(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトコカスディスカラクティーエ9103菌株(KCTC11818BP)を培地で培養する段階を含む、体内低分解速度を有するヒアルロン酸の製造方法であって、
前記ヒアルロン酸の分子量は350万Da乃至1000万Daであり、
前記培地は、ブドウ糖、酵母エキス、カゼインペプトン、グルタミン、グルコン酸ナトリウム、蓚酸、硫酸マグネシウム、リン酸一水素二カリウム、塩化ナトリウム、アセト酸ナトリウム、塩化二鉄、及びアンモニウムモリブデンを含み、かつ、下記（ａ）〜（ｃ）の一以上の条件を満たすことを特徴とする前記製造方法。
（ａ）前記カゼインペプトンの代わりにカゼイン酵素加水分解物を含む
（ｂ）前記グルタミンの代わりにアルギニンを含む
（ｃ）前記ブドウ糖の代わりに麦芽糖を含む
【請求項２】
前記培地が、さらに亜鉛イオンを含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸の分子量は400万Da乃至600万Daであることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸が架橋されていない、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は2013年03月20日に出願された大韓民国特許出願第10-2013-0029876号（出願番号）に基づく優先権を主張するものであり、前記明細書全体は本出願の参考文献である。
【０００２】
本発明は、体内低分解速度を有するヒアルロン酸の製造方法及び前記方法で製造されたヒアルロン酸を含む癒着防止用組成物に関するもので、詳細にはストレプトコカスディスカラクティエ9103菌株(KCTC11818BP)を炭素源及び窒素源が含まれた培地で培養する段階を含む体内低分解速度を有するヒアルロン酸の製造方法及び前記方法で製造されたヒアルロン酸を含む癒着防止用組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒアルロン酸(Hyaluronic  acid(HA)、Hyaluronan,(C14H20NNa011)n(n>1000))は、生体に存在する高分子であって、glycosaminogiycanの多糖類である。その構造はD-glucurnic  acidとN-acetylglucosamineが-1,3と-1,4の結合で繰返し連結された構造をおびている。水溶性物質であって粘度が極めて高く、高弾性の特性を有していて、分子量は1,000-10,000,000Da(daltons)に至る広範囲の直鎖多糖類である。
【０００４】
ヒアルロン酸は保湿効果が強く、物理的摩擦状態で強烈な潤滑作用機能が極めて優れていて、細菌などの侵入に対する保護効果などの効能と物性において極めて好ましい長所を有しているので、治療領域に必要な適用症が極めて多い。このようなヒアルロン酸を開発するには、基本的に生体組織抽出法又は微生物培養法が使用されるが、最近ではウィルス侵入、不純物、炎症反応など多くの短所により、鶏冠抽出法よりは分子量と生産性を調節することができ、高品質の原料収得が可能な微生物培養生産法が選好される趨勢にある。特に微生物培養により調節されて生産されたヒアルロン酸の分子量範囲によって開発用途が決定されるのが最近の趨勢である。10万Da以下の超低分子ヒアルロン酸は主に食品や化粧品の用途に使用され、平均分子量100万Daの低分子ヒアルロン酸は点眼剤の原料や誘導体開発対象に活用され、平均分子量300万〜400万Daのヒアルロン酸は膝関節注射剤原料として活用価値が高い。その他にも眼科手術補助剤としての使用も増加していて、身体内の超高分子として癒着防止剤の原料に脚光を浴びている。
【０００５】
