(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＥＲ３結合モチーフ（ＢＭ）を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドであって、該モチーフは：
ｉ）配列番号１〜３５のいずれか一つ；および
ｉｉ）ｉ）で定義された配列と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列からなり、
ここで、前記ＨＥＲ３結合ポリペプチドとヒトＨＥＲ３との相互作用のＫD値は最大で１×１０-9Ｍである、
前記ＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２】
前記ＨＥＲ３結合モチーフは、３ヘリックスバンドルタンパク質のドメインの一部を形成する、請求項１に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３】
ｉｘ）ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＥＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＫＳＱＡＰＫ；（式中［ＢＭ］は、請求項１に記載のＨＥＲ３結合モチーフである）、
および
ｘ）ｉｘ）で定義された配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、ここで、［ＢＭ］は請求項１において定義されたＨＥＲ３結合モチーフである、
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項４】
配列ｉｘ）は、配列番号７１〜１０５から選択される、請求項３に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項５】
同じ実験条件を使用して測定した場合、前記ＨＥＲ３結合ポリペプチドとヒトＨＥＲ３との相互作用の解離速度（ｋoff）は、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む比較用ＨＥＲ３結合ポリペプチドとヒトＨＥＲ３との相互作用の解離速度（ｋoff）と比較して少なくとも４分の１以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項６】
前記ＨＥＲ３結合ポリペプチドとヒトＨＥＲ３との相互作用のＫD値は、最大で１×１０-10Ｍである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項７】
ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチドからなる第一の部分；および
ｂ）所望の生物活性を有するポリペプチドからなる第二の部分
を含む、融合タンパク質またはコンジュゲート。
【請求項８】
前記所望の生物活性は、治療活性、結合活性、および酵素活性からなる群から選択される、請求項７に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート。
【請求項９】
標識をさらに含み、前記標識は、蛍光色素および金属、色素産生色素、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性核種および粒子からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートと、少なくとも１種の薬学的に許容される添加剤またはキャリアーとを含む組成物。
【請求項１１】
医薬品、診断剤または予後予測剤として使用するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ＨＥＲ３関連の状態の処置、診断または予後で使用するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＨＥＲ３関連の状態は、乳癌、卵巣癌、および前立腺癌からなる群から選択される癌などの癌である、請求項１２に記載の使用のためのＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物。
【請求項１４】
ＨＥＲ３を含有する疑いのあるサンプルを準備すること、前記サンプルを、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートまたは請求項１０に記載の組成物と接触させること、およびＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物の結合を検出して、サンプル中のＨＥＲ３の存在を示すことを含む、ＨＥＲ３の検出方法。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の開示は、ヒト上皮成長因子受容体３（本明細書ではＨＥＲ３と称される）に結合するポリペプチド、ならびにイメージングおよび療法におけるこのようなポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
膜貫通チロシンキナーゼ受容体の上皮成長因子ファミリー、例えばＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１またはＨＥＲ１）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥｒｂＢ３（ＥＲＢＢ３またはＨＥＲ３）、およびＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）などは、細胞内シグナル伝達経路の複雑なネットワークを介して主要な細胞機能（例えば細胞の増殖、生存、分化、および移動）を制御することに関与する。ＨＥＲ３は、その不活性なチロシンキナーゼドメインのためにこのファミリーの他の受容体とは異なっており、したがってリガンドによって誘導される他のチロシンキナーゼ受容体とのヘテロ二量体形成を介してシグナル伝達する（非特許文献１；非特許文献２）。結果として、腫瘍の進行におけるこの受容体の関与は長い間謎であった。しかしながら近年、ＨＥＲ３は、そのファミリーメンバーのアロステリックキナーゼ活性化剤として高い注目を集めている。特にＨＥＲ２およびＨＥＲ３によって形成されたヘテロ二量体は、下流の細胞内シグナル伝達の並外れて強い活性化剤であるといわれている（非特許文献３；非特許文献４）。このＨＥＲ２−ＨＥＲ３のシグナル伝達対は、ＨＥＲ２によって引き起こされた乳癌における腫瘍形成性の単位とも示唆されている（非特許文献５）。加えて、ＨＥＲ３受容体のアップレギュレーションは、インビトロおよびインビボでＨＥＲ２を過剰発現する乳癌においてチロシンキナーゼ阻害剤への耐性に重要な役割を果たすことが示されてきた（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。
【０００３】
しかしながら、ヒト癌におけるＨＥＲ３の重要性は、ＨＥＲ２によって引き起こされる乳癌に限定されない。ＨＥＲ３はさらに、いくつか例を挙げれば、インビボにおけるＨＥＲ３過剰発現前立腺癌の異種移植片の腫瘍形成性に必要であること、インビボにおける自己分泌シグナル伝達ループを介した卵巣癌の部分集合の増殖を維持すること、およびＥＲ＋乳癌細胞株の内分泌性の抵抗に関与することも示されている（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。したがってこれらの発見から、ＨＥＲ３のシグナル伝達経路がヒト癌における重要な治療標的である可能性が実証される。加えて、受容体が高レベルで発現されることは、ＨＥＲ２を過剰発現する患者と比較して生存時間が有意に短いことと関連するため、ＨＥＲ３発現は予後的重要性を有する（非特許文献１３、非特許文献１４）。
【０００４】
近年承認されたＥＧＦＲおよびＨＥＲ２受容体を対象にした療法のうち比較的大部分が、モノクローナル抗体に基づいている。ＥｒｂＢ−ファミリーの十分調査されたＥＧＦＲおよびＨＥＲ２受容体メンバーとは対照的に、抗ＨＥＲ３抗体の使用については比較的少ない報告しかない。Ｕｌｌｒｉｃｈおよび共同研究者は、抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体は、乳癌の細胞モデルにおいてＨＥＲ３介在シグナル伝達を阻害することを報告している（非特許文献１５）。しかしながら、いくつかの成功した全長モノクローナル抗体を使用した癌治療研究が報告されているが、このクラスの物質は、（診断目的でも治療的なペイロード目的でもなく）固形腫瘍を標的化するのに最適であるとは限らない。治療的作用は、腫瘍全体にわたる薬物の効率的な分布に依存し、分子イメージングは、腫瘍での取り込みと周囲の正常組織との間の比が大きいことに依存する。腫瘍の浸透率（血管外漏出を含む）は分子サイズと負の相関があるため、比較的大きい抗体分子（例えばＩｇＧ）は、本質的に低い組織分布および浸透能を有する。さらに、分子イメージングに関して、異常に長い抗体のインビボの半減期は比較的高い血中シグナルを発生させるために、腫瘍対血液のコントラストが比較的低くなる。
【０００５】
近年、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡのドメインＢから誘導されたＺドメインの３へリックスバンドルの足場をベースとしたかなり小さいＨＥＲ３特異的分子が、コンビナトリアルタンパク質工学を使用して生成された（非特許文献１６；特許文献１）。これらのＺ変異体は、ＨＥＲ３に対する親和性はナノモル未満であり、インビトロで乳癌細胞株のリガンドによって誘導されたＨＥＲ３のシグナル伝達を妨害することにより成長抑制作用を実証する（非特許文献１７）。これらの成長阻害作用はさらに、Ｚ変異体分子とリガンドであるヘレグリンとの競合的なＨＥＲ３結合の結果でもあることが実証された。
【０００６】
しかしながら、腫瘍細胞でのＨＥＲ３受容体発現は比較的低いことから、インビボでのＨＥＲ３受容体の標的化は取り組む価値が高い可能性がある。１０３〜１０４受容体／細胞の典型的な発現レベルが報告されている（非特許文献１８；非特許文献１９）。薬物の効率的な治療的作用にとって、腫瘍での高い取り込みに加えて、腫瘍中での長期の保持が極めて重要である。Ｚドメインから誘導されたポリペプチドなどの小さい標的物質は、高い血管透過性および腫瘍への迅速な拡散のために腫瘍中で、高レベルで蓄積する能力を有する（非特許文献２０）。しかしながら、未結合の低分子量タンパク質は、腫瘍から、次いで腎臓を介して循環から迅速に排除されるであろう。結果として、小さいサイズの標的物質の癌細胞に対する親和性を高くすることが、腫瘍での保持を増加させるために重要である。さらに、低い発現率（細胞１つあたり１０４の標的タンパク質またはそれ未満）で受容体タンパク質を効率的に標的化するために、近年の結果から、小さいポリペプチド（例えばＺドメインから誘導されたポリペプチド）の親和性を、できる限り高くするべきであり、好ましくは結合定数ＫＤを低いピコモルの範囲またはそれ未満にするべきであるということが示唆される（非特許文献２１）。
【０００７】
ＨＥＲ３は、ＥＧＦファミリーの他のメンバーと同じ腫瘍細胞で発現される可能性があることから、ＨＥＲ３とＥＧＦファミリーの別のメンバーとを標的化する二重特異的な分子の生産が近年いくらか関心を集めている。このような二重特異的な分子は、例えば、分子イメージング用途における標的化の特異性を高めるため、さらに同時にＨＥＲ３と腫瘍で発現される別の抗原とを標的化するための標的化媒体として利用される可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／０５６１２４
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｇｕｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９１：８１３２〜８１３６（１９９４）
【非特許文献２】Ｓｉｅｒｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３２２（３部）：７５７〜７６３（１９９７）
【非特許文献３】Ｊｕｒａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０６：２１６０８〜２１６１３（２００９）
【非特許文献４】Ｃｉｔｒｉら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２８４：５４〜６５（２００３）
【非特許文献５】Ｈｏｌｂｒｏ  Ｔら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １００：８９３３〜８９３８（２００３）
【非特許文献６】Ｓｅｒｇｉｎａら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４５：４３７〜４４１（２００７）
【非特許文献７】Ｋｏｎｇら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３：ｅ２８８１（２００８）
【非特許文献８】Ｇａｒｒｅｔｔら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０８：５０２１〜５０２６（２０１１）
【非特許文献９】Ｓｏｌｅｒら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２５：２５６５〜２５７５（２００９）
【非特許文献１０】Ｓｈｅｎｇ  Ｑら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １７：４１２〜４１２（２０１０）
【非特許文献１１】Ｌｉｕら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２０：１８７４〜１８８２（２００７）
【非特許文献１２】Ｆｒｏｇｎｅら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  １１４：２６３〜２７５（２００９）
【非特許文献１３】Ｔａｎｎｅｒら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４（２６）：４３１７〜２３（２００６）
【非特許文献１４】Ｒｅｓｃｈｋｅら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４（１６）：５１８８〜９７（２００８）
【非特許文献１５】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｒｓｔら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １１５（４）：５１９〜２７（２００５）
【非特許文献１６】Ｋｒｏｎｑｖｉｓｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２４：３８５〜３９６（２０１０）
【非特許文献１７】Ｇｏｅｓｔｒｉｎｇら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ４００２３（２０１２）
【非特許文献１８】Ａｇｕｉｌａｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：６０５０〜６０６２（１９９９）
【非特許文献１９】Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９９：１４１５〜１４２５（２００８）
【非特許文献２０】ＳｃｈｍｉｄｔおよびＷｉｔｔｒｕｐ、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ８：２８６１〜２８７１（２００９）
【非特許文献２１】Ｔｏｌｍａｃｈｅｖら（２０１２）、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ５３（６）：９５３〜６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の開示の目的は、ＨＥＲ３と高親和性で結合するＨＥＲ３結合剤の新規の群を提供することである。
【００１１】
本発明の開示の他の目的は、ＨＥＲ３発現細胞の標的化、このようなＨＥＲ３発現細胞の分子イメージング、および／またはＨＥＲ３関連の状態の処置に使用できる、ＨＥＲ３結合剤の新規の群を提供することである。
【００１２】
本発明の開示の他の目的は、これまでにＷＯ２０１１／０５６１２４で定義されたＨＥＲ３結合ポリペプチドの群とは異なる、ＨＥＲ３結合剤の定義された群を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、本発明の一態様によれば、ＨＥＲ３結合モチーフ（ＢＭ）を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドであって、該モチーフは：
ｉ）ＥＫＹＸ４ＡＹＸ７ＥＩＷ  Ｘ１１ＬＰＮＬＴＸ１７Ｘ１８ＱＸ２０  ＡＡＦＩＧＸ２６ＬＸ２８Ｄ
（式中、互いに独立して、
Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＴから選択され；
Ｘ７は、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ１１は、ＥおよびＱから選択され；
Ｘ１７は、Ｋ、Ｎ、Ｒ、およびＶから選択され；
Ｘ１８は、Ｆ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｙ、およびＷから選択され；
Ｘ２０は、ＡおよびＫから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ２８は、ＥおよびＱから選択される）；および
ｉｉ）ｉ）で定義された配列と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列からなる前記ＨＥＲ３結合ポリペプチドが提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
上述したＨＥＲ３結合ポリペプチドに関連する配列のクラスの定義は、これまでにＨＥＲ３との結合を呈することが示され、ＷＯ２０１１／０５６１２４で開示された配列に基づいて設計されたライブラリーから選択されるいくつかの新規のポリペプチド変異体の配列の分析に基づく。したがってこれらのポリペプチドは、ブドウ球菌プロテインＡのドメインのうち１つから誘導された親の足場のランダムな変異体であった。
【００１５】
同定されたＨＥＲ３結合モチーフ、または「ＢＭ」は、親の足場の標的結合領域に相当し、この領域は、３へリックスバンドルタンパク質のドメイン内で２つのアルファヘリックスを構成する。親の足場において、２つのＢＭヘリックスの様々なアミノ酸残基が、抗体の定常Ｆｃ部分と相互作用するための結合表面を構成する。ＷＯ２０１１／０５６１２４で説明されているように、結合表面残基のランダムな変化とそれに続く変異体の選択によって、結合表面のＦｃの相互作用能力は、元からＨＥＲ３との相互作用能力に置き換えられている。本発明の開示につながるこの作業で、例えば分子イメージングに好適な親和性パラメーターに関連する予想以上に優れた特性を示す新しい配列が生成された。
【００１６】
当業者であれば理解するであろうが、あらゆるポリペプチドの機能、例えば本明細書で定義されるようなポリペプチドのＨＥＲ３結合能力は、ポリペプチドの三次構造に依存する。したがって、ポリペプチドの三次構造および機能に大きな影響を及ぼすことなく、ポリペプチドのアミノ酸配列にわずかな変化を施すことが可能である。
【００１７】
したがって、一実施形態において、本ポリペプチドは、得られた配列が、配列ｉ）で定義されるクラスに属する配列と少なくとも９６％同一になるような配列ｉ）を有するＢＭの改変された変異体を含む。いくつかの実施形態において、このような変化は、本明細書で開示されるようなＨＥＲ３結合ポリペプチドの配列の全ての位置でなされてもよい。他の実施形態において、このような変化は、足場アミノ酸残基とも称される非可変位置でのみなされてもよい。このような場合、変化は、可変位置、すなわち「Ｘ」（例えば上記で定義されたＢＭのＸ４、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ２０、Ｘ２６、およびＸ２８）で表示される位置では許容されない。例えば、アミノ酸残基の所定の官能基（例えば疎水性、親水性、極性など）に属するアミノ酸残基は、同じ官能基からの別のアミノ酸残基と交換することが可能である。
【００１８】
明細書全体で使用される用語「同一性の％」は以下のように計算できる。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムを使用してクエリー配列を標的配列に対して並べる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２：４６７３〜４６８０（１９９４））。並べられた配列のうち最も短いものに対応するウィンドウで比較を行う。場合によっては、並べられた配列のうち最も短いものが標的配列のこともある。他の例において、クエリー配列が並べられた配列のうち最も短いものを構成する場合もある。各位置におけるアミノ酸残基を比較して、標的配列において同一な対応を示すクエリー配列中の位置のパーセンテージを同一性の％として報告する。
【００１９】
一実施形態において、本発明は、配列ｉ）中、互いに独立して、
Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴから選択され；
Ｘ７は、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ１１は、Ｑであり；
Ｘ１７は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ１８は、Ｍ、Ｙ、およびＷから選択され；
Ｘ２０は、Ｋであり；
Ｘ２６は、Ｋであり；
Ｘ２８は、Ｑである、上記で定義されたようなＨＥＲ３結合ポリペプチドを提供する。
【００２０】
一実施形態において、配列ｉ）中のＸ４は、Ａ、Ｅ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴから選択される。より具体的な実施形態において、配列ｉ）中のＸ４は、ＮおよびＱから選択される。さらにより具体的な実施形態において、配列ｉ）中のＸ４は、Ｎである。他の実施形態において、配列ｉ）中のＸ４は、Ｑである。
【００２１】
一実施形態において、配列ｉ）中のＸ１１は、Ｑである。
【００２２】
一実施形態において、配列ｉ）中のＸ１７は、Ｋ、Ｎ、およびＲから選択される。他の実施形態において、配列ｉ）中のＸ１７は、ＫおよびＲから選択される。より具体的な実施形態において、配列ｉ）中のＸ１７は、Ｋである。他の実施形態において、配列ｉ）中のＸ１７は、Ｒである。
【００２３】
一実施形態において、配列ｉ）中のＸ１８は、Ｍ、Ｙ、およびＷから選択される。より具体的な実施形態において、配列ｉ）中のＸ１８は、ＹおよびＷから選択される。さらにより具体的な実施形態において、配列ｉ）中のＸ１８は、Ｙである。他の実施形態において、配列ｉ）中のＸ１８は、Ｗである。他の実施形態において、配列ｉ）中のＸ１８は、Ｍである。
【００２４】
一実施形態において、配列ｉ）中のＸ１７Ｘ１８は、ＫＷ、ＫＹ、ＫＭ、およびＲＹから選択される。
【００２５】
一実施形態において、配列ｉ）中のＸ２０は、Ｋである。
【００２６】
一実施形態において、配列ｉ）中のＸ２６は、Ｋである。
【００２７】
一実施形態において、配列ｉ）中のＸ２８は、Ｑである。
【００２８】
一実施形態において、配列ｉ）は、以下の４つの条件Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶのうち少なくとも２つを満たす：
