍ）を求めた。スタンダード・メソッド２．２．２．５（ＮＦＴＡ、２００１）を使用して含水率（％）を得た。Ｌａｂ  Ｔｏｕｃｈ  ａｗアナライザ（スイス、ラーヘン、Ｎｏｃａｓｉｎａ社）を用いてペレットのサンプル２ｇの水分活性（ａｗ）を測定した。スペクトロフォトカラリメータ（spectrophotocolorimeter）（米国、バージニア州、レストン、ＬａｂＳｃａｎ  ＸＥ、
ＨｕｎｔｅｒＬａｂ社）を用いて、３つの色変量を、Ｈｕｎｔｅｒ  Ｌ（明度／暗度）、Ｈｕｎｔｅｒ  ａ（赤色度  緑色度）、およびＨｕｎｔｅｒ  ｂ（黄色度／青色度）として分析した。ペレット１００ｍｌの重さを量り、その質量（ｋｇ）を０．０００１ｍ３で
除算することで、単位密度（ＵＤ）を概算した。スタンダード・メソッドＳ２６９．４（ＡＳＡＥ２００３）に従って、ペレット耐久性指標（ＰＤＩ）を求めた。ＰＤＩは、ＰＤＩ（％）＝（Ｍａ／Ｍｂ）×１００で計算したが、ただし、Ｍａはタンブリング後の質量（ｇ）であり、Ｍｂはタンブリング前の質量（ｇ）である。ペレットの安定度（分）を静的（Ｗｓｔａｔｉｃ）メソッド（Ferouz ら、Cereal Chem (2011) 88:179-188）で求めて、それぞれが消費されるまでのタンク内でのペレット浸出を似たものにした。安定度は、（浸出による重量の減少）／（初期サンプルの乾燥重量）で計算した。ペレット直径を、従前からのノギスを使用して測定した。ＴＡ．ＸＴ  Ｐｌｕｓ  Ｔｅｘｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（米国、ニューヨーク州、スカースデール）を使用することにより、耐圧強度についてペレットをテストした。
【０１１６】
閉ループの再循環水産養殖システム（ＲＡＳ）と並列に接続した２８個の円形タンク（１１０Ｌ）中に、イエローパーチ（２．９５ｇ±０．０５の標準誤差）をタンク当たり２１匹でランダムに放流した。ＲＡＳの水流および水質は、デュアル・ソリッド・サプ・タンク、バイオリアクタ、ビーズ・フィルタ、ＵＶフィルタ、およびヒート・ポンプからなる遠心分離ポンプを用いて維持した。システムの水は、脱塩素処理を施し、１５，２００Ｌタンクに貯蔵した都市用水であった。それぞれの処置の４回の反復を、タンク内でランダムに適用した。水流は、〜１．５Ｌ／分／タンクに維持した。温度は、２２℃±１°に維持した。温度および溶存酸素を、ＹＳＩ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ（米国、オハイオ州、イエロースプリング、Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）で測定した。Ｈａｃｈ  ＤＲ  ３９００スペクトロフォトメータ（米国、コロラド州、ラブランド、Ｈａｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用することにより、アンモニア態窒素、亜硝酸態窒素、硝酸態窒素、アルカリ度（ＣａＣＯ３として）、および遊離塩素をテストした。
【０１１７】
１日に２回、食べなくなるまで、手で食餌を魚に供給し、タンク重量、観察した成長速度、および食餌消費評価に従って、食餌供給率を改変した。食餌供給３０分後に食べられていないペレットを数えることにより、分かっている与えたペレットの数から消費率（％）を概算した。消費率を概算するために、その後の乾燥重量の食べ残しの食餌を集めたものも使用した。１週間のタンク消費率概算値を、週単位の分配量に掛けて、週単位の消費量（ｇ）を得た。それぞれの処置の味の好ましさを、消費された食餌の量または受け付けられなかった食餌の量により求めた。タンク質量（＋０．０１ｇ）を隔週で測定して、食餌率を調整し、性能指標を計算した。各処置からランダムにサンプリングした４匹の魚の個々の体長（ｍｍ）および重さ（＋０．０１ｇ）も隔週で測定した。
【０１１８】
食餌転換率（ＦＣＲ）は以下の式で計算した。
