(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列がそれぞれ、配列番号１０及び配列番号２；配列番号１１及び配列番号２、或いは、配列番号１２及び配列番号２である、抗ＨＥＲ２完全ヒト抗体。
【請求項２】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はｓｃＦｖの形態である、請求項１に記載の抗ＨＥＲ２完全ヒト抗体。
【請求項３】
ヒトＩｇＧの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含み；好ましくは、ヒトＩｇＧがＩｇＧ１であり、より好ましくは、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域のアミノ酸配列が配列番号５であり、ヒトＩｇＧ軽鎖定常領域のアミノ酸配列が配列番号６である、請求項１に記載の抗ＨＥＲ２完全ヒト抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ＨＥＲ２完全ヒト抗体をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチドであって、好ましくは、前記ヌクレオチド配列において、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５であり、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が配列番号４である、ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のヌクレオチドを含む発現ベクターであって、前記ヌクレオチド配列が前記発現ベクターの発現制御配列に作動可能に連結しており；好ましくは、前記発現ベクターはｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔベクター又は２９３ベクターである、発現ベクター。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ＨＥＲ２完全ヒト抗体及び医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ＨＥＲ２完全ヒト抗体及び１つ又は複数の付加的なＨＥＲ２陽性腫瘍治療剤を含み、前記１つ又は複数の付加的なＨＥＲ２陽性腫瘍治療剤がハーセプチン又はペルツズマブである、組み合わせ薬剤。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ＨＥＲ２完全ヒト抗体を含む、ヒトＨＥＲ２を検出するためのキット。
【請求項９】
対象のＨＥＲ２陽性腫瘍、弱陽性腫瘍又は陰性腫瘍を治療するための薬剤の調製における、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ＨＥＲ２完全ヒト抗体の使用であって、好ましくは、前記ＨＥＲ２陽性腫瘍が、ＨＥＲ２陽性の乳がん、胃がん、肺がん、肺非小細胞がん、骨のがん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚又は眼内メラノーマ、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門がん、大腸がん、卵管がん、子宮体がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織のがん、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿道がん、腎細胞がん、腎盂がん、中皮腫、肝細胞がん、胆嚢がん、慢性又は急性白血病、リンパ細胞リンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）がん、脊髄腫瘍、脳幹の神経膠腫、多形性神経膠芽細胞腫、星細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌及び下垂体腺腫から選択される、使用。
【請求項１０】
対象がＨＥＲ２陽性腫瘍、弱陽性腫瘍又は陰性腫瘍を有するヒトである、請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体技術の分野に関する。特に、本発明は抗ＨＥＲ２完全ヒト抗体の突然変異体抗体及びそれをコードする遺伝子及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳がんは世界的に最も一般的な女性における悪性腫瘍である。ＨＥＲファミリーは通常の乳腺の成長と発達を調節し、ＨＥＲ２の過剰発現は乳がんに関連する。ハーセプチンの商品名を持つトラツズマブは、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）陽性転移性乳がんの治療に使用される最初のヒト化モノクローナル抗体薬剤である。ハーセプチンはＨＥＲ２陽性の悪性腫瘍に対する標準的治療レジメンとなっているが、患者の４０％はこの薬剤に非応答性のままである。また、抗ＨＥＲ２治療アプローチにおける一般的な深刻な問題として、薬剤耐性が発生している。成長因子の冗長性や細胞内シグナル伝達経路間の干渉は、乳がん患者における薬剤耐性を促進させる主な理由と考えられている。ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と共にジェネンテック社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；アメリカ合衆国）により最近、開発されたペルツズマブは、新規の抗ＨＥＲ２ヒト化抗体である。ハーセプチンとは異なり、ペルツズマブはＨＥＲ２受容体の細胞外領域ＩＩに位置する抗原エピトープを標的としている。臨床実験研究の結果、ペルツズマブ単体の使用により弱い抗腫瘍治療効果が得られることが示された。しかしながら、ペルツズマブをハーセプチンと組み合わせて使用すると、それらの効果のメカニズムを相補することによりＨＥＲシグナル伝達をより完全に遮断することができ、腫瘍細胞の成長がより効果的に阻害されるという結果が得られることが、研究により示されている。
【０００３】
タンパク質のグリコシル化修飾は、小胞体内で特定の多糖鎖がタンパク質に付加されることによりオリゴ糖鎖を形成するプロセスである。タンパク質のグリコシル化は、部位特異的であり、酵素により方向付けされる（ｅｎｚｙｍｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）。タンパク質部分への連結の様式に依存して、タンパク質のグリコシル化修飾はＯ−連結又はＮ−連結であってもよく、保存的なＮ−グリコシル化部位はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ  ／Ｓｅｒであり、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である。ヒトＩｇＧの重鎖のＦｃセグメント中のＣＨ２領域内には保存的なＮ−連結グリコシル化部位Ａｓｎ２９７がある。Ｆｃ多糖鎖は、治療抗体の臨床特性の制御と同様に、抗体の様々な受容体への最適な結合と、抗体による効果的な病原体の除去に必須である。ヒトＩｇＧ  ＦａｂのＮ−グリコシル化修飾は、抗体の抗原への結合の機能についての明確な促進又は阻害効果を有し得る。グリコシル化修飾が起きる位置の軽度の変化は、続く多糖鎖のプロセシング及び抗体の抗原への結合活性について、完全に異なる効果を生じ得る。
【０００４】
本出願人は以前、抗−ヒトＨＥＲ２（Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ）完全ヒトモノクローナル抗体ＧＢ２３５−０１９を完全ヒトｓｃＦＶファージライブラリースクリーニング技術及び遺伝子操作組み換え発現技術を用いて取得した（中国特許出願第２０１４１０７０５４０４．０号に参照することができる）。そのモノクローナル抗体は、輸血反応及び免疫原性を減少させ、薬物安全性を向上させ、より良い薬物動態プロファイルを示す。さらに、ＧＢ２３５−０１９は、ＨＥＲ２陽性腫瘍を治療するために他のＨＥＲ２陽性腫瘍治療剤と組み合わせて使用することができる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、突然変異体抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列がそれぞれ、配列番号１０及び配列番号２；配列番号１１及び配列番号２、或いは、配列番号１２及び配列番号２である、抗ＨＥＲ２完全ヒト抗体ＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体を提供する。
【０００６】
ある実施態様において、本発明の抗ＨＥＲ２完全ヒト抗体ＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はｓｃＦｖの形態である。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はｓｃＦｖは当該分野において一般的に知られている意味を有する。
【０００７】
ある実施態様において、上述の本発明の抗ＨＥＲ２完全ヒト抗体ＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体は、ヒトＩｇＧの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含んでいてもよい。特定の実施態様において、ヒトＩｇＧはＩｇＧ１である。特定の実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域のアミノ酸配列は配列番号５であり、ヒトＩｇＧ軽鎖定常領域のアミノ酸配列は配列番号６である。
【０００８】
本発明は、本発明の抗ＨＥＲ２完全ヒト抗体ＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体をコードするヌクレオチド配列を提供する。
【０００９】
特定の実施態様において、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号１３であり、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号１４であり、配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号１５であり、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号４である。
【００１０】
特定の実施態様において、本発明の抗ＨＥＲ２完全ヒト抗体ＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体は完全長の抗体であり、本発明のヌクレオチド配列において、重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号７であり、軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号８である。
【００１１】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列が発現ベクターの発現調節配列に作動可能に連結した発現ベクターを提供する。特定の実施態様において、発現ベクターはｐＧＥＭ−Ｔベクター又は２９３ベクターである。
【００１２】
本発明は、本発明の発現ベクターを含む細胞を提供する。その細胞は原核生物又は真核生物のどちらであってもよい。特定の実施態様において、細胞は、フリースタイル２９３Ｆ細胞（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ  ｃｅｌｌｓ）のような哺乳類細胞であってもよい。
【００１３】
本発明は、本発明の抗ＨＥＲ２完全ヒト抗体ＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、本発明の抗ＨＥＲ２完全ヒト抗体ＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体並びに（１つ又は複数の）付加的なＨＥＲ２陽性腫瘍治療剤を含む、組み合わせ薬剤を提供する。ここで（１つ又は複数の）ＨＥＲ２陽性腫瘍治療剤は、ハーセプチン及び／又はペルツズマブである。組み合わせ薬剤は下記の量で対象に投与することができる：０．００１から５００ｍｇ／ｋｇのＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体＋０．００１から５００ｍｇ／ｋｇのハーセプチン及び／又はペルツズマブ；０．００１から３００ｍｇ／ｋｇのＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体＋０．００１から３００ｍｇ／ｋｇのハーセプチン及び／又はペルツズマブ；０．００１から２００ｍｇ／ｋｇのＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体＋０．００１から２００ｍｇ／ｋｇのハーセプチン及び／又はペルツズマブ；０．０１から２００ｍｇ／ｋｇのＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体＋０．０１から２００ｍｇ／ｋｇのハーセプチン及び／又はペルツズマブ；０．０１から１００ｍｇ／ｋｇのＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体＋０．０１から１００ｍｇ／ｋｇのハーセプチン及び／又はペルツズマブ；０．１から９０ｍｇ／ｋｇのＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体＋０．１から９０ｍｇ／ｋｇのハーセプチン及び／又はペルツズマブ；０．１から７０ｍｇ／ｋｇのＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体＋０．１から７０ｍｇ／ｋｇのハーセプチン及び／又はペルツズマブ；０．１から６０ｍｇ／ｋｇのＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体＋０．１から６０ｍｇ／ｋｇのハーセプチン及び／又はペルツズマブ；０．１から５０ｍｇ／ｋｇのＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体＋０．１から５０ｍｇ／ｋｇのハーセプチン及び／又はペルツズマブ；０．１から４０ｍｇ／ｋｇのＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体＋０．１から４０ｍｇ／ｋｇのハーセプチン及び／又はペルツズマブ；１から４０ｍｇ／ｋｇのＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体＋１から４０ｍｇ／ｋｇのハーセプチン及び／又はペルツズマブ。本発明の抗ＨＥＲ２完全ヒト抗体ＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体は、（１つ又は複数の）付加的なＨＥＲ２陽性腫瘍治療剤と共に、別途又は同時に対象に投与することができる。投与ルートは抗体についての技術分野で一般的に使用されるものであってよい。
【００１５】
本発明は本発明の抗ＨＥＲ２完全ヒト抗体ＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体を含むキットを提供する。キットはサンプル中のＨＥＲ２タンパク質を検出することに使用できる。キットは、当該分野におけるＨＥＲ２を検出するためのキットにおいて一般的に使用される付加的な構成要素をさらに含んでいてもよい。
【００１６】
本発明は、対象のＨＥＲ２陽性腫瘍、弱陽性腫瘍又は陰性腫瘍を治療するために有用な薬剤の調製のための、本発明の抗ＨＥＲ２完全ヒト抗体ＧＢ２３５−０１９の突然変異体抗体の使用を提供する。
【００１７】
「ＨＥＲ２陽性腫瘍」の語句は、ＩＨＣ（免疫組織化学）アッセイの結果がスリープラスサイン（＋＋＋）である場合、すなわち、細胞質膜内で３０％を超える腫瘍細胞が完全及び強く染色することを示す場合には、ＨＥＲ２陽性が示され；結果がツープラスサイン（＋＋）である場合、すなわち、細胞質膜内で少なくとも１０％の腫瘍細胞が弱から中程度に完全染色を示す場合には、ＦＩＳＨ（蛍光インサイツハイブリダイゼーション法）又はＣＩＳＨ（発色インサイツハイブリダイゼーション法）アッセイがさらに実行され、その結果が陽性（遺伝子増幅が起きた）である場合には、ＨＥＲ２陽性と診断され得ることを意味する。好ましくは、ＨＥＲ２陽性腫瘍のアッセイ結果は、中国食品医薬品庁の認定を受けた検出キット（ＩＨＣ、ＦＩＳＨ又はＣＩＳＨアッセイキット）を用いて得られた結果である。腫瘍がＨＥＲ２陽性腫瘍であるか否かを決定する方法は現役の医師の間でよく知られている。
【００１８】
