(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞から膵臓ホルモン発現細胞を誘導する方法であって、
ａ．多能性幹細胞を、胚体内胚葉系（definitive endoderm lineage）に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、
ｂ．前記胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、原始腸管細胞集団へと分化させる工程と、
ｃ．前記原始腸管細胞集団を、後部前腸の細胞集団へと分化させる工程と、
ｄ．前記後部前腸の細胞集団をＣＹＰ２６Ａ阻害剤を補充した培地で培養することにより、前記後部前腸の細胞集団を膵内分泌前駆細胞集団へ分化させる工程と、
ｅ．前記膵内分泌前駆細胞集団をＢＭＰ受容体阻害剤およびＡＬＫ５阻害剤を補充した培地で培養することにより、前記膵内分泌前駆細胞集団を未成熟な膵臓ホルモン発現細胞へ分化させる工程と、
ｆ．前記未成熟な膵臓ホルモン発現細胞をＢＭＰ受容体阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤およびビタミンＡを補充した培地で培養することにより、前記未成熟な膵臓ホルモン発現細胞を膵臓ホルモン発現細胞へ分化させる工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
工程ｅおよびｆにおける前記ＢＭＰ受容体阻害剤がＬＤＮ−１９３１８９である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＬＤＮ−１９３１８９が１００ｎＭの濃度で使用される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程ｅおよびｆにおける前記ＡＬＫ５阻害剤がＳＤ−２０８である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＳＤ−２０８が２μＭの濃度で使用される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記工程ｅが膵内分泌前駆細胞集団を３日間培養することを含む、、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記工程ｆが未成熟な膵臓ホルモン発現細胞を３日間培養することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記工程ｅおよびｆにおける培地が、さらにＢＳＡ、炭酸水素ナトリウム及びＩＴＳ−Ｘで補充されている、、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記工程ｅおよびｆにおける培地が０．１％ＢＳＡ、０．００２５ｇ／ｍｌ炭酸水素ナトリウム及びＩＴＳ−Ｘで補充されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程ｅおよびｆにおける培地が、ＭＣＤＢ−１３１／高グルコースである、、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程ｅは、前記膵内分泌前駆細胞集団をＢＳＡ、炭酸水素ナトリウム、ＬＤＮ−１９３１８９及びＳＤ−２０８で補充したＭＣＤＢ−１３１／高グルコース培地で培養することにより、前記膵内分泌前駆細胞集団を未成熟な膵臓ホルモン発現細胞へ分化させることを含み、
前記工程ｆは、前記未成熟な膵臓ホルモン発現細胞をＢＳＡ、炭酸水素ナトリウム、ＬＤＮ−１９３１８９、ＳＤ−２０８およびビタミンＡで補充したＭＣＤＢ−１３１／高グルコース培地で培養することにより、前記未成熟な膵臓ホルモン発現細胞を膵臓ホルモン発現細胞へ分化させることを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
後部前腸の細胞から膵臓ホルモン発現細胞を誘導する方法であって、
ａ．後部前腸の細胞集団をＣＹＰ２６Ａ阻害剤を補充した培地で培養することにより、前記後部前腸の細胞集団を膵内分泌前駆細胞集団へ分化させる工程と、
ｂ．前記膵内分泌前駆細胞集団をＢＭＰ受容体阻害剤およびＡＬＫ５阻害剤を補充した培地で培養することにより、前記膵内分泌前駆細胞集団を未成熟な膵臓ホルモン発現細胞へ分化させる工程と、
ｃ．前記未成熟な膵臓ホルモン発現細胞をＢＭＰ受容体阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤およびビタミンＡを補充した培地で培養することにより、前記未成熟な膵臓ホルモン発現細胞を膵臓ホルモン発現細胞へ分化させる工程と、
を含む、方法。
【請求項１４】
工程ｂおよびｃにおける前記ＢＭＰ受容体阻害剤がＬＤＮ−１９３１８９である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＬＤＮ−１９３１８９が１００ｎＭの濃度で使用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程ｂおよびｃにおける前記ＡＬＫ５阻害剤がＳＤ−２０８である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＳＤ−２０８が２μＭの濃度で使用される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記工程ｂが膵内分泌前駆細胞集団を３日間培養することを含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記工程ｃが未成熟な膵臓ホルモン発現細胞を３日間培養することを含む、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記工程ｂおよびｃにおける培地が、さらにＢＳＡ、炭酸水素ナトリウム及びＩＴＳ−Ｘで補充されている、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記工程ｂおよびｃにおける培地が０．１％ＢＳＡ、０．００２５ｇ／ｍｌ炭酸水素ナトリウム及びＩＴＳ−Ｘで補充されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記工程ｂおよびｃにおける培地が、ＭＣＤＢ−１３１／高グルコースである、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記後部前腸の細胞はヒト多能性幹細胞から誘導されたものである、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記工程ｂは、前記膵内分泌前駆細胞集団をＢＳＡ、炭酸水素ナトリウム、ＬＤＮ−１９３１８９及びＳＤ−２０８で補充したＭＣＤＢ−１３１／高グルコース培地で培養することにより、前記膵内分泌前駆細胞集団を未成熟な膵臓ホルモン発現細胞へ分化させることを含み、
前記工程ｃは、前記未成熟な膵臓ホルモン発現細胞をＢＳＡ、炭酸水素ナトリウム、ＬＤＮ−１９３１８９、ＳＤ−２０８およびビタミンＡで補充したＭＣＤＢ−１３１／高グルコース培地で培養することにより、前記未成熟な膵臓ホルモン発現細胞を膵臓ホルモン発現細胞へ分化させることを含む、
請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１０年８月３１日に出願された、米国特許仮出願第６１／３７８，４８０号の利益を主張するものであり、当該出願を、本明細書にその全容において、かつあらゆる目的について援用するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、多能性幹細胞からのインスリン産生細胞への分化を促進する方法を提供する。特に、本発明は、レチノイン酸を分解して内分泌前駆細胞集団を生成する剤を用いる方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
Ｉ型糖尿病の細胞補充療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、生着に適したインスリン産生細胞すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手法として、例えば、胚性幹細胞などの多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成するものがある。
【０００４】
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにて、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓等の組織は、内胚葉から中間段階を経て発達する。このプロセスにおける中間段階は、胚体内胚葉の形成である。胚体内胚葉細胞はＨＮＦ３  β、ＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ１７などの多数のマーカーを発現する。
【０００５】
膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により生じる。膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子、ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ１が存在しない場合、膵臓の発達は、腹側芽及び背側芽の形成より先に進行しない。したがって、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程を運命づける。成熟した膵臓は、他の細胞型の中でも、外分泌組織及び内分泌組織を含む。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によって生じる。
【０００６】
生体内での膵臓の発達は、臓器前駆体の領域を運命決定するシグナルの適切な制御に少なくとも一部依存するものである。Ｋｉｎｋｅｌら（ＰＮＡＳ  Ｍａｙ  １２，２００９  ｖｏｌ．１０６  ｎｏ．１９  ７８６４〜７８６９）は、「膵臓細胞の予定運命は、レチノイン酸（ＲＡ）により決定され、膵臓領域の適切な大きさ及び位置は、ＲＡシグナル伝達の厳密な制御に依存する。我々は本報告に、通常の、膵臓の前側領域の予定運命の決定の際に、ＲＡ分解Ｃｙｐ２６酵素が重要な役割を果たすことを示す。」と記述している。
【０００７】
