(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシル含有多孔質基材支持体に基づくアフィニティークロマトグラフィーのための分離材料であって、その表面に対して、ポリマー鎖が共有結合によりグラフトされており、
ａ）多孔質基材支持体は、シリカベースの多孔質媒体であり、これはジルコニアまたはチタンの酸化物でコートされていること、
ｂ）２または３以上のグラフトポリマー鎖が、前記表面上の１つのヒドロキシル基から開始されること、ならびに、
ｃ）各々のポリマー鎖は、複数の、カップリングしたアフィニティーリガンドを有すること
を特徴とする、前記分離材料。
【請求項２】
多孔質基材支持体が、多孔質セラミック媒体であることを特徴とする、請求項１に記載の分離材料。
【請求項３】
多孔質基材支持体が、ケイ素、ジルコニウム、チタンの酸化物、それらの混合物を含む、多孔質セラミック媒体であることを特徴とする、請求項１に記載の分離材料。
【請求項４】
多孔質基材支持体が、シリカベースの多孔質媒体であることを特徴とする、請求項１に記載の分離材料。
【請求項５】
多孔質基材支持体が、その表面にヒドロキシル基を有する多孔質ポリマー支持体であることを特徴とする、請求項１に記載の分離材料。
【請求項６】
カルボン酸基を提供するアクリル酸またはその誘導体を含むグラフトポリマー鎖の共有結合のための、脂肪族ヒドロキシルまたはジオール基に富んだ、架橋されたコーティングでコートされた、多孔質基材支持体を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の分離材料。
【請求項７】
さらなる官能化のための反応性基を提供する、メタクリル酸グリシジル、ビニルアズラクトン、アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、メタクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの群から選択されるモノマーの表面開始重合による、グラフトポリマー鎖の共有結合のための、脂肪族ヒドロキシルまたはジオール基に富んだ、架橋されたコーティングでコートされた、多孔質基材支持体を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の分離材料。
【請求項８】
アクリル酸またはその誘導体およびカルボン酸基を提供するさらなるモノマーから構成されたグラフトポリマー鎖の共有結合のための、脂肪族ヒドロキシルまたはジオール基に富んだ、架橋されたコーティングでコートされた、多孔質基材支持体を含む、請求項６または７に記載の分離材料。
【請求項９】
請求項６または７に記載の、グラフトポリマー鎖の共有結合のための、脂肪族ヒドロキシルまたはジオール基に富んだ、架橋されたコーティングでコートされた、多孔質基材支持体を含む、アフィニティークロマトグラフィーのための分離材料であって、前記グラフトポリマー鎖は、
−  マレイン酸、アクリル酸、メタクリル酸、カルボキシエチルメタクリルアミド、カルボキシエチルメタクリルアミド、カルボキシルアクリルアミド、カルボキシメタクリルアミド、カルボキシプロピルアクリルアミド、カルボキシメチルアクリルアミド、２−アクリルアミド−２−メチルスルホン酸、およびアクリルアミドエタンスルホン酸の群から選択される、負の電荷を有する官能基を含むモノマー、
ならびに／または
−  ２−（ジエチルアミノエチル）アクリルアミド、２−（ジエチルアミノエチル）メタクリルアミド、２−（アクリロイルアミノエチル）−トリメチルアンモニウムクロリド、３−（アクリロイルアミノプロピル）−トリメチルアンモニウムクロリド、２−（ジメチルアミノエチル）メタクリルアミド、２−（ジメチルアミノエチル）アクリルアミド、２−（ジエチルアミノプロピル）アクリルアミド、２−（ジエチルアミノプロピル）メタクリルアミド、２−（メタアクリロイルアミノエチル）−トリメチルアンモニウムクロリド、および３−（メタアクリロイルアミノプロピル）−トリメチルアンモニウムクロリドの群から選択される、正の電荷を有する官能基を含むモノマー、
あるいは
−  マレイン酸、アクリル酸、メタクリル酸、カルボキシエチルメタクリルアミド、カルボキシエチルメタクリルアミド、カルボキシルアクリルアミド、カルボキシメタクリルアミド、カルボキシプロピルアクリルアミド、カルボキシメチルアクリルアミド、２−アクリルアミド−２−メチルスルホン酸、およびアクリルアミドエタンスルホン酸の群から選択される、負の電荷を有する官能基を含むモノマー、
ならびに／または
−  ２−（ジエチルアミノエチル）アクリルアミド、２−（ジエチルアミノエチル）メタクリルアミド、２−（アクリロイルアミノエチル）−トリメチルアンモニウムクロリド、３−（アクリロイルアミノプロピル）−トリメチルアンモニウムクロリド、２−（ジメチルアミノエチル）メタクリルアミド、２−（ジメチルアミノエチル）アクリルアミド、２−（ジエチルアミノプロピル）アクリルアミド、２−（ジエチルアミノプロピル）メタクリルアミド、２−（メタアクリロイルアミノエチル）−トリメチルアンモニウムクロリド、および３−（メタアクリロイルアミノプロピル）−トリメチルアンモニウムクロリドの群から選択される、正の電荷を有する官能基を含むモノマー、
ならびに、
１８個までの炭素原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキルを含む疎水性モノマーであって、アルコキシ、シアノ、カルボキシ、アセトキシおよびアセタミドからなる群より選択される親水性基を含んでもよい、前記疎水性モノマー
からなる、前記分離材料。
【請求項１０】
各々のポリマー鎖が、プロテインＡをカップリングするための複数の誘導体化可能な基を有することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の分離材料。
【請求項１１】
プロテインＡが、グラフトされたポリマー鎖の反応性基にカップリングされることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の分離材料。
【請求項１２】
請求項６〜９および１１のいずれか１項に記載の分離材料の調製のためのプロセスであって、
ａ）多孔質シリカ基材支持媒体を、酸化ジルコニウムまたは酸化チタンでコートすること、
およびその後、鉱酸、水酸化ナトリウムまたはプラズマで処理してもよく、
ｂ）三官能性エポキシドと反応させること、
ｃ）脂肪族ヒドロキシルまたはジオール基に富んだステップｂ）のコーティング上に、カルボン酸基を提供するアクリル酸またはその誘導体を含む鎖をグラフト重合すること、
ならびに、
ｄ）プロテインＡを、グラフトされたポリマー鎖の反応性基にカップリングすること
を特徴とする、前記プロセス。
【請求項１３】
請求項１２に記載のプロセスにおいて調製された請求項１〜１１のいずれか１項に記載の分離材料の、クロマトグラフィーカラムにおける使用。
【請求項１４】
請求項１２に記載のプロセスにおいて調製された請求項１〜１１のいずれか１項に記載の分離材料の、液体媒体からのバイオポリマーの除去のための使用。
【請求項１５】
カップリングされたプロテインＡおよび／またはグラフトされたポリマー鎖のイオン性基との相互作用により、あるいはカップリングされたプロテインＡおよび／またはグラフトされたポリマー鎖のイオン性基および疎水性基との、相互作用により、請求項１２に記載のプロセスにおいて調製された分離材料に吸着されたバイオポリマーを、
溶液中で、
ａ）イオン強度を増大させること、および／または
ｂ）ｐＨを変更すること
のいずれかにより、ならびに／あるいは
ｃ）吸着バッファーのものとは異なる極性を有する溶離液の使用を通して、
脱着させることを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の分離材料を含む、クロマトグラフィーカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結合能力が改善された新たな分離材料、その製造、および、特にプロテインＡに結合するための、その使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
プロテインＡおよびモノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体（mAb）は、薬学的適用のために用いられるので、例外的に高い純度であることが求められる［A. Jungbauer, G. Cartaら：Protein Chromatography, Process Development and Scale-Up; WILEY-VCH Verlag, Weinheim（Germany）（2010年）中］。
【０００３】
プロテインＡは、初めは元々は細菌である黄色ブドウ球菌の細胞壁において見出された５６ｋＤａの表面タンパク質である。それはspa遺伝子によりコードされ、その制御は、DNAトポロジー、細胞のモル浸透圧濃度、およびArlS-ArlRと称される二成分系によりコントロールされる。それは、免疫グロブリンに結合するその能力のために、生化学的研究において用途を見出されている。それは、元々は３ヘリックスバンドルに折り畳まれる５つの相同的なIg結合ドメインからなる。各ドメインは、多くの哺乳動物種からのタンパク質、特にはIgGに結合することができる。それは、殆どの免疫グロブリンのＦｃ領域内、およびまたヒトVH3ファミリーの場合にはＦａｂ領域内の重鎖に結合する。IgG分子が誤った向き（正常な抗体の機能に関して）に結合する血清中での相互作用を通して、細菌は、オプソニン化および食作用を妨害する。
【０００４】
ここで、用語「プロテインＡ」および「Prot A」は、交換可能に用いられ、そのネイティブのソースから回収されたプロテインＡ、合成で生成されたプロテインＡ（例えばペプチド合成により、または組換え技術により）、およびそれらのバリアントであって、Ｆｃ領域などのＣＨ２／ＣＨ３領域を有するタンパク質に結合する能力を保持するものを包含する。プロテインＡは、Repligen（GE）またはFermatechから市販で購入することができる。プロテインＡは、一般に、クロマトグラフィーマトリックス上に固定される。本発明による方法およびシステムにおいて用いられるプロテインＡの機能的な誘導体、フラグメントまたはバリアントは、マウスIgG2aまたはヒトIgGlのＦｃ領域に対しての、少なくともＫ＝Ｉ０８Ｍ、および好ましくはＫ＝Ｉ０９Ｍの結合定数により特徴づけることができる。結合定数についてのかかる値と協調する結合定数は、本発明の文脈において「高アフィニティー結合」と称される。幾つかの態様において、プロテインＡのかかる機能的誘導体またはバリアントは、天然のドメインE、D、A、B、Cから選択される野生型プロテインＡの機能的なIgG結合ドメイン、またはそれらの操作された変異体であってIgG結合の機能性を保持しているものの、少なくとも一部を含む。
【０００５】
また、固体支持体への一点付着を可能にするように操作されたプロテインＡの誘導体またはバリアントはまた、請求される方法におけるアフィニティークロマトグラフィーステップにおいて用いることができる。
【０００６】
一点付着は、一般に、タンパク質部分が、単一の共有結合を介して、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーのクロマトグラフィー支持材料に付着していることを意味する。かかる一点付着はまた、ＮまたはＣ末端の近傍またはタンパク質折り畳みの外周上の何処かの、露出したアミノ酸位置、すなわちループに配置される、好適な反応性残基の使用によっても起こすことができる。好適な反応性基は、例えば、スルフヒドリルまたはアミノ官能基である。
幾つかの態様において、プロテインＡの誘導体またはバリアントは、多点付着を介して、好適なクロマトグラフィーマトリックスに付着している。
【０００７】
一般的に、生物工学的プロセスは、不純度の高いmAbを非常に低い濃度において提供するのみであり、したがって、これらの不純物の除去は、下流プロセスとしても言及される複雑な単離および精製ステップのセットを必要とする。下流プロセスの効率は、mAbの製造コストに著しく影響を及ぼし、これは、全ての連続的なステップの手順を改善するための持続的な野心をもたらす［R. Freitag and C. Horvath; Adv. Biochem. Eng./Biotechnol., 1996, 53, 17-59］。関与する全てのプロセスステップの内で、プロテインＡクロマトグラフィー（アフィニティークロマトグラフィーとしても言及される）は、一定して、最も重要であり、高価なステップである。このことは、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーが、モノクローナル抗体mAbの下流の処理における最も重要な精製ステップの一つであることを意味する。
【０００８】
詳細に述べると、粗多成分溶液を、固体の多孔質支持体上に固定されたプロテインＡを含む固定相で充填されたカラムに通す。所望されるmAbは、mAbとプロテインＡとの間の特異的相互作用によりキャプチャーされ、一方、不純物は、脱離する溶媒と一緒にカラムを脱離する。キャプチャーされたmAbは、適切な溶離液の使用により回収する［P. Cuatrecasas, M. Wilchek, C. B. Anfinsen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, 636 (1968)］。
【０００９】
実際には、この結合および溶離の操作は、幾つかのステップのシークエンスからなる。第1のステップにおいて、カラムを、標的分子を含有する注入流がロードされることになるバッファーで洗浄する。次のステップにおいて、標的mAbおよび不純物を含有する注入流を、プロテインＡ固定相を含むカラムに通す。このステップにおいて、標的mAb分子は、プロテインＡに対するその特異的アフィニティーの長所によりキャプチャーされ、一方、不純物は殆どが通過する。その後、固定プロテインＡ相を洗浄バッファーでフラッシュし、残りの不純物を除去する。次いで、溶離バッファーをカラムに通すことにより、キャプチャーされたmAb分子を取り除く（溶離させる）。mAbの溶離は、標的mAb分子とプロテインＡとの間でのアフィニティーのシフトを誘導する溶離バッファーにより発生する化学的環境により引き起こされる。最後にカラムをクリーンにし、数回のさらなるサイクルにわたるmAbの結合および溶離を繰り返すために再生する。
【００１０】
したがって、アフィニティークロマトグラフィーは、標的mAbと固定相の表面との間の、非常に特異的な結合相互作用に依存する。理想的には、この特異的結合は、実質的なアフィニティーを有さない出発混合物の全ての成分がクロマトグラフィーカラムを通過し、一方、所望の分子は保持されるように、起こるべきである。静電気、疎水性、ファンデルワールスおよび水素結合を含む、多様な物理化学的相互作用、出発混合物を担持する媒体の性質、樹脂(resin)の表面における標的分子および結合部位の相補性の配置は、典型的に、所望される生体分子特異性の原因である［K. Huse, H.-J. Boehme and G.H. Scholz, J. Biochem. Biophys. Methods, 2002, 51, 217］。しかし、表面と生体分子との間の結合は、ｐＨもしくは塩濃度を変更することによる、または溶液中での競合的阻害剤の添加による溶離のために十分に弱いものである必要がある［A. Jungbauer G. Carta, Protein Chromatography, WILEY-VCH Verlag, 2010; R. Freitag and C. Horvath, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol., 1996, 53, 17; A. A. Shukla, B. Hubbard, T. Tressel, S. Guhan and D. Low, J. Chromatogr., B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci., 2007, 848, 28; P. Cuatrecasas, M. Wilchek and C.B. Anfinsen, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1968, 61, 636］。明らかに、アフィニティークロマトグラフィーの効率および性能は、記載された表面に対する標的分子の特異的相互作用に依存する。しかし、産生されるmAbの広範な多様性に起因して、固定相の設計は、特定のmAbの必要性に対して発達させられる。一般に、かかる設計は、固定相を、考慮中のmAbに対して特異的アフィニティーを有するリガンドで修飾することにより達成される。特異的相互作用に加えて、プロテインＡクロマトグラフィー媒体の選択は、強度（典型的には、適用される流速に対する圧力応答により特徴づけられる）、およびプロテインＡクロマトグラフィーの全てのステップにおいて用いられる幾つかの溶液に対する安定性などの、さらなるプロセスパラメーターに依存する。
【００１１】
まとめると、効率的なアフィニティークロマトグラフィー媒体の設計は、リガンド、固定相、および固定層へのリガンドの付着のための戦略の賢明な選択を必要とする。これらの要素全ての選択は、mAbを精製することにおける特異性および効率、全体としての固定相の安定性、および最終的には、アフィニティー媒体のコストにより支配される。殆どのリガンドは、所望の分子、例えば、抗体、抗原、レシチン、受容体、酵素阻害剤、ホルモンまたは生体模倣リガンドに対する、それらの天然のアフィニティーに起因して好適である［R. Freitag and C. Horvath, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol., 1996, 53, 17; K. Huse, H.-J. Boehme and G.H. Scholz, J. Biochem. Biophys. Methods, 2002, 51, 217］。プロテインＡは、モノクローナル免疫グロブリンＧ抗体のキャプチャーのために、首尾よく適用され、よく立証されたアフィニティーリガンドである［R. Freitag and C. Horvath, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol., 1996, 53, 17; A. A. Shukla, B. Hubbard, T. Tressel, S. Guhan and D. Low, J. Chromatogr., B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci., 2007, 848, 28; S.R. Narayanan, J. Chromatogr., A, 1994, 658, 237; K. Huse, H.-J. Boehme and G.H. Scholz, J. Biochem. Biophys. Methods, 2002, 51, 217; R. Hahn, P. Bauerhansl, K. Shimahara, C. Wizniewski, A. Tscheliessnig and A. Jungbauer, J. Chromatogr., A, 2005, 1093, 98］。プロテインＡは、媒体に特異性を付与するが、一方で、機械的な安定性は、基礎となる支持材料により主に提供される。幾つかの材料が、プロテインＡ固定相のための支持材料として用いられる。機械的強度に加えて、支持材料はまた、プロテインＡが効率的な様式において結合するための高い表面積を提供することができるべきである。したがって、これらの要求を満たし、好ましくは機械的におよび化学的に安定であるマトリックスが必要である。
【００１２】
さらに、クロマトグラフィーカラムの重要な特徴は、その寿命である。工業的適用のためのアフィニティークロマトグラフィーは、４つのステージ：吸着、洗浄、溶離、再生からなる［S.R. Narayanan, J. Chromatogr., A, 1994, 658, 237］。したがって、カラムの性能は、プロセスの再現性を保証するために、多数のサイクルの範囲にわたり一定であることが期待される。
