(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）酸性水溶液中で、複合体形成に十分な量の（i）脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する修飾された脂質であって、脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する前記修飾された脂質が、ポリエチレングリコール（PEG）-、PEG-セラミド-またはガングリオシド-修飾脂質である、修飾された脂質、および（ii）カチオン脂質を組み合わせること；
（b）陰イオン性薬剤と工程（a）の複合体を組み合わせること；
（c）工程（b）の複合体-陰イオン性薬剤と中性水溶液を組み合わせて、複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液を形成すること；
（d）アルコールと、中性脂質、ステロール、カチオン脂質および脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する修飾された脂質からなる群より選択される少なくとも1つの脂質とを含む溶液または懸濁液を形成することであって、脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する前記修飾された脂質が、ポリエチレングリコール（PEG）-、PEG-セラミド-またはガングリオシド-修飾脂質である；および
（e）工程（c）の複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液に工程（d）の溶液または懸濁液を添加し、それにより、前記複合体-陰イオン性薬剤を、工程（d）の溶液または懸濁液由来の低い濃度のアルコールに初めに暴露させ、より多くの工程（d）の溶液または懸濁液が工程（c）の複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液に添加されるにつれて、徐々に増加する濃度のアルコールに暴露させること
を含み、これらにより陰イオン性薬剤を含む粒子を製造する、陰イオン性薬剤を含む粒子を製造する方法。
【請求項２】
工程（a）の前記酸性水溶液は、HClを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
工程（a）の前記酸性水溶液が4より低いpHを有する、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
工程（a）の前記酸性水溶液は、約60mM HClである、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
工程（a）の前記カチオン脂質は、プロトン付加可能な基を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
工程（a）の前記カチオン脂質が4〜11のpKaを有する、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
工程（a）の前記カチオン脂質は、DODMA、DOTMAおよび表1のカチオン脂質からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
工程（a）または工程（d）の前記脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する修飾された脂質は、PEG-脂質である、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
工程（a）または工程（d）の前記修飾された脂質は、DMPE-PEG、DSPE-PEGおよびDSG-PEGからなる群より選択されるPEG-修飾脂質である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記PEGは、PEG2kである、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
工程（a）の複合体が直径60〜75nMである、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
工程（b）の前記陰イオン性薬剤は、ポリアニオン系薬剤である、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記陰イオン性薬剤は、核酸である、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび二本鎖の核酸からなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記二本鎖の核酸は、小さなヘアピンRNA（shRNA）およびsiRNAからなる群より選択される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記二本鎖の核酸は、ヒトDicerの基質である、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
工程（c）の前記中性水溶液は、水である、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
工程（d）の前記溶液または懸濁液を形成することは、中性脂質、ステロール、カチオン脂質および脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する修飾された脂質からなる群より選択される少なくとも1つの前記脂質をエタノール中に溶解することを含み、
脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する前記修飾された脂質が、ポリエチレングリコール（PEG）-、PEG-セラミド-またはガングリオシド-修飾脂質である、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
工程（d）の前記溶液または懸濁液を形成することは、100%エタノール中に溶解することを含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
工程（d）の前記中性脂質は、DSPC、DPPCおよびDOPCからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
前記ステロールは、コレステロールである、請求項1に記載の方法。
【請求項２２】
工程（d）の前記カチオン脂質は、表1から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項２３】
陰イオン性薬剤を含む前記粒子は、直径90〜110nmである、請求項1に記載の方法。
【請求項２４】
陰イオン性薬剤を含む前記粒子は、10mgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、50mgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、100mgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、250mgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、500mgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、1gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、2gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、3gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、4gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、5gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、7.5gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、10gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、20gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、40gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、50gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、100gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、200gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、300gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、400gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、500gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、1kgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、2kgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、3kgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、4kgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、5kgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤および10kgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤からなる群より選択されるスケールにて作製される、請求項1に記載の方法。
【請求項２５】
工程（d）の溶液または懸濁液に工程（c）の複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液を添加することによって工程（c）の複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液と工程（d）の溶液または懸濁液を組み合わせることを含む適切な対照方法によって形成される適切な対照粒子と比較して、陰イオン性薬剤を含む前記粒子は、改善されたサイズおよび／またはPDI、前記粒子を投与された被験体における改善された有効性および前記粒子を投与された被験体における改善された耐容性からなる群より選択される特性を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項２６】
以下の工程：
（f）組み合わせた溶液内のエタノール濃度を10%またはそれ以下まで減少させるのに十分な容積の水と陰イオン性薬剤を含む粒子を組み合わせること
をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２７】
以下の工程：
（g）前記組み合わせた溶液に対し、タンジェンシャルフロー・フィルトレーション（TFF）および透析からなる群より選択されるプロセスを行うこと
をさらに含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記組み合わせた溶液は、PBSに対して透析される、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
（a）酸性水溶液中で、複合体形成に十分な量の（i）脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する修飾された脂質であって、脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する前記修飾された脂質が、ポリエチレングリコール（PEG）-、PEG-セラミド-またはガングリオシド-修飾脂質である、修飾された脂質、および（ii）カチオン脂質を組み合わせること；
（b）陰イオン性薬剤と工程（a）の複合体を組み合わせること；
（c）工程（b）の複合体-陰イオン性薬剤と中性水溶液を組み合わせて、複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液を形成すること；
（d）アルコールと、中性脂質、ステロール、カチオン脂質および脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する修飾された脂質からなる群より選択される少なくとも1つの脂質とを含む溶液または懸濁液を形成することであって、脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する前記修飾された脂質が、ポリエチレングリコール（PEG）-、PEG-セラミド-またはガングリオシド-修飾脂質である；および
（e）インライン混合することにより工程（c）の複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液に工程（d）の溶液または懸濁液を添加し、それにより、前記複合体-陰イオン性薬剤を、工程（d）の溶液または懸濁液由来の低い濃度のアルコールに初めに暴露させ、より多くの工程（d）の溶液または懸濁液が工程（c）の複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液に添加されるにつれて、徐々に増加する濃度のアルコールに暴露させること
を含み、これらにより陰イオン性薬剤を含む粒子を製造する、陰イオン性薬剤を含む粒子を製造する方法。
【請求項３０】
第1の脂質またはステロール、第2の脂質またはステロールおよび陰イオン性薬剤を含む粒子を製造する方法であって、
（a）酸性水溶液中で、複合体形成に十分な量の（i）脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する修飾された脂質であって、脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する前記修飾された脂質が、ポリエチレングリコール（PEG）-、PEG-セラミド-またはガングリオシド-修飾脂質である、修飾された脂質、および（ii）カチオン脂質を組み合わせること
（b）陰イオン性薬剤と工程（a）の複合体を組み合わせること；
（c）工程（b）の複合体-陰イオン性薬剤と中性水溶液を組み合わせて、複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液を形成すること；
（d）アルコールを含む溶媒と第2の脂質またはステロールを組み合わせて、前記溶媒における第2の脂質またはステロール溶液を形成することであって、前記溶媒は、前記第1の脂質またはステロールを含まない；および
（e）前記第1の脂質またはステロールと前記溶媒における前記第2の脂質またはステロール溶液を組み合わせて、第2の脂質またはステロールおよび第1の脂質またはステロールの溶液を形成すること；
（f）工程（c）の複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液と工程（e）の第2の脂質またはステロールおよび第1の脂質またはステロールの溶液を組み合わせ、それにより、前記複合体-陰イオン性薬剤を、前記溶媒由来の低い濃度のアルコールに初めに暴露させ、より多くの工程（e）の溶液が工程（c）の複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液に添加されるにつれて、徐々に増加する濃度のアルコールに暴露させること；
を含み、これらにより第1の脂質またはステロール、第2の脂質またはステロールおよび陰イオン性薬剤を含む粒子を製造する、方法。
【請求項３１】
工程（e）において、前記第2の脂質またはステロールの存在下での前記溶媒における前記第1の脂質またはステロールの溶解度は、前記第2の脂質またはステロールの非存在下での前記溶媒における前記第1の脂質またはステロールの溶解度より高い、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
第2の脂質またはステロールおよび第1の脂質またはステロールの前記溶液は、構造的な脂質、ステロール、カチオン脂質および脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する修飾された脂質からなる群より選択される少なくとも1つの脂質を含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３３】
前記第2の脂質またはステロールが前記溶媒に曝露される前に、前記溶媒に前記第1の脂質またはステロールを曝露することを含む適切な対照プロセスによって形成される適切な対照粒子と比較して、前記粒子は、改善されたサイズおよび／またはPDI、前記粒子を投与された被験体における改善された有効性および前記粒子を投与された被験体における改善された耐容性からなる群より選択される特性を有する、請求項30に記載の方法。
【請求項３４】
前記陰イオン性薬剤は、核酸である、請求項30に記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび二本鎖の核酸からなる群より選択される、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
前記二本鎖の核酸は、小さなヘアピンRNA（shRNA）およびsiRNAからなる群より選択される、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記二本鎖の核酸は、ヒトDicerの基質である、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
工程（f）は、工程（c）の複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液に工程（d）の第2の脂質またはステロールおよび第1の脂質またはステロールの溶液を添加すること、並びに工程（d）の第2の脂質またはステロールおよび第1の脂質またはステロールの溶液と工程（c）の複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液とをインライン混合することからなる群より選択される方法によって行われる、請求項30に記載の方法。
【請求項３９】
工程（d）の溶液または懸濁液は、中性脂質、ステロール、カチオン脂質および脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する修飾された脂質からなる群より選択される少なくとも1つの脂質をエタノール中に溶解することによって形成される、請求項29に記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも1つの脂質は、中性脂質、ステロール、カチオン脂質およびおよび修飾された脂質を含む、請求項1または29に記載の方法。
【請求項４１】
前記中性脂質は、DSPC、DPPCおよびDOPCからなる群より選択される、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
工程（a）および／または工程（d）のカチオン脂質は、下記式を有する、請求項40に記載の方法：
【化１】
0006440679.tif 000043
（式中、それぞれのR1およびR2は、独立して、任意に置換されたC11-24アルキル、任意に置換されたC11-24アルケニル、任意に置換されたC11-24アルキニル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルキル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルケニルまたは任意に置換されたC11-24ヘテロアルキニルである；それぞれのn1およびn2は、独立して、0〜2の整数である；およびR5は、H、任意に置換されたC1-6アルキルおよび任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択される）。
【請求項４３】
工程（a）および／または工程（d）のカチオン脂質は、下記式を有する、請求項40または41に記載の方法：
【化２】
0006440679.tif 000044
（式中、それぞれのR1およびR2は、独立して、任意に置換されたC11-24アルキル、任意に置換されたC11-24アルケニル、任意に置換されたC11-24アルキニル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルキル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルケニルまたは任意に置換されたC11-24ヘテロアルキニルである；R3は、Hまたは任意に置換されたC1-6アルキルである；L1は、任意に置換されたC1-6アルキレンである；およびそれぞれのR5およびR6は、独立して、Hまたは任意に置換されたC1-6アルキルであるか、または、R5およびR6は結合して任意に置換されたC3-7ヘテロシクリルを形成する）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、「陰イオン性薬剤を製剤化するための方法」と表題を付けられ、2013年3月14日に出願された米国仮出願番号第61/784,810号からの優先権を請求し、その全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
核酸分子は、これらのサイズおよび親水性のため、細胞膜を容易に横切ることができない。したがって、送達は、核酸治療、たとえば、アンチセンスペイロードおよびRNAi技術のための主な挑戦の1つであった。全身投与後にRNase H活性またはRNAi活性を引き起こすため、核酸分子を含む製剤は、(1)ペイロードを酵素的および非酵素的分解から保護し、かつ(2)製剤の適切な体内分布を提供するだけでなく、（3）製剤の細胞の取り込みまたは内部移行を可能にし、かつ（4）細胞の細胞質への核酸ペイロードの送達を容易にしなければならない。上記基準1および2において優れている多くの製剤は基準3および4において不十分であり、したがって、多くの核酸製剤は優れた体内分布を示すが、全身送達および局所的送達の欠如のために標的遺伝子をノックダウンすることができない。
【０００３】
近年、多数の脂質に基づいた製剤が少なくとも一定のタイプの哺乳動物細胞（たとえば、哺乳動物肝細胞）への核酸ペイロードの細胞内送達を達成することが証明されたが、このような製剤の脂質、ペイロードおよびその他の成分を組み合わせることの正確な比率および方法は、核酸ペイロードの良好な送達が達成される程度に非常に影響する可能性がある。したがって、このような脂質に基づいた製剤を得るために使用されるプロセスにおける適度の変化は、送達有効性において劇的な、および驚くべき相違を作り出す潜在性を有する。したがって、核酸ペイロードの脂質に基づいた製剤（および、拡大解釈すれば、さらに一般的には陰イオン性薬剤）を得るプロセスを最適化する必要があり、それによって、このような治療的な陰イオン性薬剤の細胞への送達を増強する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、部分的に少なくとも、陰イオン性薬剤、たとえば、核酸などの陰イオン性の治療的薬剤を製剤化する方法に関する。本発明の特定の側面において、陰イオン性薬剤（たとえば、核酸ペイロード）を含む脂質含有粒子を調製するためのプロセスが同定され、それは、このような成分の添加順序のため、混合液の総脂質溶媒濃度が増加するか、または長い間下降せずに安定に保持され、結果として、改善された構造的な等質性および陰イオン性薬剤の細胞内送達の改善された有効性を有する製剤化された粒子になるという条件下で、陰イオン性薬剤と脂質複合体とを組み合わせることを含む。（理論によって拘束されることを望まないが、脂質複合体および陰イオン性薬剤を混合するプロセスの間に脂質溶媒濃度の下降を招くプロセスと比較すると、改善された構造的な等質性は、混合プロセスの間の脂質複合体溶解における還元の結果として生じるようにみえる。）理論に拘束されることを望まずに、本発明の方法の少なくとも1つの利点は、これらがその他のプロセスより拡張性があることであり、たとえば臨床試験および／または商業的販売の実行のために、十分な量での改善された粒子の形成/製剤化を可能にする。
【０００５】
本発明のその他の側面において、プロセスが提供され、それは、相対的に低い溶解性の脂質またはステロールに対して油または溶媒におけるその他の脂質および／またはステロールの混合液を添加する前に、溶媒において（または、任意に、単に純粋な脂質油または脂質油の混合液において）その他の脂質および／またはステロールを共に混合すること、任意に、溶媒におけるこのような脂質および／またはステロールの懸濁液をさらに混合することによって、室温において、溶媒（たとえば、エタノールまたはアルコールまたは有機溶液またはそれらの混合液）における個々の脂質またはステロールが有する相対的に低い溶解限度を効率的に上げることができるという、驚くべき観察に基づいている。たとえば、その他の脂質および／またはステロールの非存在下では室温のエタノールにおけるコレステロールの溶解限度は約10〜11mg/mlであることが観察されたが、本明細書において記述するように、室温のエタノール中でこのような脂質懸濁液をコレステロール（粉末として）に添加する前に、エタノール中でさらなる脂質を予備混合することは、溶液において20mg/mlまたはそれ以上のコレステロールレベルの達成を可能にし、一方でこのような溶液の総脂質含有量は、37mg/ml、74mg/mlまたはより高いレベルにさえ上げることができることが予想外に発見された。したがって、本来の溶解度が限られた脂質、ステロールおよび／または脂質のブレンドにこのような予備混合物を添加する前に、油として、粉末としておよび／または溶媒におけるその他の脂質、ステロール並びに／または脂質および／もしくはステロールのブレンドを予備混合し、これによって効率的に溶媒における本来の脂質の溶解限度を上げることにより、本来の脂質、ステロール並びに／または脂質および／もしくはステロールのブレンドの量を上げるプロセスが提供され、これらは溶媒（たとえば、アルコール溶媒、たとえばエタノール）において可溶化されてもよい。一定の関連した態様において、本発明は、油として、粉末としておよび／または溶媒（たとえば、エタノール）における高い濃度の脂質および／またはステロール成分を予備混合すること、このような予備混合された脂質および／またはステロールの非存在下では溶媒における相対的に低い溶解度を有する脂質および／またはステロールにこの混合物を添加すること、並びに陰イオン性薬剤含有水溶液または懸濁液とこの混合物を組み合わせること（任意に、このような陰イオン性薬剤は、溶媒に懸濁された脂質のこのような添加の前に脂質と複合体化される）を含む、粒子を製造するプロセスを提供する。理論によって拘束されることを望まずに、このような脂質/ステロールが粒子製剤化プロセス内でルーチン的に使用される濃度と比較して、このような高い濃度にて脂質/ステロールの高濃度溶液を提供するための新しく発見された能力は、脂質-陰イオン性薬剤粒子集団の等質性を増強すると考えられる。
【０００６】
一つの側面において、本発明は、複合体形成に十分な量において、酸性水溶液中で、脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する修飾された脂質とカチオン脂質とを組み合わせること；陰イオン性薬剤とこの複合体を組み合わせること；中性水溶液と複合体-陰イオン性薬剤を組み合わせて、複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液を形成すること；少なくとも1つの構造的な脂質、ステロール、カチオン脂質または脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する修飾された脂質を含む溶液または懸濁液を形成すること；並びに複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液に溶液もしくは懸濁液を添加することまたは溶液もしくは懸濁液と複合体-陰イオン性薬剤水溶液とをインライン混合することのいずれかを含む方法によって、前の工程の複合体-陰イオン性薬剤水溶液とこの溶液または懸濁液を組み合わせることを含む、陰イオン性薬剤を収容する粒子を製造する方法を提供する。
【０００７】
一定の態様において、酸性水溶液は、HClを含む。任意に、酸性水溶液は、4より低いpH、一定の態様において2.3、を有する。関連した態様において、酸性水溶液は、約60mM HClである。
【０００８】
一つの態様において、酸性水溶液において存在するカチオン脂質は、プロトン付加可能な基を有する。任意に、このカチオン脂質は、4〜11のpKaを有する。一定の態様において、このカチオン脂質は、DODMA、DOTMAまたは表1のカチオン脂質である。
【０００９】
一定の態様において、脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する修飾された脂質は、PEG-脂質、任意にDMPE-PEG、DSPE-PEGまたはDSG-PEGである。関連した態様において、PEGは、PEG2kである。
【００１０】
いくつかの態様において、修飾された脂質-カチオン脂質複合体は、直径60〜75nMである。
【００１１】
一定の態様において、陰イオン性薬剤は、ポリアニオン系薬剤である。関連した態様において、陰イオン性薬剤は、核酸である。任意に、核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは二本鎖の核酸である。一定の態様において、二本鎖の核酸は、低分子ヘアピンRNA（shRNA）またはsiRNAである。関連した態様において、二本鎖の核酸は、ヒトDicerの基質であり、および任意にDsiRNAである。
【００１２】
いくつかの態様において、中性水溶液は、水である。
【００１３】
一定の態様において、少なくとも1つの構造的な脂質、ステロール、カチオン脂質または脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する修飾された脂質を含む溶液または懸濁液を形成することは、エタノールにおいて少なくとも1つの脂質を溶解することを含む。任意に、この溶液または懸濁液を形成することは、100%エタノールにおいて脂質またはステロールを溶解することを含む。関連した態様において、構造的な脂質は、DSPC、DPPCまたはDOPCである。一定の態様において、ステロールは、コレステロールである。
任意に、カチオン脂質は、表1から選択される。
【００１４】
一定の態様において、陰イオン性薬剤を収容する粒子は、直径90〜110nmである。
【００１５】
一つの態様において、陰イオン性薬剤を収容する粒子は、10mgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、50mgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、100mgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、250mgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、500mgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、1gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、2gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、3gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、4gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、5gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、7.5gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、10gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、20gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、40gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、50gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、100gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、200gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、300gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、400gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、500gまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、1kgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、2kgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、3kgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、4kgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤、5kgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤または10kgまたはそれ以上の陰イオン性薬剤のスケールにて作製される
【００１６】
もう一つの態様において、陰イオン性薬剤を収容する粒子は、以下の特性の1つまたは複数を有する：溶媒ベース溶液または懸濁液に複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液を添加することを含む適切な対照プロセスによって形成される適切な対照粒子と比較して、改善されたサイズおよび／またはPDI、粒子を投与された被験体における改善された有効性または粒子を投与された被験体における改善された耐容性。
【００１７】
さらなる態様において、本方法は、組み合わせた溶液内のエタノール濃度を10%またはそれ以下まで減少させるのに十分な容積の水と陰イオン性薬剤を収容する粒子を組み合わせることをさらに含む。
【００１８】
もう一つの態様において、本方法はまた、以下のプロセスの1つを行うことを含む：組み合わせた溶液に対し、タンジェンシャルフロー・フィルトレーション（TFF）または透析。任意に、組み合わせた溶液は、PBSに対して透析される。
【００１９】
本発明のもう一つの側面は、陰イオン性薬剤を収容する粒子を産生する方法を提供し、それは、複合体形成に十分な量で、カチオン脂質と脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する修飾された脂質を酸性水溶液において組み合わせること；陰イオン性薬剤とこの複合体を組み合わせること；中性水溶液とこの複合体-陰イオン性薬剤を組み合わせて、複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液を形成すること；構造的な脂質、ステロール、カチオン脂質または脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する修飾された脂質の少なくとも1つを有する溶液または懸濁液を形成すること；および複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液にこの溶液または懸濁液を添加することを含む。
【００２０】
本発明のさらなる側面は、溶媒における第1の脂質またはステロールの溶解度を増加させる方法を提供し、それは、溶媒と第2の脂質またはステロールを組み合わせて、溶媒における第2の脂質またはステロール溶液を形成することであって、溶媒は、第1の脂質を含まない；並びに第1の脂質またはステロールと溶媒における第2の脂質またはステロール溶液を組み合わせて、第2の脂質またはステロールおよび第1の脂質またはステロールの溶液を形成することであって、第2の脂質またはステロールの存在下での溶媒における第1の脂質またはステロールの溶解度は、第2の脂質またはステロールの非存在下での溶媒における第1の脂質またはステロールの溶解度より高いことを含む。
【００２１】
本発明のさらなる側面は、溶媒における第1の脂質またはステロールの溶解度を増加させる方法を提供し、それは、または溶媒の非存在で第1の脂質またはステロールと第2の脂質またはステロールを組み合わせることを含み、第2の脂質またはステロールの存在下での溶媒における第1の脂質またはステロールの溶解度は、第2の脂質またはステロールの非存在下での溶媒における第1の脂質またはステロールの溶解度より高い。
【００２２】
一つの態様において、第1の脂質またはステロールは、ステロール、任意に、コレステロール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、3β-[-（N-（N',N'-ジメチルアミノエタン）-カルバモイル］コレステロール（DC-コレステロール）またはビス-グアニジウム-トレン-コレステロール（BGTC）である。
【００２３】
もう一つの態様において、第1の脂質またはステロールは、第2の脂質またはステロールおよび第1の脂質またはステロールの溶液内で、10mg/mlまたはそれ以上、11mg/mlまたはそれ以上、12mg/mlまたはそれ以上、15mg/mlまたはそれ以上、20mg/mlまたはそれ以上、25mg/mlまたはそれ以上、30mg/mlまたはそれ以上、35mg/mlまたはそれ以上、37mg/mlまたはそれ以上、40mg/mlまたはそれ以上、45mg/mlまたはそれ以上、50mg/mlまたはそれ以上、55mg/mlまたはそれ以上、60mg/mlまたはそれ以上、65mg/mlまたはそれ以上、70mg/mlまたはそれ以上、74mg/mlまたはそれ以上、75mg/mlまたはそれ以上、80mg/mlまたはそれ以上、85mg/mlまたはそれ以上、90mg/mlまたはそれ以上、95mg/mlまたはそれ以上、100mg/mlまたはそれ以上、150mg/mlまたはそれ以上、200mg/mlまたはそれ以上、250mg/mlまたはそれ以上、500mg/mlまたはそれ以上または1g/mlまたはそれ以上の濃度にて存在する。
【００２４】
一つの態様において、第2の脂質またはステロールおよび第1の脂質またはステロールの溶液の総脂質含有量は、12mg/mlまたはそれ以上、15mg/mlまたはそれ以上、20mg/mlまたはそれ以上、25mg/mlまたはそれ以上、30mg/mlまたはそれ以上、35mg/mlまたはそれ以上、37mg/mlまたはそれ以上、40mg/mlまたはそれ以上、45mg/mlまたはそれ以上、50mg/mlまたはそれ以上、55mg/mlまたはそれ以上、60mg/mlまたはそれ以上、65mg/mlまたはそれ以上、70mg/mlまたはそれ以上、74mg/mlまたはそれ以上、75mg/mlまたはそれ以上、80mg/mlまたはそれ以上、85mg/mlまたはそれ以上、90mg/mlまたはそれ以上、95mg/mlまたはそれ以上、100mg/mlまたはそれ以上、150mg/mlまたはそれ以上、200mg/mlまたはそれ以上、250mg/mlまたはそれ以上、500mg/mlまたはそれ以上または1g/mlまたはそれ以上である。
【００２５】
一つの態様において、溶媒における第2の脂質またはステロール溶液は、表1〜4の1つまたはそれ以上のさらなる脂質を含む。
【００２６】
もう一つの態様において、第2の脂質またはステロールおよび第1の脂質またはステロールの溶液は、構造的な脂質、ステロール、カチオン脂質または脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する修飾された脂質の少なくとも1つを含む。
【００２７】