膵島細胞の特徴を保持する細胞がマウスの胚細胞から誘導されたことが報告されている。例えば、Ｌｕｍｅｌｓｋｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：１３８９、２００１年）は、マウスの胚幹細胞の、膵島と同様のインスリン分泌構造への分化を報告している。Ｓｏｒｉａら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９：１５７、２０００年）は、ストレプトゾトシン糖尿病のマウスにおいて、マウスの胚幹細胞から誘導されたインスリン分泌細胞が糖血症を正常化することを報告している。
【０００８】
一例において、Ｈｏｒｉら（ＰＮＡＳ  ９９：１６１０５，２００２）は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＬＹ２９４００２）の阻害剤でマウス胚性幹細胞を処理することにより、β細胞に類似した細胞が生成されたことを開示している。
【０００９】
他の例では、Ｂｌｙｓｚｃｚｕｋら（ＰＮＡＳ  １００：９９８、２００３年）が、Ｐａｘ４を構成的に発現するマウス胚幹細胞からのインスリン産生細胞の生成を報告している。
【００１０】
Ｍｉｃａｌｌｅｆらは、レチノイン酸は、胚幹細胞のＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉形成に関する予定運命を制御できることを報告している。レチノイン酸は、胚における原腸形成の終了時に相当する期間中に、胚性幹細胞分化の４日目に培養液に添加すると、Ｐｄｘ１発現の誘導に最も効果的である（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４：３０１、２００５年）。
【００１１】
Ｍｉｙａｚａｋｉらは、Ｐｄｘ１を過剰発現するマウス胚幹細胞株を報告している。この結果は、外因性のＰｄｘ１発現が、得られた分化細胞内でインスリン、ソマトスタチン、グルコキナーゼ、ニューロゲニン３、ｐ４８、Ｐａｘ６、及びＨｎｆ６遺伝子の発現を明らかに増加させたことを示している（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３：１０３０，２００４）。
【００１２】
Ｓｋｏｕｄｙらは、マウス胚性幹細胞内で、アクチビンＡ（ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー）が、膵臓外分泌遺伝子（ｐ４８及びアミラーゼ）、並びに内分泌遺伝子（Ｐｄｘ１、インスリン及びグルカゴン）の発現を上方制御することを報告している。最大の効果はアクチビンＡを１ｎＭ用いた場合に観察された。Ｓｋｏｕｄｙらはまた、インスリン及びＰｄｘ１のｍＲＮＡ発現レベルはレチノイン酸による影響を受けなかった一方で、Ｐｄｘ１の転写レベルは３ｎＭのＦＧＦ７による処理により増加したことも観察している（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７９：７４９，２００４）。
【００１３】
Ｓｈｉｒａｋｉらは、胚幹細胞のＰＤＸ１陽性細胞への分化を特異的に高める増殖因子の効果を研究した。Ｓｈｉｒａｋｉらは、ＴＧＦ−β２によってＰＤＸ１陽性細胞がより高い比率で再現性よく得られたことを観察している（Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．２００５  Ｊｕｎ；１０（６）：５０３〜１６）。
【００１４】
Ｇｏｒｄｏｎらは、血清の非存在下、かつアクチビンとＷｎｔシグナル伝達阻害剤の存在下での、マウス胚性幹細胞からの短尾奇形［陽性］／ＨＮＦ３  β［陽性］内胚葉細胞への誘導を示した（米国特許第２００６／０００３４４６（Ａ１）号）。
【００１５】
Ｇｏｒｄｏｎら（ＰＮＡＳ、１０３巻、１６８０６頁、２００６年）は、「Ｗｎｔ及びＴＧＦ−β／ｎｏｄａｌ／アクチビンシグナル伝達は、前側の原始線条の生成の際に同時に必要である」と述べている。
【００１６】
しかしながら、胚幹細胞発達のマウスモデルは、例えば、ヒト等のより高等な哺乳動物内の発達プログラムを正確に模倣しない恐れがある。
【００１７】
Ｔｈｏｍｓｏｎらは、ヒト胚盤胞から胚幹細胞を単離した（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４、１９９８年）。これと同時に、Ｇｅａｒｈａｒｔ及び共同研究者は、胎児生殖腺組織から、ヒト胚生生殖（ｈＥＧ）細胞株を誘導した（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６，１９９８）。単に白血病抑制因子（ＬＩＦ）と共に培養すれば分化が阻止され得るマウス胚幹細胞とは異なり、ヒト胚幹細胞は、非常に特殊な条件下で維持する必要がある（米国特許第６，２００，８０６号、国際公開第９９／２０７４１号；国際公開第０１／５１６１６号）。
【００１８】
ダムールら（Ｄ’Ａｍｏｕｒ）は、高濃度のアクチビン及び低濃度の血清の存在下で、ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮化された培養物が調製されたことを述べている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００５）。これらの細胞を、マウスの腎臓皮膜下で移植することにより、いくつかの内胚葉性器官の特徴を有する、より成熟した細胞への分化が見られた。ヒト胚幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ−１０の添加後、ＰＤＸ１陽性細胞に更に分化し得る（米国特許出願公開第２００５／０２６６５５４Ａ１号）。
【００１９】
Ｄ’Ａｍｏｕｒら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−２４，１３９２〜１４０１（２００６））は、「我々はヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を、膵臓ホルモンインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド及びグレリンを合成できる内分泌細胞へと変換させる分化プロセスを開発した。このプロセスは、胚体内胚葉、腸管内胚葉、膵臓内胚葉及び内分泌前駆体が、内分泌ホルモンを発現する細胞へと向かう段階に類似した段階を通して細胞を指向させることにより、インビボでの膵臓器官形成を模倣する。」と述べている。
【００２０】
別の例において、Ｆｉｓｋらは、ヒト胚幹細胞から膵島細胞を産生するシステムを報告している（米国特許出願公開第２００６／００４０３８７（Ａ１）号）。この場合、分化経路は３つの段階に分割された。まず始めに酪酸ナトリウムとアクチビンＡを組み合わせて用いることで、ヒト胚性幹細胞は内胚葉へと分化した。次いで、ノギンなどのＴＧＦ−βアンタゴニストとＥＧＦ又はベータセルリンを組み合わせて用い、細胞を培養し、ＰＤＸ１陽性細胞を生成した。最終分化は、ニコチンアミドにより誘導した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
よりβ細胞に類似している、機能性のインスリン発現細胞を生成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法の開発が未だに強く求められている。本発明は、レチノイン酸を分解する剤を用い膵前駆細胞集団を生成することにより、多能性幹細胞のインスリン発現細胞への分化効率を改善するという、代替的なアプローチを取る。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
一実施形態では、本発明は、レチノイン酸を分解して内分泌前駆細胞集団を生成する剤を用いる方法を提供する。
【００２３】
一実施形態では、膵内分泌前駆細胞集団の生成は、段階的な分化プロトコルにより実施され、このプロトコルでは、まず始めに、多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系（definitive endoderm lineage）に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる。次に、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を、原始腸管細胞集団へと分化させる。次に、原始腸管細胞集団を後部前腸（Posterior foregut）の細胞集団へと分化させる。次に、レチノイン酸を分解する剤を添加した培地により、後部前腸の細胞を処理することで、後部前腸の細胞集団を内分泌前駆細胞の集団へと分化させる。
【００２４】
一実施形態では、更に、内分泌前駆細胞集団を、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例１に概述するプロトコルの第ＩＩＩ〜ＩＶステージの細胞から得られた試料により得られたリアルタイムＰＣＲデータを示す。ａ）はＰＡＸ４、ｂ）はＮＧＮ３、ｃ）はＰＤＸ１、ｄ）はＮＥＵＲＯＤ、ｅ）はＮＫＸ６．１、ｆ）はＣＤＸ２、及びｇ）はアルブミンである。ｙ軸は、未分化のＨ１細胞に対する発現倍率である。パネルＨは、第ＩＶステージの対照及びＣＹＰ２６Ａ処理培養物の、ＮＧＮ３に対する免疫染色を示す。
【図２】実施例２に概述するプロトコルの第ＩＩＩ〜ＩＶステージの細胞から得られた試料により得られたリアルタイムＰＣＲデータを示す。ａ）はＮＧＮ３、ｂ）はＮＥＵＲＯＤ、ｃ）はＣＤＸ２、ｄ）はＮＫＸ６．１、及びｅ）はＰＤＸ１である。ｙ軸は、未分化のＨ１細胞に対する発現倍率。
【図３】実施例３に概述するプロトコルの第Ｉ〜ＶＩステージの細胞の相画像を示す。
【図４】実施例３に概述するプロトコルの第ＩＶ〜ＶＩＩステージの細胞のＮＫＸ６．１発現に関するＦＡＣＳプロットを示す。
【図５】実施例３に概述するプロトコルの第Ｖ及びＶＩＩステージの細胞のＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＣＤＸ２の免疫染色画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、「発明を実施するための形態」を、本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を説明又は例示する下記の小項目に分
割する。
【００２７】
定義
幹細胞は、単独の細胞レベルで自己複製し、分化して後代細胞を生成するという、これらの両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉層（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系の機能的細胞へと分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉層の組織を生じ、胚盤胞への注入後、すべてではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
