(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローサイトメーターのプローブパネルを設計する方法であって、前記方法は、
第１チャネルで測定されるように意図される第１標識の発光によって生じる、第２チャネルへの漏れ込み効果を定量化するひずみ係数を決定することと、
前記第１標識及び第１プローブを含む、第１プローブ−標識の組み合わせの予測最大信号を入力することと、
前記ひずみ係数及び前記第１プローブ−標識の組み合わせの前記予測最大信号に基づいて、前記第２チャネルにおける検出限界の増加を計算することと、
前記計算した検出限界の増加に基づいて、前記プローブパネルに含まれるプローブ−標識の組み合わせを選択することと、を含み、
前記ひずみ係数が、前記第１プローブ−標識の組み合わせ及び第２プローブ−標識の組み合わせに対応する抗原の共発現パターンを示す係数によって数学的に修正され、前記第２プローブ−標識の組み合わせが前記第２チャネルにおいて測定されるように意図される、方法。
【請求項２】
前記ひずみ係数が、前記第１プローブ−標識の組み合わせの発光強度の関数としての前記第２チャネルにおける検出限界の増加の推定値である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ひずみ係数が、前記第１プローブ−標識の組み合わせの前記発光強度の線形関数である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２チャネルにおける検出限界の前記増加が、前記第１プローブ−標識の組み合わせの前記発光強度の関数として、測定誤差の増加によって生じる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
フローサイトメーターのプローブパネルを設計する方法であって、前記方法は、
第１チャネルで測定されるように意図される第１標識の発光によって生じる、第２チャネルへの漏れ込み効果を定量化するひずみ係数を決定することと、
前記第１標識及び第１プローブを含む、第１プローブ−標識の組み合わせの予測最大信号を入力することと、
前記ひずみ係数及び前記第１プローブ−標識の組み合わせの前記予測最大信号に基づいて、前記第２チャネルにおける検出限界の増加を計算することと、
前記計算した検出限界の増加に基づいて、前記プローブパネルに含まれるプローブ−標識の組み合わせを選択することと、を含み、
前記ひずみ係数が、前記第１プローブ−標識の組み合わせの発光強度の関数としての前記第２チャネルにおける検出限界の増加の推定値であり、
前記ひずみ係数が、クロストーク指数を使用して計算される、方法。
【請求項６】
第１候補プローブパネル内の各標識のひずみ係数を決定して、前記第２チャネルにおける検出限界の総増加を計算することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
フローサイトメーターのプローブパネルを設計する方法であって、前記方法は、
第１チャネルで測定されるように意図される第１標識の発光によって生じる、第２チャネルへの漏れ込み効果を定量化するひずみ係数を決定することと、
前記第１標識及び第１プローブを含む、第１プローブ−標識の組み合わせの予測最大信号を入力することと、
前記ひずみ係数及び前記第１プローブ−標識の組み合わせの前記予測最大信号に基づいて、前記第２チャネルにおける検出限界の増加を計算することと、
前記計算した検出限界の増加に基づいて、前記プローブパネルに含まれるプローブ−標識の組み合わせを選択することと、
第１候補プローブパネル内の各標識のひずみ係数を決定して、前記第２チャネルにおける検出限界の総増加を計算することと、を含み、
前記プローブ−標識の組み合わせを選択することが、前記計算した検出限界の総増加と、前記第２チャネルにおける予測最小信号との比較に基づいている、方法。
【請求項８】
前記第１候補プローブパネル内の各プローブの検出限界の総増加を計算することを更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
第２候補プローブパネル内の各プローブの検出限界の総増加を計算することと、
前記第１候補プローブパネル内の各プローブの前記計算した検出限界の総増加と、前記第２候補プローブパネル内の各プローブの前記計算した検出限界の総増加との比較に基づいて、前記プローブパネルを選択することと、を更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第２候補プローブパネル内の各プローブの検出限界の総増加を計算することと、
前記第１候補プローブパネル及び前記第２候補プローブパネル内の優先プローブの前記計算した検出限界の総増加に基づいて、前記プローブパネルを選択することと、を更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１チャネル及び前記第２チャネルが隣接したチャネルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
フローサイトメーターのプローブパネルを設計する方法であって、前記方法は、
第１プローブ及び第２プローブを特定することと、
前記第１プローブの予測最小信号を特定することと、
前記第２プローブに関連付けられた候補標識に基づいて、前記第１プローブの第１検出限界を決定することと、
前記第２プローブに関連付けられた異なる候補標識に基づいて、前記第１プローブの第２検出限界を決定することと、
前記第１検出限界、前記第２検出限界、及び前記第１プローブの前記予測最小信号に基づいて、前記プローブパネルの前記第２プローブに関連付ける標識を選択することと、を含む、方法。
【請求項１３】
前記第１検出限界を決定することが、前記第２プローブに関連付けられた前記候補標識の測定を意図する検出チャネルにおける予測最大信号をひずみ係数に掛けることを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１検出限界を決定することが、抗原の共発現パターンを示す係数を前記ひずみ係数に掛けることを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記係数が、１又は０のいずれかである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記予測最大信号が、標的細胞における予測抗原密度に部分的に基づいている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記予測最大信号が、前記第２プローブに関連付けられた前記候補標識に更に基づいている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記予測最大信号が、抗原の共発現パターンに部分的に基づいている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１プローブが第１チャネルで検出されるように意図され、前記第１プローブの前記第１検出限界を決定することが、前記第１チャネル以外の前記フローサイトメーターの各チャネルの予測最大信号をひずみ係数に掛けることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１プローブの前記第１検出限界を決定することが、ＣＶ増加の線形重畳モデルに基づいている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ひずみ係数が、色補正によって生じるＣＶ増加の測定値である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
フローサイトメーターのプローブパネルを設計する方法であって、前記方法は、
第１プローブ、第２プローブ、及び第３プローブを特定することと、
複数の可能なプローブパネルを特定することであって、各可能なプローブパネルが、前記第１プローブ、前記第２プローブ、又は前記第３プローブの組み合わせを含み、各プローブが関連付けられ得る標識を有する、ことと、
前記第２プローブ及びその関連付けられた可能な標識の組み合わせのスペクトル漏れ込み効果に基づいて、前記第１プローブの検出限界を決定することによって、可能な第１プローブパネルを評価することと、
前記第３プローブ及びその関連付けられた可能な標識の組み合わせのスペクトル漏れ込み効果に基づいて、前記第２プローブの検出限界を決定することによって、可能な第２プローブパネルを評価することと、
決定した前記検出限界に基づいて、前記複数の可能なプローブパネルから前記プローブパネルを選択することと、を含み、
前記可能な第１プローブパネルを評価することが、前記第１プローブ及び前記第２プローブに関連付けられた抗原の共発現パターンに部分的に基づいて、前記第１プローブの前記検出限界を決定することを含む、方法。
【請求項２３】
前記第１プローブ、前記第２プローブ、及び前記第３プローブのうちの少なくとも１つが、抗原と特異的に結合する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１プローブ、前記第２プローブ、及び前記第３プローブのうちの少なくとも１つが、検体と特異的に結合する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
抗原の前記共発現パターンが、特定の細胞種類の抗原間の共発現関係を更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１プローブ及び前記第２プローブに関連付けられた抗原の前記共発現パターンが相互に排他的である場合、前記第２プローブ及びその関連付けられた標識の組み合わせのスペクトル漏れ込み効果が０と決定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２プローブに関連付けられた前記抗原が前記第１プローブに関連付けられた前記抗原の子孫である場合、前記第２プローブ及びその関連付けられた標識の組み合わせのスペクトル漏れ込み効果が０と決定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２プローブ及びその関連付けられた標識の組み合わせのスペクトル漏れ込み効果が、ひずみ係数及び抗原の共発現パターンの関数として定量化される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２プローブ及びその関連付けられた標識の組み合わせのスペクトル漏れ込み効果が、標的細胞における予測抗原密度の関数として定量化される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記選択されたプローブパネル内のプローブペアの予測信号の集団分布のグラフィカル表示を表示することを更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記集団分布の前記グラフィカル表示を表示することが、前記第１プローブ及び前記第２プローブの前記決定した検出限界を表示することを含む、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本開示は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年３月１５日出願の米国特許仮出願第６１／７９１，４９２号に対する請求権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の実施形態は、概して生体試料の細胞を評価するためのシステム及び方法に関し、具体的には、フローサイトメトリーで使用する抗体−色素結合体の組み合わせを選択する方法に関する。更に、実施形態は、概して、マルチカラーフローサイトメトリーで陽性を分析するための自動化システム及び方法に関する。
【０００３】
蛍光フローサイトメトリーを使用した細胞表面の免疫表現型検査は、多数の異なる細胞種類を含む細胞試料内で対象の細胞を識別し、カウントするための比較的日常的なプロセスになっている。通常、細胞表面プローブ、例えば、対象の細胞の外表面上の抗原に特異的な蛍光色素標識モノクローナル抗体（ＭＡＢ）又は他の好適な標識リガンドを使用して、以降の検出のためにかかる細胞を選択的に標識する、つまり「染色」する。フローサイトメーターは、蛍光色素標識を励起するように特別に適合された放射線を、試料内の個々の細胞に１つずつ照射することにより、染色された細胞を検出するように動作する。照射時には、標識の蛍光色素及びこれらに関連付けられた細胞は、照射された細胞の物理的及び光学的特性によって決定されたパターンで入射放射線を散乱させる。フローサイトメーター内の好適な光検出器は、散乱放射線及び蛍光を検出し、これらの各出力信号を使用して、これらの対応の光散乱及び蛍光サインに基づいて異なる細胞種類を識別する。
【０００４】
フローサイトメトリーによる免疫表現型検査には、通常、所望の評価又はモニタリング手順に生理的に適した一連のプローブ又は試薬を選択することを伴う。関連して、特定の病状は患者の細胞の表面又は細胞の内側にある様々な抗原の発現によって特徴付けることができるため、かかる抗原プロファイルに対応する抗体プローブ試薬パネルを選択できる。例えば、Ｓｏｌａｓｔｒａ（商標）５−Ｃｏｌｏｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐａｎｅｌは、フローサイトメトリーによって血液リンパ腫瘍形成の特徴付けに使用される、複合抗体混合物のパネルである。このパネルは、関連する白血球表面分子の同定及び列挙に使用でき、特定の異常な血液学的結果並びに／又は血流、骨髄及び／若しくはリンパ組織中に芽球を有する患者の鑑別診断の補助として使用できる。Ｓｏｌａｓｔｒａ（商標）５−Ｃｏｌｏｒ  Ｒｅａｇｅｎｔｓは、Ｂ、Ｔ、及び骨髄系統抗原を目的とする抗体からなる。かかるパネルは、血液病理学用途のフローサイトメトリー分析で使用できる。
【０００５】
フローサイトメトリー装置を通過する試料の測定は、散乱光、蛍光を発する光、又はこれらの組み合わせの特徴的なフォトニックサインをもたらす。このサインを分析することにより、粒子の物理的及び化学的特性を推論できる。例示の粒子の生物学的特徴である、タンパク質の発現は、調査の対象であることが多い。血液試料からの粒子サインはドットプロットで表示でき、ゲーティングを使用してこれらのサインを解明できる。概して、ゲーティングは、サインを陽性又は陰性のいずれかに分類するために使用する。例えば、ゲーティングを使用して、粒子が血球か、細胞残屑の一片かどうか、又は血球が疾患マーカーを含むかどうかを判定できる。したがって、ゲーティングは、診断及び臨床血液学用途で重要である。しかしながら、陽性サイン及び陰性サインの外観が類似している場合など、粒子が陽性集団又は陰性集団のいずれに属するのかを判定することが困難なことがある。粒子を陽性又は陰性のいずれに分類するべきかの判定を支援するために、アイソタイプ制御など様々なゲーティング法又は特異性制御法、主成分分析などモデル適用クラスター分析アルゴリズム、及びＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｎｕｓｍ  Ｏｎｅ（ＦＭＯ）が提案されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在既知の抗体パネル選択法は、細胞評価及びモニタリング手順を実行する人々に多くの利益をもたらすが、それでも更なる改善が所望される。更に、試料を評価するゲーティング制御法には、改善の余地がある。本発明の実施形態は、これらの未解決のニーズの少なくとも一部に対する解決策を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の実施形態は、フローサイトメトリー、並びに他の関連細胞評価及びモニタリング法で使用する抗体−色素結合体パネルを選択し、そのシミュレーションを行う（ｓｉｍｕｌａｒｉｎｇ）ためのシステム及び方法を包含する。多くの場合、かかるパネルは、生体試料の細胞を評価するために使用できるか、設計できる。かかる細胞は、個人から、細胞培養から、ヒト又は非ヒトドナープールなどから得られてよい。いくつかの実施形態によると、本明細書に開示した方法を使用して、懸濁液中に存在し、かつ抗体、毒素、受容体リガンド、又はこれらの派生物若しくは類似化合物などこれらの構造体に非共有結合した特異的な生体蛍光色素標識プローブによって認識され得る、その表面又は内側に構造体を有する粒子（例えば、生体細胞）を含む任意の物質を評価できる。本明細書の他の箇所に記載するように、蛍光色素標識モノクローナル抗体（ＭＡＢ）又は他の好適な標識リガンドを含んでよい、例示のプローブは、対象の細胞の外表面又はその内側にある抗原に特異的であり得る。分析に外部抗原が含まれるか、内部抗原が含まれるかに応じて、異なる（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）試料調製手順が使用されてよいが、いずれの種類の分析に対しても、本明細書に記載のデータ収集法が等しく適用される。フローサイトメーター内の好適な光検出器は、散乱放射線及び蛍光を検出し、これらの各出力信号を使用して、これらの対応の光散乱及び蛍光サインに基づいて異なる細胞種類（又は特定の細胞種類のサブタイプ又は特定の細胞種類間での異なる機能状態）を識別する。これらの蛍光サインは、蛍光補正と称される手順によって計算的に分解でき、したがって、細胞／粒子の表面又は内側にある、各分析対象の単一抗原の存在に関する量的情報を提供する。
【０００８】
フローサイトメトリーを使用したマルチカラー免疫表現型分析は、通常、抗体−色素結合体のパネル又は混合物を使用することを含む。パネルは、対応の個別色素を有する個々のプローブがフローサイトメトリー装置の個々の色検出チャネルに対応するように適合できる。本明細書に記載のように、プローブパネルの選択は自動化できる。したがって、マルチカラーフローサイトメトリー分析プロセスが合理化される。フローサイトメトリーにおいてかかるプローブパネルを使用することにより、多数の検出チャネルを使用して優れたデータを効率的に収集できる。したがって、休止時間を短縮でき、検査室の生産性を最大化できる。関連して、本発明の実施形態は、優先抗原の検出に関する感度を向上し、データ分析の円滑化を推進する。
【０００９】
例示のフローサイトメトリー装置は、赤色、青色、紫色、黄色などに対応する励起スペクトルを提供する、様々なレーザー構成（例えば、多数の固体レーザー）を含んでよい。互換性のある光学フィルターを使用して、様々な色素及び波長を容易に検出できる。例示のシステムは、多数の蛍光マーカーの同時分析に使用できる。例えば、６個の蛍光検出器を有するシステムは、最大６個の蛍光信号を同時に収集できる。蛍光検出器及び／又はレーザーをシステムに更に追加でき、最大１０色以上の同時読み取りを可能にする。本発明の実施形態は、ユーザにプロット、図表、及び複雑なフローサイトメトリーデータの分析を容易にできる他の視覚特性を提供するグラフィック表示法を提供する。
【００１０】
一態様では、本発明の実施形態は、フローサイトメトリー手順で生体試料を分析するためのプローブパネルを決定するためのシステム及び方法を包含する。例示の方法は、フローサイトメーターのハードウェア構成を入力することと、複数のプローブを含む名簿を入力することであって、名簿の個々のプローブは、対応の個別チャネルに固有の検出制限に関連付けられていることと、抗原の共発現パターンを入力することと、フローサイトメーターのハードウェア構成、個別チャネルに固有の検出制限、及び抗原の共発現パターンに基づいてプローブパネルを決定することと、を含む。プローブパネルは、名簿からのプローブのサブセットを含んでよい。
【００１１】
更に、本発明の実施形態は、マルチカラーフローサイトメトリーにおいて陽性を評価するためのシステム及び方法を包含する。例示の特異性又はゲーティング制御法を使用して、例えば、疾患マーカーなど特定のタンパク質の発現について血球が陽性であるか、陰性であるかを判定するために、個々の粒子サインを評価できる。場合によっては、これらの制御法を使用して、データの収集元である細胞を分類するために、収集データに対してゲート又はグラフィカル領域を位置付けることができる。例示の制御法は、補正後のマルチカラー手順で使用できる。場合によっては、本明細書に開示の方法は、現在使用している方法には存在しない水準の標準化をもたらす。更に、本明細書に開示の制御法は、時間的効率に優れ、経済的であり、多様な発現パターンに対して有効であり、かつ陽性の定量化をもたらす。
【００１２】
上記及び本発明の実施形態の多くの他の特徴及び付随する利点は、下記の実施形態への参照により、付随の図と共に考慮されると、明らかとなりより理解されるだろう。
本願明細書は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
フローサイトメーターのプローブパネルを設計する方法であって、
第１チャネルで測定されるように意図される第１標識の発光によって生じる、第２チャネルへの漏れ込み効果を定量化するひずみ係数を決定することと、
前記第１標識及び第１プローブを含む、第１プローブ−標識の組み合わせの予測最大信号を入力することと、
前記ひずみ係数及び前記第１プローブ−標識の組み合わせの前記予測最大信号に基づいて、前記第２チャネルにおける検出限界の増加を計算することと、
前記計算した検出限界の増加に基づいて、前記プローブパネルに含まれるプローブ−標識の組み合わせを選択することと、を含む、方法。
（項目２）
前記ひずみ係数が、前記第１プローブ−標識の組み合わせの発光強度の関数としての前記第２チャネルにおける検出限界の増加の推定値である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ひずみ係数が、前記第１プローブ−標識の組み合わせの前記発光強度の線形関数である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記第２チャネルにおける検出限界の前記増加が、前記第１プローブ−標識の組み合わせの前記発光強度の関数として、測定誤差の増加によって生じる、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記ひずみ係数が、クロストーク指数を使用して計算される、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記ひずみ係数が、前記第１プローブ−標識の組み合わせ及び第２プローブ−標識の組み合わせに対応する抗原の共発現パターンを示す係数によって数学的に修正され、前記第２プローブ−標識の組み合わせが前記第２チャネルにおいて測定されるように意図される、項目１に記載の方法。
（項目７）
第１候補プローブパネル内の各標識のひずみ係数を決定して、前記第２チャネルにおける検出限界の総増加を計算することを更に含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記プローブ−標識の組み合わせを選択することが、前記計算した検出限界の総増加と、前記第２チャネルにおける予測最低信号との比較に基づいている、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記第１候補プローブパネル内の各プローブの検出限界の総増加を計算することを更に含む、項目７に記載の方法。
（項目１０）
第２候補プローブパネル内の各プローブの検出限界の総増加を計算することと、
前記第１候補プローブパネル内の各プローブの前記計算した検出限界の総増加と、前記第２候補プローブパネル内の各プローブの前記計算した検出限界の総増加との比較に基づいて、前記プローブパネルを選択することと、を更に含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
第２候補プローブパネル内の各プローブの検出限界の総増加を計算することと、
前記第１候補プローブパネル及び前記第２候補プローブパネル内の優先プローブの前記計算した検出限界の総増加に基づいて、前記プローブパネルを選択することと、を更に含む、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記第１チャネル及び前記第２チャネルが隣接したチャネルである、項目１に記載の方法。
（項目１３）
フローサイトメーターのプローブパネルを設計する方法であって、
第１プローブ及び第２プローブを特定することと、
前記第１プローブの予測最小信号を特定することと、
前記第２プローブに関連付けられた候補標識に基づいて、前記第１プローブの第１検出限界を決定することと、
前記第２プローブに関連付けられた異なる候補標識に基づいて、前記第１プローブの第２検出限界を決定することと、
前記第１検出限界、前記第２検出限界、及び前記第１プローブの前記予測最小信号に基づいて、前記プローブパネルの前記第２プローブに関連付ける標識を選択することと、を含む、方法。
（項目１４）
前記第１検出限界を決定することが、前記第２プローブに関連付けられた前記候補標識の測定を意図する検出チャネルにおける予測最大信号をひずみ係数に掛けることを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記第１検出限界を決定することが、抗原の共発現パターンを示す係数を前記ひずみ係数に掛けることを更に含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記係数が、１又は０のいずれかである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記予測最大信号が、標的細胞における予測抗原密度に部分的に基づいている、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記予測最大信号が、前記第２プローブに関連付けられた前記候補標識に更に基づいている、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記予測最大信号が、抗原の共発現パターンに部分的に基づいている、項目１４に記載の方法。
（項目２０）
前記第１プローブが第１チャネルで検出されるように意図され、前記第１プローブの前記第１検出限界を決定することが、前記第１チャネル以外の前記フローサイトメーターの各チャネルの予測最大信号をひずみ係数に掛けることを含む、項目１４に記載の方法。
（項目２１）
前記第１プローブの前記第１検出限界を決定することが、ＣＶ増加の線形重畳モデルに基づいている、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記ひずみ係数が、色補正によって生じるＣＶ増加の測定値である、項目１４に記載の方法。
（項目２３）
フローサイトメーターのプローブパネルを設計する方法であって、
第１プローブ、第２プローブ、及び第３プローブを特定することと、
複数の可能なプローブパネルを特定することであって、各可能なプローブパネルが、前記第１プローブ、前記第２プローブ、又は前記第３プローブの組み合わせを含み、各プローブが関連付けられ得る標識を有することと、
前記第２プローブ及びその関連付けられた可能な標識の組み合わせのスペクトル漏れ込み効果に基づいて、前記第１プローブの前記検出限界を決定することによって、可能な第１プローブパネルを評価することと、
前記第３プローブ及びその関連付けられた可能な標識の組み合わせのスペクトル漏れ込み効果に基づいて、前記第２プローブの前記検出限界を決定することによって、可能な第２プローブパネルを評価することと、
決定した前記検出限界に基づいて、前記複数の可能なプローブパネルから前記プローブパネルを選択することと、を含む、方法。
（項目２４）
前記第１プローブ、前記第２プローブ、及び前記第３プローブのうちの少なくとも１つが、抗原と特異的に結合する、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記第１プローブ、前記第２プローブ、及び前記第３プローブのうちの少なくとも１つが、検体と特異的に結合する、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記可能な第１プローブパネルを評価することが、前記第１プローブ及び前記第２プローブに関連付けられた抗原の共発現パターンに部分的に基づいて、前記第１プローブの前記検出限界を決定することを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
抗原の前記共発現パターンが、特定の細胞種類の抗原間の共発現関係を更に含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記第１プローブ及び前記第２プローブに関連付けられた抗原の前記共発現パターンが相互に排他的である場合、前記第２プローブ及びその関連付けられた標識の組み合わせのスペクトル漏れ込み効果が０と決定される、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記第２プローブに関連付けられた前記抗原が前記第１プローブに関連付けられた前記抗原の子孫である場合、前記第２プローブ及びその関連付けられた標識の組み合わせのスペクトル漏れ込み効果が０と決定される、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
前記第２プローブ及びその関連付けられた標識の組み合わせのスペクトル漏れ込み効果が、ひずみ係数及び抗原の共発現パターンの関数として定量化される、項目２３に記載の方法。
（項目３１）
前記第２プローブ及びその関連付けられた標識の組み合わせのスペクトル漏れ込み効果が、標的細胞における予測抗原密度の関数として定量化される、項目２３に記載の方法。
（項目３２）
前記選択されたプローブパネル内のプローブペアの予測信号の集団分布のグラフィカル表示を表示することを更に含む、項目２３に記載の方法。
（項目３３）
前記集団分布の前記グラフィカル表示を表示することが、前記第１プローブ及び前記第２プローブの前記決定した検出限界を表示することを含む、項目３２に記載の方法。
【００１３】
