(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表されるアントラセノファンまたはその塩を含むことを特徴とする、がん細胞と正常細胞とを区別可能な蛍光イメージング剤。
【化１】
0006370635.tif 000010
［式中、
ＸおよびＹは、独立してＣ1-6アルキレン基を示し、
Ｒ1〜Ｒ4は、独立して、水素原子、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6ハロゲン化アルキル基、（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基またはカルボキシ基を示し、
Ｒ5およびＲ6は、独立して水素原子またはＣ1-6アルキル基を示し、
Ｒ7およびＲ8は、独立して、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基、アミノ基、水酸基、ハロゲン原子、カルボキシ基、ニトロ基およびシアノ基からなる群より選択される置換基を示し、
ｍおよびｎは、独立して０以上、８以下の整数を示す（但し、ｍまたはｎが２以上の整数である場合、２以上のＲ7またはＲ8は互いに同一であっても異なっていてもよいものとする）］
【請求項２】
Ｒ1およびＲ2が水素原子であり、且つ、Ｒ3およびＲ4が、独立して、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6ハロゲン化アルキル基、（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基またはカルボキシ基を示す請求項１に記載の、がん細胞と正常細胞とを区別可能な蛍光イメージング剤。
【請求項３】
ＸおよびＹがｎ−ブチレン基である請求項１または２に記載の、がん細胞と正常細胞とを区別可能な蛍光イメージング剤。
【請求項４】
Ｒ5およびＲ6が水素原子を示す請求項１〜３のいずれかに記載の、がん細胞と正常細胞とを区別可能な蛍光イメージング剤。
【請求項５】
生体試料のがん細胞と正常細胞とを区別するための蛍光イメージング方法であって、
下記式（Ｉ）で表されるアントラセノファンまたはその塩を上記生体試料と接触させる工程、
【化２】
0006370635.tif 000011
［式中、
ＸおよびＹは、独立してＣ1-6アルキレン基を示し、
Ｒ1〜Ｒ4は、独立して、水素原子、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6ハロゲン化アルキル基、（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基またはカルボキシ基を示し、
Ｒ5およびＲ6は、独立して水素原子またはＣ1-6アルキル基を示し、
Ｒ7およびＲ8は、独立して、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基、アミノ基、水酸基、ハロゲン原子、カルボキシ基、ニトロ基およびシアノ基からなる群より選択される置換基を示し、
ｍおよびｎは、独立して０以上、８以下の整数を示す（但し、ｍまたはｎが２以上の整数である場合、２以上のＲ7またはＲ8は互いに同一であっても異なっていてもよいものとする）］
上記生体試料に励起光を照射する工程、
上記生体試料の蛍光像を取得する工程、および、
上記蛍光像から、核が蛍光発色している細胞をがん細胞として特定する工程を含むことを特徴とする蛍光イメージング方法。
【請求項６】
Ｒ1およびＲ2が水素原子であり、且つ、Ｒ3およびＲ4が、独立して、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6ハロゲン化アルキル基、（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基またはカルボキシ基を示す請求項５に記載の、がん細胞と正常細胞とを区別するための蛍光イメージング方法。
【請求項７】
さらに、上記生体試料に上記アントラセノファン（Ｉ）またはその塩と接触させた後、上記励起光を照射する前に、上記生体試料を洗浄する工程を含む請求項５または６に記載の、がん細胞と正常細胞とを区別するための蛍光イメージング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん細胞と正常細胞とを明確に区別してイメージングすることによりがん細胞を特定することができる蛍光イメージング剤と蛍光イメージング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍、即ちがんは、増殖力が強く、周囲の組織に浸潤しつつ全身に転移し、生体に致命的な害を与える腫瘍をいう。腫瘍の中でも良性腫瘍は、増殖はするもののその速度は遅く、また、転移はしない。それに対して悪性腫瘍は、急速に増殖する上に、リンパ節や他の臓器に転移する性質が特に問題となる。よって、悪性腫瘍は例えば外科的手術により除去しても、僅かにでも残留したがん細胞や、既にリンパ節や他の臓器に転移していたがん細胞が再び増殖を開始することがあるので、いったん治療が終了した後の予後が悪く、各がんにおいては５年後生存率が調査されており、一般的に、治療によりがんが消失したとされてから５年経過後までに再発がない場合がようやく治癒と見なされる。
【０００３】
従って、がんを早期段階でも診断可能にしたり、例えば外科的手術時にがん組織を正常組織に対して正確かつ明確に区別できるような技術が求められている。
【０００４】
