(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０１２年、１１月２７日にＧｅｒｍａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  （ＤＳＭＺ））に受託番号ＤＳＭ  ２６６８２で寄託されているサルモネラ・エンテリカ。
【請求項２】
請求項１に記載のサルモネラ菌を含むワクチン。
【請求項３】
ワクチンの製造のための請求項１に記載のサルモネラ菌の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも３つの弱毒変異を保持している安定な細菌を含有する生ワクチンを生成するための方法および前記方法によって得られる細菌を含有するワクチンを提供する。
【背景技術】
【０００２】
生細菌ワクチンの多くは、生体分子技術によって操作されている弱毒化細菌を含む。不幸にも、これらのワクチンのほとんどは、以下の理由のために実務の要求に適合することが不十分であるとみなされる：
（ａ）生成が複雑であり、時間がかかり、弱毒化の程度は制御できず、したがって、宿主の感受性への適応が、多くの場合、満たされない。
（ｂ）立法権限により要求される試験方法（臨床試験）も複雑である。
（ｃ）ワクチン接種される集団は限定されている。
【０００３】
対照的に、代謝ドリフト（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｒｉｆｔ）（ＭＤ）によって弱毒化される変異体は以下の利点により特徴付けられる：
（ａ）調製するための費用は低く、増加した世代時間およびそれにより減少したコロニーサイズのそれぞれの所望の選択による弱毒化の程度は、原則として、ほぼ任意である。
（ｂ）家畜のワクチン接種のための３つの弱毒化ＭＤ変異を有する安定な特異的ワクチン株を使用する場合、複雑な試験方法は要求されない。
（ｃ）より小さなロットサイズでも成功する。
【０００４】
ＭＤ弱毒化の進化的原理の重要なデータに関して、以下が強調されなければならない：
（ａ）病原因子対宿主の相互作用は相互の耐性に基づく。感受性の高い宿主は、強毒性の病原因子の弱毒化変異体に偶発的に感染した場合、単一の個体として生存する。宿主集団は少数の生存個体により再活性化する。病原因子は適応された弱毒化株として増殖する。粘液腫症がこのようなプロセスの典型的な例である。結論：細菌集団（ならびに真菌およびウイルスの集団）は、常に、段階的に弱毒化した変異体、とりわけ、いわゆるＭＤ変異体を含有する。
（ｂ）ＭＤ変異体は、定義により、機能障害（すなわち、弱毒化＝適応損失）を生じる代謝区画において変異を有するクローンを表す。結果として、野生株と比較して段階的に減少したコロニーサイズ（クローンに依存する）が見出され得る。通常、これらの変異体は、免疫応答性宿主によって除去されるか、あるいは適応正常細菌叢によって過増殖する。
（ｃ）ＭＤ変異体の減少したコロニーサイズは、（延長した）世代時間および（増加している）弱毒化の程度と逆相関する。
（ｄ）ＭＤ弱毒化試験ワクチンおよびワクチンの説得力のある効果が証明されている。
【０００５】
ＭＤ変異体は、以下のように選択され、単離され得る：
（ａ）例えば、ストレプトマイシン、リファンピシン、ホスホマイシン、フシジン酸、ナリジクス酸の自然発生するＭＤ抗生物質耐性（ＭＤ「ｒｅｓ」）クローン。これらのクローンは毒性耐性クローンに関して１％超の頻度で単離され得る。ＭＤ「ｒｅｓ」および毒性耐性クローンは異なる変異を生じる。したがって、ＭＤ「ｒｅｓ」および弱毒化は機能実体とみなされ得る。
（ｂ）「消滅する（ｄｙｉｎｇ  ｏｆｆ）」培養物中に間接的に蓄積する増加した環境ストレス耐性（ｉｅｔ）変異体。
（ｃ）ストレプトマイシン依存性（Ｓｍｄ）クローンに由来するストレプトマイシン独立性（Ｓｍ−ｉｄ）サプレッサー変異体。これらの２つのマーカー変異体は、ほぼ野生型の病原性から過弱毒化（ミニコロニー）まで、特に段階的に減少したコロニーサイズおよび増加している弱毒化の程度のそれぞれのクローンによって特徴付けられる広範なクローンからなる。一般に、リボゾーム変異は、多かれ少なかれ、通常のミスリーディング（誤訳）を増加させ、排他的サプレッサーもまた、弱毒化を引き起こす。
【０００６】
例えば、生サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）ワクチンによるニワトリの集団の免疫化に関して、ヒトへの感染の連鎖の遮断およびその結果として、ヒト腸炎（ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｅｓ）の減少が主要な目標である。通常、ニワトリは、いかなる臨床症状も示さず、通性病原性サルモネラ菌（および一般にさらにカンピロバクター）に耐性がある。したがって、ニワトリに関してこれらの野生株の低い病原性は、一方でニワトリについての免疫原性であるが、他方でヒトに危害を加えることを排除することを確実にする、中程度の弱毒化を示すワクチン株を必要とする。
【０００７】
