(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースポリマーの試料中のペプチドグリカン（ＰＧＮ）をアッセイする方法であって、
ａ）前記グルコースポリマーの試料をリゾチームにより酵素処理するステップと；
ｂ）前記処理された試料またはその希釈物を、外因性ＴＬＲ２受容体（Ｔｏｌｌ様受容体２）と、着色または蛍光タンパク質あるいは活性を測定可能なタンパク質をコードするレポーター遺伝子とを前記ＴＬＲ２受容体に関連したシグナル伝達経路の直接的依存の下で発現する組換え細胞と接触させるステップと；
ｃ）レポーター遺伝子シグナルを測定するステップと；
ｄ）前記試料中のＰＧＮの量を、前記ＰＧＮの量と前記レポーター遺伝子シグナルの強度との間の対応関係を示す較正曲線を用いて決定するステップと
を含み、
前記ＰＧＮの量と前記レポーター遺伝子シグナルの前記強度との間の前記対応関係を示す前記較正曲線が、ＰＡＭ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩を用いて作成される、方法。
【請求項２】
前記試料の前記酵素処理が、前記試料中に含まれる前記ＰＧＮを、特に前記ＴＬＲ２受容体を活性化することができるように断片化および脱凝集することを可能にする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料の前記酵素処理が、主に約１２０ｋＤａのサイズを有するＰＧＮを生成することを可能にする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料の前記処理が、３７．５％（重量／体積）のグルコースポリマー濃度の前記試料中における、３７℃の温度で３０分〜１６時間にわたる約２５０〜２５００Ｕ／ｍｌの濃度での前記リゾチームのインキュベーションを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料の前記処理が、３７．５％（重量／体積）のグルコースポリマー濃度の前記試
料中における、３７℃の温度で２時間にわたる約２５０Ｕ／ｍｌの濃度での前記リゾチームのインキュベーションを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記レポーター遺伝子が分泌型アルカリホスファターゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞がＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２系の細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が、必要に応じて、前記較正曲線の直線部分に対応する前記レポーター遺伝子のシグナルを生成するように希釈される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記試料がイコデキストリンの溶液の試料である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
グルコースポリマーの試料中のペプチドグリカン（ＰＧＮ）のアッセイを可能にするキットであって、
−  外因性ＴＬＲ２受容体（Ｔｏｌｌ様受容体２）と、着色または蛍光タンパク質あるいは活性を測定可能なタンパク質をコードするレポーター遺伝子とを前記ＴＬＲ２受容体に関連したシグナル伝達経路の直接的依存の下で発現する組換え細胞；および
−  ＰＡＭ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩；
−  任意選択的に、使用説明書、および前記試料を前処理するための溶液、特にリゾチーム型の酵素
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料、特にグルコースポリマーの試料中のペプチドグリカンのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
無菌炎症性エピソードは、治療目的に製造された製品を用いる治療（例えば、腹膜透析、非経口栄養法、静脈経路による注射）の過程で認められる主な合併症である。
【０００３】
これら炎症性エピソードの一部が化学的性質上の問題（化学汚染物質の偶発的存在または特定の化合物の不正確な用量）に関連するが、大部分の症例は、製造工程の過程で放出される微生物起源の汚染物質の存在に起因する。
【０００４】
現在では、リポ多糖（ＬＰＳ）およびペプチドグリカン（ＰＧＮ）が、製品中に痕跡程度に存在する場合、かかる炎症性エピソードを惹起する高いリスクを有する主な汚染物質であることは明確に確立されている。
【０００５】
ＬＡＬ（カブトガニ血球抽出成分（Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ））アッセイは通常、ＬＰＳを有する汚染物質を検出およびアッセイするため、多数の品質管理研究室によって用いられる。このアッセイは、カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ）の血リンパから抽出されるセンシング複合体による内毒素の認識に基づく。
【０００６】
無脊椎動物の血リンパの抽出物の反応性に基づく他のアッセイもまた、治療用途の製品（ＳＬＰ−Ｗａｋｏ，Ｉｍｍｕｎｅｔｉｃｓ）中のＰＧＮを検出するために現在提起されている。
【０００７】
しかし、これらのアッセイは、微生物起源の他の分子、例えばβ−グルカンとも反応することから、それほど特異的でないという不利益を有する。
【０００８】
さらに、これらの方法は、この用途に特化された機器を購入することを必要とし、それはコストを著しく増大させ、そのため、これらのアッセイ技法の利用を制限する。
