(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
【化４】
0006340416.tif 000022
を有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、および薬学的に許容可能な担体、アジュバントまたはビヒクルを含む薬学的組成物。
【請求項３】
喘息、アトピー性皮膚炎、鼻炎、アレルギー性疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、敗血性ショック、特発性肺線維症、脳卒中、火傷、関節疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、アテローム性動脈硬化、急性膵炎、乾癬、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病およびグレーブス病から選択される自己免疫疾患または炎症性疾患から選択される疾患または状態の重症度を処置するまたは和らげるための、請求項１に記載の化合物またはその塩を含む薬学的組成物。
【請求項４】
前記の疾患または障害が関節リウマチである、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む、生物学的試料においてＰＩ３Ｋ−ガンマキナーゼ活性を阻害するための組成物であって、該組成物が該生物学的試料と接触させられることを特徴とする、組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む、少なくとも１つの他のＰＩ３ＫアイソフォームよりＰＩ３Ｋ−ガンマアイソフォームを選択的に阻害するための組成物であって、該組成物が、生物学的試料と接触させられるか、またはそれを必要とする患者に投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つの他のＰＩ３ＫアイソフォームがＰＩ３Ｋ−アルファ、ＰＩ３Ｋ−ベータ、ＰＩ３Ｋ−デルタおよびその組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はホスファチジルイノシトール３−キナーゼのガンマアイソフォーム(ＰＩ３Ｋγ)インヒビターとして有用な化合物に関連する。本発明は本発明の化合物を含む薬学的に許容可能な組成物、および種々の障害の処置において上記化合物および組成物を使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＩ３Ｋは脂質キナーゼファミリーであり、膜脂質であるホスファチジルイノシトール（ＰＩ）のイノシトール環の３’−ＯＨ部位のリン酸化を触媒し、ＰＩ３−ホスフェート［ＰＩ（３）Ｐ、ＰＩＰ］、ＰＩ３，４−ビスホスフェート［ＰＩ（３，４）Ｐ２、ＰＩＰ２］およびＰＩ３，４，５−トリホスフェート［ＰＩ（３，４，５）Ｐ３、ＰＩＰ３］を産生する。ＰＩ（３，４）Ｐ２およびＰＩ（３，４，５）Ｐ３は種々の細胞内シグナリングタンパク質のリクルートメント部位として働き、次いでシグナリング複合体を形成することで、細胞膜の細胞質側に細胞外シグナルを中継する。
【０００３】
現在までに８つの哺乳類ＰＩ３Ｋが同定されており、４つのクラスＩのＰＩ３Ｋが含まれる。クラスＩａはＰＩ３Ｋα、ＰＩ３Ｋβ、およびＰＩ３Ｋδを含む。全てのクラスＩａ酵素は、ＳＨ２ドメインを含有するｐ８５アダプターサブユニットを伴い、触媒サブユニット（ｐ１  １０α、ｐ１１０βまたはｐ１１０δ）を含むヘテロ二量体複合体である。クラスＩａＰＩ３Ｋはチロシンキナーゼシグナリングによって活性化され、細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および生存に関わっている。ＰＩ３ＫαおよびＰＩ３Ｋβはまた種々のヒトのがんにおける腫瘍形成にも関係している。したがって、ＰＩ３ＫαおよびＰＩ３Ｋβの薬理的なインヒビターは種々のがんの処置に有用である。
【０００４】
ＰＩ３ＫγはクラスＩｂＰＩ３Ｋの唯一のメンバーであり、ｐ１０１調節サブユニットを伴う触媒サブユニットｐ１１０γからなる。ＰＩ３Ｋγはヘテロ三量体Ｇタンパク質のβγサブユニットとの会合を介してＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）によって調節される。ＰＩ３Ｋγは主に造血細胞および心筋細胞に発現しており、炎症および肥満細胞の機能に関わっている。したがって、ＰＩ３Ｋγの薬理的なインヒビターは種々の炎症性疾患、アレルギーおよび心血管性疾患の処置に有用である。
【０００５】
多くのＰＩ３Ｋ−ガンマインヒビターが開発されてきたが、種々の障害および疾患を処置するためにＰＩ３Ｋ−ガンマを阻害するさらなる化合物が必要である。特に望まれているものは、ｉｎ  ｖｉｖｏで薬物動態学／薬力学的挙動が改良されたＰＩ３Ｋ−ガンマインヒビターであり、例えば非標的効果を最小限にする一方で、薬物の標的組織への曝露を増大させるインヒビターなどである。単位用量ごとの曝露の増加が、標的組織への曝露と比べてオフターゲット（ｏｆｆ  ｔａｒｇｅｔ）組織の曝露を減少させる。用量を制限する毒性が、循環からの薬物のクリアランスに関連する器官または経口投与される薬剤の場合は消化管（ＧＩ）においてしばしば発生する。クリアランスの減少および改善された生物学的利用能は血漿中のＣｍａｘを増加させるが、他方腎臓、肝臓および消化管などの排泄器官のＣｍａｘを制限する。さらに、吸収の増加およびクリアランスの減少（改善された生物学的利用能）は曝露という点において、たびたび患者間における変動量の減少という結果になり、それによってまた投与される薬剤の安全プロフィールも改善される。さらに、例えばより高水溶性などの物理的特性の改善が実証される薬剤もまた望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の化合物である（Ｒ）−６−（１−（２，２−ジフルオロエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４，７，７−トリメチル−２−（５−（２，２，２−トリフルオロ−ｌ−ヒドロキシエチル）ピリジン３−イル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−オンおよびその薬学的に許容可能な組成物は、ＰＩ３Ｋγ有効的および選択的なインヒビターであり、他のＰＩ３Ｋγインヒビターと比較したとき、薬物動態学／薬力学的プロフィールが改良されていることが見出された。それゆえ、本発明は以下の構造を持つ化合物を特徴とする。
【化１】
0006340416.tif 000002
【０００７】
本発明はまた化合物１および薬学的に許容可能な担体、アジュバントまたはビヒクルを含む薬学的組成物も提供する。これらの化合物および薬学的組成物は喘息、アトピー性皮膚炎、鼻炎、アレルギー性疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、敗血性ショック、特発性肺線維症、脳卒中、火傷、関節疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、アテローム性動脈硬化、急性膵炎、乾癬、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病およびグレーブス病などの炎症性及び免疫調節性障害を含む種々の障害の処置または重症度を和らげるために有用である。
【０００８】
発明によって提供される化合物および組成物はまた、生物学的現象および病理学的現象におけるＰＩ３Ｋの研究；このようなキナーゼによって媒介される細胞内情報伝達経路の研究；および新しいキナーゼインヒビターの比較評価のために有用である。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
以下の式：
【化４】
0006340416.tif 000003
を有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
（項目２）
項目１に記載の化合物および薬学的に許容可能な担体、アジュバントまたはビヒクルを含む薬学的組成物。
（項目３）
喘息、アトピー性皮膚炎、鼻炎、アレルギー性疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、敗血性ショック、特発性肺線維症、脳卒中、火傷、関節疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、アテローム性動脈硬化、急性膵炎、乾癬、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病およびグレーブス病から選択される自己免疫疾患または炎症性疾患から選択される疾患または状態の重症度を処置するまたは和らげる方法であって、前記の患者に項目１による化合物またはその塩もしくはその薬学的組成物を投与する工程を含む方法。
（項目４）
前記の疾患または障害が関節リウマチである、項目３に記載の方法。
（項目５）
項目１に記載の化合物、もしくは上記化合物を含む組成物と生物学的試料を接触させる工程を含む、生物学的試料においてＰＩ３Ｋ−ガンマキナーゼ活性を阻害する方法。
（項目６）
項目１に記載の化合物もしくは該化合物を含む組成物に物学的試料を接触させる工程または、項目１に記載の化合物または該記化合物を含む組成物を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、前記少なくとも１つの他のＰＩ３ＫアイソフォームよりＰＩ３Ｋ−ガンマアイソフォームを選択的に阻害する方法。
（項目７）
前記少なくとも１つの他のＰＩ３ＫアイソフォームがＰＩ３Ｋ−アルファ、ＰＩ３Ｋ−ベータ、ＰＩ３Ｋ−デルタおよびその組み合わせからなる群から選択される、項目６に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、２．５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ、５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤおよび１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ（２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）で治療マウスコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて試験される化合物１についての結果を示す。
【００１０】
【図２】図２は、２．５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ、５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤおよび１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ（２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）で治療マウスコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて試験される化合物１についての結果を示す。結果では、登録時に関節炎の臨床的兆候を示す足についてのみが示される。
【００１１】
【図３】図３は、２．５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ、５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤおよび１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ（２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）で治療マウスコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて試験される化合物１についての結果を示す。結果では、登録時に関節炎の臨床的兆候を示さない足についてのみが示される。
【００１２】
【図４】図４は、５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤおよび１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤでＩＢＤモデルにおいて試験される化合物１についての結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
