(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｔであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１であり、ｂは、１８である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ａであり；
Ｘ６は、Ｅであり；
Ｘ７は、存在しない（配列番号１２））
からなるグルカゴン受容体アゴニスト、又はその医薬的に許容し得る塩。
【請求項２】
式：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｔであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１であり、ｂは、１６である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ａであり；
Ｘ６は、Ｅであり；
Ｘ７は、存在しない（配列番号１１））
からなるグルカゴン受容体アゴニスト、又はその医薬的に許容し得る塩。
【請求項３】
脂肪肝を処置する方法であって、それを必要とするウシに、請求項１又は２に記載のグルカゴン受容体アゴニスト又はその医薬的に許容し得る塩の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項４】
前記ウシが、乳牛である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
治療における使用のための、請求項１又は２に記載のグルカゴン受容体アゴニスト又はその医薬的に許容し得る塩。
【請求項６】
乳牛における脂肪肝の処置における使用のための、請求項１又は２に記載のグルカゴン受容体アゴニスト又はその医薬的に許容し得る塩。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のグルカゴン受容体アゴニスト又はその医薬的に許容し得る塩と、医薬的に許容し得る担体、希釈剤、又は賦形剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項８】
グルカゴン受容体での前記グルカゴン受容体アゴニストの活性が、ＧＬＰ−１受容体での前記グルカゴン受容体アゴニストの能力よりも少なくとも１００倍高い、請求項１又は２に記載のグルカゴン受容体アゴニスト又はその医薬的に許容し得る塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネイティブグルカゴンに比較して長時間のグルカゴン受容体での作用を有する化合物に関する。具体的には、グルカゴン受容体を長期間にわたって選択的に刺激するために導入されたネイティブグルカゴンの構造への修飾を有するグルカゴン受容体アゴニストが提供される。該グルカゴン受容体アゴニストは、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）及び／若しくは肥満などの障害を処置するために他の治療薬と併用で、又は肥満、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、脂肪異常症、メタボリックシンドローム、高インスリン血症及び／若しくは夜間低血糖、さらに乳牛における脂肪肝症候群などの種々の障害を処置するための単独療法として、有用になり得る。
【背景技術】
【０００２】
過去数十年間で、糖尿病の罹患率が上昇し続けている。Ｔ２ＤＭは、全ての糖尿病のおよそ９０％を占める糖尿病の最も一般的形態である。Ｔ２ＤＭは、インスリン抵抗性によって誘発された高い血糖値を特徴とする。現在のＴ２ＤＭケアの標準としては、食事と運動、及び経口薬での処置、並びにグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）受容体アゴニスト及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害剤などのインクレチン系治療を含む注射可能な血糖低下薬が挙げられる。経口薬での処置及びインクレチン系治療が、不十分である場合、インスリンでの処置が検討される。疾患がインスリン療法を必要とする事態まで進行した患者は一般に、持効型基礎インスリンの連日投与が開始されるが、症例によっては、必要に応じて食事中の即効型インスリン注射が含まれる場合がある。
【０００３】
この治療の利用可能性にもかかわらず、多くのＴ２ＤＭ患者の血糖値は、依然として十分にコントロールされていない。糖尿病がコントロールされなければ、患者の罹患率及び死亡率に影響を及ぼす複数の状況に陥る。主なＴ２ＤＭ危険因子の１つが、肥満である。Ｔ２ＤＭ患者の大部分（約９０％）は、過体重又は肥満である。体脂肪の蓄積が減少すれば、高血糖及び心臓血管事象をはじめとする肥満関連の併存疾患が改善することが、文書で証明されている。それゆえ、グルコースコントロール及び体重減少に効果的な治療が、より良好な疾患管理に求められている。
【０００４】
加えて、肝臓の脂肪蓄積を伴う肝臓障害の一群を指す非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、並びに炎症、肝細胞傷害及び線維症などの組織学的所見を特徴とするＮＡＦＬＤの重症形態である非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の罹患率及び自覚も、増加し続けている。ＮＡＳＨは、西欧諸国で最も一般的な肝疾患であり、米国では成人の３〜５％が罹患している。処置としては典型的には、食事変更の指導と運動があり、肝脂肪を低減するバリアトリック手術、ピオグリタゾン、スタチン、オメガ３及びビタミンＥ療法（非糖尿病性ＮＡＳＨ患者の場合）を含む場合があるが、ＮＡＳＨに関連する炎症及び／又は線維症に取り組むために認可された治療薬は存在しない。それゆえ、追加の治療が求められている。
【０００５】
グルカゴンをはじめとする治療薬として利用可能で、そして／又は開発中の複数のペプチドは、プレプログルカゴンに由来するが、プレプログルカゴンは組織内で処理されて構造的に関連する複数のペプチドを形成するポリペプチドである。グルカゴンは、プレプログルカゴンのアミノ酸５３〜８１に対応する２９アミノ酸のペプチドであり、次のアミノ酸配列ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号１）を有する。グルカゴンは、肝細胞上のグルカゴン受容体に結合してそれを活性化し、グリコーゲン分解と呼ばれるプロセスを通して肝臓からグルコース（グリコーゲンの形態で貯蔵）を放出させることによって、血中のグルコースレベルの維持を支援する。グリコーゲンの貯蔵が枯渇するようになると、グルカゴンが肝臓を刺激して、糖新生によって追加のグルコースを合成する。このグルコースは、血流に放出されて、低血糖の発症を予防する。グルカゴンの投与は、急性低血糖を処置するための確立された治療法であり、緊急のグルカゴン投与によって投与の数分以内に正常なグルコースレベルが回復され得る。特定のグルカゴン類似体が、改善された溶解度及び安定性を示すと記載された。例えば、国際公開第２０１５０９４８７５号、同第２０１５０９４８７６号、同第２０１５０９４８７８号を参照されたい。
【０００６】
プレプログルカゴンに由来する他のペプチドとしては、ＧＬＰ−１、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、及びオキシントモジュリン（ＯＸＭ）が挙げられる。ＧＬＰ−１は、３６アミノ酸のペプチドであり、その主な生物活性断片（ＧＬＰ−１７−３６）は、プレプログルカゴンのアミノ酸９８〜１２７に対応する３０アミノ酸のＣ末端アミド化ペプチドとして生成され、次のアミノ酸配列ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ（配列番号２）を有する。グルカゴンは、グルコースの放出を刺激して低血糖を予防するが、ＧＬＰ−１（配列番号２）は、インスリン合成及び分泌を刺激し、糖尿病における高血糖を予防することが示されている。エキセナチド、リラグルチド、アルビグルチド及びデュラグルチドをはじめとする種々のＧＬＰ−１類似体が、現在利用可能である。
【０００７】
ＯＸＭは、オクタペプチドカルボキシ末端伸長（プレプログルカゴンのアミノ酸８２〜８９であり、「介在ペプチド１」又はＩＰ−１と称される）を有するグルカゴンの完全な２９アミノ酸配列で構成された３７アミノ酸ペプチドであり、次のアミノ酸配列：ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号３）を有する。ＯＸＭは、グルカゴン及びＧＬＰ−１の両方を活性化するが、ＧＬＰ−１受容体よりもグルカゴン受容体に対してわずかに高い能力を有する。グルカゴン受容体とＧＬＰ−１受容体の二重の活性を有するＯＸＭ類似体が、記載された。例えば国際公開第２０１１０８７６７２号、同第２０１１０８７６７１号を参照されたい。
【０００８】
グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）は、プレプログルカゴンに由来しないが、グルコースの存在下で膵ベータ細胞からのインスリン分泌を刺激することによってグルコース恒常性において生理学的役割を担う別のペプチドである。ＧＩＰは、次のアミノ酸配列：ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱ（配列番号４）を有する４２アミノ酸のペプチドである。ＧＩＰの特定の類似体が、ＧＩＰ及びＧＬＰ−１受容体活性の両方を示すと記載された。例えば国際公開第２０１５０６７７１５号、同第２０１１１１９６５７号、同第２０１３１６４４８３号を参照されたい。
【０００９】
加えて、上記のＯＸＭの二重活性と同様に、特定のグルカゴン類似体が、グルカゴン受容体と、ＧＬＰ−１又はＧＩＰ受容体の１つ又は複数との両方でコアゴニスト活性を有すると記載された。例えば国際公開第２０１１０７５３９３号及び同第２０１２１７７４４４号では、グルカゴンとＧＬＰ−１受容体の両方で活性を有するグルカゴン類似体の説明が主張されている。同様に国際公開第２０１３１９２１３０号では、ＧＩＰ受容体での活性も有するグルカゴン類似体の説明が主張されている。さらに国際公開第２０１５０６７７１６号では、グルカゴン、ＧＬＰ−１及びＧＩＰ受容体のそれぞれで三重アゴニスト活性を有する類似体の説明が主張されている。
【００１０】
Ｔ２ＤＭ及び／又は肥満の治療として提案された種々のペプチド及びタンパク質にもかかわらず、現在利用可能であり、そして／又は開発中の治療は、限定を有する。特に、上記の二重又は三重アゴニストは、グルカゴン受容体アゴニストの代謝的利点と共にＧＬＰ−１受容体及び／又はＧＩＰ受容体アゴニストの血糖低下特性を提供することが主張され得るが、それらが刺激する様々な受容体それぞれでのそのようなペプチドの活性レベルは一定であり、そのため理想的な受容体活性化バランスを実現してインビボで高い有効性を得ながら副作用を最小にするのは困難である。そして、グルカゴン受容体アゴニズムを含まない治療は、そのような作用機序の潜在的な代謝的利点が欠如している。
【００１１】
グルカゴンの同時投与がそのような限定を軽減することは理論的には可能であろうが、現在利用可能なグルカゴン製品は、そのような適用での使用には非実用的である。詳細には、グルカゴンの血漿半減期は１時間未満であるが、利用可能で、そして／又は開発中の他の治療薬との併用を含む実施形態の場合、そのような治療薬の多くは、１日１回と低頻度で投与され、一部は１週間に１回の低頻度での投与が提案されているため、慢性的使用には非実用的である。加えて、野生型グルカゴンもまた、ＧＬＰ−１受容体で若干の活性を有しており、そのため他の化合物が低いＧＬＰ−１受容体活性を有する併用療法では、グルカゴン対ＧＬＰ−１受容体活性の適切なバランスをとる作業が複雑になり得る。その上、現在利用可能なグルカゴン製品の溶解度、並びに化学的及び物理的安定性は、そのような適用での慢性使用に適さず、他の治療薬との共配合が可能でない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、長期間の作用を有し、１日１回、週３回、週２回又は週１回と低頻度で投与することが可能なグルカゴン受容体アゴニストが、求められている。同じく、グルカゴン受容体での強力な活性と、ＧＬＰ−１受容体に比較してグルカゴン受容体での活性に関する高い選択性と、を有するグルカゴン受容体アゴニストが求められている。同じく、他の治療薬と共配合されるのに適した特性を有するグルカゴン受容体アゴニストが求められている。同じく、長期貯蔵及び使用が可能な溶解度及び安定性を有するグルカゴン受容体アゴニストが求められている。
【００１３】
本発明のグルカゴン受容体アゴニストは、これらの要件への適合に向けたものである。したがって本発明は、長期間の作用を有し、１日１回、週３回、週２回又は週１回と低頻度で投与することが可能なグルカゴン受容体アゴニストを提供する。本発明は、例えばＧＬＰ−１及び／又はＧＩＰ受容体と比較して、グルカゴン受容体で最適かつ選択的な活性を有するグルカゴン受容体アゴニストを提供する。本発明は、慢性使用及び他の処置薬との共配合に適した物理的及び化学的特性を有するグルカゴン受容体アゴニストを提供する。本発明は、他の糖尿病処置と併用された場合に高いグルコースコントロール、体重減少などの代謝的利点、及び／又は他の糖尿病処置と併用された場合に、ＰＣＳＫ９低下などの脂質への利点をもたらす、グルカゴン受容体アゴニストを提供する。特に本発明のグルカゴン受容体アゴニストとＧＬＰ−１Ｒアゴニスト又はＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストとの併用は、体重減少及び身体組成などの尺度に及ぼす有益な相乗効果を有する。本発明はまた、単独療法及び／又は他の治療薬との併用療法で用いられた場合に、肥満、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、脂質異常症、メタボリックシンドローム、高インスリン血症及び／又は夜間低血糖などの他の障害への効果的処置を提供すことに向けられている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって本発明の実施形態は、式Ｉ：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７［式Ｉ］
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｔ又はＬであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１又は２であり、ｂは、１４〜２４である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ｅ又はＡであり；
Ｘ６は、Ｔ又はＥであり；
Ｘ７は、存在しないか、又はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであり；
Ｃ末端アミノ酸は、場合によりアミド化されている（配列番号５））を含むグルカゴン受容体アゴニスト、又はその医薬的に許容し得る塩を提供する。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７［式Ｉ］
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｔ又はＬであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１又は２であり、ｂは、１４〜２４である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ｅ又はＡであり；
Ｘ６は、Ｔ又はＥであり；