【０００９】
さらに、ＬＰＳおよびＰＧＮは、それらの細菌起源に応じた可変構造を有し、それは炎症反応性における大幅な差に関与する。
【００１０】
そのため、均等な単位の標準分子（例えば、ＬＡＬアッセイにおける大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＬＰＳ）でアッセイの結果を表すことがさらに必要である。
【００１１】
さらに、これらの分子は高分子複合体の形態で存在することが最も多く、それは、そうした分子の溶解度および炎症可能性に影響する。
【００１２】
例えば、ＰＧＮは、サイズが極めて可変的であり、細菌壁の他の分子、例えばリポテイコ酸およびリポペプチドとともに凝集することが多い。
【００１３】
したがって、これらの分子に関連した炎症性負荷を専ら考慮するように「生物学的」方法が開発されている。
【００１４】
炎症性応答のエフェクター細胞は、感染病原体によって特異的に生成される分子構造を
認識するための特別なセンサを有する。
【００１５】
病原体関連分子パターン分子としてＰＡＭＰと称されるこれらの分子は、本質的にＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）およびＮＬＲ（Ｎｏｄ様受容体）によって認識され、その特異性は炎症性分子の異なるクラスの分子構造に関連している。
【００１６】
ＴＬＲ４型受容体によって認識されるリガンドであるＬＰＳに対して、ＰＧＮはＴＬＲ２型の膜受容体によって検出されるが、その最終の解重合生成物は細胞内受容体ＮＯＤ２によって認識される。
【００１７】
近年、炎症性応答の動物モデルを置き換える、インビトロ細胞アッセイが開発されている。
【００１８】
これらのアッセイの大部分は、汚染生成物の存在下での単球細胞のインキュベーションと、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ）の産生の逆滴定アッセイとに基づく。
【００１９】
しかし、血液から単離された初代細胞を用いるアッセイは、ドナーの個体間での大幅な可変性の影響を受け、それは実験バイアスに関与し得る。
【００２０】
それに対し、単球細胞株は一定の応答をもたらし、このことが、単球細胞株が一般に初代細胞に対して好ましい理由を説明する。しかし、これらの株がいずれも完全に妥当なわけではない。
【００２１】
例えば、サイトカインの選択は、大部分が一過性に発現され、培養物中のそれらの濃度が常に炎症性分子の現実的負荷を反映するとは限らないことから、批判されることが多い。
【００２２】
すべての単球細胞がＴＬＲ／ＮＬＲの大部分を発現することから、それらの使用に基づくアッセイは、汚染物質の１種に対して選択的でなく、全体的な炎症性応答をもたらすことになる。
【００２３】
さらに、主な問題は、異なる炎症性分子に対する細胞の感受性における差から生じる。
【００２４】
したがって、ＴＬＲ２リガンドのＰＧＮは、反応性がＬＰＳより著しく低く、それはこれらの手法による検出を困難にする。
【００２５】
事実、ＬＰＳは、ｎｇ／ｍｌのオーダーの濃度で有意な応答を誘導する一方、ＰＧＮでは類似の応答（ｗ／ｗ比）を得るのに１００倍高い濃度が必要である。
【００２６】
数年にわたり、トランスフェクト細胞株が、炎症性化合物の反応性を検出および定量するための生物検定における上記モデルを置き換えるものとして提起されている。
【００２７】
これらの非炎症性の株（例えば、ＨＥＫ−２９３）は、あるクラスの炎症性作動薬の特異的受容体をコードする遺伝子によって安定的にトランスフェクトされている。
【００２８】
非炎症性の株はまた、合成が炎症性受容体の活性化に依存する酵素（例えば、ルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼ）をコードするレポーター遺伝子用の発現ベクターを含有する。
【００２９】
したがって、適切な受容体を発現する細胞による汚染物質の認識は、酵素の合成を惹起することになり、その生成に続いて、その基質の着色または発光生成物への変換が生じることになる。
【００３０】
この生成物が容易に数量化できることから、この方法は汚染物質のタイプに関連した炎症性応答の迅速なアッセイを可能にする。
【００３１】
これらの細胞モデルは、サイトカインのＥＬＩＳＡアッセイの酵素アッセイとの置き換え、株の安定な特性によるアッセイでの高い再現性、発現される受容体の関数としての特定のクラスの炎症性分子の標的化、極めて低い閾値での汚染物質の検出という多数の利点を有する。
【００３２】
したがって、これらの細胞モデルは、所与のＴＬＲまたはＮＬＲの作動薬である炎症性因子を特異的に標的化し、またこの作動薬に関連した炎症性応答を定量することを可能にすることから、サイトカイン応答のインビトロアッセイを置き換えることが可能である。
【００３３】
例えば、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４を特異的に発現する細胞は、食品中の汚染物質を検出するために既に用いられている（Ｃｌｅｔｔ  Ｅｒｒｉｄｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  −  ＵＫ  ｉｎ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１０５／ｉｓｓｕｅ  ０１／Ｊａｎ  ２０１１，ｐｐ１５−２３の研究）。
【００３４】
さらに、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎなどの企業は現在、様々なＴＬＲまたはＮＲＬ受容体をトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３株（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標））といった広範な細胞を市販している。
