(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)2本の改変された重鎖であって、各重鎖が、C末端からN末端の方向に重鎖定常ドメイン3、2、および1(CH3、CH2、およびCH1)ならびに共通軽鎖の可変ドメインである軽鎖可変ドメイン(VL)を含む、2本の改変された重鎖;
b)1本の改変された軽鎖であって、C末端からN末端の方向にκアイソタイプの定常軽鎖ドメイン(CL)および第1の抗原に特異的に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメイン(VH1)を含む、1本の改変された軽鎖;ならびに
c)1本の改変された軽鎖であって、C末端からN末端の方向にλアイソタイプの定常軽鎖ドメインおよび第2の抗原に特異的に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメイン(VH2)を含む、1本の改変された軽鎖;
を含む、二価の多重特異性抗体であって、
可変ドメインVH1およびVLが、第1の抗原に特異的に結合する第1の抗原結合部位を形成し、可変ドメインVH2およびVLが、第2の抗原に特異的に結合する第2の抗原結合部位を形成する、二価の多重特異性抗体。
【請求項２】
二価の二重特異性抗体である、請求項1に記載の多重特異性抗体。
【請求項３】
IgGクラスのものである、請求項1または2に記載の多重特異性抗体。
【請求項４】
IgG1サブクラスまたはIgG4サブクラスのものである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項５】
請求項1〜4のいずれか一項に記載の多重特異性抗体をコードする、核酸。
【請求項６】
原核宿主細胞または真核宿主細胞において核酸を発現することができる、請求項5に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項6に記載の発現ベクターを含む、原核宿主細胞または真核宿主細胞。
【請求項８】
a)請求項1〜4のいずれか一項に記載の多重特異性抗体をコードする核酸分子を含む発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する段階;
b)多重特異性抗体分子の合成を可能にする条件下で宿主細胞を培養する段階;および
c)培養物から該多重特異性抗体分子を回収する段階
を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を調製するための方法。
【請求項９】
請求項1〜4のいずれか一項に記載の多重特異性抗体および少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
医薬として使用するための、請求項1〜4のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１１】
医薬を製造するための、請求項1〜4のいずれか一項に記載の多重特異性抗体の使用。
【請求項１２】
第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体および第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に基づく多重特異性抗体を作製するための方法であって、該第1の抗体および該第2の抗体が共通軽鎖を含み、
a)C末端からN末端の方向にκアイソタイプの定常軽鎖ドメインおよび重鎖可変ドメイン(VH1)を含む軽鎖を得るために、該第1の抗体に由来する重鎖の重鎖可変ドメイン(VH1)で軽鎖可変ドメイン(VL)を置換すること、および任意で、κアイソタイプの定常軽鎖ドメインで元の定常軽鎖ドメインを置換することによって、該第1の抗体に由来する軽鎖を改変する段階;
b)C末端からN末端の方向にλアイソタイプの定常軽鎖ドメインおよび重鎖可変ドメイン(VH2)を含む軽鎖を得るために、該第2の抗体に由来する重鎖の重鎖可変ドメイン(VH2)で軽鎖可変ドメイン(VL)を置換すること、および任意で、λアイソタイプの定常軽鎖ドメインで元の定常軽鎖ドメインを置換することによって、該第2の抗体に由来する軽鎖を改変する段階;
c)C末端からN末端の方向に重鎖定常ドメイン3、2、および1(CH3、CH2、およびCH1)ならびに軽鎖可変ドメイン(VL)を含む重鎖を得るために、該第1の抗体に由来する軽鎖の軽鎖可変ドメイン(VL)で重鎖可変ドメイン(VH1)を置換することによって、該第1の抗体に由来する重鎖を改変する段階、ならびに/または
C末端からN末端の方向に重鎖定常ドメイン3、2、および1(CH3、CH2、およびCH1)ならびに軽鎖可変ドメイン(VL)を含む重鎖を得るために、該第2の抗体に由来する軽鎖の軽鎖可変ドメイン(VL)で重鎖可変ドメイン(VH2)を置換することによって、該第2の抗体に由来する重鎖を改変する段階
を含む、前記方法。
【請求項１３】
a)得られる多重特異性抗体をコードする核酸分子を含む発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する段階、
b)該多重特異性抗体分子の合成を可能にする条件下で該宿主細胞を培養する段階;および
c)培養物から該多重特異性抗体分子を回収する段階
をさらに含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
請求項12または13に記載の方法によって得られる多重特異性抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共通可変軽鎖ドメイン(VL)および2つの異なる可変重鎖ドメイン(VH1およびVH2)に基づく改変された多重特異性抗体、それらの製造および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
2つまたはそれ以上の抗原に結合できる二重特異性抗体または多重特異性抗体などの操作されたタンパク質は、当技術分野において公知である。このような多重特異性結合タンパク質は、細胞融合技術、化学的結合技術、または組換えDNA技術を用いて作製することができる。
【０００３】
多種多様な組換え多重特異性抗体形態、例として、例えばIgG抗体形態と単鎖ドメインの融合による四価の二重特異性抗体が、ここ最近に開発されている(例えば、Coloma, M.J., et. al., Nature Biotech. 15 (1997) 159-163（非特許文献1）; WO 2001/077342（特許文献1）;およびMorrison, S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234（非特許文献2）を参照されたい)。
【０００４】
1つのアプローチでは、天然抗体に非常に似ている二重特異性抗体が、二重特異性抗体の所望の特異性を有するマウスモノクローナル抗体を発現する2種の異なるハイブリドーマ細胞株の体細胞融合に基づくクアドローマ技術(Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540（非特許文献3）を参照されたい)を用いて作製された。結果として生じるハイブリッドハイブリドーマ(またはクアドローマ)細胞株内で2種の異なる抗体重鎖および抗体軽鎖がランダムに対合するため、最高で10種の異なる抗体種が生じ、その内の1つだけが、所望の機能的な二重特異性抗体である。誤対合した副産物が存在し、生産収率がかなり低くなるため、高度な精製処置のための手段が必要とされる(例えば、Morrison, S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234（非特許文献2）を参照されたい)。一般に、組換え発現技術が使用される場合も、誤対合した副産物という同じ問題が依然として残る。
【０００５】
WO 98/50431（特許文献2）では、軽鎖および重鎖の誤対合を防ぐために、共通軽鎖が多重特異性抗体において使用されるが、WO 98/50431（特許文献2）によるアプローチでは、いわゆる「ノブイントゥーホール」技術(Ridgway, J.B., Protein Eng. 9 (1996) 617-621（非特許文献4）;およびWO 96/027011（特許文献3）)によってヘテロ二量体化された異なる重鎖を使用する。WO 98/50431（特許文献2）では、ヘテロ二量体化された(「ノブ-ホール」)重鎖を有する抗体の高い収量が観察された。しかし、いくらかのホモ二量体形成(「ホール-ホール」または「ノブ-ノブ」)もまた、観察された。ヘテロ二量体化される重鎖の比率は、ファージディスプレイアプローチを用いて2つのCH3ドメインの相互作用面を改造すること、およびヘテロ二量体を安定化するために両方のCH3ドメイン間にジスルフィド架橋を導入することによって、さらに高めることができた(Merchant A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681（非特許文献5）; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35（非特許文献6）)。ノブイントゥーホール技術の原理を用いる新しいアプローチが、例えばEP 1870459A1（特許文献4）において説明されている。この戦略の1つの重要な制約は、誤対合および不活性分子の形成を防止するために2つの親抗体の軽鎖が100％同一でなければならないということである。新規に(denovo)作製される抗体に適合する共通軽鎖の開発は、依然として困難である。したがって、この技術は、第1の抗原および第2の抗原に対する2種の異なる抗体を出発原料として(starting from)、2種の抗原に対する組換え二重特異性抗体を容易に開発するのには適切ではない。これらの抗体の重鎖および/または同一の軽鎖のいずれかを最適化しなければいけないことがその理由である。
【０００６】
WO 2012/023053（特許文献5）は、共通重鎖を用いる二重特異性抗体に関する。このアプローチは、一般的には、共通鎖を作製することが困難であることを考えると、具体的には、二重特異性抗体の結合特性が、重鎖のいかなる寄与もなしに、第1の抗原および第2の抗原を対象とする2本の異なる軽鎖によってのみ与えられなければならないことから、一般に応用可能であるどころか、さらにもっと制限される。これは、大多数の抗体において、重鎖超可変領域、特に例えば、重鎖の相補性決定領域3(CDR3-H)が、標的抗原に対する抗体の結合特性にとって重要な要因であることを考えると、明らかな制約である。
【０００７】
WO 2009/080252（特許文献6）は、異なるドメインから作り上げられた軽鎖を作製することによって軽鎖誤対合を防ぐために、2つの抗体アームの内の1つのみで重鎖可変ドメイン(VH)および軽鎖可変ドメイン(VL)が交換された、二価二重特異性抗体に関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO 2001/077342
【特許文献２】WO 98/50431
【特許文献３】WO 96/027011
【特許文献４】EP 1870459A1
【特許文献５】WO 2012/023053
【特許文献６】WO 2009/080252
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Coloma, M.J., et. al., Nature Biotech. 15 (1997) 159-163
【非特許文献２】Morrison, S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234
【非特許文献３】Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540
【非特許文献４】Ridgway, J.B., Protein Eng. 9 (1996) 617-621
【非特許文献５】Merchant A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681
【非特許文献６】Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、共通可変軽鎖ドメイン(VL)および2つの異なる可変重鎖ドメイン(本明細書において、それぞれ、第1の結合特異性を有する可変重鎖ドメインがVH1、第2の結合特異性を有する可変重鎖ドメインがVH2と呼ばれる)に基づく改変された多重特異性抗体、それらの製造およびそれらの使用に関する。
【００１１】
本発明は、
a)2本の改変された重鎖であって、各重鎖が、C末端からN末端の方向に重鎖定常ドメイン3〜1(CH3、CH2、およびCH1、この順番)および共通軽鎖の可変ドメインである軽鎖可変ドメイン(VL)を含む、2本の改変された重鎖;
b)1本の、1つの態様において厳密に1本の、改変された軽鎖であって、C末端からN末端の方向にκアイソタイプの定常軽鎖ドメイン(CL)(本明細書において「CLκ」と呼ばれる)および第1の抗原に特異的に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメイン(VH1)を含む、1本の改変された軽鎖;ならびに
c)1本の、1つの態様において厳密に1本の、改変された軽鎖であって、C末端からN末端の方向にλアイソタイプの定常軽鎖ドメイン(本明細書において「CLλ」と呼ばれる)および第2の抗原に特異的に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメイン(VH2)を含む、1本の改変された軽鎖
を含む、多重特異性抗体を提供する。
【００１２】
本発明による抗体の内部で、可変ドメインVH1およびVLは、第1の抗原に特異的に結合する第1の抗原結合部位を形成し、可変ドメインVH2およびVLは、第2の抗原に結合する第2の抗原結合部位を形成する。
【００１３】
本発明の1つの態様において、多重特異性抗体は、二価二重特異性抗体である。
【００１４】
本発明の1つの態様において、多重特異性抗体は、IgGアイソタイプのものである。本発明の1つの態様において、多重特異性抗体は、IgG1サブクラスまたはIgG4サブクラスのものである。本発明の1つの態様において、多重特異性抗体は、IgG1サブクラスのものである。
【００１５】
本発明の1つの局面は、本発明による多重特異性抗体をコードする核酸である。本発明の別の局面は、原核宿主細胞または真核宿主細胞において該核酸を発現することができる、該核酸を含む発現ベクターである。本発明のさらに別の局面は、該発現ベクターを含む原核宿主細胞または真核宿主細胞である。
【００１６】
本発明の1つの局面は、本発明による多重特異性抗体を調製するための方法であって、
a)本発明による多重特異性抗体をコードする核酸分子を含む発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する段階;
b)多重特異性抗体分子の合成を可能にする条件下で該宿主細胞を培養する段階;および
c)培養物から該多重特異性抗体分子を回収する段階
を含む、方法である。
【００１７】
本発明の1つの局面は、本発明による多重特異性抗体および少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物である。
【００１８】
本発明の1つの局面は、医薬として使用するための多重特異性抗体である。
【００１９】
本発明の1つの局面は、癌の治療で使用するための本発明による多重特異性抗体である。
【００２０】
本発明の1つの局面は、医薬を製造するための、本発明による多重特異性抗体の使用である。
【００２１】
本発明の1つの態様は、癌治療のための医薬を製造するための、本発明による多重特異性抗体の使用である。
【００２２】
本発明の1つの局面は、治療的有効量の本発明による多重特異性抗体を患者に投与することを特徴とする、治療法を必要とする患者を治療するための方法である。
【００２３】
本発明の1つの局面は、第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体および第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に基づく多重特異性抗体であって、第1の抗体および第2の抗体が共通軽鎖を含む多重特異性抗体を作製するための方法であって、
a)C末端からN末端の方向にκアイソタイプの定常軽鎖ドメイン(CLκ)および重鎖可変ドメイン(VH1)を含む軽鎖を得るために、該第1の抗体に由来する重鎖の重鎖可変ドメイン(VH1)で軽鎖可変ドメイン(VL)を置換すること、および任意で、κアイソタイプの定常軽鎖ドメインで元の定常軽鎖ドメインを置換することによって、該第1の抗体に由来する軽鎖を改変する段階;ならびに
b)C末端からN末端の方向にλアイソタイプの定常軽鎖ドメイン(CLλ)および重鎖可変ドメイン(VH2)を含む軽鎖を得るために、該第2の抗体に由来する重鎖の重鎖可変ドメイン(VH2)で軽鎖可変ドメイン(VL)を置換すること、および任意で、λアイソタイプの定常軽鎖ドメインで元の定常軽鎖ドメインを置換することによって、該第2の抗体に由来する軽鎖を改変する段階;
ならびに以下の段階c)およびd)のいずれか一方または両方:
c)C末端からN末端の方向に重鎖定常ドメイン3〜1(CH3、CH2、およびCH1、この順番)および軽鎖可変ドメイン(VL)を含む重鎖を得るために、該第1の抗体に由来する軽鎖の軽鎖可変ドメイン(VL)で重鎖可変ドメイン(VH1)を置換することによって、該第1の抗体に由来する重鎖を改変する段階;
d)C末端からN末端の方向に重鎖定常ドメイン3〜1(CH3、CH2、およびCH1、この順番)および軽鎖可変ドメイン(VL)を含む重鎖を得るために、該第2の抗体に由来する軽鎖の軽鎖可変ドメイン(VL)で重鎖可変ドメイン(VH2)を置換することによって、該第2の抗体に由来する重鎖を改変する段階
を含む、方法である。
【００２４】
1つの態様において、前記方法は、
-本発明による多重特異性抗体をコードする核酸分子を含む発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する段階;
-多重特異性抗体分子の合成を可能にする条件下で宿主細胞を培養する段階;および
-培養物から該多重特異性抗体分子を回収する段階
をさらに含む。
【００２５】
本発明の1つの局面は、前記方法によって得られる多重特異性抗体である。
【００２６】
本発明による多重特異性抗体は、共通軽鎖とそれぞれ対になる異なる重鎖可変ドメインを有する2種の抗体(それぞれ、第1の抗原および第2の抗原に特異的に結合する)から、容易に導き出すことができる。本発明の多重特異性抗体を用いる場合、例えば、ノブイントゥーホール技術または同様のヘテロ二量体化アプローチによる重鎖の操作は、ヘテロ二量体の結合を確実にするのに必要ではない。本発明の抗体は、IgGに似た構造を有し、非常に優れた抗原結合特性を示す。さらに、本発明の抗体内で、抗原結合は、その可変重鎖ドメインによって主に与えられるため、該抗体は、抗原結合に関して大きな多様性(high variability)を示す。これにより、抗原結合部位によって結合される可能性があるエピトープが広範囲になり、その際(as)、抗体内のすべての抗原結合領域(CDR)の最大の可変性は、重鎖可変ドメインのCDR3に関係している。結果として、しばしば、重鎖のCDR3は、特異的な抗原結合またはエピトープ結合を主に担当する。要約すれば、これは、大半の抗体において、重鎖可変ドメインのCDR3内のアミノ酸改変が、他のすべてのCDR中のアミノ酸改変よりも、抗体の抗原結合特性の点ではるかに許容度が低いことを意味する。
【００２７】
さらに、本発明の抗体は、優れた収率で生産可能であり、異なる定常軽鎖ドメイン(κおよびλ)のおかげで、κおよびλに特異的な精製段階を使用することにより、不必要なホモ二量体のような副生成物から容易に分離することができる。
[本発明1001]
a)2本の改変された重鎖であって、各重鎖が、C末端からN末端の方向に重鎖定常ドメイン3、2、および1(CH3、CH2、およびCH1)ならびに共通軽鎖の可変ドメインである軽鎖可変ドメイン(VL)を含む、2本の改変された重鎖;
b)1本の改変された軽鎖であって、C末端からN末端の方向にκアイソタイプの定常軽鎖ドメイン(CL)および第1の抗原に特異的に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメイン(VH1)を含む、1本の改変された軽鎖;ならびに
c)1本の改変された軽鎖であって、C末端からN末端の方向にλアイソタイプの定常軽鎖ドメインおよび第2の抗原に特異的に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメイン(VH2)を含む、1本の改変された軽鎖;
