(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＯおよび／またはＣＯ２を３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）に変換するプロセスであって、
培地中のカルボキシドトロフ酢酸生成菌の培養物を含有するバイオリアクターに、ガス状のＣＯ含有および／またはＣＯ２含有基質を通過させ、その結果、前記細菌が前記ＣＯおよび／またはＣＯ２を３−ＨＰに変換する工程と、
前記バイオリアクターから前記３−ＨＰを回収する工程と、を含み、
前記カルボキシドトロフ酢酸生成菌にマロニル補酵素Ａ還元酵素をコードする外因性核酸を導入して、マロニル補酵素Ａ還元酵素を発現させ、
前記細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｖｕｉからなる群から選択される、プロセス。
【請求項２】
マロニル補酵素Ａ還元酵素をコードする外因性核酸を含む、単離された遺伝子操作カルボキシドトロフ酢酸生成菌であって、前記マロニル補酵素Ａ還元酵素を発現し、３分子のＣＯまたはＣＯ２を１分子の３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）に固定することができ、
前記細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｖｕｉからなる群から選択される、カルボキシドトロフ酢酸生成菌。
【請求項３】
さらに、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼをコードする核酸を含み、前記核酸がプロモーターに作動可能に連結されている、請求項２に記載の単離された遺伝子操作カルボキシドトロフ酢酸生成菌。
【請求項４】
前記細菌がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｄａｈｌｉｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍからなる群から選択される、請求項２に記載の単離された遺伝子操作カルボキシドトロフ酢酸生成菌。
【請求項５】
前記アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、ＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａまたはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ種から選択される、請求項３に記載の単離された遺伝子操作カルボキシドトロフ酢酸生成菌。
【請求項６】
前記アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼが、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のものである、請求項３に記載の単離された遺伝子操作カルボキシドトロフ酢酸生成菌。
【請求項７】
マロニル補酵素Ａ還元酵素をコードする核酸がコドン最適化されている、請求項２に記載の単離された遺伝子操作カルボキシドトロフ酢酸生成菌。
【請求項８】
請求項２に記載の単離された遺伝子操作カルボキシドトロフ酢酸生成菌を培養する方法であって、ＣＯおよび／またはＣＯ２を含むガス状の炭素源を含む培地中で、前記細菌を培養することを含む、方法。
【請求項９】
請求項２に記載の単離された遺伝子操作カルボキシドトロフ酢酸生成菌を培養する方法であって、ＣＯおよび／またはＣＯ２を含むエネルギー源を含む培地中で、前記細菌を培養することを含む、方法。
【請求項１０】
前記培養が絶対嫌気性である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記炭素源が、産業廃棄物またはオフガスを含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌が、さらに、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼをコードする外因性核酸を含み、前記核酸がプロモーターに作動可能に連結されている、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１３】
前記マロニル補酵素Ａ還元酵素が、非硫黄光合成細菌由来である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記マロニル補酵素Ａ還元酵素が、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のものである、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記マロニル補酵素Ａ還元酵素が、配列番号１のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、請求項２に記載の単離された遺伝子操作カルボキシドトロフ酢酸生成菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＯおよび／またはＣＯ２含有基質の微生物発酵による３−ヒドロキシプロピオネート［３−ＨＰ］を生成するための組換え微生物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
３−ヒドロキシプロピオネート［３−ＨＰ］は、ポリマー材料の生成のための前駆体および化学原料として機能するプラットフォーム化学物質である。ポリ（３−ヒロドキシプロピオン酸）［Ｐ（３−ＨＰ）]は、極めて高い熱安定性などの有望な特性を有する生分解性ポリマーである。
【０００３】
３−ＨＰは、多くの貴重な工業化学物質を得るために用いることができ、この例としては、塗料、紙、接着剤、繊維、特殊コーティング剤、インキ、および高吸収性ポリマーポリアクリレートの製造に使用されているアクリル酸；溶媒、接着剤、化粧品として使用されるか、またはカーペットおよび織物に使用されるポリトリメチレンテレフタレートを作るためのものである１，３−プロパンジオール；食品の調製において飼料添加物として、および栄養産業で防腐剤として使用される３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドなど、が挙げられる。
【０００４】
３−ＨＰは、米国エネルギー省によって第３番目に重要な再生可能化学物質として挙げられており、３−ＨＰの国際市場の機会は、年間３６３万トンと推定されている（パステルら、２００３、米国ＤＯＥレポート：４８−４９）。
【０００５】
本発明の目的は、公知の方法を上回る１以上の利点を提供することができる、微生物発酵により３−ＨＰを生成するための組換え微生物および方法を提供すること、または少なくとも有用な選択肢を公衆に提供することである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、一般に、とりわけＣＯおよび／またはＣＯ２含有基質の微生物発酵による３−ＨＰを生成する方法、およびそのような方法において使用する組換え微生物を提供する。本方法は、２つの異なるＣＯ２固定経路を組み合わせて、単一の代謝産物を生成する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様において、本発明は、ＣＯおよび／またはＣＯ２含有基質の発酵によって３−ＨＰと、必要に応じて１以上の他の生成物とを生成することができる嫌気性の酢酸生成組換え微生物を提供する。
【０００８】
特定の一実施形態において、本微生物は、この組換え微生物が由来する親微生物中では天然に存在しない３−ＨＰ生合成経路中の１以上の酵素（またはそれらの１以上のサブユニット）を発現するように適合されている。別の実施形態において、本微生物は、この組換え微生物が由来する親微生物中に天然に存在する３−ＨＰ生合成経路中の１以上の酵素（またはそれらの１以上のサブユニット）を過剰発現するように適合されている。一実施形態において、本微生物は、親微生物中に天然に存在しない３−ＨＰ生合成経路中の１以上の酵素（またはそれらの１以上のサブユニット）を発現するように、かつ親微生物中に天然に存在する３−ＨＰ生合成経路中の１以上の酵素（またはそれらの１以上のサブユニット）を過剰発現するように適合されている。
【０００９】
一実施形態において、これらの１以上の酵素は、マロニル補酵素Ａ還元酵素（ＥＣ １．２．１．７５）；アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）（ＥＣ ６．４．１．２）；およびそれらのいずれか１つの機能的に同等な変異型からなる群から選択される。
【００１０】
一実施形態において、親微生物は、ＣＯおよび／またはＣＯ２含有基質を発酵して、アセチル−ＣｏＡを生成することができるが、アセチル−ＣｏＡを３−ＨＰに変換することはできず、この組換え微生物は、アセチル−ＣｏＡの３−ＨＰへの変換に関与する１以上の酵素（またはそれらの１以上のサブユニット）を発現するように適合されている。
【００１１】
一実施形態において、本微生物は、親微生物由来の１以上の核酸の発現を増加させるように適合された１以上の外因性核酸を含み、これらの１以上の核酸は、本明細書の前述の酵素（またはそれらの１以上のサブユニット）のうちの１以上をコードする。
【００１２】
一実施形態において、発現を増加させるように適合された１以上の外因性核酸は、調節エレメントである。一実施形態において、この調節エレメントはプロモーターである。
【００１３】
一実施形態において、このプロモーターは構成的プロモーターである。一実施形態において、このプロモーターは、ウッド−ユングダール遺伝子クラスターまたはホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターを含む群から選択される。
【００１４】
一実施形態において、本微生物は、本明細書の前述の酵素（またはそれらの１以上のサブユニット）のうちの１以上をコードし、これを発現するように適合された１以上の外因性核酸を含む。一実施形態において、本微生物は、これらの酵素（またはそれらの１以上のサブユニット）のうちの少なくとも２つをコードし、これを発現するように適合された１以上の外因性核酸を含む。
【００１５】
一実施形態において、この１以上の外因性核酸は、核酸コンストラクトまたはベクターであり、特定の一実施形態において、任意の組み合わせで本明細書の前述の酵素のうちの１以上をコードするプラスミドである。
【００１６】
一実施形態において、この外因性核酸は、発現プラスミドである。
【００１７】
一実施形態において、親微生物は、嫌気性アセトゲンの群から選択される。
【００１８】
特定の一実施形態において、親微生物は、カルボキシドトロフ（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈｉｃ）酢酸生成菌の群から選択され、一実施形態において、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉを含む群から選択される。
【００１９】
一実施形態において、親微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉである。特定の一実施形態において、本微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ２３６９３である。別の特定の実施形態において、本微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＤＳＭ１３５２８（またはＡＴＣＣ５５３８３）である。
【００２０】
一実施形態において、親微生物は、マロニル補酵素Ａ還元酵素および／またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、またはそれらの１以上のサブユニットをコードする１以上の遺伝子を欠いている。
【００２１】
第２の態様において、本発明は、微生物中で発現させる場合に、ＣＯおよび／またはＣＯ２含有基質の発酵によって、微生物が３−ＨＰを生成することを可能にする１以上の酵素（またはそれらの１以上のサブユニット）をコードする核酸を提供する。
【００２２】
一実施形態において、この核酸は、微生物中で発現させる場合に、ＣＯ含有基質の発酵によって、微生物が３−ＨＰを生成することを可能にする２以上の酵素（またはそれらの１以上のサブユニット）をコードする。
【００２３】
一実施形態において、この酵素は、マロニル補酵素Ａ還元酵素およびアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ならびにそれらの任意の１以上の機能的に同等な変異型から選択される。
【００２４】
一実施形態において、この核酸は、任意の順序で、マロニル補酵素Ａ還元酵素、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、またはそれらの任意の１以上の機能的に同等な変異型をコードする核酸配列を含む。
【００２５】
一実施形態において、マロニル補酵素Ａ還元酵素をコードする核酸は、配列番号１もしくはＧＩ：１６３８４８１６５、Ｃａｕｒ ２６１４の配列を有し、またはその機能的に同等な変異型である。
【００２６】
一実施形態において、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードする核酸は、配列番号１８、２０、２２、ならびに２４（もしくはＣＬＪＵ＿ｃ４２１００−４０、ＧＩ：９４４７８２６−３１、およびＧＩ：１６３８４７２１０−１１、Ｃａｕｒ＿１６４７  −４８、ＧＩ：１６３８４９２６２、Ｃａｕｒ＿３７３９、ＧＩ：１６３８４８９５１、Ｃａｕｒ＿３４２１、ＧＩ：１６３８４６９５１、Ｃａｕｒ＿１３７８）の配列、またはそれらの任意の１以上の機能的に同等な変異型を含む。
【００２７】
一実施形態において、本発明の核酸は、さらにプロモーターを含む。一実施形態において、このプロモーターは、その制御下で遺伝子の構成的発現を可能にする。特定の実施形態において、ウッド−ユングダールクラスタープロモーターが使用される。別の特定の実施形態において、ホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターが使用される。特定の一実施形態において、プロモーターは、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来である。
【００２８】
第３の態様において、本発明は、第２の態様の１以上の核酸を含む核酸コンストラクトまたはベクターを提供する。
【００２９】
特定の一実施形態において、この核酸コンストラクトまたはベクターは、発現コンストラクトまたはベクターである。特定の一実施形態において、この発現コンストラクトまたはベクターは、プラスミドである。
【００３０】
第４の態様において、本発明は、第７の態様の核酸のうちのいずれか１以上、または第３の態様のベクターもしくはコンストラクトを含む宿主生物を提供する。
【００３１】
第５の態様において、本発明は、本発明の第３の態様で言及した発現コンストラクトまたはベクターおよびメチル化コンストラクトまたはベクターを含む組成物を提供する。
【００３２】
好ましくは、この組成物は、本発明の第１の態様による組換え微生物を生成することができる。