本発明のもう一つの側面は、第1の脂質またはステロール、第2の脂質またはステロールおよび小分子を有する粒子を製造する方法を提供し、それは、溶媒と第2の脂質またはステロールを組み合わせて、溶媒における第2の脂質またはステロール溶液を形成することであって、溶媒は、第1の脂質またはステロールを含まない；並びに第1の脂質またはステロールと溶媒における第2の脂質またはステロール溶液を組み合わせて、第2の脂質またはステロールおよび第1の脂質またはステロールの溶液を形成することであって、第2の脂質またはステロールの存在下での溶媒における第1の脂質またはステロールの溶解度は、第2の脂質またはステロールの非存在下での溶媒における第1の脂質またはステロールの溶解度より高い；次いで、小分子と、この第2の脂質またはステロールおよび第1の脂質またはステロールの溶液を組み合わせることを含む。
【００２８】
本発明のさらなる側面は、第1の脂質またはステロール、第2の脂質またはステロールおよび陰イオン性薬剤を有する粒子を製造する方法を提供し、それは、溶媒と第2の脂質またはステロールを組み合わせて、溶媒における第2の脂質またはステロール溶液を形成することであって、溶媒は、第1の脂質またはステロールを含まない；並びに第1の脂質またはステロールと溶媒における第2の脂質またはステロール溶液を組み合わせて、第2の脂質またはステロールおよび第1の脂質またはステロールの溶液を形成することであって、第2の脂質またはステロールの存在下での溶媒における第1の脂質またはステロールの溶解度は、第2の脂質またはステロールの非存在下での溶媒における第1の脂質またはステロールの溶解度より高い；次いで、陰イオン性薬剤と、この第2の脂質またはステロールおよび第1の脂質またはステロールの溶液を組み合わせることを含む。
【００２９】
さらなる側面において、本発明は、第1の脂質またはステロール、第2の脂質またはステロールおよび陰イオン性薬剤を有する粒子を製造する方法を提供し、それは、複合体形成に十分な量において、脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する修飾された脂質およびカチオン脂質を酸性水溶液において組み合わせること；陰イオン性薬剤とこの複合体を組み合わせること；複合体-陰イオン性薬剤と中性水溶液を組み合わせて、複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液を形成すること；溶媒と第2の脂質またはステロールを組み合わせて、溶媒における第2の脂質またはステロール溶液を形成することであって、溶媒は、第1の脂質またはステロールを含まない；第1の脂質またはステロールと、溶媒における第2の脂質またはステロール溶液を組み合わせて、第2の脂質またはステロールおよび第1の脂質またはステロールの溶液を形成すること；並びに複合体-陰イオン性薬剤水溶液と、第2の脂質またはステロールおよび第1の脂質またはステロールの溶液を組み合わせることを含む。
【００３０】
一定の態様において、第2の脂質またはステロールの存在下での溶媒における第1の脂質またはステロールの溶解度は、第2の脂質またはステロールの非存在下での溶媒における第1の脂質またはステロールの溶解度より高い。
【００３１】
一つの態様において、第2の脂質またはステロールおよび第1の脂質またはステロールの溶液は、構造的な脂質、ステロール、カチオン脂質または脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する修飾された脂質の少なくとも1つを含む。
【００３２】
もう一つの態様において、粒子は、以下の特性の少なくとも1つを有する：第2の脂質またはステロールが溶媒に曝露される前に、溶媒に第1の脂質またはステロールを曝露することを含む適切な対照プロセスによって形成される適切な対照粒子と比較して、改善されたサイズおよび／またはPDI、粒子を投与された被験体における改善された有効性または粒子を投与された被験体における改善された耐容性および／または減少した毒性。
【００３３】
一定の態様において、第2の脂質もしくはステロールおよび第1の脂質もしくはステロールの溶液は複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液に添加され、または第2の脂質もしくはステロールおよび第1の脂質もしくはステロールの溶液と複合体-陰イオン性薬剤水溶液とはインライン混合される。
【００３４】
一定の態様において、溶媒における第1の脂質またはステロールの溶解度は、最初に第1の脂質またはステロールの溶解限度より低い濃度にて溶媒に第1の脂質またはステロールを添加し、次いで溶液に第2の脂質またはステロールを添加し、および次いで、溶液に第1の脂質またはステロールを添加して、第1の脂質またはステロールが第2の脂質/ステロール含有溶液において、第2の脂質またはステロールのこのような添加がない場合の溶媒における第1の脂質またはステロールの本来の溶解限度を超える濃度を達成するように添加されることによって、効率的に上げることができるとも考えられる。
【００３５】
一つの側面において、本発明は、下記式を有する化合物（たとえば、脂質またはカチオン脂質）を特徴とする：
【化１】
0006440679.tif 000002
【００３６】
（I）またはその薬学的に許容される塩であって、式中、それぞれのR1およびR2は、独立して、任意に置換されたC11-24アルキル、任意に置換されたC11-24アルケニル、任意に置換されたC11-24アルキニル、任意に置換C11-24ヘテロアルキル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルケニルまたは任意に置換されたC11-24ヘテロアルキニルであり、式中、R1およびR2は、＞CHNR3R4に隣接する炭素上においてオキソで置換されない；R3は、Hまたは任意に置換されたC1-6アルキルである；およびR4は、-NR4aR4bで置換される非置換のC1-6アルキル、-NR4aR4bでさらに置換された置換C1-6アルキル、または任意に置換されたC3-7ヘテロシクリルであり、式中、それぞれのR4aおよびR4bは、独立して、H、C（=NH）NH2または任意に置換されたC1-6アルキル、または式中、R4aおよびR4bが共に組み合わせられて、任意に置換されたC3-7ヘテロシクリルを形成する；および式中、R3およびR4が共に組み合わせられて、任意に置換されたC3-7ヘテロシクリルを形成する；式中、R3およびR4は共に組み合わせられず、任意に置換されたイミダゾリルまたは任意に置換されたベンズイミダゾリルまたは任意に置換されたスクシンイミジルを形成する；式中、1個のおよび1個だけの第一級アミンがR3またはR4のどちらかの上に存在することができ、または第一級アミンはR3またはR4の上のどちらにも存在しない；および式中、R3およびR4のどちらも任意に置換されたアミドでない；および式中、R1またはR2が飽和C11アルキルまたは飽和C15アルキルであるとき、R3はHではない；式中、R1またはR2が飽和C16アルキルまたは飽和C17アルキルであるとき、R1およびR2はヒドロキシで置換されない；式中、R1またはR2が飽和C17アルキルであるとき、R3またはR4はヒドロキシで置換されない；および式中、R1またはR2が飽和C18アルキルであるとき、R4は任意に置換されたイミダゾリルで置換されない。
【００３７】
いくつかの態様において、R3は、-NR3aR3bで置換されたC1-6アルキルであり、および式中、それぞれのR3aおよびR3bが、独立して、Hまたは任意に置換されたC1-6アルキルである。詳細な態様において、それぞれのR3aおよびR3bは、独立して、HまたはC1-6アルキルである。
【００３８】
いくつかの態様において、R4は、-NR4aR4bで置換された非置換のC1-6アルキルである。詳細な態様において、R4は、置換されたC1-6アルキル（たとえば、置換されたC1-3アルキル、置換されたC1-2アルキル、置換されたC1アルキル、置換されたC2アルキルまたは置換されたC3アルキル）または-NR4aR4bでさらに置換されたC1-6アミノアルキルである。いくつかの態様において、R4は、オキソで置換されたC1-6アルキルであり、および-NR4aR4bでさらに置換される。いくつかの態様において、R4aおよびR4bは共に組み合わせられて任意に置換されたC3-7ヘテロシクリル（たとえば、任意に置換されたピロリジニル、任意に置換されたイミダゾリジニル、任意に置換されたピラゾリジニル、任意に置換されたピペリジニル、任意に置換されたピペラジニル、任意に置換されたアゼパニル、任意に置換されたピロリル、任意に置換されたイミダゾリルまたは任意に置換されたピラゾリル）を形成する。いくつかの態様において、それぞれのR4aおよびR4bは、独立して、任意に置換されたC1-6アルキルである。いくつかの態様において、R4は、任意に置換されたC3-7ヘテロシクリル（たとえば、本明細書に記載のいずれか）で置換された非置換のC1-6アルキルである。いくつかの態様において、R4は、置換されたC1-6アルキル（たとえば、オキソで）または任意に置換されたC3-7ヘテロシクリル（たとえば、任意に置換されたピロリジニル、任意に置換されたイミダゾリジニル、任意に置換されたピラゾリジニル、任意に置換されたピペリジニル、任意に置換されたピペラジニル、任意に置換されたアゼパニル、任意に置換されたピロリル、任意に置換されたイミダゾリル、任意に置換されたピラゾリル、任意に置換されたピリジニル、任意に置換されたピラジニル、任意に置換されたピリミジニルまたは任意に置換されたピリダジニル）でさらに置換されたC1-6アミノアルキルである。
【００３９】
いくつかの態様において、R3およびR4は、共に組み合わせられて、任意に置換されたC3-7ヘテロシクリル（たとえば、任意に置換されたピロリジニル、任意に置換されたイミダゾリジニル、任意に置換されたピラゾリジニル、任意に置換されたピペリジニル、任意に置換されたピペラジニル、任意に置換されたアゼパニル、任意に置換されたピロリル、任意に置換されたイミダゾリル、任意に置換されたピラゾリル、任意に置換されたピリジニル、任意に置換されたピラジニル、任意に置換されたピリミジニルまたは任意に置換されたピリダジニル）を形成する。
【００４０】
いくつかの態様において、本化合物（たとえば、脂質またはカチオン脂質）は、下記式を有する：
【化２】
0006440679.tif 000003
【００４１】
（IIa）またはその薬学的に許容される塩であって、式中、それぞれのR1およびR2は、独立して、任意に置換されたC11-24アルキル、任意に置換されたC11-24アルケニル、任意に置換されたC11-24アルキニル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルキル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルケニルまたは任意に置換されたC11-24ヘテロアルキニルである；それぞれのn1およびn2は、独立して、0〜2の整数である（たとえば、n1およびn2は両方1であり、またはn1が1およびn2が2である）；およびR5は、H、任意に置換されたC1-6アルキルおよび任意に置換されたヘテロシクリル、（たとえば、非置換のC1-6-アルキル、または任意に置換されたピロリル、任意に置換されたイミダゾリル、任意に置換されたピラゾリル、任意に置換されたピリジニル、任意に置換されたピラジニル、任意に置換されたピリミジニルもしくは任意に置換されたピリダジニルで置換されたC1-6アルキル）からなる群より選択される。いくつかの態様において、本化合物は、L-2、L-5、L-6、L-22、L-23、L-24、L-25、L-26、L-28、L-29、L-45およびL-48からなる群より選択され、またはその薬学的に許容される塩である。
【００４２】
いくつかの態様において、本化合物（たとえば、脂質またはカチオン脂質）は、下記式を有する：
【化３】
0006440679.tif 000004
【００４３】
（IIb）またはその薬学的に許容される塩であって、式中、それぞれのR1およびR2は、任意に置換されたC11-24アルキル、任意に置換されたC11-24アルケニル、任意に置換されたC11-24アルキニル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルキル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルケニル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルキニルである；それぞれのn1およびn2は、独立して、0〜2の整数である（たとえば、n1およびn2は両方1であり、またはn1は1およびn2は2である）；およびR5は、H、任意に置換されたC1-6アルキルおよび任意に置換されたヘテロシクリル（たとえば、非置換のC1-6-アルキル、または任意に置換されたピロリル、任意に置換されたイミダゾリル、任意に置換されたピラゾリル、任意に置換されたピリジニル、任意に置換されたピラジニル、任意に置換されたピリミジニルもしくは任意に置換されたピリダジニルで置換されたC1-6アルキル）からなる群より選択される。いくつかの態様において、本化合物は、L-27およびL-47からなる群より選択され、またはその薬学的に許容される塩である。
【００４４】
本明細書において記述される任意の式（たとえば、式（I）、（IIa）および（IIb））のためのいくつかの態様において、R5は、-NR5aR5bで置換されたC1-6アルキルであり、式中、それぞれのR5aおよびR5bは、独立して、H、任意に置換されたC1-6アルキル（たとえば、任意に置換されたC1-6アルキル）であり、式中、R5aおよびR5bは共に組み合わせられて任意に置換されたC3-7ヘテロシクリルを形成することができる。いくつかの態様において、R5は、任意に置換されたヘテロシクリル（たとえば、任意に置換されたピロリジニル、任意に置換されたイミダゾリジニル、任意に置換されたピラゾリジニル、任意に置換されたピペリジニル、任意に置換されたピペラジニル、任意に置換されたアゼパニル、任意に置換されたピロリル、任意に置換されたイミダゾリル、任意に置換されたピラゾリル、任意に置換されたピリジニル、任意に置換されたピラジニル、任意に置換されたピリミジニルまたは任意に置換されたピリダジニル）である。
【００４５】
いくつかの態様において、本化合物（たとえば、脂質またはカチオン脂質）は、下記式を有する：
【化４】
0006440679.tif 000005
【００４６】
（IIc）またはその薬学的に許容される塩であって、式中、それぞれのR1およびR2は、任意に置換されたC11-24アルキル、任意に置換されたC11-24アルケニル、任意に置換されたC11-24アルキニル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルキル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルケニル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルキニルである；およびそれぞれのn1およびn2は、独立して、0〜2の整数である（たとえば、n1およびn2は両方1であり、またはn1は1およびn2は2である）。いくつかの態様において、本化合物は、L-46またはその薬学的に許容される塩である。
【００４７】
いくつかの態様において、本化合物（たとえば、脂質またはカチオン脂質）は、下記式を有する：
【化５】
0006440679.tif 000006
【００４８】
（IId）またはその薬学的に許容される塩であって、式中、それぞれのR1およびR2は、独立して、任意に置換されたC11-24アルキル、任意に置換されたC11-24アルケニル、任意に置換されたC11-24アルキニル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルキル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルケニルまたは任意に置換されたC11-24ヘテロアルキニルである；R3は、Hまたは任意に置換されたC1-6アルキルである；L1は、任意に置換されたC1-6アルキレンである；およびそれぞれのR5およびR6は、独立して、Hまたは任意に置換されたC1-6アルキルである、または式中、R5およびR6は結合して任意に置換されたC3-7ヘテロシクリルを形成する。
【００４９】
いくつかの態様において、本化合物（たとえば、脂質またはカチオン脂質）は、下記式を有する：
【化６】
0006440679.tif 000007
【００５０】
（IIe）またはその薬学的に許容される塩であって、式中、それぞれのR1およびR2は、独立して、任意に置換されたC11-24アルキル、任意に置換されたC11-24アルケニル、任意に置換されたC11-24アルキニル、任意に置換C11-24ヘテロアルキル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルケニルまたは任意に置換されたC11-24ヘテロアルキニルである；R3は、Hまたは任意に置換されたC1-6アルキルである；L1は、任意に置換されたC1-6アルキレンである；およびそれぞれのR5およびR6は、独立して、Hまたは任意に置換されたC1-6アルキルである、または式中、R5およびR6は結合して任意に置換されたC3-7ヘテロシクリルを形成する。
【００５１】
式（IId）または（IIe）のいくつかの態様において、R5およびR6は、結合して任意に置換されたピロリジニル、任意に置換されたイミダゾリジニル、任意に置換されたピラゾリジニル、任意に置換されたピペリジニル、任意に置換されたピペラジニルまたは任意に置換されたアゼパニルを形成する。
【００５２】
いくつかの態様において、化合物は、L-1、L-3、L-4、L-7、L-9、L-10、L-11、L-12、L-15、L-16、L-17、L-18、L-19、L-30、L-31、L-32、L-33、L-34、L-42、L-43およびL-49からなる群より選択され、またはその薬学的に許容される塩である。
【００５３】
いくつかの態様において、本化合物（たとえば、脂質またはカチオン脂質）は、下記式を有する：
【００５４】
【化７】
0006440679.tif 000008
（IIf）または
【化８】
0006440679.tif 000009
（IIg）またはその薬学的に許容される塩であって、式中、それぞれのR1およびR2は、独立して、任意に置換されたC11-24アルキル、任意に置換されたC11-24アルケニル、任意に置換されたC11-24アルキニル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルキル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルケニルまたは任意に置換されたC11-24ヘテロアルキニルである；R3は、Hまたは任意に置換されたC1-6アルキルである；L1は、任意に置換されたC1-6アルキレンである；それぞれのn3およびn4は、独立して、0〜2の整数である；およびR5は、Hまたは任意に置換されたC1-6アルキルである。
【００５５】
いくつかの態様において、本化合物は、L-14、L-21およびL-36からなる群より選択され、またはその薬学的に許容される塩である。
【００５６】
本明細書において記述される任意の式（たとえば、式（IId）〜（IIj）、たとえば、式（IId）〜（IIg））のいくつかの態様において、R3は、-NR3aR3b で置換されたC1-6アルキルであり、および式中、それぞれのR3aおよびR3bは、独立して、Hまたは任意に置換されたC1-6アルキルである。いくつかの態様において、R3は、非置換のC1-6アルキルである。
【００５７】
本明細書において記述される任意の式（たとえば、式（IId）〜（IIj）、たとえば、式（IId）〜（IIg））のいくつかの態様において、L1は、メチル、エチル、プロピルまたは-NRLaRLbで置換されるC1-6アルキレンであり、式中、それぞれのRLaおよびRLbは、独立して、Hまたは任意に置換されたC1-6アルキルである。
【００５８】
いくつかの態様において、本化合物（たとえば、脂質またはカチオン脂質）は、下記式を有する：
【化９】
0006440679.tif 000010
（IIh）またはその薬学的に許容される塩であって、式中、それぞれのR1およびR2は、独立して、任意に置換されたC11-24アルキル、任意に置換されたC11-24アルケニル、任意に置換されたC11-24アルキニル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルキル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルケニルまたは任意に置換されたC11-24ヘテロアルキニルである；R3は、Hまたは任意に置換されたC1-6アルキルである；L1は、任意に置換されたC1-6アルキレンである；およびR5は、Hまたは任意に置換されたC1-6アルキルである。
【００５９】
いくつかの態様において、L1は4位にてイミダゾリル基に連結される。
【００６０】
いくつかの態様において、本化合物は、L-8、L-13、L-20、L-35およびL-44からなる群より選択され、またはその薬学的に許容される塩である。
【００６１】
いくつかの態様において、本化合物（たとえば、脂質またはカチオン脂質）は、下記式を有する：
【００６２】
【化１０】
0006440679.tif 000011
（IIi）または
【化１１】
0006440679.tif 000012
（IIj）またはその薬学的に許容される塩であって、式中、それぞれのR1およびR2は、独立して、任意に置換されたC11-24アルキル、任意に置換されたC11-24アルケニル、任意に置換されたC11-24アルキニル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルキル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルケニルまたは任意に置換されたC11-24ヘテロアルキニルである；R3は、Hまたは任意に置換されたC1-6アルキルである；L1は、任意に置換されたC1-6アルキレンである；およびそれぞれのR5およびR6は、独立して、Hまたは任意に置換されたC1-6アルキルである。
【００６３】
いくつかの態様において、本化合物（たとえば、脂質またはカチオン脂質）は、下記式を有する：
【化１２】
0006440679.tif 000013
（IIk）またはその薬学的に許容される塩であって、式中、それぞれのR1およびR2は、独立して、任意に置換されたC11-24アルキル、任意に置換されたC11-24アルケニル、任意に置換されたC11-24アルキニル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルキル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルケニルまたは任意に置換されたC11-24ヘテロアルキニルである；R3は、Hまたは任意に置換されたC1-6アルキルである；およびそれぞれのR5およびR6は、独立して、Hまたは任意に置換されたC1-6アルキルである。
【００６４】
本明細書において記述される任意の式（たとえば、式（IId）〜（IIk）、たとえば、式（IIi）〜（IIk））のいくつかの態様において、それぞれのR5およびR6は、独立して、-NR5aR5bで置換されたC1-6アルキルであり、および式中、それぞれのR5aおよびR5bは、独立して、Hまたは任意に置換されたC1-6アルキルである。
【００６５】
いくつかの態様において、本化合物は、L-37、L-38、L-39、L-40およびL-41からなる群より選択され、またはその薬学的に許容される塩である。
【００６６】
本明細書において記述される任意の式（たとえば、式（IId）〜（IIk））のいくつかの態様において、L1は、任意に置換されたC1-6アルキレンである。
【００６７】
本明細書において記述される任意の式（たとえば、式（I）または（IIa）〜（IIk））のいくつかの態様において、R3は、任意に置換されるC1-6アルキルである。いくつかの態様において、それぞれのR1およびR2は、独立して、非置換のC11-24アルケニルまたは非置換のC11-24ヘテロアルケニルであり、直鎖状および分枝形態を含む（たとえば、それぞれのR1およびR2は、独立して、1つまたは複数の二重結合を含む非置換のC11-24アルケニルまたは非置換のC11-24ヘテロアルケニルである）。いくつかの態様において、R1またはR2の1つは、飽和C11-24アルキルでない。いくつかの態様において、R1およびR2の両方とも、飽和C11-24アルキルでない。いくつかの態様において、それぞれのR1およびR2は、独立して、リノレニル（C18：3）、リノレニルオキシ（C18：3）、リノレノイル（C18：3）、リノレイル（C18：2）、リノレイルオキシ（C18：2）、リノレオイル（C18：2）、オレイル（C18：1）、オレイルオキシ（18：1）、オレイルオキシメチレン（18：1）、オレオイル（C18：1）、オレオイルメチレン（C18：1）、ステアリル（C18：0）、ステアリルオキシ（C18：0）、ステアロイル（C18：0）、パルミチル（C16：0）、パルミチルオキシ（C16：0）、パルミトイル（C16：0）、パルミトイルメチレン（C16：0）、ミリスチル（C14：0）、ミリスチルオキシ（C14：0）、ミリストイル（C14：0）、ラウリル（C12：0）、ラウリンイルオキシ（C12：0）、およびラウロイル（C12：0）からなる群より選択され、たとえば、リノレイル（C18：2）またはオレイル（C18：1）である。いくつかの態様において、R1およびR2は、同じかまたは異なる。
【００６８】
本明細書において記述される任意の式（たとえば、式（I）または（IIa）〜（IIk））のいくつかの態様において、R3またはR4は、一次アミンで置換されるが、R3およびR4の両方ではない。いくつかの態様において、R3およびR4の両方とも、一次アミンで置換されない。
【００６９】
本明細書において記述される任意の式（たとえば、式（I）または（IIa）〜（IIk））のいくつかの態様において、R3およびR4は、これらが結合するNと共に、表2および3からのH-1〜H-52の1つのヘッド基を含む。いくつかの態様において、それぞれのR1およびR2は、独立して、リノレニル（C18：3）、リノレニルオキシ（C18：3）、リノレノイル（C18：3）、リノレイル（C18：2）、リノレイルオキシ（C18：2）、リノレオイル（C18：2）、オレイル（C18：1）、オレイルオキシ（18：1）、オレイルオキシメチレン（18：1）、オレオイル（C18：1）、オレオイルメチレン（C18：1）、ステアリル（C18：0）、ステアリルオキシ（C18：0）、ステアロイル（C18：0）、パルミチル（C16：0）、パルミチルオキシ（C16：0）、パルミトイル（C16：0）、パルミトイルメチレン（C16：0）、ミリスチル（C14：0）、ミリスチルオキシ（C14：0）、ミリストイル（C14：0）、ラウリル（C12：0）、ラウリンイルオキシ（C12：0）およびラウロイル（C12：0）からなる群より選択され、たとえば、それぞれのR1およびR2は、独立して、リノレイル（C18：2）またはオレイル（C18：1）である。
【００７０】
もう一つの側面において、本発明の化合物は、R1R2-CH-Aを含み、式中、R1およびR2はテール基（たとえば、本明細書において、たとえば表4において、記述されるいずれでも）であり、およびAはヘッド基（たとえば、本明細書において、たとえば表2および3において、記述されるいずれでも）である。いくつかの態様において、ヘッド基は、H-1〜H-52の1つ、たとえば、H-2、H-5、H-6、H-19、H-26またはH-43（たとえば、H-5またはH-43）である。
【００７１】
もう一つの側面において、本発明の化合物は、表1において提供される任意の化合物またはその薬学的に許容される塩である。
【００７２】
一つの側面において、本発明は、本明細書において記述される任意の化合物（たとえば、表1において提供される1つまたは複数の化合物）またはその薬学的に許容される塩を含む製剤を特徴とする。
【００７３】
いくつかの態様において、製剤は、2個またはそれ以上の化合物、たとえば、2、3、4、5、6、7個またはそれ以上の化合物を含む。
【００７４】
上記の側面のいずれかにおいて、本発明の化合物は、2個の不飽和脂質テール基を含む（たとえば、それぞれのR1およびR2は、独立して、任意に置換されたC11-24アルケニル、任意に置換されたC11-24アルキニル、任意に置換されたC11-24ヘテロアルケニルまたは任意に置換されたC11-24ヘテロアルキニルである）。
【００７５】
上記の側面のいずれかにおいて、本発明の化合物は、脂質テール基を含み、式中、これらの基は、-CHR3R4に隣接する酸素を含まない（たとえば、それぞれのR1およびR2は、独立して、任意に置換されたC11-24アルキル、任意に置換されたC11-24アルケニルまたは任意に置換されたC11-24アルキニルである）。
【００７６】
上記の側面のいずれかにおいて、本発明の化合物は、脂質テール基を含み、式中、これらの基は、1つまたは複数の生物分解可能な基（たとえば、1つまたは複数のエステル基）を含まない。
【００７７】
上記の側面のいずれかにおいて、本発明の化合物は、11、12、13、14、15、16または18個より多い炭素を有する2個の脂質テール基を含む（たとえば、それぞれのR1およびR2は、独立して、任意に置換されたC17-24アルケニル、任意に置換されたC15-24アルキニル、任意に置換されたC15-24ヘテロアルケニルまたは任意に置換されたC15-24ヘテロアルキニルである；それぞれのR1およびR2は、独立して、任意に置換されたC16-24アルケニル、任意に置換されたC16-24アルキニル、任意に置換されたC16-24ヘテロアルケニルまたは任意に置換されたC16-24ヘテロアルキニルである；それぞれのR1およびR2は、独立して、任意に置換されたC17-24アルケニル、任意に置換されたC17-24アルキニル、任意に置換されたC17-24ヘテロアルケニルまたは任意に置換されたC17-24ヘテロアルキニルである；またはそれぞれのR1およびR2は、独立して、任意に置換されたC18-24アルケニル、任意に置換されたC18-24アルキニル、任意に置換されたC18-24ヘテロアルケニルまたは任意に置換されたC18-24ヘテロアルキニルである）。
【００７８】
上記の側面のいずれかにおいて、本発明の化合物は、尿素基を含まない（たとえば、R3もR4も任意に置換されたアミドでない）。いくつかの態様において、本化合物は、カルバミル基を含まない。いくつかの態様において、本化合物は、複数の第一級アミン基を含まない（たとえば、R1〜R6の1つまたは複数において、たとえばR3またはR4のどちらかにおいて、2つの第一級アミン基を含まないかまたは任意の第一級アミン基を含まない）。詳細な態様において、本化合物は、1つのみの第一級アミンを含むかまたは第一級アミンを含まない（たとえば、R1〜R6の1つまたは複数において、たとえばR3またはR4のどちらかにおいて、1つのみの第一級アミンが存在するかまたは第一級アミンが存在しない）。
【００７９】
上記の側面のいずれかにおいて、本発明の化合物は、ヒドロキシ基を含まない（たとえば、R1およびR2のどちらも、1、2または3個のヒドロキシ基で置換されない；またはR3およびR4のどちらも、1、2または3個のヒドロキシ基で置換されない）。いくつかの態様において、R1またはR2が飽和C11-24アルキル基（たとえば、飽和C15アルキル、飽和C16アルキル、飽和C17アルキルまたは飽和C18アルキル）であるときに、R1および／またはR2は1、2または3個のヒドロキシ基で置換されない。いくつかの態様において、R1またはR2が飽和C11-24アルキル基（たとえば、飽和C15アルキル、飽和C16アルキル、飽和C17アルキルまたは飽和C18アルキル）であるときに、R3および／またはR4は1、2または3個のヒドロキシ基で置換されない。
【００８０】
上記の側面のいずれかにおいて、本発明の化合物は、2個しかアミド基を含まない（たとえば、化合物のヘッド基において、2個のみまたは1個のアミド基）。その他の態様において、本化合物は、R1〜R6の1つまたは複数において0、1または2個のアミド基を含む（たとえば、R3またはR4において0、1または2個のアミド基）。さらに他の態様において、本化合物は、1個のおよび1個だけのアミド基を含むことができる（たとえば、R3またはR4において1個のおよび1個だけのアミド基を含むことができる）。さらなる態様において、化合物は、1個のおよび1個だけのアミド基を含むかまたはアミド基を含まない（たとえば、R3またはR4において1個のおよび1個だけのアミド基を含むかまたはアミド基を含まない）。
【００８１】
上記の側面のいずれかにおいて、本発明の化合物は、N-（4-N',N'-ジメチルアミノ）ブタノイル-（6Z,9Z,28Z,31Z）-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-アミンまたはN-（3-N',N'-ジメチルアミノ）プロパノイル-（6Z,9Z,28Z,31Z）-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-アミンまたはその塩を除外する。いくつかの態様において、本発明の化合物は、N-メチル-N-（4-N',N'-ジメチルアミノ）ブタノイル-（6Z,9Z,28Z,31Z）-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-アミンまたはN-メチル-N-（3-N',N'-ジメチルアミノ）プロパノイル-（6Z,9Z,28Z,31Z）-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-アミンまたはその塩を除外する。
【００８２】
上記の側面のいずれかにおいて、本発明の化合物は、N-（4-N',N'-ジメチルアミノ）ブタノイル-（6Z,9Z,28Z）-ヘプタトリアコンタ-6,9,28-トリエン-19-アミン、N-メチル-N-（4-N',N'-ジメチルアミノ）ブタノイル-（6Z,9Z,28Z）-ヘプタトリアコンタ-6,9,28-トリエン-19-アミン、N-（4-N',N'-ジメチルアミノ）ブタノイル-（6Z,9Z,28Z,31Z,34Z）-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31,34-ペンタエン-19-アミン、N-メチル-N-（4-N',N'-ジメチルアミノ）ブタノイル-（6Z,9Z,28Z,31Z,34Z）-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31,34-ペンタエン-19-アミン、N-（3-N',N'-ジメチルアミノ）プロパノイル-（6Z,9Z,28Z）-ヘプタトリアコンタ-6,9,28-トリエン-19-アミン、N-メチル-N-（3-N',N'-ジメチルアミノ）プロパノイル-（6Z,9Z,28Z）-ヘプタトリアコンタ-6,9,28-トリエン-19-アミン、N-（3-N',N'-ジメチルアミノ）プロパノイル-（6Z,9Z,28Z,31Z,34Z）-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31,34-ペンタエン-19-アミン、N-メチル-N-（3-N',N'-ジメチルアミノ）プロパノイル-（6Z,9Z,28Z,31Z,34Z）-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31,34-ペンタエン-19-アミンまたはその塩を除外する。
【００８３】
上記の側面のいずれかにおいて、本発明の化合物は、ジ（（Z）-ノン-2-エン-1-イル）9-（（3-（ジメチルアミノ）プロパノイル）アミノ）ヘプタデカンジオアート、ジ（（Z）-ノン-2-エン-1-イル）9-（（4-（ジメチルアミノ）ブタノイル）アミノ）ヘプタデカンジオアート、ジ（（Z）-ノン-2-エン-1-イル）9-（（5-（ジメチルアミノ）ペンタノイル）アミノ）ヘプタデカンジオアートまたはその塩を除外する。
【００８４】
上記の側面のいずれかにおいて、本発明の化合物は、6.2より少ないpKa値および6.5を超えるpKa値を有する（たとえば、4.0〜6.2のpKa値、4.0〜5.2、4.0〜5.6または4.0〜5.8など；または6.5〜8.5、たとえば、6.5〜7.0、6.5〜7.5または6.5〜8.0）。詳細な態様において、pKa値は、約5.0〜約6.0である（たとえば、5.0〜5.5、5.0〜5.6、5.0〜5.7、5.0〜5.8、5.0〜5.9、5.0〜6.0、5.2〜5.5、5.2〜5.6、5.2〜5.7、5.2〜5.8、5.2〜5.9、5.2〜6.0、5.4〜5.5、5.4〜5.6、5.4〜5.7、5.4〜5.8、5.4〜5.9、5.4〜6.0、5.6〜5.7、5.6〜5.8、5.6〜5.9または5.6〜6.0）。pKa値は、たとえば2-（p-トルイジノ）-6-ナフタレンスルホン酸（TNS）の蛍光を測定すること、ゼータ電位測定などの、任意の有用な方法によって、決定することができる。詳細な態様において、pKa値は、帯電したカチオン脂質の濃度と帯電していない脂質の濃度との比率である（たとえば、イン・サイチュTNS蛍光滴定によって測定され、このときpKaは、最大値の半分の蛍光強度でのpHとして定義される）。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図1は、本発明の陰イオン性薬剤を含む粒子のための例示的な製造プロセスを図示する。本プロセスの実行は、酸性水溶液（ここでは、pH 2.3の60mM HCl）に懸濁された脂質複合体と陰イオン性薬剤（ここでは、水に溶解されたRNA）とを最初に組み合わせること、このような溶液を水で希釈すること、次いで、複合体-陰イオン性薬剤混合液に溶媒（ここでは、エタノール）に溶解された脂質溶液を添加することを含み、これにより陰イオン性薬剤を含む粒子を製造する。このように形成される粒子は、次いでさらなる容積の水で希釈し、および次いで任意に濾過（ここでは、タンジェンシャルフロー・フィルトレーション（TFF））に供して溶媒を除去し、および使用前に粒子を濃縮する。
【図２】図2は、3つの異なる方法によって製剤化した粒子のサイジング結果を示す：エタノールに溶解したさらなる脂質中に水性脂質-DsiRNA複合体を添加したことを含んだプロセスによって製剤化した粒子（「2072プロセス」、バリエーション1、上部パネル）；水性脂質-DsiRNA複合体中にエタノールに溶解したさらなる脂質を添加したことを含んだプロセスによって製剤化した粒子（「2072プロセス」、バリエーション2、中間パネル）；および「2072」と同一の総量および成分の比率を組み込んだが、エタノールの中で脂質の濃縮を可能にした工程を特徴としたプロセスによって製剤化した粒子（「2141プロセス」、下部パネル）、具体的には脂質含有エタノール溶液におけるコレステロールの溶解の前にエタノールに多数の脂質を溶解することによって、このようなプロセスがこのようなエタノール溶液内でこのような脂質の著しい濃縮を可能にした。
【図３】図3は、サイズ排除クロマトグラフィー（「SEC」）の最初の実行および画分2〜5の選択の後、「2072」（上部）および「2141」粒子集団に対して行った粒子サイジング実験の結果を示す。
【図４】図4は、「2072」（上部）および「2141」（底部）プロセスによって製造した粒子について、パーセント容積粒径アッセイ結果を示す。
【図５】図5は、「2072」および「2141」関連のプロセス「2141」、「2137」および「2144」を含む、種々の示されたプロセスによって製剤化したHPRT1-ターゲティングDsiRNAを収容する粒子について観察された、インビボでの標的特異的なノックダウンの結果を示す。HPRT1生データは、hSFRS9レベルに対し標準化して、次いでプロットした。
【図６】図6は、それぞれ、示したようなMYC-ターゲティングDsiRNAペイロードを収容する、「2072」で製造した粒子および「2141」で製造した粒子におけるインビボでの有効性および耐容性プロフィールを証明する。
【図７】図7は、「2072」で製造した粒子および「2141」で製造した粒子の全体のインビボ耐容性（体重および肝臓重量）を証明する。
【図８】図8は、「2072」で製造した粒子および「2141」で製造した粒子について毒性マーカー評価の結果を示す。
【図９】図9は、実施例6について有効性試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
本発明は、陰イオン性薬剤の製剤化のためのプロセスを目的とし、その実行は、このような陰イオン性薬剤が哺乳動物細胞および／または哺乳類への投与に対し細胞内局在化を達成する確率を増強する。
【００８７】
定義
別途定義されない限り、本明細書に使用される全ての専門的および科学的な用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参照は、本発明において使用した多くの用語の一般的な定義とともに技術の1つを提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology（2nd ed. 1994）；The Cambridge Dictionary of Science and Technology（Walker ed., 1988）；The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al.（eds.）, Springer Verlag（1991）；およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology（1991）。本明細書に使用される、以下の用語は、特に明記しない限り、下のそれらに帰する意味を有する。
