(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液中の循環腫瘍細胞を測定する方法であって、
約１０ｐＬ〜１０ｎＬの量の該体液に細胞を封入するステップ；
該量の体液を、４℃〜３７℃の温度で少なくとも１分間インキュベートするステップ；
該インキュベートされた該量の体液内でのｐＨの変化および／または、乳酸、乳酸塩イオンおよびプロトンから選択される少なくとも１つの分子の濃度の変化を測定するステップを含み、
該イキュベーションステップ前に同じ量の体液について測定したｐＨおよび／または濃度に対する、該ｐＨの低下、および／または該少なくとも１つの分子の濃度の増加は、該体液中の循環腫瘍細胞の存在を示す、測定方法。
【請求項２】
前記量の体液は、液滴ベースのマイクロ流体装置内での液滴の形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記液滴は、Ｗ／Ｏエマルション中の水性液滴である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記エマルションの油成分は、フルオラス油であり、好ましくは界面活性剤が添加されている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
さらに、水または塩含有緩衝液で、前記量の体液を希釈するステップを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記体液は、血液、血清、リンパ液、胸水、腹水、脳脊髄液を含む群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ｐＨの変化は、ｐＨ指示薬を使用して検出される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ｐＨ指示薬は、ｐＨ感受性色素またはｐＨが変化するとその吸収／発光スペクトルが変化する指標物質である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
可視波長を発光するレーザーによって、前記インキュベートされた前記量の体液を照射するステップをさらに含み；前記変化は、前記照射された前記量の体液の発光信号の関数である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記インキュベーションステップは、４℃および３７℃の温度で、少なくとも１分の培養時間で実施される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液、好ましくは、血液およびリンパ液中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を測定する方法および装置に関する。具体的には、体液中の循環腫瘍細胞を測定する方法は、細胞が封入されている該体液の隔離された分量でのｐＨの変化および／または、乳酸、乳酸イオン、プロトンから選択される少なくとも１つの濃度の変化を測定するステップを含む。
【０００２】
発明の背景
今日では、ＣＴＣを検出し、数えることができれば、医療分野において重要な情報をもたらし得ることは、広く認められている。
特に、この情報は、多くの形態の癌の診断、治療およびモニタリングの体系的方法を定義するために使用することができる。
【０００３】
血液からＣＴＣを単離し測定するためのいくつかの既知の手順は、例えば、特定の細胞表面マーカーを認識することができる特異抗体でコーティングされた磁気ビーズの使用を含む。抗体／表面マーカーの相互作用に基づく市販の技術の例は、Ｖｅｒｉｄｅｘにより製造されるＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）を含む。
【０００４】
しかしながら、ＣＴＣを単離し測定するための標的としての表面タンパク質の使用は、様々な問題を抱えており、例えば、ＣＴＣに対して特異なバイマーカーの欠如、ＥｐＣＡＭ＋上皮細胞の排他的単離／測定、およびさらなる分析のために単離された細胞を使用することが不可能なことである。このアプローチに関連するさらなる問題は、精製抗体が、単離／測定のために要求されるという事実による、低速（ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）では１日当たりに８回の分析しか実施できない）および高い費用（材料のみの分析毎に約３５０ドル、解析［Istituto Oncologico Veneto, Padovaによるデータ］の実施での技術的支援を含むと６５０ドル）である。
