(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における腎疾患を検出して治療的介入を行う決定を支援するための方法であって、前記対象から得られたサンプル中のバイオマーカーの量を測定すること及び前記バイオマーカーの量が正常対照と比べて変化しているかどうかを決定することを含み、前記バイオマーカーが、少なくともＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ及びＭＩＰ１αを含む方法。
【請求項２】
慢性腎疾患の処置の有効性を決定して治療的介入を行う決定を支援するための方法であって、そのような処置を受けている対象から得られたサンプル中のバイオマーカーの量を測定することを含み、前記バイオマーカーが少なくともＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ及びＭＩＰ１αを含み、かつ前記バイオマーカーのレベルを非処置対照に由来するサンプルと比較して、前記処置が前記バイオマーカーのレベルを変化させる効果を有していたかどうかを決定すること、又は前記バイオマーカーのレベルを処置前の前記対象から得られたサンプルと比較することを含み、処置後の慢性腎疾患のステージの後退若しくは維持又は慢性腎疾患のステージの進行の減速により前記処置が成功していることが示される、方法。
【請求項３】
前記腎疾患が慢性腎疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記慢性腎疾患がステージ１又はステージ２の慢性腎疾患である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記慢性腎疾患がステージ３の慢性腎疾患である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが、尿、血液、血漿、血清、又は唾液である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが血漿又は血清である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプル中の前記バイオマーカーの量が、前記バイオマーカーに特異的に結合する抗体の結合によって測定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオマーカーに特異的に結合する前記抗体が、検出可能に標識されている、請求
項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識が西洋ワサビペルオキシダーゼである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプル中のバイオマーカーの量が、バイオチップ・アレイ・テクノロジーを用いて測定される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＣＹＳＣ、及びＭＩＰ１αのレベルが測定される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＧＭＣＳＦ、ＣＹＳＣ、及びＭＩＰ１αのレベルが測定される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＴＮＦα、ＣＹＳＣ、及びＭＩＰ１αのレベルが測定される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、ＥＧＦ、ＦＡＢＰ１、ＩＬ８、ｓＴＮＦＲ１、ｓＴＮＦＲ２、Ｄ−ダイマー、ＮＧＡＬ、及びＭＩＰ１αのレベルが測定される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法において腎疾患をスクリーニングするためのキットであって、前記キットが、前記バイオマーカーに特異的に結合するプローブを含み、又は前記バイオマーカーのレベルを検出するためのイムノアッセイ若しくは１Ｄ若しくは２Ｄゲル電気泳動のための試薬を含む、キット。
【請求項１７】
請求項１又は１２〜１５のいずれか一項により定義される前記バイオマーカーのそれぞれに特異的に結合する抗体を含む基体を含む固体デバイス。
【請求項１８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１７に記載の固体デバイス。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載の固体デバイスを含む、対象における腎疾患をスクリーニングするための試薬。
【請求項２０】
請求項１７又は１８に記載の固体デバイスを含む、対象における慢性腎疾患をスクリーニングするための試薬。
【請求項２１】
請求項１７又は１８に記載の固体デバイスを含む、ステージ１又はステージ２の慢性腎疾患をスクリーニングするための試薬。
【請求項２２】
請求項１７又は１８に記載の固体デバイスを含む、ステージ３の慢性腎疾患をスクリーニングするための試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎疾患及びその診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎疾患とは、腎臓が血液から老廃物を濾過及び除去できない状態の一種を説明する一般的な用語である。腎疾患には２つの形態、すなわち急性腎傷害（ＡＫＩ）及び慢性腎疾患（ＣＫＤ）がある。ＣＫＤは通常、最も進行した状態を除き、非症候性である。そのため、通常、診断のために血液及び／又は尿検査が必要である。
【０００３】
腎臓病患者の予後改善機構（Kidney Disease Outcomes Quality Initiative: KDOQI）
により策定されたＣＫＤの定義は以下の通りであった：
１．構造的又は機能的異常（最も多いのは、アルブミン尿の増加、例えば、尿中アルブミン／クレアチニン比［ＵＡＣＲ］≧３０ｍｇ／ｇに基づく）によって定義される、少なくとも３ヶ月の腎障害；及び／又は
２．少なくとも３ヶ月の糸球体濾過率（ＧＦＲ）＜６０ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２。
【０００４】
このフレームワーク内で、ＫＤＯＱＩは更にＣＫＤを以下のように５つのステージに分類した：
・ステージ１：ＧＦＲ≧９０ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２の腎障害。
