(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ)配列番号71で示されるセンスsiRNA及び配列番号72で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号73で示されるセンスsiRNA及び配列番号74で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号75で示されるセンスsiRNA及び配列番号76で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号77で示されるセンスsiRNA及び配列番号78で示されるアンチセンスsiRNAからなるリストから選択されるsiRNA、又は配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び/又は
ｂ)プロタミン又は硫酸プロタミン
からなる群より選択される少なくとも１つの剤を含んでなる、タウオパチー、特にアルツハイマー病の治療又は予防に使用するための組成物。
【請求項２】
(１)
ａ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つのレベル及び/又は活性、
ｂ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つのレベル及び/又は活性、
ｃ)それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つのレベル及び/又は活性、並びに
ｄ)前記遺伝子又は前記転写産物又は前記翻訳産物の変異型であって、該遺伝子又は該転写産物又は該翻訳産物と少なくとも90％の配列同一性を示し、3-O-スルホントランスフェラーゼ活性を有する変異型のレベル及び/又は活性
の１又は２以上、或いは
(２)
ａ)〜ｄ)の１又は２以上と、
ｅ)3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖のレベル及び/又は活性、及び
ｆ)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質のレベル及び/又は活性
の一方又は両方、或いは
(３)
ｅ)及びｆ)
を、対象者から事前に得た生物学的流体サンプルにおいて測定し、前記レベル及び/又は前記活性を、既知の疾患又は健康状態を表すそれぞれの参照値と比較することを含んでなり、
前記遺伝子、前記転写産物、前記翻訳産物、前記変異型、前記3-O-硫酸化ヘパラン硫酸並びに前記タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の少なくとも１つのレベル及び/又は活性が対象者サンプル中で上昇していることが神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)を示すか又は前記神経変性疾患を発症するリスクを示す、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかの決定を補助するためのデータの取得方法。
【請求項３】
前記神経変性疾患がタウオパチーである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質のレベルがそれぞれの参照値に比べて少なくとも10％上昇している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的流体がCSFであり、対象者における以下：
ａ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される前記遺伝子、及び
ｂ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の前記転写産物、及び
ｃ)配列番号２及び４でそれぞれ示される前記遺伝子の前記翻訳産物、及び
ｄ)前記遺伝子又は前記転写産物又は前記翻訳産物の変異型であって、該遺伝子又は該転写産物又は該翻訳産物と少なくとも90％の配列同一性を示し、3-O-スルホントランスフェラーゼ活性を有する変異型、及び
ｅ)3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖
の活性及び/又はレベルがそれぞれの参照値と実質的に同じであり、
ｆ)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルが対象者においてそれぞれの参照値と比較して上昇しており、特に少なくとも10％上昇している、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病である請求項２に記載の方法。
【請求項７】
配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルがリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇している、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルがリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇している、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
リアルタイムPCRで測定するとき、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルが少なくとも100％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルが少なくとも100％上昇している、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号２で示される前記遺伝子の前記翻訳産物のレベルがウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50％上昇している、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号４で示される前記遺伝子の前記翻訳産物のレベルがウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50％上昇している、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号２で示される前記遺伝子の前記翻訳産物のレベルがELISA又はウェスタンブロットで測定するとき少なくとも50％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の前記翻訳産物のレベルがウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50％上昇している、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性を測定することを更に含んでなり、前記レベル及び/又は活性が参照値と比較して少なくとも50％上昇していることがアルツハイマー病を示す、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ｆ)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質のレベル及び/又は活性を測定すること
を更に含んでなり、それぞれの参照値と比較して少なくとも10％の上昇がアルツハイマー病を示す、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物学的流体がCSFであり、以下：
ａ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つ、及び
ｂ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ、及び
ｃ)それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物、及び
ｄ)3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖
の活性及び/又はレベル、及び
ｆ)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルが対象者においてそれぞれの参照値と比較して上昇している、請求項６〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
以下：
配列番号１及び/又は配列番号３を増幅するプライマー組合せ、及び/又は
配列番号２及び/又は配列番号４を検出する特異的抗体
を含んでなる、タウオパチー、特にアルツハイマー病の診断キット。
【請求項１７】
以下：
ａ)神経変性疾患に罹患した動物、特に哺乳動物から事前に採集した生物学的流体サンプルを、試験化合物と接触させ、
ｂ)
(１)
i．配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つのレベル及び/又は活性、
ii．配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つのレベル及び/又は活性、
iii．それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つのレベル及び/又は活性、並びに
iv．前記遺伝子又は転写若しくは翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型であって、該遺伝子又は転写若しくは翻訳産物と少なくとも90％の同一性を示し、3-O-スルホントランスフェラーゼ活性を有するフラグメント又は誘導体又は変異型のレベル及び/又は活性
の１又は２以上、或いは
(２)
i〜ivの１又は２以上と、
v．3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖のレベル及び/又は活性、及び
vi．タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベル
の一方又は両方、或いは
(３)
v及びvi
を測定し、
ｃ)神経変性疾患を有する哺乳動物から事前に採集した、前記化合物に接触させていないコントロールの生物学的流体サンプル中の活性及び/又はレベルを測定し、
ｄ)接触させた生物学的流体サンプル中の前記活性及び/又はレベルと、非接触の生物学的流体サンプル中のものとの差を比較することを含んでなり、
接触させたサンプルの前記活性及び/又はレベルの変化が、試験化合物が前記疾患のモジュレーターであることを示す、
神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)のモジュレーターについてのインビトロスクリーニング方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物がヒト又はマウス、例えばSAMP8マウス及び/又はADの3xTg-ADマウスモデルであるか、或いは前記動物がゼブラフィッシュである、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の診断、予後予測又は治療の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病(AD)は、患者の生活に対して活力を失わせる影響を有する。更に、これら疾患は、多大な健康上、社会的及び経済的重荷となる。ADは世界的に最も蔓延した神経変性疾患であり、世界中で27百万人以上が患っていると推定されている。ADは、臨床的に診断された全ての認知症の少なくとも50〜70％を占め、65歳以上の人口の約10％、85歳以上では50％が罹患しているおそらく最も壊滅的な加齢性神経変性状態である。ADの発症年齢は、50年の範囲内で変化し得るが、早期発症型ADは65歳より若い人で生じ、遅発性ADは65歳より老齢の人に生じる。全症例の約10％が早期発症型ADを患い、僅か１〜２％が家族性の変異体ベースの遺伝症例であり、残る98〜99％は非変異が疾患に関係している散発性である。
臨床的には、ADは、記憶形成の早期欠損に関係し、究極的には高次認知機能の完全な低下に至る進行性疾患である。認知障害としては、とりわけ、記憶障害、失語症、健忘及び遂行機能の喪失が挙げられる。ADの病状の特性は、変性プロセスに対する特定脳領域及び神経細胞亜集団の選択的脆弱性である。具体的には、この疾患の進行の間、皮質側頭葉領域及び海馬が早期に、そしてより重篤に影響を受ける。他方、小脳のような他の脳領域のニューロンは、ほとんど無傷のままであり、神経変性から保護される(Annals of Neurology 1981, 10:184-192)。現在、ADの治療法は存在しないし、その進行を止める有効な治療も存在しない。ADの生前診断は、血液又は血漿サンプルでは依然として不可能であり、不幸にも他のタウオパチーからの鑑別的AD診断を単独で達成できる、現在利用可能な脳脊髄液(CSF)中のバイオマーカーはない。
【０００３】
病理学的には、ADは、それぞれAβペプチド及び微小管関連タウタンパク質(MAPT)を蓄積する老人斑及び神経原線維もつれ(NFT)と呼ばれる２つの脳病変によって特徴付けられる。これら神経病理学的特徴は、神経変性プロセスの２つの対応する仮説「Aβ/アミロイドカスケード仮説」及び「タウ-リン酸化/NFT仮説」の原因をなす。「Aβ/アミロイドカスケード仮説」において、Aβペプチドは、β/γ-セクレターゼ複合体(これはプレセニリン-１又は２(PS-1又はPS-2)に会合する)によるアミロイド前駆体タンパク質(APP)の切断から生じ、典型的には42アミノ酸ペプチド(Aβ42)の形成を導き、Aβ42は細胞外で迅速に凝集して特徴的なアミロイド斑を形成する。APP、PS-1及びPS-2の遺伝子における遺伝子欠損に帰せられる早期発症型ADの稀な例が存在する。
ADの第２の特徴としてはタウタンパク質が挙げられる。これは、アルツハイマー病患者の脳内で、異常にリン酸化され凝集して対合螺旋状フィラメント(paired helical filament；PHF)及び神経原線維もつれ(NFT)を形成する(Iqbal K, Liu F, Gong CX, Grundke-Iqbal I. Tau in Alzheimer disase and related tauropathies. Curr Alzheimer Res Dec;7(8):656-664)。脳内でのタウタンパク質異常リン酸化並びにNFT形成及び蓄積は、この疾患の病理学的、生化学的及び臨床的進行と直接相関付けられることが示されている。ADの予後、早期診断及び関連するタウオパチーからの鑑別診断についての大いなる関心のために、ADに特徴的な予後予測用で且つ特異的なマーカーは発見が望まれている(CSF、血漿、唾液又は他の容易に取得可能な体液)。
【０００４】
アルツハイマー(AD)又は他のタウオパチーを患う患者の脳におけるインビボNFT形成の第１の特徴の１つは、生理学的条件下ではリン酸化しない特定のアミノ酸残基でのタウの異常リン酸化である(Iqbal, Liuら；Acta Neuropathol;118(1):53-69；Gong and Iqbal, 2008；Curr Med Chem 15(23)：2321-8)。タウ異常リン酸化の最初の結果は、微小管からの脱離である。これは、シナプス障害及び認知低下を生じ得る。タウが脱離すると、リン酸化は新たに接近可能となる微小管結合ドメインで継続し、得られる過剰リン酸化タウは凝集した後、オリゴマー化してNFTを形成する。このタウオリゴマー化及び続く細胞内でのNFTへの凝集は、タウ過リン酸化の２番目の結果である。これは、その後、幾らかの細胞プロセスに影響して最終的には細胞を殺傷し、AD脳で概して検出されるゴーストNFT(ゴーストもつれ)を形成し得る。タウの異常リン酸化はまた、正常タウの凝集を誘導し、これは、僅かな割合ではあるが実際にNFT中に過リン酸化タンパク質と共に事実見出される(Biochem Soc Trans 38(4)：962-6)。興味深いことに、リン酸化タウ凝集動力学、凝集体構造及び脳領域での凝集体の位置は、おそらく異なる脳領域でのタウの差異的変異効果又は未解明の他の因子の結果として、異なるタウオパチー間で異なる。重要なことには、非タウ変異がADに関わっている。
【０００５】
リン酸化タウのNFTへの凝集がこの疾患の中核であると考えられているが、タウ変異が関わる動物モデルでの種々の研究により、NFT形成及び短縮化に対するタウのリン酸化の重要性が示唆されている(Garcia-Sierra, Mondragon-Rodriguezら 2008, J Alzheimers Dis 14:401-409)。例えば、トランスジェニックショウジョウバエ(drosophila)において、異常リン酸化タウの神経蓄積がNFT形成の不在下で神経変性を導いた(Wittmann, Wszolekら 2001；Science 293:711-714)。P301L-タウ変異が誘導されたトランスジェニックマウスモデルで、NFTが形成され続けるにもかかわらず異常に過リン酸化したタウが抑制されるとき、認知改善が観察された(Santacruz, Lewisら 2005；Science 309:476-481)。3×TgADマウスでは、可溶性Aβ及び可溶性異常リン酸化タウの減少は認知低下を寛解したが、可溶性Aβのみの減少は寛解しなかった(Oddo, Vasilevkoら 2006；J Biol Chem 281:39413-39423)。これらデータは、過リン酸化タウタンパク質が行動障害及びニューロン損失に関与していることを示唆する。重要なことには、ほとんどの動物モデルでは、異常なタウリン酸化はタウ遺伝子MAPTの変異に関連付けられている(Vandrovcova, Anayaら；Curr Alzheimer Res 7:726-734)が、これら変異はADには存在せず、よって過リン酸化はまたタウ変異非依存性因子に起因し得るとの仮定が可能になる。これは未だ明らかにされていない。
【０００６】
AD患者では、タウ異常リン酸化を担う幾つかのキナーゼが、健常個体と同レベルで発現しており、この疾患では、これらタンパク質のいずれも非変異であることが報告されている。よって、過リン酸化は、リン酸化に関与するアミノ酸残基の提示を結果的に伴うタウタンパク質の立体構造変化により誘導され得ると想定されている。これら「病的」立体構造変化は、キナーゼ作用に不可欠であるようである(Hiraokaら，2004, Biochem Biophys Res Commun 315:659-663；Biochem Biophys Res Commun 2004 Mar 12;315(3):659-663)。タウを直接リン酸化し、したがって有用な治療標的と考えられる神経キナーゼとしては、ニューロンサイクリン依存性キナーゼ５(cdk5又はNCLK)、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-３β(GSK-3β)及び微小管親和性調節キナーゼ(MARK)が挙げられる(Mazanetz and Fischer, 2007, Nat Rev Drug Discov 6:464-479；Hangerら，2009, Trends Mol Med 15:112-119)。興味深いことに、非AD個体の脳では、これらキナーゼはタウを異常にリン酸化することができず、このことは、タウの立体構造変化が生じないか、存在しても非常に低レベルであり、病的レベルではないことを示唆する。疾患における重要性にもかかわらず、今日まで、キナーゼインヒビター、ホスファターゼアクチベーター及びNFT解離剤は、この疾患を停止又は後退させる真のプラス効果を提供しておらず、このことは、タウの異常リン酸化がこの病理について非復帰点であることを示唆している。よって、AD分野における優先事項の１つは、MAPT遺伝子変異非依存性のタウタンパク質異常リン酸化機序を解明することである(Gong and Iqbal, 2008；Curr Med Chem 15:2321-2328)。
【０００７】
タウが異常リン酸化部位が曝される立体構造を獲得することをヘパリンが可能にすることは、インビトロで、証明されている(Paudel and Li, 1999, J Biol Chem 274:8029-8038)。更に、NMR分光学実験は、ヘパリンがThr231残基を異常リン酸化を担うキナーゼに曝す立体構造変化を誘導することを証明している(Sibilleら，2006, Biochemistry 45:12560-12572)。Thr231残基は、AD疾患進行の間に異常にリン酸化したタンパク質の最初の残基に含まれる。ヘパリン及び他のアニオン性巨大分子もまた、幾つかのタンパク質キナーゼによるタウのリン酸化を促進することが示されている(J Protein Chem. 1995 Feb;14(2):95-105. Song JS, Yang SD；Yang SD, Yu JS, Shiah SG, Huang JJ. J Neurochem. 1994 Oct;63(4):1416-25)。
【０００８】
ヘパリン及びヘパラン硫酸(HS)は、グリコサミノグリカン(GAG)と呼ばれるポリアニオン性硫酸化グリカンのファミリーに属する。HS鎖は、Ｎ-アセチルグルコサミン(GlcNAc)に連結したウロン酸から構成される反復二糖単位から形成される。生合成の間に、二糖鎖伸長が幾つかの改変の後に続く。改変としては、ウロン酸(GlcA)をイズロン酸(IdoA)に変換するC5-エピメラーゼによるエピマー化及び種々のスルホトランスフェラーゼ(それぞれ、IdoAの2-O-位で、GlcNの6-O-位で又はGlcNの3-O-位でスルフェート基を導入するNDST(N-デアセチル-O-スルホトランスフェラーゼ)、HS2ST(2-OST)、HS6ST(6-OST)及びHS3ST(3-OST)を含む)が保証する種々の部位選択的硫酸化(Sandwallら，2010；Glycobiology;20(5):533-41)が挙げられる。種々のスルホトランスフェラーゼの上手に統制された発現は、細胞が上手に制御するHS配列の多様性をもたらす。HSは、ヘパリン結合性タンパク質(HBP)として知られるタンパク質ファミリー(幾つかの増殖因子、マトリクスタンパク質、サイトカインなどを含む)の機能の調節因子としての重要な生物学的役割を演じていると認識されている。HSの構造及び調節活性は、基本的には、N- 2-O及び6-O位でのHS鎖の特異的硫酸化により発揮される。3-O-位のみが、抗凝固及びウイルス感染に直接関連付けられている。興味深いことに、これらHS構造は、組織内で高度に一定であるが、各組織機能に適切に適合するように組織ごとに変わる。しかし、HS構造及び機能は、加齢に伴い(Huynh MBら，Neurobiol Aging. 2011 Oct 27)、病状に伴い又は組織損傷後(Huynh MBら，J Biol Chem. 2012)に相当変化することが示されている。他の硫酸化位置と比較して、非常に低い3-O-硫酸化レベルは、抗凝固のような標的付けられた生物活性を発揮するに十分であり得る。3-O-硫酸化は、いずれの認識されている増殖因子やサイトカインの活性調節にも必要でなく、細胞外マトリクスにおけるHSのいずれの機械的機能にも重要でなく、よって、任意の栄養活性にもHSにも必要でない。
【０００９】
HSスルホトランスフェラーゼの中で、NDST、2-OST及び6-OSTが最も一般的に発現し、それら活性は、増殖因子の活性を調節するHS硫酸化構造体の産生を生じる。3-OST(HS3ST)は、HS鎖中の総スルフェートの約0.5％を占める。脊椎動物の3-OSTファミリーにおける多数の遺伝子は、或る細胞タイプが特異的微細構造体HSを生成することで病理学的事象をモジュレートし得るという具合に、機能的異質性を示唆する。このことは、異なる硫酸化二糖を産生する特異イソフォームの発現に依存し得る。3-OST-1は、アンチトロンビン(AT)-結合ドメインに必須であるトリ硫酸化GlcA-GlcNS3S±6S単位を産生する。3-OST-2は、トリ硫酸化GlcA2S/IdoA2S-GlcNS3S(トリＳ単位)及びテトラ硫酸化GlcA2S/IdoA2S-GlcNS3S6S単位(テトラＳ単位)を形成する。3-OST-3A及び-3Bは、同一の触媒ドメインを有し、トリ硫酸化IdoA2S-GlcNH23S±6S単位を形成する。3-OST-5は、トリ硫酸化HexA-GlcNS3S6S、トリＳ単位及び/又はテトラＳ単位を産生する。
ADのバイオマーカー探索は、近年、顕著に進展してきた。体液(例えば、脳脊髄液(CSF)、血漿及び尿)は、ADバイオマーカー開発に重要な供給源と考えられる。しかし、今日まで、CSFのみが、脳細胞外空間との直接的接触に起因して、脳内で起こる生化学的変化を反映し得る。今までは、３つのCSFバイオマーカーAβ42、総タウ(t-タウ)及びリン酸化-タウ(p-タウ)が、高い診断能力を有すると判明している(de Souza LC ら；J Neurol Neurosurg Psychiatry;82(3):240-6)。タウは、通常、細胞内タンパク質であると考えられているにもかかわらず、疾患の場合、過リン酸化タウは、細胞外及び脳脊髄液(CSF)中に見出される。炎症及び酸化ストレスのバイオマーカーも他の供給源として挙げられる。不運にも、現在利用可能なバイオマーカーはいずれも、単独でこの疾患の診断を達成できず、２以上のバイオマーカーを同時にモニターすることが、疾患進行を検出するに適切であると示唆されている(Anoopら，International Journal of Alzheimer's Disease 2010)。
【００１０】
SH-SY5Y細胞は、主として研究に使用されるヒト神経芽腫の細胞株である。SH-SY5Yをレチノール酸で分化させることで、ADのインビトロモデルとして適切な、長い神経突起を有する神経様表現型を示す細胞が利用可能になる(Datki Zら；Neurobiol Dis 2004;17(3):507-15)。タウの異常リン酸化は、これら細胞において、２つの異なるアプローチで誘導することができる：(i)(タウをコードする遺伝子MAPTのP301L変異で特徴付けられる最も一般的なタウオパチーの１つである)前頭側頭型認知症に特徴的なP301L変異を含有するヒトタウタンパク質(FTDP-17)を安定的にトランスフェクトした細胞を用いるタウ変異依存性アプローチ(Huttonら，1998, Nature 393:702-705)；及び(ii)H2O2ストレス負荷細胞(この細胞も酸化ストレスの結果としてタウ過リン酸化を生じる)に基づく変異非依存性アプローチ(Reynolds CHら；J Neurochem. 2000 Apr;74(4):1587-95)。H2O2誘導リン酸化は、おそらくは、(マイトジェン活性化タンパク質(MAP)キナーゼファミリーのメンバーであり、種々の形態のストレスにより開始されるシグナル伝達カスケードに関与する)ストレス活性化キナーゼ(例えば、c-Jun Ｎ-末端キナーゼ(JNK)及びp38)により誘導されると報告されている。これらキナーゼの標的としては、微小管関連タウタンパク質が挙げられる(Reynolds CH J Neurochem. 2000 Apr;74(4):1587-95)。
【００１１】
AD及び関連する疾患の病理機序の解明を補助するため、特徴的なタウ異常リン酸化及びNFT形成を伴うタウオパチーのようなヒト組織病理学的特徴を再現する遺伝子改変マウス、ハエ、サカナ及びワームが開発されている。最近、Paquetらは、生存している動物において細胞及び細胞下レベルでの疾患進行の画像化を可能にする半透明の胚を有すると共に遺伝子が取り扱い易い、タウオパチーのゼブラフィッシュモデルを紹介した。ゼブラフィッシュモデルシステムのこれら特徴により、このモデルは薬剤スクリーニング及び他のタイプの応用研究に有用となる(Paquetら，2009, J Clin Invest 119:1382-1395)。
Paquetのタウオパチーモデルは、第17染色体に連関したパーキンソン症候群を伴うFTD(脳における高レベルの異常リン酸化タウの産生によって特徴付けられるタウオパチーである)の患者に見出される、タウをコードする遺伝子MAPTにおけるタウ-P301L変異を再現する(FTDP-17)。Paquetは、新たに設計したGal4-上流活性化配列ベース(Gal4/UASベース)のベクター系(これはまた、同時に発現する蛍光レポーターによるトランスジェニックサカナの同定を大いに容易にする)により、ゼブラフィッシュニューロンにおけるヒトタンパク質のトランスジェニック発現を最適化した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ほとんどのタウ指向性薬剤発見プログラムは、初期研究段階にあり、Aβに着目したプログラムより相当に遅れている。しかし、最近、重要な臨床試験において、アルツハイマー病患者の脳内のAβ量を低減させることを目的とした剤が不成功に終わったことで、他の治療アプローチ(病的タウレベルを低減させるものを含む)を希求する必要性が強調される。
【００１３】
本発明の１つの目的は、神経変性疾患の治療又は予防に使用する組成物を提供することである。
本発明の別の１つの目的は、組織、CSF又は血液中の3-O-スルホトランスフェラーゼ２若しくは４の遺伝子若しくはタンパク質又はグリカン産物により、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を診断又は予後予測する方法を提供することである。
本発明の別の１つの目的は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を診断又は予後予測する前記方法を実施するためのキットを提供することである。
本発明の別の１つの目的は、3-OST-2及び/又は-4遺伝子の発現レベルを減少させるか、又は前記遺伝子若しくはその産物の活性を阻害する化合物により、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療又は予防する方法を提供することである。
本発明の更に別の１つの目的は、ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖のレベルを減少させる化合物により、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療又は予防する方法を提供することである。
本発明の更に別の１つの目的は、グルコサミン残基の３位で硫酸化したヘパラン硫酸のレベルを減少させる化合物により、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療又は予防する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の更に別の１つの目的は、タウタンパク質のリン酸化レベルを減少させる化合物により、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療又は予防する方法を提供することである。
本発明の更に別の１つの目的は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病のモジュレーターのインビトロスクリーニング方法を提供することである。
本発明の更に別の１つの目的は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病のモジュレーターのインビボスクリーニング方法を提供することである。
本発明の更に別の１つの目的は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療又は予防に使用し得る組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、以下：
ａ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つ、及び/又は
ｂ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ、及び/又は
ｃ)それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つ、及び/又は
ｄ)前記遺伝子又は前記転写産物又は前記翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び/又は
ｅ)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び/又は
ｆ)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルに、参照値と比較して、直接又は間接に影響する少なくとも１つの剤を含んでなる、神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)の治療又は予防に使用するための組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】
【発明を実施するための形態】
【００１７】
表現「活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響する少なくとも１つの剤」により、前記遺伝子及び/又は前記転写産物及び/又は前記翻訳産物の活性及び/又はヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸及び/又はタウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルに影響し得る独特な剤が理解される。