【００１３】
mAbの精製のためのアフィニティークロマトグラフィーにおいて、固定されたプロテインＡに対するmAbの高特異性結合は、mAbの結晶化可能断片(fragmental crystallisable)（ＦＣ）領域とプロテインＡの適切な部位との相互作用により引き起こされる。プロテインＡは、細菌である黄色ブドウ球菌に由来し、実際に、細菌を哺乳動物の免疫系から保護する目的を有し、それを無効化する途上で、ＩｇＧに結合する。この技能は、基本的に、プロテインＡをアフィニティークロマトグラフィーリガンドとして使用して利用される。プロテインＡは、その全てがIgGのそれぞれのFC領域に結合することができる５つの構造的に関連する相同的ドメインを有する［K. Huse, H.-J. Boehme and G.H. Scholz, J. Biochem. Biophys. Methods, 2002, 51, 217; S. Ibrahim, Scand. J. Immunol., 1993, 38, 368; S. Hober, K. Nord and M. Linhult, J. Chromatogr., B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci., 2007, 848, 40］。タンパク質は高分子であり、それらの活性は三次構造（例えばＦＣ領域）に基づくので、それらの空間における配向、および媒質のｐＨなどの条件が、リガンドと標的分子との間−この場合はプロテインＡとIgGとの間の、首尾よい複合体構築のために重要な影響を及ぼすパラメーターである。しかし一方で、溶離の間の脱離のために、適切な特異的結合環境の必要性が重要である。IgGのＦＣ領域とプロテインＡとの複合体構築は、孔中における適切な配向を必要とする。IgG−protA複合体の３Ｄ図および配置は、H. Yangらにより解明されている［H. Yang, P. V. Gurgel, D. K. Williams, Jr., J. Cavanagh, D. C. Muddiman and R. G. Carbonell, J. Mol. Recognit., 2010, 23, 27］。
【００１４】
寸法における差異は両方のタンパク質の分子量に基づき、IgG（１４４ｋＤａ）は、プロテインＡ（４０〜６０ｋＤａ）よりも著しく大きい。それらの事実を、支持材料の孔構造の設計のために考慮する必要がある。
【００１５】
mAbに対する特異的結合部位とは別に、プロテインＡは、活性部位のアクセシビリティーを維持しながら、支持材料表面においてその固定を達成するために、官能基を提供する必要がある。プロテインＡの固定のために確立されたハンドルは、例えばエポキシ、カルボン酸またはアルデヒドなどの相補的な反応性基を備えた固定相に共有結合することができるアミン基およびチオール基である［H. Ahmed, Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification, and Characterization, CRC Press LLC, 2004; P. Cuatrecasas, J. Biol. Chem., 1970, 245, 3059; Z. Pan, H. Zou, W. Mo, X. Huang and R. Wu, Anal. Chim. Acta, 2002, 466, 141］。好適なアンカー基を備えた野生型プロテインＡが存在するが、変異によるプロテインＡの改変は、アミノ酸残基のバリエーションに起因して、カップリング化学、性能およびアルカリ耐性に関してテイラーメイドのプロテインＡ分子の作製を可能にする。官能基に関する多様なプロテインＡのアベイラビリティーは、様々な固定戦略の考慮を容易にする。一点付着であるか多点付着であるか、支持材料の選択、およびプロテインＡの官能基に依存する化学的表面活性化は、変数である。
【００１６】
多点付着は、例えば一点付着と比較して、プロテインＡ固定の耐久性の改善を約束し、mAb精製の間に任意のプロテインＡが脱離することを防止する。
【００１７】
チオールは、一般に、そのより強力な求核的性質に起因して、アミンより反応性が高く、したがって、チオールを含有するプロテインＡは、非常に効率的に、表面を提供するエポキシ基上に固定することができる。また、リガンドを含有する一級アミンについての、幾つかのカップリング方法が存在する。
本研究の焦点は、活性化された多孔質金属酸化物粒子上での固定のための複数の末端のアミンによる、プロテインＡの適用である。
【００１８】
固定相
mAbと表面との間の相互作用の特異性はPrAリガンドに依存するが、一方、プロテインＡリガンドが固定される多孔質マトリックスは、特定の基準を満たす必要がある。膜およびモノリスもまた、タンパク質クロマトグラフィーのための支持体として考慮されてきたが、多孔質の、マイクロメートルサイズのビーズが、典型的には、最も一般的かつ広範に使用される支持材料のための選択肢である［A. Jungbauer, G. Cartaら：Protein Chromatography, Process Development and Scale-Up; WILEY-VCH Verlag, Weinheim（Germany）（2010年）中］。プロテインＡ媒体の効率は、一般に、樹脂の単位容積あたりの結合能力（静的または動的なモードにおける）に関して測定される。結合能力は、表面積、孔のサイズ、孔の容積およびビーズのサイズなどの、多孔質ビーズの物理的性質の関数である。しかし、一般的に、表面積を増大させることにより、単位容積あたりより多くのプロテインＡの付着のための官能基が提供され、これにより、結合能力を増大させることができる。しかし、表面積を増大させることは、カラム中に充填される多孔質ビーズの機械的安定性を犠牲にする場合がある。
【００１９】
機械的安定性は、多孔質ビーズが、操作上の流速および結果として生じる圧力に耐えるために必要である。なぜならば、高い流速において操作することは、同じ動的結合能力においては、低い流速と比較して経済的であるからである。しかし、かかる高い速度は、カラム中での多孔質ビーズの高密度充填、および高圧での滴下を引き起こす。この観点から、均一な粒子サイズおよび狭い孔サイズ分布を有し、したがって正確な充填を可能にする材料を使用することが望ましい。小さい孔直径を有する粒子は、通常、高い表面積を提供する。しかし、孔サイズは、生体分子の拡散を可能にするために十分である必要がある。これらの物理学的特徴とは別に、支持材料はまた、幾つかの化学的特徴を有するべきである。プロテインＡクロマトグラフィーは、所望される分子と固定相との間の選択的アフィニティーの原則に基づいて機能するので、固定相は、理想的には、所望される分子との相互作用（典型的には、非特異的な吸着性の相互作用または結合として言及される）のいかなる可能性も有しないべきである［A. Jungbauer, G. Cartaら：Protein Chromatography, Process Development and Scale-Up; WILEY-VCH Verlag, Weinheim（Germany）（2010年）中］。
【００２０】
本質的な必要性に加えて、分離性能に基づいて、最近では、水酸化ナトリウム水溶液を用いてカラムを再生する（クリーンにする）ことの要求が存在する。かかる実施は、典型的には、定置洗浄（clean-in-place：CIP）として言及され、支持材料が、高ｐＨのアルカリ性条件に対する化学的耐性を提供すべきであることを必要とする［M. Rogers, M. Hiraoka-Sutow, P. Mak, F. Mann and B. Lebreton, J. Chromatogr., A, 2009, 1216, 4589］。
【００２１】
これらの基準を考慮して、実施において広く用いられる幾つかの支持材料が存在し、それらは、
天然の炭水化物ポリマー、合成ポリマーおよび無機材料を含む。天然の炭水化物ポリマーは、アガロース、セルロース、デキストランおよびキトサンを含み、タンパク質クロマトグラフィーの適用のために市販で入手可能である［A. Jungbauer, G. Cartaら：Protein Chromatography, Process Development and Scale-Up; WILEY-VCH Verlag, Weinheim（Germany）（2010年）中］。
【００２２】
イオン交換のための改変された天然の炭水化物ポリマーの使用の最初の記載は、1950年代に遡る［E.A. Peterson and H.A. Sober, J. Am. Chem. Soc., 1956, 78, 75131］。典型的には、多孔質のアガロースゲルは、熱いアガロース溶液を冷却することにより調製することができる。それらの材料の主要な特徴は、それらの親水的特徴（低い非特異的吸着）、および高容量が到達可能であるような化学的修飾およびリガンド固定のための大量のヒドロキシル基へのアクセシビリティーである。さらに、炭水化物は、極端なアルカリ性条件において、化学的に耐性であり、したがって、CIPのために好適である。
【００２３】
しかし、低い固体密度に起因して、これらのアガロースベースの材料は、機械的安定性を欠き、このことが、非常に高い流速および圧力におけるそれらの使用を限定している。これらの材料の機械的安定性は、化学的架橋により改善することができる。しかし、かかる化学的架橋は、典型的には、ヒドロキシル基をハンドルとして用い、このことが、さらなるリガンド固定のためのハンドルとして利用可能なヒドロキシル基を犠牲にすることなくアガロースゲルを架橋することができる程度を限定している。結果として、これらの架橋されたアガロースゲルの機械的強度は、無機材料などの競合材料に匹敵し得ない。
【００２４】
多孔質の合成ポリマービーズもまた、アフィニティークロマトグラフィーのための固定相として用いられる。
【００２５】
これらの所望される粒子サイズの合成ポリマービーズは、通常、賢明に選択されるポロゲン(porogen)を用いる懸濁重合またはエマルジョン重合により調製される。この懸濁重合は、典型的には、モノマーとポロゲンとのラジカル重合をシーディングすることを含み、狭い粒子サイズの分布を生じることが証明されている［T. Ellingsen, O. Aune, J. Ugelstad and S. Hagen, J. Chromatogr., 1990, 535, 147］。しかし、ビーズの合成の性質に起因して、合成のための用いられるモノマーに依存して、合成ポリマーは、天然の炭水化物ポリマーよりも著しく疎水性であり得る。モノマーの選択に依存して、ポリマービーズはまた、表面修飾のために利用可能な高密度の官能基を提供し、これにより親水性表面が得られる。それにもかかわらず、多数の官能性モノマーが市販で入手可能に起因して、懸濁法を介して生成されたポリマービーズは、化学的に多様であり、高度に調節可能である。一般的に用いられるポリマーは、ポリアクリルアミドおよびポリアクリレートである。２−ヒドロキシエチルメタクリレート（HEMA）は、高度に親水性かつ生体適合性のポリマーのための一例である［A. Jungbauer, G. Cartaら：Protein Chromatography, Process Development and Scale-Up; WILEY-VCH Verlag, Weinheim（Germany）（2010年）中］。それらのより高い固体密度に起因して、それらの材料は、通常、炭水化物より機械的に安定であるが、それらは、より親水性であるがゆえに、水性媒体中で膨満する傾向がある。もうひとつの利点は、ポリマービーズの高い化学的耐性であり、これにより、CIPが、ポリマービーズで充填されたカラムの性能に対して、樹脂構造の損傷により起因する影響を及ぼさないと予測され得る。
【００２６】
第３のクラスの支持材料は、無機、またはセラミックの粒子である。そのクラスの粒子は、例えば、いわゆるコントロールドポアガラス(controlled pore glass)（CPG）粒子である。図１は、かかる粒子およびそれらの孔構造を示す。
【００２７】
Merck Milliporeにより市販されるようなCPGなどのシリカベースのビーズは、最も高い固体密度を有し、優れた機械的強度を提供する。特に、大きな、相互連結した均一な孔を有するCPGの使用は、優れた流動毒性を可能にする［Schnabel, R.; Langer, P., J. Chromatogr., 1991, 544, 137］。さらに、形態学に起因する良好な物質移動は、妨害が極めて少ないタンパク質の孔への拡散を可能にし、したがって、それらの特性は、より高いスケールで有益である。形状および優れた流動特性を維持することは、線形の圧力の増大を伴う高い流速を促進し、一方、妨害の側ない物質移動は、短い保持時間を可能にする。しかし、CIPは、CPGなどの無機支持材料を用いることにおける主要な限定要因である［M. Rogers, M. Hiraoka-Sutow, P. Mak, F. Mann and B. Lebreton, J. Chromatogr., A, 2009, 1216, 4589］。通常、それらは、強力にアルカリ性の媒体中で可溶性であるＳｉＯ２に基づき、したがって、それらのカラムの寿命は、プロセスサイクルの数において限定される。さらに、アガロースベースの材料と比較して、より高い非特異的結合が観察されるのみならず、無機支持体上での表面修飾は、一般により挑戦的である。それにもかかわらず、無機材料に基づくタンパク質クロマトグラフィー媒体は、水酸化ナトリウムによるCIPが実施されないこの工業的セッティングにおいて、成功裏に確立されてきた。
【００２８】
全体として、ベースマトリックスの各々は、プロテインＡアフィニティー媒体のための１または２以上の利点を提供するが、最も望ましい改善は、CPGの腐食安定性におけるものである。
【００２９】
このことは、CPGなどの多孔質無機粒子の使用について、大規模なプロテインＡクロマトグラフィーにおける全てのその利点を考慮しても、アルカリ耐性の増強が望ましいことを意味する。シリカベースの材料のためのこの問題に関する幾つかの方法は、文献において記載される。それらの多くは、「エンドキャッピング」反応と称される手順を含む。残留するシラノール基を、クロロシランで処理して、シリカ表面を遮蔽する。この技術は、アルカリ耐性を増強するが、寿命はなお高ｐＨ処理のためには満足できるものではなく、さらにそれは、逆相クロマトグラフィー適用のためにより好適である［Nawrocki, J., Dunlap, C., McCormick, A., Carr, P. W., J. Chromatogr., A, 2004, 1028, 1; Samuelsson, J. A., Franz, Stanley, B. J., Fornstedt, T., J. Chromatogr., A, 2007, 1163, 177;  Kirkland, J. J., van Straten, M. A., Claessens, H.A., J. Chromatogr., A, 1995, 691, 3; Kirkland, J. J., van Straten, M. A., Claessens, H. A., J. Chromatogr., A, 1996, 728, 259］。
【００３０】
シリカ表面上のポリマーコーティングは、多くのポリマーについてよく研究される、さらなるオプションである［Petro, D. Berek, M., Chromatographia, 1993, 37, 549 36］。タンパク質精製の適用のために、デキストランまたはキトサンなどの炭水化物ベースのポリマーによる表面のコーティングの後でのシリカゲルのアルカリ耐性の著しい増強が記載されている。その後、ポリマー表面が、一般的に用いられる修飾戦略のために広がった［Fengna Xi and Jianmin Wu, React. Funct. Polym., 2006, 66, 682 ; E. Boschetti, P. Girot and L. Guerrier, J. Chromatogr., 1990, 523, 35］。これらの研究に加えて、J. Nawrockiら［J. Chromatogr., A, 2004, 1028, 1］は、広範な報告において、シリカゲルおよび多様な金属酸化物のアルカリ耐性、ならびにクロマトグラフィー適用のためのさらに重要な特性を比較した。
【００３１】
全てのこれらの研究を考慮して、多孔質ビーズの表面上へのプロテインＡの固定のために、表面が、プロテインＡの官能基のために好適な反応性のハンドルを提供することが必要である。明らかに、プロテインＡは、その構造および特性における多大な粗悪化を伴わず、反応性官能基を有することを必要とする。
【００３２】
発明の目的
したがって、一方で、アルカリの攻撃および分解の観点において安定である、好適な多孔質支持材料を、ならびに他方で、プロテインＡ固定のための官能基を有する好適な支持材料を提供することが、本発明の目的である。さらに、この新たな材料の調製のためのプロセスを提供することが、本発明の目的である。
【発明の概要】
【００３３】
発明の簡単な説明
本発明の目的は、ヒドロキシル含有多孔質基材支持体に基づくアフィニティークロマトグラフィーのための分離材料であって、その表面に対して、ポリマー鎖が共有結合によりグラフトされており、以下：
ａ）２または３以上のグラフトポリマー鎖が、前記表面上の１つのヒドロキシル基から開始されること、ならびに、
ｂ）各々のポリマー鎖は、アフィニティーリガンドをカップリングさせるための、複数の誘導体化可能な基を有すること
を特徴とする。
本発明によれば、分離材料の製造のための多孔質基材材料は、多孔質セラミック媒体、またはその表面にヒドロキシル基を有する多孔質ポリマー支持体からなってもよい。支持体として好適な多孔質セラミック媒体は、ケイ素、ジルコニウム、チタンの酸化物、およびそれらの混合物を含んでもよい。実験により、多孔質基材支持体がシリカベースの多孔質媒体である場合、または、シリカベースの多孔質媒体がジルコニアまたは酸化チタンでコートされている場合に、新たな分離材料は、良好な特性を示すことが示されている。本発明によれば、改善された特性を有するアフィニティークロマトグラフィーのための分離材料は、第１の製造ステップにおいて３官能性または４官能性以上のエポキシドにより処理された材料により提供される。好適な条件下において、反応させた３官能性または４官能性以上のエポキシドは、エポキシ官能性に富んだ架橋されたコーティングを形成する。このことは、カルボン酸基を提供するアクリル酸またはその誘導体を含むグラフトポリマー鎖の共有結合のための、脂肪族ヒドロキシルまたはジオール基に富んだ、架橋されたコーティングでコートされた、多孔質基材支持体を含む、改善された分離材料を製造することができることを意味する。
【００３４】
本発明による特に好適な分離材料は、多孔質基材支持体が、メタクリル酸グリシジル、ビニルアズラクトン、アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、メタクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの群から選択されるモノマーの表面開始重合によるグラフトポリマー鎖の共有結合のための、脂肪族ヒドロキシルまたはジオール基に富んだ架橋されたコーティングでコートされており、さらなる官能化のための反応性基を提供するものである。特に良好な特徴は、多孔質基材支持体が、アクリル酸またはその誘導体およびカルボン酸基を提供するさらなるモノマーで構築された、グラフトポリマー鎖の共有結合のための、脂肪族ヒドロキシルまたはジオール基に富んだ、架橋されたコーティングでコートされており、分離材料の各々のポリマー鎖が、プロテインＡのカップリングのための複数の誘導体化可能な基を有する場合、本発明の分離材料を示す。このようにして、有利に、プロテインＡを、グラフトされたポリマー鎖の反応性基にカップリングする。
【００３５】
ここで、本発明によるイオン交換クロマトグラフィーのための分離材料は、共有結合したグラフトポリマー鎖が、以下からなる場合に、特に良好な特性を示すことを見出した：
