(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイズが５０ｋＤａ以下の硫酸化ポリアニオン性多糖及び非硫酸化ポリアニオン性多糖を含むアオサ属緑藻種の抽出物を含む、神経障害、うつ病、ストレス、不安、神経因性の慢性疼痛、炎症性の慢性疼痛、皮膚の疼痛、皮下組織及び関連する臓器の疼痛、又は身体疼痛の予防及び／又は治療において使用するための医薬又は食品組成物。
【請求項２】
前記硫酸化ポリアニオン性多糖及び非硫酸化ポリアニオン性多糖が、マンノース及びアラビノースのうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の医薬又は食品組成物。
【請求項３】
前記硫酸化ポリアニオン性多糖及び非硫酸化ポリアニオン性多糖が、前記アオサ属緑藻種抽出物の総乾燥材料の重量に対し０．００５重量％以上のマンノース及び０．００５重量％以上のアラビノースのうちの少なくとも１つを含む、請求項２に記載の医薬又は食品組成物。
【請求項４】
前記硫酸化ポリアニオン性多糖及び非硫酸化ポリアニオン性多糖が、前記アオサ属緑藻種抽出物の総乾燥材料の重量に対し０．０１〜０．２０重量％のマンノース及び０．０１〜０．５重量％のアラビノースを含む、請求項３に記載の医薬又は食品組成物。
【請求項５】
前記硫酸化ポリアニオン性多糖及び非硫酸化ポリアニオン性多糖が、
・ガラクトース；
・グルコース；
・ラムノース；
・キシロース；及び
・グルクロン酸
を更に含む、請求項１〜請求項４のうちいずれか一項に記載の医薬又は食品組成物。
【請求項６】
前記硫酸化ポリアニオン性多糖及び非硫酸化ポリアニオン性多糖が、前記アオサ属緑藻種抽出物の総乾燥材料の重量に対し
・０．０５〜０．５重量％のガラクトース；
・０．００５〜０．０５重量％のグルコース；
・２〜１５重量％のラムノース；
・０．１〜１重量％のキシロース；及び
・１〜７重量％のグルクロン酸；
を含む、請求項５に記載の医薬又は食品組成物。
【請求項７】
前記硫酸化ポリアニオン性多糖及び非硫酸化ポリアニオン性多糖のサイズが１５ｋＤａ以下である、請求項１〜請求項６のうちいずれか一項に記載の医薬又は食品組成物。
【請求項８】
前記アオサ属緑藻種抽出物が、前記アオサ属緑藻種抽出物の総乾燥材料に対し、
・１０〜５０重量％の炭素；
・１〜１０重量％の水素；
・１〜５重量％の窒素；
・２０〜５０重量％の酸素；及び
・１〜１５重量％の硫黄；
を含む、請求項１〜請求項７のうちいずれか一項に記載の医薬又は食品組成物。
【請求項９】
前記アオサ属緑藻種抽出物が、前記アオサ属緑藻種抽出物の総乾燥材料に対し、
・１５〜３０重量％の炭素；
・３〜６重量％の水素；
・１〜３重量％の窒素；
・２５〜４０重量％の酸素；及び
・２．５〜１０重量％の硫黄；
を含む、請求項１〜請求項８のうちいずれか一項に記載の医薬又は食品組成物。
【請求項１０】
前記神経障害がアルツハイマー病である、請求項１〜請求項９のうちいずれか一項に記載の医薬又は食品組成物。
【請求項１１】
以下のステップ（ａ）〜（ｆ）を含む、請求項１〜請求項１０のうちいずれか一項に記載の医薬又は食品組成物の製造方法：
（ａ）前記アオサ属緑藻種を洗浄して砂を取り除くこと；
（ｂ）前記アオサ属緑藻種を破砕して破砕生成物を調製すること；
（ｃ）前記破砕生成物の固相をその液相から分離すること；
（ｄ）前記液相を清澄化すること；
（ｅ）前記ステップ（ｄ）で得られた絞り汁を、５０ｋＤａ未満のメンブレンで限外ろ過すること；及び
（ｆ）前記ステップ（ｅ）で得られたろ過後の絞り汁を濃縮した後乾燥させること。
【請求項１２】
前記製造方法におけるステップ（ｄ）で得られた絞り汁が１５ｋＤａのメンブレンで限外ろ過される、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記製造方法におけるステップ（ｃ）が、前記ステップ（ｂ）で得られた破砕生成物を圧搾することによりなされる、請求項１１又は請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）が（ａ１）前記アオサ属緑藻種を真水で洗浄して砂を除くことを含む；
ステップ（ｂ）が（ｂ１）リファイナーを用いて前記アオサ属緑藻種を破砕して破砕生成物を調製することを含む；
ステップ（ｃ）が（ｃ１）ベルトプレスを用いて前記破砕生成物を圧搾することにより前記破砕生成物の固相をその液相から分離することを含む；
ステップ（ｄ）が（ｄ１）ディスクスタックを備えた清澄器を用いて前記液相を清澄化することを含む；
ステップ（ｅ）が（ｅ１）前記ステップ（ｄ）で得られた絞り汁を１５ｋＤａセラミックメンブレンで限外ろ過することを含む；及び
ステップ（ｆ）が（ｆ１）前記ステップ（ｅ）で得られたろ過後の絞り汁を蒸発により濃縮した後、凍結乾燥又は微粒化により乾燥させることを含む、
のうち少なくとも１つを満たす、
請求項１１〜請求項１３のうちいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記神経障害がアルツハイマー病である、請求項１１〜請求項１４のうちいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１６】
サイズが５０ｋＤａ以下の硫酸化ポリアニオン性多糖及び非硫酸化ポリアニオン性多糖を含むアオサ属緑藻種の抽出物並びに少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む、神経障害、うつ病、ストレス、不安、神経因性の慢性疼痛、炎症性の慢性疼痛、皮膚の疼痛、皮下組織及び関連する臓器の疼痛、又は身体疼痛の予防及び／又は治療において使用するための医薬組成物。
【請求項１７】
前記神経障害がアルツハイマー病である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硫酸化されたポリアニオン性多糖及び硫酸化されていないポリアニオン性多糖を含む藻類抽出物、藻類抽出物の製造方法、並びにその治療的及び予防的適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アオサ属（Ｕｌｖａ）の種（アオサ目、緑藻植物門）は、潮間又は前浜領域に見られる豊富な藻類である。これらは、固い基質にコロニーを形成し、付着器により固定されるが、自由に漂流する生活形態を生じる種もある。アオサ属の藻類は、成長の速い藻類であり、栄養素の場所及び吸収に関して日和見性である。ウォーターカラムにおけるこれらの増殖は、アオサ属の種（Ｕｌｖａ  ｓｐ．）が青潮の形態で増殖する富栄養化した沿岸水域及びラグーンにおいて特に観察される（Fletcher, 1996）。しばしば、これにより大量生成及び岸への大量打ち上げが生じ、それらが蓄積すると有害なガスが生成する（Morand and Briand, 1996）今まで、このバイオマスはほとんど付加価値がなく、コンポスト（Maze et al. 1993, Cuomo et al. 1995）、メタン生成（Briand and Morand, 1997）、人の食物消費（Perez, 1997）、又は紙の主成分（Nicolucci and Monegato 1993）以外にこれを利用する手段があれば、それらの特異的性質を最大限に活用する可能性がもたらされ得る。
【０００３】
現在、緑藻類の利用は本質的に、望ましくないと考えられているこれらの藻類を除去するための新規な道を開く可能性をもたらす利用に基づいている。考えられている応用ルートは、バイオガス（Briand & Morand 1997、Morand & Briand 1999、Morand et al., 2006）、生体材料（バイオプラスチック）（Chiellini et al., 2008）、生分解性カップ（Sassi et al., 2008）、パッケージングのための紙及び厚紙（Nicolucci & Monegata et al., 1993）、荷電ナノコンポジット（Demais et al., 2006a、2006b）、動物栄養：動物用の解毒食品（Demais et al., 2006）、養魚のためのタンパク質及び摂餌促進物質（ａｐｐｅｔｅｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒ）（DeBose et al., 2008、Kut Guroy et al., 2007）、並びに化粧品（界面活性剤）（Ranson et al., 2008）の製造に関係する。