【００３３】
特定の一実施形態において、発現コンストラクト／ベクターおよび／またはメチル化コンストラクト／ベクターはプラスミドである。
【００３４】
第６の態様において、本発明は、本発明の第１の態様の組換え微生物を用いて、ＣＯおよび／またはＣＯ２含有基質を発酵することを含む微生物発酵によって、３−ＨＰ、と、必要に応じて１以上の他の生成物とを生成するための方法を提供する。
【００３５】
一実施形態において、本方法は、（ａ）本発明の第１の態様の１以上の微生物の培養物を含むバイオリアクターに、ＣＯおよび／またはＣＯ２含有基質を提供するステップと、（ｂ）バイオリアクター中の培養物を嫌気的に発酵して、３−ＨＰを生成するステップと、を含む。
【００３６】
一実施形態において、本方法は、産業プロセスの結果として生成されるＣＯおよび／またはＣＯ２含有ガスを、大気中に放出される前に捕捉するステップと、（ｂ）本発明の第１の態様の１以上の微生物を含む培養物によって、少なくとも３−ＨＰを生成するためにＣＯおよび／またはＣＯ２含有ガスを嫌気的に発酵するステップと、を含む。
【００３７】
本方法の態様の特定の実施形態において、本微生物は水性培地中で維持される。
【００３８】
本方法の態様の特定の実施形態において、基質の発酵はバイオリアクター内で行われる。
【００３９】
好ましくは、ＣＯおよび／またはＣＯ２含有基質は、ＣＯおよび／またはＣＯ２含有ガス状基質である。一実施形態において、この基質は、産業廃ガスを含む。特定の実施形態において、このガスは製鋼所の廃ガスまたは合成ガスである。
【００４０】
特定の実施形態において、この基質は、ＣＯ含有基質である。
【００４１】
基質がＣＯを含まず、ＣＯ２を含む本発明の実施形態において、この基質は、好ましくはＨ２も含む。
【００４２】
一実施形態において、この基質はＣＯおよびＣＯ２を含む。一実施形態において、この基質はＣＯ２およびＨ２を含む。別の実施形態において、この基質は、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２を含む。
【００４３】
一実施形態において、この基質は、典型的には、体積で少なくとも約２０％〜約１００％、２０％〜７０％、３０％〜６０％、および４０％〜５５％などの主要な割合でＣＯを含む。特定の実施形態において、この基質は、体積で約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、または約６０％のＣＯを含む。
【００４４】
特定の実施形態において、本方法は、さらに、発酵ブロスから３−ＨＰと、必要に応じて１以上の他の生成物とを回収するステップを含む。
【００４５】
第７の態様において、本発明は、第６の態様の方法によって生成された場合に、３−ＨＰを提供する。
【００４６】
別の態様において、本発明は、親微生物は、ＣＯおよび／またはＣＯ２含有基質の発酵により３−ＨＰを生成することはできないが、本微生物は、ＣＯおよび／またはＣＯ２含有基質の発酵により３−ＨＰと、必要に応じて１以上の他の生成物とを生成することができるように、１以上の外因性核酸で親微生物を形質転換することを含む本発明の第１の態様の微生物を生成する方法を提供する。
【００４７】
特定の一実施形態において、親微生物は、親微生物中に天然に存在しない３−ＨＰ生合成経路中の１以上の酵素を発現するように適合された１以上の外因性核酸で形質転換される。別の実施形態において、親微生物は、親微生物中に天然に存在する３−ＨＰ生合成経路中の１以上の酵素を過剰発現するように適合された１以上の核酸で形質転換される。別の実施形態において、親微生物は、親微生物中に天然に存在しない３−ＨＰ生合成経路中の１以上の酵素を発現し、親微生物中に天然に存在する３−ＨＰ生合成経路中の１以上の酵素を過剰発現するように適合された１以上の外因性核酸で形質転換される。
【００４８】
特定の実施形態において、これらの１以上の酵素は、本明細書で前述したとおりである。
【００４９】
特定の実施形態において、この親微生物は、本明細書で前述したとおりである。
【００５０】
一実施形態によれば、ＣＯまたはＣＯ２を３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）に変換するためのプロセスを提供する。細菌がＣＯおよび／またはＣＯ２を３−ＨＰに変換するように、培地にカルボキシドトロフ酢酸生成菌の培養物を含むバイオリアクターにガス状のＣＯ含有および／またはＣＯ２含有基質を通過させる。このカルボキシドトロフ酢酸生成菌を、マロニル補酵素Ａ還元酵素を発現するように遺伝子操作する。このカルボキシドトロフ酢酸生成菌は、天然であるかまたは外因性であるかに関わらず、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼも発現する。３−ＨＰをバイオリアクターから回収する。
【００５１】
別の実施形態によれば、マロニル補酵素Ａ還元酵素をコードする核酸を含む、遺伝子操作され、単離されたカルボキシドトロフ酢酸生成細菌を提供する。この核酸は、宿主細菌に対して外因性である。本細菌は、マロニル補酵素Ａ還元酵素を発現し、３分子のＣＯまたはＣＯ２を１分子の３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）に固定する能力を獲得する。このマロニル補酵素Ａ還元酵素は、典型的には、配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である。
【００５２】
本細菌は、さらにアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼをコードする外因性核酸を含んでもよい。このアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、典型的には、配列番号１８〜２１のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である。この核酸は、プロモーターに作動可能に連結されてもよい。この核酸は、コドン最適化されていてもよい。この核酸またはコードされたカルボキシラーゼは、非硫黄光合成細菌由来のものであってもよい。この細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉからなる群から選択され得る。外因性核酸のドナー細菌は、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉｃｕｓ種、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ種、およびＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ種などの非硫黄光合成細菌であってよい。
【００５３】
遺伝子操作された細菌は、ガス状炭素源を含む培地中で増殖させることによって培養されてもよい。この炭素源は、エネルギー源もしくは炭素源のいずれかまたは両方として使用することができるＣＯおよび／またはＣＯ２を含んでもよい。本細菌は、必要に応じて絶対嫌気的条件下で増殖させてもよい。この炭素源は、産業廃棄物またはオフガスを含んでもよい。
【００５４】
本発明は、広範には、本願明細書で言及または示された部分、要素および特徴に個々に存在するか、または前記部分、要素もしくは特徴のうちの２以上の任意のまたは全ての組み合わせ中に集合的に存在すると言うこともでき、本発明が関連する技術分野で公知の均等物を有する特定の整数が本明細書に記載されており、このような公知の均等物は、個々に記載されたものとして本明細書に援用されるとみなされる。
【００５５】
全てのその新規な態様において考慮されるべき本発明のこれらのおよび他の態様は、例としてのみ与えられ、添付の図面を参照することで以下の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】１分子の３−ＨＰの、３分子のＣＯおよび／またはＣＯ２からの持続可能な生成のための２つのＣＯ２固定経路の組み合わせを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
好ましい実施形態の以下の説明は、一般的な用語で与えられている。本発明は、本発明を支持する実験データ、本発明の種々の態様の具体例、および本発明を実施する手段を提供する、以下の見出し「実施例」の下に与えられた本開示からさらに明らかにされる。
【００５８】
本発明者らは、意外にもＣＯおよび／またはＣＯ２含有基質の発酵によって３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）を生成するために、カルボキシドトロフ酢酸生成微生物を遺伝子操作することもできた。これは、３−ＨＰの生成のための現在の方法を上回る利点を有し得る３−ＨＰの生成のための代替手段を提供する。さらに、そうでなければ大気中に放出され、環境を汚染することになる産業プロセスからの一酸化炭素を使用する手段を提供する。
【００５９】
本発明の微生物を遺伝子操作する際に、本発明者らは、意外にも、図１に示すように２つの別々のＣＯ２固定経路を組み合わせることができた。これは、ＣＯ含有基質および／またはＣＯ２含有基質を用いて３−ＨＰを生成するために持続的な発酵を提供する。したがって、ＣＯ２を固定する２つの経路は、所望の生成物を生成することと関連がある。
【００６０】
一実施形態において、本発明は、２分子のＣＯ２の固定を可能にするアセトゲンのウッド−ユングダール経路、およびＣＯ２の別の分子の固定を可能にする３−ＨＰサイクルの最初の炭素固定ステップである２つの別々のＣＯ２固定経路（図１）を組み合わせることにより、３分子のＣＯ２を１分子の３−ＨＰへ固定することについて説明する。ウッド−ユングダール経路、ＣＯデヒドロゲナーゼ（ＣＯＤＨ）の主要な酵素が、生物学的水性ガスシフト反応（ＣＯ＋Ｈ２Ｏ⇔ＣＯ２＋Ｈ２）でＣＯをＣＯ２およびエネルギーに変換することができるように、ＣＯ２を一酸化炭素（ＣＯ）と置き換えることもできた。ＣＯおよびＣＯ２の任意の混合物を使用することができる。ＣＯ２を単独で使用する場合には、水素または電気の形態のエネルギーが供給される必要があり得るが、ＣＯは、炭素およびエネルギー源の両方として機能することができる。
【００６１】
本発明者らは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおける本発明の有効性を示したが、本発明は、上記および本明細書でさらに説明するように、ＣＯおよび／またはＣＯ２含有基質上で、広範なグループの嫌気性酢酸生成微生物および発酵に適用可能である。
【００６２】
本明細書で言及する「発酵ブロス」は、少なくとも栄養培地および細菌細胞を含む培地である。
【００６３】
本明細書で言及する「シャトル微生物」は、メチルトランスフェラーゼ酵素を発現させ、目的の微生物とは区別されている微生物である。
【００６４】
本明細書で言及する「目的の微生物」は、遺伝子が発現コンストラクト／ベクター上に含まれ、シャトル微生物とは区別される微生物である。これは宿主微生物とも呼ばれる。
【００６５】
用語「主要発酵生成物」は、最高濃度および／または収率で生成される１種類の発酵生成物を意味することが意図される。１以上の発酵生成物が存在し得る。最も普及しているものは、商業的に最も有用であってもまたは有用でなくてもよい。
【００６６】
発酵プロセスに関連して使用される「効率の増加」および「増加した効率」などの用語は、発酵を触媒する微生物の増殖の速度、上昇した生成物濃度での増殖および／または生成物の生成速度、消費される基質の量当たりの生成される所望の生成物の量、所望の生成物の生成速度または生成レベル、ならびに発酵の他の副産物と比較した所望の生成物の相対的比率のうちの１以上を増加させることを含むが、これらに限定されない。
【００６７】
「一酸化炭素含有基質」という語句および同様の用語は、例えば、一酸化炭素が、増殖および／または発酵のための１以上の細菌株に利用できる任意の基質を含むと理解されたい。
【００６８】
「一酸化炭素を含むガス状基質」という語句ならびに同様の語句および用語は、一酸化炭素のレベルを含む任意のガスを含む。特定の実施形態において、この基質は、体積で少なくとも約２０％〜約１００％、２０％〜７０％、３０％〜６０％、および４０％〜５５％のＣＯを含む。特定の実施形態において、この基質は、体積で約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、または約６０％のＣＯを含む。
【００６９】
ＣＯ含有基質がいくらかでも水素を含むことを必要としないが、Ｈ２の存在は、本発明の方法による生成物形成に有害であってはならない。特定の実施形態において、水素が存在すると、アルコール生成の全体的な効率が向上する。例えば、特定の実施形態において、この基質は、Ｈ２：ＣＯを約２：１、１：１、または１：２の比率で含んでもよい。一実施形態において、この基質は、体積で約３０％以下、２０％以下、約１５％以下または約１０％以下のＨ２を含む。他の実施形態において、この基質の流れは、低濃度、例えば、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、もしくは１％未満のＨ２を含むか、または実質的に水素を含まない。この基質は、例えば、体積で約１％〜約８０％、または１％〜約３０％などのある程度のＣＯ２も含む。一実施形態において、この基質は、体積で約２０％以下のＣＯ２を含む。特定の実施形態において、この基質は、体積で約１５％以下、約１０％以下、約５％以下のＣＯ２を含むか、または実質的にＣＯ２を含まない。
【００７０】
「二酸化炭素含有基質」という語句および同様の用語は、例えば、二酸化炭素が、増殖および／または発酵のための１以上の細菌株に利用できる任意の基質を含むと理解されたい。二酸化炭素含有基質は、さらに水素および／または一酸化炭素を含んでもよい。
【００７１】
「二酸化炭素含有ガス状基質」という語句ならびに同様の語句および用語は、二酸化炭素のレベルを含む任意のガスを含む。特定の実施形態において、この基質は、体積で少なくとも約１０％〜約６０％、２０％〜５０％、３０％〜６０％、および４０％〜５５％のＣＯ２を含む。特定の実施形態において、この基質は、体積で約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、または約６０％のＣＯ２を含む。
【００７２】
好ましくは、ＣＯ２含有基質は、ＣＯまたはＨ２のレベルも含む。特定の実施形態において、この基質のＣＯ２：Ｈ２は、少なくとも約１：１、少なくとも約１：２、または少なくとも約１：３、少なくとも約１：４、または少なくとも約１：５の比率である。
【００７３】
以下の説明において、本発明の実施形態は、「ＣＯおよび／またはＣＯ２含有ガス状基質」を送達ならびに発酵することに関して記載されている。しかし、このガス状基質は、代替的な形態で提供されてもよいと理解されたい。例えば、ＣＯおよび／またはＣＯ２含有ガス状基質は、液体中に溶解されて提供されてもよい。本質的に、液体は一酸化炭素含有ガスで飽和され、その後、この液体はバイオリアクターに添加される。これは、標準的な方法を用いて達成されてもよい。一例として、マイクロバブル分散物発生装置（Ｈｅｎｓｉｒｉｓａｋら、好気性発酵のためのマイクロバブル分散物発生装置のスケールアップ（Ｓｃａｌｅ−ｕｐ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ ｆｏｒ Ａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ １０１、Ｎｕｍｂｅｒ ３／Ｏｃｔｏｂｅｒ、２００２）を使用することができる。さらなる例として、ＣＯ含有ガス状基質は、固体支持体上に吸着させてもよい。このような代替方法は、用語「ＣＯおよび／またはＣＯ２含有基質」などの使用によって包含される。
