(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーメンバーに対応する成熟配列、および
（ｂ）パッセンジャー鎖
を含む、二本鎖マイクロＲＮＡ模倣体であって、前記成熟配列は、５’末端における位置２〜７または位置１〜６においてＡＧＣＡＧＣを含有し、前記成熟配列は、配列番号１１〜１４からなる群から選択される配列を含む、前記二本鎖マイクロＲＮＡ摸倣体。
【請求項２】
前記パッセンジャー鎖は、配列番号１５〜１８からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の二本鎖マイクロＲＮＡ摸倣体。
【請求項３】
前記パッセンジャー鎖は、化学的修飾によって不活性化される、請求項１または２に記載の二本鎖マイクロＲＮＡ摸倣体。
【請求項４】
悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）を治療するために使用するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の二本鎖マイクロＲＮＡ摸倣体。
【請求項５】
前記模倣体が、ミニ細胞と共に投与するために提供される、請求項４に記載の模倣体。
【請求項６】
前記摸倣体が、補助抗癌療法との同時のまたは連続的な併用投与のために提供される、請求項４または５に記載の模倣体。
【請求項７】
抗癌療法に対する悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）癌細胞の感度を高めるために使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の二本鎖マイクロＲＮＡ摸倣体。
【請求項８】
悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）を治療するための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか一項に記載の二本鎖マイクロＲＮＡ摸倣体の使用。
【請求項９】
前記模倣体がミニ細胞と共に投与するために提供される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記模倣体が、補助抗癌療法との同時のまたは連続的な併用投与のために提供される、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１１】
抗癌療法に対する悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）癌細胞の感度を高めるために使用するための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか一項に記載のマイクロＲＮＡ摸倣体の使用。
【請求項１２】
悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）を治療するための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか一項に記載の二本鎖マイクロＲＮＡ摸倣体および補助抗癌療法の使用。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の二本鎖マイクロＲＮＡ摸倣体を含有する、悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）を治療するための医薬組成物。
【請求項１４】
前記模倣体がミニ細胞と共に投与するために提供される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記模倣体が、補助抗癌療法との同時のまたは連続的な併用投与のために提供される、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のマイクロＲＮＡ摸倣体を含有する、抗癌療法に対する悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）癌細胞の感度を高めるために使用するための医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の二本鎖マイクロＲＮＡ摸倣体を含有する、悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）を治療するための医薬組成物であって、補助抗癌療法との同時のまたは連続的な併用投与のために使用される、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる２０１３年３月１３日出願の米国特許出願第１３／８０１，０１０号に対する米国特許法第１２０条の下の利益を請求する。
【０００２】
本発明は概して、分子生物学および癌の分野に関する。より具体的には、本発明は、ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーに対応するマイクロＲＮＡ摸倣体、および悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）腫瘍細胞におけるｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの標的遺伝子の発現調節を回復させることによる、マイクロＲＮＡ摸倣体を用いてＭＰＭを治療する関連方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
悪性胸膜中皮腫は、治療がほとんど利用不可能な、ほぼ常に致死的な癌である。新たな療法が緊急に必要とされており、マイクロＲＮＡ発現の調節不全は、新規の治療標的源を提供する。
【０００４】
マイクロＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）によって転写される。Ｑｉら（２００６）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３巻４１１〜４１９を参照されたい。マイクロＲＮＡは、一次マイクロＲＮＡ転写産物（プリマイクロＲＮＡ）と呼ばれる、概して数千塩基長の最初の転写産物から生じる。プリマイクロＲＮＡは、核の中でリボヌクレアーゼであるドローシャによって約７０〜約１００ヌクレオチドのヘアピン状前駆体（プレマイクロＲＮＡ）へと加工される。細胞質への輸送後、ヘアピン状プレマイクロＲＮＡはさらに、ダイサーによって二本鎖成熟型マイクロＲＮＡを生成するよう加工される。次に、成熟型マイクロＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へと組み込まれ、この中で塩基対相補性によってその標的ｍＲＮＡと会合する。マイクロＲＮＡ塩基対がｍＲＮＡ標的と完全に対形成する比較的まれな場合においては、マイクロＲＮＡ塩基はｍＲＮＡの分解を促進する。より普遍的には、マイクロＲＮＡは標的ｍＲＮＡと不完全なヘテロ二本鎖を形成し、ｍＲＮＡ安定性に影響するかｍＲＮＡ翻訳を阻害するかのいずれかである。
【０００５】
複数の研究は、ＭＰＭにおけるｍＲＮＡ遺伝子発現を特徴づけて、潜在的な標的を識別しており、より近年では、マイクロＲＮＡ発現プロファイルは、まず正常細胞系統および腫瘍細胞系統に由来する試料、ＭＰＭ腫瘍およびプールされた正常心膜に由来する試料、またはＭＰＭおよび肺癌に由来する試料を用いた診断目的のために作成されている。当該発現プロファイルはまた、予後診断目的のために、すなわち、異なる分類のＭＰＭ腫瘍内で作成されている。例えば、Ｂｕｓａｃｃａら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：３１２〜３１９（２０１０）を参照されたい。しかしながら、ＭＰＭ腫瘍と正常胸膜組織の間で広範な比較をした者はこれまで誰もいない。
【０００６】
さらに、インビトロで使用することが比較的容易ではあるものの、マイクロＲＮＡ摸倣体は典型的には、２つの問題、すなわち（１）低い活性（低いＲＩＳＣ組み込み、および非特異的効果を含む）および（２）非効率的な送達（安定性、および作用部位に対する特異的／選択的分布と関連）により、インビボでの効能の点で弱点がある。
【０００７】
上記のように、複数の研究はＭＰＭにおける遺伝子発現を特徴づけてきた。このことには疾患過程を理解するとともに、潜在的な標的を識別するという目的があった。これらの研究は、化学療法に対する耐性と連関する変化したアポトーシス応答と関連したアポトーシス遺伝子における追加的な変化とともに、ＭＰＭにおける代謝性遺伝子および細胞周期遺伝子の一般的な上方調節を特徴づけてきた。今日まで、これらの研究は、ＭＰＭ腫瘍に普遍的な発現型の遺伝的制御の中心的な機序をまだ明らかにしていない。しかしながら、マイクロＲＮＡは、遺伝子発現の包括的な調節因子と見なされているので、マイクロＲＮＡの発現の下方調節は、遺伝子のファミリーの上方調節についての有望な説明を表す（すなわち、マイクロＲＮＡ発現の喪失は、標的遺伝子の上方調節の原因となる）。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は以下を提供する。
［１］悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）の治療のための二本鎖マイクロＲＮＡ摸倣体であって、
（ａ）ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーメンバーに対応する成熟配列、および
（ｂ）パッセンジャー鎖
を含み、ここで上記成熟配列は、５’末端における位置２〜７または位置１〜６においてＡＧＣＡＧＣを含有する、上記二本鎖マイクロＲＮＡ摸倣体。
［２］上記成熟配列は、配列番号１１〜１４からなる群から選択される配列を含む、上記［１］に記載の二本鎖ＲＮＡマイクロＲＮＡ摸倣体。
［３］上記パッセンジャー鎖は、配列番号１５〜１８からなる群から選択される配列を含む、上記［１］に記載の二本鎖マイクロＲＮＡ摸倣体。
［４］上記パッセンジャー鎖は、化学的修飾によって不活性化される、上記［１］に記載の二本鎖マイクロＲＮＡ摸倣体。
［５］ＭＰＭを有する対象におけるＭＰＭを治療するための方法であって、対象へ、有効量の上記［１］に記載の二本鎖マイクロＲＮＡ摸倣体を投与することを含む、上記方法。
