(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中でＲＮＡを発現させるインビトロ方法であって、（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止する工程、および（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する工程、を含み、
当該方法は、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒと、ワクシニアウイルスＥ３と、ワクシニアウイルスＫ３とで前記細胞を処理することを含む方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡが前記細胞に導入されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡが前記細胞に繰り返し導入されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡがエレクトロポレーションまたはリポフェクションによって前記細胞に導入されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡがインビトロ転写ＲＮＡである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止することが、オートクリンおよび／またはパラクリンＩＦＮ機能を阻害する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞中で発現される前記ＲＮＡが、プソイドウリジンおよび／または５−メチルシチジンによって修飾されていない、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止する工程および（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する工程が、前記細胞における前記ＲＮＡの安定性および／または発現を増強する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞における前記ＲＮＡの発現の増強が、前記細胞中の前記ＲＮＡの発現レベルの上昇および／または発現期間の増大を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止する工程および（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する工程が、細胞の生存能を増強する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ、ワクシニアウイルスＥ３、およびワクシニアウイルスＫ３が、前記ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ、ワクシニアウイルスＥ３および／またはワクシニアウイルスＫ３をコードする核酸の形態で前記細胞に提供される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、バリア機能を有する細胞である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞または内皮細胞である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記内皮細胞が、心臓の内皮細胞、肺の内皮細胞または臍静脈内皮細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
幹細胞特性を有する細胞を提供するための方法であって、当該方法が、請求項１から１５のいずれかに記載の方法を含み、（ｉ）体細胞を含む細胞集団を提供する工程、（ｉｉ）細胞外ＩＦＮの、前記体細胞のＩＦＮ受容体への結合を阻止する工程、（ｉｉｉ）前記体細胞における細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する工程、（ｉｖ）幹細胞特性を有する細胞への前記体細胞の再プログラム化を可能にする１つ以上の因子を発現する能力を有するＲＮＡを前記体細胞に導入する工程、および（ｖ）幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程を含む方法。
【請求項１７】
幹細胞特性を有する細胞への前記体細胞の再プログラム化を増強するｍｉＲＮＡを前記体細胞に導入する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ以上の因子が、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ以上の因子が、ＫＬＦ４および／またはｃ−ＭＹＣをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の因子が、ＮＡＮＯＧおよび／またはＬＩＮ２８をさらに含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上の因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ−ＭＹＣを含む、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つ以上の因子が、ＬＩＮ２８、またはＬＩＮ２８およびＮＡＮＯＧをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上の因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８を含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記体細胞を少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で培養する工程をさらに含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤がバルプロ酸を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｖ）が、胚性幹細胞培養条件下で前記体細胞を培養することを含む、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記幹細胞特性が胚性幹細胞形態を含む、請求項１６から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記幹細胞特性を有する細胞が、正常な核型を有し、テロメラーゼ活性を発現し、胚性幹細胞に特有の細胞表面マーカーを発現するおよび／または胚性幹細胞に特有の遺伝子を発現する、請求項１６から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記幹細胞特性を有する細胞が多能性状態を示す、請求項１６から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記幹細胞特性を有する細胞が、３つの一次胚葉すべての進化した誘導体に分化する発生潜在能を有する、請求項１６から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記体細胞が線維芽細胞である、請求項１６から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記線維芽細胞が、肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞または皮膚線維芽細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記体細胞がヒト細胞である、請求項１６から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
分化した細胞型を提供するための方法であって、（ｉ）請求項１６から３３のいずれか一項に記載の方法を用いて幹細胞特性を有する細胞を提供する工程、および（ｉｉ）分化した細胞型への部分的または完全な分化を誘導するまたは指令する条件下で前記幹細胞特性を有する細胞を培養する工程を含む方法。
【請求項３５】
（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止するために有用な物質、および（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害するために有用な物質を含有する組成物であって、
当該組成物は、（ａ）ワクシニアウイルスＢ１８ＲまたはワクシニアウイルスＢ１８Ｒをコードする核酸と、（ｂ）ワクシニアウイルスＥ３またはワクシニアウイルスＥ３をコードする核酸と、（ｃ）ワクシニアウイルスＫ３またはワクシニアウイルスＫ３をコードする核酸とを含む、組成物。
【請求項３６】
請求項３５に記載の組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞中でＲＮＡを発現させること、特にＲＮＡが発現されるべき細胞の生存能を増強することに関する。細胞は、好ましくは反復トランスフェクションなどによってＲＮＡでトランスフェクトする。特に、本発明は、細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止する工程および細胞における細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する工程を含む、細胞中でＲＮＡを発現させる方法を提供する。細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止することおよび細胞における細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することにより、特に細胞をＲＮＡで繰り返しトランスフェクトした場合、細胞中のＲＮＡの安定な発現が可能となる。あるいはまたはさらに、細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止することおよび細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することは、特に細胞をＲＮＡで繰り返しトランスフェクトした場合、細胞の生存を増強する。したがって、細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止することおよび細胞における細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することは、細胞へのＲＮＡの反復導入を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡを一種の可逆的遺伝子療法として用いることの利点には、一過性の発現および形質転換しないという特性が含まれる。ＲＮＡは、発現されるために核内に入る必要がなく、さらに宿主ゲノムに組み込まれることができないので、それにより発癌の危険性が排除される。ＲＮＡで達成可能なトランスフェクション率は比較的高く、多くの細胞型について＞９０％であり、そのためトランスフェクト細胞を選択する必要がない。さらに、達成されるタンパク質の量は生理的発現におけるものに対応する。
【０００３】
ＲＮＡは、胚または胎児を生じることなく体細胞を幹様細胞に脱分化するのに有用であると記述されてきた。体細胞の、幹細胞特性、特に多能性を有する細胞への脱分化は、体細胞の体細胞への脱分化を誘導する因子（再プログラム化転写因子（ｒＴＦ）とも称される）をコードするＲＮＡを導入し、体細胞を培養して細胞を脱分化させることによって実施され得る。脱分化した後、細胞を同じかまたは異なる体細胞型、例えば神経、造血、筋、上皮および他の細胞型に再分化するように誘導することができる。したがって、そのような幹様細胞は、「細胞療法」による変性疾患の治療のための医学的応用性があり、心臓、神経、内分泌、血管、網膜、皮膚、筋−骨格障害および他の疾患の処置の新規治療戦略において利用し得る。
【０００４】
さらに、ＲＮＡの使用は、ＤＮＡに基づくワクチンの潜在的な危険性を回避する魅力的な代替策を提供する。ＤＮＡと同様に、ＲＮＡの細胞への導入も、インビボで細胞性および体液性免疫応答の両方を誘導することができる。特に、インビトロ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）を用いた免疫療法のために２つの異なる戦略が探究されており、どちらも様々な動物モデルにおいて試験され、成功を収めている。ＲＮＡは、種々の免疫経路によって患者に直接注入されるか、またはインビトロで従来のトランスフェクション法を用いて細胞をＩＶＴ−ＲＮＡでトランスフェクトし、次にトランスフェクトした細胞を患者に投与する。ＲＮＡは、例えば翻訳され、発現されたタンパク質が細胞の表面のＭＨＣ分子に提示されて、免疫応答を惹起し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
導入されたＩＶＴ−ＲＮＡのより高い持続的な発現を達成するために、様々な改変によってＩＶＴ−ＲＮＡを安定化する試みが為されてきた。しかし、細胞中でペプチドおよびタンパク質を発現させるＲＮＡトランスフェクションに基づく戦略の成功にもかかわらず、ＲＮＡの安定性、コードされるペプチドまたはタンパク質の持続的な発現、およびＲＮＡの細胞傷害性に関連する問題が依然として存在する。例えば、外因性一本鎖ＲＮＡが哺乳動物細胞における防御機構を活性化することは公知である。さらに、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ）への体細胞の再プログラム化は、再プログラム化転写因子（ｒＴＦ）の持続的な発現を必要とし、したがってｒＴＦの一定な発現を確保するために送達を繰り返し実施しなければならない。しかし、本明細書で明らかにするように、ＲＮＡに基づく反復遺伝子導入はＩＦＮ応答の誘導を伴い、これは、ｍＲＮＡとして送達された場合ｒＴＦの持続的な発現を妨げ、それゆえＲＮＡに基づく再プログラム化の成功を妨げる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止する工程および（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する工程を含む、細胞中でＲＮＡを発現させる方法に関する。
【０００７】
１つの実施形態では、ＲＮＡは、エレクトロポレーションまたはリポフェクションなどによって細胞に導入されるまたは導入されている。１つの実施形態では、ＲＮＡは繰り返し細胞に導入されるまたは導入されている。
【０００８】
１つの実施形態では、ＲＮＡはインビトロ転写ＲＮＡである。
【０００９】
１つの実施形態では、細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止することは、オートクリンおよび／またはパラクリンＩＦＮ機能を阻害する。１つの実施形態では、細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止することは、細胞外ＩＦＮに対する結合物質、例えば細胞外ＩＦＮに対するウイルス性結合物質を提供することを含む。１つの実施形態では、細胞外ＩＦＮに対するウイルス性結合物質は、ウイルスインターフェロン受容体である。１つの実施形態では、細胞外ＩＦＮに対するウイルス性結合物質は、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒである。１つの実施形態では、細胞外ＩＦＮに対するウイルス性結合物質は、結合物質をコードする核酸の形態で細胞に提供され、ここで核酸は、好ましくはＲＮＡであり、前記ＲＮＡは、好ましくは細胞中で発現されるべきＲＮＡと共に細胞に導入されるまたは導入されている。
【００１０】
１つの実施形態では、細胞内ＩＦＮシグナル伝達は、本発明に従って阻害されない場合、翻訳の阻害および／またはＲＮＡの分解をもたらす。１つの実施形態では、細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することは、１つ以上のＩＦＮ誘導性の抗ウイルス性活性エフェクタータンパク質を阻害することを含む。１つの実施形態では、ＩＦＮ誘導性の抗ウイルス性活性エフェクタータンパク質は、ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、２'，５'−オリゴアデニル酸シンテターゼ（ＯＡＳ）およびＲＮアーゼＬ（ＲＮａｓｅＬ）から成る群より選択される。
【００１１】
１つの実施形態では、細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することは、ＰＫＲ依存性経路および／またはＯＡＳ依存性経路を阻害することを含む。
【００１２】
１つの実施形態では、ＰＫＲ依存性経路を阻害することは、ｅＩＦ２−αのリン酸化を阻害することを含む。１つの実施形態では、ｅＩＦ２−αのリン酸化を阻害することは、ＰＫＲを阻害することおよび／またはｅＩＦ２−αを模倣する偽基質を提供することを含む。１つの実施形態では、ｅＩＦ２−αを模倣する偽基質は、ｅＩＦ２−αを模倣するウイルス性偽基質である。１つの実施形態では、ｅＩＦ２−αを模倣するウイルス性偽基質は、ワクシニアウイルスＫ３である。１つの実施形態では、ｅＩＦ２−αを模倣するウイルス性偽基質は、ウイルス性偽基質をコードする核酸の形態で細胞に提供され、ここで核酸は、好ましくはＲＮＡであり、前記ＲＮＡは、好ましくは細胞中で発現されるべきＲＮＡと共に細胞に導入されるまたは導入されている。
【００１３】
１つの実施形態では、ＰＫＲを阻害することは、少なくとも１つのＰＫＲ阻害剤で細胞を処理することを含む。１つの実施形態では、ＰＫＲ阻害剤は、ＲＮＡ誘導性ＰＫＲ自己リン酸化を阻害する。１つの実施形態では、ＰＫＲ阻害剤は、ＰＫＲのＡＴＰ結合部位指向性阻害剤である。１つの実施形態では、ＰＫＲ阻害剤はイミダゾロ−オキシインドール化合物である。１つの実施形態では、ＰＫＲ阻害剤は、６，８−ジヒドロ−８−（１Ｈ−イミダゾール−５−イルメチレン）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｇ］ベンゾチアゾール−７−オンおよび／または２−アミノプリンである。１つの実施形態では、ＰＫＲ阻害剤は、ＰＫＲのウイルス性阻害剤である。１つの実施形態では、ＰＫＲのウイルス性阻害剤は、ワクシニアウイルスＥ３である。１つの実施形態では、ＰＫＲのウイルス性阻害剤は、阻害剤をコードする核酸の形態で細胞に提供され、ここで核酸は、好ましくはＲＮＡであり、前記ＲＮＡは、好ましくは細胞中で発現されるべきＲＮＡと共に細胞に導入されるまたは導入されている。１つの実施形態では、ＰＫＲを阻害することは、ＰＫＲ遺伝子の発現をサイレンシングすることを含む。
【００１４】
１つの実施形態では、ＯＡＳ依存性経路を阻害することは、ＲＮアーゼＬの活性化を阻害することを含む。１つの実施形態では、ＯＡＳ依存性経路を阻害することは、ＯＡＳを阻害することを含む。
【００１５】
１つの実施形態では、ＯＡＳを阻害することは、少なくとも１つのＯＡＳ阻害剤で細胞を処理することを含む。１つの実施形態では、ＯＡＳ阻害剤は、ＯＡＳのウイルス性阻害剤である。１つの実施形態では、ＯＡＳのウイルス性阻害剤は、ワクシニアウイルスＥ３である。１つの実施形態では、ＯＡＳのウイルス性阻害剤は、阻害剤をコードする核酸の形態で細胞に提供され、ここで核酸は、好ましくはＲＮＡであり、前記ＲＮＡは、好ましくは細胞中で発現されるべきＲＮＡと共に細胞に導入されるまたは導入されている。
【００１６】
１つの実施形態では、細胞中で発現されるＲＮＡは、プソイドウリジンおよび／または５−メチルシチジンによって修飾されていない。
【００１７】
１つの実施形態では、（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止する工程および（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する工程は、細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合が阻止されないおよび／または細胞内ＩＦＮシグナル伝達が阻害されない状況と比較して、細胞におけるＲＮＡの安定性の増強および／または発現の増強をもたらす。１つの実施形態では、細胞におけるＲＮＡの発現の増強は、好ましくは細胞中のＲＮＡの発現レベルの上昇および／または発現期間の増大を含む。
【００１８】
１つの実施形態では、（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止する工程および（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する工程は、細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合が阻止されないおよび／または細胞内ＩＦＮシグナル伝達が阻害されない状況と比較して、細胞の生存能の増強をもたらす。
【００１９】
１つの実施形態では、（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止する工程および（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する工程は、（ｉ）ワクシニアウイルスＢ１８Ｒおよび（ｉｉ）ワクシニアウイルスＥ３またはワクシニアウイルスＫ３またはその両方で細胞を処理することを含む。１つの実施形態では、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ、ワクシニアウイルスＥ３および／またはワクシニアウイルスＫ３は、同じ核酸分子または２個以上の異なる核酸分子上で、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ、ワクシニアウイルスＥ３および／またはワクシニアウイルスＫ３をコードする核酸の形態で細胞に提供され、ここで核酸は、好ましくはＲＮＡであり、前記ＲＮＡは、好ましくは細胞中で発現されるべきＲＮＡと共に細胞に導入されるまたは導入されている。
【００２０】
１つの実施形態では、細胞は、バリア機能を有する細胞である。１つの実施形態では、細胞は、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞または内皮細胞であり、ここで内皮細胞は、好ましくは心臓の内皮細胞、肺の内皮細胞または臍静脈内皮細胞である。好ましくは、細胞はヒト細胞である。
【００２１】
本発明はまた、ＲＮＡが発現されるべき細胞を処理するために、本明細書で述べる手段のような、（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止するのに適した手段および（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害するのに適した手段を使用することに関する。この方法の様々な実施形態およびその場合に有用な手段は上述されている。
【００２２】
本発明はまた、幹細胞特性を有する細胞を提供する方法であって、（ｉ）体細胞を含む細胞集団を提供する工程、（ｉｉ）細胞外ＩＦＮの、体細胞のＩＦＮ受容体への結合するを阻止する工程、（ｉｉｉ）体細胞における細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する工程、（ｉｖ）幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラム化を可能にする１つ以上の因子を発現する能力を有するＲＮＡを体細胞に導入する工程、および（ｖ）幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程を含む方法に関する。
【００２３】
１つの実施形態では、前記方法は、幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラム化を増強するｍｉＲＮＡを体細胞に導入する工程をさらに含む。
【００２４】
１つの実施形態では、前記１つ以上の因子は、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２を含む。１つ以上の因子は、ＫＬＦ４および／またはｃ−ＭＹＣおよび／またはＮＡＮＯＧおよび／またはＬＩＮ２８をさらに含み得る。１つの実施形態では、１つ以上の因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ−ＭＹＣを含み、ＬＩＮ２８および場合によりＮＡＮＯＧをさらに含み得る。１つの実施形態では、１つ以上の因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８を含む。
【００２５】
１つの実施形態では、前記方法は、少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程をさらに含み、ここで前記少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、好ましくはバルプロ酸、酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡおよび／またはスクリプタイドを含む。
【００２６】
１つの実施形態では、工程（ｖ）は、胚性幹細胞培養条件下で体細胞を培養することを含む。
【００２７】
１つの実施形態では、幹細胞特性は胚性幹細胞形態を含む。
【００２８】
１つの実施形態では、幹細胞特性を有する細胞は、正常な核型を有し、テロメラーゼ活性を発現し、胚性幹細胞に特有の細胞表面マーカーを発現するおよび／または胚性幹細胞に特有の遺伝子を発現する。
【００２９】
１つの実施形態では、幹細胞特性を有する細胞は多能性状態を示す。
【００３０】
１つの実施形態では、幹細胞特性を有する細胞は、３つの一次胚葉すべての進化した誘導体に分化する発生潜在能を有する。
【００３１】
１つの実施形態では、体細胞は、肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞または皮膚線維芽細胞などの線維芽細胞である。好ましくは、体細胞はヒト細胞である。
【００３２】
１つの実施形態では、ＲＮＡをエレクトロポレーションまたはリポフェクションによって体細胞に導入する。１つの実施形態では、ＲＮＡを繰り返し体細胞に導入する。
【００３３】
１つの実施形態では、ＲＮＡはインビトロ転写ＲＮＡである。
【００３４】
１つの実施形態では、細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止することは、オートクリンおよび／またはパラクリンＩＦＮ機能を阻害する。１つの実施形態では、細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止することは、細胞外ＩＦＮに対する結合物質、例えば細胞外ＩＦＮに対するウイルス性結合物質を提供することを含む。１つの実施形態では、細胞外ＩＦＮに対するウイルス性結合物質は、ウイルスインターフェロン受容体である。１つの実施形態では、細胞外ＩＦＮに対するウイルス性結合物質は、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒである。１つの実施形態では、細胞外ＩＦＮに対するウイルス性結合物質は、結合物質をコードする核酸の形態で細胞に提供され、ここで核酸は、好ましくはＲＮＡであり、前記ＲＮＡは、好ましくは幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラム化を可能にする１つ以上の因子を発現する能力を有するＲＮＡと共に体細胞に導入されるまたは導入されている。
【００３５】
１つの実施形態では、細胞内ＩＦＮシグナル伝達は、本発明に従って阻害されない場合、翻訳の阻害および／またはＲＮＡの分解をもたらす。１つの実施形態では、細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することは、１つ以上のＩＦＮ誘導性の抗ウイルス性活性エフェクタータンパク質を阻害することを含む。１つの実施形態では、ＩＦＮ誘導性の抗ウイルス性活性エフェクタータンパク質は、ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、２'，５'−オリゴアデニル酸シンテターゼ（ＯＡＳ）およびＲＮアーゼＬから成る群より選択される。
【００３６】
１つの実施形態では、細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することは、ＰＫＲ依存性経路および／またはＯＡＳ依存性経路を阻害することを含む。
【００３７】
１つの実施形態では、ＰＫＲ依存性経路を阻害することは、ｅＩＦ２−αのリン酸化を阻害することを含む。１つの実施形態では、ｅＩＦ２−αのリン酸化を阻害することは、ＰＫＲを阻害することおよび／またはｅＩＦ２−αを模倣する偽基質を提供することを含む。１つの実施形態では、ｅＩＦ２−αを模倣する偽基質は、ｅＩＦ２−αを模倣するウイルス性偽基質である。１つの実施形態では、ｅＩＦ２−αを模倣するウイルス性偽基質は、ワクシニアウイルスＫ３である。１つの実施形態では、ｅＩＦ２−αを模倣するウイルス性偽基質は、ウイルス性偽基質をコードする核酸の形態で体細胞に提供され、ここで核酸は、好ましくはＲＮＡであり、前記ＲＮＡは、好ましくは幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラム化を可能にする１つ以上の因子を発現する能力を有するＲＮＡと共に体細胞に導入されるまたは導入されている。
【００３８】
１つの実施形態では、ＰＫＲを阻害することは、少なくとも１つのＰＫＲ阻害剤で細胞を処理することを含む。１つの実施形態では、ＰＫＲ阻害剤は、ＲＮＡ誘導性ＰＫＲ自己リン酸化を阻害する。１つの実施形態では、ＰＫＲ阻害剤は、ＰＫＲのＡＴＰ結合部位指向性阻害剤である。１つの実施形態では、ＰＫＲ阻害剤はイミダゾロ−オキシインドール化合物である。１つの実施形態では、ＰＫＲ阻害剤は、６，８−ジヒドロ−８−（１Ｈ−イミダゾール−５−イルメチレン）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｇ］ベンゾチアゾール−７−オンおよび／または２−アミノプリンである。１つの実施形態では、ＰＫＲ阻害剤は、ＰＫＲのウイルス性阻害剤である。１つの実施形態では、ＰＫＲのウイルス性阻害剤は、ワクシニアウイルスＥ３である。１つの実施形態では、ＰＫＲのウイルス性阻害剤は、阻害剤をコードする核酸の形態で体細胞に提供され、ここで核酸は、好ましくはＲＮＡであり、前記ＲＮＡは、好ましくは幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラム化を可能にする１つ以上の因子を発現する能力を有するＲＮＡと共に体細胞に導入されるまたは導入されている。１つの実施形態では、ＰＫＲを阻害することは、ＰＫＲ遺伝子の発現をサイレンシングすることを含む。
【００３９】
１つの実施形態では、ＯＡＳ依存性経路を阻害することは、ＲＮアーゼＬの活性化を阻害することを含む。１つの実施形態では、ＯＡＳ依存性経路を阻害することは、ＯＡＳを阻害することを含む。
【００４０】
１つの実施形態では、ＯＡＳを阻害することは、少なくとも１つのＯＡＳ阻害剤で体細胞を処理することを含む。１つの実施形態では、ＯＡＳ阻害剤は、ＯＡＳのウイルス性阻害剤である。１つの実施形態では、ＯＡＳのウイルス性阻害剤は、ワクシニアウイルスＥ３である。１つの実施形態では、ＯＡＳのウイルス性阻害剤は、阻害剤をコードする核酸の形態で体細胞に提供され、ここで核酸は、好ましくはＲＮＡであり、前記ＲＮＡは、好ましくは幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラム化を可能にする１つ以上の因子を発現する能力を有するＲＮＡと共に体細胞に導入されるまたは導入されている。
【００４１】
１つの実施形態では、幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラム化を可能にする１つ以上の因子を発現する能力を有するＲＮＡは、プソイドウリジンおよび／または５−メチルシチジンによって修飾されていない。
【００４２】
１つの実施形態では、（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止する工程および（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する工程は、細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合が阻止されないおよび／または細胞内ＩＦＮシグナル伝達が阻害されない状況と比較して、体細胞において幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラム化を可能にする１つ以上の因子を発現する能力を有するＲＮＡの安定性の増強および／または発現の増強をもたらす。１つの実施形態では、体細胞におけるＲＮＡの発現の増強は、好ましくは体細胞中のＲＮＡの発現レベルの上昇および／または発現期間の増大を含む。
【００４３】
１つの実施形態では、（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止する工程および（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する工程は、細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合が阻止されないおよび／または細胞内ＩＦＮシグナル伝達が阻害されない状況と比較して、細胞の生存能の増強をもたらす。
【００４４】
１つの実施形態では、（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止する工程および（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する工程は、（ｉ）ワクシニアウイルスＢ１８Ｒおよび（ｉｉ）ワクシニアウイルスＥ３またはワクシニアウイルスＫ３またはその両方で体細胞を処理することを含む。１つの実施形態では、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ、ワクシニアウイルスＥ３および／またはワクシニアウイルスＫ３は、同じ核酸分子または２以上の異なる核酸分子上で、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ、ワクシニアウイルスＥ３および／またはワクシニアウイルスＫ３をコードする核酸の形態で体細胞に提供され、ここで核酸は、好ましくはＲＮＡであり、前記ＲＮＡは、好ましくは幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラム化を可能にする１つ以上の因子を発現する能力を有するＲＮＡと共に体細胞に導入されるまたは導入されている。
【００４５】
本発明はまた、分化した細胞型を提供する方法であって、（ｉ）本発明による幹細胞特性を有する細胞を提供するための方法を用いて幹細胞特性を有する細胞を提供する工程、および（ｉｉ）分化した細胞型への部分的または完全な分化を誘導するまたは指令する条件下で幹細胞特性を有する細胞を培養する工程を含む方法に関する。
【００４６】
本発明はまた、（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止するために有用な物質および（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害するために有用な物質を含有する組成物に関する。さらに、本発明はまた、本発明の組成物を含むキットに関する。本発明の組成物またはキットの様々な実施形態は、本発明の方法に関して上述されている。１つの実施形態では、本発明の組成物またはキットは本発明の方法において有用である。
【００４７】
１つの実施形態では、本発明の組成物またはキットは、発現のために細胞に導入されるべきＲＮＡ、例えば上述した幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラム化を可能にする１つ以上の因子を発現する能力を有するＲＮＡを含む。
【００４８】
１つの実施形態では、細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止するために有用な物質は、オートクリンおよび／またはパラクリンＩＦＮ機能を阻害する。１つの実施形態では、細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止するために有用な物質は、細胞外ＩＦＮに対する結合物質、例えば細胞外ＩＦＮに対するウイルス性結合物質を含む。１つの実施形態では、細胞外ＩＦＮに対するウイルス性結合物質は、ウイルスインターフェロン受容体である。１つの実施形態では、細胞外ＩＦＮに対するウイルス性結合物質は、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒである。１つの実施形態では、細胞外ＩＦＮに対するウイルス性結合物質は、結合物質をコードする核酸の形態で存在し、ここで核酸は、好ましくはＲＮＡである。
【００４９】
１つの実施形態では、細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害するために有用な物質は、１つ以上のＩＦＮ誘導性の抗ウイルス性活性エフェクタータンパク質を阻害する物質を含む。１つの実施形態では、ＩＦＮ誘導性の抗ウイルス性活性エフェクタータンパク質は、ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、２'，５'−オリゴアデニル酸シンテターゼ（ＯＡＳ）およびＲＮアーゼＬから成る群より選択される。
【００５０】
１つの実施形態では、細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害するために有用な物質は、ＰＫＲ依存性経路および／またはＯＡＳ依存性経路を阻害するために有用な物質を含む。
【００５１】
１つの実施形態では、ＰＫＲ依存性経路を阻害するために有用な物質は、ｅＩＦ２−αのリン酸化を阻害するために有用な物質を含む。１つの実施形態では、ｅＩＦ２−αのリン酸化を阻害するために有用な物質は、ＰＫＲを阻害するために有用な物質および／またはｅＩＦ２−αを模倣する偽基質を含む。１つの実施形態では、ｅＩＦ２−αを模倣する偽基質は、ｅＩＦ２−αを模倣するウイルス性偽基質である。１つの実施形態では、ｅＩＦ２−αを模倣するウイルス性偽基質は、ワクシニアウイルスＫ３である。１つの実施形態では、ｅＩＦ２−αを模倣するウイルス性偽基質は、ウイルス性偽基質をコードする核酸の形態で存在し、ここで核酸は、好ましくはＲＮＡである。
【００５２】
１つの実施形態では、ＰＫＲを阻害するために有用な物質は、少なくとも１つのＰＫＲ阻害剤を含む。１つの実施形態では、ＰＫＲ阻害剤は、ＲＮＡ誘導性ＰＫＲ自己リン酸化を阻害する。１つの実施形態では、ＰＫＲ阻害剤は、ＰＫＲのＡＴＰ結合部位指向性阻害剤である。１つの実施形態では、ＰＫＲ阻害剤はイミダゾロ−オキシインドール化合物である。１つの実施形態では、ＰＫＲ阻害剤は、６，８−ジヒドロ−８−（１Ｈ−イミダゾール−５−イルメチレン）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｇ］ベンゾチアゾール−７−オンおよび／または２−アミノプリンである。１つの実施形態では、ＰＫＲ阻害剤は、ＰＫＲのウイルス性阻害剤である。１つの実施形態では、ＰＫＲのウイルス性阻害剤は、ワクシニアウイルスＥ３である。１つの実施形態では、ＰＫＲのウイルス性阻害剤は、阻害剤をコードする核酸の形態で存在し、ここで核酸は、好ましくはＲＮＡである。１つの実施形態では、ＰＫＲを阻害するために有用な物質は、ＰＫＲ遺伝子の発現をサイレンシングするために有用な物質を含む。