【００８８】
本明細書に使用される用語「約」は、詳述された値の±10%を意味する。
【００８９】
本明細書に使用される用語「酸性水溶液」は、pH1.0〜pH6.9、好ましくはpH2.0〜pH4.0の水溶液を意味することが意図され、それは5〜200mM、任意に20〜100mMまたは40〜80mMのモル濃度を有する。酸性水溶液は、塩酸、クエン酸、酢酸およびその他の酸の水溶液から選択してもよい。酸性水溶液のタイプおよびpHは、このような溶液に懸濁または溶解される脂質および／または陰イオン性薬剤のタイプに応じて変化するだろう。
【００９０】
「アルケニル」によって、特に明記しない限り、1つまたは複数の炭素-炭素二重結合を含む2〜24個の炭素原子における一価の直鎖または分岐鎖群が意味される。アルケニル基は、エテニル、1-プロペニル、2-プロペニル、2-メチル-1-プロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、オレイル、リノレイル、リノレニルおよび同様のものによって例証される。用語「Cx-yアルケニル」は、x〜y個の炭素を有するアルケニル基を表す。xのための例示的な値は、2、3、4、5および11である；yについては、3、4、5、6および24である；およびx〜yについては、2〜10、2〜9、2〜8、2〜7、2〜6、2〜5、2〜4、10〜24、11〜24、12〜24、14〜24、16〜24、18〜24、10〜22、11〜22、12〜22、14〜22、16〜22、18〜22、10〜20、11〜20、12〜20、14〜20、16〜20または18〜20である。いくつかの態様において、アルケニルは、アルキル基について本明細書で定義されるように1、2、3または4個の置換基でさらに置換されることができる。
【００９１】
「アルキル」によって、特に明記しない限り、1〜24の炭素原子における一価の直鎖状または分枝した飽和基が意味される。アルキル基は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル基、tert-ブチル、ネオペンチル、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、ステアリルおよび同様のものによって例証され、および独立して以下からなる群より選択される1個、2個、3個、または2個の炭素もしくはそれ以上のアルキル基の場合、4個の置換基で任意に置換されてもよい：（1）アルコキシ；（2）アミノ、本明細書で定義される；（3）ハロ、F、Cl、BrまたはIなど；（4）（ヘテロシクリル）オキシ；（5）ヘテロシクリル；（6）アルキル；（7）アルケニル；（9）アルキニル；（10）シクロアルキル；（11）ヒドロキシ；（12）ニトロ；または（13）オキソ（たとえば、カルボキシアルデヒドまたはアシル）。いくつかの態様において、本明細書において記述したように、各々のこれらの基はさらに置換されることができる。用語「Cx-yアルキル」は、x〜y個の炭素を有するアルキル基を表す。xのための例示的な値は、1、2、3、4、5および11である；yについては、2、3、4、5、6、および24である；およびx〜yについては、1〜10、1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、10〜24、11〜24、12〜24、14〜24、16〜24、18〜24、10〜22、11〜22、12〜22、14〜22、16〜22、18〜22、10〜20、11〜20、12〜20、14〜20、16〜20または18〜20である。
【００９２】
本明細書に使用される用語「アルキレン」および接頭辞「alk-」は、2つの水素原子の除去によって直鎖または分枝鎖の炭化水素から派生する多価（たとえば、二価）炭化水素基を表す。アルキレン基は、メチレン、エチレン、イソプロピルエンおよび同様のものによって例証される。用語「Cx-yアルキレン」は、x〜y個の炭素を有するアルキレン基を表す。xのための例示的な値は1、2、3、4および5であり、およびyのための例示的な値は2、3、4、5および6である。いくつかの態様において、アルキレンは、アルキル基について本明細書で定義されるように1、2、3または4個の置換基でさらに置換されることができる。
【００９３】
「アルキニル」によって、特に明記しない限り、1つまたは複数の炭素-炭素三重結合を含む2〜24個の炭素原子における一価の直鎖または分岐鎖群が意味される。アルキニル基は、エチニル、1-プロピニルおよび同様のものによって例証される。用語「Cx-yアルキニル」は、x〜y個の炭素を有するアルキニル基を表す。xのための例示的な値は、2、3、4、5および11である；yについては、3、4、5、6および24である；およびx〜yについては、2〜10、2〜9、2〜8、2〜7、2〜6、2〜5、2〜4、10〜24、11〜24、12〜24、14〜24、16〜24、18〜24、10〜22、11〜22、12〜22、14〜22、16〜22、18〜22、10〜20、11〜20、12〜20、14〜20、16〜20または18〜20である。いくつかの態様において、アルキニルは、アルキル基について本明細書で定義されるように1、2、3または4個の置換基でさらに置換されることができる。
【００９４】
「アミド」によって、本明細書で定義されるように、カルボニル基を介して親分子基に結合するアミン基が意味される。
【００９５】
本明細書に使用される「アミノ」によって、-N（RN1）2が意味され、式中、それぞれのRN1は、独立して、H、OH、NO2、N（RN2）2、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、N-保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、アルカリル、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、ヘテロシクリル（たとえば、ヘテロアリール）、アルクヘテロシクリル（たとえば、アルクヘテロアリール）であるか、または2つのRN1が結合してヘテロシクリルもしくはN-保護基を形成し、および式中、それぞれのRN2は、独立して、H、アルキルまたはアリールである。好ましい態様において、アミノは、-NH2または-NHRN1であり、式中、RN1は、独立して、OH、NO2、NH2、NRN22、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、アルキルまたはアリールであり、およびそれぞれのRN2はH、アルキルまたはアリールであることができる。「第一級アミン」によって、構造-NH2を有する基が意味される。
【００９６】
本明細書に使用される用語「アミノアルキル」は、本明細書で定義されるようなアミノ基によって置換された、本明細書で定義されるようなアルキル基を表す。それぞれのグループについて本明細書において記述されるように、アルキルおよびアミノは1、2、3または4個の置換基で各々さらに置換されることができる。
【００９７】
薬剤の「十分な量」によって、臨床的結果などの有益な効果または所望の結果に十分な薬剤の量が意味され、およびしたがって、十分な量はそれが適用される状況に依存する。たとえば、標的遺伝子の発現レベルを減少させる製剤を投与する状況において、製剤の十分な量は、製剤の投与なしで得られた反応と比較して、標的遺伝子の発現レベルにおける減少を達成するために十分な量である。
【００９８】
用語「両親媒性脂質」は、部分的に、脂質材料の疎水性の部分が疎水性の相に志向する一方で、親水性の部分は水性相の方へ志向する任意の適切な材料をいう。親水性の特徴は、炭水化物、ホスフェート、カルボン酸、硫酸、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシルおよびその他同様の基などの、極性または帯電基の存在に由来する。疎水性は、限定されないが、長鎖の飽和および不飽和の脂肪族炭化水素基並びに1つまたは複数の芳香族、脂環式または複素環の基によって置換されたこのような基を含む無極性基の封入によって付与されることができる。両親媒性化合物の例は、リン脂質、アミノ脂質およびスフィンゴ脂質を含むが、限定されない。リン脂質の代表例は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンおよびジリノレオイルホスファチジルコリンを含むが、限定されない。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロールおよびβ-アシル酸素酸などの、リンを欠くその他の化合物もまた、両親媒性脂質として命名される群の範囲内である。加えて、上で記述される両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールを含むその他の脂質と混合することができる。
【００９９】
本明細書に使用される用語「陰イオン性薬剤」は、少なくとも1つの負に帯電した原子を含む化学的部分をいい、それは任意に製剤に組み込まれてもよい（たとえば、ペイロードとして）。「ポリアニオン系ペイロード」によって、製剤に組み込まれてもよい複数の負に帯電した原子を含む化学的部分が意味される。ポリアニオン系ペイロードの例は、核酸、RNAi薬剤、siRNA、dsRNA、miRNA、shRNA、DsiRNAおよびアンチセンスペイロードを含む。
【０１００】
「陰イオン性脂質」によって、生理的pHにて正味の負電荷を有する任意の脂質分子が意味される。これらの脂質は、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、N-ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、N-サクシニルホスファチジルエタノールアミン、N-グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（POPG）および中性脂肪に連結されるその他の陰イオン性修飾基を含むが、限定されない。
【０１０１】
本明細書に使用される、用語「アンチセンス化合物」または「アンチセンスペイロード」は、とりわけ、アンチセンス配向オリゴヌクレオチド、アンチセンスPNA、リボザイムおよび外部のガイド配列（RNase Pをリクルートする配列、たとえば、Guerrier-Takada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：8468、1997において記述される）を含む、一本鎖のアンチセンスオリゴヌクレオチド（DNA、DNA様、RNA、RNA様）または一定の二本鎖の、もしくは自己ハイブリダイズする構築物を包含する。アンチセンス化合物は、多様な手段によってこれらの効果を及ぼすことができる。このような手段の1つは、真核生物におけるRNase Hまたは原核生物におけるRNase Pなどの内因性ヌクレアーゼのアンチセンス媒介方向である（Chiang et al., J. Biol. Chem. 1266：18162、1991；Forster et al., Science、249：783、1990）。
【０１０２】
本明細書に使用される用語「水溶液」は、全体において、または部分的に、水を含む組成物をいう。
【０１０３】
用語「癌」は、異常な細胞の抑制されていない成長によって特徴づけられる疾患のクラスの任意のメンバーをいう。この用語は、悪性、良性、柔組織または固形などで特徴づけられようと、全ての公知の癌および新生物形成状態、並びに転移前および転移後の癌を含む全ての段階およびグレードの癌を含む。癌の異なるタイプの例は、肝癌、肺癌、大腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、胃（胃）癌、食道癌；胆嚢癌、膵癌、虫垂癌、乳癌、卵巣癌；子宮頸癌、前立腺癌、腎臓の癌（たとえば、腎細胞癌）、中枢神経系癌、グリア芽細胞腫、皮膚癌、リンパ腫、絨毛癌、頭頚部癌、骨肉腫および血液癌を含むが、限定されない。肝癌の特定タイプの非限定的な例は、肝細胞癌（HCC）、続発性肝癌（たとえば、あるその他の非肝臓癌細胞タイプの転移によって生じる）および肝芽腫を含む。本明細書に使用される、「腫瘍」は、1つまたは複数の癌性の細胞を含む。
【０１０４】
「カチオン脂質」によって、生理的pHにて正味陽電荷を有する任意の脂質分子が意味される。例示的なカチオン脂質は、本明細書において、たとえば表1において、記述されるいずれもを含む。一定の態様において、カチオン脂質は、粒子において総脂質の約20モル％〜約50モル％または約40モル％存在することを含んでいてもよい。
【０１０５】
本明細書に使用される用語「カルバミル」は、構造-NRN1C（=O）ORまたは-OC（=O）N（RN1）2を有するカルバメート基をいい、式中、それぞれのRN1の意味は本明細書で提供された「アミノ」の定義において見いだされ、および本明細書で定義されるように、Rはアルキル、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、アリール、アルカリル、ヘテロシクリル（たとえば、ヘテロアリール）またはアルクヘテロシクリル（たとえば、アルクヘテロアリール）である。
【０１０６】
本明細書に使用される用語「カルボニル」は、C（O）基を表し、C=Oとしても表すことができる。
【０１０７】
「シクロアルキル」によって、一価の飽和または部分的に不飽和の3〜10員の単環式または多環式（たとえば、二環式または三環系）炭化水素環系が意味される。例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロヘプチルを含む。
【０１０８】
「Dicer基質RNA」または「DsiRNA」によって、遺伝子サイレンシングが可能な25+、たとえば25〜35（たとえば25〜27、長さ25ヌクレオチドの二重鎖領域など）ヌクレオチド二本鎖分子のクラスが意味される。その他のRNAi薬剤と比較してより長い長さのため、DsiRNAは、Dicerの基質になりやすい。
【０１０９】
「二本鎖分子」によって、RNA干渉を介して遺伝子産物を静まらせるために使用することができる二本鎖RNA：RNAまたはRNA：DNA分子が意味される。
【０１１０】
「発現」によって、当該技術分野において公知の方法による遺伝子またはポリペプチドの検出が意味される。たとえば、DNA発現はたいていサザンブロッティングまたはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって検出し、およびRNA発現はたいていノーザンブロッティング、RT-PCR、遺伝子アレイ技術またはRNAse保護アッセイ法によって検出される。一般にタンパク質発現レベルを測定する方法は、限定されないが、ウェスタンブロッティング、免疫ブロット法、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、放射免疫アッセイ（RIA）、免疫沈澱、免疫蛍光、表面プラズモン共鳴、化学発光、蛍光分極、燐光、免疫組織化学的解析、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（MALDI-TOF）質量分析、マイクロ血球計算、顕微鏡法、蛍光標示式細胞分取（FACS）およびフローサイトメトリー、並びに、限定されないが酵素活性またはその他のタンパク質パートナーとの相互作用を含む、タンパク質の特性に基づいたアッセイ法を含む。
【０１１１】
用語「膜融合」は、細胞の膜と融合する、本明細書において記述したものなどの脂質粒子の能力をいう。膜は、細胞小器官、たとえば、エンドソーム、核など、を囲んでいる血漿膜または膜であることができる
【０１１２】
本明細書に使用される用語「ハロ」は、臭素、塩素、ヨウ素またはフッ素から選択されるハロゲンを表す。
【０１１３】
「ヘテロアルケニル」によって、本明細書で定義されるように、アルケニル基が意味され、それにおいて構成の炭素原子の1つまたは複数は、O、NまたはSによって各々置換された。例示的なヘテロアルケニル基は、本明細書において記述されるように、オキソ基で置換されたおよび／または酸素原子を介して親分子基に結合した、アルケニル基を含む。いくつかの態様において、ヘテロアルケニル基は、本明細書においてアルキル基について記述したように1、2、3または4個の置換基でさらに置換されることができる。
【０１１４】
「ヘテロアルキル」によって、本明細書で定義されるように、アルキル基が意味され、それにおいて構成の炭素原子の1つまたは複数は、O、NまたはSによって各々置換された。例示的なヘテロアルキル基は、本明細書において記述されるように、オキソ基で置換されたおよび／または酸素原子を介して親分子基に結合した、アルキル基を含む。いくつかの態様において、ヘテロアルキル基は、本明細書においてアルキル基について記述したように1、2、3または4個の置換基でさらに置換されることができる。
【０１１５】
本明細書に使用される用語「ヘテロアルキルエン」は、本明細書で定義されるように、アルキレン基をいい、それにおいて、構成の炭素原子の1個または2個は、O、NまたはSによって各々置換された。いくつかの態様において、ヘテロアルキルエン基は、本明細書においてアルキレン基について記述したように、1、2、3または4個の置換基でさらに置換されることができる。用語「Cx-yヘテロアルキルエン」は、x〜y個の炭素を有するヘテロアルキルエン基を表す。xのための例示的な値は、1、2、3、4、5および11である；yについては、2、3、4、5、6および24である；およびx〜yについては、1〜10、1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、10〜24、11〜24、12〜24、14〜24、16〜24、18〜24、10〜22、11〜22、12〜22、14〜22、16〜22、18〜22、10〜20、11〜20、12〜20、14〜20、16〜20または18〜20である。
【０１１６】
「ヘテロアルキニル」によって、本明細書で定義されるように、アルキニル基が意味され、それにおいて、構成の炭素原子の1つまたは複数はO、NまたはSによって各々置換された。例示的なヘテロアルキニル基は、本明細書において記述されるように、オキソ基で置換されたおよび／または酸素原子を介して親分子基に結合した、アルキニル基を含む。いくつかの態様において、ヘテロアルキニル基は、本明細書においてアルキル基について記述したように、1、2、3または4個の置換基でさらに置換されることができる。
【０１１７】
本明細書に使用される用語「ヘテロアリール」は、本明細書で定義されるように、ヘテロシクリルのサブセットを表し、それは芳香族である：すなわち、これらは、モノまたは複数環状の環系内に4n+2π電子を含む。いくつかの態様において、ヘテロシクリル基について定義されるように、ヘテロアリールは1、2、3または4個の置換基で置換される。
【０１１８】
本明細書に使用される用語「ヘテロシクリル」は、別段の定めがないかぎり、独立して窒素、酸素および硫黄からなる群より選択される1、2、3または4個のヘテロ原子を含む3-、4-、5-、6-、7-または8員の環を表す。ヘテロシクリルは、飽和でもまたは不飽和でもよく、および0〜3個の不飽和結合を含んでもよい。たとえば、5員環は0〜2個の二重結合を有し、および6および7員環は0〜3個の二重結合を有する。一定のヘテロシクリル基は、2〜9個の炭素原子、たとえば3〜7個の炭素原子を含む。その他のこのような基は、最大12個の炭素原子を含んでいてもよい。用語「ヘテロシクリル」はまた、1つまたは複数の炭素および／またはヘテロ原子が単環式環の2つの非隣接するメンバーを架橋する、架橋された複数環状の構造、たとえばキヌクリジニル基、を有する複素環式化合物をも表す。複素環基の例は、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリニル、ピロリル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピペリジニル、アゼパニル、ピラジニル、ピペラジニル、ジアゼパニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニルおよび同様のものを含む。
【０１１９】
本明細書に使用される用語「（ヘテロシクリル）オキシ」は、本明細書で定義されるように、酸素原子を介して親分子基に結合するヘテロシクリル基を表す。いくつかの態様において、ヘテロシクリル基は、本明細書で定義されるように1、2、3または4個の置換基で置換されることができる。
【０１２０】
本明細書に使用される用語「（ヘテロシクリル）オイル」は、本明細書で定義されるように、カルボニル基を介して親分子基に結合するヘテロシクリル基を表す。いくつかの態様において、ヘテロシクリル基は、本明細書で定義されるように1、2、3または4個の置換基で置換されることができる。
【０１２１】
「ハイブリダイズする」によって、種々のストリンジェンシーの条件下で、本明細書で定義されるように、十分に相補的なポリヌクレオチドまたはその部分の間で二本鎖分子を形成するよう組み合わせることが意味される。（たとえば、Wahl et al., Methods Enzymol. 152:399 (1987); Kimmel, Methods Enzymol. 152:507 (1987)を参照されたい。）たとえば、高ストリンジェンシーな塩濃度は、通常、約750mM NaClおよび75mMクエン酸三ナトリウムより少ない、約500mM NaClおよび50mMクエン酸三ナトリウムより少ない、または約250mM NaClおよび25mMクエン酸三ナトリウムより少ないであろう。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、たとえばホルムアミド、の非存在において得ることができ、その一方で、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約35%のホルムアミドまたは少なくとも約50%のホルムアミドの存在において得ることができる。高ストリンジェンシー温度条件は、通常少なくとも約30℃、37℃または42℃の温度を含むだろう。様々なさらなるパラメーター、ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、たとえばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の濃度、および担体DNAの封入または除外など、は当業者に周知である。必要に応じてこれらの種々の条件を組み合わせることによって、ストリンジェンシーの種々のレベルが達成される。一つの態様において、ハイブリダイゼーションは、750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウムおよび1%SDSにおいて30℃にて生じるだろう。代わりの態様において、ハイブリダイゼーションは、pH6.4にて、400mM NaCl、40mM PIPESおよび1mM EDTAにおいて50℃または70℃にて、12〜16時間のハイブリダイゼーションした後に生じ、その後洗浄するだろう。さらなる好ましいハイブリダイゼーション条件は、lxSSCにおいて70℃またはlxSSCにおいて50℃にて、50%ホルムアミドでハイブリダイゼーションし、その後0.3xSSCにおいて70℃にて洗浄すること、および4xSSCにおいて70℃または4xSSCにおいて50℃にて、50%ホルムアミドでハイブリダイゼーションし、その後lxSSCにおいて67℃にて洗浄することを含む。これらの条件に対する有用なバリエーションが容易であることは、当業者にとって明らかだろう。このような例示的なバリエーションの1つは、生理的細胞内条件を模倣するよう設計された条件下でのハイブリダイゼーションの評価を含み、それにおいて、陽イオンおよび陰イオンは、以下比率において類別される：陽イオンについて、10：160：2：26にてナトリウム：カリウム：カルシウム：マグネシウム；および陰イオンについて、3：10：100：20：65にてクロライド：ビカルボナート：ホスフェート：サルフェート：グルコナート。
【０１２２】
用語「疎水性の脂質」は、限定されないが、長鎖の飽和および不飽和の脂肪族炭化水素基並びに1つまたは複数の芳香族、脂環式または複素環基によって任意に置換されたこのような基を含む、無極性基を有する化合物をいう。適切な例は、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、N-N-ジアルキルアミノ、1,2-ジアシルオキシ-3-アミノプロパンおよび1,2-ジアルキル-3-アミノプロパンを含むが、限定されない。
【０１２３】
本明細書に使用される用語「ヒドロキシ」は、-OH基を表す。
【０１２４】
用語「脂質」は、水性相の方へ配向する親水性の部分によって脂質材料の疎水性の部分が水性相/溶液から保護されるように、ミセルを形成することができる、または親水性の部分が水性相の方へ配向すると共に脂質材料の疎水性の部分が二重膜の方へ配向するように、二重膜を形成することができる、任意の脂肪酸誘導体をいう。親水性の特徴は、リン酸（phosphato）、カルボン酸、硫酸（sulfato）、アミノ、スルフヒドリル、ニトロおよびその他の同様の基の存在に由来する。疎水性は、限定されないが、長鎖の飽和および不飽和の脂肪族炭化水素基および1つまたは複数の芳香族、脂環式または複素環式基によって置換されたこのような基を含む基の封入によって、付与されることができる。好ましい脂質は、ホスホグリセリドおよびスフィンゴ脂質であり、その代表例はホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンまたはジリノレオイルホスファチジルコリンを含み、使用することができる。スフィンゴ脂質およびスフィンゴ糖脂質ファミリーなどの、リンを欠くその他の化合物はまた、脂質として称される基の範囲内である。加えて、上述した両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールを含むその他の脂質と混合してもよい。
【０１２５】
用語「脂質抱合体」は、抱合された脂質、任意に脂質粒子の凝集を阻害する脂質、をいう。このような脂質抱合体は、たとえば、PEG結合されたジアルキルオキシプロピル（たとえば、PEG-DAA抱合体）、PEG結合されたジアシルグリセロール（たとえば、PEG-DAG抱合体）、PEG結合されたコレステロール、PEG結合されたホスファチジルエタノールアミンおよびPEG抱合されたセラミド（たとえば米国特許第5,885,613を参照されたい）などのPEG-脂質抱合体、陽イオンPEG脂質、ポリオキサゾリン（POZ）-脂質抱合体（たとえばPOZ-DAA抱合体；たとえば、2010年1月13日に出願の米国仮出願番号第61/294,828号および2010年1月14日に出願の米国仮出願番号第61/295,140号を参照されたい）、ポリアミドオリゴマー（たとえば、ATTA-脂質抱合体）並びにそれらの混合物を含むが、限定されない。POZ-脂質抱合体のさらなる例は、PCT公開番号WO 2010/006282において記述される。PEGまたはPOZは、脂質に直接抱合することができ、またはリンカー部分を経て脂質に連結してもよい。脂質にPEGまたはPOZを結合するために適切な任意のリンカー部分は、たとえば、エステルを含まないリンカー部分およびエステルを含むリンカー部分を使うことができる。一定の態様において、アミドまたはカルバメートなどの、エステルを含まないリンカー部分は、使用される。上記特許文献のそれぞれの開示は、全ての目的のために、これらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。粒子の凝集を阻害する抱合された脂質は、たとえば、ポリエチレングリコール（PEG）-脂質でもよく、限定されないが、PEG-ジアシルグリセロール（DAG）、PEG-ジアルキルオキシプロピル（DAA）、PEG-リン脂質、PEG-セラミド（Cer）またはそれらの混合物を含む。PEG-DAA抱合体は、たとえば、PEG-ジラウリルオキシプロピル（Ci2）、PEG-ジミリスチルオキシプロピル（Ci4）、PEG-ジパルミトイルオキシプロピル（Ci6）またはPEG-ジステアリルオキシプロピル（Ci8）でもよい。一定の態様において、粒子の凝集を防止する抱合された脂質は、粒子において存在する総脂質の0モル％〜約20モル％または約2モル％であってもよい。
【０１２６】
「脂質ベクター」によって、リポソーム、リポプレックス、ミセル、脂質ナノ粒子、コアに基づいた粒子、トランスフェクション脂質と組み合わせられたRNA結合薬剤-RNA凝集体を含む粒子または本発明のプロセスによって作製される小胞に基づいた粒子が意味される。
【０１２７】
「リンカー」によって、1つまたは複数の原子を含む、任意に置換された多価（たとえば、二価）の基が意味される。本明細書において記述したように、リンカーの例は、任意に置換されたアルキレンおよびヘテロアルキルエン基を含む。
【０１２８】
本明細書に使用される「局所的送達」は、生物内の標的部位に直接的に、干渉RNA（たとえば、DsiRNA）などの活性薬剤を送達することをいう。たとえば、薬剤は、腫瘍などの疾患部位または炎症部位などのその他の標的部位または肝臓、心臓、膵臓、腎臓および同様のものなどの標的器官に、直接注射によって局所的に送達することができる。
【０１２９】
用語「哺乳動物」は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、ウサギ、家畜および同様のものなどの任意の哺乳動物種をいう。
【０１３０】
「マイクロRNA」（miRNA）によって、RNA干渉を介して遺伝子産物を静まらせるために使用することができる一本鎖RNA分子が意味される。
【０１３１】
用語「修飾された脂質」は、たとえば、凝集および／または沈澱を阻害すること、免疫応答を阻害することおよび／またはインビボにでの循環における半減期を改善することを助けるように修飾された脂質をいう。本発明の一定の側面において、修飾された脂質は、中性脂肪である。修飾された中性脂肪は、ポリエチレングリコール2000ジステロイルホスファチジルエタノールアミン（PEG（2000）DSPE）；PEG-DMG；PEG-DMPE；PEG-DPPE；PEG-DPG；PEG-DOPE；またはPEG-DOGなどのペグ化脂質を含むが、限定されない。
【０１３２】
本明細書に使用される「脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する修飾された脂質」は、循環寿命を増加させることおよび／または陰イオン性薬剤-脂質粒子の標的組織への送達を増加させることのための手段を提供する、任意の修飾された脂質である。このような修飾された脂質の例は、ポリエチレングリコール（PEG）、PEG-セラミドまたはガングリオシド（たとえば、GM1）修飾脂質を含む。典型的には、粒子におけるPEG、PEG-セラミドまたはガングリオシド修飾脂質の濃度は、約1〜15%であるだろう。
【０１３３】
「調節する」によって、遺伝子の発現、または1つもしくは複数のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするRNA分子もしくはRNA分子相当物のレベル、または1つもしくは複数のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性が、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされることによって、発現、レベルまたは活性が調節因子の非存在において観察されるそれより多いかまたは少ないことが、意味される。たとえば、調節するという用語は、阻害または遺伝子サイレンシングを含み、および遺伝子の発現のレベルまたはRNA分子のレベル、またはそれらの均等物が、対照と比較して、少なくとも10％（たとえば、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%）減少する。
【０１３４】
本明細書に使用される用語「N-保護基」は、合成の手順の間、アミノ基を好ましくない反応から保護することが意図される基を表す。一般に使用されるN-保護基は、Greene、「Protective Groups in Organic Synthesis」、第3版（John Wiley & Sons、New York, 1999）において開示され、それは参照により本明細書に援用される。N-保護基は、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、t-ブチルアセチル、2-クロロアセチル、2-ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、o-ニトロフェノキシアセチル、α-クロロブチリル、ベンゾイル、4-クロロベンゾイル、4-ブロモベンゾイル、4-ニトロベンゾイルなどのアシル、アリーロイルまたはカルバミル基、並びにアラニン、ロイシン、フェニルアラニンおよび同様のものなどの保護された、または保護されていないD、LまたはD、Lアミノ酸などのキラル補助；ベンゼンスルホニル、p-トルエンスルホニルおよび同様のものなどのスルホニル含有基；ベンジルオキシカルボニル、p-クロロベンジルオキシカルボニル、p-メトキシベンジルオキシカルボニル、p-ニトロベンジロキシカルボニル、2-ニトロベンジロキシカルボニル、p-ブロモベンジルオキシカルボニル、3,4-ジメトキシベンジルオキシカルボニル、3,5-ジメトキシベンジルオキシカルボニル、2,4-ジメトキシベンジルオキシカルボニル、4-メトキシベンジルオキシカルボニル、2-ニトロ-4,5-ジメトキシベンジルオキシカルボニル、3,4,5-トリメトキシベンジルオキシカルボニル、1-（p-ビフェニリル）-1-メチルエトキシカルボニル、α、α-ジメチル-3,5-ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、t-ブチルオキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、2,2,2、-トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、4-ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル-9-メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニルおよび同様のものなどの基を形成するカルバメート、ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチルおよび同様のものなどのアルカリル基並びにトリメチルシリルおよび同様のものなどのシリル基を含む。好ましいN-保護基は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、t-ブチルアセチル、アラニル、フェニルスルホニル、ベンジル、t-ブチルオキシカルボニル（Boc）およびベンジルオキシカルボニル（Cbz）である。
【０１３５】
本明細書に使用される用語「有機脂質溶液」は、全体においてまたは部分的に、脂質を有する有機溶媒を含む組成物をいう。
【０１３６】
本明細書に使用される用語「オキソ」は、=Oを表す。
【０１３７】
用語「尿素」は、構造NRN1C（=O）NRN1を有する基をいい、式中、それぞれのRN1の意味は、本明細書で提供された「アミノ」の定義において見いだされる。
【０１３８】
「中性脂肪」によって、選択されたpHにて帯電していないか、または中性の両性イオン性形態のどちらかにおいて存在する多数の脂質種のいずれかが意味される。生理的pHにて、このような脂質は、たとえば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシドおよびジアシルグリセロールを含む。
【０１３９】
用語「非カチオン脂質」は、任意の両親媒性脂質並びに任意のその他の中性脂肪または陰イオン性脂質をいう。非カチオン脂質は、限定されないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、ジパルミトイルホスファチジルグリセリン（DPPG）、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（DOPE）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（POPC）、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン（POPE）、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン4-（N-マレイミドメチル）-シクロヘキサン-1-カルボキシラート（DOPE-mal）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（DMPE）、ジステロイル-ホスファチジルエタノールアミン（DSPE）、16-O-モノメチルPE、16-O-ジメチルPE、18-1-トランスPE、1-ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジエタノールアミン（phosphatidyethanolamine）（SOPE）、コレステロールまたはそれらの混合物を含む、陰イオン性脂質または中性脂肪でもよい。一定の態様において、コレステロールが含まれる場合、非カチオン脂質は、粒子において存在する総脂質の約5モル％〜約90モル％、約10モル％または約58モル％であってもよい。いくつかの態様において、核酸-脂質粒子は、たとえば、粒子において存在する総脂質の約10モル％〜約60モル％または約48モル％にてコレステロールをさらに含む。
【０１４０】
「医薬組成物」によって、薬学的に許容される賦形剤で製剤化した、本明細書において記述される化合物を含み、および哺乳動物における疾患の治療のための治療上の処方計画の一部として政府規制機関の承認を得て製造または販売される組成物が意味される。医薬組成物は、たとえば、単位剤形（たとえば、錠剤、カプセル、カプレット、ジェルキャップまたはシロップ）において経口投与のために；局所的な投与のために（たとえば、クリーム、ジェル、ローションまたは軟膏として）；静脈内投与のために（たとえば、粒子状塞栓を含まない、および静脈内使用に適切な溶媒システムにおける、無菌の溶液として）；または本明細書において記述した任意のその他の製剤において、製剤化することができる。
【０１４１】
「薬学的に許容される賦形剤」によって、本明細書において記述される化合物以外の任意の成分（たとえば、活性化合物を懸濁または溶解することができる媒体）、並びに患者において無毒性および非炎症性の特性を有する任意の成分が、意味される。たとえば、賦形剤は、以下を含んでもよい：抗癒着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング、圧迫補助具、崩壊剤、色素（色）、緩和剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、皮膜形成剤またはコーティング、香味剤、芳香剤、流動促進剤（glidant）（フローエンハンサー）、滑沢剤、保存剤、印刷インキ、収着剤、懸濁または分散剤、甘味料並びに水和水。例示的な賦形剤は、以下を含むが、限定されない：ブチル化水酸化トルエン（BHT）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性の）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、ケイ素ジオキシド、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、ナトリウムデンプングリコラート、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンA、ビタミンE、ビタミンCおよびキシリトール。
【０１４２】