癒着(adhesion)は普通炎症の治癒過程でみられるものであって、肉芽組織や瘢痕(scar)を形成するとき、互いにもつれあったり、多量析出される繊維素がもつれあってこのような現象を引き起こす。一般的に、開腹手術後67〜93%程度の頻度で癒着が発生してこの内の一部は自ら分解もするが、ほとんどの場合、傷治癒後にも癒着が存在する各種の後遺症を誘発することもある(Eur.J.Surg  1997,Suppl  577,32-39)。これを防止するために手術後の傷部位を覆ったり、薬物学的作用などにより周辺組織との癒着発生を物理、化学的に遮断する癒着防止剤に対する開発が世界的に進行している。このような癒着防止剤は多様な高分子物質などを利用して作られているが、アルギン酸、CMC及びヒアルロン酸が主に使用され、ヒアルロン酸としては、低分子ヒアルロン酸を利用して分子量や粘度又は弾性などを増大させたヒアルロン酸架橋物質が使用されている。一般的に、癒着防止剤はフィルム状の製品で販売されているが、薄いフィルムを伸ばすことが容易でなく、一つの製品を他の部位に分けて使用することが容易でなかった。これによって開発されたのがゲル状の製品であり、手術部位に注射器で絞って使用するようになっている。ゲル製品の特性上、流れ落ちることもあり得るので、高分子物質が使用されるが、ヒアルロン酸の場合、架橋されたものを大部分に使用した。前記の通り、架橋されたヒアルロン酸を癒着防止剤の原料に使用する場合において、最も問題となるのが架橋に使用される化合物であり、ヒアルロン酸が生体内物質として分解された後にも、架橋に使用された化合物が体内に滞留して副作用を引き起こす可能性がある。
【０００６】
ヒアルロン酸を含む癒着防止用組成物に対する国内主要特許内容などを説明すると、大韓民国登録特許第10-1074467号はL-アルギニンとヒアルロン酸を混合して癒着防止剤を製造し、大韓民国登録特許第10-0374666号及び大韓民国公開特許第10-2011-0114810号ではヒアルロン酸塩の一種であるヒアルロン酸ナトリウムを使用して癒着防止用ヒアルロン酸ゲルを製造した。さらに、大韓民国公開特許第10-2009-0012439号ではヒアルロン酸と架橋剤を混合して架橋されたヒアルロン酸を使用した。外国の場合、US6630167はヒアルロン酸水溶液を架橋剤水溶液に混合して癒着防止剤を製造した。従って、国内の従来の技術において架橋していないか又は構造を変更していないヒアルロン酸を単独で使用したことは見受けられず、ヒアルロン酸を使用することに対して、国内の従来技術では殆どヒアルロン酸が体内で分解が容易なため、滞留時間が短く架橋していないヒアルロン酸のみを利用することに対して、否定的な見解が大部分であった。
【０００７】
従って、架橋せずに体内で滞留期間が長いヒアルロン酸の開発及び前記ヒアルロン酸を使用して製造した癒着防止用組成物の開発が急がれている状況である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、体内滞留期間が長く癒着防止剤に効果的なヒアルロン酸を開発する方法を探索中、ストレプトコカスディスカラクティーエ9103菌株を利用して製造したヒアルロン酸が体内分解速度が遅く癒着防止効果が優れたことを発見して本発明を完成した。
【０００９】
本発明の目的はストレプトコカスディスカラクティーエ9103菌株(KCTC11818BP)を炭素源及び窒素源が含まれた培地で培養する段階を含む体内低分解速度を有するヒアルロン酸の製造方法を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は本発明のヒアルロン酸製造方法で製造されて、架橋されていないヒアルロン酸を有効成分とする癒着防止用組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は本発明のヒアルロン酸製造方法で製造されて、架橋されていないヒアルロン酸をこれを必要とする個体に投与する段階を含む癒着防止方法を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は本発明のヒアルロン酸製造方法で製造されて、架橋されていない癒着防止に使用されるヒアルロン酸を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記の目的を達成するために、本発明はストレプトコカスディスカラクティーエ9103菌株を炭素源及び窒素源が含まれた培地で培養する段階を含む体内低分解速度を有するヒアルロン酸の製造方法を提供する。
【００１４】
