(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子を分析する方法であって、
分析される分子の試料からイオンを発生させるステップと、
発生されたイオンをイオントラップ内にトラップするステップと、
発生されたイオンを前記イオントラップ内で極低温に冷却するステップと、
１つ以上の所定のスペクトル間隔内の複数の異なる波長（λ）の光であって、前記光がＵＶ光を含み、前記光の波長が前記複数の異なる波長にわたって走査される光で、前記イオントラップ内の前記イオンを照射することによって、冷却されたイオンのうちの少なくともいくつかを前記イオントラップ内でフラグメント化するステップと、
前記光の波長が走査されるのと並列して、前記複数の異なる波長（λ）のそれぞれについて所定の範囲のｍ／ｚ値にわたって、ｍ／ｚに対して検出された信号（Ｉ）を含む複数のフラグメント化されたイオンのフラグメント質量スペクトルを記録し、それによって、ｍ／ｚ及び照射波長（λ）に対する検出された信号（Ｉ）の二次元スペクトルを記録するステップと、
記録された二次元スペクトルにおけるｍ／ｚ及び照射波長（λ）の両方に対する前記検出された信号（Ｉ）の二次元依存性を数学的に分析することによって、記録された二次元スペクトルから、発生されたイオンのうちの少なくとも１つの正体及び／又は異なる発生されたイオンの相対存在度を判断して、それによって、前記分子のうちの少なくとも１つの正体及び／又は前記試料内の異なる分子の相対存在度を判断するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記判断するステップが、前記試料内の異なる分子の相対存在度を同定及び／又は判断するために、既知の分子のフラグメント化されたイオンから取得されたｍ／ｚ及び照射波長（λ）について検出された信号（Ｉ）の二次元依存性のライブラリに対して、検出された信号（Ｉ）の記録された二次元スペクトルを比較するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｍ／ｚ及び照射波長（λ）に対する検出された信号（Ｉ）の記録された二次元スペクトルが、それによって、三次元データ配列を形成し、
前記判断するステップが、前記三次元データ配列をベクトルの対に数学的に分解するステップを含み、各対が、前記試料内の異なる分子を表わし、各対の一方のベクトルが前記分子のＩ対λのスペクトルに対応し、各対の他方のベクトルが前記分子のＩ対ｍ／ｚのスペクトルに対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ベクトルの対のうちの１つ以上を１つ以上の候補分子構造について計算された１つ以上の計算されたベクトルの対と比較するステップと、
あるベクトルの対との比較から、前記試料内の分子の最も可能性が高い構造として、ある候補分子構造を選択するステップと、を更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が、分子の異なる異性体を含み、
異なる異性体から発生されたイオンのうちの少なくとも１つの正体を判断するステップが、
異なる異性体のうち最も個体数の多い異性体の数の同定と
異なる異性体のうち最も個体数の多い異性体のそれぞれの正体の判断と、
を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記分子の試料が、分子の混合物であり、
前記方法が、前記イオンを発生させる前に、前記試料を流れさせて、流れる試料を液体又はガスクロマトグラフィにさらして、それによって、流れにおける異なる分子が時間と共に分離され、流れにおける少なくとも１つの分子の濃度が、クロマトグラフピークを生成することを更に含み、対象の各クロマトグラフピークについて、二次元スペクトルがそのクロマトグラフピークについて記録される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ｍ／ｚ及び照射波長（λ）に対する検出された信号（Ｉ）の前記二次元スペクトルを記録する期間が、対象の分子についての前記クロマトグラフピークの全幅よりも長くない、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｍ／ｚ及び照射波長（λ）に対する検出された信号（Ｉ）の前記二次元スペクトルを記録する期間が、（ａ）５秒よりも長くない、（ｂ）２秒よりも長くない、（ｃ）１秒よりも長くない、（ｄ）０．５秒よりも長くない、又は（ｅ）０．２秒よりも長くない、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
イオンをフラグメント化するステップの前に、発生されたイオンの一部を選択するステップを更に含み、それによって、選択された一部のみが照射される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上の所定のスペクトル間隔が、１つの連続的な所定のスペクトル間隔にわたり、又は２つ以上の不連続的なスペクトル間隔にわたる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の異なる波長（λ）にわたって前記光の波長が走査されることは、λの非連続値がサンプリングされること、又はλの既定の擬似ランダムシーケンスが使用されることを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記イオンを照射することが、少なくともＵＶ光で前記イオンを照射することを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記イオンを照射することが、異なる波長の２つ以上の光源、任意選択的に２つ以上のレーザからの光で前記イオンを順次又は同時に照射することを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ＵＶ光及びＩＲ光を含む光で前記イオンを照射するステップを更に含み、
前記光が、同位体で標識された分子の１つ以上の特定の分子結合を励起するように調整され、励起に起因する１つ以上のＩＲ吸収帯の検出が、前記分子の同定のために使用される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記方法の１つ以上の実験的条件が、前に取得されたデータに基づいて及び／又は１つ以上の所定の条件の実現後に選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
記録された二次元スペクトルを、前駆イオンの総数又は質量分析計によって検出された総イオン電流に正規化するステップを更に含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
分子の試料を分析するための装置であって、
分子からイオンを発生させるためのイオン発生器と、
発生されたイオンを受け取るための前記イオン発生器の下流のイオントラップであって、極低温に冷却されるように、かつ前記イオンを冷却するための極低温において凝縮しないガスを提供されるように構成されている、イオントラップと、
１つ以上の所定のスペクトル間隔内の複数の異なる波長（λ）の光で前記イオントラップ内の極低温に冷却されたイオンを照射するための光源であって、前記光の波長が、使用中、前記複数の異なる波長にわたって走査され、前記イオンのフラグメンテーションを引き起こし、それによって、フラグメントイオンを形成し、前記光の波長が変動可能な、光源と、
前記フラグメントイオンの質量分析のための質量分析計であって、前記質量分析計が、前記光の波長が走査されるのと並列して、前記複数の異なる波長（λ）のそれぞれについて所定の範囲のｍ／ｚ値にわたって、ｍ／ｚに対して検出された信号（Ｉ）を含む複数のフラグメント化されたイオンのフラグメント質量スペクトルを記録し、それによって、ｍ／ｚ及び照射波長（λ）に対する検出された信号（Ｉ）の二次元スペクトルを提供するように構成されている、質量分析計と、
前記二次元スペクトルを記録し、記録された二次元スペクトルにおけるｍ／ｚ及び照射波長（λ）の両方に対する前記検出された信号（Ｉ）の二次元依存性を数学的に分析することによって、前記分子のうちの少なくとも１つの正体及び／又は前記試料内の異なる分子の相対存在度を判断する、データ取得システムと、を備える、装置。
【請求項１８】
前記装置がクロマトグラフ装置に接続され、前記試料が前記クロマトグラフ装置からの溶離液に含有される、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記光源及び質量分析計が、対象の各クロマトグラフピークについて、前記フラグメントイオンの質量分析が複数の光の波長（λ）のそれぞれにおいて行われるように動作するように構成されており、それによって、クロマトグラフピークについて、ｍ／ｚ及び照射波長（λ）に対する前記質量分析計の検出された信号（Ｉ）の二次元スペクトルが記録されることが可能である、請求項１７又は１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記光源が、ＵＶ光源及びＩＲ光源を含み、それらの光源のうちの少なくとも１つが調整可能である、請求項１７〜１９のいずれかに記載の装置。
【請求項２１】
前記イオンの物理化学特性に基づいて発生されたイオンを選択するためのデバイスを前記イオン発生器の下流に更に備え、
前記デバイスが、前記イオントラップの上流に位置し、任意選択的に、前記デバイスが、イオン移動度分離デバイス、ＦＡＩＭＳデバイス、及び質量選択器から選択されている、請求項１７〜２０のいずれかに記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子及びそれらの混合物の分析、特に、質量分析法及び光学分光法による分析に関する。本発明の態様は、分子の試料を分析する方法、及び分子の試料を分析するための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子の分析のための多くの異なる技法が存在する。１つのかかる技法は、光学分光法、特に、光吸収分光法である。かかる分光法は、赤外（ＩＲ）、可視（Ｖｉｓ）、又は紫外（ＵＶ）領域において実行され得る。気相における小さな多原子分子の振動分解ＵＶ−Ｖｉｓ／ＩＲ分光法が、特定の分子指紋を生成するために数十年にわたって使用されている。これは、分子の同定及び、理論計算と共に、それらの構造上の判断を可能にする。しかしながら、大分子（例えば、タンパク質及びペプチド）のための技法を使用することは、それらのスペクトルの複雑性及び気相における分子が低濃度であることの多さに起因して、非常に難しく、それは、スペクトルの測定のための光吸収の使用を阻害する。そのような場合では、光フラグメンテーション分光法が、分子吸収を判断し、それゆえ、分子についての構造的情報を取得するために使用され得る。これは、レーザ又は非レーザ光源からの赤外（ＩＲ）、可視（Ｖｉｓ）、及び／又は（真空紫外（ＶＵＶ）を含む）紫外（ＵＶ）放射による気相における分子の単一又は多光子解離を伴う。大きな不揮発性分子に関する別の難題は、分析のためにそれらを気相の状態にすることである。しかしながら、非常に多くの信頼性の高い及び便利な技法が、ここ数年、質量分析法と共に開発されている。これらは、イオン化技法、例えば、エレクトロスプレーイオン化を使用して分子をイオンに変えることを含む。
【０００３】
イオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいてイオンを分析する質量分析技法は、イオン及びまたそれらのフラグメントの質量スペクトルを記録することを可能にする。フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）機器、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＯｒｂｉｔｒａｐ（商標）質量分析計又はイオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）質量分析計を有するものなどを含む、高分解能機器、及び飛行時間（ＴＯＦ）機器が、それらの同位体分布を観測することによって荷電ペプチドを区別するのに十分な分解能を提供する。ハイダイナミックレンジ及びｍ／ｚ精度と相まって、これは、質量分析法が、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）及びＸ線結晶学などの他のものと共に、タンパク質及びペプチドの分析のための主要な技法になることを結果としてもたらした。
【０００４】
しかしながら、質量分析法の基本的限界は、それが、もっぱらイオン及びそれらのフラグメントの質量ならびに電荷を測定することに頼るものの、分子内の原子の配座配列又は他の構造上の配列についての限定された情報のみを提供することが多いことである。イオン移動度分光測定法（ＩＭＳ）又は非対称場ＩＭＳ（ＦＡＩＭＳ）のように、ガス中のイオンドリフトに基づく補完的な技法は、分子構造についての非常に限定された追加的な情報のみを提供する。
【０００５】
