(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)2-エチルヘキシルベンゾエート、2-エチルヘキシルパルミテート、2-エチルヘキシルココエート、2-エチルヘキシルステアレート、2-エチルヘキシルアセテートからなる群から選択される少なくとも1種の2-エチルヘキシルエステル;b)エチルアルコールおよびイソプロピルアルコールからなるアルコールを含み、2-エチルヘキシルエステルの濃度が50%であり、アルコールの濃度が35%のエチルアルコールおよび15%のイソプロピルアルコールであり、前記百分率は、組成物の全体積に対する体積百分率である、脱水およびダイアファニゼーション用組成物。
【請求項２】
a)2-エチルヘキシルベンゾエート、2-エチルヘキシルパルミテート、2-エチルヘキシルココエート、2-エチルヘキシルステアレート、2-エチルヘキシルアセテートからなる群から選択される少なくとも1種の2-エチルヘキシルエステル;b)エチルアルコールおよびイソプロピルアルコールからなるアルコールを含み、2-エチルヘキシルエステルの濃度が30〜70%の範囲であり、エチルアルコールの濃度が20〜60%の範囲であり、イソプロピルアルコールの濃度が10〜30%の範囲であり、前記百分率が組成物の全体積に対する体積百分率である組成物の、生体試料プロセシングにおける脱水およびダイアファニゼーションのための使用。
【請求項３】
2-エチルヘキシルエステルの濃度が50%であり、アルコールの濃度が35%のエチルアルコールおよび15%のイソプロピルアルコールであり、前記百分率は、組成物の全体積に対する体積百分率である、請求項2に記載の使用。
【請求項４】
生体試料が、組織学的試料、細胞学的試料、検死試料からなる群から選択される、請求項2または3に記載の使用。
【請求項５】
生体試料が、顕微分析、免疫組織化学的分析、ISH、FISH、CISH、PCRの分子生物学技法に基づく分析にかけられる試料である、請求項2から4のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
a)2-エチルヘキシルベンゾエート、2-エチルヘキシルパルミテート、2-エチルヘキシルココエート、2-エチルヘキシルステアレート、2-エチルヘキシルアセテートからなる群から選択される少なくとも1種の2-エチルヘキシルエステル;b)エチルアルコールおよびイソプロピルアルコールからなるアルコールを含み、2-エチルヘキシルエステルの濃度が30〜70%の範囲であり、エチルアルコールの濃度が20〜60%の範囲であり、イソプロピルアルコールの濃度が10〜30%の範囲であり、前記百分率が組成物の全体積に対する体積百分率である組成物での生体試料の脱水およびダイアファニゼーションの段階を含む、生体試料プロセシングのための方法。
【請求項７】
2-エチルヘキシルエステルの濃度が50%であり、アルコールの濃度が35%のエチルアルコールおよび15%のイソプロピルアルコールであり、前記百分率は、組成物の全体積に対する体積百分率である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記段階が、30℃〜80℃の範囲の温度、または室温で行われる、請求項6または7に記載の方法。
【請求項９】
前記生体試料が、組織学的試料、細胞学的試料、検死試料からなる群から選択される、請求項6から8のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織学的試料、検死試料、細胞学的試料をプロセシングするための組成物に関する。特に、本発明は、組織学的試料、検死試料、細胞学的試料または同様の試料をプロセシングするための組成物であって、有害でなく、有毒でなく、かつ簡潔に生体試料の脱水およびダイアファニゼーション(diaphanization)の両方を生じさせることができる、組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
病理解剖学で使用される分析前手順は、試料を固め、この試料を切断して分析される切片にすることを可能にする、例えば、患者または検死によって回収される組織または細胞からなるホルマリンで予備固定化された生体試料処理の一段階(またはプロセシング段階)をもたらす。
【０００３】
生体試料のプロセシングフェーズは一般に、以下の段階、すなわち、a)固定段階、b)脱水段階、c)ダイアファニゼーション段階、d)包埋段階を含む。