【００３５】
これらの細胞は、レポーターとして、炎症性作動薬に対する応答の迅速かつ容易な比色分析を可能にする、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ：分泌された胚性アルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子を含有する。
【００３６】
これらのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞は、グルコースポリマーの濃縮溶液中の汚染物質の存在およびそれらの相乗効果を検出するために既に有効に用いられている（国際公開第２０１２／１４３６４７号パンフレット）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３７】
したがって、試料、特にグルコースポリマーの試料中の全ＰＧＮをアッセイする他の改善された方法を開発する必要性が常に存在する。
【課題を解決するための手段】
【００３８】
したがって、本発明は、試料、特にグルコースポリマーの試料中のペプチドグリカンをアッセイする生物学的方法に関する。
【００３９】
特に、本発明は、グルコースポリマーの試料中のペプチドグリカン（ＰＧＮ）をアッセイする方法であって、
ａ）グルコースポリマーの試料をリゾチーム型の酵素により酵素処理するステップと；
ｂ）処理された試料またはその希釈物を、外因性ＴＬＲ２受容体（Ｔｏｌｌ様受容体２）と、着色または蛍光タンパク質あるいは活性を測定可能なタンパク質をコードするレポーター遺伝子とをＴＬＲ２受容体に関連したシグナル伝達経路の直接的依存の下で発現す
る組換え細胞と接触させるステップと；
ｃ）レポーター遺伝子シグナルを測定するステップと；
ｄ）試料中のＰＧＮの量を、ＰＧＮの量とレポーター遺伝子シグナルの強度との間の対応関係を示す較正曲線を用いて決定するステップと
を含む、方法に関する。
【００４０】
好ましくは、試料の酵素処理は、試料中に含まれるＰＧＮを、特にＴＬＲ２受容体を活性化することができるように断片化および脱凝集することを可能にする。
【００４１】
特に、試料の酵素処理は、主に約１２０ｋＤａのサイズを有するＰＧＮを生成することを可能にする。
【００４２】
好ましくは、酵素処理は、リゾチーム型の酵素により行われ、その活性は、試料中のＰＧＮ複合体を脱凝集することを可能にする。実際に、本発明は、３０〜５０００ｋＤａのサイズ、特に約１２０ｋＤａのサイズの活性ＰＧＮを放出することに関係する。
【００４３】
具体的な酵素処理条件が、この目的で選択される。
【００４４】
好ましくは、酵素はリゾチームである。
【００４５】
１つの好ましい実施形態では、酵素は、約５０Ｕ／ｍｌ〜２５００Ｕ／ｍｌの濃度で用いられ、３７℃の温度で、３７．５％（重量／体積）のグルコースポリマー濃度の試料と１０分〜２０時間にわたり接触させられる。好ましくは、酵素は、約２５０Ｕ／ｍｌ〜２５００Ｕ／ｍｌの濃度で用いられ、３７℃の温度で、３７．５％（重量／体積）のグルコースポリマー濃度の試料と３０分〜１６時間にわたり接触させられる。
【００４６】
特に好ましい実施形態では、酵素はリゾチームであり、約２５０Ｕ／ｍｌの濃度で用いられ、３７℃の温度で、３７．５％（重量／体積）のグルコースポリマー濃度の試料と２時間にわたり接触させられる。
【００４７】
次に、このように処理された試料に対して、本発明に記載のＴＬＲ２受容体を発現する組換え細胞を伴うアッセイが施される。
【００４８】
好ましくは、ＴＬＲ２受容体を発現する組換え細胞は、分泌型アルカリホスファターゼをコードするレポーター遺伝子を有する。好ましい実施形態では、細胞は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２系の細胞である。
【００４９】
好ましくは、ＰＧＮの量とレポーター遺伝子シグナルの強度との間の対応関係を示す較正曲線は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ルテウス菌（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびアリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、好ましくは黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ルテウス菌（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、およびアリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）から選択される細菌由来のＰＧＮを用いて作成される。この較正曲線は、ＴＬＲ２の作動薬、好ましくはリポペプチド、特にＰＡＭ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩である内部標準を用いて標準化または較正してもよい。
【００５０】
他の好ましい方法では、ＰＧＮの量とレポーター遺伝子シグナルの強度との間の対応関
係を示す較正曲線は、ＴＬＲ２の作動薬、好ましくはリポペプチド、特にＰＡＭ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩である内部標準を用いて作成してもよい。実際に、全体的には意外にも、ＰＡＭ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩が異なる標準ＰＧＮに対するＴＬＲ２応答を較正することを可能にすることは本発明者らによって示されている。したがって、ｎｇ／ｍｌでのＰＡＭ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩の量は、ｎｇ／ｍｌでのＰＧＮの「補正された」量に対応する。したがって、較正曲線は、細菌起源および生成方法に応じて可変性を導入する標準ＰＧＮに依存する必要がなく、全体的に再現性のある方法でＰＡＭ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩を用いて作成してもよい。