［６］上記投与するステップはさらに、上記マイクロＲＮＡ摸倣体を送達するためのミニ細胞の使用を含む、上記［５］に記載の方法。
［７］上記対象への上記マイクロＲＮＡ摸倣体の投与は、補助抗癌療法の同時のまたは連続的な併用投与を含む、上記［５］に記載の方法。
［８］抗癌療法に対するＭＰＭ癌細胞の感度を高めるための方法であって、上記［１］に記載のマイクロＲＮＡ摸倣体を上記ＭＰＭ癌細胞へ投与することを含む、上記方法。
本発明は、罹患していない個体由来の正常な胸膜組織と比較してＭＰＭ腫瘍試料中で下方調節されたマイクロＲＮＡのファミリーの識別に一部基づいている。特に、本発明者らは、ＭＰＭ組織におけるマイクロＲＮＡのｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの発現における顕著な下方調節を発見した。
【０００９】
したがって、本発明の一態様は、ＭＰＭの治療に有用な二本鎖マイクロＲＮＡ摸倣体に関する。本発明のこのようなｍｉＲＮＡ摸倣体は、
（１）ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーメンバーに相当し、かつ５’末端の位置２〜７または位置１〜６におけるＡＧＣＡＧＣを含有する成熟配列、および（２）化学修飾によって不活性化することのできるパッセンジャー鎖を含む。成熟配列は、配列番号１１〜１４からなる群から選択される配列を含むことができる。パッセンジャー鎖は、配列番号１５〜１８からなる群から選択される配列を含むことができる。
【００１０】
別の態様に従って、本発明は、ＭＰＭに苦しんでいる対象における当該疾患を治療するための方法を提供する。この方法は、先に説明したような有効量の二本鎖ｍｉＲＮＡ摸倣体を投与することを含み、ここで、このような投与は、ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの内在性発現を模倣し、それにより対象におけるｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの標的遺伝子の発現の調節を回復させる。当該投与は好ましくは、ｍｉＲＮＡ摸倣体の送達のために未処置の細菌由来のミニ細胞を用いて果たされる。本発明の方法に従って、マイクロＲＮＡ摸倣体を投与するステップは、当該対象への補助抗癌療法の同時のまたは連続した併用投与を含む。
【００１１】
本発明の別の態様において、抗癌療法の細胞毒性効果に対するＭＰＭ癌細胞の感度を高めるための方法が提供される。当該方法は、先に説明したような少なくとも１つのｍｉＲＮＡ摸倣体を当該細胞へ投与して、それによりＭＰＭ癌細胞の感度を高めることを含む。
【００１２】
本発明のこれらおよび他の態様を以下にさらに説明する。
【００１３】
先に列挙した本発明の特徴、利点および目的の事項、ならびに明確となるその他の事項が、達成されかつ詳細に理解されることができるよう、先に簡潔に要約された本発明のより詳細な説明および特定の実施形態は、添付の図において図解される。これらの図は、本明細書の一部を形成する。これらの図は、本発明の詳細な実施形態を図解しており、それゆえ、本発明を制限してはいない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＭＰＭ細胞系および腫瘍において下方調節されるｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの発現を示す。
【図２】図２は、持続的なクリソタイル曝露が、ＭｅＴ−５Ａ不死化中皮細胞におけるｍｉＲ−１５／１０７ファミリーのマイクロＲＮＡ発現を低下させることを示す。
【図３】図３は、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂまたはｍｉＲ−１６の発現を回復させることが、インビトロでのＭＰＭ細胞の増殖阻害をもたらすことを示す。
【図４】図４は、ｍｉＲ−１５／１０７共通配列に対応する配列を含む摸倣体が、ＭＰＭ細胞増殖を阻害する上で天然のｍｉＲ−１６よりも有効であることを示す。
【図５】図５は、ｍｉＲ−１６を用いたトランスフェクションが標的遺伝子を下方調節することを示す。
【図６】図６は、ｍｉＲ−１６がＭＰＭ細胞におけるゲムシタビンおよびペメトレキセドの毒性に及ぼす効果を示す。
【図７】図７は、ＥＧＦＲミニ細胞ｍｉＲ−１６（二重特異性抗体における細胞標的配列がＥＧＦＲへと方向づけられた二重特異性抗体標的化ミニ細胞充填型ｍｉＲ−１６摸倣体）として送達されるインビボでのＭＰＭにおけるｍｉＲ−１６置換の効果を示す。
【図８】図８は、共通配列由来の摸倣体であるｃｏｎ１５／１０７．２がインビボでの腫瘍増殖に及ぼす効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
記載されるように、本発明の鍵となる態様は、罹患していない個体由来の正常胸膜組織と比較してＭＰＭ腫瘍試料において下方調節されたマイクロＲＮＡのファミリーの識別である。したがって、マイクロＲＮＡのｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの発現の顕著な下方調節は、ＭＰＭ組織において生じる。
【００１６】
それゆえ、例示的な実施形態において、本発明は、ＭＰＭを治療するためのｍｉＲ−１５／１０７ファミリーに対応する治療用マイクロＲＮＡの設計、合成、構築、組成、特徴づけおよび使用に関する。より具体的には、本発明は、ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの内在的なメンバーの活性を模倣することによって、ＭＰＭ腫瘍細胞におけるｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの発現を回復させるよう作用し、それによりＭＰＭ細胞増殖の制御を再確立するマイクロＲＮＡ摸倣体に関する。マイクロＲＮＡ摸倣体はそれゆえ、ＭＰＭ細胞におけるｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの発現を回復させるための置換療法アプローチにおいて使用することができる。
【００１７】
さらなる例示的な実施形態において、マイクロＲＮＡ摸倣体は、安定性を改善し、非特異的効果を低下させ、および活性を高めるよう修飾される。追加的な実施形態は、マイクロＲＮＡ摸倣体を送達するためのミニ細胞の使用に関する。本発明の別の態様において、マイクロＲＮＡ摸倣体は、ＭＰＭの治療のために他の臨床的に使用される薬剤の効能を高めるよう作用する。
【００１８】
（ｍｉＲ−１５／１０７ファミリー）
ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーをすでに識別されており、成熟型マイクロＲＮＡ鎖の５’末端から第一か第二かのいずれかのヌクレオチドで始まる配列ＡＧＣＡＧＣを各メンバーが含有するマイクロＲＮＡスーパーファミリーとして特徴づける。ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーは、癌療法のためのならびに他の疾患および障害の療法のための介入地点を表す数多くの細胞活性の調節に関与すると考えられている。その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれるＦｉｎｎｅｒｔｙら（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第４０２巻：４９１〜５０９を参照されたい。例えば、ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーは、脊椎動物種における細胞分裂、代謝、ストレス応答および血管新生、ならびにヒトの癌、心血管系疾患および神経変性疾患と関連する遺伝子発現を調節するのに関与すると考えられている。
【００１９】
癌療法を開発するための新規のアプローチについての探索はしばしば、正常組織と腫瘍組織の間の差を識別して、腫瘍細胞の特異的なまたは選択的な標的化を可能にする試行で始まる。ＭＰＭについてはこのことは、遺伝子発現における多くの変化が、腫瘍細胞に対して特異的でありつつも、標的化されることが不可能であるか（すなわち、新薬の開発につながらない）またはあまりにも狭すぎる治療域を提供する（すなわち、正常細胞が罹患する）かのいずれかであるため、困難であることが立証されている。さらに、標的発現は常に治療の成功と相関しているとは限らない。先行研究は、多くのマイクロＲＮＡがＭＰＭにおける腫瘍抑制因子または発癌性機能を有することを示しているが、これらは、大きな割合の腫瘍または細胞系において頻繁に生じることはまだ観察されていない。この関連で、全ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーが、分析したＭＰＭ細胞系および腫瘍すべてにおいて下方調節されるという発見（図１）は、これらの変化を治療アプローチとして標的化するための強力な理論的根拠を提供する。マイクロＲＮＡのｍｉＲ−１５／１０７ファミリーのアスベスト誘発性下方調節を示すデータ（図２）と合わせると、このことは、ＭＰＭ生物学的現象におけるこれらの変化の重要な原因となる役割を立証する。この点において、ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの下方調節の識別は、少なくとも２つの理由について有意である。第一に、ＭＰＭに非常に特異的であり（変化は試料全部に存在する、図１）。第二に、ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの水準の上昇は、ＭＰＭ細胞増殖に影響するが、正常な中皮細胞には何ら影響を有さない（図３）。加えて、ＭＰＭのための治療実体としてマイクロＲＮＡを用いることは、複数の異常に発現する遺伝子を、単一の薬剤を用いて修正する能力を提供し（図５）、それにより増殖を低下させ（図３）かつ薬剤感度を高める（図６）。ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの発現を回復させることのできるマイクロＲＮＡを製剤化するために、本発明者らは、有効なマイクロＲＮＡ治療アプローチを調製するよう配列類似性などの特徴を考慮した。
