(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
小分子リガンドによりドッキング可能な標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定する方法であって、前記標的タンパク質は、哺乳類細胞の表現型を調節するものであり、該方法は、以下の工程を含み：
（ｉ）該表現型を表示する能力がある哺乳類細胞をｉｎ−ｖｉｔｒｏで培養した集団を、微生物のゲノム、またはコンパクトなゲノムを有する真核生物のゲノムから得ることができる核酸断片によりコードされる、約８個〜約１８０個のアミノ酸からなるペプチドのライブラリーと接触させる工程；
（ｉｉ）該接触を受けて該表現型に変化を示す細胞を該集団の中から同定する工程；
（ｉｉｉ）該ペプチドのライブラリーから前記細胞の該表現型を変化させるペプチドを同定する工程；
（ｉｖ）前記同定したペプチドを用意する工程；
（ｖ）該用意した同定したペプチドと結合する細胞タンパク質を同定する工程、該細胞タンパク質が、前記哺乳類細胞の該表現型を調節する標的タンパク質である；
（ｖｉ）該標的タンパク質を用意する工程；
（ｖｉｉ）微生物のゲノム、またはコンパクトなゲノムを有する真核生物のゲノムから得ることができる核酸断片によりコードされる、約８個〜約１８０個のアミノ酸からなる結合ペプチドの集団であって、該集団の前記ペプチドは該標的タンパク質と結合するために前記同定したペプチドと競合する、集団を用意する工程；
（ｖｉｉｉ）
異なる配列を有する複数の結合ペプチドであって、少なくとも１つの該結合ペプチドは前記細胞の該表現型も変化させ；該複数の結合ペプチドは結合ペプチドの該集団から同定されている、該標的タンパク質との結合立体構造を実験的に決定する工程；
（ｉｘ）該標的タンパク質と相互作用する該結合ペプチドの少なくとも１本の側鎖の（ｉ）結合エネルギーの存在部位；および／または（ｉｉ）配向性を、いずれの場合にしろ、該結合立体構造を解析することにより該相互作用部位の三次元構造を特性決定することで、同定する工程、
（ｘ）小分子リガンドをコンピューター上で三次元構造にドッキングする工程；および／または、
（ｘｉ）小分子リガンド候補の存在下で、前記標的タンパク質を前記少なくとも１つの該結合ペプチドと接触させる工程、および、前記小分子リガンド候補が前記少なくとも１つの結合ペプチドと前記標的タンパク質の結合度合いを調節するかどうかを決定する工程、
そうすることで、小分子リガンドによりドッキング可能な標的タンパク質上の該相互作用部位を特性決定する、方法。
【請求項２】
哺乳類細胞の前記表現型は、以下：
細胞信号伝達経路の調節、
生存能力、老化、分化、遊走、侵襲、走化性、アポトーシス、免疫学的アネルギー、表面マーカー発現、細胞周期の進行、転写活動、タンパク質発現、グリコシル化、感染抵抗力、浸透、およびレポーター遺伝子活動
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）該ペプチドライブラリーは、複数の分離しかつアドレス指定可能なペプチドを含む；または（ｉｉ）該ペプチドライブラリーは、該ライブラリーのペプチドをコードする複数の分離しかつアドレス指定可能な核酸から発現する、
請求項１から２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）該複数の分離しかつアドレス指定可能なペプチドは、アレイ形式に配列された該哺乳類細胞集団と接触させられ；または（ｉｉ）該複数の分離しかつアドレス指定可能な核酸は、アレイ形式に配列された該哺乳類細胞集団で発現する；および／または
該接触または該発現を受けて該表現型に変化を示す該細胞は、アレイ形式に配列された該哺乳類細胞集団から同定され；
各場合において、該アレイ形式は、プレートを利用したアッセイシステムである、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ｉ）該ペプチドライブラリーは、微生物のゲノム、または真核生物の小型のゲノムから得ることができる核酸断片によりコードされる、約８個〜約１８０個のアミノ酸からなるプールした複数の該ペプチドを含む；または（ｉｉ）該ペプチドライブラリーは、該ペプチドをコードするプールした複数の核酸から発現される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）該ペプチドは、プールした形式に配列された該哺乳類細胞集団と接触させられる；または（ｉｉ）該複数のプールした核酸は、プールした形式に配列された該哺乳類細胞集団で発現される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記集団中の前記接触または発現を受けて前記表現型に変化を示す前記細胞は、蛍光標識細胞分取法を用いて同定される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）該ペプチドライブラリーは、３×１０４以上の異なるアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）または該ペプチドライブラリーは、該ペプチドをコードする、１×１０６以上など３×１０４以上の異なる核酸配列を含む複数の核酸から発現され；および／または
（ａ）該ペプチドライブラリーは、１×１０６以上など３×１０４以上の異なるペプチドを含み；または（ｂ）該ペプチドライブラリーは、微生物のゲノム、または真核生物の小型のゲノムから得ることができる核酸断片によりコードされる、約８個〜約１８０個のアミノ酸からなる、１×１０６以上など３×１０４以上の異なるペプチドをコードする複数の核酸から発現される、
請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドライブラリーとの接触を受けて表現型に前記変化を示す前記細胞を、前記哺乳類細胞の集団から単離する工程を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）該単離された細胞から、前記ペプチドが単離および／または同定される；あるいは（ｉｉ）、前記単離された細胞から、前記ペプチドをコードする核酸を増幅および／またはクローン化することにより、該核酸が単離される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ｉ）前記単離されたペプチドは、配列決定される；または（ｉｉ）前記ペプチドをコードする前記単離された核酸は、配列決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記用意されたペプチドは、該ペプチドおよび親和タグを含む融合タンパク質の一部として用意される、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞タンパク質を同定する工程の前に、前記用意されたペプチドと結合する細胞タンパク質を単離する工程を含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞タンパク質は、前記用意されたペプチドと前記細胞タンパク質が結合できる条件下で、哺乳類細胞抽出物を前記用意されたペプチドと接触させ、前記用意されたペプチドとこれに結合した前記細胞タンパク質を含む複合体を単離することにより単離される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
該複合体は、精製により単離され；
該精製は、前記用意されたペプチドおよび親和タグを含む融合タンパク質内の該親和タグを用いて実行される、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞タンパク質は、質量分析により、または前記用意されたペプチドを用いたタンパク質マイクロアレイ分析により同定される、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチド集団内に用意されるペプチドのうち少なくとも１つを、前記表現型を表示することができる哺乳類細胞の該表現型を調節する能力について試験する工程を含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法であって；
該試験する工程は、前記表現型を表示することができる哺乳類細胞を該ペプチドと接触させる工程、および該哺乳類細胞の前記表現型が調節されるかどうかを決定する工程を含む、方法。
【請求項１８】
前記用意された標的タンパク質は、単離された形で用意される、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記単離された標的タンパク質は、固定化されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記用意された標的タンパク質は、前記標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列が宿主細胞で発現することにより用意される、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
該結合するペプチド集団の用意に先立ち、微生物のゲノム、または真核生物の小型のゲノムから得ることができる核酸断片によりコードされる、約８個〜約１８０個のアミノ酸からなるペプチドのライブラリー、または該ペプチドをコードする核酸のライブラリーを、該コードされたペプチドと前記標的タンパク質の結合についてスクリーニングすることにより、該結合するペプチド集団を得る工程をさらに含む、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチドライブラリーまたは前記核酸ライブラリーは、請求項８で定義されるとおりのものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ライブラリーは、二重ハイブリッドスクリーニングまたはファージディスプレイ法を用いてスクリーニングされる、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ライブラリーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ法を用いてスクリーニングされる、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的タンパク質に結合するペプチドの前記集団は、少なくとも５つのペプチドを含む、請求項１から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ペプチド集団内で、ペプチドの亜集団を同定する工程を含み、該亜集団は、異なる配列のペプチドを含むものである、請求項１から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ペプチド集団内のペプチドのうち少なくとも１つについて、該標的タンパク質との結合親和性を測定する工程をさらに含む、請求項１から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的タンパク質と高い親和性で結合するペプチドの亜集団を、前記ペプチド集団内で同定する工程を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記亜集団は、少なくとも３つのペプチドを含む、請求項２６または請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記亜集団のペプチドのうち少なくとも１つについて、前記標的タンパク質との結合立体構造が実験的に決定されている、請求項２６、２８、または２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記三次元構造は、コンピューター上の方法を用いて特性決定される、請求項１から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
標的タンパク質と結合する小分子リガンドを同定する方法であって、該標的タンパク質は、哺乳類細胞の表現型を調節するものであり、該方法は、以下の：
コンピューター上の方法を用いて、該標的タンパク質の相互作用部位の三次元構造にドッキング可能な小分子リガンドの構造を同定する工程を含み、該三次元構造は請求項３１に記載の方法により決定される、
方法。
【請求項３３】
以下の工程：
（ｘ）前記同定された構造を有する小分子リガンドを用意する工程；
（ｘｉ）該リガンドを前記標的タンパク質と接触させる工程；および
（ｘｉｉ）該リガンドと前記標的タンパク質の結合を決定する工程、
をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
以下の工程：
前記相互作用部位と結合する、微生物のゲノム、または真核生物の小型のゲノムから得ることができる核酸断片によりコードされる、約８個〜約１８０個のアミノ酸からなる１つ以上のペプチドを用意する工程；および
前記リガンドが持つ、前記標的タンパク質との結合について該１つ以上のペプチドと競合する能力を決定する工程、
をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
以下の工程：
前記小分子リガンドが持つ、前記表現型を表示することができる哺乳類細胞の前記表現型を調節する能力を決定する工程、
をさらに含む、請求項３３または請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
致死表現型以外および／または増殖低下表現型以外の哺乳類細胞の表現型の調節剤候補である小分子化合物を同定する方法であって、以下の工程：
（ｉ）該表現型を表示する能力がある哺乳類細胞をｉｎ−ｖｉｔｒｏで培養した集団を、微生物のゲノム、または真核生物の小型のゲノムから得ることができる核酸断片によりコードされる、約８個〜約１８０個のアミノ酸からなるペプチドのライブラリーと接触させる工程；
（ｉｉ）該接触を受けて該表現型に変化を示す細胞を該集団の中から同定する工程；
（ｉｉｉ）該細胞の該表現型を変化させる該ライブラリーのペプチドを同定する工程；
（ｉｖ）該同定したペプチドを用意する工程；
（ｖ）該用意した同定したペプチドと結合する細胞タンパク質を同定する工程、該細胞タンパク質が、該哺乳類細胞の該表現型を調節する標的タンパク質である；
（ｖｉ）該標的タンパク質および該同定したペプチドを用意する工程；および
（ｖｉｉ）該同定したペプチドと該標的タンパク質との結合に対する小分子試験化合物の効果を決定する工程、
該同定したペプチドと該標的タンパク質との結合度合いを調節する小分子試験化合物が、該哺乳類細胞の該表現型の調節剤候補である、を含む方法。
【請求項３７】
以下の工程：
前記表現型を表示する能力がある哺乳類細胞を、前記調節剤候補と接触させる工程；および
前記調節剤候補が持つ、前記哺乳類細胞の前記表現型を調節する能力を決定する工程、
をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
哺乳類細胞の表現型を調節する標的タンパク質上の小分子リガンドによりドッキング可能な相互作用部位を特性決定する方法であって、該方法は以下の工程を含み：
（ｉ）該標的タンパク質を用意する工程；
（ｉｉ）微生物のゲノム、または真核生物の小型のゲノムから得ることができる核酸断片によりコードされる、約８個〜約１８０個のアミノ酸からなるペプチドの集団を用意する工程であって、該ペプチドは該標的タンパク質と結合する、工程；
（ｉｉｉ）前記細胞の該表現型を変化させる該集団内の少なくとも１つのペプチドについて、該タンパク質との結合立体構造を実験的に決定する工程；および
（ｉｖ）該タンパク質標的と相互作用する該ペプチドの少なくとも１本の側鎖の（ｉ）結合エネルギーの存在部位；および／または（ｉｉ）配向性を、いずれの場合にしろ、該結合立体構造を解析することにより同定する工程、を含み
そうすることで、該標的タンパク質上の小分子によりドッキング可能な相互作用部位を特性決定する、方法。
【請求項３９】
前記標的タンパク質は、細胞信号伝達経路の成分である、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類細胞の表現型（致死表現型以外および／または増殖低下表現型以外の表現型など）を調節する標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定する複数の改善および統合された方法に関する。本発明のそのような方法は、哺乳類細胞のそのような表現型を調節する標的タンパク質を同定する方法、および随意に、この標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定する方法を含む。そのような同定方法および特性決定方法は、研究手段および／または治療法（そのようなタンパク質／ペプチドまたは小分子を用いる治療法など）の開発において有用である。したがって、本発明は、以下の方法にも関する：そのような標的タンパク質に結合するリガンド（小分子リガンドなど）の同定；および哺乳類細胞の上記表現型の調節剤の候補化合物の同定。本発明はさらに、特定のアミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパク質（あるいはそれらの断片、変異体および／または誘導体）、そのようなペプチドまたはタンパク質をコードする核酸、ならびにそのようなペプチドまたはタンパク質の使用またはそのような核酸の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類細胞の事実上全ての生物学的プロセスまたは表現型（特に疾患関連表現型に関与するもの）は、細胞経路により制御され；順を追って、典型的には、タンパク質などの生体巨大分子間相互作用を通じて制御される。どの生物学的プロセスまたは表現型に関与する相互作用であってもそのような相互作用には多様性があり、それらを精査および／または操作する汎用的な手段がないことと相まって、機能ゲノム学、化学生物学、および治療法候補発見についての現在の戦略に難題をもたらしている。哺乳類細胞の生物学的プロセスまたは表現型に関与するタンパク質と結合する、および／またはそのようなタンパク質との相互作用を調節する分子（生物学的に活性なペプチドまたは小分子など）を同定することは、そのような問題への価値あるアプローチとなる。
【０００３】
トランスドミナントエフェクタースクリーニングに、ペプチドライブラリーの過剰発現を用いて、特定の細胞表現型を制御するタンパク質：タンパク質相互作用が同定されている（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２７：２３−２９；国際公開第１９９７／２７２１２号）（非特許文献１および特許文献１）。さらには、合成ペプチドを生物学的治療法として用いて、タンパク質の機能または相互作用を調節するのに成功している（Ｌｅａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ７：２１−２９）（非特許文献２）。このように、生物学的に活性なペプチドは、新規細胞標的の同定および治療的操作のための重要な手段となる。しかしながら、そのようなペプチドの同定に現在利用できる方法は、あまりにも非効率的で、限られた実行可能性でしか標的指向性または表現型スクリーニングを実施できない。例えば、ランダムペプチドを用いるライブラリースクリーニングで、１，０００，０００分の１しかない低いヒット率が報告されている（Ｃｏｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：５４８−５５０；Ｐａｒｋ  ａｎｄ  Ｒａｉｎｅｓ，２０００  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８：８４７−８５１；Ｘｕ  ａｎｄ  Ｌｕｏ，２００２，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１：５７５３−５７５７；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）（非特許文献３〜５）。こうしたヒット率の低さの原因は、採用したペプチド配列のランダムな性質、または二次構造形成を抑制する拘束足場の使用など様々であった。こうした要因は、ペプチドライブラリーにより有効に調査できる化学的「空間」の複雑さを深刻に制限している可能性があり、このため代替アプローチの必要性が強調される。
【０００４】
ある機能ゲノム学的または化学生物学的技術は、標的タンパク質に結合する分子がわかっているならば、その標的を同定できるとして報告されている。例えば、Ｄａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４  （Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ２：２１５−２２４）（非特許文献６）、Ｂｒｅｈｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：  ７９−３８２）（非特許文献７）および国際公開第２００４／０１３６３３号（特許文献２）に記載のとおりである。しかしながら、そのような方法は、標的タンパク質が単離可能であり、従って同定可能であるために十分なほどの高い親和性および特異性を、既知の結合分子が有するものであることを必要とする。
【０００５】
いったん標的タンパク質および結合分子が同定されてしまえば、他の技術を利用してこれらの２つの実体間の相互作用部位を精査することができる。例えば、Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，１９  ４３５−４３７），Ｂｅｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１，Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｆｕｎｃｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１２：６３−７６），Ｓｔａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４８：２３３６−２３４５），Ｄｉ  Ｐａｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ［出版前の電子出版］  ＰＭＩＤ：２１１１３１６９）およびＰｅｔｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００，Ｐｒｏｔ  Ｓｃｉ，９：２５２８−２５３４）（非特許文献８〜１２）に記載のとおりである。しかしながら、表現型と結合との関連性に関する情報がなく、かつ各標的タンパク質または相互作用部位（特に、標的タンパク質と関連する注目の表現型を調節することが既知である結合分子のもの）に典型的に利用できる結合分子の数が少ししかない状態では、そのような限られた規模での標的タンパク質上の相互作用部位の精査に由来するデータのレベル、すなわち有用性は、所望の表現型を調節する薬物候補の効率的な発見または調査を可能にするのに十分な、相互作用部位の特性決定を行なえるものではないことが多い。
【０００６】
