(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
８９７．２Ａｍｕの測定質量＋ナトリウム、及び８７４．２Ａｍｕの測定モノアイソ卜ピック質量を有する下記式のブリオスタチン化合物Ｂ１０を含み、該ブリオスタチン化合物Ｂ１０が５０％の純度〜結晶形成純度を有する、第１の組成物。
【化１】
0006440628.tif 000007
【請求項２】
９１１．５Ａｍｕの測定質量＋ナトリウム、及び８８８．９Ａｍｕの測定モノアイソ卜ピック質量を有する下記式のブリオスタチン化合物Ｂ１２を含み、該ブリオスタチン化合物Ｂ１２が５０％の純度〜結晶形成純度を有する、第２の組成物。
【化２】
0006440628.tif 000008
【請求項３】
組成物の作成方法であって、フサコケムシから下記式のブリオスタチン化合物Ｂ１０またはブリオスタチン化合物Ｂ１２を単離するステップと、前記ブリオスタチン化合物を５０％の純度〜結晶形成純度に精製するステップとを含み、前記組成物が前記ブリオスタチン化合物を含む、作成方法。
【化３】
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0006440628.tif 000010
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年１１月２７日出願の米国特許仮出願第６１／７３０，２２７号の利益を主張する。この特許仮出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による支援に関する記載
本出願の発明は米国国立老化研究所及び国立衛生研究所認可番号ＳＲ４４ＡＧ０３４７６０に基づく連邦政府による支援により実施された。
【０００３】
本発明の実施形態は、ハッチンソン病、パーキンソン病、ダウン症候群、及びアルツハイマー病などの神経変性疾患、ＨＩＶ及びヘルペスなどのウイルス性潜伏疾患（ｖｉｒｕｓ  ｌａｔｅｎｃｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）、前立腺癌などの癌ならびに他の緑内障などのアミロイド媒介疾患の治療薬として有用な組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
アルツハイマー病、ハッチンソン病、パーキンソン病、クールー病、クロイツフェルトヤコブ病及び他の海綿状脳症などの神経変性疾患は、未だに健康上の大きな問題として残されている。現在のところ、これらの病気の治療に対し極めて限られた手段しかない。アルツハイマー病、ハッチントン病、パーキンソン病に関しては、これらの病気は、高齢の個体で、及び病気の進行と共に顕在化する傾向があり、罹患した個体が自立できることは少ない。神経変性疾患は、ベータアミロイドプラークの形成と関連している。ブリオスタチン１は、特定のプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）のイソ型の産生を刺激する。このＰＫＣは、αセクレターゼの産生を増やし、これがアミロイド前駆体タンパク質を溶解可能にし、それにより、ベータアミロイドプラークの形成を抑制する。前立腺癌などの癌に対しては、ブリオスタチン１は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）のδ転座を特異的に調節し、腫瘍壊死因子アルファのＰＫＣδ媒介放出を阻害することにより、前立腺癌細胞におけるホルボールエステル誘導アポトーシスを抑制する。ＨＩＶ潜伏などのウイルス性潜伏疾患に対しては、ブリオスタチン−１ならびに多くのＰＫＣアゴニストは、ＨＩＶ−１プロモーターに結合し、その転写活性を調節するＮＦーｋＢなどの細胞転写因子を活性化する。ＨＩＶ−１の潜伏中、ウイルスプロモーターは、ウイルスプロモーターを取り囲む核ヒストンが脱アセチル化されている（コンパクトクロマチン）ために、細胞転写因子へのアクセスが少ない。従って、ＨＤＡＣ阻害剤は、ヒストンのアセチル化を高め（弛緩クロマチン）、その結果、転写因子がＨＩＶプロモーターに容易にアクセスできるようになる。
