(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなるβ−キシロシダーゼ触媒領域を有することを特徴とする、耐熱性β−キシロシダーゼ。
【請求項２】
β−グルコシダーゼ活性を有する、請求項１に記載の耐熱性β−キシロシダーゼ。
【請求項３】
（ａ）配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｄ）配列番号２、４、又は６で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるβ−キシロシダーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、β−グルコシダーゼ活性も有する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
【請求項７】
真核微生物である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の形質転換体内で、耐熱性β−キシロシダーゼを生産することを含む、耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法。
【請求項９】
請求項１若しくは２に記載の耐熱性β−キシロシダーゼ、又は請求項３若しくは４に記載のポリヌクレオチドがコードする耐熱性β−キシロシダーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
【請求項１０】
セルロースを含む材料を、請求項１若しくは２に記載の耐熱性β−キシロシダーゼ、請求項３若しくは４に記載のポリヌクレオチドがコードする耐熱性β−キシロシダーゼ、又は請求項９に記載のグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、リグノセルロース分解物を生産することを含む、リグノセルロース分解物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性β−キシロシダーゼ、当該耐熱性β−キシロシダーゼをコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性β−キシロシダーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体及び当該耐熱性β−キシロシダーゼを用いたリグノセルロース分解物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
輸送用エネルギー供給に関わる懸念に加え、地球温暖化や大気汚染などの環境上の問題から、近年、石油代替エネルギー開発は非常に重要な課題である。植物バイオマスは、地球上に最も豊富にある再生可能エネルギー源であり、石油代替資源として期待されている。植物バイオマスの主要構成要素であるリグノセルロースは、セルロースやヘミセルロース（キシラン、アラビナン及びマンナンを含む）等の多糖類とリグニンである。これら多糖類は多様なグリコシド加水分解酵素によってグルコースやキシロース等の単糖に加水分解され、バイオ燃料や化成品原料として利用される。
【０００３】
リグノセルロースは複雑な構造を持ち、難分解性であり、単一の酵素では分解、糖化が難しい。このため、多糖類の中、セルロースの加水分解には、一般的に、グリコシド加水分解酵素のエンドグルカナーゼ（エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．４）、エキソ型のセロビオハイドロラーゼ（１，４−β−セロビオシダーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．９１）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）の３種の酵素が必要とされる。一方、ヘミセルロースの構造は植物の種類によって異なるが、例えば、広葉樹や草本等はキシランが主要な構成成分となっている。キシランの加水分解には、キシラナーゼ（エンド−１，４−β−キシラナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．８）、β−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３７）が必要とされる。β−キシロシダーゼは、キシラナーゼによるヘミセルロースの加水分解により生じたオリゴ糖を加水分解し、単糖を生成するプロセスに関わる加水分解酵素の一つである。
【０００４】
従来のリグノセルロースを資源とするバイオエタノール製造では、エタノールの高エネルギー効率変換を目的として、高固体負荷（３０〜６０％  ｓｏｌｉｄ  ｌｏａｄｉｎｇ）による糖化処理が試みられている。このような高固体負荷によるリグノセルロースの酵素糖化は、バイオマス糖化液の粘性が高く、リグノセルロースの加水分解反応が進み難い。そこで、耐熱性酵素を用いて、例えば８０℃以上の高温で酵素糖化処理を行うことにより、加水分解反応速度が上昇することに加えて、バイオマス糖化液の粘性が低下することから、糖化反応時間の短縮及び酵素量の削減が達成できると期待される。このため、各種グリコシド加水分解酵素について、より耐熱性に優れた酵素の開発が望まれている。
【０００５】
多くの耐熱性グリコシド加水分解酵素は、高温環境に生息する好熱性微生物を分離、同定し、これら培養分離された微生物から遺伝子をクローニングし、ＤＮＡ配列を決定した後、大腸菌や糸状菌などにより発現させることにより得られてきた。例えば、特許文献１には、糸状菌由来のβ−キシロシダーゼが、特許文献２には、糸状菌アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)由来のβ−キシロシダーゼであって、３０℃で酵素活性を示すものが、特許文献３には、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）由来のβ−キシロシダーゼであり、ｐＨ５．５以下、５０℃以上で酵素活性を示すものが、特許文献４には、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）由来のβ−キシロシダーゼであり、４５℃で酵素活性を示すものが、それぞれ開示されている。また、非特許文献１〜６には、特定の細菌や糸状菌から単離されたβ−キシロシダーゼであって、至適温度が６０℃付近のものが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表平１１−５０７８３７号公報
【特許文献２】特開平１１−３１３６８３号公報
【特許文献３】特表２０１１−５２３３４６号公報
【特許文献４】特開２０１３−５９２７２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kormelink et al.，Journal of Biotechnology，1993，vol.27，p.249-265.
【非特許文献２】Herrmann et al.，Biochemical Journal，1997，vol.321，p.375-381.
【非特許文献３】kitamoto et al.，Applied and Environmental Microbiology，1999，vol.65，p.20-24.
【非特許文献４】La Grange et al.，Applied and Environmental Microbiology，2001，vol.67，p.5512-5519.
【非特許文献５】Shao et al.，Applied and Environmental Microbiology，2011，vol.77，p.719-726.
【非特許文献６】Morais et al.，Journal of Biological Chemistry，2012，vol.287，p.9213-9221.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド（ＰＮＰＸ）を基質とした加水分解活性を示す新規な耐熱性β−キシロシダーゼ、当該耐熱性β−キシロシダーゼをコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性β−キシロシダーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体、及び当該耐熱性β−キシロシダーゼを用いたリグノセルロース分解物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、温泉高温土壌から直接ＤＮＡを抽出し、難培養性微生物叢の大規模メタゲノムシーケンスを行うことにより、新規アミノ酸配列を持つ耐熱性β−キシロシダーゼの取得に成功し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼ、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法、グリコシド加水分解酵素混合物及びリグノセルロース分解物の製造方法は、下記［１］〜［１０］である。
［１］  （Ａ）配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなるβ−キシロシダーゼ触媒領域を有することを特徴とする、耐熱性β−キシロシダーゼ。
［２］  β−グルコシダーゼ活性を有する、前記［１］の耐熱性β−キシロシダーゼ。
［３］  （ａ）配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｄ）配列番号２、４、又は６で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるβ−キシロシダーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
［４］  前記ポリペプチドが、β−グルコシダーゼ活性も有する、前記［３］のポリヌクレオチド。
［５］  前記［３］又は［４］のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
［６］  前記［５］の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
［７］  真核微生物である、前記［６］の形質転換体。
［８］  前記［６］又は［７］の形質転換体内で、耐熱性β−キシロシダーゼを生産することを含む、耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法。
［９］  前記［１］若しくは［２］の耐熱性β−キシロシダーゼ、前記［３］若しくは［４］のポリヌクレオチドがコードする耐熱性β−キシロシダーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
［１０］  セルロースを含む材料を、前記［１］若しくは［２］の耐熱性β−キシロシダーゼ、前記［３］若しくは［４］のポリヌクレオチドがコードする耐熱性β−キシロシダーゼ、又は前記［９］のグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、リグノセルロース分解物を生産することを含む、リグノセルロース分解物の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼは、少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性を有する。このため、当該耐熱性β−キシロシダーゼは、高温条件下におけるセルロースの糖化処理に好適である。