Ｘ７は、存在しないか、又はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであり；
Ｃ末端アミノ酸は、場合によりアミド化されている（配列番号５））からなる式を含むグルカゴン受容体アゴニスト、又はその医薬的に許容し得る塩を提供する。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７［式Ｉ］
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｔ又はＬであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１又は２であり、ｂは、１４〜２４である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ｅ又はＡであり；
Ｘ６は、Ｔ又はＥであり；
Ｘ７は、存在しないか、又はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであり；
Ｃ末端アミノ酸は、場合によりアミド化されている（配列番号５））からなるグルカゴン受容体アゴニスト、又はその医薬的に許容し得る塩を提供する。
【００１７】
特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ２がＴである、式Ｉで示される構造を有する。特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ２がＬである、式Ｉで示される構造を有する。
【００１８】
特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ５がＥである、先の実施形態のいずれかの構造を有する。特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ５がＡである、先の実施形態のいずれかの構造を有する。
【００１９】
特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ６がＴである、先の実施形態のいずれかの構造を有する。特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ６がＥである、先の実施形態のいずれかの構造を有する。
【００２０】
特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ７がＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳである、先の実施形態のいずれかの構造を有する。特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ７がＧＰＳＳＧである、先の実施形態のいずれかの構造を有する。特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ７が存在しない、先の実施形態のいずれかの構造を有する。
【００２１】
特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、ｂが１６〜２０である、先の実施形態のいずれかの構造を有する。特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、ｂが１６〜１８である、先の実施形態のいずれかの構造を有する。特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、ｂが１６である、先の実施形態のいずれかの構造を有する。特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、ｂが１８である、先の実施形態のいずれかの構造を有する。
【００２２】
特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ２がＴであり、ａが２であり、ｂが１６であり、Ｘ５がＥであり、Ｘ６がＴであり、Ｘ７がＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、Ｃ末端アミノ酸がＣ末端第一級アミドとしてアミド化されている、式Ｉで示される構造を有する（配列番号６）。
【００２３】
特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ２がＴであり、ａが２であり、ｂが１８であり、Ｘ５がＥであり、Ｘ６がＴであり、Ｘ７がＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、Ｃ末端アミノ酸がＣ末端第一級アミドとしてアミド化されている、式Ｉで示される構造を有する（配列番号７）。
【００２４】
特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ２がＬであり、ａが２であり、ｂが１６であり、Ｘ５がＥであり、Ｘ６がＴであり、Ｘ７がＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、Ｃ末端アミノ酸がＣ末端第一級アミドとしてアミド化されている、式Ｉで示される構造を有する（配列番号８）。
【００２５】
特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ２がＴであり、ａが２であり、ｂが１６であり、Ｘ５がＥであり、Ｘ６がＴであり、Ｘ７がＧＰＳＳＧであり、Ｃ末端アミノ酸がＣ末端第一級アミドとしてアミド化されている、式Ｉで示される構造を有する（配列番号９）。
【００２６】
特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ２がＴであり、ａが２であり、ｂが１８であり、Ｘ５がＥであり、Ｘ６がＴであり、Ｘ７がＧＰＳＳＧであり、Ｃ末端アミノ酸がＣ末端第一級アミドとしてアミド化されている、式Ｉで示される構造を有する（配列番号１０）。
【００２７】
特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ２がＴであり、ａが１であり、ｂが１６であり、Ｘ５がＡであり、Ｘ６がＥであり、Ｘ７が存在しない、式Ｉで示される構造を有する（配列番号１１）。
【００２８】
特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ２がＴであり、ａが１であり、ｂが１８であり、Ｘ５がＡであり、Ｘ６がＥであり、Ｘ７が存在しない、式Ｉで示される構造を有する（配列番号１２）。
【００２９】
特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、ａが２であり、Ｘ５がＥであり、Ｘ６がＴであり、Ｘ７がＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであり、Ｃ末端アミノ酸がアミド化されている、式Ｉで示される構造を有する（配列番号１６）。
【００３０】
特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、Ｘ２がＴであり、ａが１であり、Ｘ５がＡであり、Ｘ６がＥであり、Ｘ７が存在しない、式Ｉで示される構造を有する（配列番号１７）。
【００３１】
特定の実施形態において、グルカゴン受容体での該グルカゴン受容体アゴニストの活性は、ＧＬＰ−１受容体での該グルカゴン受容体アゴニストの活性よりも少なくとも１００倍高い。
【００３２】
本発明の別の実施形態は、Ｔ２ＤＭ、肥満、脂肪性肝疾患、ＮＡＳＨ、脂肪異常症、メタボリックシンドローム、高インスリン血症及び夜間低血糖からなる群から選択される疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、本発明のグルカゴン受容体アゴニストの有効量を投与することを含む、方法を提供する。
【００３３】
本発明の別の実施形態は、脂肪肝を処置する方法であって、それを必要とするウシに、本発明のグルカゴン受容体アゴニストの有効量を投与することを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、該ウシは、乳牛である。
【００３４】
本発明の別の実施形態は、Ｔ２ＤＭ、肥満、脂肪性肝疾患、ＮＡＳＨ、脂肪異常症、メタボリックシンドローム、高インスリン血症及び夜間低血糖からなる群から選択される疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に本発明のグルカゴン受容体アゴニストの有効量を、１種又は複数の追加の治療薬の有効量と併用で投与することを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、該疾患は、Ｔ２ＤＭである。特定の実施形態において、該疾患は、肥満である。特定の実施形態において、該疾患は、脂肪性肝疾患である。特定の実施形態において、該１種又は複数の追加の治療薬は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト、ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニスト、インスリン受容体アゴニスト、オキシントモジュリン、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニルウレア、ジペプチジルペプチダーゼ−４（「ＤＰＰ−４」）阻害剤、及びナトリウム・グルコース共輸送体２（「ＳＧＬＴ２」）阻害剤からなる群から選択される。特定の実施形態において、該追加の治療薬は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストである。特定の実施形態において、該ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、デュラグルチドである。特定の実施形態において、該追加の治療薬は、ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストである。特定の実施形態において、該ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストは、配列番号１５の構造を有する。特定の実施形態において、該追加の治療薬は、インスリン受容体アゴニストである。
【００３５】
特定の実施形態において、該グルカゴン受容体アゴニストは、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト又はＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストなどの追加の治療薬と併用される場合に、体重減少及び身体組成への相乗効果を有する。
【００３６】
本発明の別の実施形態は、治療における本発明のグルカゴン受容体アゴニストの使用を提供する。本発明の別の実施形態は、Ｔ２ＤＭ、肥満、脂肪性肝疾患、ＮＡＳＨ、脂肪異常症、メタボリックシンドローム、高インスリン血症及び夜間低血糖からなる群から選択される疾患を処置する上での本発明のグルカゴン受容体アゴニストの使用を提供する。特定の実施形態において、該疾患は、Ｔ２ＤＭである。特定の実施形態において、該疾患は、肥満である。特定の実施形態において、該疾患は、脂肪性肝疾患である。特定の実施形態において、本発明は、乳牛の脂肪肝の処置における使用のための本発明のグルカゴン受容体アゴニストを提供する。
【００３７】
本発明の別の実施形態は、治療における使用のために、１種又は複数の追加の治療薬との併用で同時に、別に、又は連続で使用される本発明のグルカゴン受容体アゴニストを提供する。特定の実施形態において、該一種又は複数の追加の治療薬は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト、ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニスト、インスリン受容体アゴニスト、オキシントモジュリン、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニルウレア、ＤＰＰ−４阻害剤、及びナトリウム・グルコース共輸送体２（「ＳＧＬＴ２」）阻害剤からなる群から選択される。特定の実施形態において、該追加の治療薬は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストである。特定の実施形態において、該ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、デュラグルチドである。特定の実施形態において、該追加の治療薬は、ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストである。特定の実施形態において、該ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストは、配列番号１５の構造を有する。
【００３８】
本発明の別の実施形態は、Ｔ２ＤＭ、肥満、脂肪性肝疾患、ＮＡＳＨ、脂肪異常症、メタボリックシンドローム、高インスリン血症及び夜間低血糖の処置のための薬剤を製造する上での本発明のグルカゴン受容体アゴニストの使用を提供する。
【００３９】
本発明の別の実施形態は、本発明のグルカゴン受容体アゴニストと、医薬的に許容し得る担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、該医薬組成物は、追加の治療薬をさらに含む。特定の実施形態において、該追加の治療薬は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト、ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニスト、インスリン受容体アゴニスト、オキシントモジュリン、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニルウレア、ＤＰＰ−４阻害剤、及びＳＧＬＴ２阻害剤からなる群から選択される。特定の実施形態において、該追加の治療薬は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストである。特定の実施形態において、該ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、デュラグルチドである。特定の実施形態において、該追加の治療薬は、ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストである。特定の実施形態において、該ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストは、配列番号１５の構造を有する。特定の実施形態において、該追加の治療薬は、インスリン受容体アゴニストである。
【００４０】
本発明の別の実施形態は、本発明のグルカゴン受容体アゴニストの有効量の投与を含む、非治療的体重減少を誘導する方法を提供する。
【００４１】
本発明の別の実施形態は、本発明のグルカゴン受容体アゴニストの有効量を、必要とするウシに投与することを含む、ウシにおける脂肪肝症候群を処置する方法を提供する。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、ウシの脂肪肝症候群の処置における使用のために本発明のグルカゴン受容体アゴニストを提供する。
【００４３】