−  以下の群から選択される、負の電荷を有する官能基を含むモノマー：
マレイン酸、アクリル酸、メタクリル酸、カルボキシエチルメタクリルアミド、カルボキシエチルメタクリルアミド、カルボキシルアクリルアミド、カルボキシメタクリルアミド、カルボキシプロピルアクリルアミド、カルボキシメチルアクリルアミド、２−アクリルアミド−２−メチルスルホン酸、およびアクリルアミドエタンスルホン酸
ならびに／または
−  以下の群から選択される、正の電荷を有する官能基を含むモノマー：
２−（ジエチルアミノエチル）アクリルアミド、２−（ジエチルアミノエチル）メタクリルアミド、２−（アクリロイルアミノエチル）−トリメチルアンモニウムクロリド、３−（アクリロイルアミノプロピル）−トリメチルアンモニウムクロリド、２−（ジメチルアミノエチル）メタクリルアミド、２−（ジメチルアミノエチル）アクリルアミド、２−（ジエチルアミノプロピル）アクリルアミド、２−（ジエチルアミノプロピル）メタクリルアミド、２−（メタアクリロイルアミノエチル）−トリメチルアンモニウムクロリド、および３−（メタアクリロイルアミノプロピル）−トリメチルアンモニウムクロリド
ならびに任意に
−  １８個までの炭素原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキルを含む、疎水性モノマーであって、任意に、アルコキシ、シアノ、カルボキシ、アセトキシおよびアセタミドからなる群より選択される親水性基を含むもの。
【００３６】
本発明のアフィニティークロマトグラフィーのための分離材料は、以下を特徴とするプロセスにおいて調製される：
多孔質基材支持媒体を、
ａ）三官能性エポキシドと反応させること
ｂ）脂肪族ヒドロキシルまたはジオール基に富んだステップａ）のコーティング上に、カルボン酸基を提供するアクリル酸またはその誘導体を含む鎖とグラフト重合すること、
ならびに、
ｃ）プロテインＡを、グラフトされたポリマー鎖の反応性基にカップリングすること。
有利には、多孔質シリカ基材支持媒体は、多官能性エポキシドと、特に３官能性または４官能性以上のエポキシドと反応させる前に、製造される分離材料の腐食安定性を改善するために、酸化ジルコニウムまたは酸化チタンでコートされる。
【００３７】
本発明のさらなる目的は、ここで開示されるような分離材料を含むクロマトグラフィーカラム、および液体媒体からのバイオポリマーの除去のためのそれらの使用である。特に、本発明の分離材料は、バイオポリマーが、カップリングされたプロテインＡおよび／またはグラフトされたポリマー鎖のイオン性基と、および任意に疎水性基との相互作用により、分離材料に吸着し、
溶液中で
ａ）イオン強度を増大させること、および／または
ｂ）ｐＨを変更することにより
のいずれかにより、ならびに／あるいは
ｃ）吸着バッファーのものとは異なる極性を有する溶離液の使用を通して
脱着させる、アフィニティークロマトグラフィーにおける使用のために好適である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明の詳細な説明
プロテインＡは、好適なキャリア上での固定のために用いることができる様々な反応性基を有する。チオールおよびアミンは、反応のためのプロテインＡの一般的な官能基である［H. Ahmed, Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification, and Characterization, CRC Press LLC, 2004; Z. Pan, H. Zou, W. Mo, X. Huang and R. Wu, Anal. Chim. Acta, 2002, 466, 141］。本発明者らの実験により、アミン基が、固定反応のために予想外に特に好適であり、一方、プロテインＡの分子構造は、可能な限り変化しないままであることが示された。図２は、好適なキャリアの表面上での、ヒドロキシル基によるプロテインＡの固定反応を、模式的に示す。
【００３９】
一般的に、アミン含有リガンドは、臭化シアン、オキシラン、トレシルクロリド、ジビニルスルホン、ベンゾキノンカルボジイミダゾール等の試薬を用いて、ヒドロキシル基によりキャリア表面にカップリングされる。
【００４０】
グラフト化ポリマーを介して金属酸化物表面上に好適な官能基を付加するための好適な一つの方法は、アミン反応性側基を有するそれぞれのモノマーの適用であると考えられる。この要求は、それぞれの単位としてのメタクリル酸グリシジル（１）およびアクリル酸（２）の使用により満たされる。いずれのモノマーも、市販で入手可能であり、それらの取り扱いは複雑ではない：
【化１】
0006336996.tif 000002
メタクリル酸グリシジルのエポキシ環が、アミンの求核性の攻撃のために利用可能である一方で、アクリル酸のカルボン酸基が、プロテインＡとのペプチド結合の形成を提供し、これは、カルボジイミドの補助により可能となる。
【００４１】
【化２】
0006336996.tif 000003
【化３】
0006336996.tif 000004
効率的、均一かつ網羅的な表面修飾のために、金属酸化物は、表面ヒドロキシルの量を増大するように活性化される必要がある。この問題に関する方法は、文献において記載され、鉱酸、水酸化ナトリウムまたはプラズマによる一般的な化学的処理を適用する。ジルコニアは、修飾可能な表面ヒドロキシル基を欠き、均一なポリマーのグラフト化の機会を増大するために、さらなる表面活性化が望ましい。
【００４２】
炭水化物およびＳｉＯ２などの、ヒドロキシルを提供する表面上でのリガンドカップリングのために確立された方法は、ビスオキシラン（例えば、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）の使用により成功し、一方、１つのエポキシ基は表面に付着し、第２のものはリガンドに結合する［Platis, D., Labrou, N. E.; J. Sep. Sci., 2008, 31, 636; Head, D. M.,Andrews, B. A., Asenjo, J. A., Biotechnol. Tech., 1989, 3, 27］。カップリング反応の代わりに脂肪族ヒドロキシル基の生成を目的として、残りのオキシランを加水分解して、所望されるヒドロキシル基を生成する。この戦略のさらなる利点は、スペーサーの挿入である。脂肪族骨格の長さに依存して、可能なグラフト化反応は、基礎となるセラミック表面との相互作用による影響をあまり受けなくなり、また、アルキル鎖は、その可橈性に起因して、反応体のためのヒドロキシル基のアクセシビリティーの増大を引き起こす。
【００４３】
ヒドロキシルの増大は、トリスオキシランとしてのトリメチロールプロパントリグリシジルエーテル（３）（TMTGE）の使用により改善されることが予測される。上記の表面活性化の原則を、スキーム３において説明する。現在のアプローチにおいて、加水分解の代わりに、エポキシ基をチオールグリセロール（４）でクエンチして、さらなる修飾のために利用可能なヒドロキシル基を増加させる。さらに、チオグリセロールにより提供されるジオール基は、Ｃｅ（ＩＶ）により媒介される重合による開始のために好適である。
【化４】
0006336996.tif 000005
【００４４】
有利なことに、TMTGEの使用は、そのエポキシ残基に起因して、修飾可能なヒドロキシル基を欠く表面をコートするために、およびそれらをグラフト重合のためにアクセス可能にするために、架橋された水平なネットワークを構築する可能性を提供する。
【００４５】
固体表面上で共有結合を介してポリマーを固定するための、２つのアプローチ：
grafting-from
および
grafting-to
が存在する。
【００４６】
grafting-to法を用いて、既に合成されているポリマーを、１つまたは複数のアンカー基を介して、表面上の反応性基と反応させる。この技術の主な特徴は、望ましい分子量および分子量分布、ならびにコポリマー、ブロックコポリマーの組成、または他の特別なポリマー構造を備えた、テイラーメイドの鎖の使用のオプションである［Huang, J., Koepsel, R. R., Murata, H., Lee, S. B., Kowalewski, T., Russell, A. J., Matyjaszewski, K.;Langmuir, 2008, 24, 6785］。対照的に、grafting-from法においては、重合の開始は固体表面において配置され、したがって、ポリマー鎖は、成長するラジカルが周囲のモノマーを攻撃する従来の重合機構により、固体マトリックスから成長する。
【００４７】
一般に、grafting-from技術は、grafting-to技術と比較して、高密度でのポリマー鎖のグラフト化を可能にする。なぜならば、持続的に構築されるポリマー層を通して表面における反応性部位にアクセスする必要がある長いポリマー鎖と比較して、小さなモノマーのより容易な質量移動のためである。十分に高いグラフト密度では、ポリマー鎖は、「ポリマーブラシ」を形成する隣接する鎖の間での反発に起因して、表面から遠くに伸長する。
【００４８】
ATRPは、幾つかの利点を提供する一方で、重合ステップの前に、表面に対する開始剤の固定を必要とする。対照的に、セリウム（ＩＶ）塩による開始は、開始のための表面におけるヒドロキシル基などの還元基を必要とし、シングルステップ重合をおこなうために非常に効果的であり得る。多くの場合において、このＣｅ（ＩＶ）ベースの技術は、脂肪族ヒドロキシルを有する表面に適用される。
【００４９】
グラフト密度、鎖の立体構造、および分子量分布に関するグラフト化ポリマーの特性は、重合技術、および重合自体を支配する重合条件における差異に依存する。本研究においては、ATRPおよびＣｅ（ＩＶ）により開始される重合を、それらのユニークな利点に起因して、グラフト重合に適用させた：ATRPがよく制御される重合方法である一方で、Ｃｅ（ＩＶ）は単純であり、ヒドロキシル基を有する表面から直接的に行うことができる。
【００５０】
制御ラジカル重合は、リビング重合およびフリーラジカル重合の利点を組み合わせる。一方で、狭い鎖長分布および望ましい構造（例えばブロックコポリマー）を有するテイラーメイドのポリマーの作製が可能となり、これはリビングの特徴により引き起こされる。他方で、この方法は、殆どの官能基に対して寛容であり、したがって、遷移金属により触媒されるATRPの一般的原理にしたがって、通常のラジカル重合方法におけるもののような広範なモノマーの適用が利用可能である［K. Matyjaszewski and J. Xia, Chem. Rev., 2001, 101, 2921］：
【化５】
0006336996.tif 000006
【００５１】
ラジカル（活性種）は、アルキルハライド（休眠種）からのハロゲン原子Ｘの遷移金属錯体Ｍｘ（Ｌ）ｙへの可逆性の原子移動により生成される。ビニルモノマーの存在下において、ポリマー鎖は、従来のラジカル重合と類似の増殖ステップにより構築される。終止反応は、高ラジカル濃度により促進され、したがって、活性種の濃度は制御される必要がある。
【００５２】
首尾よい重合のための主要な前提は、それが通常容易に酸化する適切な酸化ステージにおける遷移金属錯体の適用である。したがって、絶対的に酸素フリーな系が必要とされる。
【００５３】
空気に対してはるかにより耐性であり、したがって遥かにより強力な技術は、電子移動により生成されるアクチベーターによる原子移動ラジカル重合(activator generated by electron transfer atom transfer radical polymerization:AGET ATRP)として言及される。酸化ステージにおける、活性化のための原子移動を可能にする遷移金属は、in situで、還元剤を用いて生成される。AGET ATRPの原理は、Jakubowski, W.ら［Macromolecules, 2006, 39, 39］において示され、先行のものとの唯一の差異は、還元剤によるＭｘ（Ｌ）ｙのin situ生成が必要とされ、これが同時に消費されることである［Jakubowski, W., et al. Macromolecules, 2006, 39, 39; Min, K. et al., Macromolecules, 2007, 40, 1789］。
【００５４】
【化６】
0006336996.tif 000007
AGET ATRPは、基質表面上のATRP開始剤の固定による重合からのグラフト化のために、容易に用いることができる。基質は、開始剤分子を固定するために、適切なアンカー官能基を提供する必要があり、固定が不要であるように、ポリ（ビニルベンジルクロリド）などのそれぞれのハライドを含むポリマーすら用いることができる［Bayramoglu, G., et al., Colloids Surf., A, 2009, 345, 127］。
【００５５】
ATRPは、スチレン、（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、ジエンおよびアクリロニトリルなどの、増殖するラジカルを安定化することができる置換基を含む多様なモノマーに対して首尾よく適用されて来た。各々のモノマーは、化学的性質に起因してユニークな平衡速度を引き起こし、したがって、最適な重合条件は、容易には移行できない。（メタ）アクリル酸などの酸性のモノマーは、遷移金属に対して配位することにより、触媒を損ない得る。それらはまた、窒素含有リガンドをプロトン化し得、これは金属錯体化能力を損なう。
【００５６】
開始剤分子の量は、成長する鎖の数を決定する。狭い分子量分布および均一な鎖の成長のために重要であるのは、迅速かつ完全な開始である。典型的に用いられるATRP開始剤は、ハロゲン化アルカン、ベンジルハライド、α−ハロエステル、α−ハロケトン、α−ハロニトリルおよびスルホニルハライドを含むアルキルハライドである。モノマーと開始剤との構造的類似性は、有益であり、したがって、α−ブロモイソ酪酸（Ａ）は、メタクリレート（Ｂ）のATRPのための良好な開始剤であり、一方、α−ブロモプロピオン酸（Ｃ）は、アクリレート（Ｄ）の重合のために用いられる。
【化７】
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【００５７】
SI ATRPのために、開始剤は、基質表面上に固定されているべきである。多数の報告により、固定は、シリカ表面上の好適な塩化シラン（Ｅ）、アルコキシシラン（Ｆ）、または任意のヒドロキシル基を提供する基質上のα−ブロモイソブチリルブロミド（Ｇ）を用いて成功する［Kowalewski, R., et al., Eur. Phys. J. E: Soft Matter Biol. Phys., 2003, 10, 5; Cao, L., et al., Proceedings Published by the American Chemical Society, 2011;Nair, M. B., Blum, F. D.; Polym. Prepr. (Am. Chem. Soc., Div. Polym. Chem.), 2008, 49, 485］。
【化８】
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【００５８】
ATRPのための多数の触媒系は、文献において記載され、元素の周期表の６族〜１１族までの遷移金属を含む。全ての遷移金属の中で、銅触媒は、最も広まっており、多用途性およびコストに関して優れている。遷移金属種とは別に、機能的な触媒系のためにはまた、好適なリガンドが必要とされ、これは通常、可溶性ならびに触媒の活性を促進する。多座脂肪族アミンは、銅触媒ATRPのためのリガンドとして確立されており、２，２’−ビピリジン（Bpy）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’−ペンタメチル−ジエチレントリアミン（PMDETA）は、ATRPにおける銅錯体のための一般的なリガンドである。
【化９】
0006336996.tif 000010
【００５９】
前に記述したとおり、AGET ATRPに対するATRPの重要な差異は、活性化する遷移金属錯体をin situで生成するための還元剤の適用である。銅ベースの系において、このことは、酸化的に安定なＣｕ（ＩＩ）種からのＣｕ（Ｉ）錯体のin situ生成を意味する。この技術の利点は、従来のATRPと比較して改善された頑健性である。さらに、必要とされる触媒の量が減少する：全ての金属錯体は、還元剤により活性化することができ、終止により生じる活性を失った種は、再生される。AGET ATRPにおいて首尾よく適用される還元剤として、スズ（ＩＩ）種（例えば、スズ（ＩＩ）２−エチルヘキサノアート）、フェノール、グルコース、ヒドラジン、没食子酸およびアスコルビン酸が挙げられる。
【００６０】
ヒドロキシル基を提供する表面上でのメタクリレートモノマーの銅触媒SI AGET ATRPの全反応スキームを、以下のスキームにおいて表わす：
【化１０】
0006336996.tif 000011
【００６１】
重合の開始はまた、硝酸セリウムアンモニウムなどのセリウム（ＩＶ）塩により引き起こすことができる。この場合、反応は、酸化還元反応の結果としてのフリーラジカルの放出に基づき、これは、1958年に、G. MinoおよびS. Kaizermanにより初めて記載された［Mino, G., Kaizerman, S., J. Polym. Sci., 1958, 31, 242］。酸化還元系は、通常、セリウム塩と、アルコール、チオール、グリコール、アルデヒドおよびアミンなどの有機還元剤とからなる。
【００６２】
アルコールの場合の酸化還元系は、以下の式において表わされる；「Ｃｅ（ＩＶ）」は、水溶液中に存在するセリウム錯体を表わす。
【化１１】
0006336996.tif 000012
ビニルモノマーの存在下において、この反応は、ラジカル重合を引き起こす。セルロース、デンプン、またはポリ（ビニルアルコール）などの基質の使用のために、このプロセスは、グラフトポリマーを生じる。
【００６３】
Ｃｅ（ＩＶ）塩によるヒドロキシル基からのグラフト重合は、多数のビニルモノマーについて記載されており、ここで、鎖の成長は、生成されたラジカルにより開始される。機構および動力学は、フリーラジカル重合と類似し、終止および移動反応を含む。溶液中でのフリーラジカル重合と比較して、表面開始バージョンは、通常、高い局所ラジカル濃度により引き起こされる終止の増大を示す。典型的な基質は、ポリ（ビニルアルコール）、セルロース、デンプンおよび他の天然の炭水化物である。一般的プロセスは、他の表面開始重合と比較して高い頑健性の利点をもたらす。さらに、SI ATRPと比較して、Ｃｅ（ＩＶ）開始グラフト重合のための別の反応ステップにおいて、特異化した開始剤を固定することを必要としない。さらに、酸性モノマーの重合は、容易に可能であり、Ｃｅ（ＩＶ）開始は典型的には酸性の水性媒体において行われるため、理想的ですらある。
【００６４】
上記のとおり、タンパク質、および特にモノクローナル抗体は、残念ながら、細胞培養物から、低い濃度において、大量の不純物と共に得られる。しかし、これらの化合物が薬学的適用のために望ましい生成物である場合、例外的な純度が必要である。
【００６５】
したがって、モノクローナル抗体（mAb）の製造コストはまた、望ましいタンパク質の回収および精製の効率により著しく影響を及ぼされ、これは、生成プロセスの重要な部分を構成する。タンパク質の回収のための複雑な単離および精製ステップのセットは、一般に、下流プロセスとして言及される［R. Freitag and C. Horvath, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol., 1996, 53, 17］。
【００６６】
