(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
改善されたMAT（iMAT）分子であって、
（i）細胞外空間から細胞の内部へのiMAT分子の移行を可能にするアミノ酸配列である、少なくとも1つの第一のモジュール、
（ii）抗原のプロセッシング及び/又はMHC分子の抗原によるローディングに関与する細胞小器官へのiMAT分子の種特異的細胞内標的誘導を可能にするアミノ酸配列である、少なくとも1つの第二のモジュール、及び
（iii）少なくとも1つの抗原の少なくとも1つの完全又は部分的エピトープに由来し、そのようなiMAT分子によって調節される免疫応答の特異性を決定するアミノ酸配列である、抗原モジュールとして少なくとも1つの第三のモジュール、を含み、
前記iMAT分子全体において全てのシステイン残基が異なるアミノ酸残基で置換されていることを特徴とする、前記改善されたMAT分子。
【請求項２】
少なくとも１つのシステイン残基又は全てのシステイン残基が、セリン、ロイシン、イソロイシンおよびアスパラギン酸から選ばれる異なるアミノ酸残基で置換されている、請求項１に記載のiMAT分子。
【請求項３】
モジュールの全てが互いに共有結合で連結され、第一、第二及び/又は第三モジュールの2つ以上の隣接するモジュール間で追加のスペーサーモジュールが全く存在しない、請求項１又は２に記載のiMAT分子。
【請求項４】
少なくとも1つの第二のモジュールがウマのインバリアント鎖を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載のiMAT分子。
【請求項５】
少なくとも1つの第二のモジュールが配列番号:2、15又は16のアミノ酸配列の1つ以上から成る、請求項４に記載のiMAT分子。
【請求項６】
少なくとも1つの抗原モジュールが、ウマでアレルギーを誘引する少なくとも1つのアレルゲンに由来する少なくとも1つの完全又は部分的エピトープを含み、及び/又は、カビ（菌類及び/又はその胞子）、花粉、ハウスダスト又は飼い葉ダニ（及び/又はその糞）に由来する少なくとも1つアレルゲンの少なくとも１つの完全又は部分的エピトープを含む、請求項１から５のいずれか１項に記載のiMAT分子。
【請求項７】
少なくとも1つの抗原がCul n4、Cul o1、Cul o2、Cul o3、Cul o4、及び/又はCul o7アレルゲンである、請求項６に記載のiMAT分子。
【請求項８】
少なくとも1つの抗原モジュールが、ウマの1つ以上の感染症を誘引する病原体の少なくとも1つの抗原に由来する少なくとも1つの完全又は部分的エピトープを含む、請求項１から５のいずれか１項に記載のiMAT分子。
【請求項９】
さらに、少なくとも1つのタグモジュールを含む、請求項１から８のいずれか１項に記載のiMAT分子。
【請求項１０】
少なくとも１つのタグモジュールが1つのメチオニン残基の後のN-末端側に存在する1つのHis-タグである、請求項９に記載のiMAT分子。
【請求項１１】
少なくとも1つの第一のモジュールが、HIV-tat、VP22及び/又はアンテナペディアのアミノ酸配列又はその部分配列を含み、ただしそのような少なくとも1つの第一のモジュールが、細胞外空間から細胞の内部への該iMAT分子の移行のためのモジュールとして機能することを条件とする、請求項１から１０のいずれか１項に記載のiMAT分子。
【請求項１２】
モノマー形及び/又は線状形で存在する、請求項１から１１のいずれか１項に記載のiMAT分子。
【請求項１３】
配列番号:7、8、9、10、11、12、13、14、17、20、21、22又は23に記載のアミノ酸配列の1つ以上を含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載のiMAT分子。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか１項に記載のiMAT分子を含む、ワクチン又は免疫原性組成物又は医薬組成物。
【請求項１５】
ウマの1つ以上のアレルギーの予防及び/又は治療のための、請求項１４に記載のワクチン又は免疫原性組成物又は医薬組成物。
【請求項１６】
ウマの1つ以上のアレルギーが昆虫咬傷過敏症（IBH）及び/又は再発性気道閉塞（RAO）である、請求項１５に記載のワクチン又は免疫原性組成物又は医薬組成物。
【請求項１７】
ウマの1つ以上の感染症の予防及び/又は治療、及び/又はウマの1つ以上の感染症の伝播の予防、及び/又はベクターによるウマの1つ以上の感染症の伝播の予防、のための請求項１４に記載のワクチン又は免疫原性組成物又は医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１から１３のいずれか１項に記載されたiMAT分子をコードする核酸。
【請求項１９】
請求項１８に記載の少なくとも1つの核酸を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１８に記載の少なくとも1つの核酸及び/又は請求項１９に記載の少なくとも1つのベクターを含む初代細胞又は細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（単離）組換えタンパク質（改善MAT（iMAT）分子とも称される）に関し、前記は少なくとも1つの移行モジュール、少なくとも1つの標的誘導モジュール及び少なくとも1つの抗原モジュールを含み、ここで少なくとも1つのシステイン残基が異なるアミノ酸残基で置換される。iMAT分子は、実質的に少ない製造労力で生産が可能であり、種特異的でより安全でかつ免疫学的に非常に有効である。そのような（単離）組換えタンパク質は、特にワクチンとして、例えばアレルギー及び/又は感染症の治療及び/又は予防、及び/又はウマの感染症の伝播の予防のために有用である。
【背景技術】
【０００２】
抗原提示細胞（APC）による抗原のプロセッシングは2つの異なるルートで生じる。細胞内に存在する抗原はMHCI（主要組織適合性複合体クラスI、MHCクラスI）分子によって細胞表面で提示され、一方、細胞外抗原はMHCII（主要組織適合性複合体クラスII、MHCクラスII）分子によって細胞表面で提示される。両メカニズムは抗原に対する宿主の免疫応答を開始させる。細胞内部への取り込みからMHCII-抗原複合体の形で細胞表面に提示されるまでの抗原がたどるルートは、多様な細胞小器官（とりわけ小胞体、ゴルジ装置、トランスゴルジネットワーク、リソソーム、エンドソーム、及びMHCクラスII区画（MIIC））を介して進行する。MIICはMHCII媒介抗原提示で重要な部分を担う。細胞のこれらの小器官で、MHCII分子は、低分子量抗原又はタンパク質のタンパク分解フラグメントをロードされる。このプロセスでは、最初にMHCII分子と結合するインバリアント鎖（MHCIIガンマ鎖又はIiとも称される）はタンパク分解性の分解を受け、抗原は、多様なタンパク質（MHCIIと直接又は間接的に結合する）による調節の下でMHCII分子と結合する。ヒトでのこれらの調節性分子にはとりわけHLA-DM、HLA-DO、LAMP-1、LAMP-2、CD63、CD83などが含まれる。これらのタンパク質の正確な機能はこれまでのところ部分的には不明であるが、それらの多くはシグナル配列を有し、前記配列はそれらタンパク質のリソソーム、エンドソーム、トランスゴルジネットワーク、MIICなどへの輸送を促進する。抗原をMHCII分子によって提示することができるように、必要とされるタンパク分解性プロセッシングに多数のプロテアーゼが関与する。MIICに存在するプロテアーゼにはとりわけカテプシンファミリーの多様なメンバー、例えばカテプシンS及びカテプシンLが含まれる。ヒト以外の種では、MHCクラスII分子ホモローグは種々のアミノ酸配列を有する。ウマ科の動物では、MHC系の編成はヒトと類似し、連続するクラスI、III及びII領域を有する（Kelley J et al., Immunogenetics 2005, 56: 683-695）。
【０００３】
免疫応答を調節するモジュール型抗原輸送（MAT）分子、その関連構築物、方法及び使用を提供する概念はWO2004/035793（米国ではUS2005/0281816）に開示されている。前記文書は三部分分子（MAT分子）の有用性を記載する（前記分子は細胞に抗原エピトープを導入し、したがってそのようなMAT分子によって調節されるべき免疫応答を決定する）。それには多様な移行モジュール、標的誘導モジュールの他に抗原モジュールが記載されている。この技術及びその基本的方法は、第一に抗原を標的細胞の細胞外空間から細胞内空間に効率的に搬送すること、第二に細胞内部に到着後、細胞が細胞小器官に効率的に到達し続いて抗原提示のために処理されることを可能にする。一般的には、二段階プロセスを利用して対象動物で免疫応答を標的誘導し効率的に調節することができる。MAT分子の使用は例えば以下に開示されている：Martinez-Gomez JM et al. Allergy 2009, 64(1): 172-178；Rose H (Arb Paul Ehrlich Inst Bundesinstitut Impfstoffe Biomed Arzneim Langen Hess, 2009, 96, 319-327；及び最近の文献：Senti G et al. J Allergy Clin Immunol., 2012, 129(5): 1290-1296。このMAT技術を土台にして、主要なネコアレルゲンFe1d1をMHCクラスII経路への標的誘導のためにTAT誘導タンパク質移行ドメイン及びヒト切端インバリアント鎖に融合させた。免疫原性をマウスで判定し、一方、潜在的な安全性の問題は、ネコふけアレルギー患者の好塩基球反応性を基準にする適切な試験によって評価した。このモデル化合物の可能な使用が示された。前記文献では、MAT分子は所望の免疫応答（すなわち減感作）の誘発に、通常のアレルゲン特異的免疫療法（SIT）で組み換えアレルゲン又はアレルゲン抽出物より安全でより効率的であることが期待されるということが述べられている。G. Sentiらによる最近の刊行物では、ヒトのネコふけアレルギーのためのリンパ管内免疫療法が記載され、前記は3回の注射後に耐性を誘発した。MAT-Feld1によるヒトで最初の臨床試験が記載され、安全性及びたった3回のリンパ管内注射後のアレルゲン耐性誘発が示された。さらに別の従来技術は以下のとおりである。
【０００４】
G. Gadermaierら（Molecular Immunology 2010, 47: 1292-1298）は、ヨモギ属（Artemisia）花粉アレルギーの免疫療法のためにArt v1のシステイン安定化折り畳みの標的誘導を記載している。前記著者らは、低アレルゲン性分子の作出を目的とする標的誘導Art v1の翻訳後修飾のために以下のように遺伝子操作アプローチを用いた：（i）デフェンシンドメインのジスルフィド架橋を部位特異的変異導入によって破壊し、（ii）変異構築物を非グリコシル化タンパク質の生成のために大腸菌（E. coli）で発現させた。しかしながら、その目的は、明らかに単にArt v1デフェンシンドメインの三次元折り畳みを操作し、認識されるT細胞エピトープ（たとえそのようなものがシステイン残基を含んでいたとしても）は無傷のままに維持しつつ、ただ1つのシステイン残基をセリンに変更することによってIgE結合を停止させる（すなわち低アレルゲン性分子を作出する）ことであった。
第三回ウマアレルギー疾患に関するHavemeyerワークショップの報告（Holar, Iceland, June 2007, Veterinary Immunology and Immunotherapy 2008, 126: 351-361）は、昆虫咬傷過敏症（IBH）の免疫学的及び遺伝的特徴並びに再発性気道閉塞（RAO）に焦点が当てられた。このワークショップでは、IBHに対するSITの新規なアプローチ、とりわけウイルスベクターの使用又はモジュール型抗原移行（MAT）分子と結合させたアレルゲンによるタンパク質ワクチン免疫が考察された。
2010年及び2011年のSIAF年次報告では、R.CrameriはIBHに罹患したウマのワクチン免疫のためのMAT技術の使用を報告している。
【０００５】
しかしながら、従来技術に記載されたMAT分子を生成及び製造する時に大きな問題が生じた。特に、医薬品製造及び品質管理に関する国際基準の下でMAT分子を製造する下流プロセス（DSP）の開発で用いられる標準的方法を利用できなかった。MAT分子の均質な分子種を精製することは、明らかにそれらの物理化学的特性のために不可能であった。種々の分離原理（例えばサイズ排除クロマトグラフィー、RP-HPLC）を試験したが、いくつかの精製方法は従来技術に記載されたMAT分子に関して利用できなかった（本明細書の実施例5を参照）。一般的には組換えタンパク質の純度を決定するために利用される方法には、クロマトグラフィー分離（例えばRP-HPLC）及び電気泳動分離（例えばキャピラリーゾーン電気泳動、等電点分画法、還元又は非還元条件下のSDS-PAGE）が含まれる。さらに、これらの分析方法は、分子に特異的な改造を施すことなくMAT分子に適用することはできなかった。純度の評価のために、改造した固有のSDS-PAGE試験手順を開発しなければならなかった。この試験手順は、還元剤及びドデシル硫酸リチウム（LDS）によるサンプルの調製並びに75℃までの加熱を含み、電気泳動分離後に多数の再現性のある鋭利なバンドを生じた。クーマシーブルー色素による染色はゲルで直線的及び定量的態様（デンシトメトリー）を示した。MAT分子のアレルゲンモジュールの検出を可能にするモノクローナル抗体の使用によって、主要バンド及びいくつかのマイナーバンドが示された。さらに、最初のゲルから切り出したバンドを用いて第二のゲルに再ローディングした後、全てのバンドが最初のゲルと同じ位置に再現性をもって泳動した。驚くべきことに、見かけ上より小さい及びより大きい分子量を有するこれらのバンドの全てで、完全長のMAT分子が、ゲルからバンドの切り出し、それらのトリプシン消化、及びそれに続く質量分析（ナノLC/ESI-MS-MS）によって同定された。これらの実験から、SDS-PAGEにおけるMAT分子の種々の折り畳み変種の非典型的で変則的な行動態様が推断された（“ゲルシフト”）。さらにまた、MAT分子の全てのバッチで、当該タンパク質のマルチマー型が検出され、前記をモノマー型から分離することは困難であった。
例えば経済的特徴及び規制上の要求のために、（i）MAT分子の製造プロセス及び（ii）純度決定の標準的分析方法に対するそれらの安定性を改善することが必要である。加えて、特異的な標的種（例えばウマ）に対してMAT分子を改造するために、MAT技術内で免疫学的な標的誘導を改造することが要求される。
加えて、MAT分子は既知の主要なアレルゲンによって誘引されるアレルギー（例えばFeld1によるヒトのネコふけアレルギー）で容易に利用される。しかしながら、臨床的環境（例えばアレルギー）で従来技術のMAT分子を利用することは困難であるように思われる（そのような場合には、例えば多様な非交差反応性アレルゲンが関与することが知られているが、当該アレルギーを誘引するそのようなアレルゲンの重要性は不明である（すなわち主要アレルゲンは分からない）。
本発明の根本的目的は、医薬組成物（例えばワクチン）中の活性薬剤として有用な改善されたMAT分子を提供することであり、前記は従来技術の問題を克服する。
【発明の概要】
【０００６】
ある特徴では、本発明の根本的目的は、驚くべきことに（単離）組換えタンパク質、好ましくは改善されたMAT（iMAT）分子を提供することによって解決され、
前記iMATは、
（i）細胞外空間から細胞の内部へのiMAT分子の移行を可能にするアミノ酸配列である、少なくとも1つの第一のモジュール、
（ii）抗原のプロセッシング及び/又はMHC分子の抗原（好ましくはプロセッシングされた抗原）ローディングに関与する細胞小器官へのiMAT分子の種特異的細胞内標的誘導を可能にするアミノ酸配列である、少なくとも1つの第二のモジュール、及び
（iii）少なくとも1つの抗原（好ましくは少なくとも1つのアレルゲン）の少なくとも1つの完全又は部分的エピトープに由来し、そのようなiMAT分子によって調節される免疫応答の特異性を決定するアミノ酸配列である、抗原モジュールとして少なくとも1つの第三のモジュールを含み、少なくとも前記抗原モジュールでは、少なくとも1つのシステイン残基が、異なるアミノ酸残基（好ましくはセリン、ロイシン、イソロイシン及び/又はアスパラギン酸）で置換されることを特徴とする。
好ましくは、少なくとも1つの抗原モジュールで、全てのシステイン残基が、異なるアミノ酸残基（好ましくはセリン、ロイシン、イソロイシン及び/又はアスパラギン酸）で置換される。より好ましくは、iMAT分子全体で、全てのシステイン残基が、異なるアミノ酸残基（好ましくはセリン、ロイシン、イソロイシン及び/又はアスパラギン酸）で置換される。好ましくは、全てのシステイン残基が、異なるアミノ酸残基（好ましくはセリン、ロイシン、イソロイシン及び/又はアスパラギン酸）で置換されるというわけではない場合、iMAT分子全体ではなお多数のシステイン残基が残存する。
好ましくは、そのようなモジュールの全ては、互いに共有結合で連結され、場合によって、そのような第一、第二及び/又は第三のモジュールの2つ以上の隣接するモジュールの間で、場合によって全てのモジュールの間で追加のスペーサーモジュールによって連結される。より好ましくは、そのようなモジュールの全ては互いに共有結合で連結され、そのような第一、第二及び/又は第三モジュールの2つ以上の隣接するモジュール間に追加のスペーサーモジュールは全く存在しない。
【０００７】
別の特徴では、本発明の根本的な目的は驚くべきことに、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質を含むワクチン又は免疫原性組成物又は医薬組成物を提供することによって解決される。
