(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅工程に先立ち固相抽出法を用いて核酸を抽出する前処理方法であって、
処理対象と、前記処理対象に含まれる核酸を抽出する抽出液と、シリカ粒子と、濾過材とを接触させ、前記濾過材に前記核酸と前記シリカ粒子との複合体を担持させ、核酸増幅反応液を用いる核酸増幅工程へ送出する前処理方法であって、
前記シリカ粒子の粒径及び前記核酸増幅反応液中における前記シリカ粒子の濃度を一定範囲内とすることにより、前記核酸増幅工程に先立つ乾燥工程及び溶出工程を不要とし、
前記一定範囲が、シリカ粒子濃度が０．０６２５〜４μｇ／μｌ、平均粒径が０．０１〜１００μｍ、且つ、平均粒径から求められる表面積が１×１０4〜１×１０8μｍ2であることにより、前記処理対象に含有されていた核酸量を１００％とした場合の回収率が５〜３８％であり、
前記抽出液に前記処理対象を添加し、前記処理対象に含まれる核酸を抽出する抽出工程と、
前記抽出された核酸に前記シリカ粒子を接触させて、前記核酸と前記シリカ粒子との複合体を得ると共に前記複合体を前記濾過材に接触させる吸着工程と、
前記複合体と前記濾過材とを精製水で洗浄し、洗浄され且つ湿潤状態にある前記複合体と前記濾過材とを前記核酸増幅工程に送出する洗浄工程とを含む前処理方法。
【請求項２】
核酸増幅工程に先立ち固相抽出法を用いて核酸を抽出する前処理方法であって、
処理対象と、前記処理対象に含まれる核酸を抽出する抽出液と、シリカ粒子と、濾過材とを接触させ、前記濾過材に前記核酸と前記シリカ粒子との複合体を担持させ、核酸増幅反応液を用いる核酸増幅工程へ送出する前処理方法であって、
前記シリカ粒子の粒径及び前記核酸増幅反応液中における前記シリカ粒子の濃度を一定範囲内とすることにより、前記核酸増幅工程に先立つ乾燥工程及び溶出工程を不要とし、
前記一定範囲が、シリカ粒子濃度が０．０６２５〜１μｇ／μｌ、平均粒径が０．０１〜１０μｍ、且つ、平均粒径から求められる表面積が１×１０5〜５×１０7μｍ2であることにより、前記処理対象に含有されていた核酸量を１００％とした場合の回収率が５〜３８％であり、
前記抽出液に前記処理対象を添加し、前記処理対象に含まれる核酸を抽出する抽出工程と、
前記抽出された核酸に前記シリカ粒子を接触させて、前記核酸と前記シリカ粒子との複合体を得ると共に前記複合体を前記濾過材に接触させる吸着工程と、
前記複合体と前記濾過材とを精製水で洗浄し、洗浄され且つ湿潤状態にある前記複合体と前記濾過材とを前記核酸増幅工程に送出する洗浄工程とを含む前処理方法。
【請求項３】
前記濾過材を前記核酸増幅工程に送出するに先立ち、前記濾過材と前記複合体とを分離し、前記分離された複合体を前記核酸増幅工程に送出する請求項１又は２記載の前処理方法。
【請求項４】
前記吸着工程と前記洗浄工程とを一度に行う請求項１又は２記載の前処理方法。
【請求項５】
前記抽出工程と前記吸着工程とを一度に行う請求項１又は２記載の前処理方法。
【請求項６】
前記抽出工程と前記吸着工程と前記洗浄工程とを一度に行う請求項１又は２記載の前処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅工程に先立ち、固相抽出法を用いて核酸を抽出する前処理方法に関する。なお、核酸増幅工程は、標的とする核酸の塩基配列を検出又は同定するためのものである。更に詳しくは、本発明は、特別な理化学機器なしにＰＯＣＴ化を実現できるものである。
【０００２】
ＰＯＣＴとは、Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇの略であり、被検者の傍らで、あるいは被検者自らが行う検査である。これによれば、検査時間を短縮し、その場で被検者自身が結果を確認できる。日本臨床検査自動化学会は、ＰＯＣＴガイドラインにおいて、ＰＯＣＴを、「迅速かつ適切な診療・看護、疾病の予防、健康管理などの医療の質、ＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ）および満足度の向上に資するための検査」と定義する。
【背景技術】
【０００３】
近年、生命科学分野の発展は著しく、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸の解析技術は、広く利用されている。
【０００４】
核酸の解析技術は、生物学分野（生物種の同定や起源の研究など）、医療分野（病気の診断など）及び日常生活に近い分野（食糧の安全性の確認など）において広く利用されている。
【０００５】
医療分野における病気の診断、特に、早期の感染症の迅速診断において、核酸の解析技術のうちＰＣＲ法や等温核酸増幅法などを使用して標的核酸（例えば、自己に存在しない外来遺伝子の特徴的な遺伝子配列やその他の特定配列など）を増幅し解析する技術（以下「遺伝子検査」という。）は、従来の感染症診断技術である培養検査や免疫検査（抗原又は抗体などを使用した検査）などと比べて高感度である。
【０００６】
遺伝子検査を用いると、ヒトに感染症を引き起こす原因となるほとんどの細菌、真菌、原虫、及び、ウイルスなどの原因微生物を、検出又は同定することが可能である。
【０００７】
故に、遺伝子検査は、感染症の早期診断に有用な検査方法と考えられており、基幹病院など検査室を持つ大きな病院、衛生研究所、大学や企業などの研究施設、その他の人員が充実した施設など、専用の検査室又は実験室を持つ施設において頻用されている。
【０００８】
株式会社富士経済は、「２０１２臨床検査市場Ｎｏ．３細菌・遺伝子・ＰＯＣ・病理検査」において「遺伝子検査市場は、２０１３年度以降も年率２〜３％程度の拡大推移が予想される。」と指摘しており、遺伝子検査市場は感染症早期診断の観点のみでなく、経済活動の観点からもその重要度を増すと考えられる。
【０００９】
一般の人が受診する機会の多い医療施設、例えば、町の個人病院又は診療所などにおいて、遺伝子検査はほとんど利用されていない。
【００１０】
その理由は、次のようなものである。第１に、遺伝子検査は、その実施前に試薬調製や核酸の抽出の操作のように煩雑で手間がかかり、施設の負担が大きい。
【００１１】
第２に、遺伝子検査を行うには、核酸の抽出のために遠心機やマイクロピペットなどの理化学機器や自動化機器が必要になり、初期投資費及び維持管理費が高額となる。
【００１２】
第３に、施設内の医師や看護師などが、遺伝子検査に十分に習熟しているとは言えない。
【００１３】
その一方、ＰＯＣＴに対応した検査キットであって遺伝子検査に関係しないもの（例えば、標識抗体法、免疫比濁法、ラテックス凝集法、及び、イムノクロマトグラフィー法などによるもの）は、上記のような施設でも広く利用されている。厚生労働省が平成２１年１２月に発表した集計によれば、インフルエンザ抗原迅速検査キットの生産実績は、前シーズンの生産出荷数が約１３００万テストにのぼっている。
【００１４】
核酸を標的とする遺伝子検査は、免疫検査より感度が高く、感染症における早期の迅速診断に非常に有効である。
【００１５】
残念ながら、遺伝子検査に使用できるＰＯＣＴキット乃至それに準ずるキットは、現在に至るも存在しない。
【００１６】
このため、小さな施設では、遺伝子検査を行えず、検体を回収し、外部施設による検査にゆだねており、遺伝子検査結果を迅速に得ることはできない。
【００１７】
遺伝子検査に使用できるＰＯＣＴキット及びそのための方法を開発できれば、小さな施設であっても迅速な遺伝子検査結果を得られることになり、有用性が極めて高い。