定義および一般的用語
本明細書において使用される場合、他の指示がない限り以下の定義が適用される。本発明の目的のため、化学元素はｔｈｅ  Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  Ｔａｂｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＣＡＳ  ｖｅｒｓｉｏｎ，およびｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，７５ｔｈ  Ｅｄ．１９９４に従って識別される。さらに、有機化学の一般法則は“Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ：１９９９、および“Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”５ｔｈ  Ｅｄ．、Ｓｍｉｔｈ、Ｍ．Ｂ．ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ，Ｊ．，ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：２００１，にて記載されており、これらの全体内容は本明細書において参考として援用される。
【００１４】
立体化学中心が定義されて描かれている化合物は、立体化学的に純粋であるが、絶対立体化学はいまだ不確定である。このような化合物は、Ｒ配置またはＳ配置のいずれかを有しうる。そのような絶対な配置が決定される場合は、キラル中心は図中でＲまたはＳと標識される。本明細書において化合物１はＲ配置で描かれるが、本発明はＳ配置ならびにＳ配置およびＲ配置のラセミ混合物の実施形態を含む。
【００１５】
本発明はまた本発明のいかなる化合物および薬学的に許容可能な担体、アジュバントまたはビヒクルを含む薬学的組成物も特徴とする。
【００１６】
一つの実施形態において、本発明は化合物１またはその薬学的組成物を患者に投与することで、患者におけるＰＩ３Ｋキナーゼ活性を阻害する方法を特徴とする。さらなる実施形態として、ＰＩ３Ｋ−ガンマはＰＩ３Ｋ−アルファ、ＰＩ３Ｋ−βまたはＰＩ３Ｋ−デルタより選択的に阻害される。
【００１７】
他の実施形態では、本発明は患者に化合物１またはその薬学的組成物を投与することで、患者における喘息、アトピー性皮膚炎、鼻炎、アレルギー性疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、敗血性ショック、特発性肺線維症、脳卒中、火傷、関節疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、アテローム性動脈硬化、急性膵炎、乾癬、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病およびグレーブス病などの炎症性および免疫調節性障害から選択される疾患または状態の重症度を処置するまたは和らげる方法を特徴とする。
【００１８】
本発明はまた生体試料と化合物１または前記化合物を含む組成物とを接触させることを含む、生体試料においてＰＩ３Ｋ−ガンマキナーゼ活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害する非治療的な方法も特徴とする。
本発明の化合物の組成物、製剤および投与
【００１９】
他の局面では、本発明は化合物１を含む薬学的組成物を提供する。例えば、本発明は化合物１またはその薬学的に許容可能な誘導体および薬学的に許容可能な担体、アジュバント、ビヒクルを含む組成物を提供する。１つの実勢形態では、本発明の組成物における化合物の量は、生体試料または患者においてＰＩ３Ｋγを測定可能に阻害するのに有効な量である。１つの実施形態において、本発明の組成物はそのような組成物を必要とする患者への投与のために製剤化される。さらなる実施形態において、本発明の組成物は患者への経口投与のために製剤化される。本明細書において使用される「患者」という用語は動物、好ましくは哺乳類動物および最も好ましくはヒトを意味する。
【００２０】
本発明のある一定の化合物が、遊離形態で、または適切な場合でその薬学的に許容可能な誘導体として存在し得ることも理解される。本発明によると、必要としている患者に投与される際に、本明細書で他に記載されているように化合物を直接的または間接的に提供することができる薬学的に許容可能なプロドラッグ、塩、エステル、そのようなエステルの塩もしくは他の任意の付加化合物もしくは誘導体、またはその代謝物もしくはその残留物を含むが、限定されない。本明細書において使用される場合、「阻害的活性のあるその代謝物または残留物」という用語はその代謝物または残留物もまたＰＩ３Ｋ−ガンマのインヒビターであることを意味する。
【００２１】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容可能な塩」という用語は過度な毒性、過敏症、アレルギー反応などを伴わずにヒトおよび下等生物の組織との接触における利用に、妥当な医学判断の範囲内で適している塩について言及する。
【００２２】
薬学的に許容可能な塩は当該分野において周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．、はＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、６６：１−１９、１９７７において薬学的に許容可能な塩を詳細に記載しており、これらの全体内容は本明細書において参考として援用される。本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩は、適切な無機酸および有機酸ならびに無機塩基および有機塩基に由来する塩を含む。薬学的に許容可能な非毒性酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および過水素酸などの無機酸または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸などの有機酸を用いて、またはイオン交換などの当該分野において使用される他の方法を使用することで形成されるアミノ基の塩である。他の薬学的に可能な塩はアジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩（ｐｅｃｔｉｎａｔｅ）、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などを含む。適切な塩基に由来する塩はアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩およびＮ＋（Ｃ１−４  アルキル）４塩を含む。本発明はまた本明細書において開示される化合物の任意の塩基性窒素を含む基の四級化も意図する。水溶性もしくは油溶性または分散性の生成物はそのような四級化によって得られ得る。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩はナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどを含む。さらなる薬学的に許容可能な塩は、適切な場合、ハライド、ヒドロキシド、カルボキシレート、スルフェート、ホスフェート、ニトレート、Ｃ１−８スルホネートおよびアリールスルホネートなどの対イオンを使用して形成される非毒性アンモニウムカチオン、第四級アンモニウムカチオンおよびアミンカチオンを含む。
【００２３】
上記のように、本発明の薬学的に許容可能な組成物はさらに、本明細書において使用される場合において、望まれる特定の投薬形態に適合するように、いかなるおよび全ての溶媒、希釈剤もしくは他の液体ビヒクル、分散補助剤もしくは懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、保存剤、固体結合剤、滑沢剤（ｌｕｂｒｉｃａｎｔ）などを含む薬学的に許容可能な担体、アジュバントまたはビヒクルを含む。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ、２００５、ｅｄ．Ｄ．Ｂ．Ｔｒｏｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，ＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａおよびＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８−１９９９，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにおいて、それぞれの内容は本明細書において参考として援用されるが、薬学的に許容可能な組成物の製剤化において使用される種々の担体およびその調製のために公知の技術が開示される。任意の慣用される担体媒体も、任意の望ましくない生物学的効果を生ずることまたはそれ以外の有害な方法で薬学的に許容可能な組成物の他の任意の成分と相互作用することによるなど、本発明の化合物と適合しない範囲を除いて、その利用は本発明の範囲内に意図される。
【００２４】
薬学的に許容可能な担体として働くことができる材料のいくつかの例は、製剤者の判断にしたがって、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸もしくはソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩またはプロタミン硫酸塩などの電解質、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸塩、蝋、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、羊毛脂、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；コーンスターチおよびポテトデンプンなどのデンプン；セルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよびアセチルセルロースなどのその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；滑石；ココアバターおよび座薬ろうなどの賦形剤；落花生油、綿実油；紅花油；ゴマ油；オリーブ油、コーン油および大豆油などの油；プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張ＮａＣｌ水；リンガー液；エチルアルコールならびにリン酸緩衝液ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の無毒性の適合する滑沢剤（ｌｕｂｒｉｃａｎｔ）を含むが限定されず、そして着色料、放出剤、塗布剤、甘味料、香料および芳香剤、保存剤ならびに抗酸化剤もまた組成物に存在し得る。
【００２５】
本発明の組成物は経口投与、非経口投与、吸入噴霧器による投与、局所的投与、直腸投与、鼻への投与、頬への投与、膣投与または埋め込んだリザーバー（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を介して投与をされ得る。「非経口的に」という用語は本明細書で使用される場合において、皮下注射、静脈内注射、筋肉注射、関節内注射、滑液包内注射、胸骨内注射、鞘内注射、眼内注射、肝内注射、病巣内注射、硬膜外注射、髄腔内注射および頭蓋内注射または注入技術を含む。好ましくは、組成物は経口投与、腹膜組織内投与または静脈内投与をされる。本発明の組成物の無菌注射可能形態は水性または油性の懸濁物であり得る。当該分野において公知の技術にしたがって、これらの懸濁物は、適切な分散剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）または湿潤剤（ｗｅｔｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）および懸濁剤を使用して製剤化され得る。無菌注射可能調製物はまた非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の無菌注射可能溶液または無菌注射懸濁物でもあり得、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液である。利用され得る許容可能な担体および溶媒の中には水、リンガー液および等張ＮａＣｌ水がある。さらに、無菌の不揮発油は溶媒または懸濁媒体として慣用的に利用される。