また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの製造に好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】β−キシロシダーゼ遺伝子クローンＡＲ１９Ｍ−３１１−２のアミノ酸配列（配列番号１）とディクチオグロムス・サーモフィラム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）のＧＨ３ファミリーに属するβ−キシロシダーゼ（配列番号１０）のアミノ酸配列アライメント図である。
【図２】オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−３１１のアミノ酸配列（配列番号１）とＡＲ１９Ｍ−３１１−２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）とＡＲ１９Ｍ−３１１−１１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号５）とのアミノ酸配列アライメント図である。
【図３】実施例１において、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＡＲ１９Ｍ−３１１−２タンパク質（左）、及びＡＲ１９Ｍ−３１１−１１遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＡＲ１９Ｍ−３１１−１１タンパク質（右）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。
【図４】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｍ−３１１−２タンパク質の各基質に対する加水分解活性の測定結果を示した図である。
【図５】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｍ−３１１−２タンパク質の各温度におけるＰＮＰＸ加水分解活性（ｐＨ４．０）を計測した結果を示した図である。
【図６】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｍ−３１１−２タンパク質の各ｐＨにおけるＰＮＰＸ加水分解活性（７０℃）を計測した結果を示した図である。
【図７】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｍ−３１１−２タンパク質が示す、熱変性に伴って引き起こされるＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅの蛍光強度変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［耐熱性β−キシロシダーゼ］
糸状菌、細菌、アーキアを含む多くの微生物は難培養性であり、土壌など微生物環境に生息する菌の９９％が未知の菌であるといわれている。特に、高温環境に生息する微生物の培養は極めて困難であり、現在の微生物培養技術では土壌中に生息する微生物の０．１％以下を単離・培養しているにすぎないと考えられている。この高温土壌微生物の難培養性が、耐熱性酵素の開発が進まない一因である。
【００１４】
近年、ギガ塩基対の大量配列解読を可能にした次世代ギガシーケンサーが開発されたことにより、土壌等に含まれる微生物叢のゲノムを丸ごと解読することが可能となった。この解析技術を利用して、土壌などの環境サンプルから微生物集団のゲノムＤＮＡを調製し、ゲノム構成が不均一、雑多な集団について直接ゲノムを網羅的に解読し、並列コンピュータにより解読データをアセンブルすることで微生物叢ゲノム配列を再構成するメタゲノム解析法が提案され、難培養性微生物のゲノム解読が急速に進展した。
【００１５】
本発明者らは、後記実施例１に示すように、採取した高温温泉土壌から微生物集団のゲノムＤＮＡ（メタゲノムＤＮＡ）を調製し、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンス及びアノテーションを行い、既知のβ−グルコシダーゼ酵素又はβ−キシロシダーゼ酵素と類似したアミノ酸配列を持つオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）４０６個を得た。これらのＯＲＦのうち、β−グルコシダーゼ触媒領域（触媒ドメイン）又はβ−キシロシダーゼ触媒領域が確認できた完全長ＯＲＦについて、ＯＲＦの塩基配列情報に基づいてプライマーを設計し、ＰＣＲ法により、高温温泉土壌メタゲノムＤＮＡから遺伝子候補をクローニングした。ＰＣＲクローニングされたＤＮＡを大腸菌に組込み、当該塩基配列がコードするタンパク質を発現させ、ＰＮＰＸ分解活性アッセイによる機能スクリーニングを行った。最終的に、これらのＯＲＦの中からＰＮＰＸ分解活性を持つ２個の耐熱性β−キシロシダーゼＡＲ１９Ｍ−３１１−２及びＡＲ１９Ｍ−３１１−１１を得た。ＡＲ１９Ｍ−３１１−２のアミノ酸配列を配列番号３に、塩基配列を配列番号４に、ＡＲ１９Ｍ−３１１−１１のアミノ酸配列を配列番号５に、塩基配列を配列番号６に、それぞれ表す。
【００１６】
後記実施例１に示すように、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２は、ＰＮＰＸに対し高い加水分解活性を示し、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＰＮＰＧ）に対しても分解活性を示す。一方でＡＲ１９Ｍ−３１１−２は、リン酸膨潤アビセル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｗｏｌｌｅｎ  Ａｖｉｃｅｌ、ＰＳＡ）、結晶性セルロースのアビセル（Ａｖｉｃｅｌ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、β−１，３結合とβ−１，６結合グルカンからなるラミナリン（Ｌａｍｉｎａｒｉｎ）、β−１，３結合とβ−１，４結合グルカンからなるリケナン（Ｌｉｃｈｅｎａｎ）、及びキシラン（Ｘｙｌａｎ）に対し、ほとんど分解活性は示さない。この基質特異性から、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２は少なくともβ−キシロシダーゼ活性を有するグリコシド加水分解酵素であることが示唆される。
【００１７】
なお、本発明及び本願明細書において、β−キシロシダーゼ活性とは、ＰＮＰＸを基質とする加水分解活性を意味する。
また、本発明及び本願明細書において、β−グルコシダーゼ活性とは、ＰＮＰＧを基質とする加水分解活性を意味する。
【００１８】
ＡＲ１９Ｍ−３１１−２のアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して検索したところ、最も配列同一性が高かったアミノ酸配列は、ディクチオグロムス・サーモフィラム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）のＧＨ３ファミリーに属するβ−キシロシダーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  登録ＩＤ：ＹＰ＿００２２５０５６７．１）（配列番号１０）であり、その配列同一性（相同性）は７０％であった。基質特異性及び既知のタンパク質とのアミノ酸配列の配列同一性から、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２は、ＧＨ３ファミリーに属する新規なβ−キシロシダーゼであることが明らかとなった。
【００１９】
ＡＲ１９Ｍ−３１１−２は、少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性（β−キシロシダーゼ活性）を有する。実際に、後記実施例１＜１０＞に示すように、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２は、３０〜９０℃の広い温度範囲内でキシロシダーゼ活性を示す。大腸菌を宿主として発現させたＡＲ１９Ｍ−３１１−２のキシロシダーゼ活性は、３０〜８０℃の範囲内では温度が高くなるにつれて高くなり、８０〜１００℃の範囲内では、温度が高くなるにつれてキシロシダーゼ活性は低下する。また、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２のＰＮＰＸ分解活性の至適温度Ｔｏｐｔ＝８０℃、熱崩壊温度Ｔｍ＝８２．７℃を示し、既知のβ−キシロシダーゼに匹敵する高い熱安定性を持つ耐熱性β−キシロシダーゼである。ＡＲ１９Ｍ−３１１−２のＰＮＰＸ分解活性の至適ｐＨは４．０であるが、ｐＨ３．５〜ｐＨ８．０の広い範囲で高いキシロシダーゼ活性を示す。
【００２０】
一般的に何らかの生理活性を有するタンパク質は、その生理活性を損なうことなく、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。つまり、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２に対しても、β−キシロシダーゼ活性をはじめとするグリコシド加水分解活性を失わせることなく、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。
【００２１】
すなわち、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼは、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかからなるβ−キシロシダーゼ触媒領域を有する、耐熱性グリコシド加水分解酵素である。
（Ａ）配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド。
【００２２】
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が欠失する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸の一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が置換する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸が別のアミノ酸に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が付加される」とは、ポリペプチド中に新たなアミノ酸が挿入されることを意味する。
【００２３】
前記（Ｂ）のポリペプチドにおいて、配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
【００２４】
前記（Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、８０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、８５％以上１００％未満であることが好ましく、９０％以上１００％未満であることがより好ましく、９５％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９８％以上１００％未満であることがよりさらに好ましい。
【００２５】
なお、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００２６】
前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドとしては、人工的に設計されたものであってもよく、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２等のホモログ又はその部分タンパク質であってもよい。
