(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともナノピペットの先端部を純水に浸して前記先端部の内側に前記純水を保持させる工程と、
前記先端部の内側に前記純水を保持させた状態で、下記化学式（１）で表されるオルガノシロキサン化合物を含むコーティング組成物を少なくとも前記先端部の外側表面に塗布する工程と
を備えているナノピペットの作製方法。
【化１】
0006437787.tif 000006
〔式（１）中、Ｒ１はメチル基又はエチル基を表し、ｍは１以上５以下の整数を表し、ｎは１以上５０００以下の整数を表し、ＸはＣｌ又はＦを表す。〕  
【請求項２】
請求項１に記載のナノピペットの作製方法において、
前記コーティング組成物の塗布工程では、前記コーティング組成物を含むコーティング液中で、前記ナノピペットの少なくとも前記先端部を浸漬することを特徴とするナノピペットの作製方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のナノピペットの作製方法において、
前記オルガノシロキサン化合物は下記化学式（２）で表される化合物であることを特徴とするナノピペットの作製方法。
【化２】
0006437787.tif 000007
〔式（２）中、ｎは１以上５０００以下の整数を表す。〕
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示された発明は、ナノピペット及びその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞工学の分野では、細胞の改質や遺伝子操作を行うために、所望の物質を細胞に導入することがよく行われる。細胞に物質を導入する方法の中で、ナノサイズのピペットを用いるマイクロインジェクションは、エレクトロポレーションやリポフェクションに比べ、各細胞に確実に所定量の物質を注入することができるという利点を有している。そのため、近年注目を浴びている人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの幹細胞に物質を導入する際にも、マイクロインジェクションが盛んに用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第２６８９８５９号明細書
【特許文献２】特表２０１２−５０６７７１号公報
【特許文献３】特表２０１３−５２９１１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、従来のナノピペットを用いたインジェクションでは、細胞にナノピペットを挿入し、引き抜く際に、細胞の成分が汚染物としてナノピペット表面に付着する。汚染物がナノピペットに付着すると、ナノピペットの先端部が細胞に差し込みにくくなるだけでなく、細胞に与えるダメージが大きくなる。
【０００５】
この不具合を解消するため、ナノピペットの先端部を振動させることで、細胞からの汚染物の付着を軽減する手法も開発されているが、汚染物が付着しやすい細胞に対してマイクロインジェクションを行う場合にどの程度の効果があるかは不明である。
【０００６】
一方で、特許文献１にはオルガノポリシロキサンが開示されている。また、特許文献２にはシリコン系ナノ粒子を含む組成物を用いて生物付着防止コーティングを行うことが開示され、特許文献３にはオルガノシラン等を含む組成物を用いてコーティングされた医療機器物品が開示されている。
【０００７】
しかし、これらの特許文献では、ナノピペットについて何ら言及されていない。
【０００８】
現在、マイクロインジェクションを受けた後の細胞の生存率は数％〜１０％程度と言われており、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の脆弱な細胞ではさらに生存率が低いと考えられる。このため、マイクロインジェクションを受けた後の細胞の生存率を向上させることが急務となっている。
【０００９】
本発明の目的は、汚染物の付着が低減され、耐久寿命のより長いナノピペットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書に開示されたナノピペットは、少なくとも外側表面が、下記化学式（１）で表されるオルガノシロキサン化合物を含むコーティング組成物によりコーティングされた先端部を備えている。
【００１１】
【化１】
