(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質であって、
配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、
前記タンパク質は、プシコース３−エピメラーゼ活性を有し、前記ポリペプチド配列は配列番号６と同一ではないタンパク質。
【請求項２】
前記ポリペプチド配列は、配列番号６に対して少なくとも９５％、又は９９％の配列同一性を有する請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質は、固体基質上に固定化される請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
アルロース合成のためのタンパク質の使用であって、
前記タンパク質は、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、プシコース３−エピメラーゼ活性を有する、使用。
【請求項５】
核酸分子であって、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項６】
配列番号５に対して少なくとも９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有し、配列番号５と同一ではないポリヌクレオチド配列を含む請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項８】
請求項５又は６に記載の組換え核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項９】
前記宿主細胞は、酵母、バクテリア、若しくはその他の微生物であるか、又は、哺乳動物、植物、若しくはその他の培養細胞である請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記宿主細胞は大腸菌である請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
アルロースの生成方法であって、
果糖基質をアルロースに転換する条件下において、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、プシコース３−エピメラーゼ活性を有する、タンパク質を前記果糖基質に接触させるステップを含む方法。
【請求項１２】
前記タンパク質は、宿主細胞内に存在する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質は、単離形態である請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記条件には、前記タンパク質及び前記果糖基質を２５℃〜７５℃の温度範囲に維持することが含まれる請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記条件には、前記タンパク質及び前記果糖基質をｐＨ４〜ｐＨ１０の範囲に維持することが含まれる請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記条件には、前記果糖基質を７５％〜９５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲に維持することが含まれる請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号５と同一ではなく、プシコース３−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１８】
プシコース３−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んだ組換え核酸分子を含む宿主細胞であって、
前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号５と同一ではない
宿主細胞。
【請求項１９】
プシコース３−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んだ核酸分子を含むベクターであって、
前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号５と同一ではない
ベクター。
【請求項２０】
アルロースの生成方法であって、
ｉ）プシコース３−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸分子を含むベクターを提供するステップを含み、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、前記方法はさらに、
ｉｉ）前記ポリヌクレオチド配列にコードされたプシコース３−エピメラーゼ活性を有する前記タンパク質を合成するステップと、
ｉｉｉ）果糖をプシコース３−エピメラーゼ活性を有する前記タンパク質に接触させ、果糖からアルロースへの転換を可能にする条件下において、前記果糖及び前記タンパク質を維持するステップと、
ｉｖ）前記ステップｉｉｉ）において生成した前記アルロースを少なくとも部分的に精製するステップとを含む方法。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケトース３−エピメラーゼ活性を有するタンパク質と、上記タンパク質をコードする核酸分子とに係る。本発明はさらに、ベクターと、核酸分子を有する宿主細胞とに係る。本発明はさらに、上記タンパク質を使用してアルロースを合成する方法と、そのようにして生成されるアルロースとに係る。
【背景技術】
【０００２】
アルロースは、「ゼロカロリー」の甘味料であり、デキストロースと類似なものとして提案される甘味を有する。アルロースもまた、他の糖類と類似に、膨化及び褐色化といった性質を有する。アルロースの主要なターゲット市場は、現在製品にデキストロース、果糖、又はＨＦＣＳを使用しており、例えば膨化、褐色化、質感、及び甘味等の糖分で誘発される性質を顕著に変えることなく、カロリーを顕著に低減することを目指している食品メーカー及び飲料メーカーである。
【０００３】
アルロースは通常、米国では一般に安全と認められる食品（ＧＲＡＳ）ではないものの、現在ＧＲＡＳ通知が保留中である（ＧＲＮ４００）。アルロースは、加工したサトウキビ及びテンサイの糖、水蒸気処理したコーヒー、小麦製品、及び高果糖コーンシロップなどに存在する。アルロースの一般的な日常総摂取量は、１日０．２グラムを上回ると推定されている。Ｄ−アルロースは、Ｄ−果糖のＣ−３エピマーであり、アルロースと果糖の構造上の差として、アルロースは人体中で代謝されないため、ゼロカロリーということになる。従って、アルロースは、カロリーがない上、一般的な単糖類と類似な性質を維持しつつ、甘味があると報告されているため、膨化性の甘味剤として間違いのない候補だと考えられている。
【０００４】
ケトース−３−エピメラーゼは、果糖及びアルロースを相互転換することができる。米国特許第８，０３０，０３５号明細書及び国際公開第２０１１／０４０７０８号は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来で、且つ、プシコース３−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をＤ−果糖と反応させることにより、Ｄ−プシコース（アルロースの代替名）を生成できることを開示している。
【０００５】
米国特許出願公開第２０１１／０２７５１３８号明細書は、リゾビウム属の微生物由来のケトース３−エピメラーゼを開示している。このタンパク質は、Ｄ−ケトペントース又はＬ−ケトペントース及びＤ−ケトヘキソース又はＬ−ケトヘキソースに高い特異性を示し、特にＤ−果糖及びＤ−プシコースに高い特異性を示す。この文書はさらに、タンパク質を使用してケトースを生成するプロセスを開示している。
【０００６】
韓国登録特許第１０−０８３２３３９号公報は、果糖をプシコース（すなわち、アルロース）に転換することのできるシノリゾビウムＹＢ−５８型と、シノリゾビウムＹＢ−５８型の菌体を使用したプシコースの生成方法とを開示している。
【０００７】