【００５３】
１つの実施形態では、ＯＡＳ依存性経路を阻害するために有用な物質は、ＲＮアーゼＬの活性化を阻害するために有用な物質を含む。１つの実施形態では、ＯＡＳ依存性経路を阻害するために有用な物質は、ＯＡＳを阻害するために有用な物質を含む。
【００５４】
１つの実施形態では、ＯＡＳを阻害するために有用な物質は、少なくとも１つのＯＡＳ阻害剤を含む。１つの実施形態では、ＯＡＳ阻害剤は、ＯＡＳのウイルス性阻害剤である。１つの実施形態では、ＯＡＳのウイルス性阻害剤は、ワクシニアウイルスＥ３である。１つの実施形態では、ＯＡＳのウイルス性阻害剤は、阻害剤をコードする核酸の形態で存在し、ここで核酸は、好ましくはＲＮＡである。
【００５５】
１つの実施形態では、細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止するために有用な物質および細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害するために有用な物質は、（ｉ）ワクシニアウイルスＢ１８Ｒおよび（ｉｉ）ワクシニアウイルスＥ３またはワクシニアウイルスＫ３またはその両方を含む。１つの実施形態では、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ、ワクシニアウイルスＥ３および／またはワクシニアウイルスＫ３は、同じ核酸分子または２個以上の異なる核酸分子上で、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ、ワクシニアウイルスＥ３および／またはワクシニアウイルスＫ３をコードする核酸の形態で存在し、ここで核酸は、好ましくはＲＮＡである。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１：ウイルスのエスケープ機構  ウイルスは、ウイルスタンパク質またはウイルス核酸によって媒介される多くのエスケープ機構を発達させてきた。これらのウイルスエスケープタンパク質をコードするＲＮＡは、ｒＴＦをコードするＲＮＡと容易に同時導入することができる。アンタゴニストタンパク質Ｅ３（ワクシニアウイルス）はＰＫＲおよびＯＡＳに作用し、Ｋ３（ワクシニアウイルス）はｅＩＦ２αに作用し、Ｂ１８Ｒ（ワクシニアウイルス）はＩＦＮに作用する。Ｅ３とＫ３は細胞内で作用するが、ＩＶＴ−ＲＮＡによってコードされるＢ１８Ｒタンパク質は、細胞から分泌され、そこで細胞外Ｉ型ＩＦＮと結合して、ＩＦＮ受容体の結合を阻止する。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｅ：ＩＶＴ−ＲＮＡの反復導入（再プログラム化ＴＦ）  図２Ａ：ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞を、横のパネルに示されているように転写因子ＯＣＴ４（Ｏ）、ＳＯＸ２（Ｓ）、ＫＬＦ４（Ｋ）およびｃＭＹＣ（Ｍ）をコードする各々のインビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ  １５μｇまたは５μｇのいずれかでエレクトロポレーションし、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞培地中で培養した。エレクトロポレーションは、ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞に関する最適化パラメータを用いて４ｍｍギャップのキュベット中で実施した。指示されている時点で、細胞の１０％をその後のエレクトロポレーションの前に培養物から取り出し、全ＲＮＡを単離して、ヒトＥＳマーカー遺伝子ＯＣＴ４（内因性）、ＴＥＲＴ、ＧＤＦ３およびＤＰＰＡ４のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した。
【図２Ｂ】図２Ｂ：ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞を、横のパネルに示されているように転写因子ＯＳＫＭをコードする各々のＩＶＴ−ＲＮＡ  １５μｇでエレクトロポレーションし、ヒトＥＳ細胞培地中で培養した。エレクトロポレーションは、ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞に関する最適化パラメータを用いて４ｍｍギャップのキュベット中で実施した。指示されている時点で、残存する細胞を計数し、出発細胞に対する生存率を算定した。
【図２Ｃ】図２Ｃ：ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞を、ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードするＩＶＴ  ＲＮＡ  １μｇおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＩＶＴ  ＲＮＡ  ５μｇでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションは、ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞に関する最適化パラメータを用いて２ｍｍギャップのキュベット中で実施した。エレクトロポレーションの２４時間後、細胞をペレット化し、全ＲＮＡを単離して、インターフェロン（ＩＦＮ）αおよびβのｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した。
【図２Ｄ】図２Ｄ：ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞を、再プログラム化混合物をコードするＩＶＴ  ＲＮＡ  ３３，４μｇ（ｒＴＦ（ＯＳＫＭ  ＮＡＮＯＧ（Ｎ）  ＬＩＮ２８（Ｌ）（１：１：１：１：１：１））２９，５μｇ、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ｌｇＴ）１，３μｇ、ＨＴＬＶ  Ｅ６  １，３μｇおよびＧＦＰ  １．２５μｇ）でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションは、ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞に関する最適化パラメータを用いて４ｍｍギャップのキュベット中で実施した。エレクトロポレーションの４８時間後、細胞をペレット化し、全ＲＮＡを単離して、ＩＦＮ応答遺伝子ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＭＸ１、ＩＦＩＴＭ１およびＩＲＦ９のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した。
【図２Ｅ】図２Ｅ：ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞を、レポーター遺伝子Ｌｕｃ、ＧＦＰまたはプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）野生型をコードするＩＶＴ−ＲＮＡの指示量で１回エレクトロポレーションした。エレクトロポレーションは、ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞に関する最適化パラメータを用いて４ｍｍギャップのキュベット中で実施した。細胞をエレクトロポレーションの２４時間後に溶解し、ＰＫＲ標的真核生物開始因子２α（ｅＩＦ２α）の発現およびリン酸化状態を、特異抗体を用いてウェスタンブロット法によって観測した。
【図３Ａ】図３Ａ−３Ｃ：ＲＮＡに基づく遺伝子導入におけるＥ３、Ｋ３およびＢ１８Ｒの使用  図３Ａ：ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞を６ウェルに塗布し（１００，０００細胞／ウェル）、その翌日ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６μｌおよびＩＶＴ  １．４μｇを用いてリポフェクトした。ＩＶＴ−ＲＮＡ混合物は、それによりＧＦＰ  ０．８μｇとそれぞれＢ１８Ｒ、Ｅ３またはＫ３  ０．２μｇ（指示されているように）から成った。ＬｕｃをコードするＩＶＴ−ＲＮＡを使用して、混合物を合計１．４μｇにした。リポフェクションを製造者の指示に従って実施し、細胞をトランスフェクションの４８時間後に採取した。細胞の２０％をＦＡＣＳによるＧＦＰ発現の分析のために使用し（Ｂ）、残りの細胞をペレット化して、全ＲＮＡを単離し、ＩＦＮβおよびＯＡＳ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した（Ａ）。
【図３Ｂ】図３Ｂ：ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞を６ウェルに塗布し（１００，０００細胞／ウェル）、その翌日ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６μｌおよびＩＶＴ  １．４μｇを用いてリポフェクトした。ＩＶＴ−ＲＮＡ混合物は、それによりＧＦＰ  ０．８μｇとそれぞれＢ１８Ｒ、Ｅ３またはＫ３  ０．２μｇ（指示されているように）から成った。ＬｕｃをコードするＩＶＴ−ＲＮＡを使用して、混合物を合計１．４μｇにした。リポフェクションを製造者の指示に従って実施し、細胞をトランスフェクションの４８時間後に採取した。細胞の２０％をＦＡＣＳによるＧＦＰ発現の分析のために使用し（Ｂ）、残りの細胞をペレット化して、全ＲＮＡを単離し、ＩＦＮβおよびＯＡＳ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した（Ａ）。
【図３Ｃ】図３Ｃ：ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞を６ウェルに塗布し（１００，０００細胞／ウェル）、次の連続４日間、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６μｌおよびＩＶＴ  １．４μｇを用いてリポフェクトした。ＩＶＴ−ＲＮＡ混合物は、それによりＧＦＰ  ０．８μｇとそれぞれＢ１８Ｒ、Ｅ３またはＫ３  ０．２μｇ（指示されているように）から成った。ＬｕｃをコードするＩＶＴ−ＲＮＡを使用して、混合物を合計で全ＩＶＴ−ＲＮＡ  １．４μｇになるようにした。対照として、Ｌｕｃ（０．６μｇ）およびＧＦＰ（０．８μｇ）をコードする修飾（ｍｏｄ．）ＩＶＴ−ＲＮＡ  １．４μｇを使用した。これらのＲＮＡは、より低い免疫刺激特性を示すウリジンおよびシチジンの代わりに１００％プソイドウリジン（ｐｓｉ）および１００％５−メチルシチジン（５ｍＣ）から成った。リポフェクションを製造者の指示に従って実施した。最後のリポフェクションの２４時間後、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて細胞生存能を検定し、モックトランスフェクト細胞に標準化した。
【図４】図４：再プログラム化のためのＲＮＡに基づく遺伝子導入におけるＥ３、Ｋ３およびＢ１８Ｒの使用  ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞を６ウェルに塗布し（８０，０００細胞／ウェル）、次の連続４日間、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６μｌおよびＩＶＴ  １．４μｇを用いてリポフェクトした。ＩＶＴ−ＲＮＡ混合物は、それにより非修飾ＧＦＰ  ０．８μｇまたは非修飾もしくは修飾ＯＳＫＭＮＬ（１：１：１：１：１：１）０．８μｇと、それぞれ非修飾または修飾Ｂ１８Ｒ、Ｅ３およびＫ３  ０．２μｇから成った。必要に応じて、ＬｕｃをコードするＩＶＴ−ＲＮＡを使用して、混合物を合計で全ＩＶＴ−ＲＮＡ  １．４μｇになるようにした。修飾ＲＮＡは、より低い免疫刺激特性を示すウリジンおよびシチジンの代わりに１００％ｐｓｉおよび１００％５ｍＣから成った。リポフェクションを製造者の指示に従って実施した。最後のリポフェクションの２４時間後、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）とモックトランスフェクト細胞への標準化を用いて（Ａ）、および顕微鏡によって（Ｂ）、細胞生存能を検定した。その後、細胞をペレット化し、全ＲＮＡを単離して、ＩＦＮβおよびＯＡＳ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した（Ｃ）。
【図５】図５：Ｅ３、Ｋ３およびＢ１８Ｒの存在下での反復トランスフェクション後のｒＴＦの翻訳  ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞を６ウェルに塗布し（１００，０００細胞／ウェル）、次の連続３日間、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６μｌおよびＩＶＴ  １．４μｇを用いてリポフェクトした。ＩＶＴ−ＲＮＡ混合物は、それによりＧＦＰ  ０．２μｇと、非修飾または修飾ＯＣＴ４またはＳＯＸ２またはＮＡＮＯＧ  ０．６μｇならびにそれぞれ非修飾または修飾Ｂ１８Ｒ、Ｅ３およびＫ３（ＥＫＢ）０．２μｇから成った。修飾ＲＮＡは、より低い免疫刺激特性を示すウリジンおよびシチジンの代わりに１００％ｐｓｉおよび１００％５ｍＣから成った。リポフェクションを製造者の指示に従って実施した。最後のリポフェクションの２４時間後、ＯＳＮの細胞内発現を、ヒト多能性幹細胞転写因子分析キット（ＢＤ  ５６０５８９）を用いてＦＡＣＳ分析によって観測した。
【図６Ａ】図６Ａ−６Ｄ：ＥＫＢの存在下でのｒＴＦおよびマイクロＲＮＡを用いたＨＦＦの再プログラム化  図６Ａ：ＨＦＦ線維芽細胞（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を６ウェルに塗布し（１００，０００細胞／ウェル）、週に５回（月曜日から金曜日まで）２週間にわたって、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６μｌおよびＩＶＴ−ＲＮＡ  １．４μｇを用いてリポフェクトした（Ａ）。
【図６Ｂ】図６Ｂ：ＩＶＴ−ＲＮＡ混合物は、それにより非修飾ＧＦＰ  ０．８μｇまたは非修飾もしくは修飾ＯＳＫＭＮＬ（１：１：１：１：１：１）０．８μｇと、それぞれ非修飾または修飾Ｂ１８Ｒ、Ｅ３およびＫ３（ＥＫＢ）０．２μｇならびにｍｉＲＮＡ  ３０２ａ−ｄおよび３６７［各々０．４μＭ］から成るｍｉＲＮＡ混合物０．４μｇで構成された。修飾ＲＮＡは、より低い免疫刺激特性を示すウリジンおよびシチジンの代わりに１００％ｐｓｉおよび１００％５ｍＣから成った。幹細胞培地（Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ  ｍｅｄｉａ，Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）中でのリポフェクションを製造者の指示に従って実施した。６日目および１３日目に、細胞をペレット化し、全ＲＮＡを単離して、ヒトＥＳマーカーＴＥＲＴ、ＤＰＰＡ４、ＧＤＦ３、ＬＩＮ２８（内因性）およびＲＥＸ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した（Ｂ）。
【図６Ｃ】図６Ｃ：コロニー増殖を顕微鏡によって観察し（Ｃ）、さらなる分析のために、ＳｔａｉｎＡｌｉｖｅ  ＴＲＡ−１−６０抗体（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を製造者の指示に従って使用してコロニーをＥＳ表面マーカーＴＲＡ−１−６０について染色した（Ｄ）。
【図６Ｄ】図６Ｄ：コロニー増殖を顕微鏡によって観察し（Ｃ）、さらなる分析のために、ＳｔａｉｎＡｌｉｖｅ  ＴＲＡ−１−６０抗体（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を製造者の指示に従って使用してコロニーをＥＳ表面マーカーＴＲＡ−１−６０について染色した（Ｄ）。
【図７Ａ】図７Ａ−７Ｄ：ＥＫＢの存在下でのｒＴＦおよびマイクロＲＮＡを用いたＨＦＦの再プログラム化（分割１：８）  図７Ａ：ＨＦＦ線維芽細胞（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を６ウェルに塗布し（１００，０００細胞／ウェル）、週に５回（月曜日から金曜日まで）２週間にわたって、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６μｌおよびＩＶＴ−ＲＮＡ  １．４μｇを用いてリポフェクトした（Ａ）。
【図７Ｂ】図７Ｂ：ＩＶＴ−ＲＮＡ混合物は、それにより非修飾または修飾ＯＳＫＭＮＬ（１：１：１：１：１：１）０．８μｇと、それぞれ非修飾または修飾Ｂ１８Ｒ、Ｅ３およびＫ３（ＥＫＢ）０．２μｇならびにｍｉＲＮＡ  ３０２ａ−ｄおよび３６７［各々０．４μＭ］から成るｍｉＲＮＡ混合物０．４μｇで構成された。修飾ＲＮＡは、より低い免疫刺激特性を示すウリジンおよびシチジンの代わりに１００％ｐｓｉおよび１００％５ｍＣから成った。幹細胞培地（Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ  ｍｅｄｉａ，Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）中でのリポフェクションを製造者の指示に従って実施した。５日目および１２日目に、細胞をペレット化し、全ＲＮＡを単離して、ヒトＥＳマーカーＴＥＲＴ、ＤＰＰＡ４、ＧＤＦ３、ＬＩＮ２８（内因性）およびＲＥＸ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した（Ｂ）。
【図７Ｃ】図７Ｃ：コロニー増殖を顕微鏡によって観察し、さらなる分析のために、コロニーを、製造者の指示に従ってＳｔａｉｎＡｌｉｖｅ  ＴＲＡ−１−６０抗体（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を使用してＥＳ表面マーカーＴＲＡ−１−６０について（Ｃ）またはアルカリホスファターゼの活性（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄ染色キット）について（Ｄ）染色した。
【図７Ｄ】図７Ｄ：コロニー増殖を顕微鏡によって観察し、さらなる分析のために、コロニーを、製造者の指示に従ってＳｔａｉｎＡｌｉｖｅ  ＴＲＡ−１−６０抗体（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を使用してＥＳ表面マーカーＴＲＡ−１−６０について（Ｃ）またはアルカリホスファターゼの活性（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄ染色キット）について（Ｄ）染色した。
【図８】図８：ＥＫＢの力価測定  ＨＦＦ線維芽細胞（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を６ウェルに塗布し（１００，０００細胞／ウェル）、次の連続４日間、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６μｌおよびＩＶＴ  １．４μｇを用いてリポフェクトした。ＩＶＴ−ＲＮＡ混合物は、それにより非修飾ＯＳＫＭＮＬ（１：１：１：１：１：１）０．８μｇと、指示されているように可変量の非修飾Ｂ１８Ｒ、Ｅ３およびＫ３から成った。ＬｕｃをコードするＩＶＴ−ＲＮＡを使用して、混合物を合計で全ＩＶＴ−ＲＮＡ  １．４μｇになるようにした。再プログラム化実験に従って、ｍｉＲＮＡ  ３０２ａ−ｄおよび３６７［各々０．４μＭ］から成るｍｉＲＮＡ混合物０．４μｇを試料に添加した。対照として、Ｌｕｃ（０．６μｇ）およびＯＳＫＭＮＬ（０．８μｇ、１：１：１：１：１：１）をコードする修飾（ｍｏｄ．）ＩＶＴ−ＲＮＡ  １．４μｇを使用した。これらのＲＮＡは、より低い免疫刺激特性を示すウリジンおよびシチジンの代わりに１００％ｐｓｉおよび１００％５ｍＣから成った。リポフェクションを製造者の指示に従って実施した。最後のリポフェクションの２４時間後、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて細胞生存能を検定した（Ａ）。その後、細胞をペレット化し、全ＲＮＡを単離して、ＩＦＮβおよびＯＡＳ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した（Ｂ）。
【図９】図９：Ｅ３およびＫ３単独の作用  ＣＣＤ１０７９ＳＫ線維芽細胞を、指示されているようにＬｕｃをコードするＩＶＴ  ＲＮＡ（１μｇ）、ＧＦＰをコードするＩＶＴ  ＲＮＡ（５μｇ）およびＥ３またはＫ３またはその両方をコードするＩＶＴ  ＲＮＡ  ３μｇでエレクトロポレートした。エレクトロポレーションは、ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞に関する最適化パラメータを用いて２ｍｍギャップのキュベット中で実施した。（Ａ）１００００細胞／ウェルを９６ウェルプレートに２組塗布した。Ｂｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてエレクトロポレーション後の指示されている時点でルシフェラーゼ活性を測定した。２組の平均値を示す。（Ｂ）３０００００細胞／ウェルを６ウェルプレートに塗布し、エレクトロポレーションの２４時間後、細胞をペレット化して、全ＲＮＡを単離し、ＯＡＳ１およびＩＦＮ−βのｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲによって分析して、ＩＦＮ−βの場合はＱｕａｎｔｉ  Ｔｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔを用いて定量した。
【図１０】図１０：レプリコン発現の効率は種々の細胞型において大きな変動性を示す。  ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ２１）、マウス上皮ＲＴ１０１細胞およびヒト包皮線維芽細胞（ＣＣＤ１０７９ＳＫ）を、指示されているようにＧＦＰをコードするレプリコンＲＮＡの段階希釈でリポフェクトした（詳細については実施例９．２参照）。レプリコンＲＮＡの量に依存する、ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを示す。
【図１１】図１１：レプリコンＲＮＡと同時トランスフェクトしたＩＶＴ  ＲＮＡの発現は、レプリコンに許容性または非許容性の細胞において異なる度合いに阻害される。  ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ２１）、マウス上皮ＲＴ１０１細胞およびヒト包皮線維芽細胞（ＣＣＤ１０７９ＳＫ）を、ＧＦＰをコードするレプリコンＲＮＡの段階希釈でリポフェクトした（詳細については実施例９．３参照）。トランスフェクションの成功を観測するため、赤外蛍光タンパク質（ｉＲＦＰ）をコードするＩＶＴ  ＲＮＡを同時トランスフェクトした。細胞における翻訳の効率を表す、種々の細胞試料中のｉＲＦＰの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。許容細胞（ＢＨＫ２１およびＲＴ１０１）では、ＩＶＴ  ＲＮＡ発現の阻害は同時トランスフェクトしたレプリコンＲＮＡの量に相関する。非許容細胞（ＣＣＤ１０７９ＳＫ）では、阻害はレプリコンＲＮＡの量とは無関係である。非常に低い量のレプリコンＲＮＡであってもＩＶＴ  ＲＮＡ発現を効率的にブロックし、これはおそらく、これらの細胞におけるより強力なプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）活性化およびＩＦＮ応答に関連する。
【図１２】図１２：レプリコン発現はＩＦＮに暴露された細胞において効率的にブロックされる。組換えＢ１８Ｒはこのブロックを解除する。  ヒト線維芽細胞をエレクトロポレートしたヒト線維芽細胞からの上清に暴露し、次にルシフェラーゼをコードするレプリコンでリポフェクトした（詳細については実施例９．４参照）。上清を作製するため、細胞をＲＮＡなし（ＳＮ  ＥＰ「ＲＮＡなし」）、レプリコンＲＮＡ（ＳＮ  ＥＰ「レプリコン」）またはレプリコンＲＮＡプラスＢ１８ＲをコードするＩＶＴ  ＲＮＡ（ＥＰ  ＳＮ「レプリコン＋Ｂ１８Ｒ  ＲＮＡ」）でエレクトロポレートした。リポフェクション後のルシフェラーゼ活性を示す。
【図１３】図１３：ＲＮＡエレクトロポレーションはその後のレプリコンリポフェクションをブロックする。  ヒト線維芽細胞を、ＲＮＡなし（ＥＰ１：ＲＮＡなし）、ルシフェラーゼをコードするＩＶＴ  ＲＮＡ（ＥＰ２：ｌｕｃ  ＲＮＡ）またはＥ３、Ｋ３およびＢ１８ＲをコードするＩＶＴ  ＲＮＡ（ＥＰ３：ＥＫＢ  ＲＮＡ）でエレクトロポレーション（ＥＰ）した。その翌日、細胞を、ルシフェラーゼをコードするＩＶＴ  ＲＮＡまたはＥＫＢをコードするＩＶＴ  ＲＮＡと共にＧＦＰをコードするレプリコンでリポフェクトした（詳細については実施例９．５参照）。ルシフェラーゼをコードするＩＶＴ  ＲＮＡでのエレクトロポレーションは、その後のレプリコン発現をブロックする。このブロックは、ＥＢＫ  ＲＮＡの同時リポフェクションによって解除することができない。ＥＫＢをコードするＲＮＡのエレクトロポレーションはレプリコン発現を阻害しない。
【図１４】図１４：ＩＶＴ  ＲＮＡ上にコードされるＶａｃＶタンパク質はＲＮＡに対するＩＦＮ応答を阻止するが、確立されたＩＦＮ応答には限られた作用しか及ぼさない。  図１３におけるのと同じ実験。エレクトロポレーションの１日後（Ａ、Ｃ）およびリポフェクションの１日後（Ｂ、Ｄ）にｑＰＣＲによって測定したＩＦＮ−βおよびＯＡＳ１転写産物の量を示す。全体として、ＯＡＳ１は、レプリコン発現をブロックした試料中で上方調節される（図１３と比較して）。
【図１５】図１５：ＩＶＴ  ＲＮＡに対するＩＦＮ応答はＶａｃＶタンパク質によって低減されるが、ＶａｃＶタンパク質Ｅ３Ｌ、Ｋ３ＬおよびＢ１８Ｒの組合せだけがＩＦＮ応答を無効にする。  ヒト線維芽細胞を、指示されている組合せで、ＧＦＰをコードするＩＶＴ  ＲＮＡプラスワクシニアウイルスタンパク質をコードするＩＶＴ  ＲＮＡ（Ａ）またはＧＦＰをコードするレプリコンＲＮプラスワクシニアウイルスタンパク質をコードするＩＶＴ  ＲＮＡ（Ｂ）で同時トランスフェクトした（詳細については表２および実施例９．７参照）。エレクトロポレーションの１日後にｑＰＣＲによって測定し、ＶａｃＶタンパク質なしでトランスフェクトした細胞の転写産物量に標準化した、ＩＦＮ−β、ＯＡＳ１およびＯＡＳ２転写産物の量を示す。
【図１６】図１６：ＶａｃＶタンパク質の同時エレクトロポレーションは、種々のマウスおよびヒト細胞型においてＩＶＴ  ＲＮＡおよびレプリコン発現を増大させる。  ヒト線維芽細胞（ＣＣＤ１０７９ＳＫ）、マウス線維芽細胞（３Ｔ３−Ｌ１）、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびマウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を、ＶａｃＶタンパク質をコードするＩＶＴ  ＲＮＡおよびＧＦＰをコードするＩＶＴ  ＲＮＡ（Ａ）またはレプリコンＲＮＡ（Ｂ）のいずれかで同時エレクトロポレーションした（詳細については表２および実施例９．８参照）。ＶａｃＶタンパク質なしの試料のＭＦＩに標準化したＧＦＰ平均蛍光の倍数変化を示す。ヒト細胞では、レプリコン発現の増大はマウス線維芽細胞におけるよりも約３倍強力であった。Ｅ３は、ヒト線維芽細胞においてＫ３よりも大きな作用を及ぼした。
【図１７】図１７：ＶａｃＶタンパク質の同時リポフェクションは、マウスおよびヒト線維芽細胞および筋芽細胞においてＩＶＴ  ＲＮＡおよびレプリコン発現を増大させる。  図１６からの結果をリポフェクションによって確認した（リポフェクトしたＲＮＡ混合物についての詳細は表３および実施例９．９参照）。ＶａｃＶタンパク質なしの試料のＭＦＩに標準化したＧＦＰ平均蛍光の倍数変化を示す。ＶａｃＶタンパク質は、ヒト線維芽細胞および筋芽細胞においてこれらのマウス対応物におけるよりも有効である。Ｅ３Ｌがヒト細胞において主要な役割を果たすＶａｃＶタンパク質であった。
【図１８】図１８：ＶａｃＶタンパク質は、Ｂ１８Ｒを除き、成熟マウス筋管における発現を増大させる。  図１７におけるのと同様の実験。Ｃ２Ｃ１２細胞の筋管への分化後、前と同じＲＮＡ混合物（表３）を同時リポフェクトした。リポフェクションの１日後にＧＦＰ蛍光の写真を撮影した。ＧＦＰシグナルの輝度は筋管におけるＧＦＰ発現を示す。
【図１９】図１９：レプリコンＲＮＡとＥＢＫ  ＲＮＡの１：１（ｗ：ｗ）比率は最大のレプリコン発現を達成するのに十分である。  漸増量のＥＢＫ  ＲＮＡまたはＥ３  ＲＮＡを、ルシフェラーゼをコードするレプリコンと共にマウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）に同時エレクトロポレーションした（詳細については実施例９．１１参照）。ＶａｃＶタンパク質なしの試料に標準化したルシフェラーゼ活性の倍数変化を示す。過剰量は発現のさらなる増大を生じさせない。
【図２０】図２０：ＶａｃＶタンパク質Ｅ３ＬおよびＫ３Ｌはどちらも、レプリコンが誘導するＰＫＲ自己リン酸化を阻害する。Ｂ１８Ｒは作用を及ぼさない。  ヒトＣＣＤ１０７９ＳＫ線維芽細胞を、ｉＲＦＰおよび指示されるＶａｃＶタンパク質をコードするＩＶＴ  ＲＮＡと共に、ＧＦＰをコードするレプリコンＲＮＡで同時エレクトロポレーションした。モックエレクトロポレーション細胞（非トランスフェクト）およびキャップされていないレプリコンＲＮＡ（キャップなし）を陰性対照として使用した（詳細については実施例９．１２参照）。ホスホ−ＰＫＲ特異的抗体（Ｐ−ＰＫＲ）によるＰＫＲの自己リン酸化およびＰＫＲ抗体（ＰＫＲ）を用いた全ＰＫＲ発現を示す。
【図２１】図２１：ＶａｃＶタンパク質は、非細胞傷害性突然変異体レプリコンの効率的な複製を可能にし、これらのベクターの残存する細胞傷害性を阻害する。  ルシフェラーゼをコードする親および非細胞傷害性ＰＤレプリコンを、Ｅ３、Ｂ１８ＲおよびＫ３（ＥＢＫ）をコードするＩＶＴ  ＮＡと共にまたは前記ＩＶＴ  ＮＡなしでヒト線維芽細胞にエレクトロポレートした（詳細については実施例９．１３参照）。経時的なルシフェラーゼ発現（Ａ）および非トランスフェクト細胞に標準化した細胞の生存能（Ｂ）を示す。
【図２２】図２２：ＶａｃＶタンパク質はマウスの筋において裸のレプリコンの発現を増強した。インビボでの最良の比率は、ＥＢＫをコードするＩＶＴ  ＲＮＡの６倍過剰である。  ルシフェラーゼをコードするレプリコンＲＮＡ  ２μｇを、Ｅ３、Ｋ３およびＢ１８Ｒ（ＥＢＫ）をコードするＩＶＴ  ＲＮＡと共に指示されている種々の重量比で（レプリコンＲＮＡの１から６倍のＥＫＢ）Ｂａｌｂ／Ｃマウスの前脛骨筋に同時注入した（詳細については実施例９．１４参照）。インビボでのルシフェラーゼシグナルを示す。
【図２３】図２３：ＶａｃＶタンパク質は、ｉ．ｖ．リポソーム送達後にマウスの脾臓においてＩＶＴ  ＲＮＡ発現を増強した。  ルシフェラーゼをコードするＩＶＴ  ＲＮＡ  １０μｇを、ＧＦＰ  ＲＮＡ  ３０μｇまたはＥＢＫ  ＲＮＡ  ３０μｇと共に脾臓を標的とするリポソームに同時パッケージングした。ルシフェラーゼ発現を４日間にわたって観測した。
【図２４】図２４：ＮＳ３４ＡおよびＩＣＰ３４．５はレプリコン発現を増強する。  ヒト線維芽細胞を、ルシフェラーゼ−ＧＦＰ融合物をコードするレプリコンＲＮＡ  １，５μｇおよびインターフェロン阻害剤をコードするｍＲＮＡまたは対照としてｉＲＦＰをコードするｍＲＮＡ  １μｇで同時トランスフェクトした。その翌日、導入遺伝子発現をＦＡＣＳによって測定した。（Ａ）ＧＦＰ発現によって決定したトランスフェクト細胞のパーセンテージ。ＮＳ３４ＡはＥＢＫと同程度にトランスフェクション率を上昇させるが、ＩＣＰ３４．５はより強力にトランスフェクション率を上昇させた。（Ｂ）阻害剤なしの試料と比較してトランスフェクション率の倍数増加として表した、Ａと同じデータ。（Ｃ）平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表した、ＧＦＰ翻訳の変化。ＮＳ３４Ａは翻訳を増大させないが、ＩＣＰ３４．４は翻訳を増大させる。
【図２５】図２５：ＮＳ３４Ａは合成ｍＲＮＡに対するＩＦＮ応答を阻害し、ＩＣＰ３４．５はＩＦＮ応答を低減する。  ヒト線維芽細胞を、ＩＦＮ応答を誘導または阻止するために合成ｍＲＮＡ混合物５μｇでトランスフェクトした。すべての混合物は、赤外蛍光タンパク質（ｉＲＦＰ）をコードする合成ｍＲＮＡ  ２μｇおよびＩＦＮ阻害剤（指示されているように）または対照としてルシフェラーゼのいずれかをコードする合成ｍＲＮＡ  ３μｇを含んだ。その翌日、細胞を採取し、溶解して、ｑＲＴ−ＰＣＲのためにＲＮＡを抽出した。ＩＦＮβおよびＯＡＳ１／２の誘導を非トランスフェクト細胞における基線発現に標準化した。（Ａ）ＩＦＮβの転写誘導。本発明者らが以前に観察したように、ワクシニアウイルスタンパク質ＥＫＢはＩＦＮβを排除し、Ｅ３はＩＦＮβ誘導を低減した。ＮＳ３４ＡもＥＢＫと同様にＩＦＮβ誘導を排除し、ＩＣＰ３４．５はＥ３と同様にＩＦＮβ誘導を低減した。（Ｂ、Ｃ）ＩＦＮβ標的遺伝子ＯＡＳ１／２の転写誘導。ＥＢＫはＯＡＳ１／２誘導をブロックしたが、Ｅ３単独ではＯＡＳ１／２の上方調節を部分的にしか阻止することができなかった。Ｅ３と同様に、ＩＣＰ３４．５はＯＡＳ１／２誘導を阻止することができないが、ＮＳ３４Ａは両方のマーカーの誘導を大きく低減した。
【図２６Ａ】図２６Ａ−２６Ｄ：Ｒｉｂｏ−ｉＰＳの作製のために必要な最小リポフェクション。  図２６Ａ：ＨＦＦ線維芽細胞（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を６ウェルに塗布し（１００，０００細胞／ウェル）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６μｌおよびＩＶＴ−ＲＮＡ  １．４μｇを用いてスキームに示すように１〜６回リポフェクトした（Ａ）。
【図２６Ｂ】図２６Ｂ：ＩＶＴ−ＲＮＡ混合物は、それにより非修飾ＯＳＫＭＮＬ（１：１：１：１：１：１）０．８μｇと、それぞれＢ１８Ｒ、Ｅ３およびＫ３（ＥＫＢ）０．２μｇならびにｍｉＲＮＡ  ３０２ａ−ｄおよび３６７［各々０．４μＭ］から成るｍｉＲＮＡ混合物０．４μｇで構成された。幹細胞培地（Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ  ｍｅｄｉａ，Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）中でのリポフェクションを製造者の指示に従って実施した。９日目から、コロニー形成が観察され、１１日目に顕微鏡によって代表的な写真を撮影した（Ｂ）。
【図２６Ｃ】図２６Ｃ：さらなる分析のために、ＳｔａｉｎＡｌｉｖｅ  ＴＲＡ−１−６０抗体（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を使用してコロニーをＥＳ表面マーカーＴＲＡ−１−６０について染色し（Ｃ）、その後細胞をペレット化して、全ＲＮＡを単離し、ヒトＥＳマーカーＯＣＴ４（内因性）、ＮＡＮＯＧ（内因性）、ＬＩＮ２８（内因性）、ＴＥＲＴおよびＲＥＸ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した（Ｄ）。（Ｂ）３回の連日トランスフェクションが数個のコロニーを得るために必要であるが、４回の連日トランスフェクションはコロニー形成の堅固な誘導に十分であることが明らかになった。コロニーは９日目から可視になり、１１日目には十分に増殖して、ＴＲＡ−１−６０について陽性に染色することができた（Ｃ）。いくつかの多能性マーカーの発現レベルの分析は、コロニー形成と一致して、ＥＳマーカー遺伝子の誘導が３回以上のリポフェクションで達成できることを明らかにした。それにもかかわらず、ＥＳマーカー発現の堅固な誘導は４回以上のリポフェクションで達成された。ＥＳマーカー遺伝子の発現は４回を超えるリポフェクションによってさらに増強されなかったことに言及しておかねばならない（Ｄ）。
【図２６Ｄ】図２６Ｄ：さらなる分析のために、ＳｔａｉｎＡｌｉｖｅ  ＴＲＡ−１−６０抗体（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を使用してコロニーをＥＳ表面マーカーＴＲＡ−１−６０について染色し（Ｃ）、その後細胞をペレット化して、全ＲＮＡを単離し、ヒトＥＳマーカーＯＣＴ４（内因性）、ＮＡＮＯＧ（内因性）、ＬＩＮ２８（内因性）、ＴＥＲＴおよびＲＥＸ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した（Ｄ）。（Ｂ）３回の連日トランスフェクションが数個のコロニーを得るために必要であるが、４回の連日トランスフェクションはコロニー形成の堅固な誘導に十分であることが明らかになった。コロニーは９日目から可視になり、１１日目には十分に増殖して、ＴＲＡ−１−６０について陽性に染色することができた（Ｃ）。いくつかの多能性マーカーの発現レベルの分析は、コロニー形成と一致して、ＥＳマーカー遺伝子の誘導が３回以上のリポフェクションで達成できることを明らかにした。それにもかかわらず、ＥＳマーカー発現の堅固な誘導は４回以上のリポフェクションで達成された。ＥＳマーカー遺伝子の発現は４回を超えるリポフェクションによってさらに増強されなかったことに言及しておかねばならない（Ｄ）。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明を以下で詳細に説明するが、本発明は、本明細書で述べる特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および学術用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００５８】
以下において、本発明の要素を説明する。これらの要素を特定の実施形態と共に列挙するが、それらを任意の方法および任意の数で組み合わせて付加的な実施形態を創製し得ることが理解されるべきである。様々に説明される実施例および好ましい実施形態は、本発明を明確に説明される実施形態だけに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明確に説明される実施形態を、多くの開示されるおよび／または好ましい要素と組み合わせた実施形態を裏付け、包含することが理解されるべきである。さらに、本出願で述べるすべての要素の任意の順序および組合せが、文脈によって特に指示されない限り、本出願の説明によって開示されるとみなされるべきである。例えば、１つの好ましい実施形態においてＲＮＡが１２０ヌクレオチドから成るポリ（Ａ）尾部を含み、および別の好ましい実施形態では前記ＲＮＡ分子が５'キャップ類似体を含む場合、好ましい実施形態では、前記ＲＮＡは、１２０ヌクレオチドから成るポリ（Ａ）尾部および５'キャップ類似体を含む。