【００２７】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、アミノ酸配列に基づいて化学的に合成してもよく、後記の本発明に係るポリヌクレオチドを用いて、タンパク質発現系によって生産してもよい。また、前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づいて、アミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて人工的に合成することもできる。
【００２８】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性（β−キシロシダーゼ活性）を有する。このため、前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドをβ−キシロシダーゼ触媒領域として有することにより、耐熱性β−キシロシダーゼが得られる。
【００２９】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼは、ＰＮＰＸを基質とする。当該耐熱性β−キシロシダーゼは、ＰＮＰＸ以外のその他のβグルカン等を基質としてもよい。本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼが基質とし得るものとしては、例えば、ＰＮＰＧ、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｌ−アラビノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−マンノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；リケナン等のβ−１，３結合とβ−１，４結合からなるグルカン；キシラン；アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）、結晶性バクテリアセルロース(Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＢＭＣＣ)、濾紙などの結晶性セルロース、非結晶性セルロースのリン酸膨潤アビセル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｗｏｌｌｅｎ  Ａｖｉｃｅｌ、ＰＳＡ）、ＣＭＣ、セロビオース等のβ−１，４結合からなるグルカン；ラミナリン等のβ−１，３結合とβ−１，６結合からなるグルカン；β−１，３結合からなるグルカン；ゲンチオビオース等のβ−１，６結合からなるグルカン等が挙げられる。本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼとしては、ＰＮＰＸに加えて、ＰＮＰＧ、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｌ−アラビノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−マンノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、及びｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドからなる群より選択される１種以上を基質とするものが好ましく、ＰＮＰＧを基質とするものがより好ましい。
【００３０】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼは、少なくともｐＨ４．０の条件下で、ＰＮＰＸを基質とする加水分解活性（β−キシロシダーゼ活性）を、７０〜８５℃の温度範囲内で示すことが好ましく、６０〜８５℃の温度範囲内で示すことがより好ましく、３０〜９０℃の温度範囲内で示すことがさらに好ましい。本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの至適温度は、７０〜８５℃の範囲内にあることが好ましく、７５〜８５℃の範囲内にあることがより好ましい。
【００３１】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの至適ｐＨは、反応温度に依存して変化するものの、ｐＨ４．０〜６．０の範囲内にある。本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼとしては、少なくともｐＨ４．０〜８．０の範囲内においてβ−キシロシダーゼ活性を示すものが好ましい。
【００３２】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼは、β−キシロシダーゼ活性以外のグリコシド加水分解活性を有していてもよい。その他のグリコシド加水分解活性としては、エンドグルカナーゼ活性、キシラナーゼ活性、β−グルコシダーゼ活性、又はセロビオハイドロラーゼ活性等が挙げられる。本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼとしては、β−キシロシダーゼ活性に加えて、β−グルコシダーゼ活性も有していることが好ましい。
【００３３】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼは、前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのいずれかからなるβ−キシロシダーゼ触媒領域のみからなる酵素であってもよく、その他の領域を含んでいてもよい。その他の領域としては、公知のβ−キシロシダーゼが有する、酵素触媒領域以外の領域が挙げられる。例えば、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼには、公知のβ−キシロシダーゼに対し、酵素触媒領域を前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドに置換することによって得られる酵素も含まれる。
【００３４】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼがβ−キシロシダーゼ触媒領域以外の領域を含む場合、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ様ドメインを含むことも好ましい。Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ様ドメインは、β−キシロシダーゼ触媒領域の上流（Ｎ末端側）にあってもよく、下流（Ｃ末端側）にあってもよい。また、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ様ドメインとβ−キシロシダーゼ触媒領域は、直接結合していてもよく、適当な長さのリンカー領域を介して結合していてもよい。本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼとしては、β−キシロシダーゼ触媒領域の上流又は下流に、リンカー領域を介してＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ様ドメインが存在しているものが好ましく、β−キシロシダーゼ触媒領域の下流にリンカー領域を介してＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ様ドメインが存在しているものがより好ましい。
【００３５】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼは、その他にも、そのＮ末端又はＣ末端に、細胞内の特定の領域に移行させて局在させ得るシグナルペプチドや、細胞外へ分泌するシグナルペプチドを有していてもよい。このようなシグナルペプチドとして、例えば、アポプラスト移行シグナルペプチド、小胞体保留シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、又は分泌型シグナルペプチド等がある。小胞体保留シグナルペプチドとして、例えば、ＨＤＥＬのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド等がある。本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼが、そのＮ末端又はＣ末端にシグナルペプチドを有している場合には、形質転換体中で発現させた耐熱性β−キシロシダーゼを、細胞外へ分泌させたり、細胞中の小胞体等に局在させることができる。
【００３６】
また、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼは、その他にも、発現系を用いて生産した場合に簡便に精製可能とするため、例えば当該耐熱性β−キシロシダーゼのＮ末端やＣ末端に、各種タグが付加されていてもよい。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現又は精製において汎用されているタグを用いることができる。
【００３７】
［耐熱性β−キシロシダーゼをコードするポリヌクレオチド］
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼをコードする。当該耐熱性β−キシロシダーゼは、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、当該宿主の発現系を利用して生産することができる。
【００３８】
具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドは、下記（ａ）〜（ｅ)のいずれかの塩基配列からなるβ−キシロシダーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチドである。
【００３９】
（ａ）配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号２、４、又は６で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号２、４、又は６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
【００４０】
なお、本願及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が欠失する」とは、ポリヌクレオチドを構成しているヌクレオチドの一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が置換する」とは、ポリヌクレオチドを構成している塩基が別の塩基に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が付加される」とは、ポリヌクレオチド中に新たな塩基が挿入されることを意味する。
【００４１】
本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００４２】
前記（ａ）〜（ｅ）の塩基配列においては、縮重コドンは、宿主のコドン使用頻度の高いものを選択することが好ましい。例えば、前記（ａ）の塩基配列としては、配列番号２、４、又は６で表される塩基配列であってもよく、配列番号２、４、又は６で表される塩基配列を、コードするアミノ酸配列は変更せずに、宿主において使用頻度の高いコドンへ改変した塩基配列であってもよい。コドンの改変は、公知の遺伝子配列変異技術又は人工遺伝子合成によって行うことができる。
【００４３】