を含む、多重特異性抗体であって、
可変ドメインVH1およびVLが、第1の抗原に特異的に結合する第1の抗原結合部位を形成し、可変ドメインVH2およびVLが、第2の抗原に特異的に結合する第2の抗原結合部位を形成する、多重特異性抗体。
[本発明1002]
二価の二重特異性抗体である、本発明1001の多重特異性抗体。
[本発明1003]
IgGクラスのものである、本発明1001または1002の多重特異性抗体。
[本発明1004]
IgG1サブクラスまたはIgG4サブクラスのものである、前記本発明のいずれかの多重特異性抗体。
[本発明1005]
前記本発明のいずれかの多重特異性抗体をコードする、核酸。
[本発明1006]
原核宿主細胞または真核宿主細胞において核酸を発現することができる、本発明1005の核酸を含む発現ベクター。
[本発明1007]
本発明1006の発現ベクターを含む、原核宿主細胞または真核宿主細胞。
[本発明1008]
a)本発明1001〜1004のいずれかの多重特異性抗体をコードする核酸分子を含む発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する段階;
b)多重特異性抗体分子の合成を可能にする条件下で宿主細胞を培養する段階;および
c)培養物から該多重特異性抗体分子を回収する段階
を含む、本発明1001〜1004のいずれかの多重特異性抗体を調製するための方法。
[本発明1009]
本発明1001〜1004のいずれかの多重特異性抗体および少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
[本発明1010]
医薬として使用するための、本発明1001〜1004のいずれかの多重特異性抗体。
[本発明1011]
医薬を製造するための、本発明1001〜1004のいずれかの多重特異性抗体の使用。
[本発明1012]
治療的有効量の本発明1001〜1004のいずれかの多重特異性抗体を患者に投与することを特徴とする、治療法を必要とする患者を治療するための方法。
[本発明1013]
第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体および第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に基づく多重特異性抗体を作製するための方法であって、該第1の抗体および該第2の抗体が共通軽鎖を含み、
a)C末端からN末端の方向にκアイソタイプの定常軽鎖ドメインおよび重鎖可変ドメイン(VH1)を含む軽鎖を得るために、該第1の抗体に由来する重鎖の重鎖可変ドメイン(VH1)で軽鎖可変ドメイン(VL)を置換すること、および任意で、κアイソタイプの定常軽鎖ドメインで元の定常軽鎖ドメインを置換することによって、該第1の抗体に由来する軽鎖を改変する段階;
b)C末端からN末端の方向にλアイソタイプの定常軽鎖ドメインおよび重鎖可変ドメイン(VH2)を含む軽鎖を得るために、該第2の抗体に由来する重鎖の重鎖可変ドメイン(VH2)で軽鎖可変ドメイン(VL)を置換すること、および任意で、λアイソタイプの定常軽鎖ドメインで元の定常軽鎖ドメインを置換することによって、該第2の抗体に由来する軽鎖を改変する段階;
c)C末端からN末端の方向に重鎖定常ドメイン3、2、および1(CH3、CH2、およびCH1)ならびに軽鎖可変ドメイン(VL)を含む重鎖を得るために、該第1の抗体に由来する軽鎖の軽鎖可変ドメイン(VL)で重鎖可変ドメイン(VH1)を置換することによって、該第1の抗体に由来する重鎖を改変する段階、ならびに/または
C末端からN末端の方向に重鎖定常ドメイン3、2、および1(CH3、CH2、およびCH1)ならびに軽鎖可変ドメイン(VL)を含む重鎖を得るために、該第2の抗体に由来する軽鎖の軽鎖可変ドメイン(VL)で重鎖可変ドメイン(VH2)を置換することによって、該第2の抗体に由来する重鎖を改変する段階
を含む、前記方法。
[本発明1014]
a)得られる多重特異性抗体をコードする核酸分子を含む発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する段階、
b)該多重特異性抗体分子の合成を可能にする条件下で該宿主細胞を培養する段階;および
c)培養物から該多重特異性抗体分子を回収する段階
をさらに含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
本発明1013または1014の方法によって得られる多重特異性抗体。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】可変ドメインおよび定常ドメインを典型的な順序でそれぞれ含む重鎖(HC)および軽鎖(LC)のペア2つを有する、1種の抗原に特異的なIgG様完全長抗体の概略図。
【図２】図２Ａは、共通軽鎖を含む2種の抗体に基づく、2種の異なる抗原(抗原1および抗原2)に特異的に結合する本発明の二重特異性抗体の概略図。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのドメイン交換によって、二重特異性抗体の重鎖は、共通軽鎖のVLドメインを含む。抗体は2本の異なる軽鎖を含み、一方の軽鎖は、抗原2に特異的に結合する各自の(respective)可変重鎖ドメインおよびλアイソタイプの定常軽鎖ドメインを含み、他方の軽鎖は、抗原1に特異的に結合する各自の可変重鎖ドメインおよびκアイソタイプの定常軽鎖ドメインを含む。重鎖および2本の異なる軽鎖の可変ドメインおよび定常ドメインが示されている。図２Ｂは、FAPおよびDR5に特異的に結合する、本発明による二重特異性抗体の概略図。該抗体内において、抗FAP(3C6)抗体に由来する可変重鎖ドメイン(VH2)は、第1の改変された軽鎖を形成するために、λアイソタイプの定常軽鎖ドメインに結合されており;抗DR5(2A11)抗体に由来する可変重鎖ドメイン(VH1)は、第2の改変された軽鎖を形成するために、κアイソタイプの定常軽鎖ドメインに結合されている。ターゲティング部分および個々の軽鎖ドメインが示されている。抗FAP(3C6)抗体に由来するVHがCLλドメインに結合され、かつ抗DR5(8E11)抗体に由来するVHまたは抗DR5(21C11)抗体に由来するVHのいずれかがCLκドメインに結合されている二重特異性抗体も同様に作製したが、個別には示していない。
【図３】FAPおよびDR5に特異的に結合する本発明による二重特異性抗体の純度および分子量を、還元条件下および非還元条件下でCE-SDS解析によって解析した。次の二重特異性抗体のSDS-Pageとして、電気泳動図を示している:A)<FAP(3C6)[CLλ]-DR5(8E11)[CLκ]>(還元)、B)<FAP(3C6)[CLλ]-DR5(8E11)[CLκ]>(非還元)、C)<FAP(3C6)[CLλ]-DR5(21C11)[CLκ]>(還元)、D)<FAP(3C6)[CLλ]-DR5(21C11)[CLκ]>(非還元)。
【図４】例として抗FAPおよび抗DR5二重特異性抗体<FAP(3C6)[CLλ]-DR5(8E11)[CLκ]>を用いて、LC-MSによって、均質な調製を確認した。144697.1Daの位置の主要ピークは、2つの酸化部位を有する所望の抗体分子の正確な分子量に対応する。2本のκ軽鎖または2本のλ軽鎖のいずれかを含む抗体分子は、LC-MSにおいて検出されなかった。
【図５】DR5およびFAPに特異的に結合する二重特異性抗体が2種の異なる抗原に同時に結合するのを表面プラズモン共鳴によって検出するためのアッセイ法の仕組みを示す概略図。ヒトまたはカニクイザルのDR5がストレプトアビジンチップに結合され、二重特異性抗体を固定するのに使用され、一方、未結合のヒトFAPが、FAPに結合する抗原の評価に使用される。
【図６】DR5およびFAPに特異的に結合する本発明による二重特異性抗体の同時結合を検出する場合の特徴を示す、例示的なセンサーグラム。表面プラズモン共鳴測定により、本発明による二重特異性抗体が両方の抗原に同時に結合できることが確認された(<FAP(3C6)[CLλ]-DR5(2A11)[CLκ]>二重特異性抗体(試料の識別名GA803_G25_H14D_001)の解析によって得られたセンサーグラムの例示的なイメージ)。
【図７】細胞表面結合研究の結果。DR5およびFAPに特異的に結合する本発明による二重特異性抗体の、その抗原DR5への結合を、DR5を発現するMDA-MB231腫瘍細胞株を用いる細胞結合研究において、続いてFACS解析を行って評価した。<FAP(3C6)[CLλ]-DR5(2A11)[CLκ]>二重特異性抗体(試料の識別名GA803_G25_H14D_001)を用いる結合研究の結果を示している。これらの構築物は、濃度依存的にMDA-MB231細胞に結合する。
【図８】細胞表面結合研究の結果。DR5およびFAPに特異的に結合する本発明による二重特異性抗体の、その抗原FAPへの結合を、FAPを発現する線維芽細胞細胞株GM05389を用いる細胞結合研究において、続いてFACS解析を行って評価した。<FAP(3C6)[CLλ]-DR5(2A11)[CLκ]>二重特異性抗体(試料の識別名GA803_G25_H14D_001)を用いる結合研究の結果を示している。これらの構築物は、濃度依存的にGM05389細胞に結合する。
【図９】DR5およびFAPに特異的に結合し、かつ抗DR5抗体クローン2A11、8E11、および21C11の内のいずれか1つに由来する異なるDR5結合部位を含む、本発明による3種の二重特異性抗体(試料の識別名がそれぞれGA803_G25_H14D_001、GA803_G27_H14D_001、GA803_G28_H14D_00)による、DR5を発現するMDA-MB231腫瘍細胞のアポトーシスの媒介を、FAPを発現する線維芽細胞(細胞株GM05389)の非存在下または存在下のいずれかでMDA-MB231細胞を用いて評価した。構築物はいずれも、FAPの存在下でMDA-MB231細胞のアポトーシスを媒介することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
1  定義
一般に、用語「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈において特に別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。
【００３０】
本明細書の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義するように、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン(VL)フレームワークまたは重鎖可変ドメイン(VH)フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでもよく、またはアミノ酸配列交換を含んでもよい。いくつかの態様において、アミノ酸交換の数は、10個もしくはそれ以下、9個もしくはそれ以下、8個もしくはそれ以下、7個もしくはそれ以下、6個もしくはそれ以下、5個もしくはそれ以下、4個もしくはそれ以下、3個もしくはそれ以下、または2個もしくはそれ以下である。いくつかの態様において、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワークアミノ酸配列またはヒトコンセンサスフレームワークアミノ酸配列とアミノ酸配列が100％同一である。
【００３１】
本明細書において使用される「抗体」という用語は、2本の抗体重鎖および2本の抗体軽鎖からなる完全長抗体を意味する(図1を参照されたい)。
【００３２】
完全長抗体の重鎖は、N末端からC末端の方向に、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、抗体定常重鎖ドメイン1(CH1)、抗体重鎖定常ドメイン2(CH2)、および抗体重鎖定常ドメイン3(CH3)(本明細書において「VH-CH1- CH2-CH3」とも略される);ならびに任意で、サブクラスIgEの抗体の場合、抗体重鎖定常ドメイン4(CH4)を含む、ポリペプチドである。1つの態様において、このような抗体は、(CH1ドメインとCH2ドメインの間に位置する)ヒンジ領域を含む。
【００３３】
完全長抗体の軽鎖は、N末端からC末端の方向に、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL)(本明細書において「VL-CL」とも略される)を含むポリペプチドである。抗体軽鎖定常ドメイン(CL)は、κ(カッパ)アイソタイプまたはλ(ラムダ)アイソタイプのものであってよい。
【００３４】
抗体の軽鎖および重鎖は、軽鎖のCLドメインと重鎖のCH1ドメイン間および完全長抗体の2本の重鎖のヒンジ領域間で形成される、ポリペプチド間のジスルフィド結合によって、相互に連結されている。
【００３５】
典型的な完全長抗体の例は、(サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4の)IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEのような天然抗体である。
【００３６】
本発明による抗体は、単一の種、例えばヒトに由来してもよく、またはそれらはキメラ化抗体もしくはヒト化抗体であってもよい。
【００３７】
野生型の完全長抗体は、それぞれがVHドメインおよびVLドメインのペアによって形成される2つの抗原結合部位を含み、両方の抗原結合部位とも、同じ(例えば第1の)抗原に特異的に結合する(図1を参照されたい)。本発明による完全長抗体は、それぞれがVHドメインおよびVLドメインのペアによって形成される2つの抗原結合部位を含み、一方の結合部位(すなわち、共通軽鎖のVLドメインおよび第1の抗体に由来する重鎖のVHドメイン[VH1]のペアによって形成される結合部位)は、少なくとも1つの(例えば、第1の)抗原に特異的に結合し;他方の結合部位(すなわち、共通軽鎖のVLドメインおよび第2の抗体に由来する重鎖のVHドメイン[VH2]のペアによって形成される結合部位)は、少なくとも1つの他の(例えば、第2の)抗原に特異的に結合する(図2を参照されたい)。
【００３８】
抗体の「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを意味する。抗体には5つの主要なクラス、すなわちIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらの内のいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分類され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、α、δ、ε、γ、およびμとそれぞれ呼ばれる。
【００３９】
本明細書において使用される「結合部位」または「抗原結合部位」という用語は、リガンド(例えば、抗原またはその抗原断片)が実際に結合し、かつ抗体分子またはその断片に由来する、本明細書において説明する多重特異性抗体の領域を意味する。本発明による抗体の抗原結合部位は、抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。
【００４０】
所望の抗原に特異的に結合する抗原結合部位(すなわち、VH/VLドメインのペア)は、a)その抗原に特異的に結合する公知の抗体に由来してよく、あるいはb)その抗原のタンパク質もしくは核酸もしくはそれらの断片のいずれかを特に用いるデノボの免疫化方法によって、またはファージディスプレイによって得られる、新規の抗体または抗体断片に由来してよい。第1の抗原および第2の抗原に結合する本明細書において説明する多重特異性抗体の場合、第1の抗原および第2の抗原に結合する抗原結合部位は、両方の抗原結合部位において同一である、第1の共通軽鎖の可変ドメイン(VL)および第2の共通軽鎖の可変ドメイン(VL)の両方を含む。
【００４１】
本発明の多重特異性抗体の抗原結合部位は、抗原に対する結合部位の親和性に様々な程度で寄与する、6つの相補性決定領域(CDR)を含む。3つの重鎖可変ドメインCDR(CDRH1、CDRH2、およびCDRH3)ならびに3つの軽鎖可変ドメインCDR(CDRL1、CDRL2、およびCDRL3)がある。CDRおよびフレームワーク領域(FR)の範囲は、配列の多様性に基づいてそれらの領域が定められた、アミノ酸配列をまとめたデータベースと比較することによって決定される。
【００４２】
抗体特異性とは、抗原の特定のエピトープに対する抗体または多重特異性抗体の結合部位の選択的認識を意味する。例えば、天然の抗体は単一特異性である。二重特異性抗体は、2つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。抗体が複数の特異性を有する場合、認識されるエピトープは、単一の抗原と、または複数の抗原と関連していてよい。
【００４３】
本明細書において使用される「共通軽鎖」という用語は、第1の抗原に特異的に結合する結合部位を形成するために、第1の抗原に結合する抗体の第1の重鎖と対合することができ、かつ第2の抗原に特異的に結合する結合部位を形成するために、第2の抗原に結合する抗体の第2の重鎖と対合することもまたできる、軽鎖を意味する。共通軽鎖は、N末端からC末端の方向に、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL)(本明細書において「VL-CL」とも略される)を含むポリペプチドである。本発明による多重特異性抗体内で、共通軽鎖の可変ドメインVLは、第1の抗原に特異的に結合する抗体に由来する重鎖可変ドメイン(VH1)と対合して、第1の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する。さらに、共通軽鎖の可変ドメインVLは、第2の抗原に特異的に結合する抗体に由来する重鎖可変ドメイン(VH2)と対合して、第2の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する。それゆえ、このような共通軽鎖の可変ドメインを含む本明細書において説明する多重特異性抗体は、VH1およびVH2と対合して、第1の抗原に結合する抗原結合部位[VH1/VL]および第2の抗原に結合する抗原結合部位[VH2/VL]を形成する、2つの同一の共通軽鎖の可変ドメイン(VL)を含む。多重特異性抗体内に含まれる2つの共通軽鎖の可変ドメイン(VL)は、少なくとも95％、1つの態様において少なくとも99％、別の1つの態様において100％のアミノ酸配列同一性を示す。
【００４４】
共通軽鎖およびその共通軽鎖の可変ドメイン(VL)を含むそのような共通軽鎖を作製するための方法は、例えば、WO 98/50431もしくはWO2010/084197、またはUS 2013/045492、WO2011097603、およびWO2012148873(共通軽鎖マウスが使用された)において説明されている。また、本明細書において概説する実施例1において、共通軽鎖およびその可変ドメインの作製を詳細に説明する。多重特異性抗体内で1種類の共通軽鎖の可変ドメインを使用することにより、第1の抗体に由来する軽鎖および第2の抗体に由来する重鎖が対合して、機能的ではない、または言い換えると、1つまたは複数の標的抗原に結合することができない抗原結合ドメインがもたらされるヘテロ二量体の形成が避けられる。
【００４５】
本明細書において使用される「改変された軽鎖」とは、組換え手段により、そのドメイン(可変ドメインまたは定常ドメイン)の内の少なくとも1つが、対応する重鎖ドメインに交換された軽鎖を意味する。特に、本発明による多重特異性抗体内の改変された軽鎖の内部では、軽鎖可変ドメインVLが、対応する重鎖に由来する重鎖可変ドメインVHで置換された。したがって、本発明の抗体の改変された軽鎖は、N末端からC末端の方向に、ドメインVH-CLを含む。
【００４６】
本明細書において使用される「改変された重鎖」とは、組換え手段により、そのドメイン(可変ドメインVHまたは定常ドメインCH1)の内の少なくとも1つが、対応する軽鎖ドメインに交換された重鎖を意味する。特に、本発明による多重特異性抗体内の改変された重鎖の内部では、重鎖可変ドメインVHが、対応する軽鎖に由来する軽鎖可変ドメインVLで置換された。したがって、本発明の抗体の改変された重鎖は、N末端からC末端の方向に、少なくともドメインVL-CH1を含む。
【００４７】
本発明による多重特異性抗体は、2本の改変された重鎖を含み、その両方とも、少なくとも、共通軽鎖の軽鎖可変ドメインVLおよび定常重鎖ドメイン1(VL-CH1)を含む。1つの態様において、改変された重鎖は、N末端からC末端の方向に、ドメインVL-CH1-CH2-CH3を含み、典型的には、CH1ドメインとCH2ドメインの間に位置するヒンジ領域を含む。1つの態様において、多重特異性抗体の改変された重鎖は、少なくとも95％、1つの態様において少なくとも99％、別の1つの態様において100％のアミノ酸配列同一性を示す。