固定波長ＵＶ／ＶＵＶレーザ／非レーザ光源に基づいて光フラグメンテーション質量スペクトル、例えば、ＭＳ／ＭＳトップダウンのアプローチにおけるタンパク質及びペプチドのＶＵＶ光フラグメンテーションを測定することが知られている（Ｊ．Ｓ．Ｂｒｏｄｂｅｌｔ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ４３（８）、２７５７（２０１４）、ならびにＪ．Ｌｅｍｏｉｎｅ、Ｔ．Ｔａｂａｒｉｎ、Ｒ．Ａｎｔｏｉｎｅ、Ｍ．Ｂｒｏｙｅｒ、及びＰ．Ｄｕｇｏｕｒｄ、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ２０（３）、５０７（２００６）を参照）。このアプローチは、種々のフラグメント及びそれらの収率の劇的な増大を可能にし、タンパク質の同定を容易にする。特に、典型的には、ＡｒＦ又はＫｒＦエキシマレーザによる、ＶＵＶ励起が、ペプチド結合の開裂ならびに特徴的なｂ及びｙフラグメントの高い存在度を結果としてもたらす。これらの研究の全てが、固定波長を有するレーザを利用する。最近の特許公報において、ＷＯ２０１３／００５０６０Ａ２が、質量分析法における、具体的には、ペプチド配列シーケンシングのためのＭＳnアプローチにおける、フラグメンテーションの方法として光解離を開示する。しかしながら、構造的情報、例えば、配座／異性体の配列などは、通常、このアプローチによって提供されない。
【０００６】
したがって、大分子、例えば、大きな生体分子及びそれらのクラスターなど、ならびにそれらの相互作用、例えば、標的ペプチドへの薬剤の結合の分析を改善する必要性が残っている。特に、かかる分子及びそれらの混合物の構造上の、例えば、配座ならびに異性体の同定のための改善された手段を提供することが望ましい。既存の技法を用いてこれを達成することは、関係のある生体分子系及び対応する実験的アプローチの両方の複雑性に起因して、困難である。
【０００７】
上記背景技術に鑑みて、本発明が行われた。
【発明の概要】
【０００８】
本発明のある態様によれば、分子を分析する方法であって、
分析される分子の試料からイオンを発生させることと、
１つ以上の所定のスペクトル間隔内の複数の異なる波長（λ）における光でイオンを順次照射することによって、イオンのうちの少なくともいくつかをフラグメント化することと、
複数の異なる波長（λ）のそれぞれについてｍ／ｚ値のある所定の範囲にわたって検出された信号（Ｉ）対ｍ／ｚを含む、フラグメント化されたイオンのフラグメント質量スペクトルを記録して、それによって、ｍ／ｚ及び照射波長（λ）についての検出された信号（Ｉ）の二次元依存性を記録することと、
記録された二次元依存性から、分子のうちの少なくとも１つの正体及び／又は試料内の異なる分子の相対存在度を判断することと、を含む、方法が提供される。
【０００９】
本発明の別の態様によれば、分子の試料を分析するための装置であって、
分子からイオンを発生させるためのイオン発生器と、
イオン発生器の下流の発生されたイオンを受け取るためのイオントラップであって、好適には、周囲温度を下回るトラップ温度まで冷却され、かつイオンを冷却するためのトラップ温度において凝縮しないガスで充填されるように構成される、イオントラップと、
好適には冷却されたイオンを光で照射して、イオンのフラグメンテーションを引き起こし、それによって、フラグメントイオンを形成するための光源であって、光の波長が変動され得る、光源と、
フラグメントイオンの質量分析のための質量分析計であって、複数のフラグメントイオンを並列に分析するように構成される、質量分析計と、を備える、装置が提供される。
【００１０】
発明の更なる特徴は、添付の特許請求の範囲に、及び以下により詳細に記載される。
【００１１】
本発明は、分子に由来するイオンの存在度の二次元測定、すなわち、イオンの質量電荷比の関数として及びイオンのフラグメンテーションを引き起こす又は修正するために使用される光の波長の関数として、イオンの存在度の測定に基づくように理解され得る。これは、イオンの質量電荷比に対して及びイオンを照射するために使用される光の波長に対して記録される検出されたイオン信号（すなわち、所与の光の波長についての検出されたイオン信号が、複数の質量電荷比のために記録され、所与の質量電荷比についてのイオン信号が、光の複数の波長のために記録される）を含む、三次元データ配列又はデータ行列を提供し、それらは、試料内の分子の化学的、構造上の、及び配座の同定（すなわち、異性体同定）、ならびに／又はそれらの相対存在度の判断を可能にするために、（例えば、数学的分解によって）数値的に分析され得、及び／又は前に取得されたデータのライブラリと比較され得る。
【００１２】
イオンの光学分光法をパノラマ式のｍ／ｚ範囲のＭＳと、特に、ＦＴＭＳ又はＴＯＦ  ＭＳと組み合わせることは、気相のイオンの構造上及び異性体の同定のための独自の方法を創出する。本発明は、分子イオンの二次元光フラグメンテーション−ＭＳ指紋の測定を可能にする。各指紋は、特定の分子又はイオンに極めて特有のものである。特定の実施形態では、それは、大イオン、例えば、イオン生体分子及び生体分子クラスターなどの振動分解された二次元光フラグメンテーション−ＭＳ指紋の測定を可能にし、それらの光解離経路の判断の改善を可能にする。これらの特徴は、例えば、分子複合体の構造及び医学又は薬学的関連性との相互作用、例えば、標的ペプチドへの薬剤の結合、ペプチド及びペプチド薬剤の水溶媒和、ならびにアミロイド病などのような病気に関連するペプチド凝集などの判断を可能にするために、本発明において有用である。この分野における一般的な目的は、結合部位、複合体構造、及び／又は複合体形成の力学についての情報を提供することにある。
【００１３】
本発明は、高速技法として実現され得る。例えば、同定される分子は、クロマトグラフ装置からの溶離液内、及びクロマトグラフピークの幅内に存在し得、イオン存在度は、質量電荷比の関数としてのみならず、フラグメンテーションを引き起こす光の波長の関数としても記録され得る。したがって、本発明は、混合物内の複数の分子であって、特に、（例えば、クロマトグラフィによって分離される分子の試料内のように）分析される分子が時間と共に変化している、複数の分子の同定のための高速技法を提供する。
【００１４】
光学分光法及び広い質量範囲の又はパノラマ式の質量分析測定の組み合わせが、分析のスループットにおける及び分析の特異性における著しい改善を可能にする。例えば、同じ又は類似（同重）質量を有する分子種、例えば、異性体は、質量分析法だけで分解することは困難であり得るのに対して、本発明は、光学分光法測定と組み合わせて広い質量範囲の質量分析測定を使用して、配座異性体を含む、かかる異性体の同定を可能にする。複数の分子が、同じ二次元分析的測定を用いて同時に同定され得る。本発明は、特に、大きな生体分子及びそれらのクラスターを同定するのに有用である。それは、それらの異性体のみならず、それらの相互作用、例えば、標的ペプチドへの薬剤の結合を同定するために使用され得る。
【００１５】
次に、本発明の更なる特徴及び利点が、本発明を実施するための好適な実施形態を含む、更なる詳細において記載される。特に好適な特徴は、添付の特許請求の範囲に含まれる。
【００１６】
本明細書において、用語「赤外（ＩＲ）」は、特に明記されない限り、近ＩＲ、中ＩＲ、及び遠ＩＲ領域のことを言う。
【００１７】
本明細書において、用語「紫外（ＵＶ）」は、特に明記されない限り、近ＵＶ、中ＩＶ、及び真空ＵＶ領域のことを言う。
【００１８】
本明細書において、用語「ＵＶ／ＩＲ」分光法は、一般に、ＵＶ、可視、及び／又はＩＲ分光法のことを言う。
【００１９】
本明細書において、用語「分子」は、単分子、及び２つ以上の分子を含む分子実体、例えばクラスターの両方のことを言う。本発明は、好適には、２ｋＤａより少ない分子質量を有する分子の同定及び／又は定量化に適用可能である。
【００２０】
本明細書において、用語「分子の混合物」は、例えば、ＬＣもしくはＧＣ又は任意の他の分離の後のそれらの共溶出に起因して、同時に分析にさらされ得る、同じ分子の異なる異性体（例えば、配座異性体）を含む、異なる分子及び分子実体のことを言う。一部の分子についての異性体の数は数百に達し得るので、かかる分離技法のうちの任意の１つによって、それらの全てを互いから分離することは不可能であることが多い。
【００２１】
試料内の分子の同定は、イオン又は分子に由来する気相のイオンの同定から進行する。同定は、以下のうちの幾つでも含み得る。
ａ）未知のイオンの化学式の同定、
ｂ）未知のイオンの官能基（複数可）の同定、
ｃ）未知のイオンの構造式の同定、
ｄ）未知のイオンの三次元（３Ｄ）構造の同定。
【００２２】
分析にさらされる（同じ分子の異なる異性体（配座異性体）を含む）分子の混合物の場合において、同定はまた、
ａ）イオンの混合物における１つ又は複数のイオン種及びそれらの相対存在度（濃度）の同定、
ｂ）同じイオンの最も固体数の多い異性体の数の同定、
ｃ）同じイオンの最も固体数の多い異性体（配座異性体）の構造の同定を含み得る。
【００２３】
分子は、気相イオンが発生されるように、最初に気相に変えられる必要がある。イオン発生器は、好適には、質量分析法の分野において既知のイオン源である。好適なイオン発生器は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源であるが、他の大気圧イオン化（ＡＰＩ）源が使用されてもよく、イオン化は、例えば、電子衝撃（ＥＩ）イオン化及び他の技法などの方法によって行われてもよい。イオンは、例えば、ＥＳＩ源によって、プロトン化分子イオン、例えば、プロトン化ペプチドとして気相の状態にされてもよい。気相イオンは、装置の真空環境の中に運ばれる。
【００２４】
任意選択的な、ただし好適な、次の段階において、本発明は、イオンをフラグメント化する前に、発生されたイオンの一部のある物理化学特性に基づいて選択し、それによって、その選択された一部のみが照射され、例えば、その結果、限られた所定のｍ／ｚ範囲又はイオン移動度範囲のイオンのみが、その後にフラグメント化されることを更に含んでもよい。イオン選択器によるかかる選択は、装置の真空領域において行われ得る。発生されたイオンの一部は、質量電荷比、もしくはイオン移動度、又は他の物理化学パラメータに従って選択され得る。これは、例えば上流のクロマトグラフィによって、イオンの発生前の分子の任意選択的な事前選択に加えて行われ得るイオンの選択である。それゆえ、装置は、好適には、発生されたイオンを質量選択するための質量選択器をイオン発生器の下流に更に備える。質量電荷比に従う選択は、好適には、多重極質量フィルタ、好適には、透過四重極質量フィルタによって、もしくは質量選択イオントラップによって、又は別の適切なフィルタもしくはレンズによって行われる。最も好適には、質量フィルタ（例えば、四重極質量フィルタ）が、ある特定のｍ／ｚ値又は狭いｍ／ｚ範囲のイオンのみを透過させるように調整される。選択がイオン移動度に従う実施形態では、イオン移動度分離デバイスが、この目的のために、好適には、イオン発生器の下流に位置する。
【００２５】
対象の発生されたイオン、任意選択的に、それらの選択された一部が、好適には、イオン発生器の下流のイオントラップに移動される。このイオントラップは、イオン捕獲及び蓄積に適したＲＦ又は静電デバイスであるが、好適には、リニアＲＦ多重極トラップ（四重極及びそれ以上）であり、平面イオントラップ、リング電極イオントラップ、又は３Ｄ四重極トラップ（Ｐａｕｌトラップ）を含む。イオントラップに導入され、未だフラグメント化されていないイオンは、本明細書において、前駆イオンとして呼ばれる。イオントラップは、真空に保持される。任意選択的な質量選択器は、好適には、イオントラップの上流に位置する。イオントラップは、非常に多くの役割を果たし得る。イオンは、イオントラップ内に蓄積され得る。イオンは、イオントラップ内で冷却され得る。
【００２６】
本発明は、好適には、イオンをフラグメント化する前に、発生されたイオンを周囲温度未満に冷却すること、任意選択的に、イオンを極低温で冷却することを更に含む。かかる好適な場合では、前駆イオンが、好適には、イオントラップ内で冷却され、より好適には、極低温で（例えば、２０Ｋを下回る温度、例えば１０〜２０Ｋなどまで）冷却される。この目的のために、イオントラップは、好適には、周囲温度未満の温度まで冷却されるように構成され、トラップ温度において凝縮しないガスを含有する。このいわゆる冷却ガスは、好適には、パルス化分子バルブを通ってトラップの中へとパルス化される。ガスは、典型的には、イオンがトラップに到着する０．１〜１ミリ秒前に、典型的には、第１の光パルスの前に少なくとも１０〜２０ミリ秒パルス化される。イオントラップ内の冷却ガスのピーク圧力は、典型的には、０．５ミリバールである冷却ガスは、通常、イオントラップの壁との衝突によって冷却される。それによって、イオンは、冷却ガスとの衝突によって冷え得る。冷却は、イオントラップ内のイオン種の全てをそれらの基底振動量子状態まで実質的に下げる。これは、スペクトル内の熱の過密を大幅に抑制し、ＵＶ及びＩＲスペクトル内の振動分解能を可能にする。冷却はまた、イオントラップ内のイオン種の立体配座不均一性を減らし、ＵＶ／ＩＲ光によるそれらの配座異性体選択性励起を可能にする。
【００２７】
前駆イオン、好適には、冷却されたイオンが、次に、フラグメント化される。イオンは、好適には、イオントラップ内でフラグメント化され、少なくとも光フラグメント化される。照射は、好適には、イオンがイオントラップ内にある間に行われる。この目的のために、光が１又は２つの窓を通して、好適にはトラップ軸に沿って、イオントラップの中に導かれ得るように、１又は２つの光学窓が装置内に提供される。