Ｉ）Ｘ１１は、Ｑであり；
ＩＩ）Ｘ１７Ｘ１８は、ＫＷ、ＫＹ、ＫＭ、およびＲＹから選択され；
ＩＩＩ）Ｘ２０は、Ｋであり；
ＩＶ）Ｘ２８は、Ｑである。
【００２９】
より具体的な実施形態において、配列ｉ）は、条件Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶのうち少なくとも３つを満たし、例えば４つ全てを満たす。
【００３０】
以下に記載される実験の章で詳細に説明されるように、ＨＥＲ３結合変異体を選択することにより、個々のＨＥＲ３結合モチーフ（ＢＭ）配列が同定された。これらの配列が、この態様に係るＨＥＲ３結合ポリペプチドの個々の実施形態を構成する。図１に、個々のＨＥＲ３結合モチーフの配列を配列番号１〜３５として示す。したがって、この態様のいくつかの実施形態において、ＢＭ配列ｉ）は、配列番号１〜配列番号３５のいずれか１つから、例えば配列番号１〜１０のいずれか１つから、例えば配列番号１〜２から選択される、ＨＥＲ３結合ポリペプチドが提供される。１つの特定の実施形態において、前記配列は、配列番号２である。他の特定の実施形態において、前記配列は、配列番号１である。
【００３１】
本発明の開示のいくつかの実施形態において、上記で定義されたようなＢＭは、３ヘリックスバンドルタンパク質のドメインの「一部を構成する」。これは、ＢＭが元のドメイン中の類似の構造モチーフと置き換えられるように、ＢＭの配列が元の３ヘリックスバンドルドメインの配列に「挿入される」か、またはその上に「グラフトされる」ことを意味すると理解される。例えば、理論に制限されることは望まないが、ＢＭは、３ヘリックスバンドルの３つのヘリックスのうち２つを構成し、いずれかの３ヘリックスバンドル内のこのような２つのへリックスのモチーフを置き換えることができると考えられる。当業者であれば理解するであろうが、３ヘリックスバンドルドメインのうち２つのヘリックスの２つのＢＭヘリックスでの置き換えは、そのポリペプチドの基本構造に影響を及ぼさないように行われなければならない。すなわち、本発明のこの実施形態に係るポリペプチドのＣα主鎖の全体のフォールディングは、それが一部を形成する３ヘリックスバンドルタンパク質のドメインのフォールディングと実質的に同じであり、例えば二次構造の同じ要素を同じ順番で有するなどといったことが挙げられる。したがって、本発明のこの実施形態に係るポリペプチドが元のドメインと同じようにフォールディングされている場合、本発明に係るＢＭは、３ヘリックスバンドルドメインの「一部を形成」し、これは、基本の構造的特性が共通であることを意味しており、このような特性とは、例えば結果的に類似のＣＤスペクトルをもたらすような特性である。当業者であれば、関連のある他のパラメーターを認識している。
【００３２】
特定の実施形態において、ＨＥＲ３結合モチーフ（ＢＭ）はこのようにして、３ヘリックスバンドルタンパク質のドメインの一部を形成する。例えば、ＢＭは、前記３ヘリックスバンドルタンパク質のドメイン内で互いに連結するループを有する２つのアルファヘリックスを実質的に構成していてもよい。特定の実施形態において、前記３ヘリックスバンドルタンパク質のドメインは、細菌の受容体タンパク質のドメインから選択される。このようなドメインの非限定的な例は、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡの５つの異なる３へリックスドメイン、例えばドメインＢ、およびそれらの誘導体などである。いくつかの実施形態において、３へリックスバンドルタンパク質ドメインは、ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢから誘導されたタンパク質Ｚの変異体である。
【００３３】
本発明のＨＥＲ３結合ポリペプチドが３ヘリックスバンドルタンパク質のドメインの一部を形成する実施形態において、ＨＥＲ３結合ポリペプチドは：
ｉｉｉ）Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ  ＸａＸｂＬＬＸｃ  ＥＡＫＫＬ  ＮＤＸｄＱ；
（式中、
［ＢＭ］は、上記で定義されるＨＥＲ３結合モチーフであり；
Ｘａは、ＡおよびＳから選択され；
Ｘｂは、ＮおよびＥから選択され；
Ｘｃは、Ａ、Ｓ、およびＣから選択され；
Ｘｄは、ＡおよびＳから選択される）；および
ｉｖ）ｉｉｉ）で定義された配列のいずれか１つと少なくとも８９％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００３４】
前記アミノ酸配列ｉｖ）は、ｉｉｉ）で定義された配列のいずれか１つと、少なくとも９１％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％の同一性を有していてもよい。
【００３５】
上記で定義されたようなＨＥＲ３結合ポリペプチドの一実施形態において、配列ｉｉｉ）中のＸａは、Ａである。上記で定義されたようなＨＥＲ３結合ポリペプチドの代替の実施形態において、配列ｉｉｉ）中のＸａは、Ｓである。
【００３６】
上記で定義されたようなＨＥＲ３結合ポリペプチドの一実施形態において、配列ｉｉｉ）中のＸｂは、Ｎである。代替の実施形態において、配列ｉｉｉ）中のＸｂは、Ｅである。
【００３７】
上記で定義されたようなＨＥＲ３結合ポリペプチドの一実施形態において、配列ｉｉｉ）中のＸｃは、Ａである。代替の実施形態において、配列ｉｉｉ）中のＸｃは、Ｓである。さらに他の代替の実施形態において、配列ｉｉｉ）中のＸｃは、Ｃである。
【００３８】
上記で定義されたようなＨＥＲ３結合ポリペプチドの一実施形態において、配列ｉｉｉ）中のＸｄは、Ａである。代替の実施形態において、配列ｉｉｉ）中のＸｄは、Ｓである。
【００３９】
上記で定義されたようなＨＥＲ３結合ポリペプチドの一実施形態において、配列ｉｉｉ）中、Ｘａは、Ａであり；Ｘｂは、Ｎであり；Ｘｃは、Ａであり、Ｘｄは、Ａである。
【００４０】
上記で定義されたようなＨＥＲ３結合ポリペプチドのさらなる実施形態において、配列ｉｉｉ）中、Ｘａは、Ａであり；Ｘｂは、Ｎであり；Ｘｃは、Ｃであり、Ｘｄは、Ａである。
【００４１】
上記で定義されたようなＨＥＲ３結合ポリペプチドのさらなる実施形態において、配列ｉｉｉ）中、Ｘａは、Ｓであり；Ｘｂは、Ｅであり；Ｘｃは、Ｓであり、Ｘｄは、Ｓである。
【００４２】
上記で定義されたようなＨＥＲ３結合ポリペプチドのさらなる実施形態において、配列ｉｉｉ）中、Ｘａは、Ｓであり；Ｘｂは、Ｅであり；Ｘｃは、Ｃであり、Ｘｄは、Ｓである。
【００４３】
さらなる追加の実施形態において、本発明に係るＨＥＲ３結合ポリペプチドの上記の定義における配列ｉｉｉ）は、配列番号３６〜７０から、特に配列番号３６〜４５から、例えば配列番号３６および配列番号３７から選択される。具体的な実施形態において、配列ｉｉｉ）は、配列番号３７である。他の具体的な実施形態において、配列ｉｉｉ）は、配列番号３６である。
【００４４】
また、さらなる実施形態において：
ｖ）ＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ  ＳＥＬＬＸｃ  ＥＡＫＫＬ  ＮＤＳＱＡ  Ｐ；
（式中［ＢＭ］は、上記で定義されたようなＨＥＲ３結合モチーフであり、Ｘｃは、ＳおよびＣから選択される）；および
ｖｉ）ｖ）で定義された配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、上記で定義されたようなＨＥＲ３結合ポリペプチドも提供される。
【００４５】
他の実施形態において：
ｖｉｉ）ＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ  ＡＮＬＬＸｃ  ＥＡＫＫＬ  ＮＤＡＱＡ  Ｐ；
（式中［ＢＭ］は、上記で定義されたようなＨＥＲ３結合モチーフであり、Ｘｃは、ＡおよびＣから選択される）；および
ｖｉｉｉ）上記のｖｉｉ）で定義された配列のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドが提供される。
【００４６】
上述したように、ポリペプチドの三次構造および機能に大きな影響を及ぼすことなく上記のアミノ酸配列と比較してわずかな変化を含むポリペプチドも本発明の開示の範囲内である。したがって、いくつかの実施形態において、上記で定義されたようなＨＥＲ３結合ポリペプチドは、例えば、ｖ）またはｖｉｉ）で定義された配列と、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、または少なくとも９８％同一な配列を有していてもよい。
【００４７】
いくつかの実施形態において、以下の実施例で開示されるように、ＨＥＲ３結合モチーフは、
ＡＤＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＱＨＤＥ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；および
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＥＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＫＳＱＡＰＫ；
（式中［ＢＭ］は、上記で定義されたようなＨＥＲ３結合モチーフである）
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの一部を形成してもよい。
【００４８】
一実施形態において、ＨＥＲ３結合ポリペプチドは：
ｉｘ）ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＥＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＫＳＱＡＰＫ；（式中［ＢＭ］は、上記で定義されたようなＨＥＲ３結合モチーフである）、および
ｘ）ｉｘ）で定義された配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４９】
ここでも、ポリペプチドの三次構造および機能に大きな影響を及ぼすことなく上記のアミノ酸配列と比較してわずかな変化を含むポリペプチドも本発明の開示の範囲内である。したがって、いくつかの実施形態において、上記で定義されたようなＨＥＲ３結合ポリペプチドは、例えば、ｉｘ）で定義された配列と、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、または少なくとも９８％同一な配列を有していてもよい。
【００５０】
このようなポリペプチド中の配列ｉｘ）は、配列番号７１〜１０５のいずれか１つからから選択されてもよい。特に、配列ｉｘ）は、配列番号７１〜８０のいずれか１つから選択されてもよく、例えば配列番号７１〜７２から選択されてもよい。このポリペプチドの具体的な実施形態において、配列ｉｘ）は、配列番号７２である。他の具体的な実施形態において、配列ｉｘ）は、配列番号７１である。
【００５１】
上記で定義されたクラスのＨＥＲ３結合ポリペプチドは、これまでに公知の一般的なＨＥＲ３結合ポリペプチドの群（すなわちＷＯ２０１１／０５６１２４で示される群）と比較して有利な結合特性を示す。特に、本発明の開示のＨＥＲ３結合ポリペプチドの一実施形態において、同じ実験条件を使用して測定した場合、前記ＨＥＲ３結合ポリペプチドとヒトＨＥＲ３との相互作用の解離速度（ｋｏｆｆ）は、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む比較用ＨＥＲ３結合ポリペプチドとヒトＨＥＲ３との相互作用の解離速度（ｋｏｆｆ
）と比較して少なくとも４分の１以下である。他の実施形態において、本明細書で定義されるＨＥＲ３結合ポリペプチドは、前記解離速度（ｋｏｆｆ）が、配列番号１０７を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドの解離速度と比較して少なくとも８分の１以下であり、例えば少なくとも１２分の１以下であり、例えば少なくとも１５分の１以下であるＨＥＲ３結合ポリペプチドである。より具体的な実施形態において、前記解離速度（ｋｏｆｆ）は、配列番号１０７を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドの解離速度と比較して少なくとも２０分の１以下である。
【００５２】
本発明の開示に係るＨＥＲ３結合ポリペプチドの一実施形態において、前記ＨＥＲ３結合ポリペプチドとヒトＨＥＲ３との相互作用は、相互作用のＫＤ値が、最大で１×１０−９Ｍ、例えば最大で１×１０−１０Ｍ、例えば最大で１×１０−１１Ｍになるような相互作用である。
【００５３】
これらの反応速度パラメーターなどは、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）またはＰｒｏｔｅｏｎ  ＸＰＲ装置で表面プラズモン共鳴を使用して、および／または以下の実施例で記載されるような蛍光活性化セルソーティングを使用して定性的および定量的に測定できる。
【００５４】
本発明の開示の範囲から逸脱することなくポリペプチドを特定の用途に合わせるために、本明細書で開示されたいずれかの態様に係るＨＥＲ３結合ポリペプチドに様々な改変および／または付加を施すことができることを、当業者であれば理解するであろう。例えば、本明細書で開示されたＨＥＲ３結合ポリペプチドはいずれも、追加のＣ末端および／または末端アミノ酸を含んでいてもよい。このようなポリペプチドは、ポリペプチド鎖中の真に最初の位置および／または真に最後の位置、すなわちＮ末端および／またはＣ末端に追加のアミノ酸残基を有するポリペプチドと理解されるものとする。したがって、一実施形態において、本明細書で定義されるようなＨＥＲ３結合ポリペプチドは、あらゆる好適な数の追加のアミノ酸残基、例えば少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含んでいてもよい。追加のアミノ酸残基はそれぞれ、例えば、ポリペプチドの生産、精製、インビボもしくはインビトロでの安定化、結合、または検出を改善するために個別にまたは集合的に付加できる。このような追加のアミノ酸残基は、化学的結合の目的で付加された１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を含んでいてもよい。その例の１つは、システイン残基の付加である。このような追加のアミノ酸残基は、ポリペプチドの精製または検出のための「タグ」を付与することもでき、このようなタグとしては、タグに特異的な抗体と相互作用させるための、または固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）のための（Ｈｉｓ６−タグおよびＨＥＨＥＨＥタグの場合）、Ｈｉｓ６タグ、ＨＥＨＥＨＥタグまたは「ｍｙｃ」（ｃ−ｍｙｃ）タグまたは「ＦＬＡＧ」タグなどがある。
【００５５】
上述したような追加のアミノ酸は、（公知の有機化学的方法を使用した）化学的なコンジュゲーションの手段によって、または融合タンパク質としてのＨＥＲ３結合ポリペプチドの発現などの他のあらゆる手段によってＨＥＲ３結合ポリペプチドに結合されてもよい。
【００５６】
上述したような追加のアミノ酸は、例えば、１つまたはそれ以上のポリペプチドドメインを含んでいてもよい。
【００５７】
追加のポリペプチドドメインは、例えば別の結合機能、もしくは酵素的な機能、もしくは毒性機能（例えば免疫毒素）、もしくは蛍光シグナル伝達機能、もしくは治療的な機能、もしくは診断的な機能、もしくは予後予測的な機能、またはそれらの組合せなどの別の機能を有するＨＥＲ３結合ポリペプチドを提供することもできる。
【００５８】
追加のポリペプチドドメインはさらに、同じ結合機能を有するＨＥＲ３結合ポリペプチドを提供することもできる。したがって、本明細書で開示されるようなＨＥＲ３結合ポリペプチドは、少なくとも２つのＨＥＲ３結合ポリペプチド単量体単位を含んでいてもよく、これらの単量体単位のアミノ酸配列は同一でもよいし、または異なっていてもよい。本ポリペプチドの多量体形態は、それぞれＨＥＲ３結合モチーフを有し、それぞれ多量体内で「単量体」を形成する好適な数のドメインを含んでいてもよい。これらのドメインが全て同じアミノ酸配列を有していてもよいが、その代わりにこれらのドメインは異なるアミノ酸配列を有していてもよい。特に、本明細書で開示されるようなＨＥＲ３結合ポリペプチドは、ホモまたはヘテロ二量体を形成してもよい。
【００５９】
言い換えれば、本発明の開示の第二の態様において、本明細書で説明されるようなＨＥＲ３結合ポリペプチドからなる第一の部分；および所望の生物活性を有するポリペプチドからなる第二の部分を含む融合タンパク質またはコンジュゲートが提供される。所望の生物活性の例としては、これらに限定されないが、治療活性、結合活性、診断活性、予後活性、および酵素活性、加えてそれらの組合せが挙げられる。
【００６０】
一実施形態において、前記第二の部分は、ヒト内因性酵素、ホルモン、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、およびリンフォカインからなる群から選択される。他の実施形態において、前記第二の部分は、標的分子、例えばアルブミン、ＨＥＲ３、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ｃＭｅｔ、ＶＥＧＦＲ、およびＰＤＧＦＲからなる群から選択される標的分子と選択的に相互作用できる結合ポリペプチドである。したがって、第二の部分または追加の部分は、別の結合機能を有するＨＥＲ３結合ポリペプチドを提供する可能性がある。あるいは、前記第二のまたは追加の部分は、別のＨＥＲ３結合機能を有するＨＥＲ３結合ポリペプチドを提供する可能性がある。したがって、ＨＥＲ３結合ポリペプチドの多量体形態（例えば、これらに限定されないが、二量体、三量体、および四量体形態）は、前記開示の範囲内に含まれる。上述したように、多量体の単位が全ての同じアミノ酸配列を有していてもよいが、あるいは多量体の単位は、異なるアミノ酸配列を有していてもよい。
【００６１】
上述したように、本発明の開示はさらに、少なくとも１つのＨＥＲ３結合ポリペプチドの単量体単位と、別の標的との結合親和性を有する少なくとも１つの単量体単位とを含む、ＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートも包含する。このような他の標的は、他の上皮成長因子受容体、例えば特にＨＥＲ２、およびＥＧＦＲなどから選択でき、または好適な場合には、これらに限定されないが、ＩＧＦ１Ｒ、ｃＭｅｔ、ＶＥＧＦＲ、およびＰＤＧＦＲなどの他の標的からも選択できる。このような本ポリペプチドのヘテロ多量体形態は、好適な数の、少なくとも１つのＨＥＲ３結合モチーフを有するドメインと、好適な数の、１種またはそれ以上の他の標的への親和性を付与する結合モチーフを有するドメインとを含んでいてもよい。これに関する可能性の詳細な議論については、例えば、本明細書で示された新規のＨＥＲ３結合ポリペプチドに同様に関連するＷＯ２０１１／０５６１２４を参照されたい。
【００６２】
考慮される結合ポリペプチドの非限定的な一覧には、抗体、ならびに抗体結合活性を実質的に保持するそれらのフラグメントおよびドメインからなる群から選択されるポリペプチド；ミクロボディ、マキシボディ（ｍａｘｙｂｏｄｙ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、および他の小さいジスルフィド結合したタンパク質；ならびにブドウ球菌プロテインＡおよびそれらのドメイン、他の３へリックスドメイン、リポカリン、アンキリン反復ドメイン、セルロース結合ドメイン、γクリスタリン、緑色蛍光タンパク質、ヒト細胞傷害性Ｔ細胞関連抗原４、プロテアーゼ阻害剤、例えばＫｕｎｉｔｚドメイン、ＰＤＺドメイン、ＳＨ３ドメイン、ペプチドアプタマー、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、テンダミスタット、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、トランスフェリン、ジンクフィンガー、ならびにコノトキシンからなる群から選択される足場から誘導された結合タンパク質が含まれる。
【００６３】
本発明に係るＨＥＲ３結合ポリペプチドが第一の部分ならびに第二の部分および／または追加の部分を構成する本発明の開示に係る融合タンパク質またはコンジュゲートは、ＨＥＲ３との結合以外の他の機能を有しており、これらも本開示の範囲内に含まれる。融合ポリペプチドまたはコンジュゲートの第二のおよび／または追加の部分／部分（複数）は、好適には、所望の生物活性を有していてもよい。したがって、一実施形態において、追加の所望の生物活性を有するポリペプチドからなる追加の部分を含む、本明細書で説明されているような融合タンパク質またはコンジュゲートが提供され、ここで上記追加の所望の生物活性は、第二の部分の生物活性と同一でもよいし、または異なっていてもよい。本発明に係る融合タンパク質またはコンジュゲートの例としては、第二の部分が、治療活性、結合活性、酵素活性を有するか、治療的に活性なポリペプチドであるか、またはヒト内因性酵素、ホルモン、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、およびリンフォカインからなる群から選択され、さらに追加の部分が、標的分子と選択的に相互作用できる結合ポリペプチドである融合タンパク質またはコンジュゲートが挙げられる。他の例において、第二の部分および追加の部分は、標的分子と選択的に相互作用できる結合ポリペプチドであり、ここで前記標的分子は、同一でもよいし、または異なっていてもよい。
【００６４】
いくつかの実施形態において、第二のまたは追加の部分／部分（複数）は、インビボでのＨＥＲ３結合ポリペプチドの半減期を増加させる部分を含んでいてもよい。当業者には理解されるように、半減期の増加または延長は、血液からの特定の分子のクリアランスの遅延を意味する。抗体のＦｃドメインの結合（Ｆｃコンジュゲーション）またはアルブミンへの結合など、インビボで特定のポリペプチドの半減期を長くするための多数の公知の方策がある。他の例は、半減期を延長する部分、例えばインビボで血清アルブミンに会合するであろうペプチドまたはタンパク質への結合である。特に、半減期を延長する部分は、アルブミン結合部分であってもよい。アルブミン結合部分は、例えば、天然に存在するポリペプチド、またはそれらのアルブミン結合フラグメント、または操作されたポリペプチドからなっていてもよい。アルブミンなどの分子への結合親和性などの新規の特性または強化された特性を作り出すという目的で、部位特異的またはランダム化アプローチでの突然変異および変更などのタンパク質工学技術で天然に存在する出発ポリペプチドを処理することによって、天然に存在する出発ポリペプチドから操作されたポリペプチドを誘導してもよい。このような操作されたアルブミン結合ポリペプチドは、例えばタンパク質の足場の変異体であってもよく、このような変異体は、そのアルブミンへの特異的な結合親和性に関して選択されたものである。具体的な実施形態において、タンパク質の足場は、連鎖球菌プロテインＧのドメインまたはそれらの誘導体、例えば連鎖球菌Ｇ１４８株由来のプロテインＧのドメインＧＡ１、ドメインＧＡ２、およびドメインＧＡ３、特にドメインＧＡ３などから選択されてもよい。
【００６５】