【０００４】
固定段階では、例えば、手術室または解剖室または外科室から得られる解剖学的部分は、固定剤液、一般に、後の組織学的または免疫組織化学的分析の特質に応じて、10%の緩衝ホルマリン、またはアルコール、または他の特定の固定剤中に浸漬される。この段階の機能は、タンパク質変性を停止し、タンパク質鎖の脱離を防止することである。したがって、固定は、組織構造を維持する目的を有する。
【０００５】
脱水段階は、生体試料から水を除去すること(ホルマリンは、ホルムアルデヒドの水溶液である)、およびパラフィン中に生体試料を包埋することからなり、パラフィンは、水中で不溶性である。この段階は、無水水溶性溶媒中に試料を浸漬することによって実施される。
【０００６】
ダイアファニゼーション段階は、生体試料がその後パラフィン中に包埋されることを可能にする。この目的のために、この段階で水溶性溶媒を置換する、含浸剤(例えば、パラフィン)と適合性の溶媒が使用される。例えば、ダイアファニゼーション剤(diaphanizing agent)は、パラフィン溶媒、キシレンまたはキシレン代替物、例えば、D-リモネン、イソパラフィン、オクタン、アセトンなどである。
【０００７】
最後に、試料は、約54〜58℃で融解したパラフィン中に試料を浸漬することで構成される、パラフィン中に包埋する段階に付される。この段階において、組織中に含有されたダイアファニゼーション溶媒は、パラフィンによって置き換えられる。試料をタイル内に含めた後、顕微鏡で観察するために所望のミクロンサイズでミクロトームを用いた切片の切断を実施することを可能にする試料冷却および固化が実施される。
【０００８】
現在、試料プロセシングは、各試薬中の永続性の時間、温度、圧力、および真空をプログラムすることを可能にするデバイスによって自動的に実施される。一般にステーションは、12または15であり、全プロセシング段階の平均時間は、12〜18時間である。時間は、組織のタイプに依存する。慣例的な標準方法によって、プロセシングは、生物組織を脱水するために、漸増グラデーションを有するエチルアルコール中の諸工程によって実施される。諸工程は、先に50%のエチルアルコール中、次いで後続の工程で70%のエチルアルコール中、後に80%のエチルアルコール中、次いで90%のアルコール中で実施され、後に96%のアルコール中の3工程が実施され、99.99%の無水アルコール中の3工程が実施される。この段階の最後で、試料の組織中のすべての水がエチルアルコールで置き換えられる。
【０００９】
後の諸工程は、アルコールをパラフィンと適合性の溶媒と置き換える目的を有するダイアファニゼーション段階に対応する。一般に、この段階では、第1の工程でアルコールを放出した後、組織は、清潔な溶媒を含む別のステーションに渡される必要があるので、キシロールまたはその代替物が使用され、3つの異なるステーション内で3工程が実施される。
【００１０】
最後に、包埋段階において、組織は、54〜58℃で溶融したパラフィンの3または4ステーションでプロセシングされる。
【００１１】
要約すると、現況技術は、10%のホルマリン中に固定した後、以下の工程および時間を生じる:
1.00時間  50%のアルコール
1.00時間  70%のアルコール
1.00時間  80%のアルコール
1.00時間  96%のアルコール
1.00時間  96%のアルコール
1.30時間  99.99%のアルコール
1.30時間  99.99%のアルコール
1.00時間  キシロールまたは代替物
1.00時間  キシロールまたは代替物
1.30時間  キシロールまたは代替物
1.30時間  パラフィン
2.00時間  パラフィン
2.00時間  パラフィン。
【００１２】
上述したものに基づくと、公知の方法は、いくつかの不利点、すなわち、アルコール、キシロールまたはその代替物の漸増グラデーションの準備を必要にする、異なる試薬の使用;高度に揮発性の溶媒(アルコール、oキシロール)の使用;アレルギーを引き起こす物質、例えば、キシロール、トルオール、オクタン、d-リモネン、テルペンチン、アセトン、イソパラフィンなど、またはオペレーターに有害で、いくつかの場合では有毒である物質、例えば、キシロール、トルオール、オクタン、アセトン、イソパラフィンの使用;プロセシングのための長い時間および多数のステーションが準備されることを提起することが明白である。
【００１３】
