(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アベルメクチン又はその類似体を発現する組換えストレプトミセスであって、
（１）不活性化された又は活性が低下されたaveD遺伝子を有し、不活性化された又は活性が低下されたaveAl遺伝子を有し、且つ機能性のmilAl遺伝子を有するか；または
（２）不活性化された又は活性が低下されたaveAl遺伝子を有し、且つ機能性のmilAl遺伝子を有し、
アベルメクチン又はその類似体がテンベルメクチン（tenvermectin）Ａ及びテンベルメクチンＢからなる群より選択され、前記組換えストレプトミセスがストレプトミセス・アベルミティリスである、
組換えストレプトミセス。
【請求項２】
請求項１に記載の組換えストレプトミセスの、テンベルメクチンＡ又はテンベルメクチンＢの生産における使用。
【請求項３】
テンベルメクチンＡ又はテンベルメクチンＢを生産する方法であって、請求項１に記載の組換えストレプトミセスを培養すること、および培養物の中からテンベルメクチンＡ又はテンベルメクチンＢを回収することを含む、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の組換えストレプトミセスを構築する方法であって、
（１）改質するストレプトミセス・アベルミティリスを提供する工程、及び、
（２）前記の改質するストレプトミセス・アベルミティリスにおけるaveAl遺伝子を不活性化させるか又はその活性を低下させ、前記改質するストレプトミセス・アベルミティリスへ機能性のmilAl遺伝子を取り入れる工程、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学及び微生物発酵の分野に属し、具体的には、アベルメクチン又はその類似体を発現する組換え微生物および前記の組換え微生物によりアベルメクチン又はその類似体を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アベルメクチン（avermectins）及びイベルメクチン（ivermectin）は優れた農薬及び動物用医薬品であって、最近30年に、広く使用されるようになっている。その中、アベルメクチンは、ストレプトミセス・アベルミティリス（Streptomyces  avermitilis）発酵による抗虫活性を有するマクロライド系誘導体であり、ストレプトミセス・アベルミティリス発酵産物の中から分離されたアベルメクチンが、一連の構造的に類似した、対になって存在している化合物からなり、A成分と、活性がA成分よりも高いB成分とを含むものである。構造的に、A成分は、アベルメクチンのマクロライド環におけるC5位上でメトキシ基であり、B成分では同じ位置がヒドロキシル基である。アベルメクチンB成分は、それぞれBlaとB1bと呼ばれる以下の構造を有する二つの対になっている化合物を含む。
【０００３】
【化１】
0006346673.tif 000002
【０００４】
市販のアベルメクチン農薬は、通常、主にアベルメクチンB1a及びB1bからなるアベルメクチン活性成分を含む。また、イベルメクチンは、アベルメクチンから構造改質して得られるものである。ただし、約30年の使用を経ており、薬剤耐性の問題があるため、近い将来に淘汰されることになろう。ミルベマイシン（milbemycin）はStreptomyces  milbemycinicusの発酵によって生産される1組の新世代のアベルメクチン類似体であって、その抗虫活性はアベルメクチン及びイベルメクチンよりも高いが、その毒性は両者よりもはるかに低い。
【０００５】
米国特許US4,134,973には、ミルベマイシンと13-ヒドロキシルミルベマイシンの炭水化物誘導体およびこれらを一連の化学反応によって調製する方法が開示され、これらの炭水化物誘導体が、抗虫活性を持つことが確認されている。しかしながら、これらの化学反応は、一連の複雑な過程の経過や特別な反応原料を必要とし、しかも、特異性が十分に強くないため一連の副産物が発生し、環境問題をもたらし、かつ生産コストを増加させてしまう。
【０００６】
このために、生合成方法によってアベルメクチン又はその類似体を生産する代替的な方法が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第US4,134,973号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Sambrook  J、Fritsh  E、Maniatis  T.Molecular  cloning：A  Laboratory  Manual.3rded、New  York：Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、2002.
【非特許文献２】Gust  B、Kiser  T、Chater  K  F  REDIRECT  Technology：PCR-targeting  systeminstreptomyces  coelicolor.Norwich：John  Innes  Centre.2002.
【非特許文献３】Kieser  T、Bibb  MJ、Buttner  MJ  et  al.Practical  Streptomyces  Genetics.Norwich：The  JohnInnes  Foundation、2000.
【非特許文献４】夏海洋、黄雋、胡敏杰等、規則的に配列されたストレプトミセス・アベルミティリスゲノムを構築したコスミドライブラリーの工業生産菌株の遺伝改質における使用、中国抗生物質雑誌、2009、34（7）：403-405.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の一側面は、アベルメクチン又はその類似体を発現する組換えストレプトミセスであって、前記の組換えストレプトミセスは、
（1）不活性化された又は活性が低下されたaveD遺伝子を有する；および/または
（2）不活性化された又は活性が低下されたaveAl遺伝子を有し、且つ機能性のmilAl遺伝子を有する、組換えストレプトミセスを提供する。
【００１０】
本発明は、一実施形態において、組換えストレプトミセスがストレプトミセス・アベルミティリスであり、ストレプトミセス・アベルミティリスAD28又はストレプトミセス・アベルミティリスMA220が好ましく、ストレプトミセス・アベルミティリスMA220がより好ましい。
【００１１】
別の実施形態において、PCRターゲティング（PCR targeting）技術によりaveD遺伝子を不活性化された又はその活性を低下させる。
【００１２】
別の実施形態において、ストレプトミセスゲノムにおけるaveAl遺伝子を機能性のmilAl遺伝子を用いて取換えして、aveAl遺伝子を不活性化された又はその活性を低下させ、前記のストレプトミセスが機能性のmilAl遺伝子を獲得する。具体的な実施形態中に、この取換えは、細胞内で遺伝子組換えすることによって実現されている。
【００１３】
面は、本発明の組換えストレプトミセスの、アベルメクチン又はその類似体の生産における用途を提供する。
【００１４】
一実施形態において、前記のアベルメクチン又はその類似体はアベルメクチンBla及びアベルメクチンBlbである。別の実施形態において、前記のアベルメクチン又はその類似体はtenvermectinであって、具体的には、tenvermectin A及びtenvermectin Bである。
【００１５】
