(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体または抗体断片を融合させた少なくとも一つのＰＴＸ−２プロトマーを有する血清アミロイドＰ（ＰＴＸ−２）五量体を含む融合蛋白質であり、
前記抗体または抗体断片は、少なくとも一つのＰＴＸ−２プロトマーのＮ末端と融合される、融合蛋白質。
【請求項２】
前記ＰＴＸ−２五量体は、抗体または抗体断片を融合させた五つのプロトマーを含む請求項１記載の融合蛋白質。
【請求項３】
前記ＰＴＸ−２五量体は、一つ以上の未修飾のＰＴＸ−２プロトマーを含む請求項１記載の融合蛋白質。
【請求項４】
前記ＰＴＸ−２五量体は、リガンド結合部位、またはＣａ2+結合部位、またはそれらの組合せを削除する修飾がなされた、一つ以上のＰＴＸ−２プロトマーを含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合蛋白質。
【請求項５】
少なくとも一つのＰＴＸ−２プロトマーが、さらに抗体または抗体断片と少なくとも一つのＰＴＸ−２プロトマーとの間のリンカーを含む請求項１記載の融合蛋白質。
【請求項６】
前記ＰＴＸ−２五量体は、天然のＰＴＸ−２プロトマーには存在しない、少なくとも一つの追加のシステインアミノ酸を有する一つ以上のＰＴＸ−２プロトマーを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合蛋白質。
【請求項７】
少なくとも一つのシステインアミノ酸が、前記抗体または抗体断片とのジスルフィド結合に関与する請求項６記載の融合蛋白質。
【請求項８】
少なくとも一つのシステインアミノ酸が、前記ＰＴＸ−２プロトマーのもう一つのシステインとのジスルフィド結合に関与する請求項６記載の融合蛋白質。
【請求項９】
前記抗体または抗体断片が、公知の治療剤である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合蛋白質。
【請求項１０】
前記抗体断片が、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ラクダ科のＶＨＨタンパク質、またはアドネクシン（adnexins）から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合蛋白質。
【請求項１１】
前記抗体または抗体断片が、マトリクス・メタロプロテイナーゼの抗組織阻害剤（ＴＩＭＰ）抗体もしくは抗体断片、または抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）抗体もしくは抗体断片である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合蛋白質。
【請求項１２】
前記抗体または抗体断片が、抗炎症性である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合蛋白質。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合蛋白質と、一つ以上の製薬学上許容されるキャリアまたは賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
抗体又は抗体断片と融合する少なくとも一つのＰＴＸ−２プロトマーを有するＰＴＸ−２五量体の製造方法であって、
抗体又は抗体断片と融合する第一のＰＴＸ−２プロトマーをコードする核酸配列を含む第一のプラスミドを発現系に導入すること、ここで、前記第一のプラスミドはＰＴＸ−２プロトマーをコードする核酸配列を少なくとも含み、該核酸配列は、一つ以上の第一の抗体または抗体断片をコードする核酸配列と機能的に結合し、前記抗体または抗体断片は、前記ＰＴＸ−２プロトマーのＮ末端と融合される；
前記第一のＰＴＸ−２プロトマーを発現させること；および
前記発現系から、抗体又は抗体断片と融合する少なくとも一つのＰＴＸ−２プロトマーを有するＰＴＸ−２五量体を単離し、抗体又は抗体断片と融合する少なくとも１つのＰＴＸ−２プロトマーを有するＰＴＸ−２五量体を精製し、またはこれらの組合せを行うことを含む方法。
【請求項１５】
さらに、
抗体又は抗体断片と融合する第二のＰＴＸ−２プロトマーをコードする核酸配列を含む第二のプラスミドを前記発現系に導入すること、ここで、前記第二のプラスミドはＰＴＸ−２プロトマーをコードする核酸配列を少なくとも含み、該核酸配列は、一つ以上の第二の抗体または抗体断片をコードする核酸配列と機能的に結合し、前記第二の抗体または抗体断片は、前記ＰＴＸ−２プロトマーのＮ末端と融合される；
前記第一のＰＴＸ−２プロトマーと、前記第二のＰＴＸ−２プロトマー、の共発現を誘導すること、を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
さらに、
野生型プラスミドを前記発現系に導入すること、ここで、前記野生型プラスミドはＰＴＸ−２プロトマーをコードする核酸配列を少なくとも含む；および
前記第一のＰＴＸ−２プロトマー、前記第二のＰＴＸ−２プロトマー、ＰＴＸ−２プロトマー、またはこれらの組合せの共発現を誘導すること、を含む、請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１７】
前記第一のプラスミド、前記第二のプラスミド、前記野生型プラスミドまたはそれらの組合せは、さらに前記第一のＰＴＸ−２プロトマー、第二のＰＴＸ−２プロトマー、ＰＴＸ−２プロトマーまたはそれらのいかなる組合せの発現を制御するために配置された誘導プロモータを含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記共発現を誘導するステップが、前記第一のＰＴＸ−２プロトマー、前記第二のＰＴＸ−２プロトマー、ＰＴＸ−２プロトマーまたはそれらのいかなる組合せの発現を制御し、前記第一のＰＴＸ−２プロトマー、前記第二のＰＴＸ−２プロトマー、および／またはＰＴＸ−２プロトマーを、同じ割合で発現させないことを含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
発現の制御は、前記発現系の細胞における、前記第一のプラスミド、前記第二のプラスミド、前記野生型プラスミドまたはそれらの組合せの複製数を制御することによって実行される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
発現の制御は、前記第一のプラスミド、前記第二のプラスミド、前記野生型プラスミドまたはそれらの組合せの誘導プロモータによって実行される、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
抗体又は抗体断片と融合する少なくとも一つのＰＴＸ−２プロトマーを有し、処置を必要とする患者を治療するための方法に使用するためのＰＴＸ−２五量体であって、抗体又は抗体断片と融合する少なくとも一つのＰＴＸ−２プロトマーを有する前記ＰＴＸ−２五量体は、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＰＴＸ−２五量体である、該ＰＴＸ−２五量体。
【請求項２２】
前記抗体断片が、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ラクダ科のＶＨＨタンパク質、またはアドネクシン（adnexins）である、請求項２１記載の使用のためのＰＴＸ−２五量体。
【請求項２３】
前記抗体または抗体断片が、マトリクス・メタロプロテイナーゼの抗組織阻害剤（ＴＩＭＰ）抗体もしくは抗体断片、または抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）抗体もしくは抗体断片である、請求項２１記載の使用のためのＰＴＸ−２五量体。
【請求項２４】
ＰＴＸ−２五量体が、炎症を低減するために投与される、請求項２１記載の使用のためのＰＴＸ−２五量体。
【請求項２５】
抗体又は抗体断片と融合する少なくとも一つのＰＴＸ−２プロトマーを有するＰＴＸ−２五量体のコロイドの製造方法であって、
抗体又は抗体断片と融合する少なくとも一つのＰＴＸ−２プロトマーを有するＰＴＸ−２五量体を単離し、または抗体又は抗体断片と融合する少なくとも１つのＰＴＸ−２プロトマーを有するＰＴＸ−２五量体を精製し、またはそれらの組合せを行うこと；および
単離および／または精製されたＰＴＸ−２五量体にカルシウムを添加すること
を含み、
抗体又は抗体断片と融合する少なくとも一つのＰＴＸ−２プロトマーを有する前記ＰＴＸ−２五量体は、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＰＴＸ−２五量体である、
該方法。
【請求項２６】
前記コロイドが、ＰＴＸ−２の局所処方の製造に用いられる請求項２５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
組換えＤＮＡ技術の到来は、治療用途の生物学的に活性のタンパク質の大きなスケールでの生産性の可能性を提供してきた。したがって、今では、臨床においてまたは開発中の多くの組換え的に製造したタンパク質製造物、例えば巨大タンパク質（例えばエリスロポエチン）、小ペプチド断片、および抗体、ならびにその抗原結合断片がある。
【０００２】
しかしながら、製造およびヒト治療に際してこのような組換えタンパク質の利用に関して多くの共通した困難性が存在する。例えば、多くの組換え的に製造され、および精製されたタンパク質は、短いインビボでの半減期および／またはそのインビボ標的に対する弱い結合アフィニティにより特徴づけられ、これにより治療剤としての有用性が低減している。
【０００３】
ある例では、タンパク質またはそのペプチド断片を他の異種ポリペプチド領域（例えば、安定化領域、例えば免疫グロブリンＦｃ領域）に融合させることにより、または活性タンパク質の多量体の生成により、その安定性および／または生物学的活性が強化され得ることが見出されてきた。例えば、タンパク質の多量化は、しばしばこれら剤の半減期の増大の効果的な方法であり、したがってそれらの活性を長期スケールにわたって発揮させることができることが見出されてきた。さらに、多くの生物学的に活性のタンパク質が、オリゴマー構造の形態にあるときに、インビボでより有力であることが見出されてきた。多くの場合、この増大した活性は、アフィニティというよりはむしろアビディティでの結合および／または分子（例えば、二量化と通じて活性化されるインシュリンレセプタにおけるもののような同質のレセプタサブユニット）を架橋させる能力などの因子によるものである。これらの増大した半減期およびアビディティの性質は、タンパク質およびペプチド分子のより低量の一回投与量を用いて、治療コストならびに投与量に依存した副作用を潜在的に低減することを可能にする。
【０００４】
異なったアプローチが、組換えタンパク質の多量体形成のために提案されてきた。例えば、タンパク質のポリマー、例えばポリエチレングリコールへの化学的連結が試みられていた（Katre et al, (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1487）。しかしながら、この技術は、一般に厄介なものであり、大量の精製材料が必要である。抗体分子においては、タンパク質のヒンジおよび他の領域での修飾は、抗体が互いに会合する領域を調節するために試みられていた。しかしながら、結果は、一貫性がなく、予測不能であった。同様に、多量化抗体の生成のためのタンパク質Ａ融合物の使用は、抗体断片の連結に成功したが、他の分野では限定的な適用だった。
【０００５】
本願は、分子的実体を治療、防御または診断の剤として効果的に送達するための新規の骨格分子を開示する。
【発明の概要】
【０００６】
関連する出願に対するクロスレファレンス
本願は、２０１１年１２月２１日提出の仮出願６１／５７８，４９８の利益を求めるものであり、全体として言及することにより本願に組み込まれる。
【０００７】
開示された実施形態は、ペントラキシン−２（ＰＴＸ−２）の、抗体および抗体断片（例えば抗原結合抗体断片）ベースの治療剤のための骨格分子としての用途を対象にする。この実施形態では、一つ以上の抗体および抗体断片が、ＰＴＸ−２プロトマーに連結し、官能化されたＰＴＸ−２プロトマーを形成することができ、これら官能化されたＰＴＸ−２プロトマーは組み合わさって官能化されたＰＴＸ−２の五量体を形成することができる。
【０００８】
ある側面では、この開示は、つなげられた抗体または抗体断片とともに、少なくとも一つ、少なくとも二つ、少なくとも三つ、または少なくとも四つのＰＴＸ−２プロトマーを有するＰＴＸ−２の五量体を含む組成物を対象にする。他の側面では、この開示は、ＰＴＸ−２の五量体が五つのプロトマーを、つなげられた抗体または抗体断片とともに含む組成物を対象にする。
【０００９】
ある側面では、この開示のＰＴＸ−２の五量体は、一つ以上（例えば、１、２、３または４）の未修飾のＰＴＸ−２プロトマーを含む。
【００１０】
またある側面では、この開示のＰＴＸ−２の五量体は、一つ以上（例えば、１、２、３または４）の、自然発生的なＰＴＸ−２プロトマー上のリガンド結合部位、自然発生的なＰＴＸ−２プロトマー上のＣａ2+結合部位、またはその組合せを削除した修飾がなされたＰＴＸ−２プロトマーを含む。
【００１１】
ある側面では、抗体または抗体断片が、少なくとも一つ、少なくとも二つ、少なくとも三つ、少なくとも四つ、または五つ全てのＰＴＸ−２プロトマーのＣ末端またはＮ末端につなげられる。他の側面では、抗体または抗体断片が、少なくとも一つ、少なくとも二つ、少なくとも三つ、少なくとも四つ、または五つ全てのＰＴＸ−２プロトマーのＣ末端およびＮ末端の両方につなげられる。
【００１２】
またある側面では、この開示の少なくとも一つ（例えば、１、２、３、４、または５）のＰＴＸ−２プロトマーが、抗体または抗体断片と少なくとも一つのＰＴＸ−２プロトマーとの間にリンカーを含んでもよい。
【００１３】
ある側面では、抗体または抗体断片が、少なくとも一つ（例えば、１、２、３、４、または５）のＰＴＸ−２プロトマー内に挿入される。
【００１４】
またある側面では、ＰＴＸ−２の五量体が、自然発生的なＰＴＸ−２プロトマーには存在しない少なくとも一つの追加システインアミノ酸を有する、一つ以上（例えば、１、２、３、４、または５）のＰＴＸ−２プロトマーを含む。いくつかの実施形態では、この追加のシステインアミノ酸は、この抗体および抗体断片内でのジスルフィド結合に関与する。またいくつかの実施形態では、この追加のシステインアミノ酸は、ＰＴＸ−２プロトマーのもう一つのシステインとのジスルフィド結合に関与する。
【００１５】
ある側面では、ＰＴＸ−２プロトマーの抗体または抗体断片領域は、公知の治療剤である。いくつかの実施形態では、抗体および抗体断片が、マトリクス・メタロプロテイナーゼの抗組織阻害剤（ＴＩＭＰ）抗体または抗体断片、または抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）抗体または抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体または抗体断片が、抗炎症性抗体または抗体断片である。
【００１６】
ある側面では、ＰＴＸ−２プロトマーの抗体断片領域が、一本鎖の可変部（ｓｃＦｖ）、ラクダ科のＶＨＨタンパク質、またはアドネクシン（adnexins）から選択される。
【００１７】
またある側面では、この開示は、ここで開示されたようなＰＴＸ−２プロトマーおよび一つ以上の製薬学上許容されるキャリアまたは賦形剤を含む、製薬学上の処方を提供する。
【００１８】
ある側面では、この開示は、官能化されたＰＴＸ−２五量体の製造方法であって：ｉ）少なくとも第一の官能化ＰＴＸ−２プロトマーのための核酸配列を含む第一のプラスミドを発現系に導入すること、前記第一のプラスミドは自然発生的なＰＴＸ−２プロトマーのための核酸配列と実質的に同じ（similar）核酸配列および一つ以上の第一の抗体または抗体断片のための核酸配列を少なくとも有し；ｉｉ）前記第一の官能化ＰＴＸ−２プロトマーを発現させること；およびｉｉｉ）前記発現系から官能化ＰＴＸ−２五量体を単離し、または官能化ＰＴＸ−２五量体を精製し、またはこれらの組合せを行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、さらにｉ）第二のプラスミドを前記発現系に導入すること、前記第二のプラスミドは少なくとも第二の官能化ＰＴＸ−２プロトマーのための核酸配列を含み、および前記第二のプラスミドは自然発生的なＰＴＸ−２プロトマーのための核酸配列と実質的に同じ核酸配列および一つ以上の第二の抗体または抗体断片のための核酸配列を少なくとも有し；ｉｉ）前記第一の官能化ＰＴＸ−２プロトマーと、前記第二の官能化ＰＴＸ−２プロトマー、前記自然発生的なＰＴＸ−２プロトマーまたはこれらの組合せとの共発現を誘導すること、を含む。またいくつかの実施形態では、この方法は、さらにｉ）野生型プラスミドを前記発現系に導入すること、前記野生型プラスミドは自然発生的なＰＴＸ−２プロトマーのための核酸配列と実質的に同じ核酸配列を少なくとも含み；およびｉｉ）前記第一の官能化ＰＴＸ−２プロトマー、前記第二の官能化ＰＴＸ−２プロトマー、前記自然発生的なＰＴＸ−２プロトマー、またはこれらの組合せの共発現を誘導すること、を含む。またいくつかの実施形態では、前記第一のプラスミド、前記第二のプラスミド、前記野生型プラスミドまたはそれらの組合せは、さらに前記官能化ＰＴＸ−２プロトマー、前記自然発生的なＰＴＸ−２プロトマーまたはそれらのいかなる組合せの発現を制御するために配置された誘導プロモータを含む。またいくつかの実施形態では、前記発現を誘導するステップが、前記第一の官能化ＰＴＸ−２プロトマー、前記第二の官能化ＰＴＸ−２プロトマー、前記自然発生的なＰＴＸ−２プロトマーまたはそれらのいかなる組合せの発現を制御し、前記第一の官能化ＰＴＸ−２プロトマー、前記第二の官能化ＰＴＸ−２プロトマー、および／または前記自然発生的なＰＴＸ−２プロトマーを、同じ割合で発現させないことを含む。ある実施形態では、発現の制御は、前記発現系の細胞における、前記第一のプラスミド、前記第二のプラスミド、前記野生型プラスミドまたはそれらの組合せの複製数を制御することによって実行される。またある実施形態では、発現の制御は、前記第一のプラスミド、前記第二のプラスミド、前記野生型プラスミドまたはそれらの組合せの誘導プロモータによって実行される。