別の特徴では、本発明の根本的な目的は驚くべきことに、ウマの1つ以上のアレルギー、好ましくは昆虫咬傷過敏症（IBH）、じんま疹及び/又は再発性気道閉塞（RAO）の予防及び/又は治療方法で使用するために、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質又は本明細書に開示及び特許請求されるワクチンン若しくは免疫原性組成物若しくは医薬組成物を提供することによって解決される。その必要があるウマを予防及び/又は治療する対応方法、及びウマを予防及び/又は治療する医薬組成物/医薬の調製のための使用もまた本発明の範囲内であることが意図される。
別の特徴では、本発明の根本的な目的は、驚くべくことに、1つ以上のウマの感染症を予防及び/又は治療する方法で、及び/又は1つ以上のウマの感染症の伝播を予防する方法で、及び/又は病原媒介昆虫（好ましくは吸血性のハエ、小昆虫、ダニ及び/又は蚊）によるウマの1つ以上の感染症（より好ましくはロドコッカス（rhodococcus）肺炎、腺疫、アフリカウマ病、西ナイルウイルス感染）、皮膚糸状菌症、及び/又は消化管及び/又は他の器官の寄生生物、及び/又はクリプトスポリジウム症、蠕虫及び/又は前記の検出潜伏病期の伝播を予防する方法で使用するために、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質又は本明細書に開示及び特許請求されるワクチンン若しくは免疫原性組成物若しくは医薬組成物を提供することによって解決される。その必要があるウマを予防及び/又は治療する対応方法、及びウマを予防及び/又は治療する医薬組成物/医薬の調製のための使用もまた本発明の範囲内であることが意図される。
さらに別の特徴では、本発明の根本的な目的は、驚くべきことに、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質をコードする核酸を提供することによって解決される。
さらに別の特徴では、本発明の根本的な目的は、驚くべきことに、本明細書に開示及び特許請求される少なくとも1つの核酸を含むベクターを提供することによって解決される。
さらにまた別の特徴では、本発明の根本的な目的は、驚くべきことに、本明細書に開示及び特許請求される少なくとも1つの核酸及び/又は本明細書に開示及び特許請求される少なくとも1つのベクターを含む初代細胞又は細胞株を提供することによって解決される。
【０００８】
驚くべきことに、本明細書に開示及び特許請求される本発明のiMAT分子は以下のような生化学的及び/又は免疫学的特徴を有し、これらは関連する従来技術のMAT分子より本MAT分子を優れたものにする：
（i）抗原モジュールにおいて、好ましくはiMAT分子全体で少なくとも1つシステイン残基の異なるアミノ酸残基による置換（前記アミノ酸残基は最終的iMAT分子の安定性を損なわないようにコンピュータを用いて選択された）は、驚くべきことに、生物薬剤のための標準的精製手順の適用のためだけでなく標準的分析方法のためにも本発明のiMAT分子を適切にする。
（ii）iMAT分子のモジュール（すなわち第一の移行モジュール、第二の標的誘導モジュール及び第三の抗原モジュール）の好ましい直接的共有結合（そのようなモジュール間に追加のスペーサーモジュールを一切含まない（すなわちそのような第一、第二及び/又は第三のモジュールの2つ以上の隣接するモジュールの間に追加のスペーサーモジュールが一切存在しない））は、上記（i）に加えて、本発明のiMAT分子の優れた特徴に寄与する。すなわち、三次元構造でより不撓性でありしたがって立体構造性IgEエピトープを形成できないと考えられるそのようなiMATは、なおいっそう低アレルゲン性である（本明細書の実施例2に示すように実質的にアレルゲン性は検出できなかった）。
（iii）（準）N-末端Hisタグの好ましい存在は、免疫及び/又は免疫持続を追跡監視する代用マーカーとして用いることができる本発明のiMAT分子をもたらす。なぜならば、そのようなタグモジュールは、場合によって移行モジュールの1つ以上の隣接するアミノ酸残基と一緒に用いて、特異的な免疫学的に検出可能なシグナル（例えば抗体）を標的対象動物で誘発することができるからである（前記シグナルはiMAT分子の一般構造に特異的である（例えば本明細書の実施例1を参照されたい））。加えて、そのようなタグ分子の存在は、本発明のiMAT分子を含むサンプルで亜鉛又はコバルト充填固相によってタンパク質を分離するために利用でき、したがって精製プロセス時に凝集を生じることなく本発明のiMAT分子を製造する可能性をさらに高める。
（iv）本発明のiMAT分子の少なくとも1つの標的誘導モジュールは、好ましくは種特異的である。すなわちそのようなiMAT分子のウマへの適用が意図される場合には、ウマ標的誘導モジュール（例えばウマインバリアント鎖）が選択される。この種特異的標的誘導によって、本発明のiMAT分子のMHCクラスII分子への最適化された結合特性が良好に達成できる。
（v）好ましくは本発明のiMAT分子の少なくとも1つの抗原モジュールはアレルゲンである。アレルゲンは、カビ（菌類及び/又はその胞子）、花粉、ハウスダスト若しくは飼い葉ダニ（及び/又はその糞）、好ましくは樹木、牧草、草本の花粉、ブタクサ（ambrosia）及び/又はアブラナ（brassicaceae）の花粉、及び/又は以下の属の菌類及び/又はその胞子（アスペルギルス（aspergillus）、アルテルナリア（alternaria）、ボトリチス（botrytis）、セルコスポラ（cercospora）、クラドスポリウム（cladosporium）、キュルブラリア（curvularia）、ドレクスレラ（drechslera）、ユーロチウム（eurotium）、ヘルミントスポリウム（helminthosporium）、エピコックム（epicoccum）、エリシフェ/オイジウム（erysiphe/oidium）、フサリウム（fusarium）、リクテイミア（lichtheimia）、ニグロスポラ（nigrospora）、ペニシリウム（penicillium）、ペリコニア（periconia）、ペロノスポラ（peronospora）、ポリスリンシウム（polythrincium）、サッカロポリスポラ（saccharopolyspora）（以前にはまたファエニア（faenia）又はミクロポリスポラ（micropolyspora））、テルモアクチノミセス（thermoactinomyces）、ステムフィリウム（stemphylium）、トルラ（torula））、及び/又はアカルス（acarus）属、グリコファグス（glycophagus）属、チロファグス（tyrophagus）属、デルマトファゴイデス（dermatophagoides）属のダニ（又はその糞）である。本発明のiMAT分子の少なくとも1つの抗原モジュールは、より好ましくはクリコイデス（culicoides）アレルゲンである。アレルゲンは以下の基準にしたがって選択された:対象動物でアレルギーを誘引する主要なアレルゲンが不明であるとき、本発明のiMAT分子の少なくとも1つの抗原モジュールは、実施例6及び7で例示的に及び詳細に記載するバイオインフォマティクスのアプローチによって選択できる。この手段によって、改善MAT分子を達成でき、前記は、例えばウマのアレルギーの治療及び/又は予防のためのワクチンとして特に有用である。本発明のiMAT分子の少なくとも1つの抗原モジュールはまた、1つ以上の感染症に関与する病原体の抗原でありうる。前記は、ロドコッカス属、ストレプトコッカス（streptococcus）属、オルビウイルス（orbivirus）属、フラビウイルス（flavivirus）属、トリコフィトン（trichophyton）属、ミクロスポルム（microsporum）属、クリプトスポリジウム（cryptosporidium）属及び/又はストロンギルス（strongylus）属に由来し得た。本発明のiMAT分子の少なくとも1つの抗原モジュールはまた、1つ以上の感染症の伝播に関与する病原媒介昆虫の抗原、例えばクリコイデス、クレックス（culex）及び/又はイクソデス（ixodes）の唾液成分でありうる。この手段によって、改善MAT分子を達成でき、前記は、例えばウマの感染症の伝播の治療及び/又は予防のためのワクチンとして特に有用である。
特に、本発明は改善された可溶性を示す（単離）組換えタンパク質を提供し、前記はクロマトグラフィー分離技術に容易に適用でき、さらに改善された安定性を示す。
前記に加えて、本発明の（単離）組換えタンパク質は、好ましくは所望の免疫学的効果の誘発で、すなわち対象動物（好ましくはウマ）でアレルゲンに対する免疫応答の有利な種特異的調節で高い活性及び有効性を発揮する。例えばこの手段によって、IBHに罹患したウマの症候の治療及び緩和が実現可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】種、アレルゲン及びUniprotアクセッション番号が認定されたクリコイデス属のアレルゲンの例を示す（データベースリリースはUniProtリリース2013_09）。
【図２】還元条件下でのMAT-Feld1（IVN201）のSDS-PAGEを示す。A）最初のSDS-PAGE（10μgタンパク質/レーン、クーマシー染色）及びB）ゲルAから切り出しSDS-PAGEに再ローディングしたバンドのSDS-PAGE（銀染色）。
【図３】還元条件下でのFeld1のSDS-PAGEを示す（NuPAGE(商標)4-12%ビス-トリスゲル）。レーン：1）マーカー（SeeBlue Plus2前染色標準物）；2）5μgのFeld1；3）5μgのFeld1。
【図４】RP-HPLCクロマトグラフィー図を示す（0.1% TFA/アセトニトリルグラジエント）。A）添加物のない未変性タンパク質（MAT-Feld1）（左のグラフ）；b）塩化グアニジニウム＋DTTの添加によって変性させたMAT-Feld1（右のグラフ）。
【図５】MAT-Feld1分子及びそのKY手Doolittle疎水性プロットを示す。
【図６】NuPAGE(商標)SDS-PAGE系を示す（4-12%ビス-トリスゲル、1ｘMES-泳動緩衝液、35分、200V）。レーン：1)リゾチーム、1μgタンパク質（酸化）；2）PAGEルーラー前染色タンパク質ラダー；3）MAT-Feld1（5μg）、ヨードアセトアミドで酸化（ox）；4）iMAT-Cul o4（ox）；5）PAGEルーラー前染色タンパク質ラダー；6）MAT-Feld1（5μg）（還元）；7）iMAT-Cul o4（還元）；8）リゾチーム（還元）。
【図７】RP-HPLCクロマトグラフィー図（0.1% TFA/アセトニトリルグラジエント）。ピークは、添加物無しの未変性（酸化された）タンパク質（iMAT-Cul o4）を示す。
【図８】測定感作と比較した、選択クリコイデスアレルゲンの局所アラインメントヒット数の表示例を示す（詳細は説明文を参照されたい）。本図は、IBH馬コホートにおける重篤度（各アレルゲンの全スコア値）に関するHRT試験の抗原性予測（淡灰色及び右Y軸）と結果（濃灰色及び左Y軸）との間の比較を示す。重篤度は半定量スケールでの試験における反応の程度を示す（左Y軸）。予測のデータは、最高の重篤度スコアと等価の最高の出現スコアを設定することによって測定される。
【図９】以下の実験の結果を示す：穏やかに撹拌しながらRTで30分間インキュベートしたタンパク質及びAdju-Phos(商標)。インキュベーション後に、サンプルを3分間遠心分離し、続いてSDS-PAGEによって分析した。レーン1）；PAGEルーラー前染色タンパク質ラダー；2）iMAT-Cul o3上清；3）尿素中のiMAT-Cul o3ペレット；4）iMAT-Cul o3上清；5）尿素中のiMAT-Cul o3ペレット；6）空レーン；7）iMAT-Cul o2上清；8）尿素中のiMAT-Cul o2ペレット；9）iMAT-Cul o2上清；10)尿素中のiMAT-Cul o2ペレット；11)空レーン；12）iMAT-Cul o4上清；13）尿素中のiMAT-Cul o4ペレット；14）iMAT-Cul o4上清；15）尿素中のiMAT-Cul o4ペレット；（2、3、7、8、12、13は凍結融解無し）；（4、5、9、10、14、15は2回の凍結融解プロセス後）。
【図１０】感作馬（ウマ1）における5濃度のiMAT-Cul o2及びiMAT-Cul o3と対応するアレルゲンによるヒスタミン遊離試験を示す（アッセイの詳細は実施例2）。
【図１１】それぞれの融合タンパク質の一般部分（すなわち対応する抗原モジュールが存在しない）におけるMAT分子とiMAT分子のKyte-Doolittle疎水性プロットを示す。疎水性インデックスはY軸に、アミノ酸の位置はX軸に示されている。インデックスで正の数は疎水性を示す。MAT分子と比較してiMAT分子における疎水性プロット開始のグラフシフトは、iMAT分子でHisタグ及び1つのメチオニン残基の追加N-末端が存在することとスペーサーモジュールが一切存在しないことによる。
【図１２】本図は、正規のデータベースのCul o3（M4X062、配列番号:6）の13アミノ酸の長さを有する各ペプチドについてノンランダムヒットの数及び対応する前駆体タンパク質内のそれらの位置を示す。y軸はヒットの数を示し、x軸は前駆体に照らして当該アミノ酸の位置を示す。垂直の点線はシステイン残基を示し、連続ダッシュ線は見出されたノンランダム相同性の数の平均移動を示し、水平の実線はコンピュータによる切断ペプチドに対応する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の実施態様をさらに詳細に述べる前に以下を特記しておく。本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる単数形“a”、“an”及び“the”は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り対応する複数形を含む。
特段に指定されなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本発明が属する業界の者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。全ての提示される範囲及び値は、特に指示がなければ又は当業者にとって特に公知でなければ1から5%で変動しうる。したがって“約”という用語は、本明細書及び特許請求の範囲から通常は省略された。本明細書に記載した方法及び材料と同様な又は等価のいずれの方法及び材料の本発明の実施又は試験で用いることができるが、好ましい方法、装置及び材料をこれらから述べる。本明細書に記載する全ての刊行物は、当該刊行物で報告される物質、賦形剤、担体及び方法論（前記は本発明との関係で用いることが可能である）の説明及び開示の目的で参照によって本明細書に取り込まれる。前記のいずれも、本発明が先行発明を理由にそのような開示に先行する資格をもたないということを容認するものと解されるべきではない。
“単離された組換えタンパク質”、“組換えタンパク質”及び/又は“改善MAT（iMAT）”という用語は、本発明では互換的に用いられる。それらはいずれも同一の意味を有する。
本発明では“モジュール”という用語は、特異的なアミノ酸配列、例えばポリペプチドの部分、ユニット又は一部分（通常は短いアミノ酸/ペプチド配列）であり、指定の機能を有するものを指す。
本発明の“（単離）組換えタンパク質、好ましくは改善MAT（iMAT）分子の細胞外空間から細胞の内部への輸送を可能にするアミノ酸配列である、第一のモジュール”という用語（本明細書ではまた“移行モジュール”又は“移行配列”とも称される）は、積み荷分子（例えばアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び他のクラスの物質、例えば核酸又は医薬的に活性な成分（API））の細胞（特に真核細胞、より具体的には文献で公知のMHCクラスII分子を細胞表面に及び/又はMHCクラスI分子を細胞表面に発現する細胞）の内部への輸送を促進する特異的なアミノ酸配列を指す。移行モジュールの存在によって、前記積み荷分子の細胞内への侵入を促進することが可能である。
【００１１】
移行モジュールとして有用なアミノ酸配列は従来技術に記載されている。例えば、US7,653,866は、HIV-tat分子又はタンパク質VP22（単純疱疹ウイルスに由来する）を含む有用な移行配列を開示する。ある標的分子の細胞内部への侵入を促進するこの原理は、関連特許及び非特許文献の多様な研究に数多く記載されている。その他に、適切な移行配列には、ホメオタンパク質配列、ロイシンジッパー配列、アルギニンリッチ及び/又はリジンリッチ配列、及び分泌シグナル配列が存在しないにも関わらず分泌される多様な他のタンパク質又はポリペプチドが含まれる。特に有用なものは、ウイルスペプチド配列、例えばHIV転写アクチベータータンパク質（HIVtat）である。Tat配列又はTatペプチドは多様な修正を含む従来技術で既に記載されている。Tatペプチド配列について従来技術に記載されている変型は全て移行モジュールとして概ね適切である。他の例にはVP22の他にショウジョウバエ（drosophila）の相同異質形成タンパク質アンテナペディアが含まれる。前記に加えて、他のホメオタンパク質を用いることもできる。適切なホメオタンパク質の多様な例が従来技術に記載されている。その他に、ロイシンジッパータンパク質、同様なヒトcFos-(139-164)、又はヒトcJun-(252-279)を用いることができる。さらにまた、アルギニンリッチ及び/又はリジンリッチペプチドが、移行モジュールとして適切である（前記はHIV-1rev(34-50)又はウイルス若しくは酵母に由来する他のペプチドのような配列を含む）。もちろん、ポリアルギニンリッチ及び/又はポリリジンリッチペプチドを合成により製造することができる。前記ポリアルギニンリッチ及び/又はポリリジンリッチペプチドはさらに別のアミノ酸を含むことができる。適切な例は関連する従来技術に記載されている。好ましい実施態様では、少なくとも1つの移行モジュールは、なお機能的な（すなわち細胞侵入を効果的に促進できる）最小配列の代わりに、上記に例示したような完全なタンパク質配列から成っているわけではないアミノ酸配列を含む（好ましくは前記から成る）。適切な最小配列は例えば配列番号:1のアミノ酸配列である。別の好ましい実施態様では、少なくとも1つの移行モジュールは、HIV-tat、VP22及び/又はアンテナペディア又は前記の部分配列を含むが（好ましくは前記から成るが）、ただしそのような少なくとも1つの移行モジュールが、細胞外空間から細胞の内部への移行モジュールとして機能することを条件とする。
