(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニックイネの子実から組換えヒトラクトフェリンを分離、精製するクロマトグラフ法であって、順に
トランスジェニックイネの子実から組換えヒトラクトフェリンを抽出し、組換えヒトラクトフェリンを含む粗抽出液を取得する工程１と、
組換えヒトラクトフェリンを含む粗抽出液を、陽イオン交換クロマトグラフィーを利用して一次分離、精製し、組換えヒトラクトフェリンを含む溶出液を取得する工程２と、
カラム担体を再生するための処理と、
を含んでなり、ここで、
前記陽イオン交換クロマトグラフィーの担体が弱陽イオン交換担体であり、前記陽イオン交換クロマトグラフィーによる分離精製は、更に
カラム容量の５〜１５倍であり且つｐＨ６．０〜７．５の１０〜２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０〜２５ｍＭ  ＮａＡＣ、０〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液を用い、流速５０〜２００ｃｍ／時間の条件下でカラムを平衡化するステップ２Ａと、
工程１の粗抽出液を注入試料とし、ここで、試料の導電率が２〜２５ｍｓ／ｃｍであり且つｐＨが６．０〜７．５であり、試料注入が終わると、洗浄緩衝液を用いて不純物を洗い流し、ここで、該洗浄緩衝液に３〜１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３〜１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２００〜３００ｍＭ  ＮａＣｌを含み、ｐＨが６．５〜８．０であり、洗浄時の流速が５０〜２００ｃｍ／時間であるステップ２Ｂと、
３〜１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３〜１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、４００〜６５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５〜８．０の溶出緩衝液を用い、流速５０〜２００ｃｍ／時間の条件下で試料を溶出し、溶出液を取得するステップ２Ｃと、を含み、
カラム担体を再生するための処理は、
カラム容量３〜１０倍の１〜２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５〜１０．０の高塩濃度溶液を用い、流速５０〜２００ｃｍ／時間の条件下でＵＶ２８０に明らかな変化がないところまでカラムを洗い流す処理ａと
カラム容量３〜１０倍の５〜２５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ２．０〜４．０の緩衝液を用い、流速５０〜２００ｃｍ／時間の条件下でカラムを洗い流す処理ｂと、
カラム容量２〜５倍の０．５〜１．０Ｍ  ＮａＯＨ溶液を用い、流速３０〜１００ｃｍ／時間の条件下でカラムを逆転させて洗い流す処理ｃと、を含む、クロマトグラフ法。
【請求項２】
前記工程２における弱陽イオン交換樹脂が、ＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（「ｓｅｐｈａｒｏｓｅ」は登録商標）である、請求項１に記載のクロマトグラフ法。
【請求項３】
カラム担体を再生するための処理として、
さらに、カラム容量８〜１５倍の超純水を用いてｐＨが１０．０未満になるまでカラムを洗い流し、その後、担体を２０％のエタノール溶液に保存する処理ｄと
を含む、
請求項１又は２のいずれか一項に記載のクロマトグラフ法。
【請求項４】
前記工程１における組換えヒトラクトフェリンの抽出は、
ヒトラクトフェリン遺伝子が導入されたトランスジェニックイネの子実を出発原料とし、籾米の殻を除去して玄米にした後、砕いて８０〜１００メッシュの粉体を取得するステップ１と、
前記粉体と抽出緩衝液を重量体積比で１：５〜１：１０の割合で混合し、常温下で０．５〜２時間抽出して混合物を取得し、ここで、抽出緩衝液は、１０〜２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０〜２５ｍＭ  ＮａＡＣ、０〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌを含み、ｐＨが６．０〜７．５であるステップ２と、
前記混合物を濾過し、組換えヒトラクトフェリンを含む粗抽出液を取得するステップ３と
を含む、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のクロマトグラフ法。
【請求項５】
前記工程２における分離、精製は、
カラム容量１０倍の平衡化緩衝液を用いてカラムを平衡化し、ここで、該平衡化緩衝液は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  ＮａＡＣ、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含み且つｐＨ６．５であり、流速が１５０ｃｍ／時間であるステップ２Ａと、
