(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の同族抗体とその抗原との複合体に特異的に結合し、前記特定の同族抗体又は前記抗原の何れか単独には結合しない、単離されたモノクローナル抗体又はその断片の同定方法であって、前記方法が
（ａ）抗体又は抗体断片のライブラリーを、非結合抗原、及び、前記特定の同族抗体と同一のアイソタイプを有する抗体の存在下で、前記特定の同族抗体とその抗原との複合体に対してスクリーニングするステップと、
（ｂ）前記特定の同族抗体とその抗原との複合体、及び、結合した抗体又は抗体断片を単離するステップと、
（ｃ）前記抗体又は抗体断片を同定及び単離するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記単離されたモノクローナル抗体又はその断片が、前記特定の同族抗体の可変領域の１又は複数のアミノ酸を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法において、前記単離されたモノクローナル抗体又はその断片が、ヒト化又はヒトモノクローナル抗体又は断片であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法において、前記特定の同族抗体が、マウス、キメラ、ヒト化又はヒトモノクローナル抗体又はその断片であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、前記特定の同族抗体又はその断片が、アダリムマブ、ＭＯＲ１０３、リツキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、インフリキシマブ、ラニビズマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、ナタリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パニツムマブからなるがこれらに限定されないリストから選択されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法において、前記抗原がサイトカイン又は受容体であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その全体が参照により組み込まれる、２０１２年８月２０日出願の米国特許仮出願第６１／６８４，８３６号明細書による利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
抗体等の免疫グロブリンは、医薬産業において継続的に、また益々興味が持たれている。２０００年以来、モノクローナル抗体の治療的市場は急激に増大し、２００７年には、米国内で最もよく売れた２０種のバイオ医薬品のうち８種は、治療的モノクローナル抗体であり、各々、５０億米国ドルを超える世界的年間売上高を有する。
【０００３】
現在、有意な数の抗体、並びに免疫グロブリンの誘導体及び断片が、前臨床及び臨床開発中である。開発中の薬物は、ヒトに導入される前に、広範な発見及び前臨床試験にて分析及び特徴付けられている。安全かつ強力な薬物プロファイルを確立するために、中毒学的、薬物動態学的及び薬力学的特徴のような重要な基準を探索する必要がある。治療的抗体レベルを定量化及び監視するために、これらの試験の多数は、例えば患者又は実験動物からの血清又は任意の体液のようなサンプルマトリクス中の治療的抗体の特定の検出のための薬物特異的薬剤を使用する必要がある。
【０００４】
薬物特異的薬剤は、例えば、ヒト又はヒト化免疫グロブリンのみを検出し、従って非ヒト実験宿主由来のサンプル中のヒト又はヒト化治療的抗体の定量化に使用することができる抗体を含む（例えば、その全体が参照により組み込まれる国際公開第２００６０６６９１２号パンフレット；米国特許出願第１１／７９２，９１０号明細書）。更に一歩進めたものは、治療的抗体内の独特の構造に特異的な抗イディオタイプ抗体又は抗体断片の使用である。従って、抗イディオタイプ抗体は、宿主サンプルが単離されているか否かに係わらずサンプルマトリクス中の特定の治療的抗体又は抗体断片の検出に使用することができる（例えば、国際公開第２００９０３２１２８号パンフレット参照）。しかしながら、抗イディオタイプ抗体の大多数は治療的抗体の独特のＣＤＲｓの１つ以上に結合し、ＣＤＲｓは治療的抗体の抗原と特異的に相互作用するパラトープを規定するため、遊離の、抗原に結合していない治療的抗体の検出及び監視のみが可能である。
【０００５】
米国特許第２０１２／０１５７６６３号明細書は、抗体が対応する抗原に結合した場合にのみ、該抗体に結合する能力を有する所謂「ドミノ抗体」を記載している。米国特許第２０１２／０１５７６６３号明細書の抗体は、特定のハイブリドーマベースのスクリーニング技術を介して生成される。全てのドミノ抗体に共通することは、標的抗体上のドミノ抗体のエピトープが、標的抗体がその対応する抗原に結合した後の立体構造の変化を介して形成されることである。エピトープは、標的抗体の定常領域、例えば、軽鎖の定常領域）内に位置し、抗原又は標的抗体のＣＤＲ領域のいずれの部分も含まない。対照的に、本発明の複合体特異的抗体及び抗体断片は、標的抗体のＣＤＲ領域の少なくとも所定の部分に結合する。従って、ドミノ抗体は、標的抗体がそれらの対応する抗原に結合した際のみに標的抗体を認識するが、同一の抗原特異性を有する他の標的抗体にも結合し、即ち、それらは、この点でパン特異的である。対照的に、本発明の抗体及び抗体断片は、１つの単一の標的抗体に特異的であり、また標的抗体がその抗原に結合した際にのみ、この標的抗体に結合する。
【０００６】
患者に適用された治療的抗体は、常に、宿主の身体の末梢内で異なる状態間でバランスしているため、これらの異なる状態の監視及び割合は、治療的抗体の安全性のための必須情報を提供する。これらの異なる状態は、質量作用の法則に従ってバランスされ、全ての抗体、非結合抗体及び結合抗体を含み、前記バランスは、例えば治療的抗体の親和性に依存し、また身体内の抗原の濃度にも依存する。更に、身体からの治療的抗体のクリアランスが比較的遅いため、その抗原に結合した治療的抗体は、多くの場合、より長期間のその投与後に抗原レベルの増大をもたらす（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｐ．（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６３；１５２１−１５２８）。治療的抗体の存在下、結合抗原は中和され、殆どは生理活性を有さない。しかしながら、この現象は監視される必要があり、例えば急激な退薬の危険性を評価することが重要である。
【０００７】
総じて、全ての抗体、非結合抗体及び結合抗体の特定の検出は、特に興味深く、治療的抗体のプロファイリング及び後の認可に重要である（Ｋｕａｎｇ  Ｂ．（２０１０）Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ，２（６）：１１２５−４０）。結合していない治療的抗体に結合することができ、また複合体（その抗原に結合した治療的抗体）にも結合することができ、従って総抗体負荷の検出に有用な、僅かな抗イディオタイプ抗体が例示されている。そのような非パラトープ抗イディオタイプ抗体は、国際公開第２００９０３２１２８号パンフレットに開示されている。
【０００８】
対照的に、殆ど全ての抗イディオタイプ抗体は標的抗体のＤＣＲｓに指向され、従って非結合抗体のみを検出する（例えば、Ｔｏｒｎｅｔｔａ  Ｍ．（２００７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２８，３４−４４参照）。
【０００９】
しかしながら、ＣＤＲ特異的抗イディオタイプ抗体の使用、又は非パラトープ抗イディオタイプ抗体の使用のいずれも、薬物−抗原複合体のみの直接検出及び定量化が可能ではない。結合抗体を定量化するために、様々なＥＬＩＳＡベースのアッセイが確立されているが、常に間接検出のための二次的な、例えば抗ヒトＦｃ抗体を必要とする。Ｆｃ特異的検出抗体の使用は、血清免疫グロブリンから複合体を捕捉及び単離する追加のステップ及び大量の洗浄を必要とし、従ってこれらのアッセイは背景ノイズ及び信号変化の影響を受けやすい。
【００１０】
従って、抗体−抗原複合体を検出及び定量化するために、より高感度かつ頑強な代替的手法が必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、同族抗体とその抗原との複合体を特異的に検出し及び該複合体に特異的に結合する抗体及び抗体断片を開示する。本開示の抗体は、前記同族抗原結合部分又は前記抗原の何れか単独には結合せず、従って二次的なＦｃ特異的抗体を使用することなく、結合した治療的抗体を直接検出するのに使用することができる。
【００１２】
本発明はまた、特定の同族抗体とその抗原との複合体を特異的に検出し及び該複合体に特異的に結合する抗体及び抗体断片を開示する。詳細には、本発明の抗体及び抗体断片は、同一の抗原特異性を有する他の同族抗体の複合体には結合しない。
【００１３】
これらの複合体特異的抗体は、ヒト患者又は実験動物から単離されたサンプル中の、抗体−抗原複合体のみでなく、遊離又は非結合薬物を定量化する卓越した方法を可能にする。より高感度かつ頑強なアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ構成等が本明細書に開示され、薬物動態試験のための代替的な及び改善されたアッセイを提供する。更に、本明細書に開示した定量化アッセイを使用して、例えばラテラルフロー技術を用いて薬物レベルを監視する簡易試験を開発することができる。
【００１４】
本開示は更に、前記複合体の検出のためのアッセイにおける前記抗体の使用を開示する。更に、本開示は、特定の同族抗体とその抗原との複合体を特異的に検出する抗体を同定する方法を開示する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＥＬＩＳＡにて、一連の無関連及び関連抗原並びにアダリムマブ／ＴＮＦ−α複合体に対する特異的結合に関して試験した７つの抗体の結果を示す。５ｇ／ｍＬの各抗原をマイクロタイタープレート上に一晩被覆した。５％ＢＳＡで洗浄及びブロッキングした後、Ｆａｂ−ＦＨフォーマットの抗アダリムマブ／ＴＮＦ−α抗体（２μｇ／ｍＬ溶液から２０μＬ）を加えた。検出は、ＨＲＰ標識抗Ｈｉｓ抗体及びＱｕａｎｔａＢｌｕ蛍光ペルオキシダーゼ基質を使用して行った。
【図２】図２は、ＥＬＩＳＡでの、異なる固定化抗原上のＡｄａＴＮＦ＃５の滴定の結果を示す。試験した濃度範囲（０．０３〜２０００ｎｇ／ｍＬ）に亘って、ＡｄａＴＮＦ＃５は、アダリムマブ／ＴＮＦ−α複合体のみに結合し、その単一の構成成分及び他の抗原には結合しなかった。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡにて、様々な抗原に対して試験した、完全長ヒトＩｇＧ１に変換された精製ＡｄａＴＮＦ＃５の結果を示す。ＨＲＰに結合された精製ＡｄａＴＮＦ＃５−ｈＩｇＧ１は、アダリムマブとＴＮＦ−αとの複合体に特異的に結合する。
【図４】図４は、薬物動態ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。ヒトＴＮＦ−αをマイクロタイタープレート上に被覆し、増大する濃度のアダリムマブを１０％ヒト血清中に添加し、予備被覆プレートに適用した。洗浄後、抗アダリムマブ／ＴＮＦ−α  ｈＩｇＧ１抗体ＡｄａＴＮＦ＃５（ＨＲＰに結合した）を２μｇ／ｍＬで加えた。検出は、ＱｕａｎｔａＢｌｕ（登録商標）蛍光ペルオキシダーゼ基質を加えることにより行った。ＡｄａＴＮＦ＃５は、ヒト血清の存在下、アダリムマブ／ＴＮＦ−α複合体に用量依存的に結合した。
【図５】図５は、ＥＬＩＳＡにて、様々な抗原に関して試験したＩＦＸ−ＴＮＦ＃１、ＩＦＸ−ＴＮＦ＃２及びＩＦＸ−ＴＮＦ＃３の結果を示す。従って、５μｇ／ｍＬの各抗原をマイクロタイタープレート上に被覆し、Ｆａｂ−ＦＨフォーマットの抗インフリキシマブ／ＴＮＦ−α抗体（２μｇ／ｍＬ溶液から２０μＬ）を加えた。ＩＦＸ−ＴＮＦ＃１は、インフリキシマブ／ＴＮＦ−α複合体を特異的に検出することが証明された（図５）。