本明細書で用いられる場合、用語「グルカゴン受容体アゴニスト」は、グルカゴン受容体に結合してそれを活性化し、ＧＬＰ−１受容体に相対的なグルカゴン受容体での選択的活性を維持して、単独療法として投与された場合に血清グルコースレベルを上昇させる、ネイティブヒトグルカゴン（配列番号１）、グルカゴン類似体、グルカゴン誘導体、又はグルカゴン融合タンパク質のアミノ酸配列を含む化合物を意味する。そのような結合特性及び薬力学的効果は、以下の試験において記載される通り、公知のインビトロ及びインビトロ法を用いて測定され得る。グルカゴン類似体は、ネイティブヒトグルカゴン（配列番号１）のアミノ酸配列に比較した場合の１種又は複数のアミノ酸置換、欠失、反転、又は付加をはじめとする修飾を有する分子である。グルカゴン誘導体は、ネイティブヒトグルカゴン（配列番号１）又はグルカゴン類似体のアミノ酸配列を有するが、追加的にアミノ酸側鎖、α−炭素原子、末端アミノ基、又は末端カルボン酸基のうちの１つ又は複数の少なくとも１つの化学修飾を有する分子である。グルカゴン融合タンパク質は、グルカゴン、グルカゴン類似体又はグルカゴン誘導体と、免疫グロブリンＦｃ領域などの第二のポリペプチドと、を含む異種構造のタンパク質である。
【００４４】
本発明のグルカゴン受容体アゴニストの活性はまた、ＧＬＰ−１受容体に比較してグルカゴン受容体に選択的である。本明細書で用いられる場合、「に比較して選択的」、「選択性」及び「に対して選択的」は、ＧＬＰ−１受容体よりもグルカゴン受容体で５０倍、１００倍、２００倍、２５０倍、５００倍又は１０００倍高い能力を示す化合物を指す。そのような選択性は、以下の試験において記載されるものなど、公知のインビトロ法を利用して測定され得る。
【００４５】
本発明のグルカゴン受容体アゴニストは、長期間の作用プロファイルを有し、１日１回、週３回、週２回又は週１回と低頻度で投与することが可能である。グルカゴン受容体アゴニストの時間作用プロファイルは、公知の薬物動態テスト法を利用して測定され得る。
【００４６】
本発明のグルカゴン受容体アゴニストの長期作用プロファイルは、２０位のリシンアミノ酸の側鎖のイプシロンアミノ基にコンジュゲートされた脂肪酸部分の使用を通して実現される。該脂肪酸は、［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ（ここでａは、１又は２である）を含むリンカーを通して、リシン側鎖のイプシロンアミノ基にコンジュゲートされている。該リンカー内の脂肪酸及びガンマグルタミン酸は、アルブミン結合剤として作用し、持効型化合物を生成する能力を提供する。該リンカーによって２０位のリシンアミノ酸の側鎖のイプシロンアミノ基にコンジュゲートされた脂肪酸は、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでｂは、１４〜２４である）を含む。したがって完全なリンカー−脂肪酸構造は、［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１又は２であり、ｂは、１４〜２４である）を含む。以下の実施例１〜７の化学構造に示される通り、［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチルの第一の単位は、リシン側鎖のイプシロンアミノ基に連結される。［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチルの第二の単位は、その後、［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチルの第一の単位のアミノ基に結合される。その後、γＧｌｕの第一の単位は、側鎖のγ−カルボキシル基を通して［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチルの第二の単位のアミノ基に結合される。ａ＝２である場合、γＧｌｕの第二の単位は、側鎖のγ−カルボキシル基を通してγＧｌｕの第一の単位のα−アミノ基に結合される。最後に、該脂肪酸は、γＧｌｕの第一（ａ＝１の場合）又は第二（ａ＝２の場合）の単位のαアミノ基に結合される。
【００４７】
本発明のグルカゴン受容体アゴニストは、好ましくは非経口経路（例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、又は経皮）によって投与される医薬組成物として配合される。そのような医薬組成物及びそれを調製する工程は、当該技術分野で周知である（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy （D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006）を参照されたい）。好ましい投与経路は、皮下である。
【００４８】
本発明のグルカゴン受容体アゴニストは、複数の無機及び有機酸のいずれかと反応して、医薬的に許容し得る酸付加塩を形成し得る。医薬的に許容し得る塩及びそれを調製するための一般的方法論は、当該技術分野で周知である（例えば、P. Stahl, et al. Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 2nd Revised Edition (Wiley-VCH, 2011)を参照されたい）。本発明の医薬的に許容し得る塩としては、トリフルオロ酢酸塩、塩酸塩、及び酢酸塩が挙げられる。
【００４９】
ＧＬＰ−１受容体を上回るグルカゴン受容体への本発明のグルカゴン受容体アゴニストの選択性によって提供される１つの特別な利益は、本発明のグルカゴン受容体アゴニストが追加の治療薬と併用で投与された場合の、グルカゴン受容体での活性と他の受容体（例えば、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ及び／又はインスリン受容体）での活性との比など、柔軟な処置選択を提供する能力である。したがって特定の好ましい実施形態において、本発明は、患者におけるＴ２ＤＭの処置の方法であって、追加の治療薬と併用で、本発明のグルカゴン受容体アゴニスト又はその医薬的に許容し得る塩の有効量を、そのような処置を必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、該追加の治療薬は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト、ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニスト、又はインスリン受容体アゴニストからなる群から選択される。
【００５０】
本明細書で用いられる場合、用語「追加の治療薬」は、例えばＧＬＰ−１Ｒアゴニスト、ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニスト、インスリン受容体アゴニスト、オキシントモジュリン、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニルウレア、ＤＰＰ−４阻害剤、及びＳＧＬＴ２阻害剤をはじめとする現在利用可能であり、そして／又は開発中のＴ２ＤＭ及び／又は肥満の処置などの有益な治療効果を有することが知られている他の化合物を意味する。
【００５１】
本明細書で用いられる場合、「併用で」は、１種又は複数の追加の治療薬と同時の、連続の、又は単一の配合薬としての、本発明のグルカゴン受容体アゴニストの投与を意味する。
【００５２】
本明細書で用いられる場合、用語「ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト」は、ＧＬＰ−１受容体での活性を維持するネイティブヒトＧＬＰ−１（配列番号２）、ＧＬＰ−１類似体、ＧＬＰ−１誘導体、又はＧＬＰ−１融合タンパク質のアミノ酸配列を含む化合物を指す。ＧＬＰ−１受容体活性は、ＧＬＰ−１受容体結合活性又は受容体活性化を測定するインビボ実験及びインビトロアッセイを用いるなど、当該技術分野で公知の方法によって測定され得る。ＧＬＰ−１類似体は、ネイティブヒトＧＬＰ−１（配列番号２）のアミノ酸配列に比較した場合の１種又は複数のアミノ酸置換、欠失、反転、又は付加をはじめとする修飾を有する分子である。ＧＬＰ−１誘導体は、ネイティブヒトＧＬＰ−１（配列番号２）又はＧＬＰ−１類似体のアミノ酸配列を有するが、追加的にアミノ酸側鎖基、α−炭素原子、末端アミノ基、又は末端カルボン酸基のうちの１つ又は複数の少なくとも１つの化学修飾を有する分子である。ＧＬＰ−１融合タンパク質は、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類似体又はＧＬＰ−１誘導体と、免疫グロブリンＦｃ領域などの第二のポリペプチドと、を含む異種構造のタンパク質である。現在利用可能であり、そして／又は開発中のＧＬＰ−１Ｒアゴニストとしては、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、デュラグルチド及びセマグルチドが挙げられる。本発明のグルカゴン受容体アゴニストがＧＬｐ−１Ｒアゴニストと併用で投与される特定の好ましい実施形態において、該ＧＬｐ−１Ｒアゴニストは、デュラグルチドである。例えば米国特許第７，４５２，９６６号を参照されたい。
【００５３】
本明細書で用いられる場合、用語「ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニスト」は、ＧＩＰ及びＧＬＰ−１受容体の両方での活性を有する化合物を指す。ＧＩＰ受容体及びＧＬＰ−１受容体活性が、ＧＩＰ受容体及び／又はＧＬＰ−１受容体結合活性又は受容体活性化を測定するインビボ実験及びインビトロアッセイを利用するなど、当該技術分野で公知の方法によって測定され得る。ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストは現在、Ｔ２ＤＭ処置として利用可能でないが、複数のＧＩＰ類似体が、ＧＩＰ及びＧＬＰ−１受容体活性の両方を示すことが記載されており、例えば国際公開第２０１３１６４４８３号、同第２０１１１１９６５７号を参照されたい。
【００５４】
本発明のグルカゴン受容体アゴニストがＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストと併用で投与される特定の好ましい実施形態において、該ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストは、以下の構造：
ＹＸ１ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＸ２ＬＤＫＩＡＱＸ３ＡＸ４ＶＱＷＬＩＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ａｉｂであり；
Ｘ３は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１又は２であり、ｂは、１０〜２０である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ４は、Ｐｈｅ又は１−ナフチルアラニン（１−Ｎａｌ）であり；
Ｃ末端アミノ酸は、場合によりアミド化されている（配列番号１３））又はその医薬的に許容し得る塩を有する。
【００５５】
特定の好ましい実施形態において、ａは２であり、ｂは１８であり、Ｘ４は１−Ｎａｌであり、Ｃ末端アミノ酸はＣ末端第一級アミドとしてアミド化されている（配列番号１４）。特定の好ましい実施形態において、ａは１であり、ｂは１８であり、Ｘ４はＰｈｅであり、Ｃ末端アミノ酸はＣ末端第一級アミドとしてアミド化されている（配列番号１５）。そのようなＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストは、以下のペプチド合成の実施例に記載された通り、本発明のグルカゴン受容体アゴニストを調製するのに用いられ得るものなどの技術を利用して調製され得る。
【００５６】
本明細書で用いられる場合、「インスリン受容体アゴニスト」は、ヒトインスリン、又はその類似体若しくは誘導体、或いはインスリン受容体に結合してそれを活性化することが可能な任意の他のタンパク質を指す。インスリン受容体活性は、インスリン受容体結合活性又は受容体活性化を測定するインビボ実験及びインビトロアッセイを用いるなど、当該技術分野で公知の方法によって測定され得る。インスリン類似体は、ネイティブヒトインスリンに比較して１種又は複数のアミノ酸置換、欠失、反転、又は付加をはじめとする修飾を有する分子であり、その構造は周知である。インスリン誘導体は、ネイティブヒトインスリン又はその類似体のアミノ酸配列を有するが、追加的にアミノ酸側鎖、α−炭素原子、末端アミノ基、又は末端カルボン酸基のうちの１つ又は複数の少なくとも１つの化学修飾を有する分子である。インスリン融合タンパク質は、インスリン、インスリン類似体又はインスリン誘導体部分と、第二のポリペプチドと、を含む異種構造のタンパク質である。任意のインスリン受容体アゴニストは、本発明のグルカゴン受容体アゴニストがインスリン受容体アゴニストと併用で投与される実施形態で使用が検討され得るが、好ましいインスリン受容体アゴニストは、基本的作用期間又は長期の作用期間を有するものである。基本的活性を有する現在利用可能なインスリン受容体アゴニストとしては、グラルギン、インスリンデテミル、及びインスリンデグルデクが挙げられ、それらはそれぞれ連日投与に必要とされる。
【００５７】
特定の実施形態において、本発明は、患者におけるＴ２ＤＭの処置の方法であって、本発明のグルカゴン受容体アゴニスト又はその医薬的に許容し得る塩の有効量を、そのような処置を必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。
【００５８】
特定の実施形態において、本発明は、患者における肥満の処置の方法であって、本発明のグルカゴン受容体アゴニスト又はその医薬的に許容し得る塩の有効量を、そのような処置を必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。
【００５９】
特定の実施形態において、本発明は、患者における脂肪性肝疾患の処置の方法であって、本発明のグルカゴン受容体アゴニスト又はその医薬的に許容し得る塩の有効量を、そのような処置を必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。
【００６０】
特定の実施形態において、本発明は、患者におけるＮＡＳＨの処置の方法であって、本発明のグルカゴン受容体アゴニスト又はその医薬的に許容し得る塩の有効量を、そのような処置を必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。
【００６１】
他の実施形態において、本発明はまた、患者におけるＴ２ＤＭの処置の方法であって、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト、ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニスト、インスリン受容体アゴニスト、オキシントモジュリン、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニルウレア、ＤＰＰ−４阻害剤、及びＳＧＬＴ２阻害剤などの１種又は複数の追加の治療薬と併用で、本発明のグルカゴン受容体アゴニスト又はその医薬的に許容し得る塩の有効量を、そのような処置を必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本明細書で用いられる場合、「それを必要とする患者」は、例えばＴ２ＤＭ、肥満、脂肪性肝疾患、ＮＡＳＨ、及び／又はメタボリックシンドロームをはじめとする処置を必要とする疾患又は状態を有する哺乳動物、好ましくはヒト又はウシを指す。
【００６３】
本明細書で用いられる場合、用語「有効量」は、患者に単回又は反復投与されると、診断又は処置された患者に所望の効果を提供する、本発明のグルカゴン受容体アゴニスト又はその医薬的に許容し得る塩の量又は用量を指す。有効量は、公知技術の利用を通し、かつ類似の条件下で得られた結果を観察することによって、当業者に即座に決定され得る。患者の有効量を決定する際、非限定的に、哺乳動物の種；そのサイズ、年齢及び一般的健康状態；関与する具体的疾患又は障害；該疾患又は障害の度合い又は合併症又は重症度；各患者の応答；投与される個々のグルカゴン受容体アゴニスト；投与様式；投与された調製物の生物学的利用性；選択された用量レジメン；併用薬の利用；並びに他の関連状況をはじめとする複数の因子が検討される。