【０００４】
これらの藻類に含まれる多糖の化学的及び物理化学的特性のため、これらは、ヒト及び動物による消費、医薬、化学、養魚、並びに農業の分野における新規な機能的且つ生物学的活性高分子として魅力的な候補である（Robic A, et al. Carbohydrate Polymers 77 (2009) 206-216; Lahaye M Robic A, Biomacromolecules Vol 8 No. 6, 2007）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
これらの態様の１つでは、本発明は、サイズが５０ｋＤａ以下の硫酸化ポリアニオン性多糖及び非硫酸化ポリアニオン性多糖を含む、アオサ目の藻類からの抽出物、特にアオサ属型緑藻類（ｇｒｅｅｎ  ａｌｇａｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｌｖａ  ｔｙｐｅ）からの抽出物に関する。
【０００６】
以下に図面及び実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明に係る藻類抽出部（ＡＥ）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２】２つのＳｈｏｄｅｘ  ８０２及び８０３カラムを用いて分離された本発明に係る藻類抽出物で得られたクロマトグラムを示す図である。
【図３】ガスクロマトグラフィーによる本発明に係る藻類抽出物のサンプルのトリメチルシリル化誘導体の分析後に得られたクロマトグラムを示す図である。Ａｌａ：アラビノース；Ｇａｌ：ガラクトース；Ｇｌｃ：グルコース；Ｘｙｌ：キシロース；Ｍａｎ：マンノース；Ｒｈａ：ラムノース、ＧｌｃＡ：グルクロン酸。
【図４】高架式十字迷路テストにおけるオープンアームへの進入回数へのＡＥの効果を示す図である。
【図５】高架式十字迷路テストにおいてオープンアームで過ごす時間へのＡＥの効果を示す図である。
【図６】嫌悪光刺激を回避するための学習テストにおいて両方のレバーを押す行為の累積総数へのＡＥの効果を示す図である（嫌悪光刺激回避反応：ＡＬＳＡＲ）。
【図７】ＡＬＳＡＲテストで５分の時点における有効レバー（ａｃｔｉｖｅ  ｌｅｖｅｒ：ＬＡ）及び無効レバー（ｉｎａｃｔｉｖｅ  ｌｅｖｅｒ：ＬＩ）を押す行為の総数へのＡＥの効果を示す図である。
【図８】ＡＬＳＡＲテストで１０分の時点で有効レバー（ＬＡ）及び無効レバー（ＬＩ）を押す行為の総数へのＡＥの効果を示す図である。
【図９】ＡＬＳＡＲテストで１５分の時点で有効レバー（ＬＡ）及び無効レバー（ＬＩ）を押す行為の総数へのＡＥの効果を示す図である。
【図１０】ＡＬＳＡＲテストで２０分の時点で有効レバー（ＬＡ）及び無効レバー（ＬＩ）を押す行為の総数へのＡＥの効果を示す図である。
【図１１】１４日目（Ｄ１４）の行動的絶望（ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ  ｄｅｓｐａｉｒ）のプレテストにおける無動時間へのＡＥの効果を示す図である（秒、平均値±平均値の標準誤差（ＳＭＥ））。
【図１２】１５日目（Ｄ１５）の行動的絶望テストにおける無動時間へのＡＥの効果を示す図である（秒、平均値±ＳＭＥ）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
具体的なケースでは、前記本発明に係る藻類抽出物の多糖は、マンノース及び／又はアラビノースを含む。より具体的なケースでは、前記多糖は、藻類抽出物の総乾燥材料の重量に対し少なくとも０．００５重量％のマンノース及び／又は少なくとも０．００５重量％のアラビノース、特に少なくとも０．０１重量％のマンノース及び／又は少なくとも０．０１重量％のアラビノースを含む。さらに具体的なケースでは、前記多糖は、藻類抽出物の総乾燥材料の重量に対し０．０１〜０．２０重量％のマンノース及び０．０１〜０．５重量％のアラビノース、特に、０．０３〜０．１５重量％のマンノース及び０．０１〜０．２重量％のアラビノースを含む。
【０００９】
具体的なケースでは、前記多糖は、
・ガラクトース；
・グルコース；
・ラムノース；
・キシロース；及び
・グルクロン酸
を更に含む。
【００１０】
より具体的なケースでは、前記多糖は、藻類抽出物の総乾燥材料の重量に対し、
・０．０５〜０．５重量％のガラクトース、特に０．１〜０．４重量％；
・０．００５〜０．０５重量％のグルコース、特に０．０１〜０．０３重量％；
・２〜１５重量％のラムノース、特に５〜１０重量％；
・０．１〜１重量％のキシロース、特に０．３〜０．７重量％；及び
・１〜７重量％のグルクロン酸、特に１〜５重量％；
を含む。
【００１１】
したがって、例えば、
・マンノース；
・アラビノース；
・ガラクトース；
・グルコース；
・ラムノース；
・キシロース；及び
・グルクロン酸
を含む本発明に係る藻類抽出物を挙げることができる。
【００１２】
より具体的なケースでは、例えば、藻類抽出物の総乾燥材料の重量に対し、
・０．０１〜０．２０重量％のマンノース、特に０．０３〜０．１５重量％；
・０．０１〜０．５重量％アラビノース、特に０．０１〜０．２重量％；
・０．０５〜０．５重量％ガラクトース、特に０．１〜０．４重量％；
・０．００５〜０．０５重量％のグルコース、特に０．０１〜０．０３重量％；
・２〜１５重量％のラムノース、特に５〜１０重量％；
・０．１〜１重量％のキシロース、特に０．３〜０．７重量％；及び
・１〜７重量％のグルクロン酸、特に１〜５重量％；
を含む本発明に係る藻類抽出物を挙げることができる。
【００１３】
さらに具体的なケースでは、例えば、藻類抽出物の総乾燥材料の重量に対し、
・０．０９重量％のマンノース；
・０．１重量％のアラビノース；
・０．３重量％のガラクトース；
・０．０２重量％のグルコース；
・８．１重量％のラムノース；
・０．５重量％のキシロース；及び
・２．６重量％のグルクロン酸；
を含む本発明に係る藻類抽出物を挙げることができる。
【００１４】
より具体的なケースでは、本発明に係る藻類抽出物は、サイズが４０、３０、２０、又は１５ｋＤａ未満の硫酸化ポリアニオン性多糖及び非硫酸化ポリアニオン性多糖を含む。さらに具体的なケースでは、本発明に係る藻類抽出物の硫酸化ポリアニオン性多糖及び非硫酸化ポリアニオン性多糖のサイズは１５ｋＤａ以下である。
【００１５】
ダルトン（Ｄａ）は、複数の同位体（どの炭素原子もそうであるように６個の陽子に加えて、６及び７個の中性子をそれぞれ有する、主に炭素１２及び炭素１３）の混合物から推定される質量である炭素１２原子の質量の１２分の１に等しいとして定義される質量単位である。１ダルトンは、非常に良い精度で、水素の質量であり、正確な値は１．００７９４ａｍｕ（原子質量単位）である。キロダルトン（ｋＤａ）は１，０００Ｄａに等しい。
【００１６】
本発明の範囲内で、ｋＤａで言及される質量は、当業者に通常使用される任意の方法によって決定され、具体的なケースでは本発明に係る藻類抽出物の硫酸化ポリアニオン性多糖及び非硫酸化ポリアニオン性多糖の質量は、所定のサイズの分子のみを通過させるメンブレンを用いた限外ろ過により区別され得る。
【００１７】