がん細胞では、正常細胞に比べて特定の膜タンパク質が過剰発現していたり、膜タンパク質の糖鎖に変化が生じるなどといったことが見出されている。そこで、がん細胞特有の膜タンパク質を抗原とするモノクローナル抗体をがん組織の選択的イメージングやがん組織への選択的ドラッグデリバリーシステムに適用する研究が行われている。また、がん細胞では膜透過性に変化が生じていることから、がん細胞の細胞膜を選択的に透過する物質を用い、イメージングのための色素や抗がん剤の選択的ドラッグデリバリーに用いる研究も為されている。例えば特許文献１には、前立腺癌細胞の表面に存在する前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）へ特異的に結合するヒト化抗体断片をバイオイメージングや治療などに用いる発明が記載されている。また、特許文献２には、癌細胞選択的膜透過性ペプチドが開示されており、その抗腫瘍剤やバイオイメージングへの適用も記載されている。
【０００５】
しかし、いかに抗体の選択性が高いといっても、がん細胞へ結合するよりもバックグラウンドに拡散する量の方が圧倒的に多く、投与量に比してがん細胞への作用が十分でなかったり、バックグラウンドのシグナルが強い場合には小さながん組織の検出はほとんど不可能であるといった問題がある。また、がん細胞の細胞膜を選択的に透過する物質には、色素や抗がん剤を結合させた場合にも細胞膜を透過できるか不明であるという問題がある。
【０００６】
非特許文献１には、アントラセン骨格を有するシクロファンであるアントラセノファンが、マウス単球性白血病由来細胞株であるＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞の酸性オルガネラを選択的に標識できたとの研究結果が示されている。しかし、当該アントラセノファンで選択的に標識されたオルガネラはリソソームのみであり、リソソーム内部のｐＨは正常細胞でもその加水分解酵素の至適ｐＨに合わせて５以下となっているため、このアントラセノファンはおそらく正常細胞でもリソソームを選択的に標識してしまい、正常細胞とがん細胞を区別することはできないと考えられる。
【０００７】
ところで本発明者とその協力研究者は、アントラセノファンの興味深い挙動に注目し、研究を続けてきた。例えば非特許文献２，３では、９，１０−アントラセンジカルボアルデヒドとＬ−リジンメチルエステルを１：１で還元的アミノ化反応に付すことによる、それぞれ２分子ずつからなるアントラセノファンの合成方法を示している。
【０００８】
非特許文献４〜６では、上記アントラセノファン類がグアニンを含む核酸へ選択的に結合し、また、その蛍光強度が結合量やｐＨに応じて変化することを示している。
【０００９】
非特許文献７では、上記アントラセノファンをメタクリル基で置換して重合させた化合物が特定の標的化合物を認識し、その結合量に応じて蛍光強度を変化させることを示している。
【００１０】
非特許文献８，９では、メチル基で置換されたアントラセノファンを用い、アントラセノファンの蛍光特性が塩基性条件下で消失する原因が孤立電子対の移動によるものであることを明らかにしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１３−１１６８９７号公報
【特許文献２】国際公開第２０１１／１２６０１０号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｐｒａｓｈａｎｔ  Ｄ．Ｗａｄｈａｖａｎｅら，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１２，ｐｐ．８２３−８３１（２０１４）
【非特許文献２】Ｒｙｕｔａ  Ｋｕｔｓｕｍｉｚｕら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４８，ｐｐ．３２２５−３２２８（２００７）
【非特許文献３】吉田雄一ら，日本化学会バイオテクノロジー部会シンポジウム講演要旨集，１１，ｐ．９３（２００８）
【非特許文献４】Ｓ．Ｙａｍｏｒｉら，２０１０  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂａｓｉｎ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  ａｔ  Ｈｏｎｏｌｕｌｕ（２０１０）
【非特許文献５】吉田雄一ら，第４回バイオ関連化学シンポジウム，２Ｐ−Ｂ−４３（２０１０）
【非特許文献６】矢守茂明，神戸大学大学院研究科  修士論文要旨集，ｐ．７２（２０１１）
【非特許文献７】Ｙｕｉｃｈｉ  Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｔｈｅ  ７ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ  （ＭＩＰ２０１２）
【非特許文献８】Ｒｙｏｈｅｉ  Ｍｉｙａｋｅら，Ｐｉｔｔｏｃｏｎ  ２０１４，５２０−１５（２０１４）
【非特許文献９】三宅遼平ら，第２８回生体機能関連化学シンポジウム，２Ｐ−Ｂ−４３（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述したように、がん細胞に対して選択性を有する化合物を利用してがん細胞をイメージングしたりがん細胞へ抗がん剤を選択的に送達しようとする試みは為されているが、がん細胞と正常細胞とを区別することは実際には難しいところがあった。
【００１４】
そこで本発明は、がん細胞と正常細胞とを明確に区別してイメージングすることによりがん細胞を特定することができる蛍光イメージング剤と蛍光イメージング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、特定のアントラセノファンが細胞膜を透過して細胞内に取り込まれること、正常細胞では主に細胞質に分布すること、がん細胞ではさらに核膜を透過して核内に局在することを実験により見出した。よって、当該アントラセノファンは正常細胞とがん細胞とを区別できるイメージング剤の有効成分として用い得ることを見出して、本発明を完成した。
【００１６】
以下、本発明を示す。
【００１７】
［１］  下記式（Ｉ）で表されるアントラセノファンまたはその塩を含むことを特徴とする蛍光イメージング剤。
【００１８】
【化１】
0006370635.tif 000002
【００１９】
［式中、
ＸおよびＹは、独立してＣ1-6アルキレン基を示し、