「ＨＥＲ２弱陽性腫瘍」の語句は、ＩＨＣアッセイの結果がツープラスサイン（＋＋）である場合、すなわち、細胞質膜内で少なくとも１０％の腫瘍細胞が弱から中程度に完全染色を示した場合に、ＦＩＳＨ又はＣＩＳＨアッセイがさらに実行され、遺伝子増幅が起きなかった場合、ＨＥＲ２弱陽性が示されることを意味する。対応して、「ＨＥＲ２陰性腫瘍」とは、ＩＨＣアッセイの結果がワンプラスサイン（＋）又はゼロである場合に、ＨＥＲ２陰性が示されることを意味する。
【００１９】
ＨＥＲ２陽性腫瘍は、ＨＥＲ２陽性の乳がん、胃がん、肺がん、肺非小細胞がん、骨のがん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚又は眼内メラノーマ、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門がん、大腸がん、卵管がん、子宮体がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織のがん、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿道がん、腎細胞がん、腎盂がん、中皮腫、肝細胞がん、胆嚢がん、慢性又は急性白血病、リンパ細胞リンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）がん、脊髄腫瘍、脳幹の神経膠腫、多形性神経膠芽細胞腫、星細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌及び下垂体腺腫から選択され得る。
【００２０】
好ましくは、対象はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図１Ａは組み換え全長抗ヒトＨＥＲ２抗体ＧＢ２３５−０１９の重鎖発現ベクター（２９３−ＶＨ−ＣＨ）の構造の図を示し；図１Ｂは組み換え全長抗ヒトＨＥＲ２抗体ＧＢ２３５−０１９の軽鎖発現ベクター（２９３−ＶＬ−ＣＬ）の構造の図を示す図である。５’末端ＥｃｏＲ  Ｉ制限部位を含むシグナルペプチド遺伝子断片、重鎖可変領域（ＶＨ）遺伝子断片及びＴＧＡ転写終結コドン及び３’末端ＢａｍＨ  Ｉ制限部位を含む重鎖定常領域（ＣＨ）遺伝子断片を、それぞれ、対応するテンプレート及びプライマーを用いたＰＣＲ法により得て（詳細は実施例５を参照のこと）、その３つの断片をオーバーラッピングＰＣＲ法により連結し、ＧＢ２３５−０１９抗体の重鎖全長遺伝子断片を得た。同じアプローチにより、シグナルペプチド、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む、ＧＢ２３５−０１９抗体の軽鎖全長遺伝子断片を得た。重鎖全長遺伝子断片及び軽鎖全長遺伝子断片はＥｃｏＲ  Ｉ及びＢａｍＨ  Ｉを用いた制限酵素切断処理により形成させた付着末端を用いてｐＧＥＭ−Ｔベクターにそれぞれクローニングした。
【図１Ｂ】図１Ａは組み換え全長抗ヒトＨＥＲ２抗体ＧＢ２３５−０１９の重鎖発現ベクター（２９３−ＶＨ−ＣＨ）の構造の図を示す図であり、図１Ｂは組み換え全長抗ヒトＨＥＲ２抗体ＧＢ２３５−０１９の軽鎖発現ベクター（２９３−ＶＬ−ＣＬ）の構造の図を示す図である。５’末端ＥｃｏＲ  Ｉ制限部位を含むシグナルペプチド遺伝子断片、重鎖可変領域（ＶＨ）遺伝子断片及びＴＧＡ転写終結コドン及び３’末端ＢａｍＨ  Ｉ制限部位を含む重鎖定常領域（ＣＨ）遺伝子断片を、それぞれ、対応するテンプレート及びプライマーを用いたＰＣＲ法により得て（詳細は実施例５を参照のこと）、その３つの断片をオーバーラッピングＰＣＲ法により連結し、ＧＢ２３５−０１９抗体の重鎖全長遺伝子断片を得た。同じアプローチにより、シグナルペプチド、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む、ＧＢ２３５−０１９抗体の軽鎖全長遺伝子断片を得た。重鎖全長遺伝子断片及び軽鎖全長遺伝子断片はＥｃｏＲ  Ｉ及びＢａｍＨ  Ｉを用いた制限酵素切断処理により形成させた付着末端を用いてｐＧＥＭ−Ｔベクターにそれぞれクローニングした。
【図２】図２は、組み換え全長抗ヒトＨＥＲ２抗体ＧＢ２３５−０１９のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の写真を示す図である。精製したＧＢ２３５−０１９及びハーセプチン対照サンプルを５０ｍＭジチオスレイトールの還元条件下における１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。その結果、ＧＢ２３５−０１９抗体及びハーセプチン抗体の両方は、それぞれ抗体の重鎖及び軽鎖である分子量５０ＫＤａ及び２５ＫＤａを有する２つのバンドを示した。
【図３Ａ】図３Ａ及び図３ＢはＧＢ２３５−０１９の還元分子量の解析結果を示す図である。ＧＢ２３５−０１９抗体はジチオスレイトールの還元条件下においてウォーターズ  Ｈ−クラス・バイオ超高速液体クロマトグラフ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ  ｕｌｔｒａ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）により解析し、質量分析計からのオリジナルシグナルはＰＲＯＭＡＳＳソフトウェアを用いてデコンヴォリューションを行い、対応する測定分子量を得た。重鎖（Ｇ０Ｆグリカン型を含むＦｃ）の理論的分子量を、ＧＰＭＡＷ６．０ソフトウェアを用いて計算すると５０４１６．７Ｄａであり、軽鎖の理論的分子量は２３１２０．８Ｄａであった。図３Ａの結果は、ＧＢ２３５−０１９抗体の軽鎖の測定分子量は理論的分子量と一致していることを示しており、軽鎖にグリコシル化が起きていないことを意味している。図３Ｂの結果は、ＧＢ２３５−０１９抗体の重鎖の測定分子量は理論的分子量と大きく異なっている（＞１５００Ｄａ）ことを示している。理論的配列と並べることにより、Ｆｃ領域に加えてＦａｂフレームワーク領域もまた、理論的Ｎ−グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）を有することが見出された。
【図３Ｂ】図３Ａ及び図３ＢはＧＢ２３５−０１９の還元分子量の解析結果を示す図である。ＧＢ２３５−０１９抗体はジチオスレイトールの還元条件下においてウォーターズ  Ｈ−クラス・バイオ超高速液体クロマトグラフ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ  ｕｌｔｒａ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）により解析し、質量分析計からのオリジナルシグナルはＰＲＯＭＡＳＳソフトウェアを用いてデコンヴォリューションを行い、対応する測定分子量を得た。重鎖（Ｇ０Ｆグリカン型を含むＦｃ）の理論的分子量を、ＧＰＭＡＷ６．０ソフトウェアを用いて計算すると５０４１６．７Ｄａであり、軽鎖の理論的分子量は２３１２０．８Ｄａであった。図３Ａの結果は、ＧＢ２３５−０１９抗体の軽鎖の測定分子量は理論的分子量と一致していることを示しており、軽鎖にグリコシル化が起きていないことを意味している。図３Ｂの結果は、ＧＢ２３５−０１９抗体の重鎖の測定分子量は理論的分子量と大きく異なっている（＞１５００Ｄａ）ことを示している。理論的配列と並べることにより、Ｆｃ領域に加えてＦａｂフレームワーク領域もまた、理論的Ｎ−グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）を有することが見出された。
【図４】図４はＧＢ２３５−０１９突然変異体抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の写真を示す図である。精製した突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａ並びにハーセプチン対照サンプルを５０ｍＭジチオスレイトールの還元条件下における１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。その結果、ＧＢ２３５−０１９突然変異体抗体及びハーセプチン抗体の全ては、それぞれ抗体の重鎖及び軽鎖である分子量５０ＫＤａ及び２５ＫＤａを有する２つのバンドを示した。
【図５Ａ】図５Ａ、図５Ｂ及び図５ＣはＧＢ２３５−０１９突然変異体抗体の還元分子量の解析結果を示す図である。突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａはジチオスレイトールの還元条件下においてウォーターズ  Ｈ−クラス・バイオ超高速液体クロマトグラフにより解析し、質量分析計により検出されたオリジナルシグナルはＰＲＯＭＡＳＳソフトウェアを用いてデコンヴォリューションを行い、対応する測定分子量を得た。重鎖（Ｇ０Ｆグリカン型を含むＦｃ）の理論的分子量を、ＧＰＭＡＷ６．０ソフトウェアを用いて計算すると５０４１６．７Ｄａであった。図５Ａは、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ突然変異体抗体の重鎖の測定分子量は理論的分子量と一致していることを示しており、重鎖にはグリコシル化が起きていないことを意味している。図５Ｂ及び図５Ｃは、突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの重鎖の測定分子量は理論的分子量ととても良く一致している（１Ｄａ未満の差異）ことを示しており、Ｆａｂフレームワーク領域内のＮ−グリコシル化部位が取り除かれたことを意味している。
【図５Ｂ】図５Ａ、図５Ｂ及び図５ＣはＧＢ２３５−０１９突然変異体抗体の還元分子量の解析結果を示す図である。突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａはジチオスレイトールの還元条件下においてウォーターズ  Ｈ−クラス・バイオ超高速液体クロマトグラフにより解析し、質量分析計により検出されたオリジナルシグナルはＰＲＯＭＡＳＳソフトウェアを用いてデコンヴォリューションを行い、対応する測定分子量を得た。重鎖（Ｇ０Ｆグリカン型を含むＦｃ）の理論的分子量を、ＧＰＭＡＷ６．０ソフトウェアを用いて計算すると５０４１６．７Ｄａであった。図５Ａは、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ突然変異体抗体の重鎖の測定分子量は理論的分子量と一致していることを示しており、重鎖にはグリコシル化が起きていないことを意味している。図５Ｂ及び図５Ｃは、突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの重鎖の測定分子量は理論的分子量ととても良く一致している（１Ｄａ未満の差異）ことを示しており、Ｆａｂフレームワーク領域内のＮ−グリコシル化部位が取り除かれたことを意味している。
【図５Ｃ】図５Ａ、図５Ｂ及び図５ＣはＧＢ２３５−０１９突然変異体抗体の還元分子量の解析結果を示す図である。突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａはジチオスレイトールの還元条件下においてウォーターズ  Ｈ−クラス・バイオ超高速液体クロマトグラフにより解析し、質量分析計により検出されたオリジナルシグナルはＰＲＯＭＡＳＳソフトウェアを用いてデコンヴォリューションを行い、対応する測定分子量を得た。重鎖（Ｇ０Ｆグリカン型を含むＦｃ）の理論的分子量を、ＧＰＭＡＷ６．０ソフトウェアを用いて計算すると５０４１６．７Ｄａであった。図５Ａは、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ突然変異体抗体の重鎖の測定分子量は理論的分子量と一致していることを示しており、重鎖にはグリコシル化が起きていないことを意味している。図５Ｂ及び図５Ｃは、突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの重鎖の測定分子量は理論的分子量ととても良く一致している（１Ｄａ未満の差異）ことを示しており、Ｆａｂフレームワーク領域内のＮ−グリコシル化部位が取り除かれたことを意味している。
【図６】図６は組み換え全長抗ヒトＨＥＲ２  ＧＢ２３５−０１９突然変異体抗体のヒトＨＥＲ２抗原との結合を示す図である。ＥＬＩＳＡプレートをヒトＨＥＲ２抗原でコートし、さまざまな濃度のＧＢ２３５−０１９ＷＴ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａ抗体並びにハーセプチン及びペルツズマブをプレート上にコートした抗原分子と結合させ、結合抗体はＨＲＰ標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体を用いて検出した。図６の結果は、突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａと同様にＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体がヒトＨＥＲ２抗原に特異的に結合する能力を有することを示している。
【図７Ａ】図７Ａは、組み換え全長抗ヒトＨＥＲ２  ＧＢ２３５−０１９突然変異体抗体のＢＴ−４７４細胞の増殖におけるイン・ビトロ阻害効果を示す図である。高レベルのＰ−ＨＥＲ２を発現するＨＥＲ２陽性ＢＴ−４７４乳がん細胞は、６日間、ヘレグリン−αを補填した完全培地中でインキュベーションした。細胞はハーセプチンと同様に、ＧＢ２３５−０１９ＷＴ並びに別途に投与したＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａを含む突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体で、各々単独にさまざまな濃度で処理した。細胞生存率はアラマーブルーを用いて決定した。完全培地内のヘレグリン−αの添加はＢＴ−４７４細胞の増殖を誘導したという結果を示した。ＢＴ−４７４細胞は別途に投与されたハーセプチンに抵抗性となり、ＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体及び別途に投与された突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの効果は、各々単独に使用された場合に顕著ではなかった。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＢＴ−４７４細胞内におけるヘレグリン−α誘導性のハーセプチンへの抵抗性が組み換え全長抗ヒトＨＥＲ２抗体により反転されたことを示すイン・ビトロ実験結果を示す図である。高レベルのＰ−ＨＥＲ２を発現するＨＥＲ２陽性ＢＴ−４７４乳がん細胞は、６日間、ヘレグリン−αを補填した完全培地中でインキュベーションした。細胞はその後、ＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体並びにＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａを含む突然変異体抗体の各々ハーセプチンと組み合わせた組み合わせ投与により処理した。細胞生存率はアラマーブルーを用いて決定した。完全培地内のヘレグリン−αの添加はＢＴ−４７４細胞の増殖を誘導したという結果を示した。ＢＴ−４７４細胞は別途に投与されたハーセプチンに抵抗性となり、ＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体並びに突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの各々とハーセプチンと組み合わせての組み合わせ投与は、ヘレグリン−α誘導性増殖を、ヘレグリン−α誘導の前のものよりも低いレベルにまで、濃度依存的に著しく減少するように阻害した。突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５ＡはＧＢ２３５−０１９ＷＴのものと等価な効果を有していた。