本開示の実施形態によるシステム及び方法の態様は、下記の説明及び図面によって説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】いくつかの実施形態による、フローサイトメトリーシステム及び方法の態様を示す。
【図１Ａ】いくつかの実施形態による、３個のレーザーと、１０個の色フィルターブロック構成と、を有するフローサイトメトリー装置の例示のハードウェア図を示す。
【図１Ｂ】いくつかの実施形態による、プローブパネル選択法の態様を示す。
【図１Ｃ】いくつかの実施形態による、フローサイトメトリープローブに関する情報を含むデータベース内で抗体−色素結合体セットと称してよい、抗体−色素結合体の発現の態様を示す。
【図１Ｄ】いくつかの実施形態による、ユーザによって選択されて、対応のプローブに関連付けられた情報を戻す、抗原固有の抗体に関するデータベースクエリの態様を示す。
【図１Ｅ】いくつかの実施形態による、本発明の実施形態による、パネル評価法の態様を示す。
【図１Ｆ】いくつかの実施形態による、本発明の実施形態による、パネル評価法の態様を示す。
【図１Ｇ】いくつかの実施形態による、本発明の実施形態による、パネル評価法の態様を示す。
【図１Ｈ】いくつかの実施形態による、本発明の実施形態による、パネル評価法の態様を示す。
【図１Ｉ】いくつかの実施形態による、本発明の実施形態による、パネル評価法の態様を示す。
【図１Ｊ】いくつかの実施形態による、本発明の実施形態による、パネル評価法の態様を示す。
【図１Ｋ】いくつかの実施形態による、本発明の実施形態による、パネル評価法の態様を示す。
【図１Ｌ】いくつかの実施形態による、本発明の実施形態による、パネル評価法の態様を示す。
【図１Ｍ】いくつかの実施形態による、本発明の実施形態による、パネル評価法の態様を示す。
【図１Ｎ】いくつかの実施形態による、所与のＣＤを所与の色素に関連付ける、３個の結合体に関する関連性及び計算の例を示す。
【図１Ｏ】いくつかの実施形態による、所与のＣＤを所与の色素に関連付ける、３個の結合体に関する関連性及び計算の例を示す。
【図１Ｐ】いくつかの実施形態による、本発明の実施形態による、パネル評価法の更なる態様を示す。
【図１Ｑ】いくつかの実施形態による、本発明の実施形態による、パネル評価法の更なる態様を示す。
【図１Ｒ】いくつかの実施形態による、本発明の実施形態による、パネル評価法の更なる態様を示す。
【図１Ｓ】いくつかの実施形態による、本発明の実施形態による、パネル評価法の更なる態様を示す。
【図１Ｔ】いくつかの実施形態による、本発明の実施形態による、パネル評価法の更なる態様を示す。
【図１Ｕ】いくつかの実施形態による、本発明の実施形態による、パネル評価法の更なる態様を示す。
【図１Ｖ】いくつかの実施形態による、例示の１０色プローブパネルに関する結果の表示の態様を示す。
【図１Ｗ】いくつかの実施形態による、例示の１０色プローブパネルに関する結果の表示の態様を示す。
【図２】いくつかの実施形態による、オペレータの選択手順の態様を示す。
【図２Ａ】いくつかの実施形態による、標的表現型、表現型の排除、及び親／子孫スキームに関する操作選択機能をそれぞれ示す。
【図２Ｂ】いくつかの実施形態による、標的表現型、表現型の排除、及び親／子孫スキームに関する操作選択機能をそれぞれ示す。
【図２Ｃ】いくつかの実施形態による、標的表現型、表現型の排除、及び親／子孫スキームに関する操作選択機能をそれぞれ示す。
【図２Ｄ】いくつかの実施形態による、抗原密度パラメータに関する操作選択機能を示す。
【図３】いくつかの実施形態による、プローブパネル選択法の態様を示す。
【図４】いくつかの実施形態による、アイソタイプ信号伝達及び分解能感度の特定の態様を示す。
【図５】いくつかの実施形態による、発現イベントの変異係数と標準偏差との比較を示す。
【図６Ａ】いくつかの実施形態による、陰性信号イベントを判定するための２峰性分布の態様を示す。
【図６Ｂ】いくつかの実施形態による、陰性信号イベントを判定するための２峰性分布の態様を示す。
【図７】いくつかの実施形態による、信号イベントが広範に分布する態様を示す。
【図８】いくつかの実施形態による、単一の抗体−色素結合体を使用した染色手順からの実データ結果の態様を示す。
【図９】いくつかの実施形態による、補正係数と無関係であり得る、又はこれに応じて調整され得る検出限界の態様を示す。
【図１０】いくつかの実施形態による、特定色素に関する例示の漏れ込みパターンのひずみマトリックスの態様を示す。
【図１１】いくつかの実施形態による、共発現マトリックスの態様を示す。
【図１２Ａ】いくつかの実施形態による、推定染色パターンの概略図を示す。
【図１２Ｂ】いくつかの実施形態による、推定染色パターンの概略図を示す。
【図１２Ｃ】いくつかの実施形態による、推定染色パターンの概略図を示す。
【図１２Ｄ】いくつかの実施形態による、推定染色パターンの概略図を示す。
【図１２Ｅ】いくつかの実施形態による、推定染色パターンの概略図を示す。
【図１２Ｆ】いくつかの実施形態による、推定染色パターンの概略図を示す。
【図１２Ｇ】いくつかの実施形態による、推定染色パターンの概略図を示す。
【図１２Ｈ】いくつかの実施形態による、推定染色パターンの概略図を示す。
【図１２Ｉ】いくつかの実施形態による、推定染色パターンの概略図を示す。
【図１３】いくつかの実施形態による、発現パターンの分類を含む、プローブパネル評価の態様を図示する。
【図１３−１】いくつかの実施形態による、発現パターンの分類を含む、プローブパネル評価の態様を図示する。
【図１４】いくつかの実施形態による、相対的なフルオロフォアの寄与度を含む、プローブパネル評価の態様を示す。
【図１４−１】いくつかの実施形態による、相対的なフルオロフォアの寄与度を含む、プローブパネル評価の態様を示す。
【図１５】いくつかの実施形態による、相対的な色素の発現輝度を含む、プローブパネル評価の態様を示す。
【図１６Ａ】いくつかの実施形態による、プローブパネルシステムの例示のスキームを示す。
【図１６Ｂ】いくつかの実施形態による、プローブパネルに関するユーザ入力モジュールの態様を示す。
【図１６Ｃ】いくつかの実施形態による、プローブパネルに関するユーザ入力モジュールの態様を示す。
【図１６Ｄ】いくつかの実施形態による、表形式の発現関係に関するシミュレータグラフィックモジュールの態様を示す。
【図１６Ｅ】いくつかの実施形態による、表形式の発現関係に関するシミュレータグラフィックモジュールの態様を示す。
【図１６Ｆ】いくつかの実施形態による、予測結果プロファイルに関するシミュレータグラフィックモジュールの態様を示す。
【図１６Ｇ】いくつかの実施形態による、予測結果プロファイルに関するシミュレータグラフィックモジュールの態様を示す。
【図１６Ｈ】いくつかの実施形態による、ひずみ計算に関するシミュレータ数値モジュールの態様を示す。
【図１６Ｉ】いくつかの実施形態による、ひずみ計算に関するシミュレータ数値モジュールの態様を示す。
【図１６Ｊ】いくつかの実施形態による、ひずみ計算に関するシミュレータ数値モジュールの態様を示す。
【図１６Ｋ】いくつかの実施形態による、漏れ込みパターンモジュールの態様を示す。
【図１６Ｌ】いくつかの実施形態による、漏れ込みパターンモジュールの態様を示す。
【図１６Ｍ】いくつかの実施形態による、抗体データベースモジュールの態様を示す。
【図１６Ｎ】いくつかの実施形態による、抗体データベースモジュールの態様を示す。
【図１６Ｏ】いくつかの実施形態による、抗体データベースモジュールの態様を示す。
【図１７】いくつかの実施形態による、多変量解析の検出レーダーグラフィックを含む、漏れ込みパターンをモデル化する数値的アプローチの態様を示す。
【図１８Ａ】いくつかの実施形態による、多変量解析の検出レーダーグラフィックを含む、漏れ込みパターンをモデル化する数値的アプローチの更なる態様を示す。
【図１８Ｂ】いくつかの実施形態による、多変量解析の検出レーダーグラフィックを含む、漏れ込みパターンをモデル化する数値的アプローチの更なる態様を示す。
【図１９Ａ】いくつかの実施形態による、多変量解析の検出レーダーグラフィックを含む、漏れ込みパターンをモデル化する数値的アプローチの更なる態様を示す。
【図１９Ｂ】いくつかの実施形態による、多変量解析の検出レーダーグラフィックを含む、漏れ込みパターンをモデル化する数値的アプローチの更なる態様を示す。
【図２０Ａ】いくつかの実施形態による、プローブパネルの設計及びシミュレーションを行うためのコンピュータ制御の（ｃｏｍｐｕｔｅｒｚｉｅｄ）インターフェースの態様を示す。
【図２０Ｂ】いくつかの実施形態による、プローブパネルの設計及びシミュレーションを行うためのコンピュータ制御の（ｃｏｍｐｕｔｅｒｚｉｅｄ）インターフェースの態様を示す。
【図２０Ｃ】いくつかの実施形態による、プローブパネルの設計及びシミュレーションを行うためのコンピュータ制御の（ｃｏｍｐｕｔｅｒｚｉｅｄ）インターフェースの態様を示す。
【図２０Ｄ】いくつかの実施形態による、プローブパネルの設計及びシミュレーションを行うためのコンピュータ制御の（ｃｏｍｐｕｔｅｒｚｉｅｄ）インターフェースの態様を示す。
【図２０Ｅ】いくつかの実施形態による、プローブパネルの設計及びシミュレーションを行うためのコンピュータ制御の（ｃｏｍｐｕｔｅｒｚｉｅｄ）インターフェースの態様を示す。
【図２０Ｆ】いくつかの実施形態による、プローブパネルの設計及びシミュレーションを行うためのコンピュータ制御の（ｃｏｍｐｕｔｅｒｚｉｅｄ）インターフェースの態様を示す。
【図２０Ｇ】いくつかの実施形態による、プローブパネルの設計及びシミュレーションを行うためのコンピュータ制御の（ｃｏｍｐｕｔｅｒｚｉｅｄ）インターフェースの態様を示す。
【図２１Ａ】いくつかの実施形態による、プローブパネルの設計及びシミュレーションを行うためのコンピュータ制御のインターフェースの更なる態様を示す。
【図２１Ｂ】いくつかの実施形態による、プローブパネルの設計及びシミュレーションを行うためのコンピュータ制御のインターフェースの更なる態様を示す。
【図２２Ａ】いくつかの実施形態による、態様を図示する。
【図２２Ｂ】いくつかの実施形態による、態様を図示する。
【図２３】いくつかの実施形態による、プローブパネルの設計及びシミュレーションを行うためのコンピュータ制御のインターフェースの態様を示す。
【図２４】いくつかの実施形態による、プローブパネルの設計及びシミュレーションを行うためのコンピュータ制御のインターフェースの態様を示す。
【図２５】いくつかの実施形態による、プローブパネルの設計及びシミュレーションを行うためのコンピュータ制御のインターフェースの態様を示す。
【図２６】いくつかの実施形態による、プローブパネルの設計及びシミュレーションを行うためのコンピュータ制御のインターフェースの態様を示す。
【図２７】実施形態による、ＰＭＴの検出を目的としない２つの色素の信号強度によって生じた、ＰＭＴチャネルにおけるひずみをモデル化する三次元グラフを示す。
【図２８】いくつかの実施形態による、例示のひずみ表を示す。
【図２９】いくつかの実施形態による、該当するデータに対してゲーティングを行うフローサイトメトリー機器から収集したイベントデータをプロットする、実データの態様を示す。
【図２９Ａ】いくつかの実施形態による、該当するデータに対してゲーティングを行うフローサイトメトリー機器から収集したイベントデータをプロットする、実データの態様を示す。
【図２９Ｂ】いくつかの実施形態による、該当するデータに対してゲーティングを行うフローサイトメトリー機器から収集したイベントデータをプロットする、実データの態様を示す。
【図２９Ｃ】いくつかの実施形態による、該当するデータに対してゲーティングを行うフローサイトメトリー機器から収集したイベントデータをプロットする、実データの態様を示す。
【図２９Ｄ】いくつかの実施形態による、該当するデータに対してゲーティングを行うフローサイトメトリー機器から収集したイベントデータをプロットする、実データの態様を示す。
【図２９Ｅ】いくつかの実施形態による、該当するデータに対してゲーティングを行うフローサイトメトリー機器から収集したイベントデータをプロットする、実データの態様を示す。
【図３０】いくつかの実施形態による、データに対してゲーティングを行わないフローサイトメトリー機器から収集したイベントデータをプロットする、実データの態様を示す。
【図３０Ａ】いくつかの実施形態による、データに対してゲーティングを行わないフローサイトメトリー機器から収集したイベントデータをプロットする、実データの態様を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
フローサイトメトリーは、多くの場合、粒子試料を蛍光色素で標識し、次いで、様々な波長に対して特異的な様々な蛍光検出器を使用して、試料の個々の粒子のプロパティを評価することを含む。このようにして、粒子試料に関する量的データ及び質的データを入手できる。例えば、血球上の異なる細胞表面受容体を異なる蛍光色素で標識でき、フローサイトメーターは別個の蛍光チャネルを使用して、生じた放射光を検出できる。例示の実施形態では、試料の複数のパラメータを同時に取得するために、多数の蛍光色素及び多数の蛍光検出器と共に多数の励起光波長を使用できる。特定の実施形態では、多数の蛍光色素及び多数の蛍光検出器の複合利用により生じたひずみ係数を定量化できる。
【００１６】
本明細書で使用するとき、用語「イベント」は、光線を通過するときの粒子又は粒子を示すデータ若しくはサインを指し得る。イベントは、多数の検出器を使用して評価でき、各検出器は、対応する強度又は信号パラメータを提供できる。関連して、各検出器は、フローサイトメーターの対応するチャネルに関連付けることができる。例えば、個々の検出器からの測定値は、パラメータ（例えば、測定された前方散乱、側方散乱、又は蛍光）と称されてよく、粒子について各パラメータで収集されたデータはイベントと称されてよい。
【００１７】
場合によっては、測定したパラメータは、検出器チャネルの特定の閾値に達しないことがある。したがって、イベントとして登録されないことがある。この意味では、光線とサイトメーターを流れる粒子との相互作用は、粒子イベントを生じさせても、生じさせなくてもよい。所望により、かかる閾値を使用して、雑音、細胞残屑などによって生じた信号を減少させるか、排除できる。
【００１８】
本発明の実施形態は、フローサイトメーター用途で使用する光電子増倍管内の蛍光信号の検出限界を決定することを含む、システム及び方法を包含する。場合によっては、検出限界は、標的細胞（抗体−蛍光色素結合体で標識され得る）の予測発現パターン、発現パターンによって構成される抗原の蛍光標識から生じる個々の蛍光標識の予測蛍光信号強度、及び異なる光電子増倍管内の蛍光色素の予測漏れ込みマトリックスに基づいて決定され得る。
【００１９】
いくつかの実施形態によると、（光電子増倍管の前にあるバンドパスフィルターによって決定された）所与の波長検出範囲に特異的なデータ拡散を包含する追加入力が存在してよい。これは、後者が対応の光電子増倍管の感度を決定できるためであり、したがって、測定誤差（データ拡散）を決定できる。漏れ込みと結果として生じるデータ拡散との関係は、実験に基づいて評価できる。
【００２０】
例示の実施形態では、サイトメトリー装置ユーザが、蛍光色素結合体の検出限界の予測値を含む、フローサイトメーター実験の構築に使用できる所望の蛍光色素と抗体との組み合わせ（例えば、プローブパネル）を選択できる（これは、パネルシミュレーションとも称され得る）。更に、サイトメトリー装置ユーザは、このプローブパネル内の所望の単一プローブに対して最小検出限界を有するプローブパネルの提案を得るために、蛍光標識を各抗体にそれぞれ割り当てることなく、抗体の組み合わせを選択してよい。場合によっては、パネル評価又は設計法は、正規分布の測定誤差の漏れ込みによる増加の線形重畳モデルを使用することを含み得る。
【００２１】
本明細書に開示のプローブパネル評価及び設計法は、漏れ込み（あるいは、オーバースピル／オーバースピリング、スピリング、又はクロストークとも称され得る）の計算に使用する単一色素での基準蛍光色素測定値からのデータを使用できる。場合によっては、ひずみ係数は、以下の式で特徴付けられ得る。
【００２２】
【数１】
0006437522.tif 000002
【００２３】
換言すれば、ひずみ係数の決定によって、少なくとも第２チャネルへの（プローブ−標識結合体の一部である）第１標識の漏れ込み効果を定量化でき、第１標識は、第１チャネル（例えば、ＰＭＴ検出器）において測定するように意図されるか、構成され、第２チャネル（又は他の追加チャネル）は、異なる標識を測定するように意図され、構成される。いくつかの態様では、ひずみ係数は、第１プローブ−標識の組み合わせの発光強度の関数としての第２チャネルにおける検出限界の増加の推定値であり得る。他の態様では、ひずみ係数は、第１プローブ−標識の組み合わせの発光強度の線形関数であり得る。更なる態様では、ひずみ係数は、クロストーク指数を使用して計算できる。いくつかの態様では、ひずみ係数は、第１プローブ−標識の組み合わせ及び第２プローブ−標識の組み合わせに対応する抗原の共発現パターンを示す係数によって数学的に修正され、第２プローブ−標識の組み合わせは、第２チャネルにおいて測定するように意図されるか、構成される。更なる態様では、第１候補のプローブパネル内の各標識のひずみ係数を決定して、第２チャネルにおける検出限界の総増加を計算できる。
【００２４】
場合によっては、プローブパネル評価又は設計法は、異なる標的細胞での抗原の予測発現パターン（排除など）、分集団（例えば、図１Ｄに示す親−子孫）、非排他的な共発現、又は予測抗原発現特性（離散又は調節など）を使用することを含んでよい。場合によっては、プローブパネル評価又は設計法は、個々の検出チャネルについて、所望により、様々な異なる細胞種類又は抗原発現パターンについて、検出限界を予測すること、推定すること、そうでなければ決定することを含み得る。
【００２５】
抗原の説明において本明細書で使用されるとき、系図的用語「親」、「子」、「姉妹」、「おば」、及び「いとこ」は、特異抗原の表面抗原分類（「ＣＤ」）又は対応する抗体間の関係を識別し、説明するために使用される。しかしながら、本開示の文脈においては、これらの用語は細胞再生の世代を指すのではなく、所与の細胞の発生工程を指す。これは、所与の細胞表面にある抗原が特異性又は分化により変化するためである。例えば、ＣＤ４５などの抗原は天然Ｔ細胞に存在してよく、天然Ｔ細胞が分化してキラーＴ細胞になる場合、ＣＤ４５抗原は前駆体の役割を果たし、ＣＤ２（子）抗原となってよい。一方、天然Ｔ細胞が分化してヘルパーＴ細胞になる場合、ＣＤ４５抗原は前駆体としての役割を果たし、ＣＤ４（子）抗原になってよい。かかる状況において、ＣＤ４５抗原は、両姉妹ＣＤ２及びＣＤ４抗原の親抗原と称され得る。
【００２６】
抗原間で生じ得る発生関係は、概して以下のように説明される。ある細胞では、それぞれがその典型的な平均密度及び発現の範囲を有する、２つの異なる抗原が同一細胞表面に発生して、「共発現」と呼ばれる状況をもたらすことがある。細胞表面における抗原の存在が、同一細胞表面における別の特異抗原の存在を排除して、「排除」と呼ばれる状況をもたらすことがある。同一の「親」を有する抗原は、「姉妹」と呼ばれる。一部の細胞では、第２抗原も発現することがある細胞表面に第１抗原が生じることがあり、第２抗原は、第１抗原が存在しない細胞表面でも生じることがある。かかる場合には、第２抗原は「親」抗原と呼ばれ、第１抗原は「子孫」又は「子」抗原と呼ばれ、「親−子孫」又は「親−子」と呼ばれる状況をもたらす。所与の抗原の「親」の「姉妹」は、その抗原の「おば」と呼ばれる。特異抗原について検討するとき、その非排除「子孫」、その子、これらの更なる子（つまり「孫」）、更に下位の抗原、その「親」、これらの更なる「親」（つまり、「祖父母」）、並びにすべての更に上位の抗原、及びその非排除「おば」は、特異抗原の発生系図（つまり、発生ツリー）と呼ばれ得る。単一タンパク質では、異なる発生世代に属し、異なる平均密度、範囲、及びこの抗原の発現分布特性を有する可能性のある、異なる細胞種類で発現することが生じ得る。この多発現抗原の多細胞エンティティは、「多胎児」と呼ばれ得る。更に、２個の共発現抗原は発現の逆相関密度を有して、「逆相関」と呼ばれる状況をもたらしてよい。
【００２７】
任意の所与の抗原に対して発生系図を作製するための一連のガイドラインは、以下の規則を含み得る。（１）各抗原には、少なくとも１つの「親」が割り当てられる必要がある。「親」が不明の場合には、「親」として「不明」が割り当てられる。（２）存在する場合、各抗原について、「排除」、「姉妹」との「相関」又は「逆相関」が識別される必要がある。態様では、姉妹の検討順序は、アルファベット順に先行する名前を有する抗原に基づき得る。（３）存在する場合、おばが対応の抗原の親によって排除されなければ、各抗原について、「排除」、「おば」との「相関」又は「逆相関」が識別される必要がある。（４）「多胎児」は、個々の抗原系図の一貫性を維持するために、多数の異なる抗原として処理する必要がある。これは、異なる「親」、排除された、又は逆相関された「姉妹」及び「おば」を割り当てることによって行われる。（５）相関抗原は同一排除及び逆相関を共有するが、必ずしも同一多胎児を有さない。この一連の規則により、特定種及び身体区分に関する、発生系図一式を作製し、全抗原間ですべての可能な関係を構築できる。
【００２８】
いくつかの実施形態によると、検出限界を使用して、抗原発現パターン（抗原発現密度及び蛍光色素輝度を含み得る）に基づいて、所望により実験データとみ合わせて、蛍光色素−抗体パネルの順位付け、比較、ないしは別の方法での評価を実行できる。いくつかの態様では、検出限界の決定に関連する計算は、第１プローブ及び第１標識の特性に基づいて、第１プローブ−標識の組み合わせの予測最大信号に関する情報を入力すること、又は受信することを含み得る。第１プローブ−標識の組み合わせからの信号が少なくとも第２検出チャネル（すなわち、第１プローブ−標識結合体を特異的に検出するように構成されていないチャネル）への漏れ込みをもたらし得る機器又はシステムでは、ひずみ係数（ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ  ｆａｃｔ）及び第１プローブ−標識の組み合わせの予測最大信号に基づいて第２チャネルの検出限界の増加を計算できる。したがって、プローブ−標識の組み合わせは、検出限界の計算された増加に基づいてプローブパネルを含むように選択できる。更なる態様では、少なくとも第２チャネルにおける検出限界の増加は、第１プローブ（ｐｒｏｂｌｅ）−標識の組み合わせの発光強度の関数として、測定誤差の増加によって生じ得る。
【００２９】
本明細書に開示の例示のプローブパネルシステム及び方法は、複雑な漏れ込みパターンを有する、様々な結合体（例えば、蛍光色素標識抗体、パネル−標識の組み合わせなど）の組み合わせの評価での使用に非常に適している。かかるシステム及び方法は、検出チャネルの使用、及び発現パターン固有の典型的な信号強度の決定、及び典型的な信号強度に関連する検出限界の増加を含み得る。したがって、システム及び方法は、発現密度、蛍光色素強度、共発現パターン、及びひずみ係数など特定パラメータに基づいて動作してよい。場合によっては、プローブパネルの評価は、典型的な信号強度及び検出限界の増加に対して最大差を決定することを含んでよい。場合によっては、プローブパネルの評価は、１つ以上の特定の抗体−色素結合体について、典型的な信号強度対検出限界の比率を決定することを含んでよい。例示のプローブパネル評価システム及び方法は、共発現パターンの検討及び実験結果のシミュレーションに基づき得る。プローブ−標識の組み合わせの選択は、更に、計算した検出限界の総増加と、少なくとも第２チャネルにおける、予測最小増加との比較に基づくことができる。更に、全チャネルの検出限界の総増加は、１つ以上の候補プローブパネル内の各プローブに対して計算できる。いくつかの態様では、様々な結合体の組み合わせを評価するためのシステム及び方法は、第２候補プローブパネル内の各プローブに対して検出限界の総増加を計算することと、第１候補プローブパネル内の各プローブに対して計算した検出限界の総増加と、第２候補プローブパネル内の各プローブに対して計算した検出限界の総増加と、を比較することと、を含み得る。他の態様では、かかる方法又はシステムは、第２候補プローブパネル内の各プローブの検出限界の総増加を計算することと、第１候補プローブパネル及び第２候補プローブパネル内の優先プローブに対して計算された検出限界の総増加に基づいてプローブパネルを選択することと、を含み得る。他の態様では、第１チャネル及び第２チャネルは隣接したチャネルであり得る。
【００３０】
更に、いくつかの実施形態では、フローサイトメーター用プローブパネルの設計方法は、第１プローブ及び第２プローブを特定することと、第１プローブの予測最小信号を特定することと、第２プローブに関連付けられた候補標識に基づいて第１プローブの第１検出限界を決定することと、第２プローブに関連付けられた、異なる候補標識に基づいて第１プローブの第２検出限界を決定することと、第１検出限界、第２検出限界、及び第１プローブの予測最小信号に基づいて、プローブパネルの第２プローブに関連付けられる標識を選択することと、を含み得る。態様では、第１検出限界を決定することは、第２プローブに関連付けられる候補標識の測定を意図する、検出チャネルにおける予測最大信号をひずみ係数に掛けることを含み得る。他の態様では、第１検出限界を決定することは、抗原の共発現パターンを示す係数（場合によっては、この係数は、１又は０である）をひずみ係数に掛けることを含み得る。更なる態様では、予測最大信号は、標的細胞での予測抗原密度、第２プローブに関連付けられる候補標識、及び抗原の共発現パターンのいずれか又はすべてに部分的に基づき得る。かかる方法又はシステムのいくつかの実施形態は、第１チャネルでの検出を意図する第１プローブを含み、第１プローブの第１検出限界を決定することは、第１チャネル以外のフローサイトメーターの各チャネルの予測最大信号をひずみ係数に掛けることを含む。かかる態様では、第１プローブの第１検出限界を決定することは、ＣＶ増加の線形重畳モデルに基づく。いくつかの態様では、ひずみ係数は、色補正によって生じたＣＶ増加の測定値であり得る。
【００３１】
いくつかの実施形態では、フローサイトメーター用プローブパネルの設計方法は、第１プローブ、第２プローブ、及び第３プローブを特定することと、複数の可能なプローブパネルを特定することであって、各可能なプローブパネルは、第１プローブ、第２プローブ、又は第３プローブの組み合わせを含み、各プローブは関連付けられる可能な標識を有することと、第２プローブ及びその関連付けられる、可能な標識の組み合わせのスペクトラム漏れ込み効果に基づいて、第１プローブの検出限界を決定することにより、可能な第１プローブパネルを評価することと、第３プローブ及びそれに関連付けられる、可能な標識の組み合わせのスペクトラム漏れ込み効果に基づいて、第２プローブの検出限界を決定することにより、可能な第２プローブパネルを評価することと、決定した検出限界に基づいて、複数の可能なプローブパネルからプローブパネルを選択することと、を含み得る。かかる態様では、第１プローブ、第２プローブ、及び第３プローブのうちの少なくとも１つは、ある抗原に特異的に結合し得る。類似の態様では、第１プローブ、第２プローブ、及び第３プローブのうちの少なくとも１つは、ある検体に特異的に結合し得る。更なる態様では、可能な第１プローブパネルを評価することは、第１プローブ及び第２プローブに関連付けられた抗原の共発現パターンに部分的に基づいて、第１プローブの検出限界を決定することを含む。いくつかの態様では、抗原の共発現パターンは、特定の細胞種類の抗原間の共発現関係に関する情報を含み得る。態様では、第１プローブ及び第２プローブに関連付けられた抗原の共発現パターンが、プローブは相互に排他的であることを示す場合、第２プローブ及びその関連付けられた標識の組み合わせのスペクトル漏れ込み効果は、ゼロと決定できる。更なる態様では、第２プローブに関連付けられた抗原が、第１プローブに関連付けられた抗原の子孫である場合、第２プローブ及びその関連付けられた標識の組み合わせのスペクトル漏れ込み効果は、ゼロと決定できる。態様では、第２プローブ及びその関連付けられた標識の組み合わせのスペクトル漏れ込み効果は、ひずみ係数及び抗原の共発現パターンの関数として定量化できる。結合的に（Ｃｏｎｊｕｎｔｉｖｅｌｙ）、あるいは、第２プローブ及びその関連付けられた標識の組み合わせのスペクトル漏れ込み効果は、標的細胞における予測抗原密度の関数として定量化できる。いくつかの態様では、かかる方法又はシステムは、選択したプローブパネル内のプローブペアの予測信号の母集団分布のグラフィカル表示を表示することを含み得、母集団分布のグラフィカル表示を表示することは、第１プローブ及び第２プローブの決定した検出限界を表示することを含み得る。
【００３２】
本明細書に開示のプローブパネル法は、Ｎａｖｉｏｓ（商標）及びＧａｌｌｉｏｓ（商標）フローサイトメトリーシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）など様々な自動化装置での使用に非常に適している。場合によっては、ひずみ計算は、フィルターセット及び／若しくは光検出器（例えば、ＰＭＴ）の特異的なプロパティ又は性能特性に基づき得る。更に、プローブパネル法は、所望により、色素又は抗体−色素結合体の特定ライブラリ又はリポジトリ内で使用可能である色素のスペクトルプロパティに基づき得る。
【００３３】
場合によっては、プローブパネルの評価又はシミュレーションは、特定の抗原発現プロファイル又はパターンに基づき得る。かかるプロファイル又はパターンは、特定の細胞種類に関連付けられても、関連付けられなくてもよい。実施時には、ユーザは、計画された実験において選択された標的発現パターンであってよい、特定の発現パターンに従って抗体−色素結合体を選択してよい。場合によっては、フローサイトメーターなど機器は、マルチカラー（例えば、１０色）を許容するように構成されてよく、ユーザは、より少ない数のプローブを選択することを希望することがある。したがって、ユーザは、第１数のプローブを明示的に割り当て、一方では、第２数のプローブをダミー変数として残し、プローブの合計数がフローサイトメーター内の色チャネルの数に等しくなるようにしてよい。場合によっては、異なる色素（例えば、ＰＣ５及びＰＣ５．５）が同一チャネルで検出されてよく、したがって、同時適用を含まなくてよい。
