(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
直鎖、分枝状又は架橋されたポリマーであって、１００ｍｏｌ％当たり、
ａ）アルキルラジカルがそれぞれ１個〜４個の炭素原子を含む、７５％以上かつ９９．９５％以下のモル比の、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミドに由来するモノマー単位と、
ｂ）０．０５％以上かつ１％以下のモル比の、式（Ｉ）：
ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ１）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−［ＣＨ２−ＣＨ（Ｒ２）−Ｏ］ｎ−Ｒ３  （Ｉ）
（式中、ｎは１〜５０の数を表し、Ｒ１は水素原子又はメチルラジカルを表し、Ｒ２は水素原子、メチルラジカル又はエチルラジカルを表し、Ｒ３は、８個〜３０個の炭素原子を含む飽和又は不飽和の直鎖又は分枝状の脂肪族炭化水素ラジカルを表す）のモノマーに由来するモノマー単位と、
を含む、直鎖、分枝状又は架橋されたポリマーを含有する、チップ、マイクロ流体システム、マイクロシステム又はラボオンチップの表面処理剤。
【請求項２】
前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミドに由来するモノマー単位が、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ，Ｎ−ジエチルアクリルアミドに由来する、請求項１に記載の表面処理剤。
【請求項３】
前記式（Ｉ）のモノマーに由来するモノマー単位が、
ペンタコサエトキシル化ベヘニルメタクリレート、又は、
エイコサエトキシル化ステアリルメタクリレート、
に由来する、請求項１または請求項２に記載の表面処理剤。
【請求項４】
前記ポリマーが、
ｃ）０％より大きくかつ２４％以下のいずれかのモル比の、遊離型、部分的に塩化された若しくは完全に塩化された強酸官能基を含むモノマーに由来するモノマー単位、又は式（ＩＩ）：
ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ４）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｙ−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）  （ＩＩ）
（式中、ｍは１〜４の数を表し、ＹはＯ又はＮＨを表し、Ｒ４は水素原子又はメチルラジカルを表し、Ｒ５及びＲ６は、同一又は異なって、メチルラジカル又はエチルラジカルを表す）のモノマーに由来するモノマー単位をさらに含む、請求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の表面処理剤。
【請求項５】
前記ポリマーが、前記遊離型、部分的に塩化された又は完全に塩化された強酸官能基を含むモノマーに由来するモノマー単位を含む場合、該モノマー単位が、遊離型、部分的に塩化された又は完全に塩化された２−メチル−２−［（１−オキソ−２−プロペニル）アミノ］−１−プロパンスルホン酸に由来することを特徴とする、請求項４に記載の表面処理剤。
【請求項６】
前記ポリマーが、前記式（ＩＩ）のモノマーに由来するモノマー単位を含む場合、該モノマー単位が、
ジメチルアミノエチルメタクリレート、又は、
Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド、
に由来することを特徴とする、請求項４に記載の表面処理剤。
【請求項７】
前記ポリマーが、ｄ）０％より大きくかつ１％以下のモル比のジエチレン系又はポリエチレン系架橋モノマーをさらに含む、請求項１ないし請求項６のいずれか一項に記載の表面処理剤。
【請求項８】
前記ポリマーが、１００ｍｏｌ％当たり、
ａ）９９％以上かつ９９．９％以下のモル比の、前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミドに由来するモノマー単位と、
ｂ）０．１％以上かつ１％以下のモル比の、式（Ｉ’）：
ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ］ｎ’−Ｒ’３  （Ｉ’）
（式中、ｎ’は４〜２５の数を表し、Ｒ’３は、１２個〜２２個の炭素原子を含む飽和又は不飽和の直鎖又は分枝状のアルキルを表す）のモノマーに由来するモノマー単位と、
を含む、請求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の表面処理剤。
【請求項９】
前記ポリマーが、１００ｍｏｌ％当たり、
ａ）８０％以上かつ９５％以下のモル比の、前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミドに由来するモノマー単位と、
ｂ）０．１％以上かつ０．５％以下のモル比の、式（Ｉ’）：
ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ］ｎ’−Ｒ’３  （Ｉ’）
（式中、ｎ’は４〜２５の数を表し、Ｒ’３は、１２個〜２２個の炭素原子を含む飽和又
は不飽和の直鎖又は分枝状のアルキルを表す）のモノマー由来のモノマー単位と、
ｃ）４％以上かつ１９％以下のモル比の、遊離型、部分的に塩化された又は完全に塩化された２−メチル−２−［（１−オキソ−２−プロペニル）アミノ］−１−プロパンスルホン酸に由来するモノマー単位と、
を含む、請求項５に記載の表面処理剤。
【請求項１０】
前記ポリマーが、１００ｍｏｌ％当たり、
ａ）８０％以上かつ９５％以下のモル比の、前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミドに由来するモノマー単位と、
ｂ）０．１％以上かつ０．５％以下のモル比の、前記式（Ｉ’）：
ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ］ｎ’−Ｒ’３  （Ｉ’）
（式中、ｎ’は４〜２５の数を表し、Ｒ’３は、１２個〜２２個の炭素原子を含む飽和又は不飽和の直鎖又は分枝状のアルキルを表す）のモノマー由来のモノマー単位と、
ｃ）４％以上かつ１９％以下のモル比の、ジメチルアミノエチルメタクリレート、又はＮ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミドに由来するモノマー単位と、
を含む、請求項６に記載の表面処理剤。
【請求項１１】
チップ、マイクロ流体システム、マイクロシステム又はラボオンチップの表面を処理する方法であって、
