(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィロウイルスの宿主細胞への侵入過程におけるウイルス粒子のエンベロープ膜と宿主細胞のエンドソーム膜との膜融合過程を特異的に阻害する有効成分をスクリーニングする方法であって、
フィロウイルスの宿主細胞の細胞表面上のT-cell immunoglobulin and Mucin domain 1（TIM-1）と、宿主細胞のエンドソーム膜上タンパク質の１つであるNiemann-Pick C1（NPC1）との相互作用の阻害剤を特異的に検出する、前記方法。
【請求項２】
当該阻害剤によるTIM-1とNPC1との相互作用に対する阻害効果を定量的に評価することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
蛍光タンパク質再構成法（BiFC assay）を活用することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
NPC1のC末端に蛍光タンパク質であるmonomeric Kusabira-Green (mKG)のN末端断片mKG(N)を融合したNPC-1-mKG(N)融合タンパク質、およびTIM-1のC末端にmKGのC末端断片mKG(C)を融合したTIM-1-1mKG(C)融合タンパク質を細胞内で共発現させる系を活用することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
TIM-1およびNPC1がいずれも哺乳動物由来のタンパク質であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
TIM-1およびNPC1がいずれも霊長類由来のタンパク質であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
TIM-1およびNPC1がいずれもアフリカミドリザル由来のタンパク質であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，フィロウイルス感染に係る新たなメカニズムを開示するとともに、それを活用した新規なフィロウイルス感染阻害剤のスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィロウイルスはヒトを含む霊長類に感染し、極めて高い致死率を伴う重篤な出血熱を引き起こすマイナス一本鎖RNAを遺伝子とするウイルスであり、エボラウイルスおよびマールブルクウイルスが属する。フィロウイルスは中央アフリカ中央部ならびに西アフリカにおいて散発的な集団感染を引き起こし、この10年間で、感染による死亡者が約2000人と報告されている（各集団感染における死亡数はそれほど多くないため、1976年に発見されてから今までの総死亡数は3100人）。特に、2014年に勃発した集団感染は現在も継続しており、死亡者は現在のところ4000人を超え、世界保健機構からは最悪のケースにおいては死亡者が2万人に達する可能性も示されている。また、米国CDCは、2015年1月20日までに55万〜140万人の感染の恐れありとしている。フィロウイルスの集団感染は現時点においてアフリカに限定されているが、昨今の世界的な交通網の発達により将来的に我が国において集団感染が勃発する可能性は否定できない。さらに、現時点においてフィロウイルス感染に対する有効な予防・治療薬は実用化されていない。抗フィロウイルス薬の開発において、宿主細胞への侵入過程は特異的な標的の１つと成りうる。フィロウイルスの増殖を伴う作業には最高度安全実験施設（BSL4）を必要とすることから、従来、抗フィロウイルス薬のスクリーニングには、水疱性口内炎ウイルスやレトロウイルスを基盤としたシュードタイプウイルスの系が用いられていた（非特許文献１）。しかしながら、このアッセイ系はシュードタイプウイルスがコードするレポーター遺伝子の発現を評価する方法であるため、ウイルスの侵入過程を構成する、細胞表面への吸着、エンドサイトーシスの誘導、エンドソーム輸送、膜融合のどの過程を阻害するのかを特定することは出来ない。
【０００３】
一方、これまで、フィロウイルスの宿主細胞への侵入において関与する宿主因子として、細胞表面への吸着に関与する宿主因子の１つであるT-cell immunoglobulin and Mucin domain 1（TIM-1）等複数の受容体が報告されてきた（非特許文献２）。また、ウイルス粒子のエンベロープとエンドソーム膜との膜融合に必須であるNiemann-Pick C1（NPC1）（非特許文献３，４）等が同定されていたが、それらが直接的に何らかの相互作用を有するのか、または、更に別な因子が絡んで相互作用を発揮するのか等に関しては、一切解明されていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94, 14764-14769 (1997).
【非特許文献２】Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 8426-8431 (2011).
【非特許文献３】Nature 477, 344-348 (2011).