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【０１１９】
タンパク質変換率は以下の式で計算した。
0006422474.tif 000006
【０１２０】
フルトン型条件因子（Ｋ）を以下の式で計算した。
0006422474.tif 000007
【０１２１】
比成長率（ＳＧＲ）以下の式で計算した。
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【０１２２】
餌および食餌供給試験反応の統計分析を、分散分析（ＡＮＯＶＯ、ａ  ｐｒｉｏｒｉ  α＝０．０５）とともに行った。処置平均を区別するために、事後のテューキーの検定の前にＳｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｆテストを行った。
【０１２３】
[ペレットおよび食餌結果]
食餌調合物は、試験３（表１）からのＨＱＳＰＣ栄養素分析に基づくものであり、全ての濃縮大豆タンパク質は、等しく４５％（１００％フィッシュミール代替物）で試験餌中に含めた。試験５および６の分析は、予定していた食餌供給試験開始日の後に完了し（表２）、結果は概ね、同様の餌であるが等窒素系ではない餌であった。タンパク質４２％および脂質１０％を含有し、エネルギーとタンパク質との（Ｅ：Ｐ）比率が７．９１〜７．９４（ｋｃａｌ／ｇ）になるように餌を調合した。少し前の分析では、粗タンパク質（乾燥物質基準）が、４４．９％（餌１）、４３．２％（餌２および３）、３６．８％（餌４および５）、３７．５％（餌６および７）であった。全ての餌について、粗脂質は約１０％であった。餌のアミノ酸分析では、イエローパーチの要件と比較して、補充を行わなかった餌の間に潜在的な不足は明らかにされなかった（表３）。
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【０１２４】
ペレット餌は、直径を除き、処置間での測定値の有意差を示した（表４）。
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与えている値は、処置平均に関連する平均値（±標準誤差）である。差が著しくない値（Ｐ＞０．０５）は、所与の行に同一の文字を入れている。ＭＣ（％ｄｂ）＝含水量、ａｗ（−）＝水分活性、ＢＤ（ｋｇ／ｍ３）＝単位密度、ＣＳ（ｇ）＝耐圧強度、ＰＤＩ（％）＝ペレット耐久性指標、ＷＳＩｓｔｉｌｌ（％）＝静水中の水溶性指標、Ｌ（‐）＝Ｈｕｎｔｅｒ明度、ａ（‐）＝Ｈｕｎｔｅｒ黄色度、ｂ（‐）＝Ｈｕｎｔｅｒ赤色度、Ｄｉａ．（ｍｍ）＝直径
【０１２５】
含水率（ＭＣ）は、約８．４９％（餌１）〜約１４．０７％（餌４）の範囲であった。ＭＣは、ＰＤＩ、耐圧強度、色などの他の特性への影響に寄与する。ＭＣと他の変数との明白な相関は確認されなかった。
【０１２６】
ペレット中に広がる水の測度である水分活性は高く（約０．５８〜０．７４）、餌１（フィッシュミール）が他の全ての処置よりも著しく低く（約０．５８）、餌７が他の全て
の処置よりも著しく高かった（約０．７４）。０．６を超える値は、低い貯蔵安定性を示し、微生物生育を急激に増やすことがある。餌は、冷凍庫内に-２０℃で保管した。
【０１２７】
単位体積あたりの食餌の重量の測度である単位密度（ＢＤ）は、約６３４．８７〜約６９５．９の範囲であった。餌１（フィッシュミール）のＤＢは低いものであったが、このことはおそらく、理論により限定されることではないが、魚油およびフィッシュミールの含有が低いことに起因する。濃縮大豆タンパク質の餌は、脂質要件を補償する油を多く含有していたので、その分だけ高いＢＤを有していた。
【０１２８】
耐圧強度（ＣＳ）は、垂直軸方向からの応力-歪み曲線のピーク破砕力として計算した