上記標的の少なくとも１つ、すなわち前記遺伝子及び/又は前記転写産物及び/又は前記翻訳産物及び/又はヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖及び/又はタウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルに影響し得る２以上の異なる剤もまた理解されるべきである。
【００１８】
本説明の全てにおいて：
用語ヘパリン硫酸又はヘパラン硫酸又はHSを使用することができ、これらは同義である。
3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖は、ヘパラン硫酸のヘパリナーゼＩ〜III消化後に得られる。
用語ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ(２又は４)又はヘパラン硫酸(グルコサミン) 3-O-スルホトランスフェラーゼ(２又は４)は同義である。両酵素は、3-OST-2及び3-OST-4又は3OST2及び3OST4、HS3ST2及びHS3ST4、h3-OST-2及びh3-OST-4；ヘパラン硫酸3-O-スルホトランスフェラーゼ２；ヘパラン硫酸3-O-スルホトランスフェラーゼ４；ヘパラン硫酸D-グルコサミニル 3-O-スルホトランスフェラーゼ２；ヘパラン硫酸D-グルコサミニル 3-O-スルホトランスフェラーゼ４；ヘパラン硫酸グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２；ヘパラン硫酸グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ４とも呼ばれる。
【００１９】
本明細書及び特許請求の範囲で使用する単数形態「a」、「an」及び「the」は、文脈がそうでないことを示していない限り、複数のものも含む。例えば、「a cell(細胞)」は複数の細胞も意味するという具合である。用語「及び/又は」は、本明細書及び特許請求の範囲で使用する場合、この語の前後の句が二者択一として選択されるもの又は組合せのいずれとしても見なされるべきことを意味する。例えば、「レベル及び/又は活性の測定」との記載は、レベルのみ若しくは活性のみ又はレベル及び活性の両方が測定されることを意味する。用語「レベル」は、本明細書中で使用する場合、転写産物、例えばmRNA、又は翻訳産物、例えばタンパク質若しくはポリペプチド、又は酵素活性の産物、例えば特異的硫酸化を有するグリカン構造体の量、量の程度又は濃度を含む意味である。用語「活性」は、本明細書中で使用する場合、生物学的効果を生じる転写産物若しくは翻訳産物又は酵素の能力の程度、或いは生物学的に活性な分子のレベルの程度、或いはグリカンから得られる特異的に硫酸化された配列又は二糖のレベルの程度として理解される。用語「活性」はまた、酵素活性或いは(結合、拮抗、抑制、ブロッキング又は中和をいう)生物活性及び/又は薬理活性もいう。用語「レベル」及び/又は「活性」は、本明細書中で使用する場合、更に、産生する産物の量で測定される遺伝子発現レベル若しくは遺伝子活性又は酵素活性レベルをいう。
【００２０】
遺伝子発現は、本明細書中で使用する場合、更に、遺伝子発現レベル又は遺伝子活性をいう。遺伝子発現は、遺伝子産物、タンパク質、ペプチド又はグリカンの産生を導く転写及び翻訳による、遺伝子に含まれる情報の利用として定義することができる。酵素活性は、本明細書中で使用する場合、更に、酵素産物の程度をいう。「調節不全」は、遺伝子発現のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを含む。遺伝子産物は、RNA又はタンパク質を含み、遺伝子の発現の結果である。グリカン分子における遺伝子産物は、タンパク質活性により導入される特定のグリコシド置換、例えば硫酸化のレベルを含む。遺伝子産物の量は、遺伝子がどの程度活性であるかを測定するために使用することができる。酵素産物の量は、酵素がどの程度活性であるかを測定するために使用することができる。用語「遺伝子」は、本明細書及び特許請求の範囲で使用する場合、コーディング領域(エキソン)及び非コーディング領域(例えば非コーディング調節エレメント、例えばプロモーター又はエンハンサー、イントロン、リーダー及びトレイラー配列)の両方を含む。遺伝子産物は、RNA又はタンパク質を含み、遺伝子発現の結果である。酵素活性は、酵素がどのように存在しているかを測定するために使用することができる。用語「ORF」は、「オープンリーディングフレーム」の頭文字であり、少なくとも１つのリーディングフレーム中に停止コドンを有さず、したがって場合によりアミノ酸配列に翻訳され得る核酸配列をいう。「調節エレメント」は、遺伝子発現を駆動、調節する誘導性及び非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーター及び他のエレメントを含む。
【００２１】
用語「フラグメント」は、本明細書中で使用する場合、例えばオルターナティブスプライシングされた、又は短縮された、又はその他切断された転写産物又は翻訳産物を含むという意味である。グリカン分子について、用語フラグメントは、本明細書中で使用する場合、グリカンを消化してオリゴ糖又はより短いフラグメントを生じる(二糖まで進行)内因性又は外因性酵素の作用によりインビボ又はインビトロで産生される任意のサイズのグリカンを含むという意味である。用語「誘導体」は、本明細書中で使用する場合、変異体、又はRNA編集(RNA-edited)、又は酵素消化産物又は化学的に改変されたか若しくはその他変更された翻訳産物をいう。明確性を目的として、例えば、誘導体転写物とは、核酸配列に変更(例えば、単一又は複数のヌクレオチドの欠失、挿入又は交換)を有する転写物をいう。「誘導体」は、変更されたリン酸化若しくはグリコシル化若しくはアセチル化若しくは脂質化又は変更されたシグナルペプチド切断若しくは他のタイプの成熟切断のようなプロセスで生成され得る。これらプロセスは翻訳後に起こり得る。
【００２２】
用語「モジュレーター」とは、本発明及び特許請求の範囲で使用する場合、遺伝子又は遺伝子転写産物又は遺伝子翻訳産物又は酵素産物のレベル及び/又は活性を変化又は変更させることができる分子をいう。好ましくは、「モジュレーター」は、遺伝子の転写産物又は翻訳産物の生物活性を変化又は変更させることができる分子である。モジュレーションは、例えば、生物活性及び/又は薬理活性及び/又は酵素活性の増加又は減少、結合特性の変化、又は遺伝子翻訳産物の生物学的機能性若しくは免疫学的性質における任意の他の変化又は変更であり得る。「モジュレーター」とは、酵素及び/又はイオンチャネルサブユニット又はイオンチャネルの機能的性質を増強又は阻害し、したがって「モジュレート」し、イオンチャネルサブユニットの結合、拮抗、抑制、ブロッキング、中和又は隔絶を「モジュレート」し、及び活性化、拮抗及びアップレギュレーションを「モジュレート」する能力を有する分子をいう。「モジュレーション」はまた、細胞の生物活性に影響する能力をいうためにも使用される。用語「モジュレーター」、「剤」、「試薬」又は「化合物」とは、細胞、組織、体液に対して又は任意の生物学的系若しくは試験する任意のアッセイ系に関して、正又は負の生物学的効果を有する任意の物質、化学物質、組成物又は抽出物をいう。これらは、標的のアゴニスト、アンタゴニスト、部分アゴニスト又はインバースアゴニストであり得る。これらは、核酸、天然若しくは合成のペプチド又はタンパク質複合体又は融合タンパク質、天然若しくは合成のグリカン又はグリカン模擬体、例えばヘパラン硫酸模擬体であり得る。これらはまた、抗体、有機若しくは無機の分子、又は組成物、小分子、薬剤及び前記剤のいずれかの任意の組合せであり得る。これらは、検査、診断又は治療目的に使用され得る。このようなモジュレーター、剤、試薬又は化合物は、細胞培養培地に存在する因子であり得る。
【００２３】
用語「オリゴヌクレオチドプライマー」又は「プライマー」とは、相補塩基対のハイブリダイゼーションにより標的ポリヌクレオチドを得られるようにアニールし得、ポリメラーゼにより伸長され得る短い核酸配列をいう。これらは、特定配列に特異的であるように選択されてもよく、ランダムに選択されてもよい(例えば、これらは混合物中の可能な全ての配列をプライムする)。本明細書中で使用するプライマーの長さは、10ヌクレオチドから300ヌクレオチドまで変化し得る。「プローブ」は、本明細書中で説明、開示された核酸配列又はこれと相補的な配列の短い核酸配列である。これらは、所与の配列の完全長配列又はフラグメント、誘導体、イソフォーム若しくは変異型を含み得る。「プローブ」とアッセイサンプルとの間のハイブリダイゼーション複合体を同定することで、当該サンプル内における他の類似配列の存在を検出することが可能になる。本明細書中で使用する場合、「ホモログ又は相同性」は、或るヌクレオチド又はペプチド配列と別のヌクレオチド又はペプチド配列との関連性を述べるために当該分野で使用される用語であり、これは、比較する配列同士間の同一性及び/又は類似性の程度によって決定される。当該分野において、用語「同一性」及び「類似性」は、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の関連性の程度を意味し、これは、クエリー配列と他の配列、好ましくは同じタイプの配列(核酸又はタンパク質配列)とを互いにマッチングさせることにより決定される。「同一性」及び「類似性」を計算して決定するに好適なコンピュータプログラム法としては、GCC BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)、BLASTN 2.0(Gixh W., http://blast.wustl.edu)、FASTA及びGCG GelMerge(これは、最も長いオーバーラップを有する一対のコンティグを決定して整列させる)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
用語「変異型」は、本明細書中で使用する場合、本発明で開示したポリペプチド及びタンパク質に言及するときは、本発明の天然型ポリペプチド又はタンパク質の天然型アミノ酸配列内で１以上のアミノ酸が付加及び/又はされている任意のポリペプチド又はタンパク質をいう。更に、用語「変異型」は、任意のより短い又はより長いバージョンのポリペプチド又はタンパク質を含む。「変異型」はまた、HS3ST2及びHS3ST4のアミノ酸配列(配列番号２及び配列番号４の配列)と少なくとも80％の配列同一性、より好ましくは少なくとも90％の配列同一性、より好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含む。タンパク質分子の「変異型」としては、例えば、高度保存領域に保存的アミノ酸置換を有するタンパク質が挙げられる。本発明の「タンパク質及びポリペプチド」としては、HS3ST2及び/又はHS3ST4のアミノ酸配列(配列番号２及び配列番号４の配列)を含んでなるタンパク質の変異型、フラグメント及び化学物質誘導体が挙げられる。代替塩基配列に起因して或るコドンが別のコドンで置換されているが、該DNA配列より翻訳されたアミノ酸配列は不変のままである配列バリエーションも含まれる。当該分野において公知のこの現象は、特定のアミノ酸に翻訳されるコドンセットの縮重と呼ばれる。機能性に対して効果を有さないアミノ酸の交換(例えば、リジンについてアルギニン、ロイシンについてバリン、グルタミンについてアスパラギン)もまた含まれる。天然から単離し又は組換え及び/若しくは合成手段により製造することができるタンパク質及びポリペプチドも含まれ得る。天然型タンパク質又はポリペプチドとは、天然に存在する短縮型又は分泌型、天然に存在する形態(例えばスプライス-変異型及び天然に存在する対立遺伝子変異型)をいう。
【００２５】
用語「単離(された)」は、本明細書中で使用する場合、変更されたか及び/又は天然環境から取り出され(すなわち、通常存在する組織、細胞又は生物から単離され)、天然では関連していることが見出されている共存成分から分離若しくは実質的に精製されている分子又は物質をいうとみなされる。これらは「非天然型」とも呼ばれる。この概念は、更に、この分子をコードする配列が天然状態では連結されていることがあり得ること及びこの分子が組換え及び/又は合成手段により産生され得る(非天然型)ことを意味する。前記目的のために、配列が当業者に公知の方法により生物又は非生物組織体中に導入され得る場合で、そのような配列が前記生物又は非生物組織体中に依然として存在する場合であっても、それらは依然として単離されており、非天然型であるとみなされる。本発明において、用語「リスク」、「感受性」及び「素因」は、同等であり、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を発症する確率に関して使用される。
【００２６】
用語「AD」はアルツハイマー病を意味する。「AD型神経障害」は、本明細書中で使用する場合、本発明に記載され、技術水準文献(Ballard Cら，Lancet 2011；377(9770):1019-1031)で一般に知られているように、神経病理学的、神経生理学的、組織病理学的及び臨床的特徴をいう。用語「Braakステージ」又は「Braakステージ決定」とは、Braak及びBraak(Braak H, Neurosci Lett. 1986；65:351-355)により提唱された基準に従う脳の分類をいう。神経原線維もつれ及びニューロパイル糸の分布に基づいて、ADの神経病理学的進行は６つのステージに分割される(ステージ０〜６)。本発明において、Braakステージ０〜２は健常コントロール個体(「コントロール」)を表し、Braakステージ４〜６はADに罹患した個体(「AD患者」)を表す。前記「コントロール」から得られた値は「既知の健康状態」を表す「参照値」であり、前記「AD患者」から得られた値は「既知の疾患状態」を表す「参照値」である。Braakステージ２は、健常コントロール個体又はAD患者を表し得る。Braakステージが高くなるほど、ADの症状を示す確率が高くなる。神経病理学的評価のために、すなわち、ADの病理学的変化が認知症の基礎原因である確率の推定のために、Braak Hによる推奨が提供されている(www.alzforum.org)。
【００２７】
本発明による神経変性疾患又は障害は、AD、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ピック病、前頭側頭型認知症、進行型核上性麻痺、皮質基底核変性症、脳血管性タウオパチー及び軽度認知障害を含む。神経変性プロセスに関与する病状は、例えば、加齢性黄斑変性、ナルコレプシー、運動ニューロン疾患及び外傷性神経傷害及び修復並びに多発性硬化症である。
プリオン病は、本発明の範囲には含まれない。
表現「ヘパラン硫酸」とは、タウタンパク質に結合し得るヘパラン硫酸及びタウタンパク質に結合しないヘパラン硫酸を含む総ヘパラン硫酸をいう。
特に、タウタンパク質に結合し得るヘパラン硫酸は、本質的に、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸からなる。
総タウタンパク質は、リン酸化タウタンパク質(凝集しているもの又はしていないもの)及び非リン酸化タウタンパク質を意味する。
【００２８】
本発明者らは、１つ又は２つの酵素(3-OST-2及び/又は3-OST-4)及び/又は3-O-硫酸化ヘパラン硫酸及び/又はタウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルのモジュレーションが神経変性疾患を治療又は予防し得ることを見出した。
【００２９】
本発明は、以下：
ａ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つ、及び/又は
ｂ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ、及び/又は
ｃ)それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つ、及び/又は
ｄ)前記遺伝子又は前記転写産物又は前記翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び/又は
ｅ)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び/又は
ｆ)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルに、参照値と比較して、直接又は間接に影響する少なくとも１つの剤を含んでなり、前記剤が以下：
ヘパラン硫酸、又は
タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響するとき、ヘパラン硫酸の活性及び/又はレベルとタウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルとの両方が前記剤により影響されるか、
又は、前記遺伝子、前記遺伝子の前記転写産物、前記遺伝子の前記翻訳産物又は前記遺伝子若しくは前記転写産物若しくは前記翻訳産物の前記フラグメント若しくは誘導体若しくは変異型から選択される少なくとも１つの他の要素の活性及び/又はレベルもまた影響される、神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)の治療又は予防に使用するための組成物に関する。
【００３０】
よって、この実施形態において、下記のリストに挙げられる幾つかの場合があり得る。すなわち、前記剤は、下記：
−ａ)、ｂ)、ｃ)又はｄ)から選択される１つの要素のみ(したがって、ｅ)のみ又はｆ)のみの活性及び/又はレベルは排除されることを意味する)；
−以下の組合せから選択される２つの要素：ａ-ｂ、ａ-ｃ、ａ-ｄ、ａ-ｅ、ａ-ｆ、ｂ-ｃ、ｂ-ｄ、ｂ-ｅ、ｂ-ｆ、ｃ-ｄ、ｃ-ｅ、ｃ-ｆ、ｄ-ｅ、ｄ-ｆ又はｅ-ｆ；
−以下から選択される３つの要素：ａ-ｂ-ｃ、ａ-ｂ-ｄ、ａ-ｂ-ｅ、ａ-ｂ-ｆ、ａ-ｃ-ｄ、ａ-ｃ-ｅ、ａ-ｃ-ｆ、ａ-ｄ-ｅ、ａ-ｄ-ｆ、ａ-ｅ-ｆ、ｂ-ｃ-ｄ、ｂ-ｃ-ｅ、ｂ-ｃ-ｆ、ｂ-ｄ-ｅ、ｂ-ｄ-ｆ、ｂ-ｅ-ｆ、ｃ-ｄ-ｅ、ｃ-ｄ-ｆ又はｄ-ｅ-ｆ；
−以下から選択される４つの要素：ａ-ｂ-ｃ-ｄ、ａ-ｂ-ｃ-ｅ、ａ-ｂ-ｃ-ｆ、ａ-ｃ-ｄ-ｅ、ａ-ｃ-ｄ-ｆ、ａ-ｄ-ｅ-ｆ、ｂ-ｃ-ｄ-ｅ、ｂ-ｃ-ｄ-ｆ、ｃ-ｄ-ｅ-ｆ；
−以下から選択される５つの要素：ａ-ｂ-ｃ-ｄ-ｅ、ａ-ｂ-ｃ-ｄ-ｆ、ａ-ｂ-ｄ-ｅ-ｆ、ａ-ｃ-ｄ-ｅ-ｆ；
−以下から選択される６つの要素：ａ-ｂ-ｃ-ｄ-ｅ-ｆ
の活性及び/又はレベルに影響する。
【００３１】
１つの有利な実施形態において、本発明は、以下：
ａ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つ、及び/又は
ｂ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ、及び/又は
ｃ)それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つ、及び
ｄ)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響する少なくとも１つの剤を含んでなり、神経変性疾患がアルツハイマー病である、神経変性疾患の治療又は予防に使用する上記組成物に関する。
【００３２】
本発明者らは、１つ又は２つの酵素(3-OST-2及び/又は3-OST-4)及び/又は3-O-硫酸化ヘパラン硫酸及び/又はタウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルのモジュレーションがアルツハイマー病を治療又は予防し得ることを更に見出した。
【００３３】
１つの有利な実施形態において、本発明は、以下：
ａ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つ、及び/又は
ｂ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ、及び/又は
ｃ)それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つ、及び
ｄ)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び
ｅ)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響する少なくとも１つの剤を含んでなり、神経変性疾患がアルツハイマー病である、神経変性疾患の治療又は予防に使用する上記組成物に関する。
【００３４】
１つの有利な実施形態において、本発明は、以下：
ａ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つ、及び/又は
ｂ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ、及び/又は
ｃ)それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つ、及び
ｄ)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖
の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響する少なくとも１つの剤を含んでなり、神経変性疾患がアルツハイマー病である、神経変性疾患の治療又は予防に使用する上記組成物に関する。
【００３５】
１つの有利な実施形態において、本発明は、タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響する１つの剤を含んでなり、神経変性疾患がタウオパチーである、神経変性疾患の治療又は予防に使用する上記組成物に関する。
タウオパチーでは、タウタンパク質の異常リン酸化は、タウタンパク質遺伝子における変異又は欠失の結果であり、3-OST-2及び-4遺伝子の発現は変化しない。
【００３６】
本発明者らは、タウタンパク質の異常リン酸化のレベルをモジュレートするか又は該レベルに影響する剤による、タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルのモジュレーションがアルツハイマー病を含むタウオパチーを治療又は予防し得ることを更に見出した。
１つの有利な実施形態において、本発明は、以下：
ａ)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び、
ｂ)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響する少なくとも１つの剤を含んでなり、神経変性疾患がタウオパチー、特にアルツハイマー病である、神経変性疾患の治療又は予防に使用する上記組成物に関する。
１つの有利な実施形態において、その活性及び/又はレベルが(タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルにも影響する)前記少なくとも１つの剤により影響される前記ヘパラン硫酸とは、タウタンパク質に結合し得るヘパラン硫酸をいう。
【００３７】
本発明者らは、タウタンパク質へのヘパラン硫酸の結合と競合し得る剤が、ヘパラン硫酸並びにタウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルをモジュレートするか又は該活性及び/又はレベルに影響し得、したがって細胞外へのリン酸化タウタンパク質の遊離、よって別の細胞へのリン酸化タウの拡散を防止することにより、タウオパチー、特にアルツハイマー病を治療し得ることを更に見出した。
【００３８】
１つの有利な実施形態において、本発明は、以下：
ａ)それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つ、及び
ｂ)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び
ｃ)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響する少なくとも１つの剤を含んでなり、神経変性疾患がタウオパチー、特にアルツハイマー病である、神経変性疾患の治療又は予防に使用する上記組成物に関する。
【００３９】
１つの有利な実施形態において、本発明は、以下：
ａ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つ、及び
ｂ)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び
ｃ)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響する少なくとも１つの剤を含んでなり、神経変性疾患がタウオパチー、特にアルツハイマー病である、神経変性疾患の治療又は予防に使用する上記組成物に関する。
【００４０】
１つの有利な実施形態において、本発明は、以下：
ａ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つ、及び/又は
ｂ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ、及び/又は
ｃ)それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つ、及び
ｄ)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖
の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響する少なくとも１つの剤を含んでなり、神経変性疾患がアルツハイマー病である、神経変性疾患の治療又は予防に使用する上記組成物に関する。
【００４１】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記少なくとも１つの剤が、以下：
ａ)約2000ダルトン〜約20,000ダルトン、好ましくは約20,000ダルトンの分子量を有する多糖又はオリゴ糖、特にヘパラン硫酸模擬体、例えばF6分子、D6、D4、E5、CR36、HM 100若しくはHM 2602、又はフコイダン若しくはペントサンポリ硫酸、又は特にペンタサッカリド、例えばArixtra(登録商標)(フォンダパリヌクス)、フコイダン若しくはペントサンポリ硫酸、及び/又は低分子量ヘパリン、例えばエノキサパリン(Lovenox(登録商標))、及び/又は超低分子量ヘパリン、及び/又は
ｂ)オリゴヌクレオチド、特にsiRNA、例えば配列番号71で示されるセンスsiRNA及び配列番号72で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号73で示されるセンスsiRNA及び配列番号74で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号75で示されるセンスsiRNA及び配列番号76で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号77で示されるセンスsiRNA及び配列番号78で示されるアンチセンスsiRNAからなるリストより選択されるsiRNA、又はモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド、特に配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び/又は
ｃ)小分子、ヘパリン及びヘパラン硫酸作用のインヒビター、例えばプロタミン又は硫酸プロタミン
からなる群より選択される、神経変性疾患の治療又は予防に使用する上記組成物に関する。
【００４２】
前記少なくとも１つの剤は多糖又はオリゴ糖であり得、これら用語は、経口、静脈内、舌下及び/又は経鼻投与により遺伝子産物のオリゴ糖又は多糖競合体の適用をいう。一般に、グリカン療法は、HSアナログ、例えば種々のサイズ及び置換を有するデキストラン誘導体、例えばWO00/05270に引用されているもの、又はカルボキシレート及び/又はスルフェート及び/又は疎水性部分が導入されている種々のサイズのフコイダン誘導体、更にペントサンポリ硫酸及び他の天然のグリコサミノグリカン、例えばヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸(-Ａ、-Ｂ、-Ｃ、-Ｄ、-Ｅ)、ケラタン硫酸(Masato Hasegawaら，J Biol. Chem. Vol. 272, No. 52, pp. 33118-33124, 1997)の使用をベースにする。このようなグリカンは、標的遺伝子の産物の分子置換体として及び/又は内因性タンパク質活性のモジュレーターとして及び/又は標的遺伝子の産物の競合体として作用する。
このようなグリカンは、単独で又は好ましくは他の療法、例えば遺伝子療法と組み合わせて投与することができる。標的遺伝子の内因性多糖又はオリゴ糖産物を模倣し及び/又はこれと競合し及び/又はこれと置き換わることができる生物学的に活性な硫酸化多糖又はオリゴ糖誘導体の製造は報告されている(WO00/05270)。この製造方法としては、種々のサイズのデキストラン、セルロース又は他のグリカン若しくはポリアルコールにカルボキシレート及び/又はスルフェート及び/又は疎水性部分を導入することが挙げられる(WO00/05270)。
多糖又はオリゴ糖はまた、低分子量のヘパリン、例えばエノキサパリン(Lovenox(登録商標))、又は超低分子量ヘパリンであり得る。
【００４３】
用語ヘパラン硫酸模擬体(HM)とは、下記一般式(Ｉ)のグリコサミノグリカン(GAG)模倣分子のフラグメントをいう：
【化１】
0006336909.tif 000002
(式中：
ｎは１〜10,000、特に１〜200の間の整数を表し、
Ｒは、SO3-、CH2CO2又は-CH2CONHX(ここで、NHXは、直鎖又は分岐鎖のC1〜C10アルキルアミン、特にｎ-オクチルアミン又はｔ-オクチルアミン、ベンジルアミン、カルボン酸部分でアルキル又はベンジルでエステル化されているか又はされていないアミノ酸(Ｌ、Ｄ又はラセミ)、特にＬ-フェニルアラニンメチルエステル(L-Phe(OMe))又はＬ-チロシンメチルエステル又はＬ-ヒスチジンメチルエステル又はそれらの対応するＤ-アナログを表す)を表す)。
HMは、Papy-Garciaら(Papy-Garcia Dら，Macromolecules, 2005, 38, 4647-4654)に記載されているように、種々の分子量を有するデキストラン分子、特にデキストランT40、T10又はT5(それぞれ、MW＝40000、10000又は5000)から製造することができる。
【００４４】
具体的には、ヘパラン硫酸模擬体とは、
ｎが１〜50、特に１〜40、特に１〜30、特に１〜20、特に１〜10の間の整数を表し、
Ｒが、上記のとおりであり、ここで、NHXはベンジルアミン又はアミノ酸、例えばL-Phe(OMe)であり、
置換度が以下：0.2〜1.5CM、０〜0.5(ベンジルアミン又はAA)、0.2〜1.5Ｓ(ここで、CMはカルボキシメチル基に相当し(20〜150％含量が可能)、Ｓはスルフェート基に相当し(20〜150％含量が可能)；ベンジルアミン又はAA(アミノ酸)に相当する(0〜50％置換が可能))である上記式(Ｉ)をいう。
【００４５】
具体的には、HMは、以下のものに対応する：
−  F6分子(T5から製造、NHX＝L-Phe(OMe))、これは以下の置換度を有する：
0.61CM、0.15L-Phe(OMe)、0.7Ｓ
−  D4分子(T10から製造)、これは以下の置換度を有する：
0.75CM、0.2Ｓ；
ここで、CMはカルボキシメチル基に相当し(75％；20〜150％含量が可能)、Ｓはスルフェート基に相当し(20％；20〜150％含量が可能)；L-Phe(OMe)は０％で存在する(０〜50％置換が可能)
−  E5分子(T10から製造)、これは以下の置換度を有する：
0.5CM、1.0Ｓ
ここで、CMはカルボキシメチル基に相当し(50％；20〜150％含量が可能)、Ｓはスルフェート基に相当し(100％；20〜150％含量が可能)；L-Phe(OMe)は０％で存在する(０〜50％置換が可能)
−  D6分子(T0.5から製造、NHX＝L-Phe(OMe))、これは以下の置換度を有する：
0.60CM、0.2L-Phe(OMe)、1.2Ｓ
ここで、CMはカルボキシメチル基に相当し(60％；20〜150％含量が可能)、Ｓはスルフェート基に相当し(120％；20〜150％含量が可能)；L-Phe(OMe)は20％で存在する(０〜50％置換が可能)
ここで、CMはカルボキシメチル基に相当し(61％；20〜150％含量が可能)、Ｓはスルフェート基に相当し(70％；20〜150％含量が可能)；L-Phe(OMe)は15％で存在する(０〜50％置換が可能)
【００４６】
−  CR 36分子(T10から製造、NHX＝L-Phe(OMe))、これは以下の置換度を有する：
0.59CM、0.22L-Phe(OMe)、0.83Ｓ
ここで、CMはカルボキシメチル基に相当し(59％；20〜150％含量が可能)、Ｓはスルフェート基に相当し(83％；20〜150％含量が可能)；L-Phe(OMe)は22％で存在する(０〜50％置換が可能)
−  HM100(フコイダン)  0.50CM、0.20Ac、１Ｓ(Ac＝アセテート基)
ここで、CMはカルボキシメチル基に相当し(50％；20〜150％含量が可能)、Ｓはスルフェート基に相当し(100％；20〜150％含量が可能)；アセテート基は10％で存在する(０〜50％置換が可能)
−  HM 2602(T40から製造、NHX＝ベンジルアミン)、これは以下の置換度を有する
0.88CM、0.20ベンジルアミン、0.66Ｓ