【００２８】
本発明は、好適には、イオンを照射することによって前駆イオンをフラグメント化し、イオンの光フラグメンテーションを引き起こす（例えば、光フラグメンテーションを導く）及び／又はイオンの光活性化を引き起こすこと、任意選択的に、それに続いて、ガスとの衝突及び／又は（好適には、ＩＲ光、特に、ＩＲレーザ光を用いる）更なる照射を引き起こしてフラグメンテーションの収率を増大させることを含む。フラグメンテーションの任意の他の追加的な方法、例えば、電子移動解離、電子捕獲解離等が使用されてもよい。
【００２９】
衝突セルは、好適には、任意選択的な質量選択器の下流に位置する。一定の実施形態では、したがって、本発明は、レーザ又は非レーザ光源からのＩＲ、可視、もしくは（真空紫外（ＶＵＶ）を含む）紫外（ＵＶ）放射の吸収を通した気相のイオンの単一又は多光子活性化を、別のＩＲ、Ｖｉｓ、もしくはＵＶ光源を使用する、及び／又は中性バッファガス分子との光活性化イオンの衝突を使用する後続の解離と共に含み得る。
【００３０】
任意選択的に、光フラグメントは、例えば、フラグメントをイオントラップから排出して、質量選択器を使用してそれらのｍ／ｚによってフラグメントを質量選択することによって、又はイオントラップ内のフラグメントを質量選択することによって質量選択されてもよい。後者の場合では、イオントラップは、好適には、リニア又は３Ｄ四重極イオントラップであり、質量選択が、所望されないフラグメントを排出することによって行われる。質量選択されたフラグメントは、質量分析計に提供され得るか、あるいはトラップ（光フラグメンテーション）内又は別のデバイス（例えば、衝突セル、ＥＴＤセル等）内のいずれかの更なるフラグメント化にさらされ得、ＭＳnアプローチを提供する。好適な実施形態では、選択されたｍ／ｚ（例えば、同じｍ／ｚ）又はｍ／ｚ範囲の光フラグメントが、イオントラップ内で分離され、その後、フラグメント化され（任意選択的に光フラグメント化され）て、第２のフラグメント（任意選択的に、第２の光フラグメント）を生成する。擬似ＭＳnアプローチでは、第１のフラグメンテーションが第２の光フラグメント、及び／又は第３の光フラグメント等の生成をもたらした後に、イオントラップ内の全イオン個体数をフラグメント化し続けることが可能である。第２の光フラグメントは、例えば、第２のフラグメントのｍ／ｚ及び照射波長（λ）に対して検出された信号（Ｉ）の二次元依存性を測定するために、複数の照射波長のそれぞれにおいて質量分析計内で質量分析されてもよい。
【００３１】
イオンを照射するプロセスは、好適には、ＵＶ、可視、及び／又はＩＲ光で、より好適には、レーザから、イオンを照射することを含む。好適には、イオンを照射するプロセスが、少なくともＵＶ光、より好適には、ＵＶレーザ光でイオンを照射することを含む。
【００３２】
イオンを照射するプロセスは、異なる波長の２つ以上の光源から、任意選択的に２つ以上のレーザからの光でイオンを照射することを含んでもよい。イオンは、好適には、２つ以上の光源であって、一方の光源が他方の光源の直前にイオンの照射を始める（同時照射の場合を含む）ように構成された、２つ以上の光源からの光で照射される。好適には、一方の光源が、分子をフラグメント化するために固定波長を有し、別の光源が、分子のフラグメンテーション収率を修正するように調整可能な波長を有する。好適には、イオンを照射するプロセスが、固定波長ＵＶ光及び調整可能ＩＲ光、特に、固定波長ＵＶレーザ及び調整可能ＩＲレーザで、イオンを照射することを含む。本明細書において、レーザという用語は、レーザ光を生成するデバイス、例えば、光パラメトリック発振器（ＯＰＯ）などを含むことを意図される。あるいは、イオンを照射するプロセスは、固定波長ＩＲ光及び調整可能ＵＶ光でイオンを照射することを含んでもよい。それゆえ、装置の光源は、好適には、イオンを順次照射するための２つ以上の光源であって、第１の光源が、イオンのフラグメンテーションを引き起こすためのものであり、別の光源が、第１の光源によって引き起こされたフラグメンテーションを修正するためのものである、２つ以上の光源を含む。光源は、イオンを順次照射するための２つ以上の光源であって、少なくとも１つの光源が調整可能であり、任意選択的に、２つの光源が調整可能である、２つ以上の光源を含んでもよい。
【００３３】
任意選択的に、イオンは、イオントラップの各装填（ｌｏａｄ）毎に、同じ又は異なる波長の光の複数のパルスによって照射されてもよい。例えば、同じ波長のいくつかのＵＶ光フラグメンテーションパルスが、イオントラップの各装填毎に使用されてもよい。第１のパルスが、前駆イオンのフラグメンテーションを概ね結果としてもたらし、それによって、第１の光フラグメントを形成する一方で、後続のパルスは、フラグメンテーション収率を増大させ得るが、また、第１の光フラグメントの第２、第３のフラグメント等を引き起こし、それゆえ、前駆イオンについての追加的な構造上の情報を提供する。このマルチパルスアプローチは、光フラグメンテーションを使用するＭＳnアプローチに類似する。かかる場合では、（第１及び任意の第２、第３等の光フラグメントの）光フラグメント質量スペクトル全体が、好適には、１〜Ｎ間のパルスの数の関数として、各照射波長において記録され、Ｎは、トラップの各装填毎のパルスの所定の最大数である。Ｎ個の測定のかかるサイクルは、所定のスペクトル間隔（複数可）内の各波長において繰り返される必要がある。最終的に、Ｎ個の３Ｄデータ配列の結果として生じる収集物が、例えば、適切な数学的アルゴリズムを使用して、分子の構造を同定するために分析され得る。
【００３４】
ある一定の分子、例えば大きなペプチドなどは、効率的なＵＶフラグメンテーションを受けない可能性があり得る。かかる場合では、フラグメンテーション収率が、（上記した衝突セルのように）バッファガス分子との衝突によって光活性化されたイオン（例えば、ＵＶ−ＩＲで事前に励起されたイオン）に更にエネルギーを与えることによって、又は光、好適にはＩＲレーザ光を用いる更なる照射によって、あるいはその両方によって増大され得る。フラグメンテーションの任意の他の追加的な方法、例えば、電子移動解離（ＥＴＤ）、電子捕獲解離（ＥＣＤ）等が使用されてもよい。フラグメンテーションへのかかる組み合わせ型のアプローチは、有利に、ある一定のフラグメントを生成し得、それは、ＵＶ励起に特有のものであるが、それは、衝突誘発又はＵＶ誘発性解離には存在しない。
【００３５】
フラグメンテーションの収率を増大させる目的のために、装置は、更に、光を用いる照射によって光フラグメント化及び／又は光活性化されたイオンを受け取るための衝突セルであって、中性バッファガスを提供され、バッファガスとの光活性化イオンの衝突によってフラグメンテーションの収率を増大させるように構成された衝突セルを備えてもよい。バッファガスを含有する衝突セルの圧力は、典型的には、１０-3〜１０-2ミリバールである。衝突セルは、好適には、イオントラップと質量分析計との間にある場所に位置する。
【００３６】
一定の実施形態では、したがって、本発明が、レーザ又は非レーザ光源からのＩＲ、可視、もしくはＵＶ放射の吸収を通した気相のイオンの単一又は多光子活性化を、別のＩＲ、Ｖｉｓ、もしくはＵＶ光源を使用する、及び／又は中性バッファガス分子との光活性化イオンの衝突を使用する後続の解離と共に含み得る。
【００３７】
フラグメント質量スペクトルの記録は、好適には、以下の、イオントラップ質量分析計（例えば、多重極イオントラップ質量分析計、例えば、３Ｄもしくはリニアイオントラップ質量分析計など）、環状トラップ質量分析計（特に、ＦＴ静電環状トラップ質量分析計、例えば、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計など）、ＦＴ−ＩＣＲ質量分析計、又はＴＯＦ質量分析計（好適には、単一もしくは複数の反射型ＴＯＦ、又はマルチターン型ＴＯＦ）、あるいは任意の他の適切な質量分析計のうちの１つを使用して行われる。高分解能精密質量（ＨＲ−ＭＡ）質量分析計、例えば、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計などが好適である。質量分析計は、典型的には、高真空、当分野において既知であるような分析器の種類に従う好適な圧力に保持される。
【００３８】
質量分析は、質量分析計の中への分析されるイオンの導入及び質量分析計内のイオンの検出を含む。質量分析計は、好適には、イオンを受け取ってその中にトラップするための、かつ、例えば、質量分析計内で振動するようにイオンに周期運動（その用語は、本明細書において、回転運動も包含する）を受けさせるための類のものである。好適には、質量分析計内のイオンの振動が、イメージ電流検出によって検出される。かかる検出は、好適には、静電トラップ質量分析計、例えば、環状トラップなどによって提供される。好適には、質量分析計内の圧力は、１×１０-8ミリバールよりも大きくなく、好適には５×１０-9ミリバールよりも大きくなく、より好適には２×１０-9ミリバールよりも大きくなく、更により好適には１×１０-9ミリバールよりも大きくない。
【００３９】
好適には、イオントラップは、屈曲イオン光学器経由で質量分析計及び／又はイオン発生器及び／又は衝突セルに結合される。屈曲イオン光学器は、好適には、イオントラップ内にトラップされたイオンと、屈曲イオン光学器からの出口（イオンがイオントラップから遠く離れていくときに出るイオン光学器の終端部である出口）との間に真っ直ぐな照準線が存在しないようにするものである。屈曲イオン光学器は、好適には、少なくとも１つの屈曲ＲＦ専用多重極又は少なくとも１つの静電イオン屈曲デバイスを備え、好適には、ＲＦ専用多重極又は静電イオン屈曲デバイスが、イオントラップ内にトラップされたイオンと、ＲＦ専用多重極又は静電イオン屈曲デバイスからの出口との間に真っ直ぐな照準線が存在しないように曲げられる。イオントラップは、好適には、イオン光路（装置を通るイオンが後に続く経路）の終端部に、更に好適には、屈曲イオン光学器の下流に位置する。
【００４０】
屈曲イオン光学器（好適には、少なくとも１つのＲＦ専用多重極又は少なくとも１つの静電イオン屈曲デバイス）は、好適には、（少なくとも２つの源がある場合には、光源のうちの少なくとも１つを含む）光源が、ＲＦ専用多重極又は静電イオン屈曲デバイスを通して、入口及び出口の両側からイオントラップ内のイオンを自由に照射することを可能にする。
【００４１】
装置は、好適には、関連した制御電子機器と共にコンピュータを好適には含むコントローラを備え、それは、例えば記載される様態で、光パルス、イオンの発生及び導入、ならびにイオンをトラップ及びフラグメント化する記載されるステップを制御し、必要な電圧をイオントラップ、イオン光学器、質量選択器、及び衝突セルの電極に印加し、真空ポンピングを制御して指定圧力に達するようにプログラムされる。
【００４２】
装置は、好適には、質量分析計の出力、すなわち、検出された信号（Ｉ）を受信し、質量分析からのフラグメント質量スペクトルであって、光の複数の異なる波長（λ）のそれぞれについて、ある所定の範囲のｍ／ｚ値にわたって検出された信号（Ｉ）対ｍ／ｚを含む、フラグメント質量スペクトルを記録し、それによって、ｍ／ｚ及び照射波長（λ）の両方についての検出された信号（Ｉ）の二次元依存性を記録するためのデータ取得システムを備える。データ取得システムは、好適には、質量分析計からの信号及び走査された光の波長についての情報を受信して処理するためのデータプロセッサ、例えば、コンピュータなどを備え、かつ、好適には、例えば、質量フラグメントスペクトル及び波長データ配列（すなわち、３Ｄデータ配列）を記憶するために、データ記憶装置を備える。好適には、データ取得システムは、ｍ／ｚ及び照射波長（λ）についての検出された信号（Ｉ）の二次元依存性からの試料内の分子の同定のためのもの、ならびに／又は試料内の異なる分子の相対存在度を判断するためのものである。かかる同定は、システムのプロセッサ又はコンピュータ上で行われ得る。三次元データ配列の数学的分解及び／又は前に取得されたデータのライブラリとの比較が、データ取得システムによって、例えば、それのプロセッサ又はコンピュータによって、行われ得る。あるいは、試料内の分子の同定に要求された処理は、別個のデータシステム上の装置、例えば、別個のコンピュータから遠隔で実行されてもよい。データ取得システム及びコントローラは、同じコンピュータ、又は異なるコンピュータを備えてもよい。
【００４３】
本発明の態様によれば、二次元分析が、気相イオンの照射によって生成されたイオンフラグメントの少なくともいくつか（すなわち、２つ以上）の、好適には全ての、検出された信号（Ｉ）に関して、相対存在度の同時測定を含み、フラグメントの同時測定が、所定のスペクトル間隔内の複数の波長のそれぞれにおいて行われる。それゆえ、好適な実施形態では、イオンフラグメントの相対存在度の同時測定が、照射の波長が、好適には、離散した所定のスペクトルステップにおいて波長を変更することによって、走査される際に、行われる。所定のスペクトル間隔内のスペクトルステップの大きさは、スペクトル間隔にわたって同じであってもよいし、又はそれは、スペクトル間隔にわたって変化してもよい。波長は、１つの連続的な所定のスペクトル間隔にわたってもよいし、又は２つ以上の不連続的なスペクトル間隔にわたってもよい。かかる測定の出力は、三次元（３Ｄ）のデータセット（３Ｄデータ配列もしくは行列）、又は二次元（２Ｄ）スペクトル、すなわち、すなわち、イオン存在度対波長（λ）及びｍ／ｚを生成し、それらは、分子の正体及び／又は相対存在度を判断するために使用され得る。これは、例えば、ＷＯ２０１３／００５０６０Ａ２に開示されるような、先行技術とは対照的であり、その先行技術は、３Ｄデータ又はスペクトルの使用を伴わず、かつ分子の構造又は立体配座上の判断のために分光法を使用しない。