「アオサ属型緑藻類」とは、アオサ目アオサ科アオサ属に分類される緑藻類を意味する。特に以下の種及び亜種を挙げることができる：Ulva acanthophora、Ulva anandii、Ulva angusta、Ulva arasakii、Ulva armoricana、Ulva atroviridis、Ulva attenuata、Ulva beytensis、Ulva bifrons、Ulva brevistipitata、Ulva bulbosa、Ulva burmanica、Ulva byssoides、Ulva californica、Ulva chaetomorphoides、Ulva clathrata、Ulva coccinea、Ulva compressa、Ulva conglobata、Ulva cornucopiae、Ulva cornuta、Ulva covelongensis、Ulva crassa、Ulva crassimembrana、Ulva curvata、Ulva dactylifera、Ulva denticulata、Ulva elegans、Ulva elminthoides、Ulva enteromorpha、Ulva erecta、Ulva expansa、Ulva fasciata、Ulva fenestrata、Ulva flexuosa、Ulva gelatinosa、Ulva geminoidea、Ulva gigantea、Ulva grandis、Ulva hendayensis、Ulva hookeriana、Ulva hopkirkii、Ulva indica、Ulva intestinalis、Ulva intestinaloides、Ulva intricata、Ulva intybacea、Ulva javanica、Ulva kylinii、Ulva lactuca、Ulva lactucaefolia、Ulva laetevirens、Ulva laingii、Ulva linearis、Ulva lingulata、Ulva linkiana、Ulva linza、Ulva lippii、Ulva litoralis、Ulva littorea、Ulva lobata、Ulva lubrica、Ulva marginata、Ulva micrococca、Ulva myriotrema、Ulva neapolitana、Ulva nematoidea、Ulva ohnoi、Ulva olivacea、Ulva olivaceum、Ulva pacifica、Ulva papenfussii、Ulva paradoxa、Ulva parva、Ulva parvula、Ulva patengensis、Ulva percursa、Ulva pertusa、Ulva phyllosa、Ulva popenguinensis、Ulva porrifolia、Ulva procera、Ulva profunda、Ulva prolifera、Ulva pseudocurvata、Ulva pseudolinza、Ulva pulchra、Ulva purpurascens、Ulva quilonensis、Ulva radiata、Ulva ralfsii、Ulva ranunculata、Ulva reticulata、Ulva rhacodes、Ulva rigida、Ulva rotundata、Ulva rubens、Ulva saifullahii、Ulva scagelii、Ulva scandinavica、Ulva sericea、Ulva serrata、Ulva simplex、Ulva sorensenii、Ulva spinulosa、Ulva stenophylla、Ulva stipitata、Ulva sublittoralis、Ulva subulata、Ulva taeniata、Ulva tenera、Ulva tetragona、Ulva torta、Ulva tuberosa、Ulva umbilicata、Ulva uncialis、Ulva uncinata、Ulva usneoides、Ulva utricularis、Ulva utriculosa、Ulva uvoides、Ulva ventricosa。
【００１８】
より具体的なケースでは、本発明に係る藻類抽出物は、Ulva armoricana種の藻類からの抽出物である。
【００１９】
本発明の一実施形態では、藻類抽出物は、藻類抽出物の総乾燥材料に対し、
・１０〜５０重量％の炭素；
・１〜１０重量％の水素；
・１〜５重量％の窒素；
・２０〜５０重量％の酸素；及び
・１〜１５重量％の硫黄；
を含む。
【００２０】
さらに具体的なケースでは、藻類抽出物は、藻類抽出物の総乾燥材料に対し、
・１５〜３０重量％の炭素；
・３〜６重量％の水素；
・１〜３重量％の窒素；
・２５〜４０重量％の酸素；及び
・２．５〜１０重量％の硫黄；
を含む。
【００２１】
抽出物の乾燥材料中に存在するその他の化学元素は、特に代表的なものとしてはミネラル（Ｃａ、Ｋ、Ｎａ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｃｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆｅ等）などがある。
【００２２】
より具体的なケースでは、本発明に係る藻類抽出物は、図１に示す１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを特徴とする。
【００２３】
この１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、インバースＴＣＩ低温プローブ５ｍｍ  １Ｈ／１３Ｃ／１５Ｎを備えたブルカー社製Ａｖａｎｃｅ  ５００スペクトロメーターを用いて２９８Ｋで記録された。分析の前に、サンプルを９９．９７％のＤ２Ｏ原子に溶解した。化学シフトは、外部標準（トリメチルシリルプロピオン酸）と比較してｐｐｍで表される。ＨＯＤシグナルは抑制されなかった。
【００２４】
これらの態様の別の態様では、本発明は、アオサ目の海藻からの抽出物、特にアオサ属型緑藻類からの抽出物の製造方法であって、
（ａ）藻類を洗浄して砂を取り除き；
（ｂ）前記藻類を破砕し；
（ｃ）破砕生成物の固相を液相から分離し；
（ｄ）前記液相を清澄化し；
（ｅ）ステップ（ｄ）で得られた絞り汁を限外ろ過し；
（ｆ）（ｅ）で得られたろ過後の絞り汁を濃縮した後乾燥する、
方法に関する。
【００２５】
本発明に係る方法の一実施形態では、藻類は真水で洗浄される。
【００２６】
砂は、当業者に利用可能な任意の手段でそれらから除去され得る。
【００２７】
次いで、前記藻類は粉砕される。特にミリングマシン、例えばリファイナー又はカッターを用いて粉砕される。
【００２８】
その後、遠心により、又は例えばベルト若しくはプレートプレスを用いて粉砕生成物を圧搾することにより、粉砕生成物の固相（搾りかす）をその液相（絞り汁）から分離する。
【００２９】
「絞り汁」とは、藻類の細胞の二重構造の壁構造を含む細胞質液を意味する。
【００３０】
次いで、得られた液相を、例えばディスクスタックを備えた清澄器を用いて、又は遠心、デカンテーション、若しくは（例えば、ポケット又はプレートを用いた）ろ過により、清澄化する。
【００３１】
次いで、得られた絞り汁を限外ろ過する。
【００３２】
本発明に係る方法の一実施形態では、限外ろ過は、５０ｋＤａ未満のメンブレン、特に４０、３０、２０、又は１５ｋＤａのメンブレンを用いて行われる。より具体的なケースでは、メンブレンは１５ｋＤａのメンブレンである。
【００３３】
このメンブレンは、例えば、セラミックメンブレン又は有機メンブレンであり得る。より具体的なケースでは、メンブレンはセラミックメンブレンである。
【００３４】
次いで、得られたろ過後の絞り汁は、例えば逆浸透法、蒸発、又は沈殿により、濃縮され得、その後、例えば凍結乾燥又は微粒化（ａｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ）により乾燥され得る。
【００３５】
任意に、得られた抽出物はその後、粒度の均一な粉末を得るために、再度破砕され得る。
【００３６】
これらの態様の１つでは、本発明に係る方法の一部は室温で行われる。室温とは、５〜２５℃の間の温度を意味する。
【００３７】
これらの態様の別の態様では、本発明に係る方法の一部は、微生物の増殖を防ぐために、４〜１０℃の間の温度で行われる。
【００３８】