ワクチン株の有効性の１つの基準は、例えば、チャレンジ後のコロニー形成の程度の検証可能な減少である。細菌の全ての成分（例えば、外膜タンパク質）を発現するＭＤ弱毒化生ワクチンは、カンピロバクターに関してでさえも、実務的に合わせられた選択肢とみなされ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、低いまたは中程度の弱毒化に調節することによって過弱毒化が回避されるならば、サルモネラ菌およびカンピロバクターなどの通性病原性細菌についての効果的なワクチンを開発することができる。つまり、弱毒化等価物としてコロニーサイズの減少は、野生株のコロニーサイズの約２５％未満の範囲であるべきではない。さらに、この必須条件は、ＷＨＯの安全要件：２つの独立した弱毒変異の存在に起因する安定性と一致しなければならない。マーカー当たりの復帰率は約１０−８である。しかしながら、さらに高い安定性、すなわち過弱毒化ではなく、低い復帰率を示すワクチン株を開発することについての必要性が存在する。不幸にも、生ワクチンの安全性を増加させるためのさらなる変異の導入は、通常、過剰の弱毒化をもたらすので、ワクチンの効果を弱くさせる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明に内在する技術的問題は、増加した安定性によって特徴付けられる改良された生ワクチン株を提供することである。前記技術的問題の解決策は、請求項に特徴付けられている実施形態を提供すること、すなわち少なくとも３つの変異に基づいて増加した安定性を有する改良された生ワクチン株を提供し、さらに、過弱毒化を回避し、所望のレベルに弱毒化の調節を可能にすることによって達成される。実際に、本発明に通じる実験の間、３つ（またはさらにそれ以上）によって特徴付けられるＭＤ弱毒化ワクチン株の使用によって、増加した安定性および２つのＭＤ「ｒｅｓ」弱毒変異を有するワクチン株の弱毒化の程度を超えない弱毒化の程度を示す独立した弱毒変異が生成され得ることが示され得る。本発明の実験において、ストレプトマイシンが使用されたが、本発明に開示される手段はこの抗生物質のみに限定されない。以下に記載される実験は、Ｓｍｄ変異体に由来する、いわゆるＳｍ−ｉｄクローンの使用に基づく。なぜなら、これらの「二重マーカー」変異体（野生株様のコロニーからミニコロニーまでの全ての弱毒化の程度を示すクローンを含む）は、ＭＤ「ｒｅｓ」単一マーカー株の弱毒化の程度に対応する弱毒化の程度を示すワクチン株の生成を可能にするからである。本発明の株（Ｓｍ−ｉｄ／ＭＤ「ｒｅｓ」）は約１０−２４の増加した安定性を示す。
【００１０】
今までのところ、サルモネラ菌およびカンピロバクターのＳｍ−ｉｄ／ＭＤ「ｒｅｓ」ワクチン株は当該分野において記載されていなかった。さらに、２つまたは３つのＳｍ−ｉｄ変異の段階的な組み込みによって生成される４つ、５つまたはさらに６つの弱毒変異を有するワクチン株およびさらなるＭＤ「ｒｅｓ」（Ａ  ａ、Ａ  α）マーカーは新規であり、さらにストレプトマイシンについてそれぞれ、Ｓｍｄ  １→Ｓｍ−ｉｄ  Ｉ→Ｓｍｄ  ａ→Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩ→Ｓｍ−α→Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩＩ（６つの弱毒変異）およびＳｍ−ｉｄ  Ｉ／Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩ／ＭＤ「ｒｅｓ」（５つの弱毒変異）である。
【００１１】
２つ、４つまたは６つのマーカーの組み合わせを有するＳｍ−ｉｄ変異体の特定の範囲の復帰突然変異体（段階的に減少したコロニーサイズ）が：（ａ）野生株のコロニーサイズを有するＳｍ−ｉｄ株、（ｂ）Ｓｍ−ｉｄ  Ｉ様コロニーサイズのコロニーサイズを有するＳｍ−ｉｄ  Ｉ／Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩ株および（ｃ）Ｓｍ−ｉｄ  Ｉ／Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩＩ構築物に対して開始することが見出され、最も大きいコロニーがＳｍ−ｉｄ  Ｉ／Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩ様クローンのみに対応して見出された。したがって、これらは野生株様復帰突然変異体ではない。
【００１２】
原則として、Ｓｍ−ｉｄクローンの生成のための開始株としてのＳｍｄ変異体の選択および単離は最新の当該分野に属する。例えば、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）の通常のＳｍ耐性変異体コロニーの約１０％はＳｍｄクローンである（見かけの生物学的原理として）。しかしながら、これはサルモネラ菌およびカンピロバクターに当てはまらない。耐性を示す変異体のコロニーの中でサルモネラ菌のＳｍｄクローンの見かけの頻度は約０．１％であると報告されるか、またはこのような株の単離はそれぞれ突然変異生成法の使用によってのみ達成可能である。
【００１３】
興味深いことに、約５０００個のＳｍ耐性変異体の分析後、本発明者らは、Ｓｍｄ株を１つも見つけることができなかった。さらに、Ｓｍ−ｉｄ復帰突然変異体の範囲は、Ｓｍｄクローンに依存して変化するので、いくつかのＳｍｄクローンが開始変異体として必要とされることは強調されなければならない。つまり、選択のための一般的な手段が適用できない。
【００１４】
推定上、リボソームＳｍｄ経路は適応の進化的原理であるので、２つの可能な機構を試験した：
（ａ）Ｓｍｄ変異体は、それらの形成後すぐに死滅期に入る。したがって、このような変異体は、例えば、１８時間以下／３７℃培養であるが、４８時間以上３７℃Ｆ培養ではない、対数期培養物のみから単離され得る。
（ｂ）発生状態の間、Ｓｍｄクローンは脆弱であり、ミニコロニー（見落とす可能性もある）として遅い増殖を示す。これらのミニコロニーは、継代の間、「正常増殖」に適応した。
【００１５】