工程１の粗抽出液を注入試料とし、ここで、試料の導電率が２２．５ｍｓ／ｃｍであり、ｐＨが６．５であり、試料注入が終わると、洗浄緩衝液で不純物を洗い流し、ここで、該洗浄緩衝液は、４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含み且つｐＨ７．５であり、流速が１５０ｃｍ／時間であるステップ２Ｂと、
溶出緩衝液を用いて試料を溶出し、ここで、該溶出緩衝液は、４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、６００ｍＭ  ＮａＣｌを含み且つｐＨ７．５であり、溶出時の流速が１５０ｃｍ／時間であり、組換えヒトラクトフェリンを含む溶出液を回収するステップ２Ｃと、を含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のクロマトグラフ法。
【請求項６】
カラム担体を再生するための処理として、
カラム容量５倍の２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の高塩濃度溶液を用い、流速１５０ｃｍ／時間の条件下でＵＶ２８０に明らかな変化がないところまでカラムを洗い流す処理ａ１と
カラム容量５倍の２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０の緩衝液を用い、流速１５０ｃｍ／時間の条件下でカラムを洗い流す処理ｂ１と、
カラム容量３倍の０．５Ｍ  ＮａＯＨ溶液を用い、流速５０ｃｍ／時間の条件下でカラムを逆転させて洗い流す処理ｃ１と、
カラム容量１０倍の超純水を用いてｐＨが１０．０未満になるまでカラムを洗い流し、その後、担体を２０％のエタノール溶液に保存する処理ｄ１と、を含む、請求項３に記載のクロマトグラフ法。
【請求項７】
前記組換えヒトラクトフェリンの抽出は、
ヒトラクトフェリン遺伝子が導入されたトランスジェニックイネの子実を出発原料とし、籾米の殻を除去して玄米にした後、砕いて８０〜１００メッシュの粉体を取得するステップ１ａと、
前記粉体と抽出緩衝液を重量体積比で１：１０の割合で混合し、常温下で１時間抽出して混合物を取得し、ここで、抽出緩衝液は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  ＮａＡＣ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５であるステップ２ａと、
前記混合物を濾過し、組換えヒトラクトフェリンを含む粗抽出液を取得するステップ３ａと、を含む、請求項４に記載のクロマトグラフ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学の分野に属し、具体的には、組換えヒトラクトフェリンを分離、精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトフェリン（Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ、以下、「ＬＦ」とも称する）は、一種の鉄結合性タンパク質であり、哺乳類動物の乳液、各組織及びその分泌液に多く含まれ、抗菌活性、抗炎症作用の他、免疫力を高める等といった様々な生理機能を有する。インビトロ試験及び動物実験から、ラクトフェリンが腸内の微生物感染、例えば、ロタウイルス、ジアルジア、赤痢菌、サルモネラ菌感染に対して何れも予防効果を奏することが実証されている。腸管病原体に対するラクトフェリンの阻害作用は、主に細菌増殖を抑制し、若しくは菌体の表面に存在する病原性因子の機能を阻害することによりウイルスの哺乳類動物細胞への付着や侵入を低下させるといった２つの作用によって実現される。また、多数の実験研究から、ラクトフェリンを乳幼児用の調製食品に添加することは重要な意義があり、乳児の成長発育の要求を満足できると同時に、乳児の健康に対しても有利であることが実証されている。また、ニュージーランド、スイス、オーストラリア、オランダ等の農業先進国においては、全世界で誇りうる高品質生乳の産地であるのにも拘わらず、自国産の高級な乳幼児用調製ミルクに母乳成分として欠かさないラクトフェリンを添加することが行われている。
【０００３】
ところで、生乳の資源に限度がことから、ラクトフェリンの供給が市場の需要に対応できず、ラクトフェリンを獲得するための新たな製造方法が求められている。こうした現状を踏まえ、研究者によって様々な発現系においてラクトフェリンを発現し、組換えラクトフェリンを取得する試みがなされている。しかしながら、未だに産量が低く、製品精製が特に困難である等といった一連の課題を抱えている。そこで、本発明者らは水稲発現系に注目し、鋭意検討を重ねた結果、水稲の子実で組換えヒトラクトフェリン（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ、以下、「ｒＬＦ」とも称する）を発現することに成功した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、トランスジェニックイネの子実から組換えヒトラクトフェリンを分離、精製するクロマトグラフ法を提供することをその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成すべく、本発明は、以下の技術案を提供する。