【０００５】
蘚苔地衣類は、複雑な環状マクロライド分子である一群のブリオスタチンから構成される。蘚苔地衣類は、最初は、海産コケムシのフサコケムシから少量単離された。合成方法は、難しく、高価である。ブリオスタチンとして知られ、１〜２０の番号が付けられている約２０種の蘚苔地衣類組成物が特定されている。蘚苔地衣類の多くは、抗癌特性を有することが知られている。
【０００６】
高効力と活性を有する新規蘚苔地衣類化合物を得ることは、有用であると思われる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の実施形態は、約５０％の純度〜結晶形成純度を有する約８９６〜８９８Ａｍｕ（分子質量＋Ｎａ）の分子量の第１の蘚苔地衣類組成物を特徴とする。また、第１の蘚苔地衣類組成物は、約５０％の純度及び結晶形成純度を有する約８７３〜８７５Ａｍｕ（モノアイソ卜ピック質量）の分子量の蘚苔地衣類化合物として特徴付けることもできる。第１の蘚苔地衣類組成物は、８９７．２Ａｍｕの測定質量＋Ｎａ、及び８７４．２Ａｍｕの測定モノアイソ卜ピック質量を有する。以降で行う詳細な考察では、この蘚苔地衣類をＢ１０と呼ぶ。
【０００８】
本発明の実施形態は、約５０％の純度〜結晶形成純度を有する約９１０〜９１２Ａｍｕ（分子質量＋Ｎａ）の分子量の第２の蘚苔地衣類組成物を特徴とする。また、第２の蘚苔地衣類組成物は、約５０％の純度及び結晶形成純度を有する約８８８〜８９０Ａｍｕ（モノアイソ卜ピック質量）の分子量の蘚苔地衣類化合物として特徴付けることもできる。第２の蘚苔地衣類組成物は、９１１．５Ａｍｕの測定質量＋Ｎａ、及び８８８．９Ａｍｕの測定モノアイソ卜ピック質量を有する。以降で行う詳細な考察では、この蘚苔地衣類をＢ１２と呼ぶ。
【０００９】
本発明の実施形態は、約５０％の純度〜結晶形成純度を有する約８６８〜８７０Ａｍｕ（分子質量＋Ｎａ）の分子量の第３の蘚苔地衣類組成物を特徴とする。また、第３の蘚苔地衣類組成物は、約５０％の純度及び結晶形成純度を有する約８４６〜８４８Ａｍｕ（モノアイソ卜ピック質量）の分子量の蘚苔地衣類化合物として特徴付けることもできる。第３の蘚苔地衣類組成物は、８６９．５Ａｍｕの測定質量＋Ｎａ、及び８４６．６Ａｍｕの測定モノアイソ卜ピック質量を有する。以降で行う詳細な考察では、この蘚苔地衣類をＢ１４Ｂと呼ぶ。
【００１０】
本発明の実施形態は、約５０％の純度〜結晶形成純度を有する約８９５〜８９７Ａｍｕ（分子質量＋Ｎａ）の分子量の第４の蘚苔地衣類組成物を特徴とする。また、第４の蘚苔地衣類組成物は、約５０％の純度及び結晶形成純度を有する約８７２〜８７４Ａｍｕ（モノアイソ卜ピック質量）の分子量の蘚苔地衣類化合物として特徴付けることもできる。第４の蘚苔地衣類組成物は、８９５．５Ａｍｕの測定質量＋Ｎａ、及び８７２．６Ａｍｕの測定モノアイソ卜ピック質量を有する。以降で行う詳細な考察では、この蘚苔地衣類をＢ１４Ｃと呼ぶ。
【００１１】
これらの本発明の蘚苔地衣類化合物は、ブリオスタチン１〜２０の分子量とは異なる分子量を有する。
【００１２】
本発明で使用する場合、結晶形成純度は、組成物が結晶を形成できる純度を有することを意味する。通常、このような純度は、９０％より高く、より多くの場合、９５％より高い。本出願で提示された例は、９９％を越える純度を有する組成物を特徴とする。結晶純度は、不純物が検出できない組成物を含んでもよいが、それだけに限定されない。
【００１３】