【００２８】
幹細胞は、発生能によって、（１）全胚及び胚体外細胞型を生じる能力を意味する全能性、（２）全胚細胞型を生じる能力を意味する多能性、（３）細胞系の小集合を生じるが、すべて特定の組織、器官、又は生理学的システム内で生じる能力を意味する複能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）、血液細胞に限定された寡能性前駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素（例えば、血小板）を含む後代を産生できる）、（４）複能性幹細胞と比較して、より限定された細胞系統の小集合を生じる能力を意味する寡能性、並びに（５）１つの細胞系（例えば、精子形成幹細胞）を生じる能力を意味する単能性に分類される。
【００２９】
分化は、専門化されていない（「中立の」）又は比較的専門化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの専門化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化細胞又は分化誘導した細胞は、細胞系内でより専門化された（「分化決定された」）状況を示す細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「傾倒した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系統内で比較的特殊化されて（又は傾倒して）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用される場合、細胞系統は、細胞の遺伝、即ちその細胞がどの細胞に由来するか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系とは、発生及び分化の遺伝スキーム内にその細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、分化決定されていない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる。
【００３０】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」又は「ステージ１細胞」又は「ステージ１」とは、以下のマーカー、すなわち、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３  β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４、ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、又はＯＴＸ２のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。
【００３１】
本明細書で使用するとき、「膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１  β、ＰＴＦ１  α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４  α、ＳＯＸ９、ＨＢ９、又はＰＲＯＸ１のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。膵内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわち、ＨＮＦ３  β、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１を発現する。
【００３３】
本明細書で使用するとき「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。この文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出限界は、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。
【００３４】
本明細書で使用するとき、「膵内分泌前駆体細胞」は、次のマーカー：ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、又はＮＫＸ２．２のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。
【００３５】
本明細書で使用するとき、「後部前腸細胞（Posterior foregut cell）」は、次のマーカー：ＰＤＸ１又はＨＮＦ６のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。
【００３６】
本明細書で使用するとき、「未成熟な膵臓ホルモン発現細胞」は、次のマーカー：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、ＭＡＦＢ、ＰＤＸ１、ＡＲＸ、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．２、又はＮＥＵＲＯＤのうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。
【００３７】
本明細書で使用するとき、「原始腸管細胞」は、次のマーカー：ＨＮＦ１  β又はＨＮＦ４  αのうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。  
【００３８】
本明細書で使用するとき、「膵内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」又は「膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す。
【００３９】
多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーのうちの１つ以上を発現する（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，１９９８）。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現が減少し（存在する場合）、ＳＳＥＡ−１の発現が上昇する。未分化の多能性幹細胞は、典型的には、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  Ｃａｌｉｆ．））によって記載されるようにＶｅｃｔｏｒＲｅｄを基質として現像することによって検出することができる、アルカリホスファターゼ活性を有しする。未分化の多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるように、一般にＯＣＴ４及びＴＥＲＴも発現する。
【００４０】
増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、３つの胚葉のすべて、すなわち、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化する能力である。多能性幹細胞の多能性は、例えば細胞を重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、４％パラホルムアルデヒドを使用して、形成された奇形腫を固定した後、それらを３つの胚葉由来の細胞型の痕跡に関して組織学的に検査することにより確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。
【００４１】
増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用し、対応する霊長類種の発表されている核型と比較することで、核型を決定することができる。細胞は「正常な核型」を有することが望ましく、「正常な核型」とは、細胞が正倍数体であり、ヒト染色体がすべて揃っておりかつ目立った変化のないことを意味する。
【００４２】
多能性幹細胞の供給源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば胚盤胞など）、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例としては、例えばヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）などのヒト胚性幹細胞又はヒト胚生殖細胞の樹立株が挙げられる。更に、こうした細胞の初期の株化又は安定化の際に本開示の組成物を使用することも考えられるが、その場合は、供給源となる細胞は供給源の組織から直接採取される１次多能性細胞である。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）などの変異型ヒト胚幹細胞株も好適である。
【００４３】
一実施形態では、ヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎらに開示される方法の通りに調製される（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ｆｆ．，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４，１９９５）。
【００４４】
多能性幹細胞の培養
一実施形態において、多能性幹細胞は、フィーダー細胞の層上で培養され、このフィーダー細胞は、多能性幹細胞を様々な方法で支持する。代替的に、多能性幹細胞は、基本的にフィーダー細胞が存在しないにも関わらず、ほぼ分化を受けないで多能性幹細胞の増殖を支持する培養液システム中で培養される。多能性幹細胞を分化させずに無フィーダー培養液中で増殖させる際には、以前に他の細胞種を予め培養しておいて馴化させた培地を使用することでこの操作が支持される。代替的に、多能性幹細胞を無フィーダー培養液中で分化させずに増殖させる際は、合成培地を使用することでこの操作が支持される。
【００４５】
一実施形態において、多能性幹細胞は、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３９９〜４０４（２０００））に開示されている方法に従
って、マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞層上で培養されてもよい。あるいは、多能性
幹細胞は、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらに開示されている方法に従ってマウス胚性線維芽細胞フィ