【００４８】
しかし、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のC末端から1つまたは複数、特に1つまたは2つのアミノ酸の翻訳後切断を受ける場合がある。したがって、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現により宿主細胞によって産生される抗体は、完全長重鎖を含み得るか、または完全長重鎖の切断型変種(本明細書において、切断型変種重鎖とも呼ばれる)を含み得る。これは、重鎖の最後の2つのC末端アミノ酸がグリシン(G446)およびリジン(K447、KabatのEU指標による番号付与)である場合であり得る。抗体の集団は、完全長重鎖を有する抗体および切断型変種重鎖を有する抗体を含んでよい。抗体の集団は、完全長重鎖を有する抗体および切断型変種重鎖を有する抗体の混合物からなってよく、その際、抗体の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％が、切断型変種重鎖を有する。
【００４９】
本明細書において使用される「単一特異性」抗体という用語は、1つまたは複数の結合部位を有し、各結合部位が同じ抗原の同じエピトープに結合する、抗体を意味する。
【００５０】
本明細書において使用される「価」という用語は、抗体分子中に特定の数の結合部位が存在することを示す。例えば、天然抗体または本発明による完全長抗体は、2つの結合部位を有し、二価である。したがって、「二価」、「四価」、および「六価」という用語は、1つの抗体分子中に2個の結合部位、4個の結合部位、および6個の結合部位が存在することをそれぞれ意味する。本発明による多重特異性抗体は、好ましくは、二価二重特異性抗体である。
【００５１】
好ましい態様において、本発明の多重特異性抗体は完全長抗体であり、すなわち、免疫グロブリン定常領域を含む。本発明の完全長抗体は、1種または複数種の免疫グロブリンクラスの免疫グロブリン定常領域を含む。免疫グロブリンクラスには、IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEアイソタイプが含まれ、IgGおよびIgAの場合、それらのサブタイプが含まれる。好ましい態様において、本発明の完全長抗体は、IgGアイソタイプの抗体の定常ドメイン構造を有する。
【００５２】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一のアミノ酸組成を有する抗体または抗体分子の調製物を意味する。
【００５３】
「キメラ抗体」という用語は、1種の供給源または種に由来する可変領域、すなわち結合領域、および別の供給源または種に由来する定常領域の少なくとも一部分を含み、通常は組換えDNA技術によって調製される、抗体を意味する。マウス可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明によって包含される「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、特にC1q結合および/またはFc受容体(FcR)結合に関して本発明に従う特性を生じるように、定常領域が元の抗体のものから改変または変更されたものである。このようなキメラ抗体は、「クラススイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするDNAセグメントおよび免疫グロブリン定常領域をコードするDNAセグメントを含む免疫グロブリン遺伝子を発現させた産物である。キメラ抗体を作製するための方法は、従来の組換えDNAを使用し、遺伝子トランスフェクション技術は当技術分野において周知である。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855、US 5,202,238、およびUS 5,204,244を参照されたい。
【００５４】
「ヒト化抗体」という用語は、フレームワークまたは「相補性決定領域」(CDR)が、親免疫グロブリンの特異性と比べて異なる特異性を有する免疫グロブリンのCDRを含むように改変された抗体を意味する。好ましい態様において、ヒト抗体のフレームワーク領域にマウスCDRを継ぎ合わせて、「ヒト化抗体」を調製する。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327;およびNeuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照されたい。特に好ましいCDRは、キメラ抗体に関して前述した抗原を認識する配列に相当するものに対応する。本発明によって包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特にC1q結合および/またはFc受容体(FcR)結合に関して本発明に従う特性を生じるように、定常領域が元の抗体のものからさらに改変または変更されたものである。
【００５５】
「ヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むと意図される。ヒト抗体は、現況技術において周知である(van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374)。また、ヒト抗体は、免疫化すると、内因性の免疫グロブリン産生のない状況でヒト抗体の完全なレパートリーまたはセレクションを産生することができるトランスジェニック動物(例えばマウス)においても、作製され得る。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列(array)をこのような生殖系列変異マウスに移入すると、抗原投与した際にヒト抗体を産生するようになる(例えば、Jakobovits, A., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Brueggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40を参照されたい)。また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーにおいて作製することもできる(Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J.Mol.Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J.Mol.Biol. 222 (1991) 581-597)。ColeらおよびBoernerらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である(Cole, S., P., C., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss (1985) 77-96;およびBoerner, P., et al., J.Immunol. 147 (1991) 86-95)。本発明によるキメラ抗体およびヒト化抗体に関して既に言及したように、本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、例えば、「クラススイッチ」、すなわちFc部分の変更または変異(例えば、IgG1からIgG4および/またはIgG1/IgG4への変異)によって、特にC1q結合および/またはFcR結合に関して本発明に従う特性を生じるように、定常領域が改変されたそのような抗体も含む。
【００５６】
「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されるすべてのヒト抗体、例えば、NS0細胞もしくはCHO細胞などの宿主細胞から、またはヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物(例えばマウス)から単離された抗体、あるいは宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現させた抗体を含むことを意図する。このような組換えヒト抗体は、再配列された形態の可変領域および定常領域を有する。本発明による組換えヒト抗体は、インビボの体細胞超変異に供された。したがって、組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のVH配列およびVL配列に由来し関連してはいるものの、インビボにおいてヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。
【００５７】
「可変ドメイン」(重鎖の可変ドメイン(VH)または軽鎖の可変ドメイン(VL))とは、本明細書において使用される場合、抗原への抗体の結合に直接関与する、軽鎖および重鎖のペアのそれぞれを意味する。本発明の多重特異性抗体の内部で、共通軽鎖の2つの同一の可変ドメイン(VL)は、重鎖の第1の可変ドメイン(VH1)および重鎖の第2の可変ドメイン(VH2)と共に2つの異なる抗原結合部位を形成する。
【００５８】
ヒト軽鎖およびヒト重鎖の可変ドメインは、同じ一般構造を有する。各可変ドメインは、配列が広範囲に渡って保存され3つの「超可変領域」(または相補性決定領域、CDR)によって連結された4つのフレームワーク(FR)領域を含む。フレームワーク領域はβシート構造を採用し、CDRはβシート構造を連結するループを形成し得る。各鎖のCDRは、フレームワーク領域によって三次元構造で維持され、他の鎖のCDRと一緒になって抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖CDR3領域および軽鎖CDR3領域は、抗体の結合特異性/親和性において特に重要な役割を果たしている。
【００５９】
本明細書において言及される「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、飼い慣らされた動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ)、霊長類(例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えばサル)、ウサギ、ならびにげっ歯動物(例えば、マウスおよびラット)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。特定の態様において、個体または対象はヒトである。
【００６０】
「単離された」抗体とは、その天然環境の構成要素から分離された抗体である。いくつかの態様において、抗体は、例えば、電気泳動(例えば、SDS-PAGE、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリー電気泳動)またはクロマトグラフィー(例えば、イオン交換HPLCまたは逆相HPLC)手段によって測定した場合に95％または99％を超える純度まで精製される。抗体純度を評価するための方法に関する概要については、例えば、Flatman, S. et al., J.Chromatogr.B 848 (2007) 79-87を参照されたい。
【００６１】
「単離された」核酸とは、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を意味する。単離された核酸は、その核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、その核酸分子は、染色体外に存在するか、または天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【００６２】
「超可変領域」または「抗体の抗原結合部分」という用語は、本明細書において使用される場合、抗原結合を担っている抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」に由来するアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」領域または「FR」領域とは、本明細書において定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖は、N末端からC末端に向かって、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む。各鎖のCDRは、このようなフレームワークアミノ酸によって隔てられている。特に、重鎖のCDR3は、抗原結合に最も寄与する領域である。CDR領域およびFR領域は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義に従って決定される。
【００６３】
本明細書において使用される場合、「結合する」または「特異的に結合する」という用語は、インビトロアッセイ法における、好ましくは、精製した野生型抗原を用いるプラズモン共鳴アッセイ法(BIAcore(登録商標)、GE-Healthcare Uppsala, Sweden)における、抗原のエピトープへの抗体の結合を意味する。結合親和性は、用語ka(抗体/抗原複合体における抗体の会合速度定数)、kD(解離定数)、およびKD(kD/ka)を用いて定義される。「結合する」または「特異的に結合する」とは、10-8mol/lまたはそれ以下、1つの態様において、10-8M〜10-13mol/l、1つの態様において、10-9M〜10-13mol/lの結合親和性(KD)を意味する。したがって、本発明の1つの態様において、本明細書において説明する多重特異性抗体は、各抗原に特異的に結合し、各抗原に対して10-8mol/lまたはそれ以下、1つの別の態様において、10-8M〜10-13mol/l、1つのさらに別の態様において、10-9M〜10-13mol/lの結合親和性(KD)で特異的である。
【００６４】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができる任意のポリペプチド決定基を含む。特定の態様において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなど分子の化学的に活性な表面基(grouping)を含み、いくつかの態様において、特殊な三次元構造特徴、およびまたは特殊な荷電特性を有し得る。エピトープとは、抗体が結合する抗原領域である。
【００６５】
本出願内で使用される「定常領域」という用語は、可変領域以外の抗体ドメイン全体を意味する。定常領域は、抗原への結合に直接的には関与していないが、様々なエフェクター機能を示す。重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、抗体はIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMといったクラスに分類され、これらの内のいくつかは、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4、IgA1およびIgA2などのサブクラスにさらに分類され得る。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常領域は、α、δ、ε、γ、およびμとそれぞれ呼ばれる。5種の抗体クラスすべてにおいて見出すことができる軽鎖定常領域(CL)は、κ(カッパ)およびλ(ラムダ)と呼ばれる。
【００６６】
本出願で使用される「ヒト起源に由来する定常領域」という用語は、サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4のヒト抗体の重鎖定常領域および/または軽鎖κもしくはλの定常領域を意味する。このような定常領域は現況技術において周知であり、例えばKabat, E.A.によって説明されている(例えば、Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788を参照されたい)。
【００６７】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプによって異なる、抗体のFc領域に起因し得る生物学的活性を意味する。抗体エフェクター機能の例には、C1q結合および補体依存性細胞障害(CDC);Fc受容体結合;抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC);食作用;細胞表面受容体(例えばB細胞受容体)の下方調節;ならびにB細胞活性化が含まれる。
【００６８】
作用物質、例えば薬学的組成物の「有効量」とは、必要な投与量および期間で、所望の治療的結果または予防的結果を実現するのに有効な量を意味する。
【００６９】
本明細書における「Fc領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列のFc領域および変種Fc領域を含む。1つの態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、Cys226またはPro230から重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかし、Fc領域のC末端リジン(Lys447)は、存在する場合もあれば存在しない場合もある。本明細書において別段の指定が無い限り、Fc領域中または定常領域中のアミノ酸残基の番号付与は、EU指標とも呼ばれるEU番号付与方式に従い、これは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242において説明されている。
【００７０】
2  発明の態様の詳細な説明
本発明は、
a)2本の改変された重鎖であって、各重鎖が、C末端からN末端の方向に重鎖定常ドメイン3〜1(CH3、CH2、およびCH1、この順番)および共通軽鎖の可変ドメインである軽鎖可変ドメイン(VL)を含む、2本の改変された重鎖;
b)1本の、1つの態様において厳密に1本の、改変された軽鎖であって、C末端からN末端の方向にκアイソタイプの定常軽鎖ドメイン(CL)(本明細書において「CLκ」と呼ばれる)および第1の抗原に特異的に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメイン(VH1)を含む、1本の改変された軽鎖;ならびに
c)1本の、1つの態様において厳密に1本の、改変された軽鎖であって、C末端からN末端の方向にλアイソタイプの定常軽鎖ドメイン(本明細書において「CLλ」と呼ばれる)および第2の抗原に特異的に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメイン(VH2)を含む、1本の改変された軽鎖
を含む、多重特異性抗体に関する。
【００７１】
本発明はまた、
a)2本の改変された重鎖であって、各重鎖が、C末端からN末端の方向に重鎖定常ドメイン3〜1(CH3、CH2、およびCH1、この順番)および共通軽鎖の可変ドメインである軽鎖可変ドメイン(VL)を含む、2本の改変された重鎖;
b)1本の、1つの態様において厳密に1本の、改変された第1の軽鎖であって、C末端からN末端の方向にκアイソタイプの定常軽鎖ドメイン(CL)(本明細書において「CLκ」と呼ばれる)および第1の抗原に特異的に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメイン(VH1)を含む、1本の改変された第1の軽鎖;ならびに
c)1本の、1つの態様において厳密に1本の、改変された第2の軽鎖であって、C末端からN末端の方向にλアイソタイプの定常軽鎖ドメイン(本明細書において「CLλ」と呼ばれる)および第2の抗原に特異的に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメイン(VH2)を含むポリペプチドを含む、1本の改変された第2の軽鎖
を含む、多重特異性抗体にも関する。
【００７２】
本発明はさらに、
a)ドメインCH3-CH2-CH1-VLからなるポリペプチドを含み、VLが共通軽鎖の可変ドメインである、2本の改変された重鎖;
b)ドメインCLκ-VH1からなるポリペプチドを含み、VH1が、第1の抗原に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメインである、1本の改変された軽鎖;および
c)ドメインCLλ-VH2からなるポリペプチドを含み、VH2が、第2の抗原に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメインである、1本の改変された軽鎖
を含む、多重特異性抗体に関する。
【００７３】