。ＣＳは、約２４．３６〜約６７．０３と非常に多様であった。餌１（フィッシュミール）が、最も低い耐圧強度（約２４．３６）を示した。理論により限定されることではないが、このことは、ペレット化プロセス（たとえば、押出しではなくスクリュープレス）に由来するペレットの不均一性におそらくは起因している。押出しでは、湿り、圧力、温度、機械的せん断を組み合わせて食餌を処理する。このプロセスにより、スターチがゼラチン化され、これにより、ＣＳを著しく増大させることもできる。
【０１２９】
ペレット耐久性指標（ＰＤＩ）は全ての餌において非常に高く（約９８．０５％〜約９９．４８％）、処置間に著しい差は見られなかった。これらの高いＰＤＩ値は、高いＭＣならびにカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）結合剤の添加の結果であることもある。
【０１３０】
水溶性指標（ＷＳＩ）は、全ての餌において低く（約９．６５〜約１４．４３）、餌４が最も高い値の約９．６５を示し、これは、最も低い餌７とは著しく異なっていた。押出しを行った餌と比較するスクリュープレスをおこなった餌の特性に起因して、ＷＳＩは低くなることが予想された。押出しを行った餌は、スターチのゼラチン化が理由で水に対してより安定するので、水浸透が低減される。
【０１３１】
Ｈｕｎｔｅｒ色パラメータ（Ｌ、ａ、ｂ）は、成長性能との類似性を示した。Ｈｕｎｔｅｒ  ａ（赤色度）は、餌１で最も高く（５．１５）、餌２で最も低かった（２．８０）。Ｈｕｎｔｅｒ  ｂ（黄色度）は、餌４（２２．８１）および餌１（２２．７６）で最も高く、餌２で最も低かった（１８．０７）。Ｈｕｎｔｅｒ  Ｌ（明度）は、餌３で最も高く（６８．４８）、餌１で最も低かった（４７．９１）。暗い色の食餌と比較して、食餌の色が明るくなるほど、高濃度で、利用率の高いリジンを含有することが分かった。
【０１３２】
[魚性能]
餌６が、成長性能において、餌１（フィッシュミール）に最も類似した結果を示した。成長性能は、全てのカテゴリーで処置間の差が著しかった（表５）。
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実験餌を与えたパーチの平均体重増加（ＷＧ、％）、比成長率（ＳＧＲ）、生存率（Ｓ、％）、総消費量（ＴＣ、ｇ）、食餌転換率（ＦＣＲ）、タンパク効率（ＰＥＲ）、およびフルトン型条件因子（Ｋ）の値。値は、処置平均に関連する平均値（±標準誤差）である。差が著しくない値（Ｐ＞０．００５）は、所与の列に同一の文字を入れている。
【０１３３】
補充を行った餌（餌３および５）は、餌６および７を除き、補充を行っていない対応物よりもわずかに良好であった。餌６は、全ての側面で餌７を上回った。理論により束縛されることではないが、これは、結晶性アミノ酸補助剤の生物学的利用能に関連するタイミングの問題の結果である可能性がある。
【０１３４】
体重増加（ＧＷ）は、餌１が最も高く（フィッシュミール、１０２．１％）、餌６および７がこれに続いた（それぞれ８４．４％、６１．８％）。餌２および３（商用ＳＰＣ）が、最低のＷＧを示した（それぞれ１２．６２％、２３．６９％）。比成長率（ＳＧＲ）は、ＷＧの結果に対応した。ＳＧＲは、餌１で最高（１．６６）、餌２で最低（０．５５）であった。
【０１３５】
タンパク効率（ＰＥＲ）は、餌６で最も高く（１．８７）、餌１（１．７６）および餌４（１．７０）がこれに続いた。餌２および３が、それぞれ最低のＰＥＲの０．９８および１．１７を有した。ＰＥＲは、補充を行っていない餌４および６の方が、補充を行った餌５および７よりも良好であった。
【０１３６】
食餌転換率（ＦＣＲ）は、同様のパターンに従い、餌１および餌６が最低であった（それぞれ１．３９、１．５９）。これらのＦＣＲ値は、非常に高い栄養食餌品質を示している。餌２および３が、最高のＦＣＲを有した（それぞれ２．９１、２．２４）。
【０１３７】
