(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)配列番号14、19および25によってそれぞれ同定されるCDRH1、CDRH2およびCDRH3ならびに配列番号1、7および11によってそれぞれ同定されるCDRL1、CDRL2およびCDRL3、
b)配列番号15、21および26によってそれぞれ同定されるCDRH1、CDRH2およびCDRH3ならびに配列番号2、8および12によってそれぞれ同定されるCDRL1、CDRL2およびCDRL3、
c)配列番号15、21および26によってそれぞれ同定されるCDRH1、CDRH2およびCDRH3ならびに配列番号3、8および12によってそれぞれ同定されるCDRL1、CDRL2およびCDRL3、
d)配列番号16、22および27によってそれぞれ同定されるCDRH1、CDRH2およびCDRH3ならびに配列番号4、9および12によってそれぞれ同定されるCDRL1、CDRL2およびCDRL3、
e)配列番号17、23および28によってそれぞれ同定されるCDRH1、CDRH2およびCDRH3ならびに配列番号5、8および13によってそれぞれ同定されるCDRL1、CDRL2およびCDRL3、または
f)配列番号18、24および29によってそれぞれ同定されるCDRH1、CDRH2およびCDRH3ならびに配列番号6、10および12によってそれぞれ同定されるCDRL1、CDRL2およびCDRL3
を含む、CD30Lに結合する単離された抗体。
【請求項２】
配列番号74におけるアミノ酸残基201〜234によって規定されるCD30Lの領域に結合する、請求項1に記載の単離された抗体。
【請求項３】
配列番号74におけるアミノ酸残基75〜95によって規定されるCD30Lのさらなる領域に結合する、請求項1に記載の単離された抗体。
【請求項４】
a)CD30/CD30L相互作用を阻害する;
b)CD30Lに誘導されるIL-8誘導を阻害する;
c)ヒトCD30Lに対する結合について、抗体A、B、C、D、EおよびFのうち1つと交差競合する;
d)ヒトCD30Lに対する解離定数が最大で70pMである、および
e)抗体A、B、C、D、EおよびFのうち1つと実質的に同じまたはそれよりも低いKdで、ヒトCD30Lに結合する
からなる群より選択される少なくとも1つの特性を有する、請求項1または2に記載の単離された抗体であって、
抗体Aが配列番号36により規定される軽鎖可変領域及び配列番号50により規定される重鎖可変領域を含み、
抗体Bが配列番号38により規定される軽鎖可変領域及び配列番号64により規定される重鎖可変領域を含み、
抗体Cが配列番号40により規定される軽鎖可変領域及び配列番号66により規定される重鎖可変領域を含み、
抗体Dが配列番号42により規定される軽鎖可変領域及び配列番号68により規定される重鎖可変領域を含み、
抗体Eが配列番号44により規定される軽鎖可変領域及び配列番号70により規定される重鎖可変領域を含み、かつ
抗体Fが配列番号46により規定される軽鎖可変領域及び配列番号72により規定される重鎖可変領域を含む、抗体。
【請求項５】
CD30Lに対する結合について、抗体A、B、C、D、EおよびFのうち1つまたは複数のFabと競合する、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離された抗体であって、
抗体Aが配列番号36により規定される軽鎖可変領域及び配列番号50により規定される重鎖可変領域を含み、
抗体Bが配列番号38により規定される軽鎖可変領域及び配列番号64により規定される重鎖可変領域を含み、
抗体Cが配列番号40により規定される軽鎖可変領域及び配列番号66により規定される重鎖可変領域を含み、
抗体Dが配列番号42により規定される軽鎖可変領域及び配列番号68により規定される重鎖可変領域を含み、
抗体Eが配列番号44により規定される軽鎖可変領域及び配列番号70により規定される重鎖可変領域を含み、かつ
抗体Fが配列番号46により規定される軽鎖可変領域及び配列番号72により規定される重鎖可変領域を含む、抗体。
【請求項６】
a)配列番号48、50、52、54、56、58、60および62からなる群より選択される重鎖可変領域ならびに配列番号36の軽鎖可変領域を含む、単離された抗体;
b)配列番号64の重鎖可変領域および配列番号38の軽鎖可変領域を含む、単離された抗体;
c)配列番号66の重鎖可変領域および配列番号40の軽鎖可変領域を含む、単離された抗体;
d)配列番号68の重鎖可変領域および配列番号42の軽鎖可変領域を含む、単離された抗体;
e)配列番号70の重鎖可変領域および配列番号44の軽鎖可変領域を含む、単離された抗体;ならびに
f)配列番号72の重鎖可変領域および配列番号46の軽鎖可変領域を含む、単離された抗体
からなる群より選択される、CD30Lに結合する単離された抗体。
【請求項７】
IgG1型、IgG2型、IgG3型またはIgG4型である、請求項1または6に記載の単離された抗体。
【請求項８】
請求項1または6に記載の少なくとも1つの抗体および医薬的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項９】
患者においてCD30Lと関連する状態を処置または予防するための請求項8に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
患者においてCD30L活性を低減させるための請求項9に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項1または6に記載の抗体をコードする、単離された核酸分子。
【請求項１２】
請求項11に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
CD30リガンド(CD30L、CD153)は、CD30に対する天然に存在するリガンドであり、CD30に特異的に結合し、CD30を誘発してその細胞質ドメインを介してシグナル伝達させる、II型膜糖タンパク質である。CD30およびCD30Lは、それぞれTNFRスーパーファミリーおよびTNFスーパーファミリーのメンバーである、相互作用する細胞表面糖タンパク質である(Durkopら、Cell、68:421、1992;Smithら、Cell、73:1349、1993;米国特許第5,480,981号;米国特許第5,677,430号;米国特許第6,143,869号および米国特許第6,652,854号)。CD30およびCD30Lの発現は、免疫系の細胞に限定され、しっかりと調節されている。CD30は、活性化されたB細胞および活性化された/メモリー表現型を有するT細胞のサブセット上で主に発現される(Ellisら、J. Immun.、151:2380、1993;Faliniら、Blood、85:1、1995)。CD30Lは、活性化されたマウスおよびヒトのT細胞上で高レベルで発現される(Shimozatoら、Biochem. & Biophys. Res. Comm.、256:519、1999;Armitage、J. Biological Regulators & Homeostatic Agents、14:142、2000)。CD30Lの相対的遺伝子発現における劇的な変化は、胚中心をB細胞が通過する際に生じる(Kleinら、Proc. Nat. Acad. Sci.、USA、100:2639、2003)。従って、B細胞上でのCD30Lの発現は、段階特異的および状況特異的であり得る。CD30Lはまた、T細胞がB細胞と相互作用する脾臓濾胞中に存在するマウス樹状細胞様アクセサリー細胞の独自集団のマーカーであるようである(Kimら、Immunity、18:643、2003)。
【背景技術】
【０００２】
CD30/CD30Lを発現する細胞間の相互作用は、強力なT細胞依存的二次抗体応答またはクラススイッチされた抗体応答の発生に重要であるようである。かかる役割の証拠には、マウス系におけるin vitro研究(Shanebeckら、Eur. J. Immunol.、25:2147〜53、1995)およびin vivo研究(Gaspalら、J. Immunol.、174:3891〜6、2005)からのデータが含まれる。さらに、マウスCD30Lに対する遮断性ではあるが枯渇性ではないラットmAbによるマウスのin vivo処置は、T細胞および/またはB細胞依存的な自己免疫疾患のモデルのいくつかにおいて、疾患の発症または進行を阻害することが示されている(米国特許第6,667,039号)。強力な体液性免疫成分を有するモデルでは、疾患の阻害は、疾患関連抗体応答の阻害と相関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第5,480,981号
【特許文献２】米国特許第5,677,430号
【特許文献３】米国特許第6,143,869号
【特許文献４】米国特許第6,652,854号
【特許文献５】米国特許第6,667,039号
【特許文献６】国際公開第WO00/09560号
【特許文献７】米国特許第4,816,567号
【特許文献８】米国特許第6,180,370号
【特許文献９】米国特許第5,693,762号
【特許文献１０】米国特許第5,693,761号
【特許文献１１】米国特許第5,585,089号
【特許文献１２】米国特許第5,530,101号
【特許文献１３】国際公開第WO96/33735号
【特許文献１４】国際公開第WO94/02602号
【特許文献１５】米国特許第5,545,807号
【特許文献１６】米国特許第6,713,610号
【特許文献１７】米国特許第6,673,986号
【特許文献１８】米国特許第6,162,963号
【特許文献１９】米国特許第6,300,129号
【特許文献２０】米国特許第6,255,458号
【特許文献２１】米国特許第5,877,397号
【特許文献２２】米国特許第5,874,299号
【特許文献２３】米国特許第5,545,806号
【特許文献２４】国際公開第WO91/10741号
【特許文献２５】国際公開第WO90/04036号
【特許文献２６】欧州特許第546073号
【特許文献２７】米国特許第5,569,825号
【特許文献２８】米国特許第5,625,126号
【特許文献２９】米国特許第5,633,425号
【特許文献３０】米国特許第5,789,650号
【特許文献３１】米国特許第5,661,016号
【特許文献３２】米国特許第5,814,318号
【特許文献３３】米国特許第5,770,429号
【特許文献３４】国際公開第WO93/1227号
【特許文献３５】国際公開第WO92/22646号
【特許文献３６】国際公開第WO92/03918号
【特許文献３７】国際公開第WO98/24893号
【特許文献３８】国際公開第WO99/10494号
【特許文献３９】国際公開第WO88/01649号
【特許文献４０】米国特許第4,946,778号
【特許文献４１】米国特許第5,260,203号
【特許文献４２】米国特許第5,011,912号
【特許文献４３】米国特許第4,751,180号
【特許文献４４】米国特許第4,935,233号
【特許文献４５】国際公開第WO94/10308号
【特許文献４６】国際公開第WO93/10151号
【特許文献４７】米国特許第5,426,048号
【特許文献４８】米国特許第5,262,522号
【特許文献４９】米国特許第5,457,035号
【特許文献５０】国際公開第WO87/05330号
【特許文献５１】米国特許第4,399,216号
【特許文献５２】米国特許第4,912,040号
【特許文献５３】米国特許第4,740,461号
【特許文献５４】米国特許第4,959,455号
【特許文献５５】米国特許第6,270,964号
【特許文献５６】米国特許第4,965,195号
【特許文献５７】欧州特許第0 367 566号
【特許文献５８】米国特許第4,968,607号
【特許文献５９】欧州特許第0 460 846号
【特許文献６０】米国特許第6,946,292号
【特許文献６１】米国特許第7,425,446号
【特許文献６２】米国特許第7,846,725号
【特許文献６３】米国特許第8,067,232号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Durkopら、Cell、68:421、1992
【非特許文献２】Smithら、Cell、73:1349、1993
【非特許文献３】Ellisら、J. Immun.、151:2380、1993
【非特許文献４】Faliniら、Blood、85:1、1995
【非特許文献５】Shimozatoら、Biochem. & Biophys. Res. Comm.、256:519、1999
【非特許文献６】Armitage、J. Biological Regulators & Homeostatic Agents、14:142、2000
【非特許文献７】Kleinら、Proc. Nat. Acad. Sci.、USA、100:2639、2003
【非特許文献８】Kimら、Immunity、18:643、2003
【非特許文献９】Shanebeckら、Eur. J. Immunol.、25:2147〜53、1995
【非特許文献１０】Gaspalら、J. Immunol.、174:3891〜6、2005
【非特許文献１１】Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(2001)
【非特許文献１２】Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates(1992)
【非特許文献１３】HarlowおよびLane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1990)
【非特許文献１４】Immunology-A Synthesis、第2版(E. S. GolubおよびD. R. Gren編)、Sinauer Associates: Sunderland、Mass.(1991)
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【非特許文献１７】HarlowおよびLane、1988、Antibodies、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press
【非特許文献１８】Morelら、1988、Molec. Immunol. 25:7〜15
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【非特許文献２０】Moldenhauerら、1990、Scand. J. Immunol. 32:77〜82
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【非特許文献２３】Roqueら、Biotechnol. Prog.、2004、20:639〜654
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【非特許文献８８】Gribskovら、1990、Meth. Enzym. 183:146〜159
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【非特許文献９２】Thorntonら、1991、Nature 354:105
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【非特許文献９８】Hoppeら、1994、FEBS Letters 344:191
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【非特許文献１０１】Byrnら、1990、Nature 344:677
【非特許文献１０２】Hollenbaughら、1992「Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins」、Current Protocols in Immunology、補遺4、10.19.1〜10.19.11頁
【非特許文献１０３】Baumら、1994、EMBO J. 13:3992〜4001
【非特許文献１０４】AplinおよびWriston、1981、CRC Crit. Rev, Biochem.、259〜306頁
【非特許文献１０５】Hakimuddinら、1987、Arch. Biochem. Biophys. 259:52
【非特許文献１０６】Edgeら、1981、Anal. Biochem. 118:131
【非特許文献１０７】Thotakuraら、1987、Meth. Enzymol. 138:350
【非特許文献１０８】Duskinら、1982、J. Biol. Chem. 257:3105
【非特許文献１０９】Marksら、1992、BioTechnology 10:779
【非特許文献１１０】Current Protocols in Molecular Biology、1995、Ausubelら編、John Wiley & Sons, Inc.
【非特許文献１１１】Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses、Kennetら(編)Plenum Press、New York(1980)
【非特許文献１１２】BianchiおよびMcGrew、2003、Biotech. Biotechnol. Bioeng. 84:439〜44
【非特許文献１１３】Methods Enzymol.、第185巻(D. V. Goeddel編)、1990、New York: Academic Press
【非特許文献１１４】BenoistおよびChambon、1981、Nature 290:304〜310
【非特許文献１１５】Thornsenら、1984、Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659〜663
【非特許文献１１６】Yamamotoら、1980、Cell 22:787〜797
【非特許文献１１７】Wagnerら、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444〜1445
【非特許文献１１８】Prinsterら、1982、Nature 296:39〜42
【非特許文献１１９】Villa-Kamaroffら、1978、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727〜3731
【非特許文献１２０】DeBoerら、1983、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21〜25
【非特許文献１２１】Swiftら、1984、Cell 38:639〜646
【非特許文献１２２】Ornitzら、1986、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399〜409
【非特許文献１２３】MacDonald、1987、Hepatology 7:425〜515
【非特許文献１２４】Hanahan、1985、Nature 315:115〜122
【非特許文献１２５】Grosschedlら、1984、Cell 38:647〜658
【非特許文献１２６】Adamesら、1985、Nature 318:533〜538
【非特許文献１２７】Alexanderら、1987、Mol. Cell. Biol. 7:1436〜1444
【非特許文献１２８】Lederら、1986、Cell 45:485〜495
【非特許文献１２９】Pinkertら、1987、Genes and Devel. 1 :268〜276
【非特許文献１３０】Krumlaufら、1985、Mol. Cell. Biol. 5:1639〜1648
【非特許文献１３１】Hammerら、1987、Science 253:53〜58
【非特許文献１３２】Kelseyら、1987、Genes and Devel. 1:161〜171
【非特許文献１３３】Mogramら、1985、Nature 315:338〜340
【非特許文献１３４】Kolliasら、1986、Cell 46:89〜94
【非特許文献１３５】Readheadら、1987、Cell 48:703〜712
【非特許文献１３６】Sani、1985、Nature 314:283〜286
【非特許文献１３７】Masonら、1986、Science 234:1372〜1378
【非特許文献１３８】Cosmanら、1984、Nature 312:768
【非特許文献１３９】Wileyら、J Immunol 157:3235〜39、1996
【非特許文献１４０】Ceruttiら、J. Immunol. 165: 786、2000
【非特許文献１４１】Ceruttiら、Nat. Immunol. 2: 150、2001
【非特許文献１４２】HorieおよびWatanabe、Immuno. 10:457〜470、1998
【非特許文献１４３】HarlowおよびLane、1988、Antibodies: A Laboratory Manual、New York: Cold Spring Harbor(1991年版および定期的な補足)
【非特許文献１４４】John E. Coligan編、1993、Current Protocols In Immunology New York: John Wiley & Sons
【非特許文献１４５】第21版(2005)を含む任意のRemington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、PA
【非特許文献１４６】AndersenおよびFaber、Int. J. Mass Spec.、302、139〜148(2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、治療的適用および診断的適用における使用のための、CD30Lに結合するヒト抗体および/または抗原結合領域を含む組成物を有することが有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
CD30L、特にヒトCD30Lに結合する抗原結合性タンパク質が提供される。このヒトCD30L抗原結合性タンパク質は、CD30L/CD30相互作用に関連する生物学的応答のうち少なくとも1つを低減、阻害、妨害および/またはモジュレートすることができ、従って、CD30L関連の疾患または障害の影響を寛解するために有用である。CD30L抗原結合性タンパク質は、例えば、CD30L/CD30相互作用を低減、阻害、妨害および/またはモジュレートするために使用され得る。
【０００７】
一実施形態では、AA201〜234を含むCD30LのC末端領域に結合する単離された抗原結合性タンパク質が提供される。さらなる実施形態では、AA201〜234を含むCD30LのC末端領域およびAA75〜95によって規定される細胞外領域のN末端部分中に位置するCD30Lのさらなる領域に結合する抗原結合性タンパク質が提供される。本発明のさらなる実施形態では、この抗原結合性タンパク質は、a)CD30/CD30L相互作用を阻害する;b)CD30Lに誘導されるIL-8誘導を阻害する;c)ヒトCD30Lに対する結合について、抗体A〜Fのうち1つと交差競合(cross-competing)する;d)ヒトCD30Lに対する解離定数が最大で70pMである、およびe)抗体A〜Fのうち1つと実質的に同じまたはそれよりも高い親和性(より低いKD)で、ヒトCD30Lに結合するからなる群より選択される少なくとも1つの特性を有する。この親和性(即ちKD)は、当業者に公知のように、本明細書の実施例4に記載されるような、SPRまたはFACSなどによって、決定され得る。
【０００８】
さらなる実施形態では、この抗原結合性タンパク質はCD30Lに結合し、CD30Lに対する結合について、抗体A、B、C、D、EおよびFのうち1つまたは複数のFabと競合する。代替的に、前記抗原結合性タンパク質は、hCD30Lに対するその結合が、抗体A、B、C、D、EおよびFのうち1つまたは複数のFabの結合によって阻害される場合に、抗原結合性タンパク質として特徴付けられる。さらなる特定の実施形態では、このFabは、A1、A2、A3、A4、A5およびA6の各々が含まれる、抗体AのFabである。
【０００９】
一実施形態では、a)TABLE 3(表3)に示されるCDRH1と4、3、2または1以下のアミノ酸の置換、挿入または欠失によって異なるCDRH1;b)TABLE 3(表3)に示されるCDRH2と7、6、5、4、3、2または1以下のアミノ酸の置換、挿入および/または欠失によって異なるCDRH2;c)TABLE 3(表3)に示されるCDRH3と11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1以下のアミノ酸の置換、挿入および/または欠失によって異なるCDRH3からなる群より選択されるCDRH1、CDRH2およびCDRH3を含む少なくとも1つの重鎖可変領域を含み;ならびにd)TABLE 3(表3)に示されるCDRL1と4、3、2または1以下のアミノ酸の置換、挿入および/または欠失によって異なるCDRL1;e)TABLE 3(表3)に示されるCDRL2と2または1以下のアミノ酸の置換、挿入または欠失によって異なるCDRL2;f)TABLE 3(表3)に示されるCDRL3と2または1以下のアミノ酸の置換、挿入または欠失によって異なるCDRL3からなる群より選択されるCDRL1、CDRL2およびCDRL3を含む少なくとも1つの軽鎖可変領域を含む、CD30Lに結合する単離された抗原結合性タンパク質が提供される。関連の実施形態では、配列番号14、15、16、17、18および33からなる群より選択されるCDRH1;配列番号19、20、21、22、23、24および34からなる群より選択されるCDRH2;配列番号25、26、27、28、29および35からなる群より選択されるCDRH3;配列番号1、2、3、4、5、6および30からなる群より選択されるCDRL1;配列番号7、8、9、10および31からなる群より選択されるCDRL2;ならびに配列番号11、12、13および32からなる群より選択されるCDRL3、が提供される。
【００１０】
別の実施形態は、CDR1が、配列番号36、28、40、42もしくは44のアミノ酸残基23〜36を含み、CDR2が、アミノ酸残基52〜58を含み、CDR3が、アミノ酸残基91〜100を含む、CDR1、CDR2およびCDR3を含む少なくとも1つの軽鎖可変領域;またはb)CDR1が、配列番号46のアミノ酸残基25〜36を含み、CDR2が、アミノ酸残基52〜58を含み、CDR3が、アミノ酸残基91〜100を含む、CDR1、CDR2およびCDR3を含む軽鎖可変領域;ならびにCDR1が、配列番号48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70もしくは72のアミノ酸残基31〜35を含み、CDR2が、アミノ酸残基50〜65を含み、CDR3が、アミノ酸残基98〜113を含む、CDR1、CDR2およびCDR3を含む少なくとも1つの重鎖可変領域を含む、ヒトCD30Lに結合する単離された抗原結合性タンパク質を提供する。関連の実施形態では、少なくとも1つの重鎖可変領域および少なくとも1つの軽鎖可変領域を含む抗原結合性タンパク質が提供される。別の実施形態では、少なくとも2つの重鎖可変領域および少なくとも2つの軽鎖可変領域を含む抗原結合性タンパク質が提供される。
【００１１】
別の実施形態では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、CD30Lに結合する単離された抗原結合性タンパク質であって、重鎖可変領域配列が、TABLE 2(表2)に示される重鎖可変領域配列と31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1以下のアミノ酸の置換、付加および/または欠失によって異なり;軽鎖可変領域配列が、TABLE 1(表1)に示される軽鎖可変領域配列と30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1以下のアミノ酸の置換、付加および/または欠失によって異なる、CD30Lに結合する単離された抗原結合性タンパク質が提供される。
【００１２】
別の実施形態は、配列番号48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70および72に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列から構成される重鎖可変領域;ならびに配列番号36、38、40、42、44および46に対して少なくとも88%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、CD30Lに結合する単離された抗原結合性タンパク質を提供する。
【００１３】
一実施形態では、a)配列番号48、50、52、54、56、58、60および62からなる群より選択される重鎖可変領域ならびに配列番号36の軽鎖可変領域;b)配列番号64の重鎖可変領域および配列番号38の軽鎖可変領域;c)配列番号66の重鎖可変領域および配列番号40の軽鎖可変領域;d)配列番号68の重鎖可変領域および配列番号42の軽鎖可変領域;e)配列番号70の重鎖可変領域および配列番号44の軽鎖可変領域;ならびにf)配列番号72の重鎖可変領域および配列番号46の軽鎖可変領域からなる群より選択される、CD30Lに結合する単離された抗原結合性タンパク質が提供される。関連の実施形態では、この単離された抗原結合性タンパク質は抗体である。なお別の関連の実施形態では、この抗体は、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多特異性抗体またはそれらの抗体断片である。さらなる実施形態では、この抗体断片は、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片、ダイアボディ(diabody)または単鎖抗体分子である。関連の実施形態では、この抗原結合性タンパク質は、ヒト抗体である。なお別の関連の実施形態では、この抗原結合性タンパク質は、モノクローナル抗体である。さらなる関連の実施形態では、この抗原結合性タンパク質は、IgG1型、IgG2型、IgG3型またはIgG4型である。関連の実施形態では、この抗原結合性タンパク質は、IgG1型またはIgG2型である。
【００１４】
別の実施形態は、上記抗原結合性タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。関連の実施形態では、少なくとも1つの重鎖可変領域は、配列番号49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71および73からなる群より選択される単離された核酸分子によってコードされ、少なくとも1つの軽鎖可変領域は、配列番号37、39、41、43、45および47からなる群より選択される単離された核酸分子によってコードされる。別の関連の実施形態では、この核酸分子は、制御配列に作動可能に連結されている。さらなる関連の実施形態では、上記核酸を含むベクターおよびかかるベクターを含む宿主細胞が提供される。なおさらなる実施形態では、上記核酸分子またはその相補体の断片である、ハイブリダイゼーションプローブ、PCRプライマーまたは配列決定プライマーとしての使用に十分な、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００１５】
別の実施形態は、その抗原結合性タンパク質を分泌する宿主細胞から抗原結合性タンパク質を調製する工程を含む、上記抗原結合性タンパク質を作製する方法を提供する。
【００１６】
別の実施形態は、抗原結合性タンパク質が、a)CD30/CD30L相互作用を阻害する;b)CD30Lに誘導されるIL-8誘導を阻害する;c)ヒトCD30Lに対する結合について、抗体A〜Fのうち1つと交差競合する;d)解離定数≦70pMである、およびe)抗体A〜Fのうち1つと実質的に同じKdで、ヒトCD30Lに結合するからなる群より選択される少なくとも1つの特性を有する、上記単離された抗原結合性タンパク質を提供する。
【００１７】
なお別の実施形態では、上記少なくとも1つの抗原結合性タンパク質および医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提供される。関連の実施形態は、標識基またはエフェクター基をさらに含むかかる医薬組成物をさらに提供する。別の関連の実施形態では、この標識基は、同位体標識、磁気標識、酸化還元活性のある部分、光学色素、ビオチン化基、および二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープからなる群より選択される。さらなる関連の実施形態では、このエフェクター基は、放射性同位体、放射性核種、毒素、治療基および化学療法基からなる群より選択される。別の関連の実施形態では、この抗原結合性タンパク質は、標識基にカップリングされている。
【００１８】
別の実施形態は、有効量の上記少なくとも1つの単離された抗原結合性タンパク質を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、患者においてCD30Lと関連する状態を処置または予防する方法を提供する。なお別の関連の実施形態では、この単離された抗原結合性タンパク質は、単独でまたは併用治療として投与される。