ここで、CMはカルボキシメチル基に相当し(88％；20〜150％含量が可能)、Ｓはスルフェート基に相当し(66％；20〜150％含量が可能)；ベンジルアミド基は20％で存在する(０〜50％置換が可能)。
【００４７】
用語ペンタサッカリドとは、５つのグリコシド単位から構成され、硫酸化されている合成ヘパリン模擬体、例えばアンチトロンビンに結合し得るヘパリンの部分という。
具体的には、前記ペンタサッカリドは、以下の式のArixtra(登録商標)(フォンダパリヌクス)である：
【化２】
0006336909.tif 000003
【００４８】
前記多糖、オリゴ糖又はペンタサッカリドは、ヘパリン硫酸又は3-O-硫酸化ヘパリン硫酸と競合し得、内因性脳GAGより良好な親和性でタウタンパク質に結合して、タウタンパク質の異常リン酸化を低減させ得る。
よって、前記多糖、オリゴ糖又はペンタサッカリドは、タウオパチー及びアルツハイマー病を治療し得る。
前記多糖、オリゴ糖又はペンタサッカリドは、約1.5mg/Kg〜約50mg/Kgの間の用量で静脈内経路により、又は別の経路、例えば経口経路により約50mg/kg〜約500mg/kg、特に100〜200mg/kgの用量で、又はi.vで該経路に適切な投薬量で投与することができる。
１つの有利な実施形態において、前記多糖、オリゴ糖又はペンタサッカリドは、約100mg〜約3.5ｇの間の日用量で静脈内経路により、又は別の経路、例えば経口経路により約3.5ｇ〜約50ｇ、特に7.5〜15ｇの日用量で、又はi.pなどで該経路に適切な投薬量で投与することができる。
【００４９】
前記少なくとも１つの剤はまた、オリゴヌクレオチドであり得、この用語は、配列番号１及び３で示される遺伝子の発現に干渉し得るsiRNA(例えば上記のもの)、少なくとも１つのmiRNA、上記siRNAの１つのセンス配列及び１つのアンチセンスを含んでなる少なくとも１つのshRNA、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれらの組合せを指称し、これは、3-OST-2又は-4遺伝子をサイレンシングして前記遺伝子発現を改変又はブロックし得る。
よって、前記遺伝子の転写は、当初の値の少なくとも50％減少するか、又は完全にブロックされ、翻訳も同様であり、3-OST-2及び-4レベルの減少をもたらし、よって異常リン酸化タウタンパク質の減少をもたらす。
小ヘアピンリボ核酸(shRNA)は、リンカーにより連結されたセンス鎖及びアンチセンス鎖のsiRNAを含んでなる二本鎖分子である。これら分子はヘアピンを形成し、リンカーが除去されてsiRNAが遊離される。
１つの有利な実施形態において、前記shRNAは、該shRNAの発現を可能にする核酸配列を含んでなるベクター中に含まれる。
【００５０】
有利な実施形態において、本方法は、前記剤を投与するために、それ自体公知の遺伝子療法及び/又はアンチセンス核酸技術の方法を適用することを含んでなる。一般に、遺伝子療法は幾つかのアプローチを含む：変異遺伝子の分子置換、治療用タンパク質の合成を生じる新たな遺伝子の作製、及び組換え発現法又は薬剤による内因性細胞遺伝子発現のモジュレーション。遺伝子移入技法は詳細に記載されており(例えば、Behr Acc Chem Res 1993, 26: 274-278及びMulligan, Science 1993, 260: 926-931)、これには、(組換えウイルス、特にレトロウイルス及びレンチウイルスベクターのような)生物学的ベクター若しくはモデルリポソームを用いる直接遺伝子移入技法、或いはポリカチオンとのDNA共沈、化学物質(溶媒、界面活性剤、ポリマー、酵素)若しくは物理的手段(機械的、浸透圧性、熱的、電気的ショック)による細胞膜摂動又は細胞膜透過性ペプチドを用いるトランスフェクションをベースにする技法が含まれる。中枢神経系への出生後遺伝子移入は詳細に記載されている(例えば、Wolff, Curr opin neurobiol 1993, 3:743-748を参照)。
【００５１】
具体的には、本発明は、アンチセンス核酸療法により、すなわち、或る特定の決定的に重要な細胞へのアンチセンス核酸又はその誘導体の導入による不適切に発現した遺伝子又は欠陥遺伝子のダウンレギュレーション(例えば、Gillespie, DN&P 1992, 5: 389-395；Agrawal and Akhtar, Trends Biotechnol 1995, 13: 197-199；Crooke, Biotechnology 1992, 10: 882-6を参照)により神経変性疾患を治療又は予防する方法を特色とする。ハイブリダイゼーションストラテジとは別に、リボザイム、すなわち酵素として作用するRNA分子、疾患のメッセージを運ぶ破壊性RNA(destroying RNA)の適用もまた記載されている(例えば、Barinaga, Science 1993, 262: 1512-1514を参照)。好適な実施形態において、治療用アンチセンス核酸又はその誘導体は、HS3ST2及び/又はHS3ST4をコードする遺伝子の転写物を指向する。対象者の中枢神経系、好ましくは脳の細胞をこのように治療することが好適である。細胞透過は、公知のストラテジ、例えばアンチセンス核酸及びその誘導体とキャリア粒子又は上記技法とを組み合わせることにより行うことができる。標的付けられた治療用オリゴデオキシヌクレオチドの投与ストラテジは、当業者に公知である(例えば、Wickstrom, Trends Biotechnol 1992, 10:281-287を参照)。幾つかの場合において、送達は、単に、頭蓋内(脳室内)適用により行うことができる。更なるアプローチは、アンチセンスRNAの細胞内発現に向けられる。このストラテジにおいて、細胞を、エキソビボで、標的核酸の或る領域に相補的なRNAの合成を導く組換え遺伝子で形質転換する。細胞内発現したアンチセンスRNAの治療的使用は、遺伝子療法と手続き上類似する。二本鎖RNAを使用して遺伝子の細胞内発現を調節するために最近開発された方法(RNA干渉(RNAi)としても知られる)は、核酸療法の別の効果的アプローチであり得る(Hannon, Nature 418: 244-251)。
【００５２】
よって、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病又はアルツハイマー病とは異なるタウオパチーの治療は、ベクター又はエキソソームにより前記オリゴヌクレオチドを投与する遺伝子療法で行うことができる(van den Boorn JGら，Nat Biotechnol. 2011 Apr;29(4):325-6)。
アルツハイマー病の治療はまた、第１療法として遺伝子療法を、第２療法として細胞回復を誘導する細胞外媒体のヘパリン模擬体による保護を含んでなる二重療法で行うことができる。
前記オリゴヌクレオチドは、0.1〜１mMの用量、特に0.5mMで、静脈内経路又は脳室内経路により投与することができる。
前記オリゴヌクレオチドはまた、別の経路、例えば経口経路、i.p.経路などにより、当該経路に適切な投薬量で投与することができる。
【００５３】
前記少なくとも１つの剤はまた、小分子であり得、この表現により、ヘパリン及びヘパラン硫酸作用を阻害し得る分子が理解される。これは、タウタンパク質に立体構造変化を誘導してタウタンパク質の異常リン酸化をもたらすヘパリンの能力を阻害する。
プロタミン又は硫酸プロタミンはアルギニンに富む小さい核タンパク質であり、静脈内投与後に即時に作用するヘパリンのアンタゴニストである。
他の3-O-硫酸化インヒビター又はヘパラン硫酸スルホトランスフェラーゼインヒビター、特にRazi, Nら(J Biol Chem 1995, 270, 11267-75)；Rath, V. L.ら(Drug Discov Today 2004, 9, 1003-11)又はSeko, A.ら(J Inorg Biochem 2009, 103, 1061-6)に記載のものを、この実施形態において使用することができる。
US20100048638に記載されるヘパラン硫酸及びヘパラン硫酸スルホトランスフェラーゼのインヒビターもまた使用することができる。
【００５４】
１つの有利な実施形態において、本発明は、
前記少なくとも１つの剤が、以下：
ａ)上記式(Ｉ)のヘパラン硫酸模擬体、特に式(II)のヘパラン硫酸模擬体、特にF6分子、CR36、HM 100又はHM 2602、又はフコイダン若しくはペントサンポリ硫酸、又はペンタサッカリド、例えばArixtra(登録商標)(フォンダパリヌクス)、フコイダン若しくはペントサンポリ硫酸、及び/又は低分子量ヘパリン、例えばエノキサパリン(Lovenox(登録商標))、及び/又は超低分子量ヘパリン、及び/又は
ｂ)siRNA、例えば配列番号71で示されるセンスsiRNA及び配列番号72で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号73で示されるセンスsiRNA及び配列番号74で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号75で示されるセンスsiRNA及び配列番号76で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号77で示されるセンスsiRNA及び配列番号78で示されるアンチセンスsiRNAからなるリストより選択されるsiRNA、又はモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド、特に配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び/又は
ｃ)小分子、プロタミン又は硫酸プロタミンからなる群より選択されるヘパリン及びヘパラン硫酸作用のインヒビター
からなる群より選択される、神経変性疾患の治療又は予防に使用する上記組成物に関する。
【００５５】
別の１つの観点において、本発明は、以下：
ａ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリングルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つ、及び/又は
ｂ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ、及び/又は
ｃ)それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つ、及び/又は
ｄ)前記遺伝子又は前記転写産物又は前記翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び/又は
ｅ)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び/又は
ｆ)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
のレベル及び/又は活性を、対象者から事前に得た生物学的流体サンプルにおいて測定し、前記レベル及び/又は前記活性を、既知の疾患又は健康状態を表すそれぞれの参照値と比較することを含んでなり、
前記遺伝子及び/又は前記転写産物及び/又は前記翻訳産物及び/又は前記ヘパラン硫酸、特に前記3-O-硫酸化ヘパラン硫酸及び/又は前記タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の少なくとも１つのレベル及び/又は活性が対象者サンプル中で上昇していることが神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)を示すか又は前記神経変性疾患を発症するリスクを示す、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するためのインビトロ方法に関する。
【００５６】
よって、本発明者らは、神経変性疾患、特にアルツハイマー病では、3-OST-2(HS3ST2)及び/又は3-OST-4(HS3ST4)遺伝子の発現レベルが高度に上昇しており、よって3-O-硫酸化したHS又はヘパリン様HS構造物がより多くなることを見出した。
このように、配列番号１及び３で示される遺伝子の一方又は両方のレベル及び/又は活性が上昇しており、また、前記遺伝子の転写産物の一方又は両方のレベル及び/又は活性も、同様に前記遺伝子の翻訳産物、すなわち、配列番号２及び４で示されるタンパク質の一方又は両方のレベル及び/又は活性も上昇している。
3-OST-2及び-4は、ヘパラン硫酸の3-O-硫酸化を担うので、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベルもまた高度に上昇し、タウタンパク質の異常リン酸化をもたらすタウタンパク質の立体構造変化が誘導される。
よって、これら構成要素の少なくとも１つのレベル及び/又は活性が生物学的流体において参照値と比較して上昇していることの検出により、神経変性疾患、特にアルツハイマー病又はアルツハイマー病とは異なるタウオパチーの診断又は予後予測がもたらされる。
【００５７】
１つの有利な実施形態において、生物学的流体は、任意の細胞培養物、特にニューロンの初代培養物の細胞外媒体であり、また血液、血漿、血清、尿又は脳脊髄液(CSF)でもある。
好適な実施形態において、HS3ST2及び/又はHS3ST4をコードする遺伝子の転写産物レベルの測定は、対象者から得たサンプルにおいて、対象者サンプルから抽出したRNAの逆転写により得たcDNAから該遺伝子特異配列を増幅するプライマーの組合せを使用して定量的PCR分析で行う。プライマーの組合せは本発明の「実施例」に示されるが、本発明に開示した配列から作製される他のプライマーもまた使用することができる。前記遺伝子に特異的なプローブを用いるノーザンブロットもまた適用可能である。チップベースのマイクロアレイ技術により転写産物を測定することが好適であり得る。これら技法は当業者に公知である(Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001；Schena M., Microarray Biochip technology, Eaton Publishing, Natick, MA, 2000を参照)。
【００５８】
更に、HS3ST2及び/又はHS3ST4をコードする遺伝子の翻訳産物又は該翻訳産物のグリカン産物及び/又は該翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型のレベル及び/又は活性は、イムノアッセイ、活性アッセイ、クロマトグラフアッセイ、分光アッセイ、例えば質量分析、及び/又は結合アッセイを用いて検出することができる。これらアッセイは、前記タンパク質分子と抗タンパク質抗体との間の結合量を、抗タンパク質抗体又は該抗タンパク質抗体に結合する二次抗体のいずれかに付着した酵素、クロモ力学、放射活性、磁性又は発光標識を用いて測定することができる。加えて、他の高親和性リガンドも使用し得る。使用し得るイムノアッセイとしては、例えばELISA、ウェスタンブロット及び当業者に公知の他の技法が挙げられる(Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999、及びEdwards R, Immunodiagnostics: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford；England, 1999を参照)。これら全ての検出技法はまた、マイクロアレイ、タンパク質アレイ、抗体マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、電子工学的バイオチップ又はタンパク質チップベース技術の形式で用い得る(Schena M., Microarray Biochip Technology, Eaton Publishing, MA, 2000を参照)。
【００５９】
１つの有利な実施形態において、前記疾患の進行をモニターするために、対象者から或る期間にわたって採取した一連のサンプルにおいて、(ｉ)HS3ST2及び/又はHS3ST4をコードする遺伝子の転写産物、及び/又は(ii)HS3ST2及び/又はHS3ST4をコードする遺伝子の翻訳産物、及び/又は(iii)前記転写若しくは翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び/又は(iv)HS3ST2及び/又はSH3ST4をコードする遺伝子の翻訳産物に由来するグリカン産物又はこのグリカン産物のフラグメントのレベル若しくは活性又はレベル及び活性の両方を比較する。更に好適な実施形態において、前記対象者は、前記サンプルの１以上を集める前に治療を受ける。更に別の好適な実施形態において、前記レベル及び/又は活性は対象者の治療の前後に測定する。
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病を含むタウオパチーである上記インビトロ方法に関する。
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患が上記タウオパチーであり、タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質のレベルがそれぞれの参照値に比べて少なくとも10％上昇しているインビトロ方法に関する。
【００６０】
参照値は、タウオパチーにも、別の神経変性疾患にも、タウタンパク質の異常リン酸化のレベルに影響する疾患にも罹患していない患者で得られた値で与えられる。
参照値は、種々の形態をとり得る。参照値は、単一のカットオフ値、例えばメジアン若しくは平均、又は集団の75分位、90分位、95分位若しくは99分位であり得る。参照値は、比較群に基づいて確立することができ、例えば、或る規定群におけるリスクは別の規定群におけるリスクの２倍であるという具合である。参照値は範囲であり得、例えば検査集団は幾つかの群(例えば、低リスク群、中リスク群及び高リスク群)に等分(又は不等分)されるか、又は四等分される(第１四分位はリスクが最も低い個体群であり、第４四分位はリスクが最も高い個体群である)。
所定値は、選択した特定の集団の間で、習慣、民族性、遺伝学などに依存して変化し得る。
【００６１】
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化は参照値と比較して少なくとも20％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化は参照値と比較して少なくとも30％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化は参照値と比較して少なくとも40％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化は参照値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化は参照値と比較して少なくとも60％上昇している。
【００６２】
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化は参照値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化は参照値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化は参照値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化は参照値と比較して少なくとも100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は、参照値と比較して少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又は100％上昇しており、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は、前記それぞれの参照値と比較して少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又は100％上昇している。
【００６３】
１つの有利な実施形態において、本発明は、以下：
ａ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパラン硫酸グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つ、及び/又は
ｂ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ、及び/又は
ｃ)それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つ、及び/又は
ｄ)前記遺伝子又は前記転写産物又は前記翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び/又は
ｅ)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び/又は
ｆ)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
のレベル及び/又は活性を、対象者から事前に得た生物学的流体サンプルにおいて測定し、前記レベル及び/又は前記活性を、既知の疾患又は健康状態を表すそれぞれの参照値と比較することを含んでなり、
但し、測定された活性及び/又はレベルが以下：
ヘパラン硫酸、又は
タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
のものであるとき、ヘパラン硫酸の活性及び/又はレベルとタウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルとの両方が測定されるか、又は
前記遺伝子、前記遺伝子の前記転写産物、前記遺伝子の前記翻訳産物又は前記遺伝子若しくは前記転写産物若しくは前記翻訳産物の前記フラグメント若しくは誘導体若しくは変異型から選択される少なくとも１つの他の要素の活性及び/又はレベルもまた測定され、
前記遺伝子及び/又は前記転写産物及び/又は前記翻訳産物及び/又は前記ヘパラン硫酸、特に前記3-O-硫酸化ヘパラン硫酸及び/又は前記タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の少なくとも１つのレベル及び/又は活性が対象者サンプル中で上昇していることが神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)を示すか又は前記神経変性疾患を発症するリスクを示す、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するためのインビトロ方法に関する。
【００６４】
よって、この実施形態において、下記のリストに挙げられる幾つかの場合があり得る。すなわち、前記活性及び/又はレベルの測定は、下記：
−ａ)、ｂ)、ｃ)又はｄ)から選択される１つの要素のみ(したがって、ｅ)のみ又はｆ)のみの活性及び/又はレベルは排除されることを意味する)；
−以下の組合せから選択される２つの要素：ａ-ｂ、ａ-ｃ、ａ-ｄ、ａ-ｅ、ａ-ｆ、ｂ-ｃ、ｂ-ｄ、ｂ-ｅ、ｂ-ｆ、ｃ-ｄ、ｃ-ｅ、ｃ-ｆ、ｄ-ｅ、ｄ-ｆ又はｅ-ｆ；
−以下から選択される３つの要素：ａ-ｂ-ｃ、ａ-ｂ-ｄ、ａ-ｂ-ｅ、ａ-ｂ-ｆ、ａ-ｃ-ｄ、ａ-ｃ-ｅ、ａ-ｃ-ｆ、ａ-ｄ-ｅ、ａ-ｄ-ｆ、ａ-ｅ-ｆ、ｂ-ｃ-ｄ、ｂ-ｃ-ｅ、ｂ-ｃ-ｆ、ｂ-ｄ-ｅ、ｂ-ｄ-ｆ、ｂ-ｅ-ｆ、ｃ-ｄ-ｅ、ｃ-ｄ-ｆ又はｄ-ｅ-ｆ；
−以下から選択される４つの要素：ａ-ｂ-ｃ-ｄ、ａ-ｂ-ｃ-ｅ、ａ-ｂ-ｃ-ｆ、ａ-ｃ-ｄ-ｅ、ａ-ｃ-ｄ-ｆ、ａ-ｄ-ｅ-ｆ、ｂ-ｃ-ｄ-ｅ、ｂ-ｃ-ｄ-ｆ、ｃ-ｄ-ｅ-ｆ；
−以下から選択される５つの要素：ａ-ｂ-ｃ-ｄ-ｅ、ａ-ｂ-ｃ-ｄ-ｆ、ａ-ｂ-ｄ-ｅ-ｆ、ａ-ｃ-ｄ-ｅ-ｆ；
−以下から選択される６つの要素：ａ-ｂ-ｃ-ｄ-ｅ-ｆ
からなる。
【００６５】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がタウオパチーであり、前記生物学的流体がCSFであり、対象者における以下：
ａ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される前記遺伝子、及び
ｂ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の前記転写産物、及び
ｃ)配列番号２及び４でそれぞれ示される前記遺伝子の前記翻訳産物、及び
ｄ)前記遺伝子又は前記転写産物又は前記翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び
ｅ)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖
の活性及び/又はレベルがそれぞれの参照値と実質的に同じであり、
タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルが対象者においてそれぞれの参照値と比較して上昇しており、特に少なくとも10％上昇している上記インビトロ方法に関する。
【００６６】
アルツハイマー病以外のタウオパチーにおいて、異常なタウのリン酸化は、MAPT遺伝子における変異又は欠失に起因し、この変異又は欠失がタウタンパク質の異常リン酸化を誘導し、この場合、3-OSTの増加は観察されない。散発性アルツハイマー病では、タウタンパク質に変異又は欠失は存在せず、3-OSTの増加が観察される。よって、3-OSTの検出により、遺伝性タウオパチー及び散発性アルツハイマー病を含む認知症間の鑑別的診断及び/又は予後予測が可能になる。
よって、上記他の構成要素のいずれについても上昇したレベル及び/又は活性が検出されず、タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質のみが検出されることで、アルツハイマー病以外のタウオパチーの鑑別的診断及び/又は予後予測が可能になる。
表現「実質的に同じ」は、測定レベルが、選択した特定の集団の間での、習慣、民族性、遺伝学などに依存する個体変動に起因して、参照値に対して変動し得ることを意味する。したがって、測定レベルは、参照値の±10％、±５％又は±2.5％であり得る。
【００６７】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病である上記インビトロ方法に関する。
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病であり、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇している上記インビトロ方法に関する。
この実施形態において、3-OST-2遺伝子のみが前記疾患に関与し、3-OST-4遺伝子のレベルは実質的に変化しない。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400％上昇している。
【００６８】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病であり、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇している上記インビトロ方法に関する。
この実施形態において、3-OST-4遺伝子のみが前記疾患に関与し、3-OST-2遺伝子のレベルは実質的に変化しない。
１つの有利な実施形態において、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400％上昇している。
【００６９】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病であり、リアルタイムPCRで測定するとき、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルが少なくとも100％上昇し、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルが少なくとも100％上昇している上記インビトロ方法に関する。
この実施形態において、3-OST-2及び3-OST-4遺伝子の両方が前記疾患に関与している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400％上昇している。
【００７０】
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400％上昇している。
【００７１】
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400％上昇している。
【００７２】
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400％上昇している。
【００７３】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病であり、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも50％上昇している上記インビトロ方法に関する。。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも100％上昇している。
【００７４】
ヒトCSF中の3-OST-2の基礎値は60pg/mlである。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも100％上昇している。
【００７５】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病であり、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50％上昇している上記インビトロ方法に関する。
１つの有利な実施形態において、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも100％上昇している。
【００７６】
ヒトCSF中の3-OST-4の基礎値は60pg/mlである。
１つの有利な実施形態において、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも100％上昇している。
【００７７】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病であり、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ELISA又はウェスタンブロットで測定するとき少なくとも50％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50％上昇している上記インビトロ方法に関する。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇している。
【００７８】
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇している。
【００７９】
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇している。
【００８０】
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇している。
【００８１】
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇している。
【００８２】
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇している。
【００８３】
１つの有利な実施形態において、3-OST-2の参照値はヒトCSF中の3-OST-2の基礎値で、60pg/mlであり、3-OST-4の参照値はヒトCSF中の3-OST-2の基礎値で、60pg/mlである。
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病であり、
配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇しており、及び/又は
配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇しており、及び/又は
配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは少なくとも50％上昇しており、及び/又は
配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50％上昇しており、
ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性を測定することを更に含んでなり、前記レベル及び/又は活性が参照値と比較して少なくとも50％上昇していることがアルツハイマー病を示す上記インビトロ方法に関する。
【００８４】
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して100％上昇している。
【００８５】
コントロールヒト海馬中のヘパラン硫酸の基礎レベルはジメチルメチレンブルー(DMMB)アッセイ(Huynhら Neurobiol Aging. 2012 33(5):1005.e11-22)で測定するとき、約0.5μg/mg湿潤組織である。