【０００５】
ＣＴＣを測定する他の既知の方法は、非腫瘍細胞から腫瘍細胞を区別するために、（大きさ、または硬さなどの）物理的特性を使用する。しかしながら、これらの方法は、臨床的に検証されていない。
【０００６】
ＣＴＣを検出するための現在の技術の概観は、以下に見ることができる：「Circulating Tumour Cells: Liquid Biopsy of Cancer:Liquid Biopsy of Cancer（循環腫瘍細胞：癌の液体生検）」、C. Alix-PanabieresおよびK. Pantel, Clinical Chemistry 59: 1,110-118 (2013);および「Techniques for Label-Free Separation of Circulating Tumour Cells: from Historical Foundations to Recent Developments（循環腫瘍細胞のラベルフリー分離のための技術：歴史的基盤から最近の展開まで）」、C. Jin et al, Lab Chip, 2013, DOI:10.1039/C3LC50625H。
【０００７】
したがって、当該技術水準において記載される方法の欠点を克服することができる循環腫瘍細胞（Circulating Tumour Cells）の測定を改良することができる代替的なアプローチを開発する大きなニーズがある。
【０００８】
発明の概要
よって、本発明により解決される技術的課題は、上記の欠点を克服することができる代替的アプローチを使用することによって、体液中のＣＴＣを測定し、単離することができる方法を提供することである。
【０００９】
本発明に至る研究の一部は、欧州連合の第７次研究枠組み計画（ＦＰ７/２００７−２０１３）／ＥＲＣ助成金合意番号２６９０５１の下で、欧州研究会議から資金提供を受けている。
【００１０】
本発明は、腫瘍細胞の生化学が、正常細胞と異なるという観察に基づく。より具体的には、好気的条件において、ほとんどの癌細胞は、ワールブルク効果（Koppenol, W.H., P.L. BoundsおよびC.V. Dang, Otto Warburg’s contributions to current concepts of cancer metabolism.  Nat Rev Cancer, 2011年. 11(5): 325-37頁）として知られる現象を示す。すなわち、低い解糖速度、ミトコンドリア中でのピルビン酸の酸化、および乳酸の非産生を有する正常細胞と比較して、酸素の存在下でさえ乳酸産生を伴う細胞質ゾルにおける高い解糖速度である。細胞内ｐＨの酸性化を避けるために、解糖系で産生される酸は、Ｖ−ＡＴＰアーゼ、Ｎａ＋／Ｈ＋交換体（ＮＨＥ）、炭酸脱水素酵素、プロトン連結モノカルボン酸トランスポーターＭＣＴ、Ｃ１−／ＨＣＯ３交換体、およびＡＴＰ合成酵素などの、いくつかのプロトントランスポーターを介して腫瘍細胞によって排出されなければならない。これらのトランスポーターの増加した活性は、正常の細胞内外ｐＨ勾配の逆転を引き起こすので、癌細胞は、その内部を正常またはわずかにアルカリ性のｐＨに維持しながら、細胞外微小環境の顕著な酸性化を生じさせる。
【００１１】
腫瘍細胞株の代謝に関する比較的最近の研究において、単一腫瘍細胞が、１時間当たり３．６８ｘ１０−１３モルまで酸を分泌することが示されている（DeBerardinis, R.J.ら、「Beyond aerobic glycolysis: transformed cells can engage in glutamine metabolism that exceeds the requirement for protein and nucleotide synthesis（好気的解糖を越えて：トランスフォームされた細胞は、タンパク質とヌクレオチド合成の要件を超えるグルタミン代謝に関与し得る）」、Proc Natl Acad Sci USA, 2007年, 104(49):19345-50頁）。
【００１２】
血液などの体液中の稀な腫瘍細胞による酸の分泌は、プロトンが血漿中で極端に希釈されるので、直接、検出することはできない。
細胞外環境のこの変化は、検出することはできないが、発明者らは、腫瘍細胞が、非常に小さな分量中に隔離される場合、この分量中で化学組成物の変化および腫瘍細胞の異なる生化学の結果を、有意に検出できることを見出した。
【００１３】
したがって、１つの態様において、本明細書中に記載する発明は、請求項１で定義されるような循環腫瘍細胞の検出方法に関する。