【図６】図６は、抗ＭＯＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ複合体抗体を検出するスクリーニングＥＬＩＳＡの結果を示す。５μｇ／ｍＬの各抗原（ＢＳＡ、ＧＳＴ、ＭＯＲ０３２０７及びＭＯＲ１０３）をマイクロタイタープレート上に被覆した。更にＭＯＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ複合体もプレート上に固定化した。Ｍ１０３ＧｍＣＳＦ＃１、Ｍ１０３ＧｍＣＳＦ＃２及びＭ１０３ＧｍＣＳＦ＃３は、ＭＯＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ複合体を特異的に検出したが、ＧＭ−ＣＳＦ又はＭＯＲ１０３単独は検出しなかった。
【図７】図７は、Ｍ１０３ＧｍＣＳＦ＃１の標的選択性を試験したＥＬＩＳＡの結果を示す。ＭＯＲ１０３単独、ビオチン化ＧＭ−ＣＳＦ、又はＭＯＲ１０３に結合したビオチン化ＧＭ−ＣＳＦの何れかをアビジン被覆プレート上に被覆した。ＨｉｓタグＭ１０３ＧｍＣＳＦ＃１Ｆａｂを濃度を増大させて加え、検出した。Ｍ１０３ＧｍＣＳＦ＃１は、薬物−標的複合体に対する結合に高い選択性を示し、個々のタンパク質（薬物及び標的）には示さなかった。
【図８】図８は、ヒト血清中のＭＯＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ複合体を定量化するＭＳＤ（登録商標）（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）ベースのリガンド結合アッセイの結果を示す。ＭＯＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ複合体をヒト血清で補充し、Ｍｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ（登録商標）９６ウェルプレートの標準プレート上に滴定した。ＥＣＬ標識Ｍ１０３ＧｍＣＳＦ＃１  ＩｇＧを使用して、ＭＯＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ複合体を検出した。滴定曲線全体において、ＭＯＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ複合体は、５０％ヒト血清の存在下、用量依存的に特異的に検出された。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
従って、一態様において、本開示は、特定の同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体又はその断片に関する。一実施形態において、単離されたモノクローナル抗体又はその断片は、特定の同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合し、前記同族抗原結合部分又は前記抗原の何れか単独には結合しない。
【００１７】
単離されたモノクローナル抗体又はその断片
別の態様では、本開示は、単離されたモノクローナル抗体又はその断片に関し、該単離されたモノクローナル抗体又はその断片は、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ又は１ｎＭ未満のＥＣ５０濃度で、特定の同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合する。
【００１８】
別の態様では、本開示は、単離されたモノクローナル抗体又はその断片に関し、該単離されたモノクローナル抗体又はその断片は、１×１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１又は１０１３Ｍ−１未満の解離定数（ＫＤ）で、特定の同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合する。
【００１９】
一態様において、本開示は、単離されたモノクローナル抗体又はその断片に関し、該単離されたモノクローナル抗体又はその断片は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。一実施形態では、前記単離された抗体又はその断片は、ヒト又はヒト化抗体である。一実施形態では、前記単離された抗体又はその断片は、キメラ抗体である。一実施形態では、前記単離された抗体又はその断片は、ヒト重鎖定常領域及びヒト軽鎖定常領域を含む。一実施形態では、前記単離された抗体は、ＩｇＧアイソタイプである。別の実施形態では、抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はその誘導体（例えば、ＩｇＧ１ｆ  ＬＡＬＡ）であってもよい。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１ｆ  ＬＡＬＡアイソタイプのものである。一実施形態では、前記単離された抗体又はその断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ２）’、Ｆ（ａｂ）２’及びｓｃＦＶからなる群から選択される。一実施形態では、単離された抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び合成抗体からなる群から選択される。一実施形態では、抗体又はその断片は、ヒト又はヒト化抗体である。
【００２０】
同族抗原結合部分
一態様において、本開示は、同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体又はその断片に関する。別の態様では、本開示は、特定の同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体又はその断片に関する。一実施形態では、前記同族抗原結合部分、又は前記特定の同族抗原結合部分は、同族抗体又はその断片である。一実施形態では、前記同族抗体若しくはその断片、又は前記特定の同族抗体若しくはその断片は、治療的抗体又は治療的抗体断片である。別の実施形態では、前記同族抗体若しくはその断片、又は前記特定の同族抗体若しくはその断片は、診断的抗体又は診断的抗体断片である。
【００２１】
好ましい実施形態では、同族抗体又はその断片は、特定の同族モノクローナル抗体又はその断片である。「特定の同族モノクローナル抗体」とは、その抗原に特異的に結合する１つの、また唯一のモノクローナル抗体を指す。所謂「ドミノ抗体」（米国特許第２０１２／０１５７６６３号明細書参照）の標的抗体は、ドミノ抗体が、該ドミノ抗体の標的抗体の定常領域に結合し、従って１つの単一の抗体に特異的ではなく、所定の標的特異性を有する全部の、又は少なくとも多数の抗体に特異的であるため、この定義の下では特定の同族抗体ではない。
【００２２】
好ましい実施形態では、同族抗体又はその断片は、同族モノクローナル抗体又はその断片である。
【００２３】
一実施形態では、前記同族モノクローナル抗体又はその断片は、ヒト又はヒト化抗体である。一実施形態では、前記同族モノクローナル抗体又はその断片は、キメラ抗体である。一実施形態では、前記同族モノクローナル抗体又はその断片は、ヒト重鎖定常領域及びヒト軽鎖定常領域を含む。一実施形態では、前記同族モノクローナル抗体は、ＩｇＧアイソタイプである。別の実施形態では、同族抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はその誘導体（例えば、ＩｇＧ１ｆ  ＬＡＬＡ）であってもよい。一実施形態では、同族抗体は、ＩｇＧ１ｆ  ＬＡＬＡアイソタイプのものである。
【００２４】
一実施形態では、前記同族モノクローナル抗体又はその断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ２）’、Ｆ（ａｂ）２’及びｓｃＦＶからなる群から選択される。一実施形態では、前記同族モノクローナル抗体又はその断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び合成抗体からなる群から選択される。一実施形態では、同族抗体又はその断片は、ヒト又はヒト化抗体である。
【００２５】
一態様では、本開示は、同族抗原結合部分とその抗原との複合体、又は特定の同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体又はその断片に関し、ここで同族抗原結合部分は、抗体由来の足場である。一実施形態では、抗体由来の足場は、ｓｃＦｖ、四価抗体、架橋Ｆａｂ又はＩｇＧからなる群から選択される。一実施形態では、同族抗体又はその断片は、単鎖抗体である。
【００２６】
一態様では、本開示は、同族抗原結合部分とその抗原との複合体、又は特定の同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体又はその断片に関し、ここで同族抗原結合部分は、単一ドメイン抗体、マキシ抗体（ｍａｘｉｂｏｄｙ）、ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、細胞内抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ｖ−ＮＡＲ、ラクダ科動物抗体、アンキリン、ドメイン抗体、リポカリン、小モジュラー免疫薬、マキシボディ（ｍａｘｙｂｏｄｙ）、タンパク質Ａ及びアフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）からなる群から選択される。
【００２７】
一態様では、本開示は、同族抗原結合部分とその抗原との複合体、又は同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体又はその断片に関し、ここで同族抗原結合部分は、非限定的にアダリムマブ、ＭＯＲ１０３、リツキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、インフリキシマブ、ラニビズマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、ナタリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パニツムマブからなるリストから選択される。
【００２８】
抗原
一態様において、本開示は、特定の同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体又はその断片に関し、ここで抗原はタンパク質である。好ましい実施形態では、タンパク質は、ヒトタンパク質である。
【００２９】
本発明の単離されたモノクローナル抗体又は断片のエピトープは、特定の同族抗体の可変領域の１つ以上のアミノ酸を含む。従って、所定の態様において、本開示は、単離されたモノクローナル抗体又はその断片に関し、ここで前記単離されたモノクローナル抗体又はその断片のエピトープは、特定の同族抗体の可変領域の１つ以上のアミノ酸を含む。別の態様では、本開示は、単離されたモノクローナル抗体又はその断片に関し、ここで前記単離されたモノクローナル抗体又はその断片のエピトープは、特定の同族抗体の可変領域の１つ以上のアミノ酸と、前記特定の同族抗体の抗原の１つ以上のアミノ酸とを含む。
【００３０】
別の態様では、本開示は、単離されたモノクローナル抗体又はその断片に関し、ここで前記単離されたモノクローナル抗体又はその断片のエピトープは、特定の同族抗体と前記特定の同族抗体の抗原との両方からのストレッチを含む。
【００３１】
一実施形態では、タンパク質は、特定の疾患に関連している。一実施形態では、タンパク質は、特定の疾患における特定の生物学的療法のための有用な標的である。一実施形態では、タンパク質は、特定の薬物の有用な標的である。一実施形態では、タンパク質は、治療的抗体又はその断片の有用な標的である。一実施形態では、タンパク質は、診断的抗体又はその断片の有用な標的である。一実施形態では、タンパク質は、サイトカインである。一実施形態では、タンパク質は、受容体である。
【００３２】
一実施形態では、タンパク質は、炎症性疾病、自己免疫性疾病、ウィルス、細菌及び寄生虫感染症、悪性腫瘍、神経変性疾病又は任意の腫瘍関連疾病に関連している。一実施形態では、タンパク質は、癌に関連している。
【００３３】