Ｒ1〜Ｒ4は、独立して、水素原子、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6ハロゲン化アルキル基、（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基またはカルボキシ基を示し、
Ｒ5およびＲ6は、独立して水素原子またはＣ1-6アルキル基を示し、
Ｒ7およびＲ8は、独立して、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基、アミノ基、水酸基、ハロゲン原子、カルボキシ基、ニトロ基およびシアノ基からなる群より選択される置換基を示し、
ｍおよびｎは、独立して０以上、８以下の整数を示す（但し、ｍまたはｎが２以上の整数である場合、２以上のＲ7またはＲ8は互いに同一であっても異なっていてもよいものとする）］
【００２０】
［２］  Ｒ1およびＲ2が水素原子であり、且つ、Ｒ3およびＲ4が、独立して、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6ハロゲン化アルキル基、（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基またはカルボキシ基を示す上記［１］に記載の蛍光イメージング剤。
【００２１】
［３］  ＸおよびＹがｎ−ブチレン基である上記［１］または［２］に記載の蛍光イメージング剤。
【００２２】
［４］  Ｒ5およびＲ6が水素原子を示す上記［１］〜［３］のいずれかに記載の蛍光イメージング剤。
【００２３】
［５］  生体試料の蛍光イメージング方法であって、
下記式（Ｉ）で表されるアントラセノファンまたはその塩を上記生体試料と接触させる工程、
【００２４】
【化２】
0006370635.tif 000003
【００２５】
［式中、
ＸおよびＹは、独立してＣ1-6アルキレン基を示し、
Ｒ1〜Ｒ4は、独立して、水素原子、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6ハロゲン化アルキル基、（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基またはカルボキシ基を示し、
Ｒ5およびＲ6は、独立して水素原子またはＣ1-6アルキル基を示し、
Ｒ7およびＲ8は、独立して、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基、アミノ基、水酸基、ハロゲン原子、カルボキシ基、ニトロ基およびシアノ基からなる群より選択される置換基を示し、
ｍおよびｎは、独立して０以上、８以下の整数を示す（但し、ｍまたはｎが２以上の整数である場合、２以上のＲ7またはＲ8は互いに同一であっても異なっていてもよいものとする）］
上記生体試料に励起光を照射する工程、
上記生体試料の蛍光像を取得する工程を含むことを特徴とする蛍光イメージング方法。
【００２６】
［６］  Ｒ1およびＲ2が水素原子であり、且つ、Ｒ3およびＲ4が、独立して、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6ハロゲン化アルキル基、（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基またはカルボキシ基を示す上記［５］に記載の蛍光イメージング方法。
【００２７】
［７］  さらに、上記蛍光像から、核が蛍光発色している細胞をがん細胞として特定する工程を含む上記［５］または［６］に記載の蛍光イメージング方法。
【００２８】
［８］  さらに、上記生体試料に上記アントラセノファン（Ｉ）またはその塩と接触させた後、上記励起光を照射する前に、上記生体試料を洗浄する工程を含む上記［５］〜［７］のいずれかに記載の蛍光イメージング方法。
【００２９】
本発明において「Ｃ1-6アルキレン基」は、炭素数１以上、６以下の直鎖状または分枝鎖状の二価飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、メチレン、エチレン、メチルメチレン、ｎ−プロピレン、メチルエチレン、ｎ−ブチレン、メチルプロピレン、ジメチルエチレン、ｎ−ペンチレン、ｎ−ヘキシレン等である。好ましくはＣ1-4アルキレンであり、より好ましくはＣ3-4アルキレンであり、最も好ましくはｎ−ブチレンである。
【００３０】
「Ｃ1-6アルキル基」は、炭素数１以上、６以下の直鎖状または分枝鎖状の一価飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等である。好ましくはＣ1-4アルキル基であり、より好ましくはＣ1-2アルキル基であり、最も好ましくはメチルである。
【００３１】
「ハロゲン原子」としては、フルオロ原子、クロロ原子、ブロモ原子およびヨード原子を例示することができ、クロロ原子またはブロモ原子が好ましく、クロロ原子がより好ましい。
【００３２】
「Ｃ1-6ハロゲン化アルキル基」は、１以上のハロゲン原子に置換されたＣ1-6アルキル基をいう。例えば、クロロメチル、ブロモメチル、トリフルオロメチル、２−クロロエチル、２−ブロモエチル、２−フルオロエチル、ペンタフルオロエチル等である。好ましくはＣ1-4ハロゲン化アルキル基であり、より好ましくはＣ1-2ハロゲン化アルキル基である。
【００３３】
「Ｃ1-6アルコキシ基」とは、炭素数１以上、６以下の直鎖状または分枝鎖状の脂肪族炭化水素オキシ基をいう。例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ｎ−ヘキソキシ等であり、好ましくはＣ1-4アルコキシ基であり、より好ましくはＣ1-2アルコキシ基であり、最も好ましくはメトキシである。
【００３４】