「薬学的に許容される塩」によって、正確な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応および同様のものがなく、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適切であり、および妥当な利益/リスクの比率に相応する塩が意味される。薬学的に許容される塩は、当該技術分野において周知である。たとえば、薬学的に許容される塩は、以下において記述される：Berge et al., J. Pharm. Sci. 66（1）：1，1977およびPharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl and C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008。塩は、本発明の化合物の最終的な単離および精製の間にインサイチュで、または適切な有機酸と遊離塩基群を反応させることによって別々に、調製することができる。代表的な酸付加塩は、アセテート、アジペート、アルギナート、アスコルベート、アスパルテート、ベンゼンスルホナート、ベンゾアート、ビサルフェート、ボラート、ブチラート、カンフォラート、カンファースルホナート、シトラート、シクロペンタンプロピオナート、ジグルコナート、ドデシルサルフェート、エタンスルホナート、フマラート、グルコヘプトナート、グリセロホスフェート、ヘミスルフェート、ヘプトナート、ヘキサノアート、ヒドロブロミド、ハイドロクロライド、ヒドロヨージド、2-ヒドロキシ-エタンスルホナート、ラクトビオナート、ラクタート、ラウレート、ラウリルサルフェート、マラート、マレアート、マロナート、メタンスルホナート、2-ナフタレンスルホナート、ニコチナート、ニトラート、オレアート、オキサラート、パルミタート、パモアート、ペクチナート、パーサルフェート、3-フェニルプロピオナート、ホスフェート、ピクラート、ピバラート、プロピオナート、ステアラート、スクシナート、サルフェート、タータラート、チオシアナート、トルエンスルホナート、ウンデカノアート、バレラート塩および同様のものを含む。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよび同様のもの、並びに無毒性アンモニウム、四級アンモニウムおよびアミンの陽イオンを含み、限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウムおよび同様のものを含む。
【０１４３】
「RNA-結合剤」によって、核酸を結合またはハイブリダイズすることができる任意の薬剤または薬剤の組み合わせ（たとえば、治療用製剤の核酸ペイロード）が意味される。RNA-結合薬剤は、本明細書において記述される任意の脂質（たとえば、1つまたは複数のカチオン脂質、1つまたは複数のカチオン脂質の組み合わせ、本明細書または表1において記述されたものなど、並びに1つまたは複数のカチオン脂質および任意のその他の脂質の組み合わせ、中性脂肪またはPEG-脂質抱合体など、を含む。RNA-結合剤は、内部凝集体など、製剤内で任意の有用な構造を形成することができる。
【０１４４】
「RNAi薬剤」によって、標的核酸をハイブリダイズすることによって遺伝子サイレンシング効果を及ぼす任意の薬剤または化合物が意味される。RNAi薬剤は、（たとえば、ストリンジェント条件下で）配列特異的RNAiを媒介することができる任意の核酸分子、たとえば、短い干渉RNA（siRNA）、二本鎖RNA（dsRNA）、マイクロRNA（miRNA）、短いヘアピンRNA（shRNA）、短い干渉オリゴヌクレオチド、短い干渉核酸、修飾された短い干渉オリゴヌクレオチド、化学修飾されたsiRNA、転写後遺伝子サイレンシングRNA（ptgsRNA）およびDicer-基質RNA（DsiRNA）を含む。
【０１４５】
「短いヘアピンRNA」または「shRNA」によって、きついヘアピンターンをなし、および遺伝子サイレンシングが可能なRNAの配列が意味される。
【０１４６】
「センス領域」によって、もう一つの核酸のアンチセンス領域に十分な相補性を有する本発明の核酸の核酸配列が意味される。加えて、本発明の核酸のセンス領域は、標的遺伝子核酸配列と相同性を有する核酸配列を含むことができる。「アンチセンス領域」によって、標的遺伝子核酸配列に十分な相補性を有する本発明の核酸の核酸配列が意味される。
【０１４７】
本明細書において記述されるものなどの核酸-脂質粒子に関して「血清-安定」は、粒子が、フリーのDNAもしくはRNAを有意に分解するであろう血清への曝露またはヌクレアーゼアッセイの後、著しく分解されないことを意味する。適切なアッセイ法は、たとえば、標準血清アッセイ、DNAseアッセイまたはRNAseアッセイを含む。
【０１４８】
「サイレンシング」または「遺伝子サイレンシング」によって、遺伝子の発現または1つもしくは複数のタンパク質をコードするRNA分子のレベルが、RNAi薬剤の存在下で、対照条件下で（たとえば、RNAi薬剤の非存在下で、またはスクランブルされた配列もしくはミスマッチを有するRNAi分子などの不活性もしくは減弱された分子の存在下で）観察されより低く減少することが意味される。遺伝子サイレンシングは、遺伝子産物発現を1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%（すなわち、完全に阻害）減少させてもよい。
【０１４９】
「低分子阻害性RNA」、「短い干渉RNA」または「siRNA」によって、遺伝子サイレンシングが可能な10〜40（たとえば15〜25、21など、または25〜35および／もしくは25〜30、25、26もしくは27など）のヌクレオチド二本鎖分子のクラスが意味される。最も明白には、siRNAは、典型的にはRNA干渉（RNAi）経路に含まれ、それによってsiRNAが特異的遺伝子産物の発現を妨げる。
【０１５０】
用語「溶解度」は、飽和溶液を形成するための溶媒の所定の量において溶解する化合物（溶質）の量をいう。「溶液」は、気体または固体（溶質）と液体（溶媒）との均一な混合物をいう。溶液において、溶質の分子は、分離し、および溶媒の分子と混合される。物質の溶解度は、温度に依存する。「水への溶解度」は、溶媒水における溶質の溶解度をいう。
【０１５１】
「被験体」によって、ヒトまたは非ヒト動物（たとえば、哺乳動物）が意味される。
【０１５２】
「実質的同一性」または「実質的に同一」によって、参照配列と同じポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列をそれぞれ有する、または2つの配列を最適に整列させたときに、参照配列中の対応する位置にて同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドがそれぞれ特定された割合である、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列が意味される。たとえば、参照配列に対して「実質的に同一」であるアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する。ポリペプチドについては、比較配列の長さは、一般には少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個の連続アミノ酸であり、より好ましくは、少なくとも25、50、75、90、100、150、200、250、300または350個の連続アミノ酸であり、および最も好ましくは全長アミノ酸配列であろう。核酸については、比較配列の長さは、一般には少なくとも5個の連続ヌクレオチドであり、好ましくは少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25個の連続ヌクレオチドであり、および最も好ましくは全長核酸配列であろう。配列の同一性は、デフォルト設定の配列解析ソフトウェアを使用して測定してもよい（たとえば、Genetics Computer GroupのSequence Analysis Software Package、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、1710 University Avenue, Madison, WI 53705）。このようなソフトウェアは、相同性の程度を種々の置換、欠失およびその他の修飾に割り当てることによって、類似の配列と一致させてもよい。
【０１５３】
「十分に相補的な」によって、標的核酸として、正確な相補的ポリヌクレオチド配列を有する、または2つの配列を最適に整列させたときに標的核酸内の対応する位置にて正確に相補する特定の割合もしくはヌクレオチドを有する、ポリヌクレオチド配列が意味される。たとえば、標的核酸配列に対して「実質的に相補的である」ポリヌクレオチド配列は、標的核酸配列に対して少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の相補性を有する。10〜40ヌクレオチドの長さを有するRNAi薬剤については、十分に相補的な配列は、1、2、3、4または5個の非相補的ヌクレオチドを有するものを含む。実際に、たとえばDsiRNA薬剤を含む一定の態様において、活性な二本鎖のRNAi薬剤は、標的核酸に十分に相補的であるガイド鎖のわずか15〜19の連続したヌクレオチドを有することができる一方で、ガイド鎖の残りが標的核酸との相補性の任意の程度を有する必要がない（しかしながら一定の態様において、ガイド鎖の残りは部分的にまたは完全に、標的とされる核酸（たとえば、mRNA）に相補的であってもよい）。
【０１５４】
本明細書に使用される「全身送達」は、生体内で干渉RNA（たとえば、DsiRNA）などの活性薬剤の広い体内分布を導く脂質粒子の送達をいう。投与のいくつかの技術は、一定の薬剤の全身送達を導くことができるが、その他はしない。全身送達は、薬剤の有用な、好ましくは治療的な量が体の大部分に曝露されることを意味する。広い体内分布を得ることは、一般に、薬剤が投与の部位から遠い疾患部位に到達する前に迅速に分解または消失されない（最初に通過する器官（肝臓、肺、その他）による、または迅速な、非特異性の細胞結合によるなど）ような血液寿命を必要とする。脂質粒子の全身送達は、たとえば、静脈内、皮下および腹膜内を含む、当該技術において公知の任意の手段によることができる。好ましい態様において、脂質粒子の全身送達は、静脈内送達による。
【０１５５】
「標的核酸」によって、発現または活性が調節されようとする任意の核酸配列が意味される。標的核酸は、DNAまたはRNAであることができる。一定の態様において、標的核酸は、標的mRNAである。
【０１５６】
「トランスフェクション脂質」によって、核酸を送達することが可能な任意の脂質または脂質の組み合わせ、たとえば核酸ペイロード、が意味される（任意に、RNA結合薬剤と結合する核酸ペイロード、たとえば1つまたは複数のカチオン脂質）。トランスフェクション脂質は、本明細書において記述される任意の脂質を含む（たとえば、1つまたは複数のカチオン脂質、1つまたは複数のカチオン脂質の組み合わせ、本明細書または表1において記述したものなど、並びに1つまたは複数のカチオン脂質と、中性脂肪、陰イオン性脂質、PEG-脂質抱合体またはステロール誘導体などの任意のその他の脂質または薬剤との組み合わせ）。トランスフェクション脂質またはこのようなトランスフェクション脂質を含む組み合わせは、外部の、凝集体表面など、製剤内で任意の有用な構造を形成することができる。
【０１５７】
本明細書に使用されるように、および当該技術においてよく理解されるように、「治療」は、臨床的結果などの有益な、または所望の結果を得るためのアプローチである。有益な、または所望の結果は、限定されないが、1つまたは複数の症候または状態の軽減または寛解；疾患、障害または状態の程度の減少；疾患、障害または状態の状況の安定化（すなわち、悪化しない）；疾患、障害または状態の伝播の防止；疾患、障害または状態の進行の遅延または緩徐化；疾患、障害または状態の寛解または緩和；および検出可能であろうと検出不可能であろうと、緩解（部分的または全体）を含むことができる。疾患、障害または状態を「緩和する」ことは、治療の非存在における程度または時間経過と比較すると、疾患、障害または状態の程度および／または望ましくない臨床的徴候が軽減し、および／または進行の時間経過が緩徐化されもしくは長くなることを意味する。「癌を治療すること」、「癌を防止すること」または「癌を阻害すること」によって、腫瘍のサイズもしくは癌細胞の数を減少させること、腫瘍のサイズの増大もしくは癌細胞増殖を緩徐化させるかもしくは阻害すること、腫瘍もしくはその他の癌の消滅とその再発との間の無病生存時間を増加させること、腫瘍もしくはその他の癌の最初のもしくはその後の発生の可能性を防止するかもしくは減少させること、または腫瘍もしくはその他の癌と関連する有害な症候を減少させることが意味される。所望の態様において、治療で生き残る腫瘍または癌性の細胞の割合は、任意の標準的なアッセイを使用して測定されるように、腫瘍または癌性の細胞の最初の数より少なくとも20、40、60、80または100%少ない。望ましくは、本発明の化合物の投与によって誘導される腫瘍または癌性の細胞の数における減少は、非腫瘍または非癌性の細胞の数の減少より少なくとも2、5、10、20または50倍多い。望ましくは、標準的な方法を使用して決定されるように、本発明の方法は腫瘍のサイズまたは癌性の細胞の数における20、40、60、80または100%の減少を生じる。望ましくは、治療された被験体の少なくとも20、40、60、80、90または95%は、完全な緩解を有し、それにおいて腫瘍または癌の全ての形跡が消滅する。望ましくは、腫瘍または癌は、再発しないかまたは少なくとも5、10、15または20年の後に再発する。被験体における疾患または状態（たとえば、癌）を「防止的に治療すること」によって、疾患症候の出現の前に疾患または状態を発症するリスク（すなわち、発病率）を減少させることまたは重症度を減少させることが意味される。防止的治療は、疾患またはその症候の出現を完全に防止してもよいかまたは減少させてもよく、および／または疾患および／または疾患に起因する有害効果に対する部分的または完全な治癒の点で治療的でもよい。防止的治療は、疾患にかかりやすいかもしれないが、それを有するとまだ診断されなかった個体において疾患または状態が生じることを減少させるかまたは防止すること（たとえば、癌を防止すること）を含んでもよい。
【０１５８】
陰イオン性薬剤を含む粒子の組成物
いくつかの態様において、本発明の粒子は、以下を含む：カチオン脂質（たとえば、DODMA、DOTMA、DPePC、DODAPまたはDOTAP）、中性脂肪（たとえば、DSPC、POPC、DOPEまたはSM）および任意に、ステロール誘導体（たとえば、コレステロール；コレスタノン；コレステノン；コプロスタノール；3β-[-（N-（N',N'-ジメチルアミノエタン）-カルバモイル］コレステロール（DC-コレステロール）；ビス-グアニジウム-トレン-コレステロール（BGTC）；（2S,3S）-2-（（（3S,10R,13R,17R）-10,13-ジメチル-17-（（R）-6-メチルヘプタン-2-イル）-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ［a］フェナントレン-3-イルオキシ）カルボニルアミノ）エチル2,3,4,4-テトラヒドロキシブタノアート（DPC-1）；（2S,3S）-（（3S,10R,13R,17R）-10,13-ジメチル-17-（（R）-6-メチルヘプタン-2-イル）-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ［a］フェナントレン-3-イル）2,3,4,4-テトラヒドロキシブタノアート（DPC-2）；ビス（（3S,10R,13R,17R）-10,13-ジメチル-17-（（R）-6-メチルヘプタン-2-イル）-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13、14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ［a］フェナントレン-3-イル）2,3,4-トリヒドロキシペンタンジアート（DPC-3）；または6-（（（3S,10R,13R,17R）-10,13-ジメチル-17-（（R）-6-メチルヘプタン-2-イル）-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ［a］フェナントレン-3-イルオキシ）オキシドホスホリロイル）-2,3,4,5-テトラヒドロキシヘキサノアート（DPC-4））。いくつかの態様において、粒子は、以下をさらに含む：PEG-脂質抱合体（たとえば、PEG-DMG、PEG-DMPE、PEG-DPPE、PEG-DPG、PEG-DOPEまたはPEG-DOG）。
【０１５９】
いくつかの態様において、粒子は、約10モル％〜約40モル％の1つまたは複数の本発明の化合物（たとえば、本明細書において、たとえば表1において、記述した1つまたは複数の任意の化合物）、約10モル％〜約40モル％の1つまたは複数のカチオン脂質または1つのまたは複数の本発明の化合物（たとえば、本明細書において、たとえば表1において、記述した1つまたは複数の任意の化合物）、約1モル％〜約20モル％の1つまたは複数のPEG-脂質抱合体、約5モル％〜約20モル％の1つまたは複数の中性脂肪、および約20モル％〜約40モル％の1つまたは複数のステロール誘導体を含む。
【０１６０】
詳細な態様において、粒子は、約10モル％〜約80モル％（たとえば、約40モル％〜約55モル％、約48モル％など）の1つまたは複数のカチオン脂質（たとえば、本明細書において記述したように、本発明の化合物および／またはその他のカチオン脂質）、約1モル％〜約20モル％の1つまたは複数のPEG-脂質抱合体、約5モル％〜約20モル％の1つまたは複数の中性脂肪、および約20モル％〜約40モル％の1つまたは複数のステロール誘導体を含む。いくつかの態様において、粒子は、約10モル％〜約30モル％（たとえば、約22モル％）の1つまたは複数の本発明の化合物（たとえば、L-6、L-30および／または本明細書において記述したいずれか）、約15モル％〜約35モル％（たとえば、約26モル％）の1つまたは複数のカチオン脂質（たとえば、DODMAまたは本明細書において記述したいずれか）、約3モル％〜約9モル％（たとえば、約6モル％）のPEG-脂質抱合体（たとえば、PEG-DSPE、PEG-DMPEおよび／または本明細書において記述したいずれか）、約10モル％〜約20モル％（たとえば、約14モル％）の1つまたは複数の中性脂肪（たとえば、DSPCまたは本明細書において記述したいずれか）、および約20モル％〜約40モル％（たとえば、約29モル％〜約33モル％、約33モル％など）の1つまたは複数のステロール誘導体（たとえば、コレステロール、その誘導体または本明細書において記述したいずれか）を含む。
【０１６１】
いくつかの態様において、表1の1つまたは複数の化合物は、約10モル％〜約40モル％、たとえば、約10モル％〜約15モル％、約10モル％〜約20モル％、約10モル％〜約25モル％、約10モル％〜約30モル％、約10モル％〜約35モル％、約15モル％〜約20モル％、約15モル％〜約25モル％、約15モル％〜約30モル％、約15モル％〜約35モル％、約15モル％〜約40モル％、約20モル％〜約25モル％、約20モル％〜約30モル％、約20モル％〜約35モル％、約20モル％〜約40モル％、約25モル％〜約30モル％、約25モル％〜約35モル％、約25モル％〜約40モル％、約30モル％〜約35モル％、約30モル％〜約40モル％または約35モル％〜約40モル％（たとえば、約21.0モル％、21.2モル％、21.4モル％、21.6モル％、21.8モル％、22モル％、25モル％、26モル％、26モル％、30モル％、35モル％または40モル％）の表1の1つまたは複数の化合物、の量において存在する。いくつかの態様において、表1の1つまたは複数の化合物は、約10モル％〜約80モル％、たとえば、約10モル％〜約15モル％、約10モル％〜約20モル％、約10モル％〜約25モル％、約10モル％〜約30モル％、約10モル％〜約35モル％、約10モル％〜約40モル％、約10モル％〜約45モル％、約10モル％〜約50モル％、約10モル％〜約55モル％、約10モル％〜約60モル％、約10モル％〜約65モル％、約10モル％〜約70モル％、約10モル％〜約75モル％、約15モル％〜約20モル％、約15モル％〜約25モル％、約15モル％〜約30モル％、約15モル％〜約35モル％、約15モル％〜約40モル％、約15モル％〜約45モル％、約15モル％〜約50モル％、約15モル％〜約55モル％、約15モル％〜約60モル％、約15モル％〜約65モル％、約15モル％〜約70モル％、約15モル％〜約75モル％、約15モル％〜約80モル％、約20モル％〜約25モル％、約20モル％〜約30モル％、約20モル％〜約35モル％、約20モル％〜約40モル％、約20モル％〜約45モル％、約20モル％〜約50モル％、約20モル％〜約55モル％、約20モル％〜約60モル％、約20モル％〜約65モル％、約20モル％〜約70モル％、約20モル％〜約75モル％、約20モル％〜約80モル％、約25モル％〜約30モル％、約25モル％〜約35モル％、約25モル％〜約40モル％、約25モル％〜約45モル％、約25モル％〜約50モル％、約25モル％〜約55モル％、約25モル％〜約60モル％、約25モル％〜約65モル％、約25モル％〜約70モル％、約25モル％〜約75モル％、約25モル％〜約80モル％、約30モル％〜約35モル％、約30モル％〜約40モル％、約30モル％〜約45モル％、約30モル％〜約50モル％、約30モル％〜約55モル％、約30モル％〜約60モル％、約30モル％〜約65モル％、約30モル％〜約70モル％、約30モル％〜約75モル％、約30モル％〜約80モル％、約35モル％〜約40モル％、約35モル％〜約45モル％、約35モル％〜約50モル％、約35モル％〜約55モル％、約35モル％〜約60モル％、約35モル％〜約65モル％、約35モル％〜約70モル％、約35モル％〜約75モル％または約35モル％〜約80モル％、約40モル％〜約45モル％、約40モル％〜約50モル％、約40モル％〜約55モル％、約40モル％〜約60モル％、約40モル％〜約65モル％、約40モル％〜約70モル％、約40モル％〜約75モル％、約40モル％〜約80モル％、約45モル％〜約50モル％、約45モル％〜約55モル％、約45モル％〜約60モル％、約45モル％〜約65モル％、約45モル％〜約70モル％、約45モル％〜約75モル％または約45モル％〜約80モル％、約50モル％〜約55モル％、約50モル％〜約60モル％、約50モル％〜約65モル％、約50モル％〜約70モル％、約50モル％〜約75モル％または約50モル％〜約80モル％（たとえば、約21.0モル％、21.2モル％、21.4モル％、21.6モル％、21.8モル％、22モル％、25モル％、26モル％、26モル％、30モル％、35モル％、40モル％、45モル％、48モル％、49モル％、50モル％、55モル％、60モル％、65モル％、70モル％または75モル％）の表1の1つまたは複数の化合物、の量において存在する。
【０１６２】
いくつかの態様において、1つまたは複数のカチオン性脂質は、約10モル％〜約40モル％、たとえば、約10モル％〜約15モル％、約10モル％〜約20モル％、約10モル％〜約25モル％、約10モル％〜約30モル％、約10モル％〜約35モル％、約15モル％〜約20モル％、約15モル％〜約25モル％、約15モル％〜約30モル％、約15モル％〜約35モル％、約15モル％〜約40モル％、約20モル％〜約25モル％、約20モル％〜約30モル％、約20モル％〜約35モル％、約20モル％〜約40モル％、約25モル％〜約30モル％、約25モル％〜約35モル％、約25モル％〜約40モル％、約30モル％〜約35モル％、約30モル％〜約40モル％または約35モル％〜約40モル％（たとえば、約25.1モル％、25.2モル％、25.3モル％、25.4モル％、25.5モル％、25.6モル％、25.7モル％、25.8モル％、25.9モル％、26.0モル％、26.2モル％、26.4モル％、26.6モル％、26.8モル％または27モル％）の1つまたは複数のカチオン脂質（たとえば、DODMAまたは表1などの本明細書において記述したいずれか）、の量において存在する。
【０１６３】
いくつかの態様において、1つまたは複数のPEG-脂質抱合体は、約1モル％〜約20モル％、たとえば、約1モル％〜約5モル％、約1モル％〜約10モル％、約1モル％〜約15モル％、約2モル％〜約5モル％、約2モル％〜約10モル％、約2モル％〜約15モル％、約2モル％〜約20モル％、約5モル％〜約10モル％、約5モル％〜約15モル％、約5モル％〜約20モル％、約10モル％〜約15モル％、約10モル％〜約20モル％、約15モル％〜約20モル％（たとえば、約2.5モル％、2.6モル％、2.7モル％、2.8モル％、2.9モル％、3モル％、3.5モル％、4モル％、4.3モル％、4.5モル％、4.7モル％、5モル％、5.3モル％、5.5モル％、5.7モル％は、6モル％、6.5モル％、6.7モル％、7モル％、7.5モル％、8モル％、8.5モル％または9モル％）の1つまたは複数のPEG-脂質抱合体（たとえば、PEG-DSPE、PEG-DMPEおよび／または本明細書において記述したいずれか）、の量において存在する。
【０１６４】
いくつかの態様において、1つまたは複数の中性脂肪は、約5モル％〜約20モル％、たとえば、約5モル％〜約10モル％、約5モル％〜約15モル％、約5モル％〜約20モル％、約7モル％〜約10モル％、約7モル％〜約15モル％、約7モル％〜約20モル％、約10モル％〜約15モル％、約10モル％〜約20モル％、約15モル％〜約20モル％（たとえば、約13.0モル％、13.2モル％、13.4モル％、13.6モル％、13.8モル％、14モル％、14.1モル％、14.3モル％、14.5モル％、14.7モル％または14.9モル％）の1つまたは複数の中性脂肪（たとえば、DSPCまたは本明細書において記述したいずれか）、の量において存在する。
【０１６５】
いくつかの態様において、1つまたは複数のステロール誘導体は、約20モル％〜約40モル％、たとえば、約20モル％〜約25モル％約20モル％〜約30モル％、約20モル％〜約35モル％、約25モル％〜約30モル％、約25モル％〜約35モル％、約25モル％〜約40モル％、約30モル％〜約35モル％、約30モル％〜約40モル％または約35モル％〜約40モル％（たとえば、約28.4モル％、28.6モル％、28.8モル％、29.0モル％、30モル％、31モル％、32モル％、33モル％、33.2モル％、33.4モル％、33.6モル％、33.8モル％、34モル％、34.4モル％、34.7モル％または34.9モル％）の1つまたは複数のステロール誘導体（たとえば、コレステロールまたは本明細書において記述したいずれか）、の量において存在する。
【０１６６】
いくつかの態様において、粒子は、1つまたは複数のRNA結合剤および1つまたは複数のトランスフェクション脂質を含む1つまたは複数の脂質粒子を含み、1つまたは複数のRNA結合剤は、約10モル％〜約40モル％の1つまたは複数のカチオン脂質または1つまたは複数の表1の化合物および約0.5モル％〜約10モル％の1つまたは複数のPEG-脂質を含む；および1つまたは複数のトランスフェクション脂質は、約10モル％から約40モル％の1つまたは複数の表1の化合物、約5モル％〜約20モル％の1つまたは複数の中性脂肪、約0.5モル％〜約10モル％の1つまたは複数のPEG-脂質抱合体および約20モル％〜約40モル％の1つまたは複数のステロール誘導体を含む。さらなる粒子および割合は、本明細書において記述したとおりである。
【０１６７】
いくつかの態様において、粒子は、陰イオン性薬剤、たとえばRNAi薬剤（たとえば、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、ptgsRNAまたはDsiRNA、たとえばDsiRNA）などのポリアニオン系薬剤またはアンチセンス薬剤をさらに含む。いくつかの態様において、RNAi薬剤は、10〜40ヌクレオチドの長さ、たとえば、10〜15ヌクレオチド、10〜20ヌクレオチド、10〜25ヌクレオチド、10〜30ヌクレオチド、10〜35ヌクレオチド、15〜20ヌクレオチドの長さ、15〜25ヌクレオチド、15〜30ヌクレオチド、15〜35ヌクレオチド、15〜40ヌクレオチド、16〜20ヌクレオチド、16〜25ヌクレオチド、16〜30ヌクレオチド、16〜35ヌクレオチド、16〜40ヌクレオチド、20〜25ヌクレオチド、18〜20ヌクレオチド、18〜25ヌクレオチド、18〜30ヌクレオチド、18〜35ヌクレオチド、18〜40ヌクレオチド、19〜20ヌクレオチド、19〜25ヌクレオチド、19〜30ヌクレオチド、19〜35ヌクレオチド、19〜40ヌクレオチド、20〜30ヌクレオチド、20〜35ヌクレオチド、20〜40ヌクレオチド、25〜30ヌクレオチド、25〜35ヌクレオチド、25〜40ヌクレオチド、30〜35ヌクレオチド、30〜40ヌクレオチドまたは35〜40ヌクレオチドの長さ、たとえば、25〜35ヌクレオチドの長さ、たとえば、16〜30ヌクレオチドの長さ、たとえば、19〜29のヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、アンチセンス薬剤は、8〜50ヌクレオチドの長さ（たとえば、8〜10ヌクレオチド、8〜15ヌクレオチド、8〜15ヌクレオチド、8〜20ヌクレオチド、8〜25ヌクレオチド、8〜30ヌクレオチド、8〜35ヌクレオチド、8〜40ヌクレオチドまたは8〜45ヌクレオチドの長さ）、たとえば、14〜35ヌクレオチドの長さ（たとえば、14〜15ヌクレオチド、14〜20ヌクレオチド、14〜25ヌクレオチドまたは14〜30ヌクレオチドの長さ）、たとえば、17〜24ヌクレオチドの長さ、たとえば、17〜20ヌクレオチドの長さを有する。
【０１６８】
いくつかの態様において、粒子は、粒子に存在する総脂質に対する陰イオン性薬剤が約1：10（w/w）〜約1：100（w/w）比率、たとえば、粒子に存在する総脂質に対する陰イオン性薬剤が約1：10（w/w）〜約1：15（w/w）比率、約1：10（w/w）〜約1：20（w/w）比率、約1：10（w/w）〜約1：40（w/w）比率、約1：10（w/w）〜約1：50（w/w）比率、約1：10（w/w）〜約1：60（w/w）比率、約1：10（w/w）〜約1：70（w/w）比率、約1：10（w/w）〜約1：80（w/w）比率、約1：10（w/w）〜約1：90（w/w）比率、約1：10（w/w）〜約1：95（w/w）比率、約1：20（w/w）〜約1：40（w/w）比率、約1：20（w/w）〜約1：50（w/w）比率、約1：20（w/w）〜約1：60（w/w）比率、約1：20（w/w）〜約1：70（w/w）比率、約1：20（w/w）〜約1：80（w/w）比率、約1：20（w/w）〜約1：90（w/w）比率、約1：20（w/w）〜約1：95（w/w）比率、約1：20（w/w）〜約1：100（w/w）比率、約1：40（w/w）〜約1：50（w/w）比率、約1：40（w/w）〜約1：60（w/w）比率、約1：40（w/w）〜約1：70（w/w）比率、約1：40（w/w）〜約1：80（w/w）比率、約1：40（w/w）〜約1：90（w/w）比率、約1：40（w/w）〜約1：95（w/w）比率、約1：40（w/w）〜約1：100（w/w）比率、約1：50（w/w）〜約1：60（w/w）比率、約1：50（w/w）〜約1：70（w/w）比率、約1：50（w/w）〜約1：80（w/w）比率、約1：50（w/w）〜約1：90（w/w）比率、約1：50（w/w）〜約1：95（w/w）比率、約1：50（w/w）〜約1：100（w/w）比率、約1：60（w/w）〜約1：70（w/w）比率、約1：60（w/w）〜約1：80（w/w）比率、約1：60（w/w）〜約1：90（w/w）比率、約1：60（w/w）〜約1：95（w/w）比率、約1：60（w/w）〜約1：100（w/w）比率、約1：80（w/w）〜約1：90（w/w）比率、約1：80（w/w）〜約1：95（w/w）比率または約1：80（w/w）〜約1：100（w/w）比率である。
【０１６９】
いくつかの態様において、粒子は、リポソーム（たとえば、脂質ナノ粒子）、リポプレックスまたはミセルを含む。
【０１７０】
一つの側面において、本発明のプロセスは、本明細書において記述される任意の化合物（たとえば、表1において提供される1つまたは複数の化合物）もしくはその薬学的に許容される塩、または本明細書において記述される任意の粒子もしくは製剤；および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を特徴とする。
【０１７１】
もう一つの側面において、本発明は、被験体における疾患を治療する、または防止的に治療する方法を特徴とし、本方法は、本明細書において記述した方法（たとえば、下記実施例にて説明したような）によって作製した粒子、本明細書において記述した任意の製剤または記述した任意の組成物を、疾患（たとえば、肝癌（たとえば、肝細胞癌、肝芽腫、胆管癌、血管肉腫（angiosarcoma）または血管肉腫（hemangiosarcoma））、肺癌（たとえば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌）、前立腺癌または神経芽腫）を治療するために十分な量において被験体に投与することを含む。本発明は、限定されないが、以下を含む新生物疾患および関連する合併症の治療または防止的治療の方法をさらに特徴とする：癌腫（たとえば、肺、乳房、膵臓、腎臓、肝細胞性、結腸、女性生殖器、前立腺、扁平細胞、上皮内癌）、リンパ腫（たとえば、細網肉腫、非ホジキンリンパ腫）、MEN2症候群、神経繊維腫症（シュワン細胞新形成を含む）、脊髄形成異常性症候群、白血病、腫瘍血管形成、甲状腺癌、肝臓、骨、皮膚、脳、中枢神経系、膵臓、肺（たとえば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌）、乳房、結腸、膀胱、前立腺、胃腸管、子宮内膜、卵管、精巣および卵巣、消化管間質腫瘍（GIST）、前立腺腫瘍、マスト細胞腫瘍（イヌマスト細胞腫瘍を含む）、急性骨髄様の骨髄繊維症、白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、メラノーマ、肥満細胞症、膠腫、グリア芽細胞腫、星細胞腫、神経芽腫、肉腫（たとえば、神経外胚葉由来または平滑筋肉腫の肉腫）、その他の組織に対する腫瘍の転移および化学療法誘導された低酸素症。
【０１７２】
もう一つの側面において、本発明は、被験体において標的核酸の発現を調節する方法を特徴とし、本方法は、本明細書において記述したプロセス（たとえば、下記実施例にて説明したような）によって作製した任意の粒子、本明細書において記述した任意の製剤または記述した任意の組成物を、被験体において、標的遺伝子（たとえば、本明細書において記述したいずれか、たとえば、ABL1、AR、β-Catenin（CTNNB1）、BCL1、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSF1R、ERBA1、ERBA2、ERBB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ETS1、ETS2、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MET、MDM2、MLL1、MLL2、MLL3、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TAL2、TCL3、TCL5、YES、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF1、NF2、RB1、TP53、WT1、ApoB100、CSN5、CDK6、ITGB1、TGFβ1、Cyclin D1、ヘプシジン、PCSK9、TTR、PLK1およびKIF1結合タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数の標的遺伝子）の発現を減少させるのに十分な量において、投与することを含む（たとえば、本方法は、被験体において標的遺伝子の発現を減少させることを含む）。
【０１７３】
もう一つの態様において、本発明は、被験体に対して、1日当たり1回または複数回（たとえば、1日当たり1、2、3または4回）、1週当たり1回または複数回（たとえば、1週当たり2、3、4、5、6または7回）または1月当たり1回または複数回（たとえば、1月当たり2、3、4、5、6、7または10回）、本発明の粒子/陰イオン性薬剤の投薬量を投与することを特徴とする。被験体は、約0.0001〜約10mg/kg、たとえば、約0.0001〜約1mg/kg、約0.0001〜約5mg/kg、約0.001〜約1mg/kg、約0.001〜約5mg/kg、約0.001〜約10mg/kg、約0.01〜約1mg/kg、約0.01〜約5mg/kg、、約0.01〜約10mg/kg、約1〜約5mg/kgまたは約1〜約10mg/kgの範囲で、任意の投薬量処方計画（たとえば、1日当たり1回または複数回（たとえば、1日当たり1、2、3または4回）、1週当たり1回または複数回（たとえば、1週当たり2、3、4、5、6または7回）または1月当たり1回または複数回（たとえば、1月当たり2、3、4、5、6、7または10回）において、陰イオン性薬剤の投薬量を受けてもよい。
【０１７４】
一定の態様において、被験体は、約0.001〜約200mg/kg、たとえば、約0.001〜約1mg/kg、約0.001〜約10mg/kg、約0.001〜約20mg/kg、約0.001〜約50mg/kg、約0.001〜約100mg/kg、約0.01〜約1mg/kg、約0.01〜約10mg/kg、約0.01〜約20mg/kg、約0.01〜約50mg/kg、約0.01〜約100mg/kg、約0.01〜約200mg/kg、約0.1〜約1mg/kg、約0.1〜約10mg/kg、約0.1〜約20mg/kg、約0.1〜約50mg/kg、約0.1〜約100mg/kg、約0.1〜約200mg/kg、約1〜約10mg/kg、約1〜約20mg/kg、約1〜約50mg/kg、約1〜約100mg/kg、約1〜約200mg/kg、約10〜約20mg/kg、約10〜約50mg/kg、約10〜約100mg/kg、約10〜約200mg/kg、約20〜約50mg/kg、約20〜約100mg/kgまたは約20〜約200mg/kgの範囲で、任意の投薬量処方計画（たとえば、1日当たり1回または複数回（たとえば、1日当たり1、2、3または4回）、1週当たり1回または複数回（たとえば、1週当たり2、3、4、5、6または7回）または1月当たり1回または複数回（たとえば、1月当たり2、3、4、5、6、7または10回）において、本発明のプロセスによって作製した粒子の投薬量を受けてもよい。
【０１７５】
もう一つの側面において、本発明は、特定タイプの組織に本発明のプロセスによって作製した粒子/薬剤を送達する方法を特徴とする。粒子/薬剤を送達してもよい特定タイプの組織の例は、限定されないが、肝臓、膵臓、肺、前立腺、腎臓、骨髄、脾臓、胸腺、リンパ節、脳、脊髄、心臓、骨格筋、皮膚、口腔粘膜、食道、胃、回腸、小腸、結腸、膀胱、頚部、卵巣、精巣、乳腺、副腎、脂肪組織（白色および／または褐色）、血液（たとえば、造血細胞、ヒト造血性の前駆体細胞、ヒト造血幹細胞、CD34+細胞、CD4+細胞など）、リンパ球およびその他の血液系統細胞を含む。
【０１７６】
アミノ-アミンおよびアミノ-アミド脂質
本発明のプロセスにおいて使用される例示的化合物は、表1において示される。
表１
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
0006440679.tif 000018
【表１−６】
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【表１−７】
0006440679.tif 000020
【０１７７】
本発明のプロセスにおける一定の化合物（たとえば、表1において提供されるような）は、当該技術において確立されたものと類似のプロセスによって、たとえば、スキーム1〜4において示される反応順序によって、調製してもよい。
スキーム1
【化１３】
0006440679.tif 000021
【０１７８】
式C1の第二級アミンは、還元的アミノ化条件下でケトンA1を第一級アミンB1と処理することによって調製してもよく、式中、R1およびR2は、本明細書において記述したような脂質テール基であり、式中、R4は、本明細書において記述した。還元的アミノ化条件は、適切な溶媒において、ケトンA1と第一級アミンB1とを、ナトリウムシアノボロハイドライドまたはナトリウムトリアセトキシボロハイドライドなどの還元剤と組み合わせることを含む。詳細な態様において、C1のアミノ-アミン脂質をさらに酸化して、窒素と隣接するR3における炭素上のオキソ基を有する、対応するアミノ-アミド脂質を形成する。その他の態様において、C1のアミノ-アミン脂質は、窒素またはR4における任意の炭素上でさらにアルキル化を受ける。このスキームを使用して製造することができる例示的な化合物は、表1〜4において提供される。
スキーム2
【化１４】
0006440679.tif 000022
【０１７９】
式E2の第三級アミンは、還元的アミノ化条件下でケトンA2を第二級アミンD2と処理することによって調製してもよく、式中、それぞれのR1およびR2は、本明細書において記述したような脂質テール基であり、式中、R3およびR4は、本明細書において記述した。還元的アミノ化条件は、適切な溶媒において、ケトンA2と二級アミンD2とを、ナトリウムシアノボロハイドライドまたはナトリウムトリアセトキシボロハイドライドなどの還元剤と組み合わせることを含む。D2のいくつかの態様において、R3およびR4は、結合して1つまたは複数のヘテロ原子を含む複素環を形成し、および生じる第三級アミンE2は、このようなR3およびR4基を含む。詳細な態様において、E2のアミノ-アミン脂質をさらに酸化して、窒素と隣接するR3またはR4における炭素上のオキソ基を有する、対応するアミノ-アミド脂質を形成する。その他の態様において、E2のアミノ-アミン脂質は、R3および／またはR4における任意の炭素上でさらにアルキル化を受ける。