【図８】図８は乳がん細胞株ＢＴ−４７４における組み換え全長抗ヒトＨＥＲ２抗体のシグナル伝達に対する阻害効果を示す図である。Ｐ−ＨＥＲ２を高発現するＨＥＲ２陽性ＢＴ−４７４乳がん細胞を、０．１％ウシ胎仔血清培地内の飢餓培養に２４時間供した。その後、ＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体及びＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ突然変異体抗体の各々の２０μｇ／ｍｌを加え、２０μｇ／ｍｌのハーセプチン及び２０μｇ／ｍｌのペルツズマブを別途に投与した。ＢＴ−４７４細胞をそれらの抗体で６時間処置した後、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのヘレグリン−αを加え、１０分間誘導し、その時間でサンプルを取得した。細胞可溶化物をイムノブロッティングに供し、ＨＥＲ３、Ａｋｔ及びＥＲＫの全体及びそのリン酸化物をそれぞれ対応する抗体を用いて検出した。図８の結果は、ヘレグリン−α未添加の対照群と比較すると、ヘレグリン−αはＢＴ−４７４細胞内においてＨＥＲ３リン酸化の上方制御を引き起こすことを示している。別途に投与したＧＢ２３５−０１９ＷＴ及びＧＢ２３５−０１９Ｎ７３ＤはＢＴ−４７４細胞内のヘレグリン−α誘導性のＨＥＲ３リン酸化の上方制御を顕著に阻害し、ヘレグリン−αによって誘導されたＨＥＲ３リン酸化の上方制御を完全に反転させた。ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ突然変異体抗体の効果はＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体のものと同様であった。ペルツズマブもまたヘレグリン−αによって誘導されたＢＴ−４７４細胞内におけるＨＥＲ３リン酸化の上方制御を完全に阻害した。ヘレグリン−αによって誘導されたＢＴ−４７４細胞内のＨＥＲ３リン酸化の上方制御についてのハーセプチンの阻害効果もまた顕著である。また、別途に投与したＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体及びＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ突然変異体抗体はヘレグリン−αによって誘導されたＡｋｔリン酸化の上方制御を阻害しなかった一方で、ペルツズマブはヘレグリン−αによってそのように誘導されたＡｋｔリン酸化の上方制御を顕著に阻害した。別途に投与したＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ突然変異体抗体及びＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体はヘレグリン−αによって誘導されたＥＲＫ１／２リン酸化の上方制御を顕著に阻害した。ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ突然変異体抗体の効果はＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体のものと同様である。
【図９】図９は、乳がんＭＣＦ７細胞シグナル伝達における組み換え全長抗ヒトＨＥＲ２抗体の阻害効果を示す図である。低レベルのＨＥＲ２及び高レベルのＨＥＲ３を発現するが、Ｐ−ＨＥＲ２及びＰ−ＨＥＲ３を発現しないＨＥＲ２陰性ＭＣＦ７乳がん細胞は、０．１％ウシ胎仔血清培地内で２４時間、飢餓培養に供した。その後、ＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体及び突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの各々の２０μｇ／ｍｌを加え、２０μｇ／ｍｌのハーセプチン及び２０μｇ／ｍｌのペルツズマブを別途に投与した。ＭＣＦ７細胞をそれらの抗体で６時間処置した後、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのヘレグリン−αを加え、１０分間誘導し、その時間でサンプルを取得した。細胞可溶化物をイムノブロッティングに供し、ＨＥＲ３、Ａｋｔ及びＥＲＫの全体及びそのリン酸化物をそれぞれ対応する抗体を用いて検出した。図９の結果は、ヘレグリン−αを加えない対照群と比較して、ヘレグリン−αはＭＣＦ７細胞内においてＨＥＲ３リン酸化の上方制御を誘導することを示している。別途に投与したＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体並びに突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａはヘレグリン−αにより誘導されたＭＣＦ７細胞におけるＨＥＲ３リン酸化の上方制御を顕著に阻害した。別途に投与したハーセプチン及びペルツズマブもまたヘレグリン−αにより誘導されたＭＣＦ７細胞におけるＨＥＲ３リン酸化の上方制御を顕著に阻害した。別途に投与したＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体並びに突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａはヘレグリン−αにより誘導されたＡｋｔリン酸化の上方制御を顕著に阻害し、別途に投与したペルツズマブはヘレグリン−αにより誘導されたＡｋｔリン酸化の上方制御を完全に反転させた。別途に投与した突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ及びＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑはヘレグリン−αにより誘導されたＭＣＦ７細胞におけるＥＲＫ１／２リン酸化の上方制御を顕著に阻害し、別途に投与したＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａ突然変異体抗体はヘレグリン−αにより誘導されたＥＲＫ１／２リン酸化の上方制御を弱く阻害した。別途に投与したペルツズマブはヘレグリン−αにより誘導されたＥＲＫ１／２リン酸化の上方制御を完全に反転させた。
【図１０】図１０は、３つの突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの分子サイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す図である。３つの突然変異体抗体の各々の３０μｇを、それらのそれぞれの純度を決定するために分子サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）に供した。ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ抗体の主要ピークの純度は８８．３％であり、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ抗体のものは８９．７％であり、ＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａ抗体のものは９３．１％であった。
【図１１】図１１は、３つの突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの画像化キャピラリー等電点電気泳動の電気泳動図を示す図である。３つの突然変異体抗体はそれぞれ画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｍａｇｉｎｇ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ；ｉＣＩＥＦ）に供し、それぞれの主要ピークの等電点（ｐＩ）及び荷電アイソマーの純度を決定した。３つの突然変異体抗体の全ては比較的に高い測定等電点を有しており、それらは９．４から９．６の範囲内であった。ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄの等電点は、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａのものよりも約０．１低く、その主要ピーク純度は比較的に最も高かった。
【図１２】図１２は、３つの突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの還元キャピラリーゲル電気泳動の電気泳動図を示す図である。３つの突然変異体抗体は、還元キャピラリーゲル電気泳動解析（ｒＣＥ−ＳＤＳ）にそれぞれ供し、それらのそれぞれの純度（軽鎖及び重鎖のパーセンテージの合計）を決定した。３つの突然変異体抗体の全ては低分子量及び高分子量の特定の不純物を有していた。ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄは比較的に最も低い不純物の含有量であり、その純度は軽鎖及び重鎖（ＬＣ＋ＨＣ）の合計に関して最も高かった。
【図１３】図１３は、３つの突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの示差走査熱量測定の測定図を示す図である。３つの突然変異体抗体は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）にそれぞれ供し、それぞれのＴｍ値（５０％の生物学的分子がその温度においてアンフォールド状態にあることを意味する、相転移温度）を決定した。３つの分子のＴｍ１は互いに異なっている。ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３ＱのＴｍ１は比較的に最も低い値であるが、一方でＧＢ２３５−０１９Ｎ７３ＱのＴｍ１はＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの値と近い。Ｔｍ値が高ければ高いほどに、温度安定性は良い。Ｔｍ１の差異は突然変異がなんらかの効果をＣＨ２ドメインにいくらかの程度、及ぼしたことを意味している。ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａは、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑよりもより良い温度安定性を有していた。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の技術的解決法は下記の特定の例によりさらに説明されるが、本発明はそれらに限定されない。
【００２３】
実施例１  完全ヒトｓｃＦｖファージライブラリーからのヒトＨＥＲ２−Ｆｃに特異的に結合するクローンのスクリーニング
ＥＬＩＳＡ技術の抗原−抗体結合の特異性を利用して、ヒトＨＥＲ２（細胞外ドメイン）−Ｆｃ融合タンパク質（ｈＨＥＲ２−Ｆｃと略する）抗原をＥＬＩＳＡプレート上にコートし、コートした抗原に特異的に結合したファージを洗浄し、ピックアップした。ヒトＨＥＲ２−Ｆｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１０００４−Ｈ０２Ｈ）抗原はＰＢＳ（０．０１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ＋０．００２Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４＋０．１４Ｍ  ＮａＣｌ＋０．００２Ｍ  ＫＣｌ，ｐＨ＝８．６）により５μｇ／ｍｌに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウェルにて加え、４℃、一晩コートした。プレートはＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ緩衝液）で４回洗浄し、その後５％ＢＳＡ（アメリカ合衆国、Ａｍｒｅｓｃｏ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：０３３２−１００ｇ、溶液はＰＢＳである）を３００μｌ／ウェルにて、３７℃、１時間、ブロッキングを行った。プレートはＰＢＳＴにて２回、再洗浄した。７×１０１０の独立したクローンを含む完全ヒトｓｃＦｖファージ抗体ライブラリーの懸濁液（複数の健康な個体のリンパ細胞からの抗体可変領域遺伝子を人工的に合成した重鎖ＣＤＲ３遺伝子と組み合わせることにより、ＥＵＲＥＫＡ（北京）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．により構築されたもの）を、ＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウェルにて加え、３７℃で２時間、インキュベーションを行った。インキュベーションが終了した後に、ＥＬＩＳＡプレートのウェルの中のファージ懸濁液は吸引された。その後、ＰＢＳＴを各々のウェルに３００μｌ／ウェルにて加え、ウェルの内容物を５分間の間、充分に流し去り、コートした抗原に特異的に結合していないファージを除去した。０．１％ＢＳＡ（アメリカ合衆国、Ａｍｒｅｓｃｏ  Ｉｎｃ．、カタログ番号：０３３２−１００ｇ、溶液はＰＢＳである）を含む０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ＝２．２）溶出液を加え、室温で１０分間、インキュベーションを行った。その後、コートした抗原に特異的に結合したファージを溶出するために、ウェル中の内容物を充分に流し去った。溶出したファージ懸濁液は１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）緩衝液で中和した。溶出したファージは（約０．３から０．４であるＯＤ６００の値で示される）対数増殖期における１ｍＬのバクテリアＴＧ１（アメリカ合衆国、Ｌｕｃｉｇｅｎ  Ｉｎｃ．、カタログ番号：６０５００−０）に加え、得られたバクテリア溶液は３７℃、１時間、静置することにより感染させた。１０μｌの感染バクテリア溶液を１０倍連続希釈に供し、１０倍、１００倍、１０００倍希釈をプレーティングし、カウントした。９０μｌの感染バクテリア溶液を最終濃度１０％グリセリンのグリセリン中、−８０℃にて保存した。残りの感染バクテリア溶液は全て１５０ｍｍ  ２×ＹＴ−Ａ固体プレート（１７ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、１５ｇ／Ｌの寒天及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリン）上にプレーティングし、３７℃、一晩培養した。５ｍｌの２×ＹＴ−Ａ−１０％グリセリン培地を１５０ｍｍプレートに一晩加えた。プレートは滅菌した播種ロッドを用いて、残留バクテリア溶液がプレート上から無くなるまで、静かに掻爬した。第２回目の増幅段階において、適切な量の掻爬したバクテリア溶液を５ｍｌの２×ＹＴ−ＡＭＰ−グルコース液体培地（１７ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、２％のグルコース及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリン）（ＯＤ６００は好ましくは約０．０５から０．１である）に加え、３７℃、２００ｒｐｍで対数増殖期まで培養した（ＯＤ６００は約０．３から０．４である）。その後、バクテリアの総数の２０倍の量のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（アメリカ合衆国、ＮＥＢ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：Ｎ０３１５Ｓ）を加え、３７℃、１時間、感染を行った。感染後、１５００ｇ、５分間で回収したバクテリアのペレットを２×ＹＴ−ＡＭＰ−Ｋａｎａ培地（１７ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリン）に再懸濁させ、３０℃、２００ｒｐｍ、一晩培養し、組み換えファージの増幅及び調製を完結させた。第２段階のピックアップ及び第３段階の増幅及びピックアップは同じ要領で実行された。バクテリアコロニーを５ｍｌの２×ＹＴ−ＡＭＰ−グルコース液体培地（１７ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、２％のグルコース及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリン）へ移し、３７℃、２００ｒｐｍ、一晩培養した。プラスミドはプラスミド抽出キット（アメリカ合衆国、Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１２９４３）を用いて抽出し、塩基配列決定法により同定し、−８０℃にて保存した。
【００２４】
実施例２  酵素結合性免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いたヒトＨＥＲ２−Ｆｃに特異的に結合するファージの免疫反応性の同定