【００１９】
またある側面では、この開示は、患者の処置方法であって、ここで開示された少なくとも一つのＰＴＸ−２五量体またはプロトマーの有効量を、処置を必要とする患者に投与することを含む方法を対象にする。いくつかの実施形態では、前記ＰＴＸ−２五量体またはプロトマーは、患者の炎症を低減するために投与される。
【００２０】
またある側面では、この開示は、ＰＴＸ−２のコロイドの製造方法であって、ｉ）ＰＴＸ−２五量体を単離し、またはＰＴＸ−２五量体を精製し、またはそれらの組合せを行うこと；およびｉｉ）単離および／または精製されたＰＴＸ−２五量体にカルシウムを添加することを含む方法を対象にする。いくつかの実施形態では、前記コロイドが、ＰＴＸ−２の局所処方の製造に用いられる。
【００２１】
またある側面では、この開示は、患者における炎症または炎症に関連する障害を処置または予防する方法であって、ここで開示された少なくとも一つのＰＴＸ−２五量体またはプロトマーの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法を対象にする。いくつかの実施形態では、前記炎症に関連する障害は、乾癬、クローン病、自己免疫疾患（disease）例えば強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、リウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、紅斑性狼瘡およびサルコイドーシスなどから選択される。好ましい実施形態では、この開示は、患者における炎症または炎症に関連する障害を処置または予防する方法であって、抗ＴＮＦα−ＰＴＸ−２プロトマーまたはその五量体の有効量を投与することを含む方法を提供する。ある実施形態では、抗ＴＮＦα−ＰＴＸ−２プロトマーは、配列番号２のアミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２２】
またある側面では、この開示は、患者におけるＰＴＸ−２応答性障害を処置または予防する方法であって、ここで開示された少なくとも一つのＰＴＸ−２五量体またはプロトマーの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法を対象にする。いくつかの実施形態では、前記ＰＴＸ−２応答性障害は、線維症または線維症関連疾患、過敏性疾患、自己免疫疾患（disorder）、または粘膜炎から選択される。好ましい実施形態では、この開示は、この開示は、患者におけるＰＴＸ−２応答性障害を処置または予防する方法であって、抗ＴＮＦα−ＰＴＸ−２プロトマーまたはその五量体の有効量を投与することを含む方法を提供する。ある実施形態では、抗ＴＮＦα−ＰＴＸ−２プロトマーは、配列番号２のアミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
またある側面では、この開示は、患者における炎症または炎症に関連する障害およびＰＴＸ−２応答性障害を処置または予防する方法であって、ここで開示された少なくとも一つのＰＴＸ−２五量体またはプロトマーの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法を対象にする。いくつかの実施形態では、前記炎症に関連する障害は、乾癬、クローン病、自己免疫疾患（disease）例えば強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、リウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、紅斑性狼瘡およびサルコイドーシスなどから選択され、および前記ＰＴＸ−２応答性障害は、線維症または線維症関連疾患、過敏性疾患、自己免疫疾患（disorder）、または粘膜炎から選択される。好ましい実施形態では、この開示は、患者における炎症または炎症に関連する障害、およびＰＴＸ−２応答性障害を処置または予防する方法であって、抗ＴＮＦα−ＰＴＸ−２プロトマーまたはその五量体の有効量を投与することを含む方法を提供する。ある実施形態では、抗ＴＮＦα−ＰＴＸ−２プロトマーは、配列番号２のアミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
特許または出願ファイルは、カラーにて示された図面を少なくとも一つ含む。カラー図面を含むこの特許または特許出願公開公報の写しは、申請および必要な料金を納付することにより特許庁より提供される。
【図１】図１は、ペントラキシン−２（ＰＴＸ−２）五量体のＸ線結晶構造を示す。Ｎ末端およびＣ末端は示されたとおりであり、球状物は結合したＣａ2+を表す。
【図２】図２は、ＰＴＸ−３（長鎖ペントラキシン）と比較して、ＰＴＸ−２（短鎖ペントラキシン）の概略を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、官能化ＰＴＸ−２五量体の種々の例示コンフィギュレーションを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、官能化ＰＴＸ−２五量体の種々の例示コンフィギュレーションを示す。
【図４】図４は、官能化ＰＴＸ−２五量体の製造方法の一例の概略図である。最大で五つの抗体／タンパク質ＳＡＰ融合物が組合せられ、触媒活性、結合活性および／または治療活性を有する五量体（pentameric complex）を創り出すことができる。
【図５】図５は、カルシウムの添加後溶液中に残るＰＴＸ−２の割合（％）のプロットを示す。
【図６】図６は、５回の冷凍／解凍サイクル後に分解を呈さない精製ＰＴＸ−２抗ＴＮＦα融合タンパク質のサイズ排除高圧液体クロマトグラフィ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）プロットの一例である。
【図７】図７は、５回の冷凍／解凍サイクル後に分解を呈さない精製ＰＴＸ−２抗ＴＮＦα融合タンパク質のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲル電気泳動の一例の写真である。
【図８】図８は、精製後に精製ＰＴＸ−２抗ＴＮＦα融合タンパク質の種を示す液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣＭＳ）プロットの一例である。
【図９】図９は、天然ＰＴＸ−２（●）またはＰＴＸ−２抗ＴＮＦα融合タンパク質（▼）への暴露の結果として、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）におけるマクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）生成の阻害を示すプロットの一例である。
【図１０】図１０は、天然ＰＴＸ−２（●）またはＰＴＸ−２抗ＴＮＦα融合タンパク質（▼）への暴露の結果として、マクロファージ細胞におけるＩＬ−８生成の阻害を示すプロットの一例である。
【図１１】図１１は、天然ＰＴＸ−２（●）、ＰＴＸ−２抗ＴＮＦα融合タンパク質（▼）、または抗ＴＮＦα抗体、レミケード（■）への暴露の結果として、Ｌ９２９細胞におけるＴＮＦα活性の阻害を示すプロットの一例である。
【図１２】図１２は、２４時間にわたる、ラットの血液からの天然ＰＴＸ−２（●）またはＰＴＸ−２抗ＴＮＦα融合タンパク質（▼）の除去を示すプロットの一例である。
【図１３】図１３は、抗ＴＮＦα−ＶＨＨ３−ＰＴＸ−２プロトマーのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。この抗ＴＮＦα−ＶＨＨ３領域が、下線で示され、リンカー領域が太字で示され、ＰＴＸ−２領域が二重下線で示される。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の組成物および方法を記述する前に、この開示が記載された特定の方法、組成、または手順に限定されることはなく、これらは変更可能であることが理解されるべきである。また、この説明において用いられる専門用語は、特定の型や実施形態を記述することのみを目的としており、添付の請求項によってのみ制限されるであろう本願の開示の範囲を制限することが意図されることはないと理解されるべきである。特に断らない限り、ここで用いられる全ての技術および科学的用語は、当業者により理解されている共通の意味と同じ意味を有する。ここで開示されたものと同一（similar）または等価のいかなる方法および材料を本願の開示の実施形態の実施または試験に用いることができるのであるが、好ましい方法、デバイスおよび材料はここに記載される。ここで述べる全ての公開物が、全体として言及することにより本願に組み込まれる。ここでのいかなる内容も、従前の開示によりこのような開示に先行する権利を有しないことを承認すると解釈すべきではない。
【００２６】
ここでおよび添付の請求項で用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に記述しない限り、複数への言及を包含することにも留意されるべきである。したがって、例えば、「細胞（単数形）」は、一つ以上の細胞および当業者に公知のその等価物などにも言及がある。
【００２７】
ここで用いられるように、「約」という用語は、数値部分が、そこで用いられたもののプラスマイナス１０％の数値を意味する。したがって、約５０％は、４５％〜５５％の範囲を意味する。
【００２８】
ここで用いられるように、「実質的に」という用語は、特定されたものそのものではないが、大部分であることを意味する。例えば、核酸配列についての「実質的に同一である」という用語は、同じタンパク質またはペプチドのために報告された配列と当該配列が大部分において同一であることを示すが、この核酸配列は、結果物のタンパク質の構造または機能に影響を及ぼさないような種々の変異や突然変異を含んでもよい。
【００２９】
「投与する」は、治療剤に関して用いた場合、標的組織内にまたは上に直接治療剤を投与し、または患者に治療剤を投与し、当該治療剤が積極的に標的となった組織に影響を与えることを意味する。したがって、ここで用いられるように、「投与する」という用語は、ＰＴＸ−２骨格に関して用いた場合、これに限定されないが、ＰＴＸ−２骨格を対象者に全身的に、例えば静脈注射などにより提供し、当該治療剤を標的組織に届くようにする。組成物の「投与する」は、例えば注射、経口投与、局所投与により、または他の公知の技術とともにこれらを組み合わせることにより達成してもよい。このような組合せ技術は、加熱、照射、超音波および送達剤の使用を含む。
【００３０】
「提供する」は、治療剤に関して用いた場合、標的組織内にまたは上に直接治療剤を投与し、または患者に治療剤を投与し、当該治療剤が積極的に標的となった組織に影響を与えることを意味する。
【００３１】
ここで用いられるように、「動物」という用語は、限定されることはないが、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物、例えば野生、飼育動物または家畜などを含む。
【００３２】
ここで用いられるように、「改良する（improves）」という用語は、本願の開示物が、提供され、適用され、投与される組織の特徴および／または生理的属性のいずれかを変更することを表現するために用いられる。また、「改善する（improves）」は、疾患の状態に関して用いることもあり、疾患状態が「改善した」場合には、疾患状態に関する症状や生理的特徴が縮小、低減または消滅する。
【００３３】
「阻害する」という用語は、一般に、症状の発現の予防、症状を軽減すること、または疾患、病気または障害を消滅させることに言及する。
【００３４】
「任意の」または「任意に」は、続いて記載されたイベントまたは状況が起こる、起こらないが関係ないことを意味し、この開示はイベントが起こる場合および起こらない場合を含む。
【００３５】
本願の明細書の至るところで、「一次」、「二次」、「第一」、「第二」などの種々の用語が用いられる。これらの用語は、異なった要素間で区別をつけるために便利な言葉であり、このような用語は、異なった要素がどのように利用されるかについて制限することを意図するものではない。
【００３６】
ここで用いられるように、「単離された」は、ヒトの介在を通じて、天然状態から修正または除去されることを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在するロンボイドプロテアーゼ（rhomboid protease）は「単離された」ものではないが、合成のロンボイドプロテアーゼ、または天然状態の共存する材料から部分的にまたは完全に分離されたロンボイドプロテアーゼは「単離された」ものである。単離ロンボイドプロテアーゼは、実質的に精製された形態で存在するか、または非天然環境、例えばロンボイドプロテアーゼが送達された細胞内で存在することができる。
【００３７】
「模倣剤」、「ペプチド模倣剤（peptide mimetic）」および「ペプチド模倣薬（peptidomimetic）」は、ここでは同じ意味で用いられ、一般に、選択された天然ペプチドまたはタンパク質機能領域（例えば結合モチーフまたは活性部位）の三級結合構造または活性を再現したペプチド、部分ペプチドまたは非ペプチド分子に言及する。これらペプチド模倣剤としては、組換えまたは化学修飾ペプチド、ならびに非ペプチド剤、例えば後述する小分子薬物模倣剤が挙げられる。
【００３８】
「製薬学上許容される」、「生理学上耐久性のある」およびその文法上のバリエーションにより、それらは組成物、キャリア、希釈剤、および試薬または処方の他の成分に言及し、同じ意味で用いられ、また材料が望まない生理学上の効果、例えば吐き気、目まい、発疹、異常亢進、または他の有害効果なしで、その受容者に投与可能であることを表す。
【００３９】
ここで用いられるように、「治療剤」は、患者の望まない状態または疾患を処置する、戦う、好転させる、予防するまたは改善するために用いられる剤を意味する。一部において、本願開示の実施形態は、炎症、肥満に関連した疾患、メタボリック疾患、心臓血管疾患、脳血管および神経変性疾患、がんまたは細胞の異常増殖の処置を対象にする。
【００４０】
ここで用いられるように、「治療上有効な」または「有効な」という用語は、同じ意味で用いられ、本願開示の実施形態の治療剤組成物（例えば一つ以上のペプチドまたはその模倣剤）の量に言及する。例えば、組成物の治療上有効な量は、望まれる効果を達成するために計算された所定の量である。
【００４１】
組成物の「治療上有効な量」または「有効量」は、望まれる効果を達成するために計算された所定の量である。本願方法で期待されるアクティビティとしては、医療上の治療および／または予防上の処置の両方について、それぞれに見合ったもので包含する。治療上のおよび／または予防上の効果を得るために、この開示により投与される化合物の特定の投与量は、もちろん、当該ケースを取り巻く特定の状況、例えば投与化合物、投与ルート、および処置する病気などにより決定されるであろう。しかしながら、投与の有効量は、医者により関連する状況、例えば処置する病気、投与する化合物の選択、および選択された投与ルートなどの観点から決定することができ、ゆえに、上記の投与量は、形はどうであれ、この開示の範囲を制限することを意図するものではない。この開示の化合物の治療上の有効量は、典型的には、生理学上耐久性のある賦形剤組成物にて投与される場合、有効な全身濃度または組織内の局所濃度を達成することで十分である。
【００４２】
ここで用いられるように、「処置する」、「処置される」または「処置」の用語は、治療上の処置、および防御（prophylactic）および予防（preventative）上の手段の両方に言及し、対象は望まない生理学上の病気、障害または疾患を予防または進行を遅くする（小さくする）こと、または有益なまたは望まれる臨床上の結果を得ることである。この開示の目的について、有益なまたは望まれる臨床上の結果としては、これに限定されないが、症状の軽減；病気、障害または疾患の程度の減少；病気、障害または疾患の状態の安定化（すなわち悪化させない）；病気、障害または疾患の進行の開始を遅らせ、または進行を遅くする；病気、障害または疾患の状態の好転化；検出未検出は関係なく、病気、障害または疾患の鎮静化（部分的または全体）、増強または改善が挙げられる。処置としては、過剰レベルの副効果なしで臨床上有意な応答の誘発が挙げられる。また、処置としては、処置を受けなかったに想定される生存期間を比較して、生存期間を延長することが挙げられる。