【０００６】
トランスジェニックイネの子実から組換えヒトラクトフェリンを分離、精製するクロマトグラフ法であって、該クロマトグラフ法は、以下の工程を含んでなる。
【０００７】
工程１：トランスジェニックイネの子実から組換えヒトラクトフェリンを抽出し、組換えヒトラクトフェリンを含む粗抽出液を取得する。
【０００８】
工程２：組換えヒトラクトフェリンを含む粗抽出液を、陽イオン交換クロマトグラフィーを利用して一次分離、精製し、組換えヒトラクトフェリンを含む溶出液を取得し、ここで、前記陽イオン交換クロマトグラフィーの担体が弱陽イオン交換担体であり、陽イオン交換クロマトグラフィーによる分離精製は、更に以下のステップを含む。
【０００９】
ステップ２Ａ：カラム容量の５〜１５倍であり且つｐＨ６．０〜７．５の１０〜２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０〜２５ｍＭ  ＮａＡＣ、０〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液を用い、流速５０〜２００ｃｍ／時間の条件下でカラムを平衡化する。
【００１０】
ステップ２Ｂ：工程１の粗抽出液を注入試料とし、ここで、試料の導電率が２〜２５ｍｓ／ｃｍであり、ｐＨが６．０〜７．５である。試料注入が終わると、洗浄緩衝液を用いて不純物を洗い流し、ここで、該洗浄緩衝液に３〜１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３〜１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２００〜３００ｍＭ  ＮａＣｌを含み、ｐＨが６．５〜８．０であり、洗浄時の流速が５０〜２００ｃｍ／時間である。
【００１１】
ステップ２Ｃ：３〜１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３〜１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、４００〜６５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５〜８．０の溶出緩衝液を用い、流速５０〜２００ｃｍ／時間の条件下で試料を溶出し、溶出液を取得する。
【００１２】
工程３：工程２の溶出液を回収し、組換えヒトラクトフェリンを含む溶液を取得する。
【００１３】
好ましくは、上記工程２における弱陽イオン交換樹脂がＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（「ｓｅｐｈａｒｏｓｅ」は登録商標）である。
【００１４】
本発明に係るクロマトグラフ法は、カラム担体を再生するための処理として、更に以下の処理ステップを含む。
【００１５】
処理ａ：カラム容量３〜１０倍の１〜２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５〜１０．０の高塩濃度溶液を用い、流速５０〜２００ｃｍ／時間の条件下でＵＶ２８０に明らかな変化がないところまでカラムを洗い流す。
【００１６】
処理ｂ：カラム容量３〜１０倍の５〜２５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ２．０〜４．０の緩衝液を用い、流速５０〜２００ｃｍ／時間の条件下でカラムを洗い流す。
【００１７】
処理ｃ：カラム容量２〜５倍の０．５〜１．０Ｍ  ＮａＯＨ溶液を用い、流速３０〜１００ｃｍ／時間の条件下でカラムを逆転させて洗い流す。
【００１８】
処理ｄ：カラム容量８〜１５倍の超純水を用いてｐＨが１０．０未満になるまでカラムを洗い流し、その後、担体を２０％のエタノール溶液に保存する。
【００１９】
具体的に言うと、本発明に係るクロマトグラフ法は、上記工程１で組換えヒトラクトフェリンを抽出する際に以下のステップに従って行われる。
【００２０】
ステップ１：ヒトラクトフェリン遺伝子が導入されたトランスジェニックイネの子実を出発原料とし、籾米の殻を除去して玄米にした後、砕いて８０〜１００メッシュの粉体を取得する。
【００２１】
ステップ２：前記粉体と抽出緩衝液を重量体積比で１：５〜１：１０の割合で混合し、常温下で０．５〜２時間抽出して混合物を取得し、ここで、前記抽出緩衝液は、１０〜２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０〜２５ｍＭ  ＮａＡＣ、０〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０〜７．５である。
【００２２】
ステップ３：前記混合物を濾過し、組換えヒトラクトフェリンを含む粗抽出液を取得する。
【００２３】
本発明に係るクロマトグラフ法において、上記工程２における分離精製は、以下のステップに従って行われる。
【００２４】
ステップ２Ａ：カラム容量１０倍の平衡化緩衝液を用いてカラムを平衡化し、ここで、該平衡化緩衝液は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  ＮａＡＣ、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含み且つｐＨ６．５であり、流速が１５０ｃｍ／時間である。