【００１８】
現在の遺伝子検査法は、大きく次の３つの工程に分割できる。第１の工程（前処理）では、検体を採取した後、検体中でタンパク質の殻や膜などに抱合された核酸を露出させ、有機溶媒や固相担体などを用いてタンパク質などの夾雑物を洗浄又は分離を行い、核酸のみを単離する。
【００１９】
第２の工程（標的核酸の増幅）では、分離した核酸を鋳型にしてＰＣＲ反応やＬＡＭＰ反応などの核酸増幅反応法を用いて標的核酸を増幅する。
【００２０】
第３の工程（検出及び解析）では、増幅反応中又は反応後に、増幅した標的核酸又はそれに結合するマーカーなどを使用して、定性又は定量する。
【００２１】
第１の工程を容易にするための自動化機器が存在する。
【００２２】
しかしながら、第１の工程の自動化機器は、高額であるなどの理由から、現在でもあまり普及していない。
【００２３】
現実には、自動化機器よりも比較的安価に実施することが可能な用手法により前処理が行われることが多い。
【００２４】
しかしながら、用手法は、遠心機やマイクロピペットなどの機器の使い方やサンプルの扱い方などの手技の習熟を必要とするなど、実施者に対して操作の負担が重い。
【００２５】
この用手法を簡便化しＰＯＣＴ化できる手法やキットは知られていない。
【００２６】
自動化機器において用いられる固相抽出法の代表的なものの１つに、Ｂｏｏｍらが報告した方法（以下「ＢＯＯＭ法」と言う。）（非特許文献１、特許文献１参照。）がある。
【００２７】
ＢＯＯＭ法は、カオトロピック剤の存在下で核酸がシリカビーズに吸着する現象であるカオトロピック効果（非特許文献２）を基本原理にした、生体試料から核酸を単離するための固相抽出法である。
【００２８】
この方法によれば、固相担体から核酸を溶出することなく固相担体ごと核酸をＰＣＲ反応液へ添加すること（特許文献２）もでき、溶出工程の一部を簡略化することもできるが、検査室などの核酸の抽出を実施する環境が整備されていることが前提となる。
【００２９】
特許文献３は、次のように記載している。即ち、「本発明の目的は、生物材料から有機溶媒を使用することなく、簡便に、短時間に、さらに安全に、かつ再現性よくリボ核酸を抽出する方法並びにそのための試薬を提供することである。リボ核酸の場合、デオキシリボ核酸とは異なり、固相担体に吸着させた後、エタノール等の有機溶媒を全く含まない低塩濃度緩衝液にて洗浄しても、容易に固相担体から溶離せず、加熱することによって初めて溶離が促進される。本発明における第２の工程は、第１の吸着工程によりリボ核酸が吸着した固相担体を、カオトロピック物質等を除く目的で、低塩濃度緩衝液からなる洗浄液にて洗浄する工程である。ここでいう低塩濃度緩衝液からなる洗浄液とは、エタノール等の有機溶媒及びカオトロピック物質を全く含まない緩衝液を指し、緩衝液としてはトリス系緩衝液が好ましいが、特に限定されない。また、低塩濃度とは、この緩衝液が第３の溶出工程に残留した場合においても、ＲＴ−ＰＣＲ反応などの酵素反応に影響を与えない程度の塩濃度を指し、単なる水も含まれる。本発明においては、１００ｍＭ以下の緩衝液が好ましい。また、この溶液は界面活性剤を含有しても良く、ｐＨは特に限定されない。また、本発明では加熱により溶出を促進させることが必要である。加熱温度は、リボ核酸に悪影響を及ぼさない程度であれば、特に限定されないが、５０〜７０℃が好ましい。加熱時間は、３０秒〜１０分間程度である。このようにして溶出したリボ核酸は、透析やエタノール沈殿法等の脱塩、濃縮操作を施すことなく、逆転写酵素等を使用した酵素反応に直接使用することができる（一部省略）。」
【００３０】
特許文献４は、「しかしながら、本発明者らは、（３）の溶出工程で、８０℃以上で、水または低塩濃度水溶液で核酸を溶出することによって、ＤＮＡが抽出できることを見出し、本発明の完成に至った。」と記載する。
【００３１】
これらの文献に記載の方法は、次のような欠点を有し、ＰＯＣＴ化しがたい。即ち、第１に、例えば、数μｌ〜数百μｌ程度の溶液を分取又は添加し、正確なピペット操作によりコンタミネーションを防ぎ、危険な試薬を取扱わねばならず、高難度で煩雑な操作が必要である。
【００３２】
第２に、塩又は有機溶媒を含有した洗浄液で複数回洗浄し、乾燥により有機溶媒を確実に取り除く必要がある。さらに、過度の乾燥による核酸と吸着担体の固着に注意しつつ乾燥操作を実施しなければならず、時間及び労力が多大となる。
【００３３】
第３に、遠心機やマイクロピペットを用いた操作や、使用する機器の設置場所又は作業スペースを必要とし、実施環境を整えるための初期費用が嵩む。
【００３４】
【特許文献１】特許第２６８０４６２号
【特許文献２】特開平１０−７２４８５
【特許文献３】特許第３８１２６９６号
【特許文献４】特開２０１４−３０３６４号
【非特許文献１】Ｒ  Ｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２８（３）、４９５−５０３（１９９０）
【非特許文献２】Ｂ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｄ  Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ、ＰＮＡＳ、７６（２）、６１５−６１９（１９７９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３５】
以上の背景に鑑み、本発明は、遺伝子検査の前処理をＰＯＣＴ化できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
第１の発明に係る前処理方法は、処理対象と、処理対象に含まれる核酸を抽出する抽出液と、シリカ粒子と、濾過材とを接触させ、濾過材に核酸とシリカ粒子との複合体を担持させ、核酸増幅反応液を用いる核酸増幅工程へ送出する前処理方法であって、シリカ粒子の粒径及び核酸増幅反応液中におけるシリカ粒子の濃度を一定範囲内とすることにより、核酸増幅工程に先立つ乾燥工程及び溶出工程を不要とする。
【００３７】
第２の発明に係る前処理方法では、第１の発明に加え、一定範囲は、シリカ粒子濃度が０．０６２５〜４μｇ／μｌ、平均粒径が０．０１〜１００μｍ、且つ、平均粒径から求められる表面積が１×１０4〜１×１０8μｍ2である。また、第３の発明に係る前処理方法では、第１の発明に加え、一定範囲は、シリカ粒子濃度が０．０６２５〜１μｇ／μｌ、平均粒径が０．０１〜１０μｍ、且つ、平均粒径から求められる表面積が１×１０5〜５×１０7μｍ2である。
【００３８】
第４の発明に係る前処理方法では、第１の発明に加え、抽出液に処理対象を添加し、処理対象に含まれる核酸を抽出する抽出工程と、抽出された核酸にシリカ粒子を接触させて、核酸とシリカ粒子との複合体を得ると共に複合体を濾過材に接触させる吸着工程と、濾過材を精製水で洗浄し、洗浄された濾過材を核酸増幅工程に送出する洗浄工程とを含む。また、第５の発明に係る前処理方法では、第１の発明に加え、濾過材を核酸増幅工程に送出するに先立ち、濾過材と複合体とを分離し、分離された複合体を核酸増幅工程に送出する。
【００３９】
第６の発明に係る前処理方法では、第４の発明に加え、吸着工程と洗浄工程とを一度に行う。第７の発明に係る前処理方法では、第４の発明に加え、抽出工程と吸着工程とを一度に行う。また、第８の発明に係る前処理方法では、第４の発明に加え、抽出工程と吸着工程と洗浄工程とを一度に行う。
【００４０】