したがって、ＨＥＲ３結合ポリペプチドの一実施形態において、追加のアミノ酸は、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメイン（ＧＡまたはＡＢＤ）、またはそれらの誘導体を含む。本明細書で説明されるＨＥＲ３結合ポリペプチドとの融合タンパク質またはコンジュゲート中に第二の部分および／または追加の部分として含まれる可能性があるアルブミン結合ドメインの非限定的な例は、ＷＯ２００９／０１６０４３およびＷＯ２０１２／００４３８４に開示されている。理論に制限されることは望まないが、このような融合タンパク質またはコンジュゲートがインビボで血清アルブミンに結合すると、そのより長い半減期によって利益を得て、ポリペプチドそれ自体の正味の半減期を増加させると考えられる（例えばＷＯ９１／０１７４３を参照）。したがって上記で定義されたようなアルブミン結合部分を含むＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートの薬物動態プロファイルは、例えば哺乳動物の対象に投与される場合、血清アルブミンの薬物動態プロファイルと類似する。ＡＢＤおよびそれらの誘導体は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、加えてマウスおよびラットなどの他の種由来の血清アルブミンに極めて強く結合する。
【００６６】
連鎖球菌プロテインＧのＡＢＤ、およびそれらの公知の変異体の長さは、およそ４６アミノ酸である。したがって、本明細書で説明されているようなＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートがＡＢＤ部分またはそれらの誘導体を含む場合、ＨＥＲ３結合分子の全体のサイズは比較的小さい。例えばヒト対象などの哺乳動物の対象に投与される場合、ＨＥＲ３結合分子のアルブミン結合部分は、非共有結合によって血清アルブミンと会合することになり、それによって本ポリペプチドは、腎クリアランスの減少および上皮細胞での再循環の増加による利益を得る可能性がある。さらに、半減期を延長する部分を含むＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートは、それに対応する半減期を延長する部分が欠失したポリペプチドと比較して、インビボで延長された半減期を示すだけでなく、インビボでの免疫応答の低下も示す可能性がある（例えばＷＯ２００５／０９７２０２を参照）。
【００６７】
本発明に係るＨＥＲ３結合ポリペプチドを取り入れた融合タンパク質またはコンジュゲートの本明細書での説明に関して、第一の部分、第二の部分、および追加の部分という名称は、一方では本発明に係るＨＥＲ３結合ポリペプチドまたはポリペプチド（複数）と、他方では他の機能を示す部分とを明確に区別するという理由で付けられていることに留意されたい。これらの名称は、融合タンパク質またはコンジュゲートのポリペプチド鎖中の様々なドメインの実際の順番を指すことを意図していない。したがって、例えば、前記第一の部分が、これらに限定されないが、融合タンパク質またはコンジュゲートのＮ末端、中央、またはＣ末端に現れていてもよい。
【００６８】
上述したような追加のポリペプチドドメインは、公知の有機化学的方法を使用して共有結合によりＨＥＲ３結合ポリペプチドに合体させてもよい。あるいは、追加のポリペプチドドメインを含むＨＥＲ３結合ポリペプチドは、例えばポリペプチドの組換え発現系で１つまたはそれ以上の融合ポリペプチドとして発現させてもよいし、または他のあらゆる方式で、直接か、もしくはリンカー、例えばアミノ酸リンカーを介するかのいずれかで合体させてもよい。有用なアミノ酸リンカーの非限定的な例は、Ｇ、ＧＳ、［Ｇ２Ｓ］ｎ、［Ｇ３Ｓ］ｎ、［Ｇ４Ｓ］ｎ、ＧＳ［Ｇ４Ｓ］ｎ（ここでｎは、１から７の間、例えば１から２の間の整数である）、［Ｓ２Ｇ］ｍ、［Ｓ３Ｇ］ｍ、［Ｓ４Ｇ］ｍ（ここでｍは、１から７の間の整数である）、およびＶＤＧＳから選択される。
【００６９】
また本開示は、細胞毒性薬をさらに含む、第一の態様に係るＨＥＲ３結合ポリペプチド、および第二の態様に係る融合タンパク質またはコンジュゲートの実施形態も包含し、ここで細胞毒性薬は、例えば、オーリスタチン、アントラサイクリン、カリケアマイシン、コンブレタスタチン、ドキソルビシン、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、ＣＣ−１０６５抗腫瘍抗生物質、エクテイナシジン、ゲルダナマイシン、メイタンシノイド、メトトレキセート、マイコトキシン、タキソール、リシン、ブーガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）、ゲロニン、シュードモナス属外毒素３８（ＰＥ３８）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ならびにそれらの類似体およびそれらの誘導体、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される。
【００７０】
他の実施形態において、開示されたＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートは、標識をさらに含み、このような標識は、例えばインビボまたはインビトロで本ポリペプチドを検出するための、蛍光色素および金属、色素産生色素、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性核種および粒子からなる群から選択される。
【００７１】
前記標識は、本ポリペプチドを直接標識付けるのに使用できるが、間接的な標識付けも考慮される。いくつかの実施形態において、標識されたＨＥＲ３結合ポリペプチドは、所望の生物活性を有する第二の部分も含む融合タンパク質またはコンジュゲート中の部分として存在する。標識は、場合によっては、ＨＥＲ３結合ポリペプチドにのみ結合されてもよいし、場合によっては、ＨＥＲ３結合ポリペプチドとコンジュゲートまたは融合タンパク質の第二の部分との両方に結合されてもよい。さらに、標識は、第二の部分にのみ結合され、ＨＥＲ３結合部分には結合されない場合もあり得る。したがって、さらにその他の実施形態において、前記標識が第二の部分にのみ結合される第二の部分を含む、ＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートが提供される。標識されたポリペプチドが参照される場合、これは、ＨＥＲ３結合ポリペプチドと、第二の部分と、場合により追加の部分とを含む融合タンパク質およびコンジュゲートなどの本明細書で説明されているようなポリペプチドの全ての態様を参照するものと理解されるものとする。
【００７２】
したがって、標識されたポリペプチドは、ＨＥＲ３結合ポリペプチドと、例えば医療用イメージングに好適な、または療法に好適な放射性核種とだけを含有していてもよく、このような放射性核種は、ＨＥＲ３結合ポリペプチドにキレート化されていてもよいし、または共有結合で結合されていてもよい。あるいは、標識されたポリペプチドは、ＨＥＲ３結合ポリペプチドと、医療用イメージングに好適な放射性核種と、例えば治療効能のような所望の生物活性を有する小分子などの第二の部分とを含有していてもよい。
【００７３】
標識されたポリペプチドとＨＥＲ３との強い会合のために、標識されたポリペプチドは、癌の腫瘍内の細胞などのＨＥＲ３発現細胞の存在を可視化するのに使用できる。
【００７４】
放射性核種の多くは金属の性質を有し、金属は、典型的にはタンパク質およびペプチド中に存在する元素と安定な共有結合を形成できない。この理由のために、タンパク質およびペプチドの放射性金属での標識付けは、キレート剤、すなわち金属イオンとキレートと呼ばれる非共有結合化合物を形成する多座配位子を使用して行われる。アルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートの実施形態において、放射性核種の取り入れは、本ポリペプチドに放射性核種を配位したり、キレート化したり、または錯体化するためのキレート化環境を提供することによって可能である。
【００７５】
キレート剤の例の１つは、ポリアミノポリカルボキシレート型のキレート剤である。このようなポリアミノポリカルボキシレートキレート剤には２つのクラスがあり：大環式キレート剤と非環式キレート剤とに区別できる。
【００７６】
一実施形態において、ＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートは、システイン残基のチオール基またはリシン残基のイプシロンアミン基を介してＨＥＲ３結合ポリペプチドにコンジュゲートしたポリアミノポリカルボキシレートキレート剤によって提供されるキレート化環境を含む。
【００７７】
インジウム、ガリウム、イットリウム、ビスマスの放射性同位体、放射性アクチニド、および放射性ランタニドに最も一般的に使用される大環式キレート剤は、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）の様々な誘導体である。一実施形態において、ＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートのキレート化環境は、ＤＯＴＡまたはそれらの誘導体によって提供される。より具体的には、一実施形態において、本発明の開示に包含されるキレート化ポリペプチドは、ＤＯＴＡ誘導体である１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス−酢酸−１０−マレイミドエチルアセトアミド（マレイミドモノアミド−ＤＯＴＡ）を前記ポリペプチドと反応させることによって得られる。
【００７８】
加えて、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−トリ酢酸（ＮＯＴＡ）およびそれらの誘導体をキレート剤として使用してもよい。したがって、一実施形態において、ポリアミノポリカルボキシレートキレート剤が、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−トリ酢酸またはそれらの誘導体である、ＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートが提供される。
【００７９】
最も一般的に使用される非環式ポリアミノポリカルボキシレートキレート剤は、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）の様々な誘導体である。したがって、ジエチレントリアミン五酢酸またはそれらの誘導体によって提供されるキレート化環境を有するポリペプチドも本発明の開示に包含される。
【００８０】
一実施形態において、医療用イメージングに好適な放射性核種を含む、本明細書で説明されているようなＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートが提供され、前記放射性核種は、９９ｍＴｃ、６１Ｃｕ、６４Ｃｕ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１０ＭＩｎ、１１１Ｉｎ、４４Ｓｃ、および８６Ｙからなる群から選択され、または療法に好適な放射性核種を有する、本明細書で説明されているようなＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートが提供され、前記放射性核種は、２２５Ａｃ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、６７Ｃｕ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、２１２Ｐｂ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、２２７Ｔｈ、および９０Ｙからなる群から選択され、ここで前記放射性核種は、キレート化環境を介してＨＥＲ３結合ポリペプチドと錯体化される。１つの特定の実施形態において、放射性核種は、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６４Ｃｕ、および６８Ｇａからなる群から選択される。一実施形態において、放射性核種は、９９ｍＴｃおよび１１１Ｉｎから選択される。
【００８１】
ＮＯＴＡを使用することにより、ＳＰＥＣＴ用の１１１Ｉｎ（Ｔｏｌｍａｃｈｅｖら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２２：８９４〜９０２（２０１１）；Ｈｅｓｃａｍｐら、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ５３：１４３〜１５３（２０１２））、および６８Ｇａまたは１８Ｆ（１８Ｆ−ＡｌＦの化学的性質を使用（ＭｃＢｒｉｄｅら、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ５０：９９１〜８（２００９）））、そのＰＥＴ用（Ｈｅｓｃａｍｐら、上記）でのＺポリペプチドの安定な標識付けが提供される。その他にも、最適なイメージング時間が注射後６時間より長いことになる場合、同じキレート剤が、寿命が長い陽電子放出体である６４Ｃｕでの安定な標識付けに使用される場合もある（Ｐｒａｓａｎｐｈａｎｉｃｈら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０４：１２４６２〜７（２００７）、Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、ＥＪＮＭＭＩ  Ｒｅｓ  ２：８（２０１２））。
【００８２】
加えて、当業者であれば、このようなコアを「裸の」Ｍｅ、Ｍｅ＝Ｏ、Ｏ＝Ｍｅ＝Ｏ、Ｍｅ≡Ｎ、Ｍｅ（ＣＯ）３、またはＨＹＮＩＣ−Ｍｅ−コリガンドのコア（式中、Ｍｅは、ＴｃまたはＲｅの放射性同位体である）としてキレート化できる多数の他のキレート剤を予め認識することもでき、このようなキレート剤は、ペプチド合成中にポリペプチドに部位特異的に付着するか、または公知の放射標識のためのコンジュゲーション化学を使用して組換え生産されたポリペプチドにコンジュゲートできる。好ましくは、このようなキレート剤は、親水性の特徴を有する。
【００８３】
本発明の開示の関連する態様において、本明細書で定義されるようなＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートと、少なくとも１種の薬学的に許容される添加剤またはキャリアーとを含む組成物が提供される。一実施形態において、前記組成物は、治療剤などの少なくとも１種の追加の活性物質を含む。好適な治療剤は、ＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質もしくはコンジュゲートの活性を助長する物質、または例えば癌などのＨＥＲ３関連の状態の様々な態様に影響を及ぼす様々な作用機序を有する物質であり得る。追加の活性物質の非限定的な例は、免疫促進剤、放射性核種、毒物、酵素、エフェクター細胞を補充する因子、および光増感剤からなる群から選択される治療剤である。
【００８４】
本発明の開示に係るＨＥＲ３結合ポリペプチドそれ自体が、治療剤もしくは診断剤として、または例えばＨＥＲ３への直接的もしくは間接的な作用で他の治療剤もしくは診断剤を標的化するための手段として有用な可能性があることが理解されるものとする。直接的な治療的作用は、例えば、ＨＥＲ３のシグナル伝達を阻害することによって達成されてもよい。間接的な作用に関して、一実施形態では、本発明に係るＨＥＲ３結合ポリペプチドと治療剤との組合せが提供される。このような組合せにおいて有用であることを証明できる治療剤の非限定的な例は、免疫促進剤、放射性核種、毒物、酵素、エフェクター細胞を補充する因子（例えばＴまたはＮＫ細胞）、および光増感剤である。したがって、一実施形態において、ＨＥＲ３結合ポリペプチドは、そのものとして、または本発明の開示に係るＨＥＲ３結合の組合せ（例えば融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物）に含まれる場合、療法での使用に提供される。
【００８５】
ＨＥＲ３はまた、所定の癌、例えば結腸癌、子宮内膜癌、胃癌、神経膠腫、乳癌、膵臓癌、頭頸部扁平上皮癌、肺癌、黒色腫、髄芽細胞腫、神経上皮腫、卵巣癌、パジェット病、甲状腺乳頭癌、前立腺癌、皮膚の扁平上皮癌、移行上皮細胞癌、および前庭神経鞘腫の予後を予測するための有用なマーカーとしても役立つ可能性がある。例えば、高レベルの受容体発現は、ＨＥＲ２を過剰発現する患者と比較して有意に短い生存時間と関連があるため、ＨＥＲ３発現は予後的重要性を有することが示されている。
【００８６】
したがって、本発明の開示の他の態様において、医薬品、診断剤または予後予測剤（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）として使用するための、本明細書で説明されているようなＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物が提供される。一実施形態において、前記ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物は、ＨＥＲ３の機能またはシグナル伝達を調節する。本明細書において、用語「調節する」は、ＨＥＲ３の活性を変化させること、例えばＨＥＲ３を低次形態の状態にすること、ＨＥＲ３のシグナル伝達もしくは機能を部分的に阻害すること、または完全に阻害することなどを指す。一実施形態において、前記ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物はＨＥＲ３のシグナル伝達を阻害することから、医薬品として治療的作用を有する。診断剤および／または予後予測剤は、ＨＥＲ３のシグナル伝達を調節または阻害するポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物を含んでいてもよい。しかしながら、ＨＥＲ３のシグナル伝達を調節または阻害しない前記ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物も、予後予測剤または診断剤として同様に有用な場合がある。
【００８７】
一実施形態において、癌などのＨＥＲ３関連の状態の処置、診断または予後で使用するための、ＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物が提供される。一実施形態において、前記癌は、結腸癌、子宮内膜癌、胃癌、神経膠腫、乳癌、膵臓癌、頭頸部扁平上皮癌、肺癌、黒色腫、髄芽細胞腫、神経上皮腫、卵巣癌、パジェット病、甲状腺乳頭癌、前立腺癌、皮膚の扁平上皮癌、移行上皮細胞癌、および前庭神経鞘腫などの癌疾患からなる群から選択される。一実施形態において、前記癌は、乳癌、卵巣癌、および前立腺癌から選択される。ＨＥＲ３の過剰発現を特徴とする他の癌疾患も、開示されたＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物での処置に好適な可能性がある。
【００８８】
他の態様において、ＨＥＲ３を含有する疑いのあるサンプルを準備すること、前記サンプルを、本明細書で説明されているようなＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物と接触させること、およびＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物の結合を検出して、サンプル中のＨＥＲ３の存在を示すことを含む、ＨＥＲ３の検出方法が提供される。一実施形態において、前記方法は、サンプルを接触させた後、未結合のポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物を除去するために中間体を洗浄する工程をさらに含む。
【００８９】
一実施形態において、対象中のＨＥＲ３の存在を決定する方法、例えば診断または予後予測方法であって、該方法は：
対象または対象から単離したサンプルを、本明細書で説明されているようなＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物と接触させる工程、および
前記対象中で、または前記サンプルに結合したＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物の量に相当する値を得る工程
を含む前記方法が提供される。
【００９０】
一実施形態において、前記方法は、対象またはサンプルを接触させた後、且つ値を得る前に、未結合のポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物を除去するために中間体を洗浄する工程をさらに含む。
【００９１】
一実施形態において、前記方法は、前記値を参照と比較する工程をさらに含む。前記参照は、数値、閾値または可視的なインジケーターによって、例えば呈色反応に基づきスコア付けできる。様々な参照との比較方法が当業界で公知であり、使用に適している可能性があることを当業者であれば理解するであろう。
【００９２】
一実施形態において、前記方法は、インビボで行われる。
【００９３】
一実施形態において、前記方法は、インビトロで行われる。
【００９４】
このような方法の一実施形態において、前記対象は、ヒト対象などの哺乳動物の対象である。
【００９５】
さらに他の関連する態様において、癌などのＨＥＲ３の過剰発現を特徴とするＨＥＲ３関連の状態を有する、またはそのような状態を有する疑いのある対象の体、例えばヒト対象などの哺乳動物の対象の体のインビボでのイメージング方法であって：
哺乳動物の対象の体に、本明細書で説明されているような放射標識したポリペプチド、融合ポリペプチドまたはコンジュゲートを投与する工程であり、ここで放射性核種はイメージングに好適なものである、工程；および
放射標識したポリペプチドの投与から１〜７２時間以内に、医療用イメージング装置を使用して対象の体の少なくとも一部の１つまたはそれ以上の画像を得る工程であり、前記画像は、体内の放射性核種の存在を示す工程
を含む前記イメージング方法が提供される。
【００９６】
前記医療機器は、例えば、ガンマカメラ、ＰＥＴスキャナーまたはＳＰＥＣＴスキャナーであってもよい。使用に適している可能性がある他の医療用イメージング装置がどのようなものを当業者であれば理解しているであろう。また固形腫瘍およびＨＥＲ３発現が認められるあらゆる癌が、前記方法によりインビボで可視化が可能であることも当業者であれば理解しているであろう。
【００９７】
関連する態様において、必要とする対象に、本明細書で説明されているようなＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物の有効量を投与することを含む、ＨＥＲ３関連の状態の処置方法が提供される。その結果として、処置方法において、対象は、本発明に係るＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物で処置される。前記方法のより具体的な実施形態において、本明細書で説明されているようなＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物は、ＨＥＲ３の機能またはシグナル伝達を調節し、例えばＨＥＲ３の機能またはシグナル伝達を阻害する。前記方法のより具体的な実施形態において、ＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物が、対象中の細胞表面上で発現されたＨＥＲ３に結合すると、ＨＥＲ３のシグナル伝達が阻害される。
【００９８】
一実施形態において、前記ＨＥＲ３関連の状態は、結腸癌、子宮内膜癌、胃癌、神経膠腫、乳癌、膵臓癌、頭頸部扁平上皮癌、肺癌、黒色腫、髄芽細胞腫、神経上皮腫、卵巣癌、パジェット病、甲状腺乳頭癌、前立腺癌、皮膚の扁平上皮癌、移行上皮細胞癌、および前庭神経鞘腫などの癌疾患からなる群から選択される癌などの癌である。一実施形態において、前記癌は、乳癌、卵巣癌、および前立腺癌からなる群から選択される。いずれの癌においても、固形腫瘍およびＨＥＲ３発現が認められる。
【００９９】
