(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５８のアミノ酸配列を含む、単離された抗真菌性タンパク質。
【請求項２】
（ａ）隣接したコード配列のＲＮＡへの転写を生じるよう植物細胞において機能するプロモーターを含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む抗真菌性タンパク質と、前記抗真菌性タンパク質のＮ末端の植物アポプラスト標的化ペプチドと、を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｃ）転写された前記ＲＮＡの３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を生じるよう植物細胞において機能する３’非翻訳配列を含むポリヌクレオチド；
を含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子であって、
プロモーター、抗真菌性タンパク質、アポプラスト標的化ペプチドおよび３’非翻訳配列をコードするポリヌクレオチド同士が、操作可能に連結されている、
組換え二本鎖ＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、関心対象の植物における前記タンパク質の発現に対してコドンが最適化されている、請求項２に記載の組換え二本鎖ＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記関心対象の植物は食用作物植物である、請求項２または３に記載の組換え二本鎖ＤＮＡ分子。
【請求項５】
前記食用作物植物は、ダイズ、コムギ、トウモロコシ、サトウキビ、コメ、及びジャガイモからなる群から選択される、請求項４に記載の組換え二本鎖ＤＮＡ分子。
【請求項６】
トランスジェニック植物であって、その細胞が、請求項２〜５のいずれか１項に記載の組換え二本鎖ＤＮＡ分子を含む導入遺伝子を含み、前記導入遺伝子が、前記細胞に対して異種性である、前記トランスジェニック植物。
【請求項７】
トウモロコシ、ダイズ、コムギ、サトウキビ、コメ、及びジャガイモからなる群から選択される、請求項６に記載のトランスジェニック植物。
【請求項８】
請求項６または７に記載のトランスジェニック植物であって、そのゲノムが、
ＭｓＤｅｆ１、ＭｔＤｅｆ２、ＭｔＤｅｆ４、ＮａＤ１、Ｒｓ−ＡＦＰ１、Ｒｓ−ＡＦＰ２、ＫＰ４、及びＫＰ６からなる群から選択される植物デフェンシンをコードするＤＮＡであって、発現されて抗真菌性として有効量の前記デフェンシンを生成する、ＤＮＡ、ならびに／または
バチルス・チューリンゲンシス内毒素をコードするＤＮＡであって、発現されて抗昆虫性として有効量の前記バチルス・チューリンゲンシス内毒素を生成する、ＤＮＡ、ならびに／または
前記植物へ除草剤抵抗性を与えるタンパク質をコードするＤＮＡであって、発現されて除草剤抵抗性を与える抗除草性として有効量の前記タンパク質を生成する、ＤＮＡ
をさらに含む、前記トランスジェニック植物。
【請求項９】
配列番号５８のアミノ酸配列を含む抗真菌性のタンパク質またはペプチドを含む、組成物。
【請求項１０】
農業上許容し得るまたは医薬として許容し得る担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
殺虫性活性のある物質、肥料、殺虫剤、誘引剤、滅菌化剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、除草剤、及び成長調節剤からなる群から選択される１つ以上の他の活性物質との混合物に製剤化された、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
アルテルナリア属、アスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）属、アスペルギルス属、ボトリチス属、セルコスポラ属、コレトトリカム属、ディプロディア属、エリシフェ属、フザリウム属、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ）属、ヘルミントスポリウム属、マクロフォミナ属、ネクトリア属、ツユカビ属、ファコプソラ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ）属、フォーマ属、フィマトトリカム（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フィトフトラ属、プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）属、プクシニア属、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）属、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）属、ピシウム属、リゾクトニア属、スクレロティウム（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ）属、スクレロティニア属、セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）属、シエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）属、ウンシヌラ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）属、ベンチュリア属、及びベルチシリウム属からなる群から選択される真菌の一種によって生じる植物への損傷を予防、治療、防除、駆除、低下、または阻害する方法であって、配列番号５８のアミノ酸配列を含む抗真菌性タンパク質の抗真菌性有効量を前記植物に提供することを含む、方法。
【請求項１３】
前記抗真菌性タンパク質は、前記植物の細胞内で前記抗真菌性タンパク質をコードする組換えＤＮＡを発現させることによって前記植物に提供される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗真菌性タンパク質は、前記抗真菌性タンパク質を含む組成物を前記植物へ適用することによって前記植物に提供される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗真菌性タンパク質は、前記抗真菌性タンパク質を産生する、植物にコロニー形成する微生物によって、前記植物に提供される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗真菌性タンパク質は、前記抗真菌性タンパク質を産生する、植物にコロニー形成する微生物を含む組成物を前記植物に適用することによって、あるいは前記抗真菌性タンパク質自体を前記植物に適用することによって、前記植物に提供される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物は、農業上許容され得る希釈剤、賦形剤、または担体を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記植物は、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、サトウキビ、コメ、及びジャガイモからなる群から選択される、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その内容がすべてにおいて参照により本明細書に組み込まれる２０１３年４月３０日出願の米国仮特許出願第６１／８１７，４１５号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
（本発明の分野）
本発明は、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）（タルウマゴヤシ（Ｂａｒｒｅｌ  Ｍｅｄｉｃ）、タルウマゴヤシ（Ｂａｒｒｅｌ  Ｍｅｄｉｃｋ）、またはタルウマゴヤシ（Ｂａｒｒｅｌ  Ｃｌｏｖｅｒ））、すなわちＭｔＤｅｆ５デフェンシンに由来する小分子抗真菌性タンパク質及びペプチド、ならびに当該タンパク質及びペプチドの抗真菌活性に対して易罹患性の病原性真菌を防除するための方法に関する。当該抗真菌性タンパク質及びペプチドは、抗真菌性組成物の一成分として植物へ直接適用でき、当該タンパク質もしくはペプチドを産生する微生物の形態で植物へ適用でき、または植物自体は、当該タンパク質もしくはペプチドを産生するよう遺伝的に修飾されることができる。本発明はまた、病原性植物及び他の真菌類を防除する上で有用な、ＤＮＡコンストラクト、微生物、及び当該ＤＮＡコンストラクトで形質転換された植物、ならびに組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
病原性真菌類からの農業上重要な作物の防護は、作物の収量を改良する上で極めて重大である。真菌類への感染は、湿気の多い気候において特に問題であり、作物の保管中の主たる懸念となるかもしれず、当該保管において、このような感染は食物または供給原料産物の真菌毒素による腐敗及び汚染を結果として生じることが可能である。不運なことに、現代の生育方法ならびに収穫及び保管システムは、植物病原体感染を促進することが可能である。
【０００４】
植物病原体の防除はさらに、異なる属の複数の真菌類を同時に防除する必要性によって複雑になっている。例えば、アルテルナリア属、アスペルギルス属、アスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）属、ボトリチス属、セルコスポラ属、コレトトリカム属、ディプロディア属、エリシフェ属、フザリウム属、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ）属、ヘルミントスポリウム属、マクロフォミナ属、ネクトリア属、ツユカビ属、ファコプソラ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ）属、フォーマ属、フィマトトリカム（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フィトフトラ属、プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）属、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）属、プクシニア属、ピシウム属、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）属、リゾクトニア属、スケロティウム（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ）属、スクレロティニア属、セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）属、シエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）属、ウンシヌラ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）属、ベンチュリア属、及びベルチシリウム属の菌種などの真菌類はすべて、植物の病原体と認識されている。結果的に、限定された一部の真菌性病原体しか防除しない抵抗性作物植物品種または殺真菌薬は、複数の病原体が存在する条件下で適切な防護をもたらし損ねることがある。植物病原性真菌類が既存の殺真菌薬ならびにトランスジェニック及び非トランスジェニック作物品種に対して抵抗性となり、抵抗性真菌類を駆除するための異なる作用様式で真菌防除薬を導入する必要があるかもしれないことは、さらに予想される。
【０００５】
植物病原性真菌活性を阻害する１つのアプローチは、植物病原性真菌類に対する抗真菌活性を呈するペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を識別及び単離しなければならなかった（Ｂｏｗｌｅｓ，１９９０、Ｂｒｅａｒｓら，１９９４）。キチナーゼ、システイン多量含有キチン結合タンパク質、β−１，３−グルカナーゼ、パーマチン（ｐｅｒｍａｔｉｎ）（ジーマチン（ｚｅａｍａｔｉｎ）を含む）、チオニン、リボソーム不活性化タンパク質、及び非特異的脂質転移タンパク質を含む抗真菌性のペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は、真菌感染に対する植物防御における重要な役割を担っていると考えられている。トランスジェニック植物における植物病原体を防除するためのこれらのタンパク質産物の使用は、例えば、欧州特許出願第０  ３９２  ２２５号において報告されている。
【０００６】
デフェンシンとして公知の別の群のペプチドは、植物病原体を阻害することが示されている。デフェンシンとは、植物の生得的免疫の重要な構成要素を構成する４５〜５４個のアミノ酸からなる小分子のシステイン多量含有ペプチドである（Ｔｈｏｍｍａら，２００２、Ｌａｙ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ，２００５）。植物において広範に分布しているので、デフェンシンは、そのアミノ酸組成は大いに相違する。しかしながら、デフェンシンはすべて、４つまたは５つの分子内ジスルフィド結合によって安定化するコンパクトな形状を有する。植物デフェンシンは、植物の防御におけるその役割について広範に研究されてきた。いくつかの植物デフェンシンは、マイクロモルレベルの濃度で広範囲の真菌の増殖を阻害し（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔら，１９９５、Ｂｒｏｅｋａｅｒｔら，１９９７、ｄａ  Ｓｉｌｖａ  Ｃｏｎｃｅｉｃａｏ及びＢｒｏｅｋａｅｒｔ，１９９９）、トランスジェニック植物において発現する場合、真菌病原体に対する強い抵抗性を与える（ｄａ  Ｓｉｌｖａ  Ｃｏｎｃｅｉｃａｏ及びＢｒｏｅｋａｅｒｔ，１９９９、Ｔｈｏｍｍａら，２００２、Ｌａｙ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ，２００５）。ダイコン種子から単離した２つの小分子システム多量含有タンパク質Ｒｓ−ＡＦＰ１及びＲｓ−ＡＦＰ２は、純粋なタンパク質をインビトロでの抗真菌アッセイ培地へ添加すると、多くの病原性真菌類の増殖を阻害した（米国特許第５，５３８，５２５号）。Ｒｓ−ＡＦＰ２タンパク質をコードする遺伝子を含有するトランスジェニックタバコ植物は、形質転換していない植物と比べて真菌による攻撃に対して高い抵抗性があることがわかった。
【０００７】
抗真菌性デフェンシンタンパク質はまた、ムラサキウマゴヤシ（Ａｌｆａｌｆａ）（ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ））において識別され、インビトロ検査及びトランスジェニック植物の両方におけるフザリウム及びベルチシリウムなどの植物病原体を阻害することが示された（米国特許第６，９１６，９７０号）。低塩インビトロアッセイ条件下で、ムラサキウマゴヤシデフェンシンＡｌｆＡＦＰ１は、フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）の増殖を１μｇ／ｍｌで５０％阻害し、ベルチシリウム・ダーリアエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ）の増殖を４μｇ／ｍｌで５０％阻害した（すなわち、それぞれ１μｇ／ｍｌ及び４μｇ／ｍｌのＩＣ５０値）。トランスジェニックジャガイモ植物におけるＡｌｆＡＦＰ１タンパク質の発現はまた、温室試験及び圃場試験の両方においてベルチシリウム・ダーリアエに対する抵抗性を与えることが示された（Ｇａｏら，２０００）。作用様式分析はまた、ＡｌｆＡＦＰ１（ムラサキウマゴヤシデフェンシン１については、代替的にＭｓＤｅｆ１と呼ぶ）がフザリウム・グラミネアルム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）の過剰分枝を誘導し、Ｌ型カルシウムチャネルを遮断することができることを示した（Ｓｐｅｌｂｒｉｎｋら，２００４）。
【０００８】
他のデフェンシン遺伝子も、マメ科植物タルウマゴヤシにおいて識別されている（Ｈａｎｋｓら，２００５）。クローン化したＭｔＤｅｆ２タンパク質は、抗真菌活性がほとんどまたは全くないことがインビトロでの実験を通じて実証されている（Ｓｐｅｌｂｒｉｎｋら，２００４）。配列データベース検索の分析で、公知のムラサキウマゴヤシデフェンシン遺伝子との相同性を有する１０個の仮の共通配列（複数の発現遺伝子配列断片によって表される１０個の独特なデフェンシンコード遺伝子）及び６個のシングルトン（すなわち、単一の発現遺伝子配列断片によって表される６個の独特なデフェンシン遺伝子）を識別した。仮の共通配列のうちの１つは、ＴＣ８５３２７と識別され、擬似処理したタルウマゴヤシ根及び共生菌に感染したタルウマゴヤシ根の両方において発現することが示された。ＴＣ８５３２７タルウマゴヤシ配列のうちのいずれかによってコードされるタンパク質が本研究における抗真菌活性を有することはまだ実証されていなかった（Ｈａｎｋｓら，２００５）。
【０００９】
ＡｌｆＡＦＰ１（ＭｓＤｅｆ１）及びＲｓ−ＡＦＰ２などのデフェンシンタンパク質を用いて、真菌感染に対して抵抗性のあるトランスジェニック植物を得てきたが、高水準の抵抗性を供給する他のタンパク質が必要とされる。特に、真菌病原体に対する高い比活性を有するタンパク質は、トランスジェニック植物において得られる真菌抵抗性の水準を改良する上で特に有用である。さらに、異なる作用様式を介して真菌病原体を阻害するタンパク質はまた、ＡｌｆＡＦＰ１（ＭｓＤｅｆ１）及びＲｓ−ＡＦＰ２などのデフェンシンタンパク質に対して抵抗性となった真菌病原体を駆除する上で有用であろう。
【００１０】
本発明は、タルウマゴヤシＭｔＤｅｆ５．１〜５．６（配列番号１、３〜９、１６〜２２及び４９〜６４）由来の新規の小分子抗真菌性タンパク質及びペプチドのファミリーを提供することによって、この需要を満たす。
【発明の概要】
【００１１】
したがって、種々の態様のうち、本発明は以下を提供する。
【００１２】
１．配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、分離、精製された抗真菌性タンパク質またはペプチド。
【００１３】
２．Ｎ末端に植物アポプラスト、液胞、または小胞体を標的とするアミノ酸配列を含む、１に記載の分離、精製された抗真菌性タンパク質またはペプチド。
【００１４】
３．２に記載の分離、精製された抗真菌性タンパク質またはペプチドであって、前記の標的とする配列は、配列番号３０〜３５及び４２〜４８に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、分離、精製された抗真菌性タンパク質またはペプチド。
【００１５】
４．１〜３のいずれか１つに記載の前記の分離、精製された抗真菌性タンパク質またはペプチドをコードする分離、精製されたヌクレオチド配列。
【００１６】
５．関心対象の植物における発現に対してコドンが最適化された、４に記載の分離、精製されたヌクレオチド配列。
【００１７】
６．４または５に記載の分離、精製されたヌクレオチド配列であって、前記の関心対象の植物は食用作物植物である、分離、精製されたヌクレオチド配列。
【００１８】
７．６に記載の分離、精製されたヌクレオチド配列であって、前記の食用作物植物は、ダイズ、コムギ、トウモロコシ、サトウキビ、コメ、及びジャガイモからなる群から選択される、分離、精製されたヌクレオチド配列。
【００１９】
８．トランスジェニック植物であって、その細胞は、配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗真菌性タンパク質またはペプチドを含有する、トランスジェニック植物。
【００２０】
９．８に記載のトランスジェニック植物であって、前記の抗真菌性タンパク質またはペプチドはさらに、そのＮ末端に植物アポプラスト、液胞、または小胞体を標的とするアミノ酸配列を含む、トランスジェニック植物。
【００２１】
１０．８または９に記載のトランスジェニック植物であって、前記の抗真菌性タンパク質またはペプチドは、前記の細胞中に抗真菌性として有効量で存在する、トランスジェニック植物。
【００２２】
１１．８〜１０のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物であって、前記の細胞は根細胞である、トランスジェニック植物。
【００２３】
１２．８〜１１のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物であって、前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドは、アルテルナリア属、アスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）属、アスペルギルス属、ボトリチス属、セルコスポラ属、コレトトリカム属、ディプロディア属、エリシフェ属、フザリウム属、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ）属、ヘルミントスポリウム属、マクロフォミナ属、ネクトリア属、ツユカビ属、ファコプソラ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ）属、フォーマ属、フィマトトリカム（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フィトフトラ属、プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）属、プクシニア属、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）属、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）属、ピシウム属、リゾクトニア属、スケロティウム（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ）属、スクレロティニア属、セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）属、シエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）属、ウンシヌラ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）属、ベンチュリア属、及びベルチシリウム属からなる群から選択される真菌の一種によって生じる前述の植物に対する損傷を阻害する、トランスジェニック植物。
【００２４】
１３．８〜１２のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物であって、そのゲノムはさらに、
ＭｓＤｅｆ１、ＭｔＤｅｆ２、ＭｔＤｅｆ４、ＮａＤ１、Ｒｓ−ＡＦＰ１、Ｒｓ−ＡＦＰ２、ＫＰ４、及びＫＰ６からなる群から選択される植物デフェンシンをコードするＤＮＡであって、発現して抗真菌性として有効量の前述のデフェンシンを生成する、ＤＮＡ、ならびに／または
バチルス・チューリンゲンシス内毒素をコードするＤＮＡであって、発現して抗昆虫性として有効量の前述のバチルス・チューリンゲンシス内毒素を生成する、ＤＮＡ、ならびに／または
前述の植物へ除草剤抵抗性を与えるタンパク質をコードするＤＮＡであって、発現して除草剤抵抗性を与える抗除草性として有効量の前述のタンパク質を生成する、ＤＮＡ
を含む、トランスジェニック植物。
【００２５】
１４．８〜１３のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物であって、
ａ）発現のために操作可能に連結された、
（ｉ）隣接したコード配列のＲＮＡへの転写を生じるよう植物細胞において機能するプロモーター配列、
（ｉｉ）任意に、イントロン、
（ｉｉｉ）Ｎ末端に配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列と植物アポプラスト、液胞、または小胞体を標的とするアミノ酸配列とからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗真菌性タンパク質もしくはペプチドをコードするコード配列、
（ｉｖ）転写終結及び前述の転写したＲＮＡの３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を生じるよう植物細胞において機能する３’非翻訳配列
を含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子を植物細胞のゲノム中へ挿入すること、
ｂ）形質転換した植物細胞を得ること、ならびに
ｃ）前述の形質転換した植物細胞から遺伝的に形質転換した植物を再生することであって、その細胞は前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドを発現する、前述の遺伝的に形質転換した植物を再生すること
を含む方法によって作出される、トランスジェニック植物。
【００２６】
１５．前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドは、前述の形質転換した植物の細胞において抗真菌性に有効量で発現する、１４に記載のトランスジェニック植物。
【００２７】
１６．前述のコード配列は、前述のコード配列が前述の抗真菌性タンパク質もしくはペプチドをコードすることができるのに十分な、または前述のコード配列のコドンを最適化した版が前述の植物におけるその発現を最適化することができるのに十分な配列番号１０〜１５、２３〜２９、及び６５〜７８に示すヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列とある配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、１４または１５に記載のトランスジェニック植物。
【００２８】
１７．前述のプロモーターは、根特異的プロモーターである、１４〜１６のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。
【００２９】
１８．前述の根特異的プロモーターは、ＲＢ７、ＲＤ２、ＲＯＯＴ１、ＲＯＯＴ２、ＲＯＯＴ３、ＲＯＯＴ４、ＲＯＯＴ５、ＲＯＯＴ６、ＲＯＯＴ７、及びＲＯＯＴ８からなる群から選択される、１７に記載のトランスジェニック植物。
【００３０】
１９．トウモロコシ、ダイズ、コムギ、サトウキビ、コメ、及びジャガイモからなる群から選択される、８〜１８のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。
【００３１】
２０．８〜１９のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物の部分。
【００３２】
２１．原形質体、細胞、組織、器官、挿木、及び外植片からなる群から選択される、２０に記載の部分。
【００３３】
２２．花序、花、萼片、花弁、雌蘂、柱頭、花柱、子房、胚珠、胚、花床、種子、果実、雄蘂、花糸、葯、雄性配偶体もしくは雌性配偶体、花粉粒、分裂組織、頂芽、腋芽、葉、茎、根、塊根、根茎、塊茎、走根、球茎、鱗茎、側匐枝、培養中の前述の植物の細胞、培養中の前述の植物の組織、培養中の前述の植物の器官、及びカルスからなる群から選択される、２１に記載の部分。
【００３４】
２３．８〜１９のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物の子孫。
【００３５】
２４．８〜１９のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物の種子。
【００３６】
２５．トランスジェニック植物であって、その細胞が配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗真菌性タンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチドコード配列を含む、トランスジェニック植物。
【００３７】
２６．前述のヌクレオチドコード配列はさらに、前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドのＮ末端に植物アプロプラスト、液胞、または小胞体を標的とするアミノ酸配列をコードする、２５に記載のトランスジェニック植物。
【００３８】
２７．前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドは、前述の細胞中に抗真菌性として有効量で発現する、２５または２６に記載のトランスジェニック植物。
【００３９】
２８．前述の細胞は根細胞である、２５〜２７のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。
【００４０】
２９．２５〜２８のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物であって、
ａ）発現のために操作可能に連結された、
（ｉ）隣接したコード配列のＲＮＡへの転写を生じるよう植物細胞において機能するプロモーター配列、
（ｉｉ）任意に、イントロン、
（ｉｉｉ）Ｎ末端に配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列と植物アポプラスト、液胞、または小胞体を標的とするアミノ酸配列とからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗真菌性タンパク質もしくはペプチドをコードするコード配列、
（ｉｖ）転写終結及び前述の転写したＲＮＡの３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を生じるよう植物細胞において機能する３’非翻訳領域
を含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子を植物細胞のゲノム中へ挿入すること、
ｂ）形質転換した植物細胞を得ること、ならびに
ｃ）前述の形質転換した植物細胞から遺伝的に形質転換した植物を再生することであって、その細胞は前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドを発現する、前述の遺伝的に形質転換した植物を再生すること
を含む方法によって作出される、トランスジェニック植物。
【００４１】
３０．前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドは、前述の植物の細胞中で抗真菌性に有効量で発現する、２９に記載のトランスジェニック植物。
【００４２】
３１．前述のコード配列は、前述のコード配列が前述の抗真菌性タンパク質もしくはペプチドをコードすることができるのに十分な、または前述のコード配列のコドンを最適化した版が前述の植物におけるその発現を最適化することができるのに十分な配列番号１０〜１５、２３〜２９、及び６５〜７８に示すヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列とある配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、２９または３０に記載のトランスジェニック植物。
【００４３】
３２．前述のプロモーターは根特異的プロモーターである、２９〜３１のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。
【００４４】
３３．前述の根特異的プロモーターは、ＲＢ７、ＲＤ２、ＲＯＯＴ１、ＲＯＯＴ２、ＲＯＯＴ３、ＲＯＯＴ４、ＲＯＯＴ５、ＲＯＯＴ６、ＲＯＯＴ７、及びＲＯＯＴ８からなる群から選択される、３２に記載のトランスジェニック植物。
【００４５】
３４．２９〜３３のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物であって、そのゲノムはさらに、
ＭｓＤｅｆ１、ＭｔＤｅｆ２、ＭｔＤｅｆ４、ＮａＤ１、Ｒｓ−ＡＦＰ１、Ｒｓ−ＡＦＰ２、ＫＰ４、及びＫＰ６からなる群から選択される植物デフェンシンをコードするＤＮＡであって、発現して抗真菌性として有効量の前述のデフェンシンを及び生成する、ＤＮＡ、ならびに／または
バチルス・チューリンゲンシス内毒素をコードするＤＮＡであって、発現して抗昆虫性として有効量の前述のバチルス・チューリンゲンシス内毒素を及び生成する、ＤＮＡ、ならびに／または
前述の植物へ除草剤抵抗性を与えるタンパク質をコードするＤＮＡであって、発現して除草剤抵抗性を与える抗除草性として有効量の前述のタンパク質を及び生成する、ＤＮＡ
を含む、トランスジェニック植物。
【００４６】
３５．トウモロコシ、ダイズ、コムギ、サトウキビ、コメ、及びジャガイモからなる群から選択される、２９〜３４のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。
【００４７】
３６．アルテルナリア属、アスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）属、アスペルギルス属、ボトリチス属、セルコスポラ属、コレトトリカム属、ディプロディア属、エリシフェ属、フザリウム属、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ）属、ヘルミントスポリウム属、マクロフォミナ属、ネクトリア属、ツユカビ属、ファコプソラ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ）属、フォーマ属、フィマトトリカム（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フィトフトラ属、プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）属、プクシニア属、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）属、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）属、ピシウム属、リゾクトニア属、スケロティウム（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ）属、スクレロティニア属、セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）属、シエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）属、ウンシヌラ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）属、ベンチュリア属、及びベルチシリウム属からなる群から選択される真菌の一種からの損傷に対して通常易罹患性の植物であって、その細胞は、配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗真菌性タンパク質またはペプチドをコードするコード配列を含有する、植物。
【００４８】
３７．前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドはさらに、そのＮ末端に植物アポプラスト、液胞、または小胞体を標的とするアミノ酸配列を含む、３６に記載の植物。
【００４９】
３８．前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドは、抗真菌性として有効量で前述の細胞中に存在する、３６または３７に記載の植物。
【００５０】
３９．前述の細胞は根細胞である、３６〜３８のいずれか１つに記載の植物。
【００５１】
４０．トウモロコシ、ダイズ、コムギ、サトウキビ、コメ、及びジャガイモからなる群から選択される、３６〜３９のいずれか１つに記載の植物。
【００５２】
４１．配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗真菌性として有効量の抗真菌性タンパク質またはペプチドを前述の易罹患性の植物の遺伝子座へ提供することを含む、アルテルナリア属、アスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）属、アスペルギルス属、ボトリチス属、セルコスポラ属、コレトトリカム属、ディプロディア属、エリシフェ属、フザリウム属、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ）属、ヘルミントスポリウム属、マクロフォミナ属、ネクトリア属、ツユカビ属、ファコプソラ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ）属、フォーマ属、フィマトトリカム（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フィトフトラ属、プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）属、プクシニア属、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）属、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）属、ピシウム属、リゾクトニア属、スケロティウム（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ）属、スクレロティニア属、セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）属、シエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）属、ウンシヌラ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）属、ベンチュリア属、及びベルチシリウム属からなる群から選択される真菌の一種からの損傷に対して易罹患性の植物への損傷を予防、治療、防除、駆除、低下、または阻害する方法。
【００５３】
４２．前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドは、前述の易罹患性植物の細胞内で前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡを発現することによって前述の易罹患性植物の遺伝子座へ提供される、４１に記載の方法。
【００５４】
４３．前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドをコードする前述のＤＮＡは、前述のコード配列が前述の抗真菌性タンパク質もしくはペプチドをコードすることができるのに十分な、または前述のコード配列のコドンを最適化した版が前述の植物におけるその発現を最適化することができるのに十分な配列番号１０〜１５、２３〜２９、及び６５〜７８に示すヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列とある配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、４２に記載の方法。
【００５５】
４４．前述のＤＮＡはさらに、前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドのＮ末端に植物アポプラスト、液胞、または小胞体を標的とするアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、４３に記載の方法。
【００５６】
４５．前述の細胞は根細胞である、４１〜４４のいずれか１つに記載の方法。
【００５７】
４６．前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドは、前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドを産生する植物にコロニー形成する微生物によって、前述の易罹患性植物の遺伝子座へ提供される、４１に記載の方法。