「（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基」とは、Ｃ1-6アルコキシ基に置換されたカルボニル基をいう。例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｎ−プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ｎ−ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、ｎ−ペントキシカルボニル、ｎ−ヘキソキシカルボニル等であり、好ましくは（Ｃ1-4アルコキシ）カルボニル基であり、より好ましくは（Ｃ1-2アルコキシ）カルボニル基であり、最も好ましくはメトキシカルボニルである。
【００３５】
「アミノ基」には、無置換のアミノ基（−ＮＨ2）のほか、１個の上記Ｃ1-6アルキル基に置換されたモノ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基と２個の上記Ｃ1-6アルキル基に置換されたジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基が含まれるものとする。ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基においては、２個のＣ1-6アルキル基は互いに同一であっても異なっていてもよい。かかるアミノ基としては、無置換アミノ基；メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ−プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、イソブチルアミノ、ｔ−ブチルアミノ、ｎ−ペンチルアミノ、ｎ−ヘキシルアミノ等のモノ（Ｃ1-6アルキル）アミノ；ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジ（ｎ−プロピル）アミノ、ジイソプロピルアミノ、ジ（ｎ−ブチル）アミノ、ジイソブチルアミノ、ジ（ｎ−ペンチル）アミノ、ジ（ｎ−ヘキシル）アミノ、エチルメチルアミノ、メチル（ｎ−プロピル）アミノ、ｎ−ブチルメチルアミノ、エチル（ｎ−プロピル）アミノ、ｎ−ブチルエチルアミノ等のジ（Ｃ1-6アルキル）アミノを挙げることができる。好ましくは、無置換アミノ基である。
【００３６】
Ｒ7とＲ8はアントラセニル基の置換基であり、存在しない、即ちｍまたはｎが０であってもよい。Ｒ7とＲ8の数、即ちｍおよびｎとしては６以下が好ましく、４以下がより好ましく、２以下がさらに好ましく、０または１が特に好ましい。
【発明の効果】
【００３７】
本発明に係るイメージング剤によれば、その有効成分であるアントラセノファンが正常細胞では主に細胞質に分布する一方でがん細胞では核に局在することから、正常細胞とがん細胞とを明確に区別することができる。よって、本発明に係るイメージング剤は、生体組織におけるがん組織の存在または不存在や、その位置を特定できるものとして、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、本発明に係るアントラセノファンを含む培地中でインキュベートした正常細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞を明視野観察および蛍光観察した結果を示す写真である。
【図２】図２は、本発明に係るアントラセノファンを含む培地中でＮＩＨ３Ｔ３細胞をインキュベートし、培地交換した後に明視野観察および蛍光観察した結果を示す写真である。
【図３】図３は、本発明に係るアントラセノファンを含む培地中でがん細胞であるＨｅＬａ細胞をインキュベートし、培地交換した後に明視野観察および蛍光観察した結果を示す写真である。
【図４】図４は、本発明に係るアントラセノファンを含む培地中でＮＩＨ３Ｔ３細胞をインキュベートし、培地交換した後に、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて明視野観察および蛍光観察した結果を示す写真とそれらの重ね合わせ像である。
【図５】図５は、本発明に係るアントラセノファンを含む培地中でＨｅＬａ細胞をインキュベートし、培地交換した後に、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて明視野観察および蛍光観察した結果を示す写真とそれらの重ね合わせ像である。
【図６】図６は、本発明に係るアントラセノファンを含む培地中でＨｅＬａ細胞をインキュベートし、培地交換した後に、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて５μｍ毎に蛍光観察した結果を示す写真である。
【図７】図７は、本発明に係るアントラセノファンの濃度と細胞生存率（ＩＣ）との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本願発明に係る蛍光イメージング剤は、アントラセノファン（Ｉ）またはその塩を含むことを特徴とする。
【００４０】
アントラセノファン（Ｉ）の塩としては、特に制限されないが、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩などの無機酸塩；シュウ酸塩、マロン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩などの有機酸塩；グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩などの酸性アミノ酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；リジン塩、アルギニン塩、ヒスチジン塩などの塩基性アミノ酸塩が挙げられる。
【００４１】
本発明の蛍光イメージング剤は、アントラセノファン（Ｉ）またはその塩の溶液であってもよい。当該溶液の溶媒としては水が好ましいが、アントラセノファン（Ｉ）またはその塩の溶解性によっては、生体組織に害を及ぼさない範囲で、エタノールなどの水混和性有機溶媒を適量添加してもよい。また、当該水溶液は、生体組織に害を及ぼさないよう等張液または略等張液とすることが好ましい。その場合の溶媒は、リン酸緩衝液などの緩衝液や生理食塩水であってもよい。