【００６４】
本発明の特定のグルカゴン受容体アゴニストは一般に、広い投薬範囲にわたって効果的である。例えば週１回投与の場合の投与量は、１週あたり約０．０１〜約３０ｍｇの範囲内に含まれ得る。本発明のグルカゴン受容体アゴニストは、１日１回、週３回、週２回又は週１回投与され得る。週１回投与が、好ましい。
【００６５】
本明細書で用いられる用語「処置すること」又は「処置するために」は、既存の症状又は障害の進行又は重症度を制限、遅延、停止させること、又は回復に向かわせることを包含する。
【００６６】
本発明のアミノ酸配列は、２０種の天然由来アミノ酸の標準的な一文字又は三文字表記を含む。追加として「Ａｉｂ」は、アルファアミノイソ酪酸である。本発明はまた、本発明のグルカゴン受容体アゴニスト又はその医薬的に許容し得る得る塩の合成に有用な新規の中間体及び工程を包含する。本発明の該中間体及びグルカゴン受容体アゴニストは、当該技術分野で公知の種々の手順によって調製され得る。特に化学合成を利用した該工程が、以下の実施例に示されている。記載された経路それぞれの具体的合成ステップを異なる方法で組み合わせて、本発明のグルカゴン受容体アゴニストを調製することができる。該試薬及び出発原料は、当業者に即座に利用可能である。
【００６７】
本発明は、以下の実施例によってさらに示されるが、それを限定と解釈すべきではない。
【実施例】
【００６８】
ペプチド合成
実施例１
実施例１は、以下の記載：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、Ｘ１は、Ａｉｂであり；Ｘ２は、Ｔであり；Ｘ３は、Ａｉｂであり；Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、２であり、ｂは、１６である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；Ｘ５は、Ｅであり；Ｘ６は、Ｔであり；Ｘ７は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり；Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第一級アミドとしてアミド化されている（配列番号６））によって表されるグルカゴン受容体アゴニストである。
【００６９】
以下は、残基Ａｉｂ２、Ａｉｂ１６及びＫ２０以外は標準的な一文字のアミノ酸表記を用いた、これらのアミノ酸残基の構造が伸長されている実施例１の構造の描写である：
【化１】
0006354017.tif 000002
【００７０】
実施例１のペプチドは、RAPP AM-Rink Amide樹脂から出発してSymphony自動ペプチド合成装置（PTI Protein Technologies Inc.）で実施されたＦｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ方策を利用し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）により２５℃で９０分間活性化されたアミノ酸６等量（１：１：１モル比）を用いたカップリングを含む、固相ペプチド合成によって作製される。
【００７１】
Ｐｒｏ３１（４ｈ）、Ｔｒｐ２５（４ｈ）、Ｇｌｕ２４（４ｈ）、Ｖａｌ２３（１０ｈ）、Ｇｌｕ２１（４ｈ）、Ａｉｂ１６（４ｈ）、Ａｓｐ１５（４ｈ）、Ｔｈｒ７（４ｈ）、Ｔｈｒ５（４ｈ）、Ｇｌｙ４（４ｈ）、Ｇｌｎ３（４ｈ）及びＡｉｂ２（２４ｈ）の伸長カップリングが、粗ペプチドの品質を改善するのに必要である。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨビルディングブロックを、Ｌｙｓ２０カップリング（オルソゴナル保護基）に用いて、合成工程の後期での脂肪酸部分の部位特異性結合を可能にする。Ｎ末端残基は、上記のＤＩＣ−ＨＯＢｔプロトコルを用いてＢｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨとして取り込まれる（２４時間カップリング時間）。
【００７２】
上記ペプチド残基の伸長を終了した後、Ｌｙｓ２０中に存在するＡｌｌｏｃ保護基は、スカベンジャーとしてのＰｈＳｉＨ３の存在下で、触媒量のＰｄ（ＰＰｈ３）４を用いて除去する。Ｌｙｓ２０側鎖を伸長するためのＦｍｏｃ／ｔ―Ｂｕ方策を用いる追加のカップリング／脱保護サイクルは、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ２−ＣＨ２ＣＯＯＨ（ChemPepカタログ番号２８０１０２）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＨ）−ＯｔＢｕ（ChemPepカタログ番号１００７０３） 及びＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯＯｔＢｕを含む。全てのカップリングにおいて、ビルディングブロック３等量が、ＤＭＦ中のＰｙＢＯＰ（３等量）及びＤＩＥＡ（６等量）と共に２５℃で４時間、用いられる
【００７３】
同時での、樹脂からの切断及び側鎖保護基除去を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：トリイソプロピルシラン：１，２−エタンジチオール：水：チオアニソールを９０：４：２：２：２（ｖ／ｖ）で含有する溶液中、２５℃で２時間実施し、その後、冷温エーテルで沈殿させる。粗ペプチドを、Ｃ１８カラムでの水／アセトニトリル（０．０５％ｖ／ｖＴＦＡ含有）勾配での逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって９９％を超える純度（精製後の収率１５〜２０％）に精製し、適切な画分をプールして凍結乾燥し、ＴＦＡ塩を得る。
【００７４】
本質的に上記の通り実施された合成において、実施例１の純度を、分析用逆相ＨＰＬＣによって検査し、同一性を、ＬＣ／ＭＳ（観察：Ｍ＋３Ｈ＋／３ ＝１７１３．６；計算Ｍ＋３Ｈ＋／３ ＝１７１４．３；観察:Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１２８５．７；計算Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１２８５．９）を利用して確認する。
【００７５】
実施例２
実施例２は、以下の記載：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、Ｘ１は、Ａｉｂであり；Ｘ２は、Ｔであり；Ｘ３は、Ａｉｂであり；Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、２であり、ｂは、１８である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；Ｘ５は、Ｅであり；Ｘ６は、Ｔであり；Ｘ７は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり；Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第一級アミドとしてアミド化されている（配列番号７））によって表されるグルカゴン受容体アゴニストである。
【００７６】
以下は、残基Ａｉｂ２、Ａｉｂ１６及びＫ２０以外は標準的な一文字のアミノ酸表記を用いた、これらのアミノ酸残基の構造が伸長されている実施例２の構造の描写である：
【化２】
0006354017.tif 000003
【００７７】
実施例２によるペプチドは、先の実施例１に記載されたものと同様に合成される。ビルディングブロック３等量をＤＭＦ中のＰｙＢＯＰ（３等量）及びＤＩＥＡ（６等量）と共に２５℃で４時間用いて、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１８−ＣＯＯｔＢｕを取り込む。
【００７８】
本質的に先の実施例１に記載された通り実施された合成において、実施例２の純度を、分析用逆相ＨＰＬＣによって検査し、同一性を、ＬＣ／ＭＳ（観察：Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１７２３．２；計算Ｍ＋３Ｈ＋／３ ＝１７２３．６；観察: Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１２９２．９；計算Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１２９３．０）を利用して確認する。
【００７９】
実施例３
実施例３は、以下の記載：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、Ｘ１は、Ａｉｂであり；Ｘ２は、Ｌであり；Ｘ３は、Ａｉｂであり；Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、２であり、ｂは、１６である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；Ｘ５は、Ｅであり；Ｘ６は、Ｔであり；Ｘ７は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり；Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第一級アミドとしてアミド化されている（配列番号８））によって表されるグルカゴン受容体アゴニストである。
【００８０】
以下は、残基Ａｉｂ２、Ａｉｂ１６及びＫ２０以外は標準的な一文字のアミノ酸表記を用いた、これらのアミノ酸残基の構造が伸長されている実施例３の構造の描写である：
【化３】
0006354017.tif 000004
【００８１】
実施例３によるペプチドは、先の実施例１に記載されたものと同様に合成される。
【００８２】
本質的に先の実施例１に記載された通り実施された合成において、実施例３の純度を、分析用逆相ＨＰＬＣによって検査し、同一性を、ＬＣ／ＭＳ（観察：Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１７１７．４；計算Ｍ＋３Ｈ＋／３ ＝１７１８．３；観察: Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１２８８．３；計算Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１２８９．０）を利用して確認する。
【００８３】
実施例４
実施例４は、以下の記載：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、Ｘ１は、Ａｉｂであり；Ｘ２は、Ｔであり；Ｘ３は、Ａｉｂであり；Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、２であり、ｂは、１６である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；Ｘ５は、Ｅであり；Ｘ６は、Ｔであり；Ｘ７は、ＧＰＳＳＧであり；Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第一級アミドとしてアミド化されている（配列番号９））によって表されるグルカゴン受容体アゴニストである。
【００８４】
以下は、残基Ａｉｂ２、Ａｉｂ１６及びＫ２０以外は標準的な一文字のアミノ酸表記を用いた、これらのアミノ酸残基の構造が伸長されている実施例４の構造の描写である：
【化４】
0006354017.tif 000005
【００８５】
実施例４によるペプチドは、先の実施例１に記載されたものと同様に合成する。
【００８６】
本質的に先の実施例１に記載された通り実施された合成において、実施例４の純度を、分析用逆相ＨＰＬＣによって検査し、同一性を、ＬＣ／ＭＳ（観察：Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１５６３．７；計算Ｍ＋３Ｈ＋／３ ＝１５６４．４；観察: Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１１７２．９；計算Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１１７３．６）を利用して確認する。
【００８７】
実施例５
実施例５は、以下の記載：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、Ｘ１は、Ａｉｂであり；Ｘ２は、Ｔであり；Ｘ３は、Ａｉｂであり；Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、２であり、ｂは、１８である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；Ｘ５は、Ｅであり；Ｘ６は、Ｔであり；Ｘ７は、ＧＰＳＳＧであり；Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第一級アミドとしてアミド化されている（配列番号１０））によって表されるグルカゴン受容体アゴニストである。
【００８８】
以下は、残基Ａｉｂ２、Ａｉｂ１６及びＫ２０以外は標準的な一文字のアミノ酸表記を用いた、これらのアミノ酸残基の構造が伸長されている実施例５の構造の描写である：
【化５】
0006354017.tif 000006
【００８９】
実施例５によるペプチドは、先の実施例１に記載されたものと同様に合成する。
【００９０】
本質的に先の実施例１及び２に記載された通り実施された合成において、実施例５の純度を、分析用逆相ＨＰＬＣによって検査し、同一性を、ＬＣ／ＭＳ（観察：Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１５７２．９；計算Ｍ＋３Ｈ＋／３ ＝１５７３．８；観察: Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１１７９．８；計算Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１１８０．６）を利用して確認する。
【００９１】
実施例６
実施例６は、以下の記載：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、Ｘ１は、Ａｉｂであり；Ｘ２は、Ｔであり；Ｘ３は、Ａｉｂであり；Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１であり、ｂは、１６である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；Ｘ５は、Ａであり；Ｘ６は、Ｅであり；Ｘ７は、存在せず；Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端の酸である（配列番号１１））によって表されるグルカゴン受容体アゴニストである。
【００９２】
以下は、残基Ａｉｂ２、Ａｉｂ１６及びＫ２０以外は標準的な一文字のアミノ酸表記を用いた、これらのアミノ酸残基の構造が伸長されている実施例６の構造の描写である：
【化６】
0006354017.tif 000007
【００９３】