本発明の蘚苔地衣類組成物は、蘚苔地衣類に応答する神経変性疾患、癌及びウイルス潜伏などの状態の治療に有用である。本発明の蘚苔地衣類組成物は、特定のプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）のイソ型及びアミロイド前駆体タンパク質の高活性モジュレーターである。本発明の蘚苔地衣類、及び蘚苔地衣類組成物は、特定のプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）のイソ型の産生を刺激し、これがアミロイド前駆体タンパク質を可溶型に変換するα（α）分泌酵素の産生を増やす。本発明の蘚苔地衣類組成物は、ブリオスタチン１と類似の、又はそれを越える高レベルの活性を示す。
【００１４】
本発明の一実施形態は、ブリオスタチン１〜２０などの蘚苔地衣類に応答する神経変性病、癌及びウイルス潜伏などの疾患の治療に関する。方法は、第１の蘚苔地衣類組成物、第２の蘚苔地衣類組成物、第３の蘚苔地衣類組成物、及び第４の蘚苔地衣類組成物からなる群から選択される少なくとも１種の蘚苔地衣類組成物の有効量を投与するステップを含む。
【００１５】
本発明の実施形態は、患者へ投与するための、第１の蘚苔地衣類組成物、第２の蘚苔地衣類組成物、第３の蘚苔地衣類組成物、及び第４の蘚苔地衣類組成物からなる群から選択される剤形中の蘚苔地衣類組成物をさらに含む。剤形は、限定されないが、静脈内、腹腔内、錠剤、ジェルキャップ、カプセル剤、経口溶液、及び懸濁液などの経口剤形；肺又は鼻腔経路投与用噴霧又はミスト形成溶液などの噴霧剤、軟膏、ローション及び噴霧などの局所剤形；ならびに当該技術分野において既知のその他の剤形を含む多くの形状を取ることができる。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態は、第１の蘚苔地衣類組成物、第２の蘚苔地衣類組成物、第３の蘚苔地衣類組成物、及び第４の蘚苔地衣類組成物からなる群から選択される蘚苔地衣類組成物の作成方法に関し、方法は、蘚苔地衣類のソースから蘚苔地衣類組成物を単離するステップと、蘚苔地衣類組成物を５０％の純度及び結晶形成純度に精製するステップとを含む。蘚苔地衣類のソースは、好ましくは、海産コケムシのフサコケムシである。
【００１７】
これまで述べてきた、及びその他の本発明の特徴と利点は、以降で述べる図面を考察し、詳細説明を読み取ることにより明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ブリオスタチン１の高速液体クロマトグラフィーの図である。
【図２】フサコケムシの酢酸エチル（ＥＡ）粗製抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】ブリオスタチン型組成物の精製ステップのフローチャーチである。
【図４】ブリオスタチン−１及び本発明の実施態様であるその他の抽出物により誘導されたα分泌酵素活性を示す図である。
【図５】蘚苔地衣類の混合物のクロマトグラムである。
【図６】蘚苔地衣類の混合物のクロマトグラム、及び２６５ｎｍで測定した保持時間を示す。
【図７】２６５ｎｍでの種々の蘚苔地衣類のＵＶスペクトル図である。
【図８−１】ブリオスタチン１の７００〜１０００Ａｍｕの質量スペクトルの図である。
【図８−２】内部識別番号１０４及びＢ０８（ブリオスタチン２に関連）を含む画分の７００〜１０００Ａｍｕの質量スペクトル図である。
【図８−３】内部識別番号１０６及びＢ１４（ブリオスタチン３に関連）を含む画分の７００〜１０００Ａｍｕの質量スペクトル図である。
【図８−４】本発明の特徴を例示する内部識別番号１１２及びＢ１６を含む画分の７００〜１０００Ａｍｕの質量スペクトル図である。
【図８−５】内部識別番号１０２、Ｂ１２及びＢ１４（ブリオスタチン−３に関連）を含む画分の７００〜１０００Ａｍｕの質量スペクトル図である。