【００２６】
この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含むいかなる無刺激の不揮発性油も利用され得る。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は注射可能物質の調製において有用である。オリーブ油またはひまし油などの天然の薬学的に許容可能な油、特にそのポリオキシエチル化型も同様である。これらの油溶液または懸濁物はまた、乳剤および懸濁物を含む薬学的に許容可能な投薬形態の製剤化において一般的に使用されるカルボキシメチルセルロースまたは同様の分散剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）などの長鎖アルコールの希釈剤または分散剤（ｄｉｓｐｅｒｓａｎｔ）も含み得る。薬学的に許容可能な固体、液体または他の投薬形態の製造において一般的に使用されるＴｗｅｅｎ，Ｓｐａｎおよび他の乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）または生物学的利用能賦活剤などの他の一般的に使用される界面活性剤もまた製剤化の目的のために使用され得る。
【００２７】
本発明の薬学的に許容可能な組成物は、カプセル、錠剤、水性の懸濁物または水溶液を含むが限定されない、いかなる経口的に許容可能な投薬形態において経口投与され得る。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用される担体はラクトースおよびコーンスターチを含む。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤（ｌｕｂｒｉｃａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）もまた通常加えられる。カプセル形態での経口投与のために、有用な希釈剤はラクトースおよび乾燥コーンスターチを含む。経口使用のために水性懸濁物が必要とされるとき、活性成分は乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）および懸濁剤と合わせられる。望ましい場合は、一定の甘味料、香料または着色料もまた加えられ得る。
【００２８】
あるいは、本発明の薬学的に許容可能な組成物は直腸投与のために座薬形態で投与され得る。これらは薬剤と、室温では固体であるが直腸の温度では液体であり、それゆえ直腸内においては融解し薬物を放出する適切な無刺激の賦形剤を混合することによって調製され得る。そのような材料はココアバター、蜜蝋およびポリエチレングリコールを含む。
【００２９】
経口投与のための液体投薬形態は薬学的に許容可能な乳剤、マイクロ乳剤（ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ）、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤を含むが、限定されない。活性化合物に加えて、液体投薬形態は、例えば水または他の溶媒といった可溶化剤および乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）（例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタン脂肪酸エステルならびにその混合物など）などの当該分野において一般的に使用される不活性の希釈剤を含み得る。不活性の希釈剤の他に、経口組成物はまた湿潤剤（ｗｅｔｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）および懸濁剤などのアジュバント、甘味料、香料および芳香剤も含み得る。
【００３０】
例えば無菌の注射可能な水性懸濁物または油性懸濁物といった注射調製物は、適切な分散剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）または湿潤剤（ｗｅｔｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）および懸濁剤を使用する公知技術にしたがって製剤化され得る。無菌注射調製物はまた、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液のような非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の無菌注射可能溶液、懸濁物または乳剤でもあり得る。利用され得る許容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、ｗａｔｅｒ、Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張ＮａＣｌ水がある。さらに、無菌の不揮発性油は溶媒または懸濁媒体として慣用的に利用される。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含むいかなる無刺激の不揮発性油も利用され得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は注射可能物の調製において使用される。
【００３１】
注射可能製剤は、例えば細菌保持フィルターによる濾過または、無菌な水もしくは他の無菌な注射可能媒体に溶解または分散し得る無菌の固体組成物の形態の滅菌剤を使用前に組み入れることによって滅菌され得る。
【００３２】
本発明の化合物の効果を延長するために、皮下注射または筋肉内注射からの化合物の吸収を遅らせることがしばしば望ましい。これは低水溶性の結晶性または無定形の材料の液状懸濁物の使用によって成し遂げられ得る。その場合、化合物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、ついで溶解速度は結晶の大きさおよび結晶の形態に依存し得る。あるいは、化合物を油ビヒクルに溶解または懸濁することは、非経口的に投与される化合物形態の吸収を遅らせることを成し遂げる。注射可能なデポ形態は化合物のマイクロカプセル基質をポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に形成することによって作られる。化合物とポリマーの比率および利用される特定のポリマーの性質に依存して、化合物放出の速度は制御され得る。他の生分解性ポリマーの例はポリ（オルソエステル）およびポリ（無水物）を含む。デポ注射可能製剤はまた、化合物を体組織と適合するリポソームまたはマイクロ乳剤（ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ）中にいれる（ｅｎｔｒａｐ）ことによっても調製される。本発明の化合物は、数時間〜数日〜数カ月、望まれる期間中、制御されるその放出を提供するために、他の慣習的な持続する放出製剤の中に組み入れられ得る。
【００３３】
直腸投与または膣投与のための組成物は、好ましくは座薬であり、この座薬は本発明の化合物とココアバター、ポリエチレングリコールまたは座薬ろうなどの周囲の温度では固体であるが体温では液体であり、それゆえ直腸または膣腔において融解し、そして活性化合物を放出する適切な非刺激性の賦形剤または担体との混合によって調製され得る。
【００３４】
経口投与のための固体投薬形態はカプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤を含む。そのような固体投薬形態において、活性化合物は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの少なくとも一つの不活性の薬学的に許容可能な賦形剤または担体および／もしくはａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸などのフィラー（ｆｉｌｌｅｒ）または増量剤、ｂ）例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロースおよびアカシアなどの結合剤、ｃ）グリセロールなどの湿潤剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ポテトデンプンもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある一定のケイ酸塩および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、ｅ）パラフィンなどの溶解遅延剤、ｆ）第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ｇ）例えばセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤（ｗｅｔｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、ｈ）カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤およびｉ）滑石、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびその混合物などの滑沢剤（ｌｕｂｒｉｃａｎｔ）と混合される。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、投薬形態はまた緩衝剤も含み得る。
【００３５】
類似型の固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤などを使用する充填された軟ゼラチンカプセル剤および充填された硬ゼラチンカプセル剤中のフィラーとして利用され得る。錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、丸剤および顆粒剤の固体投薬形態は薬学的製剤分野において周知な腸溶性剤皮および他の剤皮などの剤皮および殻を使って調製され得る。それらは乳白剤を任意に含有し得、また腸管の一定の部分のみにおいて、もしくは優先的に、活性成分を必要に応じて遅れる様式で放出する組成物を構成し得る。使用され得る包理組成物の例は、ポリマー物質およびろうを含む。類似型の固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤などを使用する充填された軟ゼラチンカプセル剤および充填された硬ゼラチンカプセル剤中のフィラーとして利用され得る。
【００３６】
活性化合物はまた上記の一以上の賦形剤を持つマイクロカプセル形態中にあり得る。腸溶性剤皮などの剤皮および殻を使って調製され得る錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、丸剤および顆粒剤の固体投薬形態は、薬学的製剤分野において周知の制御剤皮および他の剤皮を放出する。そのような固体投薬形態において、活性化合物はスクロース、ラクトースまたはデンプンなどの少なくとも一つの不活性希釈剤と混合され得る。そのような投薬形態はまた、通常の実施と同様、例えばステアリン酸マグネシウムおよびマイクロ結晶性セルロースのような錠剤滑沢剤および他の滑沢補助剤などの不活性希釈剤以外のさらなる物質も含み得る。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、投薬形態はまた緩衝剤も含み得る。それらは任意に乳白剤を含有し得、また腸管の一定の部分のみにおいて、もしくは優先的に、活性成分を必要に応じて遅れる様式で放出する組成物を構成し得る。使用され得る包理組成物の例はポリマー物質およびろうを含む。
【００３７】
本発明の化合物の局所的投与または経皮投与のための投薬形態は軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、液剤、スプレー剤、吸入剤または貼付剤を含む。必要とされる場合、活性成分は無菌条件下で薬学的に許容可能な担体および任意の必要とされる保存剤または緩衝物と混合される。眼科製剤、点耳剤および点眼剤もまた本発明の範囲内にあると意図される。さらに、本発明は、体への化合物の制御された送達を提供するというさらなる利点を持つ経皮貼付剤の使用を意図する。そのような投薬形態は、適切な媒体に化合物を溶解または分与することよって作られ得る。吸収促進剤もまた皮膚をこえた化合物の流入を増加するために使用され得る。その速度は速度調節膜の提供またはポリマー基質もしくはゲル中の化合物の分散のいずれかによって制御され得る。
【００３８】