高等生物におけるタンパク質の折り畳みは、あらゆる真正細菌および古細菌のゲノムで見つかる「先祖ドメイン部分」という１５〜３０個のアミノ酸要素の組立から進化してきたと提案されており、「先祖ドメイン部分」は、時には固有の立体構造のない状態で、選択的機能（例えば、タンパク質：タンパク質相互作用）を規定すると考えられる（Ｂｏｇａｒａｄ  ａｎｄ  Ｄｅｅｍ，１９９９，ＰＮＡＳ  ９６：２５９１−２５９５；Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＰＮＡＳ  ９４：７６８６−７７０３；Ｌｕｐａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １３４：１９１−２０３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，２０００，ＰＮＡＳ  ９７：１００６８−１００７３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，２００６，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３６３：４６０−４６８；Ｓｏｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｕｐａｓ，２００３，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２５：８３７−８４６）（非特許文献１３〜１８）。天然の真正細菌および古細菌に由来する系統的に多様な遺伝子断片は、豊富な生物活性ペプチド源を提供することで既存のランダムおよび／または拘束ペプチドライブラリーより改善された代替物を提供するという仮説が立てられており（Ｗａｔｔ，２００６，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２４：１７７−１８３）（非特許文献１９）、そのようなペプチドをコードする核酸のライブラリーも、スクリーニング用に作られている（Ｗａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ  １：４９１−５０２；Ｗａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １：２５７−２６５；国際公開第２０００／６８３７３号；国際公開第２００４／０７４４７９号；国際公開第２００６／０１７９１３号；国際公開第２００７／０９７９２３号）（非特許文献２０〜２１および特許文献３〜６）。国際公開第２００５／１１９２４４号（特許文献７）の実施例は、天然の真正細菌および古細菌に由来する系統的に多様な遺伝子断片のライブラリーを使用した、ある種の哺乳類細胞を細胞死から救うまたはその増殖低下を防ぐペプチドのスクリーニングおよび同定を記載する。当該分野の現状に照らし合わせると、そのような哺乳類細胞の細胞死からの救出および／または増殖の向上についてのスクリーニングは、たとえスクリーン／ライブラリーのヒット率が低くても、暗にそのような課題を乗り越えることができる（なぜなら、陽性のヒットのみが、さらなる分析を必要とするデータ点（生細胞／細胞コロニー）をスクリーンに発生させるから）ので、そのようなスクリーニングはペプチドライブラリーを利用する当業者にとって可能であると推測できる。
【０００７】
上記をまとめると、先行技術は、哺乳類細胞の（所望の）表現型を調節する、特に所望の表現型が細胞死から救出されないおよび／または増殖が向上しない場合に調節する標的タンパク質の相互作用部位を特性決定することを可能にする有効なおよび／または統合された方法を提供しない。そのうえさらに、上記方法は、そのような方法に含まれる多数の重要な段階で使用するのに適した特定の生物学的ライブラリーまたはペプチドクラスの資源を提供しないし、そのような資源も利用しない。そのような特定の生物学的ライブラリーまたはペプチドクラスの資源の使用は、以下の１つ以上に関して特別な利点をもたらす：そのような工程で必要な資源および専門技術の減少；ヒット率および／または親和性の向上を通じたスクリーニングコストおよび効率；さまざまな細胞型、表現型、標的型および／または相互作用部位を精査する上での柔軟性および効率。詳細には、上記の先行技術は、（所望の）表現型スクリーニングの結果を、薬物候補、特に小分子候補を同定するのに必要な方法に反映させる、効率的な方法または手段の提供（例えば、特定の生物学的ライブラリーまたはペプチドクラスの資源の利用を提供することによる）を行なわない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第１９９７／２７２１２号
【特許文献２】国際公開第２００４／０１３６３３号
【特許文献３】国際公開第２０００／６８３７３号
【特許文献４】国際公開第２００４／０７４４７９号
【特許文献５】国際公開第２００６／０１７９１３号
【特許文献６】国際公開第２００７／０９７９２３号
【特許文献７】国際公開第２００５／１１９２４４号
【特許文献８】国際公開第２０００／０４１９６７号
【特許文献９】米国特許第６７３０２９３号
【特許文献１０】国際公開第０５／０８４１５８号
【特許文献１１】国際公開第０７／１２３６６７号
【特許文献１２】オーストラリア特許出願第２０１１９０１９９７号
【特許文献１３】米国特許仮出願第６１／４８９，１９８号
【特許文献１４】国際公開第９２／０１０４７号
【特許文献１５】国際公開第２０１０／００３１９３号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２７：２３−２９
【非特許文献２】Ｌｅａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ７：２１−２９
【非特許文献３】Ｃｏｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：  ５４８−５５０
【非特許文献４】Ｐａｒｋ  ａｎｄ  Ｒａｉｎｅｓ，２０００Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８：８４７−８５１
【非特許文献５】Ｘｕ  ａｎｄ  Ｌｕｏ，２００２，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１：５７５３−５７５７
【非特許文献６】Ｄａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，２００４（Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ２：２１５−２２４）
【非特許文献７】Ｂｒｅｈｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：３７９−３８２）
【非特許文献８】Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，１９  ４３５−４３７）
【非特許文献９】Ｂｅｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１，Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｆｕｎｃｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１２：６３−７６）
【非特許文献１０】Ｓｔａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４８：２３３６−２３４５）
【非特許文献１１】Ｄｉ  Ｐａｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ［出版前の電子出版］  ＰＭＩＤ：２１１１３１６９
【非特許文献１２】）Ｐｅｔｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００，Ｐｒｏｔ  Ｓｃｉ，９：  ２５２８−２５３４）
【非特許文献１３】Ｂｏｇａｒａｄ  ａｎｄ  Ｄｅｅｍ，１９９９，ＰＮＡＳ  ９６：  ２５９１−２５９５
【非特許文献１４】Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＰＮＡＳ  ９４：７６８６−７７０３
【非特許文献１５】Ｌｕｐａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １３４：  １９１−２０３
【非特許文献１６】Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，２０００，ＰＮＡＳ  ９７：  １００６８−１００７３
【非特許文献１７】Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，２００６，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３６３：４６０−４６８
【非特許文献１８】Ｓｏｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｕｐａｓ，２００３，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２５：８３７−８４６）
【非特許文献１９】Ｗａｔｔ，２００６，  ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈ  ２４：１７７−１８３
【非特許文献２０】Ｗａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ  １：４９１−５０２
【非特許文献２１】Ｗａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １：２５７−２６５；
【非特許文献２２】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献２３】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２
【非特許文献２４】Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ．４９，１６１−１６８
【非特許文献２５】Ｍｉｃｈｉｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８０，８２８５−８２８９
【非特許文献２６】Ｗａｄｉａ  ａｎｄ  Ｄｏｗｄｙ，２００２  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３  ５２−５６
【非特許文献２７】Ｌａｎｇｅｌ（２００２）Ｃｅｌｌ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ
【非特許文献２８】Ｗａｇｓｔａｆｆ＆Ｊａｎｓ  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３  １３７１−１３８７（２００６）
【非特許文献２９】Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｅｄ  ＲＳ  Ｔｕａｎ（Ｍａｒ  １９９７）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ
【非特許文献３０】Ｊ．Ｍ．  Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９８４）
【非特許文献３１】Ｍ．  Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ  ａｎｄ  Ａ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ，Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）
【非特許文献３２】Ｊ．  Ｈ．Ｊｏｎｅｓ，Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  １９９１
【非特許文献３３】Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０Ａ  Ｕｓｅｒｓ  Ｍａｎｕａｌ，  ＡＢＩ  Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
【非特許文献３４】Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，（Ｅｄ．）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ  Ｕｓｅｒ'ｓ  Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９２
【非特許文献３５】Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９
【非特許文献３６】Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ，（Ｅｄ．）Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  ２８９）．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ  １９９７
【非特許文献３７】Ｍｕｒｒａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２９，１７０−９
【非特許文献３８】Ｓｔａｍｍｅｒｓ，Ｄ．  Ｋ．ｅｔ  ａｌ（１９９１）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２８３，２９８−３０２
【非特許文献３９】Ｔｅｒｐｅ（２００３）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０  ５２３−５３３
【非特許文献４０】Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０；２４５−２４６
【非特許文献４１】Ｏｄｅｇｒｉｐ，２００４，ＰＮＡＳ，１０１：２８０６−２８１０
【非特許文献４２】Ｒａｋｅｓｔｒａｗ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２４：５２５−５３０）
【非特許文献４３】Ｕｒｒｙ，１９８５，Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ａｎｄ  ＯＲＤ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｉｎ：Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）
【非特許文献４４】Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７
【非特許文献４５】Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２
【非特許文献４６】Ｍｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，１１２：  ２５８−２７０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、こうした問題の１つ以上を解決する、改善されたおよび／または統合された代替手段または方法を提供することである。本発明の基礎となるそのような目的は、場所を問わず本明細書中で開示または定義されるとおりの発明の対象により、例えば、添付の請求項の発明の対象により、達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
概して、および簡単な説明として、本発明の主要な態様は、以下のとおり記載することができる：
【００１２】
第一の態様において、本発明は、哺乳類細胞の表現型（致死表現型以外および／または増殖低下表現型以外の表現型など）を調節する標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定する方法に関し、本方法は、以下の工程を含み：
・この表現型を表示する能力がある哺乳類細胞をｉｎ−ｖｉｔｒｏで培養した集団を、Ｐｈｙｌｏｍｅｒのライブラリーと接触させる工程；
・この接触を受けてこの表現型に変化を示す細胞を集団の中から同定する工程；
・細胞のこの表現型を変化させるＰｈｙｌｏｍｅｒを同定する工程；
・同定したＰｈｙｌｏｍｅｒを用意する工程；
・この用意したＰｈｙｌｏｍｅｒと結合する細胞タンパク質を同定する工程、この細胞タンパク質が、哺乳類細胞のこの表現型を調節する標的タンパク質である；
・この標的タンパク質を用意する工程；
・この標的タンパク質と結合するＰｈｙｌｏｍｅｒの集団を用意する工程；
・この集団内の少なくとも１つのＰｈｙｌｏｍｅｒについて、この標的タンパク質との結合立体構造を実験的に決定する工程；および
・このタンパク質標的と相互作用するこのＰｈｙｌｏｍｅｒの少なくとも１本の側鎖の（ｉ）結合エネルギーの存在部位；および／または（ｉｉ）配向性を、いずれの場合にしろ、この結合立体構造を解析することにより同定する工程、
そうすることで、この標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定する。
【００１３】
１つの関連する態様において、本発明は、哺乳類細胞の表現型（致死表現型以外および／または増殖低下表現型以外の表現型など）を調節する標的タンパク質を同定する方法に関し、本方法は、以下の工程を含む：
・この表現型を表示する能力がある哺乳類細胞をｉｎ−ｖｉｔｒｏで培養した集団を、Ｐｈｙｌｏｍｅｒｓのライブラリーと接触させる工程；
・この接触を受けてこの表現型に変化を示す細胞を集団の中から同定する工程；
・細胞のこの表現型を変化させるＰｈｙｌｏｍｅｒを同定する工程；
・同定したＰｈｙｌｏｍｅｒを用意する工程；および
・この用意したＰｈｙｌｏｍｅｒと結合する細胞タンパク質を同定する工程、
この細胞タンパク質が、哺乳類細胞のこの表現型を調節する標的タンパク質である。
【００１４】
別の関連する態様において、本発明は、哺乳類細胞の表現型（致死表現型以外および／または増殖低下表現型以外の表現型など）を調節する標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定する方法に関し、本方法は、以下の工程を含み：
・この標的タンパク質を用意する工程；
・この標的タンパク質と結合するＰｈｙｌｏｍｅｒｓの集団を用意する工程；
・この集団内の少なくとも１つのＰｈｙｌｏｍｅｒについて、この標的タンパク質との結合立体構造を実験的に決定する工程；および
・このタンパク質標的と相互作用するこのＰｈｙｌｏｍｅｒの少なくとも１本の側鎖の（ｉ）結合エネルギーの存在部位；および／または（ｉｉ）および／または（ｉｉ）配向性を、いずれに場合にしろ、この結合立体構造を解析することにより同定する工程、
そうすることで、この標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定する。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、哺乳類細胞の表現型（致死表現型以外および／または増殖低下表現型以外の表現型など）を調節する標的タンパク質と結合するリガンドを同定する方法に関し、本方法は、コンピューター上の方法を用いて、この標的タンパク質の相互作用部位の三次元構造にドッキング可能なリガンドの構造を同定する工程を含み、この三次元構造は本発明の方法により決定される。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は、哺乳類細胞の表現型（致死表現型以外および／または増殖低下表現型以外の表現型など）の調節剤候補である化合物を同定する方法に関し、本方法は以下の工程を含む：
・この表現型を表示する能力がある哺乳類細胞をｉｎ−ｖｉｔｒｏで培養した集団を、Ｐｈｙｌｏｍｅｒｓのライブラリーと接触させる工程；
・この接触を受けてこの表現型に変化を示す細胞を集団の中から同定する工程；
・細胞のこの表現型を変化させるＰｈｙｌｏｍｅｒを同定する工程；
・同定したＰｈｙｌｏｍｅｒを用意する工程；
・この用意したＰｈｙｌｏｍｅｒと結合する細胞タンパク質を同定する工程、この細胞タンパク質が、哺乳類細胞のこの表現型を調節する標的タンパク質である；
・この標的タンパク質およびこの用意したＰｈｙｌｏｍｅｒを用意する工程；および
・このＰｈｙｌｏｍｅｒとこの標的タンパク質との結合に対する試験化合物の効果を測定する工程、このＰｈｙｌｏｍｅｒとこの標的タンパク質との結合度合いを調節する試験化合物が、哺乳類細胞のこの表現型の調節剤候補である。
【００１７】
さらに別の態様において、本発明は、哺乳類細胞の表現型（致死表現型以外および／または増殖低下表現型以外の表現型など）を調節するＰｈｙｌｏｍｅｒを同定する方法にも関し、本方法は、以下の工程を含む：この表現型を表示する能力がある哺乳類細胞をｉｎ−ｖｉｔｒｏで培養した集団を、Ｐｈｙｌｏｍｅｒｓのライブラリーと接触させる工程；この接触を受けてこの表現型に変化を示す細胞を集団の中から同定する工程；および細胞のこの表現型を変化させるＰｈｙｌｏｍｅｒを同定する工程、このＰｈｙｌｏｍｅｒが、哺乳類細胞のこの表現型を調節するものである。
【００１８】
代替態様において、本発明は、４Ｇ９、６Ｆ６、６Ｇ８、１０Ｂ１１、２５Ｃ３、４４Ｂ２、および４８Ｅ６からなる列挙より選択される１種を含む、本発明の方法により同定されるペプチドのアミノ酸配列を含有するペプチドまたはタンパク質、あるいはその断片、変異体、および／または誘導体に関し、ならびに（ｉ）哺乳類細胞の表現型（致死表現型以外および／または増殖低下表現型以外の表現型など）を調節するための；および／または（ｉｉ）哺乳類細胞の表現型（致死表現型以外および／または増殖低下表現型以外の表現型など）を調節する標的タンパク質と結合させるための、このペプチドまたはタンパク質、あるいはその断片、変異体、および／または誘導体の使用に関する。関連するさらなる態様において、本発明は、そのようなペプチドまたはタンパク質、あるいはその断片、変異体、および／または誘導体をコードする核酸にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
図は以下を示す：
【図１】図１は、一次表現型スクリーニングの結果の図であり、各Ｐｈｙｌｏｍｅｒの発光をプレートの平均に対するパーセンテージで表す。陰性対照ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ｎＶ５−ＤＥＳＴ−ＧｕｓＢ）および陽性対照ＰＹＣ３６は、５０枚のプレートにわたる全スクリーニングを総合したそれらの統計値とともに示す。
【図２】図２は、一次スクリーニングで選抜された１４のＰｈｙｌｏｍｅｒの二次検証の図である。７つのクローンは、ＰＭＡ誘導型ＡＰ１活性の有意な（ｎ＝３、ｐ＜０．０５を＊で示す）阻害を示した；ルシフェラーゼ発現は、ウミシイタケ発光で正規化されている。
【図３ａ】図３ａは、Ｓｒｘｎ１−ルシフェラーゼ活性に対するＰｈｙｌｏｍｅｒの検証の図であり、ＰＹＣ３６に加えて３つのＰｈｙｌｏｍｅｒがＰＭＡ誘導型プロモーター活性の有意な阻害（ｎ＝３、ｐ＜０．０５を＊で示す）を実証したことを示す（図３ａ）；データは、対照（ウミシイタケ）ベクターと比較して、正規化発光の何倍の誘導であるかとして示す。
【図３ｂ】図３ｂは、Ｓｒｘｎ１−ルシフェラーゼ活性に対するＰｈｙｌｏｍｅｒの検証の図であり、図３ａの３つのＰｈｙｌｏｍｅｒは、変異型ＡＰ１反応要素を含有するＳｒｘｎ１プロモーターに、有意な効果を示さない（ｎ＝３、ｐ＞０．０５）；データは、対照（ウミシイタケ）ベクターと比較して、正規化発光の何倍の誘導であるかとして示す。
【図４】図４は、免疫沈降実験の結果の図であり、Ｖ５−２５Ｃ３ＰｈｙｌｏｍｅｒとＦｌａｇ−ＣＮＨの間の相互作用を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、Ｖ５タグ付き２５Ｃ３単独で、またはＭＡＰ４Ｋ４のｆｌａｇタグ付きＣＮＨドメインと合わせて、遺伝子導入した。細胞溶解液は、ＮＰ−４０緩衝液で調製し、マウスＶ５抗体を用いて免疫沈降させ、マウスＦｌａｇＭ２抗体を用いて免疫ブロットした。対照として、細胞にｆｌａｇ−ＣＮＨ単独での遺伝子導入も行い、Ｆｌａｇ−Ｍ２での免疫沈降および同じ抗体（ＦｌａｇＭ２）での免疫ブロットを行なった。
【図５】図５は、固定化ＭＢＰ−ＭＡＰ４Ｋ４−ＣＮＨ（不溶性画分から再折り畳みしたもの；４５μｇ／ｍｌ）の結合実験の結果の図である。ＭＢＰ−ＭＡＰ４Ｋ４−ＣＮＨは、既知のリガンドＲＡＰ２Ａと、およびＰｈｙｌｏｍｅｒ２５Ｃ３と強力に結合するが、特異性についての対照（無関係のＰｈｙｌｏｍｅｒＰＹＣ３５およびＭＢＰ融合タンパク質）とは限定的にしか、またはまったく結合しない。リガンドは全て、ＭＢＰ融合物として発現したもので、１ｕＭで試験した。
【図６ａ】図６ａは、Ｏｃｔｅｔ−Ｒｅｄバイオレイヤー干渉法による結果の図であり、固定化ＭＢＰ−ＭＡＰ４Ｋ４−ＣＮＨ（溶解性画分、４５Ｍｇ／ｍｌ）に対する２５Ｃ３（１００〜１０００ｍＭ）の滴定を示す。
【図６ｂ】図６ｂは、Ｏｃｔｅｔ−Ｒｅｄバイオレイヤー干渉法による結果の図であり、固定化ＭＢＰ−ＭＡＰ４Ｋ４−ＣＮＨ（溶解性画分、４５Ｍｇ／ｍｌ）に対するＲＡＰ２Ａ（１００〜１０００ｍＭ）の滴定を示す。
【図７ａ】図７ａは、細胞に、２５Ｃ３と空のｐｃＤＮＡ３．１ベクター（対照）のいずれかで遺伝子導入し、２４時間後に引っ掻いて傷をつけ、傷が塞がっていくのを微速度顕微鏡撮影で分析した結果の図である。傷をつけて０、１０時間後、および１５時間後の、代表的な固定化画像を示す（ｂａｒ＝１００ｕｍ）。
【図７ｂ】図７ｂは、細胞を、２５Ｃ３と空のｐｃＤＮＡ３．１ベクター（対照）のいずれかで遺伝子導入し、２４時間後に引っ掻いて傷をつけ、傷が塞がっていくのを微速度顕微鏡撮影で分析した結果の図である。２５Ｃ３および対照について、４本の引っ掻き傷の幅を経時的に測定する（＊ｐ＝＜０．００１）。
【図８】図８は、本発明の表現型スクリーニングにより同定されたあるＡＰ１阻害性Ｐｈｙｌｏｍｅｒのアミノ酸配列（および対応するコードヌクレオチド配列）を示す。
【図９】図９は、標的の発見および結合面の決定に使用できる本発明の方法の１つの流れ図である。