実施例６によるペプチドは、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｗａｎｇ樹脂（NovaBiochemカタログ番号８５６００８; 初期ロード０．５１ｍｍｏｌ／ｇ）アミド樹脂から出発してSymphony自動ペプチド合成装置（PTI Protein Technologies Inc.）で実施されたＦｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ方策を利用し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰ）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）により２５℃で９０分間活性化されたアミノ酸６等量（１：１：１モル比）を用いたカップリングを含む、固相ペプチド合成によって作製される。
【００９４】
Ｔｒｐ２５（４ｈ）、Ａｌａ２４（４ｈ）、Ｖａｌ２３（１０ｈ）、Ｇｌｕ２１（４ｈ）、Ａｉｂ１６（４ｈ）、Ａｓｐ１５（４ｈ）、Ｔｈｒ７（４ｈ）、Ｔｈｒ５（４ｈ）、Ｇｌｎ３（４ｈ）及びＡｉｂ２（２４ｈ）の伸長カップリングが、粗ペプチドの品質を改善するのに必要である。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨビルディングブロックを、Ｌｙｓ２０カップリング（オルソゴナル保護基）に用いて、合成工程の後期での脂肪酸部分の部位特異性結合を可能にする（４時間カップリング時間）。Ｎ末端残基は、上記のＤＩＣ−ＨＯＢｔプロトコルを用いてＢｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨとして取り込まれる（２４時間カップリング時間）。
【００９５】
上記ペプチド残基の伸長を終了した後、Ｌｙｓ２０中に存在するＡｌｌｏｃ保護基は、スカベンジャーとしてのＰｈＳｉＨ３の存在下で、触媒量のＰｄ（ＰＰｈ３）４を用いて除去する。Ｌｙｓ２０側鎖を伸長するためのＦｍｏｃ／ｔ―Ｂｕ方策を用いる追加のカップリング／脱保護サイクルは、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ２−ＣＨ２ＣＯＯＨ（ChemPep カタログ番号２８０１０２）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＨ）−ＯｔＢｕ（ChemPep カタログ番号１００７０３） 及びＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯＯｔＢｕを含んでいた。全てのカップリングにおいて、ビルディングブロック３等量が、ＤＭＦ中のＰｙＢＯＰ（３等量）及びＤＩＥＡ（６等量）と共に２５℃で４時間、用いられる
【００９６】
同時での、樹脂からの切断及び側鎖保護基除去を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：トリイソプロピルシラン：１，２−エタンジチオール：水：チオアニソールを９０：４：２：２：２（ｖ／ｖ）で含有する溶液中、２５℃で２時間実施し、その後、冷温エーテルで沈殿させる。粗ペプチドを、Ｃ１８カラムでの水／アセトニトリル（０．０５％ｖ／ｖＴＦＡ含有）勾配での逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって９９％を超える純度（精製後の収率１５〜２０％）に精製し、適切な画分をプールして凍結乾燥する。
【００９７】
本質的に上記の通り実施された合成において、実施例６の純度を、分析用逆相ＨＰＬＣによって検査し、同一性を、ＬＣ／ＭＳ（観察：Ｍ＋３Ｈ＋／３ ＝１３８２．７；計算Ｍ＋３Ｈ＋／３ ＝１３８３．３；観察: Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１０３６．６；計算Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１０３７．７）を利用して確認する。
【００９８】
実施例７
実施例７は、以下の記載：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、Ｘ１は、Ａｉｂであり；Ｘ２は、Ｔであり；Ｘ３は、Ａｉｂであり；Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１であり、ｂは、１８である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；Ｘ５は、Ａであり；Ｘ６は、Ｅであり；Ｘ７は、存在せず；Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端の酸である（配列番号１２））によって表されるグルカゴン受容体アゴニストである。
【００９９】
以下は、残基Ａｉｂ２、Ａｉｂ１６及びＫ２０以外は標準的な一文字のアミノ酸表記を用いた、これらのアミノ酸残基の構造が伸長されている実施例７の構造の描写である：
【化７】
0006354017.tif 000008
【０１００】
実施例７によるペプチドは、先の実施例６に記載されたものと同様に合成される。ビルディングブロック３等量をＤＭＦ中のＰｙＢＯＰ（３等量）及びＤＩＥＡ（６等量）と共に２５℃で４時間用いて、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１８−ＣＯＯｔＢｕを取り込む。
【０１０１】
本質的に先の実施例６に記載された通り実施された合成において、実施例７の純度を、分析用逆相ＨＰＬＣによって検査し、同一性を、ＬＣ／ＭＳ（観察：Ｍ＋３Ｈ＋／３＝１３９１．８；計算Ｍ＋３Ｈ＋／３ ＝１３９２．６；観察: Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１０４４．３；計算Ｍ＋４Ｈ＋／４＝１０４４．７）を利用して確認する。
【０１０２】
インビトロでの機能
結合親和性
実施例１〜７のペプチドの結合親和性を、組換えヒトグルカゴン受容体（ｈＧｃｇ−Ｒ）、マウスグルカゴン受容体（ｍＧｃｇ−Ｒ）及びラットグルカゴン受容体（ｒＧｃｇ−Ｒ）で測定する。シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）法と、ｈＧｃｇ−Ｒ、ｍＧｃｇ−Ｒ又はｒＧｃｇ−Ｒを過剰発現する安定してトランスフェクトされた２９３ＨＥＫ細胞から調製された膜と、を用いた放射性リガンド拮抗結合アッセイを実施して、実施例１〜７のペプチドについて平衡解離定数（Ｋｉ）を決定する。実験プロトコル及び結果を、以下に記載する。
【０１０３】
ヒトＧｃｇ受容体結合アッセイは、組換えｈＧｃｇ−Ｒを過剰発現する２９３ＨＥＫ細胞から単離されたクローニングｈＧｃｇ−Ｒ（Lok, S, et. al., Gene 140 (2), 203-209 (1994))を用いる。ｈＧｃｇ−Ｒ  ｃＤＮＡを、発現プラスミドｐｈＤにサブクローニングする（Trans-activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic  factor.  Grinnell, BW, et. al., Bio/Technology 5:   1189-1192  (1987)）。このプラスミドＤＮＡを２９３ＨＥＫ細胞にトランスフェクトして、２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンで選択する。
【０１０４】
マウスＧｃｇ受容体結合アッセイは、２９３ＨＥＫ膜から単離されたクローニングマウスグルカゴン受容体（ｍＧｃｇＲ）を用いる（Burcelin R, Li J, Charron MJ. Gene 164 (2), 305-10 (1995) GenBank: L38613）。ｍＧｃｇＲ  ｃＤＮＡを、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（Promega）−ＺｅｏＲにサブクローニングする。このプラスミドＤＮＡを２９３ＨＥＫ細胞にトランスフェクトして、１００μｇ／ｍＬ  Zeocinを用いてクローン株を選択する。
【０１０５】
ラットＧｃｇ受容体結合アッセイは、ｒＧｃｇ−Ｒを一過性発現する２９３ＨＥＫ細胞から単離された膜内のクローニングラットグルカゴン受容体（ｒＧｃｇ−Ｒ）を用いる（Svoboda, M, Ciccarelli, E, Tastenoy, M, Robberecht, P, Christophe, J. A cDNA construct allowing the expression of rat hepatic glucagon receptors.  Biochem. Biophys. Res. Commun. 192 (1), 135-142 (1993), GenBank: L04796）。ｒＧｃｇ−Ｒ  ｃＤＮＡを、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１  （Promega）−ＺｅｏＲにサブクローニングする。このプラスミドＤＮＡを２９３ＨＥＫ細胞にトランスフェクトして、４８時間、一過性発現させる。
【０１０６】
粗プラスミド膜を、接着培養からの細胞を用いて調製する。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及びＥＤＴＡ含有Roche Complet（商標）プロテアーゼインヒビターを含有する低張緩衝液中の細胞を、氷上で溶解する。細胞懸濁液を、Teflon（登録商標）ペッスルを取り付けたガラスPotter-Elvehjemホモジナイザーを用いて２５ストロークで破壊する。ホモジネートを４℃及び１１００×ｇで１０分間遠心分離する。上清を回収して、氷上に貯蔵し、ペレットを低張緩衝液に再懸濁させて、再度ホモジネートする。混合物を１１００×ｇで１０分間遠心分離する。２番目の上清を最初の上清とひとまとめにして３５０００×ｇ及び４℃で１時間遠心分離する。膜のペレットを、プロテアーゼインヒビターを含有するホモジナイズ緩衝液に再懸濁させて、液体窒素で瞬間凍結し、使用まで−８０℃フリーザでアリコットとして貯蔵する。
【０１０７】
Ｇｃｇは、Ｉ−１２５−ラクトペルオキシダーゼ手順によって放射性ヨウ素化して、Perkin-Elmer（NEX207）にて逆相ＨＰＬＣによって精製する。非活性は、２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌである。ＫＤ測定を、相同競合（homologous competition）又は飽和結合分析によって実施する。ヒトＧｃｇ−ＲのＫＤは、３．９２ｎＭと推定され、それを用いてｈＧｃｇ−Ｒアッセイでテストされた全ての化合物のＫｉ値を計算する。マウスＧｃｇ−ＲのＫＤは、３．５２ｎＭと推定され、それを用いてｍＧｃｇ−Ｒアッセイでテストされた全ての化合物のＫｉ値を計算する。ラットＧｃｇ−ＲのＫＤは、２１．４ｎＭと推定され、それを用いてｒＧｃｇ−Ｒアッセイでテストされた全ての化合物のＫｉ値を計算する。
【０１０８】
受容体結合アッセイを、小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）ビーズ（Perkin Elmer）を用いたシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）方式を利用して実施する。結合緩衝液は、２５ｍＭ ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．４）、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）バシトラシン（Affymetrix）、０．００３％（ｗ／ｖ）モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（TWEEN（登録商標）-20）及びＥＤＴＡ不含のRoche Complete（商標）プロテアーゼインヒビターを含有する。Ｇｃｇ（Eli Lilly and Company）をＤＭＳＯで３．４８ｍｇ／ｍＬ（１ｍＭ）に溶解して、１００μＬアリコット中、−２０℃で凍結して貯蔵する。Ｇｃｇアリコットを希釈して、１時間以内に結合アッセイで使用する。ペプチド類似体をＤＭＳＯに溶解して、１００％ＤＭＳＯで３倍系列希釈する。次に、５μＬ系列希釈化合物又はＤＭＳＯを、４５μＬアッセイ結合緩衝液又は非標識Ｇｃｇ対照（最終濃度１μＭのＮＳＢ）を含有するCorning（登録商標）3632透明ボトルアッセイプレートに移す。その後、５０μＬのｈＧｃｇ−Ｒ（１．５μｇ／ウェル）、ｍＧｃｇ−Ｒ（６．４７μｇ／ウェル）、又はｒＧｃｇ−Ｒ膜（１．５μｇ／ウェル）と、５０μＬ  Ｉ−１２５  Ｇｃｇ（反応物中の最終濃度０．１５ｎＭ）と、５０μＬ  ＷＧＡビーズ（１５０μｇ／ウェル）を添加して、プレートを密閉し、プレートシェーカ（６に設定）上で１分間混合する。室温で１２時間の静置時間の後、プレートを、PerkinElmer Trilux MicroBeta（登録商標）シンチレーションカウンタで測定する。結果を、化合物の存在下での特異的Ｉ−１２５−Ｇｃｇ結合の割合％として計算する。化合物の絶対ＩＣ５０濃度は、添加された化合物の濃度に対するＩ−１２５−Ｇｃｇの特異的結合の割合％の非線形回帰によって得られる。ＩＣ５０濃度を、Cheng-Prusoff方程式（Cheng, Y., Prusoff, W. H., Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108, (1973)）を用いてＫｉに変換する。
【０１０９】
実施例１〜７のペプチドのＫｉ及びｈＧｃｇ−Ｒ、ｍＧｃｇ−Ｒ及びｒＧｃｇ−ＲでのヒトＧｃｇを、以下の表１に示す。
【表１】
0006354017.tif 000009
【０１１０】
これらのデータから、本発明のグルカゴン受容体アゴニストが、３種の異なる種（ヒト、マウス及びラット受容体）におけるヒトグルカゴンと同様か又はそれよりも大きな親和性で、グルカゴン受容体に結合することが示される。
【０１１１】
機能的活性及び選択性
機能的活性及び選択性を、ヒトグルカゴン受容体（ｈＧｃｇ−Ｒ）、ヒトグルカゴン様ペプチド−１受容体（ｈＧＬＰ−１Ｒ）又はヒト胃抑制ペプチド（グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド受容体としても公知、ｈＧＩＰ−Ｒ）を発現するＨＥＫ２９３細胞の細胞内ｃＡＭＰの定量によって決定する。実験プロトコル及び結果を、以下に記載する。
【０１１２】
ｈＧｃｇ−Ｒ機能性ｃＡＭＰアッセイは、クローニングｈＧｃｇ−Ｒを発現する２９３ＨＥＫ細胞を用いる（Lok, S, et. al., Gene 140 (2), 203-209  (1994)）。ｈＧｃｇ−Ｒ  ｃＤＮＡを、発現プラスミドｐｈＤにサブクローニングする（Trans-activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic  factor.  Grinnell, BW, et. al., Bio/Technology 5:   1189-1192  (1987)）。このプラスミドＤＮＡを２９３ＨＥＫ細胞にトランスフェクトして、細胞を２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンで選択する。
【０１１３】
ｈＧＬＰ−１−Ｒ機能性ｃＡＭＰアッセイは、クローニングｈＧＬＰ−１−Ｒを発現する２９３ＨＥＫ細胞を用いる（Graziano MP, Hey PJ, Borkowski D, Chicchi GG, Strader CD, Biochem Biophys Res Commun. 196(1):  141-6, 1993）。ｈＧＬＰ−１Ｒ  ｃＤＮＡを、発現プラスミドｐｈＤにサブクローニングする（Trans-activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic  factor.  Grinnell, BW, et. al., Bio/Technology 5:   1189-1192  (1987)）。このプラスミドＤＮＡを２９３ＨＥＫ細胞にトランスフェクトして、細胞を２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンで選択する。
