(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロアレイを作製する方法であって、
ａ．少なくとも１つの鋳型分子が結合している第１の支持体表面を備える第１のオリジナルのアレイを準備することと、
ｂ．前記第１の支持体表面に対して空間的に配向している第２の支持体表面（受容体表面）を準備することと、
ｃ．２つの表面領域が液体を介して互いに接するように、酵素及び／又は化学反応系を含有する液体を前記第１の表面と前記第２の表面との間に準備することと、
ｄ．前記鋳型分子と前記酵素及び／又は化学反応系とを用いて生成物分子を生成することと、
ｅ．前記第１の支持体表面と前記第２の支持体表面との間の前記液体を介して、前記生成物分子を該第２の支持体表面に移動させることであって、前記鋳型分子と該第１の支持体表面との結合部位と、該第２の支持体表面上の対応する生成物分子の集積との間に相関関係が存在することと、
ｆ．前記受容体表面上の前記生成物分子の集積を、無標識法若しくは標識を使用する方法により、リアルタイムに検出することと、
を含む、方法であって、
前記第１の支持体表面は参照分子を含む参照スポットを備え、生成物分子は工程ｄ）において該参照分子から生成され、工程ｅ）及び工程ｆ）に従って該生成物分子の生成はリアルタイムに検出され、該方法は既定の参照サイズに達し次第、終了させることを特徴とする、方法。
【請求項２】
ギャップが前記第１の支持体表面と前記第２の支持体表面との間に存在し、該ギャップに、該第１の支持体表面及び該第２の支持体表面を空間的に配向する前に、配向した後に、又は配向中に前記液体を満たすことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リアルタイムでの検出は、無標識法、もしくは質量の増大、屈折率の変化、又は光学特性、磁気特性、電気特性及び／もしくは電磁特性の変化を検出する無標識法を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記リアルタイムでの検出は標識を使用する方法を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記リアルタイムでの検出は前記受容体表面を導波路として使用するものであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記生成物分子の集積は、物理的方法、電気的方法、化学的方法、蛍光測定、発光測定、分光法、吸光測定、偏光測定、反射型干渉分光法、結像反射型干渉分光法、表面プラズモン共鳴分光法、ビアコア法、偏光解析、偏光異方性解析、濁度測定、ｐＨ測定、利用可能なＨ＋イオンの測定、表面蛍光の励起による測定、内部全反射蛍光顕微鏡検査法、表面蛍光の消失を用いた測定、エバネッセント場の励起を用いた測定、及び／又はラマン分光法を用いた測定を含む群から選ばれる方法によって検出されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
作製するマイクロアレイはＤＮＡアレイ、ＲＮＡアレイ、タンパク質アレイ、及び／又は合成分子のアレイであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記鋳型分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、クローン化ＤＮＡフラグメント、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、合成ＤＮＡ産物、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、及び／又は合成ＲＮＡを含む群から選ばれることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記オリジナルのアレイはＤＮＡアレイ及びＲＮＡアレイを含む群から選ばれることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ｃ）による前記酵素反応系は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、及び／又は逆転写酵素を含む群から選ばれる酵素を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記化学反応系は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡから対応するタンパク質を生成する無細胞混合物を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出は分子マイクロアレイの作製プロセスをモニタリングするのに使用されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記オリジナルのアレイは平面アレイ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡを含有するシークエンシングチップであることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記マイクロアレイの作製後に、前記検出法を結合測定又は相互作用測定にも用いることができることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
受容体表面上での分子の集積をリアルタイムに検出する装置であって、
ｇ．酵素反応を用いてマイクロアレイを作製する装置と、
ｈ．以下から選ばれる少なくとも１の条件；
（１）検出法は、無標識法、もしくは質量の増大、屈折率の変化、又は光学特性、磁気特性、電気特性及び／もしくは電磁特性の変化を検出する無標識法を含む、
（２）検出法は、標識を使用する方法を含む、
（３）検出法は、前記受容体表面を導波路として使用するものである、
（４）前記生成物分子の集積が、物理的方法、電気的方法、化学的方法、蛍光測定、発光測定、分光法、吸光測定、偏光測定、反射型干渉分光法、結像反射型干渉分光法、表面プラズモン共鳴分光法、ビアコア法、偏光解析、偏光異方性解析、濁度測定、ｐＨ測定、利用可能なＨ＋イオンの測定、表面蛍光の励起による測定、内部全反射蛍光顕微鏡検査法、表面蛍光の消失を用いた測定、エバネッセント場の励起を用いた測定、及び／又はラマン分光法を用いた測定を含む群から選ばれる方法によって検出される、
で、無標識法若しくは標識を使用する方法からなる、検出法を用いてリアルタイムに生成物分子の集積を検出及び／又は測定することができる少なくとも１つの検出手段と、
を備える、装置。
【請求項１６】
マイクロアレイを作製するキットであって、該作製がリアルタイムに検出され、該キットは、
ｉ．第１の支持体表面と、
ｊ．少なくとも１つの鋳型分子と、
ｋ．受容体表面と、
ｌ．酵素及び／又は化学反応系と、
ｍ．以下から選ばれる少なくとも１の条件；
（１）検出法は、無標識法、もしくは質量の増大、屈折率の変化、又は光学特性、磁気特性、電気特性及び／もしくは電磁特性の変化を検出する無標識法を含む、
（２）検出法は、標識を使用する方法を含む、
（３）検出法は、前記受容体表面を導波路として使用するものである、
（４）前記生成物分子の集積が、物理的方法、電気的方法、化学的方法、蛍光測定、発光測定、分光法、吸光測定、偏光測定、反射型干渉分光法、結像反射型干渉分光法、表面プラズモン共鳴分光法、ビアコア法、偏光解析、偏光異方性解析、濁度測定、ｐＨ測定、利用可能なＨ＋イオンの測定、表面蛍光の励起による測定、内部全反射蛍光顕微鏡検査法、表面蛍光の消失を用いた測定、エバネッセント場の励起を用いた測定、及び／又はラマン分光法を用いた測定を含む群から選ばれる方法によって検出される、
で、無標識法若しくは標識を使用する方法からなる、検出法を用いてリアルタイムに生成物分子の集積を検出及び／又は測定することができる少なくとも１つの検出手段と、
を備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロアレイを作製する方法であって、このアレイの作製が生成される生成物分子の集積によりリアルタイムに検出される、方法に関するものである。本発明は更に、この方法により作製されるマイクロアレイと、マイクロアレイの作製中にアレイ表面上での分子の集積をリアルタイムに検出する装置とに関する。
【背景技術】
【０００２】