【００２５】
ステップ２Ｂ：工程１の粗抽出液を注入試料とし、ここで、試料の導電率が２２．５ｍｓ／ｃｍであり、ｐＨが６．５である。試料注入が終わると、洗浄緩衝液で不純物を洗い流し、ここで、洗浄緩衝液は、４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含み且つｐＨ７．５であり、流速が１５０ｃｍ／時間である。
【００２６】
ステップ２Ｃ：溶出緩衝液を用いて試料を溶出し、ここで、該溶出緩衝液は、４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、６００ｍＭ  ＮａＣｌを含み且つｐＨ７．５であり、溶出時の流速が１５０ｃｍ／時間であり、組換えヒトラクトフェリンを含む溶出液を回収する。
【００２７】
本発明の別の１つの目的は、トランスジェニックイネの子実から組換えヒトラクトフェリンを製造するための抽出方法を提供することであり、該抽出方法は、以下の工程を含む。
【００２８】
工程１：組換えヒトラクトフェリン遺伝子が導入されたトランスジェニックイネの子実を出発原料とし、籾米の殻を除去して玄米にした後、砕いて８０〜１００メッシュの粉体を取得する。
【００２９】
工程２：前記粉体と抽出緩衝液を重量体積比で１：５〜１：１０の割合で混合し、常温下で０．５〜２時間抽出し、混合物を取得し、ここで、前記抽出緩衝液は、１０〜２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０〜２５ｍＭ  ＮａＡＣ、０〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌを含み、ｐＨ６．０〜７．５である。
【００３０】
工程３：前記混合物を濾過し、組換えヒトラクトフェリンを含む粗抽出液を取得する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて陽イオン交換クロマトグラフィーを行った際の結果を示す電気泳動図である。そのうち、Ｍが分子量マーカー、Ｓが注入試料、ＦＴが通過ピーク、ＥｌｕがｒＬＦ溶出ピーク、Ｗａｓｈが不純物溶出ピークである。
【図２】ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓを用いて陽イオン交換クロマトグラフィーを行った際の結果を示す電気泳動図である。そのうち、Ｓが注入試料、ＦＴが通過ピーク、ＣＩＰが定置洗浄であり、２０％、４０％、６０％及び１００％はそれぞれ１．５Ｍ  ＮａＣｌの百分率である。
【図３】ＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗの実際の負荷量の測定結果を示す電気泳動図である。そのうち、Ｍが分子量マーカー、ＥｌｕがｒＬＦ溶出ピーク、Ｗａｓｈが不純物溶出ピークであり、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４３０及び４５０は、粗抽出液の通過体積（単位：ｍＬ）であり、Ｌは、注入試料である。
【図４】ＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用い、塩濃度勾配で溶出を行う際の結果を示す電気泳動図である。そのうち、Ｍが分子量マーカー、Ｌが注入試料、ＦＴが通過ピークであり、１０％、２０％及び４０％は、それぞれ溶出する際の塩濃度を示す。
【図５】ＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用い、不純物除去用の条件を確定した際の結果を示す電気泳動図である。そのうち、Ｍが分子量マーカー、Ｌが注入試料、ＦＴが通過ピークであり、１０％、２０％及び４０％は、それぞれ不純物を除去する際の塩濃度であり、Ｅｌｕは、ｒＬＦ溶出ピークである。
【図６】精製で得られたｒＬＦ産物の純度をＨＰＬＣ法により測定する際の結果を示す図（ＲＰ−ＨＰＬＣ）である。ＨＰＬＣの測定結果から、純度が９５％を超えていると確認できる。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、図面を参酌しつつ本発明の特徴と長所を詳述する。以下の実施例は本発明の一例を例示するに過ぎず、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３３】
また、以下の実施例で使われる試薬及び測定装置は、特に説明がない限り、何れも市販のものである。
【００３４】
実施例１：組換えヒトラクトフェリン粗抽出液の調製
組換えヒトラクトフェリン遺伝子が導入されたトランスジェニックイネの殻を除去して玄米にし、砕いて８０〜１００メッシュの粉体を得た。該粉体と抽出緩衝液を重量体積比（ｋｇ／Ｌ）で１：１０の割合で混合し、常温下において１時間抽出した。抽出緩衝液としては、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  無水酢酸ナトリウム（ＮａＡＣ）、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含み、ｐＨが６．５であった。得られた混合物を濾布式のプレート加圧フィルターを用いて加圧濾過し、透明なｒＬＦ粗抽出液を得た。