より具体的には、体液中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の測定方法は、
約１０ｐＬ〜１０ｎＬの量の該体液中に細胞を封入するステップ；
この量の体液を、４℃〜３７℃の温度で、少なくとも１分間、インキュベートするステップ；
該インキュベートされたこの量の体液内でのｐＨの変化および／または、乳酸、乳酸塩イオン、プロトンから選択される少なくとも１つの分子の濃度の変化を測定するステップを含み、
該インキュベーションステップ前に同じ量の体液について測定したｐＨおよび／または濃度に対する、該ｐＨの低下および／または該少なくとも１つの分子の濃度の増加は、該体液中の循環腫瘍細胞の存在を示す。
【００１４】
本発明の他の利点および特徴は、本発明のいくつかの実施形態についての以下の詳細な説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１ａおよび１ｂは、それぞれ、本発明による方法の一実施形態を実施するためのマイクロ流体チップおよび蛍光感知装置を示す。
【００１６】
【図２】図２ａおよび２ｂは、それぞれ、マイクロ流体装置中に（静止して）密に充填されたエマルションの蛍光顕微鏡写真、および液滴からの蛍光を示す、マイクロ流体装置内の液滴内に含まれる腫瘍（Ａ５４９）細胞の断面図を示す。
【００１７】
【図３】図３は、腫瘍細胞（Ａ５４９））を含む液滴および白血球細胞（ＰＢＭＣ）を含む液滴中のｐＨ感受性色素からの蛍光強度の比較を示し、この図では、液滴あたりの平均蛍光強度を示し、Ｘ軸に沿って分散データを示してデータ点をより良く可視化している。
【００１８】
【図４】図４は、蛍光酵素乳酸アッセイである。左上のより明るい液滴は、癌細胞を封入しており、液滴の大部分は空である。一方、右側にある細胞を含む２つの液滴は、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ））を封入している。１つより多くのＰＢＭＣが液滴の内側に存在し、これはただ１つの単一の癌細胞を有する液滴と比較して、液滴をより明るくしないことに留意していただきたい。
【００１９】
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、５８０／６３０発光比（比が高いほど、ｐＨが低い）がｙ軸上に、ピーク幅がｘ軸上に報告されるグラフで、癌細胞と白血球の異なる分布を示す。具体的には、図５Ａは、白血球細胞に関し；図５Ｂはトリプルネガティブ乳がん細胞に関し；図５Ｃは、転移性乳がんからの細胞に関し；図５Ｄは結腸直腸腺癌からの細胞に関する。
【００２０】
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、５８０／６３０発光比（比が高いほど、ｐＨが低い）がｙ軸上で報告されるグラフで、循環卵巣がん細胞と白血球細胞の異なる分布を示す。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、体液中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を測定する方法および装置に関する。
【００２２】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出方法
既に上記したように、体液中の循環腫瘍細胞の測定方法は、
約１０ｐＬ〜１０ｎＬの量の該体液に細胞を封入するステップ；
該隔離された量の体液を、４℃〜３７℃の温度で少なくとも１分間インキュベートするステップ；
該インキュベートされた量の体液内でのｐＨの変化および／または、乳酸、乳酸塩イオンおよびプロトンから選択される少なくとも１つの分子の濃度の変化を測定するステップを含み、
該インキュベーションステップ前に同じ量の体液について測定したｐＨおよび／または濃度に対する、該ｐＨの低下および／または該少なくとも１つの分子の濃度の増加は、該体液中の循環腫瘍細胞の存在を示す。
【００２３】
本発明の方法はまた、水または塩含有緩衝液で、当該量の体液を希釈するステップを含む。
本発明の好ましい実施形態において、該隔離された量の体液は、液滴ベースのマイクロ流体装置内での液滴の形態である。本明細書中において、表現「隔離された量の体液（isolated volume）」および「封入された量の体液（encapsulated volume）」は相互に交換可能である。
【００２４】