韓国特許出願第１０−２００９−００９８９３８号は、大腸菌を使用したプシコースの生成方法を開示しており、この大腸菌は、プシコース３−エピメラーゼをコードするポリヌクレオチドを発現する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、既存の技術を超えるべく、アルロース生成の改善を目指すものである。本発明は、過去に報告されたよりも、細胞系全体における転換率及び容積生産性の高いケトース−３−エピメラーゼを提供することを目指すものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、３つのケトース−３−エピメラーゼ酵素の同定と特徴付けに起因し、その一例としてのアミノ酸配列が配列番号２、４、及び６に示されている。このケトース−３−エピメラーゼは、果糖をアルロースに転換するのに使用されてもよい。これらのタンパク質は、過去に、仮説タンパク質として、又は、タガトースエピメラーゼ活性を有するものとして同定されてきた。しかしながら、本発明者は、これらの酵素がプシコース−３−エピメラーゼ活性を有するという驚くべき発見をした。
【００１０】
本発明の第１様態によると、タンパク質であって、配列番号２、配列番号４、又は配列番号６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記タンパク質は、ケトース３−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を提供する。
【００１１】
ポリペプチド配列は、配列番号２ 、配列番号４、又は配列番号６に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するか、又は、配列番号２ 、配列番号４、又は配列番号６に対して１００％の配列同一性を有するのが好都合である。
【００１２】
前記ポリペプチド配列は、配列番号１３の配列を含むのが好ましい。
【００１３】
前記タンパク質は、固体基質上に固定化されるのが好適である。
【００１４】
本発明の第２様態によると、アルロース合成のための、本発明の第１様態に係るタンパク質の使用を提供する。
【００１５】
本発明の第３様態によると、核酸分子であって、本発明の第１様態に係るタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【００１６】
前記核酸分子は、
ｉ）配列番号５、配列番号１、又は配列番号３に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するか、又は、配列番号５、配列番号１、又は配列番号３に対して１００％の配列同一性を有し、又は
ｉｉ）高ストリンジェントな条件下において、配列番号５、配列番号１、又は配列番号３に規定の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズする
ポリヌクレオチド配列を含むのが有利である。
【００１７】
本発明の第４様態によると、本発明の第３様態に係る核酸分子を含むベクターを提供する。
【００１８】
本発明の第５様態によると、本発明の第３様態に係る組換え核酸分子を含む宿主細胞を提供する。
【００１９】
前記宿主細胞は、酵母、バクテリア、若しくはその他の微生物であるか、又は、哺乳動物、植物、若しくはその他の細胞培養であるのが好都合である。
【００２０】
前記宿主細胞は大腸菌であるのが好適である。
【００２１】
本発明の第６様態によると、本発明の第１様態に係るタンパク質により生成されるアルロースを提供する。
【００２２】
本発明の第７様態によると、アルロースの生成方法であって、
ｉ）本発明の第１様態に係るタンパク質を提供するステップと、
ｉｉ）果糖基質をアルロースに転換する条件下において、前記タンパク質を前記果糖基質に接触させるステップを含む方法を提供する。アルロースの生成方法も本発明によって提供し、この方法は、果糖基質をアルロースに転換する条件下において、本発明の第１様態に係るタンパク質を前記果糖基質に接触させるステップを含む。
【００２３】
前記タンパク質は、宿主細胞内に存在するのが有利である。
【００２４】
あるいは、前記タンパク質は、単離形態である。
【００２５】
前記条件には、前記タンパク質及び前記果糖基質を２５℃〜７５℃、好ましくは５０℃〜６０℃、さらに好ましくは５２℃〜５５℃の温度範囲、さらに好ましくは５５℃に維持することが含まれるのが好都合である。
【００２６】
前記条件には、前記タンパク質及び前記果糖基質をｐＨ４〜ｐＨ１０の範囲に維持することが含まれるのが好適である。
【００２７】
前記条件には、前記果糖基質を７５％〜９５％（Ｗ／Ｖ）の濃度範囲に維持することが含まれるのが有利である。
【００２８】
本発明の第８様態によると、核酸分子であって、
ｉ）配列番号５、配列番号１、又は配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、又は
ｉｉ）高ストリンジェントな条件下において、配列番号５、配列番号１、又は配列番号３に規定の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズする
ポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【００２９】
この核酸分子は、ケトース３−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。本発明の一様態によると、この核酸分子は単離形態であってもよい。
【００３０】
本発明の第９様態によると、ケトース３−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んだ組換え核酸分子を含む宿主細胞であって、前記ポリヌクレオチド配列は、
ｉ）配列番号５、配列番号１、又は配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、又は
ｉｉ）高ストリンジェントな条件下において、配列番号５、配列番号１、又は配列番号３に規定の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズする
宿主細胞を提供する。
【００３１】
本発明の第１０様態によると、ケトース３−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んだ核酸分子を含むベクターであって、前記ポリヌクレオチド配列は、
ｉ）配列番号５、配列番号１、又は配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、又は
ｉｉ）高ストリンジェントな条件下において、配列番号５、配列番号１、又は配列番号３に規定の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズする
ベクターを提供する。
【００３２】
本発明の第１１様態によると、アルロースの生成方法であって、
ｉ）ケトース３−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸分子を含むベクターを提供するステップを含み、前記ポリヌクレオチド配列は、ａ）配列番号５、配列番号１、又は配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、又は、ｂ）高ストリンジェントな条件下において、配列番号５、配列番号１、又は配列番号３に規定の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズし、前記方法はさらに、
ｉｉ）前記ポリヌクレオチド配列にコードされたケトース３−エピメラーゼ活性を有する前記タンパク質を合成するステップと、
ｉｉｉ）果糖をケトース３−エピメラーゼ活性を有する前記タンパク質に接触させ、果糖からアルロースへの転換を可能にする条件下において、前記果糖及び前記タンパク質を維持するステップと、
ｉｖ）前記ステップｉｉｉ）において生成した前記アルロースを少なくとも部分的に精製するステップとを含む方法を提供する。
【００３３】
本明細書において「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指して同義に使用されている。これらの用語はまた、１つ以上のアミノ酸残基が修飾残基であるか、対応する天然由来のアミノ酸の人工の化学的模倣体等、非天然由来の残基であるアミノ酸ポリマーや、天然由来のアミノ酸ポリマーに適用される。ポリペプチドは、単離されていてもそうでなくてもよく、つまり、天然に由来する場合、周囲に存在する成分から除去されていてもそうでなくてもよい。