【００３５】
実施例２：陽イオン交換クロマトグラフィー担体及び溶出条件の選定
＜陽イオン交換クロマトグラフィー担体の選定＞
水稲の子実に高含有量で色素と多糖類物質を含むため、陽イオン担体を用いることで色素等が担体に蓄積することを避けることができ、よって、担体の利用度を高め、試料の純度を確保することが可能となる。本実施例において、担体として比較的高い作業流速を有する陽イオン交換樹脂担体を選定し、該陽イオン交換樹脂担体として、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製のＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ、及びＧＥ社製のＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（以下、「ＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ」と称する）等を用いた。また、実施例１で得られた透明なｒＬＦ粗抽出液を陽イオン交換クロマトグラフィーの注入試料とした。
【００３６】
（１）ＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いる陽イオン交換クロマトグラフィー
担体としてＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ約１８ｍＬをＥｃｏｎｏ−ｃｏｌｕｍｎ  １５／２０カラムに充填し、２００ｍＬの緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  無水酢酸ナトリウム、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含み、ｐＨ６．５）を用いて１５０ｃｍ／時間の流速でカラムを平衡化し、ｐＨ値、導電率値に変化がないところまで平衡化した。試料の導電率が２２．５ｍｓ／ｃｍであり、ｐＨが６．５であった。試料注入が終わると、緩衝液（４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて１５０ｃｍ／時間の流速で不純物を洗い流し、不純物ピークが通過した後、溶出液（４ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、６００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて１５０ｃｍ／時間の流速で試料を溶離させ、溶出液を回収することによりｒＬＦ含有画分を得た。電気泳動分析の結果を図１に示す。
【００３７】
（２）ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓを用いる陽イオン交換クロマトグラフィー
担体としてＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ約１８ｍＬをＥｃｏｎｏ−ｃｏｌｕｍｎ  １５／２０カラムに充填し、２００ｍＬの緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  無水酢酸ナトリウム、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含み、ｐＨ８．０）を用いて１５０ｃｍ／時間の流速でカラムを平衡化し、ｐＨ値、導電率値に変化がないところまで平衡化した。試料の導電率が２２．５ｍｓ／ｃｍであり、ｐＨが６．５であった。試料注入が終わると、それぞれ３００ｍＭ  ＮａＣｌ、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、９００ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５Ｍ  ＮａＣｌを含む４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５の溶出液を用いて、１５０ｃｍ／時間の流速において塩濃度勾配による溶出を行って溶出液を回収した。電気泳動分析の結果を図２に示す。図２における２０％、４０％、６０％及び１００％は、１．５Ｍ  ＮａＣｌの百分率を示すものであり、それぞれ３００ｍＭ  ＮａＣｌ、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、９００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１．５Ｍ  ＮａＣｌに該当する。
【００３８】
（３）ＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗの実際負荷量の測定