0006437787.tif 000002
【００１２】
〔式（１）中、Ｒ１はメチル基又はエチル基を表し、ｍは１以上５以下の整数を表し、ｎは１以上５０００以下の整数を表し、ＸはＣｌ又はＦを表す。〕
また、本明細書に開示されたナノピペットの作製方法は、少なくともナノピペットの先端部を純水に浸して前記先端部の内側に前記純水を保持させる工程と、前記先端部の内側に前記純水を保持させた状態で、上記化学式（１）で表されるオルガノシロキサン化合物を含むコーティング組成物を少なくとも前記先端部の外側表面に塗布する工程とを備えている。
【発明の効果】
【００１３】
本明細書に開示されたナノピペットによれば、汚染物の付着が低減され、耐久寿命をより長くすることができる。本明細書に開示されたナノピペットの作製方法によれば、上述のナノピペットを容易に作製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１（ａ）は、本明細書に開示された実施形態に係るナノピペットの先端部を示す断面図であり、（ｂ）は、当該先端部の径方向の断面図である。
【図２】図２（ａ）、（ｂ）は、図１（ａ）、（ｂ）に示すナノピペットの作製方法を示す図である。
【図３】図３（ａ）は、先端部にコーティングが施されていないナノピペットを用いた場合に、細胞への挿入試験を行った後の先端部を示す電子顕微鏡写真図であり、（ｂ）は、先端部にコーティングが施されたナノピペットを用いた場合に、細胞への挿入試験を行った後の先端部を示す電子顕微鏡写真図である。
【図４】図４（ａ）は、使用前のナノピペットの先端部におけるラマンスペクトルを示す図であり、（ｂ）は、細胞への挿入試験を行った後のナノピペットの先端部におけるラマンスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
図１（ａ）は、本明細書に開示された実施形態に係るナノピペット１の先端部９を示す断面図であり、（ｂ）は、当該先端部９の径方向の断面図である。図１（ｂ）では、先端部９で径が最も狭まった部分の断面を示している。なお、以下の説明において、「ナノピペット」とは、先端部分の内径が１μｍ未満のピペットを意味するものとする。
【００１６】
図１（ａ）、（ｂ）に示すように、本実施形態のナノピペット１は、少なくとも外側表面５が、下記化学式（１）で表されるオルガノシロキサン化合物を含むコーティング組成物によりコーティングされた先端部９を備えている。このオルガノシロキサン化合物はクロロベンゼンで終端されたポリシロキサン高分子である。
【００１７】
【化１】
0006437787.tif 000003
【００１８】
ただし、式（１）中、Ｒ１はメチル基又はエチル基を表し、ｍは１以上５以下の整数を表し、ｎは１以上５０００以下の整数を表し、Ｘは塩素（Ｃｌ）又はフッ素（Ｆ）を表す。ここで、ｎが５０００を越えるとオルガノシロキサン化合物はゴム状となるため、ｎは５０００以下としている。
【００１９】
式（１）で表される化合物のうちでも、例えば下記式（２）で表されるオルガノシロキサン化合物を含むコーティング組成物が、本実施形態のナノピペット１のコーティングに好ましく用いられる。下式（２）中、ｎは１以上５０００以下の整数を表す。
【００２０】
【化２】
0006437787.tif 000004
【００２１】
ナノピペット１の先端部９を含む本体部分は、根元部分と先端部９とに開口が形成が設けられた細長い管状であり、例えばボロンシリケートガラスや石英等のガラス材料で構成される。ナノピペット１の全長は特に限定されないが、例えば５ｃｍ程度である。先端部９は、先端方向に向かうにつれて緩やかに径が細くなっており、細胞への挿入及び微細量の液体注入がしやすくなっている。
【００２２】
先端部９の端において、直径ｒは少なくとも１μｍ未満であるが、直径ｒ及び先端部９の外径Ｒは、注入を受ける細胞のサイズによって適宜変更すればよい。ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の幹細胞へのマイクロインジェクションに使用する場合には、直径ｒが５００ｎｍ〜６００ｎｍ程度であり、外径Ｒが０．８μｍ〜２μｍ程度であることが好ましい。
【００２３】
外径Ｒが２μｍを越えるとインジェクション時に幹細胞等に与えるダメージが大きくなり過ぎて細胞の生存率が落ちてしまう。  
【００２４】