【００３４】
本明細書において使用する「アミノ酸」という用語は、天然由来のアミノ酸、合成アミノ酸、及び天然由来のアミノ酸と類似の機能を有するアミノ酸類似体やアミノ酸模倣体を指す。天然由来のアミノ酸は、遺伝子コードでコードされたものや、細胞中で翻訳された後に修飾されたもの（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリン）である。この「アミノ酸類似体」というフレーズは、天然由来のアミノ酸と同一の基本的化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、及びＲ基に結合するα炭素）を有するものの、修飾されたＲ基又は修飾された骨格（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を有する。「アミノ酸模倣体」というフレーズは、天然由来アミノ酸とは異なる構造を有するものの類似の機能を含む化学化合物を指す。特定のポリペプチドをコードする核酸分子は、遺伝子コードの縮退により、ポリヌクレオチド配列の範囲を有してもよいことを理解されなければならない。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＴはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。
【００３５】
２つの配列のパーセンテージによる「同一性」は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムバージョン２．２．２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．、Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ、Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈaｆｆｅｒ、Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ、Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ、Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ、及びＤａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７）、「ギャップＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：タンパク質データベース検索プログラムの新規作成（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を使用し、デフォルトパラメータを使用して判定してもよい。特に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムについては、インターネット上でｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／のＵＲＬにアクセスすることができる。
【００３６】
本明細書において使用する「ケトース−３−エピメラーゼ活性」という用語は、ケトースの立体化学の反転、特に果糖からアルロースへの転換を触媒することのできる酵素を意味する。例えば一実施形態によると、「ケトース−３−エピメラーゼ活性」は、果糖からアルロースへの相互転換率を、酵素が存在しないのと同一条件下において、反応混合物全体に亘って添加された酵素（０．１Ｕ／ｍｇ）のｍｇ当たり少なくとも１０ミクロモル／分ほど増加させる酵素の能力であると規定される。代替としての実施形態において、少なくとも０．０５Ｕ／ｍｇ又は０．２Ｕ／ｍｇの果糖からアルロースへの相互転換率の増加が「ケトース−３−エピメラーゼ活性」であると考えられる。Ｄ−果糖からアルロースへの転換における酵素の活性を判定するための好適なアッセイは、以下の通りである。１ｍｌのＤ−果糖（５０ｇ／Ｌ）、トリス−ＨＣＬバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）、及び０．５μＭの酵素を含有する反応混合物を５５℃で２分間、インキュベートする。この反応を、沸騰によって１０分後に停止する。生成されたＤ−アルロースの量は、ＨＰＬＣ法により判定する。酵素活性の１単位を、ｐＨ８．０及び５５℃において１分当たり１μｍｏｌのＤ−アルロース形成を触媒する酵素の量として規定する（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２０１１、５９、７７８５〜７７９２）。
【００３７】
本明細書において「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、及び「核酸分子」という用語は、複数のヌクレオチドのポリマーを指して同義に使用する。核酸分子は、天然由来の核酸（すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含むか、若しくは、ペプチド核酸、モルホリン、ロックド核酸等の人工核酸や、グリコール核酸及びトレオース核酸を含んでもよい。
【００３８】
本明細書において使用される「ヌクレオチド」という用語は、天然由来のヌクレオチドと、細胞性酵素によって認識される合成ヌクレオチド類似体を指す。
【００３９】
本明細書において使用される「ベクター」という用語は、細胞性転写及び／又は翻訳酵素に供することのできる核酸分子を含有した任意の天然又は人工の構造物を指す。一例としてのベクターには、プラスミド、ウイルス（バクテリオファージを含む）、コスミッド、人工染色体、又は転生因子が含まれる。
【００４０】
本明細書において使用される「宿主細胞」という用語は、培地で培養することができ、且つ、組換え遺伝子の発現に使用することができる任意の生体細胞を指す。このような宿主細胞は、真核性又は原核性であってもよく、細菌性細胞等の微生物であってもよく、又は、細胞株に由来の細胞（哺乳動物の不死の細胞株等）であってもよい。
【００４１】
本明細書において使用される「高ストリンジェントな条件」という用語は、ハイブリダイゼーション条件について言及する場合、６５℃にて少なくとも約６ＸのＳＳＣ及び１％のＳＤＳ、０．１ＸのＳＳＣにおける約２０％（ｖ／ｖ）のホルムアルデヒドにより約４２℃で１０分間の最初の洗浄、且つ、６５℃にて０．２ＸのＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳにより続く洗浄を行うことを意味する。従来、本明細書に記載のような高ストリンジェントな条件下で既知の核酸をプローブとして使用するハイブリダイゼーション技術は、構造的に類似の核酸を同定するものであると知られている。
【００４２】
本明細書において使用される「アルロース」という用語は、化学式Ｉに示される構造の単糖を指す。これは「Ｄ−プシコース」としても知られている。
化学式（Ｉ）
【化１】
0006340005.tif 000002
【００４３】
本明細書において使用される「果糖」という用語は、化学式ＩＩに示される構造を有する単糖を指す。果糖基質の例には、結晶性果糖及び結晶性果糖グリーンが含まれるが、これに限定されるものでない。本明細書での使用において、「結晶性果糖グリーン」とは、結晶化母液の非結晶化部分からの果糖結晶が行われる間に生成されるプロセスの流れを指す。
化学式（ＩＩ）
【化２】
0006340005.tif 000003
【００４４】
本明細書で使用される「組換え」という用語は、非天然由来のコンテキストにあり、人工的な介入によって生成された核酸分子又はポリペプチドを指す。例えば、他のポリペプチドから隔絶された第１ポリペプチド、又は、天然で第１のポリペプチドに結び付けられる任意のポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有する第２ポリペプチド配列とペプチド結合によって結合される第１ポリペプチドが組換えポリペプチドである。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係るクロストリジウム・シンデンスからのケトース−３−エピメラーゼのアミノ酸配列を示す（配列番号２）。
【００４６】
【図２】図２は、本発明の他の実施形態に係るクロストリジウム・ハイレモンアエからのケトース−３−エピメラーゼのアミノ酸配列を示す（配列番号４）。