【００３４】
本明細書の他の箇所に記載するように、ユーザがプローブパネルの特定のパラメータを選択するか、入力すると、システムは、抗体データベースモジュールから品番又は他の識別表示部を取得するか、更新するように動作できる。例えば、所望の結合体（すなわち、プローブ）がライブラリに含まれていない場合、顧客設計サービス（ｃｕｓｔｏｍｅｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｓｅｒｖｉｃｅ）（ＣＤＳ）プローブとして品番（ＰＮ）を示すことができる。場合によっては、システム及び方法は、標的抗原の発現密度に基づいて予測され得る、対応の蛍光色素プロパティ及び信号強度（例えば、推定）に基づいたプローブパネルの評価を含み、かかるパラメータは、抗体データベースモジュールから取得され得るか、読み込まれ得る。場合によっては、抗体データベースモジュールは、結合された蛍光色素と共にプローブ特異性の抗原密度に基づき得る、プローブ信号強度など、プローブパネルの評価に使用する様々なパラメータに関するデータを含んでよい。結合体強度データは推定値に基づき得るか、例えば、製造品質管理プロセスの一環として得ることができる、実験データに基づいてよい。
【００３５】
本開示の更なる実施形態は、マルチカラーフローサイトメトリーにおいて陽性を評価するためのシステム及び方法を包含する。例示の特異性又はゲーティング制御法を使用して、例えば、疾患マーカーなど特定のタンパク質の発現について血球が陽性であるか、陰性であるかを判定するために、個々の粒子サインを評価できる。場合によっては、これらの制御法を使用して、データの収集元である細胞を分類するために、収集データに対してゲート又はグラフィカル領域を位置付けることができる。例示の制御法は、補正後のマルチカラー手順で使用できる。場合によっては、本明細書に開示の方法は、現在使用している方法には存在しない水準の標準化をもたらす。更に、本明細書に開示の制御法は、時間的効率に優れ、経済的であり、多様な発現パターンに対して有効であり、かつ陽性の定量化をもたらす。
【００３６】
場合によっては、異なる蛍光色素から測定された発光スペクトルは重なり合ってよく、検出器によって得られる信号の補正に役立つ。例えば、蛍光補正法は、蛍光色素Ａが（蛍光色素Ｂを特異的に測定するように割り当てられた）チャネルＢで有する干渉の程度を決定するためにデータ分析中に適用できる。その結果、チャネルＢにおける全体的な測定蛍光を取得し、蛍光色素Ａの寄与度を引いて、チャネルＢにおける蛍光色素Ｂの蛍光を決定できる。いくつかの実施形態によると、チャネルＢにおける全体的な測定蛍光を取得し、蛍光色素Ａの寄与度を排除して、チャネルＢにおける蛍光色素Ｂの蛍光を決定できる。これは、マトリックスに基づいた補正法（デジタル補正を含む）を使用して実現してよい。
【００３７】
イベントデータは、様々な方法で視覚的に示すことができる。例えば、ヒストグラムを使用して、単一測定パラメータ（例えば、蛍光）を水平方向のＸ軸に、イベント数（例えば、細胞数）を垂直方向のＹ軸に表示できる。この方法では、特定の特性を有する試料中の細胞数を決定することが可能である。例えば、グラフ左側の低ピーク部は、弱蛍光を有する細胞の小群（陰性集団内のイベント）を示してよく、グラフ右側の高ピーク部は、強蛍光を有する細胞の大群（陽性集団内のイベント）を示してよい。
【００３８】
本明細書で使用するとき、「ゲート」は、陽性集団と陰性集団とを識別する境界として使用できる。同様に、ゲートは、イベントの部分母集団を定める境界として使用できる。ゲートは、例えば、ドットプロット又はヒストグラムなどデータプロット上のイベントのサブセットの周囲に境界を表示することにより設定できる。ゲートは、境界内に含まれるイベントを選択するように包括的であっても、境界の範囲外のイベントを選択するように排他的であってもよい。したがって、（境界の特定の側にある）陽性イベントの数は、物理的特徴又は対象マーカーを示す細胞の数を指すことができる。本発明のいくつかの実施形態によると、ゲーティングを使用して、非蛍光体に対応する信号から蛍光体に対応する信号を区別できる。いくつかの実施形態によると、光電子増倍管（ＰＭＴ）で検出される任意のイベントは、蛍光信号を発してよい。したがって、発光した蛍光は、特定の標識に関連付けることができる。
【００３９】
血液学分野では、診断及び臨床目的で、特定のゲーティング手順を使用できる。例えば、フローサイトメトリーデータでゲートを使用して、死細胞及び細胞残屑など不要な粒子からの結果を排除しつつ、白血球など特定の対象細胞を選択的に視覚化できる。状況によっては、陽性又は陰性のいずれかとしてイベントを効果的に分類するようにゲートを配置する場所を決定することは困難であり得る。適切な対照を使用することにより、陽性集団と陰性集団との差異の特定を容易にすることができる。本発明の実施形態は、血液学分野を含むが、これに限定されることなく、概してマルチカラーサイトメトリー法と併用できる。場合によっては、本発明の実施形態は、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｎｕｓｍ  Ｏｎｅ（ＦＭＯ）対照が有用であるか、必要である任意の測定に適用できる。
【００４０】
本開示の実施形態は、漏れ込みによる測定誤差の増加によって特徴付けられる、マルチカラーフローサイトメトリーにおける自動陽性分析を実行するためのシステム及び方法を提供する。実施形態は、蛍光色素漏れ込みの線形重畳モデルに基づいた個別イベントの発現パターンに従って測定誤差を計算する方法を更に包含し、重畳計算によってすべての他の検出チャネルへの蛍光色素の漏れ込み率を決定できるように、検出された粒子での抗原発現パターンを考慮しつつ、マルチカラーフローサイトメトリーの予測限界を決定するために同一又は類似の方法を使用して、パネル設計及びシミュレーション用途にも適用される。
【００４１】
関連して、本発明の実施形態は、収集した試料結果に伴う補正誤差を最小化できるように、フローサイトメトリー用の収集後補正法を包含する。例えば、補正値を固定して、マルチカラーチャネル実験で標準的な補正法を使用すると、ゲーティング境界において実験結果の過剰補正又は補正不足のいずれかが生じやすくなり得る。本発明の実施形態は、適切に補正されたデータの使用を包含するか、かかる過剰補正又は補正不足を回避する。
【００４２】
場合によっては、本明細書に開示の自動補正法は、フローサイトメトリー装置において補正結果を改善するように動作して、データ収集後の特定の陽性結果の特定を改善できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のシステム及び方法は、すべての他のチャネルで検出されたすべての他の色素からの漏れ込みの重畳モデルに基づいて、２つの結果区画の間の修正済み検出限界若しくは修正済み境界、又は各蛍光信号チャネル（例えば、光電子増倍管）の特異陽性と特異陰性との間の修正済み限界を計算するように動作できる。特異陽性と特異陰性との間にかかる修正済み限界を使用すると、結果セットの手動ゲーティングを行わずに自動的に続行でき、２つの結果区画間の境界領域にある曖昧な結果が観察されて、適切な区画に一義的に割り当てられる。
【００４３】
概要
ここで図面を参照すると、図１は、いくつかの実施形態による、フローサイトメトリーシステム及び方法の態様を示す。フローサイトメトリー装置の構成１００は、通常、特定の蛍光信号検出器アセンブリパラメータ１１０と、レーザー励起波長パラメータ１２０と、を含む。
【００４４】
フローサイトメトリー装置は、様々なレーザー励起パラメータのいずれかを用いて構成され得る。例えば、レーザーアセンブリは、３５５ｎｍ（紫外線）、４０５ｎｍ（紫色）、４８８ｎｍ（青色）、５３２ｎｍ（緑色）、５６１ｎｍ（黄色）、６３３ｎｍ（赤色）、６３８ｎｍ（赤色）などにおいて励起スペクトルを生成するように構成され得る。関連して、レーザーアセンブリは、任意の数のレーザー励起装置を含み得る。例えば、デュアルレーザーアセンブリは、４８８ｎｍにおいて励起エネルギーを送達する第１レーザーと、６３８ｎｍにおいて励起エネルギーを送達する第２レーザーと、を含んでよい。
【００４５】
図１に示すように、レーザー励起エネルギーは、抗体−色素結合体プローブの色素に作用できる。通常、特定の色素は、固有波長において励起され、続いて、固有発光スペクトルを蛍光発光する（ｆｌｏｕｒｅｓｃｅ）。１つ又はいくつかの最大蛍光発光値が存在してよい。発光スペクトルは、広範な波長にわたり得る。例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は、４８８ｎｍの光で励起され、５２０ｎｍ程度の最大蛍光発光値を生じさせる、蛍光色素である。少なくとも１つの波長において、例えば、ＰＣ５及びＰＣ５．５は、２つの波長４８８ｎｍ及び６３８ｎｍによって励起され、これによって漏れ込みパターンに複雑性が加わる。
【００４６】
信号検出器アセンブリ１１０は、様々な組み合わせのフィルター及び検出器を含み得る。この図に示すように、検出器アセンブリは、ＦＩＴＣ色素発光を検出するように指定される光電子増倍管装置ＰＭＴ１で使用する５２５／４０バンドパスフィルターを含んでよい。かかる構成は、特定の蛍光色素に関して所望の検出パラメータを提供するように設計できる。示すように、更なる構成は、ＰＥ色素発光を検出するように指定される光電子増倍管装置ＰＭＴ２で使用する５７５／３０バンドパスフィルターと、ＥＣＤ色素発光を検出するように指定される光電子増倍管装置ＰＭＴ３で使用する６２０／３０バンドパスフィルターと、ＰＣ５色素発光を検出するように指定される光電子増倍管装置ＰＭＴ４で使用する６７５／２０バンドパスフィルターと、ＰＥ−Ｃｙ７色素発光を検出するように指定される光電子増倍管装置ＰＭＴ５で使用する６９５／３０バンドパスフィルターと、ＡＰＣ色素発光を検出するように指定される光電子増倍管装置ＰＭＴ６で使用する６６０／２０バンドパスフィルターと、を含み得る。個々の検出器（例えば、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ４）は、発光スペクトルグラフ１３０で示されるように、対応の一次色素（例えば、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰＣ５）からの光波長を検出するように指定できる。バンドパスフィルターを使用して、特定量の放射光がそこを通過し、光電子増倍管（ＰＭＴ）に向かって進むようにできる。関連付けられたバンドパスフィルターを備える特定のＰＭＴは、特定の光波長によって励起された結合体の発光の検出専用（ｄｉｄｉｃａｔｅｄ  ｔｏ）であってよい。
【００４７】
３個のレーザー及び１０個の色フィルターブロック構成を有する、フローサイトメトリー装置の例示のハードウェアの図を図１Ａに示す。この図に示すように、フローサイトメトリー装置は、様々なバンドパス（ＢＰ）フィルター、並びにダイクロイック（ＤＣ）ショートパス（ＳＰ）及びロングパス（ＬＰ）フィルターを含み得る。
【００４８】
もう一度図１を参照すると、例示の方法が特定の動作を実行するユーザ又はオペレータを含んでよいことが分かる。例えば、ユーザ動作１４０は、工程１４２に示すように、フローサイトメトリー装置の構成を決定すること又は選択することと、工程１４４に示すように、対象の抗原発現パターンを決定すること又は選択することと、を含んでよい。装置構成を選択する工程に関しては、かかる選択はドロップダウン（データベース）ボタンを使用して、様々なプリセットのハードウェア構成（例えば、図１Ａに示すハードウェア構成など）から選択できる。
【００４９】
いくつかの実施形態によると、一連の様々なハードウェア構成及び一連の対象の抗原発現パターンは、ウェブベースバージョンに組み入れられてよい。いくつかの実施形態によると、システム及び方法は、ユーザが特定パターンに割り当てたよりも多くの、発現パターンに含まれるプローブパネルからの抗原が存在する可能性がある場合に表示をもたらすことができるデータベース手段を含んでよい。そのような場合、これは、結果として、これらのプローブの検出限界に対する影響を含むより多くの抗原が存在することをユーザに指摘できる。
【００５０】
いくつかの実施形態によると、ハードウェア構成は、様々なレーザーアセンブリ、フィルターセット、及び検出チャネルの組み合わせのいずれかを示してよい。例えば、ある特定のハードウェア構成は、様々な波長を発する１個以上のレーザーを含んでよい。場合によっては、ハードウェア構成は、６個の検出チャネルと、２種類のレーザー色（例えば、４８８ｎｍ及び６３８ｎｍ）と、を含んでよい。場合によっては、ハードウェア構成は、８個の検出チャネルと、２種類のレーザー色（例えば、４８８ｎｍ及び６３８ｎｍ）と、を含んでよい。場合によっては、ハードウェア構成は、１０個の検出チャネルと、３種類のレーザー色（例えば、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ及び６３８ｎｍ）と、を含んでよい。場合によっては、ハードウェア構成は、１０個の検出チャネルと、４種類のレーザー色（例えば、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、及び６３８ｎｍ）を含んでよい。
【００５１】
例示の細胞モニタリング手順は、特定の細胞表面又は内部抗原の相対定量の有無について個々の細胞を評価することを含む。図１に示すように、ある発生段階にある、又は特定の病態にある特定細胞は、細胞の表面又は細胞の内部における特定抗原（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２６、ＣＤ３、ＣＤ１５、ＣＤ５９、ＣＤ７１）の存在によって特徴付けられる、独特の抗原発現パターン１５０を示してよい。したがって、それぞれ励起時に特異的な発光スペクトルを生じさせる、かかる抗原に特異的なプローブ（例えば、ＣＤ２８に特異的な結合体、ＣＤ２６に特異的な結合体）を含む抗体−色素結合体パネルを使用して生体試料を分析し、この試料がかかる抗原を発現する細胞を含む程度及び発現細胞における抗原発現の相対定量を測定できる。このようにして、プローブパネルを使用して、患者の生理学的状態を評価又はモニターできる。図１Ｂ〜１Ｈは、ユーザ入力の処理、データベースエントリの応答及び後続の計算、並びに表示の解釈に関して更なる詳細を提供する。
【００５２】
図１Ｂは、実施形態による、プローブパネル選択法の態様を示す。この図に示すように、ユーザは、対象の特定抗原発現パターン（例えば、ＣＤ５７、ＣＤ４５、及び他の細胞マーカー）に対応する一連の抗体を入力できる。場合によっては、選択した抗体は、対応の既定の色素に割り当てられるか、関連付けられてよい。いくつかの実施形態によると、ユーザは、各特異性に既定の色素を割り当ててよい。いくつかの実施形態によると、ユーザは、特異性のみを入力し、ソフトウェアに最適な抗体−色素の割り当てを提案させる機会を有してよい。一連のプローブパネルは、特定チャネル及び関連色素の使用が意図されない、「ダミー」チャネルを更に含み得る。このダミーの指定及びパネル設計は、「サイレント」チャネル及び陰性対照として使用できる。本明細書で使用するとき、「サイレント」チャネルは、他のチャネルへの信号の漏れ込みを生じさせない検出器チャネルを示し、ひずみ表の一部として見るときは、「クリーン列」と称し得る。同様に、本明細書で使用するとき、「不変」チャネルは、チャネルが検出するように構成されていない色素から信号の漏れ込みを全く受信しない検出器チャネルを示し、ひずみ表の一部として見るときは、「クリーン行」と称し得る。
【００５３】
図１Ｂに示すように、検出チャネルＦＬ４でＣＤ３３抗原の検出用色素としてＰＣ５．５を使用することは、検出チャネルＦＬ４でのＰＣ５の使用又はＰＣ５を検出しようとすることによって複雑化する。したがって、ＰＣ５は、このプローブパネルでダミーとして割り当てられる。図１Ｂは、ユーザが特異抗原に特定検出チャネル内の所望の色素を割り当てることができることを更に示す。具体的には、示した例では、ＣＤ５７に結合されたＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ色素は、４０５ｎｍの光によって励起されＰＭＴ検出チャネルＦＬ９で検出される。この文脈では、ＦＬ９は、励起されたＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ色素の検出（したがって、ＣＤ５７の検出）用の１次チャネルであり、したがって、ＦＬ１〜８及びＦＬ１０は、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ色素からの不要な漏れ込み蛍光信号（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ  ｓｉｇｎａｌ）を検出する、２次チャネルである。
【００５４】
図１Ｃに示すように、抗体−色素結合体セットと称してよい、プローブパネルは、プローブに関する情報を含むデータベースと関連付けることができる。例えば、データベースは、パネル内の各プローブの蛍光強度に関する情報を含んでよい。いくつかの実施形態では、用語「パネル」はまた、一連の又は一群のいくつかの結合体の組み合わせを指してよい。示すように（及び、以下の図８に関して更に詳述するように）、データベースは、結合体セット（パネルとも称する）に関する情報を提供でき、この情報を使用して、グラフに示すように１０＾０を超えるディケード内の集団イベントによって示され（図１Ｃの区画（Ａ）として識別される）るように、強陽性集団の典型的な平均蛍光強度を計算できる。このデータベースを使用すると、弱陽性集団の最小蛍光強度も計算できる。離散抗原の発現特性評価においては、ＣＤ４−ＰＥグラフに示すように、陽性集団及び陰性集団は明らかに分離しており、弱陽性集団の最小蛍光強度（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）は１に等しい。しかし、ＣＤ１８４−ＰＥ対ＣＤ５７−ＰａｃＢグラフに見られるように、調節抗原の発現特性評価では、陽性細胞間での抗原密度が様々であり、最小蛍光強度は０ディケード内（すなわち、１０＾０未満）であると考えられるため、陽性集団及び陰性集団は明確に分離していない。更に、このデータベースを使用すると、図１Ｃの（Ｂ）として識別されるように、生じるすべての漏れ込み寄与度の複合効果から生じた、各結合体に関する結合体の検出限界の増加（及び対応する感度の減少）をディケード単位で計算できる。いくつかの態様では、ある結合体の別の結合体に対するひずみ係数は、比率（Ｂ）／（Ａ）で特徴付けられ得る。
【００５５】
関連して、図１Ｄに示すように、入力１６０と称し得る、ユーザが選択した一連の抗原特異的な抗体に基づいて、対応のプローブに関連付けられた情報についてデータベース１６２にクエリできる。本明細書の他の箇所に記載するように、図１Ｄに関して記載する計算１６４は、例えば図８に示す方法に関して参照用に使用できる。結合体のユーザ入力１６０に関するデータベースクエリ１６２としては、例えば、（Ｃ）各結合体のＰＥ−結合体（又は他の基準色素）の強度（１０＾０を超えるディケード）、（Ｄ）各結合体のＰＥに対する蛍光色素輝度（ＰＥ（又は他の基準色素）は１、つまり１００％に等しい）、（Ｅ）各蛍光色素の使用に関して、１ディケードの１次チャネルの信号強度ごとに２次チャネルによって生じる検出限界の典型的な増加（すなわち、ひずみ係数）、（Ｆ）離散又は調節のいずれかとして評価される、各抗原の典型的な発現特性、（Ｇ）すべての他の抗原及び各単一抗原の典型的な抗原の共発現パターン、すなわち、対象の共発現（「１」は共発現のコードであり、「０」は共発現の不在又は排除のコードである）、及び（Ｈ）すべての他の抗原及び各単一抗原の典型的な親−子孫抗原の共発現パターン（ｐａｔｔｅｒｓ）（「０」は子孫プロパティのコードであり、「１」は子孫プロパティの不在のコードである）が挙げられる。
【００５６】
図１Ｄに示すように、データベースの出力１６６は、その用途の分野によって異なる。具体的には、推定される対象の細胞種類は、免疫学的モニタリングと血球疾患では異なる。したがって、典型的な共発現パターン及びそれに関連する典型的な発現特性は、対象の細胞種類に応じて異なる。検索クエリによりデータベースから取得したデータに基づいた計算１６４は、以下の出力をもたらすことができる。強陽性集団（したがって、離散プロットに関する）の各結合体について１０＾０を超える典型的な平均蛍光強度である（Ｉ）の値は、以下のように計算できる。
（Ｉ）＝ｌｏｇ（（（１０＾（Ｃ）−１０＾０＊（Ｄ））＋１０＾０）
式中、１０＾の加算及び減算は、プロットスケーリングにおける一貫性をもたらす。発現特性に基づいた、弱陽性集団（したがって、調節プロットに関する）の各結合体の典型的な蛍光強度（ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｓｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）である（Ｊ）の値は、上記の式（Ｉ）に類似するが、（Ｃ）の値が１０＾０を超えるディケードに設定される。
【００５７】
１次チャネルでの単一結合体の漏れ込みによる２次検出チャネルでの検出限界（ＤＬ）の増加である（Ｋ）の値は、以下のように決定できる。
（Ｋ）＝（Ｉ）＊ＤＦ＊（Ｇ）＊（Ｈ）
式中、（Ｋ）の値は、１次チャネルで検出された各単一結合体について計算され、例えば、１０色パネル内の２次チャネルについて、９個の（Ｋ）の値が計算され得る。更に、対応の１次チャネルで検出された全結合体（ｃｏｎｕｇａｔｅｓ）による複合的な漏れ込みによる２次検出チャネルでのＤＬの全体的な増加の値（Ｌ）は、以下のように計算できる。
（Ｌ）＝ｌｏｇ（（１０＾（Ｋ１）−１０＾０）＋ｌｏｇ（（１０＾（Ｋ２）−１０＾０）＋ｌｏｇ（（１０＾（Ｋｎ）−１０＾０）
ここにおいても、式中、１０＾の加算及び減算は、プロットスケーリングにおける一貫性をもたらす。値（Ｌ）は、各２次チャネルに対して計算できる。かかる計算１６４の結果は、その後、表示及び更なる処理のいずれか又はこれら両方の出力１６６となり得る。
【００５８】
図１Ｅは、実施形態によるパネル評価の態様を示す。この図に示すグラフィック表示グラフは、特定のパネル設計の分析又は順位付けにおいて有用であり得る。この図に示すように、ＰＥフルオロフォア色素と結合された、ＣＤ４５抗原に特異的な抗体を有する特定のプローブ又は染色が提供される。ＰＥ色素は、４８８ｎｍのレーザーによって励起され得、ＦＬ２チャネルで検出されるスペクトル（例えば、約５７５ｎｍにおいて）を発することができる。ＣＤ４５抗原は、通常、白血球細胞で強力に発現し、ＰＥは鮮明なフルオロフォアである。したがって、ＣＤ４５−ＰＥプローブをヒト起源の検査室試料に適用するとき、強い信号強度を観察することが可能である。この図に示すように、結果はフルスケールの強度である。破線（最小分離、正方形のデータ記号）及び点線（最大分離、３角形のデータ点記号）は一致し、離散発現を示す。つまり、陽性集団及び陰性集団は、明確に分離される。
【００５９】
図１Ｆは、ＣＤ２５−ＥＣＤプローブの追加を示す。ＥＣＤ色素はまた、４８８ｎｍのレーザーによって励起され得、ＦＬ３チャネルで検出されるスペクトル（例えば、約６２５ｎｍにおいて）を発することができる。この図に示すように、ＣＤ２５は調節抗原である。つまり、破線（最小分離）と点線（最大分離）との間にずれが存在する。細胞の活性状態に応じて、細胞は、ＣＤ２５の陰性発現までＣＤ２５の高発現を有し得る。ここでは、破線（最小分離）は、第１ディケードと第２ディケードとの間の限界と一致する。これは、所望の検出限界に対応し、それによって超低発現（弱信号）の細胞及び高発現（強信号）の細胞を検出できる。この図に示すように、高発現の細胞（最大分離、点線）は、低発現の細胞（最小分離、破線）よりも約０．７５ディケード高い。最小（破線）と最大（点線）との差異（Ａ）は、この実施形態によるＣＤ２５の発現範囲を示す。このデータは、ＥＣＤ色素自体に関連付けられたパラメータも考慮できることに留意されたい。図１Ｆの下パネルのバブルプロットは、ＰＥ色素からの発光スペクトルがＥＣＤ検出チャネル（ＦＬ３）に漏れ込んでおり、ｙ軸に（ディケード単位で）投影されたときの円心位置に従って、検出限界の推定増加を生じさせることを示す。
【００６０】
本明細書の他の箇所に記載するように、かかるプロットは、異なるレーザー構成（例えば、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、及び６３８ｎｍ）に対応する異なる線を含み得る。第１ディケードと第２ディケードとの間の閾値を使用して、特定の信号データを評価できる。場合によっては、特定の共発現パターン又は細胞種類に対して、特定のバックグラウンドを推定してよい。例えば、Ｔ細胞は、Ｂ細胞に比較して特定のパターンを有してよい。したがって、ユーザは、シミュレーションプロットで表示したい表現型（及び対応する共発現パターン）を選択してよい。場合によっては、所与の発現パターンについて、ある特定の細胞種類の検出限界は、例えば、所与の発現パターンの有無及び定量的特性に応じて、別の特定の細胞種類の検出限界と異なってよい。
【００６１】
図１Ｆに示すように、検出限界は、破線（正方形のデータ点記号）で示され得る。発現特性が離散の場合、陰性集団又は陽性集団のいずれかが存在してよいが、その間には何もない。つまり、その特定の集団には、様々な程度の抗原密度を有する細胞は存在しない。したがって、破線及び点線は、（５７５ｎｍ付近におけるＣＤ４５−ＰＥのように）一致する。その点において、最高発現密度は最低発現密度と等しい。それに対して、調節発現では、抗原は、特定の細胞種類で超低発現密度において、そして超高発現密度までにおいて見出され得る。この図に示すように、調節発現は、点線で示され得る。例えば、特定のＣＤ３＋細胞種類では、ＣＤ４は、存在する（ＣＤ４＋、ＣＤ８−）か、不在である（ＣＤ４−、ＣＤ８＋）か、のいずれかであってよい。これは強力な陽性を示し、離散発現特性に相当する。本明細書の他の箇所に記載するように、プローブパネル評価は、特定の表現型に（例えば、Ｔ細胞又は単球などデフォルトの表現型を想定することにより）基づくこともできる。したがって、ユーザは、異なる細胞種類及び発現パターンに従ってプローブパネル特性を評価でき、発現パターンが特定抗原の検出限界に影響を与える程度を判定できる。
【００６２】
ＣＤ２５プローブがＥＣＤ標識を有する図１Ｆとは対照的に、図１Ｇは、より強い蛍光色素ＰＣ５．５を有するＣＤ２５プローブからの結果を示す。図１Ｇの所望の検出限界は、図１Ｆに示すものと同じである。しかしながら、信号強度の力学に関して、実施形態が想定する点線（最大）と破線（最小）との間の範囲（Ａ）は、図１Ｇにおいてはるかに高い。この図に示すように、範囲は、約１ディケードである。図１Ｇの下パネルのバブルドットは、ＰＥ色素からの発光スペクトルがＰＣ５．５検出チャネル（ＦＬ４）に漏れ込んでいることを示す。
【００６３】
図１Ｈでは、ＣＤ２５−ＥＣＤプローブが再導入される。したがって、ＣＤ２５−ＥＣＤ標識に予測され得る最高発現（信号強度）をＣＤ２５−ＰＣ５．５標識に予測され得る最高発現密度と比較することができる。対数スケールをもう一度想定すると、後者は、相当に大きい。
【００６４】
バックグラウンド（実線）について検討することも有用である。例えば、図１Ｈに示すように、特定レベルのバックグラウンドＢＧは、リンパ球発現により、ＣＤ４５−ＰＥ標識で標識される、高レベルのＣＤ４５が生じ得る。この図に示すように、ＥＣＤチャネルでのＰＥからのバックグラウンドＢＧ信号は、ＥＣＤチャネルでのＥＣＤからの信号よりも高い。したがって、情報の著しい損失が存在し、かかるパネル設計は好ましくないことがある。
【００６５】
図１Ｉでは、ＣＤ２５−ＰＣ５．５プローブが除外され、ＣＤ２５−ＰＣ７プローブが加えられる。ＰＥ及びＰＣ７からＦＬ３チャネルへの漏れ込みが存在する。図１Ｊでは、ＣＤ４５−ＰＥプローブが除外され、ＰＣ７からＦＬ３チャネルへの漏れ込みが存在する。図１Ｊに示すように、実線（バックグラウンド、ＢＧ）が、第１対数ディケードと第２対数ディケードとの間の閾値と一致するか、これに近づくときに好ましい結果がもたらされる。この図に示すように、ＥＣＤチャネルへの漏れ込みによって生じる圧倒的な量のバックグラウンドは存在しない。むしろ、ＣＤ４５−ＰＣ７プローブの発光からＥＣＤ  ＦＬ３検出チャネルへの少量の漏れ込みが存在する。したがって、バックグラウンド（ＢＧ）と最高発現密度（最大値、点線）との間には乖離が存在する。したがって、検出スキームは、超低レベルのＣＤ２５発現を有する細胞のみを失う。
【００６６】
図１Ｋは、図１ＪのＣＤ２５−ＥＣＤプローブをＣＤ２５−ＰＥプローブに置き換えて示す。ＰＥ蛍光色素は、ＥＣＤ蛍光色素よりも強力である。図１Ｋに示すように、ＰＥ検出チャネルＦＬ２のＣＤ４５−ＰＣ７プローブによってもたらされる同様のバックグラウンドＢＧが存在する。しかしながら、バックグラウンドと最大値との間の距離は、図１Ｊと比較して、図１Ｋの方が大きい。これは、ＣＤ２５プローブのＰＥ蛍光色素がより強力なためである。
【００６７】
図１Ｌでは、ＣＤ２５−ＥＣＤプローブが再びパネルに含まれる。この図では、バックグラウンド（実線）と最大（点線）信号との間の距離は、ＣＤ２５−ＥＣＤよりもＣＤ２５−ＰＥの方が大きいことが分かる。したがって、全体的な感度はより高い。この結果は、ＣＤ２５プローブで使用される蛍光色素の強度（例えば、ＰＥ強度＞ＥＣＤ強度）及びその細胞でも発現する、他の抗原（例えば、ＣＤ４５）から生じた漏れ込みパターンを考慮する。蛍光色素強度及び共発現漏れ込みパターンの両方が感度に寄与し得る。
【００６８】
図１Ｍでは、ＣＤ４５抗体は、ＡＰＣ−ＡＦ７５０フルオロフォアと結合し、漏れ込みが存在しないように見え得る。この図では、実線（ＢＧ）が第１ディケードと第２ディケードとの間の閾値と一致し、したがって、バックグラウンドは追加されていない。この図では、十分な感度が存在する。したがって、ＣＤ２５について低発現密度を有する細胞が存在する場合であっても信号を検出できる。本明細書の他の箇所に記載するように、パネルにプローブが更に加えられると、より複雑な結果が観察される。かかる結果は、様々な寄与度（例えば、フルオロフォア強度）を考慮でき、共発現パターンは漏れ込みに関係している。