本発明の化合物は、投与の容易さおよび投薬の均一性のために、好ましくは投薬単位形態で製剤化される。「投薬単位形態」という表現は本明細書において使用される場合、処置される患者に適切な、物理的に分けられた薬剤の単位について言及する。しかし、本発明の化合物および組成物の日々の総合的な使用は妥当な医学判断の範囲内で、主治医によって決定されると理解される。任意の特定の患者または特定の器官のための具体的な有効な用量の水準は、処置される障害および障害の重症度；利用される具体的な化合物の活性；利用される具体的な組成；患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事；投与時期、投与経路および利用される具体的な化合物の排出速度；処置期間；利用される具体的な化合物と組み合わせて使用される薬物または同時に存在する薬物などの医療分野において周知の要因を含む種々の要因に依存する。
【００３９】
単一の投薬形態の組成物を製造するために担体材料と合わせられ得る本発明の化合物の量は、処置される宿主、投与の特定の様式に依存して変動する。０．０１  〜  １００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．１  〜１００ｍｇ／ｋｇおよび０．１  〜  １０ｍｇ／ｋｇ  体重／日などの間の投薬量のインヒビターが、これらの組成物を受ける患者に投与され得るために、組成物は製剤化されるべきである。
【００４０】
処置されるまたは予防される、特定の状態または疾患に依存して、その状態を処置または予防するために通常投与される追加の治療薬もまた本発明の組成物中に存在し得る。本明細書において使用される場合、特定の疾患または特定の状態を処置または予防するために通常投与される追加の治療薬は、「処置される疾患または状態に適切である」として公知である。追加の治療薬の例は、以下に提供される。
【００４１】
本発明の組成物中に存在する追加の治療薬の量は、その治療薬を唯一の活性薬剤として含む組成物中に通常投与される量より決して多くない。好ましくは、現在開示される組成物中の追加の治療薬の量は、その薬剤を唯一の治療活性薬剤として含む組成物中に通常存在する量の約５０％から１００％におよぶ。
本発明の化合物および組成物の使用
【００４２】
本発明の一局面において、本発明はＰＩ３Ｋ−ガンマ介在性の状態または疾患の重症度を処置する方法または和らげる方法を特徴とする。「ＰＩ３Ｋ−ガンマ介在性疾患」という用語は、本明細書において使用される場合、ＰＩ３Ｋ−ガンマアイソフォームが機能することが公知の任意の疾患または他の有害な状態を意味する。
【００４３】
それに応じて、さらなる実施形態において、本発明の化合物はＰＩ３Ｋγ−アイソフォームの阻害に選択的である。一つの実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは、本発明の化合物または組成物は、ＰＩ３ＫアルファアイソフォームよりＰＩ３Ｋガンマアイソフォームの阻害に関して、少なくとも２０倍選択的である。他の実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは、本発明のＰＩ３Ｋγ選択的化合物はアルファ、ベータおよびデルタアイソフォームのそれぞれよりガンマアイソフォームを少なくとも２０倍阻害する。本発明はさらに、そのような治療が必要な患者を処置するために、本発明の化合物および組成物の選択をｉｎ  ｖｉｖｏで使用することを含む。
【００４４】
本発明の化合物または組成物は一以上の追加の治療薬とともに投与され得、ここで、この追加の治療薬は処置される疾患に適切であり、そしてこの追加の治療薬は単一投薬形態として本発明の化合物または組成物ともに投与されるかまたは複合的な投薬形態の一部として化合物もしくは組成物とは別個に投与される。追加の治療薬は、本発明の化合物と同時にまたは異なる時間に投与され得る。後者では、例えば６時間、１２時間、１日、２日、３日、１週、２週、３週、１カ月または２カ月ずつ投与はずらされ得る。
【００４５】
本発明は生体試料におけるＰＩ３Ｋ−ガンマキナーゼ活性の阻害方法を提供し、この方法はこの生体試料と本発明の化合物または組成物とを接触させることを含む。「生体試料」という用語は、本明細書において使用される場合、生きている生物の外の試料を意味し、限定することなしに、細胞培養物またはその抽出物；哺乳動物から得られる生検材料またはその抽出物；および血液、唾液、尿、糞、精液、涙もしくは他の体液またはその抽出物を含む。生体試料におけるキナーゼ活性、特にＰＩ３Ｋ−ガンマキナーゼ活性の阻害は当業者に公知の種々の目的のために有用である。そのような目的の例は、生物学的検体の保管および生物学的アッセイを含むが、限定されない。一つの実施形態において、生体試料におけるＰＩ３Ｋ−ガンマキナーゼ活性を阻害する方法は、非治療的方法に限定される。
本発明の化合物の調製
【００４６】
本明細書において使用される場合、全ての略語、記号および慣習は、現代科学文献中に使用されるものと一致する。例えば、Ｊａｎｅｔ  Ｓ．Ｄｏｄｄ，ｅｄ．，  Ｔｈｅ  ＡＣＳ  Ｓｔｙｌｅ  Ｇｕｉｄｅ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ａｕｔｈｏｒｓ  ａｎｄ  Ｅｄｉｔｏｒｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９７．を参照のこと。下記の定義は、本明細書において使用される用語および略語を記載する：
ＡＴＰ              アデノシン三リン酸
Ｂｒｉｎｅ          飽和ＮａＣｌ水溶液
ＣＲＥＤ            カルボニル還元酵素
ＤＣＭ              ジクロロメタン
ＤＩＥＡ            ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡ              ジメチルアセトアミド
ＤＭＡＰ            ４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ              ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ            ジメチルスルホキシド
ｄｐｐｆＰｄＣｌ２  １，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−フェロセンジクロロ−パラジウム
ＤＴＴ              ジチオトレイトール
ＥＳＭＳ            エレクトロスプレー質量分析法
Ｅｔ２Ｏ            エチルエーテル
ＥｔＯＡｃ          酢酸エチル
ＥｔＯＨ            エチルアルコール
ＨＥＰＥＳ          ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
ＨＰＬＣ            高速液体クロマトグラフィー
ＬＣ−ＭＳ          液体クロマトグラフィー−質量分析法
ｍＣＰＢＡ          メタクロロ過安息香酸
Ｍｅ                メチル
ＭｅＯＨ            メタノール
ＭＴＢＥ            メチルｔ−ブチルエーテル
ＭＣ                メチルセルロース
ＮＡＤ              ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
ＮＭＰ              Ｎ−メチルピロリジン
Ｐｈ                フェニル
ＲＴまたはｒｔ    室温（２０℃と２５℃との間）
ｔＢｕ              第三級ブチル
ＴＢＭＥ            ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル
ＴＣＡ              トリクロロ酢酸
ＴＨＦ              テトラヒドロフラン
ＴＥＡ              トリエチルアミン
【実施例】
【００４７】
合成手順
一般的に、化合物１は本明細書において記載される方法または当業者に公知の他の方法によって調製され得る。
【化２】
0006340416.tif 000004
【００４８】
スキーム１の工程１−ｉにおいて示されるように、窒素雰囲気下において、ジクロロメタン（１００ｍＬ）中のエチル２，４−ジメチルピリジン−３−カルボン酸（化合物１００１、２０．２ｇ、１１２．５ｍｍｏｌ）溶液に１，３，５−トリクロロ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン（３１．４ｇ、１３５．０ｍｍｏｌ）を１５分間、少しずつ（ｐｏｒｔｉｏｎｗｉｓｅ）加えた。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。生じた白色の沈殿物を濾過し、濾過液を次に飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×１００ｍL)およびｂｒｉｎｅ（１００ｍＬ）を用いて連続して洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、減圧下で濃縮して、エチル２−（クロロメチル）−４−メチルニコチン酸塩（２２．９ｇ、化合物１００２）を黄色油として得た。：ＥＳＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝２１３．９６。この材料をさらなる精製なしで、次の工程で使用した。
【００４９】
スキーム１の工程１−ｉｉにおいて示されるように、ジクロロメタン（４８４ｍＬ）中のエチル２−（クロロメチル）−４−メチルニコチン酸（化合物１００２、１１２．０ｇ、５２４．２ｍｍｏｌ）溶液に、３−クロロペルオキシ安息香酸（１４１．０ｇ、６２９．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を窒素雰囲気下において、室温で一晩中撹拌した。混合物をジクロロメタン（２００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）、飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液（１００ｍＬの２Ｍ溶液）およびｂｒｉｎｅを用いて連続して洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、減圧下で濃縮して、２−（クロロメチル）−３−（エトキシカルボニル）−４−メチルピリジン−１−オキシド（化合物１００３）を得た。：ＥＳＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝２３０．２５。この材料をさらなる精製なしで、次の工程で使用した。
【００５０】
スキーム１の工程１−ｉｉｉにおいて示されるように、オキシ塩化リン（４５０．１ｍＬ，４．８  ｍｏｌ）中の２−（クロロメチル）−３−（エトキシカルボニル）−４−メチルピリジン１−オキシド（化合物１００３、６９．３ｇ、３０１．８ｍｍｏｌ）溶液を、窒素雰囲気下において６０分間撹拌し、９５℃に熱した。反応化合物を室温まで冷やし、オキシ塩化リンを減圧下で蒸留し取り除いた。生じたやや黒色に近い色の残留物をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶かし、１Ｌビーカー中の氷（５００ｇ）にかけた。生じた混合物を１０分間撹拌した。混合物のｐＨを、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を用いて７よりわずかに高く調整した。有機相を分離し、水相をさらなるジクロロメタンを用いて抽出し戻した。合わせた有機相をｂｒｉｎｅで連続して洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をＥｔＯＡＣ／ヘキサン（１：３）を使用してシリカゲルの充填剤（ｐｌｕｇ）に通し、減圧条件下で揮発性のものを除去した後に、８０％純度の生成物を得た（１Ｈ  ＮＭＲによって指示されたように）。この材料を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（１０−２５％  ＥｔＯＡＣ／ヘキサン、３３０ｇ  Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  ＩＳＣＯカラム）を介してさらに精製し、エチル６−クロロ−２−（クロロメチル）−４−メチルニコチン酸塩（化合物１００４、３６．５ｇ）を得た。：ＥＳＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝２４８．０４。