【００２０】
ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーは、共通シード配列を共有し、したがって各メンバーのｍＲＮＡ標的は有意に重複する。本明細書で使用する場合、用語「マイクロＲＮＡファミリー」とは、Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ，Ｊら，ＰｌｏＳ  ｂｉｏｌ  ３（３）：ｐｅ８５（２００５）において説明されるように「シード配列」とも指す少なくとも６個の連続したヌクレオチドにわたって、同一性を共有するｍｉＲＮＡ種の一群を指す。本明細書で使用する場合、「シード配列」とは、成熟ｍｉＲＮＡ配列の位置１〜６、１〜７、２〜７、または２〜８におけるヌクレオチドを示す。マイクロＲＮＡシード配列は典型的には、ｍｉＲＮＡの５’末端に位置する。「成熟配列」とは、ＲＩＳＣへ入る完全にプロセシングされたマイクロＲＮＡの鎖を指す。
【００２１】
したがって、本発明の目的のために、ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーは以下のような１０個の配列、すなわち
ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ（配列番号１  ｕａｇｃａｇｃａｃａｕａａｕｇｇｕｕｕｇｕｇ，ＭＩＭＡＴ０００００６８）、
ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ（配列番号２  ｕａｇｃａｇｃａｃａｕｃａｕｇｇｕｕｕａｃａ，ＭＩＭＡＴ００００４１７）、
ｍｉＲ−１６−５ｐ（配列番号３  ｕａｇｃａｇｃａｃｇｕａａａｕａｕｕｇｇｃｇ，ＭＩＭＡＴ０００００６９）、
ｍｉＲ−１９５−５ｐ（配列番号４  ｕａｇｃａｇｃａｃａｇａａａｕａｕｕｇｇｃ，ＭＩＭＡＴ００００４６１）、
ｍｉＲ−４２４−５ｐ（配列番号５  ｃａｇｃａｇｃａａｕｕｃａｕｇｕｕｕｕｇａａ，ＭＩＭＡＴ０００１３４１）、
ｍｉＲ−４９７−５ｐ（配列番号６  ｃａｇｃａｇｃａｃａｃｕｇｕｇｇｕｕｕｇｕ，ＭＩＭＡＴ００２８２０）、
ｍｉＲ−５０３−５ｐ（配列番号７  ｕａｇｃａｇｃｇｇｇａａｃａｇｕｕｃｕｇｃａｇ，ＭＩＭＡＴ０００２８７４）、
ｍｉＲ−６４６−５ｐ（配列番号８  ａａｇｃａｇｃｕｇｃｃｕｃｕｇａｇｇｃ，ＭＩＭＡＴ０００３３１６）、
ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ（配列番号９  ａｇｃａｇｃａｕｕｇｕａｃａｇｇｇｃｕａｕｇａ，ＭＩＭＡＴ００００１０１）、および
ｍｉＲ−１０７（配列番号１０  ａｇｃａｇｃａｕｕｇｕａｃａｇｇｇｃｕａｕｃａ，ＭＩＭＡＴ００００１０４）
から構成される。
【００２２】
ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの標的をすべて有効に制御するために、理論上１０個のメンバーは全部、先に列挙した各配列に特異的なマイクロＲＮＡ摸倣体を用いてＭＰＭ細胞へ再導入される必要がある。依然として、これは、臨床治療への効率的なアプローチではない。代わりに、本発明は、内在性ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの機能を実行するための摸倣体として作動してそれによりＭＰＭ細胞におけるｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの発現を回復させる全ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの共通配列が設計されたマイクロＲＮＡ摸倣体アプローチを提供する（図３）。本明細書で使用する場合、句「共通配列」とは、配列の群の中で高い配列の、構造的なおよび／または機能的な同一性を共有するヌクレオチド配列を指す。この点において、共通配列を含むマイクロＲＮＡ摸倣体は、全ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの機能を模倣することができる。全ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの共通配列の設計はそれゆえ、内在性発現が模倣でき、それと同時に単一の配列実体に対して摸倣体の数を限定できる所望の標的数を最大限にする利点を生じる（すなわち、１０個のｍｉＲ−１５／１０７ファミリーメンバー）。
【００２３】
したがって、具体的な実施形態において、マイクロＲＮＡ摸倣体は、ＭＰＭ細胞を治療するための置換療法の形態として使用され、ここで、マイクロＲＮＡ摸倣体は、ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの機能を実行することができ、それによりｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの発現を回復させることができる。このように、本開示の文脈において、用語「発現を回復させること」とは、内在性ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの機能を模倣することのできるマイクロＲＮＡ摸倣体の使用を通じてのｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの発現の回復を指す。
【００２４】
（マイクロＲＮＡ摸倣体）
本明細書で使用する場合、用語「マイクロＲＮＡ摸倣体」とは、ＲＮＡｉ経路に入ることのできるかつ遺伝子発現を調節することのできる合成非コードＲＮＡを指す。本明細書で使用する場合、「合成マイクロＲＮＡ」とは、内在性マイクロＲＮＡ以外の何らかの種類のＲＮＡ配列を指す。マイクロＲＮＡ摸倣体は、内在性マイクロＲＮＡの機能を摸倣し、成熟した二本鎖分子、または摸倣体前駆体（例えば、プリマイクロＲＮＡまたはプレマイクロＲＮＡ）として設計することができる。マイクロＲＮＡ摸倣体は、修飾されたまたは修飾されていないＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体あるいは代替的な核酸化学物質から構成することができる。
【００２５】
先に開示したように、ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーは、活性（誘導）鎖の５’末端において配列５’−ＡＧＣＡＧＣ−３’を共有する１０個のマイクロＲＮＡを含む。ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの全メンバーが同じシード配列を有するという事実は、単一のマイクロＲＮＡ摸倣体を用いた遺伝子発現の包括的な調節を修正するための機会を提供する。したがって、本発明は、共通配列を含むｍｉＲ−１５／１０７ファミリーに対応するマイクロＲＮＡ摸倣体を提供し、ここで、マイクロＲＮＡ摸倣体は、全ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの内在性活性を模倣することができる。それゆえ、マイクロＲＮＡ発現の回復は、これらのマイクロＲＮＡ摸倣体の使用を通じて達成される。
【００２６】
本発明の例示的な共通配列は、以下のとおりである。
ｃｏｎｌ５／１０７．１（配列番号１１  ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＡＵＡＡＵＧＧＵＵＵＧＣＧ）、
ｃｏｎｌ５／１０７．２（配列番号１２  ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＡＵＡＡＵＧＧＵＵＵＧＣＧＧＡ、
ｃｏｎｌ５／１０７．３（配列番号１３  ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＡＵＡＡＵＧＧＵＵＵＧＣＵ)、および
ｃｏｎｌ５／１０７．４（配列番号１４  ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＵＡＵＧＧＵＵＵＧＣＧ)。
ｃｏｎｌ５／１０７．１，相補体Ａ（配列番号１５  ＣＧＣＡＡＡＣＣＡＵＵＡＵＧＵＧＣＵＧＣＵＡ)、
ｃｏｎｌ５／１０７．２，相補体Ａ（配列番号１６  ＵＣＣＧＣＡＡＡＣＣＡＵＵＡＵＧＵＧＣＵＧＣＵＡ)、
ｃｏｎｌ５／１０７．３，相補体Ａ（配列番号１７  ＡＧＣＡＡＡＣＣＡＵＵＡＵＧＵＧＣＵＧＣＵＡ)、
ｃｏｎｌ５／１０７．４，相補体Ａ（配列番号１８  ＣＧＣＡＡＡＣＣＡＵＡＣＵＧＵＧＣＵＧＣＵＡ）、
ｃｏｎｌ５／１０７．１，相補体Ｂ（配列番号１９  ＣＧＣＡＡＡＣＣＡＵＵＡＵＧＵＧＣＵＧＣＵＵ）、
ｃｏｎｌ５／１０７．２，相補体Ｂ（配列番号２０  ＵＣＣＧＣＡＡＡＣＣＡＵＵＡＵＧＵＧＣＵＧＣＵＵ)、
ｃｏｎｌ５／１０７．３，相補体Ｂ（配列番号２１  ＡＧＣＡＡＡＣＣＡＵＵＡＵＧＵＧＣＵＧＣＵＵ)、
ｃｏｎｌ５／１０７．４，相補体Ｂ（配列番号２２  ＣＧＣＡＡＡＣＣＡＵＡＣＵＧＵＧＣＵＧＣＵＵ）、
ｃｏｎｌ５／１０７．１，相補体Ｃ（配列番号２３  ＣＧＣＡＡＡＣＣＡＵＵＡＵＧＵＧＣＵＧＣＵＵＵＡ）、
ｃｏｎｌ５／１０７．２，相補体Ｃ（配列番号２４  ＵＣＣＧＣＡＡＡＣＣＡＵＵＡＵＧＵＧＣＵＧＣＵＵＵＡ）、
ｃｏｎｌ５／１０７．３，相補体Ｃ（配列番号２５  ＡＧＣＡＡＡＣＣＡＵＵＡＵＧＵＧＣＵＧＣＵＵＵＡ)、
ｃｏｎｌ５／１０７．４，相補体Ｃ（配列番号２６  ＣＧＣＡＡＡＣＣＡＵＡＣＵＧＵＧＣＵＧＣＵＵＵＡ)、
ｃｏｎｌ５／１０７．１，相補体Ｄ（配列番号２７  ＣＧＣＡＡＡＣＣＡＵＵＡＵＵＧＵＧＣＵＧＣＵＵＵＡ)、
ｃｏｎｌ５／１０７．２，相補体Ｄ（配列番号２８  ＵＣＣＧＣＡＡＡＣＣＡＵＵＡＵＵＧＵＧＣＵＧＣＵＵＵＡ)、
ｃｏｎｌ５／１０７．３，相補体Ｄ（配列番号２９  ＡＧＣＡＡＡＣＣＡＵＵＡＵＵＧＵＧＣＵＧＣＵＵＵＡ)、および