【００６９】
図１Ｎ及び図１Ｏは、所与のＣＤを所与の色素に関連付けることができる、３個の結合体の例を提供する。図１Ｎに示すように、各ＣＤ−色素結合体は、１０＾０ディケードを超えるＰＥ結合のＭＦＩを有する（ＰＥは基準色素である）。示すように、ＣＤ−Ｘは０．５のＭＦＩを有し、ＣＤ−Ｙは１のＭＦＩを有し、ＣＤ−Ｚは２．５のＭＦＩを有する。いくつかの実施形態では、親子孫マトリックスは対称であり得る。いくつかの実施形態では、親子孫マトリックスは非対称であり得る。この図に示すように、共発現マトリックスは対称であり得る。ただし、他の態様では、共発現マトリックスは非対称であり得る。更に、図１Ｏに示すように、ＣＤ−色素結合体の各色素は、ＰＥと比較した相対強度を有する。Ａ色素は０．２の強度を有し、Ｂ色素は０．４５の強度を有し、Ｃ色素は０．８５の強度を有する。所与のＣＤ−色素結合体のこれらの値により、図１Ｏに示すひずみ係数表の計算が可能になり、一部では、Ｂ色素は、Ａ色素の検出に関するＰＭＴ  ＦＬ１に影響を与える０．２５のひずみ値を有し、Ｃ色素の検出に関するＰＭＴ  ＦＬ３に影響を与える０．７５のひずみ値を有する。それに対して、Ｃ色素は、ＰＭＴ  ＦＬ１にひずみの影響を及ぼさない。同様に、Ａ色素は、Ｃ色素の検出に関するＰＭＴ  ＦＬ３にひずみの影響を及ぼさない。更にそれに対して、Ｂ色素の検出に関するＰＭＴ  ＦＬ２において、Ａ色素は０．６５のひずみ値を有し、Ｃ色素は０．１のひずみ値を有する。図１Ｏに示す計算は、図１Ｄで与えられた式を適用したものであり、図１Ｎ及び１Ｏで与えられた関連値を使用する。
【００７０】
共発現パターンが特定の親／子孫スキーム又は排除スキームを有する場合、計算された漏れ込みは、全体的なひずみに追加されないことがある。例えば、図１Ｐは、単染色（ＣＤ２５−ＰＥプローブ）に関する計算結果を示す。図１Ｑに示すように、第２染色（ＣＤ４５−ＦＩＴＣ）がパネルに加えられると、ＦＩＴＣ色素発光によってＰＥ  ＦＬ２検出チャネルへの漏れ込みが生じることが見える。ＦＩＴＣの漏れ込みに対応するバブルプロット上の円は、Ｙ軸上の特定の切片と、特定の直径を有する。この図に示すように、ＣＤ４５−ＦＩＴＣプローブは、ＰＥ  ＦＬ２チャネルでの感度を２分の１ディケード除去する。例えば、図１Ｑにおけるバックグラウンドと最大値との距離は、図１Ｐに示される距離の約２分の１である。
【００７１】
図１Ｒでは、図１ＱのＣＤ４５−ＦＩＴＣプローブをＣＤ１５−ＦＩＴＣプローブで置き換える。ＣＤ１５抗原はより低く発現し、したがってＦＩＴＣ検出チャネルにおける信号は、図１Ｑと比較して、図１Ｒの方が低い。例えば、最大値（点線）は、第３ディケードと第４ディケードとの間にないことが分かる。しかしながら、（例えば、データベースのデフォルト設定によると）ＣＤ４５はＣＤ２５と共発現するが、一方では、ＣＤ１５はＣＤ２５と共発現しない。したがって、ＣＤ１５−ＦＩＴＣプローブのＦＬ２  ＰＥチャネルへの漏れ込みによって生じる実効ひずみは存在しない。関連して、ＰＥチャネルにおけるバックグラウンドへの追加は存在しない。換言すると、漏れ込みはいまだに存在するが、候補ＣＤ２５発現の分析に関しては、ＣＤ１５陰性細胞に影響を及ぼさない。この例のＣＤ１５＋細胞は、ＣＤ２５を発現しない。したがって、細胞の生態に基づいて、ＣＤ２５発現は、ＣＤ１５＋細胞では分析されない。したがって、これらの２種類の異なる抗原は、異なるゲートを使用して評価できる。
【００７２】
共発現スキームの別の実例では、図１Ｓは、ＣＤ３−ＦＩＴＣプローブ及びＣＤ４５−ＥＣＤプローブの両方が、ＰＥ  ＦＬ２検出チャネルに対して漏れ込みスペクトル発光を生成している場合の結果を示す。全体的なひずみは、２分の１ディケードよりもやや多い。かかる結果は、Ｔ細胞で観察できる共発現パターンと一致してよい。ＦＬ１  ＦＩＴＣ検出チャネルへの少量の漏れ込みが存在することも分かる。バブルプロットは、寄与度の分解において有用である。例えば、ＦＬ２チャネルにおける漏れ込みに対応するＹ切片値を検討すると、ＣＤ４５−ＥＣＤによる漏れ込みはＣＤ３−ＦＩＴＣによる漏れ込みよりも大きいことが分かる。ＦＬ２チャネルにおける対応のバブル直径は、ＥＣＤが全体的なひずみにより大きく寄与していることを示す。
【００７３】
したがって、ＦＬ２チャネルにおける信号を改善する（例えば、感度を増加させる）には、（例えば、ＦＩＴＣによる漏れ込みを維持しつつ）ＦＬ２におけるＥＣＤによる漏れ込みを除去することがより望ましいことがある。図１Ｔは、図１ＳのＣＤ４５−ＥＣＤプローブをＣＤ４５−ＡＰＣプローブで置き換えた、かかる結果を示す。したがって、ＦＬ２  ＰＥチャネルにおいて検出限界が著しく改善する。つまり、バックグラウンド（実線）と最大（点線）との間により大きい距離が存在する。
【００７４】
図１Ｕでは、図１ＴのＣＤ３−ＦＩＴＣプローブ及びＣＤ４５−ＡＰＣプローブをそれぞれＣＤ３−ＡＰＣプローブ及びＣＤ４５−ＥＣＤプローブで置き換える。図１Ｕに示すように、ＦＬ２  ＰＥチャネルには、それでもなお２分の１ディケードの信号損失が存在する。
【００７５】
バブルプロットは、プローブ構成（例えば、抗原特異性、フルオロフォア）がどのように検出チャネルの検出限界に寄与できるかを有用に示す。
【００７６】
例示の１０色パネルプローブの結果の表示を図１Ｖに示す。区画Ａにおいて示すように、調節発現特性を有する抗原を検出する結合体を優先させるためには、推定平均蛍光強度（３角形）とＤＬの全体的な増加（円形）との距離が大きいことが望ましくてよく、同一の抗原セットに対する異なる結合体組み合わせの順位付けの基準（ｃｒｉｔｅｒｉｕｍ）として機能できる。区画Ｂにおいて示すように、強（３角形）及び弱（ボックス）平均蛍光強度に関する推定値は、典型的な抗原発現密度及び相対蛍光色素強度に基づくことができ（例えば、図１Ｄに示すように、＝（Ｉ）及び（Ｊ））、例えば、赤色レーザーに割り当てられた、対応の１次チャネルＦＬ８で検出されたＣＤｘｙ−ＡＰＣＡ７５０結合体の離散発現特性により、一致できる。区画Ｃにおいて示すように、赤色レーザーに割り当てられたＦＬ８に対してＤＬ＝（Ｌ）の全体的な増加が存在してよい。区画Ｄにおいて示すように、ＣＤｑｗ−ＥＣＤの調節発現特性により、典型的な弱陽性発現密度（３角形）は、１０＾０を超える０ディケードに設定できる。
【００７７】
例示の１０色パネルプローブの結果の別の表示を図１Ｗに示す。区間Ａにおいて示すように、このパネルのＰＥ結合体（凡例を参照）は、第３検出チャネルＦＬ３で（例えば、Ｙ軸上の切片を参照したとき）１０＾０を超える検出限界（ＤＬ）で０．６ディケードの増加をもたらし、バブル円の直径は、ＦＬ３での検出限界の全体的な増加に対するＰＥ結合体の寄与度に対応する。したがって、ＰＥ結合体がＦＬ３における検出限界の増加に最大の寄与度をもたらすことが分かる。区間Ｂにおいて示すように、このパネル内のＰＣ５／ＰＣ５．５結合体（凡例を参照）は、１０＾０を超えて０．２ディケードの低〜中程度の増加をもたらす。多くの場合、かかる増加は許容範囲である。区間Ｂはまた、バブル直径の大きさに基づいて、ＰＣ５／ＰＣ５．５結合体が、検出チャネル６でのＤＬの全体的な増加の主寄与要因として見なされ得ることを示す。
【００７８】
したがって、典型的な手順では、ユーザは、様々な検出器に関連付けられた特定フィルター（例えば、バンドパスフィルター）を含み得る特定のハードウェア構成を選択してよい。いくつかの実施形態では、かかる選択をできないようにして、特定のハードウェア構成が割り当てられてよいか、予め定められてよい。様々なハードウェア構成は、関連付けられたひずみ係数値を有してよい。場合によっては、ハードウェア構成又はひずみデータは、データベースから取得されてよい。例えば、データベースは、特定のバンドパス検出器構成（例えば、赤外線）のひずみ係数が他の検出器構成よりも大きいことを示すデータを含んでよい。したがって、感度及び／又は測定誤差は、ハードウェア構成に基づいて異なり得る。いくつかの実施形態では、データベースは、プリセットした数のハードウェア構成を含んでよく、ユーザはこれらから選択してよい。例えば、特定のハードウェア構成は、Ｎａｖｉｏｓ（商標）フローサイトメトリーシステム又はＧａｌｌｉｏｓ（商標）フローサイトメトリーシステム（いずれもＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから入手可能）に関連するデータを含んでよい。場合によっては、特定のハードウェア構成は、関連付けられたひずみ係数プロファイルを有する。ハードウェア構成に含まれるレーザーの数及び／又は検出チャネルの数は、特定のプローブパネルで使用される蛍光色素の数に対する影響を有し得る。場合によっては、バンドパスフィルターの特性は、ひずみ係数に影響を及ぼし得る。関連して、ＰＭＴ又はアバランシェフォトダイオードなど他の検出器の質は、ひずみ係数に影響を及ぼしてよい。
【００７９】
パネル設計及びシミュレーション用の抗体選択
図２は、オペレータが、抗体パネルの選択に使用する特定の抗体及び色素選択情報を入力する、オペレータ選択手順２００の態様を示す。例えば、工程２１０ａに示すように、オペレータは、所望により、工程２１０ｂに示すように、対応する色素（例えば、ＦＩＴＣ）と共に、抗原１（例えば、ＣＤ２８）に対して特異的な抗体を選択できる。更に、オペレータは、所望により、対応の色素と共に（例えば、工程２２０ｂ、２２０ｃ、２２０ｄ）、発現プロファイルの対応の抗原に対して特異的な更なる抗体を選択する（例えば、工程２２０ａ、２３０ａ、及び２４０ａ）。この図に示すように、抗原に特異的な抗体パラメータはデータベースのドロップダウンから選択でき、色素もまた、データベースのドロップダウンメニューから選択できる。場合によっては、色素選択プロセスは、オペレータによって色素が明示的に選択されないように構成され得る。それどころか、選択した抗体に関連付けられた色素は、データベースによって提供され得る。いくつかの実施形態によると、ユーザが抗体に色素を割り当てないと、システムは、対応の抗体で使用可能な全結合体を提供するデータベースからのプローブパネル全体に関する検討（感度など）に基づいて、未割り当ての全抗体について最適な色素を特定できる。システムによって選択された蛍光色素は、システムが必要な計算及び反復を実行するまで、すなわちシミュレーションデータの出力が生じるまで表示されなくてよい。
【００８０】
本明細書に開示のように、システム及び方法は、この図に示すドロップダウンデータベース及びユーザインターフェース機能を包含できる。したがって、ユーザは対象の抗原を指定でき、次に抗原の指定は、選択する抗体に影響を及ぼす。いくつかの実施形態によると、ユーザは、インターフェースで抗体を直接選択する。場合によっては、対象の抗原は、Ｔ細胞など特定の細胞種類に対応してよい。したがって、ユーザは、Ｔ細胞パネルに対応する抗体群を選択してよい。
【００８１】
図２に示すメニューは、ユーザに示され得る２つの列を含む。左列は抗体特異性に対応し、右列は色素の選択又は割り当てに対応する。プロセス中のこの段階では、ユーザは、特定の発現パターンを念頭に置いていることも、置いていないこともある。例えば、ユーザは、対象となり得る抗原のリストのみを有することがある。場合によっては、ユーザは、特定の抗原の選択時に感度のより高いことが望ましいかどうか、また、色素の選択時に、あるいは感度のより低いことが望ましいかどうかを知っていることがある。関連して、データベースは、多くの場合、特定抗原の発現密度に関するデータを含み、このデータは、システムによって色素が選択されるとき、又は割り当てられるときに考慮され得る。場合によっては、発現密度は、特定の細胞種類によって異なってよい。例えば、データベースは、特定マーカーがある細胞種類で最小限に発現し、一方、同じマーカーが別の細胞種類で高度に発現するという情報を含んでよい。ユーザが、選択した抗体に合わせて色素を選択しない場合、システムは、この抗体に対して色素を推奨するか、割り当てるときに細胞種類など他の特徴を考慮してよい。いくつかの実施形態によると、プロセス中のこの段階において、ユーザが色素を選択していない場合には、システムは、まだ色素を割り当てない。
【００８２】
通常、異なる色素は、通過光が吸収される程度、及び色素によって吸収された光が蛍光発光に変換される程度をそれぞれ示す、量子収率及び吸収係数によって定量化された異なる輝度を有する。多くの場合、吸収係数及び量子収率は互いに対応する。例えば、ＰＥ色素は、高吸収率及び量子収率を有すると見なされ、高い割合の吸収光が蛍光発光に変換される。それに対して、ＦＩＴＣは、より低い吸収係数及び量子収率を有し、より低い割合の吸収光が蛍光発光に変換される。その結果、一連の特定色素は、実現し得る感度を決定できる。したがって、ＰＥを使用すると、ＦＩＴＣを使用した場合と比較して（例えば、ＦＩＴＣ分子が、大型（＞２００ｋＤ）ＰＥ分子には実現できない小型（＜１ｋＤ）であるため、単一抗体分子がいくつかのＦＩＴＣ分子に共有結合できることを考慮しても）より高い感度を実現する能力をもたらすことができる。
【００８３】
場合によっては、ユーザは、システムデータベースによって示された、１つ以上のデフォルトの色素選択を受け入れることを選択してよい。所望により、ユーザは、デフォルトの選択を変更することを選択してよい。いくつかの実施形態によると、抗体に適した色素を選択するためにはすべてのユーザインターフェース入力によって提供されるあらゆる情報を必要とするため、プロセス中のこの段階では、システムは、抗体で使用するべき色素を推奨しなくてよい。関連して、システムデータベースは、典型的な／特定のＴ細胞抗原（例えば、ＣＤ３抗原）の特定の推定発現密度を含んでよい。特定の抗原特異性を選択するとき、システムは、特定の細胞種類上の抗原に典型的な特定の発現密度を読み出してよい。例えば、ＣＤ３抗原に対して特異的な抗体を選択する場合、データベースは、ＣＤ３抗原をＴ細胞に関連付ける関係情報を含んでよい。別の例としては、ユーザは、ＣＤ１６、ＣＤ３８などに対して特異的な抗体を選択してよい。一部の抗原は、様々な発現密度を有し、様々な種類の細胞に存在する。したがって、発現密度は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び単球の間で異なり得る。例えば、抗原特異性を選択するとき、データベースは、３つの異なる細胞種類に対して、３つの典型的な発現密度を有してよい。いくつかの実施形態では、必要に応じて、ユーザは、推定密度又はデフォルト密度を変更することを選択できる。
【００８４】
図２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃは、標的表現型、表現型の排除、及び親／子孫スキームに関する類似の操作選択機能をそれぞれ示す。図２Ｄは、抗原密度パラメータに関する操作選択機能を示す。
【００８５】
図２Ａに示すように、ユーザは、必要に応じて、データベースに含まれ得る一連の抗体に基づいて様々な表現型を定義する選択肢を有する。いくつかの実施形態では、定義した表現型に一致する典型的な抗原の共発現パターンに関する情報は、事前に選択した、又は事前に定義した典型的な抗原の共発現パターンとしてデータベースに含まれ得る。このデータベースは、発生頻度の高い抗原の共発現パターンに関するデフォルト情報を含み得る。これは、事前に定義した細胞表現型よりも特異性が低く、同一ゲートで生じない抗原の組み合わせを可能にする。一例として、Ｔ細胞は、サイトメトリーで使用する細胞表現型の有名な種類である。所望により、ユーザは、独自の表現型を定義してよい。場合によっては、ユーザは、特定の発現パターンをある表現型に割り当ててよい。この図に示すように、ユーザはまた、この工程を省略し、表現型を選択しない選択肢を有する。特定の表現型を選択するとき、データベースは、関連付けられた、抗原に特異的な抗体セットを提供できる。いくつかの実施形態によると、ユーザは、抗体を直接選択することにより表現型を定義できる。例えば、図２において色素が抗体に割り当てられている場合、図２Ａの左列での対応の抗体の選択に応じて、右列にこの事前選択内容を表示できる。右側の列では、ユーザが、自動挿入法で色素を事前に選択できてよい。いくつかの実施形態によると、プロセス中のこの段階では、ユーザは、（例えば、図２でのように）抗体に色素をこれ以上割り当てることはできないことがある。しかしながら、ユーザが図２で色素を抗体に割り当てていれば、これらの色素は、左列で対応の抗体を選択すると、右列に表示される。場合によっては、異なる表現型の間で選択するか、表現型の優先順位を付けることができる。例えば、表現型は、標的集団に基づいて、又は特定表現型で検出されるべき特定抗原に基づいて、優先順位を付けることができる。場合によっては、システムは、発現密度に基づいて抗原の優先順位を付けてよい。例えば、低発現密度の抗原は、高い優先度を与えられ得る。
【００８６】
図２Ｂに示すように、ユーザは、必要に応じて、データベースに含まれ得る、様々な表現型の排除を選択する選択肢を有する。例えば、データベースは、特定の抗原が、別の特定の抗原と同一の細胞表面では決して生じないことを示す情報を含み得る。所望により、ユーザは特定の排除を定義してよい。この図の左列に示すように、ユーザは、図２に関して前述したように以前に選択し、左列のヘッダ部に表示される抗体に対応する第１排除を定義してよい。ユーザは、パネルの多数の抗体について、この方法で多数の排除を選択してよい。例えば、ユーザは、抗原ＣＤ−Ｘが抗原ＣＤ−Ｙ及びＣＤ−Ｚを排除するべきであることを示してよい。かかる選択は、本明細書の他の箇所に記載するように、プローブパネルのグラフィック表示に影響を有し得る。いくつかの実施形態によると、特定抗原の排除は、対応の検出限界に影響を及ぼさないことがある。これは、同一細胞表面にある標識のみが互いのチャネル検出限界に影響を及ぼし得るからである。つまり、同一細胞表面に抗原がなければ、標識色素もまた同一細胞表面にない。したがって、対応の発光スペクトル間に干渉は存在し得ない。図２Ｂに示すように、ユーザはまた、排除を指定しない選択肢を有する。
【００８７】
場合によっては、ユーザは、決して共発現しない２つの抗原を選択してよい。所望により、データベースは排除に関してある程度の推測を行ってよい。例えば、システムは、特定のＴ細胞マーカー及び特定のＢ細胞マーカーが互いに排他的であると推定してよい。場合によっては、システムは、排除が存在しないことをユーザが示すことができるようにする。したがって、ユーザには、（ａ）データベースによって提供される排除を受諾する、（ｂ）積極的に排除を割り当てる、及び／又は（ｃ）任意の抗原が任意の細胞上で別の抗原で生じ得るように排除を割りあてない、など様々な選択肢が提示されてよい。
【００８８】
図２Ｃに示すように、ユーザは、必要に応じて、データベースに含まれ得る、様々な親−子孫関係を選択する選択肢を有する。例えば、データベースは、特定の抗原が、別の抗原と親関係又は子孫関係を有することを示す情報を含み得る。所望により、ユーザは、かかる関係を指定しないことを選択してよい。この図の左列に示すように、ユーザは、図２に関して前述したように以前に選択した抗体に対応してよい、第１親及び任意の関連子孫を定義してよい。親−子孫スキームの一例として、ある親−子孫関係は、親マーカーが親細胞で発現し、細胞Ａは、部分母集団／子孫のＡタンパク質に加えて親タンパク質を発現し、細胞Ｂは、部分母集団／子孫のＢタンパク質に加えて親タンパク質を発現することを意味し得る。例えば、親Ｔ細胞はＣＤ３抗原を含んでよく、一部のＴ細胞子孫は、子細胞抗原ＣＤ４と共にＣＤ３抗原を発現してよく、一部のＴ細胞子孫は、子細胞抗原ＣＤ８と共にＣＤ３抗原を発現してよい。子細胞におけるＣＤ４及びＣＤ８の発現は、相互に排他的であり得る。例えば、子細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８−又はＣＤ４−／ＣＤ８＋のいずれかであってよい。場合によっては、すべてのＣＤ４＋子細胞はＣＤ３＋であり、すべてのＣＤ８＋子細胞はＣＤ３＋である。このように、親−子孫関係は、発現パターンへの影響を有すると考えられ得る。関連して、親−子孫関係は、関連付けられたひずみの関連性に対する影響を有すると考えられ得る。一例として、親標識抗原が検出されるチャネルでひずみを生じさせる色素で子孫抗原が標識される場合、このひずみを説明する必要はなくてよい。例えば、すべてのＣＤ４＋細胞がＣＤ３についても陽性である場合、バックグラウンドにＣＤ４＋が存在しなくてよい（例えば、ＣＤ３−でもあるＣＤ４＋は存在しない）。場合によっては、親ＣＤ３標識は、子ＣＤ４チャネルにひずみを生じさせてよい。
【００８９】
したがって、親−子孫関係は、バックグラウンドのひずみへの影響を有する。ひずみが陽性集団に適用される場合、より高い範囲の対数スケールにある集団として記載され得る。一部の関連する場合では、かかる測定誤差は、陽性集団が検出されるチャネルの検出限界に関して実質的に関連性がないことがある。いくつかの実施形態によると、子孫チャネルから親チャネルへの漏れ込みが生じた場合に漏れ込み及び関連するひずみを無関係にする以外に、親−子孫関係によってもたらされる影響はない。親チャネルから子孫チャネルへの漏れ込みが生じる場合、「通常」のひずみが適用される。
【００９０】
本明細書の他の箇所に記載するように、特定蛍光色素の１次検出チャネルは、ユーザが、その蛍光色素に関連付けられた信号の検出を意図するチャネルである。単一の１次チャネルに対して、１つ以上の２次チャネルが存在してよい（例えば、１次チャネルの蛍光色素が、他のチャネルに漏れ込む発光スペクトルを有する場合）。例えば、システムは、ＦＬ２チャネルにおいて主としてＰＥ色素を検出するように構成されてよいが、ＰＥ発光スペクトルは、ＦＬ３、ＦＬ４、ＦＬ５など他チャネルに漏れ込み得る。この意味では、２次チャネルは、不要な信号強度が検出された場所を示すことができる。親−子孫関係と共にかかる漏れ込み特性を使用すると、プローブパネル設計を評価又は構成できる。場合によっては、プローブは１次チャネルに割り当てられてよく、一方では、２次チャネルへの強い漏れ込みを有し、２次チャネルが親チャネルを務める。本明細書の他の箇所に記載するように、典型的な集団の親／子孫スキームは、データベースで示され得る。場合によっては、ユーザは、デフォルトの親−子孫スキームを進めることを選択してよい。場合によっては、ユーザは、独自の親−子孫スキームを定義することを選択してよい。場合によっては、ユーザは、親子孫スキームが存在しないことを指定することを選択してよい。例えば、血球疾患の分析に関して、特定の発現パターンは著しく異常であってよい。かかる場合では、ユーザが親−子孫関係は存在しないことを示すことが望ましいであろう。
【００９１】
図２Ｄに示すように、ユーザは、必要に応じて、データベースに含まれ得る、特定の抗原密度パラメータを選択する選択肢を有する。例えば、デフォルトの抗原密度は、データベースに含まれてよい。かかるデフォルトは、ヒト末梢血に存在する典型的な集団を参照してよい。他の種類のデフォルトが組み込まれてよい。したがって、ユーザの評価対象が細胞培養セルに関連付けられた物質か、骨髄に関連付けられた物質かに応じて、例えば、異なるデフォルト及び／又は発現密度を使用できてよい。
【００９２】
図２Ｄにも示されるように、図２Ａに従ってインデックスが付けられているため、個々の抗体に表現型を選択することができる。特定の表現型に選択した各抗体は、ヒストグラムに示され得る。更に、ユーザは、典型的と考えられる発現密度を受け入れるか、変更する選択肢を有してよい。ヒストグラムの下のバーを参照すると、ボタンを移動させて、陽性集団と陰性集団とを切り替えることができる。したがって、特定集団に対して推定され得る信号対雑音比に影響を及ぼすことができる。信号対雑音比の変更は、他のチャネルに存在することが予測されるクロストーク、つまり漏れ込みに影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態による、用語「クロストーク」及び「漏れ込み」は同じ意味で用いられてよい。したがって、より鮮明な信号が推定されるか、より鮮明な信号が選択される、又は調整される場合、より多量のクロストーク、つまり漏れ込みが他チャネルに存在すると推定されてよい。場合によっては、ユーザは、デフォルト（例えば、抗原密度及び／又は信号強度）を続行することを選択してよい。場合によっては、ユーザは、Ｔ細胞集団又は単球集団又は非ヒト細胞集団又はヒト末梢血若しくは骨髄若しくはその他に無関係な集団など特定の所望の表現型の予測特性に従って信号強度を変更してよい。
【００９３】
図３は、実施形態による、プローブパネル選択法３００の態様を示す。この図に示すように、ユーザ−が選択した抗体パラメータ３１０（例えば、図２に記載のように）などデータ、フローサイトメトリー装置の構成３２０（例えば、図１に記載のように）、及び抗体データベース３３０は、優先表現型及び／又は抗原発現に従ってオペレータに最適な組み合わせを提案し、シミュレーションを行ったプローブパネルに基づいて検出限界及び集団分離を示すグラフ（例えば、Ａ、Ｂ、及びＣ）を生成するシミュレータモジュール３４０に入力できるか、これによってアクセスできる。工程３５０によって示すように、シミュレーションに基づいて、プローブパネルを選択できる。この図に示す実施形態では、選択したプローブパネルは、３個のレーザー及び１０色の検出チャネル（ＰＣ５及びＰＣ５．５を同一チャネルで検出可能）を有するフローサイトメトリー装置構成向けである。パネルは、１０個のＣＤ抗原に対して特異的な抗体−色素結合体を含む。
【００９４】
以下の表１は、データベースプローブ、又はその一部に関連付けられた、例示のプローブ名簿の態様を示す。この表に示すように、個々のプローブは、色素と結合した、抗体又は特定の抗原に特異的な他の結合剤を含み得る。
【００９５】
【表１】
0006437522.tif 000003
【００９６】
細胞又は表面抗原分類（ＣＤ）など表面構造及び構造又はＣＤに対する抗体は、同じ意味で称され得ることを理解されたい。例えば、表面抗原分類３（ＣＤ３）と認める抗体は、ＣＤ３又はＣＤ３抗体とも称され得る。場合によっては、用語「抗ＣＤ３抗体」が使用されてよい。場合によっては、ＣＤ番号が割り当てられていない細胞構造が存在する。かかる場合、構造自体の名前も、抗体の命名に使用され得る。場合によっては、抗「構造」抗体という命名法が使用されてよい。
【００９７】
本明細書の他の箇所に記載するように、データベースから取得した（又はユーザによって推定されたか、割り当てられた）発現パターンに従って、特定の発現パターンは、共発現スキーム、特異的な排除スキーム、又は親−子孫スキームに対応してよい。場合によっては、選択した抗原は、特定の表現型に割り当てられてよい。これらの情報カテゴリに基づいて、パネルＡ、Ｂ、及びＣに示すように、２変量ドットプロット図でデータをグラフィカル表示することができる。場合によっては、この表示はまた、バックグラウンドのひずみの推定値を組み込んでよい。
【００９８】
この図に示すように、集団Ｘは、特定集団での抗原Ｘの検出を意図する場合を反映してよい。パネルＡでは、右上象限から左上象限を区切る直線の鋭角的なヒンジ部が存在しており、抗原Ｙの密度に応じて、集団発現抗原Ｙの抗原Ｙの検出限界が急増することを示す。これらの検出限界特性は、集団発現抗原Ｙに対する抗原Ｘの検出限界特性とは大きく異なる。右上象限から右下象限を区切る線にはヒンジ部が存在しないが、図の輪郭に平行である。したがって、抗原Ｘの発現密度からの抗原Ｙの検出限界は対応の細胞に依存しない。したがって、このグラフィカル出力は、この特定の選択が最適でないかもしれないことをユーザに示してよい。
【００９９】
したがって、ユーザが特定の抗原発現パターン（例えば、抗体パラメータ３１０に関連付けられたために）を選択するか、これを入力すると、システムは、ユーザによる選択又は入力に基づいてデータベースから特定の抗体−色素結合体を取得してよい。次いで、ユーザは、抗原発現パターンに関連付けられた様々なグラフィカル出力を観察できる。いくつかの実施形態によると、システムは、ユーザによる抗原選択に従って、最適なプローブパネルに関する提案を生成できる。いくつかの実施形態によると、ユーザは、特定抗体の特異性プロファイル又は抗原発現パターンを選択してよく、システムは、プロファイル又はパターンに対して可能なすべての結合体の組み合わせの順列を戻してよい。場合によっては、システムは、優先抗原に従って選択した結合体の組み合わせを表示してよい。したがって、特定の抗原には優先順位が存在してよく、順位は、感度に関して最適な結果をもたらすと予測される結合体の組み合わせ及びグラフィカル出力で表示する結合体の組み合わせを決定するために使用され得る。いくつかの実施形態によると、システムは、蛍光色素の輝度、発現パターンなどに関連する優先結合体／表現型に従って、最適な結合体の組み合わせを返すことができる。場合によっては、抗原は、感度に基づいて優先順位を付けられ得る。例えば、ある抗原はより高い感度を有することが望ましく、一方、第２抗原については、より低い特異性で十分と見なされる。
【０１００】
本明細書の他の箇所に記載するように、グラフィカル出力は、様々な要素の影響を受け得る。例えば、表示は、発現パターン、フローサイトメトリー装置の構成、及び／又はプローブ特性（例えば、所与の抗体の組み合わせ又は特異的に選択された色素において、色素が所与の特性に関して最適と見なされるかどうか）に応じてよい。
【０１０１】
いくつかの実施形態によると、データベースから取得した一部又はすべてのエントリは、デフォルトであってよい。関連して、システムによって推奨されるプローブパネルに関する一部又はすべての提案は、発現パターンを含む抗原セット全体に基づいて計算され得る。例えば、１０個の抗原に対するデフォルトの１０セットは、例えば、ユーザが異なる予測発現パターンを選択するときなど、異なる推奨プローブパネルをもたらしてよい。発現パターン又は信号強度など特定のパラメータを変更すると、表示の変更が生じ得る。場合によっては、シミュレーション表示は、システムの特定の推奨を示してよい。場合によっては、シミュレーション表示は、プリセット色素に従って出力を示してよい。場合によっては、シミュレーション表示は、一部の色素をユーザが選択し、一部の色素をシステムが選択するという混合事例に従って示してよい。いくつかの実施形態によると、システムは、蛍光色素の輝度、発現パターンなどに関連する優先結合体／表現型に従って、最適な結合体の組み合わせを返すことができる。特定の表現型に関連する抗原は、２変量ドットプロット又は他の表示で示され得る。図３では、３個のプロットを示す。本発明の実施形態は、任意の数のプロットの表示を包含する。例えば、表２に示すように、５個の抗原が選択され、１０個のプロットが存在してよい。
