(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）に列挙する細胞を、
下記（Ｂ）の組成を有し、その水溶液が低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示すハイドロゲル形成性の高分子を含む水溶液中に、低温ゾル状態で包埋した後、
前記細胞を含む前記水溶液を所定温度まで冷却し、
前記細胞を凍結保存する工程を含むことを特徴とする細胞の保存方法。
（Ａ）ヒト骨髄単核球細胞，ヒト臍帯血単核球細胞，ヒト末梢血単核球細胞，ヒト末梢血ナチュラルキラー細胞，ヒト末梢血Ｔ細胞
（Ｂ）複数のポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）とポリエチレンオキサイドとが結合したハイドロゲル形成性高分子
【請求項２】
前記所定温度が液体窒素温度（−196℃）であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞の保存方法。
【請求項３】
前記所定温度が−80℃であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞の保存方法。
【請求項４】
前記細胞を含む前記水溶液は、ジメチルスルフォキシドを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の保存方法に関し、詳しくは人あるいは所定の動物の骨髄、臍帯血又は末梢血から採取した幹細胞やNK（Natural Killer）細胞、Tリンパ球細胞などの免疫細胞の保存に適した、細胞の保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、NK（Natural Killer）細胞、T細胞などの免疫細胞を移植して癌などの疾患の治療に使うことが試みられている。そのために、これら免疫細胞を予め採取して、長期間保存しておく技術が求められている。
また、各種の細胞に分化する能力（多分化能）を有する幹細胞を、目的の細胞に分化誘導し、各種の組織や臓器（軟骨、骨、神経、心臓、目など）を再生させて各種疾患の治療に用いる再生医療が注目されている。そのために、幹細胞の多分化能を維持したまま、長期間保存しておく技術が求められている。幹細胞の多分化能の指標としては、細胞表面に発現する抗原のCD（Cluster of Differentiation）マーカーが利用される。
【０００３】
再生不良性貧血や白血病などの造血機能が障害された疾患においては、骨髄や臍帯血、あるいは末梢血中に含まれる造血幹細胞を移植することにより治療することが可能である。この際、患者にはＨＬＡ（Human leukocyte associated:ヒト白血球付随）抗原が一致した細胞を移植する必要がある。ここで、骨髄移植においては、患者の近親者や骨髄バンク登録者からドナーの選定が行われているものの、ＨＬＡ抗原の多様性からＨＬＡ抗原の一致したドナーを見出すことは極めて困難である。さらに、骨髄移植の場合にはドナーの負担がかなり大きいことが、骨髄バンクへの登録者数を大幅に増やすことができない原因にもなっている。
【０００４】
一方、臍帯血や末梢血は入手が容易であるとともにドナーへの負担もほとんど無いことから、多様なＨＬＡ抗原を持つ造血幹細胞をかなり容易に確保できる。但し、骨髄細胞移植の場合と比較すれば、臍帯血や末梢血から得られる造血幹細胞数が少ないために、臍帯血移植は、小児などの治療に限定されてきた。しかしながら、造血幹細胞の培養技術に関する近年の進歩は著しく、造血幹細胞を生体外で増殖させる技術が近い将来確立されると期待されている。
この場合においては、臍帯血や末梢血から採取した造血幹細胞を凍結保存させることが要求され、必要に応じて凍結保存された前記造血幹細胞を解凍し、培養系で増殖させた後に患者に移植されることになる。
【０００５】
上述のような細胞を保存する方法としては、例えば、「“Collection, separation and cryopreservation of umbilical cord blood for use in transplantation”in Bone Marrow Translation, 1994, No. 13, pp135-143」（非特許文献１参照）などにおいて、臍帯血単核細胞を所定の培地中に浮遊させた状態で直接的に冷却し、冷凍して保存することが記載されている。
また、「“Development of a Bioartificial Liver: Properties and Function of a Hollow-fiber Module Inoculated with Liver Cells”in HEPATOLOGY Vol. 17, No. 2, 1993」（非特許文献２参照）においては、肝細胞をマイクロキャリアに固定した後冷却し、冷凍保存することが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】“Collection, separation and cryopreservation of umbilical cord blood for use in transplantation”in Bone Marrow Translation, 1994, No. 13, pp135-143
【非特許文献２】“Development of a Bioartificial Liver: Properties and Function of a Hollow-fiber Module Inoculated with Liver Cells”in HEPATOLOGY Vol. 17, No. 2, 1993
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、いずれの方法においても細胞を効率よく凍結保存し、凍結保存した前記細胞を高い効率で回復させる（生きた細胞を高効率で回収する）には十分ではない。
本発明は、造血幹細胞、NK（Natural Killer）細胞、T細胞などの細胞を効率よく凍結保存し、高い効率で回復させることのできる保存方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく細胞の新規な保存方法を見出すために鋭意検討を行った。その結果、細胞を、その水溶液が低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示すハイドロゲル形成性の高分子を少なくとも含む水溶液中に低温ゾル状態で包埋した後、前記細胞を含む前記水溶液を所定温度まで冷却し、前記細胞を凍結保存する工程を少なくとも含むことを特徴とする細胞の保存方法によって、前記細胞の冷凍保存効率が増大するとともに、解凍後の回収率や生存率も著しく増大することを見出した。
【０００９】