ｃｏｎｌ５／１０７．４，相補体Ｄ（配列番号３０  ＣＧＣＡＡＡＣＣＡＵＡＣＵＵＧＵＧＣＵＧＣＵＵＵＡ）。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態は、パッセンジャー鎖としての相補的配列（配列番号１５〜１８）とともに合成共通マイクロＲＮＡ（「誘導」）配列を完全にまたは部分的に（配列番号１１〜１４）含む。末端のミスマッチ、オーバーハングおよび／または内部バルジが誘導鎖とパッセンジャー鎖の間に組み込まれ、それが導入されてＲＩＳＣ負荷を高める二本鎖ＲＮＡ摸倣体も本発明によって企図される（配列番号２１〜３０を参照されたい）。シード配列ＡＧＣＡＧＣが誘導鎖の最初の７ヌクレオチド内に、すなわち、位置１〜６または位置２〜７に存在する場合、全ファミリーメンバーの共通配列に対応する配列の他の変種も企図される。当業者は、他の変種がＲＩＳＣ負荷を促進して活性を高めることができることを理解するであろう。例として、これらには、誘導鎖の３’末端における１つまたは２つのヌクレオチドオーバーハング、パッセンジャー鎖の３’末端におけるＤＮＡヌクレオチド（または他の化学的修飾）を含む。
【００２８】
（化学的修飾）
概して、マイクロＲＮＡ摸倣体は、手術での使用において非効率的であることが判っている。この点において、効率性を改善するために、本発明は、構造的かつ化学的に修飾された二本鎖ＲＮＡを含むマイクロＲＮＡ摸倣体を採用する。例示的な実施形態において、マイクロＲＮＡ摸倣体の限界を克服するために、摸倣体配列に対する非毒性の化学的修飾を導入して、安定性を改善し、非特異的効果を低下させ、かつ活性を高めた。
【００２９】
一実施形態において、マイクロＲＮＡ摸倣体には、成熟型マイクロＲＮＡ配列およびパッセンジャー鎖を含むＲＮＡ二本鎖を含む。一態様において、パッセンジャー鎖は、パッセンジャー鎖を不活性化させながら、二本鎖摸倣体の活性の保持を可能にするよう構造的かつ化学的に修飾され、それにより非特異的効果を低下させる。さらなる態様において、化学的修飾はヌクレアーゼ活性を阻害し、それにより安定性を高める。
【００３０】
詳細な実施形態において、本発明のマイクロＲＮＡ摸倣体は、当該摸倣体の活性を高めるよう修飾されたヌクレオチドの使用を企図する。このようなヌクレオチドには、ＲＮＡの５’末端もしくは３’末端にあるヌクレオチド、および当該分子内の内部にあるヌクレオチドを含む。マイクロＲＮＡの相補鎖において使用される修飾されたヌクレオチドは、ＲＮＡの５’ＯＨもしくはリン酸塩を遮断するか、またはマイクロＲＮＡの不活性鎖の取り込みおよび活性を防止する内部糖修飾を導入するかのいずれかである。マイクロＲＮＡ阻害薬についての修飾には、ハイブリッド形成を高めおよび細胞中の分子を安定化させる内部糖修飾、ならびに細胞中の核酸をさらに安定化させる末端修飾を含む。さらに企図されるのはマイクロＲＮＡを含有する細胞を識別するために、顕微鏡法または他の方法によって検出することのできる修飾である。
【００３１】
他の態様において、修飾は、マイクロＲＮＡの活性を崩壊させることなく、マイクロＲＮＡまたはプレマイクロＲＮＡの配列に対して行ってもよい。本明細書で使用する場合、用語マイクロＲＮＡ配列の「機能的バリアント」とは、天然のマイクロＲＮＡ配列とは異なるがマイクロＲＮＡの１つ以上の機能的特徴（例えば、化学療法薬に対する癌細胞感受性の亢進、癌細胞増殖阻害、癌細胞アポトーシスの誘導、特異的マイクロＲＮＡ標的阻害）を保有するオリゴヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ配列の機能的バリアントは、マイクロＲＮＡの機能的特徴を全部保有する。ある実施形態において、マイクロＲＮＡの機能的バリアントは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれより多くの核酸塩基の領域にわたりマイクロＲＮＡまたはその前駆体と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸塩基配列を有し、あるいは機能的バリアントはストリンジェントなハイブリッド形成条件下でマイクロＲＮＡまたはその前駆体の相補体とハイブリッド形成する。したがって、ある実施形態において、機能的バリアントの核酸塩基配列は、マイクロＲＮＡの１つ以上の標的配列とハイブリッド形成することができるかもしれない。
【００３２】
いくつかの実施形態において、相補鎖は、リン酸塩またはヒドロキシル以外の化学基が当該相補鎖の５’末端にあるよう修飾される。５’修飾の存在は明らかに、相補鎖の取り込みを排除し、その後、マイクロＲＮＡタンパク質複合体によって活性鎖の取り込みを支持する。５’修飾は、ＮＨ２、ＮＨＣＯＣＨ３、およびビオチンを含む、当該技術分野で公知の種々の分子のうちの何らかであることができる。
【００３３】
別の実施形態において、マイクロＲＮＡ経路による相補鎖の取り込みは、相補鎖の最初の２〜６ヌクレオチドにおける糖修飾を用いてヌクレオチドを組み込むことによって低下する。このような糖修飾が、マイクロＲＮＡ活性をさらに高めるために先に説明した５’末端修飾と組み合わせることができることは特筆されるべきである。マイクロＲＮＡ摸倣体において企図される糖修飾には、Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル、またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルから選択される糖置換基を含むが、これらに限定されず、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい。いくつかの実施形態において、これらの基は、Ｏ(ＣＨ２)ｘＯＣＨ３、Ｏ（（ＣＨ２）ｘＯ）ｙＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｘＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｘＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｘＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｘＯＮ（（ＣＨ２）ｘＣＨ３）２から選択してもよく、式中ｘおよびｙは１〜１０である。
【００３４】
塩基部分の変化または糖部分の変化にはマイクロＲＮＡ摸倣体の目的と一致した他の修飾も含む。このようなオリゴマー化合物は、天然または合成の修飾されていないオリゴヌクレオチドとは構造的に区別でき、なおも機能的に互換性があるものとして最良に説明される。このように、このようなオリゴマー化合物はすべて、ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーに対応する所望のＲＮＡオリゴヌクレオチド鎖の構造または機能を模倣するよう有効に機能する限り、本発明によって包含されるよう企図される。
【００３５】
いくつかの実施形態において、相補鎖は、相補鎖の３’末端におけるヌクレオチドが活性鎖と相補的ではないよう設計される。この結果、活性鎖の３’末端では安定だが活性鎖の５’末端では比較的不安定な二本鎖ハイブリッドＲＮＡを生じる。この安定性の違いは、相補鎖の取り込みを低下させながら、マイクロＲＮＡ経路による活性鎖の取り込みを高め、それによりマイクロＲＮＡ活性を高める。
【００３６】
本発明の実施における使用について企図される他の修飾に関しては、とりわけｍｉＲＮＡ摸倣体のセンス鎖への２’−Ｏ−メチル修飾の付加がｍｉＲＮＡ摸倣体分子に負の効果を有することができるという米国特許公開第２０１２／０２５９００１号における開示も参照されたい。これらの負の効果を緩和させるのが、（ｉ）センス鎖のヌクレオチドの約４０％〜約９０％が化学的に修飾された大きさが約１６〜約３１ヌクレオチドに及ぶセンス鎖、（ｉｉ）アンチセンス鎖のヌクレオチドの約４０％〜約９０％が化学的に修飾されたヌクレオチドである大きさが約１６〜約３１ヌクレオチドに及ぶアンチセンス鎖、ならびに（ｉｉｉ）アンチセンス鎖におけるヌクレオチド１とセンス鎖における反対側のヌクレオチドの間のミスマッチおよびアンチセンス鎖におけるヌクレオチド７とセンス鎖における反対側のヌクレオチドの間のミスマッチのうちの少なくとも１つ、を含むｍｉＲＮＡ摸倣体である。また、開示されるように本文脈において有利なのは、コレステロール、コレスタノール、スチグマステロール、コラン酸、およびエルゴステロールからなる群から選択される共役体部分の長さ約３〜約９原子のリンカー分子を介したｍｉＲＮＡ摸倣体のセンス鎖への結合である。リンカー分子は例えば長さ５〜８原子であることができ、かつリンカー分子は、センス鎖の３’末端へ共役体部分を結合させることができる。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本発明のマイクロＲＮＡ配列は、同じＲＮＡ分子上にまたは別個のＲＮＡ分子上にマイクロＲＮＡ配列として位置してもよい第二のＲＮＡ配列と会合してもよい。このような場合において、マイクロＲＮＡ配列は活性鎖と呼んでもよく、マイクロＲＮＡ配列と少なくとも部分的に相補的なコードしたＲＮＡ配列は、相補鎖と呼んでもよい。活性鎖および相補鎖はハイブリッド形成して、天然のマイクロＲＮＡ前駆体と類似の二本鎖ＲＮＡを生じてもよい。マイクロＲＮＡの活性は、活性鎖の取り込みを最大限にし、かつ遺伝子翻訳を調節するマイクロＲＮＡタンパク質複合体による相補鎖の取り込みを最小限にすることによって、最適化してもよい。このことは、例えば相補鎖の修飾および／または設計を通じて行うことができる。
【００３８】
核酸は、例えば、化学合成、酵素による生成または生物学的産生など、当業者に公知の何らかの技術によって生成してもよい。いくつかの実施形態において、本発明のマイクロＲＮＡ組成物は、化学的に合成される。
【００３９】
好ましい実施形態は、このような修飾の特定のセットを有する。これらは、２’Ｏ−メチル修飾した糖を用いたパッセンジャー鎖の各末端における２〜６ヌクレオチドの化学的修飾であり、パッセンジャー鎖の３’末端における２、３、４、５または６の修飾したヌクレオチドとのパッセンジャー鎖の５’末端における２、３、４、５または６の修飾されたヌクレオチドとの何らかの組み合わせを含む。類似の機能性を与える代替的な化学修飾戦略は、当業者に明らかであろう。
【００４０】
（投与方法）
マイクロＲＮＡ摸倣体は、これらの化合物を対象の癌細胞へ送達するのに適した何らかの手段によって対象へ投与することができる。例えば、マイクロＲＮＡ摸倣体は、対象の細胞を摸倣体でまたはこれらの化合物をコードする配列を含む核酸でトランスフェクトするのに適した方法によって投与することができる。一実施形態において、細胞は、マイクロＲＮＡ摸倣体をコードする配列を含むプラスミドベクターまたはウイルスベクターを用いてトランスフェクトされる。