スキーム3
【化１５】
0006440679.tif 000023
【０１８０】
式F3のアミンは、適切な溶媒において、任意に高圧下で、ケトンA3、アンモニア、二水素および触媒を組み合わせることによって、調製してもよい。式H3のアミノ-アミド脂質は、適切な溶媒において活性化されたカルボン酸G3とアミンF3を組み合わせることによって、調製してもよく、式中、LGは離脱基であり、およびR4は本明細書において記述した。例示的なLGは、ハロ（たとえば、塩化物、臭素またはヨウ素）、トシラートおよびトリフレートを含む。I3のアミノ-アミン脂質は、還元剤（たとえば、水素化リチウムアルミニウム、ボラン-テトラヒドロフランまたはボラン-ジメチルスルフィド）とアミドH3を組み合わせることによって、調製してもよい。詳細な態様において、H3のアミノ-アミド脂質は、窒素またはR4'における任意の炭素上でさらにアルキル化を受ける。その他の態様において、I3のアミノ-アミン脂質は、窒素またはR4における任意の炭素上でさらにアルキル化を受ける。
スキーム4
【化１６】
0006440679.tif 000024
【０１８１】
式K4のアミノ-アミド脂質は、適切な溶媒において、ケトンA4およびアミンJ4を組み合わせることによって、調製してもよく、式中、LGは離脱基であり、並びにR1、R2およびR4は本明細書において記述した。例示的なLGは、ハロ（たとえば、塩化物、臭素またはヨウ素）、トシラートおよびトリフレートを含む。L4のアミノ-アミン脂質は、還元剤（たとえば、水素化リチウムアルミニウム、ボラン-テトラヒドロフランまたはボラン-ジメチルスルフィド）とアミドK4を組み合わせることによって、調製してもよい。その他の態様において、K4のアミノ-アミド脂質は、窒素またはR4'における任意の炭素上でさらにアルキル化を受ける。その他の態様において、L4のアミノ-アミン脂質は、窒素またはR4における任意の炭素上でさらにアルキル化を受ける。
【０１８２】
上記のスキームのいずれかにおいて、本明細書において記述したように、R4は任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換された-L1-NR5R65、任意に置換された-C（O）-L1-NR5R6または任意に置換された-L1-ヘテロシクリルであることができる。
【０１８３】
上記のスキームのいずれかにおいて、本化合物は、N上に任意に置換されたC1-6アルキルを導入するためにさらにアルキル化され（すなわち、R3は任意に置換されたC1-6アルキルである）、第三級アミンを形成することができる。
【０１８４】
本明細書、たとえば表1において記述した脂質のいずれかは、上で提供される合成スキーム、当該技術において開示される合成スキームを適用することによって、および必要に応じて、当業者に公知の変更をなすことによって製造することができる。
【０１８５】
脂質ヘッド基
本発明のプロセスにおいて使用する化合物は、脂質ヘッド基、ヘッドピースおよび1つまたは複数の脂質テール基を含んでもよい。ヘッドピース（たとえば、＞CH-）は、ヘッド基をテール基に接続する。詳細な態様において、ヘッド基は、2つ以上の窒素原子を含む。本明細書、たとえば表2または3において記述したヘッド基のいずれかは、1つまたは複数の置換基（たとえば、アルキルについて本明細書において記述した1つまたは複数の置換基）で任意に置換してもよい。
【０１８６】
アミン基を有するヘッド基の非限定的なリストは、表2において提供される。本明細書において記述したヘッド基のいずれか、たとえば表2におけるヘッド基H-1〜H-39は、本明細書、たとえば表4において記述したテール基のいずれかと、ヘッドピース＞CH-を介して組み合わせて、本発明の化合物を形成することができる。
表2：脂質ヘッド基の例
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【０１８７】
アミド基を有するヘッド基の非限定的なリストは、表3において提供される。本明細書において記述したヘッド基のいずれか、たとえば表3におけるヘッド基H-40〜H-52は、本明細書、たとえば表4において記述したテール基のいずれかと、ヘッドピース＞CH-を介して組み合わせて、本発明のプロセスに使用するための化合物を形成することができる。
【０１８８】
表3：アミドを含む脂質ヘッド基の例
【表３−１】
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【表３−２】
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【０１８９】
脂質テール基
本明細書において記述したように、本発明のプロセスにおいて使用される化合物は、1つまたは複数のヘテロ原子を任意に含むことができる1つまたは複数のテール基を一般に含む。それぞれの化合物について、テール基は、同じであることができ、または異なることができる。本明細書、たとえば表4において記述したテール基のいずれかは、1つまたは複数の置換基（たとえば、アルキルについて本明細書において記述した1つまたは複数の置換基）で、任意に置換してもよい。
【０１９０】
例示的なテール基は、リノレニル（C18：3）、リノレニルオキシ（C18：3）、リノレノイル（C18：3）、リノレイル（C18：2）、リノレイルオキシ（C18：2）およびリノレオイル（C18：2）などの、炭素または1つもしくは複数のヘテロ原子（たとえば、O）を有する飽和および不飽和の基；並びにメチレンによりヘッドピースに接続される本明細書において記述した任意のヘテロ原子テール基、たとえば、リノレニルオキシメチレン（C18：3）、リノレノイルメチレン（C18：3）およびリノレイルオキシメチレン（C18：2）またはリノレオイルメチレン（C18：2）からなる群より選択されるテール基を含む。脂質テール基のさらなる非限定的なリストは、表4において提供される。
表4：脂質テール基の例
【表４−１】
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【表４−２】
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【０１９１】
構築されたナノ粒子における脂質のpKa値の測定
異なる脂質の生理化学的な特性は、異なる環境に存在するときの脂質の挙動を非常に決定する。このような重要な特性の1つは、脂質のイオン化定数（ka）である。脂質の固有のpKaは、構築されたナノ粒子に存在するときに、これらの挙動を正確に表さなくてもよい。水性環境に存在するときに、脂質は高誘電率の環境を経験するが、構築されたナノ粒子/小胞において、それは低誘電率を提供する脂質によって囲まれる。加えて、周囲の脂質、コレステロールおよびPEG化された（PEGylated）脂質は全て、製剤の見かけのpKaに影響する。カチオン脂質と核酸の間の相互作用の本質は静電気であり、製剤の見かけのpKaは、ナノ粒子における核酸のカプセル化およびその後の細胞内放出をもまた決定する。
【０１９２】
TNS蛍光法は、製剤における脂質の見かけのpKaを決定するために使用してもよい。TNS（2-（p-トルイジノ）-6-ナフタレンスルホン酸）は、負に帯電した蛍光色素であり、その蛍光は水の存在においてクエンチされる。TNSは、正に帯電した膜に分割し、およびこれは、脱水により蛍光の増大を生じる。したがって、蛍光における増大は、異なるpH環境において存在するときに、カチオン脂質のイオン化を見積もるために使用することができる。TNSを使用してpKaを決定する方法は、当該技術分野において公知である。
【０１９３】
溶解度を決定する方法
本発明のプロセスにおいて使用される化合物、並びに本発明のプロセスから生じる粒子および化合物は、特定の溶媒におけるその溶解度を決定するために評価することができる。本発明の化合物は、限定されないが、本明細書において記述した任意の脂質分子（たとえば、陽イオン性、陰イオン性または中性脂肪）、ステロール、成分、粒子またはこれらの組み合わせを含む。
【０１９４】
溶解度は、任意の有用な方法によっておよび／または任意の有用な測定基準によって測定することができる。例示的な方法および測定基準は、高速液体クロマトグラフィー（任意に蒸発光散乱検出器と接続される）、核磁気共鳴、質量分析法、UV/可視分光法、並びに分配係数（ログP）、溶解度（たとえば、溶媒のkg当たりの溶質のg、溶媒のdl（100mL）当たりの溶質のg、モル濃度、質量モル濃度またはモル分率によって測定される）、臨界ミセル濃度、平均粒子径、粒子のサイズ分布（たとえば、多分散性指数によって決定される）、生じる溶液の等質性およびカプセル化効率（たとえば、陰イオン性薬剤における、本明細書において記述したいずれかなど、たとえばDsiRNA）などの測定基準を含む。
【０１９５】
製剤
粒子を合成するために本発明のプロセスにおいて使用される化合物および／または粒子は、製剤を製造するために1つまたは複数の脂質分子（たとえば、陽イオン性、陰イオン性または中性脂肪）と組み合わせてもよく、または粒子は製剤でもよい。製剤はまた、1つまたは複数の成分（たとえば、ステロール誘導体、PEG-脂質共役、ポリアミド-脂質共役、ガングリオシド、抗酸化剤、界面活性剤、両親媒性物質または塩）および／または1つまたは複数の陰イオン性薬剤（たとえば、1つまたは複数の核酸またはRNAi薬剤）を含むことができる。核酸薬剤を組み込むために脂質を製剤化する方法は、記述されており、たとえば、以下を参照されたい：Judge et al., J. Clin. Invest. 119(3):661, 2009; Noble et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 64(4):741, 2009; Abrams et al., Mol. Ther. 18(1):171, 2009; Yagi et al., Cancer Res. 69(16):6531, 2009; Ko et al., J. Control. Release 133(2):132, 2009; Mangala et al., Methods Mol. Biol. 555:29, 2009、これらは、参照により本明細書に援用される。
【０１９６】
一つ以上の脂質分子を有する製剤
本発明のプロセスの粒子を組み込んだ製剤は、脂質分子（たとえば、本明細書において表にされた化合物、カチオン脂質（1つまたは複数のカチオン脂質、たとえば、本明細書において記述した1つまたは複数のカチオン脂質を任意に含む、および／または当該技術分野において公知の1つまたは複数のカチオン脂質を任意に含む）、中性脂肪、陰イオン性脂質およびPEG-脂質抱合体）の任意の有用な組み合わせを含んでもよく、本明細書において記述したように、ポリペプチド-脂質抱合体および脂質ベクターの形成または安定性を補助するその他の成分を含む。本発明のプロセスの粒子を組み込んだ製剤は、形成または安定性を補助するその他の成分を含んでもよい。
【０１９７】
製剤におけるそれぞれの成分の割合は、陰イオン性薬剤をカプセル化し、および細胞に薬剤をトランスフェクトすることができる粒子または脂質ベクターを製造するために、バランスをとることができる。例示的な製剤は、約10モル％〜約40モル％の表1の1つまたは複数の化合物、約10モル％〜約40モル％の1つまたは複数のカチオン脂質、約1モル％〜約20モル％の1つまたは複数のPEG-脂質抱合体、約5モル％から約20モル％の1つまたは複数の中性脂肪および約20モル％〜約40モル％の1つまたは複数のステロール誘導体を含む。詳細な態様において、製剤は、以下を含む：約20モル％〜約25モル％（たとえば、約21.0モル％、21.2モル％、21.4モル％、21.6モル％、21.8モル％または22モル％）の1つまたは複数の表1の化合物、約25モル％〜約30モル％（たとえば、約25.1モル％、25.2モル％、25.3モル％、25.4モル％、25.5モル％、25.6モル％、25.7モル％、25.8モル％、25.9モル％、26.0モル％、26.2モル％、26.4モル％、26.6モル％、26.8モル％または27モル％）の1つまたは複数のカチオン脂質（たとえば、DODMA)、約10モル％〜約15モル％（たとえば、約13.0モル％、13.2モル％、13.4モル％、13.6モル％、13.8モル％、14モル％、14.1モル％、14.3モル％、14.5モル％、14.7モル％または14.9モル％）の1つまたは複数の中性脂肪（たとえば、DSPC)、約2.5モル％〜約10モル％（たとえば、約2.5モル％、2.6モル％、2.7モル％、2.8モル％、2.9モル％、3モル％、3.5モル％、4モル％、4.3モル％、4.5モル％、4.7モル％、5モル％、5.3モル％、5.5モル％、5.7モル％、6モル％、6.5モル％、6.7モル％、7モル％、7.5モル％、8モル％、8.5モル％または9モル％）の1つまたは複数のPEG-脂質抱合体（たとえば、約2.8モル％、2.9モル％、3.0モル％、3.5モル％、3.7モル％、3.9モル％、4モル％、4.1モル％、4.3モル％、4.5モル％、4.7モル％、4.9モル％、5モル％、5.1モル％、5.3モル％、5.5モル％、5.7モル％、5.9モル％、6モル％、6.3モル％、6.5モル％、6.7モル％または7モル％のPEG2000-DSPEおよび／またはPEG2000-DMPE、および／または3モル％、3.5モル％、3.7モル％、3.9モル％、4モル％、4.1モル％、4.3モル％、4.5モル％、4.7モル％、4.9モル％、5モル％、5.1モル％、5.3モル％、5.5モル％、5.7モル％、5.9モル％、6モル％、6.3モル％、6.5モル％、6.7モル％または7モル％のPEG2000-DMG)、並びに約25モル％〜約35モル％（たとえば、約28.4モル％、28.6モル％、28.8モル％、29.0モル％、30モル％、31モル％、32モル％、33モル％、33.2モル％、33.4モル％、33.6モル％、33.8モル％、34モル％、34.4モル％、34.7モル％または34.9モル％）のステロール誘導体（たとえば、コレステロール)。
【０１９８】
製剤は、1つまたは複数のカチオン脂質の任意の有用な量を含むことができる。いくつかの態様において、製剤におけるカチオン脂質の含有量は、約10モル％〜約40モル％（たとえば、約10モル％〜15モル％、約15モル％〜20モル％、約20モル％〜25モル％、約25モル％〜30モル％、約30モル％〜35モル％および約35モル％〜の40モル％）である。詳細な態様において、混合したカチオン脂質（たとえば、10.8モル％のL-1および10.8モル％のL-2）が用いられる。
【０１９９】
いくつかの態様において、製剤は、1つまたは複数のRNA結合剤および1つまたは複数のトランスフェクション脂質を有する脂質粒子を含み、1つまたは複数のRNA結合剤は、約10モル％〜約40モル％の1つまたは複数のカチオン脂質（たとえば、DODMA）および約0.5モル％〜約10モル％の1つまたは複数のPEG-脂質抱合体（たとえば、PEG2000-DMPEなどのPEG-DSPEおよび／またはPEG2000-DSPEなどのPEG-DMPE）を含む；および1つまたは複数のトランスフェクション脂質は、約10モル％〜約40モル％の表1の1つまたは複数の化合物（たとえば、L-6、-30または表1におけるいずれか）、約5モル％〜約20モル％の1つまたは複数の中性脂肪（たとえば、DSPC）、約0.5モル％〜約10モル％の1つまたは複数のPEG-脂質抱合体（たとえば、PEG2000-DSPEなどのPEG-DSPEおよび／またはPEG-DMPE、たとえばPEG2000-DMPE）および約20モル％〜約40モル％の1つまたは複数のステロール誘導体（たとえば、コレステロール）を含む。
【０２００】
脂質粒子のRNA結合剤は、任意の有用な脂質および抱合体の組み合わせを含むことができる。詳細な態様において、カチオン脂質（たとえば、DODMA）の含有量は、約10モル％〜約40モル％（たとえば、約20モル％〜40モル％、20モル％〜35モル％、20モル％〜30モル％、15モル％〜40モル％、15モル％〜35モル％、15モル％〜25モル％または15モル％〜20モル％まで）である。いくつかの態様において、PEG-脂質抱合体（たとえば、PEG2000-DMPEなどのPEG-DSPEおよび／またはPEG2000-DSPEなどのPEG-DMPE）は、約0.5モル％〜約10モル％（たとえば、約0.5モル％〜1モル％、0.5モル％〜5モル％、0.5モル％〜10モル％、1モル％〜5モル％または1モル％〜10モル％）である。
【０２０１】
脂質粒子のトランスフェクション脂質は、任意の有用な脂質および抱合体の組み合わせを含むことができる。詳細な態様において、表1の1つまたは複数の化合物（たとえば、L-6、-30または表1のいずれか）の含有量は、約10モル％〜約40モル％（たとえば、約10モル％〜20モル％、10モル％〜30モル％、10モル％〜35モル％、15モル％〜20モル％、15モル％〜25モル％、15モル％〜30モル％、15モル％〜35モル％、15モル％〜40モル％、20モル％〜25モル％、20モル％〜30モル％、20モル％〜35モル％、20モル％〜40モル％、25モル％〜30モル％、25モル％〜35モル％または25モル％〜40モル％）である。いくつかの態様において、1つまたは複数の中性脂肪（たとえば、DSPC）の含有量は、約5モル％〜約20モル％（たとえば、約5モル％〜10モル％、5モル％〜15モル％、7モル％〜10モル％、7モル％〜15モル％、7モル％〜20モル％、10モル％〜15モル％または10モル％〜20モル％）である。いくつかの態様において、1つまたは複数のPEG-脂質抱合体（たとえば、PEG2000-DMPEなどのPEG-DSPEおよび／またはPEG2000-DSPEなどのPEG-DMPE）の含有量は、約0.5モル％〜約10モル％（たとえば、約0.5モル％〜1モル％、0.5モル％〜5モル％、0.5モル％〜10モル％、1モル％〜5モル％または1モル％〜10モル％）である。いくつかの態様において、1つまたは複数のステロール誘導体（たとえば、コレステロール）の含有量は、約20モル％〜約40モル％（たとえば、約20モル％〜25モル％、20モル％〜30モル％、20モル％〜35モル％、20モル％〜40モル％、25モル％〜30モル％、25モル％〜35モル％または25モル％〜40モル％）である。
【０２０２】
その他の態様において、表1から選択される化合物は、RNA-結合剤の製剤において使用される（たとえば、約25.9モル％のL-6、L-30、L-48またはL-49）。詳細な態様において、RNA-結合剤の製剤において使用される表1から選択される化合物は、トランスフェクション脂質の製剤において使用される化合物（任意に表1から）と異なる（たとえば、RNA-結合剤として25.9モル％のL-48およびトランスフェクション脂質として21.6モル％のL-30）。製剤のいくつかの態様において、1つまたは複数のRNA-結合剤は内部凝集体を形成し、および1つまたは複数のトランスフェクション脂質は外部の凝集体表面を形成する。詳細な態様において、外部の凝集体表面は、膜でなく、脂質二重層および／または多重膜層である。
【０２０３】
製剤は、1つまたは複数のPEG-脂質抱合体の任意の有用な量をまた含むことができる。いくつかの態様において、製剤においてPEG-脂質抱合体の含有量は、約1モル％〜約20モル％（たとえば、約1モル％〜約2モル％、約2モル％〜約4モル％、約2モル％〜約7モル％、約4モル％〜約8モル％、約8モル％〜約12モル％、約12モル％〜約16モル％または約16モル％〜約20モル％）である。その他の態様において、PEG-脂質抱合体の含有量は、約7モル％、6モル％、3.0モル％または2.5モル％である。その上、PEG-脂質含有量は、DSPCまたはコレステロールのどちらかまたは両方の含有量の適切な調整によって、約1モル％〜約20モル％まで変化してもよい。PEG-脂質は、C14：0（表4におけるような、たとえば、PEG-DSPEまたはPEG-DMPE、その他）、C16（PEG-DPPE、PEG-DPG、その他）、C18：0（PEG-DSPE、PEG-DSG、その他）またはC18：1（PEG-DOPE、PEG-DOG、その他）を使用することによって変化してもよい。さらにまた、異なる分子重量のPEG部分を使用することができる（PEG2000、PEG3400、PEG5000、その他）。詳細な態様において、本明細書において記述したように、混合したPEG-抱合体が使用される。詳細な態様において、PEG2000-DSPEが使用される。詳細な態様において、PEG2000-DMPEが使用される。
【０２０４】
RNAi薬剤を有する製剤
本発明のプロセスは、本明細書において記述した方法のいずれかによってRNAi薬剤を含む粒子および／または製剤を製造するために使用することができる。たとえば、以下を参照されたい：Judge et al., J. Clin. Invest. 119(3):661, 2009; Noble et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 64(4):741, 2009; Abrams et al., Mol. Ther. 18(1):171, 2009; Yagi et al., Cancer Res. 69(16):6531, 2009; Ko et al., J. Control. Release 133(2):132, 2009; Mangala et al., Methods Mol. Biol. 555:29, 2009、これらは、参照により本明細書に援用される。
【０２０５】
粒子および／または製剤は、任意の有用な比率において、RNAi薬剤および脂質分子および／または1つまたは複数の成分を含むことができる。例示的な比率は、約1：10〜約1：100（w/w）（たとえば、約1：10〜約1：50、たとえば約1：20）のRNAi薬剤：総脂質比率の（w/w）比率を含み、総脂質比率は、1つまたは複数の脂質分子（たとえば、陽イオン性、陰イオン性または中性脂肪）および1つまたは複数の成分（たとえば、ステロール誘導体、PEG-脂質抱合体、ポリアミド-脂質抱合体、ガングリオシド、抗酸化剤、界面活性剤、両親媒性物質または塩）の組み合わせの重量である。一つの態様において、薬物に対する脂質の比率（質量/質量比率）（たとえば、dsRNAに対する脂質の比率）は、約1：1〜約50：1、約1：1〜約25：1、約3：1〜約15：1、約4：1〜約10：1、約5：1〜約9：1または約6：1〜約9：1の範囲であるだろう。
【０２０６】
粒子および／または製剤は、本明細書で記述される任意のRNAi薬剤の約1mg/kg〜約10mg/kgの範囲の用量におけるRNAi薬剤を含むことができる。例示的な用量は、粒子または製剤において1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kgおよび10mg/kgのRNAi薬剤を含む。
【０２０７】
製剤を調製する方法
本発明の粒子は、多様な有用なプロセスで調製することができる。1つの例示的な手順において、本発明の粒子の成分（たとえば、1つまたは複数の脂質）は、溶媒（たとえば、水性溶媒、非水溶溶媒またはその溶媒混合物）において溶解される。本発明のプロセスに使用される例示的なFDA認可された溶媒は、酢酸、アセトン、アセトニトリル、アニソール、ベンゼン、1-ブタノール、2-ブタノール、酢酸ブチル、tert-ブチルメチルエーテル、四塩化炭素、クロロベンゼン、クロロホルム、クメン、シクロヘキサン、1,2-ジクロロエタン、1,1-ジクロロエテン、1,2-ジクロロエテン、ジクロロメタン、1,2-ジメトキシエタン、n,n-ジメチルアセトアミド、n,n-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、1,4-ジオキサン、エタノール、2-エトキシエタノール、エチルアセテート、エチレングリコール、エチルエーテル、ギ酸エチル、ホルムアミド、ギ酸、ヘプタン、ヘキサン、イソブチルアセテート、酢酸イソプロピル、メタノール、2-メトキシエタノール、メチルアセテート、イソペンチルアルコール、メチルブチルケトン、メチルシクロヘキサン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、イソブチルアルコール、n-メチルピロリドン、ニトロメタン、ペンタン、１‐ペンタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、酢酸プロピル、ピリジン、スルホラン、テトラヒドロフラン、テトラリン、トルエン、1,1,1-トリクロロエタン、1,1,2-トリクロロエテン、キシレンおよびこれらの組み合わせを含む。生じる脂質懸濁液は、任意に濾過し、混合し（たとえば、バッチ混合、インライン混合および／またはボルテックス）、蒸発させ（たとえば窒素またはアルゴンストリームを使用して）、再懸濁し（たとえば、水性溶媒、非水溶溶媒またはその溶媒混合物において）、凍結融解し、押し出され、および／または音波破砕される。さらにまた、脂質懸濁液は、最終的な懸濁液を製造するために、任意の所望の成分（たとえば、陰イオン性薬剤（たとえば、1つまたは複数のRNAi薬剤）、RNA-結合剤、トランスフェクション脂質および／または本明細書において記述した任意の脂質）と組み合わせることによって、任意に処理することができる。1つまたは複数の所望の成分は、懸濁液と同じまたは異なる溶媒において提供することができる。たとえば、脂質懸濁液は、第1の溶媒または溶媒システム（たとえば、水-HClなどの酸性水溶液、または水、水-エタノール、緩衝液（たとえば、リン酸緩衝食塩水（PBS）、ハンクス液（HBSS）、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（DPBS）、Earleの平衡塩類溶液（EBSS）、カルボナート、ラクタート、アスコルベートおよびシトラート、5mM、10mM、50mM、75mM、100mMまたは150mMなど）などの1つまたは複数の水性または非水性溶媒）、生理的オスモル濃度溶液（290mOsm/kg、たとえば、0.9%生理食塩水、5%デキストロースおよび10%スクロース）、生理食塩水、メタノール、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、n-ブタノール、イソブチルアルコール、tert-ブタノール、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、クロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサン、シクロヘキサン、アセトン、エーテル、ジエチルエーテル、ジオキサン、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン��たはこれらの組み合わせ）において提供することができ、および陰イオン性薬剤（たとえば、RNAi薬剤）は、第2の溶媒または溶媒システム、たとえば、水、水-HCl、水-エタノール、緩衝液（たとえば、リン酸緩衝食塩水（PBS）、ハンクス液（HBSS）、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（DPBS）、Earleの平衡塩類溶液（EBSS）、カルボナート、ラクタート、アスコルベートおよびシトラート、5mM、10mM、50mM、75mM、100mMまたは150mMなど）などの1つまたは複数の水性または非水性溶媒、、生理的オスモル濃度溶液（290mOsm/kg、たとえば、0.9%生理食塩水、5%デキストロースおよび10%スクロース）、生理食塩水、メタノール、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、n-ブタノール、イソブチルアルコール、tert-ブタノール、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、クロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサン、シクロヘキサン、アセトン、エーテル、ジエチルエーテル、ジオキサン、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフランまたはこれらの組み合わせ）において提供することができる。水性溶媒および／または緩衝液の例示的な濃度は、約4%〜約8%エタノール（たとえば、約4%〜5%、5%〜6%、6%〜7%または7%〜8%）、約10mM〜約100mMシトラート（たとえば、約10mM〜30mM、30mM〜50mM、50mM〜70mM、70mM〜90mMまたは90mM〜100mM）を含む。溶媒または溶媒システムのいずれかは、1つまたは複数の安定剤、抗酸化剤など、塩（たとえば、塩化ナトリウム）、クエン酸、アスコルビン酸、グリシン、システイン、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、マンニトール、ラクトース、トレハロース、マルトース、グリセロールおよび／またはグルコースを含むことができる。さらなる例において、1つまたは複数の陰イオン性薬剤は、第1の溶媒または溶媒システムを使用して脂質懸濁液に導入され、および次いでその後に第2の溶媒または溶媒システムにおける1つまたは複数のさらなる脂質（たとえば、トランスフェクション脂質）が添加され、ここで、第1および第2の溶媒または溶媒システムは同じかまたは異なる（たとえば、第1の溶媒または溶媒システムは本明細書において記述したいずれかである；および第2の溶媒または溶媒システムは、本明細書において記述したいずれかである）。詳細な態様において、第2の溶媒または溶媒システムは、生理食塩水、緩衝液（たとえば、シトラートまたはPBS）、水およびエタノールからなる群より選択される1つまたは複数の水性または非水溶溶媒を含む。最終的な懸濁液は、任意に分離され（たとえば、超遠心機によって）、混合され（たとえば、バッチ混合、インライン混合および／またはボルテックス）、再懸濁され、調整され（たとえば、1つまたは複数の溶媒または緩衝液システムで）、音波破砕され、凍結融解され、押し出され、および／または精製されることができる
【０２０８】
カチオン脂質
1つまたは複数のカチオン脂質は、本発明の方法によって製造される粒子および／または製剤に含まれることができる。表1の化合物に加えて、その他のカチオン脂質は、以下を含むが、限定されない：N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）、1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン（DOTMA）、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウム（DDAB）、1,2-ジオレイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン（DOTAP、キラル型R-DOTAPおよびS-DOTAPを含む）、N-（1-（2,3-ジオレイルオキシ）プロピル）-N-2-（スペルミンカルボキシアミド）エチル）-N,N-ジメチルアンモニウム（DOSPA）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（DOGS）、1,2-ジオレイル-3-ジメチルアンモニウムプロパン（DODAP）、N,N-ジメチル-（2,3-ジオレイルオキシ）プロピルアミン（DODMA）、N-（1,2-ジミリスチルオキシプロプ-3-イル）-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウム（DMRIE）、1,2-ジリノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン（DLinDMA）、1,2-ジリノレニルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン（DLenDMA）、1,2-ジリノレオイル-3-ジメチルアミノプロパン（DLinDAP）、1-リノレオイル-2-リノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン（DLin-2-DMAP）、1,2-ジリノレイルカルバモイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン（DLin-C-DAP）、1,2-ジリノレイルチオ-3-ジメチルアミノプロパン（DLin-SDMA）、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-［1,3］-ジオキソラン（DLin-K-DMA）、2,2-ジリノレイル-4-（2-ジメチルアミノエチル）-［1,3］-ジオキソラン（DLin-KC2-DMA）、（3aR,5s,6aS）-N,N-ジメチル-2,2-ジ（（9Z,12Z）-オクタデカ-9,12-ジエニル）テトラヒドロ-3aH-シクロペンタ［d］［1,3］ジオキソール-5-アミン、（6Z,9Z,28Z,31Z）-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-（ジメチルアミノ）ブタノアート（DLin-MC3-DMA）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-O-エチル-3-ホスホコリン（DPePC）、ジステアリルジメチルアンモニウムクロライド（DSDMA）、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（12：0 EPC、たとえば、またはその塩化物塩）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（16：0 EPC、たとえば、またはその塩化物塩）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（18：0 EPC、たとえば、またはその塩化物塩）、1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（18：1 EPC、たとえば、またはその塩化物塩）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン（DPPES）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミドL-リシン（DPPEL）、1-[2-ジオレオイルオキシ）エチル］-2-オレイル-3-（2-ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロライド（DOTIM）、（1-メチル-4-（シス-9-ジオレイル）メチル-ピリジニウム-クロライド）（SAINT）、およびC12-200、Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 107(5):1864-1869 (2010)に記載されるように、それは、参照により本明細書に援用される。
【０２０９】
カチオン脂質は、異なるキラル型（たとえば、本明細書において記述した任意のカチオン脂質のRまたはS型）または任意の塩形態（たとえば、本明細書において記述した任意のカチオン脂質の塩化物、ブロミド、トリフルオロ酢酸塩またはメタンスルホナート塩）のものを含む。
【０２１０】
加えて、多数のカチオン脂質の市販品は、粒子および／または製剤に含まれてもよい。このような市販品は、以下を含むが、限定されない：Invitrogen Corp.からのLipofectamine（商標）（DOSPAおよびDOPEの組み合わせ）およびリポフェクチン（登録商標）（DOTMAおよびDOPEの組み合わせ）；並びにPromega Corp.からのTransfectam（登録商標）（DOGSを含む組成物）およびTransfastTM。
【０２１１】
陰イオン性脂質
【０２１２】
1つまたは複数の陰イオン性脂質は、本発明の方法の製剤および／または粒子に含まれることができる。このような陰イオン性脂質は、以下を含むが、限定されない：ホスファチジルグリセロール（PG）、カルジオリピン（CL）、ジアシルホスファチジルセリン（PSs）、ジアシルホスファチジン酸（PA）、ホスファチジルイノシトール（PI）、N-アシルホスファチジルエタノールアミン（NAPE）、N-スクシニルホスファチジルエタノールアミン、N-グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロールおよびパルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（POPG）、並びに異なるキラル型（たとえば、RまたはS型）、塩形態（たとえば、塩化物、ブロミド、トリフルオロ酢酸塩またはメタンスルホナート塩）およびその混合物。
【０２１３】
中性脂肪
【０２１４】
1つまたは複数の中性脂肪は、本発明の方法の製剤および／または粒子に含まれることができる。このような中性脂肪は、以下を含むが、限定されない：セラミド、スフィンゴミエリン（SM）、ジアシルグリセロール（DAG）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC、キラル型R-DSPCおよびS-DSPCを含む）、1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DPPC）、1,2-ジオレイル-グリセロ-sn-3-ホスホエタノールアミン（DOPE）、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（POPC）、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（POPE）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DPPE）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DMPE）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DSPE）、1,2-ジエライドイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DEPE）、1-ステアロイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（SOPE）、1,2-ジリノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DLPC）、並びに異なるキラル型（たとえば、RまたはS型）、塩形態（たとえば、塩化物、ブロミド、トリフルオロ酢酸塩またはメタンスルホナート塩）およびその混合物。その他のジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンおよびジアシル-グリセロ-sn-3-ホスホエタノールアミン脂質はまた、本発明の脂質粒子において使用されてもよい。
【０２１５】
いくつかの態様において、製剤および／または粒子において存在する中性脂肪成分は、1つまたは複数のリン脂質を含む。さらなる態様において、中性脂肪成分は、1つまたは複数のリン脂質およびコレステロールの混合物を含む。いくつかの態様において、製剤および／または粒子に使用するための中性脂肪の選択は、薬動力学のおよび／または薬力学特性、たとえば脂質粒径および血流における安定性、を考慮することにより導かれる。
【０２１６】
ステロール誘導体
1つまたは複数のステロール誘導体は、本発明の方法の製剤および／または粒子に含まれることができる。理論によって制限されることを望まないが、ステロール誘導体は、製剤/粒子を安定させ、および／またはトランスフェクションを増加させるために使用することができる。例示的なステロール誘導体は、以下を含む：コレステロール、コレスタノールの誘導体（たとえば、コレスタノン、コレステノンまたはコプロスタノール）；3β-[-（N-（N',N'-ジメチルアミノエタン）-カルバモイル］コレステロール（DC-コレステロール、たとえば、そのハイドロクロライド塩）；ビス-グアニジウム-トレン-コレステロール（BGTC）；（2S,3S）-2-（（（3S,10R,13R,17R）-10,13-ジメチル-17-（（R）-6-メチルヘプタン-2-イル）-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ［a］フェナントレン-3-イルオキシ）カルボニルアミノ）エチル2,3,4,4-テトラヒドロキシブタノアート（DPC-1）；（2S,3S）-（（3S,10R,13R,17R）-10,13-ジメチル-17-（（R）-6-メチルヘプタン-2-イル）-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ［a］フェナントレン-3-イル）2,3,4,4-テトラヒドロキシブタノアート（DPC-2）；ビス（（3S,10R,13R,17R）-10,13-ジメチル-17-（（R）-6-メチルヘプトの2-イル）-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ［a］フェナントレン-3-イル）2,3,4-トリヒドロキシペンタンジオアート（DPC-3）；および6-（（（3S,10R,13R,17R）-10,13-ジメチル-17-（（R）-6-メチルヘプタン-2-イル）-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ［a］フェナントレン-3-イルオキシ）オキシドホスホリルオキシ）-2,3,4,5-テトラヒドロキシヘキサノアート（DPC-4）。