ーダー細胞層上で培養されてもよい（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９９８
：Ｖｏｌ．２８２．ｎｏ．５３９１，ｐｐ．１１４５〜１１４７）。あるいは、多能性幹
細胞は、Ｒｉｃｈａｒｄｓら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２１：５４６〜５５６，２００３
）に開示されているフィーダー細胞層の任意の１つの上で培養されてもよい。
【００４６】
一実施形態では、多能性幹細胞は、Ｗａｎｇら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２３：１２２
１〜１２２７，２００５）に開示されている方法に従って、ヒトフィーダー細胞層の上で
培養されてもよい。代替実施形態では、多能性幹細胞は、Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃら（Ｓｔｅ
ｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００５  ２３：３０６〜３１４，２００５）に開示されているヒトフ
ィーダー細胞層の上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ｍｉｙａｍｏｔｏ
ら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２：４３３〜４４０，２００４）に開示されているヒトフ
ィーダー細胞層の上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ａｍｉｔら（Ｂｉ
ｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ  ６８：２１５０〜２１５６，２００３）に開示されるヒトフィーダ
ー細胞層上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ｉｎｚｕｎｚａら（Ｓｔｅ
ｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２３：５４４〜５４９，２００５）に開示されているヒトフィーダー細
胞層の上で培養されてもよい。
【００４７】
一実施形態では、多能性幹細胞は、米国特許出願公開第２００２／００７２１１７号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許第６６４２０４８号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開第２００５０１４７９９に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ｘｕら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２：９７２〜９８０，２００４）に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開２００７／００１００１１号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開２００５／０２３３４４６号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許第６８００４８０号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開第２００５０６５３５４号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されて
もよい。
【００４８】
一実施形態では、多能性幹細胞は、Ｃｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ  ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０，Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９，２００５）に開示される方法に従って培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４：５６８〜５７４，２００６）に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開２００５／０１４８０７０号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開２００５／０２４４９６２号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開第２００５０８６８４５号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。
【００４９】
多能性幹細胞は、好適な培養基質上に播くことができる。一実施形態において、好適な培養基質は、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成し得るもの等の細胞外マトリクス成分である。一実施形態において、好適な培養基材はＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ  Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞由来の可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。
【００５０】
他の細胞外マトリクス成分及び成分混合物は代替物として好適である。増殖させる細胞型に応じて、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫塩、及び同様物を、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。
【００５１】
多能性幹細胞は、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下、基質上に好適な希釈率にて播かれてもよい。これらの特徴のすべては、播種分布に細心の注意を払うことで利益を得られるものであり、当業者は容易に決定することができる。
【００５２】
好適な培地は、以下の成分、すなわち例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ  ＃  １１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ  ＃１０８２９−０１８；ハムＦ１２／５０％  ＤＭＥＭ基本培地；２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ  ＃  １５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ  ＃  １１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ  ＃  Ｍ７５２２；ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ  ＃  １３２５６−０２９等から調製することもできる。
【００５３】
多能性幹細胞からの膵内分泌前駆細胞の生成
本発明は、多能性幹細胞集団からの、膵前駆細胞集団の生成方法を提供する。一実施形態では、本発明は、膵内分泌前駆細胞を、膵内分泌系マーカーを発現する細胞へと更に分化させる方法を提供する。
【００５４】
一実施形態では、本発明は膵前駆細胞の生成方法を提供し、この方法は、次工程：ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅを含む。
ａ．多能性幹細胞集団を培養する工程、
ｂ．多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程、
ｃ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を、原始腸管細胞集団へと分化させる工程、
ｄ．原始腸管細胞集団を、後部前腸の細胞集団へと分化させる工程、及び
ｅ．後部前腸の細胞集団をレチノイン酸を分解する剤を添加した培地で処理することにより、後部前腸の細胞集団を、膵内分泌前駆細胞集団へと分化させる工程。
【００５５】
この膵内分泌前駆細胞集団を更に処理して、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成することもできる。
【００５６】
分化の効率は、処理した細胞集団を、所望の細胞型に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する作用剤（例えば、抗体など）に暴露することにより測定することができる。
【００５７】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当技術分野にて標準的である。この方法としては、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたい）、並びにイムノアッセイ、例えば、免疫組織化学的分析、ウェスタンブロッティング、及びインタクトな細胞で利用できるマーカーについてのフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。
【００５８】
多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。多能性幹細胞のマーカーとして、例えば、以下のもの、すなわち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ  １−６０、Ｔｒａ  １−８１の１つ以上の発現が挙げられる。
【００５９】
多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現される、例えばＣＸＣＲ４等のタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に暴露することにより、分化した細胞を精製することができる。
【００６０】
本発明で用いるのに好適な多能性幹細胞としては、例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）が挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマーカー、すなわち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ９、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ  １−６０、及びＴｒａ  １−８１のうちの少なくとも１つを発現する細胞も本発明で用いるのに好適である。