【図１０】図１０は、（細胞）表現型（結合）ファルマコフォアを探索するために本発明の方法を使用する場合に採用することができる可能な工程および特定の技法を、図で表示する。
【図１１】図１１は、本発明の方法を用いて特性決定される標的タンパク質と、特に相互作用部位において、結合する小分子リガンドをスクリーニングするプローブとしてＰｈｙｌｏｍｅｒを用いる高処理蛍光偏光を、図で表示する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明、およびその具体的な例示にすぎない態様および／または実施形態は、概して以下のとおりに記載することができる：
【００２１】
１つの態様において、本発明は、哺乳類細胞の表現型の調節に関与する標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定する方法に関する。したがって、そのような態様の１つめにおいて、本発明は、哺乳類細胞の表現型（致死表現型以外および／または増殖低下表現型以外の表現型など）を調節する標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定する方法に関し、本方法は、以下の工程を含む：
この表現型を表示する能力がある哺乳類細胞をｉｎ−ｖｉｔｒｏ培養した集団を、Ｐｈｙｌｏｍｅｒのライブラリーに接触させる工程；
この接触を受けてこの表現型に変化を示す細胞を集団の中から同定する工程；
細胞のこの表現型を変化させるＰｈｙｌｏｍｅｒを同定する工程；
同定したＰｈｙｌｏｍｅｒを用意する工程；
この用意したＰｈｙｌｏｍｅｒと結合する細胞タンパク質を同定する工程、この細胞タンパク質が、哺乳類細胞のこの表現型を調節する標的タンパク質である；
この標的タンパク質を用意する工程；
この標的タンパク質に（特に相互作用部位で）結合するＰｈｙｌｏｍｅｒの集団を用意する工程；
この集団内の少なくとも１つのＰｈｙｌｏｍｅｒについて、この標的タンパク質との（特に相互作用部位での）結合立体構造を実験的に決定する工程；および
このタンパク質標的と相互作用するこのＰｈｙｌｏｍｅｒの少なくとも１本の側鎖の（ｉ）結合エネルギーの存在部位；および／または（ｉｉ）配向性を、いずれに場合にしろ、この結合立体構造を解析することにより同定する工程、
そうすることで、この標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定する。
【００２２】
用語類は、本明細書中で記述される場合、特に記載がない限り、大抵それらの一般的な意味で理解される。本明細書中「を含む」または「で構成される」という用語が用いられる場合、その用語は他の構成要素を排除しない。本発明の目的に関して、「からなる」という用語は、用語「で構成される」という用語の特定の実施形態であるとみなす。本明細書中以下、１つの群が、少なくともある一定数の実施形態を含むと定義される場合、それらの実施形態全ておよび／またはそれら実施形態のみからなる群を開示することでもあるとする。本明細書中で使用される場合、「および／または」は、２つの指定される特長または成分のそれぞれを、お互いの有無に関係なく具体的に記述するとみなされるものとする。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれについて、まさに本明細書中個別に記述されるかのように、それぞれの具体的な記述であるとみなされるものとする。本発明の文脈において、「約」および「およそ」という用語は、問題の特長の技術効果が依然として確保されると当業者に理解される精度の範囲を示す。この用語は、典型的には、表示される数値からの、±２０％、±１５％、±１０％、および例えば、±５％偏差を示す。当業者には当然であるだろうが、所定の技術効果に関する数値のそのような偏差の具体値は、その技術効果の性質に依存する。例えば、自然物のすなわち生物学的技術効果は、一般に、人工物のすなわち工学的技術効果よりも偏差が大きくなる可能性がある。
【００２３】
標的タンパク質の活動、例えば、異常機能または機能不全（または刺激によりもたらされる制御された活動）は、細胞の１種以上の特徴（表現型特徴など）を変化させる。例えば、標的タンパク質の活性化もしくは発現および／または阻害もしくは抑制は、哺乳類細胞の表現型を変化させる。そのような変化は、プラス方向の場合もマイナス方向の場合もある。さらには、ホルモン、増殖因子、分裂促進因子、ケモカイン、またはサイトカインの添加を通じて、あるいは微生物（細菌、真菌、またはウイルスなど）による細胞の感染を通じて、表現型の一方向または他方向への変化が生じる可能性がある。そのような表現型は、化合物（小分子など）の作用を通じて、特にＰｈｙｌｏｍｅｒペプチド（例えば、Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーからの１つ）の作用を通じて、どこでも部分的に逆転する可能性がある。例えば、表現型に関連した特徴の度合いは、表現型が変化すると、より検出しやすくなる、または検出しにくくなる可能性がある。その存在、不在、もしくは活性がそのような特徴の度合いの変化に関連する任意の標的タンパク質を、個別の細胞の表現型の調節に関与する標的タンパク質であると見なすことができる。
【００２４】
適切な標的タンパク質として、例えば、細胞信号伝達経路の成分が可能である。細胞信号伝達経路は、細胞中の相互作用因子の連なりであり、これらが１種以上の刺激（例えば、細胞表面で生じた、または細胞表面が接触して生じた外部刺激）に反応して細胞内（または細胞内から／細胞表面外側へ）で信号を伝達し、細胞の表現型になんらかの検出可能な変化をもたらす。細胞信号伝達経路により伝達された信号は、例えば、細胞の遺伝子発現を変化させる転写因子の活性化をもたらすものが可能である。好適な細胞信号伝達経路は、病的細胞において活性なものである。例えば、経路は、癌細胞中で構成的に活性化された（すなわち一生スイッチが入っている）ものであってもよいし、例えば、リウマチ様関節炎という状況で炎症細胞において細胞外リガンドにより不適切に活性化されたものであってもよい。
【００２５】
細胞表現型の調節に関与する標的タンパク質として、推定薬物標的が可能である。例えば、相互作用部位に結合して標的タンパク質と細胞結合パートナー（細胞信号伝達経路の一部であるものなど）との相互作用を遮断することにより、標的タンパク質の活性を薬学的に調節することは、治療効果を得ようと努める様式で細胞表現型を変化させることとなり得る。
【００２６】
培養可能でありｉｎ−ｖｉｔｒｏで維持または繁殖が可能な哺乳類細胞ならば、どれでも採用することができる。そのような細胞として、安定発現株（ＡＴＣＣまたは他の細胞収蔵所から入手可能なものなど）が可能である。あるいは、採用される哺乳類細胞として、個別の生物の組織または器官に由来する一次細胞が可能である。ある実施形態において、採用される哺乳類細胞は、遺伝子構築物（（所望の）表現型に関与するもの、例えば、レポーター遺伝子など）を一時的に遺伝子導入されていてもよい。他の実施形態において、哺乳類細胞は、表現型に変化をもたらすウイルスまたは細菌に感染していてもよい。哺乳類細胞を、所望の試験を行なう期間中、維持または繁殖させることが可能であるならば、そうした細胞を本発明に採用することができる。特に有用であるのは、哺乳類細胞であり、以下の列挙から選択されるものである：ヒト細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、霊長類細胞、および家畜哺乳類の細胞（ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、またはネコの細胞など）。本発明に採用される特定の細胞として、哺乳類の癌または腫瘍由来細胞、あるいは哺乳類の疾患または異常に関連する細胞が挙げられる。
【００２７】
適切な哺乳類細胞とは、調節のため変化を観測したいある表現型（本明細書中で記載されるものなど）を表示することできる、またはまさに表示している細胞である。例えば、細胞は、アッセイでどう阻害されるか決定しようとしている表現型を表示するものであってもよいし、アッセイでどう刺激されるか決定しようとしている表現型を表示しないものであってもよい。適切な表現型の特徴（表現型）を表示する哺乳類細胞は、当業者に既知のものをはじめとする任意のうってつけの技術または供給源により、同定または入手することができる。例えば、野生型ｐ５３配列を持つ細胞はｐ５３依存性アポトーシスの再活性化に関連した、またはその再活性化になっている表現型をスクリーニングするのに有用であるかもしれない。
【００２８】
特定の実施形態において、調節のため観測される表現型は、所定の細胞型に関して具体的に操作が加えられているものであってもよい。本明細書中、実施例の特定の実施形態の１つにも記載されているが、例えば、哺乳類のある細胞型に遺伝子組換え操作を行なって、検出するのに都合のよいまたは検出に適した表現型、例えば、蛍光タンパク質／マーカー（ＧＦＰ；ｅＧＦＰ、および当業者に周知であると思われる他の蛍光タンパク質など）、発光タンパク質／マーカー（ルシフェラーゼなど）、あるいは標識化抗体で検出可能な細胞表面マーカーなどを発現するようにしてもよい。
【００２９】
本発明のある実施形態において、哺乳類細胞の表現型とは：細胞信号伝達経路、好ましくは活性化細胞信号伝達経路に関連したものであり；および／または以下からなる列挙より選択されるものである：発光、蛍光、生存能力、老化、分化、遊走、侵襲、走化性、アポトーシス、免疫学的アネルギー、表面マーカー発現、細胞周期の進行、転写活動、タンパク質発現、グリコシル化、感染抵抗力、浸透、およびレポーター遺伝子活動。特にそのような実施形態において、表現型は、致死表現型および／または増殖低下（減少）表現型でもないし（サイトカイン依存から細胞を救出するのではない表現型など）、アポトーシス（好中球アポトーシス／細胞死を含む）からの救出でもないし、コロニー形成の誘導でもないし、救出スクリーンでもない。例えば、そのような表現型を選ぶスクリーニングは、哺乳類細胞の細胞死からの救出でも増殖の増加でもない、細胞の形質または特徴を検出するように設計することができる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、活性化細胞信号伝達経路に関連した表現型を表示してもよいし、あるいは抑制された（例えば、不活化された）細胞信号伝達経路に関連した表現型を表示してもよい。
【００３１】
注目している細胞信号伝達経路は、哺乳類細胞において構成的に活性化されていてもよい、すなわち信号伝達経路は、細胞中で一生スイッチが入っており活動しているものである。例えば、哺乳類細胞は、信号伝達経路の構成的活性化を引き起こす変異を、好ましくは信号伝達経路の上流側経路成分（細胞表面受容体など）に有することができる。構成的に活性化された細胞信号伝達経路を持つ適切な哺乳類細胞株は、当該分野で既知である。
【００３２】
あるいは、細胞に、信号伝達経路の構成的活性化を引き起こす信号伝達経路の変異体成分を遺伝子導入してもよいし、注目している細胞信号伝達経路を、細胞中で薬物または天然リガンドを用いて活性化してもよい。例えば、組換えソニック・ヘッジホッグタンパク質を用いてヘッジホッグ信号伝達を活性化させることができる。
【００３３】
本発明の様々な態様で、Ｐｈｙｌｏｍｅｒ、Ｐｈｙｌｏｍｅｒのライブラリー、またはＰｈｙｌｏｍｅｒをコードする核酸が採用される。Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーは、本発明の実施において特に利点を有することがわかっており、そのような利点として、以下の３つの特長のうちの１種以上が挙げられる：ヒット率の高さ；他の生体ライブラリーよりも低い標的偏向性；およびＰｈｙｌｏｍｅｒ／標的複合体の精製の助けとなり得る高い親和性でのヒットの可能性。
【００３４】
本発明の目的に関して、「Ｐｈｙｌｏｍｅｒ」は、微生物のゲノム（またはトランスクリプトーム）および／または真核生物の小ゲノム（コンパクトゲノムなど）のゲノムから得ることが可能な核酸断片、特に微生物（原核生物など）のゲノムから得ることが可能な（または得られる）核酸断片によりコードされる、約８個〜約１８０個のアミノ酸からなるペプチドである。ある実施形態において、核酸断片は、そのような生物から得られるものであり、核酸断片はまた、十分に特性決定されているか配列決定が済んでいるゲノムを持つ生物から得ることができるものを含み、および／または核酸断片は、約２４〜約５５０のヌクレオチド塩基対からなる断片である。例えば、断片として、原核生物のゲノム（またはトランスクリプトーム）および／または以下の生物のゲノム（またはトランスクリプトーム）から得ることができるものが可能である：アエロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）、アクイフェクス・エオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｉｓ）、  バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、メタノコックス・ヤンナスキ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ＰＣＣ６８０３、サーモプラズマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ）、およびサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）。Ｐｈｙｌｏｍｅｒをコードする核酸断片の源として、トラフグ属（Ｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ）、カエノルハブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、エシェリキア・コリ、アクイフェクス・アエリティクス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｌｉｔｉｃｕｓ）、メタノコックス・ヤンナスキ、  バチルス・スブチリス、ヘモフィルス・インフルエンザエ、ヘリコバクター・ピロリ、ナイセリア・メニンギティディス、シネコシスティス属の種、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ���、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、シュードモナス・エルギノーサ、ボレリア・ブルグドルフェリ、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム、マイコプラズマ・ニューモニエ、アーケオグロブス・フルギダス、またはビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）、あるいは表１に記載されるいずれかの種由来の核酸が挙げられる。核酸断片は、当該分野で認知されている方法、例えば、機械的剪断、ヌクレアーゼでの消化、制限エンドヌクレアーゼでの消化、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）による増幅、およびそれらの組み合わせを用いて、得ることおよび／または作成することができる。
【００３５】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒは、約１０〜約１６５アミノ酸長、例えば約１５〜１２０アミノ酸長のものが可能であり、可能な長さとして、約、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１１０アミノ酸長が挙げられ、および／またはＰｈｙｌｏｍｅｒは、そのような長さのいずれかでアミノ酸をコードすることに相当する長さを有する、微生物（例えば、微生物のゲノムまたはトランスクリプトーム）または真核生物の小ゲノム（コンパクトゲノムなど）から得ることができる核酸断片によりコードされるものが可能である。
【００３６】
ある実施形態において、Ｐｈｙｌｏｍｅｒペプチドは、ある生物活性を、例えば、そのペプチドが本来の環境下で有する任意の活性（もしあれば）と異なる生物活性を有する。例えば、Ｐｈｙｌｏｍｅｒは、哺乳類細胞中の標的タンパク質（哺乳類タンパク質など）に結合することができ、および／またはそのようなＰｈｙｌｏｍｅｒをコードする核酸を与えることができる生物内で発現した場合でもそのような標的タンパク質に結合しない。例えば、標的タンパク質は、そのような生物内で本来は見つけることはできなくてもよいし、Ｐｈｙｌｏｍｅｒはそのような生物で発現されないか、されたとしても異なる機能を有する巨大タンパク質の一部にすぎないものであってもよい。
【００３７】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーは、様々な配列を有するＰｈｙｌｏｍｅｒの集団である。例えば、Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーは、１×１０３以上、約３×１０３以上、３×１０４以上、１×１０５以上、１×１０６以上、１×１０７以上、１×１０８以上の異なるＰｈｙｌｏｍｅｒ配列、好ましくは１×１０８〜１×１０９、好ましくは１×１０９〜１×１０１０以上の異なるＰｈｙｌｏｍｅｒ配列；好ましくは１×１０１０〜１×１０１１以上の異なるＰｈｙｌｏｍｅｒ配列、好ましくは１×１０１１〜１×１０１２以上の異なるＰｈｙｌｏｍｅｒ配列、好ましくは１×１０１２〜１×１０１３以上の異なるＰｈｙｌｏｍｅｒ配列を含むことができる（または、そのような配列をコードする核酸ライブラリーから発現させることができる）。特定の実施形態において：（ｉ）Ｐｈｙｌｏｍｅｒのライブラリーは、３×１０４以上（１×１０６以上など）の異なるアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）または、このＰｈｙｌｏｍｅｒのライブラリーは、Ｐｈｙｌｏｍｅｒをコードする３×１０４以上（１×１０６以上など）の異なる核酸配列を含む複数の核酸から発現される。同じく、（ａ）Ｐｈｙｌｏｍｅｒのライブラリーは、３×１０４以上（１×１０６以上など）の異なるＰｈｙｌｏｍｅｒを含むことが可能であり；または（ｂ）Ｐｈｙｌｏｍｅｒのライブラリーは、３×１０４以上（１×１０６以上など）の異なるＰｈｙｌｏｍｅｒをコードすることができる核酸の複数から発現される。
【００３８】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒのライブラリーは、小（コンパクト）ゲノムを有する２種以上の微生物または真核生物（本明細書中記載されるそのような生物のいずれか２種以上など、ただしそれらに限定されない）から得られる核酸断片から作成してもよい。ある実施形態において、Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーは、３種以上のそのような生物（約５種〜約１００種のそのような生物など）から得られる核酸断片から作成される。例えば、Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーは、約６、１０、１５、２０、２５、３０、３５、５０、６０、７０、８０、または９０種のそのような生物から得ることができる。適切なＰｈｙｌｏｍｅｒライブラリーの１つは、表１に列挙される生物のうち（ｏｒ）少なくとも５種から得られる核酸断片から得ることができる。ライブラリーの特定の実施形態において、核酸断片を与える生物は、進化論的に異なるそのような生物から選択される。例えば、系統樹のあらゆる領域に由来する１、２、３、４、または５種以下の生物が、Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーの作成に用いられる。
【００３９】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーは、任意の都合のよい技法を用いて構築することができる。例えば、Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーは、１種以上の微生物核酸由来のヌクレオチド配列の短断片を発現ベクター中にランダムにクローン化することにより、構築することができる。Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーは、以下を含む方法により製造することができる：（ｉ）本明細書中記載される生物２種以上に由来する核酸から断片を製造する工程；（ｉｉ）核酸断片を、断片を発現するのに適した発現ベクターに挿入する工程；および（ｉｉｉ）核酸断片によりコードされるペプチドを発現させる工程。
【００４０】
本明細書中記載されるとおり、核酸断片は、複数種のそのような生物に由来する核酸（すなわちゲノムまたはトランスクリプトーム）の混合物から製造することができる。核酸は、例えば、混合物中の他のゲノムの複雑さおよび大きさと比べて、ゲノム（またはトランスクリプトーム）の複雑さおよび大きさに比例する量で混合物中に存在することができる。これにより、それぞれの生物に由来するゲノム（またはトランスクリプトーム）断片がおよそ同等に混合物を代表する。
【００４１】
核酸断片は、当業者に既知である１種以上の多様な方法により、対象の生物の１つ、２つ、またはそれより多いゲノム（またはトランスクリプトーム）から作成することができる。適切な方法として、以下の実施例に記載されるものだけでなく、例えば、機械的剪断（例えば、核酸を超音波処理または極細針に通すことによるもの）、ヌクレアーゼ（例えばデオキシリボヌクレアーゼ１）での消化、１種以上の制限酵素（好ましくは４塩基認識制限酵素の部位を認識する高頻度切断酵素）での部分もしくは完全消化、およびＤＮＡ試料の照射処理（例えば、ガンマ線照射または紫外線照射）が挙げられる。いくつかの実施形態において、核酸断片は、例えば、ランダムまたは変性オリゴヌクレオチドを用いて、低温プライマー伸長法により、またはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により、１種、２種、またはそれより多種の対象の生物から作成することができる。ランダムまたは変性オリゴヌクレオチドは、制限酵素認識配列を含むことで、増幅された核酸を適切な核酸ベクター中にクローン化することを可能にできる。
【００４２】
上記のとおりに得られる核酸の各断片は、Ｐｈｙｌｏｍｅｒをコードする。断片は、Ｐｈｙｌｏｍｅｒをペプチドとして発現させるため、発現ベクター中にクローン化することができる。
【００４３】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒをコードする核酸は、特定の配列タグと隣接させることができる（例えば、コード配列に対し５末端および３末端で）。配列タグは既知の配列で１０〜５０のヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドプライマー用の結合部位として用いることができる。好ましくは、タグの配列は、哺乳類ゲノムで見つからないものである。このことにより、Ｐｈｙｌｏｍｅｒコード配列を、都合よく、例えば必要に応じてＰＣＲにより、哺乳類細胞から増幅することが可能となる。
【００４４】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒをコードする核酸は、調節エレメントと操作可能に連結させることができる。適切な調節エレメントおよびベクターは、当該分野で周知であり、本明細書中のいずれかの箇所で記載されるものが挙げられる。核酸の製造および操作ならびにその核酸の哺乳類細胞での発現に適切な技法は、当該分野の当業者に周知である。
【００４５】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒをコードする核酸は、翻訳を制御するエレメント（Ｋｏｚａｋ配列、配列内リボソーム進入部位エレメント（ＩＲＥＳエレメント）など）と、および／または翻訳スリップを促進するエレメントと操作可能に連結させることができる。適切な調節エレメントおよびベクターは、当該分野で周知であり、本明細書中のいずれかの箇所で記載されるものが挙げられる。核酸の製造および操作ならびにその核酸の哺乳類細胞での発現に適切な技法は、当該分野の当業者に周知である。
【００４６】
本明細書中記載されるとおりのＰｈｙｌｏｍｅｒをコードする核酸は、標準技法を用いて、当業者により容易に調製、操作、クローン化、および発現させることができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２（非特許文献２２および２３）を参照）。
【００４７】
ＰｈｙｌｏｍｅｒｓおよびＰｈｙｌｏｍｅｒライブラリーは、当該分野で既知である（非特許文献１９；非特許文献２０、非特許文献２１、国際公開第２０００／０４１９６７号（特許文献８）、特許文献３、特許文献７；特許文献４、および特許文献５）。