本発明の他の目的を達成するために、本発明はヒアルロン酸製造方法で製造されて架橋されていないヒアルロン酸を有効成分とする癒着防止用組成物を提供する。  
【００１５】
本発明の他の目的を達成するために、本発明のヒアルロン酸製造方法で製造されて、架橋されていないヒアルロン酸をこれを必要とする個体に投与する段階を含む癒着防止方法を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的を達成するために、本発明のヒアルロン酸製造方法で製造されて、架橋されていない癒着防止に使用されるヒアルロン酸を提供する。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明は、ストレプトコカスディスカラクティーエ9103菌株を炭素源及び窒素源が含まれた培地で培養する段階を含む体内低分解速度を有するヒアルロン酸の製造方法を提供する。
【００１９】
好ましい本発明の製造方法は、
（ａ）ストレプトコカスディスカラクティーエ9103菌株を炭素源及び窒素源が含まれた培地で培養する段階；及び
（ｂ）前記（ａ）段階で培養された培養物からヒアルロン酸を回収する段階を含む製造方法でもある。
【００２０】
前記本発明におけるストレプトコカスディスカラクティーエ9103菌株は、牛の糞便から分離された微生物の内、ヒアルロン酸を生産する菌株を分離した後、突然変異を誘発してヒアルロン酸分解酵素を生産せず、非溶血性のものを選別した微生物である。
【００２１】
本発明におけるストレプトコカスディスカラクティーエID9103菌株は、通常のストレプトコカス属微生物の培養法により培養することができる。
【００２２】
前記培地は、炭素原及び窒素原を含む培地でもあって、アミノ酸又は金属イオンが追加して含まれることもある。
【００２３】
本発明における炭素原は、公知の微生物培養に使用される炭素原であればどんなものでも可能であり、好ましくは、ブドウ糖、果糖、麦芽糖、乳糖、ガラクトース、グリセロール及びこれらの混合物からなる群より選ばれたものでもある。より好ましくは、麦芽糖でもある。
【００２４】
本発明における窒素原は、公知の微生物培養に使用される窒素原であればどんなものでも可能であり、好ましくは、酵母エキス、カゼインペプトン、カゼイン酸分解物、カゼイン酵素分解物、バクトペプトン、カジトン、ネオペプトン及びこれらの混合物からなる群より選ばれたものでもある。より好ましくは、カゼイン酵素分解物でもある。
【００２５】
前記カゼイン酵素分解物は、カゼインを酵素分解したものを意味し、例えば、トリプトン、トリプトンティー、トリプトンエクス、ビビエルバイオセートペプトン、ディプコカゼインダイジェスト、ビクトカジトン、ビビエルトリップチカアゼペプトン、バクトトリプトン、バイテクトリプトン、エンジアミンエイ、エンジアミンエイエス、エンジアミンイケイシ、エンジアミンエルコンセントレーション、エンジケース、エンジケースエム、エンジケースエムエイ、エンジケースプラス、エンジケースティティ、ペプチカーゼ、トリプトンユエスピ、膵液分解カゼインコデクス、膵液分解カゼイン、酵素分解カゼインコーシャ、トリプトンブイでもある。
【００２６】
本発明の培地はアミノ酸又は金属イオンを追加して含むことができる。
【００２７】
前記アミノ酸はその種類に制限が無く、好ましくは、グルタミン、リシン、システンイン、アルギニン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン及びこれらの混合物からなる群より選ばれたものでもある。より好ましくは、アルギニンでもある。
【００２８】
さらに、前記金属イオンはその種類に制限はないが、好ましくはナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、マンガン及びこれらの混合物からなる群より選ばれるものでもあって、より好ましくは亜鉛でもある。
【００２９】
さらに、好ましくは本発明の培地組成物は、窒素源であって、カゼイン酵素分解物及びアミノ酸として、アルギニン、金属イオンとして亜鉛を含むものでもある。カゼイン酵素分解物とアルギニン及び亜鉛を一緒に添加した培養培地で培養する場合、本発明の菌株によるヒアルロン酸生産は分子量を限定することができ、この分子量から最も優れた癒着防止子効能を示す特徴がある。