液滴マイクロ流体装置は、ピコリットルの液滴の形態での個別の流体パケットの取り扱いを可能にし、アッセイをより低コスト、高いスルーアウトおよびより高感度で行うニーズに対処することができる。この技術は、封入およびスクリーニングのような、一連の操作および処理を行うのによく適合している。特に、液滴マイクロ流体装置は、蛍光に基づく技術または質量分析を使用して、個々の液滴を検査し、他の液滴からの液滴を区分けし、それらを保管し、それらを他のマイクロ流体装置の中に再注入し、他の液滴と液滴を融合させ、および液滴中で細胞を培養することを可能にする。したがって、全ての細胞、例えば、１ｍＬ〜１０ｍＬの血液を個々の液滴の中に封入することによって、ＣＴＣを、簡単に隔離することができ、これによって、費用のかからない診断への応用およびさらなる研究のための単一細胞を提供する。
【００２５】
特に、液滴は、マイクロ流体装置中で水性エマルションの一部であることができる。１つの実施形態において、液滴は、油中水エマルション（Ｗ／Ｏエマルション）中にあるが、原理的には、２重エマルションを使用し得る。エマルションは、チップ上でまたは別に形成することができる。ワールブルグ効果は、好気条件下で主に発生するので、溶存酸素を保持するのを助けるために、フルオラス油をエマルションの油成分として使用することが有利であり得る。さらに、界面活性剤をフルオラス油に添加することができる。適切なフルオラス油は、例えば、３Ｍ（登録商標）からのＦＣ−７７およびＦＣ−４０のような技術水準として記載されたものである。
【００２６】
上に示したように、本発明の方法は、体液中のＣＴＣを検出するために実施される。本発明の１つの実施形態において、体液は、血液、血清、リンパ液、胸水、腹水、脳脊髄液を含む群から選択される。好ましい態様において、体液は、血液である。
【００２７】
１ｍｌ当たり約４〜１１×１０６個の白血球細胞および１０９個の赤血球細胞を含み得る血液の場合、本発明の方法はまた、スループットを促進するために、赤血球細胞を除去するステップを含むことができる。
【００２８】
本発明の方法はまた、隔離された（封入された）量の体液をインキュベーションするステップを含む。より具体的には、インキュベーションステップは、室温から３７℃の温度で実施することができる。
【００２９】
インキュベーション時間は、少なくとも１分〜４８時間とすることができる。特に、乳酸塩またはｐＨ検出の場合には、少なくとも１分とすることができる。これらの時間は、細胞が取り扱われる条件（例えば、培地）の調整に伴って変わり得る。
インキュベーションステップは、チップ上またはチップなしのいずれかでも実施できる。
【００３０】
１００ｐＬの量の中に分泌されるプロトンの影響の概算（乳酸は、水中で、部分的に乳酸アニオンとＨ＋に解離する）は、インキュベーションの短期間の後でさえ、隔離された量の体液のｐＨが低下することを示す。具体的には、発明者らは、１時間で１００ｐＬ当たり約３．６８ｘ１０−１３モルのＨ＋分泌は、約３．６８ｍＭの濃度変化をたらし、それおは、純水で開始した場合、１時間のインキュベーション後、ｐＨ７からｐＨ２．４へのｐＨの低下に到るであろうことを確認した。
【００３１】
前述した通り、本明細書中で記載される方法の１つの実施形態によれば、体液中でのＣＴＣの存在は、インキュベーションステップ後に隔離された量の体液内でのｐＨ値の変化を検出することによって示すことができる。この変化は、ｐＨ値の変化を検出するのに適している当業者に公知の任意の技術を使用することによって、検出することができる。
【００３２】
ｐＨ値の変化は、ｐＨ指示薬により決定することができる。
ｐＨ指示薬は、ｐＨ感受性色素またはｐＨが変化するとその吸収／発光スペクトルを変化させる指標物質であり得る。これらの指示薬の例は、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）グリーン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（これは酸性ｐＨで緑の蛍光を発する）、ＳＮＡＲＦ（登録商標）−４Ｆ  ５―（および−６）カルボン酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（これは、５８０ｎｍおよび６４０ｎｍの蛍光の比が酸性ｐＨで増加する）、およびｐＨ感受性無機塩（これらは凝集して微結晶を形成する）である。
【００３３】
さらに、本発明の方法はまた、ｐＨ指示薬のシグナルを検出するために、色素の励起波長でのレーザーにより、インキュベートされた当該量の体液を照射するステップを含むことができる。この実施形態においてでも、ｐＨ値の変化は、照射後に放出されるシグナルの関数であることを理解することができる。
【００３４】