【非特許文献４】Nature 477, 340-343 (2011).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
高度に安全管理された施設を使用しないでも、フィロウイルスの感染を抑制する有効な薬剤を見出せるような簡便なスクリーニング系を提供するとともに、当該抗フィルウイルス剤の、フィロウイルス感受性細胞への侵入過程を解析する新たな方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
これまで、フィロウイルスの宿主細胞への侵入において関与する宿主因子として、細胞表面への吸着に関与する宿主因子の１つであるTIM-1と、ウイルス粒子のエンベロープとエンドソーム膜との膜融合に必須であるNPC1が同定されていた。我々は、蛍光タンパク質再構成法を基盤とした細胞内でのTIM-1およびNPC1の相互作用を定量化するアッセイ法を開発し、これを用いて、フィロウイルスがTIM-1を介して細胞表面に吸着した後、TIM-1と共に細胞内に取り込まれ、後期エンドソーム/リソソームにおいてTIM-1とNPC1との相互作用を経て膜融合が生じることを明らかにした。当該アッセイ法を応用することで、フィロウイルス感染における膜融合過程を特異的に阻害する低分子化合物のハイスループットスクリーニングに展開することが可能となり、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下［１］〜［８］に記載するフィロウイルスの感染を抑制する有効な薬剤を見出せるような簡便なスクリーニング系を提供するとともに、当該抗フィルウイルス剤の、フィロウイルス感受性細胞への侵入過程を解析する新たな方法を提供する。
［１］フィロウイルスの宿主細胞への侵入過程におけるウイルス粒子のエンベロープ膜と宿主細胞のエンドソーム膜との膜融合過程を特異的に阻害する有効成分をスクリーニングする方法で、
フィロウイルスの宿主細胞の細胞表面上の受容体の１つと、宿主細胞のエンドソーム膜上タンパク質の１つであるNiemann-Pick C1（NPC1）との相互作用の阻害剤を特異的に検出する方法。
［２］［１］に記載の方法で、フィロウイルスの宿主細胞の細胞表面上の受容体がT-cell immunoglobulin and Mucin domain 1（TIM-1）である、
相互作用阻害剤の特異的なスクリーニング方法。
［３］［２］に記載のスクリーニング方法が、当該阻害剤によるTIM-1とNPC1との相互作用に対する阻害効果を定量的に評価する方法。
［４］［３］に記載の方法が、蛍光タンパク質再構成法（BiFC assay）を活用する方法。
［５］［４］に記載の方法が、NPC1のC末端に蛍光タンパク質であるmonomeric Kusabira-Green (mKG)のN末端断片mKG(N)を融合したNPC-1-mKG(N)融合タンパク質、およびTIM-1のC末端にmKGのC末端断片mKG(C)を融合したTIM-1-1mKG(C)融合タンパク質を細胞内で共発現させる系を活用する方法。
［６］［１］〜［５］において、TIM-1およびNPC1がいずれも哺乳動物由来のタンパク質である評価方法。
［７］［１］〜［５］において、TIM-1およびNPC1がいずれも霊長類由来のタンパク質である評価方法。
［８］［１］〜［５］において、TIM-1およびNPC1がいずれもアフリカミドリザル由来のタンパク質である評価方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、フィロウイルスの感染を抑制する有効な薬剤を見出せるような簡便なスクリーニング系を提供するとともに、当該抗フィルウイルス剤の、フィロウイルス感受性細胞への侵入過程を解析する新たな方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Varo-E6由来TIM-1のIgVドメインを認識するモノクローナル抗体M224/1が各種フィロウイルス感染に阻害効果を示す図である。A : Vero-E6由来野生型TIM-1（WT）およびIgVドメイン欠損変異体（ΔIgV）の模式図。（SP:シグナルペプチド、TM:膜貫通領域、CT:細胞質テイル領域）。B : M224/1抗体の各種フィロウイルス感染に対する阻害効果。M224/1抗体を種々の濃度（0, 1, 10, 100 μM）で30分間前処理したVero-E6細胞に、各種フィロウイルス[Zaire株(EBOV)、Sudan株(SUDV)、Tai Forest株(TAFV)、Bundibugyo株(BDBV)、Reston株(RESTV)、Marburgvirus (MARV)]をM224/1抗体存在下で感染させ、ウイルス抗原の免疫染色をGPとNP抗体の混合物で行い、M224/1抗体未処理の際のウイルス感染を100%とした際の感染効率を測定した（Virus research 176, 83-90 (2013)）。同様の実験を３回行い、平均値と標準偏差値を示した。C : M224/1抗体の各種フィロウイルスGPを有するVSVシュードウイルス感染に対する阻害効果。M224/1抗体を種々の濃度（0, 0.1, 1, 10μM）で30分間前処理したVero-E6細胞に、各種フィロウイルス由来GP[EBOV、SUDV、TAFV、BDBV、RESTV、MARV (Angola株), MARV (Musoke株)、Llovirus (LLOV)] を有するVSVシュードタイプウイルスを抗体存在下で感染させ、シュードウイルスにコードされたGFP遺伝子のタンパク質発現量を指標に感染効率を定量した。同様の実験を３回行い、平均値と標準偏差値を示した。