したがって、本発明によれば、NK（Natural Killer）細胞、T細胞、造血幹細胞などの細胞を効率よく冷凍保存することができるとともに、高い効率で回復させることができる。この結果、造血幹細胞などの細胞の長期保存が可能となり、臍帯血移植などの種々の治療法を実現することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の内容について詳細に説明する。
本発明の細胞の保存方法においては、最初に、「ハイドロゲル形成性高分子」を含有する所定の培地中に浮遊した細胞を、所定の容器内に入れる。前記所定の培地は、細胞の種類に応じて適宜に選択する。目的に応じて血清を加えることもできる。また、本発明の方法を臍帯血移植などに用いる場合は、血液から分離した血漿や血液そのものを用いることができる。
なお、前記細胞を充填する容器は、有機溶剤に対して耐性を示すとともに、後に示すような遠心処理を用いる場合においては、これに耐え得るような機械的強度を有していることが必要である。具体的には、ポリカーボネートなどのエンジニアリングプラスチック製の容器を用いることが好ましい。そして、上記細胞を含む培地を前記容器内に充填するに先立ち、必要に応じて１２１〜１５０℃で、２０分間高圧蒸気滅菌する。
【００１１】
次いで、前記細胞を所定温度まで冷却し、凍結保存する。凍結保存させる温度は、細胞の種類、並びに保存期間などによって適宜設定するが、通常は、液体窒素を用い、この液体窒素温度である−１９６℃で保存することが好ましい。これによって死滅する細胞の数を低減することができ、回収率及び生存率ともに向上させることができる。
このような低温度で凍結保存する場合、室温付近で保持された前記細胞を−１９６℃の温度まで急冷すると、細胞内に大きな氷結が生じる場合がある。したがって、凍結保存する場合においては、比較的緩やかに徐冷却することが好ましい。具体的には、３℃／分以下で前記細胞を冷却する。
しかしながら、例えば、−１９６℃の温度まで徐冷却すると、冷却に長時間を有するようになる。したがって、より好ましくは、細胞内の氷結を防止すべく、ある一定の温度、例えば−８０℃まで徐冷却した後、凍結保存させる温度、例えば、−１９６℃の温度まで急冷却することが好ましい。急冷却速度はこの場合１０℃／分以上である。
【００１２】
一方、本発明では通常の凍結温度より高温の−８０℃での保存も可能である。−８０℃であれば、一般的なフリーザーを使用可能で、高価な液体窒素を使用しないので低コストでの細胞保存が可能である。
前記細胞を冷却し、凍結保存させるに際しては、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を含有した保存培地を用いることもできる。これによって、前記細胞を良好な状態の下に凍結保存させることができ、解凍時において高い回復率を達成することができる。なお、ＤＭＳＯを含有させる基本培地には、上述したように、細胞の種類に応じて適宜選択し、使用する。
上述したようにして凍結保存された前記細胞を、例えば移植などの目的で使用する場合は、「ハイドロゲル形成性高分子」を含有する所定の培地容器ごと水槽内に入れ、振動させることによって解凍する。そして、前記細胞を所定数まで増殖させた後、使用する。
【００１３】
本発明における細胞には、微生物細胞、植物細胞、ヒト又は動物の造血幹細胞、NK（Natural Killer）細胞、T細胞、肝細胞、臍帯血、臍帯血由来の幹細胞を多く含む有核細胞、膵ランゲルハンス島細胞、血管内皮細胞、腎臓細胞、神経細胞、下垂体細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、骨髄細胞、副腎皮質細胞、及びマクロファージなどの動物遊離細胞や神代細胞などを例示することができる。さらに、これらの細胞を株化したものや、遺伝子組み換えや細胞融合などの操作により人為的に変成させた細胞などが含まれる。特に、本発明を臍帯血由来の幹細胞に対して用いることにより、臍帯血移植などの新規な治療法を実現することができる。
【００１４】
（ハイドロゲル形成性の高分子、TGP）
本発明の「ハイドロゲル形成性高分子」（Thermoreversible Gelation Polymer, TGP）とは、架橋（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）構造ないし網目構造を熱可逆的に生成し、該構造に基づき、その内部に水等の分散液体を保持するハイドロゲルを熱可逆的に形成可能な性質を有する高分子をいう。又、「ハイドロゲル」とは高分子からなる架橋ないし網目構造と該構造中に支持ないし保持された水を含むゲルをいう。
【００１５】
（ゾル−ゲル転移温度）
本発明において「ゾル状態」、「ゲル状態」および「ゾル−ゲル転移温度の定義および測定は、文献（H. Yoshioka ら、Journal of Macromolecular Science, A31(1), 113 (1994)）に記載された定義および方法に基づく。即ち、観測周波数１Ｈｚにおける試料の動的弾性率を低温側から高温側へ徐々に温度を変化（１℃／１分）させて測定し、該試料の貯蔵弾性率（Ｇ´、弾性項）が損失弾性率（Ｇ″、粘性項）を上回る点の温度をゾル−ゲル転移温度とする。一般に、Ｇ″＞Ｇ´の状態がゾルであり、Ｇ″＜Ｇ´の状態がゲルであると定義される。このゾル−ゲル転移温度の測定に際しては、下記の測定条件が好適に使用可能である。
【００１６】
＜動的・損失弾性率の測定条件＞
測定機器（商品名）：ストレス制御式レオメーター  AR500、TAインスツルメント社製
試料溶液（ないし分散液）の濃度（ただし「ゾル−ゲル転移温度を有するハイドロゲル形成性高分子」の濃度として）：１０（重量）％
試料溶液の量：約０．８ ｇ
測定用セルの形状・寸法：アクリル製平行円盤（直径４．０ｃｍ）、ギャップ６００μｍ
測定周波数：1Hz
適用ストレス：線形領域内。
【００１７】
本発明においては、上記ゾル−ゲル転移温度は０℃より高く、37℃以下であることが好ましく、更には、5℃より高く35℃以下（特に10℃以上33℃以下である）ことが好ましい。
このような好適なゾル−ゲル転移温度を有するTGPは、後述するような具体的な化合物の中から、上記したスクリーニング方法（ゾル−ゲル転移温度測定法）に従って容易に選択することができる。
上述したような熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す（すなわち、ゾル−ゲル転移温度を有する）限り、本発明のTGPは特に制限されない。
その水溶液がゾル−ゲル転移温度を有し、該転移温度より低い温度で可逆的にゾル状態を示す高分子の具体例としては、例えば、ポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとのブロック共重合体等に代表されるポリアルキレンオキサイドブロック共重合体；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のエーテル化セルロース；キトサン誘導体（K.R.Holme.et al. Macromolecules,２４，３８２８（１９９１））等が知られている。