配列番号２、４、又は６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、塩基配列情報に基づいて化学的に合成してもよく、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２をコードする遺伝子（「ＡＲ１９Ｍ−３１１−２遺伝子」ということがある。）の全長若しくはβ−キシロシダーゼ触媒領域を含む部分領域（例えば、配列番号３中の１８位のトレオニン（Ｔ）から３４２位のアラニン（Ａ）までの３２５アミノ酸からなる部分領域をコードする領域や、３８１位のイソロイシン（Ｉ）から６１６位のトレオニン（Ｔ）までの２３６アミノ酸からなる部分領域をコードする領域や、１８位のトレオニンから６１６位のトレオニンまでの５９９アミノ酸からなる部分領域をコードする領域）を遺伝子組換え技術によって自然界から取得したものであってもよい。ＡＲ１９Ｍ−３１１−２遺伝子の全長又はその部分領域は、例えば、自然界から微生物を含むサンプルを取得し、当該サンプルから回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２、４、又は６で表される塩基配列に基づいて常法により設計したフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。当該サンプルから回収したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型としてもよい。なお、鋳型となる核酸を回収するサンプルは、温泉土壌等の高温環境下から採取されたサンプルであることが好ましい。
【００４４】
前記（ｄ）の塩基配列において、配列番号２、４、又は６で表される塩基配列との配列同一性は、８０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、８５％以上１００％未満であることが好ましく、９０％以上１００％未満であることがより好ましく、９５％以上１００％未満であることがさらに好ましい。
【００４５】
なお、塩基配列同士の配列同一性（相同性）は、２つの塩基配列を、対応する塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く塩基配列全体に対する一致した塩基の割合として求められる。塩基配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明における塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００４６】
例えば、前記（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２、４、又は６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、１又は２以上の塩基を欠失、置換若しくは付加することによって人工的に合成することができる。また、前記（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）の塩基配列としては、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２遺伝子のホモログ遺伝子の全長配列又はその部分配列であってもよい。ＡＲ１９Ｍ−３１１−２遺伝子のホモログ遺伝子は、塩基配列が既知の遺伝子のホモログ遺伝子を取得する際に用いられる遺伝子組換え技術によって取得することができる。
【００４７】
本発明に係るポリヌクレオチドは、β−キシロシダーゼ触媒領域をコードする領域のみを有するものであってもよく、当該領域に加えて、セルロース結合モジュール、リンカー配列、各種シグナルペプチド、各種タグ等をコードする領域を有していてもよい。
【００４８】
［発現ベクター］
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドを発現し得る。すなわち、前記本発明に係るポリヌクレオチドが、前記本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼを発現し得る状態で組込まれた発現ベクターである。具体的には、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、前記本発明に係るポリヌクレオチド、及びターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットが、発現ベクターに組込まれていることが必要である。なお、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより、ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことができる。ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組み込みでは、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
【００４９】
本発明及び本願明細書において、発現ベクターとは、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、外来ＤＮＡを組込むための配列を有するＤＮＡ、及びターミネーター配列を有するＤＮＡを含むベクターである。
【００５０】
当該発現ベクターとしては、大腸菌等の原核細胞へ導入されるものであってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞へ導入されるものであってもよい。これらの発現ベクターとしては、それぞれの宿主に応じて通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。
【００５１】
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された細胞と形質転換されていない細胞の選抜を容易に行うことができるためである。当該薬剤耐性遺伝子として、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びビアラホス耐性遺伝子等がある。
【００５２】
［形質転換体］
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る発現ベクターが導入されている。当該形質転換体中では、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼを発現させ得る。発現ベクターを導入する宿主としては、大腸菌等の原核細胞であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞であってもよい。大腸菌の形質転換体を培養することにより、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼを、より簡便かつ大量に生産することができる。一方で、真核細胞内ではタンパク質に糖鎖修飾が施されるため、真核細胞の形質転換体を用いることにより、原核細胞の形質転換体を用いた場合よりも、より耐熱性に優れた耐熱性β−キシロシダーゼを生産し得る。
【００５３】
発現ベクターを用いて形質転換体を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換体を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。当該方法として、例えば、ヒートショック法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等がある。このうち、宿主が植物細胞である場合には、パーティクルガン法又はアグロバクテリウム法で行うことが好ましい。
【００５４】
宿主として、原核細胞、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、又は哺乳培養細胞等を用いた場合には、得られた形質転換体は、一般的には、形質転換前の宿主と同様にして、常法により培養することができる。
【００５５】
［耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法］
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、耐熱性β−キシロシダーゼを生産する方法である。前記本発明に係るポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体内では、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼが恒常的に発現している。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体に対しては、それぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことにより、当該形質転換体内に耐熱性β−キシロシダーゼを発現させる。
【００５６】
形質転換体によって生産された耐熱性β−キシロシダーゼは、当該形質転換体内に留めた状態で使用してもよく、当該形質転換体から抽出・精製してもよい。
【００５７】
形質転換体から耐熱性β−キシロシダーゼを抽出又は精製する方法は、耐熱性β−キシロシダーゼの活性を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織からポリペプチドを抽出する場合に通常用いられている方法によって抽出することができる。当該方法として、例えば、形質転換体を適当な抽出バッファーに浸し、耐熱性β−キシロシダーゼを抽出した後、抽出液と固形残渣に分離する方法が挙げられる。当該抽出バッファーとしては、界面活性剤等の可溶化剤を含有するものが好ましい。形質転換体が植物である場合には、抽出バッファーに浸す前に、予め当該形質転換体を細断又は粉砕しておいてもよい。また、抽出液と固形残渣を分離する方法としては、例えば、濾過方法、圧縮濾過方法、又は遠心分離処理方法等の公知の固液分離処理を用いることができ、抽出バッファーに浸した状態の形質転換体を搾ってもよい。抽出液中の耐熱性β−キシロシダーゼは、塩析法、限外濾過法、又はクロマトグラフィー法等の公知の精製方法を用いて精製することができる。
【００５８】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼを、形質転換体内で分泌型シグナルペプチドを有する状態で発現させた場合には、当該形質転換体を培養した後、得られた培養物から形質転換体を除いた培養液上清を回収することにより、簡便に耐熱性β−キシロシダーゼを含む溶液を得ることができる。また、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼが、Ｈｉｓタグ等のタグを有している場合、当該タグを利用したアフィニティクロマトグラフィ法により、抽出液や培養上清中の耐熱性β−キシロシダーゼを簡便に精製することができる。
【００５９】
すなわち、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、耐熱性β−キシロシダーゼを生産すること、及び所望により前記形質転換体から前記耐熱性β−キシロシダーゼを抽出し精製することを含む。
【００６０】
［グリコシド加水分解酵素混合物］
前記本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼ、又は前記本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−キシロシダーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を含むグリコシド加水分解酵素混合物として使用することもできる。前記本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−キシロシダーゼは、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出又は精製されたものであってもよい。本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼを、その他のグリコシド加水分解酵素との混合物として多糖類の加水分解反応に用いることにより、難分解性であるリグノセルロースをより効率よく分解させることができる。