【図２】エボラウイルス様粒子(VLP)の膜融合におけるM224/1抗体の阻害効果を示す図である。A : M224/1抗体がVLPの細胞への取込みに与える影響。M224/1抗体、エンドソームの酸性化を阻害するNH4Cl、またはエボラウイルスの取込みに関与するマクロピノサイトーシスの阻害剤であるEIPA存在下で、DiI標識VLPをVero-E6細胞に30分室温で吸着させた後、37℃で30分間インキュベートし、細胞に取込まれたDiIシグナルを共焦点レーザー顕微鏡を用いて検出し、画像解析ソフトウエアを用いて1細胞当たりのDiIシグナル数（VLP数）をそれぞれ定量した。同様の実験を３回行い、平均値と標準偏差値を示した。また、有意差についてt検定を行い、p値を示した （**: p＜0.01）。B : M224/1抗体がVLPの膜融合に与える影響（DiIシグナルのサイズ）。M224/1抗体、またはNH4Cl存在下で、後期エンドソーム/リソソームマーカーであるRab7のGFP融合タンパク質(eGFP-Rab7)を発現したVero-E6細胞にDiI-VLPを取り込ませ、37℃で5時間インキュベーション後、共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析した。本実験で取得した画像について画像解析ソフトを用いて細胞内のDiIシグナルのサイズを定量した。その結果、M224/1抗体およびNH4Clを処理した場合において、有意なサイズの減少が認められた。同様の実験を３回行い、平均値と標準偏差値を示した。また、有意差についてt検定を行い、p値を示した （**: p＜0.01）。C : M224/1抗体がVLPの膜融合に与える影響（DiIシグナルの蛍光強度）。同様に画像解析ソフトを用いて細胞内のDiIシグナルの平均蛍光強度を定量した。同様の実験を３回行い、平均値と標準偏差値を示した。また、有意差についてt検定を行い、p値を示した (*: p＜0.05)。
【図３】哺乳類細胞におけるTIM-1とNPC1の相互作用を示す図である。293T細胞に強制発現したTIM-1とNPC1の相互作用。293T細胞にFLAGタグを連結したVero-E6由来TIM-1 (TIM1-FLAG)および／またはHAタグを連結したNPC1(NPC1-HA)を強制発現し、抗FLAG抗体（α-FLAG; 左パネル)ならびに抗HA抗体（α-HA; 右パネル)を用いてそれぞれ免疫沈降した。それらをそれぞれ抗HA抗体または抗FLAG抗体でイムノブロッテイング（IB）することにより、当該免疫降物（IP）に含まれるNPC1-HA（左）またはTIM1-FLAG（右）の存在をそれぞれ確認した。尚、WCE（whole cell extact）の図は、細胞の可溶化画分に含まれるNPC1-HAとTIM1-FLAGをそれぞれ示す。
【図４】蛍光タンパク質再構成法（BiFC assay）を用いたTIM-1とNPC1の細胞内における相互作用の定量法、ならびにM224/1抗体のTIM-1およびNPC1の相互作用に対する阻害作用を示す図である。A : 蛍光タンパク質再構成法を用いたVero-E6細胞由来のTIM-1とNPC1の細胞内における相互作用の定量法の原理。NPC1のC末端に蛍光タンパク質であるmonomeric Kusabira-Green (mKG)のN末端断片がリンカーを介して融合した融合タンパク質[NPC-1-mKG(N)]、mKGのN末端断片にリンカーが結合した融合タンパク質 [mKG(N)]、TIM-1のC末端にmKGのC末端断片がリンカーを介して融合した融合タンパク質 [TIM-1-mKG(C)]、およびmKGのC末端断片にリンカーが結合した融合タンパク質 [mKG(C)]を、それぞれ模式的に示した図である。B：蛍光タンパク質再構成法を用いたVero-E6細胞由来TIM-1とNPC1の細胞内における相互作用。293T細胞にNPC-1-mKG(N)およびmKG(C)（左)、mKG(N)およびTIM-1-1mKG(C)（中)、ならびにNPC-1-mKG(N)およびTIM-1-1mKG(C)（右)の発現プラスミドをそれぞれ形質導入し、24時間後に再構成されたmKGの発現量をフローサイトメトリーで解析した。目的のプラスミドが形質導入された細胞をオープン・ヒストグラムで、空のベクター・ペアーが形質導入されたコントロール細胞をクローズド・ヒストグラム（図中グレー部分）でそれぞれ表示した。C：M224/1抗体がVero-E6細胞由来TIM-1とNPC1の相互作用に与える影響。293T細胞にNPC-1-mKG(N)およびTIM-1-1mKG(C)発現プラスミドを共に形質導入8時間後、0、100、1,000、および3,000μMのM224/1抗体を添加し、さらに16時間倍養後、再構築されたmKGの局在を共焦点レーザー顕微鏡で解析した。また、同様の実験を行い、mKGの発現量をフローサイトメトリーで解析。抗体未処理の場合を100％として、M224/1抗体各濃度での阻害率を求めた。同様の実験を4回繰り返し、平均値と標準偏差値を示した。また、有意差についてt検定を行い、p値を示した （**: p＜0.01）。