【０１０２】
【表２】
0006437522.tif 000004
【０１０３】
いくつかの実施形態によると、ユーザは、表示出力プロットを確認し、優先されている任意の抗原、標的集団に関する知識、及び／又は標的共発現抗原に関する知識を考慮し、次いで、検出限界を評価し、大きなひずみが予測されるかどうかを決定できる。場合によっては、システムは特定のプローブパネルを推奨してよく、ユーザは、グラフィカル表示の内容を考慮せずに推奨パネルを選択してよい。
【０１０４】
例えば、ＣＤ３が特定抗原と共発現し、検出チャネルに漏れ込む多くの抗原が存在するために、集団に著しいひずみが存在する場合、ユーザは、かかるプローブパネルを続行しないことを決定してよい。次いで、ユーザは、図２〜２Ｄに示す任意の工程に戻って、ユーザ入力及び／又はデータベースから取得したデフォルト入力を変更してよい。
【０１０５】
検出限界
例えば、細胞が免疫蛍光色素で染色されるフローサイトメトリーにおける１つの目的は、細胞の表面又は内部で発現するタンパク質又はマーカーを分析することである。このようにして、細胞胞（又は細胞のサブセット）を特定の抗原又はマーカーに対して陽性又は陰性のいずれかとして分類できる。したがって、例えば、ある細胞は特定のマーカー又は抗原に対して「陰性」と見なされてよく、他の細胞は特定のマーカー又は抗原に対して「陽性」と見なされてよい。細胞が陰性か、陽性かを判定するためには、信号強度の閾値を定義することが役立ってよい。最小又は不在抗原レベルを発現して閾値を下回る信号強度をもたらす細胞は「陰性」と見なされ、十分な抗原レベルを発現して閾値を超える信号強度をもたらす細胞は「陽性」と見なされる。かかる信号強度の閾値は、検出限界とも称されてよい。
【０１０６】
したがって、場合によっては、検出限界は、特定スケールでの陰性イベントと陽性イベントとの間の閾値を指してよい。つまり、陽性／陰性のカットオフが存在してよく、検出できない、つまり低レベルの信号又は蛍光は陰性イベントに相当する。場合によっては、非特異的な蛍光は陰性イベントに相当する。それに対して、十分に高レベルの信号又は蛍光は、陽性イベントと見なすことができる。
【０１０７】
本明細書の他の箇所に記載するように、特定の検出限界は、アイソタイプデータ、蛍光強度、ひずみ係数などを含む式に基づき得る。
【０１０８】
アイソタイプ対照の染色
典型的な免疫表現型検査手順は、細胞表面のタンパク質と特異的に結合する抗体−色素結合体で生体試料の細胞を標識することを含む。このようにして、細胞によって発現したタンパク質を分析できる。しかしながら、結合体プローブの性質により、プローブと細胞との間で、不要な非特異的結合が生じることがある。つまり、特定のプローブは、このプローブが細胞と結合するように意図されていなくても、特定の細胞と結合することがある。
【０１０９】
アイソタイプ対照抗体を使用して、かかる非特異的結合又は蛍光に陰性対照をもたらすことができる。通常、アイソタイプ対照は、プローブ抗体が生成される同一宿主から生成される。例えば、結合体プローブの抗体がマウスから生成される場合、このプローブの対照に使用されるアイソタイプ抗体もマウスから生成される。更に、アイソタイプは、試料内で生じない（さもなければ、標的細胞で生じない）ことが既知である抗原の特異性を有するように生成され得る。
【０１１０】
アイソタイプ対照で試料を染色するとき、結果として生じる信号は、抗体−色素結合体の細胞表面への非特異的結合を示し得る。このようにして、アイソタイプ対照を使用して、結合体染色手順で生じ得るバックグラウンド強度のレベルを評価できる。例えば、アイソタイプ対照は、プローブで得た蛍光強度が特異的と見なされ得るレベルを示すことができる。つまり、設計したプローブで染色するとき、検出信号がアイソタイプ対照によるバックグラウンド強度レベルを超えると、検出信号が陽性イベントに相当すると推測できる。
【０１１１】
実際には、アイソタイプ対照を使用して、特異的結合と非特異的結合とを区別すること、特異性又はゲーティング対照を設定すること、細胞の分類に使用するゲートの位置又はグラフ領域又は境界を決定すること、特定抗原の陽性又は陰性を判定すること、データ内での陽性／陰性境界を割り当てることなどを実行できる。アイソタイプ抗体対照は、フローサイトメトリー手順で使用できる。フローサイトメトリー手順で多数の染色を用いるとき、アイソタイプ抗体対照を使用することは、特に有用であり得る。
【０１１２】
場合によっては、例えば、抗原が、陽性集団と陰性集団との間（例えば、Ｔ細胞上のＣＤ４及びＣＤ８）に重複部分がない、明らかな２峰性発現を有するとき、対照を使用せずに続行できる。
【０１１３】
アイソタイプ対照は、細胞分析手順で信号対雑音の問題に対応するときに役立ち得る。発現パターン又は対象細胞が所与のマーカーについて陽性かどうかを判定するとき、アイソタイプ対照は、特異性を過度に犠牲にすることなく、分解能感度を最適化するのに役立ち得る。アイソタイプ対照を使用するとき、検出信号が、非特異的結合のみ、又は非特異的及び特異的結合の一部の組み合わせに対応し得るのかを評価できる。本明細書の他の箇所に記載するように、アイソタイプ対照は、検出限界の決定に有用であり得る。アイソタイプは、バックグラウンドに寄与してよく、スペクトルの重複又は漏れ込みはバックグラウンドの拡散に寄与し得、これら両方は、感度に影響を及ぼし得る。
【０１１４】
図４は、アイソタイプ信号伝達及び分解能感度の特定の態様を図示する。例えば、パネルＡに示すように、左側のアイソタイプ信号は陰性イベントに相当し、右側の検出信号は陽性イベントに相当する。この図では、陰性集団は、陽性集団と比較して低バックグラウンドを有し、この集団は、容易に分解できる（例えば、明確に定義された検出限界を使用して）。それに対して、パネルＢは、陰性集団が、陽性集団と比較して高バックグラウンドを有し、したがって、集団の分解が困難であり得る。関連して、パネルＣは、陰性集団が（陽性集団に対して）低バックグラウンド及び高変動係数（ＣＶ）を有し、したがって、集団の分解が困難であり得る状況を示す。かかる状況は、アイソタイプ対照が著しい漏れ込みを示すときに存在してよい。したがって、陰性集団及び陽性集団を分解できるようにするには、陽性信号に対して低バックグラウンドの陰性信号を有し、低拡散、つまり低分散の陰性信号を有することが役立つ。
【０１１５】
本明細書の他の箇所に記載するように、あるプローブ上の色素は、別のプローブの色素からの発光の検出を意図する特異的チャネルに漏れ込む発光をもたらし得る。かかる場合、漏れ込みは、上述のように陰性集団のデータ拡散に類似してよい。
【０１１６】
場合によっては、２次チャネル内の集団の幅は、２次チャネルでの検出限界の増加に寄与し得る、１次チャネルで検出された同一集団の別の蛍光標識からの漏れ込みによって生じたデータ拡散により増加し得る。例えば、陰性集団に関する測定誤差が増加すると、分布幅も増加し得る。場合によっては、大きな測定誤差が存在することがあり、１次チャネルからの漏れ込みが存在する２次チャネルでの検出信号は、１次チャネルからの漏れ込みが不在の２次チャネルでのアイソタイプ対照信号を超えているが、それでもなお陰性イベントに相当してよい。場合によっては、漏れ込みは、検出限界の増加に寄与し得る。例えば、特定の検出チャネルへの漏れ込み量の増加は、そのチャネルの検出限界を増加させるように作用する。これは、この特定チャネルでのより強度の蛍光検出によって生じる、大きな測定誤差に関連付けられる。
【０１１７】
場合によっては、アイソタイプ抗体を使用して、ベースラインを取得できる。場合によっては、未染色細胞を使用して、ベースラインを取得できる。プロセス中の染色後に適用される洗浄工程の数が大きいほど、アイソタイプの機能は、バックグラウンド蛍光に関して未染色の細胞集団の機能に近づきやすい。つまり、徹底的な洗浄は、バックグラウンドを均質化するように作用し得、アイソタイプ染色が加えられたとしても、洗浄は、非特異的結合のアイソタイプをすべて除去するように作用する。
【０１１８】
マルチカラープローブパネルを使用した染色手順に続いて、細胞表面に関連付けられた様々な蛍光色素が存在してよい。これらの細胞上の単一の特定結合体によって検出された抗原の特異的陽性を評価するためには、この特定の単一蛍光色素の検出限界を増加させるように作用し得る、これらの細胞上での他のすべての他の蛍光色素の発光を考慮することが役立ってよい。
【０１１９】
蛍光強度
通常、フローサイトメトリーは、蛍光強度、つまり輝度値など特定のプロパティを有する色素又は蛍光色素を使用することを含む。例えば、ＰＥ色素は３４２００００の輝度強度を有してよく、ＦＩＴＣは３９０００の輝度強度を有してよい。これらの強度は、互いに対して相対的に測定でき、ある色素が最大強度の基準として選択される。本明細書の他の箇所に記載するように、個々の蛍光色素の強度は、プローブパネルの評価時に考慮され得る。
【０１２０】
ひずみ
バックグラウンド集団のひずみ、したがって、検出限界の増加は、細胞表面若しくは細胞内部に漏れ込む蛍光色素の数、又は対応の検出チャネルへの関連漏れ込み信号の強度に相当し得る。したがって、例えば、より多量の漏れ込みは、より広いバックグラウンドのひずみに相当し得る。場合によっては、細胞表面に結合した抗体の数を考慮することが可能であり、この特定の漏れ込み蛍光色素で標識された、かかるより大きい抗体の数は、バックグラウンドのひずみにより大きく寄与すると考えられる。場合によっては、データベースは、特定の細胞種類に典型的である推定強度に基づいた、バックグラウンドのひずみ推定値を含んでよい。換言すれば、ひずみは、この細胞種類に結合する漏れ込み蛍光色素で標識された抗体の数に基づき得る。
【０１２１】
一例として、他の共発現した抗原Ｚと共にＣＤ３抗原を発現するＴ細胞について検討できる。通常、Ｔ細胞は、非常に強力なＣＤ３の発現を表面に有する。ＦＬ２  ＰＥしたがって、特定チャネルへの発光信号の提供を意図する抗ＣＤ３プローブで染色すると、ＣＤ３抗体色素結合体プローブが、実際には、Ｚプローブの検出を意図するチャネルにクロストークし、次いでＺプローブの検出限界が増加してよい。マルチカラー実験を実行するとき、複雑な漏れ込みパターンが生じることがある。例えば、１０色の実験では、１つの特定の検出チャネルについて検討するとき、他の９色からの漏れ込みを考慮する必要があってよい。つまり、他の９色のそれぞれは、この特定チャネルの検出限界の増加に寄与し得る。場合によっては、ひずみは、細胞種類及び分析対象の関連発現パターンに依存してよい。場合によっては、ひずみは、漏れ込み蛍光色素を持ち運ぶ細胞種類上で結合された抗体の数に依存してよい。
【０１２２】
抗ＣＤ３プローブの例に戻ると、Ｔ細胞及びＢ細胞の両方がＺ抗原を発現する、Ｔ細胞（高抗原密度のＣＤ３）及びＢ細胞（ＣＤ３の不在）を検討することができる。ＣＤ３プローブでＴ細胞を染色するとき、この色素は、Ｚチャネル検出器への漏れ込みをもたらし得る。したがって、Ｚチャネルの検出限界が増加する。それに対して、この同一ＣＤ３プローブでＢ細胞を染色すると、Ｂ細胞にＣＤ３が不在であるために（特異的）結合は存在しない。したがって、ＣＤ３プローブ色素からの漏れ込みは存在せず、ＣＤ３プローブは、Ｚチャネルで検出限界を増加させるとは見なされない。したがって、ひずみ係数が細胞種類及び関連する抗原発現パターンに応じて変化してよいことが分かる。例えば、特定のプローブチャネルはある種類の細胞に関してある検出限界セットをもたらしてよく、別の種類の細胞に関して別の検出限界セットをもたらしてよい。関連して、特定のプローブチャネルの検出限界セットは、分析対象の細胞で発現する抗原の種類に応じて異なってよい。
【０１２３】
例えば、ある細胞種類に抗原Ａが含まれない（したがって、この抗原に対して特異的なプローブによる結合が存在しない）場合、検出限界の増加は、抗原Ｂに対して特異的である検出チャネルにおいて観察されないことがある。それに対して、ある細胞種類が（抗原Ａのプローブによって結合され、抗原Ｂの検出チャネルへの漏れ込みももたらす）抗原Ａを多量に発現する場合、抗原Ｂに対して特異的である検出チャネルにおいて検出限界の増加が存在してよい。このようにして、検出限界の増加（又は増加の欠如）は、染色した細胞の発現パターンに基づき得る。
【０１２４】
したがって、ひずみ係数は、検出限界に影響を及ぼし得る。例えば、検出限界の増加（例えば、漏れ込みによる１ディケードの増加）が存在する場合、陽性イベントが存在するとの結論を下すためには、このチャネルにおいてより大きい信号を観察する、又は検出することが必要であってよい。
【０１２５】
例えば、図８を参照すると、（ＣＤ４−ＰＥプローブの）ＰＥ色素から、ＥＣＤを検出するＦＬ３チャネルへの強力な漏れ込みが存在することが分かる。この漏れ込みのために、特異的にＰＥで標識した集団の未補正ＥＣＤ信号は、非特異的アイソタイプ染色と比較したとき、非特異的にＰＥで標識したバックグラウンド集団の未補正ＥＣＤ信号よりも数百倍明るい。
【０１２６】
場合によっては、信号の増加と共に、ＣＤ４＋集団の拡散が増加する。したがって、この集団では、より大きいＰＥ信号が存在してよい。その結果、ＦＬ３標識（ｙ軸）では、検出限界が増加してよい。
【０１２７】
補正
通常、より高い蛍光信号は、より高い絶対測定誤差を伴うであろう。例えば、図５を参照すると、ＰＥ陽性集団は、ＰＥ色素発光のＦＬ３  ＥＣＤ検出チャネルへの漏れ込みにより、ＥＣＤ用のＦＬ３検出チャネルで信号を生じさせ、したがって、この集団に関する絶対エラーが著しく高くなってよい。これは、標準偏差として示され得る。場合によっては、測定誤差は、ポアンソン分布特性に従って影響を受けてよく、補正手順によって減少させることはできない。これは、これらが、漏れ込み結合体で非特異的に標識した集団に対して、漏れ込み結合体で特異的に標識した集団の平均強度のみを補正できるためである。相対測定誤差の比較（対応の変動係数ＣＶとして示される）が十分な類似度を示す場合、これは、検出の線形性を示すものであり得る。
【０１２８】
場合によっては、変動係数間が２倍異なっていてよく、ＣＶが相対的に類似し、同一の大きさを有するものの、標準偏差は１００倍以上異なってよい。
【０１２９】
図６Ａ及び図６Ｂに示すように、ＰＥ検出ＰＭＴ及びＥＣＤ検出ＰＭＴによって測定し、互いに対してプロットした発現信号イベントの陰性蛍光値は、コンピュータ補正によって人為的に２峰性分布に生成することができる。図示する２峰性計算は、２つの測定した抗体−色素結合体の１つ目、２つの測定した抗体−色素結合体の２つ目、又は２つの測定した抗体−色素結合体の両方が陰性であるイベントを区別するように作用できる。図７は、ＥＣＤ検出ＰＭＴ及びＰＣ５検出ＰＭＴによって測定し、互いに対してプロットした、発現信号イベントの分布幅の増加を示す。図７は、漏れ込みチャネルへの陰性集団の拡散に影響を及ぼすという事実をある程度反映する。これらの図には示していないが、陽性イベントの拡散は、人為的な陰性イベントの拡散に等しい。
【０１３０】
図８に示すように、強力な漏れ込みによる検出限界の増加が存在してよい。場合によっては、ソフトウェア及び／又はハードウェアを用いて実行した計算は、補正手順で漏れ込みを補正するように作用できる。補正のある時点において、ＰＥ陰性及びＰＥ陽性は、正しい補正とも称され得る（例えば、図５を参照）、同一の平均をＥＣＤ軸において有してよい。図５に示すように、補正済みＰＥ陽性集団は、より大きい測定誤差を有してよく、したがって、ＰＥ陰性集団と比較してより大きいデータ拡散が存在する。したがって、測定誤差の増加よりも弱い、特定範囲のＥＣＤ信号が存在してよい。かかる信号は、陽性イベントとして検出できなくなってもよい。場合によっては、補正済み集団の分岐も存在してよい。
【０１３１】
Ｙスケールのある部分を線形スケーリングに変換する場合（例えば、図７を参照）、対数スケールの下端部を圧縮できる。かかる変換は、ＥＣＤ陽性集団の測定誤差（例えば、幅、つまり拡散）はＥＣＤ陰性集団よりも大きいことを示し得る。場合によっては、ＦＬ３（ＥＣＤ）陽性集団からＦＬ４（ＰＣ５）検出チャネルへの漏れ込みは、補正と称される、平均強度のコンピュータ補正後に、より大きい測定誤差へと変換され得る。ＦＬ４（ＰＣ５）検出チャネルへの漏れ込みを有する細胞結合フルオロフォアが存在し、同一細胞上で細胞構造を検出する抗体と結合してよいＥＣＤ及びＰＥなどかかる色素が、ＦＬ３（ＥＣＤ）及びＦＬ２（ＰＥ）の２重陽性細胞をもたらす場合では、ＦＬ４チャネルへの重複漏れ込みが存在してよい。これは、重複測定誤差に変換されてよい。かかるエラーは、説明できることがある。例えば、全体的なデータ拡散への各寄与度は線形値として推定でき、線形値は合計できる。次いで、この結果を再び対数値に変換してよい。更に、データベースは、同一細胞表面で発現し得る抗原に関する情報を含んでよい。かかる情報は、ＦＬ３陽性であるこの集団のために組み合わされるべき漏れ込み信号を選択する際の根拠として使用できる。したがって、ＦＬ４チャネルへの漏れ込みも有する、ＰＥなど色素が存在してよいが、かかる色素に関連付けられた抗原は、ＦＬ３＋である同一細胞種類で発現しないことがあり、したがって、このチャネルにおける全体的な測定誤差に寄与しない。
【０１３２】
いくつかの実施形態によると、細胞種類、又は発現パターン若しくはプロファイルは、結果に対する影響を有してよい。例えば、結果は、この細胞で発現し、抗体色素結合体プローブによって認識される、抗原のパターンによって異なってよい。一部の色素が２次チャネルに漏れ込む可能性があるため、各蛍光色素の検出限界は影響を受けることがある。漏れ込みが存在する場合、スケールの陰性範囲内の集団は拡散するか、ひずんでよく、検出限界は増加してよい。通常、特定の発現パターンは、細胞種類に特有である。例えば、２つの異なる細胞種類が同一発現パターンを有することはあり得ない。検出限界の増加を推定するためには、細胞上に存在する蛍光信号を特定することが有用であってよい。したがって、本明細書に記載の方法は、プローブパネルの評価で使用する発現パターンを特定することを包含する。
【０１３３】
図８のグラフは、ＰＥ色素と結合した、ＣＤ４抗原に対して特異的な抗体を使用した染色手順の結果を示す。この図に示すように、ＦＬ３検出チャネル（ＥＣＤ色素発光に対する感度を有する）は、漏れ込み、したがって、ＰＥ蛍光色素からのバックグラウンドひずみを検出している。
【０１３４】
一例として、ＣＤ３及びＣＤ４に対して陽性であるＴヘルパー細胞について検討することは有用である。場合によっては、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体）又はＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）などサイトカイン受容体が存在するかどうか、細胞を評価することが望ましいことがある。多くの場合、サイトカイン受容体は低コピー数を有する。したがって、Ｔヘルパー細胞の表面はわずかに染色されている。したがって、ＦＬ３（ＥＣＤ）チャネルでサイトカイン受容体の染色を評価することが望ましい場合、ＰＥチャネルでＴヘルパー細胞マーカー（例えば、ＣＤ４）を割り当てることが望ましくないことがある。これは、ＰＥ標識を使用して染色されるＣＤ４＋細胞が、サイトカイン検出が望ましいＦＬ３（ＥＣＤ）において検出限界の増加を示すためである。
【０１３５】
図８に示すように、ＣＤ４−集団とＣＤ４＋集団との検出限界の差異に関連して、検出限界の増加が存在する。ｙ軸の低い部分にある線は、陰性集団を限定することによりＣＤ集団を区切る。この特定のグラフは、ＰＥ発光スペクトルからＥＣＤ検出チャネルへの多量の漏れ込み、したがって、バックグラウンドひずみを示す。したがって、検出限界は、かなり増加する。この結果をグラフ左側の陰性集団と比較すると、相当量の感度（例えば、約２分の１ディケード）が失われることが分かる。したがって、陽性イベントとして検出されるか、登録されるためには、ＥＣＤ標識を使用して検出されるコピーの数が、ＣＤ４−集団と比較して、ＣＤ４＋集団では数倍（例えば、６倍）高い（例えば、より鮮明な信号）必要がある。
【０１３６】
関連した例では、ＰＣ７色素からの発光スペクトルの検出を意図するＦＬ５チャネルなど、異なる検出チャネルを検討することが有用である。この例では、ＦＬ５チャネルは、ＰＥ蛍光色素の発光に対してより遠い、特定の波長を検出する。したがって、ＦＬ５チャネルへのＰＥ発光スペクトルの漏れ込みはより少ない。そのため、（例えば、図８に示すように）ヒンジ線の傾斜は、より緩やかである。換言すると、特定チャネルへの漏れ込み量が減少すると、（例えば、図８に示すように）このチャネルに関連する、ヒンジ線の傾斜はより低くなる。
【０１３７】
特定の波長値は、結果に影響を及ぼし得る別のパラメータである。多くの場合、特定のＰＭＴ又は検出器に関連付けられた波長範囲は、フィルターの前にあるバンドパスフィルターによって少なくとも部分的に決定される。通常、特定のＰＭＴによって検出される波長が大きいほど、ＰＭＴの感度は低くなる。したがって、ＰＭＴは、より大きい固有誤差を有する。例えば、ＰＣ７検出チャネルは、７５５ｎｍよりも大きい波長の光を検出するように構成されてよく、ＰＥ検出チャネルは、５７５＋／−１５ｎｍの波長の光を検出するように構成されてよい。したがって、ＰＣ７チャネルに関連してより多くのひずみが存在してよい。これらの結果は、データベース又はテーブルに含めることができる。考慮してよい別の要素としては、２次チャネルに漏れ込む光の量が挙げられる。例えば、特定の色素が、通常、別の２次チャネルに漏れ込む光の量を考慮することは有用であろう。２次チャネルのプロパティは、波長によって異なり得る固有測定誤差に関して、検討され得る。
【０１３８】
図８に示すように、ひずみ係数は、ヒンジ線の傾斜（検出限界）によって提供される。ひずみ係数は、強度パラメータ（例えば、ＰＥ色素信号の強度）に基づき得る。更に、ｙ軸での２次チャネルの波長が大きければ、より大きい傾斜に相当し得る。したがって、ひずみ係数は、波長と共に増加してよい。場合によっては、これは、ＰＥ信号の強度に適用され得る。例えば、ＥＣＤチャネルへのＰＥ漏れ込みのひずみ係数は、赤外線チャネルのひずみ係数の方が大きいという点で、赤外線チャネルへのＰＥ漏れ込みのひずみ係数と異なってよい。関連して、赤外線チャネルはＰＥチャネルからのスペクトル距離がより大きい位置にあってよいため、光の漏れ込み量はより少なくてよい。通常、ＰＭＴ検出器は、良好な範囲の線型性を提供できる。したがって、線形アプローチは有用である。全体的なひずみ係数は、検出限界の増加に相当し得るか、これと相関し得る。図８に示すように、ひずみ係数は、象限内のヒンジ線の傾斜であり得る。したがって、検出限界は線形的に決定できる。
【０１３９】
検出限界の計算のある実施形態では、（ｉ）Ｘ軸上のＸ値、（ｉｉ）ひずみ係数又は傾斜を取得し、それによってＹ値又は検出限界を生成できる。
【０１４０】
例えば、漏れ込む信号の相対発現密度ＦＬ（ｘ）（例えば、ＣＤ４抗原密度に基づく）を提供することができ、この値は、実験データから入手できてよい。例えば、蛍光色素の輝度に相当する、ＰＥ標識の相対発現蛍光色素強度ＦＬ（ｘ）を提供することもできる。
【０１４１】
例示の実証的アプローチは、Ｔ細胞集団をＣＤ４−ＰＥプローブで染色することと、（例えば、陰性集団から２．５ディケード離れた）陽性集団を評価することと、を含んでよい。データに基づいて、結果の表を生成できる。
【０１４２】
したがって、傾斜、つまり直線関係と共にＸ値（例えば典型的な発現密度及び色素輝度に従った推定値）を入力することにより、Ｙ値、つまり検出限界を決定できる。複数の抗体−色素結合体を含むプローブパネルを検討すると、ＦＬ３チャネルへの漏れ込みをもたらす各標識のひずみ係数を取得できる。結果は、選択した色素によって異なってよい。例えば、ＣＤ４−ＰＥプローブはより大きい分離度をもたらしてよく、ＣＤ４−ＦＩＴＣプローブはより小さい分離度をもたらしてよい。
【０１４３】
場合によっては、値は、線形化され、加算され、続いて、線形化された値の合計は、対数距離を得るために、対数値に変換される。色素のそれぞれについて、異なるひずみ係数が適用されてよい。更に、陽性集団と陰性集団との間には、異なる信号／雑音比が存在してよい。
【０１４４】
いくつかの実施形態によると、所与の結合体の組み合わせについて、単一チャネルで測定される対象の特異的抗原であるＣＤ−Ｙの集団について、「不変」信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）距離の推定値は、以下で得られる。
ＦＬ（ｙ）＝相対発現密度ＦＬ（ｙ）＊相対蛍光色素強度ＦＬ（ｙ）
調節マーカーの場合、Ｓ／Ｎ距離ＦＬ（ｙ）を０に設定できる。所与の結合体の組み合わせについて、ひずみを生じさせるＣＤ−Ｘの１つ以上の集団から、個々のＣＤ−Ｘ集団のＣＤ−Ｙを測定するチャネルへの漏れ込みの推定値は、以下で得られる。
ひずみＦＬ（ｘ）−＞ＦＬ（ｙ）＝ひずみ係数ＦＬ（ｘ）−＞ＦＬ（ｙ）＊相対発現密度ＦＬ（ｘ）＊相対蛍光色素強度ＦＬ（ｘ）
ＣＤ−ＸがＣＤ−Ｙの部分母集団である場合、又はＣＤ−ＹがＣＤ−Ｘの排除マーカーセットである場合、ＦＬ（ｘ）のＦＬ（ｙ）へのＳ／Ｎひずみを０に設定できる。複数のチャネルを有する（例えば、合計１０チャネル、したがって、９個のＣＤ−Ｘチャネル）システム内の各チャネルからのひずみは、以下の式で累積できる。
ＦＬ（ｘ）−＞ＦＬ（ｙ）＿ｔｏｔ＝ｌｏｇΣ  １０＾（ＦＬ（ｘ；１．．．９）−＞ＦＬ（ｙ））
【０１４５】
一連の推定値及び集合は、システム内の各チャネル、対象の各抗原について個別に実行でき、各抗原の実効Ｓ／Ｎ距離を以下で計算できる。
実効Ｓ／Ｎ距離＝ＦＬ（ｙ）−ＦＬ（ｘ）−＞ＦＬ（ｙ）＿ｔｏｔ
式中、各チャネル内の各抗原の実効Ｓ／Ｎ距離を使用して、システム及びパネル全体の検出限界を更に決定できる。
【０１４６】
いくつかの実施形態によると、ＦＬ（ｙ）で示す、ＣＤ−Ｙの蛍光部材の特異的陽性の検出限界（ＤＬ）は、以下の式に従ってＦＬ（ｘ）で示す、ＣＤ−Ｘの部材の蛍光からの陽性漏れ込みの線形に近い関数である。
ＤＬ（ＦＬ（ｙ））＝ＤＬＩＣ（ＦＬ（ｙ））＋２５６＊（ＤＦ（ＦＬ（ｘ）−＞ＦＬ（ｙ））＊ＲＩ（ＦＬ（ｘ）））
式中、ＤＬＩＣ（ＦＬ（ｙ））は、０〜１０２３の座標として示されたアイソタイプ対照染色のＣＤ−Ｙの蛍光の検出限界として定義され、ＲＩ（ＦＬ（ｘ））は、ＦＬ（ｘ）のディケードに示されたそのＤＬＩＣ（ＦＬ（ｘ））を超えるＣＤ−Ｘの蛍光の強度として定義され、ＤＦ（ＦＬ（ｘ）−＞ＦＬ（ｙ））は、ディケードＦＬ（ｘ）で除されたディケードＦＬ（ｙ）に示された、ＲＩ（ＦＬ（ｘ））あたりのＤＬ（ＦＬ（ｙ））の増加として測定されたひずみ係数として定義される。
【０１４７】
いくつかの態様では、ＤＦ（ＦＬ（ｘ）−＞ＦＬ（ｙ））は、陽性／陰性補正手順から計算し、以下の式に従って関連付けることができる。
ＤＦ（ＦＬ（ｘ）−＞ＦＬ（ｙ））＝（ＦＬ（ｙ，ｘ）＊ＦＬＩＣ（ｘ））／（ＦＬ（ｘ）＊ＦＬＩＣ（ｙ））
式中、ＦＬ（ｙ，ｘ）は、ＦＬ（ｘ）陽性イベントの強度として定義され、ＦＬＩＣ（ｘ）及びＦＬＩＣ（ｙ）は、その対応の抗原のアイソタイプ対照染色の強度として定義される。ＣＤ−Ｘ部材ＦＬ（ｘ１，ｘ２，．．．ｘ（ｎ−１））からＣＤ−Ｙへの漏れ込み補正強度の蓄積効果は、以下で得られる。
ＤＬ（ＦＬ（ｙ））ｔｏｔａｌ＝ＤＬＩＣ（ＦＬ（ｙ））＋２５６ｌｏｇΣ１０＾（（ＤＦ（ＦＬ（ｘ１，ｘ２，．．．ｘ（ｎ−１）−＞ＦＬ（ｙ）＊ＲＩ（ＦＬ（ｘ１，ｘ２，．．．ｘ（ｎ−１）））））
かかる計算はまた、図１Ｄの第２段落に記載されている。
【０１４８】
いくつかの実施形態によると、アイソタイプ対照データは、拡散集団、つまり「サイレント（ｓｉｌｅｎｔｌｙ）」染色された（白血球）集団でゲーティングした患者ごとに提供され得る。他の実施形態では、補正データは、陽性／陰性アルゴリズムによる適用ごと（又はパネルごと）に生成され得、ひずみ係数の計算の数学的手順又は実験手順が確立され得る。更なる実施形態では、ひずみマトリックスは、アイソタイプ及び補正データのいずれか又は両方に基づいて生成され得る。補正に続いて、単一イベントごとにひずみマトリックスを適用できる。いくつかの実施形態では、補正係数を把握しているだけでは、本明細書に記載の計算を完了するために不十分な場合がある。他の実施形態では、所与の機器又は機器構成及び一連の色素で実験的に決定され得るひずみマトリックスを把握していることは、本明細書に記載の計算を完了するために十分であってよい。更なる実施形態では、特異的に陽性のゲーティングした値は、プリズム、ツリー、三次元オーバーレイ、補正プロット、プロファイルドットなどの方法で表示できる。
【０１４９】
図８を参照すると、方法は、蛍光強度で乗じた発現密度に対応するＸ軸の値を入力するか、選択することを含むことが分かる。かかるデータは、本明細書の他の箇所に記載するように、抗体表モジュールに組み入れられ（及びそこから読み取られるか、取得され）得る。場合によっては、値は、推定されてよい。場合によっては、値は、実験データに基づいてよい。例えば、ＣＤ４−ＰＥ染色実験を分析してかかるデータを取得することができる。更に、方法は、ひずみ係数をマーカーの強度（実強度又は推定強度）で乗じることを含んでよい。場合によっては、発現密度又はマーカーパターン（例えば、標的細胞の）は、デフォルトのパラメータ又は値を有し得る。かかる情報は、抗体データベースモジュールに組み入れられ得る。本明細書の他の箇所に記載するように図１Ｄの第２段落は、例示の検出限界の計算の追加の詳細を提供する。
【０１５０】
図９に示すように、検出限界の増加は、補正係数及び／又はＰＭＴ電圧と無関係であり得る。それどころか、検出限界及び／又はその増加は、発光スペクトル及びフィルター構成によって異なり得る。示すように、結果の表示方法の設定は、別個のＰＭＴチャネルからのセンサ読み取り値と組み合わせて正確に測定した所望のＰＭＴからのセンサ読み取り値によって生じ得るひずみを除去する（又は、換言すれば、補正係数を適用する）ように調整され得る。具体的には、図９は、ＥＣＤチャネルから求められ、検出結果から減じられたＰＥチャネルからのセンサ読み取り値の割合を示す、検出結果を表示する。ＰＥチャネル信号の３４％が減じられたもの、ＰＥチャネル信号の４６％が減じられたもの、及びＰＥチャネル信号の６２％が減じられたものというＰＥチャネルの減算の３つの例示の変化を示す。検出限界結果の各プロットでは、陽性又は陰性の変化として特定されたイベント数は変化するが、２つの比較した集団の間の検出ヒンジ線は変化しない。ひずみを除去することにより、より正確かつ感度の良好な結果セットがもたらされる。