【０２１７】
PEG-脂質抱合体
1つまたは複数のPEG-脂質抱合体は、本発明の方法の製剤および／または粒子に含まれることができる。理論によって制限されることを望まないが、PEG-脂質抱合体は、脂質ベクターの凝集を減少させることにおいて作用することができる。PEG-脂質抱合体は、米国特許第5,885,613および米国特許公開番号2003/0077829において記述され、それらは参照により本明細書に援用される。
【０２１８】
製剤および／または粒子に含まれてもよいPEG-脂質抱合体は、以下を含むが、限定されない：1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-（カルボニル-メトキシ-ポリエチレングリコール）（PEG-DMPEまたはDMPE-PEG）（たとえば、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-（カルボニル-メトキシ-ポリエチレングリコール-2000）（PEG-2000-DMPEまたはDMPE-PEGまたはDMPE-PEG2k））、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-（カルボニル-メトキシ-ポリエチレングリコール）（PEG-DPPEまたはDPPE-PEG）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-（カルボニル-メトキシ-ポリエチレングリコール）（PEG-DSPEまたはDSPE-PEG）、1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-（カルボニル-メトキシ-ポリエチレングリコール）（PEG-DOPEまたはDOPE-PEG）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール-3-（メトキシポリエチレングリコール）（PEG-DMGまたはDMG-PEG）（たとえば、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール-3-（メトキシポリエチレングリコール）（PEG-2000-DMGまたはDMG-PEGまたはDMG-PEG2k））、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロール-3-（メトキシポリエチレングリコール）（PEG-DPGまたはDPG-PEG）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロール-3-（メトキシポリエチレングリコール）（PEG-DSGまたはDSG-PEG）、1,2-ジオレイル-sn-グリセロール-3-（メトキシポリエチレングリコール）（PEG-DOGまたはDOG-PEG）、3-N-［（ω-メトキシポリ（エチレングリコール）2000）カルバモイル］-1,2-ジミリスチルオキシ-プロピルアミン（PEG-C-DMA）、R-3-[（ω-メトキシポリ（エチレングリコール）2000）カルバモイル）］-1,2、-ジミリスチルオキシプロピル（dimyristyloxlpropyl）-3-アミン（PEG-2000-C-DOMG）およびPEG-セラミド抱合体（たとえば、PEG-CerC14またはPEG-CerC20、それらは米国特許第5,820,873において記述され、参照によって本明細書に組み込まれる）。さらなるPEG-脂質抱合体は、本明細書において、ホスファチジルエタノールアミンまたはセラミドなどの、本明細書において記述される任意の脂質に抱合されるPEG（米国特許第5,820,873；5,534,499；および5,885,613を参照されたい、それらは、参照により本明細書に援用される）および本明細書において記述される任意のPEG-脂質抱合体の塩形態（たとえば、ナトリウム、アンモニウムまたはトリメチルアンモニウム塩）を含む。
【０２１９】
PEG-脂質抱合体は、本明細書において記述される任意の脂質分子による、または異なる分子量（たとえば、300〜5,000ダルトン）のPEG部分による置換などの、1つまたは複数の種々の修飾を含むことができる。例示的な置換は、C14：0（表4におけるような）、C16（PEG-DPPE、PEG-DPG、その他）、C18：0（PEG-DSPE、PEG-DSG、その他）またはC18：1（PEG-DOPE、PEG-DOG、その他）の1つまたは複数の使用を含み、ポリエチレングリコール部分（たとえば、PEG2000、PEG3400、PEG5000など）と組み合わせて、PEG-脂質抱合体（たとえば、mPEG2000-DMG）を形成する。種々の分子量を有するPEG部分の例は、PEG350、PEG550、PEG750、PEG1000、PEG2000、PEG3000、PEG3400、PEG4000およびPEG5000を含む。
【０２２０】
例示的な脂質
製剤および／または粒子は、任意の当該技術において承認されている脂質またはその他の関連する成分の1つまたは組み合わせを含むことができ、たとえば、以下において記述したものを含む：米国特許第6,756,054；5,976,567；6,815,432；6,858,225；6,020,526；6,638,529；6,670,393；6,034,135；5,958,901；6,172,049；8,324,366；8,158,601；8,034,376；8,329,070；7,901,708；8,283,333；8,236,943；8,188,263；8,101,741；8,058,069；7,982,027；7,803,397；7,915,399；7,807,815；7,799,565；7,745,651；6,841,537；6,410,328；7,811,602；7,244,448；および8,227,443並びに特許出願番号US 2012/0294905；US 2012/0244207；US 2012/0046478；US 2012/0183602；US 2012/0128760；US 2012/0101148；US 2009/0163705；US 2012/0016006；US 2003/0077829；WO 2010/088537；WO 2010/036962；US 2012/0095075；US 2012/0058144；US 2012/0027796；US 2011/0311583；US 2012/0027803；WO 2010/048536；WO 2011/038031；WO 2009/132131；WO 2009/100351；WO 2004/064737；WO 2004/030634；WO 2011/071860；WO 2013/013017；WO 2013/013013；WO 2010/057217；WO 2010/036962；WO 2011/153493；WO 2011/075656；WO 2010/144740；WO 2009/086558；WO 2010/054405；WO 2010/054401；WO 2010/054384；US 2011/0086826；US 2012/0225434；US 2011/0117125；WO 2009/086558；US 2011/0256175；WO 2010/042877；US 2010/0041152；US 2009/0285878；WO 2009/108235；WO 2009/108235；US 2011/0216622；US 2004/0142025；WO 2004/002453；US 2012/0202871；US 2011/0076335；WO 2011/000106；WO 2011/000107；US 2011/0195127；WO 2011/000108；US 2011/0178155；WO 2009/129319；US 2012/0328668；US 2009/0270481；US 2007/0135372；WO 2007/051303；US 2012/0183581；US 2010/0130588；US 2009/0291131；WO 2009/127060；WO 2009/082817；US 2012/0058188；US 2011/0091525；US 2006/0240093；US 2005/0175682；US 2005/0064595；WO 2005/007196；WO 2005/026372；WO 2005/007196；US 2011/0224418；US 2008/0249046；US 2006/0051405；US 2006/0025366；WO 2006/007712；WO 2006/002538；WO 2006/007712；US 2011/0262527；US 2011/0060032；US 2006/0083780；US 2006/0008910；WO 2005/120152；WO 2005/121348；WO 2005/120152；US 2005/0118253；US 2013/0022649；WO 2011/066651；US 2012/0172411；US 2011/0313017；US 2011/0201667；WO 2011/011447；US 2011/0189300；US 2006/0134189；WO 2006/053430；US 2011/0177131；US 2007/0135370；WO 2007/048046；US 2011/0071208；US 2009/0149403；US 2008/0171716；WO 2008/019486；US 2007/0218122；WO 2007/056861；US 2007/0054873；US 2007/0042031；WO 2007/012191；WO 2002/088370；US 2003/0108886；WO 2002/088370；WO 2002/087541；WO 2011/038160；WO 2010/083615；WO 2011/141705；WO 2011/141704；WO 2012/000104；WO 2011/141703；WO 2010/105372；およびWO 2006/074546。
【０２２１】
その他の成分
製剤および／または粒子は、脂質ベクターを安定させ、脂質ベクターの凝集を減少させ、および／または治療的薬剤（たとえば、RNAi薬剤）を送達することを補助するための任意のその他の成分を含むことができる。例示的な成分は、以下を含む：ω-アミノ（オリゴエチレングリコール）アルカノン酸単量体に基づいたポリアミド-脂質抱合体（ATTA-脂質）、米国特許第6,320,017および6,586,559において記述したものなど、それらは参照により本明細書に援用される；ガングリオシド（たとえば、アシアロガングリオシドGM1またはGM2；ジシアロガングリオシドGD1a、GD1a-NAcGal、GD1-b、GD2またはGD3；グロボシド、モノシアロガングリオシドGM1、GM2またはGM3、テトラシアロガングリオシドGQ1bおよびトリシアロガングリオシドGT1aまたはGT1b）；抗酸化剤（たとえば、α-トコフェロールまたはβ-ヒドロキシトルイジン）；1つまたは複数の界面活性剤（たとえば、ソルビタンモノパルミタートまたはソルビタンモノパルミタート、油性スクロースエステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンステロールエーテル、ポリオキシエチレンポリプロポキシアルキルエーテル、ブロックポリマーおよびセチルエーテル、並びにポリオキシエチレンヒマシ油または硬化ヒマシ油誘導体およびポリグリセリン脂肪酸エステル、Pluronic（登録商標）、Poloxamer（登録商標）、Span（登録商標）、Tween（登録商標）、Polysorbate（登録商標）、Tyloxapol（登録商標）、Emulphor（登録商標）またはCremophor（登録商標）など（たとえば、ポリエチレングリコールの脂肪酸エステルをもつグリセロール-ポリエチレングリコールリシノール酸塩の主要成分を有するCremophor（登録商標）EL）；1つまたは複数の両親媒性薬剤（たとえば、大豆油、サフラワー油、オリーブ油、ゴマ油、ルリヂサ油、ヒマシ油および綿実油などの植物油；鉱物油および魚油、このような供与源から水素添加および／または分画されたトリグリセリド；中鎖脂肪酸（MCT-油、たとえば、Miglyol（登録商標））および種々の合成または半合成のモノ、ジまたはトリグリセリド、WO92/05571において開示される定義された非極性脂質など、並びにアセチル化されたモノグリセリドまたは脂肪酸のアルキルエステル、このようなイソプロピルミリステート、オレイン酸エチル（EP 0 353 267を参照されたい）または脂肪酸アルコール、オレイルアルコールなど、セチルアルコール）；および本明細書において記述した任意の塩などの、1つまたは複数の塩。典型的には、凝集を減少させるために選択される脂質成分の濃度は、約1モル％〜15モル％である。
【０２２２】
脂質ベクター
本発明の方法の製剤および／または粒子は、表1から選択される1つまたは複数の化合物および／または治療的薬剤（たとえば、陰イオン性薬剤、RNAi薬剤など）を輸送することができる任意の脂質に基づいた組成物を含むことができる。例示的な脂質に基づいた組成物は、1つまたは複数の脂質分子（たとえば、表1の化合物、カチオン脂質、陰イオン性脂質または中性脂肪）および／または1つまたは複数の成分（たとえば、ステロール誘導体またはPEG-脂質抱合体）を含む。
【０２２３】
脂質ベクターは、脂質ベクターを形成することが可能な任意の生体適合性脂質または脂質の組み合わせを使用して、形成することができる（たとえば、リポソーム、リポプレックスおよびミセル）。治療的薬剤の脂質ベクターへのカプセル化は、薬剤を損傷または分解から保護することができる、または細胞へのエントリーを容易にすることができる。脂質ベクターは、電荷の相互作用（たとえば、カチオン脂質ベクターおよび陰イオン性細胞膜）の結果として、細胞膜と相互作用し、および融合し、したがって細胞質に薬剤をリリースする。リポソームは、1つまたは複数の本発明の化合物、脂質分子および／または成分を含む二重層の小胞である。脂質ナノ粒子は、約1nm〜約1,000nmのサイズの範囲のリポソームである。リポプレックスは、全体の正電荷をリポソームに与えるカチオン脂質分子とともに形成されたリポソームである。ミセルは、脂質分子の単一層をもつ小胞である。
【０２２４】
リポソーム
一定の態様において、脂質ベクターは、リポソームである。典型的には、使用される脂質は、二重層を形成することができ、および陽イオンである。適切な脂質分子のクラスは、リン脂質（たとえば、ホスファチジルコリン（phosphotidylcholine））、脂肪酸、糖脂質、セラミド、グリセリドおよびコレステロールまたはそれらの任意の組み合わせを含む。あるいは、または加えて、脂質ベクターは、中性脂肪（たとえば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE））を含むことができる。脂質ベクターを形成することができるその他の脂質は、当該技術分野において公知であり、および本明細書において記述した。
【０２２５】
本明細書に使用される「脂質分子」は、疎水性のヘッド部分および親水性のテール部分をもつ分子であり、およびリポソームを形成することが可能でもよく、表1の化合物または本明細書において記述した任意の陽イオン性、中性または陰イオン性脂質を含む。脂質分子は、親水性ポリマー基を含むように任意に修飾することができる。このような脂質分子の例は、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000］（PEG2000-DSPE）、たとえば、そのアンモニウム塩、および1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［カルボキシ（ポリエチレングリコール）-2000］（PEG2000-DSPEカルボキシ）を含む。
【０２２６】
脂質分子の例は、以下を含む：カルジオリピン（CL）、ホスファチジン酸（PA）、ホスファチジルコリン（PC）、リゾホスファチジルコリン（LPC）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、ホスファチジルグリセロール（PG）、ホスファチジルイノシトール（PI）およびホスファチジルセリン（PS）などの天然脂質；レシチン（lechitin）などの脂質混合物；スフィンゴシン、セラミド、スフィンゴミエリン、セレブロシド、スルファチド、ガングリオシドおよびフィトスフィンゴシンなどのスフィンゴ脂質；1,2-ジオレイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン（DOTAP）、1,2-ジオレイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン（DODAP）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）、3-β-［N-（N',N'-ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（DC-Chol）、N-［1-（2,3、-ジテトラデシルオキシ）プロピル］-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、N-［1-（2,3、-ジオレイルオキシ）プロピル］-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DORIE）および1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン（DOTMA）などのカチオン脂質；1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DLPC）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DMPC）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DPPC）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）および1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロール-3-ホスホコリン（POPC）などのホスファチジルコリン；1,2-ジブチリル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DSPE）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DMPE）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DPPE）、1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DOPE）、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（POPE）および1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-（グルタリル）などのホスホエタノールアミン；リン酸ジセチル（DCP）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスフェートおよび1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスフェートなどのホスファチジン酸；ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジオレイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）および1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）などのホスファチジルグリセロール；1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリンおよび1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリンなどのホスファチジルセリン；1',3’-ビス［1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ］-sn-グリセロールなどのカルジオリピン；および1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-750］、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000］、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-5000］、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000］および1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[カルボキシ（ポリエチレングリコール）-2000］などのPEG-脂質抱合体。
【０２２７】
表1のものなどの化合物は、市販の脂質組成物を含む、任意の有用な脂質組成物と組み合わせることができる。このような組成物の例は、以下を含む：Invitrogen社からのLipofectamine（商標）（DOSPAおよびDOPEの組み合わせ）およびリポフェクチン（登録商標）（DOTMAおよびDOPEの組み合わせ）；Promega社からのTransfectam（登録商標）（DOGSを含む組成物）およびTransfast（商標）；Sigma-Aldrich社からのNeuroPORTER（商標）およびEscort（商標）；RocheからのFuGENE（登録商標）6；およびStrategeneからのLipoTAXI（登録商標）。Boado, Pharm. Res. 24:1772-1787 (2007)に記載されるように、公知の脂質組成物は、Trojan Horse Lipsome技術を含む。
【０２２８】
リポソームはまた、リポソームの形成または安定性を補助するその他の成分を含むことができる。成分の例は、コレステロール、抗酸化剤（たとえば、α-トコフェロールまたはβ-ヒドロキシトルイジン）、界面活性剤および塩を含む。
【０２２９】
リポソームは、たとえばリポソームの形成または安定性を補助する1つまたは複数の表1の化合物およびその他の脂質成分を含む、脂質分子を含む任意の有用な組み合わせであることができる。当業者は、特定の薬剤のカプセル化、リポソームの安定性、反応条件のスケールアップまたは任意のその他の関連する因子を支持する組み合わせをどのように最適化すべきかについて、知っているだろう。例示的な組み合わせは、Boado, Pharm. Res. 24:1772-1787 (2007)において記述される。
【０２３０】
リポソームの製造は、典型的には一般的な二段法を介して生じる。第1の工程において、脂質および脂質成分は、揮発性の有機溶媒または溶媒の混合物において混合され、脂質の同種の混合物を保証する。溶媒の例は、クロロホルム、メタノール、シクロヘキサンおよびt-ブタノールを含む。溶媒は、次いで除去され、フィルム、粉末またはペレットにおける乾燥混合脂質を形成する。溶媒はまた、窒素、ロータリーエバポレーション、噴霧乾燥、凍結乾燥および真空乾燥を使用することによるなど、任意の公知の解析技術を使用することによって、除去することができる。
【０２３１】
第2の工程において、乾燥混合脂質は、リポソームを形成するために、水溶液で水和される。薬剤は、水溶液に添加することができ、それはカプセル化された薬剤をもつリポソームの形成を生じる。あるいは、リポソームは、最初に第1の水溶液で形成し、および次いで薬剤を含むもう一つの水溶液に曝露される。薬剤のカプセル化は、リピート凍結融解サイクル、超音波処理または混合することによるなどの、任意の公知の技術によって促進することができる。このアプローチのさらなる例は、Boado, Pharm. Res. 24:1772-1787 (2007)において記述される。あるいは、薬剤は、疎水性部分（たとえば、コレステロール）に結合させて親油性誘導体を製造し、および親油性誘導体はその他の脂質分子と使用してリポソームを形成する。
【０２３２】
第2の工程の間、乾燥混合脂質は、ポリペプチド-脂質抱合体を含んでもよいし、含まなくてもよい。プロセスは、以下を含む種々のさらなる工程を任意に含むことができる：乾燥混合脂質にそれを添加する前に脂質分子の相転移温度を過ぎて水溶液を加熱することであって、特定の温度範囲が約40℃〜約70℃を含む；乾燥混合脂質および水溶液の組み合わせをインキュベートすることであって、特定の時間範囲が約30分〜約2時間を含む；インキュベーションの間、ボルテックス混合、振盪、撹拌（stirring）または撹拌（agitation）などによって、乾燥混合脂質および水溶液を混合すること；水溶液に非電解質を添加して生理的な浸透圧を保証すること（0.9%生理食塩水、5%デキストロースおよび10%スクロースの溶液など）；押出または超音波処理などによる大きな多重膜小胞の破壊；および予め形成したリポソームとポリペプチド-脂質抱合体とのさらなるインキュベーションであって、乾燥混合脂質は、脂質分子を含んでいなかった。当業者は、この水和工程の間の特定の温度およびインキュベーション時間を同定して、リポソームへの誘導体化された脂質分子の組み込みを保証する、または安定なリポソームを得ることができるだろう。
【０２３３】
表1のものなどの脂質化合物は、リポソームを形成するプロセスにおける任意のポイントにて添加することができる。1つの例において、化合物は、乾燥混合脂質の形成の間、脂質および脂質成分に添加される。もう一つの例において、化合物は、脂質および脂質成分を含む乾燥混合脂質とともに予備成形されるリポソームに、添加される。さらにもう一つの例において、ミセルは化合物とともに形成され、リポソームは脂質および脂質成分を含む乾燥混合脂質とともに形成され、および次いでミセルおよびリポソームは共にインキュベートされる。水溶液は、薬剤またはリポソームを安定させるために、緩衝液、塩、キレート剤、生理食塩水、デキストロース、スクロース、その他などのさらなる成分を含むことができる。
【０２３４】
この手順の1つの例において、混合脂質で構成される乾燥フィルムは、薬剤を含む水溶液で水和される。この混合物は、最初に30分間50℃まで加熱し、および次いで室温に冷却される。次に、混合物は、ポリペプチド-脂質抱合体を含む乾燥フィルム上に移される。混合物は、次いで2時間37℃にてインキュベートして、薬剤を含むリポソームにポリペプチド-脂質抱合体を組み込む。たとえば、Zhang et al., J. Control. Release 112:229-239 (2006)を参照されたい。
【０２３５】
小胞構造を有する脂質粒子
一定の態様において、脂質粒子は、以下を含む：カチオン脂質（たとえば、DODMA、DOTMAおよび／またはアミノ-アミン脂質、アミノ-アミド脂質またはその他のこのような脂質、たとえば表1における）および陰イオン性薬剤（たとえば、RNAi薬剤）、並びに中性または両性イオン性脂質、PEG-脂質抱合体および任意にコレステロール。
【０２３６】
1つまたは複数のRNA結合剤および1つまたは複数のトランスフェクション脂質を有する脂質粒子
脂質粒子はまた、1つまたは複数のRNA結合剤および1つまたは複数のトランスフェクション脂質を有するものを含む。一つの態様において、1つまたは複数のRNA-結合剤は内部凝集体を形成し、および1つまたは複数のトランスフェクション脂質は外部の凝集体表面を形成する。詳細な態様において、外部の凝集体表面は、膜でなく、脂質二重層および／または多重膜層である。一定の態様において、1つまたは複数のRNA結合剤（たとえば、脂質）は、総脂質の約10〜90%を表す。その他の態様において、1つまたは複数のRNA結合剤（たとえば、脂質）は、総脂質の約50%を表す。その他の態様において、1つまたは複数のRNA結合剤（たとえば、脂質）は、総脂質の約30%を表す。一定の態様において、脂質粒子の核酸薬剤と1つまたは複数のRNA結合剤との複合体/凝集体は、以下を含む：カチオン脂質（たとえば、DODMA、DOTMAおよび／またはアミノ-アミン脂質またはアミノ-アミド脂質、たとえば表1における）およびRNAi薬剤；および脂質粒子の1つまたは複数のトランスフェクション脂質は、中性または両性イオン性脂質、PEG-脂質抱合体および任意にコレステロールを含む。その他の態様において、粒子の1つまたは複数のトランスフェクション脂質は、カチオン脂質（たとえば、DODMA、DOTMA、アミノ-アミン脂質および／またはアミノ-アミド脂質）、中性脂肪、PEG-脂質抱合体および任意にコレステロールを含む。
【０２３７】
拡張可能な脂質粒子製造プロセス
一定の態様において、本発明は、以前に実施されたプロセスを改善する粒子製造プロセスを提供し、このような改善されたプロセスは、たとえば、脂質粒子および／または製剤を作製するためのその他のこのような方法と比較して、粒子の有効性の喪失が少ないかまたは少しも有意でなく、より多量の脂質粒子の製造を可能にする。理論によって拘束されることを望まないが、本発明のプロセスは、粒子/形成調製のための代わりの方法を使用して得られたものより均一な粒径および構造の集団を製造するように設計される。本発明のこのような特性は、特異的に、本明細書において開示されるプロセスの実行の間の成分の添加の順序によることが考えられ、ここで、陰イオン性薬剤含有複合体を水溶液に懸濁し、およびさらなる脂質をエタノールなどの溶媒に懸濁し、陰イオン性薬剤複合体を含む水溶液に対してエタノール含有脂質溶液を添加すると、エタノール含有脂質溶液に対して陰イオン性薬剤複合体を含む水溶液を添加するより、陰イオン性薬剤複合体の破壊/解離をより少なくさせる。後者の添加順序が行われるとき（エタノールに対し水性）、エタノール含有脂質溶液に添加する最初の陰イオン性薬剤複合体は、高い濃度のエタノールに曝露され、それは、次いで、混合溶液の最終的なエタノール濃度を最終的に達成するために、エタノール溶液に水溶液をさらに添加されて時間とともに落ちる。エタノールの一過性の高い濃度に対するこれらの最初の陰イオン性薬剤複合体の曝露は、このような複合体に破壊的であると考えられ、結果として、最終的な粒子集団内において、粒子構造およびサイズの異種性がより大きくなり、それはまた減少した活性および／または作用強度を有する。対照的に、本発明の一定の側面は、添加順序が、さらなる脂質を含むエタノール溶液を水溶液に懸濁された陰イオン性薬剤複合体に添加するものであるとき、粒子集団の構造およびサイズの等質性、有効性および／または作用強度が改善するという驚くべき同定に関し、それは、陰イオン性薬剤複合体を、初めに低くおよび次いで徐々に増加する濃度のエタノールに曝露させ（添加順序が逆転したときのように同じ終濃度を達成するために）、今度は粒子破壊および／または解離を減少させ、および粒子集団の等質性、有効性および／または作用強度を改善させる。
【０２３８】
たとえば、溶媒（たとえば、エタノール）に懸濁された脂質に水性複合体を添加することを含む方法と、本発明の改善された方法の間の相違は控えめであり、および／または小さな製造スケール（たとえば、水1mL容積における粒子の陰イオン性薬剤1mgの調製）にて検出するのが困難であるが、製造スケールが増加するとすぐに、このような発明的相違ははるかにはっきりしかつ明らかになる。本発明のプロセスのための例示的な粒子製造スケールは、小スケール製造（たとえば、粒子における1mgの陰イオン性薬剤）だけでなく、粒子における10mgまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における50mgまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における100mgまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における250mgまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における500mgまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における1gまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における2gまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における3gまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における4gまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における5gまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における7.5gまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における10gまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における20gまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における40gまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における50gまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における100gまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における200gまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における300gまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における400gまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における500gまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における1kgまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における2kgまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における3kgまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における4kgまたはそれ以上の陰イオン薬剤、粒子における5kgまたはそれ以上の陰イオン薬剤、または粒子における10kgまたはそれ以上の陰イオン薬剤をも含む。
【０２３９】
一定の態様において、本発明の改善されたプロセスの粒子は、溶媒（たとえば、エタノール）溶液に水溶液を添加することを含む方法によって製造される対応する粒子集団より、少なくとも10%多い総有効性および／または作用強度（粒子量および／または容積などにつき）を有する。任意に、本発明の改善されたプロセスの粒子は、溶媒（たとえば、エタノール）溶液に水溶液を添加することを含む方法によって製造される対応する粒子集団より、少なくとも20%大きい、少なくとも30%大きい、少なくとも40%大きい、少なくとも50%大きい、少なくとも60%大きい、少なくとも70%大きい、少なくとも80%大きい、少なくとも90%大きい、少なくとも100%大きい、少なくとも200%大きい、少なくとも500%大きい、または少なくとも1000%大きい総有効性および／または作用強度（粒子量および／または容積などにつき）を有する。関連した態様において、本発明の改善されたプロセスの粒子は、溶媒（たとえば、エタノール）溶液に水溶液を添加することを含む方法によって製造される対応する粒子集団より、少なくとも10%低い絶対レベルまで、陰イオン性薬剤（たとえば、RNAi薬剤）の標的遺伝子発現を減少させる。任意に、本発明の改善されたプロセスの粒子は、溶媒（たとえば、エタノール）溶液に水溶液を添加することを含む方法によって製造される対応する粒子集団より、少なくとも20%低い絶対レベル、少なくとも30%低い絶対レベル、少なくとも40%低い絶対レベル、少なくとも50%低い絶対レベル、少なくとも60%低い絶対レベル、少なくとも70%低い絶対レベル、少なくとも80%低い絶対レベル、少なくとも90%低い絶対レベル、少なくとも95%低い絶対レベルまたは100%低い絶対レベルまで、陰イオン性薬剤（たとえば、RNAi薬剤）の標的遺伝子発現を減少させる。このような相違または改善は、約10mgまたはそれ以上、20mgまたはそれ以上、50mgまたはそれ以上、100mgまたはそれ以上、250mgまたはそれ以上、500mgまたはそれ以上、1gまたはそれ以上、2gまたはそれ以上、3gまたはそれ以上、4gまたはそれ以上、5gまたはそれ以上、7.5gまたはそれ以上、10gまたはそれ以上、20gまたはそれ以上、40gまたはそれ以上、50gまたはそれ以上、100gまたはそれ以上、200gまたはそれ以上または陰イオン性薬剤、300gまたはそれ以上、400gまたはそれ以上、500gまたはそれ以上、1kgまたはそれ以上、2kgまたはそれ以上、3kgまたはそれ以上、4kgまたはそれ以上、5kgまたはそれ以上または10kgまたはそれ以上のレベルなどの高い粒子製造レベルにて一般に最も観察される。
【０２４０】
本発明のプロセスの脂質粒子は、典型的に、約30nm〜約150nm、約40nm〜約150nm、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nm、約70nm〜約100nm、約80nm〜約100nm、約90nm〜約100nm、約70〜約90nm、約80nm〜約90nm、約70nm〜約80nm、または約30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nmまたは150nmの平均直径を有し、および実質的に非毒性である。加えて、本発明のプロセスの脂質粒子において存在するときに、核酸は、水溶液においてヌクレアーゼによる分解に対し抵抗性である。核酸-脂質粒子および一定の調製法は、たとえば米国特許公開第20040142025および20070042031において開示され、それらの開示は全ての目的についてこれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２４１】
RNAi薬剤
RNA干渉（RNAi）は、特異的RNA分子の分解を生じさせ、または特異的遺伝子の転写を妨げることによって、遺伝子発現を阻害する機構である。本質的に、RNAi標的は、発達およびゲノム維持を調節することにおける役割をまた果たすが、たいていウイルスおよびトランスポゾン（先天性免疫応答の形態）からのRNA分子である。RNAiの機構に対する鍵は、低分子干渉RNA鎖（siRNA）であり、それはターゲットされたメッセンジャーRNA（mRNA）分子に十分に相補的な核酸配列を有する。siRNAは、RNAi経路の中でタンパク質をターゲットされたmRNAに導き、およびこれらを分解し、およびタンパク質にもはや翻訳されることができないより小さな部分にこれらを切断する。
【０２４２】
RNAi経路は、酵素Dicerによって開始され、それは長い二本鎖のRNA（dsRNA）分子を、典型的には長さ約21〜約23ヌクレオチドおよび約19塩基対の二重鎖を含む、siRNA分子に切断する。それぞれの断片の2つの鎖のうち1つは、ガイド鎖として知られ、次いでRNA誘導型サイレンシング複合体（RISC）に組み込まれて、および相補配列と対をなす。RISCは、siRNA二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖RNAの切断を媒介する。標的RNAの切断は、siRNA二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央において起こる。この認識イベントの結果は、転写後遺伝子サイレンシングである。これは、ガイド鎖が特異的にmRNA分子と対になり、およびRISC複合体の触媒作用的成分であるArgonauteによって分解を誘導するときに、生じる。
【０２４３】
本発明の方法の粒子は、インビトロまたはインビボで（たとえば、被験体において）細胞に1つまたは複数の陰イオン性薬剤、RNAi薬剤など、を送達するために使用することができる。RNAi薬剤は、RNA：RNAまたはRNA：DNA鎖のどちらかを含む二本鎖の分子の異なるタイプを含むことができる。これらの薬剤は、二重鎖、ヘアピンループ、または二本鎖ポリヌクレオチドを単独でまたはもう一つのポリヌクレオチドとの組み合わせにおいて形成することが可能な1つまたは複数のポリヌクレオチドを発現する発現ベクターを含む、多様な構造（たとえば、3'-末端の上のオーバーハング有り無し）において細胞に導入することができる。例示的なRNAi薬剤は、siRNA、shRNA、DsiRNAおよびmiRNA薬剤を含み、それらは本明細書において記述した。一般に、これらの薬剤は、長さ約10〜約40ヌクレオチドであり、および好ましい長さは特定のRNAi薬剤について後述した。