【図５】エボラウイルスの膜融合におけるTIM-1およびNPC1との相互作用の役割を示す図である。A及びB：293T細胞にNPC-1-mKG(N)およびTIM-1-1mKG(C)発現プラスミドを共に形質導入し、24時間後にDiI標識VLPを取り込ませて、左列パネルにはDiI-VLP（赤色)の細胞内局在を、中列パネルにはmKG（緑色）の細胞内局在を、および右列パネルには両者を統合した場合の細胞内局在[DiI-VLPとmKGの共局在(黄色)]を、共焦点レーザー顕微鏡で解析した結果をそれぞれ示す。核はDAPIによって染色した(青)。下段（B）は、上段（A）を拡大した図。（上段、下段ともにパネル中のスケールバーは、 20μm。）
【図６】エボラウイルスの膜融合におけるTIM-1およびNPC1との相互作用の役割を示す仮説モデル図である。生体内に侵入したフィロウイルスは、(1)ウイルス粒子のエンベロープに存在するフォスファチジルセリン(PTdSer)とTIM-1との相互作用を介して細胞表面に吸着(Attachment)し、マクロピノサイトーシス(Macropinocytosis)によってTIM-1と共に初期エンドソーム内に取り込まれる。その後期エンドソームが成熟し、(2) エンドソーム内の酵素によってプロセッシング(Processing)を受けたGPとTIM-1複合体が、(3)NPC1とさらに相互作用することで、ウイルス粒子のエンベロープとエンドソームとの膜融合(membrane fusion)が起こり、ヌクレオカプシド（RNP）が細胞質内に放出されるという仮説モデルが示唆された。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書において、本発明に関連して用いられる科学用語および専門用語は、通常の当業者により一般に理解される意味を有する。さらに、文脈により別に必要とされない限り、単数用語は複数を含み、複数用語は単数を含む。一般に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、生化学、分子生物学、免疫学、微生物学、細胞生物学、遺伝学およびタンパク質と核酸化学ならびにハイブリダイゼーションの技術に関連して用いられる命名法は、当該分野で周知であり、かつ一般に使用されているものである。
【００１１】
本発明は、フィロウイルス特異的な感染阻害剤を見出せるような簡便なスクリーニング系を提供するとともに、当該抗フィルウイルス剤の、フィロウイルス感受性細胞への侵入過程を解析する新たな方法を提供するものである。
【００１２】
フィロウイルスはヒトを含む霊長類に感染し、極めて高い致死率を伴う重篤な出血熱を引き起こすマイナス１本鎖RNAを遺伝子とするウイルスである。当該フィロウイルス科（family）は、エボラウイルス属、マールブルクウイルス属、およびクエバウイルス（Cuevavirus）属から成り、エボラウイルス属にはザイールエボラウイルス（Zaire ebolavirus；EBOVと略す。）、スーダンエボラウイルス（Sudan ebolavirus；SUDVと略す。）、タイフォレストエボラウイルス（Tai Forest ebolavirus；TAFVと略す。）、ブンディブギョエボラウイルス（Bundibugyo ebolavirus；BDBVと略す。）、レストンエボラウイルス（Reston ebolavirus；RESTVと略す。）の5種が、マールブルクウイルス属にはマールブルクマールブルクウイルス（Marburg marburgvirus；MARVと略す。）が、クエバウイルス属にはLloviu cuevavirus（LLOVと略す。）等が含まれる。
フィロウイルス粒子は、一般に、糖タンパク質（GP）、核タンパク質（NP）、複数のウイルス蛋白質（VP24、VP30、VP35、およびVP40）、およびRNA依存的RNAポリメラーゼからなる7種のタンパク質から構成されている。エンベロープGPがウイルス表面の唯一のタンパク質であり、当該ウイルス粒子の宿主細胞膜上の受容体（リセプター）との結合、および細胞への侵入過程でのエンドソーム膜との膜融合の際に重要な役割を果たす。
特に、EBOV  GPに関しては、宿主細胞表面の膜に埋め込まれたC型レクチン（例えば、DC-SIGN）との相互作用が知られている。ウイルス粒子は、C型レクチンのような細胞表面上の受容体に結合後、マイクロピノサイトーシスによって細胞内のエンドソームに取り込まれる。そのウイルス粒子を含んだ小胞（vesicle）が後期エンドソーム／リソソームに成熟すると、GPはシステインプロテアーゼによってプロセッシングを受け開裂しNPCIとの結合領域が展開され、エンドソーム膜上のNPC1と結合、膜融合が起こると考えられている。
【００１３】