【０１５１】
図１０は、いくつかの実施形態による、特定色素の例示の漏れ込みパターンのひずみマトリックスの態様を示す。漏れ込みは、ＰＭＴ設定及び補正係数と無関係であってよく、蛍光色素、フィルター、及び整合精度に応じて異なってよい。示す態様では、漏れ込みマトリックスは定性的であり得、特定色素又はＰＭＴ検出器のインターフェースにおいてオペレータに対して効果を迅速に表示する。
【０１５２】
図１１は、いくつかの実施形態による、共発現マトリックスの態様を示す。示す態様では、共発現マトリックスは定性的であり得、特定抗原、色素、又はＰＭＴ検出器のインターフェースにおいてオペレータに対して迅速に表示する。図１１に示すように、共発現マトリックスは、相互関係を示し得る。このマトリックスでは、列は非排他的に行と発現する、列は行の排他的な部分母集団である、又は列は行と相互に排他的である（発現イベントが対称的なプロットである場合）。
【０１５３】
図１２Ａは、いくつかの実施形態による、概略的な推定染色パターンを示す。別のチャネルに漏れ込む特定マーカーに陽性が存在する場合、右グラフに示すように、ヒンジ部が観察されてよい。ユーザは、表示される出力を変化させるために、シミュレーションへの特定の入力を変更してよい。例えば、ユーザは、特定の共発現した抗原の感度を向上させるために、プローブパネルに含まれる様々な色素又は抗体を選択するか、変更してよい。図１２Ａの中央のグラフに示す状況は、ＦＬ（ｘ）陽性集団の検出限界が、陰性と比較して、ＦＬ（ｘ）陽性の影響を受けないために特に望ましい。
【０１５４】
図１２Ｂは、いくつかの実施形態による、様々なＰＥ検出限界信号を示す。図１２ＢのＰＥ信号は、図１２Ｃのグラフに示す水平方向に対応する。つまり、図１２Ｂに明示された漏れ込みは、図１２Ｃにおいても明示され得、ｙ軸に沿って強度が評価される、漏れ込み色素の蛍光強度に応じた様々なＰＥ検出限界をもたらす。比較する際、図１２Ｄでは、漏れ込み抗原は、ＰＥチャネルに漏れ込まない位置に移動しており（例えば、ＣＤ４５は、非常に強力な信号を使用して、青色レーザーによって励起されるＥＣＤから赤色レーザーで励起されるＡＰＣへと移動した）、ＣＤ４５−ＡＰＣ信号は、ＰＥチャネルにおいてバックグラウンドに影響を及ぼさない。更に、ＰＥ及びＡＰＣフルオロフォアは、異なるレーザー波長によって励起される。かかる非漏れ込み状況は、特にマルチカラー（例えば、１０色）パネル構成において稀である。これは、様々なチャネルにおいて検出限界に影響を及ぼす蛍光標識が細胞に存在するためである。
【０１５５】
図１２Ｅでは、抗原Ｘに関して陽性である細胞上で、抗原Ｙの発現に対する高感度が存在する。これは、Ｙの発現が優先される望ましい状況であってよい。陰性集団と陽性集団とを比較すると、検出限界は変化していない。ＦＬｘ集団で、ＦＬｙの低検出限界が存在する。いくつかの実施形態によると、図１２Ｅは、特異的に検出される恐れのある、非排他的に共発現した抗原の高発現細胞を含む、特殊な状況に言及してよい。場合によっては、図１２Ｃの未コメントの２重線部を参照することが役立つ。
【０１５６】
比較する際、図１２Ｆでは、細胞で標識する抗原Ｘの検出は、ＦＬｙで検出限界に影響を及ぼす発光色素の発光を含むことが分かる。集団の重複部も示す。それに対して、図１２Ｅ（又は、図１２Ｃの未コメントの２重線部）にはかかる重複部はない。したがって、図１２Ｅに示すような結果を取得するユーザは、特定のプローブパネルについて続行することを決定してよい。それに対して、この共発現が優先される場合、図１２Ｆに示す結果を取得するユーザは、この特定のプローブパネルについて続行しないことを決定してよい。
【０１５７】
図１２Ｇ（並びに、図１２Ｃの未コメントの２重線部）は、２重陽性イベントを示す２変量ドットプロットを示す。図１２Ｈは、２重陽性イベントが存在しない、類似の２変量ドットプロットを示す。図１２Ｈのプロットは、排除の結果を示す。
【０１５８】
図１２Ｉは、ユーザにとって許容範囲の結果を示す、２重陽性イベントが存在しない、別の排除状況を示す。抗原２を排除する、抗原１の陰性を考慮すると、これらの２つの抗原が同一の細胞種類で生じないことがわかる。したがって、左下象限によって特徴付けられる細胞での抗原２の評価に関心を持つユーザは、不偏の検出限界を観察できる。細胞の生物学的特性によって２重陽性集団が生じないため、ユーザは、細胞発現抗原２には目を向けないであろう。したがって、２重陽性は、分析における標的集団ではないことがある。しかしながら、抗原２の陽性（ＡＧ２−ＰＯＳ）と抗原２の陰性（ＡＧ２−ＮＥＧ）との識別は、分析の標的になり得る。同様に、抗原１の陽性（ＡＧ１−ＰＯＳ）と抗原１の陰性（ＡＧ１−ＮＥＧ）との識別も、分析の標的になり得る。これらの状況のそれぞれでは、検出限界は変化しない。
【０１５９】
Ｘ陽性細胞でのＹ抗原の発現及びＹ陽性細胞でのＸ抗原の発現はいずれもないので、右上象限には表示されない。
【０１６０】
図１３は、いくつかの実施形態による、プローブパネル評価システム及び方法の態様を示す。場合によっては、発現パターンは、様々な基準に基づいて分類できる。例えば、いくつかの実施形態では、発現パターンは、正常、リンパ球増殖性疾患、又は未熟血球疾患として分類できる。この図に示すように、発現パターンに関して、蛍光強度など様々な要素を考慮できる。場合によっては、図１３の上側の表内のセルでは、識別発現特性が、マーカー共発現を示す場合には「１」で、マーカー共発現の不在を示す場合には「０」で注釈が付けられ得る。場合によっては、図１３の下側の表内のセルでも、識別発現特性が、子孫−親マーカー共発現を示す場合には「０」で、孫−親マーカー共発現の不在を示す場合には「１」で注釈が付けられ得る。したがって、このデータを使用して、蛍光色素標識が、２次フルオロフォア標識の検出限界の増加をもたすか、もたらさないかを示すことができる。例えば、共発現が存在しない場合、細胞の蛍光標識を考慮しないことが可能であってよい。つまり、同一細胞での不在により、漏れ込み信号は生成されない。したがって、検出限界は増加しない。本明細書の他の箇所に記載するように、本開示の実施形態は、親−子孫パターンなどの他の発現パターンの態様を包含する。発現パターン情報を使用して、特定発現パターンを有する特定集団の特定チャネルにおける測定誤差が事実上増加するかどうかを判定できる。関連して、発現パターン情報は、ひずみの推定若しくは決定、及び／又は重畳に使用できる。場合によっては、例示の表は、複合ひずみ結果をもたらすように生じる漏れ込みを説明する。
【０１６１】
図１４は、いくつかの実施形態による、プローブパネル評価法、具体的には数値シミュレーション法の態様を示す。図１４として提供された表は、１つ以上の励起レーザーで励起され、ＦＬチャネル（すなわち、ＰＭＴチャネル）で検出された、様々な蛍光色素の相対寄与度を部分的に示す。この相対寄与度は、別のＰＭＴ検出器及びチャネルで測定される蛍光色素に関して所与のＰＭＴで不要に測定されたパラメータ又はイベントの補正、除去を行うための根拠をもたらす。実効ひずみマトリックスを計算して、励起レーザー、蛍光色素、及びＰＭＴ検出器の任意の所与の組み合わせのかかる相対寄与度を決定できる。
【０１６２】
図１５は、いくつかの実施形態による、プローブパネル評価法、具体的には漏れ込みパターン法の態様を示す。図１５として提供された表は、この色素パネルにおいて１００％の輝度又は強度の基準として選択したセットの単一蛍光色素に関して所与の蛍光色素の相対輝度を部分的に示す。漏れ込みパターン及び相対輝度は、特定レベルのひずみをもたらすものとして更に分類でき、関連するＰＭＴ検出器によって他の蛍光色素の検出に影響を及ぼす際の特定蛍光色素の関連性を示す。これらの値を使用して、チャネル又は色素の所与の各組み合わせについて、ひずみ信号強度１ディケードあたりの検出限界の増加を計算できる。
【０１６３】
図１６Ａは、いくつかの実施形態による、プローブパネルシステムの例示のスキームを示す。この図に示すように、システムは、シミュレータグラフィックモジュールと、シミュレータ数値モジュールと、漏れ込みパターンモジュールと、抗体データベースモジュールと、を含む。シミュレータグラフィックモジュールは、所望の抗体パネルの側面のユーザ入力、シミュレーション結果のグラフィカル出力、及びデフォルトのシミュレーションパラメータの変更に使用できる。シミュレータ数値モジュールは、シミュレーション結果の数値出力に使用できる。漏れ込みパターンモジュールは、標準光学フィルターセットによる蛍光色素プロパティ及びひずみ係数のデフォルトのシミュレーションパラメータに使用できる。抗体データベースモジュールは、抗原発現密度、共発現パターン、及び親−子孫スキームのデフォルトのシミュレーションパラメータに使用できる。
【０１６４】
場合によっては、例えば、図１３に示すように、シミュレータグラフィックモジュールは、抗体パネルに関連するユーザ入力、抗原の共発現に関するデフォルトデータの表示（例えば、「共発現の可能性／対象の共発現の可能性」）、部分母集団での共発現に関するデータの表示（例えば、「（強発現）細胞は（排他的な）部分母集団ではない」）、陽性−陰性閾値を超える平均信号強度の結合体のディケードに関する推定データの表示、及びシミュレーション結果のグラフィカル出力を実行するように構成できる。
【０１６５】
図１６Ｂ及び図１６Ｃは、いくつかの実施形態による、プローブパネルのユーザ入力モジュールの態様を示す。抗原特異性のユーザ入力に続いて、抗体データベースモジュールから対応の品番（ＰＮ）を取得し、ユーザ入力フィールドの下のフィールドに表示できる。未使用チャネルには、ユーザがダミーの指定を入力してよい。抗体−結合体が抗体データベースのレパートリーから入手できず、かつ所望の色素標識以外の色素標識に結合したにもかかわらず抗原特異性が使用可能な場合、顧客設計サービス（ＣＤＳ）などを指定できる。
【０１６６】
図１６Ｄは、いくつかの実施形態による、シミュレータグラフィックモジュールの態様を示す。この図に示すように、システムは、抗原の共発現に関するデフォルトデータを表示してよい（例えば、「共発現の可能性／対象の共発現の可能性」）。場合によっては、発現パターンに対応するソース領域（例えば、正常、リンパ球増殖、又は白血病）は、０、１、又は２を入力することにより、切り替えることができるか、選択できる。ユーザが指定する特異性は、例えば、列ヘッダ及び行ヘッダに表示され得る。いくつかの実施形態では、システムは、ユーザからの入力を受け取って、デフォルトデータをオーバーライドするように構成され得る。いくつかの実施形態では、必要に応じて、又は所望に応じて、ユーザが表のエントリを上書きできる。場合によっては、共発現データ（例えば、デフォルトエントリ）は、抗体データベースモジュールから取得できる。この図に示すように、値「１」は、真の事例（共発現が生じ、これは対象の共発現である）を示すことができる。関連して、値「０」は、偽の事例（抗原が共発現しない、又はこれらの共発現は対象ではない）を示すことができる。かかる共発現データは、抗体データベースモジュールに記憶され、ここから取得できる。空フィールドの対角軸に沿って対称性が存在する。
【０１６７】
図１６Ｅは、いくつかの実施形態による、シミュレータグラフィックモジュールの態様を示す。この図に示すように、システムは、抗原の親−子孫関係に関するデフォルトデータを表示してよい（例えば、「（強発現）細胞は子孫集団ではない」）。これについても、０、１、又は２を入力することにより、ソース範囲を切り替えることができる。この図に更に示すように、ユーザ入力に従った抗原特異性は、表の列ヘッダ及び行ヘッダに表示できる。場合によっては、必要に応じて、又は所望に応じて、ユーザがエントリを上書きしてよい。場合によっては、親−子孫データ（例えば、デフォルト）は、抗体データベースモジュールから取得できる。値「１」は、真の事例（陽性細胞（列の抗原）は子孫集団ではなく、したがって、行の抗原のチャネルではひずみが生じる）を示すことができる。値「０」は、偽の事例（陽性細胞（列の抗原）は子孫集団であり、したがって、行の抗原のチャネルではひずみが生じない）を示すことができる。例えば、この図に示す表によると、ラムダはカッパの子孫ではなく、ＭＣ７はＣＤ１９の子孫である。いくつかの実施形態によると、ＦＭＣ７はカッパ陰性であってよい。
【０１６８】
図１６Ｆは、いくつかの実施形態による、シミュレータグラフィックモジュールの態様を示す。この図に示すように、異なる曲線又は線は、異なる励起波長に対応し得る。この図では、波長は、４８８ｎｍ、６３８ｎｍ、及び４０５ｎｍである。実線でつながれる円は、大部分の複雑な発現パターンのバックグラウンドに対応する。破線でつながれる正方形は、結合体の予測最低蛍光強度に対応する。点線でつながれる３角形は、結合体の予測最高蛍光強度に対応する。個々の標識（すなわち、円、正方形、又は３角形）は、特定のバンドパスフィルター又は検出チャネル範囲の中心波長に対応するＸ軸値の上に位置する。Ｙ軸は、蛍光強度の上から４つの対数ディケードを示し、陰性集団は１番下のディケードに集中する。本明細書の他の箇所に記載するように、離散発現特性を有する抗原では、対応のＸ軸位置（バンドパス波長）について破線及び点線が一致する。更に、本明細書の他の箇所に記載するように、様々な標識間の距離に基づいて様々なプローブパネル設計を順位付けすることが可能である。例えば、プローブパネル設計は、３角形（点線）と円（実線）との最大距離に基づいて順位付けでき、正方形（破線）と丸（実線）との最小距離に基づくこともできる。
【０１６９】
場合によっては、順位付けは、複雑な漏れ込みパターンに対応し、弱発現抗原に関連付けられるプローブパネルを優先することを含んでよい。
【０１７０】
図１６Ｇは、いくつかの実施形態による、シミュレータグラフィックモジュールの態様を示す。この図では、特定の検出チャネルに関するすべてのひずみの寄与度の表示が個々のチャネルの上に位置する。円、つまりバブルは、対応の漏れ込み蛍光色素に従ってコード化（例えば、色分け）され得る。Ｙ軸の値、つまり切片は、対応のチャネルの結合体で生じた、検出限界の絶対的増加をディケード単位で示す。例えば、Ｙ軸は、ディケード単位でバックグラウンドの増加を示すことができ、０．００は、第１ディケードと第２ディケードとの閾値である（例えば、第１ディケードに集中する陰性集団）。円の直径は、対応のチャネルにおける全体的なバックグラウンドひずみに対する結合体の相対寄与度を示し得る。本明細書の他の箇所に記載するように、所与のチャネルのバックグラウンドひずみを低下させるためには、例えば、その特定のチャネルの上に位置する最大の円に対処することが有用であり得る。場合によっては、調節抗原の検出に使用するチャネルの円の数を最小化するか、削減することが有用であり得る。
【０１７１】
図１６Ｈは、いくつかの実施形態による、シミュレータ数値モジュールの態様を示す。この図に示すように、表は、漏れ込み結合体（列見出し）ごとに分解されたすべての絶対ひずみの値及びひずんだチャネルを含み、また、１ディケードの１次チャネルにおける漏れ込み蛍光色素の信号強度あたりのバックグラウンドにおける増加（ディケード単位）を示す。更に、全体的なバックグラウンドひずみに対する最大寄与度のサイズ及びバックグラウンドの全ひずみの列が含まれている。重複列は、位置パラメータに従った、陽性−陰性閾値の１０２４単位のグラフ尺度内での象限又は領域の位置を示す。バックグラウンドひずみのグラフィカル表示のソースデータも示す。
【０１７２】
いくつかの実施形態によると、以下の式に基づいて、単一の漏れ込み結合体によって生じる絶対ひずみを決定することが可能である。
（結合強度）＊（ひずみ係数）＊（共発現指数）＊（親−子孫指数）
【０１７３】
いくつかの実施形態によると、結合体強度は、ディケードで表されてよく、抗原密度及び蛍光色素輝度に基づいて、又は結合体強度に関する実験データを使用して推定値として決定され得る。
【０１７４】
いくつかの実施形態によると、以下の式に基づいて、所与チャネルにおける全ひずみを決定することが可能である。
ＬＯＧ１０（各結合体によって生じた、線形化された絶対ひずみの合計）
【０１７５】
いくつかの実施形態によると、陽性−陰性閾値領域／象限位置は、以下の式に基づいて決定できる。
（全ひずみのディケード）＊（２５６）＋２５６
式中、２５６は、陰性集団がこのグラフィカル閾値で線引きされると仮定した、第１ディケードと第２ディケードとのグラフィカル閾値である。
【０１７６】
図１６Ｉは、いくつかの実施形態による、シミュレータ数値モジュールの態様を示す。この図に示す表は、クロストーク結合体（列見出し）ごとに分解された、線形相対ひずみ寄与度（ディケード単位）及びひずんだチャネルを含む。この表は、バックグラウンドひずみのグラフィカル表示（例えば、「ひずみ寄与度」グラフ）のソースを提供し得る。表の値は、以下の式に基づき得る。
【０１７７】
【数２】
0006437522.tif 000005
【０１７８】
図１６Ｊは、いくつかの実施形態による、漏れ込みパターンモジュールの態様を示す。この図に示す表は、１ディケードのクロストーク（すなわち、漏れ込み）蛍光強度ごとに適用され得、実験に基づいて、又は以下の近似式に基づいて決定され得る、ひずみ係数を含む。
ひずみ係数＝［クロストーク指数］＊［バンドパス温度係数］
【０１７９】
図１６Ｋは、いくつかの実施形態による、漏れ込みパターンモジュールの態様を示す。クロストーク指数の定義は、この図において以下のとおりである。
クロストーク指数＝ＬＯＧ（ＳＮＲ（２次信号））／ＬＯＧ（ＳＮＲ（１次信号））
式中、ＳＮＲ＝信号対雑音比＝ＭＦＩ（陽性集団）／ＭＦＩ（陰性集団）、
ＭＦＩ＝平均蛍光強度である。
【０１８０】
図１６Ｌは、いくつかの実施形態による、漏れ込みパターンモジュールの態様を示す。この図に示すように、５２５ｎｍ（ＦＩＴＣ）では、絶対ひずみは以下の式に従って計算でき、ＤＦ（ひずみ係数）対ＣＩ（クロストーク指数）の比率は０．１５である。
絶対ひずみ＝０．１５×ＬＯＧ（ＳＮＲ（２次））
【０１８１】
つまり、１ディケードの２次信号強度あたり０．１５ディケードのひずみが存在する。これもまたこの図に示すように、６６０ｎｍ（ＡＰＣ）では、絶対ひずみは以下の式に従って計算でき、ＤＦ対ＣＩの比率は０．４２である。
絶対ひずみ＝０．４２×ＬＯＧ（ＳＮＲ（２次））
【０１８２】
つまり、ＡＰＣチャネル（６６０／２０バンドパス）では、１ディケードの２次信号強度あたり０．４２ディケードのひずみが存在する。
【０１８３】
図１６Ｍ及び図１６Ｎは、いくつかの実施形態による、抗体データベースモジュールの態様を示す。図１６Ｍ内の表は、抗原発現密度（例えば、ＣＤ８−ＰＥ＝陽性−陰性閾値の上の強度の２．５ディケードに従って評価）のデータ、品番、及び発現特性（例えば、０＝調節、１＝離散）を含む。図１６Ｎの表は、共発現パターンのデータ（例えば、「共発現の可能性／対象の共発現の可能性」）を含む。この図に示すように、対角の表セルに沿って表には対称性が存在する。
【０１８４】
図１６Ｏは、いくつかの実施形態による、抗体データベースモジュールの態様を示す。いくつかの実施形態では、抗体データベースモジュールは、親−子孫パターンに関する情報（例えば、「（強発現）細胞は子孫集団ではない」）を含んでよく、非対称であってよい。いくつかの実施形態によると、かかるデータベース情報は推定値を含み得る。いくつかの実施形態によると、かかるデータベース情報は実験値を含み得る。
【０１８５】
図１７は、いくつかの実施形態による、漏れ込みパターンをモデル化する数値的アプローチの態様を示す。この図に示すように、漏れ込みパターンの評価は、多変量データセットを処理する検出レーダーアプローチを含んでよい。図１７に示すように、多変量レーダー表示は、パネル構成１７０２に配置されたときの検出チャネルに従って、抗原の検出限界を表示できる。第１画像層１７０４に示すように、検出レーダーの各放射軸は、測定した信号の第３〜６ディケードからの蛍光チャネルを示す（各ディケードは、２０ビットセグメント）。第１内側斜線１７０６は不変検出限界を示し、このディケード以下では、アイソタイプ対照が第３ディケードに集中すると仮定する。第２画像層１７０８に示すように、第２内側斜線部１７１０は、第１内側斜線部１７０６の下に存在し、第２画像層１７０８は、各蛍光チャネルに対する推定バックグラウンドひずみを示す。第２内側斜線部１７１０を生成する推定ひずみの値は、漏れ込みパターン、相対蛍光色素強度、抗原密度、共発現マトリックス、及びひずみマトリックスに従った所与の組み合わせ結合体に基づく。
【０１８６】
第３画像層１７１２は、各結合体の予測蛍光強度の下限を示す、下限１７１４を更に含む。すべての調節発現、又は離散発現は、予測蛍光強度の下限１７１４の一部として０に設定される。第４画像層１７１６は、各結合体の予測蛍光強度の上限を示す、上限を更に含む。特定抗原の離散発現及び色素は、予測蛍光強度に対して等しい下限１７１４及び上限１７１８の値を有する。
【０１８７】
図１８Ａ及び図１８Ｂは、いくつかの実施形態による、漏れ込みパターンをモデル化する数値的アプローチの態様を示す。この図に示すように、漏れ込みパターンの評価は、検出レーダーアプローチ及び／又はひずみインジケータアプローチを含んでよい。かかるひずみインジケータ表示では、各ＤＬは、ひずむ色素を示す色を有し得る。Ｙ軸は、ひずみの量を示し得（ディケード単位）、Ｘ軸は、ひずんだ各ＦＬチャネルを示し得る。データ点の直径（すなわち、ＤＬのサイズ）は、全ひずみに対する単一結合体の相対寄与度を示し得る。
【０１８８】
図１９Ａ及び図１９Ｂは、いくつかの実施形態による、漏れ込みパターンをモデル化する数値的アプローチの態様を示す。この図に示すように、漏れ込みパターンの評価は、多変量レーダーアプローチを使用して更に示され得る、クローナリティー画面アプローチ（ｃｌｏｎａｌｉｔｙ  ｓｃｒｅｅｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ）を含んでよい。
【０１８９】
本明細書に記載したように、プローブパネル設計のシミュレーション時には、フローサイトメトリー装置をセットアップして、当該プローブパネルを使用して動作させることができる。具体的には、コンピュータ読み取り可能な固定媒体であり得るプロセッサ又はシステムは、フローサイトメーターのハードウェア構成に関する情報、複数のプローブを含む名簿に関する情報、対応の個々のチャネルに固有の検出限界に関連付けられた名簿の個々のプローブ、及び抗原の共発現パターンに関する情報を受け取ることができる。プロセッサ又は１つ以上の追加の情報的にリンクされた（ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）プロセッサは、フローサイトメーターのハードウェア構成、個々のチャネルに固有の検出限界、及び抗原の共発現パターンに基づいて、個々のプローブの組み合わせをプローブパネルとして評価でき（この組み合わせは、名簿からのプローブのサブセットである）、フローサイトメーターのハードウェア構成、個々のチャネルに固有の検出限界、及び抗原の共発現パターンで使用するプローブパネルを更に決定できる。最終的には、フローサイトメトリー手順で使用するプローブパネルを出力でき、オペレータは、フローサイトメトリー機器及び実験用のプローブパネル設計に使用できる。
【０１９０】
パネル設計及びシミュレーション用パラメータのインターフェース及び選択
プローブパネルの決定は、ウェブベースのインターフェースに示され得、ユーザは、オンラインデータベース及びツールを使用して、フローサイトメトリー実験用のプローブパネルを設計できる。（図２〜２Ｄで上述した）システム及び方法の特定の実施形態は、図２０Ａ〜２０Ｆに示すようにオペレータに提供されてよい。システム又は方法の態様は、単一形式、移行形式、又は方法内で工程を示す複数形式として提供され得る。
【０１９１】
図２０Ａは、ハードウェア構成を選択できる、インターフェース画面２０００（ハードウェア構成画面２０００とも称される）の例示の画像である。一連のタブ２００２を使用すると、データを入力できる様々なフィールド間を移動できる。これらは、示すように、パネルのシミュレーション方法の工程のタブである。タブ見出しフィールド２００４は、ユーザが閲覧中又は編集中である方法の工程を示すことができる。図２０Ａでは、「ハードウェア構成」であり、一連のタブ２００２では「工程１」として示される。ドロップダウンフィールド２００６では、オペレータが、データベースから情報を提供するハードウェア構成を選択して、パネルシミュレーションを実行するためのパラメータを設定できる。ハードウェア構成のグラフィカル表示２００８は、１個以上の励起レーザー、１個以上の励起レーザーの励起波長、１個以上の励起レーザーの電圧若しくは他の電力値、１個以上のＰＭＴ検出器、１個以上のＰＭＴ検出器の電圧若しくは他の電力値、又は１個以上の各ＰＭ検出器のバンドパスフィルターを含むが、これらに限定されないハードウェア構成の詳細をオペレータに示すことができる。いくつかの態様では、一連のハードウェア構成は、データベース及びシステムによって自動的に決定されてよい。選択したハードウェア構成により、本明細書に記載のパネル設計及びシミュレーション用のパラメータ及び値を設定できる。選択可能な「次へ＞」フィールド２０１０は、方法の後工程に進むために設けられる。ほとんどの場合に選択可能な「＜戻る」フィールド２０１２は、方法の前工程に進むために設けられる。しかしながら、示されるハードウェア構成２０００には、前工程がない。したがって、ハードウェア構成画面２０００では、「＜戻る」フィールド２０１２を選択できない。
【０１９２】
図２０Ｂは、抗体を選択できるインターフェース２０１４（抗体選択画面２０１４とも称される）の例示の画像である。図２０Ｂのタブ見出しフィールド２００４は「抗体選択」という見出しであり、一連のタブ２００２では「工程２」として示される。複数の特異性ドロップダウンフィールド２０１６ではオペレータが特異性を選択でき、複数の色素ドロップダウンフィールド２０１８では、オペレータが色素を選択できる。いくつかの実施形態では、特異性ドロップダウンフィールド２０１６で選択されるべき特異性は、一連の抗原又は抗体であり得る。特異性ドロップダウンフィールド２０１６で選択した各特異性について、複数の色素ドロップダウンフィールド２０１８から対応する色素を選択できる。いくつかの態様では、一連の特異性ドロップダウンフィールド２０１６及び色素ドロップダウンフィールド２０１８は、データベース及びシステムによって自動的に決定されてよい。選択した抗体により、本明細書に記載のパネル設計及びシミュレーション用のパラメータ及び値を設定できる。選択可能な「次へ＞」フィールド２０１０は、方法の後工程に進むために設けられる。選択可能な「＜戻る」フィールド２０１２は、方法の前工程に進むために設けられる。
【０１９３】
図２０Ｃは、表現型を選択できるインターフェース２０２０（標的表現型画面２０２０とも称される）の例示の画像である。図２０Ｃのタブ見出しフィールド２００４は「標的表現型」という見出しであり、一連のタブ２００２では「工程３」として示される。標的集団ドロップダウンフィールド２０２２では、オペレータが、標的表現型を発現する、又は発現するべき特異的抗原に関連する標的集団を選択できる。複数の「無関係抗原」２０２４が提供され、選択した標的集団とは関係ない、又は関係ないであろう、一連の抗体及び色素結合体をリスト表示する。複数の無関係抗原２０２４内の各抗体及び色素のペアは、抗体及び色素のペアが対象の抗原であることを示す、選択可能なチェックボックスを含む。複数の「対象の抗原」２０２６が提供され、選択した標的集団に関係する、又は関係すると考えられる、一連の抗体及び色素結合体をリスト表示する。複数の対象の抗原２０２６のメンバーは、当初は複数の未関係抗原２０２４で提供された抗体及び色素のペアによって自動挿入され得るか、データベース及びシステムに記憶された関係データに従って自動挿入されてよい。特定の抗体及び色素のペアが複数の対象の抗原２０２６のメンバーであることの表示は、抗体及び色素のペアの選択可能なチェックボックスをオフにすることによって削除できる。いくつかの態様では、一連の複数の無関係抗原２０２４及び複数の対象の抗原２０２６は、データベース及びシステムによって自動的に決定されてよい。いくつかの態様では、すべての抗体及び色素のペアを複数の対象の抗原２０２６のメンバーとして選択するアクティブ化可能なフィールドと、すべての抗体及び色素のペアを複数の無関係抗原２０２４のメンバーとして示すアクティブ化可能なフィールドと、を有する、対象の抗原グローバル選択フィールド２０２８が提供され得る。選択した標的表現型、無関係抗原、及び対象の抗原により、本明細書に記載のパネル設計及びシミュレーション用のパラメータ及び値を設定できる。図２０Ｃには明示的に示していないが、選択可能な「次へ＞」フィールドが、方法の後工程に進むために設けられ、選択可能な「＜戻る」フィールドは、方法の前工程に進むために設けられる。
【０１９４】