【００４４】
衝突誘発解離、高エネルギー衝突解離、ＩＲ（非共有結合型の複合体の場合）、及びＩＲ多光子解離が、イオンの最弱結合の開裂に対応する統計的なフラグメントのみを生成するような、イオンの振動活性化の方法。これらの統計的フラグメントに加えて、ＵＶフラグメンテーションが、いくらかの非統計的「促進（ｐｒｏｍｐｔ）」フラグメント（又は統計的フラグメントの高い存在度）を生み出し得、イオンの電子励起状態の励起を結果としてもたらす。既知の「促進」フラグメントは、例えば、Ｋｏｐｙｓｏｖ、Ｖ．ｅｔ  ａｌ、ＪＡＣＳ、１３６（２６）、９２８８（２０１４）による論文に記載されるように、ペプチド及びタンパク質内の芳香族残基（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ）及びホスホチロシンの側鎖の、それらのＵＶ励起による損失に対応するものであり、それらの存在及び存在度は、ペプチドの３Ｄ構造に影響され得る。これは、ＵＶ光フラグメンテーションを、特に、イオンの異性体（立体配座）構造に対する感度を高めて、かつ構造上の同定のために利用され得る。
【００４５】
ＵＶスペクトルが、分子及び分子イオン内の吸収する発色団の周りの細かい構造上の変化に対して非常に感度が高いことは、分光学の分野において既知である。好適には高いｍ／ｚ分解能の質量分析計である質量分析計上のｍ／ｚ測定と併せて、好適には振動分解されるスペクトル測定が、記録される三次元データ配列における多数の特徴を提供し、それを、分析されるイオンの固有の指紋にさせる。指紋は、振電遷移のエネルギーを反映し、それは、量子力学的レベルのイオンの基本的なものであり、したがって、分光学的正確さを伴って全実験において再生され得る。本発明において利用される指紋は、好適には、周囲を下回る温度における、最も好適には、極低温度（２０Ｋ以下、典型的には１０〜２０Ｋ）におけるイオンの指紋である。
【００４６】
３Ｄ指紋は、特に、分子のうちの少なくとも１つを同定するのに及び／又は試料内の異なる分子の相対存在度を判断するのに有用であり得る。分子は、それらの化学組成によって、又はそれらの３Ｄ構造（例えば、配座異性体を含む、異性体）によって異なり得る。好適には、分子の正体及び／又は相対存在度を判断するプロセスが、記録された二次元スペクトルを既知の分子の指紋の（前に取得された）ライブラリに対して比較することを含む。換言すれば、検出された信号（Ｉ）の記録された二次元依存性が、試料内の異なる分子の相対存在度を同定及び／又は判断するために、既知の分子のフラグメント化されたイオンから取得されたｍ／ｚ及び照射波長（λ）についての検出された信号（Ｉ）の二次元依存性の（前に取得され）ライブラリに対して比較され得る。
【００４７】
ペプチドの３Ｄ指紋は、特に、タンパク質の新たなシーケンシングにおいて有用であるように見られ、一方で、一定の官能基又は部分（例えば、フェニル、ベンジル、アルキル、エステル等）の３Ｄ指紋は、小さな代謝物をプロファイリングするのに有用であり得、かつ多くの芳香族薬剤分子及び代謝物を含む、未知の化学的構造を有する薬剤分子の３Ｄ構造を解明する際に有用であり得る。
【００４８】
例えば、ＷＯ２０１３／００５０６０Ａ２に開示されるような、先行技術は、試料内の分子の相対存在度を同定及び／又は判断するために、既知の分子についてのｍ／ｚ及び照射波長（λ）についての検出された信号（Ｉ）の二次元依存性のライブラリの使用を開示しない。
【００４９】
網羅的なライブラリの生成は、このアプローチの成功のための重要な必要条件であり、基準スペクトルが、１つ１つ個々に明瞭に定義された化合物（標準）について、及び異なる部類の化合物（例えば、ある一定の生物過程に関連する代謝物、翻訳後修正を伴うペプチド等）内で実現され得る。ライブラリスペクトルは、好適には、未知の分子又は分子の混合物の実際の測定の間におけるものに近い条件下で生成される。ライブラリは、質量分析計内に搭載されて、又はアプリケーションコンピュータ上、又はサーバ上、又は（例えば、いわゆるｍ／ｚＣｌｏｕｄライブラリのような）クラウド上に記憶され得る。最も簡単な場合では、類似性スコア（例えば、ドット積）が、ライブラリに対する測定された分子の最良適合を判断するために使用され得る。より洗練されたアルゴリズム（例えば、非負最小二乗最適化又はクラスター分析又はニューラルネットワークモデル）が、測定されたスペクトルにおけるライブラリに記憶された指紋の存在と、試料内で見付けられたような分子の相対存在度（濃度）を判断するために使用され得る。
【００５０】
最も正確な指紋を取得するために、測定された二次元スペクトル（すなわち、強度（Ｉ）対ｍ／ｚ及びλ）がイオンの総数に正規化されるべきであることが認識されるであろう。理想的には、これは、フラグメント化される前駆イオンの初期数であるべきである。あるいは、これに対する最良近似として、二次元スペクトルが、検出された総イオン電流（ＴＩＣ）に正規化されてもよい。それゆえ、方法は、好適には、記録された二次元スペクトルを、前駆イオンの総数又は質量分析計によって検出された総イオン電流に正規化することを更に含む。指紋のライブラリ内の指紋は、好適には、そのような手法で正規化された正規化指紋である。それゆえ、正規化されたスペクトルを正規化されたライブラリ指紋と比較することが好適である。本発明は、好適には、複数（例えば、全て）のフラグメントイオン（及び残りの前駆イオン）を並列に測定する質量分析器、例えば、ＦＴＭＳ、ＴＯＦ、イオントラップ、及び環状（Ｏｒｂｉｔａｌ）トラッピング質量分析計などを用いて実現され、全イオンが同じ測定サイクル（トラップの充填及び照射）において検出されるので、それらは、全二次元スペクトルのかかる全体的な正規化を可能にする。四重極質量分析計による光フラグメント化されたイオンの先行技術の質量分析を用いると、各フラグメントは、一般に、異なる数の親イオンから検出され、それらは、測定の同じサイクルにおいて検出されることができない。これは、正規化を、一般に、低い精度にさせる。
【００５１】
本発明は、２つ以上の異性体、特に、配座異性体を含む、分子の試料の分析のために使用され得、異性体の数及び／又はそれらの相対存在度を判断する。かかる場合では、判断するステップが、好適には、ベクトルの対に対して、測定された三次元データ配列を表わす行列であって、各対が、同じ分子の異なる異性体を表わす、行列を数学的に分解することを含む。各対の一方のベクトルは、信号Ｉ対λスペクトル、すなわち、その対によって表わされる異性体の吸収スペクトルに対応し、各対の他方のベクトルは、信号Ｉ対ｍ／ｚスペクトル、すなわち、異性体のフラグメンテーション質量スペクトルに対応する。ある一定の異性体を表わすベクトルの各対の外積が、測定されたものと同じサイズの行列である。したがって、測定された行列が、ベクトルの各対の外積の一次結合に分解され得、かかる分解のスカラー係数が、異なる異性体の相対存在度を表わす。この分解は、例えば、後続の代替の最小二乗分析を用いる特異値分解（任意選択的に、非負特異値分解）手順を使用して、行われ得る。他の数学的方法、例えば、非負行列因子分析もまた、使用されてもよい。
【００５２】
かかる数学的アプローチはまた、化学的に異なる分子の試料であって、それについて３Ｄ指紋が前に取得されていない試料の分析のために使用され得、それらの同定を用いなくても異なる化合物の数を判断する。
【００５３】
本発明によって提供される三次元データ配列の数学的分析は、単一実験において測定された、三次元データ配列からの個々の配座異性体の光学及び光フラグメントスペクトルの抽出を可能にする。方法は、好適には、ベクトルの対のうちの１つ以上を１つ以上の候補分子構造について計算された１つ以上の計算されたベクトルの対と比較することと、（例えば、評価された最大の一致に基づく）ある一対のベクトルについての比較から、試料内の分子の最も可能性が高い構造として、ある候補分子構造を選択することと、を含む。数学的に分解されたベクトルの対は、分解されたベクトルの対と（候補の計算された３Ｄ構造のために計算された）計算されたベクトルの対を比較することによって、いくらかの候補の計算された３Ｄ（例えば、立体配座）構造から、分子の計算された３Ｄ（例えば、立体配座）構造を選択して検証するために使用されてもよい。
【００５４】
それゆえ、分子の正体及び／又は相対存在度を判断するプロセスは、好適には、検出された信号（Ｉ）の記録された二次元依存性を数学的に分析して、分子のうちの少なくとも１つを同定すること及び／又は試料内の異なる分子の相対存在度を判断することを含む。
【００５５】
好適な実施形態では、気相イオンが、イオントラップ内で周囲をはるかに下回る温度まで冷却されるとき、より好適には、イオンが極低温で冷却されるときに、記録された２Ｄスペクトルにおける特定の光フラグメンテーションパターンの認識が、ある一定の官能基（例えば、アミノ−、ヒドロキシル−、ホスホ−等）又は部分（例えば、フェニル−、ベンジル−、ベンゾイル−等）の存在についての情報を提供し得る。ペプチドの３Ｄ指紋は、ペプチドシーケンス内の１つ又はいくつかのアミノ酸の信頼できる同定が、その一次構造の後続の解明を実質的に簡易化する、新たなシーケンシングにおいて特に有用であると理解される。これはまた、分析される試料が、典型的に数千もの異なる分子を含み得るときに、メタボロミクスの分野において有用であり得る。この特定の場合では、官能基の同定と共に、高分解能質量分析法によって提供される、元素組成の判断が、単一走査の間における沢山の代謝物の構造式の同定を可能にし得る。
【００５６】
ＵＶスペクトルは、発色団の局所環境に対して非常に感度が高いが、それらは、分子全体の構造的情報を含まない。対照的に、ＩＲスペクトルは、分子の全振動モードの振動数を直接的に反映し、したがって、それらは、分子及びイオンの計算された３Ｄ構造を検証するのに最も適したスペクトルである。このように、ＩＲ−ＵＶ二重共鳴が、非常に低い濃度における分子及びイオンの立体配座選択性ＩＲスペクトルを測定するための技法として知られている。ＵＶ光解離スペクトルが振動分解されるとき、ＵＶレーザを１つの特定の配座異性体に属するピークに調整することが可能である。次いで、調整可能なＩＲ光の先行パルスは、それが同じ配座異性体を励起する場合にのみ、光フラグメンテーション収率を修正する。これらの修正は、検出され得、この配座異性体のＩＲ吸収スペクトルを生じる。しかしながら、このアプローチは、ＵＶスペクトルが密集される又は広げられる場合に失敗する。対照的に、本発明の二次元分光法は、異なる配座異性体のＵＶ−ＭＳ指紋が完全に同一ではないという条件で、これに関わらず、配座異性体選択性ＩＲスペクトルの取得を可能にする。本発明の好適な実施形態では、測定が、ＵＶ帯原点から赤に（好適には、わずかに赤に）固定された波長におけるＵＶレーザを用いて行われてもよい。先行ＩＲパルスは、スペクトルを広げ、後続のＵＶ吸収フラグメンテーションを誘発する。測定された３Ｄスペクトルは、ＩＲスペクトル及びフラグメント質量スペクトル対に分解され得る。次いで、各対は、３Ｄ構造計算を制約及び／又は検証するための基準点として機能することができる。
【００５７】
方法は、好適には、イオンをフラグメント化する前に発生されたイオンを周囲温度よりも低く冷却することと共に、ＩＲ（任意選択的にＵＶ）光の波長を調整して、同位体標識分子の１つ以上の分子結合を選択的に励起することを更に含んでもよい。これは、「同位体シフト」と呼ばれる現象に基づく。同位体標識は、標識原子が関わるそれらの振動の振動数を変化させる（例えば、Ｏ−Ｈ伸縮は、３７００ｃｍ-1であるのに対して、Ｏ−Ｄは２７００ｃｍ-1であり、すなわち、約１０００ｃｍ-1の同位体シフトである）。この現象は、上記したＩＲ−ＵＶ技法を使用する元の分子又はその標識類似物のいずれかの選択性フラグメンテーションを可能にする。結果として生じるフラグメントは、標識原子を含有する荷電フラグメントを含み得る。
【００５８】
以下の分子結合のうちの１つ以上が、ＩＲ光によって励起され得る。
ｉ．同位体標識分子内の同位体標識、任意選択的に、2Ｄ、13Ｃ、15Ｎ、18Ｏ等又は任意のそれらの組み合わせを含有する標識への結合、
ｉｉ．有機分子内の官能基又は部分、任意選択的に、ヒドロカルビル、ハロゲン、酸素、窒素、硫黄、リン、鉄、セレン含有基のうちの１つへの結合、
ｉｉｉ．有機ポリマ内の官能基への結合であって、任意選択的に、その基が、リン酸又はグリコシル基等であり、任意選択的に、分子が、ペプチド、又はタンパク質、又はＤＮＡ、又はＲＮＡ、又は修飾ペプチド、又は修飾タンパク質、又は修飾ＤＮＡ、又は修飾ＲＮＡであり、任意選択的に、修飾ペプチド又はタンパク質が、翻訳後修飾される、結合、
ｉｖ．架橋ペプチド、又はタンパク質、又はそれらの複合体、又はＤＮＡ、又はＲＮＡ内のリンカーにおける結合であって、任意選択的に、その結合が、ジスルフィド結合であり、又はリンカーが、人為的に導入されたリンカーである、結合、