上記に示したように、ＣＴＣの検出はまた、インキュベートされた当該量の体液内で、乳酸、乳酸塩イオンおよびプロトン（乳酸は水中で、乳酸アニオンとＨ＋に部分的に解離する）から選択される少なくとも１つの分子の濃度を決定することによって実施することができる。その濃度は、そのような目的のために当業者に公知の任意の技術を用いて測定することができる。例えば、乳酸は、蛍光指示薬によって測定することができる（Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, Ｉｎｃ.による蛍光乳酸塩検出キット）。
【００３５】
またさらに別の代替的検出は、ｐＨ誘発重合を受けるモノマーを含むことができる指示薬の場合には、液滴の機械的特性および／または内容物の粘度の変化の測定に基づくことができる。モニターされる分泌（または吸収）に応じて、他の指示薬を使用してもよい。
【００３６】
本発明の方法はまた、例えば、循環腫瘍細胞を培養するために、または遺伝的もしくはプロテオミックの観点から循環腫瘍細胞を特徴付けるために、または薬物スクリーニングの目的のために、検出されたＣＴＣを含む隔離された量の体液を、順に選別するステップを含むことができる。
【００３７】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を測定するための装置
本明細書中では循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を測定するための装置も開示される。
特に、体液中の循環腫瘍細胞を検出する装置は、
約１０ｐＬ〜１０ｎＬの量の液で細胞を封入する手段；および
該インキュベートされた当該量の液内でのｐＨの変化および／または、乳酸、乳酸塩イオン、プロトンから選択される少なくとも１つの分子の濃度の変化を検出する手段を備える。
本発明の１つの実施形態において、当該量の液を隔離するための前記手段は、液滴ベースのマイクロ流体装置である。
【００３８】
本発明の方法に関して上で既に記載したように、液滴の量は、ｐＬ〜ｎＬ、例えば、１０ｎＬ、５ｎＬ、１ｎＬまたは５００ｐＬ未満の範囲であることができる；好ましい体積は、いくつかの実施形態においては、１００ｐＬのオーダーである。マイクロ流体装置において、チャネルの最大寸法は、好ましくは１，０００、５００、３００、２００または１００マイクロメートル未満である。
【００３９】
１つの実施形態において、液滴は、マイクロ流体装置内の油中水型エマルション（Ｗ／Ｏエマルション）の水性液滴である。エマルションはチップ上に、または別に形成することができる。ワールブルグ効果は、好気性条件において主に発生するので、溶存酸素を保存するのに役立つフルオラス油をエマルションの油成分として使用することが有利であり得る。好ましくは、界面活性剤をフルオラス油に添加する。適切なフルオラス油は、例えば、３Ｍ（登録商標）からのＦＣ−７７およびＦＣ−４０のような技術水準として記載されるものである。
【００４０】
本発明の１つの実施形態において、測定するための前記手段は、ｐＨ感受性色素および／または、ｐＨが変化と、その吸収スペクトルを変化させる指示薬を含む。これらの指示薬の例は、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）グリーン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（これは酸性ｐＨで緑の蛍光を発する（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、ＳＮＡＲＦ（登録商標）−４Ｆ  ５―（および−６）カルボン酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（これは、５８０ｎｍと６３０ｎｍの蛍光の比が酸性ｐＨで増加する）、およびｐＨ感受性無機塩（これは凝集して微結晶を形成する）である。
【００４１】
本発明の１つの実施形態において、測定するための前記手段は、インキュベートされた前記量の体液内での乳酸、乳酸塩イオンおよびプロトン（乳酸は水中で、乳酸アニオンとＨ＋に部分的に解離する）から選択される少なくとも１つの分子の濃度を測定できる手段とすることができる。例えば、乳酸は、蛍光指示薬によって測定することができる（Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, Ｉｎｃ.によるフルオロ乳酸塩検出キット）。
【００４２】
１つの実施形態において、その測定手段を、液滴に直接的に含ませることもできる。