図２０Ｄは、相互に排除する抗原を特定できるインターフェース２０３０（相互に排除する抗原画面２０３０とも称される）の例示の画像である。図２０Ｄのタブ見出しフィールド２００４は「相互に排除する抗原」という見出しであり、一連のタブ２００２では「工程４」として示される。一連の展開可能な抗原−抗体ペアリングフィールド２０３２が設けられ、展開すると、抗原−抗体ペアリングフィールドに排除する抗原のリスト２０３４が表示される。これは、個々のフィールドの抗原−抗体ペアリングと相互に排除してよい候補抗原のリストであり得る。排除する抗原のリスト２０３４は、リストに表示された抗原ごとにチェックボックスを有して、排除として示す特定抗原を選択できる。これは、選択した抗原（単数又は複数）は、このフィールドの抗原−抗体ペアリングの一部として特定された抗原と共発現しないことを示すものである。排除する抗原のリスト２０３４は、リスト２０３４内のすべての抗原を選択したり、リスト２０３４内のすべての抗原の選択を解除したりできる１つ以上の選択リンクを更に含み得る。排除として示される抗原は、特定した排除される抗原のリスト２０３６に表示され得る。特定した排除される抗原のリスト２０３６は、リスト表示される抗原ごとに選択されたチェックボックスを有し得る。このチェックボックスの選択を解除して、特定の抗原が所与の抗原−抗体ペアリングフィールドについて相互に排除されないことを示すことができる。態様では、排除する抗原のリスト２０３４は、オペレータ−が生成した原理に基づいてオペレータが１つ以上のリスト表示された抗原を選択することによって選択できる。他の態様では、特定した排除される抗原のリスト２０３６はデータベース及びシステムによって指定され得、選択可能な「排除の自動指定」フィールド２０３８が設けられる。オペレータは、データベース及びシステムに記憶されたデータに従って相互に排除される抗原を示すことができる。その反対に、選択可能な「すべての排除の廃棄」フィールド２０４０が設けられて、オペレータは、１つ以上の抗体−抗原ペアリングフィールドについて以前に示した相互的な排除のすべての選択を解除できる。選択した相互に排除する抗原により、本明細書に記載のパネル設計及びシミュレーション用のパラメータ及び値を設定できる。図２０Ｄには明示的に示していないが、選択可能な「次へ＞」フィールドが、方法の後工程に進むために設けられ、選択可能な「＜戻る」フィールドは、方法の前工程に進むために設けられる。
【０１９５】
図２０Ｅは、親及び子孫抗原を特定できるインターフェース２０４２（親＆子孫抗原画面２０４２とも称される）の例示の画像である。図２０Ｅのタブ見出しフィールド２００４は「親＆子孫」という見出しであり、一連のタブ２００２では「工程５」として示される。一連の展開可能な抗原−抗体ペアリングフィールド２０４４が設けられ、展開すると、抗原−抗体ペアリングフィールドに子孫抗原のリスト２０４６が表示される。これは、個々のフィールドの抗原−抗体ペアリングの抗原として示された親抗原の子孫である、子孫のリストであり得る。子孫抗原のリスト２０４６は、リストに表示された抗原ごとにチェックボックスを有して、子孫として示す特定抗原を選択できる。これは、選択した抗原（単数又は複数）は、このフィールドの抗原−抗体ペアリングの選択した抗原として示された一群の分化よりも後の発生進行又は工程にある一群の分化であることを示す。子孫抗原のリスト２０４６は、リスト２０４６内のすべての抗原を選択したり、リスト２０４６内のすべての抗原の選択を解除したりできる１つ以上の選択リンクを更に含み得る。子孫として示される抗原は、特定した子孫抗原のリスト２０４８に表示され得る。特定した子孫抗原のリスト２０４８は、リスト表示される抗原ごとに選択されたチェックボックスを有し得る。このチェックボックスの選択を解除して、所与の抗原−抗体ペアリングフィールドフィールドについて特定の抗原が子孫ではないことを示すことができる。態様では、子孫抗原のリスト２０４６は、オペレータ−が生成した原理に基づいてオペレータが１つ以上のリスト表示された抗原を選択することによって選択できる。他の態様では、子孫抗原のリスト２０４６はデータベース及びシステムによって指定され得、選択可能な「家族パターンの自動指定」フィールド２０５０が設けられて、オペレータは、データベース及びシステムに記憶されたデータに従って親及び子孫抗原関係を示すことができる。その反対に、選択可能な「すべての家族パターンの廃棄」フィールド２０５２が設けられて、オペレータは、１つ以上の抗体−抗原ペアリングフィールドについて以前に示した親及び子孫抗原関係のすべての選択を解除できる。選択した親及び子孫抗原関係により、本明細書に記載のパネル設計及びシミュレーション用のパラメータ及び値を設定できる。図２０Ｅには明示的に示していないが、選択可能な「次へ＞」フィールドが、方法の後工程に進むために設けられ、選択可能な「＜戻る」フィールドは、方法の前工程に進むために設けられる。
【０１９６】
図２０Ｆは、抗体密度を特定できるインターフェース２０５２（抗体密度画面２０５２とも称される）の例示の画像である。図２０Ｆのタブ見出しフィールド２００４は「抗原密度」という見出しであり、一連のタブ２００２では「工程６」として示される。標的集団ドロップダウンフィールド２０５６では、オペレータが、特異的抗原、具体的には、特定の細胞種類又は標的集団の特異的抗原の密度に関連する標的集団を選択できる。細胞の領域内の抗原の密度又は細胞種類若しくは標的集団の抗原の密度は、その抗原の発現強度並びに他の抗原の集団との相互作用及びこれらの集団との測定方法に対応する。信号対雑音表示２０５８は、発現のディケードにわたって、標的集団及び対応する抗原からの予測信号対バックグラウンド雑音の比率を示し得る。離散／調節選択フィールド２０６０が設けられ得る。これは、態様では、上記のように離散又は調節パラメータに従って評価するとき、信号対雑音表示２０５８が標的集団の発現を表示するように設定する、ラジオボタン選択フィールドであり得る。同様に、識別選択フィールド２０６２が設けられ得る。これは、態様では、上記のように、陽性発現と陰性発現、又は強陽性発現と弱陽性発現のいずれかとして標的集団の結果を識別するように信号対雑音表示２０５８を設定する、ラジオボタン選択フィールドであり得る。信号対雑音表示２０５８にはスライダ設定が設定されて、表示される信号対雑音表示２０５８のスケール及び領域の範囲を調節し得る。いくつかの態様では、スライダ設定は、抗原の及び標的集団表示のデータを使用して、信号対雑音表示２０５８の範囲を自動的に設定する、選択可能な「スライダの自動設定」フィールド２０６４で選択できる。他の態様では、オペレータが、ラジオスライダインターフェースであり得る、スライダインターフェース２０６６を手動で調整することによって特異的スケールを有するように、信号対雑音表示２０５８に指示できる。標的集団、離散対調節表示の選択、識別選択、スライダ設定、及び選択した抗原密度により、本明細書に記載のパネル設計及びシミュレーション用のパラメータ及び値を設定できる。図２０Ｆには明示的に示していないが、選択可能な「次へ＞」フィールドが、方法の後工程に進むために設けられ、選択可能な「＜戻る」フィールドは、方法の前工程に進むために設けられる。
【０１９７】
図２０Ｇは、所与の抗原パネル設計のパネル発現シミュレーション推定を表示するインターフェース２０６８（パネルシミュレーション画面２０６８とも称される）の例示の画像である。ハードウェア構成画面２０００、抗体選択画面２０１４、標的表現型画面２０２０、相互に排除する抗原画面２０３０、親＆子孫抗原画面２０４２、及び抗原密度画面２０５２への入力から取得された情報が収集され、使用されて、予測発現又は染色パターンが計算され得る。図２０Ｇのタブ見出しフィールド２００４は「推定染色パターン」という見出しであり、一連のタブ２００２では「工程７」として示される。表示フィールド２０７０は、本明細書に記載のグラフィカル表示を含むが、これに限定されない、所与のパネル設計の推定抗原発現の数値表示及びグラフィカル表示のいずれか、又は両方を提供し得る。図示した、ほとんどの場合に選択可能な「次へ＞」フィールド２０１０は、パネルシミュレーション画面２０６８では選択できない。これは、対応する方法又は評価に進むべき後工程が存在しないためである。選択可能な「＜戻る」フィールド２０１２は、方法の前工程に進むために設けられる。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、ウェブベースのインターフェースがオペレータに情報を示して、細胞表現型の様々な抗原間の関係を更に詳しく説明できる。図２１Ａは、ある細胞表現型のＣＤメンバー（すなわち、抗原）間の関係を説明する、例示の発生樹（系統樹（ｇｅｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｒｅｅ）の形式に類似する）である。かかる発生樹は、抗原間の親子関係を示すことができる。したがって、抗原間の姉妹関係、いとこ関係、おば関係を更に示す。いくつかの態様では、抗原は、複数の発生経路で成長することが特定され得、かつ発生樹での同一抗原の発生と共に「双子抗原」として特定され得る。更なる実施形態では、特定の抗原フィールドの選択又は一時的なハイライト表示（例えば、ソフトウェアによって定義されたフィールドでのマウスオーバー）を刺激として使用して、発生樹での他の抗原との発現関係を更に表示できる。例えば、抗原フィールドの選択又は一時的なハイライト表示によって、示した抗原について、発生樹のどの他の抗原が選択した抗原との発現から相互に排除されるか、発生樹のどの他の抗原が選択した抗原と相関性のある発現を有するか、発生樹のどの他の抗原が選択した抗原との逆相関性を有するか、発生樹のどの他の抗原が選択した抗原に対して双子であるか、又は発生樹のどの他の抗原がさもなければ選択した抗原と共発現するかを示し得る。他の態様では、抗原間の発生関係は、例示の実施形態として図２１Ｂに示すように、リスト又は表形式で提供され得る。
【０１９９】
測定パネルを使用したマルチカラー補正
上記のように、パネル発現を予測し、シミュレーションする方法は、測定パネル及び試料中の抗原からの信号の大きさ及び発生源の解明又は推定にも適用され得る。ひずみ及び共発現マトリックスを計算し、相互の共発現又は親−子孫の漏れ込みの補正に使用できる。これは、態様では、適切なゲーティングパラメータを設定することにより実行されてよい。いくつかの態様では、抗体と結合する色素の励起に使用するレーザーは、意図した色素標的以外も励起してよく、補正表、つまりマトリックスを使用して、かかる漏れ込みを調整し、補正できる。図２２Ａは、いくつかの実施形態による、レーザー内補正の態様を示す。同様に、図２２Ｂは、実施形態によるレーザー間補正の態様を示す。図２２Ａ及び図２２Ｂは共に、列２２０２に蛍光色素、行２２０４にＰＭＴセットという構成を示す、同一の補正表２２００を示す。補正表２２００は、選択した各ハードウェア構成及びパネル設計に対して特異的である、列２２１２の蛍光色素の個別識別子及び行２２０４のＰＭＴによって決定される。図２２Ａは、レーザー内補正値に重点を置いており、所与の励起レーザー波長によって生じたある蛍光色素から漏れ込む値が、同一励起レーザー波長によって引き起こされた別の蛍光色素のＰＭＴに影響を及ぼし得る。それに対して、図２２Ｂはレーザー間補正値に重点を置いており、所与の励起レーザー波長によって生じたある蛍光色素から漏れ込む値が、異なる励起レーザー波長によって引き起こされた別の蛍光色素のＰＭＴに影響を及ぼし得る。
【０２００】
図２２Ａに示すように、４０５ｎｍの波長（λ）を有する励起光によって引き起こされた蛍光色素はＦＬ９列及びＦＬ１０列に位置し、対応する検出チャネルは、ＦＬ９行及びＦＬ１０行にある。示すように、ＦＬ９及びＦＬ１０の検出は、それぞれＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ蛍光色素及びＰａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ蛍光色素に関するものである。４０５ｎｍの比較プロット２２０６は、各蛍光色素の重複領域を反映し、ＦＬ９及びＦＬ１０の列及び行の交差領域によって補正表２２００に示される。ＦＬ９及びＦＬ１０の列及び行の交差領域には、上記のように、ひずみの修正に用いられる値、つまり係数が自動入力される。同様に、６３８ｎｍの波長（λ）を有する励起光によって引き起こされた蛍光色素はＦＬ６列、ＦＬ７列、及びＦＬ８列に位置し、対応する検出チャネルは、ＦＬ６行、ＦＬ７行、及びＦＬ８行にある。示すように、ＦＬ６、ＦＬ７、及びＦＬ８の検出は、それぞれＡＰＣ蛍光色素、ＡＰＣ−Ｃｙ５又はＡＰＣ−Ａ７００蛍光色素、及びＡＰＣ−Ｃｙ７又はＡＰＣ−Ａ７５０蛍光色素に関するものである。６３８ｎｍの比較プロット２２０８は、各蛍光色素の重複領域を反映し、ＦＬ６、ＦＬ７、及びＦＬ８の列及び行の交差領域によって補正表２２００に示される。ＦＬ６、ＦＬ７、及びＦＬ８の列及び行の交差領域には、上記のように、ひずみの修正に用いられる値、つまり係数が自動入力される。更に、４８８ｎｍの波長（λ）を有する励起光によって引き起こされた蛍光色素はＦＬ１列、ＦＬ２列、ＦＬ３列、ＦＬ４列、及びＦＬ５列に位置し、対応する検出チャネルは、ＦＬ１行、ＦＬ２行、ＦＬ３行、ＦＬ４行、及びＦＬ５行にある。示すように、ＦＬ１、ＦＬ２、ＦＬ３、ＦＬ４、及びＦＬ５の検出は、それぞれＦＩＴＣ蛍光色素、ＰＥ蛍光色素、ＥＣＤ蛍光色素、ＰＣ５又はＰＣ５．５蛍光色素、及びＰＣ７蛍光色素に関するものである。４８８ｎｍの比較プロット２２１０は、各蛍光色素の重複領域を反映し、ＦＬ１、ＦＬ２、ＦＬ３、ＦＬ４、及びＦＬ５の列及び行の交差領域によって補正表２２００に示される。ＦＬ１、ＦＬ２、ＦＬ３、ＦＬ４、及びＦＬ５の列及び行の交差領域には、上記のように、ひずみの修正に用いられる値、つまり係数が自動入力される。
【０２０１】
期待するように、所与の蛍光色素と、この蛍光色素を検出するように構成されているチャネルとの交差部は、補正値、つまり係数を必要せず、補正表２２００のセルに自動入力する数値を持たない対角部として補正表２２００に示される。
【０２０２】
図２２Ｂに示すように、蛍光色素を励起するように構成されない、又は意図しない波長の励起光によっても蛍光色素は引き起こされ得る。レーザー間補正領域２２１２は、レーザー内補正領域外に補正表２２００の２つの区域を含み得る。レーザー間補正領域２２１２の２つの区域は、ＦＬ６〜ＦＬ８及びＦＬ９〜ＦＬ１０の検出チャネルに影響を及ぼす蛍光色素ＦＬ１〜ＦＬ５の補正値、つまり係数、ＦＬ１〜ＦＬ５及びＦＬ９〜ＦＬ１０の検出チャネルに影響を及ぼす蛍光色素ＦＬ６〜ＦＬ８の補正値、つまり係数、ＦＬ１〜ＦＬ５及びＦＬ６〜ＦＬ８の検出チャネルに影響を及ぼす蛍光色素ＦＬ９〜ＦＬ１０の補正値、つまり係数を示す。レーザー間補正領域２２１２の２つの区域には、上記のように、ひずみの修正に用いられる値、つまり係数が自動入力される。
【０２０３】
図２３は、いくつかの実施形態による、ひずみ計算を決定するアプローチを示す。具体的には、図２３は、［ＬＥＵＫＯ］細胞表現型に１０の色素を使用して測定した蛍光色素発現の６個の結果プロットを表示する。表２３０１は、検出でき、ゲーティングパラメータ及び関連プロットの作製に使用できる抗体−色素結合体のリストを提供し、図２３は、表２３０１内の抗体−色素結合体のリストに基づいて、ゲーティング法及びプロットの例示的選択を提供する。プロット２３０２は、一般的な側方散乱光（ＳＳＣ）に対してフローサイトメトリーシステムから測定した、ＣＤ４５−ＫｒＯ抗体−色素結合体からの信号を表示する。プロット２３０２では、第１ディケードの発現信号が、この表現型に関して［ＬＥＵＫＯ］として特定される。残りの５個のプロットは、ゲーティング法を適用した、［ＬＥＵＫＯ］信号の第１ディケードにおける信号の詳細な外挿である。プロット２３０４は、ＣＤ１３−ＰＣ５．５に対するＳＳＣ信号（ＰＣ５．５のＰＭＴで測定したＣＤ１３の信号）を表示し、その内部におけるＣＤ１３の発現領域及び密度を特定する。プロット２３０６は、ＨＬＡＤＲ−ＰＣ７に対するＳＳＣ信号（ＰＣ７のＰＭＴで測定したＨＬＡＤＲの信号）を表示し、その内部におけるＨＬＡＤＲの発現領域及び密度を特定する。プロット２３０８は、ＣＤ１１７−ＡＰＣに対するＳＳＣ信号（ＡＰＣのＰＭＴで測定したＣＤ１１７の信号）を表示し、その内部におけるＣＤ１１７の発現領域及び密度を特定する。プロット２３１０は、ＣＤ３４−ＡＰＣＡ７００に対するＳＳＣ信号（ＡＰＣＡ７００のＰＭＴで測定したＣＤ３４の信号）を表示し、その内部におけるＣＤ３４の発現領域及び密度を特定する。ＥＸＣＨＡＲプロット２３１２は、ＣＤ３３−ＡＰＣＡ７５０に対するＳＳＣ信号（ＡＰＣＡ７５０のＰＭＴで測定したＣＤ３３の信号）を表示し、その内部におけるＣＤ３３の発現領域及び密度を特定する。図２３の６個のプロットから明白なように、結果プロファイルは、測定した任意の所与の抗体−色素結合体に対して異なるように現れ得、任意の所与の抗体−色素結合体の密度は、細胞又は表現型に存在する他の抗体−色素結合体の組み合わせの信号から分離され得る。
【０２０４】
図２４は、いくつかの実施形態による、ひずみ計算を決定するアプローチを示す。具体的には、図２４は、［ＬＥＵＫＯ］細胞表現型に１０個の色素を使用して測定した蛍光色素発現の６個の結果プロットを表示し、異なるゲーティングパラメータに対する予測検出レベルの象限を示す。表２４０１は、検出でき、ゲーティングパラメータ及び関連プロットの作製に使用できる抗体−色素結合体のリストを提供し、図２４は、表２４０１の抗体−色素結合体のリストに基づいて、ゲーティング法及びプロットの例示的選択を提供する。第１プロット２４０２は、［ＬＥＵＫＯ］細胞表現型についてＣＤ３４−ＡＰＣＡ７００抗体−色素結合体から測定した信号に対する、全体的なＳＳＣ信号を表示する。ＣＤ３４陽性イベントの集団を示す信号は、領域２４１４として特定される。残りの５個のプロットは、ゲーティング法の適用を反映し、他の蛍光色素結合体からシステムによって測定された信号と比較して、信号の陽性又は陰性を特定する。プロット２４０４は、ＣＤ３４−ＡＰＣＡ７００から測定した信号にゲーティングパラメータを適用して表示して、ＣＤ１３抗原から測定した陽性信号を更に示すが、ＣＤ３３抗原及びＣＤ１１７抗原については陰性のままである。プロット２４０６は、ＣＤ３４−ＡＰＣＡ７００から測定した信号にゲーティングパラメータを適用して表示して、ＣＤ１７抗原から測定した陽性信号を更に示すが、ＣＤ１３抗原及びＣＤ３３抗原については陰性のままである。プロット２４０８は、ＣＤ３４−ＡＰＣＡ７００から測定した信号にゲーティングパラメータを適用して表示して、ＣＤ３３抗原から測定した陽性信号を更に示すが、ＣＤ１３抗原及びＣＤ１１７抗原については陰性のままである。プロット２４１０は、ＣＤ３４−ＡＰＣＡ７００から測定した信号にゲーティングパラメータを適用して表示して、ＣＤ１３抗原及びＣＤ３３抗原から測定した陽性信号を更に示すが、ＣＤ１１７抗原については陰性のままである。プロット２４１２は、ＣＤ３４−ＡＰＣＡ７００から測定した信号にゲーティングパラメータを適用して表示しており、ＣＤ１３抗原、ＣＤ３３抗原、及びＣＤ１１７抗原から測定した陽性信号を更に示す。
【０２０５】
図２５は、いくつかの実施形態による、ひずみ計算を決定するアプローチを示す。具体的には、図２５は、［ＬＥＵＫＯ］細胞表現型に１０個の色素を使用して測定した蛍光色素発現の６個の結果プロットを表示し、異なるゲーティングパラメータに対する予測検出レベルの象限を示す。表２５０１は、検出でき、ゲーティングパラメータ及び関連プロットの作製に使用できる抗体−色素結合体のリストを提供し、図２５は、表２５０１内の抗体−色素結合体のリストに基づいて、ゲーティング法及びプロットの例示的選択を提供する。プロット２５０２は、［ＬＥＵＫＯ］細胞表現型についてＣＤ１１７−ＡＰＣ抗体−色素結合体から測定した信号に対する、全体的なＳＳＣ信号を表示する。ＣＤ１１７陽性イベントの集団を示す信号は、領域２５１４として特定される。残りの５個のプロットは、ゲーティング法の適用を反映し、他の蛍光色素結合体からシステムによって測定された信号と比較して、信号の陽性又は陰性を特定する。プロット２５０４は、ＣＤ１１７−ＡＰＣから測定した信号にゲーティングパラメータを適用して表示して、ＣＤ１３抗原から測定した陽性信号を更に示すが、ＣＤ３３抗原及びＣＤ３４抗原については陰性のままである。プロット２５０６は、ＣＤ１１７−ＡＰＣから測定した信号にゲーティングパラメータを適用して表示して、ＣＤ３３抗原から測定した陽性信号を更に示すが、ＣＤ１３抗原及びＣＤ３４抗原については陰性のままである。プロット２５０８は、ＣＤ１１７−ＡＰＣから測定した信号にゲーティングパラメータを適用して表示して、ＣＤ３４抗原から測定した陽性信号を更に示すが、ＣＤ１３抗原及びＣＤ３３抗原については陰性のままである。プロット２５１０は、ＣＤ１１７−ＡＰＣから測定した信号にゲーティングパラメータを適用して表示して、ＣＤ１３抗原及びＣＤ３３抗原から測定した陽性信号を更に示すが、ＣＤ３４抗原については陰性のままである。プロット２５１２は、ＣＤ１１７−ＡＰＣから測定した信号にゲーティングパラメータを適用して表示して、ゲーティングパラメータを適用してＣＤ１３抗原、ＣＤ３３抗原、及びＣＤ４３抗原から測定した陽性信号を更に示す。
【０２０６】
図２６は、いくつかの実施形態による、ひずみ計算を決定するアプローチを示す。具体的には、図２６は、［ＬＥＵＫＯ］細胞表現型に１０個の色素を使用して測定した蛍光色素発現の７個の結果プロットを表示し、異なるゲーティングパラメータに対する予測検出レベルの象限を示す。表２６０１は、検出でき、ゲーティングパラメータ及び関連プロットの作製に使用できる抗体−色素結合体のリストを提供し、図２６は、表２６０１内の抗体−色素結合体のリストに基づいて、ゲーティング法及びプロットの例示的選択を提供する。プロット２６０２は、［ＬＥＵＫＯ］細胞表現型についてＣＤ３３−ＡＰＣＡ７５０抗体−色素結合体から測定した信号に対する、全体的なＳＳＣ信号を表示する。ＣＤ３３陽性イベントの集団を示す信号は、領域２６１６として特定される。残りの６個のプロットは、ゲーティング法の適用を反映し、他の蛍光色素結合体からシステムによって測定された信号と比較して、信号の陽性又は陰性を特定する。プロット２６０４は、ＣＤ３３−ＡＰＣＡ７５０から測定した信号にゲーティングパラメータを適用して表示して、ＣＤ１３抗原から測定した陽性信号を更に示すが、ＣＤ３４抗原、ＣＤ１１７抗原、及びＨＬＡＤＲ抗原については陰性のままである。プロット２６０６は、ＣＤ３３−ＡＰＣＡ７５０から測定した信号にゲーティングパラメータを適用して表示して、ＣＤ３４抗原から測定した陽性信号を更に示すが、ＣＤ１３抗原、ＣＤ１１７抗原、及びＨＬＡＤＲ抗原については陰性のままである。プロット２６０８は、ＣＤ３３−ＡＰＣＡ７５０から測定した信号にゲーティングパラメータを適用して表示して、ＣＤ１１７抗原から測定した陽性信号を更に示すが、ＣＤ１３抗原、ＣＤ３４抗原、及びＨＬＡＤＲ抗原については陰性のままである。プロット２６１０は、ＣＤ３３−ＡＰＣＡ７５０から測定した信号にゲーティングパラメータを適用して表示して、ＨＬＡＤＲ抗原から測定した陽性信号を更に示すが、ＣＤ１３抗原、ＣＤ３４抗原、及びＣＤ１１７抗原については陰性のままである。プロット２６１２は、ＣＤ３３−ＡＰＣＡ７５０から測定した信号にゲーティングパラメータを適用して表示して、ＣＤ１３抗原及びＨＬＡＤＲ抗原から測定した陽性信号を更に示すが、ＣＤ３４抗原及びＣＤ１１７抗原については陰性のままである。プロット２６１４は、ＣＤ３３−ＡＰＣＡ７５０から測定した信号にゲーティングパラメータを適用して表示しており、ＣＤ３４抗原、ＣＤ１１７抗原、及びＨＬＡＤＲ抗原から測定した陽性信号を更に示すが、ＣＤ１３抗原については陰性のままである。
【０２０７】
図２７は、実施形態による、ＡＰＣチャネルにおけるＡＰＣＡ７００／Ａ７５０ひずみのモデルの態様を示す。この三次元グラフは、ＡＰＣチャネルのＰＭＴによって検出したＡＰＣＡ７００信号強度の増加に対して、ＡＰＣチャネルのＰＭＴによって検出したＡＰＣＡ７５０信号強度の増加をプロットしており、いずれもＡＰＣチャネルのＰＭＴによって測定した全体的な検出レベルに対してプロットしている。選択した基準点、例えば、ＡＰＣチャネルで検出した１．００を超える点において、イベント信号は、陽性イベントであると予測される、つまり計算される。その反対に、選択した基準点より下では、イベント信号は、陰性イベントであると予測される、つまり計算される。ＡＰＣＡ７５０強度の最大点であり、かつＡＰＣＡ７００強度がゼロである点において、ＡＰＣチャネルによって測定されるイベント信号は、「純粋である」、つまりＡＰＣＡ７５０のひずみのみとなる。その反対に、ＡＰＣＡ７００強度の最大点であり、かつＡＰＣＡ７００強度がゼロである点において、ＡＰＣチャネルによって測定されるイベント信号は、「純粋である」、つまりＡＰＣＡ７００のひずみのみとなる。図２７に示すモデルは、任意の数のひずみを生じさせる蛍光色素のために更なる次元に拡張することができる。図２７に示すかかるモデルは、所望のフルオロフォアについてチャネル及びＰＭＴで記録された測定値で、ひずみを生じさせる蛍光色素からイベント信号の効果を除去する計算で使用することができる。
【０２０８】
図２８は、図２２Ａ及び図２２Ｂに関して記載したひずみ表２２００に類似の例示のひずみ表２８００を示す。ひずみ表２８００から分かるように、パネルで使用された（あるいは、パネル設計シミュレーションで使用された）特異的色素は、特異的に特定できる。同様に、発光を測定する（あるいは、パネル設計シミュレーションで使用される）機器によって使用されるハードウェアのＰＭＴチャネル検出器のバンドパスフィルタープロパティは、特異的に特定できる。態様では、ＰＭＴチャネルの色素のグループ分けは、所与の色素に使用される励起レーザーの波長に基づき得るが、ひずみ表の表示は、オペレータにとって有用であるか、適切である任意の順序でひずみ値のグループを示し得る。２つのひずみ表（ひずみ表２２００及びひずみ表２８００）を比較して明らかなように、任意の特定のハードウェア構成又はパネル設計に使用されるＰＭＴ検出器及び色素の固有性によって、補正計算を行うために使用されるひずみ値は異なる。
【０２０９】
図２９は、標的抗原２９０２、色素２９０４、及び特定した色素を活性化させるための励起レーザー２９０６の例示の配置を特定する表２９００である。示すように、励起レーザー２９０６は、次いでその標的抗原２９０２と結合する、対応の色素２９０４を励起するように作用する。態様では、かかる配置を使用して取得した補正データは、プロセッサ及び動作可能なシステム又はプログラムにエクスポートできる（Ｋａｌｕｚａ  １．２ｂｅｔａなどソフトウェアを使用して２０ビットテーブルをＥｘｃｅｌへなど）。陽性及び陰性イベントの分類は、イベントごとに個別に、具体的には特異的に評価された抗体−色素結合体において計算できる。図２９Ａ〜２９Ｅは、図２９に記載した標的抗原２９０２、色素２９０４、及び励起レーザー２９０６という配置を使用した、実施形態による実データの態様を示す。
【０２１０】
図２９Ａは、本開示の実施形態による実データの態様を示し、具体的には、ＣＤ６２Ｌ−ＦＩＴＣ対ＣＤ４−ＰａｃＢｌｕｅのイベント信号２９０２にゲーティング法を適用して、フローサイトメトリー機器から取得したイベントデータをプロットする。ＣＤ６２Ｌ−ＦＩＴＣ対ＣＤ４−ＰａｃＢｌｕｅ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）のイベント信号２９０２のプロットは、評価された不変チャネルを反映して、直交する分化を示す。したがって、全イベントの集団は、ＣＤ６２Ｌ−ＦＩＴＣ及びＣＤ４−ＰａｃＢｌｕｅの両方について陰性である集団２９０４、ＣＤ６２Ｌ−ＦＩＴＣについて陽性であり、ＣＤ４−ＰａｃＢｌｕｅについて陰性である集団２９０６、ＣＤ６２Ｌ−ＦＩＴＣについて陰性であり、ＣＤ４−ＰａｃＢｌｕｅについて陽性である集団２９０８、ＣＤ６２Ｌ−ＦＩＴＣ及びＣＤ４−ＰａｃＢｌｕｅの両方について陽性である集団２９１０というイベントの明確な集団として分類できる。
【０２１１】
図２９Ｂは、本開示の実施形態による実データの態様を示し、具体的には、ＣＤ１１７−ＰＥ対ＣＤ４５ＲＡ−ＥＣＤのイベント信号２９１２にゲーティング法を適用して、フローサイトメトリー機器から取得したイベントデータをプロットする。したがって、全イベントの集団は、ＣＤ１１７−ＰＥ及びＣＤ４５ＲＡ−ＥＣＤの両方について陰性である集団２９１４、ＣＤ１１７−ＰＥについて陽性であり、ＣＤ４５ＲＡ−ＥＣＤについて陰性である集団２９１６、ＣＤ１１７−ＰＥについて陰性であり、ＣＤ４５ＲＡ−ＥＣＤについて陽性である集団２９１８、ＣＤ１１７−ＰＥ及びＣＤ４５ＲＡ−ＥＣＤの両方について陽性である集団２９２０というイベントの明確な集団として分類できる。ＣＤ１１７−ＰＥ対ＣＤ４５ＲＡ−ＥＣＤのイベント信号のプロット２９１２は、評価したチャネルを反映して、陽性又は陰性としての個別イベントの分類に影響を及ぼす、少なとも１つの「ヒンジ部」を示す。第１ヒンジ部は、イベント集団２９１４とイベント集団２９２０との間の領域で特定でき、第２ヒンジ部は、イベント集団２９１６とイベント集団２９２０との間で特定できる。これらの結果は、様々な集団間の変動係数（ＣＶ）の多数の重畳を更に反映できる。
【０２１２】
図２９Ｃは、本開示の実施形態による実データの態様を示し、具体的には、ＣＤ６９−ＰＣ５対ＣＤ４５ＲＡ−ＥＣＤのイベント信号２９２２にゲーティング法を適用して、フローサイトメトリー機器から取得したイベントデータをプロットする。したがって、全イベントの集団は、ＣＤ６９−ＰＣ５及びＣＤ４５ＲＡ−ＥＣＤの両方について陰性である集団２９２４、ＣＤ６９−ＰＣ５について陽性であり、ＣＤ４５ＲＡ−ＥＣＤについて陰性である集団２９２６、ＣＤ６９−ＰＣ５について陰性であり、ＣＤ４５ＲＡ−ＥＣＤについて陽性である集団２９２８、ＣＤ６９−ＰＣ５及びＣＤ４５ＲＡ−ＥＣＤの両方について陽性である集団２９３０というイベントの明確な集団として分類できる。Ｄ６９−ＰＣ５対ＣＤ４５ＲＡ−ＥＣＤイベント信号のプロット２９２２は、評価したチャネルを反映して、陽性又は陰性としての個別イベントの分類に影響を及ぼす、少なとも１つの「ヒンジ部」を示す。第１ヒンジ部は、イベント集団２９２４とイベント集団２９３０との間の領域で特定でき、第２ヒンジ部は、イベント集団２９２６とイベント集団２９３０との間で特定できる。これらの結果は、様々な集団間の変動係数（ＣＶ）の多数の重畳を更に反映できる。
【０２１３】
図２９Ｄは、本開示の実施形態による実データの態様を示し、具体的には、フローサイトメトリー機器から取得したイベントデータをプロットする（ゲーティング法の適用が有用ではないか、不可能）。具体的には、ＣＤ６９−ＰＣ５対ＣＤ１６−ＡＰＣＡ７５０のイベント信号についてフローサイトメトリー機器から取得したイベントデータのプロット２９３２を示す。したがって、全イベントの集団は、ＣＤ６９−ＰＣ５及びＣＤ１６−ＡＰＣＡ７５０の両方について陰性である集団２９３４、ＣＤ６９−ＰＣ５について陽性であり、ＣＤ１６−ＡＰＣＡ７５０について陰性である集団２９３６、ＣＤ６９−ＰＣ５について陰性であり、ＣＤ１６−ＡＰＣＡ７５０について陽性である集団２９３８、ＣＤ６９−ＰＣ５及びＣＤ１６−ＡＰＣＡ７５０の両方について陽性である集団２９４０というイベントの明確な集団として分類できる。しかしながら、ＣＤ６９−ＰＣ５対ＣＤ１６−ＡＰＣＡ７５０のイベント信号のプロット２９３２は、評価したチャネルに対して個別イベントを陽性又は陰性として確実に分類する「ヒンジ部」を定義できる明確な領域を示さない。これらの結果は、様々な集団間の変動係数（ＣＶ）の多数の重畳を反映できる。したがって、いくつかの態様では、ＣＤ６９−ＰＣ５対ＣＤ１６−ＡＰＣＡ７５０の組み合わせの分析はゲーティング不能と見なされてよく、更なる分析又はパネル設計は回避され得る。