【００４３】
一般的に言えば、「組織」という用語は、同じように特殊化され、特定の機能を発揮させる際に集まる細胞のアグリゲーションに言及する。
【００４４】
ここで用いられるように、「抗体（単数）」、「抗体（複数）」、「抗体断片（単数）」または「抗体断片（複数）」の用語ならびに抗体に関連する用語、例えば一本鎖の可変断片（「ｓｃＦｖ」）が、全ての抗体、抗体断片および抗体様結合タンパク質、例えばこれに限定されないが、ラクダ科のＶＨＨタンパク質、およびアドネクシン（adnexins）まで拡大する。
【００４５】
ヒトペントラキシン−２（ｈＰＴＸ−２）（血清アミロイドＰ（ｈＳＡＰ）とも呼ばれる）は、肝臓で継続して発現し、血漿中で非共有結合プロトマーのホモペンタマーとしておよそ２０−４０μｇ／ｍｌで循環する。ヒトＰＴＸ−２は、微生物に対する固有の抵抗に作用し、および細胞残屑の掃除または食作用に作用し、創傷治癒および線維症の調節における役割を果たすように見える。これらの機能は、（ｉ）前述のような微生物および細胞残屑に関連するリガンドおよび種々の細胞外基質タンパク質に、Ｃａ2+依存の方法にて結合する、（ｉｉ）Ｃ３ｂおよびｉＣ３ｂによるオプソニン化を促進することにより補体活性化のためのＣｌｑに結合させる、（ｉｉｉ）直接オプソニン化を開始して、続けて食作用またはエンドサイトーシスを開始するためのＦｃγレセプタに結合させる、および（ｉｖ）続く単球機能の調節に関与する。損傷および修繕のサイトに局在するｈＰＴＸ−２分子自体は、これら分子の結合を通じてこれらの位置にて標的にしたり、および／または濃縮してもよい。
【００４６】
ｈＰＴＸ−２の３Ｄ構造は、Ｘ線結晶構造解析により決定されており（図１）、および異なったリガンドと複合化したいくつかのｈＰＴＸ−２結晶構造が報告されている。ｈＰＴＸ−２の五量化構造は、５回回転対象性を有し、かつ、孔を伴った極めて剛直である。ｈＰＴＸ−２五量体の直径は、およそ１００オングストロームであり、中央孔は直径２０オングストローム、深さ３５オングストロームである。それぞれのプロトマー（protomer）は、二つのシートに配置される逆平行のβ鎖を構成し、ゼリーロール・トポロジー（jellyroll topology）を有する疎水性コアを持つ。ｈＰＴＸ−２五量体は二つの面を持ち、Ａ面は五つのαへリックス（各プロトマー上のそれである）を有し、およびＢ面は二つのカルシウム結合部位が５セットある。このＢ面は、カルシウム依存リガンド結合面を提供すると考えられ、Ｂ面に結合するいくつかのカルシウム依存リガンドが同定されており、それぞれとしてホスホリルエタノールアミン、ＤＮＡ、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸および硫酸デキストラン、ラミニンおよびコラーゲンＩＶが挙げられる。ｈＰＴＸ−２のＡ面も、分子例えばＣｌｑを結合させ、Ｆｃγレセプタへの結合を通じて食作用を媒介するものと思われる。それぞれのプロトマーは、単一部位、Ａｓｎ３２でグリコシル化されている。
【００４７】
ＮおよびＣ末端は、溶媒のアクセスが可能であり、図１に示したように、各プロトマー分子の内縁に位置している。Ｎ末端は、各プロトマーの外縁および５つのプロトマーにより形成されるリングの外周上に位置する。Ｃ末端は、五量体リングの内周囲および孔に向かって位置するが、Ａ面に向かって外側に向けられている。一つのプロトマーでＮおよびＣ末端は、約２５オングストローム離れている。両末端は、サブユニット相互作用には関与していないと思われ、Ａｓｎ３２につなげられたグリカン鎖から離れている。ｈＰＴＸ−２のサブユニットは、これら相互作用に関与する各サブユニットの表面のおよそ１５％にて、非共有結合的に一緒に保持される。これら広範囲の相互作用は、ｈＰＴＸ−２五量体の重要な安定性の主要因となっている。
【００４８】
ペントラキシン−２は、他の短鎖ペントラキシン、例えばペントラキシン−１（ＰＴＸ−１、Ｃ反応タンパク質とも呼ばれる、ＣＲＰ）、および長鎖ペントラキシン、例えばＰＴＸ−３と関連する、タンパク質のペントラキシンファミリーのメンバーである。図２に示したように、全てのペントラキシンは、基本的ペントラキシン領域（円）を共有し、短鎖ペントラキシンではこの基本的ペントラキシン領域が全タンパク質として定義される。その一方で、長鎖ペントラキシンは、基本的ペントラキシン領域（円）ならびに構造的および機能的に関連のないＮ末端領域（ペントラキシン領域と長さが大体等しくなり得る）（フレア伸長部分）を含む。ＰＴＸ−３のＮ末端領域は、線維芽細胞増殖因子２を結合させると説明されてきたαへリックスコイルドコイルであると予測される。ＰＴＸ−３のＣ末端領域は、短鎖ペントラキシンＰＴＸ−２およびＣＲＰのようなＣｌｑと結合でき、長鎖ペントラキシンの結晶構造は得られていないものの、ＰＴＸ−３ペントラキシン領域の予測された構造は、ＰＴＸ−１およびＰＴＸ−２の両方と強い相同性を生んでいる。したがって、長鎖ペントラキシンは、ＰＴＸ−２のペントラキシン領域の全体およびペントラキシン五量体（pentameric nature）の構造および機能を維持しながら、ＰＴＸ−２から異なった機能的特性を持つ、追加のタンパク質領域、ペプチドまたは他の非タンパク質分子をＰＴＸ−２のＮまたはＣ末端につなげる可能性を創出する、二つの別々の機能領域を有すると思われる。
【００４９】
さらに、ｈＰＴＸ−２分子の五量体（pentameric nature）は、他の分子と相互作用のアビディティの増大をもたらす。これは、各分子からほんの一つの結合部位の閉じた利用が関与する単純なもの（simple nature）の分子相互作用において有利であり、分子のアフィニティの増大、および送達された分子の低い濃度にてより有効な応答につながる。ｈＰＴＸ−２の五量体（pentameric nature）は、例えば細胞表面上でＦｃγレセプタの架橋の可能性にもつながる。これは細胞応答に影響を及ぼし得る。これらの特性は、損傷および修繕の部位に配置させたｈＰＴＸ−２の特性と一緒になって、ｈＰＴＸ−２の潜在的な「骨格」分子として使用して、治療、予防または診断剤としての他の分子的実体を有効に送達することを構築する。ｈＰＴＸ−２に添加された他の分子的実体は、新しい機能的および／または送達的な特性をも融合タンパク質分子に追加し得る。
【００５０】
この開示の実施形態は、一般に、ペントラキシン−２（ＰＴＸ−２）の抗体および抗体断片ベースの治療剤のための骨格分子としての用途を対象にする。この実施形態では、一つ以上の抗体および抗体断片が、ＰＴＸ−２プロトマーに連結して、「官能化ＰＴＸ−２プロトマー」を形成してもよく、これら官能化ＰＴＸ−２プロトマーは組み合わさって官能化ＰＴＸ−２五量体を形成してもよい。したがって、官能化ＰＴＸ−２プロトマーを対象にする実施形態もあり、また官能化ＰＴＸ−２五量体を対象にする実施形態もある。さらには、官能化ＰＴＸ−２プロトマーおよびＰＴＸ−２五量体を含む製薬学上の組成物、および官能化ＰＴＸ−２プロトマーおよび官能化ＰＴＸ−２五量体を種々の障害および疾患の処置のために使用する方法を対象にする実施形態もある。またさらに、ここで記載された構造を有する官能化ＰＴＸ−２プロトマーおよび官能化ＰＴＸ−２五量体の製造方法を対象にする実施形態もある。
【００５１】
ここで用いられるように、「ＰＴＸ−２融合タンパク質」は、ＰＴＸ−２の構造的および機能的特性を、ＰＴＸ−２に結合またはつなげられ、さらなる構造的および機能的な特性を提供する追加の分子的実体と組み合わせて提示する分子として定義される。ＰＴＸ−２のための「骨格」機能は、ＰＴＸ−２の剛直な五量化構造、五量体の回転対象性および大きさ、各プロトマーのＮおよびＣ末端の両方の利用可能性、ならびにその構造、例えばＣａ2+結合部位およびＣａ2+依存性リガンド結合部位、ＣｌｑおよびＦｃγ結合部位、中央孔、およびグリコシル化部位など構造の他の特定の特徴を利用する。
【００５２】
官能化ＰＴＸ−２プロトマーは、前記骨格機能を実行するために多くの方法で配置し得る。例えば、いくつかの実施形態では、一つ以上の抗体、一つ以上の抗体断片、またはこれらの組合せを、ＰＴＸ−２プロトマーのＮ末端またはＣ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方のいずれかにつなげることができる。ＰＴＸ−２プロトマーのＮ末端およびＣ末端の両方は、溶媒のアクセスが可能であり、かつ、プロトマーの外周に位置し、サブユニット相互作用には関与していないため、得られるＰＴＸ−２融合タンパク質は、抗体または抗体断片のための送達ビヒクルを提供しつつ、この実施形態でのその一般的な機能および構造を維持することができる。
【００５３】
またさらなる実施形態では、一つ以上の抗体、一つ以上の抗体断片またはこれらの組合せを、ＰＴＸ−２の内部配列に挿入操作することができ、これは公知のＰＴＸ−２のＸ線結晶構造のモデリングに基づいてＰＴＸ−２プロトマーの外部表面に位置するよう設計される。このような非ＰＴＸ−２配列は、ＰＴＸ−２の全配列に加えて提供してもよく、あるいはこのような非ＰＴＸ−２配列はＰＴＸ−２配列と置き換えてもよい。ＰＴＸ−２は、一般に、前記非ＰＴＸ−２配列がＰＴＸ−２に対して追加の機能的特性を与えながら、全てのペントラキシン領域、五量化構造、および一般的なＰＴＸ−２の機能を維持してもよい。
【００５４】
またさらなる実施形態では、抗体および抗体断片は、個々のＰＴＸ−２プロトマーまたは五量化ＰＴＸ−２に、ＰＴＸ−２プロトマーまたは五量化ＰＴＸ−２上で化学的手段、例えばアミノ酸または糖質との非常にタイトな結合または化学的連結を介してつなげても、あるいは各ＰＴＸ−２プロトマーのＣａ2+結合部位とのキレート化を介してつなげてもよい。更なる実施形態では、一つ以上の他の金属結合部位を、Ｃａ2+結合部位と置き換えて、または別の方法で分子上の他のどこかのＰＴＸ−２プロトマーへ挿入操作して、特定のクラスの抗体または抗体断片と結合するＰＴＸ−２プロトマーまたは五量化ＰＴＸ−２を製造してもよい。
【００５５】
ここで開示された実施形態により包含されるＰＴＸ−２としては、いかなるソース、例えばヒトＰＴＸ−２、または他の脊椎動物または哺乳類ソースからのアイソマーまたはアナローグからのＰＴＸ−２が挙げられる。さらに、ＰＴＸ−２は、部位特異的突然変異誘発法などにより導入された、天然ＰＴＸ−２アミノ酸配列からの修飾を有するＰＴＸ−２分子を包含する。このような修飾は、当該分子の五量化ペントラキシンの一般的な特徴を維持しつつ、特定のアミノ酸および／または他の分子の特徴を修正する。「ＰＴＸ−２」は、ＰＴＸ−２五量体およびＰＴＸ−２プロトマーの両方を包含する。「ＰＴＸ−２五量体」または「五量化ＰＴＸ−２」は、少なくとも五つのＰＴＸ−２プロトマーを含むタンパク質複合体に言及し、および「ＰＴＸ−２プロトマー」は、ＰＴＸ−２五量体の個々のタンパク質ユニットの一つに言及する。
【００５６】
天然のヒトＰＴＸ−２プロトマーの配列は下記のとおりであり、Gene Bankのアセッション番号Ｎｏ．ＮＰ＿００１６３０のアミノ酸２０−２２３番に対応する（シグナル配列は表現していない）。
ＨＴＤＬＳＧＫＶＦＶＦＰＲＥＳＶＴＤＨＶＮＬＩＴＰＬＥＫＰＬＱＮＦＴＬＣＦＲＡＹＳＤＬ
ＳＲＡＹＳＬＦＳＹＮＴＱＧＲＤＮＥＬＬＶＹＫＥＲＶＧＥＹＳＬＹＩＧＲＨＫＶＴＳＫＶＩＥ
ＫＦＰＡＰＶＨＩＣＶＳＷＥＳＳＳＧＩＡＥＦＷＩＮＧＴＰＬＶＫＫＧＬＲＱＧＹＦＶＥＡＱＰ
ＫＩＶＬＧＱＥＱＤＳＹＧＧＫＦＤＲＳＱＳＦＶＧＥＩＧＤＬＹＭＷＤＳＶＬＰＰＥＮＩＬＳＡ
ＹＱＧＴＰＬＰＡＮＩＬＤＷＱＡＬＮＹＥＩＲＧＹＶＩＩＫＰＬＶＷＶ
（配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１））
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＰＴＸ−２プロトマーは、ＦＡＳＴＤＢを用いて決定された、ソースＰＴＸ−２の天然アミノ酸配列（配列番号１）と１００％の同一性を持っていてもよく、および他の実施形態では、ＰＴＸ−２プロトマーは、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を持っていてもよい。特定の実施形態では、非進化的に保存されたアミノ酸が、同一でないアミノ酸の中に含まれていてもよい。ここで用いられるように、「非進化的に保存されたアミノ酸」は、一次アミノ酸配列を、進化的に関連したもの、オーソロガス、種、例えばこの順番で比較した場合と同様に可変であるアミノ酸に言及する。以下に述べる種々の実施形態では、変異または修飾を受けてもよいＰＴＸ−２アミノ酸は、一般に、進化的に保存されないアミノ酸であってもよい。例えば、ヒトＰＴＸ−２（配列番号１）と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＰＴＸ−２プロトマーは、ヒトＰＴＸ−２と他の脊椎動物のＰＴＸ−２が異なっている位置では、異なる残基を有してもよい。
【００５８】
ある実施形態では、異なるアミノ酸は、天然アミノ酸と類似の化学的特性を有し、同類置換」をもたらしてもよい。特に、類似の特性を有することが知られているアミノ酸としては：Ｅ，Ｄ，Ｎ，Ｑ；Ｈ，Ｋ，Ｒ；Ｙ，ＦおよびＷ；Ｉ，Ｌ，Ｖ，Ｍ，Ｃ，Ａ；およびＳ，Ｔ，Ｃ，Ｐ，Ａが挙げられ、同類置換は、以下の括りのあるものからあるものへの置換である：脂肪族アミノ酸Ａｌａ，Ｖａｌ，ＬｅｕおよびＩｌｅ；塩基性アミノ酸ＬｙｓおよびＡｒｇ；酸性アミノ酸ＡｓｐおよびＧｌｕ；ヒドロキシル含有アミノ酸ＳｅｒおよびＴｈｒ；アミド含有アミノ酸ＡｓｎおよびＧｌｎ；および芳香族アミノ酸ＰｈｅおよびＴｙｒ。表現型の上ではサイレントなアミノ酸の交換についての更なるガイダンスは、Bowie et al, Science 247: 1306-1310 (1990)に見つけられる。配列番号１と少なくとも９５％の同一性を共通にするポリペプチドは、これらの発散域での同類置換を有するポリペプチドを含んでもよい。
【００５９】
いくつかの実施形態では、特定の機能、例えばＦｃγＲへの結合またはＣａ2+依存性リガンドの結合などを与えるＰＴＸ−２プロトマーの構造的な特徴は、これら特徴を除去するように変異させることができる。いくつかの実施形態では、意図する機能のためには必要ではない構造的な特徴を除去することで、ＰＴＸ−２融合タンパク質の機能および標的機能との潜在的な干渉を除去することができる。他の実施形態では、ＰＴＸ−２プロトマーへの他の交換、例えばＮまたはＣ末端でのアミノ酸配列への交換または表面に曝されたループの部分を形成する内部配列への交換などは、例えば部位特異的突然変異誘発法などにより導入することができ、およびＰＴＸ−２融合タンパク質に追加の特徴、例えば溶解度の改良または活性剤をつなげるために用いることができるアミノ酸または修飾アミノ酸を追加することを提供することができる。特定の実施形態では、ＰＴＸ−２の構造的な特徴、例えばＦｃγＲへの結合またはＣａ2+依存性リガンドの結合などの特徴は、これら機能に関与するアミノ酸の選択的変異により除去することができる。いくつかの実施形態では、このような修飾ＰＴＸ−２プロトマーまたは五量化ＰＴＸ−２は、つなげられた活性材により与えられるもう一つの部分のターゲットが望まれる場合に用いることができる。さらに、ＦｃγＲへの結合またはＣａ2+依存性リガンドの結合などの特徴の選択的な除去または低減は、ＰＴＸ−２の炎症領域に堆積する能力を低減させて、活動状態にあるＰＴＸ−２融合タンパク質の大きな滞留を可能にすることができる。したがって、修飾ＰＴＸ−２プロトマーは、循環環境での大きな滞留が望まれる場合、または内部のＰＴＸ−２結合との競合が望まれない場合に、有用である。
【００６０】
この実施形態では、ＰＴＸ−２の治療活性およびＰＴＸ−２プロトマーに部位特異的突然変異誘発または削除を提供するために用いられる抗体および抗体断片を含む二次タンパク質配列の追加は、ＰＴＸ−２の五量化構造が実質的に維持されるように配置される。このような融合タンパク質の挿入操作は、プロトマー内および分子間での結合相互作用に関与するキーとなる残基の知識と一緒に、利用可能なＰＴＸ−２のＸ線結晶構造に基づいてガイドされる。したがって、プロトマー間の相互作用に関与することが知られる配列および個々のアミノ酸残基、および一般に扁平なゼリーロールなペントラキシン構造の形成のために必要な配列および個々のアミノ酸残基は、同定することができ、二次タンパク質配列はこの領域の外側に追加され、これによりＰＴＸ−２プロトマー融合タンパク質は五量体に会合することができる。例えば、ある実施形態では、部位特異的突然変異誘発は、ＰＴＸ−２プロトマーのＣａ2+結合領域、レセプタ結合領域またはリガンド結合領域内のアミノ酸にて実行し、望まれる性質を有するＰＴＸ−２融合タンパク質を製造することができ、また他の実施形態では、Ｃａ2+結合領域、レセプタ結合領域またはリガンド結合領域が、完全にまたは実質的に削除されていてもよい。
【００６１】