幾つかの下流プロセスのうち、プロテインＡクロマトグラフィー（アフィニティークロマトグラフィーとしてもまた言及される）は、mAbに対するプロテインＡの高度に特異的なアフィニティーに起因して、mAb精製における最も重要なステップのうちの一つである。粗多成分溶液を、固定されたプロテインＡを有する固定相で充填されたカラムを通す。所望されるmAbは、mAbとプロテインＡとの間の特異的相互作用によりキャプチャーされ、一方、不純物は、溶媒と共にカラムを離れる。その後、キャプチャーされたmAbを、適切な溶離液の使用により回収する［P. Cuatrecasas, M. Wilchek and C.B. Anfinsen, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1968, 61, 636］。
【００６７】
プロテインＡクロマトグラフィーのために用いられる３つの一般的な型の支持粒子：
−天然の炭水化物ポリマー（例えば、アガロース、セルロース）、
−合成ポリマー（例えば、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート）
および
−無機材料（例えば、シリカ、多孔質ガラス、酸化ジルコニアまたは酸化チタン）
が存在する。
【００６８】
各々の材料は、幾つかの利点および欠点を示す。かかる無機材料として、ポリマーの競合物と比較して高いそれらの強剛性のために、多孔質ガラスなどが好ましい。それらは、形状および孔サイズにおける定常性を提供しつつ、流速およびその結果として圧力を増大する。直径が明確かつ可変であり、優れた流動特性を備えた大きな孔が、それらの非球系の形状にも関わらず、コントロールドポアガラス（CPG）を、大規模治療用抗体生成におけるプロテインＡ樹脂として適用することを可能にする。しかし、問題は、この無機多孔質分離材の腐食安定性の欠落である。有利なことに、この弱点を、本発明により取り除くことが可能であり、クロマトグラフィーカラムの長い寿命および一定の性能を（特に、下流プロセスにおいてクロマトグラフィー媒体をクリーニングするために最も一般的に用いられる媒体の一つである水酸化ナトリウムの存在下において）保証することができる。
【００６９】
ジルコニアおよびチタンのように、シリカよりも著しく高い化学耐性を有する金属酸化物は、匹敵する高い機械的安定性を保証するが、反応性表面ヒドロキシル基の量において限定されるため、「低分子」による従来の表面修飾は、より効率が低く、したがってより低いリガンド密度をもたらす。
【００７０】
しかし、今や、本発明により、適切な反復単位によるポリマー性の修飾により、最初のハンドルの欠失を補填することが可能であり、プロテインＡ付着のための望ましい官能基の増幅が達成可能である。
粒子修飾の成功は、主に、リガンド密度ＬＤＢＣＡおよび免疫グロブリンＧに対する静的結合能力Ｑｓにより測定される。
【００７１】
特に、セリウム（ＩＶ）塩開始による、および電子移動により生成される表面開始アクチベーターによる原子移動ラジカル重合(surface initiated activator generated by electron transfer atom transfer radical polymerization)（SI AGET ATRP）による、好適なモノマーのグラフト重合が、ここで開示される。ジルコニア表面は、化学反応に対してより耐性であるが、予想外なことに、それらは、本発明により、以下の例において示すことができるように、適応された方法により修飾することができる。
【００７２】
調製される材料の、プロテインＡを固定する能力およびその結果として生じるクロマトグラフィー性能は、幾つかの分析により支持される。ＬＤＢＣＡおよびＱｓ測定によるプロテインＡの存在およびアクセシビリティーの検証の他に、元素分析およびグラフト化の量を決定する官能基の滴定により、修飾された粒子を特徴づける。
【００７３】
材料の特徴づけ
Ｃｅ（ＩＶ）により媒介されるフリーラジカルおよびSI AGET ATRPプロセスによる固体基質のグラフト化は、広範に研究されている。この文献の大部分は、フィルムおよび線維などの低表面積基質に焦点を当てており、グラフト化性能に対する多様な重合パラメーターの効果を、典型的にはグラフト化の収率、モノマー変換、グラフトの長さにより評価されるものとして記載する。しかし、本発明により、多孔質金属酸化物粒子上での誘導体化可能なハンドルを有するグラフト化ポリマーが、アフィニティークロマトグラフィー適用のためのプロテインＡ固定のためのこれらの修飾粒子の好適性に対して多大な影響を有する。
【００７４】
この場合における重合は多孔質系において行われ、妨害の少ない官能基のアクセシビリティーならびにIgGキャプチャーのための固定されたPrAのアクセシビリティーを想定することはできないので、グラフト化性能の、最終的なクロマトグラフィー性能に対する相関は、自明ではない。したがって、モノマーの型、グラフト化の前の表面処理、重合温度、重合時間、モノマー濃度および開始剤濃度などの、潜在的に重合に影響を及ぼすパラメーターは、考慮中の系に対するそれらの影響に関して相互作用することが見出される。多孔質無機キャリアとしてのCPGは、多様な条件下において、官能性ハンドルを有するポリマーによりグラフト化され、プロテインＡは、ペンダント官能基として表わされる潜在的なハンドルに付着する。結果として生じるクロマトグラフィー性能は、重合条件に依存して、主としてリガンド密度および静的結合能力により測定し、それらの知見を、それぞれの条件下におけるグラフト化性能についての文献の報告と比較する。ProSepHCは、可変性についての対照として、および性能標的として用いられる。クロマトグラフィー性能を単純に多様な重合パラメーターの関数として試験することに加えて、グラフト化性能を、クロマトグラフィー性能と相関させた。かかる研究は、限定された孔内の利用可能空間に起因して作用する対立因子、および効率的なIgGキャプチャーのためにアクセス可能なPrAの部位の必要性を理解するために、必要であった。
さらに、PrAカップリングのための条件を、この調査の範囲内において変化させた。このさらなる研究はまた、ポリマーのテンタクルの特性と結果として生じるクロマトグラフィー性能との間の相関関係の、よりよい理解をもたらした。
【００７５】
Ｃｅ（ＩＶ）開始グラフト重合
以下の研究において、Ｃｅ（ＩＶ）開始グラフト重合により開始されるトリメチロールプロパントリグリシジルエーテル（TMTGE）コーティングの効果に関して考証する。
【００７６】
ジルコニア粒子は、腐食性の攻撃に対して安定であるので、表面上にヒドロキシル基を欠くジルコニア粒子の表面活性化を、本発明により試行し、効果的なＣｅ（ＩＶ）化学のための反応性ヒドロキシル基の数を増大するために、TMTGEコーティングによる多孔質粒子の処理のためのさらなるステップを導入する。TMTGEコーティングは、表面ヒドロキシル基およびTMTGEのエポキシ基を含む熱統計学的反応として進行する。
【００７７】
第１に、TMTGEコーティングの後で、残りのエポキシ基をアンカーとして、習慣的なエポキシ−アミン化学を用いて、直接的なプロテインＡカップリングを行った。生じたリガンド密度を、最適化のための指標として用いる。これらのコーティング実験の結果を図３ａ）およびｂ）において示し、ここで、同一のカップリング条件における、反応時間および温度に対するＬＤＢＣＡの依存性を示す［８０℃における反応時間の関数として（ａ）、および４時間の反応時間にわたる反応温度の関数として（ｂ）の、TMTGEでコートした、プロテインＡをカップリングしたCPGのＬＤＢＣＡ］。
【００７８】
図３は、同一のカップリング条件における反応時間および温度に対するＬＤＢＣＡの依存性を示す。
図３における結果に基づいて、TMTGEコーティングの成功を定性的に確認した：８０℃の高温および４時間の反応時間において、最大ＬＤＢＣＡが達成された。さらなる試みは、このステップにおける十分な再現性を実証した。結果として、TMTGEによる多孔質粒子の４時間にわたる８０℃での前処理を、重合条件の影響の研究のために用いた。
【００７９】
TMTGEによるコーティングが効果的なグラフト化のために必要であることを確実にするために、リガンド密度および静的結合能力によりモニタリングされるこの前処理ステップのグラフト化プロセスに対する影響を、第１に研究した。この目的のために、コートした、およびコートしないCPG粒子を、Ｃｅ（ＩＶ）により媒介されるアクリル酸の重合により、pAAでグラフト化し、その後、pAAのペンダントカルボン酸基を、同一の条件下において、PrAとカップリングした。図４ａおよび図４ｂは、それぞれAAおよびCANの様々な濃度における、TMTGEコーティングの、最終的な樹脂の静的結合能力およびリガンド密度に対する効果を示し［様々なモノマー濃度による、４０℃での、および０．０３Ｍの［CAN］による、コートした、およびコートしない試料の、静的結合能力（ａ）およびリガンド密度（ｂ）］、図５は、様々な開始剤濃度による、４０℃での、０．１５Ｍのアクリル酸によるコートした、およびコートしない試料の、静的結合能力（ａ）およびリガンド密度（ｂ）を示す。
【００８０】
図において示すとおり、コートされていない試料とTMTGEでコートされた試料との間のＱＳおよびＬＤＢＣＡの差異は、より高い［AA］において増幅されるが、一方、［CAN］は、その差異に対して著しい効果を有さない。それにもかかわらず、TMTGEでCPGをコートすることは、未処理のCPGと比較して、この実験のセットにおいて試験された重合条件の選択肢にかかわらず、より高いリガンド密度および静的結合能力をもたらす。
【００８１】
また、コートされていないCPGを用いて合成された樹脂のＱＳおよびＬＤＢＣＡ値は、コートされたCPGと比較して低いにもかかわらず、これらの値は、素(bare)のCPGにおいて観察されるＱＳおよびＬＤＢＣＡよりも、なお著しく高く、Ｃｅ（ＩＶ）により媒介される重合が、、不十分であるとしても、未処理のCPGによってすら成功していることを示すことに注意すべきである。それはまた、炭水化物などの基質により提供される脂肪族ヒドロキシルを用いるＣｅ（ＩＶ）開始グラフト重合の適用を記載する文献の報告の多くと一致する。それにもかかわらず、これらの重合条件下におけるTMTGEコーティングの利点は、明らかに認識可能である。
【００８２】
したがって、Ｃｅ（ＩＶ）開始重合のさらなる研究は、ＬＤＢＣＡ、ＱＳ、および基質としてのTMTGEでコートされたCPG上でのグラフト化ポリマーの相関関係にのみ、焦点を当てる。TMTGEでコートされたCPGを、メタクリル酸グリシジルおよびアクリル酸の両方を重合するために用いた。
さらなる実験を通してだが、さらなる官能化のための反応性基を提供するメタクリル酸グリシジル、ビニルアズラクトン、アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびメタクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの群より選択されるモノマーはまた、本発明による新たな分離材料の調製のために特に好適であることを見出した。しかし、実験の数を許容可能な範囲に保つために、実験計画は、上記のとおり、メタクリル酸グリシジルおよびアクリル酸の使用に限定した。
【００８３】
本発明の範囲内において、イオン交換クロマトグラフィーのための分離材料は、特に、グラフトポリマー鎖の共有結合のための脂肪族ヒドロキシルまたはジオール基に富んだコーティングでコートされた、多孔質基材支持体材料であって、前記グラフトポリマー鎖は、以下からなる：
−  以下の群から選択される、負の電荷を有する官能基を含むモノマー：
マレイン酸、アクリル酸、メタクリル酸、カルボキシエチルメタクリルアミド、カルボキシエチルメタクリルアミド、カルボキシルアクリルアミド、カルボキシメタクリルアミド、カルボキシプロピルアクリルアミド、カルボキシメチルアクリルアミド、２−アクリルアミド−２−メチルスルホン酸、およびアクリルアミドエタンスルホン酸
ならびに／または
−  以下の群から選択される、正の電荷を有する官能基を含むモノマー：
２−（ジエチルアミノエチル）アクリルアミド、２−（ジエチルアミノエチル）メタクリルアミド、２−（アクリロイルアミノエチル）−トリメチルアンモニウムクロリド、３−（アクリロイルアミノプロピル）−トリメチルアンモニウムクロリド、２−（ジメチルアミノエチル）メタクリルアミド、２−（ジメチルアミノエチル）アクリルアミド、２−（ジエチルアミノプロピル）アクリルアミド、２−（ジエチルアミノプロピル）メタクリルアミド、２−（メタアクリロイルアミノエチル）−トリメチルアンモニウムクロリド、および３−（メタアクリロイルアミノプロピル）−トリメチルアンモニウムクロリド
ならびに任意に
１８個までの炭素原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキルを含む、疎水性モノマーであって、任意に、アルコキシ、シアノ、カルボキシ、アセトキシおよびアセタミドからなる群より選択される親水性基を含むもの。
先に記載されるとおり、これらのモノマーの各々は、重合の後で、誘導体化可能なペンダント基を提供する。
【００８４】
好適な数の炭素原子を有する少なくとも１つのアルキルおよび／またはアリール基の形態において明らかな疎水性含有物を有する少なくとも１つのモノマー単位を用いて調製された、表面上に共有結合したグラフトポリマーを含む分離材料が、特に好ましい。本発明により、この型の分離材料は、バイオポリマーとの相互作用の可能性が、グラフトポリマーの疎水性含有物により、およびまた荷電された含有物により、取り除かれるので、特に有効であることを証明した。
【００８５】
結果として、アルキルビニルケトン、アリールビニルケトン、アリールアルキルビニルケトン、スチレン、アルキルアクリレート、アリールアクリレート、アリールアルキルアクリレート、アルキルアリールアクリレート、アルキルメタクリレート、アリールメタクリレート、アリールアルキルメタクリレートおよびアルキルアリールメタクリレートの群より選択される疎水性含有物を有する少なくとも１つのモノマー単位を用いる誘導体化が、特に望ましい。
【００８６】
本発明による分離材料は、したがって、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、２−、３−もしくは４−オキサペンチル、２−、３−、４−もしくは５−オキサヘキシル、２−、３−、４−、５−もしくは６−オキサヘプチル、３−ブトキシプロピル、イソプロピル、３−ブチル、イソブチル、２−メチルブチル、イソペンチル、２−メチルペンチルおよび３−メチルペンチルの群から選択される疎水性基を含む少なくとも１つのモノマー単位を用いて調製することができるが、これはまた、２−オキサ−３−メチルブチル、２−メチル−３−オキサヘキシル、２−フェニル−２−オキソエチル、フェノキシエチル、フェニル、ベンジル、フェニルエチルおよびフェニルプロピルの群からも選択され、これにより、後者の群は、生体分子との望ましい相互作用に入ることができる親水性効果を誘導する。
第１に、GMAを重合した。なぜならば、それは直接的にプロテインＡとカップリングすることができるが、他のカルボン酸基は、典型的には中間体を必要とするからである。
【００８７】
GMAのＣｅ（ＩＶ）開始グラフト化は、幾つかのGMAの濃度において、［CAN］＝０．０３Ｍ、およびDMF−水の様々な混合物および水のみにおいて行う。コントロールドポアガラス粒子からのpGMAのグラフト化の成功を証明するために、重合の後で、元素分析を行う。グラフト化されたCPGの炭素含有率であるＣ％、および重合のために最初に適用された１グラムのCPGあたりのGMAであるｎＧＭＡ，０を用いて、グラフト化収率Ｙ％は、以下の式に従って計算可能である：
【化１２】
0006336996.tif 000013
【００８８】
［GMA］＝０．１Ｍ、［CAN］＝０．０３Ｍ、Ｔ＝４０℃、ｔ＝２２時間における、Ｃｅ（ＩＶ）により媒介されるGMAの重合について、炭素含有率およびグラフト化収率は、Ｃ％＝０．７５ｗ／ｗおよびＹ％＝１５％であることが観察される。Ｃ％およびＹ％の両方についての正の、かつ顕著な値は、首尾よいGMAの重合を示す。
【００８９】
しかし、先に記載されるとおり、プロテインＡクロマトグラフィーにおいて樹脂を使用する目的のためには、プロテインＡをカップリングする能力および結合能力を最大化することが、グラフト化収率よりも重要である。したがって、pGMAがグラフトされたCPGの試料を、プロテインＡカップリングの後でのリガンド密度および静的結合能力の決定により、さらに特徴づける。pGMAがグラフトされたCPGについてのＱＳおよびＬＤＢＣＡについての結果を図６においてプロットする［０．０２５Ｍ、０．１Ｍおよび０．２７ＭのGMA濃度による、GMAがグラフトされたCPGのＬＤＢＣＡおよびＱＳ；純粋なCPGおよびProsepHCと比較する］。
【００９０】
図６において示されるとおり、プロテインＡカップリングステップの後の、pGMAがグラフトされたCPGは、リガンド密度および静的結合能力を全く有さないか、または無視し得るリガンド密度および静的結合能力を有した。非特異的結合に起因して、ＱＳ値は、素(bare)のCPGにより観察された値と同じかこれより低い。さらに、ＱＳ値は、匹敵する［AA］において最適化されていない条件下において合成されたpAAがグラフトされたCPGにより得られる値より低い。pGMAでコートされたCPGについてのプロテインＡカップリング条件は、これらの研究について最適化されなかったが、一方で、試験された条件の範囲について素のCPGと類似するかこれより低いＱＳ値は、文献において報告されている高いグラフト化収率を考慮すると、いささか驚きであった。先の報告は、高いグラフト化収率、無視し得る量の遊離のポリマー、および一報告においては、IR分光法により特徴づけられたものとして表面上でのエポキシ基の証拠を記載する［R. Murugan and S. Ramakrishna, Colloid Polym. Sci., 2004, 282, 1316］。
【００９１】
しかし、驚くべきことに、図６における結果は、重合の後でエポキシ基が残ることを示す。エポキシ基の加水分解およびその後の開始により生じる架橋されたポリ（メタクリル酸グリシジル）の生成は、GMAの優れたグラフト性能を説明する。さらに、硝酸セリウムアンモニウムは、強力な酸化剤であり、DMF、トルエンおよびアセトンを含む有機構成要素の大部分を酸化することができる。反応の間、AA重合の場合における反応溶液の典型的な黄色が、GMAの重合の場合には消えることが見出される。かかる黄色の原因は、ラジカルの生成の原因であるＣｅ（ＩＶ）種であり、このことは、Ｃｅ（ＩＶ）の網羅的な消費を示す。
【００９２】
まとめると、エポキシ基を全くまたは殆ど残さない網羅的な開始およびGMAの重合、ならびに、重合の間のＣｅ（ＩＶ）種の完全な消費は、PrAカップリングのための能力を全く有さないpGMAコーティングをもたらす。このことは、GMAのＣｅ（ＩＶ）開始グラフト重合による多孔質金属酸化物粒子の表面活性化は、PrAアフィニティー樹脂の合成のために好適ではないことを意味する。重合の間のエポキシ基の減少は、表面上のプロテインＡの首尾よい固定を妨害する。
【００９３】
GMAと比較して、同じ条件下におけるAA重合は、何らの表面処理なしで、素のCPGのものよりも高い、測定可能なリガンド密度および静的能力をもたらした。このことは、アクリル酸のヒドロキシル基からの開始は、エポキシ基の加水分解により生じるジオール基と比較して効率的ではないという事実に起因する。それにもかかわらず、ポリ（アクリル酸）グラフトのヒドロキシル基からの重合の開始は、カップリングのために必要とされるカルボン酸を効果的に消費しない。したがって、モノマーとしてアクリル酸を用いて、Ｃｅ（ＩＶ）開始グラフト化により合成される媒体の静的結合能力のさらなる最適化を行う。
【００９４】
ＱＳおよびＬＤＢＣＡは、TMTGEでコートされたCPGについての様々な重合パラメーターにより変化するが、コートされていないCPGからのＣｅ（ＩＶ）により媒介される開始の場合、依存性は観察されない。このことが、全ての実験がTMTGEでコートされた粒子を用いて行われる理由である。研究された様々な変数の範囲は、表１において表わす。
表１：コートされていないCPG上でのアクリル酸のグラフト重合についての異なるパラメーター。
【表１】
0006336996.tif 000014
【００９５】