【００６１】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３  β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４、ＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択される。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞は本発明での使用に好適である。本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、原始線条前駆細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【００６２】
膵内胚葉系（原始腸管細胞及び後部前腸の細胞を包含する）に特徴的なマーカーは、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１  β、ＰＴＦ１  α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４  α、ＳＯＸ９、ＨＢ９及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。膵内胚葉系に特徴的なこれらのマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内胚葉細胞である。  
【００６３】
膵内分泌系に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３、及びＰＴＦ−１  αからなる群から選択される。一実施形態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することができる。本発明で使用するに好適なものは、膵内分泌系の特徴を示すマーカーを少なくとも１つ発現する細胞である。本発明の一態様において、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵内分泌細胞である。膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。また、膵内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。
【００６４】
本発明の一態様では、膵内分泌細胞は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＰＤＸ１と、以下の転写因子、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３  β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、及びＰＡＸ６のうちの少なくとも１つを発現する。本発明の一態様では、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。
【００６５】
多能性幹細胞からの胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の生成
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、当該技術分野で公知の任意の方法により、多能性幹細胞集団から生成することができる。
【００６６】
例えば、Ｄ’Ａｍｏｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示の方法に従って、多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００６７】
例えば、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１，１６５１〜１６６２（２００４）に開示の方法に従って、多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００６８】
例えば、ＭｃＬｅａｎら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５，２９〜３８（２００７）に開示の方法に従って、多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００６９】
例えば、Ｄ’Ａｍｏｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示の方法に従って、多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００７０】
例えば、米国特許出願公開第１１／７３６，９０８号に開示の方法に従って、多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００７１】
例えば、米国特許出願公開第１１／７７９，３１１号に開示の方法に従って、多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００７２】
例えば、米国特許出願公開第１２／４９３，７４１号に開示の方法に従って、多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００７３】
例えば、米国特許出願公開第１２／４９４，７８９号に開示の方法に従って、多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００７４】
膵内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の生成
膵内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。一実施形態では、本発明の方法により生成された胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、当該技術分野の任意の方法により、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化する。
【００７５】
例えば、本発明の方法に従って得られた胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示される方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。
【００７６】
例えば、本発明の方法に従って得られた胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、米国特許出願公開第１１／７３６，９０８号に開示される方・BR>@に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。
【００７７】
膵内分泌前駆細胞集団の生成
一実施形態では、本発明は膵前駆細胞の生成方法を提供し、この方法は、次工程：ａ、
ｂ、ｃ、ｄ及びｅを含む。
ａ．多能性幹細胞集団を培養する工程、
ｂ．多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程、
ｃ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を、原始腸管細胞集団へと分化させる工程、
ｄ．原始腸管細胞集団を、後部前腸の細胞集団へと分化させる工程、及び
ｅ．後部前腸の細胞集団をレチノイン酸を分解する剤を添加した培地で処理することにより、後部前腸の細胞集団を、膵内分泌前駆細胞集団へと分化させる工程。
【００７８】
一実施形態では、レチノイン酸を分解する剤はＣＹＰ２６Ａ阻害剤である。ＣＹＰ２６Ａ阻害剤は、約１ｎＭ〜約１０００ｎＭの濃度で使用することができる。あるいは、ＣＹＰ２６Ａ阻害剤は、約１０ｎＭ〜約１００ｎＭの濃度で使用することができる。
【００７９】
任意のＣＹＰ２６Ａ阻害剤が本発明に使用するのに好適である。例えば、ＣＹＰ２６Ａ阻害剤は、米国特許第７，４６８，３９１号に開示の化合物から選択することができる。あるいは、ＣＹＰ２６Ａ阻害剤は、米国特許出願公開第２００５／０１８７２９８（Ａ１）号に開示の化合物から選択することができる。あるいは、ＣＹＰ２６Ａ阻害剤は、米国特許出願公開第２００４／０１０６２１６（Ａ１）号に開示の化合物から選択することができる。あるいは、ＣＹＰ２６Ａ阻害剤は、国際公開第２００５０５８３０１（Ａ１）号に開示の化合物から選択することができる。あるいは、ＣＹＰ２６Ａ阻害剤は、ＰＮＡＳ  Ｍａｙ  １２，２００９  ｖｏｌ．１０６  ｎｏ．１９  ７８６４〜７８６９に開示の化合物から選択することができる。一実施形態では、ＣＹＰ２６Ａ阻害剤はＮ−｛４−［２−エチル−１−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ブチル］フェニル｝−１，３−ベンゾチアゾール−２−アミンである。式１を参照されたい。
【００８０】
【化１】
0006353951.tif 000002
【００８１】
一実施形態では、レチノイン酸を分解する剤を添加した培地には、更に、ＢＭＰ阻害能をもつ因子、ＴＧＦβ受容体シグナル伝達阻害剤、ビタミンＡ及びＰＫＣ活性化剤からなる群から選択される少なくとも１つの因子が添加される。
【００８２】
一実施形態では、ＢＭＰ阻害能をもつ因子はノギンである。ノギンは、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、ノギンは、１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。
【００８３】
一実施形態では、ＴＧＦβ受容体シグナル伝達阻害剤はＡＬＫ５の阻害剤である。一実施形態では、ＡＬＫ５の阻害剤はＡＬＫ５阻害剤ＩＩである。ＡＬＫ５阻害剤ＩＩは、約０．１μＭ〜約１０μＭの濃度で使用することができる。一実施形態では、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩは１μＭの濃度で使用することができる。
【００８４】