「マイクロアレイ複製」の基本概念は極めて新しいものであり、これまでに限られた研究グループ及び企業でしか採用されてこなかった。そのため、この複製プロセスの最適化にはいくつかの工程が存在している。最適化の一つはマイクロ流体工学を用いた操作を含むものである（特許文献１）。しかしながら、「複製」が写真複製に類似するものであると考えられる場合、対処されるのは操作上の問題のみであり、「コピーの品質管理」自体は対処されない。写真複製機では、一貫して高品質なコピーを作製するために、リアルタイムなコントラストのモニタリングを通じて、複製機の経年数（age）、機器の１日出力量、並びに使用するインク及び紙の特性が考慮される。この「コントラストのモニタリング」は、特に使用される反応混合物、例えば酵素混合物及び鋳型分子、例えばＤＮＡアレイ鋳型が、１日出力量に応じて極度の品質変動を受け、より高速又は低速で対応するコピー又は誘導体を作製することになることから、マイクロアレイを複製する際にも必要である。これまでの全ての特許公報では、１エンドポイントのみの測定が行われている。この測定では、色素はコピーが作製された後でしか生成分子に適用されず、コピーの作製はこの色素の適用を基に検出される。そのため事実上、コピーを更なる測定に使用することはできず、コピーの作製について、どの程度コピーを進行させ、また複製プロセスを延長するか、短縮するか又は維持するかを判断する方法はない。
【０００３】
従来法では、タンパク質マイクロアレイは、タンパク質を細胞において生成して、個々のタンパク質を精製して、これらのタンパク質をマイクロアレイに移動させることによって作製される。この移動工程は「プリンタシステム」によって為される。これらの技法は既に数十年に亘って使用されている。細胞培養物を精製することによりタンパク質を生成するこの複雑な方法のために、それに伴うタンパク質マイクロアレイには、１アレイ当たりおよそ１０００ユーロかかる。またタンパク質の化学合成は、化学合成によって得られる純度が不十分であることから問題外である。短いタンパク質フラグメント、いわゆるペプチドは合成により入手可能であり、ペプチドマイクロアレイの作製は可能である。しかしながら、ペプチドマイクロアレイの生化学的有用性は、タンパク質マイクロアレイに比べて遥かに低い。
【０００４】
最近のアプローチでは、タンパク質マイクロアレイは、作製が遥かに単純なＤＮＡマイクロアレイから作製されている。２０１０年２月に刊行されたレビュー（非特許文献１）には、ＤＮＡマイクロアレイからタンパク質マイクロアレイを作製するためにこれまでに行われてきた個々の変法及びオプションが記載されている。タンパク質がＤＮＡから生成されることから、ＤＮＡは、「発現可能（expression ready）」となるには或る特定の認識配列を有していなければならない。
【０００５】
２００１年、He and TaussigはＰＩＳＡシステムを公開した（非特許文献２）。この場合、ＤＮＡを使用の直前に無細胞発現系と混合した後、表面上に分配する。次いでタンパク質をこの小液滴中で生成する。このタンパク質には、ニッケル−ＮＴＡ表面に結合するＨｉｓタグが含まれている。十分なタンパク質がマイクロアレイの表面に結合したらすぐに、洗浄工程を行う。ＤＮＡとＨｉｓタグを有しない全てのタンパク質とがこの工程において洗い流される。「精製された」Ｈｉｓタグタンパク質のみが表面上に残る。次いでこのマイクロアレイを結合測定に直接使用する。２００６年には、この技法を用いた１３０００個のタンパク質を有するマイクロアレイが公開された（非特許文献３）。
【０００６】
こうすることで、（従来技法とは対照的に）個々のタンパク質を精製する煩雑なプロセスが回避されるが、マイクロアレイへの移動の直前に個々のＤＮＡ配列を無細胞発現系に混合することに伴う労力は多大なものであり、この混合はマイクロアレイの個々のスポットに対して濃度及び時間に関する同一のパラメータ下で行わなければならない。そのため、特に並行モニタリングを行えないという不利点がある。
【０００７】
２００４年、LaBearはＮＡＰＰＡシステムを公開した（非特許文献４）。この場合、初めにストレプトアビジンを保有する表面とタンパク質配列に対する抗体（この場合、Ｈｉｓタグ）とを作製する。この表面上に、ビオチンを介してストレプトアビジンに結合するＤＮＡをプリントした。これらのＤＮＡマイクロアレイは１年〜２年保存することができる。ＮＡＰＰＡマイクロアレイ全体の貯蔵寿命は抗体の貯蔵寿命によってのみ制限される。使用の直前、マイクロアレイ全体に無細胞発現系をコーティングする。各ＤＮＡスポット上において、様々なタンパク質が形成され、空間内に自由拡散する。タンパク質には抗体に結合する配列が含まれているため、タンパク質がスポット上に又はそのすぐ近くで結合することは統計的にほぼ確実である。洗浄工程後、マイクロアレイを使用することができる。ＤＮＡ及び形成されたタンパク質のみが表面上に残る。２００８年には、このようにして１０００個あまりのタンパク質を有するマイクロアレイが作製された（非特許文献５）。
【０００８】
ＰＩＳＡに対するＮＡＰＰＡの大きな有利点は、ＤＮＡマイクロアレイを無数に作製及び保存することができることである。タンパク質は使用の直前まで生成されない。しかしながら、ストレプトアビジンと抗体との二重結合系（コスト因子）及びＤＮＡが表面上に残る（続くアッセイに干渉する）ことが不利に働くことが分かっている。
【０００９】
特にＰＩＳＡ及びＮＡＰＰＡ等のコストがかかり、かつ時間を浪費する方法の不利点はモニタリングすることができないことである。そのため反応が過度に早く停止するか、又は得られる「コピー」が要件を満たさないことから、結果として使用不可能なアレイが常に作製される。
【００１０】
２００８年、TaussigはＤＮＡマイクロアレイ鋳型を用いてタンパク質マイクロアレイを無数に作製することができる方法であるＤＡＰＡシステムを公開した（非特許文献６）。この方法では、初めにエンコーディングＤＮＡを、エポキシ基を有する（epoxy-functionalized）表面上にスポットする。それにより従来のＤＮＡマイクロアレイが作製される。このＤＮＡマイクロアレイ上に薄膜を載置し、それに無細胞発現系を含浸させる。接触が起こり、マイクロアレイが湿潤するとすぐに、タンパク質が生成され、膜へと無向（undirected）拡散する。そのためタンパク質が結合する表面はこの「サンドイッチ」の背面に即座に載置する。タンパク質が膜を通過して拡散するとすぐに、表面に結合して、タンパク質マイクロアレイを形成する。およそ３時間〜４時間後、このサンドイッチを開放して、ＤＮＡ及びタンパク質マイクロアレイを洗浄する。その後、タンパク質マイクロアレイを結合測定に使用することができ、ＤＮＡマイクロアレイは次のタンパク質マイクロアレイの作製に必要となるまで再び保存することができる。
【００１１】
ＤＡＰＡシステムの明らかな有利点は、得られるタンパク質マイクロアレイに夾雑ＤＮＡが含まれず、オリジナルのＤＮＡマイクロアレイを何回でも再使用することができることである。ＤＮＡマイクロアレイの再使用性はこれまでの全ての方法を上回る顕著な改善を示す。しかしながら、含浸膜の載置は明確に定められたやり方で行うことができず、膜自体が不織材料、ひいては不定材料であるという不利点がある。その上、膜と表面との物理的接触によって、ＤＮＡ及びタンパク質マイクロアレイの両方が損傷する。このことがこの方法の反復精度に悪影響を与える。これまでは複製プロセス及び／又は誘導体化プロセスをモニタリングすることが不可能であったため、この方法中に十分な量のコピーが作製されたかを判断することはできなかった。このようなモニタリングが可能であったとしても、劣化したＤＮＡマイクロアレイを使用すれば、それに応じて反応時間が延びる場合がある。これにより、同じアレイの継続的な再使用が満足のいく結果をもたらさなくなる時点を正確に判断することも可能となる。これによって、鋳型が要件を満たさなくなったことを確認するためにこのプロセスが完了するまで待つ必要がなくなることから、高いコスト及び大量の時間浪費を最小限に抑えることが可能になる。
【００１２】
マイクロアレイコピーの作製分野における従来技術（［１］〜［６］）には、リアルタイム検出法と組み合わせることを示唆する提案又は参考文献は含まれない。またこのような解決策はこれまで提案又は示唆されてこなかった。
【００１３】
上記の方法はいずれもコピー又は誘導体の作製のリアルタイムでのモニタリングをもたらさない。従来技術で知られる唯一の検出オプションは、装置が正しく装填され、コピー上での「白点（white spot）」に繋がる気泡が発生していないかをモニタリングするために設計されている。これはいわゆる検出ウィンドウによって達成される。しかしながら、作製されるコピー／誘導体の質又は量に関する結論を導くことはできない。