【００３０】
前記カゼイン酵素分解物及びアルギニン及び亜鉛濃度は特に制限されず、カゼイン酵素分解物は0.5%(w/v)乃至3%(w/v)の濃度で含まれ、アルギニンは(0.01%)(w/v)乃至0.6%(w/v)、亜鉛は(0.01%)(w/v)乃至0.1%(w/v)の濃度で含まれることが好ましい。
【００３１】
本発明の培養方法は特に制限はされず、例えば、回分式、流加式、連続式培養でもある。本発明の培養方法は好ましくは流加式培養方法でもある。前記流加式培養において流加式に供給される培地構成成分は、窒素源又は窒素源及び炭素源でもあって、前記窒素源はカゼイン酵素分解物であって、前記炭素源は麦芽糖であることがより好ましい。
【００３２】
本発明の製造方法においてヒアルロン酸を回収する段階は、公知の微生物培養物から有効物質を分離する方法によることもできて、具体的に濾過などによる制菌工程、中和工程又は結晶化工程、クロマトグラフィーや遠心分離などによるエンドトキシン、タンパク質、核酸、金属などの不純物などの除去及び精製工程などを含むことができる。
【００３３】
さらに、本発明のヒアルロン酸製造方法で製造されたヒアルロン酸はこれに制限はされないが、好ましくは350万Da乃至1000万Daの平均分子量を有する高分子ヒアルロン酸でもある。より好ましくは400万Da乃至600万Daの平均分子量、400万Da乃至800万Daの平均分子量、及び400万Da乃至1000万Daの平均分子量からなる平均分子量からなる平均分子量範囲群より選ばれた一つの範囲を有する高分子ヒアルロン酸でもある。さらに、本発明に記載された平均分子量は、全て重量平均分子量である。
【００３４】
本発明の製造方法は、平均分子量を限定した高分子のヒアルロン酸を高い収率で生産することができる。
【００３５】
本発明の一実施例では、本発明の製造方法で分子量が432万Da乃至598万Daで、生産量が8.07g/L乃至9.42g/Lのヒアルロン酸を製造して、生産量と分子量が高いヒアルロン酸を得た（表１参照）。
【００３６】
本発明における体内低分解速度は、ヒアルロン酸が体内に投与された後、分解速度が遅いことを意味する。
【００３７】
本発明の一実施例では、本発明の製造方法で生産されたヒアルロン酸の体内分解速度の比較実験を行った。体内分解速度比較のため、体内でヒアルロン酸を分解するヒアルロニダーゼ(hyaluronidase)酵素をヒアルロン酸に処理して、経時による分子量別(300万Da乃至400万Da、600万Da)粘度測定値(cP)を測定した。その結果、400万Da及び600万Daの分子量を有するヒアルロン酸が300万Daのヒアルロン酸に比べて経時による粘度減少率が低く示された。粘度減少率が低いのは、体内でヒアルロン酸の分解が遅く進行して、ヒアルロン酸の粘度を一定水準に維持できることを意味する。これにより本発明の製造方法で製造された400万Da以上の分子量を有するヒアルロン酸は、体内低分解速度を有することができ、好ましくは400万Da乃至600万Daの分子量を有するヒアルロン酸が、癒着防止効果に優れたものでもある。
【００３８】
本発明の製造方法で製造されたヒアルロン酸は、分子量が350万Da乃至1000万Daでもあって、好ましくは400万Da乃至1000万Daであり、より好ましくは400万Da乃至600万Daでもあるが、350万Da以下の分子量を有するヒアルロン酸は、体内分解速度が速く、癒着防止効果を期待し難く、1000万Da以上の分子量を有するヒアルロン酸は製造が難しい。
【００３９】
従って、本発明の製造方法で製造されたヒアルロン酸は体内低分解速度を有する。
【００４０】
さらに、前記ヒアルロン酸を有効成分として含む癒着防止用組成物は、体内で分解物される速度が遅いので癒着防止効果が優れている。
【００４１】
本発明は、本発明の製造方法で製造されて、架橋されていないヒアルロン酸を有効成分として含む癒着防止用組成物を提供する。
【００４２】
本発明は、本発明の製造方法で製造されて、架橋されていないヒアルロン酸をこれを必要とする個体に投与する段階を含む癒着防止方法を提供する。
【００４３】
本発明は、本発明のヒアルロン酸製造方法で製造されて、架橋されていない癒着防止に使用されるヒアルロン酸を提供する。