【００１８】
（好適なハイドロゲル形成性高分子）
本発明のTGPとして好適に使用可能な、架橋形成に疎水結合を利用したハイドロゲル形成性高分子は、曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合してなることが好ましい。
該親水性のブロックは、ゾル−ゲル転移温度より低い温度で該ハイドロゲルが水溶性になるために存在することが好ましく、また曇点を有する複数のブロックは、ハイドロゲルがゾル−ゲル転移温度より高い温度でゲル状態に変化するために存在することが好ましい。
換言すれば、曇点を有するブロックは該曇点より低い温度では水に溶解し、該曇点より高い温度では水に不溶性に変化するために、曇点より高い温度で、該ブロックはゲルを形成するための疎水結合からなる架橋点としての役割を果たす。すなわち、疎水性結合に由来する曇点が、上記ハイドロゲルのゾル−ゲル転移温度に対応する。
ただし、該曇点とゾル−ゲル転移温度とは必ずしも一致しなくてもよい。これは、上記した「曇点を有するブロック」の曇点は、一般に、該ブロックと親水性ブロックとの結合によって影響を受けるためである。
【００１９】
本発明に用いるハイドロゲルは、疎水性結合が温度の上昇と共に強くなるのみならず、その変化が温度に対して可逆的であるという性質を利用したものである。１分子内に複数個の架橋点が形成され、安定性に優れたゲルが形成される点からは、TGPが「曇点を有するブロック」を複数個有することが好ましい。
一方、上記TGP中の親水性ブロックは、前述したように、該TGPがゾル−ゲル転移温度よりも低い温度で水溶性に変化させる機能を有し、上記転移温度より高い温度で疎水性結合力が増大しすぎて上記ハイドロゲルが凝集沈澱してしまうことを防止しつつ、含水ゲルの状態を形成させる機能を有する。
さらに本発明に用いるTGPは、生体内で分解、吸収されるものであることが望ましい。すなわち、本発明のTGPが生体内で加水分解反応や酵素反応により分解されて、生体に無害な低分子量体となって吸収、排泄されることが好ましい。
本発明のTGPが曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合してなるものである場合には、曇点を有するブロックと親水性のブロックの少なくともいずれか、好ましくは両方が生体内で分解、吸収されるものであることが好ましい。
【００２０】
（曇点を有する複数のブロック）
曇点を有するブロックとしては、水に対する溶解度−温度係数が負を示す高分子のブロックであることが好ましく、より具体的には、ポリプロピレンオキサイド、プロピレンオキサイドと他のアルキレンオキサイドとの共重合体、ポリＮ−置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ−置換メタアクリルアミド誘導体、Ｎ−置換アクリルアミド誘導体とＮ−置換メタアクリルアミド誘導体との共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化物からなる群より選ばれる高分子が好ましく使用可能である。
曇点を有するブロックを生体内で分解、吸収されるものとするには、曇点を有するブロックを疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸から成るポリペプチドとすることが有効である。あるいはポリ乳酸やポリグリコール酸などのポリエステル型生分解性ポリマーを生体内で分解、吸収される曇点を有するブロックとして利用することもできる。
上記の高分子（曇点を有するブロック）の曇点が４℃より高く４０℃以下であることが、本発明に用いる高分子（曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合した化合物）のゾル−ゲル転移温度を0℃より高く37℃以下とする点から好ましい。
ここで曇点の測定は、例えば、上記の高分子（曇点を有するブロック）の約１質量％の水溶液を冷却して透明な均一溶液とした後、除々に昇温（昇温速度約１℃／ｍｉｎ）して、該溶液がはじめて白濁する点を曇点とすることによって行うことが可能である。
【００２１】
本発明に使用可能なポリＮ−置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ−置換メタアクリルアミド誘導体の具体的な例を以下に列挙する。
ポリ−Ｎ−アクロイルピペリジン；ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタアクリルアミド；ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド；ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド；ポリ−Ｎ−イソプロピルメタアクリルアミド；ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド；ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン；ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド；ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタアクリルアミド；ポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド。
上記の高分子は単独重合体（ホモポリマー）であっても、上記重合体を構成する単量体と他の単量体との共重合体であってもよい。このような共重合体を構成する他の単量体としては、親水性単量体、疎水性単量体のいずれも用いることができる。一般的には、親水性単量体と共重合すると生成物の曇点は上昇し、疎水性単量体と共重合すると生成物の曇点は下降する。従って、これらの共重合すべき単量体を選択することによっても、所望の曇点（例えば４℃より高く４０℃以下の曇点）を有する高分子を得ることができる。
【００２２】
（親水性単量体）
上記親水性単量体としては、Ｎ−ビニルピロリドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタアクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルメタアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルメタアクリレート、ヒドロキシメチルアクリレート、酸性基を有するアクリル酸、メタアクリル酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸等、並びに塩基性基を有するＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
