(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性粒子を含有する試料液と封入液との取扱い方法であって、前記試料液および封入液が不混和性であり、前記方法が、
導管中に前記封入液を流すステップと、
前記導管中に前記試料液を流して、前記試料液が、（ａ）前記封入液によって囲まれ、および（ｂ）前記導管内の所定の捕捉場所に位置するステップと、
前記捕捉場所に磁場をかけることによって前記捕捉場所で前記磁性粒子を不動化するステップと、
前記導管を前記捕捉場所で加熱して、前記不動化された磁性粒子を加熱するステップと、
前記導管中に溶離液を流して、（ａ）前記溶離液が前記封入液によって囲まれ、（ｂ）前記試料液が前記捕捉場所から流出し、および（ｃ）前記溶離液が前記捕捉場所に流れ、かつ前記不動化された磁性粒子を囲むステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記試料液を前記導管中に流すステップの前に目的生体分子を前記磁性粒子と結合させるステップをさらに含み、
前記溶離液を流すステップが、前記磁性粒子を前記溶離液で囲むことによって前記磁性粒子から前記目的生体分子を解放するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶離液を流すステップの後に前記磁場を除去することによって前記溶離液中で前記磁性粒子を可動化するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記可動化した磁性粒子を含有する前記溶離液を前記捕捉場所から流出させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記加えられた磁場によって磁性粒子が不動化された状態のまま、前記解放された目的生体分子を含有する前記溶離液を前記捕捉場所から流出させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記導管中で前記捕捉場所へ第一の洗浄液を流して、（ａ）前記洗浄液が前記封入液によって囲まれ、および（ｂ）前記第一の洗浄液が前記不動化された磁性粒子を囲むステップと、
前記磁場を除去することによって前記第一の洗浄液中で前記磁性粒子を可動化させるステップと、
前記導管中で前記可動化した磁性粒子を含有する前記第一の洗浄液を前記捕捉場所から流出させるステップと
をさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記導管中に第二の洗浄液を流すステップをさらに含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記導管中で前記捕捉場所へ第一の洗浄液を流して、（ａ）前記第一の洗浄液が前記封入液によって囲まれ、および（ｂ）前記第一の洗浄液が前記不動化された磁性粒子を囲むステップと、
前記磁場を除去することによって前記第一の洗浄液中で前記磁性粒子を可動化させるステップと、
前記磁場を再び加えることによって前記可動化した磁性粒子を不動化するステップと、
前記導管中で前記捕捉場所および前記不動化された磁性粒子から前記第一の洗浄液を流出させるステップと
をさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記導管中に第二の洗浄液を流すステップをさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
磁性粒子を含有する第一の試料液と、第二の試料液と、封入液との取扱い方法であって、両試料液が前記封入液と不混和性であり、前記方法が、
導管中に前記封入液を流すステップと、
前記導管中に前記第一の試料液を流して、前記第一の試料液が、（ａ）前記封入液によって囲まれ、および（ｂ）前記導管内の所定の捕捉場所に位置するステップと、
前記捕捉場所に磁場をかけることによって前記捕捉場所で前記磁性粒子を不動化するステップと、
前記導管を前記捕捉場所で加熱して、前記不動化された磁性粒子を加熱するステップと、
前記導管中に前記第一の試料液を流して、前記磁性粒子が前記捕捉場所で不動化された状態のまま、前記第一の試料液が前記捕捉場所から流出するステップと、
前記導管中に前記第二の試料液を流して、前記第二の試料液が、（ａ）前記封入液によって囲まれ、および（ｂ）前記不動化された磁性粒子を囲むステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記第二の試料液は、前記第二の試料液が前記不動化された磁性粒子を囲んだときに前記磁性分子と結合する目的生体分子を含有することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第二の試料液を流すステップの後に前記導管中に溶離液を流して、（ａ）前記溶離液が前記封入液によって囲まれ、（ｂ）前記第二の試料液が前記捕捉場所から流出し、および（ｃ）前記溶離液が前記捕捉場所に流れ、かつ前記不動化された磁性粒子を囲むステップをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記溶離液を流すステップが、前記磁性粒子を前記溶離液で囲むことによって前記磁性粒子から前記目的生体分子を解放するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶離液を流すステップの後に前記磁場を除去することによって前記溶離液中で前記磁性粒子を可動化させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記第二の試料液を流すステップの後に前記導管中に第一の洗浄液を流して、（ａ）前記第一の洗浄液が前記封入液によって囲まれ、（ｂ）前記第二の試料液が前記捕捉場所から流出し、および（ｃ）前記第一の洗浄液が前記捕捉場所に流れ、かつ前記不動化された磁性粒子を囲むステップと、
前記第一の洗浄液を流すステップの後に前記導管中に溶離液を流して、（ａ）前記溶離液が前記封入液によって囲まれ、（ｂ）前記第一の洗浄液が前記捕捉場所から流出し、および（ｃ）前記溶離液が前記捕捉場所に流れ、かつ前記不動化された磁性粒子を囲むステップと
をさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二の試料液を流すステップの後に前記磁場を除去することによって前記第二の試料液中で前記磁性粒子を可動化するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記第二の試料液および前記封入液が複合液体セルを構成することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
マーカーの存在の有無を前記捕捉場所の光学的または蛍光による照合によって検出するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記導管がキャピラリーチューブであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記導管が、１５℃〜１５０℃、２５℃〜９５℃、または３２℃〜６８℃の温度に加熱されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記導管が、１分〜２７０分、１分〜１８０分、３０分〜１８０分、１分〜９０分、または１分〜６０分の間加熱されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記導管が、３０分〜１８０分の間加熱され、かつ前記試料液中の目的生体分子の濃度が、１コピー／ｍＬ〜１０4 コピー／μＬであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
磁性粒子を含有する試料液と封入液との取扱い方法であって、前記試料液および封入液が不混和性であり、前記方法が、
導管中に前記封入液を流すステップと、
前記試料液が前記封入液によって囲まれるように前記導管中で前記試料液を流すステップと、
所定の場所で前記導管を加熱して、熱領域を画定するステップと、
前記導管を通って前記熱領域に前記試料液を流すステップと、
前記熱領域に磁場を与えることによって前記熱領域中で前記磁性粒子を不動化し、それによって捕捉場所に不動化された磁性粒子を生じさせるステップと、
前記導管中に溶離液を流して、（ａ）前記溶離液が前記封入液によって囲まれ、（ｂ）前記試料液が前記捕捉場所から流出し、および（ｃ）前記捕捉場所に前記溶離液が流れ、かつ前記不動化された磁性粒子を囲むステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
前記導管が、１５℃〜１５０℃、２５℃〜９５℃、または３２℃〜６８℃の温度に加熱されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記導管が、１分〜２７０分、１分〜１８０分、３０分〜１８０分、１分〜９０分、または１分〜６０分の間加熱されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記導管中に前記試料液を流すステップの前に、目的生体分子を前記磁性粒子と結合させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記導管が、３０分〜１８０分の間加熱され、かつ前記試料液中の目的生体分子の濃度が、１コピー／ｍＬ〜１０4 コピー／μＬであることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
所定の捕捉場所を有する導管と、前記導管中の或る場所に正圧を与えるか、負圧を与えるか、または外圧を与えないように構成されたポンプと、作動した場合に前記捕捉場所に磁場を与え、および作動しない場合に実質上磁場を与えないように構成された磁場源と、前記捕捉場所で前記導管に熱を与えるように構成された加熱素子と、前記ポンプおよび／または前記磁場源を作動させることができるように前記ポンプおよび前記磁場源に操作可能に取り付けられたコントローラーとを含み、前記コントローラーが、
封入液が前記導管中に流れるように前記ポンプを作動させ、
磁性粒子を含有する前記試料液が（ａ）前記封入液によって囲まれ、および（ｂ）前記導管内の前記捕捉場所に位置するような方法で前記試料液が前記導管内に流れるように前記ポンプを作動させ、
前記磁性粒子が前記捕捉場所で不動化されるように前記磁場源を作動させ、
前記不動化された磁性粒子が加熱されるように前記加熱素子を作動させ、かつ
（ａ）前記溶離液が前記封入液によって囲まれ、（ｂ）前記試料液が前記捕捉場所から流出し、および（ｃ）前記溶離液が前記捕捉場所に流れ、かつ前記磁性粒子を囲むような方法で前記溶離液が前記導管中に流れるように前記ポンプを作動させる
ようにプログラムされることを特徴とする液体取扱いシステム。
【請求項２９】
前記導管がキャピラリーチューブであることを特徴とする請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
前記封入液、試料液、および溶離液が、前記ポンプによって前記導管に加えられる負圧によって流されることを特徴とする請求項２８に記載のシステム。
【請求項３１】
前記封入液、試料液、および溶離液が、前記ポンプによって前記導管に加えられる正圧によって流されることを特徴とする請求項２８に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
生体分子の単離は、いずれの試料処理システムにおいても重要な部分である。自動化された分子分析システムの開発に伴って最大の制約は試料の準備および目的試料の精製にある。
【０００２】
すべての生化学過程について試料ターゲットの単離および精製がその成功にとって重要である。生化学分析過程の制約（これらに限定されないが、ピロシークエンシング、核酸連結反応、ポリメラーゼ連鎖反応、デジタルＰＣＲ、ｑＰＣＲ、核酸配列決定、タンパク質検出／タンパク質富化、遺伝子ビーズコーティング、特殊細胞の検出、および細胞富化）は、そのターゲットの出発濃度と、その分析に使用される反応試料内に存在する生化学的阻害物質のレベルとが原因である。
【０００３】
大部分の生化学分析の場合、最初の試料からターゲットを単離するために、また生化学阻害物質を除去するために試料に対して一連の事前分析のステップが行われる。これらのステップは、一般に労働集約的であり、最終的にターゲットの出発濃度を下げる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０４１９８３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
試料精製の現在の好ましい方法はスピンカラムを利用している。しかしながらスピンカラムは、複数回の遠心分離のステップを必要とし、したがって自動化されたＤＮＡライブラリー調製プラットホームと一体化することができない。同様にアガロースゲルから核酸フラグメントを精製するための精製技術もまた、核酸単離を達成するために遠心分離のステップを必要とする。
【０００６】