【００４８】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーは、本発明において、複数のＰｈｙｌｏｍｅｒをコードする核酸のライブラリーという形で採用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーをコードする核酸は、哺乳類細胞での発現に適したプラスミドに含有させることができる。このプラスミドを、哺乳類細胞の集団に遺伝子導入するかウイルスで導入することができ、そしてＰｈｙｌｏｍｅｒ配列を発現させる。哺乳類細胞によるその細胞内でのそのような発現により、哺乳類細胞はＰｈｙｌｏｍｅｒと接触させられ、この接触が哺乳類細胞の集団に対してライブラリー規模で行なわれる場合には、そのような発現によりこれら細胞の集団がＰｈｙｌｏｍｅｒのライブラリーと接触させられる。当業者には当然のことながら、適切な局在化もしくは分泌タグまたは配列を組み込むことにより、哺乳類細胞の特定場所または小器官を標的として、Ｐｈｙｌｏｍｅｒを核酸から発現させることができ、これにより、そのように配置された標的タンパク質と関与するある表現型の調節を促進する。例えば、細胞外受容体である標的タンパク質は、分泌タグの組み込みにより、Ｐｈｙｌｏｍｅｒと同時発現する（融合物として）ように仕向けることができる。Ｐｈｙｌｏｍｅｒをコードする発現プラスミドのライブラリーを哺乳類細胞に遺伝子導入または導入する適切な方法は、当業者に既知である。
【００４９】
別の実施形態において、Ｐｈｙｌｏｍｅｒは、無細胞発現を通じて（例えば、以下に記載されるとおり、リボソームディスプレイ法またはＣＩＳディスプレイ法により）製造することができる。さらに別の好適な実施形態において、Ｐｈｙｌｏｍｅｒペプチドは、合成技法により製造される。
【００５０】
あるいは、Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーは、本発明において、ペプチドの形で直接採用される。例えば、Ｐｈｙｌｏｍｅｒをコードする複数の個別の核酸を発現させ（例えば、酵母菌もしくは細菌発現系により、または昆虫もしくは哺乳類細胞による組織培地への分泌により）、そのようにして産生されたＰｈｙｌｏｍｅｒペプチドを収集し（および随意に精製し）、次いでプールしたＰｈｙｌｏｍｅｒペプチドを適切な哺乳類細胞と接触させることができる。次いで、標準的な逆重畳積分アプローチを用いて、そのようなＰｈｙｌｏｍｅｒプールから個別のＰｈｙｌｏｍｅｒ（ヒットするもの／陽性のもの）を同定することができる。そのうえさらに、適切な高処理タンパク質発現および精製方法（現在当該分野で既知のとおりのもの）を用いて、個別のＰｈｙｌｏｍｅｒを、そのように産生させ、そのようにして産生された複数のＰｈｙｌｏｍｅｒを個別に哺乳類細胞と接触させることができる。したがって、そのような方法により、数千以上（約数万、数十万、数百万、またはそれ以上など）のＰｈｙｌｏｍｅｒペプチド（すなわち、Ｐｈｙｌｏｍｅｒのライブラリー）を哺乳類細胞集団と接触させることができる。ペプチドを哺乳類細胞と接触（または哺乳類細胞に浸透させる）のを助ける適切な遺伝子導入方法は、当業者に既知である。なお、そのような実施形態のあるもの（細胞内タンパク質標的を精査しようとする場合など）において、哺乳類細胞と接触させる予定のＰｈｙｌｏｍｅｒペプチドは、Ｐｈｙｌｏｍｅｒペプチドが哺乳類細胞に浸透するを助ける細胞透過性シグナルまたは細胞透過性部分をさらに含むことができる。そのような透過性部分は、当該分野で周知であるとおり、細胞透過性ペプチド配列（ＴＡＴ、ＴＡＴ様、または他の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）配列など）を含むことができ、Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリに由来するものが可能である。そのようなＣＰＰ−Ｐｈｙｌｏｍｅｒ融合物は、発現系を適切に設計することにより、容易に産生させることができる。ＣＰＰは、Ｐｈｙｌｏｍｅｒペプチドを細胞内に輸送して、例えば、細胞表現型に対するＰｈｙｌｏｍｅｒペプチドの直接の効果（本明細書中記載されるとおりのものなど）についてスクリーニングするのに有用である可能性がある。
【００５１】
ＣＰＰは、結合した部分が細胞膜を横断して輸送されるのを促進する異種アミノ酸配列である。適切なＣＰＰは、当該分野で周知であり、塩基性ペプチド（ショウジョウバエホメオタンパク質など）、アンテナペディア転写タンパク質（ＡｎｔＨＤ）、ＨＳＶ構造タンパク質ＶＰ２２、ヒト免疫不全ウイルスＴＡＴタンパク質、カポジＦＧＦシグナル配列（ｋＦＧＦ）、タンパク質形質導入ドメイン４（ＰＴＤ４）、ペネトラチン、Ｍ９１８、トランスポータン−10、ＰＥＰ−Ｉペプチド、核移行配列、両親媒性ペプチド、および５つ以上の近接塩基性残基（アルギニンまたはリシンなど）を含むペプチド配列（例えば（Ｒ）９、（Ｋ）９、（Ｒ）１１、または（Ｋ）１１）などが挙げられる。他にも適切なＣＰＰが当該分野で既知である（例えば、Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ．４９，１６１−１６８；Ｍｉｃｈｉｕｅ  ｅｔａｌ．，２００５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，８２８５−８２８９；Ｗａｄｉａ  ａｎｄ  Ｄｏｗｄｙ，２００２  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３  ５２−５６；Ｌａｎｇｅｌ（２００２）Ｃｅｌｌ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ（非特許文献２４〜２７）；  米国特許第６７３０２９３号、国際公開第０５／０８４１５８号、および国際公開第０７／１２３６６７号（特許文献９〜１１），非特許文献２６；Ｗａｇｓｔａｆｆ＆Ｊａｎｓ  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３  １３７１−１３８７（２００６）（非特許文献２８）を参照）。他のＣＰＰは、Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーに由来するものも含めて、同時係属出願であるオーストラリア特許出願第２０１１９０１９９７号および米国特許仮出願第６１／４８９，１９８号（特許文献１２および１３）に記載されている。
【００５２】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーを哺乳類細胞の集団に接触させるのに続いて、この細胞集団を、表現型（表現形質または特徴など）の存在、不在、変化、または他の調節についてスクリーニングする、あるいはいずれにしろ精査することができる。
【００５３】
上記のとおり、細胞集団は、本発明で使用される細胞が通常表示しない表現形質または特徴の出現または強化についてスクリーニングすることができる。例えば、細胞は、疾病の表現型である細胞（癌細胞など）が可能であり、正常細胞の特徴である表現形質または特徴の存在（または強化）についてスクリーニングすることができる。さらなる例として、哺乳類細胞の表面でのマーカー発現は、そのようなマーカーと結合する蛍光標識した抗体および蛍光標識細胞分取法（ＦＡＣＳ）を用いることなどにより、スクリーニングの対象となる表現型の表れとなり得る。
【００５４】
細胞集団は、本発明で使用される細胞が表示する表現形質または特徴の消失または減少についてスクリーニングすることができる。例えば、細胞は、疾病の表現型である細胞（癌細胞など）が可能であり、疾患の特徴である表現形質または特徴の消失（または減少）についてスクリーニングすることができる。表現形質または特徴は、細胞信号伝達経路、例えば、癌細胞で活性な細胞信号伝達経路の阻害と関連したものが可能である。
【００５５】
細胞集団は、表現形質または特徴の度合いにおける検出可能な変化（定量的表現型の増加または減少など）についてスクリーニングすることができる。例えば、組換えレポーター遺伝子により生じる信号（発光または蛍光タンパク質など）は、定量的に測定することができ、集団中の細胞で表現型の変化または調節を表示するものは、その細胞自身の、またはその細胞のクローンの培養物の蛍光または発光強度の変化により同定される。特定の実施形態において、スクリーニングの対象となる表現型における変化は、哺乳類細胞に付随する、例えば、その細胞中の組換えレポーター遺伝子（または表面マーカー）に付随する発光または蛍光の減少（または増加）である。
【００５６】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒとの接触後に変化した表現型を表示する１個以上の細胞が、集団の中から同定される。変化した表現型を持つ細胞は、任意の都合のよい方法で同定することができる。例えば、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）などのハイコンテント・スクリーニング・プラットフォームを用いて、プラスミドライブラリーか合成ペプチド形かのいずれかの形をしたＰｈｙｌｏｍｅｒライブラリーを、細胞表現型を変化させるか、いずれにしろ調節するＰｈｙｌｏｍｅｒｓについてスクリーニングすることができる。
【００５７】
あるいは、変化した表現型を持つ細胞は、細胞表面マーカー発現の変化を通じて、例えば、蛍光標識細胞分取法（ＦＡＣＳ）を用いて、または表現型関連酵素（βガラクトシダーゼなど）の発現を通じて、例えば、生化学アッセイにより同定することができる。本発明の特定の実施形態において、表現型は、レポーター遺伝子により作り出される発光または蛍光シグナルであり、変化した表現型を表示する細胞は、当業者に既知の技法および装置を用いて、発光または蛍光シグナルの変化（例えば、増加または減少）を介して同定される。例えば、プレートリーダー、ＣＣＤ検出器、およびスキャナー装置を用いて、発光または蛍光の表現型に変化を示す細胞を集団の中から同定することができる。
【００５８】
本発明の方法の特定の実施形態において、（ｉ）Ｐｈｙｌｏｍｅｒのライブラリーは、複数の分離しかつアドレス指定可能なＰｈｙｌｏｍｅｒを含み、それらは随意に細胞透過性ペプチド配列と融合している；または（ｉｉ）Ｐｈｙｌｏｍｅｒのライブラリーは、Ｐｈｙｌｏｍｅｒをコードする複数の分離しかつアドレス指定可能な核酸から発現される。「分離しかつアドレス指定可能な」により、個別の部分が回収、解析、および／または同定できるようなやり方で順序づけられているおよび／または同定されている、複数の個別のＰｈｙｌｏｍｅｒ（またはそのようなＰｈｙｌｏｍｅｒをコードする核酸）、例えば、１×１０3以上、約３×１０3以上、３×１０4以上、１×１０5以上、１×１０6以上、１×１０7以上、１×１０8以上の個別の部分を包含する。例えば、（ｉ）複数の分離しかつアドレス指定可能なＰｈｙｌｏｍｅｒが、アレイ形式に配列された上記哺乳類細胞集団と接触させられる；または（ｉｉ）複数の分離しかつアドレス指定可能な核酸が、アレイ形式に配列された上記哺乳類細胞集団と接触させられる。アレイ形式として、複数または個々の部分が規則正しい空間配置またはパターンで（ラックに並べた管またはマイクロタイタープレートを利用した配列などで）並べられている状態が挙げられる。当業者ならお気づきだろうが、適切な４８ウェル、９６ウェル、３８４またはそれより多数のウェルのマイクロタイタープレートを本発明のアレイ形式の方法に採用することができる。他のアレイ形式として、部分のスポット配置マイクロアレイまたは他のマイクロアレイ（ペプチド、核酸、または細胞のアレイまたはマイクロアレイなど）が挙げられる。図９は、配列させたＰｈｙｌｏｍｅｒライブラリーを用いるそのような態様において可能な１つの実施形態を示す。
【００５９】
本発明の方法の他の特定の実施形態において、上記接触または上記発現を受けて上記表現型に変更を表示する上記細胞は、アレイ形式（本明細書中記載されるものなど）に配列された上記哺乳類細胞集団から同定される。例えば、本発明実施例の同定工程は、プレートリーダーを用いて、細胞培養物（各培養物は、異なるＰｈｙｌｏｍｅｒと接触している）を含むマイクロタイタープレートを、発光または蛍光強度の上昇または低下について分析することにより、行なうことができる。
【００６０】
上記のとおり、Ｐｈｙｌｏｍｅｒのライブラリー（またはこのライブラリーをコードする複数の核酸）は、プールを構成することができ、このプールを用いて哺乳類細胞集団とＰｈｙｌｏｍｅｒライブラリーを接触させる。したがって、ある実施形態において：（ｉ）Ｐｈｙｌｏｍｅｒのライブラリーは、プールされた複数のＰｈｙｌｏｍｅｒを含み、それらは随意に細胞透過性ペプチド配列と融合している；または（ｉｉ）Ｐｈｙｌｏｍｅｒ  ライブラリーは、Ｐｈｙｌｏｍｅｒをコードするプールされた複数の核酸から発現される。そのような実施形態のあるものついて、以下のことが考慮に入っている：（ｉ）上記Ｐｈｙｌｏｍｅｒは、プール形式に配列された上記哺乳類細胞集団と接触させられる；または（ｉｉ）上記プールされた複数の核酸は、プール形式に配列された上記哺乳類細胞集団で発現させられる。
【００６１】
本発明の特定の実施形態において、例えば、細胞集団がプールされたＰｈｙｌｏｍｅｒライブラリーと接触させられると、この接触（またはこのＰｈｙｌｏｍｅｒライブラリーをコードする核酸の発現）を受けて上記表現型に変化を示す細胞が、蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）を用いて同定される。
【００６２】
変化した表現型を表示すると同定された細胞は、単離および／または精製することができる。したがって、本発明の方法は、哺乳類細胞の集団から、Ｐｈｙｌｏｍｅｒのライブラリーとの接触を受けて表現型に変化を示す少なくとも１個の細胞を単離する工程を含む実施形態を含む。
【００６３】
変化した表現型を表示する細胞は、任意の適切な技法により単離することができる。例えば、ＦＡＣＳを採用することができる。あるいは、細胞を試料として採取するか一定量分取し、さらに培養することができる。したがって、いくつかの実施形態において、１個以上の細胞を培養および／または増やして、変化した表現型を表示することができる（または表示する）細胞の集団１つ以上を製造することができる。
【００６４】
細胞（単離した細胞または細胞培養物など）を用いて、表現型の変化を導く、引き起こす、またはいずれにしろそれに関連するＰｈｙｌｏｍｅｒを同定することができる。
【００６５】
１つの実施形態において：（ｉ）Ｐｈｙｌｏｍｅｒが、上記単離された細胞から、単離および／または同定される；または（ｉｉ）Ｐｈｙｌｏｍｅｒをコードする核酸が、上記単離された細胞に由来する上記核酸を増幅および／またはクローン化することにより、単離される。（ｉ）の場合、親和捕捉または精製および／またはタンパク質マイクロアレイ（例えば、プロテアーゼ消化に続く質量分析による、またはタンパク質マイクロアレイ分析によるなど）などの技法を用いて、単離された細胞からＰｈｙｌｏｍｅｒペプチドを単離および／または同定（単離および配列決定などにより）することができる。（ｉｉ）の場合、Ｐｈｙｌｏｍｅｒをコードする単離された核酸は、配列決定により同定することができる。あるいは、そのような核酸は、それらに付随する「バーコード」配列または他の同様な（分子）同定タグを用いて同定することができる。
【００６６】
別の実施形態において、例えば、分離しかつアドレス指定可能なＰｈｙｌｏｍｅｒライブラリーまたはそのようなライブラリーをコードする核酸を用いる場合、表現型の変化を導くか、引き起こすか、またはいずれにしろそれに関連したＰｈｙｌｏｍｅｒが、それぞれのアドレスを参照して同定される。例えば、ライブラリーに含まれるＰｈｙｌｏｍｅｒの配列が既知であるならば、Ｐｈｙｌｏｍｅｒ源のアドレスまたはＰｈｙｌｏｍｅｒの最初のアドレスへの逆照会により、Ｐｈｙｌｏｍｅｒの正体（アミノ酸配列など）が直接明らかになる。あるいは、表現型の変化を導くか、引き起こすか、またはいずれにしろそれに関連したＰｈｙｌｏｍｅｒのアミノ酸配列を同定する目的で、Ｐｈｙｌｏｍｅｒ源アドレスにあるＰｈｙｌｏｍｅｒペプチドの試料（またはその中の核酸）を試料として配列決定することができる。
【００６７】
哺乳類細胞において表現型の変化を導くか、引き起こすか、またはいずれにしろそれに関連したＰｈｙｌｏｍｅｒをコードする核酸（変化した表現型を表示するとして同定される１個以上の細胞において発現されるものなど）を、単離することができる。任意の都合のよい技法を採用することができる。例えば、全核酸を細胞から（またはアドレス指定可能なライブラリーのアドレス用に、最初のＰｈｙｌｏｍｅｒ源アドレスから）抽出し、Ｐｈｙｌｏｍｅｒをコードする核酸を抽出物から増幅またはクローン化することができる。いくつかの特定の実施形態において、核酸は、Ｐｈｙｌｏｍｅｒコード配列に隣接する配列特異的タグとハイブリダイズするプライマーを用いて、増幅することができる。単離した後、Ｐｈｙｌｏｍｅｒをコードする核酸をさらに、増幅、配列決定、新規ベクター中への再クローン化、および／またはなにかしらの操作を行なうことができる。他の好適な実施形態において、活性Ｐｈｙｌｏｍｅｒをコードする核酸を、表現型の変化が観測された細胞環境から直接増幅し、次いで核酸配列決定により同定することができる。
【００６８】
いくつかの実施形態において、変化した表現型を表示するとして同定された細胞から同定されたＰｈｙｌｏｍｅｒの集団を、上記のとおりの表現型スクリーニングにさらに１回、２回、３回またはそれよい多い回数かけることができる。
【００６９】
表現型の変化を導くか、引き起こすか、またはいずれにしろそれに関連すると同定されたＰｈｙｌｏｍｅｒを、本方法の続く工程に供する。Ｐｈｙｌｏｍｅｒを製造するのに様々なアプローチが利用できる。コード核酸を発現させてＰｈｙｌｏｍｅｒを産生させることができる（例えば、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｅｄ  ＲＳ  Ｔｕａｎ（Ｍａｒ  １９９７）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ（非特許文献２９）を参照）。あるいは、化学合成によりＰｈｙｌｏｍｅｒを完全にまたは部分的に作成することができる。Ｐｈｙｌｏｍｅｒは、液相または固相合成法を用いて；溶液で；または、固相、液相、および溶液反応の任意の組み合わせにより、例えば、最初にそれぞれのペプチド部分を全て揃え、必要および希望に応じて、存在する任意の保護基を外してから、それぞれのカルボン酸またはスルホン酸またはその反応性誘導体を反応させることで残基Ｘを導入することにより、合成することができる。ペプチドの化学合成は、当該分野で周知である（Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９８４）；Ｍ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ  ａｎｄ  Ａ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ，  Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｊ．Ｈ．Ｊｏｎｅｓ，Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ．  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  １９９１；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０Ａ  Ｕｓｅｒｓ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＢＩ  Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａにおいて；Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，（Ｅｄ．）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ  Ｕｓｅｒ'ｓ  Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９２，Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９、およびＧ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ，（Ｅｄ．）Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２８９）．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ  １９９７において）（非特許文献３０〜３６）。
【００７０】
特定の実施形態において、用意された（同定された）Ｐｈｙｌｏｍｅｒは、Ｐｈｙｌｏｍｅｒおよび親和タグを含む融合タンパク質、またはいずれにしろ異種ペプチドと融合した融合タンパク質の一部として用意される。例えば、細胞表現型を変化させるＰｈｙｌｏｍｅｒをコードする核酸を同定および単離した後、異種ペプチドと融合したＰｈｙｌｏｍｅｒを含む融合タンパク質を発現ベクターが発現するように、その核酸を、異種ペプチドをコードする核酸に隣接させて発現ベクター中に再クローン化することができる。適切な異種ペプチドとして、親和タグおよびＣＰＰ（上記のとおりのもの）が挙げられる。
【００７１】
親和タグは、特異的結合対の片割れとなる異種アミノ酸配列である。親和タグを含有するペプチドは、特異的結合対の相方と親和タグの結合を通じて、単離および／または検出することができる。例えば、親和タグとして、抗体分子が結合するエピトープが可能である。適切な親和タグは、当該分野で周知であり、そのようなタグとして、例えば、ＭＲＧＳ（Ｈ）６、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＦＬＡＧＴＭ）、Ｔ７−、Ｓ−（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）、ポリＡｒｇ（Ｒ５−６）、ポリＨｉｓ（Ｈ２−１０）、ポリＣｙｓ（Ｃ４）ポリＰｈｅ（Ｆｌｌ）ポリＡｓｐ（Ｄ５−１６）、ＳｔｒｅｐｔタグＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）、ｃ−ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、インフルエンザ−ＨＡタグ（Ｍｕｒｒａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２９，１７０−９（非特許文献３７））、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅタグ（Ｓｔａｍｍｅｒｓ，Ｄ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ（１９９１）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２８３，２９８−３０２（非特許文献３８））、Ｔａｇ．１００（Ｑｉａｇｅｎ；哺乳類ＭＡＰキナーゼ２由来の１２ａａタグ）、Ｃｒｕｚタグ０９（登録商標）（ＭＫＡＥＦＲＲＱＥＳＤＲ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）、およびＣｒｕｚタグ２２（登録商標）（ＭＲＤＡＬＤＲＬＤＲＬＡ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）が挙げられる。既知のタグ配列についての総説が、Ｔｅｒｐｅ（２００３）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０  ５２３−５３３（非特許文献３９）にまとめられている。
【００７２】
親和タグは、Ｐｈｙｌｏｍｅｒ製造中にＰｈｙｌｏｍｅｒを精製および／または単離するのに、および／または例えば、細胞結合パートナーと結合したＰｈｙｌｏｍｅｒを免疫沈降させるのに使うことができる。
【００７３】
本発明では、収率を改善し暗雑音を減少させる目的で、例えば、Ｐｈｙｌｏｍｅｒ製造中にＰｈｙｌｏｍｅｒを精製および／または単離するのに、および／または例えば、細胞結合パートナーと結合したＰｈｙｌｏｍｅｒを免疫沈降させるのに、タンデム親和タグ（または「ＴＡＰ」タグ）を採用することができる。
【００７４】
哺乳類細胞の表現型を変化させるＰｈｙｌｏｍｅｒを同定し、そのＰｈｙｌｏｍｅｒを、随意に融合タンパク質として用意することができると、本発明の方法は、さらに、哺乳類細胞の表現型に対するＰｈｙｌｏｍｅｒの効果を確かめる工程を含むことができる。表現型変異を誘発し、それによりＰｈｙｌｏｍｅｒの効果を確かめる目的で、例えば、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）またはカーゴペプチド配列を用いて合成されたＰｈｙｌｏｍｅｒペプチドを、直接細胞に対して用いることができる。