【００７４】
本発明の特定の実施形態において、ＣＯ含有ガス状基質（またはＣＯ２含有ガス状基質、ＣＯおよびＣＯ２含有ガス状基質、もしくはＣＯ２およびＨ２ならびにＣＯ含有ガス状基質）は、産業のオフガスまたは廃ガスである。「産業廃ガスまたはオフガス」は、産業プロセスによって生成されるＣＯおよび／またはＣＯ２を含む任意のガスを含み、鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製プロセス、石炭のガス化、バイオマスのガス化、電力生成、カーボンブラック生成、およびコークス製造の結果として生成されるガスを含むと広く解釈されたい。さらなる例が、本明細書の他の箇所に提供され得る。
【００７５】
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本明細書で使用される「発酵」、「発酵プロセス」または「発酵反応」などの語句は、プロセスの増殖相および生成物生合成相の両方を包含することが意図される。本明細書でさらに説明するように、一部の実施形態において、バイオリアクターは、第１の増殖リアクターおよび第２の発酵リアクターを含んでもよい。このように、発酵反応への金属または組成物の添加は、これらのリアクターのいずれかまたは両方への添加を含むと理解されたい。
【００７６】
「バイオリアクター」という用語は、連続攪拌タンクリアクター（ＣＳＴＲ）、固定化細胞リアクター（ＩＣＲ）、トリクルベッドリアクター（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、スタティックミキサー、またはガス−液体接触に適する他の容器もしくは他の装置を含む１以上の容器および／もしくは塔または配管の配置からなる発酵装置を含む。一部の実施形態において、このバイオリアクターは、第１の増殖リアクターおよび第２の発酵リアクターを含んでもよい。このように、バイオリアクターまたは発酵反応への基質の添加に言及する場合、必要に応じて、これらのリアクターのいずれかまたは両方への添加を含むと理解されたい。
【００７７】
「外因性核酸」は、それらが導入される微生物以外から生じる核酸である。外因性核酸は、それらが導入されるべき微生物、それらが導入されるべき生物とは異なる微生物の株もしくは種を含むが、これらに限定されない任意の適切な供給源に由来し得るか、または人工的にまたは組換えによって作成されてもよい。生物が遺伝子操作されるかまたは組換え型である場合には、天然に存在する微生物中とは異なる配列に隣接する配列を含む。一実施形態において、外因性核酸は、それらが導入される微生物中に天然に存在する核酸配列を表し、（例えば、配列（例えば、遺伝子）のコピー数を増加させることによって、または発現を増加させるために強力なプロモーターもしくは構成的プロモーターを導入することによって）特定の遺伝子の発現を増加させるかまたは過剰発現させるために導入される。別の実施形態において、外因性核酸は、それらが導入される微生物内に天然に存在しない核酸配列を表し、（例えば、プロモーターなどの調節エレメントを導入する場合に）微生物内に天然に存在しない生成物の発現または微生物由来の遺伝子の発現の増加を可能にする。外因性核酸は、それが導入される微生物のゲノム中に組み込まれるか、または染色体外状態のままであるように適合されてもよい。外因性配列は、異種供給源、例えば、別の種、属、科、または界に由来してもよい。いずれにせよ、そのように生成される細菌は、天然に存在せず、例えば、配列の違いまたはコピー数の違いのいずれかによって天然に存在するものとはことなる遺伝的相補体を有する。
【００７８】
本発明は、実質的に同じ機能を実施するという条件で、配列が本明細書に具体的に例示する配列と異なる核酸を用いて実施されてもよいと理解されたい。タンパク質またはペプチドをコードする核酸配列にとって、このコードタンパク質またはペプチドは実質的に同一の機能を有する。プロモーター配列を表す核酸配列にとって、変異型の配列は、１以上の遺伝子の発現を促進する能力を有する。このような核酸は、本明細書で「機能的に同等な変異型」と呼ばれる場合もある。一例として、核酸の機能的に同等な変異型には、対立遺伝子変異型、遺伝子のフラグメント、変異（欠失、挿入、およびヌクレオチド置換など）を含む遺伝子ならびに／または多型などが含まれる。他の微生物由来の相同遺伝子も、本明細書に具体的に例示する配列の機能的に同等な変異型の例として見なされ得る。
【００７９】
これらには、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ種、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉｃｕｓ種、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ種またはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ種などの種の相同遺伝子が含まれ、これらについての詳細は、ＧｅｎｂａｎｋまたはＮＣＢＩなどのウェブサイト上で公的に利用可能である。「機能的に同等な変異型」という語句も、その配列が特定の生物のコドン最適化の結果として変化する核酸を含むと解釈されたい。核酸の「機能的に同等な変異型」は、本明細書において、好ましくは、同定された核酸と少なくとも約７０％、好ましくは約８０％、より好ましくは約８５％、好ましくは約９０％、好ましくは約９５％、またはそれ以上の核酸配列同一性を有する。
【００８０】
また、本発明は、その配列が本明細書に具体的に例示されるアミノ酸配列と異なるポリペプチドを使用して実施されてもよいと理解されたい。これらの変異型は、本明細書で「機能的に同等な変異型」と呼ばれる場合もある。タンパク質またはペプチドの機能的に同等な変異型は、同定されたタンパク質またはペプチドと少なくとも４０％、好ましくは５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは７５％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、またはそれ以上のアミノ酸同一性を共有し、目的のペプチドまたはタンパク質と実質的に同一の機能を有するタンパク質またはペプチドを含む。このような変異型は、それらの範囲内にタンパク質またはペプチドの断片を含み、その断片は、欠失が１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２５個のアミノ酸であってもよく、ポリペプチドのいずれかの末端で残基１〜２５まで広がっていてもよく、欠失が領域内の任意の長さであってよいか、または内部位置に存在していてもよいポリペプチドの切断型を含む。本明細書の特定のポリペプチドの機能的に同等な変異型はまた、例えば、前の段落で例示したように、細菌の他の種の相同遺伝子によって発現されるポリペプチドを含むと解釈されたい。
【００８１】
本明細書で使用する「実質的に同一の機能」は、核酸またはポリペプチドが、変異型の核酸またはポリペプチドの機能を実施することができることを意味することを意図する。例えば、本発明の酵素の変異型は、酵素と同じ反応を触媒することができるであろう。しかし、変異型は、変異型のポリペプチドまたは核酸と同じレベルの活性を有することを意味すると解釈されるべきではない。
【００８２】
機能的に同等な変異型が、任意の数の公知の方法を用いて、変異型の核酸またはポリペプチドと実質的に同一の機能を有するか否かを評価することができる。しかし、一例として、Ｈｕｇｌｅｒら（２００２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２４０４−２４１０またはＫｒｏｅｇｅｒら（２０１１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１１：１００−５）に概説される方法を用いて、マロニル補酵素Ａ還元酵素およびアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性をそれぞれ測定することができる。
【００８３】
本発明に関連して使用される場合、「過剰発現する」、「過剰発現」ならびに同様の用語および語句は、同じ条件下で、親微生物のタンパク質の発現レベルと比較して１以上のタンパク質の発現の増加を含むと広く解釈される。これは、タンパク質が任意の特定レベルで発現されることを意味すると解釈されるべきではない。
【００８４】
「親微生物」は、本発明の組換え微生物を生成するために使用される微生物である。親微生物は、自然に発生するもの（すなわち、野生型微生物）または以前に変更されているが、本発明の対象である酵素のうちの１以上を発現もしくは過剰発現していないものであってよい。したがって、本発明の組換え微生物は、親微生物中で発現または過剰発現していない１以上の酵素を発現または過剰発現するように改変されている。
【００８５】
核酸「コンストラクト」または「ベクター」という用語および同様の用語は、細胞内に遺伝物質を伝達する媒体として使用するのに適した（ＤＮＡおよびＲＮＡを含む）任意の核酸を含むと広く解釈されるべきである。これらの用語は、プラスミド、（バクテリオファージを含む）ウイルス、コスミドおよび人工染色体を含むと解釈されるべきである。コンストラクトまたはベクターは、１以上の調節エレメント、複製起点、マルチクローニングサイトおよび／または選択マーカーを含んでもよい。特定の一実施形態において、コンストラクトまたはベクターは、コンストラクトまたはベクターがコードする１以上の遺伝子の発現を可能にするように適合されている。核酸コンストラクトまたはベクターは、裸の核酸、ならびに細胞（例えば、リポソーム結合核酸、核酸が含まれている生物）への送達を容易にするために、１以上の薬剤で製剤化された核酸を含む。
【００８６】
「３−ＨＰ生合成経路」は、アセチル−ＣｏＡからマロニル−ＣｏＡ、マロン酸セミアルデヒド、３−ＨＰへの変換を可能にする酵素経路である。文脈上明確に他の意味に解すべき場合を除き、３−ＨＰ生合成経路内の酵素への言及は、酵素の任意の１以上のサブユニットへの言及を含むと解釈されたい。ほんの一例として、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、４つのサブユニットを含んでもよい。
【００８７】
微生物
本明細書で前述したとおり、本発明は、ＣＯおよび／またはＣＯ２含有基質の発酵により、３−ＨＰと、必要に応じて１以上の他の生成物とを生成することができる組換え微生物を提供する。
【００８８】
特定の一実施形態において、微生物は、それが由来する親微生物中に天然に存在しない３−ＨＰ生合成経路中の１以上の酵素（またはそれらの１以上のサブユニット）を発現するように適合されている。別の実施形態において、微生物は、親微生物中に天然に存在する３−ＨＰ生合成経路において１以上の酵素（またはそれらの１以上のサブユニット）を過剰発現するように適合されている。
【００８９】
一実施形態において、親微生物は、アセチル−ＣｏＡを３−ＨＰに変換しないがアセチル−ＣｏＡを生成するためにＣＯ含有基質を発酵することができ、本組換え微生物は、アセチル−ＣｏＡを３−ＨＰに変換するのに関与する１以上の酵素（またはそれらの１以上のサブユニット）を発現するように適合されている。一実施形態において、親微生物は、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換することはできるが、マロニル−ＣｏＡを３−ＨＰに変換することはできない。別の実施形態において、親微生物は、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換することはできないが、マロニル−ＣｏＡを３−ＨＰに変換することはできる。
【００９０】
一実施形態において、３−ＨＰ生合成経路中の１以上の酵素は、マロニル補酵素Ａ還元酵素、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、およびそれらの任意の１以上の機能的に同等な変異型からなる群から選択される。
【００９１】
本微生物は、例えば、（例えば、遺伝子の発現を促進するための強力なプロモーターまたは構成的プロモーターを導入することによって）微生物内での天然の遺伝子の発現を増加させること、酵素をコードし、これを発現するように適合された外因性核酸を導入することによって、特定の酵素をコードする遺伝子のコピー数を増加させること、親微生物中に天然には存在しない酵素をコードし、これを発現するように適合された外因性核酸を導入することを含む任意の数の組換え法によって１以上の酵素（またはそれらの１以上のサブユニット）を発現または過剰発現するように適合されてもよい。
【００９２】
特定の実施形態において、親微生物は、親微生物に由来する１以上の遺伝子の発現増加または過剰発現と、親微生物に由来しない１以上の遺伝子の導入との組み合わせを提供するように形質転換することができる。例えば、３−ＨＰ生合成経路内の１以上の酵素をコードする１以上の遺伝子は、親微生物由来であってもよいが、経路内の１以上の他の酵素をコードする１以上の他の遺伝子を含まなくてもよい。本微生物は、例えば、天然のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼを過剰発現させ、マロニル−ＣｏＡを３−ＨＰに変換する酵素（例えば、マロニル−ＣｏＡ還元酵素）をコードするマロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子を導入するために遺伝子操作することができた。もう１つの方法として、本微生物は、天然のマロニル−ＣｏＡ還元酵素を過剰発現させ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子を導入するために遺伝子操作することができた。当業者は、本発明での使用の他の様々な組み合わせを認識するであろう。
【００９３】
単なる一例として、マロニル−ＣｏＡ還元酵素の例示的な配列情報は、本明細書に配列番号１の形で提供され、受入番号ＹＰ＿００１６３６２０９．１／Ｃａｕｒ＿２６１４、ＧＩ：１６３８４８１６５で公開データベースでも提供されている。さらなる例として、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの例示的な配列情報は、配列番号１８〜２１の形で提供され、受入番号ＮＣ＿０１４３２８．１−３３．１／ＣＬＪＵ＿ｃ４２１００−４０、ＧＩ：９４４７８２６−３１、およびＧＩ：１６３８４７２１０−１１、Ｃａｕｒ＿１６４７−４８、ＹＰ＿００１６３５２５４．１−５５．１；ＧＩ：１６３８４９２６２、Ｃａｕｒ＿３７３９、ＹＰ＿００１６３７３０６．１；ＧＩ：１６３８４８９５１、Ｃａｕｒ＿３４２１、ＹＰ＿００１６３６９９５．１；ＧＩ：１６３８４６９５１、Ｃａｕｒ＿１３７８、ＹＰ＿００１６３４９９５．１で公開データベースでも提供されている。天然または合成の酵素を使用することができる。典型的には、これらの酵素は、配列番号１または１８〜２１に記載の核酸によってコードされる配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。