試料の精製に使用される１つの技術は、常磁性ビーズによる精製である。この方法は、ＤＮＡ回収率の向上をもたらすことができる手法を提供し、また特定のＤＮＡフラグメントサイズを選択的に結合させるために使用することができる整調可能な緩衝条件を提供する。
【０００７】
常磁性ビーズによる精製は、静的なウェルバッチプロセスである。この現行の方法は、ビーズ混合物、すなわち常磁性ビーズとバッファーをピペットで取って初期試料と共にマイクロタイタープレートのウェルに入れるステップを伴う。溶液をピペットで取り、混合し、室温でインキュベートしてＤＮＡをビーズと結合させる。次いでマイクロタイタープレートをマグネチックプレート上に置く。この結合したＤＮＡを保持するビーズはプレートの縁部に移動し、マグネットによって拘束される。次いでピペットを使用して上清（廃物を含有する）を取り出し、廃棄する。その後、次いで複数回の洗浄のステップを行って、ビーズペレット上に存在する／ビーズペレットに存在する残留廃物を除去する。ビーズペレットを含有するプレートにピペットでエタノールを加え、インキュベートし、次いでピペットを使用して取り出す。この洗浄のステップを２回繰り返す。次いで溶離バッファーを加える。このプレートをマグネチックプレートから取り出し、その溶離バッファーをピペット混合により混合する。このマイクロタイタープレートをマグネチックプレート上に戻す。次いで精製されたＤＮＡを含有する溶離液を、ピペットを使用して引き出す。
【０００８】
常磁性ビーズを用いたプロトコルは労働集約的なプロセスであり、多数回のピペット操作のステップを必要とするために容易には自動化されない。この多数回のピペット操作のステップはまた、大量の初期および最終試料量につながり、データ点当たりの試薬の高コストという結果を生じさせる。
【０００９】
１つの用途（なおこの用途に限定されない）は、次世代シークエンシングプラットホーム用の試料精製の改良のためのものである。多くの次世代シークエンシングプラットホームは、特定の範囲内の塩基対の長さのＤＮＡフラグメントから構成されるＤＮＡライブラリーを必要とする。さらに、ＰＣＲを使用して配列を増幅させることを可能にするために、またライブラリーフラグメントがシーケンサーのフローセルにアニールすることを可能にするために、これらのＤＮＡフラグメントに、特定のヌクレオチド配列（アダプター）でタグを付けることが必要である。単一フローセル内で試料を多重化する場合、個々の試料を識別するために、ＤＮＡフラグメントに配列特異的インデックスを加えることもまた可能である。ＤＮＡのタグメンテーション（ＤＮＡを断片化し、アダプターでタグを付ける）および共通のアダプターとインデックスの添加は、２つの別々の生化学的反応で達成される。これらの反応の後、そのＤＮＡライブラリーを浄化して過剰なヌクレオチド、酵素、プライマー、塩、および他の異物を除去する。その結果、ＤＮＡをタグメント化し、タグメント化されたＤＮＡを精製し、共通のアダプターとインデックスを加え、最終のライブラリー産物を精製するために必要とされる作業の流れは、複雑かつ労働集約的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書中で概要を述べるシステムおよび方法は、汚染のない、少量の、高処理能力の、低コストの、かつ／または試料濃度の高い試料の操作の達成を促進することができる。
【００１１】
生体分子の単離および処理に常磁性ビーズを使用する装置、システム、および方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】連続フローキャピラリーによる精製システムを示す概念図である。
【図２】双方向フローキャピラリーによる精製システムを示す概念図である。
【図３】連続フローキャピラリーによる精製システムのための磁気浄化ステップを示す概念図である。
【図４】コントローラープログラミングとして実行することができる方法を示す。
【図５】コントローラープログラミングとして実行することができる方法を示す。
【図６】コントローラープログラミングとして実行することができる方法を示す。
【図７】対照のプロトコルとキャピラリー浄化のプロトコルの似た回収率を示す分光測定法の結果を示す。対照のビーズによる精製およびキャピラリービーズによる精製の両方について回収／溶離ＤＮＡ（アクチン−β増幅産物）の濃度をプロットしている。
【図８】対照の浄化およびキャピラリーの浄化のＮｅｘｔｅｒａ産物のスミアを示すゲル画像を示す。
【図９】対照のプロトコルおよびキャピラリー浄化のプロトコルから回収されたＮｅｘｔｅｒａ産物を示すｑＰＣＲの結果を示す。
【図１０】キャピラリー中でのビーズによる精製を使用した２８５ｂｐ増幅産物の回収を裏付けるゲル結果を示す。精製されていない産物（レーン１０２、１０３）を精製された産物（レーン１０４、１０５）と比較すると、プライマー二量体などの非特異的産物が成功裡に除去される（レーン１０１がラダーである）ことが明らかである。
【図１１】「キャピラリーの汚染除去−再利用の実施例」のｑＰＣＲの結果を示す。
【図１２】コントローラープログラミングとして実行することができる方法を示す。
【図１３】コントローラープログラミングとして実行することができる方法を示す。
【図１４】コントローラープログラミングとして実行することができる光学的分析を伴う細胞富化の方法を示す。
【図１５】コントローラープログラミングとして実行することができる細胞富化の方法を示す。
【図１６】コントローラープログラミングとして実行することができる常磁性ビーズを官能化する方法を示す。
【図１７】コントローラープログラミングとして実行することができる使用済み常磁性ビーズを浄化し、また除去する方法を示す。
【図１８】コントローラープログラミングとして実行することができる複合液体セル技術（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）との相互作用の方法を示す。
【図１９】平行な導管加熱ヘッドの図面を示す。
【図２０】常磁性ビーズ浄化の機器として実行することができる装置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示は、幾つかの実施形態において導管内で生体分子を単離するためのシステムおよび方法を提供する。導管は両方向の流れを有することができ、コントローラーによって制御される。
【００１４】
一実施形態では図１Ａを参照すると、常磁性ビーズおよび試料を含有するスラッグ２と、不混和性の流体バッファー３とが導管１内を流れる。この試料は、目的生体分子、生化学過程阻害物質、および異物を含むことができる。導管は、その長さに沿った一ヶ所に磁場の発生源４を有し、それは熱的に制御されるゾーンに位置する。図１Ｂを参照すると、常磁性ビーズと試料のスラッグ２および溶離バッファーのスラッグ５とは、不混和性の流体３によって分離される。常磁性ビーズおよび試料のスラッグ２は、指定された温度で磁場源４に達し、そこでビーズは磁場内に捕獲される。図１Ｃを参照すると常磁性ビーズと試料のスラッグ２は導管１内を流れ続け、一方、結合した目的生体分子を有する常磁性ビーズ６は、磁場源によって捕獲されたまま留まる。図１Ｄを参照すると溶離バッファー５は磁場源に達し、捕獲された常磁性ビーズを包み込む。結合した目的生体分子は、導管１に沿って流れるにつれて溶離バッファー中に放出される。図１Ｅを参照すると、溶離バッファーおよび目的生体分子７は、分注または更なる分析のために導管１内を流れ続ける。
【００１５】
一実施形態では図２Ａを参照すると、導管２０中の磁場および熱源２２において溶離バッファー２４中に分散した目的生体分子を常磁性ビーズ２３から解放した後、流れは逆転される。図２Ｃを参照すると、溶離バッファーおよび目的生体分子は、磁場源および熱領域２２によって捕獲された常磁性ビーズ２３を越えて流れに戻って、分注のために元の吸入位置に戻る。
【００１６】
一実施形態では溶離バッファーおよび目的生体分子は、磁場が加わらない活動中の熱領域では磁性ビーズ粒子を溶液中に含む流れの中にある。粒子は、恐らくしばらくの間保持され、次いで磁場が作動し、粒子が不動化される。
【００１７】
一実施形態では図３Ａを参照すると、溶離バッファー３６中に分散した目的生体分子が、磁場源３４によって捕獲された常磁性ビーズ３５から導管３１中で制御された温度で解放された後、不混和性流体３３と、その後にビーズ除去および浄化のスラッグ３２が続く。図３Ｂを参照すると、ビーズ除去および浄化のスラッグ３２が常磁性ビーズ３５を包み込むにつれて磁場源３４が除去される（物理的に、またはオフ状態に変えて）。図３Ｃを参照すると、常磁性ビーズ３５は対応して除去および浄化のスラッグ３２中に入り、スラッグ３７として導管３１に沿って流れ続ける。このビーズ除去および浄化の過程は、導管３１の再利用を可能にし、また試料のクロスオーバー汚染を防止する。
【００１８】
幾つかの実施形態では加熱素子は磁場源の近くに位置することができる。その加熱素子はコントローラーによって制御することができる。加熱素子は、その捕捉場所に隣接して位置することができ、そうすることによって磁性粒子が、捕捉場所で不動化されるか、スラッグ内にあり、かつ加熱素子が作動したときに、その加熱素子は磁性粒子を加熱することができる。幾つかの実施形態ではその加熱素子には、これらに限定されないがストリップヒーター、棒状ヒーター、表面加熱器、カートリッジヒーター、放射光源、加熱液体源、および投げ込みヒーターを挙げることができる。加熱素子は、導管に、または磁性粒子への熱伝達を生じさせる任意の他の構造体に熱を加えるように構成することができる。加熱素子を作動させた場合、導管および／または粒子は、約１５℃〜約１５０℃、約２５℃〜約９５℃、または約３２℃〜約６８℃の温度に加熱されることができる。幾つかの実施形態では導管および／または粒子は、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、または約９５℃の温度に加熱される。幾つかの実施形態では導管は所定の場所で加熱され、それによって熱領域を画定する。幾つかの実施形態ではその熱領域中で不動化された粒子は、導管が加熱される結果として加熱される。導管および／または粒子は、約１分〜約２７０分の間、高温の状態を保つことができる。幾つかの実施形態では導管および／または粒子は、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約７５分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１１０分、約１２０分、約１３０分、約１４０分、約１５０分、約１６０分、約１７０分、約１８０分、約１９０分、約２００分、または約２１０分の間、高温の状態を保つことができる。幾つかの実施形態では導管および／または粒子は、約１分〜約９０分の間または約１分〜約６０分の間、高温の状態を保つことができる。幾つかの実施形態ではより低濃度試料（すなわち約１コピー／ｍＬから最高約１０4 コピー／μＬまでの範囲）の場合、導管および／または粒子は、約１５分〜約２７０分の間または約３０分〜約１８０分の間、高温の状態を保つことができる。幾つかの実施形態ではより低濃度の試料は、約１コピー／ｍＬ〜約１０4 コピー／μＬ、または約０．０１コピー／μＬ〜約１０3 コピー／μＬ、または約０．１コピー／μＬ〜約１００コピー／μＬ、または約１コピー／μＬ〜約１０コピー／μＬの濃度を有する試料である。幾つかの実施形態ではより低濃度の試料は、約０．００１コピー／μＬ、約０．０１コピー／μＬ、約０．０５コピー／μＬ、約０．１コピー／μＬ、約０．５コピー／μＬ、約１コピー／μＬ、約５コピー／μＬ、約１０コピー／μＬ、約５０コピー／μＬ、約１００コピー／μＬ、約５００コピー／μＬ、約１０3 コピー／μＬ、または約１０4 コピー／μＬの濃度を有する試料である。
【００１９】
別法では、粒子を加熱ではなく冷却することができる冷却素子を磁場源の近くに位置することもできる。幾つかの実施形態においてその考えられる冷却素子には、これらに限定されないが熱電素子、冷凍装置、液冷装置を挙げることができる。幾つかの実施形態では導管は所定の場所で冷却される。幾つかの実施形態ではその所定の場所で不動化された粒子は、導管が冷却される結果として冷却される。幾つかの実施形態では導管および／または粒子を約−６℃〜約６０℃の温度に保つことができる。幾つかの実施形態では導管および／または粒子を約−４℃〜約４０℃の温度に保つことができる。幾つかの実施形態では導管および／または粒子を約４℃〜約２８℃の温度に保つことができる。幾つかの実施形態では導管および／または粒子を、約−６℃、約−４℃、約−２℃、約０℃、約２℃、約４℃、約６℃、約８℃、約１０℃、約１２℃、約１４℃、約１６℃、約１８℃、約２０℃、約２２℃、約２４℃、約２６℃、約２８℃、約３０℃、約３２℃、約３４℃、約３６℃、約３８℃、または約４０℃の温度に保つことができる。導管および／または粒子は、ある一定の温度に約１分〜約２７０分の間保つことができる。幾つかの実施形態では導管および／または粒子は、ある一定の温度に約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約７５分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１１０分、約１２０分、約１３０分、約１４０分、約１５０分、約１６０分、約１７０分、約１８０分、約１９０分、約２００分間、または約２１０分の間保つことができる。幾つかの実施形態では導管および／または粒子を、ある一定の温度に約１分〜約９０分の間または約１分〜約６０分の間保つことができる。幾つかの実施形態では導管および／または粒子は、ある一定の温度に約１５分〜約２７０分の間または約３０分〜約１８０分の間保つことができる。幾つかの実施形態ではより低濃度の試料は、約１コピー／ｍＬ〜約１０4 コピー／μＬ、または約０．０１コピー／μＬ〜約１０3 コピー／μＬ、または約０．１コピー／μＬ〜約１００コピー／μＬ、または約１コピー／μＬ〜約１０コピー／μＬの濃度を有する試料である。幾つかの実施形態ではより低濃度の試料は、約０．００１コピー／μＬ、約０．０１コピー／μＬ、約０．０５コピー／μＬ、約０．１コピー／μＬ、約０．５コピー／μＬ、約１コピー／μＬ、約５コピー／μＬ、約１０コピー／μＬ、約５０コピー／μＬ、約１００コピー／μＬ、約５００コピー／μＬ、約１０3 コピー／μＬ、または約１０4 コピー／μＬの濃度を有する試料である。いずれのケースにおいても加熱素子が使用されようと冷却素子が使用されようと、熱制御ゾーンは０．５ｍ2 もある広さ、または導管のきわめて小さい局所加熱／冷却（一般に直径０．５ｍｍまたは任意の中間のサイズ）を使用することができる。