アクリル酸ならびにメタクリル酸グリシジルおよびビニルアザラクトン(vinyl azalactone)などのその誘導体をグラフト化するためのこれらの最適化実験に加えて、適応された特性を有する分離材料を生成するために、膨大な群のポリマーを、多孔質支持材料にグラフト化することができる。
【００９６】
好適なモノマーは、以下であってよい：
マレイン酸、アクリル酸、メタクリル酸、カルボキシエチルメタクリルアミド、カルボキシエチルメタクリルアミド、カルボキシルアクリルアミド、カルボキシメタクリルアミド、カルボキシプロピルアクリルアミド、カルボキシメチルアクリルアミド、２−アクリルアミド−２−メチルスルホン酸およびアクリルアミドエタンスルホン酸の群から選択される、負の電荷を有する官能基を含むモノマー；
２−（ジエチルアミノエチル）アクリルアミド、２−（ジエチルアミノエチル）メタクリルアミド、２−（アクリロイルアミノエチル）トリメチルアンモニウムクロリド、３−（アクリロイルアミノプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、２−（ジメチルアミノエチル）メタクリルアミド、２−（ジメチルアミノエチル）アクリルアミド、２−（ジエチルアミノプロピル）アクリルアミド、２−（ジエチルアミノプロピル）メタクリルアミド、２−（メタアクリロイルアミノエチル）トリメチルアンモニウムクロリド、および３−（メタアクリロイルアミノプロピル）トリメチルアンモニウムクロリドの群から選択される、正の電荷を有する官能基を含むモノマー；
または、クロマトグラフィーによる分離において疎水性相互作用をもたらすモノマー。
【００９７】
これに加えて、アクリル酸、メタクリル酸グリシジル、ビニルアズラクトンなどのモノマーからの官能基を、６〜１８個の炭素原子を有するアルキルアミン、ベンジルアミン、フェニルエチルアミン、フェノキシルエチルアミン、フルオロベンジルアミン、アニリンまたはメトキシルベンジルアミンなどのアミン含有疎水性基で、さらに官能化することができる。
【００９８】
重合時間の効果
６時間、１８時間および２２時間後に反応を停止することにより、この系の重合時間の依存性を試験する。ＱＳおよびＬＤＢＣＡについてのそれぞれの測定についての結果を、図７において、異なる重合期間についてのリガンド密度および静的能力を参照して示す。
６時間および２２時間の重合期間の範囲におけるグラフト化されたCPGの性能の定常性は、４０℃での６時間後の反応の完了を証明する。
【００９９】
重合温度の効果
２つの異なるアクリル酸濃度により、４０℃、５０℃および６０℃において行った実験により、重合温度の影響を試験する。ＬＤＢＣＡおよびＱについてのそれぞれの値を、図８ａ）およびｂ）においてプロットする。
６０℃までの重合温度の増大は、より低い、およびより高いアクリル酸濃度の両方について、リガンド密度および静的能力について僅かにより高い値をもたらす。
図８ａ）における結果に関して、TMTGEでコートされたCPG上でのアクリル酸のグラフト化について、５０℃のおける重合の僅かな利点に注目すべきである。
【０１００】
開始剤濃度の効果
プロテインＡ固定のためのアクリル酸のグラフト重合に対する硝酸セリウムアンモニウム濃度の影響を、高い及び低いアクリル酸濃度、ならびに２つの異なるEDC濃度（EDC＝１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの頭文字；プロテインＡカップリング剤）により、試験する。知見を、図９ａ）およびｂ）において表わす。
【０１０１】
図９は、２つの異なるEDC濃度による２つのシリーズについて、特定のCAN濃度（０．０３ｍｏｌ／Ｌ）において、静的能力およびリガンド密度が最大値に達したことを示す。CAN濃度のさらなる増大または減少は、固定されたプロテインＡについてより低い値を引き起こす。さらに、反応は、高いアクリル酸濃度を用いる場合、低いアクリル酸濃度における変化と比較して、開始剤濃度の変化に対して、より感受性が高い。０．００５ＭのCANを用いる場合、高いアクリル酸濃度による試みは、ＬＤＢＣＡおよびＱＳについて、低いアクリル酸濃度による試みより低い値を示す。このことは、プロテインＡカップリング条件に起因する。
【０１０２】
硝酸セリウムアンモニウムの濃度は、上記の酸化還元反応に起因して生成されるフリーラジカル（主にヒドロキシル基を提供する表面において）の量の原因となる。ラジカルは、ポリマーグラフトを形成するための増殖ステップにおけるビニル結合による反応を介して増殖し、したがって、グラフト化収率は、放出されたラジカルの量に伴って増大する。しかし、最適値よりも高いCAN濃度について、終止反応は、より著しくなる。さらに、溶液中でのホモポリマーの形成は、CAN濃度と共に増大する。ホモ重合(homopolymerization)およびグラフト重合は、競合する反応である。
【０１０３】
モノマー濃度の効果
グラフト重合およびPrA固定の能力に対するアクリル酸濃度の影響を、全ての残りの変数は一定に保ちつつ、０．０９Ｍ〜０．８５Ｍのアクリル酸の範囲において研究する。モノマー濃度は、全ての試験された重合変数のうちで、最も感受性が高いパラメーターであることを見出した。したがって、得られたビーズの炭素含有率は、リガンド密度および静的能力に加えて、元素分析により決定した。したがって、プロテインＡカップリングに依存しないさらなるグラフト化の証拠が利用可能である。結果を図１０において表わす。
図１０におけるデータは、０．６３Ｍまでのアクリル酸濃度の増大に伴うグラフト化ポリマーの増加を示す。モノマーのさらなる濃縮は、コートされたCPG表面上に、より少ない量のポリ（アクリル酸）をもたらした。
【０１０４】
重合、PrA固定およびIgGキャプチャーの能力の相関を見出すために、図１１において、リガンド密度および静的能力をモノマー濃度に対してプロットする。
【０１０５】
図１１において示されるように、リガンド密度および静的能力についての値の傾向に関して、より高いグラフト化収率は、より高いプロテインＡ固定をもたらし、結果として特定の限定的なモノマー濃度に対してより高い静的能力をもたらす。したがって、表面上でより多くのポリマーがグラフト化されると、より高い量の官能基が利用可能となり、その結果、より多くのタンパク質分子がテンタクル上で結合することができる。しかし、一定の限度を超えて（すなわち、［AA］＞０．３５Ｍにおいて）アクリル酸濃度を増大することは、必ずしも、静的結合能力のさらなる増大をもたらさない。さらに、０．３Ｍを超えるアクリル酸濃度による試みは、測定結果における著しい変動性をもたらす傾向がある。
【０１０６】
プロテインＡの固定および効率
ポリ（アクリル酸）テンタクル上のプロテインＡの固定、およびクロマトグラフィー性能に対するその効果についてよりよい理解を得るために、上述の処理ステップ（TMTGEコーティングおよび重合）における再現性の欠如は、測定結果における変動性の原因ではないことを確認することが必要である。したがって、グラフト重合ステップのスケールアップを行った。そうすることにより、pAAがグラフトされたCPGのバッチを、プロテインＡカップリング条件の研究のために分割した。様々な量のグラフト化されたpAAを有する粒子へのタンパク質固定に対するEDC濃度およびプロテインＡ量の影響を研究した。
【０１０７】
プロテインＡ固定に対するEDC濃度の効果
プロテインＡのアミン基とペプチド結合を形成するためのカルボン酸基の活性化のために、EDCを用いた。EDCおよびプロテインＡについては同じ濃度を用いてカップリングを行ったので、カルボン酸基に対するEDCおよびプロテインＡの比は、グラフト化されたpAAの著しい増大により変化する。したがって、多様なEDC濃度および２つの異なるプロテインＡ量（樹脂１ｍＬあたり１５ｍｇおよび３０ｍｇのプロテインＡ）によるカップリングのための実験のセットをセットアップして、同じバッチのグラフト化されたCPGを用いて行う。この実験のセットについての結果を図１２ａ）およびｂ）においてプロットする。
【０１０８】
表２は、多様なEDC濃度、および２つの異なる量のプロテインＡのローディングについての、ＱＳおよびＬＤＢＣＡについての結果を示す。図１２Ｂにおいて示すとおり、ＬＤＢＣＡは、溶液中のEDCの量が０．０２５ｇ／１０ｍＬまで増大するにつれ、連続的に増大する。しかし、EDC含有量のさらなる増大は、EDC濃度の関数としての検出されるプロテインＡのプラトーをもたらす。対照的に、図１２Ａにおいて示すとおり、静的結合能力は、１０ｍＬの溶液あたり０．０２５ｇのEDC濃度において最大値を示すことが観察される。著しくより長い反応時間（２．５時間の代わりに２０時間）によるカップリングの試みは、この傾向を確認し、それによりカップリング時間の影響を除外する。
【０１０９】
図１２における結果により、EDC濃度は、達成可能な最大の静的結合能力およびリガンド密度に関して、プロテインＡカップリングに非常に高感度に影響を及ぼす。ＱＳおよびＬＤＢＣＡについて、特定のEDC濃度までの両方の値の平衡的増大が予測される。なぜならば、EDCはカップリング反応を促進し、付着したプロテインＡが多いほど、より多くのＩｇＧがキャプチャーされることが予測されるからである。
【０１１０】
EDC濃度の関数としてのＬＤＢＣＡにおいて観察されるプラトーは、現在の系における２つの限定要因に起因する。第１に、より高いプロテインＡ量が、わずかにより高いレベルプラトーをもたらすことを考慮すると、限定された量の提供されたプロテインＡが、単純に、達成し得る最大のリガンド密度を限定する可能性がある。第２に、全てのプロテインＡ分子がポリマーテンタクルの特定のセグメントを占有する。全てのアクセス可能なカルボン酸基の枯渇が、試験されたグラフト化量におけるプラトーの原因である可能性がある。
【０１１１】
EDC濃度の関数としての静的結合能力の最大値は、固定反応の間に起こる幾つかの現象に起因し得る。この側面のよりよい概要のために、用いられたものなどの、カルボン酸基に対する、およびプロテインＡに対するEDCの比を、表２において列記する。
【０１１２】
表２：上のEDC研究において用いられた、カルボン酸基に対する、およびプロテインＡに対するEDCの比。計算は、炭素含有率測定（樹脂５ｍＬあたり０．１６ｍｍｏｌのAA）、および５０キロダルトンのプロテインＡの平均分子量に基づく。
【表２】
0006336996.tif 000015
【０１１３】
表２は、カルボン酸基に基づいて、用いられたEDC濃度において、まさに静的結合能力の最大値の範囲内において（０．０２５〜０．０５ｇ／１０ｍＬ）、過剰から不足までのシフトが存在することを示す。一方、最も低いEDC濃度ですら、プロテインＡ分子と比較すると、過剰量をなす。しかし、EDCはまた、以下のスキームにおいて示されるように、加水分解反応により不可逆的に消費され得る。以下のスキームは、EDCがペプチド結合の生成のためのカルボン酸基の活性化を媒介したことを示し、副反応として加水分解を含む：
【化１３】
0006336996.tif 000016
【０１１４】
このことは、プロテインＡに対するEDCの少しの過剰（０．００５および０．００２５ｇ／１０ｍＬによる試みにおけるものなど）は、全ての利用可能なプロテインＡ分子を固定するためには十分ではないことを意味する。著しい量のEDCが水による加水分解に起因して消費され、したがって、もうタンパク質カップリングのためには利用可能でない。
静的結合能力は、リガンド密度のプラトーが開始する点において最大値に達し、結合能力は、さらなるEDCの増大に伴って劇的に減少する。
【０１１５】
高過剰量のEDCは、プロテインＡの活性部位の変更の原因となり得る。この場合、タンパク質のカルボン酸基が活性化され得、タンパク質分子の二量体化または架橋をもたらし得、それにより、IgGキャプチャーのための能力の限定をもたらし得る。
【０１１６】
また、EDCは塩酸塩(hydrochloric)として適用され得るので、多様なEDC濃度は、カップリング溶液のｐＨおよび塩濃度の変化をもたらす。これらのシフトは、鎖の立体構造における変化の原因となり得る。ポリ（アクリル酸）は、弱いポリ電解質であり、アルカリ条件下において伸展した鎖を示す。高い塩濃度およびｐＨの低下は、通常、コイル立体構造を支持する。伸展した鎖と比較して、コイルは、固定されたプロテインＡの不利な配置をもたらす場合がある。
【０１１７】
さらに、高いEDC濃度は、同時に活性化される官能基の数を増加させ、したがって、それは非常に迅速なタンパク質分子の固定の原因となる。ポリマー鎖が縺れた状態でコイルとして存在すると仮定すると、ポリマー鎖に沿った無作為のスポットにおける迅速な複点付着もまた、プロテインＡの不利な配置をもたらし、それによりそのIgGキャプチャー能力が阻害される。
【０１１８】
このEDC研究における固定されたプロテインＡのIgGキャプチャー能力に関する効率を、図１３において表わす。図１３は、EDC濃度に依存した、固定されたプロテインＡのIgGキャプチャーの効率を示す。計算は、プロテインＡについての５０ｋＤ、およびIgGについての１４４ｋＤの分子量に基づく。特に、それは、様々なEDC濃度において、幾つのIgG分子が１つのプロテインＡ分子により捕捉されるかを示す。固定されたプロテインＡの効率は、適用されるEDCの増大に灯って、一定して低下する。
【０１１９】
なお、一般的なプロテインＡは、IgG付着のための５つの活性部位を有することを考慮して、EDCがプロテインＡの活性部位を変更するか、そのアクセシビリティーの欠失の原因であるという仮説は、このプロットにより強調される。
【０１２０】
グラフト量、リガンド密度および静的結合能力の間の相関：
EDC濃度が、グラフト化されたCPGのクロマトグラフィー性能のための、タンパク質カップリングステップにおいて非常に高感度で影響を及ぼすパラメーターであると同定した後で、EDCを減少させた研究を、アクリル酸濃度およびプロテインＡ量を変化させることにより達成する。結果を図１４および１５においてプロットする。
【０１２１】
図１４ａ）およびｂ）は、高タンパク質量（樹脂１ｍＬあたり３０ｍｇのプロテインＡ）による、アクリル酸濃度および様々なEDC濃度に対する、ＬＤＢＣＡ（Ａ）およびＱＳ（Ｂ）の依存性を示す。
図１５ａ）およびｂ）は、低タンパク質量（樹脂１ｍＬあたり１５ｍｇのプロテインＡ）による、アクリル酸濃度および様々なEDC濃度に対する、ＬＤＢＣＡ（Ａ）およびＱＳ（Ｂ）の依存性を示す。
【０１２２】
図１４および図１５は、アクリル酸濃度の増大に伴うリガンド密度の増大を示す。０．６５Ｍのアクリル酸から、検出されたタンパク質についての値は、低タンパク質ロード（樹脂１ｍＬあたり１５ｍｇのプロテインＡ）について約１１ｍｇ／ｍＬにおいて、高タンパク質量（樹脂１ｍＬあたり３０ｍｇのプロテインＡ）の適用について約２０ｍｇ／ｍＬにおいて、一定を保つ。同時に、０．００２５および０．００５ｇ／１０ｍＬの非常に低いEDC濃度は、同じpAAがグラフトされた粒子を用いて、著しくより低いタンパク質固定をもたらす。
【０１２３】
リガンド密度に対するアクリル酸およびEDC濃度の効果が直接的である一方で、静的結合能力は、より複雑な様式において変化する。静的能力は、［AA］の増大に伴って増大するが、リガンド密度は［AA］＝０．４２５Ｍまでのみ増大する。０．４２５Ｍより高い［AA］については、静的能力は、リガンド密度の増大にもかかわらず低下し、このことは、０．４２５Ｍの［AA］付近に最適値が存在することを示唆する。最良のカップリング条件下において、ＱＳについて約６０ｍｇ／ｍＬの値は、［AA］＝０．４２５Ｍ.において達成可能である。０．４２５Ｍを超えるアクリル酸濃度の増大は、静的結合能力の劇的な欠失をもたらす。一方、０．６５Ｍ〜０．８５Ｍの範囲においては、より少ない固定されたPrA（より低いＬＤＢＣＡ）を有する樹脂は、より高いリガンド密度を有するものよりも多くのIgGをキャプチャーすることができる。この相関は、EDC濃度により引き起こされるＬＤＢＣＡの僅かな変化について検証されるが、より明らかには、高タンパク質量（図１４）と低タンパク質量（図１５）との適用の間の明らかな差異について、検証される。
【０１２４】
本研究において得られた様々なモノマー濃度についての静的結合能力に対するリガンド密度のプロットを、図１６において示す。この図は、０．２１Ｍ、０．４２５Ｍ、０．６５Ｍおよび０．８５Ｍのアクリル酸濃度について、リガンド密度に対する静的結合能力を示す。
【０１２５】
図１６は、高いグラフト化量（アクリル酸濃度に関連して）が、高い達成可能ＬＤＢＣＡをもたらすことを説明する。０．４２５Ｍを超えるアクリル酸濃度による重合は、しかし、ＱＳの低下をもたらし、一方、固定されるプロテインＡの量は増加する。
【０１２６】
これらの結果は、大量のグラフト化pAAを有するCPG粒子への多過ぎるプロテインＡの付加は、孔の目詰まりの原因となるか、または孔系中へのIgGのための質量移動を妨害する原因となることを示している。かかる孔の目詰まりまたは孔内部におけるIgGの質量移動の妨害は、高いＬＤＢＣＡに対する純粋なCPG（１５ｍｇ／ｍＬ）の非特異的結合能力より低いＱＳ値により、さらに確認される。
【０１２７】
表３は、炭素含有率およびBCAアッセイ測定の補助により計算された、使用されたCPG粒子の特性に対するグラフト化されたpAAおよび固定されたPrAの特徴の最終的な概要を提供する。
表３：CPG上で得られたグラフトポリマーおよび固定されたプロテインＡの特徴。
【表３】
0006336996.tif 000017
【０１２８】
表３において示されるデータに基づいて、ポリ（アクリル酸）テンタクル上での網羅的なプロテインＡ固定のために、プロテインＡ分子１つあたり、平均して、約１５０個のそれぞれの単位が必要である。
【０１２９】
全体として、１０６５Åの平均孔サイズを有する粒子の場合、６３ｍｇ／ｍＬの最大ＱＳを生じるアクリル酸濃度の最適値は、０．４２５Ｍである。最適値を超えて［AA］を増大させることは、より高いリガンド密度をもたらすが、より低い静的結合能力をもたらす。アクリル酸濃度（およびしたがってグラフト化収率）、リガンド密度および静的能力との間のかかる相関は、孔の目詰まり、および限定された標的IgG分子のためのPrA分子のアクセスに起因して観察される。
【０１３０】
Ｃｅ（ＩＶ）開始pAAグラフト化の、小さい孔サイズを有するCPGへの移行
このセクションにおいて、Ｃｅ（ＩＶ）により媒介されるAAの重合の、孔サイズがより小さい粒子（CPG1000〜CPG800）への移行を、行われた実験に基づいて議論する。先に記載されるとおり、CPG1000とCPG800とは、それらの重要な性状において異なる。CPG800は、８５９Åの平均直径および４６．４ｍ2／ｍＬの表面積（CPG1000：１０６５Å、２６．６ｍ2／ｍＬ）を備えた孔を有する。粒子サイズおよびサイズ分布は同じである。
【０１３１】
より小さな孔サイズを有するCPG上でのＣｅ（ＩＶ）開始pAAグラフト化の研究についての結果を、図１７ａ）およびｂ）においてプロットし、これらは、様々なEDC濃度、ならびに１ｍＬの樹脂あたり１５ｍｇのプロテインＡによる、孔サイズが小さいCPG上での、アクリル酸濃度に依存的な、リガンド密度（Ａ）および静的結合能力（Ｂ）の依存性を示す。
【０１３２】
図１７ａ）は、研究されたカップリング条件下において、０．１Ｍ〜０．２Ｍのアクリル酸で、達成可能なLDBCAが９．０ｇ／ｍＬから１２．２ｍｇ／ｍＬに増大することを示す。０．４２５Ｍのアクリル酸により、検出された最も高いLDBCAは１０．６ｍｇ／ｍＬである。さらに、リガンド密度は、低いAA濃度において、より強くEDC濃度により影響を受ける。０．１Ｍのアクリル酸により、より高いEDCは、明らかに、より高いリガンド密度をもたらす。
【０１３３】
この研究についての検出された静的結合能力の傾向を、図１７ｂ）において示す。達成可能なＱＳは、０．２Ｍのアクリル酸において６０．５ｍｇ／ｍＬであり、０．１Ｍによるもの（４５．０ｍｇ／ｍＬまで）、および０．４２５Ｍによるもの（５１．６ｍｇ／ｍＬまで）より高い。ＱＳに対するEDC濃度の影響は、ＬＤＢＣＡに対するその影響と対立する。試験された範囲におけるEDC濃度の役割は、図１８ａ）およびｂ）において明らかに表わされる。図１８ａ）およびｂ）は、多様なEDCおよびアクリル酸濃度における、リガンド密度（Ａ）および静的結合能力（Ｂ）を示す。図１８ａ）は、ＬＤＢＣＡは、０．１Ｍのアクリル酸において適用されたEDC濃度と共に増大するが、一方、より高いAA濃度については、決定的な傾向は存在しないことを、明らかに示す。図１８ｂ）においては、０．１Ｍおよび０．２Ｍのアクリル酸についてのＱＳは、EDC濃度の増大に伴って一定して低下することが示される。０．４２５Ｍのアクリル酸においては、結果として生じるＱＳに対するEDC濃度の影響は、無視し得る程度である。