第９の発明に係る前処理方法では、第１の発明に加え、抽出液に処理対象を添加し、処理対象に含まれる核酸を抽出する抽出工程と、シリカ粒子を担持する濾過材に、抽出された核酸を接触させて、核酸とシリカ粒子との複合体を得ると共に複合体を濾過材に担持させる吸着工程と、濾過材を精製水で洗浄し、洗浄された濾過材を核酸増幅工程に送出する洗浄工程とを含む。第１０の発明に係る前処理方法では、第９の発明に加え、濾過材を核酸増幅工程に送出するに先立ち、濾過材と複合体とを分離し、分離された複合体を核酸増幅工程に送出する。また、第１１の発明に係る前処理方法では、第９の発明に加え、吸着工程と洗浄工程とを一度に行う。
【発明の効果】
【００４１】
本発明の方法によれば、次のような効果がある。第１に、遺伝子検査における核酸の抽出工程が、簡単、容易、安全、迅速、且つ、安価になり、ＰＯＣＴ化を実現可能となる。
【００４２】
第２に、安全且つ簡便で容易な操作の組合せにより、従来法よりも処理時間の大幅な短縮を実現し、その上、安価なコストでの核酸の抽出を実施できる。その理由は、洗浄工程の洗浄液として精製水を使用するため、複数の試薬溶液を準備し使い分ける必要がなく簡単な上に、有機溶媒を不要として安全であるためである。
【００４３】
第３に、有機溶媒が不要であるから、固相担体の乾燥操作及び核酸の溶出工程も不要となる。要するに、洗浄工程後、ただちに核酸増幅反応へ移行できる。加えて、溶液の移動回数を極力少なくできるから、周辺環境への核酸飛散やクロスコンタミネーションなどのリスクを低減できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
（発明の概要）
まず、実施の形態の説明に先立ち、発明の要点を述べる。本発明者らは、前述の課題を解決すべく、従来法に多く見られた「核酸の抽出に使用した試料から可能な限り多量の核酸試料を回収する方法」から決別し、核酸増幅反応１テストに最低限必要な核酸量を確保する方法に着目し、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。
【００４５】
検討の結果、本発明者らは、核酸の前処理方法において、（ａ）カオトロピック剤、塩、酸、アルカリ、界面活性剤、有機溶媒、酵素、フレンチプレス、熱、及び、超音波などの通常当業者が考えうる方法により処理対象から核酸を抽出する工程（以下「抽出工程」と言う。）を行った後、（ｂ）抽出した核酸を固相担体に吸着させる工程（以下「吸着工程」と言う。）を行い、（ｃ）精製水を用いて固相担体に吸着した夾雑物を洗浄する工程（以下「洗浄工程」と言う。）を行い、（ｄ）洗浄工程後、ただちに核酸を固相担体ごと核酸増幅反応液へ添加することで、核酸増幅工程が実施できることを見出し、発明を完成させた。
【００４６】
更に、本発明者らは、この発明の方法を応用して、濾過材と吸水材を内包した濾過装置と固相担体とを組合せて用いることで、ＰＯＣＴが行われるような場所においても核酸の抽出が実施可能であることを見出し、精製水での洗浄と担体ごと核酸増幅反応に添加する方法からなるＰＯＣＴで実施可能な核酸の抽出キットを完成させた。
【００４７】
（発明の実施の形態）
以下、詳細な検討を示す前に、本発明における結論部分を先に述べる。
【００４８】
本発明によれば、前処理方法において、洗浄工程後、ただちに核酸増幅反応を実施することが可能である。
【００４９】
核酸が吸着した固相担体と洗浄液などの液体を分離する方法は、遠心分離や遠心カラムを用いた分離、更に、濾過分離などの方法を用いることができる。当然、磁性体を含むシリカ粒子を使用すれば、磁力を用いた分離も可能である。
【００５０】
本発明において、固相担体は、シリカ粒子である。
【００５１】
本発明によれば、前処理方法における吸着工程で吸着した核酸とシリカ粒子（以下「核酸＋シリカ複合体」と言う。）を、洗浄工程後、ただちに核酸増幅反応試薬液と接触させ、核酸増幅反応を開始できる。
【００５２】
図１は、本発明の一定範囲を示すグラフである。結論を先に言うと、核酸増幅反応液中に存在するシリカ粒子は、図１の点線内の範囲が好ましい。図１において、横軸は核酸増幅反応液中におけるシリカ粒子濃度であり、縦軸はシリカ粒子の平均粒径である。
【００５３】
具体的には、好ましい一定範囲は、シリカ粒子濃度が０．０６２５〜４μｇ／μｌ、平均粒径が０．０１〜１００μｍ、且つ、平均粒径から求められる表面積が１×１０4〜１×１０8μｍ2（図１の点線で囲まれた範囲）である。
【００５４】
さらに好ましい一定範囲は、シリカ粒子濃度が０．０６２５〜１μｇ／μｌ、平均粒径が０．０１〜１０μｍ、且つ、平均粒径から求められる表面積が１×１０5〜５×１０7μｍ2（図１の実線で囲まれた範囲）である。
【００５５】
本発明における試料（処理対象）とは、核酸を含有する可能性がある物質であれば良く、例えば、感染症の診断時に採取された検体試料である。
【００５６】
感染症の検体試料とは、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、泌尿器系材料（各種尿検体）、生殖器系材料、糞便、血液などの感染症が疑われた際に採取する検体である。
【００５７】
核酸とは、ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ）、ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ）などの核酸増幅反応の鋳型となりうると当業者が考えうるもので、原因微生物に由来する核酸や、検体試料を産する生物に由来する内在性の核酸も含みうる。
【００５８】
更に、感染症の診断時に採取された検体試料だけではなく、様々な場所にてサンプリングされる核酸を含有した試料に対する利用も含みうる。
【００５９】
例えば、食品検査（食中毒原因菌などや、組換え遺伝子検出）、農場での作物の感染症検査、及び、飲み水や工場などでの水質検査などに利用することが考えられる。
【００６０】
しかしながら、これらは例示であり、本発明は、これのみに限定されているわけではない。
【００６１】
本発明における核酸試料は、１μｇ以下の核酸量を処理することを想定しており、核酸増幅反応液へは、１ａｇ〜１００ｎｇ、好ましくは１ｐｇ〜１０ｎｇ程度の核酸量を持込むことを想定している。
【００６２】
本発明において、吸着工程は、カオトロピック剤、塩、酸、アルカリ、界面活性剤、有機溶媒、酵素、フレンチプレス、熱、及び、超音波などを用いた核酸の抽出方法により得られた核酸含有溶液に、直接、又は、その溶液を希釈又は置換した後、その溶液中にシリカ粒子を添加することで実施する。
【００６３】
前処理における吸着工程を抽出工程と同時に実施することもできる。
【００６４】
本発明において、洗浄工程に用いる洗浄液は、精製水である。
【００６５】
この精製水とは、様々な手法で精製された水であるが、通常当業者が考える核酸増幅反応を実施する際に試薬調製にも利用可能な水を含む。
【００６６】
例えば、有機溶媒を含有せず、高濃度の塩などの核酸増幅反応阻害物質を含まない水である（以下「精製水」と言う）。
【００６７】
本発明において、洗浄工程は、吸着工程後、適量の精製水による洗浄で実施される。洗浄回数は、限定されないが、１〜数回洗浄すれば良い。
【００６８】
洗浄工程後、核酸＋シリカ複合体は、ただちに核酸増幅反応試薬液へ添加される。
【００６９】
しかしながら、吸着工程において、溶媒に精製水を用いた場合、又は、吸着工程後に得られた核酸含有溶液を精製水を用いて希釈又は溶液置換した場合において、洗浄工程を省くことが可能である。