【００４７】
【図３】図３は、本発明のさらに他の実施形態に係るデスモスポラ・エスピーからのケトース−３−エピメラーゼのアミノ酸配列を示す（配列番号６）。
【００４８】
【図４】図４は、クロストリジウム・セルロリティカムからの従来既知のキシロースイソメラーゼのアミノ酸配列を示す（配列番号８）。
【００４９】
【図５】図５は、図１〜図３に示す３つのケトース−３−エピメラーゼの間の配列比較と、従来既知の３つのケトース−３−エピメラーゼの配列比較とを示す。完全保存残基をハイライトで示す。
【００５０】
【図６】図６は、本発明の一実施形態及び対照群に係る酵素を発現するよう形質転換された大腸菌による、果糖からアルロースへの転換率を示すグラフである。
【００５１】
【図７】図７は、図４に示すアミノ酸配列をコードする最適化遺伝子配列（配列番号７）と、この最適化配列の本来の配列との比較を示す。
【００５２】
【図８】図８は、図３に示すアミノ酸配列をコードする最適化遺伝子配列（配列番号５）と、この最適化配列の本来の配列との比較を示す。
【００５３】
【図９】図９は、図１に示すアミノ酸配列をコードする最適化遺伝子配列（配列番号１）と、この最適化配列の本来の配列との比較を示す。
【００５４】
【図１０】図１０は、図２に示すアミノ酸配列をコードする最適化遺伝子配列（配列番号３）と、この最適化配列の本来の配列との比較を示す。
【００５５】
【図１１】図１１は、１８Ｌスケールで本発明の一実施形態（デスモスポラ・エスピーからのケトース−３−エピメラーゼ）に係る酵素を発現するよう形質転換された大腸菌による果糖基質からアルロースへの転換調製を示すグラフである。
【００５６】
【図１２】図１２は、本発明の実施形態（ＣＨ  Ｐ３Ｅ、ＣＳ  Ｐ３Ｅ、及びＤＳ  Ｐ３Ｅ）及び既知のケトース−３−エピメラーゼ（ＣＣ  Ｐ３Ｅ）に係る酵素によるアルロースへの転換率を示すグラフである。
【００５７】
【図１３】図１３は、Ａ５６８樹脂を充填した３０ｍｌの固定床反応器におけるＤＳ  Ｐ３Ｅによるアルロースの転換率を示すグラフである。
【００５８】
【図１４】図１４は、Ａ５６８樹脂を充填した３００ｍｌの固定床反応器におけるＤＳ  Ｐ３Ｅによるアルロースの転換率を示すグラフである。
【００５９】
【図１５】図１５は、デスモスポラ・エスピーからの天然由来のケトース３−エピメラーゼの人工変異形のアミノ酸配列を示す（配列番号１３）。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
配列番号１は、クロストリジウム・シンデンスからのケトース−３−エピメラーゼをコードする遺伝子配列（大腸菌における発現に対して最適化）を示す。
【００６１】
配列番号２は、配列番号１の遺伝子配列によってコードされるケトース−３−エピメラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００６２】
配列番号３は、クロストリジウム・ハイレモンアエからのケトース−３−エピメラーゼをコードする遺伝子配列（大腸菌における発現に対して最適化）を示す。
【００６３】
配列番号４は、配列番号３の遺伝子配列によってコードされるケトース−３−エピメラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００６４】
配列番号５は、デスモスポラ・エスピー８４３７からのケトース−３−エピメラーゼをコードする遺伝子配列（大腸菌における発現に対して最適化）を示す。
【００６５】
配列番号６は、配列番号５の遺伝子配列によってコードされるケトース−３−エピメラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００６６】
配列番号７は、クロストリジウム・セルロリティカムからのケトース−３−エピメラーゼをコードする遺伝子配列（大腸菌における発現に対して最適化）を示す。
【００６７】
配列番号８は、配列番号７の遺伝子配列によってコードされるケトース−３−エピメラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００６８】
配列番号９は、クロストリジウム・シンデンスからのケトース−３−エピメラーゼをコードする天然由来の遺伝子配列を示す。
【００６９】
配列番号１０は、クロストリジウム・ハイレモンアエからのケトース−３−エピメラーゼをコードする天然由来の遺伝子配列を示す。
【００７０】
配列番号１１は、デスモスポラ・エスピー８４３７からのケトース−３−エピメラーゼをコードする天然由来の遺伝子配列を示す。
【００７１】
配列番号１２は、クロストリジウム・セルロリティカムからのケトース−３−エピメラーゼをコードする天然由来の遺伝子配列を示す。
【００７２】
配列番号１３は、デスモスポラ・エスピー８４３７のケトース−３−エピメラーゼの人工変異形のアミノ酸配列を示す。
【００７３】
本発明は、配列番号２、４、又は６に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むタンパク質全般に係る。配列番号２、４、及び６のポリペプチドの由来生物を表１に示す。
【表１】
0006340005.tif 000004
【００７４】
しかしながら、代替の実施形態によると、ポリペプチド配列は、配列番号２、４、又は６に示すものと同一でないものの、少なくとも７０％の配列同一性を有する。ポリペプチド配列は、配列番号２、４、又は６に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するか、配列番号２、４、又は６に対して１００％の配列同一性を有するのが好ましい。
【００７５】
例えば、一実施形態において、ポリペプチド配列は、配列番号６に対して８９％の配列同一性を有する配列番号１３の配列を含む。ポリペプチド配列は、ケトース−３−エピメラーゼ活性を有する。
【００７６】
従って、いくつかの実施形態において、ペプチドの１つ以上のアミノ酸が省略されるか、若しくは、異なるアミノ酸、好ましくは類似のアミノ酸に置換される。類似のアミノ酸は、関連特性を有する側鎖部分を有するアミノ酸であり、天然由来のアミノ酸を以下のグループに分類してもよい。リジン、アルギニン、ヒスチジン等、塩基性側鎖を有するグループ。アスパラギン酸及びグルタミン酸等、酸性側鎖を有するグループ。アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、及びチロシン等、電荷を持たない極性側鎖を有するグループ。グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、及びシステイン等、非極性側鎖を有するグループ。従って、これらのグループ内のアミノ酸で置換するのが好ましい。
【００７７】
一般的に、ポリペプチドは、（インビトロで合成されてもよいが）天然由来のポリペプチドの化学的性質と一致するのが好ましいが、いくつかの代替の実施形態において、ポリペプチドはペプチド模倣体である。つまり、ポリペプチドを天然では発生しないように修飾したものである。このようなペプチド模倣体には、天然由来のアミノ酸を合成アミノ酸で置換したもの、及び／又は、ポリペプチド骨格の修飾が含まれる。例えばいくつかの実施形態において、ペプチド結合は、レトロ−インベルソペプチド模倣体（ＭｅｚｉｅｒｅらによるＪ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９７年１０月、１；１５９（７）：３２３０−７参照のこと。参照として本明細書に組み込む。）を生成するため、リバースペプチド結合と置換される。あるいは、アミノ酸は、ポリマー鎖を形成するアミノ酸残基の間隔及び配向を維持するペプチド結合以外の共有結合によって結び付けられている。
【００７８】
本発明に係るこのような修飾ポリペプチド及び非修飾ポリペプチドはすべて、ケトース−３−エピメラーゼポリメラーゼ活性を有する。つまり、タンパク質は、精製されるか宿主細胞中に発現すると、果糖からアルロースへの転換を触媒する能力を有する。ケトース−３−エピメラーゼ活性を有するか否かを試験する際の好適な条件を実施例１に示す。
【００７９】
本発明に係るポリペプチドは、全細胞内に含有されてもよく、若しくは、単離されたタンパク質、部分的に精製されたタンパク質、又は固定化タンパク質であってもよい。タンパク質の精製は、細胞破壊及びろ過等、標準の方法によって行われてもよい。他の標準の方法は、当業者に既知である。