酵素結合性免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、実施例１において得られたヒトＨＥＲ２−Ｆｃに特異的に結合するファージの免疫反応性をさらに同定した。ヒトＨＥＲ２−Ｆｃ抗原（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１０００４−Ｈ０２Ｈ）をＰＢＳ（ｐＨ＝８．６）により、２μｇ／ｍｌに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウェルにて加え、４℃、一晩コーティングを行った。プレートはＰＢＳＴを用いて４回洗浄し、その後、５％ＢＳＡ（アメリカ合衆国、Ａｍｒｅｓｃｏ社から購入したもの、カタログ番号：０３３２−１００ｇ、溶液はＰＢＳである）を３００μｌ／ウェルにて加え、３７℃、１時間、ブロッキングを行った。プレートは再びＰＢＳＴを用いて２回洗浄し、その後、ファージクローンの懸濁液を１００μｌ／ウェルにて加え、３７℃で、２時間、インキュベーションを行った。プレートはＰＢＳＴを用いて４回洗浄した。ＨＲＰ標識化抗Ｍ１３Ｋ０７ファージ抗体（アメリカ合衆国、ＧＥ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：２７−９４２１−０１、ＰＢＳＴを用いて１：５０００希釈、１００μｌ／ウェル）を加え、室温で、１時間、インキュベーションを行った。プレートはＰＢＳＴを用いて４回洗浄し、その後、可溶単一成分基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｔｉａｎｇｅｎ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入したもの、カタログ番号：ＰＡ１０７−０１）を１００μｌ／ウェルにて加え、室温で１５分間、可視化のためにインキュベーションを行った。停止溶液（１Ｍ硫酸）を５０μｌ／ウェルにて加え、４５０／５７０ｎｍ波長の吸光度を多機能ＥＬＩＳＡプレート（アメリカ合衆国、バイオラッド社、モデル６８０マイクロリーダー）上で読み取った。
【００２５】
結果として、３回の繰り返しスクリーニングの後、ヒトＨＥＲ２−Ｆｃ抗原に結合し得る総数１３１２のｓｃＦＶファージクローンが得られ、その中で、ｓｃＦＶファージの４９９クローンがヒトＨＥＲ２−Ｆｃ抗原に特異的に結合し得ることが示された。ＤＮＡ塩基配列決定法により、これらのクローンの内、１０２個のｓｃＦｖがＤＮＡ配列及びアミノ酸配列の両方において異なることが明らかになった（表１に示される）。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
実施例３  ＥＬＩＳＡを用いた１０２個のヒトＨＥＲ２−Ｆｃ特異的ｓｃＦｖの、種間交差反応性、及びＨＥＲファミリーメンバー間の分子間交差反応性の検出
１０２個のヒトＨＥＲ２−Ｆｃ特異的ｓｃＦｖの、種間交差反応性、及びＨＥＲファミリーメンバー間の分子間交差反応性を、ＥＬＩＳＡを用いて検出した。コーティングのためのヒトＨＥＲ２−Ｆｃ抗原をサルＨＥＲ２−Ｆｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：９０２９５−Ｃ０２Ｈ）、マウスＨＥＲ２−Ｆｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：５０７１４−Ｍ０２Ｈ）、ヒトＨＥＲ１−Ｆｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１０００１−Ｈ０２Ｈ）、ヒトＨＥＲ３−Ｆｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１０２０１−Ｈ０５Ｈ）及びヒトＨＥＲ４−Ｆｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１０３６３−Ｈ０２Ｈ）に置き換えること以外は実施例２と同様の手順に従った。それぞれの抗原はＰＢＳ（ｐＨ＝８．６）により２μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに加え、コーティングを４℃、一晩行った。プレートはＰＢＳＴを用いて４回洗浄し、その後、５％ＢＳＡ（アメリカ合衆国、Ａｍｒｅｓｃｏ社から購入したもの、カタログ番号：０３３２−１００ｇ、溶液はＰＢＳである）を３００μｌ／ウェルにて加え、３７℃で、１時間、ブロッキングを行った。プレートは再びＰＢＳＴを用いて２回洗浄し、その後、ＳｃＦｖファージの１０２クローンの懸濁液を１００μｌ／ウェルにて加え、３７℃で、２時間、インキュベーションを行った。プレートはＰＢＳＴを用いて４回洗浄した。ＨＲＰ標識化抗Ｍ１３Ｋ０７ファージ抗体（アメリカ合衆国、ＧＥ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：２７−９４２１−０１、ＰＢＳＴを用いて１：５０００希釈、１００μｌ／ウェル）を加え、室温で、１時間、インキュベーションを行った。プレートはＰＢＳＴを用いて４回洗浄し、その後、可溶単一成分基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｔｉａｎｇｅｎ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入したもの、カタログ番号：ＰＡ１０７−０１）を１００μｌ／ウェルにて加え、室温で１５分間、可視化のためにインキュベーションを行った。停止溶液（１Ｍ硫酸）を５０μｌ／ウェルにて加え、４５０／５７０ｎｍ波長の吸光度を多機能ＥＬＩＳＡプレート（アメリカ合衆国、バイオラッド社、モデル６８０マイクロリーダー）上で読み取った。
【００２８】
ＳｃＦｖファージの９６クローンがサルＨＥＲ２−Ｆｃに交差反応性を示し、２０クローンがマウスＨＥＲ２−Ｆｃに交差反応性を示すという結果が示された。１０２クローンのいずれもヒトＨＥＲ１−Ｆｃ、ヒトＨＥＲ３−Ｆｃ及びヒトＨＥＲ４−Ｆｃには交差反応性を示さなかった（表２に示す）。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
実施例４  １０２クローンのＳｃＦｖファージの親和性ランキング
１０２クローンのＳｃＦｖファージの親和性ランキングをＥＬＩＳＡによって行った。最初の濃度が２５μｇ／ｍｌであるヒトＨＥＲ２−Ｆｃ抗原を、ＰＢＳ緩衝液を用いた１０倍希釈に供し、８つの濃度勾配を得た。希釈液はそれぞれ１０２クローンのＳｃＦｖファージと共に、室温で４時間インキュベーションし、平衡に達しさせた。その後、得られた混合液を２μｇ／ｍｌのヒトＨＥＲ２−Ｆｃ抗原（ｐＨ＝８．６  ＰＢＳ、４℃、一晩、１００μｌ／ウェル）で予めコートしたＥＬＩＳＡプレートに加え、ＥＬＩＳＡプレートは５％ＢＳＡ（アメリカ合衆国、Ａｍｒｅｓｃｏ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：０３３２−１００ｇ、溶液はＰＢＳである）を用いて捕獲されなかったＳｃＦｖ抗体が結合することから遮蔽するようにした。ＨＲＰ標識化抗Ｍ１３ファージ抗体（アメリカ合衆国、ＧＥ  Ｉｎｃ．、カタログ番号：２７−９４２１−０１、ＰＢＳＴにより１：５０００希釈、１００μｌ／ウェル）を加え、検出を実施例２と同様の手順にて実行した。１０２の陽性クローンの親和性ランキングをＩＣ５０値の観点で行った（ＩＣ５０値がより低ければ、より高い親和性を示す）。
【００３１】
結果として、１０２クローンのＳｃＦｖファージのＩＣ５０値の分布の領域が明らかになり、その中で４クローンがハーセプチンよりも高い親和性を示した。
【００３２】
【表３】
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【００３３】
実施例５  ＧＢ２３５−０１９組み換え全長ＩｇＧ１アイソタイプ抗体のための真核生物発現ベクターの構築
組み換え全長ＩｇＧ１アイソタイプ抗体ＧＢ２３５−０１９（組み換え全長抗体配列０１９クローンはＧＢ２３５−０１９と命名された）のための真核生物発現ベクターをＳｃＦｖファージの１０２クローン塩基配列から構築した。完全ヒトＳｃＦｖファージライブラリーからのスクリーニングにより得られたＷＧ１−０１９単鎖抗体クローン（ＳｃＦｖファージライブラリーからのスクリーニングにより得られた単鎖抗体配列クローンはＷＧ１−０１９と命名された）のヌクレオチド配列は配列番号９であり、配列番号３（配列番号１のアミノ酸配列をコードするもの）及び配列番号４（配列番号２のアミノ酸配列をコードするもの）のヌクレオチド配列をそれぞれ有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。シグナルペプチドはＭＥＬＧＬＳＷＩＦＬＬＡＩＬＫＧＶＱＣのアミノ酸配列とＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＧＡＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＴＴＴＴＣＣＴＧＴＴＧＧＣＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＧＴＧＴのヌクレオチド配列を有していた（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｇｅｎｅｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ，  Ｌｔｄにより合成したもの）。
【００３４】
ＧＢ２３５−０１９組み換え全長抗体は重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を有し、それぞれが配列番号７（配列番号５のアミノ酸配列をコードするもの）及び配列番号８（配列番号６のアミノ酸配列をコードするもの）のヌクレオチド配列を有していた（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｇｅｎｅｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ，  Ｌｔｄにより合成したもの）。
【００３５】
プライマーはＧＢ２３５−０１９組み換え全長ＩｇＧ１アイソタイプ抗体の重鎖及び軽鎖についての真核生物発現ベクターを構築するために設計され、それらのプライマーは下記の通りである：
１−１：５’−ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＧＡＣＴＧ−３’
２−３：５’−ＣＴＧＧＧＴＣＡＴＣＴＧＧＡＴＧＴＣＡＣＡＣＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＴＣ−３’
３−３：５’−ＧＡＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＧＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧ−３’
４−４：５’−ＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧ−３’
５−２：５’−ＡＴＣＡＡＡＣＧＴＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣ−３’
６−１：５’−ＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧ−３’
７−７：５’−ＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＴＣ  ＡＣＡＣＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＴＣ−３’
８−７：５’−ＧＡＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＧＴＧＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣ−３’
９−１：５’−ＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＡＣ−３’
１０−１：５’−ＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣ−３’
１１−１：５’−ＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧ−３’
【００３６】
合成したシグナルペプチド配列をテンプレートとして、並びに１−１及び２−３をプライマーとして使用し、ＰＣＲ法による増幅によりＥｃｏＲ  Ｉ制限部位を含む遺伝子断片を得て、「ＳＰＬ−ＧＢ２３５−０１９」と命名した；合成した軽鎖可変領域配列、配列番号４をテンプレートとして、並びに３−３及び４−４をプライマーとして使用し、ＰＣＲ法による増幅により軽鎖可変領域遺伝子断片を得て、「ＶＬ−ＧＢ２３５−０１９」と命名した；並びに、合成した軽鎖定常領域配列、配列番号８をテンプレートとして、並びに５−２及び６−１をプライマーとして使用し、ＰＣＲ法による増幅によりＴＧＡ停止コドン及びＢａｍＨ  Ｉ制限部位を含む重鎖定常領域遺伝子断片を得て、「ＣＬ−ＧＢ２３５−０１９」と命名した。ＳＰＬ−ＧＢ２３５−０１９、ＶＬ−ＧＢ２３５−０１９、及びＣＬ−ＧＢ２３５−０１９遺伝子断片をテンプレートとして、並びに１−１及び６−１をプライマーとして使用し、オーバーラッピングＰＣＲ法による増幅によりＧＢ２３５−０１９抗体の軽鎖全長遺伝子断片を得た  （Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｒら  Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ：  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９８８，  １６（１５）：７３５１−６７）。
【００３７】
同様に、合成したシグナルペプチド配列をテンプレートとして、並びに１−１及び７−７をプライマーとして使用し、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）法による増幅によりＥｃｏＲ  Ｉ制限部位を含む遺伝子断片を得て、「ＳＰＨ−ＧＢ２３５−０１９」と命名した；合成した重鎖可変領域配列、配列番号３をテンプレートとして、並びに８−７及び９−１をプライマーとして使用し、ＰＣＲ法による増幅により重鎖可変領域遺伝子断片を得て、「ＶＨ−ＧＢ２３５−０１９」と命名し、さらに、合成した重鎖定常領域配列、配列番号７をテンプレートとして、並びに１０−１及び１１−１をプライマーとして使用し、ＰＣＲ法による増幅によりＴＧＡ停止コドン及びＢａｍＨ  Ｉ制限部位を含む重鎖定常領域遺伝子断片を得て、「ＣＨ−ＧＢ２３５−０１９」と命名した。ＳＰＨ−ＧＢ２３５−０１９、ＶＨ−ＧＢ２３５−０１９、及びＣＨ−ＧＢ２３５−０１９遺伝子断片をテンプレートとして、並びに１−１及び１１−１をプライマーとして使用し、オーバーラッピングＰＣＲ法による増幅によりＧＢ２３５−０１９抗体の重鎖全長遺伝子断片を得た。
【００３８】
上述の重鎖及び軽鎖全長遺伝子断片は、遺伝子断片の５’末端にＥｃｏＲＩ制限部位を含み、断片の３’末端にＴＧＡ停止コドン及びＢａｍＨＩ制限部位を含むようにｐＧＥＭ−Ｔベクター（アメリカ合衆国、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：Ａ３６００）にクローニングされた。ＤＮＡ塩基配列決定の後、正しいものとして塩基配列決定されたクローンはＥｃｏＲＩ（アメリカ合衆国、ＮＥＢ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：Ｒ０１０１Ｓ）及びＢａｍＨＩ（アメリカ合衆国、ＮＥＢ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：Ｒ０１３６Ｓ）を用いて、３７℃、４時間にて二重切断処理し、目的の遺伝子断片を回収した。上述の切断処理により得られた抗体の重鎖全長遺伝子断片及び軽鎖全長遺伝子断片は２９３ベクター（アメリカ合衆国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：Ｋ８３００−０１）にクローニングした。ＤＮＡ塩基配列決定法により同定した後、首尾よく構築された全長抗体重鎖真核生物発現ベクター又は全長抗体軽鎖真核生物発現ベクターを含むクローンが得られた。
【００３９】
図１Ａは組み換え全長抗ヒトＨＥＲ２抗体重鎖（２９３−ＶＨ−ＣＨ）発現ベクターの構造の図を示し；図１Ｂは組み換え全長抗ヒトＨＥＲ２抗体軽鎖（２９３−ＶＬ−ＣＬ）発現ベクターの構造の図を示す。
【００４０】
実施例６  ＧＢ２３５−０１９抗体の真核生物細胞内での一過性形質移入発現及びその精製
実施例５において構築したＧＢ２３５−０１９抗体についての組み換えベクターの発現のために、フリースタイル２９３Ｆ細胞（アメリカ合衆国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入したもの、カタログ番号：Ｒ７９０−０７）を共形質移入する方法を使用することができる。形質移入の２４時間前に、フリースタイル２９３Ｆ細胞を６×１０５細胞／ｍｌに継代培養し、温度自動調節器付きシェーカー上で１３５ｒｐｍ、３７℃、８％  ＣＯ２の条件下で、形質移入の日に（血球数計測法による）細胞密度が１．２〜１．５×１０６細胞／ｍｌとなるように培養した。細胞はフリースタイル２９３培地（アメリカ合衆国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．、カタログ番号：１２３３８−０１８）を用いて、密度が１×１０６細胞／ｍｌとなるように希釈した。最良の形質移入を確実にするためには（トリパンブルー染色法による）細胞生存度が９５％を超えるべきである。