【００７５】
本発明の方法において、表現型の変化を導くか、引き起こすか、またはいずれにしろそれに関連するＰｈｙｌｏｍｅｒが結合する細胞タンパク質が同定される。したがって、そのような細胞タンパク質は、本発明において精査中の、表現型を調節する標的タンパク質（例えば、そうである、またはそうなる）とみなされる。
【００７６】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒが結合する細胞タンパク質は、様々な手段で同定することができる。詳細には、Ｐｈｙｌｏｍｅｒペプチドを用いて、そのＰｈｙｌｏｍｅｒの細胞結合パートナーを同定することができる。例えば、Ｐｈｙｌｏｍｅｒと特異的に相互作用する、またはＰｈｙｌｏｍｅｒに結合する、および／またはＰｈｙｌｏｍｅｒと高い親和性を持つ細胞タンパク質を同定することができる。
【００７７】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒと結合する細胞タンパク質は、細胞結合パートナーを選ぶ標準的なスクリーニング（以下の実施例で記載されるものなど）を用いて同定することができる。例えば、Ｐｈｙｌｏｍｅｒをベイト分子として用いて哺乳類細胞または細胞抽出物中の分子を同定することができる。
【００７８】
ベイトＰｈｙｌｏｍｅｒと結合する細胞タンパク質を単離することができるので、本発明は、細胞タンパク質を同定する前に、用意した（同定済みの）Ｐｈｙｌｏｍｅｒと結合する細胞タンパク質を単離する工程を含むことができる。適切な技法は、当該分野で周知であり、そのような技法として、放射免疫アッセイ、共免疫沈降法、二重ハイブリッド技法、標識化Ｐｈｙｌｏｍｅｒを用いた候補タンパク質アレイ探索法、シンチレーション近接アッセイおよびＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。例えば、Ｐｈｙｌｏｍｅｒを哺乳類細胞で過剰発現させて、エピトープタグと結合する抗体で免疫沈降させることができる。
【００７９】
単離に続いて、ベイトＰｈｙｌｏｍｅｒと結合した細胞タンパク質を、分析および／または同定することができる。適切な技法は、当該分野で周知であり、そのような技法として、質量分析、例えば、ＭＡＬＤＩ連結ＴＯＦ質量分析が挙げられる。特定の実施形態において、細胞タンパク質は、上記用意したＰｈｙｌｏｍｅｒと細胞タンパク質の結合が可能になるような条件下で、哺乳類細胞抽出物を上記用意したＰｈｙｌｏｍｅｒと接触させ、上記用意したＰｈｙｌｏｍｅｒとそれに結合した細胞タンパク質を含む複合体を単離することにより、単離される。随意に、複合体は、精製されることで単離され；そして好ましくは、そのような精製は、上記用意したＰｈｙｌｏｍｅｒおよび親和タグを含む融合タンパク質の親和タグを用いて達成される。Ｐｈｙｌｏｍｅｒ親和タグ融合物を用意する適切な方法は、上記に記載される。さらなる実施形態において、細胞タンパク質は、質量分析により、または上記用意したＰｈｙｌｏｍｅｒを用いるタンパク質マイクロアレイ分析により同定される。
【００８０】
本発明の方法は、標的タンパク質上の相互作用部位の特性決定にも関連することができる。そのような方法では、その方法のそのような工程で採用すると有利な性質を有することがわかっているＰｈｙｌｏｍｅｒを用いる。例えば、標的タンパク質の相互作用部位を、さらなるＰｈｙｌｏｍｅｒスクリーニングを行なうことで、特性決定することができる。さらなるＰｈｙｌｏｍｅｒスクリーニングを行なうため、標的タンパク質を、行なおうとするスクリーニング方法に都合の良い形で用意することができる。したがって、標的タンパク質は、単離された形で用意することができる；例えば、タンパク質は、化学合成されたものかもしれないし、遺伝子組換えで発現させて精製されたものかもしれない。単離された標的タンパク質は、随意に、固定されていてもよい。スクリーニング法によっては（ファージディスプレイ法など）、単離された標的タンパク質をスクリーニング用に基質（複数ウェルプレートなど）に固定することが有利であるかもしれない。特定の実施形態において、標的タンパク質は、この標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列が宿主細胞で発現することにより用意される。当業者ならお気づきだろうが、標的タンパク質を製造する適切な方法には、そのようなヌクレオチド配列の発現によるものなどがある。
【００８１】
適切な標的タンパク質として、上記のとおりのＰｈｙｌｏｍｅｒを利用した表現型スクリーニングにより同定される標的タンパク質および既知の標的タンパク質を挙げることができる。
【００８２】
他の実施形態において、標的タンパク質またはその断片（既知のタンパク質：タンパク質相互作用ドメインなど）をコードする核酸を、スクリーニングが行なわれる宿主細胞で発現させることができる。適切な発現方法は、当該分野で周知である。宿主細胞および／または核酸は、採用するスクリニーング法に適したものが可能である。例えば、二重ハイブリッドスクリニーングの場合、核酸は、以下に記載のとおり、異種ペプチド（転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインなど）と連結した標的タンパク質を含む融合タンパク質をコードするものが可能である。
【００８３】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒのライブラリーをスクリーニングして、標的タンパク質に結合するＰｈｙｌｏｍｅｒの集団を同定することができる。したがって、そのようなＰｈｙｌｏｍｅｒの集団は、ＰｈｙｌｏｍｅｒまたはＰｈｙｌｏｍｅｒをコードする核酸のライブラリーを、コードされたＰｈｙｌｏｍｅｒと上記標的タンパク質の結合についてスクリーニングすることにより、同定される。Ｐｈｙｌｏｍｅｒのライブラリーまたは核酸のライブラリーは、多様なライブリーであってよい。すなわち、ライブラリーは、多数の異なる配列（上記のものなど）を含むことができる。
【００８４】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒのライブラリーは、プラスミドの形またはＣＰＰ−Ｐｈｙｌｏｍｅｒペプチドの形をした複数のヌクレオチド配列で表すことができ、任意の都合のよい技法を用いて標的タンパク質との結合についてスクリーニングすることができる。適切なスクリーニング方法は、当該分野で周知であり、そのような方法として、ファージまたはリボソームディスプレイ法および二重ハイブリッドスクリーニング法（例えば、酵母菌または哺乳類細胞中で、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行なうもの）が挙げられる。したがって、ある実施形態において、ライブラリーは、二重ハイブリッドスクリーニング法、ファージディスプレイ法、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのディスプレイ法（例えば、リボソームディスプレイ法またはＣＩＳディスプレイ法）を用いてスクリーニングされる。
【００８５】
いくつかの実施形態において、スクリーニングは、二重ハイブリッドスクリーンを用いて行なうことができる。二重ハイブリッドスクリーンは、典型的には、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを有する転写因子を採用する。適切な転写因子としてＧＡＬ４が挙げられるが、これは、ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ＤＢＤ）、およびＧＡＬ４転写活性化ドメイン（ＧＡＬ４ＴＡＤ）、ならびにＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインの組み合わせ（ＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメインとＶＰ６０転写活性化ドメインの組み合わせなど）を有する。二重ハイブリッドアッセイ様式は、当該分野で周知である（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０；２４５−２４６（非特許文献４０）を参照）。
【００８６】
特定の実施形態において、標的タンパク質と結合するＰｈｙｌｏｍｅｒの集団を同定するのにＳＯＳ動員システム（Ａｒｏｎｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ  １９９７）が用いられる。ＳＯＳ動員システムは、酵母菌サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における分裂促進因子による信号伝達経路の活性化に基づくものである。簡単に言うと、組換えベイト標的タンパク質を、切断型ｈＳｏｓ１の翻訳領域と融合させる。ベイトの恒常的発現を可能にする発現プラスミドを、Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーを発現するライブラリーとともに、ｃｄｃ２５−２酵母菌株中に同時形質転換する（Ｇｉｅｔｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｅｓｔｉ，２００７）。Ｐｈｙｌｏｍｅｒペプチドは、膜付着用脂質化シグナルとの融合物として、誘導型ＧＡＬ１プロモーターから発現させることができる。ベイトタンパク質とプレイタンパク質の相互作用は、温度感受性変異により内在性ＲＡＳ経路が制御されている酵母菌株（ｃｄｃ２５−２）で試験することができる。推定相互作用物質を、制限温度（３７℃）に移してガラクトース依存性について試験することで、標的タンパク質と相互作用するＰｈｙｌｏｍｅｒを同定することができる。次いで、これらのクローンのペプチドコード挿入物を単離して配列決定に供することができる。
【００８７】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒを、これらのドメインのうちの１つ、および標的タンパク質またはそれぞれのカウンターパートに対する相互作用部位を含むその断片と融合させることにより、機能性転写因子は、Ｐｈｙｌｏｍｅｒが標的タンパク質と結合した場合にのみ復旧される。したがって、Ｐｈｙｌｏｍｅｒと標的タンパク質の結合を、レポーター遺伝子の転写を活性化することができる転写因子ＤＮＡ結合ドメインの結合部位に操作可能に連結されたレポーター遺伝子を用いることで測定できる。
【００８８】
二重ハイブリッドスクリーニング法は、酵母菌または哺乳類細胞で行なうことができる。適切な宿主細胞は、第一の検出可能なレポーターをコードする異種ヌクレオチド配列を含むことができる。検出可能なレポーターとは、細胞中で発現されると検出することができるポリペプチドである。例えば、検出可能なレポーターの発現は、信号（蛍光、生物発光、または発色信号など）の発生を導くことができ、次いでこの信号を、常用技法を用いて検出することができる。この信号は、発現後のレポーターから直接発せられるものでもよいし、二次分子（標識化抗体など）を通じて間接的に発せられるものでもよい。
【００８９】
適切な検出可能なレポーターとして、検出可能な蛍光信号を発する蛍光タンパク質が挙げられる。適切な蛍光レポーターとして、ＣｈｅｒｒｙおよびＧＦＰ、または励起／発光スペクトルが適切に離れていてフローサイトメトリーに用いることができるような蛍光タンパク質対で他の任意の対が挙げられる。
【００９０】
第一の検出可能なレポーターをコードするヌクレオチド配列は、転写因子により活性化される調節エレメントと操作可能に連結させることができる。Ｐｈｙｌｏｍｅｒと標的タンパク質が結合することで、ＤＮＡ結合ドメインと、転写因子の転写活性化ドメインが、調節エレメントにおいて一緒になると、調節エレメントは、レポーターをコードするヌクレオチド配列の転写を活性化する。したがって、検出可能なレポーターは、標的タンパク質に結合するＰｈｙｌｏｍｅｒを発現する細胞においてのみ発現される。
【００９１】
適切な宿主細胞は、さらに、転写因子の第一のドメイン（すなわち、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインのうちの１つ）と融合した標的タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含むことができる。ヌクレオチド配列は、発現ベクターに含まれていて調節エレメントと操作可能に連結されていてもよい。
【００９２】
検出可能なレポーターおよび標的タンパク質をコードする異種または外来性ヌクレオチド配列は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれていてもよいし、染色体外ベクターに含まれていてもよい。
【００９３】
いくつかの実施形態において、標的タンパク質と結合パートナーとの結合が細胞死を引き起こす逆酵母菌二重ハイブリッドスクリーニング（Ｖｉｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）を用いることができる。この結合を遮断するＰｈｙｌｏｍｅｒは、酵母菌細胞を細胞死から救出するので、スクリーンで容易に同定することができる。
【００９４】
逆酵母菌二重ハイブリッドシステムを修飾した方法（Ｖｉｄａｌ  ｅｔ  ａｔ  ａｌ．  １９９６により最初に記載される）は、第二の対抗選択マーカー（ＣＹＨＺ）の使用、およびスクリーニング媒体中の糖濃度調節によるストリンジェンシー滴定を可能にする。簡単に言うと、標的タンパク質（またはその断片）を、酵母菌二重ハイブリッドベクターｐＤＤ［アンピシリン選択遺伝子をカナマイシン選択に置き換えることにより修飾したｐＧｉｌｄａベイトベクター］およびｐＪＦＫ［ｐＹｅｓＴｒｐプレイベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＴＲＰ１酵母菌選択遺伝子をＨＩＳ５に、およびアンピシリン選択遺伝子をカナマイシン選択に置き換えることにより修飾したもの］それぞれの中にクローン化することができる。ベイト構築物およびプレイ構築物は、酢酸リチウムを利用した化学変換プロトコルを用いて、Ｓ．セレビシエ株ＰＲＴ４８０（ＭＡＴａ、ｈｉｓ３、ｔｒｐ１、ｕｒａ３、４ＬｅｘＡ−ＬＥＵ２、Ｉｙｓ２：：３ｃＩｏｐ−ＬＹＳ２、ＣＡＮR、ＣＹＨ２R、ａｄｅ２：：２ＬｅｘＡ−ＣＹＨ２−ＺＥＯ、ｈｉｓ５：：２ＬｅｘＡ−ＵＲＡ３−Ｇ４１８）に同時形質転換することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９８９）。遮断Ｐｈｙｌｏｍｅｒペプチドライブラリーは、修飾した高親和性化学変換プロトコルを用いて、Ｓ．セレビシエ株ＰＲＴ５１（ＭＡＴ□ｈｉｓ３、ｔｒｐ１、ｕｒａ３、６ＬｅｘＡ−ＬＥＵ２、Ｉｙｓ２：：３ｃＩｏｐ−ＬＹＳ２、ＣＹＨ２R、ａｄｅ２：：Ｇ４１８−ｐＺｅｒｏ−ａｄｅ２、ｍｅｔ１５：：Ｚｅｏ−ｐＢＬＵＥ−ｍｅｔ１５、ｈｉｓ５：：ｈｙｇｒｏ）に形質転換することができる（Ｇｉｅｔｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｅｓｔｌ，  ２００７）。ベイト／プレイプラスミド含有ＰＲＴ４８０一倍体（細胞１０8個）を、遮断Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリー（１０7ｃｆｕ）と交配させ、ＨＷ-最少培地（ヒスチジンおよびトリプトファンが欠落した最少培地）に蒔いて、二倍体を選択することができる。３０℃で２日間インキュベーションしてから、プレートを掻爬して、収穫した酵母菌細胞を洗浄し、酵母菌凍結用溶液（６５％ｖ／ｖのグリセロール、０．１ＭのＭｇＳＯ4、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＣＩ、ｐＨ８．０）に１：１（ｖ／ｖ）で再懸濁させ、１ｍｌずつに分割して−８０℃で凍結させる。ブロッカーを選択するため、１．５×１０7ｃｆｕの標的タンパク質／Ｐｈｙｌｏｍｅｒ二倍体を解凍してＨＷ-中で一晩増殖させて対数増殖期とすることができる。翌日、３×１０5個の二倍体を対抗選択培地（ＨＷＵ-（ヒスチジン、トリプトファン、およびウラシルが欠落）、０．０２％のガラクトース（ｇａｌ）、２％のラフィノース（ｒａｆｆ）、０．２μｇ／ｍｌのウラシル、０．０６％（ｗ／ｖ）の５−フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）、５μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドが補充されている）に蒔く。これらのプレートを７日間インキュベートし、次いでコロニーをＨＷＵ-（０．０２％のｇａｌ、２％のｒａｆｆ）に移し、それからＨＷＬ-（（ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシンが欠落）０．０２％のｇａｌ、２％のｒａｆｆ）に移して、遮断表現型を確認することができる。
【００９５】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーをスクリーニングするため、転写因子の第二のドメイン（すなわち、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインのうちのもう一方）と融合したＰｈｙｌｏｍｅｒのライブラリーをコードする発現ベクターの集団を、上記のとおり宿主細胞に遺伝子導入する。宿主細胞で発現したＰｈｙｌｏｍｅｒが標的タンパク質と結合すれば、転写因子の第一ドメインと第二ドメインが一緒になり、検出可能なレポーターをコードするヌクレオチド配列の転写が引き起こされる。したがって、検出可能なレポーターの発現は、Ｐｈｙｌｏｍｅｒと標的タンパク質の結合を示すものとなる。
【００９６】
検出可能なレポーターの発現は、集団中の遺伝子導入された宿主細胞で測定することができる。用いた検出可能なレポーターに応じて、任意の適切なアプローチを採用して発現を検出することができる。
【００９７】
次いで、検出可能なレポーターを発現する細胞を単離することができ、細胞から、Ｐｈｙｌｏｍｅｒをコードする核酸を単離および／または増幅することができる。
【００９８】
他の実施形態において、スクリーニングは、ファージディスプレイ技法を用いて行なうことができる。例えば、組換えで製造された発現Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーは、例えば、表面で機能性Ｐｈｙｌｏｍｅｒを表示するλバクテリオファージまたは糸状バクテリオファージを用いて、標的タンパク質と結合するＰｈｙｌｏｍｅｒからスクリーニングすることができる；例えば、国際公開第９２／０１０４７号（特許文献１４）を参照。適切なファージディスプレイ技法は、当該分野で周知である。典型的には、Ｐｈｙｌｏｍｅｒのライブラリーを表示するファージ粒子の集団を、固定化標的タンパク質と接触させる。次いで、固定化標的タンパク質と結合したファージ粒子を、集団の残部から精製および／または単離することができる。いくつかの実施形態において、ファージディスプレイ法を複数回行なうことができる。
【００９９】
固定化標的タンパク質と結合するＰｈｙｌｏｍｅｒを表示するファージ粒子の集団を単離することができる。固定化標的タンパク質と結合するＰｈｙｌｏｍｅｒをコードする核酸は、単離されたファージ粒子から精製および／または単離することができ、そして操作、配列決定、再クローン化、および／または発現させることができる。
【０１００】
さらに他の実施形態において、Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリー（またはそのようなライブラリーをコードする複数の核酸）は、ｉｎ−ｖｉｔｒｏディスプレイ法、例えばＯｄｅｇｒｉｐ（２００４，ＰＮＡＳ，１０１：２８０６−２８１０）（非特許文献４１）により記載されるものなどを用いて、スクリーニングされる。
【０１０１】
さらに他の実施形態において、Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリー（またはそのようなライブラリーをコードする複数の核酸）は、酵母菌ディスプレイ法、例えばＲａｋｅｓｔｒａｗ，  ｅｔ  ａｌ．（２０１１，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２４：５２５−５３０）（非特許文献４２）により記載されるものなどを用いて、スクリーニングされる。
【０１０２】
標的タンパク質と（特に相互作用部位で）結合するＰｈｙｌｏｍｅｒの集団の同定に続いて、ある実施形態において、本発明の方法は、Ｐｈｙｌｏｍｅｒの集団として用意された中の少なくとも１つのＰｈｙｌｏｍｅｒを、それが持つ上記の表現型を表示できる哺乳類細胞のその表現型を調節する能力について試験する工程を含む；好ましくは、この試験工程は、その表現型を表示できる哺乳類細胞をそのＰｈｙｌｏｍｅｒと接触させる工程、およびその哺乳類細胞のその表現型が調節されるかどうかを決定する工程を含む。そのような工程は、本方法の様々な工程を通じて、標的、Ｐｈｙｌｏｍｅｒおよび／または表現型の間の関連性が一貫しているおよび／または維持されていることを確認する役目を果たすことができる。例えば、そのＰｈｙｌｏｍｅｒの集団として用意された中の少なくとも１つのＰｈｙｌｏｍｅｒは、哺乳類細胞と接触すると、表現型を表示できる哺乳類細胞のその表現型を調節するものであってもよい。そのような確認工程（一工程または複数工程）は、哺乳類細胞を集団のＰｈｙｌｏｍｅｒペプチドのうち少なくとも１つと接触させ、表現型の変化について精査することにより、行なうことができる。あるいは、集団由来のＰｈｙｌｏｍｅｒをコードする核酸を哺乳類細胞中で発現させて、表現型の変化について精査することができる。
【０１０３】
ある実施形態において、本発明の方法では、標的タンパク質と（特に相互作用部位で）結合するＰｈｙｌｏｍｅｒの集団は、少なくとも５つのＰｈｙｌｏｍｅｒを含む。例えば、集団は、Ｐｈｙｌｏｍｅｒ（本明細書中記載されるスクリーンを用いて同定することができるとおりの、標的タンパク質と結合する集団に由来するものなど）を、およそ、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、または少なくとも１００、含む。関連する実施形態において、本発明の方法は、Ｐｈｙｌｏｍｅｒのこの集団内のＰｈｙｌｏｍｅｒ亜集団を同定する工程を含み、この亜集団は、およそ、少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、または少なくとも１００の異なる配列の、標的タンパク質と（特に相互作用部位で）結合するＰｈｙｌｏｍｅｒを含む。
【０１０４】
集団に含まれるＰｈｙｌｏｍｅｒは：（ｉ）哺乳類細胞中で発現させることで、または哺乳類細胞と接触させることで、元となるヒットＰｈｙｌｏｍｅｒと同じ表現型効果を誘発することが確認でき；（ｉｉ）単離、再クローン化、および／または発現、あるいはいずれにしろ製造することができ；（ｉｉｉ）アラニン置換変異誘発、あるアミノ酸の欠失、もしくは特定残基での変異誘発に供することで、結合について特性決定することができ；および／または（ｉｖ）上記のとおり、コード核酸からの組換え発現により、または化学合成により製造することができる。
【０１０５】
集団に含まれる各Ｐｈｌｏｍｅｒの標的タンパク質と（特に相互作用部位で）の結合を、例えば、１つ以上の生物物理学的パラメーターを測定することで、分析することができる。結合を測定する適切な生物物理学的技法として、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、微分層干渉法（ＤＬＩ）、および等温滴定熱測定法（ＩＴＣ）が挙げられる。
【０１０６】
本発明の特定の実施形態において、Ｐｈｙｌｏｍｅｒと標的タンパク質と（特に相互作用部位で）の結合は、熱力学的に測定することができ、結合親和性すなわちＫｄを決定することができる。したがって、本発明は、標的タンパク質と（特に相互作用部位で）結合することができると同定されているＰｈｌｏｍｅｒの集団に含まれるもののうちの少なくとも１つについて、Ｐｈｙｌｏｍｅｒの標的タンパク質に対する結合親和性（または他の定量的結合尺度）を測定することを含む実施形態を含む。そのような実施形態のあるものにおいて、結合親和性（または他の定量的結合尺度）は、およそ、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、または少なくとも１００のＰｈｙｌｏｍｅｒ（標的タンパク質と（特に相互作用部位で）結合するＰｈｙｌｏｍｅｒの集団に由来するものなど）について決定される。
【０１０７】