【００５１】
任意選択的に、本方法は、ＴＬＲ２の作動薬、好ましくはリポペプチド、特にＰＡＭ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩である内部標準を用いて較正曲線を作成する予備ステップを含む。
【００５２】
本発明はまた、グルコースポリマーの試料中のペプチドグリカン（ＰＧＮ）をアッセイするためのキットであって、
−  外因性ＴＬＲ２受容体（Ｔｏｌｌ様受容体２）と、着色または蛍光タンパク質あるいは活性を測定可能なタンパク質をコードするレポーター遺伝子とをＴＬＲ２受容体に関連したシグナル伝達経路の直接的依存の下で発現する組換え細胞；および
−  ＰＧＮの量とレポーター遺伝子シグナルの強度との間の対応関係を示す較正曲線、またはＴＬＲ２の作動薬、好ましくはリポペプチド、特にＰＡＭ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩である内部標準のいずれか；
−  任意選択的に、使用説明書、および／または試料を前処理するための溶液、特にリゾチーム型の酵素
を含む、キットに関する。
【００５３】
特定の一実施形態では、キットは、
−  外因性ＴＬＲ２受容体（Ｔｏｌｌ様受容体２）と、着色または蛍光タンパク質あるいは活性を基質の有無にかかわらず測定可能なタンパク質をコードするレポーター遺伝子とをＴＬＲ２受容体に関連したシグナル伝達経路の直接的依存の下で発現する組換え細胞；および
−  ＴＬＲ２の作動薬、好ましくはリポペプチド、特にＰＡＭ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩である内部標準；
−  任意選択的に、使用説明書および／またはリゾチーム溶液
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】漸増濃度のＰＧＮの関数としての細胞応答の理論曲線。
【図２】ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ２細胞で得られた黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＰＧＮレベルの関数としての細胞応答の較正曲線。
【図３】異なる細菌種由来の漸増濃度のＰＧＮの関数としてのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ２細胞の応答。
【図４】ＰＡＭ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩（ＰＡＭ３（ｃｙｓ））の構造。
【図５】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＰＧＮの異なるバッチにより、またＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ２細胞内のＰＡＭ３（ｃｙｓ）により誘導される応答の比較。
【図６】補正されたＰＧＮ濃度の関数としてのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ２細胞の応答。
【図７】補正された活性ＰＧＮ濃度の関数としてのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ２細胞の応答の較正曲線。
【図８】リゾチームによる処理の期間の、グルコースポリマーの試料によって誘導される細胞応答に対する効果。
【図９】１０および１００μｇ／ｍｌのリゾチームによる処理後のグルコースポリマーの試料によって誘導される細胞応答の比較。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
したがって、本発明は、試料、特にグルコースポリマーの試料中のペプチドグリカンをアッセイするための生物学的方法に関する。
【００５６】
特に、本発明は、グルコースポリマーの試料中のペプチドグリカン（ＰＧＮ）をアッセイする方法であって、
ａ）グルコースポリマーの試料をリゾチーム型の酵素により酵素処理するステップと；
ｂ）処理された試料またはその希釈物を、外因性ＴＬＲ２受容体（Ｔｏｌｌ様受容体２）と、着色または蛍光タンパク質あるいは活性を基質の有無にかかわらず測定可能なタンパク質をコードするレポーター遺伝子とをＴＬＲ２受容体に関連したシグナル伝達経路の直接的依存の下で発現する組換え細胞と接触させるステップと；
ｃ）レポーター遺伝子シグナルを測定するステップと；
ｄ）試料中のＰＧＮの量を、ＰＧＮの量とレポーター遺伝子シグナルの強度との間の対応関係を示す較正曲線を用いて決定するステップと
を含む、方法に関する。
【００５７】
好ましくは、グルコースポリマーは、腹膜透析、経腸および非経口栄養法ならびに新生児の摂食を意図している。
【００５８】
好ましい実施形態では、試験されることになるグルコースポリマーは、イコデキストリンまたはマルトデキストリンである。
【００５９】
特に、グルコースポリマーは、腹膜透析用の調製を意図する場合がある。グルコースポリマーは、その調製の１つ以上の段階で、また特に原材料のレベルで、その調製方法における任意のステップで、および／または方法の最終生成物のレベルで試験してもよい。グルコースポリマーはまた、腹膜透析用の溶液の試料として試験してもよい。