【００７０】
本発明において、濾過分離の濾過材は、メンブレンフィルターなどの通常当業者が選択するものの内、核酸の吸着が少なく、前述したシリカ粒子を濾過できるポアサイズを保持するものならば良い。
【００７１】
例えば、ポリ乳酸、セルロース、ＰＴＦＥなどを原料とした膜、メンブレンフィルター、織布、不織布などが挙げられる。
【００７２】
形態も、膜状のものに限定されず、袋状、筒状のものなどを濾過に利用できる形態ならば可能である。
【００７３】
例えば、メルク（日本ミリポア）社製のオムニポア（商標）メンブレンフィルター（ＪＣＷＰ）などが好適である。
【００７４】
本発明において、濾過分離は、吸水材を内包した濾過装置を用いることでＰＯＣＴのような条件下での核酸の抽出に対応することができる。
【００７５】
吸水材を内包した濾過装置とは、洗浄液などの溶液の流れが一方向で、その上、使用した溶液を内部に設置した吸水材により吸水し、外部へ液体の飛散を抑制する装置である。
【００７６】
本発明は、実施の形態及び実施例に特に説明が無い場合には、当業者にとって標準的な技術に準じて実施した。
【００７７】
例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＦＯＵＲＴＨ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッドシリーズ（学研メディカル秀潤社）、又は、改訂第３版遺伝子工学実験ノート（田村隆明／編、上下巻、羊土社）などに記述された方法を参考にして実施した。
【００７８】
更に、市販されている試薬や機器を用いる場合には、特に説明を記述しない場合には、付属のプロトコルに準じて行った。
【００７９】
下記に示す、実施例は、本発明を詳細に説明するための発明の一態様の例示であり、発明を限定するものではない。
【００８０】
（実施例１）
＜材料及び方法＞
（精製水）
本実施例における精製水は、Ｄｉｒｅｃｔ−Ｑ（登録商標）５ＵＶ超純水製造装置（メルク株式会社）から得られた超純水を利用した。
【００８１】
【表１】
0006437250.tif 000002
【００８２】
（固相担体）
本実施例における固相担体は、シリカ粒子である。（表１）に、使用したシリカ粒子の品名、製品番号、カタログ番号などの製品を識別できる情報と、製造又は販売会社の情報を示す。カタログや製品に添付されていた試験成績書などの情報から、平均粒径が大きなものから順番に番号を付して示してある。しかしながら、（表１）は、実施例で使用したシリカ粒子を単に例示しているのみで、本発明におけるシリカ粒子を限定するものではない。
【００８３】
（核酸試料）
本実施例における核酸試料は、マイコプラズマ肺炎の病原体であるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来ｐ１遺伝子を検出対象とした。
核酸試料は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来ｐ１遺伝子の断片を、常法を用いてｐＵＣ５７プラスミドＤＮＡに組込みクローニングすることで、作製した。
【００８４】
作製した核酸試料は、ＴＥ緩衝液を用いて３ｐｇ／μｌの濃度に調製した。
【００８５】
調製後、核酸試料は、リアルタイム定量ＰＣＲ時の検量線作成の為の標準試料などとして利用した。
【００８６】
調製した核酸試料の一部は、分取した後、ＴＥ緩衝液を用いて更に希釈して、３ｐｇ／５０μｌの濃度に調製し、核酸の抽出を実施する際の出発材料として利用した。
【００８７】
（プライマー及びプローブ）
プライマーは、Ｉｅｖｅｎらの報告（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、１９９６；１７３；１４４５−５２）に記載されていた、「Ｐ１アドヘシン遺伝子に対するプライマーセット（５’−ＧＣＣＡＣＣＣＴＣＧＧＧＧＧＣＡＧＴＣＡＧ−３’及び５’−ＧＡＧＴＣＧＧＧＡＴＴＣＣＣＣＧＣＧＧＡＧＧ−３’）」を使用した。
【００８８】
プローブは、前述のプライマーセットの増幅産物から、特異的な領域を選択し、当業者が通常使用する方法で作製した。
【００８９】
プローブの作製は、日鉄住金環境株式会社Ｊ−ＢＩＯ２１センターにＱＰｒｏｂｅ（登録商標）の受託合成を依頼することで行った。
【００９０】
（その他の試薬類の準備及び調製）
その他の試薬類の調製は、通常市販されている物を利用し、常法通りに調製をした。
【００９１】
ＢＯＯＭ法を再現又は一部を再現する場合の細胞溶解液は、「溶解用緩衝液Ｌ６」を使用した。
【００９２】
「溶解用緩衝液Ｌ６」は、特許文献１に記載された方法に準じて調製した。
【００９３】
（核酸増幅反応及びその解析方法）
核酸増幅反応は、１チューブあたり２０μｌの反応液量で、リアルタイム定量ＰＣＲを行った。
【００９４】
装置は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ｎａｎｏ  ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いた。
【００９５】
反応プロファイルは、初期変性プログラムとして９５℃：１２０秒、増幅プログラムとして９５℃：１０秒、６８℃：１０秒、及び、７２℃：１０秒を４０サイクルで実施した。
【００９６】
熱融解プログラムは、６８℃から９５℃を選択した。
【００９７】
リアルタイム定量ＰＣＲは、インターカレーター法とプローブ法を用いて実施した。
【００９８】
インターカレーター法は、色素として、２０×ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｄｙｅ（Ｂｉｏｔｉｕｍ  ｉｎｃ．）を、プローブ法は、ＱＰｒｏｂｅ（登録商標；日鉄住金環境株式会社）を用いて実施した。
【００９９】
反応終了後、得られた増幅曲線が供試したＤＮＡ由来の目的産物であるかの確認は、熱融解プログラムの結果から行った。
【０１００】
実施例において、核酸増幅反応は、特に記載しない場合にはインターカレーター法を用いて実施した。
【０１０１】
インターカレーター法において、増幅曲線の解析は、装置専用の解析ソフトウエアの「Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ」を選択し、検量線からＰＣＲ効率やＲ2の値が正常の範囲かを常法通り確認した後、得られたＣｔ値と定量値から行った。
【０１０２】
一方、ＱＰｒｏｂｅのような消光するタイプのプローブ法の解析は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ｎａｎｏ  ｓｙｓｔｅｍに備え付けの解析法が対応していなかったため、特許第４７２４３８０号に記載された方法に準じて、生データから、直接解析を行い、Ｃｔ値と定量値から行った。
【０１０３】
解析に利用したデータは、複数個の同条件のサンプルから得られたデータを平均したものを使用した。
【０１０４】
以下、事項１〜５の細目について、具体的に説明する。各事項では、技術的な課題、対応策、結果及び考察を示す。
事項１：洗浄液を精製水に変更した実施の影響
事項２：シリカ粒子を添加することの核酸増幅反応への影響
事項３：シリカ粒子の添加量の変化による核酸増幅反応への影響
事項４：シリカ粒子の使用量による核酸の吸着能と核酸増幅反応への影響
事項５：吸着工程におけるカオトロピック剤の影響及び簡易な濾過装置を用いた際の実施
【０１０５】
（事項１）