ｖ．ペプチド、タンパク質、又はそれらの複合体内の非共有結合であって、任意選択的に、非共有結合が、水素結合であり、任意選択的に、複合体が、１つ以上の水分子とのペプチド又はタンパク質の複合体である、結合。
【００５９】
かかる特定の分子結合の励起に起因したＩＲ吸収帯の検出が、それぞれの種の同定のために使用され得る。
【００６０】
本発明は、イオンの質量電荷比に対して及びイオンを照射するために使用された光の波長に対して記録された検出されたイオン信号を含む三次元データ配列又はデータ行列を提供する（すなわち、光の所与の波長について検出されたイオン信号が、複数の質量電荷比のために記録され、所与の質量電荷比についてのイオン信号が、光の複数の波長のために記録される）。ｍ／ｚ及び照射波長（λ）についての検出された信号（Ｉ）の二次元依存性を記録するデータ配列は、分子の正体及び／又は異なる分子の相対存在度の判断を可能にするために、数学的に分析され得、ならびに／あるいは前に取得されたデータのライブラリと比較され得る。
【００６１】
１つの又は少数の光フラグメントを検出することによるＵＶ及びＩＲスペクトルの測定についてのならびに一定の構造上の判断のためのスペクトルの使用についての多くの刊行物が存在する。しかしながら、広い質量範囲にわたって全ての質量についてスペクトルを測定するために先行技術の方法を使用することは、非現実的に時間を浪費し、特に、その場合、高分解能質量スペクトルが要求される。したがって、先行技術のアプローチは、質量分析情報を損失せずに、現代の分析的分離技法（例えば、高及び超高性能液体クロマトグラフィ（ＬＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、ナノスケールＬＣ、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）、イオンクロマトグラフィ（ＩＣ）、イオン移動度（ＩＭＳ）等）とオンラインでインターフェースをとることができない。これとは対照的に、本発明は、分析が、かかる分離技法とインターフェースをとることを可能にして、分析のスループット及び特異性に劇的な増加をもたらす。本発明は、存在する全ての種（すなわち、分子、それらの異性体等）についての情報を含むけれども、各質量スペクトルが広い質量範囲にわたって高い分解能かつ質量精度で取得されるので、本発明の二次元スペクトルは、単一イオン種についての同じスペクトル範囲に対応する、従来の一次元光学スペクトルと同じ長さの時間にわたって測定され得る。したがって、本発明の方法は、従来のアプローチが同じ量の情報を取得する場合よりもかなり速い。また、１次元光学スペクトルと比較すると、本発明の方法は、全フラグメントが一度に及び前駆イオンと共に測定されるので、光フラグメントの相対存在度の測定においてより正確である。
【００６２】
本発明による分析の速度に起因して、それは、特に、時間と共に変化する試料、例えば、分離技法から出てくる試料などの分析に応用される。したがって、好適な種類の実施形態では、分子の試料が、分子の混合物であり、方法は、好適には、イオンを発生させる前に、混合物を流れさせて、流れる混合物を分離プロセスにさらし、それによって、流れにおける異なる分子が、時間と共に分離され、分子の流れが、少なくとも１つの極大値を生成することを含む。分離プロセスは、クロマトグラフィ、例えば、液体又はガスクロマトグラフィの方法であり得、それゆえ、極大値は、クロマトグラフピークであり得る。クロマトグラフィは、例えば、ＨＰＬＣ、ＵＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、ナノスケールＬＣ、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）、又はイオンクロマトグラフィ（ＩＣ）であってもよい。方法は、イオンが発生された後に、分離技法がイオンに適用される場合、例えば、イオンを流れさせた後に、例えば、イオン移動度（ＩＭＳ）によってイオンを分離することなどの場合に適用されてもよい。それゆえ、流れにおける極大値が、イオン移動度ピークであり得る。有利に、ｍ／ｚ及び照射波長（λ）についての検出された信号（Ｉ）の二次元依存性を記録する期間は、興味のある分子又はイオンについての極大値の全幅よりも長くない。
【００６３】
それゆえ、かかる実施形態のための装置は、クロマトグラフ装置に接続されてもよく、試料は、クロマトグラフ装置からの溶離液内に含有され、光源及び質量分析計は、対象の各クロマトグラフピークについて、フラグメントイオンの質量分析が光の複数の波長（λ）、のそれぞれにおいて行われるように動作するように構成され、それによって、そのクロマトグラフピークについて記録されるｍ／ｚ及び照射波長（λ）についての質量分析計の検出された信号（Ｉ）の二次元依存性を可能にする。
【００６４】
λが走査のときに単調に変化すべきという要求はないことに留意されたい。一方、いくつかの場合では、λの非連続値においてサンプルを取ること、又は既定の擬似ランダムシーケンスを使用することが好ましい。λスペクトルの情報の乏しい又は冗長な領域を完全に省略することもまた好ましい。
【００６５】
前に取得されたデータに基づいて及び／又は１つ以上の所定の条件の実現後に、方法の１つ以上の実験的条件が選択されることが可能である。データ取得システムは、前に取得されたデータ（すなわち、スペクトル）に基づいて及び／又は１つ以上の所定の条件の実現後に、条件を選択するために使用され得る。例えば、選択される実験的条件は、フラグメンテーションのためのイオンの一部の選択、照射波長、質量分析の条件（例えば、走査数、ｍ／ｚ範囲、質量分解能、質量精度）、衝突セルの使用、及び衝突セルパラメータ（例えば、衝突エネルギー、バッファガス圧力）を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明に従って分子を分析するための装置を概略的に示す。
【図２】Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を用いて出現している光フラグメントの全てを監視しながら、ＵＶ励起レーザの波長を走査することによって測定された［ＹＡ−Ｈ］+ジペプチドの３Ｄデータ配列（信号（Ｉ）対λ及びｍ／ｚ）の実施例を示す。
【図３】図２に部分的に示される、３Ｄデータ配列から数学的に抽出された［ＹＡ−Ｈ］+ジペプチドの３つの最も豊富な配座異性体のＵＶ吸収スペクトル（左側）及び対応する光フラグメンテーション質量スペクトル（右側）を示す。ＵＶ照射に起因する前駆イオンの低減を反映するスペクトルがまた、比較のために示される。配座異性体Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩの計算された３Ｄ構造が、スペクトルの下に示される。
【図４（ａ）】本発明の手段によって全て取得された、テストライブラリの５つの同重リンペプチド（ａ〜ｅ）についての２Ｄスペクトル及び同重ペプチド混合物（ｆ）の２Ｄスペクトルのフラグメントを示す。２つの特定のフラグメントのｍ／ｚにおける２Ｄスペクトルのカッティングによって取得されたＵＶスペクトル、例として、２つの同重ペプチド（ａ、ｃ）の場合及び混合物（ｆ）の２Ｄスペクトルの場合が示される。混合物内の３つのペプチド及びそれらの相対濃度は、ライブラリの５つの候補の２Ｄスペクトルを使用して、混合物の２Ｄスペクトルの数学的分析（非負最小二乗法）によって判断された。
【図４（ｂ）】本発明の手段によって全て取得された、テストライブラリの同重リンペプチド（ｂ）についてのフラグメントを示す。
【図４（ｃ）】本発明の手段によって全て取得された、テストライブラリの５つの同重リンペプチド（ｃ）についてのフラグメントを示す。
【図４（ｄ）】本発明の手段によって全て取得された、テストライブラリの５つの同重リンペプチド（ｄ）についてのフラグメントを示す。
【図４（ｅ）】本発明の手段によって全て取得された、テストライブラリの５つの同重リンペプチド（ｅ）についてのフラグメントを示す。
【図４（ｆ）】本発明の手段によって全て取得された、同重ペプチド混合物（ｆ）の２Ｄスペクトルのフラグメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本発明のより詳細な理解を可能にするために、非常に多くの実施形態が、次に、例として及び添付の図面を参照して、記載される。
【００６８】
図１を参照すると、本発明に従って分子を分析するための装置２が示される。装置は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからの修正されたＱ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計を備える。装置２は、コントローラであって、様々な構成要素の動作を制御し、例えば、様々な構成要素に印加される電圧を設定し、かつ検出器を含む様々な構成要素からデータを受信して処理するコントローラ、例えば、適切にプログラムされたコンピュータ（図示しない）などの制御下にある。
【００６９】
分析される分子（図示しない）を含有する液体試料が、エレクトロスプレーイオン源４に導入され、気相イオンが、連続的な流れとして分子から発生される。一般的な試料の種類は、ペプチドであって、それらを気相の状態にするためのエレクトロスプレーイオン化技法を用いる使用のために水／メタノール溶液内に溶解されるペプチド含む。好適な実施形態では、試料が、インターフェースを取られた機器、例えば、クロマトグラフ（図示しない）などから来る。発生されたイオンは、ＲＦ専用Ｓレンズ（積み重ねリングイオンガイド）６（質量依存性に設定された、ＲＦ振幅０〜３５０Ｖｐｐ）によって移動され、（典型的には、２５Ｖのオフセットに保持された）Ｓレンズ出口レンズ８を通過する。イオンビーム内のイオンは、次いで、注入多重極１０及び屈曲フラタポール（ｆｌａｔａｐｏｌｅ）１２を通って伝達され、それらは、イオンを下流の光学器に伝達するためのＲＦ専用デバイスであり、ＲＦ振幅は、質量依存性に設定されている。次いで、イオンは、一対のレンズ（典型的には約４．５Ｖにある内部レンズ１４、及び典型的には約−１００Ｖにある外部レンズ１６を有し、両方とも質量依存性）を通過して、質量分解四重極１８に入る。
【００７０】
四重極１８ＤＣオフセットは、典型的には４．５Ｖである。四重極１８の差動ＲＦ及びＤＣ電圧が、全イオンを伝達するように（ＲＦ専用モード）、又はＭａｔｈｉｅｕの安定性図（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｄｉａｇｒａｍ）に従ってＲＦ及びＤＣを適用することによって伝達に特有のｍ／ｚを選択するように制御される。他の実施形態では、質量分解四重極１８の代わりに、ＲＦ専用四重極又は多重極がイオンガイドとして使用されてもよいが、分光計は、分析前の質量選択の能力が無いことが認識されるであろう。更に他の実施形態では、代わりの質量分解デバイス、例えば、リニアイオントラップ、磁気セクタ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｃｔｏｒ）、もしくは飛行時間分析計、又は他の質量フィルタなどが、四重極１８の代わりに利用されてもよい。四重極１８の更なる代替物として、イオン移動度分離器、例えば、イオン移動度ドリフトチューブ又はＦＡＩＭＳデバイスなどが、その代わりに使用されてもよい。
【００７１】
示された実施形態を再び参照すると、四重極１８を通って伝達されるイオンビームは、（典型的には−３５〜０Ｖに保持され、電圧は、質量依存性に設定される）四重極出口レンズ２０を通って四重極から出て、出口レンズに隣接するスプリットレンズ２２によってオン及びオフを切り換えられる。次いで、イオンは、移動用多重極２４（ＲＦ専用、ＲＦ振幅が質量依存性に設定されている）を通って湾曲リニアイオントラップ（Ｃ−トラップ）２６に移動される。
【００７２】
Ｃ−トラップは、軸方向に細長くされ（それによって、トラップ軸を定義し）、その方向においてイオンがトラップに入る。１つの動作モードでは、Ｃ−トラップ出口レンズ２８上の電圧は、イオンが通過することができず、それによって、Ｃ−トラップ２６内に蓄積されるような手法で設定され得る。このモードは、質量分解四重極１８から受け取られたフラグメント化されていない前駆イオンの質量スペクトルを収集するために使用され得、Ｃ−トラップ２６内に蓄積されるイオンは、Ｃ−トラップへのパルス状ＤＣによって、Ｃ−トラップの軸に直交に排出される（直交排出）。このようにして、Ｃ−トラップから排出されたイオンが、この場合では、Ｚレンズ３２及び偏向器３３を経由して、この場合では、静電環状トラップ質量分析計、より具体的には、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって製造されたＯｒｂｉｔｒａｐＦＴ質量分析計である質量分析計３４の中に注入される。示されるＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計に代えて、単一反射もしくは多重反射又は多重偏向ＴＯＦ、又はＦＴ−ＩＣＲ、又は静電トラップ、又はアレイ検出器を有する飛行距離質量分析計、あるいは他の適切な質量分析計が、使用されてもよい。高分解能精密質量（ＨＲ−ＡＭ）質量分析計、例えば、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計などが、好適である。