参照値は基礎レベルであると考えると、アルツハイマー病における前記レベルは海馬及び皮質において少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬及び皮質において基礎レベル及び/又は活性と比較して60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬及び皮質において基礎レベル及び/又は活性と比較して70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬及び皮質において基礎レベル及び/又は活性と比較して80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬及び皮質において基礎レベル及び/又は活性と比較して90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬及び皮質において基礎レベル及び/又は活性と比較して100％上昇している。
【００８６】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病であり、
配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇しており、及び/又は
配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇しており、及び/又は
配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは少なくとも50％上昇しており、及び/又は
配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50％上昇しており、
タウタンパク質に結合し得るヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性を測定することを更に含んでなり、前記レベル及び/又は活性が参照値と比較して少なくとも50％上昇していることがアルツハイマー病を示す上記インビトロ方法に関する。
幾つかの硫酸化グリコサミノグリカン及び模擬体は、タウに結合することができ、これらには、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸及び他の化学合成の硫酸化多糖、例えばデキストラン硫酸及びペントサン硫酸が含まれる。
【００８７】
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して110％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して120％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して130％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して140％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して150％以上上昇している。
【００８８】
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は、ヒトの海馬、皮質、CSF又は血液において測定される。
コントロールヒト海馬中のヘパラン硫酸の基礎レベルは、Huynhら(Neurobiol Aging. 2012 33(5):1005.e11-22)に記載されるジメチルメチレンブルー(DMMB)アッセイで測定するとき、約0.5μg/mg湿潤組織である。
よって、参照値は基礎レベルであると考えると、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は、アルツハイマー病において、海馬で50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して110％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して120％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して130％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して140％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して150％以上上昇している。
【００８９】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病であり、
配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇しており、及び/又は
配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇しており、及び/又は
配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは少なくとも50％上昇しており、及び/又は
配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50％上昇しており、
3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性を測定することを更に含んでなり、前記レベルが参照値と比較して少なくとも50％上昇していることがアルツハイマー病を示す上記インビトロ方法に関する。
【００９０】
よって、本発明者らは、ヘパラン硫酸のなかでも、特にタウタンパク質に結合し得るヘパラン硫酸、3-O-硫酸化-ヘパラン硫酸が高度に上昇しており、よってアルツハイマー病の診断が可能になることを見出した。
アルツハイマー病における前記上昇は、海馬、皮質、CSF及び血液で観察される。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して110％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して120％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して130％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して140％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して150％以上上昇している。
【００９１】
コントロールヒト海馬中の3-O-硫酸化ヘパラン硫酸の基礎レベルは、ジメチルメチレンブルー(DMMB)アッセイで測定するとき、約１ng/mg湿潤組織である。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して110％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して120％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して130％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して140％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して150％以上上昇している。
【００９２】
１つの有利な実施形態において、前記3-O-硫酸化ヘパラン硫酸は、トリ硫酸化GlcA2S/IdoA2S-GlcNS3S及びテトラ硫酸化GlcA2S/IdoA2S-GlcNS3S6S単位形態(これらは、ヘパリナーゼＩ、II及びIIIによるヘパラン硫酸の消化後に得られるΔUA2S-GlcNS3S及びΔUA2S-GlcNS3S6Sに相当する)から選択され、生物学的流体はCSFである。亜硝酸処理(Huynhら Neurobiol Aging. 2012 33(5):1005.e11-22)のような化学的方法もまた、HS二糖を製造するために使用することができる。
【００９３】
3-O-硫酸化ヘパラン硫酸の代表的構造は以下のとおりである：
【化３】
0006336909.tif 000004
【００９４】
タウタンパク質の異常リン酸化は、3-O-硫酸化HSにより誘導される立体構造変化の後に起こり、AD患者脳におけるHS GlcA2S/IdoA2S-GlcNS3S6S(テトラＳ単位)及びGlcA2S/IdoA2S-GlcNS3S(トリＳ単位)の形成は、リン酸化事象に先行し、よってこれら種はAD患者のCSFで見出される。
これらは、異常リン酸化がタウタンパク質遺伝子中の変異の結果である他のタウオパチーでは、存在しないか、ADより低いレベルで存在するはずである。よって、テトラＳ及びトリＳ二糖の検出は、タウオパチーとAD(変異依存性タウリン酸化を伴うものを含む)との間の鑑別的診断及び/又は予後予測に使用することができる。
【００９５】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病であり、
配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇しており、及び/又は
配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇しており、及び/又は
配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは少なくとも50％上昇しており、及び/又は配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50％上昇しており、及び/又はヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも50％上昇しており、タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質のレベル及び/又は活性を測定することを更に含んでなり、前記レベルがそれぞれの参照値と比較して少なくとも10％上昇していることがアルツハイマー病を示す上記インビトロ方法に関する。
アルツハイマー病において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベルは上昇しており、総タウタンパク質のレベルも同様である。
【００９６】
したがって、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル若しくは総タウタンパク質のレベル又はその両方を測定することにより、アルツハイマー病の診断又は予後予測又は経過観察が可能になる。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも20％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも30％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも40％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも90％上昇している。
【００９７】
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも20％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも30％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも40％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又は100％上昇しており、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又は100％上昇している。
【００９８】
本発明は、3-OST-2酵素がAD患者においてCSF中に存在するという結果を示し、該タンパク質のレベルが同一CSFサンプル中の過リン酸化タウのレベルと相関していることを示す。このことにより、該酵素は、タウタンパク質と同様、細胞外空間に見出すことができ、よってCSFに移動することが証明され、そのレベルの程度又は活性の程度がAD病の診断及び/又は予後予測マーカーとして使用できることが確証される。
【００９９】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病であり、前記生物学的流体がCSFであり、対象者における以下：
ａ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つ、及び
ｂ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ、及び
ｃ)それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物、及び
ｄ)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び
ｅ)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルがそれぞれの参照値と比較して上昇している上記インビトロ方法に関する。
【０１００】
前記遺伝子及び前記遺伝子の前記転写産物及び前記遺伝子の前記翻訳産物及びHSのレベル及び/又は活性は、タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の上昇の前に、上昇し得ることに留意すべきである。
アルツハイマー病には、タウタンパク質の異常リン酸化だけでなく、3-OST-2及び/又は3-OST-4遺伝子、前記遺伝子の転写産物の少なくとも１つ、前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つ、ヘパラン硫酸、特にタウタンパク質に結合し得るヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸もまた関与している。
このことにより、タウオパチー間の鑑別的診断及び/又は予後予測が可能になる。
よって、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性及び上記他の構成要素の少なくとも１つのレベル及び/又は活性が上昇していることを検出することにより、アルツハイマー病の診断及び/又は予後予測が可能になる。
【０１０１】
本発明の実施例は、HSの特異的硫酸化を担う酵素(3-OST-2及び4)がADの脳及びCSFで上昇していること、及びこれら酵素活性に由来するHSがタウの異常リン酸化にインビトロ及びインビボで関与することを証明する。実施例はまた、ヘパリン中の3-O-硫酸化基がインビトロで異常タウリン酸化を誘導し得ることを示す。
実施例は、GSK-3βによるタウタンパク質のリン酸化がキナーゼ反応媒体に使用する多糖又はオリゴ糖中の3-O-スルフェート基の存在に依存することを具体的に示す。更に、本発明は、使用したヘパリン様物質のいずれかに結合するのはGSK-3β酵素ではなく、タウタンパク質自体であることを示し、立体構造変化によりリン酸化部位がキナーゼ活性に提示されることを示唆する。よって、3-O-硫酸化HSは、タウタンパク質と相互作用して、キナーゼの存在下で、そのリン酸化を調節する。
前記活性及び/又はレベルはまた、前記遺伝子又は前記転写産物又は前記翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型のものであり得ることに留意すべきである。
【０１０２】
ヒトCSF中のpタウの基礎値は約60pg/ml以下であり、総タウについては約450pg/ml以下である。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも20％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも30％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも40％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも100％上昇している。
【０１０３】
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも10％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも20％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも30％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも40％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又は100％上昇しており、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又は100％上昇している。
【０１０４】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がタウオパチー、特にアルツハイマー病であり、前記生物学的流体はCSFであり、以下：
ａ)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び
ｂ)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルが対象者においてそれぞれの参照値と比較して上昇しており、特に少なくとも10％上昇しており、前記ヘパラン硫酸は、リン酸化タウタンパク質及び/又は総タウに、少なくとも10％の比で結合し得る上記インビトロ方法に関する。
本発明者らは、タウオパチー、特にアルツハイマー病において、ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖の活性及び/又はレベル並び印タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルがCSFで上昇しているだけではなく、CSFに存在するHSも総タウに結合する最高能力を有し、よってタウオパチー、特にアルツハイマー病を表すことを更に見出した。
【０１０５】
１つの有利な実施形態において、
タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は、基礎値と比較して少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又は100％上昇しており、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は、基礎値と比較して少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又は100％上昇しており、
ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖の活性及び/又はレベルは、基礎値と比較して少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又は100％上昇しており、
リン酸化タウタンパク質及び/又は総タウに結合し得るHSの比は、10％〜100％の間であり、特に少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又は100％である。
【０１０６】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病であり、前記生物学的流体が血漿であり、ヘパラン硫酸がヘパラン硫酸のヘパリナーゼＩ、II及びIII(Ｉ〜III)消化後に得られるグルコサミンの3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖である上記インビトロ方法に関する。
ヘパリナーゼＩ、II及びIII消化により得られる3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖は、例えば、以下の化合物に相当する(これらに限定されない)：
【化４】
0006336909.tif 000005
【０１０７】
本発明の別の利点は、CSFサンプルより採集が容易である血漿サンプルで非常に容易に実施することができる、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するためのインビトロ方法を提供することである。
１つの有利な実施形態において、上記のリストから選択される二糖の少なくとも１つが、アルツハイマー病を有する患者の血漿中に存在する；特に、下記の２つの二糖の少なくとも１つが血漿中に存在する。
【化５】
0006336909.tif 000006
【０１０８】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病であり、前記生物学的流体が血漿であり、翻訳産物の前記誘導体がヘパラン硫酸(グルコサミン) 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び/又は４の分解産物であり、ヘパラン硫酸がヘパラン硫酸のヘパリナーゼＩ〜III消化後に得られる3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖であり、翻訳産物の前記誘導体のレベルと3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖のレベル及び/又は活性との両方が参照値又は基礎値と比較して上昇していることが、アルツハイマー病を示す上記インビトロ方法に関する。
【０１０９】
別の１つの観点において、本発明は、以下：
配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ、及び/又は
それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つ、
のレベル及び/又は活性を、対象者から得た生物学的流体サンプルにおいて認識・検出し、前記サンプルで得られた前記レベル及び/又は活性を、既知の疾患又は健康状態を表すコントロールで得られたものと比較する手段からなる、対象者における神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)を診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は前記疾患を発症する対象者の性向若しくは素因を決定するためのキットに関する。
【０１１０】
前記少なくとも１つの遺伝子転写産物又は前記少なくとも１つの遺伝子翻訳産物を認識する手段は、例えば、抗体であり得、そのことによりElisaアッセイを行うことが可能になる。
【０１１１】
本発明は、HS3ST2及び/若しくはHS3ST4をコードする遺伝子の翻訳産物又は該タンパク質の酵素活性のグリカン産物又はそれらのフラグメント若しくは誘導体若しくは変異型である免疫原と特に免疫反応性である抗体を特色とする。免疫原は、前記遺伝子翻訳産物の免疫原性又は抗原性のエピトープ又は部分を含んでなり得る。ここで、前記免疫原性又は抗原性部分はポリペプチドであり、該ポリペプチドは動物において抗体を惹起し、該ポリペプチドには前記抗体が免疫学的に特異的に結合する。抗体を作製する方法は、当該分野において周知である(Harlowら，Antibodies, A Laboratory Manual, Vold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, new York, 1988)。用語「抗体」は、本発明で使用する場合、当該分野において公知の全ての形態の抗体を包含し、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、組換え、抗イディオタイプ、ヒト化又は単鎖抗体並びにそれらのフラグメントである(Dubel and Breitling, Recombinant Antibodies, Wiley-Liss, New York, NY, 1999)。ファージディスプレイ技術により製造された抗体もまた含まれる。本発明の抗体は、例えば従来技術に基づく種々の診断及び治療法、例えば、酵素イムノアッセイ(例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ、ELISA)、ラジオイムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、ウェスタンブロット、免疫沈降及び抗体マイクロアレイで有用である(Harlow and Lane, Using Antibodies: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, New York, 1999、及びEdwards R; Immunodiagnostics: A practical Approach, Oxford University Press, Oxford, England, A999)。これら方法には、HS3ST2及び/又はHS3ST4をコードする遺伝子の翻訳産物又は該タンパク質の酵素活性のグリカン産物又はそれらのフラグメント若しくは誘導体若しくは変異型の検出が含まれる。
【０１１２】
配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ及び/又はそれぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つのレベルが健康状態を表すコントロールと比較して上昇していることが、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を示す。
【０１１３】
１つの有利な実施形態において、本発明は、ヘパラン、及び/又はヘパラン硫酸のヘパリナーゼＩ〜III消化後に得られるグルコサミンの３位で硫酸化されたヘパラン硫酸二糖を認識・検出する手段を更に含んでなる上記キットに関する。
配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ及び/又はそれぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つのレベル及びヘパラン及び/又はヘパラン硫酸のヘパリナーゼＩ〜III消化後に得られるグルコサミンの３位で硫酸化されたヘパラン硫酸二糖のレベルが健康状態を表すコントロールと比較して上昇していることが、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を示す。
【０１１４】
１つの有利な実施形態において、本発明は、以下：
配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ、及び/又は
それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つ
のレベル及び/又は活性を、対象者から得た生物学的流体サンプルにおいて認識・検出する手段、及び
任意に、ヘパラン硫酸及び/又はヘパラン硫酸のヘパリナーゼＩ〜III消化後に得られるグルコサミンの３位で硫酸化されたヘパラン硫酸二糖を認識・検出する手段、
からなり、更に、
前記対象者から得たサンプルにおいて、タウタンパク質のリン酸化のレベルを測定する手段、及び
前記サンプルで得られた前記レベルを、既知の疾患又は健康状態を表すコントロールで得られたものと比較する手段、及び
異常リン酸化タウレベル及び/又は総タウレベル並びに配列番号２及び配列番号４の翻訳産物レベルを、既知の疾患又は健康状態を表すコントロールと比較する手段
を含んでなるキットに関する。
【０１１５】
配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ及び/又はそれぞれタウレベル及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つ及び任意にヘパラン及び/又はヘパラン硫酸のヘパリナーゼＩ〜III消化後に得られるグルコサミンの３位で硫酸化されたヘパラン硫酸二糖及び異常リン酸化タウのレベルが健康状態を表すコントロールと比較して上昇していることが、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を示す。
【０１１６】
以下：
ａ)哺乳動物又は魚類、特に神経変性疾患に罹患した哺乳動物から事前に採集した生物学的流体サンプルを、試験化合物と接触させ、
ｂ)
i．配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つ、及び/又は
ii．配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ、及び/又は
iii．それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つ、及び/又は
iv．前記遺伝子又は転写若しくは翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び/又は
v．ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖
vi．タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルを測定し、
ｃ)神経変性疾患を有する哺乳動物から事前に採集した、前記化合物に接触させていないコントロールの生物学的流体サンプル中の活性及び/又はレベルを測定し、
ｄ)接触させた生物学的流体サンプル中の前記活性及び/又はレベルの差と、非接触の生物学的流体サンプル中のものとを比較することを含んでなり、
接触させた細胞の前記活性及び/又はレベルの変化が、試験化合物が前記疾患のモジュレーターであることを示す、神経変性疾患、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)のモジュレーターについてのインビトロスクリーニング方法。
【０１１７】
よって、タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質のレベルのみを減少さ得る化合物は、タウオパチーのモジュレーターである。
−タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質のレベル
−3-OST-2及び/又は4遺伝子及び/又はその転写産物及び/又はその翻訳産物及び/又はヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖
を減少させ得る化合物は、アルツハイマー病のモジュレーターである。
【０１１８】
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸は、ヘパラン硫酸のヘパリナーゼＩ〜III消化後に得られるグルコサミンの3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖である。
前記生物学的流体は、任意の細胞培養物、特にニューロンの初代培養物の細胞外媒体であり得、また血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液(CSF)でもあり得る。
１つの有利な実施形態において、前記哺乳動物はヒト又はマウス、例えばSAMP8マウス及び/又はADの3xTg-ADマウスモデルである、神経変性疾患、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)のモジュレーターについての上記インビトロスクリーニング法。
１つの有利な実施形態において、前記魚類はゼブラフィッシュである、神経変性疾患、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)のモジュレーターについての上記インビトロスクリーニング法。
【０１１９】
別の１つの観点において、本発明は、以下：
ａ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つ、及び/又は
ｂ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパラン硫酸(グルコサミン) 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４のイソフォームをそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ、及び/又は
ｃ)それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つ、及び/又は
ｄ)前記転写若しくは翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び/又は
ｅ)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び/又は
ｆ)異常リン酸化タウタンパク質及び/又は総タウタンパク質
のレベル及び/又は活性を、対象者から得たサンプルにおいて測定し、前記レベル及び/又は前記活性を、既知の疾患又は健康状態を表すそれぞれの参照値と比較することを含んでなり、
前記転写産物又は前記翻訳産物又はヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖又は異常リン酸化タウタンパク質の少なくとも１つのレベル及び/又は活性が対象者サンプル中で上昇していることが神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)を示すか又は前記神経変性疾患を発症するリスクを示す、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための方法に関する。