【００４１】
形質移入のための試薬、フリースタイル・マックス試薬（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍａｘ  Ｒｅａｇｅｎｔ；アメリカ合衆国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１６４４７−５００）を均一に混合するために４回、穏やかに反転させた。各々３１５μｇの重鎖及び軽鎖発現ベクタープラスミドを、形質移入のための培養液ＯｐｔｉＰＲＯ  ＳＦＭ（アメリカ合衆国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１２３０９−０５０）にそれぞれ加えた。ＯｐｔｉＰＲＯ  ＳＦＭを用いて容量を１０ｍｌに補充し、混合液は均一になるように混合させた。他の遠心チューブ内に、６２５μｌのフリースタイル・マックス試薬を１０ｍｌとなるまでＯｐｔｉＰＲＯ  ＳＦＭを用いて希釈した。チューブは均一に混合するために穏やかに反転させた。希釈したプラスミド及び希釈したフリースタイル・マックス試薬を均一になるように混合させ、室温で１５分間インキュベーションした。得られた２０ｍｌの混合溶液は、５００ｍｌのフリースタイル２９３Ｆ培地（アメリカ合衆国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１２３３８−０１８）を含む振盪フラスコ内にゆっくりと加えた。振盪フラスコは温度自動調節機能付きシェーカー上で７日間培養させた（１３５ｒｐｍ、３７℃、８％  ＣＯ２）。培養物は冷却遠心機内で９０００ｒｐｍ、２０分間、遠心分離させ、その後のタンパク質精製のために上澄み液を回収した。
【００４２】
ＧＢ２３５−０１９抗体を含む上述のフリースタイル２９３Ｆ細胞上澄み液を遠心分離した。ＩｇＧ１アイソタイプ抗体をプロテインＡカラム（アメリカ合衆国、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１７−５０８０−０２）を用いて捕獲し、５０ｍＭクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．３）を用いて溶出させた。溶出液を回収し（０．５ｍｌ）、１００μｌの１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）緩衝液（ｐＨ１１．０）を加えることにより、中性に中和させた。その後、溶出液は１０Ｋ透析膜（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｇｅｎｅｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ，  Ｌｔｄから購入したもの、カタログ番号：Ｍ１９１５）に対してリン酸緩衝溶液ＰＢＳ（０．０１  Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ＋０．００２Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４＋０．１４Ｍ  ＮａＣｌ＋０．００２Ｍ  ＫＣｌ，  ｐＨ＝７．２）で透析し、タンパク質含有量をＯＤ２８０ｎｍにて決定した。得られた溶液は滅菌するために０．２２μｍフィルター（ドイツ連邦共和国、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：ＧＶＨＰ０１３００）を通して濾過し、濾液は−８０℃にて保存した。精製により得られたＧＢ２３５−０１９抗体はその純度及び分子量を最終濃度５０ｍＭジチオスレイトールの還元条件下における１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定した。
【００４３】
図２の結果は、完全な還元条件下において、ＧＢ２３５−０１９抗体がそれぞれ分子量５０ＫＤａ及び２５ＫＤａを有する２つのバンドを示し、抗体の重鎖及び軽鎖についてのバンドであることを示している（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｒｐ．）から購入したハーセプチンを陽性対照として供した）。これらの結果は、構築したＧＢ２３５−０１９抗体が正しい構造を有し、その分子量が理論値と一致することを示している。
【００４４】
実施例７  ＧＢ２３５−０１９抗体の還元分子量
１０μｇのＧＢ２３５−０１９抗体中にジチオスレイトールを最終濃度２０ｍＭになるように加え、混合液を水槽に３７℃で、３０分間インキュベーションし、全ての鎖間ジスルフィド結合を破壊した。分離した軽鎖及び重鎖は質量分析計を組み合わせた逆相クロマトグラフィーを用いて解析した。ウォーターズ  Ｈ−クラス・バイオ超高速液体クロマトグラフィー（アメリカ合衆国、Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、クロマトグラフィーカラム：ＰＬＲＰ−Ｓ  ３００Å，  ３．０μｍ、２．１×１５０ｍｍ（アメリカ合衆国、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１９１２−３３０１）で；移動相：Ａ（水）、Ｂ（アセトニトリル）及びＣ（１％トリフルオロ酢酸）で、４分後に３５％Ｂである勾配を２０分後に４２％Ｂに変化させた。ここでＣ相は１０％に維持し、流速は０．３ｍＬ／分、及び添加量は２０μｇである。サーモＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐディスカバリー（Ｔｈｅｒｍｏ  ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）質量分析計（アメリカ合衆国、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）を使用した。ここでスプレイング電圧（ｓｐｒａｙｉｎｇ  ｖｏｌｔａｇｅ）は３．７  ＫＶであり、チューブレンズは２３０Ｖであり、キャピラリー温度は３００℃であり、分解能は３００００であり、質量−電荷比の範囲は１０００から３０００である。重鎖（ＧＯＦグリカン型を含むＦｃ）の理論的分子量を、ＧＰＭＡＷ６．０ソフトウェアを用いて計算すると５０４１６．７Ｄａであり、軽鎖の理論的分子量は２３１２０．８Ｄａであった。質量分析計から生成されたオリジナルシグナルはＰＲＯＭＡＳＳソフトウェアを用いてデコンヴォリューションを行い、対応する測定分子量を得た。
【００４５】
図３Ａの結果は、ＧＢ２３５−０１９抗体の軽鎖の測定分子量は理論的分子量と一致していることを示しており、軽鎖のグリコシル化が起きていないことを意味している。図３Ｂの結果は、測定したＧＢ２３５−０１９抗体の重鎖の分子量は理論的分子量と大きく異なっている（＞１５００Ｄａ）ことを示している。理論的配列と比較することにより、Ｆｃ領域に加えてＦａｂフレームワーク領域もまた理論的Ｎ−グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）を有しており、付加的な分子量の原因となることが見出された。
【００４６】
実施例８  重鎖のＦａｂ末端におけるＮ−連結グリカンの突然変異特徴配列を有するＧＢ２３５−０１９についての真核生物発現ベクターの構築
保存的なＮ−グリコシル化部位はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒであり、ここでＸはＰｒｏを除く任意のアミノ酸である。Ｎ−連結グリカンはＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ特徴的配列のＡｓｎ残基に結合していた（Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ  Ｂ，  Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ＳＥ．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ３  （６）：  ６４３−６４９）。実施例５において得られた全長抗体ＧＢ２３５−０１９のＦａｂフレームワーク領域３のＡｓｎ７３位はＮ−グリコシル化部位であった。保存的なＮ−グリコシル化部位はＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒのユニーク配列に変異を入れることにより取り除いた（Ｗａｌｓｈ  Ｇ．  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｂｅｎｃｈｍａｒｋｓ−２００３．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２００３，  ２１：８６５−８７０）。ＩｇＢＬＡＳＴ配列比較により、生殖細胞系列遺伝子におけるＡｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒの組み合わせの存在が明らかになった。ヌクレオチド配列比較により示されたように、Ａｓｎに対応するコドン「ＡＡＣ」はＡｓｎをＡｓｐに変化させるように「ＧＡＣ」と変異させることもできた。Ａｓｎ及びＧｌｎの両方はアミド型のアミノ酸であり、Ｇｌｎが側鎖にＡｓｎよりも１つ多いメチル基を有する点でそれらは互いに保存的な置換である。同様に、Ａｓｎに対応するコドン「ＡＡＣ」はＡｓｎをＧｌｎに変化させるように「ＣＡＧ」と変異させることもできた。ＩｇＢＬＡＳＴにより、生殖細胞系列遺伝子内でＳｅｒの位置におけるＡｌａの存在が明らかになった。生殖細胞系列ヌクレオチド配列比較により、Ｓｅｒに対応するコドン「ＴＣＣ」は、ＳｅｒをＡｌａに置き換えるために「ＧＣＣ」に変異させることもできた。
【００４７】
Ｎ−連結グリカンの突然変異特徴配列を有するＧＢ２３５−０１９Ｆａｂ断片についての突然変異体抗体のための重鎖発現ベクターは、実施例５においてテンプレートとして得られた全長重鎖真核生物発現ベクターを用いた点突然変異により生成された（Ｋｕｎｋｅｌ，  Ｔ．  Ａら  ”Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ，  １９８５（８２）：４８８−４９２）。ＧＢ２３５−０１９抗体の重鎖内のＡｓｎ７３（Ｎ７３）をＡｓｐ７３（Ｄ７３）への突然変異、ＧＢ２３５−０１９抗体の重鎖内のＡｓｎ７３（Ｎ７３）をＧｌｎ７３（Ｑ７３）への突然変異、及びＧＢ２３５−０１９抗体の重鎖内のＳｅｒ７５（Ｓ７５）をＡｌａ７５（Ａ７５）への突然変異の３つの突然変異計画を立案した。ＧＢ２３５−０１９抗体のＦａｂ末端のＮ−連結グリカンの特徴配列における上述の点突然変異を有するＧＢ２３５−０１９抗体についての重鎖発現ベクターを構築するためのプライマーを設計した。それらのプライマーは下記の通りである：
１２−１：５’−ＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＣＴＣＣＡＴ−３’
１２−２：５’−ＡＴＧＧＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴＧＡＣ−３’
１３−１：５’−ＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡＧＡＣＣＴＣＣＡＴＡＡＧＣ−３’
１３−２：５’−ＧＣＴＴＡＴＧＧＡＧＧＴＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴＧＡＣ−３’
１４−１：５’−ＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＡＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＡＡＧＣＡＣ−３’
１４−２：５’−ＧＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＣＡＴＧ−３’
【００４８】
実施例５において得られた２９３−ＶＨ−ＣＨ発現ベクターをテンプレートとして、並びに１２−１及び１２−２をプライマーとして用いて、ＰＣＲ法による増幅によりＰＣＲ生成物を得た。２μｌのＤｐｎ  Ｉ（アメリカ合衆国、ＮＥＢ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１２３５Ａ）を２０μｌのＰＣＲ生成物に加え、３７℃、１時間の切断処理を行った。ＰＣＲ生成物精製キット（アメリカ合衆国、Ａｘｙｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：ＡＰ−ＰＣＲ−５０）を用いて、ＰＣＲ生成物を精製した。精製したＰＣＲ生成物は、熱ショック法（４２℃、９０秒）により、ＤＨ５α大腸菌コンピテント細胞（Ｔｉａｎｇｅｎ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入したもの、カタログ番号：ＣＢ１０１）内に形質転換させた。ＤＮＡ塩基配列決定法による同定の後、突然変異体抗体重鎖の真核生物発現ベクターが得られ、「２９３−ＶＨ−ＣＨ−Ｎ７３Ｄ」と命名した（配列番号１０及び配列番号１３のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列をそれぞれ有する重鎖可変領域を含む）。同様に、１３−１及び１３−２をプライマーとして使用し、ＰＣＲ法による増幅によりＰＣＲ生成物を得た。２μｌのＤｐｎＩ（アメリカ合衆国、ＮＥＢ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１２３５Ａ）を２０μｌのＰＣＲ生成物に加え、３７℃、１時間の切断処理を行った。ＰＣＲ生成物精製キット（アメリカ合衆国、Ａｘｙｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：ＡＰ−ＰＣＲ−５０）を用いて、ＰＣＲ生成物を精製した。精製したＰＣＲ生成物は、熱ショック法（４２℃、９０秒）により、ＤＨ５α大腸菌コンピテント細胞（Ｔｉａｎｇｅｎ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入したもの、カタログ番号：ＣＢ１０１）内に形質転換させた。ＤＮＡ塩基配列決定法による同定の後、突然変異体抗体重鎖の真核生物発現ベクターが得られ、「２９３−ＶＨ−ＣＨ−Ｎ７３Ｑ」と命名した（配列番号１１及び配列番号１４のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列をそれぞれ有する重鎖可変領域を含む）。また同様に、１４−１及び１４−２をプライマーとして使用し、ＰＣＲ法による増幅によりＰＣＲ生成物を得た。２μｌのＤｐｎＩ（アメリカ合衆国、ＮＥＢ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１２３５Ａ）を２０μｌのＰＣＲ生成物に加え、３７℃、１時間の切断処理を行った。ＰＣＲ生成物精製キット（アメリカ合衆国、Ａｘｙｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：ＡＰ−ＰＣＲ−５０）を用いて、ＰＣＲ生成物を精製した。精製したＰＣＲ生成物は、熱ショック法（４２℃、９０秒）により、ＤＨ５α大腸菌コンピテント細胞（Ｔｉａｎｇｅｎ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入したもの、カタログ番号：ＣＢ１０１）内に形質転換させた。ＤＮＡ塩基配列決定法による同定の後、突然変異体抗体重鎖の真核生物発現ベクターが得られ、「２９３−ＶＨ−ＣＨ−Ｓ７５Ａ」と命名した（配列番号１２及び配列番号１５のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列をそれぞれ有する重鎖可変領域を含む）。
【００４９】
実施例９  真核生物細胞におけるＧＢ２３５−０１９突然変異体抗体の一過性形質移入発現及びその精製
実施例８において構築した突然変異体抗体についての組み換えベクターの発現は、実施例６におけるものと同じ手順によって行った。２９３−ＶＨ−ＣＨ−Ｎ７３Ｄ、２９３−ＶＨ−ＣＨ−Ｎ７３Ｑ及び２９３−ＶＨ−ＣＨ−Ｓ７５Ａは、フリースタイル２９３Ｆ細胞（アメリカ合衆国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入したもの、カタログ番号：Ｒ７９０−０７）に共形質移入するためにそれぞれ２９３−ＶＬ−ＣＬと共に使用した。
【００５０】