【００１４】
したがって既知の方法の不利点は、これらの方法が非常に煩雑であり、そのため時間及びコストがかかることである。結果として、タンパク質の不十分な量若しくは純度、若しくはＤＮＡの不十分な量若しくは純度に起因して又は不正確に調整されたプロセス時間及びプロセス温度に起因して、使用することができないアレイを誤って作製することは特に望ましくない。しかしながら、現在のところプロセス中にアレイの作製をモニタリング及び追跡することは不可能である。
【００１５】
したがって、複製プロセスはモニタリングすることができず、一定の品質のコピー／誘導体を得るのに複製プロセスをどれくらい行えばいいかを判断するための根拠は存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５１８１６号、分子マイクロアレイを生成するためのデバイス及び方法（Device and method forgeneration of molecular microarrays）
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Chandra, Srivastava, "Cell-free synthesis-based protein microarrayand their applications", Proteomics, vol. 10, pp. 717-730, 2010
【非特許文献２】He, Taussig, "Single step generation of protein arrays from DNAby cell-free expression and in situ immobilization (PISA method)", NucleicAcids Research, vol. 29, no. 15, p. art-e73, August 2001
【非特許文献３】Sobek et al, "Microarray technology as a universal tool forhigh-throughput analysis of biological systems", Combinatorial Chemistry& High Throughput Screening, vol. 9, no. 5, pp. 365-380, June 2006
【非特許文献４】Ramachandran et al, "Self-assembling protein microarrays",Science, vol. 305, no. 5680, pp.86-90, July 2004
【非特許文献５】Ramachandran, Srivastava, LaBaer, "Applications of protein microarraysfor biomarker discovery", Proteomics Clinical Applications, vol. 2, no.10-11, pp. 1444-1459, Oct. 2008
【非特許文献６】He et al., "Printing protein arrays from DNA arrays",Nature Methods, vol. 5, no. 2, pp. 175-177, Feb. 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって本発明の目的は、上述の不利点を克服する方法及び装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
この目的は独立請求項によって達成される。有利な実施の形態は従属請求項において特定される。
【００２０】
第１の実施の形態では、本発明は、マイクロアレイを作製する方法であって、
ａ．少なくとも１つの鋳型分子が結合している第１の支持体表面を備える第１のオリジナルのアレイを準備する工程と、
ｂ．第１の支持体表面に対して空間的に配向している第２の支持体表面（受容体表面）を準備する工程と、
ｃ．２つの表面領域が液体を介して互いに接するように、酵素及び／又は化学反応系を含有する液体を第１の表面と第２の表面との間に準備する工程と、
ｄ．鋳型分子と酵素及び／又は化学反応系とを用いて生成物分子を生成する工程と、
ｅ．第１の支持体表面と第２の支持体表面との間の液体を介して、生成物分子を第２の支持体表面に移動させる工程であって、鋳型分子と第１の支持体表面との結合部位と、第２の支持体表面上の対応する生成物分子の集積との間に相関関係が存在する工程と、
ｆ．受容体表面上の生成物分子の集積をリアルタイムに検出する工程と、
を含む、方法に関する。
【００２１】
したがってこのプロセスの結果、第２の支持体表面はマイクロアレイとなる。作製プロセス自体又は生成物の品質を損なわずに、生成物の集積の検出をこの作製プロセス中に行うことができることは、この方法において全く予期せぬものであった。リアルタイムでの検出によって、生成物分子の生成の生化学的性質（biochemistry）及び速度に対するより良好な識見が可能となる。この良好な理解はより良好な製造プロトコルの作成を可能にする。また一方で同時に、本発明によって、生成物が所望のコントラストに達したら、作製プロセスを停止させることも可能となる。これは従来技術では不可能なことである。概して本発明によって、作製プロセスの品質及びコントラストを初めにモニタリングすることが可能となる。結果として、マイクロアレイの作製方法は実質的により効率的なものとなり、ひいては最終的に費用効果を高くすることができる。加えて、第２の支持体表面上に作製されるアレイの質を一定に保つことを確実なものとすることができる。
【００２２】
本発明の内容におけるコントラストは具体的に、表面上の分子の密度を表すものである。
【００２３】
本発明の内容における生成物分子は鋳型分子の増幅体（amplificates）及び／又は誘導体であるのが特に好ましい。生成物は生成される生成物分子全体であるのが好ましい。
【００２４】
本発明の内容におけるコピーは生成物分子又は生成物分子全体である。そのため、コピーは同一の分子だけでなく、工程ｄ）によって生成することができる任意のタイプの生成物分子である。したがってコピーは増幅体又は誘導体であってもよい。このことから、ＤＮＡ鋳型分子のコピーは、例えばＤＮＡ生成物分子とすることができるが、ＲＮＡ生成物分子又はタンパク質生成物分子であってもよい。
【００２５】
本発明の内容におけるリアルタイムでの検出は、特にこのプロセスを継続しながら、第１の支持体表面上での生成物分子の生成、第１の支持体表面と第２の支持体表面との間の間隙での生成物分子の存在、又は第２の支持体表面上での生成物分子の集束（convergence）若しくは集積を検出することを意味する。第２の支持体表面上での集積中又はその直後での検出が特に好ましい。このようにして、生成物分子はその生成中、集積前及び／又は集積中、及び／又は集積の直後に検出することができる。これにより、作製方法が完了した後に検出プロセスを行う工程を回避することができる。その結果として構造が変化せず、追加のプロセス工程が導入されないことは好ましいことである。これによりこの方法の効率及び速度が増大する。また要求される操作が少なくなることから、汚染のリスクも低減する。加速的に又は減速的に進行するプロセスを生成中に直接検出することもできる。このことから、例えば反応が過度に早く進行している場合、このプロセスを早めに停止させることにより、又は反応が過度に遅く進行している場合、このプロセスを遅めに停止させることにより、一定又はほぼ一定の品質の生成物分子を有する最終生成物を生成することができるように、プロセスに介入することが可能である。
【００２６】
リアルタイムでの検出により、作製プロセスを直接モニタリングすることが可能となる。結果として、生成物（例えばコピー又は誘導体）の生成に関する情報を収集することができる。このような情報は、例えば反応速度、温度依存性、ｐＨ、塩含量等の様々な境界条件の比較、及び各種製造業者に関するものである。同時に作製プロセスは、生成物が所望の表面構成（コントラスト）を達成したらいつでも停止することができる。したがってより緩徐に進行する反応に応じて、工程ｄ）による生成時間、すなわち例えば増幅時間を延長することもできる。さらに、得られるアレイのスポットが全て同じ強度を有するか、又は個々のスポットが「喪失」しているかを判断するのに、作製プロセス中に測定を行うことができる。