【００８０】
本発明の実施形態において、配列番号２、４、又は６と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。ここでタンパク質は、ケトース−３−エピメラーゼ活性を有する。例えば、一実施形態によると、核酸分子は、配列番号１３のポリペプチド配列をコードする配列を含む。
【００８１】
本発明のタンパク質を特異的にコードする配列に加えて、核酸分子は、プライマー領域、転写因子結合領域、ベクター挿入領域等の他の配列や、核酸分解を抑える配列（例えば、ポリアデノシン伸長部分）を含んでもよい。核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、本発明のタンパク質を合成するため、ポリヌクレオチドが依然として翻訳可能である場合、合成ヌクレオチドを含んでもよい。
【００８２】
前述のとおり、本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列は、本明細書に開示の特定の配列とは異なってもよい。好適な実施形態において、核酸分子は、大腸菌宿主細胞中の発現によって最適化された、配列番号１、３、又は５の配列を有するポリヌクレオチドを含む。代替の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、３、又は５のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有し、ケトース−３−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする。ポリヌクレオチド配列は、配列番号１，３、又は５の１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するか、若しくは、配列番号１、３、又は５の１つと１００％の配列同一性を有することが好ましい。代替の実施形態において、核酸分子は、高ストリンジェントな条件下において、配列番号１、３、又は５に規定の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズし、ケトース−３−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、酵素の天然由来の配列である、配列番号９、１０、又は１１の配列を有するポリヌクレオチドを含む核酸分子を提供する。
【００８３】
いくつかの実施形態において、核酸分子は、プラスミド等のベクターの一部を形成する。上述の核酸配列に加えて、プラスミドは、原核性の複製起点（例えば、大腸菌ＯＲ１の複製起点）、自己複製配列、セントロメア配列、核酸配列の上流のプロモーター配列、核酸配列の下流に配置されたターミネーター配列、抗生物質抵抗性遺伝子、及び／又は、分泌シグナル配列等、他の要素を含む。自己複製配列を含むベクターはまた、酵母人工染色体である。
【００８４】
いくつかの代替の実施形態において、ベクターは、バクテリオファージ等のウィルスであり、本発明に係る核酸配列に加えて、構造タンパク質、プロモーター、転写活性化因子等、バクテリオファージの複製を行う核酸配列を含む。
【００８５】
本発明に係る核酸分子は、本発明のタンパク質を合成するために、宿主細胞のトランスファクションまたは形質転換のために使用されてもよい。好適な宿主細胞には、大腸菌等の原核性細胞、酵母細胞等の真核性細胞、又は哺乳動物若しくは植物の細胞株が含まれる。宿主細胞は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、微粒子銃技術、又はウイルスベクターを使用することにより、トランスファクションまたは形質転換される。
【００８６】
トランスファクション後、本発明の核酸分子は、必要に応じて転写され、翻訳される。いくつかの実施形態において、合成タンパク質が宿主細胞中に残され、組換え宿主細胞の培養物が続いて使用される。他の実施形態において、例えばベクター内に分泌シグナルが存在することによる細胞からの分泌か、若しくは、宿主細胞の溶解とそこからのタンパク質の精製によって、合成タンパク質が宿主細胞から抽出される。
【００８７】
本発明に係るタンパク質は、果糖からアルロースへの転換を触媒するのに使用される。いくつかの実施形態において、タンパク質は宿主細胞内に存在し、転換混合物を形成するため、例えば２５℃〜７５℃の温度でｐＨ４〜１０における培養等、好適な条件下で１〜１０００ｇ／Ｌの濃度にて、ホウ酸塩バッファー果糖等の果糖基質と混合する。この転換混合物はさらに、溶媒と、任意で例えばエタノール、トルエン、及びメタノール等の追加の共溶媒（水に加え）を含んでもよい。果糖基質はさらに、グルコース又はスクロース等、他の糖類を含んでもよい。タンパク質は、果糖基質のアルロースへの転換を触媒する。実際、転換混合物中のすべての果糖がアルロースに転換されるわけでなく、通常、続いて蒸発及び結晶化を通じてアルロースを抽出及び精製するステップを有する。混合物中の残りの果糖は、酵母の発酵により除去してもよい。
【００８８】
代替の実施形態において、本発明に係るタンパク質は、精製された形態で提供され、また完全にインビトロの転換を行うために好適な溶媒とともに果糖基質と混合される。一実施形態において、条件として、ｐＨ４〜１０、３０℃〜７０℃の温度範囲、１０〜９５％ｗ／ｖの果糖濃度、及び溶媒としての水の使用が設定される。果糖の代替の濃度範囲として、２０〜９５％、３０〜９５％、４０〜９５％、５０〜９５％、６０〜９５％、７０〜９５％、７５〜９５％が含まれるが、これに限定されるものでない。果糖基質は、７０〜９５％の濃度範囲で提供されるのが特に好ましい。他の好適な実施形態において、果糖濃度は７５〜９５％である。
【００８９】
ケトースの転換反応は通常、１〜６０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約５〜５０％の基質濃度を使用して実施される。果糖の濃度が従来よりも高いことを除いて通常の動作条件下でのケトース転換反応にタンパク質を使用できるということが、本発明の特に有利な点である。従って、本発明に係るタンパク質により、容積生産性を増すことができる。
【００９０】
いくつかの実施形態において、本発明に係るタンパク質は、固体基質に固定化される。これにより、酵素の使用寿命が長くなり、より小型の固定床反応器内に充填することができるようになり、汚染やプロセス条件の変動に対する耐性が高くなるという利点を提供する。一例としての固体基質には、イオン交換樹脂及びポリマー封止が含まれる。いくつかの実施形態において、本発明に係るタンパク質は、デュオライトＡ５６８樹脂に固定化される。いくつかの実施形態において、本発明に係るタンパク質は、弱塩基性イオン交換（すなわち、タンパク質の電荷及び樹脂等の基質の電荷に基づく静電相互作用）により、基質上に固定化される。他の実施形態において、タンパク質は、樹脂等の基質の多孔質領域への非特異的結合により固定化される。
【００９１】
他の実施形態において、本発明はアルロースの生成方法に係る。この方法には、以下のステップが含まれる。
１）配列番号１、配列番号３、又は配列番号５と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸分子を含むベクターを提供するステップ。
２）前記ベクターでコンピテント宿主細胞を形質転換するステップ。
３）形質転換された宿主細胞を任意で培養するステップ。
４）形質転換された細胞を果糖基質と混合し、果糖からアルロースへの転換を可能にする条件下に維持するステップ。
５）蒸発及び結晶化等、従来技術の標準の方法を使用して、生成されたアルロースを精製するステップ。
【００９２】
代替の実施形態において、ステップ４）は省略される。或いは、核酸分子によってコードされたタンパク質を形質転換された宿主細胞から隔絶し、任意で基質上に固定する。そして、このタンパク質を果糖基質と混合し、果糖からアルロースへの転換を可能にする条件下に維持する。その後、ステップ５）を実施する。他の実施形態において、ステップ２）を省略し、代わりにタンパク質をインビトロ翻訳で合成する。続いて、タンパク質を単離し、果糖基質と混合する。
【００９３】