【０１２０】
この実施形態において、レベル及び/又は活性はインビボで測定される。
対象者は、哺乳動物、例えばヒト若しくはマウス、又は魚類であり得る。
よって、本発明者らは、神経変性疾患、特にアルツハイマー病では、3-OST-2及び/又は3-OST-4遺伝子の発現レベルが高度に上昇しており、HS鎖のより高度な3-O-硫酸化又はヘパリン様HS構造体をもたらすことを見出した。
このように、配列番号１及び３で示される遺伝子の一方又は両方のレベル及び/又は活性が上昇しており、また、前記遺伝子の転写産物の一方又は両方のレベル及び/又は活性も、同様に前記遺伝子の翻訳産物、すなわち、配列番号２及び４で示されるタンパク質の一方又は両方のレベル及び/又は活性も上昇している。
3-OST-2及び-4は、ヘパラン硫酸の3-O-硫酸化を担うので、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベルもまた高度に上昇し、タウタンパク質の異常リン酸化をもたらすタウタンパク質の立体構造変化が誘導される。
よって、これら構成要素の少なくとも１つのレベル及び/又は活性が対象者で上昇していることの検出により、神経変性疾患、特にアルツハイマー病又はタウオパチーの診断又は予後予測がもたらされる。
【０１２１】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がタウオパチーである、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための上記方法に関する。
１つの有利な実施形態において、本発明は、タウタンパク質のリン酸化及び/又は総タウタンパク質のレベルが参照値と比較して少なくとも10％上昇している、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための上記方法に関する。
参照値は、種々の形態をとり得る。参照値は、単一のカットオフ値、例えばメジアン若しくは平均、又は集団の75分位、90分位、95分位若しくは99分位であり得る。参照値は、比較群に基づいて確立することができ、例えば、或る規定群におけるリスクは別の規定群におけるリスクの２倍であるという具合である。参照値は範囲であり得、例えば検査集団は幾つかの群(例えば、低リスク群、中リスク群及び高リスク群)に等分(又は不等分)されるか、又は四等分される(第１四分位はリスクが最も低い個体群であり、第４四分位はリスクが最も高い個体群である)。
所定値は、選択した特定の集団の間で、習慣、民族性、遺伝学などに依存して変化し得る。
【０１２２】
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも20％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも30％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも40％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも90％上昇している。
【０１２３】
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも20％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも30％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも40％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又は100％上昇しており、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又は100％上昇している。
【０１２４】
別の観点において、本発明は、以下：
ａ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つ、及び/又は
ｂ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパラン硫酸(グルコサミン) 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４のイソフォームをそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ、及び/又は
ｃ)それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つ、及び/又は
ｄ)前記転写若しくは翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び/又は
ｅ)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び/又は
ｆ)異常リン酸化タウタンパク質及び/又は総タウタンパク質
のレベル及び/又は活性を、対象者から得たサンプルにおいて測定し、前記レベル及び/又は前記活性を、既知の疾患又は健康状態を表すそれぞれの参照値と比較することを含んでなり、
但し、測定された活性及び/又はレベルが、以下：
ヘパラン硫酸、又は
タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
のものであるとき、ヘパラン硫酸の活性及び/又はレベルとタウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルとの両方が測定されるか、又は
前記遺伝子、前記遺伝子の前記転写産物、前記遺伝子の前記翻訳産物又は前記遺伝子若しくは前記転写産物若しくは前記翻訳産物の前記フラグメント若しくは誘導体若しくは変異型から選択される少なくとも１つの他の要素の活性及び/又はレベルもまた測定され、
前記転写産物又は前記翻訳産物又はヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖又は異常リン酸化タウタンパク質の少なくとも１つのレベル及び/又は活性が対象者サンプル中で上昇していることが神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)を示すか又は前記神経変性疾患を発症するリスクを示す、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための方法に関する。
【０１２５】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記生物学的流体がCSFであり、対象者における以下：
ａ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される前記遺伝子、及び
ｂ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の前記転写産物、及び
ｃ)配列番号２及び４でそれぞれ示される前記遺伝子の前記翻訳産物、及び
ｄ)前記遺伝子又は前記転写産物又は前記翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び
ｅ)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖
の活性及び/又はレベルがそれぞれの参照値と実質的に同じであり、
タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルが対象者において参照値と比較して上昇しており、特に少なくとも100％上昇している、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための上記方法に関する。
【０１２６】
アルツハイマー病以外のタウオパチーには、タウタンパク質の異常リン酸化のみが関与し、このことによりタウオパチー間の鑑別的診断及び/又は予後予測が可能になる。
よって、上記他の構成要素のいずれについても上昇したレベル及び/又は活性が検出されず、タウタンパク質の異常リン酸化のみが検出されることで、アルツハイマー病以外のタウオパチーの診断及び/又は予後予測が可能になる。
表現「実質的に同じ」は、測定レベルが、選択した特定の集団の間での、習慣、民族性、遺伝学などに依存する個体変動に起因して、参照値に対して変動し得ることを意味する。したがって、測定レベルは、参照値の±10％、±５％又は±2.5％であり得る。
【０１２７】
ヒトCSF中のpタウの基礎値は約60pg/ml以下であり、総タウについては約450pg/ml以下である。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも20％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも30％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも40％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも100％上昇している。
【０１２８】
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも10％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも20％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも30％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも40％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又は100％上昇しており、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又は100％上昇している。
【０１２９】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための上記方法に関する。
１つの有利な実施形態において、本発明は、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルが、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇している、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための上記方法に関する。
この実施形態において、3-OST-2遺伝子のみが前記疾患に関与し、3-OST-4遺伝子のレベルは実質的に変化しない。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400％上昇している。
【０１３０】
１つの有利な実施形態において、本発明は、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルが、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇している、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための上記方法に関する。
この実施形態において、3-OST-4遺伝子のみが前記疾患に関与し、3-OST-2遺伝子のレベルは実質的に変化しない。
１つの有利な実施形態において、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400％上昇している。
【０１３１】
１つの有利な実施形態において、本発明は、リアルタイムPCRで測定するとき、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルが少なくとも100％上昇し、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルが少なくとも100％上昇している、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための上記方法に関する。
この実施形態において、3-OST-2及び3-OST-4遺伝子の両方が前記疾患に関与している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400％上昇している。
【０１３２】
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400％上昇している。
【０１３３】
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400％上昇している。
【０１３４】
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400％上昇しており、配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400％上昇している。
【０１３５】
１つの有利な実施形態において、本発明は、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルが、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50％上昇している、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための上記方法に関する。
当業者に周知の他の方法もまた、前記測定に使用することができる。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、少なくとも100％上昇している。
【０１３６】
ヒトCSF中の3-OST-2の基礎値は60pg/mlである。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも100％上昇している。
【０１３７】
１つの有利な実施形態において、本発明は、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルが、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50％上昇している、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための上記方法に関する。
当業者に周知の他の方法もまた、前記測定に使用することができる。
１つの有利な実施形態において、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、少なくとも100％上昇している。
【０１３８】
ヒトCSF中の3-OST-4の基礎値は60pg/mlである。
１つの有利な実施形態において、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも100％上昇している。
【０１３９】
１つの有利な実施形態において、本発明は、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルが、ELISA又はウェスタンブロットで測定するとき少なくとも50％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルが、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50％上昇している、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための上記方法に関する。
当業者に周知の他の方法もまた、前記測定に使用することができる。
１つの有利な実施形態において、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、参照値と比較して少なくとも50％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルはウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、参照値と比較して少なくとも100％上昇している。
【０１４０】
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇している。
【０１４１】
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇している。
【０１４２】
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇している。
【０１４３】
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇している。
【０１４４】
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇しており、配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100％上昇している。
【０１４５】
１つの有利な実施形態において、3-OST-2の参照値はヒトCSF中の3-OST-2の基礎値で、60pg/mlであり、3-OST-4の参照値はヒトCSF中の3-OST-2の基礎値で、60pg/mlである。
１つの有利な実施形態において、本発明は、ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性を測定することを更に含んでなり、前記レベル及び/又は活性が参照値と比較して少なくとも50％上昇していることがアルツハイマー病を示す、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための上記方法の１つに関する。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して100％上昇している。
【０１４６】
コントロールヒト海馬中のヘパラン硫酸の基礎レベルはジメチルメチレンブルー(DMMB)アッセイ(Huynhら Neurobiol Aging. 2012 33(5):1005.e11-22)で測定するとき、約0.5μg/mg湿潤組織である。参照値は基礎レベルであると考えると、アルツハイマー病における前記レベルは海馬及び皮質において少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬及び皮質において基礎レベル及び/又は活性と比較して60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬及び皮質において基礎レベル及び/又は活性と比較して70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬及び皮質において基礎レベル及び/又は活性と比較して80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬及び皮質において基礎レベル及び/又は活性と比較して90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬及び皮質において基礎レベル及び/又は活性と比較して100％上昇している。
【０１４７】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病であり、
配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇しており、及び/又は
配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇しており、及び/又は
配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは少なくとも50％上昇しており、及び/又は
配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50％上昇しており、
タウタンパク質に結合し得るヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性を測定することを更に含んでなり、前記レベル及び/又は活性が参照値と比較して少なくとも50％上昇していることがアルツハイマー病を示す上記インビトロ方法に関する。
幾つかの硫酸化グリコサミノグリカン及び模擬体は、タウに結合することができ、これらには、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸及び化学合成の他の硫酸化多糖、例えばデキストラン硫酸及びペントサン硫酸が含まれる。
【０１４８】
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して110％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して120％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して130％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して140％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して150％以上上昇している。
【０１４９】
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は、ヒト海馬、皮質、CSF又は血液において測定される。
コントロールヒト海馬中のヘパラン硫酸の基礎レベルは、Huynhら(Neurobiol Aging. 2012 33(5):1005.e11-22)に記載されるジメチルメチレンブルー(DMMB)アッセイで測定するとき、約0.5μg/mg湿潤組織である。
よって、参照値は基礎レベルであると考えると、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は、アルツハイマー病において、海馬で50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して110％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して120％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して130％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して140％上昇している。
１つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して150％以上上昇している。
【０１５０】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病であり、
配列番号１で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇しており、及び/又は
配列番号３で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100％上昇しており、及び/又は
配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは少なくとも50％上昇しており、及び/又は
配列番号４で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50％上昇しており、
3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性を測定することを更に含んでなり、前記レベルが基礎レベル及び/又は活性と比較して少なくとも50％上昇していることがアルツハイマー病を示す上記インビトロ方法に関する。
【０１５１】
本発明者らは、ヘパラン硫酸のなかでも、特にタウタンパク質に結合し得るヘパラン硫酸、3-O-硫酸化-ヘパラン硫酸が高度に上昇しており、よってアルツハイマー病の診断が可能になることを見出した。
アルツハイマー病における前記上昇は、海馬、皮質、CSF及び血液で観察される。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して110％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して120％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して130％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して140％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して150％以上上昇している。
【０１５２】
コントロールヒト海馬中の3-O-硫酸化ヘパラン硫酸の基礎レベルは、ジメチルメチレンブルー(DMMB)アッセイで測定するとき、約１ng/ml湿潤組織である。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して110％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して120％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して130％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して140％上昇している。
１つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して150％以上上昇している。
【０１５３】
１つの有利な実施形態において、前記3-O-硫酸化ヘパラン硫酸は、トリ硫酸化GlcA2S/IdoA2S-GlcNS3S及びテトラ硫酸化GlcA2S/IdoA2S-GlcNS3S6S単位形態から選択され、生物学的流体はCSFである。
3-O-硫酸化ヘパラン硫酸の代表的構造は以下のとおりである：
【化６】
0006336909.tif 000007
【０１５４】
１つの有利な実施形態において、本発明は、タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質のレベル及び/又は活性を測定することを更に含んでなり、それぞれの参照値と比較して少なくとも10％の上昇がアルツハイマー病を示す、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための上記方法の１つに関する。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも20％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも30％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも40％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又は100％上昇しており、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又は100％上昇している。
【０１５５】
ヒトCSF中のpタウの基礎値は約60pg/ml以下であり、総タウについては約450pg/ml以下である。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも20％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも30％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも40％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも100％上昇している。
【０１５６】
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも10％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも20％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも30％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも40％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも50％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも60％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも70％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも80％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも90％上昇している。
１つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも100％上昇している。
１つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又は100％上昇しており、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又は100％上昇している。
【０１５７】
本発明は、3-OST-2酵素がAD患者においてCSF中に存在するという結果を示し、該タンパク質のレベルが同じCSFサンプル中の過リン酸化タウのレベルと相関していることを示す。このことにより、該酵素は、タウタンパク質と同様、細胞外空間に見出すことができ、よってCSFに移動することが証明され、そのレベルの程度又は活性の程度がAD病の診断及び/又は予後予測マーカーとして使用できることが確証される。
【０１５８】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記生物学的流体がCSFであり、以下：
ａ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ２及び４をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つ、及び/又は
ｂ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ、及び/又は
ｃ)それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物、及び
ｄ)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び
ｅ)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルが対象者においてそれぞれの参照値と比較して上昇している、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための上記方法の１つに関する。
【０１５９】
前記遺伝子及び前記遺伝子の前記転写産物及び前記遺伝子の前記翻訳産物及びHSのレベル及び/又は活性は、タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の上昇の前に、上昇し得ることに留意すべきである。
【０１６０】
別の１つの観点において、本発明は、以下；
ａ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つ、及び/又は
ｂ)配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ、及び/又は
ｃ)それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つ、及び/又は
ｄ)前記遺伝子又は前記転写産物又は前記翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型
ｅ)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、
ｆ)異常リン酸化タウタンパク質及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響する少なくとも１つの剤を、治療又は予防有効量で対象者に投与することを含んでなる、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する方法に関する。
【０１６１】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記剤が、約2000〜約20,000ダルトン、好ましくは約20,000ダルトンの分子量を有する多糖又はオリゴ糖、特にヘパラン硫酸模擬体、例えばF6分子、CR36、HM100若しくはHM 2602、又はフコイダン若しくはペントサンポリ硫酸、又は特にペンタサッカリド、例えばArixtra(登録商標)(フォンダパリヌクス)、フコイダン若しくはペントサンポリ硫酸、及び/又は低分子量ヘパリン、例えばエノキサパリン(Lovenox(登録商標))、及び/又は超低分子量ヘパリンである、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する上記方法に関する。