【００２７】
本発明を用いて、初めにマイクロアレイを複製するのと並行して、このコピーの作製を検出することが可能である。従来技術との顕著な違いは、生成反応が完了するまで待つことなく、検出がコピー作製中に行われることである。これは反応工程ｄ）に影響を及ぼすことができる唯一の方法である。このような影響は好ましくは、時間に関する調整（反応の終了又は延長）、又は熱的影響（反応を加速又は減速させるための反応チャンバの加熱又は冷却）を含む。しかしながら、このような影響は他のパラメータ、例えばｐＨの値又は電場の制御も含み得る。複数のパラメータの組合せによる制御も可能である。例えば反応を、臨界温度未満に冷却することにより所望の結果が達成された場合に終了することができる。
【００２８】
本発明の内容において、２つの表面は互いに空間的に対向して配置されているのが好ましい。工程ａ）〜工程ｅ）による方法はＰＩＳＡ法、ＮＡＰＰＡ法又はＤＡＰＡ法を含むことが更に好ましい。
【００２９】
本発明は、受容体表面上での生成物分子の集積をリアルタイムに検出する方法であって、該方法は集積を検出及び／又は測定する手段の使用を含み、集積した生成物分子は、オリジナルのマイクロアレイ、好ましくは核酸マイクロアレイから酵素工程により合成される、方法にも関する。
【００３０】
この方法は更に好ましくは、ギャップ、好ましくはマイクロ流体ギャップが第１の支持体表面と第２の支持体表面との間に形成され、該ギャップに、第１の支持体表面及び第２の支持体表面を空間的に配向する前に、配向した後に、又は配向中に液体を満たすことを特徴とする。ギャップの有利点の一つは、表面がより小さい物理的ストレスに曝されることで、摩耗が排除されることである。
【００３１】
したがって工程ａ）〜工程ｃ）は任意の順序で行うことができる。２つの支持体表面を互いに空間的に離れて載置してから液体を準備することは、これにより反応が開始する前に工程ａ）及び工程ｂ）を行うことが可能となることから有益である。このことから、ギャップは２つの表面が互いに直接接するのを防ぐ物理的障壁として働く。この障壁は液体が添加された場合にのみ克服される。このようにしてこの方法はコピーの作製が開始される前に大部分を準備することができる。しかしながら、２つの支持体表面の一方の上に液体を載置した後、第２の支持体表面を適所に載置することが有益である場合もある。どのタイプの装置を選ぶかに応じて、液体を表面に迅速かつ容易に準備することができ、表面全体に容易に行き渡らせることができることから、この実施の形態はより好適であり得る。当業者であれば、独創的な創作能力を発揮せずとも、各々の構造及び使用に適切な工程ａ）〜工程ｃ）の順序を決定することが可能であろう。
【００３２】
本発明の別の特定の有利点は、コントラストをモニタリングしながら同時に本発明によるマイクロアレイを作製する方法の結果として、作製プロセスの選択的制御により、遥かに良好な結果を達成することが可能となることである。そのため、特に長い核酸セグメント、例えばゲノムＤＮＡを鋳型分子として使用することが可能である。これは従来技術を上回る大きな有利点である。Monya Bakerによるマイクロアレイに関する論文によれば（"Microarrays,megasynthesis", Nature Methods, 2011, vol. 8, pp. 457）、例えば研究者らはオリゴヌクレオチドのライブラリをどのように使用するかに関わらず、より低いエラー率でより多くの長いオリゴヌクレオチドを使用又は研究することを常に求めている（「研究者らがオリゴヌクレオチドのライブラリをどのように使用しようとするとしても、研究者らは通常、より多くのオリゴヌクレオチド、より長いオリゴヌクレオチド及びより低いエラー率を望んでいる。」）。この論文では、科学者Jay Shendureの発言も引用されており、Jay Shendureは、３００塩基対又は更には１０００塩基対という長さが可能であれば、これまでは不可能であった複数の可能性が開かれるであろうと述べている（「［達成可能な長さ］が３００塩基対又は更には１キロベースであれば、これまでにできなかった多くのことができるようになる。」）。本発明によって解決することがまさにこの課題である。例えば、ＤＮＡの長さが最大１５００塩基対のマイクロアレイを、品質を損なうことなく容易に作製することができる。したがって本発明は、この技術分野（technical world）において優先日の時点では満足に解決されていない課題の解決に明らかに寄与するものである。そのためこの課題に対する好適な解決策を見出すことが緊急に必要とされてきた。
【００３３】
第１の支持体表面が、参照分子、好ましくはＤＮＡ参照分子を含む参照スポットを備えることが更に好ましい。ここで鋳型分子のような参照分子は工程ｄ）において生成物分子へと変換され、工程ｅ）及び工程ｆ）によりこれらの生成物分子の生成はリアルタイムに検出され、既定の参照サイズに達し次第、このプロセスは終了させる。１つの好ましい実施の形態では、参照分子及び該参照分子の生成物分子の両方の反応速度及び質量が既知であることから、本プロセスにおける生成物分子の生成反応が理想とする参照プロセスに比べてどの程度進行しているかを判断するのに、その生成に関する算定又は推測を行うことができる。参照点で得られる測定値に基づき、参照スポットから同一量の生成物分子を理想的に生成するために、それに応じて反応を調整、例えば延長又は短縮することができる。したがって参照値の使用により、算定（calculability）及び制御操作が容易となる。
【００３４】
しかしながら、参照分子がタンパク質又は任意の他の可能なタイプの鋳型分子である可能性もある。参照分子は、既知のやり方で生成物分子を形成することにより、第２の支持体表面上に予測可能な構造をもたらす鋳型分子であることが特に好ましい。
【００３５】
生成物分子の生成中にリアルタイムに測定することができるように、参照分子からの生成物分子の形成を、移動のリアルタイムでのモニタリング及び制御に用いる特定の方法が特に好ましい。
【００３６】
この実施の形態は品質制御目的に特に適している。参照スポットは例えばＤＮＡから生成される。反応工程によって、ＤＮＡは対応する生成物を高い特異性で生成する。複製プロセス中、これらの生成物が第２の支持体表面の表面上にスポットを形成し、これらのスポットを、リアルタイム測定を用いて検出及び／又は測定する。これらのスポットが既定の参照サイズに達し次第、反応工程（例えば複製プロセス）を終了させる。反応工程は例えば冷却によって終了させることができる。これにより、特に上記スポットの生成反応速度に関する知識（knowledge）が入手不可能な場合に、生成される全ての他のスポットとは独立して参照スポットに関して一定の品質の「コピー」が常に作製される。この方法は好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質等の鋳型分子に使用することができる。これらの参照スポット又は対照スポットを用いることで、例えば個々のタンパク質の様々な温度依存性を補うことが可能となる。したがって、この実施の形態は本発明による方法の更なる標準化を可能にする。
【００３７】
支持体表面を微細構造化（microstructured）し、この微細構造によってギャップが生じることが更に好ましい。しかしながら、ギャップを生じさせるためにスペーサを第１の支持体表面と第２の支持体表面との間に載置することも可能である。
【００３８】
第１の支持体表面及び／又は第２の支持体表面が腔（cavities）を備えているのが更に好ましい。このような腔により、生成物分子の拡散が方向付けられ、それにより生成物分子と鋳型分子との間のより正確な空間的割当てが可能となる。
【００３９】
このことは、得られるアレイがオリジナルのアレイの対応する生成物分子を含むだけでなく、それに対して空間的に割り当てることもできることから大きな有利点をもたらす。
【００４０】
膜がこのギャップ内に位置しないのが特に好ましい。膜を含むアレイ作製法は、膜が潜在的なエラー原因であると思われることから、エラーを起こしやすい。その上、膜を排除することでコスト及び時間両方の節約が可能となる。さらにこの実施の形態では、要求される反応系の量を低減することができる。膜を使用する場合、膜に反応系を含浸させることがほとんどである。しかしながら、このためには反応系及びそこに含まれる構成要素が大量に必要となり、高いコストが生じる。これはこの実施の形態によって回避される。
【００４１】