この方法は、藻類抽出物の沈殿を含むステップがないので、先行技術に記載されているほとんどの方法と異なる。これは、溶媒、具体的なケースでは有機溶媒を使用しないことでも以前の抽出法とは区別され、このことは環境上の観点から大きな利点である。
【００３９】
これらの態様のうちの別の態様では、本発明は、上記に記載の方法により得ることができる藻類抽出物に関する。
【００４０】
これらの態様の別の態様では、本発明は、前述の方法により得ることができる上記で定義される藻類抽出物に関する。
【００４１】
これらの態様の１つでは、本発明は更に、前述の藻類抽出物及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００４２】
これらの態様の１つでは、本発明は更に、薬物として使用するための前述の藻類抽出物に関する。
【００４３】
これらの態様の１つでは、本発明は更に、神経障害、うつ病、ストレス、不安の予防及び／又は治療において使用するため、特に加齢又はアルツハイマー病の予防及び／又は治療において記憶の改善を可能にする薬剤として使用するため、神経因性及び炎症性の慢性疼痛、（皮膚、皮下組織、及び関連する臓器の）皮膚の疼痛、又は身体疼痛の予防及び／又は治療において使用するための前述の藻類抽出物に関する。
【００４４】
これらの態様のもう１つの態様では、本発明は更に、前述の藻類抽出物の薬物としての使用に関する。
【００４５】
これらの態様の１つでは、本発明は更に、神経障害、うつ病、ストレス、不安の予防及び／又は治療において使用するため、特に加齢又はアルツハイマー病の予防及び／又は治療において記憶の改善を可能にする薬剤として使用するため、神経因性及び炎症性の慢性疼痛、（皮膚、皮下組織、及び関連する臓器の）皮膚の疼痛、又は身体疼痛の予防及び／又は治療において使用するための前述の藻類抽出物の使用に関する。
【００４６】
「神経障害」とは、神経系の疾患、具体的なケースでは脳の疾患を意味する。これらの疾患のうち、特に、パーキンソン病、多発性硬化症、アルツハイマー病、認知症、片頭痛、頭痛等の脳病理を挙げることができる。
【００４７】
「うつ病」とは、個体において意欲又は生命力（ｖｉｔａｌ  ｍｏｍｅｎｔｕｍ）の低下した状態を基本的な特徴とする気分障害であり、他の症状に関連することもあり、関連しないこともある。最も特徴的な症状は、希望、願望、自尊心の低下である。その他の兆候、例えば疲労、悲嘆、否定的思考、暗い思考、自殺願望、不安、若しくは恐怖、又は特定の非常に珍しいケースでは幻覚が起こり得る。
【００４８】
このうつ病という用語は、「反復性うつ病性障害」、「神経衰弱」、「臨床的うつ病」、「単極性うつ病」、「大うつ病の特徴付けられたエピソード（ｍａｊｏｒ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｅｐｉｓｏｄｅ）」、又は更に「抑うつ症候群」の名称でも知られる。「うつ病（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎｓ）」という用語は、全ての種類のうつ病を指す。「うつ病性（ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｉｔｙ）」又は「抑うつ感情（ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｆｅｅｌｉｎｇ）」という用語も使用される。一般的な言葉では「気分の落ち込み（ｆｅｅｌｉｎｇ  ｌｏｗ）」ともいい、これは同様な症状を示すが、より軽いものである。
【００４９】
「ストレス」とは、その環境からのプレッシャー又は束縛に対する生物対象の反応の全体を意味する。これらの反応は常に、その個体の、感じるプレッシャーの受け止め方に依存する。これは、生理的及び心因性反応を生じさせる複雑な一連のイベントである。
【００５０】
「不安」とは、肉体的、感情的、認知的、及び行動的要素を特徴とする心理的及び生理的状態を意味する。心理ストレスがある場合又はない場合において、不安は、恐怖、落着きのなさ、困難、及び心配の感情を生じさせ得る。不安は、ストレスを与える状況において正常な反応と考えられている。不安が過剰になると、「不安障害」という名称のもとに分類され得る。
【００５１】
したがって、本発明に係る藻類抽出物は、例えば家畜及びペットのストレスを予防及び／若しくは治療するため、又は家畜若しくはペット用の抗うつ剤としてなど、獣医学適用において使用することができる。また例えばストレス、不安、うつ病に関連する障害を予防及び／又は治療するため、並びに特に学生において、加齢と戦うため、又はアルツハイマー病の治療の一環で、記憶の改善を可能にする薬剤として、ヒトへの適用にも用いることができる。
【００５２】
薬学的に許容される賦形剤は、医薬品の形態及び所望の投与経路に応じて、当業者に公知の通常の賦形剤から選択される。
【００５３】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、局所（ｌｏｃａｌ）、気管内、鼻腔内、経皮、又は直腸投与用の本発明の医薬組成物の場合、上記で定義した藻類抽出物は、前述の障害を予防又は治療するために従来の医薬賦形剤と混合して、単位用量として動物及びヒトに投与され得る。
【００５４】
好適な投与形態は、経口形態、例えば錠剤、軟若しくは硬ゼラチンカプセル剤、散剤、顆粒剤、又は経口用の液剤若しくは懸濁剤、舌下、バッカル、気管内、眼内、吸入による鼻腔内投与形態、局所、非経口、例えば経皮、皮下、筋肉内、又は静脈内投与形態、直腸投与形態、及びインプラントを含む。局所投与では、本発明に係る化合物はクリーム剤、ゲル剤、軟膏剤、又はローション剤中で使用され得る。
【００５５】
錠剤等の固体組成物が調製される場合、主要活性成分は、医薬的キャリア、例えばゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、タルカム、アラビアゴム等と混合され得る。
【００５６】
錠剤は更に、ショ糖、セルロース誘導体、又はその他の好適な材料でコーティングされてよく、あるいは更に、長期又は遅延型の活性を有して所定の量の活性成分を連続的に放出するように処理されてもよい。
【００５７】
ゼラチンカプセルとしての製剤は、例えば、活性成分と希釈剤を混合することにより及び得られた混合物を軟又は硬ゼラチンカプセル中に注ぐことにより得ることができる。
【００５８】
本発明に係る藻類抽出物を含む医薬組成物は、液体形態、例えば液剤、乳剤、懸濁剤、又はシロップ剤として、及び特に例えば経口又は鼻腔内投与のための好適な形態であってもよい。好適な液体担体（ｌｉｑｕｉｅｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）は、例えば水、グリセロール又はグリコールなどの有機溶媒、及び水中に様々な比率で含まれるそれらの混合物であり得る。
【００５９】
シロップ剤又はエリクシル剤としての、又はドロップ形態で投与するための製剤は更に、例えばカロリーのない（ａｃａｌｏｒｉｃ）甘味剤、メチルパラベン又はプロピルパラベンなどの防腐剤、味の付与剤、及び好適な着色剤と共に活性性分を含んでもよい。
【００６０】
水に分散性の散剤又は顆粒剤は、例えば、分散剤若しくは湿潤剤、懸濁剤、例えばポリビニルピロリドンを含んでもよく、更に甘味剤、若しくは矯味剤と混合された活性成分を含んでもよい。
【００６１】
ヒトにおいて１日に投与される用量は、１又は複数回の摂取で、０．５〜２５ｍｇ／ｋｇ、具体的なケースでは１．５〜１８ｍｇ／ｋｇ、さらに具体的なケースでは３〜１５ｍｇ／ｋｇとなる量でよい。動物における１日投与用量は、１又は複数回の摂取で、５〜１５０ｍｇ／ｋｇ、具体的なケースでは１０〜１００ｍｇ／ｋｇ、さらに具体的なケースでは２０〜８０ｍｇ／ｋｇとなる量でよい。一般的に、本発明に係る藻類抽出物の１日用量は、治療効果を生じさせることができる藻類抽出物の最小有効量である。
【００６２】
「有効量」とは、治療対象の疾患又は障害の特徴的パラメーターの１又は複数を改善する組成物の任意の量を意味する。
【００６３】