【００５８】
４７．前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドは、前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドを産生する植物にコロニー形成する微生物を含む組成物を適用することによって、あるいは前述の抗真菌性タンパク質またはペプチド自体を前述の易罹患性植物の遺伝子座へ適用することによって、前述の易罹患性植物の遺伝子座へ提供される、４１に記載の方法。
【００５９】
４８．前述の組成物は、農業上許容し得る希釈剤、賦形剤、または担体を含む、４７に記載の方法。
【００６０】
４９．前述の易罹患性植物は、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、サトウキビ、コメ、及びジャガイモからなる群から選択される、４１〜４８のいずれか１つに記載の方法。
【００６１】
５０．アルテルナリア属、アスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）属、アスペルギルス属、ボトリチス属、セルコスポラ属、コレトトリカム属、ディプロディア属、エリシフェ属、フザリウム属、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ）属、ヘルミントスポリウム属、マクロフォミナ属、ネクトリア属、ツユカビ属、ファコプソラ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ）属、フォーマ属、フィマトトリカム（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フィトフトラ属、プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）属、プクシニア属、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）属、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）属、ピシウム属、リゾクトニア属、スケロティウム（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ）属、スクレロティニア属、セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）属、シエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）属、ウンシヌラ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）属、ベンチュリア属、及びベルチシリウム属からなる群から選択される真菌の一種からの損傷に対して易罹患性植物への損傷を予防、治療、防除、駆除、低下、または阻害する方法であって、前述の真菌性損傷を阻害するのに十分な水準で前述の易罹患性植物の細胞中で、配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡを発現することを含む、方法。
【００６２】
５１．前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドは、前述の易罹患性植物の細胞のアポプラスト、液胞、または小胞体を標的とする、５０に記載の方法。
【００６３】
５２．前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドは、前述のヌクレオチド配列が前述の抗真菌性タンパク質もしくはペプチドをコードすることができるのに十分な、または前述のヌクレオチド配列のコドンを最適化した版が前述の植物におけるその発現を最適化することができるのに十分な配列番号１０〜１５、２３〜２９、及び６５〜７８に示すヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列とある配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、５０または５１に記載の方法。
【００６４】
５３．前述の細胞は根細胞である、５０〜５２のいずれか１つに記載の方法。
【００６５】
５４．前述の易罹患性植物は、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、サトウキビ、コメ、及びジャガイモからなる群から選択される、５０〜５３のいずれか１つに記載の方法。
【００６６】
５５．アルテルナリア属、アスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）属、アスペルギルス属、ボトリチス属、セルコスポラ属、コレトトリカム属、ディプロディア属、エリシフェ属、フザリウム属、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ）属、ヘルミントスポリウム属、マクロフォミナ属、ネクトリア属、ツユカビ属、ファコプソラ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ）属、フォーマ属、フィマトトリカム（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フィトフトラ属、プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）属、プクシニア属、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）属、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）属、ピシウム属、リゾクトニア属、スケロティウム（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ）属、スクレロティニア属、セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）属、シエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）属、ウンシヌラ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）属、ベンチュリア属、及びベルチシリウム属からなる群から選択される真菌の一種からの損傷に対して易罹患性の植物への損傷を阻害する方法であって、
ａ）発現のために操作可能に連結された、
（ｉ）隣接したコード配列のＲＮＡへの転写を生じるよう植物細胞において機能するプロモーター配列、
（ｉｉ）任意に、イントロン、
（ｉｉｉ）配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗真菌性タンパク質もしくはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むコード配列、
（ｉｖ）転写終結及び前述の転写したＲＮＡの３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を生じるよう前述の植物細胞において機能する３’非翻訳領域
を含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子を植物細胞のゲノム中へ挿入すること、
ｂ）形質転換した植物細胞を得ること、ならびに
ｃ）前述の形質転換した植物細胞から遺伝的に形質転換した植物を再生することであって、その細胞は前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドを発現する、前述の遺伝的に形質転換した植物を再生すること
を含む、方法。
【００６７】
５６．前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドは、抗真菌性の量で前述の形質転換した植物の細胞中で発現する、５５に記載の方法。
【００６８】
５７．前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドは、前述の形質転換した植物の細胞のアポプラスト、液胞、または小胞体を標的とする、５５または５６に記載の方法。
【００６９】
５８．前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、前述のヌクレオチド配列が前述の抗真菌性タンパク質もしくはペプチドをコードすることができるのに十分な、または前述のヌクレオチド配列のコドンを最適化した版が前述の植物におけるその発現を最適化することができるのに十分な配列番号１０〜１５、２３〜２９、及び６５〜７８に示すヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列とある配列同一性を有するヌクレオチド配列である、５５〜５７のいずれか１つに記載の方法。
【００７０】
５９．前述のプロモーターは根特異的プロモーターである、５５〜５８のいずれか１つに記載の方法。
【００７１】
６０．前述の根特異的プロモーターは、ＲＢ７、ＲＤ２、ＲＯＯＴ１、ＲＯＯＴ２、ＲＯＯＴ３、ＲＯＯＴ４、ＲＯＯＴ５、ＲＯＯＴ６、ＲＯＯＴ７、及びＲＯＯＴ８からなる群から選択される、５９に記載の方法。
【００７２】
６１．前述の易罹患性植物は、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、サトウキビ、コメ、及びジャガイモからなる群から選択される、５５〜６０のいずれか１つに記載の方法。
【００７３】
６２．アルテルナリア属、アスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）属、アスペルギルス属、ボトリチス属、セルコスポラ属、コレトトリカム属、ディプロディア属、エリシフェ属、フザリウム属、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ）属、ヘルミントスポリウム属、マクロフォミナ属、ネクトリア属、ツユカビ属、ファコプソラ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ）属、フォーマ属、フィマトトリカム（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フィトフトラ属、プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）属、プクシニア属、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）属、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）属、ピシウム属、リゾクトニア属、スケロティウム（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ）属、スクレロティニア属、セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）属、シエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）属、ウンシヌラ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）属、ベンチュリア属、及びベルチシリウム属からなる群から選択される真菌の一種を防除、駆除、または阻害する方法であって、配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗真菌性として有効量の抗真菌性タンパク質またはペプチドを含む組成物と前述の真菌種を接触させることを含む、方法。
【００７４】
６３．前述の組成物は、前述の抗真菌性タンパク質またはペプチド、及び農業上許容し得る担体、希釈剤、または賦形剤を含む、６２に記載の方法。
【００７５】
６４．前述の組成物は、前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドを発現する微生物を含む、６２に記載の方法。
【００７６】
６５．真菌によって生じる植物への損傷を予防、治療、防除、駆除、低下、または阻害する方法であって、
ａ）発現のために操作可能に連結された、
（ｉ）隣接したコード配列のＲＮＡへの転写を生じるよう植物細胞において機能するプロモーター配列、
（ｉｉ）任意に、イントロン、
（ｉｉｉ）配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗真菌性タンパク質もしくはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むコード配列、
（ｉｖ）転写終結及び前述の転写したＲＮＡの３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を生じるよう前述の植物細胞において機能する３’非翻訳領域
を含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子を植物細胞のゲノム中へ挿入すること、
ｂ）形質転換した植物細胞を得ること、ならびに
ｃ）前述の形質転換した植物細胞から遺伝的に形質転換した植物を再生することであって、その細胞は前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドを発現する、前述の遺伝的に形質転換した植物を再生すること
を含む、方法。
【００７７】
６６．前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドは、前述の形質転換した植物の細胞において抗真菌性として有効量で発現する、６５に記載の方法。
【００７８】
６７．前述のコード配列はさらに、前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドのＮ末端に植物アポプラスト、液胞、または小胞体を標的とするアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、６５または６６に記載の方法。
【００７９】
６８．前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、前述のコード配列が前述の抗真菌性タンパク質もしくはペプチドをコードすることができるのに十分な、または前述のコード配列のコドンを最適化した版が前述の植物におけるその発現を最適化することができるのに十分な配列番号１０〜１５、２３〜２９、及び６５〜７８に示すヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列とある配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、６５〜６７のいずれか１つに記載の方法。
【００８０】
６９．前述のプロモーターは根特異的プロモーターである、６５〜６８のいずれか１つに記載の方法。
【００８１】
７０．前述の根特異的プロモーターは、ＲＢ７、ＲＤ２、ＲＯＯＴ１、ＲＯＯＴ２、ＲＯＯＴ３、ＲＯＯＴ４、ＲＯＯＴ５、ＲＯＯＴ６、ＲＯＯＴ７、及びＲＯＯＴ８からなる群から選択される、６９に記載の方法。
【００８２】
７１．前述の真菌は、アルテルナリア属、アスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）属、アスペルギルス属、ボトリチス属、セルコスポラ属、コレトトリカム属、ディプロディア属、エリシフェ属、フザリウム属、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ）属、ヘルミントスポリウム属、マクロフォミナ属、ネクトリア属、ツユカビ属、ファコプソラ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ）属、フォーマ属、フィマトトリカム（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フィトフトラ属、プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）属、プクシニア属、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）属、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）属、ピシウム属、リゾクトニア属、スケロティウム（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ）属、スクレロティニア属、セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）属、シエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）属、ウンシヌラ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）属、ベンチュリア属、及びベルチシリウム属からなる群から選択される種である、６５〜７０のいずれか１つに記載の方法。
【００８３】
７２．前述の植物は、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、サトウキビ、コメ、及びジャガイモからなる群から選択される、６５〜７１のいずれか１つに記載の方法。
【００８４】
７３．真菌によって生じる植物への損傷を予防、治療、防除、駆除、低下、または阻害する方法であって、
形質転換した植物を作出するために、配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドのＮ末端に植物アポプラスト、液胞、または小胞体を標的とするアミノ酸配列とを含む抗真菌性タンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡ分子を用いて植物を形質転換することを含み、
この中で、前述の形質転換した植物の細胞は、前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドを産生し、かつ
この中で、前述の形質転換した植物は、前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドを産生しないがそれ以外の点では同一の形質転換されていない対照植物の真菌損傷と比較して、両方の植物が類似の量の前述の真菌と接触して同じ条件下で生育した場合に低い真菌損傷を呈する、方法。
【００８５】
７４．前述の細胞は根細胞である、７３に記載の方法。
【００８６】
７５．前述の真菌は、アルテルナリア属、アスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）属、アスペルギルス属、ボトリチス属、セルコスポラ属、コレトトリカム属、ディプロディア属、エリシフェ属、フザリウム属、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ）属、ヘルミントスポリウム属、マクロフォミナ属、ネクトリア属、ツユカビ属、ファコプソラ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ）属、フォーマ属、フィマトトリカム（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フィトフトラ属、プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）属、プクシニア属、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）属、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）属、ピシウム属、リゾクトニア属、スケロティウム（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ）属、スクレロティニア属、セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）属、シエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）属、ウンシヌラ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）属、ベンチュリア属、及びベルチシリウム属からなる群から選択される種である、７３または７４に記載の方法。
【００８７】
７６．前述の植物は、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、サトウキビ、コメ、及びジャガイモからなる群から選択される、７３〜７５のいずれか１つに記載の方法。
【００８８】
７７．トランスジェニック植物の根の細胞において配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗真菌性タンパク質またはペプチドを発現する前述のトランスジェニック植物を土壌中で栽培することを含む、前述の土壌の真菌混入を低下または阻害する方法。
【００８９】
７８．前述の根細胞は、抗真菌性として有効量で前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドを産生する、７７に記載の方法。
【００９０】
７９．前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドは、前述の根細胞のアポプラスト、液胞、または小胞体を標的とする、７７または７８に記載の方法。
【００９１】
８０．前述の真菌は、アルテルナリア属、アスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）属、アスペルギルス属、ボトリチス属、セルコスポラ属、コレトトリカム属、ディプロディア属、エリシフェ属、フザリウム属、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ）属、ヘルミントスポリウム属、マクロフォミナ属、ネクトリア属、ツユカビ属、ファコプソラ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ）属、フォーマ属、フィマトトリカム（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フィトフトラ属、プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）属、プクシニア属、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）属、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）属、ピシウム属、リゾクトニア属、スケロティウム（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ）属、スクレロティニア属、セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）属、シエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）属、ウンシヌラ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）属、ベンチュリア属、及びベルチシリウム属からなる群から選択される種である、７７〜７９のいずれか１つに記載の方法。
【００９２】
８１．前述のトランスジェニック植物は、トランスジェニック食用作物植物である、７７〜８０のいずれか１つに記載の方法。
【００９３】
８２．前述のトランスジェニック食用作物植物は、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、サトウキビ、コメ、及びジャガイモからなる群から選択される、８１に記載の方法。
【００９４】
８３．発現のために操作可能に連結された、
ａ）隣接したコード配列のＲＮＡへの転写を生じるよう植物細胞において機能するプロモーター配列、
ｂ）任意に、イントロン、
ｃ）Ｎ末端に配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列と植物アポプラスト、液胞、または小胞体を標的とするアミノ酸配列とからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗真菌性タンパク質もしくはペプチドをコードするコード配列、
ｄ）転写終結及び前述の転写したＲＮＡの３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を生じるよう植物細胞において機能する３’非翻訳配列
を含む、組換え二本鎖ＤＮＡ分子。
【００９５】
８４．前述のプロモーターは、根特異的プロモーターである、８３に記載の二本鎖ＤＮＡ分子。
【００９６】
８５．前述の根特異的プロモーターは、ＲＢ７、ＲＤ２、ＲＯＯＴ１、ＲＯＯＴ２、ＲＯＯＴ３、ＲＯＯＴ４、ＲＯＯＴ５、ＲＯＯＴ６、ＲＯＯＴ７、及びＲＯＯＴ８からなる群から選択される、８４に記載の組換え二本鎖ＤＮＡ分子。
【００９７】
８６．関心対象の植物における発現のためにコドンで最適化された、８３〜８５のいずれか１つに記載の組換え二本鎖ＤＮＡ分子。
【００９８】
８７．前述の関心対象の植物は、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、サトウキビ、コメ、及びジャガイモからなる群から選択される、８６に記載の組換え二本鎖ＤＮＡ分子。
【００９９】
８８．発現のために操作可能に連結された、
ａ）隣接したコード配列のＲＮＡへの転写を生じるよう植物細胞において機能するプロモーター配列、
ｂ）任意に、イントロン、
ｃ）抗真菌性タンパク質もしくはペプチドのＮ末端に配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列と植物アポプラスト、液胞、または小胞体を標的とするアミノ酸配列とからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前述の抗真菌性タンパク質もしくはペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｄ）転写終結及び前述の転写したＲＮＡの３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を生じるよう植物細胞において機能する３’非翻訳配列
を含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子を含む、発現コンストラクト。
【０１００】
８９．前述のプロモーターは根特異的プロモーターである、８８に記載の発現コンストラクト。
【０１０１】
９０．前述の根特異的プロモーターは、ＲＢ７、ＲＤ２、ＲＯＯＴ１、ＲＯＯＴ２、ＲＯＯＴ３、ＲＯＯＴ４、ＲＯＯＴ５、ＲＯＯＴ６、ＲＯＯＴ７、及びＲＯＯＴ８からなる群から選択される、８９に記載の発現コンストラクト。
【０１０２】
９１．前述の組換え二本鎖ＤＮＡ分子は、関心対象の植物における発現のためにコドンで最適化された、８９〜９０のいずれか１つに記載の発現コンストラクト。
【０１０３】
９２．前述の関心対象の植物は、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、サトウキビ、コメ、及びジャガイモからなる群から選択される、９１に記載の発現コンストラクト。
【０１０４】
９３．８３〜８７のいずれか１つに記載の組換え二本鎖ＤＮＡ分子、または８８〜９２のいずれか１つに記載の発現コンストラクトと、形質転換した植物細胞の選別のための選択可能なもしくは得点可能なマーカーとを含む、植物形質転換ベクター。
【０１０５】
９４．配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗真菌性タンパク質またはペプチドを含む、抗真菌性組成物。
【０１０６】
９５．前述の抗真菌性タンパク質もしくはペプチド、またはこれらの組み合わせは、抗真菌性として有効量で存在する、９４に記載の抗真菌性組成物。
【０１０７】
９６．農業上許容し得るまたは医薬として許容し得る担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む、９４または９５に記載の抗真菌性組成物。
【０１０８】
９７．前述の抗真菌性タンパク質もしくはペプチド、またはこれらの組み合わせは、約０．１μｇ／ｍｌ〜約５００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する、９４〜９６のいずれか１つに記載の抗真菌性組成物。
【０１０９】
９８．前述の抗真菌性タンパク質またはペプチド、あるいはこれらの組み合わせは、５μｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する、９４〜９６のいずれか１つに記載の抗真菌性組成物。
【０１１０】
９９．約３〜約９の範囲のｐＨを有する、９４〜９８のいずれか１つに記載の抗真菌性組成物。
【０１１１】
１００．不活性材料、界面活性剤、及び溶媒からなる群から選択される１つ以上の添加物とともに製剤化される、９４〜９９のいずれか１つに記載の抗真菌性組成物。
【０１１２】
１０１．殺虫性活性のある物質、肥料、殺虫剤、誘引剤、滅菌化剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、除草剤、及び成長調節剤からなる群から選択される１つ以上の他の活性物質からなる混合物中で製剤化される、９４〜１００のいずれか１つに記載の抗真菌性組成物。
【０１１３】
１０２．前述の殺虫性活性のある物質は、真菌抗生物質及び化学的殺真菌剤からなる群から選択される、１０１に記載の抗真菌性組成物。
【０１１４】
１０３．前述の真菌抗生物質及び化学的殺真菌剤は、ポリオキシム、ニッコーマイシン、カルボキシアミド、芳香族炭水化物、カルボキシム、モルフォリン、ステロール生合成阻害薬、及び有機リン酸からなる群から選択される、１０２に記載の抗真菌性組成物。
【０１１５】
１０４．易罹患性真菌種の増殖を阻害するための、９４〜１０３のいずれか１つに記載の抗真菌性組成物の使用。
【０１１６】
１０５．前述の易罹患性真菌種は、アルテルナリア属、アスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）属、アスペルギルス属、ボトリチス属、セルコスポラ属、コレトトリカム属、ディプロディア属、エリシフェ属、フザリウム属、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ）属、ヘルミントスポリウム属、マクロフォミナ属、ネクトリア属、ツユカビ属、ファコプソラ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ）属、フォーマ属、フィマトトリカム（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フィトフトラ属、プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）属、プクシニア属、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）属、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）属、ピシウム属、リゾクトニア属、スケロティウム（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ）属、スクレロティニア属、セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）属、シエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）属、ウンシヌラ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）属、ベンチュリア属、及びベルチシリウム属からなる群から選択される、１０４に記載の使用。
【０１１７】
１０６．易罹患性真菌種の増殖を阻害する上での使用のための、９４〜１０３のいずれか１つに記載の抗真菌性組成物。
【０１１８】
１０７．前述の易罹患性真菌種は、アルテルナリア属、アスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）属、アスペルギルス属、ボトリチス属、セルコスポラ属、コレトトリカム属、ディプロディア属、エリシフェ属、フザリウム属、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ）属、ヘルミントスポリウム属、マクロフォミナ属、ネクトリア属、ツユカビ属、ファコプソラ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ）属、フォーマ属、フィマトトリカム（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フィトフトラ属、プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）属、プクシニア属、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）属、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）属、ピシウム属、リゾクトニア属、スケロティウム（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ）属、スクレロティニア属、セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）属、シエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）属、ウンシヌラ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）属、ベンチュリア属、及びベルチシリウム属からなる群から選択される、１０６に記載の使用。
【０１１９】
１０８．前述のタンパク質、ペプチド、もしくはこれらの組み合わせを産生する植物にコロニー形成する微生物によって、または前述の植物にコロニー形成する微生物を含む組成物によって植物の遺伝子座へ提供される、９４〜１０３のいずれか１つに記載の抗真菌性組成物。
【０１２０】
１０９．前述のタンパク質、ペプチド、またはこれらの組み合わせは、トランスジェニック植物の細胞内で前述のタンパク質、ペプチド、またはこれらの組み合わせをコードするＤＮＡから発現する、９４または９５に記載の抗真菌性組成物。
【０１２１】
１１０．トランスジェニック植物の細胞は、抗真菌性タンパク質またはペプチドのＮ末端に配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列と植物アポプラスト、液胞、または小胞体を標的とするアミノ酸配列とからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前述の抗真菌性タンパク質もしくはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み及び発現する、易罹患性真菌を前述のトランスジェニック植物と接触させることを含む、前述の易罹患性真菌を防除、駆除、または阻害する方法。
【０１２２】
１１１．前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドは、前述のトランスジェニック植物の根の細胞において発現する、１１０に記載の方法。
【０１２３】
１１２．前述の抗真菌性タンパク質またはペプチドは、抗真菌性として有効量で前述の根の細胞によって発現する、１１１に記載の方法。
【０１２４】
１１３．前述の易罹患性真菌は、一種であり、アルテルナリア属、アスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）属、アスペルギルス属、ボトリチス属、セルコスポラ属、コレトトリカム属、ディプロディア属、エリシフェ属、フザリウム属、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ）属、ヘルミントスポリウム属、マクロフォミナ属、ネクトリア属、ツユカビ属、ファコプソラ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ）属、フォーマ属、フィマトトリカム（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フィトフトラ属、プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）属、プクシニア属、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）属、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）属、ピシウム属、リゾクトニア属、スケロティウム（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ）属、スクレロティニア属、セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）属、シエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）属、ウンシヌラ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）属、ベンチュリア属、及びベルチシリウム属からなる群から選択される、１１０〜１１２のいずれか１つに記載の方法。
【０１２５】
１１４．前述のトランスジェニック植物は、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、サトウキビ、コメ、及びジャガイモからなる群から選択される、１１０〜１１３のいずれか１つに記載の方法。
【０１２６】
１１５．ヒト療法における使用のための、配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗真菌性タンパク質またはペプチド。
【０１２７】
１１６．易罹患性の真菌感染を治療する上での使用のための、配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗真菌性タンパク質またはペプチド。
【０１２８】
１１７．ヒト療法における、配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗真菌性タンパク質またはペプチドの使用。
【０１２９】
１１８．易罹患性真菌感染を治療する上での配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗真菌性タンパク質またはペプチドの使用。
【０１３０】
１１９．易罹患性の真菌感染を治療するための薬剤の製造のための、配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗真菌性タンパク質またはペプチドの使用。
【０１３１】
１２０．配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗真菌性として有効量の抗真菌性タンパク質またはペプチドを、易罹患性の真菌感染を治療することを必要とする患者へ投与することを含む、前述の患者における易罹患性の真菌感染を治療する方法。
【０１３２】
１２１．前述の投与することは、局所的に実施される、１２０に記載の方法。
【０１３３】