カンピロバクターに関して、Ｓｍｄ−およびＳｍ−ｉｄ変異体に関する利用可能なデータはない。文献において、Ｓｍ耐性変異体に関するいくつかの暗示のみが存在する：高い耐性を示すクローンは、ストレプトマイシンの増加した濃度に対する複数の継代の使用により得られるのみであり得る。ワンステップのＳｍ耐性は２０μｇのストレプトマイシン／ｍｌの濃度の使用によってのみ達成され得る。（７２時間／３９℃の培養物を播種することによって）１００μｇのストレプトマイシン／ｍｌを使用してＳｍ耐性およびＳｍｄ変異体を示す変異体を単離するための本発明者らの実験は失敗した。驚くべきことに、細菌の量の著しい増加にも関わらず、生菌数は、以下の表に示すように２４時間／３９℃から７２時間／３９℃の培養物で著しく減少したことが見出された。
【００１６】
【表１】
0006336461.tif 000002
【００１７】
これらの結果は、カンピロバクターの培養物が培養可能な状態ではないが、生存できるという観察と一致する。
【００１８】
したがって、Ｓｍ耐性を有する変異体は、２４時間以下／３９℃の培養物を播種することによってのみ得られ得る。しかしながら、Ｓｍｄ変異体は正常なサイズまたはわずかに減少したサイズを有する耐性コロニーの中に見出すことができない。しかしカンピロバクターの非常に小さなコロニーおよびミニコロニー（明確に遅れて出現する）の中では、大部分のコロニーはＳｍｄクローンと特徴付けられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】３つの弱毒変異によって特徴付けられるサルモネラ菌ワクチン株の例。プレートのインキュベーションは約２０時間、３７℃であった。（Ａ）サルモネラ・インファンティス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｉｎｆａｎｔｉｓ）（野生株／Ｓｍ−ｉｄ  ４．２２／Ｒｉｆ２（およびＩｅｔ  ４））。
【図１Ｂ】３つの弱毒変異によって特徴付けられるサルモネラ菌ワクチン株の例。プレートのインキュベーションは約２０時間、３７℃であった。（Ｂ）サルモネラ・ビルコウ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｖｉｒｃｈｏｗ）（野生株／Ｓｍ−ｉｄ  ９．３／Ｒｉｆ  ２）。
【図１Ｃ】３つの弱毒変異によって特徴付けられるサルモネラ菌ワクチン株の例。プレートのインキュベーションは約２０時間、３７℃であった。（Ｃ）サルモネラ・ハダー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｈａｄａｒ）（野生株／Ｓｍ−ｉｄ  ４．１／Ｓｍ  ２（およびＲｉｆ  １））。
【図１Ｄ】３つの弱毒変異によって特徴付けられるサルモネラ菌ワクチン株の例。プレートのインキュベーションは約２０時間、３７℃であった。（Ｄ）サルモネラ・パラチフス  Ｂ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ）、バリアントジャバ（ｖａｒｉａｎｔ  Ｊａｖａ）３．２（野生株／Ｓｍ−ｉｄ．１．１／Ｒｉｆ  ３（およびＲｉｆ  ２））。
【図２Ａ】３つの弱毒変異によって特徴付けられるカンピロバクターワクチン株の例。プレートのインキュベーションはそれぞれ、約４８時間および７２時間、３９℃であった。（Ａ）カンピロバクター・コリＩ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ  Ｉ）（野生株／Ｓｍ−ｉｄ  ５．５／Ｐｈｏ  １およびＰｈｏ  ２）。
【図２Ｂ】３つの弱毒変異によって特徴付けられるカンピロバクターワクチン株の例。プレートのインキュベーションはそれぞれ、約４８時間および７２時間、３９℃であった。（Ｂ）カンピロバクター・コリＩＩ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ  ＩＩ）（野生株／Ｓｍ−ｉｄ  １８．１／Ｓｍ  ２）。
【図２Ｃ】３つの弱毒変異によって特徴付けられるカンピロバクターワクチン株の例。プレートのインキュベーションはそれぞれ、約４８時間および７２時間、３９℃であった。（Ｃ）カンピロバクター・ジェジュニＩ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  Ｉ）（野生株／Ｓｍ−ｉｄ  ２．３／Ｐｈｏ  １（およびＰｈｏ  ２））。
【図２Ｄ】３つの弱毒変異によって特徴付けられるカンピロバクターワクチン株の例。プレートのインキュベーションはそれぞれ、約４８時間および７２時間、３９℃であった。（Ｄ）カンピロバクター・ジェジュニＩＩ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ＩＩ）（野生株／Ｓｍ−ｉｄ  ２．１／Ｓｍ  ２）。
【図３Ａ】（２）、４、５または６つの弱毒変異によって特徴付けられるサルモネラ菌ワクチン構築物の例。プレートのインキュベーションは約２０時間、３７℃であった。（Ａ）サルモネラ・ビルコウ：  野生株／Ｓｍ−ｉｄ  Ｉ  １．４／Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩ  ０．３／Ｓｍ  ４；  野生株／Ｓｍ−ｉｄ  Ｉ  １．４／Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩ  ０．３／Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩＩ  ０．ｘ。
【図３Ｂ】（２）、４、５または６つの弱毒変異によって特徴付けられるサルモネラ菌ワクチン構築物の例。プレートのインキュベーションは約２０時間、３７℃であった。（Ｂ）サルモネラ・インファンティス：  野生株／Ｓｍ−ｉｄ  Ｉ  ４．２２／Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩ  ０．１／Ｒｉｆ  ２；  野生株／Ｓｍ−ｉｄ  Ｉ  ４．２２／Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩ  ０．１／Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩＩ  １．１。