本実施形態のナノピペット１は、例えば根元部分を市販のマニピュレーターシステムのインジェクター（図示せず）に接続することができる。このようなマニピュレーターシステムに接続する場合、顕微鏡で観察しながらナノピペット１を用いた細胞への物質注入（すなわちマイクロインジェクション）を行うことができる。なお、マイクロインジェクションを受ける細胞のサイズ及び種類には特に限定がないが、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の場合、直径は約１０μｍ程度である。
【００２５】
マイクロインジェクションを行う際には、ナノピペット１及びインジェクターにあらかじめ注入したい物質を含む液を保持させておき、先端部９を対象となる細胞に突き刺して液を注入する。ここで、インジェクターからナノピペット１にパルス状に空気を送ることで、一定量の液体が正確に細胞に注入される。注入が終わると細胞から先端部９を引き抜き、別の細胞への注入を連続的に行う。多数の細胞への物質注入を連続的に行い、先端部９が細胞の構成成分によって注入不能となる程度まで汚染された時点で、ナノピペット１を新しいものに交換する。
【００２６】
本実施形態のナノピペット１では、先端部９の外側表面５がオルガノシロキサン化合物を含むコーティング組成物によりコーティングされているので、コーティング領域３の表面張力がコーティングしない場合に比べて大幅に低減されている。このため、先端部９の外側表面５に細胞成分が付着しにくくなっており、結果としてナノピペット１の耐久寿命を大幅に延長することが可能となる。従って、ナノピペット１を交換する手間を軽減できるとともに、マイクロインジェクションに要するコストを低減することができる。
【００２７】
なお、式（２）中のＣｌ原子が、ベンゼン環のどの位置に結合していてもガラス等の表面張力を低減する効果は変わらないと考えられる。また、式（２）のＣｌをＦに置換した場合でも、同様の効果を発揮できると考えられる。
【００２８】
クロロベンゼンやフルオロベンゼンは有機溶媒として用いられたり、半導体プロセスにおいて有機物等の洗浄剤として用いられたりしている。コーティングに用いられるオルガノシロキサン化合物は、クロロベンゼンやフルオロベンゼンと同じ構造を有する官能基を、その繰り返し単位中に含んでいるので、細胞膜や血液などを弾く性質を持っている。
【００２９】
一般的に、ヒトを含めた動物細胞の至適培養温度は３７℃程度であるため、室温で行うマイクロインジェクションの作業時間が長くなると細胞にストレスがかかり、細胞の生存率が低下する。本実施形態のナノピペット１では、先端部９に汚れが付着しにくくなっているので、従来のナノピペットに比べてナノピペット１を交換する回数を大幅に減らすことができる。そのため、マイクロインジェクションに要する作業時間を大幅に短縮することができ、細胞にかかるストレスを最小限にとどめることが可能となる。
【００３０】
また、ナノピペット１に細胞膜や細胞質といった細胞の構成成分が付着しにくくなっていることで、先端部９を細胞に差し込む際、及び先端部９を細胞から引き抜く際に細胞が受ける物理的なダメージを小さくすることが可能となっている。
【００３１】
以上の理由により、本実施形態のナノピペット１を用いることにより、マイクロインジェクションを受けた後の細胞の生存率を大幅に向上させることが可能になる。例えばＥＳ細胞の核に所望の配列を有するＤＮＡを導入する場合、細胞の培養に長時間を要するにも関わらず、遺伝子組換えを起こす細胞は生存する細胞のうちのごく一部である。このような場合には、マイクロインジェクション後の細胞の生存率を向上させることで、所望の形質を有する細胞を得やすくなる。そのため、本実施形態のナノピペット１が所望の組換え細胞を得るための期間の短縮及びコスト削減に非常に効果的である。
【００３２】
先端部９のコーティングは、少なくともマイクロインジェクションの際に細胞に触れる範囲に施されてさえいれば、コーティング領域３の幅は特に限定されない。
【００３３】
また、本実施形態のナノピペット１において、先端部９の内側表面７には上述のコーティングが施されていないことがより好ましい。これは、以下の理由による。
【００３４】
ピペットの内径がナノメーターレベルになると、注入される液体は主に先端部の内側壁面を伝って先端部内を流れるようになる。このため、仮にナノピペットの先端部の内側表面がオルガノシロキサン化合物によってコーティングされていると、コーティングが無い場合と比べて液体の流れ方が変わる。また、液中の物質（タンパク質等）とコーティング膜のクロロベンゼン基又はフルオロベンゼン基との間の予測できない相互作用が起こり、インジェクション時にクロロベンゼン又はフルオロベンゼンが注入されてしまう可能性がある。