【００７３】
本発明に従う動作では、イオンの光フラグメンテーションをもたらすために、Ｃ−トラップ出口レンズ２８上の電圧は、イオンが衝突セル５０（高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）セル）に向かって（軸方向に伝達される）Ｃ−トラップを通過することを可能にするように設定される。イオンは、Ｃ−トラップと衝突セルとの間の適切な電圧によって衝突セルに注入され得る（例えば、衝突セルは、陽イオンの場合、負電位にオフセットされ得る）。衝突エネルギーは、この電圧によって制御され得る。しかしながら、イオンは、下流の衝突セルを通過してフラグメント化されるので、光フラグメンテーションがもたらされる前に、Ｃ−トラップから衝突セル５０に入るイオンは、衝突解離のためにエネルギーを与えられない。衝突セル５０は、軸性電圧勾配を使用してイオンを中に入れて導くための多重極５２を備える。以下に更に記載されるように、衝突セル５０は、以下に記載されるように、更に下流で光活性化されたイオンの光フラグメンテーション収率を増大させるように、衝突ガスを含有し得る。
【００７４】
光フラグメンテーションモードでは、イオンが、開口部５４を通って衝突セル５０を出て、ＲＦ専用屈曲多重極６０の中へ通過し、その多重極は、イオンの蓄積及び冷却のみならず光フラグメンテーションのために、屈曲ＲＦ専用多重極６０の後ろのイオン光路の終りに位置する冷イオントラップ７０の中にイオンを導く。イオントラップ７０は、イオンを中に入れるための八重極７２を備える。屈曲多重極６０の幾何形状は、光が（以下に記載されるように、例えばＵＶ及び／又はＩＲレーザビームなどの源から）冷イオントラップ内のイオンを照射するための便利なアクセスを可能にするのみならず、衝突セル５０及びＣ−トラップ２６から冷イオントラップ７０の中への暖かいガスのキャリーオーバーを回避する。あるいは、静電曲げ光学器が、屈曲ＲＦ専用多重極６０の代わりに利用されてもよいが、ＲＦ専用多重極は、フラグメントイオンのパノラマ式スペクトルを取得するために、質量分析計とは反対方向におけるイオンの無損失輸送を更に可能にする。一般に、屈曲多重極６０の好適な幾何形状、又は代替の屈曲イオン光学器は、イオン光路における９０度の曲がりを含む。屈曲ＲＦ専用多重極６０は、１組のプリント回路基板として実現され、それは、好適な構成であるが、例えばロッドを使用する、他の構成が可能である。
【００７５】
冷イオントラップ７０（図１ａ、Ｏ．Ｂｏｙａｒｋｉｎ、Ｖ．Ｋｏｐｙｓｏｖ、Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒ．８５、０３３１０５−１（２０１４））は、二段階閉サイクル冷却装置（例えば、Ｓｕｍｉｔｏｍｏ、ＲＤＳ−４０７）の第２の段階上に装備され、それは、圧縮されたＨｅガスを動作体として使用し、トラップを６Ｋまで低く冷却することができる。動作範囲は、典型的には６〜２０Ｋ、又は１０〜２０Ｋであり得る。イオントラップ７０は、トラップの放射加熱を最小限にして冷却ガス、ヘリウムを閉じ込めるための筐体によって覆われ、そのガスは、電気的に制御されたパルス状ガスバルブ（図示しない）を通してトラップの中にパルス状にされる。Ｈｅは、４Ｋを超えると凝縮しないので、冷却ガスの選択肢である。ガスパルス持続期間は、典型的には０．３〜０．５ミリ秒である。冷イオントラップ内のＨｅガスの圧力は、ガスパルス直後に典型的には０．５ミリバールであり、それは、典型的には、トラップされたイオンを光で照射する瞬間に１０-4ミリバール未満に低下する。冷却ガスは、イオントラップの壁との衝突によって冷却され、それによって、イオントラップ内に蓄積されたイオンが、冷却ガスとの衝突によって冷却し得る。
【００７６】
質量選択性四重極１８による前駆体の質量選択を任意選択的に使用して、冷イオントラップを前駆イオンで充填することは、当分野において既知であるようなデータ依存性手法で、例えば、自動利得制御のプロセスを使用して、行われてもよい。このようにして、冷イオントラップ内の前駆イオンのイオン個体数が、任意選択的な専用の事前走査を含む、質量分析計による１つ以上の前の質量分析走査から取得された情報を使用して、当分野において既知であるような最適レベルに制御され得る。これは、前駆イオンでのイオントラップ７０の過剰充填又は過少充填を回避する。
【００７７】
八重極の８個の電極に適用される電気的ＲＦ正弦波形の典型的な振動数は、５０〜１００Ｖのピーク間振幅で１ＭＨｚである。八重極の典型的な極バイアスは、イオン注入の間にＣ−トラップのものよりも１〜３Ｖ低く、八重極からのイオンの解放の間にＣ−トラップのものよりも１〜３Ｖ高い。トラップのエンドキャップ８４の電位は、典型的には、イオンがトラップされるときに、極バイアスのものよりも３〜５Ｖ上回る。エンドキャップの電位は、トラップからのイオンのパルス状解放のために極バイアスに対して−５Ｖに下がる。
【００７８】
イオンが冷イオントラップ７０内に一旦到着すると、それらの冷却の期間は、典型的には５〜１０ミリ秒である。それは、冷浴ガスとの衝突及びそれらのサイズによって判断される。イオンが冷却された後のみ、光学分光実験が開始する。
【００７９】
光学セットアップは、互いに直交に位置付けられたＵＶレーザ９０及びＩＲレーザ１００を備える。ＵＶレーザからの光は、ＵＶレンズ９２によって集束され、ビーム結合器９４によって９０度まで反射され、それにより、それは、照射軸９８に沿って導かれ、その後、それは、光学窓８２を通って、屈曲多重極６０を通り、そして冷トラップ７０の中に伝達される。ＩＲレーザ１００からの光は、ＩＲレンズ９６によって集束され、ビーム結合器９４によって伝達され、それにより、それもまた、照射軸９８に沿って導かれ、その後、それは、光学窓８２を通って、屈曲多重極６０を通り、そして冷トラップ７０の中に伝達される。ＵＶ−ＭＳのためのより単純なセットアップでは、ＩＲレーザ１００が省略されてもよく、ビーム結合器９４は、単純なＵＶミラーとすることができる（すなわち、ＩＲレーザは、任意選択的な光源である）。レーザビームは、光学窓８０を通って冷トラップから出る。また、レーザビームの終端のために任意選択的なビームストップ１０４が示される。
【００８０】
典型的な実験サイクルは、５０ミリ秒続く。それは、Ｈｅガスをその中にパルス状にしてから典型的には１ミリ秒後にトラップを装填すること（ｌｏａｄｉｎｇ）で開始する。冷却後、典型的にはＨｅパルスの２０〜４０ミリ秒後に解離光パルスが到着する。残りのＨｅが一旦ポンプで出されると、典型的には、ガスパルスの４０〜５０ミリ秒後、イオンが、冷トラップから解放され、光フラグメントのＭＳ分析のためにＯｒｂｉｔｒａｐのＣ−トラップに移動される。任意選択的に、それらは、衝突セル５０において更に活性化されてもよい。測定の各サイクルにおいて、走査されたレーザ（ＵＶ又はＩＲのいずれか）の波長が、読み取られ、質量走査のタグとして記憶される。
【００８１】
サイクル全体が、実験の繰返し率を定義するコントローラであって、イオンのトラップ、冷却、及びトラップからの解放を、光パルス及びＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計の測定サイクルと同期させるコントローラによって制御される。
【００８２】
示される実施形態は、以下に更に記載されるように、ＵＶ及びＩＲ調整可能パルス状レーザ源を含む２つの光源を使用する。本実施形態におけるＵＶレーザ源は、可視スペクトル領域において広く調整可能である（ナノ秒パルス持続期間の）パルス状光パラメトリック発振器−増幅器（ＯＰＯ−ＯＰＡ）システムである。あるいは、ＵＶ光源は、調整可能な色素レーザであってもよい。いずれの場合も、ＵＶレーザ源は、Ｎｄ：ＹＡＧパルス状レーザの第２又は第３高調波によって励起され、いずれの場合も、レーザ源は、非線形高調波変換器を装備し、３８０〜２００ｎｍのスペクトル領域においてＵＶ光を発生する。ＩＲ光源は、１２〜２．５μｍのスペクトル範囲において調整可能な及びパルス状Ｎｄ：ＹＡＧレーザによって励起される、ＩＲ  ＯＰＯ−ＯＰＡシステムである。ＵＶ光の好適な線幅は、０．２〜１ｃｍ-1であり、ＩＲ光の好適な線幅は、２〜５ｃｍ-1である。ＵＶレーザ波長の好適な間隔は、（論文、Ｖ．Ｋｏｐｙｓｏｖ、Ｎ．Ｎａｇｏｒｎｏｖａ、及びＯ．Ｂｏｙａｒｋｉｎ、ＪＡＣＳ、１３６、９２８８（２０１４）の図４において明らかにされる）既知の発色団群のＵＶ吸収の始まり（電子帯原点）のあたりのものである。Ｖ．Ｋｏｐｙｓｏｖ，Ｎ．Ｎａｇｏｒｎｏｖａ，ａｎｄ  Ｏ．Ｂｏｙａｒｋｉｎ，ＪＡＣＳ，１３６，９２８８（２０１４））．これは、特定の芳香族残基を含有する、ペプチドに特有の、以下の間隔を含む。トリプトファンの場合には３４５００〜３５２００ｃｍ-1、チロシンの場合には３４５００〜３５４００ｃｍ-1、ホスホチロシンの場合には３６２００〜３７１００ｃｍ-1、フェニルアラニン残基の場合には３７４００〜３７８００ｃｍ-1。ペプチドのＶＵＶフラグメンテーション及び非ペプチド芳香族イオンのＵＶ／ＶＵＶフラグメンテーションのための好適な間隔は、典型的には、より広い。光源の好適なパルスエネルギーは、２ｍＪ／パルスよりも大きい。
【００８３】
装置は、レーザ光を冷イオントラップ７０の中に透過させるための２つの窓８０、８２を含む。一方の窓８０は、イオン光路の終りにおける冷イオントラップ７０の終端部に隣接し、他方の窓８２は、屈曲ＲＦ専用多重極６０に隣接する。両方の窓は、ブルースター角（窓表面の法線とレーザビームとの間が約５６°）に配置され、表面反射を最小限にし、かつ、レーザビームが冷イオントラップ内のイオンを照射するための明確な照準線を可能にする。好適には、窓及び他の光学器（例えば、レンズ）は、ＵＶ及びＩＲ光の同時の透過度のためにＢａＦ2でできている。ＩＲ及びＵＶビームの両方は、同じ窓８２であるがトラップ７０の真空チャンバに入り、窓８０を通ってチャンバを去る。あるいは、ビームは、窓の一方がＵＶビームを、もう一方がＩＲビームを透過させるのに役立つように、反対方向に伝播し得る。（図１に示されない）そのような場合では、第１の窓が、ＣａＦ2又はＵＶ溶融シリカででき得、第２の窓が、ＢａＦ2材料ででき得、それぞれ、ＵＶ及びＩＲ光のための最低吸収損失を確実にする。一般に、両方の窓は、両波長に対して透明であるべきであるか、又は少なくとも一方がＵＶに透明であり、もう一方がＩＲに透明であるが、両方とも、薄い層ではなくて、分厚い層においてのみ透過されない波長を吸収し得る。
【００８４】
ＵＶ分光動作モードでは、冷イオントラップ７０内の前駆イオンのパルス状照射が、イオンの光フラグメンテーションを誘発してフラグメントイオンを形成する目的のために、第１のＵＶ波長（λ1）において最初に行われる。イオンがこの波長においてＵＶ光を吸収する場合、それらは、解離し得、前駆イオンのものとは異なるｍ／ｚを有する光フラグメントイオンを生じる。次いで、任意のフラグメントイオン及び任意のフラグメント化されないイオンが、冷イオントラップから排出され、Ｃ−トラップ２６に向かって上流に移し戻される。任意選択的に、光活性化又は励起されたフラグメント化されないイオンが、衝突セル５０内で衝突解離を受けるようにエネルギーを与えられてもよく、それは、質量分析されるイオンフラグメントの収率を増大させるが、また、新しいイオンフラグメントの出現も結果としてもたらし得る。次いで、任意のイオンフラグメントを含むイオンが、Ｃ−トラップ２６内にトラップされ、そこから、上記したようなＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計３４の中に注入される。次いで、パノラマ式フラグメント質量分析（広いｍ／ｚ範囲）が、質量分析計によって行われ、分析器から検出された信号（Ｉ）が、データ取得システム（図示しない）上に記録される。これは、照射の第１の波長（λ1）（すなわち、所与のレーザ波長におけるフラグメント質量スペクトル）に対応する質量スペクトル（すなわち、ｍ／ｚに対して検出された信号（Ｉ））を提供する。次いで、プロセス全体が、イオントラップ７０内に蓄積された前駆イオンの別の束のために再度行われるが、今度は、第２の波長（λ2）において、その後、最大λnまでの更なる波長について照射される。ここで、ｎは、使用される照射の波長の数である。換言すれば、波長が増分され、測定のサイクル全体が、ｎ個の波長が調査されるまで繰り返される。好適な波長間隔（ｓｔｅｐ）は、０．０４ｎｍよりも少ない。任意選択的に、各波長において、２つ以上の質量スペクトルが、記録され得、信号を改善するために平均化され得る。
【００８５】
ＩＲ分光モードでは、ＵＶ光波長が、吸収ＵＶピーク上（配座異性体選択的減衰ＩＲ分光法）又はＵＶ吸収スペクトルのわずかに外側（配座異性体非選択的増加ＩＲ分光法）のいずれかに固定され、一方で、先行ＩＲレーザパルスの波長は、ＵＶ分光動作モードについて上記したように測定の各サイクルにおいて変化する。ＩＲ及びＵＶパルス間の典型的な時間遅延は、５０〜１００ナノ秒である。好適な波長間隔は、５ｃｍ-1よりも少ない。
【００８６】