さらなる態様において、上述したようなＨＥＲ３結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、加えてこのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。このような発現ベクターは、例えば宿主細胞中での発現によりＨＥＲ３結合ポリペプチドの生産を可能にする場合がある。
【０１００】
様々な典型的な実施形態を参照しながら本発明を説明したが、当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変化を施してもよいし、それらの要素を等価なもので置換してもよいことを理解しているであろう。加えて、それらの本質的な範囲から逸脱することなく特定の状況または分子を本発明の教示に適合させるために多くの改変がなされてもよい。それゆえに、本発明は、本発明の実行を考慮したいずれの特定の実施形態にも限定されないが、本発明は、添付の特許請求の範囲内に含まれる全ての実施形態を含むことが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１Ａ】本発明のＨＥＲ３結合ポリペプチドに含まれるＨＥＲ３結合モチーフの例（配列番号１〜３５）、本発明に係る４９−ｍｅｒのＨＥＲ３結合ポリペプチドの例（配列番号３６〜７０）、本発明に係る５８−ｍｅｒのＨＥＲ３結合ポリペプチドの例（配列番号７１〜１０５）、これまでに公開されたＨＥＲ３特異的なＺ変異体であるＺ０５４１６（配列番号１０６）およびＺ０５４１７（配列番号１０７）、ならびにアルブミン結合ポリペプチドＰＰ０１３（配列番号１０９）のアミノ酸配列の一覧である。
【図１Ｂ】図１Ａの続き。
【図１Ｃ】図１Ｂの続き。
【図１Ｄ】図１Ｃの続き。
【図２】実施例１で説明されるアラニンスキャニング実験のフローサイトメトリー分析からの結果を示す図である。ｘ軸には１つずつアラニンで置換されたＨＥＲ３結合ポリペプチド中の１３残基が示され、ｙ軸にはＨＥＲ３結合に相当するＦＬ−２の蛍光強度と表面発現レベルに相当するＦＬ−６の蛍光強度との比率（ＨＳＡ結合によってモニターされる）が示される。
【図３】スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）で示された親和性成熟ライブラリーＳｃ：ＺＨＥＲ３ＬＩＢ２の、実施例２で説明される蛍光活性化セルソーティングからの密度プロットを示す図である。ｙ軸にはＨＥＲ３結合シグナル（ＦＬ−２）が示され、ｘ軸には表面発現レベル（ＦＬ−６）が示される。ドットプロットは、元の未分類のライブラリーからの細胞、加えてそれぞれ１回目、２回目、３回目、および４回目の選択で単離された細胞を示す。標識付けの方策２（Ｓ２）からの結果だけを示すが、標識付けの方策１（Ｓ１）でも類似の結果が観察された。ＨＥＲ３結合シグナルを比較するために、参照ポリペプチドＺ０５４１７に関するドットプロットを示す。
【図４Ａ】実施例３で説明されているような１０種の親和性成熟したＨＥＲ３結合ポリペプチドＺ０８６９４〜Ｚ０８７０３のバイオセンサーの解離速度のランク付けを示す図である。（Ａ）固定されたヒトＨＥＲ３−Ｆｃ上に注入したＳｃ：ＺＨＥＲ３ＬＩＢ２から単離した精製したＺ変異体のセンサーグラム。Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９のセンサーグラムは、強調表示される（暗い灰色で、示されている通り）。他の親和性成熟した変異体（Ｚ０８６９４〜Ｚ０８６９７およびＺ０８７００〜Ｚ０８７０３）のセンサーグラムは黒色で示される。比較のために、分析に参照ポリペプチドＺ０５４１７を含めた（薄灰色）。
【図４Ｂ】実施例３で説明されているような１０種の親和性成熟したＨＥＲ３結合ポリペプチドＺ０８６９４〜Ｚ０８７０３のバイオセンサーの解離速度のランク付けを示す図である。（Ｂ）Ｚ変異体分子ごとにＺ０５４１７の解離速度と比較してｋｏｆｆ値の倍率変化を概算することによって解離速度のランク付け（ｋｄ＝ｋｏｆｆ）を行った。
【図５Ａ】実施例３で説明されているようなＳＰＲおよびＣＤによって評価した親和性成熟したＨＥＲ３結合ポリペプチドの熱安定性を示す図である。（Ａ）示されている通り、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６装置における固定されたヒトＨＥＲ３−Ｆｃへの９０℃での熱処置の前（黒色）および後（灰色）の５０ｎＭのＺ０８６９８およびＺ０８６９９の注入。
【図５Ｂ】実施例３で説明されているようなＳＰＲおよびＣＤによって評価した親和性成熟したＨＥＲ３結合ポリペプチドの熱安定性を示す図である。（Ｂ）ＨＥＲ３特異的なＺ変異体Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９を２０℃から９０℃に加熱しながら２２１ｎｍで得られた温度可変測定（ＶＴＭ）のスペクトル。
【図５Ｃ】実施例３で説明されているようなＳＰＲおよびＣＤによって評価した親和性成熟したＨＥＲ３結合ポリペプチドの熱安定性を示す図である。（Ｃ）示されている通り、ＶＴＭ前（黒色）および後（灰色）の２０℃で２５０ｎｍから１９５ｎｍの範囲の波長でのＺ０８６９８およびＺ０８６９９のＣＤスペクトル。図からわかるように、ＶＴＭの前および後に記録されたスペクトルは完全に重複する。
【図６】実施例４で説明されているような放射標識したＺ変異体分子の様々なＨＥＲ３発現細胞に対するインビトロでの結合特異性を示す図である。細胞を、１ｎＭの放射標識した（Ａ）Ｚ０８６９８または（Ｂ）Ｚ０８６９９と１時間インキュベートした。受容体の予備的な飽和（ブロック）のために、対照群に０．７μＭの標識されていないＺ変異体分子を添加した。データを、添加された放射活性のうち細胞に結合したもののパーセント（３つの細胞培養皿の平均値）として示し、さらに標準偏差を示す。未ブロックの細胞による取り込みとブロック済み細胞による取り込みとの差は統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【図７】実施例５で説明されているようにして行われた、ＬＮＣａＰ前立腺癌の異種移植片を有するマウスにおける放射標識したＺ０８６９９の生体内分布研究からのデータを示す図である。注射後６時間のデータを、１グラムあたりの注射された活性のパーセントとして示し（ｎ＝４）、さらに標準偏差を示す。
【図８】実施例７で説明されているような２つのＺ変異体Ｚ０８６９８（白四角）およびＺ０８６９９（白丸）でのヘレグリンによって誘導された増殖の阻害からの結果を示す図である。各結合剤の一連の希釈液を固定濃度のＨＲＧ（２００ｐＭ）と混合し、ＭＣＦ−７細胞と共にｒＨＳＡの存在下で５日間インキュベートした。ｙ軸には生細胞数に比例する平均吸光度値±ＳＤが示され、ｘ軸にはＺ変異体の濃度が示される。
【図９】実施例８で説明されるＨＥＲ３リン酸化アッセイからの結果を示す図であり、４ｎＭのＨＥＲ３およびｒＨＳＡの存在下でＺ変異体Ｚ０８６９８（白抜きのバー）およびＺ０８６９９（斜線のバー）の阻害能力が評価された。データは、リン酸化ＨＥＲ３の量に比例する平均吸光度値±ＳＤで示される。点線は、陽性対照（４ｎＭのＨＲＧ）により誘導された応答を示す。破線は、陰性対照（アッセイの媒体）により誘導された応答を示す。
【図１０】実施例１０で説明されているような放射標識したＺ０８６９９変異体（９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−ＨＥＨＥＨＥ−Ｚ０８６９９）を使用した、マウスにおけるＬＳ１７４Ｔ大腸癌の異種移植片でのＨＥＲ３発現のイメージングを示す図である。注射から４時間後にマイクロＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像を獲得した。矢印は、肝臓（Ｌ）、腎臓（Ｋ）、および腫瘍（Ｔ）を指す。
【図１１】１１１Ｉｎ−ＨＥＨＥＨＥ−Ｚ０８６９８−ＮＯＴＡ（左）および１１１Ｉｎ−ＨＥＨＥＨＥ−Ｚ０８６９９−ＮＯＴＡ（右）１μｇ（０．８ＭＢｑ）を注射してから４時間後の、ＨＥＲ３を発現するＢＴ４７４異種移植片を有するマウスのガンマカメラの画像を示す図である。
【０１０２】
ここで本発明をそれに従って実施した非限定的な実験の説明によりさらに例示する。特に他の規定がない限り、全体を通して従来の化学的および分子生物学的方法が使用された。
【０１０３】
〔実施例１〕
新世代のＨＥＲ３結合Ｚ変異体の合理的な設計
この実施例では、以前の親和性成熟ライブラリー（Ｋｒｏｎｑｖｉｓｔら、２０１０、上記）から選択されたＨＥＲ３結合ポリペプチドＺ０５４１６（配列番号１０６）およびＺ０５４１７（配列番号１０７）、加えてこの実施例で説明されるような蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）で検討したＺ０５４１６のアラニンスキャニング分析からの結果に基づいて親和性成熟ライブラリーを構築した。
【０１０４】
材料および方法
ＨＥＲ３およびＨＳＡの標識付け：本明細書ではＨＥＲ３−Ｆｃと称される組換えヒトＨＥＲ３／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３４８−ＲＢ−０５０）のビオチン化を、ビオチン−ＸＸマイクロスケールタンパク質標識付けキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｂ３００１０）を供給元の推奨に従って使用して行った。アミノ酸分析を使用して標識されたタンパク質の濃度を決定した。本明細書ではＨＥＲ３−ＥＣＤと称されるＨＥＲ３（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、カタログ番号１０２０１−Ｈ０８Ｈ）の細胞外ドメインを、ＮａＨＣＯ３（０．１Ｍ、ｐＨ８．５）中のビオチンカルボン酸、スクシンイミジルエステルと１．５時間コンジュゲートした。その後、グリシンを添加して反応を止め、続いてＰＤ  ＭｉｎｉＴｒａｐ  Ｇ−２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２８−９１８０−０７）を製造元の推奨に従って使用して緩衝液をＰＢＳ（１０ｍＭのホスフェート、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．６８ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）に交換した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７スクシンイミジルエステル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ２０００６）を供給元の推奨に従って使用して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−３７８２）を蛍光標識した。過量のフルオロフォアを全て除去するために、タンパク質緩衝液を、ＰＢＳ（１０ｍＭのホスフェート、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．６８ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）または０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８ＮＦ界面活性剤（ＰＢＳＰ；ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号３００８５２３１）が補充されたＰＢＳに交換した。
【０１０５】
アラニンスキャニング変異誘発：Ｋｒｏｎｑｖｉｓｔら（２０１０、上記）で説明されているようにしてこれまでに選択されたＺ変異体Ｚ０５４１６を、それぞれの突然変異体ごとに９、１０、１１、１３、１４、１７、１８、２４、２５、２７、３２、および３５位の残基がアラニンで置き換えられた１２種の突然変異体を構築するためのテンプレートとして使用した。Ｚ０５４１６をコードするベクター（ｐＳＣＺ０５４１６（Ｋｒｏｎｑｖｉｓｔら、２０１０、上記））およびそれぞれのアラニンの置き換えを（コドンＧＣＧを使用して）コードするオリゴヌクレオチドを使用して、従来の部位特異的変異誘発を行った。追加の突然変異体において、Ｚ０５４１６内の２８位における元のアラニン残基を同じ手段でバリンに（コドンＧＴＧを使用して）置換した。遺伝子配列をＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、同じ酵素で消化したブドウ球菌ディスプレイベクターｐＳＣＺ１（Ｋｒｏｎｑｖｉｓｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２１：２４７〜２５５（２００８））にＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を供給元の推奨に従って使用してライゲートした。大腸菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＲ１ΔＭ１５（Ｒｕｅｔｈｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １０：５７６５〜５７７２（１９８２））を、プラスミド構築のための宿主として使用し、ＪＥＴＳＴＡＲキット（Ｇｅｎｏｍｅｄ、カタログ番号２２０  ０２０）を供給元の推奨に従って用いて調製を行った。ＢｉｇＤｙｅサーモサイクルシーケンシング反応およびＡＢＩプリズム３７００装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、各プラスミドにおけるアラニンまたはバリン突然変異の存在を確認した。コンストラクトを、Ｌｏｆｂｌｏｍら（Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １０２：７３６〜７４７（２００７））で説明されているようにしてエレクトロコンピテントＳ．カルノーサスＴＭ３００に形質転換した。
【０１０６】
アラニンおよびバリン突然変異体のＦＡＣＳ分析：アラニンおよびバリン突然変異体を示すブドウ球菌細胞を、酵母抽出物が補充され２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むトリプトンダイズ液体培地（ＴＳＢ−ＹＥ；Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）１０ｍｌに植え付け、３７℃、１５０ｒｐｍでかき混ぜながら一晩増殖させた。一晩の培養物からの１０６個の細胞を、０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８ＮＦ界面活性剤（ＰＢＳＰ；ｐＨ７．４；ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号３００８５２３１）が補充されたＰＢＳ８００μｌで洗浄した。細胞を遠心分離（３５００×ｇ、４℃、６分）によってペレット化し、ビオチン化した５ｎＭのＨＥＲ３−Ｆｃを含有するＰＢＳＰ５０μｌに再懸濁した。穏やかに混合しながら室温で２時間インキュベートすることによって結合の平衡に達した。細胞を氷冷ＰＢＳＰ１８０μｌで洗浄し、続いて暗所で、１５０ｎＭのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲートＨＳＡとストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲートとを含有する氷冷ＰＢＳＰ２００μｌ中で４０分インキュベートした。氷冷ＰＢＳＰ１８０μｌで１回洗浄した後、フローサイトメトリー分析前に細胞を氷冷ＰＢＳＰ２００μｌ中に再懸濁した。ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ  ＳＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）フローサイトメーターを使用して平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。実験は新たに調製した溶液を使用して異なる日に２連で実行された。
【０１０７】
ライブラリーの設計：Ｚ分子中１３の位置を、ＨＥＲ３結合Ｚ変異体Ｚ０５４１６およびＺ０５４１７の配列（Ｋｒｏｎｑｖｉｓｔら、２０１０、上記）に基づくアミノ酸残基に偏らせた新しいライブラリーを設計した。ＨＥＲ３結合Ｚ変異体Ｚ０５４１６およびＺ０５４１７の配列に基づくアミノ酸残基を、分子１つあたりおよそ突然変異３つの平均突然変異頻度が生成されるようにより高い割合で入れることにより、各位置をアミノ酸：Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｖ、Ｗ（ただし全ての位置においてＣ、Ｄ、Ｐは除く）に相当する１７のコドンでランダム化した（表１）。さらに各位置におけるランダム化の頻度を上述したアラニンスキャニング実験からの結果で標準化したところ、結果的に重要な位置における突然変異はより少なく、逆もまた同様であった（表１）。
【０１０８】
制限部位ＸｈｏＩおよびＳａｃＩを両側に有するＨＥＲ３結合ポリペプチドのへリックス１および２中の部分的にランダム化された位置をコードする二本鎖ＤＮＡ（５’−ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＣＧ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＣＧ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＴＴＡ  ＣＣＴ  ＡＡＣ  ＴＴＡ  ＡＣＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＣＡＡ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＮＮＮ  ＡＡＡ  ＴＴＡ  ＮＮＮ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  Ｃ’（配列番号１０８；ランダム化されたコドンは、ＮＮＮと示される）のＳｌｏｎｏＭａｘ（登録商標）ライブラリーをＳｌｏｎｉｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＧｍｂＨ（Ｐｕｃｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に注文した。表１に、新しいライブラリーにおける１３の可変Ｚ位置に関する理論上のアミノ酸残基分布を示す。
【０１０９】
【表１】
0006440618.tif 000002
【０１１０】
ライブラリーの構築およびクローニング：１１回のＰＣＲサイクルでＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、カタログ番号Ｆ５３０Ｌ）を使用してライブラリーを増幅した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８１０６）を供給元の推奨に従って使用して精製した。その後、ライブラリーオリゴヌクレオチドをＸｈｏＩおよびＳａｃＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）制限酵素で消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８７０４）を使用した分取ゲル電気泳動（２％アガロースゲル）によって精製した。Ｓ．カルノーサス発現ベクターｐＳＣＺ１（Ｋｒｏｎｑｖｉｓｔら、２００８、上記）の改変型をＸｈｏＩおよびＳａｃＩ−ＨＦ酵素で制限処理し、上述したようにして分取ゲル電気泳動で精製した。ベクターとインサートとが１：５のモル比になるように、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用してライブラリーのオリゴヌクレオチドをベクターにライゲートし、続いてＤＮＡフラグメントの精製および濃縮のためにフェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行った。次に、ライブラリーをコードするプラスミドをエレクトロポレーションによってエレクトロコンピテント大腸菌ＳＳ３２０（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号６０５１２−１）に形質転換し、ライブラリーの確認のために、ＡＢＩプリズム３７００装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用したＢｉｇＤｙｅサーモサイクルシーケンシングによって個々のクローンを配列決定した。その後ライブラリーのプラスミドをＪＥＴＳＴＡＲマキシキット（Ｇｅｎｏｍｅｄ、カタログ番号２２００２０）を使用して単離し、フェノール−クロロホルム抽出で精製し、イソプロパノール沈殿で濃縮した。最後に、これまでに述べられたようにして（Ｌｏｆｂｌｏｍら、２００７、上記）ライブラリー（以降、Ｓｃ：ＺＨＥＲ３ＬＩＢ２と称する）をエレクトロポレーションでエレクトロコンピテントＳ．カルノーサスに形質転換した。
【０１１１】
ライブラリー品質の分析：Ｓｃ：ＺＨＥＲ３ＬＩＢ２（少なくとも１０倍、すなわち６．７×１０８より多くのライブラリーサイズ）のアリコートを２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＴＳＢ−ＹＥ１００ｍｌに植え付け、３７℃および１５０ｒｐｍで一晩増殖させた。１６時間後、１０７個の細胞を１ｍｌのＰＢＳＰで１回洗浄した。細胞を遠心分離（３５００×ｇ、４℃、６分）によってペレット化し、２２５ｎＭのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲートＨＳＡを含有するＰＢＳＰに再懸濁し、室温で１時間、暗所でインキュベートした。氷冷ＰＢＳＰ１ｍｌで１回洗浄した後、フローサイトメトリー分析前に細胞を氷冷ＰＢＳＰ３００μｌ中に再懸濁した。ＭｏＦｌｏ  Ａｓｔｒｉｏｓセルソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）フローサイトメーターを使用して平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。
【０１１２】
結果
ＨＥＲ３結合ポリペプチドのアラニンおよびバリン突然変異体のＦＡＣＳ分析：公知のＨＥＲ３結合剤Ｚ０５４１６のヒトＨＥＲ３−Ｆｃの細胞外ドメインへの高親和性の結合部位を研究するために、アラニンスキャニング変異誘発を使用した。Ｚ足場中１３の元のランダム化した残基をそれぞれアラニンまたはバリンアミノ酸に置換し、それに続くブドウ球菌宿主への形質転換のために各コンストラクトをブドウ球菌ディスプレイベクターにサブクローニングした。１３種の置き換えを示すブドウ球菌細胞をビオチン化ＨＥＲ３−Ｆｃと共にインキュベートした。次に細胞を洗浄し、Ｚ変異体分子と融合したアルブミン結合タンパク質（ＡＢＰ）に結合させて表面発現レベルと抗原結合シグナルの標準化をモニターするために、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲートおよびＨＳＡと共にインキュベートした。洗浄後、ＨＥＲ３結合に対する各アラニンまたはバリンの置き換えの作用をフローサイトメトリーを使用して分析した。結果から、９、１０、および１７位でのアラニン置換は、ＨＥＲ３−Ｆｃへの親和性を大幅に低下させたことが示されたことから、これらの位置は標的との結合に関与することを示す（図２）。さらに残基２７位でのアラニンの置き換えは、標的に対してわずかに増加した親和性を示したことから、元の残基は標的との結合にそれほど大きい影響を及ぼさないことを示す。
【０１１３】