【図８−６】内部識別番号１０３、Ｂ１０及びＢ１２を含む画分の７００〜１０００Ａｍｕの質量スペクトル図である。
【図８−７】内部識別番号１０５、Ｂ１２及びＢ１４（ブリオスタチン−３に関連）を含む画分の７００〜１０００Ａｍｕの質量スペクトル図である。
【図９】第１の蘚苔地衣類組成物及び第２の蘚苔地衣類組成物のＵＶスペクトル図である。
【図１０】ＳＨＳＹ−５Ｙ神経芽細胞腫の細胞のα分泌酵素活性に与える１０−９Ｍのブリオスタチン−１及び異なる蘚苔地衣類の効果を示す図である。
【図１１】ＳＨＳＹ−５Ｙ神経芽細胞腫細胞のＰＫＣ−ε活性に与える１０−９Ｍのブリオスタチン−１及び異なる蘚苔地衣類の効果を示す図である。
【図１２】ＳＨＳＹ−５Ｙ神経芽細胞腫細胞のＰＫＣ−δ活性に与える１０−９Ｍのブリオスタチン−１及び異なる蘚苔地衣類の効果を示す図である。
【図１３】ＳＨＳＹ−５Ｙ神経芽細胞腫細胞のＰＫＣ−α活性に与える１０−９Ｍのブリオスタチン−１及び異なる蘚苔地衣類の効果を示す図である。
【図１４】第１の蘚苔地衣類の推定構造の図である。
【図１５】第２の蘚苔地衣類の推定構造の図である。
【図１６】ブリオスタチン−３のＮＭＲスペクトル図である。
【図１７】第１の蘚苔地衣類のＮＭＲスペクトル図である。
【図１８】第２の蘚苔地衣類のＮＭＲスペクトル図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以降では、本発明の実施形態において、第１の蘚苔地衣類組成物（Ｂ１０と呼ぶこともある）、第２の蘚苔地衣類組成物（Ｂ１２と呼ぶこともある）、第３の蘚苔地衣類組成物（Ｂ１４Ｂと呼ぶこともある）、及び第４の蘚苔地衣類組成物（Ｂ１４Ｃと呼ぶこともある）からなる群から選択される蘚苔地衣類組成物に関して記載する。これらの本発明の蘚苔地衣類化合物は、ブリオスタチン３の立体異性体であると思われるＢ１２を除いて、ブリオスタチン１〜２０の分子量とは異なる分子量を有する。
【００２０】
フサコケムシを分画し、ブリオスタチン画分（蘚苔地衣類）を作製し、個別蘚苔地衣類を単離した。
【００２１】
ＨＰＬＣ分析：
１５ｃｍ  ５ミクロンＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ＰＦＰ（２）カラム（ＵＰＳ  Ｐａｃｋｉｎｇ  Ｌ４３）及び５０マイクロリットルの８５％Ｈ３ＰＯ４／リットルで酸性化した６０％アセトニトリル移動相を使って、ＨＰＬＣでブリオスタチン−１を分析した。流量を１．０ｍＬ／分に設定し、カラム温度を３０℃に設定した。Ｍｏｄｅｌ  ９９６アレイ検出器を組み込んだＷａｔｅｒｓのＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍシステムを使ってクロマトグラフスキャンを生成した（図１）。ブリオスタチン−１を２６５ｎｍで測定し、１９５ｎｍ〜３４５ｎｍの等高線図を同時に記録した。
【００２２】
ブリオスタチン−１の作製及びキャラクタリゼーション：
最初の２つのステップで、イソプロパノール、メタノール、酢酸エチル、及び水などの有機溶媒を使い、続けて、ヘキサン／塩化メチレン及び酢酸エチル／メタノールからなる移動相を使ってシリカクロマトグラフィーにより湿ったフサコケムシからブリオスタチンを抽出するか、あるいは、洗浄、乾燥、粉砕したフサコケムシにＳｕｐｅｒＦｌｕｉｄｓ（登録商標）（臨界点近傍及び超臨界流体ならびに共溶媒を含有又は非含有で）、二酸化炭素、メタノールを加えて抽出し、二酸化炭素とメタノールを使ってＳｕｐｅｒＦｌｕｉｄｓ（登録商標）シリカクロマトグラフィーにより精製する（Ｃａｓｔｏｒ，１９９８，２００１）。
【００２３】