【００６１】
当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記耐熱性β−キシロシダーゼ以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、リグノセルロースの加水分解活性を有するものであれば特に限定されるものではない。当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記β−キシロシダーゼ以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、例えば、キシラナーゼ等のヘミセルラーゼ、セロビオハイドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、又はエンドグルカナーゼ等が挙げられる。本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物としては、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼの少なくとも一方を含むものが好ましく、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼを両方含むものがより好ましい。中でも、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上のグリコシド加水分解酵素を含むものが好ましく、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びエンドグルカナーゼを全て含むものがより好ましい。
【００６２】
当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれるその他のグリコシド加水分解酵素は、少なくとも８５℃でグリコシド加水分解酵素活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましく、７０〜９０℃でグリコシド加水分解酵素活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることがより好ましい。当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる全ての酵素が耐熱性であることにより、当該グリコシド加水分解酵素混合物によるリグノセルロースの分解反応を高温条件下で効率よく行うことができる。すなわち、当該グリコシド加水分解酵素混合物が耐熱性グリコシド加水分解酵素のみを含む場合、当該グリコシド加水分解酵素混合物をリグノセルロース糖化処理に用いることにより、糖化温度７０〜９０℃の高温環境下でリグノセルロース加水分解反応を行うことが可能になる。この高温糖化により、酵素量と糖化時間を著しく減らすことができ、糖化コストが大幅に削減される。
【００６３】
［リグノセルロース分解物の製造方法］
本発明に係るリグノセルロース分解物の製造方法は、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼにより、キシラナーゼによりへミセルロースが加水分解して生じたオリゴ糖、若しくはセロビオハイドロラーゼによりセルロースが加水分解して生じたオリゴ糖を単糖に加水分解する、リグノセルロース分解物を得る方法である。具体的には、ヘミセルロース若しくはセルロースを含む材料を、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼ、本発明に係る形質転換体、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−キシロシダーゼ、又は本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、ヘミセルロース若しくはセルロース分解物を生産する。
【００６４】
ヘミセルロース、若しくはセルロースを含む材料としては、ヘミセルロース、若しくはセルロースが含まれていれば特に限定されるものではない。当該材料としては、例えば、雑草や農業系廃棄物等のセルロース系バイオマス、又は古紙等が挙げられる。当該セルロースを含む材料は、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼと接触させる前に、破砕若しくは細断等の物理的処理、酸若しくはアルカリ等による化学処理、又は適当なバッファーへの浸漬又は溶解処理等を行っておくことが好ましい。
【００６５】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼによるヘミセルロースの加水分解反応の反応条件は、当該耐熱性β−キシロシダーゼがセロオリゴ糖加水分解活性を示す条件であればよい。例えば、６０〜９０℃、ｐＨ５．０〜９．０で反応を行うことが好ましく、７０〜９０℃、ｐＨ５．０〜９．０で反応を行うことがより好ましく、７０〜９０℃、ｐＨ６．０〜８．５で反応を行うことがさらに好ましい。前記加水分解反応の反応時間は、加水分解に供されるセルロースを含む材料の種類、前処理の方法、又は量等を考慮して適宜調整される。例えば、１０分間〜１００時間、セルロース系バイオマスを分解する場合には、１〜１００時間の反応時間で前記加水分解反応を行うことができる。
【００６６】
リグノセルロースの加水分解反応には、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼに加えて、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を用いることも好ましい。その他のグリコシド加水分解酵素としては、前記グリコシド加水分解酵素混合物に含められるグリコシド加水分解酵素と同様のものを用いることができ、少なくとも８５℃で、好ましくは少なくとも７０〜９０℃でグリコシド加水分解酵素活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましい。また、当該リグノセルロース分解物の製造方法には、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼ、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−キシロシダーゼに代えて、前記グリコシド加水分解酵素混合物を用いてもよい。
【実施例】
【００６７】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６８】
［実施例１］温泉土壌からの新規耐熱性β−キシロシダーゼのクローニング
＜１＞  温泉土壌からのＤＮＡ抽出と全ゲノムシーケンス（Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＷＧＳ）
７０〜９０℃で活性を示す新規耐熱性β−キシロシダーゼの遺伝子探索を目的として、中性〜弱アルカリ性温泉から土壌ＤＮＡを採取し、これらの土壌を構成する微生物叢メタゲノムＤＮＡの塩基配列解読を行った。
中性〜弱アルカリ性温泉土壌サンプルとして、野外にて高温の温泉が噴き出している日本国内の３ヶ所、５地点（メタゲノムＤＮＡサンプルＮ２、ＡＲ１９、ＡＲ１５、ＯＪ１、及びＨ１）から、土壌、泥、バイオマットを含む温泉水を採取した。これらの温泉土壌サンプルは、採取時の温度５８〜７８℃、ｐＨ７．２〜８のレンジにあった。
【００６９】
採取した温泉土壌サンプル１０ｇから、ＤＮＡ抽出キット（ＩＳＯＩＬ  Ｌａｒｇｅ  ｆｏｒ  Ｂｅａｄｓ  ｖｅｒ．２、ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ社製）を使い、ＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡに対して、ロシュダイアグノスティックス社製のシーケンサーＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ４５４及びイルミナ社製のシーケンサーＨｉｓｅｑ２０００を用いて、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンスを行った。４５４シーケンサーには抽出されたＤＮＡ５μｇを用い、Ｈｉｓｅｑ２０００シーケンサーには、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  Ｖ２  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて増幅した産物を用いて、メタゲノムＤＮＡの配列解読を行った。Ｈｉｓｅｑ２０００によるシーケンスでは、イルミナ社製のｃＢｏｔを用いてＤＮＡライブラリー及び試薬をフローセルに流し込み、ＤＮＡ１分子から、自動的に同一配列をもつクラスターをフローセル内に形成させた。Ｈｉｓｅｑ２０００を用いて１０１ｂｐのペアエンドシーケンスを行い、メタゲノムシーケンスデータを得た。
【００７０】
温泉土壌サンプルＡＲ１９について、メタゲノムＤＮＡの配列解読を行い、４５４シーケンサーにおいては平均リード長３９６ｂｐ、総リード数２，７６６,３３２個、総ゲノム解読量１，１０６，２４３，２８０ｂｐを得、Ｈｉｓｅｑ２０００シーケンサーにおいては平均リード長９２．６５ｂｐのペアエンドで、総リード数８９４，２３８，０９６個、総ゲノム解読量８３，１１２，１６８，７５５ｂｐを得、合計して８４．２Ｇｂｐの全ゲノムシーケンス（ＷＧＳ）データセットを得た。
【００７１】
＜２＞  温泉メタゲノムデータのアセンブルと統計量
４５４シーケンサー及びＨｉｓｅｑ２０００シーケンサーで読みとられた塩基配列に対して、ＣＬＣｂｉｏ社製のＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ｖｅｒ５．５．１）を用いてクオリティーフィルタリング及びＤｅｎｏｖｏアセンブリングを行った。クオリティーフィルタリング後には、４５４シーケンサーで得られたリードの総リード長は２，７６６,３２８ｂｐとなり、Ｈｉｓｅｑ２０００シーケンサーで得られた塩基配列データの総リード長は８１，３２３，６９２，５６３ｂｐとなった。アセンブリング後には、５００ｂｐ以上の長さを持つコンティグの数は９６７，９２５個、総全長は４１９，７８７，６０３ｂｐとなり、このうち最大コンティグ長は２８７，６４１ｂｐであった。
【００７２】
＜３＞  β−キシロシダーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測
ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（http://www.uniprot.org/）からＥＣ番号が３．２．１．４（セルラーゼ）、３．２．１．２１（β−グルコシダーゼ)、３．２．１．３７（β−キシロシダーゼ) 、３．２．１．９１（セルロース  １，４−β−セロビオシダーゼ)、３．２．１．８（エンド１，４−β−キシラナーゼ）の配列をダウンロードし（アクセス日：２０１１／１２／９）、これらグリコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースを構築した。アノテーションソフトウェアＭｅｔａｇｅｎｅ（Noguchi et al., DNA Research，2008,15(6)）を使用して、前記＜２＞で得たコンティグ配列から、遺伝子領域（＝オープンリーディングフレーム）を推定した（Ｍｅｔａｇｅｎｅ  ｏｐｔｉｏｎ：−ｍ）。推定されたＯＲＦからグリコシド加水分解酵素遺伝子を抽出するために、ＢＬＡＳＴＰ（ｂｌａｓｔａｌｌ  ｖｅｒ. ２．２．１８）を使い、前記ローカルデータベースに参照した。ＢＬＡＳＴＰのｏｐｔｉｏｎ条件は、「Ｆｉｌｔｅｒ  ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝ｆａｌｓｅ」、「Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ（Ｅ）＜１ｅ−２０」［以下、デフォルト値：Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ａ  ｇａｐ＝−１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｇａｐ＝−１、Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝０、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｆｏｒ  ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｈｉｔｓ＝０、Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ＝ｄｅｆａｕｌｔ］とし、ヒットしたＯＲＦ配列をグリコシド加水分解酵素遺伝子として収集した。収集された塩基配列は、セルラーゼ、エンドヘミセルラーゼ、脱分岐酵素等のグリコシド加水分解酵素を含んでいた。