本発明の適用可能性に関するさらなる範囲は、以下に提供する詳細な説明及び図面から明らかとなる。しかしながら、当該詳細な説明及び具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものの、本発明の精神及び範囲内の種々の変更及び改変がこの詳細な説明から当業者に明らかとなるので、実例として与えられているに過ぎない。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
本発明の先の及び他の態様、特徴、ならびに利点は、添付の図とともに挙げられる以下の詳細な説明からより良好に理解され、そのすべては、実例として与えられているに過ぎず、本発明を制限するものではない。
【図１】図１は、ＭｔＤｅｆ５を発現するダイズ系統を作出するのに使用する形質転換ベクターＡＫＫ／ＦＭＶ／Ｄｅｆ５を示す。「ＬＢ」＝Ｔ−ＤＮＡ左側境界、「Ｔ−ＤＮＡ  ＲＢ」＝Ｔ−ＤＮＡ右側境界、「ｔＮＯＳ」＝ノパリンシンターゼ終結因子配列、「ＦＭＶ」＝ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓ、「ＳＵイントロン」＝スーパーユビキチンイントロン、「ＢＡＲ」＝ビアラホス（Ｂｉａｌｏｐｈｏｓ）抵抗性遺伝子、「ＮＯＳ」＝ノパリンシンターゼプロモーター、「Ｏｒｉ」＝複製起点、「ＴｒａＦ」＝転移Ｆ、「Ｔｅｔ（Ｒ）」＝テトラサイクリン抵抗性遺伝子、「Ｋａｎ（Ｒ）」＝カナマイシン抵抗性遺伝子、「ＴｒｆＡ」＝Ｔ−ＤＮＡ複製因子、及び「Ｄｅｆ５」は、ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドコード配列を表す。
【図２】図２は、ＭｔＤｅｆ５発現コムギ系統を作出するための使用することになっている形質転換ベクターｐＺＰ２１２−Ｄｅｆ５を示す。「ＬＢ」＝Ｔ−ＤＮＡ左側境界、「Ｔ−ＤＮＡ  ＲＢ」＝Ｔ−ＤＮＡ右側境界、ｎｐｔＩＩ＝ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ、３５Ｓ＝ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ｕｂｉ及びＵｂｉイントロン＝トウモロコシＵｂｉ１Ａプロモーター及びイントロン、ＴＥＶ＝タバコエッチ病ウイルスリーダー、Ｄｅｆ５＝ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドコード配列、ｔｅｒ＝ＣａＭＶ３５Ｓ終結シグナルである。
【図３】図３は、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）ＰＨ−１分生子と当該ペプチドとのインキュベーションの２４時間後のＭｔＤｅｆ５．１ａの化学的に合成されたＧＭＡ−５ＣペプチドＧＡＣＨＲＱＧＦＧＦＡＣＦＣＹＫＫＣ（配列番号５８）のインビトロでの抗真菌活性の定量的評価を示す。値は３つの複製物の平均である。誤差棒は、標準偏差を示す。当該ペプチドのインビトロでの抗真菌活性は、すでに説明されているように測定した（Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈｙら（２００７）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９：１４９１〜１５０６）。
【発明を実施するための形態】
【０１３５】
本発明の以下の詳細な説明は、本発明を実施する上で当業者を支援するために提供される。そうであっても、以下の詳細な説明は、論議される本明細書の実施形態における修正及び変更が本発明の発見の精神または範囲から逸脱することなく、当業者によってなされ得るので、本発明を不当に制限するよう解釈すべきではない。
【０１３６】
本明細書で論議される参考文献で引用される参考文献を含む、当該参考文献の各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３７】
本明細書で説明するいずれかの特徴または特徴の組み合わせは、本開示の範囲内に含まれており、但し、いずれかのこのような組み合わせに含まれる特徴が本文脈、本明細書、及び当業者の知識から明らかなように相互に矛盾していないことを条件とする。本開示の追加的な利点及び態様は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲において明らかである。
【０１３８】
ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列、ならびに本発明のコンストラクト、方法、及び生体において有用な他の要素のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、本明細書の終わりに見出すことができる。本発明によって包含されるアミノ酸配列及びヌクレオチド配列はすべて、具体的に開示される配列からなる配列、当該具体的に開示される配列から本質的になる配列、または当該具体的に開示される配列を含む配列を含む。当業者によって認識されるように、遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書に開示されるタンパク質分子及びペプチド分子をコードする多くのヌクレオチド配列がある。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、いずれかの天然コード配列のヌクレオチド配列と最小の相同性を保有していてもよい。
【０１３９】
加えて、コドン利用法における差により変化するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に企図され、単子葉植物、双子葉植物、酵母類、または細菌類における発現のために最適化されたポリヌクレオチドを含む。Ｎａｋａｍｕｒａら（２０００）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（１）：２９２は、種々の生体におけるポリヌクレオチドの発現を高めるための好ましいコドンの組み込みを論議している。種々の単子葉植物または双子葉植物の遺伝子におけるコドン利用法は、Ｋａｗａｂｅ及びＭｉｙａｓｈｉｔａ（２００３）「３種類の双子葉植物種及び４種類の単子葉植物種におけるコドン利用法バイアスのパターン（Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｂｉａｓ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｃｏｔ  ａｎｄ  ｆｏｕｒ  ｍｏｎｏｃｏｔ  ｐｌａｎｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ）」，Ｇｅｎｅｓ  Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｓｔ．７８：３４３〜３５２ならびにＭｕｒｒａｙら（１９８９）「植物遺伝子におけるコドン利用法（Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｓ）」  ＮＡＲ  １７：４７７〜４９８において開示されている。植物におけるコドン利用法を最適化するための方法はまた、米国特許第５，５００，３６５号、第５，６８９，０５２号、第５，５００，３６５号、及び第５，６８９，０５２号において開示されている。
【０１４０】
ＭｔＤｅｆ５タンパク質コードヌクレオチド配列及びＭｔＤｅｆ５ペプチドコードヌクレオチド配列、ならびに当該配列を駆動するのに使用するプロモーターヌクレオチド配列は、ゲノムまたは非ゲノムのヌクレオチド配列であることができる。ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びＭｔＤｅｆ５ペプチドならびにプロモーターをコードするゲノム及び非ゲノムのヌクレオチド配列は、例えば、天然のｍＲＮＡ、合成で生成されるｍＲＮＡ、ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びＭｔＤｅｆ５ペプチドならびにプロモーターをコードする天然のヌクレオチド配列、ならびにＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドならびにプロモーターをコードする合成で生成されるヌクレオチド配列を含む。合成ヌクレオチド配列は、例えば、オリゴヌクレオチドの化学的合成または酵素による合成によることを含む、当該技術分野で周知の手段によって生成することができ、例えば、異なるトランスジェニック植物における効率的な発現のための、このような植物におけるコドン利用法のパターンを反映する、ｃＤＮＡのコドンの最適化された配列、通常の活性に負に影響しない保存的（または非保存的）アミノ酸置換を含有するバリアント、ＰＣＲ増幅したヌクレオチド配列などを含む。
【０１４１】
（定義）
別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する当該技術分野の当業者によって共通して理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に説明されるものと類似のまたは等価のいずれかの方法及び材料は、本明細書に説明する方法及び材料の代わりに、本発明を実施または検査する上で使用することができる。
【０１４２】
本発明の目的のために、次の用語を以下に定義する。
【０１４３】
本明細書で開示する方法及び組成物が適用されることのできる用語「食用作物植物」とは、直接的に可食性であるかまたは可食用産物を生じるかのいずれかである植物、ならびに動物を通じて直接的にヒトへ、または間接的に動物を通じてのいずれかで食物を与えるのに慣例上使用する植物を指す。このような植物の非限定例としては、
１．穀類作物：コムギ、コメ、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）（トウモロコシ（ｃｏｒｎ））、オオムギ、エンバク、モロコシ、ライムギ、及びアワ、
２．タンパク質作物：ピーナッツ、ヒヨコマメ、レンズマメ、インゲンマメ、ダイズ、アオイマメ、
３．根及び塊茎：ジャガイモ、サツマイモ、及びカッサバ、
４．油作物：トウモロコシ、ダイズ、セイヨウアブラナ（ナタネ）、コムギ、ピーナッツ、ヤシ、ココナッツ、ベニバナ、綿実、ヒマワリ、アマ、オリーブ、及びベニバナ、
５．糖作物：サトウキビ及びテンサイ、
６．果実作物：バナナ、オレンジ、リンゴ、セイヨウナシ、パンノキ、パイナップル、及びサクランボ、
７．野菜作物及び塊茎：トマト、レタス、ニンジン、メロン、アスパラガスなど、
８．ナッツ類：カシュー、ピーナッツ、クルミ、ピスタチオナッツ、アーモンド、
９．飼料及び芝草、
１０．マメ科牧草：ムラサキウマゴヤシ、クローバー
１１．薬用作物：コーヒー、ココア、コーラナッツ、ケシ、
１２．香辛料作物及び香料作物：バニラ、セージ、タイム、アニス、サフラン、メントール、ペパーミント、スペアミント、コリアンダー
が挙げられる。
【０１４４】
本方法及び組成物へも適用することができる用語「生物燃料作物」または「エネルギー作物」には、先の項目４に列挙する油作物を含み、さらに、サトウキビ、トウゴマ、アマナズナ、スイッチグラス、ススキ、タイワンアブラギリなどの植物を含む。
【０１４５】
単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、別段の明確な記載がほかにない限り、複数形の指示対象を含む。同様に、語「または」は、別段の明確な記載がほかにない限り、「及び」を含むよう意図する。それゆえ、ＡまたはＢを含むことは、ＡまたはＢあるいはＡ及びＢを含むことを意味する。
【０１４６】
「約」が意味するのは、基準の量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、水準、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重さ、長さ、またはこれらに類するものと比較して±３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％と同じ程度まで変化する量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、水準、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重さ、長さ、またはこれらに類するものである。
【０１４７】
同じ構成要素または特性に向けられる本明細書に開示するすべての範囲の終点は、包括的でありかつ独立して組み合わせることができる（例えば、「約２５重量％以下の、またはより具体的には約５重量％〜約２０重量％」の範囲は、終点及び「約５重量％〜約２５重量％」の範囲の中間値全部を含んでいる、など）。
【０１４８】
本明細書の請求項で使用する用語「を含むこと」は、制限がなく、当該請求項が、そこに具体的に列挙される特徴をすべてを有さなければならないが、同様に存在する列挙されていない追加的な特徴に関して禁止事項がないことを意味する。用語「を含むこと」は、当該請求項を、主要な量においてでさえ指定していない成分の包含について制限がないままにする。請求項における用語「から本質的になること」は、本発明が、列挙した成分を必ず含んでいて、本発明の基礎的かつ新規の特性に実質的に影響しない列挙されていない成分に対して制限がないことを意味する。「から本質的になること」の請求項は、閉鎖的な「からなること」フォーマットで書かれた閉鎖型の請求項と、「を含むこと」フォーマットで立案された完全に開放型の請求項との間の中間的な地点を占める。これらの用語は、このことが必要となり得れば、及びこのことが必要となり得る時に、本明細書で相互交換可能に使用することができる。
【０１４９】
さらに、用語「を含むこと」ならびに「を含む」及び「を含んだ」などの他の関連形態の使用は制限されてはいない。
【０１５０】
用語「異種性の」とは、核酸断片またはタンパク質の周囲に対して外来である当該核酸断片またはタンパク質を指す。核酸断片の文脈において、このことは、ある源に由来して異なる宿主へとこのような断片を導入することによって典型的に達成される。宿主生体へと挿入されたコード配列などの異種性核酸断片は通常、宿主生体の遺伝的補体において認められない。本明細書で使用する場合、用語「異種性の」はまた、同じ生体に由来するがこの生体のゲノム内の異なる、例えば非天然の位置にある核酸断片を指す。したがって、当該生体は、ゲノム内の、加えて、植物細胞の場合においては、細胞内の異なるゲノム内の、例えば、核ゲノムの中の及び同様にプラスチドゲノム内のもしくはミトコンドリアゲノム内のこのような断片の正常な位置にある当該断片の通常のコピー数よりも多く有することができる。核酸断片が挿入または転移した生体に関して異種性である核酸断片は時に「導入遺伝子」と呼ばれる。
【０１５１】
「異種性の」ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列は、内在性ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列あるいは別の植物または他の源に由来するヌクレオチド配列の１つ以上の追加的なコピーであることができる。さらに、これらは、ゲノムまたは非ゲノムヌクレオチド配列であることができる。ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドをコードする非ゲノムヌクレオチド配列としては、例えば、天然ｍＲＮＡ、例えば、酵素による合成または化学的オリゴヌクレオチド合成によって生成する合成ｍＲＮＡ、例えば、異なるトランスジェニック植物におけるコドンの利用法のパターンを反映するこのような植物における効率的な発現のためのｃＤＮＡのコドンの最適化された配列を含む化学的なオリゴヌクレオチド合成または酵素による合成によって生成するものを含む、合成で生成するＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列、遺伝暗号の縮重により天然のゲノム配列とは異なるが本明細書に開示するＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドをなおもコードするヌクレオチド配列、正常な抗真菌活性に負に影響しない保存的（または非保存的）アミノ酸置換を含むＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列、ＰＣＲ増幅したヌクレオチド配列、ならびに当業者になじみのあるヌクレオチド配列の他のゲノム形態を含む。
【０１５２】
トランスジェニック植物などの「トランスジェニック」生体とは、ヌクレオチドコード配列、発現カセット、ベクターなどを含む１つ以上の異種性核酸断片を含有するよう遺伝子操作された宿主生体である。トランスジェニック細胞を作出するための異種性核酸の宿主細胞への導入は、いずれかの特定の送達様式に限定されず、例えば、当業者に周知のような顕微注入、吸着、電気穿孔法、パーティクルガン照射、ウィスカ仲介性形質転換、リポソーム仲介性送達、アグロバクテリウム仲介性転移、ウイルスベクター及びレトロウイルスベクターの使用などを含む。
【０１５３】
用語「ゲノム」は、植物細胞内の異なるゲノムの全部、すなわち核ゲノム、プラスチド（例えば、葉緑体ゲノム）、及びミトコンドリアゲノムを集約的に指すことができ、または具体的に示される場合、これらの個々のゲノムの各々を別個に指すことができる。本明細書で使用する場合、用語「ゲノム」は、別段の記載がほかにない限り、核ゲノムを指す。本組換え方法及び植物において採用するＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドの発現のための「ゲノム」は、核ゲノムである。しかしながら、プラスチドゲノム、例えば、葉緑体ゲノムにおける発現、またはプラスチド標的配列の使用を介した葉緑体などのプラスチドゲノムへのＭｔＤｅｆ５タンパク質もしくはペプチドの標的化も、本開示によって包含される。
【０１５４】
用語「対照植物」は、形質改善する組換えＤＮＡを導入されていない植物を指す。対照植物は、このような形質改善する組換えＤＮＡを含むトランスジェニック植物における形質改善を測定及び比較するための標準として使用する。ある適切な種類の対照植物とは、トランスジェニック植物を作出するのに使用した親系統の非トランスジェニック植物、すなわち、他の点では同一の野生型の植物である。別の種類の適切な対照植物とは、具体的な形質生成ＤＮＡのない、例えば、単純に空ベクターの組換えＤＮＡを含むトランスジェニック植物である。
【０１５５】
句「抗真菌性タンパク質」または「抗真菌性ペプチド」は、本明細書で使用する場合、以下の特徴、すなわち、真菌細胞増殖を阻害または遅延させること、真菌細胞を殺滅すること、胞子発芽、芽胞形成、または接合などの真菌の生活環の段階を中断または遅延させること、ならびに／あるいは植物内での真菌細胞感染、侵入、または蔓延を中断することのうちのいずれかの１つ以上を呈するタンパク質及びペプチドを指す。したがって、正味の効果は、真菌の病原性及び／または植物に対する損傷を制限、低下、または排除することである。
【０１５６】
句「生物学的機能等価物」及びこれらに類するものは本明細書で使用する場合、本発明のＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドのものと類似のまたは同一の配列または構造特徴を含有しかつ、本発明のＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドの同じかまたは類似の、例えば約±３０％の抗真菌活性を呈するペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を指す。生物学的機能等価物にはまた、本明細書に開示するＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドに対して生じるモノクローナル抗体及び／またはポリクローナル抗体と反応する（すなわち、特異的に結合する）、かつ本発明のＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドと同じまたは類似の、例えば約±３０％の抗真菌活性を呈するペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を含む。
【０１５７】
句「真菌損傷を駆除すること」、「真菌損傷を駆除または防除すること」、「真菌損傷を防除すること」、あるいはこれらに類するものは本明細書で使用する場合、真菌病原体による感染による作物植物または作物植物産物に対する損傷の低下を指す。より一般的には、これらの句は作物植物における望ましくない真菌の存在によって生じる有害な効果の低下を指す。真菌増殖の有害な効果は、植物組織のいずれかの種類の損傷もしくは壊死、植物収量のいずれかの種類の低下、作物植物産物の価値のいずれかの低下、及び／または望ましくない真菌代謝産物もしくはマイコトキシンを含むがこれに限定しない真菌増殖副産物の産生を含むと理解される。
【０１５８】
句「ＤＮＡコンストラクト」は本明細書で使用する場合、２つ以上の通常異なるＤＮＡ配列が共有結合したいずれかのＤＮＡ分子を指す。ＤＮＡコンストラクトの例としては、いずれかの源に由来する、ゲノム組み込みまたは自己複製が可能な、プラスミド、コスミド、ウイルス、ＢＡＣ（バクテリア人工染色体）、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、植物ミニ染色体、自己複製する配列、ファージ、または直鎖状もしくは環状の一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定しない。ＤＮＡコンストラクトは、組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術、または複数の技術のうちのいずれかの組み合わせを含むがこれらに限定しない種々の方法によって組み立てることができる。
【０１５９】
句「植物病原性真菌阻害量」または「抗真菌有効量」、またはこれらに類するものは、場合によっては抗真菌目的に使用するＭｔＤｅｆ５タンパク質もしくはペプチド、またはＭｔＤｅｆ５タンパク質、ペプチド、もしくはこのいずれかの組み合わせを含有する農業組成物もしくは医薬組成物を発現するトランスジェニック植物もしくは微生物の文脈において本明細書で使用する場合、当該トランスジェニック植物における真菌増殖のいずれかの測定可能な低下及び／またはトランスジェニック植物における真菌増殖によって生じる有害な効果のいずれかの測定可能な低下を結果として生じる、あるいは真菌増殖におけるいずれかの測定可能な低下及び／またはペプチドが個々に採用される特定の適用における真菌の増殖によって生じる有害な効果のいずれかの測定可能な低下を結果的に生じる当該ＭｔＤｅｆ５タンパク質及び／またはペプチドの量を指す。後者には例えば、ヒト及び獣医学的治療適用を含む。ＭｔＤｅｆ５タンパク質もしくはペプチドまたはこのいずれかの組み合わせの抗真菌有効量とは、患者または対象への単回または複数回投与の際に、所望の予防または治療を提供する量または用量である。
【０１６０】
トランスジェニック植物の文脈において、ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドの植物病原性真菌阻害量（抗真菌有効量）は、少なくとも約０．０５ＰＰＭ、少なくとも約０．５ＰＰＭ、少なくとも約１．０ＰＰＭ、または少なくとも約２．０ＰＰＭであり、ここでＰＰＭとは、新鮮重量の植物組織中に存在するＭｔＤｅｆ５タンパク質の「百万分率」であり、ここで新鮮重量植物組織１ｇあたりのＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチド１μｇは、１ＰＰＭの濃度を表す。
【０１６１】
句「異種性プロモーター」はＤＮＡコンストラクトの文脈において本明細書で使用する場合、ｉ）操作可能に連結された構造的コード配列とは異なる源に由来するプロモーターまたはｉｉ）操作可能に連結された構造遺伝子と同じ源に由来するプロモーターのいずれかを指し、ここで、当該プロモーターの配列はその原形から修飾されている。
【０１６２】
用語「ホモログ」は本明細書で使用する場合、ＤＮＡ配列またはコードされたタンパク質配列のいずれかの同一性によって第二の遺伝子と関連付けられた遺伝子を指す。ホモログである遺伝子は、種分化の事象によって分離された遺伝子であることができる（「オルソログ」を参照されたい）。ホモログである遺伝子はまた、遺伝子複製の事象によって分離された遺伝子であってもよい（「パラログ」を参照されたい）。ホモログは、同じであるまたは異なる生体に由来することができ、同じであるまたは異なるいずれかの生体において同じ生物学的機能を発揮し得る。
【０１６３】
句「ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチド」は本明細書で使用する場合、ｉ）本明細書に開示する成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質配列またはペプチド配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有するタンパク質またはペプチド、ならびにｉｉ）ＭｔＤｅｆ５シグナルペプチド及び成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質を含むＭｔＤｅｆ５プロタンパク質配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有するタンパク質を指す。成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質配列には、ＭｔＤｅｆ５．１ａ成熟タンパク質配列（配列番号１６）、ＭｔＤｅｆ５．１ｂ成熟タンパク質配列（配列番号１７）、ＭｔＤｅｆ５．２成熟タンパク質配列（配列番号１８）、ＭｔＤｅｆ５．３成熟タンパク質配列（配列番号１９）、ＭｔＤｅｆ５．４成熟タンパク質配列（配列番号２０）、ＭｔＤｅｆ５．５成熟タンパク質配列（配列番号２１）、及びＭｔＤｅｆ５．６成熟タンパク質配列（配列番号２２）、ならびに配列番号２３〜２９によってそれぞれ具現化されるこれらのコード配列、これらの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有するタンパク質、ならびにこれらの配列の生物学的機能的等価物を含むが、それらに限定しない。ＭｔＤｅｆ５プロタンパク質配列には、ＭｔＤｅｆ５．１ａプロタンパク質配列（配列番号１）、ＭｔＤｅｆ５．１ａ−５．１ｂプロタンパク質配列（配列番号４）、ＭｔＤｅｆ５．２プロタンパク質配列（配列番号５）、ａＭｔＤｅｆ５．３プロタンパク質配列（配列番号６）、ＭｔＤｅｆ５．４プロタンパク質配列（配列番号７）、ＭｔＤｅｆ５．５プロタンパク質配列（配列番号８）、及びＭｔＤｅｆ５．６プロタンパク質配列（配列番号９）、ならびに配列番号１０〜１５によってそれぞれ具現化されるこれらのコード配列、これらの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有するタンパク質、ならびにこれらの配列の生物学的機能的等価物を含むが、それらに限定しない。
【０１６４】
成熟ＭｔＤｅｆ５．１ａタンパク質（配列番号１６）及び成熟ＭｔＤｅｆ５．１ｂタンパク質（配列番号１７）がＭｔＤｅｆ５．１ａ−ＭｔＤｅｆ５．１ｂプロタンパク質（配列番号４）の成分としての二量体として発現するように見えることを特筆することは興味深く、この中で、配列番号２に示すアミノ酸配列、すなわちＡＰＫＫＶＥＰを有するペプチドは「リンカー」として作用する。
【０１６５】
句「植物病原性真菌の増殖を阻害すること」は本明細書で使用する場合、真菌の増殖におけるいずれかの測定可能な低下を結果として生じる方法を指し、ここで、真菌の増殖には真菌の細胞、胞子、分生子、または菌糸の数及び／または程度のいずれかの測定可能な低下を含むがこれらに限定しない。本明細書で使用する場合、「植物病原性真菌の増殖を阻害すること」はまた、植物における真菌増殖による有害な効果原因におけるいずれかの測定可能な低下を含むと理解される。植物における真菌増殖の有害な効果には、植物組織のいずれかの種類の損傷もしくは壊死、植物収量のいずれかの種類の低下、作物植物産物の価値のいずれかの低下、及び／または望ましくない真菌代謝産物もしくはマイコトキシンを含むがこれに限定しない真菌増殖副産物の産生を含む。
【０１６６】
用語「オルソログ」は本明細書で使用する場合、種分化による共通の祖先遺伝子から進化した異なる種における２つ以上の相同遺伝子を指す。オルソログは、異なる種における同じ生物学的機能を有していてもよい。
【０１６７】
句「操作可能に連結された」は本明細書で使用する場合、１つの配列が、連結された配列へ必要とされる機能を提供することができるような核酸配列の結合を指す。プロモーターの文脈において、「操作可能に連結された」は、プロモーターが関心対象の配列へ結合して、それにより関心対象の当該配列の転写が当該プロモーターによって制御及び調節されることを意味する。関心対象の配列がタンパク質をコードする場合、及び当該タンパク質の発現が所望の場合、「操作可能に連結された」は、結果として生じる転写産物が効率的に翻訳されるような方法で、当該プロモーターが当該配列へ連結されることを意味する。コード配列へのプロモーターの連結が、コードされるタンパク質の転写上の融合及び発現である場合、当該連結は、結果として生じる転写産物における第一の翻訳開始コドンがコード配列の開始コドンであるようになされる。あるいは、コード配列へのプロモーターの連結が翻訳上の融合であり、かつコードされるタンパク質の発現が所望である場合、当該連結は、結果として生じる翻訳産物が所望のタンパク質をコードする翻訳上のオープンリーディングフレームを有するフレーム中にあるよう、当該プロモーター及びコード配列と結合した５’非翻訳配列において含有される第一の翻訳開始コドンが連結されるようになされる。操作可能に連結されることのできる核酸配列には、遺伝子発現機能を提供する配列（例えば、プロモーター、５’非翻訳領域、イントロン、タンパク質コード領域、３’非翻訳領域、ポリアデニル化部位、及び／または転写終結因子などの遺伝子発現配列）、ＤＮＡ転移及び／または組み込み機能を提供する配列（例えば、Ｔ−ＤＮＡ境界配列、部位特異的リコンビナーゼ認識部位、インテグラーゼ認識部位）、選択的機能を規定する配列（例えば、抗生物質抵抗性マーカー、生合成遺伝子）、スコア化可能なマーカー機能を提供する配列（例えば、レポーター遺伝子）、配列のインビトロもしくはインビボでの操作を容易にする配列（例えば、ポリリンカー配列、部位特異的組換え配列）ならびに複製機能を提供する配列（例えば、細菌の複製起点、自己複製配列、セントロメア配列）を含むが、これらに限定しない。
【０１６８】
句「％同一性」は本明細書で使用する場合、既定された長さの２つの最適に整列したＤＮＡセグメント、ＲＮＡセグメント、またはタンパク質セグメント内で同一である配列におけるエレメント（すなわち、アミノ酸またはヌクレオチド）の数を指す。「％同一性」を算出するために、同一のエレメントの数は、既定された長さの整列したセグメントにおけるエレメントの総数によって除されかつ１００を乗じられる。同一性の％をタンパク質に関して使用する場合、あるアミノ酸残基は同一ではないかもしれないが、それにもかかわらず、類似の化学的特性（例えば、酸性または塩基性、疎水性、親水性、水素結合のドナー残基またはアクセプター残基）とのアミノ酸残基の置換を反映する保存的アミノ酸置換であることは理解される。このような置換は、当該分子の機能的特性を変化させないかもしれない。結果的に、タンパク質配列の％同一性は、保存的アミノ酸置換を説明するよう上昇することができる。
【０１６９】
用語「再生」は本明細書で使用する場合、例えば種子、原形質体、植物細胞、植物細胞群、植物カルス組織、または植物の切除した片のうちのいずれか１つから植物全体を得るいずれかの方法を指す。
【０１７０】
用語「易罹患性真菌（または真菌類）」、易罹患性真菌感染、及びこれらに類するものは、植物、またはヒトもしくは動物の患者もしくは対象を感染させる真菌、あるいは本明細書に開示するＭｔＤｅｆ５分子の増殖阻害効果もしくは増殖遅延効果、及び／または発病遅延効果に対して応答性のある、ならびに当該効果によって有害に影響されるこれらの真菌感染を指す。このような易罹患性真菌は、これらの分子、または胞子発芽、芽胞形成、もしくは接合などの真菌の生活環の段階によって殺滅させることができ、植物もしくは哺乳類動物内での感染、侵入、もしくは蔓延は、ＭｔＤｅｆ５分子によって中断または遅延する。このような真菌及び真菌感染に及ぼすＤｅｆ５分子の正味の効果は、このような真菌と接触した植物、ヒト、または動物に対する真菌性発病及び／または損傷を予防、制限、低下、治療、阻害、または完全に排除することである。易罹患性真菌は、本明細書に開示するアッセイ方法のうちのいずれかによって識別することができる。
【０１７１】
用語「形質転換」は本明細書で使用する場合、外来性ＤＮＡが染色体中へと組み込まれるまたは自己複製が可能である細胞または原形質体へと当該外来性ＤＮＡ配列（例えば、ベクター、組換えＤＮＡ分子）を導入する過程を指す。
【０１７２】
句「トランスジェニック植物」は、形質転換した植物細胞、原形質体、または他の形質転換した植物組織に由来する植物またはその子孫を指し、この中で、当該植物ＤＮＡは、同じ種の対応する天然の非トランスジェニック植物において元来存在しない導入された外来性ＤＮＡ分子を含有する。
【０１７３】
用語「治療すること」（または「治療する」もしくは「治療」）は、植物または他の真菌病原体によって生じる症状、障害、容態、または疾患の進行または重症度を遅延、中断、阻止、制御、停止、低下、または逆転させることを意味し、罹患した植物またはヒトまたは獣医学的対象の真菌疾患関連の症状、容態、または障害を全部総じて排除することを含むことができる。
【０１７４】
用語「ベクター」は本明細書で使用する場合、宿主細胞において複製することのできるＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子、及び／または別のＤＮＡセグメントもしくはＲＮＡセグメントが、結合したセグメントの複製を生じるよう操作上連結することのできるＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子を指す。プラスミドは、１つの例示的なベクターである。
【０１７５】
本発明は、本明細書に開示するＭｔＤｅｆ５抗真菌性タンパク質及びペプチドを発現するのに有用な単離したＤＮＡコンストラクトを提供する。単離したＤＮＡコンストラクトは、異種性プロモーター、任意のイントロン、配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４のうちのいずれか１つと少なくとも約８５％の配列同一性を有するＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドをコードする配列、ならびにポリアデニル化配列を含み、この中で、当該プロモーター、任意のイントロン、シグナルペプチドをコードする配列、成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドをコードする配列、及びポリアデニル化配列は、発現のために操作可能に連結される。
【０１７６】
本発明の単離したＤＮＡコンストラクトはさらに、ＭｔＤｅｆ５タンパク質をコードする配列へ操作可能に連結されたシグナルペプチドをコードする配列を含むことができる。本発明のＤＮＡコンストラクトに使用するシグナルペプチドは、酵母シグナルペプチド、単子葉植物シグナルペプチド、双子葉植物シグナルペプチド、及び合成シグナルペプチドからなる群から選択される。酵母シグナルペプチドは、α因子シグナルペプチド、インベルターゼシグナルペプチド、及びＰＨＯ１シグナルペプチドからなる群から選択することができる。双子葉植物シグナルペプチドは、ＭｔＤｅｆ１．１、ＭｓＤｅｆ１．６、ＭｔＤｅｆ２．１、ＭｔＤｅｆ４、ＭｔＤｅｆ５、及びタバコＰＲ１ｂシグナルペプチドからなる群から選択することができる。単子葉植物シグナルペプチドは、システインエンドプロテイナーゼシグナルペプチド及びαアミラーゼシグナルペプチドからなる群から選択することができる。ＭｔＤｅｆ５シグナルペプチドは、配列番号３０〜３５のシグナルペプチド配列からなる群から選択することができる。
【０１７７】
ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドをコードする種々のＤＮＡ配列は、本発明のＤＮＡコンストラクトにおいて使用することができる。概して、配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４のうちのいずれか１つと少なくとも約８５％の配列同一性を有するＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドをコードする配列を使用することができる。ＤＮＡコンストラクトのコードされたＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチド配列には、成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質をコードする配列を含むが、これに限定しない。ＤＮＡコンストラクトのコードされたＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドにはまた、ＭｔＤｅｆ５シグナルペプチド及び成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質を含むＭｔＤｅｆ５プロタンパク質をコードする核酸配列を含む。ＭｔＤｅｆ５．１ａ−５．６プロタンパク質配列は配列番号１及び４〜９に示す。これらの配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するタンパク質、及びこれらの配列の生物学的機能的等価物は、本発明によって包含される。当該ＤＮＡコンストラクトによってコードされるＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドはしたがって、配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列を含むことができる。当該ＤＮＡコンストラクトによってコードされる成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質はまた、配列番号１６〜２２に示すアミノ酸配列を含むことができる。
【０１７８】
本発明のある実施形態において、単離したＤＮＡコンストラクトは、トランスジェニック植物へと導入する場合に、操作可能に連結した配列の発現を供給するプロモーター及びポリアデニル化配列を使用する。配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４のうちのいずれかと少なくとも約８５％同一であるＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドをコードする配列は、トランスジェニック植物における発現を供給するプロモーター及びポリアデニル化配列へ操作可能に連結される。植物における発現を供給するプロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、ストレス誘導性プロモーター、一時的プロモーター、及び真菌感染誘導性プロモーターからなる群から選択することができる。構成的プロモーターは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＦＭＶ３５Ｓプロモーター、トウモロコシユビキチンプロモーター、及びコメアクチンプロモーターからなる群から選択される。ポリアデニル化配列は、ＣａＭＶ３５Ｓ、ＮＯＳ、コメ乳酸脱水素酵素、及びコムギＨｓｐ１７ポリアデニル化配列からなる群から選択することができる。
【０１７９】