一実施形態では、ＰＫＣ活性化剤は、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエモイルアミノ）ベンゾラクタム、インドラクタムＶ（ＩＬＶ）、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）、及びホルボール−１２，１３−ジブチレート（ＰＤＢｕ）からなる群から選択される。一実施形態では、プロテインキナーゼＣ活性化剤は、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエモイルアミノ）ベンゾラクタムである。（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエモイルアミノ）ベンゾラクタムは、約２０ｎＭ〜約５００ｎＭの濃度で使用することができる。本明細書では、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエモイルアミノ）ベンゾラクタムは「ＴＰＢ」と呼ぶ。
【００８５】
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞の生成
一実施形態では、本発明の方法により生成された膵内分泌前駆細胞集団を、当該技術分野で公知の任意の方法により、更に、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる。
【００８６】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。
【００８７】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。
【００８８】
例えば、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、米国特許出願公開第１１／７３６，９０８号に開示される方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。
【００８９】
例えば、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、米国特許出願公開第１１／７７９，３１１号に開示の方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと更に分化させることもできる。
【００９０】
例えば、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、米国特許出願公開第６０／９５３，１７８号に開示される方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。
【００９１】
例えば、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、米国特許出願公開第６０／９９０，５２９号に開示される方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。
【００９２】
本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００９３】
（実施例１）
ＦＢＳ不含でかつＣＹＰ２６Ａ阻害剤を含有している細胞培養培地でのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の膵内分泌前駆細胞への分化
ＭＥＦ−ＣＭ（マウス胚性線維芽細胞馴化培地）を用い、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コーティングディッシュ（１：３０希釈）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号３５６２３１）で、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ｐ４０〜ｐ５０）をコロニーとして培養し、次の通りに膵内分泌前駆細胞へと分化させた。
ａ．ステージＩ（胚体内胚葉）：ヒト胚性幹細胞を、２％脂肪酸不含ＢＳＡ（カタログ番号６８７００（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、ＩＡ））と１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）に加え、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ））と８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（カタログ番号１００−１８Ｂ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ＮＪ））を添加したＲＰＭＩ培地で１日培養し、続いて、２％  ＢＳＡと１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡに加え８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日処理し、次に
ｂ．ステージＩＩ（原始腸管）：細胞を２％の脂肪酸不含ＢＳＡ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を加えたＲＰＭＩで２日処理し、次に
ｃ．ステージＩＩＩ（後部前腸）：細胞を、１：２００希釈したＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）と０．１％  ＢＳＡ（Ｌｉｐｉｄ  Ｒｉｃｈ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１０２１−０４５）と５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７と０．２５μＭのＳＡＮＴ−１と２μＭレチノイン酸（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）と１００ｎｇ／ｍＬノギン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）と２．５μＭ  ４−［４−（４−フルオロフェニル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−ピリジン−４−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ブタ−３−イン−１−オール（米国特許第６，５２１，６５５号に開示のＰ３８阻害剤）と２０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡと、を添加したＤＭＥＭ／高グルコースで５日処理し、次に
ｄ．ステージＩＶ（膵内分泌前駆体）：細胞を、１：２００希釈したＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）と０．１％  ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ）と１００ｎｇ／ｍＬノギンと１μＭ  ＡＬＫ５阻害剤（ＳＤ−２０８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００７  ７２：１５２〜１６１に開示）と５００ｎＭのＴＰＢ（α−アミロイド前駆体タンパク質修飾物質）（カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ、ＣＡ）と１０〜１００ｎＭのＣＹＰ２６Ａ阻害剤Ｎ−｛４−［２−エチル−１−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ブチル］フェニル｝−１，３−ベンゾチアゾール−２−アミンと１０〜１００ｎＭのビタミンＡ（カタログ番号Ｒ７６３２（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ））を添加したＤＭＥＭ／高グルコースで４日処理し、あるいは
【００９４】
一部の培養物では、ステージＩＶは６日間に延長した。ステージＩＩＩ及びＩＶで、膵臓関連遺伝子についてリアルタイムＰＣＲで解析するために、ｍＲＮＡを単離した。図１に示す通り、ステージＩＶでＣＹＰ２６Ａ阻害剤を添加することで、投与量に応じた様式で、内分泌腺前駆体マーカー（ＮＧＮ３、Ｐａｘ４、ＮｅｕｒｏＤ）と膵内胚葉マーカーＮＫＸ６．１の発現が著しく増加した。ビタミンＡとＣＹＰ２６Ａ阻害剤を添加しても、膵内胚葉又は内分泌腺前駆体マーカーの発現量に有意な変更は見られなかった。更に、ステージＩＶでＣＹＰ２６Ａ阻害剤を添加した場合、ＣＤＸ２（腸マーカー）及びアルブミン（肝臓マーカー）の発現が減少した。ステージＩＶで、ＮＧＮ３（カタログ番号ＡＦ３４４４，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）に対して免疫染色したところ、１００ｎＭのＣＹＰ２６Ａ阻害剤で処理した培養物で、ＮＧＮ３発現量の有意な増加が明瞭に示された。
【００９５】
（実施例２）
ＦＢＳ不含でかつＣＹＰ２６Ａ阻害剤を含有している細胞培養培地でのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の膵内分泌前駆細胞への分化の代替法
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）コーティングしたディッシュ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号３５６２３１）で、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ｐ４０〜ｐ５２）を、１６ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（カタログ番号１００−１８Ｂ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ＮＪ））及び１０μＭのＹ−２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））を添加したＭＥＦ−ＣＭ（マウス胚性線維芽細胞馴化培地）に、個別の細胞として密度１０００００個／ｃｍ2で播種した。播種の７２時間後、培養物を次の通りに胚体内胚葉（ＤＥ）へと分化させた：
ａ．ステージＩ（胚体内胚葉）：ヒト胚性幹細胞を、２％脂肪酸不含ＢＳＡ（カタログ番号６８７００（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、ＩＡ））と０．００２５ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ３１８７（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））と使用濃度のＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ））と１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）に加え２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ））を添加したＭＣＤＢ−１３１（カタログ番号１０３７２−０１９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ））培地により１日処理し、続いて、２％  ＢＳＡと重炭酸ナトリウムとＧｌｕｔａｍａｘと１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを添加したＭＣＤＢ−１３１培地により更に３日処理し、次に