【００１９】
別の実施形態は、有効量の上記少なくとも1つの抗原結合性タンパク質を投与する工程を含む、患者においてCD30L活性を低減させる方法を提供する。
【００２０】
なお別の実施形態では、上記少なくとも1つの抗原結合性タンパク質と競合する抗原結合性タンパク質が提供される。
【００２１】
別の実施形態では、完全にまたは部分的に非フコシル化された(afucosylated)、上記抗原結合性タンパク質が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】Ramos細胞およびNKエフェクターを示す図であり、白抜き四角:Rituxan(IgG1)、黒塗りひし形:抗体A1 IgG1f、黒塗り四角:抗体A1 IgG1、白抜き円:抗体A1 IgG2である。
【図１Ｂ】JD38細胞およびNKエフェクターを示す図であり、白抜き四角:Rituxan(IgG1)、黒塗りひし形:抗体A1 IgG1f、黒塗り四角:抗体A1 IgG1、白抜き円:抗体A1 IgG2である。
【図１Ｃ】DS179細胞およびNKエフェクターを示す図であり、白抜き四角:Rituxan(IgG1)、黒塗りひし形:抗体A1 IgG1f、黒塗り四角:抗体A1 IgG1、白抜き円:抗体A1 IgG2である。
【図１Ｄ】EW36細胞およびNKエフェクターを示す図であり、白抜き四角:Rituxan(IgG1)、黒塗りひし形:抗体A1 IgG1f、黒塗り四角:抗体A1 IgG1、白抜き円:抗体A1 IgG2である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、CD30LとCD30との間の相互作用を遮断する抗原結合性タンパク質、例えば、抗CD30L抗体、抗体断片および抗体誘導体、例えば、中和性の抗CD30L抗体、抗体断片または抗体誘導体を含む、CD30L抗原結合性タンパク質に関する、組成物、キットおよび方法を提供する。CD30Lに結合するポリペプチドの全てまたは一部分をコードする核酸の配列を含むポリヌクレオチドならびにその誘導体および断片、例えば、抗CD30L抗体、抗体断片または抗体誘導体の全てまたは一部分をコードするポリヌクレオチド、かかる核酸を含むプラスミドおよびベクター、ならびにかかるポリヌクレオチドならびに/またはベクターおよびプラスミドを含む細胞または細胞株もまた、提供される。提供される方法には、例えば、抗CD30L抗体などのCD30L抗原結合性タンパク質を作製、同定または単離する方法、分子がCD30LとCD30との間の相互作用を遮断するか否かを決定する方法、分子がCD30Lをアンタゴナイズするか否かを決定する方法、CD30L抗原結合性タンパク質を含む医薬組成物などの組成物を作製する方法、ならびに対象にCD30L抗原結合性タンパク質を投与する方法、例えば、CD30Lによって媒介される状態を処置する方法およびin vivoまたはin vitroでCD30LとCD30との間の相互作用を遮断する方法が、含まれる。
【００２４】
本明細書で特に規定しない限り、本発明と関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学、およびハイブリダイゼーションと関連して使用される術語体系、ならびにそれらの技術は、当該分野で周知であり、一般に使用されるものである。本発明の方法および技術は、特記しない限り、当該分野で周知の従来の方法に従って、本明細書中で引用および議論される種々の一般的およびより特異的な言及で記載された通りに、一般に実施される。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(2001)およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates(1992)、ならびにHarlowおよびLane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1990)を参照のこと。酵素反応および精製技術は、当該分野で一般に達成されるように、または本明細書に記載されるように、製造業者の仕様書に従って実施される。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学ならびに医薬品化学および製薬化学に関連して使用される用語法、ならびにそれらの実験室手順および技術は、当該分野で周知であり、一般に使用されるものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、医薬品調製、製剤および送達、ならびに患者の処置のために使用され得る。
【００２５】
特許、特許出願、記事、書籍および論文が含まれるがこれらに限定されない、本出願で引用された全ての文献または文献の一部分は、例えば、本明細書に記載される情報に関して使用され得るかかる刊行物中に記載される方法論を説明および開示することを目的として、その全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【００２６】
用語「CD30リガンド」(CD30L)とは、そのCD30結合性ムテインを含む、Smithら、Cell 73:1349〜1360、1993および米国特許第5,480,981号に開示されたような、CD30に結合することが可能なポリペプチドの属を指し;かかるポリペプチドには、膜結合型タンパク質(細胞質ドメイン、膜貫通領域および細胞外ドメインを含む)ならびにCD30結合特性を保持する短縮型タンパク質が含まれる。かかる短縮型タンパク質には、例えば、細胞外(受容体結合)ドメインのみを含む可溶性CD30Lが含まれる。CD30に結合する能力を保持する全長CD30Lポリペプチドの一部分、またはCD30ポリペプチドと特異的に結合するもしくはNF-κBの活性化などの生物学的シグナルを伝達することが可能な全長CD30の一部分に特異的に結合する抗体を惹起することが可能な全長CD30Lポリペプチドの一部分を含む、CD30L断片もまた含まれる。
【００２７】
用語「CD30」とは、TNF/NGF受容体スーパーファミリーのメンバーである受容体を指し、そのクローニングは、Durkopら(Cell 68:421、1992)に記載されている。語句「可溶性CD30」(sCD30)とは、CD30タンパク質の細胞外ドメインの全てまたは一部を含み、CD30Lと特異的に結合する能力を保持する、可溶性分子を指す。可溶性CD30ポリペプチドは、高度に精製された形態の組換えsCD30および天然に存在するsCD30タンパク質を包含する。
【００２８】
本明細書で使用する場合、語句「CD30の断片」とは、CD30Lに結合する能力を保持する全長CD30Lポリペプチドの一部分、またはCD30ポリペプチドと特異的に結合するもしくはNF-κBの活性化などの生物学的シグナルを伝達することが可能な全長CD30の一部分に特異的に結合する抗体を惹起することが可能な全長CD30Lポリペプチドの一部分を指す。
【００２９】
語句「CD30/CD30L相互作用」とは、本明細書で使用する場合、CD30によるシグナル伝達を生じる、CD30Lに対するCD30の特異的結合を指す。これには、少なくとも1つの結合パートナーがCD30またはCD30Lのいずれかの断片である場合が含まれる、即ち、この用語は、CD30Lに対するCD30断片の結合相互作用、CD30L断片に対するCD30の結合相互作用、またはCD30L断片に対するCD30断片の結合相互作用を指し得る。さらに、CD30/CD30L相互作用は、CD30Lに特異的に結合することが可能なCD30のアナログ(例えば、対立遺伝子バリアントまたはムテイン)を含み得る、またはCD30に特異的に結合することができるCD30Lのアナログ(例えば、対立遺伝子バリアントまたはムテイン)を含み得る。さらに、CD30/CD30L相互作用は、内因性CD30もしくはCD30Lタンパク質のいずれかを含み得る、または組換えタンパク質をコードする核酸でトランスフェクトされた細胞によって発現される組換えCD30もしくはCD30Lを含み得る。
【００３０】
用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖核酸および二本鎖核酸の両方を含み、天然で通常見出される配列と関連していない、ゲノムDNA、RNA、mRNA、cDNAまたはその合成起源もしくはある種の組み合わせを含む。特定された配列に加えて、特定された配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、最大10もしくはさらには最大20までの他のタンパク質もしくはその一部分についてのコード配列を含み得る、または列挙された核酸配列のコード領域の発現を制御する作動可能に連結された調節配列を含み得る、および/またはベクター配列を含み得る。このポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかの型のヌクレオチドの改変形態であり得る。この改変には、ブロモウリジン誘導体およびイノシン誘導体などの塩基改変、2',3'-デオキシリボースなどのリボース改変、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート(phosphorodithioate)、ホスホロセレノエート(phosphoroselenoate)、ホスホロジセレノエート(phosphorodiselenoate)、ホスホロアニロチオエート(phosphoroanilothioate)、ホスホルアニラデート(phoshoraniladate)およびホスホロアミデート(phosphoroamidate)などのヌクレオチド間連結改変が含まれる。
【００３１】
用語「オリゴヌクレオチド」は、100以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、10〜60塩基長である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、12、13、14、15、16、17、18、19または20〜40ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば変異体遺伝子の構築における使用のために、一本鎖または二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイのために、検出可能な標識、例えば、放射性標識、蛍光標識、ハプテンまたは抗原性標識を含み得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、PCRプライマー、クローニングプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。
【００３２】
用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、ネイティブタンパク質、即ち、天然に存在する非組換え細胞によって産生されるタンパク質のアミノ酸配列を有する巨大分子を意味する;あるいは「ポリペプチド」または「タンパク質」は、遺伝子操作された細胞または組換え細胞によって産生され、ネイティブタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、またはネイティブ配列のアミノ酸残基からの1つもしくはそれ以上の欠失、ネイティブ配列のアミノ酸残基への1つもしくはそれ以上の挿入および/もしくはネイティブ配列のアミノ酸残基の1つもしくはそれ以上の置換を有する分子を含む。この用語には、1つまたは複数のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸およびポリマーの化学的アナログであるアミノ酸ポリマーもまた含まれる。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、CD30L抗原結合性タンパク質(例えば、抗体)、ならびにこの抗原結合性タンパク質配列のアミノ酸残基からの1つまたは複数の欠失、この抗原結合性タンパク質配列のアミノ酸残基への1つまたは複数の付加および/またはこの抗原結合性タンパク質配列のアミノ酸残基の1つまたは複数の置換を有する配列を包含する。用語「ポリペプチド断片」とは、全長ネイティブタンパク質と比較して、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失および/または内部欠失を有するポリペプチドを指す。かかる断片は、ネイティブタンパク質と比較して、改変されたアミノ酸もまた含み得る。特定の実施形態では、断片は、約5〜500アミノ酸長である。例えば、断片は、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400または450アミノ酸長であり得る。有用なポリペプチド断片には、結合ドメインを含む、抗体の免疫学的に機能的な断片が含まれる。抗体などのCD30L抗原結合性タンパク質の場合、有用な断片には、1つまたは複数のCDR領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の一部分、3つ未満のCDRを含む可変領域の一部分などが含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
「アミノ酸」は、当該分野におけるその通常の意味を含む。20種の天然に存在するアミノ酸およびその略号は、従来の用法に従う。Immunology-A Synthesis、第2版(E. S. GolubおよびD. R. Gren編)、Sinauer Associates: Sunderland、Mass.(1991)を参照のこと。20種の従来のアミノ酸の立体異性体(例えば、D-アミノ酸)、非天然のアミノ酸、例えば、α-,α-二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸および他の非従来型のアミノ酸もまた、ポリペプチドに適した成分であり得る。非従来型のアミノ酸の例には、4-ヒドロキシプロリン、γ -カルボキシグルタミン酸、ε-N,N,N-トリメチルリジン、ε-N-アセチルリジン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、σ-N-メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸およびイミノ酸(例えば、4-ヒドロキシプロリン)が含まれる。本明細書で使用されるポリペプチド表記では、標準的な用法および慣習に従って、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシル末端方向である。
【００３４】
用語「単離されたタンパク質」とは、その治療的使用、診断的使用、予防的使用、研究的使用または他の使用を妨害するタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の夾雑物から精製された、抗原結合性タンパク質(その一例は抗体であり得る)などのタンパク質を指す。本明細書で使用する場合、「実質的に純粋な」とは、分子の記載された種が、存在する優勢な種であること、即ち、モル濃度基準で、分子の記載された種が、同じ混合物中の任意の他の個々の種よりも豊富であることを意味する。特定の実施形態では、実質的に純粋な分子は、存在する全ての巨大分子種の少なくとも50%(モル濃度基準)を対象の種が構成する組成物である。他の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、この組成物中に存在する全ての巨大分子種の少なくとも80%、85%、90%、95%または99%を構成する。特定の実施形態では、本質的に均質な物質は、夾雑する種が従来の検出方法によって組成物中で検出できない程度まで精製されており、従って、この組成物は単一の検出可能な巨大分子種からなる。
【００３５】
ポリペプチド(例えば、抗体などの抗原結合性タンパク質)の「バリアント」は、1つまたは複数のアミノ酸残基が、別のポリペプチド配列と比較してアミノ酸配列中に挿入されている、かかるアミノ酸配列から欠失されている、および/またはかかるアミノ酸配列中に置換されている、アミノ酸配列を含む。バリアントには、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドの「誘導体」は、例えば、別の化学的部分へのコンジュゲート化を介して、挿入バリアント、欠失バリアントまたは置換バリアントとは別個のいくつかの様式で化学的に改変されたポリペプチドである。
【００３６】
本明細書を通じて、ポリペプチド、核酸、宿主細胞などの生物学的材料と関連して使用される場合、用語「天然に存在する」または「ネイティブ」とは、天然に見出される材料を指す。この文脈では、「組換えタンパク質」は、組換え技術を使用して、即ち、本明細書に記載されるような組換え核酸の発現を介して、作製されたタンパク質である。組換えタンパク質の産生のための方法および技術は、当該分野で周知である。
【００３７】
用語「抗体」とは、標的抗原に対する特異的結合についてインタクトな抗体と競合し得る、任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリンまたはその断片を指し、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体および二特異性抗体が含まれる。かかる抗体は、抗体結合性タンパク質の一種である。特に示さない限り、用語「抗体」には、2つの全長重鎖および2つの全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、バリアント、断片およびムテインが含まれ、その例は以下に記載される。インタクトな抗体は一般に、少なくとも2つの全長重鎖および2つの全長軽鎖を含むが、いくつかの場合には、重鎖のみを含み得るラクダ科動物中に天然に存在する抗体など、より少ない鎖を含み得る。抗体は、単一の供給源のみから誘導されてもよく、「キメラ」であってもよい、即ち、抗体の異なる部分は、以下にさらに記載するように、2つの異なる抗体から誘導され得る。抗原結合性タンパク質、抗体または結合性断片は、ハイブリドーマ中で、組換えDNA技術によって、またはインタクトな抗体の酵素的切断もしくは化学的切断によって、産生され得る。
【００３８】
本明細書で使用する場合、抗体または免疫グロブリン鎖(重鎖または軽鎖)の用語「機能的断片」(または単に「断片」)は、全長鎖中に存在するアミノ酸の少なくともいくつかを欠くが抗原に対して特異的に結合することが可能である抗体の一部分(この一部分が如何にして取得または合成されたかによらない)を含む抗原結合性タンパク質である。かかる断片は、標的抗原に特異的に結合し、所与のエピトープに対する特異的結合について、インタクトな抗体を含む他の抗原結合性タンパク質と競合し得るという点において、生物学的に活性である。一態様では、かかる断片は、全長軽鎖または重鎖中に存在する少なくとも1つのCDRを保持し、いくつかの実施形態では、単一の重鎖および/もしくは軽鎖またはそれらの一部分を含む。これらの生物学的に活性な断片は、組換えDNA技術によって産生されてもよく、またはインタクトな抗体を含む抗原結合性タンパク質の酵素的切断もしくは化学的切断によって産生されてもよい。断片には、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、ドメイン抗体および単鎖抗体などの免疫学的に機能的な断片が含まれるがこれらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ラクダ科動物またはウサギが含まれるがこれらに限定されない任意の哺乳動物供給源から誘導され得る。本明細書に開示される抗原結合性タンパク質の機能的部分、例えば、1つまたは複数のCDRが、二機能性治療特性を有するまたは延長した血清半減期を有する、身体中の特定の標的に対する治療剤を創出するために、第2のタンパク質または小分子に共有結合され得ることが、さらに企図される。
【００３９】
用語「競合する」とは、抗原結合性タンパク質(例えば、中和性の抗原結合性タンパク質または中和抗体)の文脈において使用する場合、試験中の抗原結合性タンパク質(例えば、抗体またはその免疫学的に機能的な断片)が共通抗原(例えば、CD30Lタンパク質またはその断片)に対する参照抗原結合性タンパク質(例えば、リガンドまたは参照抗体)の特異的結合を防止または阻害するアッセイによって決定される、抗原結合性タンパク質間の競合を意味する。以下のような、競合的結合アッセイの多数の型が使用され得る:固相の直接的または間接的ラジオイムノアッセイ(RIA)、固相の直接的または間接的酵素イムノアッセイ(EIA)、サンドイッチ競合アッセイ(例えば、Stahliら、1983、Methods in Enzymology 92:242〜253を参照のこと);固相の直接的ビオチン-アビジンEIA(例えば、Kirklandら、1986、J. Immunol. 137:3614〜3619を参照のこと)固相の直接的標識化アッセイ、固相の直接的標識化サンドイッチアッセイ(例えば、HarlowおよびLane、1988、Antibodies、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Pressを参照のこと);I-125標識を使用した固相の直接的標識RIA(例えば、Morelら、1988、Molec. Immunol. 25:7〜15を参照のこと);固相の直接的ビオチン-アビジンEIA(例えば、Cheung、ら、1990、Virology 176:546〜552を参照のこと);および直接的標識化RIA(Moldenhauerら、1990、Scand. J. Immunol. 32:77〜82)。典型的には、かかるアッセイは、これらのいずれかを有する固体表面または細胞上に結合した精製された抗体、未標識の試験抗原結合性タンパク質および標識された参照抗原結合性タンパク質の使用を含む。異なるアプローチが、当業者に公知のように採用され得る。代替的な選択肢は、任意選択で可撓性マトリックスを介してプレートに結合した参照抗原結合性タンパク質を有することを含む。さらなるバリエーションは、添加の順序、即ち、抗原がプレート結合した参照抗原結合性タンパク質または試験抗原結合性タンパク質と最初に混合されるか否かに、基づき得る。全てのシナリオにおいて、抗原結合性タンパク質による抗原の飽和が、偽の非競合的結果を回避するために必要とされる。
【００４０】
競合的阻害は、試験抗原結合性タンパク質の存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することによって測定される。通常、この試験抗原結合性タンパク質は、過剰量で存在する。競合アッセイによって同定される抗原結合性タンパク質(競合する抗原結合性タンパク質)には、参照抗原結合性タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合性タンパク質、および立体障害が生じるように参照抗原結合性タンパク質によって結合されるエピトープに対して十分に近位の近接エピトープに結合する抗原結合性タンパク質が含まれる。通常、競合する抗原結合性タンパク質が過剰量で存在する場合、これは、共通抗原に対する参照抗原結合性タンパク質の特異的結合を、少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%または75%阻害する。いくつかの場合には、結合は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上、阻害される。
【００４１】
競合実験は、異なる感度を有し得る異なる型の分子を用いて実施され得る。抗原結合性タンパク質が抗体である場合、この分子は二価である。抗原結合性分子がFabである場合、これは一価であり、全長抗体よりも実質的に小さく、結果的に立体障害は少なくなる。競合実験では、これは、であり得る。特定の抗原結合性タンパク質について、hCD30Lに対する結合は、本明細書で規定される抗体抗原結合性タンパク質、例えば、抗体A、B、C、D、EおよびFのいずれか1つのFabの結合によって阻害される。
【００４２】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗原結合性タンパク質が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続するアミノ酸またはタンパク質の三次折り畳みによって並列された連続しないアミノ酸の両方から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露の際に保持されるが、三次折り畳みによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒での処理の際に失われる。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基などの、分子の化学的に活性な表面基を含み得、特定の3次元構造特徴および/または特定の電荷特徴を有し得る。エピトープは典型的に、独自の空間コンフォメーション中に、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35のアミノ酸を含む。エピトープは、当該分野で公知の方法を使用して決定され得る。
【００４３】
抗原結合性タンパク質の結合は、この抗原結合性タンパク質が相互作用する抗原の領域(単数または複数)によっても記載され得る。相互作用のかかる領域(複数可)は、例えば、バリアント抗原分子を使用する結合アッセイを実施することによって、または本明細書に例示されるHX-MS(実施例6を参照のこと)によって、当該分野で公知の種々の方法によって決定され得、それにより、抗原と抗原結合性タンパク質との相互作用の領域(複数可)が決定される。
【００４４】
このHX-MSテクノロジーは、タンパク質の水素交換(HX)が、質量分析(MS)によって容易に追跡され得ることを利用している。水素を含む水性溶媒を、重水素を含む水性溶媒で置き換えることによって、タンパク質中の所与の部位における重水素原子の取り込みが、1Daの質量増加を生じる。この質量増加は、交換反応のクエンチされたサンプル中で、質量分析によって時間の関数としてモニタリングされ得る。重水素標識化情報は、クエンチ条件下でのペプシン消化によっておよび得られたペプチドの質量増加に従って、タンパク質中の領域に下位局在化され得る。HX-MSは、抗体-抗原相互作用を含むタンパク質-タンパク質複合体形成の際に低減された水素交換の領域を同定することによって、分子相互作用に関与する部位を探索するために使用され得る。通常、結合界面は、溶媒の立体排除に起因する水素交換における顕著な低減によって明らかになる。タンパク質-タンパク質複合体形成は、時間の関数として、それぞれの結合パートナーの存在下および非存在下で、いずれかのタンパク質メンバー中に取り込まれた重水素の総量を測定することによって、HX-MSのみによって検出され得る。このHX-MS技術は、ネイティブ成分、即ちタンパク質および抗体またはFab断片を使用し、溶液中で実施される。従って、HX-MSは、in vivo条件を模倣する可能性を提供する(HX-MSテクノロジーの概説については、例えば、WalesおよびEngen、Mass Spectrom. Rev. 25、158 (2006)を参照のこと)。
【００４５】
本明細書に記載される特定の抗原結合性タンパク質は、AA201〜234によって規定されるヒトCD30LのC末端領域を介して、CD30Lと相互作用するまたはCD30Lに結合する。この抗原結合性タンパク質は、AA201〜234、またはAA205〜230もしくはAA211〜226などのより小さい領域によって規定されるヒトCD30LのC末端領域に結合する可能性がある。上記のように、エピトープは、連続していなくてもよく、従って、相互作用の領域であり得る。一実施形態では、本発明に従う抗原結合性タンパク質は、CD30Lの少なくとも2つの領域と結合する。かかる本発明に従うさらなる抗原結合性タンパク質は、上記のC末端領域、および細胞外ドメインのN末端部分中に位置するヒトCD30Lのさらなる領域、例えば全長hCD30LのAA70〜100によって規定される領域と相互作用し得る。かかる抗原結合性タンパク質は、AA201〜234、AA205〜230もしくはAA211〜226によって規定されるC末端領域に加えて、AA75〜95、またはAA80〜90もしくはAA82〜88などのより短い領域に結合し得る。
【００４６】
CD30L抗原結合性タンパク質
「抗原結合性タンパク質」は、本明細書で使用する場合、特定された標的抗原に特異的に結合するタンパク質を意味する;本明細書で提供される抗原は、CD30L、特にヒトCD30Lである。抗原結合性タンパク質には、例えば、CD30LとCD30との相互作用を遮断または阻害するものが含まれる。かかる「遮断性の」抗原結合性タンパク質は、CD30Lまたはその断片、バリアントもしくは誘導体に対して開発され得、CD30LとCD30との相互作用を妨害する能力について、従来のアッセイでスクリーニングされ得る。適切なアッセイの例は、本明細書に記載される、CD30LとCD30との相互作用を阻害する抗原結合性タンパク質の能力を試験するアッセイである。抗原結合性タンパク質には、CD30Lを阻害するものまたはCD30Lを活性化するものもまた含まれる。かかる阻害または中和は、抗原結合性タンパク質の非存在下における応答と比較して、抗原結合性タンパク質の存在下における生物学的応答を破壊し、当該分野で公知の、および本明細書に記載されるアッセイを使用して決定され得る。本明細書で提供される抗原結合性タンパク質は、例えば、CD30+細胞からのIL-8産生を誘導する。本明細書に開示される抗原結合性タンパク質はまた、他のTNFスーパーファミリーメンバー、特に4-1BBL、OX-40L、TNFα、TNFβ、RANKL、Trail、CD40LまたはCD27Lには結合しない。
【００４７】
異なるCD30L抗原結合性タンパク質は、CD30Lの異なるドメインもしくはエピトープに結合し得、または異なる作用機構によって作用し得る。CD30L抗原結合性タンパク質は、本明細書に記載される使用を見出すために、CD30L誘導される活性を完全に阻害する必要はない;むしろ、CD30Lの特定の活性を低減させる抗原結合性タンパク質が、使用のために同様に企図される。抗原結合性タンパク質には、ヒトCD30Lとの結合について交差競合するもの;本明細書に記載される参照抗原結合性タンパク質のいずれかと、ヒトCD30Lの同じエピトープに結合するもの;実質的に同じKdでヒトCD30Lに結合するもの;実質的に同じオフレート(off rate)でCD30Lに結合するもの、もまた含まれる。かかる特徴を測定するための種々の方法は、当該分野で公知であり、本明細書に記載されている。
【００４８】
CD30L+細胞を枯渇させるCD30L抗原結合性タンパク質もまた提供される。かかる枯渇性のCD30L抗原結合性タンパク質を用いた場合、その抗原標的を含む細胞に対する抗原結合性タンパク質の結合は、抗原の阻害もしくは細胞機能の阻害を生じ、または細胞の死を生じる。一実施形態では、本発明の枯渇性の抗体は、CD30Lに結合し、CD30に対するCD30Lリガンドの結合を遮断してもしなくてもよい。従って、枯渇性の抗原結合性タンパク質には、遮断性および非遮断性の抗原結合性タンパク質が特異的に含まれる。一態様では、CD30L+細胞を枯渇させるCD30L抗原結合性タンパク質は、当該分野で公知のアポトーシスアッセイによって決定されるように、アポトーシスまたはプログラム細胞死を誘導し得る。かかるCD30L抗原結合性タンパク質は、1)免疫応答を誘導するために、CD30L+細胞と相互作用する細胞を排除すること、および/または2)CD30Lが、特定の免疫応答に関与するが、そうするためにCD30+細胞と必ずしも相互作用する必要がない細胞型の細胞表面マーカーである、細胞を排除することによって、免疫調節機能を有し得る。この場合、CD30Lは、特定の疾患に関連する細胞型のマーカーであり、CD30/CD30L相互作用は、その疾患自体の病理発生に関与していなくてもよい。別の実施形態は、コンジュゲート化された毒素または細胞傷害剤を含む枯渇性の抗原結合性タンパク質を含み、この毒素または細胞傷害剤は、抗原結合性タンパク質コンジュゲートに結合する細胞の枯渇を誘導する。
【００４９】
抗原結合性タンパク質は、抗原に結合する部分、および任意選択で、抗原に対する抗原結合性タンパク質の結合を促進するコンフォメーションを抗原結合性部分に取らせる足場またはフレームワーク部分を含み得る。抗原結合性タンパク質の例には、抗体、抗体断片(例えば、抗体の抗原結合性部分)、抗体誘導体および抗体アナログが含まれる。この抗原結合性タンパク質は、CDRまたはCDR誘導体がグラフトされた代替的タンパク質足場または人工足場を含み得る。かかる足場には、例えば抗原結合性タンパク質の3次元構造を安定化するために導入された変異を含む抗体由来の足場、ならびに例えば生体適合性ポリマーを含む全体的に合成の足場が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Korndorferら、Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics、(2003)第53巻、第1号:121〜129;Roqueら、Biotechnol. Prog.、2004、20:639〜654を参照のこと。さらに、ペプチド抗体模倣物(「PAM」)、ならびに足場としてフィブロネクチン成分を利用する抗体模倣物に基づく足場が使用され得る。