本発明に係る方法により生成されたアルロースを、ヒト及び／又は動物の消費に供される製品に使用してもよい。いくつかの実施形態において、この製品は、食品、飲料、医薬品、栄養製品、スポーツ製品、又は化粧品であってもよい。例えば、この製品が食品である場合、この食品は、製菓、デザート製品、シリアル製品、焼き菓子、冷凍乳製品、肉類、乳製品、調味料、スナックバー、スープ、ドレッシング、混合飼料、加工食品、離乳食、ダイエット食品、シロップ、食品コーティング、ドライフルーツ、ソース、グレイビーソース、及びジャムやゼリーからなる群より選択することができる。いくつかの実施形態において、食品は、製品の表面に形成されるコーティング及びフロスティングとして、本発明に係る方法により生成されたアルロースを含んでもよい。
【００９４】
あるいは、製品が飲料である場合、この飲料は、炭酸飲料、非炭酸飲料、フルーツ風味飲料、フルーツジュース、茶、牛乳、コーヒー等からなる群より選択することができる。
【実施例】
【００９５】
実施例１
本例では、３つの推定ケトース−３−エピメラーゼ酵素の１つを発現するように宿主細胞を形質転換した。果糖基質で培養することにより、形質転換した宿主細胞のケトース−３−エピメラーゼについて試験した。
【００９６】
材料
ホウ酸塩バッファー、１Ｍ、ｐＨ８
ｉ）６２ｇのホウ酸を１ｌの脱イオン水に溶解した
ｉｉ）１０ＭのＮａＯＨによりｐＨ８に調整した
ｉｉｉ）１Ｌボトルに入れて４℃の冷蔵庫で保存した
ホウ酸塩バッファー果糖基質
ｉ）９７０ｇの液体果糖（７７％ＤＳ）を５０ｍｌのホウ酸塩バッファーｐＨ８に入れた
ｉｉ）最終容量が１Ｌとなるように水を加えた
ｉｉｉ）５ＭのＮａＯＨによりｐＨ８に調整した
発現培地ＬＢ−４×２．８Ｌバッフル付シェイクフラスコ
ｉ）１０ｇのトリプトン、７ｇのＮａＣｌ、及び１０ｇの酵母を１Ｌの脱イオン水に入れた
ｉｉ）オートクレーブ
【００９７】
方法
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．によって合成構築すべく、３つの推定ケトース−３−エピメラーゼ遺伝子配列及び１つの対照群配列を選択した。推定ケトース−３−エピメラーゼ配列は以下をコードした。
ｉ）クロストリジウム・シンデンスＡＴＣＣ３５７０４からの仮説タンパク質ＣＬＯＳＣＩ＿０２５２６（アクセッションＺＰ＿０２４３２２８１）（配列番号２）
ｉｉ）クロストリジウム・ハイレモンアエＤＳＭ１５０５３からの仮説タンパク質ＣＬＯＨＹＬＥＭ＿０５６４５（アクセッションＺＰ＿０３７７８５７６．１）（配列番号４）
ｉｉｉ）デスモスポラ・エスピー８４３７からのＤ−タガトース−３−エピメラーゼ（アクセッションＺＰ＿０８４６６０７５）（配列番号６）
【００９８】
対照群配列は、クロストリジウム・セルロリティカムＨ１０からのキシロースイソメラーゼタンパク質をコードした（アクセッションＹＰ＿００２５０５２８４）（配列番号８）。
【００９９】
遺伝子は、大腸菌（図７〜図１０参照）における発現に対して最適化された配列を有するように合成構築し、結果として得られた４つの遺伝子を各々、発現ベクターｐＥＴ１５ｂに移植した。当業者に既知の微生物及び発現ベクターの他の組み合わせでも、同様に実施できることが予測される。
【０１００】
形質転換に使用したコンピテント細胞は、３ｍｌのＬＢ培地（ＬＢ）に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を植菌し、３７℃オーバーナイトでバクテリアを繁殖させることによって調製した。３００ｍｌのＬＢにこの３ｍｌの培養物を植菌し、０．７〜１．０ＯＤ（６００）で震盪し、３７℃で細胞を成長させた。光学密度（ＯＤ）は、通常の分光光度計の６００ｎｍ波長において１ｃｍのセル内で測定した。細胞は、氷上で１０分間冷却した後、７５００ｘｇ、４℃で１５分間、遠沈した。培地を取り除き、細胞を３００ｍｌの冷水に再懸濁した。遠沈を繰り返し、細胞を１５０ｍｌの冷水に再懸濁した。遠沈を再び繰り返し、細胞を冷却・滅菌した約２ｍｌの１０％グリセロールに懸濁した。細胞を前回と同様に遠沈し、冷却・滅菌した約２ｍｌの１０％グリセロールに懸濁した。懸濁液は、滅菌したエッペンドルフチューブに１００μｌ分け、−８０℃で保管した。
【０１０１】
続いてＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社により提供される発現ベクターを使用し、エレクトロポレーションでコンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地上で陽性形質転換細胞を選択した。１ＬのＬＢを４つの２．８Ｌバッフル付きフラスコの各々に注ぎ、オートクレーブした。冷却した後、１ｍｌの１００ｍｇ／ｌアンピシリンを無菌で各フラスコに添加し、前述のように調製したコンピテント細胞のオーバーナイト培養物２〜３ｍｌを各フラスコに植菌した（発現株毎に１つのフラスコ）。０．８〜１．５のＯＤを達成するため、細胞を２００ｒｐｍの震盪により、３７℃で３時間成長させた。各フラスコには、新たに調製した１Ｍのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド溶液を１ｍｌ添加し、温度を室温（すなわち２５〜３０℃）まで下げ、約５時間、誘発を進めた。約５０００ｘｇ、４℃で３０分間、細胞を遠沈し、上澄みを移した。細胞ペレットを計量した５０ｍｌの遠心管に移し、細胞量を記録した。細胞を滅菌したグリセロール（１０％ｗ／ｗ）数ｍｌ内で再懸濁し、−８０℃で凍結した。
【０１０２】
全細胞をホウ酸塩バッファー果糖基質に混合し、Ｃａ２＋カラムによるＤＰ１−４法を使用してＨＰＬＣにより解析を行うことで、細胞の転換活性を確認した。２５０ｍｌのホウ酸塩バッファー果糖基質を入れた４つのフラスコを５５℃に温め、凍結細胞を室温に溶かした。６５００ｘｇで細胞をペレットにし、脱イオン水中に再懸濁した。２ｇ（湿重量）の細胞をホウ酸塩バッファー果糖基質中に混合し、１Ｌのバッフル付きフラスコ内において、５５℃で９０ｒｐｍの混合により培養した。０時間、１時間、２時間、及び５時間でサンプルを取り出し、ＨＰＬＣ解析にかけた。
【０１０３】
ＨＰＬＣ解析は、０．１％（Ｗ／Ｖ）で解析される２０μＬのサンプルを、０．１〜１．５ｍＬ／分の流量の水系移動相と、８０℃に維持されたＣａ２＋の形態の１〜１０μｍの粒径範囲の樹脂よりなる固定相とからなるクロマトグラフィーシステムに注入することを含む。屈折率検出器によりピークを検出及び定量化し、既知の基準による保持時間に基づいて定性的にピークを割り当てた。
【０１０４】
結果及び検討
３つのタンパク質配列を、ケトース−３−エピメラーゼタンパク質として試験すべく同定した。これらのタンパク質の配列を図１〜図３（配列番号２、４、及び６）に示す。対照群として使用したクロストリジウム・セルロリティカムＨ１０からのキシロースイソメラーゼは、従来、果糖からアルロースを生成するものとして提案されていた。このアミノ酸配列を図４に示す（配列番号８）。
【０１０５】
これらのタンパク質のアミノ酸配列を、他の既知のケトース−３−エピメラーゼのアミノ酸配列とアラインし、このアラインした配列を図５に示す。完全保存残基はハイライトで示す。これらの配列間には保存残基がほとんど存在せず、１つの配列から次の配列へと保存される残基は６５％未満である。
【０１０６】
アクセッションＮＰ＿５３５２２８及びＢＡＡ２４４２９及び配列番号８と配列番号２、４、及び６との配列間での配列同一度を判定した。結果を表２に示す。選択されたタンパク質配列の各々について、既知のケトース−３−エピメラーゼには４０〜６３％の配列同一性が認められた。全配列の配列アラインメントに基づく全体的な強い相同性は認められなかった。選択されたタンパク質は、合成構築されてＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社による市販の発現ベクターｐＥｔ１５ｂに移植された大腸菌によって、発現のために最適化された遺伝子を有した。各構築物について大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換が成功し、凍結保存した各菌株を発現ベクターとともに保存した。１Ｌスケールでタンパク質発現を実施し、全細胞を粗性触媒として回収した。転換活性を確認し、図６に４つの異なる試験菌株による実験の間に生成された％ＤＳＢアルロースを示す。
【表２】
0006340005.tif 000005
【０１０７】
３つの推定ケトース−３−エピメラーゼの発現は成功し、３つとも果糖からアルロースへの転換に成功し、各タンパク質が実際にケトース−３−エピメラーゼであることを確認した。
【０１０８】