・ステージ２：ＧＦＲが６０〜８９ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２の腎障害。
・ステージ３：ＧＦＲが３０〜５９ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２。
・ステージ４：ＧＦＲが１５〜２９ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２。
・ステージ５：ＧＦＲ＜１５ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２又は透析若しくは移植により処置される腎不全。
【０００５】
米国では、１９９９〜２００６年の米国全国健康栄養調査（ＮＨＡＮＥＳ）の研究データによれば、２０歳以上の成人の推定１１．１パーセント（２２４０万人）がＣＫＤのステージ１〜３に罹患している。更に８０万人の米国の２０歳以上の成人がＣＫＤのステージ４に罹患しており、３０万人超がステージ５のＣＫＤに罹患しており、血液透析を受けている。
【０００６】
１９８８〜１９９４年及び１９９９〜２００４年のＮＨＡＮＥＳデータの分析から、ＣＫＤの罹患率は全てのＣＫＤステージで上昇しているが、ＣＫＤステージ３に分類される人の罹患率が特に上昇していることが示される。透析を必要とするステージ５ＣＫＤの患者数も増加している。２０１５年までに７００，０００人を超える人が末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を有すると推定されている。
【０００７】
ＣＫＤは原発性腎疾患（例えば、糸球体疾患、尿細管間質疾患、閉塞、及び多発性嚢胞腎疾患）により生じ得るが、ＣＫＤ患者の大部分において、この腎障害は糖尿病及び高血圧等のその他の医学的状態に関連している。２００８年には、ＥＳＲＤの患者を除き、ＣＫＤを有するメディケア患者の４８パーセントが糖尿病を有し、９１パーセントが高血圧を有し、４６パーセントがアテローム硬化型心疾患を有していた。ＣＫＤのその他のリスク要因としては、年齢、肥満、家族歴、及び民族が含まれる。
【０００８】
ＣＫＤは、多くの健康有害事象に関連付けられている。多くの研究により、３０〜５９ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２のＧＦＲが、死亡率、循環器疾患、骨折、骨減少、感染症、認知障害、及び虚弱のリスク増大に関連することが報告されている。同様に、タンパク尿
又はアルブミン尿の重篤度と、死亡率、ＥＳＲＤ、及び循環器疾患等の健康有害事象との間に段階的な関係があるようである。更に、ＧＦＲの低下及びアルブミン尿（又はタンパク尿）の増加による、有害事象のリスクは、独立しているようであり、掛け算的であるようである。
【０００９】
早期ＣＫＤのスクリーニングを考えるための論拠としては、ＣＫＤの高い及び上昇している罹患率、その既知のリスク要因、その多くの健康有害事象、その長い無症候期、ＣＫＤの潜在的スクリーニング検査の利用可能性、並びに早期ＣＫＤの経過を変化させ得る及び早期ＣＫＤ又はその関連する健康状態の合併症を低減し得る処置の利用可能性が含まれる。
【００１０】
いくつかの機関は既に、選択された集団におけるＣＫＤスクリーニングを推奨している。Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ（ＫＤＩＧＯ）は、高血圧、糖尿病、又は循環器疾患を有する全ての患者のスクリーニングを推奨している。米国糖尿病学会は、「専門家の合意又は臨床経験」に基づき、糖尿病を有する全成人の年１回のスクリーニングを推奨している。米国高血圧合同委員会（ＪＮＣ７）は、高血圧及び糖尿病を合わせて有する全患者の年１回のスクリーニングを推奨している。米国腎臓財団も、選択されたスクリーニングを提唱しており、高血圧又は糖尿病を有するか、腎疾患、高血圧、又は糖尿病の病歴がある主要血縁者（primary relative）を有する全成人に対する無料ＣＫＤスクリーニングのスポンサーをしている。
【００１１】
ＣＫＤのステージ１〜３のほとんどの患者において、ＧＦＲはゆっくりと低下する。しかし、低下率は個体間で異なり、多くの因子が進行に影響を与えているようである。ＣＫＤのステージ１及び２は通常無症候性に進行するので、早期ＣＫＤの検出には臨床検査が必要である。
【００１２】
いくつかの機関は、ＣＫＤ患者の腎臓の機能又は損傷の変化のモニタリングを推奨している。例えば、腎臓病患者の予後改善機構（ＫＤＯＱＩ）は、ＥＳＲＤの発症を予測するため及びＣＫＤ処置の効果を評価するために、ＣＫＤに罹患している成人の少なくとも年１回の推定ＧＦＲ測定を推奨している。ＪＮＣ７は、「腎疾患」の全患者における年１回のアルブミン尿の定量的測定を推奨している。ＫＤＯＱＩも、腎臓機能が悪化しているＣＫＤ患者のより頻繁なモニタリングを推奨している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
血清又は尿中のＣＫＤの臨床的パラメーターを測定することの重要性にもかかわらず、早期ＣＫＤを検出するため及びこの疾患の進行をモニタリングするための診断検査はほとんどない。ＧＦＲの測定は腎疾患の早期発見に充分な感度でなく、一方、尿タンパクの測定は腎疾患に特異的でなく、疾患の進行のモニタリングにも適していない。したがって、早期ＣＫＤを診断するため及び腎疾患を段階付けるための特異的で感度の高い臨床マーカー又はマーカーの組合せが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、腎疾患を診断するための方法を提供する。より具体的には、本発明は、ＣＫＤの早期診断及び段階付けのための手段を提供するバイオマーカーを提供する。
【００１５】