集団の中の、標的タンパク質と（特に相互作用部位で）の結合（親和性）が定量されたＰｈｙｌｏｍｅｒは、順位付け、選択、またはなにかしらの分類を行なうことができる。例えば、結合のそのような定量的結合評価に続いて、本発明のある実施形態は、Ｐｈｙｌｏｍｅｒの集団の中で、高い親和性で標的タンパク質と（特に相互作用部位で）結合するＰｈｙｌｏｍｅｒの亜集団を同定する、例えば、標的タンパク質におよそ、５００ｕＭ以下、２５０ｕＭ以下、１５０ｕＭ以下、１００ｕＭ以下、５０ｕＭ以下、２５ｕＭ以下、１０ｕＭ以下、１ｕＭ以下、５００ｕＭ以下、２５０ｕＭ以下、１５０ｕＭ以下、１００ｕＭ以下、５０ｕＭ以下、１０ｕＭ以下、１ｕＭ以下のＫｄで結合するＰｈｙｌｏｍｅｒを同定することを含む。そのような実施形態のあるものにおいて、Ｐｈｙｌｏｍｅｒの亜集団は、Ｐｈｙｌｏｍｅｒ（高い親和性で標的タンパク質と（特に相互作用部位で）結合するＰｈｙｌｏｍｅｒなど）を、およそ、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０、含む。
【０１０８】
本発明の方法の特定の実施形態において、標的タンパク質に結合する集団に含まれるＰｈｙｌｏｍｅｒは、相互作用部位での標的タンパク質との結合について精査される。例えば、集団由来の標的タンパク質に結合するＰｈｙｌｏｍｅｒは、相互作用部位との結合性質に関して分類または選択され、そのような分類または選択は、例えば、蛍光偏光法を含む本明細書中定義される置換および／または結合アッセイ法に基づく競合置換および／または結合アッセイ法を用いて、および例えば、そのようなアッセイで競合成分の１つとして相互作用部位と結合することが既知のＰｈｙｌｏｍｅｒを用いてなどにより行なわれる。本発明の特別な特色として、Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーは、相互作用部位で標的タンパク質と結合する複数のＰｈｙｌｏｍｅｒ（約２、４、５、１０、または２０より多いＰｈｙｌｏｍｅｒなど）を用意するのに非常に適していることが見いだされている（例えば、それらＰｈｙｌｏｍｅｒの構造多様性および／または規模（管理可能な規模を含む）が理由である）。相互作用部位と結合するＰｈｌｏｍｅｒをそのように多数有することは、特にそれらＰｈｙｌｏｍｅｒが異なる、すなわち多様な配列を有する場合には、相互作用部位の特性決定において特別有利である。配列の異なるＰｈｙｌｏｍｅｒは、異なる側鎖および官能基を所有するだろうし、そのような側鎖および官能基は相互作用部位で標的タンパク質と様々な度合いで相互作用する（または相互作用しない）だろう。これにより、結合その他構造についてより大量の価値ある情報を得ることができる。この情報の増加により、例えば、相互作用部位で標的タンパク質と結合し、その結果、表現型作用を調節するリガンドをより効率的かつ効果的に同定（薬理学的用途で小分子リガンドを同定など）できるようになる。標的タンパク質の相互作用部位に結合する、集団中の多数の配列が異なるＰｈｙｌｏｍｅｒについて結合親和性を決定することにより、結合親和性に影響を及ぼすアミノ酸配列の構成要素を同定することができる。したがって、標的タンパク質と（特に相互作用部位で）結合するＰｈｙｌｏｍｅｒの亜集団を、それらの結合親和性および／または他の生物物理学的パラメーターに完全にまたは部分的に基づいて同定することができる。例えば、亜集団は、２５０ｕＭ以下のＫｄ（上記に示したものより低い任意の親和性など）で、標的タンパク質と（特に相互作用部位で）結合し、集団の中で配列多様性がより増加したまたは最大であるＰｈｙｌｏｍｅｒからなるものが可能である。
【０１０９】
標的タンパク質と結合することができるとして同定されたＰｈｙｌｏｍｅｒの集団は、他の（代替か追加かのいずれかである）特徴に基づき分類することができる。例えば、標的タンパク質と（特に相互作用部位で）の結合特異性、Ｐｈｙｌｏｍｅｒの溶解性、長さ、またはそれらの製造しやすさもしくは入手しやすさなどである。
【０１１０】
本発明の方法において、Ｐｈｙｌｏｍｅｒが標的タンパク質と（特に相互作用部位で）結合した場合の、その配向、立体配置、または姿勢が、実験的に決定される。すなわち、そのような配向、立体配置、または姿勢の決定に採用される実験データが集められる。この決定に関して、コンピューター上での結合、フィッティング、またはドッキングアプローチの採用は「実験的」とはみなさないものとする。なぜなら、そのような技法において、実際の実験データは集められないからである。少なくとも１つのＰｈｙｌｏｍｅｒ（集団に含まれるもの、またはいずれにしろ本発明の方法により同定されるものなど）の標的タンパク質との結合立体構造（配向または姿勢）を実験的に決定するために採用される実験データをもたらす適切な技法は、周知であり、そのような技法として、Ｘ線結晶構造解析および核磁気共鳴（ＮＭＲ）が挙げられる。したがって、亜集団の中の少なくとも１つのＰｈｙｌｏｍｅｒｓの上記標的タンパク質との（特に相互作用部位での）結合立体構造は、およそ、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０のそのような結合立体構造から実験的に決定される。
【０１１１】
例えば、Ｐｈｙｌｏｍｅｒの標的タンパク質との（特に相互作用部位での）結合立体構造は、標的タンパク質をその結合（同族）Ｐｈｙｌｏｍｅｒと同時結晶化させることにより、またはＰｈｙｌｏｍｅｒを適切な結晶形中に浸透させ、次いでＸ線結晶構造解析を用いて、結合したＰｈｙｌｏｍｅｒタンパク質複合体の構造を解析し、それによりＰｈｙｌｏｍｅｒの標的タンパク質との（特に相互作用部位での）結合立体構造を決定することができる。いくつかの実施形態において、ＮＭＲを用いて、タンパク質およびＰｈｙｌｏｍｅｒ中の、相互作用アミノ酸残基を確定することができる。
【０１１２】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒと標的が結合して安定な複合体となっており、相互作用原子団、結合長、および結合角に関してＰｈｙｌｏｍｅｒがどのように標的タンパク質と（特に相互作用部位で）結合するかの定義そのものである場合、Ｐｈｙｌｏｍｅｒの結合立体構造は、標的タンパク質に相対してＰｈｙｌｏｍｅｒにとって好適な（すなわちエネルギー的に最も好ましい）（空間的）配向になっている。
【０１１３】
次いで、標的タンパク質上の相互作用部位を、結合立体構造のうちの少なくとも１つ（亜集団のＰｈｙｌｏｍｅｒのうちの少なくとも１つによる結合立体構造など）から特性決定する。例えば、Ｐｈｙｌｏｍｅｒ集団の結合姿勢をまとめ合わせて、相互作用部位の三次元構造およびその部位でリガンドが結合するための構造的必要条件を確定させることができる。
【０１１４】
実験的に決定された結合立体構造に、コンピューターを利用し分析の助けも借りた綿密調査を行なうことで、Ｐｈｙｌｏｍｅｒ上の特定の残基または位置と標的タンパク質の相互作用部位のアミノ酸残基との結合相互作用を同定することができる。特定の実施形態において、複数の結合立体構造（約２、３、５、または１０の結合立体構造など）を分析／綿密調査して、相互作用の共通またはコンセンサス場所が同定される。結合相互作用（エネルギー）のそのような場所（「ホットスポット」）の同定は、相互作用部位を特性決定する１つのアプローチを提供する。実験的に決定された結合立体構造を考慮すると、そのようなホットスポットを見つけることは、当業者には一目瞭然である。例えば、疎水性Ｐｈｙｌｏｍｅｒアミノ酸側鎖が標的タンパク質表面にある疎水性ポケットに入ること、または電荷を帯びたＰｈｙｌｏｍｅｒアミノ酸側鎖が標的タンパク質内の逆極性の電荷の近傍に行くことである。
【０１１５】
相互作用部位のさらなるまたは代替特性決定は、相互作用部位の、および／または相互作用結合エネルギーが限定的もしくは低い場所の三次元構造を、分析、綿密調査、または決定することで行なうことができる。例えば、相互作用部位内にあってＰｈｙｌｏｍｅｒの結合とは直接関与しない場所を用いて、Ｐｈｙｌｏｍｅｒと標的タンパク質との結合に物質的に影響を及ぼすことなく側鎖を変える（リガンドの溶解性を上げるためなど）ことができる領域を見つけることができる。
【０１１６】
相互作用部位を特性決定する別のおよび／または追加のアプローチにおいて、上記タンパク質標的と相互作用する上記Ｐｈｙｌｏｍｅｒの少なくとも１本の側鎖（例えば、官能基）の配向（および／または正体）が同定される。官能基は、例えば、Ｐｈｙｌｏｍｅｒに含まれる、正電荷を帯びた、負電荷を帯びた、電荷を帯びていない、または疎水性のアミノ酸側鎖に含まれるものが可能であり、随意に化学修飾を受け入れることができるものである（リシン側鎖上のアミノ基など）。結合立体構造の分析を用いて、そのような配向の同定、および随意に、相互作用する側鎖／官能基の同定が行なわれる。この様式では、Ｐｈｙｌｏｍｅｒと標的タンパク質の結合を表す有効なファルマコフォアの空間的配向を確立させることができる。そのような実施形態では特に、２、３、５、８、または１０のそのような側鎖／官能基の配向（および／または正体）が同定される。そのように複数のものが、１つの結合立体構造について同定される、またはそのように複数のものが、複数（約２、３、５、または１０など）の結合立体構造の分析に起因することができる。
【０１１７】
本発明の方法のさらなる実施形態において、相互作用部位は、上記結合立体構造の分析により相互作用部位の三次元構造を特性決定することで、さらに特性決定され、好ましくは、この三次元構造はコンピューター上での方法を用いて特性決定される。
【０１１８】
本発明の特定の実施形態において、相互作用部位の特性決定は、実験的に決定された結合立体構造の分析を、結合Ｐｈｙｌｏｍｅｒでの生物物理学的または生物学的データの分析と合わせて用いる。そのような生物物理学的または生物学的データとして、本明細書中記載されるもののいずれか（結合親和性または表現型への影響度合いなど）が挙げられる。このようにして、相互作用部位についておよび／または標的タンパク質への結合に関してＰｈｙｌｏｍｅｒについて、構造／機能（構造活性のもの）の関係性を確立することができる。例えば、相互作用部位に結合する様々な異なるＰｈｙｌｏｍｅｒ（異なる配列を持つ）の構造的特性決定は、Ｐｈｙｌｏｍｅｒ／標的結合親和性の生物物理学的評価と組み合わせて、結合親和性が生じる地点に必要な化学特性基についての情報を提供する。この情報は、相互作用部位のさらなる特性決定をもたらし、したがってＰｈｙｌｏｍｅｒの結合立体構造を模倣する小分子の構造を同定するのにも、創薬プログラムの基礎となる構造／活性関連性を作り出すのにも特別に有用である。
【０１１９】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒの集団と相互作用する標的タンパク質上の（特に相互作用部位またはその周囲の）分子部位（原子または原子団など）は、Ｐｈｙｌｏｍｅｒの亜集団の結合姿勢をまとめたものから同定することができる。複数の分子部位のそれぞれについて正体および空間的座標をマッピングすることにより、相互作用部位の三次元構造を確定することができる。これらの分子部位との結合に最適な結合角および結合長を決定することができる。
【０１２０】
標的タンパク質の相互作用部位と相互作用するＰｈｙｌｏｍｅｒ中の分子部位（原子または原子団など）は、Ｐｈｙｌｏｍｅｒ（結合Ｐｈｙｌｏｍｅｒの亜集団の中の１つなど）の少なくとも１つの（または集合もしくはコンセンサス）結合立体構造から同定することができる。複数の分子部位それぞれについての正体、配向、および／または空間的座標、ならびに標的タンパク質との結合の長さおよび角度を用いて、相互作用部位におけるリガンド結合の構造的必要条件をマッピングすることができる。
【０１２１】
例えば、ファルマコフォアマップを作成することができる。ファルマコフォアマップは、相互作用部位を占める（例えばそこに結合する）目的でリガンドが必要とする化学特性基の正体および位置を規定する。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、結合Ｐｈｙｌｏｍｅｒの１種以上の変異体（例えば、配列が亜集団のＰｈｙｌｏｍｅｒ（原始または「基礎」Ｐｈｙｌｏｍｅｒ）の配列と１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸で異なっているもの）を同定する工程、ならびに１種以上のそのような変異体と相互作用部位の結合を予測および／または実験的に決定する工程を含む方法が可能である。変異体の配列は、標準技法を用いて製造することが可能であり、結合は、本明細書中に記載されるとおりなどして決定することができる。
【０１２３】
相互作用部位の三次元構造は、コンピューターモデリングで計算することができる。三次元構造は、標的タンパク質上にＰｈｙｌｏｍｅｒと相互作用することを示す分子部位を含むことができる。適切なコンピューターモデリングのパッケージソフトは、当該分野で入手可能である（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ環境（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｉｎｃ，ＵＳＡ）および本明細書中に記載される他のものなど）。
【０１２４】
リガンドの構造は、特性決定された相互作用部位にぴったりはまるまたはドッキングできるようになっている（例えば、相互作用部位とのドッキング可能性について分析される）。リガンドは、ペプチド（Ｐｈｙｌｏｍｅｒについて記載されるとおりの大きさおよび／または他の特性を有するものなど）であってもよいし、小分子であってもよい。小分子として、分子量が約８００Ｄａｌｔｏｎ（Ｄａ）未満、例えば、約５００Ｄａ未満、４５０Ｄａ未満、４００Ｄａ未満、３５０Ｄａ未満、３００Ｄａ未満、または２５０Ｄａ未満の任意の有機または無機化学分子が挙げられる。小分子は、自分自身を生物学的用途に適したものにする生物物理学的特性を有することができ、そのような特性として、溶解性、毒性基の欠如、および／または他の特性（ルールオブファイブなど）が挙げられる。
【０１２５】
したがって、別の態様において、本発明は、哺乳類細胞の表現型（致死表現型以外および／または増殖低下表現型以外の表現型など）を調節する標的タンパク質と（特に相互作用部位で）結合するリガンドを同定する方法に関し、本方法は、この標的タンパク質の相互作用部位の三次元構造にドッキング可能（例えば、首尾よくドッキングできる、または特定の試験パラメーターを前提としてドッキングする）なリガンドの構造を、コンピューターを利用した方法を用いて、同定する工程を含み、この三次元構造は本発明の方法により決定される。図１０は、そのような態様の可能な実施形態の１つを示す。
【０１２６】
コンピューター上の創薬の標準技法を採用して、リガンドが相互作用部位にぴったりはまるかどうか（すなわちドッキング可能性）を決定することができる。例えば、データベースを仮想的に（例えば、コンピューター上で）スクリーニングして、相互作用部位と合致するリガンド構造を同定することができる。例えば、市販されている小分子の構造ライブラリーを仮想的にフィルタリングして、Ｐｈｙｌｏｍｅｒ結合姿勢により定義される相互作用部位を占拠するのに適切な化学特性基、結合角などをもつ分子を見つけることができる。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、Ｇｌｉｄｅ（登録商標）（ＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒＩｎｃ、ＵＳＡ）などの仮想スクリーニング方法を用いて、この小分子サブセットで相互作用部位についての仮想スクリーニングを行なうことができる。これにより、さらなる精査対象として注目する分子の数を絞り込むことができるだろう。
【０１２８】
あるいは、化学特性単位（サブ構造、構成要素、官能基など）を、段階的な様式で、相互作用部位に仮想的に組み立てていくことで、ぴったりはまるリガンドの構造を作ることができる。例えば、Ｐｈｙｌｏｍｅｒ亜集団の結合から最適であると同定された結合長および角度で標的タンパク質上の分子部位と相互作用する分子部位を有するリガンドの構造を、同定または組み立てることができる。
【０１２９】
リガンド結合空間にぴったりはまる（またはドッキング可能な）リガンドを、同定、入手、および／または合成することができる。そのようなリガンドを、標的タンパク質と接触させて、結合を決定することができる。したがって、本発明のこの態様の方法は、さらに、以下の工程を含むことができる：上記同定された構造を有するリガンドを用意する工程；このリガンドを上記標的タンパク質と接触させる工程；およびこのリガンドとこの標的タンパク質の結合を決定する（例えば、実験的に決定する）工程。
【０１３０】
リガンドがＰｈｙｌｏｍｅｒを標的タンパク質から外すかどうかを確かめるために、そのリガンドをアッセイで試験することができる。標準的な置換／結合アッセイプラットフォーム（ＡｌｐｈａＬＩＳＡまたは蛍光偏光）を採用することができる。したがって、本方法は、さらに、以下の工程を含むことができる：上記相互作用部位と結合する１つ以上のＰｈｙｌｏｍｅｒを用意する工程；および上記リガンドが持つ、上記標的タンパク質との結合についてこの１つ以上のＰｈｙｌｏｍｅｒと競合する能力を決定する工程、および随意に、このリガンドが持つ、上記表現型を表示することができる哺乳類細胞のこの表現型を調節する能力を決定する工程。
【０１３１】
別の態様において、本発明は、哺乳類細胞の表現型（致死表現型以外および／または増殖低下表現型以外の表現型など）を調節する標的タンパク質を同定する方法に関し、本方法は以下の工程を含む：
この表現型を表示する能力がある哺乳類細胞をｉｎ−ｖｉｔｒｏで培養した集団を、Ｐｈｙｌｏｍｅｒのライブラリーと接触させる工程；
この接触を受けてこの表現型に変化を示す細胞を集団の中から同定する工程；
細胞のこの表現型を変化させるＰｈｙｌｏｍｅｒを同定する工程；
同定したＰｈｙｌｏｍｅｒを用意する工程；および
この用意したＰｈｙｌｏｍｅｒと結合する細胞タンパク質を同定する工程、
この細胞タンパク質が、哺乳類細胞のこの表現型を調節する標的タンパク質である。
【０１３２】
関連態様において、本発明は、哺乳類細胞の表現型（致死表現型以外および／または増殖低下表現型以外の表現型など）を調節するＰｈｙｌｏｍｅｒを同定する方法にも関し、本方法は以下の工程を含む：この表現型を表示することができる哺乳類細胞をｉｎ−ｖｉｔｒｏで培養した集団をＰｈｙｌｏｍｅｒライブラリーと接触させる工程；この接触を受けてこの表現型に変化を示す細胞を集団の中から同定する工程；および、細胞のこの表現型を変化させるＰｈｙｌｏｍｅｒを同定する工程、このＰｈｙｌｏｍｅｒが、哺乳類細胞のこの表現型を調節するＰｈｙｌｏｍｅｒである。
【０１３３】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒおよび標的タンパク質が結合対として同定（例えば、本発明の１つ以上の方法を採用することで）されることで、この相互作用を、Ｐｈｙｌｏｍｅｒと標的タンパク質の（特に相互作用部位での）結合を調節する化合物（小分子など）を同定するアッセイに利用することができる。したがって、１つの実施形態において、本発明はさらに以下の工程を含む：
この標的タンパク質およびこの用意されたＰｈｙｌｏｍｅｒを用意する工程；および
このＰｈｙｌｏｍｅｒとこの標的タンパク質の（特に相互作用部位での）結合に対する試験化合物の効果を決定する工程、
このＰｈｙｌｏｍｅｒとこの標的タンパク質の結合度合いを調節する試験化合物が、哺乳類細胞の上記表現型の調節剤候補である。
【０１３４】
当業者にはおわかり頂けるだろうが、そのような態様の特定の実施形態は、同様な特徴の工程を採用する本発明の他の態様について記載したものを含むことができる。
【０１３５】
したがって、そのような実施形態に関連する別の態様において、本発明は、哺乳類細胞の表現型（致死表現型以外および／または増殖低下表現型以外の表現型など）の調節剤候補である化合物（小分子など）を同定する方法にも関し、本方法は以下の工程を含む：
この表現型を表示する能力がある哺乳類細胞をｉｎ−ｖｉｔｒｏで培養した集団を、Ｐｈｙｌｏｍｅｒのライブラリーと接触させる工程；
この接触を受けてこの表現型に変化を示す細胞を集団の中から同定する工程；
細胞のこの表現型を変化させるＰｈｙｌｏｍｅｒを同定する工程；
同定したＰｈｙｌｏｍｅｒを用意する工程；
この用意したＰｈｙｌｏｍｅｒと結合する細胞タンパク質を同定する工程、この細胞タンパク質が、哺乳類細胞のこの表現型を調節する標的タンパク質である；
この標的タンパク質およびこの用意したＰｈｙｌｏｍｅｒを用意する工程；および
このＰｈｙｌｏｍｅｒとこの標的タンパク質の結合に対する試験化合物の効果を決定する工程、
このＰｈｙｌｏｍｅｒとこの標的タンパク質の結合度合いを調節する試験化合物が、哺乳類細胞のこの表現型の調節剤候補である。
【０１３６】
ある実施形態において、そのような態様は、さらに、この調節剤候補を、この表現型を表示できる哺乳類細胞と接触させる工程；および、この調節剤候補が持つ、哺乳類細胞のこの表現型を調節する能力を決定する工程を含む。
【０１３７】
当業者にはお分かり頂けるだろうが、そのような態様の特定の実施形態は、同様な特徴の工程を採用する本発明の他の態様について記載したものを含むことができる。例えば、Ｐｈｙｌｏｍｅｒと標的タンパク質の結合に対する試験化合物の効果は、標準的な置換／結合アッセイプラットフォーム（Ａｌｐｈａ−ＬＩＳＡまたは蛍光偏光）を採用して、測定することができる。
【０１３８】
標的タンパク質が哺乳類細胞の表現型を調節すると同定（例えば、本発明の１つ以上の方法を採用することで）されることで、この標的タンパク質を、表現型の調節に関与する標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定するアッセイに用いることができる。したがって、別の態様において、本発明は哺乳類細胞の表現型（致死表現型以外および／または増殖低下表現型以外の表現型など）を調節する標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定する方法に関し、本方法は以下の工程を含む：
この標的タンパク質を用意する工程；
この標的タンパク質と結合するＰｈｙｌｏｍｅｒの集団を用意する工程；
この集団内の少なくとも１種のＰｈｙｌｏｍｅｒのこの標的タンパク質との結合立体構造を実験的に決定する工程；および
このタンパク質標的と相互作用するこのＰｈｙｌｏｍｅｒの少なくとも１本の側鎖の（ｉ）結合エネルギーの存在部位；および／または（ｉｉ）配向性を、いずれの場合にしろ、この結合立体構造を解析することにより同定する工程、
それにより、この標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定する。
【０１３９】
そのような態様のある実施形態において、標的タンパク質は、細胞信号伝達経路の成分であり、および／または標的タンパク質は、本発明の方法により同定される。当業者にはおわかり頂けるだろうが、そのような態様の特定の実施形態は、同様な特徴の工程を採用する本発明の他の態様について記載したものを含むことができる。
【０１４０】
特定の態様において、本発明は、本発明の方法により同定可能な（例えば、同定された）Ｐｈｙｌｏｍｅｒのアミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパク質にも関する。最初に本発明の方法により同定されたそのようなＰｈｙｌｏｍｅｒまたはアミノ酸配列は、「基礎」Ｐｈｙｌｏｍｅｒまたは配列と指定することができ、さらに本発明は、そのような基礎Ｐｈｙｌｏｍｅｒまたは基礎アミノ酸配列の、断片、変異体、および／または誘導体（本発明のペプチドまたはタンパク質の、断片、変異体および／または誘導体など）にも関する。好ましくは、ペプチドまたはタンパク質、および／またはその断片、変異体、または誘導体は、（ｉ）哺乳類細胞の表現型（致死表現型以外および／または増殖低下表現型以外の表現型など）を調節する；および／または（ｉｉ）哺乳類細胞の表現型（致死表現型以外および／または増殖低下表現型以外の表現型など）を調節する標的タンパク質と結合する。
【０１４１】
タンパク質またはペプチドの断片は、本発明の文脈において、本明細書中定義されるとおりのタンパク質またはペプチドの配列を有することができ、そのアミノ酸配列（またはそれをコードする核酸分子）に関して、本来の（自然の）タンパク質のアミノ酸配列（またはそれをコードする核酸分子）と比較して、Ｎ末端で、Ｃ末端で、および／または配列途中で切断部分を含むことができる。つまり、そのような切断は、アミノ酸レベルでも、それに対応する核酸レベルでも、どちらでも生じる可能性がある。したがって、本明細書中定義されるとおりのそのような断片に関する配列の正体は、好ましくは、本明細書中定義されるとおりのタンパク質またはペプチド全体、あるいはそのようなタンパク質またはペプチドの（コード）核酸分子全体を示すことができる。タンパク質またはペプチドの断片は、本発明の文脈において、さらに、本明細書中定義されるとおりのタンパク質またはペプチドの配列を有することができ、その配列は、約６〜約２０またはそれより長いアミノ酸長を、好ましくは約８〜約１０のアミノ酸長、例えば８、９、または１０、（さらには６、７、１１、または１２アミノ酸長）を、好ましくは約１３以上のアミノ酸長、例えば１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれより長いアミノ酸長を有し、こうした断片は、アミノ酸配列の任意の部分から選択することができる。タンパク質またはペプチドの断片は、そのタンパク質またはペプチドのエピトープの少なくとも１つを含むことができる。そのうえ、タンパク質のドメイン（細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、または膜貫通ドメインなど）、およびタンパク質の短縮型または切断型も、タンパク質の断片を構成すると理解することができる。