【００９４】
本発明の微生物で使用する酵素（およびそれらをコードする任意の対応する遺伝子）は、細菌の異なる属および種、または他の生物を含む任意の適切な供給源に由来し得る。しかし、一実施形態において、マロニル補酵素Ａ還元酵素は、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、ＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａまたはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ種に由来する。一実施形態において、マロニル補酵素Ａ還元酵素は、上記に例示したアミノ酸配列を有するか、またはその機能的に同等な変異型である。一実施形態において、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉｃｕｓ、ＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａまたはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ種に由来する。一実施形態において、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、本明細書中の前述のアミノ酸配列を有するか、またはその機能的に同等な変異型である。
【００９５】
マロニル−ＣｏＡ還元酵素（ＥＣ １．２．１．７５）は、短鎖還元酵素（ＳＤＲ）のグループに属し、緑色非硫黄光合成細菌（クロロフレクサス門）であるＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（ＹＰ＿００１６３６２０９．１；ＡＡＳ２０４２９．１）、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ（ＹＰ＿００２４６２６００．１）、Ｏｓｃｉｌｌｏｃｈｌｏｒｉｓ ｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ（ＷＰ＿００６５６１１０５．１）、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ（ＹＰ＿００１４３３００９．１）またはＲｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ種（ＹＰ＿００１２７７５１２．１）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）種（ＷＰ＿００７１６３６８０）などのアルファプロテオバクテリアおよびガンマプロテオバクテリア（ＷＰ＿００９０１９５２８．１、ＷＰ＿００７２３４９１８．１、ＷＰ＿００９０２１８６９．１、ＷＰ＿００９４７０５７１．１）などの細菌から得ることができ、Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔｅｓ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ（ＮＰ＿３７８１６７．１）、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｓ （ＹＰ＿００４４５９５１７．１）、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｃｕｐｒｉｎａ（ＹＰ＿００４４１００１４．１）、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａ（ＹＰ＿００１１９０８０８．１）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（ＮＰ＿３４３５６３．１）、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｅｎｓｉｓ（ＷＰ＿００９０７１５１９．１）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ（ＹＰ＿００２８４４７２７．１；ＹＰ＿００２８３３５３３．１；ＹＰ＿００２８３０７９５．１）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（ＹＰ＿２５６９４１．１；ＹＰ＿２５６７３３．１）およびＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ（ＹＰ＿００３４０１５３５．１）、ならびにＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｃｈｌｏｒａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ（ＹＰ＿００４８６３６８０．１）またはＣａｌｄｉａｒｃｈａｅｕｍ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍ（ＢＡＪ４７９０２．１）などの好熱好酸性古細菌から得ることができる。
【００９６】
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ １．２．１．７５）は、ビオチン依存性カルボキシラーゼのグループに属し、緑色非硫黄光合成細菌（クロロフレクサス門）であるＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（ＹＰ＿００１６３５２５４．１−５５．１；ＹＰ＿００１６３７３０６．１；ＹＰ＿００１６３６９９５．１；ＹＰ＿００１６３４９９５．１）、またはカルボキシドトロフアセトゲンであるＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（ＮＣ＿０１４３２８．１−３３．１）などの細菌から得ることができる。
【００９７】
一実施形態において、本微生物は、親微生物に由来する１以上の核酸の発現を増加させるように適合された１以上の外因性核酸を含み、これらの１以上の核酸は、本明細書中の前述の酵素（またはそれらの１以上のサブユニット）のうちの１以上をコードする。一実施形態において、発現が増加するように適合された１以上の外因性核酸は、調節エレメントである。一実施形態において、この調節エレメントはプロモーターである。一実施形態において、このプロモーターは、好ましくは、適切な発酵条件下で高活性な構成的プロモーターである。誘導性プロモーターを使用することもできる。好ましい実施形態において、このプロモーターは、ウッド−ユングダール遺伝子クラスターまたはホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターを含む群から選択される。適切な発酵条件下での発現、好ましくは、高レベル発現を指示することができる他のプロモーターが、例示された実施形態の代替手段として有効であることを当業者なら理解するであろう。プロモーターは、下流のコード配列の発現を促進するような位置にある場合に、作動可能に連結されたと言われる。
【００９８】
一実施形態において、本微生物は、本明細書中の前述の酵素（またはそれらの１以上のサブユニット）のうちの１以上をコードし、これを発現するように適合された１以上の外因性核酸を含む。一実施形態において、本微生物は、これらの酵素（またはそれらの１以上のサブユニット）のうちの少なくとも２つをコードし、これを発現するように適合された１以上の外因性核酸を含む。
【００９９】
特定の一実施形態において、本微生物は、マロニル補酵素Ａ還元酵素またはその機能的に同等な変異型をコードする１以上の外因性核酸を含む。特定の一実施形態において、本微生物は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼまたはその機能的に同等な変異型をコードする１以上の外因性核酸を含む。アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、４個のサブユニットから構成され、各サブユニットは異なる遺伝子によってコードされ得る。これらの遺伝子は、単一の核酸または酵素の全体を共にコードする２以上の核酸中に組み合わされてもよい。さらに、特定の親微生物は、これらのサブユニットのうちの１つ、２つ、または３つのみの遺伝子を含んでもよい。したがって、本発明は、１以上の外因性核酸を用いてサブユニットの１つ、２つまたは３つのみを発現するように本微生物を遺伝子操作することを包含する。同様に、本発明は、遺伝子が本微生物に由来する場合に、サブユニットの１以上を過剰発現するように本微生物を遺伝子操作することを包含する。天然のサブユニット遺伝子の過剰発現および任意の欠損サブユニット遺伝子の導入の組み合わせも想到される。
【０１００】
一実施形態において、マロニル補酵素Ａ還元酵素は、配列番号１またはその機能的に同等な変異型を含む核酸によってコードされている。一実施形態において、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、配列番号１８、１９、２０および２１、またはそれらの任意の１以上の機能的に同等な変異型を含む１以上核酸によってコードされている。あるいは、これらの酵素は、本明細書で前述したように、例えば、公的に利用可能なデータベースに記載されているような核酸配列によってコードされていてもよい。
【０１０１】
本微生物は、１以上の外因性核酸を含んでもよい。親微生物を（遺伝子または調節エレメント（例えば、プロモーター）などの）２以上の遺伝子エレメントで形質転換することが望ましい場合には、それらの遺伝子エレメントは１以上の外因性核酸上に含まれていてもよい。
【０１０２】
一実施形態において、１以上の外因性核酸は、任意の組み合わせで、本明細書に上述した酵素のうちの１以上をコードする核酸コンストラクトまたはベクター、特定の一実施形態において、プラスミドである。
【０１０３】
これらの外因性核酸は、親微生物の形質転換の際に染色体外に存在したままであるか、または親微生物のゲノムに組込まれてもよい。したがって、これらの外因性核酸は、染色体外コンストラクトの組込み（例えば、相同組換えおよび宿主ゲノムへの標的化組込みを可能にする領域）または発現および複製（例えば、複製起点、プロモーターおよび他の調節エレメントもしくは調節配列）を支援するように適合された追加のヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１０４】
一実施形態において、本明細書に上述したような１以上の酵素（またはそれらの１以上のサブユニット）をコードする外因性核酸は、さらに、外因性核酸がコードする１以上の酵素の発現を促進するように適合されたプロモーターを含む。一実施形態において、このプロモーターは、好ましくは適切な発酵条件下で高活性な構成的プロモーターである。誘導性プロモーターを使用することもできる。好ましい実施形態において、このプロモーターは、ウッド−ユングダール遺伝子クラスターまたはホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼプロモーターを含む群から選択される。適切な発酵条件下での発現、好ましくは、高レベル発現を指示することができる他のプロモーターが、例示された実施形態の代替手段として有効であることを当業者なら理解するであろう。
【０１０５】
一実施形態において、この外因性核酸は発現プラスミドである。
【０１０６】
一実施形態において、この親微生物は、嫌気性アセトゲンの群から選択される。
【０１０７】
特定の一実施形態において、親微生物は、カルボキシドトロフ酢酸生成菌の群から選択される。特定の実施形態において、本微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉを含む群から選択される。
【０１０８】
特定の一実施形態において、この親微生物は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ種、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ種、およびＣ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ種ならびに関連分離株を含むエタン生成、酢酸生成クロストリジウムのクラスターから選択される。これらには、株Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＪＡＩ−１Ｔ（ＤＳＭ１００６１）［Ａｂｒｉｎｉ Ｊ，Ｎａｖｅａｕ Ｈ，Ｎｙｎｓ Ｅ−Ｊ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ，ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ．Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９４，４：３４５−３５１］、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）［Ｓｉｍｐｓｏｎ ＳＤ，Ｆｏｒｓｔｅｒ ＲＬ，Ｔｒａｎ ＰＴ，Ｒｏｗｅ ＭＪ，Ｗａｒｎｅｒ ＩＬ：新規な細菌およびその方法（Ｎｏｖｅｌ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｈｅｒｅｏｆ）、国際公開第２００９／０６４２００号（２００９年）］、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＬＢＳ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８＝ＡＴＣＣ ５５３８３）［Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ，Ｍｉｌｌｅｒ ＬＭ，Ｙａｎｇ Ｄ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｒＲＮＡ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｉ．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓt Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９９３，４３：２３２−２３６］、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ ５５３８０）［Ｇａｄｄｙ ＪＬ：廃ガスから酢酸を生成するクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔａｉｎ ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ｗａｓｔｅ ｇａｓｅｓ）、米国特許１９９７，第５，５９３，８８６号］、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ Ｃ−０１（ＡＴＣＣ ５５９８８）［Ｇａｄｄｙ ＪＬ，Ｃｌａｕｓｅｎ ＥＣ，Ｋｏ Ｃ−Ｗ：酢酸の調製のための微生物プロセスおよび発酵ブロスからのその抽出のための溶剤（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ Ｓｏｌｖｅｎｔ ｆｏｒ ｉｔｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ］、米国特許第６，３６８，８１９号（２００２年）］、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ Ｏ−５２（ＡＴＣＣ ５５９８９）［Ｇａｄｄｙ ＪＬ，Ｃｌａｕｓｅｎ ＥＣ，Ｋｏ Ｃ−Ｗ：酢酸の調製のための微生物プロセスおよび発酵ブロスからのその抽出のための溶剤（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ Ｓｏｌｖｅｎｔ ｆｏｒ ｉｔｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ］、米国特許第６，３６８，８１９号（２００２年）］、Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ Ｐ１１Ｔ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−６２２）［Ｈｕｈｎｋｅ ＲＬ，Ｌｅｗｉｓ ＲＳ，Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ：新規クロストリジウム種の単離および特徴付け（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃ���ｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ．、国際公開第２００８／０２８０５５号（２００８年）］、“Ｃ．ｃｏｓｋａｔｉｉ”［Ｚａｈｎら−新規エタノール生成種のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ（Ｎｏｖｅｌ ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ）（米国特許出願公開第２０１１／０２２９９４７号）］および“Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．”（Ｔｙｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｒｅｓ．４：１−１２）などの関連分離株、またはＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＯＴＡ−１（Ｔｉｒａｄｏ−ａｃｅｖｅｄｏ Ｏ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉを用いた合成ガスからのバイオエタノールの生成（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｇａｓ Ｕｓｉｎｇ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、博士論文、ノースカロライナ州立大学、２０１０）などの変異株が含まれるが、これらに限定されない。これらの株は、クロストリジウムのｒＲＮＡクラスターＩ内でサブクラスターを形成し、それらの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、９９％以上同一であり、約３０％の同様に低いＧＣ含量を有する。しかし、ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合およびＤＮＡフィンガープリンティング実験により、これらの株が別々の種に属することが示された［Ｈｕｈｎｋｅ ＲＬ，Ｌｅｗｉｓ ＲＳ，Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ：新規クロストリジウム種の単離および特徴付け（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ）、国際公開第２００８／０２８０５５号（２００８年）］。
【０１０９】
このクラスターの全ての種は、同様の形態およびサイズを有し（対数増殖する細胞は０．５〜０．７×３〜５μｍであり）、中温性（最適な増殖温度は３０〜３７℃であり）、絶対嫌気性菌である［Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ，Ｍｉｌｌｅｒ ＬＭ，Ｙａｎｇ Ｄ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｒＲＮＡ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｉ．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９９３，４３：２３２−２３６；Ａｂｒｉｎｉ Ｊ，Ｎａｖｅａｕ Ｈ，Ｎｙｎｓ Ｅ−Ｊ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ，ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ．Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９４，４：３４５−３５１；Ｈｕｈｎｋｅ ＲＬ，Ｌｅｗｉｓ ＲＳ，Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ：新規クロストリジウム種の単離および特徴付け（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ）、国際公開第２００８／０２８０５５号（２００８年）］。さらに、それらは全て、同様のｐＨ範囲（ｐＨ４〜７．５、最適な初期のｐＨは５．５〜６である）、ＣＯ含有ガス中での同様の増殖速度の強力な独立栄養成長、および特定の条件下での主要な発酵最終生成物がエタノールおよび酢酸であり、少量の２，３−ブタンジオールおよび乳酸が形成されるという同様の代謝プロファイルなどの同様の主要な系統発生形質を共有する［Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ，Ｍｉｌｌｅｒ ＬＭ，Ｙａｎｇ Ｄ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｒＲＮＡ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｉ．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９９３，４３：２３２−２３６；Ａｂｒｉｎｉ Ｊ，Ｎａｖｅａｕ Ｈ，Ｎｙｎｓ Ｅ−Ｊ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ，ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ．Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９４，４：３４５−３５１；Ｈｕｈｎｋｅ ＲＬ，ＬｅｗｉＳ ＲＳ，Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ：新規クロストリジウム種の単離および特徴付け（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ）、国際公開第２００８／０２８０５５号（２００８年）］。インドール生成も同様に全３種で観察された。しかし、これらの種は、様々な糖類（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸類（例えば、グルコン酸、クエン酸）、アミノ酸類（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、または他の基質（例えば、ベタイン、ブタノール）の基質利用において区別される。さらに、これらの種のいくつかは、他のものではそうではないが、特定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に対して栄養要求性であることが見出された。
【０１１０】
一実施形態において、親株は、その唯一の炭素源およびエネルギー源としてＣＯを使用する。
【０１１１】
一実施形態において、この親微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉである。特定の一実施形態において、本微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３である。別の特定の実施形態において、本微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＤＳＭ１３５２８（またはＡＴＣＣ５５３８３）である。
【０１１２】
一実施形態において、この親微生物は、マロニル補酵素Ａ還元酵素またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（またはそれらの１以上のサブユニット）をコードする１以上の遺伝子を欠いている。
【０１１３】
核酸
本発明は、本発明の組換え微生物を生成する際に使用する核酸および核酸コンストラクトも提供する。
【０１１４】
一実施形態において、核酸は、微生物中で発現させた場合に、ＣＯおよび／またはＣＯ２含有基質の発酵によって、微生物が３−ＨＰを生成することを可能にする３−ＨＰ生合成経路内の酵素（またはそれらの１以上のサブユニット）のうちの１以上をコードする１以上の配列を含む。特定の一実施形態において、本発明は、微生物中で発現させた場合に、ＣＯおよび／またはＣＯ２含有基質の発酵によって、微生物が３−ＨＰを生成することを可能にする２以上の酵素（またはそれらの１以上のサブユニット）をコードする核酸を提供する。
【０１１５】
特定の一実施形態において、これらの酵素は、マロニル−ＣｏＡ還元酵素、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼおよびそれらの任意の１以上の機能的に同等な変異型から選択される。
【０１１６】
一実施形態において、本発明の核酸は、マロニル補酵素Ａ還元酵素、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼまたはそれらの任意の１以上の機能的に同等な変異型をコードする１以上の核酸配列を任意の順序で、含む。
【０１１７】
一実施形態において、本発明の核酸は、任意の順序で、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼまたはそれらの任意の１以上の機能的に同等な変異型のうちの１以上のサブユニットをコードする１以上の核酸配列を含む。
【０１１８】
上記の酵素のそれぞれをコードする代表的なアミノ酸配列および核酸配列が、本明細書に提供されるか、前述のＧｅｎＢａｎｋから取得することができる。しかし、当業者は、本明細書、ＧｅｎＢａｎｋおよび他のデータベース中に含まれる情報、ならびに遺伝コードを考慮して、酵素またはその機能的に同等な変異型をコードする別の核酸配列を容易に理解するであろう。
【０１１９】
一実施形態において、マロニル補酵素Ａ還元酵素は、本明細書に上述した配列を有するか、またはその機能的に同等な変異型である。
【０１２０】
一実施形態において、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードする核酸配列は、本明細書に上述した配列を有するか、またはその機能的に同等な変異型である。
【０１２１】
一実施形態において、本発明の核酸は、さらにプロモーターを含むであろう。一実施形態において、プロモーターは、その制御下の遺伝子の構成的発現を可能にする。しかし、誘導性プロモーターを用いてもよい。当業者は容易に本発明で使用するプロモーターを認識するであろう。好ましくは、プロモーターは、適切な発酵条件下で高レベル発現を指示することができる。特定の実施形態において、ウッド−ユングダールクラスタープロモーターが使用される。別の実施形態において、ホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼプロモーターが使用される。別の実施形態において、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素プロモーター、Ｒｎｆ複合体オペロンプロモーターまたはＡＴＰ合成酵素オペロンプロモーターが使用される。特定の一実施形態において、プロモーターは、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来のものである。
【０１２２】
本発明の核酸は、親微生物の形質転換の際に染色体外に存在したままであるか、または微生物のゲノムへの組込みに適合させることができる。したがって、本発明の核酸は、組込み（例えば、宿主ゲノムへの相同組換えおよび標的組込みを可能にする領域）または染色体外コンストラクトの安定な発現および複製（例えば、複製起源、プロモーターおよび他の調節配列）を支援するように適合された追加のヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１２３】
一実施形態において、核酸は、核酸コンストラクトまたはベクターである。特定の一実施形態において、核酸コンストラクトまたはベクターは、発現コンストラクトまたはベクターであるが、クローニングに使用されるものなどの他のコンストラクトおよびベクターが本発明に包含される。特定の一実施形態において、発現コンストラクトまたはベクターはプラスミドである。
【０１２４】
本発明の発現コンストラクト／ベクターは、プロモーターに加えて、任意の数の調節エレメントおよび必要に応じて、さらなるタンパク質の発現に適する追加の遺伝子を含んでもよいことが理解されるであろう。一実施形態において、発現コンストラクト／ベクターは、１つのプロモーターを含む。別の実施形態において、発現コンストラクト／ベクターは、２以上のプロモーターを含む。特定の一実施形態において、発現コンストラクト／ベクターは、発現される各遺伝子用の１つのプロモーターを含む。一実施形態において、発現コンストラクト／ベクターは、１以上のリボソーム結合部位、好ましくは、発現される各遺伝子用のリボソーム結合部位を含む。
【０１２５】
本明細書に記載の核酸配列およびコンストラクト／ベクター配列は、リボソーム結合部位および／または制限部位に必要とされるものなどの標準的なリンカーヌクレオチドを含んでもよいことを当業者なら理解するであろう。このようなリンカー配列は、必要とされるものとして解釈されるべきではなく、定義された配列に制限をもたらさない。
【０１２６】
本発明の発現コンストラクト／ベクターを含む核酸および核酸コンストラクトは、当該技術分野において公知の任意の数の技術を用いて構築することができる。例えば、化学合成または組換え技術を使用することができる。このような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（分子クローニング：実験室マニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）に記載されている。さらなる例示的な技術は、本明細書の下記の実施例のセクションに記載されている。本質的に、個々の遺伝子および調節エレメントは、遺伝子が発現して、所望のタンパク質を形成することができるように互いに作動可能に連結される。本発明での使用に適するベクターは、当業者によって理解されるであろう。しかし、一例として、以下のベクター：ｐＭＴＬ８００００ベクター、ｐＩＭＰ１、ｐＪＩＲ７５０、および本明細書の下記の実施例のセクションに例示されるプラスミドが適し得る。