【００５０】
本明細書に記載される特定の抗原結合性タンパク質は、抗体であるまたは抗体から誘導される。かかる抗原結合性タンパク質には、それぞれ、モノクローナル抗体、二特異性抗体、ミニボディ(minibody)、ドメイン抗体、合成抗体、抗体模倣物、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物、抗体コンジュゲート、単鎖抗体およびそれらの断片が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの場合には、この抗原結合性タンパク質は、抗体の免疫学的断片(例えば、Fab、Fab'、F(ab')2またはscFv)である。種々の構造が、本明細書でさらに記載され定義される。
【００５１】
提供される特定の抗原結合性タンパク質は、本明細書に記載される1つまたは複数のCDR(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つまたはそれ以上のCDR)を含み得る。いくつかの場合には、この抗原結合性タンパク質は、(a)ポリペプチド構造ならびに(b)このポリペプチド構造中に挿入されたおよび/またはこのポリペプチド構造に接続された1つまたは複数のCDRを含む。このポリペプチド構造は、種々の異なる形態を取り得る。例えば、このポリペプチド構造は、天然に存在する抗体のフレームワークまたはその断片もしくはバリアントであり得るまたはこれらを含み得るか、あるいは事実上完全に合成であり得る。種々のポリペプチド構造の例は、以下にさらに記載される。
【００５２】
本明細書で提供される特定の抗原結合性タンパク質は、ヒトCD30Lに特異的に結合する。「特異的に結合する」とは、本明細書で使用する場合、平衡解離定数(KD)が、<10-8〜<10-10M、代替的には<10-9〜<10-10M、より具体的には<10-11M〜<10-12Mであることを意味する。一実施形態では、この抗原結合性タンパク質は、10-8、または例えば5.0×10-9または例えば10-9またはさらには5.0×10-10の平衡解離定数(KD)によって表される高い親和性で結合する。この平衡解離定数は、当該分野で公知のように決定され得る。かかる実施形態では、KDは典型的には、低密度で種を固定化し(この種は、多価であり得る)、滴定シリーズの一価の種を注入し(会合相)、次いで、複合体がばらばらになる解離相を準備することによって、決定される。一価複合体の会合および解離に対応する速度定数は、それぞれ会合速度定数kaおよび解離速度定数kdと呼ばれる。次いで、得られたデータは、3つのパラメーター:会合速度定数ka、解離速度定数kd、ならびに表面密度および化学量論に関するRmaxをフィットさせる1:1結合モデルにフィッティングされる。kd/kaの比は、平衡解離定数KDと等しい。
【００５３】
KDは、抗体がRamos細胞上のCD30L発現に結合された、本明細書の実施例4に記載されるようなFACS分析を使用して決定することもできる。
【００５４】
一実施形態は、本明細書に記載される単離された抗原結合性タンパク質であって、抗原結合性タンパク質が、少なくとも75pM、例えば50pM、例えば40pMの、ヒトCD30Lに対する親和性(即ちKD)を有する、単離された抗原結合性タンパク質に関する。さらなる実施形態では、ヒトCD30Lに対するこの抗原結合性タンパク質の解離定数(KD)は、最大でも35pM、例えば最大でも25pM、例えば20pM、例えば最大でも15pMである。この親和性(即ちKD)は、かかる実施形態では、本明細書の実施例4に記載されるように、FACSによって決定され得る。
【００５５】
別の態様は、in vitroまたはin vivo(例えば、ヒト対象に投与される場合)で少なくとも1日の半減期を有する抗原結合性タンパク質を提供する。一実施形態では、この抗原結合性タンパク質は、少なくとも3日の半減期を有する。別の実施形態では、この抗体またはその一部分は、4日以上の半減期を有する。別の実施形態では、この抗体またはその一部分は、8日以上の半減期を有する。別の実施形態では、この抗体またはその抗原結合性部分は、誘導体化していない抗体または改変していない抗体と比較して、より長い半減期を有するように、誘導体化または改変される。別の実施形態では、この抗原結合性タンパク質は、WIPO公開WO00/09560号に記載されるように、血清半減期を増加させる点変異を含む。
【００５６】
抗原結合性タンパク質が治療的適用に使用される実施形態では、抗原結合性タンパク質は、CD30Lの1つまたは複数の生物学的活性、例えば、CD30+細胞からのIL-8産生の誘導を、低減、阻害、妨害またはモジュレートし得る。
【００５７】
提供される抗原結合性タンパク質のいくつかは、天然に存在する抗体と典型的に関連した構造を有する。ある種の哺乳動物は単一の重鎖のみを有する抗体もまた産生するものの、これらの抗体の構造的単位は典型的に、各々2つの同一カプレットのポリペプチド鎖から構成される1つまたは複数のテトラマーを含む。典型的な抗体では、各対またはカプレットは、1つの全長「軽」鎖(特定の実施形態では、約25kDa)および1つの全長「重」鎖(特定の実施形態では、約50〜70kDa)を含む。各個々の免疫グロブリン鎖は、各々がおよそ90〜110アミノ酸からなり、特徴的な折り畳みパターンを示す、いくつかの「免疫グロブリンドメイン」から構成される。これらのドメインは、抗体ポリペプチドを構成する基本単位である。各鎖のアミノ末端部分は典型的に、抗原認識を担う可変領域を含む。カルボキシ末端部分は、その鎖の他方の末端よりも、進化的により保存されており、「定常領域」または「C領域」と呼ばれる。ヒト軽鎖は一般に、κおよびλ軽鎖として分類され、これらは各々、1つの可変領域および1つの定常ドメインを含む。重鎖は典型的に、μ、δ、γ、αまたはε鎖として分類され、これらは、それぞれIgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEとして抗体のアイソタイプを規定する。IgGは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4が含まれるがこれらに限定されない、いくつかのサブタイプを有する。IgMサブタイプには、IgMおよびIgM2が含まれる。IgAサブタイプには、IgA1およびIgA2が含まれる。ヒトでは、IgAおよびIgDアイソタイプは、4つの重鎖および4つの軽鎖を含み;IgGおよびIgEアイソタイプは、2つの重鎖および2つの軽鎖を含み;IgMアイソタイプは、5つの重鎖および5つの軽鎖を含む。重鎖定常領域(CH)は典型的に、エフェクター機能を担い得る1つまたは複数のドメインを含む。重鎖定常領域ドメインの数は、アイソタイプに依存する。例えば、IgG重鎖は各々、CH1、CH2およびCH3として公知の3つのCH領域ドメインを含む。提供される抗原結合性タンパク質は、これらのアイソタイプおよびサブタイプのいずれかを有し得る、例えば、CD30L抗原結合性タンパク質は、IgG1、IgG2またはIgG4サブタイプのCD30L抗原結合性タンパク質である。IgG4が所望される場合、IgG4抗体における不均一性を導き得るH鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減するために、Bloomら、1997、Protein Science 6:407に記載されるように、ヒンジ領域中に点変異(CPSCP->CPPCP)を導入することもまた望まれ得る。1つの型の本明細書に提供される抗体は、サブクラス切り替え法を使用して、異なる型に変化され得る。例えば、Lanttoら、2002、Methods Mol. Biol. 178:303〜316を参照のこと。
【００５８】
全長軽鎖および重鎖では、可変領域および定常領域は、約12アミノ酸以上の「J」領域によって接続され、重鎖は、約10アミノ酸以上の「D」領域もまた含む。例えば、Fundamental Immunology、第2版、第7章(Paul, W.編)1989、New York: Raven Pressを参照のこと。各軽鎖/重鎖対の可変領域は典型的に、抗原結合部位を形成する。
【００５９】
可変領域
本明細書に提供される種々の重鎖および軽鎖可変領域(またはドメイン)は、TABLE 1(表1)およびTABLE 2(表2)に示される。これらの可変領域の各々は、例えば、上記重鎖および軽鎖定常領域に結合され得る。さらに、そうして生成された重鎖および軽鎖配列の各々は、完全抗原結合性タンパク質構造を形成するために組み合わされ得る。
【００６０】
【表１】
0006370774.tif 000002
【００６１】
【表２】
0006370774.tif 000003
【００６２】
TABLE 1(表1)およびTABLE 2(表2)に示されるような、VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12およびVH13からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖可変領域(VH)ならびに/またはVL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6からなる群より選択される少なくとも1つの軽鎖可変領域(VL)を含む抗原結合性タンパク質が提供される。
【００６３】
TABLE 2(表2)に列挙される重鎖可変領域の各々は、抗原結合性タンパク質を形成するために、TABLE 1(表1)に示される軽鎖可変領域のいずれかと組み合わされ得る。いくつかの場合には、この抗原結合性タンパク質は、TABLE 1(表1)およびTABLE 2(表2)に列挙されるもの由来の、少なくとも1つの重鎖可変領域および/または1つの軽鎖可変領域を含む。いくつかの場合には、この抗原結合性タンパク質は、TABLE 1(表1)およびTABLE 2(表2)に列挙されるもの由来の、少なくとも2つの異なる重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含む。重鎖可変領域の種々の組み合わせは、軽鎖可変領域の種々の組み合わせのいずれかと組み合わされ得る。
【００６４】
他の場合には、この抗原結合性タンパク質は、2つの同一の軽鎖可変領域および/または2つの同一の重鎖可変領域を含む。一例として、この抗原結合性タンパク質は、TABLE 1(表1)およびTABLE 2(表2)に列挙されるような軽鎖可変領域の対と重鎖可変領域の対との組み合わせで2つの軽鎖可変領域および2つの重鎖可変領域を含む、抗体または免疫学的に機能的な断片であり得る。2つの同一の重鎖および軽鎖可変領域を含むかかる抗原結合性タンパク質の例には、抗体A VH2/VL1;抗体A1 VH1/VL1;抗体A2 VH3/VL1;抗体A3 VH4/VL1;抗体A4 VH5/VL1;抗体A5 VH6/VL1;抗体A6 VH7/VL1;抗体A7 VH8/VL1;抗体B VH9/VL2;抗体C VH10/VL3;抗体D VH11/VL4;抗体E VH12/VL5および抗体F VH13/VL6が含まれる。
【００６５】
提供されるいくつかの抗原結合性タンパク質は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、31またはそれ以上のアミノ酸残基のみにおいて、TABLE 1(表1)およびTABLE 2(表2)から選択される重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域の配列とは異なるアミノ酸の配列を含む重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含み、各かかる配列の差異は、独立して、1アミノ酸の欠失、挿入または置換のいずれかである。いくつかの抗原結合性タンパク質では、この軽鎖および重鎖可変領域は、TABLE 1(表1)およびTABLE 2(表2)に提供されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。なお他の抗原結合性タンパク質、例えば、抗体または免疫学的に機能的な断片は、本明細書に記載されるように、バリアント重鎖領域形態および/またはバリアント軽鎖領域形態もまた含む。
【００６６】
用語「同一性」とは、配列をアラインし比較することによって決定されるような、2つ以上のポリペプチド分子の配列間または2つ以上のポリヌクレオチドの配列間の関連性を指す。「パーセント同一性」は、比較される分子中のアミノ酸間またはヌクレオチド間で同一な残基のパーセントを意味し、比較されている分子のうち最小のもののサイズに基づいて計算される。これらの計算のために、アラインメント中のギャップ(存在する場合)は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム(即ち、「アルゴリズム」)によって扱われるべきである。アラインされた核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用され得る方法には、Computational Molecular Biology、(Lesk, A. M.編)、1988、New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects、(Smith, D. W.編)、1993、New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data、第I部、(Griffin, A. M.およびGriffin, H. G.編)、1994、New Jersey: Humana Press; von Heinje, G.、1987、Sequence Analysis in Molecular Biology、New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer、(Gribskov, M.およびDevereux, J.編)、1991、New York: M. Stockton Press;およびCarilloら、1988、SIAM J. Applied Math. 48:1073に記載される方法が含まれる。
【００６７】
パーセント同一性を計算する場合、比較されている配列は、配列間の最大の一致を与えるような方法でアラインされる。パーセント同一性を決定するために使用されるコンピュータプログラムは、GCGプログラムパッケージであり、これは、GAP(Devereuxら、1984、Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group、University of Wisconsin、Madison、WI)を含んでいる。このコンピュータアルゴリズムGAPは、パーセント配列同一性が決定される2つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドをアラインするために使用される。これらの配列は、そのそれぞれのアミノ酸またはヌクレオチドの最適な一致(アルゴリズムによって決定される「一致したスパン」)を目指してアラインされる。ギャップオープニングペナルティ(これは、3×平均対角として計算され、「平均対角」は、使用されている比較行列の対角の平均であり;「対角」は、特定の比較行列によって各完全アミノ酸一致に割り当てられるスコアまたは数である)およびギャップ伸長ペナルティ(これは通常、ギャップオープニングペナルティの1/10倍である)、ならびにPAM 250またはBLOSUM 62などの比較行列が、このアルゴリズムと併せて使用される。特定の実施形態では、標準的な比較行列(PAM 250比較行列についてはDayhoffら、1978、Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345〜352を;BLOSUM 62比較行列についてはHenikoffら、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915〜10919を参照のこと)もまた、このアルゴリズムによって使用される。
【００６８】
GAPプログラムを使用してポリペプチド配列またはヌクレオチド配列に関するパーセント同一性を決定するために推奨されるパラメーターは、以下である:アルゴリズム: Needlemanら、1970、J. Mol. Biol. 48:443〜453;比較行列:Henikoffら、1992、上記のBLOSUM 62;ギャップペナルティ:12(最後のギャップについてはペナルティなし)、ギャップ長ペナルティ:4、類似性の閾値:0。2つのアミノ酸配列をアラインするための特定のアラインメントスキームは、2つの配列の短い領域のみの一致を生じ得、この小さいアラインされた領域は、2つの全長配列間に有意な関連性がない場合でさえも、非常に高い配列同一性を有し得る。従って、選択されたアラインメント方法(GAPプログラム)は、標的ポリペプチドの少なくとも50連続するアミノ酸にわたるアラインメントを生じるために、そのように望まれる場合、調整され得る。
【００６９】
相補性決定領域
相補性決定領域、即ち「CDR」は、重鎖および軽鎖可変領域中のフレームワーク内に埋め込まれ、ここで、これらは、抗原結合および認識を担う領域を構成する。同じ種の免疫グロブリン鎖の可変ドメインは、例えば、より小さい全体的構造を一般に示し;超可変CDR領域によって接続された比較的保存されたフレームワーク領域(FR)を含む。抗原結合性タンパク質は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つまたはそれ以上のCDRを有し得る。上で議論した可変領域は、例えば、3つのCDRを典型的に含む。重鎖可変領域および軽鎖可変領域由来のCDRは、標的抗原(例えば、CD30L)に特異的に結合する構造を形成するために、フレームワーク領域によって典型的に整列される。N末端からC末端に向けて、天然に存在する軽鎖および重鎖可変領域は共に、これらの要素の以下の順序に典型的に従う:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4。例示的な軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインのCDR領域およびFR領域は、TABLE 1(表1)およびTABLE 2(表2)中で強調されている。CDR領域とFR領域との境界は、強調されたものから変動し得ることが認識される。番号付け系が、これらのドメインの各々中の位置を占めるアミノ酸に番号を割り当てるために考案されている。所与の抗原結合性タンパク質の相補性決定領域およびフレームワーク領域は、これらの系を使用して同定され得る。番号付け系は、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、US Dept. of Health and Human Services、PHS、NIH、NIH刊行物番号91-3242、1991、またはChothiaおよびLesk、1987、J. Mol. Biol. 196:901〜917;Chothiaら、1989、Nature 342:878〜883で規定されている。免疫グロブリン鎖中のアミノ酸に関する他の番号付け系には、IMGT(登録商標)(国際ImMunoGeneTics情報システム;Lefrancら、Dev. Comp. Immunol. 2005、29:185〜203);およびAHo(HoneggerおよびPluckthun、J. Mol. Biol. 2001、309(3):657〜670)が含まれる。本明細書に提供されるCDRは、伝統的な抗体構造の抗原結合ドメインを規定するために使用され得るだけではなく、本明細書に記載される種々の他のポリペプチド構造中に埋め込まれ得る。
【００７０】
本明細書に開示される抗原結合性タンパク質は、1つまたは複数のCDRがグラフト、挿入、埋め込みおよび/または接続され得るポリペプチドである。抗原結合性タンパク質は、例えば、1つの重鎖CDR1(「CDRH1」)および/または1つの重鎖CDR2(「CDRH2」)および/または1つの重鎖CDR3(「CDRH3」)および/または1つの軽鎖CDR1(「CDRL1」)および/または1つの軽鎖CDR2(「CDRL2」)および/または1つの軽鎖CDR3(「CDRL3」)を有し得る。いくつかの抗原結合性タンパク質は、CDRH3およびCDRL3の両方を含む。特定の実施形態は一般に、非反復性のCDRの組み合わせを利用し、例えば、抗原結合性タンパク質は一般に、1つの可変重鎖領域中に2つのCDRH2領域を用いて作製されない、など。抗原結合性タンパク質は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16もしくはそれ以上のアミノ酸残基のみにおいて、TABLE 3(表3)に示されるCDRのうち1つもしくはそれ以上のアミノ酸配列と同一であるまたはそれらとは異なる1つまたは複数のアミノ酸配列を含み得、各かかる配列の差異は、独立して、1アミノ酸の欠失、挿入または置換のいずれかである。いくつかの抗原結合性タンパク質中のCDRは、TABLE 3(表3)に列挙されたCDR配列に対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。いくつかの抗原結合性タンパク質では、これらのCDRは、CDR(複数可)の適切な抗原結合特性が達成されるように、CDR(複数可)を方向付ける「フレームワーク」領域中に埋め込まれる。
【００７１】
【表３】
0006370774.tif 000004
【００７２】
配列番号36、38、40、42および44のアミノ酸残基23〜36;配列番号46のアミノ酸残基25〜36ならびに配列番号48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70および72のアミノ酸残基31〜35を含むCDR1領域が、本明細書で提供される。配列番号36、38、40、42、44および46のアミノ酸残基52〜58ならびに配列番号48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70および72のアミノ酸残基50〜65を含むCDR2領域が提供される。配列番号36、38、40、42、44および46のアミノ酸残基91〜100ならびに配列番号48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70および72のアミノ酸残基98〜113を含むCDR3領域が提供される。
【００７３】
本明細書に開示されるCDRは、関連配列の群から誘導されるコンセンサス配列を含む。CDRL1コンセンサス配列は、TGX1SSDX2GX3YX4YVS(配列番号30)からなり、式中、X1はスレオニンまたはセリンであり、X2はバリンまたはイソロイシンであり、X3はバリン、スレオニンまたはロイシンであり、X4はアスパラギン酸またはアスパラギンである。
【００７４】
CDRL2コンセンサス配列は、EVX1X2RPS(配列番号31)からなり、式中、X1はセリン、アスパラギンまたはイソロイシンであり、X2はアスパラギンまたはリジンである。
【００７５】
CDRL3コンセンサス配列は、SSYX1SX2STWV(配列番号32)を含み、式中、X1はスレオニンまたはセリンであり、X2はアルギニンまたはセリンである。
【００７６】
CDRH1コンセンサス配列は、X1X2X3WX4(配列番号33)からなり、式中、X1はセリンまたはアスパラギンであり、X2はチロシンまたはアスパラギンであり、X3はイソロイシン、チロシンまたはセリンであり、X4はスレオニンまたはセリンである。異なる実施形態では、このCDRH1コンセンサス配列は、SYX3WX5(配列番号75)からなり、式中、X3はI、SまたはYであり、X5はTまたはSである。
【００７７】
CDRH2コンセンサス配列は、RX1X2X3SGX4X5NYX6PSLX7S(配列番号34)からなり、式中、X1はイソロイシン、バリンまたはスレオニンであり、X2はチロシン、フェニルアラニンまたはセリンであり、X3はスレオニン、セリンまたはアラニンであり、X4はイソロイシン、ロイシン、アスパラギン、セリン、アルギニンまたはグルタミンであり、X5はスレオニンまたはアスパラギンであり、X6はアスパラギンまたはリジンであり、X7はリジンまたはアルギニンである。
【００７８】
CDRH3コンセンサス配列は、X1X2X3X4X5X6X7X8YX9YX10GX11DV(配列番号35)からなり、式中、X1はグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、X2はアルギニン、チロシンまたはフェニルアラニンであり、X3はバリン、アラニン、アルギニンまたはスレオニンであり、X4はバリン、スレオニン、グリシンまたはイソロイシンであり、X5はバリン、アラニンまたはグリシンであり、X6はアラニン、スレオニン、グリシンまたはグルタミンであり、X7はスレオニン、アスパラギン酸、アルギニンまたはセリンであり、X8はアルギニンまたはチロシンであり、X9はチロシンまたはヒスチジンであり、X10はチロシン、アスパラギン酸またはセリンであり、X11はメチオニン、ロイシンまたはバリンである。
【００７９】
モノクローナル抗体
提供される抗原結合性タンパク質には、CD30Lに結合するモノクローナル抗体が含まれる。モノクローナル抗体は、当該分野で公知の任意の技術を使用して、例えば、免疫スケジュールの完了後にトランスジェニック動物から収集された脾臓細胞を不死化することによって、産生され得る。脾臓細胞は、当該分野で公知の任意の技術を使用して、例えば、脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを産生することによって、不死化され得る。ハイブリドーマ産生融合手順における使用のための骨髄腫細胞は、好ましくは、非抗体産生性であり、高い融合効率を有し、酵素が欠損していて、所望の融合した細胞(ハイブリドーマ)のみの増殖を支持する特定の選択培地中で骨髄腫細胞が増殖するのを不可能にしている。マウス融合での使用に適した細胞株の例には、Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7およびS194/5XXO Bulが含まれる;ラット融合で使用される細胞株の例には、R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983Fおよび4B210が含まれる。細胞融合に有用な他の細胞株は、U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2およびUC729-6である。
【００８０】
いくつかの場合には、ハイブリドーマ細胞株は、CD30L免疫原で動物(例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物)を免疫し;免疫した動物から脾臓細胞を収集し;収集した脾臓細胞を骨髄腫細胞株と融合させ、それによってハイブリドーマ細胞を生成し;このハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を樹立し、CD30Lポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することによって、産生される。かかるハイブリドーマ細胞株、およびそれによって産生される抗CD30Lモノクローナル抗体は、本出願の態様である。
【００８１】
ハイブリドーマ細胞株によって分泌されるモノクローナル抗体は、当該分野で公知の任意の技術を使用して精製され得る。ハイブリドーマまたはmAbは、特定の特性、例えば、CD30とCD30Lとの相互作用を低減、阻害、妨害またはモジュレートする能力を有するmAbを同定するために、さらにスクリーニングされ得る。
【００８２】
キメラ抗体およびヒト化抗体
上述の配列に基づくキメラ抗体およびヒト化抗体もまた提供される。治療剤としての使用のためのモノクローナル抗体は、使用前に種々の方法で改変され得る。一例は、機能的な免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖またはそれらの免疫学的に機能的な部分を生み出すために共有結合により接続されている、異なる抗体由来のタンパク質セグメントから構成される抗体である、キメラ抗体である。一般に、重鎖および/または軽鎖の一部分は、特定の種由来の抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であり、鎖(複数可)の残部は、別の種由来の抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である。キメラ抗体に関する方法については、例えば、米国特許第4,816,567号;およびMorrisonら、1985、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851〜6855を参照のこと。CDRのグラフトは、例えば、米国特許第6,180,370号、米国特許第5,693,762号、米国特許第5,693,761号、米国特許第5,585,089号および米国特許第5,530,101号に記載されている。
【００８３】
キメラ抗体の1つの有用な型は、「ヒト化」抗体である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト動物において最初に惹起されたモノクローナル抗体から生み出される。このモノクローナル抗体中の、典型的にはこの抗体の非抗原認識部分由来の特定のアミノ酸残基は、対応するアイソタイプのヒト抗体中の対応する残基と相同になるように改変される。ヒト化は、例えば、げっ歯類可変領域の少なくとも一部分をヒト抗体の対応する領域で置換することによって、種々の方法を使用して実施され得る(例えば、米国特許第5,585,089号および米国特許第5,693,762号;Jonesら、1986、Nature 321:522〜525;Riechmannら、1988、Nature 332:323〜27;Verhoeyenら、1988、Science 239:1534〜1536を参照のこと)。
【００８４】
特定の実施形態では、ヒト以外の種由来の定常領域が、ハイブリッド抗体を産生するために、ヒト可変領域(複数可)と共に使用され得る。
【００８５】
完全ヒト抗体
完全ヒト抗体もまた提供される。抗原に対してヒトを曝露させることなしに所与の抗原に特異的な完全ヒト抗体(「完全ヒト抗体」)を作製するための方法が利用可能である。完全ヒト抗体の産生を実行するために提供された1つの特定の手段は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ig遺伝子が不活化されたマウス中へのヒト免疫グロブリン(Ig)遺伝子座の導入は、任意の所望の抗原で免疫することが可能な動物であるマウスにおいて完全ヒトモノクローナル抗体(mAb)を産生する1つの手段である。完全ヒト抗体を使用すると、治療剤としてヒトにマウスmAbまたはマウス由来mAbを投与することによって時折引き起こされ得る免疫原性応答およびアレルギー応答を最小化できる。
【００８６】
完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン産生の非存在下においてヒト抗体のレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物(通常マウス)を免疫することによって産生され得る。この目的のための抗原は、典型的には6以上連続するアミノ酸を有し、任意選択で、ハプテンなどの担体にコンジュゲート化される。例えば、Jakobovitsら、1993、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551〜2555;Jakobovitsら、1993、Nature 362:255〜258;およびBruggermannら、1993、Year in Immunol. 7:33を参照のこと。かかる方法の一例では、トランスジェニック動物は、中にマウス重および軽免疫グロブリン鎖をコードする内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座を無能力化し、ヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含むヒトゲノムDNAの大きい断片をマウスゲノム中に挿入することによって、産生される。ヒト免疫グロブリン遺伝子座の完全未満の相補体を有する部分的に改変された動物を、次いで、所望の免疫系改変の全てを有する動物を取得するために交雑させる。免疫原を投与した場合、これらのトランスジェニック動物は、可変領域を含む、免疫原に対して免疫特異的であるが、マウスアミノ酸配列ではなくヒトアミノ酸配列を有する抗体を産生する。かかる方法のさらなる詳細については、例えば、WIPO特許公開WO96/33735号およびWO94/02602号を参照のこと。ヒト抗体を作製するためのトランスジェニックマウスに関するさらなる方法は、米国特許第5,545,807号;米国特許第6,713,610号;米国特許第6,673,986号;米国特許第6,162,963号;米国特許第5,545,807号;米国特許第6,300,129号;米国特許第6,255,458号;米国特許第5,877,397号;米国特許第5,874,299号および米国特許第5,545,806号;WIPO特許公開WO91/10741号、WO90/04036号、ならびに欧州特許第546073号および欧州特許出願公開第546073号に記載されている。