本発明の他の実施形態において、単離したＤＮＡコンストラクトはさらに、植物の核ゲノムへと導入する場合に、ならびにイントロン配列が当該プロモーター、シグナルペプチドをコードする配列、成熟ＭｔＤｅｆ５ポリペプチドをコードする配列、及びポリアデニル化配列へ操作可能に連結した場合に、操作可能に連結した配列の発現を供給する当該イントロン配列を含むことができる。このイントロン配列は、コメアクチンイントロン、トウモロコシｈｓｐ７０イントロン、トウモロコシ小サブユニットＲＵＢＩＳＣＯイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、トウモロコシＡｄｈ１イントロン、コメフェニルアラニンアンモニアリアーゼイントロン、スクロースシンターゼイントロン、ＣＡＴ−１イントロン、ｐＫＡＮＮＩＢＡＬイントロン、ＰＩＶ２イントロン及びスーパーユビキチンイントロンを含む群から選択することができる。
【０１８０】
植物における成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質の発現を供給するＤＮＡコンストラクトは、トウモロコシユビキチンプロモーター及びイントロンを含有するポリヌクレオチド、ＭｔＤｅｆ５シグナルペプチドよび成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質の両方をコードする合成ＭｔＤｅｆ５遺伝子、ならびにポリアデニル化シグナルを含むことができる。植物における成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質の発現を供給する別のＤＮＡコンストラクトは、ＦＭＶプロモーター、スーパーユビキチンイントロン、シグナルペプチド、イントロン、及び成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質をコードするゲノムＭｔＤｅｆ５配列、ならびにｔＮＯＳ終結因子を含むことができる。本発明によって包含されるＤＮＡコンストラクトには、ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドへ操作可能に連結した液胞標的化ペプチドまたは小胞体保有ペプチドをコードする配列をさらに含む植物におけるＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドの発現を供給するＤＮＡコンストラクトを含む。植物における成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質発現を供給するＤＮＡコンストラクトは、ＦＭＶプロモーター、スーパーユビキチンイントロン、シグナルペプチド、イントロン、及び液胞または小胞体標的化ペプチドへ操作可能に連結された成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質をコードするゲノムＭｔＤｅｆ５配列、ならびにｔＮＯＳ終結因子を含むことができる。
【０１８１】
本発明のＤＮＡコンストラクトはさらに、選択可能なマーカーをコードする配列を含むことができる。この選択可能なマーカーは典型的には、当該ＤＮＡコンストラクトを含有するトランスジェニック植物を選択するために使用する。当該選択可能なマーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼタンパク質、グリホサート抵抗性５−エノール−ピルビルシキマート−３−ホスファートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）タンパク質、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質、ジヒドロプテロアートシンターゼタンパク質、スルホニル尿素不応性アセト乳酸シンターゼタンパク質、アトラジン不応性Ｑタンパク質、ブロモキシニルを分解することのできるニトリラーゼタンパク質、ダラポンを分解することのできるデハロゲナーゼタンパク質、２，４−ジクロロ−フェノキシ酢酸モノオキシゲナーゼタンパク質、メトトレキサート不応性ジヒドロ葉酸還元酵素タンパク質、及びアミノエチルシステイン不応性オクトパインシンターゼタンパク質からなる群から選択することができる。
【０１８２】
本発明のＤＮＡコンストラクトはさらに、スコア化可能なマーカーをコードする配列を含むことができる。このスコア化可能なマーカーは典型的には、当該ＤＮＡコンストラクトを含有するトランスジェニック植物を識別するために使用する。スコア化可能なマーカーは、βグルクロニダーゼタンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、βガラクトしダーゼタンパク質、ｌｕｃ遺伝子由来のルシフェラーゼタンパク質、ｌｕｘ遺伝子由来のルシフェラーゼタンパク質、シアリダーゼタンパク質、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質、ノパリンシンターゼタンパク質、オクトパインシンターゼタンパク質、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼタンパク質からなる群から選択することができる。
【０１８３】
トランスジェニック植物におけるＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドを発現する上記のＤＮＡコンストラクトを含むこのような植物も本発明によって提供される。トランスジェニック植物は、食用作物植物または生物燃料作物植物、及び単子葉類または双子葉類のいずれかであることができる。本発明のトランスジェニック単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、アマ、エンバク、コメ、ライムギ、モロコシ、芝草、サトウキビ、及びコムギからなる群から選択することができる。本発明のトランスジェニック双子葉植物は、ムラサキウマゴヤシ、シロイヌナズナ、タルウマゴヤシ、バナナ、ブロッコリ、マメ、キャベツ、セイヨウアブラナ、ニンジン、カッサバ、カリフラワー、セロリ、柑橘類、ワタ、ウリ、ユーカリ、ニンニク、ブドウ、タマネギ、レタス、エンドウ、ピーナッツ、コショウ、ジャガイモ、ポプラ、マツ、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、イチゴ、テンサイ、サツマイモ、タバコ、及びトマトからなる群から選択することができる。
【０１８４】
本発明の他の実施形態において、前述のＤＮＡコンストラクトは、酵母細胞へ導入する場合に操作可能に連結された配列の発現を供給するプロモーター及びポリアデニル化配列を使用する。このプロモーターは、ＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＰＨＯプロモーター、ＭＯＸプロモーター、ＤＡＳプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、及びＬＡＣ４プロモーターからなる群から選択することができる。このポリアデニル化配列は、ＡＯＸ１、ＡＯＸ２、ＣＹＣ１、ｐ４０、ｐ７６、ＭＯＸ、ＬＡＣ４、及びアクチンポリアデニル化配列からなる群から選択することができる。当該ＤＮＡコンストラクトは、操作可能に連結したＡＯＸ１プロモーター、酵母α因子シグナル配列、成熟ＭｔＤｅｆ５デフェンシン配列、及びＡＯＸ１ポリアデニル化配列をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。あるいは、当該ＤＮＡコンストラクトは、操作可能に連結したＡＯＸ１プロモーター、酵母α因子シグナル配列、成熟ＭｔＤｅｆ５デフェンシン配列、及びＡＯＸ１ポリアデニル化配列をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。
【０１８５】
酵母における成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドの発現のためのＤＮＡコンストラクトはさらに、選択可能なまたはスコア化可能なマーカー遺伝子を含むことができる。選択可能なマーカー遺伝子は、ＡＤＥタンパク質、ＨＩＳ５タンパク質、ＨＩＳ４タンパク質、ＬＥＵ２タンパク質、ＵＲＡ３タンパク質、ＡＲＧ４タンパク質、ＴＲＰ１タンパク質、ＬＹＳ２タンパク質、ブレオマイシン抗生物質もしくはフレオマイシン抗生物質に対する抵抗性を与えるタンパク質、クロラムフェニコールに対する抵抗性を与えるタンパク質、Ｇ４１８もしくはゲネチシンに対する抵抗性を与えるタンパク質、ヒグロマイシンに対する抵抗性を与えるタンパク質、メトトレキサートに対する抵抗性を与えるタンパク質、ＡＲＯ４−ＯＦＰタンパク質、及びＦＺＦ１−４タンパク質をコードする遺伝子からなる群から選択することができる。
【０１８６】
スコア化可能なマーカー遺伝子は、βグルクロニダーゼタンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、βガラクトシダーゼタンパク質、ｌｕｃ遺伝子に由来するルシフェラーゼタンパク質、ｌｕｘ遺伝子に由来するルシフェラーゼタンパク質、シアリダーゼタンパク質、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質、ノパリンシンターゼタンパク質、オクトパインシンターゼタンパク質、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子からなる群から選択することができる。
【０１８７】
酵母におけるＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドをコードする操作可能に連結した配列の発現を供給するプロモーター及びポリアデニル化配列を含む上記のＤＮＡコンストラクトを含む酵母細胞も、本発明によって提供される。酵母細胞は、カンジダ、クルベロミセス、ハンスエラ、ピキア、サッカロミセス、分裂酵母、及びヤロウイアからなる群から選択することができる。
【０１８８】
本発明はさらに、植物病原性真菌の増殖を阻害することのできるトランスジェニック植物を得る方法を供給する。これらの方法は、植物、植物細胞、もしくは植物組織におけるＭｔＤｅｆ５タンパク質もしくはペプチドの発現を供給するＤＮＡコンストラクトを導入する工程、及び植物病原性真菌阻害量のＭｔＤｅｆ５タンパク質もしくはペプチドを発現するＤＮＡコンストラクトを含むトランスジェニック植物を得る工程を含む。本方法を実施するために、当該ＤＮＡコンストラクトは、例えば、パーティクルガン照射、ＤＮＡトランスフェクション、ＤＮＡ電気穿孔法、Ｔ−ＤＮＡ仲介性形質転換からなる群から選択される方法によって、当該植物へと導入することができる。
【０１８９】
本方法のある実施形態において使用するＤＮＡコンストラクトはさらに、選択可能なマーカー遺伝子を含むことができる。当該ＤＮＡコンストラクトがさらに、選択可能なマーカー遺伝子を含む場合、本発明のトランスジェニック植物は、植物の生育のための選択可能なマーカー遺伝子の発現を必要とする条件下で、植物、植物細胞、または植物組織を生育させることによって得る。この選択可能なマーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼタンパク質、グリホサート抵抗性５−エノール−ピルビルシキマート−３−ホスファートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）タンパク質、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質、ジヒドロプテロアートシンターゼタンパク質、スルホニル尿素不応性アセト乳酸シンターゼタンパク質、アトラジン不応性Ｑタンパク質、ブロモキシニルを分解することのできるニトリラーゼタンパク質、ダラポンを分解することのできるデハロゲナーゼタンパク質、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸モノオキシゲナーゼタンパク質、メトトレキサート不応性ジヒドロ葉酸還元酵素タンパク質、及びアミノエチルシステイン不応性オクトパインシンターゼタンパク質をコードする遺伝子からなる群から選択することができる。
【０１９０】
トランスジェニック植物を得るこれらの方法はまた、植物において機能するスコア化可能なマーカー遺伝子をさらに含むＤＮＡコンストラクトを採用することができる。この場合、スコア化可能なマーカー遺伝子の発現は、トランスジェニック植物細胞または再生したトランスジェニック植物を得るためにアッセイされる。スコア化可能なマーカー遺伝子は、βグルクロニダーゼタンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、βガラクトシダーゼタンパク質、ｌｕｃ遺伝子に由来するルシフェラーゼタンパク質、ｌｕｘ遺伝子に由来するルシフェラーゼタンパク質、シアリダーゼタンパク質、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質、ノパリンシンターゼタンパク質、オクトパインシンターゼタンパク質、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子からなる群から選択することができる。
【０１９１】
この方法において、植物病原性真菌阻害量の成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドを発現するトランスジェニック植物は、当該トランスジェニック植物におけるＭｔＤｅｆ５コード導入遺伝子の発現をアッセイすることによって得ることができる。ＭｔＤｅｆ５コード導入遺伝子の発現は、例えば、イムノアッセイ、酵素結合免疫測定法、ＲＮＡハイブリッド形成による検出を基にしたアッセイ、及び逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応による検出を基にしたアッセイからなる群から選択する方法によってアッセイすることができる。あるいは、ＭｔＤｅｆ５コード導入遺伝子の発現は、当該トランスジェニック植物を植物病原性真菌へ曝露して、植物病原性真菌の増殖が阻害されるかどうかを判定することによってアッセイする。成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質の植物病原性真菌阻害量は少なくとも約０．０５ＰＰＭ、約０．５ＰＰＭ、約１．０ＰＰＭ、または約２．０ＰＰＭであり、ここで、ＰＰＭとは、新鮮重量の植物組織中に存在するＭｔＤｅｆ５タンパク質の「百万分率」である。典型的には、μｇ量のＭｔＤｅｆ５タンパク質は、トランスジェニック植物組織の新鮮重量１ｇあたりに存在する。好ましい実施形態において、ＭｔＤｅｆ５タンパク質の植物病原性真菌阻害量は少なくとも約０．５ＰＰＭである。より好ましい実施形態において、ＭｔＤｅｆ５の植物病原性真菌阻害量は少なくとも約１．０ＰＰＭである。最も好ましい実施形態において、ＭｔＤｅｆ５の植物病原性真菌阻害量は少なくとも約２．０ＰＰＭである。
【０１９２】
本方法は、種々のＭｔＤｅｆ５分子に易罹患性の植物病原性真菌の増殖の阻害を供給する。本方法によって阻害される植物病原性真菌は、アルテルナリア属、アスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）属、アスペルギルス属、ボトリチス属、セルコスポラ属、コレトトリカム属、ディプロディア属、エリシフェ属、フザリウム属、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ）属、ヘルミントスポリウム属、マクロフォミナ属、ネクトリア属、ツユカビ属、ファコプソラ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ）属、フォーマ属、フィマトトリカム（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フィトフトラ属、プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）属、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）属、プクシニア属、ピシウム属、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）属、リゾクトニア属、スケロティウム（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ）属、スクレロティニア属、セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）属、シエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）属、ウンシヌラ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）属、ベンチュリア属、及びベルチシリウム属からなる群から選択することができる。
【０１９３】
本発明はまた、本明細書に説明する方法によって作出する、植物病原性真菌の増殖を阻害することのできるトランスジェニック植物を供給する。本発明のＤＮＡコンストラクトを植物、植物細胞、もしくは植物組織へ導入する工程、及び植物病原性真菌阻害量のＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチス（ｐｅｐｔｉｃｅ）を発現するＤＮＡコンストラクトを含むトランスジェニック植物を得る工程を含む過程によって作出されるトランスジェニック植物もしたがって本発明によって企図される。成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドの植物病原性真菌阻害量は、少なくとも約０．０５ＰＰＭ、０．５ＰＰＭ、１．０ＰＰＭ、または２．０ＰＰＭであり、ここでＰＰＭとは、新鮮重量植物組織中に存在するＭｔＤｅｆ５タンパク質の「百万分率」である。
【０１９４】
本発明はさらに、配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に示すアミノ酸配列と少なくとも約８５％の配列同一性を有するＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドを生成する方法を供給する。成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドを生成するための方法は、酵母細胞がＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドを発現する条件下で酵母におけるＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドの発現を供給するＤＮＡコンストラクトを含む酵母細胞を培養する工程、及び先行工程の培養物からＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドを単離する工程を含む。ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドは、細胞培地から第二の工程において単離することができる。あるいは、ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドは、酵母細胞から単離することができる。本方法のある実施形態において、ＭｔＤｅｆ５タンパク質は成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質である。本方法で使用する酵母細胞は、シグナルペプチドをコードする配列及び成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質をコードする配列へ操作可能に連結したＡＯＸ１プロモーターを含有するＤＮＡコンストラクトを含むピキア細胞であることができ、成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質の発現を供給する条件は、メタノールの存在下で当該ピキア細胞を培養することを含むであろう。
【０１９５】
本発明はまた、配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４のうちのいずれか１つと少なくとも約８５％の配列同一性を有するＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドを認識する抗体を供給する。配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４のうちのいずれか１つと少なくとも約８５％の配列同一性を有するＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドを認識する抗体ならびに当該抗体を検出するための試薬を含む、配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４のうちのいずれか１つと少なくとも約８５％の配列同一性を有するＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドを特異的に検出するためのキットも、本発明によって提供される。
【０１９６】
ある単離したヌクレオチド配列も本発明によって提供される。本発明の単離したヌクレオチド配列は、配列番号１０〜１５、２３〜２９、及び６５〜７８からなる群から選択されるＭｔＤｅｆ５コード配列ならびに配列番号３０〜３５及び４２〜４８からなる群から選択されるＭｔＤｅｆ５または他のシグナルペプチドコード配列を含む。先の配列に由来するオリゴヌクレオチドがさらに企図される。このようなオリゴヌクレオチドは、特筆されるヌクレオチド配列を含有するトランスジェニック植物を識別するために、またはこれらのトランスジェニック植物から得る材料を識別するために使用することができる。これらのオリゴヌクレオチドを使用してトランスジェニック植物材料を識別するための方法及びこれらの方法を実施するためのキットも企図される。
【０１９７】
配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４に種々に示すような種々の単離、精製したＭｔＤｅｆ５プロタンパク質、成熟物、及びペプチドの配列、ならびに上記のように配列番号１０〜１５、２３〜２９、及び６５〜７８にそれぞれ示すようなこれらについてのコード配列も本発明によって提供される。
【０１９８】
（植物発現カセットを含むＤＮＡコンストラクト）
単子葉植物または双子葉植物における使用のための発現カセットの構築は十分に確立されている。発現カセットは、種々のプロモーター配列、コード配列、及びポリアデニル化配列が操作可能に連結されたＤＮＡコンストラクトである。概して、発現カセットは典型的には、関心対象の配列へ操作可能に連結されたプロモーターを含み、これはポリアデニル化領域または転写終結因子領域へ操作可能に連結される。単子葉植物における導入遺伝子の発現を含むがこれに限定しないある場合において、イントロン配列を含むことも有用であることがある。イントロン配列が含まれる場合、当該イントロン配列は、典型的には当該導入遺伝子の５’非翻訳リーダー領域に位置する。ある場合において、転写産物の安定性を高めるために、または転写産物の効率的な翻訳を促進するために、導入遺伝子における特定の５’非翻訳配列を組み込むことも有用であることがある。
【０１９９】
（プロモーター）
種々のプロモーターは、本発明の実施において使用することができる。ある広範なクラスの有用なプロモーターは、植物の発生を通じてたいていの植物器官において活性がある点で「構成的」プロモーターと呼ばれる。例えば、当該プロモーターは、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターであることができる。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＦＭＶ３５Ｓプロモーターは、種々の形質転換した植物組織及びたいていの植物器官（例えば、カルス、葉、種子及び根）において活性がある。亢進した版または複製版のＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＦＭＶ３５Ｓプロモーターは、本発明の実施において特に有用である（その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３７８，６１９号）。他の有用なプロモーターには、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター及びオクトパインシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシエンスの腫瘍誘導性プラスミド上に保有される）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーター、トウモロコシユビキチンプロモーター、コメＡｃｔ１プロモーター、及びゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）３５Ｓプロモーターを含む（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，４６３，１７５号を参照されたい）。この群の例示的なプロモーターが非限定的であり、かつ当業者が本発明の実施において本明細書で明白に引用していない他のプロモーターを採用し得ることは理解される。
【０２００】
ある植物組織において活性のあるプロモーター（すなわち、組織特異的プロモーター）も、ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドの発現を駆動するために使用することができる。真菌病原体によって典型的に感染する組織におけるＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドの発現は、特に有用であると予想される。したがって、再生組織、種子、根、茎、または葉における発現は、ある作物におけるある真菌病原体による当該組織の感染を駆除する上で特に有用であることができる。有用な組織特異的な、発生上調節されるプロモーターの例としては、βコングリシニン７Ｓプロモーター（Ｄｏｙｌｅら，１９８６）、種子特異的プロモーター（Ｌａｍ及びＣｈｕａ，１９９１）、及びナピン、ファセオリン、ゼイン、ダイズトリプシン阻害薬、ＡＣＰ、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、またはオレオシンの遺伝子と関連するプロモーターが挙げられるが、これらに限定しない。根特異的プロモーターの例としては、それぞれ米国特許第５，４５９，２５２号及び第５，８３７，８７６号に説明されるＲＢ７プロモーター及びＲＤ２プロモーターが挙げられるが、これらに限定しない。
【０２０１】
別のクラスの有用なプロモーターは、種々の環境刺激によって誘導されるプロモーターである。環境刺激によって誘導されるプロモーターには、熱によって誘導されるプロモーター（例えば、Ｈｓｐ７０などの熱ショックプロモーター）、光によって誘導されるプロモーター（例えば、非常に豊富な植物ポリペプチドであるリブロース１，５−ビスホスファートカルボキシラーゼの小サブユニットｓｓＲＵＢＩＳＣＯ由来の光誘導性プロモーター）、寒冷によって誘導されるプロモーター（例えば、ＣＯＲプロモーター）、酸化ストレスによって誘導されるプロモーター（例えば、カタラーゼプロモーター）、渇水によって誘導されるプロモーター（例えば、コムギＥｍプロモーター及びコメｒａｂ１６Ａプロモーター）、及び複数の環境シグナルによって誘導されるプロモーター（例えば、ｒｄ２９Ａプロモーター、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プロモーター）を含むが、これらに限定しない。
【０２０２】
植物における真菌感染によって誘導されるプロモーターは、ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドの発現を駆動するために使用することもできる。真菌感染によって誘導される有用なプロモーターには、フェニルプロパノイド代謝に関与する遺伝子と関連するプロモーター（例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼプロモーター、カルコンシンターゼプロモーター）、植物細胞壁を修飾する遺伝子と関連するプロモーター（例えば、ヒドロキシプロリンの多量な糖タンパク質のプロモーター、グリシンの多量なタンパク質のプロモーター、及びペルオキシダーゼプロモーター）、真菌細胞壁を分解する酵素をコードする遺伝子と関連するプロモーター（例えば、キチナーゼプロモーターまたはグルカナーゼプロモーター）、タウマチン様タンパク質プロモーターをコードする遺伝子と関連するプロモーター、または真菌感染の際に有意な誘導を示す未知の機能のタンパク質をコードする遺伝子と関連するプロモーターを含む。Ｍｉｓ１及びＦｉｓ１としてそれぞれ指定されるトウモロコシプロモーター及びアマプロモーターも植物における真菌感染によって誘導され、使用することができる（米国特許出願第２００２０１１５８４９号）。
【０２０３】
防護が選択される真菌に応じて、本ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドは、真菌が攻撃する植物におけるいずれかの組織または器官において発現することができる。例えばフザリウムの場合、発現に好ましい部位は根にある。外部植物表面に入ることによって感染する真菌の場合、アポプラストにおけるＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドの蓄積が好ましく、これらの分子は、組織特異的プロモーターの使用によって、根、茎、葉などにおいて発現することができる。
【０２０４】
植物の生活環における特定の発達段階において活性のあるプロモーターも、最も必要とされる場合に真菌感染及び／または損傷に対する抵抗性を最適化するために使用することができる。
【０２０５】
（イントロン）
イントロンも、特に関心対象の配列が単子葉植物において発現することになっている場合、ＤＮＡ発現コンストラクトに含まれることができる。単子葉植物の使用のために、トウモロコシｈｓｐ７０イントロン（その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，４２４，４１２号）、トウモロコシユビキチンイントロン、Ａｄｈイントロン１（Ｃａｌｌｉｓら，１９８７）、スクロースシンターゼイントロン（Ｖａｓｉｌら，１９８９）またはコメＡｃｔ１イントロン（ＭｃＥｌｒｏｙら，１９９０）などのイントロンを使用することができる。有用な双子葉植物イントロンには、導入遺伝子へと操作可能に組み込まれたＣＡＴ−１イントロン（Ｃａｚｚｏｎｎｅｌｌｉ及びＶｅｌｔｅｎ，２００３）、ｐＫＡＮＮＩＢＡＬイントロン（Ｗｅｓｌｅｙら，２００１、Ｃｏｌｌｉｅｒら，２００５）、ＰＩＶ２イントロン（Ｍａｎｋｉｎら，１９９７）及び「スーパーユビキチン」イントロン（その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５９６，９２５号、Ｃｏｌｌｉｅｒ ら，２００５）などのイントロンを含む。この例示的なイントロンの群が非限定的であること、及び当業者は、本発明の実施において本明細書に明白に引用されていない他のイントロンを採用し得ることは理解される。
【０２０６】
本発明のある実施形態は、植物細胞からの成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドの分泌を促進するシグナルペプチドをコードする配列を含む。ＭｔＤｅｆ５．１ａ−５．６ｃＤＮＡ（配列番号１及び４〜９）の部分は、植物または他の細胞からＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドを分泌するのに使用することのできるＭｔＤｅｆ５シグナルペプチドをコードする配列（配列番号３０〜３５）を含有する。
【０２０７】
ＭｔＤｅｆ５シグナルペプチドをコードする配列は、種々の方法で本発明のＤＮＡコンストラクトにおいて使用することができる。これらのＭｔＤｅｆ５シグナル配列は、所与のＭｔＤｅｆ５ｃＤＮＡまたはゲノムクローンにおける所与のＭｔＤｅｆ５プロタンパク質コード配列と関連するＭｔＤｅｆ５シグナル配列であることができる。あるいは、ＭｔＤｅｆ５シグナルペプチドは、異なる成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質（またはＭｔＤｅｆ５ペプチド）コード配列に操作可能に連結することができる（すなわち、異なるゲノムクローンまたはｃＤＮＡクローンに由来するＭｔＤｅｆ５シグナルペプチド及び成熟タンパク質（またはペプチド）は操作可能に連結することができる）。ＤＮＡコンストラクトにおいて、ＭｔＤｅｆ５シグナルペプチド及び成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質の両方を含むいずれかのＭｔＤｅｆ５プロタンパク質をコードするヌクレオチド配列はまた、２つの異なるシグナルペプチドコード配列及び成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質コード配列の代わりに使用することができる。これらの配列によってコードされるＭｔＤｅｆ５プロタンパク質には、配列番号１及び４〜９を含むＭｔＤｅｆ５プロタンパク質配列、これらの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有するタンパク質、ならびにこれらの配列の生物学的機能的等価物を含むが、それらに限定しない。ＭｔＤｅｆ５シグナルペプチドが、単子葉植物細胞または双子葉植物細胞のいずれかから成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドを分泌するために使用することができることは予想される。ＭｔＤｅｆ５シグナルペプチド配列をコードする合成ヌクレオチド配列も使用することができる。このような合成配列は、遺伝暗号の適用を通じて本明細書に開示するＭｔＤｅｆ５シグナルペプチドから推定することができる。表１は、細胞から成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質または他のタンパク質を分泌するのに使用することのできるＭｔＤｅｆ５及び他のシグナルペプチドのリストを提供する。
【表１】
0006440687.tif 000002
【０２０８】
あるいは、他のウマゴヤシデフェンシンタンパク質に由来するシグナルペプチド配列（Ｈａｎｋｓら，２００５）を使用することができる。このような他のウマゴヤシデフェンシンタンパク質シグナルペプチドの例としては、ＭｔＤｅｆ１．１、ＭｓＤｅｆ１．６、及びＭｔＤｅｆ２．１のシグナルペプチドが挙げられるが、これらに限定しない。単子葉植物において使用することのできる有用なシグナルペプチドコード配列の別の例は、オオムギシステインエンドプロテイナーゼ遺伝子に由来するシグナルペプチドである（Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＨｏ，１９９０）。双子葉植物において使用することのできる有用なシグナルペプチドコード配列の別の例は、タバコＰＲ１ｂシグナルペプチドである。この群のシグナルペプチドは、例示的かつ非限定的であるよう意味しており、当業者は、本明細書で明白に引用していない、本発明の実施における他のシグナルペプチドを採用し得る。
【０２０９】
本発明において、成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドをコードする配列は典型的には、シグナルペプチドコード配列へ連結される。種々の成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドをコードする種々のＤＮＡ配列は、本発明を実施する上で使用することができる。当該ＤＮＡ配列は、配列番号１６〜２２及び４９〜６４に示すアミノ酸配列ならびに上記のアミノ酸配列のうちのいずれかの生物学的機能的等価物を含むがこれらに限定しない成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドをコードすることができる。ＭｔＤｅｆ５プロタンパク質、成熟タンパク質、またはペプチドの生物学的機能的等価物にはまた、配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４のうちのいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するＭｔＤｅｆ５プロタンパク質、成熟タンパク質、及びペプチドを含むが、これらに限定しない。本発明のある実施形態において、成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドをコードする配列は、タルウマゴヤシ植物組織から得るゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに物理的に由来することができ、または当該ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから得ることができる。タルウマゴヤシ由来の類似のデフェンシン遺伝子を得るためのこのような方法は説明されている（Ｈａｎｋｓら，２００５）。天然または内在性ＭｔＤｅｆ５コードヌクレオチド配列は、内在性ＭｔＤｅｆ５プロモーター配列の制御下で当該ＭｔＤｅｆ５コードヌクレオチド配列が通常発現する双子葉植物に由来する。結果的に、内在性または天然のＭｔＤｅｆ５コードヌクレオチド配列が植物において発現することができることが期待される。概して、ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドをコードする核酸は、ＭｔＤｅｆ５共通ヌクレオチド配列から、ＭｔＤｅｆ５ポリペプチド配列の「折り返し翻訳」によって由来する合成ＭｔＤｅｆ５遺伝子から、ゲノムクローンから、ゲノムクローンに由来する推定コード配列から、ｃＤＮＡ配列もしくはＥＳＴ配列から、及び突然変異誘発へ供した上記の配列のうちのいずれかから得ることができる。成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質コードヌクレオチド配列を含有する核酸の例としては、配列番号１０〜１５及び２３〜２９が挙げられるが、これらに限定しない。種々のＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドをコードするヌクレオチド配列はまた、推定イントロン配列を除去してＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドのための推定ＭｔＤｅｆ５コード配列を得ることによって、ゲノム配列から得ることができる。ＭｔＤｅｆ５ゲノムクローンからのイントロン配列の除去は、インビトロでの突然変異誘発技術によってもたらすことができる。あるいは、当該イントロン配列は、標準的なＤＮＡ合成技術によって合成されるインシリコの（コンピュータファイルにおける）及び結果として生じる推定コード配列が除去することができる。また、密接に関連する植物であるムラサキウマゴヤシが、本発明のＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドと同一であるかまたは他の点では生物学的に等価であるかのいずれかであるＭｓＤｅｆ４タンパク質をコードするＭｓＤｅｆ４ＥＳＴの供給源であってもよいことも特筆すべきである。本発明のＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドをコードするヌクレオチド配列はしたがって、ムラサキウマゴヤシなどの他のウマゴヤシ属に由来することもでき、本発明において使用することができる。成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドをコードする配列を含有する上記のヌクレオチド配列の部分は、通常連結される天然ＭｔＤｅｆ５シグナルペプチド配列へ、または標準的な組換えＤＮＡ技術を介してまたはＤＮＡ合成方法によって別のシグナルペプチドへのいずれかへ操作可能に連結することができる。