【図４Ａ】（２）、４、５または６つの弱毒変異によって特徴付けられるカンピロバクターワクチン構築物の例。プレートのインキュベーションは約４８時間、３９℃であった。（Ａ）カンピロバクター・コリＩＩ野生株／Ｓｍ−ｉｄ  Ｉ  １８．１／Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩ  ａ．１。この株は、第２のＳｍ−ｉｄ  ａ．１変異がＳｍ耐性を生じることにより特徴付けられる。
【図４Ｂ】（２）、４、５または６つの弱毒変異によって特徴付けられるカンピロバクターワクチン構築物の例。プレートのインキュベーションは約４８時間、３９℃であった。（Ｂ）カンピロバクター・コリＩＩ野生株／Ｓｍ−ｉｄ  Ｉ  １７．７／Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩ  ａ．１／Ｐｈｏ  １、野生株／Ｓｍ−ｉｄ  Ｉ  １７．７／Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩ  ａ．１／Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩＩ  α．１。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
したがって、本発明は、少なくとも３つ（および最大で６または７つ）の弱毒変異を保持している安定な細菌を含有する細菌生ワクチンを生成するための方法であって、以下の工程：
（ａ）細菌株を準備し、前記株を第１の抗生物質、好ましくはストレプトマイシンの存在下で増殖させる工程と、
（ｂ）前記第１の抗生物質に依存するクローンに対応するような「ミニ」コロニーを（ａ）の株から単離する工程と、
（ｃ）前記第１の抗生物質の非存在下で（ｂ）のクローンを増殖させ、野生株のコロニーサイズの５０％以上であるコロニーサイズによって特徴付けられる弱毒化した復帰突然変異体を単離する工程と、
（ｄ）適切な濃度、好ましくはほぼ１０倍のＭＩＣを有する、第１の抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ゲンタマイシン、アミカシンおよびトブラマイシンなどのアミノグリコシド；リファンピシン、フシジン酸、ナリジクス酸、ホスホマイシン）とは異なり得る第２の抗生物質を補った培地中で工程（ｃ）において得られたクローンを増殖させる工程と、
（ｅ）減少したサイズ（ＭＤ  Ａ「ｒｅｓ」）を示すコロニーを単離し、連続的に継代する工程と、
（ｆ）安定な特性としてコロニーサイズを段階的に減少するクローンを単離する工程と
を含む、方法を提供する。
【００２１】
工程（ａ）の細菌株は、好ましくは、「野生」毒性株から得られる。これらの株は、疾患動物（例えば、ニワトリ）から得られ得る。使用される開始天然株は特定の程度の毒性を有するはずである。
【００２２】
工程（ａ）の変異体を選択するための抗生物質の選択は実務上の性質の理由によって誘導される。例えば、ストレプトマイシンは、微生物の中の耐性の発生および依存株を急速に導くことが知られている。
【００２３】
したがって、本発明の方法の好ましい実施形態において、工程（ａ）の抗生物質はストレプトマイシンである。しかしながら、ネオマイシン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ゲンタマイシン、アミカシンおよびトブラマイシン、ならびにリファンピシン、フシジン酸およびナリジクス酸などの他のアミノグリコシド抗体もまた、工程（ａ）の抗生物質として好適であり得る。
【００２４】
抗生物質に対する耐性は異なる修飾機構から生じ得ることが知られている。特に、遺伝子修飾は細菌の染色体に影響を与え得る。染色体修飾は、一旦実施すると、獲得した特性の安定性を保証する、稀な事象である。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「ミニコロニー」という用語は、サイズの減少によって特徴付けられる細菌コロニーに関する。好ましくは、それらは対応する野生株コロニーの１０％以下のサイズによって特徴付けられる。
【００２６】
抗生物質を含有する培地上での増殖基準に応じた弱毒化細菌株の選択は、特に、減少した毒性を有する株の出現を引き起こす目的を有する種々の種のために使用されている操作である。
【００２７】
少なくとも３つ（および最大で６または７つ）の弱毒変異によって特徴付けられる本発明に係る細菌株は、第１の位置において、ストレプトマイシンなどの抗生物質の高含有量を有する培地上でのそれらの増殖能力について、天然毒性株から選択される非毒性株であり、さらに、それらは抗生物質の存在下で十分に発生するのみであり得る（工程（ｂ））。この理由のために、これらの株は、例えば、ストレプトマイシン（Ｓｍｄ変異体）に依存すると言われる。
【００２８】
第２の場所において、工程（ｃ）の株は、抗生物質依存株から選択され、特に、第２の弱毒変異またはマーカーの導入に起因してストレプトマイシンの非存在下で発生できる変異体である。これらの株はＳｍ−ｉｄ株と呼ばれる。好ましくは、洗浄工程が工程（ｂ）と（ｃ）との間で実施される。工程（ｃ）についての好ましい培地は、サルモネラ菌Ｃａｓｏ（ＳＣ）培地（例えば、サルモネラ菌について）またはＣａｓｏ培地（例えば、カンピロバクターについて）である。
【００２９】