【００４２】
本発明の蛍光イメージング剤がアントラセノファン（Ｉ）またはその塩の溶液である場合、その濃度は適宜調整すればよいが、例えば、１μＭ以上、５００μＭ以下程度とすることができる。当該濃度が１μＭ以上であれば、生体組織をより確実に蛍光染色することができる。また、当該濃度が５００μＭ以下であれば、生体組織に対する害もより少ないといえる。
【００４３】
本発明に係るアントラセノファン（Ｉ）は、例えば、下記スキームにより容易に製造することができる。なお、活性基は、適切な保護基により適時保護したり、また、脱保護してよいものとする。
【００４４】
【化３】
0006370635.tif 000004
【００４５】
［式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ1〜Ｒ6、ｍおよびｎは前記と同義を示し、ＺはＸおよびＹを示し、Ｒ9はＲ1〜Ｒ4のいずれか１以上を示し、Ｈａｌは脱離基としてのクロロ基、ブロモ基またはヨード基を示し、ＲはＣ1-4アルキル基を示す］
【００４６】
まず、公知方法に従うか或いは公知方法に準じて、９，１０−アントラセンジカルボアルデヒド（ＩＩ）とアミノ酸エステル（ＩＩＩ）から環状シッフ塩基（ＩＶ）を得、次に還元することにより、アントラセノファン（Ｖ）を容易に製造できる。
【００４７】
次に、必要に応じて、試薬Ｒ9−Ｈａｌを使ってアミノ基（−ＮＨ−基）に置換基Ｒ1〜Ｒ4を導入する。この場合、カルボキシ基に対してα位のアミノ基よりもβ位〜ε位のアミノ基の反応性の方が高いため、試薬Ｒ9−Ｈａｌの量を調整することによりβ位〜ε位のアミノ基のみに置換基を導入することが可能である。また、α位アミノ基のみに置換基を導入したい場合には、いったんβ位〜ε位のアミノ基をＢＯＣ基やアリル基など選択的除去が可能な保護基で保護しておき、α位アミノ基に置換基を導入した後に当該保護基を除去すればよい。例えばＲ1のみやＲ3のみへの置換基の導入も、試薬Ｒ9−Ｈａｌの量の調整や保護基の選択などの組み合わせにより可能である。
【００４８】
次いで、アントラセノファン（ＶＩ）のエステル基を加水分解することにより、アントラセノファン（Ｉ）を得る。この際、Ｒ1〜Ｒ4の何れか１以上が（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基であり、当該基を加水分解したくない場合には、アミノ酸エステル（ＩＩＩ）のカルボキシ保護基をベンジル基やトリフェニルメチル基など除去し易いものとしておき、選択的に脱保護すればよい。
【００４９】
本発明に係るアントラセノファン（Ｉ）は、細胞内に取り込まれる上に自ら蛍光特性を示すことから、蛍光イメージングに用いることができる。以下、アントラセノファン（Ｉ）を用いた蛍光イメージング方法につき工程毎に説明する。
【００５０】
（１）  細胞内取り込み工程
まず、アントラセノファン（Ｉ）またはその塩を生体組織と接触させることにより、アントラセノファン（Ｉ）またはその塩を、生体組織を構成する細胞内に取り込ませる。
【００５１】
本発明における「生体組織」には、まさに生体を構成する組織に加え、生体から採取した組織の一部である「生体試料」も含まれるものとする。
【００５２】
アントラセノファン（Ｉ）またはその塩と生体組織との接触方法は適宜選択すればよく、特に制限されない。例えば、アントラセノファン（Ｉ）またはその塩の溶液を生体中の対象組織へ送達されるよう注射投与したり、外科的手術において生体中の組織を露出させ、当該溶液を投与してもよい。また、生体試料を含む生理食塩水や培養液などへアントラセノファン（Ｉ）またはその塩を直接添加したり、またはその水溶液を添加してもよい。
【００５３】
アントラセノファン（Ｉ）またはその塩の使用量は、その使用態様などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、生体組織に直接投与する場合には蛍光イメージング剤におけるアントラセノファン（Ｉ）またはその塩の濃度を上記のとおり１μＭ以上、５００μＭ以下程度としたり、生体試料を含む生理食塩水や培養液などにおけるアントラセノファン（Ｉ）またはその塩の濃度がこの程度となるようにすることができる。
【００５４】
生体組織を構成する細胞内に取り込まれたアントラセノファン（Ｉ）またはその塩は、正常細胞では主に細胞質に局在するのに対して、がん細胞ではさらに核膜を透過して核内に局在する。
【００５５】
（２）  洗浄工程
次に、アントラセノファン（Ｉ）またはその塩と接触させた生体組織を洗浄する。本工程の実施は任意であるが、細胞内に取り込まれなかったアントラセノファン（Ｉ）またはその塩も蛍光を発し、細胞のイメージングが不鮮明になるおそれがあり得るので、実施することが好ましい。
【００５６】
洗浄液は、アントラセノファン（Ｉ）またはその塩を含まず、且つ生体組織に害を及ぼさないものを使用する。例えば、生理食塩水や、ｐＨが６．５以上、７．５以下程度のリン酸緩衝液を用いることができる。
【００５７】
洗浄回数などは特に制限されず適宜調整すればよいが、細胞内に取り込まれなかったアントラセノファン（Ｉ）またはその塩が十分に除去される程度にすることが好ましい。
【００５８】
（３）  光照射工程
次に、細胞内に取り込まれたアントラセノファン（Ｉ）またはその塩に励起光を照射する。照射する励起光の波長は、使用するアントラセノファン（Ｉ）またはその塩の蛍光特性を事前に測定するなどして決定すればよいが、例えば、極大波長が３５０ｎｍ以上、４５０ｎｍ以下程度の波長の励起光を用いればよい。
【００５９】
励起光の照射手段は特に制限されず、生体組織の形態などに応じて適宜選択すればよい。例えば生体試料の場合には、蛍光顕微鏡を用いれば、励起光の照射のみならず、蛍光像の観察から撮影まで行うことができる。生体内の組織を直接蛍光イメージングする場合には蛍光マイクロ内視鏡や光ファイバーを用いることができるし、外科的手術などにおいて生体組織を露出させた場合には所望の極大波長光を発することができるライトを使って直接照射することもできる。