形質移入フリースタイル・マックス試薬のための試薬（アメリカ合衆国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１６４４７−５００）は均一に混合するために、４回、穏やかに反転させた。各々３１５μｇの重鎖及び軽鎖発現ベクタープラスミドを、形質移入のための培養液ＯｐｔｉＰＲＯ  ＳＦＭ（アメリカ合衆国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１２３０９−０５０）にそれぞれ加えた。ＯｐｔｉＰＲＯ  ＳＦＭを用いて容量を１０ｍｌに補充し、混合液は均一になるように混合させた。他の遠心チューブ内に、６２５μｌのフリースタイル・マックス試薬を１０ｍｌとなるようにＯｐｔｉＰＲＯ  ＳＦＭを用いて希釈した。チューブは均一に混合するために穏やかに反転させた。希釈したプラスミド及び希釈したフリースタイル・マックス試薬は均一になるように混合させ、室温で１５分間インキュベーションした。得られた２０ｍｌの混合溶液は、５００ｍｌのフリースタイル２９３Ｆ培地（アメリカ合衆国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１２３３８−０１８）を含む振盪フラスコ内にゆっくりと加えた。振盪フラスコは温度自動調節機能付きシェーカー上で７日間培養させた（１３５ｒｐｍ、３７℃、８％  ＣＯ２）。培養液は冷却遠心機内で９０００ｒｐｍ、２０分間、遠心分離させ、その後のタンパク質精製のために上澄み液を回収した。突然変異体抗体を精製する方法は実施例６におけるものと同じである。得られた突然変異体抗体は滅菌するために０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：ＧＶＨＰ０１３００）を通して濾過し、濾液は−８０℃にて保存した。精製により得られた突然変異体抗体は、それぞれＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａと命名された。突然変異体抗体は、その純度及び分子量を最終濃度５０ｍＭジチオスレイトールの還元条件下における１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定した。
【００５１】
図４の結果は、完全な還元条件下において、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａ抗体の各々がそれぞれ分子量５０ＫＤａ及び２５ＫＤａを有する２つのバンドを示し、それぞれの抗体の重鎖及び軽鎖についてのバンドであることを示している（ロシュ社から購入したハーセプチンを陽性対照として供した）。これらの結果は、構築したＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａ抗体が正しい構造を有し、その分子量が理論値と一致することを示している。
【００５２】
実施例１０  組み換え全長ＧＢ２３５−０１９突然変異体抗体の還元分子量の解析
実施例９において得られた突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの還元分子量を解析する方法は実施例７のものと同じである。１０μｇのＧＢ２３５−０１９突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの各々にジチオスレイトールを最終濃度２０ｍＭになるように加え、突然変異体抗体を水槽にて３７℃で、３０分間インキュベーションし、全ての鎖間ジスルフィド結合を破壊した。分離した軽鎖及び重鎖は質量分析計を組み合わせた逆相クロマトグラフィーを用いて解析した。ウォーターズ  Ｈ−クラス・バイオ超高速液体クロマトグラフィー（アメリカ合衆国、Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、クロマトグラフィーカラム：ＰＬＲＰ−Ｓ  ３００Å，  ３．０μｍ、２．１×１５０ｍｍ（アメリカ合衆国、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１９１２−３３０１）で；移動相：Ａ（水）、Ｂ（アセトニトリル）及びＣ（１％ＴＦＡ）、４分後に３５％Ｂから２０分後に４２％Ｂへの勾配にした、ここでＣ相は１０％に維持し、流速は０．３ｍＬ／分、及び添加量は２０μｇである。サーモＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐディスカバリー（Ｔｈｅｒｍｏ  ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）質量分析計（アメリカ合衆国、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｉｎｃ．）を使用した。ここでスプレイング電圧は３．７ＫＶであり、チューブレンズは２３０Ｖであり、キャピラリー温度は３００℃であり、分解能は３００００であり、質量−電荷比の範囲は１０００から３０００である。３つの突然変異体抗体の重鎖（ＧＯＦグリカン型を含むＦｃ）の理論的分子量を、ＧＰＭＡＷ６．０ソフトウェアを用いて計算すると、ＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａについては５０４００．７Ｄａ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄについては５０４１７．７Ｄａ及びＧＢ２３５−０１９  Ｎ７３Ｑについては５０４３０．７Ｄａであった。質量分析計から収集されたオリジナルシグナルはＰＲＯＭＡＳＳソフトウェアを用いてデコンヴォリューションを行い、対応する測定分子量を得た。
【００５３】
図５Ａは、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄの重鎖の測定分子量は理論的分子量と一致していることを示しており、重鎖のグリコシル化が起きていないことを意味している。図５Ｂ及び図５Ｃは、突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの重鎖の測定分子量は理論的分子量ととても良く一致している（１Ｄａ未満の差異）ことを示しており、Ｆａｂフレームワーク領域内のＮ−グリコシル化部位が取り除かれたことを意味している。
【００５４】
ヒトＩｇＧの重鎖のＦｃセグメントにおけるＣＨ２領域内には保存的なＮ−連結グリコシル化部位Ａｓｎ２９７がある。Ａｓｎ２９７に連結している多糖鎖は抗体の４次構造及びＦｃセグメントの温度安定性を維持させ、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）及び半減期を、それぞれＩｇＧ分子のＦｃＲｓ、Ｃ１ｑ及びＦｃＲｎへの結合に影響を与えることにより制御し得る。
【００５５】
ヒトＩｇＧ  ＦａｂのＮ−グリコシル化修飾は、抗体の抗原への結合機能に明確な促進又は阻害効果を有するかもしれない。グリコシル化修飾が起きる場所への微小な変化は、多糖鎖の引き続いてのプロセシング及び抗体の抗原への結合活性にまったく異なる効果を及ぼし、抗体の生成プロセスにおける品質管理を複雑化させるかもしれない。突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５ＡはＧＢ２３５−０１９野生型抗体に点突然変異を与えて得られた。３つの突然変異体抗体は、ＧＢ２３５−０１９野生型抗体内の重鎖ＦａｂのＮ−連結グリカン（Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）についての特異的部位を変化させた。３つの突然変異体抗体の還元分子量の決定により、重鎖Ｆａｂにおけるグリコシル化が起きていないことが明らかになり、生成プロセスにおける品質管理に有用であると思われる。３つの突然変異体抗体については、生物学的活性解析及び物理化学解析によりさらに検証を行った。
【００５６】
実施例１１  組み換え全長ＧＢ２３５−０１９野生型抗体及び突然変異体抗体の免疫学的活性の同定
ＧＢ２３５−０１９野生型抗体（ＧＢ２３５−０１９ＷＴ）及び突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５ＡのヒトＨＥＲ２抗原への結合能を、ＥＬＩＳＡ結合アッセイを用いて下記の手順により検証した。ヒトＨＥＲ２抗原（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１０００４−Ｈ０８Ｈ）を、ＰＢＳを用いて１μｇ／ｍｌに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウェルにて加え、４℃、一晩コーティングを行った。プレートはＰＢＳＴを用いて４回洗浄し、その後、５％ＢＳＡ（アメリカ合衆国、Ａｍｒｅｓｃｏ社から購入したもの、カタログ番号：０３３２−１００ｇ、溶液はＰＢＳである）を３００μｌ／ウェルにて加え、室温で１時間、ブロッキングを行った。プレートを、ＰＢＳＴを用いて４回洗浄した後、ＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体及び突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの各々、並びにペルツズマブ（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｒｐ．から購入したもの）及びハーセプチン（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｒｐ．から購入したもの）のそれぞれを５μｇ／ｍｌから始めて、５倍希釈に供し、７つの濃度勾配を得た。各々の希釈液はＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウェルにて加え、室温で１時間インキュベーションした。プレートはＰＢＳＴを用いて４回洗浄し、その後ＨＲＰ標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（アメリカ合衆国、ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：ＡＰ１１３Ａ−Ｋ）を、ＰＢＳ緩衝液を用いて１：１００００に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウェルにて加え、室温で１時間、インキュベーションを行った。プレートはＰＢＳＴを用いて４回洗浄し、その後、可溶単一成分基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｔｉａｎｇｅｎ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入したもの、カタログ番号：ＰＡ１０７−０１）を１００μｌ／ウェルにて加え、室温で１５分間、可視化のためにインキュベーションを行った。停止溶液（１Ｍ硫酸）を５０μｌ／ウェルにて加え、４５０／６３０ｎｍ波長の吸光度をＭ５多機能ＥＬＩＳＡプレート（アメリカ合衆国、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．）上で読み取った。
【００５７】
図６の結果は、突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５ＡがヒトＨＥＲ２抗原に、濃度依存的及び飽和性の様式で特異的に結合する能力を有することを示した。突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａは、ＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体と同様の結合能を顕著な差異無く有していた。
【００５８】
実施例１２  組み換え全長ＧＢ２３５−０１９突然変異体抗体はイン・ビトロで乳がんＢＴ−４７４細胞の増殖活性を阻害した
乳がんＢＴ−４７４細胞は中程度レベルのＨＥＲ２及びＨＥＲ３並びに高レベルのＰ−ＨＥＲ２を発現するが、Ｐ−ＨＥＲ３は発現しない（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｍ．  Ｎｅｖｅ．  Ａｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．  ＣＡＮＣＥＲ  ＣＥＬＬ，  ２００６，  ５１５−５２７）。本明細書において上記に定義したように、乳がんＢＴ−４７４細胞はＨＥＲ２陽性腫瘍細胞である。ヘレグリン−α（アメリカ合衆国、Ｒ＆Ｄ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：２９６−ＨＲ）を補填した完全培地を用いた増殖阻害アッセイにおいて、対数増殖期のＢＴ−４７４細胞を９６ウェル培養プレート内で１０％のウシ胎仔血清（アメリカ合衆国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：Ａ１０４９１）を含むＲＰＭＩ１６４０完全培地（アメリカ合衆国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１００９９−１４１）内で５０００細胞／ウェルにて、３７℃、５％  ＣＯ２中で２４時間、培養した。ＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体及び突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａを別途に、並びにハーセプチンと組み合わせて投与することにより阻害アッセイを行った。別途投与グループ内において、ＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体及びＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａ突然変異体抗体並びにペルツズマブ及びハーセプチンをそれぞれ加えた（最終操作濃度、７５、１８．８、４．７、１．２、０．２９、０．０７、０．０１８、０．００５、０．００１１、及び０μｇ／ｍｌ）；並びに組み合わせ投与グループにおいて、上記の用量のＧＢ２３５−０１９ＷＴ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ、ＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａ及びペルツズマブの各々はハーセプチンと組み合わせて投与した。２時間の上記のような抗体処置の後、最終操作濃度１００ｎｇ／ｍｌのヘレグリン−α溶液を加えた。ここでウェルにはヘレグリン−α溶液の添加が無いウェルも含めている。プレートはさらに３７℃、５％  ＣＯ２中、６日間、培養した。アラマーブルー（アメリカ合衆国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：ＤＡＬ１１００）をＢＴ−４７４細胞の生存率を検出するために加え、５４４／５９０ｎｍにおける蛍光度をＭ５多機能ＥＬＩＳＡプレートリーダー（アメリカ合衆国、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．）上で読み取った。
【００５９】
アッセイの結果は、組み換え全長抗ＨＥＲ２突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａがイン・ビトロにおいて、ヘレグリン−αによって誘導されたＨＥＲ２陽性ＢＴ−４７４細胞のハーセプチン抵抗性を反転させたことを示した。図７Ａにおける結果は、ヘレグリン−αの完全培地への添加によりＢＴ−４７４細胞の増殖を誘導したことを示した。ＢＴ−４７４細胞は別途に投与されたハーセプチンに非感受性となり、突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａは、別途に投与した場合、ＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体の効果と同様に、阻害効果を示さなかった。図７Ｂにおける結果は、突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａは、各々がハーセプチンと組み合わせて投与された場合に、ヘレグリン−α誘導性増殖を阻害したことを示した。３つの突然変異体抗体の各々をハーセプチンと組み合わせて投与した場合、ヘレグリン−αにより誘導されたＢＴ−４７４細胞の増殖を阻害しただけではなく、濃度依存的に、ヘレグリン−α誘導の前のものよりも低いレベルにまで著しく阻害した。突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａは、ＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体のものと、顕著な差異無く同様の効果を有していた。
【００６０】
実施例１３  組み換え全長抗ヒトＨＥＲ２  ＧＢ２３５−０１９突然変異体抗体による乳がんＢＴ−４７４細胞シグナル伝達のイン・ビトロ阻害
対数増殖期のＢＴ−４７４細胞は６ウェル培養プレート中で１０％ウシ胎仔血清（アメリカ合衆国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１００９９−１４１）を含むＲＰＭＩ１６４０完全培地（アメリカ合衆国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：Ａ１０４９１）内に１．８×１０５細胞／ウェルにて、３７℃で、５％ＣＯ２中、２４時間、培養した。次の日、培地を廃棄し、０．１％ウシ胎仔血清（アメリカ合衆国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１００９９−１４１）を含む低血清培養用培地を代わりに使用し、２４時間、インキュベーションした。