【０１３４】
１０６５Åの孔（CPG1000）と比較して、８５９Åの平均孔サイズを有するCPG（CPG800）上でのＣｅ（ＩＶ）による開始を介するAAのグラフト化は、様々なカップリング条件ならびに重合条件により、最良のクロマトグラフィー性能をもたらす。
【０１３５】
CPG800は、CPG1000よりも著しく高い表面積を提供するので、同じ重合条件下において、樹脂１ｍＬあたりより多くのグラフト化されたpAA鎖が必要とされることが予測される。この仮定は、ポリマー鎖１本あたり、より少ない反復単位が、同じ量の官能基を提供することができることを意味する。したがって、CPG800およびCPG1000について、異なるAA濃度において、同じリガンド密度および静的結合能力が達成されることは、妥当である：
−  CPG800：０．２Ｍのアクリル酸において、ＱＳ約６０ｍｇ／ｍＬ、ＢＣＡ約１１ｍｇ／ｍＬ
−  CPG1000：０．４２５Ｍのアクリル酸において、ＱＳ約５９ｍｇ／ｍＬ、ＢＣＡ約１０ｍｇ／ｍＬ
【０１３６】
さらに、異なる孔サイズ、表面積、およびしたがって配置が変更されたグラフト化ポリマーへの移行は、［AA］に関する異なる最適な重合条件、および［EDC］に関するカップリング条件をもたらす。先に記載されるとおり、このシフトは、CPG1000と比較してCPG800のより小さな孔サイズおよび増大した表面積の結果である。CPG800についての異なる最適値はまた、クロマトグラフィー媒体として用いられるグラフト化ポリマーを有する多孔質系の、低面積基質である非多孔質と比較して複雑な性質を強調する。
【０１３７】
SI AGET ATRP
本発明のさらなる目的は、プロテインＡクロマトグラフィーにおける使用のための多孔質金属酸化物粒子の表面を活性化するための、表面開始AGET ATRPの適用性である。Ｃｅ（ＩＶ）開始グラフト重合において、グラフトポリマーの性状のためのパラメーターに影響を及ぼす可能性は変動し得、アフィニティークロマトグラフィー媒体としての使用のための材料を合成するために、SI AGET ATRPを多孔質系に適用することができるか否かを見出すために、PrA固定能力に対するこれらの変数の効果を、静的結合能力およびリガンド密度の測定により決定する。
【０１３８】
このため、GMAをモノマーとして選択し、プロテインＡを用いてグラフト化したポリマーを直接的にカップリングすることができる。対照的に、アクリル酸は弱酸性のモノマーであり、ATRPのプロセスを妨害し得る。
【０１３９】
開始剤固定の効果
先に記載されるとおり、SI AGET ATRPのモデルは、重合ステップの前に、支持材料の表面上に開始剤が固定されることを必要とする。固定された開始剤分子の量は、成長する鎖の数についての、およびしたがってグラフト密度についての決定要因である。付着した開始剤の量を変化させることは、固定ステップの間に開始剤分子の濃度を変化させることにより試みられる。
【０１４０】
残念ながら、開始剤固定ステップは、正確に再現可能な結果を可能にしない。同じ条件下における同じ固定バッチからのポリマーグラフト化は、ＱＳおよびＬＤＢＣＡについての匹敵する値をもたらす一方で、これらの値は、バッチ間で著しい変動性を示す。開始剤でグラフト化されたCPGをまた、臭素含有量について試験する。
【０１４１】
元素分析により決定される臭素含有量は、TMTGEでコートされたCPGについて、５３３ｐｐｍまでの量であり、これは６．６ｎｍ２あたり１個の開始剤分子に相当し、結果として、２個の開始剤分子間で２．９ｎｍの平均距離に相当する。同一のBib固定条件は、コートされていないCPGの表面上で１３７ｐｐｍの臭素をもたらす。２個の開始剤分子間の平均距離は、５．７ｎｍに達する。
【０１４２】
重合条件の効果
理想的なSI AGET ATRPから得られたポリマー鎖は全て同じ長さであるので、および、グラフト密度は開始剤固定により固定されるので、理論的には、グラフト層の厚みまたはブラシの長さのみが、可変である。したがって、最も挑戦的な部分は、機能するSI AGET ATRPを可能にする反応系の作製において存在する。
【０１４３】
重合のための溶媒は、以下の性状を満たす必要がある：１）全ての成分−触媒、リガンド、モノマー、および少なくとも部分的に還元剤−は、可溶性である必要がある。２）その後の水性環境における処理を考慮すると、溶媒は水と混和性であるべきである；非極性の有機溶媒は、孔のアクセシビリティーを妨げるであろう。
【０１４４】
これらの側面下において、ジメチルホルムアミドおよびテトラヒドロフランが、適切な溶媒である。アスコルビン酸、ＣｕＢｒ２、GMAおよびBpyは、DMF中で十分に可溶性である。THF中では、少量のＣｕＢｒ２のみが、リガンドとしてPMDETAの補助により、可溶性となる。アスコルビン酸は、THF中では、部分的にのみ可溶性である。
【０１４５】
いずれの溶媒中で行われる重合も、リガンド密度および静的結合能力についての妥当な値をもたらした。しかし、DMFにおけるものとは対照的に、THF中での試みは、広い範囲のモノマー濃度によって著しい変化を示さなかったので、および、THFによる可溶性の問題は広範な変動を限定するので、さらなる重合はDMF中で行う。
【０１４６】
モノマー濃度を増大することは、第1に試験するべき変数の明らかかつ容易な選択肢であった。［GMA］の効果を研究するために、pGMAがグラフトされたCPGを、エポキシ含有量を決定するために滴定した。結果を図１９においてプロットする。図１９は、多様なGMA濃度によるSI AGET ATRPを介してpGMAがグラフトされたCPG上での滴定により決定されたエポキシ基の数を示す。この図は、GMA濃度の増大に伴う、CPG表面上でのエポキシ基のほぼ線形の増大を示す。
【０１４７】
さらに、＞３００μｍｏｌ／ｍＬのエポキシ量は、従来のプロテインＡクロマトグラフィー材料調製と比較して、「低分子カップリング」により取り組まれた官能基の増量を証明する。このこととは対照的に、CPGは、樹脂１ｍＬあたり約５０μｍｏｌのヒドロキシル基を提供することが知られている。
【０１４８】
このことは、Ｃｅ（ＩＶ）により媒介される重合において、総グラフト化量は、PrA固定能力に、および恐らくは静的結合能力に影響を及ぼす最も高感度な変数の一つを表わすことを意味する。現在のSI AGET ATRPについての典型的な変数は、重合時間、触媒濃度、温度およびモノマー濃度である。しかし、多様なGMA濃度におけるpGMAグラフト量の変化がエポキシ滴定により見出されることから、達成可能なリガンド密度および静的結合能力に対するGMA濃度の効果は、最も明らかである。結果を図２０ａ）およびｂ）において表わし、これらは、SI AGET ATRPを介してグラフト化されたCPG上での静的結合能力（Ａ）およびリガンド密度（Ｂ）に対するGMA濃度の影響を示す。詳しくは、図２０は、０．０３Ｍ〜０．５５Ｍの範囲のGMAについてのＱＳおよびＬＤＢＣＡを示す。リガンド密度が著しくは変化しない（試験された［GMA］の範囲について４〜６ｍｇ／ｍＬ）一方で、ＱＳは、GMA濃度の増大に伴って連続的に低下する。静的結合能力は、［GMA］＝０．０３Ｍにおける３０．５ｍｇ／ｍＬから、［GMA］＝０．５５Ｍにおける１２．８ｍｇ／ｍＬまで低下する。
【０１４９】
これらの結果は、Ｃｅ（ＩＶ）重合により得られたポリ（アクリル酸）でグラフトされたCPG上でのプロテインＡ固定についての知見（ここでは、グラフト化pAAの付加がＬＤＢＣＡにより測定されるプロテインＡ固定能力の増大をもたらし、特定の点までは、静的結合能力の増大をももたらす）と対照的である。グラフトされたpGMAの量は、リガンド密度に対して、無視し得る効果を示す。対照的に、より少ないエポキシ基を表面上に有する樹脂については、より高い値が観察された。静的結合能力については、臭素決定およびエポキシ滴定に基づいて計算して、平均して１３個までの反復単位を有するオリゴマーが生成された点において、最も高い値が検出された。
【０１５０】
このように、GMAのSI AGET ATRPを介する粒子表面上の官能基の増量は証明される。しかし、エポキシ基の増加が変わらないリガンド密度をもたらし、静的結合能力の低下すらもたらすという事実を考慮すると、これはカップリング条件についての結論には十分ではない。
【０１５１】
クロマトグラフィー性能に対するカップリング条件の効果
SI AGET ATRPを介して得られるpGMAがグラフトされたCPG上でのプロテインＡ固定についての状況に関して、Ｃｅ（ＩＶ）重合を介してpAAがグラフトされたCPGと比較して、３つの主要な差異が存在する：
１）pAAを介するタンパク質カップリングが、EDCの影響により形作られる一方で、pGMAは全ての反復単位により即時反応性のエポキシ基を提供し、これはプロテインＡの不利な配置をもたらす可能性がある。
２）pGMAは、水に不溶性である。グラフト化された鎖は、表面上で収縮するか、または、pAAの場合におけるもののように、少なくとも拡張はしない。エポキシ基の殆どが、プロテインＡ高分子分子のために到達可能とならない。
３）達成可能なグラフト密度は、通常、Ｃｅ（ＩＶ）グラフト重合によるものより、SI ATRPによるものの方が高い。
【０１５２】
これらの不等性を代償するために、カップリング条件を改善するための幾つかの試みを行った。カップリングプロテインＡ溶液を僅かにより疎水性にするために、エタノールおよびイソプロパノールを添加した。THFまたはジオキサンなどのpGMAのためのより良好な溶媒は適用しなかった。なぜならば、環境の粗雑な変化は、プロテインＡの不活化をもたらすからである。さらに、エポキシ基を、水溶液中でのプロテインＡによる還元的アミノ化のために好適なアルデヒドに変換する、プロテインＡカップリングのための完全に異なる経路（以下のスキームを参照）を行った。より親水性の高いグラフトされたポリマー鎖の中間体は、プロテインＡのためのより良好なアクセシビリティーをもたらす可能性がある。それぞれの結果を、表４において列記する。
【０１５３】
【化１４】
0006336996.tif 000018
このスキームは、エポキシ基から開始されるプロテインＡカップリングについての代替的な「還元的アミノ化」経路を示す［H. Ahmed, Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification, and Characterization, CRC Press LLC, 2004］。
【０１５４】
表４：様々なタンパク質カップリング条件により、同じバッチのpGMAグラフトCPGにおいて得られる静的結合能力およびリガンド密度についての結果。
【表４】
0006336996.tif 000019
【０１５５】
表４は、適用されるタンパク質カップリング条件についての静的結合能力についての、ほんの僅かな変化を示す。５０％エタノール中で、および１．１Ｍの硫酸ナトリウムの存在下における、プロテインＡのカップリングは、ＱＳの２９．８ｍｇ／ｍＬでの最大値をもたらす。ＬＤＢＣＡは、硫酸ナトリウムを用いた場合に、１０．５ｍｇ／ｍＬとなり、従来のカップリング手順によるものよりも、著しくより高い。
【０１５６】
これらの結果に基づいて、著しくより高い塩濃度が、強制的にタンパク質分子をポリマーにしない限り（この場合ですら、プロテインＡは、IgGキャプチャーのために十分にアクセス可能ではない）、グラフト化されたpGMAのコイルまたはブラシの内部は、カップリング反応の間にプロテインＡにとって明らかにアクセス可能ではないか、部分的にのみアクセス可能である。
【０１５７】
ＺｒＯ２系への移行
既に先に記載したように、本発明の第１の目的は、プロテインＡクロマトグラフィー適用のための、アルカリ耐性多孔質セラミック粒子を提供することである。ＺｒＯ２粒子が腐食性攻撃に関して安定であることは知られているので、ＺｒＯ２はより反応性が低く、ヒドロキシル基を殆ど有さないことは既知ではあるが、CPGの誘導体化のためにここで開示される概念をまた、多孔質ＺｒＯ２粒子についても試験する。
【０１５８】
したがって、これまでのところ、アクリル酸のＣｅ（ＩＶ）開始グラフト重合は、最良のクロマトグラフィー性能をもたらすので、この技術を、原理の証明として、ジルコニアコートされたCPGに適用する。再び、孔サイズ、孔サイズ分布、および粒子サイズは、ガラス表面とジルコニア表面とを比較する本目的のために、重要な性状である。この理由のために、先の研究において用いられたものと同じ型のCPG（CPG1000）を、ＺｒＯ２の薄層でコートする。コートされた粒子の特徴づけを、図２１において表わす。形態学的性状は、ジルコニアコーティングにより、著しくは影響を受けない。
【０１５９】
ジルコニア表面上においては、CPGと同じ形態であっても、使用可能な表面ヒドロキシル基がより少ないことから、表面活性化および重合についての同一の条件が同じクロマトグラフィー性能をもたらすとは予測されない。しかし、CPG1000と類似の様式において、ＺｒＯ２コートされたCPGを用いて、［AA］の影響を調べた。リガンド密度および静的結合能力についての結果を、図２２ａ）およびｂ）においてプロットする。これらの図は、ジルコニアコートされたCPGのリガンド密度（Ａ）および静的結合能力（Ｂ）に対するアクリル酸濃度の影響を示す。ＥＤＣ：０．０２５ｇ／１０ｍＬ、プロテインＡ：３０ｍｇ／樹脂１ｍＬ。
【０１６０】
図22は、ジルコニアコートされたCPG上でのＣｅ（ＩＶ）開始重合のリガンド密度および静的結合能力に対するアクリル酸濃度の影響を示す。ＬＤＢＣＡは、アクリル酸濃度と共に、それが１５ｍｇ／ｍＬにおいてプラトーに達するまで、増大する。静的結合能力のプロットは、０．１７ＭのAAにおける５１．３ｍｇ／ｍＬのＱＳの最大値を示す。この点から、［AA］が増大するにつれて、ＱＳは急激に低下する。この最適［AA］は、CPG1000およびCPG800の両方と比較して、より低い。
【０１６１】
最適モノマー濃度の絶対値とは別に、これら２つのプロットは、研究された両方のサイズのCPGの場合に示されるものと類似の傾向を示す。最大ＱＳ値はCPG1000のものには達しないが、上記の結果は、原則として、腐食に対して安定なプロテインＡアフィニティー媒体の合成のために、TMTGEコーティングのプロセスとその後のpAAグラフト化およびプロテインＡ固定とを、適切なＺｒＯ２ベースの多孔質系に首尾よく移行することができることを証明する。
【表５】
0006336996.tif 000020
【０１６２】
純粋なCPGからジルコニアコートされたCPGへの移行は、１つのみの固定されたEDC濃度により行ったので、カップリング条件の最適化が可能である。
【０１６３】
まとめると、ガラスからセラミック表面へのAAのＣｅ（ＩＶ）開始グラフト重合の移行は、成功した。予想外に、アルカリ耐性とされているセラミック樹脂についての達成された静的結合能力は、同じ形態を有する、低分子により活性化される市販のCPG樹脂（ProSepHC）よりもさらに高い。
【０１６４】
得られた樹脂の動的結合能力
ＱＳが一般に合成された樹脂の最大能力を表わす一方で、実質的な運用のモードにおける樹脂の性能は、動的結合能力として測定される。かかる測定は、カラム中に樹脂を充填して、それを様々なｐＨのバッファーによる典型的なランにより試験することにより行う。DBC実験的ランにおいて得られる曲線の形状もまた、考慮中の孔系の質量移動特性についての何らかの情報を提供する。本研究において得られた樹脂について、CPG800に加えて、ATRPおよびＣｅ（ＩＶ）により媒介されるpAAのグラフト化により活性化されたCPG1000、ならびにＣｅ（ＩＶ）開始を介してpAAがグラフト化されたジルコニアコートCPG1000についてのDBCを決定した。さらに、周知の標準物として、市販で入手可能なProSepHCのDBCを決定した。それぞれのDBC測定の曲線を、図２３においてプロットする。１０％ブレークスルー（ＤＢＣ１０％）における、および５０％ブレークスルー（ＤＢＣ５０％）におけるDBCについての値を、表３において提供する。
表３：本研究において用いられた活性化技術から得られた例示的な樹脂、および標準物としての市販で入手可能なProSepHCについての、DBC10%、DBC50%およびQS。
【表６】
0006336996.tif 000021
【０１６５】
図２３は、試験されたプロテインＡ樹脂についての曲線の経過を示す。バイパスからカラム−ローディング−モードへの切り替えの後で、フィードからの著しい量のIgGがカラムから現れ(break through)、それによりUV吸収が集積するまで、最適なカラムローディングの期間は、生じるプラトーの長さにより反映される。一般的法則は、プラトーが長いほど、動的結合能力が高い。プラトーの後の曲線の傾きは、どれだけ多くのIgGがその後キャプチャーされるかを示し、主に高いIgGブレークスルーについてのDBCに影響を及ぼす。
【０１６６】
異なる樹脂についてのプロットを一見すると、全ての樹脂の間の差異、ならびに、ProSepHCおよびＣｅ（ＩＶ）により開始されるpAAのグラフト化により調製された樹脂が異なる質量移動特性を有することが示される。ProSepHCが急激なブレークスルーを示す一方で、Ｃｅ（ＩＶ）により媒介される重合により製造された樹脂は、やや延長したブレークスルーを示し、このことは、孔系における変化を示唆する。ATRP処理により得られた樹脂についての曲線の形状は、ProSepHCについての結果に匹敵する。より短いローディング−プラトーのみが、ATRP処理された樹脂について予測されるより低いDBCを反映する。
【０１６７】
Ｃｅ（ＩＶ）によりグラフト化された樹脂についてのピークは、著しくより急激ではなく、プラトーの後の傾きは、明らかにより平坦である。この現象は、妨げられた質量移動に起因する。IgGはなお拡散により生じる固定されたプロテインＡに結合するが、一方で、IgG分子のうちの主要な量は、既にカラムを通過している。なぜならば、容易にアクセス可能なプロテインＡは、既に占有されているからである。通常、ＤＢＣ５０％は、ほぼＱＳの値に達し、その値は、プラトーの長さにおいて反映される。グラフト化されたCPG800の場合は、予想外に短いプラトーは、ＱＳが示すよりも著しくより低いＤＢＣ５０％をもたらす。一方では、この樹脂についての曲線は最も平坦であり、このことは、カラムが、初期のブレークスルーポイントの後長時間を経ても、なおロードしていることを意味する。
【０１６８】
表３において表わされる予想外のDBC値は、純粋なCPGから調製される樹脂については特に、第１および第５のランの間の高い変動性である。プロセスの変動性を、図２４において表わす。
【０１６９】
図２４における結果により、純粋なCPG上でのＣｅ（ＩＶ）開始を介したpAAのグラフト化から得られる樹脂は、DBC測定の最初の５回のランの間、安定でない。対照的に、ATRP処理されたCPGおよびジルコニア表面上にpAAがグラフトされたCPG、ならびに低分子活性化CPG（ProSepHC）は、行われる測定の間、安定である。
【０１７０】
遅い質量移動により引き起こされる結合能力の低下を防止するためには、流動速度の低下が、適切なツールである。試験された樹脂についての滞留時間の変化についてのローディング挙動の差異を、図２５において説明する。３分間から９分間への滞留時間の、ＤＢＣ１０％値についての変化を、表６において列記する。
【０１７１】
図２５は、ProSepHC（ａ）、ATRP処理CPG（ｂ）、PAAテンタクルを有するCPG1000（ｃ）、およびpAAテンタクルを有するZrO2コートCPG（ｄ）についての、３分間および９分間の滞留時間によるカラムのローディング挙動の比較を示す。
表６：多様な樹脂についての、３分間および９分間の滞留時間によるＤＢＣ１０％についての結果の比較。
【表７】
0006336996.tif 000022
【０１７２】