【００１２】
“（単離）組換えタンパク質、好ましくは改善MAT（iMAT）分子の細胞小器官（抗原のプロセッシング及び/又はMHC分子の抗原（好ましくはプロセッシングされた抗原）ローディグに関与する）への種特異的細胞内標的誘導を可能にする配列である第二のモジュール”という用語（本明細書ではまた“標的誘導モジュール”又は“標的誘導配列”と称される）は、本発明では、抗原プロセッシング及び/又はMHC分子の抗原ローディングに関与する細胞小器官への本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質の細胞内輸送を可能にする/促進する特異的なアミノ酸配列を指す。
特に、そのような細胞小器官には小胞体、ゴルジ装置、トランスゴルジネットワーク、リソソーム、エンドソーム及びMHC II区画が含まれる。これらの細胞内小器官は、複数のプロセス、例えば抗原の輸送及び/又はプロセッシング、抗原又はプロセッシングされた抗原によるMHC II分子の調製及び/又はローディング、及び/又はそのような抗原をロードされたMHC II分子の細胞表面への輸送に関与する。
従来技術では多数の配列が知られている。有用な標的誘導配列のもっともよく知られた例には、MHCクラスIIのインバリアント鎖（Iiインバリアント鎖又はMHC IIガンマ鎖としてもまた知られている）が含まれる。インバリアント鎖の多様な変型が特許及び非特許文献に記載されている。
本発明の好ましい実施態様では、インバリアント鎖は、免疫応答が調節されるべき種から、及び/又はiMAT分子が細胞内で標的誘導されるべき種から選択される。
例えばウマ科の動物（例えばウマ）のためには、選択される好ましいインバリアント鎖はウマのインバリアント鎖であり、前記は配列番号:2のアミノ酸配列又はそのフラグメント（ただしそのようなフラグメントは細胞内輸送機能を維持することを条件とする）を含む（好ましくは前記から成る）。好ましいそのようなフラグメントは配列番号:15及び/又は16のアミノ酸配列である。
標的誘導配列の他の適切な例には、リソソーム膜タンパク質（標的誘導分子として適切な配列を含む）が含まれる。それらは、リソソームへの標的誘導を可能にする配列モチーフを有する、リソソームに存在する多数の膜タンパク質である。これらのタンパク質グループにはとりわけlamp1、lamp2、lamp3、limp II、lapが含まれる。その他に、テトラスパンタンパク質が標的誘導モジュールとして従来技術で知られている。標的誘導特性を示す、付け加えられるタンパク質は、エンドソーム/リソソーム区画内で見出されうる。したがって、当業者は適切な標的誘導配列をどのように決定すべきか気付いていよう。
別の好ましい実施態様では、少なくとも1つの標的誘導モジュールはウマインバリアント鎖を含み（好ましくは前記から成り）、好ましくは配列番号:2、15、16のアミノ酸配列の1つ以上から成る。
【００１３】
“少なくとも1つの抗原（好ましくは少なくとも1つのアレルゲン）の少なくとも1つの完全又は部分的エピトープに由来し、そのような（単離）組換えタンパク質、好ましくは改善MAT（iMAT）分子によって（対象動物、好ましくはウマで）調節される免疫応答の特異性を決定するアミノ酸配列である、抗原モジュールとして少なくとも1つの第三のモジュール”という用語（本明細書ではまた“抗原モジュール”又は“抗原配列”と互換的に称される）は、本発明では、対象動物（好ましくはウマ）におけるエピトープ/抗原に対する免疫応答の調節及び免疫応答の特異性の決定を可能にする特異的なアミノ酸配列を指す。
この文脈では、そのような抗原モジュールは、異なるアミノ酸残基（好ましくはセリン、ロイシン、イソロイシン及び/又はアスパラギン酸）で置換される少なくとも１つのシステイン残基を含む。したがって、免疫応答は、当該抗原の未変更アミノ酸配列に暴露された対象動物（好ましくはウマ）の免疫応答と比較して相違する。
当該方法に基づけば抗原に関して制限は存在しない。例えば、当該方法を用いて、病原体（例えばウイルス、細菌、菌類、寄生生物、原生動物など）に対する対象動物の免疫系を（すなわち非常に大雑把にワクチンとして）活性化することができる。付け加えれば、該方法をそのような病原体に対して直接用いるだけでなく、当該方法を用いて宿主免疫系を活性化し、ウイルス、細菌、菌類、寄生生物、原生動物が関与する病原媒介昆虫による疾患の伝播を予防することができる。前記に加えて、当該方法を用いて変性細胞（例えば腫瘍細胞など）に対して免疫系を活性化することができる。しかしながら、他方で、当該方法はまた、アレルゲン（例えば食物、カビ（菌類及び/又はその胞子）、花粉、動物の毛、ハウスダスト又は飼い葉ダニ（及び/又はその糞）、昆虫毒など）に由来するもの）に対して対象動物の免疫系の脱感作のために、又は例えば自己免疫（例えば関節炎、リウマチ症、糖尿病、SLE（全身性エリテマトーデス）など）が存在する場合に免疫系の標的誘導抑制のために、さらに移植拒絶反応の抑制にもまた用いることができる。明確に述べられていない、強すぎるか若しくは弱すぎる免疫反応に関係するさらに別の疾患も同様に、本明細書に開示及び特許請求されるiMAT分子を用いて治療することができる。
【００１４】
原則として、免疫応答を調節することができる全てのタイプの抗原を本発明の目的のために抗原モジュールとして用いることができる。これまでに知られている抗原及び将来発見される抗原の両方が適切である。いくつかの状況では、抗原はまた、現在の技術で公知の通常的な免疫方法では免疫応答をもたらさないが、本発明に記載する新規な方法の適用により対象動物で免疫応答をもたらす抗原でありうる。さらにまた、抗原という用語は、エピトープとしてもまた知られている抗原決定基を含む抗原フラグメントを包含する。したがって、抗原モジュールは、分子全体（例えばタンパク質）又は分子の部分（すなわち分子のフラグメント、例えばペプチド；前記は少なくとも1つの抗原決定基又はエピトープを含む）でありうる。少なくとも1つの抗原決定基又はエピトープは当該抗原に対する免疫応答を誘引することができる。エピトープは、1つ又は2つ以上のアミノ酸又はペプチド又は免疫応答を誘引できる他の構造（例えば糖構造、リン酸化アミノ酸など）又は前記の組み合わせを含むことができる。抗原は、連続エピトープ（すなわち立体構造に依存せず、例えば未変性タンパク質及び変性タンパク質に存在する）又は不連続エピトープ（すなわち立体構造に依存し、例えば未変性の折り畳まれたタンパク質に存在するが変性タンパク質には存在しない）でありうる。タンパク質及びペプチドだけでなく、糖構造、脂質（例えばリポ多糖類、リポテイコ酸）、及び細菌膜の他の構成物質（例えばCD1b結合物、例えば糖構造及び脂質））、核酸（例えばCpGモチーフを含むDNA）、有機物質（例えばラテックス）又は本発明の目的のための抗原として医薬的に活性な物質もまた用いることができる。抗原は、可能なすべての生命形（例えばヒト、動物、植物、菌類、寄生生物、単細胞微生物又は多細胞微生物、ウイルス及び他の生命形）から誘導できる。抗原は、生物学的材料から単離されてあるか、組み換え抗原として調製されてあるか、又は合成によって（例えばペプチド合成によって）調製されてあってもよい。合成により調製される抗原は、自然に存在するか、又は自然には存在せず化学合成によって入手できる物質でありうる。しかしながらいくつかの周囲状況で抗原として適切な天然には存在しない物質の例は、例えば医薬に存在する合成によって調製される物質、又は天然には存在しないアミノ酸配列を有する合成ペプチド、又はペプチド模倣物などである。天然に存在する抗原又は合成若しくは組み換え抗原は、特定の適用のためにより有利な特性をそれらに付与するために、分子生物学、酵素的、化学的及び/又は他の方法によって修正することができる。これらの有利な特性はとりわけ、抗原としてより高い若しくはより低い活性、抗原としてより広い若しくはより特異的な作用、親水性若しくは疎水性溶媒中でのより良好な可溶性、細胞膜に対する、細胞小器官の膜に対する、血液脳関門に対する、血液-CSF障壁などに対する抗原モジュールのより強い透過性、より長い若しくは短いin vivo又はin vitro半減期、より弱い若しくはより強い毒性、iMAT分子形として抗原を適用した後のin vivo若しくはin vitroにおける抗原のより良好な検出性などであり得る。加えて、1つの抗原モジュールに複数の抗原を結合させることが可能である。このために、同一抗原が2つ以上のコピーとして抗原モジュールに存在するか、又は同じ抗原の例えば種々の変型を抗原モジュールで結合させることができる。抗原モジュール中で抗原（例えば抗原1）及び他の抗原（例えば抗原2）を組合せることもまた可能である。さらに別の組み合わせ、例えば2つ以上のコピーの抗原1及び単一コピーの抗原2もまた抗原モジュールで組み合わせることができる。加えて、1つ以上の異なる及び/又は1つ以上の同一の抗原モジュールがiMAT分子に存在することもまた可能である。1つ以上の異なる抗原に由来する抗原が単独又は複数存在する同一又は改変コピーの可能な全ての組み合わせを、本発明の目的のために結合させることは原則として可能である。
【００１５】
好ましい実施態様では、抗原モジュールは少なくとも1つの抗原（ここで、そのような抗原はアレルゲンである）に由来する少なくとも1つの完全又は部分的エピトープを含む。少なくとも1つのエピトープが当該アレルゲンに対する免疫応答を誘引することができる（当該アレルゲンによって、該エピトープは、免疫応答を誘引することができる1つ又は2つ以上の構造（例えばペプチド）を含むことができる）。エピトープは、アレルゲンの連続エピトープでも不連続エピトープでもよい。エピトープは、好ましくは長さが少なくとも8アミノ酸であり、好ましくは長さが少なくとも10アミノ酸であり、より好ましくは長さが少なくとも13アミノ酸である。抗原モジュールは、少なくとも1つの完全又は部分的エピトープを含むが、2つ以上の完全又は部分的エピトープもまた含むことができ、前記は互に同一でも異なっていてもよい。さらにまた、抗原モジュールは、当該少なくとも1つの完全又は部分的エピトープに隣接する追加のアミノ酸配列を含むことができる。エピトープは天然に存在するエピトープでも修正されたエピトープでもよく、後者はそのアミノ酸配列の修正であるか又は1つ以上の翻訳後修飾によって修正される。
【００１６】
ある実施態様では、少なくとも1つの第三の抗原モジュールは、1つ以上の感染症に関与する病原体の少なくとも1つの抗原に由来する少なくとも1つの完全又は部分的エピトープを含む。前記は、ロドコッカス属、ストレプトコッカス属、オルビウイルス属、フラビウイルス属、トリコフィトン属、ミクロスポルム属、クリプトスポリジウム属及び/又はストロンギルス属に由来しうる。本発明のiMAT分子の少なくとも1つの抗原モジュールはまた、1つ以上の感染症の伝播に関与する病原媒介昆虫の抗原、例えばクリコイデス、クレックス及び/又はイクソデスの唾液成分でありうる。さらに別の好ましい実施態様では、少なくとも1つの第三の抗原モジュールは、ウマで1つ以上のアレルギーを誘引する少なくとも1つのアレルゲンに由来する少なくとも1つの完全又は部分的エピトープを含む。前記は以下に由来する少なくとも1つのアレルゲンの少なくとも1つの完全又は部分的エピトープでありうる：カビ（菌類及び/又はその胞子）、花粉、ハウスダスト若しくは飼い葉ダニ（及び/又はその糞）、好ましくは樹木、牧草、草本の花粉、ブタクサ及び/又はアブラナの花粉、及び/又は以下の属の菌類及び/又はその胞子（アスペルギルス、アルテルナリア、ボトリチス、セルコスポラ、クラドスポリウム、キュルブラリア、ドレクスレラ、ユーロチウム、ヘルミントスポリウム、エピコックム、エリシフェ/オイジウム、フサリウム、リクテイミア、ニグロスポラ、ペニシリウム、ペリコニア、ペロノスポラ、ポリスリンシウム、サッカロポリスポラ（以前にはまたファエニア又はミクロポリスポラ）、テルモアクチノミセス、ステムフィリウム、トルラ）、及び/又はアカルス属、グリコファグス属、チロファグス属、デルマトファゴイデス属のダニ（又はその糞）。
好ましい実施態様では、前記は、好ましくは吸血昆虫、より好ましくはクリコイデス属に由来する少なくとも1つのアレルゲンの少なくとも1つの完全又は部分的エピトープである。クリコイデス属のアレルゲンの例は、種、アレルゲン及びユニプロットアクセッション番号（データベースリリースはUniProt release 2013_09）に関する図1に示されている。
さらに別の好ましい実施態様では、そのような少なくとも1つのアレルゲンは、Cul n4、Cul o1、Cul o2、Cul o3、Cul o4、及び/又はCul o7アレルゲンである。抗原モジュールの好ましい特異的な配列は配列番号:3、4、5、6、18、19のアミノ酸配列である。
【００１７】
本発明における“（単離）組換えタンパク質”及び/又は“iMAT分子”の関係で、“〜によって調節される免疫応答”又は互換的に“免疫調節免疫応答”という用語は、免疫原性免疫応答及び/又は免疫寛容原性免疫応答を指す。
本発明における“アレルゲン”という用語は、その自然のままの形態で、免疫系が全ての感知される（別の状況では対象動物にとって無害の）脅威を撃退する、異常に激しい免疫応答を生じる抗原のタイプを指す。典型的には、これらの種類の反応はアレルギーとして知られる表現型をもたらす。多様なアレルゲンタイプが従来技術に記載されてあり、食物、薬剤、動物の生成物又は天然若しくは合成物質が含まれる。好ましくは、あるタンパク質がその自然のままの形で、少なくとも5匹の対象動物（好ましくはウマ）で特異的なIgE応答を誘引するとき、前記タンパク質はアレルゲンであると考えられる。念のため明記すると、“少なくとも1つのアレルゲンに由来する少なくとも1つの完全又は部分的エピトープを含む少なくとも1つの第三の抗原モジュール”に関して“アレルゲン”はもはや自然のままの形である必要はなく、換言すれば好ましくは、本発明における“アレルゲン”という用語は、本明細書に開示及び特許請求されるiMAT分子の部分としての、自然のままではないアミノ酸配列を明確に指し、前記は、少なくとも5匹の対象動物（好ましくはウマ）で特異的なIgE応答をもはや誘引しない。
本明細書でまた“抗原決定基”と互換的に称される、“エピトープ”という用語は、本発明では、免疫系（B細胞又はT細胞）によって認識される抗原の部分を指す。エピトープは、それらが結合するMHC分子の手段によって抗原提示細胞の表面で提示される。
本明細書でまた“個体”及び/又は“生物”と互換的に称される、“対象動物”という用語は好ましくはウマを指す。
本明細書でまた“ウマ”と互換的に称される、“ウマ（科の動物）”という用語は、本発明ではウマ属（genus Equus）の任意のメンバーを包含する。前記は、例えば任意のウマ、ポニー及び/又はロバ、分類学上の名称のエクウス・フェルス（Equus ferus）及び/又はエクウス・カバルス（Equus caballus）、及び/又はエクウス・フェルス亜種カバルス（Equus ferus caballus）を包含する。ウマは例えば家畜のウマでありうる。
【００１８】
“ペプチド”及び“タンパク質”という用語は、本発明では同等なものとして密接に関係して用いられる。本発明の目的のためには、ペプチド又はタンパク質は、ペプチド結合を介する少なくとも2つのアミノ酸の共有結合による接合を意味する。“アミノ酸”及び“アミノ酸残基”という用語は本出願では等価なものとして用いられる（すなわち2つの用語の意味は同一である）。アミノ酸/アミノ酸残基及びペプチド/タンパク質という用語は、本出願ではあり得るもっとも広い定義で用いられる。
この関係では、“組換えタンパク質”という用語は、遺伝子操作及び真核細胞系又は原核細胞系での発現によって入手できるポリペプチドを指す。加えて、前記用語は人工的（例えば固相）合成によって得られるポリペプチドを包含する。
本明細書で用いられるように“異なるアミノ酸残基”という用語は、特段の指示がなければシステイン以外の公知のアミノ酸残基を指す。例えば、前記アミノ酸残基は、天然に存在するアミノ酸残基（例えばセリン又はイソロイシン）でありうる。
本明細書で用いられる“線状形”という用語は、二次構造を欠く本発明のタンパク質を指す。そのようなタンパク質はしばしばランダムコイル構造を示すと考えられ、前記構造では、固定された関係はペプチド結合による隣接アミノ酸残基の結合のみである。
好ましい実施態様では、本明細書に開示及び特許請求される組換えタンパク質はモノマー形及び/又は線状形で存在する。
本明細書で用いられるように、“治療”という用語は、所望の臨床的結果（予防的及び治療的処置を含む）を得るために、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質、及び/又は対応するワクチン及び/又は免疫原性組成物及び/又は医薬組成物を投与することを指す。
本明細書で用いられるように、“免疫療法”という用語は、例えば予防的及び/又は治療的ワクチン免疫による、対象動物の治療的及び/又は予防的処置を指す。