ｂ．ステージＩＩ（原始腸管）：細胞を、２％脂肪酸不含ＢＳＡと５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７を添加したＭＣＤＢ−１３１で３日処理し、次に
ｃ．ステージＩＩＩ（後部前腸）：細胞を、１：２００希釈したＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）と使用濃度のＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ））と０．００２５ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ３１８７（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））と０．１％  ＢＳＡ（Ｌｉｐｉｄ  Ｒｉｃｈ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１０２１−０４５）と５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７と０．２５μＭのＳＡＮＴ−１と、２μＭレチノイン酸（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）と２．５μＭの４−［４−（４−フルオロフェニル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−ピリジン−４−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ブタ−３−イン−１−オール（米国特許第６，５２１，６５５号に開示のｐ３８阻害剤）と１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、ＣＡ））と５００ｎＭのＣＹＰ２６Ａ阻害剤Ｎ−｛４−［２−エチル−１−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ブチル］フェニル｝−１，３−ベンゾチアゾール−２−アミンと２０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを添加したＭＣＤＢ−１３１／高グルコース（２５ｍＭグルコース）で４日処理し、次に
ｄ．ステージＩＶ（膵内分泌前駆体）：細胞を、１：２００希釈したＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）と０．１％  ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ）と使用濃度のＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ））と０．００２５ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ３１８７（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））と１μＭのＡＬＫ５阻害剤（ＳＤ−２０８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００７  ７２：１５２〜１６１に開示）と５００ｎＭのＰＤＢｕ（ＰＫＣ活性化剤）（カタログ番号Ｐ１２６９（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））と１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、ＣＡ））と０．２５μＭのＳＡＮＴ−１（＃Ｓ４５７２（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））と５００ｎＭのＣＹＰ２６Ａ阻害剤Ｎ−｛４−［２−エチル−１−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ブチル］フェニル｝−１，３−ベンゾチアゾール−２−アミンを添加したＭＣＤＢ−１３１／高グルコース（２５ｍＭグルコース）で７日処理し、
ｅ．ステージＩＶ（膵内分泌前駆体）：細胞を、１：２００希釈したＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）と０．１％  ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ）と使用濃度のＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ））と０．００２５ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ３１８７（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））と１μＭのＡＬＫ５阻害剤（ＳＤ−２０８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００７  ７２：１５２〜１６１に開示）と５００ｎＭのＰＤＢｕ（ＰＫＣ活性化剤）（カタログ番号Ｐ１２６９（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））と１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、ＣＡ））と０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（＃Ｓ４５７２（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））を添加したＭＣＤＢ−１３１／高グルコース（２５ｍＭグルコース）で７日処理した。
【００９６】
ステージＩＩＩ及びＩＶで、膵臓関連遺伝子についてリアルタイムＰＣＲで解析するために、ｍＲＮＡを単離した。上記実施例１と同様、ステージＩＶでＣＹＰ２６Ａ阻害剤を加えた場合に、ＮＧＮ３及びＮｅｕｒｏＤなどの膵内分泌前駆体マーカーの発現が上昇したという結果が観察された。（図２を参照されたい）。ステージＩＩＩ及びＩＶの両方で阻害剤を添加すると、ＮＧＮ３及びＮｅｕｒｏＤの発現は更に上昇した。驚くべきことに、ＣＹＰ２６Ａ阻害剤をステージＩＩＩ（レチノイン酸の存在下で）に添加した場合、ＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１の発現は有意に減少したのに対してＣＤＸ２の発現は増加した。これらの結果は、ＣＹＰ２６Ａ阻害剤を添加するのに適切なステージはステージＩＶであることを示す。
【００９７】
（実施例３）
ＦＢＳ不含でかつＣＹＰ２６Ａ阻害剤を含有している細胞培養培地でのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の膵内分泌細胞への分化の代替法  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）コーティングしたディッシュ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号３５６２３１）で、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ｐ４０〜ｐ５２）を、１６ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（カタログ番号１００−１８Ｂ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ＮＪ））及び１０μＭのＹ−２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））を添加したＭＥＦ−ＣＭ（マウス胚性線維芽細胞馴化培地）に、個別の細胞として密度１０００００個／ｃｍ2で播種した。播種の７２時間後、培養物を次の通りに胚体内胚葉（ＤＥ）へと分化させた：
ａ．ステージＩ（胚体内胚葉）：ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コーティングしたディッシュで、ヒト胚性幹細胞を、２％脂肪酸不含ＢＳＡ（カタログ番号６８７００（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、ＩＡ））と０．００２５ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ３１８７（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））と使用濃度のＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ））と１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）に加え２．５μＭのＧＳＫ３Ｂ阻害剤１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オンを添加したＭＣＤＢ−１３１（カタログ番号１０３７２−０１９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ））培地で個別の細胞として１日培養し、続いて、２％  ＢＳＡと重炭酸ナトリウムとＧｌｕｔａｍａｘと１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８を添加したＭＣＤＢ−１３１培地で更に３日処理し、次に