【００６０】
（４）  蛍光像取得工程
次に、細胞内に取り込まれたアントラセノファン（Ｉ）またはその塩から発せられる蛍光に基づく蛍光像を取得する。ここで「蛍光像を取得する」には、蛍光像を拡大鏡などにより拡大した上で肉眼により観察したり、ディスプレイに表示したり、撮影したり、また、蛍光像のデータをコンピュータに取り込んだりするなど、蛍光像を客観的に把握できるようにするあらゆる態様が含まれるものとする。
【００６１】
（５）  がん細胞の特定工程
本発明に係るアントラセノファン（Ｉ）またはその塩は、正常細胞では主に細胞質に分布する一方で、がん細胞ではさらに核膜を透過して核内に局在する。よって、上記蛍光像取得工程で得られた蛍光像において、アントラセノファン（Ｉ）またはその塩による蛍光が細胞の細胞質から発せられるか或いは核から発せられるか観察することにより、正常細胞であるかがん細胞であるかを判断することが可能になる。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００６３】
合成例１：  本発明に係るアントラセノファン２の合成
【００６４】
【化４】
0006370635.tif 000005
【００６５】
（１）  アントラセノファン１の合成
公知方法に従って、９，１０−アントラセンジカルボアルデヒドとＬ−リジンメチルエステルから、還元的アミノ化反応によりアントラセノファン１を合成した。
【００６６】
（２）  アントラセノファン２の合成
アントラセノファン１（３０４．６ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２０ｍＬ）、メタノール（８０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、水酸化カリウム（１５００ｍｇ）を加えて８０℃で６時間還流した。次いで、反応溶液を塩酸によって中和（ｐＨ７）した。溶媒を留去した後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相  −  メタノール：水＝１：１→メタノール：水：１Ｎ塩酸＝２４：６：１）にて精製した。目的物の同定を1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）および1Ｈ−1Ｈ  ＣＯＳＹ  ＮＭＲにて行った。
1H-NMR（300MHz，CD3Cl，ppm）8.15-8.65（m，8H），7.12-7.90（m，8H），5.05-5.40（m，8H），3.75-3.60（m，2H），2.00-2.90（m，4H）,1.00-2.00（m，12H）
MALDI-TOF-MS：349［M+2H+］，697［M+H+］，735［M+K+］
【００６７】
合成例２：  本発明に係るアントラセノファン４の合成
【００６８】
【化５】
0006370635.tif 000006
【００６９】
（１）  アントラセノファン３の合成
アントラセノファン１（７２．４ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（０．２ｍＬ，１．１５ｍｍｏｌ，１１ｅｑ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、窒素雰囲気下でヨードメタン（５０μＬ，０．８ｍｍｏｌ，２ｅｑ）を加えて室温で一晩撹拌した。反応の追跡はＴＬＣ（展開溶媒；ジクロロメタン：トルエン：メタノール＝１０：２：１）によって行った。反応液をジクロロメタン／食塩水によって３回洗浄し、有機相を無水硫酸マグネシウムによって脱水してから溶媒を留去した。得られた固体をオートカラム（移動相  −  ジクロロメタン：トルエン：メタノール＝１５：１：１）によって精製した（収量：５４．３ｍｇ（０．０７２ｍｍｏｌ），収率：７２．２％）。同定は1Ｈ−ＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって行った。
1H-NMR（300MHz，CDCl3）ppm=8.12-8.36（m，8H），6.86-7.46（m，8H），3.94-4.58（m，8H），3.72-3.77（d，6H），3.31-3.43（m，2H），2.16-2.34（m，6H），1.84（s，4H），1.09-1.84（m，14H）
MALDI-TOF-MS：753［M+1］
【００７０】
（２）  アントラセノファン４の合成
アントラセノファン３（７８ｍｇ）をジクロロメタン（５ｍＬ）、メタノール（２０ｍＬ）、純水（５ｍＬ）に溶解させ、水酸化カリウム（３００ｍｇ，１．１５ｍｍｏｌ）を加えて８０℃還流下で４時間撹拌した。その後、１Ｍ塩酸を用いてｐＨ７に中和し、溶媒を留去した。得られた固体にメタノールを加え、沈殿として生じた塩化カリウムの一部を除去した。得られた生成物を逆相カラムクロマトグラフィー（移動相  −  メタノール：純水＝１：１→メタノール：１Ｍ塩酸＝３０：１）にて精製した（収量：８７．４ｍｇ（０．１００ｍｍｏｌ），収率：９６．７％）。同定は1Ｈ−ＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって行った。
1H-NMR（300MHz，D2O）ppm=8.1-7.8（m，8H），7.8-7.4（m，8H），4.9（br，4H），4.7（br，4H），4.3-3.9（m，2H），2.9（m，4H），2.8-2.3（m，6H），1.5-0.2（m，12H）
MALDI-TOF-MS：725［M+H+］，363［M+2H+］
【００７１】
合成例３：  本発明に係るアントラセノファン６の合成
【００７２】
【化６】
0006370635.tif 000007
【００７３】
（１）  アントラセノファン５の合成