【００８７】
上記トランスジェニックマウスは、内因性のμおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化変異と共に、再編成されていないヒト重鎖(μおよびγ)およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座(minilocus)を含む(Lonbergら、1994、Nature 368:856〜859)。従って、このマウスは、免疫に応答して、マウスIgMまたはκの発現の低減を示し、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、高親和性のヒトIgGκモノクローナル抗体を生成するために、クラススイッチングおよび体細胞変異を受ける(Lonbergら、上記;LonbergおよびHuszar、1995、Intern. Rev. Immunol. 13: 65〜93;HardingおよびLonberg、1995、Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536〜546)。かかるマウスの調製は、Taylorら、1992、Nucleic Acids Research 20:6287〜6295;Chenら、1993、International Immunology 5:647〜656;Tuaillonら、1994、J. Immunol. 152:2912〜2920;Lonbergら、1994、Nature 368:856〜859;Lonberg、1994、Handbook of Exp. Pharmacology 113:49〜101;Taylorら、1994、International Immunology 6:579〜591;LonbergおよびHuszar、1995、Intern. Rev. Immunol. 13:65〜93;HardingおよびLonberg、1995、Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536〜546;Fishwildら、1996、Nature Biotechnology 14:845〜85に詳細に記載されている。さらなる米国特許第5,545,806号;米国特許第5,569,825号;米国特許第5,625,126号;米国特許第5,633,425号;米国特許第5,789,650号;米国特許第5,877,397号;米国特許第5,661,016号;米国特許第5,814,318号;米国特許第5,874,299号;および米国特許第5,770,429号;ならびに米国特許第5,545,807号;WIPO公開WO93/1227号;WO92/22646号;およびWO92/03918号を参照のこと。これらのトランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を産生するために利用されるテクノロジーは、WIPO公開WO98/24893号およびMendezら、1997、Nature Genetics 15:146〜156にも開示されている。例えば、HCo7およびHCo12トランスジェニックマウス系統が、抗CD30L抗体を生成するために使用され得る。
【００８８】
ハイブリドーマテクノロジーを使用して、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトmAbは、上記のようなトランスジェニックマウスから産生および選択され得る。かかる抗体は、適切なベクターおよび宿主細胞を使用してクローニングおよび発現され得る、または抗体は、培養されたハイブリドーマ細胞から収集され得る。
【００８９】
完全ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーからも誘導され得る(例えば、Hoogenboomら、1991、J. Mol. Biol. 227:381;Marksら、1991、J. Mol. Biol. 222:581;WIPO公開WO99/10494号に開示される)。ファージディスプレイ技術は、糸状バクテリオファージの表面上での抗体レパートリーのディスプレイを介した免疫選択、および選択した抗原に対するその結合によるファージの引き続く選択を模倣する。
【００９０】
二特異性または二機能性抗原結合性タンパク質
「二特異性」、「二重特異性」または「二機能性」の抗原結合性タンパク質または抗体は、2つの異なる抗原結合部位、例えば、上記1つもしくはそれ以上のCDRまたは1つもしくはそれ以上の可変領域をそれぞれ有する、ハイブリッド抗原結合性タンパク質または抗体である。いくつかの場合、これらは、2つの異なる重鎖/軽鎖対および2つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。多特異性抗原結合性タンパク質または「多特異性抗体」は、1つより多い抗原またはエピトープを標的化するタンパク質または抗体である。二特異性の抗原結合性タンパク質および抗体は、多特異性抗原結合性タンパク質抗体の一種であり、ハイブリドーマの融合またはFab'断片の連結が含まれるがこれらに限定されない種々の方法によって産生され得る。例えば、SongsivilaiおよびLachmann、1990、Clin. Exp. Immunol. 79:315〜321;Kostelnyら、1992、J. Immunol. 148:1547〜1553を参照のこと。
【００９１】
免疫学的断片
抗原結合性タンパク質には、抗体の免疫学的断片(例えば、Fab、Fab'、F(ab')2またはscFv)もまた含まれる。「Fab断片」は、1つの軽鎖(軽鎖可変領域(VL)およびその対応する定常ドメイン(CL))および1つの重鎖(重鎖可変領域(VH)および第1の定常ドメイン(CH1))で構成される。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。「Fab'断片」は、1つの軽鎖およびCH1ドメインとCH2ドメインとの間の領域もまた含む1つの重鎖の一部分を含み、その結果、鎖間ジスルフィド結合が、F(ab')2分子を形成するために、2つのFab'断片の2つの重鎖間で形成される。従って、「F(ab')2断片」は、2つの重鎖間のジスルフィド結合によって一緒にされた2つのFab'断片から構成される。「Fv断片」は、抗体の単一アームの可変軽鎖領域および可変重鎖領域からなる。単鎖抗体「scFv」は、重鎖および軽鎖可変領域が、抗原結合領域を形成する、単一のポリペプチド鎖を形成するために可撓性リンカーによって接続されたFv分子である。単鎖抗体は、WIPO公開WO88/01649号、米国特許第4,946,778号および米国特許第5,260,203号;Bird、1988、Science 242:423;Hustonら、1988、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879;Wardら、1989、Nature 334:544、de Graafら、2002、Methods Mol Biol. 178:379〜387;Korttら、1997、Prot. Eng. 10:423;Korttら、2001、Biomol. Eng. 18:95〜108ならびにKriangkumら、2001、Biomol. Eng. 18:31〜40で詳細に議論されている。「Fc」領域は、抗体のCH2ドメインおよびCH3ドメインを含む2つの重鎖断片を含む。これら2つの重鎖断片は、2つ以上のジスルフィド結合およびCH3ドメインの疎水性相互作用によって、一緒にされる。
【００９２】
ドメイン抗体、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片もまた含まれる。いくつかの場合には、2つ以上のVH領域は、二価ドメイン抗体を創出するために、ペプチドリンカーを用いて共有結合で接続される。二価ドメイン抗体の2つのVH領域は、同じまたは異なる抗原を標的化し得る。ダイアボディは、2つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、各ポリペプチド鎖は、同じ鎖上の2つのドメイン間での対形成を可能にするには短すぎる、従って、各ドメインに別のポリペプチド鎖上の相補的ドメインと対形成させるリンカーによって接続されたVHドメインおよびVLドメインを含む(例えば、Holligerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444〜48、1993およびPoljakら、Structure 2:1121〜23、1994を参照のこと)。同様に、トリボディ(tribody)およびテトラボディ(tetrabody)は、それぞれ3つおよび4つのポリペプチド鎖を含み、それぞれ同じまたは異なり得る3つおよび4つの抗原結合部位を形成する抗体である。マキシボディ(maxibody)は、IgG1のFc領域に共有結合した二価scFvを含む(例えば、Fredericksら、2004、Protein Engineering, Design & Selection、17:95〜106;Powersら、2001、Journal of Immunological Methods、251:123〜135;Shuら、1993、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995〜7999;Haydenら、1994、Therapeutic Immunology 1:3〜15を参照のこと)。
【００９３】
種々の他の形態
上に開示された抗原結合性タンパク質のバリアント形態もまた提供され、この抗原結合性タンパク質のいくつかは、例えば、TABLE 1(表1)およびTABLE 2(表2)に列挙される重鎖もしくは軽鎖、可変領域またはCDRのうち1つまたは複数中に、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する。
【００９４】
天然に存在するアミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいてクラスに分割され得る:疎水性(ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile);中性親水性(Cys、Ser、Thr、Asn、Gln);酸性(Asp、Glu);塩基性(His、Lys、Arg);鎖の配向に影響を与える残基(Gly、Pro);および芳香族(Trp、Tyr、Phe)。
【００９５】
保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのうち1つのメンバーの、同じクラスの別のメンバーによる交換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、生物学的系における合成によってではなく、化学的ペプチド合成によって典型的に取り込まれる、天然に存在しないアミノ酸残基を包含し得る。これらには、ペプチド模倣物(peptidomimetic)ならびにアミノ酸部分の他の逆転(reversed)形態または反転(inverted)形態が含まれる。本明細書に記載される抗原結合性タンパク質の機能的および/または生化学的特徴におけるかかる実質的な改変は、(a)例えばシートコンフォメーションもしくはらせんコンフォメーションなどの、置換のエリアにおける分子骨格の構造、(b)標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または(c)側鎖の嵩高さ、を維持することに対するその効果が顕著に異なる、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列中の置換を創出することによって、達成され得る。
【００９６】
非保存的置換は、上記クラスのうち1つのメンバーの、別のクラス由来のメンバーによる交換を含み得る。かかる置換された残基は、ヒト抗体と相同な抗体の領域中、またはこの分子の非相同な領域中に、導入され得る。
【００９７】
かかる変化を行う場合、特定の実施形態によれば、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮され得る。タンパク質のヒドロパシープロファイルは、各アミノ酸に数値(「ヒドロパシー指数」)を割り当て、次いで、ペプチド鎖に沿ってこれらの値を繰り返し平均することによって、計算される。各アミノ酸には、その疎水性および電荷の特徴に基づいて、ヒドロパシー指数が割り当てられている。これらは以下である:イソロイシン(+4.5);バリン(+4.2);ロイシン(+3.8);フェニルアラニン(+2.8);システイン/シスチン(+2.5);メチオニン(+1.9);アラニン(+1.8);グリシン(-0.4);スレオニン(-0.7);セリン(-0.8);トリプトファン(-0.9);チロシン(-1.3);プロリン(-1.6);ヒスチジン(-3.2);グルタミン酸(-3.5);グルタミン(-3.5);アスパラギン酸(-3.5);アスパラギン(-3.5);リジン(-3.9);およびアルギニン(-4.5)。
【００９８】
タンパク質にインタラクティブな生物学的機能を付与することにおけるヒドロパシープロファイルの重要性は、当該分野で理解されている(例えば、Kyteら、1982、J. Mol. Biol. 157:105〜131を参照のこと)。特定のアミノ酸は、類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸で置換され得るが、類似の生物学的活性をなおも保持し得ることが公知である。ヒドロパシー指数に基づいて変化を行う場合、特定の実施形態では、そのヒドロパシー指数が±2以内であるアミノ酸の置換が含まれる。いくつかの態様では、±1以内のものが含まれ、他の態様では、±0.5以内のものが含まれる。
【００９９】
同様のアミノ酸の置換は、特に、それによって創出される生物学的に機能的なタンパク質またはペプチドが、本発明の場合と同様に免疫学的実施形態における使用のために意図されている場合、親水性に基づいて効率的に行われ得ることもまた、当該分野で理解されている。特定の実施形態では、その近接アミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の最大の局所平均親水性は、その免疫原性および抗原結合または免疫原性、即ち、タンパク質の生物学的特性と相関する。
【０１００】
以下の親水性値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられている:アルギニン(+3.0);リジン(+3.0);アスパラギン酸(+3.0±1);グルタミン酸(+3.0±1);セリン(+0.3);アスパラギン(+0.2);グルタミン(+0.2);グリシン(0);スレオニン(-0.4);プロリン(-0.5±1);アラニン(-0.5);ヒスチジン(-0.5);システイン(-1.0);メチオニン(-1.3);バリン(-1.5);ロイシン(-1.8);イソロイシン(-1.8);チロシン(-2.3);フェニルアラニン(-2.5)およびトリプトファン(-3.4)。類似の親水性値に基づいて変化を行う場合、特定の実施形態では、その親水性値が±2以内であるアミノ酸の置換が含まれ、他の実施形態では、±1以内のものが含まれ、なお他の実施形態では、±0.5以内のものが含まれる。いくつかの場合、親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これらの領域は、「エピトープコア領域」とも呼ばれる。
【０１０１】
例示的な保存的アミノ酸置換は、TABLE 4(表4)に示される。
【０１０２】
【表４】
0006370774.tif 000005
【０１０３】
当業者は、周知の技術を使用して本明細書で示されるように、ポリペプチドの適切なバリアントを決定することができる。当業者は、活性に重要であるとは考えられていない領域を標的化することによって、活性を破壊することなしに変化され得る、分子の適切なエリアを同定することができる。当業者は、類似のポリペプチド間で保存されている分子の残基および一部分を同定することもできる。さらなる実施形態では、生物学的活性または構造にとって重要であり得るエリアでさえ、生物学的活性を破壊することなくまたはポリペプチド構造に悪影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換に供され得る。
【０１０４】
さらに、当業者は、活性または構造にとって重要な類似のポリペプチド中の残基を同定する構造-機能研究を再検討できる。かかる比較を考慮して、類似のタンパク質中の活性または構造にとって重要なアミノ酸残基に対応する、1つのタンパク質中のアミノ酸残基の重要さを予測できる。当業者は、かかる予測された重要なアミノ酸残基について、化学的に類似したアミノ酸置換を選択することができる。
【０１０５】
当業者は、類似のポリペプチド中の3次元構造およびその構造に関連するアミノ酸配列を分析することもできる。かかる情報を考慮して、当業者は、その3次元構造に関連する抗体のアミノ酸残基のアラインメントを予測できる。当業者は、タンパク質の表面上に存在すると予測されたアミノ酸残基に対する極端な変化を行わないことを選択することができるが、これは、かかる残基が、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、当業者は、各所望のアミノ酸残基において単一のアミノ酸置換を含む試験バリアントを生成することができる。これらのバリアントは次いで、CD30L活性についてのアッセイ(以下の実施例のセクションを参照のこと)を使用してスクリーニングされ得、こうして、どのアミノ酸を変化させることがきるか、およびどれを変化させてはいけないかに関する情報が得られる。言い換えると、かかる慣用的な実験から集められた情報に基づいて、当業者は、単独でまたは他の変異と組み合わせてのいずれかで、さらなる置換が回避されるべきアミノ酸位置を容易に決定することができる。
【０１０６】
いくつかの科学出版物が、二次構造の予測に向けられてきた。Moult、1996、Curr. Op. in Biotech. 7:422〜427;Chouら、1974、Biochem. 13:222〜245;Chouら、1974、Biochemistry 113:211〜222;Chouら、1978、Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45〜148;Chouら、1979、Ann. Rev. Biochem. 47:251〜276;およびChouら、1979、Biophys. J. 26:367〜384を参照のこと。さらに、コンピュータプログラムが、二次構造の予測を補助するために、現在利用可能である。二次構造を予測する1つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、30%より大きい配列同一性または40%より大きい類似性を有する2つのポリペプチドまたはタンパク質は、類似の構造的トポロジーを有する場合が多い。タンパク質構造データベース(PDB)の最近の発展は、ポリペプチドまたはタンパク質の構造内の折り畳みの潜在的な数を含め、二次構造の増強された予測可能性を提供している。Holmら、1999、Nucl. Acid. Res. 27:244〜247を参照のこと。所与のポリペプチドまたはタンパク質中には、限定数の折り畳みが存在すること、および構造の臨界数が一旦解明されると、構造的予測は劇的により正確になることが、示唆されている(Brennerら、1997、Curr. Op. Struct. Biol. 7:369〜376)。
【０１０７】
二次構造を予測するさらなる方法には、「スレッディング(threading)」(Jones、1997、Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377〜387;Sipplら、1996、Structure 4:15〜19)、「プロファイル分析」(Bowieら、1991、Science 253:164〜170;Gribskovら、1990、Meth. Enzym. 183:146〜159;Gribskovら、1987、Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355〜4358)および「進化的連鎖(evolutionary linkage)」(Holm、1999、上記;およびBrenner、1997、上記を参照のこと)が含まれる。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、例えばシートコンフォメーションもしくはらせんコンフォメーションなどの、置換のエリアにおける分子骨格の構造を維持する;標的部位における分子の電荷もしくは疎水性を維持もしくは変更する、または側鎖の嵩高さを維持もしくは変更するなどの、以下のアミノ酸置換が行われる:(1)タンパク質分解に対する感受性を低減させる、(2)酸化に対する感受性を低減させる、(3)タンパク質複合体を形成するために結合親和性を変更させる、(4)リガンドもしくは抗原結合親和性を変更させる、および/または(5)かかるポリペプチドに他の物理化学的特性もしくは機能的特性を付与するまたはかかるポリペプチド上の物理化学的特性もしくは機能的特性を改変する。
【０１０９】
例えば、単一または複数のアミノ酸置換(特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換)は、天然に存在する配列中で行われ得る。置換は、分子間接触を形成するドメイン(複数可)の外側に存在する抗体の一部分において行われ得る。かかる実施形態では、親配列の構造的特徴を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換が使用され得る(例えば、親またはネイティブの抗原結合性タンパク質を特徴付ける二次構造を破壊しない、1つまたは複数の置き換えアミノ酸)。当該分野で認識されるポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton編)、1984、W. H. New York: Freeman and Company;Introduction to Protein Structure(BrandenおよびTooze編)、1991、New York: Garland Publishing;およびThorntonら、1991、Nature 354:105に記載されている。
【０１１０】
さらなるバリアントには、親またはネイティブのアミノ酸配列中の1つまたは複数のシステイン残基が欠失されたまたは別のアミノ酸(例えば、セリン)で置換されたシステインバリアントが含まれる。システインバリアントは、とりわけ、抗体(例えば)が生物学的に活性なコンフォメーションに再折り畳みされる必要がある場合に、有用である。システインバリアントは、ネイティブタンパク質よりも少ないシステイン残基を有していてもよく、典型的には、対形成していないシステインから生じる相互作用を最小化するために、偶数のシステイン残基を有する。
【０１１１】
開示される重鎖および軽鎖可変領域ならびにCDRは、CD30Lポリペプチドに特異的に結合し得る抗原結合領域を含む抗原結合性タンパク質を調製するために使用され得る。「抗原結合領域」とは、特定の抗原に特異的に結合するタンパク質またはタンパク質の一部分、例えば、抗原と相互作用して、標的抗原に対するその特異性および親和性を抗原結合性タンパク質に付与するアミノ酸残基を含む領域、を意味する。抗原結合領域は、1つまたは複数のCDRを含み得、特定の抗原結合領域は、1つまたは複数の「フレームワーク」領域もまた含む。例えば、TABLE 3(表3)に列挙されたCDRのうち1つまたは複数が、免疫接着(immunoadhesion)を生成するために、共有結合的または非共有結合的に分子(例えば、ポリペプチド)中に取り込まれ得る。免疫接着は、より大きいポリペプチド鎖の一部としてCDR(複数可)を取り込み得る、別のポリペプチド鎖にCDR(複数可)を共有結合的に連結させ得る、またはCDR(複数可)を共有結合的に取り込み得る。CDR(複数可)は、免疫接着が目的の特定の抗原(例えば、CD30Lポリペプチド)に特異的に結合するのを可能にする。
【０１１２】
他の抗原結合性タンパク質には、本明細書に記載される可変領域およびCDRに基づく模倣物(例えば、「ペプチド模倣物(peptide mimetic)」または「ペプチド模倣物(peptidomimetic)」)が含まれる。これらのアナログは、ペプチド領域、非ペプチド領域、またはペプチド領域と非ペプチド領域との組み合わせであり得る。Fauchere、1986、Adv. Drug Res. 15:29;VeberおよびFreidinger、1985、TINS 392頁;ならびにEvansら、1987、J. Med. Chem. 30:1229。治療的に有用なペプチドと構造的に類似したペプチド模倣物は、類似の治療効果または予防効果を生じるために使用され得る。かかる化合物は、コンピュータ化された分子モデリングの助けで開発される場合が多い。一般に、ペプチド模倣物は、所望の生物学的活性、例えば、CD30とCD30Lとの相互作用を阻害または遮断する能力を示す抗原結合性タンパク質と構造的に類似したタンパク質であるが、ペプチド模倣物は、当該分野で周知の方法によって、例えば:-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH-CH-(シスおよびトランス)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-および-CH2SO-から選択される連結によって任意選択で置き換えられた1つまたは複数のペプチド結合を有する。コンセンサス配列の1つまたは複数のアミノ酸の、同じ型のD-アミノ酸による体系的置換(例えば、L-リジンの代わりにD-リジン)が、より安定したタンパク質を生成するために、特定の実施形態において使用され得る。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一なコンセンサス配列バリエーションを含む拘束ペプチドは、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することが可能な内部システイン残基を付加することによって、当該分野で公知の方法によって生成され得る(RizoおよびGierasch、1992、Ann. Rev. Biochem. 61:387)。
【０１１３】
本明細書に記載される抗原結合性タンパク質の誘導体もまた提供される。誘導体化された抗原結合性タンパク質は、抗原結合性タンパク質または断片に望ましい特性、例えば特定の使用における増加した半減期を付与する、任意の分子または物質を含み得る。誘導体化された抗原結合性タンパク質は、例えば、検出可能な(または標識)部分(例えば、放射性分子、比色性分子、抗原性分子もしくは酵素分子、検出可能なビーズ(例えば、磁気または高電子密度(electrodense)(例えば、金)ビーズ)、または別の分子に結合する分子(例えば、ビオチンまたはストレプトアビジン))、治療的部分もしくは診断的部分(例えば、放射性部分、細胞傷害部分または医薬的に活性な部分)、または特定の使用(例えば、ヒト対象などの対象への投与、または他のin vivoもしくはin vitroでの使用)にとっての抗原結合性タンパク質の適切性を増加させる分子、を含み得る。抗原結合性タンパク質を誘導体化するために使用され得る分子の例には、アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン)およびポリエチレングリコール(PEG)が含まれる。抗原結合性タンパク質のアルブミン連結された誘導体およびPEG化誘導体は、当該分野で周知の技術を使用して調製され得る。一実施形態では、この抗原結合性タンパク質は、トランスサイレチン(TTR)またはTTRバリアントに、コンジュゲート化または他の方法で連結されている。このTTRまたはTTRバリアントは、例えば、デキストラン、ポリ(n-ビニルピロリドン)、ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコール(propropylene glycol)ホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群より選択される化学物質で化学的に改変され得る。
【０１１４】
他の誘導体には、CD30L抗原結合性タンパク質のN末端またはC末端に融合された異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現などによる、CD30L抗原結合性タンパク質と他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合コンジュゲートまたは凝集コンジュゲートが含まれる。例えば、コンジュゲート化されたペプチドは、異種シグナル(またはリーダー)ポリペプチド、例えば、酵母アルファ因子リーダー、またはペプチド、例えばエピトープタグであり得る。CD30L抗原結合性タンパク質含有融合タンパク質は、CD30L抗原結合性タンパク質の精製または同定を促進するために付加されたペプチド(例えば、ポリHis)を含み得る。CD30L抗原結合性タンパク質はまた、Hoppら、1988、Bio/Technology 6:1204;および米国特許第5,011,912号に記載されたように、FLAGペプチドに連結され得る。このFLAGペプチドは、高度に抗原性であり、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする、特異的モノクローナル抗体(mAb)によって可逆的に結合されるエピトープを提供する。FLAGペプチドが所与のポリペプチドに融合された融合タンパク質を調製するのに有用な試薬は、市販されている(Sigma、St. Louis、MO)。
【０１１５】
1つまたは複数のCD30L抗原結合性タンパク質を含むオリゴマーは、CD30Lアンタゴニストとして使用され得る。オリゴマーは、共有結合により連結されたまたは非共有結合により連結されたダイマー、トリマーまたはより高次のオリゴマーの形態であり得る。2つ以上のCD30L抗原結合性タンパク質を含むオリゴマーが使用のために企図され、その一例はホモダイマーである。他のオリゴマーには、ヘテロダイマー、ホモトリマー、ヘテロトリマー、ホモテトラマー、ヘテロテトラマーなどが含まれる。CD30L抗原結合性タンパク質に融合されたペプチド部分間の共有結合相互作用または非共有結合相互作用を介して接続された複数のCD30L結合性タンパク質を含むオリゴマーもまた、含まれる。かかるペプチドは、ペプチドリンカー(スペーサー)、またはオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであり得る。適切なペプチドリンカーには、米国特許第4,751,180号および米国特許第4,935,233号に記載されるペプチドリンカーがある。ロイシンジッパーおよび抗体由来の特定のポリペプチドが、それに結合されたCD30L抗原結合性タンパク質のオリゴマー化を促進し得るペプチドの中に存在する。可溶性オリゴマータンパク質を産生するのに適したロイシンジッパードメインの例は、WIPO公開WO94/10308号;Hoppeら、1994、FEBS Letters 344:191;およびFanslowら、1994、Semin. Immunol. 6:267〜278に記載されている。1つのアプローチでは、ロイシンジッパーペプチドに融合されたCD30L抗原結合性タンパク質断片または誘導体を含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、形成する可溶性オリゴマーCD30L抗原結合性タンパク質断片または誘導体は、培養物上清から回収される。
【０１１６】
かかるオリゴマーは、2つ〜4つのCD30L抗原結合性タンパク質を含み得る。このオリゴマーのCD30L抗原結合性タンパク質部分は、上記形態、例えば、バリアントまたは断片のいずれかであり得る。好ましくは、このオリゴマーは、CD30L結合活性を有するCD30L抗原結合性タンパク質を含む。オリゴマーは、免疫グロブリン由来のポリペプチドを使用して調製され得る。抗体由来ポリペプチドの種々の一部分(Fcドメインが含まれる)に融合された特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ashkenaziら、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535;Byrnら、1990、Nature 344:677;およびHollenbaughら、1992「Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins」、Current Protocols in Immunology、補遺4、10.19.1〜10.19.11頁によって記載されている。