本発明の1つの態様において、多重特異性抗体は、
a)CH3-CH2-CH1-VLからなるポリペプチドを含み、VLが共通軽鎖の可変ドメインである、2本の改変された重鎖;
b)CLκ-VH1からなるポリペプチドを含み、VH1が、第1の抗原に結合する抗体の可変重鎖ドメインである、1本の改変された軽鎖;
c)CLλ-VH2からなるポリペプチドを含み、VH2が、第2の抗原に結合する抗体の可変重鎖ドメインである、1本の改変された軽鎖を含み、
その際、可変ドメインVH1およびVLは、第1の抗原に特異的に結合する第1の抗原結合部位を形成し、可変ドメインVH2およびVLは、第2の抗原に特異的に結合する第2の抗原結合部位を形成する。
【００７４】
本発明による多重特異性抗体内では、第1の抗原を認識する抗体の半分が、第2の抗原を認識する抗体の半分と共に、共通軽鎖の可変ドメインを有し、該共通軽鎖の可変ドメインは、それぞれのVHドメインと取り替えられて、CH3-CH2-CH1-VL型の構造を生じる。これにより、正確な抗体鎖の結合が保証される。多重特異性抗体内に1種類の重鎖しか存在しないため、正確な重鎖対合が保証される。さらに、1種類の共通軽鎖の可変ドメインが存在するため、正確な軽鎖結合が実現する。さらに、VH1ドメインに連結されたCLκおよびVH2ドメインに連結されたCLλが存在するため、不必要なホモ二量体を除去するためのκおよびλに特異的なカラムを用いる精製段階を続いて適用することにより、所望の二重特異性抗体の精製が可能になる。本発明による多重特異性抗体内で、前記第1の結合部位の可変ドメインVLおよび前記第2の結合部位の可変ドメインVLは、少なくとも95％、1つの態様において少なくとも99％、別の1つの態様において100％のアミノ酸配列同一性を示す。1つの態様において、前記第1の結合部位の可変ドメインVLおよび前記第2の結合部位の可変ドメインVLは、アミノ酸配列が100％同一である。
【００７５】
別の1つの局面において、本発明は、
a)第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の改変された重鎖および第1の改変された共通軽鎖;ならびに
b)第2の抗原に特異的に結合する抗体の第2の改変された重鎖および第2の改変された共通軽鎖
を含み、
a)の重鎖および第1の共通軽鎖(common light)に由来する可変ドメインVHおよびVLが互いに入れ替わり、b)の重鎖および第2の共通軽鎖に由来する可変ドメインVHおよびVLが互いに入れ替わり;かつa)の第1の共通軽鎖が、κ定常軽鎖ドメインCLκを含み;かつb)の第2の共通軽鎖が、λ定常軽鎖ドメインCLλを含み;かつa)の第1の共通軽鎖に由来するVLドメインおよびb)の第2の共通軽鎖のVLドメインの両方が、同一であり;かつa)の第1の重鎖およびb)の第2の重鎖の両方の定常領域が、同一である、
多重特異性抗体に関する。
【００７６】
本発明の1つの態様において、多重特異性抗体は、二価である。本発明の1つの態様において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。本発明の1つの態様において、多重特異性抗体は、二価二重特異性抗体である。
【００７７】
本発明による多重特異性抗体の1つの態様において、完全長抗体の重鎖は、N末端からC末端の方向に、VHドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメイン(comain)からなる。1つの態様において、完全長抗体の重鎖は、N末端からC末端の方向に、VHドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメインからなる。1つの態様において、完全長抗体の重鎖は、N末端からC末端に向かって、VH、CH1、CH2、およびCH3からなるポリペプチドである。
【００７８】
本発明の1つの態様において、改変された重鎖は、アミノ酸配列が100％同一であるVL-CH1ドメインを含む。
【００７９】
本発明の1つの態様において、多重特異性抗体の重鎖定常ドメインCH3は、ヘテロ二量体化を支援するために(すなわち、アミノ酸置換によって)変更されない。具体的には、重鎖定常ドメインCH3は、例えばノブイントゥーホール技術によって、非対称的に変更されない。ノブイントゥーホール技術では、一方のCH3ドメインが「ノブ」を生じるように変更され、他方のCH3ドメインが「ホール」を生じるように変更され、その結果、「ホール」内部に「ノブ」アミノ酸を配置することにより、異なる重鎖のヘテロ二量体化が支援される。対照的に、本発明の多重特異性抗体の1つの具体的な利点は、改変された重鎖中のドメイン交換の寄与により、改変された重鎖が、多重特異性抗体の両方の軽鎖と結合することができ、かつ、当然、もう1つの同一の重鎖と対合できるため、ヘテロ二量体化を支援する必要がないことである。
【００８０】
本明細書においてポリペプチド間の「同一の」および「同一性」(例えば、重鎖間の「同一性」または共通軽鎖の可変ドメインVL間の「同一性」)に言及する場合、それらのポリペプチドのアミノ酸配列の100％の同一性を意味する。しかし、それらのポリペプチドは、ポリペプチド鎖に結合しているグリカン構造体が異なる場合がある。
【００８１】
本発明の1つの局面は、多重特異性抗体を作製するための方法であって、
a)第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の重鎖および第1の共通軽鎖を、重鎖および共通軽鎖に由来する可変ドメインVH1およびVLを互いに交換することによって、改変する段階;ならびに
b)κ定常軽鎖ドメインCLκを含むように、第1の共通軽鎖を改変する段階
c)第2の抗原に特異的に結合する抗体の第2の重鎖および第2の共通軽鎖を、重鎖および共通軽鎖に由来する可変ドメインVH2およびVLを互いに交換することによって、改変する段階;ならびに
d)λ定常軽鎖ドメインCLλを含むように、第2の共通軽鎖を改変する段階;
を含み、
b)の第2の共通軽鎖の第1の共通軽鎖に由来する両方の可変軽鎖ドメインVLが同一であり;かつ第1の重鎖および第2の重鎖の両方の定常領域が同一である、方法である。
【００８２】
抗体変種
特定の態様において、本明細書において提供される抗体のアミノ酸配列変種が企図される。例えば、抗体の結合親和性および/または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変種は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することによって、またはペプチド合成によって、調製することができる。このような改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、ならびに/または残基中への挿入、および/もしくは残基の置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴、例えば、抗原結合性を所持することを条件として、欠失、挿入、および置換の任意の組合せを行って、最終構築物に到達することができる。
【００８３】
a)置換変種、挿入変種、および欠失変種
特定の態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変種が提供される。対象となる置換変異誘発部位には、CDRおよびFRが含まれる。1つの態様において、置換変異誘発を、重鎖のCDRおよび/またはFRにおいて実施した。例示的な変更は、表1の「例示的置換」という項目の下に提供し、アミノ酸側鎖のクラスに関してさらに後述する。保存的置換は、表1の「好ましい置換」という項目の下に示す。アミノ酸置換を関心対象の抗体に導入し、その作製物を所望の活性、例えば、保持された/向上した抗原結合、低下した免疫原性、または改善したADCCもしくはCDCについてスクリーニングすることができる。
【００８４】
（表１）
0006422956.tif 000002
【００８５】
アミノ酸は、側鎖の共通特性に基づいてグループ分けされ得る:
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性で親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖の向きに影響する残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
【００８６】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
【００８７】
置換変種の1つのタイプは、親抗体(例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体)の1つまたは複数の超可変領域残基の置換を含む。一般に、その後の研究のために選択される得られた変種は、親抗体を基準としていくつかの生物学的特性の変化(例えば改善)(例えば、増大した親和性、低下した免疫原性)を有し、かつ/または親抗体のいくつかの生物学的特性を実質的に保持する。例示的な置換変種は、例えば、本明細書において説明するもののようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて簡便に作製することができる、親和性成熟抗体である。簡単に説明すると、1つまたは複数のCDR残基を変異させ、変種抗体をファージ上に提示させ、特定の生物学的活性(例えば結合親和性)についてスクリーニングする。
【００８８】
例えば、抗体親和性を向上させるために、CDR中に変更(例えば置換)を加えてよい。このような変更は、CDR「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で変異を受けるコドンにコードされる残基(例えば、Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196を参照されたい)、および/またはSDR(a-CDR)中に加えられてよく、得られた変種VHまたは変種VLを結合親和性について試験する。二次ライブラリーを構築し、それから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37において説明されている。親和性成熟のいくつかの態様において、様々な方法(例えば、誤りがちなPCR、チェーンシャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指定変異誘発)のいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子中に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリーが作製される。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体変種を同定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのCDR残基(例えば、一度に4〜6個の残基)がランダム化される、CDRを対象とするアプローチを伴う。抗原結合に関与しているCDR残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを用いて、特異的に同定することができる。特に、CDR-H3およびCDR-L3がしばしば標的とされる。
【００８９】
変異誘発の標的とされ得る抗体の残基または領域を同定するために有用な方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれ、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085によって説明されている。この方法では、残基または標的残基群(例えば、arg、asp、his、lys、およびgluなどの荷電残基)を同定し、中性アミノ酸または負電荷を持つアミノ酸(例えば、アラニンまたはポリアラニン)によって置換して、抗体と抗原の相互作用が影響を受けるかどうか判定する。最初の置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置に、さらに置換を導入してよい。あるいはまたはさらに、抗原-抗体複合体の結晶構造から、抗体と抗原の接触点を特定する。このような接触残基および隣接残基を、置換の候補として標的とするか、または除去してよい。変種をスクリーニングして、それらが所望の特性を有するかどうかを判定してよい。
【００９０】
アミノ酸配列挿入には、長さが残基1個から100個またはそれ以上の残基を含むポリペプチドまで及ぶアミノ末端融合および/またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、N末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変種には、(例えばADEPTのための)酵素または抗体の血清半減期を長くするポリペプチドへの、抗体のN末端またはC末端への融合が含まれる。
【００９１】
b)グリコシル化変種
特定の態様において、本明細書において提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を大きくするか、または小さくするように変更される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、1つまたは複数のグリコシル化部位が作り出されるかまたは取り除かれるようにアミノ酸配列を変更することによって、簡便に達成することができる。
【００９２】
抗体がFc領域を含む場合、それに結合する炭水化物を変更してよい。典型的には、哺乳動物細胞によって産生されるネイティブ抗体は、Fc領域のCH2ドメインのAsn297にN結合によって通常結合している分枝状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「軸(stem)」中のGlcNAcに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの態様において、いくつかの特性が改善した抗体変種を作製するために、本発明の抗体中のオリゴ糖に修飾を加えてよい。
【００９３】
1つの態様において、Fc領域に(直接的にまたは間接的に)結合されたフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変種が提供される。例えば、このような抗体中のフコースの量は、1％〜80％、1％〜65％、5％〜65％、または20％〜40％であってよい。フコースの量は、例えばWO 2008/077546において説明されているように、MALDI-TOF質量分析法によって測定して、Asn297に結合した糖構造物(glycostructure)すべて(例えば、複合体構造物、ハイブリッド構造物、および高マンノース構造物)の合計に対するAsn297における糖鎖内のフコースの平均量を算出することによって決定される。Asn297は、Fc領域中の297位あたり(Fc領域残基のEU指標番号付与)に位置するアスパラギン残基を意味する;しかし、Asn297は、抗体の軽微な配列変異が原因で、297位からアミノ酸±約3個だけ上流または下流に、すなわち、294位と300位の間に位置してもよい。このようなフコシル化変種は、ADCC機能が向上している場合がある。例えば、US 2003/0157108; US 2004/0093621を参照されたい。「脱フコシル化された」または「フコースを欠く」抗体変種に関連した刊行物の例には、US 2003/0157108;WO 2000/61739;WO 2001/29246;US 2003/0115614;US 2002/0164328;US 2004/0093621;US 2004/0132140;US 2004/0110704;US 2004/0110282;US 2004/0109865;WO 2003/085119;WO 2003/084570;WO 2005/035586;WO 2005/035778;WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, A. et al., J.Mol.Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech.Bioeng. 87 (2004) 614-622が含まれる。脱フコシル化抗体を産生できる細胞株の例には、タンパク質フコシル化に欠陥があるLec13 CHO細胞(Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545;US 2003/0157108;およびWO 2004/056312、特に実施例11)およびノックアウト細胞株、例えば、α-1,6-フコシル基転移酵素遺伝子FUT8ノックアウトCHO細胞(例えば、Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech.Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. et al., Biotechnol.Bioeng. 94 (2006) 680-688;およびWO 2003/085107を参照されたい)が含まれる。
【００９４】
例えば、抗体のFc領域に結合した二分岐型オリゴ糖がGlcNAcによって分岐している、分岐したオリゴ糖を有する抗体変種が、さらに提供される。このような抗体変種は、フコシル化が減少し、かつ/またはADCC機能が向上している場合がある。このような抗体変種の例は、例えば、WO 2003/011878;米国特許第6,602,684号;およびUS 2005/0123546において説明されている。Fc領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも1つのガラクトース残基を有する抗体変種もまた、提供される。このような抗体変種は、CDC機能が向上している場合がある。このような抗体変種は、例えば、WO 1997/30087; WO 1998/58964;およびWO 1999/22764において説明されている。
【００９５】
c)Fc領域変種
特定の態様において、1つまたは複数のアミノ酸改変を本明細書において提供される抗体のFc領域中に導入し、それによってFc領域変種を作製することができる。Fc領域変種は、1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸改変(例えば置換)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域)を含み得る。1つの態様において、1つまたは複数のアミノ酸位置における前記アミノ酸改変は、本発明による抗体の両方の重鎖において同一である。
【００９６】
特定の態様において、本発明は、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を有する抗体変種を企図する。このことにより、その抗体変種は、インビボでの抗体の半減期が重要ではあるが、ある種のエフェクター機能(補体およびADCCなど)が不必要または有害である用途に対する望ましい候補となる。インビトロおよび/またはインビボの細胞障害性アッセイ法を行って、CDC活性および/またはADCC活性の減少/消失(depletion)を確認することができる。例えば、Fc受容体(FcR)結合アッセイ法を行って、抗体はFcγR結合を欠く(したがって、ADCC活性を欠く可能性が高い)がFcRn結合能を保持していることを確実にすることができる。ADCCを媒介する主な細胞であるNK細胞は、Fc(RIIIのみを発現するが、単球は、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞におけるFcR発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492の464頁の表3に要約されている。関心対象の分子のADCC活性を評価するためのインビトロのアッセイ法の非限定的な例は、米国特許第5,500,362号(例えば、Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063;およびHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502を参照されたい); 米国特許第5,821,337号(Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361を参照されたい)において説明されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい(例えば、フローサイトメトリー用のACTI(商標)非放射性細胞障害性アッセイ法(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA);およびCytoTox 96(登録商標)非放射性細胞障害性アッセイ法(Promega, Madison, WI)を参照されたい)。このようなアッセイ法に有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、関心対象の分子のADCC活性は、インビボで、例えば、Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656で開示されているもののような動物モデルにおいて評価してもよい。また、C1q結合アッセイ法を実施して、抗体はC1qに結合することができず、したがって、CDC活性を欠くことを確認することもできる。例えば、WO 2006/029879およびWO 2005/100402におけるC1q結合ELISAおよびC3c結合ELISAを参照されたい。補体活性化を評価するために、CDCアッセイ法を実施してもよい(例えば、Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052;およびCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743を参照されたい)。FcRn結合およびインビボのクリアランス/半減期の測定はまた、当技術分野において公知の方法を用いて実施することもできる(例えば、Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769を参照されたい)。