請求項１ないし請求項１０のいずれか一項に記載の表面処理剤を前記表面に接触させて、インキュベートさせる段階ａ）と、
前記表面上に吸着しなかったポリマーを該表面から除去するように、段階ａ）によって得られる該表面をすすぐ段階ｂ）と、
任意に、前記段階ｂ）によって得られるすすがれた表面を乾燥させる段階ｃ）と、
を含むことを特徴とする、チップ、マイクロ流体システム、マイクロシステム又はラボオンチップの表面を処理する方法。
【請求項１２】
段階ａ）の前に、前記表面上に、１ｍｍ未満の少なくとも１つの寸法を一方向に示すチャネルを作成するように、成形又はエッチングする段階である、段階ｄ）を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
水性、水性／有機又は有機溶液中に存在する構成要素とチップ、マイクロ流体システム、マイクロシステム又はラボオンチップの表面との間の相互作用を改変させるための作用物質としての、請求項１ないし請求項１０のいずれか一項に記載の表面処理剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なポリマー、それらの製造方法、及び、表面、特に疎水性プラスチックから作られている表面の処理におけるそれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、ラボオンチップとも称されるマイクロ流体システムにおける、医学的検査、化学的解析若しくは生物学的解析、又は合成操作等の利用を発展させるための開発が行われている。
【０００３】
これらのラボオンチップは、疎水性プラスチック、例えば、ＣＯＣ（環状オレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（環状オレフィンポリマー）、及びより一般にはポリ（シクロオレフィン）、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、及びより一般にはアクリル系ポリマー、ポリカーボネート、ポリエステル、シリコーン、幾つかのポリウレタン、及びより一般には、低温条件下又は高温条件下で重合可能な、熱成形材料の任意の種類の樹脂から構成される。
【０００４】
ＣＯＣタイプの材料は例えば、それほど高密度でなく、極めて透過性であり、生体適合性であり、最大１７０℃までの耐熱性を有し、かつ良好な耐薬品性を有する。
【０００５】
しかしながら、それらの疎水性の性質は、幾つかの欠点、例えば、かかるラボオンチップにおいて研究又は製造することが望まれると考えられる、幾つかの生体分子、例えばタンパク質、有機分子、例えば、着色剤、標識、薬物又は任意の他のタイプの分子との、また、これらのラボオンチップにおいて相互作用支持体として使用されることが多いミクロ粒子又はナノ粒子との相互作用をもたらす。この欠点を克服するために、場合によっては、中性又はカチオン性、アニオン性又は両性の性質をとることができる適切なポリマーで材料の表面を処理する。
【０００６】
特許文献１は、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）の主骨格と、ポリ（メチルメタクリレート）グラフトとから構成される両親媒性櫛型コポリマーを開示している。これらの疎水性単位はＣＯＣタイプの材料上に吸着され、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）骨格が親水性の性質を材料の表面に与える。
【０００７】
事実上、このようなコポリマーの工業合成は、メチルメタクリレートマクロマーの調製、及び精製段階による溶媒相中における共重合を伴うことから困難なものとなっている。
【０００８】
さらに、細胞を固定化するためのラボオンチップの技法の開発という観点から、疎水性表面をわずかにカチオン性にすることが必要とされ得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】仏国特許出願公開第２８１０９０５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らはそれ故、上記に言及される問題を解決することを可能とする新規なポリマー、またマイクロチャネル又はマイクロ流体デバイスのポリマー表面を処理及び制御する
ことを可能とする方法を開発しようと努めた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第一の態様によれば、本発明の主題は、直鎖、分枝状又は架橋されたポリマーであって、１００ｍｏｌ％当たり、
ａ）アルキルラジカルがそれぞれ１個〜４個の炭素原子を含む、７５％以上かつ９９．９５％以下のモル比の、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミドに由来するモノマー単位と、
ｂ）０．０５％以上かつ１％以下のモル比の、式（Ｉ）：
ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ１）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−［（ＣＨ２−ＣＨ（Ｒ２）−Ｏ］ｎ−Ｒ３  （Ｉ）
（式中、ｎは１〜５０の数を表し、Ｒ１は水素原子又はメチルラジカルを表し、Ｒ２は水素原子、メチルラジカル又はエチルラジカルを表し、Ｒ３は、８個〜３０個の炭素原子を含む飽和又は不飽和の直鎖又は分枝状の脂肪族炭化水素ラジカルを表す）のモノマーに由来するモノマー単位と、
ｃ）任意に、０％より大きくかつ２４％以下のいずれかのモル比の、遊離型、部分的に塩化された若しくは完全に塩化された強酸官能基を含むモノマーに由来するモノマー単位、又は式（ＩＩ）：
ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ４）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｙ−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）  （ＩＩ）
（式中、ｍは１〜４の数を表し、ＹはＯ又はＮＨを表し、Ｒ４は水素原子又はメチルラジカルを表し、Ｒ５及びＲ６は、同一又は異なって、メチルラジカル又はエチルラジカルを表す）のモノマーに由来するモノマー単位と、
ｄ）任意に、０％より大きくかつ１％以下のモル比のジエチレン系又はポリエチレン系架橋モノマーと、
を含む、直鎖、分枝状又は架橋されたポリマーである。
【００１２】
分枝状ポリマーとは、それらが水に溶解すると、低速度勾配で極めて大きい粘度をもたらす高次の絡み合い状態が得られるような、ペンダント鎖を有する非直鎖ポリマーを指す。
【００１３】