【００６１】
その後、各々２０μｇ／ｍｌのＧＢ２３５−０１９ＷＴ及びＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ  突然変異体抗体、ハーセプチン並びにペルツズマブを別途に投与した。ＢＴ−４７４細胞を抗体で６時間処理した後、ヘレグリン−α（アメリカ合衆国、Ｒ＆Ｄ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：２９６−ＨＲ）を１５分間の誘導のために最終濃度１００ｎｇ／ｍｌで加えた。ここでウェルにはヘレグリン−αを添加しないブランク対照ウェルを含めている。プレートは反応を停止するために４℃で事前に冷却したＰＢＳで１度洗浄した。その後、１２０μｌのＬＤＳ（アメリカ合衆国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：ＮＰ０００７）をプレートに加え、プレートを氷上に置いた。細胞可溶化物を即座に回収し、後の使用のために−８０℃にて保存した。
【００６２】
回収した細胞可溶化物は、ヘレグリン−α（Ｒ＆Ｄ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：２９６−ＨＲ）により誘導されたＳＫ−ＢＲ−３細胞内のＨＥＲ−３、Ａｋｔ及びＥＲＫ１／２リン酸化への抗体の効果を決定するために、最終濃度５０ｍＭのジチオスレイトール（Ｓａｎｇｏｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：Ｄ０２８１）の還元条件下においてウェスタンブロッティング解析に供した。ウェスタンブロッティングは下記のように行った。電気泳動後のゲル上のタンパク質を電気泳動転写法（３００ｍＡ、８０分間）によりＮＣ膜（アメリカ合衆国、Ｐａｌｌ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：Ｓ８０２０９）上に転写し、５％の乾燥スキムミルク（Ｓａｎｇｏｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：ＮＢ０６６９）によりブロッキングした。その後、１：１０００に希釈したウサギ１次抗体Ｐ−ＨＥＲ３  Ｙ１２８９（アメリカ合衆国、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：８０１７）、１：１０００に希釈したウサギ１次抗体ＨＥＲ３（アメリカ合衆国、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１２７０８）、１：１０００に希釈したウサギ１次抗体Ｐ−ＡｋｔＳ４７３（アメリカ合衆国、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：４０６０）、１：１０００に希釈したウサギ１次抗体Ａｋｔ（アメリカ合衆国、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：４６９１）、１：５００に希釈したウサギ１次抗体Ｐ−ＥＲＫ１／２（アメリカ合衆国、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：４３７０）、１：１０００に希釈したウサギ１次抗体ＥＲＫ１／２（アメリカ合衆国、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：４６９５）及び１：５０００に希釈したウサギ１次抗体ＧＡＰＤＨ（アメリカ合衆国、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：５１７４）をそれぞれ加え、４℃、一晩インキュベーションを行った。ＮＣ膜を１×ＴＢＳＴを用いて３回洗浄し、その後１：１００００に希釈したＨＲＰ標識化ヤギ抗ウサギ抗体（アメリカ合衆国、ＭＥＲＣＫ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：４０１３１５）を加えた。ＮＣ膜を再び１×ＴＢＳＴを用いて３回洗浄し、その後ＥＣＬ（アメリカ合衆国、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：ＮＥＬ１０４００１ＥＡ）を可視化のために加えた。シグナルを記録するためにフィルム（Ｋｏｄａｋ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：ＦＦ０５７）を露光させた。
【００６３】
乳がんＢＴ−４７４細胞は高レベルのＰ−ＨＥＲ２を発現するが、Ｐ−ＨＥＲ３を発現しない、ハーセプチンに感受性の細胞株である。図８の結果は、ヘレグリン−αを加えない対照群と比較することにより、ヘレグリン−αはＢＴ−４７４細胞内におけるＨＥＲ３リン酸化の上方制御を引き起こすことを示している。別途に投与したＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体及びＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ突然変異体抗体は、ヘレグリン−αによって誘導されたＢＴ−４７４細胞内におけるＨＥＲ３リン酸化の上方制御を顕著に阻害し、ヘレグリン−αによって誘導されたＨＥＲ３リン酸化の上方制御を完全に反転させ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ突然変異体抗体はＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体のものと同様の効果を有していた。ペルツズマブもまたヘレグリン−αによって誘導されたＢＴ−４７４細胞内におけるＨＥＲ３リン酸化の上方制御を完全に阻害し、ハーセプチンもまたヘレグリン−αによって誘導されたＢＴ−４７４細胞内におけるＨＥＲ３リン酸化の上方制御を顕著に阻害した。
【００６４】
別途に投与したＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体及びＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ突然変異体抗体はヘレグリン−αによって誘導されたＡｋｔリン酸化の上方制御を阻害しなかった。別途に投与したペルツズマブはヘレグリン−αによって誘導されたＡｋｔリン酸化の上方制御を顕著に阻害した。別途に投与したＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ突然変異体抗体及びＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体はヘレグリン−αによって誘導されたＥＲＫ１／２リン酸化の上方制御を顕著に阻害し、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ突然変異体抗体はＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体のものと同様の効果を有していた。
【００６５】
実施例１４  組み換え全長抗ヒトＨＥＲ２  ＧＢ２３５−０１９突然変異体抗体による乳がんＭＣＦ７細胞シグナル伝達のイン・ビトロ阻害
乳がんＭＣＦ７細胞は低レベルのＨＥＲ２及び高レベルのＨＥＲ３を発現するが、Ｐ−ＨＥＲ２及びＰ−ＨＥＲ３は発現しない（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｍ．  Ｎｅｖｅ．  Ａ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．  ＣＡＮＣＥＲ  ＣＥＬＬ，  ２００６：  ５１５−５２７）。上記に定義したように、乳がんＭＣＦ７細胞はＨＥＲ２陰性腫瘍細胞である。対数増殖期におけるＭＣＦ７細胞を６ウェル培養プレート中で１０％ウシ胎仔血清（アメリカ合衆国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１００９９−１４１）を含むＲＰＭＩ１６４０完全培地（アメリカ合衆国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：Ａ１０４９１）内に１．８×１０５細胞／ウェルにて、２４時間、培養した。次の日、培地を廃棄し、０．１％ウシ胎仔血清を含む低血清培養用培地を代わりに使用し、２４時間、飢餓培養を行った。ＭＣＦ７細胞を２０μｇ／ｍｌの各々のＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体及び突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａで処置し、ペルツズマブ及びハーセプチンを別途に又はＲＰＭＩ−０．１％ウシ胎仔血清培養液内に組み合わせて６時間、投与した。１０分間の誘導のためにヘレグリン−α（アメリカ合衆国、Ｒ＆Ｄ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：２９６−ＨＲ）を１００ｎｇ／ｍｌの操作最終濃度にて加えた。ここでウェルにはヘレグリン−αを添加しないブランク対照ウェルを含めている。反応を停止するために、プレートは予め４℃で冷却したＰＢＳを用いて１度洗浄した。その後、１２０μｌのＬＤＳ（アメリカ合衆国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：ＮＰ０００７）をプレートに加え、プレートは氷上に置いた。細胞可溶化物を即座に回収し、後の使用のために−８０℃にて保存した。
【００６６】
回収した細胞可溶化物を、ＨＥＲ３の下流のＡｋｔ及びＥＲＫ１／２リン酸化に対するそれらの抗体の効果と同様に、ヘレグリン−αにより誘導されたＭＣＦ７細胞内のＨＥＲ−３リン酸化への抗体の効果を決定するために、最終濃度５０ｍＭのジチオスレイトールの還元条件下においてウェスタンブロッティング解析に供した。ウエスタンブロッティング解析は実施例１３に記載のものと同じ手順で行った。
【００６７】
図９は、ＧＢ２３５−０１９突然変異体抗体によるＨＥＲ２陰性乳がんＭＣＦ７細胞シグナル伝達の阻害を示す図である。結果は、ヘレグリン−αを加えない対照群と比較することにより、ヘレグリン−αはＭＣＦ７細胞内におけるＨＥＲ３リン酸化の上方制御を誘導することを示している。別途に投与したＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体及び突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの各々はヘレグリン−αにより誘導されたＭＣＦ７細胞におけるＨＥＲ３リン酸化の上方制御を著しく阻害した；ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄはヘレグリン−αにより誘導されたＨＥＲ３リン酸化の上方制御を完全に反転させた；別途に投与したハーセプチンもまたヘレグリン−αにより誘導されたＭＣＦ７細胞におけるＨＥＲ３リン酸化の上方制御を著しく阻害した；並びにペルツズマブはヘレグリン−αにより誘導されたＨＥＲ３リン酸化の上方制御を完全に反転させた。別途に投与したＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体及び突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの各々はヘレグリン−αにより誘導されたＭＣＦ７細胞におけるＡｋｔリン酸化の上方制御を著しく阻害した；並びにペルツズマブはヘレグリン−αにより誘導されたＡｋｔリン酸化の上方制御を完全に反転させた。別途に投与したＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体及び突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの各々はヘレグリン−αにより誘導されたＭＣＦ７細胞におけるＥＲＫ１／２リン酸化の上方制御を著しく阻害した；並びにペルツズマブはヘレグリン−αにより誘導されたＥＲＫ１／２リン酸化の上方制御を完全に反転させた。したがって、本発明の抗体もまた、ＨＥＲ２陰性腫瘍を治療するために使用することができる。
【００６８】
実施例１５  ＧＢ２３５−０１９突然変異体抗体の分子サイズ排除クロマトグラフィー解析
ＧＢ２３５−０１９突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａを、それらの純度を決定するために分子サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）にそれぞれ供した。実験条件は下記の通りである：ウォーターズ２６９５液体クロマトグラフィー（アメリカ合衆国、Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．）；連結したＴＳＫゲル  Ｇ３０００ＳＷＸＬクロマトグラフィーカラム（２カラム）（アメリカ合衆国、Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．から購入したもの）；０．１Ｍリン酸緩衝液、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０、１．０ｍＬ／ｍｉｎ、３０分間のアイソクラチック保持である移動相；各々の抗体３０μｇである添加量；及び２８０ｎｍである検出波長。
【００６９】
図１０は、３つの突然変異体抗体の分子サイズ排除クロマトグラムを示す図である。含有量は少ないながらも、３つの抗体中には少量のポリマー及び分子の断片が存在している。表４は、分子サイズ排除クロマトグラフィーによる対応する抗体の純度の結果をまとめた表である。ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ抗体の主要ピークの純度は８８．３％であり、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ抗体の主要ピークの純度は８９．７％であり、ＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａ抗体の主要ピークの純度は９３．１％であり、３つの突然変異体抗体の全ての主要ピークは８５％よりも高い値であった。
【００７０】
【表４】
0006263778.tif 000005
【００７１】
実施例１６  ＧＢ２３５−０１９突然変異体抗体の画像化キャピラリー等電点電気泳動解析（Ｉｍａｇｉｎｇ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）
突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａはそれぞれ画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｍａｇｉｎｇ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ；ｉＣＩＥＦ）に供し、それぞれの主要ピークの等電点（ｐＩ）及び荷電アイソマーの純度を決定した。実験条件は下記の通りである：プロテインシンプル（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）  ｉＣＥ２８０  キャピラリー等電点電気泳動装置（アメリカ合衆国、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｉｎｃ．）；ｉＣＩＥＦカートリッジ（アメリカ合衆国、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｉｎｃ．から購入したもの）；両性電解質溶液は、１２μｌのファーマライト（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ）３−１０（アメリカ合衆国、ＧＥ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１７０４５６０１）、０．５μｌのｐＩマーカー５．８５（アメリカ合衆国、ＧＥ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１７−０４７２−０１）、０．５μｌのｐＩマーカー９．７７（アメリカ合衆国、ＧＥ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：１７−０４７３−０１）、