【００９７】
エフェクター機能が低下している抗体には、Fc領域残基238番、265番、269番、270番、297番、327番、および329番の内の1つまたは複数が置換されたものが含まれる(米国特許第6,737,056号、KabatのEU指標による番号付与)。このようなFc変異体には、残基265番および297番がアラニンに置換された、いわゆる「DANA」Fc変異体を含む、アミノ酸265位、269位、270位、297位、および327位の内の2つまたはそれ以上における置換を有するFc変異体が含まれる(米国特許第7,332,581号、KabatのEU指標による番号付与)。
【００９８】
本明細書において使用される場合、重鎖および軽鎖のすべての定常領域および定常ドメインのアミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) において説明されているKabat番号付与システムに基づいて番号を付けられている。具体的には、可変ドメインならびにκアイソタイプおよびλアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLに対しては、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のKabat番号付与システム(647〜660頁を参照されたい)を使用し、本明細書において「Kabatによる番号付与」と呼び、定常重鎖ドメイン(CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3)に対しては、KabatのEU指標番号付与システム(661〜723頁を参照されたい)を使用し、本明細書において「KabatのEU指標による番号付与」と呼ぶ。
【００９９】
1つの態様において、多重特異性抗体は、IgGアイソタイプのものである。1つの態様において、多重特異性抗体は、IgG1アイソタイプまたはIgG4アイソタイプのものである。
【０１００】
1つの態様において、多重特異性抗体は、変異L234AおよびL235Aを含むIgG1サブクラスの定常重鎖領域を含む(KabatのEU指標による番号付与; Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242)。
【０１０１】
1つの態様において、多重特異性抗体は、変異L234A、L235A、およびP329G(KabatのEU指標による番号付与)を含むIgG1サブクラスの定常重鎖領域を含む。
【０１０２】
1つの態様において、多重特異性抗体は、IgG4サブクラスの定常重鎖領域を含む。
【０１０３】
1つの態様において、多重特異性抗体は、変異S228PおよびL235E(KabatのEU指標による番号付与)を含むIgG4サブクラスの定常重鎖領域を含む。
【０１０４】
1つの態様において、多重特異性抗体は、変異S228P、L235E、およびP329G(KabatのEU指標による番号付与)を含むIgG4サブクラスの定常重鎖領域を含む。
【０１０５】
FcRへの結合が改善されているか、または減弱しているいくつかの抗体変種が説明されている(例えば、米国特許第6,737,056号;WO 2004/056312、およびShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照されたい)。
【０１０６】
特定の態様において、抗体変種は、ADCCを向上させる1つまたは複数のアミノ酸置換、例えばFc領域の298位、333位、および/または334位(KabatのEU指標による番号付与)に置換を有するFc領域を含む。
【０１０７】
いくつかの態様において、例えば、米国特許第6,194,551号、WO 99/51642、およびIdusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184において説明されているように、C1q結合および/または補体依存性細胞障害性(CDC)の変化(すなわち、向上または減弱のいずれか)をもたらす変更が、Fc領域中に加えられる。
【０１０８】
胎児への母親のIgGの移行に関与する、半減期が長くなり新生児型Fc受容体(FcRn)への結合が向上した抗体(Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593およびKim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434)は、US 2005/0014934において説明されている。これらの抗体は、FcRnへのFc領域の結合を向上させる1つまたは複数の置換をその中に有するFc領域を含む。このようなFc変種には、Fc領域残基:238番、256番、265番、272番、286番、303番、305番、307番、311番、312番、317番、340番、356番、360番、362番、376番、378番、380番、382番、413番、424番、または434番の内の1つまたは複数における置換、例えば、Fc領域残基434番の置換を有するものが含まれる(米国特許第7,371,826号)。
【０１０９】
Fc領域変種の他の例に関しては、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740;US 5,648,260;US 5,624,821;およびWO 94/29351も参照されたい。
【０１１０】
d)システインで操作された抗体変種
特定の態様において、システインで操作された抗体、例えば、抗体の1つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオMAb」を作製することが望ましい場合がある。特定の態様において、置換される残基は、抗体の接近可能な部位に存在する。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が、その結果、抗体の接近可能な部位に位置づけられ、本明細書においてさらに説明するように、薬物部分またはリンカー-薬物部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートさせて免疫コンジュゲートを作製するために使用され得る。特定の態様において、次の残基の内の任意の1つまたは複数をシステインで置換してよい:軽鎖のV205(Kabatによる番号付与);重鎖のA118(KabatのEU指標による番号付与);および重鎖Fc領域のS400(KabatのEU指標による番号付与)。システインで操作された抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号において説明されているようにして作製することができる。
【０１１１】
e)抗体誘導体
特定の態様において、本明細書において提供される抗体は、当技術分野において公知であり、容易に入手可能である付加的な非タンパク性部分を含むようにさらに改変され得る。抗体の誘導体化に適した部分には、水溶性ポリマーが含まれるがそれに限定されるわけではない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダム共重合体のいずれか)、およびデキストランまたはポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレン(propropylene)グリコールホモポリマー、プロリプロピレン(prolypropylene)オキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が含まれるが、それらに限定されるわけではない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定であるため、製造の際に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものでよく、分枝状または非分枝状でよい。抗体に結合されるポリマーの数は変動してよく、複数のポリマーが結合される場合、それらは同じ分子または異なる分子であってよい。通常、誘導体化のために使用されるポリマーの数および/またはタイプは、限定されるわけではないが、改善しようとする抗体の特定の特性または機能、その抗体誘導体が所定の条件下で治療法において使用されるかどうかなどを含む考慮すべき事柄に基づいて決定することができる。
【０１１２】
別の態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る、抗体と非タンパク性部分とのコンジュゲートが提供される。1つの態様において、非タンパク性部分はカーボンナノチューブである(Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605)。放射線は、任意の波長のものでよく、普通の細胞には害を与えないが抗体-非タンパク性部分の近位にある細胞が死滅する温度まで非タンパク性部分を加熱する波長が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【０１１３】
組換え法および組換え組成物
抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号において説明されているようにして、組換え法および組換え組成物を用いて作製することができる。
【０１１４】
本発明の1つの局面は、本発明による多重特異性抗体を調製するための方法であって、
a)本発明による多重特異性抗体をコードする核酸分子を含む発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する段階;
b)多重特異性抗体分子の合成を可能にする条件下で宿主細胞を培養する段階;および
c)培養物から該多重特異性抗体分子を回収する段階
を含む、方法である。
【０１１５】
本発明の1つの態様において、宿主細胞は、(i)改変された重鎖をコードする核酸分子を含む発現ベクター、(ii)C末端からN末端の方向にκアイソタイプの定常軽鎖ドメイン(CL)(CLκ)および第1の抗原に特異的に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメイン(VH1)を含む改変された軽鎖をコードする核酸分子を含む、発現ベクター;ならびに(iii)C末端からN末端の方向にλアイソタイプの定常軽鎖ドメイン(CLλ)および第2の抗原に特異的に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメイン(VH2)を含む改変された軽鎖をコードする核酸分子を含む発現ベクターを用いて形質転換される。本発明の1つの態様において、宿主細胞は、前述の(ii)および(iii)で定義した個々の軽鎖の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換するために使用されるモル量合計のモル量とほぼ同じである(1つの態様において、等しい)モル量の、改変された重鎖をコードする核酸分子を含む発現ベクターを用いて形質転換される。
【０１１６】
1つの態様において、本発明による多重特異性抗体を作製するために、改変された重鎖をコードする核酸を含む厳密に1種類の発現ベクターが使用される。1つの態様において、本発明による多重特異性抗体を作製するために、改変された重鎖をコードする核酸が使用される。
【０１１７】
1つの態様において、本明細書において説明する多重特異性抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および/またはVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖および/または重鎖)をコードし得る。
【０１１８】
本明細書において同義的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変されたヌクレオチドもしくは塩基、および/またはそれらの類似体、あるいはDNAポリメラーゼもしくはRNAポリメラーゼまたは合成反応によってポリマー中に組み入れられ得る任意の基質であってよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体などの改変ヌクレオチドを含んでよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって分断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識への結合のような、合成後に行われる改変を含んでもよい。他の種類の改変には、例えば、「キャップ」、類似体による天然ヌクレオチドの1つまたは複数の置換、ヌクレオチド間改変、例えば、非荷電結合(例えば、メチルホスホナート、リン酸トリエステル、ホスホアミダート、カルバマートなど) を有するもの、および荷電結合(例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど)を有するもの、例えばタンパク質(例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ply-L-リジンなど)のようなペンダント型の部分を含むもの、インターカレーター(例えば、アクリジン、ソラレンなど)を有するもの、キレート剤(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属(oxidative metal)など)を含むもの、アルキル化剤を含むもの、結合が改変されたもの(例えばαアノマー核酸など)、ならびにポリヌクレオチドの未改変型が含まれる。さらに、糖中に通常存在するヒドロキシル基のいずれかが、例えば、ホスホナート基、リン酸基によって置換されるか、標準的な保護基によって保護されるか、もしくはさらに別のヌクレオチドへの追加的な結合を準備するように活性化されてもよく、または固体支持体もしくは半固体支持体に結合されてもよい。5'末端および3'末端のOHは、リン酸化されるか、またはアミンもしくは1〜20個の炭素原子を有する有機キャップ基部分で置換されてよい。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化されてよい。ポリヌクレオチドはまた、例えば、2'-O-メチル-リボース、2'-O-アリル-リボース、2'-フルオロ-リボース、または2'-アジド-リボース、炭素環式糖類似体、α-アノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロース、またはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、およびメチルリボシドのような塩基性(basic)ヌクレオシド類似体を含む、当技術分野において一般に公知であるリボース糖またはデオキシリボース糖の類似形態も含んでよい。1つまたは複数のリン酸ジエステル結合が、代替の結合基によって置換されてよい。これらの代替結合基には、ホスファートが、P(O)S(「チオアート」)、P(S)S(「ジチオアート」)、(O)NR2(「アミダート」)、P(O)R、P(O)OR'、CO、またはCH2(「ホルムアセタール」)(式中、各RまたはR'は、独立に、H、または任意でエーテル(-O-)結合を含む置換アルキルもしくは非置換アルキル(1〜20C)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはアラルジル(araldyl)である)によって置換される態様が含まれるが、それらに限定されるわけではない。ポリヌクレオチド中のすべての結合が同一である必要はない。上記の説明は、RNAおよびDNAを含む、本明細書において言及されるすべてのポリヌクレオチドに当てはまる。
【０１１９】
さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクターが提供される。さらに別の態様において、このような核酸を含む1つまたは複数の発現ベクターが提供される。1つの態様において、このような核酸を含み、原核宿主細胞または真核宿主細胞において該核酸を発現することができる発現ベクターが、提供される。
【０１２０】
さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。さらに別の態様において、上記に定義したそのような発現ベクターを含む原核宿主細胞または真核宿主細胞が提供される。1つの態様において、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターおよび抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む(例えば、それらを用いて形質転換されている)。1つの態様において、宿主細胞は、真核生物性、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはリンパ系細胞(例えば、Y0細胞、NS0細胞、Sp20細胞)である。
【０１２１】
1つの態様において、多重特異性抗体を作製する方法が提供され、この方法は、抗体の発現に適した条件下で、上記に提供されるような抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養する段階、および任意で、宿主細胞(または宿主細胞培地)から抗体を回収する段階を含む。
【０１２２】
多重特異性抗体を組換え作製する場合、例えば前述したような抗体をコードする核酸は、単離され、宿主細胞におけるその後のクローニングおよび/または発現のために、1つまたは複数のベクター中に挿入される。このような核酸は、従来の手順を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって)、容易に単離および配列決定され得る。
【０１２３】
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞には、本明細書において説明する原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、グリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない場合には特に、細菌において産生させることができる。細菌における抗体断片および抗体ポリペプチドの発現については、例えば、US 5,648,237、US 5,789,199、およびUS 5,840,523を参照されたい。(大腸菌(E.coli)における抗体断片の発現を説明しているCharlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254も参照されたい)。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離することができ、さらに精製することができる。