架橋されたポリマーとは、水に不溶性であるが、水に膨潤性であるため、化学ゲルが得られる、三次元網目構造の状態でもたらされる非直鎖ポリマーを指す。
【００１４】
本発明による方法によって得られるポリマーは、架橋単位及び／又は分枝状単位を含んでいてもよい。
【００１５】
特定の態様によれば、本発明の主題は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミドに由来するモノマー単位が、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（以下、ＤＭＡＭと称する）又はＮ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（以下、ＤＥＡＭと称する）に由来する、上記に規定されるポリマーである。
【００１６】
本発明に関連して、本発明の主題となるポリマーを製造するのに適切な式（Ｉ）のモノマーは、界面活性を示す。該モノマーは、疎水性支持体上に吸着することができるほど十分に疎水性である鎖と、必要に応じて誘引又は反発により生体分子と相互作用することができる十分親水性な部分とを有していなければならない。
【００１７】
上記に規定される式（Ｉ）中、二価ラジカル：
−［（ＣＨ２−ＣＨ（Ｒ２）−Ｏ］ｍ−
は特に：
エトキシル基からのみ構成される鎖（Ｒ２＝Ｈ、ｍ＞０）、
又は、プロポキシル基からのみ構成される鎖（Ｒ２＝ＣＨ３、ｍ＞０）、
又は、ブトキシル基からのみ構成される鎖（Ｒ２＝Ｃ２Ｈ５、ｍ＞０）、
又は、エトキシル、プロポキシル及び／又はブトキシル基から選ばれる、少なくとも２つの異なる基から構成される鎖のいずれかを表している。
【００１８】
この鎖が種々の基から構成される場合、種々の基は連続的に又はランダムにこの鎖に沿って全て分布する。
【００１９】
上記に規定される式（Ｉ）中のＲ３についての８個〜３０個の炭素原子を含む飽和又は不飽和の直鎖脂肪族炭化水素ラジカルは、より詳細には下記のものを指すものである：
直鎖第一級アルコ−ルに由来するラジカル、例えばオクチル、ペラルゴン、デシル、ウンデシル、ウンデセニル、ラウリル、トリデシル、ミリスチル、ペンタデシル、セチル、ヘプタデシル、ステアリル、オレイル、リノレイル、ノナデシル、アラキジル、ベヘニル若しくはエルシルアルコ−ル、若しくは１−トリアコンタノ−ルに由来するラジカル等、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、１０−ウンデセニル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、９−オクタデセニル、１０，１２−オクタデカジエニル、ノナデシル、エイコシル、ドコシル、１３−ドコセニル若しくはトリアコンチルラジカル；又は、
一般式：
ＣＨ３−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ［ＣＨ３−（ＣＨ２）ｐ−２］−ＣＨ２ＯＨ、
（式中、ｐは２〜１４の整数を表す）に対応する分枝状１−アルカノ−ルであるゲルベアルコ−ルに由来するラジカル、例えば２−エチルヘキシル、２−プロピルヘプチル、２−ブチルオクチル、２−ペンチルノニル、２−ヘキシルデシル若しくは２−オクチルドデシルラジカル等；又は、
一般式：
ＣＨ３−ＣＨ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ２ＯＨ、
（式中、ｑは２〜２６の整数を表す）に対応するイソアルコ−ルに由来するラジカル、例えば４−メチルペンチル、５−メチルヘキシル、６−メチルヘプチル、１５−メチルペンタデシル若しくは１６−メチルヘプタデシルラジカル等；又は、
２−ヘキシルオクチル、２−オクチルデシル若しくは２−ヘキシルドデシルラジカル。
【００２０】
上記に規定される式（Ｉ）中のＲ３についての８個〜３０個の炭素原子を含む飽和又は不飽和の直鎖又は分枝状の脂肪族炭化水素ラジカルはより詳細には、１２個〜２２個の炭素原子を含むアルキルラジカルを指すものである。
【００２１】
上記に規定される式（Ｉ）中、ｎはより詳細には４〜２５の数を表すものである。
【００２２】
本発明の主題は特に詳細には、式（Ｉ）のモノマーに由来するモノマー単位が、
ペンタコサエトキシル化ベヘニルメタクリレート、Ｒ１がメチルラジカルを表し、Ｒ２が水素原子を表し、Ｒ３がドコシルラジカルを表し、かつｎが２５に等しい、上記に規定される式（Ｉ）の化合物（以下、ＢＥＭ−２５（ＥＯ）と称する）、又は、
エイコサエトキシル化ステアリルメタクリレート、Ｒ１がメチルラジカルを表し、Ｒ２が水素原子を表し、Ｒ３がステアリルラジカルを表し、かつｎが２０に等しい、上記に規定される式（Ｉ）の化合物（以下、ＳＭＡ−２０（ＥＯ）と称する）、
に由来する、上記に規定されるポリマーである。
【００２３】
強酸官能基を含むモノマーは、本発明に関連して、特に、スルホン酸官能基又はホスホン酸官能基と、少なくとも１つの不飽和炭素−炭素結合とを含むアクリル系モノマーを指すものである。
【００２４】
強酸官能基が部分的に又は完全に塩化されている場合、それはより詳細には、該当のナトリウム塩、カリウム塩又はアンモニウム塩となる。
【００２５】
本発明の別の特定の態様によれば、上記に規定されるポリマーは、遊離型、部分的に塩化された又は完全に塩化された強酸官能基を含むモノマーに由来するモノマー単位を含む場合、これらモノマー単位が、遊離型、部分的に塩化された又は完全に塩化された２−メチル−２−［（１−オキソ−２−プロペニル）アミノ］−１−プロパンスルホン酸（以下、ＡＴＢＳと称する）に由来することを特徴とする。
【００２６】
本発明の２つの特定の態様によれば、上記に規定される直鎖、分枝状又は架橋されたポリマーは、式（ＩＩ）のモノマーに由来するモノマー単位を含む場合、上記式（ＩＩ）中、ｍが２又は３に等しく、及び／又はＲ５及びＲ６がそれぞれメチルラジカルを表すことを特徴とする。
【００２７】
これらの特定の態様によれば、上記に規定されるポリマーは、上記式（ＩＩ）のモノマーに由来するモノマー単位を含む場合、これらモノマー単位が、
ジメチルアミノエチルメタクリレート（以下、ＤＭＡＥＭＡと称する）、又は、
Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド（以下、ＤＭＡＰＡＡと称する）、
に由来することを特徴とする。
【００２８】
本発明の別の特定の形態によれば、後者の主題は、１００ｍｏｌ％当たり、
ａ）９９％以上かつ９９．９％以下のモル比の、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミドに由来するモノマー単位と、
ｂ）０．１％以上かつ１％以下のモル比の、式（Ｉ’）：
ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−［（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ］ｎ’−Ｒ’３  （Ｉ’）
（式中、ｎ’は４〜２５の数を表し、Ｒ’３は、１２個〜２２個の炭素原子を含む飽和又は不飽和の直鎖又は分枝状のアルキルを表す）のモノマーと、
を含む、上記に規定されるポリマーである。
【００２９】
本発明の別の主題は、より詳細には、１００ｍｏｌ％当たり、
ａ）アルキルラジカルがそれぞれ１個〜４個の炭素原子を含む、８０％以上かつ９５％以下のモル比の、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミドに由来するモノマー単位と、
ｂ）０．１％以上かつ０．５％以下のモル比の、式（Ｉ’）：
ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−［（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ］ｎ’−Ｒ’３  （Ｉ’）
（式中、ｎ’は４〜２５の数を表し、Ｒ’３は、１２個〜２２個の炭素原子を含む飽和又は不飽和の直鎖又は分枝状のアルキルを表す）のモノマー由来のモノマー単位と、
ｃ）４％以上かつ１９％以下のモル比の、遊離型、部分的に塩化された又は完全に塩化された２−メチル−２−［（１−オキソ−２−プロペニル）アミノ］−１−プロパンスルホン酸に由来するモノマー単位と、
を含む、上記に規定されるポリマー、及び、
１００ｍｏｌ％当たり、
ａ）アルキルラジカルがそれぞれ１個〜４個の炭素原子を含む、８０％以上かつ９５％以下のモル比の、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミドに由来するモノマー単位と、
ｂ）０．１％以上かつ０．５％以下のモル比の、式（Ｉ’）：
ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−［（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ］ｎ’−Ｒ’３  （Ｉ’）
（式中、ｎ’は４〜２５の数を表し、Ｒ’３は、１２個〜２２個の炭素原子を含む飽和又
は不飽和の直鎖又は分枝状のアルキルを表す）のモノマー由来のモノマー単位と、
ｃ）４％以上かつ１９％以下のモル比の、ジメチルアミノエチルメタクリレート、又はＮ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミドに由来するモノマー単位と、
を含む、上記に規定されるポリマーである。
【００３０】
本発明の主題は特に詳細には下記のポリマーである：
ＤＭＡＭ／ＢＥＭ−２５（ＥＯ）コポリマー、
ＤＭＡＭ／ＡＴＢＳ（ナトリウム塩）／ＢＥＭ−２５（ＥＯ）コポリマー、及び、
ＤＭＡＭ／ＤＭＡＰＡＡ／ＢＥＭ−２５（ＥＯ）コポリマー。
【００３１】
本発明の別の主題は、上記に規定されるポリマーを製造する方法であって、
モノマーの全てを、撹拌しながら、水又は水／アルコール混合物中に投入すること、前記アルコールはより詳細には、メタノール、エタノール又はイソプロパノールから選ばれるものとする、
窒素による散布によって混合物を脱酸素化させること、
温度を５０℃周辺に維持しながら、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（Ｖ５０とも称する）等の水溶性ラジカル重合開始剤を、続いてそこに投入した後、モノマーが完全に消費されるまで重合を起こさせること、
を特徴とする、上記に規定されるポリマーを製造する方法である。
【００３２】
別の態様によれば、本発明の主題は、疎水性材料から全て又は部分的に構成される表面を処理する方法であって、
上記に規定されるポリマーの水性、水性／有機又は有機溶液を上記表面に接触させて、インキュベートさせる段階ａ）と、
上記表面上に吸着しなかったポリマーを該表面から除去するように、段階ａ）によって得られる該表面をすすぐ段階ｂ）と、
任意に、上記段階ｂ）によって得られるすすがれた表面を乾燥させる段階ｃ）と、
を含むことを特徴とする、「静的な前処理」として通常知られている疎水性材料から全て又は部分的に構成される表面を処理する方法である。
【００３３】
上記に規定される方法に用いられる疎水性材料はポリマー材料、例えばＣＯＣ、ＣＯＰ、より一般にはポリ（シクロオレフィン）、ＰＭＭＡ、より一般にはアクリル系ポリマー、ポリカーボネート、ポリエステル、シリコーン、幾つかのポリウレタン、より一般には、低温条件下又は高温条件下で重合可能な、熱成形材料の任意の種類の樹脂であるのが好ましい。
【００３４】
好ましくは、上記に規定される方法によって処理すべき表面は、チップ、マイクロ流体システム、マイクロシステム又はラボオンチップの表面とする。
【００３５】
ポリマーの有機溶液は、上記に規定される方法の段階ａ）中、有機溶媒に溶解させた上記ポリマーの溶液を指すものである。
【００３６】
水性／有機溶液は、上記に規定される方法の段階ａ）中、水と水混和性の有機化合物との混和性混合物に溶解させた上記ポリマーの溶液を指すものである。かかる水性／有機混合物は、特にクロマトグラフィ用の移動相として当業者に既知のものである。
【００３７】
上記に規定される方法の好ましい実施形態によっては、上記有機化合物は、純物質で（pure）又は本発明によるポリマーを溶解する水との混合物として使用され、アルコール、エステル、ケトン、カルボン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、又は当業者に既知の任意の他の有機溶媒とすることができる。
【００３８】
上記に規定される方法の別の好ましい形態によれば、上記有機化合物は、処理すべき表面を構成する材料用の非溶媒である。
【００３９】
上記に規定される方法の好ましい実施形態によっては、上記有機化合物は極性化合物である。
【００４０】
上記に規定される方法の特に好ましい実施形態によれば、上記有機化合物はエタノールである。
【００４１】
上記に規定される方法において、チップとは特に、およそ０．１ｃｍ〜１ｃｍの厚みを有する、およそ５ｃｍ２〜５０ｃｍ２のプレートを指すものである。
【００４２】
上記に規定される方法において、マイクロ流体システムとは、１ミリメートル未満の寸法を少なくとも一方向に有する少なくとも１つの閉じた又は開いたマイクロキャビティを含むシステムを指すものである。
【００４３】
あてがわれる目的に応じて、上記チップ又は上記システムは、上記に規定される処理方法の段階ａ）の前に、疎水性材料から全て又は部分的に構成される表面上に、１ｍｍ未満の少なくとも１つの寸法を一方向に示すチャネルを作成するように、成形又はエッチングする段階ｄ）にかけてもよい。