ライブラリーの構築およびクローニング：新しいライブラリーは、これまでに選択されたＨＥＲ３結合ポリペプチドＺ０５４１６およびＺ０５４１７、加えてアラニンスキャンからの結果に基づいて設計された。設計されたライブラリーの理論上のサイズは、最大３つの突然変異を有するＺ変異体を含む５．６×１０６種のクローンであった。ＤＮＡフラグメントのライブラリーをブドウ球菌発現ベクターにクローニングした。個々のライブラリーメンバーの配列分析から、理論上の設計によるコドンの分布と、フレームシフトの割合が低いこと（１．８％）とが確認された。突然変異頻度は、１３のアミノ酸のうち目標とする３つよりも幾分少なく；クローン１つあたり平均して２つの突然変異が見出された。ライブラリーをＳ．カルノーサスに形質転換して、およそ６．７×１０７種の様々な個々のクローンを生成した。
【０１１４】
ライブラリー品質の分析：成熟ライブラリーＳｃ：ＺＨＥＲ３ＬＩＢ２のＺ変異体が機能的に細菌表面に示されることを確認するために、ライブラリーからのブドウ球菌細胞を蛍光標識したＨＳＡと共にインキュベートし、フローサイトメトリーを使用して分析した。結果から、ライブラリーの約８０％が、細胞表面に機能的なＡＢＰ融合を有する全長タ
ンパク質を発現したことが示された。したがってＨＥＲ３結合ポリペプチドの新しい成熟ライブラリーがうまく構築された。
【０１１５】
〔実施例２〕
ＨＥＲ３結合Ｚ変異体の選択、スクリーニング、および特徴付け
材料および方法
細胞の標識付けおよびＦＡＣＳを使用したブドウ球菌のセルソーティング：実施例１で設計されたライブラリーＳｃ：ＺＨＥＲ３ＬＩＢ２（少なくとも１０倍のライブラリーサイズ、すなわち６．７×１０８種より多くの変異体）のアリコートを１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＴＳＢ−ＹＥに植え付け、３７℃、１５０ｒｐｍで一晩増殖した。次の日、遠心分離（６０００ｒｐｍ、６分、４℃）によって細胞を回収し、ＰＢＳＰで洗浄し、その後実施例１で説明したようにビオチン化したＨＥＲ３−ＥＣＤを添加した。細胞を室温で穏やかに混合しながら結合の平衡に達するまでインキュベートした。氷冷ＰＢＳＰで洗浄し、その後、フィコエリトリンとコンジュゲートさせた５μｇ／ｍｌストレプトアビジン（ＳＡＰＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ２１３８８）および３００ｎＭのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲートＨＳＡと共に、氷上で３０分、暗所でインキュベートした。細胞を再度一回洗浄し、最後に氷冷ＰＢＳＰに再懸濁した。ライブラリーを標識し、ＭｏＦｌｏ（登録商標）Ａｓｔｒｉｏｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）フローサイトメーターを使用して合計４回ソートした。ソート１および２については、５ｎＭのビオチン化ＨＥＲ３−ＥＣＤでライブラリーを標識し、一方でソート３は、１ｎＭ（方策１）または５ｎＭ（方策２）のビオチン化ＨＥＲ３−ＥＣＤのいずれかによる２つの異なる標識付け方策を使用して行われた。方策２では、続いて細胞を５ｎＭの非ビオチン化ＨＥＲ３−ＥＣＤと共に室温で１時間インキュベートし、その後ＳＡＰＥおよびＨＳＡ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識付けすることにより、さらにライブラリーに解離速度選択を行った。ソート４の前に、まず細胞を１ｎＭのビオチン化ＨＥＲ３−ＥＣＤと共にインキュベートし；次いで細胞を洗浄し、その後１ｎＭの非ビオチン化ＨＥＲ３−ＥＣＤを室温で４時間添加することにより、ソート３からの両方の方策に続いて解離速度選択を行った。各回のソーティングでは、およそ１０倍のライブラリーサイズに相当する多数の細胞をフローサイトメーターで分析し、最大の比率の細胞表面発現へのＨＥＲ３結合を示す上位の細胞画分（およそ０．１〜０．５％）を選出し、ＴＳＢ−ＹＥを含むエッペンドルフチューブにソートした。その後、ソートされた細胞をクロラムフェニコール（１μｇ／ｍｌ）が補充されたＴＳＢ−ＹＥに植え付けて一晩増幅させ、引き続き次回のソーティングを行った。最後に、３回目および４回目のソーティング後に単離された細胞を、クロラムフェニコールを含有する寒天プレートに塗り広げた。
【０１１６】
配列決定：３回目および４回目のソーティングの後に個々のブドウ球菌クローンの配列決定を行った：ＡＢＩプリズム３７００装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用したＢｉｇＤｙｅサーモサイクルシーケンシング反応のために、各選択方策からの９６種の個々のコロニーを選別した。
【０１１７】
細胞に対する親和性のランク付け：配列決定結果に基づき選択された４０種の個々のＳｃ：ＺＨＥＲ３ＬＩＢ２クローンをクロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）を含むＴＳＢ−ＹＥに植え付け、３７℃および１５０ｒｐｍで一晩増殖させた。次いで細胞を遠心分離によってペレット化し、ＰＢＳＰで洗浄し、その後０．５ｎＭまたは２ｎＭのビオチン化ＨＥＲ３−ＥＣＤのいずれかで再懸濁した。穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした後、細胞を氷冷ＰＢＳＰで洗浄し、最終濃度５μｇ／ｍｌのＳＡＰＥ、および濃度３００ｎＭのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲートＨＳＡで、氷上で３０分標識した。最後に、細胞を洗浄し、氷冷ＰＢＳＰに再懸濁した。Ｇａｌｌｉｏｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）フローサイトメーターで、ＨＥＲ３結合から
の平均蛍光強度（ＭＦＩ）と細胞表面発現シグナルとの比率に基づき全てのサンプルをランク付けした。加えて、比較のためにＺ変異体Ｚ０５４１７前駆体を分析した。
【０１１８】
結果
改善されたＺ変異体を単離するためのフローサイトメトリーによるソーティング：成熟ＨＥＲ３結合Ｚ変異体を単離するために、ブドウ球菌ライブラリーに４回のＦＡＣＳを行った。選択プロセス全体を通して、ソーティングパラメーターおよびゲートを変化させることによって、さらに標的濃度を減少させるることに加えて後半のソーティング実行時に解離速度選択を取り入れることによっても、選択のストリンジェンシーを改変した。３回目のソーティングの前に、材料および方法の章で説明されているように異なる標識付け方策（方策１および方策２と称する）を使用した２つの異なるトラックに選択スキームを分けた。
【０１１９】
フローサイトメーターでライブラリーの標的結合特性を可視化したところ、各ソーティングの実行でＨＥＲ３陽性クローンが富化されたことが解明された（図３）。加えて、参照として含められたＺ変異体Ｚ０５４１７前駆体と比較して、改善されたＨＥＲ３結合シグナルと共に結合剤の富化をソーティング全体で観察することができた。方策１および２はいずれも類似の結果を示した。３回目および４回目のＦＡＣＳ後、個々の候補の配列決定および特徴付けのために、単離された細胞を半固形培地に塗り広げた。
【０１２０】
配列決定：３回目のソーティング後、合計１３０種の読み取りのなかから７０種の特徴的な配列を同定し、４回目および最後の回の後、１４２種の読み取りのなかから３７種の特徴的な配列を同定した。これらの結果から、３回目と４回目のソーティングの間に個々のＨＥＲ３結合クローンが富化されたことが示された。
【０１２１】
細胞に対する親和性のランク付け：３回目または４回目のソーティングのいずれかからの４０種の特徴的なクローンを、フローサイトメトリーによって、ＨＥＲ３結合シグナルと表面発現レベルとの比率を決定することによって親和性についてランク付けした。ＨＥＲ３結合ポリペプチドＺ０５４１７前駆体と比較して、分析したクローンの大部分がＨＥＲ３に対して改善された親和性を示した。親和性が改善されたこれらの結合剤の５８−ｍｅｒのＺ変異体のアミノ酸配列を、図１に、さらに配列リストに配列番号７１〜１０５として列挙する。これらのＺ変異体の推定のＨＥＲ３結合モチーフを、図１に、さらに配列リストに配列番号１〜３５として列挙する。これらのＺ変異体それぞれの内部で完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９−ｍｅｒのポリペプチドアミノ酸配列を、図１に、さらに配列リストに配列番号３６〜７０として列挙する。
【０１２２】
〔実施例３〕
選択されたＨＥＲ３結合Ｚ変異体の生産および特徴付け
この実施例において、実施例２で説明した細胞に対する親和性のランク付けから上位１０種の候補（Ｚ０８６９４〜Ｚ０８７０３；配列番号７１〜８０；図１を参照）を再度クローニングし、大腸菌細胞抽出物からＣ末端にＨｉｓ６−タグを有するＺ変異体として精製し、安定性およびＨＥＲ３への結合親和性に関してさらに特徴付けた。
【０１２３】
材料および方法
Ｚ変異体のクローニング、タンパク質発現、および精製：実施例２で選択された１０種のＨＥＲ３結合ポリペプチド（Ｚ０８６９４〜Ｚ０８７０３；配列番号７１〜８０）をコードするＤＮＡ配列を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位を導入するプライマーを使用してコロニーからＰＣＲで増幅した。続いて、Ｚ＃＃＃＃＃−ＬＥＨＨＨＨＨＨ様式でＣ末端にＨｉｓ６−タグを有するＺ変異体単量体をコードするためにＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで制限処理した発現ベクターｐＥＴ２６ｂ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）に、Ｚ変異体をクローニングした。Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）大腸菌細胞にプラスミドをヒートショックによって形質転換した。ＴＳＢ−ＹＥ中３７℃で細胞を培養し、ＯＤ６００がおよそ１に達したら、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を最終濃度１ｍＭまで添加することによりタンパク質発現を誘導した。２５℃で一晩インキュベートした後、４０００ｒｐｍ、４℃で８分遠心分離することによって細胞を回収した。細胞ペレットを溶解緩衝液（７Ｍ塩化グアニジニウム、４７ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２．６５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ）中に再懸濁し、３７℃で２時間、１５０ｒｐｍでインキュベートした。その後、１６０００ｒｐｍで２０分、４℃で遠心分離することによって死細胞片を除去した。上清を単離し、変性条件下でＨｉｓＰｕｒ（商標）コバルト樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号８９９６５）を使用したＩＭＡＣによってＺ変異体を精製した。３．５ｋＤａカットオフのＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した透析によって緩衝液をＰＢＳに交換した。ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ６５２０ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製したＺ変異体の分子量および純度を確認した。２８０ｎｍでの吸光度測定によってタンパク質濃度を決定した。
【０１２４】
バイオセンサー分析による解離速度のランク付け：ランニング緩衝液としてＰＢＳ＋０．０５％トウィーン（ＰＢＳＴ）および再生用に１５ｍＭのＮａＯＨを使用したＰｒｏｔｅＯｎＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）で全てのバイオセンサーアッセイを行った。全ての実験において、ブランク表面上の各サンプルからの応答を差し引いて緩衝液の寄与を最小化した。標準的なスルホ−ＮＨＳ／ＥＤＡＣアミン結合化学法を使用して、組換えヒトおよびマウスのＨＥＲ３−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、それぞれカタログ番号３４８−ＲＢ−０５０および４５１８−ＲＢ−０５０）を別々のＧＬＣチップ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）に固定した。リガンドをｐＨ４．５の１０ｍＭのＮａＡｃで最終濃度１０μｇ／ｍｌに希釈し、最終的な固定レベルをおよそ３０００ＲＵとした。２５ｎＭの各Ｚ変異体を固定されたリガンド上に流速１００μｌ／分で注入することにより、精製したポリペプチドに解離速度のランク付けを行った；会合および解離時間をそれぞれ１２０および１８００秒に設定した。各Ｚ変異体を２連で分析し、Ｚ変異体Ｚ０５４１７に関してこれまでに報告されたｋｏｆｆ値（Ｋｒｏｎｑｖｉｓｔら、２０１０、上記）と比較したそれぞれのＨＥＲ３特異的なＺ変異体の解離速度の倍率変化を、解離相に曲線をフィッティングすることにより決定した。
【０１２５】
熱処置の前および後のＨＥＲ３結合のバイオセンサー分析：濃度２５および５０ｎＭのＺ変異体Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９を９０℃での熱処置で１５分処理した。固定されたヒトおよびマウスのＨＥＲ３それぞれの上に、熱処置の前および後の各サンプル４００μｌを流速１００μｌ／分で注入することにより、ＨＥＲ３への結合を評価した。
【０１２６】
円二色性分光分析：Ｚ変異体Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９をＰＢＳで０．２ｍｇ／ｍｌに希釈し、円二色性分析を行った。Ｚ変異体ごとに、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ  ＡＢ）および光路長１ｍｍのセルを使用して２５０〜１９５ｎｍでのＣＤスペクトルを２０℃で記録した。加えて、温度可変測定（ＶＴＭ）を行って融解温度（Ｔｍ）を決定した。ＶＴＭにおいて、温度勾配５℃／分で２０℃から９０℃に温度を上げながら２２０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１２７】
バイオセンサー分析による親和性の決定：Ｚ変異体Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９について平衡解離定数（ＫＤ）を決定した。ＧＬＣセンサーチップ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）に上述したようなヒトＨＥＲ３−Ｆｃを、およそ６５０ＲＵの最終的な固定レベルで固定した。固定されたヒトＨＥＲ３上に、Ｚ０８６９８については７．２から１．８ｎＭの範囲、Ｚ０８６９９については６．８から１．７ｎＭの範囲の各Ｚ変異体の連続２倍希釈液を２連で注入した（タンパク質濃度はアミノ酸分析によって決定した）。流速を５０μｌ／分に設定し、それぞれ３００秒および４時間にわたり会合および解離させた。結合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）、加えてＫＤ値を、ラングミュアの１部位結合モデルにセンサーグラムをフィッティングすることによって決定した。
【０１２８】
結果
タンパク質発現および精製：Ｚ＃＃＃＃＃−Ｈｉｓ６様式の１０種のＺ変異体分子単量体（Ｚ０８６９４〜Ｚ０８７０３）から可溶性生成物が優れた生産レベルで生み出され、生産されたバッチの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により９５％を超えると概算された。ＬＣ／ＭＳ分析によって全ての純粋なＺ変異体分子の正確な分子量を確認した。
【０１２９】
バイオセンサー分析による解離速度のランク付け：上述したようにして発現された１０種のＺ変異体を、ヒトＨＥＲ３−Ｆｃが固定されたセンサーチップ表面上に注入し、３０分間解離させた。全てのＺ変異体分子が類似のＨＥＲ３への結合曲線を生じ、変異体Ｚ０５４１７前駆体と比較して解離速度が大きく低下した（図４Ａ）。単離されたＺ変異体分子の解離速度が極めて遅かったことにより、この段階で絶対解離定数は決定されなかった。その代わりに、結合剤を親和性に関してランク付けするために、これまでに報告されたＺ０５４１７のｋｏｆｆ値（Ｋｒｏｎｑｖｉｓｔら、２０１０、上記）と比較した解離定数の倍率変化を決定した（図４Ｂ）。全ての精製した親和性成熟したＺ変異体は、Ｚ０５４１７と比較して少なくとも８分の１以下の解離速度を有していた。２種の最良の結合剤であるＺ０８６９８およびＺ０８６９９は、Ｚ０５４１７の解離速度よりもおよそ２１倍遅い解離速度に相当する最も低いｋｏｆｆ値を示した。
【０１３０】
熱処置の前および後のＨＥＲ３結合のバイオセンサー分析：９０℃での熱処置の前および後におけるＨＥＲ３とＺ変異体Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９との相互作用を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって評価した。固定されたヒトおよびマウスＨＥＲ３−Ｆｃ上にＺ変異体分子を加熱の前および後で注入し、得られた結合曲線を比較した。図５Ａで示されるように、ヒトＨＥＲ３−ＦｃへのＺ０８６９８およびＺ０８６９９の結合に関するセンサーグラムは熱処置の前と後とで重複することから、Ｚ変異体分子の結合能力は高温処置の影響を受けないことが実証される。分析された両方のＺ変異体濃度（２５ｎＭおよび５０ｎＭ）、加えて加熱の前および後のマウスのＨＥＲ３受容体の結合に関しても同じことが観察された。これらの結果から、例えば、放射性核種などの薬物−コンジュゲートでの標識付けのような標識付け手法は、タンパク質を高温に加熱することが必要な場合が多いために、Ｚ変異体はそのような標識付けに好適であることが示される。
【０１３１】
円二色性分光分析：ＶＴＭから、Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９のＴｍが、それぞれ６４℃および６５℃であることが決定された（図５Ｂ）。したがって、これらのＺ変異体分子は、それぞれ６１℃および５７℃のＴｍ値を有するそれらの前駆体のＺ０５４１６およびＺ０５４１７と比較して改善された熱安定性を有することが実証される。加えて、温度可変測定の前および後に得られた２５０〜１９５ｎｍの範囲の波長でのスペクトルから、Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９はいずれもそれらのアルファヘリックス構造を維持し、加熱の前および後に生じたスペクトルが重複したことからわかるように９０℃に加熱した後でも完全に再フォールディングされることが示される（図５Ｃ）。
【０１３２】
バイオセンサー分析による親和性の決定：バイオセンサー技術を使用して、Ｚ変異体Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９の解離定数、ＫＤを決定した。各結合剤の連続希釈液を固定されたヒトＨＥＲ３−Ｆｃ上に注入し、ＫＤ値を、１部位結合モデルへの非線形回帰によって決定した。得られた親和性は、Ｚ０８６９８については５０ｐＭ、Ｚ０８６９９については２１ｐＭと概算され（表２）、最も強い結合剤Ｚ０８６９９を参照ポリペプチドＺ０５４１７と比較した場合、およそ３０倍親和性が改善されたことを示す。親和性成熟したＺ変異体のＫＤ値の低下は、Ｚ０５４１７と比較して有意に遅い解離速度のためであり、これは順に、実施例２で説明したソーティング手法で選択された解離速度の取り入れの成功をもたらす。
【０１３３】
【表２】
0006440618.tif 000003
【０１３４】
〔実施例４〕
Ｚ変異体のＨＥＲ３特異的結合を検討するインビトロでの細胞アッセイ
この実施例において、Ｃ末端にＨｉｓ６−タグを有するＺ変異体Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９を９９ｍＴｃで放射標識し、それらのインビトロにおける様々な異なる癌細胞株への細胞結合特性を分析した。
【０１３５】
材料および方法
Ｚ変異体の標識付け：他のＺ変異体に関して上述したようにＩｓｏＬｉｎｋキット（Ｃｏｖｉｄｉｅｎ）を使用して、実施例３で説明したようにして生産されたＣ末端にＨｉｓ６−タグを有するＺ変異体Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９をＨｉｓ６−タグのところで９９ｍＴｃで標識した（Ｏｒｌｏｖａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４７：５１２〜５１９（２００６））。簡単に言えば、滅菌０．９％ＮａＣｌを用いてＵｌｔｒａ−ＴｅｃｈｎｅＫｏｗジェネレーター（Ｃｏｖｉｄｉｅｎ）から溶出させた９９ｍＴｃ−過テクネチウム酸溶液５００μｌ（２００〜３２０ＭＢｑ）を、ＩｓｏＬｉｎｋキットのＩｓｏＬｉｎｋカルボニル標識化剤に添加した。この混合物を１００℃で２０分インキュベートした。この混合物４０μｌをそれぞれのＺ変異体を含有する溶液（５０μｇ、ＰＢＳ４０μｌ中およそ６．８ｎｍｏｌ）に移し、５０℃でインキュベートした。インスタント薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ；Ｔｅｃ−コントロールクロマトグラフィーストリップ、Ｂｉｏｄｅｘ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＤＡＲＫ  ＧＲＥＥＮ、カタログ番号１５０−７７１を使用）およびＰＢＳでの溶出によって、６０分インキュベートした後の標識付けの収率を分析した。Ｃｙｃｌｏｎｅ（商標）ストレージ蛍光体系で薄層クロマトグラフィーストリップに沿った放射活性分布を測定し、ＯｐｔｉＱｕａｎｔ（商標）画像分析ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して分析した。予め平衡化したＮＡＰ−５脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して標識されたＺ分子を精製し、ＰＢＳで溶出させた。ＩＴＬＣを使用して各調製物の純度を検討し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでクロス確認した。
【０１３６】
ＨＥＲ３発現細胞への標識されたＺ変異体の結合特異性：ＬＳ１７４Ｔ大腸癌、ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌、ＭＣＧ７乳房癌腫、ＬＮＣａＰ、およびＤＵ−１４５前立腺癌細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ、ＬＧＣ  Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍを介して、Ｂｏｒａｓ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、ＨＥＲ３発現細胞への結合に関する９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−Ｚ０８６９８−Ｈｉｓ６および９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−Ｚ０８６９９−Ｈｉｓ６の特異性を評価した。インビトロでの特異性試験を、これまでに説明された方法に従って行った（Ｏｒｌｏｖａら、（２００６）、上記）。簡単に言えば、放射標識したＺ変異体分子の溶液（１ｎＭで）を６枚のペトリ皿（それぞれおよそ２×１０６個の細胞を含有）に添加した。ブロックするために、標識されていないＺ変異体分子０．７μＭを１５分添加し、その後、放射標識したコンジュゲートで受容体を飽和させた。細胞を、加湿したインキュベーター中、３７℃で１時間インキュベートした。その後、培地を収集し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（緩衝液中０．２５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して細胞を取り外した。３インチのＮａＩ（ＴＩ）検出器（１４８０ＷＩＺＡＲＤ、Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を備えた自動式ガンマカウンターを使用して両方の培地および細胞中の放射活性を測定し、細胞に結合した放射活性の画分を計算した。何らかの有意差を決定するために（ｐ＜０．０５）、ＧｒａｐｈＰａｄプリズム（バージョン４．００、ウィンドウ用ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を使用した対応のない両側ｔ検定によって細胞による取り込みに関するデータを統計学的に検討した。
