(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの標的微生物の存在または不在について、単離された生物試料または環境試料を分析する方法であって、ここで、前記生物試料または環境試料が、食品、化粧品、または土壌試料であり、
前記少なくとも１つの標的微生物の存在または不在について試験する試料を調製するステップと、
前記試料を、前記試料中の食品、化粧品、または土壌の粒子と結合するよう選択された樹脂と混ぜ合わせるステップと、ここで、前記樹脂が、疎水性樹脂、ポリ芳香族樹脂、多孔性樹脂および非官能性ポリマー樹脂吸着剤からなる群から選択され、
前記樹脂を前記試料から除去するステップと、ここで、前記樹脂が前記食品、化粧品、または土壌の粒子を一緒に持ち運び、
前記樹脂を試料から除去した後に前記試料を核酸染色と結合させるステップと、ここで、前記核酸染色が前記標的微生物を透過し標識し、
前記調製した試料をフローサイトメーターを用いて分析するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記食品が、食肉、牛乳、卵、バター、および水からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料および樹脂が室温でインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸染色標識が蛍光標識である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料がフローサイトメーターを用いて分析される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
蛍光消光剤を前記生物試料に添加するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
試料中の生存微生物の存在、不在または量を決定するための、単離された生物試料または環境試料についてのアッセイであって、
樹脂を食品、化粧品、または土壌試料に添加することによって、標的生存微生物の存在または不在についてアッセイする食品、化粧品、または土壌試料を調製するステップと、ここで、前記樹脂が前記試料中の食品、化粧品、または土壌の粒子と結合するように選択され、かつ、前記樹脂が、疎水性樹脂、ポリ芳香族樹脂、多孔性樹脂および非官能性ポリマー樹脂吸着剤からなる群から選択され、
前記樹脂を前記試料から除去するステップと、ここで、前記樹脂が食品、化粧品、または土壌の粒子を一緒に持ち運び、
前記試料に、前記試料中の食品、化粧品、または土壌の粒子と結合する分子を含むバックグラウンドシグナル低減物質を添加するステップと、
生存細胞を透過し標識する核酸染色を前記試料に添加するステップと、
前記調製した生物試料をフローサイトメーターを用いて分析するステップと
を含み、
前記バックグラウンドシグナル低減分子が、前記標的生存微生物を有意に透過せず、前記核酸染色と同様の方法および同様の効率で前記食品、化粧品、または土壌の粒子と結合し、かつ
前記核酸染色と前記バックグラウンドシグナル低減分子が順次にまたは同時に添加される、アッセイ。
【請求項８】
前記核酸染色標識が蛍光標識である、請求項７に記載のアッセイ。
【請求項９】
試料中の生存微生物の存在、不在または量を決定するための、単離された生物試料または環境試料についてのアッセイであって、
樹脂を標的生存微生物の存在または不在についてアッセイする食品、化粧品、または土壌試料に添加することによって前記生物試料を調製するステップと、ここで、前記樹脂が前記試料中の食品、化粧品、または土壌の粒子と結合するように選択され、かつ、前記樹脂が、疎水性樹脂、ポリ芳香族樹脂、多孔性樹脂および非官能性ポリマー樹脂吸着剤からなる群から選択され、
前記樹脂を前記試料から除去するステップと、ここで、前記樹脂が食品、化粧品、または土壌の粒子を一緒に持ち運び、
前記試料に、前記試料中の食品、化粧品、または土壌の粒子と結合する分子を含むバックグラウンドシグナル低減物質を添加するステップと、
生存細胞を透過し標識する核酸染色を前記試料に添加するステップと、
前記調製した生物試料をフローサイトメーターを用いて分析するステップと
を含み、
前記試料に添加された前記バックグラウンドシグナル低減分子が蛍光消光剤と共有結合し、前記蛍光消光剤が、スペクトル重複によって前記核酸色素の前記蛍光シグナルを消光し、前記バックグラウンドシグナル低減分子が、前記核酸染色と同様の方法および同様の効率で前記食品、化粧品、または土壌の粒子と結合し、前記バックグラウンドシグナル低減分子が、標的生存微生物を透過せず、かつ
前記核酸染色と前記バックグラウンドシグナル低減分子が順次にまたは同時に添加される、アッセイ。
【請求項１０】
前記核酸染色標識が蛍光標識である、請求項９に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１３年３月１３日出願の米国特許仮出願第６１／７７９，７６６号の出願日の利益を主張し、本出願と共同所有される２０１２年４月５日出願の米国特許仮出願第６１／６２０，８２３号に関する。これらの開示は、ここで参照により本明細書の一部をなすものとする。
【背景技術】
【０００２】
