(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者のふけ症を診断するための非侵襲的方法であって、
ａ）上皮細胞／皮膚細胞サンプルを前記被験者から収集する工程と、
ｂ）前記上皮細胞／皮膚細胞サンプル中のヒトβデフェンシン−２（ｈＢＤ２）バイオマーカーのレベルを検出する工程と、
ｃ）前記上皮細胞中のヒトβデフェンシン−２（ｈＢＤ２）バイオマーカーの量を正常な母集団と比較して定量し、ヒトβデフェンシン−２（ｈＢＤ２）のレベルが、被験者がふけ症を有するか否かを示す工程と、
を含む方法。
【請求項２】
被験者のふけ症を診断するための非侵襲的方法であって、
ａ）哺乳類の上皮に接着物品を貼付する工程と、
ｂ）上皮細胞の該接着物品への付着を可能にする工程と、
ｃ）該接着物品を該哺乳類の上皮から取り外す工程と、
ｄ）抽出のために該接着物品を準備する工程と、
ｅ）前記接着物品に貼付された該上皮細胞からヒトβデフェンシン−２（ｈＢＤ２）バイオマーカーを抽出する工程と、
ｆ）前記接着物品に貼付された該上皮細胞からヒトβデフェンシン−２（ｈＢＤ２）バイオマーカーを測定する工程と、
ｇ）ふけ止め製品の使用の後に前記上皮細胞中の前記ヒトβデフェンシン−２（ｈＢＤ２）バイオマーカーの量を基準時サンプルと比較して定量する工程と、
を含む方法。
【請求項３】
前記上皮細胞／皮膚細胞サンプルの収集は、接着物品、毛抜き、皮膚の洗浄、及びそれらの組合わせからなる群からのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオマーカーのレベルは、前記接着物品上のタンパク質の量で前記バイオマーカーを除すことによって標準化される、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記上皮は角質層を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
バイオマーカーの基準時レベルと比較すると、ふけ止め製品の使用後にバイオマーカーのレベルに変化がある、請求項２、４又は５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
使用前の基準時レベルのバイオマーカーと比較すると、ふけ止め製品の使用後に、標準化されたバイオマーカーに基準時からの変化がある、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
使用前のバイオマーカーの基準時レベルと比較して、ジンクピリチオンシャンプーの使用後に、標準化されたバイオマーカーに変化がある、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
使用前のバイオマーカーの基準時レベルと比較して、硫化セレンシャンプーの使用後に、標準化された分子バイオマーカーに変化がある、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳類はヒトである、請求項２、４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類の皮膚健康における改善に直接、相関しているため、１種類以上の抗微生物ペプチドバイオマーカーのレベル並びにこれらのバイオマーカーの量の結びつきと相関に基づいて、皮膚に対する微生物の攻撃に起因する防御機構に関連する１種類以上のバイオマーカーの量又はその系が環境ホメオスタシスと均衡している尺度を測定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
頭皮／皮膚は、環境性の侵襲に対する防御の最前線として機能する、多数の特殊化した組織から構成される優れた器官系である。初期の研究では主として皮膚のバリア機能に焦点が置かれていたが、この器官は動的であり、ホメオスタシスの維持を助けるために環境のわずかな変化も感知し、それに反応することが明らかとなってきた。日射、汚染などの環境の影響、更にはスキンケア製品の使用により、最終的には数百又は数千の遺伝子の発現における変化につながる事象が複雑に次々と生じることになる。遺伝子発現におけるこれらの変化は一般に、最終的に細胞応答につながる化学反応を触媒するタンパク質生産（又は蓄積、遊離、修飾など）の変化に置き換えられる。これらの化学反応が進行するとき、いかなる化学過程が生じたかを示唆するものとして、代謝副産物がしばしば残される。結果として生じるこれらのタンパク質、及び、特定の皮膚状態、例えばふけ症と相関する小分子バイオマーカーを分析することにより、その状態の理解、並びに皮膚状態の診断及び／又は改善を目的とした製品の開発において、有用な情報を得ることができる。ふけ症は、フレーク化及びかゆみの感覚を伴う、一般的な慢性再発性の頭皮状態である。ふけ症の病理発生は複雑であり、頭皮と、ミクロフローラと、宿主免疫系との間の相互作用の結果であると思われている。この状態に対する以前の研究の多くは、少数の表面レベルの現象を調べることに焦点を置くものであった。従来の専門家及び自己観察に基づく評価が、生物学的レベルにおける表皮の構造及び機能の、大部分が機器に基づいた評価と組み合わされている。新しい生体分子能力により、従来の研究の手段ではこれまで達成できなかった病態生理学的な理解が一定の深さで達成されているが、この状態の重大な症状につながる分子現象の明確な説明はまだ明らかにされていない。これらの重大な分子現象を解明するために、皮膚表面のテープストリッピングに、化学的又は生体分析的方法論を続けることによって、生体分子のサンプル採取が非侵襲的に得られる。ヒスタミンが最近になって、頭皮のかゆみに関する鋭敏なバイオマーカーとして認定された。ふけ症の状態を病態生理学的に更に詳細に説明すると共に、ふけ症の治療学的な解決の程度及び完全性を示す適切な尺度としての役割を果たすために、更なるバイオマーカーが必要とされている。そのような関心分野の１つが抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）である。
【０００３】
抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）は、様々な器官の防御機構に関与する、進化的に保存された分子である。バクテリア、昆虫、植物及び脊椎動物の中で産生されるため、ＡＭＰは多岐にわたる感染病原体から防御する。哺乳類において、これらのペプチド類は、バクテリア、ウイルス、菌類、及び特定の寄生虫から防御する。近年、内毒素の中和、走化性及び免疫調節性の活動、血管形成因子及び傷修復の誘導など、ＡＭＰの新規な生物学的作用が実証されてきた。したがって、これらの分子は、自然免疫系の重要な構成成分であり、バイオマーカーの魅力的な候補でもある。特に皮膚及び頭皮に対して言えば、ＡＭＰは、表皮の物理的構造が損なわれると化学防御又はバリアを発生する能力により、皮膚及び頭皮の健康に重要である。ＡＭＰは、皮膚及び粘膜上皮など、器官の最初のバリアに、そして、濾胞構造及び汗腺など、潜在的に微生物が皮膚に侵入する部位に発現されて、病原菌による宿主組織のコロニー形成を防止する。更に、これらのペプチド類は、食細胞内の顆粒に貯蔵され、ここで、飲み込まれた微生物の死滅を補助する。抗微生物ペプチドが働く作用様式は多様であり、膜の破壊、代謝の妨害、及び細胞質構成成分のターゲティングを含む。ＡＭＰの分類は、その多様性が相当であるために困難である。アミノ酸組成、大きさ、及び立体配座構造に基づいて、ＡＭＰは、αへリックス構造を持つペプチド、ジスルフィド架橋によって安定化されたβシート構造を持つペプチド、拡張構造を持つペプチド、及びループ構造を持つペプチドなど、いくつかのカテゴリーに区分することができる。全てまとめて、これらのＡＭＰの特性により、これらのペプチド類は、新規なバイオマーカーとしての魅力的な候補となっている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の実施形態は、被験者の皮膚健康度を測定するための非侵襲的方法に関するものであり、この方法は、上皮細胞／皮膚細胞サンプルを被験者から収集する工程と、上皮細胞サンプル／皮膚細胞サンプル中の１種類以上の抗微生物ペプチドバイオマーカーのレベルを検出する工程と、１種類以上の抗微生物ペプチドバイオマーカーのレベルに基づいて、皮膚に対する微生物の攻撃に起因する防御機構又はその系が環境ホメオスタシスと均衡している指標を有するとして被験者を診断する工程であって、抗微生物ペプチドバイオマーカーは、Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ２Ｂ  ｔｙｐｅ  １−Ｍ、Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ２Ａ、Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ４、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ１００−Ａ７、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ１００−Ａ８、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ１００−Ａ９、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｇ、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ３（Ｄｅｆｅｎｓｉｎ，ａｌｐｈａ  ３）（ＨＮＰ−３）、Ｄｅｒｍｃｉｄｉｎ、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ７（ＲＮａｓｅ  ７）、ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ  ｄｅｆｅｎｓｉｎ−２（ｈＢＤ−２）及びＢｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ  １０３（ｈＢＤ−３）、或は、表１に記載されている抗微生物ペプチドバイオマーカーからなる群から選択され、ＡＭＰ族は、ＢＰＩ、デフェンシン、ヒストン、孔形成毒素、Ｓ１００タンパク質、細胞毒素、セリンプロテアーゼＳ１、デュアルオキシダーゼ、転写制御、を含む工程と、を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】非ふけ症の被験者とふけ症患者とのｈＢＤ２レベルの比較を示すグラフである。
【図２】ふけ止めシャンプー又は非ふけ止めシャンプーを用いて３週間、処置した後の、ふけ症患者のｈＢＤ２の基準時からの変化を示すグラフである。
【図３】１％  ＺＰＴ含有シャンプーを用いて３週間、処置した後の、ふけ症患者のｈＢＤ２の正常化を示すグラフである。
【０００６】
表１は、関連する抗微生物ペプチドのリストである。
【０００７】
表２は、ｉＴＲＡＱ方法論によって検出された抗微生物ペプチドのリストである。基準時にある非ふけ症、ふけ症患者と、１％  ＺＰＴ含有シャンプー又は１％硫化セレンシャンプーで３週間にわたり処置されたふけ症患者との比較が示されている。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
明細書の各請求項から、その請求範囲は特定され明確にされているが、本発明は、下記記載により、より明確に理解されるであろう。
【０００９】
本発明は、本明細書に記載した本発明の必須要素及び制限事項、並びに本明細書に記載した追加若しくは任意の成分、構成成分又は制限事項のいずれも含むことができ、これらからなることができ、又はこれらから本質的になることができる。
【００１０】
特に断らない限り、比率、部、及び比は全て、本発明の組成物の総重量に基づく。全てのこのような重量は、リスト化された成分に関する場合、活性成分のレベルに基づくものであり、したがって市販材料に包含され得るキャリア又は副生成物を包含しない。
【００１１】
以下では、本発明の様々な実施形態の構成成分及び／又は工程を、任意に加えてもよいものを含めて、詳細に記載する。
【００１２】
引用される全ての文献は、その関連部分において参照により本明細書に組み込まれるが、いずれの文献の引用もそれが本発明に関連する先行技術であることの容認として解釈されるべきではない。
【００１３】
特に記載しない限り、全ての比率は重量比である。
【００１４】
特に記載のない限り、全ての温度は摂氏である。
【００１５】
特に指摘される場合を除き、分量、百分率、部分、及び割合を含む全ての量は、「約」という単語により修正されると理解され、量は有効数字を示すことを意図しない。
【００１６】
特に記載する場合を除き、冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、「１以上」を意味する。
【００１７】
本明細書において「含む」とは、最終結果に影響を与えない他の工程及び他の成分を追加できることを意味する。この用語には、「からなる」及び「から本質的になる」という用語が含まれる。本発明の組成物及び本発明の方法／プロセスは、本明細書に記載した発明の必須要素及び制限事項、並びに本明細書に記載した追加若しくは任意の成分、構成成分、工程、又は制限事項のいずれをも含むことができ、これらからなることができ、及びこれらから本質的になることができる。