【００５９】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、"Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）"，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ  Ｈ．  Ｋｏｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載されているように定義される。
【００６０】
本発明の実施は、特に指示されない限り、当該分野の文献中で説明される化学、生化学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  １９８９参照）。
【００６１】
本明細書および以下の特許請求の範囲全体を通して、文脈上特に必要とされない限り、「含む」という語および「含むこと」などの変形は、記述される成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の包含を意味し、いかなる他の成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の排除を意味しないが、一部の実施形態では、そのような他の成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群が排除され得る、すなわち主題が記述される成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の包含に存することが理解される。本発明の説明に関連して（特に特許請求の範囲に関連して）使用される「１つの」および「その」という用語および同様の言及は、本明細書で特に指示されない限りまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を含むと解釈されるべきである。本明細書中の数値の範囲の列挙は、単に範囲内に属する各々別々の数値を個別に言及することの簡略化した方法としての役割を果たすことが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各々個別の数値は、本明細書で個別に列挙されるがごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書で述べるすべての方法は、本明細書で特に指示されない限りまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的な言語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図し、本発明の範囲または特許請求される範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、特許請求されない要素が本発明の実施に必須であると指示すると解釈されるべきではない。
【００６２】
いくつかの資料が本明細書の本文全体にわたって引用される。上記または下記で、本明細書において引用される資料の各々は（すべての特許、特許出願、学術出版物、製造者の仕様書、指示書等を含む）、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明を理由にそのような開示に先行する権利を有さないことの承認と解釈されるべきではない。
【００６３】
「阻止する」、「低減する」または「阻害する」などの用語は、好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上のレベルの全体的な減少を生じさせる能力に関する。これらの用語はまた、完全なまたは実質的に完全な減少、すなわち、ゼロまたは実質的にゼロへの減少を含む。
【００６４】
「増大させる」、「増強する」または「延長させる」などの用語は、好ましくは、およそ少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも１００％、好ましくは少なくとも２００％、特に少なくとも３００％の増大、増強または延長に関する。これらの用語はまた、ゼロからまたは測定不能もしくは検出不能なレベルからゼロを上回るレベルまたは測定可能もしくは検出可能なレベルへの増大、増強または延長にも関し得る。
【００６５】
本発明に関連して「組換え」という用語は、「遺伝子工学を通して作製された」ことを意味する。好ましくは、本発明に関連して組換えタンパク質などの「組換え実体」は、天然には存在せず、好ましくは天然では組み合わされないアミノ酸または核酸配列などの実体の組合せの結果である。例えば、本発明に関連して組換えタンパク質は、例えばペプチド結合によって一緒に融合された異なるタンパク質に由来するいくつかのアミノ酸配列を含み得る。
【００６６】
本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、ある物体が自然界で見出すことができるという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、天然源から単離することができ、実験室内で人の手によって意図的に改変されていないタンパク質または核酸は、天然に存在する。
【００６７】
核酸は、本発明によれば、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、より好ましくはＲＮＡ、最も好ましくはインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ  ＲＮＡ）である。核酸は、本発明によれば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産された分子および化学合成された分子を含む。本発明によれば、核酸は、一本鎖または二本鎖としておよび直鎖状または共有結合閉環分子として存在し得る。核酸は、本発明によれば、単離することができる。「単離された核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が、（ｉ）インビトロで、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産された、（ｉｉｉ）例えば切断とゲル電気泳動による分離によって精製された、または（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。核酸は、細胞内への導入、すなわち細胞のトランスフェクションのために、特にＤＮＡ鋳型からインビトロ転写によって調製することができるＲＮＡの形態で用いることができる。ＲＮＡは、適用の前に配列の安定化、キャッピングおよびポリアデニル化によってさらに修飾することができる。
【００６８】
２個以上のペプチドまたはタンパク質の発現のための核酸、特にＲＮＡとして、異なるペプチドもしくはタンパク質が異なる核酸分子中に存在する核酸型またはペプチドもしくはタンパク質が同じ核酸分子中に存在する核酸型を使用することができる。
【００６９】
本発明に関連して、「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全にまたは実質的にリボヌクレオチド残基から成る分子に関する。「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。「ＲＮＡ」という用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的または完全に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、基本的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ならびに１個以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変化によって天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡなどの組換え作製されたＲＮＡを含む。そのような変化には、例えばＲＮＡの末端へのまたは内部での、例えばＲＮＡの１個以上のヌクレオチドにおける非ヌクレオチド物質の付加が含まれ得る。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドには、天然には存在しないヌクレオチドまたは化学合成ヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの、非標準ヌクレオチドも含まれ得る。これらの変化したＲＮＡは、類似体または天然に存在するＲＮＡの類似体と称され得る。本発明の１つの実施形態では、ＲＮＡは化学修飾されていない。本発明の１つの実施形態では、ＲＮＡは、天然に存在するヌクレオチドなどの標準ヌクレオチドだけを含む。
【００７０】
本発明によれば、「ＲＮＡ」という用語は、「ｍＲＮＡ」を包含し、好ましくは「ｍＲＮＡ」に関する。「ｍＲＮＡ」という用語は「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡ鋳型を使用することによって作製され、ペプチドまたはタンパク質をコードする「転写産物」に関する。典型的には、ｍＲＮＡは、５'−ＵＴＲ、タンパク質コード領域および３'−ＵＴＲを含む。ｍＲＮＡは、細胞中およびインビトロで限られた半減期しか有さない。本発明に関連して、ｍＲＮＡはＤＮＡ鋳型からインビトロ転写によって作製され得る。インビトロ転写の方法は当業者に公知である。例えば、様々なインビトロ転写キットが市販されている。
【００７１】
本発明の１つの実施形態では、ＲＮＡ、特に細胞中で発現されるべきＲＮＡは、一本鎖自己複製ＲＮＡなどの自己複製ＲＮＡである。１つの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、プラスセンスの一本鎖ＲＮＡである。１つの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、ウイルスＲＮＡまたはウイルスＲＮＡに由来するＲＮＡである。１つの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、アルファウイルスゲノムＲＮＡであるかまたはアルファウイルスゲノムＲＮＡに由来する。１つの実施形態では、自己複製ＲＮＡはウイルス遺伝子発現ベクターである。１つの実施形態では、ウイルスはセムリキ森林ウイルスである。１つの実施形態では、自己複製ＲＮＡは１個以上の導入遺伝子を含み、前記導入遺伝子は、１つの実施形態では、ＲＮＡがウイルスＲＮＡである場合、構造タンパク質をコードするウイルス配列などのウイルス配列を部分的または完全に置換し得る。１つの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、インビトロ転写ＲＮＡの形態で細胞に導入される。
【００７２】
本発明によれば、ＲＮＡの安定性および翻訳効率は必要に応じて改変し得る。例えば、ＲＮＡの安定化作用を有するおよび／または翻訳効率を高める１つ以上の修飾によってＲＮＡを安定化し、その翻訳効率を高め得る。そのような修飾は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＥＰ２００６／００９４４８号に記載されている。本発明に従って使用されるＲＮＡの発現を増大させるために、コード領域内、すなわち発現されるペプチドまたはタンパク質をコードする配列内で、好ましくは発現されるペプチドまたはタンパク質の配列を変化させずに、ＧＣ含量を増大させてｍＲＮＡの安定性を高め、コドン最適化を実施し、したがって細胞中での翻訳を増強するようにＲＮＡを修飾し得る。
【００７３】
本発明で使用されるＲＮＡに関連して「修飾」という用語は、前記ＲＮＡ中に天然では存在しないＲＮＡの任意の修飾を包含する。
【００７４】
本発明の１つの実施形態では、本発明に従って使用されるＲＮＡは、キャップされていない５'−三リン酸を有さない。そのようなキャップされていない５'−三リン酸の除去は、ＲＮＡをホスファターゼで処理することによって達成できる。
【００７５】
本発明によるＲＮＡは、その安定性を高めるおよび／または細胞傷害性を低下させるために修飾されたリボヌクレオチドを有し得る。例えば、１つの実施形態では、本発明に従って使用されるＲＮＡ中で、シチジンを５−メチルシチジンで部分的または完全に、好ましくは完全に置換する。あるいはまたはさらに、１つの実施形態では、本発明に従って使用されるＲＮＡ中で、ウリジンをプソイドウリジンで部分的または完全に、好ましくは完全に置換する。
【００７６】
１つの実施形態では、「修飾」という用語は、ＲＮＡに５'−キャップまたは５'−キャップ類似体を提供することに関する。「５'−キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５'末端に認められるキャップ構造を指し、一般に独特の５'−５'三リン酸結合によってｍＲＮＡに連結されたグアノシンヌクレオチドから成る。１つの実施形態では、このグアノシンは７位でメチル化されている。「従来の５'−キャップ」という用語は、天然に存在するＲＮＡの５'−キャップ、好ましくは７−メチルグアノシンキャップ（ｍ７Ｇ）を指す。本発明に関連して、「５'−キャップ」という用語は、ＲＮＡキャップ構造に類似し、好ましくはインビボおよび／または細胞中で、ＲＮＡに結合した場合ＲＮＡを安定化するおよび／またはＲＮＡの翻訳を増強する能力を有するように修飾されている５'−キャップ類似体を含む。
【００７７】
好ましくは、ＲＮＡの５'末端は、以下の一般式：
【化１】
0006353846.tif 000002
［式中、Ｒ１およびＲ２は、独立してヒドロキシまたはメトキシであり、ならびにＷ−、Ｘ−およびＹ−は、独立して酸素、硫黄、セレンまたはＢＨ３である］
を有するキャップ構造を含む。好ましい実施形態では、Ｒ１およびＲ２はヒドロキシであり、ならびにＷ−、Ｘ−およびＹ−は酸素である。さらなる好ましい実施形態では、Ｒ１およびＲ２の一方、好ましくはＲ１はヒドロキシであり、他方はメトキシであり、ならびにＷ−、Ｘ−およびＹ−は酸素である。さらなる好ましい実施形態では、Ｒ１およびＲ２はヒドロキシであり、ならびにＷ−、Ｘ−およびＹ−の１つ、好ましくはＸ−は硫黄、セレンまたはＢＨ３、好ましくは硫黄であり、その他は酸素である。さらなる好ましい実施形態では、Ｒ１およびＲ２の一方、好ましくはＲ２はヒドロキシであり、他方はメトキシであり、ならびにＷ−、Ｘ−およびＹ−の１つ、好ましくはＸ−は硫黄、セレンまたはＢＨ３、好ましくは硫黄であり、その他は酸素である。
【００７８】
上記式中、右側のヌクレオチドは、その３'基を介してＲＮＡ鎖に結合されている。
【００７９】
Ｗ−、Ｘ−およびＹ−の少なくとも１つが硫黄である、すなわちホスホロチオエート部分を有するキャップ構造は、種々のジアステレオ異性体の形態で存在し、それらのすべては本明細書に包含される。さらに、本発明は、上記式のすべての互変異性体および立体異性体を包含する。
【００８０】
例えば、Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２がヒドロキシであり、Ｘ−が硫黄であり、ならびにＷ−およびＹ−が酸素である上記構造を有するキャップ構造は、２つのジアステレオ異性体形態（ＲｐおよびＳｐ）で存在する。これらは逆相ＨＰＬＣによって分離することができ、逆相ＨＰＬＣカラムからの溶出順序に従ってＤ１およびＤ２と命名される。本発明によれば、ｍ２７，２'−ＯＧｐｐＳｐＧのＤ１異性体が特に好ましい。
【００８１】
ＲＮＡに５'−キャップまたは５'−キャップ類似体を提供することは、前記５'−キャップまたは５'−キャップ類似体の存在下でのＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって達成でき、前記５'−キャップを作製されたＲＮＡ鎖に同時転写によって組み込むか、またはＲＮＡを、例えばインビトロ転写によって作製し、キャッピング酵素、例えばワクシニアウイルスのキャッピング酵素を用いて５'−キャップを転写後にＲＮＡに結合し得る。
【００８２】
ＲＮＡはさらなる修飾を含み得る。例えば、本発明で使用されるＲＮＡのさらなる修飾は、天然に存在するポリ（Ａ）尾部の伸長もしくは末端切断、または前記ＲＮＡのコード領域に関連しない非翻訳領域（ＵＴＲ）の導入などの５'ＵＴＲもしくは３'ＵＴＲの変化、例えばグロビン遺伝子、例えばα２グロビン、α１グロビン、βグロビン、好ましくはβグロビン、より好ましくはヒトβグロビンに由来する３'ＵＴＲの１コピー以上、好ましくは２コピーと既存の３'ＵＴＲの交換または前記グロビン遺伝子由来の３'ＵＴＲの１コピー以上、好ましくは２コピーの挿入であり得る。
【００８３】
マスクされていないポリＡ配列を有するＲＮＡは、マスクされたポリＡ配列を有するＲＮＡよりも効率的に翻訳される。「ポリ（Ａ）尾部」または「ポリＡ配列」という用語は、典型的にはＲＮＡ分子の３'末端に位置するアデニル（Ａ）残基の配列に関し、「マスクされていないポリＡ配列」は、ＲＮＡ分子の３'末端のポリＡ配列がポリＡ配列のＡで終了し、ポリＡ配列の３'末端側、すなわち下流に位置するＡ以外のヌクレオチドが後続していないことを意味する。さらに、約１２０塩基対の長いポリＡ配列は、ＲＮＡの最適な転写産物安定性および翻訳効率をもたらす。
【００８４】
それゆえ、本発明に従って使用されるＲＮＡの安定性および／または発現を増大させるために、好ましくは１０〜５００、より好ましくは３０〜３００、さらに一層好ましくは６５〜２００、特に１００〜１５０個のアデノシン残基の長さを有するポリＡ配列と共に存在するようにＲＮＡを修飾し得る。特に好ましい実施形態では、ポリＡ配列は約１２０個のアデノシン残基の長さを有する。本発明に従って使用されるＲＮＡの安定性および／または発現をさらに増大させるために、ポリＡ配列を脱マスク化することができる。
【００８５】
加えて、ＲＮＡ分子の３'非翻訳領域（ＵＴＲ）への３'非翻訳領域の組込みは、翻訳効率の上昇をもたらすことができる。２つ以上のそのような３'非翻訳領域を組み込むことによって相乗効果を達成し得る。３'非翻訳領域は、それらが導入されるＲＮＡに対して自己または異種であってよい。１つの特定の実施形態では、３'非翻訳領域はヒトβグロビン遺伝子に由来する。
【００８６】
上述した修飾、すなわちポリＡ配列の組込み、ポリＡ配列の脱マスク化および１つ以上の３'非翻訳領域の組込みの組合せは、ＲＮＡの安定性および翻訳効率の上昇に相乗的影響を及ぼす。
【００８７】
ＲＮＡの「安定性」という用語は、ＲＮＡの「半減期」に関する。「半減期」は、分子の活性、量または数の半分を除去するのに必要な期間に関する。本発明に関連して、ＲＮＡの半減期は前記ＲＮＡの安定性の指標である。ＲＮＡの半減期は、ＲＮＡの「発現の持続期間」に影響を及ぼし得る。長い半減期を有するＲＮＡは長期間発現されると予測できる。
【００８８】
言うまでもなく、本発明によれば、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を低下させることが望ましい場合、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を上昇させる上述した要素の機能を妨げるようにＲＮＡを修飾することが可能である。
【００８９】
「発現」という用語は、本発明によればその最も一般的な意味で使用され、例えば転写および／または翻訳による、ＲＮＡおよび／またはペプチドもしくはタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、特にペプチドまたはタンパク質の産生に関する。また、核酸の部分的発現も含む。さらに、発現は一過性または安定であり得る。
【００９０】
本発明によれば、「ＲＮＡ発現」、「ＲＮＡを発現すること」または「ＲＮＡの発現」などの用語は、ＲＮＡによってコードされるペプチドまたはタンパク質の産生に関する。好ましくは、そのような用語は、ＲＮＡによってコードされるペプチドまたはタンパク質を発現する、すなわち産生するためのＲＮＡの翻訳に関する。
【００９１】
本発明に関連して、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列中の遺伝暗号がＲＮＡに転写される過程に関する。その後、ＲＮＡはタンパク質へと翻訳され得る。本発明によれば、「転写」という用語は「インビトロ転写」を含み、ここで「インビトロ転写」という用語は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが、好ましくは適切な細胞抽出物を使用して、無細胞系においてインビトロ合成される過程に関する。好ましくは、クローニングベクターを転写産物の作製に適用する。これらのクローニングベクターは一般に転写ベクターと称され、本発明によれば「ベクター」という用語に包含される。本発明によれば、本発明で使用されるＲＮＡは、好ましくはインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって入手し得る。転写を制御するためのプロモーターは、任意のＲＮＡポリメラーゼについての任意のプロモーターであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの特定の例は、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは、本発明によるインビトロ転写はＴ７またはＳＰ６プロモーターによって制御される。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって入手し得る。ｃＤＮＡはＲＮＡの逆転写によって入手し得る。
【００９２】
ベクター鋳型を含むｃＤＮＡは、転写後、場合により異なるペプチドもしくはタンパク質を発現する能力を有する異なるＲＮＡ分子の集団をもたらす、異なるｃＤＮＡ挿入物を担持するベクターを含み得るか、または転写後、１種のペプチドもしくはタンパク質だけを発現する能力を有する１つのＲＮＡ種だけの集団をもたらす１種だけのｃＤＮＡ挿入物を担持するベクターを含み得る。したがって、単一ペプチドもしくはタンパク質だけを発現する能力を有するＲＮＡを生成する、または２種以上のペプチドもしくはタンパク質を発現する能力を有するＲＮＡライブラリおよび全細胞ＲＮＡなどの異なるＲＮＡの組成物、例えばペプチドもしくはタンパク質の組成物を生成することが可能である。本発明は、すべてのそのようなＲＮＡの細胞への導入を想定する。
【００９３】
本発明による「翻訳」という用語は、メッセンジャーＲＮＡの鎖が、ペプチドまたはタンパク質を作製するようにアミノ酸の配列のアセンブリを指令する、細胞のリボソーム中の過程に関する。
【００９４】
本発明によれば、核酸と機能的に連結し得る発現制御配列または調節配列は、核酸に関して同種または異種であってよい。コード配列および調節配列は、コード配列の転写または翻訳が調節配列の制御下または影響下にあるように共に共有結合されている場合、「機能的に」連結されている。コード配列が機能性タンパク質に翻訳される場合、コード配列と調節配列の機能的連結により、調節配列の誘導は、コード配列の読み枠シフトを引き起こすことなくまたはコード配列が所望のタンパク質もしくはペプチドに翻訳されることを不可能にすることなく、コード配列の転写をもたらす。
【００９５】
「発現制御配列」または「調節配列」という用語は、本発明によれば、核酸の転写または誘導されたＲＮＡの翻訳を制御する、プロモーター、リボソーム結合配列および他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施形態では、調節配列を制御することができる。調節配列の正確な構造は、種または細胞型に応じて異なり得るが、一般に転写および翻訳の開始に関与する５'非転写配列ならびに５'および３'非翻訳配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等を含む。特に、５'非転写調節配列は、機能的に結合した遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列が含まれるプロモーター領域を含む。調節配列はまた、エンハンサー配列または上流活性化配列も含み得る。
【００９６】
「発現の増強」、「増強された発現」または「増大された発現」などの用語は、本発明に関連して、所与の数のＲＮＡ分子によって発現されるペプチドまたはタンパク質の量が、同じ数のＲＮＡ分子によって発現されるペプチドまたはタンパク質の量より高いことを意味し、ここでＲＮＡ分子の発現は、ＲＮＡの増強されたまたは増大された発現をもたらす条件、例えば細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止しないことおよび細胞における細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害しないことに対して、細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止することおよび細胞における細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することなどの条件を除き、同じ条件下で実施される。これに関連して、「同じ条件」は、同じペプチドまたはタンパク質をコードする同じＲＮＡ配列を同じ手段によって同じ細胞に導入し、細胞を同じ条件下で（増強されたまたは増大された発現をもたらす条件を除く）培養し、ペプチドまたはタンパク質の量を同じ手段によって測定する状況を指す。ペプチドまたはタンパク質の量は、モル単位で、または重量単位、例えばグラムで、または質量によってまたはポリペプチド活性によって表してよく、例えばペプチドもしくはタンパク質が酵素である場合は触媒活性として表してよく、またはペプチドもしくはタンパク質が抗体もしくは抗原もしくは受容体である場合は結合親和性として表してよい。１つの実施形態では、「発現の増強」、「増強された発現」または「増大された発現」などの用語は、本発明に関連して、所与の数のＲＮＡ分子によって所与の期間内に発現されるペプチドまたはタンパク質の量が、同じ数のＲＮＡ分子によって同じ期間内に発現されるペプチドまたはタンパク質の量より高いことを意味する。例えば、特定の時点で所与の数のＲＮＡ分子によって発現されるペプチドまたはタンパク質の最大値は、同じ数のＲＮＡ分子によって発現されるペプチドまたはタンパク質の最大値より高くてよい。他の実施形態では、所与の数のＲＮＡ分子によって発現されるペプチドまたはタンパク質の最大値は、同じ数のＲＮＡ分子によって発現されるペプチドまたはタンパク質の最大値より高い必要はないが、所与の期間内に所与の数のＲＮＡ分子によって発現されるペプチドまたはタンパク質の平均量は、同じ数のＲＮＡ分子によって発現されるペプチドまたはタンパク質の平均量より高くてよい。後者の場合は、本明細書では「より高レベルの発現」または「増大したレベルの発現」と称され、発現のより高い最大値および／または発現のより高い平均値に関する。あるいはまたはさらに、「発現の増強」、「増強された発現」または「増大された発現」などの用語はまた、本発明に関連して、ペプチドまたはタンパク質がＲＮＡ分子によって発現される時間が、同じＲＮＡ分子によってペプチドまたはタンパク質が発現される時間より長くてよいことを意味する。したがって、１つの実施形態では、「発現の増強」、「増強された発現」または「増大された発現」などの用語はまた、本発明に関連して、ＲＮＡが安定に存在し、発現される期間が、同じ数のＲＮＡが安定に存在し、発現される期間よりも長いため、所与の数のＲＮＡ分子によって発現されるペプチドまたはタンパク質の量が、同じ数のＲＮＡ分子によって発現されるペプチドまたはタンパク質の量より高いことを意味する。これらの場合は、本明細書では「増大された発現の持続期間」とも称される。好ましくは、そのようなより長い期間は、細胞へのＲＮＡの導入後または細胞へのＲＮＡの最初の導入後（例えば反復トランスフェクションの場合）少なくとも４８時間、好ましくは少なくとも７２時間、より好ましくは少なくとも９６時間、特に少なくとも１２０時間、またはさらにそれ以上長い発現を指す。
【００９７】
ＲＮＡの発現のレベルおよび／または発現の持続期間は、例えばＥＬＩＳＡ法、免疫組織化学法、定量的画像解析法、ウェスタンブロット法、質量分析法、定量的免疫組織化学法または酵素検定法を用いることにより、ＲＮＡによってコードされるペプチドもしくはタンパク質の総発現量および／もしくは所与の期間に発現された量などの量、ならびに／または発現の時間を測定することによって決定し得る。
【００９８】
特定の実施形態では、本発明によるＲＮＡは、異なるＲＮＡ分子の集団、例えば場合により異なるペプチドおよび／またはタンパク質をコードする異なるＲＮＡ分子の混合物、全細胞ＲＮＡ、ＲＮＡライブラリまたはその一部、例えば特定の細胞型、例えば未分化細胞、特に胚性幹細胞などの幹細胞において発現されるＲＮＡ分子のライブラリ、またはＲＮＡ分子のライブラリの画分、例えば分化した細胞に比べて未分化細胞、特に胚性幹細胞などの幹細胞における発現が強化されたＲＮＡを含む。したがって、本発明によれば、「ＲＮＡ」という用語は、細胞からのＲＮＡの単離を含む過程によっておよび／または組換え手段、特にインビトロ転写によって入手し得る、ＲＮＡ分子の混合物、全細胞ＲＮＡまたはその画分を含み得る。
【００９９】
好ましくは、本発明によれば、細胞中で発現されるべきＲＮＡは、インビトロまたはインビボのいずれかで、好ましくはインビトロで前記細胞に導入される。ＲＮＡは、細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止するおよび／または細胞における細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する前、その後および／またはそれと同時に細胞に導入し得る。好ましくは、細胞中でのＲＮＡの発現を所望する限り、細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合は阻止され、細胞内ＩＦＮシグナル伝達は阻害される。本発明による方法の１つの実施形態では、細胞に導入されるべきＲＮＡは、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られる。
【０１００】
本発明に従って使用されるＲＮＡは公知の組成物を有してもよく（この実施形態では、好ましくはいずれのペプチドまたはタンパク質がＲＮＡによって発現されているかが公知である）、またはＲＮＡの組成物が部分的もしくは完全に未知であってもよい。あるいは、本発明に従って使用されるＲＮＡは公知の機能を有してもよく、またはＲＮＡの機能が部分的または完全に未知であってもよい。
【０１０１】
本発明によれば、「発現する能力を有するＲＮＡ」および「をコードするＲＮＡ」という語は、本明細書では互換的に使用され、特定のペプチドまたはタンパク質に関して、ＲＮＡが、適切な環境中、好ましくは細胞中に存在する場合、発現されて前記ペプチドまたはタンパク質を産生できることを意味する。好ましくは、本発明によるＲＮＡは、細胞の翻訳機構と相互作用して、ＲＮＡが発現することができるペプチドまたはタンパク質を提供することができる。
【０１０２】
本発明によれば、ＲＮＡは、インビトロまたはインビボのいずれかで、好ましくはインビトロで細胞に導入し得る。ＲＮＡがインビトロで導入された細胞は、好ましくは本発明の方法によるインビトロでのＲＮＡの発現後に、患者に投与し得る。
【０１０３】
「導入する」、「導入する」または「トランスフェクトする」などの用語は、本明細書では互換的に使用され、核酸、特に外因性または異種核酸、特にＲＮＡの細胞への導入に関する。前記用語はまた、核酸、特にＲＮＡの細胞への反復導入を含み、ここで反復とは、１回より多いこと、例えば２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、６回以上、７回以上、８回以上を意味する。核酸の前記反復導入の時間間隔は、３日以内、２日以内、２４時間以内、さらにはそれ以下であってもよい。幹細胞特性を有する細胞の提供に関する本発明のこれらの態様は、少なくとも連続３日間、少なくとも連続４日間、少なくとも連続５日間または少なくとも連続６日間の、核酸、特にＲＮＡの細胞への反復導入を含み得る。核酸は、幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラム化を可能にする１つ以上の因子を発現する能力を有するＲＮＡを含み得る。しかし、核酸はまた、本明細書で開示されるタンパク質もしくはペプチドなどの、細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止する１つ以上のタンパク質もしくはペプチドをコードする核酸、特にＲＮＡ、および／または本明細書で開示されるタンパク質もしくはペプチドなどの、細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する１つ以上のタンパク質もしくはペプチドをコードする核酸、特にＲＮＡも含み得る。したがって、核酸はまた、例えばＢ１８ＲならびにＥ３およびＫ３の一方または両方をコードする核酸、特にＲＮＡも含み得る。さらに、核酸は、幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラム化を増強するｍｉＲＮＡを含み得る。好ましくは、核酸、特にＲＮＡの細胞への反復導入は、連続１０日間、連続８日間または連続６日間を超えて実施されない。好ましくは、核酸、特にＲＮＡの細胞への反復導入は、連続して３、４、５または６日間実施される。好ましくは、核酸、特にＲＮＡは、１日１回、２回または３回、好ましくは１日１回細胞に導入される。
【０１０４】
本発明によれば、細胞は、単離された細胞であり得るかまたは器官、組織および／もしくは生物の一部を形成し得る。本発明によれば、ＲＮＡを細胞に導入するのに適した任意の技術を使用し得る。好ましくは、ＲＮＡは標準的な技術によって細胞に導入される。そのような技術には、核酸のリン酸カルシウム沈殿物のトランスフェクション、ＤＥＡＥと結合した核酸のトランスフェクション、対象とする核酸を担持するウイルスによるトランスフェクションまたは感染、エレクトロポレーション、リポフェクションおよびマイクロインジェクションが含まれる。本発明によれば、核酸の投与は、裸の核酸としてまたは投与試薬と組み合わせて達成される。好ましくは、核酸の投与は裸の核酸の形態である。好ましくは、ＲＮＡは、ＲＮアーゼ阻害剤などの安定化物質と組み合わせて投与される。本発明はまた、長期間の持続的発現を可能にするための細胞への核酸の反復導入も想定する。
【０１０５】
細胞は、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのリポソームに基づく市販のトランスフェクションキットを用いてトランスフェクトすることができ、またＲＮＡが、例えばＲＮＡと複合体を形成するかまたはＲＮＡが封入もしくは被包された小胞を形成することによって結合し、裸のＲＮＡと比較してＲＮＡの増大した安定性をもたらすことができる任意の担体を用いてトランスフェクトすることができる。本発明に従う有用な担体には、例えば脂質含有担体、例えばカチオン性脂質、リポソーム、特にカチオン性リポソーム、およびミセルが含まれる。カチオン性脂質は、負に荷電した核酸と複合体を形成し得る。任意のカチオン性脂質を本発明に従って使用し得る。
【０１０６】
好ましくは、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡの細胞への導入は、細胞における前記ペプチドまたはタンパク質の発現をもたらす。特定の実施形態では、特定の細胞への核酸の標的化が好ましい。そのような実施形態では、細胞への核酸の投与に適用される担体（例えばレトロウイルスまたはリポソーム）は標的化分子を示す。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体または標的細胞上の受容体のリガンドなどの分子を核酸担体中に組み込み得るかまたは核酸担体に結合し得る。核酸をリポソームによって投与する場合は、標的化および／または取り込みを可能にするために、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質をリポソーム製剤に組み込み得る。そのようなタンパク質は、特定の細胞型に特異的なキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、インターナライズされるタンパク質に対する抗体、細胞内の位置を標的とするタンパク質等を包含する。
【０１０７】
エレクトロポレーションまたは電気透過化処理は、外部から印加された電場によって引き起こされる細胞形質膜の電気伝導率および透過性の有意な増大に関する。これは通常、分子生物学において何らかの物質を細胞に導入する方法として用いられる。エレクトロポレーションは通常、細胞溶液中に電磁場を作り出す器具であるエレクトロポレータを用いて行われる。細胞懸濁液を、側面に２つのアルミニウム電極を有するガラス製またはプラスチック製キュベットにピペットで注入する。エレクトロポレーションのために、典型的には約５０マイクロリットルの細胞懸濁液を使用する。エレクトロポレーションの前に、細胞懸濁液をトランスフェクトしようとする核酸と混合する。混合物をピペットでキュベットに注入し、電圧および静電容量を設定して、キュベットをエレクトロポレータに挿入する。好ましくは、エレクトロポレーションの直後に（キュベット中またはエッペンドルフチューブ中で）液体培地を添加し、細胞の回復および場合により抗生物質耐性の発現を可能にするように、チューブを細胞の最適温度で１時間以上インキュベートする。
【０１０８】
本発明によれば、ひとたびインビトロまたは被験体中に存在し得る細胞によって取り込まれるかまたは細胞に導入された核酸、例えばペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡは、前記ペプチドまたはタンパク質の発現をもたらすことが好ましい。細胞は、コードされるペプチドまたはタンパク質を細胞内で（例えば細胞質内および／または核内で）発現し得るか、コードされるペプチドまたはタンパク質を分泌し得るか、またはその表面に発現し得る。ペプチドまたはタンパク質（例えばＢ１８Ｒ）が細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止すべきである場合は、ペプチドまたはタンパク質の分泌が好ましい。ペプチドまたはタンパク質（例えばＥ３、Ｋ３）が細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害すべきである場合は、ペプチドまたはタンパク質の細胞内発現が好ましい。
【０１０９】
本発明に従って体細胞の再プログラム化のための特定の因子を発現する能力を有するＲＮＡが体細胞に導入される場合、ＲＮＡのこの導入は、再プログラム化過程を完了するために一定の期間にわたって前記因子の発現をもたらし、幹細胞特性を有する細胞の発生をもたらすことが好ましい。好ましくは、本明細書で開示される特定の因子を発現する能力を有するＲＮＡの体細胞への導入は、長期間にわたる、好ましくは少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも１１日間、より好ましくは少なくとも１２日間にわたる前記因子の発現をもたらす。そのような長期発現を達成するには、ＲＮＡを、好ましくは定期的に（すなわち反復して）２回以上、好ましくはエレクトロポレーションを用いて細胞に導入する。好ましくは、長期間にわたる１つ以上の因子の発現を確実にするためにＲＮＡを少なくとも２回、より好ましくは少なくとも３回、より好ましくは少なくとも４回、さらに一層好ましくは少なくとも５回から好ましくは６回まで、より好ましくは７回まで、さらには８、９または１０回まで、好ましくは少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも１１日間、より好ましくは１２日間にわたって細胞に導入する。好ましくは、ＲＮＡの各反復導入の間に経過する期間は、２４時間〜１２０時間、好ましくは４８時間〜９６時間である。１つの実施形態では、ＲＮＡの各反復導入の間に経過する期間は、７２時間以下、好ましくは４８時間以下または３６時間以下である。１つの実施形態では、次のエレクトロポレーションの前に、細胞を先のエレクトロポレーションから回復させる。この実施形態では、ＲＮＡの各反復導入の間に経過する期間は、少なくとも７２時間、好ましくは少なくとも９６時間、より好ましくは少なくとも１２０時間である。いずれの場合も、因子が再プログラム化過程を支持する量でおよび支持する期間にわたって細胞中で発現されるように条件を選択すべきである。