【０１２７】
本発明の核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡを含む任意の適切な形態であってもよいことを理解されたい。
【０１２８】
本発明は、本明細書に記載の核酸のうちの任意の１以上を含む宿主生物、特に、ウイルス、細菌、および酵母を含む微生物も提供する。
【０１２９】
１以上の外因性核酸が、裸の核酸として親微生物に送達するか、または形質転換プロセスを容易にするために、１以上の薬剤（例えば、リポソーム結合核酸、その核酸が含まれる生物）で製剤化されてもよい。１以上の核酸は、適切な場合、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせであってもよい。制限阻害剤（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）は、特定の実施形態で使用することができる。例えば、Ｍｕｒｒａｙ，Ｎ．Ｅ．ら（（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６４，４１２）を参照されたい。
【０１３０】
本発明の微生物は、組換え微生物を生成するための当該技術分野において公知の任意の数の技術を使用して、親微生物および１以上の外因性核酸から調製することができる。単なる一例として、（形質導入またはトランスフェクションを含む）形質転換は、エレクトロポレーション、超音波、ポリエチレングリコール媒介性形質転換、化学的もしくは天然の能力、または結合によって達成することができる。適切な形質転換技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ：分子クローニング：実験室マニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９に記載されている。
【０１３１】
特定の実施形態において、形質転換される微生物中で活性のある制限系により、微生物に導入される核酸をメチル化する必要がある。これは下記のもの、および本明細書の下記の実施例のセクションにさらに例示されるものを含む様々な技術を用いて行うことができる。
【０１３２】
一例として、一実施形態において、本発明の組換え微生物は、（ｉ）本明細書に記載の発現コンストラクト／ベクター、および（ｉｉ）メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むメチル化コンストラクト／ベクターのシャトル微生物を導入する工程と、メチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現させる工程と、シャトル微生物からの１以上のコンストラクト／ベクターを単離する工程と、１以上のコンストラクト／ベクターを目的微生物に導入する工程とを含む方法によって生成される。
【０１３３】
一実施形態において、ステップＢのメチルトランスフェラーゼ遺伝子を構成的に発現させる。別の実施形態において、ステップＢのメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現が誘導される。
【０１３４】
シャトル微生物は、微生物、好ましくは、発現コンストラクト／ベクターを構成する核酸配列のメチル化を促進する制限陰性微生物（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）である。特定の実施形態において、シャトル微生物は、制限陰性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｎｅｇａｔｉｖｅ）大腸菌、枯草菌、またはラクチス乳酸菌である。
【０１３５】
メチル化コンストラクト／ベクターは、メチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む。
【０１３６】
発現コンストラクト／ベクターおよびメチル化コンストラクト／ベクターが、シャトル微生物に導入されると、メチル化コンストラクト／ベクター上に存在するメチルトランスフェラーゼ遺伝子が誘導される。誘導は任意の適切なプロモーターシステムによるものであってもよいが、本発明の特定の一実施形態において、メチル化コンストラクト／ベクターは、誘導性ｌａｃプロモーターを含み、ラクトースまたはその類似体、より好ましくはイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導される。他の適切なプロモーターは、ａｒａ、ｔｅｔ、またはＴ７系を含む。本発明のさらなる実施形態において、メチル化コンストラクト／ベクターのプロモーターは構成的プロモーターである。
【０１３７】
特定の実施形態において、メチル化コンストラクト／ベクターは、シャトル微生物のアイデンティティに特異的な複製起点を有し、その結果、メチル化コンストラクト／ベクター上に存在する任意の遺伝子がそのシャトル微生物内で発現する。好ましくは、発現コンストラクト／ベクターは、目的微生物のアイデンティティに特異的な複製起点を有し、その結果、発現コンストラクト／ベクター上に存在する任意の遺伝子が目的微生物中で発現する。
【０１３８】
メチルトランスフェラーゼ酵素の発現により、発現コンストラクト／ベクター上に存在する遺伝子のメチル化が生じる。その後、発現コンストラクト／ベクターは、多くの公知の方法のいずれか１つによりシャトル微生物から単離することができる。ほんの一例として、後述の実施例のセクションに記載の方法を用いて、発現コンストラクト／ベクターを単離してもよい。
【０１３９】
特定の一実施形態において、コンストラクト／ベクターの両方が同時に単離される。
【０１４０】
この発現コンストラクト／ベクターを、公知の任意の数の方法を用いて目的微生物に導入してもよい。しかし、一例として、後述の実施例のセクションに記載の方法を用いてもよい。発現コンストラクト／ベクターはメチル化されるので、発現コンストラクト／ベクター上に存在する核酸配列を、目的微生物に組み込み、うまく発現させることができる。
【０１４１】
メチルトランスフェラーゼ遺伝子を、シャトル微生物に導入して、過剰発現させてもよいことが想到される。したがって、一実施形態において、得られたメチルトランスフェラーゼ酵素を、公知の方法を用いて回収し、発現プラスミドをメチル化するためにインビトロで用いてもよい。その後、発現コンストラクト／ベクターは、発現のために目的微生物に導入してもよい。別の実施形態において、メチルトランスフェラーゼ遺伝子を、シャトル微生物のゲノム中に導入し、その後、発現コンストラクト／ベクターをシャトル微生物に導入し、このシャトル微生物から１以上のコンストラクト／ベクターを単離し、次いで、この発現コンストラクト／ベクターを目的微生物に導入する。
【０１４２】
上記の発現コンストラクト／ベクターおよびメチル化コンストラクト／ベクターは、重要な組成物を提供するために組み合わせてもよいことが想到される。このような組成物は、本発明の組換え微生物を生成するための制限バリア機構を回避するのに特に有用である。
【０１４３】
特定の一実施形態において、この発現コンストラクト／ベクターおよび／またはメチル化コンストラクト／ベクターは、プラスミドである。
【０１４４】
当業者は、本発明の微生物を生成する際に使用するのに適切な多くのメチルトランスフェラーゼを認識するであろう。しかし、一例として、枯草菌ファージΦΤ１メチルトランスフェラーゼおよび下記の実施例に記載のメチルトランスフェラーゼを用いてもよい。一実施形態において、メチルトランスフェラーゼは、配列番号６のアミノ酸配列を有するか、またはその機能的に同等な変異型である。適切なメチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、所望のメチルトランスフェラーゼの配列および遺伝コードを考慮して容易に認識されるであろう。一実施形態において、メチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、下記の実施例に記載したようなもの（例えば、配列番号２６の核酸、またはその機能的に同等な変異型）である。
【０１４５】
メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を可能にするように適合された任意の数のコンストラクト／ベクターを用いて、メチル化コンストラクト／ベクターを作製してもよい。しかし、一例として、以下の実施例のセクションに記載のプラスミド（例えば、配列番号７）を用いてもよい。
【０１４６】
生成法
本発明は、本発明の組換え微生物を用いてＣＯおよび／またはＣＯ２含有基質を発酵することを含む微生物発酵による３−ＨＰおよび必要に応じて、１以上の他の生成物を生成する方法を提供する。好ましくは、３−ＨＰは、主要発酵生成物である。本発明の方法を用いて、産業プロセスから全大気中の炭素排出量を削減することができる。
【０１４７】
好ましくは、発酵は、本発明の組換え微生物を用いて、少なくとも３−ＨＰを生成するためにバイオリアクター中で嫌気的に基質を発酵するステップを含む。
【０１４８】
一実施形態において、本方法は、
（ａ）本発明の１以上の微生物の培養物を含むバイオリアクターにＣＯおよび／またはＣＯ２含有基質を提供するステップと、
（ｂ）少なくとも３−ＨＰを生成するためにバイオリアクターで培養物を嫌気的に発酵させるステップと、
を含む。
【０１４９】
一実施形態において、本方法は、
（ａ）産業プロセスの結果生成されるＣＯおよび／またはＣＯ２含有ガスを、ガスが大気中に放出される前に捕捉するステップと、
（ｂ）本発明の１以上の微生物を含む培養物によって、少なくとも３−ＨＰを生成するためにＣＯおよび／またはＣＯ２含有ガスを嫌気的に発酵させるステップと、
を含む。
【０１５０】
一実施形態において、この基質はＣＯを含む。一実施形態において、この基質は、ＣＯ２およびＣＯを含む。別の実施形態において、この基質はＣＯ２およびＨ２を含む。別の実施形態において、この基質は、ＣＯ２およびＣＯならびにＨ２を含む。
【０１５１】
本発明の特定の一実施形態において、微生物により発酵されるガス状基質は、ＣＯ含有ガス状基質である。このガス状基質は、産業プロセスの副産物として得られるか、または、自動車の排気ガスなどのいくつかの他の供給源から得られるＣＯ含有廃ガスであってよい。特定の実施形態において、産業プロセスは、製鋼所などの鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製プロセス、石炭のガス化、電力生産、カーボンブラック生成、アンモニア生成、メタノール生成およびコークス製造からなる群から選択される。これらの実施形態において、ＣＯ含有ガスは、任意の従来の方法を使用して、大気中に放出される前に、産業プロセスから捕捉されてもよい。ＣＯは、合成ガス（一酸化炭素および水素を含むガス）の成分であってもよい。産業プロセスから生成されるＣＯは、通常、再燃されてＣＯ２を生成するので、本発明は、ＣＯ２温室効果ガス排出量を減少させ、バイオ燃料として使用するためのブタノールを生成するのに特に有用である。ガス状ＣＯ含有基質の組成に応じて、発酵に導入する前に、それを処理して、塵粒子などの望ましくない任意の不純物を除去することが望ましい場合もある。例えば、ガス状基質は、公知の方法を用いてろ過または洗浄されてもよい。
【０１５２】
本発明の特定の実施形態において、微生物によって発酵させたガス状基質は、ＣＯ２およびＨ２含有ガス状基質である。ＣＯ２／Ｈ２含有基質は、産業プロセスの副産物として得られる廃ガスであってよい。特定の実施形態において、産業プロセスは、水素生成からなる群から選択される。特定の実施形態において、ＣＯ２およびＨ２含有ガス状基質は混合ガス流であってよく、少なくとも一部のガス流は、１以上の産業プロセスに由来し、ガス状基質のＣＯ２：Ｈ２比を最適化するために、少なくとも一部のＣＯ２またはＨ２と混合される。これは、ＣＯ２またはＨ２のいずれかに富む産業用ガス流に特に有益であってよい。ＣＯ２およびＨ２基質、またはＣＯ２とＨ２の混合基質の供給源として使用することができる副生成物ガス流を生成する産業プロセスの例としては、コークス製造、精製プロセス、アンモニア生成プロセス、メタノール生成プロセス、酢酸生成、天然ガス精製所および発電所が挙げられる。
【０１５３】
細菌の増殖およびガスの３−ＨＰ含有生成物への変換のために、ＣＯおよび／またはＣＯ２含有基質ガスに加えて、適切な液体栄養培地がバイオリアクターに供給される必要があることが理解されるであろう。この基質および培地は、連続したバッチまたはバッチ供給様式でバイオリアクターに供給されてもよい。栄養培地は、使用する微生物の増殖を可能にするのに十分なビタミンおよびミネラルを含有する。ＣＯおよび／またはＣＯ２を用いて１以上の生成物を生成するための発酵に適する嫌気性培地が、当該技術分野において公知である。例えば、適切な培地についてはＢｉｅｂｅｌ（２００１）に記載されている。本発明の一実施形態において、培地は、後述の実施例のセクションに記載されているようなものである。
【０１５４】
発酵は、望ましくはガスの３−ＨＰ含有生成物への変換を生じさせるのを支援する発酵に適する条件下で行われるべきである。液相中のＣＯおよび／またはＣＯ２が、生成物阻害を回避するために律速の最大生成物濃度にならないことを確実にするために考慮されるべき反応条件には、圧力、温度、ガス流速、液体流速、培地のｐＨ、培地の酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽型リアクターを使用する場合）、接種レベル、最大ガス基質濃度が含まれる。
【０１５５】
さらに、基質の流れのＣＯおよび／またはＣＯ２濃度（またはガス状基質中のＣＯおよび／またはＣＯ２分圧）を増加させ、したがって、ＣＯおよび／またはＣＯ２が基質である発酵反応の効率を増加させることが望ましい場合が多い。圧力を高めて動作させると、３−ＨＰ含有生成物を生成するための炭素源として微生物が取り込むことができるＣＯおよび／またはＣＯ２の気相から液相への移動速度を著しく増加させることができる。同様に、これは、バイオリアクターが大気圧よりも高圧で維持される場合に、（バイオリアクター内の液体体積を入力ガス流速で割ったものとして定義される）保持時間を低減することができることを意味する。最適な反応条件は、使用される本発明の特定の微生物に部分的に依存するであろう。しかし、一般的には、発酵は、周囲圧力より高い圧力で行うことが好ましい。また、所定のＣＯおよび／またはＣＯ２の少なくとも３−ＨＰへの変換率は、部分的には、基質保持時間の関数であるので、ひいては、所望の保持時間を達成することは、バイオリアクターの必要な容量を決定し、加圧されたシステムの使用は、必要なバイオリアクターの容積を大幅に低減し、その結果、発酵装置の資本コストを低下させることができる。米国特許第５，５９３，８８６号中の実施例によると、リアクター容積は、リアクターの動作圧の増加に比例して減少し得る、すなわち１０気圧で動作するバイオリアクターは、１気圧で動作するリアクターの容積の１０分の１のみを必要とする。
【０１５６】