【００３５】
これに対し、本実施形態のナノピペット１では先端部９の内側表面７にコーティングが施されていないことにより、所定量の液体を正確に細胞内に注入しやすくなっているとともに、インジェクション時に余分な化学物質を注入しないよう工夫されている。
【００３６】
次に、本実施形態のナノピペット１の作製方法について説明する。図２（ａ）、（ｂ）は、本実施形態のナノピペット１の作製方法を示す図である。
【００３７】
まず、外径が１ｍｍ程度、内径が０．５ｍｍ程度でボロンシリケート等からなるガラスキャピラリをプラーにセットして、先端部の内径が１μｍ未満のナノピペット１ａを作製する。
【００３８】
次に、図２（ａ）に示すように、ナノピペット１ａの少なくとも先端部を容器１１に入れた純水１３に浸す。これにより、ナノピペット１ａの先端部の内側に純水が保持される。本工程において、浸漬時間は特に限定されないが、例えば１分間程度ナノピペット１ａを浸漬してもよい。
【００３９】
続いて、図２（ｂ）に示すように、ナノピペット１ａの先端部の内側に純水を保持させた状態で、化学式（１）で表されるオルガノシロキサン化合物を含むコーティング組成物を少なくとも先端部の外側表面５に塗布する。
【００４０】
【化１】
0006437787.tif 000005
【００４１】
上式（１）中、Ｒ１はメチル基又はエチル基を表し、ｍは１以上５以下の整数を表し、ｎは  以上    以下の整数を表し、ＸはＣｌ又はＦを表す。
【００４２】
本工程では例えば、ナノピペット１ａの先端部の内側に純水を保持した状態で、容器１５に入れた上式（１）で表されるオルガノシロキサン化合物を含むコーティング液１７に当該先端部を浸す。ここで用いられるコーティング液１７はオルガノシロキサン化合物以外の補助成分を含んでいてもよい。コーティング液の溶媒としてヘキサン等の有機溶媒を用いることができる。浸漬時間は特に限定されないが、例えば１０秒間程度で十分である。
【００４３】
コーティング液は疎水性なので、純水で満たされたナノピペット１ａの先端部の内側に侵入できず、先端部の外側表面５のみに塗布される。
【００４４】
次いで、ナノピペット１ａの先端部を純水でリンスして余剰のコーティング液１７を除去し、その後ナノピペット１ａを乾燥させる。これにより、先端部９の外側表面５がオルガノシロキサン化合物を含む組成物でコーティングされ、内側表面７がコーティングされないナノピペット１を容易に得ることができる。
【００４５】
ここで、コーティング剤として高分子のオルガノシロキサン化合物を用いていることにより、コーティング領域３を加熱せず、乾燥させるだけで繰り返しの使用に耐えるコーティングを形成することが可能になる。具体的には、塗布及び乾燥の過程でオルガノシロキサン化合物中のＳｉＯＨがガラス表面のＳｉＯＨと化学的に結合するので、一旦コーティングが形成された後は、マイクロインジェクション中にオルガノシロキサン化合物が溶け出すことはない。
【００４６】
なお、以上で説明したナノピペット１は本発明の実施形態の一例であって、ナノピペット本体の構成材料や内径及び直径等のサイズ、形状、コーティング組成物の組成等は本発明の趣旨を逸脱しない範囲において適宜変更してもよい。また、ナノピペット１の作製方法も上述の方法に限られず、例えばコーティング液１７の塗布をスプレー等の塗布機材を用いて行ってもよい。  
【実施例】
【００４７】
本実施形態のナノピペット１の効果を確認するために行った実験の結果を以下に示す。
【００４８】
−ナノピペットの作製−
外径が１ｍｍ、内径が０．５ｍｍのボロンシリケート製のガラスキャピラリをプラー（P-2000;Sutter社製）にセットして、先端の外径が１μｍ、当該先端の内径が５００ｎｍのナノピペットを準備した。
【００４９】
次に、ナノピペットの根元部分を開放した状態で先端部を純水に１分間浸して先端部の内側に純水を保持させた。続いて、先端部の内側に純水を保持させ、ナノピペットの根元部分を閉塞させた状態でナノピペットの先端部をコーティング液に１０秒間浸した。ここで、コーティング液としては、上述の化学式（２）で表されたオルガノシロキサン化合物をヘプタンに溶かした溶液（商品名Sigmacote；シグマアルドリッチ社製）を用いた。コーティング液中のオルガノシロキサン化合物の濃度は１〜４ｗｔ％であった。