アルコール、およびキシロールまたはキシロール代替物の代わりに、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、および原油に由来する炭化水素、例えば、オクタンまたはイソパラフィンの混合物を使用する、プロセシングの他の方法も公知である。特に、EP0822403およびEP1508026の特許には、試料の脱水およびダイアファニゼーションを同時に実施することを可能にする混合物の使用に基づく組織プロセシングのための方法が記載されている。このような混合物は、オクタン(またはイソパラフィン)、イソプロピルアルコール、およびエタノールによって構成される。しかし、これらの方法が試料プロセシング時間を低減しても、これらは、高い揮発度、ならびにオペレーターおよび環境に対する有害性を有するオクタンまたはイソパラフィンなどの物質を使用するという深刻な不利点を提起する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】EP0822403
【特許文献２】EP1508026
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上記を考慮して、したがって、公知の試薬の不利点を克服することができる新しい試薬を提供する必要性が明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の発明者らは、現在、2-エチルヘキシルベンゾエート、2-エチルヘキシルパルミテート、2-エチルヘキシルココエート、2-エチルヘキシルステアレート、2-エチルヘキシルアセテート、好ましくは2-エチルヘキシルベンゾエートからなる群から選択される2-エチルヘキシルエステルが、ダイアファニゼーション能力を有することを見出した。したがって、本発明者らは、分析にかけられる生体試料をプロセシングするための脱水およびダイアファニゼーション組成物であって、ヒトに対して発癌性の多環式芳香族炭化水素を含まない、組成物を調製した。本発明による組成物は、公知の試薬と異なり、仕事中の化学剤、物理剤、および生物剤中の曝露に由来するリスクに対する労働者保護に関する、ならびに労働者の安全性および健康の改善に関係する欧州指令に従って、オペレーターに有害でも有毒でもない。さらに、本発明の組成物は、仕事場の安全性に関する欧州指令に常に従って低い揮発度、およびより高い環境尊重に関して高い生分解性(約88%)を与える。
【００１７】
本発明による組成物を使用すると、特に試料プロセシング時間を低減し、プロセシングの段階を単純化することが可能になる。本発明による組成物は実際に、脱水段階およびダイアファニゼーション段階の公知の試薬に取って代わる。したがって、直接に、または10%のホルマリン中で固定した後、試料は、唯一の試薬として本発明の組成物でプロセシングされ、エチルアルコール中の脱水、ならびにキシロールおよびその代替物中のダイアファニゼーションという別個のフェーズを回避する。さらに、本発明の方法によれば、プロセシングステーションは、3つに低減され、試薬中の永続性の平均時間は、1.30時間である。より正確には、固定後の組織プロセシングは、それぞれ1.30時間にわたる、3つの異なるステーションにおける同じ試薬中の組織の3つの工程、および次いでパラフィン中の包埋フェーズに渡すことを含む。
【００１８】
したがって、先行技術に対してプロセシングの時間は、慣例的なプロセシングの15〜18時間に対して、完全なプロセシングについて約9時間に低減される。高百分率の脂質物質を有し(したがってクリティカルな)および4mmの厚さを有する組織に適用される、本発明によるプロセシングの例を以下に報告する。低百分率の脂質物質を有し、より薄い厚さを有する組織は、プロセシング時間およびステーションを顕著に低減する。
【００１９】
固定後の本発明の組成物を使用するプロセシングは、以下のステーションおよび時間を含み得る:
1.30時間  本発明の試薬対象;
1.30時間  本発明の試薬対象;
1.30時間  本発明の試薬対象;
1.30時間  パラフィン;
1.30時間  パラフィン;
1.30時間  パラフィン。
【００２０】
小さい生検のための代替として、本方法は、
5分  本発明の試薬対象;
5分  本発明の試薬対象;
5分  本発明の試薬対象;
5分  本発明の試薬対象;
5分  パラフィン;
5分  パラフィン
を含み得る。
【００２１】