本明細書で用いられるように、“1つ以上の感染症の伝播”に関連して“病原媒介昆虫”という用語は生きている生物を指し、本明細書では“生物学的ベクター”、“生物学的キャリアー”及び/又は“疾患キャリアー”という用語と互換的に用いられ、例えば吸血性のハエ、小昆虫、ダニ及び/又は蚊である。
【００１９】
さらにまた、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質は追加の少なくとも1つのタグモジュールを含むことが可能であり、好ましいことである。すなわち、1つ以上の異なる及び/又は同一のタグモジュールは、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質の部分であることが可能であり、好ましいことである。タグモジュールは、短いペプチド（しばしば20アミノ酸まで）、又はアミノ酸を含まない官能基（例えばビオチン又はジゴキシゲニン）から成ることができる。適切なタグモジュールには周知の好ましいHisタグが含まれ、前記は4から12以上のヒスチジン配列、好ましくは完全に連続するヒスチジン残基、好ましくは連続する5、6又は7ヒスチジン残基を含む。他の適切なタグモジュールには、HA-タグ、FLAG-タグ、GST-タグ又はStrep-タグが含まれる。タグは、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質のどこにでも存在しうるが、好ましい実施態様では、タグは（単離）組換えタンパク質のN-末端及び/又はC-末端に存在する。
タグモジュールは、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質の単離に有用であり、加えて、そのような（単離）組換えタンパク質の存在に関しin vitro又はin vivoでの検出を可能にする。さらにまた、タグモジュールは、隣接モジュール由来又は別個のモジュールの離れて配置されているリンカー由来の1つ以上の隣接アミノ酸残基と一緒に用いられて、標的対象動物で特異的な免疫学的に検出可能なシグナルを誘発することができる（前記シグナルは免疫及び/又は免疫持続期間の代用マーカーとして用いることができる）。本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質による免疫療法は、抗原特異的、好ましくはアレルゲン特異的免疫応答を標的対象動物で誘引し、前記免疫応答は、天然に存在する抗原（好ましくはアレルゲン）に暴露後の自然な免疫応答と質的に区別できない。したがって、抗原モジュールと結合する抗体は、iMAT誘発免疫調節作用の有効性のための代用マーカーという目的のためには適切ではない。この障害は、C-末端及び/又はN-末端タグモジュールによって（場合によって隣接アミノ酸と一緒になって）得られる、固有の抗原特異的免疫学的シグナルを測定することによって排除できる。したがって、適切な代用マーカーを提供することが可能である。
【００２０】
好ましい実施態様では、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質はさらに、少なくとも１つのタグモジュール、好ましくは少なくとも１つのHisタグを含み、ここでそのような少なくとも1つのタグモジュールは、好ましくは（単離）組換えタンパク質のN-末端及び/又はC-末端に、より好ましくは1つのメチオニン残基の後ろのN-末端に存在する。
さらにまた、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質のモジュール、すなわち少なくとも1つの移行モジュール、少なくとも1つの標的誘導モジュール及び少なくとも1つの抗原モジュールは、場合によって、そのようなモジュールの少なくとも2つの間に位置する1つ以上のスペーサーモジュールによって離れて配置される。
スペーサーモジュールは特にペプチド配列又は有機分子であり得る。本発明の目的のために用いることができる多数のスペーサー分子が当業界で公知である。加えて、本発明の目的のために将来開発又は発見されるスペーサー分子を用いることもまた可能である。適切なスペーサー分子は、とりわけペプチドスペーサー、架橋剤、天然又は合成ポリマー、例えば核酸、置換若しくは未置換炭水化物などである。
結合は、共有結合（好ましい）及び非共有結合の両方によって生じうる。スペーサーモジュールは、とりわけ、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質の種々のモジュールがそれらの機能性に関して互に有害な影響をもたないように、それらモジュールを互に間隔をあけて隔てる仕事をもつ。本発明の目的のために（単離）組換えタンパク質のモジュールは1つ以上のスペーサーモジュールによって結合させることができ、前記モジュールは化学的及び/又は酵素的反応によって（例えばプロテアーゼによって）切断できる。したがって、スペーサーモジュールによって連結される、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質のモジュールを要求に応じて互に分離することは可能である。
好ましい実施態様では、しかしながら、特に抗原モジュールが、少なくとも1つのアレルゲンである少なくとも1つの抗原の少なくとも1つの完全又は部分的エピトープに由来するアミノ酸配列の場合には、そのような追加のスペーサーモジュールはそのような第一、第二及び/又は第三のモジュールの2つ以上の隣接するモジュールの間に全く存在しない（すなわち追加のスペーサーモジュールは一切存在しない）
【００２１】
本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質の個々のモジュールの所望されるどのような編成も一般に可能である。各モジュールは（単離）組換えタンパク質で1回以上存在できる。最小限の要件は、少なくとも1つの移行モジュール、少なくとも1つの標的誘導モジュール及び少なくとも1つの抗原モジュールの存在である。追加されるモジュール（例えばタグモジュール、スペーサーモジュールなど）は場合によって存在しうるが、存在することを必要とされない。全てのモジュールが、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質で1回以上存在することができる。モジュールが2回以上存在する場合には、それらは同一コピーの形で存在するか、又はあるモジュールの異なる型が各事例で単一コピーとして若しくは2つ以上のコピーとして存在できる。同じクラスのモジュール（例えばHisタグモジュール及びビオチンタグモジュール）で完全に異なるモジュールが、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質で存在することもまた可能である。両モジュールは当該（単離）組換えタンパク質で機能的に同じ仕事（タグのジュール）を実施するが、それらの分子構造に関して共通のものを有する必要はない。
好ましい実施態様では、1つのモジュールの2つ以上のコピーが本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質に存在することが可能である。すなわち、同一又は異なる抗原モジュールの2つ以上のコピーが存在しうる。また別には、（単離）組換えタンパク質は、対象動物で免疫応答を調節するために2つの異なる抗原モジュールを含むことができる。
【００２２】
組換えタンパク質の抗原モジュールの2つ以上の同一コピーは、例えば、そのような関連抗原に対して強化された免疫応答を引き起こすことができる。2つ以上の異なる抗原モジュールは、例えば1つの（単離）組換えタンパク質内で一緒にされて2つ以上の異なる抗原に対する免疫応答を同時に調節することができる。2つ以上の移行モジュールを本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質で用いることができる。例えば、Tat配列及びVP22配列を利用して移行をより効率的にすることができる。なぜならば、（単離）組換えタンパク質の移行はより広域の多様な細胞タイプ又は組織タイプで効率的に生じるからである。例えば2つ以上のタグモジュール（例えばHis-タグ及びFLAG-タグ）を1つの（単離）組換えタンパク質で用いることもまた可能である。そのような事例では、例えばHis-タグは組換えタンパク質の単離に用いられ、例えばFLAG-タグは（単離）組換えタンパク質の検出に利用される。2つ以上の異なる標的誘導モジュール（例えばMHC II分子のインバリアント鎖由来の配列及びさらに別の標的誘導モジュールとしてマンノース6-リン酸基）を1つの（単離）組換えタンパク質で用いることが可能である。例えばインバリアント鎖はMIICへの標的誘導モジュールとして機能し、マンノース6-リン酸基はリソソームへの標的誘導を媒介し、したがって抗原提示効率又は抗原提示細胞により提示される種々の抗原エピトープの全体的な数を増加させることが可能である。加えて、本発明のiMAT分子は、同一又は異なる種に由来する2つ以上の異なるインバリアント鎖を包含でき、したがって本発明のタンパク質を異なる種で用いることを可能にする。
【００２３】
本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質内の個々のモジュールの位置は、少なくとも1つの移行モジュール、少なくとも1つの標的誘導モジュール及び少なくとも1つの抗原モジュールが存在する限り所望にしたがって変動しうる。（単離）組換えタンパク質のモジュールの全て又はいくつかは線状連続編成モジュールの形態で存在せず、環状若しくは分枝モジュール構造又は他のデンドリマーの形態で、又は線状及び/又は分枝状及び/又は環状及び/又はデンドリマー分子部分の組み合わせとして存在することもまた可能である。発現ベクターの商業的供給業者が存在し、前記業者は、これらのメカニズムによって環状融合タンパク質を調製することを可能にする特異的なベクターを供給する（例えばIMPACTTM-TWIN系（New England Biolabs, Beverly, MA, USA））。分枝モジュールは例えばペプチドを合成することによって調製でき、前記ペプチド合成では、ポリL-リジンから出発し、新しいリジン残基がその後に続くリジン残基の各々の両遊離アミノ基に付加される。この方法では、実質的に任意の分枝度を有するペプチド構造を作出することが可能である。前記分枝ペプチドの基本構造上に続いて例えば移行モジュール及び/又は標的誘導モジュールを合成することが可能である。さらに別のモジュールを線状、環状若しくは分枝状ペプチド基本構造上にタンパク質連結によって結合させることもまた可能である。ペプチド合成の間に例えばビオチン基をペプチド基本構造に導入することもまた可能であり、続いてモジュールをこれらのビオチン基に例えばストレプトアビジン、Strep-タグ系を介して又はPinPointTM系（それぞれ、IBA GmbH, ゲッティンゲン，ドイツ及びPromega Biosciences Inc., San Louis Obispo, CA, USA）を介して付加することができる。このようにして付加されたモジュールを続いて非共有結合によりペプチドの基本構造に結合させる。好ましい実施態様では、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質は、配列番号:7、8、9、10、11、12、13、14、17、20、21、22、23のアミノ酸配列の1つ以上を含む（好ましくは前記配列から成る）。
【００２４】
本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質は、昆虫咬傷過敏症（IBH）及び/又はじんま疹に罹患するウマで特異的に治療及び/又は予防を意図する方法で特に有用である。
昆虫咬傷過敏症は、対象動物で全身性応答を引き起こすがそうでなければ無害な昆虫の唾液、毒液、身体部分、排泄物又は分泌物によって誘発されうる。実際、IBHは痛みを伴う一般的なウマのアレルギー性皮膚疾患であり、慢性再発性季節性のアレルギー皮膚炎として出現し、世界中の多様な地域で見いだされるクリコイデス属の昆虫の咬傷によってしばしば引き起こされる。IBHは、種々の名称（例えばスイートイッチ、夏疥癬、夏湿疹、カーセン（Kasen）、クイーンズランド疥癬、季節性皮膚炎又はクリコイデス過敏症）で世界的に報告されている。罹患動物は強い痒み及び痛みを有し、自身を激しく擦り咬む。典型的な症状は掻痒である。ハエの咬傷は水疱を形成し、前記水疱は滲出性でかさぶた、痂皮を形成し皮膚落屑を生じる。長期にわたって擦ったり咬んだりすることによって、とりわけ脱毛及び皮膚の損傷を生じ、時には出血性開放性のただれをもたらす。場合によって、二次的な細菌感染が発生する。ウマがそのたてがみ及び尾の上部の毛をこすり落とすことも稀ではない。長期間には、皮膚の肥厚及び毛の色素沈着の低下が生じうる。たてがみ及び尾はもっとも一般的に影響を受けるが、重篤な徴候を有するウマは体全体の広い領域に病巣を有しうる。診断は臨床試験及び典型的な季節発生性徴候に基づく。ウマのIBHの疾病生理学はほとんど知られていない。他の種と比較して、皮膚症状を示すアレルギーに対しては顕著な相違が存在するように思われる。したがって、治療に対するウマの応答もまた異なる。例えば、ヒスタミン受容体アンタゴニストは臨床症状を緩和できない（Olsen et al. Vet.J. 2011, 187: 347-351）。アレルゲン特異的免疫療法（SIT）もまた過去にウマのIBHで用いられたが成功しなかった（Ginel et al., Vet. Derm. 2014, 25: 29-e10）。この医学的問題を解決するために、本明細書に開示及び特許請求されるIBH用（単離）組換えタンパク質の少なくとも1つの抗原モジュールは、クリコイデス属（ハエ目：セラトポゴニダエ（Ceratopogonidae））の種々の種の小昆虫から単離された、最近見つけられたアレルゲングループから選択される。加えて、IBH罹患ウマは7.1倍高いじんま疹罹患リスクを有する（Kehrli D et al, J Vet Intern Med 2015, 29(1): 320-326）。じんま疹（じんま疹（hive）又は発疹（nettle rash）としても知られている）は、皮膚に出現する分離した腫脹を特徴とする。これらは、輪状斑点、円形病巣、馬蹄形状であるか、又は他の不規則な形状を有しうる。症例の大半は再発性で、じんま疹は突然開始し、24−48時間又は数日以内に自然に消失する。じんま疹に関与するIgE媒介アレルギー成分が存在するという良好な証拠が存在するが、疾病生理学はなおあまり理解されていない。直接の引き金は、素因を有する対象動物（例えばIBHに罹患したウマ、及び/又はまた別に環境性アレルゲンに対し皮膚過敏症の素因を有する対象動物）における昆虫の刺し傷又は咬み傷、食物、薬剤反応、敷き藁、化学物質などでありうる。したがって免疫療法が成功すれば（例えばIBHで）、そのような対象動物の再発性じんま疹の出現を減少させることができる。
【００２５】
さらに別の実施態様では、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質は、再発性気道閉塞（RAO）に罹患するウマで特異的に治療及び/又は予防を意図する方法で特に有用である。
ウマの再発性気道閉塞（RAO）（ヒトの喘息に類似する呼吸疾患）は、もっとも一般的に中齢及び老齢のウマの肺を冒す世界的にもっとも一般的に診断される症状の１つである。前記はまた、肺胞性肺気腫、又は気管支炎/細気管支炎、又は以前には慢性閉塞性肺疾患と呼ばれる。夏季（例えばウマが放牧場にいるとき）であれば、夏季放牧場関連閉塞性肺疾患又は夏季放牧場関連RAOという用語が用いられる。RAOは、レアギン抗体（主としてIgE）により開始する典型的な一連の事象が関与する1型即時型過敏症のアレルギー疾患である（レアギン抗体は、ヒスタミン及び他の化学的媒介物質（一緒に働いて気道炎症及び可逆的な気道閉塞を誘発する）の産生をもたらすマスト細胞の脱顆粒を生じる）。増悪時に観察される症状は重篤であり、運動耐容能力の低下、咳、鼻汁排出及び休息時呼吸努力の増加が含まれうる。診断的手段（例えば肺機能測定、血中ガス分析又は気管支肺胞洗浄）は当該疾患の追加情報を提供できる。典型的な治療は緩和治療のみ（例えば気管拡張剤及び/又はコルチコステロイド）を含むが、これまでのところ、利用可能な根本的治療はない（Leclere et al. Respirology 2011, 16: 1027-1046, Pirie, Equine Vet J 2014, 46: 276-288）。
最近、クララ（Clara）細胞の10kDaタンパク質（CC10）による治療が、RAO罹患馬で防御に有効であると又は前記のウマの受動免疫療法として有用であるとして特許請求されている。CC10は、ヒト及び動物の気道上皮でもっぱら生成される抗炎症防御タンパク質ファミリーのメンバーの1つである。前記発明はUS2014/0105906に記載されている。
RAOは複合疾患であるが、風媒アレルゲンへの確実な暴露が病因論で中心的役割を果たす。臨床的寛解は、空気中アレルゲンへの暴露を排除することによって通常達成される。しかしながら、RAOの始動に関与する主要な抗原はこれまでのところ明確には同定されていない。多数の潜在的因子が例えば有機ダスト中に存在する（有機ダストは馬小屋につながれたウマでは主として馬小屋又は乾草の埃として存在し、放牧馬では花粉がさらに関与する（Leclere et al. Respirology 2011, 16: 1027-1046, Pirie, Equine Vet J 2014, 46: 276-288））
本発明のiMAT分子の抗原モジュールは、本明細書の実施例6及び7で例示的かつ詳細に記載されるように、バイオインフォマティクスの手法によって選択できる。この手法によって、iMAT分子は、特にワクチンとして（例えば対象動物（好ましくはウマ）のRAOの治療及び/又は予防のために）有用となりうる。
【００２６】