【０１１０】
各々のペプチド、タンパク質または因子について、好ましくは少なくとも１μｇ、好ましくは少なくとも１．２５μｇ、より好ましくは少なくとも１．５μｇ、好ましくは２０μｇまで、より好ましくは１５μｇまで、より好ましくは１０μｇまで、より好ましくは５μｇまで、好ましくは１〜１０μｇ、さらに一層好ましくは１〜５μｇ、または１〜２．５μｇのＲＮＡをエレクトロポレーションごとに使用する。
【０１１１】
好ましくは、反復エレクトロポレーションによって細胞の生存能の喪失が起こる場合、それまでにエレクトロポレーションを受けたことがない細胞を担体細胞として添加する。好ましくは、それまでにエレクトロポレーションを受けたことがない細胞を、４回目とそれ以降のエレクトロポレーション、好ましくは５回目とそれ以降のエレクトロポレーションの１つ以上の前、その間または後に、例えば４回目と６回目のエレクトロポレーションの前、その間または後に添加する。好ましくは、それまでにエレクトロポレーションを受けたことがない細胞を、４回目または５回目とそれ以降の各エレクトロポレーションの前、その間または後に添加する。好ましくは、それまでにエレクトロポレーションを受けたことがない細胞は、ＲＮＡが導入される細胞と同じ細胞である。
【０１１２】
「細胞生存能の増強」、「増強された細胞生存能」または「増大された細胞生存能」などの用語は、本発明に関連して、特定の条件下での生存可能な細胞または生細胞の量が他の条件下での生存可能な細胞または生細胞の量よりも高いことを意味し、ここで培養は、増強されたまたは増大された細胞生存能をもたらす条件、例えば細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止しないことおよび細胞における細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害しないことに対して、細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止することおよび細胞における細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することなどの条件を除き、同じ条件下で実施される。これに関連して、「同じ条件」は、同じ細胞を使用し、細胞を同じ条件下で（増強されたまたは増大された細胞生存能をもたらす条件を除く）培養し、細胞生存能を同じ手段によって測定する状況を指す。「同じ条件」はまた、細胞へのＲＮＡの導入または反復導入も包含する。
【０１１３】
ウイルス感染の間に生成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、いくつかの細胞の抗ウイルス応答を活性化する。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ｄｓＲＮＡウイルスの遺伝物質を構成するだけでなく、プラス鎖ＲＮＡウイルスおよび一部のＤＮＡウイルスによって感染細胞中で生成される。最もよく特性づけられた細胞の抗ウイルス応答の中には、ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）およびオリゴアデニル酸シンテターゼ（ＯＡＳ）／ＲＮアーゼＬ系によって媒介されるタンパク質合成の遮断がある。Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）ならびにＲＮＡヘリカーゼＲＩＧ−ＩおよびＭＤＡ５は、ｄｓＲＮＡのセンサーとしての役割を果たす；図１参照。活性化後、これらは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現で終わるシグナル伝達カスケードを誘導する。Ｉ型ＩＦＮの誘導は、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）と称される転写因子のファミリーによって主として転写レベルで制御される。
【０１１４】
インターフェロンは、抗ウイルス、抗増殖および免疫調節活性を特徴とする重要なサイトカインである。インターフェロンは、調節される細胞の表面のインターフェロン受容体に結合することによって細胞内での遺伝子の転写を変化させ、調節して、それにより細胞内でのウイルス複製を阻止するタンパク質である。本発明によれば、「細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合」という語句は、ＩＦＮ、特にＩ型ＩＦＮの、細胞表面のインターフェロン受容体への結合に関する。
【０１１５】
インターフェロンは２つの型に分類することができる。ＩＦＮ−γは唯一のＩＩ型インターフェロンである；他はすべてＩ型インターフェロンである。Ｉ型インターフェロンとＩＩ型インターフェロンは、遺伝子構造（ＩＩ型インターフェロン遺伝子は３つのエクソンを有し、Ｉ型は１個のエクソンを有する）、染色体位置（ヒトでは、ＩＩ型は１２番染色体に位置し、Ｉ型インターフェロン遺伝子は９番染色体に連鎖し、その上に存在する）、およびそれらが産生される組織の種類（Ｉ型インターフェロンは遍在的に合成され、ＩＩ型はリンパ球によって合成される）が異なる。Ｉ型インターフェロンは細胞受容体への結合を互いに競合的に阻害するが、ＩＩ型インターフェロンは異なる受容体を有する。本発明によれば、「インターフェロン」または「ＩＦＮ」という用語は、好ましくはＩ型インターフェロン、特にＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βに関する。
【０１１６】
ヒトＩＦＮ−αは、約２０個の遺伝子から成る多重遺伝子族によってコードされる；各遺伝子は単一サブタイプのヒトＩＦＮ−αをコードする。ヒトＩＦＮ−αポリペプチドは、ウイルスもしくは二本鎖ＲＮＡへの暴露後に多くのヒト細胞株およびヒト白血球細胞によって、または形質転換白血球細胞株（例えばリンパ芽球様細胞株）において産生される。ＩＦＮ−αは細胞表面受容体と相互作用し、細胞遺伝子の幅広いが特異的なセットの発現を主として転写レベルで誘導する。
【０１１７】
ヒトＩＦＮ−βは、１６６個のアミノ酸残基から成る２２ｋＤａの分子量を有する調節ポリペプチドである。ヒトＩＦＮ−βは、ウイルス感染または他の生物製剤への暴露に応答して体内の大部分の細胞、特に線維芽細胞によって産生され得る。ヒトＩＦＮ−βは多量体細胞表面受容体に結合し、生産的な受容体結合は、ＩＦＮ−β誘導性遺伝子の発現を導く細胞内事象のカスケードをもたらし、これは次に、抗ウイルス、抗増殖または免疫調節性と分類され得る作用を生じさせる。
【０１１８】
ＩＦＮは、ウイルス複製サイクルを妨げることができる大量の抗ウイルス遺伝子の発現を誘導する。本発明によれば、「抗ウイルス性活性エフェクタータンパク質」という用語は、その転写がＩ型ＩＦＮによってシグナル伝達されるＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）によってコードされるタンパク質の群に関する。これらのタンパク質は異なるウイルス成分およびウイルス生活環の異なる段階を標的とし、侵入ウイルスを排除することを目指す。「抗ウイルス性活性エフェクタータンパク質」は、個別にウイルス転写をブロックし、ウイルスＲＮＡを分解し、翻訳を阻害し、タンパク質機能を改変してウイルス複製のすべての段階を制御する、種々のエフェクター経路に関与する。そのようなタンパク質には、２'，５'−オリゴアデニル酸シンテターゼ（ＯＡＳ）、特に２'，５'−オリゴアデニル酸シンテターゼ１（ＯＡＳ１）、ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）およびＲＮアーゼＬ（ＲＮａｓｅＬ）が含まれる。ＰＫＲおよびＯＡＳはどちらもｄｓＲＮＡによって直接活性化される。したがって、ｄｓＲＮＡはこれらの抗ウイルス性活性エフェクタータンパク質の発現を誘導し、またこれらの活性化のためにも必要である。
【０１１９】
ＰＫＲは構成的に発現され、Ｉ型ＩＦＮによって誘導される。ｄｓＲＮＡへの結合後、ＰＫＲは二量体化し、自己リン酸化を受けて完全な触媒活性を獲得する。ひとたび活性化すると、ＰＫＲは真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２−αをリン酸化する。リン酸化状態で、ｅＩＦ２−αはヌクレオチド交換因子ｅＩＦ２−βと安定な複合体を形成し、その後、もはやＧＤＰ／ＧＴＰ交換によるタンパク質翻訳の開始のために再循環されない。その結果として、ＰＫＲの活性化は感染細胞におけるタンパク質合成の全体的なブロックをもたらし、ウイルス子孫の産生を阻止することができる。このようにして、ｅＩＦ２−αと組み合わせたＰＫＲは抗ウイルス経路（ＰＫＲ依存性経路）を構成する。
【０１２０】
「ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ」（ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ；ＰＫＲ）という用語は、ウイルスＲＮＡ配列によって形成される広範な二次構造への結合およびこの二次構造による活性化によってウイルス応答において最初に同定されたインターフェロン誘導性セリン／トレオニンプロテインキナーゼである、ＲＮＡ結合タンパク質に関する。ヒトＰＫＲは、約２０ｋＤａのＮ末端ｄｓＲＮＡ結合ドメインおよびＣ末端プロテインキナーゼドメインを有する６８ｋＤａである。インビトロでは、ＰＫＲは、広範な二本鎖二次構造を有するＲＮＡ分子への結合によって活性化される。インビボでは、この酵素は、ウイルス二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはｄｓＲＮＡを含むウイルス複製中間体によって活性化されると考えられる。ＰＫＲへの二本鎖ＲＮＡの結合は酵素のコンフォメーション変化を引き起こし、このコンフォメーション変化は、キナーゼドメイン中のＡＴＰ結合部位を変化させ、ＰＫＲ配列全体にわたる複数のセリンおよびトレオニン残基の自己リン酸化をもたらす。ＲＮＡによって刺激された自己リン酸化は、その公知の基質である真核生物開始因子２（ｅＩＦ２−α）のリン酸化を含む、多くの推定上の経路を介してアポトーシス刺激およびプロ炎症性刺激に対する細胞の感受性を増大させる。
【０１２１】
「ＰＫＲ」という用語は、好ましくはヒトＰＫＲ、特に配列表の配列番号：１４に従うアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含むタンパク質に関する。１つの実施形態では、「ＰＫＲ」という用語は、配列番号：１３に従う核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質に関する。「ＰＫＲ」という用語には、任意の変異体、特に突然変異体、スプライス変異体、コンフォメーション変異体、アイソフォーム変異体、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものが含まれる。対立遺伝子変異体は、遺伝子の通常配列の改変に関し、その意味は不明であることが多い。完全な遺伝子配列決定は、しばしば所与の遺伝子について数多くの対立遺伝子変異体を同定する。種ホモログは、所与の核酸またはアミノ酸配列のものとは異なる種を起源とする核酸またはアミノ酸配列である。当業者は、上述したＰＫＲのｃＤＮＡ配列がＰＫＲ  ｍＲＮＡと等価であり、ＰＫＲに対する阻害性核酸の作製のために使用できることを理解する。
【０１２２】
プロテインキナーゼ自己リン酸化を含むプロテインキナーゼ活性は、当業者に公知の様々な技術によって測定することができる。１つの方法は、例えばリンタンパク質をトリクロロ酢酸によってセルロースストリップ上に沈殿させ、次いで洗浄するか、またはリンタンパク質をホスホセルロースストリップ上に吸着させることによってリン酸化キナーゼ基質から未反応のＡＴＰを分離することを含む。例えば、デホスホＰＫＲはポリ［Ｉ：Ｃ］とのインキュベーションによって活性化することができ、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰの存在下で自己リン酸化を進行させることができる。このＲＮＡ誘導性ＰＫＲ自己リン酸化をブロックする化合物の能力を試験することができる。別の方法は、ホスホＰＫＲまたは完全長ＰＫＲに特異的な抗体を用いたウェスタンブロット法によって同じ細胞溶解物中のＰＫＲの総量に対してホスホＰＫＲを検出し、定量することを含む。別の方法は、ＰＫＲのリン酸化基質、例えばホスホｅＩＦ２−αまたは完全長ｅＩＦ２−αに特異的な抗体を用いたウェスタンブロット法によって同じ細胞溶解物中のｅＩＦ２−αの総量に対してホスホｅＩＦ２−αを検出し、定量することを含む。
【０１２３】
「ｅＩＦ２−α」という用語は、好ましくはヒトｅＩＦ２−α、特に配列表の配列番号：１６に従うアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含むタンパク質に関する。１つの実施形態では、「ｅＩＦ２−α」という用語は、配列番号：１５に従う核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質に関する。「ｅＩＦ２−α」という用語には、任意の変異体、特に突然変異体、スプライス変異体、コンフォメーション変異体、アイソフォーム変異体、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものが含まれる。
【０１２４】
ＯＡＳは、低い構成的レベルで発現され、Ｉ型ＩＦＮによって誘導される。このタンパク質は不活性単量体として細胞質中に蓄積する。ウイルスｄｓＲＮＡによる活性化後、この酵素はオリゴマー化し（ＯＡＳ１の場合）、独特の２'，５'−ホスホジエステル結合によってＡＴＰ分子を縮合することができる四量体を形成して、２'，５'−オリゴアデニル酸を合成し、これが次に、構成的に発現されている不活性ＲＮアーゼＬを活性化する。２'，５'−オリゴアデニル酸のＲＮアーゼＬへの結合は、それらのキナーゼ様ドメインを介して、酵素単量体の二量体化を引き起こし、次に細胞（およびウイルス）ＲＮＡを切断する。結果として、ウイルスタンパク質の合成が阻害され、ウイルスＲＮＡゲノムが直接破壊される。このようにして、ＲＮアーゼＬと組み合わせたＯＡＳは抗ウイルスＲＮＡ崩壊経路（ＯＡＳ−ＲＮアーゼＬ抗ウイルス経路またはＯＡＳ依存性経路）を構成する。
【０１２５】
ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３およびＯＡＳＬ（ＯＡＳ様）と称される、ヒトにおいて同定された４つのＯＡＳ遺伝子は、１２番染色体（マウスでは５番染色体）にマッピングされている。ＯＡＳ１は、４０ｋＤａと４６ｋＤａの２つのタンパク質を産生する、ヒトでは２つ（マウスでは８）のスプライス形態を有し、これら２つのタンパク質は、それぞれそれらのＣ末端の１８アミノ酸と５４アミノ酸によって異なる。ＯＡＳ２は、６９ｋＤａと７１ｋＤａの２つのタンパク質をコードする４つの選択的にスプライシングされた転写産物を産生する。ＯＡＳ３は、１００ｋＤａタンパク質を産生する単一転写産物をコードする。これらのタンパク質は互いにかなりの相同性を有し、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２およびＯＡＳ３はそれぞれ１、２および３個の「ＯＡＳ」ドメインをコードする。最も特徴的なＯＡＳタンパク質はＯＡＳＬである。２つのＯＡＳＬ転写産物が発現され、３０ｋＤａと５９ｋＤａの２つのタンパク質を産生する。より高い分子量のＯＡＳＬはそのＣ末端に推定上の核小体局在化シグナルを含み、これがおそらく細胞におけるその特有の（その他のＯＡＳアイソフォームと異なる）分布の原因である。ＯＡＳＬタンパク質もＯＡＳドメインを有するが、鍵となる残基の突然変異がこのヒトタンパク質の触媒機能を無効にしている。興味深いことに、２つのマウスホモログの１つはその２'，５'−ポリメラーゼ活性を保持する。ＯＡＳドメインに加えて、ＯＡＳＬは、ＩＳＧ１５に相同なユビキチン様ドメインをコードする特有の１６０アミノ酸のＣ末端を有する。したがって、ＯＡＳＬはＩ型ＩＦＮでの細胞の処理後に細胞タンパク質に結合（ＩＳＧ化）する。各々の形態のヒトＯＡＳタンパク質の分別発現および誘導があると思われる。また、３つの機能的ＯＡＳタンパク質の各々が特有の生物学的機能を有する。ＯＡＳ１およびＯＡＳ２のＯＡＳドメイン内のトリペプチドモチーフ（ＣＦＫ）はオリゴマー化を媒介し、そのためこれらの酵素の触媒活性形態は、ＯＡＳ１およびＯＡＳ２についてそれぞれ四量体および二量体である。このトリペプチドモチーフはＯＡＳ３およびＯＡＳＬのＯＡＳドメインでは保存されておらず、それゆえこれらのタンパク質は単量体として機能する。ＯＡＳ単量体の重合はそれらのプロセシング性に影響を及ぼし、ＯＡＳ３は２'，５'−結合オリゴマーの二量体分子を合成し、ＯＡＳ１およびＯＡＳ２は三量体および四量体オリゴマーを合成することができる。二量体２'，５'−結合オリゴマーはＲＮアーゼＬの効率的な活性化因子ではなく、その結果として、別の過程を調節すると思われ、１つの報告は、ＤＮＡトポイソメラーゼＩを調節することによる遺伝子発現における役割を示唆している。本発明によれば、「２'，５'−オリゴアデニル酸シンテターゼ」または「ＯＡＳ」という用語は、好ましくはＲＮアーゼＬ、好ましくはＯＡＳ１およびＯＡＳ２の活性化因子である分子に関する。
【０１２６】
「ＯＡＳ」という用語は、好ましくはヒトＯＡＳ、特に配列表の配列番号：１８もしくは２０に従うアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含むタンパク質に関する。１つの実施形態では、「ＯＡＳ」という用語は、配列番号：１７または１９に従う核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質に関する。「ＯＡＳ」という用語には、任意の変異体、特に突然変異体、スプライス変異体、コンフォメーション変異体、アイソフォーム変異体、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものが含まれる。
【０１２７】
２'，５'−依存性ＲＮアーゼＬは、２つのキナーゼ様ドメイン（ＰＵＧおよびＳＴＹＫｃ）ならびに８つのアンキリンリピートを有する８０ｋＤａタンパク質として発現される。この酵素は不活性単量体として構成的に発現される。この酵素の自己阻害は、アンキリンリピートへの２'，５'−オリゴマー（ＯＡＳタンパク質によって生成される）の結合、およびその後のホモ二量体化後に解除される。次に活性な二量体酵素がｓｓＲＮＡを分解する。
【０１２８】
「ＲＮアーゼＬ（ＲＮａｓｅＬ）」という用語は、好ましくはヒトＲＮアーゼＬ、特に配列表の配列番号：２２に従うアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含むタンパク質に関する。１つの実施形態では、「ＲＮアーゼＬ」という用語は、配列番号：２１に従う核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質に関する。「ＲＮアーゼＬ」という用語には、任意の変異体、特に突然変異体、スプライス変異体、コンフォメーション変異体、アイソフォーム変異体、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものが含まれる。
【０１２９】
本発明によれば、「細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止する」という用語は、ＩＦＮ、特にＩ型ＩＦＮの、それらの特異的受容体との相互作用の阻害、すなわちブロックまたは低減に関し、したがってＩＦＮ機能を阻害するまたは低減することに関する。細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合は、例えば細胞外ＩＦＮに対する結合物質を提供することによって阻止され得る。細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止するうえで１つ以上のタンパク質またはペプチド、例えば本明細書で開示されるタンパク質またはペプチド、例えば細胞外ＩＦＮに対する１つ以上の結合物質を含む、本発明のこれらの態様は、これらの１つ以上のタンパク質またはペプチドをコードする核酸、特にＲＮＡを、例えば核酸を細胞に導入することによって、細胞に提供することを含み得る。
【０１３０】
例えば、Ｂ１８Ｒタンパク質は、強力な中和活性を備えるマウス、ヒト、ウサギ、ブタ、ラットおよびウシＩ型インターフェロンに対して特異性を有するワクシニアウイルスＩ型インターフェロン受容体である。Ｂ１８Ｒタンパク質はウェスタンリザーブワクシニアウイルス株のＢ１８Ｒ遺伝子によってコードされる。この６０〜６５ｋＤの糖タンパク質はインターロイキン１受容体に関連し、他のＩ型ＩＦＮ受容体と異なり、クラスＩＩサイトカイン受容体ファミリーに属する免疫グロブリンスーパーファミリーの成員である。Ｂ１８Ｒタンパク質はヒトＩＦＮαに高い親和性（ＫＤ、１７４ｐＭ）を有する。ウイルス宿主応答修飾因子の中で、Ｂ１８Ｒタンパク質は、可溶性細胞外ならびに細胞表面タンパク質として存在し、オートクリンおよびパラクリンの両方のＩＦＮ機能の遮断を可能にするという点で独特である。Ｂ１８Ｒタンパク質は、ヒト細胞上のＩＦＮ−α１、ＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−α８／１／８およびＩＦＮ−ωの抗ウイルス力を阻害することが示されている。可溶性Ｂ１８Ｒタンパク質は、ＩＦＮ−α、β、δ、κを含むＩ型インターフェロンを中和するのに極めて強力である。
【０１３１】
「Ｂ１８Ｒ」という用語は、好ましくは配列表の配列番号：２４に従うアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含むタンパク質に関する。１つの実施形態では、「Ｂ１８Ｒ」という用語は、配列番号：２３に従う核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質に関する。「Ｂ１８Ｒ」という用語には、任意の変異体、特に突然変異体、スプライス変異体、コンフォメーション変異体、アイソフォーム変異体、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものが含まれる。
【０１３２】
細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合は、例えばＩＦＮ、特に細胞外ＩＦＮのレベルを低下させることによってさらに阻止し得る。１つの実施形態では、細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合は、ＩＦＮ遺伝子発現を妨げることによって阻止される。例えば、Ｃ型肝炎ウイルスセリンプロテアーゼＮＳ３／４Ａタンパク質複合体は、ＩＦＮプロモーター活性を妨げ、低減することができ、ＩＦＮ遺伝子発現の特異的阻害剤である。「ＮＳ３／４Ａ」という用語は、好ましくは配列表の配列番号：２９に従うアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含むタンパク質に関する。「ＮＳ３／４Ａ」という用語には、任意の変異体、特に突然変異体、スプライス変異体、コンフォメーション変異体、アイソフォーム変異体、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものが含まれる。
【０１３３】
本発明によれば、「細胞内ＩＦＮシグナル伝達」という用語は、ＩＦＮがそれらの特異的受容体と相互作用することによって活性化される細胞内シグナル伝達事象およびエフェクター機能、特に抗ウイルス機能に関し、ＩＦＮによって誘導されるタンパク質、特に抗ウイルス性活性エフェクタータンパク質の機能を含む。特に、「細胞内ＩＦＮシグナル伝達」という用語は、ＰＫＲ依存性経路の一部であるタンパク質、特にＰＫＲおよびｅＩＦ２−α、ならびに／またはＯＡＳ依存性経路の一部であるタンパク質、特にＯＡＳおよびＲＮアーゼＬを介したシグナル伝播および前記タンパク質によって及ぼされるエフェクター機能、特に抗ウイルス機能を含む。
【０１３４】
「細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する」という用語は、細胞内ＩＦＮシグナル伝達の阻害または低減に関し、細胞内ＩＦＮシグナル伝達に関与するタンパク質、特にＰＫＲ依存性経路および／またはＯＡＳ依存性経路の一部であるタンパク質の発現、活性または活性化を阻害することによって達成され得る。例えば、多くのウイルスはＰＫＲおよびＯＡＳ／ＲＮアーゼＬ経路に対応するための進化した機構を有する。これらの機構は、細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害するために本発明に従って使用し得る。細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害するうえで１つ以上のタンパク質またはペプチド、例えば本明細書で開示されるタンパク質またはペプチド、例えばＰＫＲ依存性経路および／またはＯＡＳ依存性経路を阻害する１つ以上のタンパク質またはペプチドを含む、本発明のこれらの態様は、これらの１つ以上のタンパク質またはペプチドをコードする核酸、特にＲＮＡを、例えば核酸を細胞に導入することによって、細胞に提供することを含み得る。
【０１３５】
本発明によれば、ＰＫＲ依存性経路は、ＰＫＲの活性もしくは活性化を阻害するもしくは低減する物質によって、またはｅＩＦ２−αを脱リン酸化するかもしくはそのリン酸化を阻止し、それによりＰＫＲ誘導性シグナルを終結させる物質によって阻害され得る。例えば、細胞内ＩＦＮシグナル伝達は、ＰＫＲシグナル伝達カスケードに対するウイルスの防御機構のいずれかを利用することにより、本発明に従って阻害され得る。これに関して、本発明は、デコイｄｓＲＮＡ（例えばアデノウイルスＶＡＩ  ＲＮＡ；エプスタイン‐バーウイルスＥＢＥＲ；ＨＩＶ  ＴＡＲ）、ＰＫＲ分解を生じさせる化合物（例えばポリオウイルス２Ａｐｒｏ）、例えばウイルスｄｓＲＮＡを隠すことを介して、ＰＫＲの活性化を阻害する化合物（例えばワクシニアウイルスＥ３／Ｅ３Ｌ；レオウイルスσ３；インフルエンザウイルスＮＳ１、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）ＵＳ１１）、二量体化をブロックする化合物（例えばインフルエンザウイルスｐ５８ＩＰＫ；Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ａ）、偽基質（例えばワクシニアウイルスＫ３／Ｋ３Ｌ；ＨＩＶ  Ｔａｔ）または基質の脱リン酸化（例えば単純ヘルペスウイルスＩＣＰ３４．５）の使用を含み得る。ワクシニアウイルスＥ３は、ｄｓＲＮＡに結合し、隔離して、ＰＫＲおよびＯＡＳの活性化を阻止する２５ｋＤａのｄｓＲＮＡ結合タンパク質（Ｅ３Ｌ遺伝子によってコードされる）である。Ｅ３はＰＫＲに直接結合することができ、その活性を阻害して、ｅＩＦ２−αのリン酸化の低減をもたらす。ワクシニアウイルス遺伝子Ｋ３Ｌは、ＰＫＲのリン酸化不能な偽基質として働き、ｅＩＦ２−αのリン酸化を競合的に阻害するｅＩＦ２−αサブユニットの１０．５ｋＤａホモログをコードする。ワクシニアウイルスＣ７／Ｃ７ＬはｅＩＦ２−αのリン酸化を阻害する。ＨＳＶ−１由来のＩＣＰ３４．５タンパク質は、細胞ＰＰ１ホスファターゼの調節サブユニットとして機能し、ｅＩＦ２−αを脱リン酸化するように指令して、それによりＰＫＲ誘導性シグナルを終結させる。マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）タンパク質ｍ１４２およびｍ１４３は、ＰＫＲの活性化、翻訳開始因子ｅＩＦ２のリン酸化、およびその後のタンパク質合成の遮断を阻害するｄｓＲＮＡ結合タンパク質として特性づけられている。
【０１３６】
デコイＲＮＡは、酵素を本物の基質ではなく偽基質に結合させるために、酵素のＲＮＡ基質と類似の構造を有し、したがって酵素の活性をブロックする、偽基質ＲＮＡである。
【０１３７】
「Ｅ３」という用語は、好ましくは配列表の配列番号：２６に従うアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含むタンパク質に関する。１つの実施形態では、「Ｅ３」という用語は、配列番号：２５に従う核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質に関する。「Ｅ３」という用語には、任意の変異体、特に突然変異体、スプライス変異体、コンフォメーション変異体、アイソフォーム変異体、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものが含まれる。
【０１３８】
「Ｋ３」という用語は、好ましくは配列表の配列番号：２８に従うアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含むタンパク質に関する。１つの実施形態では、「Ｋ３」という用語は、配列番号：２７に従う核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質に関する。「Ｋ３」という用語には、任意の変異体、特に突然変異体、スプライス変異体、コンフォメーション変異体、アイソフォーム変異体、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものが含まれる。
【０１３９】
「ＩＣＰ３４．５」という用語は、好ましくは配列表の配列番号：３０に従うアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含むタンパク質に関する。「ＩＣＰ３４．５」という用語には、任意の変異体、特に突然変異体、スプライス変異体、コンフォメーション変異体、アイソフォーム変異体、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものが含まれる。
【０１４０】
本発明によれば、「ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）の活性を低減する」という用語は、ＰＫＲの活性が人の手によって低減されない／低減されていない通常の状況、特に細胞における通常の状況と比較して、ＰＫＲのより低い度合いのホモ二量体化、ＰＫＲのより低い度合いの自己リン酸化および／またはｅＩＦ２−αなどのＰＫＲのキナーゼ基質である標的のより低い度合いのリン酸化をもたらす手段に関する。好ましくは、前記用語には、ＰＫＲのより低い度合いの自己リン酸化および／またはＰＫＲのキナーゼ基質である標的のより低い度合いのリン酸化をもたらすすべての手段が含まれる。
【０１４１】
１つの実施形態では、細胞中のＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）の活性を低減することは、ＰＫＲの発現および／または活性の阻害剤で細胞を処理することを含む。本発明によれば、「発現および／または活性を阻害する」という語句は、発現および／または活性の完全なまたは基本的に完全な阻害ならびに発現および／または活性の低減を含む。
【０１４２】
１つの実施形態では、前記ＰＫＲ阻害剤はＰＫＲタンパク質を対象とし、好ましくはＰＫＲに特異的である。ＰＫＲは様々な方法で、例えばＰＫＲの自己リン酸化および／または二量体化を阻害すること、ＰＫＲ偽活性化因子を提供すること、またはＰＫＲ偽基質を提供することを介して阻害することができる。ＰＫＲ阻害剤は、上記で論じたウイルスの防御機構に関与する物質であり得る。例えば、ワクシニアウイルスＥ３Ｌは、ウイルス感染細胞において、おそらくｄｓＲＮＡ活性化因子を隔離することによってＰＫＲを阻害するｄｓＲＮＡ結合タンパク質をコードする。同じくワクシニアウイルスによってコードされるＫ３は、ＰＫＲに結合することによって偽基質阻害剤として機能する。したがって、ワクシニアウイルスＥ３Ｌを提供することはＰＫＲの阻害をもたらし得る。アデノウイルスＶＡＩ  ＲＮＡ、ＨＩＶ  Ｔａｔまたはエプスタイン‐バーウイルスＥＢＥＲ１  ＲＮＡを提供することは、ＰＫＲの偽活性化をもたらし得る。したがって、例えば本明細書で述べるようなＰＫＲ活性をブロックするすべてのウイルス因子、すなわちウイルス由来阻害剤は、ＰＫＲの活性を低減するために使用し得る。
【０１４３】
１つの実施形態では、ＰＫＲ阻害剤は化学的阻害剤である。好ましくは、ＰＫＲ阻害剤は、ＲＮＡ誘導性ＰＫＲ自己リン酸化の阻害剤である。好ましくは、ＰＫＲ阻害剤は、ＰＫＲのＡＴＰ結合部位指向性阻害剤である。
【０１４４】
１つの実施形態では、ＰＫＲ阻害剤は、６，８−ジヒドロ−８−（１Ｈ−イミダゾール−５−イルメチレン）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｇ］ベンゾチアゾール−７−オンである。１つの実施形態では、ＰＫＲ阻害剤は以下の式を有する。
【化２】
0006353846.tif 000003
【０１４５】
１つの実施形態では、ＰＫＲ阻害剤は２−アミノプリンである。１つの実施形態では、ＰＫＲ阻害剤は以下の式を有する。
【化３】
0006353846.tif 000004
【０１４６】
好ましくは、上記で開示される阻害剤は、少なくとも０．５μＭ以上、少なくとも１μＭ以上または少なくとも２μＭ以上の濃度で、好ましくは５μＭまで、４μＭまで、３μＭまでまたは２μＭまでの濃度で使用される。
【０１４７】
さらなる実施形態では、ＰＫＲの活性の阻害剤は、ＰＫＲに特異的に結合する抗体である。ＰＫＲへの抗体の結合は、例えば結合活性または触媒活性を阻害することによって、ＰＫＲの機能を妨げることができる。
【０１４８】
１つの実施形態では、ワクシニアウイルスＥ３および／またはＫ３などの１つ以上のウイルス由来阻害剤で細胞を処理すること、ならびに６，８−ジヒドロ−８−（１Ｈ−イミダゾール−５−イルメチレン）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｇ］ベンゾチアゾール−７−オンおよび／または２−アミノプリンなどの１つ以上の化学的ＰＫＲ阻害剤で細胞を処理することによって細胞中のＰＫＲの活性を低減することを想定する。
【０１４９】
本発明によれば、ＯＡＳ依存性経路は、ＯＡＳおよび／またはＲＮアーゼＬの活性または活性化を阻害するまたは低減する物質によって阻害され得る。例えば、ワクシニアウイルスＥ３は、ｄｓＲＮＡに結合し、隔離して、ＯＡＳの活性化を阻止する２５ｋＤａのｄｓＲＮＡ結合タンパク質（Ｅ３Ｌ遺伝子によってコードされる）である。
【０１５０】
本発明によれば、「ＯＡＳの活性を低減する」という用語は、好ましくは２'，５'−オリゴアデニル酸のより低い度合いの産生、したがってＲＮアーゼＬのより低い度合いの活性化をもたらす手段に関する。
【０１５１】
１つの実施形態では、細胞中のＯＡＳおよび／またはＲＮアーゼＬの活性を低減することは、ＯＡＳおよび／またはＲＮアーゼＬの発現および／または活性の阻害剤で細胞を処理することを含む。本発明によれば、「発現および／または活性を阻害する」という語句は、発現および／または活性の完全なまたは基本的に完全な阻害ならびに発現および／または活性の低減を含む。
【０１５２】
１つの実施形態では、以下では「標的タンパク質」と称される、ＰＫＲ、ＯＡＳまたはＲＮアーゼＬの発現の阻害は、標的タンパク質をコードする転写産物、すなわちｍＲＮＡの産生を阻害するもしくはレベルを低減することによって、例えば転写を阻害するもしくは転写産物の分解を誘導することによって、および／または標的タンパク質の産生を阻害することによって、例えば標的タンパク質をコードする転写産物の翻訳を阻害することによって起こり得る。１つの実施形態では、前記阻害剤は標的タンパク質をコードする核酸に特異的である。特定の実施形態では、標的タンパク質の発現の阻害剤は、標的タンパク質をコードする核酸に選択的にハイブリダイズし、前記核酸に特異的であって、それにより前記核酸の転写および／または翻訳を阻害する（例えば低減する）阻害性核酸（例えばアンチセンス分子、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはこれらをコードするＤＮＡ）である。
【０１５３】
本発明の阻害性核酸は、標的核酸に対してアンチセンス方向の配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。適切な阻害性オリゴヌクレオチドは、典型的には５から数百ヌクレオチドまでの長さ、より典型的には約２０〜７０ヌクレオチド長以下、さらに一層典型的には約１０〜３０ヌクレオチド長にわたる。これらの阻害性オリゴヌクレオチドは、インビトロまたはインビボのいずれかで、遊離（裸の）核酸としてまたは保護された形態で、例えばリポソーム中に被包して適用し得る。リポソームまたは他の保護された形態の使用は、インビボでの安定性を増強し、したがって標的部位への送達を促進し得るので、好都合であり得る。
【０１５４】
また、標的核酸は、細胞中の対応するｍＲＮＡの切断を標的とするリボザイムを設計するために使用し得る。同様に、これらのリボザイムは、遊離（裸の）形態でまたは安定性および／もしくは標的化を増強する送達システム、例えばリポソームを使用して投与し得る。
【０１５５】
また、標的核酸は、核酸の発現を阻害する（例えば低減する）ことができるｓｉＲＮＡを設計するために使用し得る。ｓｉＲＮＡは、遊離（裸の）形態でまたは安定性および／もしくは標的化を増強する送達システム、例えばリポソームを使用して投与し得る。これらは、これらの前駆体またはこれらをコードするＤＮＡの形態でも投与し得る。
【０１５６】
ｓｉＲＮＡは、好ましくはセンスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、ここでセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖はＲＮＡ二本鎖を形成し、センスＲＮＡ鎖は、標的核酸、好ましくはＰＫＲをコードするｍＲＮＡ中の約１９〜約２５個の連続するヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
【０１５７】
本発明によれば、（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止するおよび（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害するための上述したペプチドまたはタンパク質の代わりに、前記ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸を提供できることが理解されるべきである。本明細書で使用される「核酸の形態で提供される」という語句はこの可能性を説明する。例えば、細胞を、ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸、特にＲＮＡでトランスフェクトしてもよく、核酸は、ペプチドまたはタンパク質を産生するように細胞中で発現され得る。
【０１５８】