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記剤が約20,000ダルトンの分子量を有する多糖又はオリゴ糖、特にヘパラン硫酸模擬体、例えばF6分子であり、前記剤が約1.5mg/Kg〜約50mg/Kgの間の用量で静脈内経路により投与される、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する上記方法に関する。
前記剤はまた、別の経路、例えば経口経路により、約50mg/kg〜約500mg/kg、特に100〜200mg/kgで、又はi.pなどで該経路に適切な投薬量で投与することができる。
【０１６２】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記剤がオリゴヌクレオチド、例えば配列番号71で示されるセンスsiRNA及び配列番号72で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号73で示されるセンスsiRNA及び配列番号74で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号75で示されるセンスsiRNA及び配列番号76で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号77で示されるセンスsiRNA及び配列番号78で示されるアンチセンスsiRNAからなるリストから選択されるsiRNA、又はモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
直接又は間接に影響される活性及び/又はレベルが配列番号１及び配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の転写産物であり、
少なくとも１つの転写産物のレベルが減少しており、特に当初の値のおよそ少なくとも50％である、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する上記方法に関する。
【０１６３】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記剤がオリゴヌクレオチド、例えばモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つの遺伝子が配列番号１で示され、前記オリゴヌクレオチドが配列番号５で示される、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する上記方法に関する。
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記剤がオリゴヌクレオチド、例えばモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、前記遺伝子が配列番号３で示され、前記オリゴヌクレオチドが配列番号６で示される、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する上記方法に関する。
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記剤がオリゴヌクレオチド、例えばモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも１つの遺伝子が配列番号１及び配列番号３で示される２つの遺伝子から本質的になり、配列番号１で示される遺伝子用オリゴヌクレオチドが配列番号５で示され、配列番号３で示される遺伝子用オリゴヌクレオチドが配列番号６で示される、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する上記方法に関する。
【０１６４】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記剤がオリゴヌクレオチド、例えばモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、前記剤が0.1〜１mMの間の用量、特に0.5mMで静脈内経路により投与される、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する上記方法に関する。
前記剤はまた、別の経路、例えば経口経路、i.p.経路などにより、当該経路に適切な投薬量で投与することができる。
【０１６５】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記剤が多糖、好ましくはペンタサッカリド、例えばArixtra(登録商標)(フォンダパリヌクス)、フコイダン又はペントサンポリ硫酸、及び/又は低分子量ヘパリン、例えばエノキサパリン(Lovenox(登録商標))、及び/又は超低分子量ヘパリンであり、
直接又は間接に影響される活性及び/又はレベルが配列番号２で示される前記遺伝子の翻訳産物である、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する上記方法に関する。
本発明は多糖に限定されず、任意のヘパリンタイプのものを前記剤として使用することができる。
【０１６６】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記剤が多糖、好ましくは糖、例えばArixtra(登録商標)(フォンダパリヌクス)、フコイダン又はペントサンポリ硫酸、及び/又は低分子量ヘパリン、例えばエノキサパリン(Lovenox(登録商標))、及び/又は超低分子量ヘパリンであり、前記剤が約1.5mg/Kg〜約50mg/Kgの間の用量で静脈内経路により投与される、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する上記方法に関する。
前記剤はまた、別の経路、例えば経口経路により、約50mg/kg〜約500mg/kg、特に100〜200mg/kgで、又はi.pで該経路に適切な投薬量で投与することができる。
【０１６７】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記剤が小分子、ヘパリン及びヘパラン硫酸作用のインヒビター、例えばプロタミン又は硫酸プロタミンである、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する上記方法に関する。
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記剤が小分子であり、前記剤が約1.0mg/Kg〜約50mg/Kgの間の用量で静脈内経路により投与される、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する上記方法に関する。
前記剤はまた、別の経路、例えば経口経路により、約50mg/kg〜約500mg/kg、特に100〜200mg/kgで、又はi.pで該経路に適切な投薬量で投与することができる。
【０１６８】
別の１つの観点において、本発明は、ヘパラン硫酸の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響する少なくとも１つの剤を治療又は予防有効量で対象者に投与することを含んでなる、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する方法に関する。
3-O-硫酸化インヒビター又はヘパラン硫酸スルホトランスフェラーゼインヒビター、特にRazi, Nら(J Biol Chem 1995, 270, 11267-75)；Rath, V. L.ら(Drug Discov Today 2004, 9, 1003-11)又はSeko, A.ら(J Inorg Biochem 2009, 103, 1061-6)に記載のものを、この実施形態において使用することができる。
US20100048638に記載されるヘパラン硫酸のインヒビターもまた使用することができる。
【０１６９】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記少なくとも１つの剤が更にタウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質のレベルに直接又は間接に影響する、ヘパラン硫酸の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響する少なくとも１つの剤を治療又は予防有効量で対象者に投与することを含んでなる、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する上記方法に関する。
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記剤が約0.5mg/Kg〜約50mg/Kgの間の用量で静脈内経路により投与される、ヘパラン硫酸の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響し、かつタウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質のレベルに直接又は間接に影響する少なくとも１つの剤を治療又は予防有効量で対象者に投与することを含んでなる、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する上記方法に関する。
前記剤はまた、別の経路、例えば経口経路により、約50mg/kg〜約500mg/kg、特に100〜200mg/kgで、又はi.pなどで該経路に適切な投薬量で投与することができる。
【０１７０】
別の１つの観点において、本発明は、以下：
ａ)神経変性疾患を有する哺乳動物の脳細胞を試験化合物と接触させ、
ｂ)
i．配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つ、及び/又は
ii．配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ、及び/又は
iii．それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つ、及び/又は
iv．前記遺伝子又は転写若しくは翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び/又は
v．ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び/又は
vi．タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルを測定し、
ｃ)神経変性疾患を有する哺乳動物の、前記化合物に接触させていないコントロールの脳細胞における活性及び/又はレベルを測定し、
ｄ)接触させた細胞における前記活性及び/又はレベルの差と、非接触の細胞におけるものとを比較することを含んでなり、
接触させた細胞の前記活性及び/又はレベルの変化が、試験化合物が前記疾患のモジュレーターであることを示す、神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)のモジュレーターについてのインビトロスクリーニング方法に関する。
【０１７１】
１つの有利な実施形態では、上記インビトロスクリーニングにおいて、工程ｂ)で測定された活性及び/又はレベルが、以下：
ヘパラン硫酸、又は
タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
のものであるとき、ヘパラン硫酸の活性及び/又はレベルとタウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルとの両方が測定されるか、又は
前記遺伝子、前記遺伝子の前記転写産物、前記遺伝子の前記翻訳産物又は前記遺伝子若しくは前記転写産物若しくは前記翻訳産物の前記フラグメント若しくは誘導体若しくは変異型から選択される少なくとも１つの他の要素の活性及び/又はレベルもまた測定される。
【０１７２】
別の１つの観点において、本発明は、以下：
ａ)神経変性疾患を有する哺乳動物の脳細胞を試験化合物と接触させ、
ｂ)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の固定化ヘパリンへの結合を測定し、
ｃ)神経変性疾患を有する哺乳動物の、前記化合物に接触させていないコントロールの脳細胞における結合を測定し、
ｄ)接触させた細胞における前記結合の差と、非接触の細胞におけるものとを比較することを含んでなり、
接触させた細胞の前記結合の変化が、試験化合物が前記疾患のモジュレーターであることを示す、神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)のモジュレーターについてのインビトロスクリーニング方法に関する。
【０１７３】
別の１つの観点において、本発明は、以下：
ａ)試験化合物を、神経変性疾患の素因を有するか又は該疾患の症状を既に発症している試験動物に投与し、
ｂ)
i．配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つ、及び/又は
ii．配列番号１及び配列番号３で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも１つ、及び/又は
iii．それぞれ配列番号２及び４で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも１つ、及び/又は
iv．前記遺伝子又は転写若しくは翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び/又は
v．ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び/又は
vi．タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルを前記動物において測定し、
ｃ)神経変性疾患の素因を有するか又は該疾患の症状を既に発症している、前記化合物に接触させていないコントロールの動物において活性及び/又はレベルを測定し、
ｄ)接触させた動物における前記活性及び/又はレベルの差と、非接触の動物におけるものとを比較することを含んでなり、
接触させた動物の前記活性及び/又はレベルの変化が、試験化合物が前記疾患のモジュレーターであることを示す、神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)のモジュレーターについてのインビボスクリーニング法に関する。
【０１７４】
１つの有利な実施形態では、上記インビボスクリーニングにおいて、工程ｂ)で測定された活性及び/又はレベルが、以下：
ヘパラン硫酸、又は
タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
のものであるとき、ヘパラン硫酸の活性及び/又はレベルとタウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルとの両方が測定されるか、又は
前記遺伝子、前記遺伝子の前記転写産物、前記遺伝子の前記翻訳産物又は前記遺伝子若しくは前記転写産物若しくは前記翻訳産物の前記フラグメント若しくは誘導体若しくは変異型から選択される少なくとも１つの他の要素の活性及び/又はレベルもまた測定される。
【０１７５】
別の１つの観点において、本発明は、以下：
ａ)試験化合物を、神経変性疾患の素因を有するか又は該疾患の症状を既に発症している試験動物に投与し、
ｂ)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の固定化ヘパリンへの結合を測定し、
ｃ)神経変性疾患の素因を有するか又は該疾患の症状を既に発症している、前記化合物に接触させていないコントロールの動物において結合を測定し、
ｄ)接触させた動物における前記結合の差と、非接触の動物におけるものとを比較することを含んでなり、
接触させた動物の前記活性及び/又はレベルの変化が、試験化合物が前記疾患のモジュレーターであることを示す、神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)のモジュレーターについてのインビボスクリーニング法に関する。
【０１７６】
１つの好適な実施形態において、本発明は、前記動物がマウス、例えばSAMP8マウス及び/又はADの3xTg-ADマウスモデルである、神経変性疾患、特にアルツハイマー病のモジュレーターについての上記インビボスクリーニング法に関する。
１つの好適な実施形態において、本発明は、前記動物がゼブラフィッシュである、神経変性疾患、特にアルツハイマー病のモジュレーターについての上記インビボスクリーニング法に関する。
【０１７７】
図面の説明
図１は、ヘパラン硫酸(HS)のアセンブリ及び既知のリガンド(FGF、FGFR及びアンチトロンビンを含む)の結合部位を示す。グルコサミン残基の3-O-位の硫酸化は、ヘパラン硫酸(グルコサミン) 3-O-スルホトランスフェラーゼのファミリーHS 3-O-スルホトランスフェラーゼ-1〜-6(HS3ST1〜6)により触媒される。この3-O-硫酸化はヘパラン硫酸生合成における最後の代謝的修飾であり(Bishopら，2007, Heparan sulphate proteoglycans fine-tune manmalian physiology. Nature 446:1030-1037)、ヘパラン硫酸の栄養機能に関連せず、組織発現は非常に低い(総HSの約0.2％)ので、ほとんどが、これら糖のマイナーな硫酸化形態である。
【０１７８】
図2A〜2Cは、AD死後脳の海馬における総硫酸化GAGレベル(2A)及び特に総HSスルフェートレベル(2B)が年齢適合正常コントロール脳のGAG及びHSと比較して上昇していることを示す(個体及び脳の特徴を表Ｉに記載する)。DMMBアッセイ(Huynhら，neurobiology of aging 2010)を使用して、GAG及びHSレベルを死後脳サンプルで検出、定量した。
図2A：総GAG(μg/mg組織)。白ヒストグラム：コントロール。黒ヒストグラム：AD患者。
図2B：総HS(μg/mg組織)。白ヒストグラム：コントロール。黒ヒストグラム：AD患者。
図2C：左上(ａ)：コントロール脳；右上(ｂ)：AD脳における斑(plaque)及びもつれ(tangle)。左下(ｃ)：AD脳における斑；右下(ｄ)：AD脳におけるもつれ。
【０１７９】
表１．脳組織を提供した対象者の特徴
【表１】
0006336909.tif 000008
【０１８０】
図３は、HS生合成に関与するスルホトランスフェラーゼ及び幾つかの他の酵素の転写物レベルを示す。
NS：酵素発現に有意な変化なし
ND：当該酵素の検出なし
【０１８１】
図4A〜4Hは、AD対象者及び年齢適合コントロールの海馬におけるHS及び過リン酸化タウの共存を示す。
アルツハイマー病(AD)及び年齢適合のヒト海馬凍結切片を抗HS抗体(10E4)(図4A及びB)及び抗タウ262抗体(図4C及びD)とインキュベートし、続いてフルオロプローブAlexa 568及びAlexa 488を付した二次抗体で標識した。
切片をDAPIで標識した(図4E及びF)。右パネルは重ね合わせである(図4G及びH)。スケールバー50μm。
【０１８２】
図５は、AD患者の脳脊髄液(CSF)中の3-OST-2(HS3ST2)タンパク質レベルを、同一サンプル中のリン酸化タウタンパク質(pタウ、Ser231エピトープ)レベルと比較して示す。ウェスタンブロットを使用して、サンプル中のタンパク質レベルを検出し比較した。
【０１８３】
図6A及び6Bは、年齢適合正常コントロール脳のGAGより高い、AD海馬抽出GAGのヒトタウタンパク質結合能を示す。ELISA試験を使用して、種々のGAGのタウタンパク質結合能を比較した。ELISA競合アッセイを使用して、競合GAGの不在下で固定化ヘパリンにタウを結合させた。アッセイには、GAG(0.1〜1000ng/mLを使用)をタウタンパク質(100ng/mLで使用)と共にELISAに加えた。４℃にて１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、プレート中に残存するタウシグナルを記録した。Ｘ軸：総硫酸化GAGへのタウタンパク質の結合％。EC50は、固定化ヘパリンへのタウタンパク質結合の50％を阻害するに必要なGAG濃度を表す。Ｙ軸：コントロール(白ヒストグラム)、AD(黒ヒストグラム)。
【０１８４】
図6A  ELISA型競合アッセイで測定したとき、コントロールGAGが示すタウタンパク質へのGAG結合を100％効果と見なした。
Ｘ軸：総硫酸化GAGへのタウタンパク質結合％
Ｙ軸：コントロール(白ヒストグラム)、AD(黒ヒストグラム)
図6B  ELISA型競合アッセイで測定した総GAGのタウへの結合能の変化。固定化ヘパリンへの当該因子の結合の50％を阻害するに必要なGAG濃度を表す。
【０１８５】
図7A及び7Bは、インビトロでのタウ異常リン酸化に対するGAG及びヘパリンの効果を示す。
図7Aは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３(GSK-3)による組換えヒトタウタンパク質(ヒトタウの441アミノ酸イソフォーム)の病的異常リン酸化を誘導する、AD海馬抽出GAG(GAG-AD)の効果が年齢適合脳GAG(GAG-CT)の効果と比較して上昇していることを示す。タウ396抗体を使用して、異常リン酸化タウの形成を検出した。
ｘ軸：時間(ｈ)
ｙ軸：pmol Ｐタウ/mol タウ
黒三角：ヘパリン、黒丸：GAG-AD、白丸：GAG-CT、白三角：コントロール。
【０１８６】
図7Bは、GSK-3キナーゼによる組換えヒトタウタンパク質の病的異常リン酸化を誘導する、ヘパリン、3-O-硫酸化を含むヘパリンオリゴ糖(Arixtra)及び3-O-硫酸化を欠くヘパリンオリゴ糖の効果を示す。タウ396抗体を使用して、異常リン酸化タウの形成を検出した。
ｘ軸：時間(ｈ)
ｙ軸：pmol Ｐタウ/mol タウ
黒三角：ヘパリン、黒菱形：Arixtra(３硫酸化)、白菱形：ヘキサヘパリン(非３硫酸化)、白三角：コントロール。
【０１８７】
図8A〜8Gは、SH-SY5Y分化細胞の２つのモデルにおける異常リン酸化に対するGAG(ヘパラン硫酸を含む)硫酸化阻害の効果を示す。
図8Aは、野生型分化SH-SY5Y細胞におけるGAG硫酸化阻害の効果を示す。硫酸化は、クロラート(50mM)(3'-ホスホアデノシン 5'-ホスホスルフェート生合成のインヒビター)を用いて阻害する。クロラート処理後に減少した異常リン酸化タウエピトープS199、T231、S262及びS396レベルをウェスタンブロット分析で確証した。
ｘ軸：タウエピトープ：左から右へ、抗タウ199、抗タウ231、抗タウ262又は抗タウ396リン酸化エピトープ
ｙ軸：ｐタウ/βアクチン
【０１８８】
図8Bは、ウェスタンブロット分析で明らかにされた、クロラート処理有り/無しでの、異常リン酸化タウエピトープS199、T231、S262及びS396レベルに対するH2O2(500mM)の効果(０〜24時間)を示す。
図8Cは、フローサイトメトリ分析で明らかにされた、野生型細胞での、異常リン酸化タウエピトープS199及びS396レベルに対するクロラート処理(75mM)の効果を示す。
ｘ軸：タウエピトープ：左から右へ、抗タウ199リン酸化エピトープ(クロラートなし及びあり)又は抗タウ396リン酸化エピトープ(クロラートなし及びあり)
ｙ軸：pタウ/総タウ
【０１８９】
図8Dは、フローサイトメトリ分析で明らかにされた、野生型H2O2(500mM)ストレス負荷細胞での、異常リン酸化タウエピトープS199及びS396レベルに対するクロラート(75mM)処理の効果を示す。
ｘ軸：タウエピトープ：左から右へ、抗タウ199リン酸化エピトープ(クロラートなし及びあり)又は抗タウ396リン酸化エピトープ(クロラートなし及びあり)
ｙ軸：pタウ/総タウ
【０１９０】
図8Eは、フローサイトメトリ分析で明らかにされた、hTauP301L SH-SY5Y細胞での、異常リン酸化タウエピトープS199及びS396レベルに対するクロラート(75mM)処理の効果を示す。hTauP301L SH-SY5Y細胞は、ヒトタウ(hTau)で恒久的にトランスフェクトされ、変異P301Lが導入されている細胞である。
ｘ軸：タウエピトープ：左から右へ、抗タウ199リン酸化エピトープ(クロラートなし及びあり)又は抗タウ396リン酸化エピトープ(クロラートなし及びあり)
ｙ軸：pタウ/総タウ
【０１９１】
図8Fは、タウの異常リン酸化(エピトープS396)に対する、SH-SY5Y細胞へのhTauP301L変異導入の効果を示す。
図8Gは、タウの異常リン酸化(エピトープS396)に対する、hTauP301L SH-SY5Y細胞における3-OST-2サイレンシング(センス用には配列番号73で示されるsiRNA、アンチセンス用には配列番号74で示されるsiRNA)の効果を示す。Ctrl：コントロールのhTauP301L SH-SY5Y細胞；Lipo：リポフェクタミン処理細胞(ネガティブsiRNAコントロール)、10、20、40及び80nMのHS3ST2 siRNA。
【０１９２】
図９は、タウ-P301Lを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュモデルの技術的利点を示す。
駆動構築物は、応答構築物のUASに結合するGal4-VP16の発現を駆動する神経細胞ゼブラフィッシュプロモーターHuCを含有する。これは、最小プロモーターを介してhTAU-P301L及びローダミン(DsRed)の二指向性発現を活性化する。タウ及びDsRedのUAS依存性遺伝子発現は、生存サカナにおいて、DsRed蛍光で示される。駆動構築物及び応答構築物は、Tol2トランスポゾン部位に挟まれている(図２)(Paquetら，2009)。
【０１９３】
図10A及び10Bは、hTAU-P301Lトランスジェニックゼブラフィッシュにおけるタウのリン酸化を示す。
図10A：５日齢ゼブラフィッシュ胚の脳(野生型(ａ) 対 hTAU-P301Lトランスジェニックモデル(ｂ))を解剖して抗タウAT180抗体で標識した。標識された過リン酸化部位(緑色)が、トランスジェニックモデルにおいて、終脳(Tel)、小脳(Cer)及び脊髄上部領域(SC)に位置する(略号：Ａ：前側、Ｐ：後側、TeO：視蓋、Cer：小脳)。
【０１９４】
図10B：トランスジェニックhTAU-P301Lにおける(リン酸化タウタンパク質レベル)/(総タンパク質レベル)と野生型非トランスジェニック同腹体との比較。過リン酸化タウタンパク質蓄積は、トランスジェニックhTAU-P301Lにおいて、非トランスジェニック同腹体と比較して90倍増大していることが証明される。
Ｘ軸：リン酸化タウ/総タンパク質。
Ｙ軸：左ヒストグラム：野生型タンパク質、右ヒストグラム：変異タウ。
【０１９５】
図11は、トランスジェニックhTAU-P301Lゼブラフィッシュにおける3-OST-2及び-4の発現を示す。
3-OST-2及び3-OST-4の相対量は、トランスジェニックhTAU-P301Lサカナ(「DsRed」と示す) 対 WTでリアルタイムPCRにより検出した。WTによる酵素発現を100％とした。
Ｘ軸：相対量のパーセンテージ
Ｙ軸：左から右へ：
左側の白及び黒ヒストグラム(3-OST-2)：白：WT；黒：DsRed
右側の白及び黒ヒストグラム(3-OST-4)：白：WT；黒：DsRed
【０１９６】
図12A及び12Bは、注入24時間後の3-OST-2モルファントの生存率及びリン酸化タンパク質レベルの減少を示す。
図12A：生存率は、0.5mMのモルホリノ濃度を用いた3-OST-2モルファントで測定した。24hpf(受精後時間)後のトランスジェニックhTAU-P301Lゼブラフィッシュ胚において、3-OST-2をコードする遺伝子のモルホリノ-媒介ノックダウンを、コントロールとして用いた非注入胚と比較した。
Ｘ軸：注入の％
Ｙ軸：左ヒストグラム：致死率、右ヒストグラム：生存率
図12B：モルファント胚におけるリン酸化タウタンパク質レベル)/(総タンパク質レベル)と非注入コントロールとの比較(ｎ＝98のプール、３つの異なる注射シリーズ)。
Ｘ軸：(リン酸化タウ)/(μg/ml 総タンパク質)。Ｙ軸：MO 3-OST-2
【０１９７】
図13A〜13Fは、抗PHF-タウ抗体クローンAT8で検出した異常リン酸化タウタンパク質の脊髄内蓄積を減少させる、ゼブラフィッシュモデル(Paquetら 2009)における3-OST-2のモルホリノ阻害を示す。
図13A、13C及び13E：変異タウタンパク質P301L発現ゼブラフィッシュ脊髄の免疫染色(図13A：タウタンパク質(DsRed)、図13C：抗PHF-タウ抗体クローンAT8で検出した過リン酸化タウタンパク質、13E：13A及び13Cを１つにした図)
図13B、13D及び13F：3-OST-2タンパク質が阻害されている変異タウタンパク質P301L発現ゼブラフィッシュ(モルファント)脊髄の免疫染色(図13B：変異の存在を示すDsRed、図13D：抗PHF-タウ抗体クローンAT8で検出した過リン酸化タウタンパク質、図13F：13B及び13Dを１つにした図)。
【０１９８】
図14A〜14Fは、異常リン酸化タウタンパク質のゼブラフィッシュ脳内蓄積を減少させる、ゼブラフィッシュモデル(Paquetら 2009)における3-OST-2の阻害を示す。
図14A、14C及び14E：非注入コントロールに相当する、変異タウタンパク質P301L発現ゼブラフィッシュ脳の免疫染色(図14A：DsRed、図14C：抗PHF-タウ抗体クローンAT8で検出した過リン酸化タウタンパク質、14E：14A及び14Cを１つにした図)。
図14B、14D及び14F：3-OST-2タンパク質が阻害されている変異タウタンパク質P301L発現ゼブラフィッシュ(モルファント)脳の免疫染色(図14B：DsRed、図14D：抗PHF-タウ抗体クローンAT8で検出した過リン酸化タウタンパク質、14F：14B及び14Dを１つにした図)。
【０１９９】
図15A〜15Fは、タウタンパク質の異常リン酸化及び変異効果からの軸索回復に対する3-OST-2発現阻害の効果を示す。
図15A、15C及び15E：非注入コントロールに相当する、変異タウタンパク質P301L発現ゼブラフィッシュ軸索の免疫染色(図15A：DsRed、図15C：抗pタウ231で検出した過リン酸化タウタンパク質、15E：15A及び15Cを１つにした図)。(10×、スケールバー＝50mm)。
図15B、15D及び15F：3-OST-2タンパク質が阻害されている変異タウタンパク質P301L発現ゼブラフィッシュ(モルファント)軸索の免疫染色(図15B：変異を示すDsRed、図15D：過リン酸化タウタンパク質、15F：15B及び15Dを１つにした図)。
3OST-2スプライスモルファントではDsRed/hTauP301Lよりpタウ231染色が低く、矢印は軸索異常が反転していることを示す(10×、スケールバー＝50mm)。
【０２００】
図16A〜16Fは、タウタンパク質の異常リン酸化及び変異効果からの軸索回復に対する3-OST-2発現阻害の効果を示す。
図16A、16C及び16E：非注入コントロールに相当する、変異タウタンパク質P301L発現ゼブラフィッシュ軸索の免疫染色(図16A：DsRed、図16C：抗pタウ231で検出した過リン酸化タウタンパク質、16E：16A及び16Cを１つにした図)。(20×、スケールバー＝20mm)。
図16B、16D及び16F：3-OST-2タンパク質が阻害されている変異タウタンパク質P301L発現ゼブラフィッシュ(モルファント)軸索の免疫染色(図16B：タウタンパク質(DsRed)、図16D：抗pタウ231で検出した過リン酸化タウタンパク質、16F：16B及び16Dを１つにした図)。
3OST-2スプライスモルファントではDsRed/hTauP301LよりP-タウ231染色が低く、軸索異常は明らかに逆転している(20×、スケールバー＝20mm(第１列)、50mm(第２列)。
【０２０１】
図17A及び17Bは、ADの老化促進モデル(SAMP8マウス)におけるHS模擬体F6の効果を示す。SAMR1マウスをコントロールとして使用した(コントロール)。F6は、腹腔内(i.p.)で25若しくは50mg/kg又は経口で100若しくは200mg/kgの高用量(Ｈ)及び低用量(Ｌ)で使用した；週２回を２週間。処置は、マウスが５ヶ月齢時に始め、マウスが７ヶ月齢のとき終了した。ヒペルジンＡ(Hyperzine A)はポジティブコントロール薬剤として使用した。
図17A：空間学習能力(ｎ＝10)。プラットフォームへの到達に成功したマウス％
ヒストグラム  左から右へ：コントロールモデル(SAMP8)、フペルジンＡ、F6：腹腔内50mg/kg、F6：腹腔内25mg/kg、F6：経口200mg/kg、F6：経口100mg/kg。
図17B：空間記憶能力(ｎ＝10)。７週齢(２ヶ月処置)時の四分円プラットフォームの探索時間。
ヒストグラム  左から右へ：コントロールモデル(SAMP8)、フペルジンＡ、F6：腹腔内50mg/kg、F6：腹腔内25mg/kg、F6：経口200mg/kg、F6：経口100mg/kg。
F6は、２ヶ月処置後(７ヶ月齢時)にモリス水迷路において空間記憶保持を増大させた。
【０２０２】
図18は、病的リン酸化タンパク質(pタウ199/202)の特異抗体を用いて行った脳(皮質)のウェスタンブロット分析(WB)で示された、ヘパラン硫酸F6を腹腔内用量25若しくは50mg/Kg又は経口用量100若しくは200mg/kgで処置したSAMP8の脳内での過リン酸化タウタンパク質(病的pタウ199/202)の減少を示す。この研究は２ヶ月処置後に(７ヶ月齢マウスで)行った。