【００５１】
スキーム１の工程１−ｉｖにおいて示されるように、イソプロパノール（１．７Ｌ）中の１−（２，２−ジフロロエチル）ピラゾール−４−アミン（４８．２ｇ、３２７．５ｍｍｏｌ）溶液に、エチル６−クロロ−２−（クロロメチル）−４−メチルニコチン酸塩（化合物１００４、６５．０ｇ、２６２．０ｍｍｏｌ）を加え、次にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４５．６ｍＬ、２６２．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を７２時間５５℃で熱した。生じた濃い白色の懸濁物を室温まで冷やし、濾過し、さらなるイソプロパノール（２００ｍＬ）およびジエチルエーテル（５００ｍＬ）を用いて洗浄した。生じた固形物を真空オーブンにおいて５０℃で一晩中乾燥させ、５６ｇの２−クロロ−６−（１−（２，２−ジフルオロエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４−メチル−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−オン（化合物１００５）を提供した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．２８（ｓ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝０．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｓ，Ｈ），６．３７（ｔｔ，＝５４．９，．７Ｈｚ，Ｈ），４．８５（ｓ，Ｈ），４．６７（ｔｄ，Ｊ＝１５．２，３．７Ｈｚ，２Ｈ），２．６５（ｓ，３Ｈ）。この材料は７％の環化していない副生成物［エチル６−クロロ−２−（（（１−（２，２−ジフロオロエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ）メチル）−４−メチルニコチン酸塩］を含有し、後の反応においてそのまま使用した。
【００５２】
スキーム１の工程１−ｖにおいて示されるように、ＤＭＦ（７８２．０ｍＬ）中の２−クロロ−６−（１−（２，２−ジフルオロエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４−メチル−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−オン（化合物１００５、４６．０ｇ、１４７．１ｍｍｏｌ）溶液に、ヨウ化メチル（２０．１ｍＬ、３２３．６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５℃まで冷やし、水素化ナトリウム（１２．９ｇ、鉱油中６０％分散の３２３．６ｍｍｏｌ）を１５分間少しずつ（ｐｏｒｔｉｏｎｗｉｓｅ）加えた。反応混合物を３℃で４５分間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は出発材料の消耗に加えて、モノメチル化生成物（１０％）、ビスメチル化生成物（７４％）およびトリメチル化生成物（１５％）の混合物を示した。さらなる水素化ナトリウム（１．２９ｇ、鉱油中６０％分散の３２．３６ｍｍｏｌ）を加え、さらに１時間後、ＨＰＬＣ分析は８４％のビスメチル化の望まれる生成物および１６％のトリメチル化の副生成物を示した。飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（１Ｌ）、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液（４００ｍＬ）および水（１Ｌ）を加えることによって反応をクエンチした。ＥｔＯＡｃ（８００ｍＬ）を用いて二度水相を抽出した。合わせた有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（８００ｇのＴｅｌｅｄｙｎｅ  ＩＳＣＯカラムを使用した０−４０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配）を介して精製し、２−クロロ−６−（１−（２，２−ジフルオロエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４，７，７−トリメチル−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−オン（化合物１００６、２４ｇ）を白色の固形物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．２１（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｓ，１Ｈ），７．５４（ｓ，１Ｈ）６．５８−６．２５（ｍ，１Ｈ），４．６７（ｔｄ，Ｊ＝１５．１，３．７Ｈｚ，２Ｈ），２．６５（ｓ，３Ｈ），１．５１（ｓ，６Ｈ）。
【化３】
0006340416.tif 000005
【００５３】
スキーム２の工程２−ｉにおいて示されるように、水（１０Ｌ）を２０Ｌ反応器に加え、次にＫＨ２ＰＯ４（１３６ｇ）を加えた。均質性を得るまで混合物を撹拌し、０．１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４緩衝液を提供した。この緩衝液のｐＨを、２Ｍ  ＮａＯＨを加えることによってｐＨ７．５に調整した。内部の温度を３７℃にした。約５００ｍＬの緩衝液を取り出し、ＮＡＤおよびＣＲＥＤ  Ａ１３１  細胞ペースト（Ａｌｍａｃ  Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．）を後に加えるために使用した。それに応じて、緩衝液（１００ｍＬ）中のＮＡＤ（２０ｇ）溶液を残っている９．５Ｌの緩衝液に加え、次にＭＴＢＥ（１．５Ｌ）中の１−（５−ブロモピリジン−３−イル）−２，２，２−トリフルオロエタン−１−オン（１０２０ｇ）溶液を加えた。反応物の中で、イソプロパノール（１Ｌ）を使って追加のフラスコをすすいだ。緩衝液（４００ｍＬ）中のＣＲＥＤ  Ａ１３１  細胞ペースト（１００ｇ）の懸濁物を撹拌した反応混合物に加えることによって還元を始めた。反応過程の間、二相性の反応試料（約２ｍＬ）を撹拌している混合物から取り出し、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）を使用して抽出し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させ、ＤＭＳＯ−ｄ６中で１Ｈ  ＮＭＲによって分析して、出発材料から生成物への変換を監視した。１時間後、５０％の変換を観察した。３時間後、９９％以上の変換を観察した。反応のｐＨを２Ｍ  ＮａＯＨを用いて１１に調整し、３０分間撹拌し、酵素を変性した。ｐＨを２Ｍ  ＨＣｌを用いて９に再調整した。ＥｔＯＡｃ（５Ｌ）および珪藻土（６５０ｇ）を反応混合物に加え、１０分間継続して撹拌した。生じた乳濁液を珪藻土のパッド（ｐａｄ）を通して濾過し、有機相および水相に分離した。パッド（ｐａｄ）をＥｔＯＡｃ（２Ｌ）を用いて洗浄し、有機層を分離した。水層をＥｔＯＡｃ（６Ｌ）を用いて再抽出し、合わせた有機相をｂｒｉｎｅ（４Ｌ）を用いて洗浄し、ＭｇＳＯ４（２００ｇ）を加えることによって乾燥させて、３０分間撹拌した。減圧条件下で濾過し、揮発性のものを除去し、淡黄色の油であって動かないで急速に凝固する油を得た。固形物を砕いて大きな塊にし、シクロヘキサン（２Ｌ）中に懸濁した。ＥｔＯＡｃ（〜５００ｍＬ）を混合物に加え、４５℃で撹拌し、固形物を溶かした。混合物は次に細かい白色の固形物が溶液から沈殿し始めるまで、減圧条件下で再濃縮した。さらなるシクロヘキサン（２Ｌ）を加え、氷浴で溶液を０℃まで冷やした。３０分間撹拌後、固形物を濾過によって集め、シクロヘキサン（５００ｍＬ）を用いて洗浄し、真空オーブンにおいて乾燥させて、８１２ｇの（Ｒ）−１）−１−（５−ブロモピリジン−３−イル）−２，２，２−トリフルオロエタン−１−オール（化合物１００７、ＨＰＬＣにより９９．９５％  ｅｅ）を顆粒状の白色固形物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．７２（ｓ，１Ｈ），８．６１（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｓ，１Ｈ），５．０９−５．１５（ｍ，１Ｈ）。
【００５４】
スキーム２の工程２−ｉｉにおいて示されるように、ジオキサン（１．２Ｌ）中の（１Ｒ）−１−（５−ブロモ−３−ピリジル）−２，２，２−トリフルオロ−エタノール（化合物１００７、４９．５ｇ、１９３．３ｍｍｏｌ）、４，４，５，５−テトラメチル−２−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−１，３，２−ジオキサボロラン（５８．９ｇ、２３２．０ｍｍｏｌ）およびＫＯＡｃ（３７．９ｇ、３８６．６ｍｍｏｌ）溶液を窒素で２０分間フラッシュ（ｆｌｕｓｈ）した。反応混合物にｄｐｐｆＰｄＣｌ２＊ＤＣＭ（７．８ｇ、９．７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物をさらに２０分間窒素でフラッシュ（ｆｌｕｓｈ）し、熱し、２時間還流した。室温まで冷やした後、混合物をフロリジルのパッド（ｐａｄ）に通して濾過し、ケークを５０％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２（１．５Ｌ）で洗浄した。生じた濾過液を減圧条件下で濃縮し、黄色油を得、ヘキサン（８００ｍＬ）で希釈し、減圧条件下で濃縮し、発泡状の黄色の固形物を得た。黄色の固形物をヘキサン（８００ｍL)を用いて２時間撹拌した結果、白色固形物の沈殿物が生じた。白色の固形物を濾過によって集め、乾燥し、（１Ｒ）−２，２，２−トリフルオロ−１−［５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２-イル）−３−ピリジル］エタノール（化合物１００８、４８．４ｇ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．９７（ｓ，１Ｈ），８．７８（ｓ，１Ｈ），８．２９（ｓ，１Ｈ），５．１０−５．２１（ｍ，１Ｈ）；１．３８（ｓ，６Ｈ），１．２９（ｓ，６Ｈ）。
【００５５】
スキーム２の工程２−ｉｉｉにおいて示されるように、ＤＭＦ（６３０ｍＬ）および水中の２−クロロ−６−（１−（２，２−ジフルオロエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４，７，７−トリメチル−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−オン、（化合物１００６、４２．０ｇ、１２３．３ｍｍｏｌ）、（１Ｒ）−２，２，２−トリフルオロ−１−［５−（４，４，５，５，−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−３−ピリジル］エタノール（化合物１００８、４６．７ｇ、１４８．０ｍｍｏｌ）およびＮａ２ＣＯ３（２８．８ｇ、２７１．３ｍｍｏｌ）溶液を３０分間窒素でフラッシュ（ｆｌｕｓｈ）した。混合物にｄｐｐｆＰｄＣｌ２＊ＤＣＭ（２．９９ｇ、３．６９９ｍｍｏｌ）を加え、混合物をさらに３０分間窒素でフラッシュ（ｆｌｕｓｈ）した。反応混合物を１０３℃まで熱し、２時間撹拌した。混合物を室温まで冷やし、水（２Ｌ）を用いて希釈した。水相をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）を用いて２度抽出した。合わせた有機相を減圧条件下、高真空下で濃縮し、ＤＭＦを除去した。残留物をＥｔＯＡｃを用いて希釈し、水を用いて洗浄し、次にｂｒｉｎｅを用いて洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、減圧条件下で濃縮した。未精製の残留物を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（１５００ｇ  Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  ＩＳＣＯカラムを使用した０−１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配）を介して精製し、５４ｇの望まれる生成物を薄い赤色の発泡状固形物として得た。固形物をジクロロメタンに溶かし、フロリジルの充填剤（２００ｍＬ）に押し通し、引き続いてＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２混合物［１回目４０％（１Ｌ）、次に６０％（１Ｌ）そして次に８０％（１Ｌ）］を用いて洗浄した。濾過液を合わせ、減圧条件下で濃縮した。残留物をヘプタン（４００ｍＬ）で２回希釈し、減圧条件下で濃縮し、ケークを得て、次にＴＢＭＥを用いて洗浄し、薄い黄色を除去し、真空オーブンにおいて６０℃で４日間乾燥させ、（Ｒ）−６−（１−（２，２−ジフルオロエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４，７，７−トリメチル−２−（５−（２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシエチル）ピリジン−３−イル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−オン（化合物１、４７ｇ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．３３（ｓ，１Ｈ），８．７５（ｓ，１Ｈ），８．５４（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．６２（ｓ，１Ｈ），６．１４（ｔｔ，Ｊ＝５５．４，３．６Ｈｚ，１Ｈ），５．２８−５．１１（ｍ，１Ｈ），４．５１（ｔｄ，Ｊ＝１３．５，４．２Ｈｚ，２Ｈ），４．３３（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ），２．８２（ｓ，３Ｈ），１．６８（ｓ，６Ｈ）。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＰＩ３Ｋ−ガンマ脂質キナーゼに対する効力