本発明の第三の側面は、請求項1又は2に記載の組換えストレプトミセスを培養すること、および培養物の中からアベルメクチン又はその類似体を回収することを含む、アベルメクチン又はその類似体を生産する方法を提供する。
【００１６】
一実施形態において、前記のアベルメクチン又はその類似体がアベルメクチン成分B1a及びB1bである。別の実施形態において、前記のアベルメクチン又はその類似体がtenvermectinであって、具体的には、tenvermectin A及びtenvermectin Bである。
【００１７】
本発明の第四の側面は、請求項1又は2に記載の組換えストレプトミセスを構築する方法であって、前記の方法は、
（1）改質するストレプトミセスを提供する工程を含み、さらに、下記の工程の少なくとも1つの工程を含む方法：
（2）前記の改質するストレプトミセスにおけるaveD遺伝子を不活性化された又はその活性を低下させる工程；及び（3）前記の改質するストレプトミセスにおけるaveAl遺伝子を不活性化された又はその活性を低下させ、前記の改質するストレプトミセスへ機能性のmilAl遺伝子を取り入れる工程。
【００１８】
一実施形態において、前記の改質するストレプトミセスがストレプトミセス・アベルミティリスであり、ストレプトミセス・アベルミティリスMA-4680が好ましい。
【００１９】
別の実施形態において、工程（2）中にPCRターゲティング（PCR targeting）技術によりaveD遺伝子を不活性化された又はその活性を低下させる。
【００２０】
別の実施形態において、工程（3）中に、ストレプトミセスゲノムにおけるaveAl遺伝子を機能性milAl遺伝子を用いて取換えて、aveAl遺伝子を不活性化された又はその活性を低下させ、前記のストレプトミセスが機能性のmilAl遺伝子を獲得するようにする。
【００２１】
また、本発明の第五の側面は、本発明に記載の方法によって得られたアベルメクチン又はその類似体の、殺虫剤としての用途を提供する。
【００２２】
本開示内容には、保護要求される幾つかの具体的な実施形態について単に例を挙げて説明したが、その中に、1つまたは複数の実施形態に記載の1つまたは複数の技術的特徴は、1つまたは複数の任意な他の実施形態と組み合わせてもよく、これらを組み合わせて得られた技術案は本出願の保護の範囲内にあり、これらを組み合わせて得られた技術案が具体的に本開示内容に記載したことにする。
【００２３】
上記の少なくとも1つの側面によって、本発明の組換えストレプトミセスは、アベルメクチン又はその類似体を効率良く生産することができる。アベルメクチンの生産に用いた場合に、特異的にアベルメクチンBla及びBlbを生産して、基本的にアベルメクチンA成分を含まないか、あるいは、含まれるアベルメクチンA成分の含有量を大幅に削減することができる。アベルメクチン類似体の生産に用いる場合に、前記のアベルメクチン類似体はenvermectinであってもよく、その中に前記のtenvermectinがtenvermectin A及びtenvermectin Bが含まれる。なお、本発明は、組換えストレプトミセスを構築するときに、PCRターゲティング技術によってaveD遺伝子を効率良く不活性化できる。本発明の組換えストレプトミセスの発酵によって生産されたアベルメクチン又はその類似体が安定性がよく、収率が高く、化学合成方法と比較してより環境に優しく簡単で、また、生産コストが大幅に削減される。しかも、本発明の方法で得られたアベルメクチン又はその類似体は著しく良好な抗虫活性を有する。
【００２４】
本開示内容では、保護要求される幾つかの具体的な実施形態について単に例を挙げて説明するが、その中で、1つまたは複数の実施形態に記載の1つまたは複数の技術的特徴は、1つまたは複数の任意な他の実施形態と組み合わせてもよく、これらを組み合わせて得られた技術案は本出願の保護の範囲内にあり、これらを組み合わせて得られる技術案は、具体的に本開示内容に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
以下に本発明について例を挙げて添付の図面と更なる詳細な説明と関連して説明する。なお、以下の説明は、単に本発明が保護要求する技術案の例示に過ぎず、これらの技術案を限定するものではない。本発明の範囲は、添付の特許請求書に記載の内容を基準とする 。
【００２６】
図1：Streptomyces  milbemycinicus体内組み換え系を利用して組換えプラスミドを構築する模式図である；
図2：組換えプラスミドpUAmT14の物理地図である；
図3：組換えプラスミドpUAmT-kaveDの物理地図である；
図4：出発菌株であるストレプトミセス・アベルミティリスMA-4680aveD遺伝子を不活性化する過程の模式図である；
図5：発酵液のHPLCの図である。Aが出発菌株MA-4680の発酵液の図であり、Bが遺伝子工学菌AD28の発酵液の図である；
図6：組換えプラスミドpMA13aadMADの構築流れ図である；
図7：出発菌株であるStreptomyces  milbemycinicus  HS023から3-22#菌株までのゲノム変化の模式図である；
図8：組換えプラスミドpUAmT-MA15AA1Uの構築流れ図である；
図9：ave4l遺伝子の上流断片を3-22#菌株ゲノムに挿入する模式図である；
図10：組換えプラスミドpUAmT-AMAの構築流れ図である；
図11：遺伝子工学菌AD28からMA220までのゲノム変化の過程図である；
図12：遺伝子工学菌AD28及びMA220の発酵産物の比較である。Aが遺伝子工程菌MA220の発酵サンプルのHPLCの図であり、Bが遺伝子工学菌AD28の発酵サンプルのHPLCの図である；
図13：tenvermectin Aの質量スペクトルである；
図14：CDCl3中に溶解されたtenvermectin Aの1H-NMRスペクトルである；
図15：CDCl3中に溶解されたtenvermectin Aの13C-NMRスペクトルである；
図16：CDCl3中に溶解されたtenvermectin AのDEPT135図である；
図17：tenvermectinBの質量スペクトルである；
図18：CDCl3中に溶解されたtenvermectin Bの1H-NMRスペクトルである；
図19：CDCl3中に溶解されたtenvermectin Bの13C-NMRスペクトルである；
図20：CDCl3中に溶解されたtenvermectin BのDEPT135図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書で使用される用語は、先行技術中の当該用語と同じ意味を持っている。以下、使用される用語の意味を明らかに示すために、いくつかの用語は本出願における具体的な意味を示す。以下の定義がこの用語の一般的な意味と矛盾が生じた場合には、以下の定義が優先するものとする。
【００２８】
本明細書で使用されるように、「機能的遺伝子」とは、宿主生物でその機能を発揮することができる遺伝子を意味する。例えば、前記の遺伝子が1種または複数種の酵素をコードしている場合、宿主生物は前記の1種または複数種の酵素を発現することができ、前記の1種または複数種の酵素の活性を検出し、かつ宿主生物に前記の酵素の機能を実行することができる。相応に、「機能性を有する遺伝子」とは、宿主生物に前記の遺伝子を含み、かつこの遺伝子がこの宿主生物中でその機能を発揮することを意味する。この場合は、宿主生物は、機能的遺伝子の必要な部分のみを含んでも良く、この必要な部分が当該宿主生物を前記の機能的遺伝子の機能を発現させることができるものであれば良い。