１つの実施形態では、細胞を、（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止するおよび／または（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害するように、発現されるべきペプチドもしくはタンパク質、例えば幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラム化を可能にする１つ以上の因子をコードするＲＮＡの導入、またはＲＮＡの最初の導入（反復トランスフェクションの場合）の前に、それと同時におよび／またはその後に処理する。１つの実施形態では、細胞を、（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止するおよび／または（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害するように、ＲＮＡの導入またはＲＮＡの最初の導入（反復トランスフェクションの場合）の後に、好ましくは直後に処理する。
【０１５９】
１つの実施形態では、細胞を、（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止するおよび／または（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害するように、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間またはそれ以上にわたって処理する。最も好ましくは、細胞を、（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止するおよび／または（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害するように、場合によりＲＮＡの反復トランスフェクションによって、ＲＮＡの発現を所望する期間全体にわたって、例えば永続的に処理する。
【０１６０】
本発明によれば、インビトロまたはインビボで、好ましくはインビトロで、（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止することおよび（ｉｉ）細胞における細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することを想定する。したがって、本発明によれば、細胞は、単離された細胞であり得るかまたは器官、組織および／もしくは生物の一部を形成し得る。
【０１６１】
「アンチセンス分子」または「アンチセンス核酸」は、核酸の発現を調節する、特に低減するために使用し得る。「アンチセンス分子」または「アンチセンス核酸」という用語は、本発明によれば、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾オリゴリボヌクレオチドまたは修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドであって、特定の遺伝子を含むＤＮＡまたは前記遺伝子のｍＲＮＡに生理的条件下でハイブリダイズし、それにより前記遺伝子の転写および／または前記ｍＲＮＡの翻訳を阻害するオリゴヌクレオチドを指す。本発明によれば、「アンチセンス分子」はまた、核酸またはその一部をその天然のプロモーターに対して逆方向に含む構築物も包含する。核酸またはその一部のアンチセンス転写産物は、天然に存在するｍＲＮＡと二本鎖を形成することができ、したがってｍＲＮＡの蓄積または翻訳を阻害し得る。別の可能性は、核酸を不活性化するためのリボザイムの使用である。
【０１６２】
好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｎ末端または５'上流部位、例えば翻訳開始部位、転写開始部位またはプロモーター部位とハイブリダイズする。さらなる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３'非翻訳領域またはｍＲＮＡスプライシング部位とハイブリダイズする。
【０１６３】
本明細書で使用される「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」とは、分解されるべき標的遺伝子またはｍＲＮＡを同定するために使用される、好ましくは１０ヌクレオチド長より大きい、より好ましくは１５ヌクレオチド長より大きい、最も好ましくは１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長のＲＮＡ分子を意味する。１９〜２５ヌクレオチドの範囲がｓｉＲＮＡについての最も好ましい大きさである。
【０１６４】
ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖は、３'突出部も含み得る。本明細書で使用される場合、「３'突出部」は、ＲＮＡ鎖の３'末端から伸びる少なくとも１つの非対合ヌクレオチドを指す。したがって１つの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１〜約６ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを含む）長、好ましくは１〜約５ヌクレオチド長、より好ましくは１〜約４ヌクレオチド長、特に好ましくは約２〜約４ヌクレオチド長の少なくとも１つの３'突出部を含む。ｓｉＲＮＡ分子の両方の鎖が３'突出部を含む実施形態では、突出部の長さは各鎖について同じであってもよくまたは異なっていてもよい。最も好ましい実施形態では、３'突出部はｓｉＲＮＡの両方の鎖上に存在し、２ヌクレオチド長である。例えば、本発明のｓｉＲＮＡの各々の鎖は、ジデオキシチミジル酸（「ＴＴ」）またはジウリジル酸（「ｕｕ」）の３'突出部を含み得る。
【０１６５】
ｓｉＲＮＡの安定性を増強するために、３'突出部を分解に対して安定化することもできる。１つの実施形態では、アデノシンヌクレオチドまたはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含めることによって突出部を安定化する。あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば３'突出部中のウリジンヌクレオチドの２'−デオキシチミジンによる置換は許容され、ＲＮＡｉ分解の効率に影響を及ぼさない。特に、２'−デオキシチミジン中に２'−ヒドロキシルが存在しないことにより、組織培養培地中での３'突出部のヌクレアーゼ耐性が有意に増強される。
【０１６６】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、２つの相補的な一本鎖ＲＮＡ分子を含み得るか、または２つの相補的な部分が塩基対合し、一本鎖「ヘアピン」領域によって共有結合で連結されている単一分子を含み得る。すなわち、センス領域とアンチセンス領域はリンカー分子によって共有結合で連結され得る。リンカー分子はポリヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーであり得る。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、後者のタイプのｓｉＲＮＡ分子のヘアピン領域は、「ダイサー」タンパク質（またはその等価物）によって細胞内で切断され、２つの個別の塩基対合したＲＮＡ分子のｓｉＲＮＡを形成すると考えられる。
【０１６７】
本明細書で使用される場合、「標的ｍＲＮＡ」は、下方調節のための標的であるＲＮＡ分子を指す。
【０１６８】
ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからのＲＮＡの発現は、最初に転写されるヌクレオチドがプリンである場合にのみ効率的であると考えられるので、標的部位を変化させずにｐｏｌ  ＩＩＩ発現ベクターからｓｉＲＮＡを発現させることができる。
【０１６９】
本発明によるｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列のいずれかにおいて約１９〜２５個の連続するヌクレオチドの任意のストレッチ（「標的配列」）を標的とすることができる。ｓｉＲＮＡについての標的配列を選択するための技術は、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００２年１０月１１日に改訂された、Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ"に記載されている。"Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ"は、Ｄｒ．Ｔｈｏｍａｓ  Ｔｕｓｃｈｌ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡによって運営されているウェブサイトにおいてワールドワイドウェブ上で入手可能であり、ｔｈｅ  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのウェブサイトにアクセスし、「ｓｉＲＮＡ」というキーワードで検索することによって見出すことができる。したがって、本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、標的ｍＲＮＡ中の約１９〜約２５ヌクレオチドの任意の連続するストレッチと実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
【０１７０】
一般に、標的ｍＲＮＡ上の標的配列は、好ましくは開始コドンから５０〜１００ヌクレオチド下流（すなわち３'方向）から始まる、標的ｍＲＮＡに対応する所与のｃＤＮＡ配列から選択することができる。標的配列は、しかし、５'もしくは３'非翻訳領域または開始コドンの近傍の領域にも位置し得る。
【０１７１】
ｓｉＲＮＡは、当業者に公知の多くの技術を用いて入手することができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、化学合成するかまたは当分野で公知の方法を用いて、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許出願公開第２００２／００８６３５６号に記載されているショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）インビトロ系を用いて組換え生産することができる。
【０１７２】
好ましくは、ｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホルアミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて化学合成される。ｓｉＲＮＡは、２つの別々の相補的なＲＮＡ分子として、または２つの相補的な領域を有する単一ＲＮＡ分子として合成することができる。
【０１７３】
あるいは、ｓｉＲＮＡはまた、任意の適切なプロモーターを使用して組換え環状または線状ＤＮＡプラスミドから発現させることもできる。プラスミドから本発明のｓｉＲＮＡを発現させるための適切なプロモーターには、例えばＵ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。
【０１７４】
他の適切なプロモーターの選択は当分野の技術範囲内である。本発明の組換えプラスミドは、特定の組織または特定の細胞内環境におけるｓｉＲＮＡの発現のための誘導的プロモーターまたは調節可能なプロモーターも含み得る。
【０１７５】
組換えプラスミドから発現されたｓｉＲＮＡは、標準的な技術によって培養細胞発現系から単離することができるか、または細胞内で発現させることができる。ｓｉＲＮＡをインビボで細胞に送達するための組換えプラスミドの使用は当分野の技術範囲内である。ｓｉＲＮＡは、２つの別々の相補的なＲＮＡ分子として、または２つの相補的な領域を有する単一ＲＮＡ分子として組換えプラスミドから発現させることができる。
【０１７６】
ｓｉＲＮＡを発現させるのに適したプラスミドの選択、ｓｉＲＮＡを発現させるための核酸配列をプラスミドに挿入するための方法、および対象とする細胞に組換えプラスミドを送達する方法は、当分野の技術範囲内である。
【０１７７】
「細胞」または「宿主細胞」という用語は、好ましくは無傷の細胞、すなわち酵素、細胞小器官または遺伝物質などのその正常な細胞内成分が放出されていない無傷の膜を有する細胞に関する。無傷の細胞は、好ましくは生存可能な細胞、すなわちその正常な代謝機能を実行する能力を有する生細胞である。好ましくは、前記用語は、本発明によれば、外因性核酸で形質転換またはトランスフェクトすることができる任意の細胞に関する。「細胞」という用語は、本発明によれば、原核細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））または真核細胞を包含する。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギおよび霊長動物由来の細胞などの哺乳動物細胞が特に好ましい。１つの実施形態では、細胞は、本明細書で述べる体細胞である。１つの実施形態では、細胞は、バリア機能を有する細胞である。好ましくは、細胞は、線維芽細胞、例えば本明細書で述べる線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、または内皮細胞、例えば心臓の内皮細胞、肺の内皮細胞もしくは臍静脈内皮細胞である。好ましくは、細胞はヒト細胞である。
【０１７８】
線維芽細胞は、細胞外マトリックスおよびコラーゲンを合成し、創傷治癒において重要な役割を果たす細胞の種類である。線維芽細胞の主な機能は、細胞外マトリックスの前駆体を継続的に分泌することによって結合組織の構造的完全性を維持することである。線維芽細胞は、動物における結合組織の最も一般的な細胞である。線維芽細胞は形態学的に不均一であり、その位置および活性に依存して多様な外観を有する。
【０１７９】
ケラチノサイトは、ヒト皮膚の最外層である表皮において支配的な細胞型である。ケラチノサイトの主要な機能は、皮膚およびその下にある組織を熱、紫外線および水分喪失などの環境被害から保護するケラチン層の形成である。
【０１８０】
上皮は、身体全体の構造の腔および表面を裏打ちする細胞から成る組織である。多くの腺も上皮組織から形成されている。上皮は結合組織の上に存在し、２つの層は基底膜によって分離されている。ヒトでは、上皮は一次体組織として分類され、その他には結合組織、筋組織および神経組織がある。上皮細胞の機能は、分泌、選択的吸収、保護、経細胞輸送および感覚の検出を含む。
【０１８１】
内皮は、血管の内表面を裏打ちし、管腔内の循環血液と血管壁の残りの部分との間の境界面を形成する細胞の薄層である。これらの細胞は内皮細胞と呼ばれる。内皮細胞は、心臓から最小の毛細管までの循環系全体を裏打ちしている。内皮組織は特殊な型の上皮組織である。
【０１８２】
本発明によれば、「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合によって共有結合で連結された２個以上、好ましくは３個以上、好ましくは４個以上、好ましくは６個以上、好ましくは８個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１６個以上、好ましくは２１個以上、および好ましくは８、１０、２０、３０、４０または５０個、特に１００個までのアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」という用語は、大きなペプチド、好ましくは１００個を超えるアミノ酸残基を有するペプチドを指すが、一般に「ペプチド」と「タンパク質」という用語は同義語であり、本明細書では互換的に使用される。
【０１８３】
本発明はまた、本明細書で述べるペプチド、タンパク質またはアミノ酸配列の「変異体」も包含する。
【０１８４】
本発明に関して、アミノ酸配列の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。
【０１８５】
アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列における１個または２個以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、１個以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列中の特定の部位に挿入されるが、生じる産物の適切なスクリーニングを伴うランダム挿入も可能である。
【０１８６】
アミノ酸付加変異体は、１個以上のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０または５０個またはそれ以上のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端融合物を含む。
【０１８７】
アミノ酸欠失変異体は、配列からの１個以上のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０または５０個またはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。欠失はタンパク質のいずれの位置においてでもよい。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失変異体は、Ｎ末端および／またはＣ末端切断変異体とも呼ばれる。
【０１８８】
アミノ酸置換変異体は、配列内の少なくとも１個の残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されていることを特徴とする。修飾が、相同なタンパク質またはペプチドの間で保存されていないアミノ酸配列内の位置に存在することおよび／またはアミノ酸を類似の性質を有する他のアミノ酸で置換することが好ましい。好ましくは、タンパク質変異体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち同様に荷電したまたは荷電していないアミノ酸による置換である。保存的アミノ酸変化は、側鎖が関連しているアミノ酸のファミリーの１つによる置換を含む。天然に存在するアミノ酸は一般に４つのファミリー：酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）アミノ酸に分けられる。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時に芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。
【０１８９】
好ましくは、所与のアミノ酸配列と、前記所与のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。類似性または同一性の程度は、好ましくは参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％であるアミノ酸領域に関して与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００個のアミノ酸から成る場合、類似性または同一性の程度は、好ましくは少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０または約２００個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸に関して与えられる。好ましい実施形態では、類似性または同一性の程度は参照アミノ酸配列の全長に関して与えられる。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアラインメントは、当分野で公知のツールを用いて、好ましくは最良の配列アラインメントを用いて、例えばＡｌｉｇｎを用いて、標準的な設定で、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ニードル、マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５で実施することができる。
【０１９０】
「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換を示すアミノ酸のパーセンテージを示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、それらの配列の間で同一であるアミノ酸またはヌクレオチドのパーセンテージを示す。
【０１９１】
「同一性パーセンテージ」という用語は、最良のアラインメント後に得られた、比較しようとする２つの配列の間で同一であるアミノ酸残基のパーセンテージを表すことが意図されており、このパーセンテージは純粋に統計的であって、２つの配列の間の相違は無作為におよびそれらの長さ全体にわたって分布する。２つのアミノ酸配列間の配列比較は、従来これらの配列を最適に整列した後に比較することによって実施され、前記比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するためにセグメントごとにまたは「比較ウインドウ」ごとに実施される。比較のための配列の最適アラインメントは、手作業による以外に、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３の局所相同性アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを用いるコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）によって作成され得る。
【０１９２】
同一性パーセンテージは、比較する２つの配列の間の同一位置の数を決定し、これら２つの配列の間の同一性パーセンテージを得るためにこの数を比較する位置の数で除して、得られた結果に１００を乗じることによって計算される。
【０１９３】
相同なアミノ酸配列は、本発明によれば、アミノ酸残基の少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を示す。
【０１９４】
本明細書で述べるアミノ酸配列変異体は、当業者によって、例えば組換えＤＮＡ操作によって容易に調製され得る。置換、付加、挿入または欠失を有するペプチドまたはタンパク質を調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）に詳述されている。さらに、本明細書で述べるペプチドおよびアミノ酸変異体は、公知のペプチド合成技術、例えば固相合成および同様の方法によって容易に調製され得る。
【０１９５】
本発明は、本明細書で述べるペプチドまたはタンパク質の誘導体を包含し、それらは「ペプチド」および「タンパク質」という用語に含まれる。本発明によれば、タンパク質およびペプチドの「誘導体」は、タンパク質およびペプチドの修飾形態である。そのような修飾は、任意の化学修飾を包含し、炭水化物、脂質および／またはタンパク質もしくはペプチドなどの、タンパク質またはペプチドに関連する任意の分子の単一または複数の置換、欠失および／または付加を含む。１つの実施形態では、タンパク質またはペプチドの「誘導体」には、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、パルミトイル化、ミリストイル化、イソプレニル化、脂質化、アルキル化、誘導体化、保護基／ブロッキング基の導入、タンパク質分解切断または抗体もしくは別の細胞リガンドへの結合から生じる修飾類似体が含まれる。「誘導体」という用語はまた、前記タンパク質およびペプチドのすべての機能的な化学的等価物にも及ぶ。好ましくは、修飾ペプチドは、増大した安定性および／または増大した免疫原性を有する。
【０１９６】
本発明によれば、ペプチドまたはタンパク質の変異体は、好ましくはそれが由来するペプチドまたはタンパク質の機能的特性を有する。そのような機能的特性を、本明細書ではＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４およびｃ−ＭＹＣについてそれぞれ説明する。好ましくは、ペプチドまたはタンパク質の変異体は、動物の分化細胞を再プログラム化するうえで、それが由来するペプチドまたはタンパク質と同じ特性を有する。好ましくは、変異体は動物分化細胞の再プログラム化を誘導または増強する。
【０１９７】
１つの実施形態では、ＲＮＡによってコードされるペプチドまたはタンパク質は、幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラム化を可能にする因子である。１つの実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、１つ以上の抗原および／または１つ以上の抗原ペプチドを含む。好ましくは、前記ＲＮＡは、特に細胞に導入された場合、前記ペプチドまたはタンパク質を発現する能力を有する。
【０１９８】
「幹細胞」は、自己複製する能力、未分化状態に留まる能力、および分化状態になる能力を有する細胞である。幹細胞は、少なくとも動物が天然に存在する生存期間中は、際限なく分裂することができる。幹細胞は最終分化していない；幹細胞は分化経路の最終段階にはない。幹細胞が分裂する場合、各々の娘細胞は、幹細胞のままであり得るかまたは最終分化を導く経路を開始することができる。
【０１９９】
全能性幹細胞は、全能分化特性を有し、完全な生物へと発生する能力を有する細胞である。この特性は、精子による卵母細胞の受精後、８細胞期までの細胞が有する。これらの細胞を単離し、子宮内に移植した場合、それらは完全な生物に発生することができる。
【０２００】
多能性幹細胞は、外胚葉層、中胚葉層および内胚葉層から誘導される様々な細胞および組織に発生する能力を有する細胞である。受精の４〜５日後に生成される、胚盤胞の内部に位置する内部細胞塊に由来する多能性幹細胞は「胚性幹細胞」と呼ばれ、様々な他の組織細胞に分化することができるが、新しい生存生物を形成することはできない。
【０２０１】
複能性幹細胞は、通常はそれらの起源である組織および器官に特異的な細胞型だけに分化する幹細胞である。複能性幹細胞は、胎児期、新生児期および成体期における様々な組織および器官の成長および発生に関与するだけでなく、成体組織ホメオスタシスの維持および組織損傷時の再生を誘導する機能にも関与する。組織特異的複能性細胞は「成体幹細胞」と総称される。
【０２０２】
「胚性幹細胞」または「ＥＳＣ」は、胚に存在するまたは胚から単離された幹細胞である。これは、生物中に存在するありとあらゆる細胞に分化する能力を有する、多能性であり得るか、２つ以上の細胞型に分化する能力を有する、複能性であり得る。
【０２０３】
本明細書で使用される場合、「胚」は、その発生の初期段階にある動物を指す。これらの段階は、３つの胚葉が規定され、確立される着床および原腸形成、ならびにそれぞれの器官および器官系への胚葉の分化を特徴とする。３つの胚葉は、内胚葉、外胚葉および中胚葉である。
【０２０４】
「胚盤胞」は、受精卵子が卵割を経て、液体で満たされた腔を取り囲む球状の細胞層が形成されつつあるまたは形成され終えた、発生の初期段階の胚である。この球状の細胞層は栄養外胚葉である。栄養外胚葉の内側には、内部細胞塊（ＩＣＭ）と称される細胞のクラスターがある。栄養外胚葉は胎盤の前駆体であり、ＩＣＭは胚の前駆体である。
【０２０５】
体性幹細胞とも呼ばれる成体幹細胞は、成体において認められる幹細胞である。成体幹細胞は分化した組織中で認められ、自己複製することができ、多少の制限を伴うが、分化してその起源組織の特殊な細胞型を生じることができる。その例には、間葉系幹細胞、造血幹細胞および神経幹細胞が含まれる。
【０２０６】
「分化細胞」は、より特殊化した形態または機能へと漸進的な発生変化を起こした成熟細胞である。細胞分化は、細胞が、明らかに特殊化した細胞型へと成熟するときに経る過程である。分化細胞は独特の特性を有し、特定の機能を果たし、対応するより分化されていない細胞よりも分裂する可能性が低い。
【０２０７】
「未分化」細胞、例えば未成熟細胞、胚性細胞または原始細胞は、典型的には非特異的な外観を有し、複数の非特異的な活動を実施し得るが、分化細胞が典型的に果たす機能は、全くではないにせよ、わずかしか果たすことができない。
【０２０８】
「体細胞」は、ありとあらゆる分化細胞を指し、幹細胞、生殖細胞または配偶子を含まない。好ましくは、本明細書で使用される「体細胞」は、最終分化細胞を指す。
【０２０９】
本明細書で使用される場合、「拘束された」は、特定の機能に永続的に拘束されているとみなされる細胞を指す。拘束された細胞は「最終分化細胞」とも称される。
【０２１０】
本明細書で使用される場合、「分化」は、特定の形態または機能への細胞の適応を指す。細胞において、分化は、より拘束された細胞をもたらす。
【０２１１】
本明細書で使用される場合、「脱分化」は、形態または機能の特殊化の喪失を指す。細胞において、脱分化は、より拘束されていない細胞をもたらす。
【０２１２】
本明細書で使用される場合、「再プログラム化」は、細胞の遺伝的プログラムのリセットを指す。再プログラム化された細胞は、好ましくは多能性を示す。
【０２１３】
「脱分化された」および「再プログラム化された」という用語または類似の用語は、本明細書では、幹細胞特性を有する体細胞由来細胞を表すために互換的に使用される。しかし、前記用語は、機械論的または機能的考察によって本明細書で開示される主題を限定することを意図しない。
【０２１４】
「幹細胞特性の発生を誘導するＲＮＡ」または「幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラム化を可能にする１つ以上の因子を発現する能力を有するＲＮＡ」という用語は、体細胞中に導入された場合、脱分化するように細胞を誘導するＲＮＡを指す。
【０２１５】
本明細書で使用される場合、「生殖細胞」は、精母細胞もしくは卵母細胞などの性細胞、または性細胞へと発生する細胞を指す。
【０２１６】
本明細書で使用される場合、「多能性」は、胎盤の細胞または子宮の他の支持細胞を除く任意の細胞型を生じることができる細胞を指す。
【０２１７】
「幹細胞特性を有する細胞」、「幹細胞の性質を有する細胞」または「幹様細胞」などの用語は、本明細書では、分化した体性非幹細胞に由来するが、幹細胞、特に胚性幹細胞に典型的な１つ以上の特徴を示す細胞を指示するために使用される。そのような特徴には、緻密なコロニー、高い核対細胞質比および顕著な核小体などの胚性幹細胞形態、正常な核型、テロメラーゼ活性の発現、胚性幹細胞に特有の細胞表面マーカーの発現、ならびに／または胚性幹細胞に特有の遺伝子の発現が含まれる。胚性幹細胞に特有の細胞表面マーカーは、例えばステージ特異的胚抗原３（ＳＳＥＡ−３）、ＳＳＥＡ−４、腫瘍関連抗原１−６０（ＴＲＡ−１−６０）、ＴＲＡ−１−８１およびＴＲＡ−２−４９／６Ｅから成る群より選択される。胚性幹細胞に特有の遺伝子は、例えば内因性ＯＣＴ４、内因性ＮＡＮＯＧ、増殖分化因子３（ＧＤＦ３）、発現抑制１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４およびテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）から成る群より選択される。１つの実施形態では、幹細胞に典型的な１つ以上の特徴には、多能性が含まれる。
【０２１８】
本発明の方法の１つの実施形態では、幹細胞特性は胚性幹細胞形態を含み、ここで前記胚性幹細胞形態は、好ましくは緻密なコロニー、高い核対細胞質比および顕著な核小体から成る群より選択される形態学的基準を含む。特定の実施形態では、幹細胞特性を有する細胞は、正常な核型を有し、テロメラーゼ活性を発現し、胚性幹細胞に特有の細胞表面マーカーを発現し、および／または胚性幹細胞に特有の遺伝子を発現する。胚性幹細胞に特有の細胞表面マーカーは、ステージ特異的胚抗原３（ＳＳＥＡ−３）、ＳＳＥＡ−４、腫瘍関連抗原１−６０（ＴＲＡ−１−６０）、ＴＲＡ−１−８１およびＴＲＡ−２−４９／６Ｅから成る群より選択され得、胚性幹細胞に特有の遺伝子は、内因性ＯＣＴ４、内因性ＮＡＮＯＧ、増殖分化因子３（ＧＤＦ３）、発現抑制１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４およびテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）から成る群より選択され得る。
【０２１９】
好ましくは、幹細胞特性を有する細胞は、脱分化されたおよび／または再プログラム化された体細胞である。好ましくは、幹細胞特性を有する細胞は、多能性状態などの胚性幹細胞の基本的特性を示す。好ましくは、幹細胞特性を有する細胞は、３つの一次胚葉すべての高度な誘導体へと分化する発生能を有する。１つの実施形態では、一次胚葉は内胚葉であり、高度な誘導体は腸管様上皮組織である。さらなる実施形態では、一次胚葉は中胚葉であり、高度な誘導体は横紋筋および／または軟骨である。なおさらなる実施形態では、一次胚葉は外胚葉であり、高度な誘導体は神経組織および／または表皮組織である。１つの好ましい実施形態では、幹細胞特性を有する細胞は、ニューロン細胞および／または心臓細胞へと分化する発生能を有する。
【０２２０】
１つの実施形態では、体細胞は、間葉表現型を有する胚性幹細胞由来の体細胞である。好ましい実施形態では、体細胞は、線維芽細胞、例えば胎児線維芽細胞もしくは出生後線維芽細胞、またはケラチノサイト、好ましくは毛包由来ケラチノサイトである。さらなる実施形態では、線維芽細胞は、肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞または皮膚線維芽細胞である。特定の実施形態では、線維芽細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にカタログ番号ＣＣＬ−１８６の下で寄託されている線維芽細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にカタログ番号ＣＲＬ−２０９７の下で寄託されている線維芽細胞、またはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にカタログ番号ＣＲＬ−２５２２の下で寄託されている線維芽細胞、またはＳｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによってカタログ番号ＰＣ５０１Ａ−ＨＦＦの下で配給されている線維芽細胞である。１つの実施形態では、線維芽細胞は成体ヒト皮膚線維芽細胞である。好ましくは、体細胞はヒト細胞である。本発明によれば、体細胞は遺伝子改変されていてもよい。
【０２２１】
本発明に従う「因子」という用語は、ＲＮＡによるその発現に関連して使用される場合、タンパク質およびペプチドならびにその誘導体および変異体を包含する。例えば、「因子」という用語は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４およびｃ−ＭＹＣを含む。
【０２２２】
因子は、任意の動物種、例えば哺乳動物およびげっ歯動物の因子であり得る。哺乳動物の例には、ヒトおよび非ヒト霊長動物が含まれるが、これらに限定されない。霊長動物には、ヒト、チンパンジー、ヒヒ、カニクイザルおよび他の任意の新世界ザルまたは旧世界ザルが含まれるが、これらに限定されない。げっ歯動物には、マウス、ラット、モルモット、ハムスターおよびスナネズミが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２３】
本発明によれば、幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラム化を可能にする能力を有する１つ以上の因子は、（ｉ）ＯＣＴ４およびＳＯＸ２、（ｉｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２ならびにＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８の一方または両方、（ｉｉｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２ならびにＫＬＦ４およびｃ−ＭＹＣの一方または両方から成る群より選択される因子の集合を含む。１つの実施形態では、ＲＮＡによって発現され得る前記１つ以上の因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８を含むか、またはＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ−ＭＹＣを含む。好ましくは、ＲＮＡは、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションによって前記動物分化体細胞に導入される。好ましくは、本発明の方法は、例えば胚性幹細胞培養条件下、好ましくは多能性幹細胞を未分化状態に維持するのに適した条件下で体細胞を培養することにより、幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にすることをさらに含む。
【０２２４】
ＯＣＴ４は、真核ＰＯＵ転写因子類の転写因子であり、胚性幹細胞の多能性の指標である。これは、母性発現されるオクトマー結合タンパク質である。ＯＣＴ４は、卵母細胞、未分化胚芽細胞の内部細胞塊およびまた始原生殖細胞中に存在することが認められている。遺伝子ＰＯＵ５Ｆ１はＯＣＴ４タンパク質をコードする。この遺伝子名の別称には、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＯＴＦ３およびＭＧＣ２２４８７が含まれる。胚性幹細胞が未分化状態に留まるには、特定の濃度のＯＣＴ４の存在が必要である。
【０２２５】
好ましくは、「ＯＣＴ４タンパク質」または単に「ＯＣＴ４」は、ヒトＯＣＴ４に関し、好ましくは配列番号：１に従う核酸によってコードされるアミノ酸配列、好ましくは配列番号：２に従うアミノ酸配列を含む。当業者は、上述したＯＣＴ４のｃＤＮＡ配列がＯＣＴ４  ｍＲＮＡと等価であり、ＯＣＴ４を発現する能力を有するＲＮＡの作製に使用できることを理解する。
【０２２６】
Ｓｏｘ２は、単一のＨＭＧ  ＤＮＡ結合ドメインを有する転写因子をコードするＳｏｘ（ＳＲＹ関連ＨＭＧボックス）遺伝子ファミリーの成員である。ＳＯＸ２は、神経前駆細胞を、それらが分化する能力を阻害することによって制御することが認められている。この因子の抑制は脳室帯からの剥離をもたらし、それに続いて細胞周期からの離脱が起こる。これらの細胞はまた、前駆細胞マーカーおよび初期ニューロン分化マーカーの喪失を通してその前駆細胞特性も喪失し始める。
【０２２７】
好ましくは、「ＳＯＸ２タンパク質」または単に「ＳＯＸ２」は、ヒトＳＯＸ２に関し、好ましくは配列番号：３に従う核酸によってコードされるアミノ酸配列、好ましくは配列番号：４に従うアミノ酸配列を含む。当業者は、上述したＳＯＸ２のｃＤＮＡ配列がＳＯＸ２  ｍＲＮＡと等価であり、ＳＯＸ２を発現する能力を有するＲＮＡの作製に使用できることを理解する。
【０２２８】
ＮＡＮＯＧはＮＫ−２型ホメオドメイン遺伝子であり、おそらく胚性幹細胞の複製および分化に不可欠な遺伝子の発現を調節することによって、幹細胞多能性を維持するうえで重要な役割を果たすと提案されている。ＮＡＮＯＧは、そのＣ末端に埋込まれた２つの並はずれて強力な活性化ドメインを有する転写活性化因子として挙動する。ＮＡＮＯＧ発現の低減は胚性幹細胞の分化を誘導する。
【０２２９】
好ましくは、「ＮＡＮＯＧタンパク質」または単に「ＮＡＮＯＧ」は、ヒトＮＡＮＯＧに関し、好ましくは配列番号：５に従う核酸によってコードされるアミノ酸配列、好ましくは配列番号：６に従うアミノ酸配列を含む。当業者は、上述したＮＡＮＯＧのｃＤＮＡ配列がＮＡＮＯＧ  ｍＲＮＡと等価であり、ＮＡＮＯＧを発現する能力を有するＲＮＡの作製に使用できることを理解する。
【０２３０】
