(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離したポリペプチドであって、
主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩα２、β１およびβ２ドメインを含まず、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインおよび抗原決定基を含み、
抗原決定基が、ミエリンタンパク質ペプチド抗原、セリアック病関連ペプチド抗原、関節リウマチ関連ペプチド抗原、ブドウ膜炎関連ペプチド抗原、又はＩ型糖尿病関連ペプチド抗原を含む、単離したポリペプチド、又は
ＭＨＣクラスＩＩα２、β１およびβ２ドメインを含まず、ＣＤ７４に結合あるいはＣＤ７４の発現又は活性を減少させることが可能である、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインの一部および抗原決定基を含み、
抗原決定基が、ミエリンタンパク質ペプチド抗原、セリアック病関連ペプチド抗原、関節リウマチ関連ペプチド抗原、ブドウ膜炎関連ペプチド抗原、又はＩ型糖尿病関連ペプチド抗原を含む、単離したポリペプチド。
【請求項２】
α１ドメインがヒトＭＨＣクラスＩＩα１ドメインを含むことを特徴とする、請求項１に記載の単離したポリペプチド。
【請求項３】
α１ドメインがＤＲ−α、ＤＱ−α１、ＤＰ−α１、ＤＭ−α１又はＤＯ−α１ドメインを含むことを特徴とする、請求項２に記載の単離したポリペプチド。
【請求項４】
ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインが成熟したＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸残基１−７５又はそれらの少なくとも５つの隣接アミノ酸を含むことを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１つに記載の単離したポリペプチド。
【請求項５】
α１ドメインが、配列番号１−４９のいずれか１つにおいて説明されたアミノ酸配列を備える、α鎖からのα１ドメインを含むことを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１つに記載の単離したポリペプチド。
【請求項６】
ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインの一部が、成熟したＤＲ−α鎖のアミノ酸残基３８−５８又はその一部、あるいはＤＰα又はＤＱαの相同領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単離したポリペプチド。
【請求項７】
抗原決定基がα１ドメインに共有結合することを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか１つに記載の単離したポリペプチド。
【請求項８】
共有結合がペプチドリンカー又は化学的クロスリンカーを含むことを特徴とする、請求項７に記載の単離したポリペプチド。
【請求項９】
抗原決定基がミエリンタンパク質ペプチド抗原であって、該ミエリンタンパク質ペプチド抗原がミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチド、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチドまたはプロテオリピッドタンパク質（ＰＬＰ）ペプチドを含むことを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか１つに記載の単離したポリペプチド。
【請求項１０】
ミエリンタンパク質ペプチド抗原がＭＯＧのアミノ酸３５−５５、ＭＢＰのアミノ酸８５−９９、ＭＢＰのアミノ酸１４９−１７１又はＰＬＰのアミノ酸１３９−１５１を含むことを特徴とする、請求項９に記載の単離したポリペプチド。
【請求項１１】
前記抗原決定基がＩ型糖尿病関連ペプチド抗原であって、該Ｉ型糖尿病関連ペプチド抗原はインスリンＢ鎖のアミノ酸１６−２３を含むことを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか１つに記載の単離したポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードする単離した核酸分子。
【請求項１３】
操作可能にプロモーターと結合した請求項１２に記載の単離した核酸分子を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１乃至１１のいずれか１つに記載の単離したポリペプチドあるいは請求項１２又は１３に記載の単離した核酸分子、及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
被験体における障害を処置又は阻害するための薬剤の製造における、請求項１乃至１１のいずれか１つに記載の単離したポリペプチド、請求項１２又は１３に記載の単離した核酸分子、又は請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１６】
前記障害が炎症性及び／又は自己免疫障害を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記炎症性及び／又は自己免疫障害が、多発性硬化症、セリアック病、関節リウマチ、Ｉ型真性糖尿病、炎症性腸疾患、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、ブドウ膜炎、視神経炎を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記障害が網膜障害、発作又は物質依存を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【請求項１９】
前記物質依存がアンフェタミン乱用を含むことを特徴とする、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
ポリペプチド、核酸又は医薬組成物が非経口又は経口で投与されることを特徴とする、請求項１５乃至１９のいずれか１つに記載の使用。
【請求項２１】
被験体は１０μｇから１ｇのポリペプチド、核酸又は医薬組成物を投与されること
を特徴とする、請求項１５乃至２０のいずれか１つに記載の使用。
【請求項２２】
被験体からのサンプルにおけるＣＤ７４発現又は活性レベルを測定する工程と、
ＣＤ７４発現又は活性レベルを対照と比較する工程と、
ＣＤ７４発現又は活性レベルが対照と同等又はより低い場合該処置が効果的であるとするように、処置の効果を決定する工程と
を含む、被験体における障害の処置の効果を決定するための薬剤の製造における、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメイン又はその一部、および抗原決定基を含み、α２ドメイン、β１ドメインおよびβ２ドメインを含まず、
抗原決定基が、ミエリンタンパク質ペプチド抗原、セリアック病関連ペプチド抗原、関節リウマチ関連ペプチド抗原、ブドウ膜炎関連ペプチド抗原、又はＩ型糖尿病関連ペプチド抗原を含む、ポリペプチドの使用。
【請求項２３】
被験体からのサンプルにおけるＣＤ７４発現又は活性レベルを測定する工程と、
ＣＤ７４発現又は活性レベルを対照と比較する工程と、
ＣＤ７４発現又は活性レベルが対照よりも高い場合ポリペプチドの用量を増やすべきであることが示唆され、ＣＤ７４発現又は活性レベルが対照と同等又はより低い場合ポリペプチドの用量を減らすべきであることが示唆され、それによって被験体における障害の処置の効果を最適化するように被験体に次に投与するポリペプチドの用量を決定する工程と
を含む、被験体における障害の処置の効果を最適化するための薬剤の製造における、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメイン又はその一部、および抗原決定基を含み、α２ドメイン、β１ドメインおよびβ２ドメインを含まず、
抗原決定基が、ミエリンタンパク質ペプチド抗原、セリアック病関連ペプチド抗原、関節リウマチ関連ペプチド抗原、ブドウ膜炎関連ペプチド抗原、又はＩ型糖尿病関連ペプチド抗原を含む、ポリペプチドの使用。
【請求項２４】
被験体からのサンプルにおけるＣＤ７４発現又は活性レベルが対照よりも高い場合ポリペプチドの用量を増やす工程、あるいはＣＤ７４発現又は活性レベルが対照と同等又はより低い場合ポリペプチドの用量を減らす工程
を含む、被験体における障害を処置又は阻害するための薬剤の製造における、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメイン又はその一部および抗原決定基を含み、α２ドメイン、β１ドメインおよびβ２ドメインを含まず、
抗原決定基が、ミエリンタンパク質ペプチド抗原、セリアック病関連ペプチド抗原、関節リウマチ関連ペプチド抗原、ブドウ膜炎関連ペプチド抗原、又はＩ型糖尿病関連ペプチド抗原を含む、ポリペプチドの使用。
【請求項２５】
前記ＣＤ７４発現レベルがＣＤ７４ＲＮＡ及び／又はタンパク質発現レベルを含むことを特徴とする、請求項２２乃至２４のいずれか１つに記載の使用。
【請求項２６】
ＣＤ７４の活性レベルがＮＦ-κＢ活性、細胞増殖、アポトーシス又はこれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項２２乃至２４のいずれか１つに記載の使用。
【請求項２７】
ポリペプチドが主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩα１ドメインおよび抗原決定基を含み、ポリペプチドがＭＨＣクラスＩＩα２、β１およびβ２ドメインを含まず、又は
ＣＤ７４に結合あるいはＣＤ７４の発現又は活性を減少させることが可能である、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインの一部および抗原決定基を含み、ポリペプチドがＭＨＣクラスＩＩα２、β１およびβ２ドメインを含まない、ことを特徴とする、請求項２２乃至２６のいずれか１つに記載の使用。
【請求項２８】
α１ドメインがヒトＭＨＣクラスＩＩα１ドメインを含むことを特徴とする、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
α１ドメインがＤＲ−α、ＤＱ−α１、ＤＰ−α１、ＤＭ−α１又はＤＯ−α１ドメインを含むことを特徴とする、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインがＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸残基１−７５又はそれらの少なくとも５つの隣接アミノ酸を含むことを特徴とする、請求項２７乃至２９のいずれか１つに記載の使用。
【請求項３１】
α１ドメインが、配列番号１−４９の１つとして説明されたアミノ酸配列を備える、α鎖からのα１ドメインを含むことを特徴とする、請求項２８乃至３０のいずれか１つに記載の使用。
【請求項３２】
ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインの一部が、ＤＲ−α鎖のアミノ酸残基３８−５８、あるいはＤＰ−α又はＤＱ―αの相同領域を含むことを特徴とする、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
抗原決定基がα１ドメインに共有結合することを特徴とする、請求項２２乃至３２のいずれか１つに記載の使用。
【請求項３４】
共有結合がペプチドリンカー又は化学的クロスリンカーを含むことを特徴とする、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
抗原決定基がミエリンタンパク質ペプチド抗原であって、該ミエリンタンパク質ペプチド抗原がミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチド、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチドまたはプロテオリピッドタンパク質（ＰＬＰ）ペプチドを含むことを特徴とする、請求項２２乃至３４のいずれか１つに記載の使用。
【請求項３６】
ミエリンタンパク質ペプチド抗原がＭＯＧのアミノ酸３５−５５、ＭＢＰのアミノ酸８５−９９、ＭＢＰのアミノ酸１４９−１７１又はＰＬＰのアミノ酸１３９−１５１を含むことを特徴とする、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
抗原決定基がＩ型糖尿病関連ペプチド抗原であって、該Ｉ型糖尿病関連ペプチド抗原はインスリンＢ鎖のアミノ酸１６−２３を含むことを特徴とする、請求項３５に記載の使用。
【請求項３８】
被験体からのサンプルが単球、Ｂ細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ７４＋細胞又はこれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項２２乃至３７のいずれか１つに記載の使用。
【請求項３９】
前記障害が炎症性及び／又は自己免疫障害を含むことを特徴とする、請求項２２乃至３８のいずれか１つに記載の使用。
【請求項４０】
前記炎症性及び／又は自己免疫障害が、多発性硬化症、セリアック病、関節リウマチ、Ｉ型真性糖尿病、炎症性腸疾患、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、ブドウ膜炎、視神経炎を含むことを特徴とする、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記障害が網膜障害、発作又は物質依存を含むことを特徴とする、請求項２２乃至３８のいずれか１つに記載の使用。
【請求項４２】
細胞におけるＣＤ７４の発現又は活性レベルを下げるための薬剤の製造におけるポリペプチドの使用であって、該ポリペプチドが、
主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩα１ドメインおよび抗原決定基を含み、ＭＨＣクラスＩＩα２、β１およびβ２ドメインを含まず、又は
ＭＨＣクラスＩＩα２、β１およびβ２ドメインを含まないＭＨＣクラスＩＩα１ドメインの一部および抗原決定基を含み、
抗原決定基が、ミエリンタンパク質ペプチド抗原、セリアック病関連ペプチド抗原、関節リウマチ関連ペプチド抗原、ブドウ膜炎関連ペプチド抗原、又はＩ型糖尿病関連ペプチド抗原を含むことを特徴とする、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願への相互参照＞
本出願は、２０１２年１月６日に出願された米国仮特許出願第６１／５８４，０４５号の利益を主張し、引用によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
＜技術分野＞
本開示は、部分的な主要組織適合複合体ポリペプチド及びその使用方法、特に炎症性又は自己免疫障害の処置又は阻害に使用する方法に関する。
【０００３】
＜政府支援の承認＞
本発明は国立衛生研究所によって与えられた、許可番号ＮＳ４７６６１、ＡＩ４３９６０およびＤＫ０６８８８６１、及び退役軍人省によって与えられたＭｅｒｉｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ａｗａｒｄ  Ｐｒｏｇｒａｍの下、政府支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
哺乳動物における特異性抗原に対する免疫反応の開始は、Ｔ細胞へのその抗原の提示によってもたらされる。抗原は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）との関連で、Ｔ細胞へと提示される。ＭＨＣは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に位置付けられ、ＭＨＣの三次元構造は、提示された抗原が適合する、溝または間隙を含む。Ｔ細胞上の適切な受容体が、必要な共刺激シグナルがある状態でＡＰＣ上のＭＨＣ／抗原複合体と相互作用するとき、Ｔ細胞は刺激され、細胞毒性Ｔ細胞の機能の誘発、Ｂ細胞活性の誘発、およびサイトカイン生成の刺激を含む、免疫系の活性化事象の特徴がよく特徴付けられたカスケードの様々な態様を引き起こす。
【０００５】
多発性硬化症の病理は中枢神経系に対する異常な免疫反応によって特徴づけられる。具体的には、ミエリン抗原に対して反応するＴ−リンパ球は中枢神経系内の炎症性反応を開始すると考えられている。結果として生じる炎症性反応は補充されたＴ−リンパ球、活性化したマクロファージ、Ｂ−リンパ球及び形質細胞を含む。これらの炎症性細胞から放出された可溶性メディエーターは脱髄、より少ない程度であれば軸索変性をもたらす。これと同様に、多くの自己免疫障害における炎症性反応は、多くの場合進行性である組織損傷をもたらす。
【０００６】
最近の進歩にも関わらず、自己免疫及び炎症性障害に対する効果的な処置が未だに必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書中に開示されるのは、分離した主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩα１ドメインポリペプチド及びその使用方法である。幾つかの実施形態において、分離したポリペプチドはＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチド（又はその一部）を含み又はからなり、ＭＨＣクラスＩＩα２、β１又はβ２ドメインを含まない。幾つかの例において、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインは抗原決定基と、例えばペプチドリンカー、化学的リンカー又は直接的な共有結合によって、共有結合する。
【０００８】
開示されたＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドは被験体の障害を処置又は阻害するために使用され、該障害は炎症性及び／又は自己免疫障害を含む。幾つかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチド（α１ポリペプチド又は抗原ペプチドを伴うα１ポリペプチド）又はその一部は、炎症性及び／又は自己免疫疾患あるいは障害を有する被験体に障害を処置又は阻害するのに効果的な量で投与される。幾つかの例において、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドはＣＤ７４の発現及び／又は活性を減少させる。
【０００９】
ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインを含むポリペプチド又はＭＨＣクラスＩＩα１ドメイン（又はその一部）及びβ１ドメイン（例えばβ１α１ポリペプチド）を含むポリペプチドを有する被験体における処置の有効性を決定する又は評価する、あるいは処置を最適化する方法も本明細書中に開示される。幾つかの実施形態において、前記方法は被験体からのサンプルにおけるＣＤ７４の発現又は活性を測定する工程、ＣＤ７４の発現又は活性を対照と比較する工程、処置の有効性を決定する工程あるいはＣＤ７４発現及び／又は活性レベルに基づいてポリペプチドの用量を調節するべきかを決定する工程を含む。
【００１０】
開示の前述の及びその他の特徴は、添付の図への言及とともに進められる以下の詳細な説明によってより明確になるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
図で、および明細書の全体にわたって、以下の用語が交換可能に使用される：
ｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５は、ＲＴＬ３４２Ｍと交換可能に使用される、
ｐＤＲ２／ペプチドは、ＲＴＬ３０２−５Ｄと交換可能に使用される、
ｐＤＲ２／ＭＢＰ−８５−９９は、ＲＴＬ３４０と交換可能に使用される、
及び、ｐＤＲ２／ｈＭＯＧ３５−５５は、ＲＴＬ１０００と交換可能に使用される。
【図１Ａ】図１Ａは、ｍＭＯＧ−３５−５５ペプチド／完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）／Ｐｔｘにより免疫性を与えられたＤＲ＊１５０１−Ｔｇマウスの連日の平均臨床ＥＡＥスコア（左）又は蓄積疾患指数（ＣＤＩ；  右）を示す１対のグラフである。疾患発症時（≧２の臨床ＥＡＥスコア）で、示されているように、ビヒクル、ｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５、ｐＤＲ２／ペプチドなし又はｐＤＲ２／ＭＢＰ−８５−９９でマウスは処置された。矢印は、マウスが処置された日を示す。＊  ｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５対ビヒクル、ｐＤＲ２／ＭＢＰ−８５−９９、及びｐＤＲ２／ペプチドなしにおいてｐ＜０．００３。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ｈＭＯＧ−３５−５５ペプチド／ＣＦＡ／Ｐｔｘにより免疫性を与えられたＤＲ＊１５０２−Ｔｇマウスの連日の平均臨床ＥＡＥスコア（左）又ＣＤＩ（右）を示す１対のグラフである。示されているように、疾患発症時（＞２の臨床ＥＡＥスコア）に、ビヒクル、ｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５、ｐＤＲ２／ペプチドなし又はｐＤＲ２／ＭＢＰ−８５−９９でマウスは処置された。矢印は、マウスが処置された日を示す。＊  ｐＤＲ２／ｈＭＯＧ−３５−５５対ビヒクル、ｐＤＲ２／ＭＢＰ−８５−９９、及びｐＤＲ２／ペプチドなしにおいてｐ＜０．００２３。
【図２Ａ】図２Ａは、単球を確認するために使用される単球ゲートの設定を示す１対のフローサイトメトリープロットである。単球は左パネルに示される前方散乱／側方散乱プロット中の円によって示された領域内にあるものとして同定され、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）−陽性死細胞は右パネルに示されるように除外される。
【図２Ｂ】図２Ｂは、５００μｇの標識化されたｐＤＲ２の注入の前及び１５分後のＤＲ＊１５０１−Ｔｇ未処理マウスから採取し、単球ゲート、ＣＤ１１ｂ（最上の行）、ＣＤ１９（２番目の行）、ＣＤ１１ｃ（３番目の行）及びＣＤ３（最下の行）の発現をフィコエリトリン（ＰＥ）による染色、標識化されたｐＤＲ２誘導体の結合のためのＦＩＴＣ−染色（ｘ軸）によって分類した血液のフローサイトメトリープロットを示す。左パネルはＲＴＬなしの対照の結合を示し、中央パネルはＲＴＬ３４２Ｍ（ｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５）の結合を示し、右パネルはＲＴＬ１０００（単肢（ｍｏｎｏｍｅｌｉｃ）のｐＤＲ２／ｈＭＯＧ−３５−５５）の結合を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＤＲ＊１５０１−Ｔｇ未処理マウスから採取し、５００μｇの標識化されたｐＤＲ２とともにインビトロでインキュベートした血液を、単球ゲート、ＣＤ１１ｂ（最上の行）、ＣＤ１９（２番目の行）、ＣＤ１１ｃ（３番目の行）及びＣＤ３（最下の行）の発現のためのフィコエリトリン（ＰＥ）による染色、標識化されたｐＤＲ２誘導体の結合のためのＦＩＴＣ−染色（ｘ軸）によって分類したフローサイトメトリープロットを示す。左パネルはＲＴＬなしの対照の結合を示し、中央パネルはＲＴＬ３４２Ｍの結合を示し、右パネルはＲＴＬ１０００を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、１０μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ−５４６で標識化されたＲＴＬ３４２Ｍで４０分間処置され、蛍光顕微鏡法によって評価されたＤＲ＊１５０１／ＧＦＰトランスジェニックマウスからのＧＦＰ＋ＣＤ１１ｂ＋細胞のデジタル画像である。