【００１８】
本明細書において「有効な」とは、処置する症状の著しく好ましい改善をもたらすのに十分高い対象活性物質の量を意味する。対象活性物質の有効量は、処置する特定の症状、症状の重さ、処置期間、併用している処置の性質及び同様の要因により変化する。
【００１９】
本明細書で用いられるとき、生体分子の「示差レベル」という用語は、任意のレベル増加又はレベル低下を含み得る。一実施形態において、示差レベルは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、あるいはそれ以上、増加したレベルを意味する。
【００２０】
別の実施形態において、示差レベルは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％（すなわち生体分子が存在しない）低下したレベルを意味する。生体分子は、スチューデントｔ検定、ウェルチの２標本のｔ検定又はマッチドペアｔ検定を用いて判定して統計的に有意である（すなわち、≦０．２０（両側）のｐ値を用いて統計的有意性が判定された）示差レベルで表される。
【００２１】
「皮膚」という用語は、脊椎動物の外皮を意味し、２層の細胞、つまり厚い内層（真皮）と薄い外層（表皮）からなる。表皮は、皮膚の外側の非血管層である。表皮は５層の上皮で構成されており、これらは、内から外へ（１）基底層（表皮基底層）、（２）有棘層（表皮有棘層）、（３）顆粒層（表皮顆粒層）、（４）透明層（表皮透明層）、及び（５）角質層（表皮角質層）である。
【００２２】
「サンプル」という用語は、被験者の皮膚又は表皮からの任意の標本を指す。
【００２３】
「非侵襲的」という用語は、診断又は治療のために皮膚又は身体開口部に器具又は装置を挿入することを必要としない手順を意味する。
【００２４】
「接着装置」とは、基材上の接着剤又は接着性物質を用いることにより皮膚の表皮層の除去に用いられる装置を意味する。例えば、Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）（ポリアクリル酸エステル接着剤、ＣｕＤｅｒｍ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ））、Ｄｕｒａｐｏｒ，Ｓｅｂｕｔａｐｅ（商標）（アクリル酸ポリマーフィルム、ＣｕＤｅｒｎ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ））、Ｔｅｇａｄｅｒｍ（商標）、Ｄｕｃｔテープ（３３３ダクトテープ、Ｎａｓｈｕａテープ製品）、Ｓｃｏｔｃｈ（登録商標）Ｔａｐｅ（３Ｍ  Ｓｃｏｔｃｈ  ８１０（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎ．））、Ｄｉａｍｏｎｄ（商標）（Ｔｈｅ  Ｓｅｌｌｏｔａｐｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））、Ｓｅｎｔｅｇａ（商標）（ポリプロピレンテープ、Ｓｅｎｔｅｇａ  Ｅｉｋｅｔｔｅｎ  ＢＶ（Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））などの接着テープを備える皮膚サンプルが用いられてよい。接着剤は、一般に用いられる感圧タイプの接着剤のいずれか又は皮膚含有物（skin content）上で直ちに凝固するもの（シアノアクリレートなど）であってよい。接着剤は、サンプル抽出を容易にするために、可撓性又は固形の裏材上にあってよい。定圧装置（例えば、Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ＣｕＤｅｒｍ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ））を用いて、サンプル抽出中に接着装置に圧力を加えてよい。
【００２５】
組織からのサンプルは、当該技術分野において周知のあらゆる方法によって分離されてよい。サンプルを分離するための侵襲的方法には、例えば血液採取中の針の使用、並びに様々な組織の生検、ブリスター法及びレーザーポレーションが挙げられる。これらの方法の侵襲的性質が原因で、死亡及び罹患リスクが増加する。更に、侵襲的方法は、皮膚の状態に悪影響を及ぼす場合があり、不正確な結果又は誤った結果をもたらし得る。その上更に、侵襲的方法は、大規模な集団での実行が困難である。侵襲的方法は、参加者に不快感をもたらす場合があり、感染又は他の副作用の可能性がより大きいことがある。本発明は、抗微生物ペプチドを皮膚から計測するための非侵襲的方法を提供する。
【００２６】
「客観的に」という用語は、偏り又は先入観がないことを意味する。あるいは、いずれかの専門家による評価又は自己評価は、本質的に「主観的」である。
【００２７】
「正常化」及び／又は「正常化された」という用語は、ふけ症患者の集団が、正常な集団の状態に近づく程度を意味する。
【００２８】
「標準化」及び／又は「標準化された」という用語は、対応する接着剤又は接着物品上で計測されたタンパク質の量に対して表される抗微生物性タンパク質価を意味する。非限定的な例が、ｎｇ抗微生物タンパク質／μｇ可溶性タンパク質である。
【００２９】
「基準時」という用語は、調査開始時に収集され、調査で見出された変化を測定する基となる情報を意味する。基準時のサンプルが、ふけ症患者又は非ふけ症被験者から得られる。
【００３０】
本発明の更なる実施形態では、用いられ得る他の「非侵襲的」サンプル採取法が多数存在する。
【００３１】
Ｓｅｂｕｔａｐｅ（商標）：これは、Ｓｅｂｕｔａｐｅ（商標）（アクリル酸ポリマーフィルム、ＣｕＤｅｒｎ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ））が極めて弱い粘着性を示し、目に見えて炎症を起こしている皮膚にも不快感を与えずに貼付して、取り外すことができるという点で、非侵襲的手法である。この技法により回収／測定されたバイオマーカーは、タンパク質（例えば、サイトカイン）、ペプチド（例えば、神経ペプチド）、及びメディエータを含んでいた。歴史的には、このテープは皮脂収集用に製造販売されているので、脂質分析に有用であり得る。
【００３２】
Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）：Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープはポリアクリル酸エステル接着剤であり、これもまたＣｕＤｅｒｍが製造している。このテープは、Ｓｅｂｕｔａｐｅ（商標）と同一のバイオマーカーの回収に用いられてよいが、特定の表皮構造タンパク質（例えば、ケラチン、インボルクリン）も取り出す。このテープは、全身炎症反応マーカーとしてのコルチゾール及び血清アルブミン、並びに角質層脂質の回収に用いられてきた。