鋳型分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、クローン化ＤＮＡフラグメント、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、合成ＤＮＡ産物、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、及び／又は合成ＲＮＡを含む群から選ばれることを特徴とする、方法が更に好ましい。オリジナルのアレイがＤＮＡアレイ及びＲＮＡアレイを含む群から選ばれるのが特に好ましい。
【００４２】
更に好ましい実施の形態では、本発明は生成物分子が集積された後の第２の支持体表面がマイクロアレイであることを特徴とする、方法に関する。該マイクロアレイはＤＮＡアレイ、ＲＮＡアレイ、タンパク質アレイ及び／又は合成分子のアレイであるのが好ましい。
【００４３】
この方法については、生成物分子がＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、合成分子又は他の分子であるかは関係ない。このことは、このような構造を極めて広範なアレイの作製に使用することができることから、特に有益である。リアルタイムでの検出は得られる全ての生成物分子に対して可能である。
【００４４】
本発明の内容において、「複製」は特に、鋳型分子の増幅及びその誘導体化を意味する。本発明では、増幅体は特に増幅反応によって生成される個々の鋳型分子の全ての画像全体を指す。増幅体は鋳型分子の同一の又は明らかに誘導可能な誘導体であるのが好ましい。増幅体又はその小区分（sub-sections）は１つ若しくは複数の小区分又は１つ若しくは複数のサンプルフラグメント全体から誘導することができる。生成物分子は特に増幅体及び／又は誘導体であり、それらの分子クラスはオリジナルの鋳型分子と異なっていることが有利である場合もある。
【００４５】
初期の実験では、ＤＮＡが鋳型分子として選ばれた。次いでタンパク質の「コピー」を反応工程によって作製した。小型システムにおいて生成物分子（この場合、タンパク質）の生成が予想されるよりも遥かに迅速に進行したことが見出されたことは予想外のことであった。特にＤＡＰＡシステムに比べて、３倍〜１０倍早い反応時間が達成され、そのため今後は、タンパク質のコピーをおよそ９０分ではなく僅かおよそ１５分で完了することができる。この加速は全く予測不能であり、酵素系のほんの僅かな変化が、コピーを作製するのに要求される時間の大幅な変化をもたらしたことが見出されたことから、表面上での分子の集積のリアルタイムでの検出を、容易には推測することのできなかったこの効果に対する解決策として確立することができた。
【００４６】
ＤＮＡからＤＮＡへのコピーを用いて（鋳型分子がＤＮＡであり、生成物分子がＤＮＡである）、これまでに知られていない純度のＤＮＡマイクロアレイを作製することができた。これはとりわけ、使用した酵素に基づくものであった。シークエンシングプロセスは使用した複製プロセスよりもエラーを起こしやすいことから、このようなプロセスでは純度が高すぎて推測することができない。したがって、現時点において純度の質を完全に検出することができる測定技法は存在していない。この純度はより慣用的な検出法の測定エラーよりも高い。
【００４７】
さらに、ＤＮＡは有益には、全体積単位のコピーを作製するのに十分なものであった。
【００４８】
このようにして本発明による方法により、劇的なコストの節約をもたらす、マイクロアレイのより迅速で、合成的により純粋で、材料集約性が低く、かつ労働集約性が低い作製が可能となるとともに、従来技術の方法を用いても作製することができないか又はかなりの時間、コスト及び労働を費やすことによってのみ非効率に作製することができる、マイクロアレイの作製が可能となる。
【００４９】
この方法は、リアルタイムでの検出が、無標識法、好ましくは質量の増大（growth）、屈折率の変化、光学特性、磁気特性、電気特性及び／又は電磁特性の変化を検出する無標識法であることを特徴とするのが更に好ましい。
【００５０】
無標識法又は無マーキング法は、時間効率がよく、費用効果が高いと同時に、弱い結合を検出することが可能であることから、本発明による作製方法での使用に特に有益である。無標識検出法は、感度が高く、マーカー及び／又は標識、例えば或る特定のタグ、色素又は他の試薬の使用が不必要になることから、特に好適である。これにより作製方法を行うのに要求される供給源が低減する。結果として作製方法が単純化され、マーカーを排除することにより、潜在的なエラー原因が最小限に抑えられる。無標識検出法を用いることで、これまでのこれらの分子の修飾を必要とすることなく、生成物分子の集積を直接検出することが可能である。この変法は、生成物アレイの質が標識及びマーカーによって損なわれないことから、更に有利なものである。
【００５１】
好ましい無標識検出法は、結像反射型干渉分光法（ｉＲＩｆＳ）（［７］も参照されたい）、SRU BiosystemsのＢＩＮＤ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（［８］も参照されたい）、ビアコア検出、偏光解析、濁度及び／又は吸光の測定、又は電気素子を用いた測定である。加えて、下記の検出法は無標識でも実施することができる。ＴＩＲＦ（全内部反射蛍光）は、生成物を励起することができる場合の無標識法である。サイクリックボルタンメトリ（cyclovoltammetry）を用いた測定も、生成物に直接アクセス可能な場合に無標識で行うことができる。インピーダンス測定は、生成物が表面の電気特性を変える場合の無標識検出法である。得られる生成物が発光を放出する場合、発光測定も無標識法である。生成物自体が蛍光性である場合、蛍光測定も無標識法である。
【００５２】
更に好ましい実施の形態では、本発明は、リアルタイムでの検出が標識を使用する方法であることを特徴とする、方法に関する。或る特定の適用領域において、標識を用いた検出法の使用は便宜的かつ有益なものであり得る。当業者であれば、独創的な創作能力を発揮せずとも、各々の作製方法に最も適した方法を選択することが可能である。標識技法を用いた好ましい検出法としては、電荷マーカーを用いた測定、表面蛍光の消失を用いた測定、ＴＩＲＦ（標識は励起性を増大させるのに使用される）、サイクリックボルタンメトリを用いた測定、インピーダンス測定（電気特性を増幅させるのに組み込まれた標識を使用する場合）、発光測定（カップリング反応が起こる場合）、又は蛍光測定（フルオロフォアを組み込むことによる）が挙げられる。標識を用いた検出法の使用により、検出感度が増大し、結果として特に正確な結果を達成することが可能となる。
【００５３】
本発明は更に、直接検出法をリアルタイムでの検出に用いた、マイクロアレイを作製する方法に関する。直接検出法は、本発明の内容において、ｉＲＩｆＳ、ＢＩＮＤ、ＳＰＲ、ビアコア法、偏光解析、又はＴＲＩＦであるのが好ましい。濁度の測定又は吸光測定は生成物が色素を有する場合に好ましい直接検出法として使用することができる。
【００５４】
電気素子を用いた測定も、本発明の内容において、分子が帯電している場合に直接検出法として使用することができる。電荷マーカーを用いた測定は、電荷マーカーが分子に組み込まれ、及び／又は該分子から切り離される場合に直接検出法として使用される。サイクリックボルタンメトリを用いた測定は、生成物にアクセス可能な場合に直接検出法として使用することができる。インピーダンス測定も、生成物自体が表面の電気特性を変えることができる場合に直接検出に使用することができる。その上、表面蛍光の捕捉を用いた測定は、生成物が電荷を誘導する場合に直接検査に使用することができる。同じことが、生成物が発光を生じる場合の発光測定、及び生成物自体が蛍光性である場合の蛍光測定にも当てはまる。直接検出法を使用する有利点は、生成物が直接、付加的な補助分子を介さずに生成されることから、潜在的なエラー原因が排除されることである。
【００５５】
しかしながら、間接検出を介してリアルタイムでの検出を行うことが好ましい場合もある。生成物の生成を間接的に検出する好ましい検出法は、ｉＲＩｆＳ、ＢＩＮＤ、ＳＰＲ、ビアコア法、濁度の測定、及び吸光測定である。これら全ての間接検出法では、生成物自体ではなく、副生成物の生成又は二次反応が検出される。更に好ましい間接検出法は、電気素子を用いた測定（二次生成物が帯電している場合、又は二次反応が起こる場合）、電荷マーカーを用いた測定（マーカーを含有する二次生成物が生成される場合）、サイクリックボルタンメトリによる測定（酸化還元副生成物が生成される場合）、インピーダンス測定（副生成物に含まれる場合）、ＴＲＩＦ（副生成物に組み込まれる場合）、表面蛍光の消失を用いた測定（副生成物が電荷を誘導する場合）、発光測定（副生成物、例えばピロリン酸塩を使用する場合）、又は蛍光測定（副生成物が蛍光性である場合）である。当業者であれば、特定の方法について直接検出よりも間接検出が好ましい場合を認識するであろう。