【図３Ａ】図３Ａは、前方散乱及び側方散乱によって分析されたリンパ球ゲートの設定を示す１対のプロットである。リンパ球は左パネルに示される前方散乱／側方散乱プロット中の円によって示された領域内にあるものとして同定され、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）−陽性死細胞は右パネルに示されるように除外される。
【図３Ｂ】図３Ｂは、５００μｇの標識化されたＲＴＬの注入の前及び１５分後のＤＲ＊１５０１−Ｔｇ未処理マウスから採取し、リンパ球ゲート、ＣＤ１１ｂ（最上の行）、ＣＤ１９（２番目の行）、ＣＤ１１ｃ（３番目の行）及びＣＤ３（最下の行）の発現をフィコエリトリン（ＰＥ）による染色、標識化されたｐＤＲ２誘導体の結合のためのＦＩＴＣ−染色（ｘ軸）によって分類した血液のフローサイトメトリープロットを示す。左パネルはＲＴＬなしの対照の結合を示し、中央パネルはＲＴＬ３４２Ｍの結合を示し、右パネルはＲＴＬ１０００の結合を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＤＲ＊１５０１−Ｔｇ未処理マウスから採取し、５００μｇの標識化されたＲＴＬとともにインビトロでインキュベートした血液を、リンパ球ゲート、ＣＤ１１ｂ（最上の行）、ＣＤ１９（２番目の行）、ＣＤ１１ｃ（３番目の行）及びＣＤ３（最下の行）の発現をフィコエリトリン（ＰＥ）による染色、標識化されたｐＤＲ２誘導体の結合のためのＦＩＴＣ−染色（ｘ軸）によって分類したフローサイトメトリープロットを示す。左パネルはＲＴＬなしの対照の結合を示し、中央パネルはＲＴＬ３４２Ｍの結合を示し、右パネルはＲＴＬ１０００の結合を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、図２Ａの単球ゲートに基づいてゲートを通り、ビヒクルのみ（左パネル）、ｐＤＲ２特異的なＦａｂ１ｂ１１（中央パネル）又は対照ＦａｂＤ２（右パネル）と９０分間インキュベーションした後、ＣＤ１１ｂの発現とＦＩＴＣ−ＤＲ２コンストラクトの結合のために染色した、未処理のＤＲ＊１５０１−Ｔｇマウスから採取した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のフローサイトメトリープロット（左）、及びＦａｂが存在しない状態でのｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５の結合の割合で標準化した、ｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５の結合を表す棒グラフ（右）のセットを含む。＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図で示すように発病時にビヒクル、ＲＴＬ３４２Ｍ、ＲＴＬ３４２Ｍ＋Ｆａｂ１ｂ１１、ＲＴＬ３４２Ｍ＋ＦａｂＤ２又はＦａｂ１ｂ１１単独のいずれかを３日間連日処置した（矢印は処置した日を示す）ＥＡＥを有するＤＲ＊１５０１−Ｔｇマウスの連日の平均臨床ＥＡＥスコア（上）及びＣＤＩ（下）を示す１対のグラフである。Ｆａｂフラグメントは処置前にｐＭＨＣとともにインキュベートした。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０００１、＃ｐ＜０．０００５。
【図４Ｃ】図４Ｃにおいて、上部パネルはＦＡＢ１Ｂ１１を伴うＲＴＬ３４２Ｍ、対照ＦａｂＤ２を伴うＲＴＬ３４２Ｍ、ＲＴＬなし又はＦａｂ１Ｂ１１のみでの前培養後のＣＤ７４の平均蛍光強度（ＭＦＩ）のヒストグラムである。下部パネルは上部パネルのデータを要約した棒グラフである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５。
【図４Ｄ】左パネルは、臨床症状の開始時に１００μｇのＲＴＬ３４２Ｍ（ｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５）、等モル（１０μｇ）の遊離ｍＭＯＧ−３５−５５ペプチド又はビヒクルを点滴で１日１回５日間注入された、ｍＭＯＧ−３５−５５／ＣＦＡ／Ｐｔｘに誘発されたＥＡＥを有するＤＲ＊１５０１−Ｔｇマウスの臨床ＥＡＥスコアの線グラフである。右パネルは、同じ動物の蓄積疾患指数を示す棒グラフである。＊  ｐ＜０．０５（連日スコア）＊＊  ｐ＜０．０１（ＣＤＩスコア）対ビヒクルで処置された又は遊離ｍＭＯＧ３５−５５で処置された群。
【図５Ａ】図５Ａは脾細胞へのＲＴＬ１０００の結合の線グラフである。未処置の脾臓細胞はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８Ｒで標識化されたＲＴＬ１０００の示された濃度とともにインキュベートされた。細胞は、６Ｍ尿素で溶解し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによってタンパク質を分離し、蛍光強度計によって定量化した。データは２−結合部位モデル（Ｒ２＝０．９９８）に最も良く適合する。２つの結合部位のＫＤ値は、より高い親和性部位に対しては２．６５  ｎＭであり、より低い親和性部位に対しては１３１．０  ｎＭだった。
【図５Ｂ】図５Ｂは、表示の標識化されていない競合物質の増加した量での存在下でＤＲ＊１５０１−Ｔｇマウスから単離した全細胞への、標識化されたＲＴＬ１０００の結合を示す線グラフである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、表示の標識化されていない競合物質の増加した量での存在下でＭＨＣクラスＩＩノックアウトマウスから単離した全細胞への、標識化されたＲＴＬ１０００の結合を示す線グラフである。
【図６】図６は、ｐＤＲ２に結合したタンパク質の免疫沈殿のブロットの１対のデジタル画像である。ＤＲ＊１５０１−Ｔｇマウスからの脾細胞の表面はビオチン化され、ＣＨＡＰＳを含んでいる緩衝剤により溶解された。溶解物はＲＴＬ１０００とともにインキュベートし、次にＤＲ２−特異的モノクローナル抗体ＴＵ３９を溶解物に加えた。結合していない材料を取り除くために免疫複合体を洗浄し、結合タンパク質を８−１０分間電気泳動サンプル緩衝剤を減少させる際に沸騰させることにより、免疫複合体から分離した。免疫沈殿から回収したタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、フィルター上にブロットし、次にストレプトアビジンＰＥ（左）あるいはＱｕａｎｔｕｍ−Ｒｅｄで標識化された抗ＤＲ２  ＨＫ１４抗体（右）で探索した（ｐｒｏｂｅｄ）。
【図７】図７は、表面プラズモン共鳴によって測定された、ヒストン複合体へのＲＴＬ１０００の結合を示すプロットである。ヒストン複合体はアミン結合によってＣＭ５センサチップに結合し、ＲＴＬ１０００は示された濃度で複合体に結合した。結合曲線は、基線変動を有する１：１ラングミュア結合モデル（Ｋａ＝５．７４  ｘ  １０３  Ｍ−１ｓ−１；  Ｋｄ＝３．３  ｘ  １０−３  ｓ−１；  ＲＭａｘ＝２２３  ＲＵ；  Ｃｈｉ２＝９．８９）に適合し、結果として５７５ｎｍの明確な結合定数ＫＤを生じる。
【図８Ａ】図８Ａは、ＣＤ７４に結合したタンパク質の免疫沈殿物のウェスタンブロットのデジタル画像である。ＤＲ＊１５０１−Ｔｇマウスからの脾細胞は表面がビオチン化され、溶解した。溶解物を抗ＣＤ７４抗体と結合するタンパク質Ｌビーズと混合した。これらを４℃に一晩インキュベートした。タンパク質は免疫複合体から回収し、ブロットし、ストレプトアビジン−ＰＥを用いて視覚化した。Ｍは分子量マーカーを示す、Ｔは溶解物の合計を示す、ＣＤ７４  ＩＰは免疫沈殿したＣＤ７４を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、２５ナノモルの表示のＦＩＴＣで標識化された、ＲＴＬ分子とともにインキュベートされた、表面がビオチン化されたＤＲ＊１５０１−Ｔｇ脾細胞から免疫沈殿したＣＤ７４タンパク質複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの１対のデジタル画像である。ゲルはＦＩＴＣの存在下でスキャンした。
【図９Ａ】図９Ａは、標識化されていないＤＲ−α１およびＤＲ２−β１の存在下で、ＦＩＴＣで標識化されたＲＴＬ１０００とともにインキュベートされた、表面がビオチン化されたＤＲ＊１５０１−Ｔｇ脾細胞から免疫沈殿したＣＤ７４タンパク質複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデジタル画像である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、用量依存的な様式でのＤＲ−α１によるＲＴＬ１０００の結合の阻害を示すグラフである。ポリアクリルアミドゲル上のＦＩＴＣで標識化されたＲＴＬ１０００のバンドを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸＲ  ｓｃａｎｎｅｒを用いて、その後Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ＯｎｅＲ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた濃度測定による定量化によって検出した。データはＤＲ−α１の濃度に対して標準化され、プロットされ、曲線はＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍＲソフトウェアを使用して１−部位または２−部位競合モデルと適合させた。４４７ｎＭのＥＣ５０及び０．９５６のＲ２を有する１−部位競合方程式（ｅｑｕａｔｉｏｎ）と最も良く適合した。
【図１０Ａ】図１０Ａは、免疫吸着したＣＤ７４とともにインキュベートした場合の、漸増量のＦＩＴＣで標識化されたＲＴＬ１０００、ＲＴＬ３４２Ｍ、  ＲＴＬ３４０  （ｐＤＲ２／ＭＢＰ−８５−９９）、ＲＴＬ３０２−５Ｄ  （単量体ｐＤＲ２／ペプチドなし）及びＤＲ−α１の結合を示すプロットである。データは、全ての結合したリガンドについてＲ２＞０．９５での１−又は２−部位結合を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアを使用して分析した。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、Ｌ２４３モノクローナル抗体と結合したプロテインＬビーズによってＣＤ７４を欠失した溶解物から免疫吸着し、濃縮したＭＨＣクラスＩＩとインキュベートした場合の、漸増量のＦＩＴＣで標識化されたＲＴＬ１０００、ＲＴＬ３４２Ｍ、ＲＴＬ３４０、ＲＴＬ３０２−５Ｄ、及びＤＲ−α１の  結合を示すプロットである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、未処置のマウスと比較した、ＥＡＥマウスにおける単球上のＣＤ７４の発現を示すヒストグラムである。挿入物は、未処置（ｎ＝４）及びＥＡＥを有し、ｍＭＯＧ−３５−５５  で免疫化された（ｎ＝４）マウスからの単球におけるＣＤ７４発現の蛍光強度の平均を示す。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ビヒクルまたはＲＴＬ３４２Ｍ（１００μｇ）により処置されたＥＡＥマウスの血液および脾臓でのＣＤ７４発現を示す棒グラフである。＊ｐ＜０．０５。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ビヒクル（左）又はＲＴＬ３４２Ｍ（１００μｇ、右）により処置されたマウスの脊髄中での単球におけるＣＤ７４発現を示す１対のプロットである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、表示された濃度のＲＴＬ１０００により処置されたＣＤ１１ｂ＋単球でのＲＴＬ１０００  ＦＩＴＣ結合（上部）およびＣＤ７４発現（下部）を示す１セットのプロットである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＣＤ７４発現の割合、および表示のＲＴＬの結合の割合を示す１セットの線グラフである。右下のパネルは、ＲＴＬ結合およびＣＤ７４発現の間の逆相関性を示すすべてのコンストラクトの線形回帰分析である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ビヒクル（ｐＭＨＣ処置なし）で処置されたＣＤ１１ｂ＋ヒト単球上のＲＴＬ結合（上部）及びＣＤ７４発現（下部）を示す１セットのプロットである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＣＤ１１ｂ＋ヒト単球上の１μｇのＲＴＬ３４２Ｍの結合（上部）及びＣＤ７４発現（下部）を示す１セットのプロットである。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ＣＤ１１ｂ＋ヒト単球上の１μｇのＲＴＬ１０００の結合（上部）及びＣＤ７４発現（下部）を示す１セットのプロットである。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、ＣＤ１１ｂ＋ヒト単球上の５μｇのＲＴＬ１０００の結合（上部）及びＣＤ７４発現（下部）を示す１セットのプロットである。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、ＣＤ１１ｂ＋ヒト単球上の５μｇのＲＴＬ３４０の結合（上部）及びＣＤ７４発現（下部）を示す１セットのプロットである。
【図１３Ｆ】図１３Ｆは、分析前の培養液において様々な濃度のＲＴＬ１０００で処置されたヒト単球におけるＲＴＬ１０００の結合対ＣＤ発現の線形回帰を示す線グラフである。生データは図１３Ａ−Ｅで示される。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＭＢＰ−８５−９９での免疫化によってＥＡＥが誘発されたマウスの連日の平均臨床ＥＡＥスコアを示す線グラフ（左）及びＣＤＩを示す棒グラフ（右）である。ＭＢＰ−ＴＣＲ／ＤＲ２−Ｔｇマウスは、疾患の発症（グラフでは矢印で示される）後５日間ビヒクル、ＲＴＬ３４２Ｍ、ＲＴＬ１０００、ＲＴＬ３４０又はＲＴＬ３０２−５Ｄにより処置された。＊  ＲＴＬ３４２Ｍ対ビヒクルに対してｐ＜０．０２及び＊＊＊ＥＡＥ連日平均スコア及びピーク疾患（ｐｅａｋ  ｄｉｓｅａｓｅ）のＲＴＬ３４０とＲＴＬ１０００対ビヒクルに対してｐ＜０．００２（左パネル）。＊＊ＲＴＬ３４２Ｍ対ビヒクルに対してｐ〈０．００１４及び＊＊＊ＣＤＩのＲＴＬ３４０とＲＴＬ１０００対ビヒクルに対してｐ〈０．００１（右パネル）。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ｍＭＯＧ−３５−５５での免疫化によってＥＡＥが誘発されたマウスの連日の平均臨床ＥＡＥスコアを示す線グラフ（左）及びＣＤＩを示す棒グラフ（右）である。ＥＡＥを有するＤＲ＊１５０１マウスは、疾患の発症時にＲＴＬ３４０（１００μｇ）、ＲＴＬ３４２Ｍ（１００μｇ）、ＲＴＬ３０２−５Ｄ  （１００  μｇ，  ５回の連日処置），  又はＲＴＬ３０２−５Ｄ  （１  ｍｇ），  又は  ＲＴＬ３４２Ｍ  （１００  μｇ，  ２回の連日処置）により処置された。ビヒクルおよび未処置の群は、互いに著しく異なってはおらず、混合された。＊  ｐ〈０．０４、ＲＴＬ３０２−５Ｄ（１ｍｇＸ２）、＊＊＊ｐ〈０．０００１、ＲＴＬ３４２Ｍ（１００μｇ  Ｘ５）、＃ｐ〈０．０１、ＥＡＥ連日平均スコア及びピーク疾患のＲＴＬ３４２Ｍ（１００μｇＸ２）対ビヒクル／未処置（左パネル）、＊＊＊ｐ〈０．０００１、ＲＴＬ３４２Ｍ（１００μｇ  Ｘ２および５回の連日処置）、ｐ〈０．０１３、ＣＤＩのＲＴＬ３０２−５Ｄ（１ｍｇＸ２の連日処置）対ビヒクル／未処置（右パネル）。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、図１４Ｂで示されるマウスの群のＣＤ１１ｂ＋細胞上のＣＤ７４レベル間の関連性および平均ＣＤＩを示すグラフである。
【図１５】図１５は、ｐＤＲ２及びそれと共有結合したｍＭＯＧ−３５−５５（１００μｇ）、ペプチドなしのｐＤＲ２（１０００μｇ）、ＤＲ−α１（７５０μｇ）又はビヒクルのみのいずれかで処置されたマウスの臨床ＥＡＥスコア示す線グラフ（上部）及びＣＤＩを示す棒グラフ（下部）である。各処置群は３頭のマウスからなる。＊  ｐ〈０．０５  ｐＤＲ２  ｍＭＯＧ−３５−５５対未処置；＃  ｐ〈０．０５、ｐＤＲ２／ペプチドなし対未処置、φｐ〈０．０５  ＤＲ−α１対未処置。
【図１６】図１６は、ビヒクル  （未処置），  ペプチドなしの修飾されたｐＤＲ２  （ＲＴＬ３０２−５Ｄ），  修飾されたｐＤＲ２及びそれと共有結合したｍＭＯＧ−３５−５５  （ＲＴＬ３４２Ｍ）、又はＤＲ−α１のいずれかで処置されたマウスの臨床ＥＡＥスコア示す線グラフ（上部）及びＣＤＩを示す棒グラフ（下部）である。各処置群は３頭のマウスからなる。
【図１７Ａ】図１７Ａは、表示の処置をされたＥＡＥ  ＤＲ２−Ｔｇマウスの脊髄からＣＤ１１ｂ＋単球上のＣＤ７４の発現を示す棒グラフである。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、表示の処置をされたＥＡＥ  ＤＲ２−Ｔｇマウスの脊髄からＣＤ１１ｂ＋単球上のＩＣＡＭの発現を示す棒グラフである。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、表示の処置をされたＥＡＥ  ＤＲ２−Ｔｇマウスの脊髄からＣＤ１１ｂ＋単球上のＣＤ８０の発現を示す棒グラフである。
【図１８Ａ】図１８Ａは、１０μｇ／ｍｌのＲＴＬ３４２Ｍ又はバッファーにより１時間処置され、その後１００ｎｇ／ｍｌのＭＩＦあり又はなしで１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ刺激を与えた３頭の未処置のＤＲ＊１５０１−Ｔｇマウスから単離された脾細胞においてリアルタイムＰＣＲで測定されたＩＣＡＭ−１の相対的な発現を示すグラフである。＊ｐ＜０．０５。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、５０のμｇ／ｍｌ  ＲＴＬ３４２Ｍにより２時間処置されたＤＲ＊１５０１／ＧＦＰ−ＴｇマウスからのＧＦＰ＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の平均軌道速度の棒グラフである。１０のタイムラプス領域（ｔｉｍｅ−ｌａｐｓｅ  ｆｉｅｌｄ）（５つの未処置および５つの処置領域）が、実際の蛍光顕微鏡法によって画像化された。＊＊＊ｐ＜０．０００５。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、図１８Ｂに記載したように単離され、処置された細胞の平均軌道変位（ｔｒａｃｋ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）長さの棒グラフである。＊＊＊ｐ＜０．０００５。
【図１８Ｄ】図１８Ｄは、４つの代表的な領域から個々の細胞（各々の領域で９−１１個の細胞）の軌道を示す１対のグラフである。図１８Ｂに記載されているように、細胞は単離され、処置された。
【図１９】図１９は、ＤＲＡα１アミノ酸３８−５８領域（囲まれている）を示すＭＨＣクラスＩＩα鎖アミノ酸配列の一部の例示的なアライメントである。配列は以下のとおりである：ＤＲ２（配列番号１１０）、ＤＲ４（配列番号１１１）、ＤＰ２（配列番号１１２）、ＤＱ２（配列番号１１３）、ＩＡ（配列番号１１４）、ＩＡｇ７（配列番号１１５）およびＲＴ１．Ｂ（配列番号１１６）。
【図２０】図２０は、ＲＴＬコンストラクトがＣＤ７４に対する抗ＣＤ７４抗体の結合を妨害しないことを確認するウェスタンブロットの画像である。ＤＲ＊１５０１溶解物は、４℃で１５時間、リガンドなし、１５μｇのＲＴＬ３４２Ｍ又はＤＲ−α１で前培養した。溶解物はタンパク質／ビーズに吸着されたｌｎ−１  Ａｂに加えた。免疫複合体は、１％ＣＨＡＰＳ／ＴＥＮ緩衝剤で４回、次にＴＥＮバッファーで４回洗浄した。材料は、２％ＳＤＳとサンプルバッファーで７−９分間沸騰することにより、ビーズから溶出した。その後、サンプルを１０−２０％のポリアクリルアミドゲルで分析し、ＰＶＤＦに転写し、ＣＤ７４を検出するために抗ＣＤ７４  ｍＡｂ  ｌｎ−ｌ−ＦＩＴＣにより探索した（ｐｒｏｂｅｄ）。
【図２１】図２１は、Ｘ軸にＣＤ７４発現とＹ軸にＣＤ１１ｂ発現を示す１セットの３つのプロットである。ｍＭＯＧ３５−５５／ＣＦＡ／Ｐｔｘに誘発されたＥＡＥを有するＤＲ＊１５０１−Ｔｇマウスは、臨床症状の開始時に１００μｇのＲＴＬ３４２Ｍ、５００μｇのＤＲ２−β１又はビヒクルを３日間連日投与で処置した。＊ｐ＜０．０５。
【図２２】左パネルは、図２１に記載されているように処置されたマウスの臨床ＥＡＥスコアを示す線グラフである。右パネルは、同じマウスの蓄積疾患指数の棒グラフである。＊＊  ｐ〈０．０１、＊＊＊  ｐ〈０．００１
【図２３】左パネルは、臨床症状の開始時にビヒクル、ＤＲ２−β１（５００μｇ）、ＤＲ−α１（１００μｇ）、ＤＲ−α１（３００μｇ）、ＤＲ−α１（５００μｇ）、ＤＲ−α１（１０００μｇ）又はＲＴＬ３４２Ｍ（１００μｇ）で処置した、ｍＭＯＧ３５−５５／ＣＦＡ／Ｐｔｘに誘発されたＥＡＥを有するＤＲ＊１５０１−Ｔｇマウスの臨床ＥＡＥスコアを示す線グラフである。＊  ｐ〈０．０５  ＤＲα１対ビヒクル；δｐ〈０．０４  ＲＴＬ３４２Ｍ、ＤＲ−α１（３００μｇ）、ＤＲ−α１（５００μｇ）、ＤＲ−α１（１０００μｇ）対ＤＲ２−Ｐ１；＃  ｐ〈０．０００３  ＲＴＬ３４２Ｍ、ＤＲ−α１（３００μｇ）、ＤＲ−α１（５００μｇ）、ＤＲ−α１（１０００μｇ）対ビヒクル；φｐ〈０．０５  ＤＲ−α１（１００μｇ）対ＤＲ２−β１。右パネルは、同じ動物の蓄積疾患指数を示す棒グラフである。＊Ｐ  ＜  ０．０５；＊＊ｐ〈０．００５  ＤＲ−α１（１００μｇ）対ビヒクル；＊＊＊ｐ〈０．０００５対ビヒクル。
【００１２】
＜配列表＞
本明細書に参照される、開示された核酸およびアミノ酸の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義されるように、ヌクレオチド塩基およびアミノ酸のための標準の文字略語を使用して示される。少なくともいくつかの場合において、各核酸配列の１つの鎖だけが示されるが、相補鎖は、示された鎖への任意の言  及によって含まれると理解される。
【００１３】
配列番号１−４９は、例示的なＭＨＣクラスＩＩα鎖ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号５０−８５は、例示的な抗原決定ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号８６−１０８は、ｐＤＲ２／ｈＭＯＧ３５−５５を結合するタンパク質由来のペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１０９は、ＭＨＣ  ＤＲＡ残基３８−５８フラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号１１０−１１６は、ＭＨＣクラスＩＩα鎖アミノ酸配列の部分的なアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
共刺激分子の非存在下で、共有結合したＭＨＣクラスＩＩβ１及びα１ドメイン（β１α１ポリペプチド、Ｔ細胞受容体リガンド（ＲＴＬ）とも呼ばれる）を含む２つのドメインのＭＨＣコンストラクトが同種Ｔ細胞受容体と直接的に相互作用し（ＭｃＭａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７８：３０９６１−３０９７０，  ２００３）、部分的なＴ細胞受容体アゴニストとして機能し、準最適（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）な下流シグナル伝達及びサイトカインシフトを引き起こすことが以前に示されている（Ｂｕｒｒｏｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６７：  ４３８６−４３９５，  ２００１；  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７１：  １９３４−１９４０，  ２００３）。引用によってその全体が組み込まれる米国特許第６，２７０，７７２号、米国特許公開第２００５／０１４２１４２及び２００９／０２８０１３５を参照されたい。連結ミエリンペプチドを含むＲＴＬは、実験的な自己免疫性脳脊髄炎を有するマウス（Ｂｕｒｒｏｗｓ，  Ｃｕｒｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  ４：  １８５−１９３，  ２００５）及び第Ｉ相臨床試験において多発性硬化症の患者（Ｙａｄａｖ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ７４：  Ａ２９３−２９４，  ２０１０；  Ｏｆｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３１：  ７−１４，  ２０１１）を処置するために利用することに以前成功している。