【００７３】
＜４＞  遺伝子のグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリー分類
前記＜３＞で収集された塩基配列について、タンパク質の機能領域配列データベースｐｆａｍ  ＨＭＭｓ（Ｐｆａｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２３．０  ａｎｄ  ＨＭＭＥＲ  ｖ２．３；Finn et al.，Nucleic Acids Research Database，2010，Issue 38，p.D211-222)を基準に、機能分類を行った。具体的には、タンパク質モチーフ検索プログラムＨＭＭＥＲ（Durbin et al.，‘The theory behind profile HMMs. Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids’, 1998，Cambridge University Press.；ｈｍｍｐｆａｍ（Ｖｅｒ．２．３．２）、Ｅ−ｖａｌｕｅ  ｃｕｔｏｆｆ＜１ｅ−５; Ｄａｔａｂａｓｅ＝Ｐｆａｍ＿ｆｓ（ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｆｉｎｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．))を用いて、Ｐｆａｍ領域データベースとの相同性から、前記＜３＞で収集された各塩基配列についてグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリーを決定した。なお、ＧＨ触媒ドメインの配列を７０％以上カバーしているものを、各ファミリーに属する酵素遺伝子としてカウントした。
【００７４】
８４．２Ｇｂｐ長のメタゲノムＡＲ１９シーケンスデータから、Ｍｅｔａｇｅｎｅにより６０２，５８９個のＯＲＦが予測され、完全長のＯＲＦは２５１，１４６個であった。ＢＬＡＳＴＰによる相同性検索から、β−グルコシダーゼ又はβ−キシロシダーゼ配列として４０６個のＯＲＦがヒットした。 この４０６個のＯＲＦの中、ｐｆａｍ  ＨＭＭｓにより、１６８個がβ−グルコシダーゼ遺伝子又はβ−キシロシダーゼ遺伝子と予測され、２３８個（完全長ＯＲＦが９２個、不完全長ＯＲＦが１４６個）がＧＨ触媒ドメインの配列のカバー率が７０％未満、若しくは、ｐｆａｍデータベースにヒットしない配列であった。
【００７５】
β−グルコシダーゼ遺伝子又はβ−キシロシダーゼ遺伝子と予測されたＯＲＦ１６８個のＧＨファミリー分類結果を表１に示す。ＧＨ触媒ドメインのカバー率が７０％未満の配列及びＰｆａｍとの相同性が確認できなかった配列は、ＧＨ不明に分類した。表１に示すように、ＡＲ１９メタゲノムからは、β−グルコシダーゼ又はβ−キシロシダーゼと予測されたＯＲＦであって、ＧＨ１ファミリーに属する完全長ＯＲＦが１９個、ＧＨ３ファミリーに属する完全長ＯＲＦが５７個、ＧＨ３１ファミリーに属する完全長ＯＲＦが１３個、ＧＨ４３ファミリーに属する完全長ＯＲＦが１３個、それぞれ得られた。β−グルコシダーゼ遺伝子又はβ−キシロシダーゼ遺伝子と推定された全ての完全長ＯＲＦについて、プライマーを設計し、温泉土壌メタゲノムＤＮＡからＰＣＲにより遺伝子をクローニングした。この結果、ＧＨ３ファミリーに属し、キシロシダーゼ配列を持つオープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−３１１から、β−キシロシダーゼ遺伝子が単離された。
【００７６】
【表１】
0006364662.tif 000002
【００７７】
＜５＞  オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−３１１
オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−３１１は、７５１アミノ酸残基からなるポリペプチド（配列番号１）をコードし、１位のアミノ酸残基がメチオニンから開始し、３’末端が終始コドンで終わる完全長配列（配列番号２）であった。モチーフの配列相同性から、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−３１１は、１８位のトレオニン（Ｔ）から３４２位のアラニン（Ａ）までの３２５アミノ酸がＧｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ３の触媒ドメインのＮ末端側ドメインであり、３８１位のイソロイシン（Ｉ）から６１６位のトレオニン（Ｔ）までの２３６アミノ酸がＧｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ３の触媒ドメインのＣ末端側ドメインであり、６５１位のグルタミン酸（Ｅ）から７２０位のセリン（Ｓ）までの７０アミノ酸がＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ様ドメインであるマルチドメインタンパク質をコードしていると推測された。シグナル配列予測ソフトウェアＳｉｇｎａｌＰ  ４．１を使った解析によれば、開始コドンである１位のメチオニン（Ｍ）から１７位までのアミノ酸配列はいかなる分泌シグナルもコードしておらず、機能は不明であった。
【００７８】
＜６＞  遺伝子クローニング
配列番号９で表される塩基配列からなるフォワードプライマー（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＧＡＴＧＧＴＴＡＣＡＡＡＧ−３’：配列番号７で表される塩基配列の５’末端側に４塩基（ＣＡＣＣ）付加したもの。５’側に付加したＣＡＣＣは、ベクターに挿入するための配列である。）と配列番号８で表される塩基配列からなるリバースプライマー（５’−ＴＴＡＡＧＧＴＴＣＴＡＴＡＡＴＴＡＣＣＴＣＧＣＴＡＧ−３’）を用い、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  Ｖ２  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＧＥヘルスケア社製）で増幅した温泉土壌ＤＮＡをテンプレートにして、ＰＣＲを行った。配列番号７で表される塩基配列は、配列番号２、４、又は６で表される塩基配列の１〜２３位の塩基からなる部分配列と相同的な（同一の）塩基配列である。また、配列番号８で表される塩基配列は、配列番号２、４、又は６で表される塩基配列の２２３１〜２２５６位の塩基からなる部分配列と相補的な塩基配列である。増幅したＰＣＲ産物は、Ｃｈａｍｐｉｏｎ  ｐＥＴ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ（登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）のｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入し、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０株に形質転換した。コロニーＰＣＲによりポジティブクローンを選抜し、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃、２００ｒｐｍで１７〜２０時間培養した後、ミニプレップキット（Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）  ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドの調製を行った。調製したプラスミドは、ライフテクノロジーズ社の３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンサーを用いて配列確認を行った。
【００７９】
ＰＣＲクローニングにより、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−３１１から２個の遺伝子クローンＡＲ１９Ｍ−３１１−２及びＡＲ１９Ｍ−３１１−１１を得た。β−キシロシダーゼ候補遺伝子ＡＲ１９Ｍ−３１１−２（以下、「ＡＲ１９Ｍ−３１１−２遺伝子」という。）の塩基配列（配列番号４）とβ−キシロシダーゼ候補遺伝子ＡＲ１９Ｍ−３１１−１１（以下、「ＡＲ１９Ｍ−３１１−１１遺伝子」という。）の塩基配列（配列番号６）は、いずれもオープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−３１１（配列番号２）と同様に２２５６ｂｐを含み、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−３１１とはそれぞれ１９塩基、又は２０塩基異なっていた。表２に、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２遺伝子及びＡＲ１９Ｍ−３１１−１１遺伝子がオープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−３１１と相違している塩基を示した。オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−３１１とＡＲ１９Ｍ−３１１−２遺伝子及びＡＲ１９Ｍ−３１１−１１遺伝子の塩基配列の差異は、メタゲノムショットガンシーケンスデータのミスアセンブル、又は当該遺伝子の一塩基多形に起因すると考えられた。
【００８０】
【表２】
0006364662.tif 000003
【００８１】
ＡＲ１９Ｍ−３１１−２遺伝子がコードするポリペプチド（ＡＲ１９Ｍ−３１１−２）のアミノ酸配列（配列番号３）及びＡＲ１９Ｍ−３１１−１１遺伝子がコードするポリペプチド（ＡＲ１９Ｍ−３１１−１１）のアミノ酸配列（配列番号５）は、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−３１１がコードするアミノ酸配列（配列番号１）とはそれぞれ６アミノ酸、４アミノ酸異なっていた。表３に、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２及びＡＲ１９Ｍ−３１１−１１が、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−３１１がコードするタンパク質と相違しているアミノ酸残基を示す。さらに、図２に、ＡＲ１９Ｍ−３１１、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２及びＡＲ１９Ｍ−３１１−１１のアミノ酸残基の配列アライメントを示した。図中、「・」は同一のアミノ酸残基を示し、置換しているアミノ酸残基を白抜き文字で示している。ＡＲ１９Ｍ−３１１−２とＡＲ１９Ｍ−３１１−１１は、 ２箇所のアミノ酸残基が異なっており、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２の３５５位アラニン（Ａ）と６３５位のイソロイシン（Ｉ）が、ＡＲ１９Ｍ−３１１−１１ではいずれもバリン（Ｖ）である。