（疎水性単量体）
一方、上記疎水性単量体としては、エチルアクリレート、メチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート等のアクリレート誘導体およびメタクリレート誘導体、Ｎ−ｎ−ブチルメタアクリルアミド等のＮ−置換アルキルメタアクリルアミド誘導体、塩化ビニル、アクリロニトリル、スチレン、酢酸ビニル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
（親水性のブロック）
一方、上記した曇点を有するブロックと結合すべき親水性のブロックとしては、具体的には、メチルセルロース、デキストラン、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリＮ−ビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリＮ−メチルアクリルアミド、ポリヒドロキシメチルアクリレート、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸およびそれらの塩；ポリＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、ポリＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩等が挙げられる。
また親水性のブロックは生体内で分解、代謝、排泄されることが望ましく、アルブミン、ゼラチンなどのたんぱく質、ヒアルロン酸、ヘパリン、キチン、キトサンなどの多糖類などの親水性生体高分子が好ましく用いられる。
【００２５】
曇点を有するブロックと上記の親水性のブロックとを結合する方法は特に制限されないが、例えば、上記いずれかのブロック中に重合性官能基（例えばアクリロイル基）を導入し、他方のブロックを与える単量体を共重合させることによって行うことができる。また、曇点を有するブロックと上記の親水性のブロックとの結合物は、曇点を有するブロックを与える単量体と、親水性のブロックを与える単量体とのブロック共重合によって得ることも可能である。また、曇点を有するブロックと親水性のブロックとの結合は、予め両者に反応活性な官能基（例えば水酸基、アミノ基、カルボキシル基、イソシアネート基等）を導入し、両者を化学反応により結合させることによって行うこともできる。この際、親水性のブロック中には通常、反応活性な官能基を複数導入する。また、曇点を有するポリプロピレンオキサイドと親水性のブロックとの結合は、例えば、アニオン重合またはカチオン重合で、プロピレンオキサイドと「他の親水性ブロック」を構成するモノマー（例えばエチレンオキサイド）とを繰り返し逐次重合させることで、ポリプロピレンオキサイドと「親水性ブロック」（例えばポリエチレンオキサイド）が結合したブロック共重合体を得ることができる。このようなブロック共重合体は、ポリプロピレンオキサイドの末端に重合性基（例えばアクリロイル基）を導入後、親水性のブロックを構成するモノマーを共重合させることによっても得ることができる。更には、親水性のブロック中に、ポリプロピレンオキサイド末端の官能基（例えば水酸基）と結合反応し得る官能基を導入し、両者を反応させることによっても、本発明に用いる高分子を得ることができる。また、ポリプロピレングリコールの両端にポリエチレングリコールが結合した、プルロニック  Ｆ−１２７（商品名、旭電化工業（株）製）等の材料を連結させることによっても、本発明に用いるTGPを得ることができる。
【００２６】
この曇点を有するブロックを含む態様における本発明の高分子は、曇点より低い温度においては、分子内に存在する上記「曇点を有するブロック」が親水性のブロックとともに水溶性であるので、完全に水に溶解し、ゾル状態を示す。しかし、この高分子の水溶液の温度を上記曇点より高い温度に加温すると、分子内に存在する「曇点を有するブロック」が疎水性となり、疎水的相互作用によって、別個の分子間で会合する。
【００２７】
一方、親水性のブロックは、この時（曇点より高い温度に加温された際）でも水溶性であるので、本発明の高分子は水中において、曇点を有するブロック間の疎水性会合部を架橋点とした三次元網目構造を持つハイドロゲルを生成する。このハイドロゲルの温度を再び、分子内に存在する「曇点を有するブロック」の曇点より低い温度に冷却すると、該曇点を有するブロックが水溶性となり、疎水性会合による架橋点が解放され、ハイドロゲル構造が消失して、本発明のTGPは、再び完全な水溶液となる。このように、好適な態様における本発明の高分子のゾル−ゲル転移は、分子内に存在する曇点を有するブロックの該曇点における可逆的な親水性、疎水性の変化に基づくものであるので、温度変化に対応して、完全な可逆性を有する。
本発明者らの検討によれば、上記したTGPの水中における微妙な親水性−疎水性のバランスが、細胞を水中で低温保存する際の細胞の安定性に寄与しているものと考えられる。
【００２８】
（ゲルの溶解性）
上述したように水溶液中でゾル−ゲル転移温度を有する高分子を少なくとも含む本発明のハイドロゲル形成性の高分子は、該ゾル−ゲル転移温度より高い温度（ｄ℃）で実質的に水不溶性を示し、ゾル−ゲル転移温度より低い温度（ｅ℃）で可逆的に水可溶性を示す。
上記した高い温度（ｄ℃）は、ゾル−ゲル転移温度より１℃以上高い温度であることが好ましく、２℃以上（特に５℃以上）高い温度であることが更に好ましい。また、上記「実質的に水不溶性」とは、上記温度（ｄ℃）において、水１００ｍＬに溶解する上記高分子の量が、５．０ｇ以下（更には０．５ｇ以下、特に０．１ｇ以下）であることが好ましい。
【００２９】
一方、上記した低い温度（ｅ℃）は、ゾル−ゲル転移温度より（絶対値で）１℃以上低い温度であることが好ましく、２℃以上（特に５℃以上）低い温度であることが更に好ましい。また、上記「水可溶性」とは、上記温度（ｅ℃）において、水１００ｍＬに溶解する上記高分子の量が、０．５ｇ以上（更には１．０ｇ以上）であることが好ましい。更に「可逆的に水可溶性を示す」とは、上記TGPの水溶液が、一旦（ゾル−ゲル転移温度より高い温度において）ゲル化された後においても、ゾル−ゲル転移温度より低い温度においては、上記した水可溶性を示すことをいう。
上記高分子は、その１０％水溶液が５℃で、１０〜３，０００センチポイズ（更には５０〜１，０００センチポイズ）の粘度を示すことが好ましい。このような粘度は、例えば以下のような測定条件下で測定することが好ましい。
粘度計：ストレス制御式レオメータ（機種名：AR500、TAインスツルメンツ社製）
ローター直径：６０ｍｍ
ローター形状：平行平板
【００３０】