【００１５】
本明細書に記載されているように、驚くべきことに２つのドメインのＲＴＬは、ＭＨＣクラスＩＩ不変鎖（ＣＤ７４）、細胞表面ヒストン及びＭＨＣクラスＩＩ自身を含む複合体に結合することが現在見出されている。具体的には、ＣＤ７４への結合はＭＨＣクラスＩＩα１ドメイン及びＣＤ７４間の相互作用を伴い、結果として単球上のＣＤ７４の急激な用量依存ダウンレギュレーションが生じる。このダウンレギュレーションは、２つのドメインのＲＴＬ及びα１ドメイン単独によってもたらされる。加えて、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメイン単独による処置はマウスにおける重症度を減少させることが予想外に見出されており、これはα１ドメインが、例えば炎症性及び／又は自己免疫障害のための治療用組成物として利用できることを示している。
【００１６】
ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインを含み、他のＭＨＣクラスＩＩドメインを含まない治療剤の１つの利点は、処置前の患者のＨＬＡ細分類の必要性が減ることである。これは、ＤＲβ鎖ポリペプチドの全てと相互作用する単一のα鎖ポリペプチドを有するＨＬＡ−ＤＲにおいて特に当てはまる。よって、ＤＲβ１ドメインを含むポリペプチドを伴う処置に現在求められているように、ＤＲα１ドメインポリペプチドはＨＬＡ分類の必要がなく、全ての個体に投与し得ると考えられている。その他のＨＬＡ細分類に関しては、α及びβの対立遺伝子の両方ではなく、むしろαドメイン対立遺伝子の細分類のみが必要になる。また、β１ドメインを含むポリペプチド（例えばβ１α１ポリペプチド）よりもサイズが小さいため、開示されたＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドはより早く安く大量に生成できる。αドメインのフラグメントは合成ペプチドとして生成でき、生産の容易性及び速度がさらに増す。
【００１７】
マウスの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の処置におけるＭＨＣクラスＩＩβ１α１ポリペプチド及びα１ドメインポリペプチドの効果は、下記実施例に示されるように、ＣＤ７４をダウンレギュレーションする予想外の能力と密接に相関する。よって、ＣＤ７４レベル（例えばＣＤ７４発現又は活性）はＭＨＣクラスＩＩβ１αポリペプチド又はＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドで処置した被験体における処置の効果を示すマーカーとして利用し得る。同様に、ＣＤ７４レベルはＭＨＣクラスＩＩβ１α１ポリペプチド又はＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドを有する被験体への処置を最適化（例えば用量を最適化又は調節）するのに利用し得る。
【００１８】
＜Ｉ．略語＞
ＡＰＣ  抗原提示細胞
ＣＤＩ  累積疾患指数
ＥＡＥ  実験的自己免疫性脳脊髄炎
ＨＬＡ  ヒト白血球抗原
ＭＢＰ  ミエリン塩基性タンパク質
ＭＩＦ  マクロファージ遊走阻止因子
ＭＨＣ  組織適合性主複合体
ＭＯＧ  ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質
ＰＢＭＣ  末梢血単核球
ｐＭＨＣ  部分的ＭＨＣ（β１α１）ポリペプチド
ＰＬＰ  プロテオリピッドタンパク質
ＲＴＬ  組み換え型Ｔ細胞受容体リガンド
【００１９】
＜ＩＩ．用語＞
特に明記のない限り、技術用語は、慣例的用法に従って使用される。分子生物学の一般的な用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９４  （ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）によって出版された、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｖ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，  １９９４  （ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）によって出版された、Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、およびＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９５  （ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）によって出版された、Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ  （ｅｄ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅに見出され得る。
【００２０】
他に定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本明細書に開示される主題が属する当該技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明確に明示していない限り、複数の指示物を含む。同様に、語「または」は、文脈が他に明確に明示していない限り、「および」を含むように意図される。従って、「Ａ又はＢを含む」はＡ、又はＢ、あるいはＡ及びＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）および分子量の値（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ  ｖａｌｕｅ）は、おおよそであり、説明のために提供されることが、さらに理解されるべきである。本明細書において記載されるものと類似または等価の方法および材料は、本開示の実施または試験において用いることができるが、好適な方法および材料は、以下に記載される。
【００２１】
同定される全ての特許および他の刊行物は、説明および開示を目的として本明細書において引用によってその全てが組み込まれる。本明細書中に記載される全てのＧｅｎｂａｎｋ受入番号は、２０１２年１月６日のＧｅｎＢａｎｋに示されるように引用によってその全てが組み込まれる。不一致（ｃｏｎｆｌｉｃｔ）である場合、用語の説明を含む本明細書が制御するであろう。加えて、材料、方法及び実施例は例示的であるのみであり、限定することを意図していない。
【００２２】
開示の様々な実施形態の説明を容易にするために、以下に特定の用語の説明が提供される：
【００２３】
抗原：動物へと注入または吸収される組成物を含む、動物において抗体の生成またはＴ細胞反応を刺激し得る化合物、組成物、または物質。抗原は、異種免疫原によって誘発されたものを含む、特異的な体液免疫または細胞免疫の生成物と反応する。用語「抗原」は、すべての関連する抗原エピトープを含む。「エピトープ」又は「抗原決定基」は、Ｂ及び／又はＴ細胞が反応する抗原上の部位を指す。１つの実施形態において、エピトープがＭＨＣ分子との接合において存在する場合、Ｔ細胞はエピトープに反応する。エピトープは隣接アミノ酸又はタンパク質の三次フォールディングによって並列となる非隣接アミノ酸の両方から形成され得る。隣接アミノ酸から形成されたエピトープは典型的に変性溶媒への暴露でも保持される一方、三次フォールディングによって形成されるエピトープは典型的に変性溶媒による処置で失われる。エピトープは独特な立体構造を持つ、典型的に少なくとも３つの、通常はより多い少なくとも８つのアミノ酸（例えば約８−５０又は８−２３のアミノ酸）を含む。エピトープの立体構造を決定する方法は例えばＸ線結晶構造解析及び二次元核磁気共鳴を含む。
【００２４】
抗原は組織特異的抗原又は疾患特異的抗原であっても良い。これらの用語は組織特異的抗原が疾患特異的抗原でもあり得るため、排他的なものではない。組織特異的抗原は１つ以上の組織で発現することができ、例えば限定されないが中枢又は末梢神経系で発現する抗原である。
【００２５】
ＣＤ７４：ＣＤ７４分子、主要組織適合複合体、クラスＩＩ不変鎖又はＩｉとしても知られている。ＣＤ７４は免疫応答のためのシャペロン制御抗原提示である。マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）の細胞表面受容体でもある。
【００２６】
ＣＤ７４の核酸及びタンパク質配列は公的に入手可能である。例えばＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１０２５１５８、ＮＭ＿００４３５５及びＮＭ＿００１０２５１５９は例示的なヒトＣＤ７４核酸配列を開示しており、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０２０３２９、ＮＰ＿００４３４６、ＮＰ＿００１０２０３３０は例示的なヒトＣＤ７４タンパク質配列を開示している。同様に、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１０４２６０５及びＮＭ＿０１０５４５は例示的なマウスＣｄ７４核酸配列を開示しており、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０３６０７０及びＮＰ＿０３４６７５は例示的なマウスＣｄ７４タンパク質配列を開示している。これらの配列の各々は２０１２年１月６日のＧｅｎＢａｎｋに示されるように引用によってその全てが組み込まれる。
【００２７】
保存的変異体：アミノ酸残基の、類似した生化学的特性を有する別のアミノ酸残基との置換。「保存的」アミノ酸置換は、ＭＨＣクラスＩＩα１ポリペプチドのようなＭＨＣクラスＩＩポリペプチドに実質的に影響しない又は活性を減少させない置換である。ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、５または１０の保存的置換などの、１−１０の保存的置換、２−５の保存的置換、４−９の保存的置換を含むことができる。保存的置換の具体的な、限定しない例は、以下の例を含む：
【００２８】
【表１】
0006364352.tif 000002
【００２９】
対照：「対照」は実験的なサンプルとの比較に使用されるサンプル又は基準を指す。幾つかの実施形態において、対照は健康な被験体又は健康な被験体の集団から得られたサンプルである。他の実施形態において、対照は歴史的対照又は標準的基準値あるいは値の範囲（例えば以前に試験された対象サンプル、例えばベースライン又は通常値を表すサンプルの群、例えば健康な被験体のＣＤ７４発現又は活性のレベル）である。さらなる例において、対照は処置前に被験体から得られたもの（例えばＭＨＣクラスＩＩβ１α１ポリペプチド又はＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドによる処置前のＣＤ７４発現又は活性レベル）である。
【００３０】
ドメイン：ポリペプチドまたはタンパク質のドメインとは、特定の機能に一致し得るアミノ酸配列の独立した部分である。例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子を構成するαおよびβポリペプチドは、それぞれ２つのドメインα１、α２およびβ１、β２を有することがそれぞれ認められている。これら各分子の種々のドメインは典型的に、アミノ酸配列の連結により結合されている。１つの実施態様において、リンカーまたは隣接ドメインのすべてまたは一部を含むように配列を伸長して、全ドメイン配列を組換え分子内に含める。例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子のα１ドメインを選択する場合、選択する配列は一般にα鎖のアミノ酸残基１位から全α１ドメインにわたって伸長し、アミノ酸残基約７６〜９０（α１ドメインとα２ドメインの間に位置するα１ドメインのカルボキシ末端）に位置するリンカー配列のすべてまたは一部を含むことになる。種々のＭＨＣ分子ドメインの正確なアミノ酸番号は哺乳動物の種に応じて、および種内の遺伝子のクラス間で異なる。組換え分子に使用するための配列を選択する上で重要な局面は、アミノ酸番号に基づく正確な構造定義よりもむしろドメイン機能の維持である。当業者であれば、ドメイン機能は、選択したドメインの全アミノ酸配列よりも幾分少ないものを用いても維持され得ることを理解すると思われる。例えば、ドメイン機能に影響を及ぼすことなく、α１ドメインのアミノ末端またはカルボキシ末端でいくつかのアミノ酸を削除することができる。
【００３１】
選択した特定ドメインの機能活性は、例えばＴ細胞増殖アッセイ法及び／又はＣＤ７４結合アッセイ法を用いて、本開示によって提供されるＭＨＣクラスＩＩポリペプチド（例えば、α１又はβ１α１ポリペプチド）の状況で評価することができる。
【００３２】
効果的な量：疾患又は疾病の進行を阻害する、軽減する、あるいは疾患又は疾病によって引き起こされる症状を緩和するのに十分な特定の化合物の用量又は量である。例えば、これは炎症性及び／又は自己免疫障害のような障害を処置又は阻害するのに必要な、開示されたＭＨＣ分子の量又は用量であり得る。１つの実施形態において、効果的な量は単独で、又は１つ以上の治療剤とで被験体において必要な反応、例えば炎症性又は自己免疫性障害あるいは他の疾患又は障害の処置あるいは阻害を誘発する量である。
【００３３】
炎症：炎症性物質を隔離する働きをする、組織への損傷により誘発される局所的な防御反応である。炎症は、病原体、損傷を受けた細胞又は刺激物のような有害な刺激への血管組織の複雑な生物学的反応によって統合（ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅｄ）される。これは有害な刺激を取り除くため及び組織の治癒過程を開始するための、生物による防御しようとする試みである。炎症性反応は、組織的に又は炎症部位で局所的に、のいずれかにおける白血球の蓄積で特徴づけられる。炎症性反応は当該技術分野においてよく知られている様々な方法、例えば白血球数、多形核好中球（ＰＭＮ）数、血管増強化学発光法のようなＰＭＮ活性の度合いの測定方法、存在するサイトカインの量の測定方法によって測定されても良い。一次的な炎症性障害は、炎症自体によって引き起こされる障害である。二次的な炎症性障害はその他の障害の結果としての炎症である。炎症は、限定されないが関節リウマチ、変形性関節症、炎症性肺疾患（慢性閉塞性肺疾患を含む）、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む）、歯周病、リウマチ性多発筋痛、アテローム性動脈硬化、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、ショーグレン症候群、喘息、アレルギー性鼻炎、及び皮膚疾患（皮膚筋炎及び乾癬を含む）等を含む多くの炎症性疾患につながる。炎症性要素（限定されないが多発性硬化症を含む）を含む自己免疫障害も炎症性障害と考えられている。
【００３４】
疾患を予防する（防ぐ）または処置する：疾患を「予防する（防ぐ）」とは、例えば自己免疫疾患または神経変性疾患などの疾患になりやすい傾向にあることがわかっている人において、疾患の完全な発症を抑制することを指す。疾患の予防は、例えば疾患又は障害を有するあるいは疾患又は障害が進行するリスクがある被験体において、疾患の部分的な予防から実質的な完全な予防（阻止）までの範囲に及び得る。幾つかの実施形態において、用語「予防する（防ぐ）」は疾患の発病又は進行を減少させるあるいは遅らせることを指す。疾患又は障害を阻害又は処置する薬学的化合物の効果的な量で処置される被験体は、例えば家族歴、あるいは疾患又は障害が進行するリスク因子を基礎としたそのような障害の標準診断技術によって同定される。一方「処置」とは、疾患または病的状態の徴候または症状が発症し始めた後に、これを改善する治療的介入を指す。
【００３５】
単離された：「単離された」生物学的成分（例えば核酸、ペプチド又はタンパク質）は、その生物学的成分が天然に存在する生物の細胞中の他の生物学的成分、すなわち他の染色体ならびに染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、並びにタンパク質から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸、ペプチド及びタンパク質はしたがって、標準的な精製法によって精製された核酸及びタンパク質を包含する。この用語はまた、宿主細胞内で組換え発現によって調製されたおよび化学合成された核酸、ペプチド及びタンパク質も包含する。
【００３６】
リンカー：  ２つの分子（例えば２つのポリペプチドドメイン）を共有結合する分子である。リンカー（ペプチドリンカー又は化学的リンカー）は本開示の組み換え型ＭＨＣに含まれ得、例えばα１ドメイン及び抗原ペプチドの間に含まれ得る。ペプチドリンカー配列は一般に２〜２５アミノ酸長であって当技術分野において周知であり、これにはＣｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）に記載されているグリシン（４）−セリンスペーサーが含まれるが、これに限定されるわけではない。同様に、化学的リンカー（例えばチオール結合又は架橋剤）が当該技術分野において周知である。
【００３７】
ＭＨＣクラスＩＩ：ＭＨＣクラスＩＩ分子は、非共有結合した２つのタンパク質、α鎖及びβ鎖から形成される。α鎖はα１及びα２ドメインを含み、β鎖はβ１及びβ２ドメインを含む。抗原が適合する裂け目（ｃｌｅｆｔ）は、α１及びβ１ドメインの相互作用によって形成される。α２及びβ２ドメインは、α及びβ鎖をＡＰＣの細胞膜の中に固定する膜貫通型Ｉｇフォールド様ドメインである。抗原と結合した場合の（及び適切な共刺激シグナルの存在下で）ＭＨＣクラスＩＩ複合体はＣＤ−４Ｔ細胞を刺激する。ＣＤ−４Ｔ細胞の主要な機能は、炎症性反応を開始し、免疫系の他の細胞を制御し、抗体合成のためにＢ細胞へ助けを提供することである。
【００３８】
薬学的に許容される担体：薬学的に許容される担体は、従来の担体である。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  １５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９７５）  には、本明細書中に開示のタンパク質の薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている。
【００３９】
ポリペプチド：モノマーがアミド結合によって一緒に連結されるアミノ酸残基であるポリマー。アミノ酸がアルファアミノ酸であるときに、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のいずれかが使用され得、Ｌ−異性体が好ましい。本明細書に使用されるような、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」又は「ペプチド」は、任意のアミノ酸配列を包含し、糖タンパク質などの修飾された配列を含むように意図される。用語「ポリペプチド」、「タンパク質」又は「ペプチド」は、自然発生のタンパク質に加え、組み換えで又は合成的に生成されるものも包含するように特に意図される。用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、グリコシル化、リン酸化又はユビキチン化されたもののような自然発生の修飾された形態のタンパク質を含むことを留意しなければならない。
【００４０】
精製した：用語「精製した」は、絶対的な純度を必要とせず、むしろ、相対語として意図される。したがって、例えば、精製したペプチド調製物は、ポリペプチド又はタンパク質が、細胞または調製物内のその環境、例えば細胞中又は調製物中におけるポリペプチド又はタンパク質よりも濃縮された調製物である。好ましくはタンパク質又はペプチドが、調製物の総ペプチド又はタンパク含量の少なくとも５０％を示すように調製物は精製される。幾つかの実施形態において、精製された調製物はその少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上のタンパク質又はペプチドを含む。
【００４１】
組み換え型：組み換え型の核酸またはポリペプチドは、自然発生でない配列を有するか、または２つ以上のその他の分離した配列の断片の人為的な組み合わせによって作られる配列を有するものである。この人為的な組み合わせは、化学合成、またはより一般には、核酸の分離した断片の人為的操作、例えば、遺伝子工学手法によってしばしば達成される。
【００４２】
サンプル：被験体から得られる核酸（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む））、タンパク質又はこれらの組み合わせを含む生物学的試料。例は限定されないが、末梢血、微細針吸引物、尿、唾液、組織生検、手術標本、及び剖検材料を含む。１つの例において、サンプルは血液サンプル（例えば血液、血清のような血液の誘導体及び画分）又は単離されたあるいは精製された細胞の集団（例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ＰＢＭＣ、リンパ球等の部分的に単離された又は部分的に精製された細胞の集団）を含む。
【００４３】
配列同一性：２つの核酸配列、又は２つのアミノ酸配列間の類似性は、配列間の類似性によって表され、配列同一性とも呼ばれる。配列同一性は、同一性（または類似性もしくは相同性）のパーセンテージによって評価されることが多い。パーセンテージが高いほど２つの配列の類似性が高い。
【００４４】
比較のための配列アライメントの方法は、当技術分野ではよく知られている。様々なプログラム及びアライメントアルゴリズムが以下に記載されている：Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，  １９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３，  １９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，  １９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ，  Ｇｅｎｅ，  ７３：２３７−２４４，  １９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ，  Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．５：１５１−１５３，  １９８９；Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６，  １０８８１−９０，  １９８８；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８，  １５５−６５，  １９９２；  及び  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４：３０７−３３１，  １９９４。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３−４１０、１９９０年）  は、配列アライメント法および相同性計算の詳細な考察を提示している。ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  （ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３−４１０、１９９０年）  は配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連して用いるために、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ、メリーランド州ベゼスタ）  を含むいくつかの供給源から、およびインターネット上で入手可能である。