本発明による組成物を利用することによる生体試料プロセシングが使用された実験的試行では、組織の細胞構造の改善、すなわち、診断用化合物の形態および染色の保存が観察された。この理由で、多数の比較試行が実施された事実が強調されるべきであり、すなわち、各試料は、より多くの部分に分割され、試料の1つの部分は、従来の方法に従ってプロセシングにかけられ、一方、別の部分は、本発明の組成物対象でプロセシングにかけられた。従来の方法および本発明の組成物対象の両方によって得られた結果を比較すると、本発明の組成物対象でプロセシングされた試料は、切断および染色後に、顕微鏡下でより明らかに、かつより良好に区別されて現れるという結果が実証された。細胞構造は、よりはっきりと現れ、したがってより容易な読みおよび診断の解釈を可能にする。同じ時間の処理を使用して比較したさらなる免疫組織化学的試験を実施した(同じ時間の抗原回収、抗体インキュベーション、検出システム、および発色)。抗原-抗体反応の陽性および陰性に関する限り、結果は重複し、さらに、本発明の組成物対象でプロセシングした試料は、顕微鏡段階で抗原-抗体陽性部位におけるより良好な発色解像力を与えた。したがって、本発明によるプロセシングは、特に、陽性の組織範囲についての定量分析が実施される必要がある場合において、診断をより信頼できるものにする。
【００２２】
したがって、2-エチルヘキシルベンゾエート、2-エチルヘキシルパルミテート、2-エチルヘキシルココエート、2-エチルヘキシルステアレート、2-エチルヘキシルアセテートからなる群から選択される少なくとも1種の2-エチルヘキシルエステル;b)エチルアルコールおよび/またはイソプロピルアルコールを含み、またはこれらからなる組成物は、本発明の具体的な目的である。イソプロピルアルコールは、刺激物と見なされ、高度に揮発性であり、したがって、これを少し使用することがより良好であるので、低百分率のイソプロピルアルコールとのエチルアルコールの混合物が使用されることが好ましい。しかし、試料は、エチルアルコールのみと2-エチルヘキシルエステル、好ましくは2-エチルヘキシルベンゾエート、またはイソプロピルアルコールのみと2-エチルヘキシルエステル、好ましくは2-エチルヘキシルベンゾエートを含有する組成物でもプロセシングすることができる。
【００２３】
本発明による組成物中で、好ましくは、2-エチルヘキシルエステル、好ましくは2-エチルヘキシルベンゾエートの濃度は、30〜70%の範囲であり、エチルアルコールの濃度は、20〜60%の範囲であり、イソプロピルアルコールの濃度は、10〜30%の範囲であり、前記百分率は、組成物の全体積に対する体積百分率である。好適な実施形態によれば、2-エチルヘキシルエステル、好ましくは、2-エチルヘキシルベンゾエートの濃度は、50%であり、35%のエチルアルコールおよび15%のイソプロピルアルコールであり、前記百分率は、組成物の全体積に対する体積百分率である。
【００２４】
本発明の代替の実施形態によれば、2-エチルヘキシルエステルは、55〜70%の濃度のグルタル酸ジイソブチルまたはグルタル酸ジメチル、10〜30%の濃度のアジピン酸ジイソブチルまたはアジピン酸ジメチル、および10〜25%の濃度のコハク酸ジイソブチルまたはコハク酸ジメチルの混合物によって置き換えることができ、前記百分率は、ジイソブチルまたはジメチルのグルタル酸エステル、アジピン酸エステル、およびコハク酸エステルの混合物の全体積に対する体積百分率である。
【００２５】
生体試料、例えば、組織学的試料、細胞学的試料、検死試料、または同様のもののプロセシングのための上記に定義した組成物の使用は、本発明のさらなる目的である。前記試料は、本発明によるプロセシングの後、顕微分析、免疫組織化学的分析、ISH、FISH、CISH、PCRの分子生物学技法に基づく分析にかけることができる。
【００２６】
本発明はさらに、上記に定義した組成物を用いた、生体試料、例えば、組織学的試料、細胞学的試料、検死試料などの生体試料処理の段階を含み、またはそれからなる、生体試料をプロセシングするための方法に関する。本発明の方法によれば、試料処理は、20〜30℃から80℃の範囲の温度、または室温で行うことができる。
【００２７】
生体試料のダイアファニゼーション剤としての2-エチルヘキシルベンゾエート、2-エチルヘキシルパルミテート、2-エチルヘキシルココエート、2-エチルヘキシルステアレート、2-エチルヘキシルアセテート、2-エチルヘキシルベンゾエート、好ましくは、2-エチルヘキシルベンゾエートからなる群から選択される少なくとも1種の2-エチルヘキシルエステルの使用は、本発明のさらなる目的である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