液滴内でのｐＨ値の変化の測定はまた、感知装置、例えば、蛍光センシング装置を含むマイクロ流体装置におけるチャネルに液滴を通すことによって実施することもできる。
【００４３】
さらに、その装置は、ｐＨ指示薬のシグナルを検出するために、蛍光体の励起範囲の波長を発光することができるレーザーを含むことができる。この実施形態においてでも、ｐＨ値の変化は、照射後に放出されるシグナルの関数であることを理解できる。この装置は、光電子増倍管のような検出器を含むことができる。
【００４４】
実験例
１．材料
ＰｈＲｏｄｏ Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ.）、ｐＨ感受性色素、酸性ｐＨでの蛍光グリーン
フルオロ乳酸検出キット（Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, Ｉｎｃ.）
Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
ＨＦＥ−７５００（３Ｍ Ｉｎｃ）
ＦＣ−４０(３Ｍ)、フッ素化オイル
ＰＢＳ(リン酸緩衝生理食塩水)緩衝液
ＤＩ水中の０．９% ＮａＣＩ 溶液
ＰＤＭＳ（ポリジメチルシリコーン）キット（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）
ＳＮＡＲＦ−５Ｆまたは４Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
【００４５】
２．溶液
油相：ＨＦＥ−７５００（ハイドロフルオロエーテル溶媒）における２％（ｗ／ｗ）のＳＳ０１
色素ストック：ＤＩ（脱イオン）水中の１ｍｇ／ｍｌのｐＨｒｏｄｏグリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ.）；
色素ストック：２ｍＭのＳＮＡＲＦ−５Ｆまたは４Ｆ；
グルコースストック：ＤＩ水中の０．５Ｍグルコース；
ｐＨｒｏｄｏグリーンのためのインキュベーション緩衝液：ＰＢＳおよび０．９％ＮａＣｌを体積比で１：３および１：５（緩衝性イオン（ＨＰＯ４２−およびＨ２ＰＯ４）の約３および２ｍＭの濃度）で混合した。５０μＬのグルコースストックおよび２０μＬの色素ストック溶液を得られた緩衝溶液の各々１ｍＬに添加した（最終濃度２５ｍＭのグルコースおよび２０μｇ／ｍｌのｐＨｒｏｄｏグリーン）；
ＳＮＡＲＦ−５Ｆまたは４Ｆのためのインキュベーション緩衝液：ＨＢＳＳ、１０ｍＭのグルコース、Ｊｏｋｌｉｋの改変ＥＭＥＭ。
【００４６】
３．細胞
Ａ５４９細胞（ヒト肺がん、Ｈｕｂｒｅｃｈｔ ｌａｂ）を１０分、＋１０％ウシ胎児血清でＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地、培地）中で培養し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを使用して分離し、インキュベーション緩衝液中に再懸濁した。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ（登録商標）の密度勾配分離によって単離した。抗凝固剤を含む全血からバッフィーコートを採取し、約４．５倍に希釈する。Ｆｉｃｏｌｌを血液の下に添加し、細胞を室温で２５分間、８００ｇで遠沈する。中間相を除去し、２回洗浄した（６５０ｇで１０分、および５５０ｇで５分）。最後に、細胞を無血清ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地）中に再懸濁する。
【００４７】
４．ＰＤＭＳ装置製造
フォトリソグラフィーは、ＰＤＭＳの複製のためのマスターを製造するために使用された。ＳＵ８−２０２５の２５μｍ厚さの層は、シリコン・ウエハー上で回転され、焼かれ、透明性マスクを通して曝露され、再び焼かれ、現像された。製造者が提案する処理条件は、全体のプロセスのために使用された。
【００４８】
ＰＤＭＳプレポリマーおよび架橋剤を１０：１の質量比（ｗ／ｗ）で混合し；混合物をマスターに注ぎ、脱気し、少なくとも２時間、６５℃で硬化した。
複製をマスターから剥離し、容器は鈍い皮下注射針を使用して穴をあけた。ＰＤＭＳの複製を石鹸水とエタノールで洗浄し、窒素を吹付け乾燥した。清潔なガラススライドおよび清潔なＰＤＭＳの複製を酸素プラズマで処理し、結合した。装置をＦＣ−４０中で１％の（トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル）−１−トリクロロシランでシラン化し、マイクロ流体チャネルに（マイクロ流体ネットワーク全体を完全に湿らせるのに十分なように）導入され、次にその装置を９５℃で少なくとも３０分間保持した。