【００４５】
高い度合いの配列同一性を示さない核酸配列は、類似のアミノ酸配列をコードするとしても遺伝子コードの縮重による。核酸配列の変化は、実質的に同じタンパク質をコード化する複数の核酸分子を生成するためのこの縮重によってもたらされると理解される。
【００４６】
被験体：ヒトおよびヒト以外の哺乳動物の両方を含むカテゴリーである、多細胞の脊椎生物。
【００４７】
＜ＩＩＩ．ＭＨＣクラスＩＩα１ポリペプチド＞
本明細書中に開示されているのは、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメイン又はそのフラグメントを含み、ＭＨＣクラスＩＩα２、β１又はβ２ドメインを含まない単離されたポリペプチドである。哺乳動物のＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖のタンパク質のアミノ酸配列に加え、これらのタンパク質をコード化する核酸も同様に、当該技術分野に周知であり、ＧｅｎＢａｎｋ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を含む多数のソースから入手可能である。例示的な配列は、Ａｕｆｆｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３０８：３２７−３３３，  １９８４（ヒトＨＬＡ  ＤＱ  α）；Ｌａｒｈａｍｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：７３１３−７３１７，  １９８３  （ヒトＨＬＡ  ＤＱ  β）；  Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：３５４３−３５４７，  １９８３  （ヒトＨＬＡ  ＤＲ  α）；  Ｔｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ４：２８３９−２８４７，  １９８５  （ヒトＨＬＡ  ＤＲ  β）；  Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：７５１５−７５２８，  １９８５  （ヒトＨＬＡ  ＤＰ  α）；  Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：１６０７−１６２１，  １９８５  （ヒトＨＬＡ  ＤＰ  β）；  Ｓｙｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７：３９８５，  １９８９  （ラットＲＴ１．Ｂ  α）；  Ｓｙｈａ−Ｊｅｄｅｌｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １０８９：４１４−４１６，  １９９１  （ラットＲＴ１．Ｂ  β）；  Ｂｅｎｏｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：５３４−５３８，  １９８３  （マウスＩ−Ａ  α）；  Ｅｓｔｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：３５９４−３５９８，  １９８６  （マウスＩ−Ａ  β）において提供され、それらすべては、引用によって本明細書に組み込まれる。追加のＭＨＣクラスＩＩα及びβ鎖ポリペプチドは当業者によって、例えばＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース（ワールド  ワイド  ウェブ上のｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／で入手可能）のような公的なデータベースから同定することができる。
【００４８】
幾つかの実施形態において、開示されたポリペプチドは例えばＤＲ−α１、ＤＰ−α１、ＤＱ−α１、ＤＭ−α１又はＤＯ−α１ドメイン、あるいはこれらの部分のようなＭＨＣクラスＩＩαＩドメインを含む。特定の実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインはヒトＨＬＡ−ＤＲＡポリペプチドである。α１ドメインは哺乳動物ＭＨＣクラスＩＩα鎖タンパク質において明確に定義されている。幾つかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩα鎖は、ポリペプチドの輸送に関わり、成熟したαポリペプチドを生成するためにタンパク質分解的に除去されるリーダー配列を含む。α１ドメインは一般的に約１−９０残基の成熟（タンパク質分解的に加工した）α鎖を含むとみなされる。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質のα１及びα２ドメイン間の天然のペプチドリンカー領域は、考慮中の特定のα鎖に依存して、成熟α鎖の約アミノ酸７６から約アミノ酸９３までに及ぶ。例示的なＭＨＣクラスＩＩαポリペプチドが本明細書中に提供される（例えば配列番号：  １−４９）。したがって、α１ドメインは成熟α鎖のアミノ酸残基約１−９０を含み得るが、当業者はこのドメインのＣ末端の切除は正確に定義される必要がなく、例えば成熟α鎖のアミノ酸残基７０−１００の任意の点で起こりうることを認識するだろう。幾つかの例において、α１ドメインは成熟したＭＨＣクラスＩＩαドメインのアミノ酸１−７０、１−７１、１−７２、１−７３、１−７４、１−７５、１−７６、１−７７、１−７８、１−７９、１−８０、１−８１、１−８２、１−８３、１−８４、１−８５、１−８６、１−８７、１−８８、１−８９、１−９０、１−９１、１−９２、１−９３、１−９４、１−９５、１−９６、１−９７、１−９８、１−９９又は１−１００を含む。他の例において、α１ドメインは完全長のＭＨＣクラスＩＩαポリペプチド（例えば本明細書中に開示された配列番号：  １−４９）の約２０−１２０残基（例えば残基約２０−１００、２４−１１０、２４−１０９、２５−１００、２５−１０９、２６−１１０、２６−１０９、３０−１２０、３２−１２０、３２−１１５、２６−９０、２６−８５、２６−８４又は他の重複領域）を含む。幾つかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインはＮ−末端メチオニンを含まないが、例えば細菌、酵母、又は哺乳動物システムにおける発現の結果としてＮ−末端メチオニンは存在し得る。
【００４９】
さらなる例において、α１ドメインは５’及び／又は３’末端の幾つかのアミノ酸の欠失又は追加、例えば約１−１０アミノ酸の追加又は欠失、例えば５’及び／又は３’末端の１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０アミノ酸の追加又は欠失、又はこれらの組み合わせ（例えば一端の欠失及び他端の追加）を含み得る。α１ドメインの組成物も、問題になっている哺乳動物及び特定のα鎖に依存してこれらのパラメーターの範囲外で変化し得る。当業者は、アミノ酸の正確な数的パラメーターはドメイン機能（例えばＣＤ７４結合又はダウンレギュレーション）の維持ほど重要ではないことを理解するだろう。
【００５０】
他の例において、α１ドメインポリペプチドは、例えばＣＤ７４に結合できる、及び／又はＣＤ７４の発現又は活性を減少させるα１ドメインの一部のようなα１ドメインの一部を含む又はからなる。例えば、ＭＨＣクラスＩＩα１ポリペプチドは成熟ＨＬＡ−ＤＲＡポリペプチドのアミノ酸３８−５８（例えばＫＫＥＴＶＷＲＬＥＥＦＧＲＦＡＳＦＥＡＱＧ、配列番号：１０９）、又はその一部（例えば５以上の隣接アミノ酸、例えば５−１６、８−１５、８−１０又は１２−１５の隣接アミノ酸）、あるいはＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＭ又はＨＬＡ−ＤＯポリペプチドの相同領域を含み得る又はからなり得る。例示的なアライメントは図１９に示す。当業者は、例えば多重整列ツールを用いて他のＭＨＣクラスＩＩαドメインポリペプチドの相同領域を同定できる。
【００５１】
幾つかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩαポリペプチドは、配列番号１−４９として説明されたアミノ酸配列を含む又はからなる。追加の実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩαポリペプチドは、配列番号１−４９として説明されたアミノ酸配列又はそのフラグメントの１つと少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の配列を有する。例示的な配列は、インターネット上ですぐに利用可能なコンピュータプログラム及び本明細書中で説明されるアミノ酸配列を使用して得ることができる。幾つかの実施形態において、ポリペプチドはＣＤ７４に結合する等のＭＨＣクラスＩＩα１ポリペプチドの機能を保持する。例示的なＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドは表２及び表３に示されているものを含む。
【００５２】
【表２】
0006364352.tif 000003
【００５３】
【表３】
0006364352.tif 000004
【００５４】
ＭＨＣクラスＩＩα１ポリペプチドの一次アミノ酸配列の小規模な修飾は、本明細書中に記載されている修飾していない対応するポリペプチドと比較して実質的に同等の活性を有するペプチドを結果として生じる。そのような修飾は、部位特異的変異によるもの等の意図的なもの、又は自然発生したものであり得る。これらの修飾によって生成された全てのポリペプチドが本明細書中に含まれる。したがって、ＭＨＣクラスＩＩα１ポリペプチドの特定の限定しない例は、α１ポリペプチドの保存的変異体（例えば、保存的アミノ酸置換、例えば１以上の保存的アミノ酸置換、例えば１−１０の保存的置換、２−５の保存的置換、４−９の保存的置換、例えば１、２、５又は１０の保存的置換）である。例示的な保存的置換のリストは上記に提供される。例えば配列番号：１−４９又はそのフラグメントで示されるアミノ酸配列の置換は、これらのリストに基づいて行うことができる。
【００５５】
α１ドメインをコードする核酸分子は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅のような標準的な手段によって生成し得る。α１ドメインのオープンリーディングフレームを増幅するためのプライマーを設計するための標準的なアプローチは、例えば問題になっている哺乳類種から調製されたｃＤＮＡライブラリを含み、そのようなライブラリは市販されている、又は標準的な方法で調製し得る。したがって、例えばα１ドメインポリペプチドをコードするコンストラクトは、α１ドメインをコードする領域の５’及び３’末端に対応するプライマーを使用したＰＣＲによって生成され得る。ＰＣＲ増幅に続き、増幅された核酸分子は標準的なクローニングベクターにクローン化し得る。幾つかの実施形態において、例えば抗原決定基の便利なクローニング又は連結を容易にするために（後述）、α１ドメインを増幅するのに使用した１つ又は両方のプライマーは、α１ドメインをコードするフラグメントが増幅及び選択された制限酵素で消化した後、他の核酸とすぐにライゲートできるように適切な制限酵素部位を含み得る。
【００５６】
幾つかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドは原核又は真核細胞において核酸コンストラクトから発現する。ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドを発現する核酸コンストラクトは、タンパク質を発現する細胞のタイプによって選択されたプロモーター、エンハンサー、及び３’制御領域のような制御要素も含み得る。コンストラクトは、選択された細胞のタイプにおいてＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドを発現するのに適切なベクターに導入する。
【００５７】
ポリペプチドの発現及び精製のための多くの原核及び真核細胞システムが知られている。例えば、ポリペプチドをコードするコンストラクトの上流に強力で調節されたプロモーターおよび有効なリボソーム結合部位を置くことによって、原核細胞中で異種ポリペプチドを産生することができる。適当なプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）、ファージＴ７およびλＰＬプロモーターが含まれる。細菌において異種タンパク質を産生するための方法およびプラスミドベクターが、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  １９９２  （ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ２０００）；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９９に記載されている。
【００５８】
大量のタンパク質を発現するのに適した原核細胞には、大腸菌および枯草菌が含まれる。しばしば、高レベルで発現されたタンパク質が不溶性の封入体において認められる。これらの凝集体からタンパク質を抽出する方法がＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１、１５章参照）に記載されている。原核細胞におけるＭＨＣポリペプチドの組換え発現は、別法として融合タンパク質の最適な発現と精製のために設計された市販のシステムを用いて都合よく得ることもできる。このような融合タンパク質は、一般に精製を容易にするタグを含む。このようなシステムの例には、限定されないが、ｐＭＡＬタンパク質融合および精製システム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）、ＧＳＴ遺伝子融合システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、およびｐＴｒｃＨｉｓ発現ベクターシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）が含まれる。追加のシステムはＨｉｓ６−タグ（例えばＲｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）又はストレプタビジン結合ペプチド（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を含む。例えば、ｐＭＡＬ発現システムは、発現したタンパク質にマルトース結合タンパク質を付加するベクターを利用する。融合タンパク質は大腸菌中で発現され、これをアミロースカラムを用いて細胞粗抽出物から精製する。必要があれば、第Ｘａ因子などの適当なプロテアーゼを用いた処理によって、マルトース結合タンパク質ドメインを融合タンパク質から切断することができる。次いで、第二のアミロースカラムを通すことによって、マルトース結合フラグメントを調製物から除去することができる。
【００５９】
ＭＨＣクラスＩＩα１ポリペプチドはまた、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）によって生産されているピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、バキュロウイルスおよびシンドビス発現システムを含む、真核細胞発現システムにおいても発現されうる。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、サル腎臓（ＣＯＳ）、ＨｅＬａ、スポドプテラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、およびサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの真核細胞も、ＭＨＣクラスＩＩα１ポリペプチドを発現するために用いることができる。これらの細胞において用いるのに適した調節領域には、哺乳動物の場合にはＣＭＶ、アデノウイルスおよびＳＶ４０などからのウイルスプロモーターが含まれ、酵母細胞の場合には３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼのプロモーターが含まれる。
【００６０】
ＤＮＡの真核細胞、特にヒトまたは他の哺乳動物細胞への移入は、今日では通常の技法である。ベクターを純粋なＤＮＡとして、例えばリン酸カルシウムもしくはリン酸ストロンチウムによる沈降、電気穿孔法、リポフェクション、ＤＥＡＥデキストラン、微量注入法、プロトプラスト融合、または微量遺伝子銃によって、レシピエント細胞に導入する（トランスフェクション）。代替的に、核酸分子をウイルスベクターを用いた感染によって導入することもできる。例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルスを用いるシステムが開発されている。
【００６１】
哺乳動物細胞で産生されたＭＨＣクラスＩＩα１ポリペプチドを、タンパク質を上清中に遊離した後に抽出し、抗ＭＨＣ抗体を用いて調製した免疫親和性カラムを用いて精製することもできる。代替的に、ＭＨＣポリペプチドを、例えばβ−グロビンとのキメラタンパク質として発現させてもよい。その後、β−グロビンに対する抗体を用いてキメラタンパク質を精製する。次いで、β−グロビン遺伝子とＭＨＣクラスＩＩα１ポリペプチドをコードする核酸配列との間に設計した対応するプロテアーゼ切断部位を用いて、翻訳後に２つのポリペプチド断片をお互いに分離する。β−グロビンキメラタンパク質生成のための一つの有用な発現ベクターはｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）である。
【００６２】
原核細胞においてＭＨＣポリペプチドを発現させると、グリコシル化されていないポリペプチドを生じることになる。天然のグリコシル化標的部位でのポリペプチドのグリコシル化は、哺乳動物細胞などの適当な真核細胞発現システムでポリペプチドを発現させることにより達成することができる。他の例において、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインは、例えば１以上のＮ−連結グリコシル化、リン酸化、又は他の修飾のような必要な翻訳後修飾部位を含むように修飾され得る（例えば部位特異的変異を用いて）。
【００６３】
発現したタンパク質の精製は、一般に６Ｍの尿素を含む塩基性溶液（一般にはｐＨ１０付近）中で実施する。次いで、精製したタンパク質の折り畳みは、中性ｐＨの緩衝溶液（一般にはおよそｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））に対する透析によって達成される。
【００６４】
＜ＩＶ．抗原決定基＞
幾つかの実施形態において、開示された方法は共有結合した抗原決定基を含むＭＨＣクラスＩＩ分子（例えばＭＨＣクラスＩＩα１ドメイン）を利用する。当技術分野ではよく知られているとおり（例えば、米国特許第５，４６８，４８１号参照）、ＡＰＣ表面のＭＨＣ複合体における抗原の提示は一般に、完全な抗原性ペプチドを必要としない。むしろ、β１とα１ドメイン（ＭＨＣ  ＩＩの場合）またはα１とα２ドメイン（ＭＨＣ  Ｉの場合）の間の溝にあるペプチドは一般に、完全な抗原性ペプチドの小さい断片である。Ｊａｎｅｗａｙ  ＆  Ｔｒａｖｅｒｓ  （１９９７）に論じられているとおり、ＭＨＣクラスＩ分子のペプチド溝に位置するペプチドは、結合ポケットのサイズによって制約を受けており、一般的にはアミノ酸８個〜１５個の長さ（例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５アミノ酸）、より一般的にはアミノ酸８個〜１０個の長さである（しかし、考えられる例外については、Ｃｏｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４を参照のこと）。これとは対照的に、ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド溝に位置するペプチドは、このような制約を受けないためにサイズが大きいことが多く、一般的には少なくともアミノ酸３−５０個の長さ（例えば８−３０、１０−２５又は１５−２３アミノ酸の長さ）がある。幾つかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド溝に位置するペプチドは、１５−２３アミノ酸の長さである。幾つかの実施形態において、開示された組成物は、例えばＭＨＣクラスＩＩα１ドメインと共有結合した抗原ペプチドのような抗原ペプチドを含む。ペプチドフラグメントは、例えばペプチド合成機械の使用のような標準的な手段で調製される。
【００６５】
幾つかの実施形態において、抗原決定基は、ミエリンタンパク質（例えばミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）またはプロテオリピッドタンパク質（ＰＬＰ））など神経細胞又は中枢神経系タンパク質からのペプチドを含む。他の実施例において、抗原決定基は、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）アレスチン、フォスズシンまたはリカベリン等網膜タンパク質からのペプチドである。追加の抗原決定基は、タイプＩＩコラーゲン（コラーゲンＩＩ）、フィブリノゲン−α、ビメンチン、α−エノラーゼおよびヒト軟骨糖タンパク質−３９、α２グリアジンまたはインスリンからのペプチドを含む。いくつかの実施例において、抗原決定基はリン酸化、グリコシル化またはシトルリン化のような翻訳後修飾を含む。例示的な抗原ペプチドは表４に提供される。当業者は特定の疾患または疾病に関連する新たな抗原決定基を同定することができる。
【００６６】
【表４】
0006364352.tif 000005
【００６７】
いくつかの実施例において、発現されたペプチドにおいてα１ドメインのアミノ末端に抗原ペプチドが連結するように、抗原ペプチドはＭＨＣクラスＩＩα１ポリペプチドと、ＭＨＣクラスＩＩα１ポリペプチドをコードするコンストラクトの５’末端に選択された抗原をコードする核酸に操作可能に連結するよう共有結合している。他の実施例において、発現されたペプチドにおいてα１ドメインのカルボキシ末端に抗原ペプチドが連結するように、抗原ペプチドはＭＨＣクラスＩＩα１ポリペプチドと、ＭＨＣクラスＩＩα１ポリペプチドをコードするコンストラクトの３’末端に選択された抗原をコードする核酸に操作可能に連結するよう共有結合している。この結果を得るのに好都合な方法の１つは、抗原をコードする配列を、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインをコードする領域を増幅するのに使用するＰＣＲプライマーに組み込む方法である。いくつかの実施例において、リンカーペプチド配列をコード化する配列は、抗原ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ  α１ポリペプチドの間で含まれている。しかし、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインをコードする領域の５’末端（あるいは、３’末端）に抗原性ペプチドを正確にライゲートする必要はない。例えば、抗原をコードする領域は、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインをコードする領域の５’末端（あるいは、３’末端）の最初のいくつかのコドン内に（典型的には最初の１０以内に）、抗原をコードする領域を挿入し得る。
【００６８】