２μｌの５００ｍＭ  Ｌ−アルギニン（Ｓａｎｇｏｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：ＡＢ０２０５−１００ｇ）、２μｌの２００ｍＭ  イミノ二酢酸（Ｓａｎｇｏｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：ＩＢ０５３０−１００ｇ）、７０μｌの１％メチルセルロース（Ｓａｎｇｏｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：ＭＢ０６１６−２５０ｇ）及び１１３μｌの５．３Ｍ尿素（Ｓａｎｇｏｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：ＵＢ０１４８−５００ｇ）を混合することにより調製した。添加溶液を１８０μｌの両性電解質溶液を２０μｌの２．５ｍｇ／ｍＬタンパク質溶液と混合することにより調製した。サンプルシステムは１５００Ｖ、１分間、プレフォーカスさせ、３０００Ｖ、１０分間、フォーカスさせた。フォーカスパターンは２８０ｎｍの検出波長でＣＣＤカメラを用いて記録した。
【００７２】
図１１は、３つの突然変異体抗体の画像化キャピラリー等電点電気泳動の電気泳動図を示す図である。表５は、３つの突然変異体抗体の対応する主要ピークの等電点及び電荷アイソマーの純度の結果を要約した表である。３つの突然変異体抗体は、約９．４から９．６の範囲内の測定等電点を有していた。ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄの等電点は、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａのものよりも約０．１低く、その主要ピーク純度はそれぞれ最も高かった。
【００７３】
【表５】
0006263778.tif 000006
【００７４】
実施例１７  ＧＢ２３５−０１９突然変異体抗体のキャピラリーゲル電気泳動解析
突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａは、それぞれ還元キャピラリーゲル電気泳動解析（ｒＣＥ−ＳＤＳ）に供し、それぞれの純度（軽鎖及び重鎖のパーセンテージの合計）について決定した。実験条件は下記の通りである。ＳＤＳ−ＭＷ解析キット（アメリカ合衆国、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：３９０９５３）及び非コーティングキャピラリーチューブ（Ｍｉｃｒｏ  ｓｏｌｖ  Ｉｎｃ．から購入したもの）を解析に使用した。１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、１％  ＳＤＳ（Ｓａｎｇｏｎ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：ＳＢ０４８５−１００ｇ）溶液をβ−メルカプトエタノール（アメリカ合衆国、Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．から購入したもの、カタログ番号：Ｍ６２５０）と５５：５の割合で混合させた。６０μｌの上述の混合溶液を４０μｌの２．５ｍｇ／ｍＬサンプル溶液と混合させ、７０℃の水槽に１０分間インキュベーションした。サンプル添加は５ＫＶ、２０秒間で行い、分離は１５ＫＶ、３０分間で行った。波長を２１４ｎｍとして、ＵＶ検出器を使用した。
【００７５】
図１２は、３つの突然変異体抗体の還元キャピラリーゲル電気泳動の電気泳動図を示す図である。表６は、３つの突然変異体抗体の軽鎖及び重鎖の合計に関して、純度の結果を要約する表である。３つの突然変異体抗体の全ては少量の低分子量の不純物及び高分子量の不純物を含んでいた。ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄは比較的に最も低い不純物の含有量であり、軽鎖及び重鎖（ＬＣ＋ＨＣ）の合計に関するその純度は最も高かった。
【００７６】
【表６】
0006263778.tif 000007
【００７７】
実施例１８  ＧＢ２３５−０１９突然変異体抗体の示差走査熱量測定解析
突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）にそれぞれ供し、それぞれのＴｍ値（５０％の生物学的分子がその温度においてアンフォールド状態にあることを意味する、相転移温度）を決定した。実験条件は下記の通りである。１３０μｌの検出細胞容量を有するマイクロキャル（ＭｉｃｒｏＣａｌ）  ＶＰ−キャピラリー  ＤＳＣ示差走査熱量測定器（アメリカ合衆国、ＧＥ  Ｉｎｃ．）を使用した。３つの突然変異体抗体をＰＢＳ（０．０１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ＋０．００２Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４＋０．１４Ｍ  ＮａＣｌ＋０．００２Ｍ  ＫＣｌ，ｐＨ＝８．６）を用いて各々０．９ｍｇ／ｍＬに希釈した。ＰＢＳはブランク対照として使用し、温度変化を３０℃から９５℃へと設定し、スキャニング速度を６０℃／時に設定した。
【００７８】
図１３は３つのＧＢ２３５−０１９突然変異体抗体の示差走査熱量測定の測定図を示す。上記３つの分子のＴｍ１はさまざまである。ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３ＱのＴｍ１は比較的に最も低い値であるが、一方でＧＢ２３５−０１９Ｎ７３ＱのＴｍ１はＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの値と近い。Ｔｍ値が高ければ高いほどに、温度安定性は良い。Ｔｍ１の差異は突然変異がなんらかの効果をＣＨ２ドメインにいくらかの程度、及ぼしたことを意味している。ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５ＡはＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑよりもより良い温度安定性を有していた。
【００７９】
我々は以前、完全ヒトｓｃＦＶファージライブラリースクリーニング技術及び遺伝子エンジニアリング組み換え発現技術を用いて、抗ヒトＨＥＲ２（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）完全ヒトモノクローナル抗体ＧＢ２３５−０１９を取得した（中国特許出願第２０１４１０７０５４０４．０号を参照することができる）。ＧＢ２３５−０１９は濃度依存性及び飽和性の様式でヒトＨＥＲ２、サルＨＥＲ２及びマウスＨＥＲ２に結合することができたが、ヒトＨＥＲ１、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４抗原には結合することができなかった。ハーセプチンと組み合わせてのＧＢ２３５−０１９の投与は、ＨＥＲ３リガンドヘレグリン−αにより誘導されたＢＴ−４７４細胞のハーセプチンに対する抵抗性を反転することができ、ＧＢ２３５−０１９の別途投与は、ＨＥＲ３リガンドヘレグリン−αにより誘導されたＢＴ−４７４細胞におけるＨＥＲ３リン酸化の上方制御を阻害した。また、ハーセプチンと組み合わせてのＧＢ２３５−０１９の投与は、ペルツズマブと同様に、ＨＥＲ３リガンドヘレグリン−αにより引き起こされたＳＫ−ＢＲ−３細胞のハーセプチンに対する抵抗性を反転させることができた。ハーセプチンと組み合わせてのＧＢ２３５−０１９の投与は、マウスにおけるヒト乳がん（ＫＰＬ−４）異種移植片の成長を顕著に阻害した。ＧＢ２３５−０１９のＦａｂフレームワーク領域３におけるＡｓｎ７３は、Ｎ−グリコシル化部位であり、還元分子量の決定により、ＧＢ２３５−０１９  Ｆａｂ上には複雑な多糖鎖が存在していたことが見出された。ヒトＩｇＧ  ＦａｂのＮ−グリコシル化修飾は、抗体の抗原に対する結合機能における明らかな促進又は阻害効果を有するかもしれない。グリコシル化修飾が起きた場所におけるわずかな変化は、多糖鎖の続いて起こるプロセシング及び抗体の抗原に対する結合活性に対してまったく異なる効果を生じ、抗体産生プロセスにおける品質管理を複雑化させるかもしれない。３つの突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａは、ＧＢ２３５−０１９野生型抗体において点突然変異を施して得られたものである。３つの突然変異体抗体は、ＧＢ２３５−０１９野生型抗体の重鎖ＦａｂのＮ−連結グリカンについての特徴配列（Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）を変化させた。還元分子量の決定により、３つの突然変異体抗体は重鎖Ｆａｂにおいてグリコシル化されていないことが確認された。
【００８０】
免疫学的活性の同定により、突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａは、ヒトＨＥＲ２抗原に濃度依存的及び飽和性の様式で特異的に結合する能力を有することが明らかになった。突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａは、顕著な差異無く、ＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体のものと同様の結合能力を有していた。ハーセプチンと組み合わせた突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの各々の投与はヘレグリン−αにより誘導された増殖を阻害した。ハーセプチンと組み合わせた３つの突然変異体抗体の各々の投与は、ヘレグリン−αにより誘導されたＢＴ−４７４細胞の増殖を阻害するだけではなく、ヘレグリン−α誘導の前のものよりも低いレベルへの低下を、濃度依存的に著しく阻害した。３つの突然変異体抗体もまた、ＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体のものと同様の効果を、顕著な差異無く有していた。ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ突然変異体抗体を別途に投与すると、ヘレグリン−αにより誘導されたＢＴ−４７４細胞におけるＨＥＲ３リン酸化の上方制御を顕著に阻害し、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ突然変異体抗体の効果はＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体のものと同様であった。ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ突然変異体抗体及びＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体の各々を別途に投与すると、ヘレグリン−αにより誘導されたＢＴ−４７４細胞におけるＥＲＫ１／２リン酸化の上方制御を顕著に阻害し、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ突然変異体抗体の効果はＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体のものと同様であった。ＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体及び突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの各々を別途に投与すると、ヘレグリン−αにより誘導されたＭＣＦ７細胞におけるＨＥＲ３リン酸化の上方制御を著しく阻害し、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄはヘレグリン−αにより誘導されたＭＣＦ７細胞におけるＨＥＲ３リン酸化の上方制御を完全に反転させた。ＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体及び突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの各々を別途に投与すると、ヘレグリン−αにより誘導されたＭＣＦ７細胞におけるＡｋｔリン酸化の上方制御を著しく阻害した。ＧＢ２３５−０１９ＷＴ抗体及び突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの各々を別途に投与すると、ヘレグリン−αにより誘導されたＭＣＦ７細胞におけるＥＲＫ１／２リン酸化の上方制御を著しく阻害したが、それは３つの突然変異体抗体の生物学的活性をさらに確証した。上述のことをまとめると、本発明の抗体はＨＥＲ２陽性腫瘍の治療のみだけでなく、ＨＥＲ２陰性腫瘍の治療にも使用することができる。
【００８１】
我々は突然変異体抗体ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａの物理的及び化学的特性を解析した。分子サイズ排除クロマトグラフィーにより３つの突然変異体抗体の解析により、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ抗体の主要ピークの純度は８８．３％であり、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ抗体の主要ピークの純度は８９．７％であり、ＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａ抗体の主要ピークの純度は９３．１％であり、３つの突然変異体抗体の全ての主要ピークの純度は８５％より高いことが明らかになった。画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）により、それぞれの主要ピークの等電点（ｐＩ）及び３つの突然変異体抗体の荷電アイソマーの純度が明らかになった。３つの突然変異体抗体は、約９．４から９．６の範囲の測定等電点を有していた。ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄの等電点は、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａのものよりも約０．１低く、その主要ピークは比較的に最も高かった。還元キャピラリーゲル電気泳動解析（ｒＣＥ−ＳＤＳ）により、３つの突然変異体抗体のそれぞれの純度（軽鎖及び重鎖のパーセンテージの合計）が明らかになった。３つの突然変異体抗体の全ては少量の低分子量不純物及び高分子量不純物を有していた。ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄは比較的に最も低い不純物含有量であり、その純度は軽鎖及び重鎖の合計（ＬＣ＋ＨＣ）の観点で最も高かった。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により、３つの突然変異体抗体のそれぞれのＴｍ値（５０％の生物学的分子がその温度においてアンフォールド状態にあることを意味する、相転移温度）が明らかになった。３つの分子のＴｍ１はさまざまであった。ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３ＱのＴｍ１は比較的に最も低い一方で、ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３ＱのものはＧＢ２３５−０１９Ｓ７５Ａのものと近い値であった。Ｔｍ値が高ければ高いほど、より良い温度安定性である。Ｔｍ１についての差異は、突然変異がＣＨ２ドメインになんらかの効果を及ぼしたことを、ある程度示している。ＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｄ及びＧＢ２３５−０１９Ｓ７５ＡはＧＢ２３５−０１９Ｎ７３Ｑよりも良い温度安定性を有していた。
【図１Ａ】
0006263778.tif 000008
【図１Ｂ】
0006263778.tif 000009
【図２】
0006263778.tif 000010
【図３Ａ】
0006263778.tif 000011
【図３Ｂ】
0006263778.tif 000012
【図４】
0006263778.tif 000013
【図５Ａ】
0006263778.tif 000014
【図５Ｂ】
0006263778.tif 000015
【図５Ｃ】
0006263778.tif 000016
【図６】
0006263778.tif 000017
【図７Ａ】
0006263778.tif 000018
【図７Ｂ】
0006263778.tif 000019
【図８】
0006263778.tif 000020
【図９】
0006263778.tif 000021
【図１０】
0006263778.tif 000022
【図１１】
0006263778.tif 000023
【図１２】
0006263778.tif 000024
【図１３】
0006263778.tif 000025
【配列表】
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