本発明は、対照個体に由来する血清と比べてステージ１、ステージ２、及びステージ３のＣＫＤ患者に由来する血清中で個々のバイオマーカーのレベルの変化が検出可能であるという本発明者らの驚くべき発見に基づく。対照個体に由来する血清と比べてステージ１、ステージ２、及びステージ３のＣＫＤ患者に由来する血清中においてレベルの変化が検出可能なバイオマーカーとしては、補体Ｃ３ａ（ｄｅｓ）Ａｒｇ（Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１α）、アディポネクチン（ＡＤＰＮ）、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＣＤ２６）、クレアチニン、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、シスタチンＣ（ＣＹＳＣ）、Ｄ−ダイマー、内皮増殖因子（ＥＧＦ）、Ｅセレクチン（ＥＳＥＬ）、脂肪酸結合タンパク質１（肝臓脂肪酸結合タンパク質；ＦＡＢＰ１又はＬＦＡＢＰ）、顆粒球及びマクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、細胞接着分子１（ＩＣＡＭ１）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インターロイキン１０（ＩＬ１０）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）、インターロイキン１α（ＩＬ１α）、インターロイキン１β（ＩＬ１β）、インターロイキン２（ＩＬ２）、インターロイキン４（ＩＬ４）、インターロイキン５（ＩＬ５）、インターロイキン６（ＩＬ６）、Ｌセレクチン（ＬＳＥＬ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ１）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカイン（ＮＧＡＬ）、神経特異性エノラーゼ（ＮＳＥ）、Ｐセレクチン（ＰＳＥＬ）、可溶性インターロイキン２α（ｓＩＬ２α）、可溶性インターロイキン６受容体（ｓＩＬ６Ｒ）、可溶性腫瘍壊死因子受容体１（ＳＴＮＦＲ１）、可溶性腫瘍壊死因子受容体２（ＳＴＮＦＲ２）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、並びに血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）が含まれる。 
【００１６】
第１の態様では、本発明は、対象における腎疾患を検出する方法であって、対象から得られたサンプル中のバイオマーカーの量を測定すること及びバイオマーカーの量が正常対照と比べて変化しているかどうかを決定することを含み、バイオマーカーが、Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、及びＶＣＡＭ１からなる群から選択される、方法を提供する。
【００１７】
第２の態様では、本発明は、Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、及びＶＣＡＭ１からなる群から選択されるバイオマーカーに結合する抗体を含む基体（substrate）を含む固体デバイス（solid state device）を提供する。
【００１８】
第３の態様では、本発明は、慢性腎疾患の処置の有効性を決定する方法であって、そのような処置を受けている対象から得られたサンプル中のＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、及びＶＣＡＭ１からなる群から選択されるバイオマーカーの量を測定すること並びにバイオマーカーのレベルを非処置対照由来サンプルと比較して、処置がバイオマーカーレベルを変化させる効果を有していたかどうかを決定することを含む方法を提供する。
【００１９】
第４の態様では、本発明は、慢性腎疾患の処置の有効性を決定する方法であって、そのような処置を受けている対象から得られたサンプル中のＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、
ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、及びＶＣＡＭ１からなる群から選択されるバイオマーカーの量を測定すること並びにバイオマーカーのレベルを処置前の対象から得られたサンプルと比較することを含み、処置後の慢性腎疾患のステージの後退若しくは維持又は慢性腎疾患のステージの進行の減速により処置が成功であったことが示される、方法を提供する。
【００２０】
第５の態様では、本発明は、慢性腎疾患に罹患している対象のための薬物処置プロトコールを決定する方法であって、薬物で処置された対象から採取したサンプル中のＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、及びＶＣＡＭ１からなる群から選択されるバイオマーカーのレベルを非処置対照から得られたサンプル中でのレベルと比較して薬物がバイオマーカーレベルを変化させる効果を有していたかどうかを決定すること並びに対象がステージ１、ステージ２、又はステージ３の慢性腎疾患であるかに基づいて薬物処置プロトコールを選択することを含む方法を提供する。
【００２１】
第６の態様では、本発明は、本発明の上記態様のいずれかに係る方法において腎疾患をスクリーニングするためのキットの使用であって、キットが、Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＦＡＢＰ、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、及びＶＣＡＭ１からなる群から選択されるバイオマーカーに特異的に結合するプローブ又はＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＦＡＢＰ１、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、及びＶＣＡＭ１からなる群から選択されるバイオマーカーのレベルを検出するためのイムノアッセイ若しくは１Ｄ若しくは２Ｄゲル電気泳動の試薬を含む、使用を提供する。
【００２２】
添付の図面を参照して発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】健康対照、ステージ１又はステージ２のＣＫＤに罹患している患者、及びステージ３のＣＫＤに罹患している患者から採取した血清サンプル中で測定されたＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇのレベルを要約したボックスプロットを示す図である。
【図２】健康対照、ステージ１又はステージ２のＣＫＤに罹患している患者、及びステージ３のＣＫＤに罹患している患者から採取した血清サンプル中で測定されたＭＩＰ１αのレベルを要約したボックスプロットを示す図である。
【図３】健康対照、ステージ１又はステージ２のＣＫＤに罹患している患者、及びステージ３のＣＫＤに罹患している患者から採取した血清サンプル中で測定されたＳＴＮＦＲ１のレベルを要約したボックスプロットを示す図である。
【図４】健康対照、ステージ１又はステージ２のＣＫＤに罹患している患者、及びステージ３のＣＫＤに罹患している患者から採取した血清サンプル中で測定されたＳＴＮＦＲ２のレベルを要約したボックスプロットを示す図である。