【００３３】
カップスクラブ法：カップスクラブ法は、通常、緩衝液及び非イオン性界面活性剤の存在下で、皮膚の表面からタンパク質を直接抽出する。カップスクラブ法は、主にサイトカインなど可溶性バイオマーカーの回収に用いられるが、有機小分子の回収にも用いられてよい。カップスクラブ法では、テープストリップよりも多くのサイトカインを回収し、定量化することができる。これは以下のいくつかの理由に起因し得る。（ａ）洗剤の存在及びそれらの液体の性質により、カップスクラブ法では、テープストリップでサンプル採取されるものとは異なるタンパク質の集団がサンプル採取される可能性が最も高い。（ｂ）カップスクラブ法を用いると、サイトカインは既に溶液中にあるので、サンプル収集後にサイトカインを更に抽出する必要がない。
【００３４】
毛抜き：毛の抜き取りは、ヒト又は動物の毛を、それらの単位体を所有者の体から通常はピンセットで機械的に引っ張ることによって取り除くプロセスである。毛抜きの小胞領域は、サイトカインなどの可溶性バイオマーカーの回収のために、通常は緩衝液及び非イオン性界面活性剤の存在中に抽出され、また有機小分子を回収するために有機溶剤で抽出され得る。
【００３５】
動物（即ち、イヌ）収集法：Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）：Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（商標）テープサンプルは、イヌの毛皮を（剃毛せずに）分けて、イヌの皮膚上で収集される。皮膚の炎症、分化、及び関門の完全性に関する様々なバイオマーカー、例えば、総タンパク量、可溶性タンパク質、皮膚多項目同時解析（皮膚ＭＡＰ）、皮膚サイトカイン、及び角質層脂質（セラミド、コレステロール、脂肪酸）などがテープから分析されてよい。
【００３６】
本発明の実施形態では、本発明は、抗微生物タンパク質の分離で用いるためのサンプルを非侵襲的に得るための方法及び分析を提供する
【００３７】
ある実施形態では、接着装置の使用は、かかるサンプル採取を達成するために用いられてよい。フケサンプル採取のための、かかるサンプル採取調査に備えて、認定選別員は、基準訪問時に、被験者ごとに粘着性頭皮フレーク化スコア（ＡＳＦＳ）評価を完了し、テープストリップサンプルの採取に関する最高フレーク化オクタントを決定する。最高フレーク化オクタントは、基準時にて、また処置期間の後にサンプル採取される。テープストリップサンプルは、各時点（例えば、基準時及び第３週）で被験者ごとに回収する。
【００３８】
テープストリップによるサンプル採取は、必要に応じて同じ位置で追加の回数を繰り返し、各Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープディスクを前回サンプル採取した領域の上に置く。サンプル収集後のＤ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープは、ラベル付きプレートの適切にラベルが貼られたウェルに入れる。
【００３９】
サンプル採取に続いて、抽出及び定量化手順を実行する。本発明のある実施形態において、Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープサンプルの抽出による抗微生物タンパク質の定量化が、ｉＴＲＡＱタンパク質プロファイリング又は抗体に基づいたアッセイのいずれかによる解析を用いて実施することができる。
【００４０】
ｉＴＲＡＱ（isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation）は、非ゲル性のプロテオミクス手法であり、ＡＢＳｃｉｅｘ社によって最初に開発されたものである。これは、種々の生物学的処理／条件下で１回の実験にてサンプルからタンパク質同定（ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｐｒｏｔｅｉｎ）と相対定量化に同時に用いることができる。この技法は、様々な分子量の４種類又は８種類の同位体標識（isotope-coded covalent tags）を使用して、タンパク質消化からペプチドのＮ末端及び側鎖アミンを標識するものである。種々のサンプル／処置から全てのペプチドを標識した後、サンプルをプールし、ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳなどの液体クロマトグラフィータンデム質量分析法によって分析する。
【００４１】
本発明のこの実施形態において、ｉＴＲＡＱによる抗微生物ペプチド分析の準備におけるサンプル抽出を実施した。
【００４２】
Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープサンプルプレートを、それらをサンプル収集後に貯蔵していた−８０℃のフリーザーから取り出し、ドライアイスの上に置く。接着剤面を内側にして、予めラベル付けされたポリプロピレン採取管にテープストライプを挿入する。
【００４３】
５％の酢酸を含有する抽出緩衝液を各採取管に加え、次いで超音波処理を用いて抽出する。必要な場合、抽出溶液を含んだ採取管に更なるテープを入れ、この抽出プロセスを、サンプルを濃縮する手段として繰り返す。各抽出溶液をテープストリップから分離し、各サンプルのアリコートを、分析のために、予めラベル付けされたポリプロピレン採取管の中に入れ、−８０℃で凍結させる。ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社カタログ番号２３２２７）を使用した可溶性タンパク質分析のために、別のアリコートを指定する。
【００４４】
抽出プロセスに続いて、製造業者推奨の手順に従ってｉＴＲＡＱ標識−ｉＴＲＡＱアッセイを実施する。簡潔に言えば、各条件から得た約１０〜５０μｇの等量のタンパク質を、トリプシン酵素を用いて３７℃にて終夜、還元、アルキル化、及び消化する。質量分析法を用いた更なるタンパク質同定及び定量化のために、各消化物を特定のｉＴＲＡＱ試薬（例えば試薬１１３、１１４など）で標識し、次いで互いに混合して単一のサンプル混合物を生成する。
【００４５】