【０１２４】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物も、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主または発現宿主であり、これらには、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、その結果、部分的または全面的にヒトグリコシル化パターンを有する抗体を産生する真菌株および酵母株が含まれる。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414;およびLi, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照されたい。
【０１２５】
グリコシル化抗体の発現のために適した宿主細胞はまた、多細胞生物(無脊椎動物および脊椎動物)にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞および昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と組み合わせて、特にスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞のトランスフェクションのために使用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている。
【０１２６】
植物細胞培養物もまた、宿主として使用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、同第6,040,498号、同第6,420,548号、同第7,125,978号、および同第6,417,429号(トランスジェニック植物において抗体を産生させるためのPLANTIBODIES(商標)技術を説明している)を参照されたい。
【０１２７】
脊椎動物細胞もまた、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で増殖するように順応させた哺乳動物細胞株が、有用である場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7);ヒト胚性腎臓株(例えばGraham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74で説明されている293または293細胞);仔ハムスター腎臓細胞(BHK);マウスセルトリ細胞(例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252で説明されているTM4細胞);サル腎臓細胞(CV1);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76);ヒト子宮頸部癌細胞(HELA);イヌ腎臓細胞(MDCK);バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A);ヒト肺細胞(W138);ヒト肝臓細胞(Hep G2);マウス乳房腫瘍(MMT060562);例えば、Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68で説明されている、TRI細胞;MRC5細胞;およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、DHFR- CHO細胞(Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞;ならびにY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に適したいくつかの哺乳動物宿主細胞株の概要については、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照されたい。
【０１２８】
本発明による多重特異性抗体は、組換え手段によって作製される。したがって、本発明の1つの局面は、本発明による多重特異性抗体をコ―ドする核酸であり、さらなる局面は、本発明による多重特異性抗体をコ―ドする該核酸を含む細胞である。組換え作製のための方法は、最新技術において広く知られており、原核細胞および真核細胞におけるタンパク質発現と、それに伴うその後の多重特異性抗体の単離および通常は薬学的に許容される純度までの精製とを含む。
【０１２９】
前述したように宿主細胞において抗体を発現させる場合、各々の修飾された軽鎖および重鎖をコードする核酸が、標準的な方法によって発現ベクターに挿入される。発現は、CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母、または大腸菌細胞のような適切な原核宿主細胞または真核宿主細胞において実施され、抗原結合タンパク質は、これらの細胞(培養上清または溶解後の細胞)から回収される。抗体を組換えによって作製するための一般的方法は最新技術において周知であり、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282、Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880といった総説論文で説明されている。
【０１３０】
本発明による多重特異性抗体は、1つの定常κ軽鎖ドメイン(CLκ)および1つの定常λ軽鎖ドメイン(CLλ)を有し、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインA-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどによって培地から適宜分離され、具体的には、本発明による多重特異性抗体は、(例えば、実施例3で説明するように)κ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーおよびλ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーを用いる2つの連続的なアフィニティークロマトグラフィー段階と、それに続くサイズ排除クロマトグラフィー段階によって精製される。
【０１３１】
本出願において使用される「宿主細胞」という用語は、本発明による抗体を作製するために操作できる任意の種類の細胞系を意味する。1つの態様において、HEK293細胞およびCHO細胞が宿主細胞として使用される。
【０１３２】
本明細書において使用される場合、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という表現は同義的に使用され、このような呼称はすべて、子孫を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という単語は、継代(transfer)の回数に関係なく、初代対象細胞およびそれに由来する培養物を含む。意図的な変異または偶発性の変異が原因で、すべての子孫のDNA内容物が全く同一ではない場合があることもまた、理解されている。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能または生物活性を有する変種子孫が含まれる。
【０１３３】
NS0細胞における発現は、例えば、Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270によって説明されている。一過性発現は、例えば、Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9によって説明されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289;およびNorderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87によって説明されている。好ましい一過性発現系(HEK 293)は、Cytotechnology 30 (1999) 71-83においてSchlaeger, E.-J.およびChristensen, K.によって、J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199においてSchlaeger, E.-J.によって説明されている。
【０１３４】
例えば、原核生物に適した制御配列には、プロモーター、任意でオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナルを使用することが公知である。
【０１３５】
核酸は、別の核酸配列と機能的に関係して配置されている場合、「機能的に連結」されている。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのDNAは、あるポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、そのポリペプチドのDNAに機能的に連結されており;プロモーターもしくはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、そのコード配列に機能的に連結されており;または、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に機能的に連結されている。一般に、「機能的に連結される」とは、連結されるDNA配列が隣接していていること、分泌リーダーの場合、隣接し、かつリーディングフレーム中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接していなくてもよい。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合には、合成のオリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の手法に従って使用される。
【０１３６】
本明細書において使用される「形質転換」という用語は、宿主細胞中へのベクター/核酸の移行プロセスを意味する。強力な細胞壁障壁を持たない細胞が宿主細胞として使用される場合、トランスフェクションは、例えば、Graham, F., L., and Van der Eb, A., J., Virology 52 (1973) 456-467によって説明されているようなリン酸カルシウム沈殿法によって実施される。しかし、核注入またはプロトプラスト融合など細胞中にDNAを導入するための他の方法もまた、使用され得る。原核細胞または実質的な細胞壁構築物を含む細胞が使用される場合、例えば、トランスフェクションの1つの方法は、Cohen, S., N., et al, PNAS. 69 (1972) 2110-2114によって説明されているような塩化カルシウムを用いるカルシウム処理である。
【０１３７】
本明細書において使用される場合、「発現」とは、核酸がmRNAに転写されるプロセスおよび/または転写されたmRNA(転写物とも呼ばれる)が続いてペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを意味する。転写物およびコードされるポリペプチドは、まとめて遺伝子産物と呼ばれる。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来している場合、真核細胞における発現は、mRNAのスプライシングを含み得る。
【０１３８】
「ベクター」は、挿入された核酸分子を宿主細胞中に、かつ/または宿主細胞間で移行させる、核酸分子、特に自己複製する核酸分子である。この用語は、主に細胞中へのDNAまたはRNAの挿入(例えば染色体組込み)のために機能するベクター、主にDNAまたはRNAの複製のために機能するベクターの複製(replication of vectors)、ならびにDNAまたはRNAの転写および/または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。また、前述の機能の内の複数を提供するベクターも含まれる。
【０１３９】
「発現ベクター」は、適切な宿主細胞中に導入された場合に、転写されポリペプチドに翻訳されることができるポリヌクレオチドである。「発現系」とは、通常、所望の発現産物をもたらすように機能できる発現ベクターからなる適切な宿主細胞を意味する。
【０１４０】
抗体の精製は、アルカリ/SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野において周知の他のものを含む標準技術によって、細胞構成要素または他の混在物、例えば、他の細胞核酸または細胞タンパク質を除去するために実施される。Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照されたい。本発明による完全な多重特異性抗体は、抗体の各アームに2つの異なる定常軽鎖ドメイン(κおよびλ)を含むため、それらは、(例えば、実施例3で説明するように)κ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーおよびλ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーを用いる2つの連続的なアフィニティークロマトグラフィー段階と、それに続くサイズ排除クロマトグラフィー段階によって、不完全な副産物または誤対合した副産物から精製することができる。
【０１４１】
一般に、微生物タンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィー(例えば、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーまたはプロテインGアフィニティークロマトグラフィー)、イオン交換クロマトグラフィー(例えば、陽イオン交換(カルボキシメチル樹脂)、陰イオン交換(アミノエチル樹脂)、および混合モードの交換)、硫黄親和性吸着(例えば、β-メルカプトエタノールおよび他のSHリガンドを使用)、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー(例えば、フェニルセファロース、アザアレーン親和性(aza-arenophilic)樹脂、またはm-アミノフェニルボロン酸を使用)、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー(例えば、Ni(II)親和性材料およびCu(II)親和性材料を使用)、サイズ排除クロマトグラフィー、ならびに電気泳動法(例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動)などの様々な方法が十分に確立されており、タンパク質精製のために広く普及して使用されている(Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102)。
【０１４２】
「薬学的組成物」という用語は、その中に含まれる有効成分の生物活性が有効になるのを可能にするような形態で存在し、かつその組成物が投与されると思われる対象に対して許容されないほど毒性である追加成分を含まない、調製物を意味する。薬学的組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、治療的有効量の有効成分を含む。
【０１４３】
「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」とは、対象にとって非毒性である、薬学的組成物中の有効成分以外の成分を意味する。薬学的に許容される担体または賦形剤には、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、または保存剤が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１４４】
薬学的組成物
本明細書において説明する多重特異性抗体の薬学的組成物は、所望の程度の純度を有するそのような抗体を1種または複数種の任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980))と混合することによって、凍結乾燥組成物または水性液剤の形態で調製される。通常、薬学的に許容される担体は、使用される投与量および濃度において受容者に非毒性であり、限定されるわけではないが、次のものが含まれる:リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール;メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾールなど);低分子量(約10残基未満の)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリ(ビニルピロリドン)のような親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物;EDTAのようなキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖;ナトリウムのような塩を形成する対イオン;金属複合体(例えばZn-タンパク質複合体);ならびに/またはポリエチレングリコール(PEG)のような非イオン系界面活性剤。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体には、さらに、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)のような侵入型(interstitial)薬物分散剤、例えば、rhuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International, Inc.)のようなヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質が含まれる。rhuPH20を含む、いくつかの例示的なsHASEGPおよび使用方法は、米国特許出願公開第2005/0260186号および同第2006/0104968号において説明されている。1つの局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼのような1種または複数種の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０１４５】
例示的な凍結乾燥抗体製剤/組成物が、米国特許第6,267,958号において説明されている。水性抗体製剤/組成物には、米国特許第6,171,586号およびWO 2006/044908において説明されているものが含まれ、後者の製剤/組成物は、ヒスチジン-酢酸緩衝液を含む。
【０１４６】
本明細書において開示する組成物はまた、治療される個々の適応症に対する必要に応じて複数の有効成分、好ましくは、補完的な活性を有し、互いに悪影響を及ぼさないものも含んでよい。このような有効成分は、意図される目的のために有効な量で組み合わせられて存在するのが適切である。
【０１４７】
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術もしくは界面重合により調製されたマイクロカプセル中に、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メチルメタクリラート)マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル)中に、またはマクロエマルジョン中に閉じ込めることができる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)で開示されている。
【０１４８】
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適切な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、これらのマトリックスは、造形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態で存在する。
【０１４９】
通常、インビボ投与のために使用される組成物は、滅菌済みである。無菌状態は、例えば、滅菌ろ過膜に通してろ過することによって、容易に実現することができる。
【０１５０】
本明細書において使用される場合、「治療(treatment)」(およびその文法的変形、例えば「治療する(treat)」または「治療すること(treating)」)とは、治療される個体の自然経過を変更しようとする臨床的介入を意味し、予防のため、または臨床的病状の過程のいずれかに実施され得る。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の直接的または間接的な任意の病理学的転帰の減少、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後改善が含まれるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせるため、または疾患の進行を遅くするために使用される。
【０１５１】