アントラセノファン１（７２．４ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（０．２ｍＬ，３ｅｑ）を１−フルオロ−２−ヨードエタン（０．５ｍＬ，１．１ｇ，０．８１ｍｍｏｌ，８１ｅｑ）に加え、４０℃まで温度を上げて一晩撹拌した。反応の追跡をＴＬＣ（展開溶媒  −  ジクロロメタン：トルエン：メタノール＝３０：１：１）で行ったところ、Ｒｆ値０．５の位置に新しいスポットが確認された。反応液にジクロロメタン（１０ｍＬ）を加え、飽和食塩水で３回洗浄を行った。有機相から溶媒を留去した後、オートカラム（移動相  −  ジクロロメタン：トルエン：メタノール＝４０：１：１）で精製した（収量：８５ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ），収率：１００％）。目的物の同定は1Ｈ−ＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで行った。
1H-NMR（300MHz，CDCl3）ppm=8.4-8.2（m，8H），7.5-7.1（m，8H），4.7-4.3（m，8H），4.2（m，4H），3.7（m，4H），3.5-3.2（m，4H），3.1-2.7（m，2H），2.7-2.4（m，6H），1.9-0.9（m，12H）
MALDI-TOF-MS：817［M+H+］，409［M+2H+］
【００７４】
（２）  アントラセノファン６の合成
アントラセノファン５をジクロロメタン（５ｍＬ）、メタノール（２０ｍＬ）、水（５ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、水酸化カリウム（３００ｍｇ，１６ｅｑ）を加えて６０℃で２４時間還流した。反応後、塩酸を用いて中和を行い、析出した塩を濾過した。溶媒を留去し、逆相カラム（移動相  −  水：メタノール＝１：１→メタノール：１Ｍ塩酸＝３０：１）にて精製した（収量：７５ｍｇ（０．８０ｍｍｏｌ），収率：８０％）。
1H-NMR（300MHz，D2O）ppm=8.6-8.2（m，8H），7.8-7.4（m，8H），5.8-5.0（m，8H），4.3-4.0（m，4H），3.9-3.5（m，10H），2.0-0.9（m，12H）
MALDI-TOF-MS：810［M+Na+］
【００７５】
合成例４：  本発明に係るアントラセノファン７の合成
【００７６】
【化７】
0006370635.tif 000008
【００７７】
アントラセノファン１（７２．４ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（０．１ｍＬ，６ｅｑ）を加えた。気相を窒素置換した後、クロロギ酸メチル（３８．６μＬ，５ｅｑ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応の追跡はＴＬＣ（展開溶媒  −  ジクロロメタン：トルエン：メタノール＝１０：２：１，Ｒｆ値：０．４→０．６）にて行なった。反応を止めてジクロロメタン／飽和食塩水で３回分液操作をした後、有機相を無水硫酸マグネシウムで脱水し、溶媒を留去した。オートカラム（移動相  −  ジクロロメタン：トルエン：メタノール＝１０：２：１，検出波長：３９５ｎｍ）にて目的物を精製した（収量：７０．４ｍｇ（０．０７４ｍｍｏｌ），収率：７４％）。目的物の同定は1Ｈ−ＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで行った。
1H-NMR（300MHz，CDCl3）ppm=8.09-8.25（m，8H），7.39-7.48（m，8H），5.01-5.98（m，8H），3.60-3.98（m，18H），2.67-3.16（m，2H），-0.19-2.37（m，16H)
MALDI-TOF-MS：979.58［M+Na+］
【００７８】
試験例１  バイオイメージング試験
（１）  細胞培養
−８０℃で冷凍保存していたＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来細胞）とＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス繊維芽細胞）を解凍し、４．５ｇ／グルコース、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウムを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍに１０％ＦＢＳと１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含む培地で、約５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2となるように培養した。
【００７９】
（２）  アントラセノファンによるバイオイメージング
本発明に係るアントラセノファン２またはアントラセノファン４を１ｍＭの濃度で０．１Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７．４）に溶解し、２００ｎｍ以下のフィルターで滅菌濾過した。ＨｅＬａ細胞またはＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養培地（２ｍＬ）に、上記アントラセノファン溶液（２００μＬ）を加えた。別途、対照として、上記溶液の代わりにリン酸バッファのみを加えた試料を作製した。
【００８０】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞では、アントラセノファン溶液を加えてから２４時間インキュベートした後に、蛍光顕微鏡、水銀ランプおよびミラーユニット（それぞれＯＬＹＭＰＵＳ社製「ＩＸ７３：２Ｄｅｃｋ」，「Ｕ−ＨＧＬＧＰＳ」，「Ｕ−ＦＵＷ］）を使って明視野観察および蛍光観察した。蛍光観察では、励起波長を３４０〜３９０ｎｍ、測定波長を４２０ｎｍとし、倍率を×４０、露光時間を０．５秒に設定した。さらに、細胞をＤ−ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、アントラセノファンを含まない培地を加えた上で、同様に明視野観察と蛍光観察を行った。培地交換前のＮＩＨ３Ｔ３細胞の結果を図１に、培地交換後のＮＩＨ３Ｔ３細胞の結果を図２に示す。また、図１および図２の蛍光観察写真における細胞部分と細胞が無い部分から蛍光増強度を算出した。結果を表１に示す。