【０１３７】
結果
Ｚ変異体の標識付け：ＩｓｏＬｉｎｋキットを使用した放射標識により、９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−Ｚ０８６９８−Ｈｉｓ６については４３±６％、９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−Ｚ０８６９９−Ｈｉｓ６については７３±１２％の収率が得られた。使い捨てのＮＡＰ−５カラムで精製した後、両方の標識されたコンジュゲートについて純度は９７％より高かった。
【０１３８】
ＨＥＲ３発現細胞への標識されたＺ変異体の結合特異性：結合特異性試験を行い、ＨＥＲ３発現細胞への９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−Ｚ０８６９８−Ｈｉｓ６および９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−Ｚ０８６９９−Ｈｉｓ６の結合に受容体が介在するのかどうかを検討した。同じだが非標識のＺ変異体分子とプレインキュベートして受容体を飽和させたところ、放射標識したＺ変異体分子の結合が有意に（ｐ＜０．０５）減少し、これは結合が特異的であることを示唆している（図６）。
【０１３９】
〔実施例５〕
ＨＥＲ３結合Ｚ変異体のインビボでの生体内分布研究
この実施例は、マウスのＨＥＲ３と交差反応することが実施例３で実証されたＺ０８６９８およびＺ０８６９９の放射標識したコンジュゲートを使用してマウスで行われたインビボでの研究を説明する。第一に、正常なマウスを使用して、生体内分布特性を研究し、さらに肺、肝臓、胃、小腸、および唾液腺などのＨＥＲ３が通常発現される臓器における２種の放射標識したＺ変異体分子のインビボでの蓄積の特異性を試験した。第二に、前立腺癌の異種移植片を有するヌードマウスで放射標識したＺ０８６９９の生体内分布および腫瘍標的化特性をさらに検討した。
【０１４０】
材料および方法
実施例４で説明したようにして標識された９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−Ｚ０８６９８−Ｈｉｓ６および９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−Ｚ０８６９９−Ｈｉｓ６Ｚ変異体を使用して生体内分布研究を行った。実験動物の保護に関する国内法令に従って、動物実験に関する地域倫理委員会によって承認された動物実験を計画し、実施した。
【０１４１】
正常なＮＭＲＩマウスにおける生体内分布研究：４匹の雌ＮＭＲＩマウス（平均体重２４．５±１．６ｇ）の群で、９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−Ｚ０８６９８−Ｈｉｓ６または９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−Ｚ０８６９９−Ｈｉｓ６（マウス１匹あたりＰＢＳ１００μｌ中６５
ｋＢｑ）を静脈内注射した。標識されていないＺ変異体分子でマウス１匹あたり１μｇ（０．１３ｎｍｏｌ）または１０μｇ（１．３ｎｍｏｌ）に希釈することによって注射したタンパク質用量を調整した。注射（ｐｉ）から４時間後、致死量の麻酔（体重１グラムあたりケタラール−ロンプン２０μｌ；ケタラール（５０ｍｇ／ｍｌ、Ｐｆｉｚｅｒ）；ロンプン（２０ｍｇ／ｍｌ、Ｂａｙｅｒ））の注射により４匹のマウスの群を屠殺し、続いてヘパリン（５０００ＩＥ／ｍｌ、Ｌｅｏ  Ｐｈａｒｍａ）ですすいだシリンジで心臓穿刺と採血を行った。血液、肺、肝臓、脾臓、胃、小腸、腎臓、子宮、唾液腺、筋肉、および骨のサンプルを収集し、重さを量り、それらの放射活性を３インチのＮａＩ（ＴＩ）検出器（１４８０ＷＩＺＡＲＤ、Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を備えた自動式ガンマカウンターを使用して測定した。１００〜１６０ｋｅＶのエネルギー範囲でテクネチウム−９９ｍ放射活性を測定した。データをバックグラウンドに対して補正した。組織での取り込みを、１グラムあたりの注射された放射活性のパーセントとして（％ＩＡ／ｇ）計算した。屠殺体中の放射活性を、全サンプルあたりの％ＩＡとして計算した。何らかの有意差を決定するために（ｐ＜０．０５）、ＧｒａｐｈＰａｄプリズム（バージョン４．００、ウィンドウ用ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）を使用した対応のない両側ｔ検定によって、生体内分布データを統計学的に検討した。
【０１４２】
腫瘍を有するヌードマウスにおける生体内分布研究：ＨＥＲ３を発現する前立腺癌の異種移植片を使用して、９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−Ｚ０８６９９−Ｈｉｓ６のインビボでの腫瘍標的化特性を研究した。５０％マトリゲル中でＬＮＣａＰ細胞（６×１０６）を雄ＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／ｎｕマウスの右後肢に埋め込んだ。埋め込みから４週間後、腫瘍の重さが０．８±０．４ｇの時点で生体内分布実験を行った。動物の平均体重は実験時に２０．１±０．６ｇであった。ＨＥＲ３を発現する臓器中の取り込みを飽和させることが可能かどうかを評価するために、３匹のマウス群で、９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−Ｚ０８６９９−Ｈｉｓ６（マウス１匹あたりＰＢＳ１００μｌ中８５ｋＢｑ）を静脈内注射した。標識されていないＺ０８６９９−Ｈｉｓ６分子でマウス１匹あたり０．１μｇ（０．０１３ｎｍｏｌ）または１μｇ（０．１３ｎｍｏｌ）に希釈することによって、注射されたタンパク質用量を調整した。注射から６時間後に動物を屠殺し、上述したように生体内分布を測定して分析した。
【０１４３】
結果
正常なマウスにおける生体内分布研究：雌ＮＭＲＩマウスで、９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−Ｚ０８６９８−Ｈｉｓ６および９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−Ｚ０８６９９−Ｈｉｓ６の生体内分布を注射から４時間後に検討した。両方のコンジュゲートが、血液および骨や筋肉などの非ＨＥＲ３発現組織から迅速に排除された。ＨＥＲ３発現組織（肺、肝臓、胃、小腸、および唾液腺）において、より多くのタンパク質用量（１０μｇ、１．３ｎｍｏｌ）が注射されたとき、両方のコンジュゲートの取り込み（％ＩＡ／ｇ）はより低かった。この結果から取り込みの飽和可能性が示され、これはＨＥＲ３特異的な標的化の強い裏付けである。
【０１４４】
腫瘍を有するマウスにおける生体内分布研究：図７に、ＬＮＣａＰ異種移植片を有するヌードマウスにおける９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−Ｚ０８６９９−Ｈｉｓ６の生体内分布データを示す。正常なＮＭＲＩマウスに関するデータと一致して、タンパク質用量の増加は肝臓、胃、および唾液腺における取り込みの低下を引き起こした。より多くのタンパク質用量では腫瘍での取り込みが増加する傾向がみられたが、この増加は統計学的に有意ではなかった（それぞれ０．１μｇおよび１μｇの用量で注射した場合、１．９±０．８対２．９±０．８％ＩＡ／ｇ）。タンパク質用量を増加させたことにより、より有意に高い腫瘍対血液、腫瘍対唾液腺、腫瘍対肝臓、および腫瘍対骨の比率が得られた。総合すると、腫瘍を有するマウスにおける生体内分布研究の結果から、例えばＨＥＲ３特異的な標的化に放射標識したＺ０８６９９を使用して前立腺癌におけるＨＥＲ３発現のイメージングが実行可能であることが示唆される。したがって、例えばＺ０５４１６およびＺ０５４１７などのこれまでに単離されたＨＥＲ３特異的なＺ変異体は、ＨＥＲ３への親和性はナノモル未満であるにもかかわらず、他の組織と比較して腫瘍細胞におけるＨＥＲ３発現が比較的低いためにイメージングに十分なコントラストが得られないと考えられるが、本明細書で開示された新世代の高親和性Ｚ変異体の使用は、それに勝る利点をもたらすはずである。
【０１４５】
〔実施例６〕
アルブミン結合ドメインと融合した選択されたＨＥＲ３結合Ｚ変異体の生産
この実施例において、実施例２で説明した細胞に対する親和性のランク付けから２種のＨＥＲ３結合Ｚ変異体（Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９）と、２種の参照Ｚ変異体Ｚ０５４１６およびＺ０５４１７とを、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０９）との融合体として再度クローニングし、大腸菌細胞抽出物から精製した。
【０１４６】
材料および方法
Ｚ変異体のサブクローニング：これは、実質的にＷＯ２００９／０７７１７５で説明される他のＺ変異体に関して説明されている通りに行われた。Ｚ変異体単量体をｐＡＹ０１４４９ベクターから増幅した。標準的な分子生物学的技術を使用して、Ｎ末端および／またはＣ末端の融合を用いたＺ変異体分子を構築するためのサブクローニング方策を適用した。様々なプライマー対を使用してＰＣＲを行い、得られた遺伝子フラグメントを精製し、リガーゼ緩衝液中でハイブリダイズした。ハイブリダイズした遺伝子フラグメントをｐＡＹ０３３６２ベクターにサブクローニングし、Ｃ末端ＰＰ０１３融合体を得た。ＨＥＲ３結合Ｚ変異体を単量体としてサブクローニングし、発現ベクターによってコードされた正確なコンストラクトはＭＧＳＳＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤＳＳ−［ＰＰ０１３］であった。
【０１４７】
培養および精製：大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）をそれぞれのＺ変異体の単量体の遺伝子フラグメントを含有するプラスミドで形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンが補充されたＴＳＢ＋ＹＥ培地（酵母抽出物を含むトリプトンダイズ液体培地）１ｌ中３７℃で培養した。ＯＤ６００＝１で、最終濃度０．１７ｍＭのＩＰＴＧを添加して、タンパク質発現を誘導し、培養物を３７℃でさらに５時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって回収した。Ｚ変異体を含む細胞ペレットを、７Ｕ／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号１．０１６５４．００１）が添加されたＴＳＴ緩衝液（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％、トウィーン２０、ｐＨ８．０）中に再懸濁し、超音波で破壊した。遠心分離（＞２０分、２５０００ｇ、４℃）によって溶解産物を透明化し、ＴＳＴ緩衝液で前もって平衡化された充填済み親和性アガロース１ｍｌにロードした。カラム体積（ＣＶ）の５倍のＴＳＴ緩衝液、続いて３ＣＶの５ｍＭのＮＨ４Ａｃ（ｐＨ５．５）で洗浄した後、結合したＺ変異体を２ＣＶの０．１ＭのＨＡｃで溶出させた。各Ｚ変異体を、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７−０８５１−０１）でＰＢＳ（２．６８ｍＭのＫＣｌ、０．４７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）に移した。ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計を使用して、さらにそれぞれのタンパク質の吸光係数を使用して２８０ｎｍで吸光度を測定することによってタンパク質濃度を決定した。最終産物の純度をクーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００ＬＣ／ＭＳＤ  システム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でのＨＰＬＣ−ＭＳ分析を使用して精製した各タンパク質変異体の同一性を決定した。
【０１４８】
結果
Ｚ変異体のサブクローニング：発現ベクターｐＡＹ０３３６２でサブクローニングするためのＺ変異体を選んだ。クローニングにより、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３と融合した４種の単量体、Ｚ０５４１６、Ｚ０５４１７、Ｚ０８６９８、およびＺ０８６９９のうち１種を含む４種の融合タンパク質を得た。
【０１４９】
培養および精製：単量体として構築されＣ末端にＡＢＤを有する２種の本発明のＺ変異体Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９は、大腸菌でうまく発現された。２ｇの細菌ペレットから親和性によって精製したＺ変異体の量を、分光光度法により２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定したところ、それぞれのＺ変異体で３ｍｇから６ｍｇの範囲であった。生産されたＺ変異体の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で検討したところ９５％を超えると推定された。各タンパク質変異体の正確な分子量をＨＰＬＣ−ＭＳによって確かめた。
【０１５０】
〔実施例７〕
インビトロの増殖アッセイにおけるＨＥＲ３結合Ｚ変異体の阻害能力の評価
この実施例において、実施例６で説明されているようにＣ末端でＰＰ０１３に融合したＺ変異体Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９を、ＭＣＦ−７細胞を使用したインビトロアッセイでヘレグリンによって誘導された増殖を阻害するそれらの能力について試験した。
【０１５１】
材料および方法
全て実施例６で説明したようにして生産された、Ｃ末端にアルブミン結合融合パートナーを有するＺ変異体Ｚ０８６９８、Ｚ０８６９９、Ｚ０５４１６、およびＺ０５４１７を試験した。推奨通りに、完全培地（ピルビン酸ナトリウム（Ｌｏｎｚａ）、非必須アミノ酸（Ｌｏｎｚａ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）、および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＬ−グルタミン含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｏｎｚａ））中で、細胞株ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２）を増殖させた。実験日に、細胞を補充なしのＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄し、アッセイ用培地（ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン、９μＭ組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）＋２％透析済みＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＬ−グルタミン含有ＲＰＭＩ１６４０培地）に再懸濁した。Ｚ変異体をアッセイ用培地中の２００ｐＭのＨＲＧ（ＮＲＧ１−β１／ＨＲＧ１−β１ＥＧＦドメイン、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と混合することによって、ヘレグリン（ＨＲＧ）によって誘導された増殖をブロックするＺ変異体の能力を分析した。固定濃度のＨＲＧ（２００ｐＭ）を含む連続５倍希釈液で分子を滴定した。体積１００μｌの９６ウェルの細胞培養プレートで滴定を行った。ウェル１つ（１００μｌ）あたり１５００個の細胞を添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。インキュベート後、細胞計数キット−８（ＣＣＫ−８、Ｆｌｕｋａ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して各ウェル中の生細胞数の決定を行った。ＲＰＭＩ１６４０培地で２倍希釈したＣＣＫ−８細胞増殖試薬をウェルあたり１９μｌ添加し、４時間後にマイクロプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ３、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。４パラメーターの用量作用曲線に対する非線形回帰によって細胞成長のデータを検討し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ウィンドウ用バージョン５．０１、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を決定した。
【０１５２】
結果
ＨＲＧによって誘導された増殖アッセイにおける評価：図８に結果を示す。ＨＲＧによって誘導された増殖アッセイで、アルブミン結合ドメインと融合したＺ変異体Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９の半最大阻害濃度、ＩＣ５０を決定した。各結合剤の連続希釈液を固定濃度のＨＲＧと混合し、ＭＣＦ−７細胞と共にｒＨＳＡの存在下で５日間インキュベートした。４パラメーターの用量作用曲線に対する非線形回帰によってＩＣ５０値を決定した。Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９について得られたＩＣ５０値はそれぞれ０．４ｎＭおよび０．６ｎＭであり、これは、参照ポリペプチドＺ０５４１７と比較してインビトロでのブロック能力がそれぞれおよそ１００倍および７０倍に改善されたことを示す。
【０１５３】
〔実施例８〕
ＨＥＲ３リン酸化アッセイにおいてＨＥＲ３結合Ｚ変異体の阻害能力を検討するインビトロの細胞アッセイ
この実施例において、生産されたＣ末端のアルブミン結合ドメインを有するＺ変異体Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９を、ＨＥＲ３リン酸化を阻害するそれらの能力について試験した。
【０１５４】
材料および方法
実施例６で説明されているようにしてＣ末端にＰＰ０１３融合パートナーを有するＺ変異体Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９を生産し、試験した。推奨通りに完全培地で細胞株ＭＣＦ−７を増殖させた。
【０１５５】
細胞溶解産物の生産：６０×１５ｍｍの細胞培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に細胞１×１０６個／５ｍｌの濃度でＭＣＦ−７細胞を播種し、そのまま完全培地中で２４時間成長させた。実験開始４時間前に培地をアッセイ用培地に交換した。Ｚ変異体Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９を、固定濃度のＨＲＧ（４ｎＭ）を含むアッセイ用培地で４、４０、および４００ｎＭに希釈し、細胞と共に３７℃で１０分間インキュベートした。細胞を氷上で維持し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。１ｍＭの活性化オルトバナジウム酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含む氷冷ＰＢＳ２ｍｌ中で、セルスクレーパーで細胞をほぐし、チューブに移し、予め冷却した（４℃）遠心分離機で、４００ｇで３分遠心分離した。上清を捨て、溶解緩衝液（１％ＮＰ−４０、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセリン、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭの活性化オルトバナジウム酸ナトリウム）を細胞１０６個あたり１００μｌ添加した。４℃で３０分インキュベートした後、エッペンドルフチューブ中でサンプルを、予め冷却した（４℃）遠心分離機で１３０００×ｇで１５分遠心分離した。各チューブからの上清を収集し、ホスホ−ＨＥＲ３ＥＬＩＳＡで以下のように使用した。
【０１５６】
ホスホ−ＨＥＲ３  ＥＬＩＳＡ：リン酸化ＨＥＲ３を検出するためのヒトホスホ−ＥｒｂＢ３  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を製造元の説明書に従って使用した。９６ウェルの半分の領域のプレートを、ＰＢＳ中の４μｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ３抗体で、室温で一晩覆った。プレートを洗浄し、ＰＢＳ中１％ＢＳＡで、室温で２時間ブロックした。洗浄後、「希釈剤番号１２」（１％ＮＰ−４０、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセリン、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭの活性化オルトバナジウム酸ナトリウム）で１：２０に希釈した細胞溶解産物５０μｌを各ウェルに添加した。プレートを２時間インキュベートし、洗浄し、「希釈剤番号１４」（２０ｍＭのトリス、１３７ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％トウィーン２０、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．２〜７．４）で１：２０００に希釈したＨＲＰで標識した抗ホスホ−チロシン抗体と共に２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、基質を添加した（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。約２０分後、２ＭのＨ２ＳＯ４で反応を止め、マイクロプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ３、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を４５０および５７０ｎｍで使用してプレートを読んだ。
【０１５７】
結果