【００４４】
上記に規定される上記方法の主題は特に、上記表面の湿潤性、特に水とのその接触角の改変、及び／又はその電気浸透特性の改変、及び／又は構成要素（分子又は微粒子）に対するその吸着特性の改変である。
【００４５】
上記に規定される方法は、構成要素、例えば有機分子、生体分子、例えば核酸、タンパク質、ペプチド、代謝産物、医薬有効成分、グリコールペプチド、多糖類、又は更には細胞、ウイルス、粒子、コロイド若しくはミセル等のマイクロメートル若しくはナノメートルのサイズの物体に対する疎水性表面の接着性を改変させるのに特に有益である。
【００４６】
本発明は有益なことに、上記構成要素の付着を低減させるための多数の用途に使用することができる。しかしながら、本発明は、例えば、細胞が自然には付着しないと考えられる疎水性表面への細胞の付着を促すために、カチオン性ポリマーの使用により、又は、それに対して、幾つかの細胞の付着を促すことができる、ポリリジン若しくはフィブロネクチン等のカチオン性ポリマーの吸着を促すために、アニオン性ポリマーの使用により、反対の電荷の構成要素の固着を疎水性表面上に誘起することによって、幾つかの構成要素の付着を容易にさせるのにも有益とすることができ、又は電気浸透特性も改変させることができる。
【００４７】
このため、本発明の別の主題は、水性、水性／有機又は有機溶液中に存在する構成要素と疎水性材料から全て又は部分的に構成される表面との間の相互作用を改変させるための作用物質としての、上記に規定されるポリマーの使用である。
【００４８】
上記水溶液中に存在する構成要素は特に、核酸、タンパク質、ペプチド、代謝産物、医薬有効成分、グリコペプチド又は多糖類等の有機分子又は生体分子のみを指すものでなく、細胞、ウイルス、粒子、コロイド又はミセル等のマイクロメートル又はナノメートルのサイズの物体も指すものである。
【００４９】
上記に規定される使用によるこの実施形態は特に、その処理の間、ポリマーが、表面上
に吸着される部分と、溶液中に存在する部分とで永久的に平衡状態にあり、上記表面上でポリマーが置き換えられることを可能とする、「ダイナミックコーティング（dynamic coating）」として知られる表面処理の原理に対応するものである。この有利な実施形態は、場合によっては、表面処理の寿命を延長させることを可能にする。ダイナミックコーティング中、使用されるポリマーの濃度は好ましくは、静的な前処理に使用されるものよりも低く、好ましくは１０−６重量％〜０．１重量％、好ましくは１０−４重量％〜０．０１重量％である。
【００５０】
実施形態によっては、２つの形態の利点を合わせるために、上記ダイナミックコーティングを、静的な前処理と併用することができる。
【００５１】
別の好ましい実施形態によれば、静的な前処理又はダイナミックコーティングに使用される溶液中のポリマーの濃度は、その臨界ミセル濃度（すなわちＣＭＣ）から求められる。
【００５２】
ＣＭＣを求める方法は、当業者に既知のものであり、文献に記載されている。それ故、静的な前処理では、有利な実施形態では、ポリマーを、表面処理に使用される溶液中、０．１×ＣＭＣ〜１００×ＣＭＣ、より好ましくは１×ＣＭＣ〜５０×ＣＭＣの濃度で使用する。ダイナミックコーティングでは、使用されるポリマーの濃度は好ましくは、１０−３×ＣＭＣ〜１０×ＣＭＣ、好ましくは１０−２×ＣＭＣ〜ＣＭＣとなると考えられる。
【００５３】
本発明の別の主題は、１０−４％〜１０％の重量濃度で、上記に規定される直鎖、分枝状又は架橋されたポリマーを含む、水性、有機又は水性／有機溶液である。
【００５４】
特定の形態によれば、上記に規定される上記水性、有機又は水性／有機溶液は、上記直鎖、分枝状又は架橋されたポリマーの濃度が、１０−４重量％〜１重量％、好ましくは１０−３重量％〜０．１重量％となる水溶液である。
【００５５】
別の特定の形態によれば、上記に規定される上記水性、有機又は水性／有機溶液は、上記直鎖、分枝状又は架橋されたポリマーの濃度が、１０−４重量％〜１０重量％、好ましくは１０−２重量％〜１重量％となるエタノール溶液である。
【００５６】
最後に、本発明の主題は、キットであって、
ａ）上記に規定される直鎖、分枝状又は架橋されたポリマーを含む、少なくとも１つの容器と、
ｂ）上記直鎖、分枝状又は架橋されたポリマーを含む上記水性、有機又は水性／有機溶液を調製することができかつ調製することを意図した液体ベースを含む、少なくとも１つの容器と、
を含む、キットである。
【００５７】
このキットを用いてこのように調製される、上記直鎖、分枝状又は架橋されたポリマーを含む上記水性、有機又は水性／有機溶液は続いて、特に、処理表面をより親水性とするために、又は構成要素に対するその吸着特性を改変させるために、又はその電気浸透特性を改変させるために、上記に規定される処理方法に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】マイクロチャネルの設計を表す図。
【図２ａ】ＨＥＣ＋ＰＬＬ溶液で培養されたＭＣＦ−７細胞の顕微鏡写真。
【図２ｂ】カチオン性ＤＭＡＭ−Ｃ２２処理剤（ＰＬＬを含まず）で培養されたＭＣＦ−７細胞の顕微鏡写真。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００５９】
以下の実施例は、本発明を例示するものであるが、本発明を限定するものではない。
【００６０】
実施例１：ＤＭＡＭ／ＢＥＭ−２５（ＥＯ）コポリマー（ポリマー１）の調製
ポリマー１を次のように調製する。
モノマーを、下記表に示される量において水中で混合させる。
【００６１】
【表１】
0006370369.tif 000002
【００６２】
４５分間の脱酸素化後、反応媒体を５０℃とし、Ｖ５０をリアクタに投入した。反応媒体はわずかに白化し、粘性となる。およそ３．６℃の温度の上昇が記録される。反応を２時間後に停止させる。濾過、洗浄及び乾燥後、ポリマー１が得られる。ポリマー１は次のように特性決定する：
外観：曇った粘性液体；
２５℃におけるポリマー１の３重量％水分散液の粘度（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ（商標）ＲＶＴ、スピンドル３、速度：５ｒｐｍ（revolutions per minute））：４４０ｍＰａ・ｓ；
２５℃におけるポリマー１の３重量％水分散液の粘度（ＣＡＰ２０００（商標）、コーン１、速度：５０ｒｐｍ）：１９６ｍＰａ・ｓ；
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドの残存含有率：０．０５重量％未満；
得られるポリマーの重量：１００ｇ。
【００６３】