【０１１７】
CD30L抗原結合性タンパク質を抗体のFc領域に融合させることによって創出された2つの融合タンパク質を含むダイマーもまた含まれる。このダイマーは、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を適切な発現ベクター中に挿入し、この組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞中でこの遺伝子融合物を発現させ、発現された融合タンパク質に、酷似した抗体分子をアセンブルさせることによって、作製され得、その際、鎖間ジスルフィド結合がFc部分間で形成して、ダイマーが生じる。かかるFcポリペプチドには、抗体のFc領域から誘導されたポリペプチドのネイティブ形態およびムテイン形態が含まれる。ダイマー化を促進するヒンジ領域を含むかかるポリペプチドの短縮形態もまた含まれる。Fc部分を含む融合タンパク質(およびそれから形成されたオリゴマー)は、プロテインAまたはプロテインGカラム上でのアフィニティクロマトグラフィーによる容易な精製の利点を提供する。WIPO公開WO93/10151号ならびに米国特許第5,426,048号および米国特許第5,262,522号に記載された1つの適切なFcポリペプチドは、ヒトIgG1抗体のFc領域のN末端ヒンジ領域からネイティブC末端へと延びる単鎖ポリペプチドである。別の有用なFcポリペプチドは、米国特許第5,457,035号およびBaumら、1994、EMBO J. 13:3992〜4001に記載されるFcムテインである。このムテインのアミノ酸配列は、アミノ酸19がLeuからAlaに変化され、アミノ酸20がLeuからGluに変化され、アミノ酸22がGlyからAlaに変化されていること以外、WIPO公開WO93/10151号中に提示されるネイティブFc配列のアミノ酸配列と同一である。このムテインは、Fc受容体に対する低減された親和性を示す。
【０１１８】
グリコシル化
この抗原結合性タンパク質は、ネイティブ種において見出されるものとは異なるまたはそこから変更されたグリコシル化パターンを有し得る。当該分野で公知のように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列(例えば、以下で議論する、特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または非存在)、またはそのタンパク質が産生される宿主細胞もしくは生物の両方に依存し得る。特定の発現系が以下で議論される。
【０１１９】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、N結合型またはO結合型のいずれかである。N結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン-X-セリンおよびアスパラギン-X-スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列であり、式中、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸である。従って、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を創出する。O結合型グリコシル化とは、糖類N-アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうち1つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般にはセリンまたはスレオニンへの結合を指すが、5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリジンもまた使用され得る。
【０１２０】
抗原結合性タンパク質に対するグリコシル化部位の付加は、上記トリペプチド配列のうち1つまたは複数を含むように、アミノ酸配列を変更させることによって、簡便に達成される(N結合型グリコシル化部位について)。この変更は、出発配列に対する1つもしくはそれ以上のセリン残基もしくはスレオニン残基の付加またはかかる残基による置換によっても、行われ得る(O結合型グリコシル化部位について)。容易さのために、抗原結合性タンパク質アミノ酸配列は、特に、所望のアミノ酸へと翻訳されるコドンが生成されるように、予め選択された塩基において標的ポリペプチドをコードするDNAを変異させることによって、DNAレベルでの変化を介して変更され得る。
【０１２１】
抗原結合性タンパク質上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、このタンパク質へのグリコシドの化学的カップリングまたは酵素的カップリングである。これらの手順は、N結合型およびO結合型グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生を必要としないという点で、有利である。使用されるカップリング様式に依存して、糖(複数可)は、(a)アルギニンおよびヒスチジン、(b)遊離カルボキシル基、(c)システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、(d)セリン、スレオニンもしくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、(e)フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンのものなどの芳香族残基、または(f)グルタミンのアミド基、に結合され得る。これらの方法は、PCT公開WO87/05330号、ならびにAplinおよびWriston、1981、CRC Crit. Rev, Biochem.、259〜306頁に記載されている。
【０１２２】
出発抗原結合性タンパク質上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物へのタンパク質の曝露を必要とする。この処理は、ポリペプチドをインタクトなままにしつつ、連結している糖(N-アセチルグルコサミンまたはN-アセチルガラクトサミン)を除き、ほとんどまたは全ての糖の切断を生じる。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddinら、1987、Arch. Biochem. Biophys. 259:52およびEdgeら、1981、Anal. Biochem. 118:131によって記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakuraら、1987、Meth. Enzymol. 138:350によって記載されるような、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。潜在的なグリコシル化部位におけるグリコシル化は、Duskinら、1982、J. Biol. Chem. 257:3105によって記載されるように、化合物ツニカマイシンの使用によって防止され得る。ツニカマイシンは、タンパク質-N-グリコシド結合の形成を遮断する。
【０１２３】
従って、態様は、グリコシル化部位(複数可)の数および/または型が、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して変更されている、抗原結合性タンパク質のグリコシル化バリアントを含む。特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質バリアントは、親ポリペプチドよりも多いまたは少ない数のN結合型グリコシル化部位を含む。この配列を排除または変更する置換は、親ポリペプチド中に存在するN結合型炭水化物鎖の付加を防止する。例えば、グリコシル化は、Asnの欠失により、または異なるアミノ酸によるAsnの置換により、低減され得る。抗体は典型的に、Fc領域中にN結合型グリコシル化部位を有する。
【０１２４】
標識およびエフェクター基
抗原結合性タンパク質は、1つまたは複数の標識を含み得る。用語「標識」または「標識基」とは、任意の検出可能な標識を指す。一般に、標識は、それらが検出されるアッセイに依存して、種々のクラスに入る:a)放射性同位体または重同位体であり得る同位体標識;b)磁気標識(例えば、磁気粒子);c)酸化還元活性のある部分;d)光学色素;酵素基(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ);e)ビオチン化基;およびf)二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体についての結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど)。いくつかの実施形態では、この標識基は、潜在的な立体障害を低減させるために、種々の長さのスペーサーアームを介して抗原結合性タンパク質にカップリングされる。タンパク質を標識するための種々の方法は、当該分野で公知である。適切な標識基の例には、以下が含まれるがこれらに限定されない:放射性同位体または放射性核種(例えば、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、蛍光基(例えば、FITC、ローダミン、ランタニドリン光体)、酵素基(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)、化学発光基、ビオチニル基、または二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体についての結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)。いくつかの実施形態では、この標識基は、潜在的な立体障害を低減させるために、種々の長さのスペーサーアームを介して抗原結合性タンパク質にカップリングされる。タンパク質を標識するための種々の方法は、当該分野で公知であり、適当と思われる場合に使用され得る。
【０１２５】
用語「エフェクター基」は、細胞傷害剤として作用する、抗原結合性タンパク質にカップリングされる任意の基を意味する。適切なエフェクター基の例は、放射性同位体または放射性核種(例えば、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)である。他の適切な基には、毒素、治療基または化学療法基が含まれる。適切な基の例には、カリチアマイシン、オーリスタチン、ゲルダナマイシンおよびメイタンシンが含まれる。いくつかの実施形態では、このエフェクター基は、潜在的な立体障害を低減させるために、種々の長さのスペーサーアームを介して抗原結合性タンパク質にカップリングされる。
【０１２６】
CD30L抗原結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド
抗体またはその断片、誘導体、ムテインもしくはバリアントの一方または両方の鎖をコードするポリヌクレオチド、重鎖可変領域またはCDRのみをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定、分析、変異または増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ、PCRプライマーまたは配列決定プライマーとしての使用に十分なポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、および上記の相補的配列を含む、本明細書に記載される抗原結合性タンパク質またはその一部分をコードするポリヌクレオチドもまた提供される。これらのポリヌクレオチドは、任意の長さであり得る。これらのポリヌクレオチドは、例えば、それらの間の全ての値を含め、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、85、95、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000もしくはそれ以上の核酸長であり得、および/または1つもしくはそれ以上のさらなる配列、例えば調節配列を含み得、および/またはより大きいポリヌクレオチドの一部、例えばベクターであり得る。これらのポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得、RNAおよび/またはDNA核酸ならびにそれらの人工バリアント(例えば、ペプチド核酸)を含み得る。
【０１２７】
特定の抗原結合性タンパク質またはその一部分(例えば、全長抗体、重鎖もしくは軽鎖、可変ドメイン、またはCDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2もしくはCDRL3)をコードするポリヌクレオチドは、CD30Lまたはその免疫原性断片で免疫されたマウスのB細胞から単離され得る。このポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの従来の手順によって単離され得る。ファージディスプレイは、抗体および他の抗原結合性タンパク質の誘導体が調製され得る公知の技術の別の例である。1つのアプローチでは、目的の抗原結合性タンパク質の成分であるポリペプチドは、任意の適切な組換え発現系で発現され、発現されたポリペプチドは、アセンブルされて抗原結合性タンパク質分子を形成する。ファージディスプレイは、鎖シャッフリングを介して、異なる特性(即ち、それらが結合する抗原に対する変動する親和性)を有する抗原結合性タンパク質を誘導するためにも使用される、Marksら、1992、BioTechnology 10:779を参照のこと。
【０１２８】
遺伝子コードの縮重に起因して、本明細書に示されるポリペプチド配列の各々は、提供されているもの以外の多数の他のポリヌクレオチド配列によってもコードされる。例えば、本明細書に提供される重鎖可変ドメインは、ポリヌクレオチド配列配列番号49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71および73によってコードされ得る。軽鎖可変ドメインは、ポリヌクレオチド配列配列番号37、39、41、43、45および47によってコードされ得る。従って、本出願が、各抗原結合性タンパク質をコードする各縮重ヌクレオチド配列についての、適切な書面による明細および実施可能性を提供することを、当業者は理解する。
【０１２９】
一態様は、特定のハイブリダイゼーション条件下で他のポリヌクレオチド分子にハイブリダイズするポリヌクレオチドをさらに提供する。核酸をハイブリダイズする方法、ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本的パラメーター、および適切な条件を考案するためのガイダンスは、当該分野で周知である。例えば、Sambrook、FritschおよびManiatis(2001、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.ならびにCurrent Protocols in Molecular Biology、1995、Ausubelら編、John Wiley & Sons, Inc.を参照のこと。本明細書で規定する場合、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、5×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)、0.5%SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)を含むプレ洗浄溶液、約50%ホルムアミド、6×SSC、および55℃のハイブリダイゼーション温度のハイブリダイゼーション緩衝液(または他の類似のハイブリダイゼーション溶液、例えば、約50%ホルムアミドを含み、42℃のハイブリダイゼーション温度を用いるもの)、および0.5×SSC、0.1%SDS中60℃の洗浄条件を使用する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、45℃で6×SSC中でハイブリダイズし、その後、68℃で0.1×SSC、0.2%SDS中での1回またはそれ以上の洗浄が続く。さらに、当業者は、それら間の全ての値を含め、互いに少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一な核酸配列を含むポリヌクレオチドが、典型的には互いにハイブリダイズしたままであるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加または減少させるために、ハイブリダイゼーション条件および/または洗浄条件を操作することができる。
【０１３０】
変化は、ポリヌクレオチド中への変異によって導入され得、それにより、このポリヌクレオチドがコードするポリペプチド(例えば、抗原結合性タンパク質または抗原結合性タンパク質誘導体)のアミノ酸配列中の変化を導く。変異は、部位特異的変異誘発およびランダム変異誘発などの、当該分野で公知の任意の技術を使用して導入され得る。変異体ポリペプチドが発現され得、所望の特性について選択され得る。変異は、ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの生物学的活性を顕著に変更することなく、このポリヌクレオチド中に導入され得る。例えば、非必須アミノ酸残基における置換。代替的に、ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの生物学的活性を選択的に変化させる1つまたは複数の変異が、このポリヌクレオチド中に導入され得る。例えば、変異は、抗原結合性タンパク質の活性を増加、低減または排除する、および抗原結合性タンパク質の抗原特異性を変化させるなど、生物学的活性を量的または質的に変化させ得る。
【０１３１】
別の態様は、核酸配列の検出のためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとしての使用に適したポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部分のみ、例えば、プローブもしくはプライマーとして使用され得る断片またはポリペプチドの活性部分(例えば、CD30L結合部分)をコードする断片を含み得る。核酸の配列に基づくプローブは、その核酸または類似の核酸、例えば、ポリペプチドをコードする転写物を検出するために使用され得る。このプローブは、標識基、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子を含み得る。かかるプローブは、ポリペプチドを発現する細胞を同定するために使用され得る。
【０１３２】
抗原結合性タンパク質を発現させる方法
本明細書で提供される抗原結合性タンパク質は、いくつかの従来技術のいずれかによって調製され得る。例えば、CD30L抗原結合性タンパク質は、当該分野で公知の任意の技術を使用して、組換え発現系によって産生され得る。例えば、Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses、Kennetら(編)Plenum Press、New York(1980);ならびにAntibodies: A Laboratory Manual、HarlowおよびLane(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y. (1988)を参照のこと。
【０１３３】
上記少なくとも1つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、発現ベクター、転写または発現カセットの形態の発現系および構築物もまた、かかる発現系または構築物を含む宿主細胞同様、本明細書に提供される。本明細書で使用する場合、「ベクター」とは、タンパク質コード情報を宿主細胞中に移入させるための使用に適した任意の分子または実体(例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス)を意味する。ベクターの例には、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム性哺乳動物ベクターおよび発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターが含まれるがこれらに限定されない。組換え発現ベクターなどの発現ベクターは、宿主細胞の形質転換に有用であり、作動可能に連結された1つまたは複数の異種コード領域の発現を(宿主細胞と併せて)指向および/または制御する核酸配列を含む。発現構築物には、転写、翻訳に影響する配列または転写、翻訳を制御する配列、およびイントロンが存在する場合には、作動可能に連結されたコード領域のRNAスプライシングに影響を与える配列が含まれ得るが、これらに限定されない。「作動可能に連結された」とは、この用語が適用される成分が、その成分にその固有の機能を実行させる関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結された」、ベクター中の制御配列、例えばプロモーターは、制御配列の正常な活性が、コードされたタンパク質の組換え発現を生じるタンパク質コード配列の転写を導くように、配置される。
【０１３４】
別の態様は、組換え発現ベクターなどの発現ベクターが導入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞(例えば、大腸菌(E. coli))または真核生物細胞(例えば、酵母、昆虫または哺乳動物の細胞(例えば、CHO細胞))であり得る。ベクターDNAは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して、原核生物細胞または真核生物細胞中に導入され得る。哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小さい部分のみが、そのゲノム中に外来DNAを組み込み得ることが公知である。これらの組み込み体を同定および選択するために、選択可能なマーカー(例えば、抗生物質に対する耐性について)をコードする遺伝子が一般に、目的の遺伝子と共に宿主細胞中に導入される。好ましい選択可能なマーカーには、G418、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するものが含まれる。導入されたポリヌクレオチドで安定にトランスフェクトされた細胞は、他の方法の中でも、薬物選択(例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する)によって同定され得る。
【０１３５】
抗原結合性タンパク質は、ハイブリドーマ細胞株(例えば、特に、抗体が、ハイブリドーマ中で発現され得る)またはハイブリドーマ以外の細胞株において発現され得る。抗原結合性タンパク質をコードする発現構築物は、哺乳動物、昆虫または微生物の宿主細胞を形質転換するために使用され得る。形質転換は、米国特許第4,399,216号;米国特許第4,912,040号;米国特許第4,740,461号;米国特許第4,959,455号に例示されるように、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ中にポリヌクレオチドをパッケージングする工程、当該分野で公知のトランスフェクション手順によってこの構築物で宿主細胞を形質導入する工程を含む、宿主細胞中にポリヌクレオチドを導入するための任意の公知の方法を使用して、実施され得る。使用される最適な形質転換手順は、形質転換されている宿主細胞の型に依存する。哺乳動物細胞中への異種ポリヌクレオチドの導入方法は、当該分野で周知であり、デキストラン媒介性のトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性のトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中でのポリヌクレオチド(複数可)の封入、核酸と正に荷電した脂質との混合、および核中へのDNAの直接的マイクロインジェクションが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３６】
組換え発現構築物は典型的に、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。このポリペプチドは、以下のうち1つまたは複数を含み得る:本明細書で提供されるような1つまたは複数のCDR;軽鎖可変領域;重鎖可変領域;軽鎖定常領域;重鎖定常領域(例えば、CH1、CH2および/またはCH3);および/またはCD30L抗原結合性タンパク質の別の足場部分。これらの核酸配列は、標準的なライゲーション技術を使用して、適切な発現ベクター中に挿入される。一実施形態では、この重鎖または軽鎖定常領域は、本明細書に提供される重鎖または軽鎖可変領域のC末端にアペンドされ、発現ベクター中にライゲーションされる。このベクターは典型的に、使用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択される(即ち、このベクターは、宿主細胞の機構と適合性であり、遺伝子の増幅および/または発現を生じさせ得ることを可能にする)。いくつかの実施形態では、ジヒドロ葉酸レダクターゼなどのタンパク質レポーターを使用するタンパク質-断片相補性アッセイを使用するベクターが使用される(例えば、米国特許第6,270,964号を参照のこと)。適切な発現ベクターは、例えば、Invitrogen Life Technologies(Carlsbad、CA)またはBD Biosciences(San Jose、CA)から購入され得る。抗体および断片をクローニングおよび発現するのに有用な他のベクターには、BianchiおよびMcGrew、2003、Biotech. Biotechnol. Bioeng. 84:439〜44に記載されるベクターが含まれる。さらなる適切な発現ベクターは、例えば、Methods Enzymol.、第185巻(D. V. Goeddel編)、1990、New York: Academic Pressで議論されている。
【０１３７】
典型的には、宿主細胞のいずれかにおいて使用される発現ベクターは、プラスミド維持のためならびに外因性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。かかる配列は、集合的に「隣接配列」と呼ばれ、特定の実施形態では、典型的に、以下のヌクレオチド配列のうち1つまたは複数を含む:プロモーター、1つまたは複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能なマーカーエレメント。提供される発現ベクターは、市販のベクターなどの出発ベクターから構築され得る。かかるベクターは、所望の隣接配列の全てを含んでいてもいなくてもよい。本明細書に記載される隣接配列のうち1つまたは複数がベクター中に未だ存在していない場合、これらは、個々に取得され得、ベクター中にライゲーションされ得る。隣接配列の各々を取得するために使用される方法は、当業者に周知である。
【０１３８】
任意選択で、このベクターは、「タグ」コード配列、即ち、CD30L抗原結合性タンパク質コード配列の5'末端または3'末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含み得る;このオリゴヌクレオチド配列は、それに対する市販の抗体が存在するポリHis(例えばヘキサHis)または別の「タグ」、例えばFLAG(登録商標)、HA(ヘマグルチニンインフルエンザウイルス)もしくはmycをコードする。このタグは典型的に、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、宿主細胞からのCD30L抗原結合性タンパク質のアフィニティ精製または検出のための手段として機能し得る。アフィニティ精製は、例えば、アフィニティマトリックスとしてこのタグに対する抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによって、達成され得る。任意選択で、このタグは、切断のために特定のペプチダーゼを使用するなどの種々の手段によって、精製されたCD30L抗原結合性タンパク質から引き続いて除去され得る。
【０１３９】
隣接配列は、同種(即ち、宿主細胞と同じ種および/系統由来)、異種(即ち、宿主細胞の種または系統以外の種由来)、ハイブリッド(即ち、1つより多い供給源由来の隣接配列の組み合わせ)、合成またはネイティブであり得る。このように、隣接配列の供給源は、隣接配列がその中で機能的であり、宿主細胞機構によって活性化され得ることを条件として、任意の原核生物もしくは真核生物、任意の脊椎動物もしくは無脊椎動物生物、または任意の植物であり得る。
【０１４０】
これらのベクター中で有用な隣接配列は、当該分野で周知のいくつかの方法のいずれかによって取得され得る。典型的には、本明細書で有用な隣接配列は、マッピングおよび/または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して適切な組織供給源から単離され得る。いくつかの場合には、隣接配列の完全ヌクレオチド配列が既知であり得る。ここで、この隣接配列は、核酸合成またはクローニングのための本明細書に記載される方法を使用して合成され得る。
【０１４１】
隣接配列の全てまたは一部分のみが既知である場合、この隣接配列は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、ならびに/あるいはオリゴヌクレオチドおよび/または同じもしくは別の種由来の隣接配列断片などの適切なプローブを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、取得され得る。隣接配列が未知である場合、隣接配列を含むDNAの断片は、例えば、コード配列またはさらには別の遺伝子(単数または複数)を含み得る、DNAのより大きい一片から単離され得る。単離は、適切なDNA断片を産生するための制限エンドヌクレアーゼ消化と、その後のアガロースゲル精製、Qiagen(登録商標)カラムクロマトグラフィー(Qiagen、Chatsworth、CA)または当業者に公知の他の方法を使用する単離とによって、達成され得る。この目的を達成するのに適した酵素の選択は、当業者に容易に明らかである。
【０１４２】
複製起点は、典型的には市販の原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は、宿主細胞中でのベクターの増幅を助ける。選択したベクターが複製起点部位を含まない場合、複製起点は、公知の配列に基づいて化学的に合成することができ、ベクター中にライゲーションされ得る。例えば、プラスミドpBR322(New England Biolabs、Beverly、MA)由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適しており、種々のウイルス起点(例えば、SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス(VSV)またはパピローマウイルス、例えばHPVもしくはBPV)が、哺乳動物細胞においてベクターをクローニングするために有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターには必要とされない(例えば、SV40起点は、ウイルス初期プロモーターもまた含むことだけを理由として、しばしば使用される)。
【０１４３】
転写終結配列は典型的に、ポリペプチドコード領域の末端に対して3'側に位置し、転写を終結させるように機能する。通常、原核生物細胞中の転写終結配列は、ポリT配列が後に続くG-Cリッチ断片である。この配列は、ライブラリーから容易にクローニングされるか、またはベクターの一部として市販されてさえいるが、本明細書に記載されるものなどの核酸合成のための方法を使用しても、容易に合成できる。
【０１４４】
選択可能なマーカー遺伝子は、選択的培養培地中で増殖した宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、(a)抗生物質または他の毒素、例えば、原核生物宿主細胞についてはアンピシリン、テトラサイクリンもしくはカナマイシンに対する耐性を付与するタンパク質;(b)細胞の栄養要求性欠損を補完するタンパク質;あるいは(c)複合培地または限定培地からは入手できない必須栄養素を補充するタンパク質をコードする。特定の選択可能なマーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利には、ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞の両方において選択のために使用され得る。
【０１４５】