本発明のある実施形態において、多重化されたｉＴＲＡＱ標識サンプルは、Ｔｅｍｐｏ  ＬＣ−ＭＡＬＤＩスポッターシステム（ＡＢＳｃｉｅｘ）又はＷａｔｅｒｓ  ＣａｐＬＣ−Ｐｒｏｔｅｉｎｅｅｒ  Ｓｐｏｔｔｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を使用して１μｌ／ｍｉｎ〜５μｌ／ｍｉｎの低流量ＬＣ分離にさらす。カラム（Ｍｅｒｃｋ社の０．１ｍｍ×１５ｃｍの一体式シリカカラム）から流出したペプチドを、ＭＡＬＤＩマトリックス（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸−ＣＨＣＡ）と連続的に混合し、自動的にＭＡＬＤＩプレート上に斑点として付ける。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ分析をＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＭＡＬＤＩ  ＡＢ４８００  Ｐｌｕｓ又はＢｒｕｋｅｒ  ＵｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦシステムのいずれかで実施する。ＭＳ及びＭＳ／ＭＳデータを収集する。タンパク質同定及び相対定量化を、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔソフトウェア（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）又はＭａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）とＷａｒｐＬＣソフトウェア（Ｂｕｒｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）のいずれかによって行う。タンパク質同定に関しては、ＭＡＬＤＩ  ＡＢ４８００  Ｐｌｕｓデータ用のＵｎｉｐｒｏｔ及びＵｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ  ＭＡＬＤＩデータ用のＮＣＢＩｎｒに対してデータセットを探索する。相対定量化に関しては、ＭＳ／ＭＳスペクトルのｉＴＲＡＱレポーターイオンの信号を、同定したペプチドの相対的存在量（比）の算出に使用する。特定のタンパク質から得たペプチドの混合比は、そのタンパク質の相対定量化を表す。質量分析データの全ては、供給業者のソフトウェアパッケージをいかなる改良もなしに使用して、初期に自動的に処理する。タンパク質の相対定量化（表２）のためにｉＴＲＡＱ比を算出するため、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．）を使用して質量分析データを更に処理する。次いで化合物の相対定量化値をサンプル体積に従って調節し、上で説明したようにＢＣＡタンパク質アッセイで測定した、抽出物中の可溶性タンパク質の量に合わせて標準化する。
【００４６】
本発明のこの実施形態において、抗体に基づいたアッセイによる抗微生物ペプチド分析の準備におけるサンプル抽出を実施した。
【００４７】
抗体に基づいたイムノアッセイのために、適切な標準抽出緩衝液を各採取管に加え、次いで超音波処理を用いて氷上で抽出する。各抽出溶液をテープストリップから分離し、各サンプルのアリコートを９６ウェルのポリプロピレンプレートの指定位置に入れる。次に、Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープサンプルのアリコートにアルブミンなど従来の試薬を補充して実験機器の壁に検体が付着して失われるのを防ぎ、９６ウェルのポリプロピレンディープウェルプレートに移し−８０℃で凍らせる。別個のアリコートには試薬を補充せず、ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２３２２７）を用いて可溶性タンパク質を分析する。
【００４８】
抽出プロセスに続いて、従来の方法を用いて適切な標準物質及び対照群を調製することができる。ＡＭＰは、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプラットフォーム上でイムノアッセイによって定量化する。結果は、ＡＭＰ／テープストリップの質量として報告するか、テープストリップ抽出物にも見られるタンパク質の量でＡＭＰの量を除して標準化してよい。タンパク質法については、別途記載している。データ分析は、標準的な統計的手法及び計算によって実行する。
【００４９】
方法の拡張
用いた抽出手順は上述したが、上述のアウトラインが示された多数の工程に用いることができる別の方法が多数存在し、これらの方法は、論理的拡張である。テープストリップからＡＭＰ（抗微生物タンパク質を意味する）を分離するために用いた抽出溶媒は、好適な回収をもたらす、任意の適切な水性、有機、又は有機／水性混合物であってよい。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ及びＧＣ／ＭＳ／ＭＳは、その高い選択性及び感度のために、生体マトリックスにおける有機分子の定量分析の最新手法として一般に見なされている。しかしながら、要求される感度と選択性をもたらす任意生体分析的技法及び／又は他の手法、例えば、ｉＴＲＡＱ標識に続く液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化質量分析、ラベルフリー定量的質量分析（Label-Free Quantitation Mass Spectrometry）及び多重反応モニタリング（ＭＲＭ）質量分析法が用いられてもよい。例えば、ＮＭＲ、キャピラリー電気泳動、超臨界液体、及び他のクロマトグラフィー技法及び／又はそれらの組合わせを含め、ＡＭＰを評価するための他の方法が用いられてきた。同様に、質量分析、電気化学的アッセイ、及び蛍光アッセイなど分離技術を用いない機器による方法も用いられてきた。更に、競合及び非競合酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などリガンド結合法又は他の標識化スキームも用いられてきた。酵素に基づいたアッセイ及び抗体に基づいたアッセイが、ＡＭＰなどの分析において長年にわたって用いられてきた。細胞又は組織のいずれかを使用する方法を用いるバイオアッセイも、検出手段として用いられてきた。本発明のある実施形態において、毛抜きによる抗微生物タンパク質の定量化は、テープストリップサンプルに用いられるものと同じ基本的抽出及び分析法で実行することができる。
【００５０】
テープストリップ抽出物のタンパク質定量：
上記の好適な方法を用いて測定した皮膚のテープストリップサンプル上のＡＭＰのレベルは、テープストリップ抽出物に見られるタンパク質の量を用いて標準化してよい。標準化は、テープストリップ抽出物中のタンパク質の量で抗微生物タンパク質レベルを除して行う。