【００６０】
本方法の第１ステップでは、グルコースポリマーの試料は、酵素的に処理される。
【００６１】
この処理の目的は、ＰＧＮを断片化し、および／または凝集体中に含有もしくは捕捉されるＰＧＮを脱凝集することであり、その目的は、ＴＬＲ２受容体と相互作用し、かつＴＬＲ２受容体を活性化させることが可能なＰＧＮを作成することである。
【００６２】
前述のように、この処理は、凝集体中に含有または捕捉されるＰＧＮを脱凝集させ、また大き過ぎるＰＧＮを断片化し、特に３０〜５０００ｋＤａのサイズを有する、特に約１２０ｋＤａの可溶性ＰＧＮを作成することを可能にするものとする。
【００６３】
しかし、この処理は、ＰＧＮがＴＬＲ２受容体と相互作用する能力に影響してはならない。それは、好ましくは、ＴＬＲ２と相互作用し、かつ受容体を活性化させることが可能な最大量のＰＧＮを放出するため、またＴＬＲ２上で既に活性を示す最大量のＰＧＮを貯えるため、最適化される。
【００６４】
一実施形態では、３７．５％（重量／体積）のグルコースポリマー濃度での試料の処理は、３７℃の温度でリゾチーム溶液によって実施される。
【００６５】
好ましくは、試料の処理は、３７．５％（重量／体積）のグルコースポリマー濃度の試料中における、３７℃の温度で１０分〜２０時間にわたる約５０Ｕ／ｍｌ〜２５００Ｕ／ｍｌの濃度でのリゾチームのインキュベーションを含む。
【００６６】
当然ながら、グルコースポリマー濃度が変化する場合、当業者は、それに応じて酵素の量および／またはインキュベーションの期間を適応させる必要がある。
【００６７】
好ましい実施形態では、３７．５％（重量／体積）のグルコースポリマー濃度の試料の処理は、３７℃の温度でのリゾチーム溶液によって実施される。次に、リゾチームは、２５０Ｕ／ｍｌ〜２５００Ｕ／ｍｌの濃度において３７℃の温度で３０分〜１６時間にわたり用いられる。好ましくは、リゾチームは、２５０Ｕ／ｍｌの濃度において３７℃の温度で２時間にわたり用いられる。
【００６８】
リゾチームは、例えばＥｕｒｏｍｅｄｅｘによって販売されている酵素である（基準：５９３４；初期：卵白色；活性：≧２５０００単位／ｍｇ）。しかし、当業者がまた、酵素活性および純度に関して同じ判断基準を満たす他のリゾチームを用いてもよいことは認められるべきである。
【００６９】
後のステップでは、試料および／またはその希釈物は、ＴＬＲ２受容体を発現する組換え細胞と接触させられる。この細胞は、始原細胞がＴＬＲ２を発現せず、ＴＬＲ２受容体、好ましくはヒトＴＬＲ２受容体をコードする核酸の導入によって改変されている細胞であることから、組換え体として認定される。
【００７０】
ＴＬＲ２受容体の活性は、前記受容体に関連したシグナル伝達経路の直接的依存の下にあるレポーター遺伝子を用いて検出される。好ましくは、このレポーター遺伝子は、着色または蛍光タンパク質あるいは活性を基質の有無にかかわらず測定可能なタンパク質をコードする。
【００７１】
特に、レポーター遺伝子は、アルカリホスファターゼをコードする。レポーター遺伝子は、特にアルカリホスファターゼの分泌型（ＳＥＡＰ：分泌型胚性アルカリホスファターゼ）を生成し得、その合成はＴＬＲ２に関連したシグナル伝達経路の直接的依存の下で行われる。
【００７２】
好ましい実施形態では、用いられる細胞株は、ヒトＴＬＲ２をコードするベクターの安定なトランスフェクションによって改変されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）系（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎによって販売）、すなわちＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２系である。しかし、当業者がまた、他の市販されている系（Ｉｍｇｅｎｅｘ）を用いるかまたはそれを調製してもよいことは認められるべきである。
【００７３】
細胞がＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２である場合、細胞は、好ましくは９６ウェルプレートに対して約５０，０００細胞／ウェルの密度で用いられる。
【００７４】
次いで、本方法は、レポーター遺伝子シグナルを測定するステップを含む。
【００７５】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２系を用いる好ましい実施形態では、シグナルは、アルカリホスファターゼの活性の尺度である。好ましくは、酵素反応は、アッセイ対象の培地に対するＳＥＡＰ試薬の比が１：３であること（例えば５０μｌの培地および１５０μｌのＳＥＡＰ試薬）を用いて行われる。さらに、少なくとも６０分の反応時間が好ましい。
【００７６】
最終的に、試料中のＰＧＮの量は、ＰＧＮの量とレポーター遺伝子シグナルの強度との間の対応関係を示す較正曲線を用いて判定される。
【００７７】
ＰＧＮ標準は、均等な単位の活性ＰＧＮにおける結果を表すように、好ましくはＴＬＲ２の作動薬である内部標準を用いて較正される。
【００７８】
内部標準は、リポペプチド、好ましくは合成物質、特にＰＡＭ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩（ＰＡＭ３（ｃｙｓ）、ＰＡＭまたはＰａｍはパルミチン酸を示す）であってもよい。
【００７９】
したがって、ＰＧＮの量とレポーター遺伝子シグナルの強度との間の対応関係を示す較正曲線は、ＴＬＲ２の作動薬、好ましくはリポペプチド、特にＰＡＭ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩である内部標準を用いて直接的に得てもよく、ｎｇ／ｍｌでのＰＡＭ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩の量はｎｇ／ｍｌでのＰＧＮの量に対応する。