より高い又は低い投与量が好ましい特定のケースもあり得、そのような投与量は本発明の範囲から逸脱しない。通例では、各患者（ヒト又は動物）の好適な投与量は、投与経路、前記患者の体重及び反応に応じて医師又は獣医によって決定される。
【００６４】
その態様の別の態様では、本発明に係る藻類抽出物は、食物組成物中で、前述の病理を予防及び／又は治療するために用いられ得る。
【００６５】
「食物組成物」とは、例えば、任意の種類の機能性食品、ヨーグルト又は飲料、特に乳飲料としての任意の種類の食品、医薬用であってもなくてもよい食料品への取込みが意図されるプレミックス形態の任意の種類の原材料、技術的添加剤又は補助剤、ヒト又は動物向けの任意の種類の完全な又は栄養補助的な食料品を意味する。
【００６６】
別の態様では、本発明は更に、有効量の本発明に係る藻類抽出物の患者への投与を含む上記の病理を治療する方法に関する。
【実施例】
【００６７】
実施例１：本発明に係る藻類抽出物の調製
藻類を洗浄するための機械を用いて、１トンの新鮮な生のアオサ属型緑藻類を真水で洗浄して砂を除去する。
【００６８】
特に断りのない限り、本方法のステップは室温で行われる。
【００６９】
次いで、この藻類（乾燥材料８％の、１メートルトンの水気を切った藻類）を、工業用リファイナー（イノテック社のブランドタイプ「Ｉ１７５ＣＤＩ−７５Ｄ」）を用いて微粒子へと破砕する。「微粒子」とは、サイズが５０〜２００ｎｍの間の第１の集団及びサイズが６００〜１，０００ｎｍの間の第２の集団の２つの集団を有する、サイズが５０〜１，０００ｎｍに含まれる粒子を意味する。
【００７０】
次いで、破砕された材料を、ブランドＦｌｏｔｔｗｅｇタイプ「Ｂ  ＦＲＵ  ８００  ＨＫ」の工業用ベルトプレスを用いて約１メートルトン／時の処理量で圧搾した。
【００７１】
このステップにより、液相（絞り汁）から固相（搾りかす）を分離することができる。得られる絞り汁の収率は７５％である。
【００７２】
次いで、得られた７５０ｋｇの生の絞り汁を、ブランドＦｌｏｔｔｗｅｇタイプ「ＡＣ  ２０００」のディスクスタックを備えた清澄器を用いて清澄化する。
【００７３】
これにより、３．１０％の乾燥質量（９５〜９８％の質量収率）及びクリーム（質量で２〜５％）を含む、７１０ｋｇの清澄な絞り汁が得られる。
【００７４】
その後、清澄な絞り汁を１５ｋＤａのセラミックメンブレン（タミ・インダストリーズ社（Ｔａｍｉ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ））で限外ろ過する。
【００７５】
これにより透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）及び濃縮液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）が得られる。透過液は、２．２％の乾燥材料を含む６４０ｋｇの（９１％の体積収率）ろ過後の絞り汁が得られるまで維持される。
【００７６】
次いで、ろ過後の絞り汁（透過液）を、蒸発により濃縮させた後の凍結乾燥により乾燥させる。
【００７７】
濃縮は、単効用エバポレーター（ｓｉｍｐｌｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ；ＥＶＡ  １０００、ピグナット社（Ｐｉｇｎａｔ））を以下のパラメーターで用いて達成される：強制リフロー、供給流速１０Ｌ／ｈ、蒸気圧１ｂａｒ、真空圧０．３ｂａｒ、及び蒸発温度９０℃。
【００７８】
最初の濃縮は、８Ｌ／ｈの蒸発水流で行い、ブリックス度は５．５（乾燥材料濃度４．５％に等しい）から１４．７に上昇する。
【００７９】
次いで、この溶液の２回目の濃縮を５〜６Ｌ／ｈの蒸発水流で行い、ブリックス度は３４まで上昇する。溶液の乾燥材料濃度は３８．４％と測定される。
【００８０】
次いで、凍結乾燥を、バイオブロック・サイエンティフィック社（Ｂｉｏｂｌｏｃｋ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）製の装置（バージョンＣＨＲＩＳＴ  ａｌｐｈａ  １−４  ＬＳＣ）を用いて、このステップの最低温度でもある−８０℃の凍結温度で行う。
【００８１】
次いで、得られた粉末を、フィリップス社ブランドの遊星ミリングマシン（ｐｌａｎｅｔａｒｙ  ｍｉｌｌｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅ）ＭｉｎｉＭｉｌｌを用いて破砕する。生成物をミリングボウルに導入した（各ミリングボウルに４個のジルコニアボールと共に１０ｇの生成物）。全体を、速度１０で１５分間の回転にセットする。
【００８２】
これにより１４ｋｇの藻類抽出物粉末が得られた。
【００８３】
実施例２：ＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）による本発明に係る藻類抽出物の硫酸化ポリアニオン性多糖及び非硫酸化ポリアニオン性多糖のサイズの決定
実施例１に従って製造された本発明に係る藻類抽出物を１，０００Ｄａメンブレンを用いて限外ろ過し、濃度０．５ｇ／Ｌで水に溶解する。次いで、これを直列に配置された２つのＳｈｏｄｅｘ  ８０２及び８０３カラムに注入する（８０２カラムの分画ドメイン：４・１０３Ｄａ；８０３カラム：１．７・１０５Ｄａ）。使用される溶離液は、流速０．５ｍｌ／分の０．１Ｍ硝酸ナトリウム及び０．２％アジ化ナトリウムである。検出はワイアット社（Ｗｙａｔｔ）製の屈折計及びワイアット社製の１８度の光散乱検出器を用いてなされる。ｄｎ／ｄｃは０．１５０ｍｌ／ｇに等しいと想定される。
【００８４】
屈折計で検出されたクロマトグラムを図２に示す。
【００８５】
本発明に係る藻類抽出物から平均サイズ４．４ｋＤａの多糖が得られる。
【００８６】
実施例３：本発明に係る藻類抽出物の組成の決定
実施例１に従って製造された本発明に係る藻類抽出物を、撹拌しながら機能するアミコンセル中でのフロント限外ろ過により精製する。カットオフ閾値が１，０００Ｄａの再生セルロースメンブレンを用いる。５７２．１ｍｇの本発明に係る藻類抽出物のサンプルを１５０ｍｌのミリＱ超純水に溶解する。質量１，０００Ｄａ未満の全ての分子を５リットルの水で除去する。濃縮液を凍結乾燥する。１１７ｍｇのサンプルが計量される。したがって、限外ろ過による収率は２０．５％（ｗ／ｗ）である。以下の分析は限外ろ過されたサンプルで行った。
【００８７】
Montreuil（Montreuil et al., 1986）に改変されたＫａｍｅｒｌｉｎｇの方法（Kamerling et al. 1975）に従い、本発明に係る藻類抽出物の多糖を構成する単糖の割合を決定する。単糖の同定及び定量には、単量体のみを得るために、重合体のメタノール分解による加水分解が必要である。次いで、グリコシド残基を、揮発性にするためにトリメチルシリル化する。このようにして、これらを、ｏ−トリメチルシリル化メチルグリコシドの形態でガスクロマトグラフィーにより同定及びアッセイする。
【００８８】
以下の試薬を用いる：
・３Ｎメタノール／ＨＣＩ溶液（スペルコ社（Ｓｕｐｅｌｃｏ））；
・炭酸銀；
・ミオイノシトール；
・ピリジン；
・Ｓｙｌｏｎ  ＢＦＴ（ＢＳＴＦＡ＋ＴＭＣＳ  ９９：１）試薬（スペルコ社）；及び
・ジクロロメタン。
【００８９】
操作手順は以下の通りである：４００μｇの前述のように製造した本発明に係る藻類抽出物及び５０μｇのミオイノシトールを、５００μｌの３Ｎメタノール／塩酸混合物（スペルコ社）存在下の乾燥浴中に１００℃で４時間置く。室温に冷却した後、メタノール分解物（ｍｅｔｈａｎｏｌｙｓａｔｅ）を炭酸銀で中和する。サンプルを３，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、窒素ジェット下で上清を蒸発させる。次いで、化合物を８０μｌのピリジンに溶解し、８０μｌのｓｙｌｏｎ（ＢＳＴＦＡ：ＴＭＣＳ＝９９：１、スペルコ社）と８０℃で２５分間インキュベートする。窒素ジェット下で過剰な試薬を穏やかに蒸発させた後、トリメチルシリル化メチルグリコシドを５００μｌのジクロロメタンに取り、次いで、ガスクロマトグラフィーに注入する（カラムへの注入、ＦＩＤ検出器：水素炎イオン化）。キャリアガスは窒素である。ＨＰ−５ＭＳタイプのカラム（３０ｍ、内径０．２５ｍｍ）は無極性である。温度上昇のプログラムは以下の通りである：１２０℃を１分維持、次いで１８０℃まで１．５℃／分のグラジエント、次いで２００℃まで２℃／分のグラジエント。