最も活性なタンパク質はＤＳ  Ｐ３Ｅ（デスモスポラ・エスピー８４３７からのＤ−タガトース３−エピメラーゼ、配列番号６）であり、容積生産性１１２ｇ／Ｌ／時間について、リットル当たり８ｇの細胞湿重量を利用して、たった２時間で７５０ｇ／Ｌの果糖溶液の３０％を転換することができた。
【０１０９】
実施例２
本例では、スケーラビリティを判定し、さらなる感覚調査及び臨床調査を行うべくアルロースを生成するために、１８Ｌスケールにおいて細胞成長及び転換に関して現在の最高条件を実現した。転換に続いて、果糖を除去する最初の洗浄ステップを実施した。本例は、このプロセスのスケーラビリティと、スケールアップに伴う予期しない問題と、研究室で生成できるアルロースの妥当な量とを同定することを目的とするものであった。
【０１１０】
材料
イソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）
ろ過滅菌したアンピシリン水溶液１００ｍｇ／ｍｌ
結晶果糖グリーン
液体果糖（７７％ＤＳ）
成長培地
ｉ）２５ｇのＮａＣｌ、２５ｇのＳｔａｌｅｙｄｅｘ３３３（登録商標）、６ｇのグリセロール、５０ｇのトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、６０ｇの酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、８ｇの第一リン酸カリウム、及び８ｇの第二リン酸カリウムを６ｌの脱イオン水に入れた
ｉｉ）トリス塩基（固体）でｐＨを〜７．８に調整した
ｉｉｉ）フォイルで頂上部を覆った６×２．８Ｌバッフル付きフラスコで、フラスコにつき１Ｌのオートクレーブを行った
トリスバッファー、１Ｍ、ｐＨ８
ｉｖ）１２１ｇを１Ｌの脱イオン水に入れた
ｉｖ）ＨＣｌでｐＨ８に調整した
ｉｖ）１Ｌボトルに入れて４℃の冷蔵庫で保存した
【０１１１】
方法
細胞を繁殖させるため、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補った５ｍｌのＬＢ培地の６つのオーバーナイト培地から開始した。これらの培地に、大腸菌生成菌株（配列番号６のタンパク質を発現するＢＬ２１−ＤＥ３  ｐＥＴ１５ｂＤＳ−Ｐ３Ｅ）を植菌し、３７℃オーバーナイト（〜１６時間）で成長させた。６Ｌの成長培地を調製し、上述のようにオートクレーブし、５ｍｌのオーバーナイト培地を各フラスコに添加し、１９０ｒｐｍ、３７℃で４時間これを震盪した。新たに１Ｍの溶液を調製し、フラスコにリットル当たり１ｍｌ添加することにより、１ｍＭのＩＰＴＧを各フラスコに添加した。引き続き１４〜１６時間震盪を行うことにより、温度を２５℃まで下げた。
【０１１２】
細胞を収集するため、Ｍｏｄ３２２のフロア遠心分離機と１Ｌボトル（８００ｍｌ以下の培地を充填）を使用して、培地を６０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離した。１容量％の漂白剤を添加したキルバケット内にこの培地を移し、３０分間置いた。遠心管を計量し、細胞１グラム当たり３ｍｌの脱イオン水を管に添加した。均一な細胞スラリーが得られるまで、へら及びボルテックスジェニーを使用して細胞を再懸濁した。懸濁液を４０ｍｌの遠心管に移し、６５００ｘｇで再度ペレットにした。洗浄液をキルバケット内に移し、細胞を同一容量の水で再懸濁した。
【０１１３】
第２細胞バッチにより、細胞の増殖及び収集を繰り返した。
【０１１４】
結晶果糖グリーンの５ガロン（１８．９Ｌ）バケットを室温まで温め、１６，５０６ｇの結晶果糖グリーンを１８Ｌの較正目盛りを付した５ガロン（１８．９Ｌ）の消毒済みプラスチックバケットに添加することにより、結晶果糖グリーン転換基質を調製した。上述のように調製した９００ｍｌの１ＭトリスｐＨ８．０をバケットに添加し、１８Ｌ較正目盛りまで水を入れ、均一になるまでオーバーヘッドミキサーを使用して混合した。この混合物と未使用の結晶果糖グリーンを低温室に戻して保存した。
【０１１５】
１８Ｌの較正目盛りを付した５ガロン（１８．９Ｌ）の消毒済みプラスチックバケット内にて、１７，４６０ｇの液体果糖（７７％ＤＳ）及び５００ｍｌの１ＭトリスｐＨ８．０（上述のように調製したもの）を組み合わせ、液体果糖転換基質を調製した。１８Ｌの較正目盛りまで水を入れ、オーバーヘッドミキサーを使用して均一になるまで混合した。
【０１１６】
全細胞を転換するため、１８Ｌの調製済み結晶果糖グリーン転換基質をウォーターバス中で５５℃に温め、オーバーヘッドミキサーにより約１５０ｒｐｍで穏やかに混合した。細胞収集で得られた再懸濁細胞ペーストを、合計１００ｇの湿重量の細胞まで添加した。５時間後、サンプルを取り出し、ＨＰＬＣ解析を行った。バケット全体を４℃に冷蔵することにより、反応を停止させた。サンプルについて、大腸菌、大腸菌群、及びＴＰＣの微生物分析を行った。
【０１１７】
全細胞の転換プロセスは、１８Ｌの調製液体果糖転換基質で繰り返した。１２０ｇの湿重量の細胞を使用し、ＨＰＬＣ解析のため、２時間及び４時間でサンプルを抽出した。
【０１１８】
酵母発酵を使用して、結晶果糖グリーン転換基質から果糖を取り除いた。結晶果糖グリーン転換生成物は、５４Ｌの総容量で組み合わされたアルロース及び果糖が〜２５０ｇ／Ｌの最終濃度となるよう、２倍容の水で希釈した。５４Ｌの希釈混合物を、消毒済みの４つの５ガロン（１８．９Ｌ）バケットに分け、各バケットが約１３Ｌとなるようにした。バケットのうち２つは、冷蔵庫に保存した。残り２つのバケットには、オーバーヘッドミキサーからの激しい攪拌と、約０．３ＶＶＭの空気流を送るためのディフューザを含む９Ｌ／分の空気ポンプからの通気とに供した。１２０ｇの乾燥活性パン酵母（Ｆｌｅｉｓｈｍａｎブランド）を各バケットに添加し、混合し、ＤＰ１−４アルロース解析のため時々のサンプリングで２日間（〜３６時間）通気した。バケットは酵母を沈殿させるため、オーバーナイト、低温室に移された。その後、上澄みを２つの新たな消毒済みの清潔なバケットに移し、残りの酵母部分を、上述のように調製した２つの冷蔵結晶果糖グリーン含有バケットに移した。攪拌及び混合プロセスを繰り返し、その後、酵母を取り除いた。酵母発酵ステップに続いて、約４５Ｌの上澄みを得て、３つの消毒済みの清潔なバケットに無菌ろ過し、さらなる処理を施すために４℃で保存した。
【０１１９】
結果及び検討
約２２０ｇのＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ−１５ｂ−ＤＳ  Ｐ３Ｅ細胞を１２Ｌの培養物から得て、上述のとおり２つの１８Ｌの生物変換に分けた。従って、全細胞生体触媒の総濃度は、結晶果糖グリーン転換については５．６ｇ／Ｌであり、液体果糖転換については６．７ｇ／Ｌであった。
【０１２０】
図１１は、アルロースをアルロース＋果糖のパーセンテージとして計算して、双方の転換が即座に〜２５％に達したことを示している。これは、従来、この細胞種別と類似の転換培地とを使用して小規模で達成した転換レベルより僅かに低いが、非常に接近している。転換は、液体果糖基質により、僅か２時間後には既に２２％に達した。
【０１２１】
各１８Ｌ転換において、約３．３ｋｇのアルロースが生成された。２つの基質の間には顕著な差が現れなかった。
【０１２２】
２５０ｍｌからのスケールアップでは、予期しなかった問題は発生せず、期待どおりに進行した。
【０１２３】
微生物試験は、結果として、生きた大腸菌は存在せず、陰性の結果となり、グラム当たり＜３の大腸菌群が見られ、一般生菌数は２であった。従って、５５℃の温度とＤＳシロップの高いパーセンテージを組み合わせることで、全細胞の生体触媒を死滅させるのに十分であった。
【０１２４】
新たに同定した酵素ＤＳ  Ｐ３Ｅを使用して果糖からアルロースへの生物変換は１８Ｌまでのスケールアップに成功した。
【０１２５】
実施例３
グルコース酵母抽出培地を用いるｐＨ制御流加培養法を使用し、発酵研究室において２つの１０Ｌ発酵により、新たに同定したＤＳ  Ｐ３Ｅタンパク質（配列番号６）を含有する大腸菌株を生成した。これらの発酵は、期待どおりに進行した。
【０１２６】
発酵バッチ成長及び流加培養の間、細胞は、約１時間の倍加時間で、指数的に成長した。グルコース濃度は、約５．５時間で約９ｇ／Ｌから＜１ｇ／Ｌに落ちた（ＯＤ〜２８）。酵素生成の誘発フェーズでは、ＯＤが継続して約１３０まで上昇し、その後は著しい変化が観察されなかった。遠心分離による発酵物の収集では、４．５ｋｇ（１０ｌｂｓ）の湿細胞ペースト又は約１．１ｋｇ（２．５ｌｂｓ）の乾燥細胞重量が得られた。
【０１２７】