幾つかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインに対する抗原ペプチドの連結のための遺伝子システムは、異なる抗原ペプチドを有するＭＨＣクラスＩＩα１ドメインを多く生成する際に特に有用である。記載されたシステムはＭＨＣクラスＩＩα１ドメイン（例えば、α１ドメインの５’又は３’末端）に独自の制限部位が含まれている発現ベクターの構築を可能にする。そのようなコンストラクトと併用して選択された制限酵素部位によって挟まれた抗原をコードする領域をそれぞれ有する、抗原ペプチドをコード化する配列のライブラリを作製する。ＭＨＣクラスＩＩα１ドメイン内への特定の抗原を包含させることは、続いて（ａ）選択された制限酵素で抗原をコード化する領域を放出する工程、（ｂ）ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインコンストラクトを同じ制限酵素で開裂する工程、及び（ｃ）抗原をコード化する領域をＭＨＣクラスＩＩα１ドメインコンストラクトをライゲートする工程、によって単純に実行される。この方法で、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメイン‐ペプチド抗原コンストラクトの大多数を短時間で作製し、発現させることができる。
【００６９】
いくつかの実施例において、抗原はジスルフィド結合によってＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドに共有結合する。いくつかの実施例において、ジスルフィド結合は、ＭＨＣクラスＩＩαＩドメインポリペプチド中の自然発生のシステイン残基（例えば、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメイン中のシステイン残基）を利用して形成される。当業者は、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチド中の適切なシステイン残基を同定することができる。他の実施例において、ジスルフィド結合は、突然変異誘発によってＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチド中で導入されたシステイン残基などの、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチド中の非自然発生のシステイン残基を利用して形成される。
さらなる実施例において、ジスルフィド結合は、ペプチド抗原中の自然発生のシステイン残基を利用して形成される。さらなる実施例において、ジスルフィド結合は、突然変異誘発によってペプチド抗原において導入されたシステイン残基などの、ペプチド抗原中の非自然発生のシステイン残基を利用して形成される。
【００７０】
＜Ｖ．  障害を処置する又は阻害する方法＞
本明細書に記載されているのは、被験体の障害を処置する又は阻害する方法であって、限定されないが炎症性及び／又は自己免疫障害を含む。開示された方法はＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチド（例えばα１ドメインポリペプチド又は抗原と共有結合したα１ドメインポリペプチド）を被験体に投与する工程を含む。
【００７１】
幾つかの実施形態において、前記方法は、処置するための障害を有する被験体を選択する工程と、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチド又はＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドをコードする核酸の効果的な量を被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施例において、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインは、抗原決定基又はペプチド（上記議論されたものなど）に共有結合する。
【００７２】
幾つかの実施形態において、被験体は炎症性の及び／又は自己免疫性疾患または障害を有し、限定されないが以下を含む：全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、ウェゲナー肉芽腫症、炎症性腸疾患、多発性筋炎、皮膚筋炎、複数の内分泌腺の障害、シュミット症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、セリアック病、アジソン病、副腎炎、グレーブス病、甲状腺炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、悪性貧血、胃萎縮症、慢性肝炎、ルポイド肝炎、アテローム性動脈硬化症、初老期痴呆、脱髄症、多発性硬化症、亜急性皮膚エリテマトーデス、副甲状腺機能低下症、ドレスラ―症候群、重症筋無力症、自己免疫性血小板減少、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、疱疹状皮膚炎、円形脱毛症、類天疱瘡、強皮症、全身性進行性硬化症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着症、指虚血現象、食道蠕動運動低下、強指症および毛細血管拡張症）、成人で発症した真性糖尿病（タイプＩＩ糖尿病）、雄雌自己免疫性不妊症、強直性脊椎症、潰瘍性大腸炎、クローン病、混合性結合組織病、結節性多発動脈炎、全身性壊死性血管炎、若年性の発症関節リウマチ、糸球体腎炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎、グッドパスチャー症候群、シャーガス病、サルコイドーシス、リウマチ熱、喘息、反復流産、抗リン脂質抗体症候群、農夫肺、多形性紅斑、ポスト噴門切開術症候群、クッシング症候群、自己免疫性の慢性活動性肝炎、トリ愛好者肺、アレルギー性疾患、アレルギー性脳脊髄炎、中毒性表皮壊死症、脱毛症、アルポート症候群、歯槽骨炎、アレルギー性肺胞炎、線維化性肺胞炎、間質性肺疾患、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、輸血副作用、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、高安動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨細胞性動脈炎、回虫症、アスペルギルス症、センプター症候群（Ｓａｍｐｔｅｒ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、湿疹、リンパ腫様肉芽腫症、ベーチェット病、キャプラン症候群、川崎病、デング熱、脳脊髄炎、心内膜炎、心内膜心筋線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、乾癬、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、慢性の毛様体炎、異虹彩色性毛様体炎、フックス毛様体炎（Ｆｕｃｈ’ｓ  ｃｙｃｌｉｔｉｓ）、ＩｇＡ腎症、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、糸球体腎炎、移植片対宿主病、移植拒絶反応、ヒト免疫不全ウィルス感染、エコーウイルス感染症、心筋症、アルツハイマー病、パルボウイルス感染、風疹ウィルス感染、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染、ホジキンのおよび非ホジキンリンパ腫、腎細胞癌、多発性骨髄腫、イートン・ランバート症候群、再発性多発性軟骨炎、悪性黒色腫、クリオグロブリン血症、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、エプスタイン・バーウイルス感染、ルブラウイルスおよびエバン症候群。追加の炎症性疾患は変形性関節症、炎症性肺疾患（慢性閉塞性肺疾患を含む）、歯槽膿漏症、リウマチ性多発性筋痛、アテローム性動脈硬化症、全身性硬化症、アレルギー性鼻炎および皮膚障害（皮膚筋炎と乾癬を含む）等を含む。
【００７３】
他の実施形態において、被験体は網膜色素変性のような網膜変性、錐体杆体変性、レーベル先天黒内障または黄斑症（例えば加齢性黄斑変性、シュタルガルト様黄斑変性、卵黄様黄斑ジストロフィ（ベスト病）、マラチアレベンティニーズ（Ｍａｌａｔｔｉａ  Ｌｅｖｅｎｔｉｎｅｓ）（ドイン蜂巣網膜ジストロフィー（Ｄｏｙｎｅ’ｓ  ｈｏｎｅｙｃｏｍｂ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ））、糖尿病黄斑症、オカルト黄斑ジストロフィおよびセロファン黄斑症）のような網膜障害を有する。他の実施例において、網膜障害は、例えば自己免疫性網膜症、糖尿病性網膜症または血管性網膜症のような網膜症を含む。またさらなる実施例において、網膜障害は網膜剥離または緑内障を含む。網膜障害は進行性であっても（例えば網膜変性または緑内障）、急性（例えば網膜剥離）であってもよい。追加の実施例において、前記被験体はブドウ膜炎または視神経炎を有する被験体である。他の実施形態において、前記被験体は発作（例えば虚血性脳卒中または出血性卒中）があったものである。またさらなる実施例において、前記被験体は、物質依存を有する被験体であって、例えば物質依存によって誘発された認識機能障害又は神経心理障害を有する被験体である。
【００７４】
幾つかの実施形態では、被験体には、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインまたはその一部（例えばＣＤ７４に結合可能な、又はＣＤ７４の発現及び／又は活性を減少可能なα１ドメインの一部）を含む効果的な量の組成物が投与される。
本明細書に記載されているＭＨＣクラスＩＩα１ドメインの１つ以上（例えば２、３、４または５以上ＭＨＣクラスＩＩα１ドメイン）を含む医薬組成物は、選ばれた投与の特定の様式に依存して、適切な固体又は液体担体とともに処方され得る。本開示に役立つ薬学的に許容可能な担体および賦形剤は従来のものである。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｅｄｉｔｏｒ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ，  ２１版  （２００５）を参照されたい。
例えば、非経口製剤は通常、例えば水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水溶性のデキストロース、グリセロール等の薬学的に及び生理学的に許容可能な液体ビヒクルである注射可能な液体を含む。固形組成物（例えば、粉末剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態）に関して、従来の無毒な固形担体は、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、スターチまたはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中性な担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤などの無毒な補助剤、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンラウリン酸モノエステルを少量含むことができる。賦形剤は、例えばヒト血清アルブミンまたは血漿製剤など他のタンパクを質含むことができる。
【００７５】
医薬組成物の剤形は、選ばれた投与の様式によって決定される。例えば、注射可能な液体を加えて、局所、吸引、経口及び坐剤の製剤を使用することができる。局所製剤は目薬、軟膏剤、噴霧剤、貼付剤などを含むことができる。吸引製剤は液体で（例えば溶液または懸濁液）あってもよく、ミスト剤、噴霧剤などを含み得る。経口の製剤は液体（例えばシロップ剤、溶液又は懸濁液）又は固体（例えば粉末剤、丸剤、錠剤又はカプセル剤）であっても良い。坐剤は固体、ゲル剤、又は懸濁液形態であっても良い。固形組成物については、従来の無毒な固体の担体は医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、スターチまたはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。そのような剤形を調製する実際の方法は当業者に知られている又は明白である。
【００７６】
いくつかの実施例において、医薬組成物は、それらの意図した目的を達成する任意の手段によって投与されても良い。選択されたＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチド又はその一部（あるいはそのようなポリペプチドをコードする核酸）を投与するための量及びレジメンは、担当の臨床医によって決定される。治療の適用に効果的な量は、処置される疾病の性質および重症度、選択された特定のＭＨＣクラスＩＩα１ドメインまたはその一部、患者の年齢や状態および他の臨床的な因子に依存して変化するだろう。典型的には、用量範囲は、約０．１μｇ／ｋｇ（体重）から約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）までである。他の適切な範囲は、約１００μｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）まで、約５００μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）まで、又は約１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量を含む。服薬スケジュールは、タンパク質に対する被験体の感受性等多くの臨床的因子に依存して週に１回から１日に１回までの範囲で変化し得る。
服薬スケジュールの例は、約１ｍｇ／ｋｇを１か月に１回、２週に１回、週に１回、週に２回、週に３回又は１日に１回、約２．５ｍｇ／ｋｇの用量を、週に１回、週に２回、週に３回、又は１日に１回、約５ｍｇ／ｋｇの用量を、週に１回、週に２回、週に３回、又は１日に１回、約１０ｍｇ／ｋｇの用量を、週に１回、週に２回、週に３回、又は１日に１回、あるいは約３０ｍｇ／ｋｇの用量を、週に１回、週に２回、週に３回、又は１日に１回である。
【００７７】
１つ以上の開示されたＭＨＣクラスＩＩα１ドメイン分子を含む医薬組成物は、正確な用量を個体に投与するのに適しているユニット用量剤形に処方し得る。限定されない１つの特定の例において、ユニット用量は、約１ｎｇから約５ｇまで（例えば約１０μｇから約１ｇまで、又は約１０ｍｇから１００ｍｇまで）のＭＨＣＩＩα１ドメインを含むことができる。投与された活性化合物の量は、処置される被験体、病気の重症度および投与の方法に依存し、処方する臨床医の判断に任せるのが最適である。これらの範囲内において、投与される製剤は処置されている被験体において所望の効果を達成するのに効果的な量の有効成分の量を含む。
【００７８】
本開示の化合物は、例えば、局所、経口、筋肉内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮内、鞘内、皮下、眼内、吸引を介して、または坐剤を介して等様々な方法が有効である、ヒト又は他の動物の組織に投与し得る。１つの実施例において、化合物は被験体の皮下に投与される。別の実施例において、化合物は被験体の静脈内に投与される。投与の特定の様式および投与レジメンは、症例の詳細（例えば被験体、疾患、関連する疾患の状態及び処置が予防的なのか否か）を考慮に入れて臨床医によって選択される。処置は、数日、数カ月又は数年にもわたる、月に１回、週に２回、週に１回、１日に１回又は１日に数回の化合物の投与を伴い得る。
【００７９】
幾つかの実施形態において、開示されたＭＨＣクラスＩＩα１ドメイン分子は、局所適用のための不活性マトリックスに含み得る。いくつかの実施例において、製剤は、例えば硝子体内への注入等、眼に注入することができる。不活性のマトリックスの１つの例として、リポソームは卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）等のｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から調製され得る。カチオン性及びアニオン性リポソームを含むリポソームは、当業者に知られているような標準的な手順を使用して作製することができる。１つ以上のＭＨＣクラスＩＩα１ドメインを含むリポソームは、滴剤の形態又は水性基剤クリームの形態として局所的に適用することができる、又は眼内で注入することができる。局所適用のための製剤では、リポソーム・カプセル剤が眼表面からの損傷及び涙により分解するとともに、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインはゆっくり経時的に放出される。
眼内注入のための製剤では、リポソーム・カプセル剤は細胞の消化により分解される。これらの製剤は両方とも、被験体がＭＨＣクラスＩＩα１ドメインの実質的に一定の濃度に経時的に晒されることを可能にするので、遅延放出薬物送達システムという利点を備えている。１つの例において、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインは、ＤＭＳＯまたは以前に記載されるようなアルコール等有機溶媒に溶解でき、ポリ酸無水物、ポリ（グリコール）酸、ポリ（乳）酸、又はポリカプロラクトンポリマーを含むことができる。ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインは、インプラントのサイズ、形状および処方に依存して、眼の様々な部位に注入することができる送達システムおよび移植手順のタイプに含むことができる。適切な部位は限定されないが、前眼房、前上葉区、後眼房、後上葉区、硝子体腔、上脈絡膜腔、結膜下、上強膜、角膜内、上角膜および強膜を含む。
【００８０】
いくつかの実施例において、開示されたＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドの効果的な量（例えば治療上効果的な量）は、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチド、又は被験体における障害（炎症性の及び／又は自己免疫疾患など）を処置する又は阻害するのに必要な抗原（例えばミエリンタンパク質抗原、網膜抗原または上記で議論されたものなど他の抗原）を含むＭＨＣクラスＩＩαＩドメインポリペプチドの量であり得る。他の実施例において、治療上効果的な量の開示されたＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチド、又は物質依存（物質依存から結果として生じる認識機能障害又は神経精神障害など）により関係する網膜障害、発作または障害を処置する又は阻害するのに必要な抗原を含むＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドの量であり得る。
【００８１】
本開示は、障害の処置に役立つ１つ以上の他の薬剤と１つ以上の開示されたＭＨＣクラスＩＩα１ドメインの組み合わせを含む。いくつかの実施例において、本開示の化合物は限定されないが非ステロイド性抗炎症薬、コルチコステロイド、メトトレキサート、抗ＴＮＦ化合物、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｏｎｌａｔｅ）、アミノサリチル酸（ａｍｉｎｏｓｌｉｃｙｌａｔｅｓ）、抗生物質、インターフェロン、酢酸グラチラマー  、抗体療法（リツキシマブまたはミラツムマブなど）又は免疫抑制剤あるいは免疫調節物質の化合物を含み、炎症性または自己免疫障害のための１つ以上の治療の効果的な量で投与することができる。別の実施例において、本開示の化合物は限定されないが遺伝子療法、ビタミン又はミネラルサプリ（例えば、ビタミンＡ、Ｃ、及び／又はＥまたは亜鉛及び／又は銅）、抗血管新生療法（例えばラニビズマブまたはベバシズマブ）、光凝固、光力学療法、ルテイン又はゼアキサンチン、コルチコステロイドあるいは免疫抑制剤を含み、網膜障害のための１つ以上の治療の有効量と組み合わせて投与することができる。特定の疾患のための適切な併用療法は、当業者によって選択され得る。用語「組み合わせて投与」または「同時投与」は、活性剤の同時又は連続する投与を指す。
【００８２】
＜ＶＩ．処置を評価するまたは最適化する方法＞
本明細書に開示されているのは、被験体の疾患または、障害（炎症性または自己免疫傷害を含み、これらに限定されない）の処置の効果を評価する、または最適化する方法である。方法はＣＤ７４発現または活性レベルの測定をおよびＣＤ７４発現または活性レベルに基づいたＭＨＣクラスＩＩα１ドメイン（またはその一部）、ＭＨＣクラスＩＩβ１ドメイン、ポリペプチドまたはその組み合わせによる処置または処置の調節（例えば、投与量の増加あるいは減少）の効果の測定を含む。幾つかの実施例では、ＣＤ７４の発現は炎症性または自己免疫傷害を有する被験体で増加する（例えば炎症性または自己免疫傷害のない被験体と比較して）。
【００８３】
幾つかの実施形態では、方法はＭＨＣクラスＩＩα１ドメイン（またはその一部）、ＭＨＣクラスＩＩβ１ドメイン、またはその組み合わせ（β１α１ポリペプチド等）を含むポリペプチドにより処置された被験体における障害（上記セクションＶで議論されたもの等）に対する処置の効果の測定を含む。方法は被験体からのサンプルにおけるＣＤ７４の発現または活性レベルを測定することを含む。ＣＤ７４の発現または活性レベルは対照と比較され、そして処置の効果は測定される。幾つかの実施例では、処置はＣＤ７４の発現または活性レベルが対照以下である場合に効果的であると考えられる。他の実施例では、処置はＣＤ７４の発現または活性レベルが対照より大きい場合は次善（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌｌｙ）に効果的か効果的でないと考えられる。
【００８４】
他の実施形態では、方法は被験体における障害（上記セクションＶで議論されたもの等）に対する処置の効果を最適化することを含む。方法は傷害を有する被験体に対してＭＨＣクラスＩＩα１ドメイン（またはその一部）、ＭＨＣクラスＩＩβ１ドメインまたはそれらの組合せ（β１α１ポリペプチド等）を含むポリペプチドの投与する工程、および被験体からのサンプルにおけるＣＤ７４発現または活性のレベルを測定する工程を含む。ＣＤ７４の発現または活性のレベルは対照と比較され、その後、被験体に投与されるポリペプチドの投与量が測定される。幾つかの実施例では、ＣＤ７４発現の活性レベルが対照より大きいときポリペプチドの投与量は増加され得る。他の実施例では、ＣＤ７４の発現または活性のレベルが対照以下であるときポリペプチドの投与量は維持するか減少し得る。
【００８５】
さらなる実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメイン（またはその一部）、ＭＨＣクラスＩＩβ１ドメイン、またはその組合せ（β１α１ポリペプチド等）を含むポリペプチドを障害を有する被験体に投与するおよび被験体のサンプル中のＣＤ７４発現または活性レベルが対照より大きい場合に投与量を増加し、または被験体からサンプル中のＣＤ７４の発現または活性レベルが対照以下である場合に投与量を維持するか減少させることにより被験体の障害を処置するまたは阻害する方法を含む。
【００８６】
幾つかの実施例では、対照より大きいＣＤ７４発現または活性のレベル（例えば、統計的に対照より有意に大きい）は、被験体に続いて投与されたＭＨＣクラスＩＩポリペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドまたはその一部、あるいはＭＨＣクラスＩＩβ１α１ポリペプチド）の量または投与量を増加させる必要性を示す。他の実施例では、対照未満であるＣＤ７４の発現または活性のレベルは（例えば、統計的に対照より有意に小さい）、被験体に続いて投与されたＭＨＣクラスＩＩポリペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドまたはその一部、あるいはＭＨＣクラスＩＩβ１α１ポリペプチド）の量または投与量を維持するか減少させる必要性を示す。幾つかの実施例では、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩβαポリペプチド）の投与量は対照のＣＤ７４発現または活性レベルと同等のＣＤ７４発現または活性レベルを生産するように調節される。当業者により、測定されたＣＤ７４の発現または活性、疾患または、障害、被験体の疾病および他の因子に基づいて投与量を調節することができる（例えば、投与量を増加および減少させる）。幾つかの実施例では、投与量は調節され、そして、調整された用量の投与後、ＣＤ７４発現または活性レベルは測定される（例えば、調整された用量の投与の後、約１、２、３、４、５、６、７、１０、１４またはより後）。投与量はＣＤ７４の発現または活性のレベルに基づいて、再び維持するかあるいは調節され得る。これは、目的のＣＤ７４の発現または活性のレベルを達成するために、同様に疾患または障害の目的とする阻害を達成するために必要な回数繰り返され得る（例えば疾患または障害の症状の改善）。