本発明のTGPの水溶液は、上記ゾル−ゲル転移温度より高い温度でゲル化させた後、多量の水中に浸漬しても、該ゲルは実質的に溶解しない。上記TGPが形成するハイドロゲルの上記特性は、例えば、以下のようにして確認することが可能である。
すなわち、TGP０．１５ｇを、上記ゾル−ゲル転移温度より低い温度（例えば氷冷下）で、蒸留水１．３５ｇに溶解して１０wt％の水溶液を作製し、該水溶液を径が３５ｍｍのプラスチックシャーレ中に注入し、３７℃に加温することによって、厚さ約１．５ｍｍのゲルを該シャーレ中に形成させた後、該ゲルを含むシャーレ全体の重量（ｆグラム）を測定する。次いで、該ゲルを含むシャーレ全体を２５０ｍｌ中の水中に３７℃で１０時間静置した後、該ゲルを含むシャーレ全体の重量（ｇグラム）を測定して、ゲル表面からの該ゲルの溶解の有無を評価する。この際、本発明のハイドロゲル形成性の高分子においては、上記ゲルの重量減少率、すなわち（ｆ−ｇ）／ｆが、５．０％以下であることが好ましく、更には１．０％以下（特に０．１％以下）であることが好ましい。
本発明のTGPの水溶液は、上記ゾル−ゲル転移温度より高い温度でゲル化させた後、多量（体積比で、ゲルの０．１〜１００倍程度）の水中に浸漬しても、長期間に亘って該ゲルは溶解することがない。このような本発明に用いる高分子の性質は、例えば、該高分子内に曇点を有するブロックが２個以上（複数個）存在することによって達成される。
【００３１】
これに対して、ポリプロピレンオキサイドの両端にポリエチレンオキサイドが結合してなる前述のプルロニックＦ−１２７を用いて同様のゲルを作成した場合には、数時間の静置で該ゲルは完全に水に溶解することを、本発明者らは見出している。
非ゲル化時の細胞毒性をできる限り低いレベルに抑える点からは、水に対する濃度、すなわち｛（高分子）／（高分子＋水）｝×１００（％）で、２０％以下（更には１５％以下、特に１０％以下）の濃度でゲル化が可能なTGPを用いることが好ましい。
本発明に用いられるTGPの分子量は3万以上3,000万以下が好ましく、より好ましくは10万以上1,000万以下、さらに好ましくは50万以上500万以下である。
【００３２】
［実施例および比較例］
以下にTGPの製造例および本発明の実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は特許請求の範囲により限定されるものであり、以下の実施例によって限定されるものではない。
［製造例１］
ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイド共重合体（プロピレンオキサイド／エチレンオキサイド平均重合度約６０／１８０、旭電化工業（株）製：プルロニックＦ−１２７）１０ｇを乾燥クロロホルム３０ｍｌに溶解し、五酸化リン共存下、ヘキサメチレンジイソシアネート０．１３ｇを加え、沸点還流下に６時間反応させた。溶媒を減圧留去後、残渣を蒸留水に溶解し、分画分子量３万の限外濾過膜（アミコンＰＭ-30）を用いて限外濾過を行い、高分子量重合体と低分子量重合体を分画した。得られた水溶液を凍結して、Ｆ−１２７高重合体およびＦ−１２７低重合体を得た。
上記により得たＦ−１２７高重合体（本発明のハイドロゲル形成性高分子、ＴＧＰ−１）を、氷冷下、８質量％の濃度で蒸留水に溶解した。この水溶液をゆるやかに加温していくと、２１℃から徐々に粘度が上昇し、約２７℃で固化して、ハイドロゲルとなった。このハイドロゲルを冷却すると、２１℃で水溶液に戻った。この変化は、可逆的に繰り返し観測された。一方、上記Ｆ−１２７低重合体を、氷点下８質量％の濃度で蒸留水に溶解したものは、６０℃以上に加熱しても全くゲル化しなかった。
【００３３】
［製造例２］
トリメチロールプロパン１モルに対し、エチレンオキサイド１６０モルをカチオン重合により付加して、平均分子量約７０００のポリエチレンオキサイドトリオールを得た。
上記により得たポリエチレンオキサイドトリオール１００ｇを蒸留水１０００ｍｌに溶解した後、室温で過マンガン酸カリウム１２ｇを徐々に加えて、そのまま約１時間、酸化反応させた。固形物を濾過により除いた後、生成物をクロロホルムで抽出し、溶媒（クロロホルム）を減圧留去してポリエチレンオキサイドトリカルボキシル体９０ｇを得た。
上記により得たポリエチレンオキサイドトリカルボキシル体１０ｇと、ポリプロピレンオキサイドジアミノ体（プロピレンオキサイド平均重合度約６５、米国ジェファーソンケミカル社製、商品名：ジェファーミンＤ−４０００、曇点：約９℃）１０ｇとを四塩化炭素１０００ｍｌに溶解し、ジシクロヘキシルカルボジイミド１．２ｇを加えた後、沸点還流下に６時間反応させた。反応液を冷却し、固形物を濾過により除いた後、溶媒（四塩化炭素）を減圧留去し、残渣を真空乾燥して、複数のポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとが結合した本発明のハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−２）を得た。これを氷冷下、５質量％の濃度で蒸留水に溶解し、そのゾル−ゲル転移温度を測定したところ、約１６℃であった。
【００３４】
［製造例３］
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（イーストマンコダック社製）９６ｇ、Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（国産化学（株）製）１７ｇ、およびｎ−ブチルメタクリレート（関東化学（株）製）７ｇをクロロホルム４０００ｍｌに溶解し、窒素置換後、Ｎ，Ｎ’−アゾビスイソブチロニトリル１．５ｇを加え、６０℃で６時間重合させた。反応液を濃縮した後、ジエチルエーテルに再沈（再沈殿）した。濾過により固形物を回収した後、真空乾燥して、７８ｇのポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）を得た。
上記により得たポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）に、過剰のイソプロピルアミンを加えてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）を得た。このポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）の水溶液の曇点は１９℃であった。
前記のポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）１０ｇ、および両末端アミノ化ポリエチレンオキサイド（分子量６，０００、川研ファインケミカル（株）製）５ｇをクロロホルム１０００ｍｌに溶解し、５０℃で３時間反応させた。室温まで冷却した後、イソプロピルアミン１ｇを加え、１時間放置した後、反応液を濃縮し、残渣をジエチルエーテル中に沈澱させた。濾過により固形物を回収した後、真空乾燥して、複数のポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）とポリエチレンオキサイドとが結合した本発明のハイドロゲル形成性高分子（TGP-5）を得た。