【００２０】
加熱ゾーンは１本の導管または複数本の導管を有することができる。
【００２１】
一実施形態ではその方法は、キャピラリーチューブと、ポンプと、そのキャピラリーチューブの長さに沿ったある一定の場所に局在する磁場との使用を含む。まず、ビーズ混合物のスラッグ（バッファーと生化学塗膜を有するビーズとを含む）および目的生体分子をキャピラリーチューブ中に導入する。ビーズは、生化学塗膜を有する磁性ビーズ、あるいは常磁性被膜を有する非磁性ビーズ（シリカ、セラミック、ポリマーなど）であることができる。これに不混和性流体、例えば空気または油のスラッグが続き、次にエタノール、空気、油、および溶離バッファーの個別スラッグが続く。これらスラッグは、局在する磁場を通ってチューブ内を流れ、そこで常磁性ビーズは磁場内に捕捉されるが、ビーズ混合物のスラッグのその他の成分はチューブに沿って流れ続け、常磁性ビーズからすべての非結合分子を除去する。次にそれらスラッグの連続的な流れは油または空気のスラッグをもたらし、それはビーズ混合物のスラッグとエタノールのスラッグの混合を防ぐバッファーとして使用される。エタノールのスラッグは、常磁性ビーズ由来の残留異物を取り除く。最初のスラッグ回収手順のプロトコルによってはこの浄化ステップを繰り返すこともできる。エタノールのスラッグが通過した後、チューブに沿ったエタノールの微量元素が溶離バッファーのスラッグと混合しないように、溶離バッファーのスラッグに先立って油バッファーが通過する。次いで溶離バッファーが常磁性ビーズ上を流れ、常磁性ビーズから生体分子ターゲットを解放して溶離バッファーのスラッグ中に入れる。このスラッグは、更なる生化学的処理および分析のためにチューブに沿って流れ続ける。
【００２２】
一実施形態では導管および磁場源は、周囲条件を超える制御された温度である。
【００２３】
一実施形態では導管および磁場源は、周囲条件を下回る制御された温度である。
【００２４】
一実施形態では導管および磁場源は全工程の一局面については加熱（すなわち単離工程の溶離のステップの領域の加熱）されるが、他のすべての工程は周囲条件で行われる。
【００２５】
一実施形態では熱領域の温度を制御するためにコントローラーが使用される。
【００２６】
一実施形態では溶離バッファーのスラッグが常磁性ビーズ上を通過した後、流れの方向が逆転され、目的生体分子を含む溶離バッファーがこの系から分注される。
【００２７】
一実施形態では溶離バッファーのスラッグの通過の後に磁場が除去され、次に来るエタノールのスラッグが、常磁性ビーズをキャピラリーチューブ内の流れに戻す。次にこのスラッグに、油のスラッグ、エタノールのスラッグ、および油のスラッグが続き、キャピラリーチューブを浄化し、また次のスラッグ反応の汚染を防ぐ。
【００２８】
一実施形態ではエタノールのスラッグには常に空気のスラッグが続く。これは系内のエタノールの除去を確実にするのに役立つ。この空気のスラッグは、空気中へのエタノールの蒸発を可能にする。
【００２９】
生体分子の例には、（これらに限定されないが）細胞、核酸、タンパク質、酵素、血液、唾液、および有機物質が挙げられる。
【００３０】
ビーズミックスは一般に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および塩を含むバッファー溶液中に分散させたビーズから構成される。
【００３１】
ビーズサイズは一般に、０．１〜５００ミクロンの範囲内にある。
【００３２】
ビーズは磁性であるか、磁気塗料を塗布される。
【００３３】
ビーズの材料は、磁気塗料が塗布されたポリマー、セラミック、または金属であることができる。
【００３４】
一実施形態ではビーズは、細胞が付着するように官能化される。
【００３５】
一実施形態ではビーズは、核酸が付着するように官能化される。
【００３６】
一実施形態ではビーズは、酵素、試薬、プライマー、または有機物質が付着するように官能化されるか、それらの付着に限定される。
【００３７】
不混和性相を生じさせるために使用される油には、シリコーン油、ペルフルオロカーボン油、およびペルフルオロポリエーテル油を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３８】
溶離バッファーには、滅菌水と、その用途に応じて所望の範囲内にｐＨを維持するためにｐＨ緩衝剤が加えられた滅菌水とを挙げることができるが、これらもまた限定されない。
【００３９】
導管は、キャピラリーチューブであることができる。
【００４０】
導管材料は、ポリマー、セラミック、または金属であることができる。
【００４１】
導管は、疎水性表面を有することができる。
【００４２】
導管はポリマーキャピラリーチューブ、例えばＰＴＦＥ材料キャピラリーチューブであることができる。
【００４３】
導管の直径は、一般には直径１０ミクロン〜１０ミリメートルの範囲内である。
【００４４】
一実施形態では導管は、少なくとも１０ミクロンまたはそれ以上の壁厚を有する。
【００４５】
導管の内部形状は、円形、正方形、楕円形、長方形の輪郭（必ずしもこれらに限定されないが）であることも、波状面を有することも、少なくとも片面に平らな面を有することも、また表面強化の形状構成を有することもできる。
【００４６】
導管内の流量は、一般には０．００００１μＬ／時〜１０００ｍＬ／時の範囲内である。
【００４７】
導管の外部形状は、円形、正方形、楕円形、長方形の輪郭（必ずしもこれらに限定されないが）であることも、波状面を有することも、少なくとも片面に平らな面を有することも、また表面強化の形状構成を有することもできる。
【００４８】
一実施形態では導管は、基体上にエッチングされたチャンネルである。
【００４９】
一実施形態では導管は、チップ上に成形されたチャンネルである。
【００５０】
一実施形態では導管は、チップをベースにした分析システム中に組み込まれる。
【００５１】
少なくとも１個または複数個の磁場が、導管の長さに沿って位置する。その磁場は、永久磁石によって、またはある種の電磁的方法によって発生させることができる。
【００５２】
一実施形態では磁場は制御可能であり、それらはマグネットの移動／除去または電磁場の無励磁化／中和のいずれかによって無力化することができる。
【００５３】
一実施形態では磁場源は、導管の周囲に配置されて多極を生じる。
【００５４】
一実施形態では磁場源は、導管の長さに沿って配置されて多極を生じる。
【００５５】
一実施形態では磁場および熱領域は、互いに隣接して位置する。
【００５６】
一実施形態では、導管に沿って複数の熱領域が存在する。
【００５７】
一実施形態では磁場および熱領域は、導管に沿って隔てられる。
【００５８】
一実施形態では導管は、磁場、続いて熱領域、続いて別の磁場を有する。
【００５９】
一実施形態では系を通る流れは、正圧によって生じる。
【００６０】
一実施形態では系を通る流れは、負圧によって生じる。
【００６１】
一実施形態ではその方法は、キャピラリーチューブと、ポンプと、そのキャピラリーチューブの長さに沿ったある一定の場所に局在する磁場との使用を含む。まず、ビーズ混合物（バッファーと、生化学塗膜を有するビーズとを含む）のスラッグをキャピラリーチューブ中に引き込む。これに不混和性流体、例えば空気または油のスラッグが続き、次に精製のための試料のスラッグが続く。この後に更なる不混和性スラッグ、またエタノール、空気、油、および溶離バッファーの更なる個別スラッグが吸い上げられる。これらスラッグは、局在する磁場を通ってチューブ内を流れ、そこで常磁性ビーズが磁場内に捕捉されるが、ビーズ混合物のスラッグのその他の成分はチューブに沿って流れ続ける。流量および磁場は、その生化学過程にとって十分な滞留時間が確実に保証されることを可能にするように制御される。これら流動性流体は導管に沿って流れ続け、産物をビーズに結合させ、またすべての非結合分子を常磁性ビーズから除去する。これらスラッグの連続的な流れは、油または空気のスラッグをもたらし、それらは水性スラッグ、例えばこれらに限定されないがビーズ混合物、エタノール、および希釈バッファーのスラッグの混合を防ぐバッファーとして使用される。エタノールのスラッグは、常磁性ビーズ由来の残留異物を取り除く。最初のスラッグ回収手順のプロトコルによってはこの浄化のステップを繰り返すこともできる。エタノールのスラッグが通過した後、チューブに沿ったエタノールの微量元素が溶離バッファーのスラッグと混合しないように溶離バッファーのスラッグに先立って油バッファーが通過する。次いで溶離バッファーが常磁性ビーズ上を流れ、常磁性ビーズから生体分子ターゲットを解放して溶離バッファーのスラッグ中に入れる。このスラッグは、更なる生化学的処理および分析のためにチューブに沿って流れ続ける。
【００６２】
系中に引き込まれるスラッグには、これらに限定されないがビーズミックス、油、溶離バッファー、エタノール、水、空気、試料、生化学ミックス（試薬、酵素など）、官能化ビーズのミックス、グルコース、緩衝剤、添加剤、光学マーカー、蛍光マーカー、および細胞を挙げることができる。
【００６３】
装置内で使用されるスラッグの順序には下記が挙げられるがこれらに限定されない。
ビーズミックスおよび試料−油−溶離バッファー。
ビーズミックスおよび試料−油−溶離バッファー。
ビーズミックスおよび試料−空気−油−溶離バッファー。
ビーズミックスおよび試料−空気−エタノール−油−溶離バッファー。
ビーズミックスおよび試料−油−エタノール−油−溶離バッファー。
ビーズミックスおよび試料−空気−エタノール−空気−エタノール−空気−油−溶離バッファー。
ビーズミックスおよび試料−油−エタノール−油−エタノール−空気−油−溶離バッファー。
ビーズミックスおよび試料−油−エタノール−油−エタノール−空気−油−生化学ミックス−油−溶離バッファー。
ビーズミックス−油−試料−油−エタノール−空気−油−生化学ミックス−油−溶離バッファー。
ビーズミックス−油−ビーズ官能化物の混合物−油−懸濁バッファー。
ビーズミックス−油−ビーズ官能化物の混合物−油−試料−油−エタノール−空気−油−生化学ミックス−油−溶離バッファー。
ビーズミックスおよび試料−油−洗浄バッファーＡ−油−洗浄バッファーＢ−油−空気−溶離バッファー。
ビーズミックスおよび試料−油−洗浄バッファーＡ−油−洗浄バッファーＡ−油−洗浄バッファーＢ−油−洗浄バッファーＢ−油−空気−溶離バッファー。
【００６４】
これらの順序および他の順序は、系からビーズを除去するための追加のステップ（すなわちスラッグの通過）を含むことができる。そのステップは、コントローラーと、チューブに沿った磁場中での摂動とにより行うことができる。
【００６５】
一実施形態では光学的検出が磁場源で使用される。
【００６６】
一実施形態では光学的検出が、スラッグの分析のために磁場源の上流で使用される。
【００６７】
一実施形態では光学的検出が、スラッグの分析のために磁場源の下流で使用される。
【００６８】
一実施形態ではキャピラリーチューブの複数の平行ラインが、単一磁場を通り過ぎた先で使用される。
【００６９】
一実施形態ではキャピラリーチューブの複数の平行ラインが、複数の局在する磁場を通り過ぎた先で使用される。
【００７０】
一実施形態では導管の少なくとも１本または複数本のラインを集めてポンプおよびコントローラーを系に組み込むためのカセットにする。
【００７１】
一実施形態では目的分子を含む溶離バッファーを分配して更なる生化学処理および分析のための複合液体セルにする。
【００７２】
一実施形態では使い捨てのキャピラリーチューブが使用される。これらのチューブは、各試料過程について交換される。
【００７３】
一実施形態では導管は再利用可能である。
【００７４】
一実施形態では導管が再利用可能な場合、系を除染し浄化するための流れが系内で使用される。
【００７５】
一実施形態では導管が再利用可能な場合、系を除染し浄化するために漂白が系内で使用される。
【００７６】
一実施形態では導管が再利用可能な場合、系を除染し浄化するために市販のＤＮＡ消化酵素が系内で使用される。