【０２４４】
RNAi薬剤による機能的遺伝子サイレンシングは、ターゲットされた遺伝子産物の完全な阻害を必ずしも含まない。いくつかの場合において、RNAi薬剤によって生じる遺伝子産物発現におけるわずかな減少は、宿主細胞、組織、器官または動物における有意な機能的または表現型変化で言い換えてもよい。したがって、遺伝子サイレンシングは、機能的な均等物であることが理解され、およびサイレンシングを達成する遺伝子産物分解の程度は遺伝子標的または宿主細胞型の間で異なってもよい。
【０２４５】
siRNA
低分子干渉RNA（siRNA）は、一般に3'-末端上の1つまたは2つのヌクレオチドのオーバーハングを有するまたはいかなるオーバーハングも有さない、長さ16〜30ヌクレオチドの二本鎖RNA分子（たとえば、18〜25ヌクレオチド、たとえば21ヌクレオチド）である。当業者は、この配列長を変化させてもよい（たとえば、遺伝子サイレンシングの全体レベルを増加または減少させるために）。一定の態様において、オーバーハングは、3'-末端にてUUまたはdTdTである。一般に、siRNA分子は、標的DNA分子の1つの鎖に完全に相補的であり、単一の塩基対ミスマッチでさえサイレンシングを減少させることが示されたからである。その他の態様において、siRNAsは、たとえば、2'-デオキシ-または2'-O-メチル修飾または本明細書において記述した任意の修飾などの修飾されたバックボーン組成物を有してもよい。
【０２４６】
siRNAは、配列特異的様式において遺伝子発現を阻害するかまたはダウンレギュレートすることが可能な核酸分子をいう；たとえば、Zamore et al., Cell 101:25 33 (2000)；Bass, Nature 411:428-429 (2001)；Elbashir et al., Nature 411:494-498 (2001);並びに国際公開番号WO 00/44895、WO01/36646、WO99/32619、WO00/01846、WO01/29058、WO99/07409およびWO00/44914を参照されたい。遺伝子サイレンシングに使用するためのsiRNA分子を調製する方法は、米国特許第7,078,196において記述され、それは参照により本明細書に援用される。
【０２４７】
shRNA
短いヘアピンRNA（shRNA）は、ヘアピンループ構造が存在する一本鎖RNA分子であり、同じ鎖の中の相補的なヌクレオチドが分子間結合を形成することを可能にする。shRNAは、siRNAと比較して、ヌクレアーゼ分解に対し減少した感受性を示すことができる。一定の態様において、shRNAは、長さ19〜29ヌクレオチドのステム長を有する（たとえば、19〜21ヌクレオチドまたは25〜29ヌクレオチド）。いくつかの態様において、ループサイズは、長さ4〜23ヌクレオチドである。shRNAは、作用強度を減少させることなく、1つまたは複数のミスマッチ、たとえばshRNAステムの2つの鎖間のG-Uミスマッチ、を一般に含むことができる。
【０２４８】
DsiRNA
dicer基質RNA（DsiRNA）は、25〜35ヌクレオチドの二本鎖RNA薬剤である。このような長さの薬剤は、RNA干渉（RNAi）経路のDicer酵素によって処理されると考えられるが、25ヌクレオチドより短い薬剤は一般にDicer産物を模倣して、Dicer処理から逃れる。いくつかの態様において、DsiRNAは、アンチセンスまたはセンス鎖の3'-末端にて、1〜4ヌクレオチド（たとえば、1つまたは2つのヌクレオチド）の一本鎖のヌクレオチドオーバーハングを有する。
【０２４９】
DsiRNA薬剤の一定の修飾された構造は、米国特許公開番号2007/0265220などにおいて、以前に記述されており、それは参照により本明細書に援用される。本発明の製剤における使用に適するさらなるDsiRNA構造および特異的組成物は、米国特許出願第12/586,283；米国特許公開第2005/0244858、2005/0277610、2007/0265220、2011/0021604、2010/0173974、2010/0184841、2010/0249214、2010/0331389、2011/0003881、2011/0059187、2011/0111056；および国際公開番号WO 2010/080129、WO 2010/093788、WO 2010/115202、WO 2010/115206、WO 2010/141718、WO 2010/141724、WO 2010/141933、WO 2011/072292、WO 2011/075188において記述され、それらは参照により本明細書に援用される。一般に、DsiRNA構築物は、19〜23merのsiRNAsについて記述した固相オリゴヌクレオチド合成方法を使用して合成される（米国特許第5,804,683；5,831,071；5,998,203；6,117,657；6,353,098；6,362,323；6,437,117；6,469,158；6,111,086；6,008,400；および6,111,086を参照されたい）。
【０２５０】
miRNA
MicroRNA（miRNA）は、長さ17〜25ヌクレオチド（たとえば、21〜23ヌクレオチド）の一本鎖RNA分子である。当業者は、遺伝子サイレンシングの全体レベルを増加または減少させるために、この配列長を変化させてもよい。これらの薬剤は、標的メッセンジャーRNA上の相補配列と結合することによって、標的遺伝子を静まらせる。本明細書に使用される、用語「miRNA前駆体」は、限定されないが、一次RNA転写物、pri-miRNAおよびpre-miRNAを包含するために使用される。本発明の「miRNA薬剤」は、pri-miRNA、pre-miRNAおよび／またはmiRNA（または成熟miRNA）を含むことができる。一定の態様において、本発明のsiRNA（たとえば、DsiRNA）は、miRNA配列を組み込むガイド鎖を表してもよく、または上記miRNAとして機能するmiRNA配列に十分に相同的である（このようなsiRNAを「miRNA擬態者」と表現する）。
【０２５１】
アンチセンス化合物
例示的なアンチセンス化合物は、連続したヌクレオシド長の範囲を含み、範囲の上限は50ヌクレオシドであり、および範囲の下限は8ヌクレオシドである。一定の態様において、範囲の上限は35ヌクレオシドであり、および範囲の下限は14ヌクレオシドである。さらなる態様において、範囲の上限は24ヌクレオシドであり、および範囲の下限は17ヌクレオシドである。なおさらなる態様において、アンチセンス化合物は、20の連続ヌクレオシドである。当業者は、本明細書において開示したように、範囲の上限が、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50の連続したヌクレオシドを含み、および範囲の下限が、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20の連続したヌクレオシドを含むことを、容易に認識するだろう。
【０２５２】
例示的なアンチセンス化合物は、転写、翻訳を妨げ、分解（任意にヌクレアーゼ媒介された分解）を促進し、および／またはさもなければ標的配列の機能を破壊するために（たとえば、別の機能的標的配列の機能を妨げる、たとえば、アンチセンス化合物で媒介された機構を経た、プロモーター、エンハンサーまたはその他の機能的核酸標的配列の破壊）、標的配列に十分に相補的である、少なくとも8、任意に少なくとも12、任意に少なくとも15の連続したヌクレオシドの伸長を含む。
【０２５３】
修飾は、アンチセンス化合物にすることができ、末端、選択された核酸塩基位置、糖位置の1つに、またはヌクレオシド間結合の1つに付着される抱合基を含んでもよい。可能な修飾は、2'-フルオロ（2'-F）、2'-Oメチル（2'-OMe）、2'-O-（2-メトキシエチル）（2'-MOE）、高親和性糖修飾、反転した無塩基キャップ、デオキシ核酸塩基および二環式核酸塩基類似体、ロックド核酸（LNA）およびエチレン架橋核酸（ENA））などを含むが、限定されない。
【０２５４】
RNAi薬剤を作製する方法
RNAi薬剤は、標的核酸（たとえば、標的遺伝子）へと方向づける少なくとも1つのアンチセンス核酸配列を含む。アンチセンスヌクレオチドは、選ばれた標的配列に相補的であるDNAまたはRNAの一本鎖である。アンチセンスRNAの場合には、これらは、相補的なRNA鎖の翻訳をそれに結合することによって防止する。アンチセンスDNAは、特異的な、相補的な（コードまたは非コード）RNAをターゲットするために使用することができる。特定の態様において、アンチセンスヌクレオチドは、約10〜約40ヌクレオチド、より好ましくは、約15〜約30ヌクレオチドを含む。アンチセンスヌクレオチドは、所望の標的遺伝子に対し、最大80%、85%、90%、95%、99%または100%でさえ相補性を有することができる。
【０２５５】
アンチセンスおよびセンスヌクレオチド、並びに対応する二重鎖またはヘアピンループを製造する方法は、当該技術分野において公知であり、および任意の標的核酸配列をターゲットするアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造するために、容易に適応することができる。標的配列を解析すること並びに二次構造、Tm、結合エネルギーおよび相対安定性を決定することなどによって、標的特異性を最適化するために；および／または二量体、ヘアピンまたは宿主細胞における標的mRNAに対する特異的結合を減少または妨げるだろうその他の二次構造などの、二次構造の形成を減少させるために、アンチセンス核酸配列を選択することができる。いくつかの態様において、mRNAの非常に好ましい標的領域は、AUG翻訳開始コドンの位置またはその近くの領域およびmRNAの5'領域に実質的に相補的である配列を含む。これらの二次構造解析および標的部位選択の考慮が行われることができ、たとえば、OLIGOプライマー解析ソフトウェア（Molecular Biology Insights）のv.4および／またはBLASTN 2.0.5アルゴリズムソフトウェア（Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25（17）：3389-3402（1997））を使用する。RNAi薬剤を調製するための非限定的な方法は、米国特許第5,804,683；5,831,071；5,998,203；6,117,657；6,353,098；6,362,323；6,437,117；6,469,158；6,111,086；6,008,400；および6,111,086において記述され、それらは、参照により本明細書に援用される。
【０２５６】
RNAi薬剤は、一本鎖の、二本鎖の、直鎖状の、環状の（たとえば、プラスミド）、ニックの入った環状の、コイル状の、高次コイル状の、鎖状化されたまたは帯電されたなどの、任意の有用な形態を有することができる。加えて、ヌクレオチドは、5'および3'のセンスおよびアンチセンス鎖末端修飾を含んでもよく、およびブラントまたは突出した末端ヌクレオチド（たとえば、3'-末端にてUUまたはTT）またはこれらの組み合わせを有することができる。
【０２５７】
修飾核酸は、修飾されたDNAまたはRNA分子を含み、本明細書において記述したポリヌクレオチド（たとえば、RNAi薬剤）において天然に存在する核酸の代わりに使用してもよい。修飾核酸は、本明細書において記述したポリヌクレオチドの半減期、安定性、特異性、送達性、溶解度およびヌクレアーゼ耐性を改善することができる。たとえば、siRNA薬剤は、部分的にまたは完全に、上述した有益な品質を与えるヌクレオチド類似体で構成されることができる。Elmenら（Nucleic Acids Res. 33:439-447（2005））により記載されるように、標的遺伝子産物に対してサイレンシング活性を示すsiRNA分子を構築するために、合成の、RNA様のヌクレオチド類似体（たとえば、ロックド核酸（LNA））を使用することができる。
【０２５８】
ホスホロチオアート（PS）バックボーン修飾は、ホスホジエステル結合における非架橋酸素が硫黄によって置換されており、ヌクレアーゼ分解に対して核酸薬物を安定させるために配備された、最も初期の、および最も共通の手段の1つである。一般に、PS修飾は、活性に多くの影響のない両方のsiRNA鎖に広範囲になされることができるように見える（Kurreck、Eur. J. Biochem. 270：1628-44（2003））。詳細な態様において、PS修飾は、通常3'および5'末端の1または2塩基に制限される。ボラノホスフェートリンカーは、低毒性を有すると共に、siRNA活性を増強するために使用することができる（Hall et al., Nucleic Acids Res. 32：5991-6000（2004））。オリゴヌクレオチドバックボーンに対するその他の例示的な修飾は、メチルホスホナート、ホスホロジチオアート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、アルキルホスホナート（たとえば、3'-アルキレンホスホナート）、キラルホスホナート、ホスフィン酸エステル、ホスホロアミダート（たとえば、3'-アミノホスホロアミダート）、アミノアルキルホスホロアミダート、チオノーホスホロアミダート、チオノーアルキルホスホナート、チオノーアルキルリン酸トリエステルおよびペプチド結合によって連結される反復するN-（2-アミノエチル）-グリシンユニットを有するタンパク質ヌクレオチド（PNA）バックボーンを含み、代表的なPNA化合物は、米国特許第5,539,082、5,714,331および5,719,262およびNielsen et al. Science 254：1497-1500（1991））において開示したものを含むが、限定されない。
【０２５９】
バックボーンに対するその他の修飾は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合でリン原子を置換するもの、混合されたヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合（たとえば、モルホリノ結合；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシドおよびスルホンバックボーン；ギ酸アセチルおよびチオギ酸アセチルバックボーン；メチレンギ酸アセチルおよびチオギ酸アセチルバックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファミン酸エステルバックボーン；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノバックボーン；スルホナートおよびスルホンアミドバックボーン；アミドバックボーン；および混合されたN、O、SおよびCH2成分部分を有するその他）を含む。
【０２６０】
一定の修飾された核酸塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるために、特に有用であり、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン並びにN-2、N-6およびO-6置換プリンなどである（たとえば、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、5-プロピニルシトシンおよび5-メチルシトシン）。例示的な修飾された核酸塩基は、5-メチルシトシン（5-me-Cまたはm5c）；5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチンおよびヒポキサンチン；アデニンおよびグアニンの2-アミノアデニン、6-メチルおよびその他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよびその他のアルキル誘導体；2-チオウラシル；2-チオチミン；2-チオシトシン；5-ハロウラシルおよびシトシン；5-プロピニルウラシルおよびシトシン；6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン；5-ウラシル（偽ウラシル）；4-チオウラシル；8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシおよびその他の8-置換されたアデニンおよびグアニン；5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよびその他の5-置換されたウラシルおよびシトシン；7-メチルグアニン；7-メチルアデニン；8-アザグアニン；8-アザアデニン；7-デアザグアニン；7-デアザアデニン；3-デアザグアニン；および3-デアザアデニンを含む。これらの修飾核酸塩基は、詳細な態様において、本明細書において記述した任意の糖修飾などのその他の修飾と組み合わせてもよい。
【０２６１】
修飾オリゴヌクレオチドはまた、1つまたは複数の置換された糖部分を含んでもよく、修飾は、リボース環（たとえば、リボース環の2'-OH）、または1つもしくは複数のユニバーサル塩基の任意の反応部位にてなされることができる。例示的な修飾は、2'-ハロ、F、BrまたはClなど；2'-O-アルキル、2'−S-アルキルまたは2'-Nアルキル、2'-OMeなど；2'-O-（アルキル-O）n-アルキル、2'-O-メトキシエチル（2'-O-MOE）、2'-O［（CH2）nO］mCH3、2'-O（CH2）nOCH3、2'-O（CH2）2ON（CH3）2O（CH2）nNH2、O（CH2）nCH3、2'-O（CH2）nONH2および2'-O（CH2）nON[（CH2）nCH3））］2など、ここでnおよびmは、1〜約10である；2'-O-アルケニル、2'-S-アルケニルまたは2'-N-アルケニル；2'-O-アルキニル、2'-S-アルキニルまたは2'-N-アルキニル、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換または非置換のC1-10アルキルまたはC2-10アルケニルおよびアルキニルでもよい、並びにロックド核酸（LNA）を形成するためのリボースの2'位と4'位の間の架橋修飾を含む。例示的なユニバーサル塩基は、修飾されたヌクレオチドにおけるヌクレオチド糖部分の1'位または1-β-D-リボフラノシル-5-ニトロインドールおよび1-β-D-リボフラノシル-3-ニトロピロールなどのヌクレオチド糖部分置換における等価の位置に位置される複素環部分を含む。
【０２６２】
一定の態様において、修飾の記述された形態および／または修飾のパターンを有する核酸を使用することができる。例示的な修飾および核酸の修飾パターンに関するさらなる詳細は、たとえば、少なくとも以下の参考文献において見いだされる：米国特許出願公開第2010/0240734；国際公開第2010/080129；国際公開第2010/033225；米国特許出願公開第2011/0021604；国際公開第2011/075188；国際公開第2011/072292；国際公開第2010/141724；国際公開第2010/141726；国際公開第2010/141933；国際公開第2010/115202；国際公開第2008/136902；国際公開第2011/109294；国際公開第2011/075188；PCT/US11/42810；PCT/US11/42820；米国特許出願公開第61/435,304；米国特許出願公開第61/478,093；米国特許出願公開第61/497,387；米国特許出願公開第61/529,422；米国特許第7,893,245；国際公開第2007/051303；および米国特許出願公開第2010/0184209。各々の前述の文献は、その全体において参照により本明細書に援用される。
【０２６３】
RNAi遺伝子ターゲット
一定の態様において、本発明は、RNAi薬剤との組み合わせにおいて、粒子または製剤による治療による、患部組織または器官における標的遺伝子のサイレンシングを特徴とする。本発明の治療的な可能性は、疾患状態（たとえば、癌）の確立または維持に含まれることが知られるかまたは考えられる特異的なおよび標的の遺伝子のmRNA分子がRNAi薬剤によって分解されるときに、現実化される。
【０２６４】
本発明で使用するためのRNAi標的の例は、以下を含む：接着分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Wntファミリー・メンバー、Paxファミリー・メンバー、ウィングドヘリックスファミリー・メンバー、Hoxファミリー・メンバー、サイトカイン/リンホカインおよびこれらの受容体、成長/分化因子およびこれらの受容体、神経伝達物質およびこれらの受容体などの、発達上のタンパク質；癌遺伝子にコードされたタンパク質（たとえば、ABL1（UniProtエントリー番号P00519、NCBI Gene ID：25）、AR（UniProtエントリー番号P10275、NCBI遺伝子ID：3647）、β-カテニン（CTNNB1、UniProtエントリー番号P35222、NCBI遺伝子ID：1499）、BCL1（UniProtエントリー番号P24385、NCBI遺伝子ID：595）、BCL2（UniProtエントリー番号P10415、NCBI遺伝子ID：596）、BCL6（UniProtエントリー番号P41182）、CBFA2（UniProtエントリー番号Q01196、NCBI遺伝子ID：861）、CBL（UniProtエントリー番号P22681、NCBI遺伝子ID：687）、CSF1R（UniProtエントリー番号P07333、NCBI遺伝子ID：1436）、ERBA1（UniProtエントリー番号P10827、NCBI遺伝子ID：7067）、ERBA2（UniProtエントリー番号P10828、NCBI遺伝子ID：7068）、ERBB（UniProtエントリー番号P00533、NCBI遺伝子ID：1956）、ERBB2（UniProtエントリー番号P04626、NCBI遺伝子ID：2064）、ERBB3（UniProtエントリー番号P21860、NCBI遺伝子ID：190151）、ERBB4（UniProtエントリー番号Q15303、NCBI遺伝子ID：600543）、ETS1（UniProtエントリー番号P14921、NCBI遺伝子ID：2113）、ETS2（UniProtエントリー番号P15036、NCBI遺伝子ID：2114）、ETV6（UniProtエントリー番号41212、NCBI遺伝子ID：2120）、FGR（UniProtエントリー番号P09769、NCBI遺伝子ID：2268）、FOS（UniProtエントリー番号P0110、NCBI遺伝子ID：2353）、FYN（UniProtエントリー番号P06241、NCBI遺伝子ID：2534）、HCR（UniProtエントリー番号Q8TD31、NCBI遺伝子ID：54535）、HRAS（UniProtエントリー番号P01112、NCBI遺伝子ID：3265）、JUN（UniProtエントリー番号P05412、NCBI遺伝子ID：3725）、KRAS（UniProtエントリー番号P01116、NCBI遺伝子ID：3845）、LCK（UniProtエントリー番号P06239 NCBI遺伝子ID：3932）、LYN（UniProtエントリー番号P07948、NCBI遺伝子ID：4067）、MDM2（UniProtエントリー番号Q00987、NCBI遺伝子ID：4193）、MLL1（UniProtエントリー番号Q03164、NCBI遺伝子ID：4297）、MLL2（UniProtエントリー番号O14686、NCBI遺伝子ID：8085）、MLL3（UniProtエントリー番号Q8NEZ4、NCBI遺伝子ID：58508）、MYB（UniProtエントリー番号P10242、NCBI遺伝子ID：4602）、MYC（UniProtエントリー番号P01106、NCBI遺伝子ID：4609）、MYCL1（UniProtエントリー番号P12524、NCBI遺伝子ID：4610）、MYCN（UniProtエントリー番号P04198、NCBI遺伝子ID：4613）、NRA（UniProtエントリー番号P01111、NCBI遺伝子ID：4893）、PIM1（UniProtエントリー番号P11309、NCBI遺伝子ID：5292）、PML（UniProtエントリー番号P29890、NCBI遺伝子ID：5371）、RET（UniProtエントリー番号P07949、NCBI遺伝子ID：5979）、SRC（UniProtエントリー番号P12931、NCBI遺伝子ID：6714）、TAL1（UniProtエントリー番号P17542、NCBI遺伝子ID：6886）、TAL2（UniProtエントリー番号Q16559、NCBI遺伝子ID：6887）、TCL3（UniProtエントリー番号P31314、NCBI遺伝子ID：3195）、TCL5（UniProtエントリー番号P17542、NCBI遺伝子ID：6886）およびYES（UniProtエントリー番号P07947、NCBI遺伝子ID：7525））；腫瘍サプレッサータンパク質（たとえばBRCA1（UniProtエントリー番号P38398、NCBI遺伝子ID：672）、BRCA2（UniProtエントリー番号P51587、NCBI遺伝子ID：675）、MADH4（UniProtエントリー番号Q13485、NCBI遺伝子ID：4089）、MCC（UniProtエン���リー番号P23508、NCBI遺伝子ID：4163）、NF1（UniProtエントリー番号P21359、NCBI遺伝子ID：4763）、NF2（UniProtエントリー番号P35240、NCBI遺伝子ID：4771）、RB1（UniProtエントリー番号P06400、NCBI遺伝子ID：5925）、TP53（UniProtエントリー番号P04637、NCBI遺伝子ID：7157）、PLK1（UniProtエントリー番号P53350、NCBI遺伝子ID：9606）、KIF1-結合タンパク質（UniProt Entry番号Q96EK5、NCBI遺伝子ID：9606）およびWT1（UniProtエントリー番号P19544、NCBI遺伝子ID：4790））；リポタンパク質（たとえばアポリポタンパクB（ApoB100、UniProtエントリー番号P04114、NCBI遺伝子ID：338））；酵素（たとえば、ACCシンターゼおよびオキシダーゼ、ACPデサチュラーゼおよびヒドロキシラーゼ、ADPグルコースピロホリラーゼ、ATPase、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコンシンターゼ、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、DNAおよびRNAポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、顆粒結合デンプンシンターゼ、GTPase、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ（hernicellulases）、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ（たとえばPLK1（UniProtエントリー番号P53350、NCBI遺伝子ID：9606））、ラクターゼ、リガーゼ（たとえば、リングフィンガー-およびWDリピート-含有タンパク質2（RFWD2）、別名COP1）、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物成長制御因子シンターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼおよびペプチダーゼ、プラナーゼ（pullanases）、リコンビナーゼ、逆転写酵素、リブロース-1,5-二リン酸エステルカルボキシラーゼオキシゲナーゼ（RuBisCos）、トポイソメラーゼ、転移酵素、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ1（HPRT1）など、およびキシラナーゼ）。
【０２６５】
肝臓は、代謝（たとえば、種々の高コレステロール血症におけるリポタンパク質代謝）および循環タンパク質（たとえば、血友病における凝固因子）の分泌においてその中心的役割を与えられる核酸療法のために最も重要な標的組織の1つである。加えて、慢性肝炎および肝硬変などの後天性障害は、共通であり、およびまた、ポリヌクレオチドに基づいた肝臓療法によって潜在的に治療される。肝臓に影響を及ぼす、または影響を受ける多数の疾患または状態は、肝臓における遺伝子発現のノックダウン（阻害）を介して、潜在的に治療される。例示的な肝臓病および状態は、以下を含むリストから選択してもよい：肝癌（肝細胞癌（HCC）を含む）、ウイルス感染（肝炎を含む）、代謝性障害（高脂血症および糖尿病を含む）、繊維増多および急性肝臓損傷。肝臓治療（たとえば、特にHCCにターゲットされる治療を含む）のための、および任意に、その他の癌を含むその他の標的、疾患および／または障害に対処する治療のための例示的な分子標的は、以下を含む：とりわけ、CSN5（UniProtエントリー番号Q92905、NCBI遺伝子ID：10987）、CDK6（UniProtエントリー番号Q00534、NCBI遺伝子ID：1021）、ITGB1（UniProtエントリー番号P05556、NCBI遺伝子ID：3688）、MYC（UniProtエントリー番号P01106、NCBI遺伝子ID：4609）、TGFβ1（UniProtエントリー番号P01137、NCBI遺伝子ID：7040）、サイクリンD1（UniProtエントリー番号Q9H014、NCBI遺伝子ID：595）、ヘプシジン（UniProtエントリー番号P81172、NCBI遺伝子ID：57817）、PCSK9（UniProtエントリー番号Q8NBP7、NCBI遺伝子ID：255738）およびトランスチレチン（TTR、UniProt Entry番号P02766、NCBI Gene ID：7276）。
【０２６６】
本発明の方法の粒子および／または製剤は、正常組織（たとえば、正常肝組織）に、ならびに種々のモデル（たとえば、正所性肝臓モデル、皮下肝臓モデル、その他）に、任意にターゲットすることができる。
【０２６７】
発明の方法の粒子のための1つの例示的な標的は、アポリポタンパク質B（ApoB）であり、それはリポタンパク質の種々のクラスにおいて見いだされる：キロミクロン、超低密度リポタンパク質（VLDL）、断続性密度リポタンパク質（IDL）および低密度リポ蛋白（LDL）。ApoBは、細胞の結合およびApoB/E受容体によるLDL粒子の内部移行のための識別シグナルとして機能する。アポリポタンパク質B含有リポタンパク質の蓄積または過剰は、アテローム硬化症などの脂質関連障害を導く可能性がある。ApoBを減少させる製剤化された療法は、脂質関連障害を治療するために有用でありえる。アンチセンス療法の形態における核酸に基づく療法の1つは、インビボでマウスにおけるApoBレベルを減少させることが示され、および治療がその後に血清コレステロールおよびトリグリセリドレベルを減少させた（米国特許公開番号2003/0215943）。これらの結果は、ApoBの適度なダウンレギュレーションおよびその脂質関連障害を治療することにおける標的としての使用を証明した。
【０２６８】
本発明の方法の粒子のためのもう一つの例示的な標的は、プロテインCであり、それはたとえば、血友病の治療を標的としてもよい。
【０２６９】
脂質-DsiRNAナノ粒子は、典型的にはDsiRNAsと脂質を混合して複合体を形成することによって自発的に形成する。所望の粒径分布に応じて、生じるナノ粒子混合物は、たとえば、サーモバレル押出成形機、Lipex Extruder（Northern Lipids, Inc）など、を使用して、ポリカーボネート膜（たとえば、100nmカットオフ）を介して押し出すことができる。いくつかの場合において、押出工程は、省略することができる。使用する粒子のさらなる調製において、エタノール除去および同時の緩衝液交換は、たとえば、透析またはタンジェンシャルフロー・フィルトレーションによって達成することができる。緩衝液は、たとえば、約pH7、たとえば約pH6.9、約pH7.0、約pH7.1、約pH7.2、約pH7.3または約pH7.4にて、たとえばリン酸緩衝食塩水（PBS）と交換することができる。
【０２７０】
粒子の製剤は、典型的には視覚的検査によって特徴づけられる。これらは、凝集体または沈殿物がない白っぽい半透明溶液であるべきである。脂質-ナノ粒子の粒径および粒径分布は、たとえば、Malvern Zetasizer Nano ZS（Malvern、USA）を使用して、光散乱によって測定することができる。粒子は、約20〜300nm（40〜100nmのサイズなど）であるべきである。粒径分布は、単峰形であるべきである。製剤並びに包括された画分における総DsiRNA濃度は、色素除外アッセイを使用して推定される。製剤化されたDsiRNAの試料は、製剤を破壊する界面活性剤、たとえば0.5%のTriton-X100、の有無において、Ribogreen（分子プローブ）などのRNA結合色素とインキュベートすることができる。製剤における総DsiRNAは、標準曲線に関連して、界面活性剤を含む試料からのシグナルによって決定することができる。包括された画分は、「フリー」のDsiRNA含有量（界面活性剤の非存在におけるシグナルによって測定される）を総DsiRNA含有量から減算することによって、決定される。包括されたDsiRNAの割合は、典型的には＞85%である。一定の製剤については、粒径は、少なくとも30nm、少なくとも40nm、少なくとも50nm、少なくとも60nm、少なくとも70nm、少なくとも80nm、少なくとも90nm、少なくとも100nm、少なくとも110nmおよび少なくとも120nmである。適切な範囲は、典型的には少なくとも約50nm〜少なくとも約110nm、少なくとも約60nm〜少なくとも約100nmまたは少なくとも約80nm〜少なくとも約90nmである。
【０２７１】
治療的薬剤の送達
本発明のプロセスの粒子および／または製剤は、細胞に治療的薬剤（たとえば、核酸またはRNAi薬剤などの陰イオン性薬剤）を送達するために使用してもよい。粒子および／または製剤によって送達される薬剤は、遺伝子サイレンシング（たとえば、被験体においてインビトロまたはインビボで）のために、または被験体における疾患（たとえば、癌）を治療または防止的治療するために、使用することができる、。
【０２７２】
治療的薬剤の送達は、任意の有用な方法を使用することによって評価してもよい。たとえば、本発明のプロセスによって製造される粒子および／または製剤による送達は、同等の用量における対照と比較して、1）標的遺伝子のノックダウンまたは2）毒性もしくは耐容性によって評価してもよい。これらの評価は、本明細書において記述した任意のカチオン脂質（たとえば、DOTAP、DODMA、DLinDMAおよび／またはDLin-KC2-DMA）などの、粒子および／または製剤における脂質の任意の有用な組み合わせにより、任意に、たとえば表1の化合物との組み合わせにおいて、決定することができる。詳細な態様において、本発明のプロセスを使用するときに、治療的薬剤（たとえば、陰イオン性薬剤、RNAi薬剤など）の送達の改善が観察され、ここで、対照と比較すると、改善は25%を超える（たとえば、送達において2倍の、5倍の、10倍の、100倍のまたは1000倍を超える改善）。
【０２７３】
RNAi薬剤の送達
RNAiサイレンシングは、広く多様な細胞において使用することができ、ここで、HeLa S3、COS7、293、NIH/3T3、A549、HT-29、CHO-KIおよびMCF-7細胞株は、siRNAサイレンシングのいくつかのレベルに感受性のもののうちである。さらにまた、哺乳動物細胞における抑制は、標的遺伝子に特異的にRNAレベルにて起こることができ、ここで、RNA抑制とタンパク質抑制との間の強力な相関が観察された。したがって、本発明のプロセスによって製造した粒子およびその製剤は、1つまたは複数の細胞に（たとえば、インビトロまたはインビボにおいて）RNAi薬剤を送達するために使用してもよい。本明細書において記述したように、例示的なRNAi薬剤はsiRNA、shRNA、dsRNA、miRNAおよびDsiRNA薬剤を含む。
【０２７４】
インビトロ標的ノックダウン
RNAi薬剤の送達は、任意の有用な方法によって評価することができる。たとえば、治療的薬剤を含む製剤は、細胞培養モデル（たとえば、HeLa細胞）においてインビトロにてトランスフェクトすることができ、ここで、終点測定は、以下の1つまたは複数を含むが、限定されない：（i）qPCRを使用してmRNA定量化；（ii）ウェスタンブロットを使用してタンパク質定量化；（iii）本発明のプロセスによって作製した粒子の陰イオン性薬剤および／またはカチオン脂質の標識された細胞内移行。取り込みまたは送達は、前述した終点の程度および期間の両方について評価してもよい。送達の前に、製剤は、約30分間室温にて細胞培地において希釈してもよく、および終濃度は、用量反応実験において、陰イオン性薬剤、または1つもしくは複数の脂質もしくはその他の粒子および／または製剤成分の0から50nMまで変化することができる。時間経過実験については、用量-実験からの最適濃度は、種々の潜病伏期、たとえば、30分〜7日について研究してもよい。
【０２７５】
陰イオン性薬剤および脂質製剤の機能性はまた、蛍光タグで脂質化合物および治療的薬剤を差別的に標識すること並びに蛍光共存研究を行うことによって、試験してもよい。陰イオン性薬剤および／または結合した蛍光標識を送達する本発明の化合物の能力は、細胞内部で総蛍光を測定することによって、およびエンドソームまたはリソソームコンパートメントと安定して関連しない蛍光を測定することによって、評価してもよい（機能的に、RNAiをトリガーする治療的薬剤は、細胞内部に到達するだけでなく、細胞の細胞質にも到達することが必要とされる）。蛍光局在化の実行および細胞の輸送研究は、当該技術において記述された（Lu、et al., Mol. Pharm. 6（3）：763, 2009；McNaughton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106（15）：6111、2009）。
【０２７６】
特定の標的細胞型および標的組織に対する送達
本発明のプロセスによって作製した粒子は、種々の疾患を治療するために種々の器官および組織に治療的薬剤（たとえば、陰イオン性薬剤）を送達するために使用することができる。例示的な標的組織または器官は、肝臓、膵臓、肺、前立腺、腎臓、骨髄、脾臓、胸腺、リンパ節、脳、脊髄、心臓、骨格筋、皮膚、経口粘膜、食道、胃、回腸、小腸、結腸、膀胱、頚部、卵巣、精巣、乳腺、副腎、脂肪組織（白色および／または褐色）、血液（たとえば、造血性細胞、ヒト造血性の前駆体細胞、ヒト造血幹細胞、CD34+細胞、CD4+細胞など）、リンパ球およびその他の血液系統細胞を含むが、限定されない。
【０２７７】
癌治療
本発明のプロセスによって製造した粒子は、癌または癌を発症するリスク（たとえば、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%増加したリスク）を有する被験体に対し、1つまたは複数の治療的薬剤（たとえば、RNAi薬剤）を送達するために使用することができる。例示的な癌は、肝癌（たとえば、肝細胞癌、肝芽腫、胆管癌、血管肉腫または血管肉腫）または神経芽腫を含む。例示的な新生物形成疾患および関連する合併症は、以下を含むが、限定されない：癌腫（たとえば、肺、乳房、膵臓、腎臓、肝細胞性、結腸、女性生殖器、扁平細胞、上皮内癌）、リンパ腫（たとえば、細網肉腫、非ホジキンリンパ腫）、MEN2症候群、神経繊維腫症（シュワン細胞新形成を含む）、脊髄形成異常性症候群、白血病、腫瘍血管形成、甲状腺癌、肝臓、骨、皮膚、脳、中枢神経系、膵臓、肺（たとえば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（NSCLC））、乳房、結腸、膀胱、前立腺、胃腸管、子宮内膜、卵管、精巣および卵巣、消化管間質腫瘍（GIST）、前立腺腫瘍、マスト細胞腫瘍（イヌマスト細胞腫瘍を含む）、急性骨髄様の骨髄繊維症、白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性的なリンパ性白血病、多発性骨髄腫、メラノーマ、肥満細胞症、膠腫、グリア芽細胞腫、星細胞腫、神経芽腫、肉腫（たとえば、神経外胚葉由来または平滑筋肉腫の肉腫）、その他の組織に対する腫瘍の転移および化学療法誘導された低酸素。
【０２７８】
投与および用量
本発明はまた、治療的薬剤（たとえば、RNAi薬剤）を含む製剤などの、化合物または治療上有効な量の組成物を含む医薬組成物の製造のためのプロセスに関する。組成物は、多様な薬物送達システムに使用するために製剤化することができる。1つまたは複数の生理的に許容される賦形剤または担体もまた、適当な製剤のための組成物において含まれることができる。本発明に使用するための適切な製剤は、Remington’s Pharmaceutical Science、Mack Publishing Company、Philadelphia、PA、17th ed.、1985において見いだされる。薬物送達のための方法の簡単な総説については、たとえば、Langer、Science 249：1527-1533、1990を参照されたい。