一例として、高圧でガスからのエタノール発酵を行うことの利点について説明されている。例えば、国際公開第０２／０８４３８号は、３０ｐｓｉｇおよび７５ｐｓｉｇの圧力下で行われるガスからのエタノール発酵を記載しており、エタノールの生産性はそれぞれ、１日当たり１５０ｇ／ｌおよび３６９ｇ／ｌである。しかし、大気圧で同様の培地および入力ガス組成物を用いて行われる例示的な発酵は、１日当たり、１リットルあたり１０〜２０倍未満のエタノールを生成することが判明した。
【０１５７】
ＣＯおよび／またはＣＯ２含有ガス状基質の導入速度は、液相中のＣＯおよび／またはＣＯ２濃度が、律速にならないことを確実にするような速度であることも望ましい。これは、ＣＯおよび／またはＣＯ２によって制限される条件の結果として、１以上の生成物が培養によって消費されるからである。
【０１５８】
発酵反応に供給するために使用されるガス流の組成が、その反応の効率および／またはコストに大きく影響し得る。例えば、Ｏ２は、嫌気性発酵プロセスの効率を減少させ得る。発酵前後の発酵プロセスの段階での望ましくないまたは不要なガスの処理は、このような段階の負担を増加させ得る（ガス流がバイオリアクターに入る前に圧縮される場合に、発酵に必要とされていないガスを圧縮するために不要なエネルギーが使用され得る）。したがって、不要な成分を除去し、望ましい成分の濃度を増加させるために、基質の流れ、特に、産業供給源に由来する基質の流れを扱うことが望ましい場合がある。
【０１５９】
特定の実施形態において、本発明の細菌の培養は、水性培地中で維持される。好ましくは、水性培地は、最小の嫌気性微生物増殖培地である。適切な培地は、当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，１７３，４２９号、同第５，５９３，８８６号および国際公開第０２／０８４３８号に記載されており、後述の実施例のセクションに記載のものである。
【０１６０】
３−ＨＰ、または３−ＨＰおよび／または１以上の他の生成物を含む混合流は、分別蒸留または蒸発、パーベーパレーション、ガスストリッピング、および例えば、液体−液体抽出を含む抽出発酵などの当該技術分野において公知の方法によって発酵ブロスから回収してもよい。
【０１６１】
本発明の特定の好ましい実施形態において、３−ＨＰおよび１以上の生成物は、バイオリアクターからブロスの一部を連続的に除去し、ブロスから微生物細胞を分離し（濾過が都合がよい）、ブロスから１以上の生成物を回収することによって発酵ブロスから回収される。アルコールは、例えば、蒸留によって有利に回収され得る。アセトンは、例えば、蒸留によって回収され得る。生成される任意の酸は、例えば、活性炭上の吸着によって回収され得る。分離される微生物細胞は、好ましくは、発酵バイオリアクターに戻される。任意のアルコール（類）および酸（類）が除去された後に残っている無細胞透過物も、好ましくは、発酵バイオリアクターに戻される。（ビタミンＢなどの）追加の栄養素が無細胞透過物に加えられ、バイオリアクターに戻される前に、栄養培地に補充されてもよい。
【０１６２】
また、酢酸の活性炭への吸着を高めるためにブロスのｐＨが上記のように調整された場合には、ｐＨを、バイオリアクターに戻される前に、発酵バイオリアクター中のブロスのｐＨと類似のｐＨに再調整する必要がある。
【０１６３】
３−ＨＰは、パーベーパレーション、逆浸透、および液体−液体抽出技術を含むがこれらに限定されない任意の適切な手法を用いて発酵後に回収されてもよい。
【実施例】
【０１６４】
以下に、以下の非限定的な実施例を参照して、本発明をより詳細に説明する。
【０１６５】
実施例１
アセトゲンの直線的ウッド−ユングダール経路ならびに緑色非硫黄細菌および古細菌で見つかった３−ＨＰサイクル（Ｔｈａｕｅｒ，２００７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１７３２−３３）の２つのＣＯ２固定経路を、プラットフォーム化学の３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）に向かう持続可能なルートを提供するために組み合わせた。このルートは、１分子の３−ＨＰに３分子のＣＯまたはＣＯ２の固定を可能にする。カルボキシドトロフ酢酸生成生物であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍを選択し、非硫黄光合成細菌のＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉｃｕｓに由来する、最初のＣＯ２固定ステップを実施する遺伝子を用いて代謝的に操作した（図１）。
【０１６６】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉなどのカルボキシドトロフアセトゲンは、２分子のＣＯまたはＣＯ２を固定し、それらを融合して、アセチル−ＣｏＡを形成することにより独立栄養的に増殖することができる。Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉｃｕｓなどの非硫黄光合成細菌は、循環プロセスでＣＯ２を固定することができる。これらは、出発点としてアセチル−ＣｏＡを使用し、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ．６．４．１．２）により触媒されるＡＴＰ依存性の段階でアセチル−ＣｏＡを融合して、マロニル−ＣｏＡを形成し、次いで、マロニル−ＣｏＡは、マロニル補酵素Ａ還元酵素（ＥＣ １．２．１．７５）の作用によりこのサイクルの主要中間体である３−ＨＰに還元することができる（Ｈｕｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ，２００２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２４０４−１０）。３分子のＣＯまたはＣＯ２を３−ＨＰに固定する新たな代謝経路を形成するために、マロニル補酵素Ａ還元酵素遺伝子、酵素（ＧＩ：１６３８４８１６５、Ｃａｕｒ＿２６１４；ＹＰ＿００１６３６２０９．１）を、カルボキシドトロフ生物に導入した。アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ：配列番号１８〜２１；Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ：ＣＬＪＵ＿ｃ４２１００−４０，ＧＩ：９４４７８２６−３１、ＮＣ＿０１４３２８．１−３３．１）は、脂肪酸生合成の一部として宿主生物中に既に存在することが確認されたが、Ｃｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉｃｕｓのアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＧＩ：１６３８４７２１０−１１、Ｃａｕｒ＿１６４７−４８、ＹＰ＿００１６３５２５４．１−５５．１；ＧＩ：１６３８４９２６２、Ｃａｕｒ＿３７３９、ＹＰ＿００１６３７３０６．１；ＧＩ：１６３８４８９５１、Ｃａｕｒ＿３４２１、ＹＰ＿００１６３６９９５．１；ＧＩ：１６３８４６９５１、Ｃａｕｒ＿１３７８、ＹＰ＿００１６３４９９５．１）は、必須のマロニル補酵素Ａ還元酵素に加えて導入することができる。
【０１６７】
材料および方法
微生物および増殖条件
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ２３６９３は、ＤＳＭＺ（ドイツ微生物および細胞培養コレクション（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβｅ ７ Ｂ、３８１２４ ブラウンシュヴァイク、ドイツ））から得られるＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ１００６１に由来する。
【０１６８】
大腸菌のＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’Ｋａｎを、ストラタジーン社（カリフォルニア州サンタクララ、９５０５１−７２０１、米国）から購入した。
【０１６９】
大腸菌は好気的条件下で培養したが、他の全ての株は、果糖（従属栄養増殖）またはヘッドスペースに製鋼所の３０ポンドのＣＯ含有ガス（ニュージーランドのグレンブルックにあるニュージーランドスチールサイトから収集；組成：４４％ＣＯ、３２％Ｎ２、２２％ＣＯ２、２％Ｈ２）（独立栄養増殖）を含む血清ボトル中の５０ｍｌ容量の液体培地中で絶対嫌気的に増殖させた。
【０１７０】
培地を、標準的な嫌気性技術を用いて調製した（Ｈｕｎｇａｔｅ ＲＥ：厳格な嫌気性菌の培養のためのロールチューブ法（Ａ ｒｏｌｌ ｔｕｂｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｉｃｔ ａｎａｅｒｏｂｅｓ）、Ｎｏｒｒｉｓ ＪＲおよびＲｉｂｂｏｎｓ ＤＷ（編）、微生物学における方法、巻３Ｂ  アカデミックプレス、ニューヨーク、１９６９：１１７−１３２；Ｗｏｌｆｅ ＲＳ：微生物のメタン形成（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｅ）．Ａｄｖ Ｍｉｃｒｏｂ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９７１，６：１０７−１４６）。製剤を表１〜３に示す。固体培地には、１．２％バクト寒天（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｔｏｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ ０７４１７、米国）を添加した。
【０１７１】
特に明記しない限り、全ての株を３７℃で増殖させた。
【０１７２】
【表１】
0006445970.tif 000002
【０１７３】
【表２】
0006445970.tif 000003
【０１７４】
【表３】
0006445970.tif 000004
【０１７５】
Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのマロニル補酵素Ａ還元酵素を有する発現プラスミドの構築
標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を使用した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．、分子クローニング：実験室マニュアル第３版、コールド・スプリング・ハーバー研究所プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、２００１）。Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのマロニル補酵素Ａ還元酵素のＤＮＡ配列を、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ（ＧＩ：１６３８４８１６５，Ｃａｕｒ＿２６１４；ＹＰ＿００１６３６２０９．１）から入手した。
【０１７６】
Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのマロニル補酵素Ａ還元酵素をコドン最適化し（配列番号１）、ＡＴＧ：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ ＧｍｂＨ（Ｍｅｒｚｈａｕｓｅｎ、ドイツ）が合成し、さらなるサブクローニングのためにＮｄｅＩおよびＥｃｏＩ制限部位に隣接させた。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーター（Ｐｐｔａ−ａｃｋ）を、マロニル補酵素Ａ還元酵素の発現のために用いた。用いた全てのＤＮＡ配列を表４に示す。
【０１７７】
【表４】
0006445970.tif 000005
【０１７８】
ホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンのプロモーター領域（Ｐｐｔａ−ａｃｋ）（配列番号：１７）を、Ｐｐｔａ−ａｃｋ−ＮｏｔＩ−Ｆ（配列番号８：ＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＡＴＧＡＴＡＴＴＴＡＴＧＴＣＣ）およびＰｐｔａ−ａｃｋ−ＮｄｅＩ−Ｒ（配列番号９：ＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＴＴＣＣＴＣＣ）のプライマーを用いて増幅し、ＮｏｔＩおよびＮｄｅＩ制限部位および株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’Ｋａｎを用いて大腸菌−クロストリジウムシャトルベクターｐＭＴＬ ８５１４１（ＦＪ７９７６５１．１、ナイジェルミントン；ノッティンガム大学、英国）［Ｈｅａｐ ＪＴ，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ ＯＪ，Ｃａｒｔｍａｎ ＳＴ，Ｍｉｎｔｏｎ ＮＰ．  Ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｈｕｔｔｌｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９，７８：７９−８５］にクローニングした。
【０１７９】
その後、作製したプラスミドｐＭＴＬ ８５１４５中の抗生物質耐性遺伝子を、ＦｓｅＩおよびＰｍｅＩ制限部位および株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’Ｋａｎを用いて、ｐＭＴＬ ８２２５４（ＦＪ７９７６４６．１；英国ノッティンガム大学、ナイジェルミントン）［Ｈｅａｐ ＪＴ，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ ＯＪ，Ｃａｒｔｍａｎ ＳＴ，Ｍｉｎｔｏｎ ＮＰ．Ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｈｕｔｔｌｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９，７８：７９−８５］からのエリスロマイシン耐性遺伝子で置換した。作製したプラスミドｐＭＴＬ ８５２４５（配列番号３）およびｐＭＴＬ８３１５１（ＦＪ７９７６４７．１；英国ノッティンガム大学、ナイジェルミントン）［Ｈｅａｐ ＪＴ，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ ＯＪ，Ｃａｒｔｍａｎ ＳＴ，Ｍｉｎｔｏｎ ＮＰ．Ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｈｕｔｔｌｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９，７８：７９−８５］からのｒｅｐＬ遺伝子の１６２５ｂｐ断片の両方を、ＦｓｅＩおよびＡｓｃＩで切断した。ライゲーションを行い、プラスミドｐＭＴＬ８３２４５を得た。
【０１８０】