【００９０】
各単糖は、内部標準に対する相対的保持時間を、同じ条件下で処理された純粋な単糖と比較することにより同定される。本発明に係る藻類抽出物の多糖内の各単糖の割合を決定するために、内部標準に対する各単糖の反応係数を計算する。
【００９１】
得られた結果を以下の表１及び図３に示す。
【００９２】
表１：藻類抽出物の総重量に基づく重量により表した、ガスクロマトグラフィーによるトリメチルシリル化誘導体の分析後に得られた本発明に係る藻類抽出物の組成。Ａｒａ：アラビノース；Ｇａｌ：ガラクトース；Ｇｌｃ：グルコース；Ｘｙｌ：キシロース；Ｍａｎ：マンノース；Ｒｈａ：ラムノース、ＧｌｃＡ：グルクロン酸。
【００９３】
【表１】
0006440631.tif 000002
【００９４】
実施例４：機能性テストバッテリー及び追加的テスト（オープンフィールド、高架式十字迷路、嫌悪刺激回避テスト）による藻類抽出物（ＡＥ）の効果の評価
２０、４０、及び８０ｍｇ／ｋｇの用量で１４日間経口投与された本発明に係る藻類抽出物（ＡＥ）の効果を雄の成体ウィスターラットで評価した。
【００９５】
ＡＥの効果は、機能性テストバッテリー（ＦＯＢ）により、キャリア（天然水）で処置した対照バッチと比較したラット６匹のグループで評価した。追加的テスト、オープンフィールド、高架式十字迷路、及び嫌悪光刺激回避テストを行ってＡＥの効果の評価を完了した。
【００９６】
使用したラットは、ＡＳＡＢ及びＣａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎに規定された倫理規則に則って試験された。
【００９７】
設備及び方法
動物
６０日齢の２４匹の雄ウィスターＣｒｌ：ＷＩ（Ｈａｎ）ラット（チャールス・リバー・ラボラトリーズ社、６９−Ｓｔ−Ｇｅｒｍａｉｎ  ｓｕｒ  ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、フランス）を使用した。ラットの受取り後、ラットに印をつけ、Ｆタイプのポリカーボナート製ケージ（４８×２７×２０ｃｍ、Ｕ．Ａ．Ｒ．社；９１−Ｅｐｉｎａｙ−Ｓｕｒ−Ｏｒｇｅ，Ｆｒａｎｃｅ）に２匹ずつ分けた。動物は温度２２±２℃、湿度５０±２０％の空調された動物収容設備に入れた。ラットは標準的な２０１６飼料（ハーラン社（Ｈａｒｌａｎ）の代理のムセドラ社（Ｍｕｃｅｄｏｌａ）；ミラノ、イタリア）及び飲料を自由に摂取でき、逆転した１２時間の明暗サイクル（午後８時から午前８時に明）に曝された。
【００９８】
実験室の状態に１週間慣らした後、ラットを計量し、ランダムに４つの処置群に分けた（ｎ＝６）。
【００９９】
種々の生成物間の干渉の可能性を避けるために、同じケージのラットは全て同じ処置を受けた。異なる群のラットは全て同じように及び同じ条件下で取り扱った。
【０１００】
ＦＯＢテスト
以下の設備をこのテストに用いた：
・透明の観察ケージ；
・懸垂デバイス；
・グリッピングデバイス；
・運動及び探索活動のためのオープンフィールド；
・標準的な音刺激を発する聴覚刺激装置；
・種々の触覚刺激のためのスタイラス；
・デジタル温度計。
【０１０１】
ＦＯＢテストは、生成物を投与する前（Ｔ０）並びに２０、４０、及び８０ｍｇ／ｋｇの用量で経口経路による１４日間の処置期間後（Ｔ１４）に盲検として行った。
【０１０２】
テストは以下の３つの観察段階を含んだ：
・動物を邪魔しない直接観察段階；
・動物を扱う能動的観察段階；
・反応性テスト後の動物の行動反応を評価するための段階。
【０１０３】
記録された変数は以下の通りである：
・行動的効果：自発運動活性、運動行動障害、触られることへの逃避反応、被刺激性、引き起こされた攻撃的及びすくみ行動、眠気、排尿及び排便、感覚運動反応（視覚性踏み直り（ｖｉｓｕａｌ  ｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、足を挟むこと、尾を挟むこと、及び音刺激への反応）；
・神経学的効果：瞳孔反応、眼瞼反射、骨盤上昇、尾の位置、肢及び腹部の筋肉緊張度、ロールオーバーテスト、グリップテスト、震え、及び起毛；
・生理的効果：流涎、流涙、下痢、直腸温度、心臓−呼吸リズム；
・死亡率。
【０１０４】
以下のテストは２週間の生成物投与後に行った。
【０１０５】
高架式十字迷路テスト（ＬＣＳ）
十字の形状をした実験デバイスが地上から８０ｃｍの高さにある。デバイスは、長さ５０ｃｍ、幅１５ｃｍの４つのアームを含む。２つの反対のアームは高さ４０ｃｍの垂直な壁によって閉じられており、他の２つのアームは何もない空間に開いており、したがって、不安を惹起する位置となる。１８日目の処置投与の１時間後に、動物をデバイスの十字の中央に置き、４つのアームの全体に自由にアクセスできるようにした。ＡＮＹＭＡＺＥシステムを用いて動物の行動を５分間記録した。このテストで調査した変数は、オープンアームへの進入の回数及びこれらのオープンアームで過ごした時間である。オープンアームの進入回数が少ないこと及び過ごした時間が短いことは不安を示すと考えられる（Lister, 1987）。
【０１０６】
嫌悪光刺激回避反応（ＡＬＳＡＲ）テスト
このモデルは、強く照射された環境に対するラットの嫌悪を利用する。ラットは、正の強化として３０秒の暗闇期間を得るための有効レバーを押すことにより作動する条件付けの範囲で、その嫌悪光環境をマスターするように学習する。
【０１０７】
実験デバイスは、強く照射された隔離されたケージ（５０×４０×３７ｃｍ）にあり、２つのレバーを含み、１つは有効レバーであり、作動されると３０秒の暗闇が得られ、その後光が戻り、もう一方のレバーは無効である（如何なる正の強化も生じさせない）。暗闇期間中に有効レバーを押す行為は更なる暗闇期間を与えない。ラットをケージ中に２０分間置き、実験中に各レバーを押す行為の回数を数える。
【０１０８】
このテストバッテリーは、４つの条件付けデバイスからなり、コンピューターによって完全に自動化及び制御されている。したがって、テスト中、実験者は部屋にいない。
【０１０９】
被験生成物の１８日間投与後、ＡＬＳＡＲモデルで機能する条件付けの範囲内で、ラットの獲得訓練における認知レベルを試験した。
【０１１０】
記録された変数は、明期の間に有効レバー（ＬＡ）及び無効レバー（ＬＩ）を押す行為の総数並びに両方のレバーのそれぞれを押す行為の回数であった。
【０１１１】
有効及び無効な押す行為の回数から、テストセッション中の操作活性のレベルを評価することができた。明期の間に２つのレバーのぞれぞれを押す行為の回数を比較することにより（ＬＡ対ＬＩ）、獲得訓練（両方のレバー間の区別）を評価した。
【０１１２】
生成物
生成物は、実施例１に従って調製された水溶性藻類抽出物の凍結乾燥及び破砕濃縮された画分を表す粉末としてのＡＥ（藻類抽出物）である。ＡＥは、天然水に溶かし、ＦＯＢテスト及び追加的行動テストの６０分前に、胃内栄養管を用いて経口投与される。
【０１１３】
統計解析
クラスカル・ワリス検定を適用した。不均一の場合はその後に、処置群と対照群を比較するためにマンホイットニーのＵ検定を行った。
【０１１４】
反復ＦＯＢ測定における各群のＴ０とＴ１４の２つずつの比較、及び照射環境中での両方のＡＬＳＡＲレバーの区別には、ウィルコクソン検定を用いた。
【０１１５】
統計及びグラフの処理操作は、ソフトウェアパッケージＳｔａｔｖｉｅＷ  ５（ＳＡＳインスティチュート社（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｉｎｃ．）、米国）を用いて行った。
【０１１６】
結果
ＦＯＢテスト
Ｔ０及びＴ１４のＦＯＢにおける処置群とキャリア群の比較
処置投与前のＴ０のＦＯＢでは、調べた全てのラット群の結果は均一である（表２、表３）。