【００４１】
本発明の特定の一実施形態において、インビボでの非効率的な送達と関連した問題を回避するために、本発明による摸倣体は好ましくは、未処置の細菌由来のミニ細胞の使用に基づいた、ＥｎＧｅｎｅＩＣ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ（シドニー市）によって開発された「ＥｎＧｅｎｅＩＣ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅ」系を介して送達される。ＥＤＶ（商標）系は、例えば、その個々の内容が参照により本明細書に組み込まれる公開された国際出願ＷＯ２００６／０２１８９４およびＷＯ２００９／０２７８３０において説明される。
【００４２】
例示的な実施形態において、それゆえ、本明細書に説明されるマイクロＲＮＡ摸倣体は、未処置の細菌由来のミニ細胞を用いて送達される。これらのミニ細胞は、二重特異性抗体を用いて標的組織へ特異的に送達される。このような抗体の片腕は、標的組織に対する特異性を有する一方で、もう片方はミニ細胞に対する特異性を有する。この抗体により、ミニ細胞が標的細胞表面へ持ち込まれ、次にミニ細胞は、エンドサイトーシスによって細胞内へと持ち込まれる。腫瘍細胞への取り込みの後、ミニ細胞の内容物、すなわちマイクロＲＮＡ摸倣体の放出がある。この点における抗体について、ＭＰＭについての何らかの細胞表面マーカーに対する特異性は、本発明に従って使用され得る。したがって、本文脈における二重特異性抗体に適したこのような特異性を説明しているのが、治療抗体が開発中である類上皮型中皮腫の１００％に発現するヒトメソテリン（Ｋｅｌｌｙら，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１１：５１７〜５２２（２０１２）を参照されたい。）、またはＭＰＭおよび胃腸杯細胞において特異的に発現するインテレクチン１（Ｗａｓｈｉｍｉら，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ３９８８９（２０１２）を参照されたい。）に対する特異性であり得る。
【００４３】
核酸を投与する他の方法は当該技術分野で周知である。特に、核酸治療薬について既に使用されている投与経路は、現在使用中の製剤とともに、核酸についての好ましい投与経路および製剤を提供する。核酸組成物は、経口、静脈内、胸膜内、腹腔内、筋肉内、経皮的、皮下的、局所的、舌下のまたは直腸の手段を含むがこれらに限定されないいくつかの経路によって投与することができる。
【００４４】
核酸は、リポソームまたはナノ粒子を介しても投与することができる。このような投与経路および適切な製剤は概して、当業者に公知である。本明細書で説明される製剤の投与は、マイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡをコードする核酸がその標的へ到達することができる何らかの許容し得る方法によって達成してもよい。選択された特定の様式は、もちろん、具体的な製剤、治療中の対象の状態の重症度、および治療効力に必要な薬用量などの例示的な因子による。本明細書で概して使用する場合、核酸の「有効量」とは、化合物または治療薬を受けていない対応する対象と比較して、製剤を投与された対象における癌または関連疾患の１つ以上の症状を治療することができ、癌または関連疾患の１つ以上の症状の進行を逆転させることができ、癌または関連疾患の１つ以上の症状の進行を停止させることができ、あるいは、癌または関連疾患の１つ以上の症状の発症を予防することができる量である。薬剤の実際の有効量は、利用中の具体的な薬剤またはその組み合わせ、製剤化される具体的な組成物、投与様式、対象の年齢、体重、容態、ならびに治療中の症状または容態の重症度に従って変化することができる。
【００４５】
他の適切な送達系には、徐効性、遅延放出性、持効性、または徐放性の送達系を含むが、これらに限定されない。このような系は、多くの場合において反復投与を回避し、対象および医師に対する簡便さを増し得る。多くの種類の放出送達系は当業者にとって利用可能でありかつ公知である。当該種類には例えば、ポリ乳酸および／またはポリグリコール酸、ポリ無水物、ポリカプロラクトン、コポリオキサラート、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシブチル酸、ならびに／あるいはこれらの組み合わせなどの重合体ベースの系を含む。
【００４６】
マイクロＲＮＡ摸倣体を含有する本発明の医薬組成物は、従来の医薬賦形剤および／または添加剤も含むことができる。適切な医薬賦形剤には、安定化剤、抗酸化物質、オスモル濃度調整剤、緩衝剤、およびｐＨ調整剤を含む。適切な添加剤には、例えば、生理学的に生体適合性のある緩衝剤（例えば、塩酸トロメタミン）、キレート剤（例えば、ＤＴＰＡまたはＤＴＰＡビスアミド）もしくはカルシウムキレート複合体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）の添加、あるいは任意でカルシウム塩もしくはナトリウム塩（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムまたは乳酸カルシウム）の添加を含む。
【００４７】
（投薬）
マイクロＲＮＡ発現の喪失とＭＰＭの間の関連性が試料中で一致しているので、本発明の一態様は、ＭＰＭ腫瘍細胞におけるマイクロＲＮＡ置換に関する。本態様において、初期的な動物実験を基に、ＭＰＭの進行が本発明のｍｉＲ含有ｍｉＲを用いた治療によって停止することが企図される。さらなる態様において、連続した時間枠を通じての複数回用量を対象へ投与することができることが企図される。いくつかの態様において、１週間につき１用量が適切に有効な効果を有するかもしれないが、対象によっては頻度を増すことおよび／または薬用量を増すことに応じてより顕著に有効な効果を示すかもしれない。
【００４８】
本発明の別の実施形態において、長期的な投薬は、ＭＰＭ疾患制御を達成することができる。なおも他の実施形態において、マイクロＲＮＡ摸倣体を受けているＭＰＭ腫瘍細胞が永久的な増殖停止に入ることが企図される。この点において、永久的な増殖停止は、マイクロＲＮＡ摸倣体の作用機序（細胞周期促進遺伝子および代謝促進遺伝子の下方調節、抗アポトーシス生存促進性遺伝子、ならびに薬剤耐性遺伝子）および表現型の結果（細胞周期停止）に起因することができる。継続治療はしたがって、疾患の制御または維持（すなわち、安定した疾患）を誘導するために、本発明の一態様に従って企図される。本発明の態様に従って、ＭＰＭ腫瘍が永久的な細胞増殖停止に入る腫瘍の退縮（すなわち、部分的／完全な応答）が企図される。
【００４９】
さらに、以下にさらに詳細に考察するように、本発明のマイクロＲＮＡ摸倣体はさらに、化学療法および放射線などの従来の癌療法に対して細胞を感作させるよう機能する。本態様において、摸倣体を化学療法と組み合わせることが追加的な治療効果を提供することが企図される。
【００５０】
ＭＰＭについての現行治療ではすべて、療法に対する応答は、常に再発を伴う。したがって、本発明のなおも別の態様において、腫瘍がマイクロＲＮＡ発現とＭＰＭの間の関連性の点において再発時にこの発現プロファイルを保有することが企図される。この点において、再発は、説明されるとおり、本明細書に開示される同じマイクロＲＮＡ摸倣体を用いた再治療を許容する。本実施形態において、長期の腫瘍抑制は、疾患の性質を変化させ、ＭＰＭをある形態の慢性疾患へと潜在的に変化させる。
【００５１】
他の態様において、特定の対象についての薬用量は、従来の考慮を用いて（例えば、適切な従来の薬理学的プロトコルによって）当業者が判断することができる。医師は例えば、最初は比較的低用量を、その後、適切な応答が得られるまで、用量を増して処方してもよい。対象へ投与される用量は、対象における有益な治療応答を経時的にもたらすのに、または例えば症状もしくは他の適切な活性を適用に応じて低下させるのに十分である。用量は、特定の製剤の効力および採用されるマイクロＲＮＡの活性、安定性または血清半減期ならびに対象の容態、ならびに治療されることになっている対象の体重または表面積によって判断される。用量の大きさは、特定の対象における特定のベクターの投与および製剤に付随する何らかの有害な副作用の存在、性質、および程度によっても判断される。
【００５２】
（併用療法）
本明細書に説明されるマイクロＲＮＡ摸倣体は、抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性薬、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体、および生物学的応答修飾薬の投与を含むがこれらに限定されない何らかの公知の従来療法によって治療条件を補充することができる。２つ以上の組み合わされた化合物は同時にまたは連続して使用してもよい。例えば、マイクロＲＮＡ摸倣体は、抗癌カクテルの一部として治療有効量で投与することもできる。抗癌カクテル剤は、送達のための医薬として許容し得る担体に加えて、マイクロＲＮＡ摸倣体と１つ以上の抗癌薬との混合物である。抗癌カクテルの癌治療としての使用は通例である。
【００５３】
一実施形態において、マイクロＲＮＡ摸倣体を他の治療様式と併用することが想定される。したがって、先に説明したマイクロＲＮＡ療法に加えて、従来のがん治療薬などだがこれに限定されないより「標準的な」療法を対象へ提供してもよい。
【００５４】