上のWB：タウ199、及び下のWB：GADPH
左から右へ：コントロールモデル(SAMP8)、フペルジン(抗アルツハイマーコントロール)、２ヶ月間(５ヶ月齢から７ヶ月齢までの間、週２回)、F6 25mg/kgを腹腔内処置したSAMP、F6 50mg/kgを腹腔内処置したSAMP、F6 100mg/kgを経口処置したSAMP、F6 200mg/kgを経口処置したSAMP。
モデルにおける矢印は、コントロールと比較して上昇した過リン酸化タウタンパク質を示す。
F6処理群(50mg/kg)における矢印は、モデルと比較して減少した過リン酸化タウタンパク質を示す。
【０２０３】
図19A〜19Iは、SAMR1マウス(７ヶ月齢)及びヘパラン硫酸模擬体F6を腹腔内用量25mg/Kgで処置した又はしなかったSAMP8マウス(７ヶ月齢)(３マウス)の遊泳図(モリス水迷路)を示す。
図19A、19D及び19G：コントロールSAMR1マウス(コントロール)。
図19B、19E、19H：モデルSAMP8マウス。
図19C、19F、19I：F6処置したモデルSAMP8マウス。
処置動物は、有意な記憶増大を示す。
【０２０４】
図20は、ヒトタウタンパク質に対するヘパリン/グリコサミノグリカン競合アッセイを示す。
ｘ軸：左から右へ：ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ａ(CSA)、コンドロイチン硫酸Ｃ(CSC)、HS、フコイダン、F6。
ｙ軸：hタウに対する試験化合物の結合のパーセンテージ
フコイダン及びF6は、ヒトタウタンパク質への結合についてヘパリンと競合し得る。
【０２０５】
図21は、F6、CR36、HM2602及びデキストランの血液脳関門(BBB)透過性研究を示す。
ｘ軸：時間(分)
ｙ軸：経膜通過のパーセンテージ
四角：HM-オリゴ糖F6
三角(上向き)：HM-オリゴ糖CR36
菱形：HM2602
三角(下向き)：オリゴ-デキストラン
【０２０６】
図22は、ウェスタンブロットゲルのデンシトメトリー分析で測定したCSF中のpタウ231及びHS3ST2レベルを、DMMB法で測定したCSF中のHS硫酸レベルと相関させて示す。
全ての患者が、臨床的及び生化学的評価でADと診断された。程度に応じて「＋」、「++」、「+++」で示した。ADの程度は、WBのデンシトメトリー分析で測定したCSF中のpタウ231レベルにより推定した。
各々３サンプルを分析した。
ｘ軸：左から右へ：AD＋、AD++及びAD+++。
ADの各程度について、左から右へのヒストグラム：pタウ231、HS3ST2、HS。
左ｙ軸：光学密度/タンパク質濃度(任意単位)
右ｙ軸：総HS量(μg/mL)
この図は、OST-2、HS及びリン酸化タウの濃度が、ADの程度の増大(AD＋からAD+++まで)につれて、有意に上昇することを示す。
【０２０７】
図23は、AD患者(図５と同一患者)由来CSFの存在下(0.5ug/ウェル)での固定化ヘパリンへのタウ結合のパーセンテージを示す。HSはCSFから抽出し、DMMB法で定量し、この競合アッセイに使用した。ELISAプレート中で、固定化ヘパリンへのタウタンパク質結合はCSF由来HSで阻害される。
このELISAアッセイに使用した総タウは市販のものであった。
これら結果は、最高量のpタウを含有するCSFは、固定化ヘパリンへのタウ結合を阻害する最も高い能力を有するHSも含むことを示す。
各CSFサンプルを、結合試験で３回アッセイした。
このことは、タウオパチーとCSF HSが総タウに結合する能力との間の相関を示す。
【０２０８】
図24A〜24Hは、0.1及び10μg/mLのF6分子を用いた細胞(SH-SY5Y分化細胞)間のタウ凝集体転移阻害モデルを示す。ドナー細胞におけるタウ-EYFPの発現に使用した構築物は、以前に報告されたとおりである：J Biol Chem. 2009 May 8;284(19):12845-52. Epub 2009 Mar 11. Propagation of Tau misfolding from the outside to the inside of a cell. Frost B, Jacks RL, Diamond MI。
図24A〜24Eはこの研究に使用した一般的なプロトコルを示す。
【０２０９】
図24A：
凝集体ドナー細胞：SH-SY5Y細胞を、Frost B, Jacks RL, Diamond MI. J Biol Chem. 2009 May 8;284(19):12845-52. Transfected cells produce green Tau aggregatesに従って、タウ-EYFPでトランスフェクトする。
レシピエント細胞：野生型SH-SY5Y細胞
図24B：トランスフェクト細胞をトランスウェルの上部チャンバ中で培養した。非トランスフェクト細胞をトランスウェルの底部チャンバ中で培養した。凝集体ドナー細胞(タウ-EYFトランスフェクト細胞)及びレシピエント細胞(非トランスフェクト細胞)の両方を、10μMのレチノール酸の存在下で７日間培養して分化させる。
【０２１０】
図24C：凝集体ドナー細胞(トランスフェクト細胞)及びレシピエント細胞(非トランスフェクト細胞)の両方に酸化ストレスパルス(H2O2、500μM)を30分間供する。この後、ストレス因子含有培地を、F6分子を含有するか又は含有しない新鮮培地と交換した。
図24D：凝集体ドナー細胞及びレシピエント細胞を24時間共培養する。
図24E：レシピエント細胞を固定し、bIII-チューブリン(赤)で標識し、顕微鏡で検査する。
細胞を固定し、標識した。Ａ)薬剤処理しなかったストレス負荷細胞。Ｂ)F6(10μg/mL)で処理したストレス負荷細胞。Ｃ)各条件について、３つの異なる培養物において10の異なる視野でタウ凝集体を計数した。
【０２１１】
図24F：F6で処理せず且つストレス負荷SH-SY5Y/タウ-EYFPと共インキュベート(共培養)したストレス負荷レシピエントSH-SY5Y細胞は、ストレス負荷ドナー細胞由来の緑色タウ凝集体に感染していることが示される(白色矢印)。
図24G：F6分子(10μg/mL)で処理され且つストレス負荷SH-SY5Y/タウ-EYFPと共インキュベートしたストレス負荷レシピエントSH-SY5Y細胞。各条件について、３つの異なる培養物において10の異なる視野でタウ凝集体(白色矢印)を計数した。
図24H：処置に応じた視野あたりの蛍光タウ凝集体数。
ｘ軸：左から右へ：非ストレス負荷、ストレス負荷、ストレス負荷＋F6(0.1μg/mL)、及びストレス負荷＋F6(10μg/mL)。
ｙ軸：視野あたりの蛍光タウ凝集体数
F6分子は、蛍光タウ凝集体数を顕著に減少させる。
【０２１２】
図24A〜24Hは、F6分子が細胞(SH-SY5Y分化細胞)間のタウ凝集体転移を阻害し、よって多糖(例えば、ヘパラン硫酸模擬体、特にF6分子)がタウオパチー、特にアルツハイマー病を治療し得ることを示す。
【０２１３】
図25は、レチノール酸で分化させ且つペプチドAβ25-35(25μM)で処理したSH-SY5Y細胞におけるヘパラン硫酸模擬体F6の保護効果を示す。
ｘ軸：左から右へ：Aβなしコントロール、Aβありコントロール、Aβ＋F6(１μg/mL)、Aβ＋F6(10μg/mL)；
ｙ軸：MTT検査で測定した生存細胞の％
ｐ値＜0.05を統計学的に有意とみなした。
注記：*≦0.05、**≦0.01、***≦0.001
【０２１４】
図26は、ペプチドAβ42で処理したSH-SY5Y分化細胞に対する種々のヘパラン硫酸模擬体の効果を示す。
ｘ軸：左から右へ：Aβなしコントロール、Aβありコントロール、Aβ＋E5(10μg/mL)；Aβ＋F6(10μg/mL)；Aβ＋D6(10μg/mL)；
ｙ軸：MTT検査で測定した生存細胞の％
カラムをコントロール＋Aβと比較する：ｐ値＜0.05を統計学的に有意とみなした。
注記：*≦0.05、**≦0.01、***≦0.001
【０２１５】
図27は、Aβ25-35での６時間又は24時間処理後の細胞タンパク質抽出物中のタウリン酸化を示す。AT 180で検出したヘパラン模擬体D6及びF6(10μg/mL)の効果。
ヘパラン硫酸模擬体はリン酸化タウを減少させる。
【０２１６】
図28A〜28Cは、10μg/mLのヘパラン硫酸模擬体Dx、D4、D5、D6、F6で処理したAβ42ストレス負荷細胞におけるタウリン酸化を示す。
図28A：pタウ396
図28B：βアクチン
図28C：種々の化合物に応じたpタウ396/βアクチン
ｘ軸：左から右へ：コントロール、Aβ 12時間、Aβ 24時間、デキストラン、D4、D6、E5、F6。
ｙ軸：pタウ396/β-アクチン(コントロールの％)
統計計算は、２つのWBからの平均シグナルを用いて行う。
ヘパラン硫酸模擬体はリン酸化タウを減少させる。
【０２１７】
図29は、10μg/mLのヘパラン硫酸模擬体D4、E5及びF6で24時間処理したAβ42ストレス負荷細胞におけるタウリン酸化を示す。
ヘパラン硫酸模擬体、例えばD4、E5及びF6は、リン酸化タウを減少させる。
【実施例】
【０２１８】
実施例
実施例１．コントロール及びADヒト脳組織からの脳組織切出し：
死後ヒト脳サンプル採取を、AD登記作成協議会(Consortium to Establish a Registry of AD：CERAD)に従って行った。本研究には２つの実験群が含まれた：60〜77歳(平均年齢67.8±2.9歳)の老齢群(ｎ＝８、コントロール群)及び69〜82歳(平均年齢76.8±3.5歳)のAD群(ｎ＝８)。本研究に参加した対象者は、有資格者の神経病理学者による死後評価を受けた。死後間隔は、両群について、8.0時間から15.2時間まで異なった。２群間に死後遅延について統計学的に有意な差はなかった(ｐ＝0.1781)。剖検時に脳を得て、剖検後２時間以内に矢状方向に半分にした。一方の半球を、前頭面に沿って２cm厚の切片に切り分けて、海馬(側頭葉)、皮質及び小脳を切り出した。切出し直後に組織をドライアイスで凍結させた。組織サンプルを使用時まで−80℃で保存した。
【０２１９】
実施例２．コントロール及びADヒト脳組織内の老人斑及び神経原線維もつれ(NFT)の定量：
脳内の神経病理学的変化を、アルツハイマー病登記作成協議会(CERAD)及びBraak and Braakのガイドラインを用いて調べた。老人斑及びNFTは、ビールショースキー(Bielschowsky)−中前頭回、中側頭回、下頭頂小葉、後頭極、海馬CA1及び嗅内皮質(enthorinal cortex)の染色切片−に基づいて決定した。老人斑は10×対物レンズを用いて計数し、NFTは20×対物レンズを用いて計数した。相加平均は、各領域について６視野のカウント(老人斑/mm2及びNFT/mm2)から算出した(平均±SEM)。次いで、CERADが提唱するガイドライン及びBraak and Braakの基準を用いて神経病理学的診断を行った。AD脳は、海馬分析からステージIII〜Ｖであると特徴付けられた。コントロール脳は非ADであると判定された。
【０２２０】
実施例３．ヒト海馬における免疫組織化学的HS及びタウ共存
アルツハイマー及び年齢適合コントロールのヒト海馬切片(20μm)を３％酢酸で室温(rt)にて10分間固定した。次いで、切片をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中３％のBSAと30分間インキュベートし、PBS中0.2％のTriton X100で30分間透過化した。HSを、透過化緩衝液(1:200)に溶解した抗ヘパラン硫酸(10E4エピトープ, Seikagaku corp.、AMS Biotechnology販売)及び抗タウホスホセリン262(Millipore)とrtにて１時間30分間インキュベートして染色した。Alexa 568蛍光プローブ(Molecular Probes)及びAlexa 488蛍光プローブ(Interchim)に接合した二次抗体で組織スライドを染色することにより、蛍光を導入した。次いで、切片を１μg/mL DAPI溶液で３分間DAPI標識し、エタノールでリンスした。画像は、先ず、BH-2エピ蛍光光学顕微鏡(Olympus)に取り付けたCCDモノクロカメラ(CFW-1310M, Scion Corporation, USA)を用いて撮影した。Scion VisiCapture 2.0ソフトウエアを用いて画像を収集した。画像処理は、ImageJソフトウェア(W. Rasband, National Institute of Mental Health, Maryland, USA)を用いて行なった。核のDAPI標識は、以前に記載されたとおりに定量した(Blondetら，2006)。
【０２２１】
実施例４．アルツハイマー病海馬における3-OST酵素の発現
本実施例では、HS生合成に関与する3-OST酵素の発現が、アルツハイマー病海馬サンプルでコントロール海馬サンプルと比較して変化しているかどうかを調べた(表２)。結果は、アルツハイマー病海馬における3-OST-2及び3-OST-4の過剰発現を示す。このことにより、脳のHS鎖における3-O-硫酸化の増大及び3-OST-2転写物のは発現増強がアルツハイマー病に特徴的であると考えられ得ることが示唆される。コントロール実験として、(アルツハイマー病脳で増強していることが知られている(Burbaevaら，2005))グルタミンシンセターゼ(GS)及びグリセルアルデヒド-３-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)が予想どおり発現されており、(アルツハイマー病で年齢適合個体群と比較して安定に維持されていると報告されている(Cartierら，2005))ケモカインレセプター４の発現が不変であることも確証した。遺伝子発現の予想された増大と一致する我々の結果(表２)は、RIN数により示されるように、生物学的材料の質がこれら研究と一致するものであったことを示している。
【０２２２】
【表２】
0006336909.tif 000009
【０２２３】
コントロール及びADヒト脳組織からのRNA抽出及びRTqPCR：
総RNAをヒト海馬から抽出した。定量的PCR(qPCR)用のプライマー(Eurofins, Germany)はPrimer3outputが設計した。qPCRは、鋳型cDNAからLightCycler FastSart DNA Master SYBR Greenキットの製造業者(Roche, Germany)の指示に従って行った。qPCR条件は、プライマーセットに依存した(表３)。サンプルは１回で同時に増幅させた。遺伝子発現の相対的定量は、ΔΔCT法(Schefeら，2006)とも呼ばれる比較CT法を用いて行った。２つの参照遺伝子(α-チューブリン及びTFIID)を内因性コントロールとして使用した。これら遺伝子の標準化はGenormプログラム(Vandesompeleら，2002)で達成した。
【０２２４】
【表３−１】
0006336909.tif 000010
【表３−２】
0006336909.tif 000011
【０２２５】
実施例５．AD患者  脳脊髄液について：
脳脊髄液(CSF)サンプルは、ADの臨床的特徴を有する患者から腰椎穿刺により得た。患者及びサンプルは、Sarazinら(Habertら，Brain perfusion SPECT correlates with CSF biomarkers in Alzheimer's disease. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2010；37:589-593)により以前に記載されている。AD患者は、ADの予測についての国立神経病、感染症、脳卒中、アルツハイマー病及び関連疾患研究所連合(National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke and the Alzheimer's Disease and Related Disorders Association：NINCDSADRDA)の基準を満たしていた。全ての対象者は、同じ臨床的、生化学的(CSFバイオマーカー測定)及び神経画像検査手順を受けた。全ての患者は、液体減衰反転回復法(FLAIR)、T1-及びT2-強調シーケンスを含むルーチンのMRI検査を受けた。患者は、巣状病変の臨床上の証拠も神経画像検査上の証拠も示さず、皮質又は皮質下血管病変も示さなかった。AD患者は、種々の程度の皮質及び/又は皮質下萎縮を示すことがあった。患者は、認知行動に干渉する医学的状態を有さず、重篤な抑うつも示さなかった。すべての患者は、診断時から、アセチルコリンエステラーゼインヒビターで治療されていた。患者は、コミュニティーで生活していた。
【０２２６】
CSF検査
腰椎穿刺により得たCSFサンプルは、10分間1,500rpmで４℃にて遠心分離して、細胞を除去し、0.4mlポリプロピレンチューブに小分けして、分析まで−80℃で保存した。
【０２２７】
ウェスタンブロッティングによるリン酸化タウ及びHS3ST-2測定用の組織及びCSFタンパク質抽出物の調製
凍結脳組織を液体窒素蒸気下でホモジナイズし、Laemmli緩衝液４×(事前に1:100のβ-メルカプトエタノールを添加)中に懸濁させた。混合物を５分間煮沸し、５分間超音波処理した。次いで、チューブを10分間遠心分離した(1,500rpm、４℃)。Pierce(登録商標)BCA Protein Assayキットを製造業者の指示に従って用いて組織ホモジネート及びCSFサンプル中のタンパク質濃度を算出し、等量のサンプルを10％ゲル上で電気泳動させた(Invitrogen Corp)。転写後、膜をブロッキング緩衝液(PBS中３％乳、0.02％ Tween-20)で40分間ブロックし、ヤギ抗HS3ST2(T-15, Santa Cruz)で室温にて２時間探査した。膜をPBST中で１回リンスした後、同じ緩衝液中で５分間３回洗浄した。二次抗体をPBST中に希釈し、RTにて45分間インキュベートした(ウサギ抗ヤギ, Jackson Immuno Research)。膜をPBSTでリンスし、同じ緩衝液中で５分間３回洗浄した。ブロットを、Immobilon Western Chemiluminiscent HRP Substrate(Millipore)を製造業者の指示に従って用いて発色させた。
その後、膜をTBS １×中で洗浄し、次いでTBS中１％ BSA、0.1％ Tween-20(TBST)中に希釈した抗pタウThr231(ウサギポリクローナル, Millipore, ref 9668, lot NG1863963)と室温にて２時間インキュベートした。膜をTBST中で５分間３回洗浄した後、二次抗体(ロバ抗ウサギ, Jackson ImmunoResearch)とインキュベートした。ブロットを同じ試薬で発色させた。
【０２２８】
脳及びCSFからのグリコサミノグリカン(ヘパラン硫酸及びコンドロイチン硫酸)の抽出及び定量
GAGを脳組織及びCSFから以下のとおり抽出した：凍結脳組織サンプルを粉末にし、ホモジナイズして抽出緩衝液(50mM Tris, pH7.9, 10mM NaCl, ３mM MgCl2及び１％のTriton X-100)中に懸濁して最終的に１mL緩衝液あたり25mgの組織とした。CSF又は脳ホモジネートをプロテイナーゼＫ(PK)(Merck)(最終50μg/mLサンプル)で56℃にて一晩処理し、続いて90℃にて30分間処理して酵素を不活化させた。室温(rt)まで冷却させた後、DNase I(Qiagen)を加え(7.5mU/mLサンプル)、サンプルを37℃にて一晩インキュベートした。次いで、サンプルを４Ｍ NaClで１:１希釈し、遠心分離し(13 000ｇ, 20分間)、ペレットを廃棄した。脂質を１:１クロロホルム抽出により除去し、記載(Huynhら Neurobiol Aging. 2011)されるような1-9ジメチル-メチレンブルー(DMMB)アッセイに従って総(トータルの)硫酸化GAGを定量した。コンドロイチナーゼABC(ChABC)(Sigma-Aldrich)又は亜硝酸処理を用いて、総GAGサンプル中のHS又はCSを選択的に定量した(Huynhら 2011)。既知量のCS標準物を用いて構築した較正曲線を各アッセイに含ませた。抽出法及び定量法は、GAGをスパイクしたげっ歯類脳サンプルにおいて、以前に記載されたとおりに検証した(Huynhら，Neurobiol Aging. 2011)。
【０２２９】
脳及びCSFからのGAG(ヘパラン硫酸及びコンドロイチン硫酸)の単離、抽出及び定量
GAGは以下のとおり単離した：PK/DNAse消化サンプルを４Ｍ NaCl最終サンプル濃度にして、10分間激しく撹拌した。TCA処理(10％最終濃度)でタンパク質を沈降させた後、上清をクロロホルム洗浄し、続いて水相の抽出緩衝液及びその後の純水に対する迅速透析(Slide-A-Lyzer Mini Dialysis Units 3,500 MWCO, Pierce)で明澄化した。凍結乾燥後、材料を、水又は必要に応じてグリカナーゼ消化緩衝液(10mM酢酸ナトリウム, ２mM CaCl2, pH７)中に溶解させた。次いで、GAGをDMMBプロトコルに従って定量した。抽出HS又はCSの同定及び特異的回収は、以前に記載されたように、HS回収についてはコンドロイチナーゼABC(ChABC)での特異的消化により、CS回収についてはヘパリナーゼＩ/II/III又は亜硝酸処理により行った(Huynhら，Neurobiol Aging. 2011)。
【０２３０】
LC/MSによる脳及びCSFのHS二糖分析
グリカナーゼ消化緩衝液(10mM酢酸ナトリウム、２mM CaCl2、pH７)中に溶解した、脳及びCSFから抽出し凍結乾燥させたGAGサンプルを、同時に、ヘパリナーゼＩ、II及びIIIカクテル(各0.25mU、24時間、37℃)で消化させた。サンプルをろ過後、キャピラリ液体クロマトグラフィーシステム(LC)に連結したLTQ/orbitrapから構成されたLC/MSシステムに注入した。使用した分離・検出方法は、Methods Enzymol. 2011又はYangら(Ultra-performance ion-pairing liquid chromatography with on-line electrospray ion trap mass spectrometry for heparin disaccharide analysis. Analytical Biochemistry 415 (2011) 59-66)に記載された方法である。
【０２３１】
実施例６．アルツハイマー病のGAGはタウ結合能力が増大している
アルツハイマー病及び年齢適合コントロールの海馬からのGAGを、下記のとおり、ELISA競合結合アッセイを用いて、タウタンパク質への結合能力について試験した。図6Aは、アルツハイマー病GAGへのタウ結合能の有意な増大を示す。この効果は、0.1ng/mL GAGについて既に観察されていた。多糖へのタウの50％結合を得るに必要な有効濃度(EC50)の評価により、アルツハイマー病GAGがコントロールと比較して減少していることが示され(図6B)、このことは、疾患例においてタウに対するGAGの親和性が増大していることを意味する。これら結果は、アルツハイマー病による海馬内でのGAG組成変化がより多くのGAGとタウとの結合を生じることを示唆する。
【０２３２】
ヒトタウタンパク質に対するヘパリン/グリコサミノグリカン競合アッセイ：AD及びコントロール海馬から抽出したGAGのヒトタウタンパク質(R&D systems)への結合を、ELISAベースの競合結合アッセイ(Najjamら，1997)により評価した。ELISA型96ウェルプレートを、以前に記載されたように調製した２μg/mL BSA-ヘパリンコンジュゲート溶液(Najjamら，1997)を用いて被覆した。PBS/0.05％ Tween-20(洗浄溶液)で洗浄後、ウェルをPBS中３％ BSAで飽和させた。次いで、アッセイするタンパク質(PBS中)を濃度依存的様式でプレートに加えて、固定化ヘパリンに対する50％結合を与えるタンパク質濃度(ED50)を決定した。このデータから、競合アッセイで使用するタウタンパク質用量を100ng/mLに固定した。このタウ濃度を使用して、可溶性且つ競合性の抽出GAG(０、0.01、0.1、0.5、１、10、100及び500ng/mL)の存在下で、固定化ヘパリンへのタウ結合の程度に関する変化を調べた。コントロール及びADのGAGとタウタンパク質とを、ヘパリン固定化ウェルに同時に加え、プレートをrtにて１時間インキュベートした。洗浄後、プレートに結合したままのタンパク質を、対応する特異抗体(1:1000、１時間、rt)、続いてペルオキシダーゼ標識二次抗体(1:5000、１時間、rt)で標的した。ペルオキシダーゼ活性を、テトラメチルベンジジン(TMB)検出キット(Pierce)で測定した。年齢適合群のGAGを用いたときに残存するシグナルを参照結合(100％)とした(図21)。
【０２３３】
実施例７．コントロール及びADのGAG又は3-O-硫酸化されたか若しくはされていないHSオリゴ糖の存在下での脳GSK-3キナーゼによるヒトタウのリン酸化
グリコーゲンシンターゼキナーゼ３(GSK-3)によるリン酸化。組換えhTau41(Millipore)を１単位/mlの組換えGSK3(Millipore)と、50mg/mlのヘパリン、Arixtra(登録商標)又は非3-O-硫酸化ヘパリンヘキササッカリドの存在下又は非存在下で０〜24時間インキュベートした。リン酸化アッセイ(0.050ml)を30℃にて行った。リン酸化アッセイは、25mM Tris-HCl、pH7.4、0.1mM EGTA、0.1mMオルトバナジン酸ナトリウム、2.5mM PKI(サイクリックAMP依存性タンパク質キナーゼの特異的インヒビター)、プロテアーゼインヒビター(0.5mMフェニルメチルスルホニルフロリド、５mg/mlアプロチニン、５mg/mlロイペプチン及び0.5mg/mlペプスタチン)、タウタンパク質(４mM)、10mM酢酸マグネシウム、２mM [g-32P]ATP(約100cpm/nmol)、５単位/mlの組換え再構成GSK3を含んでなっていた。反応はATPで開始させ、10分〜24時間の間の種々の時間でアリコートを取り出し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びイムノブロッティングに使用した。イムノブロットは記載されたように行った(Masato Hasegawaら，J Bio Chem. (1997) 272 (52), pp. 33118-33124)。或いは、Whatman P-81紙への吸着後に32Ｐ放射活性の取込みを記載されたように測定した。ヘパリン及び抽出GAGを50mg/mlでアッセイに含ませた。
【０２３４】
実施例８．タウ過リン酸化ADの変異依存性(hTauP301L)及び変異非依存性(酸化ストレス)細胞モデルにおけるグリコサミノグリカン硫酸化の抑制
２つの細胞タイプを使用した：(i)異常リン酸化が酸化ストレスにより誘導される野生型SH-SY5Y細胞(変異非依存性モデル)、及び(ii)FTDP-17に特徴的な変異hTAU-P301Lを有する完全ヒトタウタンパク質で安定にトランスフェクトされた細胞(変異依存性モデル)。タウ変異の結果として、細胞は高レベルの異常リン酸化タウを示す。
変異依存性モデルについては、細胞を記載されたように培養した(Schaeffer Vら，J Neurobiol 2006, Jul;66(8):868-881)。変異非依存性モデルについては、ヒトSH-SY5Y神経芽腫細胞を、５％ウシ胎仔血清及びペニシリン/ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)中で増殖させた(５％ CO2及び95％空気)。両モデルについて、細胞を、25cm2ディッシュに106細胞/cm2の密度でプレートし、標準条件下で24時間インキュベートした。次いで、細胞(両モデル)を10μMレチノール酸(RA)で３日間処理して神経分化を誘導した。
変異非依存性モデルに関しては、次いで、分化細胞をH2O2(500mM)で30分間処理し、培地を、RAを補充した新鮮培地に再び交換した。この酸化処理は細胞においてタウのThr231及びSer396での異常リン酸化を誘導する。
酸化剤除去の６時間後。
３日間の分化後、両モデルの細胞を、RA(10μM)の存在下で、50mMの最終濃度で加えた塩素酸ナトリウム(GAG硫酸化のインヒビター)で処理して分化を維持した。細胞をこれら条件下にて更に24時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、採集し、抗タウ-pSer199及び抗タウ-pSer396抗体(Millipore)を用いるpタウのフローサイトメトリ分析及びウェスタンブロット分析に使用した。
【０２３５】
実施例９．タウ過リン酸化ADの変異依存性(hTauP301L)及び変異非依存性(酸化ストレス)細胞モデルにおける3-OST-2(HS3ST2)のサイレンシング
HS3ST2及びHS3ST4 siRNAサイレンシングの効果を、記載した２つのAD細胞モデルにおいて試験したが、クロラート処理を、siRNA(センスについては配列番号73で示すsiRNA、アンチセンスについては配列番号74で示すsiRNA)(10、20、40及び80nM)のリポフェクタミンでのトランスフェクションに置き換えた。全ての場合で、細胞をプレートし、標準条件下で60％コンフルーエンスまでインキュベートし、siRNAサイレンシングをhTauP301L細胞においては直接行い、WT細胞についてはH2O2ストレスの前後に行った。随意に、サイレンシングを行った細胞及びコントロールをレチノール酸(10μM)で３日間分化させた。採集した細胞を、抗タウ-pSer199及び抗タウ-pSer396抗体(Millipore)を用いるフローサイトメトリで周知の技法を用いて分析した。少なくとも10000細胞(事象)を分析した。HS3ST2サイレンシングは、HS3ST2転写物のRTqPCR分析により、HS3ST2タンパク質発現についてはウェスタンブロット分析により確証した。
【０２３６】
ウェスタンブロット分析
細胞を採集後、１mM Na3VO4及び0.1％プロテアーゼインヒビターカクテル(Sigam)を含有する溶解緩衝液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、１％ Triton X-100、１mM EDTA、10mM NaF、pH8.0)中で氷浴にて５分間インキュベートした。溶解物を遠心分離し、上清中のタンパク質を、BCAタンパク質アッセイキット(Pierce)を用いて定量した。30μgのタンパク質に相当する抽出物を、組織及びCSFタンパク質サンプルに関して記載したように、電気泳動により分離した。上記の抗タウ-pSer199及び抗タウ-pSer396(Millipore)を用いて異常リン酸化タウを検出した。HS3ST2の分析に関しては、酵素の事前の免疫沈降(milteniキット)が培養細胞中の検出を向上させるために必要であった。タンパク質ローディングを評価するために、膜を直ぐに剥がし、β-アクチンについて再探査した。結果は、アクチンに対する標的タンパク質の比として表した。独立実験をコントロールに対して規格化した。
【０２３７】
実施例10．ゼブラフィッシュにおけるタウタンパク質の過リン酸化の分析
変異した過リン酸化タウタンパク質レベルに対する3-OST発現の効果を調べるために、ニューロン喪失、タウ過リン酸化、凝集、もつれ形成及び行動変化を含むタウオパチーの特性(Paquetら，2009)を示すhTAU-P301Lトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を使用した。先ず、５日齢のhTAU-P301Lトランスジェニック胚の脳を過リン酸化タウタンパク質に対する抗体で標識して、タウオパチーを示唆する過リン酸化部位が存在するかどうかを評価した。予想通り、野生型がタウ過リン酸化を全く示さなかったこととは対照的に、hTAU-P301L変異体でタウの過リン酸化が観察された(図10A)。更に、過リン酸化タウは変異体の小脳及び脊髄上部領域に位置していただけではなく、終脳にも高度に発現していた。このことは、前脳がタウのミスフォールディングに極度に影響され得ることを示唆する。
異常リン酸化は、同一サンプルで分析した総タウタンパク質レベルに対する異常リン酸化タウレベルの比として古典的に表現される。トランスジェニックゼブラフィッシュでは、異常リン酸化タウレベル/総タウタンパク質レベルは、下記のようにP-タウ及びT-タウELISAアッセイで測定した。トランスジェニックhTAU-P301Lで、異常に過リン酸化したタウタンパク質の蓄積(総タウタンパク質量基準)がWTと比較して90倍上昇していることが観察された(図10B)。更に、Aβ42がこれらサカナに存在するかどうかを決定するために、Aβ42 ELISA分析を行った。予想通り、FTDのこのトランスジェニックhTAU-P301LモデルではAβ42は観察されなかった。
【０２３８】
配列番号５の3-OST-2をコードする遺伝子をモルホリノ媒介ノックダウンしたトランスジェニックhTAU-P301L胚及び非注入胚を、24hpfでのDsRed蛍光タンパク質強度に基づいてスクリーニングした。3-OST-2をコードする遺伝子をモルホリノ媒介ノックダウンしたトランスジェニックhTAU-P301Lゼブラフィッシュモデルにおけるタウタンパク質の過リン酸化レベルを調べた。最初に、WT系統とタウタンパク質のP301L変異を有するトランスジェニックゼブラフィッシュとの交配により得られたゼブラフィッシュ胚に、モルホリノを種々の濃度(0.3mM、0.5mM及び１mM)で注入した。注射の24時間後に生存している胚の数を評価し、生存率を決定した。0.5mMのモルホリノ濃度が主要な異常性も奇形も生じず、モルファント間の生存率が最適である(注射の24時間後で67％の生存率)ことが観察された。よって、この濃度を更なる分析に選択した(図12)。