NPC1は、大きなコレステロール移送タンパク質であり（Science, 1997; 277 p228）、後期エンドソーム／リソソームの膜上に存在し、フィロウイルスの細胞内侵入過程において膜融合に関与するタンパク質であると考えられている（Nature, 2011; 477(7364) p340）。一方、TIM-1は、A型肝炎ウイルスの受容体（レセプター1：HAVcr-1）として知られているT細胞の膜タンパク質である（Nature Immunol. 6, 447−454 (2005)）。フィロウイルスの感染においては、TIM-1はウイルス粒子のエンベロープ上のフォスファチジルセリン（PtdSer）と直接的な相互作用を示し、GPとは無関係にウイルス粒子と宿主細胞の接着を起こす受容体として機能することが示されている（J Immunol. 2010 Feb 15; 184(4): 1918-30.）。更に、フィロウイルス等のTIM-1は、宿主細胞への接着のみならず感染の増幅にも関与することが示されている（PLoS pathogens 9, e1003232 (2013)）。
【００１４】
本明細書では種々の抗体が使用されるが、使用される「抗体」という用語は、各種ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはそのFab断片等の抗原結合性断片のいずれかまたはそれらを複数種含むものである。原則、ポリクローナル抗体は複数種類の抗原部位（エピトープ）と結合することが可能で、モノクローナル抗体は1種の抗原部位とのみ結合する。また、一般にモノクローナル抗体（IgG）は、同一分子内に2個の抗原結合部位を有するが、そのFab断片の抗原結合部位は、1個のみである。ちなみに、本発明で使用する抗TIM-1モノクローナル抗体M224/1（北海道大学グローバルCOEプログラム、2011年度 PD・RA研究成果発表会、Programme & Abstract参照；http://www.vetmed.hokudai.ac.jp/gcoe/pdf/Program_120307.pdf#search='Ebola++M224%2F1'）は、マウス由来のモノクローナル抗体で、フォルマリン固定したVero-E6細胞を用いて5週齢の雌BALB/cマウスを感作、得られた脾臓細胞をマウスミエロ−マ細胞を用いてハイブリドーマを作成、Vero-E6由来野生型TIM-1(WT)と結合する抗体産生クローンを常法により選択、産生されたものである。当該抗体の精製には、例えばポリAを用いたアフィニティー・クロマトグラフィー等を活用して高純度の抗体を得ることが出来る。また、そのFab断片もパパイン処理等のFab断片を作製する常法に従って調製できる。
【００１５】
ところで、NPC1およびTIM-1タンパク質の各種哺乳動物でのアミノ酸配列は、多くの動物種で解析されており、GenBankのwebsite（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/）等を検索ことによって情報を得ることが出来る。例えば、NPC1タンパクのアミノ酸配列に関しては、ヒト由来の場合はUniProtKB/Swiss-Prot: Accession No. O15118およびGenBank: Accession No. AAB63982を、アフリカミドリザル由来の場合NCBI Reference Sequence: Accession No. XP_007972965を、マウス由来の場合UniProtKB/Swiss-Prot: Accession No. O35604およびGenBank: Accession No. AAB63372等を参照することにより配列情報などを得ることが出来る。また、TIM-1タンパクにおいては、ヒト由来の場合はGenBank: Accession No. AFO66592やUniProtKB/Swiss-Prot: Accession No. Q96D42を、アフリカミドリザル由来の場合はUniProtKB/Swiss-Prot: Accession No. O46598を、更に、マウス由来の場合はUniProtKB/Swiss-Prot: Accession No. Q5QNS5等を参照することにより情報を得ることが出来る。TIM-1以外のフィルイウルス感染に関与する膜タンパク質に関しても同様である。また、それらをコードするヌクレオチド配列に関しても同様にGenBank等に開示されている。本発明での実施例では、限られた動物種由来のタンパク質を用いて実施しているのみであるが、当業者においては、これらの公知情報および周知の遺伝子工学的手法、ならびに、本発明で開示した方法を活用して他の哺乳動物種のNPC1およびTIM-1等で同様な評価系を作製することは容易である。従って、それら各種哺乳動物種由来のNPC1およびTIM-1等を用いて、それらの相互作用に対する阻害剤を評価する方法は、いずれも本発明に含まれるものである。尚、本発明の実施例で使用したTIM-1およびNPC1はいずれもアフリカミドリザル由来のタンパク質で、それらのアミノ酸配列は、それぞれUniProtKB/Swiss-Prot: Accession No. O46598、およびNCBI Reference Sequence: Accession No. XP_007972965に開示されている。