当該技術分野で周知の、かつ本明細書に説明される核酸との併用療法として使用することのできる抗癌薬には、アクチノマイシンＤ、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン（シス−ＤＤＰ）、シクロホスファミド、シタラビンＨＣｌ（シトシンアラビノシド）、ダカルバジン、ファクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、ドキソルビシンＨＣｌ、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、フロクスリジン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシ尿素（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンアルファ２ａ、インターフェロンアルファ２ｂ、酢酸ロイプロリド（黄体形成ホルモン放出ホルモン放出因子類似体）、ロムスチン、メクロレタミンＨＣｌ（窒素マスタード）、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート（ＭＴＸ）、マイトマイシン、ミトキサントロンｈｃｌ、オクトレオチド、プリカマイシン、プロカルバジンｈｃｌ、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、アムサクリン、アザシチジン、ヘキサメチルメラミン、インターロイキン２、ミトグアゾン、ペントスタチン、セムスチン、テニポシド、および硫酸ビンデシンを含むが、これらに限定されない。
【００５５】
化学療法薬は例えば、ＤＮＡと直接架橋する薬剤、ＤＮＡ中へと挿間する薬剤、ならびに核酸合成に影響することによって染色体および有糸分裂の異常をもたらす薬剤であることができる。ＤＮＡと直接架橋する薬剤、具体的には核酸は、相乗的な抗悪性腫瘍性結合をもたらすＤＮＡ損傷を生じることが想定されており、本明細書で示されている。シスプラチンなどの薬剤、および他のＤＮＡアルキル化薬を使用してもよい。ＤＮＡを損傷させる薬剤には、ＤＮＡ複製、有糸分裂、および染色体分離に干渉する化合物も含む。これらの化合物の例には、アドリアマイシン（ドキソルビシンとしても公知）、エトポシドとしても公知のＶＰ−１６、ベラパミル、ポドフィロトキシン、およびこれらに類するものを含む。例示的な化学療法薬には少なくとも、Ｉ）ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン、アクチノマイシンＤなどの抗生物質、２）シスプラチンなどの白金系薬剤、３）タキソールおよびビンクリスチン、ビンブラスチンなどの植物アルカロイド類、４）カルムスチン、メルファラン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、およびロムスチンなどのアルキル化薬を含む。
【００５６】
本発明の例示的な実施形態において、マイクロＲＮＡ摸倣体は、単一の薬剤として投与することができるが、他の薬剤、例えば、ペメトレキセド、シスプラチン（またはカルボプラチン）およびゲムシタビンなどと併用することもできる。
【００５７】
併用療法は、ＭＰＭ腫瘍細胞を単一の組成物と、もしくは１つ以上のマイクロＲＮＡ摸倣体および第二の癌治療薬を含む薬理学的製剤と接触させることによって、または腫瘍細胞を２つの異なる組成物もしくは製剤と同時に接触させることによって達成してもよく、ここで、１つの組成物には１つ以上のマイクロＲＮＡ摸倣体を含み、他方には第二の癌療法薬を含む。あるいは、１つ以上のマイクロＲＮＡ摸倣体の投与は、数分から数週間に及ぶ間隔で他の癌療法薬の投与に先行または追随してもよい。他方の癌療法薬および１つ以上のマイクロＲＮＡ摸倣体が個別に対象へ適用される実施形態において、癌療法薬および１つ以上のマイクロＲＮＡ摸倣体が腫瘍細胞に及ぼす有利に組み合わされた効果をなおも発揮することができるよう、各送達時間の間で長期間が経過しなかったことが概して確認される。
【００５８】
さらなる薬理学的治療薬および投与方法、薬用量などは、当業者に周知であり（例えば、関連部分における参照により本明細書に組み込まれる「医師の卓上参考書（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」、Ｋｌａａｓｅｎの「治療薬の薬理学的基礎（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの医薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」および「メルクインデックス第１１版」を参照されたい。）、本明細書における開示の点で本発明と組み合わされてもよい。薬用量におけるいくつかの変更は、治療中の対象の容態に応じて必然的に生じる。投与についての責任者は、いかなる事象においても、個々の対象について適切な用量を判断し、かつこのような個々の判断は、当業者の技術内である。
【実施例】
【００５９】
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を説明する目的のために与えられる。当該実施例は、いかなる様式においても本発明を制限するよう意味するものではない。当業者は、本発明が、目的を実行しかつ記載された結果および利点、ならびに本明細書に固有のいかなる目的、結果および利点も得るよう十分に適用することは認識するであろう。本実施例は（本明細書に説明される方法とともに）、好ましい実施形態を現在代表する。当該実施例は例示的であって、本発明の範囲における制限として意図するものではない。請求項の範囲によって規定されるような本発明の精神内に包含される変法および他の使用は当業者が気づくであろう。
【００６０】
（実施例１）
（ＭＰＭにおけるｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの発現低下に関する発見）
マイクロＲＮＡは、癌の発達において重要な役割を有しており、マイクロＲＮＡの発現は、ＭＰＭを含む腫瘍において調節不全である。本発明者らは、ＭＰＭ細胞系およびわずかなセットの腫瘍試料におけるｍｉＲ−１６の発現変化を識別し、ＭＰＭ細胞系およびより大きなセットの腫瘍検体における関連マイクロＲＮＡの全ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの発現をさらに評価した（図１）。
【００６１】
７つのＭＰＭ細胞系からなるパネルを、中皮細胞系ＭｅＴ−５Ａと比較した。細胞をＡＴＣＣ（Ｈ２８、Ｈ２０５２、Ｈ２４５２、Ｈ２２６およびＭＳＴＯ−２１１Ｈ）および研究協力者ら（ＭＭ０５およびＲｅｎ）から入手し、３７℃、５％ＣＯ２の推奨培地中で培養した。全ＲＮＡを細胞（８０％コンフルエンスまで増殖）からＴｒｉＺＯＬ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて単離した。６０個の腫瘍検体は、ホルマリン固定し、パラフィン包埋したブロックからなった。腫瘍マイクロＲＮＡ発現を、正常胸腺組織の２３個のホルマリン固定した試料と比較した。腫瘍検体からＲＮＡを単離するために、熟練の病理学者が、各ブロック由来のヘマトキシリン・エオシン染色したスライド上で腫瘍含有物を標識し、当該スライドをレーザーキャプチャー顕微切断のためのガイドとして使用して、腫瘍含有物を濃縮した。簡潔には、試料を膜スライド（Ｚｅｉｓｓ）上にマウントし、ＰＡＬＭシステム（Ｚｅｉｓｓ）を用いてレーザーキャプチャー法を実行した。捕捉した組織を接着収集管に集め、脱パラフィンをキシレン中で行った。製造元の説明書に従ってＦＦＰＥ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、捕捉した腫瘍検体および正常組織からＲＮＡを抽出した。細胞系および組織試料からのＲＮＡを２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの読み取りでナノ光度計を用いて定量化した。細胞系および腫瘍試料の両方について、逆転写（ＲＴ）は、マイクロＲＮＡ特異的なステムループプライマー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。１００ｎｇの全ＲＮＡを室温での反応におけるテンプレートとして使用し、これにはまた４μｌの室温プライマー混合物（等モル濃度混合物中で多重の１０個以内のマイクロＲＮＡ特異的室温プライマーを用いる）も含み、反応は製造元の説明書に従って１０μｌの容積で実施した。結果として生じる相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を５７．８μｌの水の添加によって希釈し、この希釈液から２．２５μｌのｃＤＮＡをテンプレートとして定量的ＰＣＲ反応へと添加した。定量的ＰＣＲはさらに、マイクロＲＮＡ特異的ＴａｑＭａｎプライマー／プローブおよびＴａｑＭａｎ  ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（両方ともＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、総反応容積１０μｌで含有した。反応物を手動でセットアップし、Ｍｘ３０００ＰリアルタイムＰＣＲ機（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において二つ組で、９５℃で１０分間の酵素活性化に次いで９５℃で１５秒間の変性４０周期、および６０℃で６０秒間のアニーリング／伸長を実行した。Ｃｑ（定量化周期）のための値は、ＭｘＰｒｏソフトウェアを用いて適応性ベースラインおよび背景ベースの閾値アルゴリズムを適用して判断した。定量的ＰＣＲ結果の分析を、２−ΔΔＣｑ法（Ｌｉｖａｋらによって説明されるとおり）を用いて実行し、当該分析は、ＲＮＵ６Ｂ発現水準に対する標準化を含んでいた。各試料における発現を、対照の平均的な発現と比較して算出した。
【００６２】
ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーにおける１０個のマイクロＲＮＡのうち、６個（ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７）は全試料において検出し、４個（ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−５０３およびｍｉＲ−６４６）は不検出であった。細胞系において、６個全部の検出可能なマイクロＲＮＡの平均２〜５倍の下方調節を、不死化正常中皮細胞における発現と比較して観察した（図１を参照されたい。）。腫瘍において、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂおよびｍｉＲ−１９５は平均で８〜２５倍下方調節したのに対し、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７は、正常胸腺（同図）におけるこれらのマイクロＲＮＡの水準と比較した場合、４〜６倍ほど下方調節した。