担体としてＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ約１８ｍＬをＥｃｏｎｏ−ｃｏｌｕｍｎ  １５／２０カラムに充填し、２００ｍＬの緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  無水酢酸ナトリウム、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含み、ｐＨ６．５）を用いて１５０ｃｍ／時間の流速でカラムを平衡化し、ｐＨ値、導電率値に変化がないところまで平衡化した。実施例１における導電率が２２．５ｍｓ／ｃｍ、ｐＨが６．５、総体積量が４５０ｍＬの試料を、１５０ｃｍ／時間の流速でＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗに注入し、注入時のＵＶ２８０を記録しつつＵＶ２８０が水平域の１０％を超えるところまで注入し続けた。試料注入量を記録し、該流速条件下におけるＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ担体１ｍＬ当たりの抽出液の実際負荷量を算出した。試料注入が終わった後、樹脂に対して再生処理を施した。電気泳動分析の結果を図３に示す。
【００３９】
以上の実験から、注入条件に変化がないとき、強陽イオン交換担体に比べ、弱陽イオン交換担体であるＣＭ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗが分離性能と分離効率においてより優れていることが実証された。また、ＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ担体は開発されてから相当時間が経っていることから、その長所として製造技術の成熟度が高く、化学安定性に優れ、使用寿命が長く、製造コストが低い等といったことを挙げることができる。したがって、各要素を総合的に考慮した場合、ＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗが陽イオン担体として最も適したものであった。
【００４０】
＜溶出条件の選定＞
ｒＬＦを含む抽出液を、ＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを充填したカラムに注入し、塩濃度を段階的に引き上げて塩濃度勾配による溶出を行った（図４を参照）。その結果、１０％の１．５Ｍ  ＮａＣｌの勾配で不純物バンドが明らかに現れ、標的タンパク質にほとんど損失がないのが確認でき、一方、２０％の１．５Ｍ  ＮａＣｌ勾配の場合、不純物バンドが少量で溶離し、標的タンパク質に損失が比較的少ないのが確認できた。標的タンパク質は、４０％の１．５Ｍ  ＮａＣｌ条件下で脱着して溶出された。６０％及びそれ以上の塩濃度では溶出ピークが見当たらないことから、４０％の１．５Ｍ  ＮａＣｌの濃度で標的タンパク質を完全に溶出することができると認められた。溶出濃度について更に検討を行った結果、塩濃度が４０％未満である場合、標的タンパク質の純度にさほど影響がないが、溶出ピークのテーリング現象が酷く、収率が一定程度以下に低下することが確認でき、そこで、４０％の１．５Ｍ  ＮａＣｌを溶出条件として確定した。
【００４１】
＜不純物洗浄条件の選定＞
平衡化条件及び溶出条件を変えないことを前提とし、それぞれ１０％、１５％及び２０％の不純物洗浄条件について比較を行った（図５を参照）。検討結果から、不純物洗浄時の塩濃度が高くなるにつれて標的タンパク質の損失も少し増えるだけであり、不純物の除去率が明らかに向上し、３つの条件下でタンパク質の収率に特に差がないことが確認できた。そこで、標的タンパク質の純度を確保する観点から、２０％の１．５Ｍ  ＮａＣｌを不純物洗浄条件として確定した。
【００４２】
精製性能に加えて収率を考慮した場合、不純物洗浄条件として４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５が好適であり、標的タンパク質の溶出条件として４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５が好適であった。
【００４３】
実施例３：ｒＬＦ精製後のＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ担体再生条件の選定
陽イオン交換によりｒＬＦを精製した後、ＣＩＰ（定置洗浄）処理を行う際にカラムに褐色の色素沈降物が現れたため、通常の方法に従って水、３０％のイソプロパノール、７０％のエタノール、０．０１Ｍ  ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＯＨ、及び８Ｍ  尿素でカラム再生を試みたが何れも効果がなかった。その原因として、ｒＬＦに結合した鉄分が強アルカリの条件下で水酸化鉄を形成して沈降することが考えられる。しかし、強酸性条件では担体に不利な影響を与える恐れがあるため、クエン酸ナトリウムが酸性条件下において鉄イオンと錯体を形成する特性を利用することで色素沈降物を除去することに決めた。
【００４４】
クエン酸ナトリウムを用いてＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦの再生を図る際、クエン酸ナトリウムとカラムに付着する鉄との錯体形成に低ｐＨが必須条件となり、加えて担体のｐＨ許容範囲も考慮に入れた結果、ｐＨ３．０が最も適していた。また、担体再生に当たり、正常範囲の溶液量（カラム容量の約５倍）を前提にしつつ、クエン酸の濃度について検討を行った結果、以下の表１に示されるように、一定の濃度で鉄イオンの除去が不十分であると、後のＮａＯＨを用いる再生処理でカラムに褐色の色素沈降物が付着し、一方、鉄イオンが完全に除去されると、カラムが正常な色合いを呈することが確認できた。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