ＨＥＲ３リン酸化アッセイ：図９に結果を示す。ＭＣＦ−７細胞におけるＨＲＧによって誘導されたＨＥＲ３のリン酸化を阻害する能力を決定した。各結合剤の連続希釈液を固定濃度のＨＲＧと混合し、ＭＣＦ−７細胞と共にｒＨＳＡの存在下で１０分間インキュベートした。４００ｎＭの濃度で、Ｚ変異体Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９は、ＨＥＲ３のリン酸化を８９％阻害した。この作用はＺ変異体の濃度に応じて減少し、４０ｎＭで、Ｚ０８６９８およびＺ０８６９９は、ＨＥＲ３リン酸化をそれぞれ６７％および５１％阻害した。４ｎＭで作用はなくなった。これらの結果は、インビトロでのブロック能力が、リン酸化で検討した場合、参照ポリペプチドＺ０５４１７と比較しておよそ１０倍改善されたことを示す。
【０１５８】
〔実施例９〕
ＨＥＲ３結合Ｚ変異体二量体の阻害能力の評価
この実施例では、ＭＣＦ−７細胞を使用したインビトロのアッセイにおいて、Ｚ−ＰＰ０１３−Ｚの様式でアルブミン結合ＰＰ０１３と融合したＺ０８６９８を含むＺ変異体二量体を、ヘレグリンによって誘導されたシグナル伝達を阻害するそれらの能力に関して試験した。Ｚとアルブミン結合部分との間にそれぞれＧＧＧＧＳの１回または４回の反復を含む２種の異なるリンカーの長さ、すなわちＺ０８６９８−Ｇ４Ｓ−ＰＰ０１３−Ｇ４Ｓ−Ｚ０８６９８およびＺ０８６９８−（Ｇ４Ｓ）４−ＰＰ０１３−（Ｇ４Ｓ）４−Ｚ０８６９８を検討した。
【０１５９】
材料および方法
クローニングおよび生産：実質的に実施例６で説明した通りにして、さらにＮｄｅｌおよびＡｓｃＩ制限部位を取り入れるプライマーを使用した標準的な分子生物学的技術を適用して、二量体Ｚ変異体のサブクローニングを行った。ＨＥＲ３結合Ｚ変異体をＰＰ０１３と融合した二量体としてサブクローニングしたところ、発現ベクターによってコードされた正確なコンストラクトは、それぞれＭ−［Ｚ０８６９８］−ＧＡＰ（ＧＧＧＧＳ）ＴＳ−［ＰＰ０１３］−ＧＴ（ＧＧＧＧＳ）ＰＲ−［Ｚ０８６９８］、およびＭ−［Ｚ０８６９８］−ＧＡＰ（ＧＧＧＧＳ）４ＴＳ−［ＰＰ０１３］−ＧＴ（ＧＧＧＧＳ）４ＰＲ−［Ｚ０８６９８］であった。大腸菌でこのタンパク質変異体を発現させ、実質的に実施例６で説明した通りに、ただしアフィニティークロマトグラフィー工程の後、且つ最後のＰＢＳへの緩衝液交換の前に分取逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）精製工程を追加することにより精製した。
【０１６０】
インビトロでの細胞アッセイ：ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２）をトリプシン処理し、ＥｎＳｐｉｒｅ−ＬＦＣマイクロプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６０５５４０８）でウェルあたり細胞２５０００個播種し、そのまま完全培地中で、３７℃で２０時間成長させた。実験日に、細胞をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ９２６９）で１回洗浄した。ＨＢＳＳをウェルあたり１００μｌで添加し、ＥｎＳｐｉｒｅ装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）内でプレートを周囲温度で１．５時間インキュベートして、これをアッセイの読み出しに使用した。ヘレグリンによって誘導されたシグナル伝達をブロックするＺ０８６９８−Ｇ４Ｓ−ＰＰ０１３−Ｇ４Ｓ−Ｚ０８６９８およびＺ０８６９８−（Ｇ４Ｓ）４−ＰＰ０１３−（Ｇ４Ｓ）４−Ｚ０８６９８それぞれの能力を、これらのＺ−ＰＰ０１３−Ｚ変異体をＨＢＳＳ中１ｎＭのＨＲＧと混合することによって分析した。比較のために、Ｚ０８６９８−ＰＰ０１３単量体を含めた。１３０μｌ／ウェルの最後のアッセイ体積で、固定濃度のＨＲＧ（１ｎＭ）を含む連続５倍希釈液で分子を滴定した。刺激を加えたときの動質量の再分布をＥｎＳｐｉｒｅ装置で６０秒ごとに１時間記録した。用量作用曲線から半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を決定した。
【０１６１】
結果
Ｚ０８６９８−Ｇ４Ｓ−ＰＰ０１３−Ｇ４Ｓ−Ｚ０８６９８、Ｚ０８６９８−（Ｇ４Ｓ）４−ＰＰ０１３−（Ｇ４Ｓ）４−Ｚ０８６９８、およびＺ０８６９８−ＰＰ０１３について得られたＩＣ５０値は、それぞれ０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、および１ｎＭであった。したがって、ヘレグリンによって誘導されたシグナル伝達を阻害する能力は、Ｚ−ＰＰ０１３−Ｚ様式の二量体コンストラクトによって増加した。Ｚとアルブミン結合部分との間のリンカー長さの作用はそれほど重要ではなかった。Ｚ０８６９８−ＰＰ０１３変異体（１ｎＭ）のＩＣ５０値は、実施例７で説明される増殖アッセイで得られた結果と一致し、参照ポリペプチドＺ０５４１７−ＰＰ０１３より優れていることが示された。
【０１６２】
〔実施例１０〕
９９ｍＴｃ（ＣＯ）３で標識したＺ変異体を使用したマウスにおけるＨＥＲ３を発現する異種移植片のイメージング
この実施例において、放射標識されたＨＥＲ３特異的Ｚ変異体をイメージングへ使用することについての実行可能性を調査した。Ｎ末端にＨＥＨＥＨＥ−タグを有するＺ０８６９９を９９ｍＴｃ（ＣＯ）３で標識し、ＬＳ１７４Ｔ大腸癌の異種移植片を有するマウスに注射した。注射から４時間後に腫瘍をマイクロＳＰＥＣＴ／ＣＴで可視化した。
【０１６３】
材料および方法
Ｚ変異体のクローニング、生産、および標識付け：Ｚ０８６９９をコードするＤＮＡを、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位とＮ末端ＨＥＨＥＨＥ−タグのコドンとを取り入れるプライマーを使用したＰＣＲで増幅した。実質的に実施例３で説明したようにして、ただしＩＭＡＣ精製後に分取逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）精製工程を追加して、ＨＥＨＥＨＥ−Ｚ０８６９９のサブクローニングおよび生産を行った。ヒスチジル−グルタミル−ヒスチジル−グルタミル−ヒスチジル−グルタミル−（ＨＥＨＥＨＥ）−タグは、より好都合な生体内分布プロファイルを有し、特に肝臓での取り込みが少ないにもかかわらずＩＭＡＣ精製が可能なことから、これをＨｉｓ６タグの代わりに選択した（Ｔｏｌｍａｃｈｅｖら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２１：２０１３〜２０２２（２０１０））。ＩｓｏＬｉｎｋキットを使用した９９ｍＴｃ（ＣＯ）３での標識付けを実施例４で説明したようにして行った。
【０１６４】
インビボでのイメージング：皮下にＬＳ１７４Ｔ大腸癌の異種移植片を有するＢａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスに９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−ＨＥＨＥＨＥ−Ｚ０８６９９（１．６ＭＢｑ／１μｇ）を注射した。注射から４時間後、動物を安楽死させ、画像品質を改善するために死後に膀胱を切り出した。次いでマイクロＳＰＥＣＴ（ＦＯＶ：８ｃｍ、７５Ａ１０コリメーター、２００〜２５０ｋｅＶにわたる捕捉、３２回の投影）で静止状態の全身の断層撮影試験を行った。解剖学的な相関に関して、動物をＣＴで試験した。
【０１６５】
結果
図１０に、腫瘍を有するマウス（ＬＳ１７４Ｔ大腸癌の異種移植片）に９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−ＨＥＨＥＨＥ−Ｚ０８６９９を投与してから４時間後に獲得したマイクロＳＰＥＣＴ画像を示す。腫瘍が明確に可視化された。腎臓および肝臓における放射活性の蓄積もみられる。
【０１６６】
〔実施例１１〕
１１１Ｉｎで標識したＺ変異体を使用したマウスにおけるＨＥＲ３を発現する異種移植片のイメージング
この実施例において、放射標識したＨＥＲ３特異的Ｚ変異体をイメージングへ使用することについての実行可能性をさらに調査した。ＳＰＥＣＴまたはＰＥＴイメージングに好適な多数の放射性核種と安定な複合体を形成するＮＯＴＡキレート剤を、特徴的なＣ末端システインを介してＨＥＨＥＨＥ−Ｚ０８６９８およびＨＥＨＥＨＥ−Ｚ０８６９９にコンジュゲートした。分子を１１１Ｉｎで標識し、ＢＴ４７４乳房癌腫の異種移植片を有するマウスに注射した。注射から４時間後、腫瘍をＳＰＥＣＴガンマカメライメージングで可視化した。
【０１６７】
材料および方法
ＮＯＴＡが結合したＺ変異体のクローニングおよび生産：それぞれＣ末端にシステイン残基を有するＨＥＨＥＨＥ−Ｚ０８６９８、およびＨＥＨＥＨＥ−Ｚ０８６９９を、実質的に実施例３で説明したようにしてクローニングして発現させた。回収した細胞を１×ＰＢＳ中に再懸濁し、フレンチプレスの使用によって破壊した。サンプルを最大７０℃で熱処理し、１０分インキュベートし、続いて氷上で１０分冷却した。溶解産物を遠心分離によって（１０分、３００００ｇ、４℃）透明化した。Ｚ変異体の２０ｍＭシステインをＤＴＴで、４０℃で３０分還元した。ＰＤ−１０カラムで緩衝液を２０ｍＭの酢酸ＮＨ４、ｐＨ５．５に交換することにより過量のＤＴＴを除去した。モル濃度が３倍過量のキレート剤であるマレイミド−ＮＯＴＡ（ＣｈｅＭａｔｅｃｈ、カタログ番号Ｃ１０１）を用いて、ＮＯＴＡとのコンジュゲーションを行った。この混合物を４０℃で４０分インキュベートした。コンジュゲートしていないキレート剤からの精製をＲＰ−ＨＰＬＣで行った。各ＮＯＴＡが結合したＺ変異体の正確な分子量をＨＰＬＣ−ＭＳで確かめ、ＣＤ測定を行って保存された構造的な完全性を確認した。
【０１６８】
１１１Ｉｎでの標識：ＨＥＨＥＨＥ−Ｚ０８６９８−ＮＯＴＡまたはＨＥＨＥＨＥ−Ｚ０８６９９−ＮＯＴＡ（４０μｇ、６ｎｍｏｌ）ｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸ＮＨ４（１００μｌ）を１１１Ｉｎ−塩化物溶液（４０ＭＢｑ）５４μｌと混合した。この混合物を８５℃で１時間インキュベートした。標識付けの効率を、０．２Ｍクエン酸、ｐＨ２．０で溶出させたＩＴＬＣで分析した（実施例４で説明したようにして）。このコンジュゲートを、使い捨てのＮＡＰ−５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造元の説明書に従って使用して精製した。
【０１６９】
インビボでのイメージング：腫瘍を有するマウス（ＢＴ４７４乳房癌腫の異種移植片）に１１１Ｉｎ−ＨＥＨＥＨＥ−Ｚ０８６９８−ＮＯＴＡまたは１１１Ｉｎ−ＨＥＨＥＨＥ−Ｚ０８６９９−ＮＯＴＡ１μｇ（０．８ＭＢｑ）を注射した。４時間のｐｉで、動物を安楽死させ、画像品質を改善するために死後に膀胱を切り出した。中エネルギー汎用型（ＭＥＧＰ）コリメーターを備えたＧＥＩｎｆｉｎｉａガンマカメラを使用して静止状態の平面イメージングを行った。２５６×２５６マトリックスにおいて３のズーム率で静止状態の画像（２０分）を得た。
【０１７０】
結果
各ＮＯＴＡがコンジュゲートしたＺ変異体の正確な分子量をＨＰＬＣ−ＭＳで確かめ、純度が９５％を超えることが見出された。最大９０℃に加熱した後でも、保存されたヘリックス構造、加えて可逆的なフォールディングがＣＤ測定から確認された。１１１Ｉｎ−ＨＥＨＥＨＥ−Ｚ０８６９８−ＮＯＴＡおよび１１１Ｉｎ−ＨＥＨＥＨＥ−Ｚ０８６９９−ＮＯＴＡの放射性化学物質の収率はそれぞれ９７％および９６％であった。
【０１７１】
図１１に、１１１Ｉｎ−ＨＥＨＥＨＥ−Ｚ０８６９８−ＮＯＴＡおよび１１１Ｉｎ−ＨＥＨＥＨＥ−Ｚ０８６９９−ＮＯＴＡをそれぞれを注射してから４時間後の腫瘍を有するマウスのガンマ−カメラ画像を示す。腫瘍が明確に可視化され、画像から、血液と、肝臓および腎臓を除く他の臓器とでバックグラウンドがほとんどなかったことから、高い腎クリアランスが示された。１１１Ｉｎ−ＨＥＨＥＨＥ−Ｚ０８６９８−ＮＯＴＡの血液クリアランスがより優れており、より低いバックグラウンドの放射活性がもたらされた。
【０１７２】
結論として、実施例１０および１１で開示された結果から、悪性腫瘍におけるＨＥＲ３発現の放射性核種のイメージングは、腫瘍における低いＨＥＲ３発現および正常な組織でのバックグラウンド発現にもかかわらず、本明細書で開示されたＨＥＲ３特異的高親和性Ｚ変異体を使用して実行可能であることが示される。改善されたイメージングのコントラストは、標識付けの化学的性質を最適化することやトレーサーの投与により得ることができる。
【０１７３】
〔実施例１２〕
インビボでのＨＥＲ３結合Ｚ変異体の投与による腫瘍成長の阻害
本明細書で開示されるようなＨＥＲ３結合Ｚ変異体がインビボで腫瘍成長を阻害することを示すために、異種移植されたマウスにＺ変異体を投与して、腫瘍成長をモニターした。このようなＨＥＲ３を発現する腫瘍モデルのうち有用なものは、ＡＣＨＮ異種移植片モデルである。
【０１７４】
異種移植片実験用の細胞を得るために、インビトロで、１０％ウシ胎児血清を含有するＭＥＭ培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号１２−６１１）中でＡＣＨＮ細胞（ＣＲＬ−１６１１、ＬＧＣ標準）を培養した。ＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）の右脇腹に５〜１０×１０６個のＡＣＨＮ細胞を皮下注射することによってＡＣＨＮ腫瘍を確立した。ノギスを使用して腫瘍体積を測定し、腫瘍の長さと幅を週３回測定した。長さ×幅の二乗×０．４４として腫瘍体積を計算した。腫瘍体積がおよそ２００ｍｍ３に達したら、一般的に容認された原理に従って研究を開始した。マウスを類似の腫瘍サイズの分布を有する群にランダム化した。
【０１７５】
ＨＥＲ３結合Ｚ変異体で腫瘍成長を阻害するために、マウス（１０匹／群）に２０、２または０．２ｍｇ／ｋｇの内毒素非含有のＺ変異体または媒体対照（ＰＢＳ緩衝液）を静脈内注射した。注射を３週間にわたり週３回繰り返した。ノギスを使用して腫瘍体積を週３回測定することにより治療的作用を追跡し、各マウスの体重も同時に記録した。研究の最後における処置群と媒体群との平均腫瘍体積の差をスチューデントのｔ検定により検討した。
【０１７６】
上記の実験結果から、本明細書で開示されたＨＥＲ３結合Ｚ変異体による用量依存性の腫瘍成長阻害が示されることが予想された。
【０１７７】
項目分けされた実施形態の一覧
１．ＨＥＲ３結合モチーフ（ＢＭ）を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドであって、該モチーフは：
ｉ）ＥＫＹＸ４ＡＹＸ７ＥＩＷ  Ｘ１１ＬＰＮＬＴＸ１７Ｘ１８ＱＸ２０  ＡＡＦＩＧＸ２６ＬＸ２８Ｄ
（式中、互いに独立して、
Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＴから選択され；
Ｘ７は、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ１１は、ＥおよびＱから選択され；
Ｘ１７は、Ｋ、Ｎ、Ｒ、およびＶから選択され；
Ｘ１８は、Ｆ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｙ、およびＷから選択され；
Ｘ２０は、ＡおよびＫから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ２８は、ＥおよびＱから選択される）；および
ｉｉ）ｉ）で定義された配列と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列からなる前記ＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１７８】
２．配列ｉ）中、互いに独立して、
Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴから選択され；
Ｘ７は、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ１１は、Ｑであり；
Ｘ１７は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ１８は、Ｍ、Ｙ、およびＷから選択され；
Ｘ２０は、Ｋであり；
Ｘ２６は、Ｋであり；
Ｘ２８は、Ｑである
項目１に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１７９】
３．配列ｉ）中のＸ４は、Ａ、Ｅ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴから選択される、項目１に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１８０】
４．配列ｉ）中のＸ４は、ＮおよびＱから選択される、前記項目のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１８１】
５．配列ｉ）中のＸ４は、Ｎである、項目４に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１８２】
６．配列ｉ）中のＸ４は、Ｑである、項目４に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１８３】
７．配列ｉ）中のＸ１１は、Ｑである、前記項目のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１８４】
８．配列ｉ）中のＸ１７は、Ｋ、Ｎ、およびＲから選択され、例えばＫおよびＲから選択される、前記項目のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１８５】
９．配列ｉ）中のＸ１７は、Ｋである、項目８に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１８６】
１０．配列ｉ）中のＸ１７は、Ｒである、項目８に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１８７】
１１．配列ｉ）中のＸ１８は、Ｍ、Ｙ、およびＷから選択される、前記項目のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１８８】
１２．配列ｉ）中のＸ１８は、ＹおよびＷから選択される、項目１１に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１８９】
１３．配列ｉ）中のＸ１８は、Ｙである、項目１２に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１９０】
１４．配列ｉ）中のＸ１８は、Ｗである、項目１２に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１９１】
１５．配列ｉ）中のＸ１８は、Ｍである、項目１１に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１９２】
１６．配列ｉ）中のＸ１７Ｘ１８は、ＫＷ、ＫＹ、ＫＭ、およびＲＹから選択される、前記項目のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１９３】
１７．配列ｉ）中のＸ２０は、Ｋである、前記項目のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１９４】
１８．配列ｉ）中のＸ２６は、Ｋである、前記項目のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１９５】
１９．配列ｉ）中のＸ２８は、Ｑである、前記項目のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１９６】
２０．配列ｉ）は、以下の４つの条件Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶのうち少なくとも２つを満たす、前記項目のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド：
Ｉ）Ｘ１１は、Ｑであり；
ＩＩ）Ｘ１７Ｘ１８は、ＫＷ、ＫＹ、ＫＭ、およびＲＹから選択され；
ＩＩＩ）Ｘ２０は、Ｋであり；
ＩＶ）Ｘ２８は、Ｑである。
【０１９７】
２１．前記４つの条件Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶのうち少なくとも３つを満たす、項目２０に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１９８】
２２．前記４つの条件Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの全てを満たす、項目２１に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０１９９】
２３．配列ｉ）は、配列番号１〜３５のいずれか１つから選択される、前記項目のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２００】
２４．配列ｉ）は、配列番号１〜１０のいずれか１つから選択される、項目２３に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２０１】
２５．配列ｉ）は、配列番号１および配列番号２から選択される、項目２４に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２０２】
２６．配列ｉ）は、配列番号２である、項目２５に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２０３】
２７．配列ｉ）は、配列番号１である、項目２５に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２０４】
２８．前記ＨＥＲ３結合モチーフは、３ヘリックスバンドルタンパク質のドメインの一部を形成する、前記項目のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２０５】
２９．前記ＨＥＲ３結合モチーフは、実質的に、前記３ヘリックスバンドルタンパク質のドメイン内で互いに連結するループを有する２つのヘリックスの一部を形成する、項目２８に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２０６】
３０．前記３ヘリックスバンドルタンパク質のドメインは、細菌の受容体ドメインから選択される、項目２９に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２０７】
３１．前記３ヘリックスバンドルタンパク質のドメインは、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡのドメインまたはそれらの誘導体から選択される、項目３０に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２０８】
３２．ｉｉｉ）Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ  ＸａＸｂＬＬＸｃ  ＥＡＫＫＬ  ＮＤＸｄＱ；
（式中、
［ＢＭ］は、項目１〜２７のいずれか１項で定義されたＨＥＲ３結合モチーフであり；
Ｘａは、ＡおよびＳから選択され；
Ｘｂは、ＮおよびＥから選択され；
Ｘｃは、Ａ、Ｓ、およびＣから選択され；
Ｘｄは、ＡおよびＳから選択される）；
および
ｉｖ）ｉｉｉ）で定義された配列と少なくとも８９％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、前記項目のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２０９】
３３．配列ｉｉｉ）中のＸａは、Ａである、項目３２に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２１０】