【００８２】
【表３】
0006364662.tif 000004
【００８３】
図１に、遺伝子クローンＡＲ１９Ｍ−３１１−２のβ−キシロシダーゼ触媒領域のアミノ酸配列とディクチオグロムス・サーモフィラムのＧＨ３ファミリーに属するβ−キシロシダーゼのアミノ酸配列アライメントを示す。図１中、黒白反転のアミノ酸は、これらの全アミノ酸配列において同一アミノ酸残基（identical）を示し、網掛けのアミノ酸は、これらのアミノ酸配列において類似アミノ酸残基(similar)を示し、「−」は欠失（ギャップ）を示す。ギャップを含むＡＲ１９Ｍ−３１１−２は、ディクチオグロムス・サーモフィラムのＧＨ３ファミリーに属するβ−キシロシダーゼと７０％の配列同一性を示していた。
【００８４】
＜７＞  遺伝子発現及びβ−キシロシダーゼ酵素タンパクの精製
シーケンス確認後、目的遺伝子（ＡＲ１９Ｍ−３１１−２遺伝子及びＡＲ１９Ｍ−３１１−１１遺伝子）をもつプラスミドを、ヒートショック法によりタンパク質発現用大腸菌へ導入した。形質転換用コンピテントセルは、Ｃｈａｍｐｉｏｎ（登録商標）  ｐＥＴ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ（登録商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）に付属するＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）株を用いた。目的の遺伝子をもつ大腸菌を１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００＝０．２〜０．８程度まで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、さらに５〜２０時間培養することによって、目的タンパク質の発現誘導を行った。培養後、遠心分離を行って大腸菌を回収し、培養液の１／１０容量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置ａｓｔｒａｓｏｎ３０００（ＭＩＳＯＮＩＸ社製）を用いて、５分間破砕−５分間休止工程を７〜８回繰り返し、目的タンパク質を含む遺伝子組換え大腸菌の粗抽出物を得た。当該遺伝子組換え大腸菌粗抽出物をフィルター（孔径φ＝０．４５μｍ、ミリポア社製）で濾過し、得られた濾液を遺伝子組換え大腸菌破砕上清とした。
【００８５】
ＡＲ１９Ｍ−３１１−２遺伝子及びＡＲ１９Ｍ−３１１−１１遺伝子の遺伝子組換え大腸菌破砕上清を、それぞれ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したイオン交換カラムＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、中高圧液体クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡ  ｄｅｓｉｇｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜５０％の濃度勾配でタンパク質を分画した。β−キシロシダーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、遠心式の限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ社製）によって７５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）へ溶液交換した。溶液交換後のβ−キシロシダーゼ活性分画を、同液で平衡化した疎水性相互作用分離カラムＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｎｅｎｙｌ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜１００％の濃度勾配でタンパク質を分画した。β−キシロシダーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後に、液量が８ｍＬ程度になるまでＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０を用いて濃縮した。濃縮したサンプルは、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したゲル濾過カラムＨｉｌｏａｄ２６／６０  ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、カラム体積の１〜１．５倍容の同バッファーを流速２〜３ｍＬ／ｍｉｎで流すことによって分画した。
【００８６】
次いで、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２に対しては、キシロシダーゼ活性のあった分画をまとめて混合し、ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０によって５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換と濃縮を行い、ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰを用いて、前記と同様にしてタンパク質をさらに分画した。その後、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２とＡＲ１９Ｍ−３１１−１１の両方に対し、キシロシダーゼ活性のあった分画をまとめて混合した後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換と濃縮を行い、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２は終濃度約３．７７ｍｇ／ｍＬ、ＡＲ１９Ｍ−３１１−１１は終濃度約３５．６ｍｇ／ｍＬの精製酵素を得た。
【００８７】
遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により確認した。遺伝子組換え大腸菌破砕上清５μｇ及び精製酵素０．５μｇに対し、２−メルカプトエタノール含有試料用緩衝４倍濃縮液（和光純薬社製）を１倍になるようにそれぞれ混合した後に９５℃で４分間処理した後、１０％のクライテリオンＴＧＸステインフリーゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて泳動を行った。泳動終了後、画像撮影システムＣｈｅｍｉＤｏｃ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により、タンパク質のバンドを可視化した。
【００８８】
図３に、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２遺伝子（図３左）又はＡＲ１９Ｍ−３１１−１１遺伝子（図３右）を導入した形質転換大腸菌から調製された遺伝子組換え大腸菌破砕上清及び当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清から精製された精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す。レーン１はタンパク質質量指標、レーン２は遺伝子組換え大腸菌破砕上清、レーン３は精製酵素の電気泳動パターンである。この結果、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２遺伝子とＡＲ１９Ｍ−３１１−１１遺伝子のいずれにおいても、前記遺伝子組換え大腸菌破砕上清（レーン２）において、アミノ酸配列（配列番号３又は５）から予想される質量近傍に強いバンドが認められ、精製酵素（レーン３）では、当該バンドに対応する単一バンドが認められた（図中、矢印）。
【００８９】
＜８＞  ＰＮＰＸを基質としたβ−キシロシダーゼ活性測定（ＰＮＰＸ加水分解活性）
精製したＡＲ１９Ｍ−３１１−２とＡＲ１９Ｍ−３１１−１１の比活性を比較するため、それぞれのＰＮＰＸ加水分解活性（β−キシロシダーゼ活性）を調べた。各酵素は、前記＜７＞で得られた精製酵素を水で１０ｎｇ／μＬに希釈した精製酵素溶液を用いた。
β−キシロシダーゼ活性測定には、ＰＮＰＸを基質として用いた。ＰＮＰＸ（Ｓｉｇｍａ社製）を水で溶かし、３．４ｍＭとなるように調整したものを、基質溶液として用いた。なお、以降の実験に用いたＰＮＰＸ基質溶液は、全て当該方法により調製した３．４ｍＭのＰＮＰＸ水溶液を用いた。
【００９０】
具体的には、１００μＬの３．４ｍＭのＰＮＰＸ水溶液と、５０μＬの２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ４．０）と、２０μＬの精製酵素溶液（１０ｎｇ／μＬ）と、３０μＬの精製水とからなる酵素溶液を、７０℃で２０分間反応させた。全ての計測において、遺伝子組換え大腸菌破砕上清又は精製酵素の代わりに精製水を入れて同条件で反応させた混合液をコントロール区とした。また、基質溶液と酵素（精製酵素溶液）は、反応温度で５分間それぞれ別々に保温した後に混合し、反応開始とした。反応終了後は、各混合液に対して等量の０．２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３溶液を加えて撹拌することにより反応を停止させた後、それを遠心し、上清を得た。上清中のｐ−ニトロフェノール量は、分光光度計を用いて４２０ｎｍの吸光度を計測し、予め作成していたｐ−ニトロフェノール量と４２０ｎｍの吸光度の検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素による加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求めた。１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。また各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。
【００９１】
この結果、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２とＡＲ１９Ｍ−３１１−１１はいずれもβ−キシロシダーゼ活性（ＰＮＰＸ加水分解活性）を有することが確認された。７０℃におけるＡＲ１９Ｍ−３１１−２の比活性（Ｕ／ｍｇ）は２８．１Ｕ／ｍｇであり、ＡＲ１９Ｍ−３１１−１１の比活性（Ｕ／ｍｇ）は２５．６Ｕ／ｍｇであった。そこで、以下の実験では、比活性がより高いＡＲ１９Ｍ−３１１−２を用いた。
【００９２】
＜９＞  ＡＲ１９Ｍ−３１１−２の基質特異性
ＡＲ１９Ｍ−３１１−２に対して、様々なセルロース基質とヘミセルロース基質に対する加水分解活性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素を水で１０ｎｇ／μＬに希釈した精製酵素溶液を用いた。また、基質として、ＰＳＡ、アビセル粉末、ＣＭＣ（Ｓｉｇｍａ社製）、キシラン（ブナ材由来、Ｓｉｇｍａ社製）、リケナン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、ラミナリン（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｄｉｇｉｔａｔａ由来、Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＸ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＧ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