ＬＩＮ２８は、ＲＮＡ結合モチーフの独特の対合、すなわち低温ショックドメインと一対のレトロウイルス型ＣＣＨＣジンクフィンガーとを有する保存された細胞質タンパク質である。哺乳動物では、ＬＩＮ２８は多様な型の未分化細胞中に豊富に存在する。多能性哺乳動物細胞では、ＬＩＮ２８は、ポリ（Ａ）結合タンパク質とのＲＮアーゼ感受性複合体中およびスクロース勾配のポリソーム画分中で認められ、これがｍＲＮＡの翻訳に関連することを示唆する。
【０２３１】
好ましくは、「ＬＩＮ２８タンパク質」または単に「ＬＩＮ２８」は、ヒトＬＩＮ２８に関し、好ましくは配列番号：７に従う核酸によってコードされるアミノ酸配列、好ましくは配列番号：８に従うアミノ酸配列を含む。当業者は、上述したＬＩＮ２８のｃＤＮＡ配列がＬＩＮ２８  ｍＲＮＡと等価であり、ＬＩＮ２８を発現する能力を有するＲＮＡの作製に使用できることを理解する。
【０２３２】
クルッペル様因子（ＫＬＦ４）は、種々の組織、例えば結腸、胃および皮膚の分裂終了上皮細胞において強く発現されるジンクフィンガー転写因子である。ＫＬＦ４はこれらの細胞の最終分化に必須であり、細胞周期調節に関与する。
【０２３３】
好ましくは、「ＫＬＦ４タンパク質」または単に「ＫＬＦ４」は、ヒトＫＬＦ４に関し、好ましくは配列番号：９に従う核酸によってコードされるアミノ酸配列、好ましくは配列番号：１０に従うアミノ酸配列を含む。当業者は、上述したＫＬＦ４のｃＤＮＡ配列がＫＬＦ４  ｍＲＮＡと等価であり、ＫＬＦ４を発現する能力を有するＲＮＡの作製に使用できることを理解する。
【０２３４】
ＭＹＣ（ｃＭＹＣ）は、広範囲のヒト癌において過剰発現される癌原遺伝子である。これは、特異的に突然変異されるかまたは過剰発現された場合、細胞増殖を増大させ、癌遺伝子として機能する。ＭＹＣ遺伝子は、エンハンサーボックス配列（Ｅボックス）への結合およびヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）の動員を介して全遺伝子の１５％の発現を調節する転写因子をコードする。ＭＹＣは転写因子のＭＹＣファミリーに属し、このファミリーにはＮ−ＭＹＣおよびＬ−ＭＹＣ遺伝子も含まれる。ＭＹＣファミリー転写因子は、ｂＨＬＨ／ＬＺ（塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスロイシンジッパー）ドメインを含む。
【０２３５】
好ましくは、「ｃＭＹＣタンパク質」または単に「ｃＭＹＣ」は、ヒトｃＭＹＣに関し、好ましくは配列番号：１１に従う核酸によってコードされるアミノ酸配列、好ましくは配列番号：１２に従うアミノ酸配列を含む。当業者は、上述したｃＭＹＣのｃＤＮＡ配列がｃＭＹＣ  ｍＲＮＡと等価であり、ｃＭＹＣを発現する能力を有するＲＮＡの作製に使用できることを理解する。
【０２３６】
本明細書における特定の因子、例えばＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４もしくはｃ−ＭＹＣへの言及、またはその特定の配列への言及は、本明細書で述べるこれらの特定の因子またはその特定の配列のすべての変異体も包含すると理解されるべきである。特に、細胞によって天然に発現されるこれらの特定の因子／配列のすべてのスプライス変異体、翻訳後修飾変異体、コンフォメーション変異体、アイソフォーム変異体および種ホモログも包含すると理解されるべきである。
【０２３７】
「ｍｉＲＮＡ」（マイクロＲＮＡ）という用語は、標的ｍＲＮＡの分解を誘導するおよび／または翻訳を阻止することにより、ＥＳＣの自己複製／分化および細胞周期進行に関連する機能を含む多数の細胞機能を調節する、真核細胞において認められる２１〜２３ヌクレオチド長の非コードＲＮＡに関する。ｍｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ転写産物（ｍＲＮＡ）上の相補的配列に結合し、通常は翻訳抑制または標的分解および遺伝子サイレンシングをもたらす、転写後調節因子である。正しい組合せのｍｉＲＮＡは、インビトロで幹細胞特性を有する細胞への体細胞の直接細胞再プログラム化を誘導する能力を有することが認められている。例えば、ｍｉＲＮＡクラスター３０２〜３６７は体細胞の再プログラム化を増強することが観察されている。
【０２３８】
好ましくは、本明細書で述べる幹細胞特性を有する細胞を提供するための方法において使用される幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程は、胚性幹細胞培養条件下、好ましくは多能性幹細胞を未分化状態に維持するのに適した条件下で体細胞を培養することを含む。
【０２３９】
好ましくは、幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にするために、１つ以上のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤および／または１つ以上のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で細胞を培養する。好ましい化合物は、５'−アザシチジン（５'−ａｚａＣ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、デキサメタゾン、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、スクリプタイドおよびバルプロ酸（ＶＰＡ）から成る群より選択される。好ましくは、細胞を、好ましくは０．５〜１０ｍＭ、より好ましくは１〜５ｍＭ、最も好ましくは約２ｍＭの濃度のバルプロ酸（ＶＰＡ）の存在下で培養する。
【０２４０】
本発明の方法を用いて、任意の型の体細胞の脱分化を達成することができる。使用し得る細胞には、本発明の方法によって脱分化され得るまたは再プログラム化され得る細胞、特に完全にまたは部分的に分化した細胞、より好ましくは最終分化した細胞が含まれる。好ましくは、体細胞は、前胚、胚、胎児および出生後多細胞生物に由来する二倍体細胞である。使用し得る細胞の例には、線維芽細胞、例えば胎児および新生児線維芽細胞または成体線維芽細胞、ケラチノサイト、特に一次ケラチノサイト、より好ましくは毛に由来するケラチノサイト、脂肪細胞、上皮細胞、表皮細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経細胞、グリア細胞、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋細胞、メラノサイト、造血細胞、骨細胞、マクロファージ、単球および単核細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４１】
本発明の方法を使用できる細胞は、任意の動物種、例えば哺乳動物およびげっ歯動物の細胞であり得る。本発明によって脱分化および再分化させることができる哺乳動物細胞の例には、ヒトおよび非ヒト霊長動物が含まれるが、これらに限定されない。本発明を実施し得る霊長動物細胞には、ヒト、チンパンジー、ヒヒ、カニクイザルおよび他の任意の新世界ザルまたは旧世界ザルの細胞が含まれるが、これらに限定されない。本発明を実施し得るげっ歯動物細胞には、マウス、ラット、モルモット、ハムスターおよびスナネズミ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４２】
本発明に従って調製される脱分化細胞は、多能性幹細胞と同じ要求性の多くを示すと予想され、胚性幹細胞に使用される条件下で、例えばＥＳ細胞培地または胚細胞の成長を支持する任意の培地で増殖させ、維持することができる。胚性幹細胞は、培養中の不活化胎児線維芽細胞上で、例えば照射マウス胚性線維芽細胞またはヒト線維芽細胞（例えばヒト包皮線維芽細胞、ヒト皮膚線維芽細胞、ヒト子宮内膜線維芽細胞、ヒト卵管線維芽細胞）上で維持された場合、インビトロでその多能性を保持する。１つの実施形態では、ヒトフィーダー細胞は、直接分化によって同じ再プログラム化細胞の培養物から誘導された自己フィーダー細胞であり得る。
【０２４３】
さらに、ヒト胚性幹細胞は、マウス胎仔線維芽細胞によって順化された培地中のマトリゲル上でも成功裏に増殖させることができる。ヒト幹細胞は、長期間にわたって培養中で成長させることができ、特定の培養条件下では未分化状態に留まることができる。
【０２４４】
特定の実施形態では、細胞培養条件は、細胞を、細胞の分化を阻害するまたはさもなければ細胞の脱分化を促進することができる因子、例えば非ＥＳ細胞、栄養外胚葉または他の細胞型への細胞の分化を阻止することができる因子と接触させることを含み得る。
【０２４５】
本発明に従って調製される脱分化細胞は、細胞の表現型の変化を観測することならびにそれらの遺伝子発現およびタンパク質発現を特性づけることを含む方法によって評価することができる。遺伝子発現はＲＴ−ＰＣＲによって決定することができ、翻訳産物は免疫細胞化学およびウェスタンブロット法によって決定することができる。特に、脱分化細胞を、トランスクリプトミクスを含む当分野で周知の技術を用いて特性づけ、遺伝子発現のパターンおよび再プログラム化された細胞が胚性幹細胞などの未分化多能性対照細胞の予想される発現パターンと類似の遺伝子発現パターンを示すかどうかを決定することができる。
【０２４６】
脱分化細胞の以下の遺伝子の発現をこれに関して評価することができる：ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、増殖分化因子３（ＧＤＦ３）、発現抑制１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、胚抗原３（ＳＳＥＡ−３）、ＳＳＥＡ−４、腫瘍関連抗原１−６０（ＴＲＡ−１−６０）、ＴＲＡ−１−８１およびＴＲＡ−２−４９／６Ｅ。
【０２４７】
再プログラム化細胞を比較し得る未分化細胞または胚性幹細胞は、分化体細胞と同じ種由来であり得る。あるいは、再プログラム化細胞を比較し得る未分化細胞または胚性幹細胞は、分化体細胞とは異なる種由来であり得る。
【０２４８】
一部の実施形態では、未分化細胞において特異的に発現される特定の遺伝子が再プログラム化細胞でも発現される場合、再プログラム化細胞と未分化細胞、例えば胚性幹細胞との間には遺伝子発現パターンの類似性が存在する。例えば、典型的には分化体細胞では検出できない特定の遺伝子、例えばテロメラーゼを使用して、再プログラム化の程度を観測し得る。同様に、特定の遺伝子に関しては、発現が存在しないことを用いて再プログラム化の程度を評価し得る。
【０２４９】
テロメラーゼ活性の誘導によって示される自己複製能は、脱分化細胞において観測することができる、幹細胞の別の特性である。
【０２５０】
核型分析は、有糸分裂細胞からの染色体スプレッド、スペクトル核型分析、テロメア長のアッセイ、全ゲノムハイブリダイゼーション、または当分野で周知の他の技術を用いて実施し得る。
【０２５１】
本発明を用いて、適切な因子をコードするＲＮＡを、例えばエレクトロポレーションによって、１つ以上の体細胞中に組み込む。組込み後、細胞を、好ましくは脱分化細胞の維持を支持する条件（すなわち幹細胞培養条件）を用いて培養する。次に脱分化細胞を増殖させ、細胞療法のために必要な異なる型の体細胞に再分化するように誘導することができる。本発明に従って得られる脱分化細胞は、インビトロまたはインビボで１つ以上の所望体細胞型に分化するように誘導することができる。
【０２５２】
好ましくは、本発明に従って得られる脱分化細胞は、３つの胚葉、すなわち内胚葉、中胚葉および外胚葉のいずれかに由来する細胞を生じさせ得る。例えば、脱分化細胞は、骨格筋、骨格、皮膚の真皮、結合組織、泌尿生殖器系、心臓、血液（リンパ細胞）および脾臓（中胚葉）；胃、結腸、肝臓、膵臓、膀胱；尿道の内層、気管の上皮部分、肺、咽頭、甲状腺、副甲状腺、腸（内胚葉）；または中枢神経系、網膜および水晶体、頭蓋および知覚神経節ならびに脳および感覚神経、色素細胞、頭部結合組織、表皮、毛、乳腺（外胚葉）に分化し得る。本発明に従って得られる脱分化細胞は、当分野で公知の技術を用いてインビトロまたはインビボで再分化させることができる。
【０２５３】
本発明の１つの実施形態では、本発明の方法から生じる再プログラム化された細胞を使用して、分化した子孫を生成する。したがって、１つの態様では、本発明は、（ｉ）本発明の方法を用いて再プログラム化細胞を得ること；および（ｉｉ）再プログラム化細胞の分化を誘導して、分化細胞を生成することを含む、分化細胞を生成するための方法を提供する。工程（ｉｉ）はインビボまたはインビトロで実施することができる。さらに、分化は、例えば再プログラム化細胞が導入された身体、器官または組織に、添加することができるかまたはインサイチュで存在する適切な分化因子の存在を介して誘導することができる。分化細胞を使用して、細胞、組織および／または器官移植の領域で好都合に使用される細胞、組織および／または器官を誘導することができる。所望する場合は、再プログラム化に先だって遺伝子改変を、例えば体細胞に導入することができる。本発明の分化細胞は、好ましくは胚性幹細胞または胚性生殖細胞の多能性を有さず、基本的に、組織特異的な部分的または完全に分化した細胞である。
【０２５４】
本発明の方法の１つの利点は、本発明によって得られる再プログラム化細胞が、事前に選択または精製または細胞株の樹立を行わずに分化させ得ることである。したがって特定の実施形態では、再プログラム化細胞を含む不均一な細胞集団を所望の細胞型に分化させる。１つの実施形態では、本発明の方法から得られた細胞の混合物をインビトロで１つ以上の分化因子に暴露し、培養する。
【０２５５】
本明細書で開示される方法によって得られる再プログラム化細胞を分化させる方法は、再プログラム化細胞を透過処理する工程を含み得る。例えば、本明細書で述べる再プログラム化技術によって生成された細胞、あるいは再プログラム化細胞を含む不均一な細胞混合物を、１つ以上の分化因子または分化因子を含む細胞抽出物もしくは他の調製物に暴露する前に透過処理し得る。
【０２５６】
例えば、分化細胞は、少なくとも１つの分化因子の存在下で未分化再プログラム化細胞を培養し、培養物から分化細胞を選択することによって入手し得る。分化細胞の選択は、分化細胞上に存在する特定の細胞マーカーの発現などの表現型に基づき得るか、または機能アッセイ（例えば特定の分化細胞型の１つ以上の機能を果たす能力）によって実施し得る。
【０２５７】
別の実施形態では、本発明に従って再プログラム化された細胞を、そのＤＮＡ配列の付加、欠失または修飾を介して遺伝子改変する。
【０２５８】
本発明に従って調製された再プログラム化細胞もしくは脱分化細胞または再プログラム化細胞もしくは脱分化細胞に由来する細胞は、研究および治療において有用である。再プログラムされた多能性細胞は、限定されることなく、皮膚、軟骨、骨、骨格筋、心筋、腎、肝、血液および造血、血管前駆体および血管内皮、膵β、ニューロン、グリア、網膜、神経、腸、肺および肝細胞を含む身体の細胞のいずれかに分化させ得る。
【０２５９】
再プログラム化細胞は、再生／修復療法に有用であり、それを必要とする患者に移植し得る。１つの実施形態では、細胞は患者にとって自家である。
【０２６０】
本発明に従って提供される再プログラム化細胞は、例えば心臓、神経、内分泌、血管、網膜、皮膚、筋骨格障害および他の疾患の処置における治療戦略に使用し得る。
【０２６１】
例えば、限定を意図しないが、本発明の再プログラム化細胞は、年齢または癌放射線療法および化学療法などのアブレーション療法に起因して天然の細胞が激減している動物において細胞を補充するために使用することができる。別の非限定的な例では、本発明の再プログラム化細胞は、器官再生および組織修復において有用である。本発明の１つの実施形態では、再プログラム化細胞を、損傷した筋組織、例えばジストロフィー筋および心筋梗塞などの虚血事象によって損傷した筋を再活性化するために使用することができる。本発明の別の実施形態では、本明細書で開示される再プログラム化細胞を、外傷または手術後の、ヒトを含む動物における瘢痕化を改善するために使用することができる。この実施形態では、本発明の再プログラム化細胞は、全身投与、例えば静脈内投与され、損傷した細胞によって分泌される循環サイトカインによって動員されて、新たに損傷を受けた組織の部位へと移動する。本発明の別の実施形態では、再プログラム化細胞を、修復または再生を必要とする治療部位に局所投与することができる。
【０２６２】
さらなる実施形態では、本発明で使用されるＲＮＡは、治療的価値のあるペプチドまたはタンパク質をコードする。前記ＲＮＡを含む細胞は、本発明の方法を用いて、例えばインビトロでこのＲＮＡを、したがってペプチドまたはタンパク質を発現するように操作することができる。ペプチドまたはタンパク質を発現する細胞を、その後患者に導入することができる。
【０２６３】
特に好ましい実施形態では、本発明で使用されるＲＮＡは、免疫原、抗原または抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードする。１つの実施形態では、前記ペプチドまたはタンパク質は、発現後に前記免疫原、抗原または抗原ペプチドを提供するようにプロセシングされる。別の実施形態では、ペプチドまたはタンパク質自体が免疫原、抗原または抗原ペプチドである。免疫原、抗原または抗原ペプチドを含むそのようなペプチドまたはタンパク質を発現する細胞は、例えば患者において免疫原、抗原または抗原ペプチドに対する免疫応答を惹起するために免疫療法において使用することができる。
【０２６４】
本発明による「抗原」は、免疫応答を惹起する任意の物質を含む。特に、「抗原」は、抗体またはＴリンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応する任意の物質に関する。本発明によれば、「抗原」という用語は、少なくとも１つのエピトープを含む任意の分子を包含する。好ましくは、本発明に関連して抗原は、場合によりプロセシング後に、好ましくは抗原に特異的な免疫反応を誘導する分子である。本発明によれば、免疫反応の候補物である任意の適切な抗原を使用してよく、ここで免疫反応は、体液性ならびに細胞性免疫反応の両方であり得る。本発明の実施形態に関連して、抗原は、好ましくはＭＨＣ分子に関連して細胞によって、好ましくは抗原提示細胞によって提示され、これは抗原に対する免疫反応をもたらす。抗原は、好ましくは天然に存在する抗原に対応するまたはそれに由来する生成物である。そのような天然に存在する抗原は、アレルゲン、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物および他の感染因子ならびに病原体を含み得るかもしくはこれらに由来してよく、または抗原は腫瘍抗原であってもよい。本発明によれば、抗原は天然に存在する生成物、例えばウイルスタンパク質またはその一部に対応し得る。
【０２６５】
好ましい実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、すなわち細胞質、細胞表面または細胞核に由来し得る腫瘍細胞の一部、特に主として腫瘍細胞の細胞内にまたは表面抗原として存在するものである。例えば、腫瘍抗原には、癌胎児性抗原、α１−フェトプロテイン、イソフェリチンおよび胎児性スルホグリコプロテイン、α２−Ｈ−鉄タンパク質およびγ−フェトプロテイン、ならびに様々なウイルス腫瘍抗原が含まれる。本発明によれば、腫瘍抗原は、好ましくは型および／または発現レベルに関して腫瘍または癌に特有のならびに腫瘍細胞または癌細胞に特有の任意の抗原を含む。別の実施形態では、抗原は、ウイルスリボヌクレオタンパク質またはコートタンパク質などのウイルス抗原である。特に、抗原は、特にＴ細胞受容体の活性の調節によって、免疫系の細胞、好ましくはＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球の調節、特に活性化をもたらすＭＨＣ分子によって提示されるべきである。
【０２６６】
好ましい実施形態では、抗原は腫瘍抗原であり、本発明は、そのような腫瘍抗原を発現する、好ましくはＭＨＣクラスＩと共にそのような腫瘍抗原を提示する腫瘍細胞に対する抗腫瘍ＣＴＬ応答の刺激を含む。
【０２６７】
「免疫原性」という用語は、免疫反応を誘導する抗原の相対的有効性に関する。
【０２６８】
「病原体」という用語は病原微生物に関し、ウイルス、細菌、真菌、単細胞生物および寄生生物を含む。病原性ウイルスの例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ＨＢＶ、ＨＣＶ、パピローマウイルスおよびヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）である。単細胞生物は、プラスモディウム、トリパノソーマ、アメーバ等を含む。
【０２６９】
本発明で使用し得る抗原の例は、ｐ５３、ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ、ｓｓ−カテニン／ｍ、Ｂｃｒ−ａｂＬ  ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディン−１２、ｃ−ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇａｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、ＨＡＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ−Ａ、好ましくはＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１またはＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｂ、ＭＡＧＥ−Ｃ、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＮＡ８８−Ａ、ＮＦ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ｐ１９０マイナーＢＣＲ−ａｂＬ、Ｐｌａｃ−１、Ｐｍ１／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１またはＳＡＲＴ−３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥおよびＷＴ、好ましくはＷＴ−１である。
【０２７０】
本発明による「抗原の一部もしくはフラグメント」または「抗原ペプチド」は、好ましくは不完全な形態の抗原であり、抗原に対する免疫応答を惹起する能力を有する。
【０２７１】
これに関連して、本発明はまた、本明細書では「抗原ペプチド」とも称される、抗原に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを使用する。「抗原ペプチド」または「抗原に由来する抗原ペプチド」とは、抗原のフラグメントまたはペプチドのアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含むオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。抗原ペプチドは任意の長さであってよい。
【０２７２】
好ましくは、抗原ペプチドは、抗原または抗原の発現、好ましくは抗原の提示を特徴とする細胞に対する免疫応答、好ましくは細胞性応答を刺激する能力を有する。好ましくは、抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩと共に抗原を提示することを特徴とする細胞に対する細胞性応答を刺激する能力を有し、好ましくは抗原応答性ＣＴＬを刺激する能力を有する。好ましくは、本発明による抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ提示ペプチドであるか、またはＭＨＣクラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ提示ペプチドを生成するようにプロセシングされ得る。好ましくは、抗原ペプチドは、抗原のフラグメントのアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗原の前記フラグメントは、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ提示ペプチドである。好ましくは、本発明による抗原ペプチドは、そのようなフラグメントのアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含み、そのようなフラグメント、すなわち抗原由来のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ提示ペプチドを生成するようにプロセシングされる。
【０２７３】
抗原ペプチドが直接、すなわちプロセシングされずに、特に切断されずに提示される場合、その抗原ペプチドは、ＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩ分子に結合するのに適した長さを有し、好ましくは７〜２０アミノ酸長、より好ましくは７〜１２アミノ酸長、より好ましくは８〜１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長である。好ましくは、直接提示される抗原ペプチドの配列は抗原のアミノ酸配列に由来し、すなわちその配列は抗原のフラグメントに実質的に対応し、好ましくは完全に同一である。
【０２７４】
抗原ペプチドがプロセシング後に、特に切断後に提示される場合、プロセシングによって生成されるペプチドは、ＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩ分子に結合するのに適した長さを有し、好ましくは７〜２０アミノ酸長、より好ましくは７〜１２アミノ酸長、より好ましくは８〜１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長である。好ましくは、プロセシング後に提示されるペプチドの配列は抗原のアミノ酸配列に由来し、すなわちその配列は抗原のフラグメントに実質的に対応し、好ましくは完全に同一である。したがって、本発明による抗原ペプチドは、１つの実施形態では、抗原のフラグメントに実質的に対応し、好ましくは完全に同一である、７〜２０アミノ酸長、より好ましくは７〜１２アミノ酸長、より好ましくは８〜１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長の配列を含み、抗原ペプチドのプロセシング後に、提示されるペプチドを形成する。しかし、抗原ペプチドはまた、上記で述べた配列よりもさらに一層長い抗原のフラグメントに実質的に対応し、好ましくは完全に同一である配列も含み得る。１つの実施形態では、抗原ペプチドは抗原の配列全体を含み得る。
【０２７５】
ＭＨＣクラスＩによって提示されるペプチドの配列に実質的に対応するアミノ酸配列を有するペプチドは、ＭＨＣクラスＩによって提示されるペプチドのＴＣＲ認識のためまたはＭＨＣへのペプチド結合のために必須ではない１つ以上の残基において異なっていてもよい。そのような実質的に対応するペプチドはまた、抗原応答性ＣＴＬを刺激する能力を有する。ＴＣＲ認識には影響を及ぼさないが、ＭＨＣへの結合の安定性を改善する残基において提示ペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するペプチドは、抗原ペプチドの免疫原性を改善することができ、本明細書では「最適化ペプチド」と称され得る。これらの残基のいずれが、ＭＨＣまたはＴＣＲのどちらかへの結合に影響を及ぼす可能性がより高いと考えられるかについての既存の知識を利用して、実質的に対応するペプチドの設計への合理的なアプローチを使用し得る。生じる機能性のペプチドは抗原ペプチドとして企図される。
【０２７６】
「抗原プロセシング」は、抗原のフラグメントへの分解（例えばタンパク質のペプチドへの分解）および「抗原提示細胞」による特異的Ｔ細胞への提示のためのこれらのフラグメントの１つ以上とＭＨＣ分子との会合（例えば結合による）を指す。
【０２７７】
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、その細胞表面にＭＨＣ分子と共同してタンパク質抗原のペプチドフラグメントを提示する細胞である。一部のＡＰＣは抗原特異的Ｔ細胞を活性化し得る。
【０２７８】
「免疫療法」という用語は、特異的免疫反応の活性化を含む治療に関する。
【０２７９】
「インビボ」という用語は、被験体における状況に関する。
【０２８０】
「被験体」および「個体」という用語は互換的に使用され、哺乳動物に関する。例えば、本発明に関連して哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長動物、家畜、例えばイヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ等、実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット等、ならびに動物園の動物などの捕えられている動物である。本明細書で使用される「動物」は、ヒトも包含する。「被験体」という用語は、患者、すなわち動物、好ましくは疾患を有するヒトも包含し得る。
【０２８１】
本発明によれば、被験体への投与を所望する場合、投与のための組成物は、一般に医薬的に適合性の量および医薬的に適合性の調製物中で投与される。「医薬的に適合性」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない非毒性の物質を指す。この種の調製物は、通常、塩、緩衝物質、防腐剤、賦形剤および担体を含んでよく、当業者に公知の方法で投与される。
【０２８２】
本発明を以下の図面および実施例によって詳細に説明するが、これらは説明のためにのみ使用され、限定を意図されない。説明および実施例により、同様に本発明に包含されるさらなる実施形態が当業者にアクセス可能である。
以下、参考形態の例を付記する。
１．細胞中でＲＮＡを発現させる方法であって、（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止する工程、および（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法。
２．前記ＲＮＡが前記細胞に導入されている、１．に記載の方法。
３．前記ＲＮＡが前記細胞に繰り返し導入されている、１．または２．に記載の方法。
４．前記ＲＮＡがエレクトロポレーションまたはリポフェクションによって前記細胞に導入されている、１．から３．のいずれかに記載の方法。
５．前記ＲＮＡがインビトロ転写ＲＮＡである、１．から４．のいずれかに記載の方法。
６．細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止することが、オートクリンおよび／またはパラクリンＩＦＮ機能を阻害する、１．から５．のいずれかに記載の方法。
７．細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止することが、細胞外ＩＦＮに対する結合物質を提供することを含む、１．から６．のいずれかに記載の方法。
８．前記細胞外ＩＦＮに対する結合物質が、細胞外ＩＦＮに対するウイルス性結合物質である、７．に記載の方法。
９．前記細胞外ＩＦＮに対するウイルス性結合物質がウイルスインターフェロン受容体である、８．に記載の方法。
１０．前記細胞外ＩＦＮに対するウイルス性結合物質がワクシニアウイルスＢ１８Ｒである、８．または９．に記載の方法。
１１．記細胞外ＩＦＮに対するウイルス性結合物質が、前記結合物質をコードする核酸の形態で前記細胞に提供される、８．から１０．のいずれかに記載の方法。
１２．前記細胞内ＩＦＮシグナル伝達が、翻訳の阻害および／またはＲＮＡの分解をもたらす、１．から１１．のいずれかに記載の方法。
１３．細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することが、１つ以上のＩＦＮ誘導性の抗ウイルス性活性エフェクタータンパク質を阻害することを含む、１．から１２．のいずれかに記載の方法。
１４．前記ＩＦＮ誘導性の抗ウイルス性活性エフェクタータンパク質が、ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、２'，５'−オリゴアデニル酸シンテターゼ（ＯＡＳ）およびＲＮアーゼＬから成る群より選択される、１３．に記載の方法。
１５．細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することが、ＰＫＲ依存性経路および／またはＯＡＳ依存性経路を阻害することを含む、１．から１４．のいずれかに記載の方法。
１６．前記ＰＫＲ依存性経路を阻害することが、ｅＩＦ２−αのリン酸化を阻害することを含む、１５．に記載の方法。
１７．ｅＩＦ２−αのリン酸化を阻害することが、ＰＫＲを阻害することおよび／またはｅＩＦ２−α模倣偽基質を提供することを含む、１６．に記載の方法。
１８．前記ｅＩＦ２−αを模倣する偽基質が、ｅＩＦ２−αを模倣するウイルス性偽基質である、１７．に記載の方法。
１９．前記ｅＩＦ２−αを模倣するウイルス性偽基質がワクシニアウイルスＫ３である、１８．に記載の方法。
２０．前記ｅＩＦ２−αを模倣するウイルス性偽基質が、前記ウイルス性偽基質をコードする核酸の形態で前記細胞に提供される、１８．または１９．に記載の方法。
２１．ＰＫＲを阻害することが、少なくとも１つのＰＫＲ阻害剤で前記細胞を処理することを含む、１４．または１７．に記載の方法。
２２．前記ＰＫＲ阻害剤が、ＲＮＡ誘導性ＰＫＲ自己リン酸化を阻害する、２１．に記載の方法。
２３．前記ＰＫＲ阻害剤が、ＰＫＲのＡＴＰ結合部位指向性阻害剤である、２１．または２２．に記載の方法。
２４．前記ＰＫＲ阻害剤がイミダゾロ−オキシインドール化合物である、２１．から２３．のいずれかに記載の方法。
２５．前記ＰＫＲ阻害剤が、６，８−ジヒドロ−８−（１Ｈ−イミダゾール−５−イルメチレン）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｇ］ベンゾチアゾール−７−オンおよび／または２−アミノプリンである、２１．から２４．のいずれかに記載の方法。
２６．前記ＰＫＲ阻害剤が、ＰＫＲのウイルス性阻害剤である、２１．から２３．のいずれかに記載の方法。
２７．前記ＰＫＲのウイルス性阻害剤がワクシニアウイルスＥ３である、２６．に記載の方法。
２８．前記ＰＫＲのウイルス性阻害剤が、前記阻害剤をコードする核酸の形態で前記細胞に提供される、２６．または２７．に記載の方法。
２９．ＰＫＲを阻害することが、ＰＫＲ遺伝子の発現をサイレンシングすることを含む、１４．または１７．に記載の方法。
３０．前記ＯＡＳ依存性経路を阻害することが、ＲＮアーゼＬの活性化を阻害することを含む、１５．から２９．のいずれかに記載の方法。
３１．前記ＯＡＳ依存性経路を阻害することが、ＯＡＳを阻害することを含む、１５．から３０．のいずれかに記載の方法。
３２．ＯＡＳを阻害することが、少なくとも１つのＯＡＳ阻害剤で前記細胞を処理することを含む、１４．または３１．に記載の方法。
３３．前記ＯＡＳ阻害剤が、ＯＡＳのウイルス性阻害剤である、３２．に記載の方法。
３４．前記ＯＡＳのウイルス性阻害剤がワクシニアウイルスＥ３である、３３．に記載の方法。
３５．前記ＯＡＳのウイルス性阻害剤が、前記阻害剤をコードする核酸の形態で前記細胞に提供される、３３．または３４．に記載の方法。
３６．前記細胞中で発現される前記ＲＮＡが、プソイドウリジンおよび／または５−メチルシチジンによって修飾されていない、１．から３５．のいずれかに記載の方法。
３７．（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止する工程および（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する工程が、前記細胞における前記ＲＮＡの安定性および／または発現を増強する、１．から３６．のいずれかに記載の方法。
３８．前記細胞における前記ＲＮＡの発現の増強が、前記細胞中の前記ＲＮＡの発現レベルの上昇および／または発現期間の増大を含む、３７．に記載の方法。
３９．（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止する工程および（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する工程が、細胞の生存能を増強する、１．から３８．のいずれかに記載の方法。
４０．ワクシニアウイルスＢ１８ＲならびにワクシニアウイルスＥ３およびワクシニアウイルスＫ３の一方または両方で前記細胞を処理することを含む、１．から３９．のいずれかに記載の方法。
４１．前記ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ、ワクシニアウイルスＥ３および／またはワクシニアウイルスＫ３が、前記ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ、ワクシニアウイルスＥ３および／またはワクシニアウイルスＫ３をコードする核酸の形態で前記細胞に提供される、４０．に記載の方法。
４２．前記細胞が、バリア機能を有する細胞である、１．から４１．のいずれかに記載の方法。
４３．前記細胞が、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞または内皮細胞である、１．から４２．のいずれかに記載の方法。
４４．前記内皮細胞が、心臓の内皮細胞、肺の内皮細胞または臍静脈内皮細胞である、４３．に記載の方法。
４５．前記細胞がヒト細胞である、１．から４４．のいずれかに記載の方法。
４６．幹細胞特性を有する細胞を提供するための方法であって、（ｉ）体細胞を含む細胞集団を提供する工程、（ｉｉ）細胞外ＩＦＮの、前記体細胞のＩＦＮ受容体への結合を阻止する工程、（ｉｉｉ）前記体細胞における細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する工程、（ｉｖ）幹細胞特性を有する細胞への前記体細胞の再プログラム化を可能にする１つ以上の因子を発現する能力を有するＲＮＡを前記体細胞に導入する工程、および（ｖ）幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程を含む方法。
４７．幹細胞特性を有する細胞への前記体細胞の再プログラム化を増強するｍｉＲＮＡを前記体細胞に導入する工程をさらに含む、４６．に記載の方法。
４８．前記１つ以上の因子が、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２を含む、４６．または４７．に記載の方法。
４９．前記１つ以上の因子が、ＫＬＦ４および／またはｃ−ＭＹＣをさらに含む、４８．に記載の方法。
５０．前記１つ以上の因子が、ＮＡＮＯＧおよび／またはＬＩＮ２８をさらに含む、４８．または４９．に記載の方法。
５１．前記１つ以上の因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ−ＭＹＣを含む、４６．から４９．のいずれかに記載の方法。
５２．前記１つ以上の因子が、ＬＩＮ２８および場合によりＮＡＮＯＧをさらに含む、５１．に記載の方法。
５３．前記１つ以上の因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８を含む、４６．から４８．のいずれかに記載の方法。
５４．前記体細胞を少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で培養する工程をさらに含む、４６．から５３．のいずれかに記載の方法。
５５．前記少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤がバルプロ酸を含む、５４．に記載の方法。
５６．工程（ｖ）が、胚性幹細胞培養条件下で前記体細胞を培養することを含む、４６．から５５．のいずれかに記載の方法。