特定の試料中の生存生物を同定し、その総数を決定することは、非常に重要である。特に重要なのは、食物および環境中の病原生物を素早く、効率的に、かつ正確に、監視および同定することによって、食物および水の供給の安全性をモニタリングし保証することである。
【０００３】
これを達成するそのような方法の１つは、総生存微生物（ＴＶＯ）アッセイである。ＴＶＯアッセイは、産業微生物学分野において、品質管理アプリケーションとして今日広く使用されている。ＴＶＯアッセイは、例えば、消費者向け食品、食肉などの中の細菌の数および種類をモニタリングするために使用される。ＴＶＯ法は、飲料水中の細菌集団をモニタリングするために使用することもできる。食物および水をモニタリングすることは、当然、その食物および水の供給が消費に安全であることを確実なものにするために重要である。
【０００４】
ＴＶＯアッセイの工程には、通常、１）試験試料を得ること、および２）適した容器に入れた寒天（ゼラチン質の栄養物質）上で該試料を培養または平板培養することが含まれる。微生物を増殖させ、寒天上に形成されたコロニーの数に基づいてコロニー形成単位（ＣＦＵ）を計算する。ＣＦＵは、コロニー増殖のための時間を経た後に初めて計算することができる。試料は一般に希釈されるので、ＣＦＵを計算する場合にはこの希釈係数（すなわち試料と総体積の体積比）を考慮に入れる。
【０００５】
また、標的微生物を単離し、どんな種類の微生物が存在するかをより正確かつ容易に決定することを助けるために、試料を様々な種類の選択培地を含有する多様な寒天プレートで培養することもできる。選択剤（例えば、抗生物質、抗真菌剤など）は、特定の非標的微生物（例えば、対象外の細菌）を排除する。これにより、多くの様々な種類の微生物からコロニーが形成された場合に、偽の結果が生じ得る可能性が回避される。
【０００６】
選択剤は、ある特定の種類の微生物の増殖をその他の微生物よりも助長することもできる。ＴＶＯアッセイは様々な微生物種、例えば、様々な細菌種の検出を可能にするが、食物および環境の微生物学者は、多くの場合、計数と同定の両方を選択することはできず、どちらか一方を選択しなければならない。特定の生物群の増殖を助長するために選択剤を添加することはできるが、ＴＶＯアッセイは、多くの場合、正常な健康な細胞が栄養豊富な培地（すなわち、選択圧なし）において増殖する能力に基づく。そのため、ＴＶＯは、試験される試料中の微生物の総数または１つの群の微生物を測定することができる。しかし、具体的な微生物を区別する能力がないために、ＴＶＯは、微生物集団全体に対して比較的非特異的であり得る。
【０００７】
具体的な微生物、特に病原体を同定する多数のその他の方法が利用可能である。そのような方法は臨床状況で広く使用されている。微生物を検出するための方法は、多くの場合、標的微生物の数を増加させるためおよび損傷した微生物を蘇生させるために、微生物培養物の富化に左右される。選択的および差別的な平板培養を用いる場合、研究者は、標的生物をバックグラウンド微生物叢から識別することが可能である。しかし、結果はほぼ常に非計数的である。言い換えれば、特定の細菌集団の存在または不存在のみを決定することができるにすぎず、数量を決定することはできない。
【０００８】
試料富化と選択的平板培養の結果の両方を利用することは、時間のかかるアッセイであり、これは多くの場合、予備的結果でさえも得られるまでに数日を要する。そのような富化および選択的平板培養は、試料中の微生物の数および種類を決定するための常套手段であるが、それは一般に寒天上で増殖したコロニーを計数した後、最終結果を得るのに数日を要することがある。結果を得るのに要する時間量が、常套のＴＶＯアッセイを使用することの最も顕著な欠点である。
【０００９】
選択的および差別的な平板培養工程をなくすことによって検出時間を短縮しようとする様々な方法が開発されている。そのような方法には、ＤＮＡハイブリダイゼーション、凝集、および酵素免疫測定法が含まれる。これらの代替技法は検出時間を短縮したが、これらの方法は標的病原体の１０３〜１０４ＣＦＵの極限検出しか可能でないため、培養富化工程がなお必要である。そのため、推定的に陽性の結果に対する確認がＴＶＯアッセイにはなお必要である。
【００１０】
さらに、生物試料、特に食物試料を分析して複数の微生物の存在または不在について検出するために利用可能な万能な方法または単一技法は存在しない。このことにより、微生物についてのアッセイの前の、生物試料から微生物を分離し、その後それを濃縮するための試料調製工程は、食物由来病原体をはじめとする病原体の検出のための分子法での律速段階となる。
【００１１】
微生物の分離のための具体的な試料調製技法に関して、遠心分離とそれに続く洗浄および濾過工程を利用する技法は、加工中にそれらが微生物の著しい損失または微生物への損傷をもたらすために有利ではない。さらに、該全手順は、自動化に適していない。
【００１２】
試料からの微生物の分離を実現するため、特定の微生物に対する親和剤が用いられてきた。しかし、微生物を複合マトリックスから単離するために用いる親和剤も、１）その他の試料構成要素由来の全ての生物と選択的に結合する万能な親和剤の不足；２）様々な生物と万能な親和性試薬との結合親和性の変動性；および３）結合した生物を溶離して溶液中に戻すことの困難さのために、戦略的に配置することが複雑である。
【００１３】