工程（ｄ）は、さらなるＭＤ抗生物質耐性（「ｒｅｓ」）変異（第３の弱毒マーカーとして）を導入することを可能にする。好ましくは、抗生物質は、ストレプトマイシン、リファンピシンまたはホスホマイシンである。工程（ｄ）における抗生物質の濃度は慣例の手順に従って当業者によって決定され得る。好ましくは、サルモネラ菌に関して、リファンピシン、ストレプトマイシン（注記：大部分のＳｍ−ｉｄ変異体はストレプトマイシン感受性であり、したがってさらなるＭＤ  Ｓｍ「ｒｅｓ」マーカーに適している）およびホスホマイシンの濃度は約１０倍のＭＩＣ値に対応し、フシジン酸について約４倍のＭＩＣ値に対応する。好ましくは、カンピロバクターについて、少なくとも２００μｇのホスホマイシン／ｍｌおよび少なくとも１００μｇのストレプトマイシン／ｍｌがそれぞれ使用される。
【００３０】
工程（ｅ）において、さらなる減少したわずかなコロニーサイズによって特徴付けられる以前の工程のＳｍ−ｉｄ／ＭＤ抗生物質「ｒｅｓ」株が単離され、安定性を検査するために連続的に継代される。好ましくは、少なくとも３０回の連続継代が実施される。
【００３１】
最後に、工程（ｆ）において、安定な特性としてコロニーサイズを徐々に減少する工程（ｅ）から単離されたクローンが提供される。
【００３２】
本発明の方法の好ましい実施形態において、工程（ａ）〜（ｃ）は、少なくとも４つの弱毒変異を保持している細菌を生成するために少なくとも１回反復される。この方法により、例えば、以下のスキーム（Ｓｍについて示す）：
（ａ）Ｓｍｄ  １  →  Ｓｍ−ｉｄ  Ｉ  →  Ｓｍｄ  ａ  →  Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩ；
（ｂ）Ｓｍｄ  １  →  Ｓｍ−ｉｄ  Ｉ  →  Ｓｍｄ  ａ  →  Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩ  →  Ｓｍｄ  α  →  Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩＩ；
（ｃ）Ｓｍｄ  １  →  Ｓｍ−ｉｄ  Ｉ  →  Ｓｍｄ  ａ  →  Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩ  →  Ｓｍｄ  α  →  Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩＩ  →  ＭＤ
抗生物質「ｒｅｓ」に従って、新たな弱毒変異体を生成することができる。
【００３３】
驚くべきことに、４またはさらに６つの変異を保持しているＳｍ−ｉｄ変異体由来の株は、これらの弱毒変異を有する株と比較して、高い程度の弱毒化を示さないが、さらにより高い安定性であること見出された。
【００３４】
本発明に従ってＭＤ抗生物質「ｒｅｓ」変異体株を選択するための抗生物質の選択は、実務上の性質の理由によって誘導され、原則として、代謝ドリフト（ＭＤ）変異を誘導できる任意の抗生物質、例えば、ストレプトマイシン（注記：大部分のＳｍ−ｉｄ変異体はストレプトマイシン感受性であり、したがってさらなるＭＤ  Ｓｍ「ｒｅｓ」マーカーに適している）、リファンピシン、ホスホマイシン、フシジン酸またはナリジクス酸が、本発明の目的のために使用され得る。
【００３５】
本発明の方法は特定の細菌に限定されない。サルモネラ種およびカンピロバクター種以外に、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌、バチルス・セレウス（シュードアントラクス（Ｐｓｅｕｄｏａｎｔｈｒａｘ））、ペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）などのエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐ．）、クエブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐ．）、エロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）／アビバクテリウム属（Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、リエメレラ属（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ  ｓｐ．）、オルニソバクテリウム・ライノトラキア（Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐ）およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ）などの他の細菌もまた、本発明の方法に従って安定な細菌を含有する細菌生ワクチンを生成するために使用されてもよい。
【００３６】
しかしながら、好ましい細菌は、サルモネラ菌および／またはカンピロバクター、特に、サルモネラ・ボンゴール（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ    ｂｏｎｇｏｒｉ）、Ｓ．エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）亜種エンテリカ（ｅｎｔｅｒｉｃａ）、アリゾナ（ａｒｉｚｏｎａｅ）、ジアリゾナ（ｄｉａｒｉｚｏｎａｅ）、サラマ（ｓａｌａｍａｅ）、ホウテネ（ｈｏｕｔｅｎａｅ）およびインディカ（ｉｎｄｉｃａ）、好ましくは、以下の血清型：ダブリン（Ｄｕｂｌｉｎ）、ガリナルム（Ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）（次亜種ガリナルムおよびプルロム（Ｐｕｌｌｏｒｕｍ））、コレラスイス（Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、チフィスイス（Ｔｙｐｈｉｓｕｉｓ）、チフス（Ｔｙｐｈｉ）、パラチフス（Ｐａｒａｔｙｐｈｉ）Ａ、Ｂ、Ｃ、アボルツセキ（Ａｂｏｒｔｕｓｅｑｕｉ）、アボルツソビス（Ａｂｏｒｔｕｓｏｖｉｓ）、アボニ（Ａｂｏｎｙ）、エンテリティディス（Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、チフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、コペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）、インファンティス（Ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビルコウ（Ｖｉｒｃｈｏｗ）、ハダー（Ｈａｄａｒ）、アゴナ（Ａｇｏｎａ）、ニューポート（Ｎｅｗｐｏｒｔ）、アナツム（Ａｎａｔｕｍ）、ハイデルベルグ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、パナマ（Ｐａｎａｍａ）、インディアナ（Ｉｎｄｉａｎａ）、セントポール（Ｓａｉｎｔｐａｕｌ）、ブランデンブルグ（Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ）などのＳ．エンテリカ亜種エンテリカ、ならびにカンピロバクター・コリ、カンピロバクター・ジェジュニ、およびカンピロバクター・フィタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ）である。
【００３７】
本発明の方法の好ましい実施形態において、工程（ａ）および（ｂ）において、サルモネラ菌変異体は、対数期培養物から、３７℃のインキュベーションにて少なくとも４８時間または４８時間超の後、出現し始めるミニコロニーとして単離される。
【００３８】
本発明の方法のさらなる好ましい実施形態において、工程（ａ）および（ｂ）において、カンピロバクター変異体は、３９℃のインキュベーションにて少なくとも７２時間または７２時間超の後に出現し始めるミニコロニーとして単離される。
【００３９】
本発明はまた、本発明の方法によって得られる生細菌株ならびに本発明の生細菌株および生物学的に許容可能な担体を含むワクチンも提供する。ワクチン接種組成物は、もちろん、新たに培養された細菌によって構成され得る。
【００４０】
好ましくは、本発明のワクチン組成物は凍結乾燥される。
【００４１】
ワクチン接種細菌を投与するために、それらが懸濁される培地は重要ではない。もちろん、この培地は、それらが含有する細菌の良好な生存能力を妨げてはいけない。
【００４２】
本発明のワクチンは、個体の免疫化に適した量で投与され、１種以上の一般的な補助剤をさらに含有してもよい。「個体の免疫化に適した量」という利用されている用語は、個体が免疫化され得る細菌の任意の量を含む。「個体の免疫化に適した量」は当業者に公知の方法を使用して決定され得る。本明細書で使用される場合、「個体」という用語は、任意の種類の個体を含む。このような個体の例は動物（およびヒトである）。
【００４３】
好ましいワクチンの投与は経口経路であるが、注射も、筋肉内、皮下、皮内または任意の他の形態の適用で個体の様々な部位になされてもよい。ほぼ等量を有する１回以上の「ブースター注射」を実施することも有益であり得る。
【００４４】
本発明のワクチンは、化合物が、感染またはコロニー形成、例えば、サルモネラ菌またはカンピロバクターによって引き起こされる感染／コロニー形成の発生を予防または遅延するために投与されるという点で予防的であってもよい。
【００４５】
以下の株は、ブダペスト条約の下で、２０１２年、１１月２７日にＧｅｒｍａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  ２５  Ｍｉｋｒｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託されている。
【００４６】
【表２】
0006336461.tif 000003
【実施例】
【００４７】
以下の実施例はより詳細に本発明を説明する。
実施例１
物質
（Ａ）株
サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血清型ビルコウ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｖｉｒｃｈｏｗ）、
サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血清型インファンティス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｉｎｆａｎｔｉｓ）、
サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血清型ハダー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｈａｄａｒ）、
サルモネラ・パラチフス  Ｂ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ）（ｖａｒ．Ｌ−Ｔａｒｔｒａｔ＋、以前はＪａｖａ）、
カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）（Ｌｏｈｍａｎｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｃｕｘｈａｖｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙによって提供された）。
【００４８】
（Ｂ）培地