更なる他の実施形態では、「ＰＴＸ−２プロトマー」は、ＰＴＸ−２プロトマーのいかなる部分をも含む機能的断片および融合タンパク質を包含してもよい。ＰＴＸ−２の「機能的断片」は、一つ以上のＰＴＸ−２プロトマーの部分、または全体としてＰＴＸ−２プロトマーに関する一つ以上の機能を実行する能力を維持する領域を含むことができる。例えば、機能的断片が、五量体アセンブリに必要なＰＴＸ−２プロトマーの部分のみを含んでもよい実施形態もあり、また機能的断片が、五量体アセンブリに必要なＰＴＸ−２プロトマーの部分およびリガンド結合またはＣａ2+結合に必要なＰＴＸ−２プロトマーの部分を含んでもよい実施形態もある。ある実施形態では、さらに、この機能的領域は、活性剤を含むように修飾してもよく、これにより官能化ＰＴＸ−２プロトマーの機能的断片を創り出すことができる。
【００６２】
また更なる実施形態は、ＰＴＸ−２の異形を含む。「ＰＴＸ−２の異形」は、十分に類似する一次アミノ酸配列および／またはＰＴＸ−２プロトマーの構造的な同一性を有するタンパク質、またはヒトＰＴＸ−２五量体と比較して一つ以上の改良した特徴、例えばこれに限定されないが、増大した水溶解性、増大した血漿半減期、増大したインビトロ安定性、増大したインビボ安定性、および増大した潜在性を含む改良した特徴を示す２〜５のアセンブルしたＰＴＸ−２プロトマーからのタンパク質に言及する。
【００６３】
一般的に、本実施形態で有用なＰＴＸ−２プロトマーまたはＰＴＸ−２プロトマーの機能的断片は、生体関連の温度、ｐＨ、およびオスモル濃度にて、水溶液で溶解性であってもよい。非共有結合で一緒に会合してＰＴＸ−２を形成するプロトマーは、同じアミノ酸配列および／または翻訳後修飾を備えてもよく、あるいは個々のプロトマーは異なったアミノ酸配列および／または翻訳後修飾を備えてもよい。
【００６４】
いくつかの実施形態では、抗体または抗体断片はＰＴＸ−２プロトマーにつなげることができ、組換え技術を用いて、ＰＴＸ−２プロトマーのＮ末端および／またはＣ末端で配列を追加、または除去して、融合タンパク質を創り出すことができる。この実施形態では、一つ以上の抗体または抗体断片が、ＰＴＸ−２プロトマーのＮまたはＣ末端に導入されてもよく、またいくつかの実施形態では、二つ以上の抗体または抗体断片が連続して導入され、各抗体または抗体断片が少なくとも一つの他の抗体または抗体断片の位置で、糸でつながれたパールの状態のように隣接してもよい。他の実施形態では、一つ以上の抗体または抗体断片は、ＰＴＸ−２プロトマーのＮおよびＣ末端のそれぞれについてエンコードしてもよい。例えば、特定の実施形態では、第一の抗体または抗体断片のアミノ酸配列が、ＰＴＸ−２プロトマーのＣ末端に導入され、および第二の抗体または抗体断片アミノ酸配列が同じＰＴＸ−２プロトマーのＮ末端に導入されてもよい。
【００６５】
また他の実施形態では、ＰＴＸ−２プロトマーに追加された抗体または抗体断片アミノ酸配列は、追加された抗体または抗体断片アミノ酸配列をＰＴＸ−２プロトマーの必須構造ユニットから離すリンカーを含むこともできる。このようなリンカーは、さらに空間的により近い非ＰＴＸ−２部分を離してもよいし、持ち込んでもよく、および／またはタンパク質に、抗体、抗体断片またはＰＴＸ−２プロトマーの折り畳みを働きかけることもできる。当業者により知られた非常に多くのリンカー配列のどれもが、実施形態では使用することができる。いくつかの具体的な実施形態では、このリンカーはフレキシブルなリンカーであってもよく、およびアミノ酸配列の繰り返しユニット、ＧＧＧＧＳ、（ＧＧＧＧＳ）n（ｎは１〜５である）を含んでもよい。特定の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳであり、これはｓｃＦｖの軽鎖および重鎖を分けるために共通して用いられる。また他の実施形態では、例えばｎが３未満であるような、このリンカーの短い型を用いることができる。さらに他の実施形態では、リンカーは剛直なリンカーであってもよく、これはαへリックス形成配列のベース、例えば（ＰＡＰＡＰ）ｎとなり得る（ｎは１〜５である）。この実施形態では、フレキシブルまたは剛直なリンカーのいずれかの長さは、例えばＰＴＸ−２プロトマーおよび隣り合ったプロトマー上の抗体または抗体断片アミノ酸の間配列の間で望まれる空間的距離を提供するため、またはＰＴＸ−２の機能的および／または生理的特性を維持することを確実にするために調節することができる。
【００６６】
さらに他の実施形態では、システインペアを取り込んで鎖中または鎖間のジスルフィドを形成し、ループまたは領域を安定化し、および抗体または抗体断片をＰＴＸ−２プロトマー上で提示するのを助けるようにしてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、システインはＰＴＸ−２プロトマーに、例えば部位特異的突然変異誘発法により組み込み、ＰＴＸ−２プロトマーにつなげられた抗体または抗体断片アミノにて、システインとジスルフィド結合を形成させることができる。他の実施形態では、ＰＴＸ−２の部分（これらの機能が削除されたときに、ＦｃγＲ結合またはＣａ2+依存性リガンド結合が生じる部分）で削除または置換により生じた結果として失われる相互作用を形成し得た、ＰＴＸ−２プロトマーの部分を安定化させるために、部位特異的突然変異誘発法を、ジスルフィド結合を追加するために用いることができる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＰＴＸ−２五量体の融合タンパク質は、それぞれが同じ抗体または抗体断片をつなげて有する官能化ＰＴＸ−２プロトマーから構成され、また他の実施形態では、五量化ＰＴＸ−２の融合タンパク質は、それぞれが異なった抗体または抗体断片をつなげて有する官能化ＰＴＸ−２プロトマーを含んでもよい。更なる他の実施形態では、五量化ＰＴＸ−２の融合タンパク質は、官能化および非官能化ＰＴＸ−２プロトマーを含むことができ、この五量化ＰＴＸ−２の融合タンパク質の官能化ＰＴＸ−２プロトマーは同じまたは異なった抗体または抗体断片をつなげて有していてもよい。他の実施形態では、それぞれが異なった抗体または抗体断片をつなげて有する官能化ＰＴＸ−２プロトマーを、ＰＴＸ−２五量体に組み合わせてもよい。当業者により理解されるように、官能化ＰＴＸ−２プロトマーおよび非官能化ＰＴＸ−２プロトマーのいずれの組合せをも有する五量化ＰＴＸ−２五量体を創り出すことができ、特定の抗体または抗体断片の利用は、官能化五量化ＰＴＸ−２を製造するために用いられる官能化ＰＴＸ−２プロトマーおよび非官能化ＰＴＸ−２プロトマーの混合物での官能化プロトマーの部分を修飾することにより達成される。例えば、官能化ＰＴＸ−２プロトマーが１、非官能化ＰＴＸ−２プロトマーが４の割合で調製された官能化ＰＴＸ−２プロトマーおよび非官能化ＰＴＸ−２プロトマーの混合物は、官能化ＰＴＸ−２プロトマーが１、非官能化ＰＴＸ−２プロトマーが４の平均割合のＰＴＸ−２五量体を創り出すことができる。
【００６８】
官能化ＰＴＸ−２五量体の具体的な実施形態としては、現在の医療の要求を満たすように設計された潜在的な治療との関連を有するＰＴＸ−２五量体が挙げられる。例えば、図３Ａ、図３Ｂに示したように、いくつかの実施形態では、ＰＴＸ−２五量体のそれぞれのプロトマーは、官能化してもよく、およびＮまたはＣ末端に導入された抗体および抗体断片を含んでもよい。特に、図３Ａは、ほぼ原寸に比例して図示されたｓｃＦｖ断片、例えば抗炎症剤として使用することができる抗ＴＮＦαｓｃＦｖ、を含むＰＴＸ−２プロトマーを示し、更なる実施形態では、図３Ｂに示すように、ＰＴＸ−２五量体は官能化ＰＴＸ−２プロトマーおよび非官能化ＰＴＸ−２プロトマーを含んでもよい。図３Ａおよび図３Ｂに示した抗体断片は、原寸に比例して図示され、ＰＴＸ−２上のＮ末端伸長部分とほぼ同じ分子サイズである。
【００６９】
ある側面では、この開示は、ＴＮＦαに結合する、官能化ＰＴＸ−２プロトマーならびにこれを含む五量体を提供する。ある実施形態では、ＴＮＦαに結合する官能化ＰＴＸ−２プロトマーは、抗ＴＮＦα抗体またはその抗原結合断片を含む。例えば、ここで開示された抗ＴＮＦαＰＴＸ−２プロトマーは、ＴＮＦα抗体のインフリキシマブまたはその抗原結合部分を含んでもよい。好ましい実施形態では、ここで開示された官能化ＰＴＸ−２プロトマーならびにこれを含む五量体は、配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。任意に、ここでの開示の官能化ＰＴＸ−２プロトマーならびにこれを含む五量体は、次から選択された一つ以上の修飾アミノ酸残基を含む：グリコシル化アミノ酸、ポリエチレングリコール分子を結合させた（PEGylated）アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に接合されたアミノ酸、有機誘導体剤に接合されたアミノ酸。
【００７０】
ＴＮＦαに結合する官能化ＰＴＸ−２プロトマー、ならびにこれを含む五量体は、ＴＮＦαと結合する官能化ＰＴＸ−２プロトマーおよび製薬学上許容されるキャリアを含む製薬学上の調合剤として処方することができる。このような製薬学上の調合剤は、一つ以上の追加化合物、例えば患者のＴＮＦαに関連する障害および／または炎症を処置するために用いられる化合物を含んでもよい。一般に、官能化ＰＴＸ−２プロトマー、ならびにこれを含む五量体は、患者内での望まれない免疫応答の見込みを低減させるために、抗ＴＮＦαＰＴＸ−２プロトマーの自然なグリコシル化を好適に媒介する哺乳類細胞株で発現することが好ましい。ヒトおよびＣＨＯ細胞株を用いることができ、他の共通する哺乳類発現系が有用であることは期待されることである。
【００７１】
この開示の実施形態は、官能化ＰＴＸ−２プロトマーの製造方法をも含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗体断片ＤＮＡ配列を、ＰＴＸ−２プロトマーＤＮＡ配列に導入して、発現時に官能化ＰＴＸ−２プロトマーを製造する組換えＤＮＡ配列を創り出すことができる。標準的な分子生物学上の技術が、発現ベクターが適切な発現系に導入されたときに官能化ＰＴＸ−２プロトマーの発現を導く、オープニングリーディングフレームに適切なＤＮＡ配列を有する発現ベクターまたはプラスミドを創り出すために用いることができる。上記で指摘したように、抗体または抗体断片の配列は、ＰＴＸ−２プロトマーのＮ末端またはＣ末端に融合させて、この配列を適切な方向に入るように配置してもよい。いくつかの実施形態では、例えば上記のようなリンカーのためのＤＮＡ配列は、Ｎ末端またはＣ末端と、抗体または抗体断片配列との間に配置することができる。ある実施形態では、同じまたは異なった抗体または抗体断片のための二つ以上の配列は、Ｎ末端またはＣ末端のＤＮＡ配列で連続的に導入してもよく、リンカーのための配列は各抗体または抗体断片配列の間に配置することができる。さらに他の実施形態では、一つ以上の抗体または抗体断片配列を、Ｎ端末およびＣ末端のＤＮＡ配列の両方に導入することができる。
【００７２】
種々の実施形態の発現ベクターは、複製、選択などのために必要な多くの追加配列を含んでもよく、および多くの公知のこのような配列のいずれでも使用することができ、およびいかなるタイプのプロモータを官能化ＰＴＸ−２プロトマーの発現を促進するために用いることができる。例えば、いくつかの実施形態では、構成的プロモータが官能化ＰＴＸ−２プロトマーの発現を制御してもよく、他の実施形態では、発現ベクターがさらに官能化ＰＴＸ−２プロトマーの発現を制御するように配置した誘導プロモータを含んでもよい。
【００７３】
発現系は、実施形態により多様であってもよく、およびバクテリア培養物または種々の細胞培養物を含んでもよく、および特定の実施形態では、適切な開始グリカン構造（starting glycan structure）がＰＴＸ−２プロトマーのＡｓｎ３２に追加させるように、組換えＰＴＸ−２プロトマーを、哺乳類または昆虫細胞培養系で発現させることができる。これらの官能化および非官能化ＰＴＸ−２プロトマーの共発現の結果、異なる活性剤または異なった数の活性剤をそれぞれに提示するＰＴＸ−２五量体が生じさせるように、官能化ＰＴＸ−２プロトマーおよび自然発生的な、または野生型のＰＴＸ−２プロトマーの発現のためのプラスミドはいくらでも発現系に導入することができる。いくつかの実施形態では、官能化および非官能化ＰＴＸ−２プロトマーの発現を制御して、各官能化ＰＴＸ−２プロトマーおよび／または野生型のＰＴＸ−２プロトマーの割合を制御することができる。発現を制御することは、いかなる手段を以てして実行してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、各プロトマーの得られるＰＴＸ−２五量体における割合は、官能化ＰＴＸ−２プロトマーおよび非官能化ＰＴＸ−２プロトマーが発現されるプラスミドの複製数により制御することができ、またこの実施形態では、発現は構成的プロモータにより制御することができる。他の実施形態では、発現は誘導プロモータにより制御することができる。
【００７４】
発現に続いて、ＰＴＸ−２プロトマーおよび／または五量化ＰＴＸ−２は、公知の技術、例えば遠心分離、超遠心分離、塩析、透析、ろ過、カラムクロマトグラフィなどおよびこれらの組合せの技術を用いて、単離および精製される。特定の実施形態では、組換えの官能化または非官能化ＰＴＸ−２プロトマーは、さらにタグ、例えばヒスチジンテイル（histidine tail）を含み、精製に際して助けとなる。
【００７５】
一つよりも多い数の型の官能化ＰＴＸ−２プロトマーを用いてＰＴＸ−２五量体を創り出す、ある実施形態では、官能化ＰＴＸ−２プロトマーおよび／または非官能化ＰＴＸ−２プロトマーのための、一つ以上の発現ベクターが、適切な発現系に導入され、プロトマーの望まれる組合せが同時に発現、すなわち共発現される。そして、適切な精製技術が用いられ、例えば組換え的に導入された精製タグの包含を通じて、および／または当該部分のそれぞれの排他的な特性を利用したクロマトグラフィ分離の逐次使用を通じて、これらからの部分の望ましい組合せを有する、これらのＰＴＸ−２五量体を分離することができる。他の実施形態では、ＰＴＸ−２プロトマーの相互作用領域での特定のアミノ酸などの設計上の特徴を特定のプロトマーに導入して、らしくない部分（non-like moieties）を生じさせるＰＴＸ−２プロトマーの会合が、アセンブリの間促進される。
【００７６】
いくつかの実施形態では、官能化ＰＴＸ−２五量体が、一般に、ＰＴＸ−２五量体は十分なＰＴＸ−２プロトマーおよび／または官能化ＰＴＸ−２プロトマーの存在下で形成されるため、調製後直接に単離および／または精製され、そしてこの実施形態では、これらの単離および／または精製された官能化ＰＴＸ−２五量体を、例えば製薬学上の組成物に直接取り込むことができる。他の実施形態では、官能化ＰＴＸ−２プロトマーの製造方法が、官能化ＰＴＸ−２五量体を単離および／または精製し、そして官能化ＰＴＸ−２五量体を官能化ＰＴＸ−２プロトマーへ解離させることを含む。そして、分離された官能化ＰＴＸ−２プロトマーは、他の官能化または非官能化ＰＴＸ−２プロトマーと組み合わさり、ＰＴＸ−２プロトマーの組合せからＰＴＸ−２五量体を再形成することができる。この実施形態の一例の概略図を図４に示す。そこに示されるように、最大で五つの異なったＰＴＸ−２プロトマーが組み合わさって、最大で五つの異なった活性剤がつながったＰＴＸ−２五量体が生じる。他の実施形態では、組み合わせたＰＴＸ−２プロトマーが、１〜５までの官能化ＰＴＸ−２プロトマーを含み、五種未満の異なった活性剤を有するＰＴＸ−２五量体が生じる。更なる他の実施形態では、非官能化ＰＴＸ−２プロトマーを、１〜５の活性剤がつながったＰＴＸ−２プロトマーと組み合わせて、ＰＴＸ−２五量体と関連する活性剤の数を下げてもよい。
【００７７】
ある側面では、この開示は、官能化抗ＴＮＦαＰＴＸ−２プロトマー、断片、およびその機能的変異体をエンコードする核酸を提供する。対象となる核酸は、一本鎖、二本鎖のいずれでもよい。この核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれでもよい。ある実施形態では、この開示は、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する、抗ＴＮＦαＰＴＸ−２プロトマーをエンコードする、単離した、または組換えの核酸配列を提供する。当業者は、配列番号２と相補的な核酸配列が、この開示の範囲内であることも理解するであろう。ここで開示された抗ＴＮＦαＰＴＸ−２プロトマー核酸は、発現のために操作可能にプロモータに連結してもよく、この開示はこの組換えポリヌクレオチドを用いた形質転換された細胞を提供する。好ましくは、この細胞はＣＨＯ細胞である。
【００７８】
ＰＴＸ−２融合タンパク質は、治療上、予防上または診断上の用途を有する、例えば：
【００７９】
アビディティ：
アビディティは、多結合のアフィニティの強さの組合せを表し、増強したアビディティは、送達した剤の潜在性を、改良した結合特性を通じて特異性を増強させることにより改良し、これにより送達剤に関する治療指数を増大させることができる。治療上または予防上用途の多くの活性剤が、それが結合する分子に対する比較的低いアビディティ（低い有効性、非特異的効果、および低いおよび到底不十分な治療指数の結果となる）のため、有効性において限界がある。理論に束縛されることを望むわけではないが、送達剤に関する増大したアビディティは、多重化、例えば五量化ＰＴＸ−２である骨格上に分子を提示することにより達成することができ、これにより多数の結合アフィニティの強度の増大を通じて剤の局所的な濃度が増大する。この利点が、より大きな全身的効果を避け、局所的効果を活発にするために用いることができ、およびこれがより高い特異性およびできる限り低い全身性毒作用を生じさせる。したがって、いくつかの実施形態では、ＰＴＸ−２融合タンパク質は、治療上または予防上の抗体または抗体断片のアビディティを増大させるのに用いることができる。