【００７７】
一実施形態ではその使用される洗浄剤は、これらに限定されないが、漂白剤、塩基、洗剤、表面殺菌剤、中性洗剤、弱酸、および殺菌剤であることができる。
【００７８】
一実施形態では洗浄バッファーは、これらに限定されないが、エタノール、イソプロパノール、非イオン界面活性剤、未変性界面活性剤、非イオン未変性界面活性剤、トリスアミノメタン（ＴＲＩＳ）、塩化水素（ＨＣｌ）、および水であることができる。
【００７９】
幾つかの実施形態は、常磁性ビーズおよび試料の流体投入口と、不混和性流体の投入口と、溶離バッファーの投入口と、流体導管と、磁場源と、液体取扱いシステムと、その液体取扱いシステムと磁場源に操作可能に連結したコントローラーを有する試料取扱いシステムとを包含する。幾つかの実施形態ではコントローラーは、（１）（ａ）磁場源を通過した所で常磁性ビーズおよび試料のスラッグを抜き取り、そこで（ｂ）常磁性ビーズおよび結合した目的生体分子を捕獲し、（ｃ）残存する試料内容物が磁場源のそばを通ってスラッグ内を流れ続け、（２）不混和性流体のスラッグを抜き取り、（３）（ａ）磁場源を通過した所で溶離バッファーを抜き取り、そこで（ｄ）結合した目的生体分子を磁場で常磁性ビーズから溶離バッファー中に放出し、（ｅ）そのスラッグが分注または更なる分析のために導管内を流れ続けるようにプログラムすることができる。具体例としての工程系統図を図４〜６、図１２〜１８に示す。
【００８０】
幾つかの実施形態では液体取扱いシステムは、導管および駆動機器を含む。幾つかの実施形態ではコントローラーは、駆動機器を駆動させて導管にステップ（１）および（２）を行わせ、次いで浄化のプロトコル用のスラッグ（一般にはエタノールのスラッグ）を抜き出させ、次いでステップ（３）および（４）を行わせるようにプログラムすることができる（図５）。幾つかの実施形態ではコントローラーはまた、駆動機器を駆動させてステップ（５）の後およびステップ（３）の前に導管が生化学試薬のスラッグを引き込むようにプログラムすることもできる（図６）。
【００８１】
幾つかの実施形態では磁場源は固定マグネットを含む。幾つかの実施形態ではコントローラーは、駆動機器を駆動させて導管にステップ（１）、（２）、（３）、（４）を行わせ、磁場源を通過した所でスラッグを抜き取る（ａ）ようにプログラムすることができる（図１２）。幾つかの実施形態ではコントローラーは、駆動機器を駆動させて導管に作業（ａ）を行いながらステップ（１）、（２）、（５）、（６）、（３）、（４）を行わせるようにプログラムすることができる（図１３）。
【００８２】
幾つかの実施形態ではコントローラーは、駆動機器を作動させて、（７）導管に常磁性ビーズのスラッグを引き込ませ、（８）抗体のスラッグを引き込ませ、（９）生化学試料のスラッグを引き込ませ、次いで作業（ａ）および磁場源での光学的検出（ｆ）を行いながらステップ（３）、続いてステップ（４）を引き起こすようにプログラムすることができる（図１４）。幾つかの実施形態ではコントローラーが作業（ｆ）を行わない場合もある（図１５）。
【００８３】
幾つかの実施形態では磁場源は非定常状態の磁場源を備える。
【００８４】
幾つかの実施形態では熱領域が磁場源と並置される。
【００８５】
幾つかの実施形態では熱領域が磁場源を取り囲む。
【００８６】
幾つかの実施形態では熱領域は磁場源と無関係に作動する。
【００８７】
幾つかの実施形態ではコントローラーは、駆動機器を駆動させて、（１０）導管に常磁性ビーズのスラッグを引き込ませ、次いで作業（ａ）を行いながら、（１１）常磁性ビーズ官能化物ミックスのスラッグを引き込ませ、次いで（１２）常磁性ビーズバッファーのスラッグを引き込ませ、またコントローラーが磁場源の状態を変化させて、（ｆ）オフ状態の磁場源を通過した所でそれらスラッグを流すステップを行ってから、（１３）官能化された常磁性ビーズの量をバッファー中に分配するようにプログラムすることができる（図１６）。
【００８８】
幾つかの実施形態ではコントローラーは、（ａ）を行いながらのステップ（４）、（５）、（６）に続いて、（１２）常磁性ビーズバッファーのスラッグを抜き取り、磁場源を変化させてステップ（ｆ）、続いてステップ（５）、次に（６）を行ってから、（１４）バッファー溶液中の使用済み常磁性ビーズの量を分配するようにさらにプログラムされる（図１７）。
【００８９】
幾つかの実施形態ではコントローラーは、（１５）封入液の投入口から封入液を抜き取り、抜き取った封入液をステップ（４）の前の、（１６）分散媒（ｃａｒｒｉｅｒ  ｌｉｑｕｉｄ）の遊離表面上の、安定化機構の近くに放出するようにさらにプログラムされる。幾つかの実施形態ではコントローラーは、ステップ（４）の代わりにステップ（１３）またはステップ（１４）を行うようにプログラムすることもできる。
【００９０】
このキャピラリービーズによる精製は、標準的なプロトコルと比べて複数の利点を提供する。この自動化された浄化の方法は、実際手に触れる時間をなくし、総プロトコル時間を著しく減らす。この手法はまた、ＤＮＡ精製のステップの再現性を改善することができると考えられる。この微少流体キャピラリーの手法は、少量をピペットで取ることに関連するかなりの量の減少なしにナノリットルの量の浄化を可能にする。これは、きわめて少ない試料量の処理を可能にし、かつ試薬の消費を減らす。標準的な精製プロトコルにおける別の重要な要素は、使用者によって引き起こされるばらつきである。本発明のシステムおよび方法は、精製プロトコルからこのばらつきを取り除く。
【００９１】
用途
キャピラリー浄化および複合液体セル処理
一実施形態では目的生体分子を含む溶離バッファーを、相互に不混和性の分散媒の遊離表面に位置決めされた不混和性液体セルに分注する。得られた複合液体セルは、輸送すること、および／または合流させること、および／または混合すること、および／またはその上で生化学的処理を行わせることができる。
【００９２】
一実施形態では目的生体分子を含む溶離バッファーは、機械的安定化機構を有する相互に不混和性の分散媒の遊離表面に位置決めされた不混和性液体セルに分注される。
【００９３】
一実施形態では導管中に引き込まれた一連の流体は、導管から相互に不混和性の分散媒の遊離表面上に分注するとすぐに複合液体セルを生じる。
【００９４】
一実施形態では常磁性ビーズは、導管浄化プロトコルの後に表面の再官能化のために複合液体セルに分注される。
【００９５】
一実施形態では、処理のために導管中に引き込まれるその流体は複合液体セルである。
【００９６】
一実施形態では、系中に引き込まれる複合液体セルは常磁性ビーズおよびバッファーである。
【００９７】
一実施形態では、系中に引き込まれる複合液体セルは初期試料を含有する。
【００９８】
一実施形態では、系中に引き込まれる複合液体セルは、目的生体分子を放出するための溶離バッファーを含有する。
【００９９】
一実施形態では、系中に引き込まれる複合液体セルは、導管中の磁場源における常磁性ビーズ上での処理のための生化学ミックスを含有する。
【０１００】
一実施形態では複合液体セル技術を使用して常磁性ビーズおよび初期試料を合流させる。複合液体セル技術は、汚染を防止し、かつ容易な処理、および／またはインキュベーション、および／または保管、および／または輸送、および／または精製前の試料の混合を可能にする。
【０１０１】
一実施形態では複数個の複合液体セルが平行に生成される。
【０１０２】
本発明のシステムおよび方法を適用することができる複合液体セルシステムの例は、例えばＰＣＴ／ＩＥ２０１１／００００４０号明細書中で開示されており、これにより本明細書中に参照により援用される。
【０１０３】
磁性粒子を含有する試料液と不混和性封入液とを取り扱うための幾つかの方法は、導管中に封入液を流すステップと、導管中に試料液を流し、そうすることによって試料液が、（ａ）封入液によって囲まれ、および（ｂ）導管内の所定の捕捉場所に位置するステップと、捕捉場所に磁場をかけることによってその捕捉場所で磁性粒子を不動化するステップと、導管中に溶離液を流し、そうすることによって、（ａ）溶離液が封入液によって囲まれ、（ｂ）試料液が捕捉場所から流出し、および（ｃ）溶離液が捕捉場所に流れ、かつ不動化された磁性粒子を囲むステップとを含む。目的分子は、その磁性粒子と結合させることができる。結合は、試料液を流す前に、あるいはこの過程中のまたは別の液状媒体中の他の箇所において試料液中で起こる。目的分子、例えば生体分子はまた、それら粒子を溶離液で囲むことによって磁性粒子から自由にする（結合させない）こともできる。この過程の間、粒子は可動化されても、またされなくてもよい。例えば、試料液が捕捉場所にある場合、または溶離液が捕捉場所にある場合、または別の液体が捕捉場所にある場合、粒子を可動化させることができる。この方法はまた、溶離液中で磁性粒子を可動化するステップ、および溶離液を捕捉場所から磁性粒子および／または遊離した目的分子と一緒に流出させるステップを含むことができる。また、磁性粒子を不動化された状態で残したまま、溶離液を捕捉場所から目的分子と一緒に流出させることもできる。
【０１０４】
これら方法はまた、導管中で捕捉場所へ１種類または複数種類の洗浄液を流し、そうすることによって、（ａ）洗浄液が封入液によって囲まれ、および（ｂ）その洗浄液が不動化された磁性粒子を囲むステップを含むこともできる。洗浄液が捕捉場所にある状態で、その洗浄液中でその磁性粒子を可動化することができる。この洗浄液はまた、導管中で捕捉場所から流出させることもできる。可動化させた場合、その磁性粒子を洗浄液と一緒に運ぶことができる。別法では磁性粒子を捕捉場所の洗浄液中で可動化し、次いで再度不動化することもできる。次いで、その磁性粒子を捕捉場所に残したまま、洗浄液を捕捉場所から導管中に流出させることができる。また第二の洗浄液を導管中に流すこともできる。
【０１０５】
磁性粒子を含有する第一の試料と、第二の試料液と、封入液（両試料液は封入液と不混和性である）とを取り扱うための幾つかの方法は、導管中に封入液を流すステップと、導管中に第一の試料液を流し、そうすることによって第一の試料液が、（ａ）封入液によって囲まれ、および（ｂ）導管内の所定の捕捉場所に位置するステップと、捕捉場所に磁場をかけることによってその捕捉場所で磁性粒子を不動化するステップと、導管中に第一の試料液を流し、そうすることによって磁性粒子が捕捉場所で不動化された状態のまま、捕捉場所から第一の試料液を流出させるステップと、導管中に第二の試料液を流し、そうすることによって第二の試料液が、（ａ）封入液によって囲まれ、および（ｂ）不動化された磁性粒子を囲むステップとを含む。
【０１０６】
第二の試料液は、その第二の試料液が磁性粒子を囲んだ場合、その磁性分子と結合する目的分子、例えば生体分子を含有することができる。磁性粒子は、第二の試料液中で不動化された状態のままであっても、また第二の試料液中で可動化されてもどちらでもよい。これら方法はまた、第二の試料液を流すステップの後に、導管中に溶離液を流し、そうすることによって、（ａ）溶離液が封入液によって囲まれ、（ｂ）第二の試料液が捕捉場所から流出し、および（ｃ）溶離液が捕捉場所に流れ、かつ不動化された磁性粒子を囲むステップを含むことができる。溶離液を流すステップは、溶離液で磁性粒子を囲むことによって磁性粒子から目的生体分子を解放するステップを含むことができる。その磁性粒子は、溶離液中で可動化されても、溶離液中で不動化された状態のままでもどちらでもよい。
【０１０７】
これら方法はまた、洗浄液を使用するステップ、例えば第二の試料液を流すステップの後に導管中に第一の洗浄液を流し、そうすることによって、（ａ）第一の洗浄液が封入液によって囲まれ、（ｂ）第二の試料液が捕捉場所から流出し、および（ｃ）第一の洗浄液が捕捉場所に流れ、かつ不動化された磁性粒子を囲むステップと、第一の洗浄液を流すステップの後に導管中に溶離液を流し、そうすることによって、（ａ）第一の洗浄液が封入液によって囲まれ、（ｂ）第一の試料液が捕捉場所から流出し、および（ｃ）溶離液が捕捉場所に流れ、かつその不動化された磁性粒子を囲むステップとを含むことができる。
【０１０８】
本明細書中で開示される方法のいずれかにおいて、試料液および封入液は、その開示された方法の間の或る箇所において、またはその全体にわたって複合液体セルを構成することができる。同様に、開示される方法のいずれかにおいて、目的分子と一緒にマーカーを使用することができる。そのようなマーカーは、捕捉場所の光学的または蛍光による照合によって検出することができる。これらの方法のいずれかにおいて導管は、例えばキャピラリーチューブであることができる。
【０１０９】