第３のステップは、ブリオスタチン−１の純度を６０〜７０％に改善するメタノールと水からなる移動相とＣＧ７１ポリマー樹脂（Ｒｏｈｍ−Ｈａａｓ）を使ったセグメンテーションクロマトグラフィー（ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）ステップである。第４のステップは、２個のｓｅｍｉ−ｐｒｅｐ  ＨＰＬＣ  Ｃ１８カラム（Ｂａｋｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）と、ブリオスタチン−１の純度を９５％超に改善するアセトニトリル及び水からなる移動相を使ったセグメンテーションクロマトグラフィー法を利用する。第５のステップは、ブリオスタチン−１を９８．５％超に精製するアセトニトリルと水を使った結晶化を利用する。
【００２４】
ブリオスタチン−１の特定を、紫外線（ＵＶ）スペクトル、ならびに高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の保持時間を米国国立癌研究所（ＮＣＩ）、国立衛生研究所（ＮＩＨ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ、により提供された標準に対比して、確認した。また、これとは別に、ブリオスタチン−１の特定を、質量スペクトル（ＭＳ）データ、ならびに元素分析、プロトン及び炭素核磁気共鳴（ＮＭＲ）、赤外（ＩＲ）分光法、示差走査熱量計（ＤＳＣ）及び融点を測定して確認した。
【００２５】
ブリオスタチン−１の９９．６４％ＣＰへの精製
精製手順と結果
米国国立癌研究所（ＮＣＩ）から提供を受けたフサコケムシの酢酸エチル抽出物（試料Ｃ−０２１５１９＃７）を出発原料として使用した。合計約５７ｇのＥＡ抽出物をジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解し、アッセイしてブリオスタチン−１及びその他の蘚苔地衣類の存在を測定した。ここで図２を見ると、フサコケムシのＥＡ粗製抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムが示されている。標識矢印は、ブリオスタチン様化合物の内部識別番号を示す。これらの化合物には、Ｂ１０、Ｂ１２、及びブリオスタチン３（Ｂ１６）、ならびにブリオスタチン−２（Ｂｒｙｏ−２）及びブリオスタチン−３（Ｂｒｙｏ−３）が含まれる。ブリオスタチン−１（Ｂｒｙｏ−１）は、２４．２分で溶出する。表記Ｂ１０は、本発明の第１の蘚苔地衣類に対応する蘚苔地衣類である。表記Ｂ１４は、本発明の第３と第４の蘚苔地衣類を生ずる。
【００２６】
ブリオスタチン−１は、図３に示す種々のクロマトグラフィー樹脂を使ってフサコケムシＥＡ粗製抽出物から精製された。初期のステップ（ステップ１とステップ２）は、Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  Ａｃｔｉｖｅ（１００〜２００μｍ）を使って行い、試料をＤＣＭ中の漸増濃度の酢酸エチルで溶出した。シリカ精製ステップは、ＥＡ粗製抽出物の非極性化合物（図３のクロマトグラフの最後に溶出する）からいくつかの有色成分を除去し、大部分のＢ１６のピークを除去するのに有用である。
【００２７】
次に、ブリオスタチン−１含有画分をＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ７１で精製した。これは、ブリオスタチン様化合物を酸性化メタノールと水による溶出を可能とした。この樹脂は、環境に有害な塩素系溶剤の使用を最小限にするのを容易にする。ＣＧ７１精製ステップは、ブリオスタチン−１の前に溶出する「Ｘ５」ピークを取り除く。これは、ブリオスタチン−１の直前の不純物（主にＢ１６）を最小限にする役割も果たした。
【００２８】