実施例２及び実施例３：ポリマー２及びポリマー３の調製
ポリマー２及びポリマー３が得られるように、使用する様々な化合物の重量含有率は下記表に示されるように変更して、実施例１と同じ操作条件下で他の試験を行った。
【００６４】
【表２】
0006370369.tif 000003
【００６５】
操作条件は、先行の実施例１のものと同一である。ポリマー２及びポリマー３は次のように特性決定する。
【００６６】
ポリマー２
外観：曇った粘性液体；
２５℃におけるポリマー２の３重量％水分散液の粘度（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ（商標）ＲＶＴ、スピンドル３、速度：５ｒｐｍ）：２２４０ｍＰａ・ｓ；
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドの残存含有率：０．０５重量％未満；
得られるポリマーの重量：１００ｇ。
【００６７】
ポリマー３
外観：白色の高粘性液体；
２５℃におけるポリマー３の３重量％水分散液の粘度（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ（商標）ＲＶＴ、スピンドル３、速度：５ｒｐｍ）：３８００ｍＰａ・ｓ；
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドの残存含有率：０．０５重量％未満；
得られるポリマーの重量：１００ｇ。
【００６８】
実施例４：ＤＭＡＭ／ＡＴＢＳＮａ／ＢＥＭ−２５（ＥＯ）アニオン性ポリマー（ポリマー４）の調製
ポリマー４を次のように調製する。
モノマーを、下記表に示される量において水中で混合させる。
【００６９】
【表３】
0006370369.tif 000004
【００７０】
４５分間の脱酸素化後、反応媒体を５０℃とし、Ｖ５０をリアクタに投入した。反応媒体は開始剤の投入後急速に白化し、粘性となる。撹拌を弱める。２時間の反応後、加熱を停止して、生成物を取り出す前に２時間放置する。ＤＭＡＭ含有率は０．０５％未満であり（Ｓ５２−３８５Ｂ法）、これは、重合反応が実際に起こったことを意味している。
【００７１】
実施例５：ＤＭＡＭ／ＤＭＡＰＡＡ／ＢＥＭ−２５（ＥＯ）カチオン性ポリマー（ポリマー５）の調製
【００７２】
【表４】
0006370369.tif 000005
【００７３】
使用される手順は上記のものとする。反応媒体をｐＨ＝７に維持すると、それは急速に白化し、粘性となる。１時間３０分間の反応後、加熱を停止して、反応媒体を一晩冷やし
ておく。ＤＭＡＭ含有率は０．０５％未満であり、これは、重合反応が実際に起こったことを意味している。
【００７４】
実施例６：ＣＯＣから作られている表面の処理
Topas Advanced Polymersによって販売されている一連のＴｏｐａｓ（商標）８００７プレート（５ｃｍ×５ｃｍ×５ｍｍ）を、アセトン及びイソプロパノールで洗浄した後、圧縮空気で乾燥させる。
【００７５】
Life Technologiesによってリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate-Buffered Saline）（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）の名称で販売されているｐＨ＝７．４のリン酸バッファ中に０．０１重量％のポリマー１を含む、２００マイクロリットルの、本発明による処理溶液Ａ１を続いて、プレートの片面に均一に広げた後、このように処理した表面を、周囲温度で１時間インキュベートさせる。
【００７６】
別の実験では、エタノール中に０．１重量％のポリマー１を含む、２００マイクロリットルの、本発明による処理溶液Ｂ１を、第２のプレートの片面に均一に広げた後、このように処理した表面を、周囲温度で１時間インキュベートさせる。
【００７７】
いずれの場合も、吸着していないポリマーを除去するためにプレートを続いて浸透水（osmosed water）ですすぎ、その後、圧縮空気で乾燥させる。
【００７８】
このように作製したプレートは、それらのその後の使用への準備が整った状態である。
【００７９】
２つの新たなプレートも、使用するポリマーがポリマー２である以外は溶液Ａ１及び溶液Ｂ１と同一の処理溶液Ａ２及び処理溶液Ｂ２を用いて同じプロトコルに従って作製する。
【００８０】
実施例７：接触角の測定
溶液Ａ１、Ｂ１、Ａ２及びＢ２で処理したプレート上の水の接触角を、光学ゴニオメータを用いて測定した。
【００８１】
３マイクロリットルの一滴の水を、シリンジを用いて滴下し、その形成中の液滴の画像を高解像度カメラによってかすめ入射角で（in grazing incidence）解析した後、ソフトウェアを用いて加工処理した。
【００８２】
本来同じ供給源に起因するものの、本発明のポリマーの処理にかけていないＣＯＣ表面を対照として使用する。
【００８３】
あらゆる場合において、エラーバーを求めるために１０個の測定結果の平均をとっている。以下の表に記録した結果から、ポリマー及び実施形態は全て、接触角を著しく低減させることを可能とする、すなわち初めに疎水性であった表面をより顕著に湿潤させたことが明らかである。
【００８４】
【表５】
0006370369.tif 000006
【００８５】
実施例８：マイクロチャネルの処理
マイクロチャネルの作製
十字を有するアルミニウムモールドを、Minitec Machinery Corporationの装置及び１００μｍの直径を有する切削工具を用いた微細機械加工によって作製する。
【００８６】
マイクロチャネルの設計を図１に表す。それぞれの枝の長さは次のとおりである：
枝ｉ：４ｍｍ；枝ｉｉ：４ｍｍ；枝ｉｉｉ：４ｍｍ；枝ｉｖ：５０ｍｍ。
【００８７】
実施例７に示されるＣＯＣプレートを、加熱した油圧プレス（ＳＰＥＣＡＣ（商標））を用いてモールド（母材）と接触させる。５０ｋＰａの圧力において１３０℃で１０分間エンボス加工を行う。続いて、同じ圧力下で４０℃まで冷却させた後、プレスを開き、マイクロチャネルが設けられたプレートを取り出す。穿孔機を用いてリザーバに穿孔をあけ、プレートを超音波イソプロパノール浴内で洗浄した後、乾燥させる。
【００８８】
ＣＯＣフィルムを用いてマイクロチャネルを続いて密閉させる。マイクロチャネルを設けるプレート及びフィルムを、シクロヘキサン蒸気に曝すために、蓋をしたペトリ皿に入れたシクロヘキサン浴上に４分間置いた後、６０℃、５０ｋＰａで２０分間互いに加圧させる。チャネルの幅は１００μｍであり、それらの深さは５０μｍである。十字の各枝の先端にあるリザーバは、３ｍｍの直径及び５ｍｍの深さを有する。チップ内の流体を、十字の最も長い枝の先端から移動させるために、Ｔｙｇｏｎ（商標）チューブの一方を、チップのリザーバに接続し、他方はＭＦＣＳ  Ｆｌｕｉｇｅｎｔ（商標）圧力制御システムのリザーバに接続する。