一実施形態では、一実施形態では、タンパク質は、非限定的にＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＶＥＧＦ−Ａ、α４−インテグリン、ＣＤ２０、ＩｇＥ（Ｆｃ領域）、ＥＧＦＲ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１９、Ｍ−ＣＳＦ、ＣＤ３８、ＭＩＦ、ＤＤＴ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１α、ＩＬ１−β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、Ｈｅｒ２／ｃ−ｎｅｕ、ＣＤ５２、ＣＤ３３からなるリストから選択される。
【００３４】
一態様において、本開示は、同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体又はその断片に関し、ここで複合体は、非限定的にアダリムマブ／ＴＮＦ−α、ＭＯＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ、トラスツズマブ／Ｈｅｒ２／ｃ−ｎｅｕ、アレムツズマブ／ＣＤ５２、ベバシズマブ／ＶＥＧＦ−Ａ、セツキシマブ／ＥＧＦ−Ｒ、ゲムツズマブ／ＣＤ３３、インフリキシマブ／ＴＮＦ−α、ラニビズマブ／ＶＥＧＦ−Ａ、ウステキヌマブ／ＩＬ−１２、ウステキヌマブ／ＩＬ−２３、ゴリムマブ／ＴＮＦ−α、ナタリズマブ／α４−インテグリン、オファツムマブ／ＣＤ２０、リツキシマブ／ＣＤ２０、オマリズマブ／ＩｇＥ（Ｆｃ領域）、パニツムマブ／ＥＧＦＲからなる群から選択される。
【００３５】
単離されたモノクローナル抗体又はその断片の使用
一態様において、本開示は、サンプル中の同族抗原結合部分とその抗原との複合体、又は特定の同族抗原結合部分とその抗原との複合体の検出のための、単離された抗体又はその断片の使用に関し、ここで前記単離された抗体又はその断片は、同族抗原結合部分とその抗原との複合体、又は特定の同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合し、前記同族抗原結合部分又は前記抗原の何れか単独には結合しない。
【００３６】
別の態様では、本開示は、同族抗原結合部分とその抗原との複合体、又は同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合し、前記同族抗原結合部分又は前記抗原の何れか単独には結合しない、単離された抗体又はその断片を使用する、サンプル中の同族抗原結合部分及びその抗原の複合体、又は特定の同族抗原結合部分及びその抗原の複合体の検出方法に関する。
【００３７】
一態様において、本開示は、サンプル中の同族抗原結合部分とその抗原との複合体、又は特定の同族抗原結合部分とその抗原との複合体の検出方法に関し、該方法は、
ａ）前記サンプルを、単離された抗体又はその断片と接触させるステップと、ここで前記単離された抗体又はその断片は、前記複合体に特異的に結合し、前記同族抗原結合部分又は前記抗原の何れか単独には結合せず、
ｂ）前記複合体に結合した前記単離された抗体又は断片を検出するステップと、を含む。
【００３８】
別の態様では、本開示は、サンプル中の同族抗原結合部分とその抗原との複合体、又は特定の同族抗原結合部分とその抗原との複合体の検出方法に関し、該方法は、
ａ）前記サンプルを、単離された抗体又はその断片と接触させるステップと、ここで前記単離された抗体又はその断片は、前記複合体に特異的に結合し、前記同族抗原結合部分又は前記抗原の何れか単独には結合せず、
ｂ）前記複合体に結合した前記単離された抗体又は断片を検出するステップと、
ｃ）前記複合体に結合した前記単離された抗体又は断片を、抗原結合同族抗原結合部分の濃度と相関させるステップと、を含む。
【００３９】
別の態様では、本開示は、サンプル中の同族抗体及びその抗原、又は特定の同族抗体とその抗原との複合体検出方法に関し、該方法は、
ａ）分析するべきサンプルを提供するステップと、
ｂ）前記サンプルを、単離された抗体又はその断片と接触させるステップと、ここで前記単離された抗体又はその断片は、前記複合体に特異的に結合し、前記同族抗体又は前記抗原の何れか単独には結合せず、
ｃ）前記複合体に結合した前記単離された抗体又は断片を検出するステップと、
ｄ）前記複合体に結合した前記単離された抗体又は断片を、抗原結合同族抗体の濃度と相関させるステップと、を含む。
【００４０】
一実施形態では、前記同族抗原結合部分は、同族抗体又はその断片である。好ましい実施形態では、同族抗体又はその断片は、同族モノクローナル抗体又はその断片である。一実施形態では、前記同族モノクローナル抗体その断片は、ヒト又はヒト化抗体である。一実施形態では、前記同族モノクローナル抗体その断片は、キメラ抗体である。一実施形態では、前記同族モノクローナル抗体その断片は、ヒト重鎖定常領域及びヒト軽鎖定常領域を含む。一実施形態では、前記同族モノクローナル抗体は、ＩｇＧアイソタイプである。別の実施形態では、同族抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はその誘導体（例えば、ＩｇＧ１ｆ  ＬＡＬＡ）であってもよい。一実施形態では、同族抗体は、ＩｇＧ１ｆ  ＬＡＬＡアイソタイプのものである。
【００４１】
一実施形態では、前記同族モノクローナル抗体その断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ２）’、Ｆ（ａｂ）２’及びｓｃＦＶからなる群から選択される。一実施形態では、前記同族モノクローナル抗体その断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び合成抗体からなる群から選択される。一実施形態では、同族抗体その断片は、ヒト又はヒト化抗体である。
【００４２】
一実施形態では、前記特定の同族抗体とその抗原との複合体は、非限定的にアダリムマブ／ＴＮＦ−α、ＭＯＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ、トラスツズマブ／Ｈｅｒ２／ｃ−ｎｅｕ、アレムツズマブ／ＣＤ５２、ベバシズマブ／ＶＥＧＦ−Ａ、セツキシマブ／ＥＧＦ−Ｒ、ゲムツズマブ／ＣＤ３３、インフリキシマブ／ＴＮＦ−α、ラニビズマブ／ＶＥＧＦ−Ａ、ウステキヌマブ／ＩＬ−１２、ウステキヌマブ／ＩＬ−２３、ゴリムマブ／ＴＮＦ−α、ナタリズマブ／α４−インテグリン、オファツムマブ／ＣＤ２０、リツキシマブ／ＣＤ２０、オマリズマブ／ＩｇＥ（Ｆｃ領域）、パニツムマブ／ＥＧＦＲからなる群から選択される。
【００４３】
一態様において、本開示は、サンプル中の抗原結合部分の検出方法に関し、該方法は、
ａ）同族抗原結合部分の抗原を固定化するステップと、
ｂ）前記固定化された抗原と前記サンプルとの接触をもたらすステップと、
ｃ）前記同族抗原結合部分とその抗原との間で形成された複合体を、前記複合体に特異的に結合し、前記同族抗原結合部分又は前記抗原の何れか単独には結合しない、単離された抗体又はその断片を用いて検出するステップと、を含む。
【００４４】
別の態様では、本開示は、サンプル中の非結合同族抗原結合部分の検出方法に関し、該方法は、
ａ）同族抗原結合部分の抗原を固定化するステップと、
ｂ）前記固定化された抗原と前記サンプルとの接触をもたらすステップと、
ｃ）前記同族抗原結合部分とその抗原との間で形成された複合体を、前記複合体に特異的に結合し、前記同族抗原結合部分又は前記抗原の何れか単独には結合しない、単離された抗体又はその断片を用いて検出するステップと、を含む。
【００４５】
別の態様では、本開示は、サンプル中の非結合同族抗原結合部分の検出方法に関し、該方法は、
ａ）同族抗原結合部分の抗原を固定化するステップと、
ｂ）前記固定化された抗原と前記サンプルとの接触をもたらすステップと、
ｃ）前記同族抗原結合部分とその抗原との間で形成された複合体を、前記複合体に特異的に結合し、前記同族抗原結合部分又は前記抗原の何れか単独には結合しない、単離された抗体又はその断片を用いて検出するステップと、
ｄ）ｂ）で形成された複合体を、サンプル中の非結合同族抗原結合部分の濃度と相関させるステップと、を含む。
【００４６】
一実施形態では、方法、前記検出は、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、間接競合免疫アッセイ、直接競合免疫アッセイ、非競合免疫アッセイ、サンドウィッチ免疫アッセイ、凝集アッセイ及びＭＳＤ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）からなる群から選択される手段により達成される。好ましい実施形態では、前記検出は、サンドウィッチＥＬＩＳＡにより達成される。別の好ましい実施形態では、前記検出は、ＭＳＤ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）アッセイにより達成される。
【００４７】
一実施形態では、サンプルは、組織又は液体サンプルである。更なる実施形態では、液体サンプルは、唾液、尿、全血、血漿又は血清である。好ましい実施形態では、サンプルは、実験動物又はヒトから得られる。より好ましい実施形態では、サンプルは、ヒトから得られた全血、血漿又は血清である。
【００４８】
一態様において、本開示は、同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合し、前記同族抗原結合部分又は前記抗原の何れか単独には結合しない、単離されたモノクローナル抗体、又はその断片を同定する方法に関し、該方法は、
（ａ）抗体又は抗体断片のライブラリーを、非結合抗原と、同族抗体と同一のアイソタイプを有する抗体との存在下で、同族抗体とその抗原との複合体、又は特定の同族抗体とその抗原との複合体に対してスクリーニングするステップと、
（ｂ）前記同族抗体とその抗原との複合体、又は前記特定の同族抗体とその抗原との複合体、及び結合した抗原結合部分を単離するステップと、
（ｃ）前記抗原結合部分を同定及び単離するステップと、を含む。
【００４９】
別の態様では、本開示は、同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合し、前記同族抗原結合部分又は前記抗原の何れか単独には結合しない、単離されたモノクローナル抗体、又はその断片を同定する方法に関し、該方法は、
（ａ）抗体又は抗体断片のライブラリーを、非結合抗原と、同族抗体と同一のアイソタイプ及び同一のフレームワークを有する抗体との存在下で、同族抗体とその抗原との複合体、又は前記特定の同族抗体とその抗原との複合体に対してスクリーニングするステップと、
（ｂ）前記同族抗体とその抗原との複合体、又は前記特定の同族抗体とその抗原との複合体、及び結合した抗原結合部分を単離するステップと、
（ｃ）前記抗原結合部分を同定及び単離するステップと、を含む。
【００５０】
一態様において、本開示は、同族抗原結合部分とその抗原との複合体、又は特定の同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合し、前記同族抗原結合部分又は前記抗原の何れか単独には結合しない、１つ以上の抗体、又はその断片と、そのような複合体の検出に必要な少なくとも１つの試薬又は装置と、を含むキットに関する。
【００５１】
別の態様では、本開示は、同族抗原結合部分とその抗原との複合体、又は特定の同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合する１つ以上の抗体、又はその断片と、特定の同族抗原結合部分及びその抗原の、１つ以上の異なる同族抗原結合部分とその抗原との複合体の検出に必要な少なくとも１つの試薬又は装置と、を含むキットに関する。別の態様では、本開示は、同族抗原結合部分とその抗原との複合体、又は特定の同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合する抗体又はその断片と、前記複合体の検出に必要な少なくとも１つの試薬又は装置と、を含むキットに関する。一実施形態では、前記装置は、ラテラルフロー装置である。
【００５２】