食物および水中の病原体を同定するためのその他の技法も公知である。例えば、フローサイトメトリーは、微生物を計数および同定するための迅速な技法として報告されている。フローサイトメトリーは、本来、真核生物細胞集団を分離および分析するために使用される方法であるが、微生物の評価および検出でも用いられている。具体的には、蛍光染色した微生物に光線を通過させる。対象の微生物に特有のパターンが、吸着と分散の両方の組合せによって実現される。（（Ｂｒｅｅｕｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ  ａｎｄ  ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｓｔｅｒａｓｅｓ  ｉｎ  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，ｗｈｉｃｈ  ｒｅｓｕｌｔ  ｉｎ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｉｏｂｉｏｌ．，６１（４）：１６１４−９（Ａｐｒｉｌ  １９９５）；ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ＆  Ｂｅｕｍｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０（１−２）：１１９−３０（Ｓｅｐｔ  １９９９））。
【００１４】
フローサイトメトリーの主な利点は、実施が高速かつ容易であることである。フローサイトメトリーは様々な種類の試料および方法に適合可能であり、それにより自動化させることもできる有力な応用である。工業バイオテクノロジー、食物および医薬品の品質管理、飲料水および廃水システムの日常的モニタリング、ならびに土壌および自然の水生生息地における微生物生態学的研究において、多数のフローサイトメトリーの応用が出現していることは驚くことではない。フローサイトメトリーの結果は、標準的なプレートカウント法の結果とよく相関する。しかし、フローサイトメトリーはその他の制限、例えば検出のために標的微生物を色素標識する必要があること、設備のコストが高いこと、および人材の特殊な訓練が必要であることなど、を有する。この技法を広範かつ日常的に使用することにより、これらの欠点は軽減され始めている。
【００１５】
しかし、フローサイトメトリーに関して、特に「複合マトリックス」と呼ばれるものに由来する生物試料または環境試料を分析する状況において、その他の実際的問題が依然としてある。複合マトリックスは、生物試料または環境試料中の微生物の検出に干渉する物質で構成され得る。非特異的蛍光の、または最適な検出限界未満の粒子状物質による干渉、この方法を固体または粒子状の食物試料に適用することの困難さ、特殊な染色を使用しなければ生存細胞と死細胞を区別できないこと、および試料処理中に起こり得る細胞生存能の破壊によって、検出にさらなる限界が課せられる（Ｑｕｉｎｔｅｒｏ−Ｂｅｔａｎｃｏｕｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ  ａｎｄ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４９（３）：２０９−２４（Ｍａｙ  ２００２））。
【００１６】
試料中に干渉物質または粒子状物質が存在すると、バックグラウンドノイズが増加し、フローサイトメトリーを用いた生物試料または環境試料の分析が複雑になる。これらの欠点が念頭にあるため、多くの研究者らは、試料、特に微粒子を含有する試料を分析するためにフローサイトメトリーの使用を十分に調査することに乗り気ではなかった。研究者らはそれを日常的な使用にあまり有望でないと考えたためである。
【００１７】
細胞壁構造および蛍光色素の透過性のために、ＥＤＴＡ等の薬剤は、染色溶液中でグラム陰性細菌細胞の外膜を不安定化して色素の取込みを増加させることが時々必要とされる。複合マトリックス、例えば牛挽肉抽出物などの中の一部のグラム陰性細菌の染色強度は、緩衝液または少量の複合マトリックスを含有する緩衝液中の細菌の染色強度ほど高くなく、ＥＤＴＡの添加はこれらの種類の試料で低い染色強度の問題に対応することができない。その結果、特定の生物の染色集団はバックグラウンドに非常に近く、低いシグナル対バックグラウンド比は、最終的に計数精度および感受性に影響を及ぼすことになる。
【００１８】
従って、フローサイトメトリーを用いて試料中の微生物の存在または不在を検出するための現在の方法の欠点に対応する方法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｂｒｅｅｕｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ  ａｎｄ  ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｓｔｅｒａｓｅｓ  ｉｎ  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，ｗｈｉｃｈ  ｒｅｓｕｌｔ  ｉｎ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｉｏｂｉｏｌ．，６１（４）：１６１４−９（Ａｐｒｉｌ  １９９５）
【非特許文献２】ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ＆  Ｂｅｕｍｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０（１−２）：１１９−３０（Ｓｅｐｔ  １９９９）