【００２９】
本明細書で使用されるように、「遺伝子を不活性化された又は活性を低下させ」とは、特定処理なしの対照に比べて、特定処理した後の遺伝子がその機能を失っているか、或いはその機能が低減されており、宿主生物中にこの遺伝子の活性を発現することができない、或いは発現されたこの遺伝子の活性が低いことを意味する。この不活性化された又は活性の低下は多くの理由によって引き起こされる。例えば、遺伝子欠失、遺伝子突然変異、アンチセンス阻害、遺伝子サイレンシング、阻害剤の添加等による遺伝子不活性化された又は活性の低下であってもよい。
【００３０】
本明細書で使用されるように、「アベルメクチン又はその類似体」とは、アベルメクチン又は類似の構造を有するマクロライド系抗虫化合物を言う。これらにはアベルメクチン、イベルメクチン、ミルベマイシン、tenvermectin等が含まれるが、これらに限定されるものではない。具体的には、アベルメクチン又はその類似体はアベルメクチンBla及びBlb、tenvermectin、或いはtenvermectinA及びBであってもよい。
【００３１】
アベルメクチン及びイベルメクチン（ivermectin）は優れた農薬及び動物用医薬品であって、最近30年に、広く使用されるようになっている。イベルメクチンはアベルメクチンから構造改質を経て得られるものである。ただし、約30年の使用を経ており、薬剤耐性の問題があるため、近い将来に淘汰することになる。したがって、対応する代替製品を必要とする。ミルベマイシン（milbemycin）はStreptomyces  milbemycinicus（Streptomyces  milbemycinicus）の発酵によって発生される1組の新世代のアベルメクチン類似体であって、その抗虫活性がアベルメクチン及びイベルメクチンよりも高いが、その毒性は両者よりもはるかに低い。アベルメクチンBlaとBlb及び相応するイベルメクチン及びミルベマイシンの構造を例とすると、ミルベマイシンとアベルメクチン及びイベルメクチンとは、構造的に違いが小さく、3つだけの位置で異なっており、具体的には以下のとおりである。
【００３２】
【化２】
0006346673.tif 000003
【００３３】
これより、イベルメクチンとアベルメクチンとの違いはC22-23位（構造式中に2に示すように）の単結合と二重結合だけであるが、イベルメクチンの方がアベルメクチンよりも抗虫活性が高い。ミルベマイシンとアベルメクチンとの構造の違いはC25位（構造式中に1に示すように）の基と、C22-23位及びC13位（構造式中に3に示すように）にあるものである。上述したように、ミルベマイシンはアベルメクチンに対して優越性を持つため、アベルメクチンの構造を改質して、これをミルベマイシンに近接させながらその自身のいくつかの特性、例えはC13位の二糖を保留して、アベルメクチンの活性及び毒性を改善することが考えられる。
【００３４】
具体的には、ミルベマイシンのマクロライド環上でC13位に二糖構造を連接すると、以下のような構造を有する13-ヒドロキシルミルベマイシンの炭水化物誘導体が得られる。
【００３５】
【化３】
0006346673.tif 000004
【００３６】
本開示において、このような炭水化物誘導体はtenvermectinと呼ばれ、その2種の成分がそれぞれtenvermectin A及びtenvermectin Bと呼ばれる。
【００３７】
多量の検討努力により、本発明者らは、ストレプトミセスゲノムにおいて、ミルベマイシン生合成経路中にC22-C25位構造の役割を負うmilAl遺伝子を用いて、アベルメクチン生合成経路中の相応する部分（即ちaveAl遺伝子）を置換することにより、本発明が望まれるアベルメクチン類似体（即ちtenvermectinであり、tenvermectinA及びBを含む）が得られることを見出した。
【００３８】
本発明者らは、いずれの理論にも限定されず、本発明の技術案は新しい生合成経路を設計したが、この新しい経路はアベルメクチン生合成経路及びミルベマイシン生合成経路の両方を組み合わせて利用したものである。アベルメクチン発生菌のうち、アベルメクチン生合成中のマクロライド環のC22-C25位構造合成に役割を負うaveAl遺伝子を、ミルベマイシン生合成経路中に相応する位置の合成に役割を負うmilAl遺伝子に置換することにより、完全に生合成経路を経て本発明のアベルメクチン類似体（即ちtenvermectin）を得た。
【００３９】
アベルメクチン及びミルベマイシンはいずれもマクロライド系化合物に属し、その主体構造はともに生体内にポリケチドシンターゼ経路（PKS経路）を経て発生されたものである。両方が類似の主体構造を持ち、そのPKSの構造も似ている。
【００４０】
例えば、アベルメクチンのC22-25位における構築はローディングエリア（LD）、モジュール1（SU1）及びモジュール2（SU2）を含むaveAl遺伝子（GenBank：AB032367.1）によるものである。ローディングエリアがC25位のグループ構造を担当し、モジュール1がC23-24位の構造を担当し、モジュール2がC23位の還元程度を担当する。相応に、ミルベマイシンのC22-25位における構造はローディングエリア（LD）、モジュール1（SU1）及びモジュール2（SU2）を含むmilAl遺伝子（GenBank：NC_016582.1（1146684..1159715））によるものである。
【００４１】
しかしながら、具体な新生合成経路の設計中に、遺伝子置換を達成するために、遺伝子置換を構築するための組換えプラスミドを必要とする。置換されたaveAl遺伝子の大きさが約12kbであり、置換のmil4l遺伝子の大きさが約13kbである。このような大きな断片について、酵素消化やPCR等の従来の手段にて組換えプラスミドの構築を完了することは困難であり、これは、断片が大きすぎるので、適切に動作できる単一の消化部位を見つけることは困難であり、PCRによってそのような大きな断片を増幅させると、増幅効率が低い一方、突然変異が導入されやすいためである。本発明者らは、細胞内遺伝子組換え技術を用いることにより、このような大きな断片の置換を達成することができ、置換したmilAl遺伝子を保留して正常に機能することができることを見出した。
【００４２】
また、アベルメクチンにはA及びBの2類成分があり、B成分の活性がA成分よりも高い。これは、B成分のC5位がヒドロキシル基で、A成分のC5位がオキシメチル基であるからである。A成分の含有量が低下され又は基本的にA成分が含まれないアベルメクチンを得ることが期待されている。例えば、得られたアベルメクチンは主にアベルメクチンB1a及びBlbからなる。
【００４３】
多大な検討努力により、本発明者らは、アベルメクチン発生菌中にaveD遺伝子を不活性化する又はその活性を低下させることにより、A成分を大幅に低減又は更に実質的に発生させないことができることを見出した。いずれの理論に限定されずに、本発明者らは、これは、aveD遺伝子（GenRank：AB032524.1）コードのC5-オキシメチル基転移酵素がメチル基をB成分のC5位ヒドロキシル基に転移することによって、アベルメクチンB成分をA成分に変換することができると考えた。aveD遺伝子を不活性化又はその活性を大幅に低下させることにより、この代謝過程を抑制又はさらに不活性化することができるので、アベルメクチンA成分の発生を抑制し、そして相応に主にアベルメクチンB成分（Bla及びBlb）からなるアベルメクチン発酵産物を得た。よって、本発明は、aveD遺伝子を不活性化してA成分の発生を遮断することによって、アベルメクチンの活性を増強しながらその毒性を減少する技術案を提供する。