１０００ｍｌのカンピロバクター培地（Ｃａｓｏ培地）は、３５ｇのＣａｓｏ寒天（Ｓｉｆｉｎ）、３ｇの酵母エキス、３ｇのカゼイン加水分解物、４ｇの活性炭、０．２５ｇのＦｅＳＯ４、０．２５ｇのピルビン酸ナトリウム、５ｇの寒天Ｋｏｂｅ（Ｒｏｔｈ）を含有する。
【００４９】
１０００ｍｌのサルモネラ菌培地（ＳＣ培地）は、３５ｇのＣａｓｏ寒天（Ｓｉｆｉｎ）、３ｇの酵母エキス、１ｇのグルコース、５ｇの寒天Ｋｏｂｅ（Ｒｏｔｈ）を含有する。
【００５０】
（Ｃ）抗体
ストレプトマイシン（Ｓｍ）（Ｒｏｔｈ番号０２３６．２）、ホスホマイシン（Ｐｈｏ）（Ｓｉｇｍａ番号Ｐ５３９６）、リファンピシン（Ｒｉｆ）（Ｒｉｅｍｓｅｒ  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ  ＡＧ、Ｆａｔｏｌ  Ｅｒｅｍｆａｔ  ６００ｍｇ）
【００５１】
（Ｄ）野生型株のＭＩＣ値
【表３】
0006336461.tif 000004
【００５２】
実施例２
Ｓｍｄ変異体の選択および単離
（ａ）サルモネラ菌のＳｍｄ変異体の実務的に合わせられた単離
サルモネラ菌の１８時間／３７℃培養物の約１０１０ｃｆｕを、５００μｇのストレプトマイシン／ｍｌを補ったＳＣ寒天を含有するペトリ皿に入れた。正常なサイズおよびわずかに減少したサイズを有する単一のコロニー（毒性Ｓｍ耐性コロニーおよびＭＤ  Ｓｍ「ｒｅｓ」コロニー）を有するコロニーを除いて、株に依存して頻度を変動する「ミニコロニー」（大部分は小さなコロニーバリアント＝ｓｃｖ）が検出できる。（３７℃にて）約４８時間以上のインキュベーション時間後、１〜２個のさらなるミニコロニー（正常なサイズを有する約３０個のコロニーおよびわずかに減少したサイズを有するコロニー当たり）が検出でき、それらはｓｃｖと区別できない。ｓｃｖ表現型の出現の頻度に依存して、これらのミニコロニーのうちの３％〜２０％は、Ｓｍｄ変異体を表すことが示され得る。
【００５３】
耐性変異体に対するＳｍｄクローンの算出した頻度は１％以上であった。
【００５４】
注記：Ｓｍｄクローンの単離は出発物質としてＳｍ感受性野生型株の使用によって達成される。株は、好ましくは、低いＭＩＣ値を有する。
【００５５】
（ｂ）カンピロバクターのＳｍｄ変異体の実務的に合わせられた単離
円盤の表面全体が覆われるように接種したＣａｓｏ寒天ペトリ皿培養物（２４時間／３９℃；約１０１０ｃｆｕ）から得た細菌物質を、１００μｇのストレプトマイシン／ｍｌを補った１または２個のＣａｓｏ寒天ペトリ皿上に播種し、３９℃にて７２時間インキュベートした。株に依存して、正常なサイズを有する１０以下のコロニー／プレート（平均値）およびわずかに減少したサイズを有するコロニー（ストレプトマイシン耐性およびＭＤ  Ｓｍ「ｒｅｓ」コロニー）が検出可能であった。さらに、正常なサイズを有するコロニーおよびわずかに減少したサイズを有するコロニーと比較して、約２０％の頻度を有する明らかに減少したサイズを有するコロニー（直径は正常なサイズの２５％以下である）が検出できた。これらのコロニーの約３分の１はＳｍｄクローンであった。
【００５６】
耐性変異体に対してＳｍｄクローンの算出した頻度は５％以上であった。
【００５７】
実施例３
Ｓｍ−ｉｄ変異体の選択および単離
（ａ）Ｓｍｄクローン由来のサルモネラ菌Ｓｍ−ｉｄ変異体の単離
洗浄したＳｍｄ変異体の約１０９ｃｆｕ（ペトリ皿当たり）をＳＣ培地に播種し、３７℃にて４８時間インキュベートした。得られた弱毒化復帰突然変異体から、さらに試験したこのような変異体のみは、（低い弱毒化のみを有するＳｍ−ｉｄクローンを得る目的に従った）野生型株コロニーと比較して約５０％以上のコロニーサイズを示した。
【００５８】
（ｂ）Ｓｍｄクローン由来のカンピロバクターＳｍ−ｉｄ変異体の単離
円盤の表面全体が覆われるように接種したＣａｓｏ寒天（１００μｇのストレプトマイシン／ｍｌを補った）ペトリ皿培養物（２４時間／３９℃）から得た細菌物質を１回の洗浄工程に供し、１：１（約３×１０９ｃｆｕ）から１：４の比でＣａｓｏ培地に入れ、次いで３９℃にて７２時間インキュベートした。これらの培養条件下で、大部分のＳｍｄクローンは、１０以下の弱毒化復帰突然変異体（平均）の発生を示した。これらの弱毒化復帰突然変異体のほとんどはＳｍ感受性であった。一般に、野生型株コロニーと比較して約５０％以上の減少したコロニーサイズを示すＳｍ−ｉｄクローンをさらに処理した。
【００５９】
いくつかの株、例えば、カンピロバクター・ジェジュニは、野生型株と比較して５０％以下のコロニーサイズを有するＳｍ−ｉｄからのみの単離を可能にした。
【００６０】
注記：全てのカンピロバクター株およびそれら由来のＳｍｄ変異体は、あらゆる問題を生じずにＳｍ−ｉｄ復帰突然変異体の単離を可能にしなかった。しかしながら、例えば、数個の独立したＳｍｄ変異体を使用して、問題のある株由来のＳｍ−ｉｄ復帰突然変異体も単離することはできる。
【００６１】
実施例４
さらなるＭＤ抗生物質「ｒｅｓ」変異体の単離
弱毒化および認識の第３のマーカーとして選択したＳｍ−ｉｄ変異体におけるさらなるＭＤ抗生物質「ｒｅｓ」変異体の組み込みを上記のように実施した。
【００６２】
簡潔に述べると、
（ａ）サルモネラ菌：選択したＳｍ−ｉｄクローンの１０９−１０ｃｆｕを、リファンピシンまたはストレプトマイシンの約１０倍のＭＩＣ値濃度（フシジン酸に関して、約４倍のＭＩＣ値濃度）をそれぞれ補ったＳＣ培地でインキュベートし、３７℃にて４８時間インキュベートした。
（ｂ）カンピロバクター：全表面を覆うようにＳｍ−ｉｄ変異体を接種し、３９℃にて２４時間インキュベートしたペトリ皿培養物（Ｃａｓｏ培地）の物質を、２００μｇのホスホマイシン／ｍｌまたは１００μｇのストレプトマイシン／ｍｌを補ったＣａｓｏ培地で１：４から１：８の比で入れ、３９℃にて７２時間以上インキュベートした。