【００１６】
本発明は、フィロウイルス感染における膜融合過程を特異的に阻害する化合物を見出す方法を提供することであるが、それには2種類のタンパク質の相互作用を解析する方法を利用する。タンパク質間の相互作用（protein-protein interaction; PPI）を検出する方法としては、2つの分子が結合して初めて活性を示すことを利用する方法（two-hybrid法）、免疫沈降法により相互作用を有するタンパク質の複合体を回収する方法（共免役沈降法）、相互作用を有するタンパク質にそれぞれタグをつけておく方法（プルダウン・アッセイ）、蛍光相関分光法（FCS）、免疫染色法や、蛍光タンパク質再構成法（bimolecular fluorescence complementation assay ; BiFC）、FRET法（WO2013/141372）等、多数の方法が知られている。本発明では、免疫染色法、共免役沈降法以外に、対象となる2種のタンパク質にFLAGタグまたはHAタグをそれぞれ結合させた融合タンパクを免疫染色で検出する方法（PLoS Pathog. 2011 Jun;7(6):e1002067.）、および、monomeric Kusabira-Green (mKG)のN末端断片[mKG(N)]またはC末断片[mKG(C)]をそれそれ2種のタンパク質に融合させた融合タンパク質を用いる方法（Molecular Cell, (2002),789-798）を活用した実施例を示すが、本発明はそれらに限定されない。2種のタンパク質分子の細胞内での相互作用を解析できる方法であれば、上記方法に以外であれども本発明の範疇に含まれる。
【００１７】
さらに、フィロウイルスの細胞への吸着・膜融合には、TIM-1に加えてC型レクチンやAxl等の様々な宿主因子が寄与することを示唆するデータもあり（データ未表示）、本発明は、将来的にそれら各種因子とNPC1との相互作用が関与するフィロウイルス侵入効率を評価するアッセイ系へと展開することが期待される。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
モノクローナル抗体M224/1の各種フィロウイルス感染に対する阻害効果
図１に、Vero-E6由来TIM-1のIgVドメインを認識するモノクローナル抗体M224/1の各種フィロウイルス感染に対する阻害効果を示す。図１-Aには、Vero-E6由来野生型TIM-1(WT)とIgVドメイン欠損変異体(ΔIgV)の模式図を示した(SP:シグナルペプチド、TM:膜貫通領域、CT:細胞質テイル領域)。Vero-E6由来野生型TIM-1とIgVドメイン欠損変異体を、それぞれヒト胎児由来腎臓上皮細胞である293Tに強制発現させ、M224/1抗体およびヤギ由来抗TIM-1ポリクローナル抗体(α-TIM-1；AF1750、R&D Systems)との結合能をフローサイトメトリーで検出した。その結果、α-TIM-1は野生型TIM-1を発現した293T細胞（293T-TIM-1 WT）およびIgVドメイン欠損変異体を発現した293T細胞（293-TIM-1 ΔIgV）の両者に結合したが、M224/1抗体は、IgVドメイン欠損変異体を発現した293T細胞には結合しないことが明らかとなった（データ未表示）。図１-Bに示すように、M224/1抗体を種々の濃度（0、1、10、および100μM）で前処理したVero-E6細胞に、各種フィロウイルス（EBOV、SUDV、TAFV、BDBV、RESTV、およびMARV）を感染させた結果、濃度依存的な感染阻害が認められた。一方、対照として用いた水疱性口内炎ウイルス(VSV)の感染は阻害されず、本抗体のフィロウイルス特異性が示された。更に、M224/1抗体のFabフラグメントを種々の濃度（0、10、100、1000、および3000μM）で使用した場合も濃度依存的なエボラウイルス（EBOV）の感染阻害が認められた（データ未表示）。さらに、図１-Cに示すように、Vero-E6細胞に対する各種フィロウイルス由来GPを有するVSVシュードタイプウイルスの感染が、M224/1抗体存在下で濃度依存的に阻害された。以上の結果から、Vero-E6由来TIM-1のIgVドメインを認識するモノクローナル抗体M224/1は各種フィロウイルス感染に対して普遍的な阻害効果を示すことが明らかになった。
【実施例２】
【００２０】
エボラウイルス様粒子(VLP)の膜融合におけるM224/1抗体の阻害効果