【図５】健康対照、ステージ１又はステージ２のＣＫＤに罹患している患者、及びステージ３のＣＫＤに罹患している患者から採取した血清サンプル中で測定されたＩＬ−８のレベルを要約したボックスプロットを示す図である。
【図６】健康対照、ステージ１又はステージ２のＣＫＤに罹患している患者、及びステージ３のＣＫＤに罹患している患者から採取した血清サンプル中で測定されたＥＧＦのレベルを要約したボックスプロットを示す図である。
【図７】健康対照、ステージ１又はステージ２のＣＫＤに罹患している患者、及びステージ３のＣＫＤに罹患している患者から採取した血清サンプル中で測定されたクレアチニンのレベルを要約したボックスプロットを示す図である。
【図８】各バイオマーカーを含む全組合せについて、ステージ１、ステージ２、及びステージ３の慢性腎疾患患者から対照対象が識別されるように達成された総ＡＵＣ値（aggregated AUC value）を示す図である。
【図９】各バイオマーカーを含む全組合せについて、対照対象からステージ１又はステージ２慢性腎疾患患者が識別されるように達成された総ＡＵＣ値を示す図である。
【図１０】各バイオマーカーを含む全組合せについて、対照対象からステージ３慢性腎疾患患者が識別されるように達成された総ＡＵＣ値を示す図である。
【図１１】各バイオマーカーを含む全組合せについて、全３グループの患者（対照、ステージ１／２、ステージ３）が全て識別されるように達成された総ＡＵＣ値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、患者から得られたサンプル中のＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、及びＶＣＡＭ１からなる群から選択されるバイオマーカーのレベルを決定し、そのレベルを対照と比較することにより腎疾患を検出する方法を提供する。対照と比較したサンプル中のバイオマーカーレベルの変化により、患者が腎疾患に罹患しているか又は腎疾患を発症するリスクがあることが示される。
【００２５】
本発明において、「腎疾患」という用語は、健康患者と比べた腎機能の低下を特徴とする状態又は疾患を意味すると理解される。腎疾患としては、慢性腎疾患（ＣＫＤ）、急性腎傷害（ＡＫＩ）、糖尿病性腎症、糸球体腎症、巣状糸球体硬化症、免疫複合体腎症（immune complex nephropathy）、又はループス腎炎が含まれ得る。腎疾患は、薬物誘発腎損傷又は腎臓移植片拒絶によって生じ得る。腎疾患は、ネフローゼ症候群又は腎不全として特徴付けられ得る。
【００２６】
バイオマーカーの「量（amount）」は、サンプル中のバイオマーカーの量（quantity）、発現レベル、又は濃度を指す。バイオマーカーの量は、１又は複数の他の分析物の量の割合又はパーセンテージとして表されたバイオマーカー測定値を指すこともある。１又は複数のそのような他の分析物の量は、サンプル又は状態の大部分において一定のままであり得る。例として、他の分析物は、アルブミン、β−アクチン、又は全基質タンパク質（total matrix protein）であり得る。
【００２７】
バイオマーカーの量は更に、関心のある臨床状態にとって１又は複数の他の分析物の量が何らかの生化学的意義を有することが提唱されている、その１又は複数の他の分析物の量の割合又はパーセンテージとして表されたバイオマーカー測定値を指し得る。
【００２８】
「プローブ」という用語は、標的分子に特異的に結合できる分子であって、前記特異的結合の結果、標的分子を検出することができるような分子を指す。本発明で使用され得るプローブとしては、例えば抗体、アプタマー、及びオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００２９】
「抗体」という用語は、重鎖及び軽鎖の免疫グロブリン可変ドメイン（ＶＨＳ及びＶＬＳ）の結合特性、より具体的には相補性決定領域（ＣＤＲ）の結合特性によって決定されるような標的上のエピトープを特異的に認識する免疫グロブリンを指す。多くの潜在的抗体形態が当該技術分野で知られており、複数のインタクトなモノクローナル抗体又はインタクトなモノクローナル抗体を含むポリクローナル混合物、抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、及びＦｖ断片、線状抗体  単鎖抗体、及び抗体断片を含む多重特異性抗体）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖＳ）、多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び標的上の所与のエピトープの認識に必要なドメインを含む融合タンパク質が含まれるが、これに限定されない。好ましくは、本発明の文脈における抗体への言及はモノクローナル抗体を指す。抗体は、検出を可能にするために種々の検出可能な標識、例えば、限定されるものではないが放射性核種、フルオロフォア、色素、又は例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼ等の酵素にコンジュゲートしていてもよい。
【００３０】
「アプタマー」という用語は、標的分子に特異的に結合するオリゴヌクレオチド分子又はポリペプチド分子を指す。オリゴヌクレオチドアプタマーは、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）又はデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）であり得、典型的には、オリゴヌクレオチドの短い鎖からなる。ポリペプチドアプタマーは通常、タンパク質スキャフォールドの一方の末端又は両方の末端に結合され得る短いペプチドドメインからなる。
【００３１】
抗体−エピトープ相互作用の文脈において、「特異的に結合する」という用語は、抗体及びエピトープが、抗体又はエピトープのいずれかを別の物質、例えば無関係のタンパク質に置き換えた場合より、より頻繁に若しくはより迅速に、又はより長い期間若しくはより大きなアフィニティーで、又は上記の任意の組合せで結合する相互作用を指す。必ずではないが一般的に、結合への言及は特異的認識を意味する。更に、抗体は２つ以上の抗原を特異的に認識してもよいと考えられる。モノクローナル抗体による標的の特異的結合又はその欠如を決定する当該技術分野で公知の技術としては、限定されるものではないが、ＦＡＣＳ分析、免疫細胞化学的染色、免疫組織化学、ウェスタンブロッティング／ドットブロッティング、ＥＬＩＳＡ、アフィニティークロマトグラフィーが含まれる。例えば、限定されるものではないが、特異的結合又はその欠如は、前記標的を特異的に認識することが当該技術分野で知られている抗体の使用を含む対照及び／又は前記標的の特異的認識がないか若しくは最小限である対照（例えば、対照は、非特異的抗体の使用を含む）を用いた比較分析によって決定され得る。前記比較分析は、定性的又は定量的であり得る。しかし、所与の標的の排他的特異的認識を示す抗体又は結合部分は、例えば標的及び相同タンパク質の両方を特異的に認識する抗体と比べた時、前記標的への特異性がより高いと言われると理解される。