【００８７】
対照はＣＤ７４の発現または活性レベルのために適切な任意の対照である。幾つかの実施形態では、対照は健康な被験体または健康な被験体の個体集団から得られたサンプルである。他の実施形態では、対照は、過去に用いられた対照または標準対照値、または値の範囲（以前に試験された対照試料、ベースラインまたは正常値を表わす一群のサンプル、健康な被験体におけるＣＤ７４の発現または活性のレベル等）である。幾つかの実施例では、対照は健康な被験体または健康な被験体群における参照値における、ＣＤ７４  ＲＮＡ（例えばＣＤ７４  ｍＲＮＡ）またはＣＤ７４タンパク質の発現レベルである（健康な被験体の個体集団中の平均のＣＤ７４レベルなど）。他の実施例では、対照は健康な被験体の活性レベル、健康な被験体または参照値からのサンプル中のまたは健康な被験体の個体集団のＣＤ７４の活性レベル等である（健康な被験体の個体集団中の平均のＣＤ７４活性レベルなど）。さらなる実施例では、対照は、未処置の被験体またはＭＨＣクラスＩＩβ１α１ポリペプチドまたはＭＨＣはＩＩα１ドメインポリペプチでの処置を開始前の被験体からのサンプルにおけるＣＤ７４発現または活性レベルである（例えば、同じ障害と同じ被験体または異なる被験体など）。他の実施例では、対照は、健康な被験体のコホート内でのＣＤ７４発現または活性レベルである（例えば年齢、性別、障害または他の臨床的な因子の１以上が一致した被験体のコホート）。
【００８８】
幾つかの実施形態では、サンプルは、ＭＨＣα１ドメイン、ＭＨＣクラスＩＩβ１ドメイン、またはその組み合わせを含むＭＨＣクラスＩＩポリペプチドの投与のようにＭＨＣクラスＩＩポリペプチドを投与された被験体に由来する。幾つかの実施例では、ポリペプチドはＭＨＣクラスＩＩα１ドメインを含み、ＭＨＣクラスＩＩα２、β１またはβ２ドメインを含まない（例えば本明細書に記載されたＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチド）。他の実施例では、ポリペプチドはα１ドメインのアミノ末端がβのカルボキシ末端に共有結合で結合される（例えば直接またはペプチドリンカーによって）ＭＨＣクラスＩＩβ１α１ドメインを含む。ＭＨＣクラスＩＩβ１α１ポリペプチドは以前に記載されている。例えば米国特許６，２７０，７７２号、米国出願公開番号２００５／０１４２１４２号、２００９／０２８０１３５号、２０１１／０２６２４７９号、２０１１／０００８３８２号、２０１１／０２１７３０８号、その各々の全体は引用により本明細書に組み入れられる。幾つかの実施例では、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドまたはＭＨＣＩＩβ１α１ポリペプチドはＭＨＣクラスＩＩポリペプチド、例えば共有結合でまたは非共有結合で結合された抗原測定基を含む。
【００８９】
＜ＣＤ７４の発現または活性レベルの測定＞
ＣＤ７４の発現または活性レベルを測定する方法は当業者に既知である。幾つかの実施例では、ＣＤ７４の発現の測定はＣＤ７４核酸またはタンパク質の発現（存在、欠如、または量等）の測定を含む。幾つかの実施例では、方法はＣＤ７４の１、２または３以上のアイソフォームの存在または量を測定することを含む（代替的にスプライシングされたアイソフォーム等）。他の実施例では、ＣＤ７４活性の測定は、例えばＣＤ７４活性により媒介されるか修飾される細胞または分子の事象のようなタンパク質の活性の測定を含む。
【００９０】
ＣＤ７４の発現または活性レベルの測定に適しているサンプルは、核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む））、タンパク質、またはその組み合わせを含む被験体から得られた生物標本を含む。実施例は限定されないが、末梢血、細針吸引液、尿、唾液、組織生検、外科標本および検死材料を含む。一つの実施例では、サンプルは血液サンプル（血液など；血清などの血液の派生物および画分）、または単離されたあるいは精製された細胞集団を含む（例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ＰＢＭＣ、リンパ球など、部分的に分離されたあるいは部分的に精製された細胞集団を含む）。幾つかの実施例では、サンプルは単球、Ｂ細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ７４＋細胞またはその２以上の組み合わせから基本的に成る、またはからなるサンプルを含む。
【００９１】
＜ＣＤ７４発現＞
遺伝子発現はＣＤ７４をコード化するＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の検出により評価し得る。
ＲＮＡは、市販のキットを含む当業者に既知の方法により被験体からのサンプル（血液サンプルなど）から分離され得る。ＲＮＡ抽出のための一般方法は技術分野において既知で、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９７）を含む分子生物学の標準的教科書に開示されている。パラフィン固定組織からのＲＮＡ抽出のための方法は例えば、Ｒｕｐｐ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋｅｒ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：５６−６０  （１９８８），  ａｎｄ  Ｄｅ  Ａｎｄｒｅｓ  ｅｔ  ａｈ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：４２−４４  （１９９５）に開示される。
【００９２】
遺伝子発現を測定する方法は、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づいた方法、ポリヌクレオチドのシークエンス解析に基づいた方法、およびプロテオミクスに基づいた方法を含む。当業者は、ＣＤ７４の遺伝子発現の測定法のために適切なプライマーに及び／又はプローブを得ることができる。幾つかの実施例では、サンプル中のｍＲＮＡ発現は、ノーザンブロッティングまたはｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション  （Ｐａｒｋｅｒ  ＆  Ｂａｒｎｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０６：２４７−２８３，１９９９）；ＲＮＡｓｅ保護アッセイ（Ｈｏｄ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：８５２−４，１９９２）；また逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓ  ｅｔ  ａｈ，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：２６３−４，１９９２）、定量的ＲＴ−ＰＣＴまたはＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲなどＰＣＲベースの方法を使用して定量化される。代替的に、ＤＮＡ二重螺旋、ＲＮＡ複合体、およびＤＮＡ‐ＲＮＡハイブリッド複合体または、ＤＮＡタンパク質複合体を含む特異的な複合体を認識することができる抗体を使用することができる。配列決定を基にした遺伝子発現解析のための代表的な方法は、遺伝子発現の連続分析（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＳＡＧＥ）および多量の並列シグネチャー配列による遺伝子発現解析（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＭＰＳＳ）を含む。一例では、ＲＴ−ＰＣＲはＣＤ７４発現を測定するために被験体と対照からサンプルでは例えば異なるサンプル中のｍＲＮＡのレベルを比較するために使用することができる。
【００９３】
誤差およびサンプリング間のサンプル多様性の影響を最小限にするために、内部標準を使用してＲＴ−ＰＣＲを行うことができる。理想的な内部標準は様々な組織に一定レベルに発現され、実験的な処置に影響されない。遺伝子発現のパターンを標準化するため一般に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨおよびβ−アクチンのｍＲＮＡ、および１８ＳリボソームＲＮＡである。
【００９４】
ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は目的の遺伝子の発現を検出するおよび比較するもう一つの方法である。ＩＳＨは、単一細胞レベルに核酸ハイブリッド形成の技術を適用および外挿し、技術分野の細胞化学、免疫細胞化学および免疫組織化学的検査との組合せによって、形態の維持および細胞のマーカーの識別が維持され確認されることを可能になり、組織と血液サンプルなどの個体集団内の特定細胞に対する配列の局在化を可能にする。ＩＳＨは、組織（ｉｎ  ｓｉｔｕ）の一部分、または組織が十分に小さいときに全体の組織（全組織標本ＩＳＨ）中の１以上の特異的な核酸配列を局在化するために相補的な核酸を使用する一種のハイブリッド形成である。ＲＮＡ  ＩＳＨは癌の生存因子に関連する遺伝子の発現など組織中の発現パターンをアッセイするために使用することができる。
【００９５】
幾つかの実施形態の検出方法では、１以上の「ハウスキーピング」遺伝子の発現または「内部対照」の発現も評価することができる。これらの用語は、その存在がＣＤ７４遺伝子（あるいはタンパク質）の発現レベルの評価を可能にし、任意の構成的にまたは全体的に発現した遺伝子（あるいは以下に議論されるようにタンパク質）を含む。そのような評価は、遺伝子転写の全体な構成のレベルの測定、およびＲＮＡ（あるいはタンパク質）回収における変化のための対照を含む。
【００９６】
幾つかの実施例では、ＣＤ７４タンパク質の発現は分析される。ＣＤ７４には特異的な抗体は、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ＣＳＨＬ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８）で提示されたものなど技術分野において既知の多くの免疫測定方法のうち一つをタンパク質発現の検出および定量化に使用することができる。そのような抗体を構築する方法は、技術分野では既知である。さらに、そのような抗体は商業的に入手可能である。典型的な市販の抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）の、カタログ番号ｓｃ−７０７８１、ｓｃ−１６６０４７、ｓｃ−８１６２６およびｓｃ−６５２７２、Ａｂｃａｍ  （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のカタログ番号ａｂ９５１４、ａｂ２２６０３、ａｂ６４７７２およびａｂｌ０８４０２、およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）のカタログ番号ＭＡＢ３５９０１およびＡＦ３５９０を含む。
【００９７】
任意の標準の免疫学的アッセイ様式（ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーまたはＲＩＡアッセイなど）は、タンパク質レベルを測定するために使用し得る。したがって、一例では、サンプル中のＣＤ７４タンパク質のポリペプチドレベルは容易にこれらの方法を使用して評価することができる。免疫組織化学法もＣＤ７４検出および定量化のために利用することができる。そのような技術に関する一般的なガイダンスは、Ｂａｎｃｒｏｆｔ  ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎｓ（Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，  １９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８）において見出されることができる。
【００９８】
＜ＣＤ７４の活性＞
ＣＤ７４（不変鎖、Ｉｉ）は、２つの高度に非構造化された領域によって挟まれた３量体化ドメインを含んでいるタイプＩＩ膜貫通糖タンパク質である（Ｊａｓａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：７６１−７６８，１９９９）。ＣＤ７４の１つの役割は、シャペロンとして機能するＡＰＣの細胞表面に対するエンドサイトーシス経路を通って新しく合成されたＭＨＣクラスＩＩである（Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ，  Ｃｅｌｌ  ８４：５０５−５０７，１９９６）。ＣＤ７４は、またＣＤ４４、ＣＸＣＲ２およびＣＸＣＲ４と共同する、遊走阻止因子（ＭＩＦ）の受容体である（Ｌｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９７：  １４６７−１４７９，２００３；  Ｎａｕｊｏｋａｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｅｌｌ  ７４：２５７−２６８，１９９３）。ＣＤ７４によるＭＩＦシグナル変換は、細胞外シグナルに調節されるキナーゼ（ＥＲＫ）１／２の活性化、ＮＦ−κΒの活性化、Ｂｃｌ−２発現およびＩＬ−８分泌が含まれる（例えばＬｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １９７：  １４６７−１４７６，２００３；  Ｓｔａｒｌｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｌｏｏｄ  １０７：４８０７−４８１６，  ２００６；  Ｂｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：１３４０８−１３４１３，２００７；  Ｇｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：２７８４−２７９２，２００８）。ＭＩＦにより活性化されたＣＤ７４を介したシグナル伝達の活性化の１つの結果は、細胞増殖または生存の増加、あるいはアポトーシスの減少である。
【００９９】
当業者は、ＣＤ７４活性のレベルを同定し測定することができる。幾つかの実施例では、ＣＤ７４活性は、例えばＣＤ７４によって調節された、１以上の下流のエフェクターの活性の測定、１以上の細胞表現型（細胞増殖、生存または移行など）により間接的に測定される。他の実施例では、ＣＤ７４活性は、ＭＩＦの結合または実施例３に記載されているようなＭＨＣクラスＩＩβ１α１ポリペプチドあるいはＭＨＣクラスＩＩα１ポリペプチドの結合により測定される。幾つかの実施形態では、ＣＤ７４の活性は、被験体（炎症性の及び／又は自己免疫性疾患または対照の被験体など）からのサンプルによって測定され、それらは単球、Ｂ細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ７４＋細胞またはそれらの２以上の組み合わせを含む。幾つかの実施例では、ＣＤ７４の活性は、サンプルをＭＩＦと接触し、ＥＲＫ１／２活性（例えばリン酸化）、ＮＦ−κΒ活性化（例えばｐｐ６５／ＲｅｌＡを介した転写）、Ｂｃｌ−２発現、ＩＣＡＭ−１発現、及び／又はＩＬ−８分泌などのＣＤ７４の下流のエフェクターの活性により測定される。幾つかの実施例では、サンプルのＭＩＦとの接触は、少なくとも１つのＣＤ７４の下流のエフェクターの活性の増加を結果として生じる。このＣＤ７４活性レベルは、健康な被験体または未処置の障害を有する被験体からサンプルなど、ＭＩＦにより接触させられた対照と比較することができる。これらの活性を測定する方法は、当業者に既知である（例えばウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、レポーターアッセイまたはＰＣＲに基づく方法の利用）。典型的なアッセイはＬｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １９７：  １４６７−１４７６，２００３；  Ｓｔａｒｌｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｌｏｏｄ  １０７：４８０７−４８１６，２００６；  Ｂｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：  １３４０８−１３４１３，２００７；  及び  Ｇｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：２７８４−２７９２，２００８；で示されるこれら各々は、これらの全体が引用によって本明細書に組み込まれる。
【０１００】
他の実施例では、ＣＤ７４活性はサンプルをＭＩＦと接触させ、細胞増殖、細胞移動、表現型及び／又はアポトーシスなどの細胞表現型を十分な期間の後に観察することにより測定される。細胞増殖の測定方法は当該技術分野に既知である。例えばＤＮＡラベル（例えば５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、［Ｈ］３チミジンまたは蛍光ラベル）の取り込み、ＭＴＴまたはＸＴＴアッセイ、または細胞計数等がある。アポトーシスの測定方法が、当該技術分野に既知である。例えば、アポトーシス性細胞死は細胞収縮、細胞膜の泡状突起、及び染色体の切断を引き起こす染色体凝縮によって特徴付け得る。アポトーシスを受ける細胞は、またヌクレオソーム間のＤＮＡ開裂による特徴パターンを示す。ボイデンチャンバーアッセイなどの細胞の移動の測定方法は、当業者に既知である。ＣＤ７４活性レベルは、健康な被験体または障害を有する未処置の被験体からのサンプルなどＭＩＦにより接触させられた対照と比較することができる。典型的なアッセイはＬｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １９７：  １４６７−１４７６，２００３；  Ｓｔａｒｌｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０７：４８０７−４８１６，  ２００６；  Ｂｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：  １３４０８−１３４１３，２００７；  及び  Ｇｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８３：２７８４−２７９２，２００８；に示される。これら各々は、それらの全体が引用によって本明細書に組み込まれる。以下の実施例は一定の特定の特徴及び／又は実施形態を例証するために提供される。これらの実施例は本開示を特定の特徴または実施形態に記載したに限定して解釈されるべきでない。
＜実施例＞
【０１０１】
＜実施例１：材料及び方法＞
【０１０２】
マウス：ＤＲ＊１５０１−Ｔｇ、ＤＲ＊１５０２−ＴｇおよびＭＢＰ−ＴＣＲ／ＤＲ２−Ｔｇマウスは、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｔ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒで交配され、また８−１２の週齢に使用された。すべての手順は制度上のガイドラインに従って認可され行われた。
【０１０３】
ＤＲ２−Ｔｇ−およびＭＢＰ−ＴＣＲ／ＤＲ２ＴｇマウスにおけるＥＡＥの誘導：ＨＬＡ−ＤＲ２マウスは、ＨＬＡ導入遺伝子の発現のためＦＡＣＳによってスクリーニングされた（ＭｃＭａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３０８６１−３０９７０，２００３）。８〜１２週齢間のＨＬＡ−ＤＲ２の陽性の雄雌マウスは、２００μｇの免疫原のペプチドを含む０．２ｍｌの乳剤および４００μｇの熱死滅結核菌Ｈ３７ＲＡ（Ｄｉｆｃｏ，  Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）を含む完全フロインドアジュバントで脇腹の４部位に皮下に免疫された（Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：２７−１３３，２００３；  Ｂｕｅｎａｆｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３０：１１４−１２４，２０１０）。さらに、マウスは免疫（それぞれマウス当たり、７５ｎｇおよび２００ｎｇ）の０日と２日後に百日咳毒素（Ｐｔｘ）（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ）を与えられた。免疫されたマウスは組み合わせた６点の範囲の後肢および前肢麻痺スコア組合せであるＥＡＥの臨床症状を毎日に評価された。後肢スコア：０＝正常；０．５＝柔軟な尾または軽度の後肢衰弱（例えば、マウスが尾の根本の９０°変化の後に逆位に抵抗できない）；１＝柔軟な尾および軽度の後肢衰弱；２＝柔軟な尾および中程度の後肢衰弱（例えば、マウスが逆位の後に急速に元に戻ることができない）；３＝柔軟な尾および中程度に重症の後肢衰弱（例えばマウスの歩行の間どちらかの側面に対する後方の範囲の逆位および明確な傾きの後に元に戻ることができない）；４＝柔軟な尾および重症の後肢衰弱（後足は移動することができるが、前向きと比べてしばしば引きずることがある）；５＝柔軟な尾および麻痺（後肢が動かない）。前肢麻痺スコアは正常な移動での明確な限度の０．５または完全な前肢麻痺の１のいずれかである。組み合わせたスコアは、後肢スコアおよび前肢スコアの合計である。
【０１０４】
稀に、重度ＥＡＥを有するＨＬＡ−ＤＲ２マウスの死亡があり、そして、これらのケースでは、マウスは実験の残りにおいて６として採点された。平均ＥＡＥスコアおよびＲＴＬまたはビヒクル処置の誘導に基づいてグループ化したマウスグループの標準偏差は、連日計算され、全体の実験のために合計された（蓄積疾患指数（ＣＤＩ）、合計の疾患負荷を表わす）。日平均スコアは、ビヒクルとｐＤＲ２の処置グループの間のノンパラメトリック比較に対する両側の（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）マン−ホイットニーのＵ検定によって分析された。平均ＣＤＩはＴｕｋｅｙ事後試験を伴う一方向の分散分析（ＡＮＯＶＡ）により、およびすべてのグループの間の有意性を確認するダンの多重比較ポスト試験によるノンパラメトリックの一方向のクラスカル＝ヴァリス分散分析により分析された。
【０１０５】
ＤＲ２−ＴｇマウスのＥＡＥに対するｐＭＨＣ処置：ｐＤＲ２コンストラクト（表５）はＨＬＡ−ＤＲ２−ＴｇおよびＭＢＰ−ＴＣＲ／ＤＲ２−Ｔｇマウスの誘発されたＥＡＥを処置するために指示された量で５日間連日皮下に注射され、臨床症状は上述のように採点された。中和実験のために、ＤＲ＊１５０１−Ｔｇマウスは、ビヒクル（５％のｗ／ｖグルコースと２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０）、２０μｇ  ＲＴＬ３４２Ｍ（ｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５）または２０μｇのＲＴＬ３４２Ｍと１：１（４０μｇ）または１：２（８０μｇ）のモル比でＦａｂｌＢｌｌ（ＤＲ２コンストラクトの２つのドメインに特異的）またはＦａｂＤ２（ｐＤＲ４／ＧＡＤ−５５５−５６７コンストラクトには特異的）とともにプレインキュベートされ皮下に処置された。ＦａｂｌＢｌｌのみを含むビヒクルはネガティブ対照として行われた。方法は以前にＤａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：１４６５−１４７９，２０１１に記載されていた。
【０１０６】
【表５】
0006364352.tif 000006
【０１０７】