図２５ａ）および図２５ｂ）は、ProSepHC（ａ）およびATRP処理樹脂（ｂ）についての、変化した滞留時間における曲線の経過の僅かな変動のみを示している。変動性は、主に、僅かにより低いIgGフィード濃度（バイパスピークを参照）に起因する。表６におけるにＤＢＣ１０％ついてのほぼ一貫した値は、これら２つの樹脂に対する滞留時間の影響の不在を確認する。
【０１７３】
対照的に、図２５ｃ）における、および図２５ｄ）における曲線は、IgGが現れる前により長い滞留時間を有する、著しくより長いプラトーを示している。この観察は、表６において列記されるＤＢＣ１０％についてのそれぞれの値において反映される。
【０１７４】
まとめると、進行中のDBC研究は、pGMAのSI AGET ATRPを介するCPGの表面活性化は、表面積に限定され、低分子による表面活性化に匹敵する、タンパク質固定をもたらすことを示す。この事実は、DBC測定において妨げられない質量移動をもたらし、およびしたがって、急激なシグナルをもたらす。対照的に、Ｃｅ（ＩＶ）により開始されるpAAのグラフト化により活性化されたCPGの高い達成可能静的結合能力は、IgGキャプチャーのための質量移動の妨害を伴うことが、進行中のDBC研究により証明された。ProSepHCとポリマーがグラフト化されたCPGとの間のこの差異は、２つの樹脂の質量移動特性における差異を示唆する：ProSepHCの均一な孔構造に起因して、長い滞留時間および短い滞留時間において測定されたDBCの間には、２つの異なる滞留時間において著しい差異を示すポリマーがグラフト化されたCPGと比較して、著しい差異は存在しない。
【０１７５】
本発明の特別な利点は、最初に利用可能なヒドロキシル基を始めとする、多孔質セラミックベースの粒子の表面において利用可能な官能基の増量である。セリウム（ＩＶ）塩が、重合およびSI AGET ATRPを開始した。アクリル酸およびメタクリル酸グリシジルのモノマーとしての使用は、その後のタンパク質固定のために適切な官能基を提供する。
【０１７６】
ここで開示される両方の重合技術は、官能基増量の要求を満たす。SI AGET ATRPは、モノマー濃度に対するその線形依存において示されるように、グラフト重合を介するエポキシ基の量に対する容易な制御までもを可能にする。
しかし、グラフト化された粒子の使用のためには、表面上のグラフトポリマー鎖の実際の生成よりも重要であるのは、PrA固定のためのそれらの有用性、および、IgG分子の付着のためのプロテインＡリガンドのアクセシビリティーである。
プロテインＡクロマトグラフィーのための支持粒子の活性化のための開示される重合技術の好適性は、少なくとも適用されるモノマーについて、および多様なプロセス条件の範囲において、著しく異なる。
【０１７７】
Ｃｅ（ＩＶ）により開始されるpAAのグラフト化、およびその後のカップリング剤としてのカルボジイミド（EDC）の補助によるPrAカップリングは、高い利用可能なリガンド密度および静的結合能力をもたらす。最初の官能基増量のアイディアにより、特定の点までは、達成可能なＬＤＢＣＡおよびＱＳは、グラフト化されたポリマーの量に比例する。この点から、ＬＤＢＣＡは停滞し、ＱＳはさらに低下する。この現象は、限定された利用可能な孔内の空間に起因する。グラフト化されたpAAの量に依存せず、リガンド密度および結果として生じる静的結合能力は、カップリング条件、特にEDC濃度により、高感度に影響を受ける。
【０１７８】
SI AGET ATRPを介するGMAのグラフト重合は、妥当な量の反応性エポキシ基をもたらし（滴定結果により示されるように）、これはポリマー鎖の成長に伴って増大する。
【０１７９】
このようにして、本発明により、必要とされるヒドロキシル基を提供する脂肪族コーティングを有するコントロールドポアガラスにおいて、２つの異なるgrafting-from重合技術を行った。
【０１８０】
両方の技術、メタクリル酸グリシジルのSI AGET ATRP、およびモノマーとしてアクリル酸を用いるセリウム（ＩＶ）塩開始グラフト重合は、その後のプロテインＡクロマトグラフィー適用のためのプロテインＡ固定を可能にする。
【０１８１】
基本的には、グラフトpAAが多いほど、より多くのプロテインＡの固定が可能であるが、結果として生じるIgGキャプチャーのための能力の増大は限定され、孔の目詰まりを回避しなければならない。パラメーターの変動の範囲において、アクリル酸濃度が、グラフト化量のための影響を及ぼす主要なパラメーターとして同定される。リガンド密度および静的結合能力もまた、カップリングプロセスにおけるEDC濃度により強力に影響を受ける。これらの影響と比較して、重合温度、重合時間（６時間の後）および開始剤濃度などのパラメーターは、著しい影響を有しない。
【０１８２】
SI AGET ATRPを介するCPG上におけるpGMAのグラフト化のために、鎖の成長を、結果として生じる材料のエポキシ滴定によりモニタリングした。利用可能なエポキシ基の量は、適用されたモノマー濃度と共に直線的に増大した。リガンド密度が広い範囲のモノマー濃度に対して同様である一方で、静的結合能力は、エポキシ基の増大に伴って、むしろ減少した。注意すべきことに、達成可能なクロマトグラフィー性能のレベルは、Ｃｅ（ＩＶ）開始を介してpAAでグラフト化されたCPGと比較して、より低い。
【０１８３】
タンパク質カップリングの手段は、ポリマー鎖の立体構造、ならびに同時に活性化されるハンドルの数により影響を受ける。鎖の立体構造が主にカップリングプロセスの間の化学的環境（溶媒、ｐＨ、塩濃度）により決定される一方で、pGMAにおける活性化されるハンドルの数は、全ての反復単位が１つのエポキシ基を提供するので、予め決定される。pAAについては、EDC濃度は、決定的である。
【０１８４】
実験は、pGMAテンタクルは水溶液中では表面上で収縮しており、したがってグラフトされた層の表面のみが、プロテインＡのアミン基により利用可能であることを示した。pAA鎖は、対照的に、水中でのそれらの高い可溶性およびそれらのポリ電解質的特徴に起因して伸展しており、これは、垂直方向における全てのポリマーセグメントの高いアクセシビリティーをもたらす。同時に活性化される官能基が多過ぎることは、明らかに、プロテインＡの多点付着により引き起こされる、ポリマー鎖間の架橋を誘導し、結果的に、IgGのための固定されたプロテインＡ分子のアクセシビリティーがより少なくなる。
【０１８５】
アクリル酸のＣｅ（ＩＶ）開始グラフト重合を介する表面活性化により、非常に効率的なプロテインＡクロマトグラフィー材料の生成のための手段を見出した。樹脂１ｍＬあたりIgGが６３ｍｇという達成可能な静的結合能力は、同じ支持材料を用いる、従来の「小分子」活性化により修飾される市販製品（ProSepHC）についての３５ｍｇ／ｍＬと比較して、はるかに高い。
【０１８６】
開発されたプロセスの頑健性、および水溶液を使用する可能性のために、開示される手順は、ATRP系と比較して、より経済的であり、環境に優しい。
Ｃｅ（ＩＶ）グラフト重合による高い利用可能な静的結合能力に起因して、原理は、ジルコニアコートされたCPGに移行され、これは、アルカリ耐性のセラミックベースの粒子をもたらす。
【０１８７】
まとめると、Ｃｅ（ＩＶ）により媒介されるアクリル酸の重合を介する表面活性化により、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂の生成のための非常に有利な手順を見出した。本研究において行われたCPGに対する適用および異なる系への移行の広範な研究は、当該プロセスが、腐食に対して安定なセラミックベースの支持材料のための活性化のために、特に好適であることを示す。
【０１８８】
本明細書は、当業者が本発明を包括的に適用および実施することを可能にする。さらなる所見がなくとも、したがって、当業者が上記の説明を最も広い範囲において利用することができることが想定される。
何か不明であった場合は、言うまでもなく、引用される刊行物および特許文献を参照すべきである。これらの文書は、本明細書の開示の内容の一部として同様にみなされる。
【０１８９】
よりよい理解のために、および本発明を説明するために、以下に、本発明の保護の範囲内である例が提供される。これらの例はまた、可能なバリアントを説明するためにも役立つ。しかし、記載される本発明の原理の一般的な有効性に起因して、例は、本願の保護の範囲をこれらのみに減少させるために適するものではない。
【０１９０】
当業者にはさらに言うまでもなく、提供される例において、およびまた明細書の残りにおいて、組成物中に存在する成分量は、常に、重量またはモル％により、全体としての組成物に基づいて１００％の合計までのみ増加し、仮に示されるパーセントの範囲からより高い値が生じ得るとしても、これを超過することはできない。他に示されない限り、％データは、重量またはモル％による％であるものと考えられ、ただし、例えば溶媒が特定の容積比における混合物として用いられる溶離液などの、容積データにおいて示される比を例外とする。
例および明細書において、ならびに請求の範囲において提供される温度は、常に℃におけるものである。
【０１９１】
例
一般的手順
表面修飾
TMTGEコーティング
一般的なアプローチのために、５ｍＬのCPG（約２２０μｍｏｌの表面ヒドロキシル基）を、フリットを備えた２０ｍＬのカラム中で測定する。この目的のために、CPGを純水中でスラリー化して、カラム中で沈降させる。容積を決定する前に、カラムをタップする必要がある。なぜならば、タッピングが、CPGのさらなる強化をもたらし、それにより、真の容積の測定をもたらすからである。測定されたCPGを、１０ｍＬの５％硝酸と共に２０ｍＬの反応バイアルに移し、スラリーをハイブリダイザーにおいて２．５時間８０℃において回転させる。その後、粒子を水で数回、洗浄水のｐＨが中性になるまで洗浄する。
【０１９２】
TMTGEコーティング自体もまた、２０ｍＬの反応バイアルにおいて行う。５ｍＬのCPGに、２．５ｍＬのTMTGE（９．６ｍｍｏｌ）および２．５ｍＬのDMFを添加する。反応混合物を、８０℃まで４時間にわたり加熱する。コートされた粒子を、DMFで３回および水で３回洗浄する。クエンチのために、０．５ＭのＮａＣｌを含む０．２ＭのＮａＨＣＯ３中１０ｍＬの１０％チオグリセロール溶液を、反応バイアル中の粒子に添加する。クエンチプロセスを一晩行う。翌日、CPG粒子を、水で５回洗浄し、最後に、それらを次の反応ステップにおいて直接的に用いるか、または２０％エタノール中で貯蔵する。
直接的なグラフト化のために、CPGは、単に、５％硝酸により８０℃で２．５時間処理して、反応の前に水で洗浄する。
【０１９３】
例１
セリウム（ＩＶ）開始グラフト重合
Ｃｅ（ＩＶ）開始グラフト重合は、一般に以下のように進行する。５ｍＬの前処理したCPG（TMTGE処理を行うか、または行わない）のために、５ｍＬのアクリル酸水溶液（０．１８Ｍ〜１．７Ｍ）および５ｍＬの硝酸セリウムアンモニウム水溶液（０．０１Ｍ〜０．２Ｍ）を、調製する−各溶液は、０．０５ｍＬの６５％硝酸を含む。水で洗浄した後で、濡れたフィルターケーキを、隔壁を備えた２０ｍＬの反応バイアルに移す。両方の溶液を添加した後、反応混合物をホモジェナイズし、窒素でパージする。重合のために、反応バイアルをハイブリダイザーにおいて４０℃〜６０℃において６時間〜２２時間回転させる。その後、グラフト化された粒子を、多孔質ポリマー粒子上でのCAN開始グラフト重合のための特許プロトコルに基づく大規模な洗浄シークエンスに暴露する［６３］。洗浄手順は、フリットを備えた２０ｍＬのカラム中で行う。全てのステップについて、CPG粒子を再スラリー化する。シークエンスは、以下のとおりである：
−  ７×水
−  １０×１Ｍの硫酸（０．２Ｍのアスコルビン酸を含有する）
−  ５×水
−  ２×１０ｍＭのPBS溶液
−  ２×水
残りのセリウム塩および遊離のポリマーを取り除いた後、得られたグラフト化ビーズを、プロテインＡカップリングのために用いるか、または２０％エタノール中で貯蔵する。
【０１９４】
例２
CPG表面上でのα−ブロモ臭化イソブチリル（Bib）の固定
CPG粒子を、上記のとおり、硝酸のみを用いて調製するか、またはTMTGEでコートする。固定のために、１００ｍＬの前処理されたCPGを、60℃で96時間、真空下において、残りの水分が完全に取り除かれたことを確認するために丸底フラスコ中で乾燥させる。丸底フラスコを窒素でパージし、隔壁で密封する。無水THF（１８０ｍＬ）およびトリエチルアミン（１４ｍＬ、１００．４ｍｍｏｌ）を、シリンジを用いて丸底フラスコに移す。懸濁液を０℃まで冷却し、氷槽においてゆっくりと振盪しながら、１０ｍＬのBib（８０．９ｍｍｏｌ）を一滴ずつ、１０分間の間に添加する。Bibの添加の後で、丸底フラスコを、なお氷槽においてさらに１０分間振盪する。次いで、反応混合物をオービタルシェイカーに置き、ここでそれを室温で一晩、穏和に振盪する。懸濁液は、初めの３０分間の間に褐色に変化する。その後、固定されたATRP開始剤を有する粒子を、洗浄溶媒の上清が無色であり続けるようになるまで、THFおよび水で交互に徹底的に洗浄する。得られた粒子を、冷蔵庫でTHF中で貯蔵する。
【０１９５】
例３
SI AGET ATRP
SI AGET ATRPを介するCPGの典型的な表面活性化は、以下のように進行する。第１に、触媒系をストック溶液において調製する。この目的のために、４６．８ｍｇのＣｕＢｒ２（０．２１ｍｍｏｌ）および１６４．２ｍｇのBpy（１．０５ｍｍｏｌ）を、５０ｍＬのDMF中で溶解し、５分間にわたり超音波処理する。その後、５ｍＬの固定された開始剤を有するCPGを、フリットを備えた２０ｍＬのカラム中で測定し、DMFで２回洗浄する。CPG（５ｍＬ）、１ｍＬの開始剤溶液（４．２μｍｏｌのＣｕＢｒ２）、７．５ｍＬのDMF、および０．５３ｍＬのGMA（４．０ｍｍｏｌ）を、隔壁を備えた２０ｍＬの反応バイアルに移し、混合物を窒素で５分間パージする。実際の重合の開始は、シリンジで、５０ｍｇのアスコルビン酸（０．２８ｍｍｏｌ）を含む１ｍＬのDMFを添加することの結果として起こる。反応混合物は、初めの５分間の間に、ターコイズから褐色に変化する。反応バイアルを、ハイブリダイザーにおいて２２時間にわたり３０℃でスピンする。重合の後で、粒子を、遊離のポリマーを取り除くために、DMF中で最低５回、水で３回、洗浄および再スラリー化して、その後、それらをPrAカップリングのために用いるか、２０％エタノール中で貯蔵する。
【０１９６】
タンパク質カップリング
例４
ポリ（アクリル酸）コートされた樹脂の使用
ポリ（アクリル酸）グラフトで修飾されたCPG粒子（５ｍＬ）を、フリットを備えた２０ｍＬのカラム中で測定し、０．１ＭのＮａＨＣＯ３水溶液で３回洗浄する。次いで、粒子を２０ｍＬの反応バイアルに移し、０．１ｇのEDC（０．５２ｍｍｏｌ）を含む、０．１ＭのＮａＨＣＯ３中のプロテインＡ溶液（１５ｍｇ／ｍＬ）１０ｍＬの添加により流す。プロテインＡカップリングは、ハイブリダイザーにおいて３７℃で２．５時間行う。その後、粒子を、０．１ＭのＮａＨＣＯ３で３回洗浄して、付着しなかったプロテインＡを取り除く。得られた修飾CPGを、０．１ＭのＮａＨＣＯ３中の３％エタノールアミン溶液中で、室温で一晩スピンする。翌日、試料を水で３回洗浄する。
【０１９７】
例５
ポリ（メタクリル酸グリシジル）コートされた樹脂の使用
ポリ（メタクリル酸グリシジル）グラフトにより修飾された５ｍＬのCPGを、フリットを備えた２０ｍＬのカラム中で測定し、０．１ＭのＮａＨＣＯ３水溶液で３回、コンディショニングする。粒子を、次いで、２０ｍＬの反応バイアルに移し、１０ｍＬの、０．１ＭのＮａＨＣＯ３中のプロテインＡ溶液（１５ｍｇ／ｍＬ）を添加する。プロテインＡカップリングは、ハイブリダイザーにおいて３７℃で２．５時間行う。その後、粒子を、０．１ＭのＮａＨＣＯ３で３回洗浄して、付着しなかったプロテインＡを取り除く。残りのエポキシ基を、０．５ＭのＮａＣｌを含む、０．２ＭのＮａＨＣＯ３中の１０ｍＬの１０％チオールグリセロール溶液による室温での一晩の処理により、クエンチする。粒子を、０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．２ＭのTRIS、および０．０５Ｍの酢酸で交互に、そして最後に０．１ＭのＮａＨＣＯ３でさらに洗浄する。
【０１９８】
クロマトグラフィー性能
動的結合能力（DBC）
充填されたカラムのアフィニティークロマトグラフィーにおける性能を、特徴づけのための動的結合能力（DBC）を用いて、一般的に決定する。DBCは、定常注入流により、出口において規定のパーセンテージのフィードIgG濃度に達するまで（典型的には１０％）、カラム中で付着することができる量のIgGを提供する。それは、通常、カラムの容積ＶＣに対して正規化され、以下の式により表わすことができる。
【化１５】
0006336996.tif 000023
【０１９９】
DBCは、基本的に、静的結合能力ＱＳとしても言及される平衡結合能力に依存するが、移動相分散効果および溶質の質量移動耐性などの分散的要因によって影響を受ける。したがって、静的結合能力は、系の熱力学を反映し、固定相をIgG付着の理論上の最大能力に関して特徴づけるために用いることができる。まとめると、多数の樹脂の性状が、タンパク質クロマトグラフィーカラムの性能の原因である。
【０２００】
それにもかかわらず、ポリマーグラフト多孔質セラミックのプロテインＡクロマトグラフィーにおける大規模適用のためには、DBCが重要な指標である。新たに生成された固定相について、DBCは以下のとおり決定される。
図２６は、DBC測定における機器の組み立てについてのフロースキームを模式的に示す。
【０２０１】
DBC測定は、Aektaクロマトグラフィー系により行い、フロースキームを図２６において模式的に現す。現在の目的のために、クロマトグラフィーカラムはそれぞれの樹脂で充填されるが、一方で、正確なカラムの容積を知る必要がある。測定のために、充填されたカラムを、クロマトグラフィー系にインストールする。調製ステップにおいて、系全体を、ローディングバッファーでフラッシュして、化学的環境をIgGフィードの条件と確実に等しくする。その後、入口をIgGフィードに切り替え、一方で、カラムをはじめはスキップして、バイパスのみを用いる。このセットアップにより、ＵＶ検出を介したフィードのIgG濃度の内部決定が可能となり、さらに、カラムの前のローディングバッファーのチューブの容積が最少化される。IgG濃度についてのシグナルをＵＶ検出器によりモニタリングした後、フィードを、カラムを通して実際のDBC測定へと向ける。例示的な結果として生じたクロマトグラムを図２７において示す。
【０２０２】
図２７は、市販で利用可能なProSepHCについてのDBC測定についての典型的なクロマトグラムを示す。バイパス切り替えにより生じる最初のシグナルが、１００％IgGブレークスルーについてのＵＶ吸収を決定する。弁がバイパスの位置からカラムローディングの位置に切り替わった後、ＵＶシグナルが特定の量の「非結合IgG」を反映する値（DBC決定についての０％点）に達するまで、それは約１カラムの容積を必要とする。その後、カラムにIgGをロードする。IgGが注入流によりカラムに入る間、ＵＶシグナルの無視し得る傾きにより反映される。全ての容易にアクセス可能なプロテインＡのスポットが占有されるブレークスルーポイントから、検出されるIgGの量は、非常に迅速に増大する。IgGブレークスルーの特定のパーセンテージまでにカラムを通過したフィード容積およびIgGフィード濃度は既知であるので、ＤＢＣＸ％は、上記の対応する式により計算可能である。
【０２０３】
リガンド密度LDBCA（BCAアッセイ）
タンパク質濃度の決定のためのビシンコニン酸（BCA）アッセイは、P.K. Smithらにより1985年に紹介されている。全てのタンパク質が固定されること、および樹脂容積が既知であることを仮定すると、それを、プロテインＡクロマトグラフィー媒体のリガンド密度の測定のために用いることができる。BCAアッセイの原理は、ビシンコニン酸を用いるビウレット反応（以下のスキームを参照）による、タンパク質の存在下におけるＣｕ（ＩＩ）からのＣｕ（Ｉ）錯体の形成に基づく。この深紫色の錯体は、５６２ｎｍにおいて吸光度の最大値を示し、したがって、濃度は、ＵＶ分光計を用いて定量することができる。タンパク質間で感度の変動が存在するので、全ての測定について、それぞれのタンパク質による標準曲線が必要とされる。リガンド密度は、樹脂１ｍＬあたりのプロテインＡのｍｇ数において特定される。