別の態様では、本開示は、同族抗原結合部分とその抗原との複合体、又は特定の同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合する１つ以上の抗体、又はその断片を含むラテラルフロー装置に関する。一実施形態では、前記１つ以上の抗体又はその断片は、同族抗原結合部分とその抗原との複合体、又は特定の同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合し、前記同族抗原結合部分又は前記抗原の何れか単独には結合しない。更なる実施形態では、前記１つ以上の抗体は、非限定的にアダリムマブ／ＴＮＦ−α、ＭＯＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ、トラスツズマブ／Ｈｅｒ２／ｃ−ｎｅｕ、アレムツズマブ／ＣＤ５２、ベバシズマブ／ＶＥＧＦ−Ａ、セツキシマブ／ＥＧＦ−Ｒ、ゲムツズマブ／ＣＤ３３、インフリキシマブ／ＴＮＦ−α、ラニビズマブ／ＶＥＧＦ−Ａ、ウステキヌマブ／ＩＬ−１２、ウステキヌマブ／ＩＬ−２３、ゴリムマブＴＮＦ−α、ナタリズマブ／α４−インテグリン、オファツムマブ／ＣＤ２０、リツキシマブ／ＣＤ２０、オマリズマブ／ＩｇＥ（Ｆｃ領域）、パニツムマブ／ＥＧＦＲからなる群から選択される複合体の１つに結合する抗体又はその断片の群から選択される。
【００５３】
別の態様では、本開示は、同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその断片をコードする、単離された核酸に関する。
【００５４】
別の態様では、本開示は、同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその断片をコードする単離された核酸を含むベクターに関する。
【００５５】
別の態様では、本開示は、同族抗原結合部分とその抗原との複合体に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその断片をコードする、単離された核酸を含むベクターを含む宿主細胞に関する。一実施形態では、宿主細胞は、原核生物又は真核生物宿主細胞である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。
【００５６】
別の態様では、本開示は、表１に記載した抗体と交差競合する、単離されたモノクローナル抗体又はその断片に関する。所定の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体又はその断片は、表１に記載した抗体と交差競合し、ＥＬＩＳＡベースの交差競合において、表１に記載した抗体の１つの特異的な結合を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％低下させる。
【００５７】
別の態様では、本開示は、表１に記載した抗体と同一のエピトープと相互作用する（例えば、結合、安定化、空間分布により）、単離されたモノクローナル抗体又はその断片に関する。
【００５８】
一態様では、本開示は、表１の抗体の何れかのＫａｂａｔにより定義された６つのＣＤＲｓを含む、単離されたモノクローナル抗体又はその断片に関する。別の態様では、本開示は、表１の抗体の各々のＫａｂａｔにより定義された６つのＣＤＲｓを含む、単離されたモノクローナル抗体又はその断片に関する。
【００５９】
一態様では、本開示は、表１の抗体の何れかのＶＨ及びＶＬを含む、単離されたモノクローナル抗体又はその断片に関する。
【００６０】
別の態様では、本開示は、単離されたモノクローナル抗体又はその断片をコードする核酸に関し、ここで核酸は、表１の抗体の何れかのＶＨ及びＶＬを含む。
【００６１】
別の態様では、本開示は、表１に記載した核酸に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の配列同一性を有する、単離されたモノクローナル抗体又はその断片をコードする核酸に関する。
【００６２】
定義
本明細書で使用される用語「抗原結合部分」は、所定の抗原に特異的に結合する能力を与えるポリペプチドを含む部分を指す。例えば、抗体、抗体断片、抗体誘導体、抗体様足場及び代替的な足場は、少なくとも１つの抗原結合部分を含む。抗原結合部分はまた、単一ドメイン抗体、マキシ抗体、ミニ抗体、細胞内抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ｖ−ＮＡＲ及びｓｃＦｖに組み込まれてもよい（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，９，１１２６−１１３６参照）。抗原結合部分を含む分子の更なる例は、本明細書にて下記に提供され、フィブロネクチン（Ａｄｎｅｘｕｓ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡが完全に所有）、ラクダ科動物抗体、アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ及びＡｂｌｙｎｘ  ｎｖ，Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、リポカリン（Ｐｉｅｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ  ＡＧ，Ｆｒｅｉｓｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、小モジュラー免疫薬（Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、タンパク質Ａ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＧ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びアフィリン（γ−クリスタリン又はユビキチン）（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＧｍｂＨ，Ｈａｌｌｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む。
【００６３】
本明細書で使用される用語「抗原結合領域」は、抗原結合部分と抗原との間の特定の結合に関与する抗原結合部分のドメインを指す。例えば、抗体又はその断片の抗原結合領域は、重鎖（本明細書ではと略すＶＨ）及び軽鎖（本明細書ではＶＬと略す）のＮ末端可変領域のアミノ酸残基により形成される。ＶＨ及びＶＬの可変領域は、各々、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される３つの超可変領域を含む。ＶＨの３つのＣＤＲｓ及びＶＬの３つのＣＤＲｓは、互いに３次元的に配置されて、抗原結合表面を形成する。
【００６４】
本明細書で使用される用語「抗体」は、抗体全体、及び抗体の任意の断片又は単鎖を含む。天然に存在する「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）及び重鎖定常領域から構成されている。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域から構成されている。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成されている。ＶＨ及びＶＬ領域は、更に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域に細分されてもよく、該領域は、より保存された、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される領域が組み入れられている。ＶＨ及びＶＬの各々は、以下の順序で、アミノ末端からカルボキシ末端へ配置された３つのＣＤＲｓ及び４つのＦＲｓから構成されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の構成成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織又は因子に対する免疫グロブリンの結合を仲介し得る。抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、サブクラス、又はそれらの改変型（例えば、ＩｇＧ１ｆ  ＬＡＬＡ）のものであってもよい。
【００６５】
用語、抗体の「断片」は、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つ以上の断片を指す。用語「断片」に包含される結合断片の例には、Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片；Ｆ（ａｂ）２断片、ジスルフィド架橋によってヒンジ領域に結合された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；並びに、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに、ＶＬ及びＶＨ領域が対となって一価分子を形成する単鎖断片（ｓｃＦｖ）（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として既知；例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９−５８８３参照）が挙げられる。２つのドメインＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によりコードされているが、組み換え方法を用いて、それらが単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする人工ペプチドリンカーによって連結され得る。そのような単鎖抗体は、１つ以上の抗原結合部分を含む。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技術を用いて得られ、断片は無傷抗体と同一の方法で、有用性に関してスクリーニングされる。
【００６６】
「抗原」は、抗原結合部分により特異的に結合される任意の分子又は任意の分子の複合体として定義される。
【００６７】
用語「複合体」は、互いに対して親和性を有する少なくとも２つの部分の間の会合体（例えば、化学的又は生化学的）を指す。「タンパク質複合体」又は「ポリペプチド複合体」は、少なくとも１つ以上のポリペプチドを含む複合体を指す。本明細書で使用されるように、複合体は、同族抗原結合部分及びその抗原を含む。一実施形態では、複合体は、抗体−抗原複合体である。好ましい実施形態では、複合体は、治療的抗体及びその抗原を含む抗体−抗原複合体である。
【００６８】
用語「同族」は、一緒に機能する構成成分、又は互いに対するある特異性の態様を有する構成成分、例えばオルトゴナルｔＲＮＡ及びオルトゴナルアミノアシル−ｔＲＮＡシンターゼ、又は抗体及び抗原を指す。構成成分は、相補的であるとも称され得る。本明細書で使用されるように、同族抗原結合部分は、その抗原に特異的に結合する抗原結合部分である。
【００６９】
用語「重鎖可変領域ＣＤＲ１」及び「Ｈ−ＣＤＲ１」は、用語「重鎖可変領域ＣＤＲ２」及び「Ｈ−ＣＤＲ２」、用語「重鎖可変領域ＣＤＲ３」及び「Ｈ−ＣＤＲ３」、用語「軽鎖可変領域ＣＤＲ１」及び「Ｌ−ＣＤＲ１」；用語「軽鎖可変領域ＣＤＲ２」及び「Ｌ−ＣＤＲ２」並びに用語「軽鎖可変領域ＣＤＲ３」及び「Ｌ−ＣＤＲ３」のように、交換可能に使用される。
【００７０】
本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図される。本明細書で使用されるように、ヒト抗体は、重鎖若しくは軽鎖可変領域又は完全長重鎖若しくは軽鎖を含む。所定の場合に、ヒト抗体は、アミノ酸配列において、生殖細胞免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、又は少なくとも９５％、又は更には少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であってもよい。それにより、前記ヒト抗体は、Ｂ細胞から単離されたＶＨ／ＶＬレパートリーのＰＣＲ増幅により生成され又は合成により生成されたヒト生殖細胞遺伝子に由来する抗体を含む技術プラットフォームから得ることができる。技術プラットフォームには、ファージ、リボソーム又は酵母上に表示されるヒト免疫グロブリン遺伝子を含むライブラリーベースの手法が挙げられる。代表的なディスプレイ技術は、科学コミュニティーにて標準である。更に、ヒト免疫グロブリンレパートリーを保有する遺伝子導入マウスの免疫化は、関心対象の抗原に対するヒト抗体を生成する他の手法である。ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ（登録商標）概念（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７−８６）に基づく抗体ライブラリーから選択された抗体又はその断片は、完全にヒトと考慮される。