実施例３．ＰＩ３Ｋ阻害アッセイ
【００５６】
Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕｌｔｅｒのＢｉｏｍｅｋ  ＦＸを使用し、１００％ＤＭＳＯ中の本発明の化合物について、各々が１．５μＬの２．５倍希釈系列を１０個、９６ウェルポリスチレンプレート［Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｓｔａｒ  Ｉｔｅｍ  Ｎｏ．３６９７］中の個々のウェル（以降「試験ウェル」）に加えた。一つの試験ウェルはまた化合物を含まない１．５μＬのＤＭＳＯも含んだ。別のウェルは酵素を完全に阻害することが既知の濃度のインヒビターをＤＭＳＯ中に含んだ（以降「バックグラウンドウェル」）。Ｔｉｔｅｒｔｅｋ  Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐを使用して、５０μＬのＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ［１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ，０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、６０μＭ  ホスファチジルイノシトール（４，５）−ビスホスフェート  ｄｉＣ１６（ＰＩ（４，５）Ｐ２；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｃａｔ．  Ｎｏ．８４００４６Ｐ）および関心のあるＰＩ３Ｋアイソフォーム（アイソフォーム濃度に関しては表１参照）］を各ウェルに加えた。反応を始めるために、５０μＬのＡＴＰ  Ｍｉｘ［２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、６μＭ  ＡＴＰ（１００μＣｉ／μｍｏｌｅ  ３３Ｐ−ＡＴＰを各ウェルに加え、次に２５℃で３０分間ウェルをインキュベートした。各ウェルの終濃度は５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、３０μＭ  ＰＩ（４，５）Ｐ２、３μＭ  ＡＴＰおよび関心のあるＰＩ３Ｋアイソフォームであった（表２参照）。各ウェルの最終化合物濃度は１０μＭから１ｎＭにおよんだ。
【表１】
0006340416.tif 000006
【００５７】
インキュベーション後、各ウェルの反応を５０μＬの停止溶液［３０％  ＴＣＡ／Ｗａｔｅｒ、１０ｍＭ  ＡＴＰ］を加えることによってクエンチした。次にクエンチした反応混合物のそれぞれを９６ウェルガラス繊維フィルタープレート［Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｓｔａｒ  Ｉｔｅｍ  Ｎｏ．３５１１］に移した。プレートを真空濾過し、改造したＢｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＥＬＸ−４０５  Ａｕｔｏ  Ｐｌａｔｅ  Ｗａｓｈｅｒにおいて、１５０μＬの５％ＴＣＡ／ｗａｔｅｒを用いて３回洗浄した。５０μＬのシンチレーション液（ｆｌｕｉｄ）を各ウェルに加え、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＴｏｐＣｏｕｎｔＴＭ  ＮＸＴ  液体シンチレーション計数器でプレートを読み、阻害値を表す３３Ｐカウントを得た。
【００５８】
バックグラウンドウェルの値を、それぞれの試験ウェルで得た値から引き、そのデータはＭｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｏｎｅ，Ｃｏｍｍｅｎｔｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２：３４７−３６８，１９８５に記載された競合的に強く結合する（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｔｉｇｈｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ）Ｋｉ方程式に適合させた。化合物１のＰＩ３Ｋ−ガンマ阻害の程度はＡＴＰ濃度につれて直線的に変動し、競合阻害が実証され、Ｋｉ値は８±４ｎＭであった。さらに、化合物１をＰＩ３Ｋ−アルファアイソフォーム、ＰＩ３Ｋ−ベータアイソフォームおよびＰＩ３Ｋ−デルタアイソフォームに対して試験したとき、アイソフォーム選択性もまた見られ、表２において示されるようにＰＩ３Ｋ−ガンマに関して１５倍より大きい選択性を持つと判明した。
【表２】
0006340416.tif 000007
細胞効力
【００５９】
ＰＩ３Ｋはマルチサブユニット複合体であって、調節サブユニットおよび触媒サブユニットから構成される。このクラスの酵素はホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）のリン酸化を触媒し、二次メッセンジャー（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）であるホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリホスフェート（ＰＩＰ３）を生じさせる。受容体の活性化はＰＩＰ３水準の一時的な上昇を導く。ＰＩＰ３は細胞膜でドッキング部位として働き、プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインを含有するタンパク質、例えばＡｋｔ、ＰＤＫ−１、Ｔｅｋキナーゼなどをリクルートし（ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ）、活性化する。次にこれらは重要な細胞機能、例えば増殖（ｇｒｏｗｔｈ）、代謝、移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、呼吸バーストなどを調節する。ＰＩ３Ｋシグナリング経路下流の作動因子は共通であるので、活性化に際しＰＩ３Ｋのどのアイソフォームがリクルート（ｒｅｃｒｕｉｔ）されるかを決定するのは受容体である。これに基づいて、多くの生化学的なｐＡｋｔに基づいたアッセイおよび機能アッセイを使用し、他のＰＩ３Ｋアイソフォームと比べたＰＩ３Ｋ−ガンマインヒビターの効力および選択性を分析した。
実施例４．ＴＨＰ−１細胞において、ＭＣＰ−１がｐＡｋｔを刺激した
【００６０】
ＭＣＰ−１のようなケモカインがその受容体に結合し、ＰＩ３Ｋ−ガンマシグナリング経路の活性化が生じる。ＰＩ３Ｋ−ガンマはＰＩＰ３の生成およびＰＤＫ−１ならびにＡｋｔのような下流分子の活性化を導く。細胞において、Ａｋｔリン酸化はＰＩ３Ｋ活性の尺度である。このアッセイにおいて、ＴＨＰ−１細胞（ヒト単球性細胞株）を一晩中飢えさせ、ｐＡｋｔの水準をデプリートさせる（ｄｅｐｌｅｔｅ）。そして次のＭＣＰ−１を用いた３分間の刺激はＰＩ３Ｋ−ガンマが誘導するＡｋｔのスレオニン３０８部位およびセリン４７３部位のリン酸化を導く。細胞を固定し、細胞内のｐｈｏｓｐｈｏＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）を染色し、そしてＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭサイトメーターを使用して分析し、その結果細胞内ＰＩ３Ｋ−ガンマ活性を測定した。化合物１はこのアッセイにおいて、０．２４±０．０７μＭのＩＣ５０を有していた。表３参照。
【表３】
0006340416.tif 000008
実施例５．全血および白血球酸化バーストアッセイ
【００６１】
好中球、単球およびマクロファージは自然免疫の重要な媒介物である。それらは活性酸素種（ＲＯＳ）を自然免疫炎症反応の一部として放出する。ＲＯＳ生成はケモカイン、細菌のペプチドおよび補体などの炎症の媒介物によって誘導され、自然免疫細胞を炎症部位にリクルート（ｒｅｃｒｕｉｔ）する。これらの炎症の媒介物はＰＩ３Ｋ−ガンマの活性化を誘発し、下流のシグナリングカスケードを始め、細胞膜において完全なＮＡＤＰＨ酸化酵素複合体の集合を導いて、ＲＯＳを生成する。ＰＩ３Ｋ−ガンマの機能活性を、全血および軟膜好中球（ｈｕｆｆｙ  ｃｏａｔ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）および単球においてＲＯＳ生成を介して測定した。細胞をＴＮＦ−アルファを用いて１０分間、次に細菌細胞壁由来の走化性ペプチドであるｆＭＬＰを用いて２０分間刺激し、非蛍光色素ジヒドロローダミン１，２，３（ＤＨＲ）をロード（ｌｏａｄ）した。細胞によって生成されるＲＯＳはＤＨＲを酸化して蛍光ローダミンにし、細胞内の蛍光ローダミン量の上昇を引き起こす。ＰＩ３Ｋ−ガンマ機能活性は好中球および単球がｆＭＬＰ刺激後にＲＯＳを生成する能力によって測定される。白血球および全血試料をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭで分析し、蛍光ローダミン陽性の細胞を定量した。軟膜細胞は血清非存在下のＩＣ５０を生成し、全血アッセイは血清存在下のＩＣ５０を生成する。化合物１は軟膜白血球アッセイにおいて０．２２μＭのＩＣ５０を有し、全血アッセイにおいては０．５７μＭを有した。表３参照。
実施例６．ＴＨＰ−１細胞においてＣＳＦ−１はｐＡｋｔを刺激した
【００６２】
増殖（ｇｒｏｗｔｈ）因子、サイトカインおよびＣＳＦ１のような受容体チロシンキナーゼの他のリガンド（ｌｉｇａｎｄ）はその受容体に結合し、クラスＩＡ  ＰＩ３Ｋシグナリング経路の活性化を導く。ＰＩ３Ｋ活性化はＰＩＰ３の生成およびＰＤＫ−１ならびにＡｋｔのような下流分子の活性化を導く。Ａｋｔリン酸化は細胞におけるＰＩ３Ｋ活性の尺度である。ＴＨＰ−１細胞（ヒト単球細胞株）を一晩中飢えさせ、ｐＡｋｔ水準をデプリートさせる（ｄｅｐｌｅｔｅ）。ＣＳＦ−１を用いた５分間の刺激はＰＩ３Ｋα／β／δが誘導するＡｋｔのスレオニン３０８部位およびセリン４７３部位のリン酸化を導く。細胞を固定し、細胞内ｐｈｏｓｐｈｏＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）を染色し、次にＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭサイトメーターで分析した。これは細胞のクラスＩＡ  ＰＩ３Ｋ阻害の尺度である。このアッセイにおいて、化合物１は９．７μＭより大きいＩＣ５０を有し、クラスＩＡ  ＰＩ３Ｋについて選択性を実証した。表４参照。
実施例７．ヒトＢ細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）アッセイ
【００６３】