フローサイトメトリー：未処置ＤＲ２  ＰＢＭＣサブタイプの分析は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ヨウ化プロピジウム、アロフィコシアニンの４色を用いたフローサイトメトリーで行われた。血液が未処置ＤＲ２マウスから心臓瀉血により１×ＰＢＳ／ＥＤＴＡ中に採取された。１×ＰＢＳで血液を洗浄した後に、赤血球は、１×ＲＢＣ溶解バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により溶解され、ＲＰＭＩ中で２回洗浄された。１００万の細胞が１μｇの非ラベルｐＤＲ２、１μｇのｐＤＲ２  ＦＩＴＣまたは１μｇ、Ｆａｂにより中和されたｐＤＲ２  ＦＩＴＣＲＰＭにより、３７°Ｃで１時間インキュベートされた。Ｆａｂの結合によるｐＤＲ２の中和を評価するために、細胞とのインキュベーションの前に、ｐＤＲ２ｓは１：１のモル比のＦａｂ  １Ｂ１１またはＦａｂＤ２とともに室温で２時間インキュベートされた。ｐＤＲ２のインキュベーションの直後にＣＤ３  ＰＥ（（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＣＤ７４  ＰＥ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）またはＣＤ１１ｂＰＥＣＤｌ１ｂアロフィコシアニン、ＣＤｌｌｃ  アロフィコシアニン、ＣＤ１９  アロフィコシアニン（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）との４℃での３０分間のインキュベーションが行われた。抗体とｐＤＲ２は、２回の追加の１×ＰＢＳ／０．５％のＢＳＡ染色培地による洗浄によって完全に取り除かれた。細胞は、ヨウ化プロピジウムを含む染色培地に再懸濁され、そして即座にＦＣＳ  ＥＸＰＲＥＳＳ（商標）ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ（商標）により分析された。データは１００，０００のゲートによって選択された生存している単球またはリンパ球（インビボの解析）、あるいは１０，０００のゲートによって選択された単球（インビトロの解析）を示す。
【０１０８】
ｐＤＲ２結合の顕微鏡法および画像化：ＣＤ１１ｂ＋細胞は、マウス単球濃縮キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）によってＤＲ＊１５０１／ＧＦＰ−Ｔｇマウスから陰性のもの（ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ）を単離し、１０ｍｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６でタグ付けされたＲＴＬ３４２Ｍによって処置された。画像は、制御された環境チャンバに入った専用のＸＹＺステージを有するＯｌｙｍｐｕｓ  ＩΧ７１倒立顕微鏡：微分干渉コンストラクト（ＤＩＣ）透射光および蛍光用の固体ユニット、を利用するｗｉｄｅ  ｆｉｅｌｄ  Ｃｏｒｅ  ＤＶ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，Ｉｓｓａｑｕａｈ，ＷＡ）により高分解能で得られた。Ｃｏｏｌｓｎａｐ  ＥＳ２  ＨＱカメラは、ＦＩＴＣおよびＴＲＩＴＣへの２色６０ｘ（開口数、１．４２）Ｐｌａｎ  Ａｐｏ  Ｎ対物レンズを光軸として画像を得るために使用された。ピクセルサイズは０．１０７０４ミクロンであった。画像は１０回の反復アルゴリズムを使用して、適切なＯＴＦ（光学的伝達関数）によりデコンボリューションされた。ヒストグラムは最陽性画像のために最適化され、２４ビットのＴＩＦＦとして融合され、画像を保存する前に統一性のための他のすべての画像に適用された。データは、Ｉｍａｒｉｓ（登録商標）（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）およびＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を使用して、視覚化され分析された。
【０１０９】
タンパク質精製および標識化：クローニング、発現、および大腸菌で生成された封入体からのｐＤＲ２タンパク質の精製は、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２４１７０−２４１７６，２００１らに記載されていた通りであった。
【０１１０】
細胞表面タンパク質のビオチン化および細胞融解：ＤＲ＊１５０１−ＴｇまたはＭＨＣクラスＩＩノックアウトマウスから脾細胞はＲＰＭＩに集められ、実験で使用される前に氷上に保存された。細胞は、ｐＨ８．０の冷ＰＢＳでよく洗浄され、過剰な標識化を防ぐため１５分間氷の上でＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｃａｔ  Ｎｏ．  ２１３３５）によりビオチン化された。その反応は、ｐＨ７．４のＴＥＮ（５０ｍＭトリス、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）緩衝液によりビオチン化された細胞懸濁液を５倍に希釈することにより止められた。その後の洗浄はビオチン化試薬を取り除くためにＴＥＮ緩衝液により実行され、そして、ペレットは溶解まで凍結状態に維持された。細胞ペレットは氷上で解凍され、そして、溶解は１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む（ＴＥＮ−ＴＸ１００）または１％のＣＨＡＰＳを含む（ＴＥＮ−ＣＨＡＰＳ）のＴＥＮ緩衝液に１μΜのＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えてプロテアーゼ阻害剤（Ｈａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の存在下で３０〜６０分間行われた。溶解の後、細胞は４°Ｃで１５分間１４，０００ＲＰＭで沈殿させられ、そして、上清はさらなる分析のために収集された。
【０１１１】
直接的および競合結合アッセイ：ＤＲ＊１５０１−Ｔｇマウスから２００万の脾細胞が漸増濃度のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８−標識化ｐＤＲ２／ｈＭＯＧ−３５−５５（ＲＴＬ１０００）を有するＲＰＭＩ中で、氷中で１時間インキュベートされた（食細胞の機構による取り込みを最小限するため）。細胞はその後、後の分析のために結合された標識化リガンドを分離し及び可溶性にするため、１００μＬの６Ｍの尿素により溶解された。溶解物は不溶性物質（核、細胞小器官）を取り除くために遠心分離機にかけられ、そして、上清は１０−２０％ポリアクリルアミドゲル中でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分離された。その後、ゲルは標識化ｐＤＲ２のためにスキャンされた。バンドの蛍光強度は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（登録商標）ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデンシトメトリーにより定量化され、標識化ＲＴＬ１０００濃度に対してプロットされた。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアを使用し、１−または２−結合部位の数理モデルにフィッティングされて分析された。
【０１１２】
競合的結合は、非ラベルｐＤＲ２コンストラクト（０−８μΜ）の濃度漸増の条件下で２００万の脾細胞および一定濃度の標識化ＲＴＬ１０００（２８０ｎＭ）を使用して行われた。その後、全体の細胞の飽和アッセイのために、上述のように細胞は洗浄され、溶解され、分析された。結果は、特異的結合の半分と競合するために必要とされる競合物の濃度であるＥＣ５０として提示される。
【０１１３】
ＣＤ７４およびＭＨＣクラスＩＩ分子のための免疫沈降法、および直接的および競合結合アッセイ：免疫沈降法実験については、氷冷ＴＥＮ−ＴＸ１００またはＴＥＮ−ＣＨＡＰＳ中で２時間、抗体ＴＵ３９（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）はビーズ複合プロテインＡと先に結合され、その後、これらの複合体にＲＴＬ結合が後続する。溶解物（先にビーズ結合プロテインＡにより前もって取り除かれた）はチューブに加えられ、そして、結合は４°Ｃで、穏やかな軌道震盪により一晩行われた。サンプルはＴＥＮ緩衝液および適切な界面活性剤によりよく洗浄された。ＣＤ７４免疫沈降法のために、ＬＮ―１  ｍＡｂが上述されるようなビーズ複合プロテインＬに吸着された。また、透明になる前の溶解液はこの混合物に加えられた。必要な場合、結合物は免疫複合体を電気泳動サンプル緩衝液中で沸騰させることにより溶出され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって分析された。
【０１１４】
ＲＴＬコンストラクトの直接の結合のために、上述のように、プロテインＬ／ｌｎ−ｌ／ＣＤ７４複合体は調製された。標識化リガンドのコンストラクトは１％のＣＨＡＰＳを含むＴＥＮ緩衝液中で４°Ｃで４時間インキュベートされ、そして遊離のリガンドは十分な洗浄によって除かれた。上述のように、結合タンパク質の溶出は実行され、そして溶出物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。競合実験は２：１モル比の標識化ＲＴＬ１０００に対する「コールド」競合物を使用して５００μＬの反応体積でＴＥＮ−ＣＨＡＰＳ緩衝液中で３〜４時間の４°Ｃで行われた。ＣＤ７４に対する結合のためのＲＴＬ１０００およびＤＲ−α１ドメインの競合は０．１６０ｎｍｏｌ（４μｇ）標識化ＲＴＬ１０００を使用してＤＲ−α１ドメインの濃度の漸増（０、０．０３２、０．０９６、０．３２０および０．９６０  ｎｍｏｌ）で合計反応体積は０．５ｍＬで行われた。これらの条件下では、ＲＴＬ１０００の最終濃度は３２０ｎＭであった。すべてのアッセイの蛍光標識、発色団は、適切な波長にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（登録商標）ＦＸ  ｓｃａｎｎｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してスキャンすることにより検出され、そして、蛍光強度はイメージャーに付属するＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して測定された。
【０１１５】
ＲＴＬ受容体の個別の構成部分に対するリガンド結合を試験するために、上述のように、ＤＲ＊１５０１−Ｔｇ脾細胞はビオチン化され、溶解され、そして、ＣＤ７４は、抗ＣＤ７４モノクローナル抗体ｌｎ−１によって４°Ｃで一晩、免疫沈降された。免疫複合体（プロテインＬ−ビーズ／ｌｎ−ｌ／ＣＤ７４）は、異なるコンストラクトの濃度の漸増（０〜１０ｎＭ）を用いてと直接的な結合飽和を行うことによってＦＩＴＣ標識化ｐＤＲ２  ＲＴＬコンストラクトを結合するそれらの能力が分析された。結合は、１％のＣＨＡＰＳを含むＴＥＮ緩衝液中で緩やかな振盪、４°Ｃにおいて４時間行われた。その後、複合体は１％のＣＨＡＰＳ／ＴＥＮにより洗浄され、そして一度ＴＥＮ緩衝液により過剰な界面活性剤を除くため洗浄された。結合タンパク質は２％のＳＤＳ電気泳動サンプル緩衝液中で間９０°Ｃで６〜８分に溶出され、そしてビーズは沈殿された。上清が集められタンパク質が１０−２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離した後、ゲルはＦＩＴＣ発色団のためにスキャンされ、デンシトメトリーによって定量化された。リガンド濃度はバンドの蛍光強度に対してプロットされ、そして、生成された曲線はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアにより１−または２−結合部位にフィッティングされた。同様に、ＤＲ＊１５０１−ＴｇマウスからＭＨＣクラスＩＩは、ＣＤ７４を枯渇させた抽出物からプロテインＬビーズに結合したＬ２４３モノクローナル抗体により精製された。これらの条件下では、ＤＲ＊１５０１−ＴｇマウスからＭＨＣクラスＩＩの均質調製は単離された。ｐＤＲ２コンストラクトの飽和濃度に対する直接の結合は実行され、上述のように分析された。
【０１１６】
電気泳動、ウェスタンブロッティングおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ：免疫沈降法から溶出の後、１０−２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してタンパク質は分離されクマシーブルー染色によって視覚化され、またはＰＶＤＦにブロットされ、ストレプトアビジン結合ＰＥによって検出された。ＰＥ染色によって検出された関係のあるタンパク質は、クマシーブルーによって染色されたレプリカゲルによって局在化された、ゲルバンド切りだされ、トリプシンにより消化され、そしてＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって特定された。
【０１１７】
表面プラズモン共鳴：ヒストン複合体（Ｓｉｇｍａ）は６５９７の共鳴単位（ＲＵ）の結果として生じる最終的な共鳴で１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ６．０内での標準アミン結合によってＣＭ５バイオセンサー・チップに連結された。エタノールアミンはネガティブ対照として個別のフローセルで連結された。反応速度測定は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  ｐＨ７．４，  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．００５％  Ｐ２０）中で２０μＬ／分の流量によるＢｉａｃｏｒｅ  ３０００により実行され、質量移動効果の証拠のない条件で行われた。ｐＤＲ２／ｈＭＯＧ−３５−５５は一連の濃度で注入され、そして、表面は各々の注入の前に５０ｍＭ  ＮａＯＨにより再生された。基線変動を有した１：１結合モデルへの動態データのフィッティングがＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して行われた。
【０１１８】
ＭＩＦにより増幅されたＩＣＡＭ−１の発現のＲＴＬ３４２Ｍ（ｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５）阻害：脾細胞はＤＲ＊１５０１−Ｔｇマウスから単離され存在で培養され、そして２％の熱不活性化ＦＣＳを含む完全なＲＰＭＩ培地１６４０中で１０μｇ／ｍｌ  ＲＴＬ３４２Ｍ存在下または不存在下で、３７°Ｃ、５％  ＣＯ２で１時間培養された。細胞は、回収の１時間前に１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（大腸菌，セロタイプ  ０５５：Ｂ５，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１００ｎｇ／ｍｌの組み換え型のＭＩＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）により刺激された。全ＲＮＡは、製造業者の指示に従ってＲＮｅａｓｙ（登録商標）培養細胞キットを使用して脾細胞から単離され、それはＤＮａｓｅ工程（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含んでいた。定量的リアルタイムＰＣＲはＩＣＡＭ−１（アッセイＩＤ：Ｍｍ００５１６０２３＿ｍｌ）のためのＡＢＩ  ７０００  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｅ−ｏｎ−ｄｅｍａｎｄ  ａｓｓａｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行われた。ＧＡＤＰＨハウスキーピング遺伝子は内部の対照として増幅された。プライマーは製造業者の指示に従って使用された。
【０１１９】
＜実施例２：ＤＲ２−ＴｇマウスにおけるｐＭＨＣコンストラクトによるＥＡＥの処置＞
本実施例は、ＤＲ２トランスジェニックマウスにおけるＥＡＥに対するｐＭＨＣコンストラクトおよびペプチドの効果を記載する。
【０１２０】
ＥＡＥのｐＤＲ２処置の特異性は、ＤＲ＊１５０１−Ｔｇマウス（マウス（ｍ）ＭＯＧ−３５−５５ペプチド（Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｈ、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：９５−１０４，２００７）の注入の後にのみＥＡＥを発症したＤＲＡ：ＤＲβ１＊系統）およびＤＲ＊１５０２−Ｔｇ  マウス（ヒト（ｈ）ＭＯＧ−３５−５５ペプチド（Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｈ，  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．７７：６７０−６８０，２００））の注入の後にのみＥＡＥを発症したＤＲｐｉ＊１５０２系統）を含むＤＲ２−Ｔｇマウスの２つの異なる種類で評価された。ＤＲ＊１５０１−Ｔｇマウスは、疾患発症の後にｐＤＲ２に結合された関連したｍＭＯＧ−３５−５５ペプチド（配列番号：５０）により効果的に処置された（図１Ａ；表６）。ＤＲ＊１５０２−Ｔｇマウスは、関連するペプチド（ｐＤＲ２／ペプチド無し、図１ＡおよびＩＢ、表６および７）のない非同系統の脳炎誘発性のペプチド（疾患誘発に使用されたそれと異なる）を含んでいるｐＤＲ２／ＭＢＰ−８５−９９（配列番号：５６）ではなく、同じｐＤＲ２プラットフォーム（図ＩＢ；表７）に関連する同系統のｈＭＯＧ−３５−５５ペプチド（配列番号：５１）により効果的に処置された。
【０１２１】
【表６】
0006364352.tif 000007
【０１２２】
【表７】
0006364352.tif 000008
【０１２３】
＜実施例３：ｐＤＲ２結合部位＞
本実施例は、ＰＢＭＣの上のｐＤＲ２結合部位の特定を記載する。未処置のＤＲ＊１５０１−ＴｇマウスはｐＤＲ２に結合されたＲＴＬ３４２Ｍ−ＦＩＴＣまたはＲＴＬ１０００−ＦＩＴＣをｉ．ｖ．で注入された。実行可能なＰＢＭＣサブタイプはフローサイトメーターを使用して、単球ゲート中のｐＭＨＣ結合のために評価された。単球個体集団は前方散乱およびサイドの分散を使用して、確認された。また、実際の単球は、前方散乱およびヨウ化プロピジウム染色（図２Ａ）の組み合わせを使用して確認された。
【０１２４】
エキソビボで検出された主要なＲＴＬに結合する細胞集団は、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｃ＋ＤＣと弱い結合のみをするＣＤ１１ｂ＋単球であった（図２Ｂ）（図２Ｂ（最上列）；ＰＥとＦＩＴＣの両方には陽性の細胞が右上の円の１／４に蓄積していることに注意）。結合は、ｍＭＯＧおよびｈＭＯＧペプチドの両方の場合に実質的に類似していた（図２Ｃ）。これらのそれぞれのＰＢＭＣの部分集団の最小限のＲＴＬ結合のみがリンパ球ゲートで検出された（図３Ａ−Ｃ）。
【０１２５】
ＲＴＬ３４２ＭおよびＲＴＬ１０００の両方の細胞結合のこのパターンは、ＤＲ＊１５０１−ＴｇマウスからＰＢＭＣと１時間のインキュベーションの後にインビトロで確認された。図２Ｂで示される結果に類似して、ｐＭＨＣ複合体にインビトロで結合する個体集団はＣＤ１１ｂ＋単球であり、最小限の結合でＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｃ＋ＤＣであった（図２Ｃ）。ＧＦＰ標識化ＣＤ１１ｂ＋単球に対する標識化ＲＴＬ３４２Ｍの結合は色彩を増強した蛍光顕微鏡法によって視覚化された（図２Ｄ）、細胞表面と同様に取り込まれたＲＴＬ複合体でもなされた。
【０１２６】
１Ｂ１１抗体のＦａｂフラグメントはｐＭＨＣ分子の２つのドメインと結合する。Ｆａｂ１Ｂ１１は、ＥＡＥモデルにおける細胞結合を阻害するおよびＲＴＬ処置を中和する能力を試験された。ｐＤＲ／ＧＡＤ５５５−５６７に結合するＤ２抗体からの対照Ｆａｂフラグメントも同様に利用された（Ｄａｈａｎ  ｅｔ  ａｈ，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：１４６５−１４７９，２０１１）。ＣＤ１１ｂ＋単球に対するｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５の結合は、約６０％（ｐ＜０．０００１）（図４Ａ）によってＦａｂｌＢｌ  １がある状態で阻害された。ＣＤ１１ｂ＋単球に対するｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５の結合は、ＦａｂＤ２がある状態で約２０％増加したが、この結果は統計的に有意ではなかった。同様に、ＥＡＥを有するＤＲ＊１５０１−Ｔｇマウスへの注入の前に、ＦａｂＤ２では無くＦａｂ１Ｂ１１と共にｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５のインキュベーションの結果ｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５（ｐ＜０．０００１、図４Ｂ）の保護活性の約６０％の中和がもたらされた。
【０１２７】
Ｆａｂ１Ｂ１１抗体も、ＣＤ７４のＲＴＬより誘導されたダウンレギュレーションを遮断する能力を試験された。ＦａｂＤ２ではなくＦａｂ１Ｂ１１共にＲＴＬ３４２Ｍの１：１または１：２のモル比での２時間のインキュベーションの結果、インビトロにおいてＲＴＬ３４２Ｍにより誘導されたＣＤ１１ｂ＋単球におけるＣＤ７４発現のダウンレギュレーションの６０％の遮断に結果として生じた（ｐ＜０．０１）（図４Ｃ）。
【０１２８】
関連する研究では、ＲＴＬ３４２Ｍ（それぞれ１０μｇ対１００μｇ）としての等モルの濃度のフリーｍＭＯＧ−３５−５５ペプチドの５日間の連日の注入は、ＲＴＬ３４２Ｍ（図４Ｄおよび表８）と比較したＥＡＥの有意な阻害を生成しなかった、すなわち、阻害活性はＦａｂ１Ｂ１１の中和作用はＭＯＧペプチドによって媒介されたものではなく、ｍＭＯＧ−３５−５５よりもむしろＤＲ２β１α１部分によるものが明らかになった。Ｆａｂ１Ｂ１１に対するＦａｂＤ２のこれらの組み合わせた選択効果は、ＲＴＬとＤＲα１の結合およびＣＤ７４のダウンレギュレーションがその治療活性に必要なことを立証する。
【０１２９】
【表８】
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【０１３０】
飽和結合曲線は漸増濃度のＡｌｅｘａ−４８８−標識化ＲＴＬ１０００により氷上で１時間インキュベートされた２００万の脾臓細胞を使用して証明され（食作用および低い親和性の非特異性の結合を阻害するために）、その後よく洗浄された。捕捉されたＲＴＬ１０００を有する細胞は遠心分離機にかけられ、細胞ペレットは６Ｍの尿素中で可溶化され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたタンパク成分はゲル電気泳動の後に抽出されたＡｌｅｘａ−４８８−標識化ＲＴＬ１０００の蛍光強度によって定量化された。図５Ａで示されたように、飽和データは誇張した２つの部位の結合曲線に最良にフィットし、（Ｒ＝０．９９８）、１−結合部位はＲＴＬ１０００に対する高親和性結合および２．６５のｎＭで急速な飽和を示し、もう１−結合部位はＲＴＬ１０００に対してより１３１ｎＭのＫＤの低い親和性を示した。
【０１３１】
競合実験は、その後、漸増濃度の非標識のＲＴＬ１０００と組み合わせたＡｌｅｘａ４８８標識化ＲＴＬ１０００混合物は脾臓細胞の固定数と共にインキュベートがされた。これらの競合実験もＤＲ＊１５０１−Ｔｇ脾細胞に対するｐＤＲ２／ｈＭＯＧ３５−５５の２−部位結合パターンを同様に実証した（図５Ｂ）。低親和性部位は１１ｎＭのＥＣ５０をもち、標識化ＲＴＬ１０００を除くために比較的低濃度の非標識ＲＴＬ１０００が必要であったことを示す。反対に、高親和性部位には４，０００ｎＭのＥＣ５０を持ち、標識化ＲＴＬ１０００を除くために３５０倍より多い濃度の非標識ＲＴＬ１０００が必要であったことを示す。
【０１３２】
付加的な競合研究が他のｐＤＲ２コンストラクトの漸増濃度と混合されたＡ４８８標識ＲＴＬ１０００を使用して、ＭＨＣクラスＩＩβ１α１およびペプチド部分の両方の結合を評価するために行われた。ＲＴＬ１０００、ＲＴＬ３４２ＭおよびＲＴＬ３４０（ｐＤＲ２／ＭＢＰ−８５−９９）の全ては、低および高親和性の結合部位（図５Ｂおよび表９）の両方に対して競合することができ、「空の」ｐＤＲ２／ペプチド無しは低い親和性部位に対してのみｐＤＲ２／ｈＭＯＧ−３５−５５と競合した。これらのデータは、共有結合で結合されたペプチドがない場合でもＲＴＬのための低い親和性を持つ結合部位がβ１α１部分と相互作用することを明確に示し、一方、共有結合で結合された抗原性ペプチド部分を含む抗原性ペプチド部分を備える場合高親和性の結合部位は、にＲＴＬに結合する可能性が高い。