液体取扱いシステムは、所定の捕捉場所を有する導管と、その導管中の或る場所に正圧を与えるか、負圧を与えるか、または外圧を与えないように構成されたポンプと、作動した場合に捕捉場所に磁場を与え、および作動しない場合に実質上磁場を与えないように構成された磁場源と、コントローラー（このコントローラーはポンプおよび／または磁場源を作動させることができるようにポンプおよび磁場源に操作可能に取り付けられる）とを含むことができる。コントローラーは、ポンプを作動させて封入液を導管中に流すように、またポンプを作動させて試料液（試料液は磁性粒子を含有する）が、（ａ）封入液によって囲まれ、および（ｂ）導管内の捕捉場所に位置するような方法で試料液を導管内に流すように、また磁場源を作動させて磁性粒子が捕捉場所で不動化されるように、またポンプを作動させて、（ａ）溶離液が封入液によって囲まれ、（ｂ）試料液が捕捉場所から流出し、および（ｃ）溶離液が捕捉場所に流れ、かつその磁性粒子を囲むような方法で溶離液が導管中に流れるようにプログラムすることができる。より広くは、コントローラーは、開示した方法のいずれかを実施するためにポンプを作動させるように、また磁場源を作動かつ／または無力化するようにプログラムすることができる。この導管は、例えばキャピラリーチューブであることができる。ポンプは、導管に正圧および／または負圧を与えるように構成することができる。例えばポンプは、導管中に正圧下で一方向に流体を流し、また導管中に負圧下で別の方向に流体を流すように構成することができる。
【０１１０】
シークエンシング
多くの次世代シークエンシング（ＮＧＳ）プラットホームは、特定範囲内の塩基対の長さのＤＮＡフラグメントから構成されたＤＮＡライブラリーを必要とする。さらに、これらのＤＮＡフラグメントは、ＰＣＲを使用して配列を増幅することを可能にするために、かつライブラリーフラグメントがシーケンサーのフローセルにアニールすることを可能にするために特定のヌクレオチド配列（アダプター）でタグを付ける必要がある。また、単一フローセル内の試料を多重化する場合、個々の試料を識別するためにＤＮＡフラグメントに配列特異的インデックスを加えることができる。ＤＮＡのタグメンテーション（ＤＮＡを断片化し、アダプターでタグを付ける）および共通のアダプターとインデックスの添加は、２つの別々の生化学的反応で達成される。これらの反応の後、そのＤＮＡライブラリーを浄化して、過剰なヌクレオチド、酵素、プライマー、塩、および他の異物を除去する。その結果、ＤＮＡをタグメント化し、タグメント化されたＤＮＡを精製し、共通のアダプターとインデックスを加え、また最終のライブラリー産物を精製するために必要とされる作業の流れは、複雑かつ労働集約的である。一実施形態ではこのキャピラリーによる浄化システムは、遺伝子配列決定の中で必要とされる試料精製およびＤＮＡ単離のステップを自動化するために使用することができる。この方法の完全な例を下記に開示する。
【０１１１】
遺伝子配列決定のビーズコーティング
遺伝子配列決定のビーズの調製は、用途に特化した化学を使って小さなビーズをコーティングする工程である。一実施形態では遺伝子スクリーニングに先立つビーズのコーティングは、ビーズミックスのスラッグを流すステップ、続いて導管内で固定磁場を通過した所でビーズをコーティングするために使用される特定のプライマー化学によって達成される。次いで溶離バッファーのスラッグを通過させ、その導管内で使用される溶離バッファーの量によってビーズ濃度を制御することができる。磁場が取り除かれ、官能化されたビーズミックスが更なる処理のために導管に沿って流れる。
【０１１２】
一実施形態では導管内の流れを逆転することができ、その官能化されたビーズミックスは、保管または更なる生化学的処理のために分配される。
【０１１３】
これらの方法は、現在では従来の技術を使用して達成することができないマイクロリットル以下の流体の体積を取り扱い、混ぜ合わせることができ、それによって初期試料の量を減らし、かつ反応量を減らすことによりビーズコーティングの効率を向上させることができる。ＰＣＲと熱循環および遺伝子配列決定を使用する更なる処理は特別仕様である。
【０１１４】
この技術の使用は、これらの比較的小さな目標体積の回収手順を大いに単純化する。このシステムは、処理中の生化学試料がピペット操作による損失を被らないので１００％の体積回収を容易にする。これらの特徴は、生化学過程の自動化をより容易にしやすくする。
【０１１５】
スモールＲＮＡのサイズセレクション
スモールＲＮＡ分子の配列決定は、逆転写後の圧倒的な量のバックグラウンドの非特異的産物（その長さは、小さな目的分子の長さよりもわずかに短い）によって複雑になる。現在では小さな標的ｃＤＮＡ分子（ＲＮＡから逆転写された）は、所望のゲル電気泳動バンドを切り取ることによってサイズ選択される。一般にはゲル切片由来のＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ反応物に加え、次いでスピンカラムによる手法を使用して浄化する。作業の流れは労働集約的であり、かつＤＮＡ収率／回収率は劣る。
【０１１６】
一実施形態では精製およびサイズセレクションは、必要な試薬をキャピラリーにポンプで注入することによって達成される。特定量のＤＮＡビーズ溶液、エタノール、空気、および溶離バッファーを導管内に引き込み、流す。ＤＮＡ−ビーズ溶液が磁場を通って流れるにつれて、ビーズおよび結合したＤＮＡは溶液から除去されて、導管壁でペレットを形成する。ビーズ−ＤＮＡペレットは、その不動化されたペレットのそばを通って後続のエタノールのスラッグが流れるにつれて洗浄される。次いでＤＮＡがビーズから溶離され、溶離バッファーがビーズペレットのそばを通って流れるにつれて溶液になる。ポンプを逆転させ、精製されたＤＮＡを含有する溶離液を、後続のＮＧＳライブラリーの調製のワークフローのステップのために回収する。
【０１１７】
一実施形態では常磁性ビーズをｃＤＮＡ産物と混合する。磁性ビーズのサイズセレクション特性を使用し、特定の緩衝条件（異なる緩衝条件を使用することによって異なるサイズのＤＮＡを結合させることができる）を選択することによってそのスモールｃＤＮＡ分子を排他的にビーズと結合させることができる。一方、残留分子は溶液中に残ったままであり、廃物に送られる。次いでこの小さな標的分子は、溶離バッファーが固定化されたビーズペレットを通過するにつれて溶離される。
【０１１８】
一実施形態ではサイズセレクションの過程は、エタノールのスラッグなしで行われる。
【０１１９】
ＮＧＳシークエンシングのためのＤＮＡライブラリーのサイズセレクション
次世代シーケンサーのそれぞれは、適切な読込み長さ（塩基対）を有する。ライブラリー構築の間にＤＮＡは、広範囲の塩基対の長さを有するＤＮＡ分子に断片化される。サイズセレクションは、現在ではマイクロタイタープレート上で常磁性ビーズを使用して行われており、それは労働集約的であり、かつピペット操作による誤差および使用者のプロトコルのばらつきに由来する効率の悪さに悩む。このキャピラリーによる導管システムを、ＤＮＡライブラリーのサイズセレクションに使用することができる。
【０１２０】
核酸の精製
このキャピラリーによる導管システムは、ＰＣＲの前および／または後の試料の精製および／または単離に使用することができる。常磁性ビーズは、核酸の精製および／または単離のための場所として使用される。
【０１２１】
常磁性ビーズを使用して、取り込まれなかった過剰のデオキシヌクレオチド三リン酸、塩、および酵素をＰＣＲ後に除去することができる。これらの異物の効率的な除去は、遺伝子型の特定、サンガー、および次世代シークエンシングなどの下流の用途における成功を確実にするために必要である。ビーズによる精製は、増幅産物の高い回収率、異物の効果的な除去、および浄化の柔軟性を提供する。可能性のある実施形態の方法の幾つかの例を下記に示す。
【０１２２】
タンパク質の富化
また、キャピラリーによる導管システムを使用してタンパク質の富化を行うことができる。常磁性ビーズが目的タンパク質を富化する場所として使用される。
【０１２３】
ビーズは、抗体に対して高い親和性を有する媒体でコーティングされる。目的タンパク質に特異的な抗体をビーズに加え、ビーズ表面に位置する結合部位に結合させる。次いで目的タンパク質を含有する生体試料を加え、抗体に付着させる。磁場を与えることにより、バックグラウンド分子を含有する生体試料からの分離および単離が可能になる。上清を廃棄し、溶離バッファーを加えることにより、精製された目的タンパク質が得られる。このビーズを用いたタンパク質の富化の手法は、キャピラリーを用いたシステムを使用して達成され、自動化された高い処理能力の方法でタンパク質の富化を可能にする。
【０１２４】
構築された合成核酸構造物
本明細書に概要を述べたシステムと似たシステムでは常磁性ビーズを、核酸構造物（オリゴヌクレオチド）の組立てを支援するために使用することができる。
【０１２５】
磁性ビーズは、関連する結合化学作用に曝す際に重要な大きな比表面積を与える。オリゴヌクレオチド合成は、所望の配列が組み立てられるまで、ヌクレオチド残基を成長鎖の５’−末端に段階的に加えることによって行われる。ステップは、共役に先立って官能基を酸性溶液によって除去するデブロッキング（脱トリチル化）を含む。共役は、ヌクレオシドホスホルアミダイトを導入し結合させて、次の塩基を構築する。次いでキャップ形成により更なる鎖伸長の阻止を確実にする。これは、その固体担体を無水酢酸および１−メチルイミダゾールで処理することによって行われる。次いで安定性を増すために酸化を行う。
【０１２６】
細胞の富化／単離
常磁性ビーズを使用して生体試料から目的細胞を単離し、富化することができる。この手法は、カラムを使用することなしに直接に生体試料から細胞を富化し、高い細胞の生存可能性および収率を確実にする。これは、目的細胞が極めて希薄な微小残存病変における腫瘍細胞分析などの用途において特に重要である。
【０１２７】
富化は、特異的細胞マーカーに対する抗体でコーティングした常磁性ビーズを生体試料に加えることによって達成される。目的細胞はビーズと結合し、マグネットを使用して分離される。次いでバックグラウンド細胞を含有する上清を廃棄する。次いで分析のためにその目的細胞を回収することができる。この常磁性ビーズによる細胞の単離および富化の手法をキャピラリーによるシステムに導入し、自動化された細胞富化および下流の分析のための他のミクロ流体技術との一体化を可能にすることができる。
【０１２８】
具体例としての実施形態
幾つかの実施形態において本発明は、磁性粒子を含有する試料液と封入液（この試料液および封入液は不混和性である）との取扱い方法に関し、この方法は、
導管中に封入液を流すステップと、
導管中に試料液を流し、そうすることによって試料液が、（ａ）その封入液によって囲まれ、および（ｂ）導管内の所定の捕捉場所に位置するステップと、
その捕捉場所に磁場を与えることによって捕捉場所で磁性粒子を不動化するステップと、
その捕捉場所の導管を加熱し、それによって不動化された磁性粒子を加熱するステップと、
導管中に溶離液を流し、そうすることによって、（ａ）溶離液が封入液によって囲まれ、（ｂ）試料液が捕捉場所から流出し、および（ｃ）溶離液が捕捉場所に流れ、かつその不動化された磁性粒子を囲むステップと
を含む。
【０１２９】
幾つかの実施形態において本発明は、
試料液を導管中に流すステップの前に、目的生体分子を磁性粒子と結合させるステップをさらに含み、かつ
その溶離液を流すステップが、磁性粒子を溶離液で囲むことによって磁性粒子から目的生体分子を解放するステップをさらに含む、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１３０】
幾つかの実施形態において本発明は、溶離液を流すステップの後に磁場を除去することによって溶離液中の磁性粒子を可動化するステップをさらに含む、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１３１】
幾つかの実施形態において本発明は、可動化した磁性粒子を含有する溶離液を捕捉場所から流出させるステップをさらに含む、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１３２】
幾つかの実施形態において本発明は、加えられた磁場によって磁性粒子が不動化された状態のまま、供給目的生体分子を含有する溶離液を捕捉場所から流出させるステップをさらに含む、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１３３】
幾つかの実施形態において本発明は、
導管中で捕捉場所へ第一の洗浄液を流し、そうすることによって、（ａ）その洗浄液が封入液によって囲まれ、および（ｂ）その第一の洗浄液が不動化された磁性粒子を囲むステップと、
磁場を除去することによって第一の洗浄液中で磁性粒子を可動化するステップと、
導管中で可動化した磁性粒子を含有する第一の洗浄液を捕捉場所から流出させるステップと
をさらに含む、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１３４】
幾つかの実施形態において本発明は、第二の洗浄液を導管中に流すステップをさらに含む、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１３５】
幾つかの実施形態において本発明は、
導管中で捕捉場所へ第一の洗浄液を流し、そうすることによって、（ａ）その洗浄液が封入液によって囲まれ、および（ｂ）その第一の洗浄液が不動化された磁性粒子を囲むステップと、
磁場を除去することによって第一の洗浄液中で磁性粒子を可動化させるステップと、
磁場を加えることによってその可動化した磁性粒子を不動化するステップと、
捕捉場所および不動化された磁性粒子から導管中に第一の洗浄液を流出させるステップと
をさらに含む、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１３６】