【０１４２】
１つ以上の突然変異で本来の（例えば、基礎）配列と異なる（アミノ酸の置換、挿入、および／または欠失が１カ所以上あるなどの）アミノ酸配列を有するタンパク質またはペプチドの変異体を作成することができる。好ましくは、こうした断片および／または変異体は、自然の全長タンパク質と比較して、同じ生物学的機能または特異的活性（例えば、特異的抗原性質）を有する。タンパク質またはペプチドの変異体は、その自然の、すなわち生理学的に変異していない、配列と比較して、保存的アミノ酸置換を含むことができる。こうしたアミノ酸配列ならびにそれらをコードするヌクレオチド配列を特に、本明細書中定義されるとおりの変異体という用語に含める。同じクラスに由来するアミノ酸どうしが交換される置換は、保存的置換と呼ばれる。詳細には、同じクラスに由来するアミノ酸どうしとは、脂肪族側鎖、正または負の電荷を帯びた側鎖、側鎖またはアミノ酸に芳香族基を含むもの、水素結合を形成できる側鎖、例えばヒドロキシル官能基を有する側鎖、を有するアミノ酸どうしである。このことは、例えば、極性側鎖を有するアミノ酸は、同様な極性側鎖を有する別のアミノ酸で置き換えられる、または、例えば、疎水性側鎖を特徴とするアミノ酸は、同様な疎水性側鎖を有する別のアミノ酸と置換される（例えばセリン（トレオニン）がトレオニン（セリン）により、またはロイシン（イソロイシン）がイソロイシン（ロイシン）により）ことを意味する。挿入および置換は、特に、三次元構造にまったく修飾をもたらさない、または結合領域に影響を及ぼさない配列位置において、可能である。挿入または欠失による三次元構造の修飾は、例えばＣＤスペクトル（円二色性スペクトル）を用いて容易に測定することができる、（Ｕｒｒｙ，１９８５，Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，ＣｉｒｃｕｌａｒＤｉｃｈｒｏｉｓｍ  ａｎｄ  ＯＲＤ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｉｎ：Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）（非特許文献４３）。
【０１４３】
２つの配列（例えば、本明細書中定義されるとおりの核酸配列またはアミノ酸配列、好ましくは、本明細書中定義されるとおりの重合体キャリアの核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、またはそれ自身のアミノ酸配列）の同一性のパーセンテージを決定する目的で、配列を整列させ、続いて互いに比較することができる。したがって、例えば第一の配列のある位置を、第二の配列の相当する位置と比較することができる。第一の配列のある位置が、第二の配列の位置の場合と同じ成分で占められているならば、２つの配列は、この位置において同一である。そうでないならば、これらの配列は、この位置において異なっている。第一の配列と比較して第二の配列に挿入が起こっているならば、第一の配列に空位置を挿入してもっと整列させることができる。第一の配列と比較して第二の配列に欠失が起こっているならば、第二の配列に空位置を挿入してもっと整列させることができる。すると、２つの配列の同一性の割合は、同一位置の個数を位置の合計数（片方の配列にのみ存在するものも含める）で割った関数となる。２つの配列の同一性のパーセンテージは、数学アルゴリズムを用いて決定することができる。使用可能な好適な数学アルゴリズムの例として、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７またはＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（非特許文献４３〜４４）のアルゴリズムが挙げられるが、それに限定されない。そのようなアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラムに統合される。このプログラムにより、本発明の配列とある度合いで同一である配列を同定することができる。タンパク質またはペプチドの変異体は、そのタンパク質またはペプチドと、１０、２０、３０、５０、７５、または１００個の一続きのアミノ酸にわたって、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有することができる。同様に、核酸配列の変異体は、その核酸配列と、１０、２０、３０、５０、７５、または１００個の一続きのヌクレオチドにわたって、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％のヌクレオチド同一性を有することができる。
【０１４４】
誘導体は、別の分子（上記のペプチドまたはタンパク質など）から誘導される分子である。ペプチドまたはタンパク質の誘導体は、本発明で使用されるペプチドまたはタンパク質を含む融合物も包含する。例えば、融合物は、標識、例えば、エピトープ（例えば、ＦＬＡＧエピトープ、またはＶ５エピトープ、またはＨＡエピトープなど）を含む。例えば、エピトープは、ＦＬＡＧエピトープである。そのようなタグは、例えば、融合タンパク質を精製するのに有用である。ペプチドまたはタンパク質の「誘導体」という用語は、誘導体化ペプチドまたはタンパク質、例えば、アミノ酸以外の化学特性部分を１つ以上含有するように修飾されたペプチドまたはタンパク質なども包含する。化学特性部分は、ペプチドまたはタンパク質と、例えば、アミノ末端のアミノ酸残基、カルボキシル末端のアミノ酸残基、または内部アミノ酸残基を介して共有結合することができる。そのような修飾として、ペプチドまたはタンパク質中の反応性部分への保護基またはキャップ基の付加、検出可能な標識の付加、およびペプチドまたはタンパク質化合物の活性に不利な破壊を加えない他の変更が挙げられる。例えば、誘導体は、ＰＥＧ部分、放射性核種、着色ラテックスなどを含有することができる。誘導体は、一般に、相対的に改善された特徴、例えば、プロテアーゼ耐性の向上、および／または半減期の延長、および／またはヒトもしくは動物の身体の細胞間もしくは組織間での輸送可能性の向上、および／または副作用の減少、および／または親和性もしくは免疫原性の向上、を有するまたは表す。国際公開第２０１０／００３１９３号（特許文献１５）は、当業者に既知の標準的な手順を用いる、個別にまたは組み合わせて用いることができる、ペプチドまたはタンパク質誘導体を提供する様々な方法論を記載しており、そのような方法として、例えばＰＥＧ化、ＨＥＳ化、ＰＡＳ化、またはグリコシル化によるタンパク質またはペプチドの誘導体化が挙げられる。
【０１４５】
この態様の特定の実施形態において、本発明のペプチドまたはタンパク質は、以下からなる列挙から選択される（基礎）ペプチドのアミノ酸配列を含む：４Ｇ９、６Ｆ６、６Ｇ８、１０Ｂ１１、２５Ｃ３、４４Ｂ２、および４８Ｅ６。本発明はまた、そのようなアミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパク質の、断片、変異体、および／または誘導体にも関する。特にそのような実施形態において、そのような部分は、ＭＡＰ４Ｋ４と結合する。
【０１４６】
ある実施形態において、本発明によるペプチドまたはタンパク質、あるいはその断片、変異体、および／または誘導体は、単離されたまたは精製された形をしている。ある試料が、望ましくない成分または不明成分（不純物など）を試料の約５０％、４０％、２０％、１０％、５％、２．５％、または１％（例えば、質量％）未満の量でしか含有しない場合、その試料は精製されていると見なされる。
【０１４７】
他の態様において、本発明は、本発明のペプチドまたはタンパク質、またはその断片、変異体、および／もしくは誘導体を、以下の目的で使用することに関する：（ｉ）哺乳類細胞の表現型（致死表現型以外および／または増殖低下表現型以外の表現型など）を調節する；および／または（ｉｉ）哺乳類細胞の表現型（致死表現型以外および／または増殖低下表現型以外の表現型など）を調節する標的タンパク質と結合させる。そのような使用は、例えば、ｉｎ−ｖｉｔｒｏまたはｅｘ−ｖｉｔｒｏの方法（本明細書で記載されるような方法など）に採用できる。あるいは、そのような使用は、ｉｎ−ｖｉｖｏで（例えば、薬理学に用いて標的タンパク質の活性を調節して体内の細胞の表現型を変更させ、そうすることで、例えば、薬理学的に関連する効果を得ようと努力するなど）採用できる。したがって、関連する態様において、本発明は、治療に用いるための、本発明のペプチドまたはタンパク質、またはその断片、変異体、および／もしくは誘導体、ならびに／または本発明のペプチドまたはタンパク質、またはその断片、変異体、および／もしくは誘導体を含む薬学的組成物に関する。
【０１４８】
さらに別の態様において、本発明は、本発明のペプチドまたはタンパク質（またはその断片、変異体、および／もしくは誘導体）をコードすることができる配列を含む核酸にも関する。好ましくは、本発明の核酸は、表２のヌクレオチド配列から選択されるものを含む。ある実施形態において、本発明の核酸は、単離されたまたは精製された形をしており、および／または組換え核酸である。本発明の核酸は、ペプチドまたはタンパク質（本発明のものなど）を産生させる（製造するなど）のに用いることができる。
【０１４９】
当然のことながら、本明細書に含まれる教示に照らして、当業者の力量内で、本発明の教示を具体的な課題または状況に応用すること、および本発明の改変または本発明に対して特徴（さらなる態様および実施形態など）を追加することができるだろう。
【０１５０】
文脈で特に記載されない限り、上記に記載される特徴の説明および定義は、本発明の特定の態様または実施形態のどれかに限定されるものではなく、記載される態様および実施形態全てに等しく当てはまる。
【０１５１】
本明細書に記載される全ての参照、特許、および文献は、その全体が参照として本明細書により援用される。
【０１５２】
ここから、本明細書に記載される説明、図、および表を参照しながら、本発明のある態様および実施形態を、例として、説明する。本発明の方法、使用、および他の態様についてのこれらの例は、代表例にすぎず、本発明の範囲がそのような代表例のみに制限されると理解されはしない。
【実施例】
【０１５３】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーの構築
Ｐｈｙｌｏｍｅｒ断片の作成
配列決定された細菌ゲノム由来のゲノムＤＮＡ（表１）を、例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関から入手し、ランダム低温線形増幅法用テンプレートとして用いた。増幅は、増幅の偏りを最小限にする目的で、ＡＴとＧＣのどちらが豊富な配列でも等しい効率でアニーリングするように設計された増幅プロトコルで、ＦＬＡＧタグを含有するランダム縮重プライマー（ＢＧＦ−Ｎ６およびＢＧＦ−Ｎ９）を用いたプライマー伸長法により、クレノー断片を用いて行なわれた。増幅は、以下のとおりの４つのラウンドにわたって行なわれた：
・増幅ラウンド１：３．３３ｕＭのＢＧＦ−Ｎ６プライマー、１×のクレノー緩衝液、２００ｕＭのｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、ＰＥＧ（８５００）を、合計体積で３０ｕｌ。プライマー、ＤＮＡ、および水を混合する；３〜５分間沸騰させ、氷上で急冷し、次いでその他の試薬の入った管に移す。１５℃で３０分間、室温で２時間、次いで３７℃で１５分間インキュベートする。
・増幅ラウンド２：管を５分間沸騰させ、急冷し、０．５ｕｌのクレノー酵素を加える。１５℃で３０分間、室温で２時間、次いで３７℃で１５分間インキュベートする。
・増幅ラウンド３：管を５分間沸騰させ、急冷し、以下を加える：４μΙのＢＧＦ−Ｎ９プライマー（２５ｕＭ）、１μΙの１０×緩衝液、３ｕｌのｄＮＴＰ（２ｍＭ）、０．５ｕｌのクレノー、１．５ｕｌの水。１５℃で３０分間、室温で２時間、次いで３７℃で１５分間インキュベートする。
・増幅ラウンド４：管を５分間沸騰させ、急冷し、０．５μｌのクレノー酵素を加える。１５℃で３０分間、室温で２時間、次いで３７℃で１５分間インキュベートする。生成物は、Ａｍｐｌｉｃｏｎスピンカラムを用いて精製した。
【０１５４】
用いたプライマー配列は、以下のとおり（向きは５’から３’へ、制限部位は小文字で示す）：
・ＢＧＦ−Ｎ６：ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＣＴＴＡＴＣＡＡＴＣＡＡＴＣＡＮＮＮＮＮＮ（配列番号１）
・ＢＧＦ−Ｎ９：ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＣＴＴＡＴＣＡＡＴＣＡＡＴＣＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（配列番号２）
・ＢＧＦ−Ｆ５：ＧＡＧＡＧｇａａｔｔｃＡＧＧＴＣＡＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧ（配列番号３）
・ＢＧＦ−Ｒ６−Ａｃｃ６５１：ＧＡＧＡＧｇｇｔａｃｃＡＧＧＴＣＡＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧ（配列番号４）
【０１５５】
上記増幅による生成物を、通常のＰＣＲ用テンプレートとして、ゲノム断片を増幅させるのにも、および増幅された断片全ての５’末端に、プライマーＢＧＦ−Ｆ５およびＢＧＦ−Ｒ６を用いて制限酵素消化配列を添加するのにも用いた。２５回のＰＣＲサイクル後、増幅による生成物を、ゲル電気泳動で診断して、サイズが５０〜１０００ｂｐの範囲である断片のスメアの存在を確認した。生成物は、Ａｍｐｌｉｃｏｎスピンカラムを用いて精製した。
【０１５６】
表１：実施例で使用したＰｈｙｌｏｍｅｒライブラリーを構築するのに用いたゲノム
【表１】
0006336400.tif 000002
【０１５７】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーの構築
標的に基づくスクリーニング（本実施例では、酵母菌二重ハイブリッドに基づくスクリーニングを用いる）用のｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーを作成するため、リスト１（表２）の生物種から上記のとおりにして得た生物学的に多様な遺伝子断片を、Ｇａｔｅｗａｙ組換えクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯ−ＴＡエントリーベクター中にクローン化して、１．７×１０7ｃｆｕのライブラリーを作った。このライブラリー全体の挿入断片を、Ｇａｔｅｗａｙ組換えクローニング技術を用いて、「デスティネーション」ベクターであるｐＪＧ４−５由来の酵母菌二重ハイブリッドプレイベクターに移した。この技術は、膜利用Ｒａｓ動員二重ハイブリッドシステム（Ｈｅｎｎｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｗａｌｈｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）に匹敵するものであった。
【０１５８】
表現型スクリーニング用の哺乳類発現Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーを作成するため、ＧａｔｅｗａｙシステムのｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯ−ＴＡエントリーベクター中の一次Ｐｈｙｌｏｍｅｒエントリーライブラリーを、Ｇａｔｅｗａｙ組換えクローニング技術を用いて、哺乳類発現デスティネーションベクターｐｃＤＮＡ３．１／ｎＶ５−ＤＥＳＴに移した。
【０１５９】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーを用いた表現型スクリーニングの効率を精査するため、今回は、上記の哺乳類発現Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーから無作為にクローンを選択し、そのように選択した個別クローンの２ｍｌ培養物を増殖させ、ＰｕｒｅＬｉｎｋ９６プラスミド精製システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてミニプレップＤＮＡを回収することにより、３１２０の個別クローンからなるサブライブラリーを作った。Ｇａｔｅｗａｙ組換え法を用いてＧｕｓＢコード配列を、ｐＥＮＴＲ−ＧｕｓＢベクターからｐｃＤＮＡ３．１／ｎＶ５−ＤＥＳＴに組換えることにより、コントロールベクターも作成した。各プレートの異なる６つのウェルから集めたプラスミドＤＮＡを、分光光度測定により定量して、平均ＤＮＡ濃度を求めた。
【０１６０】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーの表現型スクリーニング
驚いたことに、Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーで哺乳類細胞の表現型スクリーニングを行なうと非常に高いヒット率になることが見いだされた。約３，０００のクローンに限定したライブラリーから、１４の最初のヒットが選択された：ランダムペプチドライブラリーで既に報告されたもの（非特許文献４；Ｘｕ  ａｎｄ  Ｌｕｏ  ２００２；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）よりはるかに高いヒット率である。確認実験から、そのように同定されたＰｈｙｌｏｍｅｒは、試験した表現型に対する特異性を示すことがわかった；哺乳類細胞の表現型に影響を及ぼす多様なＰｈｙｌｏｍｅｒペプチドを同定するこのアプローチの正当性を立証するものである。
【０１６１】
３１２０の個別の遺伝子導入準備済みプラスミドからなる小ライブラリーを、マイクロタイタープレートを利用した遺伝子導入アッセイシステム（すなわち、およびアレイを利用した形式）でＵ２ｏＳ細胞株に用いて、この小ライブラリーから発現されたＰｈｙｏｍｅｒの効果を、ＰＭＡ介在ＡＰ１駆動型ルシフェラーゼレポーター発現で査定した。同定済みのＰｈｙｌｏｍｅｒであるＰＹＣ３６（ＧＬＱＧＲＲＲＱＧＹＱＳＩＫＰ、配列番号５）陽性対照として用いた。このＰｈｙｌｏｍｅｒは、ｃ−Ｊｕｎベイトに対する逆標的利用酵母菌二重ハイブリッドスクリーニングにより発見され、ＡＰＩ依存性転写に影響を及ぼすことが知られている（Ｍｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，１１２：２５８−２７０）（非特許文献４５）。
【０１６２】
簡単にいうと、３枚組のプレートに、１×１０5個のＵ２ｏＳ細胞を蒔き、一晩後、ＡＰ１ルシフェラーゼレポーター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と、小ライブラリーからの個別のＰｈｙｌｏｍｅｒ構築物または陽性対照（ｐｃＤＮＡ３．１／ＰＹＣ３６）もしくはベクター対照（ｐｃＤＮＡ３．１／ｎＶ５−ＤＥＳＴ−ＧｕｓＢ）のいずれかとを両方で１００ｎｇ用いて同時遺伝子導入した。遺伝子導入の６時間後、ＰＭＡ（１００ｎΜ）を用いてＡＰ１依存性ルシフェラーゼ発現を誘導し、２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した（ＳｔｅａｄｌｙＧｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【０１６３】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒクローンの大部分は、ＡＰ１依存性ルシフェラーゼの活性に最小限の効果しか示さなかったものの、驚いたことに、比較的多数のクローンが、ＰＹＣ３６のように、転写を阻害すること、および多数のクローンが明らかにレポーター活性を向上させることが、観測された（図１）。
【０１６４】
この一次スクリーニングから、本発明者らは、ＰＹＣ３６に似た、ＡＰ１阻害性プライマーに注目して、１４の最初のヒットを選択した。そのうち、７つ（表２および図８）は、ウミシイタケルシフェラーゼ発現で正規化した二次レポーターアッセイにおいてＡＰ１ルシフェラーゼ活性を阻害することが確認された（図２）。簡単に言うと、最初のヒットＰｈｙｌｏｍｅｒのＤＮＡを、小ライブラリー用に選択した原始のクローンから再度調製し（Ｅｎｄｏ−Ｆｒｅｅ  Ｍａｘｉ−Ｐｒｅｐ、Ｑｉａｇｅｎ）、ＡＰ１ルシフェラーゼまたはＳｒｘｎ１ルシフェラーゼ（Ｐａｐａｄｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）（ホタル）、ｐＲＬ−ＴＫ（ウミシイタケ）、およびＰｈｙｌｏｍｅｒプラスミドを含むＤＮＡを８００ｎｇ用いて、５×１０5個のＵ２ｏＳ細胞に同時遺伝子導入した。ウミシイタケに対してホタル活性を正規化することにより、レポーター活性／阻害を計算した。
【０１６５】
表２：表現型スクリーニングにより同定されたＡＰ１阻害性Ｐｈｙｌｏｍｅｒのアミノ酸配列、およびそれをコードする対応核酸配列
【表２】
0006336400.tif 000003
【０１６６】
これらのＰｈｙｌｏｍｅｒｓを用いた遺伝子導入は、Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｒｅ  Ｂｌｕｅシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて生存能力で査定したところ、おおむね無毒であった（データは示さず）。ＡＰ１阻害に対するこれらの特異性を最初に査定するため、本発明者らは、２種の別個の転写因子、すなわちＮｏｔｃｈおよびＦＯＸＯクラスのフォークヘッド転写因子の活性化を検出するように設計された２種の異種レポーター構築物に、それらがヒットするかどうかを試験した。試験した７つのＰｈｙｌｏｍｅｒのうち、６つはこれらのレポーターに対して何も効果を示さなかったが、１つのＰｈｙｌｏｍｅｒ（４Ｇ９）は、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの両方を含む、全てのレポーター構築物を、おおむね阻害した（データは示さず）。
【０１６７】
追加の確認実験として、本発明者らは、これら６つのＰｈｙｌｏｍｅｒが既知のＡＰ１標的遺伝子の発現を特異的に制御するかどうかを、スルフィレドキシン（Ｓｒｘｎ１）プロモーターに対するそれらの効果を試験することで調べた。このプロモーターは、抗酸化反応機構のＡＰ１依存性成分であることが最近確立された（Ｐａｐａｄｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。試験した６つのＰｈｙｌｏｍｅｒのうち、３つは、このプロモーターのＰＭＡ依存性活性化を阻害した：６Ｇ８、２５Ｃ３、および４８Ｅ６である（図３ａ）。重要なことは、これらのＰｈｙｌｏｍｅｒが、ＡＰ１反応要素が変異により切断されてしまっているコントロールＳｒｘｎ１プロモーターからのＰＭＡ誘導型転写になにも影響を及ぼさなかった（図３ｂ）ことであり、これによりＳｒｘｎ１プロモーターに対するこれらの効果がＡＰ１特異的であることが確認された。
【０１６８】
まとめると、これらの実験は、Ｐｈｙｌｏｍｅｒをコードする核酸のライブラリーを用いて、培養哺乳類（ヒト）細胞で、直接、表現型のスクリニーングを行なうと、ＡＰ１依存性転写に特異性を示すＰｈｙｌｏｍｅｒを、高いヒット率で回収することができることを示唆する。
【０１６９】
同定されたＰｈｙｌｏｍｅｒｓの産生
Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）細胞中のｐＤＥＳＴ−ＨｉｓＭＢＰ発現ベクターから、ペプチド２５Ｃ３をＨｉｓ−ＭＢＰタグ付き融合構築物として発現させた（Ｎａｌｌａｍｓｅｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。簡単に言うと、細胞を、５００ｍｌの２ＹＴブロス（０．４％のグルコース、５０ｕｇ／ｍＬのカルベニシリン、３０ｕｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充）中、３７℃で、ＯＤ５９５が０．６になるまで増殖させ、０．６になったら、３７℃で１ｍＭのＩＰＴＧを用いて、２時間、タンパク質発現を誘導した。細胞をＰＢＳ（ｐＨ８．０）に入れて洗浄し、５０ｍｌの溶解緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ８．０）、１．０ｍＭのＰＭＳＦ、コンプリートプロテアーゼインヒビタータブレット）に入れて超音波処理（２ｘ１．０分間、デューティ比８０％）することにより溶解させ、溶解液を４３，１４６ｇで２０分間遠心分離することにより清澄させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）分析により、溶解性画分中にペプチド融合物が保持されていることを確認した。