総消費（ｄｍｄ）は、餌６（４５１．５ｇ）および餌１（４５０．２０ｇ）で最も高く、餌２（１４０．９１）および餌３（１８１．６０）で最も低かった。全ての餌は、食べなくなるまで与えた。餌消費量を味の好ましさを示すものとみなしたが、このことも、餌２での魚の生存率が著しく低くなっている（８２．２９％）ことの理由である。生存率は、餌１については１００％であり、餌６については９８．８１％であった。
【０１３８】
フルトンの条件因子（Ｋ）は、餌５について最高であり（１．１４）、餌２について最低であった（１．０１）。ＨＱＳＰＣ食餌の全てが、この特定の性能パラメータについてフィッシュミール対照以上になった。商用ＳＰＣ餌は、他の全ての餌のものよりも低かった。
【０１３９】
[他アッセイ]
試験分析の終わりには、最終成長、ＦＣＲ、ＰＥＲ、消費量、および剖検による栄養の不足の調査が含まれてもよい。標準方式を使用することにより、リジンおよびメチオニンについて血漿のアッセイを完成させることもできる。筋肉の割合、肝臓体細胞指標、内蔵体細胞指標、身組成、および後腸組織構造（腸炎炎症のスコア）を量化するために、個々の魚を頚椎脱臼で安楽死させることもある。試験餌のタンパク質およびエネルギーの利用率を、食餌および糞便物質中の酸化クロム（ＣｒＯ３）マーカーを使用することにより概算することもできる。糞便物質は、剖検により下部腸管から集めることもできる。
【０１４０】
テスト用餌中の栄養素についての見掛けの消化率係数（ＡＤＣ）を、以下の式を使用して計算してもよい。
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【０１４１】
この式で、Ｄｒｅｆ＝参考餌マッシュの栄養素（総エネルギーのｋＪ／ｇ）の％（現状どおりのもの）であり、Ｄｉｎｇｒ＝テスト原料の栄養素（総エネルギーのｋＪ／ｇ）の％（現状どおりのもの）である。
【０１４２】
[まとめ]
イエローパーチ用のスクリュープレスを施した合成食餌を、ＨＱＳＰＣ餌、フィッシュ対照ミール、および商用濃縮大豆タンパク質（ＳＰＣ）を使用して例示した。ＨＱＳＰＣベースの餌は、フィッシュミールと同等の性能を有し、商用ＳＰＣを上回った。成長および転換性能は予想を超え、ＨＱＳＰＣ餌中の粗タンパク質含有量は、フィッシュミール対照よりも約７％低く、商用ＳＰＣよりも約６％低かった。したがって、本ＨＱＳＰＣ餌は、フィッシュミールの完全代替物として働くことができる。
【０１４３】
[フィッシュミール代替物としてのＨＱＳＰＣのニジマスにおける性能評価]
上記のイエローパーチの結果に加えて、環境に適応させたニジマス系統（シャスタ）を使用することにより、９０日間の食餌供給試験を行った。表６は、魚の種類およびサイズごとのタンパク質標的をまとめている。これらの餌タンパク質標的またはレベル（％）を、こうした商業的に重要な魚用の実験餌の調合に使用することができる。
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【０１４４】
対照フィッシュミール餌、またはフィッシュミール（餌２-３５％含有）７０％をＨＱ
ＳＰＣ生産物（試験６）と入れ替えた餌をマスに与えた（表７参照）。
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【０１４５】
Ｓｅｌｅｃｔａ  ＳＰＣ６０などの他の濃縮大豆タンパク質に推奨されている３０％含
有を超えるように、３５％の含有レベルを使用した。等カロリー、等窒素の餌を使用したこの試験では、対照と提供したテスト餌との間での同等の性能が実証された。
【０１４６】
表８は、９０日の食餌供給試験中に観察されたニジマス性能特性をまとめたものである。ＨＱＳＰＣを含有する餌２では、体重増加または食餌転換／効率に低下は見られず、死んだ魚は見られなかった（生存率１００％）。こうした観察結果は、イエローパーチの試験で観察された各結果について同様であった。
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与えている値は、処置平均に関連する平均値（±標準誤差）である。
【０１４７】
[まとめ]