【０１１４】
ｈＧＩＰ−Ｒ機能性アッセイは、ｐｃＤＮＡ３．１（Promega）−ＮｅｏＲプラスミドにクローニングされたｈＧＩＰ−Ｒを用いる（Usdin,T.B., Gruber,C., Modi,W. and Bonner,T.I., GenBank: AAA84418.1）。ｈＧＩＰ−Ｒ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｎｅｏプラスミドを、懸濁培養用に、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｓ）にトランスフェクトして、５００μｇ／ｍＬ  Geneticin （Invitrogen）の存在下で選択する。
【０１１５】
各受容体過剰発現細胞株を、アッセイ容量４０μＬ中で、1xGlutaMAX（商標）（０．８５％ＮａＣｌ中のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチド、Gibco カタログ番号３５０５０）、０．１％カゼイン（Sigma カタログ番号Ｃ４７６５）、２５０μＭ  ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）及び２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２− エタンスルホン酸）、HyCloneカタログ番号ＳＨ３０２３７．０１］を補充されたＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Gibcoカタログ番号３１０５３）中のペプチドで処理する。室温で６０分間インキュベートした後、得られた細胞内ｃＡＭＰ（環状アデノシン３’，５’−一リン酸塩）の増加を、CisBio cAMP Dynamic 2 HTRFアッセイキット（CisBio 62AM4PEC）を用いて定量的に測定する。細胞溶解緩衝液（２０μＬ）中のｃＡＭＰ−ｄ２コンジュゲートを添加し、その後、同じく細胞溶解緩衝液（２０μＬ）中の抗ｃＡＭＰ−Ｅｕ３＋−クリプタートを添加することによって、細胞内のｃＡＭＰレベルを検出する。得られた拮抗測定物を、室温で少なくとも６０分間インキュベートし、その後、３２０ｎｍでの励起並びに６６５ｎｍ及び６２０ｎｍでの発光を用いるPerkinElmer Envision（登録商標）装置を利用して検出する。Envisionの単位（６６５ｎｍ／６２０ｎｍでの発光×１０，０００）は、存在するｃＡＭＰの量と反比例し、ｃＡＭＰ標準曲線を利用してウェルあたりのｎＭ  ｃＡＭＰ量に変換する。各ウェル内で作製されたｃＡＭＰの量（ｎＭ）を、１０ｎＭ  ヒトＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２（ｈＧＬＰ−１Ｒアッセイ用）、１０ｎＭヒトＧｃｇ（ｈＧｃｇ−Ｒアッセイ用）又は１０ｎＭヒトＧＩＰ（１−４２）ＮＨ２（ｈＧＩＰ−Ｒアッセイ用）のいずれかで観察された最大応答への割合に変換する。相対的ＥＣ５０値及び最大の割合（Ｅｍａｘ）を、添加されたペプチドの濃度に対する最大応答％を利用した非線形回帰分析によって得て、４パラメータロジスティック方程式に当てはめる。
【０１１６】
実施例１〜７の機能的データ、ヒトＧＩＰ（１−４２）ＮＨ２、ヒトＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、及びヒトＧｃｇの機能的データを、以下の表２に示す。ＥＣ５０の平均を、カッコ内に示された反復回数（ｎ）と共に幾何平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。（＞）修飾子は、％有効性が５０％に達していないことを示し、計算されたＥＣ５０は、テストされた最大濃度を利用して得られている。
【表２】
0006354017.tif 000010
【０１１７】
これらのデータから、本発明のグルカゴン受容体アゴニストがヒトグルカゴンと類似の、グルカゴン受容体での能力を有し、ＧＬＰ−１及びＧＩＰ受容体に比較して高い選択性を有することが示される。
【０１１８】
薬物動態性
ラットにおける薬物動態性
雄スプラーグドーリーラットに、１ｍＬ／ｋｇ容量のＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）中の実施例の化合物を単回皮下用量（１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ）で投与する。血液を、投与後１、６、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、及び２４０時間目に、各動物から採取する。
【０１１９】
化合物の血漿濃度を、ＬＣ／ＭＳによって測定する。各方法で、インタクトペプチド（ペプチド＋延長部分（peptide plus linked time extension））を測定した。各アッセイでは、該化合物、及び内部標準（ＩＳ）として用いられた類似体を、メタノール及び０．１％ギ酸を用いて、１００％ラット又はサル血漿（５０μｌ）から抽出する。２つの異なる層が遠心分離によって形成され、化合物及びＩＳは、上清に位置する。９６ウェルプレートに通過画分を採取するために、上清のアリコット２７５μｌを、Thermo Protein Precipitation Plateに移し、そこで真空を適用する。
【０１２０】
加熱した窒素ガスで試料を乾燥させて、上清を除去する。３０％アセトニトリル及び５％ギ酸の１５０μｌ容量をウェルに添加して、試料を再構成する。注入された試料（２０μｌ）を、Supelco Analytical Discovery BIO Wide Pore C5-3（５ｃｍ×０．１ｍｍ、３μｍカラム）にロードする。カラム溶離液は、検出及び定量のために、Thermo Q-Exactive質量分析装置に送られる。
【０１２１】
雄スプラーグドーリーラットへの単回１００ｎｍｏｌ／ｋｇ皮下用量による平均薬物動態パラメータを、以下の表３に示す（実施例１、２及び５、並びに実施例３のＴｍａｘ及びＣｍａｘはｎ＝３であり；実施例３及び４でのＴ１／２、ＡＵＣ0−ｉｎｆ及びＣＬ／Ｆはｎ＝２である）
【表３】
0006354017.tif 000011
略語：ＡＵＣ0−ｉｎｆ＝０〜無限大の曲線下面積、ＣＬ／Ｆ＝クリアランス／生物学的利用度、Ｔｍａｘ＝最大濃度までの時間、Ｃｍａｘ＝最大血漿濃度、Ｔ１／２＝半減期、ＮＤ＝データなし
【０１２２】
これらのデータから、実施例１〜５がネイティブヒトグルカゴンに比較して長い作用時間を有し、およそ３０分間のＴ１／２を有することが示される。
【０１２３】
カニクイザルにおける薬物動態性
雄カニクイザルに、０．２５ｍＬ／ｋｇ容量のＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）中のテスト化合物を単回静脈内（５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ）又は皮下（５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ）用量で投与する。血液を、投与後０．５（ＩＶのみ）、６、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８、１９２、２４０、３３６、４８０、５７６、及び６７２時間目に、各動物から採取する。化合物の血漿濃度を、先のスプラーグドーリーラットの試験に概ね記載された通りＬＣ／ＭＳによって測定する。
【０１２４】
平均（ｎ＝２）薬物動態パラメータを、以下の表４に示す。
【表４】
0006354017.tif 000012
略語：ＡＵＣ0−ｉｎｆ＝０〜無限大の曲線下面積、ＣＬ＝クリアランス、ＣＬ／Ｆ＝クリアランス／生物学的利用度、Ｔｍａｘ＝最大濃度までの時間、Ｃ０＝０時間に外挿された濃度、Ｃｍａｘ＝最大血漿濃度、Ｔ１／２＝半減期、ＮＡ＝適用できない
【０１２５】
これらのデータから、実施例１及び２がネイティブヒトグルカゴンに比較して長い作用時間を有し、１時間未満のＴ１／２を有することが示される。
【０１２６】
インビボ試験
ラットにおける連続グルコースモニタリング
１２〜１４週齢の正常雄スプラーグドーリーラット（HARLAN（商標）、Indianapolis, IN）を、１２時間の明暗周期を含む温度制御（２４℃）施設において、自由に飼料（TD2014 TEKLAD GLOBAL RODENT DIET（登録商標）、HARLAN（商標）Labs、Indianapolis, IN）及び水に接近できるようにして、個別に飼育する。２週間の施設への馴化後に、ラットにHD-XGトランスミッタ（Data Sciences International, St Paul, MN）を移植する。
【０１２７】
トランスミッタ移植手術は、２％〜３％イソフルラン（２−クロロ−２−（ジフルオロメトキシ）−１，１，１−トリフルオロエタン）麻酔の下で実施する。トランスミッタのグルコースセンサーを、下行大動脈内に設置する。トランスミッタの温度センサーを、トランスミッタ本体と共に腹腔内に設置する。トランスミッタ移植手術の7日後に、ラット全匹を一時的な容器に入れ、ラットをホームケージ内で自由に運動させながら、血糖値及び深部体温の測定値を１分間隔で連続して記録する。DATAQUEST A.R.T.（商標）systemソフトウエア（Data Sciences International, St Paul, MN）によって、データ獲得を制御及び分析する。グルコースセンサーの初期較正は、術後７日目の腹腔内耐糖能テスト（ｉｐＧＴＴ）によって実現し、その後の較正は、尾部血液によるグルコース測定によって１日おきに実施する。術後９〜１１日目に開始し、１０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量のテスト化合物を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）の１ｍＬ／Ｋｇ体重中での皮下注射によって１回投与する。血糖値を、７日目までモニタリングする。
【０１２８】
血糖値データから、実施例１〜７がそれぞれ、用量依存性のある血糖値の持続的上昇をもたらすことが示される。
【０１２９】
乳牛における血糖濃度への影響
平均１３１３ポンドで少なくとも１回の正常な泌乳を完了した非泌乳期のホルスタイン乳牛５匹を、実施例６の増加用量で処置する。最初、ウシを１．５ｍｇ／匹の実施例６の皮下注射で処置する。血糖濃度を、投与後１６８時間目まで携帯グルコメータを用いて様々な感覚で測定する。この投与期間及びその後の投与期間全てで、０時間目に測定された血糖濃度をその期間のベースラインとする。初回投与後１週間目に、ウシを５．０ｍｇ／匹の実施例６で処置する。血液濃度を再度、処置後１６８時間目までモニタリングする。最後に、５．０ｍｇ／匹の実施例６投与後２週間目に、全てのウシを１５ｍｇ／匹ＳＣの実施例６で処置し、血糖濃度を投与後３３６時間目までモニタリングする。
【０１３０】
データを表５に示す。テストされた全用量の実施例６が、ベースライン濃度を上回る血糖濃度の急速な上昇をもたらす。加えて、１．５、５．０、及び１５．０ｍｇ／匹の投与は、それぞれ９６時間、１４４時間及び３１２時間継続する血糖の持続的増加をもたらす。
【表５】
0006354017.tif 000013
【０１３１】
物理的及び化学的特性
溶解度及び安定性
実施例１〜６の試料を、Ｈ２Ｏ中で５ｍｇ／ｍＬに調製して、緩衝液Ｃ６Ｎ（１０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）、Ｃ７Ｎ（１０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７）、Ｈ６．５（１０ｍＭヒスチジン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）及びＨ７．５Ｎ（１０ｍＭヒスチジン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）の中へ、記載された通り透析する。試料を、記載された通り１０ｍｇ／ｍＬペプチドに濃縮し、４℃で１週間保持する。試料を視覚的に、そして記載された通りＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価する。
【０１３２】
全ての配合における実施例１〜６が、４℃で１週間後に透明及び無色になる。ＳＥＣ−ＨＰＬＣデータを、表６に提供する。高分子量（ＨＭＷ）ポリマーの有意な成長又は主ピークの消失は起こらない。ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる回収率は、実施例１〜６では５％以内である。
【表６】
0006354017.tif 000014
【０１３３】
実施例１〜２の溶解度を、３種の追加の配合物：Ｔ７（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７）、Ｔ７Ｔｍ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０２％ポリソルベート−２０、２９ｍＭ  ｍ−クレゾール、ｐＨ７）、及びＴ７Ｎｍ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２９ｍＭ  ｍ−クレゾール、ｐＨ７）でも評価する。化合物を、記載された透析を通してＴ７中で調製する。試料をＴ７、Ｔ７Ｔｍ又はＴ７Ｎｍで２ｍｇ／ｍＬに配合し、その後、記載された通り１０ｍｇ／ｍＬペプチドに濃縮する。配合物を４℃で１週間保持し、視覚的に、そして記載された通りＳＥＣ−ＨＰＬＣ及びＲＰ−ＨＰＬＣによって評価する。
【０１３４】
全ての配合物は、透明及び無色のままである。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ及びＲＰ−ＨＰＬＣデータを、表７に示す。ＨＭＷポリマーの成長は、いずれの配合物でも０．２％を超えていない。ＲＰ−ＨＰＬＣによるピーク回収率は、全ての配合物で５％以内である。
【表７】
0006354017.tif 000015
【０１３５】
これらのデータから、実施例１〜６が、異なる緩衝剤条件下で許容し得る溶解度特性を有することが示される。
【０１３６】
化学的安定性
実施例１の化学的安定性を、様々なｐＨ値の異なる緩衝液で測定する。試料を、Ｈ２Ｏで５ｍｇ／ｍＬ濃度に調製して、Slide-A-Lyzer Dialysisカセット2000 MWCO （部品番号66203）を用いて該当する緩衝液にて４℃で一晩透析し、０．２２μｍフィルター（Millex, SLGV013SL）でろ過し、その後、各緩衝液で１ｍｇ／ｍＬに希釈する。緩衝組成物は、Ｈ２Ｏ中の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８（Ｔ８）、Ｈ２Ｏ中の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７（Ｔ７）、Ｈ２Ｏ中の１０ｍＭヒスチジン  ｐＨ７（Ｈ７）、又はＨ２Ｏ中の１０ｍＭクエン酸塩  ｐＨ６（Ｃ６）である。各１ｍｇ／ｍＬ試料を、３本のバイアルに移す。試料を４℃、２５℃及び４０℃に保持する。試料を２週間おきに合計４週間評価する。試料を濁度及び相分離について視覚的に評価する。化合物の安定性を、１０％Ｂ均一溶媒で３分間、３０％Ｂで３分間、３０−６０％Ｂで３０分間、及び９５％Ｂで２分間のＡＢ（Ａ＝０．１％  ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、Ｂ＝０．０８５％  ＴＦＡ／アセトニトリル）勾配で、流速０．９ｍＬ／分（波長２１４ｎｍ）で、６０℃に加熱されたWaters Symmetry Shield RP18, 3.5 μm, 4.6 X 100 mmカラム（部品番号18600179）にて分析用逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により評価する。安定性はまた、流速０．５ｍＬ／分で４０分間流す、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０％アセトニトリル、ｐＨ７．２のランニング緩衝液で、Insulin HMWP, 7.8 X 300 mmカラム （部品番号WAT2015549）でのサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によって評価する。