【００５１】
テープストリップ抽出物又は皮膚上での抗微生物ペプチドレベルの定量化に用いた等価マトリックス中のタンパク質の量は、文献に記載されている様々なタンパク質定量法を用いて定量化してよい。かかる方法の例としては、任意の比色分析法、蛍光法、発光法を使用する総窒素定量、総アミノ酸定量、及びタンパク質定量が挙げられる。これらの方法は、タンパク質定量前のテープストリップ抽出物の更なるサンプル調製を含んでも含まなくてもよい。テープストリップ抽出物中のタンパク質定量に用いる特定の方法の非限定例については、下記に述べる。タンパク質定量法の包括的なレビュー、適用性、及び制限は、ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ／Ｆｉｌｅｓ／１６０１６６９＿ＰＡｓｓａｙＦＩＮＡＬ＿Ｉｎｔｌ．ｐｄｆからダウンロードできるＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。タンパク質定量化に関する更なる情報は、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｒｅｄｉｎｂａｕｇｈ，Ｍ．Ｇ．ａｎｄ  Ｔｕｒｌｅｙ，Ｒ．Ｂ．（１９８６）、Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｗｉｔｈ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅｓ  ａｎｄ  ｓｕｃｒｏｓｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｆｒａｃｔｉｏｎｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５３，２６７〜２７１に見出すことができる。
【００５２】
ヒトの皮膚からサンプル採取した接着テープは、ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質含有物を抽出し、分析する。ヒトの皮膚からサンプル採取したテープストリップは、通常の抽出緩衝液で抽出する。以降の抽出では、テープ抽出物のアリコートを９６ウェルのポリプロピレンディープウェルプレートに移し入れ、タンパク質定量に備えて２〜８℃で保管する。
【００５３】
ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔは、アルカリ媒質中のタンパク質によるＣｕ2+のＣｕ1+への還元を基本としており、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）によるＣｕ+1の高感度かつ選択的な比色検出を併用する。２個のＢＣＡ分子と１個のＣｕ1+イオンのキレート化によって形成された紫色の反応生成物は、波長５６２ｎｍで強い吸光度を示す。光学密度（ＯＤ）は、マイクロプレートリーダーを用いて測定する。１ミリリットル当たりのマイクログラム（μｇ／ｍＬ）で表されるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の濃度を増加させて、測定時に較正曲線を生成するために用いる。ＢＳＡ原液から調製された適切な分析用ＱＣを用いて、サンプル分析中に分析性能をモニタリングする。
【００５４】
本発明の別の実施形態では、タンパク質定量は、ＳｑｕａｍｅＳｃａｎ（登録商標）８５０Ａ（ＣｕＤｅｒｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ））を用いたタンパク質測定値など接着剤又は接着物品上のタンパク質の直接測定により行われてもよい。
【実施例】
【００５５】
ＡＭＰ分析の基本手順
被験者が認定選別員によって評価されて、被験者の頭皮状態が確定される。ふけ症の被験者は、認定選別員が評価する可視のフレーク化のレベルで識別する。非ふけ症の健康な頭皮の被験者は基準時で評価して、各バイオマーカーの規格化レベルを確定する。被験者は、２つの別個の臨床研究（調査番号１及び調査番号２）において認定選別員によって識別する。調査番号１において、ｈＢＤ２レベルに関して基準時で評価された非ふけ症の被験者が６０人いる。１１９人のふけ症患者をＺＰＴ  １％含有のふけ止めシャンプーに配し、１１５人のふけ症患者を硫化セレン１％含有のふけ止めシャンプーに配し、６０人のふけ症患者をふけ止め活性剤を含有しない非ふけ止めシャンプーに配する。被験者は、基準時にそして３週間の製品使用後にヒトβデフェンシン２（ｈＢＤ２）に関して評価する。
【００５６】
調査番号２において、１２１人の非ふけ症被験者、３１１人のふけ症被験者をＺＰＴ１％含有シャンプーに配し、６３人のふけ症被験者を硫化セレン１％含有のシャンプーに配する。各群のテープストリップサンプルを、ｉＴＲＡＱ方法論を用いて分析する。
【００５７】
ふけ症被験者は、ふけ止めシャンプー（１％のジンクピリチオン又は１％の硫化セレンを含有するか、あるいはふけ止め活性剤を含有しないシャンプー組成物）を用いた３週間の治療期間を受け、テープストリップサンプルは、基準時の来院にて認定選別員によって判定された最高フレーク化オクタントから収集する。ふけ症被験者の場合、頭皮テープストリップは、基準時に、また３週間の製品治療の後に採取する。非ふけ症被験者の場合、頭皮テープストリップは基準時にのみ採取する。テープは、抽出時まで−８０℃に保つ。フケが含まれる位置は、髪を分けて、Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープ（ＣｕＤｅｒｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を貼付し、必要に応じてテープを擦りつけることによってサンプル採取する。非ふけ症被験者の場合、フレークのない位置でサンプル採取する。テープは、予めラベル付けされた１２ウェルの培養皿に入れて保管する。
【００５８】
サンプルは従来の抽出緩衝液を用いて抽出し、氷上で超音波処理する。次いでＤ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープサンプルの抽出物のアリコートを、予めラベル付けされたポリプロピレン採取管に移し、分析のために−８０℃で凍らせる。ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社カタログ番号２３２２７）を使用した可溶性タンパク質分析のために、別のアリコートを指定する。
【００５９】