３４．配列ｉｉｉ）中のＸａは、Ｓである、項目３２に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２１１】
３５．配列ｉｉｉ）中のＸｂは、Ｎである、項目３２〜３４のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２１２】
３６．配列ｉｉｉ）中のＸｂは、Ｅである、項目３２〜３４のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２１３】
３７．配列ｉｉｉ）中のＸｃは、Ａである、項目３２〜３６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２１４】
３８．配列ｉｉｉ）中のＸｃは、Ｓである、項目３２〜３６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２１５】
３９．配列ｉｉｉ）中のＸｃは、Ｃである、項目３２〜３６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２１６】
４０．配列ｉｉｉ）中のＸｄは、Ａである、項目３２〜３９のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２１７】
４１．配列ｉｉｉ）中のＸｄは、Ｓである、項目３２〜３９のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２１８】
４２．配列ｉｉｉ）中、Ｘａは、Ａであり；Ｘｂは、Ｎであり；Ｘｃは、Ａであり、Ｘｄは、Ａである、項目３２に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２１９】
４３．配列ｉｉｉ）中、Ｘａは、Ａであり；Ｘｂは、Ｎであり；Ｘｃは、Ｃであり、Ｘｄは、Ａである、項目３２に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２２０】
４４．配列ｉｉｉ）中、Ｘａは、Ｓであり；Ｘｂは、Ｅであり；Ｘｃは、Ｓであり、Ｘｄは、Ｓである、項目３２に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２２１】
４５．配列ｉｉｉ）中、Ｘａは、Ｓであり；Ｘｂは、Ｅであり；Ｘｃは、Ｃであり、Ｘｄは、Ｓである、項目３２に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２２２】
４６．配列ｉｉｉ）は、配列番号３６〜７０のいずれか１つから選択される、項目３２〜４５のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２２３】
４７．配列ｉｉｉ）は、配列番号３６〜４５のいずれか１つから選択される、項目４６に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２２４】
４８．配列ｉｉｉ）は、配列番号３６および配列番号３７から選択される、項目４７に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２２５】
４９．配列ｉｉｉ）は、配列番号３７である、項目４８に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２２６】
５０．配列ｉｉｉ）は、配列番号３６である、項目４８に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２２７】
５１．ｖ）ＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ  ＳＥＬＬＸｃ  ＥＡＫＫＬ  ＮＤＳＱＡ  Ｐ；
（式中［ＢＭ］は、項目１〜２７のいずれか１項で定義されたＨＥＲ３結合モチーフであり、Ｘｃは、ＳおよびＣから選択される）；および
ｖｉ）ｖ）で定義された配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜３２のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２２８】
５２．ｖｉｉ）ＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ  ＡＮＬＬＸｃ  ＥＡＫＫＬ  ＮＤＡＱＡ  Ｐ；
（式中［ＢＭ］は、項目１〜２７のいずれか１項で定義されたＨＥＲ３結合モチーフであり、Ｘｃは、ＡおよびＣから選択される）；および
ｖｉｉｉ）ｖｉｉ）で定義された配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜３２のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２２９】
５３．ＡＤＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＱＨＤＥ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；および
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＥＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＫＳＱＡＰＫ；
（式中［ＢＭ］は、項目１〜２７のいずれか１項で定義されたＨＥＲ３結合モチーフである）
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜３１のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２３０】
５４．ｉｘ）ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＥＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＫＳＱＡＰＫ；
（式中［ＢＭ］は、項目１〜２７のいずれか１項で定義されたＨＥＲ３結合モチーフである）、および
ｘ）ｉｘ）で定義された配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜５１のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２３１】
５５．配列ｉｘ）は、配列番号７１〜１０５から選択される、項目５４に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２３２】
５６．配列ｉｘ）は、配列番号７１〜８０から選択される、項目５５に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２３３】
５７．配列ｉｘ）は、配列番号７１および配列番号７２から選択される、項目５６に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２３４】
５８．配列ｉｘ）は、配列番号７２である、項目５７に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２３５】
５９．配列ｉｘ）は、配列番号７１である、項目５７に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２３６】
６０．同じ実験条件を使用して測定した場合、前記ＨＥＲ３結合ポリペプチドとヒトＨＥＲ３との相互作用の解離速度（ｋｏｆｆ）は、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む比較用ＨＥＲ３結合ポリペプチドとヒトＨＥＲ３との相互作用の解離速度（ｋｏｆｆ）と比較して少なくとも４分の１以下である、前記項目のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２３７】
６１．前記解離速度（ｋｏｆｆ）は、少なくとも８分の１以下であり、例えば少なくとも１２分の１以下であり、例えば少なくとも１５分の１以下である、項目６０に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２３８】
６２．前記解離速度（ｋｏｆｆ）は、少なくとも２０分の１以下である、項目６１に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２３９】
６３．前記ＨＥＲ３結合ポリペプチドとヒトＨＥＲ３との相互作用のＫＤ値は、最大で１×１０−９Ｍ、例えば最大で１×１０−１０Ｍ、例えば最大で１×１０−１１Ｍである、前記項目のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２４０】
６４．少なくとも１種の追加のアミノ酸残基をさらに含む、前記項目のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【０２４１】
６５．ａ）前記項目のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチドからなる第一の部分；および
ｂ）所望の生物活性を有するポリペプチドからなる第二の部分
を含む融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２４２】
６６．前記所望の生物活性は、治療活性である、項目６５に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２４３】
６７．前記所望の生物活性は、結合活性である、項目６５に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２４４】
６８．前記所望の生物活性は、酵素活性である、項目６５に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２４５】
６９．所望の生物活性を有する第二の部分は、治療的に活性なポリペプチドである、項目６６に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２４６】
７０．所望の生物活性を有する第二の部分は、ヒト内因性酵素、ホルモン、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、およびリンフォカインからなる群から選択される、項目６５に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２４７】
７１．結合活性を有する第二の部分は、標的分子と選択的に相互作用できる結合ポリペプチドである、項目６７に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２４８】
７２．前記標的分子は、アルブミン、ＨＥＲ３、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ｃＭｅｔ、ＶＥＧＦＲ、およびＰＤＧＦＲからなる群から選択される、項目７１に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２４９】
７３．さらなる所望の生物活性を有するポリペプチドからなる追加の部分を含み、該生物活性は、第二の部分の生物活性と同一でもよいし、または異なっていてもよい、項目６５〜７２のいずれか１項に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２５０】
７４．第二の部分は、項目６６〜７０のいずれか１項で定義された通りであり、追加の部分は、項目７１〜７２のいずれか１項で定義された通りである、項目７３に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２５１】
７５．第二の部分および追加の部分はそれぞれ個々に、項目７１〜７２のいずれか１項で定義された通りである、項目７３に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２５２】
７６．細胞毒性薬をさらに含む、前記項目のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２５３】
７７．前記細胞毒性薬が、オーリスタチン、アントラサイクリン、カリケアマイシン、コンブレタスタチン、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、ＣＣ−１０６５抗腫瘍抗生物質、エクテイナシジン（ｅｃｔｅｉｎｓａｓｃｉｄｉｎ）、ゲルダナマイシン、メイタンシノイド、メトトレキセート、マイコトキシン、タキソール、リシン、ブーガニン、ゲロニン、シュードモナス属外毒素３８（ＰＥ３８）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ならびにそれらの類似体およびそれらの誘導体、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、項目７６に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２５４】
７８．標識をさらに含む、前記項目のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２５５】
７９．前記標識は、蛍光色素および金属、色素産生色素、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性核種および粒子からなる群から選択される、項目７８に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２５６】
８０．システイン残基のチオール基またはリシン残基のアミン基を介してＨＥＲ３結合ポリペプチドにコンジュゲートしたポリアミノポリカルボキシレートキレート剤によって提供されるキレート化環境を含む、前記項目のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２５７】
８１．前記ポリアミノポリカルボキシレートキレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸またはそれらの誘導体である、項目８０に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２５８】
８２．前記１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸誘導体は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス−酢酸−１０−マレイミドエチルアセトアミドである、項目８１に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２５９】
８３．前記ポリアミノポリカルボキシレートキレート剤は、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−トリ酢酸またはそれらの誘導体である、項目８０に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２６０】
８４．前記ポリアミノポリカルボキシレートキレート剤は、ジエチレントリアミン五酢酸またはそれらの誘導体である、項目８０に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２６１】
８５．医療用イメージングに好適な放射性核種を含むＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートであり、前記放射性核種は、９９ｍＴｃ、６１Ｃｕ、６４Ｃｕ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１０ＭＩｎ、１１１Ｉｎ、４４Ｓｃ、および８６Ｙからなる群から選択されるか、または療法に好適な放射性核種を有するＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートであり、前記放射性核種は、２２５Ａｃ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、６７Ｃｕ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、２１２Ｐｂ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、２２７Ｔｈ、および９０Ｙからなる群から選択され、ここで前記放射性核種は、キレート化環境を介してＨＥＲ３結合ポリペプチドと錯体化される、項目７８〜８４のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２６２】
８６．前記放射性核種は、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６４Ｃｕ、および６８Ｇａからなる群から選択される、項目８５に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２６３】
８７．前記放射性核種は、９９ｍＴｃおよび１１１Ｉｎから選択される、項目８６に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
【０２６４】
８８．前記項目のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートと、少なくとも１種の薬学的に許容される添加剤またはキャリアーとを含む組成物。
【０２６５】
８９．少なくとも１種の追加の活性物質をさらに含む、項目８８に記載の組成物。
【０２６６】
９０．前記少なくとも１種の追加の活性物質は、治療剤である、項目８９に記載の組成物。
【０２６７】
９１．前記治療剤は、免疫促進剤、放射性核種、毒物、酵素、エフェクター細胞を補充する因子、および光増感剤からなる群から選択される、項目９０に記載の組成物。
【０２６８】
９２．医薬品、診断剤または予後予測剤として使用するための、項目１〜８７のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは項目８８〜９１のいずれか１項に記載の組成物。
【０２６９】
９３．前記ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物は、ＨＥＲ３のシグナル伝達を調節し、例えばＨＥＲ３のシグナル伝達を阻害する、項目９２に記載の使用のためのＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物。
【０２７０】
９４．ＨＥＲ３関連の状態の処置、診断または予後における、項目９２または９３に記載の使用のためのＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物。
【０２７１】
９５．前記ＨＥＲ３関連の状態は、癌である、項目９４に記載の使用のためのＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物。
【０２７２】
９６．前記癌は、乳癌、卵巣癌、および前立腺癌からなる群から選択される、項目９５に記載の使用のためのＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物。
【０２７３】
９７．ＨＥＲ３を含有する疑いのあるサンプルを準備すること、前記サンプルを、項目１〜８７のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは項目８８〜９１のいずれか１項に記載の組成物と接触させること、およびＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物の結合を検出して、サンプル中のＨＥＲ３の存在を示すことを含む、ＨＥＲ３の検出方法。
【０２７４】
９８．対象中のＨＥＲ３の存在を決定する方法であって、該方法は：
−  対象または対象から単離したサンプルを、項目１〜８７のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは項目８９〜９１のいずれか１項に記載の組成物と接触させる工程、および
−  前記対象中で結合した、または前記サンプルに結合したＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物の量に相当する値を得る工程
を含む前記方法。
【０２７５】
９９．前記値を参照と比較する工程をさらに含む、項目９８に記載の方法。
【０２７６】
１００．前記方法は、インビボで行われる、項目９７〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【０２７７】
１０１．前記方法は、インビトロで行われる、項目９７〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【０２７８】
１０２．ＨＥＲ３の過剰発現を特徴とする癌を有する、または該癌を有する疑いのある対象の体のインビボでのイメージング方法であって、該方法は：
−  哺乳動物の対象の体に、項目８５〜８７のいずれか１項に記載の放射標識したポリペプチド、融合ポリペプチドまたはコンジュゲートを投与する工程であり、ここで放射性核種はイメージングに好適なものである、工程；および
−  放射標識したポリペプチドの投与から１〜７２時間以内に、医療用イメージング装置を使用して対象の体の少なくとも一部の１つまたはそれ以上の画像を得る工程であり、前記画像は、体内の放射性核種の存在を示す工程
を含む前記イメージング方法。
【０２７９】
１０３．前記対象は、哺乳動物の対象であり、例えばヒト対象である、項目９８〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【０２８０】
１０４．必要とする対象に、項目１〜８７のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートまたは項目８９〜９１のいずれか１項に記載の組成物の有効量を投与することを含む、ＨＥＲ３関連の状態の処置方法。
【０２８１】
１０５．前記ＨＥＲ３結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートまたは組成物は、ＨＥＲ３のシグナル伝達を阻害する、項目１０４に記載の方法。
【０２８２】
１０６．前記ＨＥＲ３関連の状態は、癌である、項目１０４または１０５に記載の方法。
【０２８３】
１０７．前記癌は、乳癌、卵巣癌、および前立腺癌からなる群から選択される、項目１０６に記載の方法。
【０２８４】
１０８．項目１〜７５のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０２８５】
１０９．項目１０８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【０２８６】
１１０．項目１０９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【０２８７】
１１１．項目１０８に記載のポリヌクレオチドを発現させることを含む、項目１〜７５のいずれか１項に記載のポリペプチドを生産する方法。
【０２８８】
１１２．
−  前記発現ベクターからの前記ポリペプチドの発現が可能な条件下で項目１１０に記載の宿主細胞を培養すること、および
−  前記ポリペプチドを単離すること
を含む、項目１〜７５のいずれか１項に記載のポリペプチドを生産する方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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