５７．前記幹細胞特性が胚性幹細胞形態を含む、４６．から５６．のいずれかに記載の方法。
５８．前記幹細胞特性を有する細胞が、正常な核型を有し、テロメラーゼ活性を発現し、胚性幹細胞に特有の細胞表面マーカーを発現するおよび／または胚性幹細胞に特有の遺伝子を発現する、４６．から５７．のいずれかに記載の方法。
５９．前記幹細胞特性を有する細胞が多能性状態を示す、４６．から５８．のいずれかに記載の方法。
６０．前記幹細胞特性を有する細胞が、３つの一次胚葉すべての進化した誘導体に分化する発生潜在能を有する、４６．から５９．のいずれかに記載の方法。
６１．前記体細胞が線維芽細胞である、４６．から６０．のいずれかに記載の方法。
６２．前記線維芽細胞が、肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞または皮膚線維芽細胞である、６１．に記載の方法。
６３．前記体細胞がヒト細胞である、４６．から６２．のいずれかに記載の方法。
６４．分化した細胞型を提供するための方法であって、（ｉ）４６．から６３．のいずれかに記載の方法を用いて幹細胞特性を有する細胞を提供する工程、および（ｉｉ）分化した細胞型への部分的または完全な分化を誘導するまたは指令する条件下で前記幹細胞特性を有する細胞を培養する工程を含む方法。
６５．（ｉ）細胞外ＩＦＮのＩＦＮ受容体への結合を阻止するために有用な物質および（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害するために有用な物質を含有する組成物。
６６．６５．に記載の組成物を含むキット。
【実施例】
【０２８３】
（実施例１）ＩＶＴ−ＲＮＡの反復導入（再プログラム化ＴＦ）
誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ）への体細胞の再プログラム化は、再プログラム化転写因子（ｒＴＦ）の持続的な発現を必要とする。ｒＴＦをウイルスによって細胞に送達する場合に生じるゲノム組込みの危険性を回避するため、ｒＴＦをｍＲＮＡとして、宿主ゲノムの付随する改変を伴わずに、エレクトロポレーションまたはリポフェクションによって効率的に送達することができる。但し、この送達は、ｒＴＦの一定の発現を確保するために、繰り返し実行しなければならない。
【０２８４】
ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞を、図２Ａの横のパネルに示されているように転写因子ＯＣＴ４（Ｏ）、ＳＯＸ２（Ｓ）、ＫＬＦ４（Ｋ）およびｃＭＹＣ（Ｍ）をコードする各々のインビトロ転写（ＩＶＴ）−ＲＮＡ  １５μｇまたは５μｇのいずれかでエレクトロポレートし、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞培地中で培養した。エレクトロポレーションは、ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞に関する最適化パラメータを用いて４ｍｍギャップのキュベット中で実施した。指示されている時点で、細胞の１０％をその後のエレクトロポレーションの前に培養物から取り出し、全ＲＮＡを単離して、ヒトＥＳマーカー遺伝子ＯＣＴ４（内因性）、ＴＥＲＴ、ＧＤＦ３およびＤＰＰＡ４のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した。４つのｒＴＦ（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃＭＹＣ）をコードするＩＶＴ−ＲＮＡの反復エレクトロポレーションは、ＧＦＤ３、ＤＰＰＡ４およびＴＥＲＴなどの一部の多能性マーカーの速やかな誘導をもたらす。内因性ＯＣＴ４などの他のマーカーは、全くまたはわずかしか誘導されなかった。
【０２８５】
ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞を、図２Ｂの横のパネルに示されているように転写因子ＯＳＫＭをコードする各々のＩＶＴ−ＲＮＡ  １５μｇでエレクトロポレートし、ヒトＥＳ細胞培地中で培養した。エレクトロポレーションは、ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞に関する最適化パラメータを用いて４ｍｍギャップのキュベット中で実施した。指示されている時点で、残存する細胞を計数し、出発細胞に対する生存率を算定した。反復ＩＶＴ−ＲＮＡ導入は大量の細胞死を伴い、それゆえ再プログラム化の成功は達成不可能である。
【０２８６】
ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞を、ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードするＩＶＴ  ＲＮＡ  １μｇおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＩＶＴ  ＲＮＡ  ５μｇでエレクトロポレートした。エレクトロポレーションは、ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞に関する最適化パラメータを用いて２ｍｍギャップのキュベット中で実施した。エレクトロポレーションの２４時間後、細胞をペレット化し、全ＲＮＡを単離して、インターフェロン（ＩＦＮ）αおよびβのｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した。ＩＶＴ−ＲＮＡのエレクトロポレーションは、その２４時間後にＩＦＮαおよびβの誘導を伴うことが観察された：図２Ｃ参照。
【０２８７】
ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞を、再プログラム化混合物をコードするＩＶＴ  ＲＮＡ  ３３，４μｇ（ｒＴＦ（ＯＳＫＭ  ＮＡＮＯＧ（Ｎ）  ＬＩＮ２８（Ｌ）（１：１：１：１：１：１））２９，５μｇ、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ｌｇＴ）１，３μｇ、ＨＴＬＶ  Ｅ６  １，３μｇおよびＧＦＰ  １．２５μｇ）でエレクトロポレートした。エレクトロポレーションは、ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞に関する最適化パラメータを用いて４ｍｍギャップのキュベット中で実施した。エレクトロポレーションの４８時間後、細胞をペレット化し、全ＲＮＡを単離して、ＩＦＮ応答遺伝子ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＭＸ１、ＩＦＩＴＭ１およびＩＲＦ９のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した。検討した５つのＩＦＮ応答遺伝子すべてがＩＶＴ−ＲＮＡのエレクトロポレーションの４８時間後に誘導される；図２Ｄ参照。ＩＦＮ応答は、もともとウイルス感染に対する宿主の先天性免疫応答の一部として進化してきた。ウイルス核酸はセンサー分子によって効率的に認識され、これが、アポトーシス、細胞骨格リモデリング、ＲＮＡ分解およびタンパク質翻訳の停止を含む抗ウイルス活性をもたらす。これらの機構は、ＲＮＡに基づく遺伝子導入を明らかに妨げる。
【０２８８】
ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞を、図２Ｅに示されているレポーター遺伝子Ｌｕｃ、ＧＦＰまたはプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）野生型をコードするＩＶＴ−ＲＮＡの量で１回エレクトロポレーションした。エレクトロポレーションは、ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞に関する最適化パラメータを用いて４ｍｍギャップのキュベット中で実施した。細胞をエレクトロポレーションの２４時間後に溶解し、ＰＫＲ標的真核生物開始因子２α（ｅＩＦ２α）の発現およびリン酸化状態を、特異抗体を用いてウェスタンブロット法によって観測した。ＩＦＮ応答において主要な役割を果たす因子の１つはＰＫＲであり、これは、活性化後にその標的であるｅＩＦ２αをリン酸化し、翻訳の阻害をもたらす。本発明者らは、ＩＶＴ−ＲＮＡのエレクトロポレーションの２４時間後にｅＩＦ２αがリン酸化されることを示すことができ、ＰＫＲの活性化をＲＮＡに基づく再プログラム化の顕著な障害の１つとして同定した。
【０２８９】
ＲＮＡに基づく反復遺伝子導入はＩＦＮ応答の誘導を伴い、これはｒＴＦの持続的な発現を妨げ、それゆえＲＮＡに基づく再プログラム化の成功を妨げる。
【０２９０】
（実施例２）
ＲＮＡに基づく遺伝子導入におけるＥ３、Ｋ３およびＢ１８Ｒの使用
概念実証として、ウイルスエスケープタンパク質Ｅ３、Ｋ３およびＢ１８Ｒ（ワクシニアウイルス）をコードする非修飾ＩＶＴ−ＲＮＡを非修飾ＩＶＴ−ＲＮＡの混合物（ルシフェラーゼ／ＧＦＰ）に添加し、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）にリポフェクトして、レポーター遺伝子ＧＦＰの翻訳およびＲＮＡに対するＩＦＮ応答を分析した。さらに、反復リポフェクション後の細胞の生存をＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）によって評価した。
【０２９１】
ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞を６ウェルに塗布し（１００，０００細胞／ウェル）、その翌日ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６μｌおよびＩＶＴ  １．４μｇを用いてリポフェクトした。ＩＶＴ−ＲＮＡ混合物は、それによりＧＦＰ  ０．８μｇとそれぞれＢ１８Ｒ、Ｅ３またはＫ３  ０．２μｇ（図３Ａ、Ｂに示されているように）から成った。ＬｕｃをコードするＩＶＴ−ＲＮＡを使用して、混合物を合計１．４μｇにした。リポフェクションを製造者の指示に従って実施し、細胞をトランスフェクションの４８時間後に採取した。細胞の２０％をＦＡＣＳによるＧＦＰ発現の分析のために使用し（図３Ｂ）、残りの細胞をペレット化して、全ＲＮＡを単離し、ＩＦＮβおよびＯＡＳ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した（図３Ａ）。図３Ａに示すように、ＩＦＮβおよびＩＦＮ応答遺伝子ＯＡＳ１は、明らかにＩＶＴ−ＲＮＡ（Ｌｕｃ／ＧＦＰ）のリポフェクションによって誘導される。この誘導は、ＩＦＮβの場合はＥ３／Ｋ３単独によって低減され得るが、３つのウイルスエスケープタンパク質すべての組合せだけが、リポフェクションの４８時間後にＩＶＴ−ＲＮＡによるＩＦＮβおよびＯＡＳ１誘導の両方を有意に低減することができる。図３Ｂに示すように、レポーター遺伝子ＧＦＰの発現はＥ３およびＫ３の添加によって増強される。Ｂ１８ＲはＧＦＰの翻訳に影響を及ぼさない。
【０２９２】
ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞を６ウェルに塗布し（１００，０００細胞／ウェル）、次の連続４日間、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６μｌおよびＩＶＴ  １．４μｇを用いてリポフェクトした。ＩＶＴ−ＲＮＡ混合物は、それによりＧＦＰ  ０．８μｇとそれぞれＢ１８Ｒ、Ｅ３またはＫ３  ０．２μｇ（指示されているように）から成った。ＬｕｃをコードするＩＶＴ−ＲＮＡを使用して、混合物を合計で全ＩＶＴ−ＲＮＡ  １．４μｇになるようにした。対照として、Ｌｕｃ（０．６μｇ）およびＧＦＰ（０．８μｇ）をコードする修飾（ｍｏｄ．）ＩＶＴ−ＲＮＡ  １．４μｇを使用した。これらのＲＮＡは、より低い免疫刺激特性を示すウリジンおよびシチジンの代わりに１００％プソイドウリジン（ｐｓｉ）および１００％５−メチルシチジン（５ｍＣ）から成った。リポフェクションを製造者の指示に従って実施した。最後のリポフェクションの２４時間後、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて細胞生存能を検定し、モックトランスフェクト細胞に標準化した。図３Ｃに示すように、非修飾ＩＶＴ−ＲＮＡの連日リポフェクション（Ｌｕｃ／ＧＦＰ、４回）は細胞生存能の大きな喪失を伴う。３つのウイルスエスケープタンパク質すべての組合せはこの障害を克服することができ、修飾ＩＶＴ−ＲＮＡ（１００％ｐｓｉおよび５ｍＣ）の使用よりもさらに一層細胞の生存を増強する。
【０２９３】
ＩＶＴ−ＲＮＡによってコードされるＥ３、Ｋ３およびＢ１８Ｒの組合せを添加した場合、ＲＮＡに基づく反復遺伝子導入が可能であると結論される。概念実証が達成された。
【０２９４】
（実施例３）
再プログラム化のためのＲＮＡに基づく遺伝子導入におけるＥ３、Ｋ３およびＢ１８Ｒの使用
Ｅ３、Ｋ３およびＢ１８ＲをコードするＩＶＴ−ＲＮＡの添加がＲＮＡに基づく反復遺伝子導入を可能にするという概念の実証に至った後、本発明者らは、これが再プログラム化混合物の導入についてもあてはまるかどうかを検討した。この目的のために、６つのｒＴＦ（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８；略記：ＯＳＫＭＮＬ）を１：１：１：１：１：１のモル比で混合し、リポフェクションによってＨＦＦに導入した。再び、４回の連日反復リポフェクション後に細胞の生存およびＩＦＮ応答の誘導を分析した。
【０２９５】
ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞を６ウェルに塗布し（８０，０００細胞／ウェル）、次の連続４日間、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６μｌおよびＩＶＴ  １．４μｇを用いてリポフェクトした。ＩＶＴ−ＲＮＡ混合物は、それにより非修飾ＧＦＰ  ０．８μｇまたは非修飾もしくは修飾ＯＳＫＭＮＬ（１：１：１：１：１：１）０．８μｇと、それぞれ非修飾または修飾Ｂ１８Ｒ、Ｅ３およびＫ３  ０．２μｇから成った。必要に応じて、ＬｕｃをコードするＩＶＴ−ＲＮＡを使用して、混合物を合計で全ＩＶＴ−ＲＮＡ  １．４μｇになるようにした。修飾ＲＮＡは、より低い免疫刺激特性を示すウリジンおよびシチジンの代わりに１００％ｐｓｉおよび１００％５ｍＣから成った。リポフェクションを製造者の指示に従って実施した。最後のリポフェクションの２４時間後、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）とモックトランスフェクト細胞への標準化を用いて（図４Ａ）、および顕微鏡によって（図４Ｂ）、細胞生存能を検定した。その後、細胞をペレット化し、全ＲＮＡを単離して、ＩＦＮβおよびＯＡＳ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した（図４Ｃ）。予想されたように、Ｅ３／Ｋ３／Ｂ１８Ｒ（ＥＫＢ）が存在しない場合、非修飾ＩＶＴ−ＲＮＡ（Ｌｕｃ／ＧＦＰまたはＯＳＫＭＮＬ）でトランスフェクトした細胞の生存能は失われる。このセットの実験において、ＥＫＢが存在する場合、生存能はモックトランスフェクト細胞と同等である。レポーター遺伝子ＩＶＴ−ＲＮＡで見られるように（図３参照）、生存率は修飾ＩＶＴ−ＲＮＡ単独よりもＥＫＢの存在下ではさらに高い。図４Ａで認められた作用を、顕微鏡で撮影した代表的写真によって図４Ｂで視覚化する。非修飾ＩＶＴ−ＲＮＡでトランスフェクトした細胞は、このセットの実験において４回の連日反復リポフェクション後に生き残れなかったので、ＩＦＮ応答は、残存する試料においてしかｑＲＴ−ＰＣＲによって分析することができなかった。図４Ｃに見られるように、ＩＦＮβおよびＯＡＳ１の誘導によって測定したＩＦＮ応答は、ＥＫＢが存在する試料ではほとんど減少する。ＩＦＮ応答の低減は、修飾ＩＶＴ−ＲＮＡを使用した場合よりもさらに一層少ない。
【０２９６】
ＩＶＴ−ＲＮＡによってコードされるＥ３、Ｋ３およびＢ１８Ｒの組合せを添加した場合、再プログラム化ｒＴＦを用いたＲＮＡに基づく反復遺伝子導入が可能であると結論される。細胞の生存およびＩＦＮ応答の低減は、修飾ＩＶＴ−ＲＮＡの場合よりもさらに一層顕著である。
【０２９７】
（実施例４）
Ｅ３、Ｋ３およびＢ１８Ｒの存在下での反復リポフェクション後のｒＴＦの翻訳
細胞の生存およびＩＦＮ応答の低減に加えて、Ｅ３、Ｋ３およびＢ１８Ｒの存在下での３回の連日リポフェクション後にｒＴＦがどのように翻訳されるかも検討した。導入したｒＴＦ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧの発現レベルを細胞内ＦＡＣＳ染色によって分析した。
【０２９８】
ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞を６ウェルに塗布し（１００，０００細胞／ウェル）、次の連続３日間、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６μｌおよびＩＶＴ  １．４μｇを用いてリポフェクトした。ＩＶＴ−ＲＮＡ混合物は、それによりＧＦＰ  ０．２μｇと、非修飾または修飾ＯＣＴ４またはＳＯＸ２またはＮＡＮＯＧ  ０．６μｇならびにそれぞれ非修飾または修飾Ｂ１８Ｒ、Ｅ３およびＫ３（ＥＫＢ）０．２μｇから成った。修飾ＲＮＡは、より低い免疫刺激特性を示すウリジンおよびシチジンの代わりに１００％ｐｓｉおよび１００％５ｍＣから成った。リポフェクションを製造者の指示に従って実施した。最後のリポフェクションの２４時間後、ＯＳＮの細胞内発現を、ヒト多能性幹細胞転写因子分析キット（ＢＤ  ５６０５８９）を用いてＦＡＣＳ分析によって観測した。ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２の発現レベルは、非修飾で適用した場合ＥＫＢの存在下でより高かった；図５参照
【０２９９】
ＥＫＢの存在下で、非修飾ＩＶＴ−ＲＮＡは、より効率的な再プログラム化をもたらし得るｒＴＦのより高い発現を導くと結論される。
【０３００】
（実施例５）
ＥＫＢの存在下でのｒＴＦおよびマイクロＲＮＡを用いたＨＦＦの再プログラム化
ｒＴＦ混合物の反復リポフェクションは、再プログラム化混合物へのＥＫＢの添加によって達成され、連日リポフェクション後により良好な生存率およびＩＦＮ応答のより大きな低減をもたらした。さらに、ＥＫＢの存在下でｒＴＦのより高い発現レベルが達成された。その次の実験では、これらの混合物を、ＨＦＦの再プログラム化を達成するための長期リポフェクションに使用した。再プログラム化をさらに増強するため、クラスター３０２／３６７のマイクロＲＮＡも再プログラム化混合物に添加した。これらのｍｉＲＮＡは、主として細胞の自己複製および多能性の維持に関与すると考えられ、レンチウイルスベクターによって発現された場合再プログラム化を導くことができた（Ａｎｏｋｙｅ−Ｄａｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０３０１】
ＨＦＦ線維芽細胞（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を６ウェルに塗布し（１００，０００細胞／ウェル）、週に５回（月曜日から金曜日まで）２週間にわたって、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６μｌおよびＩＶＴ−ＲＮＡ  １．４μｇを用いてリポフェクトした（図６Ａ）。ＩＶＴ−ＲＮＡ混合物は、それにより非修飾ＧＦＰ  ０．８μｇまたは非修飾もしくは修飾ＯＳＫＭＮＬ（１：１：１：１：１：１）０．８μｇと、それぞれ非修飾または修飾Ｂ１８Ｒ、Ｅ３およびＫ３（ＥＫＢ）０．２μｇならびにｍｉＲＮＡ  ３０２ａ−ｄおよび３６７［各々０．４μＭ］から成るｍｉＲＮＡ混合物０．４μｇで構成された。修飾ＲＮＡは、より低い免疫刺激特性を示すウリジンおよびシチジンの代わりに１００％ｐｓｉおよび１００％５ｍＣから成った。幹細胞培地（Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ  ｍｅｄｉａ，Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）中でのリポフェクションを製造者の指示に従って実施した。６日目および１３日目に、細胞をペレット化し、全ＲＮＡを単離して、ヒトＥＳマーカーＴＥＲＴ、ＤＰＰＡ４、ＧＤＦ３、ＬＩＮ２８（内因性）およびＲＥＸ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した。コロニー増殖を顕微鏡によって観察し、さらなる分析のために、ＳｔａｉｎＡｌｉｖｅ  ＴＲＡ−１−６０抗体（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を製造者の指示に従って使用してコロニーをＥＳ表面マーカーＴＲＡ−１−６０について染色した。
【０３０２】
図６Ｂに示すように、いくつかの多能性マーカーの発現レベルの分析は、非修飾ＯＳＭＮＬ、非修飾ＥＫＢおよびｍｉＲＮＡ混合物を含む試料において、分析したすべての多能性マーカーが、修飾ＯＳＫＭＮＬ、修飾ＥＫＢおよびｍｉＲＮＡ混合物または非修飾ＥＫＢ単独とｍｉＲＮＡ混合物の場合に比べて高発現されることを明らかにした。非修飾ＩＶＴ−ＲＮＡは、それにより５ｍＣおよびＰｓｉでの修飾を凌駕する。１０日目から、非修飾ＯＳＫＭＮＬ、非修飾ＥＫＢおよびｍｉＲＮＡ混合物を含む試料でコロニー形成が観察された；図６Ｃ参照。ｍｉＲＮＡ単独などの他の試料では、コロニー形成は観察されなかった。修飾ＯＳＫＭＮＬと修飾ＥＫＢおよびｍｉＲＮＡ混合物の組合せでは、１〜３個のコロニーが出現したが、ＥＫＢの存在下での非修飾ＯＳＭＮＬとｍｉＲＮＡ混合物の組合せをかなり下回った。図６Ｄに示すように、非修飾ＯＳＫＭＮＬ、非修飾ＥＫＢおよびｍｉＲＮＡ混合物での反復トランスフェクションによって達成されたＲｉｂｏ−ｉＰＳは、ヒト胚性幹細胞の表面マーカーであるＴＲＡ−１−６０について陽性に染色することができた。
【０３０３】
非修飾ＥＫＢおよびクラスター３０２／３６７からの成熟ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ混合物と組み合わせた非修飾ＩＶＴ−ＲＮＡによってコードされるｒＴＦでのＲＮＡに基づく反復遺伝子導入は、多能性マーカーおよび幹細胞表面マーカーの高発現を特徴とするＲｉｂｏ−ｉＰＳ細胞の極めて効率的で堅固な作製をもたらすと結論される。非修飾ＩＶＴ−ＲＮＡの使用は、それにより修飾ＩＶＴ−ＲＮＡの使用を凌駕する。
【０３０４】
（実施例６）
ＥＫＢの存在下でのｒＴＦおよびマイクロＲＮＡを用いたＨＦＦの再プログラム化（分割１：８）
非修飾ＩＶＴ−ＲＮＡによってコードされるｒＴＦ、ＥＫＢおよびｍｉＲＮＡ混合物３０２／３６７を用いた再プログラム化のための最初のセットの実験では、細胞を１：４に分割した。その次の実験では、細胞の高密度な増殖を避けるため細胞を１：８に分割した。
【０３０５】
ＨＦＦ線維芽細胞（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を６ウェルに塗布し（１００，０００細胞／ウェル）、週に５回（月曜日から金曜日まで）２週間にわたって、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６μｌおよびＩＶＴ−ＲＮＡ  １．４μｇを用いてリポフェクトした（図７Ａ）。ＩＶＴ−ＲＮＡ混合物は、それにより非修飾または修飾ＯＳＫＭＮＬ（１：１：１：１：１：１）０．８μｇと、それぞれ非修飾または修飾Ｂ１８Ｒ、Ｅ３およびＫ３（ＥＫＢ）０．２μｇならびにｍｉＲＮＡ  ３０２ａ−ｄおよび３６７［各々０．４μＭ］から成るｍｉＲＮＡ混合物０．４μｇで構成された。修飾ＲＮＡは、より低い免疫刺激特性を示すウリジンおよびシチジンの代わりに１００％ｐｓｉおよび１００％５ｍＣから成った。幹細胞培地（Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ  ｍｅｄｉａ，Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）中でのリポフェクションを製造者の指示に従って実施した。５日目および１２日目に、細胞をペレット化し、全ＲＮＡを単離して、ヒトＥＳマーカーＴＥＲＴ、ＤＰＰＡ４、ＧＤＦ３、ＬＩＮ２８（内因性）およびＲＥＸ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した。コロニー増殖を顕微鏡によって観察し、さらなる分析のために、コロニーを、製造者の指示に従ってＳｔａｉｎＡｌｉｖｅ  ＴＲＡ−１−６０抗体（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を使用してＥＳ表面マーカーＴＲＡ−１−６０について、またはアルカリホスファターゼの活性（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄ染色キット）について染色した。
【０３０６】
図７Ｂに示すように、いくつかの多能性マーカーの発現レベルの分析は、非修飾ＯＳＫＭＮＬ、非修飾ＥＫＢおよびｍｉＲＮＡ混合物を含む試料では、分析したすべての多能性マーカーが、修飾ＯＳＫＮＬ、修飾ＥＫＢおよびｍｉＲＮＡ混合物の場合に比べて高発現されることを明らかにした。やはり、非修飾ＩＶＴ−ＲＮＡは５ｍＣおよびＰｓｉでの修飾を凌駕する。また、１０日目から両方の試料（非修飾または修飾ＯＳＫＭＮＬ）でコロニー形成が観察された。これらのコロニーは、ヒト胚性幹細胞の表面マーカーであるＴＲＡ−１−６０について陽性に染色することができた；図７Ｃ参照。図７Ｄに示すように、コロニーはまた、もう１つの幹細胞マーカーであるアルカリホスファターゼの高活性も示した。修飾ＯＳＫＭＮＬに比べて非修飾ＯＳＫＭＮＬの明らかに高い効率は、図７Ｄの上のパネルにおいて明瞭に認めることができる。
【０３０７】
非修飾ＥＫＢおよびクラスター３０２／３６７からの成熟ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ混合物と組み合わせた非修飾ＩＶＴ−ＲＮＡによってコードされる再プログラム化ｒＴＦでのＲＮＡに基づく反復遺伝子導入は、多能性マーカーおよび幹細胞表面マーカーの高発現を特徴とするＲｉｂｏ−ｉＰＳ細胞の極めて効率的で堅固な作製をもたらすと結論される。非修飾ＩＶＴ−ＲＮＡの使用は、それにより修飾ＩＶＴ−ＲＮＡの使用を凌駕する。
【０３０８】
（実施例７）
ＥＫＢの力価測定
再プログラム化の効率をさらに高める１つの可能性は、より多くのｒＴＦ−ＩＶＴ−ＲＮＡまたはＩＶＴ−ＲＮＡによってコードされる他の増強因子の添加である。リポフェクションプロトコルは一定量のＩＶＴ−ＲＮＡに限定されるので、本発明者らは、再プログラム化カクテルに添加した場合にＥＫＢの量を低減することができるかどうかを検討した。そのためＨＦＦを、それぞれ０．０００１μｇ〜０．２μｇ（再プログラム化実験で使用される量）にわたる種々の量のＥＫＢと組み合わせた６つのｒＴＦおよびｍｉＲＮＡでリポフェクトした。４回の連日反復リポフェクション後に細胞の生存およびＩＦＮ応答の誘導を分析した。
【０３０９】
ＨＦＦ線維芽細胞（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を６ウェルに塗布し（１００，０００細胞／ウェル）、次の連続４日間、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６μｌおよびＩＶＴ  １．４μｇを用いてリポフェクトした。ＩＶＴ−ＲＮＡ混合物は、それにより非修飾ＯＳＫＭＮＬ（１：１：１：１：１：１）０．８μｇと、指示されているように可変量の非修飾Ｂ１８Ｒ、Ｅ３およびＫ３から成った。ＬｕｃをコードするＩＶＴ−ＲＮＡを使用して、混合物を合計で全ＩＶＴ−ＲＮＡ  １．４μｇになるようにした。再プログラム化実験に従って、ｍｉＲＮＡ  ３０２ａ−ｄおよび３６７［各々０．４μＭ］から成るｍｉＲＮＡ混合物０．４μｇを試料に添加した。対照として、Ｌｕｃ（０．６μｇ）およびＯＳＫＭＮＬ（０．８μｇ、１：１：１：１：１：１）をコードする修飾（ｍｏｄ．）ＩＶＴ−ＲＮＡ  １．４μｇを使用した。これらのＲＮＡは、より低い免疫刺激特性を示すウリジンおよびシチジンの代わりに１００％ｐｓｉおよび１００％５ｍＣから成った。リポフェクションを製造者の指示に従って実施した。最後のリポフェクションの２４時間後、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて細胞生存能を検定した。その後、細胞をペレット化し、全ＲＮＡを単離して、ＩＦＮβおよびＯＡＳ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した。
【０３１０】
図８Ａに示すように、反復リポフェクション後のＨＦＦの生存能は、ＥＫＢを各因子のＩＶＴ−ＲＮＡ  ０．０２５μｇに低減するまで維持された。ＩＦＮβおよびＯＡＳ１の発現レベルを測定することによるＩＦＮ応答の分析は、やはりＩＶＴ−ＲＮＡに対するＩＦＮ応答がＥＫＢの０．０２５μｇの量まで明白に低減されることを明らかにした；図８Ｂ参照。それにもかかわらず、残存するＩＦＮ応答の誘導により、本発明者らは０．０５μｇのＥＫＢの使用を推奨する。
【０３１１】
ＥＫＢの量は、各々のＩＶＴ−ＲＮＡの０．０２５〜０．０５μｇまで低減することができると結論される。
【０３１２】
（実施例８）
Ｅ３およびＫ３単独の作用
これまでは、Ｅ３とＫ３の組合せだけを使用した。このセットの実験では、レポーター遺伝子Ｌｕｃの翻訳およびＩＦＮ応答へのＥ３およびＫ３単独の作用を分析した。
【０３１３】
ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞を、指示されているようにＬｕｃをコードするＩＶＴ  ＲＮＡ（１μｇ）、ＧＦＰをコードするＩＶＴ  ＲＮＡ（５μｇ）およびＥ３またはＫ３またはその両方をコードするＩＶＴ  ＲＮＡ  ３μｇでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションは、ＣＣＤ１０７９Ｓｋ線維芽細胞に関する最適化パラメータを用いて２ｍｍギャップのキュベット中で実施した。１００００細胞／ウェルを９６ウェルプレートに２組塗布した。Ｂｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてエレクトロポレーション後の図９Ａに示されている時点でルシフェラーゼ活性を測定した。２組の平均値を示す。さらに、３０００００細胞／ウェルを６ウェルプレートに塗布し、エレクトロポレーションの２４時間後、細胞をペレット化して、全ＲＮＡを単離し、ＯＡＳ１およびＩＦＮ−βのｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲによって分析して、ＩＦＮ−βの場合はＱｕａｎｔｉ  Ｔｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔを用いて定量した。
【０３１４】
図９Ａに示すように、Ｌｕｃの翻訳は、Ｅ３またはＫ３単独により、これらの両方を一緒に用いた場合と同程度に増強された。ＩＶＴ−ＲＮＡのリポフェクションに関して見られるように、ＩＦＮβおよびＩＦＮ応答遺伝子ＯＡＳ１は、ＩＶＴ−ＲＮＡ（Ｌｕｃ／ＧＦＰ）のエレクトロポレーションによって明らかに誘導される。これらの誘導は、エレクトロポレーションの２４時間後にＥ３またはＫ３によってまたは両方の組合せのいずれによっても低減することができない；図９Ｂ参照。
【０３１５】
これらの実験は、ＩＶＴ−ＲＮＡによってコードされる１つの細胞内ウイルスエスケープタンパク質（Ｅ３またはＫ３）が、ＥＫＢの組合せで認められるようにＲＮＡに基づく反復遺伝子導入を可能にするのに十分であり得ることを指示する。
【０３１６】
（実施例９）
自己複製するＲＮＡの発現を増強するためのウイルスインターフェロン阻害剤の使用
アルファウイルスのゲノムは、大きなポリタンパク質についての２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするプラスセンスの一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ（＋））である。ゲノムの５'末端のＯＲＦは非構造タンパク質ｎｓＰ１〜ｎｓＰ４（ｎｓＰ１〜４）をコードし、これらは翻訳され、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）へとプロセシングされる；３'末端のＯＲＦは、構造タンパク質−キャプシドおよび糖タンパク質をコードする。どちらのＯＲＦも、構造ＯＲＦの転写を支配する、いわゆるサブゲノムプロモーター（ＳＧＰ）によって分離されている（Ｓｔｒａｕｓｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９４，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８，４９１−５６２）。遺伝子ベクターとして利用される場合は、ＳＧＰの後の構造タンパク質が導入遺伝子に置き換えられる。そのようなベクターをウイルス粒子にパッケージングするために、構造タンパク質がヘルパー構築物からトランスで発現されなければならない（Ｓｍｅｒｄｏｕ  ａｎｄ  Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，１０９２−１０９８；Ｅｈｒｅｎｇｒｕｂｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，２００７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９６，７０４１−７０４６）。
【０３１７】
アルファウイルスは、もっぱらＲＮＡレベルで感染細胞の細胞質中で複製する（アルファウイルスの生活環の総説については、Ｊｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｆｕｔｕｒｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４，８３７−８５６）。感染後、ｓｓＲＮＡ（＋）ゲノムはｎｓＰ１２３４ポリタンパク質前駆体の翻訳のためのｍＲＮＡとして働き、前記前駆体は、自己タンパク質分解によってフラグメントｎｓＰ１２３およびｎｓＰ４へとプロセシングされるウイルス生活環の初期段階にある。フラグメントｎｓＰ１２３およびｎｓＰ４は、ゲノムＲＮＡ鋳型から（−）鎖ＲＮＡを転写する（−）鎖レプリカーゼ複合体を形成する。後期段階で、ｎｓＰ１２３４ポリタンパク質は完全に単一タンパク質へと切断され（Ｓｈｉｒａｋｏ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，１８７４−１８８５）、これらが、新たな（＋）鎖ゲノムを合成する（＋）鎖レプリカーゼ複合体、ならびに構造タンパク質または導入遺伝子をコードするサブゲノム転写産物へと集合する（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３２３，１５３−１６３；Ｖａｓｉｌｊｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，４１６３６−４１６４５）。サブゲノムＲＮＡならびに新たなゲノムＲＮＡは、キャップされ（Ｃｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｇｏｍａｔｏｓ，１９８１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １１４，５４２−５５４；Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５，４３５−４４３）、ポリアデニル化されており（Ｓａｗｉｃｋｉ  ａｎｄ  Ｇｏｍａｔｏｓ，１９７６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０，４４６−４６４）、したがって標的細胞の感染後にｍＲＮＡとして認識される。新しいゲノムＲＮＡだけが、出芽ビリオンへのゲノムＲＮＡの独占的なパッケージングを確実にするパッケージングシグナルを含む。
【０３１８】
ベクター学のためのアルファウイルスレプリコンの利点は、キャップされ、ポリアデニル化されたＲＮＡゲノムの正方向に基づく。翻訳可能なレプリコンＲＮＡはインビトロで容易に合成することができ、キャップ類似体をインビトロ転写反応に加えることによってキャッピングが達成され、ポリＡ尾部はプラスミド鋳型上にポリＴトラックとしてコードされる（Ｅｈｒｅｎｇｒｕｂｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，２００７，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｃｈａｐｔｅｒ  ４，Ｕｎｉｔ）。インビトロ転写された（ＩＶＴ）レプリコンを従来のトランスフェクション技術によってトランスフェクトし、低い量の出発ＩＶＴレプリコンでも速やかに増殖する。導入後数時間以内に（Ｂｒｕｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｅｎｎｅｄｙ，１９７５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２８，１１１−１２７）、ＳＧＰの下流に位置づけられた導入遺伝子が、細胞当たり約４０．０００〜２００．０００コピーという非常に高いコピー数のサブゲノムＲＮＡに転写され（Ｔｕｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２，５５５−５６５）、したがって組換えタンパク質が強く発現されることは驚くには当たらない。
【０３１９】
特定の目的に応じて、ＩＶＴレプリコンを標的細胞に直接トランスフェクトし得るか、または構造遺伝子をトランスで提供するヘルパーベクターを用いてアルファウイルス粒子にパッケージングし得る（Ｓｍｅｒｄｏｕ  ａｎｄ  Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，１０９２−１０９８；Ｂｅｒｇｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．）１１，９１６−９２０）。皮膚または筋への導入は、体液性および細胞性免疫応答の強力な誘導と並行して、高く持続的な局所発現をもたらす（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ．Ｏｎｅ．７，ｅ２９７３２；Ｇｅａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １０９，１４６０４−１４６０９）。合わせて考慮すると、インビトロでのレプリコンの作製および導入の容易さ、レプリコンによる高い発現レベルと免疫応答は、感染症または癌に対するワクチン接種のために理想的である（最近、Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０，４４１４−４４１８によって論じられた）。
【０３２０】