その後の精製は、Ａｍｉｃｏｎ  Ｃ１８  ４０μｍ樹脂及び２個のｐｒｅｐ−Ｃ１８カラム（２．５ｘ２．５ｃｍ、１０μｍカラム）を使って行った。このステップは、ブリオスタチン−１からＢ１２及びＢｒｙｏ−３のさらなる分離を可能とした。しかし、ブリオスタチン−１のピークの肩部に「Ｘ５」ピークがまだ存在した。最終の結晶化ステップにより、ブリオスタチン−１の９９％超のクロマトグラフィー純度（ＣＰ）への精製が達成され、粗製抽出物から６９％が回収された。
【００２９】
ＨＰＬＣ測定：
図３に略述した各精製ステップで、Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）カラム（２５０ｘ４．６ｍｍ、１０μｍ）を使ってブリオスタチン−１を測定した。リン酸で酸性化した８０％アセトニトリル（ＡＣＮＰ）を２ｍＬ／分の流量を使って、無勾配モードで溶出を行った。カラム温度を３０℃に設定した。
【００３０】
ブリオスタチン様化合物（蘚苔地衣類）
フサコケムシを分画し、ブリオスタチン−１の代替物として機能する可能性のあるブリオスタチン画分を作製した。これらの画分を精製し、インビトロ分析を行うためにＬＳＵに送付した（表１）。
【表１】
0006440628.tif 000002
【００３１】
ｓ−ＡＰＰα分泌の誘導におけるブリオスタチン−１類似体（蘚苔地衣類）の有効性
図４に示すｓ−ＡＰＰα分泌の誘導におけるいくつかのブリオスタチン−１類似体（蘚苔地衣類）の有効性画分Ｄを除いて、それらは全て、ブリオスタチン−１に比べて大きなｓ−ＡＰＰα放出を誘導した。ブリオスタチン−１に対する最良の代替画分は、類似体Ｅで、これは表記Ｂ１６に対応し、ブリオスタチン３であると特定された。生物活性は、次の画分の順であった：Ｅ（１０５）＞Ｇ（１１２）、Ｆ（１０６）、Ｃ（１０３）＞Ａ（１０１）、Ｂ（１０２）＞Ｄ（１０４）。
【００３２】
予備的データから、Ｂ１２又はＢ１４は、ブリオスタチン−１より生理活性がかなり高い可能性があると思われる。ほとんどの画分は２種以上の蘚苔地衣類を含んでいるので、９７．５％ＣＰ超のＢ１６を含む画分Ｇを除いて、いずれの成分が生物活性を担っているかの判断は困難である。本発明の第１の蘚苔地衣類組成物のＢ１０は、ブリオスタチン−１より著しく高い活性を有し、これにより、治療薬として別の有望な代替蘚苔地衣類がもたらされる。
【００３３】
ＨＰＬＣ標準化：
ここで、２６５ｎｍでの蘚苔地衣類混合物の高速液体クロマトグラフを示す図５に目を向けると、種々の蘚苔地衣類がフサコケムシＥＡ粗製抽出物中に存在する。
【００３４】
同定（保持時間に基づく）及びその後の各蘚苔地衣類の精製のために、蘚苔地衣類の混合物（Ｂ０９、Ｂ１０、Ｂ１２、Ｂ１４Ｃ、Ｂ１４Ｂ、Ｂ１６、ブリオスタチン−１、ブリオスタチン−２、及びブリオスタチン−３）を標準化した。高速液体クロマトグラフィー精製の結果を示すクロマトグラムを図６に示す。これらの蘚苔地衣類は、ブリオスタチン−１と類似のＵＶパターンを含み、２６５ｎｍでの種々の蘚苔地衣類のＵＶスペクトル（図７）に示されるように、２６５ｎｍに最大波長を有する。
【００３５】
既知の基準を使って、及び／又は文献中の既知の質量と比較して、ＵＶ−ＨＰＬＣ及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる各蘚苔地衣類の同定を試みた。前に行った予備的インビトロ実験（上述）では、これらの蘚苔地衣類が、ブリオスタチン−１デカンで観察されるのと同じ％の、あるいは、それより大きい％のｓ−ＡＰＰα分泌を誘導できることが示されているので、これは重要である。
【００３６】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに基づく予備的キャラクタリゼーション