【００８０】
例えば、いくつかの実施形態では、レセプタのシグナルの低減させることは、例えば疾患状態に関連する同族リガンド（cognate ligand）の過剰生産がある場合に、望ましい。官能化ＰＴＸ−２は、この同族リガンドの作用をブロックしてその疾患を処置するために用いることができる。例えば、リウマチ性関節炎は、炎症性サイトカイン、例えばＴＮＦαの過剰生産により引き起こされ、組織損傷につながり得る。特定の実施形態では、官能化ＰＴＸ−２は、官能化ＰＴＸ−２上の抗体または抗体断片を提供することにより、同族リガンドと直接結合し、レセプタへの結合を阻害する。この実施形態では、官能化ＰＴＸ−２は、リガンドと直接結合し、リガンドの循環濃度を低減させ、そして炎症を低減させる。
【００８１】
標的化（targeting）：
ＰＴＸ−２融合タンパク質は、治療上または予防上の適用のために、特定の他の分子または特定の細胞またはインビボ部位を特異的に標的とするために操作することもできる。例えば：
【００８２】
ＰＴＸ−２直接標的化：ＰＴＸ−２は、感染、傷、修復および線維症の各部位で濃縮する様々なリガンド、ならびに補体経路のＣｌｑコンポーネント、および様々な免疫細胞例えば単球の表面で発現するＦｃγＲと結合する。したがって、いくつかの実施形態では、ＰＴＸ−２は、感染、傷、修復および線維症の各部位、および種々の免疫細胞の表面へ抗体または抗体断片を向かわせる手段を提供し、ある実施形態では、ＰＴＸ−２は、抗体または抗体断片を、エンドサイトーシスまたは食作用によるＦｃγＲ内在化を通じて、これら細胞に入ることを可能にする。ＰＴＸ−２は、アポトーシスの細胞残屑にも結合し、および、間接的に、線維症の特質である過剰な細胞外基質に対する応答がある筋線維芽細胞の活性化を低減することができる。
【００８３】
他の部分を通じた標的化：いくつかの実施形態では、一つ以上の抗体または抗体断片が、ＰＴＸ−２骨格の部分として含まれ、および結果生じるＰＴＸ−２融合タンパク質の特定細胞または組織タイプへのターゲットになるよう利用されてもよい。例えば、抗体または抗体断片が、特定のレセプタ、細胞表面分子に結合し、またはもう一つの部位、例えば補体結合部位または細胞外基質部位などに結合し、およびＰＴＸ−２融合タンパク質をその特定の細胞型または組織へ異動させてもよい。特定の実施形態では、抗体または抗体断片がつなげられたＰＴＸ−２融合タンパク質は、エンドサイトーシスを誘導することができるＡＰＣ表面レセプタに標的とする。ＡＰＣとのコンタクトの際に、五量化ＰＴＸ−２融合タンパク質は内在化を可能にする。他の実施形態では、五量化ＰＴＸ−２融合タンパク質は、ＣＤ４０またはＤＣ成熟をトリガーにすることに関与する他の細胞表面マーカーと結合することができる抗体または抗体断片を含むことができる。この実施形態では、ＣＤ４０またはＤＣ成熟をトリガーにすることに関与する他の細胞表面マーカーへ結合することは、有効な抗腫瘍免疫が増強される結果になり得るＤＣ成熟につながる。
【００８４】
異なる細胞型を近接近に提示するためのターゲット化：さらに他の実施形態では、ＰＴＸ−２融合タンパク質は、同じまたは異なる型の細胞を一緒に提示するよう作用することができる抗体または抗体断片を含み、この提示が細胞または経路の、活性化または不活性化に影響を及ぼしし、いくつかの実施形態ではコンタクトした細胞を死に至らせることができる。この実施形態では、複合の抗体または抗体断片を、ＰＴＸ−２融合タンパク質に与えてもよく、および各個々の細胞標的化部分は細胞内シグナル伝達に影響を及ぼしてもよい。例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、好中球、単球、マクロファージなどは、細胞表面リガンドおよび細胞表面レセプタとの物理的コンタクト、および溶解性リガンドの細胞表面レセプタとの相互作用の両方を通じて、互いに相互作用することが知られている。ＰＴＸ−２融合タンパク質を用いてこれら細胞型を結合させることができる抗体または抗体断片の提示により、上記で挙げた細胞と潜在的にそれら関与する他の細胞型との間の相互作用が、互いの細胞の近接を改良することにより増強される。
【００８５】
活性の中性化：
いくつかの実施形態では、官能化ＰＴＸ−２融合タンパク質は、インビボでの循環する望まない分子と結合して、その活性を中性化することができる。この実施形態では、望まない分子としては、これに限定されないが、外因性の要因、例えばバクテリア毒素またはウイルス、または疾患を通じて望まないレベルで提示する外因性の分子、例えば炎症性サイトカインなどが挙げられる。理論に束縛されることを望むわけではないが、ＰＴＸ−２骨格上の多価の抗体または抗体断片は、アビディティを改良することができ、よりタイトな結合およびより迅速なそして前記望まない分子の有効な隔離または中性化につながる。
【００８６】
外因性の分子の中性化：特定の生体分子、例えばホルモン、サイトカイン、成長因子などの上昇したレベルは、疾患に寄与する。例えば、ＨＶ−ＥＧＦレベルは、種々のがんにおいて上昇し、ＴＮＦレベルは、免疫関連疾患において上昇するであろう。このような生体分子のレベルの中性化または低減は、治療的価値になり得ることであり、いくつかの治療剤が、現在において、循環サイトカインを隔離して、炎症を低減させるように作用するものとして利用可能となっており、例えばエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、抗体のＦｃ部分に融合した溶解性組換ＴＮＦレセプタ、およびインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、リウマチ性関節炎または他の疾患における炎症性サイトカインＴＮＦのレベルを低減させる抗ＴＮＦ抗体などである。
【００８７】
ＰＴＸ−２骨格から創り出された五量化ＰＴＸ−２融合タンパク質は、このような治療剤においての外因性の分子の中性化に関して利点がある。例えば、いくつかの実施形態では、例えばｓｃＦｖまたはＴＮＦレセプタに結合できる他の抗体誘導体を提示する、官能化ＰＴＸ−２プロトマーから製造されたＰＴＸ−２五量体は、ＴＮＦレセプタが三量体であり、各レセプタ結合部位が一つの五量化ＰＴＸ−２融合タンパク質が結合するが、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）やＲｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）は二分子を要求するため、アビディティを改良し、および二価のＦｃ融合タンパク質に関する有効性を増大させてきたであろう。更なる実施形態では、ＰＴＸ−２プロトマーは、つながったｓｃＦｖまたは他の抗体誘導部分を含み、抗ＴＮＦαＰＴＸ−２融合タンパク質を生産し、これら誘導タンパク質を炎症の処置に用いることもできる。理論に束縛されることを望むわけではないが、これらタイプの融合タンパク質の両方は、三量化の溶解性ＴＮＦαを、二価のＥｎｂｒｅｌ（登録商標）より有効に中性化することができ、膜結合の三量化ＴＮＦαを介しての抗炎症の「逆」シグナル伝達において、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）より有効であろう。
【００８８】
したがって、この開示の官能化ＰＴＸ−２プロトマー（例えば抗ＴＮＦαＰＴＸ−２プロトマー）ならびにその五量体は、患者の炎症および／または炎症関連疾患の治療または予防に用いることができる。特定の側面では、この開示は、患者のＴＮＦα関連障害、例えば乾癬、クローン病、自己免疫疾患（disease）例えば強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、リウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、紅斑性狼瘡およびサルコイドーシスの処置方法を提供する。特定の側面では、この開示の官能化ＰＴＸ−２プロトマー（例えば抗ＴＮＦαＰＴＸ−２プロトマー）は、インビトロおよびインビボ（すなわちそれを必要とする患者にて）のＩＬ−８の生産を阻害または低減するために用いることができる。
【００８９】
感染の外因性の要因の中性化：ウイルス性疾患の防御および処置において、ヒトの抗体ベースの分子の中性化は、ワクチンが開発困難であり、または内在する安全性に対する懸念、例えば乳児または免疫不全状態の個人にもたらすことがある場合に、有用である。最近、ファージ提示法のライブラリからの抗体断片配列の選択が、インビトロおよびインビボで有効性を示す抗体ベースの中性化剤の開発につながっている。例えば、ヒト組換え抗体断片は、メタ肺炎ウイルスおよびＲＳＶをインビボで有効に中性化することが示され、型共通の単純ヘルペスウイルスへのヒト組換え抗体が、インビボの単純ヘルペスウイルスに対して保護を提供することが示された。いくつかの実施形態では、組換え抗体断片、例えばｓｃＦｖまたはＦａｂ部分および抗体様結合活性を有する他のタンパク質、例えばラクダ科のＶＨＨタンパク質およびアドネクシンをつなげて有し、ＰＴＸ−２プロトマーを提示するＰＴＸ−２の五量化融合タンパク質は、より遅いオフレート（off-rate）を生じさせる高い価数に基づいて、より高いアビディティを有する。したがって、このＰＴＸ−２融合タンパク質は、ウイルスタンパク質への結合を、少なくとも結合部位の一つが結合状態で残るまでは維持し、および種々のウイルスを中性化することによい有効である。
【００９０】
五量化ＰＴＸ−２融合タンパク質は、ウイルス分子の架橋をも誘導し凝集させて、感染ユニットの数を減らすことができる。したがって、多重の抗体誘導断片を提示する五量化ＰＴＸ−２融合タンパク質は、ウイルス分子を架橋を通じて凝集させること、およびこの粒子をウイルスタンパク質への高いアビディティ結合を通じて中性化することの両方を可能にする。さらに、プロトマー抗体配列間の距離は、少なくとも二つのウイルスタンパク質への結合のための距離的な必要条件を満たすに際して、より大きなフレキシビリティを提供する。なぜならば、この抗体配列は、隣り合うプロトマーのおおよその距離から全ＰＴＸ−２分子のスパンまたはそれ以上を横切る程度のどこかに存在する。
【００９１】
ＰＴＸ−２応答性障害
いくつかの実施形態では、この開示の官能化ＰＴＸ−２プロトマーを含むＰＴＸ−２プロトマーならびにその五量体は、一つ以上の天然ＰＴＸ−２活性、例えば単球から線維化関連細胞への分化を阻害する能力などを保持する。したがって、この開示は、治療上有効な量のＰＴＸ−２プロトマー、例えばこの開示の官能化ＰＴＸ−２プロトマーをそれを必要とする患者に投与することにより、患者のＰＴＸ−２応答性障害を処置する方法を提供する。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ＰＴＸ−２応答性障害性は線維症である。ＰＴＸ−２の繊維状のための治療上の処置としての使用は、米国特許２００７／０２４３１６３に開示され、この文献はここで言及することにより組み込まれる。対象となる方法での処置の影響を受けやすい線維症および線維症関連障害としては、これらに限定されないが、結合組織疾患、間質性肺疾患、ヒト線維性の肺疾患（例えば、閉塞性細気管支炎、特発性肺線維症、既知の病因からの肺線維症、肺疾患中の腫瘍間質、肺に影響を及ぼす全身性硬化症、ハーマンスキー・パドラック症候群、炭坑夫塵肺症、石綿肺症、珪肺症、慢性肺高血圧症、ＡＩＤＳ関連肺高血圧症、サルコイドーシス、中等度から重度の喘息など）、線維性血管病、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、食道静脈瘤、冠状梗塞症、脳梗塞症、心筋線維症、筋骨格線維症、外科手術後の癒着、ヒト腎臓疾患（例えば、腎炎症候群、アルポート症候群、ＨＩＶ関連腎症、多発性嚢胞腎、ファブリ病、糖尿病性腎症、慢性糸球体腎炎、全身性ループスを伴う腎炎など）、全身性進行性硬化症（ＰＳＳ）、原発性スカロッピング胆管炎（scalloping cholangitis）、肝線維症、肝硬変、腎線維症、肺線維症、嚢胞性線維症、慢性移植片対宿主病、強皮症（局所的および全身的）、グレーブス眼症、糖尿病性網膜症、緑内障、ペイロニー病、ペニス線維症、膀胱鏡の後の尿道狭窄、外科手術後の内部降着、瘢痕、骨髄線維症、特発性腹膜後線維化症、既知の病因からの腹膜線維症、薬物性エルゴチン中毒、良性または悪性ガンへの線維症インシデント（fibrosis incident）、微生物感染症への線維症インシデント（例えば、ウイルス、バクテリア、寄生虫、菌類など）、アルツハイマー病、炎症性腸疾患への線維症インシデント（クローン病、顕微鏡的大腸炎における狭窄形成を含む）、間質細胞腫瘍、粘膜炎、化学製品または環境傷害によって誘発される線維症（例えば、がん化学療法、農薬、放射線（例えば、がん放射線療法））が挙げられる。いくつかの実施形態では、線維症関連障害は、全身的または局所的な、強皮症、ケロイド、肥厚性瘢痕、アテローム性動脈硬化症、動脈の再狭窄、肺炎症および線維症、特発性肺線維症、肝硬変、慢性Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎感染症の結果としての線維症、腎疾患、瘢痕組織から生じている心臓疾患、黄斑変性症、および網膜および硝子体の網膜症から選択される。いくつかの実施形態では、繊維状関連障害は、化学治療薬物、放射線誘発線維症、および傷および熱傷から生じる。いくつかの実施形態では、線維症関連障害または病気は、線維柱帯切除術または他の目の外科手術の後の外科手術後瘢痕などから生じる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ＰＴＸ−２応答性障害は、過敏性障害、例えばＴｈ１またはＴｈ２応答により媒介されるものなどである。ＰＴＸ−２での処置により影響を受けやすい過敏性関連障害としては、これに限定されないが、アレルギー性鼻炎、アレルギー性副鼻腔炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性気管支収縮、アレルギー性呼吸困難、アレルギー性の肺の粘液酸性の増大、アトピー性湿疹、皮膚炎、じんましん、アナフィラキシー、肺炎、およびアレルギー性喘息などが挙げられる。いくつかの実施形態では、この開示のＰＴＸ−２プロトマーは、種々の抗原が効かないアレルギー特異的な免疫応答、例えばアナフィラキシーの処置をするために用いられる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ＰＴＸ−２応答性障害は、自己免疫疾患、例えばＴｈ１またはＴｈ２応答をにより媒介されるものなどである。この開示のＰＴＸ−２プロトマーでの処置により影響を受けやすい自己免疫関連障害としては、これに限定されないが、１型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、自己免疫性心筋炎、天疱瘡、重症筋無力症、橋本甲状腺炎、グレーブス病、アジソン病、自己免疫性肝炎、慢性ライム関節炎、家族性拡張型心筋症、若年性皮膚筋炎、多発性軟骨炎、シェーグレン症候群、乾癬、若年性特発性関節炎、炎症性腸疾患、全身性紅斑性狼瘡、慢性閉塞性肺疾患および移植片対宿主病疾患が挙げられる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ＰＴＸ−２応答性障害は、粘膜炎である。
ある側面では、この開示の官能化ＰＴＸ−２を含むＰＴＸ−２融合タンパク質は、患者の多発的、または無関係な障害を処置するために用いることができる。いくつかの実施形態では、この開示の官能化ＰＴＸ−２を含むＰＴＸ−２融合タンパク質およびその五量体は、患者のＰＴＸ−２応答性障害（例えば、繊維状または線維症関連障害）および炎症性および／または炎症性関連障害（例えば、乾癬、クローン病、自己免疫疾患、強直性脊椎炎、乾癬性間接炎、リウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、紅斑性狼瘡、サルコイドーシスなど）を処置または予防するために用いることができる。
【００９６】
潜在的な防御および治療上の半減期の増大：
いくつかの実施形態では、例えば抗体または抗体断片をつなげて有する官能化ＰＴＸ−２プロトマーを含むＰＴＸ−２融合タンパク質は、活性剤の半減期を増大させるのに有用である。ヒトＰＴＸ−２は、血清中で極めて安定であり、かつ、特にＣａ2+の存在下でのタンパク質分解に対して耐性である。したがって、安定性のより低い分子をＰＴＸ−２骨格につなげることは、その低い安定性の分子の半減期を改良することができる。例えば、いくつかの実施形態では、抗体または抗体断片の有効半減期は、この抗体または抗体断片をＰＴＸ−２プロトマーにつなげることにより最高で５０％以上、増大させることができる。
【００９７】