事項１では、ＢＯＯＭ法（特許文献１に記載されているプロトコルＹ（以下「プロトコルＹ」と言う。）において、洗浄工程の洗浄液として使用される「Ｌ２」、「７０％エタノール」、及び、「アセトン」を、全て精製水に変更したり、その他の条件をプロトコルＹに準じて実施することが可能か調査した。
【０１０６】
プロトコルＹの「出発材料」として、３ｐｇ／５０μｌの濃度に調製した核酸試料を用いた。
【０１０７】
シリカ粒子として（表１）のシリカ粒子番号４を使用し、特許文献１の材料及び方法に記載された「シリカ粗材（ＳＣ）の懸濁液」に準じて調製した。
【０１０８】
抽出後、得られた溶出液の２μｌを分取して、１８μｌのＰＣＲ試薬液に添加し、全量が２０μｌのＰＣＲ反応液になるように調製した。
【０１０９】
調製したＰＣＲ反応液にリアルタイム定量ＰＣＲを適用し、定量値を得た。
【０１１０】
得られた定量値を２５倍して、１チューブあたりで回収できた核酸量とし、それらの平均を求めた。
【０１１１】
出発材料に含有されていた核酸量３ｐｇを１００％とした場合のパーセンテージを求め、回収率（％）とした。
【０１１２】
【表２】
0006437250.tif 000003
【０１１３】
（表２）には、１チューブあたりの平均回収率（％）と、溶出液１０μｌあたりの回収率（％）とが示されている。
【０１１４】
（表２）において、陽性対象は、出発材料に含有していた３ｐｇを１００％回収した場合の値を、参考として記載している。
【０１１５】
従来例として、ＢＯＯＭ法をプロトコルＹに準じて実施した。
【０１１６】
得られた定量値に基づき、事項１と同様に回収率（％）を求めた。（表２）には、１チューブあたりの平均回収率（％）と、溶出液１０μｌあたりの回収率（％）とが、事項１の結果とともに併記されている。
【０１１７】
（表２）から、洗浄液を全て精製水に変更した場合は、従来例では７８．５９％だった回収率が、事項１では１．９９％と、顕著に核酸の回収率が低下することが分かる。
【０１１８】
即ち、単純に洗浄液を精製水に変更することは、一般の溶出操作と同様の意味を持ち、シリカ粒子に吸着した核酸まで洗い流れてしまうことが改めて確認できる。
【０１１９】
データを示してはいないが、出発材料が３ｐｇと少量の核酸を扱う場合、出発材料をμｇ単位で扱う時よりも回収率が低下する傾向があった。
【０１２０】
事項１においてＰＣＲ反応液は、最大で１０μｌまでの溶出液を添加することが可能と推測でき、それでも３ｐｇの０．４０％である約１２ｆｇしか核酸増幅反応液中へ持込むことができないと推論される。
【０１２１】
一方、従来例は、同様に考察すると、３ｐｇの１５．７２％である約４７０ｆｇを持ち込める。
【０１２２】
以上から、ＢＯＯＭ法のプロトコルＹにおいて、単純に洗浄液を水に変更するだけでは、十分な核酸量を得ることができないことが分かる。
【０１２３】
（表２）における従来例の結果は、３ｐｇの核酸量を含有した出発材料から、５〜１５％前後回収できるならば、１テストの核酸増幅反応においては十分に検出可能な量であることを示している。
【０１２４】
本発明において、低濃度の核酸溶出液が得られた場合において、エタノール沈殿法や濃縮カラムなどによる濃縮操作又は溶液置換などの操作は、操作の煩雑さが増してしまうため、選択しにくい。
【０１２５】
以上の結果から、ＢＯＯＭ法の洗浄工程の洗浄液を精製水に単純に置換えて実施する方法は、出発材料の核酸量が少ない場合や低濃度の核酸溶出液が得られた場合には、不十分であると考察できる。
【０１２６】
一方、精製水による洗浄が可能ならば、様々な利点が得られる。
【０１２７】
従来例に示したＢＯＯＭ法などでは、純粋な核酸溶液を得るために、夾雑物を取り除く、又は、吸着に利用した塩を取り除くために、複数の洗浄液で複数回の洗浄操作を行い、加えて、乾燥操作を行うなど、煩雑で手間のかかる操作が必要である。
【０１２８】
精製水による洗浄が可能なら、これらの操作を大幅に省ける。加えて、核酸＋シリカ複合体は湿潤状態で次の核酸の増幅工程に持ち込めるため、乾燥によるシリカ粒子への核酸の固着の強化を心配する必要がない。さらに、単純な操作での核酸を抽出できるから、遺伝子検査などの操作に習熟していない実施者に対しても容易な操作を提供できるし、乾燥操作による核酸の固着を心配する必要がないため、核酸吸着能が高い小さなシリカ粒子も有効に利用できる。
【０１２９】
小さな粒径を持つシリカ粒子を有効に利用することができるならば、固相担体としてのシリカ粒子は、使用量を大幅に減らせる。
【０１３０】
（事項２）
事項２では、全量２０μｌのリアルタイム定量ＰＣＲ反応液を用いた反応系において、シリカ粒子（５μｇ／ｔｕｂｅ）と核酸試料（３ｐｇ／ｔｕｂｅ）を添加して得られたＣｔ値を比較することで、シリカ粒子を添加することの核酸増幅反応への影響を調査した。
【０１３１】
Ｃｔ値の比較対照のため、陽性対照（シリカ粒子（０μｇ／ｔｕｂｅ）、核酸試料（３ｐｇ／ｔｕｂｅ））と、陰性対照（シリカ粒子（０μｇ／ｔｕｂｅ）、核酸試料（０ｐｇ／ｔｕｂｅ））を準備した。
【０１３２】
陽性対照においては、Ｃｔ値の基準とするため、得られたＣｔ値から平均値を求め、その値を１００％とした。各シリカ粒子から得られたＣｔ値は同様に平均値を求め、陽性対照の平均値で割り、１００を掛けることで、Ｃｔ値の変化割合（％）とした。
【０１３３】
事項２では、事項１とは異なり、全てのシリカ粒子を市販されている状態のまま（例えば、使用する粒子の粒径の範囲を揃える操作や表面の修飾など、市販された状態のシリカ粒子から改質操作を実施せずに）で用い、設定した使用量を分取しやすい適当な濃度でシリカ粒子懸濁液を調製して使用した。
【０１３４】
（事項３）
事項３では、事項２に準じ、各シリカ粒子の添加量の変化による核酸増幅反応への影響を調査した。
【０１３５】
シリカ粒子を、ＰＣＲチューブあたりに１０μｇ、２０μｇ、及び、４０μｇを添加して、全量２０μｌのリアルタイム定量ＰＣＲ反応液を調製して実施した。
【０１３６】
【表３】
0006437250.tif 000004
【０１３７】
（表３）は、事項２及び事項３の結果をまとめて示す。
【０１３８】
事項２については、（表３）を縦方向に比較することで、同じ使用量条件下での使用した各シリカ粒子の違いを観察できる。
【０１３９】
事項３については、（表３）の各シリカ粒子を横方向に比較することで、そのシリカ粒子がリアルタイム定量ＰＣＲ反応液中に存在する量の変化により、リアルタイム定量ＰＣＲ反応へ及ぼす影響を観察できる。
【０１４０】
（表３）において、「ｎ／ａ」とあるのはデータが無いことを、「※１」とあるのはリアルタイム定量ＰＣＲ反応液μｌあたりのシリカ粒子量（μｇ）を、それぞれ示す。
【０１４１】
事項２の結果（５μｇ／ｔｕｂｅ）は、シリカ粒子がリアルタイム定量ＰＣＲ反応液１μｌあたりに０．２５μｇが含有しているだけでも、リアルタイム定量ＰＣＲ反応に大きな影響（Ｃｔ値の変化が１０％を超える）を及ぼすものがあることを示す。
【０１４２】
使用したもののうち、Ｃｔ値の変化割合が２％以下に抑えられているものもあるなど、ほとんどＣｔ値のバラツキの範囲内であると評価しても良いものもあった。この結果を参考にして、事項３に進んだ。
【０１４３】
事項３では、事項２の結果を受けて、シリカ使用量を増加させて比較した。
【０１４４】
事項３の結果は、核酸吸着能が高い平均粒径の小さなシリカ粒子ほど使用量の増加とともにＣｔ値の変化割合が大きくなる傾向があり、平均粒径の大きな粒子はあまり変化が観察されない傾向があることを示す。