【００４４】
実施例1  組換えストレプトミセス・アベルミティリス菌株MA220の構築
【００４５】
1.ストレプトミセス・アベルミティリス及びStreptomyces  milbemycinicusゲノムDNAの抽出：
【００４６】
a）それぞれにストレプトミセス・アベルミティリスMA-4680（Streptomyces  avermitfilisMA-4680.ATCC No.31267）及びStreptomyces milbemycinicus HS023（Streptomyces  milbemycinicus  HS023.CGMCCNo.7677）の胞子を30ml  TSB培地（Tryptic  Soy  Broth、BD会社番号211822）に接種して、30℃、220rpmにて30-48h培養した。
【００４７】
b）菌糸体を遠心分離、収集して、滅菌水で2回洗浄した後、菌糸体の体積の4倍量のリゾチーム溶液（10.3％スクロース、10mMTris-HCl、pH8.0、4mg/mlリゾチーム）に懸濁させ、37℃で1-2h水浴した。
【００４８】
c）1/10の体積の10％SDS溶液を添加し、20mg/mlのプロテイナーゼK溶液を加えて最終濃度100μg/mlとして、37℃で30min-1h水浴した。
【００４９】
d）等体積のフェノール-クロロホルム溶液（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝25：24：1、pH8.0）を加えて2回抽出した。
【００５０】
e）上清に1/10体積の3M  NaAc-HAc溶液（pH5.3）、および等体積のイソアミルアルコールを加えて、12000rpmにて5min遠心分離してゲノムDNAを沈殿させた。
【００５１】
f）沈殿を70％エタノールで2回洗浄し、室温で乾燥した後、20μg/ml  RNaseを含む10mM  Tirs-HCl溶液（pH8.0）で溶解させて、ゲノムDNA溶液を得た。
【００５２】
2.キャリア  pUAmT14の構築：
【００５３】
プラスミド  pIJ773（Plant  Bioscience  Limited、Norwich、UKより；GustB、etal.、PCR-targeted  Streptomyces  gene  replacement  identifies  aprotein  domain  needed  for  biosynthesis  of  the  sesquiterpene  soil  odorgeosmin.（2003）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  100（4）：1541-1546；及びGust  B、etal.、REDIRECT  Technology：PCR-targeting  system  in  streptomyces  coelicolor.Norwich：John  Innes  Centre.（2002）を参照）をXbaI（TaKaRa）及びBstBI（TaKaRa）で説明書に従って二重消化し、電気泳動してaac（3）IV遺伝子及びoriTを含む1271bp断片を回収し、BKLキット（TaKaRa）で説明書に従ってブラントエンド化して断片1を得た。pUC19キャリアをDraI（TaKaRa）及びSspI（TaKaRa）にて説明書に従って二重消化して、電気泳動して1748bpのキャリア断片を回収して、断片2を得た。断片1と断片2とを接続して（TaKaRaのSolutionI溶液で説明書に従って操作した、以下同じ）、組換えプラスミドpUAmT14を得た。pUAmT14の物理地図を図2に示す。
【００５４】
3.ストレプトミセス・アベルミティリスaveD遺伝子を不活性化するための組換えプラスミドpUAmT-kaveDの構築：
【００５５】
Cosmid6-9（参考文献4：夏海洋、黄雋、胡敏杰等、規則的に配列されたストレプトミセス・アベルミティリスゲノムを構築したコスミドライブラリーの工業生産菌株の遺伝改質における使用、中国抗生物質雑誌、2009、34（7）：403-405を参照）に含まれるDNA断片はStreptomyces  avermitilis  MA-4680ゲノムの第1124992-1167304位の塩基位置にあるものである。PCR  targeting技術を利用してaveD遺伝子の第442-521位にある塩基断片（SEQ  ID  NO：1）を取り出し、FLP組換え酵素により耐性遺伝子カセットを除去して、81bpが新たな配列（SEQ  ID  NO：2）に置換された組換えプラスミド6-9kaveDを得た。基本的に文献に記載の方法に従ってPCRターゲティングを実施した（GustB、etal.、PCR-targeted  Streptomyces  gene  replacement  identifies  a  protein  domain  needed  for  biosynthesis  of  the  sesquiterpene  soil  odor  geosmin.（2003）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  100（4）：1541-1546；及びGust  B、etal.、REDIRECT  Technology：PCR-targeting  system  in  streptomy  cescoelicolor.Norwich：John  Innes  Centre.（2002）を参照）。具体的な過程は以下のとおりである。
【００５６】
a）PCRプライマーの設計：5′端の39bpがaveD遺伝子の第403-441位の塩基と同じ、3′端の20bpがテンプレートの耐性遺伝子カセットの「左腕」であるプライマーaveD59（SEQ  ID  NO：3）を設計した；5′端の39bpがaveD遺伝子の第522-560位の塩基と逆相補し、3′端の20bpがテンプレートの耐性遺伝子カセットの「右臂」であるプライマーaveD58（SEQ  ID  NO：4）を設計した（「左腕」及び「右臂」が固定配列であり、GustB、KiserT、Chater  K  F.REDIRECT  Technology：PCR-targeting  system  in  streptomyces  coelicolor.Norwich：JohnInnesCentre.2002、第6頁を参照）。
【００５７】
b）PCR増幅耐性遺伝子カセット：プラスミドpIJ773をテンプレートとしてPCR増幅を行った。PCRで使用したのは、TaKaRa会社のPrimeSTAR  DNAポリメラーゼである。
以下の反応液を調製する：
プライマーaveD59（25μM）                              0.5μl
プライマーaveD59（25μM）                              0.5μl
プラスミドpIJ773                                       0.2μl(約10ng)
5×PrimeSTAR  緩衝液                                   10μl
dNTPs（各25mM）                                        4μl
PrimeSTAR ポリメラーゼ（2.5U/μl）                     0.5μl