【００４４】
さらに、本発明は、本発明のヒアルロン酸を有効成分として含む癒着防止剤を提供する。本発明の癒着防止剤は、本発明のヒアルロン酸を含むことを特徴として、追加して生理食塩水、蒸留水、リン酸ナトリウム緩衝溶液などを含むことができる。
【００４５】
本発明のヒアルロン酸は、既存のヒアルロン酸に比べて体内で分解速度が遅く、架橋されていない状態でも十分な時間癒着防止のための潤滑効果を示すので癒着防止剤として使用が可能である。
【００４６】
前記架橋されていないヒアルロン酸は、化学的架橋剤、化学的変性剤及びヒアルロン酸と錯物を形成する陽イオン性高分子が含まれていない本発明の製造方法で製造されたヒアルロン酸を意味する。
【００４７】
前記化学的架橋剤は、ヒアルロン酸と反応して３次元ネットワーク構造を形成する化合物であって、ポリグリシジルエーテルなどの多価エポキシ化合物、ジビニルスルホン、ホルムアルデヒド、オキシ塩化燐、カルボジイミド化合物とアミノ酸エステルの配合物、及びカルボジイミド化合物とジヒドラジド化合物の配合物からなる群より選ばれる一つ以上の化合物でもある。
【００４８】
前記化合物変性剤は、ヒアルロン酸のカルボキシル基、ヒドロキシル基又はセトアミド基と反応して共有結合を形成する化合物であって、無水アセト酸と濃硫酸の配合物、無水トリフルオロアセト酸と有機酸の配合物、及びアルキルヨード化合物からなる群より選ばれた一つ以上の化合物でもある。
【００４９】
前記ヒアルロン酸と錯物を形成する陽イオン性高分子は、ヒアルロン酸のカルボキシル基と高分子化合物のアミノ基又はアミノ基の間でイオン結合を通じて錯物を形成する高分子であって、キトサン、ポリライシン、ポリビニルピリジン、ポリエチレンイミン、及びポリジメチルアミノエチルメタクリレートからなる群より選ばれる一つ以上の陽イオン性高分子でもある。
【００５０】
本発明で癒着防止用組成物が投与される個体とは、動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトを含む動物でもあって、動物から由来した細胞、組織、器官などでもある。前記個体は治療を要する患者でもある。
【００５１】
本発明における投与は、癒着防止を目的にヒアルロン酸を有効成分とする癒着防止剤を、これを必要とする個体に塗布、撒布又は付着することなどで処理することを意味する。
【００５２】
本発明の癒着防止用組成物は体内どこにでも投与することができるが、開腹手術、婦人科手術及び開胸術において、腹腔及び胸腔内の各種磁気、腱外膜、頭蓋骨、神経及び眼球、整形外科手術で腱と靭帯、及び神経外科手術で境膜に投与することができる。
【００５３】
さらに、本発明の癒着防止用組成物はこれに制限はされないが、ゲル、フィルム及び膜の形態で使用することができる。
【発明の効果】
【００５４】
以上説明した通り、本発明は体内低分解速度を有するヒアルロン酸の製造方法、及び前記方法で製造されたヒアルロン酸を含む癒着防止用組成物を提供する。本発明の製造方法で製造されたヒアルロン酸は、350万Da乃至1000万Daの高分子ヒアルロン酸であって、体内分解速度が遅く、癒着防止効果が優れている。従って、本発明の製造方法で製造されたヒアルロン酸を含む本発明の癒着防止用組成物は、癒着防止効果に優れ架橋されていないヒアルロン酸を使用することにより、既存の架橋剤及び化合物を含む癒着防止用組成物が有する問題点、及び既存のヒアルロン酸が有する問題点を取除くことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、分子量による癒着防止効能の差を見るために開腹をした状態の写真である。
【図２】図２は、経時によるヒアルロン酸の分解速度比較を示した図である。（Ｙ軸：粘度(cP)、Ｘ軸：分(min))
【発明を実施するための形態】
【００５６】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
【００５７】
但し、前記実施例は本発明を例示するのみであって本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００５８】
<実施例１>
分子量による癒着防止効果実験