抽出に続いて、ｉＴＲＡＱ分析又はイムノアッセイに基づく方法により、タンパク質発現プロファイリングに関してサンプルを分析する。化合物の相対定量化値は、上で説明したようにＢＣＡタンパク質アッセイで測定した、抽出物中の可溶性タンパク質の量に合わせて標準化する。分析は、ふけ止めシャンプー治療群に対しては基準時及び第３週のサンプルで、非ふけ症群に対しては基準時のみで実施する。ＡＭＰはｉＴＲＡＱによって検出し、Ｕｎｉｐｒｏｔ及びＮＣＢＩｎｒデータベースにある対応する既知の化学構造に基づいて識別する。ＡＭＰは、個々のＡＭＰに合わせて特別に設計されたＭｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプラットフォームでイムノアッセイを用いて、適切な標準物質及び対照群を用いた免疫学に基づくアッセイによって定量化する。マッチドペアＴ検定を用いて、非ふけ症（健康）被験者と、ふけ症基準時と、ふけ症治療した被験者との間の差異を分析する。ふけ症治療した被験者を非ふけ症と比較して、ふけ止め製品を用いた治療後の正常化の程度を判断する。
【００６０】
結果の概要
データの統計分析：データは、基準時及び第３週（治療後）のフケ被験者並びに基準時の非フケ被験者について回収した。被験者間並びに被験者内（基準時−＞第３週）での分析物レベルの大幅な変動を考慮すると、分析前にデータをｌｏｇ１０スケールに変換することがより効率的である。統計分析は、対応するｌｏｇ１０比値（すなわち、ｌｏｇ１０（第３週／基準時））に基づいて実行する。次に、最終的に報告された結果を元のスケール（又は、基準時値からの％変化）に再変換して、解釈を容易にする。全ての統計分析は、ＳＡＳ  ＪＭＰ（バージョン７．０．２）ソフトウェアを用いて実行する。統計的有意性の判定には、ｐ値は≦０．２０（両側）を用いる。
【００６１】
該当する抗微生物ペプチドを表１に示す。表１には、ＵｎｉＰｒｏｔによって分類及び確認した８４種類の抗微生物ペプチドが含まれている。重複のないＵｎｉＰｒｏｔ  Ｅｎｔｒｙ名が、一般的に用いられているタンパク質名と共にリスト化されている。また、この調査においてｉＴＲＡＱで確認された１１種類のタンパク質が表１に示されている。ｉＴＲＡＱによって確認された１１種類のタンパク質のうちの７種類は既知のＡＭＰと一致する。それらは、Ｐ８１５３４（ＨＢＤ３）、Ｐ５９６６６（ＨＮＰ−３）、Ｐ８１６０５（ダームシジン）、Ｐ０５１０９（Ｓ１００Ａ８）、Ｐ０６７０２（Ｓ１００Ａ９）、Ｐ０８３１１（カテプシンＧ）、及びＱ９Ｈ１Ｅ１（ＲＮアーゼ７）である。ｉＴＲＡＱによって確認された抗微生物タンパク質は、分類されているＡＭＰの大多数を占めている。
【００６２】
表２は、この調査においてｉＴＲＡＱによって確認された１１種類のタンパク質を列挙しており、これらは各群の間で少なくとも１つの統計的に有意な差を有している。表２のこれらのタンパク質のうちのいくつかは、ＡＭＰとして公式に分類されていないが、これらのタンパク質がＡＭＰとして機能することを示唆する多数の文献引用があり、それぞれ本明細書に援用される（Ｌｅｅ  ＤＹ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ４  ｉｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｂｏｃｙｔｅｓ  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００９  Ｏｃｔ；１２９（１０）：２４８９〜９６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｊｉｄ．２００９．１０６．Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｊｕｎ  １８（本明細書に援用）；Ｐａｖｉａ，ＫＥ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｖｅｌ  Ｈｉｓｔｏｎｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｕｓｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １８１８，Ｉｓｓｕｅ  ３，Ｍａｒｃｈ  ２０１２，Ｐａｇｅｓ  ８６９〜８７６（本明細書に援用）；Ｇｌａｓｅｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｓｏｒｉａｓｉｎ（Ｓ１００Ａ７）ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６，５７〜６４（２００４）．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ：２８  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００４；｜ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ１１４２（本明細書に援用））。
【００６３】
報告されている抗微生物機能に加えて、それらの分子構造は、いくつかの既知のＡＭＰ族（例えばヒストン及びＳ１００タンパク質）と類似している。表２のデータは、基準時における非ふけ症及びふけ症被験者及びＺＰＴ１％含有又は硫化セレン１％含有シャンプーのいずれかで治療されたふけ症被験者に対する、３週間の治療対基準時の、ｉＴＲＡＱ方法論によって識別された抗微生物ペプチドの比率及び関連するｐ値を示している。加えて、治療されたふけ症被験者と非ふけ症被験者との比較が、健康状態に向かう正常化の指標として示されている。
【００６４】
次の抗微生物ペプチド、つまり、ヒストンＨ２Ｂ型１−Ｍ、ヒストンＨ２Ａ、ヒストンＨ４、タンパク質Ｓ１００−Ａ７、タンパク質Ｓ１００−Ａ８、タンパク質Ｓ１００−Ａ９、カテプシンＧ、好中球デフェンシン３（デフェンシン、α３）（ＨＮＰ−３）、ダームシジン、リボヌクレアーゼ７（ＲＮアーゼ７）、及びβデフェンシン１０３（ｈＢＤ−３）が識別されている。比率＞１で示されるように、非ふけ症に対してふけ症の際に低くなるダームシジンを除き、ＡＭＰの全てが、基準時においてふけ症の際に非ふけ症に対して上昇している。ＺＰＴ  １％又は硫化セレン１％を含有するふけ止めシャンプーで治療した後、これらの比率は、ふけ症の際に上昇するＡＭＰの全てに対して低下しており、改善が示されている。ダームシジンは基準時に対して増加しており、改善が示されている。ふけ症治療された被験者のレベルを非ふけ症被験者と比較すると、ＡＭＰの多くは、≦１（又はダームシジンの場合は≧１）の比率で示される、健康な頭皮に関連付けられるレベルに戻っている。
【００６５】