再蒸留水                                               34μl
PCR反応プログラム：
94℃、2min、
（98℃×10sec、50℃×45sec、72℃×1min30sec）×10cycles、
（98℃×10sec、68℃×1min30sec）×15cycles、
72℃×2min、16℃×1min。
PCR産物がアガロースゲル電気泳動により、標の断片約1.4kbをゲル抽出し、ゲル抽出キット（TaKaRa）で説明書に従って回収した。
【００５８】
c）ライブラリープラスミドの大腸菌BW25113/pIJ790への転化：大腸菌BW25113/pIJ790のシングルコロニーをクロロマイセチン25μg/mlを含むLB培地（トリプトン1.0％、酵母粉0.5％、NaCl0.5％、グルコース0.1％）10mlに接種した後、30℃、250rpmで一晩振とう培養した（14-18h、以下同じ）。一夜越した菌液100μlを取ってクロロマイセチン25μg/mｌを含むSOB培地（トリプトン2.0％、酵母粉0.5％、NaCl0.05％、250mmol/L  KCl溶液を1リットル当たり10ml添加した。使用前に、滅菌された2mol/L  MgCl2を1リットル当たり5ml添加した）10mlに移して、30℃で、250rpmにてOD600が0.4程度までに3-4h培養した。4℃下で、4000rpmにて5min遠心分離し菌体を収集し、氷予冷した10％グリセリン10mlで2回洗浄し、沈殿を氷予冷した10％グリセリン100μlで懸濁沈殿させて、エレクトロポレーションコンピテントにした。コンピテント細胞50μl中にライブラリープラスミドcosmid6-9を約100ng（2-3μl）添加して、氷で予冷した0.2cmキュベット中に電気変換を行う。電気ショックパラメータ：200Ω、25μF、2.5kV。電気ショックの持続時間を4.5-4.9ms間とする。電気ショックした後、直ぐに氷で予冷したLB培地1mlに加えて、30℃で1h振とう培養した。転化液50μlを取って100μg/mlカルベニシリン、50μg/mlカナマイシン及び25μg/mlクロロマイセチンを含むLB平板（1.5％寒天粉を含むLB培地）に塗布して、30℃で一晩培養してシングルコロニーを成長させた。
【００５９】
d）ライブラリープラスミドのPCR  targeting：ランダムにライブラリープラスミドcosmid6-9を含む大腸菌BW25113/pIJ790シングルコロニーをピックして100μg/mlカルベニシリン、50μg/mlカナマイシン及び25μg/mlクロロマイセチンを含むLB培地10mlに接種し、30℃で、250rpmにて一晩振とう培養した。一夜越した菌液100μlを取って100μg/mlカルベニシリン、50μg/mlカナマイシン、25μg/mlクロロマイセチン及び10mML-アラビノースを含むSOB培地10mlに移して、30℃で、250rpmにて振とう培養して、工程c）の方法によってエレクトロポレーションコンピテントに調製した。50μlコンピテント細胞中に工程b）で得られたPCR産物の回収液約100ng（2-3μl）を添加して、氷予冷した0.2cmキュベット中で電気ショックを行った。電気ショックパラメータ：200Ω、25μF、2.5kV。電気ショックの持続時間を4.5-4.9ms間とした。直ぐに予冷したLB培地1mlに加えて、30℃で1h振とう培養した。簡単な遠心分離をした後、上清の大部分を除去し、残留した上清で沈殿を懸濁させ、全量を100μg/mlカルベニシリン、50μg/mlカナマイシン及び50μg/mlアプラマイシンを含むLB平板に塗布して、37℃で一晩培養した。シングルコロニーを採取して100μg/mlカルベニシリン、50μg/mlカナマイシン及び50μg/mlアプラマイシンを含むLB培地3ml中に移し、37℃で、250rpmにて6h程度振とう培養し、Axygen小量プラスミド抽出キットで説明書に従ってプラスミドを抽出し、かつ制限エンドヌクレアーゼで消化検査をして、正確なプラスミドを選別して組換えプラスミド6-9daveDを得た。
【００６０】
e）FLPを用いた耐性遺伝子及びoriTの去除：大腸菌DH5α/BT340を25μg/mlクロロマイセチンを含むLB培地10mlに接種し、30℃で、250rpmにて一晩振とう培養した。工程c）の方法によってエレクトロポレーションコンピテントを調製する。50μlコンピテント細胞中に工程d）で得られた組換えプラスミド6-9daveD約100ng（1-2μl）を添加して、氷予冷した0.2cmキュベット中で電気ショックを行った。電気ショックパラメータ：200Ω、25μF、2.5kV。電気ショックの持続時間を4.5-4.9ms間とした。直ぐに予冷したLB培地1mlに加えて、30℃で1h振とう培養した。50μl転化液をとって50μg/mlアプラマイシン及び25μg/mlクロロマイセチンを含むLB平板に塗布して、30℃で48h培養してシングルコロニーを成長させた。シングルコロニーをランダムに、抗生物質を含まないLB平板上にピックして、線を引いてシングルコロニーを分離させて、42℃で一晩培養して、FLP組換え酵素を発現させ、かつその後にプラスミドBT340を喪失させた。20-30個のシングルコロニーをピックしてそれぞれに50μg/mlアプラマイシンを含むLB平板及び50μg/mlカナマイシンを含むLB平板上に播種して、37℃で一晩培養した。アプラマイシンに感受性でカナマイシンに非感受性のクローンが耐性遺伝子カセットを去除した標的クローンである。標的プラスミドをピックしてクローンを抽出し、制限エンドヌクレアーゼで正確なプラスミドを消化し、選別して組換えプラスミド6-9kaveDを得た。
【００６１】
組換えプラスミドpUAmT-kaveDの構築：組換えプラスミド6-9kaveDをClaI（TaKaRa）及びBstBI（TaKaRa）で説明書に従って二重消化を行って、6984bp断片を回収し、BstBI消化されかつ脱リン酸化（即ち消化反応液中に直接にFastAP（Fermentas）1μlを加えて、37℃で5-10min水浴する、以下に同じ）のキャリアpUAmT14と接続して、組換えプラスミドpUAmT-kaveDを得た。この物理地図を図3に示す。
【００６２】
4.ストレプトミセス・アベルミティリスMA-4680aveD遺伝子の不活性化：
【００６３】
a）属間接合（intergeneric conjugation）の方法による組換えプラスミドpUAmT-kaveDのストレプトミセス・アベルミティリスMA-4680への導入：大腸菌ET12567（pUZ8002）に転化して、工程3-c）に記載の方法によってエレクトロポレーションコンピテント（培養温度：37℃、培地における抗生物質最終濃度：クロロマイセチン25μg/ml、カナマイシン25μg/ml）を調製し、50μlコンピテント細胞中に組換えプラスミドpUAmT-kaveDを約100ng（1-2μl）を添加して、0.2cm氷予冷したキュベット中に電気変換を行う。電気ショックパラメータ：200Ω、25μF、2.5kV。電気ショックした後、直ぐに氷予冷したLB培地1mlに加えて、37℃で1h振とう培養した。50μl転化液をとって、50μg/mlアプラマイシン、100μg/mlカルベニシリン、50μg/mlカナマイシン及び25μg/mlクロロマイセチンを含むLB平板に塗布して、37℃で一晩培養した。ランダムに1つの形質転換体をピックして、25μg/mlクロロマイセチン、100μg/mlカルベニシリン、50μg/mlカナマイシン及び50μg/mlアプラマイシンを含むLB培地10mlに接種し、37℃、250rpmにて一晩振とう培養した。一夜越した菌液100μlを、25μg/mlクロロマイセチン、50μg/mlカナマイシン及び50μg/mlアプラマイシンを含有する新鮮なLB培地10mlに移して、37℃、250rpmにてOD600が0.4程度までに振とう培養した。LB培地10mlで2回洗浄し、LB培地1mlに懸濁させる。500μl菌液を取って、500μl  2×YT培地（トリプトン1.6％、酵母粉1.0％、NaCl0.5％）に懸濁され、かつ50℃の熱ショックを10min経た約108個の細胞のストレプトミセス・アベルミティリスMA-4680胞子と混合させ、簡単に遠心分離した後、上清の大部分を除去し、残留した上清で細胞を懸濁させ、MgCl2を10mM含むMS平板（大豆ミール2％、マンニトール2％、寒天粉2％）に塗布して、30℃で16-20h培養した。0.5mgナリジクス酸（nalidixi  cacid）及び1.25mgアプラマイシンを含有する滅菌水を平板上に覆って、30℃で培養を5日間以上継続して形質転換体を成長させた。