このようにして得たTGP-5を氷冷下、５質量％の濃度で蒸留水に溶解し、そのゾル−ゲル転移温度を測定したところ、約２１℃であった。
【００３５】
［製造例４］
（滅菌方法）
上記した本発明のハイドロゲル形成性高分子（TGP-5）の２．０ｇを、ＥＯＧ（エチレンオキサイドガス）滅菌バッグ（ホギメディカル社製、商品名：ハイブリッド滅菌バッグ）に入れ、ＥＯＧ滅菌装置（イージーパック、井内盛栄堂製）でＥＯＧをバッグに充填し、室温にて一昼夜放置した。さらに４０℃で半日放置した後、ＥＯＧをバッグから抜き、エアレーションを行った。バッグを真空乾燥器（４０℃）に入れ、時々エアレーションしながら半日放置することにより滅菌した。
この滅菌操作により高分子のゾル−ゲル転移温度が変化しないことを、別途確認した。
【００３６】
［製造例５］
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３７ｇと、ｎ−ブチルメタクリレート３ｇと、ポリエチレンオキサイドモノアクリレート（分子量４，０００、日本油脂（株）製：ＰＭＥ−４０００）２８ｇとを、ベンゼン３４０ｍｌに溶解した後、２，２´−アゾビスイソブチロニトリル０．８ｇを加え、６０℃で６時間反応させた。得られた反応生成物にクロロホルム６００ｍｌを加えて溶解し、該溶液をエーテル２０Ｌ（リットル）に滴下して沈澱させた。得られた沈殿を濾過により回収し、該沈澱を約４０℃で２４時間真空乾燥した後、蒸留水６Ｌに再び溶解し、分画分子量１０万のホローファイバー型限外濾過膜（アミコン社製Ｈ１Ｐ１００−４３）を用いて１０℃で２Ｌまで濃縮した。該濃縮液に蒸留水４Ｌを加えて希釈し、上記希釈操作を再度行った。上記の希釈、限外濾過濃縮操作をさらに５回繰り返し、分子量１０万以下のものを除去した。この限外濾過により濾過されなかったもの（限外濾過膜内に残留したもの）を回収して凍結乾燥し、分子量１０万以上の本発明のハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−４）６０ｇを得た。
上記により得た本発明のハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−４）１ｇを、９ｇの蒸留水に氷冷下で溶解した。この水溶液のゾル−ゲル転移温度を測定したところ、該ゾル−ゲル転移温度は２５℃であった。
【００３７】
［製造例６］
製造例３の本発明のハイドロゲル形成性高分子（TGP-5）を１０質量％の濃度で蒸留水に溶解し、３７℃におけるηを測定したところ、５．８×１０5  Ｐａ・ｓｅｃであった。一方、寒天を２質量％の濃度で蒸留水に９０℃で溶解して、１０℃で１時間ゲル化させた後、３７℃におけるηを測定したところ、そのηは機器の測定限界（１×１０7Ｐａ・ｓｅｃ）を越えていた。
【００３８】
［製造例７］
N−イソプロピルアクリルアミド71.0ｇおよびn−ブチルメタクリレート4.4ｇをエタノール1117ｇに溶解した。これにポリエチレングリコールジメタクリレート（PDE6000、日本油脂株式会社製）22.6ｇを水773ｇに溶解した水溶液を加え、窒素気流下70℃に加温した。窒素気流下70℃を保ちながら、N,N,N’,N’-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）0.8ｍLと10％過硫酸アンモニウム（APS）水溶液8ｍLを加え30分間攪拌反応させた。さらにTEMED0.8ｍLと10％APS水溶液8ｍLを30分間隔で4回加えて重合反応を完結させた。反応液を10℃以下に冷却後、10℃の冷却蒸留水5Lを加えて希釈し、分画分子量10万の限外濾過膜を用いて10℃で2Lまで濃縮した。
該濃縮液に冷却蒸留水4Lを加えて希釈し、上記限外濾過濃縮操作を再度行った。上記の希釈、限外濾過濃縮操作を更に5回繰り返し、分子量10万以下のものを除去した。この限外濾過により濾過されなかったもの（限外濾過膜内に残留したもの）を回収して凍結乾燥し、分子量10万以上の本発明のハイドロゲル形成性高分子（TGP−5）72ｇを得た。
上記により得た本発明のハイドロゲル形成性高分子（TGP−5）1ｇを、9ｇの蒸留水に氷冷下で溶解した。この水溶液のゾル−ゲル転移温度を測定したところ、該ゾル−ゲル転移温度は20℃であった。
【００３９】
［製造例８］
N−イソプロピルアクリルアミド42.0ｇおよびn−ブチルメタクリレート4.0ｇをエタノール592ｇに溶解した。これにポリエチレングリコールジメタクリレート（PDE6000、日本油脂株式会社製）11.5ｇを水65.1ｇに溶解した水溶液を加え、窒素気流下70℃に加温した。窒素気流下70℃を保ちながら、N,N,N’,N’-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）0.4ｍLと10％過硫酸アンモニウム（APS）水溶液4ｍLを加え30分間攪拌反応させた。さらにTEMED0.4ｍLと10％APS水溶液4ｍLを30分間隔で4回加えて重合反応を完結させた。反応液を5℃以下に冷却後、5℃の冷却蒸留水5Lを加えて希釈し、分画分子量10万の限外濾過膜を用いて5℃で2Lまで濃縮した。
該濃縮液に冷却蒸留水4Lを加えて希釈し、上記限外濾過濃縮操作を再度行った。上記の希釈、限外濾過濃縮操作を更に5回繰り返し、分子量10万以下のものを除去した。この限外濾過により濾過されなかったもの（限外濾過膜内に残留したもの）を回収して凍結乾燥し、分子量10万以上の本発明のハイドロゲル形成性高分子（TGP−6）40ｇを得た。
上記により得た本発明のハイドロゲル形成性高分子（TGP−6）1ｇを、9ｇの蒸留水に氷冷下で溶解した。この水溶液のゾル−ゲル転移温度を測定したところ、該ゾル−ゲル転移温度は7℃であった。
【００４０】
［製造例９］
N−イソプロピルアクリルアミド45.5ｇおよびn−ブチルメタクリレート0.56ｇをエタノール592ｇに溶解した。これにポリエチレングリコールジメタクリレート（PDE6000、日本油脂株式会社製）11.5ｇを水65.1ｇに溶解した水溶液を加え、窒素気流下70℃に加温した。窒素気流下70℃を保ちながら、N,N,N’,N’-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）0.4ｍLと10％過硫酸アンモニウム（APS）水溶液4ｍLを加え30分間攪拌反応させた。さらにTEMED0.4ｍLと10％APS水溶液4ｍLを30分間隔で4回加えて重合反応を完結させた。反応液を10℃以下に冷却後、10℃の冷却蒸留水5Lを加えて希釈し、分画分子量10万の限外濾過膜を用いて10℃で2Lまで濃縮した。
該濃縮液に冷却蒸留水4Lを加えて希釈し、上記限外濾過濃縮操作を再度行った。上記の希釈、限外濾過濃縮操作を更に5回繰り返し、分子量10万以下のものを除去した。この限外濾過により濾過されなかったもの（限外濾過膜内に残留したもの）を回収して凍結乾燥し、分子量10万以上の本発明のハイドロゲル形成性高分子（TGP−7）22ｇを得た。