ニジマス用のスクリュープレスを施した合成食餌を、ＨＱＳＰＣ餌およびフィッシュ対照ミールを使用して例示した。この試験では、ＨＱＳＰＣベースの餌は、フィッシュミールと同等の性能を有した。やはり、これらのデータは、ＨＱＳＰＣ餌がＳＰＣ使用の予想結果より優れており（たとえば、ＨＱＳＰＣは含有レベル３０％を超える濃度で使用することができる）、フィッシュミールの有効な代替物として働くことができることを示している。
【０１４８】
[実施例２  微生物変換を使用したＨＰ‐ＤＤＧＳの生産]
バレル長：スクリュー直径が１：２０で、圧縮比が３：１の単一スクリュー押出し機（米国、ニュージャージー州、ハッケンサック、Brabender Plasti-corder Extruder Model
PL2000）を使用した押出しの、ＤＤＧＳの糖化の改善への影響を調べた（図４および５
）。ＤＤＧＳ含水率２５％、温度１００℃〜１６０℃、スクリュー回転数２００ｒｐｍでは、トウモロコシ繊維からの糖の回収率は３６％になると分かった（図５）。様々なＮＯＶＯＺＹＭＥリグノセルロース分解酵素の性能を別々に評価し、ＣＥＬＬＩＣ  ＣＴＥＫ２  ６％（グルカン１ｇ当たり）、ＣＥＬＬＩＣ  ＨＴＥＫ２  ０．３％（全固形分１ｇ当たり）の糖回収率は最大で７０％であることが分かった。これらの前処置条件および糖化条件を、ＨＰ‐ＤＤＧＳを生成するのに使用することもできる。処理コストを削減するためにフェドバッチ・バイオリアクタを使用するのとともに、添加する酵素の必要性を低減するためのセルラーゼ生産株との共培養などの次のオプションを実施してもよい。
【０１４９】
大豆ミール中の炭水化物について本微生物の成長およびガム生産を評価し、本明細書に開示する手法を使用することにより、タンパク含有量を４２％から少なくとも６０％に上昇させることが可能であることが分かった。このことは、微生物（例、オーレオバシディウム・プルランス）が、オリゴ糖の代謝を阻害する広範囲の要素を細胞塊（すなわち、タ
ンパク質）および微生物ガムに効率的に変換することが可能であることを示すものであった。大豆ミールを用いたこの試みは、蒸留廃液全体、希薄蒸留廃液、凝縮トウモロコシ可溶分などのトウモロコシ加工副産物からの所定の範囲の微生物ガム（エキソポリサッカライド）の生産を評価した事前の研究に基づいて開始された。この研究を通して、様々なトウモロコシ加工副産物上で効率良く成長し、入手可能な糖から高レベルの細胞塊およびガムを生産する様々な微生物菌株を蓄積した。キーとなる操作パラメータおよびコストをより低くしたガム回収方法が、特定および開発されてきた。この研究内容、および、微生物の株が広範囲の加水分解酵素を生産するという知識に基づいて、ＤＤＧＳをＨＰ‐ＤＤＧＳ（例、ＮＲＲＬ番号５０７９３、オーレオバシディウム・プルランス株）に効果的に変換することを可能にする頑健なプロセスが特定されている。
【０１５０】
前処置のために、バレル長：スクリュー直径が１：２０で、圧縮比が３：１の単一スクリュー押出し機（米国、ニュージャージー州、ハッケンサック、Brabender Plasti-corder Extruder Model PL2000）中で、従前のドライ分別および／または低油ＤＤＧＳを押し
出した。ＤＤＧＳサンプル（含水率を２５％に調整）、食餌の温度、バレル、および押出し機の出口部分を１００℃〜１６０℃に維持し、スクリュー回転数を２００ｒｐｍに設定して、バレルの両側でリッジ状チャネルに対するせん断効果をもたらすようにする。選択したこれらの温度、スクリュー回転数、含水率のレベルは、ＤＤＧＳ基質の破壊に起因する、トウモロコシ繊維からの３６％の糖放出をもたらした予め規定していた最適条件に基づくものであった。
【０１５１】
押し出した従前のドライ分別ＤＤＧＳを、5 L New Brunswick Bioflo 3 bioreactor（