【００６３】
（実施例２）
（クリソタイルアスベスト繊維へのＭＰＭ細胞の曝露の際のｍｉＲ−１５／１０７ファミリー発現の低下）
アスベストは、ＭＰＭにおける病因に関連する因子であるが、マイクロＲＮＡ発現に及ぼす効果はわかっていない。アスベスト曝露後に観察される変化は、ＭＰＭの生物学的反応における原因となる役割を示唆している。本分野における先行研究は、細胞毒性濃度のアスベスト繊維への急性の曝露が細胞に及ぼす効果に焦点を当ててきた。遺伝子発現の変化がこれらの事例において観察されているが、このような処置の最も有力な結果は、広範な細胞毒性および細胞死をもたらすアポトーシスおよび壊死の組み合わせである。
【００６４】
中皮細胞におけるマイクロＲＮＡ発現に及ぼすアスベスト曝露の生理学的に関連のある効果を識別するために、ＭｅＴ−５Ａ細胞をクリソタイルアスベスト繊維へ持続的に曝露した。ＭｅＴ−５Ａ細胞を０、０．１または１μｇのクリソタイルアスベスト繊維の存在下で推奨される培地条件下で３か月間持続的に増殖させた。示される時点で、細胞を収集し、ＲＮＡをマイクロＲＮＡ発現測定のために単離した。ＲＮＡ単離およびＲＴ−定量的ＰＣＲを実施例１に説明したとおり実施した。マイクロＲＮＡの水準をＵ６発現に対して標準化したので、未処置の細胞における標準化された発現に対して表す。図２は、１μＭのアスベストへの持続的な曝露がすべての時点においてｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７の発現低下をもたらし、ｍｉＲ−１５ａ発現を７０日目以降低下させる。これらの結果は概して、アスベスト曝露をマイクロＲＮＡ発現の変化と連関させる最初のものであり、かつ長期アスベスト曝露と関連した遺伝子発現の変化を分析する最初のものである。当該結果は、アスベスト曝露とｍｉＲ−１５／１０７ファミリー発現の間の直接的な連関を提供し、したがってこれらがＭＰＭ進行における早期のかつ重要な変化であるかもしれないことを示唆している。
【００６５】
（実施例３）
（ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの置換はインビトロでのＭＰＭ細胞の増殖阻害をもたらす）
ＭＰＭ細胞増殖に及ぼすｍｉＲ−１５／１０７ファミリーメンバーを回復させる効果を測定するために、ＭＰＭ細胞系をマイクロＲＮＡ摸倣体でトランスフェクトし、細胞増殖に及ぼす効果を測定した。摸倣体は、成熟型ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１５ａまたはｍｉＲ−１５の配列に対応する二本鎖ＲＮＡあるいはｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの共通配列に対応する合成配列からなり、ＨＰＬＣ精製した凍結乾燥した二重鎖として提供された（Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＧｅｎｅＰｈａｒｍａ）。摸倣体を水中で２０μＭの濃度で再懸濁した。次に、これらを細胞へと、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（「ＬＲＭ」、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を示された濃度で使用して細胞中へと逆トランスフェクトした。第一に、無血清培地中の適切な濃度の摸倣体を等容積の無血清培地中の１％ＬＲＭ溶液と混合して、室温で２０〜１２０分間インキュベートすることによってリポプレックスを生成した。多穴プレートを複製するようリポプレックスを分配し、懸濁液（１０％ＦＣＳ含有培地）中の細胞を各ウェル中のリポプレックス混合物へ添加し、それにより細胞の最終密度は７５００個／ｃｍ２となるようにした。トランスフェクションを２４時間進行させておいた後、培地を１０％ＦＣＳ含有の新鮮培地と交換し、細胞をさらに３７℃で収集時までインキュベートした。その後、複製プレートをトランスフェクション４８、７２、９６および１２０時間後に収集し、これは培地を除去することおよび−８０℃でプレートを凍結させることを包含した。実験の終了時に、プレートを融解し、０．０１％ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを含有する１５０μｌの溶解緩衝液を各ウェルへ添加し、ＤＮＡ含有量を測定した。暗所で一晩インキュベーションした後、４８５ｎｍの励起および５３５ｎｍの発光に設定したＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ蛍光計において蛍光を測定することによって、ＤＮＡ含有量を定量化した。本アッセイにおける総蛍光（すなわち、ウェルあたりのＤＮＡ）は、細胞数と線形関係を示し、増殖を測定することができる。
【００６６】
図３は、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂまたはｍｉＲ−１６と配列において対応するマイクロＲＮＡ摸倣体を用いたトランスフェクション後に、４つのＭＰＭ細胞系（Ｈ２８、ＭＭ０５、Ｈ２０５２およびＭＳＴＯ）における増殖の用量依存的かつ時間依存的低下があったことを示す。正常な中皮細胞系ＭｅＴ−５Ａに及ぼすこれらの処置の効果はなかった。それゆえ、マイクロＲＮＡ発現を回復させること、およびしたがって標的遺伝子発現の制御は、特にＭＰＭ細胞の増殖の阻害を結果的に生じた。
【００６７】
ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーがＭＰＭ細胞に及ぼす効果をさらに研究するために、当該ファミリーの共通配列に対応する摸倣体を設計した。共通摸倣体を以下に示す。
【表１】
0006437930.tif 000002
【００６８】
これらの共通配列は、当該整列に含まれるマイクロＲＮＡの数に応じてさまざまであり、ｍｉＲ−１５ファミリーのみ（ｃｏｎ１５／１０７．１）から全１５／１０７ファミリー（ｃｏｎ１５／１０７．２〜４）までさまざまであった。ｃｏｎ１５／１０７．３における共通長は、いくつかのマイクロＲＮＡのより長い成熟型配列を占めるために長くなった。これら４つの共通マイクロＲＮＡを次に、種々の濃度のＭＳＴＯ細胞またはＨ２８細胞中へとトランスフェクトし、細胞増殖に及ぼす効果を先のとおり評価した。図４は、ｍｉＲ−１５／１０７共通配列を基にした摸倣体全部が天然ｍｉＲ−１６配列よりも増殖阻害性があったことを示す。このことは当該共通配列が天然ｍｉＲ−１６よりも有望な治療候補であることを示す。
【００６９】
（実施例４）
（ｍｉＲ−１６を用いたトランスフェクションは標的遺伝子を下方調節する）
マイクロＲＮＡは転写後遺伝子調節に関与する。マイクロＲＮＡの作用の主要機序は、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳の阻害を介するものであり、このことは頻繁に、標的ｍＲＮＡの脱安定化をもたらす。それゆえ、推定される標的の遺伝子発現をマイクロＲＮＡが調節する能力は、関心対象のマイクロＲＮＡの調節後の標的ｍＲＮＡ濃度を分析することによって測定することができる。この方法で調節された標的は次に、マイクロＲＮＡ摸倣体トランスフェクション後に観察される表現型効果に関与する遺伝子の候補である。タンパク質レベルでも下方調節される当該遺伝子は、マイクロＲＮＡの真の標的である見込みがより高いとみなされる。
【００７０】
ＭＰＭ細胞の細胞生物学的反応に及ぼす摸倣体のトランスフェクションの効果を連関させるために、２４個の候補ｍｉＲ−１６標的遺伝子の発現を、ｍｉＲ−１６摸倣体で処理したＭＰＭ細胞において測定した（図５）。Ｈ２８細胞およびＭＳＴＯ細胞を６穴プレートにおいて、ｍｉＲ−１６摸倣体または対照（各５ｎＭ）を用いて、実施例３について説明した方法によって逆トランスフェクトした。４８時間のトランスフェクション後、ＴｒｉＺＯＬを用いてＲＮＡを単離し、ナノ光度計（Ｉｍｐｌｅｎ、ドイツ国ミュンヘン市）を用いて定量化した。複製ウェルから、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってタンパク質を単離および定量化した。ｃＤＮＡの合成は、２５０ｎｇのＲＮＡをテンプレートとして用い、ランダムオリゴおよびオリゴｄＴからなる混合物をプライマーとして用いた。このｃＤＮＡを次に、製造元の説明書によってＢｒｉｌｌｉａｎｔ  ＩＩ  ＳＹＢＲグリーン化学反応（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）混合物を用いて、ｍｉＲ−１６の予測された標的に特異的なプライマーを用いた１０μｌの定量的ＰＣＲ反応におけるテンプレートとして用い、当該反応をＭＸ３０００ＰリアルタイムＰＣＲ機（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において実行した。定量的ＰＣＲの結果をΔΔＣｔ法によって分析し、これにより標的遺伝子発現を１８Ｓの発現に対して標準化し、摸倣体をトランスフェクトした細胞からの結果は、対照をトランスフェクトした細胞における標的の標準化された発現に対して表した。これらの結果は、１．２〜４倍に及ぶ２４個の標的における下方調節を示した。タンパク質レベルでは、ＣＣＮＤ１およびＢｃｌ−２の発現をウェスタンブロットによって分析した。タンパク質（２０μｇ）を１０％プレキャストポリアクリルアミドゲル（Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＴＧＸ  Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌｓ、Ｂｉｏｒａｄ）で分離し、Ｂｉｏｒａｄ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒａｄ、オーストラリア国ニューサウスウェールズ州）を用いてＰＶＤＦ膜へと転写した。膜を乳粉を用いてブロッキングした後、標的特異的抗体（Ｂｃｌ−２、ＣＣＮＤ１）で標識した後、ウサギまたはマウス特異的二次抗体を用いた検出を行った（抗体はすべてＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｉｎｃ製）。化学発光（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ基質キット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて当該タンパク質の存在を検出し、Ｋｏｄａｋ  Ｇｅｏｌｏｇｉｃ  ２２００画像化システムを用いて測定した。ベータアクチン（βアクチン）の発現は等量のタンパク質負荷量について制御するよう含まれていた。ＣＣＮＤ１およびＢｃｌ−２の両方のタンパク質発現は、対照と比較してｍｉＲ−１６処理細胞において有意に下方調節された（図５参照）。総合すると、ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現におけるこれらの変化は、ｍｉＲ−１６摸倣体トランスフェクションの観察された発現型効果が増殖におよびアポトーシス応答の変化に関与する遺伝子と関連していることを示す。