作製したプラスミドｐＭＴＬ ８３２４５（配列番号４）およびマロニル補酵素Ａ還元酵素遺伝子の３６６０ｂｐのコドン最適化生成物の両方を、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。ライゲーションを行い、その後、ライゲーション生成物を、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’Ｋａｎに形質転換し、プラスミドｐＭＴＬ８３２４５−ＳＤＲ（配列番号５）を得た。（表５に示す）オリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡ配列決定により、変異のないマロニル補酵素Ａ還元酵素遺伝子のクローニングの成功を確認した。
【０１８１】
【表５】
0006445970.tif 000006
【０１８２】
酵素活性の決定
プラスミドｐＭＴＬ ８３２４５−ＳＤＲを含有する組換え株を、好気的条件下で、適切な抗生物質を含むＬＢ培地で一晩増殖させた。これらの細胞を新鮮なＬＢ培地に接種し、初期ＯＤ６００は０．１であった。細胞を対数増殖期（ＯＤ６００  約０．６）に回収し、１３，０００×ｇ、１０分間４℃で遠心分離した。細胞ペレットを、１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．８）で２回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を含む同じ洗浄緩衝液に再懸濁し、１００μｍのガラスビーズ１．４４ｇと混合した。チューブを氷上で５分間冷却し、その後、ミニビーズビーター（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）中で５０００ｒｐｍで１分間叩打し、氷上に１分間置くサイクルを５サイクル行って細胞を破壊した。溶解後、試料を遠心分離（１３０００×ｇ、１０分間、４℃）し、上清を等分し、分析まで−８０℃で保存した。抽出物のタンパク質含有量を、市販のキット（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）マイクロプレートＢＣＡタンパク質アッセイキット−還元剤相溶性、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて決定した。
【０１８３】
Ｈｕｇｌｅｒら（Ｈｕｇｌｅｒ，Ｍ．，Ｍｅｎｅｎｄｅｚ，Ｃ．，Ｓｃｈａｇｇｅｒ,Ｈ．，Ｆｕｃｈｓ，Ｇ．，２００２．Ｍａｌｏｎｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ，Ａ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ｃｙｃｌｅ ｆｏｒ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ ＣＯ２ ｆｉｘａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４（９），２４０４−２４１０）によって報告された方法を用いて、マロニル−ＣｏＡ還元酵素活性を４５℃で測定した。ルーチンアッセイのために、酵素溶解物を、３ｍＭの１，４−ジチオエリトリトール、２ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．３ｍＭのＮＡＤＰＨを含む１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）中で、４５℃で１０分間プレインキュベートした。０．３ｍＭのマロニル−ＣｏＡの添加により反応を開始した。消費したＮＡＤＰＨの量を、３４００Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸光係数（Δε３６５）を用いて決定した。ＳＤＲの活性の１単位を、１分あたり２μモルのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ＋へ酸化するのに必要な酵素量として定義した。ＳＤＲの活性に対する温度の効果を調べるために、アッセイを３７℃でも行った。
【０１８４】
Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のマロニル補酵素Ａ還元酵素を有する発現プラスミドのメチル化
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉおよびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ由来のメチルトランスフェラーゼ遺伝子から設計した合成ハイブリッドタイプＩＩメチルトランスフェラーゼ遺伝子（配列番号６）を用いて、３−ＨＰ発現プラスミドｐＭＴＬ８３２４５−ＳＤＲのメチル化を大腸菌内でインビボで行った。メチルトランスフェラーゼ（配列番号６）を合成し、ベクターｐＧＳ２０（ＡＴＧ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｍｅｒｚｈａｕｓｅｎ、ドイツ）中の誘導ｌａｃプロモーター（配列番号７）と融合した。
【０１８５】
発現プラスミドおよびメチル化プラスミドの両方を、それらの互換性グラム−（−）複製起点（発現プラスミド中の高コピーＣｏｌＥ１およびメチル化プラスミド中の低コピーｐｌ５Ａ）により可能となる制限陰性大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’Ｋａｎの同じ細胞に形質転換した。インビボでのメチル化を１ｍＭのＩＰＴＧの添加により誘導し、メチル化プラスミドを、ＱＩＡＧＥＮプラスミドミディキット（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を用いて単離した。得られた混合物を、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ２３６９３での形質転換実験のために使用したが、グラム−（＋）複製起点（ｒｅｐＨ）を有する豊富な（高コピー）発現プラスミドのみがクロストリジウム内で複製することができる。
【０１８６】
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ中のメチル化３−ＨＰ発現プラスミドの形質転換
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ２３６９３のコンピテントセルを作製するために、５０ｍｌの培養物（炭素源として製鋼所のガスおよび果糖を含むＰＥＴＣ培地（表１）；３７℃）を３日間連続して新鮮な培地で継代培養した。これらの細胞を用いて、４０ｍＭのＤＬ−トレオニンを含む５０ｍｌのＰＥＴＣ培地に０．０５のＯＤ６００ｎｍで接種した。培養物のＯＤ６００ｎｍが０．４５に達した時に、これらの細胞を嫌気性チャンバーに移し、４℃、４７００×ｇで回収した。この培養物を、氷冷エレクトロポレーション緩衝液（２７０ｍＭのスクロース、１ｍＭのＭｇＣｌ２、７ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、最終的に６００μｌの容量の新鮮なエレクトロポレーション緩衝液に懸濁した。この混合物を、メチル化プラスミドミックスを約１０μｇ含む０．４ｃｍの電極ギャップを備える予め冷却したエレクトロポレーションキュベットに移した。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍと比較したＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのゲノム中に追加のタイプＩ型制限系を特定したので、１μｌのタイプＩ制限阻害剤（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１３、米国）をこのプラスミド混合物に添加した。これらの細胞をプラスミドおよび制限阻害剤と混合し、以下の設定：２．５ｋＶ、６００オーム、および２５μＦで、ジーンパルサーＸ細胞エレクトロポレーションシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ ９４５４７、米国）を用いてすぐにパルスした。時定数は３．７〜５．１ｍｓであった。再生のために、この培養物を、細胞の回収を増大させる５ｍｌのＰＥＴＣ−ＭＥＳ培地（表１）に移した。この培養物を、チューブホルダーを備えるスペクトロニックヘリオスイプシロン分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ ０２４５４，、米国）を用いて、波長６００ｎｍで監視した。成長（１回の倍増）が観察された後、この培養物を、それぞれ５μｇ／ｍｌのクラリスロマイシンおよび唯一の炭素源としてヘッドスペース内に３０ｐｓｉの製鋼所ガスを含むＰＥＴＣ−ＭＥＳ培地で１０ｍｌまで、その後、５０ｍｌまでスケールアップした。
【０１８７】
代謝物の分析
３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）および他の代謝物のＨＰＬＣ分析を、３５℃で動作させたＲＩＤ（屈折率検出器）を備えるＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣシステムおよび３５℃に保ったアミネックスＨＰＸ−８７Ｈカラム（３００×７．８ｍｍ、粒径５μｍ）を用いて実施した。弱酸性水（０．００５ＭのＨ２ＳＯ４）を０．６ｍｌ／分の流速で移動相として用いた。タンパク質および他の細胞残渣を除去するために、４００μｌの試料を、１Ｍ硫酸中の１％（ｗ／ｖ）５−スルホサリチル酸１００μｌと混合し、沈殿した残渣を分離するために３分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。その後、上清１０μｌを分析のためにＨＰＬＣに注入した。
【０１８８】
結果
形質転換細胞における３−ＨＰの生成
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるＣ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ経路遺伝子を用いたＣＯおよびＣＯ２／Ｈ２からの３−ＨＰ生成：
成長実験を、ゴム栓を有する血清ボトルおよびヘッドスペース内に唯一のエネルギーおよび炭素源として３０ｐｓｉの製鋼所ガス（ニュージーランドのグレンブルックにあるニュージーランドスチールサイトから収集される；組成：４４％ＣＯ、３２％Ｎ２、２２％ＣＯ２、２％Ｈ２）中５０ｍｌのＰＥＴＣ−ＭＥＳ培地（表１；果糖を含まず）中で、プラスミドｐＭＴＬ８３２４５−ＳＤＲを保有する形質転換したＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ２３６９３を用いて行った。ＨＰＬＣ分析を用いて３−ＨＰ生成を確認した。
【０１８９】
実施例２
増強したビオチン生合成を介した３−ＨＰの生成の向上
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）によるＣＯ２のアセチル−ＣｏＡへの固定化は、ビオチン（ビタミンＢ７、ビタミンＨ）によって媒介される。ビオチンは、このカルボキシル化反応のための補因子として必要とされる。
【０１９０】
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、４つの異なるサブユニットであるＡｃｃＡ、ＡｃｃＢ、ＡｃｃＣ、およびＡｃｃＤからなる複合体であり、ビオチンがサブユニットＡｃｃＢに共有結合している。ビオチンのカルボキシル化は、ＡＴＰを消費して、サブユニットＡｃｃＣによって触媒される。その後、ＡｃｃＡおよびＡｃｃＤによりＣＯ２をカルボキシル化ビオチンからアセチル−ＣｏＡへ移動させると、マロニル−ＣｏＡが生じる。アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ複合体の活性化の最初のステップでは、ビオチンのＡｃｃＢへの結合は、ビオチン−[アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ]リガーゼ（ホロ酵素合成酵素）によって触媒される。
【０１９１】
カルボキシドトロフアセトゲンにおけるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼを介したＣＯ２固定および３−ＨＰ生成を改善するために、ビオチン補因子のプールを、この補因子の生合成経路に関与する遺伝子の過剰発現によって増加させることができる。ビオチン生合成には、酵素６−カルボキシヘキサノエート−ＣｏＡリガーゼ［ＥＣ：６．２.１．１４］、８−アミノ−７−オキソノナノエート合成酵素[ＥＣ：２．３．１．４７]、アデノシルメチオニン−８−アミノ−７−オキソノナノエートアミノトランスフェラーゼ[ＥＣ：２．６．１．６２]、ビオチン合成酵素[ＥＣ：２．８．１．６]、ビオチン−[アセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼ]リガーゼ[ＥＣ：６．３．４．１５]、ビオチニダーゼ[ＥＣ：３．５．１．１２]、ビオチンタンパク質リガーゼ[ＥＣ：６．３．４．１５；ＥＣ：６．３．４．１１；ＥＣ：６．３．４．１０；ＥＣ：６．３．４．９]、エチオビオチン合成酵素[ＥＣ：６．３．３．３]、タイプＩＩＩパントテン酸キナーゼ[ＥＣ：２．７．１．３３]が含まれる。
【０１９２】
実施例３
律速脂肪酸生合成を介した３−ＨＰ生成の向上
マロニル−ＣｏＡは、脂肪酸生合成の前駆体でもある。３−ＨＰの生成を増加させるために、脂肪酸生合成の速度を、３−ＨＰ生成に有利に制限することができる。マロニル−ＣｏＡ：アシルキャリアタンパク質トランスアシラーゼ（ＦａｂＤ）[ＥＣ：２．３．１．３９]は、脂肪酸鎖の伸長を開始する。この酵素をコードする遺伝子を、マロニル−ＣｏＡが天然の脂肪酸生合成のために使用されるのを防ぐためにダウンレギュレートするか、またはこの酵素の活性を低下させることができる。
【０１９３】
読者が過度の実験をすることなく本発明を実施するのを可能にするために、特定の好ましい実施形態を参照して、本明細書で本発明を説明してきた。しかし、当業者であれば、成分およびパラメータの多くを、本発明の範囲から逸脱することなくある程度変更もしくは改変するか、または公知の同等物と置換できることを容易に認識するであろう。そのような改変および均等物は、個別に記載されるように本明細書に援用されることを理解されたい。タイトル、または見出しなどは、本明細書の読者の理解を高めるために提供され、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１９４】
上記および下記に引用した全ての出願、特許および刊行物の全開示内容は、存在する場合には、参照により本明細書に援用される。しかし、本明細書中の任意の出願、特許および刊行物への言及は、それらが有効な先行技術を構成するか、または世界中の全ての国における共通の一般知識の一部をなすという承認もしくは任意の形態の示唆として解釈されるものではなく、また解釈されるべきではない。
【０１９５】
本明細書および以下の全ての特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの言葉は、排他的な意味ではなく、包括的な意味、すなわち、「含むが、これらに限定されない」という意味で解釈されるべきである。
【図１】
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【配列表】
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