ｂ．ステージＩＩ（原始腸管）：細胞を、２％脂肪酸不含ＢＳＡ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＭＣＤＢ−１３１培地で２日処理し、次に  ｃ．ステージＩＩＩ（後部前腸）：細胞を、１：２００希釈したＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）と使用濃度のＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ））と０．００２５ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ３１８７（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））と０．１％  ＢＳＡ（高脂質）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１０２１−０４５）と５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７と０．２５μＭのＳＡＮＴ−１と２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）と２．５μＭの４−［４−（４−フルオロフェニル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−ピリジン−４−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ブタ−３−イン−１−オールと１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、ＣＡ））と２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したＭＣＤＢ１３１／高グルコース（２５ｍＭのグルコース）で４日処理し、次に
ｄ．ステージＩＶ（膵前駆体）：細胞を、１：２００希釈したＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ）と０．１％  ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ）と使用濃度のＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ））と０．００２５ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ３１８７（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））と１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、ＣＡ））と５０ｎＭのＰＤＢｕ（ＰＫＣ活性化剤）（カタログ番号Ｐ１２６９（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））と０．２５μＭのＳＡＮＴ−１（＃Ｓ４５７２（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））と１００ｎＭのＣＹＰ２６Ａ阻害剤Ｎ−｛４−［２−エチル−１−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ブチル］フェニル｝−１，３−ベンゾチアゾール−２−アミンを添加したＭＣＤＢ１３１／高グルコース（２５ｍＭグルコース）で３日処理し、次に
ｅ．ステージＶ（膵内分泌前駆体）：細胞を、１：２００希釈したＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）と０．１％  ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ）と使用濃度のＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ））と０．００２５ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ３１８７（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））と１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、ＣＡ））と０．２５μＭのＳＡＮＴ−１（＃Ｓ４５７２（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））と２μＭのＡＬＫ５阻害剤（ＳＤ−２０８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００７  ７２：１５２〜１６１に開示）と１００ｎＭのＣＹＰ２６Ａ阻害剤Ｎ−｛４−［２−エチル−１−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ブチル］フェニル｝−１，３−ベンゾチアゾール−２−アミンを添加したＭＣＤＢ１３１／高グルコース（２５ｍＭグルコース）で３日処理し、次に
ｆ．ステージＶＩ（未成熟な膵ホルモン発現細胞）：細胞を、１：２００希釈したＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）と０．１％  ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ）と使用濃度のＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ））と０．００２５ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ３１８７（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））と１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、ＣＡ））と２μＭのＡＬＫ５阻害剤（ＳＤ−２０８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００７  ７２：１５２〜１６１に開示）を添加したＭＣＤＢ１３１／高グルコース（２５ｍＭグルコース）で３日処理し、次に
ｇ．ステージＶＩＩ（膵ホルモン発現細胞）：細胞を、１：２００希釈したＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）と０．１％  ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ）と使用濃度のＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ））と０．００２５ｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ３１８７（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））と１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、ＣＡ））と２μＭのＡＬＫ５阻害剤（ＳＤ−２０８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００７  ７２：１５２〜１６１に開示）と１００ｎＭビタミンＡ（カタログ番号Ｒ７６３２（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））を添加したＭＣＤＢ１３１／高グルコース（２５ｍＭのグルコース）で３日処理し。
【００９８】
一部の培養物では、ステージＶＩＩを１８日に延長した。リアルタイムＰＣＲ解析、免疫蛍光染色（ＩＦ）、及びＦＡＣＳ解析のため、ステージＶ及びＶＩで試料を回収した。ＦＡＣＳ及び免疫蛍光染色（ＩＦ）の両方に際し、ＮＫＸ６．１抗体をアイオワ大学のハイブリドーマバンク（カタログ番号Ｆ５５Ａ１２）から得、ＣＤＸ２抗体をＡｂｃａｍ（カタログ番号ａｂ７６５４１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ））から得、ＰＤＸ−１抗体をＡｂｃａｍ（カタログ番号ａｂ４７２６７）から購入した。図３は、各種分化ステージでの培養物の形態を強調して示す。ステージＩＩ以降、培養物はステージＩＩＩ〜ＶＩを通して均質の形態を示した。図４は、各種分化ステージに関し、ＦＡＣＳにより測定されたものとしてＮＫＸ６．１の発現を示す。この図は、実施例３に開示のプロトコルにより、分化の後期のステージを通してＮＫＸ６．１の発現が高く維持され得ることを強調している。図５は、プロトコルのステージＶ及びステージＶＩＩに関しＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＣＤＸ２発現のＩＦ染色を示す。ＮＫＸ６．１陽性細胞の９０％超がＰＤＸ１も陽性であったのに対し、ＣＤＸ２に陽性の染色細胞は１０％未満であった。
【００９９】
本明細書の全体を通じて引用した刊行物は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適宜解釈される以下の「特許請求の範囲」によって定義されるものである点は認識されるであろう。  本発明は以下を提供する。
［１］
多能性幹細胞から膵内分泌前駆細胞集団を誘導する方法であって、
ａ．多能性幹細胞集団を培養する工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系（definitive endoderm lineage）に特徴的な
マーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、原始腸管細胞集団へと分
化させる工程と、
ｄ．前記原始腸管細胞集団を、後部前腸の細胞集団へと分化させる工程と、
ｅ．前記後部前腸の細胞集団を、レチノイン酸を分解する剤を添加した培地で処理する
工程と、を含む、方法。
［２］
前記レチノイン酸を分解する剤がＣＹＰ２６Ａ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
［３］
前記ＣＹＰ２６Ａ阻害剤が約１ｎＭ〜約１０００ｎＭの濃度で使用される、請求項２に記載の方法。
［４］
前記ＣＹＰ２６Ａ阻害剤が約１０ｎＭ〜約１００ｎＭの濃度で使用される、請求項２に記載の方法。
［５］
前記ＣＹＰ２６Ａ阻害剤がＮ−｛４−［２−エチル−１−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ブチル］フェニル｝−１，３−ベンゾチアゾール−２−アミンである、請求項２に記載の方法。 
【図１−１】
0006353951.tif 000003
【図１−２】
0006353951.tif 000004
【図１−３】
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【図１−４】
0006353951.tif 000006
【図２−１】
0006353951.tif 000007
【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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