さらに別の実施態様では、開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質は、細菌によって引き起こされる感染症に罹患するウマで特異的に治療及び/又は予防を意図する方法で特に有用である。
ロドコッカス・エキ（Rhodococcus equi）は、病原性土壌生息放線菌であり、肺及び肺以外の化膿性肉芽腫性感染症（ウマのロドコッカス症）を引き起こす。仔馬は特に感受性が高く致死的な肺炎を起こす。潰瘍性腸炎、骨髄炎及び敗血症性関節炎が稀に観察される。多くの免疫手法が仔馬のロドコッカス症の予防のために試みられたが成果は限定的であった。抗生物質治療は高価であるとともに有効性が一定せず、最近の研究は抗生物質耐性株の出現を強調している。
感染は主として当該病原体を運ぶ風媒ダストの吸入による。宿主への侵入に際して、R.エキは吸入後に局所マクロファージ（特に肺胞マクロファージ）に取り込まれる。前記は肺機能の緩徐な進行性低下とともに拡散し、早期臨床診断を困難にする。初期臨床徴候は、しばしば微熱、稀に咳、又はわずかな呼吸速度上昇（運動又は調教によるストレスがなければ明らかになりえない）のみから成る。加えて、診断はそれほど容易ではない（地域性R.エキ肺炎が存在する農場を監視するための推奨ツールは、これまでところ白血球濃度の分析、及び経気管洗浄液の細菌の培養、及びPCRによるR.エキの同定、又はそのような材料による細胞学的試験である（van Bargen, K and Haas, A. FEMS Microbiol Rev 2009, 33: 870-891；Vazquez-Boland, JA et al., Vet Microbiol 2013, 167: 9-33））。
前記の医学的問題を解決するために、本明細書に開示及び特許請求される、ロドコッカス症専用（単離）組換えタンパク質の少なくとも1つの抗原モジュールは、R.エキ由来抗原（例えば病毒性関連タンパク質A（VapA）、免疫優性表面発現リポタンパク質又は他の表面タンパク質）から選択できるか、又はR.エキ感染ファージからもまた誘導することができる。改善MAT分子は、ワクチンとして、例えばウマロドコッカス症の治療及び/又は予防のために特に有用でありうる。治療はiMAT分子の仔馬への投与を含むことができ、及び/又は本発明にしたがって妊娠牝馬の治療もまた含むことができる。
腺疫はウマの感染症のもう1つの例であり（腺疫は頭部及び頸部リンパ節の膿瘍形成を特徴とする）、ストレプトコッカス・エキ（Streptococcus equi）によって引き起こされる、もっとも頻繁に診断されるウマの感染症の1つであり、新規な予防ワクチンの開発がなお希求されている。
【００２７】
さらに別の実施態様では、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質は、ウイルスによって引き起こされる感染症に罹患するウマで特異的に治療及び/又は予防を意図する方法で特に有用である。
アフリカウマ病（AHS）は感染性が強く致死的疾患であり、一般的にウマ、ラバ及びロバが罹患する。前記は、レオウイルス科に属するオルビウイルス属のウイルスによって引き起こされる。AHSは直接性接触伝染性ではないが、昆虫ベクターによって拡散されることが知られている。昆虫ベクターは主にクリコイデスであるが、クレックス、アノフェレス（Anopheles）及びアエデス（Aedes）、又はダニ（例えばヒアロンマ（Hyalomma）又はルヒピセファルス（Rhipicephalus））による伝播もまた記載されている。今日まで、AHSのために有効な治療は存在せず、感染馬の90%近くがほぼ呼吸器不全のために感染24時間で死亡する。結果として、当該疾患の制御は予防性ワクチンに依存する。
西ナイルウイルス（WNV）は、フラビウイルス科フラビウイルス属の日本脳炎ウイルス血清型群にグループ分けされる蚊媒介プラス鎖RNAウイルスである。WNVは、西ナイル熱とも称される症候群の原因因子である。鳥類が病原体保有宿主であり、WNVは、自然界では蚊-鳥-蚊サイクルで維持される。しかしながら、ウマが感染するときはしばしば認識されないままである。ウマは死ぬか、又は重篤な神経症状（麻痺、歩行失調、横臥、線維束性筋委縮を含む）のために安楽死される（他は軽度から重度の灰白脳脊髄炎を示す）。WNV感染の診断及び確認は、ウイルスの同定により直接的に、又は臨床標本の抗体検査によって間接的に為しうる。しかしながら前記診断及び確認は、ウマにおけるウイルス血症の典型的に短い持続時間及びその低レベルによって妨げられる。
【００２８】
さらに別の実施態様では、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質は、病原媒介昆虫（例えば吸血性ハエ、小昆虫、ダニ及び/又は蚊）によるウマの感染症の伝播の予防を特異的に意図する方法で特に有用である。
病原体は、節足動物の唾液（広範囲の生物活性分子を含む）とともに哺乳動物宿主の皮膚にデリバーされる。これらの唾液成分は止血及び免疫応答を変更させることができ、病原体の感染を成立させる能力に寄与することができる。吸血性節足動物の唾液腺中の感染性微生物の存在は、それ自体唾液組成を変更させる（例えば感染した蚊のアピラーゼ又は抗トロンビナーゼの濃度の変化）。これらの抗原又は他のものは、本発明のiMAT分子の抗原モジュールでの利用に良好に適合し、宿主免疫系を活性化させウマでの病原媒介昆虫による伝染性病原体の伝播を予防するワクチンとして特に有用でありうる。
さらに別の実施態様では、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質は、菌類によって引き起こされる感染性疾患に罹患するウマで特異的に治療及び/又は予防を意図する方法で特に有用である。
皮膚糸状菌症又は白癬は、動物及び人間に存在する毛髪及び皮膚表面の角質化細胞層の菌類感染である。動物好性又は好地性皮膚糸状菌群に属するミクロスポルム属又はトリコフィトン属のいくつかの種は動物の臨床的感染を引き起こすことができる。菌類及び/又はその胞子の多様な表面抗原は、本発明のiMAT分子の抗原モジュールでの利用に良好に適合し、ウマの皮膚糸状菌症を治療び/又は予防するワクチンとして特に有用でありうる。
さらに別の実施態様では、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質は、寄生生物によって引き起こされる感染性疾患に罹患するウマで特異的に治療及び/又は予防を意図する方法で特に有用である。
ウマに感染する寄生生物は世界中に普遍的に存在し臨床的に重要である。ウマの健康にとって脅威となる主要な寄生生物は、シアトストミンス（cyathostomins）、パラスカリス・エクオルム（parascaris equorum）、アノプロセファラ・パーフォリアタ（anoplocephala perfoliata）、及びストロンギルス・ブルガリス（strongylus vulgaris）である。駆虫薬耐性レベルの上昇がウマの寄生生物で世界的に報告されている。原生動物（例えばクリプトスポリジウム）については、ほとんどの薬剤が宿主での寄生生物再生を持続的に阻害しえない。殆どの仔馬が影響を受け、結果は先天性免疫及び後天性免疫に依存する。成熟寄生生物の他に検出潜伏期に由来する抗原が、本発明のiMAT分子の抗原モジュールで利用されるもう1つの例であり、例えばウマの寄生生物感染を治療及び/又は予防するワクチンとして特に有用でありうる。
【００２９】
特にウマの免疫応答を調節する事例では、少なくとも1つの標的誘導モジュールは、好ましくはウマインバリアント鎖、より好ましくは配列番号:2、15、16の1つ以上のアミノ酸配列である。
有利な実施態様では、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質はモノマー型として存在する。なぜならば、例えば、組み換えにより導入されるアレルゲンは、特に封入体を介して生成される場合は、凝集物を形成する傾向があるからである。（単離）組換えタンパク質の完全な配列で少なくとも1つ、好ましくは全てのシステイン残基を置換することによって、好ましくはセリン、ロイシン、イソロイシン及び/又はアスパラギン酸で置換することによって、分子間ジスルフィド結合の形成を防ぐことが、すなわち一切の凝集（特に自然のものではない一切の分子間及び/又は分子内結合）を回避することが可能である。すなわち、システイン残基を完全に欠く（単離）組換えタンパク質は凝集しない。結果として、タンパク質は容易に発現され、改善された標的誘導及びMHC提示を示す。
さらにまた、例えばアレルゲンのそのようなシステインフリー変種（前記では野生型アレルゲンのアミノ酸配列のシステイン残基は単独で又は組み合わせて変異導入されてある）は、対応する野生型アレルゲンと比較してIgE反応性の低下を示し、同時にTリンパ球に対する反応性は実質的に保持し、したがって低アレルゲン性である。
本発明はしたがって、例えばウマでIBHを誘引するアレルゲンの低アレルゲン性変種に関し、前記変種では野生型アレルゲンのシステイン残基は単独で又は組み合わされて変異導入されてある。
さらにまた、例えば亜鉛-又はコバルト-充填固相を用いて、サンプル（本発明のiMAT分子を含む）でタンパク質を分離するためのタグモジュールの存在は、精製プロセス中に凝集を生じることなく融合タンパク質を製造する実現性をさらに改善する。典型的には、タグモジュールは、連続する5から6個のヒスチジン残基のポリヒスチジンタグを含む。
【００３０】
本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質は医薬組成物で有用である。例えば、（単離）組換えタンパク質はワクチンとして使用される。したがって、本発明は、本明細書に開示及び特許請求される1つ以上の（単離）組換えタンパク質を含むワクチン組成物を提供する。そのようなワクチン組成物は以下に罹患するウマで治療的に又は予防的に用いることができる：昆虫咬傷過敏症（IBH）、じんま疹及び/又はウマ再発性気道閉塞（RAO）、病原体（例えばロドコッカス・プニューモニアエ）によって誘発される感染症、腺疫、アフリカウマ病、西ナイルウイルス感染、皮膚糸状菌症、及び/又は消化管又は他の器官の寄生生物、例えばクリプトスポリジウム症、蠕虫及び/又はその検出潜伏期。加えて、当該方法はそのような病原体に向けて用いるだけでなく、宿主免疫系を活性化して病原媒介昆虫（例えば吸血性のハエ、小昆虫、ダニ及び/又は蚊）よる伝播を予防することができる。
したがって、本発明の好ましい実施態様では、対象動物（例えばウマ）のためのワクチンは、クリコイデス属の小昆虫及び/又は他の吸血性昆虫の咬傷への応答によって引き起こされるIBHを治療及び/又は予防するために提供される。加えて、IBHに対する免疫療法が成功すれば、一般的に環境性アレルゲンに対する皮膚過敏症を低下させることができ、したがってそのような素因を有する対象動物で再発性じんま疹の出現を低下させることができる。
本発明のさらに別の実施態様では、対象動物（例えばウマ）のためのワクチンは、例えばカビ（菌類及び/又はその胞子）、花粉、ハウスダスト又は飼い葉ダニ（及び/又はその糞）への応答によって引き起こされるRAOを治療及び/又は予防するために提供される。
本発明のさらに別の実施態様では、対象動物（例えばウマ）のためのワクチンは、例えばロドコッカス属、ストレプトコッカス属、オルビウイルス属、フラビウイルス属、トリコフィトン属、ミクロスポルム属、クリプトスポリジウム属及び/又はストロンギルス属が関与する感染症を治療及び/又は予防するために提供される。加えて、当該ワクチンは、宿主の免疫系を活性化して病原媒介昆虫（例えばクリコイデス、クレックス及び/又は他の吸血性昆虫）による疾患の伝播を予防するために提供されうる。
【００３１】
（単離）組換えタンパク質の医薬組成物（例えばワクチン型）は、好ましくは舌下投与、皮下及び/又は皮内注射、リンパ節への注射のために、及び/又は経粘膜、特に胃腸管又は呼吸器系の粘膜を介する投与のために設計される。
本発明の好ましい実施態様では、医薬組成物は非経口的に投与される。
本発明のiMAT分子を医薬として又はワクチンとして用いて、例えばアレルギー疾患を修正することができる。例えば、昆虫咬傷過敏症（IBH）はそのようなiMAT分子によって治療できる。
IBH誘引昆虫（クリコイデスのような昆虫）のアレルゲンを含む組換え製造iMAT分子の少量（もっぱら1つ以上の抗原モジュールの重量に関して1から1000μg）を例えば1回から5回皮下に、皮内に又は直接リンパ節に注射し、強力で長期間持続する免疫応答をウマで誘発して臨床症状の緩和に至る。
ある好ましい実施態様では、本発明のiMAT分子は少なくとも1つのアジュバントと組み合わせて投与される。アジュバントには以下の1つ以上が含まれる（ただしこれらに限定されない）：ミョウバン、BCG、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、脂質エマルジョン、脂質又はポリマー性ナノ粒子又はミクロ粒子、ミセル、リポソーム、サポニン、脂質A、又はムラミルジペプチド、細菌生成物、ケモカイン、サイトカイン及びホルモン、キトサン、デンプン、アルギン酸塩、セルロース誘導体（例えばエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、核酸又は核酸構築物。これら組成物の1つ以上を添加して免疫応答を強化又は修正することができる。また別には、iMAT分子をアジュバント無しで又は水性型で投与することもできる。
iMAT分子は、約1μgから1000μg（この用量及び以下の用量はもっぱら1つ以上の抗原モジュールの重量に関する）の用量で、より好ましくは約10μgから約100μg、さらに好ましくは約20μgから約50μgの用量で投与できるが、ただし最適用量は、注射される抗原（好ましくはアレルゲン）、対象動物の重さ、対象動物の免疫系などにしたがって変動しうる。多くの事例で効果的な治療は1回の投与で達成できる。いくつかの実施態様では、治療は1回から15回の投与を含む。好ましい実施態様では、治療は1回から5回の投与、より好ましくは1回から3回の投与を含む。最初の治療のためには、投与は周期的に、例えば数日にわたって、1カ月若しくは1年に1回又は2回、又は1年に数回でありうる。免疫応答の維持のために、投与は数カ月から数年の間隔で実施できる。
本発明の好ましい実施態様では、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質は、リンパ節内投与のために設計される。リンパ節への直接投与の過程で、対応するリンパ節を注射手順の間に例えば超音波によって可視化し、注射針の位置及びリンパ節の変化（例えば腫脹）をモニターすることができる。下顎リンパ節、腋窩リンパ節、鼠径リンパ節及び/又は膝窩リンパ節への注射が、超音波誘導位置測定及び注射の容易さゆえに好ましい。
【００３２】
吸血性昆虫の唾液中で同定されたタンパク質のいくつか（＞20）が、ウマでIgE反応性及び病理学的皮膚反応を誘発することは当業界で公知である（Schaffartzik, Veterinary Immunology and Immunopathology 2012, 147: 113- 126; Allergome (www.allergome.org)）。したがって、関連するアレルゲンの大半が特異的免疫療法のための医薬に含まれる場合にのみ治療は成功しうると予測される。しかしながら、驚くべきことに、本発明のそのようなiMAT分子の1つ、2つ、3つ又は4つだけで（各々が例えば昆虫唾液の異なる抗原モジュール又はただ1つのエピトープのモザイク様構築物を含む）、罹患対象動物の免疫調節整及び/又は症状改善を誘発するために十分である（ただし、iMAT分子は1から5回皮下、皮内及び/又はリンパ節に直接注射される）。
好ましい実施態様では、単一iMAT分子が用いられ、ウマで治療効果の誘発及び/又は昆虫咬傷過敏症（IBH）、じんま疹及び/又はウマ再発性気道閉塞（RAO）の発症予防のために十分である。
別の好ましい実施態様では、2つ、3つ又は4つのiMAT分子の組み合わせが、同時投与、連続投与及び/又は時系列的組み合わせによる共同投与の手段によって用いられる。
好ましい実施態様では、単一iMAT分子が用いられ、ウマの感染症（例えば、ロドコッカス肺炎、腺疫、アフリカウマ病、西ナイルウイルス感染、皮膚糸状菌症）、及び/又は消化管若しくは他の器官の寄生生物（例えばクリプトスポリジウム症、蠕虫及び/又は前記の検出潜伏病期）、及び/又はそのような感染症の（例えば吸血性のハエ、小昆虫、ダニ及び/又は蚊による）伝播の治療的効果の誘発及び/又は予防及び/又は伝播の予防に十分である。
別の好ましい実施態様では、2つ、3つ又は4つのiMAT分子の組み合わせが、同時投与、連続投与及び/又は時系列的組み合わせによる共同投与の手段によって用いられる。
【００３３】
本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質の熱力学的評価にしたがえば、安定性はシステイン変異（すなわち種々のアミノ酸による置換）によって影響される。例えば、置換はCysのSerへの置換でありうる。しかしながら、安定性は、Serアミノ酸以外の異なるアミノ酸を用いたときより高くなり所望の安定性及び可溶性を達成できる。すなわち、第一の選択はCysのSerによる置換でありうるが、不安定な場合には、Ser以外の他のアミノ酸残基でCysを入れ替えるべきである。
標的誘導される配列でシステインの代わりに入れ替えられる安定なアミノ酸残基を選択するために、三工程アプローチが選択される:
1．末端6ヒスチジンタグ、iMAT配列及び問題のタンパク質の一次配列を含む標的誘導されるタンパク質の三次元構造をモデリングする。モデリングは自然のままの配列及びシステイン置換により実施できる。
2．単一点置換（例えばシステイン残基の異なるアミノ酸残基（例えばSer及び/又はIle）による置換）に基づいてタンパク質の安定性を反復決定し、さらに利用可能な三次元構造の全てを分析することによって採点して安定な入れ替えを決定する。