【０１３３】
【表９】
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【０１３４】
上述の競合研究もＭＨＣクラスＩＩ欠損マウスからの脾細胞を使用して同様に行われた。図５Ｃおよび表９で示されるように、低い親和性の結合部位のみがＭＨＣクラスＩＩ−ＫＯ脾細胞において存在した。これらの結果は細胞表面に発現されたＭＨＣクラスＩＩ自体が、ＲＴＬのための高親和性結合部位であることを示唆している。
【０１３５】
ＴＵ３９モノクローナル抗体単独の、あるいはプロテインＡに接合されたＴＵ３９に結合したＲＴＬ１０００は１％のＣＨＡＰＳ緩衝液中でビオチン化された脾細胞全体と共に一晩インキュベートされた。結合膜タンパク質は電気泳動とウェスタンブロッティングによって溶出され分析された。ビオチン化されたタンパク質は、ストレプトアビジン−ＰＥにより視覚化された。ＲＴＬ１０００は抗ＤＲ−ｍＡｂ  ＨＫ１４により視覚化された。この分析によりＲＴＬ１０００に加えて、ＲＴＬ１０００無しでインキュベートされたサンプルと比較して少なくとも４本の異なるバンドが、存在しなかったバンド（３１ｋＤと７２ｋＤ）または濃縮されたバンド（１５ｋＤと１８ｋＤ）が明らかになった（図６）。平行バンドは非染色サンプルから溶出され、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって配列決定された（表１０）。
【０１３６】
【表１０】
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【０１３７】
主要なｐＤＲ２−結合タンパク質は、Ｈ４ヒストン（１４ｋＤ）、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＢおよびＨ３ヒストン（１８ｋＤ）、ＣＤ７４（３１ｋＤ）およびＭＨＣクラスＩＩ（７２ｋＤ））であると同定された。ｐ７２ｋＤクラスＩＩ配列は、ｐＤＲ２コンストラクトからではなく発現したＤＲ２−組み換え遺伝子（Ｍａｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｈ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２３：３４３−３４７，１９９９）から由来する、Ｈ−２Ｅα２ドメインであると同定された。表面プラズモン共鳴測定を使用したさらなる評価は、ＲＴＬ１０００とヒストン複合体の間の低い親和性の結合の相互作用を確認した（図７）。
【０１３８】
ｐＭＨＣ受容体の主成分としてＣＤ７４の関与を確認するために、ＣＤ７４は、プロテインＬ−結合抗ＣＤ７４モノクローナル抗体（ｌｎ−１）を使用して、ビオチン化されたＤＲ＊１５０１−Ｔｇ脾細胞膜調製物から免疫沈降法され、ストレプトアビジン−ＰＥ（図８Ａ）により視覚化された。免疫沈降されたＣＤ７４はｐ７２とｐ１３０タンパク質と複合体を形成することがわかった。全長のＭＨＣクラスＩＩ分子は確認されなかった。さらに、ＦＩＴＣ標識化ＲＴＬがビーズによって免疫精製されたＣＤ７４と共にインキュベートされた後、ＲＴＬ１０００とＲＴＬ３４２Ｍの両方はＣＤ７４により容易に共免疫沈降された。ＲＴＬ３４０およびＲＴＬ３０２−５Ｄ「空の」ｐＤＲ２はＣＤ７４と共に共免疫沈降されたが、さらに低いレベルであった（図８Ｂ）。
【０１３９】
ＤＲ−α１ドメインのみ（ＤＲ２−β１ドメインまたはペプチド無し）含むコンストラクトはＣＤ７４により共免疫沈降された（図８Ｂ）。この結果は、ＤＲ−α１ドメインのみのものがｐＤＲ２／ｈＭＯＧ−３５−５５に対してＣＤ７４との結合において競合したことを示す競合的結合実験によって支持された（図９Ａ）。ＤＲ２β１ドメイン（ＤＲ−α１ドメインまたはペプチド無し）はＣＤ７４と共に免疫共免疫沈降降せず、またはｐＤＲ２／ｈＭＯＧ−３５−５５に対してＣＤ７４またはペプチドとの結合において競合しなかった（図８Ｂ、図９Ａ）。これらの実験は、ＤＲ２−β１ドメインまたはペプチドの無いＤＲ−α１ドメインのためのＣＤ７４上の単一の結合部位の存在を証明した（図９Ｂ）。
【０１４０】
免疫精製されたＣＤ７４に対するＦＩＴＣ標識化ＲＴＬコンストラクトの漸増濃度による直接の結合はＲＴＬ１０００、ＲＴＬ−３４２ＭおよびＤＲ−α１（しかし他のＲＴＬコンストラクトでは無く）に対する結合（図１０Ａ）は用量依存性であること、飽和可能性があり約２．９−４．５ｎＭの単一結合部位を含んでいることを示した（表１１）。ＦＩＴＣ標識化ｐＤＲ２コンストラクトの同じ膜調製物（ＣＤ７４枯渇の後の）中のＭＨＣクラスＩＩ分子の４つのドメインに対する結合はＲＴＬ１０００およびＲＴＬ３４２Ｍで結合を証明したが、しかしＤＲ−α１または他のｐＤＲ２コンストラクトでは結合を証明しなかった（図１０Ｂ）。検出された結合は用量依存性で、飽和可能で、約１．１−２．０ｎＭの単一結合部位を同様に含んでいた（表１１）。
【０１４１】
【表１１】
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【０１４２】
これらのデータは、ＣＤ７４におけるｐＤＲ２分子のＤＲ−α１部分の決定因子用の単一の結合部位の存在を、そして別に、共有結合で結合されたペプチド自体または代替的にＰｐＤＲ２の抗原ペプチドの形成する構造上感受性の結合部位（本発明の共有結合された抗原ペプチド等）を含み得るＤＲ−α１上には存在しないクラスＩＩの４−ドメイン上のわずかに高い親和性の結合部位の存在を示した。
【０１４３】
これらのデータは、単離され精製されたペプチドまたはＤＲ２β１の無いＤＲ−α１ドメインがＣＤ７４に結合できることをさらに示す。
【０１４４】
＜実施例４：ＣＤ７４の発現レベル＞
本実施例は、ｐＭＨＣ結合のＣＤ７４の発現に対する効果を記載する。
【０１４５】
エキソビボ研究は、未処置のマウスと比較してＥＡＥを有するマウスではＣＤ１１ｂ＋単球におけるＣＤ７４の発現が増加することを実証した（図１１Ａ）。臨床症状の発症時にＲＴＬ３４２Ｍを有するＥＡＥマウスの処置は４８時間以内のＣＤ７４の発現の有意なダウンレギュレーションをもたらした。この結果は、血液、脾臓および脊髄から単離されたＣＤ１１ｂ＋細胞において観察された（図１１Ｂおよび１１Ｃ）。ｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５による処置はＭＨＣクラスＩＩの細胞表面の発現を変化させなかった。これは文献と対照的に、ＭＨＣクラスＩＩが単球細胞表面上のＣＤ７４と一般に関係しないことを示唆する（Ｒｏｃｈｅ  ｅｔ  ａｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８５８１−８５９５，１９９３；  Ｅｙｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２６２６６−２６２７１，１９９９）。ＣＤ７４の発現のダウンレギュレーションは、ＲＴＬによって遮断される抗ＣＤ７４結合部位の阻止によらなかった、なぜならＣＤ７４はＲＴＬ３４２ＭまたはＤＲ−α１とプレインキュベートされたビオチン化ＤＲ＊１５０１−Ｔｇ脾細胞膜調製物からプロテインＬ結合抗ＣＤ７４  ｌｎ−１  ｍＡｂで免疫沈降法され得るからである（図２０）。
【０１４６】
ＲＴＬ１０００（図１２Ａ）において示されるように、未処置のＣＤ１１ｂ＋単球は漸増濃度のＲＴＬコンストラクトのより３７°Ｃで１時間インキュベートされ、そして、ＲＴＬの結合およびＣＤ７４の細胞表面における発現がＦＡＣＳによって評価された。異なる５のコンストラクトはＲＴＬ結合を増加させる機能としてのＣＤ７４の発現の減少を示した（図１２Ｂ）。この関連性は全てのコンストラクトのデータポイントが組み合わされたとき統計的に有意であった（ｐ＜０．００１、図１２Ｂ右下パネル）。ＤＲ−α１単独のためのｐＭＨＣ濃度およびＣＤ７４の発現の間の逆相関に注意されたい。
【０１４７】
ヒト単球に対するＲＴＬ１０００の結合も評価された。ヒトＣＤ１１ｂ＋の単球はＤＲ２＋のヒトドナーから単離され、そして１μｇ  ＲＴＬ３４２Ｍ、１μｇ  ＲＴＬ１０００、５μｇ  ＲＴＬ１０００、５μｇ  ＲＴＬ３４０およびビヒクル単独により処置された（図１３Ａ−Ｅ）。ＣＤ７４を発現する細胞の割合、および処置の後でＦＩＴＣ−ＲＴＬ１０００に結合する細胞の割合に関するすべての処置条件からの結果の回帰分析は、図１３Ｆに示される。ＣＤ７４を発現する細胞の割合は標識化ＲＴＬ１０００に結合する細胞の割合と逆相関する。
【０１４８】
＜実施例５：ＥＡＥに対するＲＴＬコンストラクトの効果＞
本実施例は、ＤＲ−α１単独の効果を含むＥＡＥに対するｐＭＨＣコンストラクトの効果を記載する。
【０１４９】
ＲＴＬ１０００またはＲＴＬ３４２ＭはＲＴＬ３４０、ｐＤＲ２／ペプチド無しまたはビヒクルの非同種ペプチドにより誘発されたＥＡＥを処置する能力が比較された。ＭＢＰ−ＴＣＲ／ＤＲ２−ＴｇマウスにおいてＥＡＥは、ＭＢＰ−８５−９９ペプチド／ＣＦＡ／Ｐｔｘで誘発された。図１４Ａおよび表１２で示されるように、ＲＴＬ１０００とＲＴＬ３４２Ｍの両方はｐＤＲ２／ＭＢＰ−８５−９９（同種のペプチドであるがＣＤ７４を調節力が強くないものを有する）のそれに比較可能なＥＡＥに対する効果を示した。対照的に、「空の」ｐＤＲ２／ペプチド無しはＥＡＥの処置に効果的でなく、ＣＤ７４の発現において弱い効果があった。
【０１５０】
【表１２】
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【０１５１】
ペプチドに依存しないｐＤＲ２コンストラクトのＥＡＥに対する阻害効果をさらに調査するために、ｐＤＲ２／ペプチド無し、ｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５、およびビヒクルの標準用量および処置レジメン（１００μｇＸ  ５）と比較してＣＤ７４の有意な結合および調整を示す１０倍高用量のｐＤＲ２／ペプチド無し（５日の間の１ｍｇのＸ２）の、ｍＭＯＧ３５−５５で誘発されたＥＡＥＤＲ２−Ｔｇマウスに対する治療効果が試験された。図１４Ｂおよび表１３で示されたように、１ｍｇの用量のｐＤＲ２／ペプチド無しによるＥＡＥの処置は、結果として実際に処置にビヒクルと比較して、毎日のおよび蓄積されたＥＡＥスコアの有意な減少を生じた。標準用量のＲＴＬ３４２Ｍによる２日または５日間の連日の処置は、ＥＡＥのより強力な阻害を結果として生じた。
【０１５２】
ＣＤ７４レベルは未処置のＤＲ２Ｔｇマウス（臨床的なＥＡＥのないＣＤ７４の背景強度）からのＣＮＳに由来したＣＤ１１ｂ＋細胞において評価され、そして、ｍＭＯＧ−３５−５５で免疫化されたＤＲ２−Ｔｇマウス（ＤＲ＊１５０１Ｔｇ）は、ＲＴＬ３４２Ｍ（１００μｇのｐＭＨＣで連日二回）、「空の」ＲＴＬ３０２−５Ｄ（１ｍｇＸ２）、またはビヒクル（処置効果のない最大の疾患の誘発レベルのＣＤ７４）でＥＡＥの誘発の１５日後に処置された。図で１４Ｃ示されるように、ＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＣＤ７４レベルとマウスの異なるグループにおける平均的なＣＤＩの間に有意な関連性があった（ｐ＝０．０３５）。
【０１５３】
【表１３】
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【０１５４】
マウスにおいてＥＡＥはｍＭＯＧ−３５−５５による免疫化によって誘発された。疾患発症時には、マウスは以下のコンストラクトのうちの１つにより処置された：（ｉ）共有結合でｍＭＯＧ−３５−５５を結合したｐＤＲ２（１００μｇ）、（ｉｉ）ペプチドの無いｐＤＲ２（１０００μｇ）（ｉｉｉ）ＤＲ−α１（７５０μｇ）、または（ｉｖ）ビヒクル単独。コンストラクトは、２日連続で皮下に投与された。免疫後１５日目においては、マウスは屠殺され、そして脊髄は各々のグループで採取され、貯蔵された。単離された細胞は、ＣＤ７４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ８０、ＩＣＡＭおよびＨＬＡ−ＤＲの発現のため染色され、ＦＡＣＳによって分析された。ペプチドの無いｐＤＲ２、およびＤＲ−α１により処置マウスの臨床スコアはビヒクルにより単独で処置されたものよりも低かった（図１５）。類似した結果は、ビヒクル、ＲＴＬ３０２−５Ｄ（溶液での凝集を減少させるための５つのアミノ酸置換を持つｐＤＲ２）、ＲＴＬ３４２Ｍ（ＭＯＧ３５−５５を有するＲＴＬ３０２−ｍ５Ｄ）あるいはＤＲ−α１により処置されたマウスで得られた（図１６）。結果は有意水準までは上昇しないが、この結果は、より大きなサンプル数により、またはｐＤＲ２（ペプチド無し）またはＤＲ−１を使用してＥＡＥを処置する最適な処置レジメンを達成するために用量及び／又は投与パラメーターを変更することにより統計的に有意な結果を得る可能性があることを示唆する。
【０１５５】
ＣＤ７４の発現は、ｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５により処置されたマウスの脊髄に由来するＣＤ１１ｂ＋単球で減少した（図１７Ａ）。ＣＤ８０発現はｐＤＲ２／ペプチド無しおよびｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５で処置されたマウスにおいて減少した（図１７Ｂ）。ＩＣＡＭ発現は、任意の処置グループで未処置の対照と比較して有意に変化しなかった（図１７Ｃ）。
【０１５６】
ｐＭＨＣの結合が直接的にＭＩＦに誘発されたシグナル伝達を阻害するかどうかを証明するために、未処置の脾細胞はＭＩＦおよびＬＰＳでの刺激前にｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５と共に１時間インキュベートされ、その後、ＩＣＡＭ−１の発現が評価された。図１８Ａで示されるように、ｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５はＭＩＦによって増幅されたＬＰＳ背景レベルに対するＩＣＡＭ−１メッセージを有意に減少させ、ＭＩＦ依存性の効果に対する完全な阻害を示したが、ＬＰＳ依存性の活性化に対するさらなる効果は無かった。
【０１５７】
ＣＤ７４に対するＭＩＦの結合はマクロファージのランダムな移動を阻害することは既知である。ｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５結合によって媒介されるＣＤ７４の細胞表面の発現の減少による単球の移動パターンの変化を決定するために、未処置のＤＲ＊１５０１／ＧＦＰ−Ｔｇマウスから単離されたＧＦＰ＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の移動は、生体画像化顕微鏡法を使用してｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５有り、または無しでインビトロで２時間トラッキングされた。図１８Ｂ−Ｄで示されるように、ｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５がある状態で、測定された速度（ｐ＜０．０００５、図１８Ｂ）、平均二乗変異（ｐ＜０．０００５、図１８Ｃ）およびランダムな移動経路（図１８Ｄ）で有意な増加が観察された。これらのデータは、ｐＤＲ２／ｍＭＯＧ−３５−５５によって誘発されたＣＤ７４の細胞表面の発現の減少が、ＩＣＡＭ−１の発現の減少およびＣＤ１１ｂ＋単球のランダム移動の増加と関連していることを示唆し、そしてそれはＭＩＦ効果の遮断と一致している。
【０１５８】
＜実施例７：ＥＡＥに対するＤＲα１の用量反応＞
ＥＡＥはｍＭＯＧ−３５−５５による免疫化によってマウスで誘発された。疾患の発症時において、マウスは以下のうちの１つにより処置された：（ｉ）ビヒクル単独（ｉｉ）５００μｇのＤＲ２−β１、（ｉｉｉ）１００μｇのＤＲ−α１、（ｉｖ）３００μｇのＤＲ−α１（ｖ）５００μｇのＤＲ−α１、（ｖｉ）１０００μｇのＤＲ−α１および１００μｇのＲＴＬ３４２Ｍ（ＤＲ２／ｍＭＯＧ３５−５５）。すべての投与量は連日２回だった。結果を図２３および表１４に示す。
【０１５９】
【表１４】
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【０１６０】
付加的に、ＤＲ２−Β１のみで処置されたマウスはＣＤ７４をダウンレギュレートせず、処置されなかった。ｍＭＯＧ３５−５５／ＣＦＡ／Ｐｔｘに誘発されたＥＡＥを有するＤＲ＊１５０１−ＴＧマウスは１００μｇ  ＲＴＬ３４２Ｍ、５００μｇ  ＤＲ２−β１またはビヒクルにより臨床症状の開始時に３日間、連日処置された。データは図２１および図２２および表１５に要約される。
【０１６１】
【表１５】
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【０１６２】
＜実施例８：被験体の多発性硬化症を処置するまたは阻害する方法＞
本実施例は、被験体の有する多発性硬化症を処置するまたは阻害する典型的な方法を記載する。しかしながら、当業者は、被験体の多発性硬化症を処置または阻害するためにこれらの特定の方法を逸脱する方法を使用することができることを認識する。当業者は、異なる自己免疫障害等の異なる障害に対して被験体を処置するこれらの方法を同様に変更することができる。
【０１６３】
多発性硬化症がある被験体が選択される。被験体は、０．１ｍｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの用量でＭＨＣクラスＩＩα１ポリペプチド（またはその一部）またはミエリン抗原（ＭＯＧ  ３５−５５、ＭＢＰ  ８５−９９またはＰＬＰ  １３９−１５１など）に共有結合で結合されたＭＨＣクラスＩＩα１ドメイン（またはその一部）ポリペプチドにより週ごとに処置される（例えば皮下注射によって）。被験体は１以上のＭＲＩ測定を含む１以上の多発性硬化症の測定ために評価される（Ｔ２病変負荷、Ｔ１低強度の量、ＮＡＡレベルおよび全脳萎縮のように）；治療の前の、治療の期間に定期的の、及び／又は処置コースの終わりにおける臨床的な測定（ＥＤＳＳの変化など、ＳＲＳ（スクリップスの神経性の評定尺度）の変化、再発率、および９穴釘試験（９−ｈｏｌｅ  ｐｅｇ  ｔｅｓｔ））、または免疫学測定（例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２のＴ細胞リンケージのマーカー、様々なＴ細胞マーカーのＦＡＣＳ分析、インビトロでのＴ細胞によるサイトカイン産生、およびＴ細胞の増殖）。
【０１６４】
被験体では多発性硬化症（あるいは別の自己免疫障害）を処置または阻害するためのＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドの治療の有効性は、１以上の症状の進行の改善、あるいは減少を、例えば未処置の被験体、処置前の障害を有する被験体（例えば、処置前の同被験体）、またはプラセボ（例えばビヒクルのみ）により処置された障害を有する被験体等の対照と比較することにより示される。
【０１６５】
＜実施例９：被験体における処置効果の測定方法＞
本実施例は、被験体に対するＭＨＣクラスＩＩポリペプチド処置の効果の測定のための典型的な方法を記載する。しかしながら、当業者は、被験体に対する処置の効果を測定するためにこれらの特定の方法を逸脱した方法を使用することができることを認識する。
【０１６６】
ＭＨＣクラスＩＩβ１α１ポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチド（またはその一部）の少なくとも１回用量により処置された被験体は選択される。血液サンプルなどのサンプルは被験体から得られる。幾つかの実施例では、サンプル中のＣＤ７４の発現は、例えば、サンプルから核酸を抽出することによりＣＤ７４の発現をＲＴ−ＰＣＲにより測定すること、ＣＤ７４タンパク質発現をＥＬＩＳＡによって、またはフローサイトメトリーによって測定される。他の実施例では、例えば、サンプルをＭＩＦと接触しＥＲＫ１／２活性、ＮＦ−κΒ活性化、Ｂｃｌ−２発現、ＩＬ−８分泌、細胞増殖またはアポトーシスの１以上の測定により測定される。ＣＤ７４の発現及び／又は活性のレベルは、対照（例えば、参照値またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチド処置前の被験体からのサンプルにおける決定されたＣＤ７４の発現または活性レベル）と比較される。
【０１６７】
その処置はＣＤ７４の発現及び／又は活性レベルが対照以下である場合に効果的であると決定される。その処置はＣＤ７４の発現及び／又は活性レベルが対照より大きい場合に次善に効果的であると決定される。処置が効果的であると決定された場合、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドの投与量は維持（または減少）され得る。処置が次善に効果的あると決定された場合、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドの投与量が増加され得る。当業者は、ＣＤ７４の発現または活性レベル、処置されている障害、被験体の疾病および他の因子に基づいて、適切な投与量（投与量の徐々に増加または減少など）を選択し得る。
【０１６８】
＜実施例１０：被験体における処置の効果を最適化する方法＞
本実施例は、被験体のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドを用いた処置の効果を最適化する典型的な方法を記載する。しかしながら、当業者は、被験体の処置効果を最適化するためにこれらの特定の方法を逸脱する方法を使用することができることを認識する。
【０１６９】
自己免疫性か炎症性の障害（多発性硬化症等）を有する被験体が選択される。被験体は、ＭＨＣクラスＩＩβ１α１のポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチド（またはその一部）の用量を投与される。血液サンプルなどのサンプルは被験体から得られる。幾つかの実施例では、ＣＤ７４の発現は、例えば、サンプルから核酸を抽出することによりＣＤ７４の発現をＲＴ−ＰＣＲにより測定することにより、ＣＤ７４タンパク質発現をＥＬＩＳＡによって、またはフローサイトメトリーによって測定される。他の実施例では、ＣＤ７４の活性は、例えば、サンプルをＭＩＦと接触しＥＲＫ１／２活性、ＮＦ−κΒ活性化、Ｂｃｌ−２発現、ＩＬ−８分泌、細胞増殖またはアポトーシスの１以上の測定により測定される。ＣＤ７４の発現及び／又は活性のレベルは、対照（例えば、参照値またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチド処置前の被験体からのサンプルにおける決定されたＣＤ７４の発現または活性レベル）と比較される。被験体にその後に投与されるポリペプチドの投与量は、その後、決定される。ＣＤ７４の発現または活性レベルが対照より大きい場合、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドの投与量は処置の効果を高めるために増加され得る。
【０１７０】
ＣＤ７４の発現または活性レベルが対照以下である場合、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドの投与量は維持するか減少し得る。当業者は、ＣＤ７４の発現または活性レベル、処置されている障害、被験体の疾病および他の因子に基づいて、適切な投与量（投与量を徐々に増加または減少など）を選択することができる。
【０１７１】
開示の原理が適用されても良い多くの可能性のある実施形態を考慮して、例証する実施形態が単なる例であり、本発明の範囲の制限として受け取られるべきでないことは認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は特許請求の範囲によって定義される。我々は、それ故、これらの特許請求の範囲の範囲内および精神内で生ずるものすべてを本発明として主張する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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