【００４９】
５．検出
静止している液滴の観察：オリンパスＩＸ８１倒立落射蛍光顕微鏡を蛍光測定のために使用した。顕微鏡は、ｘＣｉｔｅ １２０Ｑランプ（Ｌｕｍｅｎ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ.）、フィルターセット、およびｉＸｏｎ ８９７カメラ（Ａｎｄｏｒ）が装備されていた。
流れる液滴の観察：図１に示されるように、オリンパスＩＸ７１倒立顕微鏡が流れる液滴の１つ１つを分析するために使用された。レーザー（Ｃｕｂｅ、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｉｎｃ.）ビームが拡大され（約１０倍）、検出チャネルの真ん中に焦点が絞られた。励起された液滴の蛍光シグナルは、ＰＭＴ検出器（Ｈ８２４９、Ｈａｍａｍａｔｓｕ）によって検出された。
【００５０】
６．ｐＨ変化の検出
ｐＨ値が癌性の細胞および白血球細胞について別々に評価された。１つの実験において、インキュベーション緩衝液中の３０〜５０μＬの細胞懸濁液は、Ｔ結合マイクロ流体装置で乳化された（高さ：２５μｍ；連続相チャネルおよび分散相チャネルの幅は、２０μｍであった）。分散相の流速は１２０μＬ／時間であった；連続相の流速は、６００μＬ／時間であった。懸濁液はプラスチックバイアルに回収され、その後１時間、３７℃でインキュベートした。観察のために、液滴は、ａ）顕微鏡スライド上に置かれ、またはｂ）マイクロ流体装置中に注入された。検出をＰｈｒｏｄｏＧｒｅｅｎまたはＳＮＡＲＦ−５Ｆまたは４Ｆによって実施した。最初、ｐＨ低い間は、蛍光が増加し、ｐＨが変化すると、ＳＮＡＲＦは吸収スペクトルを変化させる。より具体的には、ｐＨが低下していくと、５８０ｎｍで蛍光が増加し、６４０ｎｍで蛍光が低下する。したがって、５８０／６３０の比が高くなるほど、ｐＨが低い。蛍光は、倒立落射蛍光顕微鏡を使用して検出された。
【００５１】
結果
結果を図５および６、ならびに以下の表１に示す。
特に、上記で既に指摘したように、５８０／６３０比が高くなるほど、ｐＨが低くなる。白血球細胞がｐＨ７．０以下とならないのに対し、癌細胞は、７．４〜６．４の範囲である。
【００５２】
【表１】
0006437009.tif 000002
【００５３】
図６Ａ〜６Ｂを参照すると、ｘ＜７およびｙ＞１．５の閾値は、血液細胞に関して、癌細胞を検出する際に１００％の特異性を提示することを理解できる。
【００５４】
７．乳酸分泌の検出
乳酸分泌は、赤血球溶解液からの癌細胞（Ａ５４９）および白血球細胞の混合懸濁液を使用して評価された。３チャネル構造のマイクロ流体回路を使用した：１つのチャネルは、細胞懸濁液をもたらし、１つは乳酸塩アッセイのための酵素をもたらし、１つは油相をもたらす。乳化ステップは、細胞代謝を停止して癌細胞による全溶液の乳酸汚染を回避するため、４℃で実施された。封入前の非特異的な活性化を避けるために、マイクロ流体装置を用いることで、マイクロ液滴への封入の後でのみ、乳酸アッセイの酵素に細胞をさらすことができた。写真を、乳化の１５分後に室温で撮影した。
【００５５】
結果
細胞を含む液滴でのｐＨ変化による蛍光を図２に示す。Ａ５４９腫瘍細胞を含む液滴は、空の液滴から区別される。別の実験において、ＰＢＭＣをグルコースの存在下、インキュベートした。Ａ５４９とＰＢＭＣの比較を図３に示す：空の液滴および細胞含有液滴は、人により蛍光顕微鏡写真から選択され、空の液滴の測定は、両方の実験の比較のために含められた。両方の細胞型は、ｐＨの減少（蛍光強度の増加）を示すが、これは、Ａ５４９腫瘍細胞の場合、非常により顕著である。
乳酸アッセイの場合、類似の結果を図４で見ることができる。
【００５６】
したがって、本明細書中に記載される本発明の方法の実施形態は、ＣＴＣの検出および高速計数のための抗体を含まない方法を容易にすることを理解することができる。本発明の方法の目的の実施形態は、予後、治療モニタリングおよびセラノスティックへの適用に使用することができる。例えば、本発明の方法は、治療の層別化および／またはリアルタイムモニタリング、ならびに転移性再発および／または転移の進行のリスクを推定するために使用することができる。
【００５７】
本発明は、好ましい態様を参照してこれまでに説明されてきた。同じ発明の核に言及す他の態様があり、すべて以下に記載の特許請求の範囲の保護範囲内に入ることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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