他の実施形態では、ＰＴＸ−２骨格の安定性は、ＰＴＸ−２の安定性を増強するように作用する抗体または抗体断片を有する官能化ＰＴＸ−２プロトマーを提供することにより増大し、これにより循環においてＰＴＸ−２骨格の半減期をさらに増大させることができる。例えば、ＦｃＲｎ（種々の免疫細胞で発現するレセプタ）は、循環するＩｇＧに結合し、エンドサイトーシスを誘導することにより、ＩｇＧ（複数）の半減期を増大させることが示されている。したがって、エンドソーム中のＩｇＧは分解から保護される。免疫細胞が活性化されるときに、エンドサイトーシスを受けたＩｇＧ（複数）は、エクソサイトーシスを介して細胞外へ移動し、および循環へもう一度放出され得る。ＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３領域中のいくつかの特定のアミノ酸残基がＦｃＲｎへの結合には必須であり、ＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３領域間のヒンジ領域中のアミノ酸はＦｃγＲ結合に関与するそれらとは異なる。ＩｇＧへのＦｃγＲ（複数）への結合のキーとなる残基および構造上の特徴も公知である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２およびＣＨ３抗体領域のキーとなる構成要素を保持したキメラＰＴＸ−２骨格は、ＦｃγＲ結合のための必須アミノ酸は除去しつつＦｃＲｎには結合するものであるが、このキメラＰＴＸ−２骨格は調製可能であり、およびＩｇＧＦｃ領域（ＣＨ２−ＣＨ３）がＦｃγＲに結合するＰＴＸ−２と干渉する可能性を除去しつつ、ＰＴＸ−２の投与方式および有効性を改良することができる。
【００９８】
診断：
ここで用いられるように、「診断剤」は、疾患の指標である内因性分子または外因性分子の存在および濃度を検出するためのインビトロアッセイに用いられる分子に言及する。この診断剤は、例えば回復の指標となる特定のバイオマーカーまたは伝統的なワクチンの場合における抗体の存在および濃度をアッセイすることにより、治療剤または防御剤の有効性を検出するためにも使用することができる。現在、多くの診断剤は、抗体試薬または抗体の検出物を含む。抗体または抗体断片をつなげて有する官能化ＰＴＸ−２プロトマーから調製されたＰＴＸ−２融合タンパク質の多価性は、一価の抗原／二価の抗体相互作用と比べると、結合の相手との改良した相互作用をもたらすことができる。いくつかの場合では、感受性および特異性の増大は、他の手段では低すぎて検出できないレベルの濃度でサンプル中に存在する分子のための診断アッセイの開発を可能にする官能化ＰＴＸ−２診断剤により提供され得る。したがって、いくつかの実施形態は、インビトロ診断アッセイにおいて診断剤として用いることができる抗体誘導タンパク質または抗原ベースのタンパク質を提示する官能化ＰＴＸ−２プロトマーおよびＰＴＸ−２融合タンパク質を対象にする。例えば、いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖを提示するＰＴＸ−２融合タンパク質は、特定の、ウイルスに対する抗体の形成を検出するためのウイルスコートタンパク質配列、またはタンパク質またはバイオマーカーの検出および定量するために製造してもよい。
【００９９】
他の実施形態では、ＰＴＸ−２骨格ベースの診断剤、例えばここで記載されたものは、さらに、このような診断剤を組織または細胞をインビボでイメージングするために用いることを可能にするマーカーやプローブを含んでもよい。理論に束縛されることを望むわけではないが、多量化ＰＴＸ−２骨格ベースの診断剤を提供することは、類似の抗体ベースの診断剤と比べて、より強力な感受性およびより高いレゾリューションを提供することができる。特定の実施形態では、ＰＴＸ−２骨格ベースの診断剤は、疾患部位のターゲット化が特に重要である場合において、インビボイメージングのために用いることができる。特定の実施形態では、ＰＴＸ−２骨格ベースの診断剤は、ＰＴＸ−２が本来のアフィニティを有する部位、例えば創傷、修復、線維症などが生じている領域のターゲット化に利用することができる。この実施形態では、ターゲット部分を含む必要がなくなる。
【０１００】
診断剤として用いられるＰＴＸ−２骨格は、当技術にて公知のマーカーやプローブ、例えば、これに限定されないが、蛍光プローブ、ナノ粒子、ラジオヌクレオチド（radionucleotides）などを含んでもよい。このＰＴＸ−２骨格タンパク質の多価性により、多重ターゲット部分の取り込みならびに検出部分例えば近赤外フルオロフォアを与えることが期待される。特定の実施形態では、ＰＴＸ−２骨格は、近赤外線ベースの蛍光プローブを含むことができる。近赤外線ベースの蛍光プローブは、より大きな検出深度（depth of detection）および増大した感受性を可能にする、生体組織による光子減衰を低減する長波長発光、ならびに改良した安全性およびコスト効果の利点を提供する。蛍光イメージングのもう一つの利点は、蛍光プローブがつながれたタンパク質またはペプチドを、いくつかの他のイメージング方法のように、単なる解剖学上または形態学上のイメージというよりむしろ分子イメージを提供するように設計、対象とすることができることである。例えば、近赤外染料分子でラベルされたトラスツズマブ（Herceptin（登録商標））は、乳がんにおけるＥＧＦＲ２過剰発現のレベルを検出するために用いられてきた。他の実施形態では、ＰＴＸ−２骨格は、特定の生化学上のイベント、例えば酵素活性に感受性のある、一つ以上の光活性染料または蛍光スイッチ染料を含む。タンパク質の分布および特定の位置を直接検出するためのイメージングに加えて、実施例で記載されたものと同様の用途が、この種のＰＴＸ−２骨格タンパク質である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ＰＴＸ−２の特定の構造上の特徴、例えばＦｃγＲ結合またはＣａ2+依存性リガンド結合を、診断剤の調製に用いられるＰＴＸ−２プロトマーから除去して、診断アッセイの結果を傷つけることがある、意図された標的の外側の要素への結合および／または非特異的相互作用を除去することができる。この実施形態では、突然変異生成が、ＰＴＸ−２の構造上の特徴または部分と関連する相互作用に必須のアミノ酸を変更するために用いることができ、このような機能が除去されることを行う。他の実施形態では、ＰＴＸ−２骨格は、ＰＴＸ−２が、本来のアフィニティを有する対象の組織または細胞、例えば繊維症および／または傷の部位などに対するマーカーまたはプローブを送達するために用いることができる。さらに他の実施形態では、ＰＴＸ−２骨格は、以下のような他の公知の結合の相手、例えばアトポーシス細胞または細胞残屑の表面に曝されるホスファチジルエタノールアミンをターゲット化するために用いることができる。したがって、いくつかの実施形態では、ＰＴＸ−２骨格の診断剤が、他の疾患または処置、例えばがんまたはアテローム性動脈硬化症におけるアポトーシスの監視に有用である。
【０１０２】
さらに他の実施形態では、ＰＴＸ−２骨格タンパク質は、他のイメージング技術とともに使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＴＸ−２骨格は、ＰＴＸ−２骨格を常磁性のイメージング剤とＰＴＸ−２骨格とを組み合わせることにより、ＭＲＩのための診断剤を開発するために用いることができる。このような常磁性イメージング剤は、当技術で公知のものである。疾患や疾患になった組織に関与する細胞を標的とする同様なＰＴＸ−２骨格は、この技術を用いて調製することができ、および形態学上および生化学上の情報を提供することができる有用な診断イメージング剤を提供することができ、またＭＲＩイメージング剤および特定の標的部分を提示するＰＴＸ−２骨格は、疾患または回復のレセプタまたは他の生化学上のマーカーを標的化および監視するために用いることができる。更なる他の実施形態では、創傷および修復または特定の細胞型の特定の部位へのＰＴＸ−２の内在的標的化は、このような診断イメージング剤を標的化するためにも用いることができる。
【０１０３】
実施形態は、製薬学上の組成物であって、少なくとも一つ以上の官能化ＰＴＸ−２五量体、例えば上記で記載したものおよび一つ以上の製薬学上許容されるキャリアまたは賦形剤を含有する組成物も対象にする。この実施形態は、製薬学上の組成物において、官能化ＰＴＸ−２五量体のタイプによる制限はない。したがって、いくつかの実施形態では、製薬学上の組成物は、疾患の処置または予防に有用な抗体または抗体断片をつなげて有するＰＴＸ−２骨格を含む診断上または防御上の組成物であってもよい。他の実施形態では、製薬学上の組成物のＰＴＸ−２骨格が、抗体または抗体断片、プローブまたはマーカーを有してもよく、診断的な製薬学上の剤として用いてもよい。製薬学上の処方および製薬学上の組成物は、当技術においてよく知られており、例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA」において見つけることができ、当該文献は全てにおいてここで言及することにより組み込まれる。そこで記載され、あるいはさもなければ当技術において公知のいかなる処方も、この開示の実施形態に包含される。
【０１０４】
製薬学上の賦形剤は、当技術においてよく知られており、また、これに限定されないが、糖類、例えばラクトースまたはスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール、セルロース調製物、カルシウムホスフェート例えばリン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウム、ならびにバインダー、例えばスターチペースト、例えばトウモロコシでんぷん、小麦のでんぷん、米でんぷん、ジャガイモでんぷん、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルポリピロリドンまたはこれらの組合せが挙げられる。
【０１０５】
特定の実施形態では、製薬学上の処方は、上記で記載され、具現化された官能化ＰＴＸ−２五量体のいずれも、製薬学上許容されるキャリアまたは賦形剤、および製薬学技術にて公知の補助成分、例えばバインダー、フィラー、崩壊剤、甘味料、湿潤剤、着色剤、徐放剤などを含んでもよく、および特定の実施形態では、製薬学上の組成物は、一つ以上の第二の活性剤を含んでもよい。崩壊剤としては、例えば上記のスターチ、カルボキシメチルスターチ、架橋性ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウム、およびそれらの組合せが挙げられる。補助剤としては、例えばフロー調節剤（flow-regulating agents）および潤滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸またはその塩、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム、ポリエチレングリコール、およびこれらの組合せが挙げられる。特定の実施形態では、ドラジェ核（dragee cores）を、胃液に耐性の好適なコーティング剤、例えば濃縮された糖類溶液とともに調製することができ、これらは例えばアラビアゴム、タルク、ポリビニルポリピロリドン、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物およびこれらの組合せを含んでもよい。胃液耐性のコーティング剤を製造するために、好適なセルロース調製物、例えばアセチルセルロースフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートも用いることができる。さらに他の実施形態では、同定または活性化合物容量の組合せ（combinations of active compound doses）を特徴づけるために、染料（pigment stuff）および顔料を、タブレットまたはドラジェコーティング剤に添加してもよい。種々の実施形態では、キャリアまたは賦形剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ではない。特定の実施形態では、処方に用いられるキャリアまたは賦形剤は、２．５％よりも大きい、例えば５％よりも大きい、さらには７．５％よりも大きい、または１０％よりも大きい濃度のエタノールであってもよく、また、いくつかの実施形態では、処方に用いられるキャリアまたは賦形剤は、２．５％よりも小さい濃度のエタノールであってもよい。
【０１０６】
更なる他の実施形態では、上記で具現化された官能化ＰＴＸ−２五量体は、局所投与用、例えばローションとして処方してもよい。この実施形態では、局所的処方は、水またはアルコールベースで調製された水中油（oil in water）のエマルションであってもよく、いくつかの実施形態では、この局所的処方中の水またはアルコール濃度が、対象の肌に適用後、当該処方の構成要素の乾燥を容易にするのに十分な高さであるとよい。このような局所的処方は、局所的処方の調製に有用である当技術で公知のいかなる成分を含んでもよく、例えばこれに限定されないが、可溶化剤、界面活性剤、補助界面活性剤、およびこれらの組合せである。特定の実施形態では、このような局所的処方は、可溶化剤、例えばカプリオール（Capryol）（登録商標）９０、カプリオール（Capryol）（登録商標）Ｐｇｍｃ、ラブラフィル（Labrafil）（登録商標）Ｍ１９４４ＣＳ、ラブラフィル（Labrafil）（登録商標）Ｍ２１２５ＣＳ、ラブラソル（Labrasol）（登録商標）、ラブラファック（Labrafac）（登録商標）、リポフィル（Lipophile）（登録商標）Ｗｌ１３４９、ラブラファック（Labrafac）（登録商標）ＰＧ、ラウログリコール（Lauroglycol）（登録商標）９０、ラウログリコール（Lauroglycol）（登録商標）ＦＣＣ、プルロール（Plural）（登録商標）、オレイク（Oleique）ＣＣ４９７、トランスクトール（Transcutol）（登録商標）Ｐなど、およびこれらの組合せ；界面活性剤、例えばラブラソル（Labrasol）（登録商標）、プルロール（Plural）（登録商標）ジイソステアリック（Diisostearique）など、およびこれらの組合せ；補助界面活性剤、例えばカプリオール（Capryol）（登録商標）９０、ラウログリコール（Lauroglycol）（登録商標）９０など、およびこれらの組合せを含んでもよい。この実施形態では、ここで挙げられた可溶化剤、界面活性剤、および補助界面活性剤のいずれもを、別々の局所的処方中にて用いてもよいし、一つの局所的処方中にて組合せてもよい。
【０１０７】
特定の実施形態では、局所的またはデポー処方を、溶液中でカルシウムを官能化ＰＴＸ−２プロトマーの調製物に提供することにより調製することができる。この実施形態では、官能化ＰＴＸ−２は、局所的処方の製造に使用することができるコロイド縣濁物を形成する。官能化ＰＴＸ−２調製物に添加されるカルシウムの量は、実施形態間で多様であってもよく、また、コロイドを形成するために必要なカルシウム量であってもよい。しかしながら、特定の実施形態では、カルシウム量は、ＰＴＸ−２調製物におけるＣａ2+結合部位とほぼ同じのモル数またはそれ以上である。ＰＴＸ−２調製物に対するカルシウムの効果は、コロイド縣濁物からカルシウムを、例えば縣濁物からカルシウムを除去することが可能なキレート化剤を提供することにより除去することにより逆にすることができる。理論に束縛されることを望むわけではないが、このコロイド効果は、局所的処方の調製、および局所的処方ならびにコロイド縣濁物の徐放、およびコロイド縣濁物の徐放、例えばデポー注射に有用である。
【０１０８】
溶液中で全ての利用可能なＰＴＸ−２からコロイド縣濁物を形成するために、全体で１０のカルシウム結合部位／ＰＴＸ−２の五量体があるため、カルシウム量は、ＰＴＸ−２溶液中のカルシウム結合部位数とおよそ同じモル数でなければならない。カルシウム添加後、ＰＴＸ−２−Ｃａ縣濁物は、遠心分離によりペレット中に回収された。図５に示したように、カルシウム濃度が、遠心分離後のＰＴＸ−２のカルシウム結合部位の濃度と大体同じかそれ以上である場合、ＰＴＸ−２の＜１％が、溶液中に維持される。カルシウム依存性縣濁物は、キレート剤（chelator）例えばＥＤＴＡまたはクエン酸塩（citrate）の過剰モルの添加により容易に逆にもなり、結果生じ、コロイド縣濁物から回収された溶解性ＰＴＸ−２溶液は、ＳＥＣデータベースの出発ＰＴＸ−２溶液に対する凝集物量において増加があるようには見えない。
【０１０９】
他の実施形態は、局所的処方の製造方法およびこの方法により調製された局所的処方を含む。例えば、いくつかの実施形態では、局所的処方は、上記で記載した化合物のいずれかを可溶化剤と組み合わせること、および当該可溶化剤を、溶液を提供するために可能な限り高い濃度で提供することにより調製することができる。いくつかの実施形態では、この方法は、さらに最も高い可溶化特性、例えば最も高いＭＳＡを有する可溶化剤を同定すること、およびさらなるステップにてこれら可溶化剤を使用することを含む。この方法は、さらに界面活性剤または乳化剤を溶液に取り込むことを含んでもよく、いくつかの実施形態では、この界面活性剤は低親水性・親油性バランス（ＨＬＢ）数を有する。また、いくつかの実施形態では、この可溶化溶液は、界面活性剤に非常にゆっくりと添加し、特定の実施形態では、可溶化剤の最終濃度は、最終溶液の約６０％から約８０％である。また、他の実施形態では、アルコールを局所的処方に取り込んでもよく、改良された乾燥時間が提供され、および化合物または組成物を保存する助けとなる。更なる他の実施形態では、この方法は、マイクロエマルションを製造するために補助安定剤の添加を含んでもよい。