3．工程1及び2を繰り返すことによって、安定化構造を再モデリングし、安定性を実証する。
【００３４】
三次元タンパク質構造は分子レベルにおけるタンパク質の機能の理解に極めて重要であり、多くの種々のタイプの生物学的実験（例えば位置指定変異導入）の合理的設計に非常に重要である。しかしながら、構造的な特徴を有するタンパク質の数は、既知のタンパク質配列の数と比較して小さい。あるタンパク質配列（標的）に対して既知の構造を有する相同なタンパク質（鋳型）を同定することが可能である。これらの事例では、相同性モデリングは、タンパク質の3Dモデルをその一次アミノ酸配列から作出するために選択される方法であることが立証された。相同性モデルの構築は以下の4つの主要な工程を含む:（1）構造鋳型の同定、（2）標的配列と鋳型構造とのアラインメント、（3）モデルの構築、及び（4）モデルの質の評価。これらの工程は、満足なモデリング結果が達成されるまで繰り返すことができる。正確なホモローグモデルを決定できない場合には、一次構造（アミノ酸配列）からタンパク質構造を決定するコンピュータによるアプローチが用いられる。“de novo”又は“ab initio”な方法は、物理学的原理に基づき、折り畳みプロセスを模倣しようとする。そのような方法は、多数の立体構造の実例を示す必要があり、最小値の自由エネルギーの構造を同定するために非常に正確なエネルギー関数を要求する。多くの方法が記載されたこれらの原理の組み合わせを用いている。
タンパク質の安定性におけるアミノ酸置換の影響について相応に正確な評価を提供するコンピュータツールの利用可能性は、広範囲な応用に際して決定的に重要である。特に、そのようなツールは、修正タンパク質の作出をもっぱら目指すタンパク質の操作及び設計の促進及び支援に潜在能力を有する。
タンパク質の安定性は、折り畳みが解除され、さらに迅速に可逆的に再度折り畳まれるタンパク質の熱力学的安定性という観点から考えることができる。これらの事例では、タンパク質の安定性は、折り畳み状態と非折り畳み状態との間のGibbs自由エネルギーの差である。安定性に影響を与える唯一の因子は折り畳み状態及び非折り畳み状態の相対的自由エネルギーである。折り畳み自由エネルギーの差が大きければ大きいほどさらにより大きな正の値であればあるほど、タンパク質は変性に対してより安定となる。折り畳み自由エネルギーの差は典型的には小さく、球形タンパク質については5−15kcal/molの規模である。しかしながら、他方では、タンパク質の安定性は、過酷な温度又は溶媒条件に耐えるタンパク質の特性とみなすことができる。これは熱力学的安定性に関係するが、折り畳み/非折り畳みの可逆性又は不可逆性（動力学的安定性）にもまた関係する。
【００３５】
タンパク質中の単一位置置換によって引き起こされる熱力学的安定性の変化を予測するために、いくつかの異なるアプローチを適用して、タンパク質の構造及び機能におけるそのような置換の影響を調べることができる（Pires DE et al., Bioinformatics 2014, 30(3):335-342）。そのようなアプローチは、1つの単独タンパク質のアミノ酸配列から置換の影響を理解しようとするもの、及び広範囲の構造情報を探索するものに大雑把に分類することができる。構造を基準とするアプローチは典型的には、置換によるタンパク質の安定性の変化又は実際の自由エネルギーの値の変化（ΔΔG）の方向を予測しようとする。
各々特定のタンパク質及びその対応するモデルについての結果を、採点系（用いられるモデルにおける発生及びタンパク質の安定性における自由エネルギー変化（ΔΔG）を基準にして入れ替えを等級分けする）を用い、特定の置換の出現数に関して統計的に解析し、それによって入力構造及び可能な入れ替えの中でもっとも強い脱安定化残基（もし存在するならば）を決定する。採点は、各モデルの問題の各位置でもっとも低いΔΔG（ΔΔG＜0）を決定し、対応する線形値及び累積ΔΔGの値を潜在的な各入れ替え位置に割り当てることによって計算し、続いて結果を評価してモデル間での一貫性を決定する。計算したタンパク質モデルは異なる品質（正確な三次元構造を予測する確率）を有するので、重み係数を提供してより正確なモデルに由来する結果を優先させることができる。有意な（ΔΔGに基づく）脱安定化残基（もし存在するならば）に置換される。すなわち新規なモデルが作出され、定常状態に達するまで解析が繰り返される。加えて、主成分分析を介してxyz座標を解析することによって作出モデルを評価して、個々の位置でのアミノ酸入れ替えによる潜在的な構造的折り畳みの誤りが決定される。
【００３６】
さらにまた別の特徴では、本発明の根本的な目的は、驚くべきことに、予め定めたアミノ酸配列でそのようなアミノ酸配列の安定化を可能にするアミノ酸置換を同定する方法を提供することによって解決され、前記方法は以下の工程を含む：
（i）標的誘導される予め定めたアミノ酸配列の三次元/四次元構造をモデリングする工程、
（ii）単一点置換（例えばシステイン残基の異なるアミノ酸（好ましくはセリン及び/又はイソロイシン残基）による置換）に基づいてタンパク質の安定性を反復して決定する工程、及び自由エネルギー変化（ΔΔG）におけるタンパク質の安定性に基づく採点系を用いて、全ての利用可能なアミノ酸配列の三次元/四次元構造を解析することによって安定化置換を決定する工程、
（iii）アミノ酸配列の三次元/四次元構造を再モデリングする工程並びに（ii）及び（iii）の工程を定常状態が達成されるまで繰り返すことによってその安定性を計算する工程。
さらにまた別の特徴では、本発明の根本的な目的は、驚くべきことに、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質を提供することによって解決され、ここでその完全又は部分的アミノ酸配列は、本明細書に開示及び特許請求される予め定めたアミノ酸配列でアミノ酸置換を同定する方法によって安定化された（本明細書の実施例5を参照されたい）。
実施例
以下の実施例は本発明をさらに詳述するために供されるが、本明細書に開示される本発明の範囲を制限するものと解されるべきではない。
【実施例１】
【００３７】
免疫/免疫持続期間の代用マーカー
本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質のウマへの投与は、当該抗原モジュールに存在するアレルゲン及び/又はエピトープに対し免疫学的応答を生じる。加えて、C-又はN-末端タグモジュールは、標的対象動物で固有の製品特異的免疫学的シグナル（例えば抗体又はT細胞応答）（前記は免疫又は免疫持続期間の代用マーカーとして用いられうる）を検出するために、隣接モジュール由来の隣接アミノ酸残基と一緒に利用されうる。この代用マーカーは、治療特異的免疫学的パラメーターとして、投与後の免疫若しくは免疫調節又は免疫持続期間若しくは免疫調節持続期間の評価を可能にする。したがって、本発明の（単離）組換えタンパク質によって始動される免疫応答の特異的なインジケーターは、末端タグ（場合によって隣接アミノ酸残基とともに）特異的抗体（例えばIgG抗体）の誘発である。前記とはまた別に或いは前記に加えて、インジケーターは、スペーサーと本明細書に開示及び特許請求される1つのモジュールの接合部又は2つのモジュール間の接合部に特異的な抗体の誘発である。
【実施例２】
【００３８】
低アレルゲン性
IBH罹患馬から新鮮採取血液を調製して、本明細書に開示及び特許請求される（単離）組換えタンパク質/iMAT分子に対する好塩基球反応性を試験することができる。前記はKaulの修正方法によって決定できる（Kaul, S., 1998. Type I allergies in the horse: Basic development of a histamine release test （ウマにおけるI型アレルギー：ヒスタミン遊離テスト(HRT)の基礎開発）. Doctoral thesis. Veterinary School Hannover, Germany）。略記すれば、iMAT分子及び/又は組み換えアレルゲンの10倍連続希釈シリーズ（例えば10nMから0.001nMの最終アレルゲン濃度の範囲）をPIPES緩衝液（pH7.4）（AppliChem, Darmstadt, Germany）で調製する。Na-EDTA凝固阻害血液から得た洗浄赤血球及び白血球を個々の希釈と一緒に1時間37℃でインキュベートする。氷上で20分間インキュベートして反応を停止させ、遊離ヒスタミンを含む上清を遠心分離後の各サンプルから収集する。最大ヒスタミン含量は水浴中で10分間血液細胞を煮沸することによって得られる（最大遊離）。遊離緩衝液と洗浄血液細胞とのインキュベーションは陰性コントロール（偶発遊離）として供された。ヒスタミン濃度は、競合RIA（LDN Nordhorn, Germany）を製造業者の指示にしたがって用いて決定される。
或いは、別の好塩基球活性化試験は細胞抗原活性化試験CAST(商標)ELISAであり、前記もまたin vitroアレルギー刺激試験と考えることができる。このアッセイは製造業者の指示にしたがって実施される（Buhlmann Laboratories AG, Allschwil, Switzerland）。CAST(商標)では、アレルギーの対象動物の血液に由来する沈殿白血球をサイトカインIL-3で同時にプライムし、さらにiMAT分子及び/又は組み換えアレルゲンで刺激する。とりわけ好塩基球はアレルギー媒介物質、スルフィドロイコトリエンLTC4並びにその代謝物LTD4及びLTE4を生成する。これらの新しく合成されたスルフィドロイコトリエン（sLT）を続いてELISA試験（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）で測定する。
これらのアッセイを用いてiMAT分子（アレルゲンを含む）の効果を対応する組み換えアレルゲン単独と比較することによってin vitroでiMAT分子の有害事象誘発潜在能力（例えば投与の副作用としてアナフィラキシーを誘発する）を判定することができる。
組み換えアレルゲンと比較して、iMAT分子による好塩基球脱顆粒化（例えばヒスタミン及び/又はスルフィドロイコトリエン遊離）の低下は、有害作用に対する低い潜在能力（すなわちiMAT分子のより良好な安全性プロフィール）を示している。
前記HRT（又はCAST(商標)）をウマの1型アレルギー反応のin vitro誘発試験として用いることができる。アレルゲン特異的ヒスタミン遊離は、好塩基球活性化に対する対応するアレルゲンの関連性を示し、したがって対象動物のアレルゲン特異的過敏の定量的パラメーターとして用いることができる。
【００３９】
従来技術に記載のMAT分子を対応する自然のままのアレルゲン（Fel d1）との比較で用い、細胞抗原刺激試験（CAST）だけでなく皮内及び皮下試験でも低アレルゲン性を示すことができた（Senti G et al., J Allergy Clin Immunol. 2012, 129(5): 1290-1296）。当該アレルゲンとFeld1を含むMATとの間の感受性における定量的な差は、それぞれ100倍、23倍及び16倍であった。MAT-Feld1は明らかに低アレルゲン性であったが、ある程度のアレルゲン性は残っていた。
本発明の関係で、本発明にしたがって製造したCulo2及びCulo3を抗原モジュールに含む2つのiMATの安全性をそれぞれ試験した。IBHに罹患する多重感作馬の新鮮採取血液を上記に記載のヒスタミン遊離試験（HRT）で用いた。
図10に示すように、自然のままのアレルゲンは強いヒスタミン遊離を誘引したが、一方、驚くべきことに2つの別個のiMAT分子（iMAT-Culo3及びiMAT-Culo2）は実質的に全く応答を示さなかった。したがって、iMAT分子は、従来技術に記載のMAT分子と比較して安全性に関して明瞭な卓越性を示した（上記参照）。
IBH罹患馬を前記iMAT分子で治療しても、アレルゲン関連有害反応は生じないことを期待できる。
MAT分子とは対照的に、iMAT分子のこの驚くべき安全性特性の結果は、脱感作タンパク質として用いられるiMAT分子を病原体に対するワクチンと同様に用いることができるということである。iMAT分子を含むワクチンはアレルギー性有害事象に関してアレルゲン特性を示さないので、古典的な治療用アレルゲンのような用量段階上昇を必要としない。一連の治療でiMAT分子の初回注射用量は有効性のみを考慮して先きに選択することができ、潜在的なアレルギー性有害反応を斟酌する必要がない。このようなことは従来技術のMAT分子の使用では実施できない。なぜならば、自然のままのアレルゲンと比較して、MATのアレルゲン性は一定レベルに低下させられているだけだからである。しかしながらMAT分子はそれでもなおアレルゲンであり、対照的にiMAT分子はそうではない。これら改善された特性の利点はより有効な治療レジメンを可能にする（例えば高い生物製剤含量（例えばiMATタンパク質20μgから50μgの3倍）の皮下又はリンパ節内の3回注射）。
試験した2つのiMAT分子のアレルギー性欠如は、従来技術に記載のMAT分子とは対照的に、そのようなiMAT分子では別個の分子の分離にリンカーアミノ酸残基（すなわち第一、第二及び/又は第三モジュール間のスペーサーモジュール）が用いられなかったという事実によって説明できる。ペプチド又はタンパク質リンカーによって結合される2つ以上の機能的ポリペプチドを含むように操作される融合タンパク質は、当該タンパク質の機能（例えば免疫系によるエピトープ認識）のために重要であることが従来技術で知られている（Klein JS et al., Protein Eng Des Sel. 2014, 27(10): 325-330）。機能的ユニット間の分離距離は、エピトープへの接近及びアビジティーによる結合能力に強い影響を与えることができる。モジュール間、特に標的誘導ドメインと抗原モジュール間のアミノ酸残基リンカーの欠如がより不撓性の構造をもたらすならば、アレルゲンモジュールの立体構造エピトープは不正確な折り畳みのために形成され得ない。その高親和性受容体によって好塩基球表面に結合される抗体（例えばIgE）の架橋が活性化及びヒスタミン遊離の誘発に必要である。しかしながら、不正確に折り畳まれたアレルゲンはそのような架橋を誘発できない可能性がある。したがって、リンカーを欠くiMAT分子は立体構造性IgEエピトープを形成し得ず、そのことはiMAT分子を非アレルゲン性にする。
【実施例３】
【００４０】
アレルゲン/バイオマーカーのインシリコ検出
本発明のIBHに関する説明で詳細に述べたように、IBHを誘引する主要なアレルゲンは未だに記載されていないが、IBHを標的とするiMAT抗原モジュールのバイオインフォマティクスによる操作を用いて、ある種のアレルゲンの関連をインシリコで判定することができる（本明細書の実施例6を参照されたい）。例えば、図8に示すように、インシリコの結果だけでなくCulo3の機能的HRTのex vivo試験の結果は、Culo3が主要アレルゲンであることを示しているように思われる。試験したウマの大半が（全てではないが）Culo3に対して明瞭に過敏を示した。
このことは驚くべきことである（なぜならば、他の実験、例えば以下の研究者らによる実験（van der Meide et al. (Vet J 2014, 200: 31-37）では、種々のアレルゲンが当該疾患に対するそれらの関連性で区別され得なかったからである)。IBH罹患馬の約80%から90%が試験したアレルゲンの各々に対して感作されていることが示された。したがって、驚くべきことに、本発明で、（i）Culo3は実際にIBHの主要アレルゲンである（すなわち50%を超える動物が感作されている）、及び（ii）Culo3は他のアレルゲンと比較して抜きんでた関連を有することを示すことができた。
iMAT抗原モジュールで用いられていることとは別に、対応するアレルゲンはまた、治療の開始に先立って前記アレルゲンに対する過敏の強度を精査することによって治療の成功を最適化するために役立つ。さらに、一連の治療を通して、免疫系の種々の成分のアレルゲン特異的調節（例えばアレルゲン特異的IgEの変化）をモニターすることができ、IgG抗体力価は治療及び/又は予防効果の指標となりうる。
したがって、コンピュータ検出アレルゲン及び/又は対応するアレルゲン特異的免疫グロブリンを診断及び/又は治療評価バイオマーカーとして利用することができる。
【実施例４】
【００４１】
ウマのIBHの治療用ワクチン/予防
単一iMAT分子又は本発明の異なる抗原モジュールを含むiMAT分子の組み合わせを、IBH罹患又はIBH誘発昆虫咬傷のリスクを有するウマの予防的又は治療的処置に用いることができる。本発明のiMAT分子をウマの顎下リンパ節に投与できる（Landholt et al., Vet Rec 2010, 167: 302-304）。略記すれば、当該リンパ節上の毛を刈り取り、外科操作に備える。触診及び超音波による誘導により、25G注射針をリンパ節に挿入する。注射するiMAT分子をアジュバントに吸着させる。アジュバントは、例えばリン酸アルミニウム（Adju-Phos（商標）；Brenntag Biosector, Denmark）から成る。iMAT分子ストックはバイアル中の375μg/mLの凍結溶液であり、各バイアルは500μLを含み使用前に融解される。
iMAT分子溶液を融解後、該溶液の400μLをリン酸アルミニウムゲル懸濁物の200μLと混合する。この最終溶液をリンパ節内注射に先立ち室温に60分間放置して、iMAT分子を例えばAdju-Phos(商標)に吸着させる。50μgのiMAT分子を含む混合物の200μLをリンパ節注射のために500μL注射器に移す。典型的には、まず初めに1回の注射及びiMAT分子当たり20μgから50μgの用量で(もっぱら1つ以上の抗原モジュールの重量に対して)、前記調製物を0日目、28日目及び56日目に投与する。