【００５０】
次に、ナノピペットの先端部を純水を用いてリンスし、余剰なコーティング液を除去した。これにより作製されたナノピペットを本実施例に係るナノピペット１として実験に用いた。一方、コーティングを施す前のナノピペットを比較例に係るナノピペットとして実験に用いた。
【００５１】
−マイクロインジェクション−
本願発明者らは、常法に従って調製したラットＥＳ細胞を多数準備し、実施例に係るナノピペット１と比較例に係るナノピペットとをそれぞれ用いてマイクロインジェクションを連続して行った。マイクロインジェクションは市販のマニピュレーター（電動マイクロインジェクタ（IM-300)；ナリシゲ社製）に各ナノピペットを接続して行った。
【００５２】
ただし、本試験はナノピペットへの汚れの付着を調べるためのものであるので、細胞への液体注入は行わず、ナノピペットの先端部をＥＳ細胞に挿入してから抜く作業を繰り返した。
【００５３】
ＥＳ細胞への挿入を８回繰り返した時点で、各ナノピペットの先端部を電子顕微鏡を用いて写真撮影するとともに、両先端部のラマンスペクトルを測定した。ラマンスペクトルの測定には、空間分解ラマン測定装置（500MsII；SPEX社製）を用いた。
【００５４】
−試験結果−
図３（ａ）は、比較例に係るナノピペットを用いた場合に、細胞への挿入試験を行った後の先端部を示す電子顕微鏡写真図であり、（ｂ）は、本実施例に係るナノピペット１を用いた場合に、細胞への挿入試験を行った後の先端部９を示す電子顕微鏡写真図である。
【００５５】
図３（ａ）に示す結果から、比較例に係るナノピペットでは、８回の挿入で先端部に大量の汚れが付着することが分かった。なお、比較例に係るナノピペットを用いた場合、１０回未満挿入を繰り返した時点でマイクロインジェクションが不能となった。
【００５６】
これに対し、図３（ｂ）に示すように、本実施例に係るナノピペット１では、８回の挿入後でも先端部９に付着する汚れが少量であり、２０回までのマイクロインジェクションが可能であった。
【００５７】
図４（ａ）は、使用前の両ナノピペットの先端部におけるラマンスペクトルを示す図であり、（ｂ）は、細胞への挿入試験を行った後の両ナノピペットの先端部におけるラマンスペクトルを示す図である。
【００５８】
図４（ａ）に示す結果から、使用前の段階では実施例及び比較例に係るナノピペットはほぼ同じラマンスペクトルを示し、コーティングの有無は１０００ｃｍ−１〜２０００ｃｍ−１の範囲でラマンスペクトルに影響しないことが分かる。
【００５９】
また、図４（ｂ）に示すように、比較例に係るナノピペットの先端部２０では、炭素のＳＰ３軌道とＳＰ２軌道とに対応するラマン強度のピークが見られた。これらのピークは、先端部２０に付着したＥＳ細胞の細胞成分によるものと考えられる。
【００６０】
これに対し、実施例に係るナノピペット１の先端部９のスペクトルパターンは、使用前のスペクトルパターンとほぼ同様であった。なお、図４（ａ）、（ｂ）に示すスペクトル中で、１５５６ｃｍ−１の位置に観察された小さなピークは、ナノピペットを作製する際に炭酸レーザーを照射したことによって生じた数原子層のグラファイトによるものであり、ＥＳ細胞由来の有機物によるものではない。
【００６１】
図４（ａ）、（ｂ）に示す結果からも、本実施例に係るナノピペット１の先端部９では、比較例に係るナノピペットの先端部２０に比べて大幅に汚れの付着が抑えられていることが確認できた。
【００６２】
以上の試験結果から、本実施例に係るナノピペット１では、先端部９の汚れの付着が抑えられていることにより耐久寿命が大幅に向上することが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
以上説明したように、本明細書に開示されたナノピペットは、例えば細胞工学等いおいて、微量の液体を対象物に注入する際に用いられる。
【符号の説明】
【００６４】
１、１ａ      ナノピペット
３      コーティング領域
５      外側表面
７      内側表面
９      先端部
１１、１５      容器
１３      水
１７      コーティング液
【図１】
0006437787.tif 000008
【図２】
0006437787.tif 000009
【図３】
0006437787.tif 000010
【図４】
0006437787.tif 000011