【００７１】
（実施例５）
（ＭＰＭ細胞におけるゲムシタビンおよびペメトレキセドの毒性に及ぼすｍｉＲ−１６の効果）
ＭＰＭは、化学療法に耐性があるとみなされており、この耐性は、腫瘍細胞のアポトーシス応答における変化と関連していると考えられる。ｍｉＲ−１５／１０７ファミリーの予測された標的の多くがこれらのプロセスと関連した遺伝子であるので、マイクロＲＮＡ摸倣体は、化学療法薬に対してＭＰＭ細胞を感作させることが予測され得る。このことは、ｍｉＲ−１６と薬剤ゲムシタビンおよびペメトレキセドの併用について検査された（図６）。
【００７２】
ｍｉＲ−１６発現を回復させることが薬剤毒性に及ぼす効果を検査するために、正常中皮細胞系ＭｅＴ−５Ａ（Ａ、Ｄ）および２つのＭＰＭ系であるＭＭ０５（Ｂ、Ｅ）およびＭＳＴＯ−２１１Ｈ（Ｃ、Ｆ）を、実施例３において説明したとおり、９６穴プレートにおいて、１ｎＭもしくは５ｎＭのｍｉＲ−１６（閉じた記号）または対照の摸倣体（閉じた記号）でトランスフェクトした。その後培地を２４時間後に、三つ組でアッセイされる各濃度のペメトレキセド（１．９５〜５００ｎＭ）もしくはゲムシタビン（０．６２５〜１６０ｎＭ）の連続希釈物を含有する培地と交換した。７２時間後、プレートを収集し、実施例３において説明するとおり、ＤＮＡ含有量を測定した。薬剤へ曝露された細胞の増殖を未処理の細胞に対して標準化し、増殖を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０値）を測定した。ｍｉＲ−１６が薬剤感度に及ぼす効果は、摸倣体および対照をトランスフェクトした細胞におけるＩＣ５０値を比較することによって判定した。このことは図６に示されており、図６は、ＭＭ０５細胞（Ｂ、Ｅ）およびＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞（Ｃ、Ｆ）の両薬剤に対する用量依存的な２〜５倍の感作を示すが、正常ＭｅＴ−５Ａ細胞（Ａ、Ｄ）には効果がないことを示す。
【００７３】
（実施例６）
（ＶｅｃｔＥＤＶｍｉＲ−１６として送達される、インビボでのＭＰＭにおけるｍｉＲ−１６交換の効果）
【００７４】
癌における腫瘍抑制因子マイクロＲＮＡの喪失した発現の回復の際に観察される増殖（および他の）阻害効果は、当該マイクロＲＮＡが新規の治療標的を表していることを示唆する。この可能性を研究するために、このことは、前臨床マウスモデルにおいて検査しなければならない。しかしながら、インビボ状況においてこれらのインビトロ効果を再現するために、マイクロＲＮＡ摸倣体は、治療効果を有する腫瘍内の細胞への送達を制限するハードルを克服しなければならない。ここで、ｍｉＲ−１６または共通摸倣体の送達は、標的化されたミニ細胞アプローチを用いた。ミニ細胞は、米国特許公報第２０１１／０１１１０４１号に対する参照において先に開示したように、細菌の非同期分割に由来するナノ粒子である。
【００７５】
ｍｉＲ−１６の回復のインビボでの効力をヌードマウスにおけるＭＰＭの皮下ヒト異種移植モデルにおいて評価した（図７および図８）。無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）マウス（４〜６週齢）をＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ（西オーストラリア州パース市）から購入し、動物実験はすべて、Ｓｙｄｎｅｙ  Ｌｏｃａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｄｉｓｔｒｉｃｔｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、ＣｏｎｃｏｒｄおよびＲＰＡＨによって認可された。ＭＳＴＯ細胞を培養し、５０μｌの増殖因子低減マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに５０μｌの無血清培地における１．５×１０６個の細胞を、肩甲骨間に皮下的に注射した。腫瘍の体積（ｍｍ３）は、示された日に記載されるように、長さ（ｌ）および幅（ｗ）を測定して体積（Ｖ＝ｌｗ２／２）を算出することによって測定した。実験的処置および対照処置は、腫瘍の体積が平均約１００ｍｍ３になったら実施し、この時、腫瘍量は、腫瘍の摘出および組織学的検査の後に測定されるように、明確に触知できかつ血管新生化していた。マウスを異なる群へと無作為化した後、種々の処置を開始した。腫瘍体積測定はすべて、投与される処置に対して盲検の研究者によって実施された。
【００７６】
３つの実験を実施した。第一の実験において、マウスを１×１０９個のｍｉＲ−１６含有ミニ細胞または対照含有ミニ細胞の示される用量で示される日に、１週間につき１、２または４回処置した（図７）。対照マウス（生理塩類溶液または空のミニ細胞で処置）における腫瘍は、本実験の時間経過において１００ｍｍ３から４００ｍｍ３まで増大した。ｍｉＲ−１６摸倣体を受けているマウスにおける腫瘍はより緩徐に発達し、効果は処置数に依った。週１回用量を受けている腫瘍保持マウスは、対照処置マウスにおける腫瘍よりも緩徐に発達する腫瘍を有しており、この発達の阻害は３０日後まで維持され、この時点でこれらの腫瘍の大きさは対照の腫瘍の大きさと類似していた。週２回用量を受けているマウスは、３３日後の実験終了時までにおよそ２００ｍｍ３まで大きさが増大する腫瘍を有しており、対照のミニ細胞をずっと受けているマウスにおける腫瘍よりもかなり小さかった。週４回処置したマウスは、ｍｉＲ−１６摸倣体の初回投与後の第一の週について大きさが増大しない腫瘍を有していた。本実験の終了までに、これらの腫瘍は、大きさが１７０ｍｍ３までしか増大せず、対照と比較した場合の発達の７５％阻害に相当した。
【００７７】
第二の実験において、マウスを、ｍｉＲ−１６または対照を負荷した２×１０９個の用量のミニ細胞で週４回処置した（図７）。本実験において、対照ミニ細胞で処置したマウスにおける腫瘍は、用量の半分を受ける第一の実験における速度に匹敵する速度で発達した。ｍｉＲ−１６の増加させた用量を受けているマウスにおいて、ｍｉＲ−１６摸倣体の抗腫瘍効果の顕著な亢進があった。処置後の初期段階において、これらの腫瘍の体積は、１００ｍｍ３の開始時点から減少した。そこから、腫瘍の体積は約８０ｍｍ３に留まり、２６日後の処置の休止後および２９日後の本実験の終了後にわずかな増大があったにもかかわらず、１００ｍｍ３を下回ったままであった。このことは、生理塩類溶液および対照で処置した群と比較して、これらのｍｉＲ−１６で処置した動物における腫瘍の発達の完全な阻害に相当する。
【００７８】
第三の実験において、マウスを、ｃｏｎ１５／１０７．２摸倣体または対照を負荷した１×１０９個の用量のミニ細胞で週４回処置し、処置は、腫瘍が平均１００ｍｍ３に到達すると開始した（図８）。本実験において、対照のミニ細胞で処置したマウスにおける腫瘍は、第一の実験と類似の速度で発達し、生理塩類溶液で処置したマウスにおける腫瘍と比較して発達がわずかに低下した。ｃｏｎ１５／１０７．２摸倣体を受けているマウスにおいて、明らかな抗腫瘍効果があった。８回の処置に相当する本実験の最初の１０日間で、腫瘍の体積は、１００ｍｍ３という初回の大きさを下回っていた。その後、腫瘍の体積は、生理塩類溶液処置したマウスおよび対照処置したマウスにおけるそれぞれ２５０ｍｍ３および２２５ｍｍ３と比較して、本実験の終了までに約１５０ｍｍ３まで徐々に増大した。
【００７９】
ＶｅｃｔＥＤＶｍｉＲ−１６またはＶｅｃｔＥＤＶｃｏｎ１５／１０７．２の投与後のマウスにおいて観察されるＭＳＴＯ−２１１Ｈ由来の異種移植片腫瘍の発達の阻害は非常に強く、かつ同じ（および他の）ＭＰＭ細胞の培養物におけるインビトロで観察される阻害を超過する（図３を図７および図８と比較されたい。）。このことは、インビトロで細胞の９５％超がｍｉＲ摸倣体でトランスフェクトされるのに対し、インビボで当該摸倣体を受けている腫瘍細胞の数が１０％以下となりそうであるという事実を考慮すると、驚くべきことである。
【００８０】
観察された効果は、ｍｉＲ−１６（および他のファミリーメンバー）が内皮細胞に及ぼす阻害効果に起因し、それにより腫瘍細胞および、腫瘍の発達に必要な血管新生に関与する間質細胞の両方を有効に標的にすると考えられる。皮下異種移植片モデルにおける摸倣体処置の発達阻害効果は、同じモデルにおける他の全身処置について報告された効果よりも大きい。
【００８１】
本発明は、記載された目的および利点ならびに本発明に固有の目的および利点を達成するのに十分適している。先に開示した詳細な実施形態は、本発明が、本明細書の教示の利点を有する当該技術分野の当業者に対して明らかである、異なるが等価の様式で改変および実施され得るので、説明であるに過ぎない。さらに、以下の特許請求の範囲に説明される以外に、本明細書に示される構造の詳細に対しても設計の詳細に対しても制限は何ら意図していない。それゆえ、先に開示した詳細な実例となる実施形態を変更または改変してもよく、ならびに、このような変法がすべて本発明の範囲および精神内と見なされることは明白である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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