【００７１】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する独特の結合特異性及び親和性を有する独特の結合部位を示す。
【００７２】
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体の反応性を保持すると共に、ヒト内で免疫原性がより低い抗体である。これは例えば非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残りの部分（即ち、定常領域、及び可変領域のフレームワーク部分）をそれらのヒト対応物で代替することにより達成され得る。例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ（１９９１）Ｉｍｍｕｎ．，２８：４８９−４９８；及びＰａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ（１９９４）Ｉｍｍｕｎ．，３１：１６９−２１７を参照されたい。ヒト操作技術の他の例には、非限定的に、米国特許第５，７６６，８８６号明細書に開示されているＸｏｍａ技術が挙げられる。
【００７３】
用語「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域、又はその一部分が、変更、代替又は交換されているため、抗原結合部位（可変領域）が異なる又は変更されたクラス、エフェクター機能及び／若しくは種の定常領域、又はキメラ抗体に新しい特性を付与する完全に異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物等に結合され；又は（ｂ）可変領域、又はその一部分が、異なる又は変更された抗原特異性を有する可変領域で変更、代替又は交換されている、抗体分子である。例えば、マウス抗体は、その定常領域をヒト免疫グロブリンからの定常領域で代替することにより改変され得る。ヒト定常領域による代替に起因して、キメラ抗体は、抗原を認識するその特性を保持すると共に、本来のマウス抗体と比較して、ヒト内で抗原性が低下され得る。
【００７４】
用語「単離された」は、例えば、異なる抗原特異性を有する他の抗体又は抗原結合部分を実質的に含まない、抗体又は抗原結合部分であり得る化合物を指す。更に、単離された抗体抗原結合部分は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない可能性がある。
【００７５】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書で交換可能に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する、天然に存在するアミノ酸の人工化学的ミメティック（模倣物）であるアミノ酸ポリマー、並びに、天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーであるアミノ酸ポリマーに適用される。特に示さない限り、特定のポリペプチド配列は、その保存的に改変された変異体も暗に包含する。
【００７６】
用語「サイトカイン」は、細胞内メディエーターとして他の細胞上に作用する、１つの細胞集団により放出されるタンパク質の一般的用語である。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるものは、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン等の成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体ホルモン（ＬＨ）等の糖タンパク質ホルモン；肝臓増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子ａ及びβ；ミュラー管抑制因子；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子Ａ〜Ｆ例えば、ＶＥＧＦ−Ａ）；インテグリン例えば、α４−インテグリン）；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−β等の神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−ａ及びＴＧＦ−β等のトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦｓ）；インシュリン様の増殖因子−Ｉ及び−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、−β、及び−γ等のインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）等のコロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；及び顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ１７−ファミリーメンバー（例えば、ＩＬ−１７Ｃ）等のインターロイキン（ＩＬｓ）；ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−β等の腫瘍壊死因子；並びにＬＩＦ、キットリガンド（ＫＬ）、ＭＩＦ、Ｄ−ＤＴを含む他のポリペプチド因子である。本明細書で使用されるように、用語サイトカインは、天然源由来又は組み換え細胞培養物由来のタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
【００７７】
用語「受容体」は、例えば細胞内で、特定のリガンド又は結合パートナーとの相互作用の結果として、生物活性に影響を与える能力を有するタンパク質の一般的用語である。細胞膜結合受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、１つ以上の膜貫通又は膜貫通型ドメイン、及び、一般にシグナル伝達に関与する細胞内エフェクタードメインにより特徴付けられる。細胞膜受容体に対するリガンド結合は、細胞膜を横切って連絡する細胞外ドメインにおける変化、１つ以上の細胞内タンパク質との直接又は間接的な相互作用を生じ、酵素活性、細胞形状、又は遺伝子発現プロファイル等の細胞特性を変更する。受容体はまた、細胞表面から解かれてもよく、細胞質、細胞核であってもよく、又は細胞から完全に解放されてもよい。一般に、受容体は、膜結合、細胞質又は細胞核；単量体（例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、β−アドレナリン受容体）又は多量体（例えば、’ＰＤＧＦ受容体、成長ホルモン受容体、ＩＬ−３受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ  Ｉ受容体、エリスロポエチン受容体及びＩＬ−６受容体）であり得る。受容体のより詳細な例には、非限定的に更に、分化のクラスター（例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ３３）、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＥ（Ｆｃ領域））、上皮増殖因子受容体（例えば、ＥＧＦＲ）又は受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）（例えば、Ｈｅｒ２／ｃ−ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、Ｈｅｒ４）が挙げられる。
【００７８】
用語「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子により提供される抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４等のＩｇＧ）を指す。アイソタイプは、これらのクラスのうちの１つの改変型も含み、改変はＦｃ機能を変更し、例えば、エフェクター機能又はＦｃ受容体に対する結合を向上又は低下させるように為されている。例えばＩｇＧ１ｆ  ＬＡＬＡは、エフェクター機能が有意に低下されているＩｇＧアイソタイプの改変型である。アミノ酸の特定の置換は、非改変抗体と比較して、ＦｃγＲＩ受容体に対する結合親和性を低下させた。ＩｇＧ１ｆ  ＬＡＬＡは、その全体が参照により組み込まれる米国特許出願第０８／４７９，７５２号明細書（ＳＣＯＴＧＥＮ  ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ  ＩＮＣ．）に記載されている。本開示の所定の実施形態では、抗体の抗原結合部分は、タイプＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩＧＥ又はＩｇＤのものである。特定の実施形態において、抗体は、タイプＩｇＧのものである。本開示の所定の実施形態において、抗体は、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のものである。特定の実施形態において、抗体は、サブタイプＩｇＧ１又はＩｇＧ４のものである。別の特定の実施形態において、抗体は、サブタイプＩｇＧ１又はＩｇＧ１ｆ  ＬＡＬＡのものである。
【００７９】
表現、抗原に「特異的に結合する」は、タンパク質及び他の生物製剤の不均一集団中の抗原の存在下で判定できる結合反応を指す。それにより、表現「抗原を認識する」及び「抗原に特異的な」は、本明細書で用語「抗原に特異的に結合する」と交換可能に使用される。例えばモノクローナル抗体のような抗原結合部分の、抗原に対する特異的結合は、当技術分野にて既知の確立された様々な方法により決定することができ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロット、イムノブロット、ＭＳＤ、ＢＩＡｃｏｒｅ及びＳＥＴを含む。本開示にて、抗原結合部分は、抗原結合部分が背景の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、特定の抗原に結合可能であると示された場合、抗原に特異的であると見なされる。それにより、背景は、選択抗原に対して非特異的であることが既知の抗原結合部分により、又は非関連抗原に対する結合と比較することにより、決定される。
【００８０】
「交差競合」は、標準的な競合結合アッセイにおいて、特定の抗原に対する他の抗体又は抗原結合部分の結合を妨げる、抗体又は他の抗原結合部分の能力を意味する。抗体又は他の抗原結合部分が特定の抗原に対する他の抗体又は抗原結合部分の結合を妨げることができる能力又は程度、及び、従ってそれが本発明による交差競合であり得るか否かは、標準的な競合結合アッセイを用いて決定することができる。１つの好適なアッセイは、Ｂｉａｃｏｒｅ技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用することによる）の使用を含み、該機器は、表面プラズモン共鳴技術を用いて、相互作用の程度を測定することができる。交差競合を測定する他のアッセイは、ＥＬＩＳＡベースの手法を用いる。それらの交差競合に基づく「エピトープビニング」抗体の高スループットプロセスは、国際特許出願国際公開第２００３／４８７３１号パンフレットに記載されている。
【００８１】