異なる蘚苔地衣類のキャラクタリゼーションは、島津ＨＰＬＣシステムを備えたＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  ＡＰＩ２０００システムを使って行った。Ｑ１スキャンパラメータを７００〜１０００Ａｍｕスキャンのブリオスタチン−１  ｍ／ｚ  ４２７［Ｍ＋Ｎａ］用に最適化した（図８−１）。その他の画分の質量スペクトルスキャンは、図８−２〜８−７に示す。個別蘚苔地衣類及び蘚苔地衣類混合物を含む全部で７種の画分を分析した（表２）。
【表２】
0006440628.tif 000003
【００３７】
考察：
ブリオスタチン−１で観察されたＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータは、９２７Ａｍｕにピークを示し、これは［Ｍ＋ＮＡ］に相当し、文献で既に報告されている（Ｍａｎｎｉｎｇら，２００５）。ブリオスタチン−１〜１８のスペクトルデータを表３にまとめる。行われたＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に基づいて、画分１０４と画分１０６を、それぞれ、ブリオスタチン−２（８６３Ａｍｕ）とブリオスタチン−３（８８９Ａｍｕ）であると確定した。
【００３８】
画分１１２では、Ｂ１６の質量が文献に報告されているいずれの蘚苔地衣類にも一致しないことを示した。画分１０２、１０３及び１０５は、ブリオスタチン−３で観察されたものと同じ質量ピークを示した画分１０２と１０５の両方は、混合物の形でＢｒｙｏ−３を含み、これにより、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで観察された９１１ピークを説明可能であろう。画分１０３中になぜ９１１Ａｍｕが認められるのかは明確ではない。これは、Ｂ１２がブリオスタチン−３（８８９Ａｍｕ）と同じ質量を有する可能性があることを示す。このことは、Ｂ１２とＢｒｙｏ−３の両方を含む画分１０５が９１１Ａｍｕのピークを示すのみであるという事実により裏付けられている。画分１０３で観察された８９７ピークは、Ｂ１０に対応する可能性があるが、それは、文献で報告されたブリオスタチンの質量のいずれにも一致しない。画分１０２の９２５Ａｍｕのピークは、画分１０６でも観察されている。
【表３】
0006440628.tif 000004
0006440628.tif 000005
【００３９】
ブリオスタチン類似体の単離：Ｂ１６（９８．５％ＣＰ）及びＢ１４Ｂ（９３．４％ＣＰ）前に行ったブリオスタチン−１の精製から集めた側画分から蘚苔地衣様化合物のＢ１６及びＢ１４Ｂを精製し、４℃で貯蔵した。蘚苔地衣類のＵＶスペクトルはブリオスタチン−１のものと同じである（図９）。
【００４０】
ＨＰＬＣ測定：
精製の間に、Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）カラム（２５０ｘ４．６ｍｍ、１０μｍ）を使ってＢ１６とＢ１４Ｂを測定した。２ｍＬ／分の流量の無勾配モードの８０％ＡＣＮＰ（リン酸で酸性化したアセトニトリル）で溶出を行った。カラム温度を３０℃に設定した。
【００４１】
精製手順と結果：
２本のｐｒｅｐ−Ｃ１８カラム（２．５ｘ２．５ｃｍ、１０μｍ）及びｓｅｍｉ−ｐｒｅｐカラムを使ってＢ１６とＢ１４Ｂ含有画分を精製した。漸増濃度のＡＣＮＰを使って、段階勾配で精製を行った。各蘚苔地衣類が個別のカラム上にほぼ位置するようになるまで、溶出をモニターした。カラムからＡＣＮＰの急勾配を使って画分を追い出し、アッセイして各ピークの濃度を測定した。
【００４２】