【００５６】
直接的にかつ無標識で行われる検出法が特に好ましい。
【００５７】
リアルタイムでの検出が受容体表面を導波路として使用するものであることを特徴とする、方法も好ましい。
【００５８】
生成物分子の集積が、物理的方法、電気的方法、化学的方法、蛍光測定、発光測定、分光法、吸光測定、偏光測定、反射型干渉分光法、結像反射型干渉分光法、表面プラズモン共鳴分光法、ビアコア法、偏光解析、偏光異方性解析（［９］も参照されたい）、濁度測定、ｐＨ測定、利用可能なＨ＋イオンの測定、表面蛍光の励起を用いた測定、内部全反射蛍光顕微鏡検査法、表面蛍光の消失を用いた測定、エバネッセント場の励起を用いた測定、及び／又はラマン分光法を用いた測定を含む群から選ばれる方法によって検出されることを特徴とする、方法も好ましい。
【００５９】
無標識の結像反射型干渉分光（ｉＲＩｆＳ）検出法が本明細書では特に好ましい。この場合、屈折率が異なる薄層上での光の干渉によりシグナルが発生する。使用するガラスの屈折率が水の屈折率と異なっていれば、そのガラスをシグナル発生に使用することができる。高屈折層、例えば酸化チタンをガラスに導入すると、更なるシグナル増幅が得られる。これによりシグナルを増幅させる多光束干渉が起こる。
【００６０】
鋳型分子がｉＲＩｆＳを用いて検出される場合、生成物分子の結合の結果としての表面質量の変化を検出することができる。しかしながら、他の表面干渉技法、例えばＢＩＮＤも使用することができる。ＢＩＮＤは、複数の生体分子相互作用の検出を可能にする無標識検出技法である。ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）には、表面プラズモン共鳴へと励起することができる自由電子が必要とされる。必然的に、これはこれらの共鳴を可能にするために、表面が金属薄層（大抵、銅、金又は銀）を備えていなければならないことを意味する。安定性及び生体適合性の理由から、金が好ましい。好ましくは無標識ビアコア技法も、結合測定を行うのに使用することができる。この技法はこれまではアレイコピーに使用されてこなかった。したがって、この検出法が陽性結果をもたらすことは全く予期せぬものであった。この目的では受容体表面は、複製分子が堆積し、コピーを作製する金層を備えるのが好ましい。検出はコピーの表面上で直接行われることもある。
【００６１】
生成物の生成は、偏光解析の光学的検出法を用いてもリアルタイムに首尾よく検出することができる。この方法を用いて、層の厚さ、ひいては分子の集積を判断することもできる。この場合、入射光線が表面上で反射する。分子が表面上に集積している場合、反射挙動が変化し、円偏光又は楕円偏光の場合、偏光比のシフトが起こる。偏光方向の変化は質量集積に対応する。測定も表面上で行われ、そのようにして生成物の生成に関する直接的な情報が得られる。この検出法も無標識であることから、上述の有利点を有する。この検出法を用いて、集積密度の非常に正確な決定を実現することができることは予期せぬことであった。またこの方法には追加の材料が必要とされないことが特に有益である。
【００６２】
濁度及び／又は吸光を測定することによるリアルタイムでの検出も好ましい。この測定は、表面上ではなく、その上にある領域（volumes）で行われる。光を当て（beamed）、後方散乱から及び／又は通過する光の量から、生成物上の領域がどのくらい強く光を散乱及び／又は吸収するかを任意に決定する。例えば生化学反応の進行により形成される複合体（complexer）をこの目的に使用することができる。形成されるリン酸マグネシウムがこの目的に特に適している［Mori et al (2001), "Detection of loop-mediated isothermal amplificationreaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation",Biochemical and Biophysical Research Communications 289: 150-154］。反応が進行すると、スポットの上の液体が混濁し、「透明性が低く」なる。透過光が測定される場合、スポットはより暗く見え、後方散乱が測定される場合、スポットはより明るく見える。
【００６３】
電気素子を用いた測定（［１０］も参照されたい）が有益であることが更に分かっている。ＩＯＮ  ｔｏｒｒｅｎｔでの検出と同様に、受容体表面はｐＨ値及び／又はＨ＋イオンのアベイラビリティを測定する印刷電極を備えることもできる。生成反応が起こると、Ｈ＋イオンの濃度は局所的に反応物付近へと変化する。これはコピーの作製の間接的なマーカーであり、驚くほど信頼性のある結果をもたらすことが可能であった。
【００６４】
複製反応の直接検出を、電荷マーカー、並びにサイクリックボルタンメトリ及び／又はインピーダンス測定等を用いて実現することができる。表面上の分子が伸びる場合及び／又は結合が起こる場合、これらの分子は表面の電気化学的特性を変える。次いでこの変化を、対応するいわゆる櫛型電極を用いて検出することができ、それにより生成反応の直接検出が可能となる。
【００６５】
ＴＩＲＦ（全内部反射蛍光）の場合、レーザー光線が、全反射するようにガラス基板に連結される。次いで、表面上に生じるエバネッセント場が、表面に極めて近いフルオロフォアのみを励起する。これまで、この方法はマイクロアレイ上での結合の検出にしか使用されてこなかった。したがって、この信頼性のあるシステムによって、アレイコピーの作製を検出することもできたことは予期せぬことであった。この検出技法を本発明に有用なものにするには、好ましくは蛍光モノマーを反応混合物に添加した後、生成物分子に組み込むか（組込み効率の低減）、又は同じように複製された後、蛍光特性を有する追加の分子を鋳型分子のレベルで添加する（実際の複製に対する競合反応）。これらの生体分子が表面上に集積すると、蛍光シグナルを発生させる。
【００６６】
表面蛍光の消失を用いた測定によるリアルタイムでの検出も有益であり得る。これには無標識蛍光技法も含まれる。このために、ＤＮＡ鎖をフルオロフォアでマーキングする。次いでこの鎖上に、ＤＮＡで標識された第１の分子をハイブリダイズする。交流電場を印加することによって、ＤＮＡを表面へと引き付け、フルオロフォアが消光によって排除される。結合の結果、質量が大きくなり、交流電場により「表面への引き付け」が減速する。結果として、質量、ひいては結合の増大を検出することができる。この方法により、生成物の生成の直接検出も可能となる。
【００６７】
発光及び／又は蛍光を用いた測定によっても本発明の内容においてより信頼性があり、かつ正確なリアルタイムでの検出が可能になることは予期せぬものであった。濁度の測定ではなく、反応副生成物を使用して、発光又は蛍光を発生させることもできる。発光は既に、例えばＦＬＸ  ４５４シークエンシングチップとともに用いられており、「パイロシークエンシング」という用語で知られている。それに応じて類似の構造物をＲＮＡ又はタンパク質に対して生成することができる。反応が起こると、生成される分子の量に基づき周囲の領域が発光し始め、及び／又は蛍光を有するようになる。これはどのくらいの分子がコピーに結合することが可能であるかの間接的な指標である。
【００６８】
酵素反応系が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、及び／又は逆転写酵素を含む群から選ばれる酵素を含むことを特徴とする、方法も好ましい。各々の酵素の選択は作製方法によって作製される所望のアレイに基づくものである。当業者であれば、独創的な創作能力を発揮せずとも、対応する生成物分子の生成にはどの酵素を選ばなくてはいけないかを認識するであろう。例えば、生成物分子がＤＮＡであり、ＤＮＡマイクロアレイを作製する場合は、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素を使用することが好ましい。これに対して、ＲＮＡマイクロアレイを作製し、生成物分子がＲＮＡである場合は、ＲＮＡポリメラーゼの使用が好ましい。
【００６９】