【００３２】
本発明において「対照値」とは、健康な個体において通常見られるＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、又はＶＣＡＭ１等の特定のバイオマーカーのレベルであると理解される。バイオマーカーの対照レベルは、健康個体から単離されたサンプルの分析によって決定されてもよく、健康個体に典型的であると当業者に理解されるバイオマーカーのレベルであってもよい。「対照値」は、健康個体におけるバイオマーカーの正常レベルであると当業者に見なされる値の範囲であり得る。当業者には、健康個体由
来サンプル中のバイオマーカーのレベルをユーザーが分析することによるか、又はサンプル中のバイオマーカーのレベルを決定するために用いられるアッセイの製造業者によって提供される典型的な値を参照することにより、バイオマーカーの対照値が計算され得ることが理解されよう。
【００３３】
好ましくは患者から単離されるサンプルは血清サンプルであるが、血液、血漿、尿、又は唾液（特に唾液クレアチニンに関して）であってもよい。バイオマーカーのレベルの決定は、患者に由来する１又は複数のサンプルを用いてなされてよい。サンプルは、当該技術分野で日常的に使用される方法によって患者から得られ得る。
【００３４】
本発明者らは、サンプル中のＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、及びＶＣＡＭ１からなる群から選択されるバイオマーカーのレベル変化の検出を利用して、ＣＫＤに罹患している患者を同定すること又は疾患の進行を段階付けることができることを見出した。したがって、本発明は早期ＣＫＤの診断に用いることが出来る。本発明において、「早期（early stage）」とは、ＫＤＯＱＩの分類による定義でＣＫＤの第
１又は第２ステージのいずれかを意味すると理解される。
【００３５】
第１の態様では、本発明は、ＣＫＤに罹患している患者を同定するか又は患者のＣＫＤの進行を段階付ける方法であって、対象から得られたサンプル中のバイオマーカーの量を測定すること及びバイオマーカーの量が正常対照と比べて変化しているかどうかを決定することを含み、バイオマーカーが、Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、及びＶＣＡＭ１からなる群から選択される、方法を提供する。バイオマーカーの値の対照範囲は、集団の人口統計及び検査されているサンプルによって異なり得る。例えば、健康個体由来の値の対照範囲は、血液サンプルと尿サンプルでは異なり得る。所与のサンプル及び患者人口統計の上側及び下側の閾値は、患者コホート由来のサンプルを分析して平均値を見つけることにより、当業者によって決定され得る。対照患者及びＣＫＤ罹患患者において測定された各バイオマーカーのレベルを以下の表１に示す。
【００３６】
更なる態様では、本発明は、ＣＫＤの種々のステージの患者を同定するか又はＣＫＤの進行を段階付ける方法であって、対象から得られた１又は複数のサンプル中の２つ以上のバイオマーカーの量を測定すること及びバイオマーカーの量が正常対照と比べて変化しているかどうかを決定することを含み、２つ以上のバイオマーカーが、Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ＳＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、及びＶＣＡＭ１からなる群から選択される、方法を提供する。
【００３７】
診断方法の正確度は、その受信者動作特性（ＲＯＣ）によって最も良く説明される（Zweig, M. H., and Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577）。ＲＯＣグラフは、
観察されたデータの全範囲にわたり決定閾値（decision threshold）を連続的に変えて得
られる感度／特異性ペアの全てのプロットである。ＲＯＣプロットは、決定閾値の全範囲にわたり１−特異性に対して感度をプロットすることにより２つの分布間の重複を示すものである。ｙ軸は感度、すなわち［（真陽性試験結果の数）／（真陽性試験結果の数＋偽陰性試験結果の数）］として定義される真陽性率である。これは疾患又は状態の存在についての陽性度とも呼ばれる。これは罹患したサブグループからのみ計算される。ｘ軸は偽陽性の割合、すなわち１−特異性［（偽陽性結果の数）／（真陰性結果の数＋偽陽性結果の数）として定義される］である。これは特異性の指標であり、非罹患サブグループ全体から計算される。真及び偽陽性の割合は２つの異なるサブグループの検査結果を用いて完全に別個に計算されるので、ＲＯＣプロットはサンプルの疾患罹患率から独立している。ＲＯＣプロット上の各点は、特定の決定閾値に相当する感度／特異性ペアを表す。識別が完全な検査（２つの結果の分布に重複がない）は、真陽性の割合が１．０又は１００％であり（完全な感度）、偽陽性の割合が０である（完全な特異性）、左上隅を通るＲＯＣプロットを示す。全く識別しない検査の理論的プロット（２つのグループの結果の分布が同一）は、左下隅から右上隅への４５°の対角線である。ほとんどのプロットはこれら２つの極端な例の間に収まる。定性的に、プロットが左上隅に近いほど、検査の全体的正確度が高くなる。
【００３８】
臨床検査の診断正確度を定量化するための便利な目標の１つは、その成績を１つの数で表すことである。最も一般的な包括的測定値は、ＲＯＣプロットの曲線下面積（ＡＵＣ）である。ＲＯＣ曲線下面積は、認識される測定値により状態が正確に同定される確率の尺度である。慣習的に、この面積は常に≧０．５である。値は、１．０（２グループの検査値の完全な分離）と０．５（２グループ間で検査結果に明白な分布の差がない）の間である。面積は、特異性９０％での感度又は対角線に最も近い点等のプロットの特定の部分のみに依存せず、プロット全体に依存する。これは、ＲＯＣプロットが完全なもの（面積＝１．０）にどれだけ近いかの定量的・記述的表現である。本発明の文脈における、ＣＫＤに罹患している患者を同定するため又はｃｋｄの進行を段階付けるためにそのバイオマーカーのレベルの変化が用いられる個々のバイオマーカーのＡＵＣ値を表２に示す。