Ｂ細胞はその発生と活性に関してＰＩ３Ｋδに非常に依存している。ＰＩ３Ｋ−ガンマはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）複合体を介するシグナリングにおける欠くことのできない役割および冗長でない（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）な役割を有している。ＩｇＭが誘導するＣａ＋流入および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の両方は、ＰＩ３Ｋ−δを欠損させたマウスにおいてまたはＰＩ３Ｋ−δインヒビターにより弱められる。ＰＩ３Ｋ−ガンマはＢ細胞の活性において何ら役割を持たない。ＰＩ３Ｋ−ガンマアイソフォームに関するＢＣＲ複合体の特異性のため、これが細胞におけるＰＩ３Ｋ−ガンマ阻害の程度を評価する理想的なＰＩ３Ｋ−ガンマ試験である。試験化合物存在下において、精製されたヒトＢ細胞を抗ＩｇＭによって刺激する。４日後、細胞の生存／増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を、ウェル内の細胞のＡＴＰ量を測定するためのｔｉｔｅｒ−ｇｌｏを使用して測定した。増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の欠乏または減少はＰＩ３Ｋ−ガンマ阻害程度の尺度である。化合物１は３．０５±０．４４μＭのＩＣ５０を有し、これはＰＩ３Ｋ−δの１１倍の選択性ウインドウ（ｗｉｎｄｏｗ）を示す。表４参照。
実施例８．ＨＵＶＥＣ増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）アッセイ
【００６４】
ＰＩ３Ｋは重要なシグナリング分子であり、細胞生存、増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および細胞周期へのエントリー（ｅｎｔｒｙ）を調節する多くの増殖（ｇｒｏｗｔｈ）因子の下流にある。ＰＩ３Ｋ−アルファアイソフォームおよびＰＩ３Ｋ−ベータアイソフォームは両方、細胞周期へのエントリー（ｅｎｔｒｙ）を調節する；いずれかのアイソフォームの阻害は細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）の減少につながる。ＨＵＶＥＣは主要なヒト臍帯静脈内皮細胞であり、ＰＩ３ＫαおよびＰＩ３Ｋβの両方を発現している。ＰＩ３Ｋ−アルファまたはＰＩ３Ｋ−ベータのいずれかまたは両方の阻害はＨＵＶＥＣの細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）を阻害する。化合物をＨＵＶＥＣの上にプレート（ｐｌａｔｅ）し、化合物を処置して９６時間後に、ウェル内の細胞のＡＴＰを測定するための細胞ｔｉｔｅｒ−ｇｌｏを使用して、細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）／生存を測定する。増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の欠乏または減少はＰＩ３Ｋ−アルファおよび／もしくはＰＩ３Ｋ−ベータの阻害程度の尺度である。このアッセイにおいて、化合物１は１９μＭを超えるＩＣ５０を持ち、ＰＩ３Ｋ−アルファ／ベータより７４倍を超える選択性であると実証した。表４参照。
実施例９．ＭＣＦ−７増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）アッセイ
【００６５】
ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナリング経路は多くの通常の細胞過程を調節し、この過程は細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、生存および増殖（ｇｒｏｗｔｈ）を含み、腫瘍形成において重大である。ＰＩ３Ｋシグナリング経路の制御不全はヒトがんにおいて一般的におきる。ＭＣＦ７はヒト胸部癌腫細胞株であり、この細胞株はｐ１１０αタンパク質のらせん状ドメインに活性化Ｅ５４５Ｋ  ＰＩ３Ｋαヘテロ接合性の変異を持ち、ＰＩ３Ｋα経路の過度な活性を導く。ＭＣＦ７細胞におけるＰＩ３Ｋシグナリングの阻害は細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）を阻害し、それゆえＰＩ３Ｋ−アルファシグナリングのインヒビターは、ＭＣＦ７増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）アッセイにおいて評価され得る。化合物はＭＣＦ７に加えられ、化合物処置９６時間後に細胞ｔｉｔｅｒ−ｇｌｏを使用してウェル内の細胞のＡＴＰ量を測定することで、細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）／生存は測定される。増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の欠乏または減少はＰＩ３Ｋ−アルファ阻害程度の尺度である。このアッセイにおいて、化合物１は１７μＭを超えるＩＣ５０を有し、そしてＰＩ３Ｋ−アルファよりも６７倍を超える選択性を実証した。表４参照。
【００６６】
上記で示されるように、化合物１は非常に優れた効力を持ち、ＰＩ３Ｋ−ガンマ関連細胞アッセイにおいて０．２５μＭであり、細胞を基にしたアッセイにおいて、ＰＩ３Ｋ−デルタの１２倍、ＰＩ３Ｋ−アルファおよびＰＩ３Ｋ−ベータの４０〜８０倍の選択性を持つ。
【表４】
0006340416.tif 000009
薬物代謝
実施例１０．組み換えＣＹＰ酵素による化合物１の代謝
【００６７】
組み換えＣＹＰ酵素（ＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、２Ｅ１および３Ａ４）を含有したミクロソームを使用し、どのＣＹＰが化合物１の酸化を触媒するか決定した。それゆえ、化合物１（１μＭ）を、個々の組み換えＣＹＰとともに、補因子のＮＡＤＰＨ存在下において、インキュベートした。インキュベーション期間の最後に、残っている元の薬品の割合をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって決定し、最初に存在した量と比較した。結果は表５に示される。化合物１の代謝は、ＣＹＰ３Ａ４とともにインキュベーションした場合のみ検出されたが、見かけ上の速度は低かった。
【表５】
0006340416.tif 000010
実施例１１．化合物１によるＣＹＰ酵素の阻害
【００６８】
ヒト肝臓ミクロソームにおいて化合物１（０．０１〜１００μＭ）が可逆的にＣＹＰ酵素（ＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ６，２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６および３Ａ４）を阻害する能力を評価した。阻害アッセイをそれぞれのＣＹＰ酵素に対する選択的ＣＹＰプローブを用いて、（解離定数（Ｋｍ）値に近い）特異の基質濃度で行った。データは表６に示される。化合物１はＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ６および２Ｃ８の中程度のインヒビターであった；ＩＣ５０値は４〜７μＭにおよんだ。
【表６】
0006340416.tif 000011
【００６９】
化合物１によるＣＹＰ３Ａ４の時間依存性的阻害もまたヒト肝臓ミクロソームにおいてＩＣ５０シフトアッセイを使用して評価した。研究において、０．１〜５０μＭの化合物１を０分および３０分ヒト肝臓ミクロソームとともに、ＮＡＤＰＨ存在下および非存在下において、プレインキュベート（ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｅ）した。次にインキュベーションを緩衝液で１０倍希釈し、残っているＣＹＰ３Ａ４（テストステロン−６−ベータ−ヒドロキシラーゼ）活性を１０分間測定した。ＮＡＤＰＨの存在下または非存在下において、化合物１のＩＣ５０に有意な差はなかった（ＩＣ５０ｓｈｉｆｔ＝１）。
【００７０】
この結果は、追跡研究において事実であると確かめられ、この研究ではヒト肝臓ミクロソームにおいて、１０または５０μＭのいずれかの濃度の化合物１とともに、０、５、１０、１５および３０分間プレインキュベーションした後のＣＹＰ３Ａ４の時間依存的阻害を評価した。ポジティブコントロールであるミフェプリストンのＫｏｂｓ＝０．０５３／分と比べて、研究におけるＣＹＰ３Ａ４活性の低下に関する観察された速度定数（Ｋｏｂｓ）は、試験した両方の濃度において０．００３９／分であった。これらの研究の両方からのデータは、化合物１は時間依存的な様式でＣＹＰ３Ａ４を阻害しないと実証する。
実施例１２．酵素誘導
【００７１】
化合物１がプレグナン−Ｘ受容体（ＰＸＲ）を活性化する能力を、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子中にある２つのプロモーターが連結されたヒトＰＸＲ遺伝子およびルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定して過剰発現するヒト肝がん細胞株であるＤＰＸ２細胞において０．１〜３０μＭの範囲の６つの濃度で評価した。リファンピシンをポジティブコントロールとして使用した。アッセイにおいて、化合物１はわずかな水準の活性を示し、ポジティブコントロールの５％の反応を起こし、ＥＣ５０値は３０μＭより大きかった。
【００７２】
化合物１がＣＹＰ１Ａ２およびＣＴＰ３Ａ４を誘導する能力もまた肝細胞において評価した。０．１〜３０μＭの濃度の化合物１を３人の異なる提供者からの冷凍保存された初代培養ヒト肝細胞とともに４８時間インキュベートし、ポジティブコントロール（すなわちＣＹＰ誘導物質：ＣＹＰ１Ａ２について５０μＭオメプラゾールおよびＣＹＰ３Ａ４について１０μＭリファンピシン）の効果と比べた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して、特異的なＣＹＰプローブ基質（ＣＹＰ１Ａ２についてフェナセチンおよびＣＹＰ３Ａ４についてテストステロン）の代謝産物形成を監視することによってＣＹＰ活性を決定した。ＣＹＰのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）をＲＴ−ＰＣＲによって分析し、ＣＹＰ誘導能力を確かめた。結果は表７に示される。
【００７３】
３つ全ての肝細胞のロットにおける、化合物１への曝露後のＣＹＰ１Ａ２またはＣＹＰ３Ａ４の活性およびｍＲＮＡ水準の変化はポジティブコントロールの２０％未満だった。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏのデータは化合物１はヒト肝細胞において、４８時間の曝露後にＣＹＰ１Ａ２またはＣＹＰ３Ａ４を誘導する低い能力を有することを示す。
【表７】
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実施例１３．エフラックス（ｅｆｆｌｕｘ）の透過性の能力
【００７４】
化合物１の透過性をＣａｃｏ−２細胞株およびＭａｄｉｎＤａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）野生型細胞株の両方を使用して評価した。頂端側（ＡからＢ方向の透過性を測定）または側底側（ＢからＡ方向の透過性を測定）で、細胞を緩衝物中の薬物に曝露し、３７℃で１時間インキュベートした。結果は表７に示される。ＭＤＣＫ細胞株およびＣａｃｏ−２細胞株の両方において、透過性はＡからＢ方向が高かった。（それぞれ３３および１８×１０−６ｃｍ／秒）
【００７５】
化合物１はエフラックス（ｅｆｆｌｕｘ）トランスポーターの基質であるかどうかのアセスメントをヒトＰ−ｇｐ（ＭＤＲ）を過剰発現するＭＤＣＫ細胞株を使用して行った。方向性のある輸送を、この細胞株において検出し（エフラックス（ｅｆｆｌｕｘ）割合＝３５．１）、化合物１はＰ−ｇｐの基質であることと示した。表８参照。
【表８】
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ｉｎ  ｖｉｖｏにおける薬物動態
実施例１４．静脈内ボーラス投与量
【００７６】
単一のボーラス投与量の静脈内投与後、試験したすべての種において化合物１は低い全身クリアランスおよび長い半減期を有した。表９参照。マウス、ラット、イヌおよびサルの肝血流における化合物１のクリアランス値はおよそ５．４％、３．６％、１３％および２６％を表す。分布容積は体内水分全体よりも多く、化合物１の組織への分布を示していた。