【０２１０】
本発明の他の実施形態において、ＭｔＤｅｆ５コードヌクレオチド配列は、本明細書に開示するＭｔＤｅｆ５タンパク質配列またはペプチド配列からデノボ合成することができる。ＭｔＤｅｆ５コードヌクレオチド配列の配列は、遺伝暗号の使用を通じてＭｔＤｅｆ５タンパク質配列またはペプチド配列から推定することができる。「ＢａｃｋＴｒａｎｓｌａｔｅ」（ＧＣＧ（商標）パッケージ、Ａｃｃｌｅｒｙｓ社，カリフォルニア州サンディエゴ市）などのコンピュータプログラムは、タンパク質配列またはペプチド配列を、当該タンパク質またはペプチドをコードする対応するヌクレオチド配列へ変換するために使用することができる。
【０２１１】
さらに、合成ＭｔＤｅｆ５コードヌクレオチド配列は、植物において最適に発現するよう設計することができる。米国特許第５，５００，３６５号は、合成した遺伝子によってコードされるタンパク質の発現水準を最適化するために植物遺伝子を合成するための方法を説明している。この方法は、外来性の導入遺伝子の構造的な遺伝子配列の修飾に関するものであり、当該配列をより「植物のよう」にし、それゆえ、当該植物によってより効率的に転写、加工、翻訳、及び発現させる。植物において十分発現する遺伝子の特徴には、当該植物宿主によって通常使用されるコドンの使用、及び遺伝子転写産物のコード領域における望ましくないイントロンのスプライシングまたはポリアデニル化を生じることのできる配列の除去を含む。単子葉植物における導入遺伝子の高い発現を得るための類似の方法は、米国特許第５，６８９，０５２号に開示されている。さらに、米国特許第５，５００，３６５号及び米国特許第５，６８９，０５２号において開示される合成設計方法はまた、概して植物におけるまたは特に単子葉植物における発現について最適化するシグナルペプチドコード配列を合成するために使用され得る。
【０２１２】
本発明の他の実施形態において、細胞内小器官におけるＭｔＤｅｆ５の局在性を供給するペプチドをコードする配列は、当該ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドをコードする配列へ操作可能に連結することができる。シグナルペプチドへ操作可能に連結するＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドは、分泌経路へ入ると期待され、小胞体（ＥＲ）などの小器官によって保有することができ、あるいは適切な保有を操作可能に連結すること、またはＭｔＤｅｆ５タンパク質もしくはペプチドのＣ末端に対してペプチドを標的化することによって液胞に対して標的化することができる。液胞標的化ペプチドの例としては、オオムギレクチン遺伝子由来のＣＴＰＰ液胞標的かシグナルが挙げられるがこれに限定しない。ＥＲ標的化ペプチドの例としては、ＫＤＥＬアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられるが、これに限定しない。
【０２１３】
小胞体または液胞のいずれかにおけるＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドの局在性は、トランスジェニック植物における高い発現及び／またはトランスジェニック植物における真菌増殖を阻害する上での高い効能などの所望の特性を供給することができる。
【０２１４】
上記のように、関心対象の配列はまた、ポリアデニル化シグナルを含有する３’非翻訳領域へ操作可能に連結することができる。このポリアデニル化シグナルは、当該ＲＮＡの３’末端へのポリアデニル酸配列の付加を供給する。アグロバクテリウム腫瘍誘導性（Ｔｉ）プラスミドノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子３’及びエンドウｓｓＲＵＢＩＳＣＯ  Ｅ９遺伝子３’非翻訳領域は、ポリアデニル酸シグナルを含有し、本発明の実施において使用することのできるこのような３’非翻訳領域の非限定例を表す。この例示的なポリアデニル化領域の群が非限定的であること、及び当業者が本発明の実施において本明細書に明白に引用されていない他のポリアデニル化領域を採用し得ることは理解される。
【０２１５】
先に説明した植物発現カセットを含むＤＮＡコンストラクトは典型的には、種々のベクターにおいて維持される。ベクターは、宿主細胞において当該ベクター及び共有結合した配列の複製を供給する配列を含有する。例えば、細菌ベクターは、１つ以上の細菌宿主における当該ベクターの複製を許容する複製起点を含有する。アグロバクテリウム仲介性植物形質転換ベクターは典型的には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びアグロバクテリウムの両方において複製を許容する配列、ならびに植物染色体への発現カセットの組み込みを許容するよう位置取られた１つ以上の「境界」配列を含む。このようなアグロバクテリウムベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネスのいずれかにおける使用に適応することができる。抗生物質に対する抵抗性を与える遺伝子をコードする選択可能なマーカーはまた典型的には、ベクター中に含まれて、細菌宿主における当該ベクターの維持を供給する。
【０２１６】
（抗真菌性植物を得るための方法）
植物病原性真菌の増殖を阻害することのできるトランスジェニック植物を得る方法も本発明によって提供される。まず、種々の双子葉植物及び単子葉植物におけるＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドの発現に適した発現ベクターは、植物、植物細胞、プロトプラスト、または植物組織へと、本明細書に説明するような形質転換技術を用いて導入される。次に、ＭｔＤｅｆ５発現ベクターを含有するまたは含むトランスジェニック植物は、当該発現ベクターを受容する植物、植物細胞、プロトプラスト、または植物組織からトランスジェニック植物を再生することによって得られる。最終工程は、植物病原性真菌阻害量の成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドを発現するトランスジェニック植物を得ることであり、ここで「植物病原性真菌阻害量」とは、当該トランスジェニック植物における真菌増殖のいずれかの測定可能な低下及び／または当該トランスジェニック植物における真菌増殖によって生じる有害効果のいずれかの測定可能な低下を提供するのに十分なＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドの水準である。
【０２１７】
ＭｔＤｅｆ５発現ベクターのうちのいずれかは、アグロバクテリウム仲介性形質転換、根粒菌仲介性形質転換、シノリゾビウム仲介性形質転換、粒子仲介性形質転換、ＤＮＡトランスフェクション、ＤＮＡ電気穿孔法、または「ウィスカ」仲介性形質転換などの方法を介して宿主植物の染色体へと導入することができる。導入遺伝子を導入する上記の方法は、当業者に周知であり、米国特許出願第２００５０２８９６７３号（トウモロコシのアグロバクテリウム仲介性形質転換）、米国特許第７，００２，０５８号（ダイズのアグロバクテリウム仲介性形質転換）、米国特許第６，３６５，８０７号（コメの粒子仲介性形質転換）、及び米国特許第５，００４，８６３号（ワタのアグロバクテリウム仲介性形質転換）において説明されており、これらの各々はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。根粒菌またはシノリゾビウムなどの細菌を用いて植物を形質転換する方法は、Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，１０；４３３（７０２６）：６２９〜６３３において説明されている。ＭｔＤｅｆ５発現ベクターが、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、Ｇｉｎ、Ｐｉｎ、Ｓｒｅ，ｐｉｎＤ、Ｉｎｔ−Ｂ１３、及びＲを含む部位特異的リコンビナーゼによって認識されるシス作用型部位特異的組換え部位を含むことができることはさらに理解される。次いで、部位特異的リコンビナーゼの使用を通じてトランスジェニック植物のゲノムにおける特異的な位置にＤＮＡ分子を組み込む方法を使用することができる（米国特許第７，１０２，０５５号）。当業者はさらに、これらの遺伝子転移技術のうちのいずれかを使用して、発現ベクターを植物細胞、プロトプラスト、植物組織、または植物の染色体へと導入することができることは認識している。
【０２１８】
トランスジェニック植物において組換えミニ染色体の維持を供給する植物セントロメアを含む植物ミニ染色体を導入する方法も、本発明を実施する上で使用することができる（米国特許第６，９７２，１９７号）。本発明のこれらの実施形態において、当該トランスジェニック植物は、宿主植物の染色体へと組み込まれていない染色体外要素としてミニ染色体を保有する。
【０２１９】
トランスジェニック植物は典型的には、選択可能なマーカー遺伝子へ関心対象の遺伝子（この場合はＭｔＤｅｆ５コードヌクレオチド配列）を連結すること、連結した導入遺伝子を植物細胞、原形質体、植物組織、または植物へと、上記の方法のうちのいずれか１つによって導入すること、及び植物の生育のために選択可能なマーカー遺伝子の発現を必要とする条件下でトランスジェニック植物を再生または別法で収穫することによって得られる。選択可能なマーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼタンパク質、グリホサート抵抗性５−エノール−ピルビルシキマート−３−ホスファートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）タンパク質、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質、ジヒドロプテロアートシンターゼタンパク質、スルホニル尿素不応性アセト酢酸シンターゼタンパク質、アトラジン不応性Ｑタンパク質、ブロモキシニルを分解することのできるニトリラーゼタンパク質、ダラポンを分解することのできるデハロゲナーゼタンパク質、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸モノキシゲナーゼタンパク質、メトトレキサート不応性ジヒドロ葉酸還元酵素タンパク質、またはアミノエチルシステイン不応性オクトパインシンターゼタンパク質をコードする遺伝子であることができる。各遺伝子とともに使用する対応する選択的薬剤は、ネオマイシン（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質選択用）、ホスフィノトリシン（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼタンパク質選択用）、グリホサート（グリホサート抵抗性５−エノール−ピルビルシキマート−３−ホスファートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）タンパク質選択用）、ヒグロマイシン（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質選択用）、スルファジアジン（ジヒドロプテロアートシンターゼタンパク質選択用）、クロルスルフロン（スルホニル尿素不応性アセト酢酸シンターゼタンパク質選択用）、アトラジン（アトラジン不応性Ｑタンパク質選択用）、ブロモキシニル（ニトリラーゼタンパク質選択用）、ダラポン（デハロゲナーゼタンパク質選択用）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸モノオキシゲナーゼタンパク質選択用）、メトトレキサート（メトトレキサート不応性ジヒドロ葉酸還元酵素タンパク質選択用）、またはアミノエチルシステイン（アミノエチルシステイン不応性オクトパインシンターゼタンパク質選択用）であることができる。
【０２２０】
トランスジェニック植物はまた、関心対象の遺伝子（この場合、ＭｔＤｅｆ５コードヌクレオチド配列）をスコア化可能なマーカー遺伝子へ連結すること、連結した導入遺伝子を植物細胞へと、上記の方法のうちのいずれか１つによって導入すること、及びスコア化可能なマーカー遺伝子の発現に対して陽性の検査結果である形質転換した植物細胞からトランスジェニック植物を再生することによって得ることができる。スコア化可能なマーカー遺伝子は、βグルクロニダーゼタンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、βガラクトシダーゼタンパク質、ｌｕｃ遺伝子に由来するルシフェラーゼタンパク質、ｌｕｘ遺伝子に由来するルシフェラーゼタンパク質、シアリダーゼタンパク質、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質、ノパリンシンターゼタンパク質、オクトパインシンターゼタンパク質、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子であることができる。
【０２２１】
発現ベクターが植物細胞または植物組織へと導入される場合、形質転換した細胞または組織は典型的には、植物全体の形成を促進する条件下で当該細胞または組織を培養することによって植物全体へと再生される（すなわち、葉、茎、根、及びある植物においては再生組織を再生する過程）。単一の植物プロトプラストまたは種々の外植片のいずれかからのトランスジェニック植物の発生または再生は、当該技術分野において周知である（Ｈｏｒｓｃｈ，Ｒ．Ｂ．ら，１９８５）。この再生及び生育過程は典型的には、形質転換した細胞の選択の工程、及び根の生えた小植物を生じる条件下で、選択した細胞を培養する工程を含む。結果として生じるトランスジェニック根つき苗条はその後、土壌などの適切な植物生育媒体中に植えられる。あるいは、導入遺伝子はまた、カルス期組織培養を通過することなく再生された分離した植物根分裂組織及び植物へと導入することもできる（米国特許第７，００２，０５８号）。導入遺伝子が植物へと、またはより具体的には植物の分裂組織へと直接導入される場合、種子は、当該植物から収穫されて、当該導入遺伝子の存在について選択またはスコア化することができる。性的に再生するトランスジェニック植物種の場合、種子は、「自己の」（自家受粉された）または異系交雑した（すなわち、花粉ドナーまたはレシピエントとして使用した）植物から収集して、トランスジェニック植物系統を確立及び維持することができる。性的に再生しないトランスジェニック植物は、植物性に繁殖して当該トランスジェニック植物系統を確立及び維持することができる。本明細書で使用する場合、「トランスジェニック植物系統」は、当該植物ゲノムにおける１つ以上の位置へと導入遺伝子が挿入された形質転換事象に由来するトランスジェニック植物を指す。関連する態様において、本発明はまた、先の過程に従って作出した、形質転換植物によって産生した種子、このような種子由来の子孫、及び本来のトランスジェニック植物の子孫によって産生した種子を包含する。このような子孫及び種子は、これらのゲノムへと安定して組み込まれたＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドをコードする導入遺伝子を有し、このような子孫植物は、メンデルの様式における安定した導入遺伝子の導入によって生じる形質を受け継ぐ。１つ以上のＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドをコードするトランスジェニックＤＮＡセグメントをゲノム中へ組み込んだこのようなトランスジェニック植物はすべて、本発明の態様である。本明細書に説明するＤＮＡコンストラクトを含有するトランスジェニック植物、及び当該植物に由来する材料がＰＣＲまたはＤＮＡコンストラクトにおける配列を特異的に検出することのできる他の方法の使用を通じて識別され得ることはさらに認識される。
【０２２２】
（トランスジェニック植物の識別及びＭｔＤｅｆ５発現の定量）
トランスジェニック植物が一旦再生または収穫されると、種々の方法を使用して、植物病原性真菌阻害量のＭｔＤｅｆ５を発現するトランスジェニック植物を識別または得ることができる。１つの一般的なセットの方法は、産生されたＭｔＤｅｆ５の量を測定するアッセイを実施することである。例えば、ＭｔＤｅｆ５を認識する抗体を採用する種々の抗体ベースの検出方法を使用して、産生されたＭｔＤｅｆ５の量を定量化することができる。このような抗体ベースのアッセイの例としては、ＭｔＤｅｆ５認識抗体が酵素、同位体、フルオロフォア、ランタニド、及びこれらに類するものを用いて検出可能に標識されたＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、または他の方法が挙げられるが、それらに限定しない。このようなアッセイにおける基準物質としての精製または単離したＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドを用いること（すなわち、既知の量のＭｔＤｅｆ５を提供すること）によって、植物材料１ｇあたりのモル量における、または植物材料１ｇあたりの質量における植物組織中に存在するＭｔＤｅｆ５の量を測定することができる。ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドは典型的には、「百万分率」または「ＰＰＭ」の水準でトランスジェニック植物中に発現し、ここでＭｔＤｅｆ５のマイクログラム水準は、新鮮重量の植物組織のグラム量で存在する。この場合、新鮮重量植物組織１グラムあたりのＭｔＤｅｆ５１マイクログラムは、１ＰＰＭのＭｔＤｅｆ５濃度を表す。ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドの植物病原性真菌阻害量は、少なくとも約０．０５ＰＰＭである（すなわち、新鮮重量植物組織１グラム当たり０．０５μｇのＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチド）。好ましい実施形態において、ＭｔＤｅｆ５の植物病原性真菌阻害量は少なくとも約０．５ＰＰＭである。より好ましい実施形態において、ＭｔＤｅｆ５の量は少なくとも約１．０ＰＰＭである。最も好ましい実施形態において、ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドの量は少なくとも約２．０ＰＰＭである。
【０２２３】
あるいは、トランスジェニック植物によって産生されるＭｔＤｅｆ５コードｍＲＮＡの量は、植物病原性真菌阻害量のＭｔＤｅｆ５を発現する植物を識別するために測定することができる。産生されるタンパク質の量を産生されるＲＮＡの量に対して関連付けるための技術は当業者に周知であり、特定のＲＮＡ水準（すなわち、ＭｔＤｅｆ５ｍＲＮＡ）を（免疫学的方法または他の方法によって測定される）ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドの水準に対して関連付ける標準曲線を作成することなどの方法を含む。ＭｔＤｅｆ５ｍＲＮＡを定量化する方法は典型的には、ＭｔＤｅｆ５ｍＲＮＡかまたはｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）もしくは、ＭｔＤｅｆ５ＲＮＡ由来のＰＣＲ産物かのいずれかのいずれかに対するポリヌクレオチドの特異的なハイブリッド形成を包含する。このようなポリヌクレオチドプローブは、ＭｔＤｅｆ５コード導入遺伝子のセンス鎖のヌクレオチド配列及び／またはアンチセンス鎖のヌクレオチド配列のいずれかに由来することができる。ＭｔＤｅｆ５ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡに対するポリヌクレオチドプローブのハイブリッド形成は、同位体、フルオロフォア、ランタニド、またはビオチンもしくはジゴキシゲニンなどのハプテンを用いて標識したプローブの使用を含むがこれに限定しない方法によって検出することができる。標識したプローブのハイブリッド形成は、ＭｔＤｅｆ５ＲＮＡが溶液中にある場合に、または膜などの固体支持体上で固定されている場合に検出することができる。定量的な逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の使用によってＭｔＤｅｆ５ＲＮＡを定量化する場合、ＭｔＤｅｆ５由来のＰＣＲ産物は、上記の標識したポリヌクレオチドプローブのうちのいずれかの使用によって、臭化エチジウムもしくはＳＹＢＲグリーンなどの挿入色素の使用、あるいはＰＣＲ反応（すなわち、ＴａｑＭａｎ（商標）反応、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスター市）において使用されるポリメラーゼ５’ヌクレアーゼ活性によってフルオロフォアが放出される場合、またはフルオロフォア及び消光剤が相補鎖のポリメラーゼ仲介生合成によって置換される場合（すなわち、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プローブまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ（商標）プローブ）にのみフルオロフォア由来の発光を検出するようにフルオロフォア及び消光剤を含有するハイブリッド形成プローブの使用によって検出することができる。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を実施してｍＲＮＡ水準を定量化するための種々の方法は、十分に特徴づけられている（Ｂｕｓｔｉｎ，Ｓ．Ａ，２００２）。ミスマッチ核酸複合体（すなわち、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）、Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ウィスコンシン州マジソン市）を認識する酵素の作用によって活性化される蛍光プローブも、ＲＮＡを定量化するために使用することができる。当業者は、定量的核酸配列ベースの増幅（Ｑ−ＮＡＳＢＡ（商標））などのＲＮＡ定量技術を使用してＭｔＤｅｆ５コードｍＲＮＡを定量して発現する植物を識別することができることも理解している。
【０２２４】
植物病原性真菌阻害量のＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドを発現するトランスジェニック植物は、植物病原性真菌の増殖の阻害についてこのような植物を直接アッセイすることによっても識別することができる。このようなアッセイは、抵抗性トランスジェニック植物を識別するために独立してまたはＭｔＤｅｆ５発現アッセイと併用してのいずれかで使用することができる。ある植物病原体真菌によるある植物の感染は、容易に観察される植物生育に対する異なる効果を結果的に生じることができる。結果的に、ＭｔＤｅｆ５コード導入遺伝子を用いて形質転換したこのような植物に病原性植物真菌を単純に負荷して、このような感染と通常関連する症状の低下を観察することによって、ＭｔＤｅｆ５発現トランスジェニック植物を識別することができる。このような観察は、ＭｔＤｅｆ５コード導入遺伝子を含有するトランスジェニック植物を感染させるのに使用する植物病原体真菌の同じ種類及び同じ用量を用いて、ＭｔＤｅｆ５コード導入遺伝子を含有しておらずその他は同一である非トランスジェニック対照植物を同時感染させることによって容易になる。真菌感染を防除または駆除するトランスジェニック植物の識別は、感染した植物における低い疾患症状の観察、低い真菌増殖を基に（例えば、感染した組織１ｇあたりのコロニー形成単位数を計数することによって）、及び／または感染した植物組織中に存在するマイコトキシンの量の測定によってであることができる。ベルチシリウム・ダーリアエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ）に対して抵抗性のあるトランスジェニックＭｓＤｅｆ１発現ジャガイモ植物を識別するための発現アッセイとの真菌の疾患重症度アッセイ及びコロニー形成アッセイの併用は説明されている（米国特許第６，９１６，９７０号及びＧａｏら，２０００）。真菌病原体を駆除または防除する種々のＭｔＤｅｆ５発現トランスジェニック植物は、当該植物を感染させる真菌病原体に対する抵抗性についてトランスジェニック植物をスコア化することによって識別することができることが同様に期待される。疾患症状の低下または真菌増殖の低下を観察することによってアッセイすることのできるＭｔＤｅｆ５導入遺伝子付与性真菌抵抗性の例としては、フザリウム・ベルチシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）、ステノカルペラ・マイディス（Ｓｔｅｎｏｃａｒｐｅｌｌａ  ｍａｙｄｉｓ）及び／もしくはセルコスポラゼアエ・マイディス（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ−ｍａｙｄｉｓ）に対するトランスジェニックトウモロコシの抵抗性、胴枯れ病（フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ））、うどんこ病（エリシフェ・グラミニス  ｆ．属トリチシ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｆ．  ｓｐ．  ｔｒｉｔｉｃｉ））、もしくは葉さび病（プクシニア・レコンジタ  ｆ．属トリチシ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｒｅｃｏｎｄｉｔａ  ｆ．  ｓｐ．  ｔｒｉｔｉｃｉ））に対するトランスジェニックコムギの抵抗性、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）に対するトランスジェニックワ��の抵抗性、イネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）及び紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）に対するトランスジェニックコメの抵抗性、ならびにアジアダイズさび病（ファコプソラ・パキリジ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）)、フィトフトラ性根腐病（フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）属)、白カビ（スクレロティニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）属）、急死症候群（フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ））及び／もしくはダイズ落葉病（フィアロフォラ・グレガタ（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｔａ））に対するトランスジェニックダイズの抵抗性が挙げられるが、これらに限定しない。
【０２２５】
植物病原性真菌阻害量のＭｔＤｅｆ５を発現するトランスジェニック植物は、このような植物における真菌増殖による有害効果作用の原因の低下を測定することによって識別することもできる。このような低下は、ＭｔＤｅｆ５を発現しないその他は同一である非トランスジェニック対照植物に対するＭｔＤｅｆ５発現トランスジェニック植物における有害作用の程度を比較することによって確認することができる。測定することのできる植物中の真菌増殖の有害効果には、いずれかの種類の植物組織の損傷もしくは壊死、いずれかの種類の植物収量低下、作物植物製品の価値のいずれかの低下、及び／またはマイコトキシンを含むがこれに限定しない望ましくない真菌代謝産物もしくは真菌増殖副産物の産生を含む。マイコトキシンは、ポリケチド（アフラトキシン、デメチルステリグマトシスチン、Ｏ−メチルステリグマトシスチンなどを含む）、フモニシン、アルペリシン（例えば、Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２）、スフィンゴフンギン（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）、トリコテセン、フミフンギン、及びこれらに類するものを含むがそれらに限定しない、真菌種によって産生されるいくつかの毒性分子を含む。マイコトキシン水準を定量化する方法は広く文書化されている。その上、アフラトキシン、フモニシン、デオキシニバレノール、及びゼアラレノンなどのマイコトキシンの測定のための市販のキットも利用可能である（ＶＩＣＡＭ、米国マサチューセッツ州ウォータータウン市）。
【０２２６】
（標的植物／関心対象の植物）
広範な種々の植物は、真菌感染を駆除もしくは防除するトランスジェニック植物、またはこのような感染に抵抗するトランスジェニック植物を得るために、ＭｔＤｅｆ５発現ベクターを用いて形質転換することができる。関心対象の植物には、先に列挙したように、食用作物植物及び生物燃料またはエネルギー作物植物の両方を含む。本明細書に説明する発現ベクター及び方法によって得ることのできるトランスジェニック単子葉植物には、オオムギ、トウモロコシ、アマ、エンバク、コメ、ライムギ、モロコシ、芝草、サトウキビ、及びコムギを含むが、これらに限定しない。本明細書に説明する発現ベクター及び方法によって得ることのできるトランスジェニック双子葉植物には、ムラサキウマゴヤシ、シロイヌナズナ、タルウマゴヤシ、バナナ、ブロッコリ、マメ、キャベツ、セイヨウアブラナ、ニンジン、カッサバ、カリフラワー、セロリ、柑橘類、ワタ、ウリ、ユーカリ、ニンニク、ブドウ、タマネギ、レタス、エンドウ、ピーナッツ、コショウ、ジャガイモ、ポプラ、マツ、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、イチゴ、テンサイ、サツマイモ、タバコ、及びトマトを含むが、これらに限定しない。
【０２２７】
（集合した遺伝子：複合的抵抗性）
植物における複数の抗真菌性タンパク質及び／または他の抗病原体タンパク質の同時の共発現は、植物病原体の防除の１つを超える様式を活用するという点で有利である。このことは、２つ以上の抗真菌性タンパク質が発現する場合、抵抗性真菌種を生じる可能性を最小限にし、抵抗の範囲を広げ、及び相乗的な抗真菌性効果を潜在的に結果として生じ、それにより抵抗性の水準を高め得る。
【０２２８】
本発明のＭｔＤｅｆ５分子をコードするＤＮＡと共発現することができるというある利点を与える他のタンパク質には、（１）グルコースオキシダーゼ（グルコースからグルコン酸へと転換し、植物病原体に対する広範な範囲の抵抗性を与える過酸化水素を同時に産生する）、ピルビン酸酸化酵素、シュウ酸酸化酵素、コレステロール酸化酵素、アミノ酸酸化酵素、及び過酸化水素を含む過酸化物を生じるために第一級基質もしくは第二級基質として分子状酸素を使用する他の酸化酵素などの酵素をコードするＤＮＡ、（２）ＳＡＲ８．２ａ及びＳＡＲ８．２ｂタンパク質などの発病関連タンパク質、タバコＰＲ−１ａ、ＰＲ−ｌｂ、ＰＲ−ｌｃ、ＰＲ−１’、ＰＲ−２、ＰＲ−３、ＰＲ−４、ＰＲ−５、ＰＲ−Ｎ、ＰＲ−Ｏ、ＰＲ−Ｏ’、ＰＲ−Ｐ、ＰＲ−Ｑ、ＰＲ−Ｓ、及びＰＲ−Ｒタンパク質の酸性形態及び塩基性形態、タバコ塩基性キチナーゼ及びキュウリキチナーゼ／リゾチームなどのキチナーゼ、キュウリ塩基性ペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、タバコ塩基性グルカナーゼなどのグルカナーゼ、オスモチン様タンパク質、（３）植物ウイルスのウイルスカプシドタンパク質及びレプリカーゼ、（４）シロイヌナズナＲＰＳ２（Ｂｅｎｔら，１９９４）、シロイヌナズナＲＰＭ１（Ｇｒａｎｔら，１９９５）、タバコＮ遺伝子及びＮ’遺伝子、トマトＣｆ−９、アマニＬ６、及びコメＸａ２１を含むがこれらに限定しない植物Ｒ遺伝子（抵抗性遺伝子）及びその類似体、（５）病原体誘導性または化学誘導性プロモーターを使用して発現可能な、クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）Ａｖｒ９などの病原体Ａｖｒ遺伝子（６）安息香酸２−ヒドロキシラーゼなどのサリチル酸の生合成に関与する遺伝子、ならびに（７）ＭｓＤｅｆ１、ＭｔＤｅｆ２、ＮａＤ１、Ｒｓ−ＡＦＰ１及びＲｓ−ＡＦＰ２を含むがこれらに限定しないＭｔＤｅｆ５の作用様式とは異なる抗真菌性作用様式を有する他のデフェンシンタンパク質を含む。本ＭｔＤｅｆ５デフェンシンを有するトランスジェニック植物において共発現して真菌病原体感染に対する抵抗性を与えることのできる他の抗真菌性タンパク質には、ＫＰ４及びＫＰ６タンパク質を含む。
【０２２９】
ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドを発現するトランスジェニック植物における昆虫及び除草剤抵抗性遺伝子の共発現は、さらに農業上の利点さえ与える。このようなトランスジェニック植物のゲノムはそれゆえ、以下を含む。
【０２３０】
例えば、ＭｓＤｅｆ１、ＭｔＤｅｆ２、ＭｔＤｅｆ４、ＮａＤ１、Ｒｓ−ＡＦＰ１、Ｒｓ−ＡＦＰ２、ＫＰ４、及びＫＰ６からなる群から選択される植物デフェンシンをコードするＤＮＡであって、このようなＤＮＡは発現して抗真菌性として有効量のデフェンシンを及び生成し、ならびに／または
【０２３１】
バチルス・チューリンゲンシス内毒素をコードするＤＮＡであって、このようなＤＮＡは、発現して抗昆虫性として有効量のバチルス・チューリンゲンシス内毒素を及び生成し、ならびに／または
【０２３２】
このような植物へ除草剤抵抗性を与えるタンパク質をコードするＤＮＡであって、このようなＤＮＡは、発現して除草剤抵抗性を与える抗除草剤として有効量のタンパク質を及び生成する。
【０２３３】
（酵母発現ベクター及び形質転換系）
酵母におけるＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドの発現は、本明細書で具体的に企図される。種々の酵母属における異種性タンパク質の産生のための発現ベクターの構築は十分に確立されている。一般に、このような発現ベクターは典型的には、ポリアデニル化領域または終結因子領域へ操作可能に連結された関心対象の配列へ操作可能に連結されたプロモーターを含む。異種性遺伝子を上手く発現するのに使用されてきた酵母属の例としては、カンジダ、クルベロミセス、ハンスエラ、ピキア、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、及びヤロウイアが挙げられる。サッカロミセスのための発現ベクター及び形質転換系に関する一般的な説明は、Ｋｉｎｇｓｍａｎら（１９８５）において見られる。サッカロミセス以外の酵母に有用な発現ベクター及び形質転換系はＲｅｉｓｅｒら（１９９０）において説明される。
【０２３４】
一般に、前述のプロモーター及びポリアデニル化領域は、所望の酵母宿主における当該領域の操作可能性を基に選択される。例えば、ピキアのＡＯＸ１またはＡＯＸ２プロモーターは、ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドなどの異種性タンパク質を発現するためのピキアのＡＯＸ１、ＡＯＸ２、ｐ４０、またはｐ７６ポリアデニル化配列とともに使用することができる。ＡＯＸ１及びＡＯＸ２の両プロモーターは、増殖培地へのメタノールの添加によって誘導する場合に連結した異種性遺伝子の豊富な発現を供給するので、ピキアにおいて特に有用である。これらのピキアプロモーター及びポリアデニル化配列の使用は、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許第４，８５５，２３１号において説明される。
【０２３５】
同様に、ハンスエラＭＯＸ、ＤＨＡＳ、またはＦＭＤＨプロモーターは、ハンスエラにおけるＭｔＤｅｆ５などの異種性タンパク質を発現するために使用することができる。ＭＯＸ、ＤＨＡＳ、またはＦＭＤＨプロモーターは、増殖培地へのメタノールの添加によって誘導する場合に、連結した異種性遺伝子の豊富な発現を供給するので、ハンスエアにおいて特に有用である。ハンスエラにおけるＭＯＸ及びＤＨＡＳプロモーターの使用は、米国特許第５，７４１，６７２号において説明されるのに対し、ハンスエラにおけるＦＭＤＨプロモーターの使用は、米国特許第５，３８９，５２５号において説明され、これらの各々はその全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０２３６】
クルベロミセスについては、ラクターゼプロモーター及びポリアデニル化配列は、ＭｔＤｅｆ５などの異種性遺伝子を発現するために使用することができる。ラクターゼプロモーター及びポリアデニル化配列へ操作可能に連結した異種性遺伝子の発現は、ガラクトースの存在下でクルベロミセスを増殖させることによって達成される。クルベロミセスにおけるラクトースプロモーター及びポリアデニル化配列の使用は、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許第６，６０２，６８２号において説明される。
【０２３７】
形質転換した酵母によって増殖培地中へとＭｔＤｅｆ５などの異種性タンパク質の分泌を供給する酵母発現ベクターも企図される。成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドの分泌は典型的には、成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドをコードする配列へのシグナルペプチド配列またはシグナルペプチド及びプロペプチド配列の操作可能な連結によって達成される。酵母における異種性タンパク質の分泌に有用なシグナルペプチドの例としては、α因子シグナルペプチド、インベルターゼシグナルペプチド、ＰＨＯ１シグナルペプチドが挙げられるがこれらに限定せず、これらはすべて酵母に由来する。α因子シグナルペプチドは典型的には、サッカロミセス、クルベロミセス、またはカンジダに由来するのに対し、ＰＨＯ１シグナルペプチドはピキアに由来する。
【０２３８】
タンパク質の分泌に特に有用なシグナルペプチド配列またはシグナルペプチド及びプロペプチド配列は、サッカロミセス・セレビシアエα因子に由来し、米国特許第４，５４６，０８２号、第４，５８８，６８４号、第４，８７０，００８号、及び第５，６０２，０３４号において説明される。サッカロミセス・セレビシアエα因子シグナルペプチド及びプロペプチドの配列は、サッカロミセス・セレビシアエα接合因子遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１１４９）の主要な、プロセシングを受けていない翻訳産物のアミノ酸１〜８３からなる。ある実施形態において、α接合因子プロタンパク質のアミノ酸１〜約１９ないし２３を含むα接合因子のシグナルペプチド配列は、成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質のＮ末端へ直接連結して、成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質の分泌を供給することができる。この場合、シグナルペプチドは、分泌過程の経過において成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質から切断される。あるいは、α接合因子のシグナルペプチド及びプロペプチドは、スペーサー配列を介して成熟ＭｔＤｅｆ５コード配列へ操作可能に連結することができる。このスペーサー配列は、リーダー配列及び関心対象の遺伝子のタンパク質分解性プロセシングを供給する種々の配列を含むことができる。天然のサッカロミセス・セレビシアエα接合因子遺伝子において、スペーサー配列はアミノ酸残基８４〜８９に対応し、配列Ｌｙｓ８４−Ａｒｇ８５−Ｇｌｕ８６−Ａｌａ８７−Ｇｌｕ８８−Ａｌａ８９によって表される。配列Ｌｙｓ−ＡｒｇはＫＥＸ２プロテアーゼ認識部位に対応するのに対し、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ配列は、複製されたジペプチジルアミノペプチダーゼまたはＳＴＥ１３認識部位に対応する。ある実施形態において、８９個のアミノ酸のサッカロミセス・セレビシアエα因子シグナル、プロペプチドコード領域及び全体の天然スペーサーコード領域（すなわち、残基８４及び８５でＬｙｓ−Ａｒｇ  ＫＥＸ２プロテアーゼの両切断部位を含有しかつＧｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａジペプチジルペプチダーゼまたは残基８６〜８９でＳＴＥ１３認識部位を含有するα接合因子前駆体タンパク質のＮ末端の８９個のアミノ酸残基）をコードするＤＮＡ断片は、成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質をコードする配列へ操作可能に連結される。α接合因子前駆体タンパク質のＮ末端の８９個のアミノ酸がＭｔＤｅｆ５などの異種性タンパク質のＮ末端へ融合する場合、プロペプチド配列は典型的には、ＫＥＸ２またはＳＴＥ１３のいずれかの認識部位で内在性酵母プロテアーゼによる開裂を介して異種性タンパク質から解離する。他の実施形態において、より小さな８５個のアミノ酸のサッカロミセス・セレビシアエα因子シグナルペプチド、プロペプチド、及びＫＥＸ２スペーサー配列（すなわち、残基８４及び８５におけるちょうどＬｙｓ−Ａｒｇ  ＫＥＸ２プロテアーゼ切断部位を含有するα接合因子前駆体タンパク質のＮ末端の８５個のアミノ酸残基）をコードするＤＮＡ断片は、成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質をコードする配列へ操作可能に連結される。α接合因子前駆体タンパク質のＮ末端の８５個のアミノ酸がＭｔＤｅｆ５などの異種性タンパク質のＮ末端へ融合する場合、プロペプチド配列は典型的には、ＫＥＸ２認識部位における内在性酵母プロテアーゼによる切断を介して異種性タンパク質から解離する。したがって、ＭｔＤｅｆ５タンパク質は、ｇｌｕ−ａｌａ反復なしで発現することができる。