これらの全体的な肯定的態様にもかかわらず、レプリコンに基づく遺伝子導入は、細胞死を生じさせる、宿主細胞における翻訳の有効なブロックによって課せられる制限に直面する。翻訳のブロックは２つの機構によって引き起こされる：第一に、レプリカーゼタンパク質ｎｓＰ２が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩを分解することによって宿主の翻訳を積極的に停止させ（Ａｋｈｒｙｍｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６，７１８０−７１９１）、第二に、インターフェロン（ＩＦＮ）応答がプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の活性化による翻訳の停止を媒介する（Ｇｏｒｃｈａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８，８４５５−８４６７）。ｎｓＰ２に関連する細胞傷害性は、細胞における持続的な複製および遺伝子発現の能力を有する非細胞傷害性突然変異体を選択することによって克服された（Ｃａｓａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３７６，２４２−２５１；Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．７，２０２−２０９）。しかし、これらの研究の大部分は、おそらくＩＦＮ応答の欠損に関連する可能性が高い、レプリコン発現に対して高度に許容性であるＢＨＫ２１細胞において実施された（Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，９８９１−９８９８）。ＩＦＮコンピテント細胞では、ＰＫＲ活性化およびＩＦＮ応答がまだ予想でき、これが非細胞傷害性ベクターの安定な発現を制限する。
【０３２１】
翻訳を阻害することに加えて、ＩＦＮ応答はアルファウイルス複製にとっても障害である（Ｄｅｕｂｅｒ  ａｎｄ  Ｐａｖｌｏｖｉｃ，２００７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８８，１９５２−１９５９）。特に、ｄｓＲＮＡによって活性化されるＰＫＲは複製をブロックする（Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９０，１３８２−１３９１）。活性化ＰＫＲは真核生物開始因子２α（ｅＩＦ２α）をリン酸化し、この因子はその後、もはやキャップされたｍＲＮＡの翻訳を開始させることができない（Ｐｉｎｄｅｌ  ａｎｄ  Ｓａｄｌｅｒ，２０１１，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．３１，５９−７０）。それにより、細胞は多くのウイルスのタンパク質発現を阻害し、ウイルス−宿主共進化の結果として、多くのウイルスが引き換えにＰＫＲ阻害性タンパク質を発現する（Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７０，１０３２−１０６０）。アルファウイルスはＰＫＲを強力に活性化するが、しかし、ＰＫＲを阻害することなくその生活環を達成する。そのサブゲノム転写産物は、活性化ＰＫＲの存在下で構造タンパク質へと効率よく翻訳され、これは翻訳エンハンサー（ＴＥ）と呼ばれる５'末端のサブゲノムＲＮＡモチーフに依存する（Ｇｏｒｃｈａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８，８４５５−８４６７）。ＴＥを欠く突然変異ウイルスの複製は大きく損なわれるが、ワクシニアウイルス（ＶａｃＶ）由来のＰＫＲ阻害剤、Ｅ３Ｌの発現によってトランスで救済され得る（Ｄｏｍｉｎｇｏ−Ｇｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ．Ｏｎｅ．６，ｅ１６７１１）。
【０３２２】
ＴＥはキャプシドのコード領域へと伸びており、そのため構造タンパク質が導入遺伝子で置き換えられた場合は除去されるので、レプリコンベクターは通常ＴＥを有さない。したがって、導入遺伝子発現はＰＫＲ活性化によって抑制される。ドミナントネガティブＰＫＲの共発現は、上述したＥ３ＬによるＴＥ欠損ウイルス複製の救済と同様に、発現を抑制解除し得る（Ｇｏｒｃｈａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８，８４５５−８４６７）。他方で、導入遺伝子ＯＲＦのＮ末端部分へのＴＥ配列の融合は導入遺伝子の発現を可能にするが、機能的ＴＥはサブゲノムＵＴＲだけでなく、キャプシドタンパク質のＮ末端アミノ酸（ＳＦＶ中の３４アミノ酸）も含むという難点を伴う（Ｓｊｏｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．）１２，１１２７−１１３１）。キャプシド−導入遺伝子融合が許容される限り、そのようなベクター設計が使用でき、さもなければＴＥが、例えば２ヘルパーＲＮＡ系のｐＳＦＶ−ヘルパー−Ｓにおいて実現される、２Ａ自己切断に先行すべきである（Ｓｍｅｒｄｏｕ  ａｎｄ  Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，１０９２−１０９８）。
【０３２３】
ここで本発明者らは、ＴＥを欠く発現レプリコンが、トランスフェクト細胞のインターフェロン（ＩＦＮ）応答を阻害することによって改善され得ることを実証する。本発明者らは、ワクシニアウイルス（ＶａｃＶ）由来のタンパク質、すなわちＥ３Ｌ、Ｂ１８ＲおよびＫ３Ｌ（ＥＫＢ）を共発現させることによってレプリコン発現を改善した。本発明者らは、ＥＢＫが合成ｍＲＮＡ上にコードされ得ることおよび簡単な同時トランスフェクションによってレプリコン発現をトランスで増強できることを初めて示す。本発明者らは、同時トランスフェクトしたＶａｃＶタンパク質がＩＦＮ応答を阻害し、ＰＫＲ活性化を阻止して、それによりレプリコンがコードするタンパク質の翻訳を増大させることを認めた。発現は、ヒトおよびマウス由来の種々の細胞型において増大したが、全体として、増大はマウス細胞におけるよりもヒトにおいてより著明であった。本発明者らは、筋および脾臓への送達後にインビボでＥＢＫ  ＲＮＡによる発現増大を確認した。種々の単一タンパク質の寄与を評価した場合、Ｅ３が発現の主たるエンハンサーとしての役割を果たし、Ｂ１８ＲはＩＦＮ応答を完全にブロックするために不可欠であることを認めた。
【０３２４】
本発明者らは、ＩＦＮ阻害剤の同時導入が、治療的遺伝子送達またはワクチン接種のためのレプリコンに基づくベクターの効果を増強する有望なツールであると結論する。それにより、患者を治療するのに必要なＲＮＡの全体的な量を低減することができ、これはＲＮＡワクチンの有効性と利益性を増大させる。
【０３２５】
９．１  実験材料および方法：
ベクターおよびＲＮＡのインビトロ転写：セムリキ森林ウイルスレプリコンベクター（ｐＳＦＶ−ｇｅｎ−ＧＦＰ）および非細胞傷害性突然変異ベクター（ｐＳＦＶ４（ＰＤ））は、Ｋ．Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１５，８３−９１；Ｅｈｒｅｎｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９６，７０４１−７０４６）の好意により提供された。ｐＳＦＶにコードされるポリＡ尾部を、もとのベクター中の６２アデノシン残基から１２０アデノシン残基に伸長させ、ＳａｐＩ制限部位をポリＡのすぐ下流に位置づけた。このポリＡ設計は最適化合成ｍＲＮＡベクターからコピーされ、翻訳を増強すると記述されている（Ｈｏｌｔｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ  １０８，４００９−４０１７）。本発明者らは、レポーター遺伝子ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をサブゲノムプロモーターの３'側にクローニングした。赤外蛍光タンパク質（ｉＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、Ｅ３Ｌ、Ｂ１８ＲまたはＫ３Ｌ（ＥＢＫ）をコードするｐＳＴ１ベクターをクローニングした。ｐＳＴ１ベクターのインビトロ転写およびＲＮＡの精製は以前に記述されている（Ｈｏｌｔｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ  １０８，４００９−４０１７；Ｋｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１７，９６１−９７１）。ｐＳＦＶベクターを、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ  Ｋｉｔ，Ａｍｂｉｏｎ）を使用してインビトロ転写した。精製ＲＮＡの品質を分光測光法および２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＵＳＡ）での分析によって評価した。
【０３２６】
ＲＮＡ導入：ＲＮＡを、方形波エレクトロポレーション装置（ＢＴＸ  ＥＣＭ  ８３０，Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）により、以下の設定を用いて室温で種々の標的細胞にエレクトロポレートした：ヒト線維芽細胞ＣＣＤ１０７９ＳＫ（５５０  Ｖ／ｃｍ；１２ミリ秒の３パルス）；ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ；６２５Ｖ／ｃｍ、２４ミリ秒の１パルス）；ＢＪ線維芽細胞（５５０Ｖ／ｃｍ、１２ミリ秒の３パルス）；ＲＴ１０１（７５０Ｖ／ｃｍ、１２ミリ秒の１パルス）；Ｃ２Ｃ１２（６００Ｖ／ｃｍ、５ミリ秒の５パルス）；ＢＨＫ２１（７５０Ｖ／ｃｍ、１６ミリ秒の１パルス）；３Ｔ３−Ｌ１（６２５Ｖ／ｃｍ；５ミリ秒の５パルス）；ヒト骨格筋細胞（ｈＳＫＭＣ；７００Ｖ／ｃｍ、１０ミリ秒の１パルス）。エレクトロポレーションのために、ＲＮＡを６２，５μｌ／ｍｍキュベットギャップサイズの最終容量で再懸濁した。連続するパルスの間隔はすべての設定において４００ミリ秒であった。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸを製造者の指示に従って使用して（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ＲＮＡリポフェクションを実施した。細胞を約２００００細胞／ｃｍ２の増殖面積で塗布し、総量２６０ｎｇ／ｃｍ２のＲＮＡおよび１μｌ／ｃｍ２のＲＮＡｉＭＡＸでトランスフェクトした。異なるＲＮＡ種の混合物をＲＮアーゼ不含エッペンドルフチューブ中で調製し（表２および表３に列挙する）、トランスフェクションまで氷上で保存した。３Ｔ３−Ｌ１細胞を除き、トランスフェクションの２４時間後にトランスフェクト細胞を採取して、トランスフェクション効率（ｉＲＦＰ発現によって示す）およびレプリコンまたは合成ｍＲＮＡ発現（ＧＦＰによって示す）をＦＡＣＳによって測定した。３Ｔ３−Ｌ１細胞は、エレクトロポレーション後レプリコン発現によって急速に死滅し、そのためリポフェクションの２４時間後ではなく、エレクトロポレーションの８時間後に採取した。
【０３２７】
細胞：試験で使用した細胞を表１に列挙する。
【表１】
0006353846.tif 000005
【０３２８】
インビボＲＮＡ導入：ルシフェラーゼをコードするレプリコンをＰＢＳに再懸濁し、マウスの前脛骨筋に注入した。ＥＢＫをコードするＩＶＴ  ＲＮＡを図の脚注に示すように同時導入した。インビボルシフェラーゼ発現を記述されているように（Ｋｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１７，９６１−９７１）測定した。
【０３２９】
フローサイトメトリ：ｉＲＦＰまたはＧＦＰをコードするＩＶＴ  ＲＮＡの発現を、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてフローサイトメトリによって測定し、取得したデータを対応するＤｉｖａソフトウェアまたはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）によって解析した。
【０３３０】
ルシフェラーゼアッセイ：ホタルルシフェラーゼの発現を評価するため、１Ｅ４エレクトロポレーション細胞を９６ウェル白色マイクロプレート（Ｎｕｎｃ，Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に塗布した。細胞の直接溶解およびルシフェラーゼ検出を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて製造者の指示に従って実施した。マイクロプレート発光リーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００（Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて生物発光を測定した。データは相対ルシフェラーゼ単位［ＲＬＵ］で表し、ルシフェラーゼ陰性細胞を使用してバックグラウンドシグナルを差し引いた。
【０３３１】
ウェスタンブロット法：ＰＫＲ発現およびリン酸化を細胞溶解物のウェスタンブロットによって検出した。使用した抗体：ホスホＰＫＲ（ａｂ３２０３６；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、ＰＫＲ（ａｂ４５４２７；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）。ヤギ抗ウサギ二次抗体（ｓｃ−２００４；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ，ＵＳＡ）。
【０３３２】
９．２  レプリコン発現の効率は細胞株依存性である
ＢＨＫ２１、ＲＴ１０１およびＣＣＤ１０７９Ｓｋ細胞を、ＧＦＰをコードするレプリコンＲＮＡの段階希釈（図１０に示すように２μｇ〜０，０２μｇ）でリポフェクトした。リポフェクションの成功を観測するため、ｉＲＦＰをコードする固定量のＩＶＴ  ＲＮＡ  ０，５μｇを同時トランスフェクトした。すべての試料中の総ＲＮＡ量を２，５μｇに調整するため、ルシフェラーゼをコードする可変量のＲＮＡを同時トランスフェクトした。
【０３３３】
ＢＨＫ２１細胞およびＲＴ１０１細胞は高度に許容性であり、広範囲のトランスフェクトレプリコンＲＮＡ量にわたって高いレプリコン発現レベルを示すが、ヒト線維芽細胞（ＣＣＤ１０７９ＳＫ）ではレプリコン発現が大きく低下する；図１０参照。
【０３３４】
９．３  同時トランスフェクトしたＩＶＴ−ＲＮＡの発現は非許容性細胞において低下する
図１１に示されている、図１０と同じ実験は、レプリコン段階希釈からの選択した試料におけるｉＲＦＰ発現レベルである。
【０３３５】
ＢＨＫ２１およびＲＴ１０１細胞におけるｉＲＦＰの共発現は、レプリコンの量と逆相関で増大する。これに対し、ＣＣＤ１０７９Ｓｋ細胞ではレプリコンの量と無関係にｉＲＦＰ発現が低下し、非常に低い量のレプリコンでもＰＫＲを強力に活性化することを示す。
【０３３６】
９．４  分泌ＩＦＮはＩＶＴ−ＲＮＡおよびレプリコン発現をブロックし、Ｂ１８Ｒはこのブロックを解除する
ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）を以下のようにエレクトロポレーション（ＥＰ）した：ＲＮＡなし；４０μｇ／ｍｌのルシフェラーゼをコードするレプリコンＲＮＡまたは４０μｇ／ｍｌのＧＦＰをコードするレプリコンＲＮＡおよび４０μｇ／μｌの可溶性ワクシニアウイルス（ＶａｃＶ）ＩＦＮデコイ受容体Ｂ１８ＲをコードするＩＶＴ  ＲＮＡ。エレクトロポレーション後、細胞を３，３Ｅ０４細胞／ｃｍ２で塗布し、１２０μｌ／ｃｍ２培地を添加した。その翌日、細胞の上清（ＳＮ）を採集し、前日に９６ウェルプレートに塗布した（５０００細胞／ウェル）ＨＦＦ細胞に導入した。レプリコンをエレクトロポレーションした細胞からの上清には、２００ｎｇ／ｍｌの組換えＢ１８Ｒ（ｒｅｃ．Ｂ１８Ｒ）をさらに添加した。細胞を上清と共に６時間インキュベートした。その後細胞を、各ウェル当たりＲＮＡｉＭＡＸ  １μｌと共に製剤した、各ウェル当たり（Ａ）ＩＶＴ  ＲＮＡ  ０，２５μｇまたは（Ｂ）ルシフェラーゼをコードするレプリコンＲＮＡ  ０，２５μｇでリポフェクトした。リポフェクションの前には培地を交換しなかった。その翌日ルシフェラーゼ発現を測定した；図１２参照。
【０３３７】
レプリコンでトランスフェクトした細胞の上清は、ルシフェラーゼをコードするＩＶＴ−ＲＮＡおよびレプリコンの発現を阻害した。組換えＢ１８Ｒならびに同時エレクトロポレーションの際に分泌されたＢ１８Ｒはこの阻害に拮抗し、ＩＦＮが上清中の阻害因子であることを証明する。
【０３３８】
９．５  ＩＶＴ−ＲＮＡのエレクトロポレーションはその後に導入されたレプリコンＲＮＡの発現をブロックする。ＶａｃＶタンパク質は発現のブロックを解除する
ヒト包皮線維芽細胞（ＣＣＤ１０７９ＳＫ）を以下のようにエレクトロポレーション（ＥＰ）した：ＲＮＡなし（ＥＰ１）；８０μｇ／ｍｌのルシフェラーゼをコードするＩＶＴ  ＲＮＡ（ＥＰ２）または８０μｇ／ｍｌのワクシニアウイルス（ＶａｃＶ）タンパク質Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒ（ＥＢＫ）をコードするＩＶＴ  ＲＮＡ（ＥＰ３）。エレクトロポレーション後、細胞を６ウェルプレートに各ウェル当たり２Ｅ０５細胞で塗布した。その翌日、細胞を総ＲＮＡ量２，５μｇでリポフェクトした；ＧＦＰをコードするレプリコンＲＮＡ  ０，７５μｇを、指示されているようにルシフェラーゼをコードするＲＮＡまたはＥＢＫをコードするＲＮＡのいずれか１，２５μｇと同時トランスフェクトした。２４時間後にＧＦＰ発現をＦＡＣＳによって測定した；図１３参照。
【０３３９】
ＲＮＡなしでエレクトロポレーションした細胞では、レプリコン発現の低い基線レベルが同時リポフェクトしたＥＢＫによって増大された。ルシフェラーゼをコードするＩＶＴ−ＲＮＡでエレクトロポレーションした細胞はレプリコン発現をブロックし、同時リポフェクトしたＥＢＫはこのブロックを解除することができなかった。ＥＢＫをコードするＩＶＴ−ＲＮＡでエレクトロポレーションした細胞では、レプリコン発現は阻害されなかった。
【０３４０】
これらのデータは、レプリコンＲＮＡがトランスフェクトされる前に活性な抗ウイルス状態にある細胞ではレプリコン発現が低下することを示す。
【０３４１】
９．６  ＩＶＴ−ＲＮＡ上にコードされるＶａｃＶタンパク質はＲＮＡに対するＩＦＮ応答を阻止するが、確立されたＩＦＮ応答には限られた作用しか及ぼさない
ヒト包皮線維芽細胞（ＣＣＤ１０７９ＳＫ）を最初にエレクトロポレートし、次に図１３におけるようにリポフェクトした。ＲＮＡをこれらの細胞から単離し、ＩＦＮ応答マーカーに関してｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した；図１４参照。パネル（Ａ）および（Ｃ）は、リポフェクションの直前を意味する、エレクトロポレーションの翌日のＯＡＳ１およびＩＦＮβ転写産物の誘導を示す。パネル（Ｂ）および（Ｄ）は、エレクトロポレーションおよびその後のリポフェクション後のＯＡＳ１およびＩＦＮβ誘導を示す。
【０３４２】
（Ａ）リポフェクションの時点では、ルシフェラーゼをコードするＲＮＡでエレクトロポレートした細胞においてのみＯＡＳ１が誘導される。（Ｂ）同時リポフェクトしたＥＢＫは、事前にエレクトロポレーションされていない細胞ではレプリコンが誘導するＯＡＳ１の上方調節を阻害する（３本の柱の１番目の群）。しかし、ＥＢＫ同時リポフェクションは、ルシフェラーゼをコードするＩＶＴ−ＲＮＡの事前のエレクトロポレーションによるＯＡＳ１誘導を逆転させない（３本の柱の２番目の群）。レプリコンおよびＥＢＫでエレクトロポレートした細胞は、リポフェクションによるＩＦＮ応答の誘導に対して抵抗性である。全体として、ＯＡＳ１転写産物の上方調節はレプリコン発現のブロックと良好に相関する。（Ｃ）ＩＦＮβ転写産物は両方のＲＮＡエレクトロポレーション試料において上方調節されるが、Ｂ１８Ｒは誘導のレベルを低下させた。（Ｄ）リポフェクトしなかった細胞は、エレクトロポレーションからのＩＦＮβ転写産物を喪失した（４番目の柱）。ＲＮＡなしでエレクトロポレーションしたＩＦＮナイーブ細胞は、ＲＮＡがＥＢＫをコードしない限り、ＲＮＡでリポフェクトした場合にＩＦＮβ転写産物を上方調節する。ＥＢＫリポフェクションは事前のエレクトロポレーションのＩＦＮβ転写産物の誘導を逆転させない（６番目の柱）。これに対し、ＥＢＫエレクトロポレーションは、おそらく分泌されたＢ１８Ｒのおかげで、リポフェクションによるＩＦＮβの上方調節を阻止する。
【０３４３】
９．７  ＶａｃＶタンパク質はヒト細胞においてＩＶＴ−ＲＮＡおよびレプリコンに対するＩＦＮ応答を低減する
ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）およびＣＣＤ１０７９ＳＫ線維芽細胞（ＣＣＤ）を、ｉＲＦＰをコードするＩＶＴ−ＲＮＡ  ０，５μｇと共に、（Ａ）ＩＶＴ  ＲＮＡ    ０，７５μｇまたは（Ｂ）ＧＦＰをコードするレプリコンＲＮＡ  ０，７５μｇでトランスフェクトした。ＶａｃＶタンパク質をコードするＩＶＴ  ＲＮＡ  １，２５μｇを指示されているように（表２参照）同時トランスフェクトし、ＶａｃＶタンパク質の混合物は１：１比であった。ルシフェラーゼをコードするＩＶＴ  ＲＮＡ（Ｌｕｃ）をＩＦＮ応答誘導についての陽性対照として用い、データを標準化するために使用した；図１５参照。
【０３４４】
ＩＶＴ  ＲＮＡに応答したＩＦＮβ誘導は、ＥＫＢの組合せならびにＥ３ＬとＫ３Ｌの組合せによって阻害されたが、Ｂ１８Ｒ単独によっては阻害されなかった。レプリコンＲＮＡに応答したＩＦＮβはすべてのＶａｃＶタンパク質によって阻害されたが、３つすべての組合せが最良であった。ＩＶＴ  ＲＮＡならびにレプリコンＲＮＡに応答したＯＡＳ１およびＯＡＳ２誘導はＥＫＢによって排除された。Ｂ１８Ｒ単独では、レプリコンＲＮＡに応答したＯＡＳ１／２誘導を阻害したが、ＩＶＴ  ＲＮＡに応答したＯＡＳ１／２誘導は阻害しなかった。Ｋ３ＬおよびＥ３Ｌはより有効でなかった。
【０３４５】
Ｂ１８ＲはＩＦＮ応答を完全に排除するのに不可欠である。ＥＢＫの組合せだけがすべてのＩＦＮ応答遺伝子を有効にブロックした。
【０３４６】
９．８  ＶａｃＶタンパク質はマウスおよびヒト細胞株においてエレクトロポレーションされたＩＶＴ  ＲＮＡおよびレプリコンＲＮＡの発現を増強する
マウス３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞、ヒトＣＣＤ１０７９ＳＫ細胞、マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞およびヒト一次ＨＵＶＥＣ細胞を、指示されているようにＶａｃＶタンパク質をコードするＩＶＴ  ＲＮＡと共に、（Ａ）ＩＶＴ  ＲＮＡまたは（Ｂ）ＧＦＰをコードするレプリコンＲＮＡでエレクトロポレートした。エレクトロポレーションの成功を観測するためにｉＲＦＰをコードするＩＶＴ  ＲＮＡをすべての試料に同時トランスフェクトした（トランスフェクション混合物の詳細については表２参照）；図１６参照。
【表２】
0006353846.tif 000006
【０３４７】
（Ａ）本発明者らは、ＥＫＢまたはＥ３および／もしくはＫ３により、マウスおよびヒト線維芽細胞においてＩＶＴ  ＲＮＡに基づくＧＦＰ発現の中等度の増大を認めたが、マウス筋細胞およびヒトＨＵＶＥＣでは影響がなかった。
（Ｂ）レプリコン発現は、試験した４つの細胞すべてにおいてＩＶＴ  ＲＮＡより高い度合いで増大した。ＶａｃＶタンパク質の同時導入は、特にヒト線維芽細胞においてレプリコン発現の増大をもたらし、本発明者らは、マウス線維芽細胞におけるよりも約３倍強力な増大を認めた。Ｅ３はヒト線維芽細胞において主要な役割を果たし、Ｋ３はより弱く発現を増大させる。
【０３４８】
９．９  ＶａｃＶタンパク質はマウスおよびヒト細胞にリポフェクトしたＩＶＴ  ＲＮＡおよびレプリコンＲＮＡの発現を増強する
マウス（３Ｔ３−Ｌ１）およびヒト（ＣＣＤ１０７９ＳＫ）線維芽細胞ならびにマウス（Ｃ２Ｃ１２）およびヒト（ｈＳｋＭＣ）筋芽細胞を、指示されているようにＶａｃＶタンパク質をコードするＩＶＴ  ＲＮＡと共に、（Ａ）ＩＶＴ  ＲＮＡまたは（Ｂ）ＧＦＰをコードするレプリコンＲＮＡでリポフェクトした（詳細については表３参照）。リポフェクションの成功を観測するためにｉＲＦＰをコードするＩＶＴ  ＲＮＡをすべての試料に同時トランスフェクトした（トランスフェクション混合物の詳細については表３参照）；図１７参照。
【表３】
0006353846.tif 000007
【０３４９】
（Ａ）ＩＶＴ  ＲＮＡ発現の増大がすべての細胞で検出され、ＧＦＰは、同時トランスフェクトしたＥ３Ｌ単独またはＫ３Ｌと組み合わせたＥ３ＬおよびＢ１８Ｒの存在下で５倍まで増大した。Ｋ３Ｌ単独は、ヒトＣＣＤ１０７９Ｓｋ細胞ではより有効でなかったが、それでもまだＩＶＴ  ＲＮＡ発現を２倍以上増大させた。Ｂ１８Ｒ単独では影響を及ぼさなかった。
（Ｂ）レプリコン発現は、Ｅ３  ＩＶＴ  ＲＮＡによってヒト線維芽細胞およびヒト筋細胞において増大したが、Ｋ３Ｌはほとんど影響を及ぼさなかった。マウス細胞では、発現は同じく増大したが、その度合いはヒト細胞におけるよりもはるかに低かった。ＣＣＤ１０７９ＳＫ細胞で得られた結果は他のヒト線維芽細胞（ＨＦＦおよびＢＪ細胞）でも確認された。
【０３５０】
全体として、図１６および１７からの結果は、ＶａｃＶタンパク質がマウスとヒト細胞間の種障壁を乗り越えるのに役立ち得ることを示す。
【０３５１】
９．１０  ＶａｃＶタンパク質はマウス筋管におけるレプリコン発現を増強する
マウスＣ２Ｃ１２由来筋管を、ＧＦＰをコードするレプリコンでリポフェクトした。ｉＲＦＰまたはＶａｃＶタンパク質をコードするＩＶＴ ＲＮＡを指示されているように同時トランスフェクトした（詳細については表３参照）；図１８参照。
【０３５２】
ＧＦＰレプリコン単独と比較して、ＶａｃＶタンパク質は、成熟筋管におけるＢ１８Ｒを除き、ＧＦＰ発現を増大させた。
【０３５３】
９．１１  過剰のＶａｃＶ  ＩＶＴ  ＲＮＡはレプリコン発現をさらに増強しない
マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞を、ルシフェラーゼをコードするレプリコンＲＮＡ  ３μｇでエレクトロポレートした。ＶａｃＶタンパク質をコードするＩＶＴ ＲＮＡを、指示されている種々の重量比で同時エレクトロポレーションした；図１９参照。試料の１番目の群ではＥ３、Ｂ１８ＲおよびＫ３（ＥＢＫ）を１：１：１で混合し、２番目の群では１番目の群と同じ量のＥ３を同時エレクトロポレーションしたが、Ｋ３とＢ１８Ｒを除いた。エレクトロポレーションの６時間後にルシフェラーゼ発現を測定し、ＶａｃＶタンパク質なしで得られた発現（１番目の柱；「１：０」）に標準化した。
【０３５４】
ＥＢＫの混合物およびＥ３単独はルシフェラーゼレプリコン発現を増大させたが、高度に過剰のＥＢＫまたはＥ３  ＲＮＡを使用することの利益はなかった。
【０３５５】
９．１２  ＶａｃＶタンパク質はレプリコンＲＮＡ導入時のＰＫＲの自己リン酸化および基質リン酸化を低減する
ヒトＣＣＤ１０７９ＳＫ線維芽細胞を、ｉＲＦＰおよび指示されているＶａｃＶタンパク質をコードするＩＶＴ  ＲＮＡと共に、ＧＦＰをコードするレプリコンＲＮＡで同時エレクトロポレーションした（表２参照）；図２０参照。モックエレクトロポレーション細胞を陰性対照として用いた。ＩＶＴ  ＲＮＡのみおよびＥＢＫ  ＲＮＡと同時エレクトロポレーションしたＩＶＴ  ＲＮＡを、ＩＶＴ  ＲＮＡが媒介するＰＫＲ活性化をレプリコン媒介性ＰＫＲ活性化と比較するための参照試料として使用した。キャップされていないレプリコンを、ＰＫＲ活性化への複製の寄与を示すための対照として用いた。
【０３５６】
レプリコンによって引き起こされるＰＫＲリン酸化は、ＩＶＴ  ＲＮＡによるものよりもはるかに強力である。キャップされていないレプリコンＲＮＡは、非複製ＩＶＴ  ＲＮＡと類似の強さのＰＫＲ自己リン酸化をもたらす。Ｅ３およびＫ３はＰＫＲ自己リン酸化を低減し、Ｂ１８ＲはＰＫＲリン酸化に影響を及ぼさない。
【０３５７】
９．１３  ＶａｃＶタンパク質は非細胞傷害性突然変異レプリコンの効率的な複製を可能にする
親および非細胞傷害性ＰＤベクター（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１５，８３−９１）を、Ｅ３、Ｂ１８ＲおよびＫ３（ＥＢＫ）をコードするまたはコードしないＩＶＴ  ＮＡと共にヒト線維芽細胞にエレクトロポレートした；図２１参照。（Ａ）ルシフェラーゼ発現を指示されている時点で測定し、（Ｂ）ＸＴＴ生存能染色を用いてエレクトロポレーションの２４時間後に細胞の生存能を評価した。生存能を非トランスフェクト試料に標準化した。
【０３５８】
（Ａ）ＥＢＫを添加しなければ、ヒト線維芽細胞における非細胞傷害性ＰＤベクターの発現は低下する。ＥＢＫの添加はＰＤベクター発現の緩やかな増大を誘導し、７２時間後に、２４時間後の親ベクターの発現と同等のレベルに達する。（Ｂ）ＥＢＫの存在下では、トランスフェクト細胞は非常に高い生存能スコアを示した。
【０３５９】
９．１４  ＶａｃＶタンパク質はインビボでレプリコン発現を増強する
ルシフェラーゼをコードするレプリコンＲＮＡ  ２μｇを、Ｅ３、Ｂ１８ＲおよびＫ３（ＥＢＫ）をコードするＩＶＴ  ＲＮＡと共に、指示されている種々の重量比で（レプリコンＲＮＡの１〜６倍のＥＫＢ）Ｂａｌｂ／Ｃマウスの前脛骨筋に同時注入した；図２２参照。ＲＮＡはＰＢＳに再懸濁した。
【０３６０】
３倍および６倍過剰のＥＢＫ  ＲＮＡは、インビボで用量依存的にレプリコン発現を増大させる。
【０３６１】
９．１５  ＶａｃＶタンパク質は脾臓におけるＩＶＴ  ＲＮＡの発現を増大させる
ルシフェラーゼをコードするＩＶＴ  ＲＮＡ  １０μｇをＧＦＰ  ＲＮＡ  ３０μｇまたはＥＢＫ  ＲＮＡ  ３０μｇと共に、脾臓を標的とするリポソームに同時パッケージングした。ルシフェラーゼ発現を４日間にわたって観測した；図２３参照。
【０３６２】
ＥＢＫは時間経過全体にわたって発現を増強した。
【０３６３】
（実施例１０）
ＮＳ３４ＡおよびＩＣＰ３４．５はレプリコン発現を増強する
本発明者らは、ワクシニアウイルスタンパク質Ｅ３、Ｂ１８ＲおよびＫ３（ＥＢＫ）がレプリコン発現、特にサブゲノム転写産物の翻訳を増大させることを示した。本発明者らはさらなるＩＦＮ阻害剤：ＲＩＧ−ＩおよびＭＤＡ５の活性化に拮抗するＣ型肝炎ウイルスＮＳ３４Ａ、ｅＩＦ２αを積極的に脱リン酸化する単純ヘルペスウイルスＩＣＰ３４．５を試験した。
【０３６４】
ヒト線維芽細胞を、ルシフェラーゼ−ＧＦＰ融合物をコードするレプリコンＲＮＡ  １，５μｇおよびインターフェロン阻害剤をコードするｍＲＮＡまたは対照としてｉＲＦＰをコードするｍＲＮＡ  １μｇで同時トランスフェクトした。その翌日、導入遺伝子発現をＦＡＣＳによって測定した；図２４参照。
【０３６５】
（Ａ）ＧＦＰ発現によって決定したトランスフェクト細胞のパーセンテージ。ＮＳ３４ＡはＥＢＫと同程度にトランスフェクション率を上昇させるが、ＩＣＰ３４．５はより強力にトランスフェクション率を上昇させた。（Ｂ）阻害剤なしの試料と比較してトランスフェクション率の倍数増加として表した、Ａと同じデータ。（Ｃ）平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表した、ＧＦＰ翻訳の変化。ＮＳ３４Ａは翻訳を増大させないが、ＩＣＰ３４．４は翻訳を増大させる。これはおそらく、ＮＳ３４ＡがＰＫＲを阻害しないという事実に起因すると考えられる。
【０３６６】
（実施例１１）
ＮＳ３４Ａは合成ｍＲＮＡに対するＩＦＮ応答を阻害し、ＩＣＰ３４．５は低減する
本発明者らは、ワクシニアウイルスタンパク質Ｅ３、Ｂ１８ＲおよびＫ３（ＥＢＫ）が、混合物として使用した場合、ＩＦＮ応答を完全に阻害することを示した。Ｅ３は単独でＩＦＮ応答を低減することができた。ＩＦＮβ標的遺伝子（ＯＡＳ１／２）の誘導に関しては、Ｂ１８Ｒが必要であること、およびＥ３またはＫ３は上方調節を部分的にのみ阻止できることを認めた。ここで、本発明者らはさらなるＩＦＮ阻害剤：ＲＩＧ−ＩおよびＭＤＡ５の活性化に拮抗するＣ型肝炎ウイルスＮＳ３４Ａ、ｅＩＦ２αを積極的に脱リン酸化する単純ヘルペスウイルスＩＣＰ３４．５を試験した。
【０３６７】
ヒト線維芽細胞を、ＩＦＮ応答を誘導するまたは阻止するための合成ｍＲＮＡ混合物５μｇでトランスフェクトした。すべての混合物は、赤外蛍光タンパク質（ｉＲＦＰ）をコードする合成ｍＲＮＡ  ２μｇおよびＩＦＮ阻害剤（図２５に指示されているように）または対照としてルシフェラーゼのいずれかをコードする合成ｍＲＮＡ  ３μｇを含んだ。その翌日、細胞を採取し、溶解して、ｑＲＴ−ＰＣＲのためにＲＮＡを抽出した。ＩＦＮβおよびＯＡＳ１／２の誘導を非トランスフェクト細胞における基線発現に標準化した；図２５参照。
【０３６８】
（Ａ）ＩＦＮβの転写誘導。本発明者らが以前に観察したように、ワクシニアウイルスタンパク質ＥＫＢはＩＦＮβを排除し、Ｅ３はＩＦＮβ誘導を低減した。ＮＳ３４ＡもＥＢＫと同様にＩＦＮβ誘導を排除し、ＩＣＰ３４．５はＥ３と同様にＩＦＮβ誘導を低減した。（Ｂ、Ｃ）ＩＦＮβ標的遺伝子ＯＡＳ１／２の転写誘導。ＥＢＫはＯＡＳ１／２誘導をブロックしたが、Ｅ３単独ではＯＡＳ１／２の上方調節を部分的にしか阻止することができなかった。これは以前に観察されている。Ｅ３と同様に、ＩＣＰ３４．５はＯＡＳ１／２誘導を阻止することができないが、ＮＳ３４Ａは両方のマーカーの誘導を大きく低減した。
【０３６９】
したがって、合成ｍＲＮＡ上にコードされる場合、ＮＳ３４Ａは強力なＩＦＮ阻害剤であり、ＩＣＰ３４．５は強力なＰＫＲ阻害剤である。どちらも、レプリコンまたは合成ｍＲＮＡ遺伝子導入および発現を増強することができる。
【０３７０】
（実施例１２）
Ｒｉｂｏ−ｉＰＳの作製のために必要な最小リポフェクション
非修飾ＥＫＢおよびクラスター３０２／３６７からの成熟ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ混合物と組み合わせた非修飾ＩＶＴ−ＲＮＡを用いた再プログラム化プロトコルの高い効率から、再プログラム化の成功のためには連日リポフェクションが最小限何回必要かという疑問が生じる。
【０３７１】
ＨＦＦ線維芽細胞（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を６ウェルに塗布し（１００，０００細胞／ウェル）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６μｌおよびＩＶＴ−ＲＮＡ  １．４μｇを用いてスキームに示すように１〜６回リポフェクトした；図２６参照（Ａ）。ＩＶＴ−ＲＮＡ混合物は、それにより非修飾ＯＳＫＭＮＬ（１：１：１：１：１：１）０．８μｇと、それぞれＢ１８Ｒ、Ｅ３およびＫ３（ＥＫＢ）０．２μｇならびにｍｉＲＮＡ  ３０２ａ−ｄおよび３６７［各々０．４μＭ］から成るｍｉＲＮＡ混合物０．４μｇで構成された。幹細胞培地（Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ  ｍｅｄｉａ，Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）中でのリポフェクションを製造者の指示に従って実施した。９日目から、コロニー形成が観察され、１１日目に顕微鏡によって代表的な写真を撮影した（Ｂ）。さらなる分析のために、ＳｔａｉｎＡｌｉｖｅ  ＴＲＡ−１−６０抗体（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を使用してコロニーをＥＳ表面マーカーＴＲＡ−１−６０について染色し（Ｃ）、その後細胞をペレット化して、全ＲＮＡを単離し、ヒトＥＳマーカーＯＣＴ４（内因性）、ＮＡＮＯＧ（内因性）、ＬＩＮ２８（内因性）、ＴＥＲＴおよびＲＥＸ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した（Ｄ）。
【０３７２】
（Ｂ）３回の連日トランスフェクションが数個のコロニーを得るために必要であるが、４回の連日トランスフェクションはコロニー形成の堅固な誘導に十分であることが明らかになった。コロニーは９日目から可視になり、１１日目には十分に増殖して、ＴＲＡ−１−６０について陽性に染色することができた（Ｃ）。いくつかの多能性マーカーの発現レベルの分析は、コロニー形成と一致して、ＥＳマーカー遺伝子の誘導が３回以上のリポフェクションで達成できることを明らかにした。それにもかかわらず、ＥＳマーカー発現の堅固な誘導は４回以上のリポフェクションで達成された。ＥＳマーカー遺伝子の発現は４回を超えるリポフェクションによってさらに増強されなかったことに言及しておかねばならない（Ｄ）。
【０３７３】
非修飾ＥＫＢおよびクラスター３０２／３６７からの成熟ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ混合物と組み合わせた非修飾ＩＶＴ−ＲＮＡを用いた再プログラム化プロトコルは、４回の連日リポフェクションに短縮して、ヒトＥＳマーカー遺伝子およびＥＳ表面マーカーＴＲＡ−１−６０の高い誘導を伴うＲｉｂｏ−ｉＰＳ作製の堅固な誘導をもたらすことができる。Ｒｉｂｏ−ｉＰＳコロニーの形成のために必要な連日リポフェクションの最小数は３と決定することができた。
【図１】
0006353846.tif 000008
【図２Ａ】
0006353846.tif 000009
【図２Ｂ】
0006353846.tif 000010
【図２Ｃ】
0006353846.tif 000011
【図２Ｄ】
0006353846.tif 000012
【図２Ｅ】
0006353846.tif 000013
【図３Ａ】
0006353846.tif 000014
【図３Ｂ】
0006353846.tif 000015
【図３Ｃ】
0006353846.tif 000016
【図４】
0006353846.tif 000017
【図５】
0006353846.tif 000018
【図６Ａ】
0006353846.tif 000019
【図６Ｂ】
0006353846.tif 000020
【図６Ｃ】
0006353846.tif 000021
【図６Ｄ】
0006353846.tif 000022
【図７Ａ】
0006353846.tif 000023
【図７Ｂ】
0006353846.tif 000024
【図７Ｃ】
0006353846.tif 000025
【図７Ｄ】
0006353846.tif 000026
【図８】
0006353846.tif 000027
【図９】
0006353846.tif 000028
【図１０】
0006353846.tif 000029
【図１１】
0006353846.tif 000030
【図１２】
0006353846.tif 000031
【図１３】
0006353846.tif 000032
【図１４】
0006353846.tif 000033
【図１５】
0006353846.tif 000034
【図１６】
0006353846.tif 000035
【図１７】
0006353846.tif 000036
【図１８】
0006353846.tif 000037
【図１９】
0006353846.tif 000038
【図２０】
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【図２１】
0006353846.tif 000040
【図２２】
0006353846.tif 000041
【図２３】
0006353846.tif 000042
【図２４】
0006353846.tif 000043
【図２５】
0006353846.tif 000044
【図２６Ａ】
0006353846.tif 000045
【図２６Ｂ】
0006353846.tif 000046
【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【配列表】
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