【化１６】
0006336996.tif 000024
BCAアッセイにおけるＣｕ（Ｉ）とビシンコニン酸との錯体化
【０２０４】
例６
本研究において、リガンド密度測定は、以下のように行われる。１ｍＬの樹脂を、フリットを備えた５ｍＬのカラム中で、それを気泡を避けながらタッピングすることにより、正確に計量する。濡れたフィルターケーキを９ｍＬの水で希釈し、分散をスタラーバーでホモジェナイズし、５ｍＬの試験管１つ毎に１２５μＬずつ、３回移す。次いで、３７５μＬの水を添加する。標準曲線のために、以下の表に従って、試験管をプロテインＡ標準溶液（１ｍｇ／ｍＬ）で満たす：
【表８】
0006336996.tif 000025
【０２０５】
各試験管に、４ｍＬのBCAアッセイ溶液（１：５０；Pierce（登録商標）BCAタンパク質アッセイ、試薬Ａ：試薬Ｂ）を添加し、キャップをした試験管を、４時間にわたり室温で回転させる。粒子が沈降した後、各上清の５６２ｎｍにおける吸光度を、水をブランクとして測定し、一方、プロテインＡの量は、標準曲線の補助により計算する。よりよい正確性のために、３回の測定の平均を結果のために用いる。
【０２０６】
静的結合能力ＱＳ
修飾された媒体の容積あたりのプロテインＡの量がCAアッセイにより決定される一方で、静的結合能力の測定は、媒体がキャプチャーすることができるIgGの量を提供する。静的結合能力は、必ずしもリガンド密度と共に直線的に増大する必要はない。分子の配向および立体的アクセシビリティーは、重要な要因であり、したがって、両方の値の知見が、表面修飾後の孔構造のトポロジーおよび性質のアイディアを提供する。高いＬＤＢＣＡにおける低いＱＳがPrAアクセシビリティーの欠如を暗示する一方で、その反対は、非特異的結合についての指標である。
ＱＳ測定の原理は、以下のとおりである。緩衝化されたIgG溶液（フィード）を、規定容積の修飾樹脂に添加する。表面上の利用可能なPrAの消耗に到達すると、フィードのIgG濃度から上清のIgG濃度を減算したものが、固定相の容積あたりのキャプチャーされたIgGの量であり、これが静的結合能力ＱＳである。IgG濃度は、通常は４時間後の、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収により決定する。
【化１７】
0006336996.tif 000026
【０２０７】
本研究における測定のために、１ｍＬの樹脂を正確に計量し、水で１：１０似希釈する（ＬＤＢＣＡ測定を参照）。分散をスタラーバーでホモジェナイズして、１６ｍＬの試験管中に１ｍＬずつ３回移す。全てのチューブ、および正確なIgGフィード濃度の決定のためにさらに１つのブランクの試験管を、IgGフィード溶液（５ｍＭのEDTAを含むPBSバッファー中１ｍｇ／ｍＬ）で満たす。試験管にキャップをして、４時間にわたり室温で回転させる。粒子が沈降した後、各上清の２８０ｎｍにおける消光率Ｅ２８０ｎｍを、ブランクとして５ｍＭのEDTAを含むPBSバッファーで測定する。上清中のIgG
の絶対濃度ｃＩｇＧは、Beer-Lambertの法則を介して、以下のとおり計算する：
【化１８】
0006336996.tif 000027
IgG濃度の決定のために変換された：
【化１９】
0006336996.tif 000028
結果のよりよい正確性のために、３回の測定の平均を用いる。
【０２０８】
ＱＳについて、ならびにＬＤＢＣＡについての全ての測定は、試料の一つとしてのPro Sep vA High Capacity（ProSepHC）のＱＳおよびＬＤＢＣＡの決定により検証される。ProSepHCは、同じ支持材料をベースとした市販の利用可能なプロテインＡ樹脂であり、本研究において用いられるが、低分子固定技術により修飾される。両方の特徴付けの方法の正確性は、何回かの測定の繰り返しにより、およびブランクCPGのＱＳおよびＬＤＢＣＡの決定により、さらに証明される。
【０２０９】
化学的特性
エポキシ滴定
エポキシ滴定は、文献のプロトコルに基づいて行う［８１］。SI AGET ATRPの直後に、１ｍＬのDMFで洗浄した粒子を正確に測定して、５ｍＬの１，４−ジオキサンで洗浄する。pGMAグラフトCPGを、２０ｍＬの反応バイアルに移し、１０ｍＬの、１，４−ジオキサン中約０．２ＭのＨＣｌを添加する。混合物を５時間にわたり強く振盪し、次いで、残りの酸を、フェノールフタレインを指示薬として用いて、エタノール中０．０５ＭのＮａＯＨで滴定する。ブランクCPGを用いて同じ手順を行い、それにより、必要とされるＮａＯＨの差異が、pGMAグラフトCPG１ｍＬあたりのエポキシ基の量を意味する。
【０２１０】
元素分析
炭素含有率（Galbraith Labs, Inc., Knoxville, TN）：
LECO炭素／硫黄決定装置は、燃焼および非分散性赤外線検出により、広範な有機および無機材料中の炭素および硫黄を測定するために設計される。試料を、１４５０±５０℃において、純粋な酸素の大気中で、Thermoliteを燃焼補助剤として用いて燃焼させる。
分析物：炭素    範囲：１．７〜０．０５％
【０２１１】
臭素含有量（Galbraith Labs, Inc. , Knoxville, TN）：
試料を、燃焼カップ中に計り入れ、鉱油を燃焼補助剤として加える。臭素（Ｂｒ）の決定のために、１％過酸化水素溶液をボンベ中に加える。試料およびカップを、好適な吸収溶液と共に、Parr酸素燃焼ボンベ中に密封する。ボンベを酸素でパージして、次いで、25〜30atmの酸素圧まで加圧し、発火させる。ボンベの含有物をよく混合し、その後のイオンクロマトグラフィーのためにビーカーに移す。
分析物：臭素    範囲：ｐｐｍ〜％
【０２１２】
プロテインＡアフィニティー媒体の合成のための多孔質ビーズからのＣｅ（ＩＶ）開始グラフト化：
例７
CPGからのＣｅ（ＩＶ）開始グラフト化：コートされていないCPGおよびトリメチロールプロパントリグリシジルエーテル（TMTGE）コートされたCPGの比較（表面活性化ステップ）。
ポリ（アクリル酸）（pAA）のＣｅ（ＩＶ）（CAN）開始グラフト化を、コートされていないCPGおよびTMTGE-コートされたCPGの両方において試みる。
【０２１３】
CPGは、初めに、「コートされた」および「コートされていない」試料の両方について、硝酸で処理する。硝酸洗浄の後、「コートされていない」CPGを直接的にpAAでグラフト化する一方で、「コートされた」CPGは、Ｃｅ（ＩＶ）開始のために好適なジオール基を提供するために、初めにTMTGEでコートし、残りのエポキシ基をチオグリセロールでクエンチする。
【０２１４】
以下の図２８および２９は、最終的な樹脂の静的結合能力（Ｑｓ）およびリガンド密度（ＬＤＢＣＡ）に対するTMTGEコーティングの効果を、それぞれアクリル酸およびＣｅ（ＩＶ）濃度の関数として示す。
【０２１５】
図２８ａ）、２８ｂ）、２９ａ）および２９ｂにおいて示すとおり、グラフト化効率、および結果としてＱｓおよびＬＤＢＣＡを改善するために、CPGをTMTGEでコートすることの明らかな利点が存在する。また、コートされていないCPGを用いて合成された樹脂のＱＳおよびＬＤＢＣＡ値は、コートされたCPGと比較して低いにもかかわらず、これらの値はなお、素のCPGにおいて観察されるＱＳおよびＬＤＢＣＡより著しく高いことに、注意すべきである。この観察は、未処理のCPGを用いても、Ｃｅ（ＩＶ）により媒介される重合が、たとえ不十分であったとしても、成功することを示唆する。
【０２１６】
例８
PrAアフィニティー樹脂の合成のためのＴｉＯ２／ＺｒＯ２コートされたCPGからのＣｅ（ＩＶ）グラフト化。
ＺｒＯ２コートされたCPGを、CPGと類似の様式において処理する。第１に、Ｃｅ（ＩＶ）による開始のための好適なジオール基を付与するために、ＺｒＯ２コートされたCPGをTMTGEでコートし、残りのエポキシ基をチオグリセロールでクエンチする。次いで、Ｃｅ（ＩＶ）により開始されるポリマーグラフト化を、アクリル酸を用いて行い、CPGのものと類似の様式において、PrAをpAAグラフトにカップリングして、PrAアフィニティー媒体を形成させる。
図３０は、Ｃｅ（ＩＶ）グラフト化法によりＺｒＯ２コートされたCPGから合成されたPrAアフィニティー媒体のＱｓおよびＬＤＢＣＡに対するアクリル酸濃度の効果を示す。
【０２１７】
リガンド密度は、それが１５ｍｇ／ｍＬにおいてプラトーレベルに達するまで、アクリル酸濃度と共に増大することが観察される。Ｑｓのプロットは、０．１７ＭのAAにおける５１．３ｍｇ／ｍＬのＱｓの最大値を示す。この点から、Ｑｓは、［AA］が増大するにつれて、急速に低下する。ＺｒＯ２コートされたCPGを用いて得られる最大のＱｓおよびＬＤＢＣＡは、CPGのものに匹敵する。このプロットは、腐食に対して安定なPrAアフィニティー媒体の合成の可能性のために、TMTGEコーティングと、その後のpAAグラフトおよびPrA固定のプロセスを、適切なＺｒＯ２ベースの多孔質系に首尾よく移行することができることを証明する。
【０２１８】
以下の図３１は、ＺｒＯ２コートCPGベースのPrA媒体についての動的結合能力（DBC）測定のトレースを示す。この測定に基づいて、前記材料のDBCは、１０％ブレークスルーおよび３分間の滞留時間において２９．１ｍｇ／ｍＬであることを見出した。
【０２１９】
例９
PrAアフィニティー媒体の合成のためのポリマー性多孔質（Eshmuno（登録商標））ビーズからのＣｅ（ＩＶ）グラフト化。
ポリマー性多孔質ビーズを、pAAでグラフト化し、pAAグラフトにプロテインＡをカップリングして、PrAアフィニティー媒体を形成させた。
【０２２０】
Eshmuno（登録商標）ビーズについては、表面はTMTGEで処理する必要がない。Ｃｅ（ＩＶ）開始グラフト化は、以下に簡単に記載するように、如何なる前処理／活性化ステップもなしで、ビーズから直接的に行う：
１）Eshmuno（登録商標）ビーズ（５ｍｌ）を、Ｃｅ（ＩＶ）、６５％硝酸および既知濃度のアクリル酸を含む容積と混合し、pAAをビーズにグラフト化するために、ハイブリダイザーにおいて４０℃で２２時間混合する。
２）ビーズを、脱イオン水、アスコルビン酸を含む硫酸水溶液、水、リン酸バッファー、および最後に水で洗浄する。
３）プロテインＡカップリングのために、pAAがグラフトされたビーズを、既知量の活性化剤（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸（EDC））を含む好適なバッファー中のプロテインＡ溶液と混合する。
４）最後に、ビーズをエタノールアミンでクエンチして、任意の残留する反応性基を取り除く。
【０２２１】
図３２は、Ｃｅ（ＩＶ）開始グラフト化プロセスを用いることによりEshmuno（登録商標）ビーズを用いて合成された代表的なプロテインＡアフィニティー媒体のＱｓおよびＬＤＢＣＡを示す。しかし、ポリマー性多孔質粒子により、９．６ｍｇ／ｍＬもの高さのＬＤＢＣＡが達成された。
【０２２２】
例１０
pAAグラフトCPGビーズの静的イオン交換能力
１．pAAがグラフトされたCPGビーズを、２０時間にわたり、［AA］＝０．４５Ｍおよび［Ｃｅ（ＩＶ）］＝０．０３Ｍにおいて、４０℃で、TMTGE-コートされたCPGビーズから重合を行うことにより合成する。
２．５０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび４０ｍＭの塩化ナトリウムバッファーを含む、ｐＨ＝４．５および６．５ｍＳ／ｃｍの伝導率における、ローディングバッファーを調製する。
３．ビーズを、初めに５回、１回ごとに脱イオン水およびローディングバッファーで洗浄する。IgGおよびリゾチームの溶液を、ローディングバッファー中で５ｍｇ／ｍＬの濃度において調製する。
４．各測定について、１ｍＬのpAAグラフトCPGビーズを測定する。
５．測定されたビーズを、４０ｍＬのIgGおよびリゾチーム溶液中で懸濁し、１６時間室温でゆっくりと回転させる。
６．１６時間のインキュベーションの後で、ビーズを沈降させ、上清を測定のために用いる。
７．上清（ＣＳ）および出発溶液（ＣＩ）中のIgGおよびリゾチームの濃度を、ＵＶ分光計を用いて、２８０ｎｍの波長において測定する。
８．以下の式を用いてビーズのイオン交換能力を計算する。
【化２０】
0006336996.tif 000029
pAAグラフトビーズの静的能力は、IgGおよびリゾチームについてそれぞれ５６±２ｍｇ／ｍＬおよび４５±２ｍｇ／ｍＬであることが見出される。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
図のリスト
【図１】図１：コントロールドポアガラス（CPG）粒子および孔構造の走査型電子顕微鏡像。
【図２】図２：図２は、好適なキャリアの表面上でのプロテインＡとヒドロキシル基との固定反応を模式的に示す。
【図３ａｂ】図３ａ）およびｂ）は、同一のカップリング条件における反応時間および温度に対するＬＤＢＣＡの依存性を示す［８０℃での反応時間（ａ）の、および４時間の反応時間の反応温度（ｂ）の関数としての、TMTGEでコートされた、プロテインＡがカップリングされたCPGのLDBCA］。
【図４ａｂ】図４ａ）およびｂ）は、最終的な樹脂の静的結合能力およびリガンド密度に対するTMTGEコーティングの効果を、それぞれ様々な濃度のAAおよびCANにおいて示す。
【０２２４】
【図５ａｂ】図５ａ）およびｂ）は、４０℃での、０．１５Ｍのアクリル酸における、様々な開始剤濃度による、コートされた試料およびコートされていない試料の静的結合能力（ａ）およびリガンド密度（ｂ）を示す。
【図６】図６は、０．０２５Ｍ、０．１Ｍおよび０．２７Ｍの異なるモノマー濃度によるpGMAグラフトCPGについてのＱＳおよびＬＤＢＣＡについての重合結果を示す；純粋なCPGおよびProsepHCと比較する。
【図７】図７は、コートされていないCPG上でのアクリル酸の重合において、様々な重合期間について入手したリガンド密度および静的能力を示す。
【０２２５】
【図８】図８は、２つの異なるアクリル酸濃度による、重合温度に依存的な、入手したリガンド密度（ａ）および静的能力（ｂ）を示す。
【図９】図９は、多様なアクリル酸およびEDC濃度による、CAN濃度に依存的なリガンド密度および静的能力を示す。
【図１０】図１０は、様々なアクリル酸濃度についての、グラフト化されたCPGの炭素含有率を示す。
【０２２６】
【図１１】図１１は、アクリル酸濃度に依存的なリガンド密度（Ａ）および静的結合能力（Ｂ）を示す。
【図１２ａｂ】図１２ａ）およびｂ）は、多様なEDC濃度および２つの異なるプロテインＡ量；１５ｍｇのPrA/mL樹脂（低タンパク質）、３０ｍｇのPrA/mL樹脂（高タンパク質）による試みについての静的結合能力（ａ）およびリガンド密度（ｂ）を示す。TMTGEコートCPG上で、０．４２５Ｍのアクリル酸、０．０３ＭのCANを用いて、４０℃において、グラフト重合を行う。
【図１３】図１３は、EDC濃度に依存的な、固定されたプロテインＡのIgGキャプチャー能力に関する効率を示す。計算は、５０ｋＤのプロテインＡについて、および１４４ｋＤのIgGについての分子量に基づく。
【０２２７】
【図１４ａｂ】図１４ａ）およびｂ）は、高タンパク質量（樹脂１ｍＬあたり３０ｍｇのプロテインＡ）による、アクリル酸濃度および様々なEDC濃度に対するＬＤＢＣＡ（ａ）およびＱＳ（ｂ）の依存性を示す。
【図１５ａｂ】図１５ａ）およびｂ）は、低タンパク質量（樹脂１ｍＬあたり15ｍｇのプロテインＡ）による、アクリル酸濃度および様々なEDC濃度に対するＬＤＢＣＡ（Ａ）およびＱＳ（Ｂ）の依存性を示す。
【図１６】図１６は、０．２１Ｍ、０．４２５Ｍ、０．６５Ｍおよび０．８５Ｍのアクリル酸濃度についての、リガンド密度に対する静的結合能力を示す。
【０２２８】
【図１７】図１７は、孔サイズが小さなCPG上での、様々なEDC濃度および樹脂１ｍＬあたり１５ｍｇのプロテインＡによる、アクリル酸濃度に対するリガンド密度（ａ）および静的結合能力（ｂ）の依存性を示す。
【図１８ａｂ】図１８ａ）およびｂ）は、多様なEDCおよびアクリル酸濃度におけるリガンド密度（Ａ）および静的結合能力（Ｂ）を示す。
【図１９】図１９は、多様なGMA濃度による、SI AGET ATRPを介してpGMAがグラフトされたCPG上の、滴定により決定されたエポキシ基の数を、線形関数として示す。
【０２２９】
【図２０ａｂ】図２０ａ）およびｂ）は、SI AGET ATRPを介してグラフト化されたCPG上での、静的結合能力（ａ）およびリガンド密度（ｂ）に対するGMA濃度の影響を示す。
【図２１】図２１：純粋なCPG（Ａ）、およびジルコニアコートされたCPG（Ｂ）のEDX測定。
【図２２ａｂ】図２２ａ）およびｂ）は、ジルコニアコートされたCPGのリガンド密度（ａ）および静的結合能力（ｂ）に対するアクリル酸濃度の影響を示す。EDC：０．０２５ｇ／１０ｍＬ、プロテインＡ：３０ｍｇ／樹脂１ｍＬ。
【０２３０】
【図２３】図２３は、ジルコニアコートされたCPG上での様々な樹脂の動的結合能力測定についての結果を示す。IgGフィード濃度は２ｍｇ／ｍＬであり、滞留時間は３分間である。
【図２４】図２４は、５回の測定ランの間のＤＢＣ５０％の変化を示す。
【図２５ａ−ｄ】図２５ａ）〜ｄ）は、ProSepHC（ａ）、ATRP処理CPG（ｂ）、PAAテンタクルを有するCPG1000（ｃ）、およびpAAテンタクルを有するZrO2コートCPG（ｄ）についての、３分間および９分間の滞留時間によるカラムのローディング挙動の比較を示す。
【０２３１】
【図２６】図２６は、DBC測定における機器の組み立てについての模式的なフロースキームを示す。
【図２７】図２７は、市販の利用可能なProSepHCのDBC測定についての典型的なクロマトグラムを示す。
【図２８ａｂ】図２８ａ）およびｂ）は、コートされた試料およびコートされていない試料の静的結合能力（Ａ）およびリガンド密度（Ｂ）を、４０℃での０．０３Ｍの［Ｃｅ（ＩＶ）］におけるアクリル酸濃度の関数として示す。
【０２３２】
【図２９ａｂ】図２９ａ）およびｂ）は、コートされた試料およびコートされていない試料の静的結合能力（Ａ）およびリガンド密度（Ｂ）を、４０℃での０．１５Ｍのアクリル酸における開始剤濃度の関数として示す。
【図３０ａｂ】図３０ａ）およびｂ）は、ＺｒＯ２コートCPGのリガンド密度（Ａ）および静的結合能力（Ｂ）に対するアクリル酸濃度の影響を示す。EDC：０．０２５ｇ／１０ｍＬ、プロテインＡ：３０ｍｇ／樹脂１ｍＬ。
【図３１】図３１は、ＺｒＯ２コートCPGから合成されたPrAアフィニティー媒体の動的結合能力測定についてのトレースを示す。
【図３２】図３２は、ポリマー性多孔質ビーズから合成された例示的なPrAアフィニティー媒体のＱｓおよびＬＤＢＣＡを示す。
【図１】
0006336996.tif 000030
【図２】
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【図３ａｂ】
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【図４ａｂ】
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【図５ａｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０ａｂ】
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【図２１】
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【図２２ａｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５ａ−ｄ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８ａｂ】
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【図２９ａｂ】
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【図３０ａｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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