【０１４５】
事項１の従来例のシリカ粒子の使用量は、ＢＯＯＭ法のプロトコルＹを再現した「シリカ粗材（ＳＣ）の懸濁液」の場合で約３０〜５０％のシリカ粒子懸濁液となった。それゆえ、抽出を実施する際に１チューブに存在したシリカ粒子量は、約１２〜２０ｍｇ程度と推測される。
【０１４６】
使用したシリカ粒子の差異を考慮して少なく見積もっても、ＢＯＯＭ法を再現するには１ｍｇ程度のシリカ粒子が必要と考察される。
【０１４７】
特許文献２では、核酸が吸着したまま固相担体を懸濁液にした後、２／５量を直接添加してＰＣＲ反応を実施している。
【０１４８】
その際、ＰＣＲ反応液中に存在するシリカ粒子は、ＢＯＯＭ法では少なくとも２００μｇ程度のシリカ粒子が５０μｌのＰＣＲ反応液（４．００μｇ／μｌ）に存在していた。
【０１４９】
しかしながら、事項２及び事項３では、多くても４０μｇのシリカ粒子が２０μｌのリアルタイム定量ＰＣＲ反応液（２．００μｇ／μｌ）に存在していた。
【０１５０】
事項２及び事項３の結果から、ＢＯＯＭ法では使用した固相担体の全てを次の操作に持込む場合、シリカ粒子の使用量が多いため核酸増幅反応を強く阻害する可能性があると考えられる。
【０１５１】
ＢＯＯＭ法は、固相担体量が多いため、核酸を溶出するか、溶出しなければ一部の担体を分取して、使用量を調製する必要があるなど、１μｇ以下の核酸量を含む出発材料を扱うにはやや無駄が多い方法であると言えよう。また、分取する操作が必要で、煩雑であるため、核酸の抽出などの核酸の取扱いに習熟していない実施者に対して難度の高い操作が要求される。
【０１５２】
ＢＯＯＭ法は、感染症の迅速診断などのように検体中に含有される核酸量が１ａｇ〜５００ｎｇ程度の場合や、簡便で迅速な操作が求められている場合、又は、単純で解り易い操作が求められている場合などには、利用し難いと考えられる。
【０１５３】
事項２、３の結果から、核酸の抽出は、シリカ粒子量を調整して、必要な核酸量を確保しつつ、更に、核酸増幅反応を阻害せず又はほとんど阻害しない使用範囲を限定することができるならば、単純で容易な操作のみで迅速に実施可能であると考察される。
【０１５４】
（事項４）
事項４では、例示したシリカ粒子が、実際に前処理に利用できるかを調査する。洗浄工程までは、事項１に準じて実施する。
【０１５５】
４０μｌの精製水中に、１．２５μｇ、２．５μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、４０μｇ、及び、８０μｇのシリカ粒子が含有されるようにシリカ懸濁液を調整した。
【０１５６】
洗浄工程後、ただちに５μｌ精製水で核酸＋シリカ複合体を懸濁し、核酸＋シリカ複合体の懸濁液を得た。
【０１５７】
核酸＋シリカ複合体懸濁液の全量を１５μｌのリアルタイム定量ＰＣＲ反応試薬へ添加して、リアルタイム定量ＰＣＲ反応を行った。
【０１５８】
反応終了後、各使用量条件下における各シリカ粒子の定量値は、平均を求めた。
【０１５９】
求めた平均の定量値は、出発材料から直接得られた定量値の平均を１００％とした場合に対するパーセンテージを求め、回収率とした。
【０１６０】
【表４】
0006437250.tif 000005
【０１６１】
回収率は、５％以上を評価対象として評価し、評価基準と共に（表４）にまとめた。
【０１６２】
（表４）において、「ｎ／ａ」とあるのはデータ無し、「※１」とあるのはリアルタイム定量ＰＣＲ反応液１μｌあたりのシリカ粒子量（μｇ／μｌ）を示す。「※２」とあるのはシリカ粒子の平均粒径を示し、購入した製品に添付された検査成績書によるもの、あるいは検査成績書が添付されていない場合はカタログやホームページ等に公開されている平均粒径を記載してある。
【０１６３】
事項４における回収率は、精製水を用いた洗浄工程を行う前処理方法においてシリカ粒子の性質を総合して評価するためのものであり、前処理工程から増幅反応工程においてシリカ粒子が及ぼす影響を表す。
【０１６４】
例えば、前処理において、吸着工程ではシリカ粒子の核酸吸着能を、洗浄工程では精製水に曝された場合の核酸保持能などを、それぞれ示す。
【０１６５】
核酸増幅反応において、リアルタイム定量ＰＣＲ反応の阻害率、及び、リアルタイム定量ＰＣＲ反応における蛍光検出の阻害率などを総合して評価したものとなる。
【０１６６】
回収率は、（表４）に示した「＋」の数が多いものほどより良い。
【０１６７】
１０％以上の結果（「＋＋、＋＋＋」）は、１．２５〜２．５μｇ／チューブの条件下では粒径が０．３μｍ近辺からそれ以下の粒径の範囲に、５μｇ／チューブの条件下では粒径が０．０１〜３μｍの範囲で、１０〜２０μｇ／チューブの条件下では粒径が１〜５．３μｍの範囲で、４０μｇ／チューブの条件下では粒径が１．９μｍ近辺の範囲で観察された。
【０１６８】
一方、８０μｇ／チューブの条件下では、実施した条件の範囲で良好な結果を示したものは観察されなかった。
【０１６９】
事項４では、固相担体であるシリカ粒子の使用量と粒径との関係から、結果が大きく異なる場合があることが示された。
【０１７０】
つまり、シリカ粒子の使用量を調製して使用することで、精製水を洗浄液として使用し、更に、使用した全ての核酸＋シリカ複合体を核酸増幅反応試薬に添加しても、核酸増幅反応１テストに必要な核酸量を十分に確保することができ、更に、核酸増幅反応を阻害するなどの影響を及ぼさないことが示唆された。
【０１７１】
事項４において、良好な結果を示した粒径の多くは、既にＢＯＯＭ法など多くの方法で、特に好適な条件とされている１〜１０μｍの粒径を持つものであった。
【０１７２】
なお、ＢＯＯＭ法などの従来法（例えば、特許文献１〜４）は、０．０５μｍ〜５００μｍの範囲のシリカ粒子を使用可能と記載しているが、特許文献１に「実際に、シリカ粒子のＮＡ含有量は粒子が小さければ小さいほど高いが、特にＮＡ含有量の高い出発材料の場合、及びＮＡ分子が比較的長い場合は、過度に小さいシリカ粒子を使用すると、形成されるＮＡ−シリカ複合体をそれ以上有効に再分散することができなくなる。換言するならば、結合したＮＡを純粋な形で複合体から回収することができない。」（「ＮＡ」は核酸を意味する）と記載されており、小さな粒径の使用を避けているものと考えられる。加えて、「シリカ粗材（ＳＣ）の懸濁液」の調製時に、１μｍ以下の粒子を可能な限り除く操作も行っている。
【０１７３】
しかしながら、事項４では、平均粒径が１μｍ以下のシリカ粒子においても良好な結果が得られることが分かった。
【０１７４】
本発明者らは、事項２、３、及び、４を、インターカレーター法を用いた再現実験及びＱＰｒｏｂｅを用いたプローブ法での再現実験を繰り返して行うことで、Ｃｔ値の変化割合が少なくリアルタイム定量ＰＣＲ反応に及ぼす影響が少なく、且つ、高い回収率が得られ良好な結果を示したシリカ粒子の粒径と使用量の関係を調査した。
【０１７５】
その結果、図１に示すように、本発明者らは、核酸増幅工程にも影響を及ぼさず且つ十分な核酸量を確保できるシリカ粒子の使用範囲（一定範囲）を特定することに成功した。。
【０１７６】
繰り返しになるが、好ましい一定範囲は、図１の点線で示すように、シリカ粒子濃度が０．０６２５〜４μｇ／μｌ、平均粒径が０．０１〜１００μｍ、且つ、平均粒径から求められる表面積が１×１０4〜１×１０8μｍ2である。
【０１７７】
さらに好ましい一定範囲は、図１の実線で示すように、シリカ粒子濃度が０．０６２５〜１μｇ／μｌ、平均粒径が０．０１〜１０μｍ、且つ、平均粒径から求められる表面積が１×１０5〜５×１０7μｍ2である。