【０２１４】
図２９Ｅは、本開示の実施形態による実データの態様を示し、具体的には、フローサイトメトリー機器から取得したイベントデータをプロットする（ゲーティング法の適用は有用ではないか、不可能）。具体的には、ＣＤ６９−ＰＣ５対ＣＤ５６−ＡＰＣのイベント信号についてフローサイトメトリー機器から取得したイベントデータのプロット２９４２を示す。したがって、全イベントの集団は、ＣＤ６９−ＰＣ５及びＣＤ５６−ＡＰＣの両方について陰性である集団２９４４、ＣＤ６９−ＰＣ５について陽性であり、ＣＤ５６−ＡＰＣについて陰性である集団２９４６、ＣＤ６９−ＰＣ５について陰性であり、ＣＤ５６−ＡＰＣについて陽性である集団２９４８、ＣＤ６９−ＰＣ５及びＣＤ５６−ＡＰＣの両方について陽性である集団２９５０というイベントの明確な集団として分類できる。しかしながら、ＣＤ６９−ＰＣ５対ＣＤ５６−ＡＰＣのイベント信号のプロット２９４２は、評価したチャネルに対して個別イベントを陽性又は陰性として確実に分類する「ヒンジ部」を定義できる明確な領域を示さない。これらの結果は、様々な集団間の変動係数（ＣＶ）の多数の重畳を反映できる。したがって、いくつかの態様では、ＣＤ６９−ＰＣ５対ＣＤ５６−ＡＰＣの組み合わせの分析はゲーティング不能と見なされてよく、更なる分析又はパネル設計は回避され得る。
【０２１５】
図３０は、標的抗原３００２、色素３００４、及び識別した色素を活性化させるための励起レーザー３００６の例示の配置を特定する表３０００である。示すように、励起レーザー３００６は、次いでその標的抗原３００２と結合する、対応の色素３００４を励起するように作用する。
【０２１６】
図３０Ａは、図３０に記載した標的抗原３００２、色素３００４、及び励起レーザー３００６という配置を使用した、本開示の実施形態による実データの態様を示し、具体的には、フローサイトメトリー機器から取得したイベントデータをプロットする。図３０Ａでは、ゲーティング法又はアルゴリズムは適用されず、イベント信号の評価に使用したＰＭＴ検出チャネルに基づいた、陽性及び陰性の分類を総合的に評価できる。具体的には、ＣＤ２７−ＰＣ７対ＣＤ３−ＰａｃＯ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ）のイベント信号についてフローサイトメトリー機器から取得したイベントデータのプロット３００８を示す。全イベントの集団は、ＣＤ２７−ＰＣ７及びＣＤ３−ＰａｃＯの両方について陰性である集団３０１０、ＣＤ２７−ＰＣ７について陽性であり、ＣＤ３−ＰａｃＯについて陰性である集団３０１２、ＣＤ２７−ＰＣ７について陰性であり、ＣＤ３−ＰａｃＯについて陽性である集団３０１４、ＣＤ２７−ＰＣ７及びＣＤ３−ＰａｃＯの両方について陽性である集団３０１６というイベントの明確な集団として分類できる。しかしながら、本開示に示すようにゲーティング法を適用しないと、異なる抗原−抗体結合体からのイベント信号の集団は、別のイベント信号集団に対して誤って陽性にグループ分けされることがある。例えば、図３０Ａでは、ＣＤ１９−ＰＣ５．５に対して陽性であるイベント信号集団３０１８は、ＣＤ２７−ＰＣ７に対して陽性であり、ＣＤ３−ＰａｃＯに対して陰性であるイベント信号３０１２と同じグループに誤って分けられ得る。これらの結果についても、様々な集団間の変動係数（ＣＶ）の多数の重畳を反映し、更に、ゲーティング法を適用しないと生じ得る誤差を更に反映できる。
【０２１７】
検出限界の予測又は決定時には、様々な原理を使用し、適用できる。例えば、いくつかの実施形態によると、鮮明な色素は、弱発現抗原で良好に機能してよく、不鮮明な色素及び鮮明な色素の両方とも強発現抗原で良好に機能する。更に、不変チャネルは弱発現抗原で良好に機能してよく、サイレントチャネルは強発現抗原で良好に機能してよい。場合によっては、排除抗原間での漏れ込みを可能にすることが望ましい。場合によっては、非排他的に共発現したマーカー間での漏れ込みを回避することが望ましい。場合によっては、部分母集団マーカーから親マーカーへの漏れ込みを可能にすることが望ましい。場合によっては、親マーカーから部分母集団マーカーへ、又は共発現マーカーから部分母集団若しくは他の共発現マーカーへの漏れ込みを回避することが望ましい（目的が、陽性範囲内での区別、すなわち、強陽性イベントと弱陽性イベントとの区別である場合）。場合によっては、検出チャネルごとにひずみを生じさせる蛍光色の数を最小化することが望ましい。
【０２１８】
本開示の様々な実施形態には、下記のものがある。態様では、本開示は、フローサイトメトリー手順で生体試料を分析するためにプローブパネルを決定する方法に関し、この方法は、複数のプローブを含む名簿に関する情報を受信することであって、名簿の個々のプローブは個々のチャネルに固有の検出限界に関連付けられていることと、抗原の共発現パターンに関する情報を受信することと、フローサイトメーターのハードウェア構成、個々のチャネルに固有の検出限界、及び共発現パターンに基づいて、個々のプローブの組み合わせをプローブパネルとして評価することであって、組み合わせが名簿からのプローブの部分母集団であることと、フローサイトメーターのハードウェア構成、個々のチャネルに固有の検出限界、及び共発現パターンと共に使用するプローブパネルを決定することと、フローサイトメトリー手順で使用するプローブパネルを出力することと、を含む。いくつかの態様では、方法は、フローサイトメーターのハードウェア構成に関する情報を受信することを更に含み得る。他の態様では、フローサイトメーターのハードウェア構成に関して受信さする情報は、少なくとも１個の励起レーザー強度、少なくとも１個の励起レーザー波長、及び少なくとも１個の光電子増倍管検出チャネル範囲のいずれか、又はすべてを含み得る。更なる態様では、複数のプローブを含む名簿に関する情報を受信することは、複数のプローブのチャネル固有の検出限界のライブラリを有する、コンピュータ読み取り可能な固定媒体にアクセスすること、オペレータが、少なくとも１個のプローブパネルのメンバーとして抗体及び対応する色素を選択すること、少なくとも１個のプローブパネルのメンバーとしてライブラリから抗体及び対応する色素を自動的に選択すること、並びにプローブパネルの各メンバーのライブラリから抗体及び対応する色素を自動的に選択することのいずれか又はすべてを更に含み得る。いくつかの実施形態では、名簿は、１個以上のダミーメンバーを含み得る。いくつかの態様では、抗原の共発現パターンに関する情報を受信することは、共発現関係のライブラリを有するコンピュータ読み取り可能な固定媒体にアクセスすることを含み得る。更なる態様では、個々のプローブの組み合わせをプローブパネルとして評価することは、２個以上の個々のプローブのチャネルに固有の検出限界間の重複部、つまりひずみを計算することを含み得る。いくつかの態様では、抗原の共発現パターンは、特定の細胞種類の抗原間の共発現関係を含み得る。
【０２１９】
本開示の更なる実施形態は、フローサイトメトリー手順で生体試料を分析するためにプローブパネルを決定するシステムに関し得、システムは、情報入力装置と、少なくとも１個の励起レーザー及び少なくとも１個の光電子増倍管検出器を有するハードウェア構成を備えるフローサイトメーターと、データベースに記憶されたプローブライブラリであって、ライブラリの個々のプローブが対応の個々のチャネルに固有の検出限界に関連付けられているプローブライブラリと、データベースに記憶された抗原の共発現パターンと、フローサイトメーターのハードウェア構成、個々のプローブのチャネル固有の検出限界、及び抗原の共発現パターンに基づいて、プローブライブラリから選択された個々のプローブの名簿を評価するように構成されるプロセッサと、名簿からの個々のプローブの部分母集団を含む、プローブパネルの検出限界の決定を提供する出力装置と、を含み得る。態様では、システムのフローサイトメーターのハードウェア構成は、最大１０個の光電子増倍管検出器を含み得るが、他の実施形態では、フローサイトメーターのハードウェア構成は、１０個を超える光電子増倍管検出器を有し得る。他の態様では、システムのフローサイトメーターのハードウェア構成は、最大４個の励起レーザーを含み得るが、他の実施形態では、フローサイトメーターのハードウェア構成は４個を超える励起レーザーを有し得る。いくつかの態様では、情報入力装置は、オペレータが名簿内の評価用プローブライブラリから個々のプローブを選択すること、オペレータが個々のプローブのチャネル固有の検出限界をプローブライブラリに入力すること、プロセッサがプローブパネルの各メンバーに対してプローブライブラリから抗体及び対応する色素を自動的に選択すること、のいずれか又はすべてを可能にするように構成され得る。更なる態様では、組み合わせを評価するプロセッサは、２個以上の個々のプローブのチャネル固有の検出限界間の任意の重複、つまりひずみを計算できる。
【０２２０】
本開示の更なる実施形態は、フローサイトメトリー手順で生体試料を分析する方法に関し、この方法は、フローサイトメーターを使用して生体試料内で複数のプローブの光出力を測定することと、フローサイトメーターのハードウェア構成に関する情報を受信することと、生体試料で使用した複数のプローブを含む名簿に関する情報を受信することであって、名簿の個々のプローブが対応の個々のチャネルに固有の検出限界に関連付けられていることと、抗原の共発現パターンに関する情報を受信することと、名簿内の個々のプローブに対して陽性基準及び陰性基準を決定し、フローサイトメーターのハードウェア構成、個々のチャネルに固有の検出限界、及び抗原の共発現パターンに基づいて名簿のゲーティングパラメータを決定することと、陽性基準、陰性基準、及びゲーティングパラメータに従って生体試料内で複数のプローブの光出力を評価することと、を含む。態様では、フローサイトメーターのハードウェア構成に関する情報を受信することは、少なくとも１つの励起レーザー強度、少なくとも１個の励起レーザー波長、及び少なくとも１個の光電子増倍管検出チャネル範囲に関する情報を受信することを更に含む。いくつかの態様では、複数のプローブを含む名簿に関する情報を受信することは、複数のプローブに関するチャネル固有の検出限界のライブラリを有するコンピュータ読み取り可能な固定媒体にアクセスすること、及びオペレータが複数のプローブに対して抗体及び対応する色素を選択することのいずれか、又は両方を更に含み得る。更なる態様では、名簿は、１個以上のダミーメンバーを含み得る。いくつかの態様では、抗原の共発現パターンに関する情報を受信することは、共発現関係のライブラリを有するコンピュータ読み取り可能な固定媒体にアクセスすることを更に含み得る。他の態様では、個々のプローブの組み合わせをプローブパネルとして評価することは、２個以上の個々のプローブのチャネル固有の検出限界間の重複部、つまりひずみを計算することを含み得る。更に他の態様では、抗原の共発現パターンは、特定の細胞種類の抗原間の共発現関係を含み得る。
【０２２１】
本開示の更なる実施形態は、フローサイトメトリー手順で生体試料を分析するためのシステムに関し得、システムは、生体試料で使用する複数のプローブを含む名簿を入力できる、オペレータ入力装置と、少なくとも１個の励起レーザー及び少なくとも１個の光電子増倍管検出器を有するフローサイトメーターのハードウェア構成と、ライブラリの個々のプローブが対応の個々のチャネルに固有の検出限界に関連付けられている、データベースに記憶されたプローブライブラリと、データベースに記憶された抗原の共発現パターンと、複数のプローブによって発光され、少なくとも１個の光電子増倍管検出器で検出される光を評価し、複数のプローブのチャネル固有の検出限界間の重複部及びひずみを計算するように構成されるプロセッサと、生体試料内でのプローブの有無を決定する出力装置と、を含み得る。いくつかの態様では、システムは、最大１０個の光電子増倍管検出器を含むフローサイトメーターのハードウェア構成を有し得る。他の態様では、システムは、最大４個の励起レーザーを含むフローサイトメーターのハードウェア構成を有し得る。更なる態様では、システムは、オペレータが名簿内の評価用プローブライブラリから個々のプローブを選択できるように構成されているか、オペレータがプローブライブラリに個々のプローブのチャネル固有の検出限界を入力できるように構成される、オペレータ入力装置を含み得る。
【０２２２】
本開示の更なる実施形態は、一連のフローサイトメトリーのハードウェア構成を提供することと、複数の一連の抗体ペアリングを提供することと、一連の少なくとも１個の標的集団を提供することと、複数の一連の複数の抗体を提供し、複数の抗体の抗体が対象の抗原であるか、無関係の抗原であるかを示す、少なくとも１つの選択を提供することと、複数の一連の抗原−抗体ペアリング提供し、個々の抗原−抗体ペアリングについて、個々の抗原−抗体ペアリングが相互に排除する一連の抗原を提供することと、複数の一連の抗原−抗体ペアリングを提供し、個々の抗原−抗体ペアリングについて、個々の抗原−抗体ペアリングの発生子孫である一連の抗原を提供することと、一連の調節可能な抗原密度パラメータを提供することと、一連のフローサイトメトリーのハードウェア構成、複数の一連の抗体ペアリング、一連の少なくとも１個の標的集団、一連の複数の抗原、少なくとも１個の抗原−抗体ペアリングが相互に排除する一連の抗原、少なくとも１個の抗原−抗体ペアリングの発生子孫である一連の抗原、及び一連の調節可能な抗原密度パラメータの選択に応じて、プローブパネルの検出限界推定値を表示することと、を含む、フローサイトメトリー手順で生体試料を分析するためのプローブパネルを決定する方法に関し得る。実施形態では、複数の一連の抗体ペアリングを提供することは、各抗体ペアリングに一連の選択性を提供することと、各抗体ペアリングに一連の（ａ  ｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ）色素を提供することと、を更に含み得る。態様では、一連の少なくとも１個の標的集団の選択を提供することは、標的集団の表現型に対応する選択を提供することを含み得る。いくつかの態様では、一連の少なくとも１個の標的集団を提供することは、標的集団の追加又は削除を可能にするように構成できる。いくつかの態様では、個々の抗原−抗体ペアリングが相互に排除する一連の抗原は、相互排除データベースによって自動的に決定でき、抗原−抗体ペアリングが相互に排除する一連の抗原は、自動的に選択される。他の態様では、個々の抗原−抗体ペアリングの発生子孫である一連の抗原は、発生家族パターンデータベースによって自動的に決定でき、個々の抗原−抗体ペアリングの発生子孫である一連の抗原は自動的に選択される。いくつかの態様では、提供される調節可能な抗原密度パラメータは、陽性検出限界推定値と陰性検出限界推定値との表示を区別するための選択を含み得、他の態様では、提供される調節可能な抗原密度パラメータは、強陽性検出限界推定値と弱陽性検出限界推定値との表示を区別するための選択を含み得る。更なる態様では、提供される調節可能な抗原密度パラメータは、離散検出限界推定値又は調節検出限界推定値のいずれかを表示する選択を含み、更なる態様では、提供される調節可能な抗原密度パラメータは、プローブパネルの推定検出限界に従って表示をスケールする選択を含む。
【０２２３】
本明細書に記載の計算、つまり演算はそれぞれ、ハードウェア、ソフトウェア、及び／又はファームウェアを有するコンピュータ、通信ネットワーク、又はその他プロセッサを用いて実行されてよい。ハードウェア、ソフトウェア、及び／又はファームウェアを有する、付随するコンピュータ、通信ネットワーク、又はその他プロセッサを備える例示のシステムは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／９３５，１５４号に見出すことができる。様々な方法工程はモジュールによって実行されてよく、モジュールは、本明細書に記載される方法工程を実行するために配置される、任意の広範なデジタル及び／又はアナログデータ処理ハードウェア及び／又はソフトウェアを備えてよい。データ処理ハードウェアを任意に備えるモジュールは、これらに伴って適当な機械プログラミングコードを有することによって、これらの工程のうち１つ以上を実行するのに適しており、２つ以上の工程（又は２つ以上の工程の部分）に対するモジュールは、任意の広範な統合処理及び／又は分散処理アーキテクチャにおいて、単一のプロセッサボードに組み込まれている、又は、異なるプロセッサボードに分かれている。これらの方法及びシステムは、多くの場合、上記方法工程を実行するための命令を伴う、コンピュータ読み取り可能なコードを組み込む有形媒体を利用するだろう。好適な有形媒体は、メモリ（揮発性メモリ及び／又は不揮発性メモリを含む）、記憶媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、テープなどへの磁気記録、ＣＤ、ＣＤ−Ｒ／Ｗ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤなどといった光学式メモリ、又は任意のその他デジタル若しくはアナログ記憶媒体）などを含んでよい。
【０２２４】
本明細書に記載のフローサイトメトリーシステムは、本発明の方法の様々な態様を実行するように構成され得るということが理解される。例えば、システムのプロセッサ構成要素又はモジュールは、センサ入力装置若しくはモジュールから、ユーザインターフェース入力装置若しくはモジュールから、及び／又は診断システムから、任意でアナライザシステムインターフェース並びに／又はネットワークインターフェース及び通信ネットワークを介して、細胞パラメータ信号を受信する用に構成される、マイクロプロセッサ制御モジュールであり得る。場合によっては、センサ入力装置は、フローサイトメーターなど細胞分析システムを含んでよいか、その一部であってよい。場合によっては、ユーザインターフェース入力装置及び／又はネットワークインターフェースは、フローサイトメーターなど細胞分析システムによって生成された細胞パラメータ信号を受信するように構成されてよい。場合によっては、アナライザシステムは、フローサイトメーターなど細胞分析システムを含んでよいか、その一部であってよい。
【０２２５】
プロセッサ構成要素又はモジュールはまた、任意で本明細書に開示の方法のいずれかに従って処理された、細胞パラメータ信号を、センサ出力装置若しくはモジュールに、ユーザインターフェース出力装置若しくはモジュールに、ネットワークインターフェース装置若しくはモジュールに、アナライザシステムインターフェースに、又はこれらの任意の組み合わせに、送信するように構成され得る。本発明の実施形態による装置又はモジュールのそれぞれは、プロセッサによって処理されるコンピュータ読み取り可能な媒体上の１つ以上のソフトウェアモジュール、若しくはハードウェアモジュール又はこれらの組み合わせを含み得る。様々な一般的に使用されるプラットフォーム、例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、ＭａｃＩｎｔｏｓｈ、及びＵｎｉｘ（登録商標）のいずれかが、一般的に使用されるプログラミング言語のいずれかと共に、本発明の実施形態を実装するために使用され得る。
【０２２６】
ユーザインターフェース入力装置は、例えば、タッチパッド、キーボード、マウスなどのポインティングデバイス、トラックボール、グラフィックスタブレット、スキャナー、ジョイスティック、ディスプレイに組み込まれるタッチスクリーン、音声認識システムなどの音声入力装置、マイクロホン、及び他の種類の入力装置を含んでよい。ユーザ入力装置はまた、有形記憶媒体から又は通信ネットワークから、本明細書に開示の方法又はその態様のいずれかを具体化するコンピュータ実行可能コードをダウンロードしてよい。端末ソフトウェアは時々アップデートされ、必要に応じて端末にダウンロードできることが理解されるであろう。概して、用語「入力装置」は、情報をモジュールシステムに入力するための、様々な従来の専用装置及び方法を含むことを意図する。
【０２２７】
ユーザインターフェース出力装置は、例えば、ディプレイサブシステム、プリンタ、ファックス、又は音声出力装置など非視覚表示を含んでもよい。ディスプレイサブシステムは、陰極管（ＣＲＴ）、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）などフラットパネル装置、投射装置などであってよい。ディスプレイサブシステムはまた、音声出力装置を介するものなど非視覚的表示を提供してもよい。概して、用語「出力装置」の使用は、モジュールシステムからユーザに情報を出力するための、様々な従来の専用装置及び方法を含むことを意図する。
【０２２８】
バスサブシステムは、モジュールシステムの様々な構成要素及びサブシステムを意図又は所望に応じて互いに通信させるためのメカニズムを提供できる。モジュールシステムの様々なサブシステム及び構成要素は、同じ物理的位置にある必要はないが、分散ネットワーク内の様々な位置に分散されてもよい。バスサブシステムは、単一バスであってよく、複数のバスを使用してもよい。
【０２２９】
ネットワークインターフェースは、外部ネットワーク又は他の装置へのインターフェースを提供し得る。外部通信ネットワークは、相手方との通信を必要又は所望に応じて生じさせるように構成され得る。多くの実施形態では、通信ネットワークはウェブベース、又はクラウドベースの処理システムであり得、リモートアクセス及び処理を可能にする。したがって、これは電子パケットをモジュールシステムから受信し、必要又は所望に応じて任意の情報をモジュールシステムに返送できる。システムの内部にかかるインフラストラクチャ通信リンクを提供することに加え、通信ネットワークシステムはまたインターネットなど他のネットワークへの接続を提供してよく、有線、無線、モデム、及び／又は他の種類のインターフェース接続を備え得る。
【０２３０】
本開示で論じたすべての特許、特許公開、特許出願、雑誌論文、書籍、技術文献などは、それらの全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３１】
当然のことながら、本発明の図及び説明を簡略化して、本発明の明確な理解に関連する要素を説明している。当然のことながら、図は、組立図としてではなく、例示目的で示されている。省略された詳細点及び変更点、又は別の実施形態は、当業者の専門範囲内である。
【０２３２】
本発明の特定の態様では、ある要素若しくは構造を提供するため、又は、ある機能を実行するために、単一の構成要素を複数の構成要素と置き換えてよく、複数の構成要素を単一の構成要素と置き換えてよいことが理解され得る。かかる置換が本発明の特定の実施形態の実行に有効でない場合を除き、かかる置換は本発明の範囲内であると見なされる。
【０２３３】
本明細書に示される実施例は、本発明の潜在的かつ特定の実施例を例示することを意図している。当業者には、実施例は、主に本発明の説明を目的としていると理解され得る。本発明の趣旨から逸脱することなく、本明細書に記載されるこれらの図又は操作に対して変更があってもよい。例えば、特定の場合では、方法工程又は操作が異なる順序で実施、つまり実行されてよく、あるいは、操作を追加、削除、又は変更してもよい。
【０２３４】
図に描写する又は上述する構成要素の異なる配置は、示していない又は記載していない構成要素及び工程と同様に可能である。同様に、いくつかの特徴及び部分的組み合わせが有益であり、他の特徴及び部分的組み合わせへの参照なしに用いられてもよい。本発明の実施形態は、限定目的ではなく例示目的で説明しており、本発明の読者には、別の実施形態が明らかになるであろう。したがって、本発明は、上記の、又は図に示した実施形態に限定されず、以下の特許請求の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態及び変更がなされてよい。
【図１】
0006437522.tif 000006
【図１Ａ】
0006437522.tif 000007
【図１Ｂ】
0006437522.tif 000008
【図１Ｃ】
0006437522.tif 000009
【図１Ｄ】
0006437522.tif 000010
【図１Ｅ】
0006437522.tif 000011
【図１Ｆ】
0006437522.tif 000012
【図１Ｇ】
0006437522.tif 000013
【図１Ｈ】
0006437522.tif 000014
【図１Ｉ】
0006437522.tif 000015
【図１Ｊ】
0006437522.tif 000016
【図１Ｋ】
0006437522.tif 000017
【図１Ｌ】
0006437522.tif 000018
【図１Ｍ】
0006437522.tif 000019
【図１Ｎ】
0006437522.tif 000020
【図１Ｏ】
0006437522.tif 000021
【図１Ｐ】
0006437522.tif 000022
【図１Ｑ】
0006437522.tif 000023
【図１Ｒ】
0006437522.tif 000024
【図１Ｓ】
0006437522.tif 000025
【図１Ｔ】
0006437522.tif 000026
【図１Ｕ】
0006437522.tif 000027
【図１Ｖ】
0006437522.tif 000028
【図１Ｗ】
0006437522.tif 000029
【図２】
0006437522.tif 000030
【図２Ａ】
0006437522.tif 000031
【図２Ｂ】
0006437522.tif 000032
【図２Ｃ】
0006437522.tif 000033
【図２Ｄ】
0006437522.tif 000034
【図３】
0006437522.tif 000035
【図４】
0006437522.tif 000036
【図５】
0006437522.tif 000037
【図６Ａ】
0006437522.tif 000038
【図６Ｂ】
0006437522.tif 000039
【図７】
0006437522.tif 000040
【図８】
0006437522.tif 000041
【図９】
0006437522.tif 000042
【図１０】
0006437522.tif 000043
【図１１】
0006437522.tif 000044
【図１２Ａ】
0006437522.tif 000045
【図１２Ｂ】
0006437522.tif 000046
【図１２Ｃ】
0006437522.tif 000047
【図１２Ｄ】
0006437522.tif 000048
【図１２Ｅ】
0006437522.tif 000049
【図１２Ｆ】
0006437522.tif 000050
【図１２Ｇ】
0006437522.tif 000051
【図１２Ｈ】
0006437522.tif 000052
【図１２Ｉ】
0006437522.tif 000053
【図１３】
0006437522.tif 000054
【図１３−１】
0006437522.tif 000055
【図１４】
0006437522.tif 000056
【図１４−１】
0006437522.tif 000057
【図１５】
0006437522.tif 000058
【図１６Ａ】
0006437522.tif 000059
【図１６Ｂ】
0006437522.tif 000060
【図１６Ｃ】
0006437522.tif 000061
【図１６Ｄ】
0006437522.tif 000062
【図１６Ｅ】
0006437522.tif 000063
【図１６Ｆ】
0006437522.tif 000064
【図１６Ｇ】
0006437522.tif 000065
【図１６Ｈ】
0006437522.tif 000066
【図１６Ｉ】
0006437522.tif 000067
【図１６Ｊ】
0006437522.tif 000068
【図１６Ｋ】
0006437522.tif 000069
【図１６Ｌ】
0006437522.tif 000070
【図１６Ｍ】
0006437522.tif 000071
【図１６Ｎ】
0006437522.tif 000072
【図１６Ｏ】
0006437522.tif 000073
【図１７】
0006437522.tif 000074
【図１８Ａ】
0006437522.tif 000075
【図１８Ｂ】
0006437522.tif 000076
【図１９Ａ】
0006437522.tif 000077
【図１９Ｂ】
0006437522.tif 000078
【図２０Ａ】
0006437522.tif 000079
【図２０Ｂ】
0006437522.tif 000080
【図２０Ｃ】
0006437522.tif 000081
【図２０Ｄ】
0006437522.tif 000082
【図２０Ｅ】
0006437522.tif 000083
【図２０Ｆ】
0006437522.tif 000084
【図２０Ｇ】
0006437522.tif 000085
【図２１Ａ】
0006437522.tif 000086
【図２１Ｂ】
0006437522.tif 000087
【図２２Ａ】
0006437522.tif 000088
【図２２Ｂ】
0006437522.tif 000089
【図２３】
0006437522.tif 000090
【図２４】
0006437522.tif 000091
【図２５】
0006437522.tif 000092
【図２６】
0006437522.tif 000093
【図２７】
0006437522.tif 000094
【図２８】
0006437522.tif 000095
【図２９】
0006437522.tif 000096
【図２９Ａ】
0006437522.tif 000097
【図２９Ｂ】
0006437522.tif 000098
【図２９Ｃ】
0006437522.tif 000099
【図２９Ｄ】
0006437522.tif 000100
【図２９Ｅ】
0006437522.tif 000101
【図３０】
0006437522.tif 000102
【図３０Ａ】
0006437522.tif 000103