【０２３９】
ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドを発現する形質転換した酵母を得るために、酵母ＭｔＤｅｆ５発現カセット（例えば、酵母プロモーター、酵母シグナルペプチドコード配列、成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質配列、及びポリアデニル化配列）は典型的には、形質転換した酵母の分泌を供給する他の配列と組み合わされる。有用な選択可能なマーカー遺伝子の例としては、ＡＤＥタンパク質、ＨＩＳ５タンパク質、ＨＩＳ４タンパク質、ＬＥＵ２タンパク質、ＵＲＡ３タンパク質、ＡＲＧ４タンパク質、ＴＲＰ１タンパク質、ＬＹＳ２タンパク質、ブレオマイシンもしくはフレオマイシン抗生物質に対する抵抗性を与えるタンパク質、クロラムフェニコールに対する抵抗性を与えるタンパク質、Ｇ４１８もしくはジェネテシンに対する抵抗性を与えるタンパク質、ヒグロマイシンに対する抵抗性を与えるタンパク質、メトトレキサート及びに対する抵抗性を与えるタンパク質、ＡＲＯ４−ＯＦＰタンパク質、及びＦＺＦ１〜４タンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定しない。
【０２４０】
酵母ＭｔＤｅｆ５発現カセット及び選択可能なマーカー遺伝子を含むＤＮＡ分子は、酵母スフェロプラストへのトランスフェクションまたは電気穿孔法などの技術によって酵母細胞へと導入される。本発明のある実施形態において、酵母ＭｔＤｅｆ５発現カセット及び選択可能なマーカー遺伝子を含むＤＮＡ分子は、形質転換した酵母宿主細胞のゲノムへと組み込まれた直鎖状ＤＮＡ断片として導入される。組込みは、酵母宿主細胞ゲノムにおける無作為な部位でのまたは酵母宿主細胞ゲノムの特定部位でのいずれかで生じ得る。相同組換えは典型的には、酵母宿主細胞ゲノムにおける発現ベクター及び配列中に含有される配列間の相同組換えによって達成される。相同な配列内で（例えば、ピキア宿主細胞における内在性ＡＯＸ１へ発現ベクターを組み込む場合には、ピキア発現ベクターのＡＯＸ１プロモーター配列内で）発現ベクターを線形化することによって達成される。本発明の他の実施形態において、酵母発現カセットは染色体外（組み込まれていない）配列として発現カセットを含有するＤＮＡの複製を供給する自己複製配列（ＡＲＳ）などの追加の配列も含むことができる。このような染色体外配列は典型的には、連結された選択可能なマーカー遺伝子の存在についての持続的な選択によって酵母細胞において維持される。複製及び有糸伝達を供給する配列を含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）は、酵母宿主におけるＤＮＡコンストラクトを維持するのに使用することができる別の種類のベクターである。
【０２４１】
（酵母におけるＭｔＤｅｆ５タンパク質を生成する方法）
酵母ＭｔＤｅｆ５発現カセットを用いて形質転換した酵母細胞を使用して、ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドを生成することができる。これらのＭｔＤｅｆ５分子は、植物へ適用できる抗真菌性組成物を製造するために抗真菌薬として、ＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドを認識する抗体を生じるための免疫原として、あるいは種々の試料におけるＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドの濃度を測定するためのキットにおける標準品として、直接使用することができる。ＭｔＤｅｆ５抗真菌性分子を発現する形質転換した酵母細胞はまた、病原性真菌感染を駆除／防除するために植物へ適用することができる。ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドを産生する方法は典型的には、まず酵母細胞が成熟ＭｔＤｅｆ５分子を発現する条件下でＭｔＤｅｆ５発現カセットを用いて形質転換した酵母細胞を培養する工程を含む。一般に、酵母細胞が成熟ＭｔＤｅｆ５分子を発現する条件とは、酵母発現カセットにおけるＭｔＤｅｆ５コード配列へ操作可能に連結した酵母プロモーターの発現を許容するまたは特異的に誘導する条件である。当該酵母がピキアでありかつシグナルペプチド／ＭｔＤｅｆ５遺伝子がＡＯＸ１またはＡＯＸ２プロモーターの制御下にある場合、増殖培地へのメタノールの添加は、成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質の発現を供給する。同様に、当該酵母がハンスエラでありかつシグナルペプチド／ＭｔＤｅｆ５遺伝子がＭＯＸ、ＤＨＡＳ、またはＦＭＤＨプロモーターの制御下にある場合、増殖培地へのメタノールの添加は、成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質の発現を供給する。あるいは、当該酵母がクルベロミセスでありかつシグナルペプチド／ＭｔＤｅｆ５遺伝子がラクターゼプロモーターの制御下にある場合、増殖培地へのガラクトースの添加は、成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質の発現を供給する。
【０２４２】
一旦、形質転換した酵母培養物が、十分な時間成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質の発現を供給する培養条件下でインキュベートしたら、成熟ＭｔＤｅｆ５分子は培養物から単離されることができる。十分な時間は、培養物の一部または一定分量を周期的に収集してＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドの存在についてアッセイすることによって判断することができる。タンパク質染色、ウェスタンブロット分析、またはいずれかの免疫検出方法（例えば、ＥＬＩＳＡなど）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の分析用アッセイを使用して、ＭｔＤｅｆ５産生をモニターすることができる。例えば、１〜８日間のメタノールの存在下でのインキュベーションは、ピキアにおけるＡＯＸ１プロモーターからの成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質の発現を供給するのに十分である。
【０２４３】
培養物からのＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドの単離は、部分的または完全であることができる。酵母シグナルペプチドが成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質をコードする配列へ操作可能に連結されたＭｔＤｅｆ５発現ベクターについては、成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質は、酵母細胞培地から回収することができる。
【０２４４】
成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質を含有する酵母細胞培地は、遠心分離または濾過によって酵母細胞から分離することができ、したがって、成熟ＭｔＤｅｆタンパク質の単離をもたらすことができる。成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質を含有する酵母細胞培地は、透析及び／または濃縮技術（例えば、沈降、凍結乾燥、濾過）のうちのいずれかの組み合わせによってさらに加工して、ＭｔＤｅｆ５タンパク質を含有する組成物を製造することができる。ＭｔＤｅｆ５タンパク質の生成はまた、ＭｔＤｅｆ５タンパク質の部分的に純粋または完全に純粋ないずれかの調製を結果的に生じる追加の精製工程を含むことができる。このような精製をもたらすために、濾過用のサイズ排除膜を使用することができる。あるいは、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、またはアフィニティクロマトグラフィーなどの種々の種類のクロマトグラフィー技術を使用して、ＭｔＤｅｆ５タンパク質の部分的または完全に純粋な調製物を生成することができる。
【０２４５】
種々の単離技術の組み合わせを採用して、成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質を生成することもできる。例えば、細胞培地は、遠心分離によって細胞から分離して透析または調整することができる。透析または調整に好ましい緩衝液は、ｐＨ約４．５〜６．０の２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液である。この透析液を次に、イオン交換クロマトグラフィーへ供する。例えば、ｐＨ約６．０の２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で平衡化したＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５などの陽イオン交換樹脂を使用することができる。陽イオン交換樹脂へ結合したＭｔＤｅｆ５タンパク質を洗浄した後、溶出する。例えば、上記のカラムをｐＨ約６．０の２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄した後、ｐＨ７．６の１ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス中で溶出する。デフェンシンタンパク質を含有する画分をアッセイによってまたは紫外光吸光度によって識別した後、サイズカットオフ濾過膜によって濃縮する。次に、濃縮したＭｔＤｅｆ５タンパク質を透析して、所望の緩衝液中に本質的に純粋なＭｔＤｅｆ５タンパク質を得る。所望の緩衝液には、ｐＨ７．６の１０ｍＭトリスなどの緩衝液を含むが、これに限定しない。
【０２４６】
（ＭｔＤｅｆ５配列における保存的アミノ酸変化を含有するペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質）
ＭｔＤｅｆ５プロタンパク質、成熟タンパク質、及びペプチドと生物学的に機能的に等価のペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質には、本明細書に開示するＭｔＤｅｆ５配列の配列番号１、３〜９、１６〜２２、及び４９〜６４における保存的アミノ酸置換を含有するアミノ酸配列を含むが、これに限定しない。このようなアミノ酸配列において、配列中の１つ以上のアミノ酸は、別のアミノ酸（類）で置換され、その帯電性及び極性は、天然のアミノ酸のものと類似しており、すなわち、保存的アミノ酸置換は結果的にサイレント変化を生じる。
【０２４７】
ＭｔＤｅｆ５配列内でのアミノ酸についての置換は、天然のアミノ酸が属するクラスの他の構成要素から選択することができる。アミノ酸は、次の４つの群、すなわち、（１）酸性アミノ酸、（２）塩基性アミノ酸、（３）中性極性アミノ酸、及び（４）中性非極性アミノ酸へと分けることができる。これらの種々の群内の代表的なアミノ酸には、（１）アスパラギン酸及びグルタミン酸などの酸性（負に帯電した）アミノ酸、（２）アルギニン、ヒスチジン、及びリジンなどの塩基性（正に帯電した）アミノ酸、（３）グリシン、セリン、トレオニン、システイン、シスチン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンなどの中性極性アミノ酸、（４）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンなどの中性非極性（疎水性）アミノ酸を含むが、これらに限定しない。
【０２４８】
ＭｔＤｅｆ５配列内での保存的アミノ酸変化は、これらの群のうちの１つ内の１つのアミノ酸を同じ群内の別のアミノ酸と置換することによって行うことができる。ＭｔＤｅｆ５の生物学的な機能的等価物は、１０個以下の保存的アミノ酸変化を、より好ましくは７個以下の保存的アミノ酸変化を、最も好ましくは５、４、３、２、または１個の保存的アミノ酸変化を有することができる。コードするヌクレオチド配列（例えば、遺伝子、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）はしたがって、対応する塩基置換を有し、当該配列に、ＭｔＤｅｆ５分子（ｍｏｅｌｃｕｌｅ）の生物学的に機能的等価の形態をコードさせる。
【０２４９】
本明細書で企図する生物学的に機能的等価のペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は、関心対象の特定のＭｔＤｅｆ５タンパク質もしくはペプチドの配列の配列とまたは当該配列内の対応する部分と約７０％以上の配列同一性、好ましくは約８５％以上の配列同一性、より好ましくは約９０％〜約９５％の配列同一性、例えば、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、もしくは約９５％の配列同一性、さらにより好ましくは約９６％、９７％、もしくは９８％を超える配列同一性、または約９９％の配列同一性を有するべきである。このような生物学的に機能的等価のペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は好ましくは、本明細書に開示する抗真菌活性アッセイ法のうちのいずれかによって測定される、本明細書に開示する対応するＭｔＤｅｆ５分子の抗真菌活性の約±３０％またはさらには約＋３０％超の抗真菌活性を呈する。
【０２５０】
このような生物学的に機能的等価のペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質についてのコード配列は、当該コード配列が、生物学的に機能的等価の抗真菌性ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質をコードすることができるのに十分な、またはこのようなコード配列のコドンの最適化された版が植物におけるその発現を最適化することができるのに十分な、配列番号１０〜１５、２３〜２９、及び６５〜７８に示すヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列との配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むべきである。
【０２５１】
（配列同一性を判定するための方法）
比較のための配列の整列の方法は、当該技術分野で周知である。比較のための配列の最適な整列は、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）の類似性方法についての検索によって、以下のアルゴリズム：カリフォルニア州マウンテンビュー市ＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓによるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ、ならびにカリフォルニア州サンディエゴ市Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製のＧＣＧ．ＲＴＭ．Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（商標）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡを含むがこれらに限定しないアルゴリズムの計算機による実施によって行うことができる。
【０２５２】
遺伝子の同一性は、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（非冗長的ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳物、３次元構造Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに由来する配列、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬ、及びＤＤＢＪデータベースの最新の主要な発表をすべて含む）において含有される配列との類似性についての既定パラメータの下でのＢＬＡＳＴ（塩基局所整列検索ツール、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０、ＮＣＢＩ（米国国立バイオテクノロジー情報センター、米国国立医学図書館、郵便番号２０８９４  メリーランド州ベセスダ地区ロックビルパイク８６００）から入手可能な情報も参照されたい）検索を行うことによって判定することができる。ＢＬＡＳＴＮプログラムを使用して「ｎｒ」データベースに含有されるすべての公的に入手可能なＤＮＡ配列との類似性についてｃＤＮＡ配列を分析する。ＤＮＡ配列は、すべてのリーディングフレームにおいて翻訳され、ＮＣＢＩによって提供されるＢＬＡＳＴＸプログラム（Ｇｉｓｈ，Ｗ．及びＳｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６〜２７２（１９９３））を用いて「ｎｒ」データベースに含有されるすべての公的に入手可能なタンパク質配列との類似性について比較される。いくつかの場合、ＤＮＡの重複セグメントを含有する２つ以上のクローン由来の配列決定データを用いて、隣接するＤＮＡ配列を構築する。
【０２５３】
配列整列及び％同一性計算は、Ａｃｃｅｌｒｙｓ社、カリフォルニア州サンディエゴ市製のＧＣＧ．ＲＴＭ．Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（商標）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＰｉｌｅＵｐまたはＰｒｅｔｔｙなどのソフトウェアを使用して実行することができる。ＧＡＰ及びＢｅｓｔＦｉｔを用いたポリヌクレオチド配列の対での整列のための既定パラメータは、ギャップ創出罰則＝５０、ギャップ伸長罰則＝３であり、ｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐはスコア化マトリックスである。ＧＡＰ及びＢｅｓｔＦｉｔを用いたポリペプチド配列についての対での整列についての既定パラメータは、ギャップ創出罰則＝８、ギャップ伸長罰則＝２であり、ＢＬＯＳＵＭ６２はスコア化マトリックスである。ポリヌクレオチド整列またはポリペプチド整列の末端にあるギャップについての罰則はない。
【０２５４】
ＰｉｌｅＵｐ及びＰｒｅｔｔｙを用いたポリヌクレオチド配列比較についての既定パラメータは、ギャップ創出罰則＝５、ギャップ伸長罰則＝１である。ＰｉｌｅＵｐまたはＰｒｅｔｔｙを用いたポリペプチド配列比較についての既定パラメータは、ギャップ創出罰則＝８、ギャップ伸長罰則＝２であり、ＢＬＯＳＵＭ６２はスコア化マトリックスである。
【０２５５】
配列整列はまた、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算一式（ＤＮＡＳＴＡＲ社、ウィスコンシン州マジソン市）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて達成することができる。当該配列の複数の整列は、既定パラメータ（ギャップ罰則＝１０、ギャップ長罰則＝１０）による整列のＣｌｕｓｔａｌ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１〜１５３）を用いて実施することができる。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いての対での整列のための既定パラメータは、ＫＴＵＰＬＥ１、ギャップ罰則＝３、ウィンドウ＝５及び保存される距線＝５である。
【０２５６】
他の対での比較ツールも利用可能であり、当業者に公知である。
【０２５７】
示すように、修飾及び変化は、本発明のＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドの構造、ならびに当該タンパク質及びペプチドをコードするＤＮＡセグメントにおいてなすことができ、また、所望の抗真菌性特徴をもつペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする機能的分子を得る。以下は、等価のまたはさらには改善された第二世代分子を創出するためのタンパク質のアミノ酸を変化することを基にした考察である。本発明の特定の実施形態において、突然変異したＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドは、当該タンパク質またはペプチドの分子の抗真菌活性を高めかつ植物細胞における組換え導入遺伝子の抗真菌活性及び／または発現を結果的に高めるのに有用であるよう企図されている。アミノ酸変化は、表２に与えるコドンによって、ＤＮＡ配列のコドンを変化させることによって達成することができる。
【表２】
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【０２５８】
例えば、あるアミノ酸は、生化学的または生物学的活性の明らかな喪失なしでタンパク質構造における他のアミノ酸と置換することができる。タンパク質の生物学的機能活性を規定するのは当該タンパク質の相互作用能及び性質であるので、あるアミノ酸配列の置換は、タンパク質配列、及びもちろんその潜在的なＤＮＡコード配列においてなすことができ、それにもかかわらず、類似の特性を持つタンパク質を得ることができる。したがって、種々の変化は、本発明のＭｔＤｅｆ５タンパク質配列、または当該タンパク質配列の生物学的有用性または活性の明らかな喪失なく、当該タンパク質配列をコードする対応するＤＮＡ配列においてなすことができる。
【０２５９】
Ｂｅｔｔｓ及びＲｕｓｓｅｌｌ（（２００３），「アミノ酸特性及び置換の結果（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）」，遺伝学者のためのバイオインフォマティクス（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｓｔｓ），Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒ．Ｂａｒｎｅｓ及びＩａｎ  Ｃ．Ｇｒａｙ編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社，第１４章，２８９〜３１６頁）は、特定のアミノ酸変化がタンパク質の構造及び機能に対する作用を予測及び解釈するのを支援する目的で、種々の異なるタンパク質の関連で、突然変異の性質及びアミノ酸の特性を総説している。著者らは、アミノ酸突然変異を考慮することに関連するタンパク質の特徴には、細胞の環境、３次元構造、及び進化、ならびに進化上の、化学的、及び構造的原理に基づいたアミノ酸の分類、ならびに異なる脈絡におけるタンパク質の構造及び機能における異なるクラスのアミノ酸についての役割を含むことを指摘している。著者らは、共通の物理化学的特性、大きさ、水に対する親和性（極性及び非極性、陰性または陽性の帯電）、芳香性及び脂肪性、水素結合能、領域を鋭く曲げようとする性質などを包含する、当該総説の図１４．３に示すものなどのカテゴリーへのアミノ酸の分類は、単純な分類依存すると誤解が生じる可能性があることを明らかにし、代替的なアミノ酸が、各位置におけるタンパク質へと操作され得ることを示唆している。特定の突然変異がタンパク質の構造及び機能にどのように影響し得るかを解釈するための基準は、この総説の第１４．７段落において要約されており、まずタンパク質についての照会、次に企図する特定のアミノ酸置換のついての照会を含んでいる。
【０２６０】
アミノ酸変化をなすうえでの出発地点として、アミノ酸の疎水性親水性指標指数は考慮することができる。タンパク質に対する相互作用性生物学的機能を与える上での疎水性親水性指標アミノ酸指数の重要性は概して、当該技術分野で理解されている（参照により本明細書に組み込まれているＫｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性指標特徴が、結果として生じるタンパク質の２次構造に寄与し、それが次に、当該タンパク質と他の分子、例えば酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原、及びこれらに類するものとの相互作用を規定することは許容される。
【０２６１】
各アミノ酸は、その疎水性及び帯電性の特徴を基に、疎水性親水性指標指数を割り当てられている（Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。これらとは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、及びアルギニン（−４．５）である。
【０２６２】
あるアミノ酸が、類似の疎水性親水性指標指数もしくはスコアを有する他のアミノ酸によって置換することができ、なおも類似の生物学的活性を有するタンパク質を結果的に生じ、すなわち、なおも生物学的な機能的等価のタンパク質を得ることができることは、当該技術分野で公知である。このような変化をなすうえで、疎水性親水性指標指数が＋２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、＋１以内であるアミノ酸置換は特に好ましく、＋０．５以内のアミノ酸置換はさらにより特に好ましい。
【０２６３】
類似のアミノ酸の置換が親水性を基に効果的になすことができることも当該技術分野で公知である。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号は、タンパク質の隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるように、タンパク質の最大局所平均親水性が、当該タンパク質の生物学的特性と相関することを述べている。
【０２６４】
米国特許第４，５５４，１０１号において詳述されるように、以下の親水性値は、アミノ酸残基へ割り当てられている。すなわち、アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０．＋０．１）、グルタミン酸（＋３．０．＋０．１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５．＋０．１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）である。
【０２６５】
（ＭｔＤｅｆ５配列における非保存的置換）
ＭｔＤｅｆ５配列における非保存的置換が、本明細書に開示するＭｔＤｅｆ５分子の機能的な生物学的等価物であるＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドを得るためになすことができることはさらに認識されている。これらの場合において、非保存的置換は、所与のＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドの機能的な生物学的等価物を供給する非保存的置換を識別するための真菌増殖の阻害に対する当該比保存的置換の作用について単純に検査されることができる。
【０２６６】
（ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドの断片及びバリアント）
本発明の抗真菌性デフェンシンには、ＭｔＤｅｆ５プロタンパク質、成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質、及びＭｔＤｅｆ５ペプチドを含む。これらのＭｔＤｅｆ５分子のものと比較して同じ、類似の、またはさらにより大きな抗真菌活性を有するこれらの配列の断片及びバリアントも、本発明によって包含される。したがって、抗真菌活性を呈する成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質における少なくとも８個以上のアミノ酸の連続した配列は、本発明によって包含される。本発明によって包含される抗真菌活性を有するＭｔＤｅｆ５分子の断片またはバリアントはまた、ＭｔＤｅｆ５配列におけるアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含むことができる。
【０２６７】
１つ以上のアミノ酸がＮ末端、Ｃ末端、当該タンパク質の中間、もしくはこれらの組み合わせから欠失している、先端を切断した形態であることができる、かつ抗真菌活性を有している成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質の断片も、本発明によって包含される。これらの断片は、ＭｔＤｅｆ５分子の天然または合成の突然変異体であることができ、現に開示している抗真菌活性アッセイ法のうちのいずれかによって測定される、本明細書に開示する対応するＭｔＤｅｆ５タンパク質またはペプチドの抗真菌活性の好ましくは約±３０％、またはさらに約＋３０％超の、ＭｔＤｅｆ５の抗真菌活性を保有している。
【０２６８】
ＭｔＤｅｆ５タンパク質のバリアントには、１つ以上のアミノ酸が天然配列へと挿入された形態を含む。これらのバリアントはまた、ＭｔＤｅｆ５の天然もしくは合成の突然変異であることができ、現に開示している抗真菌活性アッセイ法のうちのいずれかによって測定される、本明細書に開示する対応するＭｔＤｅｆ５タンパク質の抗真菌活性の約±３０％、または約＋３０％超の抗真菌活性を保有すべきである。
【０２６９】
上記の組み合わせ、すなわちアミノ酸の欠失及び付加の両方を含有する抗真菌性ＭｔＤｅｆ５デフェンシンの形態も、本発明によって包含される。アミノ酸置換はまた、当該デフェンシンの形態に存在することもできる。
【０２７０】
本発明によって包含されるＭｔＤｅｆ５タンパク質の断片及びバリアントは好ましくは、ＭｔＤｅｆ５配列の、または当該配列内の対応する部分との約７０〜７５％以上の配列同一性、好ましくは約８５％以上の配列同一性、より好ましくは約９０％〜９５％の配列同一性、及びさらにより好ましくは約９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するべきである。このような生物学的に機能的等価のペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は好ましくは、現に開示している抗真菌活性アッセイ法のうちのいずれかによって測定される、本明細書に開示する対応するＭｔＤｅｆ５分子の抗真菌活性の約±３０％、またはさらには約＋３０％超の抗真菌活性を呈する。
【０２７１】
（ＭｔＤｅｆ５バリアントを設計するためのＭｔＤｅｆ５デフェンシンの構造機能関連性の使用）
ＭｔＤｅｆ５タンパク質は、デフェンシン遺伝子ファミリーのメンバーであり、したがって、デフェンシンによって共有されるある構造的及び生化学的特性を有すると予測される。特に、ＭｔＤｅｆ５タンパク質は、デフェンシンタンパク質において典型的に観察される３つの逆平行β鎖及び１つのαへリックスから構成される、システインで安定化するα／βモチーフを有すると予測される（Ａｌｍｅｉｄａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００２）３１５，７４９〜７５７、Ｔｈｏｍｍａら，Ｐｌａｎｔａ（２００２）２１６：１９３〜２０２）。理論によって制限されることなく、ＭｔＤｅｆ５と他のデフェンシンの間の構造的相同性を使用して、類似のまたはさらに増大した抗真菌活性を有するバリアントを識別することができる。
【０２７２】
あるいは、ＭｔＤｅｆ５デフェンシンの保存された構造特徴を使用して、他の所望の特性を有するバリアントＭｔＤｅｆ５デフェンシン誘導体を操作することもできる。例えば、デフェンシンタンパク質におけるジスルフィド結合を典型的に形成するＭｔＤｅｆ５の８個の正準のシステイン残基は典型的には、いずれかのＭｔＤｅｆ５バリアントにおいて保存または維持されるであろう。ＭｔＤｅｆ５におけるジスルフィド結合の予測される対形成は、システイン残基３と５０の間、１４と３５の間、２０と４４の間、及び２４と４６の間である。したがって、Ｃｙｓ対１は、Ｃｙｓ３−Ｃｙｓ５０はジスルフィド結合によって形成されると予測され、Ｃｙｓ対２はＣｙｓ１４−Ｃｙｓ３５ジスルフィド結合によって形成されると予測され、Ｃｙｓ対３は、Ｃｙｓ２０−Ｃｙｓ４４ジスルフィド結合によって形成されると予測され、及びＣｙｓ対４は、Ｃｙｓ２４−Ｃｙｓ４６ジスルフィド結合によって形成されると予測される。理論によって制限されることはないが、１つ以上のジスルフィド結合を欠失するＭｔＤｅｆ５システインバリアントが、トランスジェニック植物製品を消費する動物またはヒトによってより容易に消化されると予測されるので、このようなバリアントが動物の餌としてまたはヒトの消費のための食物として最終的に使用されるトランスジェニック植物における使用のために所望され得ると考えられている。動物またはヒトの消化管におけるより短い半減期を有するＭｔＤｅｆ５バリアントタンパク質は理論上、当該タンパク質の抗真菌活性を保有しながらも食物アレルゲンとなる可能性が低いと期待されている。したがって、より少数のジスルフィド結合を有しかつ抗真菌活性をなおも保有するＭｔＤｅｆ５デフェンシン誘導体を設計することが所望であろう。
【０２７３】
（ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドの他の生物学的に機能的等価の形態）
本発明において有用なＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドの他の生理学的に機能的等価の形態には、これらの分子または上記のようなその生物学的な機能的等価物と、対応するＭｔＤｅｆ５分子の抗真菌活性と比較して同じ、類似の、またはより大きな抗真菌活性を呈する融合産物を形成する他のペプチド、ポリペプチド、または他のタンパク質との共役体を含む。
【０２７４】
集合した遺伝子の考察において上述したように、植物における複数の抗真菌性及び／または他の抗病原体タンパク質の同時の共発現は、植物病原体の防除の１つを超える様式を利用する点で有利である。このことは、２つ以上の抗真菌性タンパク質が発現する場合、抵抗性真菌種を生じる可能性を最小限にし得、抵抗性の範囲を広げ得、及び相乗的な抗真菌性作用を潜在的に結果的に生じ得、それにより抵抗性の水準を高め得る。
【０２７５】
（部位特異的突然変異誘発）
部位特異的突然変異誘発とは、個々のペプチド、または生物学的に機能的等価のペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質の分子をコードするＤＮＡの特異的変異誘発を通じての、当該分子の調製において有用な技術である。当該技術はさらに、例えば、当該ＤＮＡへと１つ以上のヌクレオチド配列変化を導入することによって、前述の考慮のうちの１つ以上を組み込む、配列バリアントを調製及び検査する即戦力を提供する。部位特異的突然変異誘発は、十分な大きさ及び配列複雑性のプライマー配列を提供して、横断する欠失接合部の両側に安定した二本鎖を形成するための、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードする特異的なオリゴヌクレオチド配列及び十分な数の隣接するヌクレオチドの使用を通じての突然変異体の生成を許容する。典型的には、変更する配列の接合部の両側に約５〜１０残基を有する、長さ約１７〜２５ヌクレオチドのプライマーが好ましい。
【０２７６】
一般に、部位特異的突然変異誘発の技術は、種々の公開物によって具現化されているように、当該技術分野で周知である。認識されているように、当該技術は典型的には、一本鎖及び二本鎖の両形態で存在するファージベクターを採用する。特定部位の突然変異誘発において有用な典型的なベクターには、Ｍ１３ファージなどのベクターがある。これらのファージベクターは容易に商業的に入手でき、当該ファージベクターの使用は概して、当業者に周知である。二本鎖プラスミドも、プラスミドからファージへと関心対象の遺伝子を転移させる工程を排除する特定部位の突然変異誘発において日常的に採用される。突然変異誘発を実施するための市販のキットも利用可能であり、使用することができる。例示的なキットには、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）特定部位の突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国カリフォルニア州ラホヤ地区）を含む。
【０２７７】
一般に、本明細書に従った特定部位の突然変異誘発はまず、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列を一本鎖ベクターまたは二本鎖ベクターの配列内に含む当該一本鎖ベクターを得ること、または当該二本鎖ベクターの２つの鎖が離れて溶融することによって実施される。所望の突然変異した配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは概して合成で調製される。次に、このプライマーは、一本鎖ベクターとアニールされて、突然変異保有鎖の合成を完了させるために大腸菌ポリメラーゼＩクレノー断片などのＤＮＡ重合酵素へ供される。したがって、ヘテロ二本鎖が形成され、この中で、一方の鎖は元の変異していない配列をコードし、かつ第二の鎖は所望の突然変異を保有する。次に、このヘテロ二本鎖ベクターを使用して、大腸菌細胞などの適切な細胞を形質転換し、突然変異した配列配置を保有する組換えベクターを含むクローンが選択される。
【０２７８】
特定部位の突然変異誘発を用いる、選択したペプチドコードＤＮＡセグメントの配列バリアントの調製は、潜在的に有用な種を生成する手段として提供されており、ペプチド及び当該ペプチドをコードするＤＮＡ配列の配列バリアントを得ることができる他の方法があるので、制限しているよう意図するものではない。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターは、ヒドロキシルアミンなどの突然変異誘発剤を用いて処理して、配列バリアントを得ることができる。
【０２７９】
（ＭｔＤｅｆ５抗体組成物及び抗体を作製する方法）