【非特許文献３】Ｑｕｉｎｔｅｒｏ−Ｂｅｔａｎｃｏｕｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ  ａｎｄ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４９（３）：２０９−２４（Ｍａｙ  ２００２）
【発明の概要】
【００２０】
本発明は、試料中の少なくとも１つの微生物の存在または不在を同定する方法に関する。本明細書に記載されるように、少なくとも１つの微生物の存在または不存在について試験される生物試料または環境試料を最初に入手し、その後実施するアッセイ用に調製する。調製した試料を樹脂と融合させ、その後、樹脂を試料から取り除く。次に、調製した試料をアッセイ標的用の標識と結合させ、その後、試料を分析してアッセイ標的の存在または不存在を決定する。
【００２１】
本発明の一実施形態では、分析される試料は、複合マトリックスであるかまたは複合マトリックスを含む生物試料または環境試料から得る。複合マトリックスは多様な試料に見出され、それには、限定されるものではないが、食品、化粧品、および土壌試料が挙げられる。分析される試料は、樹脂の導入の前に特定の種類の生物試料または環境試料について公知の技法を用いて調製されてよく、当業者に周知であり得る。
【００２２】
本発明のもう一つの実施形態では、樹脂は、複合マトリックスと下流の試料アッセイ分析の干渉を調節するかまたは減少させるために使用される。様々な樹脂が当技術分野で公知であり、１または複数の特定の樹脂の選択は、分析する生物試料または環境試料の性質に左右される。樹脂は、濾過などの技法によってアッセイを実施する前に除去することができるが、用いる特定の技法は主に設計選択の問題であり、樹脂および試料調製の種類による。当業者は、これらおよびその他の要因に基づいて適した分離技術を選択することになる。
【００２３】
もう一つの実施形態では、試料は、樹脂処理および樹脂の除去後に、フローサイトメーターを用いて分析される。適切な色素、例えば核酸色素またはその他の蛍光色素などを、樹脂の除去後かつフローサイトメトリーの前に試料と結合させる。色素はフローサイトメーターでのアッセイ標的の検出を容易にする。消光などの向上技法を用いて、アッセイの完全性をさらに向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】フローサイトメトリーを用いて生物試料中の細菌を検出するための本明細書に記載される方法の一実施形態の工程を説明する図である。
【図２】樹脂で処理した試料と樹脂で処理していない試料を比較する、生物試料中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の存在または不存在を検出するためのフローサイトメトリー分析中に生成した一連のドットプロットを表す図である。
【図３】樹脂で処理した試料と樹脂で処理していない試料を比較する、生物試料中の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の存在または不存在を検出するためのフローサイトメトリー分析中に生成した一連のドットプロットを表す図である。
【図４】スパイクされた牛挽肉中の細菌の量を求めるフローサイトメトリー分析中に生成した、その結果をＴＶＯアッセイから得た結果と比較する、一連のドットプロットを表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
生細菌、死細菌、および総細菌の正確な決定は、多くの微生物学用途において重要である。培養に基づく方法論には、固体増殖培地でコロニーを形成し、液体栄養ブロス中で増殖する生存微生物が要求される。これらの伝統的な、培養に基づく試験は時間がかかるので、増殖が遅いか培養できない生存微生物ではうまく機能することができない。従って、これらの伝統的な、培養に基づく試験は、病原体の存在についての食物および水の健康関連のモニタリングなどの用途で必要とされるようなリアルタイムな結果または時宜を得た情報を提供しない。
【００２６】
本明細書において、複合マトリックスから得た生物試料のためのフローサイトメトリーを発展させることによる、公知のアッセイ、例えばＴＶＯアッセイなどを改善するための方法が開示される。複合マトリックス、例えば食品、化粧品、および土壌試料などから得たかまたはそれらを含有する生物試料は、複合マトリックスの粒子に引き起こされる干渉のためにフローサイトメトリーを用いて正確に分析することが困難であり得る。より具体的には、標的微生物をその他の試料構成要素と区別することはなお困難であるので、複合マトリックスは、試料中の標的微生物を光学的に検出することを困難にする。
【００２７】
具体的には、本明細書に記載される方法は、複合マトリックス（例えば、挽肉、卵、牛乳、土壌、化粧品など）と一般に記載される試料の微生物以外の構成物質から試料中の微生物を分離し、標的微生物を含有すると思われる試料を標的微生物の存在または不存在を検出するための試験またはアッセイに供する前の試料の品質を向上させる。本明細書に記載される方法を用いる利点としては、限定されるものではないが、複数の微生物菌株の検出の容易化、マトリックス関連アッセイ阻害剤の除去、干渉マトリックス微粒子の除去、検出シグナルを読み取る強度または能力の向上、ならびに代表的な食物試料サイズおよび／または小さい培地体積の使用を可能にするのに十分な試料の小型化の提供が挙げられる。