【表９−１】
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【表９−２】
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実施例１５．経口の生物学的利用能
【００７７】
表１０に示されるように、マウス、ラット、イヌおよびサルに化合物１の単一用量の投与をした後、化合物１の経口の生物学的利用能は高かった（８０％より大きい）。（１００％より大きい）サルにおける生物学的利用能はＩＶと経口服用との間の１０倍差によって説明され得る。全ての種において、化合物１は急速に吸収され、全身の濃度は服用からおよそ１〜３時間で最高になることが観察された。
【表１０】
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【００７８】
表１１は国際特許出願公開番号ＷＯ  ２０１１／０８７７７６（「‘７７６  出願」）に記載されるＰＩ３Ｋインヒビターについての薬物動態データを提供し、それぞれは化合物１の核ファーマコフォア構造と同じ核ファーマコフォア構造を有している。‘７７６  出願の２２９、２２９、２３４および２４２ページの化合物７０５、７０９、７３５および７７２をそれぞれ参照。静脈内送達後の化合物１の全身の血漿のクリアランスは、他の化合物を用いた研究において観察される場合より有意に低かった（２．５倍〜８倍）。血漿クリアランスデータは静脈内のデータ、経口曝露、ＡＵＣおよびＣｍａｘ値と一致する。これらのデータは、化合物１はこれらの化合物と比較して、思いがけなく有望な薬物動態プロフィールを有することを示す。
【表１１−１】
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【表１１−２】
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実施例１６．ラットにおける組織分布
【００７９】
５ｍｇ／ｋｇの経口用量を雄ラットに投与後、化合物１はほとんどの組織に充分に分布した。表１２参照。脳および脳脊髄液（ＣＳＦ）は化合物１への曝露がとても低く、それぞれ１１１ｎｇ／ｇおよび２７ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘ（血漿曝露の０．１％未満）を示した器官であった。化合物１は肝臓、腎臓に充分に分布し、Ｃｍａｘはそれぞれ１１４００ｎｇ／ｇおよび４７７０ｎｇ／ｇであった。組織対血漿の比率は肝臓＞腎臓＞心臓＞肺＞脾臓＞脳＞ＣＳＦの傾向に従った。調べたそれぞれの器官における化合物１の排泄反応速度論は血漿反応速度論に追随した。単一用量の投与後、化合物１の組織蓄積の証拠はなかった。
【表１２】
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実施例１７．マウスＣＩＡモデルにおける化合物１
【００８０】
治療マウスコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて、２．５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ（５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）、５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）または１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ（２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）で化合物１を試験した。Ｓｙｋ低分子インヒビターであって、参考基準として使用されたフォスタマチニブを３０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ（６０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）で経口的に服用させた。化合物を１０日間、１２／１２時間ＢＩＤの服用計画で、研究の終了まで服用させた。化合物１を０．２％ＭＣ、１％ＳＬＳにおいて調製した。服用量は１０ｍＬ／ｋｇであった。末期の血漿試料を最後の服用後２、４および１２時間において集めた。四肢全ておよび両方の膝を集め、病理組織診断のために処理した。
【００８１】
ＣＩＡモデルにおいて、臨床的関節炎スコアの評価および関節の病理組織診断によって決定したとき、化合物１を用いた処置は有意かつ有益な効果を示した。２．５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  化合物１（＊ｄ２〜１１）、５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  化合物１（＊ｄ２〜１１）、１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  化合物１（＊ｄ２〜１１）または３０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  フォスタマチニブ（＊ｄ２〜１１）で処置されたマウスについて、ビヒクルコントロールと比べたとき、毎日測定された関節炎スコアは正常に向かって有意に減少した。図１参照。登録時に関節炎の臨床的兆候を示したそれらの足（治療足）だけを考える場合、臨床的関節炎スコアは、５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  化合物１（＊ｄ５〜１１）または１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  化合物１（＊ｄ２〜１１）で処置したマウスについては有意に減少したが、３０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  フォスタマチニブ（＊ｄ２〜１１）処置群については減少しなかった。図２参照。登録時に関節炎の臨床的兆候を示さなかったそれらの足（予防足）だけを考える場合、２．５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  化合物１（＊ｄ２、４〜１１）、５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  化合物１（＊ｄ２〜１１）、１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  化合物１（＊ｄ２〜１１）または３０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  フォスタマチニブ（＊ｄ５〜９）で処置したマウスについて、ビヒクルコントロールと比べた場合、臨床的関節炎スコアは有意に減少した。図３参照。
【００８２】
表１３において示されるように、３０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  フォスタマチニブ（２５％）、２．５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  化合物１（２８％）、５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  化合物１（６３％）または１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  化合物１（８９％）で処置したマウスについて、ビヒクルコントロールと比べた場合、曲線下の面積（ＡＵＣ）として表された臨床的関節炎スコアは正常に向かって有意に減少した。治療足だけを考えた場合、１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  化合物１（７９％）で処置したマウスについて、関節炎スコアＡＵＣは有意に減少した。予防足だけを考えた場合、３０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  フォスタマチニブ（３２％）、２．５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  化合物１（４２％）、５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  化合物１（８１％）および１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  化合物１（９８％）で処置したマウスについて、ビヒクルコントロールと比べた場合、関節炎スコアＡＵＣは有意に減少した。
【表１３】
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実施例１８．マウスＩＢＤモデルにおける化合物１
【００８３】
ＰＩ３Ｋγインヒビターである化合物１を、ＣＤ４０が誘導する大腸炎モデルにおいて試験し、疾患経過における効果を決定した。抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（アゴニスト、すなわち中和抗体に対する活性化抗体）をＴ細胞およびＢ細胞を欠損するマウス（Ｒａｇ  １−／−マウス）に注射し、全身の炎症および腸の炎症の両方を誘導し、自然免疫経路を介する大腸炎および消耗性疾患を導くことによってＩＢＤのＣＤ４０モデルは誘導される（例えばＩｍｍｕｎｉｔｙ  ２５，３０９−３１８，８月  ２００６参照）。簡潔に言えば、抗ＣＤ−４０モノクローナル抗体であるＦＧＫ４５をＲａｇ１ノックアウトマウス腹腔内に注射した。第０日に開始し、ＰＢＳ、ビヒクルまたは５ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｉ．ｄ．もしくは１０ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｉ．ｄ．の化合物１でマウスを試験した。化合物１を７日間、１０／１４時間ｂ．ｉ．ｄ．の服用計画で腹腔内投与した。化合物１を５％  ＮＭＰ／１５％  ＰＥＧ−４００／８０％  水中の０．５％ＨＰＭＣ−Ｅ５０溶液中で製剤化した。研究の末期において、血清および結腸試料を薬物濃度分析のための最後の服用後２時間において集めた。研究の間、体重を毎日測定した。研究の末期において、最後の投与後２時間において集めた血漿試料において、化合物１濃度を分析した。高速液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析（ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）法を使用して、濃度を決定した。
【００８４】
抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を注射したマウスおよびビヒクルまたはＰＢＳを用いて処置したマウスは、体重が低下し（基準線からの割合変化として測定）、その低下は第１日から始まり、基準値に向かって回復する前、第３〜４日において最高になった。図４に示されるように、疾患が誘導する体重低下は、ＰＢＳ処置群においては、第３日および第４日でそれぞれ１７．２％および１７％であり、ビヒクル処置群においては、第３日および第４日でそれぞれ１２．８％および１２．６％であった。図４はまた５ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｉ．ｄ（＊ｐ＜０．０５  ｄ３、＊＊ｐ＜０．０１  ｄ４）または１０ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｉ．ｄ（＊＊＊ｐ＜０．００１  ｄ３〜４）の化合物１を用いて処置したマウスにおいては、ビヒクルコントロールと比べた場合、体重低下は有意に阻害されることも示す。
【表１４】
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【００８５】
上記発明は理解の明快さを目的として、図解および例という方法によっていくらか詳細に記載されているが、添付の請求の範囲の趣旨からも範囲からも逸脱することなく、ある一定の変更および改変がなされ得ることは、当業者にとって本発明の教示に照らし容易に明白である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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