【００８０】
他の方法では、ＰＧＮの量とレポーター遺伝子シグナルの強度との間の対応関係を示す較正曲線は、ＴＬＲ２の作動薬、好ましくはリポペプチド、特にＰＡＭ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩である内部標準を用いて標準化または較正してもよい。
【００８１】
この内部標準は、好ましくは合成物質であるか、または明確に規定された構造／組成を有する。較正または標準化は、各用量反応曲線の直線部分の勾配を比較することにより、また較正標準を用いて得られる曲線とＰＧＮ標準の曲線とを重ねることを可能にする補正因子を算出することにより行われる。
【００８２】
ＰＧＮの量とレポーター遺伝子シグナルの強度との間の対応関係を示すこの曲線はまた、ＴＬＲ２の作動薬、好ましくはリポペプチド、特にＰＡＭ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩である内部標準を用いて、特に同じ細胞、同じ条件下で漸増用量のＴＬＲ２作動薬の内部標準を用いて得てもよい。
【００８３】
ＰＧＮの場合と同様、較正曲線は、グルコースポリマーの不在下または好ましくはグルコースポリマーの存在下で得てもよい。
【００８４】
典型的には、較正曲線は、Ｓ字型の細胞応答を示す通常の曲線である（図１）。
−  部分（Ａ）は、ＴＬＲ２の有効な活性化を示す濃度を下回る、低濃度のＰＧＮを用いて得られた応答に対応する。したがって、この非直線領域は、本方法の検出限界閾値に対応する。本方法の可変性を含むように、この検出閾値は、暗雑音（刺激の不在下で得られる応答）の値として３回推定される；
−  部分（Ｂ）は、線形応答が認められることから最も興味深い。有効な応答を有するこの領域により、細胞応答とＰＧＮレベルとの間の直接的関係を決定することが可能になる。したがって、これはアッセイ領域である；
−  部分（Ｃ）は、過剰濃度のＰＧＮの存在下での細胞応答の飽和に対応する。事実、ＴＬＲ２受容体の飽和がみられる。
【００８５】
較正曲線の直線部分は、ＰＧＮの量がレポーター遺伝子シグナルに正比例する領域（部分Ｂ）に対応すると考えられる。
【００８６】
ＰＧＮで重度に汚染される可能性が高い試料の場合、常に直線領域内に位置するように、数回の連続希釈を行うことが必要になる。逆に、アッセイの感受性を高めることが所望
される場合、低濃度のＰＧＮは試料の濃縮ステップを必要とする。
【００８７】
任意選択的に、本方法は、ＴＬＲ２を発現しない、より一般的には生得免疫受容体を発現しない対照細胞を用いるアッセイをさらに含む。例えば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ２株を用いてもよい。これは対照株であり、その使用は、グルコースポリマーの試料が固有の機構によって酵素の生成を誘発しないことを検証するのに有用である。
【００８８】
本発明はまた、グルコースポリマーの試料中のペプチドグリカン（ＰＧＮ）のアッセイを可能にするキットであって、次を含むキットに関する。
−  外因性ＴＬＲ２受容体（Ｔｏｌｌ様受容体２）と、着色または蛍光タンパク質あるいは活性を基質の有無にかかわらず測定可能なタンパク質とをコードするレポーター遺伝子をＴＬＲ２受容体に関連したシグナル伝達経路の直接的依存の下で発現する組換え細胞。この細胞は、特に好ましくはＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２系である。キットはまた、負の対照として、生得免疫受容体を発現しない細胞、例えばＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ２系を含んでもよい；
−  ＰＧＮの量とレポーター遺伝子シグナルの強度との間の対応関係を示す較正曲線、またはＴＬＲ２の作動薬、好ましくはリポペプチド、特にＰＡＭ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩である内部標準のいずれか。任意選択的に、キットは、較正曲線と、ＴＬＲ２の作動薬、好ましくはリポペプチド、特にＰＡＭ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩である内部標準とを含んでもよい。あるいは、キットは、較正曲線とともに、この較正曲線の作成に用いられた微生物と同じものに由来する較正されたＰＧＮ標準を含んでもよい；
−  任意選択的に、使用説明書、試料を前処理するための溶液、レポーター遺伝子の応答の測定に用いられるべき試薬、マイクロプレートなど。キットは、特にリゾチームを含んでもよい。
【実施例】
【００８９】
アッセイは、ＴＬＲ２受容体を発現する株によるＰＧＮの特異的認識およびＴＬＲ２に関連したシグナル伝達経路の活性化を介して測定可能な酵素活性の生成に基づく。
【００９０】
細胞物質
このアッセイに関する実験においては、次の２つの株を用いる。
−  ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２（ＨＥＫ−ＴＬＲ２）株：可溶性ＰＧＮに対する強力な反応性を伴う、ＴＬＲ２リガンドに対する特異的応答。
−  ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ２（ＨＥＫ−Ｎｕｌｌ）株：試料の細胞傷害性効果に関連した非特異的応答。
【００９１】