図２にエボラウイルス様粒子(VLP)の膜融合におけるM224/1抗体の阻害効果を示す。VLPのエンベロープを脂溶性トレーサーDiI（1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanineperchlorate, Invitrogen）によって蛍光標識し、Vero-E6細胞に吸着または取り込まれたDiIシグナルを共焦点レーザー顕微鏡を用いて検出、画像解析ソフトウエアを用いて1細胞当たりのDiIシグナル数を定量した（PLoS Pathog. 2010 Sep 23;6(9):e1001121参照）。まず、M224/1抗体およびヤギ由来抗TIM-1ポリクローナル抗体（α-TIM-1）存在下でDiI標識VLPをVero-E6細胞に30分室温で吸着させた後、1細胞あたりの細胞表面に検出されたVLP数をそれぞれ定量したところ、TIM-1ポリクローナル抗体（α-TIM-1）で処理した場合と比較し、M224/1抗体で処理した場合の吸着阻害効果は著しく低いことが示された（両者の有意差についてのt検定： p値＜0.01）（データ未表示）。また、図２-Aに示すように、M224/1抗体（50μM）、エンドソームの酸性化を阻害するNH4Cl（20μM）、エボラウイルスの取込みに関与するマクロピノサイトーシスの阻害剤であるEIPA（5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride）（100μM）存在下でDiI標識VLPをVero-E6細胞に30分室温で吸着させた後、37℃で30分間インキュベートし、１細胞あたりに取り込まれたVLP数を定量したところ、M224/1抗体、もしくはEIPA処理した場合においては有意な細胞への取込み阻害がそれぞれ示された。次に、後期エンドソーム/リソソームマーカーであるRab7のGFP融合タンパク質を発現したVero-E6細胞に（PLoS Pathog. 2010 Sep 23;6(9):e1001121参照）、上記に示した方法を用いてDiI標識VLPを取り込ませ37℃で5時間インキュベート後、共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析した。その結果、M224/1抗体（50μM ）およびNH4Cl（20μM）を処理した場合においては有意なDiIシグナル（赤色）の減少が認められ、さらにそれらのケースでeGFP-Rab7 (緑色)とDiI-VLP（赤色）を統合した場合、いずれもeGFP- Rab7（緑色）部位にはDiI-VLP（赤色）が、ほとんど認められなかった。一方、コントロール（非処理群）ではeGFP-Rab7（緑色）とDiI-VLP（赤色）の両者を統合した場合黄色の発色が認められ、DiI標識したエボラウイルス様粒子(VLP)が後期エンドソーム/リソソーム様領域に局在することが示された（データ未表示）。更に、図２-Bに示すように、上記の実験で取得した画像について画像解析ソフトを用いて細胞内のDiIシグナルのサイズを定量した結果、M224/1抗体およびNH4Clを処理した場合、いずれも顕著なサイズの減少が認められた。同様に、画像解析ソフトを用いて細胞内のDiIシグナルの平均蛍光強度を定量した結果、M224/1抗体およびNH4Clを処理した場合において、有意な蛍光強度の減少が認められた（図２-C）。以上の結果から、 M224/1抗体はエボラウイルスの細胞への吸着および膜融合における阻害効果を示すが、特に膜融合に対して著しい阻害効果を示すことが明らかになった。
【実施例３】
【００２１】
哺乳類細胞におけるTIM-1とNPC1の相互作用
図３に哺乳類細胞におけるTIM-1とNPC1の相互作用を示す。
Vero-E6細胞におけるTIM-1とNPC1の局在を確認するため、一次抗体としてはヤギ由来抗TIM-1ポリクローナル抗体（α-TIM-1；AF1750、R&D Systems）およびマウス由来抗NPC1モノクローナル抗体（ab55706,  Abcam）を、二次抗体としては抗ヤギIgG/Alexa Fluor 594（Invitrogen）および抗マウスIgG/Alexa Fluor 488（Invitrogen）をそれぞれ用いて免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡で検出した。その結果（α-TIM-1で免疫染色した赤色、抗NPC1抗体で免疫染色した場合が緑色、両者が重なった部分は黄色）、いずれも細胞内の同一部位（後期エンドソーム/リソソーム様領域）で検出され、TIM-1とNPC1の両者が細胞内の後期エンドソーム/リソソーム様領域において共局在していることが明らかとなった（データ未表示）。また、293T細胞にFLAGタグを連結したVero-E6由来TIM-1およびHAタグを連結したNPC1をそれぞれ単独（293T-TIM-1または293T-NPC1）もしくは両者（293T-TIM-1/NPC1）を強制発現し、抗FLAG  M2モノクローナル抗体（Sigma）ならびに抗HA  3F10モノクローナル抗体（Roche）を用いて免疫染色法により局在を検討した。その結果（TIM-1タンパク存在部位が赤色、NPC1タンパク存在部位が緑色、および両者が共存している部分は発色を統合した画像で黄色）、両者を発現した場合においてのみ前記3種の蛍光を解析した画像で、細胞内の同一部位にそれぞれのタンパク質が検出されたことから、TIM-1とNPC1を共に発現している293T細胞においては、共局在することが判明した（データ未表示）。また図３に示すように、293T細胞にFLAGタグを連結したVero-E6由来TIM-1およびHAタグを連結したNPC1を強制発現し、前記抗FLAG抗体ならびに抗HA抗体を用いてそれぞれ免疫沈降（IP）、それらの沈降物をSDS-PAGEおよびイムノブロッテイング法（IB）で確認した結果、抗FLAG抗体で免疫沈降させた場合はIBでHAの存在が、逆に抗HA抗体で免疫沈降させた場合はIBでFLAGの存在が、それぞれの抗体で確認され、両者が細胞内で相互作用することが判明した。以上の結果から、哺乳類細胞においてTIM-1およびNPC1が相互作用することが示された。