【００８１】
【表１】
0006370635.tif 000009
【００８２】
図１のとおり、アントラセノファン水溶液中であるにもかかわらず、蛍光によって細胞を確認することができた。その理由としては、アントラセノファンが細胞内に導入され、細胞内のｐＨが細胞周辺のｐＨ（７．４）に比して低くなっていることから蛍光強度が増大したためであることや、細胞内の分子との相互作用による蛍光増強度の増強も考えられる。
【００８３】
図２からは、アントラセノファンが細胞全体ではなく、ある一定の場所に局在化している事が確認された。
【００８４】
また、表１のとおり、アントラセノファン２よりもアントラセノファン４において蛍光の増強度がより強く測定された。この結果は、アントラセノファン４がｐＨ７．４の環境下においてアントラセノファン２に比べて蛍光強度が小さいためであると考えられる。従って、アントラセノファン４を用いることで、より高感度に細胞のイメージングを行えることが確認された。
【００８５】
ＨｅＬａ細胞では、培地交換後のみにおいて明視野観察と蛍光観察を行った。結果を図３に示す。
【００８６】
図３の結果から、本発明のアントラセノファンは、がん細胞であるＨｅＬａ細胞では正常細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞とは違った挙動を示すことが観察された。具体的には、本発明のアントラセノファンはＮＩＨ３Ｔ３細胞と比べてＨｅＬａ細胞への導入量自体は少ないが、局在の度合いをみると、アントラセノファンはＨｅＬａ細胞内での方がより局所的に存在していることが確認できた。
【００８７】
試験例２  バイオイメージング試験  −  局在の特定
上記試験例１の結果により、本発明に係るアントラセノファンが細胞内のどこかに局在していることが確認された。そこで、細胞内のどこにアントラセノファンが局在しているかを確認するために、共焦点レーザー蛍光顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社製「ＦＶ１０００−ＫＤＭ」，以下、「ＬＳＭ」と略記する）による観察を行った。
【００８８】
上記試験例１と同様にして本発明に係るアントラセノファン４を含む培地中で細胞をインキュベートし、培地を交換した後、ＬＳＭを用いて観察した。この際、レーザー励起波長を４０５ｎｍ、測定波長を４２５〜５００ｎｍとし、倍率を×１００に設定した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の結果を図４に、ＨｅＬａ細胞の結果を図５に示す。
【００８９】
また、アントラセノファン４を取り込ませたＨｅＬａ細胞の観察において、５μｍ毎にスライスして撮影を行うことにより、アントラセノファンが局在している部分の状態を観察した。結果を図６に示す。
【００９０】
図４に示されているとおり、正常細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞では、本発明のアントラセノファンは細胞膜を透過して細胞内に取り込まれ、主に核以外の細胞質に分布していることが観察された。
【００９１】
一方、図５のとおり、がん細胞であるＨｅＬａ細胞では、さらに核膜をも透過して選択的に核内に局在していた。このことは、アントラセノファンがＨｅＬａ細胞内において球形である核に存在していることが示されている図６の断層写真でも明らかである。
【００９２】
以上の結果のとおり、本発明に係るアントラセノファンは正常細胞では細胞質に分布するのに対してがん細胞では核内に局在することから、正常細胞とがん細胞を区別することができ、例えば生体内におけるがん細胞の検出に有用であることが実験的に証明された。
【００９３】
試験例３  毒性試験
９６ウェルマイクロプレートに、２４時間インキュベートしたＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養液を１００μＬずつ添加した。別途、アントラセノファン２またはアントラセノファン４の０．１〜５００μＭ溶液を滅菌濾過した後、各ウェルへ１０μＬずつ添加し、さらに２４時間インキュベートした。細胞を含まない培地のみでアントラセノファンを添加しないブランクと、細胞を含むがアントラセノファンを添加しない陰性対照も設けた。次いで、水溶性テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８溶液を各ウェルに１０μＬずつ添加し、２時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた測定値より、下記式により細胞生存率（ＩＣ）を算出した。結果を図７に示す。
細胞生存率（％）＝［（Ａs−Ａb）／（Ａc−Ａb）］×１００
Ａs：細胞および披検物質を含むウェルの測定値
Ａc：細胞のみ含み披検物質を含まないウェルの測定値
Ａb：細胞および披検物質の両方を含まない培地のみのウェルの測定値
【００９４】
図７に示す結果のとおり、細胞の生存率が５０％になる値（ＩＣ50）の算出を試みたが、アントラセノファン２、アントラセノファン４ともに、それぞれ水に溶解できる範囲において生存率が５０％にならなかったため、ＩＣ50無し、即ち低毒性であるとの結果になった。このように、本発明に係るアントラセノファンは毒性が低いことから、生細胞のイメージングに用いても問題無いことが明らかにされた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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