上記により得た本発明のハイドロゲル形成性高分子（TGP−7）1ｇを、9ｇの蒸留水に氷冷下で溶解した。この水溶液のゾル−ゲル転移温度を測定したところ、該ゾル−ゲル転移温度は37℃であった。
【実施例１】
【００４１】
（ヒト骨髄単核球細胞の凍結保存）
ヒトから採取した骨髄を滅菌遠心管に入れ、室温で3,000ｒｐｍ10分間遠心後、上澄みをピペットで除去した。15ｍｌの沈殿細胞に15ｍｌのリン酸緩衝液（米国LifeTechnologies社製、カタログ番号70011-044）を加えて分散させ、15ｍｌのフィコール溶液（英国GE Healthcare LifeSciences社製、カタログ番号17030010）を重層させた。室温で1,500ｒｐｍ30分間遠心後、分離層を撹乱しないようにしつつ骨髄単核球細胞層を別の滅菌容器に移し、骨髄単核球細胞層の２倍量のリン酸緩衝液を加えた。室温で1,200ｒｐｍ10分間遠心後、上澄みをピペットで除去した。沈殿細胞に30ｍｌのリン酸緩衝液を加えて穏やかに撹拌し、20μｌを採取して細胞数を計測した。細胞数の計測は、20μｌの細胞分散液に20μｌのチュルク染色液を加え、10μｌを採取して生細胞数を計測した。30ｍｌの細胞分散液を室温で1,200ｒｐｍで8分間遠心後、上澄みをピペットで除去した。沈殿細胞を穏やかに撹拌し、凍結保存試験に供した。
【００４２】
（細胞保存液の調製）
３種類の細胞保存液（I,II,III）の調製には以下の材料を使用した。
a. 2ｍｌ容量の凍結保存用チューブ（Greiner bio-one社製、カタログ番号126263）
b. ジメチルスルホキシド（DMSO）（米国Sigma社製、カタログ番号RNBB3216）
c. デキストラン-40溶液：インド国Claris life Science社製、カタログ番号A127529） 
d. 熱可逆ハイドロゲル形成性高分子（TGP）溶液：10％の濃度で製造例７で合成したTGP-5を、実施例1〜3についてはIMDM培養液（米国Invitrogen社製、カタログ番号12440）に溶解、実施例4,5についてはALｙS培養液（日本国Cell Science & Technology Inst 社製、カタログ番号87-762）に溶解
e. ディスポーザブルピペット（10ｍｌ）（Thermo社製、カタログ番号159633）
細胞保存液（I）の調製
デキストラン-40溶液1.8ｍｌとDMSO0.2ｍｌを凍結保存用チューブ内で混合
細胞保存液（II）の調製
TGP溶液1ｍｌ、デキストラン-40溶液0.9ｍｌ、DMSO0.1ｍｌを凍結保存用チューブ内で混合
細胞保存液（III）の調製
TGP溶液2ｍｌを凍結保存用チューブ内に採取
【００４３】
細胞の凍結保存手法として以下の４種類の細胞保存方法（I,II,III,IV）を試験した。
細胞保存法（I）
前記ヒト骨髄細胞を、前記凍結保存用チューブ内の細胞保存液（I,II,III）にそれぞれ細胞数2〜4ｘ106となるように分散させて密栓し、４℃で１時間置いた後、−８０℃のフリーザー（Thermo Penpol社 モデル番号DF80U）に移した。１週間後または１カ月後に−８０℃のフリーザーから取り出し、３７℃３分間で融解させた。融解後の細胞分散液に等量の、アルブミン（米国Baxter社製、カタログ番号LA12C101AA）：デキストラン-40溶液の混合液（20：80）を加えて混合し、高速遠心機（日本国、国産社製、H30R）で1500rpm10分間遠心分離した。各細胞保存液（I,II,III）から得られた細胞について、トリパンブルー排出法による生細胞数計測と、フローサイトメトリー（FACS）によるCD34陽性細胞分率をそれぞれ測定した。
【００４４】
細胞保存法（II）
前記ヒト骨髄細胞を、前記凍結保存用チューブ内の細胞保存液（I,II,III）にそれぞれ細胞数2〜4ｘ106となるように分散させて密栓し、即座に−８０℃のフリーザー（Thermo Penpol社 モデル番号DF80U）に移した。それ以降は細胞保存法（I）と同様の試験を行った。
【００４５】
細胞保存法（III）
前記ヒト骨髄細胞を、前記凍結保存用チューブ内の細胞保存液（I,II,III）にそれぞれ細胞数2〜4ｘ106となるように分散させて密栓し、４℃で１時間置いた後、−１９６℃の液体窒素タンクに移した。それ以降は細胞保存法（I）と同様の試験を行った。
【００４６】
細胞保存法（IV）
前記ヒト骨髄細胞を、前記凍結保存用チューブ内の細胞保存液（I,II,III）にそれぞれ細胞数2〜4ｘ106となるように分散させて密栓し、即座に−１９６℃の液体窒素タンクに移した。それ以降は細胞保存法（I）と同様の試験を行った。
各細胞保存液（I,II,III）を用い、各細胞保存方法（I,II,III,IV）を採用した、１週間凍結保存の結果を表１に、１カ月凍結保存の結果を表２にそれぞれまとめて記載した。
【００４７】
【表１】
0006373241.tif 000002
【００４８】
【表２】
0006373241.tif 000003
ヒト骨髄単核球細胞の凍結保存について、細胞保存液II（10％TGP溶液1ｍL、デキストラン溶液0.9ｍｌ、DMSO0.1ｍｌ）を用いた場合がより良い細胞生存率を示した。
【実施例２】
【００４９】
（ヒト臍帯血単核球細胞の凍結保存）
ヒトの臍帯血単核球細胞は、骨髄に代えてヒトから採取した臍帯血を使用する以外は実施例１と同様のフィコール比重勾配遠心法により単離した。
ヒト骨髄細胞に代えてヒトの臍帯血単核球細胞を用いる以外は実施例１と同様の細胞凍結保存試験を行い、１週間凍結保存の結果を表３に、１カ月凍結保存の結果を表４にそれぞれまとめて記載した。
【００５０】
【表３】
0006373241.tif 000004
【００５１】
【表４】
0006373241.tif 000005
ヒト臍帯血単核球細胞の凍結保存について、短期保存では、細胞保存液II（10％TGP溶液1ｍL、デキストラン溶液0.9ｍｌ、DMSO0.1ｍｌ）を用い、即座に−８０℃のフリーザーに移した細胞保存法（II）を採用した時が細胞生存率の観点からは最も良かったが、CD34陽性細胞保存率の観点からは、細胞保存液III（10％TGP溶液2ｍL）を用いた方が良かった。
【実施例３】
【００５２】
（ヒト末梢血単核球細胞の凍結保存）
ヒトの末梢血単核球細胞は、骨髄に代えてヒトから採取した末梢血を使用する以外は実施例１と同様のフィコール比重勾配遠心法により単離した。
ヒト骨髄細胞に代えてヒトの末梢血単核球細胞を用いる以外は実施例１と同様の細胞凍結保存試験を行い、１週間凍結保存の結果を表５に、１カ月凍結保存の結果を表６にそれぞれまとめて記載した。
【００５３】
【表５】
0006373241.tif 000006
【００５４】
【表６】
0006373241.tif 000007