この細胞を、供給業者（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）の推奨に従って培養する。７５％のコンフルエントで、細胞を０．２８×１０６細胞／ｍｌの密度で再懸濁する。刺激前、１８０μｌの細胞懸濁液を、培養ウェル（９６ウェルプレート）内、すなわち５０，０００細胞／ウェルで分布させる。次に、細胞を、２０μｌのグルコースポリマーの試料を３７．５％（重量／体積）（すなわち、３．７５％での試料の最終希釈）で添加することによって２４時間刺激する。２４時間刺激後、細胞応答を生成される酵素活性の定量化により測定する。
【００９２】
１  −  内部標準を用いたＰＧＮの生物検定用の較正曲線の確立
用量反応曲線は、異なる細菌種のＰＧＮを３７．５％（重量／体積）で調製した汚染されていないマルトデキストリン（Ｐ−１１．１１基準）の溶液で希釈することによって作成した。アッセイされるＰＧＮは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号７７１４０）、ルテウス菌（Ｍｉｃｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号５３２４３）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、＃ｔｌｒｌ−ｐｇｎｂ２）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、＃ｔｌｒｌ−ｐｇｎｅｋ）およびアリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）（株ＣＮＣＭＩ−４６８９）から抽出する。
【００９３】
得られた曲線は、細胞物質を用いて実施されるアッセイ（バイオアッセイ）において認められる応答として一般的である（図１および２）。０．２未満の吸光度値が細胞応答を誘導するには低過ぎるＰＧＮ濃度の証拠である一方、２を超える値はＴＬＲ２受容体の飽和に関連したプラトー効果を示す。したがって、吸光度のこれら２つの限界値間の領域のみが、ＳＥＡＰの生成と試料中に存在するＰＧＮの量との相関を可能にする。
【００９４】
認められる応答は、ＰＧＮの各種に関連した細胞反応性の大幅な可変性を示す。実際に、最大応答の５０％（ＥＣ５０）に等しい応答をもたらす濃度は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＰＧＮで約２０ｎｇ／ｍｌ、ルテウス菌（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）で１５００ｎｇ／ｍｌ、またアリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２からの抽出物で２０００ｎｇ／ｍｌ超である（図３）。
【００９５】
しかし、これらの差は、ＰＧＮがその細菌の起源に応じて異なる構造を有し、それが炎症反応性の大幅な多様性に関与することから想定された。これらの観察結果から、均等な単位の活性ＰＧＮにおける結果を表すことができるように、内部標準を規定することの重要性が強調される。
【００９６】
ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞の応答を変更する可能性が高い別の要素がＰＧＮのサイズであり、それはＴＬＲ２に対するその溶解度および反応性に影響することになる。したがって、抽出条件によりＰＧＮのサイズが変化し、ひいては部分的分解が生じ得ることから、これらの高分子を精製するための手順は、細胞の応答に多大な影響を有し得る。
【００９７】
したがって、ＰＧＮの可変性に関する誤差を回避し、また「活性」ＰＧＮの量として結果を表すように、較正曲線に対して内部標準を導入することが必要であると思われる。
【００９８】
ＰＡＭ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩（ＰＡＭ３（ｃｙｓ））は、細菌リポペプチドの構造を模倣するトリアシル化（ｔｒｉａｃｙｌａｔｅｄ）合成リポペプチドであり、ＴＬＲ２の強力な作動薬として作用する。それは均一な構造であることから、ＴＬＲ２受容体を発現する細胞の応答を較正するための正の対照として用いられることが多い（図４）。
【００９９】
この仮説を試験するため、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）から抽出したＰＧＮの３つの別々のバッチ：２つのＳｉｇｍａ製バッチ（カタログ番号７７１４０：バッチ１、０００１４４２７７７；バッチ２、ＢＣＢＨ７８８６Ｖ）および１つのＩｎｖｉｖｏＧｅｎ製バッチ（＃ｔｌｒｌ−ｐｇｎｓａ）によって誘導されるＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞の応答を、ＰＡＭ３（ｃｙｓ）によって誘導されるものと比較した（図５）。
【０１００】
結果によると、ＰＧＮの３つのバッチ間の反応性が可変であることが示される。実際に、３つのバッチにおけるＥＣ５０値は各々、４、２０および４００ｎｇ／ｍｌであった。これらのデータによると、同じ細菌種から抽出されるＰＧＮが、たとえバッチが同じ供給業者から入手され、理論的に同じ手順によって抽出された場合であっても、反応性に差があることを示し得るリスクが存在することが示される。想定どおり、細胞は、ＰＡＭ３（ｃｙｓ）に対して、ＥＣ５０が８ｎｇ／ｍｌであり、強力な反応性を示す。
【０１０１】
ＰＧＮの各バッチは、ＰＡＭ３（ｃｙｓ）に対して、各用量反応曲線の直線部分の勾配を比較することによって、またＰＧＮの曲線をＰＡＭ３（ｃｙｓ）の曲線に重ねるための補正因子を算出することによって較正してもよい。図６に示される例では、補正因子は、バッチ１、２および３に対して各々、０．４、２および４０で推定した。これは、ＰＡＭ３（ｃｙｓ）によって誘導される応答に一致する応答を得るのに、バッチ１からは２．５倍少ないＰＧＮが必要であるが、バッチ２からは２倍多いＰＧＮおよびバッチ３からは４０倍多いＰＧＮが必要であることを意味する。ＰＧＮの実際の量を補正後、すべての点が、ＰＡＭ３（ｃｙｓ）で得られる曲線に重ねられた１つの同じ曲線上に整列されることを認めることができる（図６）。したがって、この内部標準を用いることにより、ＰＧＮのすべてのバッチに対する補正濃度を得て、また「活性」ＰＧＮについて較正された用量反応曲線を確立することが可能になる。