生成されたデータは、走査（ＩＲ又はＵＶ）レーザの波長によってそれぞれ標識された、１組のフラグメント質量スペクトルである。これは、３Ｄデータ配列又はスペクトルを構成し、それは、各光フラグメントについて測定された光吸収スペクトルのみならず、各波長において測定された光フラグメント質量スペクトルを含有する。図２には、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を用いて全ての出現している光フラグメントを監視する間に、ＵＶ励起レーザの波長を走査することによって測定されたジペプチドの３Ｄデータ配列（信号（Ｉ）対（波数として表現される）λ及びｍ／ｚ）（実質的な光フラグメンテーションに対応するｍ／ｚのものだけが示される）の単純な例が示される。
【００８７】
ＵＶ吸収及びフラグメンテーションの両方は、調査下で選択されたイオンに非常に特有であり得るので、３Ｄスペクトルは、この特異性についてのデータを含有し、特に、選択されたイオン（及び、それゆえ、イオンが生成される元の分子）に（指紋として）特徴的である。
【００８８】
測定されたスペクトル（すなわち、強度（Ｉ）対ｍ／ｚ及びλ）は、前駆イオンの総数に、これに対する良好な近似として、検出された総イオン電流（ＴＩＣ）に正規化され得る。
【００８９】
全てのイオンが同じ化学的構造のもの（例えば、ペプチドのための単一シーケンス）であるが、異なる異性体（例えば、配座異性体）であって、ある一定の波長（複数可）における異なるチャネルに対してフラグメンテーション収率が異なる、異性体を含有する場合、３Ｄデータ配列が、ベクトルの対に数学的に分解され得、それは、イオンの異なる異性体（配座異性体）に、及び対角行列に対応し、それは、これらの異性体の相対存在度を示す。ベクトルの各対において、一方のベクトルが、ある特定の異性体（配座異性体）のいわゆる光吸収スペクトル（すなわち、Ｉ対λ）に対応し、もう一方のベクトルが、いわゆるフラグメンテーション質量スペクトル（すなわち、Ｉ対ｍ／ｚ）に対応する。図３には、［ＹＡ−Ｈ］+ペプチドの３つの最も豊富な配座異性体のＵＶ光吸収スペクトル（左側）（すなわち、Ｉ対λ）及び対応する質量スペクトル（すなわち、Ｉ対ｍ／ｚ）を示す実施例が示される。スペクトルは、後続の代替の分解の最小二乗（ＡＬＳ）最適化を用いる特異値分解（ＳＶＤ）を使用して、図２に示される２Ｄスペクトルから数学的に抽出された。他の数学的方法、例えば、非負行列因子分析がまた、使用されてもよい。ベクトルの対（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）の数は、存在する最も本質的な異性体（配座異性体）の数、すなわち、この場合では、３を与える。計算は、種Ｉと種ＩＩとの間の主な差が、ペプチド骨格に関する芳香環の配向と、環とＮ個の末端との間の距離であることを（図３の下部に）示す。種ＩＩＩは、種Ｉの構造を有するが、それは、環内に１つの13Ｃ同位体を含有する。
【００９０】
Ｉ（ｍ／ｚ）ベクトル（フラグメンテーション質量スペクトル）は、当分野において既知のＭＳアプローチを使用する、イオントラップ内に存在する前駆イオンの化学的構造の判断のために使用され得る。Ｉ（λ）ベクトル（光学スペクトル）は、構造上の判断のために、特に、イオントラップ内に存在するイオン配座異性体の計算された３Ｄ構造の検証のために使用され得る。高レベル計算が、候補３Ｄ構造のプールを生成し、各候補構造について、吸収スペクトルＩ（λ）（ＩＲ、ＵＶ、又はその両方）もまた計算される。次いで、これらの計算された候補スペクトルが、（ただ１つの分子のみが調査中である場合、配座異性体選択性である）分解された実験的スペクトル（ベクトルＩ（λ））と比較される。実験的スペクトルと計算されたスペクトルとの間の良好な一致が一旦達成されると、対応する計算された構造が、有効とみなされる。このアプローチは、特に、小さなペプチド、薬剤、及び代謝物に適している。
【００９１】
別の種類の実験では、わずかに構造上異なるもの、恐らく同じ又はほぼ同じｍ／ｚを有するイオン（例えば、同重ペプチド）の混合物が存在し得、それは、ＭＳ単独で同定するのが困難であり得る。推測された各候補イオンのための３Ｄデータが本発明に従って測定された場合、既知の候補３Ｄデータに基づいて、混合物の測定された３Ｄデータを分解して、混合物内のイオンの存在及び相対存在度を判断することが可能である。図４には、かかるイオンの同定がどのように機能し得るかが示される。一価同重ペプチドの混合物を調査した。（本発明の手段によって以前に取得された）既知の２Ｄスペクトルを有する５つの候補ペプチドのテストライブラリプールを参照のために使用した。これらの５つの参照２Ｄスペクトルが、図４（ａ）〜（ｅ）に示される。図４（ｆ）には、本発明の手段によって取得された混合物の２Ｄスペクトルが示される。スペクトルは、ｍ／ｚ及びＵＶ光子エネルギー（ｃｍ-1単位）の２つの軸を示し、信号強度は、適切な（図示される白黒画像には見えない）カラーマッピングによって示される。各２Ｄスペクトルについて、２つのパネルが、グラフの明瞭さのために示され、それは、吸収の始まりを含有する２つの波長領域に対応するが、また最も特異的な領域でもある。また、ｍ／ｚ＝７４４．２６９Ｄａ及びｍ／ｚ＝６６４．３０２Ｄａにおける２Ｄ指紋のうちのいくつかが示され、それらは、それぞれ、Ｔｙｒ及びｐＴｙｒにおけるＣα〜Ｃβ結合開裂（チロシン側鎖及びリン酸化チロシン側鎖の損失）に対応する。混合物の２Ｄスペクトルの最小二乗分析を使用して、混合物内の３つの構成要素の存在を正確に提言することが可能であった。
【００９２】
装置を通る及び質量分析計内のイオンビームの経路は、当分野において既知のような適切な真空条件下にあり、異なるレベルの真空が、分光計の異なる部分に適することが認識されるであろう。
【００９３】
本明細書に記載される非常に多くのパラメータ又は量、例えば、波長及びｍ／ｚなどが、代替の、ただし、慣習的に理解される用語で表現され得ることが認識されるであろう。例えば、本明細書において、波長は、同等の波数（ｃｍ-1）又はエネルギー（ｅＶ等）又は振動数として表現されてもよく、それゆえ、波長への言及は、波数、エネルギー、又は振動数への言及を含む。本明細書において、質量及び質量電荷比（ｍ／ｚ）という用語は、交換可能に使用される。その上、それらの用語は、質量又はｍ／ｚに関連する測定された量、例えば、ＦＴＭＳにおける振動数及びＴＯＦ質量分析法における時間を含む。
【００９４】
本発明の前述の実施形態に対する変形は、本発明の範囲内に依然としてある限り、行われ得ることが認識されるであろう。本明細書に開示される各特徴は、特に明記されない限り、同じ、同等、又は類似目的を果たす代替の特徴と交換されてもよい。それゆえ、特に明記されない限り、開示される各特徴は、包括的な一連の同等又は類似の特徴の単なる一例である。
【００９５】
本明細書において提供される任意の及び全ての例、又は例示的な言い回し（「例えば（ｆｏｒ  ｉｎｓｔａｎｃｅ）」、「例えば〜など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」、「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」、及び同様の言い回し）の使用は、単に、発明をより良く例示することを意図され、特に特許請求されない限り、本発明の範囲への限定を示すものではない。本明細書におけるどの言い回しも、本発明の実施に不可欠なものとして任意の特許請求されない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【００９６】
特許請求の範囲内を含む、本明細書において使用される際、特に文脈が示さない限り、本明細書における用語の単数形は、複数形を含むものとして解釈され、逆の場合も同様である。例えば、特に文脈が示さない限り、特許請求の範囲内を含む本明細書における単数形の指示語、例えば、「ａ」又は「ａｎ」などは、「１つ以上」を意味する。
【００９７】
本明細書の記載及び特許請求の範囲全体を通して、単語「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む」、「有する」、及び「含有する」、ならびにそれらの単語の変形、例えば、「備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」等は、「限定されるものではないが、〜を含む」を意味し、他の構成要素を排除することを意図されない（及び排除しない）。
【００９８】
本明細書に記載されるいかなるステップも、特に明記されない限り又は特に文脈が要求しない限り、任意の順序であるいは同時に行われてもよい。
【００９９】
本明細書に開示される特徴の全ては、かかる特徴及び／又はステップのうちの少なくともいくつかが相互排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わされてもよい。特に、本発明の好適な特徴は、本発明の全ての態様に適用可能であり、任意の組み合わせで使用されてもよい。同様に、本質的でない組み合わせで記載された特徴は、別個に（組み合わせではなくて）使用されてもよい。
以下に本発明の実施態様を記載する。
（実施態様１）分子を分析する方法であって、分析される分子の試料からイオンを発生させるステップと、発生されたイオンを周囲温度未満に冷却するステップと、１つ以上の所定のスペクトル間隔内の複数の異なる波長（λ）における光であって、前記光の波長が、前記複数の異なる波長にわたって走査される光で、前記イオンを照射することによって冷却されたイオンのうちの少なくともいくつかをフラグメント化するステップと、前記光の波長が走査されるのと並列して、前記複数の異なる波長（λ）のそれぞれについて所定の範囲のｍ／ｚ値にわたって、ｍ／ｚに対して検出された信号（Ｉ）を含む複数のフラグメント化されたイオンのフラグメント質量スペクトルを記録し、それによって、ｍ／ｚ及び照射波長（λ）に対する検出された信号（Ｉ）の二次元スペクトルを記録するステップと、記録された二次元スペクトルから、発生されたイオンのうちの少なくとも１つの正体及び／又は異なる発生されたイオンの相対存在度を判断して、それによって、前記分子のうちの少なくとも１つの正体及び／又は前記試料内の異なる分子の相対存在度を判断するステップと、を含む、方法。
（実施態様２）前記判断するステップが、検出された信号（Ｉ）の記録された二次元スペクトルを数学的に分析して、前記分子のうちの少なくとも１つを同定するステップ及び／又は前記試料内の異なる分子の相対存在度を判断するステップを含む、実施態様１に記載の方法。
（実施態様３）前記判断するステップが、前記試料内の異なる分子の相対存在度を同定及び／又は判断するために、既知の分子のフラグメント化されたイオンから取得されたｍ／ｚ及び照射波長（λ）について検出された信号（Ｉ）の二次元依存性のライブラリに対して、検出された信号（Ｉ）の記録された二次元スペクトルを比較するステップを含む、実施態様２に記載の方法。
（実施態様４）ｍ／ｚ及び照射波長（λ）に対する検出された信号（Ｉ）の記録されたスペクトルが、それによって、三次元データ配列を形成し、前記判断するステップが、前記三次元データ配列をベクトルの対に数学的に分解するステップを含み、各対が、前記試料内の異なる分子を表わし、各対の一方のベクトルがＩ対λのスペクトルに対応し、各対の他方のベクトルが前記分子のＩ対ｍ／ｚのスペクトルに対応する、実施態様２に記載の方法。
（実施態様５）前記ベクトルの対のうちの１つ以上を１つ以上の候補分子構造について計算された１つ以上の計算されたベクトルの対と比較するステップと、あるベクトルの対との比較から、前記試料内の分子の最も可能性が高い構造として、ある候補分子構造を選択するステップと、を更に含む、実施態様４に記載の方法。
（実施態様６）ｍ／ｚ及び照射波長（λ）に対する検出された信号（Ｉ）の記録されたスペクトルが、それによって、三次元データ配列を形成し、前記判断するステップが、前記データ配列の数学的分析の以下の方法、即ち、前記試料内の異なる分子の相対存在度を同定及び／又は判断するために、既知の分子のフラグメント化されたイオンのライブラリから取得された行列の１次結合に前記データ配列を分解するステップ、前記データ配列を１組の係数及びそれぞれのベクトルの対に分解するステップであって、各係数及びそれぞれのベクトルの対が、異なる分子実体を表わし、各対の一方のベクトルがＩ対λのスペクトル（吸収スペクトル）に対応し、各対の他方のベクトルがＩ対ｍ／ｚのスペクトル（フラグメンテーション質量スペクトル）に対応し、前記係数が前記実体の相対存在度に対応する、分解するステップ、のいずれかを含む、実施態様２に記載の方法。
（実施態様７）前記判断するステップが、それぞれの分子実体の最も可能性が高い構造を見付けるために、抽出された前記１つ以上の吸収スペクトル及び／又はフラグメンテーション質量スペクトルを、１つ以上の候補分子構造について計算された１つ以上の計算されたスペクトルと比較するステップを更に含む、実施態様６に記載の方法。
（実施態様８）前記分子の試料が、同時に分析にさらされる異なる異性体、任意選択的に配座異性体を含む１つ以上の分子実体を含む、実施態様１〜７のいずれかに記載の方法。
（実施態様９）イオンの正体を判断するステップが、イオンの化学式の同定、イオンの官能基（複数可）の同定、イオンの構造式の同定、イオンの三次元（３Ｄ）構造の同定、の任意のものを含む、実施態様１〜８のいずれかに記載の方法。
（実施態様１０）前記試料が、分子の異なる異性体を含み、異なる異性体から発生されたイオンのうちの少なくとも１つの正体を判断するステップが、イオンの最も固体数の多い異性体の数の同定とイオンの最も固体数の多い異性体のそれぞれの正体の判断と、を含む、実施態様１〜９のいずれかに記載の方法。