治療期間を通して及び/又は治療期間の後で、IBHの治療又は予防の有効性を、皮膚病巣（損傷毛、脱毛、かさぶた/擦過及び湿潤領域）の定量的、半定量的又は定性的評価によって臨床的に精査することができる。擦過/かきむしりの強さを採点することができる。
これらの臨床パラメーターを、以前のIBHシーズンにおける個々のウマの臨床徴候及び/又は治療介入の開始前の重篤度と比較することができる。また別に、未治療又はプラセボ治療のIBH罹患馬との比較によって、IBHの臨床徴候におけるiMAT分子媒介治療及び/又は予防の有効性を示すことができる。
前記ウマの新鮮血液を、ウマの1型アレルギー反応のin vitro誘発試験（例えばHRT又はCAST(商標)による）で用いることができる（詳細については上記実施例3を参照されたい）。ある種のクリコイデスアレルゲンによるチャレンジへの応答における好塩基球の脱顆粒の減少、例えばiMAT投与前と比較して投与後のヒスタミン及び/又はスルフィドロイコトリエン遊離の減少は治療及び/又は予防効果を示す。
また別に或いは前記に加えて、ある種のクリコイデスのアレルゲンによる皮内誘発試験（Langner et al., Vet Immunol Immunopathol 2008, 122(1-2):126-37）を前記のウマで用いることができる。応答（即時及び/又は後期反応性）の低下は、iMAT分子の投与の治療効果及び/又は予防効果を示す。
【００４２】
さらにまた、免疫系の種々の構成要素の調節（例えばアレルゲン特異的IgEの変化）をモニターすることができ、IgG抗体力価は治療及び/又は予防効果の指標となりうる。IgEレベルの変化とは別に、アレルゲン特異的IgGの増加は驚くべきことに、そのようなiMAT分子でウマをIBHのために治療したときに見出すことができる。これらの抗体はIgE媒介アナフィラキシーをin vivoで遮断することができ、好塩基球及びマスト細胞からの炎症媒介物質のアレルゲン誘発遊離だけでなくT細胞へのIgE媒介アレルゲン提示もまた阻害するように思われる。アレルゲンと特異的に結合するiMAT誘発IgG抗体の中で、いくつかのアレルゲン特異的サブタイプは、それらはアレルゲン特異的IgE抗体と競合するために重要な“防御的”役割を果たし、IgE媒介抗原提示を阻害することによってCD4+ T細胞の活性化を防止することができると提唱されている。さらにまた、分泌されるIgGサブセットは、マスト細胞及び好酸球の顕著な減少を促進し、前記は炎症媒介物質遊離の低下を伴う（Senna G et al., Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2011, 11(4): 375-380）。
FcεRI依存性好塩基球ヒスタミン遊離（Niederberger V et al., Proc Natl Acad Sci USA 2004, 101: 14677-14682）及び/又はIgE-アレルゲン複合体のB細胞とのFcεRII(CD23)依存性結合の阻害によって測定される、IgG活性“遮断”血清の機能的アッセイは、個々の臨床応答のより良好な予測を提供するように思われる（Wacholz PA et al., J Allergy Clin Immunol 2003; 112: 915-922）。
アレルゲン特異的免疫療法は免疫系の種々の構成要素を調節することができる。細胞性調節はアレルゲン誘発T細胞増殖の低下から成り、アレルゲン特異的T細胞の抹消寛容の誘発及び抗原特異的Th2優勢免疫応答の低下（Th1反応に有利でIFN-ガンマ産生を増加させる）を示す（Durham SR et al., J Allergy Clin Immunol 1996, 97: 1356-1365）。この免疫学的スイッチの連係に必要な重要な細胞タイプは異種T細胞集団（調節性T細胞（Treg）と称される）である。細胞レベルでは、アレルゲン療法の成功のための決定的要件は1型Treg細胞の抹消誘発である。抗原認識に特異的な1型Treg細胞に関する機能的研究によって、Th1及びTh2応答の1型Treg細胞による調節はサイトカインIL-10（免疫抑制的特性を有する）の分泌にほぼ依存することが明らかになった。実際、IL-10は特異的アレルゲンに対する抹消T細胞の増殖応答を阻害し、T細胞免疫不応答の誘発で中心的な役割を果たす（James LK, Durham SR, Clin Exp Allergy 2008, 38: 1074-1088）。In vitroでは、IL-10は調節因子FoxP3の発現を強化し、好酸球機能を調節し、マスト細胞によって遊離される前炎症媒介物質を減少させる（Mobs C, et al., Int Arch Allergy Immunol 2008, 147: 171-178）。
前記iMAT分子媒介免疫療法の目覚ましい臨床有効性のもう1つの可能なマーカーは、アレルゲン特異的T細胞の数又は性質における変化の検出である。例えば、Bet v1テトラマー染色試験をもとにして、カバノキ花粉特異的循環CD4+ T細胞のレベル及び特徴をSITの前後に潜在的に比較することができる（van Overtvelt L et.al., J Immunol 2008, 180: 4514-4522）。最近、形質転換増殖因子、(TGF)-βもまたSITの成功に重要なサイトカインとして同定された。多くの作用(例えば特異的なTh1、Th2及びTh17細胞の抑制、FoxP3の誘発及びTregの抑制性機能)が、その関連性の説明となりうる。加えて、TGF-βはランゲルハンス細胞でのFcεRI発現をダウンレギュレートし、IgE合成を抑制する（Akdis CA, Akdis MJ, Allergy Clin Immunol 2009, 123: 735-746）。
【実施例５】
【００４３】
本発明のiMAT分子とWO2004/035793（US対応US2005/0281816）の従来技術MATとの比較
MATタンパク質の純度の評価のために、ラウリル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）試験の手順が確立された（Thompson J et al.,J Biol Chem 2002, 277: 34310-34331）。当該方法（還元剤（ラウリル硫酸リチウム）及び75℃での加熱によるサンプル調製を含む）は、電気泳動分離後に再現性のある複数のくっきりとしたバンドを生じる。クーマシーブルーによる染色は、200から1000ngのタンパク質をロードしたゲルで直線性の定量的（デンシトメトリー）特色を提供する。モノクローナル抗体を用いてアレルゲンモジュールとしてFeld1を有するMATモジュール（MAT-Feld1）でアレルゲンモジュールを検出したとき、主要バンド及び13のマイナーバンドはいずれもMAT-Feld1タンパク質を含む。小さなバンドは、ゲルに再ローディングした後で最初のゲルの場合と同じ位置に泳動する（図2）。PAGE前のサンプル調製におけるいくつかの異なる方法（例えば異なる温度及び緩衝液組成によるプロトコル）によって、同じバンドパターンが得られた。
これらのバンドの全てで、各バンドをゲルから切り出し、トリプシンで消化し、質量分析法（nanoLC/ESI-MS）による分析をすると、完全長（完全）MAT-Feld1タンパク質及びほんの痕跡の宿主細胞タンパク質の存在を示すことができた。これらの実験から、SDS-PAGEにおけるMAT-Feld1の例えば種々の折り畳み変種の変則的特色（ゲルシフト）を推断することができる。これは、分析調製物中のMAT-Feld1は、生物製剤分子として（特に臨床用及び/又は市販生物製剤の製造のために）適切ではないことを意味している。なぜならば、その純度を標準的な方法（例えばSDS-PAGE）では決定できず、上記に説明した修正方法でのみ決定できたからである。
MAT-Feld1分子のゲルシフト現象とは対照的に、Feld1それ自体はSDS-PAGEでそのような変則的特色を示さない（図3、レーン2及び3）。Feld1は予想した分子量（19.6kD）でくっきりとした単一バンドを示す。
さらに別の変則的特色はRP-HPLC分析で観察できた。この解析方法ではMAT-Feld1の単一ピークは、当該タンパク質の未変性の立体構造でも、カオトロピックな還元状態により誘発した変性型でも認められなかった（図4）。しかしながら、GMP認証の生物製剤製造のためには、市販医薬調製物でバイオ分子の単一アイソフォームは必須である。
【００４４】
SDS-PAGE及びRP-PCR分析におけるこれらの観察は、アミノ酸配列による物理化学的特性によって説明できる。Kyte-Doolittleの疎水性プロットにおける分析（Kyte J, Doolittle RF, Journal of Molecular Biology 1982, 157(1), 105-132）は隣接する超疎水性及び親水性ドメイン（前記がこの変則的行動態様の原因でありうる）を明らかにした（図5）。
特に、融合タンパク質の標的誘導ドメインの疎水性領域は膜タンパク質のトランスメンブレンセグメントと類似する（前記がそのような変則的特色を引き起こすことは当業界では公知である（Rath A et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009, 106(6): 1760-1765））。
“ゲルシフト”と称される、SDS-PAGEでの泳動（公式の分子量と相関しない）は、膜タンパク質について共通であるように思われる。このことは、もっぱら分子量にしたがって分子を分離する、分子の未変性の2D又は3D構造とは無関係のSDS-PAGE方法の前提条件が前記の事例には当てはまらないことを意味している。上記引用論文（PNASの論文）で、著者らはヘリックス膜タンパク質の変則的ゲル移動性を精査し、ここで彼らは、野生型とヒト嚢胞性線維症のトランスメンブレン伝導度調節因子（CFTR）のトランスメンブレンセグメント3及び4に由来する変異ヘリックス-ループ-ヘリックス（“ヘアピン”）配列（疾患表現型の残基置換を含む）のライブラリーを用いている。彼らは、これらのヘアピンは、SDS-PAGE（3.4−10gのSDS/gタンパク質の範囲のローディング変性剤を含む）においてそれらの実際の公式分子量に対して−10%から＋30%の速度で泳動することを見出した。加えて、彼らは、変異体のゲルシフトは、ヘアピンのSDSローディング受容力における変化及びヘアピンのヘリックス度と強く相関することを示し、ゲルシフトの挙動は変性剤結合の変化にその起源があることを示唆した。いくつかの事例では、SDSによる弁別的溶媒和はタンパク質-変性剤接触をタンパク質-タンパク質接触に入れ替えることから生じ、変性剤結合と折り畳みが密接につながっていることが暗示される。
【００４５】
MAT及びiMATタンパク質のRP-HPLC分析（図4及び7）と同様にSDS-PAGE（図6）は、それぞれ泳動パターン又は溶出における実質的な相違を明らかにした。MAT-Feld1の酸化型はSDS-PAGEゲルで単一のくっきりとしたバンドではなく（レーン3）、MAT-Feld1の実際の32.2kDより大きな及び小さな見かけの分子量のいくつかの拡散したバンドを示した。対照的に、iMAT-Cul04は酸化条件下で単一のくっきりとしたバンド（M＝41.6kD）を示した。さらにRP-HPLCクロマトグラフィー図も単一ピークを示した（図7）。
還元条件下のSDS-PAGEでは、MAT-Feld1はほぼ既知分子量へ泳動する主要バンドに加えて図2に提示されるいくつかのマイナーバンドを示し、前記は再出現した完全なMAT-Feld1配列を含むことが判明している（図6、レーン6）。前記はMAT-Feld1の属性であり、MAT-Feld1の変則的特色に特徴的である。加えて、還元条件下のMAT-Feld1のRP-HPLCクロマトグラフィー図（図4、右のグラフ）は、MAT-Feld1の少なくとも3つの異なるアイソタイプを示している。対照的に、iMAT分子は、RP-HPLC（図7）と同様にSDS-PAGE（図6、レーン7）で特徴的な単一アイソタイプを明瞭に示している。
還元条件はMAT分子中のジスルフィド架橋の切断をもたらし、したがって、ジスルフィド架橋がもっぱらMATの変則的特色の原因であるならば、還元条件下でMAT及びiMAT分子は同様な動きを示すはずである。しかしながら、この場合はそうではない。なぜならば、MAT分子の変則的ゲルシフト及びRP-HPLCにおけるアイソフォームの出現は還元条件下で依然として存在するからである。
しかしながら、iMAT分子はそのようなゲルシフトを示さず、かつ当該タンパク質の未変性の（酸化）型でRP-HPLCクロマトグラフィー図でピークを示す。さらにまた、MAT及びiMAT分子のKyte-Doolittleプロット（Kyte, J. and Doolittle, R. 1982. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 157: 105-132）は、Hisタグ、TAT及び標的誘導ドメインの配列をカバーするN-末端ではほとんど同一である（図11）。結果として、当業者は、従来技術の欠点を克服するために、システイン残基が他のアミノ酸残基で置換された従来技術のMATの構築に興味をもたないであろう。
3つの獲得iMAT分子を下記の実施例6にしたがって“バイオインフォマティクスによる操作”で構築し、組換え発現技術によって大腸菌で産生させた。3つのiMAT分子はいずれも2回の凍結融解後に緩衝液（20mMクエン酸塩、1Mアルギニン、pH6.0）で安定であり、アジュバントとしてAdju-Phos(商標)（Brenntag, Denmark）に吸着させることができ、したがってiMAT分子をワクチンとして用いることができる。当該タンパク質はAdju-Phos(商標)から分解することなく同じ緩衝液に脱着されうる（図9）。
【実施例６】
【００４６】
ウマのIBHを標的とするiMAT分子の“バイオインフォマティクスによる操作”
iMAT技術を用いて、例えばアレルギー性昆虫咬傷過敏症（IBH）のウマを効果的に治療するために、さらに以下のことが必須である：
a）iMAT分子のアレルゲンモジュールとして、主要なアレルゲンであり、したがって極めて普遍性を有して罹患馬で過敏症を引き起こし、したがってまた寛容誘発のための標的でありうるタンパク質であるクリコイデスタンパク質の選別、及び
b）熱力学的に安定であり、タンパク質工学によって効率的に製造でき、加えて標準的方法で分析することが可能で十分な品質（すなわち物質の同一性、純度及び性能）を担保できる、前記主要アレルゲンを用いたiMAT分子の構築。
これらの要件を満たすために、本発明のiMAT分子に含まれるべきアレルゲンの選別のためにバイオインフォマティクスによるプローチを選択した。選別の目的は、（i）IBHにおける関連性が期待される（すなわちIBH罹患馬の大半が対応するアレルゲンに感作されている）１つ以上のアレルゲンを選択すること、及び（ii）アレルゲンの特徴を有する線状エピトープを含む（すなわち発表されたアレルゲンのペプチド配列と相同な多数の短いペプチド配列（7から13アミノ酸残基）を含む）確率が最も高いアレルゲンを選択することである。
これまでのところ、唾液中に見出されるクリコイデス由来（クリコイデス・ソノレンシス（Culicoides sonorensis）、クリコイデス・ヌベクロスス（Culicoides nubeculosus）、クリコイデス・オブソレツス（Culicoides obsoletus））の約230のタンパク質が知られ、前記は潜在的に対象動物（例えばウマ）でアレルギーを誘引する。医薬調製物のために適切な抗原を選別するために、公知の非クリコイデスアレルゲンとの局所配列アラインメントに基づく相同性比較を選択した。抗体認識のためのエピトープ（ほとんど立体構造エピトープ）の検出は、しばしば機能的解析（例えばペプチドマイクロアレイ）によって達成されるか、又はT細胞エピトープ（線状エピトープ）のためにはMHC分子とのペプチド結合の確率の計算によって達成される。とりわけiMAT技術の治療原理は、エンドサイトーシス及びエンドソームでの酸依存プロテアーゼによる分解とその後のMHCクラスII結合及び抗原提示を基礎に置く。ウマでは、そのような系の特徴はこれまでのところ完全には究明されていない。なぜならば、ウマのMHC遺伝子の対立遺伝子多様性はヒトの系と比較してはるかにわずかしか明らかではなく、したがって実験的にも容易に利用できない状態である。さらにまた、I型アレルギーとしてのIBH及び当該症状を引き起こす原因アレルゲンに関する研究も最近始まったばかりである。エフェクター細胞（すなわち好中球顆粒細胞）で活性なアレルゲンとして特徴付けられた最初のタンパク質が記載されたのは2008年より前ではない（Langner et al., Vet Immunol Immunopathol 2008, 122(1-2):126-137）。
【００４７】
したがって、アレルゲン選別のために別個の（実験的ではなくバイオインフォマティクスによる）アプローチが選択され、前記アプローチは、公知の非クリコイデスアレルゲン性タンパク質（その大半がヒトでアレルギーを起こすことが知られている）に対するクリコイデスタンパク質由来ペプチドの局所相同性検索に基づく。アレルゲン特性を有すると疑われるタンパク質のアミノ酸配列を公開データベース（例えばUNIPROT）から取り出し、冗長性を取り出したデータセット内での配列相同性の分析によって決定する。高度に同族性の配列のカウンターパートを排除し、得られた残留配列を蓋然性の高い有効抗原の標準配列データベースとしてその後の分析のために供した。高アレルゲン潜在性を有する推定的クリコイデスタンパク質を決定するために、コンピュータでタンパク質を1アミノ酸シフトにより6から15アミノ酸の長さのペプチドに切断した。次に、各クリコイデスタンパク質及び対応するペプチドと標準配列データベースとのローカルペアワイズアラインメントを実施した。前記に続いて、得られたアラインメントヒットのスケーリングを、あるクリコイデスタンパク質の自己アラインメントスコアを1に設定し、したがって対応するペプチドのアラインメントヒットをそれに応じて設定することによって実施した。次に、ある閾値を超えるアラインメントヒットの数を各ペプチドについてカウントし、既知のアレルゲン特性をもたないタンパク質配列のランダムに作成したデータベースとローカルペアワイズアラインメントによって比較し、続いてスケーリング及びカウントを実施した。得られた“非アレルギー性タンパク質”のカウントをアレルゲン結果のカウントから差し引き、さらに全ての対応するペプチドに対するヒット数を基にして各クリコイデスタンパク質に対する累積ヒットスコアを計算した（図12）。最も高いカウントを有するタンパク質をiMAT抗原モジュール候補として選別した。