【０１０２】
この方法を適用することにより、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞の応答の検量線は、０．０７ｎｇ／ｍｌ（すなわちグルコースポリマーで２ｎｇ／ｇ）の検出閾値および０．３〜２００ｎｇ／ｍｌ（すなわちグルコースポリマーで８〜５４００ｎｇ／ｇ）の活性ＰＧＮの濃度における直線領域を有する（図７）。
【０１０３】
２．グルコースポリマーの試料の酵素処理
リゾチームによる酵素処理の目的は、ＰＧＮがＴＬＲ２受容体を介した炎症性応答を誘導できるように、試料中に含まれるＰＧＮを断片化し、および／または脱凝集することである。特に、試料の酵素処理により、ＰＧＮの部分的解重合が生じ、３０〜５０００ｋＤａのサイズ、特に約１２０ｋＤａのサイズの可溶性ＰＧＮが生成する。しかし、酵素処理は、ＰＧＮがＴＬＲ２受容体と相互作用する能力に影響してはならない。酵素処理は、ＴＬＲ２と相互作用可能な最大量の可溶性ＰＧＮを放出し、また既にＴＬＲ２上で活性を示す最大量のＰＧＮを貯えるように、好ましくは最適化される。
【０１０４】
酵素処理の試験は、次の４つの標準試料に対して実施した。
（１）汚染されていないマルトデキストリン（基準Ｐ−１１．１１）の調製物、
（２）黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来の亜最適用量のＰＧＮ（最終２０ｎｇ／ｍｌ）で人為的に汚染されたＰ−１１．１１マルトデキストリン（Ｐ−１１．１１＋ＰＧＮと称する）の調製物、
（３）汚染されたイコデキストリン（基準Ｉ−２０９Ｊ）の調製物、および
（４）グルコースポリマーマトリックス（基準Ｅ１２４２）。
【０１０５】
【表１】
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【０１０６】
この処理は、グルコースポリマーの３７％（重量／体積）溶液に対して実施した。次に溶液を、細胞の存在下で、試験対象の２０μｌの溶液を１８０μｌの細胞懸濁液に添加することにより、１／１０に希釈した。
【０１０７】
これらの実験で用いたリゾチームは、Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘによって販売されている（基準：５９３４；初期：卵白色；活性：≧２５０００単位／ｍｇ）。
【０１０８】
初回試験は、２５０Ｕ／ｍｌ（１０μｇ／ｍｌ）の濃度でのリゾチームの存在下で、Ｐ
ＧＮ（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｉ−２０９Ｊイコデキストリンまたは１９２０−Ｅ１２４２ラブマトリックス（ｌａｂ  ｍａｔｒｉｘ）で汚染させたＰ−１１．１１マルトデキストリンの調製物をインキュベートすることによって実施した。処理は、３７℃で３０分〜１６時間の様々な時間にわたり実施した（図８）。細胞を刺激した後、結果は、酵素処理によりＰＧＮのＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞に対する反応性が高まることを示す。さらに、ＨＥＫ−Ｎｕｌｌ細胞において応答は全く認められず、これはリゾチームによる処理が細胞傷害性効果を有しないことを示す。
【０１０９】
リゾチームによって誘導される細胞応答の増大が短期間認められ、最適な効果は処理の２時間後である。それに対して、加水分解時間の延長により、細胞応答が低下する。この観察結果は、リゾチームの存在下での処理の延長が、ＰＧＮの過剰な解重合をもたらし、それによりＰＧＮがＴＬＲ２受容体と相互作用する能力が低下することを示す。
【０１１０】
次に、同じ試料を用いて実験を再現したが、ただし、リゾチームを１０および１００μｇ／ｍｌの濃度で用いた（図９）。３７℃での処理から２時間後、１０および１００μｇ／ｍｌの２つの濃度間での細胞応答における有意差は認められない。実際に、酵素処理により、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞に対するＰＧＮの反応性が同様に高まり、ＨＥＫ−Ｎｕｌｌ細胞ではリゾチーム濃度を高めても細胞傷害性が認められない。
【０１１１】
これらの結果によると、２５０Ｕ／ｍｌの濃度のリゾチームによる３７℃で２時間にわたる処理が、グルコースポリマーの試料中に存在するＰＧＮの部分的解重合をもたらし、またＰＧＮのＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞に対する反応性を高めるのに有効であることが示される。
【０１１２】
結論として、上記の最適な条件下でのリゾチームによる処理は、グルコースポリマーの調製物中に存在するＰＧＮの反応性を高めるのに有効である。
【０１１３】
ＰＧＮの種およびグルコースポリマーの試料の性質（最終生成物対工程段階に由来するマトリックス）に応じて、酵素処理によってもたらされる活性化効果は、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞の反応性を最大で１．５倍高める。したがって、この処理は、特に、試料中に微量存在する全ＰＧＮを「活性」ＰＧＮに変換し、またその生物検定を可能にする場合に適している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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