化学反応系が、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡから対応するタンパク質を生成する無細胞混合物を含むことを特徴とする、方法が更に好ましい。
【００７０】
酵素反応系が、例えばＤＮＡからＲＮＡへと、またＲＮＡからタンパク質へと転写させる酵素を含有するようなタンパク質合成系であるのが更に好ましい。このような反応系を選択することによって、生成物分子としてタンパク質を含むタンパク質マイクロアレイを作製することができる。生成物分子としてのタンパク質の生成
【００７１】
検出が分子マイクロアレイの作製プロセスをモニタリングするのに使用されることを特徴とする、方法も好ましい。この実施の形態は、これまではマイクロアレイの作製プロセスのモニタリングが不可能であったことから特に好ましい。この実施の形態は作製プロセスと、アレイ作製中にモニタリングを行うことを可能にするリアルタイムでの検出との組合せである。これにより、エラー原因を適時に特定し、排除することができることから、多くの有利点がもたらされる。
【００７２】
オリジナルのアレイが平面アレイ、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡのシークエンシングチップを含有する平面アレイであることを特徴とする、方法も好ましい。
【００７３】
装置が装填される際に気泡が形成されるか否かをモニタリングするのに使用することができる検出ウィンドウを提供する方法が従来技術より知られている。この検出ウィンドウは好ましくは、生成物の生成のリアルタイムでの検出、ひいてはコントラストのモニタリングに使用することができる。
【００７４】
マイクロアレイの作製後に、検出法を結合測定又は相互作用測定に更に用いることができることを特徴とする、方法も好ましい。この方法は、検出系を用いることで、実際のアレイの作製の検出、及び同じ検出系を用いるその後の分析の実施が可能となることから特に有益である。さらに本発明の検出系を用いることで、新たな検出系を用いずその後の試験を行うことができることは予期せぬことであった。これによって、同じ構造を保持することが可能となり、それによりこのプロセス及びその後の分析が単純化される。アレイの損傷リスクも要求される作業量の減少により低減する。要求されるプロセス工程も少なくなり、検出ユニットを再使用することができるだけでなく、マイクロアレイを作製するために液体を供給する装置全体を試験対象の液体、例えば細胞溶解物、サンプル材料又はシステム液を供給するのに使用することができる。このようにして作製装置を作製の直後に分析装置としても使用することができる。
【００７５】
更なる好ましい実施の形態では、本発明は作製がリアルタイムにモニタリングされる上記の方法のいずれかに従って作製されるマイクロアレイに関する。
【００７６】
更なる好ましい実施の形態では、本発明は受容体表面上での分子の集積をリアルタイムに検出する装置であって、
酵素反応を用いてマイクロアレイを作製する装置と、
好ましくは上述の検出法を用いてリアルタイムに生成物分子の集積を検出及び／又は測定することができる検出手段と、
を備える、装置に関する。
【００７７】
このような装置によって、生成物の生成を生成プロセス中に検出することができ、必要に応じて生成プロセスを調整（延長、短縮等）することができるようにすることが可能である。
【００７８】
本発明はマイクロアレイを作製及び／又は複製する方法であって、該方法はオリジナルのマイクロアレイ、好ましくは核酸マイクロアレイと受容体表面とを準備することを含み、生成物分子が酵素反応によって生成され、対応するマイクロアレイとして受容体表面上に堆積され、分子の集積がリアルタイムに検出及び／又は測定されることを特徴とする、方法にも関する。
【００７９】
したがってこの装置及び方法によって、プロセスパラメータを作製プロセス中に調整することが可能となり、それにより得られる生成物のコントラスト及び／又は質を制御することができる。生成される生成物（好ましくはコピー及び／又は誘導体）の各々の生成速度に基づき、プロセス時間を調整することができる。
【００８０】
本発明には、アレイ複製及び／又はアレイ作製に関する全てのオプションを合わせた、表面への結合のリアルタイムでの検出に関する全てのオプションが包含される。
【００８１】
更なる好ましい実施の形態では、本発明はマイクロアレイを作製するキットであって、該作製がリアルタイムに検出され、該キットは、
ｉ．第１の支持体表面と、
ｊ．少なくとも１つの鋳型分子と、
ｋ．受容体表面と、
ｌ．酵素及び／又は化学反応系と、
ｍ．好ましくは上記の検出法を用いてリアルタイムに生成物分子の集積を検出及び／又は測定することができる少なくとも１つの検出手段と、
を備える、キットに関する。
【００８２】
これに関して、鋳型分子が第１の支持体表面に結合することが特に好ましい。
【００８３】
本発明による方法を実施することができるキットを作製することができたことは全く予期せぬことであった。意外にも、キットの部品を、機能性を損なうことなく長期間に亘って保存することができる。そのため本発明によるキットを長期間保存することにより、本発明による方法の実施を何倍にも単純なものにすることができる。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００８４】
便宜上、記載されている全ての適用はタンパク質トランスレータ（translator）の形（核酸からタンパク質）で示されている。これは本発明の限定をなすものではない。全ての方法を全てのマイクロアレイ複製技法に適用することができる。また形状、親分子及び増幅材料の好適な選択により、ＤＮＡからＤＮＡへの、ＤＮＡからＲＮＡへの、ＲＮＡからタンパク質への、及びＲＮＡからＤＮＡへのこの方法の適用も想到されるが、これに限定されない。
【００８５】
図１に、ＤＮＡからタンパク質の場合のマイクロアレイ作製技法の展開を示す。ＰＩＳＡでは、ＤＮＡと酵素混合物とを混合して、収集体表面上に直接置く。このシステムによって、アレイの作製中にタンパク質が直接生成される。ＮＡＰＰＡでは、ＤＮＡを予め表面上に固定し、その後酵素混合物でコーティングした。このようにして初めにＤＮＡアレイを作製した後に必要に応じてタンパク質を生成するシステムが与えられる。ＤＡＰＡでは、ＤＮＡ表面と収集体表面とが分離されている。前もってＤＮＡアレイを作製し、その後タンパク質アレイにおいて何回も複製することができる。
【００８６】
タンパク質トランスレータは、スペーサを介して選択的に液体を送り込み、それにより複製反応及び／又は生成反応をいつでも開始することが可能なシステムである。加えて、使用するタンパク質トランスレータの形状及び材料により、タンパク質の収集体表面への結合の直接検出が可能となる。しかしながら、タンパク質の代わりに、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は他のタイプの生成物分子を生成することも可能である。
【００８７】
図２に、異なる速度で進行する反応の図を示す。ｐＨ値、塩含量若しくは温度差、又はＤＮＡアレイ（オリジナル）と受容体表面（生成物／コピー／誘導体）との間の距離の変動を僅かに調整しただけで、異なる速度の生化学反応、ひいては生成物分子の異なる生成速度がもたらされる。これらの生成物分子も同様に異なる速度で拡散し、異なる速度での生成物の生成が起こる。そのため高速の反応では、生成物が過剰発生して、低速反応では、それに応じて生成物が過小発生する。本発明によるリアルタイムでの検出に基づく生成時間の直接調整により、一定品質の生成物（コピー／誘導体）の生成が可能となる。
【００８８】
図３に、ＲＩｆＳ技法のシグナル発生の図を示す（http://barolo.ipc.uni-tuebingen.de/research/bilder/rifs-prin-antialising-%20englisch.jpgに従って変更）。これは本発明による方法への使用が好ましい検出法である。入射光が表面上に干渉を生じさせる。これを「埋込（buried）」高屈折層、例えば酸化チタンを用いて増幅することができる。この結像法によって、生成物の生成又は結合のビデオを直接作成することが可能となる。この技法には平板表面が必要である。
【００８９】
図４に、ＢＩＮＤ技法におけるシグナル発生の図を示す（http://www.srubiosystems.com/Technology/index.htmlに従って変更）。入射白色光が、構造化された高屈折層上に干渉を生じさせ、この干渉が表面と相互作用する。異なる干渉が、分子の表面密度に寄与し得る異なる濃淡（tints）をもたらす。この技法には高屈折層の埋込格子型構造が必要である。