本発明の1つの局面は、本発明による多重特異性抗体を含む薬学的組成物である。
【０１５２】
本発明の別の局面は、薬学的組成物を製造するための、本発明による多重特異性抗体の使用である。
【０１５３】
本発明のさらなる局面は、本発明による多重特異性抗体を含む薬学的組成物を製造するための方法である。
【０１５４】
別の局面において、本発明は、組成物、例えば、本発明による多重特異性抗体を含み、薬学的担体と合わせて製剤化された薬学的組成物を提供する。
【０１５５】
本発明の別の局面は、医薬として使用するための前記薬学的組成物である。本発明の別の局面は、癌治療のための前記薬学的組成物である。
【０１５６】
本発明の別の局面は、医薬として使用するための、本発明による多重特異性抗体である。本発明の別の局面は、癌を治療するための、本発明による多重特異性抗体である。
【０１５７】
本発明の別の局面は、医薬を製造するための、本発明による多重特異性抗体の使用である。本発明の別の局面は、癌を治療するための医薬を製造するための、本発明による多重特異性抗体の使用である。
【０１５８】
本発明の別の局面は、本発明による多重特異性抗体をそのような治療を必要とする患者に投与することによって、疾患に罹患している患者を治療する方法である。本発明の別の局面は、本発明による多重特異性抗体をそのような治療を必要とする患者に投与することによって、癌に罹患している患者を治療する方法である。
【０１５９】
本発明の薬学的組成物は、当技術分野において公知である様々な方法によって投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路および/または様式は、所望の結果に応じて異なる。ある種の投与経路によって本発明の化合物を投与するために、化合物の不活性化を防止するための材料で化合物をコーティングすること、または化合物の不活性化を防止するための材料と共に化合物を同時投与することが必要な場合がある。例えば、適切な担体、例えば、リポソーム、または希釈剤中に入れて、化合物を対象に投与してもよい。薬学的に許容される希釈剤には、生理食塩水および水性緩衝溶液が含まれる。薬学的担体には、無菌の水溶液または分散液、および無菌の注射液剤または分散剤を用時調製するための無菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質に対してこのような媒体および作用物質を使用することは、当技術分野において公知である。
【０１６０】
「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、本明細書において使用される場合、経腸投与および局所投与以外の、通常は注射による投与様式を意味し、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内の注射および輸注を含む。
【０１６１】
本明細書において使用される癌という用語は、増殖性疾患、例えば、リンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、細気管支肺胞(bronchioloalviolar)細胞肺癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚黒色腫または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、胃の癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、腟癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌または尿管癌、腎細胞癌、腎う癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系(CNS)の新生物、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫(schwanoma)、上衣腫(ependymona)、髄芽細胞腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、およびユーイング肉腫を意味し、上記の癌のいずれかの難治性変種または上記の癌の内の1種もしくは複数種の組合せを含む。
【０１６２】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの補助剤も含んでよい。微生物の存在の防止は、前記の滅菌手順、ならびに様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、およびソルビン酸などを含めることの両方によって徹底することができる。また、糖および塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含めることが望ましい場合もある。さらに、注射可能な薬剤形態の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど吸収を遅延させる作用物質を含めることによって実現することができる。
【０１６３】
選択された投与経路に関わらず、適切な水和型で使用され得る本発明の化合物、および/または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知である従来の方法によって、薬学的に許容される剤形に製剤化される。
【０１６４】
本発明の薬学的組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性とならずに、個々の患者、組成物、および投与様式にとって望ましい治療応答を達成するのに有効である量の有効成分を得られるように変更することができる。選択される投与量レベルは、使用される本発明の個々の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される個々の化合物の排出速度、治療の継続期間、使用される個々の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および/または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的健康状態、および以前の病歴、ならびに医薬分野で周知である同様の因子を含む様々な薬物動態学的因子に依存すると考えられる。
【０１６５】
これらの組成物は、無菌であり、かつ注射器によって組成物を送達可能である程度に流動性でなければならない。水のほかには、担体は、好ましくは、等張性の緩衝生理食塩水である。
【０１６６】
適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用、分散系の場合には必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトールまたはソルビトール、および塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。
【０１６７】
以下の実施例および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲において説明される。本発明の精神から逸脱することなく、説明される手順に修正を加え得ることが理解される。
【０１６８】
3  発明の具体的な態様
以下に、本発明の具体的な態様を挙げる:
1  a)2本の改変された重鎖であって、各重鎖が、C末端からN末端の方向に重鎖定常ドメイン3、2、および1(CH3、CH2、およびCH1)ならびに共通軽鎖の可変ドメインである軽鎖可変ドメイン(VL)を含む、2本の改変された重鎖;
b)1本の改変された軽鎖であって、C末端からN末端の方向にκアイソタイプの定常軽鎖ドメイン(CL)および第1の抗原に特異的に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメイン(VH1)を含む、1本の改変された軽鎖;ならびに
c)1本の改変された軽鎖であって、C末端からN末端の方向にλアイソタイプの定常軽鎖ドメインおよび第2の抗原に特異的に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメイン(VH2)を含む、1本の改変された軽鎖
を含む、多重特異性抗体であって、
可変ドメインVH1およびVLが、第1の抗原に特異的に結合する第1の抗原結合部位を形成し、可変ドメインVH2およびVLが、第2の抗原に特異的に結合する第2の抗原結合部位を形成する、多重特異性抗体。
2  二重特異性である、態様1記載の抗体。
3  二価である、態様1または2記載の抗体。
4  二重特異性かつ二価である、前記態様のいずれか1つに記載の抗体。
5  IgG1サブクラスまたはIgG4サブクラスのものである、前記態様のいずれか1つに記載の抗体。
6  IgG1サブクラスのものである、前記態様のいずれか1つに記載の抗体。
7  IgG4サブクラスのものである、前記態様のいずれか1つに記載の抗体。
8  改変された重鎖が、アミノ酸配列が100％同一であるVL-CH1ドメインを含む、前記態様のいずれか1つに記載の抗体。
9  多重特異性抗体の重鎖定常ドメインCH3が、ヘテロ二量体化を支援するためにアミノ酸置換によって変更されない、前記態様のいずれか1つに記載の抗体。
10  多重特異性抗体の重鎖定常ドメインCH3が、ヘテロ二量体化を支援するために、ノブイントゥーホール技術によるアミノ酸置換によって変更されない、前記態様のいずれか1つに記載の抗体。
11  多重特異性抗体の重鎖定常ドメインCH3のアミノ酸配列が100％同一である、前記態様のいずれか1つに記載の抗体。
12  a)改変された重鎖が、C末端からN末端の方向にCH3-CH2-ヒンジ-CH1-VLからなり、VLが共通軽鎖の可変ドメインであり;
b)第1の改変された軽鎖が、C末端からN末端の方向に、κアイソタイプの定常軽鎖ドメイン(CL)および第1の抗原に特異的に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメイン(VH1)からなり;かつ
c)第2の改変された軽鎖が、C末端からN末端の方向に、λアイソタイプの定常軽鎖ドメイン(CL)および第2の抗原に特異的に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメイン(VH2)からなる、
前記態様のいずれか1つに記載の抗体。
13  a)前記態様のいずれか1つに記載の多重特異性抗体をコードする核酸分子を含む発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する段階;
b)多重特異性抗体分子の合成を可能にする条件下で宿主細胞を培養する段階;および
c)培養物から該多重特異性抗体分子を回収する段階
を含む、前記態様のいずれか1つに記載の多重特異性抗体を調製するための方法。
14  宿主細胞が、3種の異なる発現ベクターを用いて形質転換され、第1の発現ベクターが、κアイソタイプの定常軽鎖ドメインを含む改変された軽鎖をコードする核酸分子を含み、第2の発現ベクターが、λアイソタイプの定常軽鎖ドメインを含む改変された軽鎖をコードする核酸分子を含み、かつ第3の発現ベクターが、改変された重鎖をコードする核酸分子を含む、態様13記載の方法。
15  態様1〜12のいずれか1つに記載の抗体の軽鎖をコードする核酸。
16  態様1〜12のいずれか1つに記載の抗体の重鎖をコードする核酸。
17  態様1〜12のいずれか1つに記載の多重特異性抗体をコードする核酸。
18  態様15〜17のいずれか1つに記載の核酸を含む発現ベクター。
19  原核宿主細胞または真核宿主細胞において核酸を発現することができる、態様18記載の発現ベクター。
20  態様18または19に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
21  3種の異なる発現ベクターを含み、第1の発現ベクターが、κアイソタイプの定常軽鎖ドメインを含む改変された軽鎖をコードする核酸分子を含み、第2の発現ベクターが、λアイソタイプの定常軽鎖ドメインを含む改変された軽鎖をコードする核酸分子を含み、かつ第3の発現ベクターが、改変された重鎖をコードする核酸分子を含む、態様20記載の宿主細胞。
22  真核生物または原核生物である、態様20または21記載の宿主細胞。
23  真核生物である、態様20または21記載の宿主細胞。
24  原核生物である、態様20または21記載の宿主細胞。
25  第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体および第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に基づく多重特異性抗体であって、第1の抗体および第2の抗体が共通軽鎖を含む多重特異性抗体を作製するための方法であって、
a)C末端からN末端の方向にκアイソタイプの定常軽鎖ドメインおよび重鎖可変ドメイン(VH1)を含む軽鎖を得るために、該第1の抗体に由来する重鎖の重鎖可変ドメイン(VH1)で軽鎖可変ドメイン(VL)を置換すること、および任意で、κアイソタイプの定常軽鎖ドメインで元の定常軽鎖ドメインを置換することによって、該第1の抗体に由来する軽鎖を改変する段階; 
b)C末端からN末端の方向にλアイソタイプの定常軽鎖ドメインおよび重鎖可変ドメイン(VH2)を含む軽鎖を得るために、該第2の抗体に由来する重鎖の重鎖可変ドメイン(VH2)で軽鎖可変ドメイン(VL)を置換すること、および任意で、λアイソタイプの定常軽鎖ドメインで元の定常軽鎖ドメインを置換することによって、該第2の抗体に由来する軽鎖を改変する段階;
c)C末端からN末端の方向に重鎖定常ドメイン3、2、および1(CH3、CH2、およびCH1)ならびに軽鎖可変ドメイン(VL)を含む重鎖を得るために、該第1の抗体に由来する軽鎖の軽鎖可変ドメイン(VL)で重鎖可変ドメイン(VH1)を置換することによって、該第1の抗体に由来する重鎖を改変する段階;ならびに/または
C末端からN末端の方向に重鎖定常ドメイン3、2、および1(CH3、CH2、およびCH1)ならびに軽鎖可変ドメイン(VL)を含む重鎖を得るために、該第2の抗体に由来する軽鎖の軽鎖可変ドメイン(VL)で重鎖可変ドメイン(VH2)を置換することによって、該第2の抗体に由来する重鎖を改変する段階
を含む、方法。
26  態様1〜12のいずれか1つに記載の多重特異性抗体を作製するための、態様25記載の方法。
27  態様25または26記載の方法によって得られる多重特異性抗体。
28  少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、態様1〜12および26のいずれか1つに記載の多重特異性抗体を含む、薬学的組成物。
29  治療的有効量の多重特異性抗体を含む、態様28記載の薬学的組成物。
30  医薬として使用するための、態様1〜12および26のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
31  癌を治療する際に使用するための、態様1〜12および26のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
32  医薬として使用するための、態様28または29記載の薬学的組成物。
33  癌を治療する際に使用するための、態様28または29記載の薬学的組成物。
34  医薬を製造するための、態様1〜12および26のいずれか1つに記載の多重特異性抗体の使用。
35  癌を治療するための医薬を製造するための、態様1〜12および26のいずれか1つに記載の多重特異性抗体の使用。
36  治療的有効量の態様1〜12および26のいずれか1つに記載の多重特異性抗体を患者に投与することを特徴とする、治療法を必要とする患者を治療するための方法。
37  治療的有効量の態様1〜12および26のいずれか1つに記載の多重特異性抗体を患者に投与することを特徴とする、治療法を必要とする癌患者を治療するための方法。
【０１６９】
配列の説明
SEQ ID NO: 1  改変された重鎖CH3-CH2-CH1-VL(VLは、共通軽鎖の可変ドメインである)(CLC-Fcクロス(cross)-Mab)のヌクレオチド配列。
SEQ ID NO: 2  CLκ-VH1-CLκ(VH1は、第1の抗原に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメインである)からなるポリペプチドを含む改変された軽鎖([抗DR5 2A11 VH1]-CLκ)のヌクレオチド配列。
SEQ ID NO: 3  CLκ-VH1-CLκ(VH1は、第1の抗原に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメインである)からなるポリペプチドを含む改変された軽鎖([抗DR5 8E11 VH1]-CLκ)のヌクレオチド配列。
SEQ ID NO: 4  CLκ-VH1-CLκ(VH1は、第1の抗原に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメインである)からなるポリペプチドを含む改変された軽鎖([抗DR5 21C11 VH1]-CLκ)のヌクレオチド配列。
SEQ ID NO: 5  改変された軽鎖VH2-CLλ(VH2は、第2の抗原に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメインである)([抗FAP 3C6 VH2]-CLλ)のヌクレオチド配列。
SEQ ID NO: 6  改変された重鎖CH3-CH2-CH1-VL(VLは、共通軽鎖の可変ドメインである)(CLC-Fc クロス(cross)-Mab)のアミノ酸配列。
SEQ ID NO: 7  CLκ-VH1-CLκ(VH1は、第1の抗原に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメインである)からなるポリペプチドを含む改変された軽鎖([抗DR5 2A11 VH1]-CLκ)のアミノ酸配列。
SEQ ID NO: 8  CLκ-VH1-CLκ(VH1は、第1の抗原に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメインである)からなるポリペプチドを含む改変された軽鎖([抗DR5 8E11 VH1]-CLκ)のアミノ酸配列。
SEQ ID NO: 9  CLκ-VH1-CLκ(VH1は、第1の抗原に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメインである)からなるポリペプチドを含む改変された軽鎖([抗DR5 21C11 VH1]-CLκ)のアミノ酸配列。
SEQ ID NO: 10  改変された軽鎖VH2-CLλ(VH2は、第2の抗原に結合する抗体に由来する可変重鎖ドメインである)([抗FAP 3C6 VH2]-CLλ)のアミノ酸配列。
【実施例】
【０１７０】
実施例1
共通軽鎖ライブラリー(CLCL)の作製および結合物の作製
重鎖中に位置する多様性のすべてを有するファージディスプレイのためのライブラリーを作製した。軽鎖は、以前のヒト化プロジェクトに由来する既存の抗体から選択した(WO 2013/026832において説明される抗MCSP抗体LC007のヒト化軽鎖ML1(LC007ヒト化抗体ML1 VL))。
【０１７１】
このライブラリーに含めるために、2つの異なる重鎖を選択した。一つ目はDP47であり、もう一方はDP88である(それぞれ、IMGTアクセッション番号:IGHV3-23*01およびIGHV1-69*06)。Jエレメントは、それぞれJH4
0006422956.tif 000003
およびJH6
0006422956.tif 000004
であった。2本の重鎖のCDR3は、(Virnekas et al.; Nucleic Acids Res. 1994 Dec 25;22(25):5600-7)において説明されているトリヌクレオチド構成単位(building block)に基づくランダム化プライマーを用いて多様化した。両方のライブラリー中のCDR3ループの長さは、Dエレメントに対応するそのストレッチについて、4アミノ酸長、6アミノ酸長、または8アミノ酸長のいずれかであった(アミノ酸95〜98、95〜100、または95〜100b)。抗体ライブラリーは、従来のM13ファージディスプレイ系にFab形態でクローニングした(de Haard et al.; Journal of Biological Chemistry Volume 274, Issue 26, 25 June 1999, Pages 18218-18230)。
【０１７２】