幾つかの実施形態において本発明は、導管中に第二の洗浄液を流すステップをさらに含む、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１３７】
幾つかの実施形態において本発明は、磁性粒子を含有する第一の試料液と、第二の試料液と、封入液（これら両試料液は封入液と不混和性である）との取扱い方法に関し、この方法は、
導管中に封入液を流すステップと、
導管中に第一の試料液を流し、そうすることによってその第一の試料液が、（ａ）封入液によって囲まれ、および（ｂ）導管内の所定の捕捉場所に位置するステップと、
その捕捉場所に磁場を与えることによって捕捉場所で磁性粒子を不動化するステップと、
捕捉場所の導管を加熱し、それによってこの不動化された磁性粒子を加熱するステップと、
導管中に第一の試料液を流し、そうすることによって磁性粒子が捕捉場所で不動化された状態のまま、捕捉場所から第一の試料液を流出させるステップと、
導管中に第二の試料液を流し、そうすることによってその第二の試料液が、（ａ）封入液によって囲まれ、かつ不動化された磁性粒子を囲むステップと
を含む。
【０１３８】
幾つかの実施形態において本発明は、第二の試料液が不動化された磁性粒子を囲んだときその第二の試料液が、磁性粒子と結合している目的生体分子を含有する、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１３９】
幾つかの実施形態において本発明は、第二の試料液を流すステップの後、導管中に溶離液を流し、そうすることによって、（ａ）溶離液が封入液によって囲まれ、（ｂ）第二の試料液が捕捉場所から流出し、および（ｃ）溶離液が捕捉場所に流れ、かつ不動化された磁性粒子を囲むステップをさらに含む、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１４０】
幾つかの実施形態において本発明は、溶離液を流すステップが、溶離液で磁性粒子を囲むことによって磁性粒子から目的生体分子を解放するステップをさらに含む、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１４１】
幾つかの実施形態において本発明は、溶離液を流すステップの後に磁場を除去することによって溶離液中で磁性粒子を可動化させるステップをさらに含む、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１４２】
幾つかの実施形態において本発明は、
第二の試料液を流すステップの後に、導管中に第一の洗浄液を流し、そうすることによって、（ａ）その第一の洗浄液が封入液によって囲まれ、（ｂ）第二の試料液が捕捉場所から流出し、および（ｃ）第一の洗浄液が捕捉場所に流れ、その不動化されている磁性粒子を囲むステップと、
第一の洗浄液を流すステップの後に、導管中に溶離液を流し、そうすることによって、（ａ）溶離液が封入液によって囲まれ、（ｂ）第一の洗浄液が捕捉場所から流出し、および（ｃ）溶離液が捕捉場所に流れ、不動化されている磁性粒子を囲むステップと
をさらに含む、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１４３】
幾つかの実施形態において本発明は、第二の試料液を流すステップの後に磁場を除去することによって第二の試料液中で磁性粒子を可動化させるステップをさらに含む、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１４４】
幾つかの実施形態において本発明は、第二の試料液および封入液が複合液体セルを構成する、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１４５】
幾つかの実施形態において本発明は、マーカーの存在の有無を捕捉場所の光学的または蛍光による照合によって検出するステップをさらに含む、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１４６】
幾つかの実施形態において本発明は、導管がキャピラリーチューブである、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１４７】
幾つかの実施形態において本発明は、導管が約１５℃〜約１５０℃の温度に加熱される、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１４８】
幾つかの実施形態において本発明は、導管が約２５℃〜約９５℃の温度に加熱される、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１４９】
幾つかの実施形態において本発明は、導管が約３２℃〜約６８℃の温度に加熱される、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１５０】
幾つかの実施形態において本発明は、導管が約１分〜約２７０分の間加熱される、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１５１】
幾つかの実施形態において本発明は、導管が約１分〜約１８０分の間加熱される、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１５２】
幾つかの実施形態において本発明は、導管が約３０分〜約１８０分の間加熱される、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１５３】
幾つかの実施形態において本発明は、導管が約１分〜約９０分の間加熱される、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１５４】
幾つかの実施形態において本発明は、導管が約１分〜約６０分の間加熱される、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１５５】
幾つかの実施形態において本発明は、導管が約３０分〜約１８０分の間加熱され、かつ試料液中の目的生体分子の濃度が約１コピー／ｍＬ〜約１０4 コピー／μＬである、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１５６】
幾つかの実施形態において本発明は、磁性粒子を含有する試料液と封入液との取扱い方法（試料液および封入液は不混和性である）に関し、この方法は、
導管中に封入液を流すステップと、
その封入液によって試料液が囲まれるように導管中に試料液を流すステップと、
所定の場所で導管を加熱し、それによって熱領域を画定するステップと、
導管を通って熱領域に試料液を流すステップと、
その熱領域に磁場を与えることによって熱領域中で磁性粒子を不動化し、それによって捕捉場所に不動化磁性粒子を生じさせるステップと、
導管中に溶離液を流し、そうすることによって、（ａ）溶離液が封入液によって囲まれ、（ｂ）試料液が捕捉場所から流出し、および（ｃ）捕捉場所に溶離液が流れ、不動化されている磁性粒子を囲むステップと
を含む。
【０１５７】
幾つかの実施形態において本発明は、導管が約１５℃〜約１５０℃の温度に加熱される、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１５８】
幾つかの実施形態において本発明は、導管が約２５℃〜約９５℃の温度に加熱される、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１５９】
幾つかの実施形態において本発明は、導管が約３２℃〜約６８℃の温度に加熱される、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１６０】
幾つかの実施形態において本発明は、導管が約１分〜約２７０分の間加熱される、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１６１】
幾つかの実施形態において本発明は、導管が約１分〜約１８０分の間加熱される、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１６２】
幾つかの実施形態において本発明は、導管が約３０分〜約１８０分の間加熱される、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１６３】
幾つかの実施形態において本発明は、導管が約１分〜約９０分の間加熱される、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１６４】
幾つかの実施形態において本発明は、導管が約１分〜約６０分の間加熱される、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１６５】
幾つかの実施形態において本発明は、
導管中に試料液を流すステップの前に、目的生体分子を磁性粒子と結合させるステップをさらに含む、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１６６】
幾つかの実施形態において本発明は、導管が約３０分〜約１８０分の間加熱され、かつ試料液中の目的生体分子の濃度が約１コピー／ｍＬ〜約１０4 コピー／μＬである、本明細書中で述べた方法のいずれか１つに関する。
【０１６７】
幾つかの実施形態において本発明は、所定の捕捉場所を有する導管と、その導管中の或る場所に正圧を与えるか、負圧を与えるか、または外圧を与えないようにされたポンプと、作動した場合に捕捉場所に磁場を与え、および作動しない場合に実質上磁場を与えないようにされた磁場源と、コントローラー（このコントローラーはポンプおよび／または磁場源を作動させることができるようにポンプおよび磁場源に操作可能に取り付けられる）とを含む液体取扱いシステムに関し、そのコントローラーは、
封入液が導管中に流されるようにポンプを作動させ、
試料液（試料液は磁性粒子を含有する）が、（ａ）封入液によって囲まれ、および（ｂ）導管内の捕捉場所に位置するような方法で試料液を導管内に流すようにポンプを作動させ、
磁性粒子が捕捉場所で不動化されるように磁場源を作動させ、
その不動化された磁性粒子が加熱されるように加熱素子を作動させ、また
（ａ）溶離液が封入液によって囲まれ、（ｂ）試料液が捕捉場所から流出し、および（ｃ）捕捉場所に溶離液が流れ、磁性粒子を囲むような方法で導管中に溶離液が流されるようにポンプを作動させるようにプログラムされる。
【０１６８】
幾つかの実施形態において本発明は、導管がキャピラリーチューブである、本明細書中で述べたシステムのいずれか１つに関する。
【０１６９】
幾つかの実施形態において本発明は、封入液、試料液、および溶離液が、ポンプによって加えられる負圧によって流される、本明細書中で述べたシステムのいずれか１つに関する。
【０１７０】
幾つかの実施形態において本発明は、封入液、試料液、および溶離液が、ポンプによって加えられる正圧によって流される、本明細書中で述べたシステムのいずれか１つに関する。
【実施例】
【０１７１】
下記実施例は特定の実施形態を例示するが、開示された主題の範囲を限定するものと考えるべきではない。
【０１７２】
２８５ｂｐ増幅産物の精製および回収
この実施例は、ＧｅｎＣｅｌｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍのキャピラリーによる核酸精製システムから得られたデータを提示する。この実験は、このキャピラリー精製システムがＰＣＲ産物を精製し回収することができることを実証するために行った。
【０１７３】
アクチン−β遺伝子上の２８５ｂｐフラグメントを標的とするフォワードおよびリバースプライマーを使用し、意図する産物をＰＣＲを使用して増幅させた。次いでその産物を使用し、このキャピラリーを用いた常磁性ビーズの精製機器の性能を評価した。１８μＬのビーズ−バッファーミックス（ＡＭＰｕｒｅ  Ｘｐ、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を、ピペットでＰＣＲ管中の１０μＬのＰＣＲ産物に加えた。その１．８倍のビーズミックス濃度は、１００ｂｐを超えるフラグメントが回収されることを裏付ける。ＡＭＰｕｒｅ  Ｘｐのプロトコルで推奨されているようにビーズ−ＤＮＡミックスをピペット混合し、室温で５分間インキュベートしてＤＮＡをビーズと結合させた。２８μＬのビーズ−ＤＮＡ溶液、続いて５μＬの７０％エタノールのスラッグを２回、１０μＬの空気のスラッグ、２．５μＬのポリジメチルシロキサン油、および１０μＬの溶離バッファー（ヌクレアーゼが含まれていない水）を吸入してＰＴＦＥキャピラリーチューブ（内径４００ミクロン）に入れた。これら一連のＤＮＡ−ビーズミックス、エタノール、空気、油、および溶離バッファーのスラッグは、シリンジポンプ（ＰＨＤ  ２０００、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して１０μＬ／分の一定流量で送り込まれた。試薬の上記順序は、ＡＭＰｕｒｅ  Ｘｐのプロトコルによって指定された精製のステップによく似ている。ビーズおよび結合した目的ＤＮＡは、ビーズ−ＤＮＡ溶液がマグネットを通過するにつれて溶液からキャピラリーの壁へ移った。エタノールのスラッグが、その時点で固定されているＤＮＡ−ビーズペレット上を通過し、ペレットを洗浄し、残留する異物を除去した。次いで空気および油のスラッグが送られてペレットのそばを通り過ぎ、残留エタノールを除去した。この精製過程の最終ステップにおいて溶離バッファーのスラッグがビーズペレットを通過するにつれて目的ＤＮＡをビーズから溶離し、溶液にした。ポンプを逆転させ、溶離液を分析用の無菌ＰＣＲ管中に回収した。この実験は、繰り返して２回行った。次いでゲル電気泳動を使用して溶離液を分析した。