この結果から、１００ｍＬの量で２０ｍＭ  クエン酸ナトリウムを使うことで、カラムに付着した鉄イオンが完全に除去されるのが確認できたので、該濃度をクエン酸ナトリウムの用量とした。
【００４７】
ＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗの再生に当たり、まずは高塩溶液で処理し、その後にＮａＯＨで洗浄するのが一般的であるが、以上の結果、並びに標的タンパク質の特性を考慮した結果、以下の順に変えることにした。すなわち、まず高塩溶液（２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）でできる限り残留のｒＬＦを溶離させ、その後、酸性クエン酸ナトリウム（２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）で残りのｒＬＦに結合した鉄分を除去し、最後に１Ｍ  ＮａＯＨで通常の通りに洗浄した。
【００４８】
具体的に言うと、実施例１でＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて陽イオン交換クロマトグラフィーを行う際に使用した、担体としてＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ  １８ｍＬが充填されたカラムについて、まず、高塩溶液（２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）１００ｍＬを用いて１５０ｃｍ／時間の流速でカラムを洗い流し、ＵＶ２８０に明らかな変化がないようにした。次に、緩衝液（２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）１００ｍＬを用いて１５０ｃｍ／時間の流速でカラムを洗い流し、ｐＨを４．０以下にし、その後、カラムを逆転させて０．５Ｍ  ＮａＯＨ溶液１００ｍＬを用いて５０ｃｍ／時間の流速で洗浄した。ＮａＯＨによる洗浄作業が終わると、超純水２００ｍＬを用いてカラムを洗浄し、ｐＨが１０．０未満となるようにした。最後に、担体を２０％のエタノール溶液において長期保存した。
【００４９】
実施例４：組換えヒトラクトフェリンの分離精製、及び担体の再生
＜陽イオン交換による仕上げ精製＞
担体としてＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ約１５０ｍＬをＸＫ５０カラムに充填し、緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  無水酢酸ナトリウム、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）２０００ｍＬを用いて１５０ｃｍ／時間の流速でカラムを平衡化し、ｐＨ値、導電率に変化がないところまで平衡化した。実施例１で得られた粗抽出液を試料としたところ、試料の導電率が２２．５ｍｓ／ｃｍであり、ｐＨが６．４６であった。試料注入が終わると、洗浄緩衝液（４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて１５０ｃｍ／時間の流速で不純物を洗い流し、不純物の洗浄液を回収した。その後、溶出緩衝液（４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて１５０ｃｍ／時間の流速で試料を溶出し、溶出液を回収してｒＬＦ含有画分を取得した。
【００５０】
次に、以下の順に従って担体を再生した。すなわち、まず、高塩溶液（２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）５００ｍＬを用いて１５０ｃｍ／時間の流速でカラムを洗い流し、ＵＶ２８０に明らかな変化がないようにした。次に、緩衝液（２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）５００ｍＬを用いて１５０ｃｍ／時間の流速でカラムを洗い流し、ｐＨを４．０以下にし、その後、カラムを逆転させて０．５Ｍ  ＮａＯＨ溶液５００ｍＬを用いて５０ｃｍ／時間の流速で洗浄した。ＮａＯＨによる洗浄作業が終わると、超純水１５００ｍＬを用いてカラムを洗浄し、ｐＨが１０．０未満となるようにした。最後に、担体を２０％のエタノール溶液において長期保存した。
【００５１】
ＨＰＬＣを用いて上述のように分離、精製されたｒＬＦを分析したところ、図６に示されるように、ｒＬＦのＨＰＬＣ純度が９８％であった。また、以下の表２に示される通り、ｒＬＦの収率が２７．２４±０．７７％に達し、つまり、籾米１ｋｇ当たり２．２５ｇのｒＬＦが得られた。
【００５２】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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