ＳＤラット(female,SPF,（株）オリエントバイオ)を吸込み式で麻酔して、手術する間継続して麻酔した。四肢を手術台に固定して、腹部の毛を剃刀で取除き消毒後ハサミで腹部を開腹した。盲腸を取出して荒いガーゼで血痕がガーゼにつく程に傷を明渡し、盲腸があった位置の腹壁又は同じ方法で盲腸と内腹膜壁との癒着が起こる条件を作った。試料を処理後縫合して、２週間飼育後開腹して、癒着の如何を確認した。試料は平均分子量300万Daのヒアルロン酸と400万Da及び600万Daのヒアルロン酸をリン酸ナトリウム緩衝溶液に溶かして使用し、無菌状態を維持した。
【００５９】
300万Daのヒアルロン酸を利用して癒着防止効能を確認した結果、腸と腹壁間に癒着が発生したことを確認することができ、400万Da以上では癒着を発見することができなかった。従って、400万Da乃至600万Daのヒアルロン酸で癒着防止効能があることを確認した（図１）。
【００６０】
<実施例２>
高分子ヒアルロン酸生産のための基本培養条件
-72℃の冷凍機で保管されたストレプトコカスディスカラクティーエID9103菌株培養液4mlを急速解凍して、5.2%ブレインハートインフュージョン個体培地に塗抹して37で24時間培養後、縦横1cm2の面積で生育されたコロニーを切り出して、3%のトドフュイトブロス(Todd-Hewitt  broth)滅菌液体培地(heart,infusion  0.31%,neopeptone  2%,dextropse  0.2%,Disodium  phosphate  0.04%,sodium  carbonate  0.25%;BD社，米国)40mlに接種した。
【００６１】
37,150rpmで振盪培養した40mlを１次種菌培養液に使用した。対数増殖段階の６時間培養状態で無菌的に１次種菌液を3%トドフュイトブロス滅菌液体培地(40ml,pH7.8)３個に接種した。培養条件は、37.150rpmで20時間以上無菌的に培養することにより、２次種菌培養液に使用した。この時、終了した２次種菌培養液は6.40.2のpH状態を維持しており、OD(600)は0.350.05でなければならない。２次種菌培養液80mlを本培養培地に接種して40時間以上培養することにより、培地造成によるヒアルロン酸の生産性の差を観察して、爾後ヒアルロン酸の生産性増大のための条件を決定した。以上の培養工程は全て実施例で同一に適用された。
【００６２】
ヒアルロン酸を最適に生産するための本培養培地決定試験は、7.5L醗酵槽で3.5L培養液条件で実施した。培地造成は、ブドウ糖6%(w/v)、酵母エキス0.5%(w/v)、カゼインペプトン2%(w/v)、グルタミン0.06%(w/v)、グルコン酸ナトリウム0.1%(w/v)、蓚酸0.02%(w/v)、硫酸マグネシウム0.15%(w/v)、リン酸一水素二カリウム0.25%(w/v)、塩化ナトリウム0.5%(w/v)、アセト酸ナトリウム0.5%(w/v)、塩化二鉄0.007%(w/v)、アンモニウムモリブデン0.05%(w/v)、培養条件は、pH7.0,34の条件を基にした。
【００６３】
本発明で培養液内に存在するヒアルロン酸濃度はカバゾル方法(T,Bitter,Anal.Biochem.,1962,4,330-334)と濁度分析法(S,Jung-Min,Carbohyd,Polym.,2009,78,633-634)で二重確認した。
【００６４】
ヒアルロン酸の平均分子量は、ゲル濾過クロマトグラフィー法(Narlin  B.Beaty  et  al,Anal.Biochem.,1985,147,387-395)で求めた。分析条件は下記の通りである。カラムはToyo  Soda  TSK  gelG6000PWXLを使用し、移動相は150mM  NaCl,3mM  Na2HP04(pH7.0),0.02%  N2N2である。Detectionはrefrative  index  detector(Shodex;Showa  Denko  K.K.日本)を使用し、標準物質はpolyethylen  oxideを分子量別に2mg/ml濃度で調剤して使用した。前記培養条件で生産されたヒアルロン酸の濃度は7g/Lであり、分子量は300万Daと測定された。
【００６５】
<実施例３>