【００６４】
b）aveD遺伝子不活性化突然変異株の選別：形質転換体を、20μg/mlのナリジクス酸及び25μg/mlアプラマイシンを含むYMS（酵母エキス0.4％、可溶性澱粉0.4％、麦芽エキス1.0％、寒天粉1.8％）平板上で1回継代した後に、さらに抗生物質を含まないYMS平板上で二回継代して、シングルコロニーを単離させた。シングルコロニーがそれぞれに25μg/mlアプラマイシンを含むこと及び抗生物質を含まないYMS培地上で培養して、アプラマイシンに敏感な菌株を選別した。選別したアプラマイシン感受性株が本実施例の工程1の方法によってゲノムDNAを抽出し、それぞれにプライマーaveDF（SEQ  ID  NO：5）/aveDR（SEQ  ID  NO：6）及びaveDF（SEQ  ID  NO：5）/aveDM（SEQ  ID  NO：7）を利用してrTaqDNAポリメラーゼ（TaKaRa、以下に同じ）で説明書に従ってPCR検査する。前者が1094bpを増幅できるが後者が標的バンドに増幅できないものは標的菌株である。番号がAD28の菌株をさらなる遺伝子組み換えの標的菌株として選別する。出発菌株ストレプトミセス・アベルミティリスMA-4680aveD遺伝子の不活性化の過程を図4に示す。
【００６５】
5.遺伝子工学菌AD28の発酵の検証：AD28シングルコロニーを種培地（トウモロコシ澱粉2.5％、大豆ミール0.8％、ピーナッツミール1％、酵母粉0.95％、CoCl20.003％、pH7.2-7.4）に接種し、28℃、250rpm、40hにて培養した。6％の接種量で発酵培地（トウモロコシ澱粉14％、アミラーゼ0.003％、大豆ミール2.0％、酵母粉1％、ゼオライト粉0.2％、MnSO4  0.0024％、Na2MoO4  0.0024％、CoCl2・6H2O  0.002％、pH7.2-7.4）に移して、28℃、250rpmにて8日間培養した。発酵液1mlを取って、無水メタノール4mlを加えて浸漬し、超音波1時間した後に濾過する。濾液を直接にHPLC分析に使用した。HPLC分析の条件：カラム：C18  Hypersil  ODS2  4.6×250×5（大連エリート）；移動相：メタノール：エタノール：水＝81：7：12；流速：1ml/min；吸収波長：240nm。結果を図5に示す。Aが出発菌株MA-4680の発酵液のHPLC図であり、Bが遺伝子工学菌AD28の発酵液のHPLC図である。その結果、遺伝子工学菌AD28が発酵によってアベルメクチンA成分が産生されないことを示した。
【００６６】
6.Streptomyces  milbemycinicus  milAl遺伝子の下流断片を置換するための組換えプラスミドpMA13aadMADの構築：Streptomyces  milbemycinicus  HS023ゲノムDNAをテンプレートとして、プライマーMA13F1（SEQ  ID  NO：8）及びMA13R2（SEQ  ID  NO：9）を利用してPrimeSTAR  DNAポリメラーゼ（TaKaRa、以下に同じ）で説明書に従ってPCR反応を行って、3212bpの標の断片3を得た。組換えプラスミドpUAmT14がSma  Iで消化された後に、FastAPで脱リン酸化し、BKLキット処理された断片3と接続して、組換えプラスミドpUAmT-MA13′を得た。Streptomyces  milbemycinicus  HS023ゲノムDNAをテンプレートとして、プライマーMA1DF3（SEQ  ID  NO：10）及びMA1DR4（SEQ  ID  NO：11）を利用してPrimeSTAR  DNAポリメラーゼでPCR反応を行って、3268bpの断片4を得た。組換えプラスミドpUAmT-MA13′がEcoRV（TaKaRa）で消化された後、FastAPで脱リン酸化し、BKLキット処理された断片4と接続して、組換えプラスミドpMD-MA1Dを得た。組換えプラスミドpUAmT-MA13′を、HindIII+NsiIで説明書（TaKaRa）に従って二重消化し、6199bp断片をゲルエクストラして断片5を得た；組換えプラスミドpMD-MA1DがHindIII+NsiIで二重消化し、3258bp断片をゲルエクストラして断片6を得た。断片5と断片6とを接続して組換えプラスミドpUAmT-MA13Dを得た。ストレプトミセス・アベルミティリスMA-4680ゲノムDNAをテンプレートとして、プライマーAA1DF9（SEQ  ID  NO：12）及びAA1DR10（SEQ  ID  NO：13）を利用してPrimeSTAR  DNAポリメラーゼでPCR反応を行って、3266bpの断片7を得た。組換えプラスミドpUAmT-MA13DをNsiI（TaKaRa）で説明書に従って消化した後に回収し、BKLキットで処理して、反応産物がFastAPで脱リン酸化してからさらにBKLキット処理された断片7と接続して、Streptomyces  milbemycinicus  milAl遺伝子の下流断片を置換するための組換えプラスミドpMA13aadMADを得た。構築過程を図6に示す。
【００６７】
7.Streptomyces  milbemycinicus  milAl遺伝子の下流断片の置換：工程4-a）に記載の接合転移方法によって、組換えプラスミドpMA13aadMADをStreptomyces  milbemycinicus  HS023に転化する。形質転換体が抗生物質を含まない選別2回をした継代後に、つまようじでシングルコロニーをピックし、それぞれに25μg/mlアプラマイシンを含む及び抗生物質を含まないYMS平板上に28℃で5-6d培養した。アプラマイシンを含むYMS培地上で成長せずアプラマイシンを含まないYMS培地上で成長するシングルコロニーを選択してYMS培地上で拡大培養しながら、工程1の方法によってゲノムDNAを抽出し、プライマーmilDF11（SEQ  ID  NO：14）及びmilDR12（SEQ  ID  NO：15）を利用してrTaqDNAポリメラーゼでPCR検査する。PCR産物が3825bpのは標的菌株であり、PCR産物が1467bpであるのは復帰突然変異株である。選別結果より、3-22#菌はmilAl遺伝子の下流断片が成功に置換されたStreptomyces  milbemycinicusであって、さらなる操作の標的菌株として使用する。出発菌株HS023から3-22#菌株までのゲノム変化を図7に示す。
【００６８】