【０１７４】
これら２つの溶離液試料を未精製の２８５ｂｐのアクチン−β産物と比較したゲル電気泳動の結果を図１０に見ることができる。図１０を観察すると上記キャピラリー精製技術が成功裡にその３８５ｂｐを回収したことが明らかである。溶離液のバンドを非洗浄ＰＣＲ産物のバンドと比較すると、この精製手順がプライマー二量体などの非特異的産物を取り除いたことが明らかである。
【０１７５】
ＤＮＡ回収率：従来のＤＮＡ単離プロトコルとの比較
この実施例は、従来のビーズによる精製プロトコルとキャピラリービーズによる精製プロトコルの回収率を比較したＧｅｎＣｅｌｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのキャピラリー核酸精製システムで得られたデータを提示する。これらの実験は、キャピラリービーズによる精製手法の性能を評価するために使用された。
【０１７６】
２８５ｂｐアクチン−β増幅産物を精製用のＤＮＡ鋳型として使用した。２８５ｂｐ増幅産物の精製および回収の実施例において上記で概要を述べたキャピラリービーズによる精製プロトコルの後にその増幅産物を精製し回収した。この実験を繰り返して４回行い、その溶離液試料を分析のために保管した。
【０１７７】
別個の実験においてＡＭＰｕｒｅ  Ｘｐプロトコルの後、２８５ｂｐ増幅産物を含有する１０μＬの鋳型溶液を浄化した。１８μＬのＡＭＰｕｒｅ  Ｘｐビーズミックスを、１０μＬの鋳型溶液を含有する９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェルにピペットで移した。このＤＮＡ−ビーズ混合物をピペット混合し、室温で５分間インキュベートした。そのマイクロタイタープレートをマグネチックプレート上に置いて、結合したＤＮＡを含有するビーズを溶液から分離した。ピペットを使用して上清を吸い出し、廃棄した。ビーズペレットに２００μＬの７０％エタノールを加え、室温で３０秒間インキュベートした。次いでピペットを使用してエタノールを吸い出し、廃棄した。これを合計２回の洗浄について繰り返した。最終の洗浄ステップの後、エタノールが残らず除去されたことを確実にするためにペレットを自然乾燥した。１０μＬの溶離バッファー（ヌクレアーゼが含まれていない水）をウェルに加え、それをピペットでマグネチックプレートからビーズペレットに移し、ビーズからＤＮＡを溶離し、溶液にした。そのマイクロタイタープレートをマグネチックプレート上に置き、溶離液を新しいマイクロタイタープレートに移した。この実験は繰り返して３回行われ、その試料を分析のために保管した。
【０１７８】
従来の浄化プロトコルの手法およびキャピラリー浄化の手法により回収された溶離液を、ＵＶ可視分光測定法の測定値（ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化した。このＵＶ可視分光測定法による定量化の結果を図７に見ることができる。図７に示した定量化の結果は、キャピラリー浄化の回収率が、従来のプロトコルを使用して達成される回収率と同一であることを実証している。この結果はＤＮＡ回収率が、従来のＡＭＰｕｒｅ  Ｘｐのプロトコルを使用して達成される回収率に等しいことを裏付ける。本明細書に概要を述べたキャピラリーのＤＮＡ精製手法は、性能の二律背反なしに高度に自動化された精製を提供する。
【０１７９】
ＤＮＡライブラリーの調製
この実施例は、キャピラリービーズによる精製をどのようにして次世代シークエンシングのＤＮＡライブラリー調製プロトコルに組み込むことができるかを例示する。ここで提示したデータは、ＤＮＡライブラリー調製プロトコル内の様々な生化学的過程の後に現在行われている精製のステップをキャピラリー浄化の手法を使用して置き換えることができ、それが次世代シーケンサーのＤＮＡライブラリーの調製に完全に自動化された高処理能力の手法を提供することを実証する。
【０１８０】
この実施例では、Ｎｅｘｔｅｒａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に現在使用されている浄化のステップの代わりにキャピラリー浄化を行った。９μＬのタグメンテーション反応物を準備した。この反応物は、対照のゲノムＤＮＡと、高分子量緩衝剤と、Ｎｅｘｔｅｒａ酵素ミックスと、ヌクレアーゼが含まれていない水とを含有した。この反応においてＤＮＡは断片化され、アダプターでタグを付けられる。タグメンテーション反応物を準備し、５５℃で５分間インキュベートした。タグメンテーションの後、その試料を、推奨されているＺｙｍｏ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の代わりにキャピラリービーズによる精製システムを使用して精製した。９μＬのタグメント化した産物を１６．２μＬのＡＭＰｕｒｅ  Ｘｐビーズ溶液に加え、ピペット混合し、室温で５分間インキュベートした。次いでこのＤＮＡ−ビーズ溶液を吸入してＰＴＦＥキャピラリー（内径４００ミクロン）に入れた。次いでそのキャピラリーに、２．５μＬの空気のスラッグ、１０μＬのＤＮＡ結合バッファーのスラッグ、２．５μＬの空気のスラッグ、２．５μＬの空気のスラッグによって区切られた２個の５μＬのエタノールのスラッグ、１０μＬの空気のスラッグと、２．５μＬの油のスラッグ、および１５μＬの溶離バッファー（ヌクレアーゼが含まれていない）を装入した。この一連の試薬スラッグは、シリンジポンプ（ＰＨＤ  ２０００、Ｈａｒｖａｒｄ）を使用して１０μＬ／分で送り込まれた。ビーズおよび結合した目的ＤＮＡは、ビーズ−ＤＮＡ溶液がマグネットを通過するにつれて溶液からキャピラリーの壁へ移った。次いでＤＮＡ結合バッファー（Ｚｙｍｏ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  Ｋｉｔ，Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）が、その不動化されているビーズペレットを通過し、断片化された目的ＤＮＡからトランスポザーゼ酵素（既知のＰＣＲ阻害物質）を引き離した。その後、エタノール洗浄のステップが、ビーズ−ＤＮＡペレットを通過し、残留した異物を除去した。次いで空気のスラッグおよび油のスラッグがペレットを通過し、残留エタノールを除去した。最後に、溶離バッファーがペレットを通過するにつれて、タグメント化されたＤＮＡがビーズから溶離された。ポンプを逆転させ、後続のＮｅｘｔｅｒａライブラリー調製プロトコルのステップのために溶離バッファーを回収した。
【０１８１】
１１μＬの溶離液をＰＣＲ反応物に加えた（最終体積２５μＬ）。次いで、リミテッドサイクルＰＣＲを、Ｎｅｘｔｅｒａのプロトコルで指定された熱サイクル条件に従ってＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。このＰＣＲ反応物を７２℃で３分間、９５℃で３０秒間加熱し、続いて９５℃で１０秒間、６２℃で３０秒間、および７２℃で３分間の９サイクルの加熱を行った。このＰＣＲのステップの間に、タグメント化されたＤＮＡの末端にブリッジＰＣＲと相性の良い部位および特異的インデックスを加える。リミテッドサイクルＰＣＲのステップの後、そのＤＮＡライブラリー産物を、推奨されているＺｙｍｏ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）またはＡｍＰｕｒｅ  Ｘｐ精製キットの代わりにキャピラリービーズによる浄化を使用して精製した。２５μＬのＰＣＲ反応物のうちの１５μＬを、２５μＬのＡｍＰｕｒｅ  Ｘｐビーズ溶液に加え、ピペット混合し、室温で５分間インキュベートした。そのビーズ−ＤＮＡ溶液を吸引してＰＴＦＥキャピラリー（内径４００ミクロン）に入れた。次いでそのキャピラリーに、２．５μＬの空気のスラッグ、空気のスラッグによって区切られた２個の５μＬのエタノールのスラッグ、続いて１０μＬの空気のスラッグ、２．５μＬの油のスラッグ、および１５μＬの溶離バッファー（ヌクレアーゼが含まれていない）のスラッグを装入した。ビーズ−ＤＮＡ溶液がマグネットを通過するにつれてビーズおよび結合したＤＮＡは溶液からキャピラリーの壁へ移った。その後、エタノール洗浄のステップが、ビーズ−ＤＮＡペレットを通過し、残留する異物を除去した。次いで空気のスラッグおよび油のスラッグがペレットを通過し、残留エタノールを除去した。最後に、溶離バッファーがペレットを通過するにつれて、ＤＮＡライブラリー配列がビーズから溶離された。ポンプを逆転させ、分析のために溶離バッファーを回収した。この実験は、繰り返して２回行われた。
【０１８２】
ゲル電気泳動を使用して、この回収されたＤＮＡライブラリーを分析した。ゲル電気泳動の結果は図８に見ることができる。このゲルの結果をよく見ると、Ｎｅｘｔｅｒａのプロトコル中に導入された２回のキャピラリー浄化のステップが、ライブラリー配列を成功裡に浄化し、精製したことは明らかである。２００ｂｐを超えるＤＮＡライブラリーフラグメントに対応するスミアバンドを図８に見ることができ、これはキャピラリービーズによる浄化が、タグメンテーション後のトランスポザーゼ酵素の除去と、タグメンテーションおよびリミテッドサイクルＰＣＲ後の産物の精製に有効であることを実証する。これは、キャピラリービーズによる浄化システムが、ＤＮＡライブラリー調製のプロトコル内の従来の精製ステップの実現可能な選択肢であることを立証する。
【０１８３】
ＤＮＡライブラリーの調製：従来のＤＮＡ精製のプロトコルとの比較
この実施例は、ＤＮＡライブラリー調製のプロトコルで用いるためのキャピラリービーズによる精製システムの正当性を立証する。このＤＮＡライブラリー調製のプロトコルは、プロトコルどおりに、かつキャピラリー浄化のステップにより行った。次いで両実験から得られる最終ライブラリー産物を比較し、従来の浄化のステップの代わりのキャピラリー浄化のステップの有効性を確かめた。
【０１８４】
以前のＤＮＡライブラリー調製の実施例で述べたと同様に、タグメンテーション後、およびリミテッドサイクルＰＣＲ後にキャピラリー浄化のステップを使用してＮｅｘｔｅｒａライブラリー調製のプロトコルを実施した。これは繰り返して２回行われ、最終ライブラリー産物を回収し、分析のために保管した。
【０１８５】
Ｎｅｘｔｅｒａライブラリー調製のプロトコルを、１つの改変個所を伴ってその推奨されたプロトコルどおりに行った（すなわちタグメンテーション後の浄化は、ＡｍＰｕｒｅ  Ｘｐ精製キットを使用して行った）。タグメンテーション反応物を、以前のＤＮＡライブラリー調製の実施例で述べたと同様に準備した。次いで９μＬのタグメンテーション反応物を、ＡｍＰｕｒｅ  Ｘｐ精製キットを使用して精製した。その９μＬのタグメント化産物をマイクロタイタープレートのウェル中の１６．２μＬのＡｍＰｕｒｅ  Ｘｐビーズ溶液に加え、ピペット混合し、室温で５分間インキュベートした。このマイクロタイタープレートをマグネットプレート上に置いて、その溶液から結合したＤＮＡを含有するビーズを分離した。ピペットを使用して上清を吸引し、廃棄した。２００μＬのＤＮＡ結合用バッファーをビーズペレットに加え、室温で６０秒間インキュベートしてタグメント化ＤＮＡからトランスポザーゼ酵素を引き離した。２００μＬの７０％エタノールをビーズペレットに加え、室温で３０秒間インキュベートした。次いで、ピペットを使用してエタノールを吸引により除き、廃棄した。これを合計２回の洗浄について繰り返した。最終の洗浄のステップの後、エタノールが残らず除去されたことを確実にするためにペレットを自然乾燥した。１５μＬの溶離バッファー（ヌクレアーゼが含まれていない水）をウェルに加え、ピペットでビーズペレットに移し、それをマグネチックプレートから取り出して溶離バッファー中でのビーズの再懸濁を可能にし、ＤＮＡをビーズから溶離し、溶液にした。マイクロタイタープレートをマグネチックプレート上の元の位置に戻し、ビーズと溶離液を分離し、その溶離液をＰＣＲ反応物に移した（最終体積２５μＬ）。
【０１８６】
ＤＮＡライブラリー調製の実施例で述べたと同様にリミテッドサイクルＰＣＲを行った。ＰＣＲ後、２５μＬのＰＣＲ反応物のうちの１５μＬを、マイクロタイタープレートのウェル中の２５μＬのＡｍＰｕｒｅ  Ｘｐビーズ溶液に加えた。このＤＮＡ−ビーズ混合物をピペット混合し、室温で５分間インキュベートした。このマイクロタイタープレートをマグネチックプレート上に置いて、結合したＤＮＡを含有するビーズを溶液から分離した。ピペットを使用して上清を吸引し、廃棄した。２００μＬの７０％エタノールをビーズペレットに加え、室温で３０秒間インキュベートした。次いで、ピペットを使用してエタノールを吸引により除き、廃棄した。これを合計２回の洗浄について繰り返した。最終のステップの後、エタノールが残らず除去されたことを確実にするためにペレットを自然乾燥した。１５μＬの溶離バッファー（ヌクレアーゼが含まれていない水）をウェルに加え、ピペットでビーズペレットに移し、それをマグネチックプレートから取り出して溶離バッファー中でのビーズの再懸濁を可能にし、ビーズからＤＮＡを解放し、溶液にした。マイクロタイタープレートをマグネチックプレート上の元の位置に戻し、ビーズを溶液から分離し、その最終ライブラリー産物を含有する溶離液を分析のために新しいマイクロタイタープレートに移した。この実験は、繰り返して２回行われた。