高分子ヒアルロン酸生産性及び分子量
窒素源は微生物の代謝において重要な役割をし、ヒアルロン酸の生産にも影響を及ぼすものとして知られている。従って、基本的に使用される窒素源であるペプトン類を含み、アミノ酸類の変更を通じて、得ようとする400万乃至600万Daのヒアルロン酸の生産に寄与できると判断された。
【００６６】
各ペプトン類によってヒアルロン酸の生産量と分子量に差があることを確認して、多くのペプトン類の内、基本培地源であるカゼイン（酵素加水分解物）が8g/Lを上回る生産量と432万Daの分子量を示し、最も良い結果を示したので、以下の実施例の試験でカゼインを同一に使用した。
【００６７】
基本培地であるグルタミンの代わりにアルギニンを添加した群の場合、ヒアルロン酸の生産量と分子量はそれぞれ8.53g/L以上、約483万Daの優れた結果を示した。
【００６８】
炭素源も同様に微生物成長と代謝で重要な役割をするばかりでなく、ヒアルロン酸の前駆体として使用されている。従って、炭素源の種類の変更は、400万乃至600万Daヒアルロン酸の生産に影響を与えると判断された。
【００６９】
基本培地であるブドウ糖の代わりに麦芽糖を添加した群の場合、8.72g/Lの生産量と約552万Daの分子量ヒアルロン酸を生産し、優れた結果を示した。
【００７０】
金属イオンは微生物の細胞内でDNAの発現や酵素の活性などによる多様な役割をしていると知られている。従って、ヒアルロン酸の生産において、関与している酵素やDNAの活性化及び発現に影響を与えるものと期待して、多様な金属イオンなどを試験した。
【００７１】
亜鉛を添加した群の場合、9.42g/Lの生産量と約598万Daの分子量ヒアルロン酸を生産し、優れた結果を示した。
【００７２】
【表１】
0006370002.tif 000002
【００７３】
<実施例４>
ヒアルロン酸の体内分解速度比較実験
体内でヒアルロン酸を分解する酵素であるヒアルロニダーゼ(hyaluronidase)を利用して、300万Da、400万Da及び600万Daのヒアルロン酸に対する分解速度比較実験を行った。分解速度比較実験は粘度測定値(cP)を利用し、ヒアルロニダーゼ混合前後の粘度測定は、値の差を通じてヒアルロン酸の分解程度を比較した。粘度測定はBrookfield  Difital  Viscometer  LVDV-1+(Brookfield,USA)で実施し、spindle  31,0.3RPM,25で測定した。その結果を表２と図２に示す。
【００７４】
【表２】
0006370002.tif 000003
【００７５】
表２及び図２において、300万Daのヒアルロン酸の粘度減少率(27.5%)は、400万Da及び600万Daのヒアルロン酸と比べて大きかった。一方、400万Da及び600万Daヒアルロン酸は、300万Daのヒアルロン酸に比べて粘度減少率が約３倍乃至４倍低く、体内分解速度がさらに遅いことが分かり、これにより体内で粘度を一定水準に維持するものと確認された。従って、本発明の製造方法で製造された400万Da以上の分子量を有するヒアルロン酸は、体内低分解速度を有し、好ましくは400万Da乃至600万Daの分子量を有するヒアルロン酸が、癒着防止効果に優れていた。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明は、体内低分解速度を有するヒアルロン酸の製造方法及び前記方法で製造されたヒアルロン酸を含む癒着防止用組成物を提供する。本発明の製造方法で製造されたヒアルロン酸は、350万Da乃至1000万Daの高分子ヒアルロン酸で、体内分解速度が遅く癒着防止効果が優れている。従って、本発明の製造方法で製造されたヒアルロン酸を含む本発明の癒着防止用組成物は、癒着防止効果に優れ架橋されていないヒアルロン酸を使用することにより、既存の架橋剤及び化合物を含む癒着防止用組成物が有する問題点及び既存のヒアルロン酸が有する問題点を改善することができ、産業上の利用可能性が高い。
【図１】
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【図２】
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