他の選択可能な遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は、増殖または細胞生存に必須のタンパク質の産生のために必要とされる遺伝子が、組換え細胞の後続世代の染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に適した選択可能なマーカーの例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)およびプロモーターなしのチミジンキナーゼ遺伝子が含まれる。哺乳動物細胞形質転換体は、形質転換体だけがベクター中に存在する選択可能な遺伝子によって生存するように独自に順応される、選択圧下に置かれる。選択圧は、形質転換された細胞を、培地中の選択剤の濃度が連続的に増加される条件下で培養し、それにより、選択可能な遺伝子とCD30Lに結合する抗原結合性タンパク質などの別の遺伝子をコードするDNAとの両方の増幅を導くことによって、課される。結果として、抗原結合性タンパク質などのポリペプチドの増加した量が、増幅されたDNAから合成される。
【０１４６】
リボソーム結合部位は通常、mRNAの翻訳開始に必要であり、Shine-Dalgarno配列(原核生物)またはKozak配列(真核生物)によって特徴付けられる。このエレメントは典型的に、プロモーターに対して3'側かつ発現されるポリペプチドのコード配列に対して5'側に位置する。
【０１４７】
グリコシル化が真核生物宿主細胞発現系において所望される場合などのいくつかの場合、グリコシル化または収量を改善するための種々のプレ配列またはプロ配列を操作することができる。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更することができ、またはグリコシル化にも影響を与え得るプロ配列を付加することができる。最終タンパク質産物は、-1位(成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して)において、完全には除去されていない可能性がある、発現に伴う1つまたは複数のさらなるアミノ酸を有し得る。例えば、この最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ切断部位中に見出される1つまたは2つのアミノ酸残基を有し得る。代替的に、いくつかの酵素切断部位の使用は、その酵素が成熟ポリペプチド内のかかるエリアにおいて切断する場合、所望のポリペプチドの僅かに短縮された形態を生じ得る。
【０１４８】
発現およびクローニングは典型的に、宿主生物によって認識される、CD30L抗原結合性タンパク質をコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する、構造遺伝子の開始コドンに対して上流(即ち、5'側)(一般には、約100〜1000bp以内)に位置する、転写されない配列である。プロモーターは、2つのクラスのうち1つに慣習的にグループ分けされる:誘導性プロモーターおよび構成的プロモーター。誘導性プロモーターは、培養条件におけるある種の変化、例えば、栄養素の存在もしくは非存在、または温度における変化に応答して、その制御下にあるDNAからの増加したレベルの転写を開始する。他方、構成的プロモーターは、それらが作動可能に連結された遺伝子を均一に転写する、即ち、遺伝子発現に対する制御がほとんどまたは全くない。種々の潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。適切なプロモーターは、制限酵素消化によって供給源DNAからプロモーターを取り出し、所望のプロモーター配列をベクター中に挿入することによって、CD30L抗原結合性タンパク質の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードするDNAに作動可能に連結される。
【０１４９】
酵母宿主での使用に適したプロモーターもまた、当該分野で周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞での使用に適したプロモーターは、周知であり、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス2)、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルスおよびサルウイルス40(SV40)などのウイルスのゲノムから取得されたプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。他の適切な哺乳動物プロモーターには、異種哺乳動物プロモーター、例えば、ヒートショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが含まれる。
【０１５０】
目的になり得るさらなるプロモーターには以下が含まれるがこれらに限定されない:SV40初期プロモーター(BenoistおよびChambon、1981、Nature 290:304〜310);CMVプロモーター(Thornsenら、1984、Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659〜663);ラウス肉腫ウイルスの3'の長い末端反復配列中に含まれるプロモーター(Yamamotoら、1980、Cell 22:787〜797);ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444〜1445);メタロチオネイン遺伝子由来のプロモーターおよび調節配列(Prinsterら、1982、Nature 296:39〜42);ならびに原核生物プロモーター、例えばβ-ラクタマーゼプロモーター(Villa-Kamaroffら、1978、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727〜3731);またはtacプロモーター(DeBoerら、1983、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21〜25)。組織特異性を示し、トランスジェニック動物において利用されてきた、以下の動物転写制御領域もまた目的である:膵腺房細胞において活性なエラスターゼI遺伝子制御領域(Swiftら、1984、Cell 38:639〜646;Ornitzら、1986、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399〜409;MacDonald、1987、Hepatology 7:425〜515);膵臓β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域(Hanahan、1985、Nature 315:115〜122);リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedlら、1984、Cell 38:647〜658;Adamesら、1985、Nature 318:533〜538;Alexanderら、1987、Mol. Cell. Biol. 7:1436〜1444);精巣、乳房、リンパ系および肥満細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域(Lederら、1986、Cell 45:485〜495);肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinkertら、1987、Genes and Devel. 1 :268〜276);肝臓において活性なアルファ-フェト-タンパク質遺伝子制御領域(Krumlaufら、1985、Mol. Cell. Biol. 5:1639〜1648;Hammerら、1987、Science 253:53〜58);肝臓において活性なアルファ1-アンチトリプシン遺伝子制御領域(Kelseyら、1987、Genes and Devel. 1:161〜171);骨髄系細胞において活性なβ-グロビン遺伝子制御領域(Mogramら、1985、Nature 315:338〜340;Kolliasら、1986、Cell 46:89〜94);脳中のオリゴデンドロサイト細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readheadら、1987、Cell 48:703〜712);骨格筋において活性なミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域(Sani、1985、Nature 314:283〜286);ならびに視床下部において活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域(Masonら、1986、Science 234:1372〜1378)。
【０１５１】
エンハンサー配列は、高等真核生物による転写を増加させるために、ベクター中に挿入され得る。エンハンサーは、転写を増加させるようにプロモーターに対して作用する、通常約10〜300bp長の、DNAのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、比較的配向非依存的および位置非依存的であり、転写単位に対して5'側および3'側の両方の位置において見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が公知である(例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ-フェト-タンパク質およびインスリン)。しかし、典型的には、ウイルス由来のエンハンサーが使用される。当該分野で公知のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが、真核生物プロモーター活性化のための、例示的な増強性エレメントである。エンハンサーは、コード配列に対して5'側または3'側のいずれかでベクター中に配置され得るが、典型的には、プロモーターの5'側の部位に位置する。適切なネイティブまたは異種シグナル配列(リーダー配列またはシグナルペプチド)をコードする配列は、抗体の細胞外分泌を促進するために、発現ベクター中に組み込まれ得る。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、抗体が産生される宿主細胞の型に依存し、異種シグナル配列がネイティブシグナル配列を置き換え得る。哺乳動物宿主細胞において機能的なシグナルペプチドの例には、米国特許第4,965,195号に記載される、インターロイキン-7のシグナル配列;Cosmanら、1984、Nature 312:768に記載される、インターロイキン-2受容体のシグナル配列;欧州特許第0 367 566号に記載される、インターロイキン-4受容体シグナルペプチド;米国特許第4,968,607号に記載される、I型インターロイキン-1受容体シグナルペプチド;欧州特許第0 460 846号に記載される、II型インターロイキン-1受容体シグナルペプチドが含まれる。
【０１５２】
ベクターが構築された後、完成したベクターは、増幅および/またはポリペプチド発現に適した宿主細胞中に挿入され得る。選択された宿主細胞中への、抗原結合性タンパク質のための発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、DEAE-デキストラン媒介性のトランスフェクション、または他の公知の技術を含む周知の方法によって、達成され得る。選択される方法は、一部、使用される宿主細胞の型の関数である。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y. (2001)に示されている。
【０１５３】
宿主細胞は、適切な条件下で培養される場合、培養培地から引き続いて回収され得る(宿主細胞がタンパク質を培地中に分泌する場合)またはこのタンパク質を産生する宿主細胞から直接回収され得る(分泌されない場合)タンパク質を合成する。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性のために望ましいまたは活性に必要なポリペプチド改変(グリコシル化またはリン酸化など)および生物学的に活性な分子への折り畳みの容易さなどの、種々の因子に依存する。
【０１５４】
発現のための宿主として入手可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で周知であり、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えば、Hep G2)、およびいくつかの他の細胞株が含まれるがこれらに限定されない、American Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な不死化細胞株が含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有し、CD30L結合特性を有する抗原結合性タンパク質を構成的に産生するかを決定することを介して、選択され得る。別の実施形態では、その独自の抗体を作製しないが異種抗体を作製および分泌する能力を有するB細胞系譜由来の細胞株もまた、選択され得る。別の実施形態では、完全にまたは部分的に非フコシル化された抗体を産生するフコシルトランスフェラーゼノックアウト細胞株(米国特許第6,946,292号、米国特許第7,425,446号、米国特許第7,846,725号、米国特許第8,067,232号、Potelligent(登録商標)細胞、BioWa、Princeton、NJ。
【０１５５】
CD30L in vitroバイオアッセイ
CD30/CD30L相互作用を阻害するアンタゴニストを同定するための方法もまた提供される。これらの方法は、CD30Lに応答してCD30+細胞から産生されるマーカーサイトカインの誘導を使用する。この方法は、目的の試験化合物をCD30Lの供給源と組み合わせる工程;CD30とCD30Lとの相互作用に応答してマーカーサイトカインを発現することが可能なCD30+細胞に、試験化合物/CD30Lの組み合わせを添加する工程;細胞上清を収集する工程;ならびに産生されたおよび/または細胞上清中に放出されたマーカーサイトカインの量を測定することによって、試験化合物がCD30/CD30L相互作用を阻害するか否かを決定する工程を含む。例えば、かかるCD30L依存的in vitroバイオアッセイは、内因性CD30の発現、およびCD30とCD30Lとの相互作用に応答したこれらの細胞からのIL-8の放出のために、ヒト未分化大細胞リンパ腫(ALCL)細胞株Karpas-299(K299)を使用し得る。これらの方法は、本明細書に提供される実施例においてさらに例示される。
【０１５６】
試験化合物には、抗体、その抗原結合性断片およびそれらの誘導体が含まれるがこれらに限定されない、CD30L抗原結合性タンパク質が含まれる。試験化合物には、組換え可溶性CD30化合物(Fcタグ、ポリHISタグ、FLAG(登録商標)タグなどと融合されたCD30細胞外ドメインなど)ならびに小分子もまた含まれ得る。適切なCD30+細胞株は、CD30とCD30Lとの相互作用に応答してマーカーサイトカインを発現する;かかる細胞株には、ヒトCD30+未分化大細胞リンパ腫細胞株K299(Karpas-299、DSMZ、Germany)が含まれる。
【０１５７】
CD30Lの供給源には、可溶性CD30L構築物および膜会合型CD30Lが含まれる。可溶性CD30Lには、CD30L断片、好ましくはCD30Lの細胞外領域の断片を含むキメラ組成物が含まれる。かかる可溶性構築物には、マルチマーのロイシンまたはイソロイシンジッパー構築物が含まれる。かかる構築物は、ヒトまたはカニクイザルCD30Lの細胞外ドメインのN末端に結合した33アミノ酸のロイシンジッパーモチーフを含む。可溶性組換えCD30L構築物もまた市販されている(R&D Systems、Minneapolis、MN)。他の可溶性CD30Lには、FLAG(登録商標)タグ(Axxora LLC、San Diego、CA)に融合したCD30L細胞外ドメインもまた含まれる。膜会合型CD30Lには、ネイティブのおよびトランスフェクトされたCD30L発現細胞および細胞株が含まれる。かかる細胞株には、CD30L+ヒトB細胞株Ramos(ATCC、Manassas、VA)などのヒト細胞が含まれるがこれらに限定されない。カニクイザル血液T細胞およびマウス樹状細胞株もまた企図される。
【０１５８】
CD30+細胞からのIL-8産生のCD30L誘導を決定するための方法であって、試験化合物をCD30Lの供給源と組み合わせる工程;照射されたCD30+細胞に試験化合物-CD30Lの組み合わせを添加する工程;細胞上清を収集する工程;および細胞上清中に放出されたIL-8の量を決定する工程を含む方法が本明細書で提供される。このCD30L依存的in vitroバイオアッセイは、内因性CD30の発現、およびCD30とCD30Lとの相互作用に応答したこれらの細胞からのIL-8の放出のために、ヒト未分化大細胞リンパ腫(ALCL)細胞株Karpas-299(K299)を使用する。放出されたIL-8は、例えばIL-8 ELISAによって定量され得る。本明細書に記載される抗原結合性タンパク質などのCD30Lアンタゴニストは、可溶性CD30L(単一細胞アッセイ)または膜会合型CD30L(二重細胞アッセイ)のいずれかと共にインキュベートされ、次いで、K299細胞と共に培養される。細胞上清が次いで収集され、本明細書に記載される抗原結合性タンパク質などのCD30Lアンタゴニストによる遮断に応答したK299細胞からのIL8放出の阻害が、IL-8サンドイッチELISAを使用して決定される。
【０１５９】
単一細胞アッセイのために、CD30Lアンタゴニストは、所望の範囲の最終濃度、例えば、1μg/ml〜10pg/mlを得るために、Costar(登録商標)96ウェルプレート(Corning;Acton、MA)などの96ウェルマイクロタイタープレート中に滴定される。本明細書に記載されるものなどのCD30L抗原結合性タンパク質は、陽性コントロールとして使用され得る。これらのプレートを、室温で約45分間インキュベートした。次いで、各ウェルにCD30+細胞供給源を添加した。これらのプレートを、37℃で5%CO2で24時間インキュベートした。
【０１６０】
二重細胞アッセイのために、CD30L供給源は、膜結合しており、照射される。CD30L発現細胞には、ヒトCD30L+ヒトB細胞株Ramos(ATCC、Manassas、VA)、活性化カニクイザル血液T細胞またはマウスマウスDC細胞株などの細胞が含まれるがこれらに限定されない。このCD30L発現細胞は、最も高いレベルの細胞表面CD30L発現を有する細胞を選択するために使用する前に、FACSソーティングに供され得る。このCD30L発現細胞は、CD30+細胞供給源に添加する前に、CD30Lアンタゴニストと組み合わされ、45分間インキュベートされる。再び、これらのプレートは、37℃で5%CO2で24時間インキュベートされる。
【０１６１】
両方のアッセイのために、放出されたIL8は、例えばIL-8サンドイッチELISAなどの、IL-8を検出するための任意の方法によって、決定および定量され得る。かかるアッセイは、R&D Systems(Minneapolis、MN)によって提供されるものなどが、市販されている。IL-8レベルは、市販のソフトウェア、例えばDeltaSoft(DeltaSoft, Inc.、Hillsborough、NJ)およびGraphPad PRISM(GraphPad Software Inc.、San Diego、CA)を使用して決定されるELISA標準曲線およびIC50値から内挿され得る。
【０１６２】
診断目的および治療目的のためのヒトCD30L抗原結合性タンパク質の使用
本明細書に提供される抗原結合性タンパク質は、生物学的サンプル中のCD30Lを検出するため、およびCD30Lを産生する細胞または組織の同定のために、有用である。CD30Lに特異的に結合する抗原結合性タンパク質は、それを必要とする患者においてCD30Lに関連する疾患の診断および/処置において使用され得、例えば、CD30L抗原結合性タンパク質は、診断アッセイ、例えば、CD30+細胞からのIL-8の誘導において使用され得る。CD30Lに結合する抗原結合性タンパク質は、CD30Lに関連する疾患を寛解する際に、治療的使用を有し得る。
【０１６３】
適応症
本発明は、本明細書に開示されるような医学的障害の予防または治療的処置における使用のための、CD30L抗原結合性タンパク質の使用にも関する。CD30L抗原結合性タンパク質は、CD30Lが、根底にある疾患もしくは障害と関連するまたはかかる疾患もしくは障害に寄与することにおいて役割を果たす、あるいは陰性症状に別の方法で寄与する、種々の状態を処置するために有用である。
【０１６４】
本明細書に記載されるCD30L抗原結合性タンパク質のうち1つまたは複数を含む組成物の有効量を、それを必要とする患者に投与することによる、種々の疾患、例えば、自己免疫疾患および慢性炎症性疾患ならびに癌を処置するための方法が提供される。かかる組成物は、CD30+細胞とCD30L+細胞との間の相互作用を遮断し;CD30L+細胞を枯渇させることによって;またはCD30L+細胞に対するアゴニスト活性によって、免疫応答をin vivoでモジュレートするために有用である。
【０１６５】
CD30Lは、「逆方向シグナル伝達(reverse signaling)」を示し得、好中球および末梢血T細胞上に発現されたCD30Lは、これらの細胞における代謝活性を刺激するために架橋することによって活性化され得る(Wileyら、J Immunol 157:3235〜39、1996;Ceruttiら、J. Immunol. 165: 786、2000;Ceruttiら、Nat. Immunol. 2: 150、2001)。このように、本明細書に記載されるCD30Lに結合する抗原結合性タンパク質は、逆方向CD30Lシグナル伝達を遮断するためまたはCD30L+細胞を刺激するために、使用され得る。
【０１６６】
CD30+細胞は、ホジキン病と強く関連しており、CD30は、いくつかの血液悪性疾患について広く使用される臨床マーカーである(概説については、HorieおよびWatanabe、Immuno. 10:457〜470、1998を参照のこと)。本明細書に記載されるCD30L抗原結合性タンパク質の1つまたは複数を含む組成物は、単独でまたは他の治療と組み合わせて、かかる状態を処置する際に有用であり得る。
【０１６７】
CD30Lは、活性化されたT細胞および特定のB細胞および樹状細胞集団上で発現される。CD30は、活性化されたT細胞およびB細胞の集団上で発現される。この発現パターンは、CD30Lを標的化することが、T細胞とB細胞と樹状細胞との間の相互作用をモジュレートするために有用であることを示唆している。CD30Lは、体液性免疫に影響を与えることが示されている。本明細書に記載される抗原結合性タンパク質は、炎症性疾患、特にT細胞依存的B細胞応答によって駆動される炎症性疾患に関連する治療レジームにおいて使用される。
【０１６８】
関節炎は、本明細書に開示される方法および組成物によって処置され得る。本明細書で使用する場合、用語「関節炎」とは、最初に関節または関節を取り囲む結合組織を最初に冒す慢性炎症性状態を指すが、種々の身体臓器もまた冒されるようになり得る。関節炎は、元々自己免疫性もしくは外傷性であり得、または外来抗原への曝露によって誘発され得、その後、誘発性の抗原の継続した存在にはもはや依存しない慢性状態を導く。用語「関節炎」には、本明細書で使用する場合、変形性関節炎(arthritis deformans);骨関節炎(osteoarthritis);関節リウマチ(成人および若年性);ライム病関節炎;ライター病が含まれる反応性関節炎;乾癬性関節炎;結節性関節炎(arthritis nodosa);強直性脊椎炎が含まれるがこれらに限定されない血清陰性脊椎関節症が含まれる。
【０１６９】
本明細書に記載される抗原結合性タンパク質は、疼痛があり、関節、筋肉、神経、腱、皮膚、眼、結合組織または種々の他の臓器系のしばしば多発性の局在化炎症を含む、任意の慢性障害として本明細書に規定される種々のリウマチ性障害を処置する際に有用である。これらには以下が含まれるがこれらに限定されない:関節炎;強皮症;痛風;全身性エリテマトーデス;リウマチ性多発筋痛;スチル病;慢性ぶどう膜炎;孤発性封入体筋炎が含まれる皮膚筋炎および多発性筋炎が含まれる、随意筋の炎症を生じる障害。全身性エリテマトーデスは、関節、皮膚、腎臓、心臓、肺、血管および脳の炎症を引き起こし得る。その進行した形態では、全身性エリテマトーデスこの状態は、腎不全を生じ得る。
【０１７０】
以下が含まれるがこれらに限定されない内分泌系の種々の障害を処置するための治療において、本明細書に記載される抗原結合性タンパク質を使用するための方法もまた提供される:若年または成人発症型糖尿病(自己免疫性のインスリン依存型の糖尿病;非インスリン依存型および肥満媒介性(obesity-mediated)糖尿病が含まれる);特発性副腎萎縮;アジソン病;甲状腺機能低下症;グレーブス病;自己免疫性甲状腺炎、例えば橋本甲状腺炎;および多腺性自己免疫症候群(I型およびII型)。
【０１７１】
本明細書に記載される抗原結合性タンパク質は、以下が含まれるがこれらに限定されない胃腸系の状態を処置するための治療においても有用である:自己免疫性硬化性胆管炎;セリアック病;クローン病および潰瘍性大腸炎が含まれる炎症性腸疾患;慢性膵炎が含まれる自己免疫性膵炎;特発性胃不全麻痺;ならびに胃潰瘍および十二指腸潰瘍が含まれる特発性潰瘍。
【０１７２】
尿生殖器系の障害、例えば、自己免疫性糸球体腎炎および特発性糸球体腎炎;ならびに良性前立腺肥大症が含まれる慢性特発性前立腺炎(非細菌性)を処置するための治療において、本明細書に記載される抗原結合性タンパク質を使用するための方法もまた含まれる。
【０１７３】
以下が含まれるがこれらに限定されない種々の血液学的障害を処置するための治療において本明細書に記載される抗原結合性タンパク質を使用するための方法もまた、本明細書に提供される:悪性貧血および再生不良性貧血ならびにファンコニー再生不良性貧血が含まれる貧血および血液学的障害;自己免疫性溶血性貧血;特発性血小板減少性紫斑病(ITP);骨髄異形成症候群(不応性貧血、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、過剰な芽細胞を伴う不応性貧血、形質転換における過剰な芽細胞を伴う不応性貧血が含まれる);ならびに自己免疫性リンパ増殖性症候群(ALPS)。
【０１７４】
開示された抗原結合性タンパク質は、自己免疫性肝炎または慢性炎症性肝炎などの、肝臓を冒す状態を処置するために、さらに有用である。
【０１７５】
さらに、難聴を含む種々の自己免疫性障害または慢性炎症性障害を処置するために使用される、開示された抗原結合性タンパク質および組み合わせ。これらのうちの1つは、自己免疫性プロセスから生じると考えられている内耳または蝸牛神経関連の難聴、即ち、自己免疫性難聴である。この状態は現在、CD30/CD30L相互作用の阻害剤または遮断剤と共に同時発生的に投与され得るステロイド、メトトレキサートおよび/またはシクロホスファミドで処置されている。
【０１７６】
以下が含まれるいくつかの炎症性肺障害もまた、開示された抗原結合性タンパク質で処置され得る:特発性リンパ脈管筋腫症;慢性非感染性気管支炎または肺気腫と関連する慢性閉塞性肺疾患(COPD);ならびに線維性肺疾患、例えば嚢胞性線維症および特発性肺線維症。
【０１７７】
移植片対宿主病が含まれる移植に関連する障害もまた、開示された抗原結合性タンパク質で処置可能である。移植片対宿主病を予防または寛解するために、開示された抗原結合性タンパク質のうち1つまたは複数を含む組成物が、骨髄移植、または心臓、肝臓、肺、皮膚、腎臓もしくは他の臓器の移植が含まれる固形臓器移植の前に、それと同時に、またはその後に、投与され得る。
【０１７８】
開示された抗原結合性タンパク質は、自己免疫性ぶどう膜炎が含まれる慢性炎症性眼疾患を処置するためにも有用である。
【０１７９】
かかる化合物は、喘息などの気道炎症と関連する疾患を処置するためにも有用である。
【０１８０】
本明細書に記載される抗原結合性タンパク質は、以下が含まれる女性の生殖系を冒す炎症性障害を処置するためにも有用である:多発性着床不全(multiple implant failure)/不妊症;胎児喪失症候群またはIV胚喪失(自然流産);および子宮内膜症。
【０１８１】
本明細書に記載される抗原結合性タンパク質で処置可能な他の医学的障害には、中枢神経系の慢性炎症および/または変性疾患が含まれる。これには、例えば、脱髄に関連する疾患、例えば、多発性硬化症、全身性強皮症およびギラン・バレー症候群(急性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、急性運動性軸索型ニューロパチー、急性運動感覚性軸索型ニューロパチーおよびフィッシャー症候群が含まれる)が含まれる。多発性硬化症は、CD30とCD30Lとの相互作用を阻害または遮断することが可能な薬剤で処置され得る、中枢神経系の慢性変性疾患の代表である。例えば、米国特許第6,652,854号を参照のこと。
【０１８２】
開示された抗原結合性タンパク質で処置可能な他の慢性炎症性状態には、寒冷凝集素病;ベーチェット症候群;シェーグレン症候群;および特発性腱鞘炎、ならびに遺伝性欠損に関連する種々の慢性炎症性障害が含まれる。対象の阻害剤、組成物および併用治療はさらに、コルチコステロイドで同時発生的に処置され得る、ベル麻痺(特発性顔面神経麻痺);慢性疲労症候群(進行中の感染とは関連しない);慢性変性性椎間板(vertebral disc)疾患;湾岸戦争症候群;および重症筋無力症を処置するために有用である。
【０１８３】
皮膚または粘膜に関与する障害もまた、本明細書に記載される抗原結合性タンパク質を使用して処置可能である。これらには、円板状エリテマトーデス、亜急性皮膚エリテマトーデス、皮膚血管炎、ダリエー病、毛包性角化症、尋常性天疱瘡および腫瘍随伴性天疱瘡が含まれる棘融解疾患;酒さ性ざ瘡;円形脱毛症;水疱性類天疱瘡;湿疹;多形紅斑および水泡性多形紅斑(erythema multiforme bullosum)(スティーヴンス・ジョンソン症候群)が含まれる紅斑;炎症性皮膚疾患;扁平苔癬;線状IgA水疱性疾患(小児の慢性水疱性皮膚症);皮膚の弾力性の喪失;好中球性皮膚炎(スイート症候群);毛孔性紅色粃糠疹;乾癬;壊疽性膿皮症;皮膚の弾力性の喪失;ならびに中毒性表皮壊死症が含まれる。
【０１８４】
開示された抗原結合性タンパク質で処置され得る他の疾患には、自己免疫関連の慢性粘膜皮膚カンジダ症;アレルギー;サルコイドーシス;多中心性細網組織球症;ウェゲナー肉芽腫症;巨細胞動脈炎が含まれる動脈炎;血管炎および慢性自己免疫性心筋炎が含まれる。
【０１８５】
本明細書に記載される抗原結合性タンパク質を使用して医学的障害を処置するために、治療有効量の治療剤が、それを必要とする哺乳動物に投与される。この薬剤は、障害の重症度を反映する少なくとも1つの指標における持続性の改善を誘導するために適切な用量のレジメンおよび投与頻度に従って投与される。患者が、少なくとも1日間離れているが、好ましくは1週間、2週間、3週間または4週間またはそれ以上離れている、少なくとも2回の時期に改善を示す場合に、改善は「持続性」とみなされる。障害の重症度は、徴候もしくは症状に基づいて決定されるか、または患者に与えられる質問表、例えば、慢性疾患状態の状態を評価するために医師によってしばしば使用される生活の質質問表によって、決定され得る。
【０１８６】
患者の病気の重症度を反映する1つまたは複数の指標が、薬物処置の頻度および持続時間が十分であるか否かを決定するために評価され得る。選択された指標のベースライン値は、治療剤の最初の用量の投与の前に、患者の試験によって確立される。好ましくは、ベースライン試験は、第1の用量を投与して約60日以内に行われる。
【０１８７】
処置されている状態が全身性エリテマトーデスである場合、処置の十分さを決定するための指標は、以下のうち1つにおける観察された改善からなり得る:疲労;発熱;口および鼻の潰瘍;顔面発疹(「バタフライ発疹(butterfly rash)」);光線過敏症(SLEは、日光への曝露後に再燃する場合が多い);胸膜炎;心膜炎;レイノー現象(寒冷への曝露による、手指および足指への循環の低減);腎臓機能;および白血病数(SLE患者は、白血病数が減少している場合が多い)。
【０１８８】
医薬的に許容される担体で製剤化された本明細書に開示された抗原結合性タンパク質を含む医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態では、医薬的に許容される担体は、ヒト対象での投与に適切である。
【０１８９】
診断方法
記載される抗原結合性タンパク質は、CD30/CD30L相互作用と関連する疾患および/または状態を検出、診断またはモニタリングするために、診断目的で使用され得る。CD30Lの存在の検出において有用な方法の例には、イムノアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)およびラジオイムノアッセイ(RIA)が含まれる。
【０１９０】