【００２８】
本明細書に記載される方法は、低レベルの病原体または散発的汚染を検出する必要がある場合の試料調製の改良を助け、それは微生物の増殖を促進するために検出の前に試料培養を富化する必要を低減するかまたは除去さえし得る。
【００２９】
本明細書に記載される方法は、標的微生物／病原体／細菌のアッセイに干渉する可能性のあるマトリックス関連阻害剤を試料から除去することにより、試料中の標的微生物／病原体／細菌（存在する場合）を濃縮すると同時に、標的微生物／病原体／細菌の存在または不存在を示す試料から得た検出可能なシグナルを増強する。本方法は、それが万能でもあり（例えば、複数の種類のマトリックスおよび標的微生物／病原体／細菌に適用可能）、簡単で、迅速で安価であるという点で有利である。さらに、本明細書に記載される方法は、標的微生物／病原体／細菌と残りのマトリックス成分との交差反応性のために、または死んだ標的細胞の検出のために起こり得る偽陽性もしくは陰性結果の可能性を減らす。
【００３０】
本明細書に記載される方法は、複合マトリックスと組み合わさった試料の中に樹脂を導入して、下流の試料アッセイ分析との複合マトリックスの干渉を調節または低減させる。樹脂または樹脂の組合せは、残留マトリックス成分を吸着し、試料から樹脂を分離することにより、今度は複合マトリックスを試料から除去する。本願を通じて、樹脂による吸着とは、マトリックスの内部の微生物の生存能力に悪影響を及ぼすことなく、複合マトリックスからのシグナル検出の干渉を調節する、または低下させる、または排除する樹脂の能力を意味することは当然理解される。本明細書においてより詳細に記載されるように、試料中の微生物／病原体／細菌の存在または不存在を検出するための下流のアッセイは、一般に信頼できる検出のために標的が生存可能であることが必要とされる。樹脂およびマトリックス中に存在し得るその他の試料構成物質の物理的影響は、樹脂が標的微生物の生存能力に著しい悪影響を及ぼさない限り重要ではない。
【００３１】
より詳細には、本明細書に記載される方法の実践において使用され得る樹脂には、非官能性ポリマー樹脂吸着剤が含まれる。樹脂は、本明細書において孔と呼ばれるくぼみ／不均一表面を有する。非官能性ポリマー樹脂は、本明細書において、試料構成物質と著しく反応し得る部分または官能基を保有していないポリマー樹脂である。
【００３２】
もう一つの実施形態では、非官能性樹脂、例えばローム＆ハース社製造のＸＡＤ樹脂、特にスチレンとジビニルベンゼンの非官能性共重合体であるＸＡＤ−４樹脂などが、記載される方法の実践で使用され得る。
【００３３】
樹脂孔径は本明細書に記載される方法の実践においてあまり重要でないことは理解されるはずである。一般に、樹脂は、細菌が樹脂の内部に透過することを許容するために十分な大きい孔径を有さない。しかし、ある種の樹脂は、分子が樹脂の内部に透過することを許容する大きい内部表面を備えるマクロ多孔質構造を有する。そのようなマクロ多孔質樹脂は、本発明の実践での使用に完全に適している、なぜなら、孔内部での細菌の捕捉は微生物の生存能力に必ずしも悪影響を及ぼさないためである。当業者は、マクロ多孔質樹脂が細菌を捕捉する範囲で、捕捉の程度が下流の試料分析に悪影響を及ぼさないかどうかを決定することができる。吸着が主に樹脂の外部表面において影響を受ける、比較的小さい孔を有する樹脂、つまり微孔性樹脂も本発明の実践に適している。
【００３４】
特に好ましい樹脂は、非官能性ポリマー吸収剤樹脂、例えばＸＡＤ−４などである。そのような樹脂は、干渉するマトリックス成分を試料から除去すると同時に、生物試料中に含まれる微生物の生存能力に悪影響を及ぼさない。本明細書に記載されるガイダンスに基づいて、当業者は、本明細書に記載される方法での使用に適したその他の疎水性多孔性樹脂を選択することができる。
【００３５】
試料を樹脂で処理した後、複合マトリックスを吸着させた樹脂を試料から分離する。複合マトリックス、例えば牛挽肉抽出物などの中の一部のグラム陰性細菌の染色強度が、緩衝液または少量の複合マトリックスを含有する緩衝液中の細菌の染色強度ほど高くなく、色素取込みを増加させるＥＤＴＡの添加がそれ自体かつ単独でこの問題を解決できないので、染色の前に標的微生物を複合マトリックスから分離することは、有利である。
【００３６】
次に、試料中の１以上の標的微生物の存在または不存在を検出するアッセイのために試料を染色する。次に、単離し、濃縮し、染色した生物試料を、フローサイトメトリーを用いて標的微生物の存在または不存在について分析する。
【００３７】
開示される方法は、生物試料を入手することを企図する。生物試料または環境試料は、複合マトリックス、例えば食物、土壌、化粧品などの形態であり得る。適した試料は液体形態である。
【００３８】