ＰＳＡはリン酸溶液でアビセル粉末（微結晶性セルロース粉末、Ｍｅｒｃｋ社製）を一旦溶解させた後に滅菌蒸留水を加えて析出させた後、ｐＨが５以上になるまで洗浄することによって調製した。なお、以降の実験に用いたＰＳＡは全て当該方法により調製した。
【００９３】
具体的には、まず、反応液として、５０μＬの２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ４．０）と、２０μＬの精製酵素溶液（１０ｎｇ／μＬ）と、３０μＬの精製水とからなる混合液を７０℃で５分間プリインキュベーションした後、さらに１００μＬの各基質溶液（ＰＳＡ、アビセル粉末、ＣＭＣ、キシラン、リケナン、及びラミナリンは１質量％水溶液、ＰＮＰＸ及びＰＮＰＧは３．４ｍＭ水溶液）を添加し、得られた混合液を７０℃で２０分間（アビセル粉末を基質とした場合は２時間）インキュベートすることにより酵素反応を行った。ＰＳＡ、アビセル粉末、又はキシランを基質とした場合には、反応中、不溶性基質の沈殿を防ぐため、サーモミキサー（エッペンドルフ社製）により混合液に１４００ｒｐｍの振動を加えて撹拌した。
【００９４】
反応終了後、ＰＮＰＧ又はＰＮＰＸを基質とした反応においては、前記＜８＞のＡＲ１９Ｍ−３１１−２のＰＮＰＸ加水分解活性を調べた場合と同様にして、反応後の混合液の上清の４２０ｎｍの吸光度を測定し、加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。ＰＳＡ、アビセル粉末、ＣＭＣ、キシラン、リケナン、又はラミナリンを基質とした反応においては、反応終了後、等量の３，５−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＮＳ溶液）を加えて１００℃で５分間加熱処理し、５分間の冷却後に遠心し、上清を得た。上清中の還元糖量を、分光光度計を用いて５４０ｎｍの吸光度を計測し、グルコースで作成した検量線（キシランを基質とした場合はキシロースで作成した検量線）を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素による加水分解によって生成した還元糖量を求めた。１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。
【００９５】
各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。測定結果を図４に示す。この結果、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２はＰＮＰＸに対し高い加水分解活性を示し、ＰＮＰＧに対してもわずかな分解活性を示した。一方、その他の基質に対しては、ほとんど分解活性は示さなかった。
【００９６】
＜１０＞  ＰＮＰＸを基質としたβ−キシロシダーゼ活性のｐＨ及び温度依存性
ＡＲ１９Ｍ−３１１−２のＰＮＰＸ加水分解活性の温度依存性及びｐＨ依存性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素を水で１０ｎｇ／μＬに希釈した精製酵素溶液を用いた。
【００９７】
精製したＡＲ１９Ｍ−３１１−２のＰＮＰＸ加水分解活性のｐＨ依存性の測定は、１００μＬの３．４ｍＭ ＰＮＰＸ水溶液と、５０μＬのマッキルベインバッファー（ｐＨ３〜８）、５０μＬの酢酸バッファー（ｐＨ３．５〜６）、又は５０μＬのリン酸バッファー（ｐＨ６〜８）と、３０μＬの精製水と、２０μＬの精製酵素溶液（１０ｎｇ／μＬ）からなる混合液を、７０℃で２０分間反応させた以外は、前記＜８＞と同様に行い、酵素による加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、ＰＮＰＸ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
【００９８】
精製したＡＲ１９Ｍ−３１１−２のＰＮＰＸ加水分解活性の温度依存性の測定は、反応温度を３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００℃で行った以外は、前記＜８＞と同様に行い、酵素による加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、ＰＮＰＸ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
【００９９】
各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。計測結果を図５及び６に示す。図５は、横軸を温度として、各温度における精製酵素ＡＲ１９Ｍ−３１１−２のＰＮＰＸ加水分解活性（ｐＨ４．０）を計測した結果を示した図であり、図６は、横軸をｐＨとして、各ｐＨにおける精製酵素ＡＲ１９Ｍ−３１１−２のＰＮＰＸ加水分解活性（７０℃）を計測した結果を示した図である。図６中、「ＭＢ」はマッキルベインバッファー（ｐＨ３〜８）を用いた場合の結果を、「ＳＡＢ」は酢酸バッファー（ｐＨ３．５〜６）を用いた場合の結果を、「ＰＢ」はリン酸バッファー（ｐＨ６〜８）を用いた場合の結果を、それぞれ示す。ｐＨは、基質とバッファーと酵素の混合液の実測値をプロットした。
【０１００】
精製酵素ＡＲ１９Ｍ−３１１−２は、温度範囲７０〜８５℃において高いＰＮＰＸ加水分解活性を示した（図５）。最も高い活性を示した至適温度（Ｔｏｐｔ）は、ｐＨ４．０で８０℃であった。酵素反応温度を９０℃以上にした場合には、精製酵素ＡＲ１９Ｍ−３１１−２のＰＮＰＸ加水分解活性は急激に減少した。
【０１０１】
また、精製酵素ＡＲ１９Ｍ−３１１−２は、反応温度７０℃において、ｐＨ４．０〜８．０の範囲においてＰＮＰＸ加水分解活性を示した（図６）。精製酵素ＡＲ１９Ｍ−３１１−２の至適ｐＨは、反応温度７０℃で、ｐＨ４．１９（基質、バッファーと酵素の混合液の実測値）であった。
【０１０２】
＜１１＞  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙによるβ−キシロシダーゼの熱安定性測定
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ （ＤＳＦ）は、蛍光色素とリアルタイムＰＣＲ装置を用いて、タンパク質の熱変性を計測する方法の一つであり、様々なタンパク質に応用可能である。ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ等、ＤＳＦに使われる蛍光色素は、疎水性部位と結合する無極性条件下で蛍光を発し、一方、水に溶けた極性条件下では発光が抑えられる。通常、タンパク質はその熱変性温度において折畳み構造が解け、内部にある疎水性部位がタンパク質表面に露出する。この露出した疎水性部位にＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇが結合すると、波長４７０〜４８０ｎｍの励起光により、波長５９５ｎｍ付近にピークを持つ強い蛍光を発する。タンパク質溶液の温度を一定間隔で段階的に上昇させ、蛍光強度を計測することにより、熱崩壊温度（＝蛍光強度の変化点）が算出される。
【０１０３】
計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素ＡＲ１９Ｍ−３１１−２を水で１ｍｇ／ｍＬに調整した精製酵素溶液を用いた。
具体的には、９６穴ＰＣＲプレート（Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ  ９６  Ｗｅｌｌ  ＰＣＲ  Ｐｌａｔｅ  ＭＬＬ−９６５１、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）のウェルに１００倍希釈したＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（ライフテクノロジーズ社製）を２μＬ、濃度１ｍｇ／ｍＬの精製酵素溶液を１μＬ、２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ４．０）を５μＬ、精製水を１２μＬ加え、各ウェルの容積を２０μＬとした。ＰＣＲプレートはＯｐｔｉｃａｌ ８連フラットキャップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）でシールし、リアルタイムＰＣＲ装置（ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で０．２℃ずつ、３０℃から１００℃までウェルの温度を上昇させ、ターゲット温度が達成されてから１０秒間経過した後、各ウェルの蛍光強度を同時計測した。波長帯域４５０〜４９０ｎｍの光発光ダイオード（ＬＥＤ）によりＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅを励起し、ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ放射光は５６０〜５８０ｎｍレンジの帯域通過フィルターを通し、ＣＣＤカメラで蛍光強度の計測を行い、蛍光強度変化を温度の関数としてプロットした。リアルタイムＰＣＲに付属の解析ソフトウェアＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製)を使い、データ解析を行った。
【０１０４】
図７には、ＤＳＦ法により計測したＡＲ１９Ｍ−３１１−２酵素タンパク質が示す、熱変性に伴って引き起こされるＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅの蛍光強度変化を示す。図７の上段グラフは実測データであり、図７の下段グラフには、図７の上段グラフの蛍光強度変化曲線の１階微分「−ｄ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）／ｄｔ」を示している。熱変性温度（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；Ｔｍ値）は、温度関数である蛍光強度曲線の１階微分（図７の下段グラフのＹ軸に示した「−ｄ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）／ｄｔ」の極大値として定義した。蛍光強度曲線の一階微分から求めた、ＡＲ１９Ｍ−３１１−２酵素タンパク質は、ｐＨ４．０の時、７１．５±０．１（ｎ＝３）と８２．７±０．１（ｎ＝３）の２回、一階微分にピークを示した。 ＰＮＰＸ加水分解活性により算出した至適温度は８０℃であることから、１回目のピーク温度７１．５℃において、当該酵素タンパク質は何らかの構造変化を起こしたが、酵素活性は損なわれていない、と考えられた。２回目のピークは酵素活性の至適温度Ｔｏｐｔ＝８０℃に近い値を示し、この２回目のピークが示す温度が、この酵素の熱変性温度Ｔｍ＝８２．７℃であると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼは、少なくとも８０℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＮＰＸを基質とした加水分解活性を有しており、高温条件下におけるセルロース含有バイオマスの糖化処理に好適である。このため、当該耐熱性β−キシロシダーゼ及びその生産に用いられるポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、例えば、セルロース含有バイオマスからのエネルギー産生の分野において利用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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