【０１３７】
物理的外観は、透明〜無色であり、実施例１の場合ｐＨ７及びｐＨ８で乳光又は粒子は存在しない。ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果を、以下の表８に要約する。回収率は、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣによって５％以内であり、許容し得る。
【表８】
0006354017.tif 000016
【０１３８】
４℃及び４０℃で４週間保持されたＴ８緩衝液中の試料は、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によっても分析する。主な変性部位は、ｐＨ８で実施例１について同定されていない。総括すると、実施例１の化学的安定性は、テストされた緩衝液条件下で優れた安定性を示している。
【０１３９】
物理的安定性
実施例１のテスト試料を、Ｔ７緩衝液で透析により調製し、その後、記載された通りＴ７ｍ、Ｔ７Ｎｍ、及びＴ７Ｔｍ中の２ｍｇ／ｍＬペプチドとして配合する。各配合物を透明ガラスバイアルに移して、テフロン（登録商標）コーティング磁気フリー（flee）によって４００ｒｐｍにて室温で６時間撹拌する。アリコット１００μＬを、０、１時間目、３時間目及び６時間目に評価のために採取する。試料は、視覚的に、そして先の通りＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価する。
【０１４０】
全ての配合物は、透明及び無色のままであり、乳光又は沈殿は存在しない。表９に示される通り、ＳＥＣ−ＨＰＬＣの主ピークのペプチドの割合％は、全ての配合物で５％以内のままである。データから、実施例１がテストされた条件下で良好な物理的安定性を有することが示される。
【表９】
0006354017.tif 000017
【０１４１】
併用試験
ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニスト又はＧＬＰ−１Ｒアゴニストとの共配合における活性
実施例１及び３と、配列番号１５のＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニスト又はデュラグルチドとの共配合を、以下の安定性試験に記載される通り調製し、個々の化合物及び共配合物の活性を、上記方法を利用して測定する。データを、表１０及び１１に示す。（＞）修飾子は、％有効性が５０％に達していないことを示し、計算されたＥＣ５０は、テストされた最大濃度を利用して得られている。
【表１０】
0006354017.tif 000018
【表１１】
0006354017.tif 000019
【０１４２】
これらのデータから、実施例１及び３の生物活性が、ストレス及び非ストレス条件下、並びに／又はＧＬＰ−１Ｒアゴニスト若しくはＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストと併用で維持されることが示される。
【０１４３】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト又はＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストとの併用のインビボ試験
本発明のグルカゴン受容体アゴニストと、持効型ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト又はＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストとの併用の影響を、Ｃ５７／ＢＬ６飼料により誘導された肥満（ＤＩＯ）マウスでテストする。ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストは、上記の通り配列番号１４の構造を有する。ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、国際公開第２００５０００８９２号に記載されたＧＬＰ−１−Ｆｃ融合物である。共配合物は、以下の共配合安定性試験に概ね記載される通り調製される。
【０１４４】
Ｃ５７／ＢＬ６  ＤＩＯ動物は、糖尿病ではないが、高脂肪（脂肪で６０％Ｋｃａｌ）食を１２週間配置された後、インスリン抵抗性、脂質異常症、及び肝脂肪症、メタボリックシンドロームの全ての特徴を示す。したがって、これらの動物における試験を用いて、体重減少、身体組成及び肝脂肪症などのパラメータに及ぼす提示された治療薬の影響を検討することができる。
【０１４５】
体重４２〜４７ｇで初期脂肪量が１１．９ｇ〜１７．２ｇの範囲の２０〜２１週齢雄ＤＩＯ  Ｃ５７／Ｂｌ６マウスを用いる。動物は、１２時間の明暗周期（２２：００に照明）を含む温度制御（２４℃）施設において、自由に飼料及び水に接近できるようにして、個別に飼育する。２週間の施設への馴化後に、マウスを体重に基づいて無作為化するため（ｎ＝５／群）、各群は類似の開始平均体重を有する。
【０１４６】
ビヒクル、ビヒクル（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）に溶解されたテスト化合物（用量範囲３〜１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニスト（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）又はそれらの組み合わせ（用量範囲３〜１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）を、１５日間にわたる３日の暗所周期開始前に３０〜９０分間、随意に摂食するマウスにＳＣ注射によって投与する。ＳＣ注射は、１、４、７、１０、及び１３日目に作製する。１日の体重、摂食量及びグルコース量を、試験期間を通して測定する。体重の絶対変動を、最初の分子注射前の同じ動物の体重を差し引くことによって計算する。０日目及び１４日目に、総脂肪量を、Echo Medical System （Houston, TX）装置を用いた核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって測定する。
【０１４７】
１日の血糖値を、尾静脈血からAccu-Chekグルコメータ（Roche）で測定する。試験終了時に、動物を殺処分し、肝臓を摘出して凍結させる。殺処分時に採取された肝臓のホモジネートで測定された肝トリグリセリド、及び血漿コレステロールを、Hitachi Modular P臨床分析装置で測定する。群間の統計比較を、一元配置分散分析と、その後のダネット多重比較検定を利用して実施する。体重減少の低下に関するＥＤ５０値を、非線形適合ツールを利用したGraphPad Prismで測定する。
【０１４８】
上記のとおり実施された試験の体重減少及び脂肪量変動率％データを、以下の表１２（実施例１）及び１３（実施例１及び２）に示す。表１１の結果は、１群あたり５匹の平均±ＳＥＭとして表し、表１２の結果は、１群あたり６匹の平均±ＳＥＭとして表す。
【０１４９】
実施例１及び２と、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト又はＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストのいずれかとの併用は、実施例１若しくは２、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト又はＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストの単独の影響に比較して、体重及び脂肪量への相乗効果を有する（表１２及び１３）。
【表１２】
0006354017.tif 000020
＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１はビヒクル対照群から有意である（一元配置分散分析、ダネット検定） 
【表１３】
0006354017.tif 000021
＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１はビヒクル対照群から有意である（一元配置分散分析、ダネット検定） 
【０１５０】
血糖値、血漿コレステロール及び肝トリグリセリドに及ぼす影響のデータを、以下の表１４（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５）及び１５（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６）に示す。個別に投与された実施例１及び２は、用量依存的に血糖を増加させるが、そのような実施例のグルカゴン受容体アゴニストと、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト又はＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストのいずれかとの組み合わせは、血糖、血漿コレステロール及び肝トリグリセリドを減少させる。
【表１４】
0006354017.tif 000022
＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１は対照群から（一元配置分散分析、ダネット検定） 
【表１５】
0006354017.tif 000023
＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１は対照群から（一元配置分散分析、ダネット検定） 
【０１５１】
ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストとの共配合における安定性
実施例１及び３の試料を調製して、記載された通りＴ７で透析する。両実施例を別々に、Ｔ７、Ｔ７ｍ、Ｔ７Ｎ及びＴ７Ｎｍ中の１ｍｇ／ｍＬペプチドとして配合させる。配列番号１５のＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストも調製して、実施例のグルカゴン受容体アゴニストに関して記載された通りＴ７で透析する。ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストを、Ｔ７、Ｔ７ｍ及びＴ７Ｎｍ中の１ｍｇ／ｍＬペプチドとして配合させる。１ｍｇ／ｍＬの実施例１と１ｍｇ／ｍＬのＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニスト、又は１ｍｇ／ｍＬの実施例３と１ｍｇ／ｍＬのＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストを含有する共配合試料も調製して、Ｔ７、Ｔ７ｍ、Ｔ７Ｎ及びＴ７Ｎ中で配合させる。各配合試料を、３本のバイアルに移す。試料を４℃、２５℃及び４０℃に保持する。試料を２週間おきに合計４週間評価する。試料を、濁度及び相分離について視覚的に評価する。安定性を、単剤配合物に関する上記の通りＲＰ−ＨＰＬＣによって評価する。記載されたＲＰ−ＨＰＬＣ法は、実施例の化合物とＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストの主ピークだけでなくｐＨ９及び４０℃で３日間試料にストレスを加えることによって生じた全ての変性ピークとの良好な分離を与える。
【０１５２】
全試料の総ピーク回収率は、ＲＰ−ＨＰＬＣでは５％以内である。配合物は全て、透明及び無色のままで、乳光又は沈殿は存在しない。４週間後のＲＰ−ＨＰＬＣによって観察されたそれぞれの主ピークにおけるペプチドの変化率％を、表１６に要約する。単一薬物として配合された場合を全てのテスト配合物におけるＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストとの共配合と比較すると、主ピークの消失率％は、実施例１では有意に変化していない。ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストは、単剤として配合された場合を実施例１又は実施例３のいずれかとの共配合に比較すると、主ピークの一定した消失率％を示している。データから、実施例１及び３が単剤として配合された場合、又はＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストと共配合された場合に、許容し得る安定性を有すること、並びに実施例１及び３が、共配合におけるＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニスト安定性に有害な影響を及ぼさないことが示される。
【表１６】
0006354017.tif 000024
【０１５３】
４℃及び４０℃で４週間インキュベートされた、Ｔ７Ｎｍに配合された実施例１の試料、ＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニスト及びそれらの組み合わせ、並びにＴ７に配合された実施例１とＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストとの組み合わせの試料を、ＬＣ−ＭＳでも評価する。主な変性部位は、同定されていない。実施例１及びＧＩＰ−ＧＬＰ−１コアゴニストの両方で、単剤配合物を共配合物と比較すると、化学修飾が有意に異ならない。
【０１５４】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストとの共配合における安定性
Ｔ７緩衝液への調製に関する上記のものと同じ方法を利用して、実施例１及び３を調製し、Ｃ６．５（１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６．５）で透析させる。化合物を、緩衝液Ｃ６．５、Ｃ６．５Ｍ（１０ｍＭクエン酸塩、４６．４ｍｇ／ｍＬ  Ｄ−マンニトール、ｐＨ６．５）、Ｃ６．５Ｔ（１０ｍＭクエン酸塩、０．０２％ポリソルベート−８０、ｐＨ６．５）、及びＣ６．５Ｔ（１０ｍＭクエン酸塩、４６．４ｍｇ／ｍＬ  Ｄ−マンニトール、０．０２％ポリソルベート−８０、ｐＨ６．５）中の１ｍｇ／ｍＬペプチドで別々に配合させる。Ｃ６．５中の４６．５ｍｇ／ｍｌデュラグルチドの原液濃度を利用して、Ｃ６．５及びＣ６．５ＭＴ中の３ｍｇ／ｍＬのデュラグルチドを配合させる。Ｃ６．５ＭＴ中の共配合物を、３ｍｇ／ｍＬデュラグルチドと１ｍｇ／ｍＬ実施例１、又は３ｍｇ／ｍＬデュラグルチドと１ｍｇ／ｍＬ実施例３を有するように調製する。各配合された試料を３本のバイアルに移し、４℃、２５℃及び４０℃で保持する。試料を２週間おきに合計４週間評価する。試料を濁度及び相分離について視覚的に評価する。安定性を、上記の通りＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価する。記載されたＨＰＬＣ法は両者とも、実施例の化合物とデュラグルチドの主ピークだけでなくｐＨ９及び４０℃で３日間試料にストレスを加えることによって生じた全ての変性ピークとの良好な分離を与える。
【０１５５】