【実施例４】
【００２２】
TIM-1とNPC1の細胞内における相互作用阻害物質の定量的解析法
図４に 蛍光タンパク質再構成法［bimolecular fluorescence complementation（BiFC) assay; Molecular Cell, (2002),789-798.参照]を用いたTIM-1とNPC1の細胞内における相互作用を定量するアッセイ法の確立、ならびに同法を用いて証明したM224/1抗体のTIM-1およびNPC1の相互作用に対する阻害作用を示す。
図４-AにTIM-1とNPC1の細胞内における相互作用の定量法の原理を示す。NPC1のC末端に蛍光タンパク質であるmonomeric Kusabira-Green (mKG)のN末端断片がリンカーを介して融合した融合タンパク質[NPC-1-mKG(N)]、mKGのN末端断片にリンカーが結合した融合タンパク質 [mKG(N)]、TIM-1のC末端にmKGのC末端断片がリンカーを介して融合した融合タンパク質 [TIM-1-mKG(C)]、およびmKGのC末端断片にリンカーが結合した融合タンパク質 [mKG(C)]の発現プラスミドをそれぞれ構築した（J Virol. 2009 Jul;83(13):6429-34.参照）。図４-Bに示すように、293T細胞にNPC-1-mKG(N)およびTIM-1-mKG(C)発現プラスミドを形質導入し、24時間後に再構成されたmKG（緑色蛍光タンパク質）の発現量をフローサイトメトリーで解析した。その結果、NPC-1-mKG(N)およびTIM-1-mKG(C)両者を発現させた際（図４-B右パネル）にのみ有意な蛍光強度の増強が認められた。また、293T細胞にNPC-1-mKG(N)およびTIM-1-mKG(C)発現プラスミドを形質導入し、24時間後に細胞内における再構築されたmKGの局在を共焦点レーザー顕微鏡で検証した。その結果、後期エンドソーム/リソソーム様領域においてmKG（緑色）の局在が認められた。さらに、293T細胞にNPC-1-mKG(N)およびTIM-1-mKG(C)発現プラスミドを形質導入8時間後、M224/1 抗体および対照の抗インフルエンザウイルス  ヘマグルチニンIgG1抗体（WZ83 59-6-1抗体）を添加し、さらに16時間倍養後、再構築されたmKGの局在を共焦点レーザー顕微鏡で検証した。その結果、M224/1抗体存在下において有意なmKG発現の減少が認められた。さらに、当該実験において種々の濃度（100、1,000、および3,000μM）のM224/1抗体で処理し、mKGの発現量をフローサイトメトリーで定量化した結果、M224/1抗体による阻害が濃度依存的であることが示された（図４-C）。即ち、蛍光タンパク質再構築法を活用したTIM-1とNPC1の細胞内における相互作用のアッセイ法を用いて、TIM-1とNPCの相互作用を阻害する物質を定量的に検出することに成功した。
【実施例５】
【００２３】
VLPの膜融合におけるTIM-1およびNPC1の相互作用の重要性
図５にDiI標識VLPの膜融合においてTIM-1およびNPC1との相互作用が重要である結果を示す。
293T細胞にNPC-1-mKG(N)およびTIM-1-mKG(C)発現プラスミドを形質導入し、24時間後にDiI標識VLPを取り込ませて、mKGとDiIの細胞内局在を共焦点レーザー顕微鏡で解析した結果を図５-Aに示す。図５-Bにはその拡大図を示した。その結果、mKG（緑色）、DiI（赤色）両者が細胞内の同一部位に存在することが示され、再構成したmKGとDiIが、後期エンドソーム/リソソーム様領域において共局在することが示された。以上の結果から、フィロウイルスの膜融合において、TIM-1およびNPC1の相互作用が重要であることが示唆された。
【００２４】
＜まとめ＞
フィロウイルス取り込みにおけるTIM-1およびNPC1との相互作用の仮説モデル
図６には、フィロウイルス取り込みにおける、TIM-1およびNPC1との相互作用の重要性に関する仮説モデルを示した。すなわち、生体内に侵入したフィロウイルスは、ウイルス粒子のエンベロープのフォスファチジルセリン（PtdSer）を介してTIM-1と吸着し、これに引き続いてマクロピノサイトーシスによって細胞内に取り込まれる。その後エンドソーム内が成熟し、システインプロテアーゼによってプロセッシングを受けたGPとTIM-1複合体がNPC1と相互作用することで膜融合が起こり、ヌクレオカプシド（RNP）が細胞質内に放出されるという仮説モデルが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明は、フィロウイルスの感染を抑制する特性の高い有効な薬剤を見出せるような簡便なスクリーニング系として利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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