【０２７９】
医薬組成物は、防止的および／または治療的な治療のために、非経口、鼻腔内、局所的（topical）、経口または局所的（local）投与、経皮的手段によるなどが意図される。医薬組成物は、（たとえば、静脈内、筋肉内または皮下注射によって）、または経口摂取によって、または血管のもしくは癌の状態によって影響を受ける領域における局所的な適用もしくは関節内注射によって、非経口的に投与することができる。さらなる投与経路は、血管内、動脈内、内部腫瘍、腹膜内、脳室内、内部硬膜外、並びに経鼻、眼、内部強膜、眼窩内、直腸、局所的またはエアゾール吸入投与を含む。持効性投与はまた、デポー注射または受食性インプラントもしくは成分としてこのような手段によって、本発明において特異的に含まれる。したがって、本発明は、許容される担体、好ましくは水性担体、たとえば、水、緩衝水、生理食塩水、PBSおよび同様のものにおいて溶解または懸濁した上記薬剤を含む非経口投与組成物を提供する。組成物は、pH調整および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、洗浄剤および同様のものなど、生理学的条件に近づけるために要求される薬学的に許容される補助物質を含んでもよい。本発明はまた、経口送達のための組成物を提供し、それは錠剤、カプセルおよび同様のものの製剤のために結合剤または充填剤などの不活性成分を含んでもよい。さらにまた、本発明は、局所的投与のための組成物を提供し、それはクリーム、軟膏および同様のものの製剤のために溶媒または乳化剤などの不活性成分を含んでもよい。
【０２８０】
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌してもよいし、濾過して無菌してもよい。生じる水溶液は、そのまま使用するためにパッケージしてもよく、または凍結乾燥してもよく、凍結乾燥された調製物が投与の前に無菌の水性担体と組み合わせられる。調製物のpHは、典型的には、3〜11、より好ましくは、5〜9または6〜8、および最も好ましくは7〜8、7〜7.5など、であるだろう。固体形態で生じる組成物は、多数の単一用量ユニットにおいてパッケージしてもよく、それぞれが上記薬剤または錠剤もしくはカプセルのシールパッケージなどにおける薬剤の固定量を含む。固体形態における組成物はまた、局所的に適用できるクリームまたは軟膏のためにデザインされる搾り取り可能なチューブなどにおいて、柔軟な量で容器にパッケージすることができる。
【０２８１】
有効量を含む組成物は、防止的または治療的な治療のために投与することができる。防止的適用において、組成物は、腫瘍または癌の発症に対する臨床的に決定された素因または増加した罹患率を有する患者に投与することができる。本発明の組成物は、臨床的疾患または腫瘍化の発症を遅延させ、減少させまたは好ましくは防止するために十分な量において患者（たとえば、ヒト）に投与することができる。治療的適用において、組成物は、状態およびその合併症の症候を治すために、または少なくとも部分的に停止させるために十分な量において、すでに癌で苦しんでいる患者（たとえば、ヒト）に、投与される。この目的を達成するのに適切な量は、「治療的に有効な用量」、疾患または医学的状態と関連するいくつかの症候を実質的に改善するために十分な化合物の量として、定義される。たとえば、癌の治療において、疾患または状態の任意の症候を減少させ、防止し、遅延させ、抑制しまたは抑える薬剤または化合物は、治療的に有効だろう。薬剤または化合物の治療的に有効な量は、疾患または状態を治すことは要求されないが、疾患または状態の発症が遅れ、遅らせられもしくは防止される、または疾患もしくは状態の症候が寛解し、または疾患または状態の期間が変えられ、またはたとえば、より重篤でなくさせ、または個体において回復が促進されるように、疾患または状態の治療を提供するだろう。
【０２８２】
この使用のために有効な量は、疾患または状態の重症度並びに患者の体重および一般的な状態に依存してもよいが、一般に患者当たり用量当たり約0.5mg〜約3000mgの範囲の薬剤または薬剤（s）でもよい。最初の投与およびブースター投与のための適切な処方計画は、典型的に、その後の投与によって1つまたは複数の毎時間の、毎日の、毎週のまたは毎月の間隔にて繰り返される用量によって追従される、最初の投与に代表される。本発明の組成物に存在する薬剤の総有効量は、ボーラスとしてまたは比較的短い期間にわたる注射のどちらかによって、単一用量として哺乳動物に投与することができ、または分割された治療プロトコルを使用して投与することができ、それにおいて、複数の用量は、より延長された期間にわたって投与される（たとえば、用量4〜6、8〜12、14〜16または18〜24時間毎に、または2〜4日後と、1〜2週毎、月1回）。あるいは、血液における治療的に有効な濃度を維持するために十分な持続的静脈内注入が想定される。
【０２８３】
本発明の組成物中に存在し、および哺乳動物（たとえば、ヒト）に適用される本発明の方法において使用される、1つまたは複数の薬剤の治療上有効な量は、年齢、体重および哺乳動物の状態における個体の相違を考慮して当業者によって決定することができる。本発明の薬剤は、有効量において被験体（たとえば、哺乳動物、ヒトなど）に投与され、それは治療した被験体において望ましい結果を作り出す量である（たとえば、癌または神経変性障害の緩徐化または緩解）。このような治療上有効な量は、当業者によって経験的に決定することができる。
【０２８４】
患者はまた、用量当たり約0.1〜3,000mgの範囲における薬剤を、1週当たり1または複数回（たとえば、1週当たり2、3、4、5、6または7またはそれ以上の回数）、1週当たり0.1〜2,500（たとえば、2,000、1,500、1,000、500、100、10、1、0.5または0.1）mg用量、受けてもよい。患者はまた、2または3週毎に1回、用量当たり0.1〜3,000mgの範囲における組成物の薬剤を受けてもよい。
【０２８５】
投与されることになっている製剤および薬剤（たとえば、DsiRNA）の量（用量）は、経験的に決定することができる。一定の態様において、遺伝子発現の有効なノックダウンは、0.0001〜10mg/kg動物体重の核酸薬剤および0.001〜200mg/kg動物体重の送達製剤を使用して観察される。マウスにおける例示的な量は、0.1〜5mg/kgの核酸薬剤および0.7〜100mg/kgの送達製剤である。任意に、約1〜50mg/kgの送達製剤が投与される。薬剤（たとえば、DsiRNA）の量は、典型的にはより多い用量でも毒性でないので、容易に増加される。
【０２８６】
一定の態様において、用量は数日、数週またはより長く（たとえば、1〜28日またはそれ以上）にわたって毎日、または一回だけ、またはその他の間隔にて、たとえば、急性対慢性指標その他に応じて、投与することができる。
【０２８７】
有効量を含む本発明の組成物の単一または複数の投与は、治療医師によって選択される用量レベルおよびパターンで、実施することができる。用量および投与計画は、疾患の重症度または患者における状態に基づいて決定し、および調整することができ、それは、臨床医によって一般に行われる方法または本明細書において記述したものに従った治療のコースの全体にわたってモニターしてもよい。
【０２８８】
本発明の化合物および製剤は、治療または療法の従来方法と組み合わせて使用してもよく、または治療または療法の従来方法とは別々に使用してもよい。本発明の化合物および製剤がその他の薬剤と組み合わせて療法において投与されるとき、これらは個体に順次または並行して投与してもよい。あるいは、本発明に従った医薬組成物は、本明細書において記述した薬学的に許容される賦形剤と会合した本発明の化合物または製剤と、当該技術分野において公知のもう一つの治療的または防止的薬剤との組み合わせを含む。
【０２８９】
製剤化された薬剤は、キットとして共にパッケージすることができる。非限定的な例は、たとえば、2つの丸剤、丸剤および粉末、バイアルにおける坐薬および液体、2つの局所的なクリームその他を含むキットを含む。キットは、粉末形態を再構成するためのバイアル、注射のための注射器、カスタマイズされたIV送達系、吸入器その他など、患者に対する単位用量の投与を補助する任意の構成要素を含むことができる。加えて、単位用量キットは、組成物の調製および投与のための説明書を含むことができる。キットは、1人の患者のための単一使用の単位用量、特定の患者のための複数使用（一定の用量にて、またはそれにおいて個々の化合物が療法の進行につれて作用強度において変化してもよい）として、製造してもよい；またはキットは、複数の複数の患者に投与するために適切な複数用量を含んでもよい（「ばら包装」）。キットの構成要素は、カートン、ブリスター包装、瓶、チューブおよび同様のものにおいて構築してもよい。
【実施例】
【０２９０】
実施例1：陰イオン性薬剤含有粒子の製造のためのプロセス（プロセス2141）
HPRT1及びMYC DsiRNAs
粒子は、下記構造の1つを有するRNAi薬剤（HPRT1またはMYCのためのDsiRNA）を伴うカチオン脂質（DODMA）、中性脂肪（DSPC）、PEG-脂質抱合体（PEG-DMPEおよびPEG-DMG）およびコレステロールより、後述するように調製された：
【化１７】
0006440679.tif 000033
ここで、英大文字はRNAヌクレオチドを示し、下線を引いた英大文字は2'-O-メチル-RNAヌクレオチドを示し、および英小文字はDNAヌクレオチドを示す。なお、配列番号：2、4、6および8は、この出願で提供される配列表において、上で相補的な3'-5'方向において表されるが、それらは、必要に応じておよび表11において下記の配列表で示したように、5'-3'方向において表される。
【０２９１】
DsiRNA鎖の調製：オリゴヌクレオチド合成および精製
個々のRNA鎖を合成して、標準的な方法に従ってHPLC精製した（Integrated DNA Technologies、Coralville、Iowa）。たとえば、RNAオリゴヌクレオチドは、固相ホスホロアミダイト化学を使用して合成され、脱保護し、および標準的な技術を使用してNAP-5カラム（Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、N.J.）上で脱塩した（Damha and Olgivie、Methods Mol. Biol. 20：81、1993；Wincott et al., Nucleic Acids Res. 23：2677、1995）。オリゴマーは、15分の段階-直線勾配を使用して、Amersham Source 15Qカラム上でイオン交換高圧液体クロマトグラフィー（IE-HPLC）を使用して精製した（1.0cm×25cm；Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、N.J.）。勾配は、90：10の緩衝液A：Bから52：48の緩衝液A：Bまでであった、それにおいて、緩衝液Aは100mM Tris pH 8.5であり、および緩衝液Bは100mM Tris pH 8.5、1MNaClである。試料は260nmにてモニターし、および全長オリゴヌクレオチド種に対応するピークを収集し、プールし、NAP-5カラム上で脱塩し、および凍結乾燥した。
【０２９２】
それぞれのオリゴマーの純度は、Beckman PACE 5000（Beckman Coulter、Inc., Fullerton, Calif.）上でキャピラリー電気泳動法（CE）によって決定した。CEキャピラリーは、100μm内径を有し、ssDNA 100R Gel（Beckman-Coulter）を含んでいた。典型的には、約0.6ナノモルのオリゴヌクレオチドをキャピラリーに注射して、444V/cmの電場において走らせ、260nmでの紫外線吸収によって検出した。変性Tris-Borate-7M尿素ランニングバッファーは、Beckman-Coulterから購入した。オリゴリボヌクレオチドは、後述した実験に使用するために、CEによって評価されるように、少なくとも90%純粋であるものが得られた。化合物の同一性は、製造業者が推奨したプロトコルに続いて、Voyager DETM Biospectometry Workstation（Applied Biosystems、Foster City, Calif.）上でマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（MALDI-TOF）質量分析装置によって検証した。全てのオリゴマーの相対的な分子質量は、たいてい予想される分子質量の0.2%以内で得られた。
【０２９３】
DsiRNA二重鎖の調製
一本鎖RNA（ssRNA）オリゴマーは、たとえば、100mM酢酸カリウム、30mM HEPES、pH7.5からなる二重鎖緩衝液において100μMの濃度にて、再懸濁した。相補的なセンスおよびアンチセンス鎖は、たとえば50μMの二重鎖の最終溶液を産するために、同等のモル量において混合した。試料は、RNA緩衝液（IDT）において5分間100℃まで加熱して、使用前に室温に冷却させた。二本鎖RNA（dsRNA）オリゴマーは、-20℃にて保管した。一本鎖ＲＮＡオリゴマーは、凍結乾燥して、または-80℃にてヌクレアーゼフリーの水において保管した。
【０２９４】
粒子の調製
DsiRNA-脂質複合体は、最初に、（a）12.5mの水に溶解した24mg/mL抗HPRT1 DsiRNAを（b）60mM HCl（pH＝2.3）において表5の成分を含む37.5mLの脂質懸濁液と組み合わせることによって製造した。
表5：DsiRNA-脂質複合体を形成するために使用される水性脂質の組成物
【表５】
0006440679.tif 000034
【０２９５】
表5の上記成分は、10〜12サイクルで100nm膜を介して押し出し、次いで粒径および多分散性指数（PDI）を評価し、それは、それぞれ80.76nmおよび0.058であった。DsiRNAおよび最初の脂質懸濁液を組み合わせた後に、水100mLを添加して、結果として、最終pH値2.8におけるDsiRNA-脂質複合体の150mL容積を得た（図1を参照）。DsiRNA-脂質複合体は、次いで混合容器中で沈澱させ、および100%エタノールにおいて溶解した脂質のさらなる溶液100mL（37mg/mLの総脂質含有量を有する）を次いで水性DsiRNA-脂質複合体懸濁液に添加した。この脂質のさらなる溶液の組成物は、表6において示される。
表6：DsiRNA-脂質複合体に添加されるEtOH溶解した脂質の組成物
【表６】
0006440679.tif 000035
【０２９６】
DsiRNA-脂質複合体とさらなる脂質を混合することを完成すると、即座に、水500mLを粒子に添加し、それは、14.3%エタノールまで、混合懸濁液のエタノール濃度をさらに減少させた（任意に、この段階にて可変性の容積のエタノールを添加してもよく、たとえば、25%までエタノール濃度を減少させるために180mLの水、8%までエタノール濃度を減少させるために1.75Lの水、4%にエタノール濃度を減少させるために3.75Lの水、その他）。この混合懸濁液は、タンジェンシャルフロー・フィルトレーション（TFF）に次いで供し、結果として約150mLの濃縮された容積となった。この懸濁液は、次いで600mLPBSで透析して、次いで50mLPBSで2回リンスし、結果として220mLの総容積になった。
【０２９７】
粒径（93.11nm）、多分散性指数（PDI = 0.106）および濃度は、次いで測定した。濃度について、DsiRNA-脂質複合体が1.3mg/mLであるとして測定され、カプセル化効率は95.44%であることが観察され、総容積は220mLsであり、それは52.96mLPBSの添加が試料の終濃度を1mg/mLに持ってくるために必要とされたことを意味する。特に、この粒子含有試料の最終的なエタノール濃度は、0.15%より低かった。実施例1において証明されるプロセスは、本明細書において一般に「プロセス2141」といい、および後述する「プロセス2072」からの実施例2とは区別される。
【０２９８】
実施例2：実施例1のプロセス2141と比較したプロセス2072
上記のプロセスに類似するが、エタノールにおけるさらなる脂質の濃度が、上述したプロセス（「2072プロセス」と称する）と比較して減少したことにおいてのみ、上記のプロセスから区別されるプロセスは、最初に、形成される粒子の特性を調べた。この実施例のプロセスに関して、「2072プロセス」における粒子の製剤の間に使用される脂質の比率および総量は、結果がこの実施例において記述され、および「2141プロセス」は、それは上記の実施例1において示されるが、同じであった。「2141プロセス」と「2072プロセス」間の唯一の相違は、プロセスのエタノール溶液成分におけるさらなる脂質において使用された脂質の濃度において見いだすることができ、それは、「2072プロセス」と比較して、下記実施例に記載されるように、ある意味では「2141プロセス」において上昇した。
【０２９９】
エタノールにおけるさらなる脂質にDsiRNA-脂質複合体を添加することを含む「2072プロセス」によって、ならびにDsiRNA-脂質複合体にエタノールにおけるさらなる脂質を添加することを含む「2141プロセス」の両方によって製造される粒子は、これらの物理的特性について評価して、比較した。図2の上部2枚のパネルは、DsiRNA-脂質複合体とエタノールにおけるさらなる脂質との添加の順序における逆転（プロセス2072と比較したプロセス2141）が、逆のプロセスによって得られた粒子の平均粒子径およびサイズ分布において劇的な、および驚くべき相違を作り出したことをを証明する。具体的には、DsiRNA-脂質複合体をエタノールにおけるさらなる脂質に添加した「2072プロセス」によって粒子の100mgバッチ（DsiRNA含有量＝100mg）を作製したときに、生じる粒子は152.6nmの平均サイズを有し、その一方で、この粒子集団の異種性は高く、この調製物について0.265の観察されたPDI値において反映された。対照的に、DsiRNA-脂質複合体懸濁液にエタノールにおけるさらなる脂質を添加することを含むプロセス（「2141プロセス」）によって、より大きな粒子の300mgバッチ（DsiRNA含有量＝100mg）を作製したときに、平均粒子径は98.85まで減少し、および粒子集団のサイズ分布はまた、劇的により均一である（PDI＝0.127）ことが見いだされた。
【０３００】
この結果は、添加の順序の実行された変化が劇的な、有益な、および驚くべき様式において粒径および均一性に影響を与えることを証明した。下記実施例において証明されるように、このような粒子集団のより小さい平均粒径および減少した異種性が、これらを被験体に投与したときに粒子集団の改善された有効性（ノックダウンおよび表現型影響）および改善された耐容性/減少した毒性の両方に関連していた。
【０３０１】
実施例3：エタノールにおけるさらなる脂質の濃度を上昇させることは、粒子特性を改善した
図1において模式的に例証される上述したプロセスは、それはまた、本明細書において、「2141」と称されるが、DsiRNA-脂質複合体とエタノールにおけるさらなる脂質との添加の順序におけるその他の試験したプロセスから区別されるだけでなく、エタノール溶液におけるさらなる脂質において可溶化された脂質およびステロールの濃度によって、その他のプロセスからもまた区別された。特異的に、「2072プロセス」において、コレステロールはエタノールにおけるおよそ10〜11mg/mlの濃度にて溶媒に添加し、それはエタノールにおけるコレステロールの溶解限度に接近した。さらなる脂質は、次いでこのコレステロール含有エタノール混合物に添加して「エタノールにおけるさらなる脂質」成分を作製し、およびおよそ20mg/mlの総脂質の「エタノールにおけるさらなる脂質」溶液に存在することができた総脂質の量の限界があった。対照的に、本発明の「2141プロセス」において、表1のL-30、DSPCおよびDSPE-PEG2kは、上の表6において示される量において、100mlのエタノール中で組み合わせた。このエタノール溶液は、次いで粉末としてのコレステロールに、およそ11mg/mlのコレステロール濃度にて添加したが、この「エタノールにおけるさらなる脂質」溶液の総脂質含有量は、凝集またはその他の有害作用の非存在において37mg/mlの総脂質含有量を達成したという差異があった。（実際は、この「エタノールにおけるさらなる脂質」溶液のさらなるバッチはまた、エタノールにおいておよそ21mg/mlのコレステロール（エタノールにおけるコレステロールのみの溶解度を劇的に超えたレベル）および74mg/mlの総脂質を有して、首尾よく調製された。）
【０３０２】
「2072」および類似の方法に使用されるおよそ20mg/mlまたはより低いレベルを上回る、「2141プロセス」/粒子の場合にはおよそ34mg/mlまで、現在のプロセスの「エタノールにおけるさらなる脂質」溶液の総脂質含有量を推進する影響は、予想外だった、および劇的だった：「2072プロセス」によって調製した粒子と比較して、「2141プロセス」によって調製した粒子は、改良されたサイズおよび多分散性を有した；「2141」粒子はまた、「2072プロセス」によって調製される粒子より優れた標的特異的なノックダウンを証明し、肝癌のHep3Bマウスモデルにおいて腫瘍容積を減少させることにて改善された有効性を示し、およびマウスにおいて、「2072プロセス」によって調製した対応する粒子より非常によく耐容性を示した。
【０３０３】
図2の下部2枚のパネルは、「2072プロセス」（それは、製剤プロセスの間に、20mg/mlまたはより低い、エタノールにおけるさらなる脂質の総濃度を特徴とした）を使用して調製されるこのような粒子と比較して、「2141プロセス」（それは、製剤プロセスの間に、エタノールにおけるさらなる脂質の高い濃度を特徴とした）を使用して調製される粒子の集団について観察された、改良されたサイズおよび多分散性値を示す。具体的には、「2072プロセス」によって製造した対応する粒子と比較して、それは98.85nmの平均サイズを示し、および0.127のPDIが観察されたが、「2141プロセス」は、0.072のPDIが観察されるとともに95.07nmの平均サイズを有する粒子をもたらした。したがって、「2141プロセス」によって製造した粒子は、両方の粒子集団の物理的特性の総評価によって、「2072プロセス」によって製造した対応する粒子より、わずかにより小型であり、および相当に均一であることが観察された。
【０３０４】
「2141」で製造した、および「2072」で製造した粒子の物理的な特徴のさらなる評価は、2つの粒子集団の間にさらにより劇的な相違を明らかにした。両方の粒子集団をゲルろ過クロマトグラフィー（「SEC」）に供し、およびシグナル強度を調べたとき、「2141」で製造した粒子の均一性は特に目立っていた。図3に示したように、「2072」で製造した粒子集団のSEC画分2〜5は、特異的に粒子集団の有意な異種性を明らかにし、図3の上部パネルの「2072」粒子集団は、主要なピークより小さい粒径の有意なマイナーピークを明らかにし、それはミセル細片に対応するようにみえた；対照的に、下部パネルの「2141」で製造した粒子は、このようなマイナーピークを示さなかった、および「2141」で製造した粒子のサイジングはより密接にクラスター形成していた。したがって、「2072プロセス」によって製造した粒子と比較すると、「2141プロセス」によって作製した粒子は、より一貫したサイズおよびより少ないミセル細片を有した。上述したように、「2141」で製造した、および「2072」で製造した粒子の脂質組成が同一だったため、この効果は特に注目に値した。
【０３０５】
「2072」で製造した粒子と比較した「2141」で製造した粒子のさらなる試験は、「2072」で製造した粒子集団の異種性と比較して、「2141」で製造した粒子集団の相対的な均一性をさらに定義した。パーセント容積解析は、セファロース4Bカラム、30ml上で実行されるLNPにおいて1.0mg/mL DsiRNAの1.0mlを使用して行われ、および粒子は、平均粒子径（Malvern）によって評価されるそれぞれの画分についてRNA含有量とともに、%容積を測定した。図4に示したように、パーセント容積解析を「2072」および「2141」で製造した粒子の両方に対して行ったとき、「2072」で製造した粒子（図4、上部パネル）は、粒子集団内で、明らかにミセル細片に対応する21〜32nm粒子の大多数画分（57%）を有することが観察され、その一方で、「2072」で製造した粒子集団のたった36%は、DsiRNA含有粒子であることが評価される79〜106nm粒子に対応した。対照的に、パーセント容積によって評価した「2141」で製造した粒子は、著しく均一であった−98%を上回る粒子集団が、DsiRNA含有粒子に対応した51〜78nmウィンドウにおいて同定された。したがって、「2141プロセス」は、適切なサイズの粒子にDsiRNAペイロードの完全に近い組み込みを生じたが、「2072プロセス」は、このようなストリンジェント解析下で、粒子集団内でかなり多くのミセル細片を蓄積していたことが観察された。
【０３０６】
実施例4：「2141プロセス」は、増強された標的特異的なノックダウンを示し、表現型活性を改善し、および十分に耐容性を示す粒子を製造した
「2141」で製造した粒子の有効性は、一連の実験においてインビボにて評価した。第1に、上記の通りに抗HPRT1ペイロードDsiRNAを収容する「2141」製剤化粒子は、マウス腫瘍における標的特異的なノックダウン有効性について調べた（このような実験において、Hep3B腫瘍を保持するマウスは粒子5mg/kgを投与され（図5に示すように「2141」またはその他）、およびHPRT1の肝腫瘍ノックダウンは投与後48時間にて評価された、N＝7/群）。図5に示したように、「2141プロセス」によって作製した粒子（それはまた、「2137」および「2144」粒子によっても共有され、このようなこれらの3つの群の間で変化する脂質成分の比率のみを伴う）は、マウス腫瘍においてHPRT1のおよそ80%ノックダウンさせた。この結果は、「2072プロセス」によって作製した粒子について観察されたものより著しく優れており、それはマウス腫瘍において標的とされたHPRT1転写物のおよそ70%のノックダウンを生じた。したがって、「2141プロセス」は、それはプロセスの「エタノールにおけるさらなる脂質」成分中に存在する脂質の高い濃度においてのみ「2072プロセス」から区別され、インビボで標的転写物（ここでは、HPRT1）の標的特異的なノックダウンにより有効である粒子の集団を製造した。理論によって拘束されることを望まないが、この著しい改善の少なくとも一部は、おそらく「2141プロセス」を介して得られた粒子の劇的に改善された均一性に起因した。
【０３０７】
「2072」製剤化粒子と比較して、「2141」製剤化粒子のインビボでの表現型有効性をもまた調べた。このような実験内で、2つのMYCターゲティングDsiRNAs（「MYC-622」および「MYC-1711」）は、「2141プロセス」または「2072プロセス」を使用して製剤化した。これらのMYCターゲティングDsiRNAsを含む粒子は、次いでHep3B腫瘍をもつマウスに投与して、有効性を評価した（マウスは、図6において示される濃度にてTIW×2を投薬し、および腫瘍重量は最終的な用量の投与後48時間にて評価した）。前の実験において、MYC-622およびMYC-1711ペイロードの両方は、匹敵する有効性を有することが観察された（データ示さず）。図6に示したように、MYC-622 DsiRNAをもつ「2072」製剤化粒子と比較すると、「2141プロセス」によって粒子において製剤化したMYC-1711 DsiRNAペイロードは、インビボでHep3B腫瘍容積を減少させることにおいて、およそ4〜5倍より大きな作用強度（用量のレベルに対し拡大縮小される有効性）を示した。具体的には、それぞれ、3mg/kgまたは5mg/kgにて投与されるMYC-1711ペイロードを収容する「2141」製剤化粒子は、それぞれ73%および77%の腫瘍サイズにおける減少を示した。減少のこれらのレベルは、「2072プロセス」によって製造したMYC-ターゲティングペイロードを収容する粒子について観察されるいずれよりも有意に大きかった、およびさらに、抗MYCペイロードを有する「2141」製剤化粒子の1mg/kgより少ない用量は、腫瘍サイズにおいて有意な減少を示した（0.3mg/kgについておよそ28%の減少および0.5mg/kgについておよそ47%の減少）。それぞれの製剤の耐容性はまた、以下の毒性マーカーを調べることによって評価した：ALK Phos、ALT、AST、ALBおよび総ビリルビン。図6の下部の表に示したように、「2072プロセス」によって製造した粒子は、「2141プロセス」によって製造した粒子について観察されたより非常に大きな程度まで、このような毒性マーカーのレベルを上げた。
【０３０８】
「2141プロセス」または「2072プロセス」のどちらかによって製造した粒子の耐容性を評価するために、さらなるアッセイを行い、および全てのこのようなアッセイは、「2141プロセス」によって製造した粒子の増強された耐容性/毒性の不足を強調した。製剤がマウスにおいてかなり許容されないとき、このようなマウスはこのような製剤の投与の後、たいてい体重の喪失を示すだろう。一方、肝臓重量は、このようなマウスではたいてい増加する。図7に示したように、「2072」および「2141」で製造した粒子の全体の耐容性は、マウスに対するこのような粒子の10mg/kgの投与（BIW×2、4用量総量、n＝15/群）における体重および肝臓重量に対する影響の評価を介して比較した。これらのプロセスのそれぞれによって製剤化した粒子間の著しい相違が観察され、「2072」製剤化粒子が体重（「2072」製剤化粒子の投与はほぼ20%の体重減少を作り出した）および肝臓重量（「2072」製剤化粒子を投与したマウスについて、肝臓重量におけるおよそ50%の増大が観察された）に対する劇的な影響を示した。対照的に、体重に対する有意な影響は、「2141」製剤化粒子を投与されたマウスについて観察されなかった、および「2141」製剤化粒子は、肝臓重量において非常に緩やかな（約10〜20%）増大のみを引き起こした（効果はまた、調べた2つの「2141」調製物の1つにおいてのみ観察された）。したがって、「2141」製造した粒子は、インビボで、製剤耐容性の総指標に基づいて、著しく十分に許容された。
【０３０９】
「2141」製剤化粒子のこのような耐容性/毒性結果は、10mg/kgの投与（BIW×2、4用量総量、n＝15/群）にて「2072」および「2141」製剤化粒子を投与したこれらのマウスにおける、以下の毒性マーカーの評価によって、補強された：ALT、AST、ビリルビン、CPK、アルカリ性ホスファターゼおよびアルブミン。図8に示すように、「2072」製剤化粒子のこのような上昇した、繰り返した用量は、これらのマーカーのそれぞれにおいて製剤毒性を指し示す変化を引き起こした：ALT、AST、ビリルビン、CPKおよびアルカリ性ホスファターゼレベルはすべて有意に上昇し、その一方で、アルブミンレベルは有意に減少した。際立って対照的に、「2141」製剤化粒子は、調べた毒性マーカーにおけるこのような劇的な変化を示さなかった：平行してPBS処理した動物と比較して、「2141」製剤化粒子のいずれもこのような毒性マーカーにおける任意の有意な変化を示さなかった。したがって、「2141プロセス」（それは、製剤プロセスの間、エタノールにおけるさらなる脂質の高い濃度を特徴とした）は、改善された物理的な特徴（サイズ、PDI、その他）を有するだけでなく、製剤プロセスの間、エタノールにおけるさらなる脂質の高い濃度の使用を特徴にしない方法によって製造した対応する粒子より、インビボで効果的であり、並びにより優れて許容される粒子を製造した。
【０３１０】
実施例5：陰イオン性薬剤含有粒子を製造するためのプロセスおよび製剤化
陰イオン性薬剤を保持する粒子の製造において使用するための脂質組成物は、実施例1（2141プロセス）について上述したように、および図1において示されるプロセスに従って、一般的に製剤化した。プロセスは、DODMA、DL-048、DL-049、DL-033並びに脂質-陰イオン性薬剤粒子製剤、たとえば、DMPE-PEG2k、DMG-PEG2kおよびDSPE-PEG2kなどのPEG-脂質抱合体の間、粒子凝集を防止する修飾された脂質などのカチオン脂質を含むコア脂質を含む、第1の脂質懸濁液を調製することを含む。コア脂質は、酸性水溶液において混合されて、脂質複合体を形成する。
【０３１１】
第2の（さらなる）脂質溶液は、溶媒、たとえばエタノール、好ましくは100%のエタノールにおいて調製される。表7および8に示すように、第2の脂質溶液は、構造的な脂質、ステロール、カチオン脂質および修飾された脂質からなる群より選択される1つまたは複数の脂質を含む。例は、DDPC、DSPC、MSPC、POPC、Lyso PC、POGP、コレステロール、DL-033、DL-036、DMPD-PEG2k、DSPE-PEG2kおよびDSG-PEG2kおよび同様のものを含む。製剤に使用される化合物の化学的略語は、表9において下で定義される。
【０３１２】
コアの第1の脂質組成物および第2のさらなる脂質組成物を調製するための脂質の特異的例示的な組み合わせは、表7および8にリストされ、および実施例1について上述したように調製し、および特異的性質について試験した。実施例1について記述したように、陰イオン性薬剤ペイロードを含む粒子を製造するための好ましい方法は、酸性水溶液、好ましくは水性HCl溶液において、複合体を形成するために十分な量で、脂質-陰イオン性薬剤粒子形成の間の粒子凝集を防止する修飾された脂質およびカチオン脂質（たとえば、表7および8において示されるコアカチオン脂質）を組み合わせる工程を含む。脂質複合体は、次いで陰イオン性薬剤、核酸分子など、と組み合わせて複合体-陰イオン性薬剤を形成することができ、および中性水溶液と組み合わせて複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液を形成することができる。
【０３１３】
さらなる脂質は、組み合わせられて、構造的な脂質、ステロール、カチオン脂質および修飾された脂質から選択される1つまたは複数の脂質を含むさらなる脂質溶液または懸濁液を形成する。好ましい態様において、さらなる脂質は、エタノール、好ましくは100%のエタノールなどの溶媒において組み合わせられ、および好ましくは、表7および8において示されるエンベロープ脂質の1つまたは複数を含む。さらなるエンベロープ脂質の溶液または懸濁液は、好ましくは複合体-陰イオン性薬剤に添加して、陰イオン性薬剤を含む粒子を製造する。
【０３１４】
抗原薬剤を含む粒子は、表7および8において記述される製剤を使用して製造し、および製剤のそれぞれは、実施例1および2において記述される2072プロセスによって作製した粒子と比較して、2141プロセスによって製造した粒子について記述される改善された特徴を有する粒子を提供した。改良された特徴は、均一性（homogenicity）、均一性（uniformity）、ペイロードおよび治療的有効性を含んだ。
【０３１５】
表10において証明されるように、粒子は、下記特徴および／またはマーカーの1つまたは複数によって測定されるように、2072プロセスによって製造した粒子を超える改善された特徴を有する：平均粒径、多分散性指数（PDI）、パーセントペイロード、たとえば、粒子の中のおよび／または標的細胞に送達された核酸、疾患マーカーアルカリ性ホスファターゼ、CPK、ALT、AST、アルブミン、総ビリルビン、HPRT1、体重または肝臓重量における変化、たとえば、ペイロードおよびその標的の代表的な診断アッセイにおいて測定される。下記の表10を参照されたい。
表7。EnCore LNP製剤組成物（%モル）−腫瘍中心
【表７】
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表8。EnCore LNP製剤組成物−肝臓中心
【表８】
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表9。化学的名称
【表９】
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表10。改良された粒子特徴および有効性
【表１０】
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【０３１６】
実施例6：肝臓中心製剤：HAO1ノックダウン
さらなる脂質-核酸製剤は、2041プロセスに従って実施例1について記述したように調製し、治療的粒子の有効な製造について試験して、HAO1遺伝子およびタンパク質ノックダウンに十分な最小用量および頻度を決定した。HAOをターゲットするDsiRNAは、表11において下で示した特異的製剤に従って、EnCore脂質粒子において製剤化し、および実施例1、2141プロセスについて記述したように調製した。製剤2401および2373は、脂質および核酸薬剤の同じ組み合わせを含むが、2401プロセスが複合体-陰イオン性薬剤水性懸濁液とエンベロープ脂質溶液または懸濁液をインライン混合することを含むのに対し、2373プロセスはバッチ混合を利用したことにおいて異なる。
【０３１７】
粒子は、雌性のマウスに静脈内注射し、および動物は投薬後24および168時間に犠牲にされた。血漿および肝臓組織試料は、ヒドロキシ酸オキシダーゼ1（HAO1）遺伝子およびタンパク質発現の解析のために収集した。ターゲティングDsiRNAは、RNAi薬剤（MAO1のためのDsiRNA）であり、以下配列、それぞれ配列番号：7および8を有する。なお、アンチセンス配列番号：8は、3'-5'方向において下で示されるが、配列表において、全ての配列は5'-3'において示される。
【化１８】
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【０３１８】
この研究において、エンベロープ脂質としてPOPGで製造される粒子の有効性は、DPPCと比較した。粒子は、0.5%〜3%のPOPGの様々な量を含み、その一方で、エンベロープ脂質コレステロールおよびDL-036およびコア脂質DL-048およびDMG-PEG2kを含むその他の成分は、全ての製剤全体に一定であった。下記表10を参照されたい。
【０３１９】
粒子は、下記表11において記述される特異的製剤、および配列番号：7および8から形成したDsiRNAを使用して、それは細胞内標的MAO1を妨げるようにデザインされ、実施例1および5について上で開示したように調製した。
【０３２０】
この研究については、マウスのFVII DsiRNAペイロードを含む製剤は、図9に示すように10μg/kg（円）、25μg/kg（ダイヤモンド）または50μg/kg（正方形）にて、CB57-BL6雌性のマウスに静脈内注射した。血清試料は、活性アッセイを使用してFVIIタンパク質減少にアクセスするために、投薬後24時間で収集した。PBSは、負の対照として含まれた。異なるEnCore製剤は、表11および図9に示すように個々の4桁の番号で標識した。脂質の異なる組成物は、図の下部に示されるようにそれぞれの製剤のために使用した。
【０３２１】
粒子は、脂質粒子を経て阻害する治療的分子を受けているマウスにおけるFactor VIIの存在を解析することによって、改良された有効性について試験した。アッセイは、ヒト因子X、Factor VIIの基質のFactor Xaへの変換を測定し、反応は次いでsXa-11、色素生産性基質に作用して、405nmにて測定される色を作り出した。データは、表11および図9において示される。
表11。肝臓中心の有効性スクリーンのための製剤
【表１１】
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【０３２２】
その他の態様
本発明は、その具体的態様と関連して記述されたが、さらなる修飾が可能であることが理解されよう、およびこの出願は、一般的に、本発明の原理に従う、および本発明が属する当該技術の範囲内で公知のまたは慣習的な慣行の中で達する本開示からのこのような逸脱を含む、本発明のいかなる変更、用途または適応をもカバーすることが意図され、および先に記載される基本的特徴に適用されてもよい。
【０３２３】
全ての刊行物、特許および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願がその全体において参照により組み込まれることを特異的におよび個々に示した場合と同程度まで、これらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる。
【０３２４】
本明細書において開示した配列のリスト：
【表１２】
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*ここで、英大文字はRNAヌクレオチドを示し、下線を引かれた英大文字は2'-O-メチル-RNAヌクレオチドを示し、および英小文字はDNAヌクレオチドを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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