図１のデータは、ふけ症のｈＢＤ２レベルが非ふけ症のレベル（ｐ値＝＜０．０００１）よりも相当に高いことを示している。これらのｈＢＤ２レベルは、テープストリップ抽出物中のタンパク質の量で除されている。ｈＢＤ２レベルは、正常な皮膚のｈＢＤ２レベルを確立するように、独立した非ふけ症群から決定される。
【００６６】
図２のデータは、３週間の期間にわたるふけ止めシャンプーを用いた治療後には、基準時レベル（ｐ値＜０．０００１）に対して、ｈＢＤ２レベルに３３％の減少があることを示している。レベルを非ふけ症の母集団と比較することによって明らかとなるように、ｈＢＤ２の減少は改善と一致するものである。ふけ止めシャンプーは、非ふけ止めシャンプー（ｐ値＝０．０４６）に対して相当な改善を示している。上述の好適な方法論を用いて測定した、ヒトの皮膚のテープストリップサンプル上におけるｈＢＤ２のレベルは、テープストリップ抽出物に見られるタンパク質量を用いて標準化することができる。これらのｈＢＤ２レベルは、テープストリップ抽出物中のタンパク質の量で除されている。
【００６７】
図３のデータは、ふけ止め治療により、ｈＢｄ２レベルが減少して、図１にて上で論じた非ふけ症群により一致していることを示している。ふけ症母集団は、正常化した及び／又は健康な状態により一致した値に戻ることを望んでいるため、これは利点を伝達する有用な手段となる。
【００６８】
特定の実施形態において、そのような性能評価は、治療前後の被験者の皮膚の健康状態をふけ止め組成物と比較するために有利となり得る。例えば、あるふけ止め組成物は、被験者が特定のふけ止め組成物又は療法に切り替え、それを維持する場合に被験者が体験する、より迅速な緩和を促進し得る。被験者の特定の皮膚健康の利点を客観的に測定する評価により、特定のふけ止め組成物又は療法を用いる治療の前と、被験者が特定のふけ止め組成物又は療法に切り替えた後とで、被験者の状態を比較することが可能になる。加えて、そのような評価は、特定の治療又は療法が促進する特定の皮膚健康の利点に関する主張を支持する、補助的な認定ツールとしても用いられ得る。例えば、特定の組成物又は療法を、かゆみの症状を軽減するものとして奨励する場合、本明細書で開示した評価を用いて、特定の健康上の利点に関する主張を支持し、かゆみから生じる被験者の不快感が軽減したことを示し得る。ふけ止め組成物又は療法によって恩恵を受け得る皮膚の健康の非限定的な要素には、かゆみ、フレーク化、刺激、皮膚保護の完全性、乾き、酸化ストレスと酸化ダメージ、自己防衛、自然保護が含まれる。
【００６９】
多くの分析結果がまた、特定の製品、製品の組合わせ、及び技術の有効性を販売促進するために、市場開発又は宣伝の情報としても用いることができる。本発明によって実証され得る、製品包装上に配し得る宣伝文句の例には、限定するものではないが、立証に関する宣伝文句（例えば、「臨床的に証明された」又は「試験から明らか」）、使用前後に関する宣伝文句（例えば、「使用後にふけが５０％減」）、単一の宣伝文句、比較に関する宣伝文句、倍数に関する宣伝文句（例えば「ふけが３分の１に減少」）、及び予防と治療に関する宣伝文句が挙げられる。例えば、製品パッケージでは分析結果について述べ、客観的に証明された製品の有効性又は比較結果を説明してもよい。また、分析データが種々の療法に関連する臨床情報に用いられてもよく、それらの療法は種々の製品又は製品群と共に用いられても用いられなくてもよい。
【００７０】
更なる実施形態では、使用前のバイオマーカーの基準時レベルと比較して、ジンクピリチオンシャンプーの使用後に、標準化されたバイオマーカーに変化がある。別の実施形態では、使用前のバイオマーカーの基準時レベルと比較して、硫化セレンシャンプーの使用後に、標準化された分子バイオマーカーに変化がある。更なる実施形態において、治療後に正常な母集団と比較して皮膚の健康に少なくとも５％の改善を確立するバイオマーカーの測定値が存在し得る。更なる実施形態において、治療後に正常な母集団と比較して、皮膚の健康に少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、更には１００％の改善が存在し得る。別の実施形態において、ふけ症と非ふけ症（治療なし）との間に少なくとも５％の差が存在し得る。更に、ふけ症と非ふけ症との間に少なくとも１０％の差が、ふけ症と非ふけ症との間に少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の差が、更にはふけ症と非ふけ症との間に１００％の差が存在し得る。
【００７１】
本明細書に開示した寸法及び値は、記載された正確な数値に厳密に限定されるものだと理解されるべきではない。むしろ、特に断らない限り、そのような寸法のそれぞれは、記載された値及びその値の周辺の機能的に同等の範囲の両方を意味するものとする。例えば、「４０ｍｍ」として開示される寸法は、「約４０ｍｍ」を意味することを意図する。
【００７２】
「発明を実施するための形態」で引用する全ての文献は、関連部分において本明細書に参照により組み込まれるが、いずれの文献の引用も、それが本発明に関する先行技術であることを容認するものとして解釈されるべきではない。本明細書中の用語の任意の意味又は定義が、参照により組み込まれた文献中の同一用語の任意の意味又は定義と相反する限りにおいては、本明細書においてその用語に与えられた意味又は定義を適用する。
【００７３】
本発明の特定の実施形態が例示され記載されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の様々な変更及び修正を実施できることが、当業者には自明であろう。したがって、本発明の範囲内にあるそのような全ての変更及び修正を添付の特許請求の範囲で扱うものとする。
【００７４】
【表１−１】
0006336565.tif 000002
【００７５】
【表１−２】
0006336565.tif 000003
【００７６】
【表１−３】
0006336565.tif 000004
【００７７】
【表１−４】
0006336565.tif 000005
【００７８】
【表１−５】
0006336565.tif 000006
＃  ＵｎｉＰｒｏｔ  ＡＭＰリストにはまだ含まれていないが、その抗微生物機能が言及されているタンパク質（ｒｅｆ）
【００７９】
【表２】
0006336565.tif 000007
凡例：
Ｄ＝ふけ症
ＮＤ＝非ふけ症
ＺＰＴ＝１％  ＺＰＴシャンプー
硫化セレン＝１％硫化セレンシャンプー
ＮＡ＝分析せず
【図１】
0006336565.tif 000008
【図２】
0006336565.tif 000009
【図３】
0006336565.tif 000010