【０１８７】
従来のプロトコルおよびキャピラリー浄化のステップを組み込んだプロトコルを使用して回収された最終ライブラリー産物を、ゲル電気泳動を使用して分析した。そのゲルの結果を図８に見ることができる。このゲルの結果をよくみると、キャピラリー浄化のプロトコルから回収された産物のスミアの強度およびサイズは、従来のプロトコルを使用して調製したライブラリーのそれにほぼ等しいことが明らかである。これは、キャピラリービーズによる精製ステップをプロトコルに導入することが、従来のプロトコルを使用して得られる回収率およびライブラリー品質に似た回収率およびライブラリー品質をもたらすことを実証している。キャピラリーによる手法は、他の公開されている構築技術と一体化して完全に自動化されたＤＮＡライブラリー調製システムを提供することができる労働力を使わない高処理能力の手法を提供する。
【０１８８】
少量のＤＮＡライブラリーの調製：従来のＤＮＡ精製プロトコルとの比較
この実施例は、少量のＤＮＡライブラリーの調製におけるキャピラリービーズによる精製システムの有効性を明らかにする。このＤＮＡライブラリー調製のプロトコルは、プロトコルどおりに、かつ反応量を減らすためにキャピラリー浄化のステップを使用して行った。次いで両実験から得られる最終ライブラリー産物を比較し、少量のＤＮＡライブラリーを調製する場合に従来の浄化ステップの代わりのキャピラリー浄化ステップを使用する利点を確かめた。
【０１８９】
この実験の前半部分では、２．５μＬのタグメンテーション反応物を準備し、５５℃で５分間インキュベートした。タグメンテーションの後、その２．５μＬのタグメンテーション反応物を４．５μＬのＡＭＰｕｒｅ  Ｘｐビーズ溶液に加え、ピペット混合し、室温で５分間インキュベートした。この溶液を、以前の実施例で述べたと同様にＤＮＡ結合用バッファー添加のステップを伴うＡＭＰｕｒｅ  Ｘｐのプロトコルを使用して精製した。ヌクレアーゼが含まれていない１．１μＬの水中でこのタグメント化産物を溶離し、ＰＣＲ反応物に加えた。次いでこの２．５μＬのＰＣＲ反応物をＡＭＰｕｒｅ  Ｘｐのプロトコルに従って精製し、最終ライブラリー産物をヌクレアーゼが含まれていない４μＬの水で溶離し、分析のために保管した。この実験の後半部分では、同じ量を、以前の実施例で述べたと同様にキャピラリー浄化のステップを使用して精製した。これら両方法は繰り返して２回行われた。
【０１９０】
この最終ＤＮＡライブラリー産物を２０μＬのＰＣＲ反応物に加え、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して分析した。そのフォワードおよびリバースプライマーは、ＤＮＡライブラリーフラグメントの末端に加えられるアダプターに特異的であり、それはシーケンサーに準備されたフラグメントのみが定量化されることを保証する。ＳＹＢＲグリーン検出化学反応が使用された。また、回収されたライブラリー産物の絶対定量を可能にするためにＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって供給される標準をその同じｑＰＣＲプレート上に流した。そのｑＰＣＲプレートは、ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔ  Ｋｉｔに従って４０サイクルをかけられた（ＡＢｉ  ＳｔｅｐＯｎｅ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０１９１】
このｑＰＣＲの結果は図９に見ることができる。キャピラリー浄化を使用して回収されたこれら２つのライブラリーは、従来のプロトコルを使用して回収されたライブラリーよりも早期の定量サイクル（Ｃｑ）値を有する。Ｃｑは、その蛍光シグナルがバックグラウンドの蛍光レベルを超えるサイクル数と定義され、出発産物の量と関係がある。キャピラリー浄化された産物のＣｑ値は、２．８および２．９であった。従来の方法を使用して浄化した産物のＣｑ値は３．６および４．０であり、キャピラリー浄化した産物よりもかなり遅かった。これは、少量からＤＮＡライブラリーを調製する場合、キャピラリー浄化がすぐれた回収率を提供することを実証している。これは、ピペット操作による誤差が著しい従来のプロトコルと比べて、キャピラリーに関連した試料の損失が軽減されるためである。
【０１９２】
このキャピラリー浄化と関連したすぐれたＤＮＡ回収率は、次の実施例においてさらに裏付けられる。
【０１９３】
キャピラリービーズによる単離を使用した少量の試料からのＤＮＡ回収
この実施例は、少量のＤＮＡライブラリーを扱う場合、キャピラリー浄化の手法がすぐれた回収率をもたらすことを立証する。この実施例では複数回の実験を行って、キャピラリー浄化を使用したＤＮＡライブラリーの回収を調べた。
【０１９４】
従来のプロトコルの後に、完全なＮｅｘｔｅｒａのプロトコルを実施した。その最終ＤＮＡライブラリー産物を保管し、鋳型として使用した。２．５μＬのＤＮＡライブラリーを４．５μＬのＡＭＰｕｒｅ  Ｘｐビーズ溶液に加え、ピペット混合し、以前の実施例で概略を述べたキャピラリー浄化手順にかけた。次いで回収された産物をＰＣＲ反応物に加えた。２．５μＬの鋳型を含有する陽性対照を繰り返して３回流し、分析した。ｑＰＣＲを使用してその回収されたライブラリー産物および陽性対照を分析した。陽性対照および溶離液のＣｑ値を表１に提示する。陽性対照のＣｑ値は、精製プロセスの前のＤＮＡライブラリー産物の出発量を表す。陽性対照では２．５μＬのＤＮＡライブラリー産物が使用され、少量キャピラリー浄化プロセスに投入されたので、回収効率１００％と仮定して両方のＣｑ値は等しいはずである。陽性対照および溶離液のＣｑ値を調べると、試料をキャピラリービーズによる浄化にかけた後、ライブラリー産物の全部ではないことがあり得るが大部分が回収されることが明らかである。溶離液のＣｑ値は陽性対照にほぼ等しく、これはＤＮＡライブラリー産物の効率的な回収を実証している。
【０１９５】
この実施例は、キャピラリー浄化の手法が、少ない量からＤＮＡライブラリーを効率的に回収できることを立証する。
【０１９６】
【表１】
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【０１９７】
キャピラリーの汚染除去−再利用
以前の実施例で概略を述べたキャピラリー浄化手順は、一般にはＰＣＲ産物またはＤＮＡライブラリーなどの高濃度試料を精製する。ビーズを溶液から分離し、キャピラリーの壁に保持させるとき、必然的にキャピラリーは少量の目的ＤＮＡで汚染される。そのラインを廃棄しない場合、それは試料間で汚染を持ち越すことにつながる。これはきわめて望ましくないことは明らかである。この実施例は、一連の洗浄のステップが、キャピラリービーズによる精製を行った後にキャピラリー中に残留する核酸を十分に除去または破壊する、すなわちキャピラリーの再利用を可能にすることを実証する。
【０１９８】
ＰＣＲ産物を、「キャピラリービーズによる単離を使用した少量の試料からのＤＮＡ回収」の実施例において概略を述べたその正確なプロトコルの後にキャピラリー浄化の手法を使用して精製した。次いで９μＬのキャピラリー陰性スラッグ（ヌクレアーゼが含まれていない水）をキャピラリーに沿って通過させ、回収してこのラインが汚染されたかどうかを調べた。その後、キャピラリーを洗浄試薬（ＬｏｏｋＯｕｔ  ＤＮＡ  Ｅｒａｓｅ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で３分間満たした。洗浄剤をポンプで取り除き、ラインを滅菌水で洗い流した。除染後、９μＬの滅菌したキャピラリー陰性スラッグをキャピラリーに沿って２回通過させて、洗浄のステップ後の汚染のレベルを調べた。この回収された溶離液およびキャピラリー陰性物（ｎｅｇａｔｉｖｅｓ）をＰＣＲ反応物に加えた。また、陽性対照および鋳型なしの陰性対照（ｎｏ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を調製し、ｑＰＣＲ（ＡＢｉ  ＳｔｅｐＯｎｅ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用いて分析した。このｑＰＣＲの結果を図１１に見ることができる。図１１をよく見ると、キャピラリー浄化を行った直後にキャピラリーがかなり汚染されていることは明らかである。除染のステップの後、キャピラリー陰性物のＣｑ値は、鋳型なしの陰性対照のＣｑ値の範囲内に入る。鋳型なしの陰性対照およびキャピラリー陰性物が示すＣｑ値は、プライマー二量体生成物に一致する。キャピラリー陰性物は目的産物に対して陰性のままであり、キャピラリー洗浄後の効果的な除染を示す。
【０１９９】
上記洗浄のステップの導入は、各精製／サイズセレクション実験後のラインの再利用を可能にする。
【０２００】
ウィルスＲＮＡおよびＤＮＡの単離：従来の精製との比較
血漿を使用してＤＮＡまたはＲＮＡのウィルス様粒子（ＶＬＰ）の段階希釈液を調製した。市販の単離キットのプロトコル（ＭａｇＭａｘ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）どおり、１．５ｍＬ管中の各血漿添加ＶＬＰ希釈液に適切な量の溶菌バッファー／キャリアＲＮＡを加え、次いでそれを磁気スタンド上に置いてウィルスを崩壊させ、核酸を放出させた。このミックスに磁性ビーズを加え、核酸をビーズと結合させた。プロトコルに従ってこのミックスを磁気スタンド上に置いた。このビーズ／核酸ミックスをマグネットに付着させ、上清を除去した。このビーズ／核酸複合体を、洗浄バッファーの添加と、それを磁気スタンド上に置くことによるデブリの除去との繰り返しステップによりさらに洗浄した。最終のステップにおいてビーズ／核酸複合体に溶離バッファーを加え、単離された核酸の溶離バッファー中への放出を引き起こした。下流で逆転写酵素−ｑＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）反応において適切な溶離液の量を使用し、市販のｑＰＣＲ機器上で増幅させた。
【０２０１】
血漿を使用してＤＮＡまたはＲＮＡのウィルス様粒子の段階希釈液を調製した。市販のキットのプロトコル中で推奨されている量は、本発明の設定に合わせるために減らした。段階希釈ＶＬＰ添加血漿と前もって混ぜ合わせた溶菌バッファーを、導管を使用した精製ヘッドにより吸引した。ビーズバッファーと溶菌試料の混合は導管内で行われた。試料、溶菌バッファー、およびビーズのプラグを磁気源のそばに流し、ビーズおよび結合した核酸を捕捉した。洗浄バッファーが吸引され、入れ替わって磁性ビーズを覆った。これらの過程に続いて気体のプラグが磁性ビーズ上に引き込まれ、ビーズ領域からの洗浄バッファーの除去を確実にした。磁気源および導管が加熱され、適切な量の溶離バッファーが吸引され、磁性ビーズ上に保持された。マグネットを除去し、熱領域内で溶離バッファーとビーズを入れ替えた。マグネットを所定の位置に戻して溶離バッファーからビーズを除去し、その溶離バッファーを更なる処理のために分注した。
【０２０２】
表２は、両方の精製方法から得られた結果、すなわち標準的な磁気スタンドによる単離と対比してＧｅｎＣｅｌｌ単離装置を比較する。これらの結果は、ＲＮＡ  ＶＬＰに関するものである。標準的な磁気スタンドを実験台上で使用した場合、１８５コピーの投入（１００％の単離回収と仮定して）に等しい１０3 個のＲＮＡ  ＶＬＰの投入ではＲＴ−ｑＰＣＲ増幅は達成されなかった。ところがＧｅｎＣｅｌｌ単離装置上において増幅は、１０3 個のＲＮＡ  ＶＬＰの投入（この場合もやはり１００％の単離回収と仮定して３５コピーの投入に等しい）で達成された。これは、ある導管構成において磁性ビーズを使用するＧｅｎＣｅｌｌ単離装置上での単離が、磁気スタンドによる実験台上での標準的な単離よりも低い検出限界を生じることを実証している。
【０２０３】
【表２】
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【０２０４】
定義
本開示において用語「スラッグ」の使用は用語プラグと同義であり、導管内を流れる流体の不連続の量を指す。
【０２０５】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年６月１８日出願の米国仮特許出願第６１／８３６，４６１号明細書の利益を主張し、その全体がこれにより本明細書中に参照により援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0006440699.tif 000010
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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