8.Streptomyces  milbemycinicus  milAl遺伝子の上流にストレプトミセス・アベルミティリスAD28のaveAl遺伝子の上流断片を挿入するための組換えプラスミドpUAmT-MA15AA1Uの構築：Streptomyces  milbemycinicus  HS023ゲノムDNAをテンプレートとして、プライマーMA15F13（SEQ  ID  NO：16）及びMA15R14（SEQ  ID  NO：17）を利用してPrimeSTAR  DNAポリメラーゼでPCR増幅して、得られた3097bp断片がPstI及びHindIIIで説明書（TaKaRa）に従って二重消化し、同様に消化されたpUAmT14プラスミドと接続して、組換えプラスミドpUAmT-MA15を得た。ストレプトミセス・アベルミティリスAD28ゲノムDNA（ゲノムDNA抽出の方法が本実施例の工程1と同じ）をテンプレートとして、プライマーAA1UF15（SEQ  ID  NO：18）及びAA1DR16（SEQ  ID  NO：19）を利用してPrimeSTAR  DNAポリメラーゼでPCR増幅して、得られた3103bp断片がEcoRI及びKpnIで説明書（TaKaRa）に従って二重消化し、同様に消化された組換えプラスミドpUAmT-MA15と接続して、組換えプラスミドpUAmT-MA15AA1Uを得た。構築過程を図8に示す。
【００６９】
9.Streptomyces  milbemycinicus  milAl遺伝子の上流へストレプトミセス・アベルミティリスaveAl遺伝子の上流断片の挿入：工程4-a）に記載の方法によって、工程8で得られた組換えプラスミドpUAmT-MA15AA1Uを接合転移の方法によって工程7で得られた3-22#菌株に転化して、形質転換体を成長させ、標的菌株とする。aveAl遺伝子の上流断片が3-22#菌株ゲノムに挿入することを図9に示す。
【００７０】
10.Streptomyces  milbemycinicus  milAl遺伝子でストレプトミセス・アベルミティリスaveAl遺伝子を置換するための組換えプラスミドpUAmT-AMAの構築：工程9で得られた形質転換体から一つのシングルコロニーをピックして20μg/mlナリジクス酸及び25μg/mlアプラマイシンを含むTSB培地に接種し、工程1に記載の方法によってゲノムDNAを抽出した。抽出されたゲノムDNAがSwaI（TaKaRa）で説明書に従って消化反応を行た。反応終了後、1/10体積の3M  NaAc-HAc溶液（pH5.3）、および等体積のイソアミルアルコールを加えて、12000rpmで5min遠心分離してDNAを沈殿させた。沈殿を70％エタノールで2回洗浄し、室温乾燥した後、10mM  Tirs-HCl溶液（pH8.0）20μlに溶解させて回収液を得た。3μl回収液を取って大腸菌DH5αコンピテント細胞を接続転化する（DH5αコンピテント細胞の調製方法および電気変換過程が工程3-cと同じ、但し、培地中に抗生物質を添加せず且つ培養温度が37℃である）。転化液を遠心分離して上清の大部分を除去した後、残留した液体で沈殿を懸濁させ、全量を25μg/mlアプラマイシンを含むLB平板に塗布し、37℃で16ｈ培養して形質転換体にする。形質転換体がプラスミドを抽出した後、Streptomyces  milbemycinicus  mil4l遺伝子でストレプトミセス・アベルミティリスaveAl遺伝子を置換するための組換えプラスミドpUAmT-AMAになる。pUAmT-AMAの構築過程を図10に示す。
【００７１】
11.ストレプトミセス・アベルミティリスaveAl遺伝子の置換：工程4a）に記載の接合転移方法によって組換えプラスミドpUAmT-AMAを工程4で得られたAD28菌株に転化する。形質転換体が抗生物質を含まない選別2回をした継代後に、つまようじでシングルコロニーをピックし、それぞれに25μg/mlアプラマイシンを含む及び抗生物質を含まないYMS平板上に28℃で5-6d培養した。アプラマイシンを含むYMS培地上で成長せずアプラマイシンを含まないYMS培地上で成長するシングルコロニーを選択してYMS培地上で拡大して培養しながら、本実施例の工程1の方法によってゲノムDNAを抽出し、プライマー025A1EF（SEQ  ID  NO：20）/026A1ER（SEQ  ID  NO：21）及びプライマー027M1EF（SEQ  ID  NO：22）/028M1ER（SEQ  ID  NO：23）を利用してrTaqDNAポリメラーゼでPCR検査する。プライマー025A1EF（SEQ  ID  NO：20）/026A1ER（SEQ  ID  NO：21）が2005bpの標の断片に増幅でき、027M1EF（SEQ  ID  NO：22）/028M1ER（SEQ  ID  NO：23）が標的断片を得られないものが成功に置換された遺伝子工学菌株である。成功に置換された遺伝子工学菌株MA220を標的菌株としてピックしてさらなる実験を行う。遺伝子工学菌AD28からMA220までのゲノム変化過程を図11に示す。
【００７２】
12.遺伝子工学菌MA220の発酵及びHPLC分析：方法が本実施例の工程5と同じである。図12にHPLC結果を示す：Aが遺伝子工学菌MA220の発酵サンプルのHPLC図であり、Bが遺伝子工学菌AD28の発酵サンプルのHPLC図である。その結果、明らかに遺伝子工学菌MA220の発酵産物中に二つの新規化合物を発生したことが示されている（図中でピーク出る時間がそれぞれに8.773及び11.066である）。
【００７３】
実施例2  遺伝子工学菌MA220の発酵産物の抽出及び同定
【００７４】
発酵液を濾布で濾過してろ過ケーキを得て、エタノールを用いてろ過ケーキを2回抽出して、エタノール抽出液を得た。エタノール抽出液が乾燥するまで真空濃縮して、tenvermectinA及びBを含むエキスが得られる。エキスをシリカゲルと混合した後、シリカゲルカラムで、90：10、80：20、70：30、6：40の石油エーテル/アセトンにて勾配溶離して、流分溶出画分を収集し、TLC検出して、二つの標的成分を含む洗脱液が得られ、乾燥するまで真空濃縮させる。上記の成分は、以下の条件でクロマトグラフィーをリバースクロマトグラフィーさせる。
液体系：Agilent  1100セミ分取高圧液体クロマトグラフィー
カラム：ZORBAX.EclipseXDB-C18（250mm*9.4mm）
溶離液：メタノール/アセトニトリル/水＝46：46：8
流速：1.5mL/min
検出波長：λ＝240nm
[0072]
保持時間が17.1minであるピックを収集して化合物1を得る；保持時間が21.5minであるピックを収集して化合物2が得られる。
化合物1及び化合物2の質量スペクトル分析およびNMR分析図を図面13-20に示す。その結果、分子量がそれぞれに832と846であることが示されている。構造分析の結果より、前記のtenvermectinに示す構造であって、2つの成分がそれぞれにtenvermectinA（TEVA）及びtenvermectinB（TEVB）であることを示している。
【００７５】
実施例3 遺伝子工学MA220の収率及び安定性試験