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合し、又は分子と別様に相互作用することが可能な任意のタンパク質を含む。エピトープ決定基は、一般に、アミノ酸又は炭水化物又は糖側鎖等の、分子の化学的に活性な表面基からなり、特定の３次元構造特性、及び特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、「線状」又は「立体構造的」であり得る。用語「線状エピトープ」は、タンパク質と相互作用分子（抗体等）との間の相互作用の全地点がタンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状に生じる（連続）エピトープを指す。用語「立体構造的エピトープ」は、不連続アミノ酸が３次元立体構造にて一体となっているエピトープを指す。立体構造的エピトープでは、相互作用地点は互いに分離したタンパク質上のアミノ酸残基を渡って生じる。
【００８２】
「〜と同一のエピトープに結合する」は、抗体又は他の抗原結合部分が特定の抗原に結合する能力、及び、例示された抗体と同一のエピトープを有することを意味する。例示された抗体及び他の抗体のエピトープは、エピトープマッピング技術を用いて決定することができる。エピトープマッピング技術は、当技術分野にて周知である。例えば、立体構造的エピトープは、例えば水素／重水素交換、ｘ線結晶学及び２次元核磁気共鳴等によって、アミノ酸の空間立体配座を決定することにより容易に同定される。
【００８３】
本明細書で使用される用語「親和性」は、例えばモノクローナル抗体のような抗原結合部分と抗原との、単一の抗原部位における相互作用の強度を指す。各抗原部位内で、抗体「アーム」の可変領域は、多数の部位において弱い非共有結合力を介して抗原と相互作用し；相互作用が多くなる程、親和性が高くなる。
【００８４】
本明細書で使用される用語「ＫＤ」は、ＫｄとＫａとの比（即ち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られる解離定数を指し、モル濃度（Ｍ）として表される。例えばモノクローナル抗体のような抗原結合部分に関するＫＤ値は、当技術分野にて確立された方法を用いて決定することができる。例えばモノクローナル抗体のような抗原結合部分のＫＤを決定するための方法は、ＳＥＴ（可溶性平衡滴定（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ））、又は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム等のバイオセンサシステムを使用した表面プラズモン共鳴である。本開示では、抗原結合部分は、典型的には、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満、又は１０−１５Ｍ未満、又はそれより低い解離定数（ＫＤ）（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する。
【００８５】
「疾患」は、例えば治療的抗体又は他の抗原結合部分を使用することによる医療的処置から利益を得るであろう任意の状態である。疾患の非限定的な例には、自己免疫性疾病、炎症、細胞増殖性疾患；Ｂ細胞リンパ腫、非白血病及びリンパ系腫瘍；神経細胞、グリア、星状細胞、視床下部及び他の腺、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇａｌ）、上皮、間質及び胞胚腔疾患；並びに炎症性、免疫性、又は感染性疾病が挙げられる。用語「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」は、ある程度の異常な細胞増殖に関連した疾患を指す。一実施形態では、疾患は癌である。
【００８６】
本明細書で使用されるように、用語「自己免疫性疾病」は、一般に、自己認識の構成成分を有するとして特徴付けられる疾病を指す。自己免疫性疾病の例には、非限定的に、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、全身性エリトマトーデス、突発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、橋本甲状腺炎、バセドウ病、強直性脊椎炎Ｓｊｏｇｒｅｎｓ疾病、ＣＲＥＳＴ症候群、強皮症、ＩｇＡ腎障、類天疱瘡、尋常性天疱瘡（Ｐｅｍｐｈｉｇｏｕｓ  Ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ＡＮＣＡ関連血管炎、抗リン脂質抗体症候群、及び更に多数が挙げられる。殆どの自己免疫性疾病は、慢性炎症性疾病でもある。これは炎症性細胞（白血球）の長期間（＞６ヶ月）の活性化に関連した疾病プロセスとして定義される。慢性炎症は患者器官又は組織の損傷をもたらす。多数の疾病は慢性炎症性疾患であるが、自己免疫性の基礎を有するとして知られていない。例えば、アテローム性動脈硬化症、鬱血性心疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、結節性多発動脈炎、ウィップル病、原発性硬化性胆管炎及び更に多数。
【００８７】
用語「癌」は、典型的には未制御の細胞成長／増殖により特徴付けられる哺乳動物内の生理学的状態を指す。癌の例には、非限定的に：癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、及び白血病が挙げられる。癌のより詳細な例には、非限定的に：結腸直腸癌、慢性リンパ性白血病（ＧＬＬ）、非小細胞（ＮＳＣＬＣ）を含む肺、乳房、卵巣、頸部、子宮内膜、前立腺、結腸直腸、腸カルチノイド、膀胱、胃、膵臓、肝臓（肝細胞）、肝芽腫、食道、経肺腺癌、中皮腫、滑膜肉腫、骨肉腫、頭部及び頸部扁平上皮細胞癌、若年性鼻咽腔血管線維腫、脂肪肉腫、甲状腺、黒色腫、基底細胞癌（ＢＣＣ）、髄芽腫及びデスモイドが挙げられる。主題の方法による処置に特に興味深い癌には、グリア細胞種、髄芽腫、結腸癌、結腸直腸癌、黒色腫、乳癌、肺癌、肝癌及び胃癌が挙げられる。
【００８８】
用語「治療的抗体」は、ヒトでの使用が意図される任意の抗体製剤に関する。そのような治療的抗体は、モノクローナル抗体が好ましい。更に好ましいそのようなモノクローナル抗体は、大型類人猿から得られ、又はヒトモノクローナル抗体であろう。ヒトモノクローナル抗体が好ましいであろう。また好ましいそのような治療的モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体であろう。治療的抗体は、腫瘍学的疾病（例えば、非ホジキンリンパ腫、乳癌及び結腸直腸癌を含む血液系及び固体悪性腫瘍）、免疫疾患、中枢神経疾患、血管疾患、又は感染性疾病等の様々な疾患の処置に広く使用されている。そのような抗体は、一実施形態では、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＶＥＧＦ−Ａ、α４−インテグリン、ＣＤ２０、ＩｇＥ（Ｆｃ領域）、ＥＧＦＲ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１９、ＭＣＳＦ、ＣＤ３８、ＭＩＦ、ＤＤＴ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１２、Ｈｅｒ２／ｃ−ｎｅｕ、ＣＤ５２、ＣＤ３３に対する抗体である。そのような抗体は、例えばアダリムマブ、ＭＯＲ１０３、リツキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、インフリキシマブ、ラニビズマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、ナタリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ及びパニツムマブである。
【００８９】
本願に使用されている用語「サンプル」は、非限定的に、生物又は死んだ生物（ｆｏｒｍｅｒｌｙ  ｌｉｖｉｎｇ  ｔｈｉｎｇ）からの任意の量の物質を示す。そのような生物には、非限定的に、ヒト、マウス、猿、ラット、兎、及び他の動物が挙げられる。そのような物質には、非限定的に、個人からの唾液、尿、全血、血清又は血漿が挙げられる。臨床ルーチンで最も広く使用されているサンプル源は、全血、血漿又は血清である。好ましい実施形態では、サンプルは患者から単離された。より好ましい実施形態では、サンプルはヒトから単離された。
【００９０】
本明細書で使用される用語「患者」は、哺乳動物を示す。本発明による患者は、好ましくはヒトである。
【００９１】
本明細書で使用されるように、用語「結合」は、例えば化学的カップリングによる共有結合、又は、例えばイオン相互作用、疎水性相互作用、水素結合等による非共有結合であり得る結合又は付着を指す。好ましい実施形態では、結合又は付着は、非共有結合相互作用である。一例では、用語、結合は、同族抗原結合部分の、その抗原に対する付着を指す。
【００９２】
用語「抗原−結合」抗原結合部分は、実験動物又は患者の循環中に存在する、その抗原に結合した抗原結合部分を示すのに使用される。更なる実施形態では、抗原−結合抗原結合部分は、抗体である。更なる実施形態では、抗原−結合抗原結合部分は、治療的抗体である。
【００９３】
用語「非結合」抗原結合部分は、その抗原に結合していない、実験動物又は患者の循環中に存在する抗原結合部分を示すのに使用される。更なる実施形態では、抗原結合部分は、抗体又はその断片である。更なる実施形態では、抗原結合部分は、治療的抗体である。
【００９４】
用語「収集物」又は「ライブラリー」は、少なくとも２つのメンバーを意味する。用語「メンバー」は、非限定的に、抗体若しくはその断片をコードする核酸、又は抗体若しくはその断片自体を含む。
【００９５】
用語「ライブラリー」は、本明細書に記載した多様性を有する、２つ以上の存在物（ｅｎｔｉｔｙ）を含む存在物のセットを指す。例えば、「抗体又は抗体断片のライブラリー」は、抗体又は抗体断片をコードし、本明細書に記載した多様性を有する、２つ以上のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのセットを指す。例えば、例えばＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ライブラリーのような市販のファージディスプレイライブラリーを使用することができる。
【００９６】
本明細書で使用されるように、用語「多様性」は、多様さ、即ち顕著な不均一性を指す。
【００９７】
用語「フレームワーク」は、可変ドメインの抗原結合ループのための足場としての役割を果たす、該可変ドメインの一部としてＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）により定義された抗体可変ドメインを意味する。フレームワーク領域の例には、可変重鎖又は可変軽鎖の何れかのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４が挙げられる。
【００９８】
用語「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子により提供される抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ４等のＩｇＧ）を指す。アイソタイプは、これらのクラスのうちの１つの改変型も含み、改変は、Ｆｃ機能を変更するために、例えばエフェクター機能又はＦｃ受容体に対する結合を向上又は低下させるために為されている。
【００９９】
「抗イディオタイプ抗体」は、他の抗体の抗原結合領域に特異的に結合し、従って他の抗体により特異的に結合される抗体を意味する。抗イディオタイプ抗体は、通常、他の抗体により認識されるエピトープを模倣し得る。イディオタイプは、免疫グロブリンの可変領域内の構造の遺伝的に決定された変種である。イディオタイプ可変性の正確な遺伝学的基礎は、部分的にのみ説明されている。しかしながら、イディオタイプ変種は、特に抗原結合領域の範囲内に、イディオトープとも称される、アミノ酸配列及びタンパク質構造（所謂、決定基）を含む。用語「イディオタイプ」は、抗体分子の可変領域の決定基の完全セットを指定する。