【０１１７】
Ｔ１４（１４日間の処置投与後）のＦＯＢテストでは、クラスカル・ワリス検定により、種々の処置群間の多くの変数内で結果の均一性が示された（表２）。
【０１１８】
他方、調べた特定の変数では、特定の用量のＡＥがキャリアと比べて有意な効果を示した（表３）。
【０１１９】
２週間にわたるＡＥの連日投与により変化した主な変数は以下の通りである：
・収容ケージ中でのラットの行動及びその自発運動活性：３つの用量で処置されたラットがより活動的であり、より機敏である。
・観察ケージ中でのラットの行動：ここでもラットは２つのより強い用量でより活動的であり、より機敏である。
・提示された物体への興味：３つの用量で、ＡＥはラットの好奇心及び目新しいものへの興味を刺激する作用を有するようである（探索活動の増加、快楽主義、抗うつ作用）。
・指の接近又はラットへの接触後のラットの逃避反応は、３つの用量のＡＥで有意に減少しており、これはＡＥの抗ストレス／抗不安作用に分類される。
・尾を挟むこと又は足を挟むことへの反応も、３つの用量で有意に減少している。これらの反応減少は、ＡＥの抗ストレス／抗不安作用及び／又は鎮痛作用に分類される。
・ラットの心臓及び呼吸の頻度は、３つの用量のＡＥで処置されたラットよりも減少しているようであり、これらはＡＥの抗ストレス／抗不安作用に分類される。
・ラットの興奮、神経過敏、及び被刺激性が、最も強い２つの用量のＡＥの投与で有意に低下しており、これは静穏、抗ストレス、及び／又は抗攻撃性作用に分類される。
【０１２０】
表２：２０、４０、及び８０ｍｇ／ｋｇの用量（経口）で１４日間のＡＥ投与の前（Ｔ０）及び後（Ｔ１４）の変数の状態
【０１２１】
【表２】
0006440631.tif 000003
【０１２２】
表３：２０、４０、及び８０ｍｇ／ｋｇの用量（経口）で１４日間のＡＥ投与の前（Ｔ０）及び後（Ｔ１４）の変数の状態
【０１２３】
【表３】
0006440631.tif 000004
＃：Ｐ＜０．１０；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１（マンホイットニー検定：ｖｓ．キャリア）
【０１２４】
Ｔ０とＴ１４のＦＯＢ間の種々の反復変数の比較
特定の用量で１４日間のＡＥ連日投与は、調べた特定の主要変数に効果があるようである（表４）：
・観察ケージ中におけるラットの行動及びその自発運動活性は３つの用量のＡＥで有意に増加した（刺激作用又は抗ストレス作用）。
・観察アリーナにおける対照ラットの移動待ち時間は増加し、運動活性（通過空間）は減少し、一方、ＡＥで処置されたラットでは、これらの変数はＴ０とＴ１４のＦＯＢ間で安定なままである（抗ストレス及び抗うつ作用）。
・提示物体への興味：２０ｍｇ／ｋｇの用量、経口（ｐｅｒ  ｏｓ）で、ＡＥは、ラットに提示された刺激物体へのラットの興味を刺激する（新規物探索の意欲、快楽主義：抗ストレス及び抗うつ作用）。
・オープンブランチ上の通過空間の数：キャリアと比べて、ＡＥはオープンブランチ上の通過空間の数を減少させない（抗ストレス作用）。
・指の接近に対する逃避反応：３つの用量のＡＥによって、実験者の指が近づいた時の逃避反応が減少する（抗ストレス作用）。
・尾を挟むことに対する反応は、対照ラットでは増加しており、２０ｍｇ／ｋｇのＡＥ下では減少している（抗ストレス作用及び／又は鎮痛作用）。
・後ろ足を挟むことに対する反応は３つの用量のＡＥで減少している（抗ストレス作用及び／又は鎮痛作用）。
・音刺激に対するジャンプ反応は、４０及び８０ｍｇ／ｋｇのＡＥ用量で有意に減少している（静穏及び抗ストレス作用）、
・心臓及び呼吸の頻度は、２０及び４０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＥで減少している（静穏及び抗ストレス作用）、
・興奮、神経過敏、及び被刺激性：最も強い用量の８０ｍｇ／ｋｇで、ＡＥは、ラットの興奮、神経過敏、及び被刺激性への良い効果を示している（静穏、抗ストレス、及び／又は抗攻撃性作用）。
【０１２５】
表４：各処置群におけるＴ０とＴ１４のＦＯＢ間における変数の時間依存的変化へのＡＥの効果
【０１２６】
【表４】
0006440631.tif 000005
【０１２７】
Ｎ．Ｓ．：Ｔ０とＴ１４の間で有意でない。
0006440631.tif 000006
Ｔ０とＴ１４の間での減少
0006440631.tif 000007
【０１２８】
Ｔ０とＴ１４の間での増加
＊：Ｐ＜０．０５；＃：Ｐ＜０．１０（傾向）
【０１２９】
高架式十字迷路テスト（ＬＣＳ）
高架式十字迷路テストでは、１８日間の連日処置後、２０、４０及び、８０ｍｇ／ｋｇ（経口）の用量のＡＥによって、処置されたラットのオープンアーム中への進入の回数（表５、図４）及びそこで過ごした時間（表６、図５）が有意に増加しており、これはＡＥの抗ストレス活性を示している。
【０１３０】
表５：高架式十字迷路テストにおけるオープンアームへの進入の回数へのＡＥの効果
【０１３１】
【表５】
0006440631.tif 000008
【０１３２】
表６：高架式十字迷路テストにおいてオープンアーム中で過ごす時間へのＡＥの効果
【０１３３】
【表６】
0006440631.tif 000009
【０１３４】
嫌悪光刺激回避反応テスト（ＡＬＳＡＲ）
１８日間のＡＥ連日投与後、クラスカル・ワリス検定により、種々の処置群のラットが両方のレバー（有効レバー＋無効レバー）を押す行為の累積回数は５分、１０分、１５分、及び２０分で均一であることが示された（図６）。
【０１３５】
嫌悪光刺激を回避するテストにおいて、１８日間のＡＥ投与後、テストの最初の５分の最後で、用量２０ｍｇ／ｋｇ（経口）で処置されたラットは有効レバーと無効レバーを区別している傾向が見られる（図７）。
【０１３６】
１０分間のテスト期間の最後で、用量４０ｍｇ／ｋｇ（経口）のＡＥで処置されたラットは有効レバーと無効レバーを有意に区別しており、用量２０及び８０ｍｇ／ｋｇ（経口）で処置されたラットは両方のレバー間を区別して作動させる傾向がある。これは、区別の傾向を何ら示さない対照ラットでは見られないことである（図８）。
【０１３７】
テストの１５分間の最後で、用量２０及び４０ｍｇ／ｋｇ（経口）のＡＥで処置されたラットは有効レバーと無効レバーを有意に区別している。用量８０ｍｇ／ｋｇ（経口）で処置されたラットはもはや両方のレバーを区別していない。対照ラットは訓練テストのこの段階でも依然として全く区別を示していない（図９）。
【０１３８】
テストの２０分間の最後で、用量２０及び４０ｍｇ／ｋｇ（経口）のＡＥで処置されたラットはまだ有効レバーと無効レバーを有意に区別している。用量８０ｍｇ／ｋｇ（経口）で処置されたラットはもはや何ら区別を示さず、対照ラットは区別の開始を示し始めている（図１０）。
【０１３９】
これらの結果は、特に２０及び４０ｍｇ／ｋｇ（経口）の用量での、獲得訓練へのＡＥの有効性を示している。
【０１４０】
生理学的及び無害性データ
ＡＥの投与は、用量に関係なく、用量２０、４０、又は８０ｍｇ／ｋｇ（経口）で連日処置されたラットの体重又はラットの食物摂取量に何ら影響を示さなかった。用量２０、４０、及び８０ｍｇ／ｋｇ／ｄ（経口）のＡＥで２１日間処置された動物において毒性は検出されなかった。
【０１４１】
結論
したがって、本発明に係る藻類抽出物の投与は、生成物の神経学的作用、特に抗ストレス／抗不安、抗うつ、鎮痛活性並びに記憶の訓練及び容易化の早期獲得活性を示す。
【０１４２】
実施例５：行動的絶望テストによる藻類抽出物（ＡＥ）の効果の評価
３つの用量（１０、２０、及び４０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）で予防的処置として経口投与された本発明に係る藻類抽出物（ＡＥ）の抗うつ作用を、行動的絶望テスト（ＢＤＴ）で雄の成体ウィスターラットで評価した。
【０１４３】
１４日間にわたり半慢性的処置として抽出物を連日投与した。キャリア（天然水）で処置された対照バッチ及び用量１０ｍｇ／ｋｇ／ｄのイミプラミンで処置された参照バッチとの比較で、ラット１２匹の群のＢＤＴにおける抽出物の効果を評価した。