遺伝子工学菌MA220の胞子を勾配的に希釈してからYMS培地に塗布し、28℃で6-8d培養して、シングルコロニーを成長させる。ランダムに15個の形態が相対的に一致するシングルコロニー（即ち白色または黒ぽっいではなく灰色である胞子を生成でき、コロニーのサイズが相対的に一致するシングルコロニー）を選び取って、それぞれにMA220-1〜MA220-15と番号を付け、YMS平板上で播種して、28℃で6-8d培養したところが、コロニーの大きさがともに0.7-0.8cmの間にあり、基本的に一致する。これらのシングルコロニーを実施例1の工程5の方法によって発酵させ、それぞれのシングルコロニーに対応する種子液をそれぞれに3ボトルの発酵培地に接種して並列テストをしながら対照MA220-CKを設置し、即ちMA220でYMS平板上でローンを発酵する。発酵の結果はHPLCで検査して実施例2で得られたサンプルを標準品として、発酵単位を計算するものである。結果を表1に示す。
【００７６】
【表１Ａ】
0006346673.tif 000005
【表１Ｂ】
0006346673.tif 000006
【表１Ｃ】
0006346673.tif 000007
【００７７】
結果より、遺伝子工学菌MA220の発酵が比較的安定であることが示されている。即ち、発酵のpHが7.0-7.3の間、TEVA/TEVBの値が3/1程度、総発酵単位が基本的に1300μg/ml以上である。
【００７８】
実施例4  害虫及びダニに対するtenvermectinの生物活性
【００７９】
1.ニセナミハダニに対するtenvermectinの屋内活性測定：ニセナミハダニを供試虫として、tenvermectinの屋内活性について測定し、かつアベルメクチンを対照薬剤として、tenvermectinとアベルメクチンとの活性を比較した。
【００８０】
供試生物：ニセナミハダニ（Tetranychus  cinnabarinus）を人工気候室条件下[（26±1）℃、RH（70±5）％、H/D14]でソラマメの苗に接種して培養した。
【００８１】
供試薬剤：96％アベルメクチン（河北威遠生物化学工業株式会社）、98％tenvermectin（TEVA：TEVB＝8：2（重量比））（本発明の実施例2の方法により調製して得られる）：それぞれ1gの96％アベルメクチン及び98％tenvermectinを秤量してビーカー中に添加するとともに、93gメタノール及び6g乳化剤OP10を添加して、濃度が10000mg/Lである製剤を作成し、これを水で濃度が0.005、0.01、0.025、0.05mg/Lの薬液に希釈して供試した。
【００８２】
実験方法：リーフディスク浸虫浸液法を採用する：屋内で飼養する生理的状態一致な成ダニを選ぶ。一致に成長したソラマメの葉を選択し、穴パンチャーを用いて直径2cmリーフディスクを作成し、各皿にリーフディスク3枚で、リーフの背側を上向きにプラスチック皿の中心の脱脂綿上で置いて、小さな毛筆で成ダニをピックして各リーフディスクが30匹までにリーフディスク上に接種し、そして、適切な量の水を加えて、（26±1）℃、光強度3000〜45001x、14h/d、RH50％〜75％の培養室内に入れた。2h後に実体顕微鏡を使用して成ダニ数を検査して、各皿リーフディスク上でダニの数が20匹未満ではないことを確認できた。調製された質量濃度0.005、0.01、0.025、0.05mg/Lの薬剤をビーカー中に入れて、そして、葉身を鉗子で挟んで薬剤浸漬時間5sで低濃度から高濃度までに順次に薬剤浸漬した。対照には、蒸留水でメスの成ダニを処理し、質量濃度一つごとに一つの処理であり、各処理を3回繰り返した。葉身上での薬剤がドライである時に、処理したリーフディスクを（26±1）℃及び14h光周期の人工气候室に入れ24h培養し、培養皿中に少量の水を加えて保湿させた。
薬剤浸漬後にダニが非常に活発であり、処理後5-8hで活動が遅くし始め、12-24h後に蟲体が静止した。
死亡判定標準：検察時に毛筆でダニ体をタッチして、完全に動かないものが死亡と判定した。
実験の結果を表2に示す。
【００８３】
【表２Ａ】
0006346673.tif 000008
【００８４】
結果より、ニセナミハダニに対して、tenvermectinがLC50が0.0049mg/Lであり、アベルメクチンがLC50が0.0083mg/Lであり、ニセナミハダニに対するtenvermectinの活性がアベルメクチンよりも高いことが示されている。
【００８５】
2.オオタバコガ及びヨトウムシに対するtenvermectinの活性測定：オオタバコガ及びヨトウムシを供試虫として、tenvermectinの活性について測定し、且つミルベマイシン及びアベルメクチンを対照薬剤とした。
【００８６】
【表２Ｂ】
0006346673.tif 000009
【００８７】
水で一定の濃度に希釈して供試した。
試験方法：飼料に薬物を混合して虫に使う方法を採用して、供試虫に対する供試薬剤の胃毒活性を測定した。
試験結果：供試薬剤が3齢オオタバコガ及び3齢ヨトウムシに対する活性を表3と表4に示す。
【００８８】
【表３】
0006346673.tif 000010
【００８９】
【表４Ａ】
0006346673.tif 000011
【００９０】
実験結果より、同じ薬物濃度下で、オオタバコガ及びヨトウムシに対するtenvermectinの活性がミルベマイシンよりも高く、アベルメクチンに接近することが示されている。
【００９１】
3.マツ材線虫に対するイベルメクチンの活性測定：マツ材線虫を供試虫として、tenvermectin、アベルメクチン、イベルメクチン、ミルベマイシン、エマメクチン安息香酸塩などの16員マクロライド系化合物の屋内活性について測定して、マツ材線虫に対するこれらの薬剤の活性の違いを比較した。
試験薬剤：0.5％アベルメクチンクリーム、0.5％tenvermectinクリーム、0.5％イベルメクチンクリーム、2％ミルベマイシンクリーム、2.5％エマメクチン安息香酸塩マイクロエマルション剤の5種の薬剤。
【００９２】
【表４Ｂ】
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【００９３】
試験方法：浸液法を採用して。各薬剤ごとには5個の質量濃度2、5、10、20、50mg/Lとし、各濃度を3回繰り返し、24h後に実験結果（表5を参照）を統計した。
【００９４】
【表５】
0006346673.tif 000013
【００９５】
試験の結果により、供試された16員マクロライド系化合物中において、マツ材線虫に対するtenvermectinの活性が最も高かった。
【００９６】
参考文献
1.Sambrook  J、Fritsh  E、Maniatis  T.Molecular  cloning：A  Laboratory  Manual.3rded、New  York：Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、2002.
2.Gust  B、Kiser  T、Chater  K  F  REDIRECT  Technology：PCR-targeting  systeminstreptomyces  coelicolor.Norwich：John  Innes  Centre.2002.
3.Kieser  T、Bibb  MJ、Buttner  MJ  et  al.Practical  Streptomyces  Genetics.Norwich：The  JohnInnes  Foundation、2000.
4.夏海洋、黄雋、胡敏杰等、規則的に配列されたストレプトミセス・アベルミティリスゲノムを構築したコスミドライブラリーの工業生産菌株の遺伝改質における使用、中国抗生物質雑誌、2009、34（7）：403-405.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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