【０１００】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸及びまた合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸ミメティック（模倣物）を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によりコードされたもの、並びに後に改変されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造、即ち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。それらの類似体は、改変Ｒ基（例えば、ノルロイシン）又は改変ペプチドバックボーンを有するが、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造を保持する。アミノ酸ミメティック（模倣物）は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学的化合物を指す。
【０１０１】
用語「核酸」は、本明細書では用語「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及び、単鎖又は二本鎖形態の何れかのそれらのポリマーを指す。この用語は、基準の核酸と同様の結合特性を有し、基準のヌクレオチドと同様に代謝される、既知のヌクレオチド類似体、又は改変バックボーン残基若しくは結合を含む、合成、天然に存在する、及び天然に存在しない核酸を包含する。そのような類似体の例には、非限定的に、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡｓ）が挙げられる。特に示さない限り、特定の核酸配列は、その保存的に改変された変異体（例えば、縮重コドン置換体）及び相補的な配列、並びに明白に示される配列も暗に包含する。詳細には、下記に詳細に説明するように、縮重コドン置換体は、１つ以上の選択された（又は全部の）コドンの第３の位置が、混合塩基（ｍｉｘｅｄ−ｂａｓｅ）及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８）。
【０１０２】
用語「組み換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）は、組み換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。それらの用語は、特定の対象細胞のみではなく、それらの細胞の後代も指すことが意図されることを理解するべきである。所定の改変は突然変異又は環境的影響の何れかに起因して、後生に生じ得るため、それらの後代は、実際には、親細胞と同一でない場合があるが、尚、本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【０１０３】
本明細書で使用される用語「ベクター」は、外来性遺伝子材料を他の細胞内に移動するのに使用される分子ビヒクルを指す。ベクター自体は、一般に挿入断片（関心対象の配列）と、ベクターの「バックボーン」としての役割を果たす、より大きい配列とからなるＤＮＡ配列である。ベクターが遺伝子情報を他の細胞に移動する目的は、典型的には、標的細胞内で挿入断片を単離し、増加させ、又は発現することである。
【０１０４】
本明細書で使用される用語「ラテラルフロー」は、基質又は担体、例えばラテラルフロー膜の面に沿った液体の流れを指す。一般に、ラテラルフロー装置は、毛細管作用、即ちウィッキング又はクロマトグラフ作用により溶液を輸送することが可能な材料の細長片（又は、流体連通する複数の細長片）を含み、細長片（１つ又は複数）内の異なる範囲又はゾーンは、基質に拡散的又は非拡散的に結合したアッセイ試薬を含み、該基質は、溶液がそれらのゾーンへ輸送され又は該ゾーンを通して移動されたときに、検出可能なシグナルを生成する。典型的には、そのようなアッセイは、液体サンプルを受容するように適合された適用ゾーン、適用ゾーンから側方に離間し、適用ゾーンと流体連通する試薬ゾーン、及び試薬ゾーンから側方に離間し、試薬ゾーンと流体連通する検出ゾーンを含む。試薬ゾーンは、液体中で可動であり、かつサンプル中の分析物と相互作用して、例えば分析物−試薬複合体を形成することが可能な、及び／又は、検出ゾーン内の結合分子と相互作用することが可能な化合物（例えば、抗体）を含んでもよい。検出ゾーンは、細長片上に固定化され、分析物及び／又は試薬及び／又は分析物−試薬複合体と相互作用して、検出可能なシグナルを生成することが可能な結合分子（例えば、抗体）を含んでもよい。そのようなアッセイは、直接（サンドウィッチアッセイ）又は競合結合を介して、サンプル中の分析物を検出するのに使用することができる。ラテラルフロー装置の例は、米国特許第６，１９４，２２０号明細書、米国特許第５，９９８，２２１号明細書及び米国特許第５，７９８，２７３号明細書に提供されている。
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【実施例】
【０１０５】
抗体／抗原複合体に特異的なＦａｂ断片及び抗体の生成
抗体／抗原複合体を特異的に認識する抗体を選択するために、市販のファージディスプレイライブラリー、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ライブラリーを使用した。前記抗体ライブラリーは、ＨｕＣＡＬ（登録商標）概念（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７−８６）に基づき、ファージ表面上にＦａｂを表示するのにＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（登録商標）技術を使用する（Ｌｏｈｎｉｎｇに付与された国際公開第２００１／０５９５０号パンフレット）。しかしながら、利用可能な任意の他の抗体ライブラリーが複合体特異的な抗体の同定に好適であろう。
【０１０６】
抗体／抗原複合体抗体を同定するために、標的抗体／抗原複合体を標的とする特定のパニング戦略を開発した。それにより、組み換えられ、精製された抗原及びその対応する組み換え治療的抗体をパニングに使用した。記載した下記の実施例によれば、３つの異なる抗体／抗原複合体に関して、特定の複合体のみに結合する抗体を同定した。記載した全てのパニング戦略及び抗原を、抗体選択プロセスに使用した。各パニング戦略は、少なくとも３回（ｒｏｕｎｄ）の個々のパニングからなり、独特の抗原、抗原濃度及び洗浄の厳格性を含んでいた。
【０１０７】
実施例１：アダリムマブ／ＴＮＦ−α複合体に特異的なＦａｂ断片及び抗体の生成及び特徴付け。
アダリムマブ／ＴＮＦ−α複合体に特異的に結合する抗体を同定するために、溶液パニング手法において、磁気ビーズ及びアダリムマブに結合した組み換えＴＮＦ−α（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ５７０１０８、Ｌｏｔ  Ｂ１３７１４３）を抗原として使用した。
【０１０８】
ａ）パニング
溶液パニングのために、ＴＮＦ−αをＥｐｏｘｙ  Ｍ−４５０磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０、Ｄｙｎａｌ）に共有結合させ、ファージディスプレイ抗体ライブラリーのファージ製剤を洗浄し、Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）でブロックする。
【０１０９】
アダリムマブ／ＴＮＦ−α複合体を提供するために、磁気ビーズに結合した組み換えＴＮＦ−αを、アダリムマブと共にプレインキュベートした。１回目のパニングのために、Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）及びＴｗｅｅｎ／ＰＢＳの存在下、ファージ−抗体を、精製ヒトＩｇＧ１κ（５０μｇ／ｍＬ）、１０％ヒト血清、５０ｇ／ｍｌリツキシマブ（ＩｇＧ１κ）及び１μｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−αの存在下、アダリムマブ／ＴＮＦ−α複合体に加えて、ＩｇＧ１κ及び遊離ＴＮＦ−αに特異的な、又はヒト血清の任意の構成成分と交差反応する全ファージ−抗体を吸着させた。ローテータ上にて２〜８℃で一晩インキュベートした後、ファージ−抗原混合物をチューブに移動し、磁気分離器を使用して磁気ビーズを捕捉した。ビーズから上清を注意深く除去し、残ったビーズをＰＢＳＴで洗浄した。
【０１１０】
続く２回目及び３回目のパニングを、遊離ＴＮＦ−αの濃度を増大させて（２回目のパニングで５μｇ／ｍｌ；３回目のパニングで２５μｇ／ｍｌ）厳格性を増大させ、同様の方法で行い、遊離ＴＮＦ−αと交差反応した抗体を廃棄した。
【０１１１】
パニングの各回後、残ったファージを溶出し、溶出したファージを大腸菌ＴＧ１細菌の感染に直ちに使用した。ヘルパーファージを使用することによるファージの救助後、ポリクローナル増幅ファージ出力を再度タイター（ｔｉｔｅｒ）し、連続選択ステップに使用した。３回目のパニング後、溶出した抗原特異的ファージのＤＮＡを、感染細菌から単離し、ＦａｂコードＤＮＡを、ＰＣＲを介して特定のＦａｂ発現ベクター内にサブクローン化した。Ｆａｂコードベクターを使用したＴＧ１−Ｆ細菌の形質転換後、ＨｕＣＡＬ−Ｆａｂ断片を含む周辺質抽出物の単一クローン発現、及び調製を行った。Ｆａｂ含有周辺質抽出物を、初期スクリーニング及び特徴付けに使用した。
【０１１２】
更なる特徴付けのために、精製Ｆａｂを使用した。ＴＧ−１細胞内でのＦａｂ断片の発現を、１ｍＭクロラムフェニコール及び０．１％ブドウ糖で補充した５００ｍｌの２ｘＹＴ培地を使用して、シェーカーフラスコ内で行った。発現は、０．７５ｍＭ  ＩＰＴＧを３０℃で２０時間加えることにより誘導した。リゾチーム、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ及びＢｅｎｚｏｎａｓｅを含む溶解緩衝液を使用して細胞を破壊し、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によりＦａｂ断片を単離した。ＵＶ分光光度法によりタンパク質濃度を決定した。Ｆａｂ断片の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して変性、還元状態にて分析し、ＨＰ−ＳＥＣにより天然状態にて分析した。
【０１１３】
完全長ＩｇＧｓを発現するために、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＧ４＿Ｐｒｏ、及びヒトＩｇＧ１ｆ  ＬＡＬＡに関して、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインを、Ｆａｂ発現ベクターから適切なｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈｌｇベクター内にサブクローン化した。
【０１１４】
ｂ）スクリーニング
一次スクリーニングをＥＬＩＳＡにより行った。上述したパニング手順の結果から３６８のクローンを無作為に選定し、３８４ウェルのＥＬＩＳＡプレート内で成長させた。抗体発現の誘導（０．７５ｍＭ  ＩＰＴＧ、３０℃で２０時間）と、リゾチームを使用した細胞溶解の後、抗体を含む細胞溶解物をＥＬＩＳＡにて試験した。
【０１１５】
従って、以下の抗原、アダリムマブ／ＴＮＦ−α複合体、骨髄腫細胞ラインからの精製ヒトＩｇＧ１／κ；リツキシマブ及び遊離組み換えＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡプレート上に被覆した。
【０１１６】
複合体上で正（背景の少なくとも５倍のシグナル）であったが、他の抗原に結合しなかった、全部で１２のクローンを同定した。その後、１２のクローンを配列決定して独特の抗体を同定した。７つの独特の配列が同定できた。これらの７つのクローンを発現及び精製した後、特徴付けた。
【０１１７】
ｃ）特徴付け
最初に、７つの抗体を、ＥＬＩＳＡにて、一連の無関連及び関連抗原並びにアダリムマブ／ＴＮＦ−α複合体に対する特異的結合に関して試験し、ここでアダリムマブをプレート上に被覆して、ＴＮＦ−αを複合体の形成に供し、又はその逆の何れかであった。従って、５μｇ／ｍＬの各抗原をマイクロタイタープレート上に一晩被覆した。５％ＢＳＡで洗浄及びブロッキングした後、Ｆａｂ−ＦＨフォーマットの抗アダリムマブ／ＴＮＦ−α抗体（２μｇ／ｍＬ溶液から２０μＬ）を加えた。検出は、ＨＲＰ標識抗Ｈｉｓ抗体及びＱｕａｎｔａＢｌｕ蛍光ペルオキシダーゼ基質を使用して行った。ＡｄａＴＮＦ＃１及びＡｄａＴＮＦ＃５は、複合体に対して高い特異性を有することが証明された（図１）。
【０１１８】