ワーキング・ボリューム３〜４Ｌ）内で、ｐＨを５．８にして、固体負荷率が少なくとも５％になるように水と混ぜ合わせる。オートクレーブ処理および冷却の後、予備データを前もって集めていたＮＯＶＯＺＹＭＥ酵素の反応混液を使用することにより、スラリーを糖化する。最初の試験で使用する用量には、ＣＥＬＬＩＣ  ＣＴＥＫ２  ６％（グルカン１ｇ当たり）およびＣＥＬＬＩＣ  ＨＴＥＫ２  ０．３％（全固形分１ｇ当たり）が含まれる。糖化を５０℃、１５０ｒｐｍで２４時間実施して、繊維およびオリゴ糖を単糖に可溶化する。次いで、温度を３５℃に下げ、ｐＨを４．０に調整し（細胞成長を最適化するため）、スラリーに、本微生物の２４時間培養物を２％（ｖ／ｖ）接種する。スラリーに０．５Ｌ／Ｌ／分で通気を行い、糖利用が終了するまで（９６〜１２０時間と予想される）インキュベーションを継続する。次いで、以下のパラメータを評価する。
１）本微生物と共培養することになるセルラーゼ生産微生物による、セルラーゼ酵素の代用
２）初期の固体負荷率の最大化
３）酵素の正味用量を最小限に抑え、タンパク質濃度およびガム濃度を最大にし、生産物回収コストを最小限に抑えるための、糖化または微生物変換局面（すなわち、フェドバッチ操作）中でのより多くの押出し物質の添加
【０１５２】
インキュベーション中、サンプルを６〜１２時間の間隔で取り出す。ＨＰＬＣ分析用のサンプルを、沸騰させ（酵素を不活性化するため）、遠心分離し、０．２２μｍのフィルタに通し、オートサンプラ・バイアルに入れ、分析を行うまで凍結させる。ＷＡＴＥＲＳ
ＨＰＬＣシステムを使用することにより、炭水化物および有機溶媒について、これらのサンプルをアッセイする。微生物群を評価するために、サンプルの微生物数計数を行う。また、国立再生可能エネルギー研究所（ＮＲＥＬ）の手順を使用することにより、セルロースおよびヘミセルロースのレベルについてサンプルをアッセイする。
【０１５３】
次いで、変換されたスラリーにエタノール沈殿および遠心分離を行って、タンパク質、微生物ガムおよび微生物バイオマス（ＨＰ‐ＤＤＧＳ）を残っている培養液から分離する。理論により限定されることではないが、沈殿しているガムが存在すると、懸濁固体を回
収する際の遠心分離の効率が改善される。次いで、ＨＰ‐ＤＤＧＳの組成を求め、魚食餌供給試験で使用する。蒸留により液体流からエタノールを回収し、残液を化学的に分析して、潜在的な用途（例、ＨＰ‐ＤＤＧＳまたはバイオガス生産への組込み）を評価する。
【０１５４】
このようにして生産したＨＰ‐ＤＤＧＳは、結合剤として機能し、潜在的に免疫促進剤として機能する微生物ガムを含有する。微生物が排出する他の加水分解酵素は、ペプチド、アミノ酸、および残留する任意の脂質を放出するはずであり、これにより、魚食餌供給試験における食餌摂取、成長性能、および栄養素利用が増大する。
【０１５５】
[パーチフィッシュにおけるフィッシュミール代替物としてのＨＰ‐ＤＤＧＳの性能評価]
対象種の要件に鑑みて、特にイエローパーチに焦点を置いて、上記の従前のドライ分別ＨＰ‐ＤＤＧＳを栄養的確性について分析する。サンプルに、Ｖａｎ  Ｓｏｅｓｔ繊維、不溶性炭水化物、アミノ酸、脂肪酸、およびミネラルの近似分析といった化学的分析を行う。これにより、栄養上のベンチマークが満たされていることが確実になる。ＨＰ‐ＤＤＧＳの栄養分吸収阻止特性（例、フィチン酸含有量）を現在のＤＤＧＳと比較し、更なるプロセス改変のための基礎を提供する。
【０１５６】
イエローパーチについての既知の栄養要件（例、タンパク質４２％、脂質８％）に従って従前のドライ分別ＨＰ‐ＤＤＧＳを使用することにより、完全である実用的な餌を調合する。微量栄養素の要件が満たされることを確実にするために、植物ベースの餌のための基礎ミネラル・プレミックスおよび基礎ビタミン・プレミックスを使用する。（分析により必要とみなされた）任意の補助剤を、補助剤なしの同一の調合物と比較することにより評価し、これにより、補助剤効果を考慮するために、食餌供給試験を要因分析にて行う。全ての食餌供給試験は、フィッシュミールをベースとした対照餌、およびレベルを等級分けしたＨＰ‐ＤＤＧＳを含有するそれぞれの餌を含む。食餌供給試験用のペレットを、実験室規模の単一スクリュー押出し機（例、Brabender Plasti-corder Extruder Model PL2000）を使用することで生産する。