生物試料または環境試料は、一般に上記および図１で考察されるように分析用に調製される。試料調製は、試料の性質による。分析用の生物試料または環境試料の試料調製は、当業者に周知であり、そのため本明細書中で詳細に説明しない。一つの代表的な実施形態では、食肉を最初に緩衝液とブレンドする。食肉抽出物を得るために食肉と適当な緩衝液をブレンドするための標準プロトコールの使用は、本明細書に記載される方法での使用に適していると企図される。ブレンディングは、多様な技法、例えば食肉試料に適切な体積のリン酸緩衝希釈水を添加し、ストマッカー袋（＜５０μＭフィルタ・Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂａｇ  ｓｙｓｔｅｍ：１１１６２５または同等物）に移し、ストマッカー（例えば、Ｔｅｋｍａｒ（Ｓｅｗａｒｄ）Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ  Ｌａｂ  Ｂｌｅｎｄｅｒ  ４００または同等物）中でブレンドすることなどを用いて達成される。そのようなプロトコールは当業者に周知であり、本明細書中で詳細に説明しない。そのようなプロトコールの例は、ＵＳＤＡのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｓｉｓ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ＯＰＨＳ／ｍｉｃｒｏｉａｂ／ｍＩｇｃｈｐ３．ｐｄｆ）に記載され、これは参照により本明細書に援用される。
【００３９】
次に、適当量の調製した試料を、樹脂を含有しているかまたは樹脂が添加される無菌容器、例えば試験管などに移す。当業者は、試料に添加される樹脂の量を決定することができる。試料からデブリを除去するのに十分な樹脂を添加するが、下流の試験のために試料中の微生物の生存能力に悪影響を及ぼさないように注意を払う必要がある。具体的には、調製した生物試料は、フローサイトメトリーを用いる生物試料の分析を干渉する物質（例えば、複合マトリックスの構成要素）と結合する／相互作用する可能性のある樹脂で処理／インキュベートされる。
【００４０】
一実施形態では、調製した生物試料は、室温で１時間未満、樹脂で処理される。好ましくは、調製した生物試料は、樹脂で処理した試料を２５ｒｐｍで回転させることによって、３０分以内のより短い時間、樹脂で処理される。もう一つの実施形態では、樹脂は非官能性非イオン性吸着樹脂である。
【００４１】
所定時間の後、調製した生物試料から樹脂を分離し、それによって樹脂に吸着した複合マトリックスを取り除く。
【００４２】
もう一つの実施形態では、樹脂は、濾過によって、または樹脂を沈殿させて樹脂が沈殿した容器から上清を除去することによって、生物試料または環境試料から除去されるかまたは他の場合には分離される。
【００４３】
調製した生物試料から樹脂を除去した後、残りの試料構成物質を、標的微生物の検出のために染色剤と結合させる。染色剤の一例は分子標識である。さらなる代表的な実施形態では、分子標識は、蛍光色素または染色剤である。そのような染色剤は、当業者に周知である。そのため、そのような染色剤、およびそれらを展開する方法は、本明細書中で詳細に説明しない。しかし、適した染色プロトコールは、本出願と共同所有され、参照により本明細書に援用される２０１２年４月５日出願の米国特許仮出願第６１／６２０，８２３号に記載される。
【００４４】
さらなる実施形態では、染色は、核酸色素染色（例えば、インビトロジェン社ＳＹＴＯ（登録商標）１３）を用いることによって達成され得る。染色を選択する際に、当業者は以下の要因を考慮する。ｉ）対象の標的微生物（例えばグラム陽性またはグラム陰性）、試料中の微生物の存在または不存在を決定するために展開される下流のアッセイ、およびｉｉｉ）選択した染色と試料構成物質のためのその他の染色の対比。当業者は、本明細書に記載される方法のために色素染色を選択する場合のその他の考慮事項を認識している。
【００４５】
上記のように、生存する生物と死んだ生物の両方を透過可能な蛍光核酸色素が、フローサイトメトリー研究のために懸濁液中の細胞を標識するために使用される。しかし、そのようなフローサイトメトリー研究の検出感度は、標的とされる細胞が、核酸色素と非特異的に結合する粒子とともに懸濁液中に存在する間には、影響を受ける可能性がある。その溶液由来の干渉粒子からの蛍光シグナルを除去およびマスクし、後に検出感度を高めるいくつかのアプローチが本明細書に記載されている。
【００４６】
米国特許仮出願第６１／６２０，８２３号に記載されているように、一実施形態では、生存細胞を透過しないが核酸染色剤と同様の結合特性を有する過剰量のバックグラウンドシグナル低減分子が、順次にまたは細胞透過性核酸染色剤と同時に対象の試料に添加される。バックグラウンドシグナル低減分子は生存細胞を透過できないため、細胞透過性核酸色素だけが生存細胞を標識し、それらの細胞から蛍光シグナルを発生させることができる。色素と非特異的に結合する干渉粒子と、透過性細胞膜を有する死細胞は、核酸染色剤と上記のバックグラウンドシグナル低減分子の両方と結合する。バックグラウンドシグナル低減分子は、余分な細胞粒子および死細胞と結合するために核酸染色剤と競合する。その結果、試料をフローサイトメトリーにより分析する際に、核酸染色剤と非標的粒子の非特異的結合に起因する蛍光シグナルの強度の低下が起こる。このバックグラウンドシグナル低減分子が存在することより、樹脂によって試料から一部の非標的粒子が抽出された後に試料中に残る非標的粒子と核酸染色剤との非特異的結合に起因するバックグラウンドシグナルの強度が低下する。
【００４７】
もう一つの実施形態では、染色処理は、消光プロトコールと併せても実施することができる。例えば、核酸色素での染色を完了する前に、消光剤、例えばニトラジンイエローなどを、染色処理中に添加して、標的微生物の検出シグナルをバックグラウンドシグナルと区別するのを助けることができる。そのようなシグナル消光は、その結果望ましくないシグナルの蛍光強度を下げることによって対比を強調する。消光剤は、そうしなければ偽のシグナルを生成するであろう色素蛍光を吸収することによってこれを達成する。