診断的適用のために、抗原結合性タンパク質は典型的に、検出可能な標識基で標識される。適切な標識基には以下が含まれるがこれらに限定されない:放射性同位体もしくは放射性核種(例えば、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、蛍光基(例えば、FITC、ローダミン、ランタニドリン光体)、酵素基(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)、化学発光基、ビオチニル基、または二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体についての結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)。いくつかの実施形態では、この標識基は、潜在的な立体障害を低減させるために、種々の長さのスペーサーアームを介して抗原結合性タンパク質にカップリングされる。タンパク質を標識するための種々の方法が、当該分野で公知であり、使用され得る。
【０１９１】
他の診断方法が、CD30Lを発現する細胞(単数または複数)を同定するために提供される。特定の実施形態では、この抗原結合性タンパク質は、標識基で標識され、CD30Lに対する標識された抗原結合性タンパク質の結合が検出される。さらなる特定の実施形態では、CD30Lに対する抗原結合性タンパク質の結合は、in vivoで検出される。さらなる特定の実施形態では、このCD30L抗原結合性タンパク質は、当該分野で公知の技術を使用して、単離および測定される。例えば、HarlowおよびLane、1988、Antibodies: A Laboratory Manual、New York: Cold Spring Harbor(1991年版および定期的な補足);John E. Coligan編、1993、Current Protocols In Immunology New York: John Wiley & Sonsを参照のこと。
【０１９２】
他の方法が、CD30Lに対する結合について、提供される抗原結合性タンパク質と競合する試験分子の存在を検出するために提供する。1つのかかるアッセイの例は、試験分子の存在下または非存在下で、ある量のCD30Lを含む溶液中の遊離抗原結合性タンパク質の量を検出することを含む。遊離抗原結合性タンパク質(即ち、CD30Lに結合していない抗原結合性タンパク質)の量における増加は、その試験分子が、CD30L結合について抗原結合性タンパク質と競合することが可能であることを示す。一実施形態では、この抗原結合性タンパク質は、標識基で標識される。代替的に、この試験分子が標識され、遊離試験分子の量が、抗原結合性タンパク質の存在下および非存在下でモニタリングされる。
【０１９３】
処置の方法:医薬製剤、投与経路
治療有効量の1つまたは複数の抗原結合性タンパク質と医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および/またはアジュバントとを含む医薬組成物が、提供される。さらに、かかる医薬組成物を投与することによって患者を処置する方法が含まれる。用語「患者」には、ヒト患者が含まれる。用語「処置する」および「処置」は、障害の少なくとも1つの症状もしくは他の局面の軽減もしくは予防、または疾患重症度の低減などを包含する。用語「治療有効量」または「有効量」とは、哺乳動物において任意の治療応答を生じることが決定されたCD30L抗原結合性タンパク質の量を指す。かかる治療有効量は、当業者によって容易に確認される。本開示の目的のために、用語「病気」、「疾患」、「医学的状態」、「異常な状態」、「病弊」、「医学的障害」、「障害」などは、相互交換可能に使用される。
【０１９４】
抗原結合性タンパク質は、実行可能な治療剤を構成するために、完全な治癒をもたらす必要はなく、疾患の全ての症状または兆候を根絶する必要もない。当該分野で認識されるように、治療剤として使用される薬物は、所与の疾患状態の重症度を低減させ得るが、有用な治療剤とみなされるために、疾患の全ての兆候を消滅させる必要はない。同様に、予防的に投与される処置は、実行可能な予防剤を構成するために、状態の発症を予防するのに完全に有効である必要はない。疾患の影響を単に低減させること(例えば、その症状の数もしくは重症度を低減させることによって、または別の処置の有効性を増加させることによって、または別の有利な効果を生じさせることによって)、またはその疾患が対象において発生もしくは悪化する可能性を低減させることが、十分である。本明細書で提供される特定の方法は、特定の障害の重症度を反映する指標のベースラインを超える持続性の改善を誘導するのに十分な量および時間で、患者にCD30Lアンタゴニスト(例えば、本明細書に開示された抗原結合性タンパク質)を投与する工程を含む。
【０１９５】
当該分野で理解されるように、本発明の分子を含む医薬組成物は、適応症に適した様式で患者に投与される。医薬組成物は、非経口、外用または吸入によるものが含まれるがこれらに限定されない任意の適切な技術によって投与され得る。注射される場合、この医薬組成物は、例えば、関節内、静脈内、筋内、病変内、腹腔内もしくは皮下経路を介して、ボーラス注射によって、または持続注入によって、投与され得る。例えば疾患または損傷の部位における局在化投与が、経皮送達およびインプラントされた物からの徐放と同様、企図される。吸入による送達には、例えば、経鼻もしくは経口吸入、ネブライザーの使用、エアロゾル形態でのアンタゴニストの吸入などが含まれる。他の代替法には、点眼剤;丸剤、シロップ、ロゼンジ剤またはチューインガムが含まれる経口調製物;ならびにローション剤、ゲル剤、スプレー剤および軟膏剤などの外用調製物が含まれる。
【０１９６】
ex vivo手順における抗原結合性タンパク質の使用もまた企図される。例えば、患者の血液または他の体液は、ex vivoでCD30Lに結合する抗原結合性タンパク質と接触させられ得る。この抗原結合性タンパク質は、適切な不溶性マトリックスまたは固体支持体材料に結合され得る。
【０１９７】
有利には、抗原結合性タンパク質は、生理学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤などの1つまたは複数のさらなる成分を含む組成物の形態で投与される。任意選択で、この組成物は、併用治療のために1つまたは複数の生理学的に活性な薬剤をさらに含む。医薬組成物は、緩衝液、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、低分子量ポリペプチド(例えば、10個未満のアミノ酸を有するもの)、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、例えばグルコース、スクロースもしくはデキストリン、キレート剤、例えばEDTA、グルタチオン、安定剤および賦形剤からなる群より選択される1つまたは複数の物質と一緒に、CD30L抗原結合性タンパク質を含み得る。中性の緩衝化生理食塩水または同種血清アルブミンと混合された生理食塩水が、適切な希釈剤の例である。適切な業界基準に従って、ベンジルアルコールなどの防腐剤もまた添加され得る。この組成物は、希釈剤として適切な賦形剤溶液(例えば、スクロース)を使用して、凍結乾燥物として製剤化され得る。適切な成分は、使用される投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性である。医薬製剤において使用され得る成分のさらなる例は、第21版(2005)を含む任意のRemington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、PA中に提示されている。
【０１９８】
医師による使用のためのキットは、本明細書で議論される状態のいずれかを処置する際の使用のための、CD30L抗原結合性タンパク質およびラベルまたは他の指示書を含む。一実施形態では、このキットは、上に開示した組成物の形態であり得、1つまたは複数のバイアル中に存在し得る、1つまたは複数のCD30L結合性の抗原結合性タンパク質の無菌調製物を含む。
【０１９９】
投薬量および投与頻度は、投与経路、使用される特定の抗原結合性タンパク質、処置される疾患の性質および重症度、その状態が急性であるか慢性であるか、ならびに対象のサイズおよび全般的状態などの因子に従って変動し得る。適切な投薬量は、当該分野、例えば、用量増加研究を含み得る臨床試験において公知の手順によって決定され得る。
【０２００】
典型的な投薬量は、上述の因子に依存して、約0.1μg/kgから最大約30mg/kgまたはそれ以上までの範囲であり得る。特定の実施形態では、この投薬量は、0.1μg/kgから最大約30mg/kgまで、任意選択で1μg/kgから最大約30mg/kgまで、任意選択で10μg/kgから最大約10mg/kgまで、任意選択で約0.1mg/kgから5mg/kgまで、または任意選択で約0.3mg/kgから3mg/kgまでの範囲であり得る。
【０２０１】
投薬頻度は、使用される製剤中での特定のCD30L抗原結合性タンパク質の薬物動態パラメーターに依存する。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に到達するまで、この組成物を投与する。従って、この組成物は、単一用量として、または経時的な2回以上の用量として(これらは、同じ量の所望の分子を含んでも含まなくてもよい)、またはインプラントデバイスもしくはカテーテルを介した持続注入として、投与され得る。適切な投薬量は、適切な用量反応データの使用を介して確認され得る。本発明のCD30L抗原結合性タンパク質は、例えば、ある期間にわたって一定の間隔で、例えば1回または1回より多く、投与され得る。特定の実施形態では、CD30L抗原結合性タンパク質は、少なくとも1か月以上、例えば、1か月間、2か月間もしくは3か月間、またはさらには無期限の期間にわたって、投与される。慢性状態を処置するためには、長期処置が一般に最も有効である。しかし、急性状態を処置するためには、1週間から6週間までなどのより短い期間にわたる投与が十分であり得る。一般に、この抗原結合性タンパク質は、選択された指標(単数または複数)についてのベースラインを超えた、医学的に適切な程度の改善を患者が顕在化させるまで、投与される。
【０２０２】
処置されている障害の重症度を反映する少なくとも1つの指標において改善、好ましくは持続性の改善を誘導するのに十分な量および時間で患者に投与されるCD30L抗原結合性タンパク質が企図される。患者の病気、疾患または状態の程度を反映する種々の指標が、処置の量および時間が十分であるか否かを決定するために評価され得る。かかる指標には、例えば、問題の障害の疾患重症度、症状または兆候の、臨床的に認識された指標が含まれる。一実施形態では、対象が2〜4週間離れた少なくとも2回の時期に改善を示す場合に、改善は持続性であるとみなされる。改善の程度は一般に、徴候、症状、生検または他の試験結果に基づいてこの決定を行い得、対象に与えられる質問表、例えば所与の疾患のために開発された生活の質質問表もまた使用し得る医師によって、決定される。本発明の方法および組成物の特定の実施形態は、CD30L抗原結合性タンパク質および1つもしくはそれ以上のさらなるCD30Lアンタゴニスト、例えば、2つ以上の本発明の抗原結合性タンパク質、または本発明の抗原結合性タンパク質および1つもしくはそれ以上の他のCD30Lアンタゴニストの使用を含む。単独でまたは患者が罹患している状態を処置するために有用な他の薬剤と組み合わせて投与されるCD30L抗原結合性タンパク質もまた提供される。かかる薬剤の例には、タンパク質性の薬物および非タンパク質性の薬物の両方が含まれる。かかる薬剤には、例えば、自己免疫または慢性炎症に寄与し得るTNFα、IL-1、IL-2、RANKまたは他のサイトカインのアンタゴニストが含まれる。サイトカインアンタゴニストには、サイトカインおよび/またはその受容体を標的化するアンタゴニストが含まれる。サイトカインを標的化するアンタゴニストは、サイトカインに対する可溶性受容体を含み得、通常は、サイトカインに対する受容体の細胞外ドメインの一部または全てを含む。この可溶性サイトカイン受容体は、モノマーとして、またはダイマーもしくはより高次のマルチマーとして(例えば、可溶性受容体が、ヒト免疫グロブリンのダイマー促進性Fc部分に結合された融合分子として)、使用され得る。他の実施形態では、この可溶性サイトカイン受容体は、その血清半減期を増加させるためにPEG化される。いくつかの実施形態では、この可溶性サイトカインアンタゴニストは
、可溶性TNF受容体(I型またはII型)を含む。炎症性サイトカインを阻害する小さい有機分子もまた、対象の治療剤と組み合わせて使用され得る。1つより多いCD30リガンド抗原結合性タンパク質および/またはその抗原結合領域が、自己免疫性疾患または慢性炎症性疾患を処置するために同時発生的に投与され得、単独で、あるいは同じ自己免疫性状態もしくは慢性炎症性状態に対して有効なまたは同じ患者において異なる状態を処置するために投与されている他の薬物と一緒に、投与され得る。
【０２０３】
複数の治療が共投与される場合、投薬量は、当該分野で認識されるようにまたは公知のように、しかるべく調整され得る。かかる薬剤は、同時に、連続的に、交互に、または治療の全過程を有効にさせる任意の他のレジメンに従って、投与され得る。
【０２０４】
ヒト患者に加えて、CD30L抗原結合性タンパク質は、非ヒト動物、例えば家庭のペット(イヌ、ネコ、トリ、霊長類など)、家畜(domestic farm animal)(ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、トリなど)の処置において有用である。かかる場合、適切な用量は、動物の体重に従って決定され得る。例えば、0.2〜1mg/kgの用量が使用され得る。代替的に、この用量は、動物の表面積に従って決定され、例示的な用量は、0.1〜20mg/m2の範囲、またはより好ましくは、5〜12mg/m2の範囲である。イヌまたはネコなどの小動物については、適切な用量は0.4mg/kgである。CD30L抗原結合性タンパク質(好ましくは、レシピエント種由来の遺伝子から構築された)は、注射もしくは他の適切な経路によって、動物の状態が改善されるまで、1週間に1回もしくはそれ以上の回数投与されるか、または無期限に投与され得る。
【０２０５】
実施した実験および達成された結果を含む以下の実施形態および実施例は、例示目的のためにのみ提供されているのであって、添付された特許請求の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【０２０６】
実施形態
1.a)TABLE 3(表3)に示されるCDRH1と4以下のアミノ酸の置換、挿入または欠失によって異なるCDRH1;
b)TABLE 3(表3)に示されるCDRH2と7以下のアミノ酸の置換、挿入および/または欠失によって異なるCDRH2;
c)TABLE 3(表3)に示されるCDRH3と11以下のアミノ酸の置換、挿入および/または欠失によって異なるCDRH3;
からなる群より選択されるCDRH1、CDRH2およびCDRH3を含む少なくとも1つの重鎖可変領域を含み;かつ
d)TABLE 3(表3)に示されるCDRL1と4以下のアミノ酸の置換、挿入および/または欠失によって異なるCDRL1;
e)TABLE 3(表3)に示されるCDRL2と2以下のアミノ酸の置換、挿入または欠失によって異なるCDRL2;
f)TABLE 3(表3)に示されるCDRL3と2以下のアミノ酸の置換、挿入または欠失によって異なるCDRL3
からなる群より選択されるCDRL1、CDRL2およびCDRL3を含む少なくとも1つの軽鎖可変領域を含む、CD30Lに結合する単離された抗原結合性タンパク質。
【０２０７】
2.
配列番号14、15、16、17、18および33からなる群より選択されるCDRH1;
配列番号19、20、21、22、23、24および34からなる群より選択されるCDRH2;
配列番号25、26、27、28、29および35からなる群より選択されるCDRH3;
配列番号1、2、3、4、5、6および30からなる群より選択されるCDRL1;
配列番号7、8、9、10および31からなる群より選択されるCDRL2;ならびに
配列番号11、12、13および32からなる群より選択されるCDRL3
を含む、実施形態1に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２０８】
3.a)CDR1が、配列番号36、28、40、42もしくは44のアミノ酸残基23〜36を含み、CDR2が、アミノ酸残基52〜58を含み、CDR3が、アミノ酸残基91〜100を含む、CDR1、CDR2およびCDR3を含む軽鎖可変領域;または
b)CDR1が、配列番号46のアミノ酸残基25〜36を含み、CDR2が、アミノ酸残基52〜58を含み、CDR3が、アミノ酸残基91〜100を含む、CDR1、CDR2およびCDR3を含む軽鎖可変領域
からなる群より選択される少なくとも1つの軽鎖可変領域;ならびに
CDR1が、配列番号48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70もしくは72のアミノ酸残基31〜35を含み、CDR2が、アミノ酸残基50〜65を含み、CDR3が、アミノ酸残基98〜113を含む、CDR1、CDR2およびCDR3を含む少なくとも1つの重鎖可変領域
を含む、ヒトCD30Lに結合する単離された抗原結合性タンパク質。
【０２０９】
4.少なくとも1つの重鎖可変領域および少なくとも1つの軽鎖可変領域を含む、実施形態1に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２１０】
5.少なくとも2つの重鎖可変領域および少なくとも2つの軽鎖可変領域を含む、実施形態1に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２１１】
6.重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、CD30Lに結合する単離された抗原結合性タンパク質であって、重鎖可変領域配列が、TABLE 2(表2)に示される重鎖可変領域配列と31以下のアミノ酸の置換、付加および/または欠失によって異なり;軽鎖可変領域配列が、TABLE 1(表1)に示される軽鎖可変領域配列と30以下のアミノ酸の置換、付加および/または欠失によって異なる、CD30Lに結合する単離された抗原結合性タンパク質。
【０２１２】
7.
配列番号48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70および72に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列から構成される重鎖可変領域;ならびに
配列番号36、38、40、42、44および46に対して少なくとも88%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、CD30Lに結合する単離された抗原結合性タンパク質。
【０２１３】
8.
a)配列番号48、50、52、54、56、58、60および62からなる群より選択される重鎖可変領域ならびに配列番号36の軽鎖可変領域を含む、単離された抗原結合性タンパク質;
b)配列番号64の重鎖可変領域および配列番号38の軽鎖可変領域を含む、単離された抗原結合性タンパク質;
c)配列番号66の重鎖可変領域および配列番号40の軽鎖可変領域を含む、単離された抗原結合性タンパク質;
d)配列番号68の重鎖可変領域および配列番号42の軽鎖可変領域を含む、単離された抗原結合性タンパク質;
e)配列番号70の重鎖可変領域および配列番号44の軽鎖可変領域を含む、単離された抗原結合性タンパク質;ならびに
f)配列番号72の重鎖可変領域および配列番号46の軽鎖可変領域を含む、単離された抗原結合性タンパク質
からなる群より選択される、CD30Lに結合する単離された抗原結合性タンパク質。
【０２１４】
9.抗体である、上述の実施形態1〜8のいずれかに記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２１５】
10.前記抗体が、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多特異性抗体またはそれらの抗体断片である、実施形態9に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２１６】
11.前記抗体断片が、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片、ダイアボディまたは単鎖抗体分子である、実施形態10に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２１７】
12.ヒト抗体である、実施形態10に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２１８】
13.モノクローナル抗体である、実施形態10に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２１９】
14. IgG1型、IgG2型、IgG3型またはIgG4型である、実施形態9に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２２０】
15. IgG1型またはIgG2型である、実施形態14に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２２１】
16.
a)CD30/CD30L相互作用を阻害する;
b)CD30Lに誘導されるIL-8誘導を阻害する;
c)ヒトCD30Lに対する結合について、抗体A〜Fのうち1つと交差競合する;
d)解離定数≦70pMである、および
e)抗体A〜Fのうち1つと実質的に同じKDで、ヒトCD30Lに結合する
からなる群より選択される少なくとも1つの特性を有する、上述の実施形態のいずれかに記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２２２】
17. AA201〜234、または例えばAA205〜230もしくはAA211〜226によって規定されるCD30LのC末端領域に結合する、CD30Lに結合する単離された抗原結合性タンパク質。
【０２２３】
18. AA75〜95、例えばAA80〜90またはAA82〜88によって規定されるCD30Lのさらなる領域に結合する、実施形態17に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２２４】
19.
a)CD30/CD30L相互作用を阻害する;
b)CD30Lに誘導されるIL-8誘導を阻害する;
c)ヒトCD30Lに対する結合について、抗体A〜Fのうち1つと交差競合する;
d)ヒトCD30Lに対する解離定数が最大で70pMである、および
e)抗体A〜Fのうち1つと実質的に同じまたはそれよりも低いKdで、ヒトCD30Lに結合する
からなる群より選択される少なくとも1つの特性を有する、実施形態17または18に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２２５】
20.hCD30Lに対する抗原結合性タンパク質の結合が、抗体A、B、C、D、EおよびFのうち1つまたは複数のFabの結合によって阻害される、上述の実施形態17〜19のいずれかに記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２２６】
21. CD30Lに対する結合について、抗体A、B、C、D、EおよびFのうち1つまたは複数のFabと競合する、上述の実施形態17〜19のいずれかに記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２２７】
22.Fabが抗体A1のFabである、実施形態20〜21のいずれかに記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２２８】
23.最大でも75pM、例えば最大でも50pM、例えば40pMの、ヒトCD30Lに対する解離定数(KD)を有する、上述の実施形態17〜22のいずれかに記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２２９】
24.
CDRL1が、配列番号30のCDRL1コンセンサス配列であり、
CDRL2が、配列番号31のCDRL2コンセンサス配列であり、
CDRL3が、配列番号32のCDRL3コンセンサス配列であり、
CDRH1が、配列番号33のCDRH1コンセンサス配列であり、
CDRH2が、配列番号34のCDRH2コンセンサス配列であり、
CDRH3が、配列番号35のCDRH3コンセンサス配列である
CDRH1、CDRH2およびCDRH3ならびにCDRL1、CDRL2およびCDRL3を含む、上述の実施形態17〜23のいずれかに記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２３０】
25.
CDRL1が、配列番号30のCDRL1コンセンサス配列であり、
CDRL2が、配列番号31のCDRL2コンセンサス配列であり、
CDRL3が、配列番号32のCDRL3コンセンサス配列であり、
CDRH1が、配列番号17の配列または配列番号75のCDRH1コンセンサス配列であり、
CDRH2が、配列番号34のCDRH2コンセンサス配列であり、
CDRH3が、配列番号35のCDRH3コンセンサス配列である
CDRH1、CDRH2およびCDRH3ならびにCDRL1、CDRL2およびCDRL3を含む、上述の実施形態17〜23のいずれかに記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２３１】
26.
CDRL1が、配列番号30のCDRL1コンセンサス配列であり、
CDRL2が、配列番号31のCDRL2コンセンサス配列であり、
CDRL3が、配列番号32のCDRL3コンセンサス配列である
CDRH1、CDRH2およびCDRH3、ならびに
CDRH1が、配列番号17の配列または配列番号75のCDRH1コンセンサス配列であり、
CDRH2が、配列番号19、20、21、22、23および24から選択され、
CDRH3が、配列番号35のCDRH3コンセンサス配列である
CDRL1、CDRL2およびCDRL3
を含む、上述の実施形態17〜23のいずれかに記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２３２】
27.
CDRL1が、配列番号30のCDRL1コンセンサス配列であり、
CDRL2が、配列番号31のCDRL2コンセンサス配列であり、
CDRL3が、配列番号32のCDRL3コンセンサス配列である
CDRH1、CDRH2およびCDRH3、ならびに
CDRH1が、配列番号17の配列または配列番号75のCDRH1コンセンサス配列であり、
CDRH2が、配列番号19、20、21、22、23および24からなる群より選択され、
CDRH3が、配列番号25、26、27、28および29からなる群より選択される
CDRL1、CDRL2およびCDRL3
を含む、上述の実施形態17〜23のいずれかに記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２３３】
28.
配列番号14、15、16、17および18からなる群より選択されるCDRH1;
配列番号19、20、21、22、23および24からなる群より選択されるCDRH2;
配列番号25、26、27、28および29からなる群より選択されるCDRH3;
配列番号1、2、3、4、5および6からなる群より選択されるCDRL1;
配列番号7、8、9および10からなる群より選択されるCDRL2;ならびに
配列番号11、12および13からなる群より選択されるCDRL3
を含む、上述の実施形態17〜23のいずれかに記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２３４】
29.
a)配列番号14、19、25によって同定されるCDRH1、CDRH2およびCDRH3ならびに配列番号1、7および11によって同定されるCDRL1、CDRL2およびCDRL3、
b)配列番号15、21、26によって同定されるCDRH1、CDRH2およびCDRH3ならびに配列番号2、8および12によって同定されるCDRL1、CDRL2およびCDRL3、
c)配列番号15、21、26によって同定されるCDRH1、CDRH2およびCDRH3ならびに配列番号3、8および12によって同定されるCDRL1、CDRL2およびCDRL3、
d)配列番号16、22、27によって同定されるCDRH1、CDRH2およびCDRH3ならびに配列番号4、9および12によって同定されるCDRL1、CDRL2およびCDRL3、
e)配列番号17、23、28によって同定されるCDRH1、CDRH2およびCDRH3ならびに配列番号5、8および13によって同定されるCDRL1、CDRL2およびCDRL3、または
f)配列番号18、24、29によって同定されるCDRH1、CDRH2およびCDRH3ならびに配列番号6、10および12によって同定されるCDRL1、CDRL2およびCDRL3
を含む、上述の実施形態17〜23のいずれかに記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【０２３５】
30.実施形態1〜29のいずれかに記載の少なくとも1つの抗原結合性タンパク質と競合する、抗原結合性タンパク質。
【０２３６】
31.完全にまたは部分的に非フコシル化されている、実施形態1〜29のいずれかに記載の抗原結合性タンパク質。
【０２３７】
32.上述の実施形態のいずれかに記載の抗原結合性タンパク質をコードする、単離された核酸分子。
【０２３８】
33.少なくとも1つの重鎖可変領域が、配列番号49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71および73からなる群より選択される単離された核酸分子によってコードされ、少なくとも1つの軽鎖可変領域が、配列番号37、39、41、43、45および47からなる群より選択される単離された核酸分子によってコードされる、実施形態32に記載の単離された核酸分子。
【０２３９】
34.制御配列に作動可能に連結されている、実施形態33に記載の核酸分子。
【０２４０】
35.実施形態32に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【０２４１】
36.実施形態32に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【０２４２】
37.実施形態35に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【０２４３】
38.実施形態33もしくは34に記載の核酸分子またはその相補体の断片である、ハイブリダイゼーションプローブ、PCRプライマーまたは配列決定プライマーとしての使用に十分な、単離されたポリヌクレオチド。
【０２４４】
39.抗原結合性タンパク質を分泌する宿主細胞から前記抗原結合性タンパク質を調製する工程を含む、実施形態1〜31のいずれかに記載の抗原結合性タンパク質を作製する方法。
【０２４５】
40.実施形態1〜31のいずれかに記載の少なくとも1つの抗原結合性タンパク質および医薬的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【０２４６】
41.標識基またはエフェクター基をさらに含む、実施形態40に記載の医薬組成物。
【０２４７】
42.前記標識基が、同位体標識、磁気標識、酸化還元活性のある部分、光学色素、ビオチン化基、および二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープからなる群より選択される、実施形態41に記載の医薬組成物。
【０２４８】
43.前記エフェクター基が、放射性同位体、放射性核種、毒素、治療基および化学療法基からなる群より選択される、実施形態42に記載の医薬組成物。
【０２４９】
44.有効量の実施形態1〜31のいずれかに記載の少なくとも1つの単離された抗原結合性タンパク質を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、患者においてCD30Lと関連する状態を処置または予防する方法。
【０２５０】
45.単離された抗原結合性タンパク質が、単独でまたは併用治療として投与される、実施形態44に記載の方法。
【０２５１】
46.有効量の実施形態1〜31のいずれかに記載の少なくとも1つの抗原結合性タンパク質を投与する工程を含む、患者においてCD30L活性を低減させる方法。
【０２５２】
47.処置の方法における使用のための、上述の実施形態1〜31のいずれかに記載の抗原結合性タンパク質。
【０２５３】
48.炎症性疾患の処置のための、上述の実施形態1〜31のいずれかに記載の抗原結合性タンパク質。
【０２５４】
49.自己免疫疾患、例えば関節炎(関節リウマチ(RA)が含まれる)、ならびに全身性エリテマトーデス(SLE)、クローン病および潰瘍性大腸炎が含まれる炎症性腸疾患(IBD)の処置のための、上述の実施形態1〜31のいずれかに記載の抗原結合性タンパク質。
【実施例】
【０２５５】
(実施例1)
ヒトCD30L抗体の生成
XenoMouse(商標)テクノロジー(Amgen、Thousand Oaks、CA)を使用して、組換えヒトCD30L活性を認識し阻害するヒトモノクローナル抗体を開発した。選択した抗体は、ヒトおよびカニクイザルCD30Lとは交差反応性であったが、マウスCD30Lとは交差反応性でなかった。