特定の実施形態において、本発明者らは、本明細書に開示するＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドへ結合するモノクローナルもしくはポリクローナルのいずれかの抗体の使用を企図する。抗体を調製及び特徴づけするための手段は、当該技術分野で周知である（例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれる抗体の使用：実験室マニュアル（Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９９９、及び米国特許第４，１９６，２６５号を参照されたい）。
【０２８０】
（ＭｔＤｅｆ５タンパク質スクリーニング及び検出キット）
本発明は、ＭｔＤｅｆ５タンパク質もしくはペプチド、またはＭｔＤｅｆ５関連のペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、またはこのような分子を産生する細胞を含有すると思われる試料をスクリーニングするための免疫検出方法及びキットを企図する。キットは、本発明の１つ以上の抗体を含有することができ、試料と本発明の抗体の間の相互作用を検出するための試薬（類）を含有することもできる。提供される試薬（類）は、放射性標識、蛍光標識または酵素標識することができる。当該キットは、本発明の核酸または抗体と結合または相互作用することができる公知の放射性標識薬を含有することができる。免疫複合体形成の検出は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、イムノブロット（例えば、ドットブロット）、間接的免疫蛍光技術、及びこれらに類するものの適用を介して達成することができる。
【０２８１】
（ＭｔＤｅｆ５農業的及び医薬的抗真菌性組成物）
本発明は、抗真菌性植物、または抗真菌性ヒトもしくは獣医学的病原性真菌阻害量（「抗真菌性有効量」）の１つ以上の本発明の単離、精製した抗真菌性ＭｔＤｅｆ５タンパク質もしくはペプチド、またはこれらの生物学的な機能的等価物のいずれかを含む農業的及び医薬的抗真菌性組成物を包含する。このような組成物は、本明細書に開示するＭｔＤｅｆ５タンパク質もしくはペプチドのうちの１つもしくはいずれかの組み合わせ、及び農業としてもしくは医薬として／獣医学として許容され得る担体、希釈剤、もしくは賦形剤を含むことができる。以下に示すように、農業的及び治療的脈絡において関連する他の成分は、このような組成物中に同様に含むことができる。当該抗真菌性組成物は、植物、またはヒトもしくは動物の真菌感染と関連したＭｔＤｅｆ５タンパク質もしくはペプチドに対して感受性のある病原性真菌類の増殖を阻害しまたは当該病原性真菌類を殺滅するために使用することができる。このような抗真菌性組成物は、局所投与のために製剤化することができ、植物、植物環境（土壌を含む）、またはヒトもしくは動物のいずれかへ局所的に適用することができる。
【０２８２】
（ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドを含む農業用組成物、ならびにタンパク質及びペプチドを産生する微生物）
本ＭｔＤｅｆ５分子単独のうちのまたはいずれかの組み合わせにおけるいずれかを含む農業用組成物は、例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ−Ｋｕｃｈｌｅｒ（１９８６）化学技術（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），第４版，第７巻，Ｈａｎｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ社，ミュンヘン、ｖａｎ  Ｆａｌｋｅｎｂｅｒｇ（１９７２〜１９７３）殺虫薬製剤（Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ），第２版，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社，ニューヨーク、ならびにＫ．Ｍａｒｔｅｎｓ（１９７９）スプレー乾燥ハンドブック（Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ），第３版，Ｇ．Ｇｏｏｄｗｉｎ社，ロンドンにおいて説明されるように製剤化することができる。担体、不活性材料、界面活性剤、溶媒、及び他の添加物などの必要な製剤助剤も当該技術分野で周知であり、例えば、Ｗａｔｋｉｎｓ，殺虫剤粉末希釈剤及び担体のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ  Ｄｕｓｔ  Ｄｉｌｕｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ），第２版，Ｄａｒｌａｎｄ  Ｂｏｏｋｓ社，ニュージャージー州カールドウェル自治地区、ならびにＷｉｎｎａｃｋｅｒ−Ｋｕｃｈｌｅｒ（１９８６）化学技術（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），第４版，第７巻，Ｈａｎｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ社，ミュンヘンにおいて説明されている。これらの製剤を用いて、最終製剤またはタンク混合物の形態における、本ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドと、他の殺虫剤として活性のある物質、及び／または増殖調節剤などとの混合物を調製することも可能である。
【０２８３】
単独であろうと他の活性剤との組み合わせにおいてであろうと、本抗真菌性ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドは、約０．１μｇｍｌ〜約１００ｍｇｍｌの範囲における濃度、好ましくは約５μｇｍｌと約５ｍｇｍｌの間の濃度で、約３．０〜約９．０の範囲におけるｐＨで適用することができる。このような組成物は、例えば、約１ｍＭと１Ｍの間、好ましくは約１０ｍＭと１００ｍＭの間、より好ましくは約１５ｍＭと５０ｍＭの間のリン酸緩衝液を用いて緩衝することができる。低い緩衝液濃度の場合、約１ｍＭ〜約１Ｍ、より好ましくは約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲でイオン強度を高めるための塩、好ましくはＮａＣｌを添加することが望ましい。
【０２８４】
本ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドを組み合わせることのできる幾多の従来の真菌抗生物質及び化学的殺真菌薬は当該技術分野で公知であり、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ及びＷａｌｋｅｒ（１９８３）殺虫剤マニュアル（Ｔｈｅ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｍａｎｕａｌ），第７版，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌにおいて説明されている（ｄｅｓｃｎｂｅｄ）。これらには例えば、ポリオキシン、ニッコーマイシン、カルボキシアミド、芳香族炭水化物、カルボキシン、モルフォリン、ステロール生合成の阻害薬、及び有機リン化合物を含む。本抗真菌性タンパク質及びペプチドと組み合わせて製剤化することのできる他の有効成分には、例えば、殺虫剤、誘引剤、滅菌化剤、殺ダニ剤（ａｃａｎｃｉｄｅｓ）、殺線虫剤、及び除草剤を含む。米国特許第５，４２１，８３９号は、本抗真菌性ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドなどの物質を製剤化することができる多くの活性薬の包括的な要約を含有している。
【０２８５】
ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドならびにこれらの生物学的な機能的等価物は、植物における広範な種々の易罹患性真菌を防除する上で有用であると期待されており、以下の属及び種における当該真菌、すなわち、アルテルナリア属（アルテルナリア・ブラッシキコラ（ｂｒａｓｓｉｃｏｌａ）、トマト輪紋病菌）、アスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）属（アスコキタ・ピシ）、アスペルギルス属（アスペルギルス・フラーブス、アスペルギルス・フミガーツス）、ボトリチス属（灰色かび病菌）、セルコスポラ属（ダイズ紫斑病菌、トウモロコシ斑点病菌）、コレトトリカム属（インゲンマメ炭疽病菌）、ディプロディア属（ディプロディア・マイディス）、エリシフェ（イネうどんこ病菌、オオムギうどんこ病菌）属、フザリウム属（紅色雪腐病菌、フザリウム・オキシスポルム、フザリウム・グラミネアルム、フザリウム・クルモルム、フザリウム・ソラニ、フザリウム・モニリフォルメ、フザリウム・ロゼウム）、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ）属（コムギ立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃｉ））、ヘルミントスポリウム属（ヘルミントスポリウム・ツルシクム、北方斑点病菌、トウモロコシごま葉枯病菌）、マクロフォミナ属（マクロフォミナ・ファゼオリナ、マクロフォミナ・グリセア（ｇｒｉｓｅａ））、ネクトリア属（ネクトリア・ヘマトコッカ（ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃａ））、ツユカビ属（ダイズべと病菌、タバコべと病菌）、ファコプソラ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ）属（ダイズさび病菌）、フォーマ属（フダンソウじゃのめ病菌）、フィマトトリカム（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属（ワタ根腐病）、フィトフトラ属（トルコギキョウ疫病菌、キク疫病菌、ダイズ茎疫病菌、ジャガイモ疫病菌）、プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）属（ブドウべと病菌）、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）属（リンゴうどんこ病菌）、プクシニア属（トウモロコシさび病菌、オオムギ黄さび病菌、コムギ黒さび病菌、アスパラガスさび病菌、カモジグサさび病菌、ラッカセイさび病菌）、ピシウム属（腰折病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ））、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属（コムギ黄斑病菌（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｔｒｉｔｉｃｉ−ｒｅｐｅｎｔｅｎｓ））、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）属（イネいもち病菌）、ピシウム属（キク立枯病菌）、リゾクトニア属（リゾクトニア・ソラニ、リゾクトニア・セレアリス（ｃｅｒｅａｌｉｓ））、スクレロティウム（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ）属（白絹病菌）、スクレロティニア属（菌核病菌）、セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）属（トマト白星病菌、ダイズ褐紋病菌、コムギふ枯病菌、コムギ葉枯病菌）、シエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）属（根腐病菌）、ウンシヌラ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）属（ブドウうどんこ病菌）、ベンチュリア属（リンゴ黒星病菌）、及びベルチシリウム属（バーティシリウム萎凋病菌、バーティシリウム萎ちょう病）によって具現化される。
【０２８６】
本明細書に包含される農業上有用な抗真菌性組成物には、ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドを産生することができかつ、根、芽、葉、または植物の他の部分を含む植物にコロニー形成することのできる、細菌及び真菌の細胞などの宿主細胞の形態における当該組成物も含む。
【０２８７】
用語「植物にコロニー形成する微生物」は、「植物環境」にコロニー形成できかつ当該「植物環境」において本ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドを発現することのできる微生物を指すために本明細書で使用する。植物にコロニー形成する微生物とは、植物環境における植物と共生的なまたは非有害な関係で存在することのできる微生物である。
【０２８８】
米国特許第５，２２９，１１２号は、本明細書に開示するＭｔＤｅｆ５抗真菌性タンパク質及びペプチドへ適用可能な抗真菌性タンパク質を発現するよう操作することのできる植物にコロニー形成する種々の微生物、及びその使用方法を開示している。本発明による植物における真菌感染及び損傷を阻害する上で有効な現に開示しているＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドを発現する、植物にコロニー形成する微生物には例えば、バチルス科ファミリーの胞子形成生体、例えば、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・イスラエレンシス、及び枯草菌などのバチルス属、シュードモナス属、アルスロバクター属、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｙｒｉｌｌｕｍ）属、クラビバクター属、大腸菌属、アグロバクテリウム属、例えば、アグロバクテリウム・ラジオバクター、根粒菌属、エルウィニア属、アゾトバクター属、アゾスピリルム属、クレブシエラ属、アルカリゲネス属、根圏細菌属、及びフラボバクテリウム属からなる群から選択される細菌、ならびに出芽酵母、ピキア・パストリス、及びピキア・メタノリカからなる群から選択される酵母を含む。
【０２８９】
用語「植物環境」には、植物の表面、例えば、葉、幹、芽、茎、花卉部、もしくは根の表面、当該植物の内部及びその細胞、ならびに「根圏」、すなわち、取り囲んで当該植物の根によって影響を及ぼされる土壌に対する表面を含む。
【０２９０】
本ＭｔＤｅｆ５分子を根圏へ適用することが所望である場合、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来の根圏にコロニー形成する細菌は特に有用であり、特に蛍光性をシュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えばシュードモナス・フルオレセンスは、植物根圏において及び植物根の表面に多数コロニー形成する上で特に競合的である。適切な葉面（葉）にコロニー形成する細菌の例は、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・シリンゲ、及びエルウィニア属である。
【０２９１】
本発明の抗真菌性の植物にコロニー形成する微生物は、植物環境へ、例えば、葉、蕾、根、芽、花卉部、種子等の表面へ、または土壌へ直接適用することができる。種子被膜として使用する場合、本発明の植物にコロニー形成する微生物は、播種前に植物種子へ適用される。概して、少量の抗真菌活性のある微生物は、このような種子を処理するために必要とされる。
【０２９２】
特定の植物に必要とされる本発明の方法において有用な植物にコロニー形成する微生物の抗真菌性有効量の判定は、当該技術分野の技術内であり、植物種、真菌病原体、播種方法、及び土壌種類（例えば、ｐＨ、有機物質含有量、水分含有量）のような因子に左右される。
【０２９３】
理論上、本明細書に開示するＭｔＤｅｆ５抗真菌性タンパク質及びペプチドをコードするＤＮＡを含有する本発明の単一の植物にコロニー形成する微生物は、抗真菌量のデフェンシンを発現するのに十分な数のクローンのコロニーへと増殖できるので、真菌病原体を防除するのに十分である。しかしながら、実際、微生物の生存及び増殖に影響し得る環境因子の変動により、十分な数の植物にコロニー形成する微生物が植物環境（例えば、根または葉群）において提供されて、生存及び／または増殖を確実にするべきである。例えば、種子あたり１０３〜１０１０個の細菌または酵母の適用は、当該微生物による根の表面へのコロニー形成を保証するのに十分であり得る。５０〜２５０ナノグラムのデフェンシンを発現する集団を維持するのに十分な細菌または他の植物にコロニー形成する微生物を植物環境に投与することが好ましい。例えば、植物表面１平方センチメートルあたり１０５〜１０８個の細菌が真菌感染を防除するのに適し得る。少なくとも０．５ナノグラム、好ましくは１〜１００ナノグラムの抗真菌活性のあるタンパク質またはペプチドが、植物に対する真菌損傷を防除するために十分であり得る。
【０２９４】
本発明の抗真菌活性のある植物と関連する微生物を含有する組成物は、アジュバント、希釈剤、担体等を用いて当該生物活性のある微生物を製剤化することによって調製して、細かく分割した粒子状固体、顆粒、ペレット、湿潤可能な粉末、粉体、水性懸濁液、分散液、もしくはエマルションの形態で組成物を提供することができる。適切な担体ビヒクルの実例となるのは、溶媒、例えば水または有機溶媒、及び細かく分割された固体、例えば、カオリン、チョーク、炭酸カルシウム、タルク、ケイ酸塩、及びセッコウである。
【０２９５】
本発明はまた、封入された形態における本発明の方法及び組成物における抗真菌性の、植物にコロニー形成する微生物の使用も包含し、例えば、当該植物にコロニー形成する微生物は、重合体の外殻壁、ゼラチン、脂質及びこれらに類するもの内に封入することができる。例えば乳化剤、分散剤、界面活性剤、湿潤剤、消泡剤、及び凍結防止剤のような他の製剤助剤は、このような組成物が、特に使用前のいずれかの時間ほど保存される場合に抗真菌性組成物へと組み込むことができる。
【０２９６】
抗真菌活性のある植物にコロニー形成する微生物に加えて、本発明の組成物は、例えば抗真菌薬、除草剤、または殺虫剤のような他の公知の生物活性剤を追加的に含有することができる。また、２つ以上の抗真菌活性のある植物にコロニー形成する微生物を組み合わせることができる。
【０２９７】
本発明の遺伝子操作した、植物にコロニー形成する微生物を含有する抗真菌性組成物の活性薬としての適用は、例えば、散布機、動力散粉機、針出棒及び手動噴霧機、素早い散粉機、及び粒剤付与装置を利用する従来技術によって実施することができる。
【０２９８】
本発明の組成物は、例えば、防除されることになっている具体的な真菌病原体、処置されることになっている具体的な植物（及び植物部分または土壌）、及び抗真菌活性のある組成物を適用する方法のような因子に応じて変化する抗真菌性有効量で適用される。
【０２９９】
（ＭｔＤｅｆ５抗真菌性タンパク質及びペプチド含有医薬組成物）
本発明は、植物の遺伝子座へ適用することのできるＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドを発現するトランスジェニック植物ならびに形質転換した微生物だけでなく、ヒトまたは動物に感染する易罹患性病原性真菌類の増殖を阻害しまたは当該真菌類を殺滅すること、すなわち、抗真菌性有効量のＭｔＤｅｆ５タンパク質、ペプチド、またはこれらの生物学的な機能的等価量を、このような真菌感染を処置することを必要とする患者または他の対象へ投与することによって当該真菌感染を処置することに使用することができる医薬組成物も包含する。
【０３００】
ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドを含むこのような医薬組成物ならびにこれらの生物学的機能等価物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：薬学の科学と実践（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）（２００５），第２１版，フィラデルフィア科学大学，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓにおいて説明されるような従来法によって製剤化することができる。このような組成物は、ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチド、ならびにこれらの種々の組み合わせを約０．１μｇ  ｍｌ〜約１００ｍｇ  ｍｌの範囲の濃度で、好ましくは約５μｇ  ｍｌと約５ｍｇ  ｍｌの間の範囲の濃度で、約３．０〜約９．０の範囲のｐＨで含有することができる。このような組成物は、例えば、約１ｍＭと１Ｍの間、好ましくは約１０ｍＭと１００ｍＭの間、より好ましくは約１５ｍＭと５０ｍＭの間のリン酸緩衝液を用いて緩衝することができる。低い緩衝液濃度の場合、約１ｍＭ〜約１Ｍの、より好ましくは約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲のイオン強度を高める塩、好ましくはＮａＣｌを添加することが望ましい。
【０３０１】
ＭｔＤｅｆ５タンパク質及びペプチドは、単独で、互いとのいずれかの組み合わせで製剤化することができ、これらのうちのいずれかは、非限定的な例として、ポリエン抗真菌薬、イミダゾール、トリアゾール、及びチアゾール抗真菌薬、アリルアミン、ならびに人間医学及び獣医学において日常的に使用されるエキノカンジンのような他の従来の抗真菌性治療用化合物との組み合わせで追加的に製剤化することができる。
【０３０２】
本ＭｔＤｅｆ５分子の投与は、種々の従来経路を介して達成することができ、局所適用が好ましい。
【０３０３】
以下の実施例は、本発明の種々の態様を説明しており、当該実施例において有用な化合物、組成物、及び方法の限定よりもむしろ、単に実例となるよう意図されているに過ぎない。
【実施例】
【０３０４】
（実施例１）
（ダイズ形質転換ベクターＡＫＫ／ＦＭＶ／ＭｔＤｅｆ５の構築）
図１に示すように、ＭｔＤｅｆ５遺伝子またはそれ自体のシグナルペプチドを有するｃＤＮＡは、ダイズ発現ベクターＡＫＫ１４７２におけるフィグワートモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Ｓａｎｇｅｒら（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １４：４３３〜４４３）とノパリンシンターゼポリアデニル化シグナル（Ｇｌｅａｖｅ（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：１２０３〜１２０７）の間のＮｃｏＩ−ＸｂａＩ断片としてクローン化される（Ｈａｍｍｅｓら（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  １８：１２４７〜１２５７）。ＭｔＤｅｆ５キメラ遺伝子もしくはｃＤＮＡ及び選択可能なマーカー遺伝子としてＢａｓｔａ（登録商標）抵抗性を与えるｂａｒ遺伝子（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：２５１９〜２５２３）を含有するＡＫＫ１４７２ベクターは、ダイズ形質転換のためのアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＥＨＡ１０５へ転移する（Ｃｌｅｍｅｎｔｅら（２０００）Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．４０：７９７〜８０３、Ｚｈａｎｇら（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓ．Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔ．５６：３７〜４６）。
【０３０５】
（実施例２）
（トランスジェニック植物のダイズ形質転換及び再生）
アグロバクテリウムを用いてトランスジェニックダイズ系統を作出するために本実施例において使用する形質転換プロトコルはすでに説明されている（Ｃｌｅｍｅｎｔｅら（２０００）Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．４０：７９７〜８０３、Ｚｈａｎｇら（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓ．Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔ．５６：３７〜４６）。
【０３０６】
種子の外部（この場合、「ジャック」と呼ばれるダイズ種変種）はまず、商業等級のＣｌｏｒｏｘ（登録商標）（５％次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）水溶液）を一晩用いて滅菌する。次に、滅菌した種子を、２％スクロースを補充した発芽培地（ＧＭ；ＧａｍｂｏｒｇのＢ５培地（Ｇａｍｂｏｒｇら（１９６８）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：１５１）、ｐＨ５．８、０．８％寒天で凝固）中で２４℃で５日間発芽させる（１８：６の照明体制）。実施例１のベクターで形質転換したアグロバクテリウム・ツメファシエンスは、低速遠心分離を介して収集し、０．６〜１．０の最終ＯＤ６５０となるよう共培養培地において懸濁する。共培養培地は、１．６７ｍｇ／ｌの６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、０．２５ｍｇ／ｌのジベレリン酸（ＧＡ３）、３％のスクロース、２００μＭのアセトシリンゴン、２０ｍＭの２−（Ｎ−モルフォリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）を補充したｐＨ５．４の１／１０のＧａｍｂｏｒｇのＢ５培地である。
【０３０７】
以下のプロトコルは、すでに説明されている（Ｃｌｅｍｅｎｔｅら（２０００）上述、Ｚｈａｎｇら（１９９９）上述）。
【０３０８】
アグロバクテリウム種菌をペトリ皿の中に、調製した外植片（創傷由来、発芽種子）とともに、時折撹拌しながら３０分間播種する。次に、外植片を共培養皿（０．７６ｇのＧａｍｂｏｒｇ基礎塩混合物、７．４ｇのＭＥＳ、６０ｇのスクロース、１ＭのＫＯＨを用いてｐＨを５．４へ調整、及び温培地中に溶解した５ｇ／Ｌのアガロースを含有するペトリ皿）上へ播種し、向軸側を下にした。当該皿をパラフィルムで巻き、２４℃、１８：６の照明体制で３日間静置する。共培養期の後、外植片を、０．２５ｍｇ／ｌのＧＡ３を補充した液体発芽開始培地（３．０８ｇのＧａｍｂｏｒｇ  Ｂ５塩類、３０ｇのスクロース、０．５６ｇのＭＥＳ、１ＭのＫＯＨを用いてｐＨを５．６へ調整）中で簡単に洗浄する。最初の２週間後、胚軸領域を発達中の節に対して直線切りにし、グルホシナートの非存在下で２週間インキュベートする。次に、当該組織を新鮮発芽開始培地へと２週間ごとに移し、合計およそ１０週間ほど３ｍｇ／ｌのグルホシナートを添加する。当該組織は、新鮮に切断された表面が培地中に包埋するよう向けられているとともに、分化領域は表面に対して同一平面である。発芽開始期の終了時に、分化中の外植片のみを使用する。子葉を外植片からはずし、新鮮切断を発達中の節の基部において（水平に）行い、組織を発芽生長培地へ移し、２４℃で１８／６の照明体制で培養する。発芽生長培地は、１ｍｇ／ｌのゼアチンリボシド、０．１ｍｇ／ｌのインドール酢酸（ＩＡＡ）、０．５ｍｇ／ｌのＧＡ３、３％のスクロース、１００ｍｇ／ｌのピログルタミン酸、５０ｍｇ／ｌのアスパラギン、３ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．６）を補充したＭＳ塩類／Ｇａｍｂｏｒｇのビタミン類から構成され、０．８％の精製寒天で凝固させる。ｂａｒ遺伝子はマーカーとして使用するので、３ｍｇ／ｌのグルホシナートを添加する。当該組織を２週間ごとに新鮮発芽生長培地へと移す。各転移時に、新鮮水平薄片を組織の底部において行う。生長した芽（３ｃｍ超）をさらなる選択なしで発根培地へと発根させる。発根培地は、４．３３ｇの村重及びＳｋｏｏｇ基礎塩類混合物、２０ｇのスクロース、０．５６ｇのＭＥＳから構成される。ｐＨは、１ＭのＫＯＨを用いて５．６へ調整し、１ｌあたり３ｇのＰｈｙｔａｇｅｌを添加する。当該溶液をオートクレーブし（２０分間）、冷却すると、１ｍｇのＧａｍｂｏｒｇ  Ｂ５ビタミン類（１０００倍）、１ｍｌのＬ−アスパラギン一水和物（５０ｍｇ／ｍｌストック）、及び１ｍｌのＬ−ピログルタミン酸（１００ｍｇ／ストックｍｌ）を添加する。
【０３０９】
次に、植物を生育させて、ＭｔＤｅｆ５遺伝子またはｃＤＮＡの存在を検出するために、ＰＣＲを用いて選択する。ＲＮＡレベルでのＭｔＤｅｆ５遺伝子またはｃＤＮＡの発現は、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて測定し、ＭｔＤｅｆ５タンパク質の発現は、ＭｔＤｅｆ５ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定する。製造元の説明書に従って、ＡＢ  ＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ−リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州カールスバッド市）において、ホモ接合体をＰｒｏｍｅｇａ  ＧｏＴａｑ（登録商標）定量的ＰＣＲマスター混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ社，ウィスコンシン州マジソン市）を用いる定量的ＰＣＲを用いて最終的に選択する。
【０３１０】
ＭｔＤｅｆ５  ＤＮＡコンストラクト挿入についてホモ接合性であるトランスジェニック植物が得られ、同定され、その後、Ｃｈｅｎら（１９９９）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９９：７５５〜７６０に説明されるような赤かび病、Ｃｈｅｎｇら（２０１０）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２１：１９５〜２０４）に説明されるような葉さび病及び黄さび病、ならびにＮｉｒｍａｌａら（２０１１）ＰＮＡＳ  １０８：１４６７６〜１４６８１において説明されるような黒さび病に対する抵抗性について検査する。
【０３１１】
（実施例３）
（コムギ形質転換ベクターｐＺＰ２１２／トウモロコシＵｂｉ１Ａプロモーター／ＭｔＤｅｆ５／３５Ｓ３’の構築）
コムギにおけるＭｔＤｅｆ５の発現について、ＭｔＤｅｆ５遺伝子またはｃＤＮＡは、ＭｔＤｅｆ５遺伝子またはｃＤＮＡシグナルペプチドのアミノ酸配列及び成熟タンパク質が変化しないままであるよう単子葉植物の好ましいコドンを基に合成される。合成ＭｔＤｅｆ５遺伝子またはｃＤＮＡは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ地区）から得る。合成ＭｔＤｅｆ５遺伝子は、トウモロコシユビキチン（Ｕｂｉ１）プロモーター／イントロンとＣａＭＶ３５Ｓポリアデニル化シグナル配列の間に置かれ、図２に示すように、二成分植物発現ベクターｐＺＰ２１２のＴ−ＤＮＡ境界の間でクローン化される（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚら，１９９４）。
【０３１２】
合成ＭｔＤｅｆ５遺伝子もしくはｃＤＮＡ及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼ選択可能マーカー遺伝子（ｎｐｔＩＩ）を含有するｐＺＰ２１２ベクターは、ボブホワイト種及び／またはＸＣ９種のコムギへと導入する。当該トランスジェニックコムギは、以下の実施例４において説明するように得られる。
【０３１３】
（実施例４）
（コムギ形質転換及びトランスジェニック植物の再生）
コムギ形質転換に使用するプロトコルは、Ｃｈｅｎｇら（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １１５：９７１〜９８０によって既に説明された。
【０３１４】
これらの形質転換については、春播きコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  ｃｖ  Ｂｏｂｗｈｉｔｅ）を使用する。未成熟穎果を開花１４日後の植物から収集する。未成熟胚を無菌で摘出し、１００ｍｇのＬ型アスコルビン酸含有の半固体または液体のＣＭ４培地（ＣＭ４Ｃ）上で培養する（Ｚｈｏｕら（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  １５：１５９〜１６３）。ＣＭ４培地中のＭＳ塩類（村重及びＳｋｏｏｇ（１９６２）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｎｔ．１５：４７３〜４９７）を全強度（元の量）または１／１０の強度へ調整する（Ｆｒｙら（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ６：３２１〜３２５）。未成熟胚を３〜４時間培養する。ＣＭ４Ｃ培地上で未成熟胚を１０〜２５日間培養することによって、胚形成カルスを調製する。未成熟胚に由来するカルス片に、胚形成カルスセクターを用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種する。実施例３（図２）に説明するベクターを保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８（ＡＢＩ）をダイズ形質転換のために、実施例３において先に説明したとおり調製する。アグロバクテリウム・ツメファシエンスをＡ６００細胞密度が１〜２となるまで接種のために増殖させる。ＣＭ４Ｃ培地上で維持した未成熟胚及び胚形成カルスをペトリ皿中のアグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液中へと移す。接種は暗所で２３〜２５℃で３時間実施する。接種後、アグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞を取り出し、全強度ＭＳ塩類含有液体ＣＭ４Ｃ含有かつ１０ｇ／Ｌのグルコース及び２００μＭのアセトシリンゴンを補充した半固体培地（Ｇｅｌｒｉｔｅ）上に外植片を置く。共培養は暗所で２４〜２６℃で２〜３日間行う。共培養後、感染した未成熟胚及びカルスを、２５０ｍｇ／Ｌカルベニシリン含有固体ＣＭ４Ｃ培地上で２〜５日間、選択なしで培養する。次に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス感染した外植片をカルス誘導のために、３ｍｇ／ｌのグルホシナート及び２５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを補充したＣＭ４Ｃ培地へと移す。２週間後、外植片を第一再生培地ＭＭＳ０．２Ｃ（ＭＳ塩類及びビタミン類、１．９５ｇ／ＬのＭＥＳ、０．２ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、１００ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸、及び４０ｇ／Ｌのマルトースからなり、３ｍｇ／ｌのグルホシナート及び２５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを補充した２ｇ／Ｌのゲルライトによって凝固させる）へと移す。再生培地への移動時に、１つの未成熟胚に由来するカルス各片または接種したカルス１片をいくつかの小片（およそ２ｍｍ）へと分ける。さらに２週間、若い芽及び生育可能なカルス組織を第二の再生培地ＭＭＳＯＣへと移し、当該再生培地は、ＭＭＳ０．２Ｃと同じ成分を含有し、すべての抗生物質が含まれている。芽は、約３ｃｍ以上の小植物へと生育し、当該芽は、さらなる生育及び選別のために再生培地を含有する大き目の培養容器へと移す。この段階におけるＰＣＲ検査のために、葉試料を小植物のうちのいくつかから採取する。高度にグルホシナート抵抗性のある植物を土壌へ移す。同じ胚またはカルス片に由来する植物をすべて、所与の事象のクローンと見なす。
【０３１５】
次に、当該植物を生育させ、ＭｔＤｅｆ５またはｃＤＮＡの存在を検出するためにＰＣＲを用いて選別する。ＲＮＡレベルでのＭｔＤｅｆ５遺伝子またはｃＤＮＡの発現は、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて測定し、ＭｔＤｅｆ５タンパク質の発現は、ＭｔＤｅｆ５ポリクローナル抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定する。ホモ接合体は、製造元の説明書に従って、ＡＢ  ＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ−リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州カールスバッド市）においてＰｒｏｍｅｇａ  ＧｏＴａｑ（登録商標）定量的ＰＣＲマスター混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マジソン市）を用いる定量的ＰＣＲを用いて最終的に選別される。
【０３１６】
ＭｔＤｅｆ５ＤＮＡコンストラクト挿入のためにホモ接合性であるトランスジェニック植物が得られ、同定され、その後、Ｃｈｅｎら（１９９９）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９９：７５５〜７６０に説明されるような赤かび病、Ｃｈｅｎｇら（２０１０）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２１：１９５〜２０４）に説明されるような葉さび病及び黄さび病、ならびにＮｉｒｍａｌａら（２０１１）ＰＮＡＳ  １０８：１４６７６〜１４６８１において説明されるような黒さび病に対する抵抗性について検査する。
【０３１７】
（実施例５）
（Ｃ末端伸長を有する化学的に合成されたＭｔＤｅｆ５．１ａガンマ中心ペプチド（ＧＭＡ−５Ｃ）（ＧＡＣＨＲＱＧＦＧＦＡＣＦＣＹＫＫＣ（配列番号５８））のインビトロでの抗真菌活性）
全長のＭｔＤｅｆ５タンパク質に由来する小ペプチドが抗真菌活性を呈するかどうかを判定するために、Ｃ末端の１８個のアミノ酸からなるペプチドをＧｅｎｅｍｅｄ社、テキサス州から得て、フザリウム・グラミネアルムＰＨ−１に対するその抗真菌活性について検査する。このペプチドは、ガンマ中心モチーフ及び成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質の最後の６個のアミノ酸を含有している。
【０３１８】
ＭｔＤｅｆ５．１ａのガンマ中心モチーフの抗真菌活性を、アミノ酸配列ＧＡＣＨＲＱＧＦＧＦＡＣＦＣＹＫＫＣ（配列番号５８）を有する化学的に合成したＧＭＡ−５Ｃペプチドを用いて評価する。化学的に合成したＧＭＡ−５Ｃペプチドのインビトロでの抗真菌活性の定量的評価を、Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈｙら（２００７）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９：１４９１〜１５０６において説明されるようなペプチドとのフザリウム・グラミネアルムＰＨ−１分生子のインキュベーション２４時間後に評価する。本結果は図３に示し、ここで、報告される値は３つの複製物の平均である。誤差棒は、標準偏差を示す。
【０３１９】
本データは、このペプチドのＩＣ５０（真菌増殖の５０％阻害について必要な濃度）は約６〜１２μＭであるのに対し、ＩＣ１００（真菌増殖の１００％阻害について必要な濃度）は約２４μＭであることを実証している。
【０３２０】