【００４８】
本明細書に記載される方法は、上記のバックグラウンドシグナルを消光することも企図する。米国特許仮出願第６１／６２０，８２３号に記載されているように、一実施形態では、色素または総色素分子の核酸結合ドメインは、スペクトル重複によって核酸色素の蛍光シグナルを消光し得る、生存細胞を透過しない１以上の蛍光消光剤と共有結合する。そのような分子は、順次にまたは細胞透過性核酸染色剤と同時に対象の試料に添加することができる。その分子は生存細胞を透過できないため、細胞透過性核酸色素だけが生存細胞を標識し、蛍光シグナルを発生させることができる。非標的粒子、例えば、透過性細胞膜を有する死細胞、および色素と非特異的に結合する干渉粒子などは、核酸染色剤および結合消光剤の両方と結合する。消光剤と結合した分子は、非標的粒子上の結合部位を核酸染色剤と競合する。消光剤は、非標的粒子と結合した核酸染色剤によって発せられるシグナルの蛍光強度を低下させることになる（消光剤が、非標的粒子と結合した核酸染色剤と十分に近接している場合）。
【００４９】
調製した生物試料は、樹脂を除去し試料中の標的生存微生物を分子標識した後に、それから分析する。一実施形態では、分析は、フローサイトメーターを用いて実施される。フローサイトメトリーの利用は、当業者に周知であり、本明細書中では説明しない。フローサイトメトリー分析の説明は、Ｈａｍｍｅｓ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｗａｔｅｒ：ａｄｖａｎｔａｇｅｓ，ｐｉｔｆａｌｌｓ，ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３９７，ｐｐ．１０８３−１０９５（２０１０）に記載され、これは参照により本明細書に援用される。方法全体を自動化することもできる。記載される方法は、複合マトリックスを含む試料中の病原体を検出するようにフローサイトメトリーを適合させる。
【００５０】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態をさらに説明するために記載される。従って、それらの実施例は、使用される材料、組成物および条件に関して限定していない。通常遭遇し、当業者に明白である、多様な条件およびパラメータのその他の適した変更および適合は、本明細書に記載される本発明の意図および範囲内である。
【実施例１】
【００５１】
図１は、一般に、食肉試料を調製および試験することに関与する工程を説明する。これらの工程は、以下でより詳細に考察される。
【００５２】
［樹脂調製］
５０ｇのＸＡＤ−４樹脂を秤量し、室温で３０分間、１００ｍＬの変性エタノールとともに２４０ｒｐｍで振盪することにより洗浄することによって樹脂を調製した。
【００５３】
エタノール洗浄の後、樹脂を沈殿させてエタノールをデカントした。次に、樹脂を２５０ｍＬの脱イオン水に懸濁し、２４０ｒｐｍかつ室温にて３０分間シェーカーの中に放置した。振盪後、樹脂を沈殿させて、脱イオン水をデカントした。このプロセスを３〜４回繰り返した。
【００５４】
次に、樹脂を２５０ｍｌの脱イオン水に懸濁し、１２１℃で３０分間オートクレーブ処理することによって殺菌した。任意に、樹脂を必要になるまで２〜８℃で貯蔵した。
【００５５】
［試料調製］
牛挽肉（２５グラム）に、対象の微生物（例えば、大腸菌ＡＴＣＣ番号２５９２２、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ番号１４０２８、緑膿菌ＡＴＣＣ番号２７８５３、緑膿菌ＡＴＣＣ番号９０２７、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｅｒｕｓ）ＡＴＣＣ番号２５９２３、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＡＴＣＣ番号１２２２８またはＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ番号１３９３２）を混入させ、その結果挽肉１グラム当たり１×１０６微生物の細菌量となった。
【００５６】
菌を混入させた牛挽肉（２５グラム）を、２００ｍＬのリン酸緩衝液ｐＨ７．２（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｂｏｔｔｌｅｄ  Ｍｅｄｉａ  ＢＤ−２１４９７３または同等物）に添加し、ストマッカー袋（＜５０μＭフィルタ・Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂａｇ  ｓｙｓｔｅｍ：１１１６２５または同等物）に移し、ストマッカー（例えば、Ｔｅｋｍａｒ（Ｓｅｗａｒｄ）Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ  Ｌａｂ  Ｂｌｅｎｄｅｒ  ４００または同等物）中に２分間ブレンドした。
【００５７】
ストマッカー処理した液体を、４０μｍストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｆａｌｃｏｎ  ３５２３４０または同等物）に通して濾過して牛挽肉抽出物を作成した。牛挽肉抽出物の一部を、公知の技法を用いる寒天上での平板培養によるＴＶＯアッセイに使用した。ＴＶＯアッセイは、フローサイトメトリーの結果との比較として行った（図４参照）。