【０２５６】
ハイブリドーマ上清を、293T細胞上で発現された組換えヒトCD30Lに対する結合について蛍光定量的微量(fluorometric microvolume)アッセイテクノロジー(FMAT)によってスクリーニングし、Ramos細胞上のネイティブヒトCD30Lに対する結合について蛍光活性化細胞ソーティング(FACs)分析によってスクリーニングした。このFMATアッセイでは、プレートを、CD30Lを発現する293T細胞で被覆し、ハイブリドーマ上清を添加し、次いで二次抗ヒトIg抗体を、標準的なELISA技術を介した検出のために添加した。陰性コントロールは、CD30Lを発現しない対応する非トランスフェクト293T細胞であった。
【０２５７】
上清を精製し、組換え抗体を、IgG1構築物およびIgG2構築物として発現させた。これらの抗体を、ネイティブヒトおよびカニクイザルCD30Lに対する結合について再スクリーニングした。簡潔に述べると、ヒトバーキットリンパ腫Ramos細胞(3×105個/ウェル)を、ブロッキング緩衝液(0.02%アジ化ナトリウム、2%正常ヤギ血清および1%正常ウサギ血清を含むPBS)中での抗CD30L IgG抗体の滴定(10μg/mL〜3.2ng/mLの最終濃度)と共に、丸底96ウェルマイクロタイタープレート(Costar(登録商標)96ウェルプレート(Corning;Acton、MA)中でインキュベートした。ヒトCD30.Fc融合タンパク質を、結合についての陽性コントロールとして含めた。細胞を、4℃で30分間インキュベートし、次いで、PBSで2回洗浄し、30μL/ウェルの抗hu IgG-ビオチン(ブロッキング緩衝液中1:50;Jackson Immunoresearch、West Grove、PA)と共に4℃でさらに30分間インキュベートした。PBSで2回洗浄した後、細胞を、30μL/ウェル(PBS中1:50希釈)のストレプトアビジン-フィコエリトリン(PE;Molecular Probes、Eugene、OR)と共に4℃で30分間インキュベートした。細胞を、PBSで2回洗浄し、FACs分析のために調製した。結果はTable 5(表5)中に見出すことができる。
【０２５８】
カニクイザル活性化T細胞を、Isolymphでの密度遠心分離(2000rpm.、20分間)によって、ヘパリン処理したカニクイザル血液から末梢血単核球(PBMC)を単離することによって調製した。PBMCを、25mLのPBS中で再懸濁し、2-アミノエチルイソチオウロニウムブロミド(AET)処理したヒツジ赤血球の50%溶液300μlに添加し、4℃で10分間約700rpmで遠心分離した。ペレット化した細胞を、4℃でさらに20分間インキュベートし、穏やかに再懸濁し、Isolymphで遠心分離した。上清を除去して、T細胞/赤血球ペレットを残した。次いで、このペレットを、25mLの溶解緩衝液(水中0.85%の塩化アンモニウム)中で再懸濁し、37℃で10分間インキュベートした。得られたT細胞をペレット化し、培養培地(RPMI-1640培地+10%熱不活化胎仔ウシ血清)中で2回洗浄し、次いで、10ng/mLのホルボールミリステートアセテート(PMA;Sigma Chemicals、St Louis、MO)および500ng/mLのイオノマイシン(Calbiochem、San Francisco、CA)の存在下で37℃で18時間培養した(1×106個/mL)。培養期間の最後に、カニクイザルT細胞を計数し、PBSで1回洗浄し、PBS中2%のヤギ血清、1%のウサギ血清および0.1%のヒト血清と共に、4℃で30分間インキュベートした。次いで、細胞を、ヒトRamos細胞について上記したように抗huCD30L抗体で染色した。結果はTable 5(表5)中に見出すことができる。
【０２５９】
これらの抗体を、可溶性ヒトCD30.Fc分子に対するヒトCD30Lの結合を遮断する能力についてもスクリーニングした。簡潔に述べると、ヒトRamos細胞または活性化カニクイザルT細胞を、ブロッキング緩衝液中50μg/mLの抗CD30L IgGと共に、4℃で30分間インキュベートした。次いで、可溶性huCD30.Fc-Hisを、2.5ug/mLの最終濃度で添加し(30μL/ウェル)、4℃で30分間インキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄し、5μg/mLのマウス抗Hisモノクローナル抗体(ブロッキング緩衝液中30μL/ウェル)と共にインキュベートし、4℃で30分間インキュベートした。PBSで2回洗浄した後、細胞を、抗マウスIgG-PE(PBS中1:50;BD Pharmingen、San Diego、CA)と共に、4℃でさらに30分間インキュベートした。次いで、細胞を、PBSで2回洗浄し、FACs分析のために調製した。結果はTable 5(表5)中に見出すことができる。
【０２６０】
(実施例2)
CD30L抗体の機能的スクリーニング
これらの抗体を、2つのIL-8放出アッセイを使用して、CD30L/CD30相互作用を遮断する能力について特徴付けた。これらのアッセイは、内因性CD30を発現し、CD30Lに応答してIL-8を放出する、ヒト未分化大細胞リンパ腫(ALCL)細胞株Karpas-299(K299)を使用する。簡潔に述べると、精製された抗ヒトCD30L IgG抗体を、組換えCD30L(単一細胞アッセイ)、またはネイティブCD30Lを発現するRamos細胞(二重細胞アッセイ)のいずれかと共にインキュベートし、K299細胞と共に培養した。規定されたインキュベーション期間の後、細胞上清を収集し、サンドイッチELISAを使用してIL-8含量について分析して、抗体候補による、CD30Lに応答したK299細胞からのIL-8放出の阻害を決定した。
【０２６１】
単一細胞アッセイ
抗CD30L IgG抗体を、培養希釈剤(RPMI-1640培地+10%熱不活化胎仔ウシ血清)中に滴定し、丸底96ウェルマイクロタイタープレート(Costar(登録商標)96ウェルプレート(Corning;Acton、MA))中に入れ、1μg/mlから10pg/mlの最終濃度範囲を得た。陽性コントロールとして、マウス抗ヒトCD30Lモノクローナル抗体を、米国特許第5,480,981号に記載される通りに調製した。希釈剤およびCD30L IgGの最終容量は、100μl/ウェルであった。次いで、各ウェルに、50μlの組換えヒトCD30Lイソロイシンジッパー(huCD30L LZ)を添加した。huCD30L LZ構築物は、ロイシン残基をイソロイシン残基で置き換えることによって改変されたイソロイシンジッパーモチーフに、そのN末端において連結された、ヒトCD30Lの細胞外ドメイン(米国特許第5,480,981号を参照のこと)からなる。この単一細胞アッセイを使用して、huCD30L LZの代わりにcyno CD30L LZを使用して、cyno交差反応性もまた決定した。cynoCD30L LZを、ヒトLZ分子について記載されたように調製した。
【０２６２】
これらのプレートを、室温で45分間インキュベートした。各ウェルに、50μlのK299細胞(細胞4×105個/ml)を添加した。次いで、これらのプレートを、37℃で5%CO2で24時間インキュベートした。
【０２６３】
細胞上清中のIL-8の量を、製造業者の指示に従ってCDCL8/IL-8 ELISA DuoSetキットを使用して(R&D Systems、Minneapolis、MN)、サンドイッチELISAによって決定した。IL-8レベルを、DeltaSoft 3バージョン2.2ソフトウェア(DeltaSoft, Inc. Hillsborough、NJ)を使用して、ELISA標準曲線から内挿した。全ての結果を、IC50値と同様に、GraphPad PRISMソフトウェアv. 4.01(GraphPad Software Inc.、San Diego、CA)によって計算された、3連の培養物についての平均値±平均値の標準誤差(SEM)として表した。抗体A1についてhuCD30L LZを使用して導出されたIC50値は、2700pMであった。cynoCD30L LZを使用した結果は、Table 5(表5)中に見出すことができる。
【０２６４】
二重細胞アッセイ
上記のように、抗CD30L IgG抗体を、培養希釈剤中に滴定し、丸底96ウェルマイクロタイタープレート中に配置して、1μg/mlから10pg/mlの最終濃度範囲を得た。希釈剤およびCD30L IgGの最終容量は、100μl/ウェルであった。各ウェルに、50μlの照射した(5000RADS)CD30L+Ramos細胞(4×106個/ml、ATCC)を添加した。このRamos細胞を、FACSソーティングに供して、最も高いレベルの細胞表面CD30L発現を有する細胞を選択した。
【０２６５】
これらのプレートを、室温で45分間インキュベートした。各ウェルに、50μlのK299細胞(細胞4×105個/ml)を添加した。これらのプレートを、37℃で5%CO2で24時間インキュベートした。
【０２６６】
培養上清中のIL-8の量を、製造業者の指示に従ってCDCL8/IL-8 ELISA DuoSetキットを使用して(R&D Systems、Minneapolis、MN)、サンドイッチELISAによって決定した。IL-8の量およびIC50値を、上記のように計算した、Table 5(表5)を参照のこと。
【０２６７】
抗体リードを、マウス抗ヒトCD30Lモノクローナル抗体コントロールと比較して、CD30Lに誘導されるIL-8誘導を阻害する能力に基づいて選択した。
【０２６８】
【表５】
0006370774.tif 000006
【０２６９】
(実施例3)
結合競合によるCD30L抗体のビニング
ビニングを、1つの標識されたCD30L抗体がrhCD30Lに対する結合について過剰量の他の未標識CD30L抗体と競合する、結合競合アッセイを使用して実施した。互いに競合する抗体を、同じビンに割り当てた。抗体A〜Fは、rhCD30Lに対する結合について互いに競合した。
【０２７０】
(実施例4)
CD30L抗体についての細胞上平衡解離定数(Kd)の決定
Ramos細胞上で発現されたCD30Lに対するCD30L抗体の結合親和性を、FACS Kd法によって決定した。これらのRamos細胞を、RMPI1640培地+10%FBS+L-glut+0.05%アジド中で培養した。抗体を、細胞培養培地を使用して60nMから338fMまで1:3で滴定し、2つの異なる一定細胞濃度(25000および250000細胞)でインキュベートする、2つの平衡反応を設定した。これらのプレートをパラフィンで密封し、振盪しながら37℃で20時間インキュベートした。平衡プレートを遠心分離し、細胞ペレットを、氷冷FACS緩衝液(1×D-PBS+2%FBS)で2回洗浄した。次いで、細胞を、暗中で氷上で1時間、二次抗体ヤギ抗ヒトFc Cy5(Jackson Immuno Research、West Grove、PA)および7AAD(BD-Biosciences、Rockville、MD)と共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞を、フローサイトメトリー分析の前に氷冷FACS緩衝液で2回洗浄した。生細胞集団上でゲートしたFL4シフトのGeoMean値は、結合した[Ab]を測定する。次いで、平衡溶液中の理論的遊離[Ag]を反映するGeoMean値の逆数を計算した。GeoMean読み取りの逆数値を、各抗体についての分析およびKd計算のためにKinExAソフトウェア中で使用した。遊離[Ag]測定を、滴定成分の出発濃度に対してプロットし、これらのプロットから、2つの異なる細胞濃度において、KinExATM Proソフトウェアにおけるn曲線(n-curve)分析を使用する曲線フィッティングからKdを取得した。95%信頼区間はKd低およびKd高として与えられる。
【０２７１】
Table 6(表6)に示すように、これらの抗体は、Ramos細胞上で発現されたCD30Lに対して高い親和性を有する。全てが、低いpM範囲のKd値を有した。
【０２７２】
【表６】
0006370774.tif 000007
【０２７３】
(実施例5)
ADCCアッセイ
A1由来の可変ドメインを、ヒトIgG1定常ドメインに結合させた(A1 IgG1)。この抗体を、非フコシル化抗体A1 IgG1fを生じるFut-8ノックアウトCHO細胞株中で発現させた。
【０２７４】
CD30L抗体媒介性の標的細胞の死滅を、抗体依存性細胞傷害(ADCC)アッセイにおいて評価した。標的細胞Ramos(CD30L発現レベル高い)、JD38(CD30L発現レベル中程度)、DS179(CD30L発現レベル低い)およびEW36(CD30L発現なし)を収集し、cRPMI-10培地(RPMI(Life Technologies、Carlsberg、CA)+10%胎仔ウシ血清)中に細胞2×106個/mlで再懸濁した。無水DMSO中のカルセイン-AM、4MM(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO)を、10μMの最終濃度(1:400希釈)になるように添加した。細胞を、37℃で30分間インキュベートし、その後PBS中で2回洗浄した(1500rpm、各々4℃で5分間)。ペレットを、cRPMI-10中で再懸濁し、細胞0.2×106個/mLの濃度に調整し、次の工程での使用のために氷上に置いた。
【０２７５】
抗体A1 IgG1および抗体A1 IgG1fを、U底96ウェルプレート(BD、Franklin Lakes、NJ)に、10ug/mlから開始して10倍連続希釈で最初に添加した。リツキシマブ(Genentech、South San Francisco、CA)を、陽性抗体コントロールとして使用した。抗体A1(IgG2)を、陰性コントロールとして添加した。次いで、上記の、カルセイン-AM標識した標的細胞を、各ウェルに添加し(細胞10,000個/ウェル)、37℃で20分間抗体と共にインキュベートした。インキュベーション後、各ウェルに、細胞4×106個/mlの濃度で50μlのNK細胞を添加し、37℃で4時間インキュベートした。NK細胞をペレット化し(1500rpm、4℃で5分間)、cRPMI-10中に再懸濁し、細胞濃度を細胞4×106個/mLに調整した。
【０２７６】
インキュベーション後、コントロールウェルを、20μl/ウェルの9% NP-40(IGEPAL CA 630、Sigma-Aldrich)を添加することによって調製して、100%溶解を刺激した。全ての他のウェルは、cRPMI-10培地単独を20μl/ウェル受けた。これらのプレートを、4℃で4分間800RPMで遠心した。上清(150μl)を取り出し、きれいな底の黒色96ウェルプレート(Corning、Lowell、MA)に移し、蛍光を、プレートリーダー(Molecular Devices、Spectra max GEMINI)、励起485、発光535で読み取った。
【０２７７】
パーセント最大溶解を、(サンプル値-自発的溶解)/(100%溶解-自発的溶解)*100として計算した。
【０２７８】
4種の標的細胞のCD30L抗体媒介性の死滅の結果を図1(A〜D)に示す。抗体A1 IgG1は、CD30L発現細胞のいずれにおいても、細胞死滅を媒介しなかった(図1A〜図1Dを参照のこと)。抗体A1 IgG1fは、高いCD30L発現を有する標的細胞(図1Aを参照のこと)および中程度のCD30L発現を有する標的細胞(図1Bを参照のこと)の両方において、細胞死を誘導した。抗体A1 IgG1fは、中程度のレベルのCD30Lを有する標的細胞においてよりも高いCD30L発現を有する標的細胞において、より高いレベルの枯渇を媒介した(図1Aおよび図1Bを参照のこと)。抗体A1 IgG1fは、低いCD30L発現を有する標的細胞(C)もCD30L発現を有さない標的細胞(D)も、死滅させなかった。
【０２７９】
(実施例6)
抗CD30L mAbのHX-MSによるエピトープマッピング
抗CD30L抗体のCD30L結合領域を、HX-MSによって評価して、本明細書に記載される抗体A〜Fとの分子相互作用に関与するヒトCD30Lの領域(単数または複数)を同定した。
【０２８０】
材料
hCD30L:hCD30Lの細胞外ドメインの2つの異なるバージョンを使用し、His-hCD30L-ECは、配列番号74によって同定されるように、hCD30Lの残基63〜234を含み、その名称が示すように、N末端Hisタグ(RnD Systems)を有するタンパク質が産生される。FLAG-hCD30L-ECは、配列番号74の残基66〜234を含み、N末端FLAG-Hisタグを用いて哺乳動物細胞から取得した。
【０２８１】
ヒトCD30Lの細胞外ドメインのcDNAは、Origeneから購入した。FLAG-His6タグおよびTEVプロテアーゼ切断部位を、2工程伸長PCRによってアミノ酸66〜234のコード配列のN末端に融合させ、CD33シグナルペプチドとインフレームで、pJSV001プラスミドのEcoRI部位とBamHI部位との間にクローニングした。
【０２８２】
以下で使用したFLAG-hCD30L-ECは、N-グリコシル化を消滅させるN153Q点変異を含んでいる。N153Q変異体を、Qiagen quick-change point mutagenesis Kit(QIAGEN)を用いて生成した。
【０２８３】
HEK293 6E細胞を、タンパク質産生に使用した。これらの細胞を、25ug/mlのGeneticin 418(Gibco)および0.1% F-68(Gibco)を補充したFreeStyle(商標)培地(Gibco)を用いて培養した。トランスフェクションの当日に、細胞を、細胞1×106個/mlの密度で維持し、製造業者の指示に従って293 Fectin(Invitrogen)でトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、ペプトン(Promega)を培養物に添加して、0.5%の最終濃度にした。細胞を、5日間増殖を続けさせ、その後上清を回収した。
【０２８４】
培養上清を、遠心分離(15,000rpm×20分間、4℃)によって収集し、次いで、0.22μm硝酸セルロースメンブレンでの濾過によって清澄化した。清澄化した上清を、Ni-chelated sepharose XK60カラム(20ml)(GE healthcare)にアプライし、その後10カラム容量を20mM NaH2PO4 pH7.4、0.5M NaClで洗浄した。次いで、タンパク質を、5カラム容量の20mM NaH2PO4 pH7.4、0.5M NaCl、0.5Mイミダゾールを用いて溶出した。溶出したタンパク質をプールし、Amicon ultra 15遠心分離ユニット(10,000Da MWCO、Millipore)によって約5mlに濃縮し、Hiload 26/60 Superdex 200 318mlカラム(GE Healthcare)上にロードして凝集物を除去し、PBSに緩衝液交換した。濃縮後、最終タンパク質濃度を、NANODROP UV分光計を用いて280nm吸光度を測定することによって決定した。タンパク質純度を、SDS-PAGEによって評価した。
【０２８５】
脱グリコシル化を、5ugのhCD30L当たり1UのPNGaseF(Roche)を使用して、37℃でおよそ16時間実施した。脱グリコシル化されたタンパク質を、4℃で貯蔵し、1週間以内に実験に使用した。全てのタンパク質を、HX-MS実験の前にPBS pH7.4に緩衝液交換した。
【０２８６】
HX-MS実験
計測手段およびデータ記録
HX実験を、Synapt G2質量分析器(Waters Inc.)につないだHDX Technology(Waters Inc.)を用いてnanoACQUITY UPLC Systemで実施した。Waters HDXシステムは、LeapShellソフトウェア(Leap Technologies Inc/Waters Inc.)によって操作されるLeapロボット(H/D-x PAL;Waters Inc.)を含み、これが、重水素交換反応の開始、反応時間制御、クエンチ反応、UPLCシステムへの注入、および消化時間制御を実施した。Leapロボットは、それぞれ、緩衝液貯蔵およびHX反応のために20℃に維持され、タンパク質およびクエンチ溶液の貯蔵のために2℃に維持された、2つの温度制御されたスタックを備えた。Waters HDXシステムはさらに、分取カラムおよび分析カラム、ならびにLCチュービングおよび切り替え弁を1℃に保持する温度制御されたチャンバを含んだ。別々に温度制御されたチャンバは、ペプシンカラムを25℃に保持する。インラインペプシン消化のために、300 pmol hCD30Lを含むクエンチされたサンプル100μLを、100μL/分のアイソクラチックな流速(0.1%ギ酸:CH3CN 95:5)を使用して、25℃に配置したPoroszyme(登録商標)Immobilized Pepsin Cartridge(2.1×30mm(Applied Biosystems))にロードし、これを通過させた。得られたペプチドを、VanGuard分取カラムBEH C18 1.7μm(2.1×5mm(Waters Inc.))上で捉え、脱塩した。引き続いて、分析カラムUPLC-BEH C18 1.7μm(1×100mm(Waters Inc.))とインラインに分取カラムを配置するように弁を切り替え、ペプチドを、nanoAQUITY UPLCシステム(Waters Inc.)から40μl/分で送達される10〜50%のBの9分勾配を使用して分離した。移動相は、A:0.1%ギ酸およびB:CH3CN中の0.1%ギ酸からなった。ESI MSデータおよび分離上昇エネルギー(separate elevated energy)(MSE)実験を、Synapt G2質量分析器(Waters Inc.)を使用して陽イオンモードで獲得した。ロイシン-エンケファリンを、ロックマスとして使用し(m/z 556.2771における[M+H]+イオン)、データを、連続体モードで回収した(さらなる説明については、AndersenおよびFaber、Int. J. Mass Spec.、302、139〜148(2011)を参照のこと)。
【０２８７】
データ分析
消化ペプチドを、ペプチドおよび断片がSynapt G2(Waters Inc.)のイオン移動度特性を利用してさらに整列される、標準的なMSE方法を使用して別々の実験において同定した。MSEデータを、ProteinLynx Global Serverバージョンバージョン2.5(Waters Inc.)を使用して処理した。HX-MS生データファイルを、DynamX 2.0ソフトウェア(Waters Inc.)において処理した。DynamXは、ロックマス相関および重水素取り込み決定、即ち、重水素化されたペプチドの重心決定を自動的に実施する。さらに、全てのペプチドを手動で調査して、ソフトウェアによる正確なピークおよび重水素割り当てを確実にした。
【０２８８】
エピトープマッピング実験
アミド水素/重水素交換(HX)を、対応する重水素化された緩衝液(即ち、D2O中で調製したPBS、96% D2O最終、pH7.4(未修正の値))中への、mAb A、B、C、D、EまたはFの存在下または非存在下でのhCD30Lの6倍希釈によって開始した。全てのHX反応は、20℃で実施し、6.6μM mAbの存在下または非存在下で6μM hCD30L(使用したモノマーのMw)を含み、従って、2.2倍モル濃度過剰のmAbを得た。0.25、0.5、1、3および10分間の時間間隔で、50μlアリコートのHX反応を、50μlの氷冷クエンチング緩衝液(1.35M TCEP)によってクエンチし、2.5の最終pH(未修正の値)を得た。
【０２８９】
結果
hCD30Lタンパク質
hCD30L中のグリコシル化の存在は、HXMS分析を阻む。タンパク質グリコシル化の未知の質量およびしばしば不均一な性質に起因して、得られた消化ペプチドは、MSにおいて同定および分析することができない。しかし、hCD30Lからのグリコシル化の除去は、HXMSに適した十分に規定されたアミノ酸配列を創出でき、これは、MSにおいて同定および分析できる。
【０２９０】
hCD30L細胞外ドメインは、以下のTable 7(表7)の第1列に列挙したように、5つの潜在的N-グリコシル化部位を含む。グリコシル化を、PNGaseFによる処理および点変異の両方によって、除去を試み、HXMS分析により適したタンパク質を得た。
【０２９１】
His-hCD30L-ECのMSおよびSEC-MALS分析により、5つの潜在的N-グリコシル化部位のうち4つが、実際にグリコシル化されていたことが示された(Table 7(表7);データ示さず)。ネイティブ条件下でこのタンパク質をPNGaseFで処理すると、グリコシル化のうち2つだけが、PNGaseFによって酵素的に除去でき、従って、2つのN-グリコシル化が、タンパク質上に残った。
【０２９２】
ネイティブ条件下でFLAG-hCD30L-ECをPNGaseFで処理したところ、MSおよびSEC-MALSの両方が、このタンパク質が完全に脱グリコシル化され得ることを実証した。結論として、N153Q変異が、His-hCD30L-ECから酵素的に除去できなかったN-グリコシル化部位を消滅させ、このタンパク質は、HXMSに最適とみなされた。グリコシル化部位(複数可)の評価の概要は、Table 7(表7)中に含まれる。
【０２９３】
【表７】
0006370774.tif 000008
【０２９４】
HX-MS分析
重水素交換反応後、hCD30L-ECは、ペプシンで消化されて、Table 8(表8)に記載される消化ペプチド領域を生じる。hCD30L残基の番号付けは配列番号74に従うが、N末端FLAG-HisタグDYKDDDDKHHHHHHENLYFQGは、hCD30L配列の一部ではない。FLAG-hCD30L-ECの一次構造の83%をカバーする、40の消化ペプチドのHX時間経過を、mAb A、B、C、D、EまたはFの存在下または非存在下でモニタリングし、データをTable 8(表8)に含めた。
【０２９５】
本研究において分析しなかった残りの配列を、消化ペプチドでカバーした;しかし、シグナル強度は、データ分析には不十分であった。mAb A1、B、C、D、EまたはFの存在下または非存在下で、初期の時点(<10分)で観察された交換パターンは、2つの異なる群に分割され得る:hCD30L-EC消化ペプチドの1群は、mAbの結合によって影響を受けない交換パターンを示す。対照的に、hCD30L中のペプチドの別の群は、mAb結合の際に交換からの保護を示す(Table 8(表8))。重複する消化ペプチドの場合、交換保護情報は、ペプチドN末端および最初のペプチド結合の完全な逆交換(back-exchange)を仮定するペプチド内の特定の残基またはストレッチへの下位局在化が試みられる。ペプチドにおける交換保護は、mAb結合に関与しているこの領域を示す。従って、エピトープは、特定のペプチドによって規定される領域内に部分的にまたは完全に位置付けられる。しかし、HX-MSの分解能は、重水素化されたタンパク質のペプシン消化に基づくので、所与の領域内の交換保護は、消化ペプチドによって規定される領域内の全ての残基が、必ずしもmAb結合に関与するわけではないことを示す。
【０２９６】
mAb A1のエピトープマッピング
mAb A1のエピトープを、FLAG-hCD30L-ECを使用して3回およびHis-hCD30L-ECを使用して1回の、4回の異なる実験でマッピングした。両方のタンパク質を、HX-MS実験の前にPNGaseFで処理した。これらの研究の結果は、使用したhCD30Lタンパク質から独立して高度に類似しており、全てが同じエピトープ情報を生じた。しかし、配列カバー度は、グリコシル化された領域中の検出可能なペプチドの欠如に起因して、His-hCD30L-EC実験において明らかにより低かった。
【０２９７】
mAb A1についてのエピトープシグナルは、残基Cys88まで、hCD30LのN末端領域(Table 8(表8))において観察された。交換保護は、出発点(残基45、62または66)から延びるペプチドが長くなるほど強くなり、従って、ペプチドのよりC末端の領域中およびまた残基88における交換保護を示す。対照的に、ペプチド45〜65、45〜81および66〜81は、交換保護を示さなかった。さらに、残基D81は、グリコシル化されたNがPNGaseFの作用によってDになるグリコシル化部位である。従って、N/D81は、おそらくはmAb結合に関与しない。従って、エピトープシグナルは、領域82〜88 CSEDLLC内の残基から生じるようである。
【０２９８】
mAb A1についてのエピトープシグナルは、領域F211〜S226をカバーする6つの異なるペプチドにおいて、hCD30LのC末端領域(table8(表8))においても観察された。観察された交換保護のレベルに基づいて、領域の全ての部分が、結合に関与する、またはより低いもしくはより高い程度までmAb Aの結合によって影響されるようである。抗体によって結合される領域は、Table 8(表8)中で太字フォントで示す。
【０２９９】
結論として、mAb A結合に関与するhCD30Lの領域は、領域82〜88 CSEDLLCおよび領域211〜226 FQYIDTSTFPLENVLSとして検出される。
【０３００】
mAb B、C、D、EおよびFのエピトープマッピング
mAb B、C、D、EおよびFのエピトープを、HX-MS実験前にPNGaseFで処理したFLAG-hCD30L-ECを使用してマッピングした。これらの研究のエピトープ結果は、交換保護の規模に関しても、mAb Aと高度に類似していた(table 8(表8))。mAb Eに対するエピトープマッピングを2回実施したが、A、B、CおよびDはそれぞれ1回マッピングした。
【０３０１】
【表８Ａ】
0006370774.tif 000009
【０３０２】
【表８Ｂ】
0006370774.tif 000010
【０３０３】
結論として、結合mAb B、C、D、EおよびFに関与するhCD30Lの領域は、mAb A1の結合に関与する領域と類似しており、領域82〜88 CSEDLLCおよび領域211〜226 FQYIDTSTFPLENVLSとして検出される。
【０３０４】
(実施例7)
固定化抗CD30L A-FABを使用するCD30L抗体のビニング
抗ヒトCD30Lモノクローナル抗体を、古典的なサンドイッチアプローチを使用して、Biacore T200(GE Healthcare 28-9750-01)でエピトープビニングした。
【０３０５】
立体障害を低減させるために、固定化した抗体を、一価形式で使用した。抗hCD30L抗体の抗原結合領域が重複するエピトープに結合したか否かを決定するために、抗体A1のFabによって既に結合されたCD30Lに結合する抗体A〜Fの能力を試験した。
【０３０６】
Fab断片は、ヒンジ領域のシステインの上流を切断するパパインで抗体全体を消化することによって、または重鎖および軽鎖可変領域の組換え発現によって、取得され得る。抗hCD30L A1のFab断片(A1-FAB)を、システインの存在下で固定化されたパパインを使用して調製して、ヒンジ領域の直ぐ上でIgG全体を酵素的に切断して、抗体分子1つ当たり2つのFab断片および1つのFc断片を創出した。このFabを、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーを使用してFcから分離し、次いで、PBSに緩衝液交換した。この手順を、製造業者の指示に従って実施した(Pierce Fab Preparation Kit #44985、US)。
【０３０７】
抗ヒトCD30L FAB(抗体A1のFab)を固定化し、ヒトCD30L-His10トリマー(R&D Systems 1028-CL)をその上に捕捉した。引き続いて、可溶性抗hCD30L A〜Fを注入した。第2の抗体の結合は、2つの抗体が異なるエピトープビン中に存在することを示す。
【０３０８】
抗hCD30L A1-FABを、10mM酢酸塩緩衝液、pH5.0中で40μg/mLに希釈し、標準的な手順を使用して、3566RUのレベルまで、CM5チップ(GE healthcare BR-1000-12、BR-1000-50)にアミンカップリングした。ヒトCD30L-His10トリマー(R&D Systems 1028-CL)を、HBS-P+(GE healthcare BR-1006-71)中で10nMに希釈して、A-FAB表面上に注入して、約175RUのCD30Lを捕捉した。第2の抗体を、捕捉されたhCD30L上に75nMで注入した。コントロールは、可溶性抗体の代わりに、ヌル捕捉(緩衝液のみ)および緩衝液の注入を含んだ。全ての実験を25℃で実施した。
【０３０９】
A-FABによるhCD30Lの被覆は、抗体A〜Fの下位群の結合を遮断した。A-FabおよびAを使用するコントロールは、予測されたように、両方遮断された。さらに、抗体FおよびBもまた、捕捉されたhCD30Lに対する結合が妨げられ、一方、抗体E、CおよびDは、hCD30Lに結合することが可能であり、その結合エピトープが、A、BおよびFの結合エピトープから識別できることが実証された。結論として、抗体A、FおよびBは、hCD30Lに対する結合について抗体A1のFabと競合する。
【図１Ａ】
0006370774.tif 000011
【図１Ｂ】
0006370774.tif 000012
【図１Ｃ】
0006370774.tif 000013
【図１Ｄ】
0006370774.tif 000014
【配列表】
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