【００３９】
本発明において２つ以上のバイオマーカーが用いられる場合、好適な数学的又は機械学習分類モデル、例えばロジスティック回帰分析式が導かれ得る。熟練した統計学者には、患者の年齢及び性別等の他の変数を含み得るそのような好適なモデルがどのようにして導かれるかが理解されよう。ＲＯＣ曲線を用いてモデルの正確度を評価することができ、モデルを独立して又はアルゴリズム中で用いて、臨床的決断を支援することができる。ロジスティック回帰分析式は、そのようなケースに使用される一般的な数学的／統計学的方法であり、本発明における選択肢であるが、他の数学的／統計学的、決定木、又は機械学習法を用いることもできる。当業者には、異なる集団又は患者コホートから得られたデータセットに適用するために、所与の集団で作製されたモデルを調整する必要があり得ることが理解されよう。
【００４０】
本発明者らは更に、Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、及びＶＣＡＭ１からなる群から選択される２つ以上のバイオマーカーの組合せのレベルの変化の検出を、ＣＫＤに罹患している患者を同定するため又はこの疾患の進行を段階付けるために用いることができることを見出した。本発明の文脈において、バイオマーカーのレベルの変化をＣＫＤに罹患している患者の同定又はＣＫＤの進行の段階付けに用いることができ、バイオマーカーの組合せのＡＵＣ値が個々のバイオマーカー単独のいずれよりも大きい、２つ以上のバイオマーカーの組合せのＡＵＣ値を表３に示す。
【００４１】
更に別の態様では、本発明は、腎臓病が疑われる患者において治療的介入を行う決定を支援する方法であって、対象から得られたサンプル中のＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、及びＶＣＡＭ１からなる群から選択されるバイオマーカーの量を測定することと、バイオマーカーの量が正常対照と比べて変化しているかどうかを決定することと、測定されたバイオマーカーの量に基づいて治療的介入を拒絶する又は行う行程とを含む方法を提供する。
【００４２】
治療的介入を行う決定は、医師によってなされ、前記介入は腎臓病と戦うようにデザインされる。そのような治療的介入は、成体幹細胞療法、移植療法、透析、食事管理、運動、又は薬物療法の１又は複数を含み得る。薬物療法は以下からなる群から選択され得る：利尿薬、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、アンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、βアドレナリン拮抗薬、αアドレナリン拮抗薬、カルシウムチャネル拮抗薬、スタチン、エリスロポエチン、ビタミンＤ、ビタミンＣ、ビタミンＢ、葉酸、尿酸低下薬（hypouricaemic
）、リン吸着剤、カリウム結合樹脂、免疫抑制薬、及びカルシウムサプリメント。
【００４３】
バイオマーカー測定ステップは、バイオマーカーに特異的に結合できる抗体を患者サンプルに添加した後に形成される免疫複合体の測定で置き換えることもできる。バイオマーカーに抗体が結合すると免疫複合体が形成され、これは当該技術分野で公知の標準的技術を用いて検出及び測定することができる。
【００４４】
血清中で測定された各バイオマーカーのレベルを表１に示す。不明瞭でないように説明すると、Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＩＣＡＭ１、ＩＬ１０、ＩＬ１β、ＩＬ５、ＩＬ６、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、又はＶＣＡＭ１の発現レベルの上昇（健康な非疾患対照と比較した時）が、ステージ１又はステージ２の慢性腎疾患の存在又はリスクを示す。Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１β、ＩＬ５、ＩＬ６、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、又はＶＣＡＭ１の発現レベルの上昇（健康な非疾患対照又はステージ１若しくはステージ２の慢性腎疾患患者と比較した時）が、ステージ３慢性腎疾患の存在又はリスクを示す。クレアチニン、ＩＬ４、ＬＳＥＬ、又はＮＳＥの発現レベルの低下（健康な非疾患対照と比較した時）が、ステージ１又はステージ２の慢性腎疾患の存在又はリスクを示す。ＩＬ１α、ＩＬ４、又はＮＳＥの発現レベルの低下（健康な非疾患対照又はステージ１若しくはステージ２の慢性腎疾患患者と比較した時）が、ステージ３慢性腎疾患の存在又はリスクを示す。
【００４５】
表２に、そのバイオマーカーのレベルの変化がＣＫＤに罹患している患者を同定するため又はＣＫＤの進行を段階付けるために用いられる、個々のバイオマーカーのＡＵＣ値を示す。このデータは、健康対照対象と慢性腎疾患患者（対照対ＣＫＤ）、健康対照対象とステージ１又はステージ２慢性腎疾患患者（対照対ステージ１／２）、健康対照対象とステージ３慢性腎疾患患者（対照対ステージ３）、及び健康対照対象とステージ１又はステージ２慢性腎疾患患者とステージ３慢性腎疾患患者（全体）を識別するために個々のバイオマーカーを使用するためのＡＵＣ値を示している。
【００４６】
表３に、そのバイオマーカーのレベルの変化がＣＫＤに罹患している患者を同定するため又はＣＫＤの進行を段階付けるために用いられる、２つ以上のバイオマーカーの組合せのＡＵＣ値を示す。このデータは、健康対照対象と慢性腎疾患患者（対照対ＣＫＤ）、健康対照対象とステージ１又はステージ２慢性腎疾患患者（対照対ステージ１／２）、健康対照対象とステージ３慢性腎疾患患者（対照対ステージ３）、及び健康対照対象とステージ１又はステージ２慢性腎疾患患者とステージ３慢性腎疾患患者（全体）を識別するために用いられるバイオマーカーの組合せのＡＵＣ値を示している。
【００４７】
【表１−１】
0006440719.tif 000002
【表１−２】
0006440719.tif 000003
【００４８】
【表２−１】
0006440719.tif 000004
【表２−２】
0006440719.tif 000005
【００４９】
【表３】
0006440719.tif 000006
【００５０】