次のステップでは、抗体を異なる固定化抗原上に滴定することにより、ＡｄａＴＮＦ＃５をより詳細に試験した。試験した濃度範囲（０．０３〜２０００ｎｇ／ｍＬ）に亘って、抗体は、アダリムマブ／ＴＮＦ−α複合体のみに結合し、インフリキシマブ／ＴＮＦ−α複合体、非結合アダリムマブ又は遊離ＴＮＦ−α、及び他の抗原には結合しなかった（図２）。
【０１１９】
ＡｄａＴＮＦ＃５を完全長ヒトＩｇＧ１フォーマットに変換し、ヒト細胞ライン中で発現させ、タンパク質Ａクロマトグラフィーを介して精製して更に分析した。最初に、（二価）ＩｇＧ１フォーマットの抗体が尚、同一の特異性を示すか否かを試験した。抗原を５μｇ／ｍＬでマイクロタイタープレート上に一晩被覆した。５％ＢＳＡで洗浄及びブロッキングした後、ＨＲＰ結合ＡｄａＴＮＦ＃５−ｈＩｇＧ１（ＨｉＳｐｅｃ緩衝液中の２μｇ／ｍＬ溶液から２０μＬ）を加えた。検出は、ＱｕａｎｔａＢｌｕ（登録商標）蛍光ペルオキシダーゼ基質を使用して行った。ＨＲＰに結合した精製ＡｄａＴＮＦ＃５−ｈＩｇＧ１は、アダリムマブとＴＮＦ−αとの複合体に特異的に結合した。（図３）
【０１２０】
更なる特徴付けのために、固定化アダリムマブ−ＴＮＦ−α複合体に関する、ＡｔｔａｎａＡ２００機器を使用したリアルタイム標識遊離分子相互作用分析により、ＡｄａＴＮＦ＃５の一価固有親和性をｋＤ＝６７ｎＭとして測定した。次いで、複合体特異的抗体ＡｄａＴＮＦ＃５を、ヒト血清中に添加したアダリムマブの決定に使用できるか否かを試験した。ヒトＴＮＦ−αを５μｇ／ｍＬでマイクロタイタープレート上に被覆し、一晩インキュベートした。ＰＢＳＴ中の５％ＢＳＡで洗浄及びブロッキングした後、増大する濃度のアダリムマブを１０％ヒト血清中に添加し、予備被覆プレートに適用した。洗浄後、抗アダリムマブ／ＴＮＦ−α  ｈＩｇＧ１抗体ＡｄａＴＮＦ＃５（ＨＲＰに結合した）を２μｇ／ｍＬで加えた。検出は、ＱｕａｎｔａＢｌｕ（登録商標）蛍光ペルオキシダーゼ基質を加えることにより行った。ＡｄａＴＮＦ＃５は、アダリムマブＴＮＦ−α複合体に用量依存的に結合した（図４）。従って、この新規な特異性を使用して、最も頻繁に使用されている架橋フォーマットに依存しない非常に高感度の定量化アッセイを開発することができる。
【０１２１】
実施例２：インフリキシマブ／ＴＮＦ−α複合体に特異的なＦａｂ断片及び抗体の生成及び特徴付け。
インフリキシマブＴＮＦ−α複合体に特異的に結合する抗体を同定するために、溶液パニング手法において、磁気ビーズ及びインフリキシマブに結合した組み換えＴＮＦ−α（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ５７０１０８、Ｌｏｔ  Ｂ１３７１４３）を抗原として使用した。
【０１２２】
パニング及びスクリーニングは、実施例１に記載したように行った。一次スクリーニングの後、３つの独特の抗体がインフリキシマブ／ＴＮＦ−α複合体に結合することが同定され、これらを発現させ、精製し、更なる特徴付け試験に供した。
【０１２３】
ＩＦＸ−ＴＮＦ＃１、ＩＦＸ−ＴＮＦ＃２及びＩＦＸ−ＴＮＦ＃３を、一連の無関連及び関連抗原並びにインフリキシマブ／ＴＮＦ−α複合体に対する特異的結合に関してＥＬＩＳＡにて試験した。従って、５μｇ／ｍＬの各抗原をマイクロタイタープレート上に一晩被覆した。Ａ５％ＢＳＡで洗浄及びブロッキングした後、Ｆａｂ−ＦＨフォーマットの抗インフリキシマブ／ＴＮＦ−α抗体（２μｇ／ｍＬ溶液から２０μＬ）を加えた。検出は、ＨＲＰ標識抗Ｈｉｓ抗体及びＱｕａｎｔａＢｌｕ蛍光ペルオキシダーゼ基質を使用して行った。ＩＦＸ−ＴＮＦ＃１は、複合体に対して高い特異性を有することが証明された（図５）。
【０１２４】
実施例３：ＭＱＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ複合体に特異的なＦａｂ断片及び抗体の生成及び特徴付け。
ＭＯＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ複合体に特異的に結合する抗体を同定するために、固相パニング手法において、組み換えビオチン化ヒトＧＭ−ＣＳＦ及びＭＯＲ１０３を抗原として使用した。
【０１２５】
ａ）パニング
実施例１に記載したパニング手順に従って、ファージ製剤を調製した。
【０１２６】
ＭＯＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ複合体を提供するために、組み換えＧＭ−ＣＳＦをストレプトアビジン被覆プレート上に固定化し、ＭＯＲ１０３を加えて複合体を形成した。
【０１２７】
全３回のパニングを、１００μｇ／ｍｌのＭＯＲ３２０７（リゾチーム特異的ヒトＩｇＧ１）及び５μｇ／ｍｌの遊離ＧＭ−ＣＳＦの存在下で行った。実施例１に記載したように、単離されたファージのＤＮＡをＦａｂ−発現ベクター内にサブクローン化し、各クローンを一次スクリーニングに供した。
【０１２８】
ｂ）スクリーニング
一次スクリーニングをＥＬＩＳＡにより行った。上述したパニング手順の結果から３６８のクローンを無作為に選定し、２８４ウェルのＥＬＩＳＡプレート内で成長させた。抗体発現の誘導（０．７５ｍＭＩＰＴＧ、３０℃で２０時間）と、リゾチームを使用した細胞溶解の後、抗体を含む細胞溶解物をＥＬＩＳＡにて試験した。
【０１２９】
従って以下の抗原、ＭＯＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ複合体、精製ヒトＭＯＲ３２０７（ＩｇＧ１／κ）；ＭＯＲ１０３及び遊離組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦをＥＬＩＳＡプレート上に被覆した。
【０１３０】
複合体上で正（背景の少なくとも５倍のシグナル）であったが、他の抗原に結合しなかった全部で３つの独特のクローンを同定した。その後、選択したクローンを発現及び精製し、一連の無関連及び関連抗原並びにＭＯＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ複合体に対する特異的結合に関してＥＬＩＳＡにて試験した。
【０１３１】
５μｇ／ｍＬの各抗原（ＢＳＡ、ＧＳＴ、ＭＯＲ０３２０７及びＭＯＲ１０３）をマイクロタイタープレート上に一晩被覆した。ビオチン化ＧＭ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ−ｂｉｏ）の固定化のために、ニュートラアビジンを５μｇ／ｍＬで一晩被覆し、５％ＢＳＡでブロックした後、ＧＭ−ＣＳＦ−ｂｉｏを加えた。ＭＯＲ１０３を５μｇ／ｍｌで加えてＧＭ−ＣＳＦ−ｂｉｏを固定化することにより各ＭＯＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ−ｂｉｏ複合体を形成した。５％ＢＳＡで洗浄及びブロッキングした後、Ｃ末端６−Ｈｉｓタグを含むＦａｂフォーマットの抗ＭＯＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ抗体（２ｇ／ｍＬ溶液から２０μＬ）を加え、その後、抗Ｈｉｓ検出抗体を使用して検出し、洗浄後、ＱｕａｎｔａＢｌｕ蛍光ペルオキシダーゼ基質を使用して定量化した。
【０１３２】
３つの全抗体（Ｍ１０３ＧｍＣＳＦ＃１、Ｍ１０３ＧｍＣＳＦ＃２、及びＭ１０３ＧｍＣＳＦ＃３）は、ＭＯＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ複合体を特異的に検出するが、ＧＭ−ＣＳＦ又はＭＯＲ１０３単独は検出しないことが分かった（図６）。ＭＯＲ１０３に対するＭ１０３ＧｍＣＳＦ＃１の幾分かの結合が観察されたが、続く滴定ＥＬＩＳＡで確認できなかった。
【０１３３】
ｃ）特徴付け
Ｍ１０３ＧｍＣＳＦ＃１を更に特徴付けた。ＭＯＲ１０３単独、ビオチン化ＧＭ−ＣＳＦ、又はＭＯＲ１０３に結合したビオチン化ＧＭ−ＣＳＦの何れかをアビジン被覆プレート上に被覆した。ＨｉｓタグＭ１０３ＧｍＣＳＦ＃１Ｆａｂを濃度を増大させて加え、Ｈｉｓ特異的ＰＯＤ結合二次抗体を使用して検出し、ＱｕａｎｔａＢｌｕ蛍光ペルオキシダーゼ基質を使用して定量化した。Ｍ１０３ＧｍＣＳＦ＃１は、薬物−標的複合体に対する結合に高い選択性を示し、個々のタンパク質（薬物及び標的）には示さなかった（図７）。薬物−標的複合体に対するＭ１０３ＧｍＣＳＦ＃１Ｆａｂの一価親和性：ｋＤ＝４．９ｎＭ。
【０１３４】
実施例４：同族抗体とその抗原との複合体に特異的な抗体を使用して、ヒト血清中の抗体／抗原複合体を検出するアッセイ。
ヒト血清又は血漿からの特定の抗体／抗原複合体を監視及び定量化するために、ＭＳＤ（登録商標）（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）技術に基づいて、頑強な薬物動態学的検出アッセイを確立した。
【０１３５】
手短には、ＰＢＳに溶解した２μｇ／ｍｌのラット抗ヒトＧＭ−ＣＳＦを、Ｍｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ（登録商標）９６ウェルプレートの標準プレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；Ｃａｔ：Ｌ１１ＸＡ−３）の各ウェルに被覆した。
【０１３６】
翌日、ＭＯＲ１０３（ｈＩｇＧ；ＤＳＭ：Ｐ１９２９２；ＣＭＣ２；ｃｏｎｃ．：２．０ｍｇ／ｍＬ）及びＧＭ−ＣＳＦ（Ｂａｙｅｒ；ＮＤＣ５０４１９−００２−３３  Ｌｏｔ：Ｂ１６８９１；ｃｏｎｃ．：０．２５ｍｇ／ｍＬ）をＬＣＢ緩衝液（ＬｏｗＣｒｏｓｓ−Ｂｕｆｆｅｒ、Ｃａｎｄｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ  Ｃａｔ＃１００５００、Ｌｏｔ＃１００Ｃ４３４ｃ）中で希釈した。ＭＯＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ複合体を形成するために、ＭＯＲ１０３及びＧＭ−ＣＳＦを５：１比で混合し、１００％ヒト血清（プールした、男性；Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ：Ｈ４５２２；Ｌｏｔ：１１Ｍ０６０５）で補充した。１時間のインキュベーション後、ＭＯＲ１０３及びＧＭ−ＣＳＦミックスをＬＣＢ緩衝液で２倍に希釈し、最終血清濃度５０％をもたらし、プレインキュベーションプレートから予備被覆Ｍｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ（登録商標）９６ウェルプレートに移動し、更に室温で１時間インキュベートした。アッセイプレートをＰＢＳＴを使用して洗浄し、４００ｎｇ／ｍｌのＥＣＬ標識Ｍ１０３ＧｍＣＳＦ＃１  ＩｇＧ（Ｌｏｔ：１１０８０１＿１１ＳＴＥ１１＊１；ＥＣＬ−標識：Ｌｏｔ：１１０８３１＿５ＡＵＮ５１；ｃｏｎｃ．：ＰＢＳ中１．７ｍｇ／ｍＬ）を１時間加えてＭＯＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ複合体を検出し、続いてＭＳＤ読み取り用緩衝液（ｒｅａｄ  ｂｕｆｆｅｒ）Ｔ（Ｃａｔ：Ｒ９２ＴＣ−１）を使用して定量化し、ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）内で測定した。
【０１３７】
滴定曲線全体において、ＭＯＲ１０３／ＧＭ−ＣＳＦ複合体は、ヒト血清の存在下、用量依存的に特異的に検出され、各濃度に関する逆精度（ｂａｃｋ  ａｃｃｕｒａｃｙ）は、少なくとも９６〜１０４％であった（下記参照、図８）。
0006437913.tif 000006
【０１３８】
本開示を完全に記載してきたが、例示であり、更なる限定を意味するものではない以下の例及び特許請求の範囲により更に説明される。
【０１３９】
前述の書面による明細書は、当業者が本開示を実施することを可能にするのに十分であると考慮される。しかしながら、文章中に前述のものが如何に詳細に記載され得るかに係わらず、本開示は多数の方法で実施することができ、添付の特許請求の範囲及びその任意の等価物に従って解釈するべきであることを認識するであろう。
【図１】
0006437913.tif 000007
【図２】
0006437913.tif 000008
【図３】
0006437913.tif 000009
【図４】
0006437913.tif 000010
【図５】
0006437913.tif 000011
【図６】
0006437913.tif 000012