【０２３９】
トランスジェニックゼブラフィッシュ：hTAU-P301Lを発現するトランスジェニック系統は、Christian Haas教授の厚意により提供された(Paquetら，2009)。この動物を記載されたように飼育した。簡潔には、Mosaic DsRedポジティブ幼生を飼育し、野生型サカナと異系交配した。ゼブラフィッシュを28℃にてWesterfield(1995)が記載する標準条件下で維持した。Kimmelら(1995)が記載するように、発生ステージは受精後の時間(hpf)として決定した。全ての実験は、実験脊椎動物のケア及び使用に関する倫理規定(Direction departementale des services veterinaries de Paris)に従って行った。
【０２４０】
ゼブラフィッシュからの総RNA抽出及びqPCR
総RNAは、WT及びDsRedポジティブゼブラフィッシュサンプルの100の解剖胚のプールから抽出した。RNA抽出は、RNAeasy(登録商標)ミニキット(50)を用いて達成した。HS3ST2発現をmRNAレベルで測定するために、単離RNAから逆転写酵素反応によりcDNAを合成した。簡潔には、総抽出RNA(１μg)を、５mM dNTP及びRNaseインヒビター(Invitrogen)の混合物中でランダムプライマー(30μg/mL)と65℃にて５分間インキュベートした。その後、５×第１鎖緩衝液、１mM DTT及びRNaseインヒビターSuperscript II Rnase H- Reverse Transcriptase(Invitrogen)と42℃にて52分間、70℃にて15分間インキュベートした。転写酵素を含まない混合物をネガティブコントロールとした。qPCRに関しては、プライマーはPrimer3outputが設計したものをEurofins(Gemany)より入手した(表４)。qPCRに関しは、増幅は、LightCycler(ソフトウェアバージョン3.5；Roche Switserland)で、FastSart DNA Master SYBR Green I(Roche, Switzerland)を用いて、製造業者が提供する標準的な操作手順に従って行った。１回のアッセイで全てのサンプルを同時に増幅した。相対的定量を上記のように行った(Vandesompeleら，2002, Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol 3:RESEARCH0034)。
【０２４１】
【表４−１】
0006336909.tif 000012
【表４−２】
0006336909.tif 000013
【０２４２】
hTAU-P301Lを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ系統におけるHS3ST2コーディング遺伝子のモルホリノ媒介ノックダウン
モルホリノオリゴヌクレオチド(MO)は、HS3ST2 mRNA：5'-ATGGCATATAGGT TCCTGTCAAGCC…-3'の翻訳をブロックするために、ゼブラフィッシュ3-OST-2遺伝子の隣接領域を標的するように設計した。モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Gene Tools(LLC One Summerton Way, Philomath, OR, USA)により設計した。MO HS3ST2-ATG：5'-GGCTTGACAGGAACCTATATGCCAT-3'。
【０２４３】
モルホリノ注入
モルホリノを、Danieau緩衝液(58mM NaCl、0.7mM KCl、0.4mM MgSO4、0.6mM Ca(NO3)、５mM HEPES pH7.6)に異なる３濃度に希釈し、0.3mg/mLデキストランローダミン(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)と共に注入した。１細胞ステージ又は２細胞ステージのトランスジェニックゼブラフィッシュ胚に、プレッシャーマイクロインジェクター及びZeiss立体顕微鏡(Zeiss)を用いて約２nLの0.5mM又は１mMモルホリノ溶液を微小注入した。３つのモルホリノ溶液を、サカナの生存度、異常性及び奇形について試験した。主要な異常性も奇形も引き起こさなかった生存濃度のみを使用した(0.5mM)。胚をフィッシュウォーター中に28℃にて維持した。20hpf後、胚を、メラニン経路中の全てのチロシナーゼ依存性工程のインヒビターである１× PTU(1-フェニル2-チオウレア)とインキュベートした。卵膜除去(dechorionation)の２日後、DsRedポジティブ胚を選択した：変異サカナに特徴的な顕著な赤色蛍光標識を示す胚のみを、モルホリノの存在についてポジティブと見なした。次いで、胚を48及び120hpfで固定又は解剖した。
【０２４４】
ゼブラフィッシュにおける過リン酸化タウタンパク質の免疫細胞化学による分析
ゼブラフィッシュ胚を0.64mMトリカイン(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)で麻酔し、４％パラホルムアルデヒド中で１時間rtにて固定した。５dpfの胚を１時間固定した後、脳をPBS中で解剖した。６回のリン酸緩衝液での各５分間の洗浄後、解剖脳又は全胚を、0.2％ゼラチン(Merck, Darmstadt, Germany)及び0.25％ Triton X100(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)で１時間rtにてブロッキング及び透過化し、続いて0.02％ NaN3を含有する緩衝液に1:100希釈した一次抗体たる抗PHF-タウ抗体クローンAT8(Thermo Scientific)及び抗PHF-タウ抗体クローンAT180(Thermo Scientific)とインキュベートした。ポジティブDsRed胚を選択するために、1:50希釈した抗DsRed(Clontech)でも標識した。脳又は胚をヤギ抗マウスビオチン化抗体(Vector, 1:400希釈)溶液と１時間30分間rtにてインキュベートし、続いてストレプトアビジンAlexa 488(Molecular probes、1:400希釈で使用)溶液中で１時間rtにてインキュベートした。脳又は胚をPBS緩衝液中１％アガロース(低融点、Biorad)でマウントした。モルファント表現型の画像を、明視野照明下で、ACT-1ソフトウェア(Version 2.63 Nikon)で制御したデジタルカメラ(DXM 1200F, Nikon)を備えた立体顕微鏡(SteREO Lumar. V12, Zeiss)で記録した。蛍光標識の組合せを、Axiovisionソフトウェアで制御したAxioCam MRmカメラ(Zeiss)を備えるApoTomeシステム(Zeiss)を備えた顕微鏡を用いて画像化した。
【０２４５】
ゼブラフィッシュからのタンパク質抽出及びELISAによるタウ定量
AB系統とP301L変異タウ遺伝子を有するトランスジェニックゼブラフィッシュとの交配により得られた胚を、24hpf及び48hpfにDsRed蛍光タンパク質についてスクリーニングし、卵黄を除去した。50mM Tris HCl pH８、150mM NaCl、10％ Triton X100、１mM EDTA、プロテアーゼインヒビター(カクテル、Roche)、10mM NaF及び１mMオルトバナジン酸ナトリウムを含有する氷冷抽出緩衝液を２倍体積で胚に加えた。組織を超音波処理により断片化し(Branson, Sonifier 250)、４℃にてホモジナイズした(Stuart rotator SB3)。10 000rpmで30分間の遠心分離後(Eppendorf Centrifuge, Sigma-202 MK)、上清を廃棄した。タンパク質濃度はBradford法に従って測定した。
異常リン酸化タウ(P-タウ)は、INNOTEST(登録商標) PHOSPHO-TAU (181P) ELISA(Innogenetics, Gent Belgium)で測定した。モノクローナル抗体HT7(正常タウ及びP-タウのアミノ酸159〜163を認識)及びビオチン化モノクローナル抗体AT270(リン酸化スレオニン181残基を含むP-タウを認識)の組合せを用いて、タウオパチー関連病状に特徴的なP-タウ181レベルを測定した。ELISA INNOTESTに備えられた合成ホスホペプチドを標準化に使用した。
総タウ(T-タウ)は、INNOTEST hTAU-Ag ELISA(Innogenetics, Gent, Belgium)で測定した。このT-タウアッセイは、捕捉用にモノクローナル抗体(AT120)を、検出用にビオチン化モノクローナル抗体(HT7及びBT2)を利用する(Vanmechelenら,2000)。Aβ42もまた、INNOTESTTM β-Amyloid (1-42) ELISA(Innogenetics, Gent, Belgium)で測定した。
【０２４６】
実施例11．ヘパラン模擬体(F6及びCR36)合成は、SAMP8マウス脳内でタウの過リン酸化を阻害する
一般的な合成手順を下記に示す：
【化７】
0006336909.tif 000014
【０２４７】
【表５】
0006336909.tif 000015
【０２４８】
本発明で使用したヘパラン模擬体(HM)は、組織再生特性を有するためにRGTA(組織再生剤ReGeneraTing Agentの略号)としても知られるデキストラン誘導体である。これら化合物は一般式AaXxYy(式中、Ａはモノマーを表し、グルコース単位を含み、ＸはRCOOR'成分を表し、カルボキシメチル成分を含み、ＹはＡと共有結合したO-又はN-スルホネート成分を表し、次の式：-ROSO3R'、-RNSO3R'(ここで、Ｒはアミノ酸置換を含む芳香族置換を有し得るアルキル鎖を表し、Ｒ'は水素原子又はカチオンを表す)の１つを有し、ａはモノマー数を表し、ｘはモノマーＡに連結したＸ成分の置換度を表し、ｙはモノマーＡ上のＹ基の置換度を表す)を有する。CR36、F6及びこの定義に該当する他の分子は、以前の特許で報告されたように製造される。しかし、本発明で使用する化合物の合成及び構造特徴決定は、下記で特定されるとおりである。F6及びCR36の合成の差は、合成に使用する出発材料のデキストランであり、カルボキシメチル化、アミド化及び硫酸化反応は同じである。
【０２４９】
デキストランのカルボキシメチル化：F6については、デキストランT5(MW＝5000Da)を出発材料として使用した。CR36については、デキストランT10(MW＝10000Da)を出発材料として使用した。デキストラン(30ｇ、0.185モルのグルコース)を146mLの水に溶解させ、別途に59.2ｇのNaOH(1.4モル)を59mLの水に溶解させた。両溶液とも４℃に冷却した。NaOH溶液をデキストラン溶液に撹拌下で15℃を超えないように温度を制御しながらゆっくりと注いだ。反応混合物を20分間撹拌した後、４℃まで冷却した。モノクロロ酢酸(61.3ｇ、6.5モル)を少量ずつ、反応温度を＜20℃に制御しながら加えた後、反応混合物を50℃にて40分間撹拌した。次いで、反応を終了させ、得られる水溶液を分子量1000のカットオフ膜でタンジェンシャル限外ろ過により精製し、続いて記載のように凍結乾燥させた。より高いカルボキシメチル含量を有する生成物を製造するためには、同じ手順を２回又は３回繰り返し、所望のdsCMを得た。
D6、D4及びE5は類似の方法で合成する。
【０２５０】
アミド化反応。CMD(５ｇ、dsCM 1.1、21.5ミリモルのCOO-)を136mLの水に溶解させた後、71mLのアセトンを加えた。温度を40℃に維持した。カルボキシル官能基を活性化させるため、20mLのアセトン中5.3ｇの２-エトキシ-１-エトキシカルボニル-１,２-ジヒドロキノリン(21.5ミリモル)を加え、反応混合物を20分間40℃にて撹拌した。最終溶媒は比60/40の水とアセトンから構成された。次いで、フェニルアラニンメチルエステル(21.5ミリモル)を加え、HCl ４ＭでpHを７に調整した。反応物を40℃で一晩撹拌した。得られる水溶液のタンジェンシャル限外ろ過により最終生成物を精製し、続いて凍結乾燥させた。
【０２５１】
2M2Bの存在下での硫酸化多糖のSO3-DMF媒介合成。10g/LのCMDPh水溶液(24.3ミリモルのグルコース)を40mLのホルムアミド及び160mLのDMFに溶解させた。完全な溶解後、40mLの2M2B(26.5ｇ、378.6ミリモル)をゆっくりと加えた。SO3-DMF複合体(7.4ｇ、48.6ミリモル)を迅速に加え、反応混合物を30℃にて２時間撹拌した。200mLのNaHCO3中にゆっくりと注いで反応を終了させ、上記のとおり、最終生成物をタンジェンシャル限外ろ過により精製し、続いて凍結乾燥させた。アミド化生成物は硫酸化前にはプロトン化していなかった。
【０２５２】
生成物の精製及び構造特徴決定
生成物の精製は、1000通常分子量カットオフ(NMWCO)の再生セルロース膜(Pellicon2、0.5m2、Millipore, MA)で５ＬのNaCl １Ｍ、次いで20ＬのMilli-Q水に対してタンジェンシャル限外ろ過で体系的に達成した。得られる濃縮溶液を凍結乾燥させた。Universal mill A10 IKA(IKA-WERKE GMBH & CO. KG, Germany)により、純粋な乾燥生成物をホモジナイズして微粉末を得た。200 MHz Brukerスペクトロメータ及び600 MHz Varianスペクトロメータを用い、残留H2Oピークを標準として使用してD2O中のサンプルからの1H NMRスペクトルを記録した(4.805ppm)。分子量の絶対値測定及びサイズ分布は、多糖溶液について0.1Ｍ LiNO3に溶出させるサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により行った。これには、差分屈折率検出器(RI, ERC 7515A, Erma Cr. Inc., France)と直列に接続した多角レーザ光散乱光度計(MALLS；Dawn DSP-F, Wyatt Technology, Santa Barbara, CA)と組み合わせた。TSK Gel G3000 PWXL(TosoHaas, Cambridge, U.K.)カラムを多糖分析に使用した。置換度(ds)は、置換カルボキシメチル基の数(dsCM)、置換カルボキシメチルアミドの数(dsX)及びスルフェート基の数(dsS)として定義した。
【０２５３】
F6：0.61CM、0.15L-Phe(OMe)、0.7Ｓ
ここで、CMはカルボキシメチル基に相当し(61％、20〜150％含量が可能)、Ｓはスルフェート基に相当し(70％、20〜150％含量が可能)；L-Phe(OMe)は15％で存在する(０〜50％置換が可能)。
−CR 36：T10から製造(NHX＝L-Phe(OMe))、これは以下の置換度を有する：59CM、22L-Phe(OMe)、83Ｓ。
ここで、CMはカルボキシメチル基に相当し(59％、20〜150％含量が可能)、Ｓはスルフェート基に相当し(83％、20〜150％含量が可能)；L-Phe(OMe)は22％で存在する(０〜50％置換が可能)。
【０２５４】
SAMP8マウスのF6での処置
合計60匹の５ヶ月齢雄性SAMP8及び14匹の５ヶ月齢SAMR1(正常コントロール)を、クリーングレードの動物舎において22〜24にて55±５％の湿度で12時間の明暗サイクルで飼育した。全てのマウスを標準飼料で飼育した。SAMP8及びSAMR1の平均寿命はそれぞれ15±２ヶ月及び30±３ヶ月であった。全てのマウスを５日間順応飼育した後に、60匹のSAMP8マウスを体重に従って各群15マウスの６群に分けた：モデル群、フペルジンＡ群、F6高用量群(F6 H、50mg/kg)及びF6低用量群(F6 L、50mg/kg)。フペルジンＡ群には、3.86μg/KgのフペルジンＡ(ヒト臨床用量と等価、正常ナトリウムに溶解)を１日１回経口投与した；F6 H群には、50mg・Kg-1 F6(正常ナトリウムに溶解)を４日毎に１回腹腔内注射した；F6 L群には、25mg・Kg-1 F6(正常ナトリウムに溶解)を４日毎に１回腹腔内注射した；モデル群及びSAMR1正常コントロール群(コントロール)には、等価用量の溶質(200μL精製水)を１日１回経口投与した。全ての群を２ヶ月間処置した後、行動及び分子生物学検出を行った。
【０２５５】
行動及び分子生物学検出：
SAMの学習及び記憶能力に対するGAGアナログの効果の測定
行動検出を順次行った：定位ナビゲーション(place navigation)(１〜４日目)、空間探索試験(５日目)及びフットショック回避試験(８〜９日目)。定位ナビゲーションモリス水迷路(MWM)検出は、報告された文献を参照し、若干の改変を加えて行った(参考文献)。各群における、逃避潜時、遊泳距離、異なる四分円内での滞留時間、異なる四分円内での遊泳路長、全遊泳路長、遊泳速度、逃避成功パーセンテージを調べた。実験前に、マウスを先ず、水面下のプラットフォームに15秒間置き(順応期)、次いで第１四分円内及び第３四分円内のそれぞれで水中にプール壁に向けて置いた。マウスに90秒間MWM中を自由に遊泳させ、５秒を超えるプラットフォーム滞留時間を、プラットフォーム探知の成功と見なし、水中に入れてからプラットフォーム探知の成功までの時間を逃避潜時として用いた。マウスが90秒以内にプラットフォームに到達できなかった場合、逃避潜時は90秒として記録した。毎日の平均逃避潜時を算出して、空間記憶の獲得能力を評価した。全てのマウスを４日間継続して訓練し、各群においてプラットフォーム探知に成功したマウスのパーセンテージ(泳いで水から出た率)を毎日算出した。
【０２５６】
空間探索試験。定位ナビゲーション終了翌日(５日目)にプラットフォームを移動した。各マウスを第３四分円から90秒間自由に遊泳させた。90秒の間の、(定位ナビゲーション測定中にプラットフォームが位置していた実際の位置を横切る)環帯横断数、同じプラットフォーム内での遊泳距離率及び遊泳時間率(マウスにつき、全遊泳距離又は全遊泳時間に対する第３四分円のプラットフォーム内での遊泳距離及び時間のパーセンテージ)を記録して、空間記憶獲得能力を評価した。
【０２５７】
フットショック回避。MWM試験終了２日後、マウスにフットショック回避試験を行った。跳躍装置は方形で、８室を有していた。各室の底には帯電した銅製細網が備えられ、電圧はコンピュータにより制御・調節でき、この実験では40Ｖの電圧を使用した。各室の底には、絶縁された直径５cmの円形プラットフォームが同じ側に備えられ、その周囲にはフェンダーが設けられ、観察者に対面する天板側は透明であり、他の側は不透明であった。室の天板は取り外し可能であり、マウスを出し入れできた。マウスは、絶縁プラットフォーム内に立って、電気ショックを回避できた。実験は二相：記憶獲得及び記憶固定からなった。
【０２５８】
記憶獲得実験。マウスを室に２分間入れて環境に慣らした後、実験開始時に銅製細網上に置き、５分間スイッチを入れた(40Ｖ)。電気ショック後マウスが最初に絶縁プラットフォーム上に逃避する潜時、５分間のうちのプラットフォーム上での時間(安全領域にいる時間)、電気ショックを受けた時間(誤った領域にいる時間)、電気ショックの時間及びマウスが電気ショックを受けた頻度を学習成績として記録して、受動回避応答の能力を判断した。
【０２５９】
記憶固定実験。記憶獲得実験終了翌日、マウスをプラットフォーム上に載せて、スイッチを５分間入れた。プラットフォームから銅製細網上に最初に飛び降りた時間(潜時)、安全領域(プラットフォーム上)にいる時間、誤った領域(銅製細網上)にいる時間、電気ショックの頻度及びマウスが電気ショックを受けた数を記録して、記憶成績を評価した。
【０２６０】
ウェスタンブロット。フットショック回避試験終了後、２/３のマウスから眼球摘出により血液を採集したのち、屠殺した。全脳を氷上に取り出し、プールした正常ナトリウムで洗浄して血液を除いた後、左右の大脳皮質及び海馬領域をそれぞれ分離し、凍結チューブに入れ、最後に液体窒素中に保存した。各群３匹のマウスの左海馬領域及び大脳皮質を秤量し、１mLのタンパク質溶解液[50mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、１％ Trition X-100、１mM EDTA、10mM NaF、１mM Na3VO4、カクテルインヒビター１％]を氷上の20mg粉砕サンプルに30分間加えた後、13,000rpmで15分間４℃にて遠心分離し、上清を回収し、−80℃にて保存した。BCAキットを用いてタンパク質含量を測定した。合計30μgのタンパク質を回収してウェスタンブロットを行った。SDS-PAGE後、タンパク質をPVDF膜に４℃で転写し、３％ BSAで１時間ブロックした後、一次抗体を加えて一晩４℃にてインキュベートした。以下の一次抗体を使用した：抗タウ１(１:200)、抗タウ５(１:500)、抗pタウ199/202(１:1,000)、抗pタウ231(１:1,000)、抗pタウ404(１:1,000)。蛍光標識二次抗体を加え、暗所で室温にて１時間インキュベートした。最後に、Odyssey赤外画像化システムを使用して、バンドをスキャンし、分析した。
【０２６１】
蛍光免疫組織化学。サンプル処理。フットショック回避試験終了後、１/３のマウスに0.1Ｍ PBSを５分間、４％パラホルムアルデヒド(0.1Ｍ PBS、pH7.4)を10分間心臓内灌流し、マウスの肝臓及び腸が白くなり、尾が攣縮したら、全脳を迅速に取り出し、４％パラホルムアルデヒドで24時間固定した後、(0.1Ｍ PBS、pH7.4中)20％スクロース溶液に一晩４℃にて入れて置いた。その後、脱水手順を行った：50％アルコールに36時間、70％アルコールに48時間、80％アルコールに６時間、95％アルコールに４時間(×２)、100％アルコールに３時間(×３)、ジメチルベンゼンに1.5時間(×２)、パラフィンワックスに４時間(×２)。最後に、サンプルをパラフィン包埋し、５μm厚の連続切片とした。
【０２６２】
蛍光染色：各々決定した指標の非特異的一次免疫染色及び非特異的二次免疫染色においてポジティブ染色が観察されなかったことに基づいて蛍光染色の実験形式を開発した。
脱パラフィン化：ジメチルベンゼンに５分間３回、100％アルコールに３分間２回、95％アルコールに１分間、70％アルコールに１分間、50％アルコールに１分間、水で５分間洗浄。
抗原回収：100℃にて20分間のシトレート水浴、水で10分間洗浄、PBSで５分間１回の洗浄。抗原ブロッキング：３％ BSAで30分間室温にてブロックした。内因性ビオチンブロッキング：キットの指示書に従って行った。溶液Ａ及びＢでそれぞれ15分間ブロックした。一次抗体：１％ BSA＋0.2％ Triton X-100＋PBSで希釈し、一晩４℃にてインキュベートした。抗タウ５(１:100)、抗pタウ199/202(１:100)、抗pタウ231(１:100)、抗pタウ262(１:200)、抗pタウ396(１:100)、抗CS(１:100)、抗カテプシンＤ(１:100)、抗カテプシンＢ(１:50)、抗HS(A04B08)(１:20)。二次抗体：１％ BSA＋0.2％ Triton X-100＋PBSで希釈し(１:200)、暗所で室温にて１時間インキュベートした。HSは報告された文献(Ottenheijmら，2007)を参照し、抗VSVは希釈して(１:５)、室温にて１時間インキュベートした後、染色を行った。
シグナル増幅。キットの指示書に従って行い、それぞれ２滴の溶液Ａ及びＢを10mLのPBS中に加え、暗所で30分間室温にてインキュベートした。呈色：５mlのTris-HCl(0.1Ｍ、pH8.2)に、レバミゾール溶液を１滴並びにキットの溶液Ａ、Ｂ及びＣをそれぞれ２滴加え、暗所で20分間室温にてインキュベートした。DAPI染色：１μg・ml-1 DAPIを使用して３分間室温にて染色した。マウントし、暗所で４℃にて保存した。適時写真を撮影した。
【０２６３】
実施例12．分化又は未分化SH-SY5Y細胞におけるAβ42神経毒性に対するF6及びCR36処理
F6及びCR36を、分化及び未分化ヒトSH-SY5Y細胞(Datkiら，2003)において、Aβ42毒性を改変する能力についてアッセイした。未分化SH-SY5Y細胞は、10％ FBSを補充したDMEM中37℃にて５％ CO2で維持した。アッセイのために、細胞を96ウェルプレートに15,000細胞/ウェルで播種し、10％ FBSを補充したDMEM中24時間維持した。分化細胞アッセイのために、培地に10μMレチノール酸(Sigma-Aldrich)を補充し、細胞を３日間分化させた。未分化細胞アッセイについてはレチノール酸処理を行わなかった。ヒトAβ42ペプチド(Sigma-Aldrich)を、水溶液(50μM)中で、rtにて３日間穏やかに振盪させることにより、即席に凝集させた。次いで、凝集Aβ42を分化又は未分化細胞に10μMの最終濃度で加えた。このAβ42ペプチド濃度は、50％近辺の細胞生存度が得られるように用量-効果実験により固定した(データは示さず)。F6、CR36又はコントロール生成物(LiCl2、ヘパリン、エノキサパリン、DMMB)を細胞に0.01、0.1又は１μg/mLの最終濃度で10μMの凝集Aβ42ペプチドと共に加え、細胞を１日間インキュベートした。MTTアッセイ(Mosmann, 1983)で細胞生存度を測定した。簡潔には、培地を交換し、10μLのMTTストック溶液(５mg/mL)を各ウェルに加えた。細胞を２時間rtにてインキュベートし、MTT溶液を廃棄した。DMSOを各ウェルに加え、光学密度を560nmで読み取った。光学密度は、分化及び未分化の両方の細胞についての較正曲線(データは示さず)により、細胞数に直接相関させた。
【０２６４】
実施例13．血液脳関門(BBB)通過
血液脳関門(BBB)透過性研究を、hCMEC/D3細胞単層において、以前に記載されたように作製したBBB細胞(B. B. Wekslerら；FASEB J. 2005 Nov;19(13):1872-4)で行った。簡潔には、トランスウェルポリカーボネートインサートフィルターで、異なるサイズの分子に対するBBBの透過性を測定した。HCMEC/D3細胞をフィルター上にEGM-2培地中２×105細胞/cm2のコンフルーエント密度で播種した。48時間後、F6、CR36、HM2602及びオリゴデキストランを含むアッセイ分子を上部チャンバに加え、下部チャンバを10分間隔でサンプリングし、硫酸化糖を検出するためのDMMB法を用いて、細胞に覆われたインサートを通過する分子を測定した(図22)。
データ分析
データ分析は、Prism 5.0(GraphPad Software Inc., CA)ソフトウェアを用いて行った。データは平均±SEMとして示した。対応のある比較は二試料ｔ検定及びマンホイットニー検定を用いて行い、多重比較は一元ANOVAを用いて行った。
【０２６５】
結論
ヒトアルツハイマー海馬において、タウに関するGAG結合親和性の増大が観察された。更に、アルツハイマー病では、(核の周囲で濃い)HS及び過リン酸化タウの共存に伴う強力な染色が観察された。これら結果は、アルツハイマー病でHS含量が上昇することを示した。HSのこの上昇は、HSの構造及び組成変化を伴い、転写物過剰発現で検知される推定の3-O-硫酸化増加を伴っていた。3-O-硫酸化は、ヘパリンに特徴的に見出されるHS生合成の改変であり、3-O-スルホトランスフェラーゼ(3-OST)により行われる。3-OSTにより改変されたHSは、その後、アルツハイマー病で重要な役割を演じ得る。２つの3-OSTイソフォームの発現は、アルツハイマー病脳で顕著に上昇した。我々の結果は、ヘパリンにより誘導されるタウ立体構造変化がタウの過リン酸化を誘導し得ることを示す文献データにより補強されるが、アルツハイマー病脳由来のHSにおける稀な硫酸化パターンの病的徴候が病理に関与している可能性を示唆する。3-OSTに対応する転写物の存在が、本研究で使用したトランスジェニックhTAU-P301Lゼブラフィッシュモデルにおいて確証された。このモデルはまた、タウタンパク質の異常な過リン酸化により特徴付けられる。
ここで、モルホリノによる3-OST-2発現の減少によって、異常タウ過リン酸化の蓄積が顕著に減少することがインビボで証明されている。このことは、リン酸化プロセスにおけるHSの必須要件を強力に示唆する。特に、HSの構造及び組成は、病的タウ改変に3-O-硫酸化を必要とするようである。
【０２６６】
3-OST-2のサイレンシング後の過リン酸化タウ蓄積の減少は、3-O-硫酸化HSがタウタンパク質とキナーゼ及び/又はホスファターゼとの間の相互作用を刺激すること、又はHSの特定の硫酸化シーケンスがキナーゼ及び/又はホスファターゼに関するタウ親和性を調節し得ることを示唆する。
アルツハイマー病に存在する3-O-硫酸化HSの構造に誘導される変化、続く3-OST-2の阻害は、微小管分解及び該タンパク質の重合化(この重合化は不溶性PHFの形成をもたらす)を促進する可能性のあるタウ立体構造変化を予防し得る。これら変化は、タウをホスファターゼに曝して、リン酸化タウ蓄積レベルの低下を導き得る。幾つかの証拠が、オリゴマー形態のタウもまた、疾患病理に或る役割を有し得、タウ凝集を標的する薬剤を用いるNFTの解体がおそらくは利用可能なタウオリゴマー量の上昇を生じ得ることを示唆する。このように、3-OST-2の阻害は、細胞を、タウ異常リン酸化、微小管分解及びPHF形成から保護する。
この研究の結果は、タンパク質キナーゼの阻害又はNFT脱凝集ストラテジ以外のアプローチでタウリン酸化を標的することの実現可能性を示唆する。インビボにてタウのリン酸化に対する3-OST-2モルホリノの阻害効果及び/又は細胞におけるsiRNAの使用により、阻害効果の機序に関する更なる研究が可能になる。
【０２６７】
実施例14：Aβペプチド神経毒性保護アッセイ
F6又は他のHMを、分化及び未分化ヒトSH-SY5Y細胞(Datkiら，2003)において、Ab42毒性を改変する能力についてアッセイした。未分化SH-SY5Y細胞を、10％ FBSを補充したDMEM中37℃にて５％ CO2で維持した。アッセイのために、細胞を96ウェルプレートに15,000細胞/ウェルで播種し、10％ FBSを補充したDMEM中24時間維持した。分化細胞アッセイのために、培地に10μMレチノール酸(Sigma-Aldrich)を補充し、細胞を３日間分化させた。未分化細胞アッセイについてはレチノール酸処理を行わなかった。示されたとおりのヒトAβ25-35ペプチド又はAβ42ペプチド(Sigma-Aldrich)を、水溶液(50μM)中で、rtにて３日間穏やかに振盪させることにより、即席に凝集させた。次いで、凝集Aβ42を分化又は未分化細胞に、Aβ42については10μMで、Aβ25-35については25μMで加えた(最終濃度)。このAβ42ペプチド濃度は、50％近辺の細胞生存度が得られるように用量-効果実験により固定した(データは示さず)。F6又は他の分子を細胞に１又は10μg/mLの最終濃度で凝集Aβ42ペプチドと共に加え、細胞を１日間インキュベートした。MTTアッセイ(Mosmann, 1983)で細胞生存度を測定した。簡潔には、培地を交換し、10μLのMTTストック溶液(５mg/mL)を各ウェルに加えた。細胞を２時間rtにてインキュベートし、MTT溶液を廃棄した。DMSOを各ウェルに加え、光学密度を560nmで読み取った。光学密度は、分化及び未分化の両方の細胞についての較正曲線(データは示さず)により、細胞数に直接相関させた。
【０２６８】
タウのウェスタンブロッティング：p-タウの検出のために、タウ180抗体(Thermo Fisher Scientific Inc.，3747 N Meridian Rd, Rockford, IL USA 61101から市販)を用いて、タンパク質抽出物(30μgのタンパク質)をブロットした。
この研究で使用したヘパラン硫酸模擬体の構造的特徴(実施例14)
【化８】
0006336909.tif 000016
結果を図25〜29に示す。
【図１】
0006336909.tif 000017
【図２】
0006336909.tif 000018
【図３】
0006336909.tif 000019
【図４】
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【図５】
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【図６】
0006336909.tif 000022
【図７】
0006336909.tif 000023
【図８−１】
0006336909.tif 000024
【図８−２】
0006336909.tif 000025
【図８−３】
0006336909.tif 000026
【図９】
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【図１０】
0006336909.tif 000028
【図１１】
0006336909.tif 000029
【図１２】
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【図１３】
0006336909.tif 000031
【図１４】
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【図１５】
0006336909.tif 000033
【図１６】
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【図１７】
0006336909.tif 000035
【図１８】
0006336909.tif 000036
【図１９】
0006336909.tif 000037
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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