ＣＫＤのステージのいずれかへと患者を層別化することは、ある種の処置が別のものより患者に有益であるかどうかを評価するのに有用であり、処置が成功であるかどうかをモニタリングするのにも有用である。患者の層別化は更に、患者の予後を決定することを助けることにより、将来のケアの要求を可能にする。
【００５１】
本発明の方法は、当該技術分野で公知のＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＦＡＢＰ、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦ
Ｒ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、又はＶＣＡＭ１のレベルを決定する方法、例えば酵素的及び／又は化学的なタンパク質の定量又は免疫学的アッセイに基づく方法を用い得る。Ｃ３ａ
ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＦＡＢＰ、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、又はＶＣＡＭ１のレベルを決定するための免疫学的アッセイは、例えばサンドイッチアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、競合アッセイ（競合的ＲＩＡ）、ブリッジイムノアッセイ、免疫組織化学（ＩＨＣ）、及び免疫細胞化学（ＩＣＣ）を含む種々のアッセイフォーマットで行われ得る。Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＦＡＢＰ、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、又はＶＣＡＭ１のレベルを決定する方法は、Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＦＡＢＰ、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、又はＶＣＡＭ１に結合する抗体と患者サンプルを接触させること及び結合を検出することを含む。Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＦＡＢＰ、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、又はＶＣＡＭ１に対する特異性を有する抗体は、従来の方法を用いて支持体材料上に固定化され得る。Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＦＡＢＰ、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、又はＶＣＡＭ１に対する特異性又は反応性（バイオマーカーに対するもの又はその他の識別のための分析物に対するものであり得る）を有する更なる抗体を用いることによるか又は表面プラズモン共鳴（ビアコア社、スウェーデン）等の物理的方法を用いることにより、支持体上の抗体へのＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＦＡＢＰ、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、又はＶＣＡＭ１の結合を検出することができる。
【００５２】
好ましくは、患者から単離されたサンプル中のＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＦＡＢＰ、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、又はＶＣＡＭ１からなる群から選択される１又は複数のバイオマーカーのレベルを決定するために固体デバイスが用いられ得る。固体デバイスは、活性化表面の別個の領域にＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ
、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＦＡＢＰ、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、又はＶＣＡＭ１に対する抗体がアプライされる活性化表面を有する基体を含む。好ましくは、固体デバイスは、患者から単離されたサンプル中のＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＦＡＢＰ、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、又はＶＣＡＭ１のレベルが、サンプル中のＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＦＡＢＰ、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、又はＶＣＡＭ１の任意のその他のレベルと同時に決定されるように、多成分分析（multi-analyte assay）を行うことができる。この実施形態では、固体デバイスは、基体に共有
結合した所望の抗体をそれぞれが有する多数の別個の反応部位を有し、反応部位間の基体表面は標的バイオマーカーに関して不活性である。したがって、本発明において使用される固体多成分デバイスはほとんど又は全く非特異的結合を示さないと考えられる。
【００５３】
本発明で使用され得るデバイスは、好適な基体の表面を活性化し、表面の別個の部位に一連の抗体をアプライすることにより作製され得る。好適な基体は、プラスチック、セラミック、又はガラス等の任意の不活性材料から作製される。所望であれば、他の活性領域をブロックしてもよい。例えば共有結合により、リンカーを介して基体にリガンドが結合され得る。特に、活性化表面が、オルガノシラン、二官能性リンカー、及び抗体と連続的に反応させられることが好ましい。本発明の方法で使用される固体デバイスは、例えばその内容全体を本明細書に援用する英国特許出願公開第２３２４８６６（Ａ）号に開示の方法に従って製造され得る。好ましくは、本発明の方法で使用される固体デバイスは、バイオチップ・アレイ・テクノロジー・システム（Biochip Array Technology system: BAT）（ランドックス・ラボラトリーズ・リミテッド社から入手可能）の一部を構成するバイオチップである。
【００５４】