ヒト末梢血単核球細胞の凍結保存について、短期保存では、細胞保存液III（10％TGP溶液2ｍL）を用い、４℃で１時間置いた後、−８０℃のフリーザーで凍結保存する細胞保存法（I）を採用した時が最も良かった。長期保存では、細胞保存液II（10％TGP溶液1ｍL、デキストラン溶液0.9ｍｌ、DMSO0.1ｍｌ）を用い、即座に−１９６℃の液体窒素タンクに移した細胞保存法（IV）を採用した時が最も良かった。
【実施例４】
【００５５】
（ヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の凍結保存）
ヒトの末梢血を滅菌遠心管に入れ、室温で3,000ｒｐｍ10分間遠心後、血漿（上澄み）をピペットで取り出し、別の滅菌遠心管に移した。血漿は56℃30分間熱処理して不活性化した後、室温で3,000ｒｐｍ10分間遠心し、上澄みを別の滅菌遠心管に移して−20℃で保存した。一方、15ｍｌの末梢血沈殿細胞に15ｍｌのリン酸緩衝液（米国LifeTechnologies社製、カタログ番号70011-044）を加えて分散させ、15ｍｌのリンフォプレップ溶液（ノルウェー国Axis-Shield社製、カタログ番号LYS3773）を重層させた。室温で1,500ｒｐｍ30分間遠心後、分離層を撹乱しないようにしつつヒト末梢血ナチュラルキラー細胞層を別の滅菌容器に移し、ヒト末梢血ナチュラルキラー（NK）細胞層の２倍量のリン酸緩衝液を加えた。室温で1,200ｒｐｍ10分間遠心後、上澄みをピペットで除去した。沈殿細胞に30ｍｌのリン酸緩衝液を加えて穏やかに撹拌し、20μｌを採取して細胞数を計測した。細胞数の計測は、20μｌの細胞分散液に20μｌのチュルク染色液を加え、10μｌを採取して生細胞数を計測した。30ｍｌの細胞分散液を室温で1,200ｒｐｍ8分間遠心後、上澄みをピペットで除去した。沈殿細胞を穏やかに撹拌し、NK細胞培養に供した。
【００５６】
NK細胞培養用のフラスコ（日本国、東京、Biotherapy Institute社製）を滅菌リン酸緩衝液で３回洗浄し、1ｘ106／ｍｌの細胞数で培養液に分散させたNK細胞を39℃でNK細胞培養用のフラスコに入れた。5％CO2下24時間培養後、温度を37℃に変えて２日間培養した。
ヒト骨髄細胞に代えてヒトの末梢血ナチュラルキラー細胞を用い、CD34陽性細胞分率に代えてCD56陽性細胞分率を測定する以外は実施例１と同様の細胞凍結保存試験を行い、１週間凍結保存の結果を表７に、１カ月凍結保存の結果を表８にそれぞれまとめて記載した。
【００５７】
【表７】
0006373241.tif 000008
【００５８】
【表８】
0006373241.tif 000009
ヒト末梢血ナチュラルキラー細胞（実施例４）の凍結保存について、短期および長期保存とも、細胞保存液II（10％TGP溶液1ｍL、デキストラン溶液0.9ｍｌ、DMSO0.1ｍｌ）を用い、４℃で１時間置いた後、−８０℃のフリーザーで凍結保存する細胞保存法（I）または−１９６℃の液体窒素タンクに移す細胞保存法（III）を採用した場合がより良い細胞生存率を示した。しかしながら、CD56陽性細胞保存率の観点からは、細胞保存液I（デキストラン溶液1.8ｍｌとDMSO0.2ｍｌ）を使用した方が良かった。
【実施例５】
【００５９】
（ヒト末梢血T細胞の凍結保存）
ヒトの末梢血を滅菌遠心管に入れ、室温で3,000ｒｐｍ10分間遠心後、血漿（上澄み）をピペットで取り出し、別の滅菌遠心管に移した。血漿は56℃30分間熱処理して不活性化した後、室温で3,000ｒｐｍ10分間遠心し、上澄みを別の滅菌遠心管に移して−20℃で保存した。一方、10ｍｌの末梢血沈殿細胞に10ｍｌのリン酸緩衝液（米国LifeTechnologies社製、カタログ番号70011-044）を加えて分散させ、10ｍｌのリンフォプレップ溶液（ノルウェー国Axis-Shield社製、カタログ番号LYS3773）を重層させた。室温で1,500ｒｐｍ30分間遠心後、分離層を撹乱しないようにしつつヒト末梢血白血球細胞層を別の滅菌容器に移し、ヒト白血球細胞層の２倍量のリン酸緩衝液を加えた。室温で1,200ｒｐｍ10分間遠心後、上澄みをピペットで除去した。沈殿細胞に30ｍｌのリン酸緩衝液を加えて穏やかに撹拌し、20μｌを採取して細胞数を計測した。細胞数の計測は、20μｌの細胞分散液に20μｌのチュルク染色液を加え、10μｌを採取して生細胞数を計測した。30ｍｌの細胞分散液を室温で1,200ｒｐｍ8分間遠心後、上澄みをピペットで除去した。沈殿細胞を穏やかに撹拌し、T細胞培養に供した。
T細胞培養用のフラスコ（日本国、東京、Biotherapy Institute社製）を滅菌リン酸緩衝液で３回洗浄し、1ｘ106／ｍｌの細胞数で培養液に分散させたT細胞を39℃でT細胞培養用のフラスコに入れた。5％CO2下24時間培養後、温度を37℃に変えて２日間培養した。
ヒト骨髄細胞に代えてヒトの末梢血T細胞を用い、CD34陽性細胞分率に代えてCD3陽性細胞分率を測定する以外は実施例１と同様の細胞凍結保存試験を行い、１週間凍結保存の結果を表９に、１カ月凍結保存の結果を表１０にそれぞれまとめて記載した。
【００６０】
【表９】
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【００６１】
【表１０】
0006373241.tif 000011
T cell（ヒト末梢血T細胞、実施例５）の凍結保存についても、短期および長期保存とも、細胞保存液II（10％TGP溶液1ｍL、デキストラン溶液0.9ｍｌ、DMSO0.1ｍｌ）を用い、４℃で１時間置いた後、−８０℃のフリーザーで凍結保存する細胞保存法（I）または−１９６℃の液体窒素タンクに移す細胞保存法（III）を採用した場合がより良い細胞生存率を示した。CD3陽性細胞保存率の観点からは、細胞保存液I（デキストラン溶液1.8ｍｌとDMSO0.2ｍｌ）を使用し、即座に−８０℃のフリーザーに移した細胞保存法（II）または４℃で１時間置いた後、−１９６℃の液体窒素タンクに移す細胞保存法（III）を採用した方が良かった。
【００６２】
全体として、いずれの細胞においても細胞保存液II（10％TGP溶液1ｍL、デキストラン溶液0.9ｍｌ、DMSO0.1ｍｌ）を用いた場合が細胞生存率において、より良い結果であった。注目している免疫細胞の生存率（CD56％、CD3％など）については、採用する細胞保存液の種類や凍結方法によって違いがみられた。しかしながら、これら免疫細胞の生存率は、フローサイトメトリー分析に使われた細胞量が反映されるので、生細胞率ｘ免疫細胞の生存率で比較すると、やはり細胞保存液IIが良い結果であった。
【００６３】
［発明の効果］
以上説明したように、本発明によれば、所定の細胞を効率よく固定化し、長時間保存した後も高い回収率及び生存率を達成することができる。したがって、例えば、臍帯血由来の細胞を多量に凍結保存することができ、臍帯血移植などの新規な治療法の実現に寄与することができる。