【００８９】
水溶液（Ａ１又はＡ２）によるマイクロチャネルの処理は、次のとおりに行う：
初めに、マイクロチャネルに、圧力（（ΔＰ＝３．５×１０４Ｐａ（３５０ｍｂａｒ））で濾過した５００μＬのエタノールを充填する；
続いて、２×１０４Ｐａ（２００ｍｂａｒ）で５００μＬの１×ＰＢＳバッファによりマイクロチャネルをすすぐことによって、エタノールを除去する；
その後、５００μＬの処理溶液を１０４Ｐａ（１００ｍｂａｒ）の圧力で注入し、流動することなく室温で１時間インキュベートさせる；
最後に、チャネルを、１０４Ｐａ（１００ｍｂａｒ）の推進圧力において５００μＬのＰＢＳですすぐ。
【００９０】
アルコール溶液（Ｂ１又はＢ２）によるマイクロチャネルの処理は、次のとおりに行う：
ポリマーを含むアルコール溶液を上述のものと同じ条件下で直接注入する；
チャネルを、真空下で乾燥させた後、ＰＢＳ水溶液ですすぐ。
【００９１】
実施例９：実施例８で作製したマイクロチャネルにおける電気浸透性の測定
Yasui T.他、「プラスチックチップ上における非変性タンパク質のマイクロチップ電気
泳動用の低粘度ポリマー溶液の特性決定（Characterization of low viscosity polymer solutions for microchip electrophoresis of non-denatured proteins on plastic chips）」、Biomicrofluidics, Vol. 5, Issue 4, page 044114に記載されているように、電流測定法によって、電気浸透特性を測定する。
マイクロチャネル、サンプルリザーバｉ、バッファリザーバｉｉ及びサンプル排出口リザーバｉｉｉに、第１のリン酸バッファ２０ｍＭ（ｐＨ＝７．５）を充填する；
バッファ排出口リザーバｉｖに、５倍に希釈したバッファ、すなわち、４ｍＭ（ｐＨ＝７．５）を充填する；
電圧源ＨＶＳ４４８  １５００Ｖ  Ｌａｂｓｍｉｔｈ（Livermore）を使用して、２７０Ｖ／ｃｍの電場を印加し、電気浸透性によってバッファの前線（buffer front）をバッファ排出口リザーバから移動させ、Labsmithにより供給されるソフトウェアを用いて電流を操作中に測定する；
プラトーに達するまでに必要な時間を用いて、電気浸透性の直鎖比率を測定する。この実験のために、３つの独立した測定を行った。
【００９２】
以下の表に記録した結果から、あらゆる場合において、本発明による処理によって、電気浸透性を低減させることが可能となることが示され、これは、マイクロチャネルの表面にある親水性ポリマーの層の永続的な存在に特徴づけられるものである。
【００９３】
【表６】
0006370369.tif 000007
【００９４】
実施例１０：ＣＯＣから作られているマイクロチャネルの溶液Ｂ２による処理の、タンパク質の吸着に対する効果
モールドの形状を、３ｃｍの長さ及び５００μｍの幅を有する単純な直線チャネルを示すものとした以外は実施例８に記載されるものと同じプロトコルに従って、単純な直鎖チャネルを作製した。
【００９５】
実施例８に記載したプロトコルに従った、溶液Ｂ２によるマイクロチャネルの表面の処理後、マイクロチャネルを、５００μＬの１×ＰＢＳの循環によって充填する。ＢＳＡ（Life Technologies（商標）による蛍光性ウシ血清アルブミン）の０．１重量％懸濁液溶液（１×ＰＢＳ中）をその後、チャネルに１０３Ｐａ（１０ｍｂａｒ）の圧力で投入し、周囲温度で１０分間インキュベートさせる。チャネルを続いて、１０ｍｂａｒの圧力下において、タンパク質を含まない１×ＰＢＳで１０分間すすぐ。Ｃｏｏｌｐｉｘ  Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）カメラ、ＨＧＦＩＬ（商標）１３０Ｗランプ及び１セットのＦＩＴＣ（商標）フィルタを備えるＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）顕微鏡を２００ｍｓの固定露光時間で用いて、インキュベーション前後のマイクロチャネルの蛍光を記録する。３つの異なる測定を、各条件について異なる点において行い、シグナルをカメラのバックグラウンドノイズ及びＣＯＣの自己蛍光（マイクロチャネルの外側で記録される）で補正した。処理の可逆的な性質を評価するために、また表面が悪影響を受けていないことを確認するために、結果に重大な変化を生じさせることなく、タンパク質を固着させ、ＰＢＳですすぎ、アルコールで乾燥させた後に、再度処理するというサイクルを３回行った。以下の表に記録したものから、本発明による処理が、表面、特に疎水性表面に強く付着することが知られているこのタンパク質の吸着を大きく低減させることが明らか
である。
【００９６】
【表７】
0006370369.tif 000008
【００９７】
実施例１１：マイクロチャネル内におけるミクロ粒子の吸着
ビーズのコロイド安定性を確実なものとするために、蛍光タンパク質の溶液を、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０（商標）を豊富に含むＰＢＳに溶解させた０．１３ビーズ／μＬの濃度における７０μＬのマイクロビーズ溶液（「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈ」）で置き換えた以外は実施例１０に関するものと同じプロトコルを使用した。
【００９８】
初めに、この溶液を１００ｍｂａｒで投入し、その後、ビーズの沈降を促すよう１μＬ／分の流量とするために圧力を低減した。最後に、吸着していないビーズを、３００ｍｂａｒの圧力において、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０（商標）を豊富に含むＰＢＳの溶液ですすぐことによって除去した。
【００９９】
未処理のマイクロチャネル及び溶液Ｂ２で前処理したマイクロチャネルの画像を、１０倍の対物レンズを備える実施例１０に記載したものと同じ顕微鏡を用いて撮り、ビーズを計数するために、自動処理にかけた。表１０．１の３段目に挙げられる結果から、処理が、ミクロ粒子の吸着を飛躍的に低減させることが示される。
【０１００】
実施例１２：ポリマー１及びポリマー２のＣＭＣの決定
ＣＭＣは、１０−８％〜１％で様々な値をとる１×ＰＢＳバッファにおけるポリマーの一連の希釈溶液を用いたウィルヘルミー（Wilhelmy）プレート法（Ｋ１０装置、Kruss）によって求める。２つのポリマーについて、この方法で求めたＣＭＣは、ポリマーの０．５重量％〜２×１０−３重量％である。
【０１０１】