果糖基質（８３６ｋｇＤＳ（乾燥固体）ベース）を、ＲＯ水で６９％ＤＳ（９２０グラム／Ｌ）に希釈し、５２℃まで過熱し、ｐＨを７．８に調整した。低レベルの攪拌（〜５０ｒｐｍ）を利用して、反応全体を通じて混合を促進し、上述のように発現した４．５ｋｇ（湿ペースト）の全細胞のバッチ全体を反応液に添加し、時間０のサンプルを採った。これは、前回試験した研究室スケール転換と類似の０．４８ｇ／Ｌの生体触媒充填を提供したものの、９２０ｇ／Ｌで基質濃度はより高くなった。４時間及び１６時間でサンプルを採り、ＨＰＬＣで解析した。
【０１２８】
ＤＳの喪失は観察されず、反応の間、生物学的生成物は生成されなかった。この反応は、１６時間の反応終了時、〜３０％のアルロースの平衡値付近まで進行した。４時間で、反応は１８％の転換まで既に進行していた。７５０ｇ／Ｌの基質（実施例１及び２）とともに０．５ｇ／Ｌの生体触媒を使用して前回得られた容積転換率は、４６ｇ／Ｌ＊ｈｒ、又は、単位生体触媒当たり９２ｇ／Ｌ＊ｈｒ／生体触媒グラムであった。ここで、より高い基質濃度と僅かに低い温度（５２℃対５５℃）を使用すると、容積転換率は、４１ｇ／Ｌ＊ｈｒ、又は、８５ｇ／Ｌ＊ｈｒ／生体触媒のグラム（４時間のデータポイントを使用して算出）であった。これにより、エピメラーゼ反応の著しい柔軟性を実証した。反応が１６時間で終了した場合、２３０ｋｇのアルロースがアルロース：果糖の２８：７２の混合物中に存在した。
【０１２９】
実施例４
４つ異なる酵素（配列番号２、４、６、及び８）による果糖の転換を、７５０ｇ／Ｌにてトリスバッファー果糖基質上で比較した。２５〜３０℃でなく、１６℃にて細胞を誘導し、転換率は前回の実験より低かった。２００ｍＬの基質に対して、５００ｍＬのバッフル付きフラスコ内で２ｇの湿重量の再懸濁細胞を添加し、９０ｒｐｍの震盪にて５５℃で培養した。ＨＰＬＣ解析を行うため、２時間及び３．５時間でサンプルを採った。結果を図１２に示すが、ここではＣＣ  Ｐ３Ｅは配列番号８に対応し、ＣＨ  Ｐ３Ｅ、ＣＳ  Ｐ３Ｅ、及びＤＳ  Ｐ３Ｅが各々、配列番号４、２、及び６に対応する。この実験において、配列番号２、４、６、又は８に規定のタンパク質の１つを発現する４つの菌株はすべて、３．５時間で基質の約５％をアルロースに転換する略同一の活性レベルを有しているようであった。
【０１３０】
実施例５
本例では、固定化酵素を使用したアルロース生成の第１の試みを実施した。本例は、酵素の利用を改善することを目的としている。
【０１３１】
材料
Ｃｏｄｅｘｉｓより調製された凍結乾燥酵素粉末、Ｌｏｔ  Ｄ１３００７又はＤ１３００８
デスモスポラ・エスピー、プシコース−３−エピメラーゼ
デュオライトＡ５６８（Ｄｏｗ）
アンバーライトＸＡＤ２（Ｓｉｇｍａ）
トリスバッファー１Ｍ
ｉ）１Ｍの濃度で溶解することにより水中に調製
ｉｉ）ＨＣｌでｐＨを８．０に調整
ｉｉｉ）使用前に１００ｍＭに希釈
結晶果糖グリーン、８０％の乾燥固体で以下の組成を有する。
ｉ）９０％ＤＳＢ果糖
ｉｉ）７％ＤＳＢデキストロース
ｉｉｉ）３％ＤＰ２＋
ｉｖ）その他の単糖類
ＭｎＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）
【０１３２】
方法
１）小規模の固定化
固定化の効率を試験するため、約３０ｍｌの容量の被覆カラム（１１ｍｍ×３００ｍｍのカラム寸法）内で小さな固定床反応を実施した。ＸＡＤ２樹脂及びＡ５６８樹脂の双方を水で数回洗浄することにより、微粒子（すなわち、樹脂作製時の副産物である樹脂微粒子（つまり、壊れた／割れた粒子））と作製時の残留物とを取り除いた。２ｇの凍結乾燥酵素（すなわち、エピメラーゼ）を約５０ｍｌの水に溶解し、２つのアリコートに分けた。ｐＨを測定し、６．５であると判定した。約３０ｍｌの各樹脂を、室温で約１時間、軽い攪拌によって１つのアリコートのエピメラーゼ溶液とインキュベートした。その後、樹脂を被覆カラム内に詰め、蠕動ポンプを使用してさらに２時間、固定床を通じてエピメラーゼ溶液を循環させた。その後、１０ベッド容積のトリスバッファー１００ｍＭ、ｐＨ８．０でカラムを洗浄した。この時点での廃水は透き通って見え、Ａ２８０では分光学的に測定されたタンパク質はなかった。結晶果糖グリーンをＲＯ水で６０％ＤＳまで希釈し、ｐＨを８．０に調整した後、２８ｐｐｍのＭｎＣｌ２及び１０ｍＭのトリスバッファーｐＨ８．０を添加することにより、結晶果糖グリーン供給物を調製した。
【０１３３】
その後、再循環水浴で被覆カラムを５７℃の温度まで加熱しながら、１時間当たり８ベッド容積（ＢＶ／ｈ）の速度で、供給物を３０ｍｌ固定床反応器を通じて供給した。反応器の廃液を回収し、ＦＴ−ＩＲで解析してアルロースと果糖の相対濃度を出した。このプロセスを計５日間続けた。この供給速度は、転換率を維持するため、試験的生成工程を通じて１時間当たり８ベッド容積から１時間当たり６ベッド容積に調整した。
【０１３４】
２．３００ｍｌ固定床反応器へのスケールアップ
固定化のスケールアップした効率を試験するため、約３００ｍｌの質量の被覆カラム内（２５ｍｍ×６００ｍｍカラム寸法）により大型の固定床反応器を作製した。ＸＡＤ２樹脂及びＡ５６８樹脂を水で数回洗浄することにより、微粒子や作製時の残留物を取り除いた。１０ｇの凍結乾燥エピメラーゼを約１００ｍｌの水に溶解した。約３００ｍｌのＡ５６８樹脂を３００ｍｌの被覆カラムに詰め、蠕動ポンプを使用して室温で約２時間、固定ベッドを通じてエピメラーゼ溶液を循環させた。その後、室温にて、カラムを５ベッド容積のトリスバッファー１００ｍＭ、ｐＨ８．０で洗浄した。この時点での廃水は透き通って見え、Ａ２８０では分光学的に測定されたタンパク質はなかった。結晶果糖グリーンをＲＯ水で６０％ＤＳまで希釈し、ｐＨを８．０まで調整した後、２８ｐｐｍのＭｎＣｌ２及び１０ｍＭのトリスバッファーｐＨ８．０を添加することにより、結晶果糖グリーン供給物を調製した。その後、再循環水浴で被覆カラムを５７℃の温度まで加熱しながら、１時間当たり８ベッド容積（ＢＶ／ｈ）の速度で、供給物を３０ｍｌ固定床反応器を通じて供給した。反応器の廃液を回収し、ＦＴ−ＩＲで解析してアルロースと果糖の相対濃度を出した。このプロセスを計４日間続けた。この供給速度は、試験的生成工程を通じて１時間当たり８ベッド容積から１時間当たり２ベッド容積に調整した。さらに、カラムを２週間、室温に置いた後、カラム保管中のエピメラーゼ安定性の判定を再開した。
【０１３５】
結果及び検討
ＸＡＤ２を入れた３０ｍｌのカラムでは、いずれのサンプルにも顕著な転換が見られず、従って、さらなる解析を実施しなかった。しかしながら、ＤｏｗｅｘのＡ５６８で著しい転換が観察された。図１３は、Ａ５６８樹脂を入れた３０ｍｌの固定床反応器における反応の時間経過を示している。僅か１ｇのエピメラーゼを含有する固定床転換を１２０時間続けることで、４ｋｇ超のアルロースを生成した。転換率は、１２０時間を越えると徐々に低下し、これを補償すべくカラムの流量を７２時間で低下させた。反応中、アルロースの平衡近傍濃度が得られた。
【０１３６】
図１４は、Ａ５６８樹脂による３００ｍｌの反応工程を示している。利用可能な供給物の量（７２時間で８６ｌの供給物を使用）に限度があるため、流量は２４時間で低下した。７２時間で、１０ｇのエピメラーゼから２０ｋｇ超のアルロースを生成した。何らかの性能低下が観察されたものの、７２時間終了時にも依然として転換率は高いままであった。
【０１３７】
溶液中のエピメラーゼの安定性は、フラスコ反応において以前に判定した。５３℃にて８時間以内に９０％超の活性が損なわれた。本例において、転換は５７℃で実施された。反応率、平衡比、及び微生物安定性の観点から、温度はより高いほうが有利である。本例では、１２０時間後でも顕著なエピメラーゼ活性が維持された。
【０１３８】
供給の限定的であった大規模の反応において、１０ｇのエピメラーゼを使用することによって２０ｋｇのアルロースを生成し、結果としてエピメラーゼの正味の投与量は０．０５％（ｍ／ｍ）であった。小規模の反応では、１ｇのエピメラーゼから４．８ｋｇのアルロースが生成され、結果としてエピメラーゼの正味の投与量は０．０２％（ｍ／ｍ）であった。標準的な果糖の生成において、固定のグルコイソメラーゼは０．０１〜０．００５％（ｍ／）の割合で使用されるものの、この生成は６〜１２ヶ月かかる作業である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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