次に本発明を、その好適な実施形態に従って、例示的であるが限定的でない方法によって説明する。
【実施例１】
【００２９】
厚さ約1mmおよび長さ1cmの小さい生検(肺、腎臓、肝臓)のプロセシング。
実施直後の生検採取物(内視鏡または経皮的な方法によって行ったTAC)を、本発明の組成物(50%のアルコール混合物+50%の2-エチルヘキシルベンゾエート)中に1時間(試料が既にホルマリン中に固定されているか否かにかかわらず30分間)直ちに浸漬する。全プロセシングは、30分の固定、本発明の組成物対象中でそれぞれ約7分の3工程、58℃で融解したパラフィン中でそれぞれ約5分の2工程を含む。したがって、試料をパラフィン中に包埋し、ミクロトームによって切断する。得られた切片を60℃で約20分間ストーブ上に置く。後に、ヘマトキシリンおよびエオシンで予備染色を実施する(スライドのアセンブリングを含んだ染色段階は、約1時間の標準継続時間を有する)。したがって、スライドを顕微鏡下で眺める。
【００３０】
結論:生検採取の時点から診断構築(暫定的であっても、しかしいずれにしても、形態学的な)の時点まで、「固定された」生検でない場合、わずか3時間が必要であり、既に「10%のホルマリン中で固定されて」実験室に到着した生検の場合では、約2時間半が必要である。
【００３１】
同じ生体試料の一部分を、イソプロピルアルコール、エチルアルコール、およびオクタン、または代替として、イソパラフィンを含有する溶液でプロセシングにかけた。本発明の組成物対象でプロセッシングした試料は、ヘマトキシリン-エオシンで組織化学的染色をした後、形態学的観点および色収率の両方から、より高い構造を示した。したがって、より高い解像力の細胞構造詳細を観察することができた。さらに、免疫組織化学的試験により、結果は、抗原-抗体反応の陽性および陰性に関して重複することが示された。さらに、本発明の組成物対象でプロセシングした試料は、顕微鏡段階において、陽性抗原-抗体部位における発色の解像力がより良好であった。したがって、本発明によるプロセシングは、特に、診断目的のために、陽性の組織範囲についての定量分析が実施されることが必要である場合において、診断をより信頼できるものにする。
【実施例２】
【００３２】
サイズが1cm×1cm×0.5cmの平行六面体形状を有する、見かけ上正常な組織による体積で約50%、および50%について見かけ上正常でない、すなわち病理学的な(可能性のある腫瘍)組織で構成された肺組織採取物のプロセシング。
手術室で回収した直後の組織試料を、上記で述べたサイズまで小さくし、約60分の3工程で、本発明の組成物(50%のアルコール混合物+2-エチルヘキシルベンゾエート)中に3時間浸漬する。
【００３３】
したがって、試料を、約1時間(それぞれ30分の2工程)にわたってパラフィン中に浸漬し、ミクロトームによって切断し、約20分間ストーブ上に置き、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する(約1時間の染色の継続時間)。
【００３４】
結論:手術室での採取から診断構築の時点まで、手術室から実験室まで材料を輸送するための平均時間を考慮しても、約6時間が必要である。
【００３５】
先の場合と同様に、試料を、イソプロピルアルコール、エチルアルコール、およびオクタンまたは代替としてイソパラフィンを含有する溶液でもプロセシングした。本発明の組成物対象でプロセシングした試料の結果は、オクタンを含有する組成物およびイソパラフィンを含有する組成物の両方で得られた結果に対して重複していると見なされた。免疫組織化学的試験により、先と同様に、本発明の組成物対象でプロセシングした試料は、顕微鏡段階において、陽性抗原-抗体部位における発色の解像力がより良好であることが示された。したがって、本発明によるプロセシングは、特に、診断目的のために、陽性の組織範囲についての定量分析が実施されることが必要である場合において、診断をより信頼できるものにする。同じ試験を従来のプロセシングによって実施したところ、結論は、同じであり、形態学的側面および免疫組織化学的反応は、本発明の組成物対象でのプロセシングの場合において明らかにより良好であった。