【０１７０】
２５Ｃ３融合ペプチドを、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ  ＦＰＬＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、２段階プロトコルで精製した。簡単に言うと、タンパク質を、ＭＢＰ−Ｔｒａｐカラム（５ｍｌ）に通すアフィニティークロマトグラフィーで、ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で洗い、ＰＢＳ（ｐＨ８．０）／マルトース（１０ｍＭ）に勾配を付けて溶出させることにより精製し、次いで、ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で平衡化したＨｉＰｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００カラムを通すゲル濾過でさらに精製した。Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ（８．０％）分析により、単量体タンパク質種の存在を確認した。得られる融合ペプチドの量は、ＢＣＡアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて定量した。
【０１７１】
本研究で用いた合成ペプチドはどれも、Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）により合成されたもので、純度は、＞７０％（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究用）または＞９５％（ｉｎ  ｖｉｖｏ研究用）であった。
【０１７２】
哺乳類細胞の表現型を調節する標的の同定
本発明者らは、Ｐｈｙｌｏｍｅｒ  ２５Ｃ３（好極限性細菌ディノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｃｆｉｏｄｕｒａｎｓ）に由来する）を選択して、その細胞結合パートナーを同定するさらなる研究を行なった。驚いたことに、直接表現型スクリーニングで高いヒット率が観測されるだけでなく、一次ヒットが、哺乳類細胞の表現型を調節するタンパク質標的を同定するのに直接用いることができるほど高い安定性および親和性を有することが見いだされた。
【０１７３】
簡単に言うと、Ｕ２ｏＳ細胞をＶ５タグ付き２５Ｃ３発現ベクター（ｐＣＤＮＡ３．１  Ｖ５−Ｈｉｓ  Ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手）で遺伝子導入し、細胞溶解液を抗Ｖ５抗体で免疫沈降させた。
【０１７４】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験は全て、Ｅｋｓｉｇｅｎｔ  ＮａｎｏＬＣ−１Ｄ  Ｐｌｕｓ（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ）ＨＰＬＣシステムおよびＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて行なった。免疫沈降したタンパク質は、標準的な手順を用いて、プロテアーゼ（例、トリプシン）で消化した。ペプチドの分離は、逆相クロマトグラフィーで、ＬＣ−Ｐａｃｋｉｎｇｓ（Ｄｉｏｎｅｘ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）ＰｅｐＭａｐ１００カラムを用い、流速３００ｎＬ／分で行なった。オートサンプラーから、ペプチドを０．１％のギ酸とともに、流速１０ｕＬ／分で５分間注入した。５分間注入後、弁を切り替えて、ペプチドをプレカラムから分析カラムに溶出させた。溶媒Ａは、水＋０．１％ギ酸であり、溶媒Ｂは、アセトニトリル＋０．１％ギ酸であった。用いた勾配は、５０分で５−５０％のＢであった。Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅナノスプレー発生装置を用いて、ＬＣからの溶出液を質量分析計中に噴射した。溶出イオンのｍ／ｚ値は全て、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（分解能７５００に設定）ＬＴＱ線形イオントラップハイブリッド装置において、衝突誘起解離法（ＣＩＤ）により測定して、ＭＳ／ＭＳスペクトルを得た。測定後、Ｂｉｏｗｏｒｋｓ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（バージョン３．３．１  ＳＰ１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてデータを処理した。簡単に言うと、Ｓｅｑｕｅｓｔ  Ｂａｔｃｈ  Ｓｅａｒｃｈ  ツール（Ｂｉｏｗｏｒｋｓに含まれる）を用いて、ｍｓ／ｍｓデータを全て．ｄｔａ（テキスト）ファイルに変換した。ＳＳＨ  Ｓｅｃｕｒｅ  Ｓｈｅｌｌクライアントプログラム（バージョン３．２．９  Ｂｕｉｌｄ  ２８３、ＳＳＨ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．）のＳＳＨスクリプトを用いて、データファイルを１つのｍｇｆファイルに変換した。次いで、１つにまとめられたファイルを、Ｍａｓｃｏｔ検索アルゴリズム（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｏｎｄｏｎ  ＵＫ）処理に供して、カルバミドメチル化学修飾および偶発的酸化修飾（Ｍ）を用いてＮＣＢＩヒトテータベースに対して検索を行なった。
【０１７５】
上記の質量分析プロテオミクスにより、Ｐｈｙｌｏｍｅｒ２５Ｃ３と免疫沈降するパートナー群のうち２つがＭＡＰ４Ｋ４およびシトロンキナーゼであると同定した。なお、興味深いことに、これらのタンパク質は両方とも、推定上のタンパク質：タンパク質相互作用モジュールであるシトロン相同性ドメイン（ＣＮＨ）を含有する。重要なことは、ＭＡＰ４Ｋ４（Ｎｃｋ−相互作用キナーゼ（ＮＩＫ）としても知られる）が、ＪＮＫ活性の確立された上流レギュレーター（Ｔａｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）であるということであり、これは、本発明者らのスクリーニングにおいて２５Ｃ３がＡＰ１阻害剤として同定されたことと一致する。実際、Ｕ２ｏＳ細胞でのＭＡＰ４Ｋ４のｓｉＲＮＡ性ノックダウンは、２５Ｃ３過剰発現がそうであるように、ＡＰ１依存性ルシフェラーゼ発現を阻害した（データは示さず）。
【０１７６】
次に、本発明者らは、Ｖ５タグ付き２５Ｃ３を用いて、ＨＥＫ２９３細胞でＦＬＡＧタグ付きのＭＡＰ４Ｋ４のＣＮＨドメインを免疫沈降させることにより、２５Ｃ３とＭＡＰ４Ｋ４の相互作用をｅｘ  ｖｉｖｏで確認した（図４）。簡単に言うと、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対し、Ｖ５タグ付き２５Ｃ３単独で、またはＮ末端にＦｌａｇタグが融合したヒトＭＡＰ４Ｋ４のＣＮＨドメイン（アミノ酸１００２から１３００まで）を発現するｐｃＤＮＡ３．１構築物とともに遺伝子導入を行なった。細胞溶解液をＮＰ−４０緩衝液で調製し、マウス抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で免疫沈降させ、次いでマウス抗Ｆｌａｇ抗体（Ｍ２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で免疫ブロッティングした。対照として、細胞に対しＦｌａｇ−ＣＮＨ単独で遺伝子導入を行い、それから抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降および免疫ブロッティングを行なった。
【０１７７】
標的とＰｈｙｌｏｍｅｒの結合の親和性の特性決定
バイオレイヤー干渉法を用いて、２５Ｃ３とＭＡＰ４Ｋ４のＣＮＨドメインとの結合親和性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することにより、標的とＰｈｙｌｏｍｅｒの相互作用の結合親和性を特性決定した（図５および表３）。
【０１７８】
表３：対照との比較によるＡＰＩ阻害性Ｐｈｙｌｏｍｅｒ  ２５Ｃ３のＭＡＰ４Ｋ４−ＣＮＨに対する結合親和性の特性決定
【表３】
0006336400.tif 000004
【０１７９】
リガンドを増量しながら結合動態を分析すると、驚いたことに、２５Ｃ３Ｐｈｙｌｏｍｅｒは、２８ｎＭというＫｄでＭＡＰ４Ｋ４に結合し、結合親和性は陽性対照としての天然のリガンドＲＡＰ２Ａ（Ｍａｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）より５倍低いにすぎないという知見が示される。ＲＡＰ２Ａを同じ実験系で測定するとＫｄは４．８ｎＭである（図６および表４）。
【０１８０】
表４：ＭＡＰ４Ｋ４−ＣＮＨに対する結合親和性についてのＡＰＩ阻害性Ｐｈｙｌｏｍｅｒ２５Ｃ３とＲＡＰ２Ａの比較
【表４】
0006336400.tif 000005
【０１８１】
Ｏｃｔｅｔ−ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて、ＲＡＰ２Ａ、２５Ｃ３、およびＰＹＣ３５（配列ＡＹＱＳＩＲＳＧＧＩＥＳＳＳＫＲＥＲ（配列番号２０）を有する陰性対照ペプチド；Ｍｅａｄ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１０）を、それぞれＭＢＰ融合物として、ＭＡＰ４Ｋ４−ＣＮＨに対する相対結合特性を測定した。データは、データ取得ソフトウェア・バージョン６．２で取得し、全ての工程／希釈は、ベースライン緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ８．０）中で、回転速度１０００ｒｐｍで行なった。簡単に言うと、ストレプトアビジンでコーティングしたバイオセンサーを予め平衡化してから、そこにビオチン化ＭＡＰ４Ｋ４−ＣＮＨ（４５ｕｇ／ｍＬ）を固定した。ベースライン平衡化に続いて、ＭＡＰ４Ｋ４−ＣＮＨでコーティングしたセンサーをＲＡＰ２Ａ、ＰＹＣ３５、および２５Ｃ３（１．０ｍＭで）と接触させ、続いて各工程において２０００秒間ベースライン緩衝液に入れて解離させた。固定されたビオチン化ＭＡＰ４Ｋ４−ＣＮＨを、記載のとおり１００〜１０００ｎＭの濃度範囲にわたってＲＡＰ２Ａおよび２５Ｃ３と接触させることにより、ＲＡＰ２Ａおよび２５Ｃ３のＭＡＰ４Ｋ４−ＣＮＨに対する結合親和性を測定した。
【０１８２】
結合速度データを、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルターを用いて処理してから、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ分析ソフトウェア・バージョン６．３で分析および評価した。ＭＡＰ４Ｋ４−ＣＮＨに対するＲＡＰ２Ａ、２５Ｃ３、およびＰＹＣ３５の相対結合速度を決定するため、１：１モデルに局所的に基づいて最適化曲線を作成した。ＭＡＰ４Ｋ４−ＣＮＨに対するＲＡＰ２Ａおよび２５Ｃ３の結合親和性を決定するため、１：１モデルに包括的に基づいて最適化曲線を作成して、ｋon、ｋoff、およびＫDの値を導きだした。
【０１８３】
標的とＰｈｙｌｏｍｅｒの結合の調節剤を同定するアッセイ（予見的実施例）
上記のバイオレイヤー干渉アッセイを用いて、Ｐｈｙｌｏｍｅｒとその標的タンパク質との結合度合いに影響を及ぼす化合物を同定する。簡単に言うと、２５Ｃ３／ＭＡＰ４Ｋ４−ＣＮＨ結合アッセイを上記のとおりに確立させるが、ただしモル過剰（例えば、１０ｍＭ）の試験化合物をさらに存在させて、ＫDの値に対する試験化合物の効果を測定する。ＭＡＰ４Ｋ４−ＣＮＨに対する２５Ｃ３の結合と競合、これをかく乱、および／またはこれを阻害することができる化合物を、標的タンパク質と結合する化合物とみなす。
【０１８４】
次いで、そのようなアッセイで同定された化合物を、例えば、化合物を細胞遊走アッセイ（下記のものなど）で細胞と接触させることにより、その化合物が持つ哺乳類細胞の所望の表現型を調節する能力について試験する。
【０１８５】
代替アプローチでは、蛍光偏光法（分子量が顕著に異なる２種の分子間の結合を分析するのに適した同種アッセイの１種）を用いて、Ｐｈｙｌｏｍｅｒと標的タンパク質の相互作用に干渉する可能性のある小分子を同定する（図１１）。
【０１８６】
小さい結合パートナー、この場合は標的タンパク質（例えば、ＭＡＰ４Ｋ４）に結合するＰｈｙｌｏｍｅｒペプチド（例えば、２５Ｃ３）を、フルオロフォア（例えば、ＴＡＭＲＡまたはＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ−４８８）で標識し、直線偏光で露光する。励起した小さい結合パートナーが、大きい結合パートナー（この場合は標的タンパク質）と結合すると、形成されるフルオロフォア標識化複合体は高分子量になって、回転が遅くなるので、蛍光発光の時点でフルオロフォアの空間配向が比較的均一になり、これは高度の蛍光偏光として検出される。
【０１８７】
対照的に、励起した小さい結合パートナーが結合していない（例えば、相互作用阻害剤の存在下で）場合、それらはより速く回転し、蛍光発光の時点で空間配向がより不均一になり、これは低度の蛍光偏光として検出される。
【０１８８】
結合実験は、適切なプレートリーダー、例えば、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  Ｐｌｕｓプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）またはＰａｒａｄｉｇｍプレートリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、および非結合表面を持つ黒色マルチウェルプレートを用いて測定される。フルオロフォアを励起するのに適した波長の直線偏光で励起すると、元の励起面に対して平行な蛍光強度および垂直な蛍光強度が、蛍光偏光値として記録される。
【０１８９】
蛍光偏光値は、１０００倍してｍＰで表すことができる。小分子ライブラリーを用いた競合アッセイ用に、阻害のパーセンテージを計算し、データを％阻害でプロットする。このデータから、相互作用阻害剤小分子の、最大半量の抑制となる濃度（ＩＣ５０）を決定する。
【０１９０】
これらのアッセイのいずれかから同定された小分子阻害剤を、次いで、表現型スクリーニング（例えば、ＡＰ−１依存性ルシフェラーゼアッセイ）で試験して、それらが元のヒットＰｈｙｌｏｍｅｒの表現型を再現できるかどうか査定する。あるいは、相補的表現型スクリーニング（以下に記載されるアッセイなど）を用いて、そうした小分子が持つ哺乳類細胞の所望の表現型を調節する能力を精査することができる。
【０１９１】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒとの結合による表現型調節
本発明者らは、２５Ｃ３の過剰発現が、ＭＡＰ４Ｋ４依存性細胞反応を歪める可能性があることを実証しようと努めた。最近のデータから、ＭＡＰ４Ｋ４は遊走促進性キナーゼであり、胚発生中の細胞運動を制御していること（Ｘｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）およびモデル細胞遊走アッセイで細胞運動を制御していること（Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）が示されている。そこで、本発明者らは、Ｕ２ｏＳ細胞で２５Ｃ３を過剰発現させ、微速度撮影法を用いて細胞が欠損を塞ぐのにかかる時間を精査した（図７）。２５Ｃ３は細胞の遊走および傷の塞がりを顕著に遅くし、引っ掻いた後２４時間経過してもその欠損は開いたままであった。これにより、２５Ｃ３がＭＡＰ４Ｋ４阻害の効果を表現型模写する可能性があることが実証された。
【０１９２】
簡単に言うと、Ｕ２ｏＳ細胞を、２試料チャンバースライド（Ｎｕｎｃ  Ｌａｂ−Ｔｅｋ  １７７４２９）に１チャンバーあたり、１０％のウシ胎児血清を補充した無抗生物質ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１ｍｌ中、約０．２×１０6個で蒔いた。蒔いてから２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用い、使用説明書に従って、１．６ｕｇのプラスミドＤＮＡを遺伝子導入した。遺伝子導入から２４時間後、Ｕ２ｏＳ細胞の集密単層に、滅菌１０ｕｌチップで引っ掻き傷を作り、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、培地を、１０％のウシ胎児血清を補充したライボビッツＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２１０８３−０２７）に交換した。スライドを、Ｚｅｉｓｓ微速度撮影顕微鏡の温度およびＣＯ２制御装置を内蔵した試料固定装置（ｒｉｇ）に装着した。引っ掻き傷を付けた領域の画像を５分ごとに２４時間撮影した。Ｖｅｌｏｃｉｔｙソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、画像を分析し、傷の幅を測定した。
【０１９３】
結合Ｐｈｙｌｏｍｅｒの集団の供給を増大させるための、標的に基づくスクリーニング（予見的実施例）
酵母菌サッカロマイセス・セレビシエ中の分裂促進因子信号伝達経路の活性化に基づく、ＳＯＳ動員システム（Ａｒｏｎｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）に類似した新規細胞質スクリーニングシステムが、用いられる。簡単に言うと、組換えベイトタンパク質は、ヒトＭＡＰ４Ｋ４−ＣＮＨを切断形ｈＳｏｓ１の翻訳領域に融合させる。このベイトを構成的に発現させる発現プラスミド（Ｇｉｅｔｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｅｓｔｌ，２００７）を、Ｐｈｙｌｏｍｅｒペプチドライブラリー（上記のとおりに調製）とともに、ｃｄｃ２５−２酵母菌株に同時形質転換させる。Ｐｈｙｌｏｍｅｒペプチドは、膜付着用脂質化シグナルとの融合物として誘導ＧＡＬ１プロモーターから発現される。ベイトタンパク質とプレイタンパク質の相互作用を、温度感受性変異体（ｃｄｃ２５−２）により内因性ＲＡＳ経路を制御することができる酵母菌株で試験する。推定状の相互作用物質を、制限温度（３７℃）に移し、ガラクトース依存性について試験することで、ＭＡＰ４Ｋ４と相互作用するＰｈｙｌｏｍｅｒを同定する。これらのクローンに含まれる、ペプチドをコードする挿入物を単離して、配列決定を行なうことにより、標的タンパク質ＭＡＰ４Ｋ４に結合するＰｈｙｌｏｍｅｒの集団を同定、ひいては増大および提供を行なう。
【０１９４】
標的とＰｈｙｌｏｍｅｒの相互作用の結合立体構造の実験的決定（予見的実施例）
標的タンパク質ＭＡＰ４Ｋ４と結合する集団に含まれるＰｈｙｌｏｍｅｒを、上記のとおりに同定された複数のＰｈｙｌｏｍｅｒを合成（上記のとおり）することにより用意する。そのようなＰｈｙｌｏｍｅｒから構造的または配列的に多様な組を選択する。標的タンパク質ＭＡＰ４Ｋ４を、精製した組換え産物として、および１つ以上の結合Ｐｈｙｌｏｍｅｒ用に用意し、そのようなＰｈｙｌｏｍｅｒそれぞれを、標準手順を用いて精製ＭＡＰ４Ｋ４と共結晶化させるか、あるいは予め確立させたＭＡＰ４Ｋ４結晶に浸透させる。次いで、Ｐｈｙｌｏｍｅｒ配位結晶でＸ線回折による結晶解析を行なうことにより、そのようなＰｈｙｌｏｍｅｒとＭＡＰ４Ｋ４の結合立体構造を、実験的に決定する。実験による回折データは、適切な設備（Ｓｗｉｓｓ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ、Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ、またはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙなど）で集め、そのような実験データを適切なプログラムパッケージ（ＸＤＳなど）で処理する。ＣＣＰ４プログラム群に含まれるＭｏｌｒｅｐ５またはＰｈａｓｅｒ６を用いて、分子置換法により構造を解析する。Ｃｏｏｔを用いて分子モデルを手動で再構築し、Ｒｅｆｍａｃを用いて構造の精度を上げる。次いで、Ｐｈｙｌｏｍｅｒ／標的複合体を、画像化環境（ＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒまたはＡｃｃｅｌｒｙｓのものなど）にて、使用者により査定する。
【０１９５】
相互作用部位の特性決定（予見的実施例）
結合Ｐｈｙｌｏｍｅｒと標的タンパク質の相互作用について１つ以上の結合立体構造を上記のとおりに集める。コンピューターを利用し分析の助けも借りて結合立体構造を綿密調査することにより、Ｐｈｙｌｏｍｅｒ上の特定残基または位置とＭＡＰ４Ｋ４の相互作用部位のアミノ酸残基とのコンセンサス結合相互作用を同定することができる。結合相互作用（エネルギー）のそのような「ホットスポット」の場所は、相互作用部位を特性決定する１つのアプローチを提供する。そのようなホットスポットは、当業者には明らかであるだろう。例えば、疎水性Ｐｈｙｌｏｍｅｒアミノ酸側鎖が標的タンパク質表面にある疎水性ポケットに収まること、または電荷を帯びたＰｈｙｌｏｍｅｒアミノ酸側鎖が標的タンパク質内の反対極性の電荷付近に行くことである。
【０１９６】
相互作用部位の三次元構造、および／または限られた相互作用結合エネルギーの場所を綿密調査または決定することにより、さらなる特性決定が行なわれる。
【０１９７】
標的タンパク質と結合するリガンドの同定（予見的実施例）
本明細書中に記載される方法により提供されるとおりの相互作用部位の特性決定を考慮すると、１つ以上のＰｈｙｌｏｍｅｒに結合する複数の似た領域を有する、または特性決定された相互作用部位のコンピューターモデル内にドッキング可能であるリガンドの構造を、コンピューター上の方法で、同定することができる。適切なコンピューターモデリング、画像化、仮想スクリーニング、および／またはドッキングプログラムとして、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ環境（Ｓｃｈｒｉｄｉｎｇｅｒ  Ｉｎｃ，ＵＳＡ）、特に「Ｇｌｉｄｅ」に含まれるプログラム、およびＡｃｃｅｌｒｙｓ環境に含まれる類似プログラムが挙げられる。これらのコンピューター環境に利用される確立された力場を用いて、提案される小分子リガンドについて、結合エネルギーに寄与する相対エンタルピーおよびエントロピーを予測し、合計することで、結合の自由エネルギーを計算する。強力なコンピューター資源を併用し、市販されている小分子の構造の仮想ライブラリーを組立てて、標的タンパク質に対してスクリーニングすることができ、そのデータは順位付けされた結合自由エネルギー予測値の形となって表れる。このようにして、数百万の化合物からなる仮想ライブラリーを、もっと小数の分子ライブラリーに格付け分類することができ、そのような分子を、実験アッセイにより、標的タンパク質との結合についてより都合よく確認することができる。
【０１９８】
理想的な構造で表されるリガンド（小分子など）を通常の化学的手法により合成し、単数または複数の適切なアッセイに提供する。例えば、そのように同定および用意されたリガンドの効果を、そのリガンドが持つ、上記の方法の１つにより同定または特性決定されるとおりの相互作用を示すＰｈｙｌｏｍｅｒと標的タンパク質の間の結合度合いを調節する能力について試験することができる。リガンドは、例えば、上記の細胞遊走アッセイで、そのリガンドが持つ哺乳類細胞の所望の表現型を調節する能力について試験することができる。
【図１】
0006336400.tif 000006
【図２】
0006336400.tif 000007
【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
0006336400.tif 000017
【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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