【０１５７】
全ての食餌供給試験で、処置ごとの４つの実験単位の複製を使用する（それぞれ６０〜１２０日）。試験は、遠心ポンプにより駆動される固体サンプ、バイオリアクタ、ならびにフィルタ（１００μｍバッグ・フィルタ、炭素フィルタ、および紫外線フィルタ）からなる閉ループ再循環システムに並列に接続した１１０Ｌ円形タンク（タンクごとに２０匹の魚）内で実施する。生物種特有の成長に最適な温度を維持するために、必要に応じてヒート・ポンプを使用してもよい。全てのシステムにおいて、水質（例、溶存酸素、ｐＨ、温度、アンモニア、および窒素）をモニタする。
【０１５８】
実験餌を魚のサイズに応じて供給し、１日に２〜５回の食餌供給に分ける。１〜４週間（魚のサイズおよび試験期間による）で行う全質量測定で、成長性能を求める。飽和食餌供給を可能にするために、また、廃物の流れを低減するために、増分に応じて分配量を調整する。個々のタンクからの残った食餌の集合から、隔週で消費量を評価する。残った食餌を一定温度に乾燥し、冷却し、重さを量って、食餌転換率を見積もることができる。タンパク質消化率、エネルギー消化率、およびリン消化量を、各実験の中間時点に手で取り除いた糞便物質、または１度の食餌試験の終わりに検剖により下部腸管から手で取り除いた糞便物質から求める。生存率、体重増加、成長速度、健康指標、食餌転換、タンパク質消化率、エネルギー消化率、タンパク効率、リン利用を処置群間で比較する。剖検を行った魚の近似分析を行って、餌処置間で身の組成を比較することができる。食餌供給試験の目的次第では、アミノ酸および脂肪酸の分析を身成分について必要に応じて行う。
【０１５９】
餌反応および食餌供給試験反応の統計分析は、「ａ  ｐｒｉｏｒｉ  α＝０．０５」を用いて完成させる。処置間での性能パラメータの分析は、必要に応じて、分散または共分
散の適切な分析（Ｐｒｏｃ  Ｍｉｘｅｄ）および事後多重比較で実施する。魚性能および組織反応の分析を、非線形モデルで評価する。
【０１６０】
[暫定的な物質収支、エネルギー要件、およびコストの判定]
従前のドライ分別ＨＰ‐ＤＤＧＳ変換プロセスの投入量および産出量をモニタし、プロセス物質収支を確立するためにそれらを使用する。同様に、プロセスについてのエネルギー要件を測定および／または推定して、総エネルギー使用を計算する。同時に、これらの投入量を使用して暫定的コストを評価し、これを、従前のドライ分別ＨＰ‐ＤＤＧＳの値と比較する。
【０１６１】
本明細書で引用した全ての参考文献、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０１６２】
上の議論から、当業者は本発明の本質的な特性を確認することが可能であり、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な用途および条件に適応するために、各実施形態に様々な変更および改変を行うことが可能である。したがって、図示および本明細書中で記載したものに加えて、実施形態の様々な修正形態が、上記の説明から当業者には明らかになるであろう。こうした実施形態も、添付の特許請求の範囲に含まれることを意図している。
【受託番号】
【０１６３】
オーレオバシディウム・プルランス    ＮＲＲＬ５０７９２
オーレオバシディウム・プルランス    ＮＲＲＬ５０７９３
オーレオバシディウム・プルランス    ＮＲＲＬ５０７９４
オーレオバシディウム・プルランス    ＮＲＲＬ５０７９５
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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