【００６３】
（多かれ少なかれ）減少したサイズを示すコロニーを単離し、連続継代に供した。これらのコロニーの約２０％は、安定な特徴としてコロニーサイズを特に段階的に減少するクローンを維持した。
【００６４】
実施例５
４または６つの弱毒化変異を有するワクチン株の生成
４または６つの弱毒化変異を有するワクチン株の生成は、第２、および任意に第３のＳｍ−ｉｄサプレッサー変異を基礎Ｓｍ−ｉｄ  Ｉクローン：Ｓｍ−ｉｄ  Ｉ／Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩ／Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩＩ内に連続的に組み込むことによって達成した。
【００６５】
（ａ）サルモネラ菌：約１０１０ｃｆｕの基礎Ｓｍ−ｉｄ  Ｉ変異体（またはＳｍ−ｉｄ  ＩＩ開始株）を５００μｇのストレプトマイシン／ｍｌを補ったＳＣ培地に入れ、３７℃にて４８時間インキュベートした。約５％のＳｍ耐性コロニーはＳｍｄ変異体である（ここで、「正常なサイズ」を有するコロニーとして最初に増殖する）。それぞれＳｍ−ｉｄ  Ｉ株およびＳｍ−ｉｄ  ＩＩ株に由来するこれらのＳｍｄクローンの使用によって、Ｓｍ−ｉｄ変異体を実施例３（ａ）に記載されているアプローチに従って再び単離した。所望のコロニーサイズの減少を有するクローンをさらに処理した。
【００６６】
（ｂ）カンピロバクター：表面全体が覆われるようにＳｍ−ｉｄ変異体を接種し、３９℃にて２４時間インキュベートしたＣａｓｏ培地のペトリ皿培養物から得た物質を、１００μｇのストレプトマイシン／ｍｌを補ったＣａｓｏ培地に１：４の比に入れ、３９℃にて７２時間インキュベートした。「正常なサイズ」を有する約１５個のＳｍ耐性コロニーを除いて、２から３個の小さなコロニーが検出できた。これらのコロニーのうちの５０％はＳｍｄクローンであった。これらのＳｍｄクローン（それぞれＳｍ−ｉｄ  Ｉ株およびＳｍ−ｉｄ  ＩＩ株に由来する）を、再びＳｍ−ｉｄ変異体を単離することについて、実施例３（ｂ）に従って開始クローンとして使用した。所望のコロニーサイズの減少を示すクローンをさらに処理した。
【００６７】
実施例６
選択したＳｍ−ｉｄ  ＩＩ変異体由来のＭＤ抗生物質「ｒｅｓ」変異体の単離
（ａ）サルモネラ菌：さらなる５回目の弱毒化および認識マーカーとして選択したＳｍ−ｉｄ  Ｉ／Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩ変異体内への有益なＭＤ抗生物質「ｒｅｓ」変異の組み込みを、実施例４（ａ）に記載されているアプローチに従って同様に実施した。
【００６８】
（ｂ）カンピロバクター：さらなる５回目の弱毒化および認識マーカーとして選択したＳｍ−ｉｄ  Ｉ／Ｓｍ−ｉｄ  ＩＩ変異体内への変異内への有益なＭＤ抗生物質「ｒｅｓ」変異の組み込みを、実施例４（ｂ）に記載されているアプローチに従って同様に実施した。
【００６９】
注記：上記のアプローチはまた、弱毒化および認識のための７回目のマーカーとして選択したＳｍ−ｉｄ  ＩＩＩ変異体（６個の弱毒化変異を有する）内へのＭＤ抗生物質「ｒｅｓ」変異のさらなる組み込みのために使用され得る。しかしながら、これは、実務に対する関連性を妨げ得る、過弱毒化を生じる場合がある。
【００７０】
実施例７
弱毒化の推定程度の予め適応された評価についての棒グラフに変換されたコロニーサイズ
対応する野生型株およびこれらの株由来のＭＤ変異体の懸濁液を対数的に希釈し、次いでペトリ皿当たり１０〜５０ウェルの定義可能な単一コロニーが得られ得るように培養培地上に播種した。希釈の等級当たり少なくとも５個のペトリ皿を、培地に起因する増殖の差を補償するために調製する。標準下した条件（例えば、同一のインキュベーション時間、培地の同一の層厚さ）下で増殖させた単一コロニーを撮影する。デジタル写真をＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒプログラム（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で処理する：個々のコロニーの直径を決定し、保存する。値を平均化した後、データを野生型株コロニーのサイズ（１００％として与える）に対して棒グラフとしてプロットする。
【００７１】
実施例８
安定なワクチン株からのワクチンの調製ならびにニワトリのヒヨコ／ニワトリおよび保護されるさらなる宿主のそれぞれのワクチン接種のための使用
生ワクチンを調製するために、３つ（それぞれ４、５および６つ）の弱毒変異を有するワクチン株を、対数増殖期まで一般的な液体培地中で増殖させた。ワクチン懸濁液およびワクチン堆積物にそれぞれ適切な安定化剤を補い、続いて凍結乾燥した。得られたワクチンを経口または非経口投与によって投与した（症状の種類に応じて、１、２または３回の用量）。
【図１Ａ】
0006336461.tif 000005
【図１Ｂ】
0006336461.tif 000006
【図１Ｃ】
0006336461.tif 000007
【図１Ｄ】
0006336461.tif 000008
【図２Ａ】
0006336461.tif 000009
【図２Ｂ】
0006336461.tif 000010
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
0006336461.tif 000012
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0006336461.tif 000014
【図４Ａ】
0006336461.tif 000015
【図４Ｂ】
0006336461.tif 000016