ビオチン標識し、ストレプトアビジンビーズ上に固定した後、組換えFAPタンパク質およびDR5タンパク質に対してファージパニングを実施した。ELISAによる選択後に結合を確認し、陽性クローンを従来のジデソシキ(didesoxy)配列決定法によって配列決定した後に、IgG形態またはCrossMab形態に変換した。
【０１７３】
実施例2
改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体の作製
いかなるヘテロ二量体化アプローチ(例えばノブイントゥーホール技術)も用いずに、2種の異なる抗原に同時に結合できる二重特異性抗体(各抗原に対して一価)を作製するために、いわゆるCrossMab技術を用いる共通軽鎖ライブラリーの組合せを適用した:共通軽鎖(CLC)の可変領域を標準的なヒトIgG1抗体のCH1ドメインに融合して、両方の特異性に対して共通である(Fcに融合された)VL/VH交差(crossed)分子を形成させた。交差対応物(VH-CL)を作製するために、(共通軽鎖ライブラリーから単離された)抗原Aに特異的な可変重鎖ドメインを、定常ヒトk軽鎖に融合し、一方で、(同様に共通軽鎖ライブラリーから単離された)抗原Bに特異的な可変重鎖ドメインを、定常ヒトl軽鎖に融合した。これにより、望まれないホモ二量体抗体を除去するためのKappaSelectカラムおよびLambdaFabSelectカラム(GE Healthcare)を用いる精製段階を続いて適用することにより、所望の二重特異性抗体を精製することが可能になる。
【０１７４】
概念実証のため、これらの分子が活性型で生産され得るかを確認するために、ヒトデスレセプター5(TRAIL-R2)およびヒト線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)を対象とする抗体を組み合わせて、1+1の価数を有する二重特異性抗体にした。
【０１７５】
第1の構築物では、DR5結合物2A11をFAP結合物3C6と組み合わせた。この分子が両方の抗原に結合することができ、かつアポトーシス誘導アッセイ法において活性であることを示した後に、前述したようにして、さらに2種のDR5-FAP二重特異性構築物を作製した:この場合、FAP結合物3C6を、共通軽鎖ライブラリーから単離した異なるDR5結合物(すなわち8E11および21C11)に融合した。DR5およびFAPに特異的に結合する本発明によるこれらの二重特異性抗体はさらに、「改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体」とも呼ばれる。
【０１７６】
抗体発現ベクターはすべて、Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989において説明されているような標準的な組換えDNA技術を用いて作製した。分子生物学的試薬は、製造業者の推奨に従って使用した。遺伝子または遺伝子断片は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するか、またはGeneart AG(Regensburg, Germany)において自動遺伝子合成によって合成オリゴヌクレオチドから作製された。PCR増幅されるか、またはサブクローニングされたDNA断片は、DNA配列決定(Synergene GmbH, Switzerland)によって確認された。標準的なMaxiprepキット(Qiagen)を用いてトランスフェクションに使える品質の(transfection-grade)プラスミドDNAを調製するために、プラスミドDNAを適切な大腸菌宿主株に形質転換し、増幅させた。二重特異性分子を作製するために、ポリエチレンイミン(PEI)に基づく標準的方法を用いて、各遺伝子をコードするプラスミドをHEK293 EBNA細胞にトランスフェクトした。3種の発現ベクターの使用したプラスミド比は1:1:1であった。トランスフェクトされた細胞を7日間培養した後、精製するために上清を採取した。
【０１７７】
（表２）改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体のヌクレオチド配列
0006422956.tif 000005
0006422956.tif 000006
0006422956.tif 000007
【０１７８】
（表３）改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体の
0006422956.tif 000008
0006422956.tif 000009
【０１７９】
そして、DR5およびFAPに特異的に結合する以下の3種の本発明による二重特異性抗体を作製した。
【０１８０】
（表４）改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体
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【０１８１】
改変された共通軽鎖-κ-λ二重特異性抗体の構造の概略図を図2Aに示している。2本の同一の改変された重鎖および2本の異なる改変された軽鎖の可変ドメインおよび定常ドメインを示している。図2Bにおいて、κ-λ二重特異性抗体の概略図を、一例としての抗体GA803_G25_H14D_001(抗DR5 2A11および抗FAP 3C6に基づく)について示している。ターゲティング部分および個々の軽鎖ドメインを示している。類似したドメイン構造を有する、3C6と8E11および21C11との組合せを作製した。
【０１８２】
実施例3
改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体の発現および精製
ポリエチレンイミンを用いて、懸濁状態で増殖しているHEK293-EBNA細胞に哺乳動物用発現ベクターを同時トランスフェクトすることによって、この分子を産生させる。これらの細胞に、1:1:2の比の対応する発現ベクターをトランスフェクトする(「改変されたVH1-κ軽鎖のベクター(DR5-CLκ)」:「改変されたVH2-λ軽鎖のベクター(FAP-CLλ)」:「共通軽鎖VLを有する改変された重鎖のベクター(CLC-Fcクロス-Mab)」)。
【０１８３】
HEK293-EBNA細胞を、無血清のCD CHO培地中に懸濁して培養する。500ml容振盪フラスコ中で生産するために、トランスフェクションより24時間前に、4億個のHEK293-EBNA細胞を播種する。トランスフェクションのために、細胞を210×gで5分間遠心分離し、上清を、予め温めたCD CHO培地20mlに交換する。最終的な量が200μgのDNAとなるように、CD CHO培地20mlに発現ベクターを混合する。540μlのPEIを添加した後、溶液を15秒間ボルテックスし、続いて、室温で10分間インキュベートする。その後、細胞をDNA/PEI溶液と混合し、500ml容振盪フラスコに移し、5％ CO2雰囲気のインキュベーター中で、37℃で3時間、インキュベートする。インキュベーション期間の後、F17培地160mlを添加し、細胞を24時間培養する。トランスフェクション後1日目に、1mMバルポリ酸(valporic acid)および7％ Feed 1を添加する。7日間の培養後、210×gで15分間の遠心分離によって精製するために、上清を採取し、溶液を滅菌ろ過し(0.22μmフィルター)、最終濃度0.01％w/vのアジ化ナトリウムを添加し、4℃で維持する。
【０１８４】
κ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーおよびλ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーを用いる2つの連続的なアフィニティークロマトグラフィー段階と、それに続くサイズ排除クロマトグラフィー段階によって、分泌されたタンパク質を細胞培養上清から精製する。
【０１８５】
1つ目のアフィニティークロマトグラフィー段階のために、Tricorn 5/50カラム(CV=1mL、GE Healthcare)に充填され、5mlの50mM TRIS、100mMグリシン、150mM NaCl、pH8.0で平衡にされたCapture Select Kappaアフィニティーマトリックス(BAC)上に、上清を載せる。少なくとも15カラム容量の50mM TRIS、100mMグリシン、150mM NaCl、pH8.0を用いて洗浄することによって、未結合タンパク質を除去する。目的タンパク質は、50mM TRIS、100mMグリシン、150mM NaCl、pH2.0までの25カラム容量にわたる段階的pH勾配(step pH-gradient)において溶出される。
【０１８６】
1つ目の精製段階から得られた溶出液を、50mM TRIS、100mMグリシン、150mM NaCl、pH8.0に1:1で加えて希釈することによって中和する。
【０１８７】
2つ目のアフィニティークロマトグラフィー段階は、Tricorn 5/50カラム(CV=1mL、GE Healthcare)に充填され、5mlの50mM TRIS、100mMグリシン、150mM NaCl、pH8.0で平衡にされたCapture Select Lambdaアフィニティーマトリックス(BAC)において実施する。添加後、少なくとも15カラム容量の50mM TRIS、100mMグリシン、150mM NaCl、pH8.0を用いてカラムを洗浄する。段階的pH勾配でpHをpH2.0に低下させることによって、目的タンパク質をカラムから溶出させる。Capture Select Lambdaアフィニティーカラムから得られた画分を集め、スピン濃縮装置(Amicon MWCO: 30.000Da)を用いて濃縮する。それによって、緩衝液をpH6.0の20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム溶液に交換する。
【０１８８】
続いて、濃縮されたタンパク質溶液を、pH6.0の20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム溶液で平衡にしたSuperdex 200 10/300GLカラム(GE Healthcare)に載せる。
【０１８９】
実施例4
改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体の特徴付け
280nmにおける光学濃度(OD)を測定し、アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を用いることによって、精製タンパク質試料のタンパク質濃度を決定する。
【０１９０】
分子の純度および分子量を、還元剤の存在下および非存在下でのCE-SDS解析によって解析する。Caliper LabChip GXIIシステム(Caliper lifescience)を製造業者の取扱説明書に従って使用する。解析のために2ugの試料を使用する。改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体のSDS-Pageとして、電気泳動図を示している:A)3C6/8E11(還元)、B)3C6/8E11(非還元)、C)3C6/21C11(還元)、D)3C6/21C11(非還元)(結果を図3に示している)。
【０１９１】
TSKゲルG3000 SW XL分析用サイズ排除カラム(Tosoh)を用いて、25℃、25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-アルギニン一塩酸塩(Monohydrocloride)、0.02％(w/v)NaN3、pH6.7のランニング緩衝液において、抗体試料の凝集物含有量を解析する。
【０１９２】
κ軽鎖およびλ軽鎖を伴う共通重鎖からなる分子は、2つの連続的なアフィニティークロマトグラフィー段階によって均質に精製することができる。調製物の最終的な単量体含有量を表5に挙げている。
【０１９３】
（表５）改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体の収量および最終的な単量体含有量
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【０１９４】
改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体のLC-MS解析
改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体の脱グリコシル
改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体GA803_G27_H14D_001が均質に調製されていることを2つの連続的なアフィニティークロマトグラフィー段階によって確認するために、最終タンパク質溶液をLC-MS解析によって解析する。炭水化物によってもたらされる(introduced)異成分を除去するために、改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体をPNGaseFで処理する。したがって、濃度0.5mg/mlの20μgタンパク質に2μlの2M Trisを添加することによって、タンパク質溶液のpHをpH7.0に調整する。IdeS 0.8μgを添加し、25℃で68時間、インキュベートする。
【０１９５】
脱グリコシルされた改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体のLC-MS解析(オンライン検出)
TOF 6441質量分析計(Agilent)と連結したAgilent HPLC 1200を用いて、LC-MS法を実施する。クロマトグラフィー分離は、Macherey Nagelポリステレン(Polysterene)カラム;RP1000-8(粒径8μm、4.6×250mm;カタログ番号719510)を用いて実施する。溶離液Aは、水に溶かした5％アセトニトリルおよび0.05％(v/v)ギ酸であり、溶離液Bは、95％アセトニトリル、5％水、および0.05％ギ酸である。流速は1ml/分であり、分離を40℃で実施し、前述の処理によって、7μg(15μl)の抗体試料を得た。
【０１９６】
（表６）LC-MS溶離液の条件
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【０１９７】
質量分析計に塩が混入するのを妨げるように質量分析計を予防するために、最初の4分間、溶出液を廃棄物に振り分ける。乾燥ガス流量12l/分、温度350℃、および噴霧器圧力60psiで、ESI源を流していた。350Vのフラグメンター電圧および質量範囲700〜3200m/zを用い、陽イオンモードを用いて、MSスペクトルを取得する。MSデータは、機器のソフトウェアによって4〜17分間、取得する。
【０１９８】
結果:
一例としての改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体3C6/8E11について、LC-MSにより、均質に調製されたことが図4に示されている。144697.1Daの位置の主要ピークは、2つの酸化部位を有するタンパク質の正確な分子量に対応している。2本のκ軽鎖または2本のλ軽鎖のいずれかを有する分子はLC-MSにおいて検出されていない(図4)。
【０１９９】
実施例5
表面プラズモン共鳴による、改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体の2種の異なる抗原への同時結合の解析
いずれの表面プラズモン共鳴(SPR)実験も、HBS-EPをランニング緩衝液として用い(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％ Surfactant P20、Biacore、Freiburg/Germany)、25℃で、Biacore(登録商標)T100において実施する。
【０２００】
腫瘍抗原FAPおよびヒトデスレセプター5(DR5)への改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体(GA803_G25_H14D_001)の同時結合は、ストレプトアビジンチップ(Biacore, Freiburg/Germany)上に約120レゾナンスユニット(RU)のビオチン化ヒトDR5およびビオチン化カニクイザルDR5を直接結合させることによって実施する。概略図を図5に示す。改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体(GA803_G25_H14D_001)を150nMで90秒間捕捉する。続いて、ヒトFAPを、濃度500nM、流速30μl/分で90秒間、通過させる。解離を60秒間測定する。10mMグリシン、pH1.5を30秒間注入することによって、表面を再生する。
【０２０１】
改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体が捕捉されていない表面に組換えヒトFAPが流される参照フローセルから得られた応答を引くことによって、バルク屈折率の差を補正する。
【０２０２】
結果
表面プラズモン共鳴測定により、改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体(GA803_G25_H14D_001)が両方の抗原に同時に結合できることを確認した(図6に示している)。
【０２０３】
実施例6
改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体の細胞表面結合
DR5を発現するMDA-MB 231腫瘍細胞株の細胞およびFAPを発現する線維芽細胞細胞株GM05389の細胞への、改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λヒト二重特異性抗体の結合を、FACSによって測定した。対照として、同じ結合物を含む別の四価の二重特異性DR5/FAP抗体構築物を使用した。手短に言えば、96ウェル丸底プレートのウェル1つ当たり20万個の細胞を、指定濃度の構築物40μlと共に4℃で30分間、インキュベートした。0.1％BSAを含むPBSで細胞を洗浄することによって、未結合の構築物を除去した。結合した構築物を、Dylight649結合AffiniPure F(ab')2断片ヤギ抗ヒトIgG Fcg断片特異的二次抗体(Jackson ImmunoResearch 109-496-098番;使用溶液(working solution)  PBS、0.1％ BSAで1:50希釈)を用いて検出した。4℃で30分間のインキュベーションの後、洗浄によって未結合抗体を除去し、1％ PFAを用いて細胞を固定した。BD FACS CantoII(ソフトウェアBD DIVA)を用いて細胞を解析した。結果を図7および8に示す。改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体GA803_G25_H14D_001の結合を、DR5陽性MDA-MB231細胞において試験した。構築物は、濃度依存的にMDA-MB231細胞に結合する(図7)。
【０２０４】
改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体GA803_G25_H14D_001の結合を、FAP陽性GM05389線維芽細胞において試験した。構築物は、濃度依存的にGM05389細胞に結合する(図8)。
【０２０５】
実施例7
アポトーシスアッセイ法
改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λヒト二重特異性抗体のアポトーシス誘導を、同時培養アッセイ法において細胞死検出ELISAplus(Roche Applied Science 11774425001番)を用いて測定した。簡単に説明すると、10'000個のFAP発現細胞GM05389を96ウェル平底細胞培養プレートに播種し、インキュベーター中で一晩インキュベートした。翌日、希釈した構築物を指定濃度で添加し、10分間インキュベートして、抗体を結合させた。次いで、10'000個のアポトーシス感受性MDA-MB 231腫瘍細胞をプレートに添加した。陰性対照として、GM05389の非存在下でアポトーシス誘導を試験する。24時間のインキュベーション後、製造業者の取扱説明書で説明されているようにして、細胞死検出ELISAを実施した。結果を図9に示す。異なるDR5結合物を有する3種の改変された共通軽鎖DR5/FAP-κ-λ二重特異性抗体のアポトーシス誘導を、FAP発現線維芽細胞(GM05389)の非存在下または存在下でMDA-MB 231において試験した。構築物はいずれも、FAPの存在下で特異的アポトーシスを誘導することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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