【００５８】
［樹脂による試料処理］
調製したＸＡＤ−４樹脂（５グラム）を、５０ｍｌポリプロピレン管に無菌的に移した。調製した牛挽肉抽出物（１０ｍｌ；大腸菌２５９２２、ネズミチフス菌１４０２８、緑膿菌２７８５３、緑膿菌９０２７、黄色ブドウ球菌２５９２３、表皮ブドウ球菌１２２２８またはＬ．モノサイトゲネス１３９３２）を混入済）を、５ｇのＸＡＤ−４疎水性樹脂と室温において３０分間結合させ、２５ｒｐｍで回転させた。樹脂を沈殿させ、その後樹脂を含まない上清を染色に使用した管の中に除去またはデカントすることによって、樹脂を試料から分離した。あるいは、試料を樹脂とともにインキュベートした後、上清を、フィルタ（すなわち、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）細胞ストレーナー（４０μｍ））を通して染色に使用した管の中に注入した。Ｆａｌｃｏｎ（商標）は、ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー社の商標である。
【００５９】
［樹脂で処理した試料の染色およびＦＡＣＳ分析］
樹脂で処理した試料からの抽出物を、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、核酸色素染色の１：１００ストック（例えば、インビトロジェン社によるＳＹＴＯ（登録商標）１３）を用いて室温で１５分間蛍光染色した。染色の完了の２分前に、１０％ニトラジンイエローを添加した。次に、樹脂で処理した試料を、標準プロトコールを用いてベクトン・ディッキンソン社ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーターでフローサイトメトリーによって分析した。樹脂と結合しなかったその他の同一試料も染色し、対照として使用した。
【００６０】
［結果］
樹脂および消光剤での処理の後、蛍光強度は、樹脂と結合しなかった試料と比較して、大腸菌、ネズミチフス菌、緑膿菌２７８５３および緑膿菌９０２７について、それぞれ１７％、７６％、１７４％および１０８％に増加した。（図２および３参照）。フローサイトメトリーの結果は、試験した全ての細菌のコロニー数の結果とよく相関した。図４を参照されたい。例えば、樹脂で処理した緑膿菌試料は、フローサイトメトリーによって８．１×１０４ｃｆｕ／ｍｌそしてコロニー数算定によって８．７×１０４ｃｆｕ／ｍｌを生じた。樹脂で処理しなかった緑膿菌の試料は、フローサイトメトリーで４．９×１０４ｃｆｕ／ｍｌ、コロニー数では１．１×１０５ｃｆｕ／ｍｌを生じた。図３（ＦＬ１＝５０４４）の情報から得たこの結果は、樹脂で処理していない試料は、コロニー数測定値と相関できなったことを示す。未処理の試料から得た結果に基づけば、検出可能なシグナルの低下をもたらす複合マトリックス粒子からの許容できないほど高い干渉があるように思われる。
【００６１】
樹脂が存在するために、グラム陽性細菌の全体的な蛍光染色強度は、樹脂がない場合のグラム陽性細菌の染色強度（３．４％〜９．７％の間）よりもわずかに低かった。それにもかかわらず、試験した３つのグラム陽性菌株（黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、およびＬ．モノサイトゲネス）の高い蛍光染色強度のために、低い染色強度は、細菌計数精度および感受性に影響を及ぼさなかった。
【００６２】
樹脂で処理した菌を混入させていない牛肉試料中の少量の蛍光細菌様粒子も観察されたが、それは単なるバックグラウンドとみなされた。
【００６３】
樹脂を観察して、干渉を取り除き、試料を得た。この試料は、試料中の細菌を著しく損失することなく、一部の細菌集団についてより高い蛍光シグナルを生じた（例えば、実際に試料に添加された細菌の量に基づいて、計算によって試料中に存在すると予測される量と比較して、樹脂で処理した試料の細菌集団の減少は３０％未満である（すなわち、計算は既知量の細菌を混入させた試料に基づく））。
【００６４】
全手順は、樹脂とともに室温における３０分のインキュベーションと、それに続く簡単な分離工程だけを要した。フローサイトメーターは、複合マトリックス（例えば、食肉粒子）によって詰まる可能性が高いので、濾過工程は樹脂処理がなくてさえも必要とされるため、樹脂処理の後の濾過工程は追加の工程を加えるものではない。干渉する粒子を試料から除去することにより、その他の試料構成物質から微生物を単離する親和剤は、もはや必要がなくなった。
【００６５】
本明細書中で本発明を特定の実施形態を参照して記載したが、これらの実施形態が本発明の原理と応用を単に例証することは理解される。そのため、多数の修正が実例となる実施形態になされることができ、添付される特許請求の範囲に定義される本発明の意図および範囲から逸脱することなく、その他のアレンジ（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ）が考案され得ることが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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