【００９０】
図５に、ビアコア技法のシグナル発生の図を示す（http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0165993610002487-gr1.jpg及びhttp://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0022283600936623-gr2.gifに従って変更）。既定の角度での入射光が表面上でプラズモンと相互作用した後、僅かに調整した角度（ＳＰＲ角度）で放出される。分子の表面への結合によって、プラズモンが「同調し（tuned）」、角度が調整される。これによってリアルタイムでの検出が得られる。この技法には金コーティングが必要である。
【００９１】
図６：偏光解析のシグナル発生の図（２０１２年５月２０日のhttp://www.optrel.de/pdfs/flyer/imaging-elli.pdfに従って変更）。偏光が表面上に当てられる。光の後方散乱部は偏光方向、すなわち長軸方向に依存し、横偏光部は異なる反射をし、それにより主偏光軸の回転が起こる。この表面は表面修飾を必要としないが、低速であり、上述の技法ほどの感度はない。
【００９２】
図７に、濁度測定のシグナル発生の図を示す。有益な点は、市販の顕微鏡をこの目的に使用することができることである。光が当てられる。反応が起こると、生成されるスポットの上の培地が混濁する。濁度の強度は生成される分子の量の評価基準（measurement）である。これは表面上に集積する分子の量の間接的な評価基準である。この技法は任意の表面修飾を必要とせず、その代わり反応混合物中にシグナル発生分子のみを必要とする。
【００９３】
図８に、イオン測定のシグナル発生の図を示す（http://de-de.invitrogen.com/etc/medialib/images/Sequencing/Semiconductor-Sequencing/Ion-Torrent.Par.79124.Image.660.400.1.Step-2.gif及びhttp://www.technologyreview.com/files/49534/sequencing_x220.jpgに従って変更）。生化学反応の定量的検出は既に、イオン検出を用いたｉｏｎ  ｔｏｒｒｅｎｔにおいて実現されている。対応する電極を複製基板に埋設することにより、これも代替検出となる。しかしながら、電極の作製にはコストがかかる。
【００９４】
図９に、表面上でのイオン測定のシグナル発生の図を示す（http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0956566304002544-gr1.jpgに従って変更）。この場合、櫛型電極をＤＮＡ及びタンパク質の選択的生成、並びに後の結合測定に使用する。同一のシステムを受容体表面上での分子の集積の測定にも使用することができる。このためには、対応する電極を受容体表面に導入しなければならない。
【００９５】
図１０に、表面上での蛍光のシグナル発生の図を示す（http://www.zeptosens.com/en/pdf/planar_wave_guide.pdf及びhttp://www.lbb.ethz.ch/Equipment/zeptoreader/ZeptoREADER_Principle.jpg?hiresに従って変更）。この場合、受容体表面は導波路として使用し、表面近くにあり、それにより結合しているフルオロフォアのみを励起させるのにエバネッセント場を用いる。この場合、蛍光は組み込まれた蛍光モノマー又は生成された分子の蛍光を用いて発生させることができる。
【００９６】
図１１に、表面上での蛍光消失によるシグナル発生の図を示す（http://dynamic-biosensors.com/index.php/bio-sensor-technology/switchsense-technology-alias.htmlに従って変更）。運動はＡＣ電圧を用いて誘導される。表面からの平均距離は分子の質量の評価基準である。したがって蛍光の増減に基づき、結合が起こっているか否かを判断することができる。このためには、受容体表面にＤＮＡ又は可動性の長分子をコーティングする。
【００９７】
図１２に、溶液中の蛍光又は発光によるシグナル発生の図を示す（http://www.nature.com/nmeth/journal/v8/n7/images_article/nmeth.1629-F1.jpgに従って変更）。生化学反応をピロリン酸塩等の得られる副生成物と結び付けることにより、発光又は蛍光を発生させることができる。このために、対応する追加の酵素系及び基質の両方を反応混合物に加えた。
【００９８】
図１３に、表面増幅ラマン分光法によるシグナル発生の図を示す（http://spie.org/Images/Graphics.Newsroom/Imported-2011/003645/003645_10_fig2.jpg及びhttp://sbir.gsfc.nasa.gov/SBIR/successes/images/9-028pic.jpgに従って変更）。ラマンスペクトルはレーザー照射によって誘導することができる。この効果は表面上で増幅することができる。このプロセスにおいて、金属ナノ粒子を表面に適用することが好ましい。この実施形態では、ラマン放射を分析するのに高感度検出器も使用され、対応する光学系を必要とする。
【００９９】
図１４に「タンパク質コピー」の検出を示す。ＤＮＡアレイのタンパク質コピーを本発明による装置を用いて作製することができ、またそれと同時にこの生成物の生成をリアルタイムに検出することができることを実証することができた。最終的に、タンパク質を特定の蛍光標識抗体で染色した。比較のために、ＤＡＰＡ（Ａ）及び携帯式装置でのタンパク質コピー（Ｂ）を連動して実施した。全ての場合で、タンパク質コピーを作製することができた。しかしながら、コピーはＤＡＰＡよりも携帯式装置においてより高速であることが見出された。その上、コピー（Ｂ）は過剰発生している。正確にはこの理由から、リアルタイムでの検出が必要とされる。白色及び赤色の矢印はコピーのエラーを示す（ＤＡＰＡ（Ａ）：白色＝疵（scratches：スクラッチ）、赤色＝膜繊維による染み、携帯式装置（Ｂ）、白色＝気泡、それによりコピーなし、赤色＝僅かな液体の偏流、それによる条痕）。
【０１００】
図１５にＤＮＡコピーの検出を示す。この場合、ＤＮＡはシークエンシングチップ（Ａ）から表面（Ｂ）上へと複製されている。次いで、コピー及びシークエンシングチップを特定のハイブリダイゼーションプローブで染色した。２つの緑色ピクセル（Ｂの白色矢印）を複製することはできなかった。シークエンシングチップは３Ｄ構造に起因して不鮮明に見える。ＤＮＡ複製反応（Ｃ）はおよそ１１００００の腔を備える広範囲に亘って進行させることができた。
【０１０１】
図１６にｉＲＩｆＳを用いた無標識測定の検出を示す。使用するフローチャンバにおいて、結合測定（図の真ん中）及び分子の集積を結像によって検出することができた。ほぼ１００個の異なるポイントのリアルタイムでの検出（図の右側）も可能であった。
【０１０２】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】ＤＮＡからタンパク質の場合のマイクロアレイ作製技法の展開を示す。
【図２】異なる速度で進行する反応の図を示す。
【図３】ＲＩｆＳ技法のシグナル発生の図を示す。
【図４】ＢＩＮＤ技法におけるシグナル発生の図を示す。
【図５】ビアコア技法のシグナル発生の図を示す
【図６】偏光解析のシグナル発生の図。
【図７】濁度測定のシグナル発生の図を示す。
【図８】イオン測定のシグナル発生の図を示す。
【図９】表面上でのイオン測定のシグナル発生の図を示す。
【図１０】表面上での蛍光のシグナル発生の図を示す。
【図１１】表面上での蛍光消失によるシグナル発生の図を示す。
【図１２】溶液中の蛍光又は発光によるシグナル発生の図を示す。
【図１３】表面増幅ラマン分光法によるシグナル発生の図を示す。
【図１４】「タンパク質コピー」の検出を示す。
【図１５】ＤＮＡコピーの検出を示す。
【図１６】ｉＲＩｆＳを用いた無標識測定の検出を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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