本発明はこのように説明されているが、本発明を多くの方法で変化させ得ることは明白である。このような変化は、本発明の精神及び範囲からの逸脱と見なすべきではなく、当業者に明白であろうような改変はすべて、以下の特許請求の範囲内に含むよう意図される。
【０３２１】
（配列表）
（アミノ酸及びヌクレオチドの配列情報）
（各ＭｔＤｅｆ５デフェンシンのγ中心モチーフは１０ポイントタイプの太字斜体で示した、ＭｔＤｅｆ５シグナルペプチド（８〜２９個のアミノ酸、下線）と成熟ＭｔＤｅｆ５デフェンシンタンパク質（およそ５０個のアミノ酸）とを含むタルウマゴヤシＭｔＤｅｆ５．１ａ〜ＭｔＤｅｆ５．６デフェンシンプロタンパク質アミノ酸配列）
【数１】
0006440687.tif 000004
【０３２２】
（γ中心モチーフコード配列を太字タイプで示した、ＭｔＤｅｆ５シグナルペプチド（８〜２９個のアミノ酸）コード配列（下線）と成熟ＭｔＤｅｆ５タンパク質（およそ５０個のアミノ酸）コード配列とを含むタルウマゴヤシＭｔＤｅｆ５．１ａ〜ＭｔＤｅｆ５．６プロタンパク質ｃＤＮＡコード配列）
ＭｔＤｅｆ５．１ａ及びＭｔＤｅｆ５．１ｂ  ｃＤＮＡ（配列番号１０）：太字、斜体、及び下線で示したヌクレオチド配列は、「リンカー」ペプチドアミノ酸配列ＡＰＫＫＶＥＰをコードする：
【数２】
0006440687.tif 000005
【０３２３】
成熟タルウマゴヤシＭｔＤｅｆ５．１ａ〜ＭｔＤｅｆ５．６デフェンシンタンパク質アミノ酸配列
【数３】
0006440687.tif 000006
【０３２４】
（成熟タルウマゴヤシＭｔＤｅｆ５．１ａ〜ＭｔＤｅｆ５．６デフェンシンタンパク質ｃＤＮＡコード配列）
【数４】
0006440687.tif 000007
【０３２５】
（ＭｔＤｅｆ５．１ａ〜ＭｔＤｅｆ５．６シグナルペプチドアミノ酸配列）
ＭｔＤｅｆ５．１ａ−５．１ｂシグナルペプチド配列：
ＭＴＳＳＡＳＫＦＹＴＩＦＩＦＶＣＬＡＦＬＦＩＳＴＳＥＶＥＡ（配列番号３０）
ＭｔＤｅｆ５．２シグナルペプチド配列：
ＭＡＳＳＳＰＫＬＦＴＩＦＬＦＬＩＬＶＶＬＬＦＳＴＳＥＶＱＡ（配列番号３１）
ＭｔＤｅｆ５．３シグナルペプチド配列：
ＭＴＳＳＡＴＫＦＹＴＩＦＶＦＶＣＬＡＬＬＬＩＳＩＣＥＶＥＡ（配列番号３２）
ＭｔＤｅｆ５．４シグナルペプチド配列：
ＭＡＳＳＴＬＫＦＮＴＩＦＬＦＬＳＬＡＬＬＬＦＦＴＬＥＶＱＧ（配列番号３３）
ＭｔＤｅｆ５．５シグナルペプチド配列：
ＭＡＳＳＡＬＫＹＹＴＦＦＬＦＦＩＬＡＬＩＬＬＰＴＬＥＶＱＧ（配列番号３４）
ＭｔＤｅｆ５．６推定シグナルペプチド配列：
ＭＶＣＴＥＶＱＡ（配列番号３５）
【０３２６】
（ＭｔＤｅｆ５．１ａ〜５．６シグナルペプチドｃＤＮＡコード配列）
ＭｔＤｅｆ５．１ａ〜５．１ｂシグナルペプチドｃＤＮＡコード配列：
ＡＴＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＧＣＴＡＧＴＡＡＡＴＴＣＴＡＴＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＧＴＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＣＡ（配列番号３６）
ＭｔＤｅｆ５．２シグナルペプチドｃＤＮＡコード配列：
ＡＴＧＧＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＴＡＡＡＴＴＧＴＴＴＡＣＣＡＴＣＴＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＣＧＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＣＴＣＡＡＣＴＴＣＧＧＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＡ（配列番号３７）
ＭｔＤｅｆ５．３シグナルペプチドｃＤＮＡコード配列：
ＡＴＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＧＣＴＡＣＴＡＡＡＴＴＴＴＡＣＡＣＣＡＴＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＴＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＴＡＴＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＣＡ（配列番号３８）
ＭｔＤｅｆ５．４シグナルペプチドｃＤＮＡコード配列：
ＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＴＴＡＡＡＴＴＣＡＡＣＡＣＴＡＴＣＴＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＴＧＣＡＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＴＴ  ＣＡＣＡＴＴＧＧＡＧＧＴＡＣＡＡＧＧＡ（配列番号３９）
ＭｔＤｅｆ５．５シグナルペプチドｃＤＮＡコード配列：
ＡＴＧＧＣＴＴＣＣＴＣＴＧＣＴＣＴＴＡＡＡＴＡＣＴＡＣＡＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＴＴＴＴＣＡＴＣＣＴＴＧＣＡＣＴＴＡＴＣＣＴＧＴＴＡＣＣ  ＣＡＣＡＴＴＧＧＡＧＧＴＡＣＡＡＧＧＡ（配列番号４０）
ＭｔＤｅｆ５．６シグナルペプチドｃＤＮＡコード配列：
ＡＴＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＧＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＡ（配列番号４１）
【０３２７】
（ＭｔＤｅｆ４．１〜４．３及び他のシグナルペプチドアミノ酸配列）
ＭｔＤｅｆ４．１（Ｈ３３Ｒ）シグナルペプチド配列：
ＭＡＲＳＶＰＬＶＳＴＩＦＶＦＬＬＬＬＶＡＴＧＰＳＭＶＡＥＡ（配列番号４２）
ＭｔＤｅｆ４．２シグナルペプチド配列：
ＭＡＲＳＶＰＬＶＳＴＩＦＶＦＦＬＬＩＶＡＴＥＭＧＰＳＭＶＡＡ（配列番号４３）
ＭｔＤｅｆ４．３シグナルペプチド配列：
ＭＡＲＳＶＰＬＶＳＴＩＦＶＦＦＬＬＬＶＡＴＥＭＧＰＩＭＶＡＥＡ（配列番号４４）
ＡＬ３８５７９６シグナルペプチド配列：
ＭＡＲＳＶＦＬＶＳＴＩＦＶＦＬＬＶＬＶＡＴＧＰＳＭＶＡＥＡ（配列番号４５）
ＡＷ５７３７７０シグナルペプチド配列：
ＭＡＲＳＶＳＬＶＦＴＩＦＶＦＬＬＬＶＶＡＴＧＰＳＭＶＡＥＡ（配列番号４６）
ＢＥ９９９０９６シグナルペプチド配列：
ＭＡＲＳＶＰＬＶＳＴＩＦＶＦＬＬＬＬＶＡＴＧＰＳＭＶＧＥＡ（配列番号４７）
ＭｔＤｅｆ４シグナルペプチドコンセンサス配列：
ＭＡＲＳＶＰＬＶＳＴＩＦＶＦＬＬＬＬＶＡＴＧＰＳＭＶＡＥＡ（配列番号４８）
【０３２８】
（ＭｓＤｅｆ１、ＭｔＤｅｆ４、及びＭｔＤｅｆ５．１ａ〜５．６γ中心モチーフ（ＧＸＣＸ３−９Ｃ）ペプチドアミノ酸配列）
ＭｓＤｅｆ１：ＧＲＣＲＤＤＦＲＣ（配列番号４９）
ＭｔＤｅｆ４：ＧＲＣＲＧＦＲＲＲＣ（配列番号５０）
ＭｔＤｅｆ５．１ａ：ＧＡＣＨＲＱＧＦＧＦＡＣ（配列番号５１）
ＭｔＤｅｆ５．１ｂ：ＧＡＣＨＲＱＧＩＧＦＡＣ（配列番号５２）
ＭｔＤｅｆ５．２：ＧＧＣＨＬＤＮＴＧＶＦＣ（配列番号５３）
ＭｔＤｅｆ５．３：ＧＡＣＨＲＱＧＹＧＦＡＣ（配列番号５４）
ＭｔＤｅｆ５．４：ＧＡＣＨＱＤＧＦＧＦＡＣ（配列番号５５）
ＭｔＤｅｆ５．５：ＧＡＣＨＲＤＧＩＧＦＡＣ（配列番号５６）
ＭｔＤｅｆ５．６：ＧＧＣＨＬＤＮＴＧＶＦＣ（配列番号５７）
【０３２９】
（Ｃ末端伸長を有するＭｔＤｅｆ５．１ａ〜５．６γ中心ペプチド（ＧＭＡ−５Ｃ））
ＭｔＤｅｆ５．１ａ：ＧＡＣＨＲＱＧＦＧＦＡＣＦＣＹＫＫＣ（配列番号５８）
ＭｔＤｅｆ５．１ｂ：ＧＡＣＨＲＱＧＩＧＦＡＣＦＣＫＫＫＣ（配列番号５９）
ＭｔＤｅｆ５．２：ＧＧＣＨＬＤＮＴＧＶＦＣＦＣＤＦＫＣ（配列番号６０）
ＭｔＤｅｆ５．３：ＧＡＣＨＲＱＧＹＧＦＡＣＦＣＹＫＫＣ（配列番号６１）
ＭｔＤｅｆ５．４：ＧＡＣＨＱＤＧＦＧＦＡＣＦＣＹＦＮＣ（配列番号６２）
ＭｔＤｅｆ５．５：ＧＡＣＨＲＤＧＩＧＦＡＣＦＣＹＦＮＣ（配列番号６３）
ＭｔＤｅｆ５．６：ＧＧＣＨＬＤＮＴＧＶＦＣＦＣＤＦＫＣ（配列番号６４）
【０３３０】
ＭｔＤｅｆ５．１ａ〜５．６γ中心モチーフ（ＧＸＣＸ３−９Ｃ）ペプチドアミノ酸配列ｃＤＮＡコード配列
ＭｔＤｅｆ５．１ａ：ＧＧＴＧＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＣＴＴＧＣ（配列番号６５）
ＭｔＤｅｆ５．１ｂ：ＧＧＴＧＣＴＴＧＴＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＴＴＧＧＴＴＴＴＧＣＴＴＧＣ（配列番号６６）
ＭｔＤｅｆ５．２：ＧＧＧＧＧＴＴＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＡＡＣＡＣＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＴＧＴ（配列番号６７）
ＭｔＤｅｆ５．３：ＧＧＴＧＣＴＴＧＴＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＡＴＧＧＴＴＴＴＧＣＴＴＧＣ（配列番号６８）
ＭｔＤｅｆ５．４：ＧＧＧＧＣＡＴＧＣＣＡＣＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＣＴＴＧＣ（配列番号６９）
ＭｔＤｅｆ５．５：ＧＧＧＧＣＡＴＧＴＣＡＣＣＧＴＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＴＴＴＧＣＴＴＧＣ（配列番号７０）
ＭｔＤｅｆ５．６：ＧＧＧＧＧＴＴＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＡＡＣＡＣＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＴＧＴ（配列番号７１）
【０３３１】
（Ｃ末端伸長を有するＭｔＤｅｆ５．１ａ〜５．６γ中心ペプチド（ＧＭＡ−５Ｃ）のｃＤＮＡコード配列）
ＭｔＤｅｆ５．１ａ：ＧＧＴＧＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＣＴＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＡＣＡＡＡＡＡＡＴＧＴ（配列番号７２）
ＭｔＤｅｆ５．１ｂ：ＧＧＴＧＣＴＴＧＴＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＴＴＧＧＴＴＴＴＧＣＴＴＧＣＴＴＣＴＧＣＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＧＴ（配列番号７３）
ＭｔＤｅｆ５．２：ＧＧＧＧＧＴＴＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＡＡＣＡＣＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＣＴＧＣＧＡＣＴＴＣＡＡＡＴＧＣ（配列番号７４）
ＭｔＤｅｆ５．３：ＧＧＴＧＣＴＴＧＴＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＡＴＧＧＴＴＴＴＧＣＴＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＡＣＡＡＡＡＡＧＴＧＴ（配列番号７５）
ＭｔＤｅｆ５．４：ＧＧＧＧＣＡＴＧＣＣＡＣＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＣＴＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＡＴＴＧＣ（配列番号７６）
ＭｔＤｅｆ５．５：ＧＧＧＧＣＡＴＧＴＣＡＣＣＧＴＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＴＴＴＧＣＴＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＡＣＴＴＣＡＡＣＴＧＣ（配列番号７７）
ＭｔＤｅｆ５．６：ＧＧＧＧＧＴＴＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＡＡＣＡＣＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＣＴＧＣＧＡＣＴＴＣＡＡＡＴＧＣ（配列番号７８）
【０３３２】
（引用した非特許文献）
種々の特許文献及び非特許文献が本明細書で引用され、これらの各々の開示はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３３３】
Ｂｅｎｔ  ＡＦ，  Ｋｕｎｋｅｌ  ＢＮ，  Ｄａｈｌｂｅｃｋ  Ｄ，  Ｂｒｏｗｎ  ＫＬ，  Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｒ，  Ｇｉｒａｕｄａｔ  Ｊ，  Ｌｅｕｎｇ  Ｊ，Ｓｔａｓｋａｗｉｃｚ  ＢＪ．  （１９９４）  ＲＰＳ２  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ：  ａ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５（５１８０）：  １８５６〜１８６０。
Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ，  Ｗ．Ｆ．，  Ｔｅｒｒａｓ，  Ｆ．Ｒ．，  Ｃａｍｍｕｅ，  Ｂ．Ｐ．，及びＶａｎｄｅｒｌｅｙｄｅｎ，  Ｊ．  （１９９０）．  Ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｆｕｎｇａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６９，  ５５〜６０。
Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ，  Ｗ．Ｆ．，  Ｔｅｒｒａｓ，  Ｆ．Ｒ．，  Ｃａｍｍｕｅ，  Ｂ．Ｐ．，及びＯｓｂｏｒｎ，  Ｒ．Ｗ．  （１９９５）．  Ｐｌａｎｔ  ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ：  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １０８，  １３５３〜１３５８。
Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ，  Ｗ．Ｆ．，  Ｃａｍｍｕｅ，  Ｂ．Ｐ．Ａ．，  Ｄｅ  Ｂｏｌｌｅ，  Ｍ．Ｆ．Ｃ．，  Ｔｈｅｖｉｓｓｅｎ，  Ｋ．，  Ｄｅ  Ｓａｍｂｌａｎｘ，  Ｇ．Ｗ．，及びＯｓｂｏｒｎ，  Ｒ．Ｗ．  （１９９７）．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６，  ２９７〜３２３。
Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓ  Ｗ，  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ＨＪ，  Ｗｅｉｒ  Ｂ，  Ｋａｉｎｅｓ  Ｓ，  Ｓｍｉｔｈ  ＬＭ，  Ｙａｎｇ  Ｗ，  Ｍａｙｅｒ  ＪＥ，  Ｒｏａ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｃ，  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  ＲＡ．．  ２００５．  Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｗｅｒ  ｔｏ  ｐｌａｎｔｓ  ｂｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  ２００５．  Ｎａｔｕｒｅ．  ４３３（７０２６）：６２９〜６３３。
Ｂｕｓｔｉｎ，  Ｓ．Ａ．  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ  （ＲＴ−ＰＣＲ）：  ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  （２００２）  ２９，  ２３〜３９。
Ｃａｌｌｉｓ，  Ｊ，  Ｆｒｏｍｍ，  Ｍ，  Ｗａｌｂｏｔ，  Ｖ．  （１９８７）  Ｉｎｔｒｏｎｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｉｚｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １９８７  Ｄｅｃ；ｌ（１０）：  ｌ  １８３〜２００。
Ｃａｐｐｅｌｉｎｉ，  Ｒ．Ａ．，及びＰｅｔｅｒｓｏｎ，  Ｊ．Ｌ．  （１９６５）．  Ｍａｃｒｏｃｏｎｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ａ  ｎｏｎ−ｓｐｏｒｕｌａｔｉｎｇ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  Gｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ．  Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ  ５７，  ９６２〜９６６。
Ｃａｚｚｏｎｎｅｌｌｉ，  Ｃ．Ｉ．及びＪ．  Ｖｅｌｔｅｎ．  （２００３）  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  Ｉｎｔｒｏｎ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｆｒｏｍ  Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ２１  ：  ２７１〜２８０。
Ｃｏｌｌｉｅｒ，  Ｒ．，  Ｂ．  Ｆｕｃｈｓ，  Ｎ．  Ｗａｌｔｅｒ，  Ｗ．Ｋ．  Ｌｕｔｋｅ，及びＣ．Ｇ．  Ｔａｙｌｏｒ．  （２００５）  Ｅｘ  ｖｉｔｒｏ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｐｌａｎｔｓ：  ａｎ  ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ，  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｏｏｔ  ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ４３：  ４４９〜４５７。
Ｃｏｒｒｅｌｌ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｋｌｉｔｔｉｃｈ，  Ｃ．Ｊ．Ｒ．，及びＬｅｓｌｉｅ，  Ｊ．Ｆ．  （１９８７）．  Ｎｉｔｒａｔｅ  ｎｏｎｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  gｒａｍｉｎｅａｒｕｍ  ａｎｄ  tｈｅｉｒ  ｕｓｅ  iｎ  vｅｇｅｔａｔｉｖｅ  cｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｓ．  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ７７，  １６４０〜１６４６。
ｄａ  Ｓｉｌｖａ  Ｃｏｎｃｅｉｃａｏ，  Ａ．，及びＢｒｏｅｋａｅｒｔ，  Ｗ．Ｆ．  （１９９９）．  Ｐｌａｎｔ  Ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ．  Ｉｎ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ，  Ｓ．  Ｍｕｔｈｕｋｒｉｓｈｎａｎ，  ｅｄ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ），  ｐｐ．  ２４７〜２６０。
Ｄｏｙｌｅ  ＪＪ，  Ｓｃｈｕｌｅｒ  ＭＡ，  Ｇｏｄｅｔｔｅ  ＷＤ，  Ｚｅｎｇｅｒ  Ｖ，  Ｂｅａｃｈｙ  ＲＮ，  Ｓｌｉｇｈｔｏｍ  ＪＬ．  （１９８６）Ｔｈｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｓｅｅｄ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  ａｎｄ  Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２６１（２０）：９２２８〜３８。
Ｆｒａｍｅ，  Ｂ．Ｒ．，  Ｓｈｏｕ，  Ｈ．，  Ｃｈｉｋｗａｍｂａ，  Ｒ．Ｋ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｚ．，  Ｘｉａｎｇ  Ｃ，  Ｆｏｎｇｅｒ，Ｔ．Ｍ．，  Ｐｅｇｇ  ＳＥ，  Ｌｉ  Ｂ，  Ｎｅｔｔｌｅｔｏｎ  ＤＳ，  Ｐｅｉ  Ｄ，及びＷａｎｇ  Ｋ．  （２００２）  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｉｚｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｂｉｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２９（ｌ）： １３〜２２。
Ｇａｏ，  Ａ．，  Ｈａｋｉｍｉ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｍｉｔｔａｎｃｋ，  Ｃ．Ａ．，  Ｗｕ，  Ｙ．，  Ｗｏｅｒｎｅｒ，  Ｍ．Ｂ．，  Ｓｔａｒｋ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｓｈａｈ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｌｉａｎｇ，  Ｊ．，及びＲｏｍｍｅｎｓ，  Ｃ．Ｍ．Ｔ．  （２０００）．  Ｆｕｎｇａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｏｔａｔｏ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏn  ｏｆ  ａ  ｐｌａｎｔ  ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，  １３０７〜１３１０。
Ｇｒａｎｔ  ＭＲ，  Ｇｏｄｉａｒｄ  Ｌ，  Ｓｔｒａｕｂｅ  Ｅ，  Ａｓｈｆｉｅｌｄ  Ｔ，  Ｌｅｗａｌｄ  Ｊ，  Ｓａｔｔｌｅｒ  Ａ，  Ｉｎｎｅｓ  ＲＷ，  Ｄａｎｇｌ，  ＪＬ．  （１９９５）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＲＰＭｌ  ｇｅｎｅ  ｅｎａｂｌｉｎｇ  ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２６９（５２２５）：８４３〜６。
Ｈａｍｍｏｎｄ−Ｋｏｓａｃｋ，  Ｋ．Ｅ．，  Ｕｒｂａｎ，  Ｍ．，  Ｂａｌｄｗｉｎ，  Ｔ．，  ＤａｕｄＩ，  Ａ．，  Ｒｕｄｄ，  Ｊ．Ｊ．，  Ｋｅｏｎ，  Ｊ．，  Ｌｕｃａｓ，  Ｊ．Ａ．，  Ｍａｇｕｉｒｅ，  Ｋ．，  Ｋｏｒｎｙｕｋｈｉｎ，  Ｄ．，  Ｊｉｎｇ，  Ｈ．−Ｃ，  Ｂａｓｓ，  Ｃ，及びＡｎｔｏｎｉｗ，  Ｊ．  （２００４）．  ４ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ．  Ｉｎ  Ｎｅｗ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｐｌａｎｅｔ，  Ｔ．  Ｆｉｓｃｈｅｒ，  Ｔｕｒｎｅｒ，  Ｎ．，  Ａｎｇｕｓ，  Ｊ．，  Ｍｃｌｎｔｙｒｅ，  Ｌ．，  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｍ．，  Ｂｏｒｒｅｌｌ，  Ａ．，  Ｌｌｏｙｄ，  Ｄ．，  ｅｄ  （Ｂｒｉｓｂａｎｅ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ：  Ｔｈｅ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｌｔｄ，  Ｇｏｓｆｏｒｄ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。
Ｈａｎｋｓ，  Ｊ．Ｎ．，  Ｓｎｙｄｅｒ，  Ａ．Ｋ．，  Ｇｒａｈａｍ，  Ｍ．Ａ．，  Ｓｈａｈ，  Ｒ．Ｋ．，  Ｂｌａｙｌｏｃｋ，  Ｌ．Ａ．，  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  Ｍ．Ｊ．，及びＳｈａｈ，  Ｄ．Ｍ．  （２００５）．  Ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ：  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｉｇｎａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ ５８，  ３８５〜３９９。
Ｈｏｒｓｃｈ，  Ｒ．Ｂ．，  Ｊ．Ｅ．  Ｆｒｙ，  Ｎ．  Ｈｏｆｆｍａｎら  （１９８５）  Ａ  ｓｈｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｗｏｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２２７：  １２２９−１２３１
Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ＳＭ，  Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ＡＪ，  Ｄｏｂｓｏｎ  ＭＪ，  Ｍｅｌｌｏｒ  Ｊ，  Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＮＡ．  （１９８５）Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｅｎｇ  Ｒｅｖ．  ３：３７７〜４１６．
Ｋｏｅｈｌｅｒ  ＳＭ，及びＨｏ，ＴＨ．  （１９９０）  Ｈｏｒｍｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｉｎ  ｂａｒｌｅｙ  ａｌｅｕｒｏｎｅ  ｌａｙｅｒｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．  （８）：７６９〜８３。
Ｌａｍ  Ｅ，及びＣｈｕａ  ＮＨ．（１９９１）  Ｔｅｔｒａｍｅｒ  ｏｆ  ａ  ２１−ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｓｅｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｗａｔｅｒ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９１  Ｓｅｐ  １５；２６６（２６）：  １７１３１〜５。
Ｌａｙ，  Ｆ．Ｔ．，及びＡｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｍ．Ａ．  （２００５）．  Ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ  ６，  ８５〜１０１。
Ｌｉａｎｇ，  Ｊ．，  Ｓｈａｈ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｗｕ，  Ｙ．，  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｃ．Ａ．，及びＨａｋｉｍｉ，  Ｓ．Ｍ．  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  ６，９１６，９７０  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ａｌｆａｌｆａ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｐｌａｎｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｆｕｎｇｉ；  ｉｓｓｕｅｄ  Ｊｕｌｙ  １２，  ２００５。
Ｍａｎｋｉｎ，  Ｓ．Ｌ，  Ｇ．Ｃ．  Ａｌｌｅｎ，及びＷ．Ｆ．  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ．  １９９７．  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｌａｎｔ  Ｉｎｔｒｏｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  Ｐｙｒａｌｉｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐ  １５（２）：  １８６〜１９６。
ＭｃＥｌｒｏｙ，  Ｄ，  Ｚｈａｎｇ  Ｗ，  Ｃａｏ  Ｊ，  Ｗｕ  Ｒ．  １９９０．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｃｔｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．  ２，  １６３−１７１
Ｒｅｉｓｅｒ  Ｊ，  Ｇｌｕｍｏｆｆ  Ｖ，  Ｋａｌｉｎ  Ｍ，  Ｏｃｈｓｎｅｒ  Ｕ．  （１９９０）  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔｓ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.；４３：７５〜１０２。
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，及びＲｕｓｓｅｌｌ，  Ｄ．Ｗ．  （２００１）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｏｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｏｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
Ｓｅｏｎｇ，  Ｋ．，  Ｈｏｕ，  Ｚ．，  Ｔｒａｃｙ，  Ｍ．，  Ｋｉｓｔｌｅｒ，  Ｈ．Ｃ．，及びＸｕ，  Ｊ．−Ｒ．  （２００５）．  Ｒａｎｄｏｍ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｇｅｎｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｗｈｅａｔ  ｓｃａｂ  ｆｕｎｇｕｓ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ．  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ９５，  ７４４〜７５０。
Ｓｉｄｏｒｏｖ，  Ｖ，  Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｌ，  Ａｄｄａｅ，  Ｐ，及びＤｕｎｃａｎ，  Ｄ．  （２００６）  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｅｄｌｉｎｇ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｉｚｅ  ｃａｌｌｕｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．  ２００６  Ａｐｒ；２５（４）：３２０〜８。（Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｏｃｔ  ２７）
Ｓｐｅｌｂｒｉｎｋ，  Ｒ．Ｇ．，  Ｄｉｌｍａｃ，  Ｎ．，  Ａｌｌｅｎ，  Ａ．，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｔ．Ｊ．，  Ｓｈａｈ，  Ｄ．Ｍ．，及びＨｏｃｋｅｒｍａｎ，  Ｇ．Ｈ．  （２００４）．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ａｎｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｍｏｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｌａｎｔ  ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １３５，  ２０５５〜２０６７。
Ｔｅｒｒａｓ，  Ｆ．Ｒ．，  Ｓｃｈｏｏｆｓ，  Ｈ．Ｍ．，  Ｄｅ  Ｂｏｌｌｅ，  Ｍ．Ｆ．，  Ｖａｎ  Ｌｅｕｖｅｎ，  Ｆ．，  Ｒｅｅｓ，  Ｓ．Ｂ．，Ｖａｎｄｅｒｌｅｙｄｅｎ，  Ｊ．，  Ｃａｍｍｕｅ，  Ｂ．Ｐ．，及びＢｒｏｅｋａｅｒｔ，  Ｗ．Ｆ．  （１９９２）．  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｎｏｖｅｌ  ｃｌａｓｓｅｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒａｄｉｓｈ  （Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）  ｓｅｅｄｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７，  １５３０１〜１５３０９。
Ｔｈｅｖｉｓｓｅｎ，  Ｋ．，  Ｆｒａｎｃｏｉｓ，  Ｉ．Ｅ．，  Ａｅｒｔｓ，  Ａ．Ｍ．，及びＣａｍｍｕｅ，  Ｂ．Ｐ．  （２００５）．  Ｆｕｎｇａｌ  ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ  ａｓ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ６，  ９２３〜９２８。
Ｔｈｅｖｉｓｓｅｎ，  Ｋ．，  Ｇｈａｚｉ，  Ａ．，  Ｄｅ  Ｓａｍｂｌａｎｘ，  Ｇ．Ｗ．，  Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，  Ｃ，  Ｏｓｂｏｒｎ，  Ｒ．Ｗ．，及びＢｒｏｅｋａｅｒｔ，  Ｗ．Ｆ．  （１９９６）．  Ｆｕｎｇａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｐｌａｎｔ  ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｉｏｎｉｎｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１，  １５０１８〜１５０２５。
Ｔｈｅｖｉｓｓｅｎ，  Ｋ．，  Ｃａｍｒｎｕｅ，  Ｂ．Ｐ．，  Ｌｅｍａｉｒｅ，  Ｋ．，  Ｗｉｎｄｅｒｉｃｋｘ，  Ｊ．，  Ｄｉｃｋｓｏｎ，  Ｒ．Ｃ．，  Ｌｅｓｔｅｒ，  Ｒ．Ｌ．，  Ｆｅｒｋｅｔ，  Ｋ．Ｋ．，  Ｖａｎ  Ｅｖｅｎ，  Ｆ．，  Ｐａｒｒｅｔ，  Ａ．Ｈ．，及びＢｒｏｅｋａｅｒｔ，  Ｗ．Ｆ．  （２０００）．  Ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｅｎｚｙｍｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｔｏ  ａｎ  ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ｐｌａｎｔ  ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ｆｒｏｍ  ｄａｈｌｉａ  （Ｄａｈｌｉａ  ｍｅｒｃｋｉｉ）．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ ９７，  ９５３１−９５３６。
Ｔｈｅｖｉｓｓｅｎ，  Ｋ．，  Ｗａｒｎｅｃｋｅ，  Ｄ．Ｃ．，  Ｆｒａｎｃｏｉｓ，  Ｉ．Ｅ．，  Ｌｅｉｐｅｌｔ，  Ｍ．，  Ｈｅｉｎｚ，  Ｅ．，  Ｏｔｔ，  Ｃ，  Ｚａｈｒｉｎｇｅｒ，  Ｕ．，  Ｔｈｏｍｍａ，  Ｂ．Ｐ．，  Ｆｅｒｋｅｔ，  Ｋ．Ｋ．，及びＣａｍｒｎｕｅ，  Ｂ．Ｐ．  （２００４）．  Ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎｓｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｐｌａｎｔｓ  ｉｎｔｅｒａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｆｕｎｇａｌ  ｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９，  ３９００〜３９０５。
Ｔｈｏｍｍａ，  Ｂ．Ｐ．，  Ｃａｍｒｎｕｅ，  Ｂ．Ｐ．，及びＴｈｅｖｉｓｓｅｎ，  Ｋ．  （２００３）．  Ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．  Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓｏｒｄ  ３，  １〜８。
Ｔｈｏｍｍａ，  Ｂ．  Ｐ．Ｈ．Ｊ．，  Ｃａｍｒｎｕｅ，  Ｂ．Ｐ．Ａ．，及びＴｈｅｖｉｓｓｅｎ，  Ｋ．  （２００２）．  Ｐｌａｎｔ  ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ．  Ｐｌａｎｔａ  ２１６，  １９３〜２０２。
Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．（１９９９）．  Ｅｄ．  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ。
Ｖａｓｉｌ  Ｖ，  Ｃｌａｎｃｙ  Ｍ，  Ｆｅｒｌ  ＲＪ，  Ｖａｓｉｌ  ＩＫ，  Ｈａｎｎａｈ  ＬＣ．  （１９８９）  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｆｉｒｓｔ  ＩｎｔｒｏＮ  ｏｆ  Ｍａｉｚｅ  Ｓｈｒｕｎｋｅｎ−  １  Ｌｏｃｕｓ  ｉｎ  Ｇｒａｓｓ  Ｓｐｅｃｉｅｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １９８９  Ｄｅｃ；９１（４）：  １５７５〜１５７９。
Ｗｅｓｌｅｙ  ＳＶ，  Ｈｅｌｌｉｗｅｌｌ  ＣＡ，  Ｓｍｉｔｈ  ＮＡ，  Ｗａｎｇ  ＭＢ，  Ｒｏｕｓｅ  ＤＴ，  Ｌｉｕ  Ｑ，  Ｇｏｏｄｉｎｇ  ＰＳ，  ＳｉｎｇｈＳＰ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｄ，  Ｓｔｏｕｔｊｅｓｄｉｊｋ  ＰＡ，  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＳＰ，  Ｇｌｅａｖｅ  ＡＰ，  Ｇｒｅｅｎ  ＡＧ，  Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ＰＭ．  （２００１）．  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２７（６）：５８１〜５９０。
【図１】
0006440687.tif 000008
【図２】
0006440687.tif 000009
【図３】
0006440687.tif 000010
【配列表】
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