実施例１３：細胞の付着を容易にするための、帯電ポリマータイプの本発明によるポリマーの使用
本研究は、１４５μｍの厚みを有するＴｏｐａｓ  ８００７  ＣＯＣシートからなるＣＯＣから作られている開曲面上で行った。開曲面を、２ｍｍ×４ｍｍの寸法で切り出し、顕微鏡の下でのその取扱いを容易にするために、ＵＶ照射により硬化し得る接着剤（ＮＯＡ８１、Ｎｏｒｌａｎｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ）で、ＳｔａｒＦｒｏｓｔスライドガラスに接着させた。ＵＶランプ（Fisher Scientific）による照射時間（insolation time）は１０分を使用する。
【０１０２】
処理剤の選択：
現行の技術水準の参照として、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ、平均分子量  約９００００、Sigma Aldrich）と、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ、分子量：１５００００〜３０００００、濃度：０．０１％、滅菌濾過済、Sigma Aldrich）との二重層の形態の処理剤を利用する。ＨＥＣ処理剤は、生体適合性であり、ＣＯＣに吸着して、親水性とする（処理したＣＯＣの接触角＝５６°）。ＰＬＬは、ＨＥＣで処理したＣＯＣに吸着し、その上に、ガラスへの細胞の付着を改善させる正の電荷をもたらす。
【０１０３】
本例では、２つの本発明による帯電ポリマーを使用した：
ＤＭＡＭ−Ｃ２２  Ｍポリマーの別のバッチは、１０％のアニオン性電荷（スルホン酸ナ
トリウム）でグラフト化し、ポリマーの第３のバッチは、１０％のカチオン性電荷（塩酸第三級アミンタイプ）でグラフト化させた。それ故、アニオン性ポリマーを使用して、ＰＬＬを、ＣＯＣの表面にくっつけることができ、カチオン性ポリマーを単独で使用することも可能となった。
【０１０４】
スライドの作製：
ＣＯＣの表面を処理するために、以下の溶液を調製した：
溶液１：１×ＰＢＳ中の２重量％のＨＥＣ
溶液２：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中の０．１重量％の中性ＤＭＡＭ−Ｃ２２  Ｍ（実施例３に記載のポリマー３）
溶液３：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中の０．１重量％のアニオン性ＤＭＡＭ−Ｃ２２（実施例４に記載のポリマー４）
溶液４：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中の０．１重量％のカチオン性ＤＭＡＭ−Ｃ２２（実施例５に記載のポリマー５）。
【０１０５】
ポリマー溶液を、ＣＯＣ上で一晩インキュベートした後、５０μＬの１×ＰＢＳで一回すすぎ、その後、１×ＰＢＳ浴中で５分間すすいだ。
【０１０６】
溶液１、溶液２及び溶液３で処理したＣＯＣスライドを続いて、５％のＣＯ２を含む湿潤雰囲気の恒温器内において３７℃でＰＬＬの溶液で２時間処理した後、１×ＰＢＳですすいだ。
【０１０７】
溶液４で処理したＣＯＣスライドを、ＰＬＬを用いずに直接使用した。
【０１０８】
撮像を容易にするよう５０μＬの体積の細胞を局在化するために、また細胞の付着のための表面積を限定するために、スライド毎に、シリコーンマイクロチャンバを接着した。
【０１０９】
２０００細胞／μＬの濃度の上皮細胞の１０μＬの溶液（ＭＣＦ−７株、乳癌）を、各チャンバに注入した。
【０１１０】
５％のＣＯ２を含む湿潤雰囲気の恒温器内で２４時間培養した後、基材に付着しなかった細胞を除去するために、スライドを、１×ＰＢＳで２回洗浄した。ＣＯＣに付着した細胞を続いて、３．７％のパラホルムアルデヒド溶液中で３０分間固定させた。固定後、スライドを１×ＰＢＳで２回洗浄した。
【０１１１】
ＥｐＣＡＭ−ＦＩＴＣ標識化＋ＤＡＰＩ／Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ：
処理の効果を比較するために、蛍光で標識化した後にスライドにくっつけた細胞を、蛍光顕微鏡によって観察した。細胞膜を、抗ＥｐＣＡＭ抗体（２０μＬのＥｐＣＡＭ  Ａｂ＋５００μＬのＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）で、周囲温度で３０分間標識化した。続いて、第１の洗浄を１％のＢＳＡを含む５０μＬの１×ＰＢＳ溶液で行った後、１×ＰＢＳの浴内において周囲温度で５分間洗浄した。最後に、一滴のＤＡＰＩ／Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを、細胞の各スポットに塗布し、５０ｍｍ×２４ｍｍの寸法を有するカバーガラスで全て被覆した。蛍光画像（ＤＡＰＩ＋ＦＩＴＣ）が得られるまで、サンプルを４℃で保持した。
【０１１２】
結果：
ＨＥＣ＋ＰＬＬ溶液は、ＣＯＣの表面への細胞の付着を改善させる。他方、この処理剤は、ＭＣＦ−７細胞の培養に適しないように思われる。本発明者らによる実験では、本発明者らは、ＣＯＣに付着する細胞の低い密度を観測した。多くの細胞は、破裂したか、又はアポトーシスプロセスを経たと思われ、ＥｐＣＡＭ標識化によって視認できる膜は、図２ａに見られるように明確に定義されることも、観測されることもない。
ＣＯＣ＋ＤＭＡＭ−Ｃ２２  Ｍ（０．３５％）＋ＰＬＬでは、ＦＩＴＣチャネル内の高バックグラウンドノイズ、細胞の好適な密度ではあるが多くが溶解した細胞又はアポトーシス細胞であることが観測される。この処理剤は、細胞をＣＯＣにくっつけるための良好な候補となるが、それらの培養についてはそうではないと思われる。
ＣＯＣ＋アニオン性ＤＭＡＭ−Ｃ２２＋ＰＬＬでは、バックグラウンドノイズが低いことから、この処理剤が抗体の非特異的な吸着を促さないことが示される。しかしながら、ＣＯＣの表面にくっつく細胞の密度は低いため、細胞の基材への付着が困難であることが示唆される。準アポトーシス（Semiapoptotic）細胞ではあるが、溶解していない細胞も観察された。
カチオン性ＤＭＡＭ−Ｃ２２処理剤（ＰＬＬを含まず）は、付着及びＭＣＦ−７細胞の分裂を促すのに好適なものと思われる。好適な細胞密度、及び分裂細胞に特徴的な、細胞のダブレット又はマルチプレットが、図２ｂに観察される。
【０１１３】
それ故、本発明による帯電ポリマーは、細胞の付着を改善させるのにカチオン性ポリマーと組み合わされるか又は細胞の培養を促すのに単独で使用される、アニオン性形態で現行の技術水準に対する改善に寄与することができることが見出された。
【図１】
0006370369.tif 000009
【図２ａ】
0006370369.tif 000010
【図２ｂ】
0006370369.tif 000011