本発明の方法で使用される固体デバイスは、Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＦＡＢＰ、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、又はＶＣＡＭ１に対する抗体を含む。好ましくは、抗体は、Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＦＡＢＰ、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、又はＶＣＡＭ１に特異的であり、他の抗原への交差反応性が０．５％未満、好ましくは０．１％未満である。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。本発明の方法で使用される固体デバイスはランドックス社のＢＡＴ  ａｎａｌｙｓｅｒを用いて処理され得る。
【００５５】
本発明は更に、対象から得られたサンプル中のＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩ
Ｐ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、及びＶＣＡＭ１からなる群から選択される２つ以上のバイオマーカーの量を測定するアッセイを提供する。本発明のアッセイを用いて、サンプル中のこれらのバイオマーカーの３、４、５、６、７、又はそれ以上の組合せのレベルを測定することができる。このようなアッセイは、本発明の固体デバイスを用いて行われ得、本発明の方法で使用され得る。
【００５６】
本発明の方法は、手術後の患者をモニタリングして、患者が腎臓の合併症を発症するリスクを評価するために用いることができる。具体的には、手術後の所与の間隔で患者からサンプルが得られ得、サンプル中のＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＦＡＢＰ、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、又はＶＣＡＭ１からなる群から選択される任意の１又は複数のバイオマーカーのレベルが決定される。特定のタイムフレームにわたりＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＡＤＰＮ、ＣＤ２６、クレアチニン、ＣＲＰ、ＣＹＳＣ、Ｄ−ダイマー、ＥＧＦ、ＥＳＥＬ、ＦＡＢＰ１、ＧＭＣＳＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＬＦＡＢＰ、ＬＳＥＬ、ＭＣＰ１、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＮＳＥ、ＰＳＥＬ、ｓＩＬ２α、ｓＩＬ６Ｒ、ＳＴＮＦＲ１、ＳＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、又はＶＣＡＭ１からなる群から選択される任意の１又は複数のバイオマーカーのレベルを評価することにより、臨床医は、患者が早期ＣＫＤに罹患しているかどうかの指標を得ることができ、それに応じて医療介入が行われ得る。
【実施例】
【００５７】
慢性腎疾患に罹患している３７６名の患者及び２１１名の健康対照に由来する血清サンプルを、当該技術分野で公知の方法で静脈穿刺を用いて採取し、使用する準備ができるまで−８０℃で保存した。ＫＤＯＱＩのガイドラインを用いて患者のＣＫＤを段階付け、この分析のために、従来のバイオマーカーに基づく方法では容易に決定されない早期腎疾患の代表としてステージ１及びステージ２のＣＫＤに罹患している患者を組み合わせた。
【００５８】
サンプルコホートの構成は以下の通りであった：
・合計５８７例の血清サンプル
・２７１例のＣＫＤステージ１／２患者
・１０５例のＣＫＤステージ３患者
・２１１例のドナー対照
【００５９】
サンプル中のバイオマーカーのレベルを決定するために、クレアチニン測定を除き、バイオチップ・アレイ・テクノロジー（ＢＡＴ）を用いたイムノアッセイを用いた。クレアチニンは、市販の臨床化学アッセイ（製品番号ＣＲ３８１４；ランドックス・ラボラトリーズ社）を用いて測定し、サンプルはＲＸ  Ｄａｙｔｏｎａ（ランドックス・ラボラトリーズ社から入手可能）を用いて分析した。
【００６０】
プロトコールの説明
データはアッセイの各単位において報告され、分析前に標準化の技術は用いなかった。データを最初に従来の単変量ノンパラメトリック検定を用いて分析した。表１に、試験し
た各分析物の中央値及び５〜９５パーセンタイルを示す。多重比較（対照対ステージ１／２、対照対ステージ３、ステージ１／２対ステージ３）のためのボンフェローニ補正及びマン・ホイットニーを用いて有意性を決定した。更にこのデータに対して受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を行い、全ＣＫＤ患者（ステージ１／２／３）対健康対照、ステージ１／２対健康対照、ステージ３対健康対照を同定するため並びに健康対照、ステージ１／２、及びステージ３（全体）を区別するための曲線下面積を決定した。これらのＡＵＣ値を表２に要約した。
【００６１】
潜在的なマーカーの組合せが診断及び層別化の成績を改善し得るかどうかを決定するために、２つの方法を用いた。第１の方法は、健康対照からＣＫＤ患者を識別するためのモデルを作成するためにコホートのサブセットを用いた、ロジスティック回帰分析の使用である。必要な最適な変数を選択するために後進法（backward entry）を用いた。その後、このモデルを検証用サブセットで検証し、ロジスティック回帰分析式を用いて予想されるＣＫＤの確率を計算した後、ＲＯＣ分析を行った。
【００６２】
第２の方法は、診断成績及び疾患の層別化を改善するためにこれらのバイオマーカーを組み合わせることの価値を完全に調べるために行われ、全ての可能な１、２、３、及び４つのバイオマーカーの組合せについて、ランダムに選択されたデータのサブセットを用いてランダムフォレストを成長させた。合計６６，６７５個のモデルが作製され、別個の検証用サブセットからＡＵＣを計算した。各値を含む全ての組合せのＡＵＣを総計し、平均総ＡＵＣが最大であったマーカーを最も重要なマーカーと見なした。この中で、Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇが、ほとんど全ての組合せにおいて最も成績が良く、上位成績モデルの７８％に存在した。ＣＫＤの識別及び疾患のステージの区別におけるいくつかの組合せのＡＵＣを表３に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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