【０１７８】
以上の結果を得た本発明者らは、カオトロピック効果による核酸とシリカ粒子の吸着現象だけではなく、シリカ粒子の構造がもたらす静電気力や分子間力などの他の現象が有効であるという仮説を立てた。
【０１７９】
本発明者らは、この仮説の真偽を確かめるため、カオトロピック剤などの塩、その他の静電気力を高める塩、あるいは有機溶媒などを一切含めずに、抽出を有効に実施できるかどうか調査した。
【０１８０】
本発明者らは、カオトロピック剤などの塩、その他の静電気力を高める塩、あるいは有機溶媒などを一切使用しなくとも抽出を有効に実施できるという結果を得た。但し、カオトロピック塩を使用する場合に比べると、若干回収率が落ちているが、実用上十分な結果が得られた。更に、濾過分離を併用すると、抽出がより効果的になる点が判明した。
【０１８１】
（事項５）
事項５では、吸着工程におけるカオトロピック剤の影響を調査し、図２（ｅ）に示す簡易な濾過装置を用いて実際にＰＯＣＴ化できるかどうか検討した。
【０１８２】
図２（ｅ）に示すように、この濾過装置は、矩形箱状をなす筐体７と、筐体７の上部中央に固着される漏斗部２とを備え、筐体７の内部に、濾過材３、第１吸水材４、第２吸水材５及び調整部材６とからなる層構造体とを備える。
【０１８３】
筐体７としては、市販のプラスチック製箱のように、加工が容易な部材を用いると良い。本例では、筐体７として、株式会社良品計画製のＰＰ小型石鹸ケース（商品番号４７６９７６８１、約６４ｍｍ×５２ｍｍ×２０ｍｍ）を用いたが、勿論、これは単なる例示であり、種々変更しても本発明の保護範囲に包含される。
【０１８４】
漏斗部２は、処理対象を含む液を滴下し、無駄なく濾過材３へ導くための部材であり、滴下が容易であれば省略しても良い。漏斗部２としては、例えば、マイクロピペットのチップや、検査薬などに多く見られる形状のノズル部などを流用してもよい。
【０１８５】
本例では、筐体７の上面に５ｍｍ程度の孔を開設し、その孔に漏斗部２の下端部をねじ込むことにより、漏斗部２を筐体７に固着した。
【０１８６】
本例の層構造体は、次の濾過材３、第１吸水材４、第２吸水材５及び調整部材６とからなる。
【０１８７】
濾過材３として、本例では、メルク（日本ミリポア）社製のオムニポアメンブレンフィルター（ＪＣＷＰ）を、カールクラフト社製のワンホールパンチ（孔径７ｍｍ）で打ち抜いた円状の膜片を用いた。濾過材３の直径は５〜７ｍｍ程度、濾過材３のポアサイズは１〜１０μｍ程度が適当である。
【０１８８】
濾過材３は、漏斗部２の下端部などから溶液１が漏出しない程度に十分に密着させて設置する必要がある。
【０１８９】
第１吸水材４として、本例では、アドバンテック社製の生産用濾紙（Ｎｏ．６０）を２５．０ｍｍ×２５．０ｍｍに切断し、濾過材３の直下に１枚設置した。  
【０１９０】
第２吸水材５として、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製のＷｈａｔｍａｎガラス繊維濾紙角形グレードＧＦ／Ｄを２５．０ｍｍ×２５．０ｍｍに切断し、第１吸水材４の下方に２枚設置した。
【０１９１】
さらに、調整部材６として、第２吸水材５の下方に、プラスチックの板を重ねたが、調整部材６は省略できる場合もある。
【０１９２】
事項５の吸着工程において、５０μｌの出発材料を、１．５ｍｌチューブに分取した６００μｌの精製水に添加し、そこへ、４０μｌのシリカ粒子懸濁を添加し、直ぐに転倒混和（５秒間）した後、室温にて５分間放置し、再度、転倒混和（５秒間）した。その後、均質化させた核酸とシリカ粒子を含有した溶液を、図２（ｅ）に示す濾過装置の漏斗部２に全量を滴下して、濾過分離を行った（１〜２分程度）。濾過分離後、核酸＋シリカ複合体を得た。事項５で使用したシリカ粒子懸濁液は、精製水に（表１）に示したシリカ粒子番号６を添加して、１．７５μｇ／μｌの濃度に調製することで準備した。
【０１９３】
洗浄工程は、得られた核酸＋シリカ複合体に６００μｌの精製水に添加することで行った。
【０１９４】
洗浄工程後、核酸＋シリカ複合体は、濾過材ごと全てをピンセットで回収し、ただちに６８μｌリアルタイム定量ＰＣＲ反応試薬に添加（核酸＋シリカ複合体と濾過材の体積を約２μｌ分として、全量で７０μｌのリアルタイム定量ＰＣＲ反応液を調製）して、核酸増幅反応に使用した。
【０１９５】
同様に、陽性対照は、出発材料を５０μｌ精製水に変更して事項５を行い、抽出後得られたシリカ粒子と濾過材を核酸増幅反応試薬に添加し、更に、３ｐｇ核酸試料を直接添加して、全量７０μｌのリアルタイム定量ＰＣＲ反応液を調製した。
【０１９６】
陰性対照は、事項５からシリカ粒子を除いた実施を陰性対照１（固相担体無し）、陽性対照から核酸試料を除いた実施を陰性対照２（核酸試料無し）とした。
【０１９７】
【表５】
0006437250.tif 000006
【０１９８】
これらの結果は、事項４と同様に回収率を求め、求めた回収率とその平均を（表５）に示した。
【０１９９】
事項５における回収率は、平均２６％と本発明者らが予想した回収率よりも高い結果となった。
【０２００】
この結果は、市販されているシリカ基質を保持した前処理用ミニカラムに溶出操作後も残留していると考えられている５−１０％の核酸量（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＦＯＵＲＴＨ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ｖｏｌ．１、ｐ４を参照）よりも、残留し溶出されていない核酸量（本発明では回収率）が２倍以上も高い数値である。
【０２０１】
陰性対照１では、残留し溶出されていない核酸量（本発明では回収率）は、回収率が平均１．２８％と低く、シリカ粒子が存在しなければ、核酸増幅反応の鋳型として十分な核酸量を得ることが難しいことが示された。
【０２０２】
これらの結果から、本方法が核酸を固相担体から溶出させる働きを持つ精製水などの溶液に曝されても核酸を溶出し難いため、十分な核酸量を保持できていたことが分かる。
【０２０３】
１テストの核酸増幅反応液中において、本方法は、保持した核酸を核酸増幅反応に利用できる形態にできることが示された。
【０２０４】
本方法は、カオトロピック効果に頼った吸着工程を必要としないため、検体試料の状態に合わせて多様な前処理方法を選択できる。
【０２０５】
ＢＯＯＭ法プロトコルＹでは、１つのサンプルのみを処理する場合でも最低でも３０分程度かかっていた時間を、本方法では約１７分程度に短縮することができた。
【０２０６】
以上の結果から、本方法は、従来法と比較して、簡単、容易、安全、迅速、且つ安価な前処理方法であることが明らかであり、遺伝子検査の前処理をＰＯＣＴ化できる。
【０２０７】
本発明の濾過装置を用いると、従来まで必要と考えられていた理化学機器（例えば、乾燥操作に使用する、例えば、ヒートブロックなどの装置や、遠心装置やマイクロピペットなどの基本的な理化学機器）をほとんど用いることなく実施でき、機器の有無による実施環境の制限を取り除くことができる。
【０２０８】
従来まで必要と考えられていた理化学機器は、高額なものが多く、機器を揃えるなどの初期投資費は免疫検査のＰＯＣＴキットと比較すると多大である。
【０２０９】
本発明は、これらの使用を避けることが可能なため、核酸の抽出の実施コストを低く抑えることができる。
【０２１０】
本発明は、洗浄工程の簡便化及び溶出工程の省略により操作手順を単純化し、核酸の抽出に習熟していない実施者に対しても、十分に実施可能な程度に簡便である。