【０１１０】
この開示の製薬学上の組成物は、どの動物にも投与でき、特に哺乳類であり、この哺乳類は、この開示の化合物を投与された結果として有益な効果を経験することができるものであって、例えばヒト、イヌ科、ネコ科、家畜、ウマ、ウシ、ヒツジなどが挙げられる。実施形態の製薬学上の組成物により供給された、この開示による少なくとも一つの化合物の投与量または量は多様であってよく、また例えば製薬学上の組成物の用途、および製薬学上の組成物の投与または送達モード、および処置される疾患の兆候、および受容者の年齢、伸長、体重、および現在の処置、およびもしあれば処置の頻度、および望まれる効果の特徴などに依存する。この開示の種々の実施形態は、一つ以上のこの開示の化合物を、疾患、例えばがんを処置または予防するのに十分な量にて含む製薬学上の組成物を含む。一つ以上の化合物の有効量は、多様であってよく、および例えば約０．００１ｍｇから約１０００ｍｇであり、また他の実施形態では、０．０１ｍｇから１００ｍｇであってもよい。
【０１１１】
この開示の製薬学上の組成物は、意図された目的を達成する手段のいずれもにより投与することができる。例えば、この開示により包含される投与ルートとしては、これに限定されないが、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、頬、結膜下、硝子体内または他のルート、直腸、非経口、全身的（intrasystemically）、膣内、局所的（粉末、軟膏、滴剤又は経皮パッチによる局所的のような）、吸入（ネブライザーまたはドライパウダー（dry powder））など、経口噴霧又は鼻内噴霧が挙げられ、上記で記載された組成物と組み合わせて計画される。
【０１１２】
非経口投与のための処方は、この開示の一つ以上の化合物を水溶形態、例えば注射により投与可能な生理学上許容される希釈剤中のシクロデキストリン包接錯体、水溶性塩、およびアルカリ溶液で含む。この実施形態の生理学上許容される希釈剤としては、例えば滅菌液、例えば水、食塩水、水溶性デキストロース、他の製薬学上許容される糖類溶液；アルコール類、例えばエタノール、イソプロパノールまたはヘキサデシルアルコール；グリコール類、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコール；グリセロールケタール類、例えば２，２−ジメチル−１，３−ジオキシラン−４−メタノール；エーテル類、例えばポリ（エチレングリコール）４００；製薬学上許容されるオイル類、例えば脂肪酸、脂肪酸エステルまたはグリセリド、またはアセチル化脂肪酸グリセリドなどを挙げることができる。いくつかの実施形態では、非経口投与のために安定な処方は、さらに一つ以上の製薬学上許容される界面活性剤、例えば石鹸または洗浄剤；懸濁化剤、例えばペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロース；乳化剤；製薬学上許容されるアジュバント、またはこれらの組合せを含んでもよい。この処方において有用である追加の製薬学上許容されるオイル類としては、石油、動物油、植物油または合成物起源油、例えばこれに限定されないが、ピーナッツ油、大豆油、ごま油、綿実油、オリーブ油、ひまわり油、ペトロラタム（petrolatum）および鉱油；脂肪酸、例えばオレイン酸、ステアリン酸およびイソステアリン酸；脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルのオイル類が挙げられる。追加の好適な洗浄剤としては、例えば脂肪酸アルカリ金属（fatty acid alkali metal）、アンモニウム、およびトリエタノールアミン塩；カチオン性洗浄剤、例えばジメチルジアルキルアンモニウムハライド、アルキルピリジニウムハライド、およびアルキルアミンアセテート；アニオン性洗浄剤、例えばアルキル、アリール、およびオレフィンスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテルおよびモノグリセリドサルフェート、およびスルホスクシネートが挙げられる。いくつかの実施形態では、ノニオン性洗浄剤、例えばこれに限定されないが、脂肪族アミンオキシド類（fatty amine oxides）、脂肪酸アルカノールアミン類、およびポリオキシエチレンポリプロピレン共重合体；または両性洗浄剤、例えばアルカリ−βアミノプロピオネートおよび２−アルキルイミダゾリン四級塩、およびこれらの組合せもこの開示の非経口処方にて有用である。
【０１１３】
緩衝剤、防腐剤、界面活性剤なども、非経口投与に好適な処方に添加することができる。例えば、好適な界面活性剤としては、ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えばソルビタンモノオレエート、およびポリプロピレンオキサイドをプロピレングリコールと縮合して形成されるエチレンオキサイドの疎水性塩を伴う高分子量アダクトなどを挙げることができる。
【０１１４】
非経口投与のための製薬学上の組成物は、約０．５から約２５重量％の一つ以上の官能化ＰＴＸ−２五量体および約０．０５から約５％の縣濁化剤を、等張性媒体中に含むことができる。種々の実施形態では、注射可能な溶液は、滅菌であるべきであり、およびシリンジに容易にロードできる程度に流動性を有するべきである。さらに、注射可能な製薬学上の組成物は、製造および貯蔵条件下で安定であり、バクテリアおよび菌類などの微生物の汚染作用（contaminating action）から保護される。
【０１１５】
局所的処方としては、皮膚または粘膜、例えば肺および眼の表面への投与が挙げられる。局所的処方のための組成物は、加圧型または非加圧型であるドライパウダーとして製造することができる。非加圧型のパウダー組成物では、混合剤中の活性成分が微粉化したパウダーとして製造される。この実施形態では、混合剤の粒子の少なくとも９５重量％が、０．０１から１０マイクロメートルの範囲の有効粒子サイズを有する。いくつかの実施形態では、微粉化した混合剤パウダーは、さらに内部キャリア、例えば直径で１００マイクロメーターまでの大きな粒子サイズを有する糖と混合する。あるいは、この組成物は、圧縮ガス、例えば窒素または液化ガスの高圧化体を用いて加圧型としてもよい。液化ガスの高圧化媒体を用いた実施形態では、この高圧化体は、化合物および／またはこの化合物を含む混合剤が、実質的に少しでも、この高圧化体に溶解しないように選択することができる。いくつかの実施形態では、この組成物の加圧型の形態は、界面活性剤（surface-active agent）をも含んでもよい。この界面活性剤（surface-active agent）は、液体または固体のノニオン的界面活性剤であり、または固体のアニオン性界面活性剤であり、ある実施形態ではこのアニオン性界面活性剤はナトリウム塩の形態であってもよい。
【０１１６】
直腸内または膣内投与のための組成物は、この開示の化合物または組成物を好適で、刺激性の少ない賦形剤またはキャリア、例えばココアバター、ポリエチレングリコールまたは坐薬ワックスと混合することにより調製することができる。このキャリアは、室温で固体であるが、体温では液体となるものであり、これにより、直腸または膣腔にて融解し（melt）、薬物を放出することができる。
【０１１７】
更なる他の実施形態では、この開示の化合物または組成物は、リポソームの形態で投与することができる。リポソームは一般に、水性媒体に分散させたときにモノラメラまたはマルチラメラの水和した液体の結晶を形成する、リン脂質または他の脂質物質から誘導される。非毒性で、生理学上許容され、代謝可能なリポソームを形成することができる脂質を使用することができ、特定の実施形態では、利用される脂質は、天然および／または合成のリン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームを形成するための方法は、公知である（例えば、「Prescott, Ed., Meth. Cell Biol. 14:33 (1976)」を参照。これは、全てにおいてここで言及することにより組み込まれる。）一つ以上のこの開示の化合物をリポソームの形態に含む組成物は、例えば安定化剤、防腐剤、賦形剤などを含むことができる。
【０１１８】
更なる他の実施形態では、一つ上のこの開示の化合物は、インビトロ用途のために処方することができる。この実施形態では、この開示の組成物は、一つ以上の上記で述べた化合物をアッセイに好適なキャリア中に含む。このようなキャリアは、固体、液体、または期待であってもよく、また滅菌はされていても、いなくてもよい。好適なキャリアの具体例としては、これに限定されないが、ジメチルスルホキシド、エタノール、ジクロロメタン、メタノールなどを挙げることができる。
【０１１９】
更なる他の実施形態は、上記で記載した製薬学上の組成物を使用する方法を対象にする。この実施形態は、抗体または抗体断片をつなげて有する一つ以上のプロトマーを有する一つ以上のＰＴＸ−２融合タンパク質の有効量を投与することを含む。抗体または抗体断片は、ＣまたはＮ末端に融合し、またはＰＴＸ−２プロトマーの一次配列の内部へ挿入し、またはＰＴＸ−２プロトマーにつなげられてもよい。更なる他の実施形態では、ＰＴＸ−２融合タンパク質は、二つ以上の異なる抗体または抗体断片を含んでもよい。
【０１２０】
この方法を用いて処理される疾患状態は、実施形態間で多様であり、つなげる抗体または抗体断片、または抗体または抗体断片の組合せによっても多様である。しかしながら、ある実施形態では、疾患状態が、炎症または慢性炎症、例えば関節炎またはリウマチ性関節炎に関する炎症であり、またこの実施形態では、処置は、少なくともある程度は、ＰＴＸ−２融合タンパク質の炎症領域に堆積するという本来の性質に頼る。
【実施例】
【０１２１】
本願開示がある好ましい実施形態について詳細に記載されているが、他のバージョンは可能である。したがって、添付のクレームの思想および範囲が、本願明細書に含まれる記述および好ましいバージョンに限定されるべきではない。本願開示の種々の側面が、以下の非制限的な実施例について説明される。
【０１２２】
実施例１  抗ＴＮＦα融合タンパク質の調製
発現ベクターを、抗ＴＮＦα抗体断片（ＶＨＨ３）、リンカー、およびＰＴＸ−２の一次配列を含む融合タンパク質をエンコードするよう設計した。この発現ベクターから製造された融合タンパク質（抗ＴＮＦα−ＶＨＨ３−ＰＴＸ−２）は、分子量：４０４５１．５（グリコシル化されていない）の３６４ａａであることが期待され、およびリンカーを介してＰＴＸ−２プロトマーに連結したＮ末端に抗ＴＮＦα抗体断片を有することが期待された。この発現ベクターは、ＧＰＥｘ（登録商標）技術（Catalent Middleton, Middleton, WI)に基づいて細胞株に形質転換した。
【０１２３】
この融合タンパク質を、１リットルの供給回分の振とうフラスコ（fed-batch shake flask）にて生成し、遠心分離、続いて０．２μｍのろ過にてきれいにした。それから、このろ液を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／１００ｍＭのＮａＣｌ／１ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ８．０で平衡化したホスホエタノールアミンアフィニティ樹脂（ＰＥ）にロードし、融合タンパク質を捕捉しておき、このカラムを平衡緩衝剤で洗った。融合タンパク質は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／１００ｍＭのＮａＣｌ／５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で溶出し、続いてPall DV50フィルタによるバイラル濾過（viral filtration）、および０．２μｍのろ過を行った。
【０１２４】
溶出された融合タンパク質は、さらにSource 30Qのアニオン交換カラム（Ｓ３０Ｑ）で精製した。このカラムを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０で平衡化し、および前記溶出したタンパク質を、このカラムにロードする前に、平衡緩衝剤にて３倍に希釈した。それから、融合タンパク質を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ中の２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０までの２０ＣＶ傾斜（20-CV gradient）にて溶出した。溶出ピークのフラクションをプールし、Milliporeの１０ｋＤａスピン濃縮器（Millipore lOkDa spin concentrator）を用いて５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。５ｍｇ／ｍＬ溶融タンパク質サンプルを、インビトロバイオアッセイ、およびラットにおける薬物動態（ＰＫ）解析（静脈注射）ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥ−ＨＰＣＬ分析により試験した。
【０１２５】
ＳＥ−ＨＰＣＬ分析は、Agilent１２００システムを用いて、０．５から１１５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で全てのサンプルについて行って、凝集量（aggregate content）を評価した。精製した融合タンパク質を、５回の凍結／解凍サイクル（−２０から＋２０℃）の対象とし、各サイクル後に１０μｇのサンプルをTosoh 3000 SW XLのサイズ排除カラムに、カラム温度２５℃にてロードした。５０ｍＭのＴｒｉｓ／５０ｍＭのリン酸ナトリウム／０．２５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．５の移動相を、１．０ｍＬ／分の流速で通液した。融合タンパク質の検出は２８０ｎｍで行った。これら実験のクロマトグラフィの結果を図６に、５回の凍結／解凍サイクルのそれぞれの前後での精製融合タンパク質をオーバーレイ（overlay）として示し、および各ＨＰＬＣトレースのために特定した五量体の割合を以下の表１に与える。これらデータは、凍結解凍サイクルの間に五量化ＰＴＸ−２がほとんど解離も、または凝集もせず、融合タンパク質の凍結／解凍サイクルに対する安定性を証明することを示した。
【０１２６】
【表１】
0006340319.tif 000002
【０１２７】
上記に記載したＳＥ−ＨＰＣＬ分析のように、精製された抗ＴＮＦａ−ＶＨＨ３−ＰＴＸ−２融合タンパク質は、５回の凍結／解凍サイクル（−２０から＋２０℃）の対象とされ、およびおよそ各レーン４μｇのタンパク質が、ＭＯＰＳ流動緩衝剤（Invitrogen, Inc.）を用いて４−１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードされた。このゲルは、１５０Ｖで５０分間流され、SimplyBlue  Safe stain（Invitrogen, Inc.）を用いて染色した。得られたゲルの一例を、図７に示し、各レーンは以下のとおり設計された：
【０１２８】
【表２】
0006340319.tif 000003
【０１２９】
これらデータは、期待される分子量（４２ｋＤａ）を有する融合タンパク質を示す。さらに、４２ｋＤａのバンドの強度、および視認される分解生成物の非存在は、融合タンパク質の分解がほとんどまたは全くないことは、５回の凍結／解凍サイクルの後も起こっていることを示した。
【０１３０】
ＬＣ−ＭＳ分析が、全てのサンプルで行われ、融合タンパク質に関連するグリカンのシアル酸量を評価した。ＨＰＬＣ分析は、WatersのLCT Premier XEに連結したWaters 2695上で行った。種々のサンプルのおよそ１０μｇを、PerSeptive BiosystemsのPoros R2/10 カラムに注入した。移動相Ａ（水の中の０．０５％のギ酸）および移動相Ｂ（アセトニトリル中の０．０５％のギ酸）を、０．２ｍＬ／分で、５分かけて３０％Ｂから７０％Ｂとなるように傾斜をかけて流した。全流出物を、質量分析装置に注入した。質量分析装置は、キャピラリー３０００ボルトおよびコーン５０ボルト、脱溶媒和温度２５０℃、ソース温度１２０℃、それぞれ５０および５５０Ｌ／分のコーンガスおよび溶媒和ガスで流した。ＭＣＰ検出器を、２０００ボルトに設定した。データを、最大エントロピー（MaxEnt）法、バックグラウンド除去法、平滑化、およびセンタリングを用いたMass Lynx 4.0で分析した。各フラクションの全初期パラメータを使用した。代表的な出力（trace）を図８に示す。ラベルされた集団（mass）の全ては、予期された抗ＴＮＦａ−ＶＨＨ３−ＰＴＸ−２のグリコ型の変異体である。これらのデータは、４２０５５Ｄａおよび４２３４７Ｄａの二つの主要な観測種の集団であって、これらは期待されたアグリコ（aglyco）タンパク質（４０４５２  Ｄａ）および二分岐のグリカン構造（GlcNAc2-Man3-(GlcNAc-Gal)2)の集団であり、末端に０個または１個のシアル酸を持つ集団にそれぞれ対応する。