【０１４４】
使用したラットはＡＳＡＢ及びＣａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎにより規定される倫理規則に則って処置された。
【０１４５】
設備及び方法
動物
２００〜２２５ｇの６０匹の雄ウィスターラット（チャールス・リバー・ラボラトリーズ社、フランス）を用いた。ラットは、受取り後、印を付けられ、Ｆタイプのポリカーボナート製のケージ（４８×２７×２０ｃｍ、Ｕ．Ａ．Ｒ．社、９１−Ｅｐｉｎａｙ−Ｓｕｒ−Ｏｒｇｅ、フランス）に４匹ずつ分けられた。動物は、２２±２℃の温度及び５０±２０％の相対湿度で空調された動物収容設備に収容された。ラットは標準的な飼料２０１６（ハーラン社；ガナ（Ｇａｎｎａｔ）、フランス）及び飲料を自由に摂取できた。ラットは逆転した１２時間の明暗サイクルに曝された。
【０１４６】
実験室の条件に１週間慣らした後、ラットを計量し、体重に従って５つの処置群にランダムに分けた（ｎ＝１２／群）。
処置群：
・対照群：天然水（キャリア）で処置、
・イミプラミン群：用量１０ｍｇ／ｋｇ／ｄのイミプラミンで処置（Ｉｍｉ）、
・ＡＥ群１０：用量１０ｍｇ／ｋｇ／ｄのＡＥで処置（ＡＥ１０）、
・ＡＥ群２０：用量２０ｍｇ／ｋｇ／ｄのＡＥで処置（ＡＥ２０）、
・ＡＥ群４０：用量４０ｍｇ／ｋｇ／ｄのＡＥで処置（ＡＥ４０）。
【０１４７】
種々の処置間の干渉の可能性を避けるために、同じケージのラットは全て同じ用量のＡＥを受ける。異なる群のラットは全て同じように及び同じ条件下で扱われる。      
【０１４８】
行動的絶望テスト（ＢＤＴ）
実験デバイスは、２５℃で高さ３０ｃｍまで水を充填した高さ５０ｃｍ、直径２０ｃｍのプレキシガラス製シリンダーにあった。
【０１４９】
被験生成物による１３日間の連日処置後、各動物の無動時間を評価するために１４日目（Ｄ１４）にラットをデバイス中に１５分間置いた。この最初のテストの直後、ラットは１４回目の処置を受けた。
【０１５０】
１５日目（Ｄ１５）に、ラットは２回の処置を受けた。１回目はテストの５時間前であり、２回目はテストの１時間前である。この方法は、うつに対する生成物の有効性を試験するために文献中で一般に用いられている。テストは、前日と同じ条件下で５分間行った。
【０１５１】
両方のテスト（Ｄ１４及びＤ１５）の最初の５分の間に記録される無動時間は、動物が逃げられない状況に直面した時のあきらめの能力を反映している。このあきらめ行動はうつと一致する。
【０１５２】
生成物
生成物は、実施例１に従って製造された水溶性藻類抽出物の凍結乾燥及び破砕濃縮された画分を表す粉末としてのＡＥ（藻類抽出物）である。被験抽出物を天然水に溶かし、３つの試験用量のいずれかで連続１５日にわたり投与体積５ｍｌ／ｋｇでラットに経口投与した。動物の個別の処置を体重に合わせるために、２又は３日毎に動物を計量した。全実験期間中、動物の食物及び水の摂取量を２又は３日毎に記録した。
【０１５３】
参照群の動物は、天然水に溶かした１０ｍｇ／ｋｇ／ｄのイミプラミン塩酸塩（シグマアルドリッチ社）を投与体積５ｍｌ／ｋｇで毎日受けた。
【０１５４】
キャリア群の動物は、投与体積５ｍｌ／ｋｇで天然水を毎日受けた。
【０１５５】
統計解析
パラメトリックモードのＡＮＯＶＡを適用した。不均一の場合、その後に処置群とキャリア群及び参照群とを比較するために対応のないｔ検定を用いて比較を行った。
【０１５６】
対応のあるＡＮＯＶＡを用いた。不均一の場合、その後に各群におけるＢＤＴの反復測定値を２つずつ比較するために対応のあるｔ検定を用いて比較を行った。
【０１５７】
食物及び水の摂取量について、ノンパラメトリックなモード分析を適用した：クラスカル・ワリス、次いで必要な場合、マンホイットニーのＵ検定を用いて２つずつ群を比較した。
【０１５８】
統計及びグラフの処理操作はソフトウェアパッケージＳｔａｔｖｉｅｗ５（ＳＡＳインスティチュート社、米国）を用いてなされた。
【０１５９】
結果
行動的絶望テスト：Ｄ１４でのプレテスト
Ｄ１４で、行動的絶望のプレテストにおいて、ＡＮＯＶＡは、種々の処置群の動物の無動時間について不均一性を示さなかった（表７；図１１）。このプレテストは、種々の処置群の動物においてあきらめの誘導が得られる可能性を示している。
【０１６０】
表７：Ｄ１４での行動的絶望プレテストにおける無動時間（秒）へのＡＥの効果（秒、平均値±平均値の標準誤差（ＳＭＥ））
【０１６１】
【表７】
0006440631.tif 000010
【０１６２】
ＮＳ：有意差なし。
【０１６３】
Ｄ１５での行動的絶望テスト
Ｄ１５で、行動的絶望テストにおいて、ＡＮＯＶＡにより、種々の処置群の動物の無動時間について不均一性が示された（表８）。
【０１６４】
対応のないｔ検定により、イミプラミン、ＡＥ２０、及びＡＥ４０で処置された動物の無動時間はキャリアで処置された動物より有意に短いことが示された（それぞれ、ｔ＝３．６９、Ｐ＝０．００１３；ｔ＝２．２０、Ｐ＝０．０３９；及びｔ＝３．２９、Ｐ＝０．００３）。
【０１６５】
対応のないｔ検定により、ＡＥ２０で処置された動物の無動時間はイミプラミンで処置された動物より有意に長い傾向があることが示された（ｔ＝１．７２、Ｐ＝０．０９９）（表８；図１２）。
【０１６６】
表８：Ｄ１５での行動的絶望テストにおける無動時間（秒）へのＡＥの効果（秒、平均値±平均値の標準誤差（ＥＳＭ））
【０１６７】
【表８】
0006440631.tif 000011
【０１６８】
ＮＳ：有意差なし。
【０１６９】
Ｄ１４及びＤ１５でのテスト結果の比較
対応のあるｔ検定により、イミプラミン及びＡＥ４０で処置されたラットの無動時間がＤ１４とＤ１５の間で有意に減少していることが示された（それぞれ、ｔ＝２．９０、Ｐ＝０．０１５及びｔ＝２．４２、Ｐ＝０．０３４）（表９）。
【０１７０】
表９：Ｄ１４及びＤ１５でのテスト結果の比較（秒、平均値±ＳＭＥ）
【０１７１】
【表９】
0006440631.tif 000012
【０１７２】
ＮＳ：有意差なし。
【０１７３】
体重変化、食物、及び水の摂取量
３つの用量で投与されたＡＥは、動物の体重変化並びに食物及び水の摂取量に関して影響を示さなかった。
【０１７４】
行動的絶望テスト
Ｄ１４：動物のあきらめを設定するためのテスト中、用量２０及び４０ｍｇ／ｋｇのＡＥで処置された動物の無動時間が他の群の動物より短いが、キャリア、イミプラミン、及び３つの被験用量で投与されるＡＥで処置されたラット間で有意な差は観察されなかった。
【０１７５】
Ｄ１５：２０及び４０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されたＡＥで、これらの用量で処置された動物の無動時間がキャリアで処置された動物より有意に短かったことから、抗うつ作用が確認された。４０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されたＡＥは、１０ｍｇ／ｋｇのイミプラミンで処置された動物と同様な無動時間が得られる可能性を示した。用量１０、２０、及び４０ｍｇ／ｋｇのＡＥで処置された動物で用量依存的効果が観察された。
【０１７６】
Ｄ１４及びＤ１５での無動時間の比較：用量１０ｍｇ／ｋｇのイミプラミンで処置された動物及び用量４０ｍｇ／ｋｇのＡＥで処置された動物のみ、Ｄ１４とＤ１５の間で無動時間が有意に減少していた。
【０１７７】
動物の行動及び藻類抽出物の無害性
１０、２０、及び４０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されたＡＥで、実験中、全ての動物で異常な行動は観察されなかった。１０、２０、及び４０ｍｇ／ｋｇ／ｄの用量のＡＥで１４日間処置された動物において毒性は検出されなかった。
【０１７８】
結論
したがって、本発明に係る藻類抽出物の投与によって、生成物の抗うつ作用が示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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