全ての安定性試料の総ピーク回収率は、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣの両者とも５％以内である。配合物は全て、透明及び無色のままで、乳光又は沈殿は存在しない。４週間後のＳＥＣ−ＨＰＬＣによって観察されたそれぞれの主ピークにおける化合物の変化率％を、表１７に要約する。実施例１及び３は、概ね安定しており、主ピークの有意な消失を示さない。実施例１は、デュラグルチドとの共配合を単剤配合物と比較した場合に、安定性の低下を示さない。実施例３は、デュラグルチドとの共配合を単剤配合物と比較した場合に、わずかな安定性低下を示す。ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、実施例１又は３のいずれかとの共配合を単剤配合物と比較すると、安定性の低下を示さない。
【表１７】
0006354017.tif 000025
【０１５６】
ＲＰ−ＨＰＬＣによって観察された通り、安定性の傾向は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって観察されたものと類似している。４週間後のＲＰ−ＨＰＬＣによって観察されたそれぞれの主ピークにおける化合物の変化率％を、表１８に要約する。実施例１及び３は、概ね安定しており、主ピークの有意な消失を示さない。実施例１は、ＧＬＰ−１Ｒとの共配合を単剤配合物と比較した場合に、安定性の低下を示さない。実施例３は、ＧＬＰ−１Ｒとの共配合を単剤配合物と比較した場合に、わずかな安定性低下を示す。ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、実施例のいずれかとの共配合を単剤配合物と比較すると、安定性の低下を示さない。
【表１８】
0006354017.tif 000026
また、本発明は以下を提供する。
［１］  式：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｔであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１であり、ｂは、１８である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ａであり；
Ｘ６は、Ｅであり；
Ｘ７は、存在しない（配列番号１２））
を含むグルカゴン受容体アゴニスト化合物、又はその医薬的に許容し得る塩。
［２］  式：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｔであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１であり、ｂは、１８である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ａであり；
Ｘ６は、Ｅであり；
Ｘ７は、存在しない（配列番号１２））
からなるグルカゴン受容体アゴニスト化合物、又はその医薬的に許容し得る塩。
［３］  式：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｔであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１であり、ｂは、１６である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ａであり；
Ｘ６は、Ｅであり；
Ｘ７は、存在しない（配列番号１１））
を含むグルカゴン受容体アゴニスト化合物、又はその医薬的に許容し得る塩。
［４］  式：
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｔであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１であり、ｂは、１６である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ａであり；
Ｘ６は、Ｅであり；
Ｘ７は、存在しない（配列番号１１））
からなるグルカゴン受容体アゴニスト化合物、又はその医薬的に許容し得る塩。
［５］  脂肪肝を処置する方法であって、それを必要とするウシに、［１］〜［４］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニストの有効量を投与することを含む、方法。
［６］  前記ウシが、乳牛である、［５］に記載の方法。
［７］  治療における使用のための、［１］〜［４］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニスト。
［８］  乳牛における脂肪肝の処置における使用のための、［１］〜［４］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニスト。
［９］  ［１］〜［４］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニストと、医薬的に許容し得る担体、希釈剤、又は賦形剤と、を含む、医薬組成物。
［１０］  グルカゴン受容体での前記グルカゴン受容体アゴニストの活性が、ＧＬＰ−１受容体での前記グルカゴン受容体アゴニストの能力よりも少なくとも１００倍高い、［１］〜［４］のいずれか１項に記載のグルカゴン受容体アゴニスト。
【０１５７】
配列
配列番号１  −  ヒトグルカゴン
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ   
配列番号２  −  ヒトＧＬＰ−１
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ    
配列番号３  −  ヒトＯＸＭ
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ   
配列番号４  −  ヒトＧＩＰ
ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱ    
配列番号５  −  グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｔ又はＬであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１又は２であり、ｂは、１４〜２４である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ｅ又はＡであり；
Ｘ６は、Ｔ又はＥであり；
Ｘ７は、存在しないか、又はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであり；
Ｃ末端アミノ酸は、場合によりアミド化されている）
配列番号６  −  グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｔであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、２であり、ｂは、１６である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ｅであり；
Ｘ６は、Ｔであり；
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり；
Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第一級アミドとしてアミド化されている）
配列番号７  −  グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｔであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、２であり、ｂは、１８である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ｅであり；
Ｘ６は、Ｔであり；Ｘ７は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり；
Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第一級アミドとしてアミド化されている）
配列番号８  −  グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｌであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、２であり、ｂは、１６である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ｅであり；
Ｘ６は、Ｔであり；
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり；
Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第一級アミドとしてアミド化されている）
配列番号９  −  グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｔであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、２であり、ｂは、１６である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ｅであり；
Ｘ６は、Ｔであり；
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧであり；
Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第一級アミドとしてアミド化されている）
配列番号１０  −  グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｔであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、２であり、ｂは、１８である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ｅであり；
Ｘ６は、Ｔであり；
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧであり；
Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第一級アミドとしてアミド化されている）
配列番号１１  −  グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｔであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１であり、ｂは、１６である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ａであり；
Ｘ６は、Ｅであり；
Ｘ７は、存在せず；
Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端の酸である）
配列番号１２  −  グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｔであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１であり、ｂは、１８である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ａであり；
Ｘ６は、Ｅであり；
Ｘ７は、存在せず；
Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端の酸である）
配列番号１３  −  ＧＩＰ−ＧＬＰコアゴニスト
ＹＸ１ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＸ２ＬＤＫＩＡＱＸ３ＡＸ４ＶＱＷＬＩＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ａｉｂであり；
Ｘ３は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１又は２であり、ｂは、１０〜２０である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ４は、Ｐｈｅ又は１−ナフチルアラニン（１−Ｎａｌ）であり；
Ｃ末端アミノ酸は、場合によりアミド化されている）
配列番号１４  −  ＧＩＰ−ＧＬＰコアゴニスト
ＹＸ１ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＸ２ＬＤＫＩＡＱＸ３ＡＸ４ＶＱＷＬＩＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ａｉｂであり；
Ｘ３は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、２であり、ｂは、１８である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ４は、１−Ｎａｌであり；
Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第一級アミドとしてアミド化されている）
配列番号１５  −  ＧＩＰ−ＧＬＰコアゴニスト
ＹＸ１ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＸ２ＬＤＫＩＡＱＸ３ＡＸ４ＶＱＷＬＩＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ａｉｂであり；
Ｘ３は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１であり、ｂは、１８である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ４は、Ｐｈｅであり；
Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第一級アミドとしてアミド化されている）
配列番号１６  −  グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｔ又はＬであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、２であり、ｂは、１４〜２４である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ｅであり；
Ｘ６は、Ｔであり；
Ｘ７は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ及びＧＰＳＳＧからなる群から選択されるペプチドであり；
Ｃ末端アミノ酸は、アミド化されている）
配列番号１７  −  グルカゴン受容体アゴニスト
ＹＸ１ＱＧＴＦＸ２ＳＤＹＳＫＹＬＤＸ３ＫＫＡＸ４ＥＦＶＸ５ＷＬＬＥＸ６Ｘ７
（式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり；
Ｘ２は、Ｔであり；
Ｘ３は、Ａｉｂであり；
Ｘ４は、Ｋ側鎖のイプシロンアミノ基への（［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−アセチル）２−（γＧｌｕ）ａ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２Ｈ（ここでａは、１であり、ｂは、１４〜２４である）のコンジュゲーションによって化学修飾されたＫであり；
Ｘ５は、Ａであり；
Ｘ６は、Ｅであり；
Ｘ７は、存在しない）
【配列表】
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