【０２１１】
以上の検討を踏まえると、次に述べる各実施の形態における前処理方法を実施できることが理解されよう。勿論、以上何度も述べた一定範囲の条件を満たすことが前提となる。
【０２１２】
（実施の形態１）
図２は、本発明の実施の形態１における前処理方法の各工程図である。実施の形態１は、基本形である。
【０２１３】
＜抽出工程＞
まず、図２（ａ）に示すように、抽出液１１を入れたチューブ１０に処理対象１２を添加する。小時間静置すると、処理対象の核酸を被覆する成分（例えば、細胞膜や細胞壁等）が抽出液１１により破壊され、図２（ｂ）に示すように核酸１３と夾雑物（例えば、細胞膜片等）とが抽出液１１に混在する核酸含有溶液となる。
【０２１４】
＜吸着工程＞
次に、図２（ｃ）に示すように、チューブ１０の核酸含有溶液に、シリカ粒子１４を添加し、核酸１３とシリカ粒子１４とを吸着させる。その結果、核酸１３とシリカ粒子１４との複合体１５が形成される。
【０２１５】
この溶液を、図２（ｄ）に示すように、濾過装置の漏斗部２に滴下し、濾過材３等により濾過し、図２（ｅ）に示すように、濾過材３上に複合体１５を回収する。
【０２１６】
＜洗浄工程＞
図２（ｆ）に示すように、濾過材３上に回収された複合体１５に精製水１６を滴下し、洗浄する。そして、図２（ｇ）に示すように、濾過材３を濾過装置から取り外すと、図２（ｈ）に示すように、そのままあるいは、濾過材３と複合体１５とを分離して複合体１５のみを、次の核酸増幅工程へ排出する。
【０２１７】
（実施の形態２）
図３は、本発明の実施の形態２における前処理方法の各工程図である。実施の形態２は、実施の形態１を変形したものであり、吸着工程と洗浄工程とを一度に行うものである。
【０２１８】
実施の形態２は、うがい液、唾液、涙液などの処理対象に使用できると考えられる。これらの処理対象は、抽出液に精製水を用いることができるため、核酸増幅反応を阻害する物質（タンパク質、脂質、塩、有機溶剤等）の含有量が比較的少ないと考えられるためである。
【０２１９】
＜抽出工程＞
抽出工程（図３（ａ）〜図３（ｂ））は、実施の形態１と同様である。
【０２２０】
＜吸着工程＋洗浄工程＞
実施の形態１とは異なり、洗浄工程において精製水１６による洗浄は行わない。その代わり、溶液を、図３（ｄ）に示すように、濾過装置の漏斗部２に滴下し、濾過材３等により濾過する際に、抽出液１０自体で洗浄を行う。その他は、実施の形態１と同様である。
【０２２１】
（実施の形態３）
図４は、本発明の実施の形態３における前処理方法の各工程図である。実施の形態３は、実施の形態１を変形したものであり、抽出工程と吸着工程とを一度に行うものである。
【０２２２】
即ち、図４（ａ’）に示すように、チューブ１０に抽出液１１のみならず、一定範囲を満たすようにシリカ粒子１４を予め添加しておく。そこに、処理対象１２を添加し、チューブ１０内において、核酸１３の抽出のみならず、抽出された核酸１３とシリカ粒子１４とを吸着させ、複合体１５を形成する。
【０２２３】
その他の点は、実施の形態１と同様である。
【０２２４】
（実施の形態４）
図５は、本発明の実施の形態４における前処理方法の各工程図である。実施の形態４は、実施の形態１を変形したものであり、抽出工程と吸着工程と洗浄工程とを一度に行うものである。
【０２２５】
実施の形態４は、吸着工程と洗浄工程とを一度に行う点で実施の形態２と同様であるから、うがい液、唾液、涙液などの処理対象に使用できると考えられる。これらの処理対象は、抽出液に精製水を用いることができるため、核酸増幅反応を阻害する物質（タンパク質、脂質、塩、有機溶剤等）の含有量が比較的少ないと考えられるためである。
【０２２６】
まず、図５（ａ’）において、チューブ１０に抽出液１１のみならず、一定範囲を満たすようにシリカ粒子１４を予め添加しておく。そこに、処理対象１２を添加し、チューブ１０内において、核酸１３の抽出のみならず、抽出された核酸１３とシリカ粒子１４とを吸着させ、複合体１５を形成する。
【０２２７】
さらに、実施の形態１とは異なり、洗浄工程において精製水１６による洗浄は行わない。その代わり、溶液を、図５（ｄ）に示すように、濾過装置の漏斗部２に滴下し、濾過材３等により濾過する際に、抽出液１０自体で洗浄を行う。その他は、実施の形態１と同様である。
【０２２８】
（実施の形態５）
図６は、本発明の実施の形態５における前処理方法の各工程図である。実施の形態５は、次のような要素を有する核酸抽出キットを使用すると好適に実施できる。即ち、抽出液１１は、処理対象１２に含まれる核酸を抽出する。濾過材３には、シリカ粒子１４が配置される。第１吸水材４は、濾過材３に重ねて配置され、濾過材３に滴下される抽出液から吸水を行う。ここで、シリカ粒子１４の粒径及び核酸増幅反応液中におけるシリカ粒子１４の濃度は、上記一定範囲内とされ、この核酸抽出キットは、濾過材３が洗浄された後乾燥工程及び溶出工程を経ず直ちに核酸増幅工程へ移動できるように構成されている。
【０２２９】
＜抽出工程＞
まず、図６（ａ）に示すように、抽出液１１を入れたチューブ１０に処理対象１２を滴下添加する。小時間静置すると、処理対象の核酸を被覆する成分（例えば、細胞膜や細胞壁等）が抽出液１１により破壊され、図６（ｂ）に示すように核酸１３と夾雑物（例えば、細胞膜片等）とが抽出液１１に混在する核酸含有溶液となる。
【０２３０】
＜吸着工程＞
実施の形態５では、実施の形態１とは異なり、図６（ｅ’）に示すように、濾過装置の濾過材３にシリカ粒子１４を配置しておくものであり、シリカ粒子１４を溶液に添加しない。
【０２３１】
しかしながら、チューブ１０の核酸含有溶液を漏斗部２に滴下すれば、核酸１３とシリカ粒子１４とが吸着する。その結果、核酸１３とシリカ粒子１４との複合体１５が形成される。
【０２３２】
その他は、実施の形態１と同様である。
【０２３３】
（実施の形態６）
図７は、本発明の実施の形態６における前処理方法の各工程図である。実施の形態６は、実施の形態５を変形したものであり、吸着工程と洗浄工程とを一度に行うものである。
【０２３４】
吸着工程と洗浄工程とを一度に行う点において実施の形態２と共通するため、実施の形態６は、精製水が使用されるうがい液、唾液、涙液などの処理対象に使用できると考えられる。これらの処理対象は、抽出液中に核酸増幅反応を阻害する物質（タンパク質、脂質、塩、有機溶剤等）の含有量が比較的少なく、抽出液中で核酸を遊離できると考えられるためである。
【０２３５】
その他は、実施の形態５と同様である。
【図面の簡単な説明】
【０２３６】
【図１】本発明の一定範囲を示すグラフ
【図２】本発明の実施の形態１における前処理方法の各工程図
【図３】本発明の実施の形態２における前処理方法の各工程図
【図４】本発明の実施の形態３における前処理方法の各工程図
【図５】本発明の実施の形態４における前処理方法の各工程図
【図６】本発明の実施の形態５における前処理方法の各工程図
【図７】本発明の実施の形態６における前処理方法の各工程図
【符号の説明】
【０２３７】
２  漏斗部
３  濾過材
４  第１吸水材
５  第２吸水材
６  調整部材
７  筐体
１０  チューブ
１１  抽出液
１２  処理対象
１３  核酸
１４  シリカ粒子
１５  複合体
１６  精製水
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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