バイオインフォマティクスによる抗原選別方法を検証するために、13頭の臨床診断されたIBH罹患馬で5つのクリコイデスアレルゲンに対する感作の出現を測定した。全ての選別抗原を、血液サンプルから単離したウマ好塩基球のアレルゲン特異的ヒスタミン遊離による半定量的ex vivo機能実験で試験した（ヒスタミン遊離試験＝HRT、アッセイの詳細は実施例2を参照されたい）。組み換えアレルゲンを3つの濃度で試験し、各アレルゲンのスコア値は0（感作無し）から6（最高の感作）の範囲であった。13頭全てのウマのデータをバイオインフォマティクスの計算の結果と比較した（図8）。この分析は、感作（コホートのアレルゲン毎の全スコア値）と予想スコアとの間の全体的に優れた相関性（r＝0.97）を示している。この相関性分析から、バイオインフォマティクス抗原選別方法は、iMAT分子抗原モジュールのための関連するクリコイデスアレルゲンの選択に適切であると我々は結論した。したがって、選別アレルゲンを含む本発明のiMAT分子を用いてIBH罹患馬を治療し、罹患対象動物の大きな割合のサブグループにおいて高い確率でこれらアレルゲンに対する寛容を誘発することができる。バイオインフォマティクス分析に基づいて3つのアレルゲン（すなわちCulo3、Culo2及びCulo4）を選別し、3つの異なるiMAT分子に加えた。
選別したアレルゲンの各々を別々のiMAT分子に抗原モジュールとして組み入れ、続いて三次元タンパク質構造の反復モデリング及び単一アミノ酸置換後における遊離エネルギーの変化の計算によって熱力学的安定性を最適化させた。物理化学的特性及び安定性は、一次アミノ酸配列内で種々のアミノ酸残基を置換することによって影響を受ける。
本明細書に記載の分析（抗原検索及びモデリング）結果は、薬剤製造及び例えばIBH治療のためにウマへの適用に適切なiMATアミノ酸配列のために変換された。
【実施例７】
【００４８】
本発明のモザイク様iMAT分子の構築
本発明のiMAT分子は、1つ以上のアレルゲン成分が抗原モジュールに含まれる場合にさらに改善できると期待される。この目的のために、上記に記載したバイオインフォマティクスによる選別アプローチ（実施例6）の基本原理を異なる態様で適用することが可能である。アレルゲンデータベースで見いだされるアレルゲンペプチドのヒット数に基づいて完全なアレルゲンを選別する代わりに、そのようないくつかのアレルゲンに極めて豊富なペプチドだけを用いて、iMAT抗原モジュールを作り上げる。したがって、そのようなiMAT分子は、いくつかのアレルゲンに由来するペプチドの抗原モジュールから成る。これは、単一iMAT分子のスペクトルをその標的アレルギープロフィールに関して拡大することを可能にし、したがって薬理学的薬剤の開発に有益である。
そのようなモザイク様iMATタンパク質に適した短いペプチド配列を見つけるために、唾液で見いだされるクリコイデス種（クリコイデス・ソノレンシス、クリコイデス・ヌベクロスス、クリコイデス・オブソレツス）由来の230のタンパク質を、上記に記載したように相同性比較によって分析した（実施例6参照）。略記すれば、コンピュータ切断クリコイデスタンパク質（6−15アミノ酸残基のペプチド長を有する）で、アレルゲン関連タンパク質の標準配列データベース及び非アレルギー関連タンパク質のランダムデータベースに対して局所アラインメントを実施した。標準データベース内で見いだされる各ペプチドに対する有意な相同性の差の数を決定した。続いて、偽陽性ヒットを減らすために標準データベースの3倍のサイズのランダムデータベースに対して各ペプチドで局所アラインメントを実施した。各ペプチド長に対して上位（例えば10パーセンタイル）の相同性を維持するものが、モザイク様又はハイブリッドアレルゲン保持iMAT分子の構築用土台として供するために特に適切である。モザイク様iMAT分子を構築するために、上位ランキングペプチドを埋め込むための足場タンパク質としてタンパク質前駆体を、（例えば上位ランキングペプチドに対応する前駆体タンパク質のリストから）選択する。足場タンパク質からシグナルペプチド配列を取り除き、追加の隣接N-又はC-末端アミノ酸を有する上位ランキングペプチドを足場タンパク質の本来の配列に挿入するか、又は足場タンパク質の本来の配列の部分と入れ替えることができる。挿入又は入れ替えのための位置は、類似性アラインメントを用いるか又は対応する前駆体タンパク質中の当該ペプチドの位置を参照して決定される。次の工程として、Hisタグ、TAT及び標的誘導ドメインが付加される。最後に、システイン残基を上記に記載した最大安定化残基に入れ替える。このアプローチの例示的事例では、クリコイデス・ソノレンシスの唾液タンパク質（UniProtデータベース登録“Q66U13”）を足場タンパク質として用いた。当該配列のこの部分を保存するために、当該タンパク質内のアレルゲン性のもっとも強い構造を決定した。シグナルペプチド配列を除去し、続いてUniProtデータベース登録配列、“Q5QBI9”、“Q5QBK6”、“Q5QBL6”、“Q5QBJ4”及び“Q5QBI2”を付加する。その後、このモザイク様アレルゲンをiMAT一般分子構造に組み込む。最後に、システイン残基を他のアミノ酸（好ましくはセリン、ロイシン、イソロイシン及び/又はアスパラギン酸）に入れ替える（前記アミノ酸は構築されたiMAT分子（融合タンパク質）の安定性を損なわない）。
配列番号:17は、本発明の例示的モザイク様（ハイブリッド）iMAT分子の全配列を示す（アミノ酸残基1：N-末端メチオニン、アミノ酸残基2−7：Hisタグ、アミノ酸残基8−18：TAT配列、アミノ酸残基19−28：標的誘導ドメイン、アミノ酸残基129−333：ハイブリッドアレルゲン（足場タンパク質Q66U13（シグナルペプチド無し）及び挿入/入れ替え配列：アミノ酸残基:137−151：Q5QBI9、アミノ酸残基155−166：Q66U13、アミノ酸残基185−200：Q5QBK6、アミノ酸残基215−229：Q5QBL6、アミノ酸残基235−250：Q5QBL6、アミノ酸残基265−278：Q5QBJ4、アミノ酸残基318−333：Q5QBI2；システインの置換（セリン）：46、146、158、173、222、225、246、273、283、329；システインの置換（ロイシン）：295；システインの置換（イソロイシン）：299；システインの置換（アスパラギン酸）：181）。
【実施例８】
【００４９】
ウマの再発性気道閉塞（RAO）の治療用ワクチン/予防
本発明の単一iMAT分子又は異なる抗原モジュールを含むiMAT分子の組み合わせを、RAO及び/又は夏季放牧場関連RAOに罹患しているか又はそのリスクがあるウマの予防的又は治療的処置に用いることができる。ウマでは、本発明のiMAT分子を実施例4に記載したように投与できる。既知のRAO病歴を有する成馬が用いられるであろう。処置に先立って、例えば、顔面マスクを着用させて枠場に立たせて気道の完全な健康診断（呼吸流量測定、上気道内視鏡検査、及び気管支肺胞洗浄（BAL）（例えばBAL液中の好中球百分率の分析のため）を含む）を実施できるようにウマを馴らす。全血球計算及び生化学プロフィールを実施して、付随する症状の存在を排除する。以下のパラメーターを精査して呼吸器系を試験し、iMAT分子の治療的及び/又は予防的処置の有効性を測定することができる：肺機能変数、例えば呼吸数、肺内外圧差、肺抵抗、肺エラスタンスにおける変化。加えて、これらパラメーターを荷重臨床採点系に取り入れ、例えば呼吸努力/腹部持上げ、鼻汁排出及び/又は発赤、咳及び/又は異常な肺音、気管支音及び/又は気管音の臨床スコアを判定することもできる。
したがって全処置期間を通して及び/又はその後で、RAOの治療又は予防の有効性を定量的、半定量的又は定性的評価によって臨床的に精査することができる。これらの臨床的パラメーターを、以前のシーズンにおける個々のウマの臨床徴候、及び/又は治療的介入の開始前の重篤度と比較することができる。また別に、未治療又はプラセボ治療のRAO罹患馬との比較によって、RAO臨床徴候のiMAT媒介治療及び/又は予防の有効性を示すことができる。
前記ウマの気管支肺胞（BAL）洗浄液及び/又は新鮮血をウマの1型アレルギー反応のin vitro誘発試験で用いることができる（例えばHRT又はCAST(商標)による：詳細は実施例2及びHareらの論文（Hare et al Can J Vet Res 1998; 62: 133-139）を参照されたい）。ある種のアレルゲンによるチャレンジへの応答における肺マスト細胞及び/又は好塩基球脱顆粒の減少、例えばiMAT分子治療前と比較した治療後のヒスタミン及び/又はスルフィドロイコトリエン遊離の減少は治療及び/又は予防の効果を示す。
また別に或いは前記に加えて、皮内誘発試験、皮膚穿刺試験又はBAL液若しくは血清でのアレルゲン特異的IgE及び/又はIgG測定である種の組み換えアレルゲンを用いて前記のウマを追跡監視することができる（Tilley P et al., J Equine Vet Sci 2012, 32: 719-727）。応答（即時及び/又は後期反応性）の低下及び/又は抗体力価の変化はiMAT分子処置の治療及び/又は予防効果を示す。
【００５０】
参考文献
0006370398.tif 000002
【００５１】
配列表
配列番号:1は、本発明の1つの移行モジュールのための適切な最小アミノ酸配列に関し、前記配列はなお機能的、すなわち細胞侵入を効果的に促進できる。
配列番号:2は、ウマインバリアント鎖の完全長アミノ酸配列に関する。
配列番号:3は、Culn4アレルゲンの完全長アミノ酸配列に関する。
配列番号:4は、Culo1アレルゲンの完全長アミノ酸配列に関する。
配列番号:5は、Culo2アレルゲンの完全長アミノ酸配列に関する。
配列番号:6は、Culo3アレルゲンの完全長アミノ酸配列に関する。
配列番号:7は、本発明のCuln4 iMAT分子に関する。
配列番号:8は、本発明のCuln4 iMAT分子に関する。
配列番号:9は、本発明のCulo1 iMAT分子に関する。
配列番号:10は、本発明のCulo1 iMAT分子に関する。
配列番号:11は、本発明のCulo2 iMAT分子に関する。
配列番号:12は、本発明のCulo2 iMAT分子に関する。
配列番号:13は、本発明のCulo3 iMAT分子に関する。
配列番号:14は、本発明のCulo3 iMAT分子に関する。
配列番号:15は、細胞内輸送機能が維持された、ウマインバリアント鎖のアミノ酸配列の固有フラグメントに関する。
配列番号:16は、細胞内輸送機能が維持された、ウマインバリアント鎖のアミノ酸配列の固有フラグメントに関する。
配列番号:17は、本発明の例示的なモザイク様iMAT分子の全配列に関する。
配列番号:18は、完全なCulo4アレルゲンのアミノ酸配列に関する。
配列番号:19は、完全なCulo7アレルゲンのアミノ酸配列に関する。
配列番号:20は、本発明のCulo4 iMAT分子に関する。
配列番号:21は、本発明のCulo4 iMAT分子に関する。
配列番号:22は、本発明のCulo7 iMAT分子に関する。
配列番号:23は、本発明のCulo7 iMAT分子に関する。
本明細書に引用された全ての従来技術の参考文献は、本出願に随伴する配列表と同様に、参照によりその全体が互に独立して本明細書に含まれる。
【００５２】
（1）細胞外空間から細胞の内部へ当該組換えタンパク質の輸送を可能にする少なくとも1つの第一のモジュール、抗原のプロセッシング又はMHC分子の抗原ローディングに関与する細胞内小器官へ当該組換えタンパク質の細胞内での輸送を可能にする少なくとも1つの第二のモジュール、及び個体内で当該組換えタンパク質によって調節される免疫応答の特異性を決定する少なくとも1つの抗原モジュールを含み（これらのモジュールは共有結合によって互いに連結される）、場合によって前記モジュールの少なくとも1つの間にスペーサーモジュールを含む単離された組換えタンパク質であって、
（a）前記第一のモジュールは、細胞外空間から細胞の内部への移行を可能にする配列であり、
（b）前記第二のモジュールは、抗原のプロセッシング又はMHC分子の抗原ローディングに関与する細胞内小器官への当該組換えタンパク質の細胞内での種特異的標的誘導を可能にするアミノ酸配列であり、
（c）前記抗原モジュールは、アレルゲンである抗原の少なくとも1つのエピトープに由来するアミノ酸配列であり、
前記単離された組換えタンパク質では、少なくとも抗原モジュールにおいて、少なくとも1つのシステイン残基がセリン又は異なるアミノ酸残基で置換される。
（2）前記抗原モジュールで又は単離組換えタンパク質全体で、全てのシステイン残基が異なるアミノ酸残基で置換されている、項目（1）に記載の単離された組換えタンパク質。
（3）システイン残基がセリン残基で置換されている、項目（1）又は（2）に記載の単離された組換えタンパク質。
（4）第二のモジュールがウマインバリアント鎖、例えば配列番号:2、15、16のアミノ酸配列であり、及び/又は抗原モジュールがウマでアレルギーを誘引するアレルゲンに由来するエピトープを含む、項目（1）又は（2）に記載の単された組換えタンパク質。
（5）抗原モジュールが、吸血性昆虫、特にクリコイデス亜属に由来するアレルゲンの少なくとも1つのエピトープを含む、項目（1）又は（2）に記載の単された組換えタンパク質。
（6）アレルゲンが、Culn4、Culo1、Culo2又はCulo3アレルゲンの少なくとも1つである、項目（1）から（5）のいずれか1項目に記載の単された組換えタンパク質。
（7）タグモジュール（例えばHisタグ）をさらに含み、それによって前記タグモジュールがN-末端及び/又はC-末端に存在しうる、項目（1）から（6）のいずれか1項目に記載の単された組換えタンパク質。
（8）第一のモジュールが、HIV-tat、VP22及び/又はアンテナペディア又は移行のためのモジュールとして機能的なその部分配列である、項目（1）から（7）のいずれか1項目に記載の単された組換えタンパク質。
（9）モノマー形で存在する、項目（1）から（8）のいずれか1項目に記載の単された組換えタンパク質。
（10）線状形で存在する、項目（1）から（9）のいずれか1項目に記載の単された組換えタンパク質。
（11）配列番号:7から14の配列のいずれか1つを含むか又は前記から成る、項目（1）から（10）のいずれか1項目に記載の単された組換えタンパク質。
（12）医薬組成物における使用のための、項目（1）から（11）のいずれか1項目に記載の単された組換えタンパク質。
（13）医薬組成物がワクチンである、項目（12）に記載の使用のための単離組換えタンパク質。
（14）舌下投与、皮下若しくは皮内注射、リンパ節への注射、又は経粘膜（特に胃腸管又は呼吸器系の粘膜を介する）投与のために設計された、項目（12）から（13）のいずれか1項目に記載の使用のための単離組換えタンパク質。
（15）項目（1）から（11）のいずれか1項目に記載の単された組換えタンパク質をコードする核酸。
（16）項目（15）に記載の少なくとも1つの核酸配列を含むベクター。
（17）項目（15）に記載の少なくとも1つのベクター又は項目（15）に記載の核酸を含む、初代細胞又は細胞株。
（18）以下の工程を含む、予め定めたアミノ酸配列を安定化させる、前記予め定めたアミノ酸配列でアミノ酸置換を同定する方法:
（i）標的とするタンパク質の三次元構造をモデリングする工程；
（ii）単一点置換（例えばシステインの異なるアミノ酸残基による置換）に基づいてタンパク質の安定性を反復して決定し、さらに利用可能な全ての三次元構造を解析することによって安定化させる入れ替え置換を決定するためにスコアリングする工程；
（iii）新規な構造を再モデリングし、さらに工程（a）及び（b）を繰り返すことによって安定性を検証する工程。
（19）工程（b）で折り畳みの自由エネルギーの変化が評価される、項目（18）に記載の方法。
（20）工程（b）でスコアリングシステム（用いたモデルにおける発生及びタンパク質安定性における自由エネルギーの変化（ΔΔG）を基準にして置換を等級付けする）を用いて特定の置換の出現数を解析する、項目（18）又は（19）に記載の方法。
（21）項目（18）から（20）のいずれか1項目に記載の方法によって入手される、項目（1）から（11）のいずれか1項目に記載の組換えタンパク質。
（22）ウマの昆虫咬傷過敏の予防及び/又は治療のための、項目（1）から（14）のいずれか1項目に記載の組換えタンパク質。
【図１】
0006370398.tif 000003
【図２】
0006370398.tif 000004
【図３】
0006370398.tif 000005
【図４】
0006370398.tif 000006
【図５】
0006370398.tif 000007
【図６】
0006370398.tif 000008
【図７】
0006370398.tif 000009
【図８】
0006370398.tif 000010
【図９】
0006370398.tif 000011
【図１０】
0006370398.tif 000012
【図１１】
0006370398.tif 000013
【図１２】
0006370398.tif 000014
【配列表】
0006370398000001.app