（実施態様１１）前記分子の試料が、分子の混合物であり、前記方法が、前記イオンを発生させる前に、前記試料を流れさせて、流れる試料を分離プロセスにさらして、それによって、流れにおける異なる分子が時間と共に分離され、流れにおける少なくとも１つの分子の濃度が、少なくとも１つの極大値を生成することを更に含む、実施態様１〜１０のいずれかに記載の方法。
（実施態様１２）前記分離プロセスが、液体又はガスクロマトグラフィであり、前記極大値が、クロマトグラフピークである、実施態様１１に記載の方法。
（実施態様１３）対象の各クロマトグラフピークについて、前記フラグメントイオンの質量分析が、複数の光の波長（λ）のそれぞれにおいて行われ、それによって、ｍ／ｚ及び照射波長（λ）に対する質量分析の検出された信号（Ｉ）の二次元スペクトルが、そのクロマトグラフピークについて記録される、実施態様１２に記載の方法。
（実施態様１４）ｍ／ｚ及び照射波長（λ）に対する検出された信号（Ｉ）の前記二次元依存性を記録する期間が、対象の分子についての前記極大値の全幅よりも長くない、実施態様１１〜１３のいずれかに記載の方法。
（実施態様１５）ｍ／ｚ及び照射波長（λ）に対する検出された信号（Ｉ）の前記二次元スペクトルを記録する期間が、（ａ）５秒よりも長くない、（ｂ）２秒よりも長くない、（ｃ）１秒よりも長くない、（ｄ）０．５秒よりも長くない、又は（ｅ）０．２秒よりも長くない、実施態様１１〜１４のいずれかに記載の方法。
（実施態様１６）イオンをフラグメント化するステップの前に、発生されたイオンの一部を選択するステップを更に含み、それによって、選択された一部のみが照射される、実施態様１〜１５のいずれかに記載の方法。
（実施態様１７）発生されたイオンの前記一部が、質量電荷比、もしくはイオン移動度、又は他の物理化学パラメータに従って選択される、実施態様１６に記載の方法。
（実施態様１８）イオンを冷却するステップが、極低温で前記イオンを冷却するステップを含む、実施態様１〜１７のいずれかに記載の方法。
（実施態様１９）前記複数の異なる波長にわたって前記光の波長が走査されることは、離散した所定のスペクトルステップで波長が変化されることを含み、前記所定のスペクトル間隔内の前記スペクトルステップの大きさが、（ｉ）前記スペクトル間隔にわたって同じ、又は（ｉｉ）前記スペクトル間隔にわたって変化する、実施態様１〜１８のいずれかに記載の方法。
（実施態様２０）前記１つ以上の所定のスペクトル間隔が、１つの連続的な所定のスペクトル間隔にわたり、又は２つ以上の不連続的なスペクトル間隔にわたる、実施態様１〜１９のいずれかに記載の方法。
（実施態様２１）前記複数の異なる波長（λ）にわたって前記光の波長が走査されることは、λの非連続値がサンプリングされること、又はλの既定の擬似ランダムシーケンスが使用されることを含む、実施態様１〜２０のいずれかに記載の方法。
（実施態様２２）イオンを照射することによってイオンをフラグメント化するステップが、前記イオンの直接的な光フラグメンテーション、あるいは前記イオンの光活性化の後の、バッファガスを用いる更なる照射及び／又は衝突，及び／又は電子移動解離（ＥＴＤ），及び／又は電子捕獲解離（ＥＣＤ）によって誘発されるフラグメンテーションを含む、実施態様１〜２１のいずれかに記載の方法。
（実施態様２３）前記イオンを照射することが、同じ波長又は異なる波長の光の１つ以上のパルスで前記イオンを照射することを含む実施態様１〜２２のいずれかに記載の方法。
（実施態様２４）前記イオンを照射することが、ＵＶ、可視、及び／又はＩＲ光、任意選択的に、ＵＶ、可視、及び／又はＩＲレーザ光で前記イオンを照射することを含む、実施態様２０に記載の方法。
（実施態様２５）前記イオンを照射することが、少なくともＵＶ光で前記イオンを照射することを含む、実施態様２０又は２１に記載の方法。
（実施態様２６）前記イオンを照射することが、少なくともＩＲ光で前記イオンを照射することを含む、実施態様２０又は１６に記載の方法。
（実施態様２７）前記イオンを照射することが、異なる波長の２つ以上の光源、任意選択的に２つ以上のレーザからの光で前記イオンを順次又は同時に照射することを含む、実施態様２０〜２３のいずれかに記載の方法。
（実施態様２８）一方の光源の波長が、イオンをフラグメント化するための固定波長であり、もう一方の光源が、前記イオンのフラグメンテーション収率を修正するために調整可能な波長を有する、実施態様２４に記載の方法。
（実施態様２９）前記イオンを照射することが、ＵＶ光及び調整可能なＩＲ光、特にＵＶレーザ光及び調整可能なＩＲレーザ光で、前記イオンを順次又は同時に照射することを含む、実施態様２５に記載の方法。
（実施態様３０）前記フラグメント質量スペクトルを記録することが、リニアイオントラップ質量分析計、環状トラップ質量分析計、ＦＴ−ＩＣＲ質量分析計、又はＴＯＦ質量分析計を使用して行われる、実施態様１〜２９のいずれかに記載の方法。
（実施態様３１）ＵＶ光及びＩＲ光を含む光で前記イオンを照射するステップを更に含み、前記光が、同位体で標識された分子の１つ以上の特定の分子結合を励起するように調整され、励起に起因する１つ以上のＩＲ吸収帯の検出が、前記分子の同定のために使用される、実施態様１〜３０のいずれかに記載の方法。
（実施態様３２）以下の特定の分子結合、即ち、ｉ．任意選択的に、2Ｄ、13Ｃ、15Ｎ、18Ｏ等、又は任意のそれらの組み合わせを含有する、同位体で標識された分子内の同位体標識への結合、ｉｉ．任意選択的に、ヒドロカルビル、ハロゲン、酸素、窒素、硫黄、リン、鉄、セレン含有基のうちの１つである、有機分子内の官能基又は部分への結合、ｉｉｉ．有機ポリマ内の官能基への結合であって、任意選択的に、前記基が、リン酸又はグリコシル基等であり、任意選択的に、前記分子が、ペプチド、又はタンパク質、又はＤＮＡ、又はＲＮＡ、又は修飾ペプチド、又は修飾タンパク質、又は修飾ＤＮＡ、又は修飾ＲＮＡであり、任意選択的に、前記修飾ペプチド又はタンパク質が、翻訳後修飾される、結合、ｉｖ．架橋ペプチド、又はタンパク質、又はそれらの複合体、又はＤＮＡ、又はＲＮＡ内のリンカーにおける結合であって、任意選択的に、前記結合がジスルフィド結合であるか、又は前記リンカーが、人為的に導入されるリンカーである、結合、ｖ．ペプチド、タンパク質、又はそれらの複合体内の非共有結合であって、任意選択的に、前記非共有結合が、水素結合であり、任意選択的に、前記複合体が、１つ以上の水分子を有する前記ペプチド又はタンパク質の複合体である、結合、のうちの１つ以上の励起に起因するＩＲ吸収帯の検出が、それぞれの単数又は複数の分子実体の同定のために使用され得る、実施態様１〜３１のいずれかに記載の方法。
（実施態様３３）前記方法の１つ以上の実験的条件が、前に取得されたデータに基づいて及び／又は１つ以上の所定の条件の実現後に選択される、実施態様１〜３２のいずれかに記載の方法。
（実施態様３４）記録された二次元スペクトルを、前駆イオンの総数又は質量分析計によって検出された総イオン電流に正規化するステップを更に含む、実施態様１〜３３のいずれかに記載の方法。
（実施態様３５）分子の試料を分析するための装置であって、分子からイオンを発生させるためのイオン発生器と、発生されたイオンを受け取るための前記イオン発生器の下流のイオントラップであって、周囲温度未満の温度に冷却されるように、かつ前記イオンを冷却するための周囲温度未満において凝縮しないガスを提供されるように構成されている、イオントラップと、１つ以上の所定のスペクトル間隔内の複数の異なる波長（λ）における光で冷却されたイオンを照射するための光源であって、前記光の波長が、使用中、前記複数の異なる波長にわたって走査され、前記イオンのフラグメンテーションを引き起こし、それによって、フラグメントイオンを形成し、前記光の波長が変動可能な、光源と、前記フラグメントイオンの質量分析のための質量分析計であって、質量分析が、複数のフラグメントイオンを並列に分析するように構成されている、質量分析計と、を備える装置。
（実施態様３６）前記装置がクロマトグラフ装置に接続され、前記試料が前記クロマトグラフ装置からの溶離液に含有される、実施態様３５に記載の装置。
（実施態様３７）前記光源及び質量分析計が、対象の各クロマトグラフピークについて、前記フラグメントイオンの質量分析が複数の光の波長（λ）のそれぞれにおいて行われるように動作するように構成されており、それによって、クロマトグラフピークについて、ｍ／ｚ及び照射波長（λ）に対する前記質量分析計の検出された信号（Ｉ）の二次元スペクトルが記録されることが可能である、実施態様３５又は３６に記載の装置。
（実施態様３８）前記イオン発生器が大気圧イオン化源である、実施態様３５〜３７のいずれかに記載の装置。
（実施態様３９）前記光源が、前記イオンを照射するために、ＵＶ、可視、又はＩＲ光のうちの１つ以上の源、任意選択的にレーザ光源を備える、実施態様３５〜３７のいずれかに記載の装置。
（実施態様４０）前記光源のうちの少なくとも１つが、前記イオンのフラグメンテーションを引き起こすように構成されている、実施態様３９に記載の装置。
（実施態様４１）前記光源のうちの少なくとも１つが調整可能である、実施態様３９又は４０に記載の装置。
（実施態様４２）前記光源が、前記イオンを照射するための２つ以上の光源を含み、前記２つ以上の光源が、前記イオンのフラグメンテーションを引き起こすための第１の光源と、前記第１の光源によって引き起こされた前記フラグメンテーションを修正するための別の光源と、を含む、実施態様３９〜４１のいずれかに記載の装置。
（実施態様４３）前記光源が、ＵＶ光源及びＩＲ光源を含み、それらの光源のうちの少なくとも１つが調整可能である、実施態様３９〜４２のいずれかに記載の装置。
（実施態様４４）前記装置が、前記光源から前記イオントラップの中に前記光を透過させるための少なくとも１つの光学窓を備える実施態様３５〜４３のいずれかに記載の装置。
（実施態様４５）前記イオントラップが、少なくとも１つのＲＦ専用多重極又は少なくとも１つの静電イオン屈曲デバイスを備えるイオン光学器経由で、前記質量分析計及び／又は前記イオン発生器に連結され、前記ＲＦ専用多重極又は静電イオン屈曲デバイスが、前記イオントラップ内にトラップされるイオンと、前記ＲＦ専用多重極又は静電イオン屈曲デバイスからの出口との間に真っ直ぐな照準線が存在しないように曲げられている、実施態様３５〜４４のいずれかに記載の装置。
（実施態様４６）前記少なくとも１つのＲＦ専用多重極又は少なくとも１つの静電イオン屈曲デバイスは、前記ＲＦ専用多重極又は静電イオン屈曲デバイスを通して前記光源が前記イオントラップを自由に照射可能とする、実施態様４５に記載の装置。
（実施態様４７）前記イオントラップが、前記ＲＦ専用多重極の下流のイオン光路の終端部に位置する、実施態様４５又は４６に記載の装置。
（実施態様４８）前記イオントラップが、リニアＲＦ多重極トラップ、３Ｄ  ＲＦ四重極トラップ、又はリング電極ＲＦトラップのうちの１つである、実施態様３５〜４７のいずれかに記載の装置。
（実施態様４９）前記イオンの物理化学特性に基づいて発生されたイオンを選択するためのデバイスを前記イオン発生器の下流に更に備え、前記デバイスが、前記イオントラップの上流に位置し、任意選択的に、前記デバイスが、イオン移動度分離デバイス、ＦＡＩＭＳデバイス、及び質量選択器から選択されている、実施態様３５〜４８のいずれかに記載の装置。
（実施態様５０）発生されたイオンを質量選択するための多重極質量フィルタを前記イオン発生器の下流に更に備え、前記質量フィルタが、前記イオントラップの上流に位置する、実施態様４９に記載の装置。
（実施態様５１）光による照射によって光活性化されたイオンを受け取るための衝突セルを更に備え、前記衝突セルは、バッファガスが提供され、前記バッファガスとのイオンの衝突によって前記フラグメンテーションの収率を増大させるように構成されている、実施態様３５〜５０のいずれかに記載の装置。
（実施態様５２）前記質量分析計が、リニアイオントラップ質量分析計、環状トラップ質量分析計、ＦＴ−ＩＣＲ質量分析計、又はＴＯＦ質量分析計のうちの１つである、実施態様３５〜５１のいずれかに記載の装置。
（実施態様５３）複数の光の異なる波長（λ）のそれぞれについてある所定の範囲のｍ／ｚ値にわたって、ｍ／ｚに対して検出された信号（Ｉ）を含む、前記質量分析からのフラグメント質量スペクトルを記録し、それによって、ｍ／ｚ及び照射波長（λ）に対する検出された信号（Ｉ）の二次元依存性を記録する、データ取得システムを更に備える、実施態様３５〜５２のいずれかに記載の装置。
（実施態様５４）前記データ取得システムが、ｍ／ｚ及び照射波長（λ）に対する検出された信号（Ｉ）の二次元スペクトルから、前記分子のうちの少なくとも１つの正体及び／又は前記試料内の異なる分子の相対存在度を判断する、実施態様５３に記載の装置。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４（ａ）】
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【図４（ｂ）】
0006445154.tif 000006
【図４（ｃ）】
0006445154.tif 000007
【図４（ｄ）】
0006445154.tif 000008
【図４（ｅ）】
0006445154.tif 000009
【図４（ｆ）】
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