【０１３１】
実施例２  単球の分化の阻害
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）で刺激し、単球の線維化関連細胞への分化を促進させ、およびマクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）の生産性を高めた。ＰＢＭＣは、バイオロジカルスペシャルティ社（Biological Specialty Corporation）から入手し、付属のFibroLife Media（ライフラインセルテクノロジー社（Life Line Cell Technology））にて、各ウェルあたり５００００細胞で固定した。細胞は、２５ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦで処理し、単球の線維化関連細胞への分化を刺激し、ＭＤＣ放出を増大させた。天然のＰＴＸ−２の（ｒｈＰＴＸ−２）および抗ＴＮＦａ−ＶＨＨ３−ＰＴＸ−２を順次希釈し、ウェルの最終濃度が３０μｇ／ｍｌから０．００４５μｇ／ｍｌの範囲になるようにした。この細胞を９６時間３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。上澄みをプレートから取出し、ＭＤＣ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステム）にて試験し、ＭＤＣレベルを測定し、タンパク質投与量に依存したＭＤＣ発現の阻害だったかどうかを決定した。プレートは、Tecan Infinite M200のプレートリーダにて、Magellanのソフトウェアを用いて読み取った。阻害割合を、プリズムの４パラメータロジスティックにフィットさせた分析（Prism 4-parameter logistic fit analysis）を用いて計算、分析した。
【０１３２】
ｒｈＰＴＸ−２および抗ＴＮＦａ−ＶＨＨ３−ＰＴＸ−２の両方のＭＤＣの阻害割合（％ＭＤＣ阻害）を示す具体的な曲線を、図９に示す。これらデータは、単球から線維化関連細胞への分化およびＭＤＣ生産性の阻害が同様の投与量依存性であることを証明し、この融合タンパク質はＰＴＸ−２生物活性を維持していることを示した。
【０１３３】
実施例３  ＩＬ−８活性の阻害
ヒト末梢血から単離された不死化された単球／マクロファージ細胞（ＳＣマクロファージ細胞）を、ＩＬ−８生産性を増大させるホルボール  １２−ミリスタート  １３−アセタート（ＰＭＡ、Sigma-Aldrich）を用いて刺激した。細胞は、３０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡを含むIscove’s Modified Dulbecco’s Mediumにて、各ウェルあたり５００００細胞で固定した。ｒｈＰＴＸ−２および抗ＴＮＦａ−ＶＨＨ３−ＰＴＸ−２を順次希釈し、ウェルの最終濃度が６０μｇ／ｍｌから０．００９μｇ／ｍｌの範囲になるようにした。この細胞を４８時間３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。このインキュベーション後、上澄みをプレートから取出し、ＩＬ−８  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステム）にて試験し、およびＩＬ−８レベルを測定し、タンパク質投与量に依存したＩＬ−８発現の阻害だったかどうかを決定した。プレートは、Tecan Infinite M200のプレートリーダにて、Magellanのソフトウェアを用いて読み取った。阻害割合を、プリズムの４パラメータロジスティックにフィットさせた分析（Prism 4-parameter logistic fit analysis）を用いて計算、分析した。
【０１３４】
ｒｈＰＴＸ−２および抗ＴＮＦａ−ＶＨＨ３−ＰＴＸ−２の両方のＩＬ−８阻害の割合（％ＩＬ−８阻害）を示す具体的な曲線を、図１０に示す。これらデータは、ｒｈＰＴＸ−２および抗ＴＮＦａ−ＶＨＨ３−ＰＴＸ−２の両方のが、ＩＬ−８阻害が投与量依存性であることを証明している。さらに、このアッセイにおいて、抗ＴＮＦａ−ＶＨＨ３−ＰＴＸ−２がｒｈＰＴＸ−２より潜在性が高いように見え、両方の活性が同じ分子上で存在する場合、ＰＴＸ−２生物活性と抗ＴＮＦα生物活性との間の予期せぬ相乗効果を示す。
【０１３５】
実施例４  抗ＴＮＦα活性
Ｌ９２９細胞を、ｒｈＰＴＸ−２、レミケード、または抗ＴＮＦａ−ＶＨＨ３−ＰＴＸ−２の存在下、細胞毒性ＴＮＦαで処理して、ＰＴＸ−２に関連する抗ＴＮＦα抗体様断片と比較してむき出しの抗ＴＮＦα抗体（レミケード（Remicade）（登録商標））の抗ＴＮＦα活性の保護効果を評価した。ｒｈＰＴＸ−２、レミケードおよび抗ＴＮＦａ−ＶＨＨ３−ＰＴＸ−２は、アッセイ媒体（１０％ＦＢＳおよび２ｍＭＬ−グルタミンを含むイーグルス最小必須培地（Eagle’s MEM））中で個々に順次希釈し、および２５μｌのヒトＴＮＦα（１．５ｎｇ／ｍｌ）、２５μｌのアクチノマイシンＤ（４０μｇ／ｍｌ）および５０μｌのＬ９２９細胞（ウェルあたり２５０００細胞）をこれら試験ウェルのそれぞれに添加した。２５μｌのアッセイ媒体、２５μｌのアクチノマイシンＤ、および５０μｌのＬ９２９細胞およびヒトＴＮＦαを３１２５ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌ、１ｐｇ／ｍｌの濃度およびＴＮＦαのないコントロールウェルもプレート上で存在させた。このプレートを２０時間３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。インキュベーション後、３０μｌ  ＭＴＳ試薬（プロメガ（Promega）（登録商標））を各ウェルに添加し、このプレートをさらに２時間インキュベートした。４９０ｎｍで吸収を読み、エクセルおよびグラフパッド プリズム（GraphPad Prism）のＳ字投与応答分析を用いて、生存能力曲線を計算した。
【０１３６】
具体的な結果を図１１に示す。期待されるように、ｒｈＰＴＸ−２は、このアッセイでは活性を示さず、抗ＴＮＦａ−ＶＨＨ３−ＰＴＸ−２はＴＮＦα誘導された細胞毒性に対して潜在的な保護の効果を証明し、この融合タンパク質はＴＮＦαを阻害し、天然ＰＴＸ−２の存在しないときの活性を示した。さらに、これらデータは、抗ＴＮＦａ−ＶＨＨ３−ＰＴＸ−２が、ＴＮＦα阻害ベースの抗体としての業界水準であるレミケードと比較したときに改良された抗ＴＮＦα阻害活性を提供することを示す。
【０１３７】
実施例５  薬物動態学
抗ＴＮＦａ−ＶＨＨ３−ＰＴＸ−２、ｒｈＰＴＸ−２の薬物動態学上の活性を示すために、抗ＴＮＦａ−ＶＨＨ３−ＰＴＸ−２をラットに静脈注射（ｉｖ）で、５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与した。血漿サンプルを種々の時点で採取し、これらサンプルをＰＴＸ−２  ＥＬＩＳＡにて分析した。オスのスプラーグドーリーラット（Male Sprague Dawley rats）（１７５−２００グラム）を、ヒルトップラブアニマルズ（Hilltop Lab Animals （Scottdale, PA））から、二重頸静脈カテーテル（ＪＶＣ）を外科的に埋め込んだものを購入した。使用する日に、ラットは計量され、ＪＶＣを開通させた。開通ＪＶＣを持つラットは、最終的な投与量５ｍｇ／ｋｇのｒｈＰＴＸ−２および８．２ｍｇ／ｋｇの抗ＴＮＦａ−ＶＨＨ３−ＰＴＸ−２（ｒｈＰＴＸ−２の５ｍｇ／ｋｇとなる）のために、左側のＪＶＣに１．６７ｍＬ／ｋｇで投与した。投与に続いて、カテーテルを０．５ｍＬの食塩水でフラッシュして、結んでとめた。
【０１３８】
拡張管の全長は、右側のＪＶＣと接続し、特別に設計された靴箱ケージ（shoebox cage）のトップを通り過ぎ、非拘束（unrestrained）の血液サンプルの回収を可能にした。全血液サンプル（０．５ｍＬ）を、ＥＤＴＡを並べた１ｃｃのシリンジプレドース（syringes predose）へ、投与後５分および１、２、４、８および２４時間で回収した。回収カテーテルはおよそ０．４ｍＬのヘパリン化された食塩水でフラッシュし、１６ｍＭの血液をＥＤＴＡ二ナトリウム、２５μＬを含むチューブへ移した。チューブは、４℃、１５０００ＲＰＭで１０分間の遠心分離をするまでは、氷上で保持した。血漿は回収して、低温チューブに移し、−８０℃で分析まで保存した。８時間の回収後、拡張管を外し、ＪＶＣを結んでまとめ、動物をホームケージに戻した。最後の血液回収物は、２４時間で、ＣＯ2吸引後の心穿刺により回収した。
【０１３９】
血漿中のｒｈＰＴＸ−２の濃度を、酵素連結の免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を用いて決定した。簡潔に、９６ウェルのマイクロプレートをマウスのモノクローナル抗ＰＴＸ−２抗体で皮覆して、そのサンプル内の全てのｒｈＰＴＸ−２または融合タンパク質を捕捉する。ポリクローナルのラビット抗ＰＴＸ−２抗体を検出用に用いて、その後ゴートアンチラビット（goat anti-rabbit）のホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体（horseradish peroxidase conjugate）系で続けた。各ウェルの光学密度は、４５０ｎｍで測定し、６３０ｎｍで補正した。必要に応じて、ｒｈＰＴＸ−２または抗ＴＮＦａ−ＶＨＨ３−ＰＴＸ−２の標準曲線は、各プレート上で、０．１２５から２０．０ｎｇ／ｍＬの範囲でキャリブレーションし、および定量下限を０．２５ｎｇ／ｍＬ込みであった。必要最低限のサンプル希釈は２００倍であり、これは５０．０ｎｇ／ｍＬのＬＬＯＱ（定量限界）に相当する。全サンプルの結果が標準曲線から補間され、ｎｇ／ｍＬからμｇ／ｍＬへ変換される。
【０１４０】
具体的なクリアランスチャート（clearance chart）を図１２に提供する。これらデータは、二つのタンパク質間での薬物動態学と同様のものを示す。したがって、抗ＴＮＦａ−ＶＨＨ３−ＰＴＸ−２は、天然ＰＴＸ−２の分布およびクリアランスとほとんど同一の薬物のような分布およびクリアランスを示す。
本発明は一側面において以下の発明を包含する。
（発明１）
抗体または抗体断片をつないで有する少なくとも一つのＰＴＸ−２プロトマーを有する血清アミロイドＰ（ＰＴＸ−２）五量体を含む組成物。
（発明２）
前記ＰＴＸ−２五量体は、抗体または抗体断片をつないで有する五つのプロトマーを含む発明１記載の組成物。
（発明３）
前記ＰＴＸ−２五量体は、一つ以上の未修飾のＰＴＸ−２プロトマーを含む発明１記載の組成物。
（発明４）
前記ＰＴＸ−２五量体は、自然発生的なＰＴＸ−２プロトマー上のリガンド結合部位、または自然発生的なＰＴＸ−２プロトマー上のＣａ2+結合部位、またはそれらの組合せを削除する修飾がなされた、一つ以上のＰＴＸ−２プロトマーを有する発明１記載の組成物。
（発明５）
前記抗体または抗体断片は、少なくとも一つのＰＴＸ−２プロトマーのＣ末端またはＮ末端につながる、発明１記載の組成物。
（発明６）
少なくとも一つのＰＴＸ−２プロトマーが、さらに抗体または抗体断片と少なくとも一つのＰＴＸ−２プロトマーとの間のリンカーを含む発明５記載の組成物。
（発明７）
抗体または抗体断片が、少なくとも一つのＰＴＸ−２プロトマー内に挿入された発明１記載の組成物。
（発明８）
少なくとも一つのＰＴＸ−２プロトマーが、さらに抗体または抗体断片と少なくとも一つのＰＴＸ−２プロトマーとの間のリンカーを含む発明７記載の組成物。
（発明９）
前記ＰＴＸ−２五量体は、自然発生的なＰＴＸ−２プロトマーには存在しない、少なくとも一つの追加のシステインアミノ酸を有する一つ以上のＰＴＸ−２プロトマーを含む、発明１記載の組成物。
（発明１０）
少なくとも一つのシステインアミノ酸が、前記抗体または抗体断片とのジスルフィド結合に関与する発明９記載の組成物。
（発明１１）
少なくとも一つのシステインアミノ酸が、前記ＰＴＸ−２プロトマーのもう一つのシステインとのジスルフィド結合に関与する発明９記載の組成物。
（発明１２）
前記抗体または抗体断片が、公知の治療剤である、発明１記載の組成物。
（発明１３）
前記抗体断片が、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ラクダ科のＶＨＨタンパク質、またはアドネクシン（adnexins）から選択される、発明１記載の組成物。
（発明１４）
前記抗体または抗体断片が、マトリクス・メタロプロテイナーゼの抗組織阻害剤（ＴＩＭＰ）抗体または抗体断片、または抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）抗体または抗体断片である、発明１記載の組成物。
（発明１５）
前記抗体または抗体断片が、抗炎症剤である、発明１記載の組成物。
（発明１６）
さらに一つ以上の製薬学上許容されるキャリアまたは賦形剤を含む、発明１記載の組成物。
（発明１７）
官能化ＰＴＸ−２五量体の製造方法であって、
少なくとも第一の官能化ＰＴＸ−２プロトマーのための核酸配列を含む第一のプラスミドを発現系に導入すること、前記第一のプラスミドは自然発生的なＰＴＸ−２プロトマーのための核酸配列と実質的に同じ核酸配列および一つ以上の第一の抗体または抗体断片のための核酸配列を少なくとも有し；
前記第一の官能化ＰＴＸ−２プロトマーを発現させること；および
前記発現系から官能化ＰＴＸ−２五量体を単離し、または官能化ＰＴＸ−２五量体を精製し、またはこれらの組合せを行うことを含む方法。
（発明１８）
さらに、
少なくとも第二の官能化ＰＴＸ−２プロトマーのための核酸配列を含む第二のプラスミドを前記発現系に導入すること、前記第二のプラスミドは自然発生的なＰＴＸ−２プロトマーのための核酸配列と実質的に同じ核酸配列および一つ以上の第二の抗体または抗体断片のための核酸配列を少なくとも有し；
前記第一の官能化ＰＴＸ−２プロトマーと、前記第二の官能化ＰＴＸ−２プロトマー、前記自然発生的なＰＴＸ−２プロトマーまたはこれらの組合せとの共発現を誘導すること、を含む、発明１７記載の方法。
（発明１９）
さらに、
野生型プラスミドを前記発現系に導入すること、前記野生型プラスミドは自然発生的なＰＴＸ−２プロトマーのための核酸配列と実質的に同じ核酸配列を少なくとも含み；および
前記第一の官能化ＰＴＸ−２プロトマー、前記第二の官能化ＰＴＸ−２プロトマー、前記自然発生的なＰＴＸ−２プロトマー、またはこれらの組合せの共発現を誘導すること、を含む、発明１７または１８記載の方法。
（発明２０）
前記第一のプラスミド、前記第二のプラスミド、前記野生型プラスミドまたはそれらの組合せは、さらに前記官能化ＰＴＸ−２プロトマー、前記自然発生的なＰＴＸ−２プロトマーまたはそれらのいかなる組合せの発現を制御するために配置された誘導プロモータを含む、発明１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（発明２１）
前記発現を誘導するステップが、前記第一の官能化ＰＴＸ−２プロトマー、前記第二の官能化ＰＴＸ−２プロトマー、前記自然発生的なＰＴＸ−２プロトマーまたはそれらのいかなる組合せの発現を制御し、前記第一の官能化ＰＴＸ−２プロトマー、前記第二の官能化ＰＴＸ−２プロトマー、および／または前記自然発生的なＰＴＸ−２プロトマーを、同じ割合で発現させないことを含む、発明１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（発明２２）
発現の制御は、前記発現系の細胞における、前記第一のプラスミド、前記第二のプラスミド、前記野生型プラスミドまたはそれらの組合せの複製数を制御することによって実行される、発明２１記載の方法。
（発明２３）
発現の制御は、前記第一のプラスミド、前記第二のプラスミド、前記野生型プラスミドまたはそれらの組合せの誘導プロモータによって実行される、発明２１記載の方法。
（発明２４）
患者の処置方法であって、発明１記載の少なくとも一つのＰＴＸ−２五量体の有効量を、処置を必要とする患者に投与することを含む方法。
（発明２５）
前記抗体断片が、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ラクダ科のＶＨＨタンパク質、またはアドネクシン（adnexins）である、発明２４記載の方法。
（発明２６）
前記抗体または抗体断片が、マトリクス・メタロプロテイナーゼの抗組織阻害剤（ＴＩＭＰ）抗体または抗体断片、または抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）抗体または抗体断片である、発明２４記載の方法。
（発明２７）
発明１記載の少なくとも一つのＰＴＸ−２五量体が、炎症を低減するために投与される、発明２４記載の方法。
（発明２８）
ＰＴＸ−２のコロイドの製造方法であって、
ＰＴＸ−２五量体を単離し、またはＰＴＸ−２五量体を精製し、またはそれらの組合せを行うこと；および
単離および／または精製されたＰＴＸ−２五量体にカルシウムを添加すること
を含む方法。
（発明２９）
前記コロイドが、ＰＴＸ−２の局所処方の製造に用いられる発明２８記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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