記載のカラムシステムを使って、蘚苔地衣類Ｂ１６とＢ１４Ｂを成功裏に分離した。Ｃ１８とＰＦＰカラムの両方の使用は、Ｂ１４ＢからＢ１６を分離し、Ｂ１４ＣからＢ１４Ｂを部分精製するために必要である。Ｂ１４Ｃと標識のピークは、Ｂ１４Ｂと共溶出した別の蘚苔地衣類で、これは、７０％ＡＣＮＰで分析時に、より良好に測定できる。Ｂ１６とＢ１４Ｂ／Ｃの両方の結晶化は、蘚苔地衣類含有画分にＭｅＯＨを添加することにより可能であった。９８．５％ＣＰのＢ１６結晶が合計２１２ｍｇ回収された。９３．４％ＣＰのＢ１４Ｂ／Ｃが合計１０８ｍｇ回収され、後の精製のために貯蔵された。その後、Ｂ１４Ｂ／ＣをＢ１４ＢとＢ１４Ｃに分離した。精製蘚苔地衣類をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで再分析した。結果を表４にまとめている。
【表４】
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【００４３】
精製蘚苔地衣類の生物活性：
図１０では、１０−９Ｍの精製蘚苔地衣類が、ＳＨＳＹ−５Ｙ神経芽細胞腫細胞のα分泌酵素活性を高めることが示される。Ｂ３、Ｂ１４Ｂ及びＢ１６が、ブリオスタチン−１に比べて、α−分泌酵素の産生を改善することが示される。
【００４４】
図１１では、Ｂ１０が、ブリオスタチン−１に比べて、ＰＫＣ−εの産生を改善することが示される。図１２では、Ｂ１０が、ブリオスタチン−１に比べて、ＰＫＣ−δの産生を改善することが示される。図１３では、Ｂ１０が、ブリオスタチン−１に比べて、ＰＫＣ−αの産生を改善することが示される。
【００４５】
ＮＭＲと構造的キャラクタリゼーション：
３種の変異体を、ブリオスタチン１とブリオスタチン３に対するＮＭＲの１Ｈと１３Ｃ共鳴、及び結合性（ＨＳＱＣとＨＭＢＣスペクトル）に関し比較した。３種全ての変異体は、ブリオスタチン３のＣ２２ならびに類似のＲ１及びＲ３側鎖（ＯＡｃ及び８−炭素  ２，４−エン）の位置に明らかに閉環があった。ブリオスタチン３に対する変異体は：
【００４６】
Ｂ１０：ＮＭＲは、Ｃ１８からの１つのメチル基の消失を示し、質量差と一致した。予測Ｃ４５Ｈ６２Ｏ１７＝８７４．４（モノアイソ卜ピック）であり、観察Ｂ１０＝８７４．４であった。Ｂ１０の推定構造を図１４に示す。
【００４７】
Ｂ１２は、立体異性体であるように見える：１９〜２４の環に隣接するプロトンの数については、化学シフトの中程度の変化があるが、ブリオスタチン３と同じ共有結合構造を示す。また、これは、ブリオスタチン３（Ｃ４６Ｈ６４Ｏ１７＝８８８．４）と同じ質量を有する。閉環の機構が完全に立体選択的ではない場合、最も可能性のある部位は、Ｃ２２であろう。隣接部位（１９、２０、又は２３）での反転によりＮＭＲの変化も説明できるが、これらの変異体は、その他のブリオスタチンの間では認められない。Ｂ１２の推定構造を図１５に示す。
【００４８】
Ｂ１６では、２６−ＯＨはケトンになる。この変化は、Ｂ１６（Ｃ４６Ｈ６２Ｏ１７＝８８６．４）とＢｒｙｏ−３（８８８．４）との間で観察された質量差の２Ｄａの説明になる。ブリオスタチン−３の２６−ケトンは、既知である（Ｓｃｈａｕｆｅｌｂｅｒｇｅｒ  １９９１）。
【００４９】
これらの構造は、図１６〜１８のＮＭＲスペクトルにより示されるＮＭＲデータにより示唆される。図１６は、ブリオスタチン−３のＮＭＲスペクトルを示す。図１７は、Ｂ１０のＮＭＲスペクトルを示す。図１８は、ブリオスタチン−３のＮＭＲスペクトルに重ねられたＢ１２のＮＭＲスペクトルを示す。
従って、我々の現在の理解に基づくこれらの化合物を作製し、使用するための最良の形態の本発明の実施形態を開示した。当業者なら、このような好ましい実施形態は変更や修正される可能性があり、従って、本発明は、その厳密な詳細に限定されるのではなく、次の請求項の主題及びその等価物を包含するものでなければならないことを容易に理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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