(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において局所化された脂肪沈着を非手術的に除去するための製剤であって、前記製剤は、８未満のｐＨを有する薬学的に許容される製剤において脂肪溶解濃度のコレート及びケノデオキシコレートのうち１以上を含み、前記コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上は、脂肪溶解のための活性成分として使用される、製剤。
【請求項２】
前記製剤は、７．５未満のｐＨを有するものである、対象において局所化された脂肪沈着を非手術的に除去するための請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記製剤は、前記コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上が約０．５％ないし約４．０％の濃度を有するものである、対象において局所化された脂肪沈着を非手術的に除去するための請求項１または２に記載の製剤。
【請求項４】
前記製剤は、前記コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上が約０．５％ないし約２．０％の濃度を有するものである、対象において局所化された脂肪沈着を非手術的に除去するための請求項１〜３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５】
抗炎症剤、鎮痛剤、分散剤、透過増強剤、及びその組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの追加的な活性成分をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項６】
抗微生物剤、抗血栓剤、抗凝集剤、泡抑制剤、抗炎症剤、麻酔剤、鎮痛剤、ステロイド、鎭静剤、抗分散剤、筋肉弛緩剤、及びその組み合わせからなる群から選択される治療剤をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項７】
前記製剤は、注射可能な製剤である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項８】
前記製剤は、脂肪溶解注射製剤である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項９】
局所化された脂肪蓄積を有する対象において局所化された脂肪沈着を非手術的に除去するための８未満のｐＨを有する製剤の製造における、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上の、脂肪溶解のための活性成分としての使用。
【請求項１０】
前記製剤は、皮下注射のための製剤である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記局所化された脂肪蓄積は、下眼瞼脂肪ヘルニア、脂肪腫、脂肪異栄養症、セルライト関連性脂肪蓄積、及びその組み合わせからなる群より選択される、請求項９または１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記脂肪沈着は、目の下、あごの下、腕の下、臀部、ふくらはぎ、背、太股、足首、胃、及びその組み合わせからなる群より選択される対象の部位に局所化される、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
（ａ）請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤を含む第１容器、及び（ｂ）手術を使用せず、対象において脂肪沈着を減少させるための前記製剤を使用するためのマニュアルを含む、対象において局所化された脂肪沈着を非手術的に除去するためのキット。
【請求項１４】
第２容器をさらに含み、前記第２容器は、抗微生物剤、抗血栓剤、抗凝集剤、泡抑制剤、抗炎症剤、麻酔剤、鎮痛剤、ステロイド、鎭静剤、抗分散剤、筋肉弛緩剤、及びその組み合わせからなる群より選択される第２治療剤を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記製剤は沈殿物を含まない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１６】
前記製剤は沈殿物を含まない、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
前記製剤は沈殿物を含まない、請求項１３または１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
脂肪吸引術（ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ）は、脂肪整形術（ｌｉｐｏｐｌａｓｔｙ）、脂肪組織吸引切除術（ｌｉｐｏｓｃｕｌｐｔｕｒｅ  ｓｕｃｔｉｏｎ  ｌｉｐｅｃｔｏｍｙ；または単にｌｉｐｏ）とも知られており、人体の多くの多様な部位から脂肪除去する美容外科手術である。手術部位は、腹部、大腿部及び臀部から、首、腕の裏側部位などに至るまで多様である。
【０００２】
１回の手術によって、安全に除去される脂肪の量は、いくつかの因子によって制限される。あまりにも過度な量の脂肪を除去するには、否定的側面がある。「過多吸引された（ｏｖｅｒ−ｓｕｃｔｉｏｎｅｄ）」患者には、皮膚で非正常的なしこり（ｌｕｍｐｉｎｅｓｓ）及び／または溝（ｄｅｎｔｓ）が観察されもする。さらに多量の脂肪が除去されるほど、さらに高い手術危険性がもたらされる。
【０００３】
注射脂肪溶解術（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｌｉｐｏｌｙｓｉｓ）は、脂肪細胞を破壊するための目的で、薬物混合物を患者に注射する美容的過程である。一般的には、ホスファチジルコリン（ＰＰＣ：ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）基盤及びデオキシコレート（ＤＣＡ：ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）基盤の薬物を使用するこの運用は、血液疾患を治療するために、前記薬物製剤を初期静脈注射として使用することから始まった。
【０００４】
ＰＰＣは、ヘッドグループ（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）としてコリンが導入されたリン脂質類である。これは、生物学的膜の主要成分であり、卵黄または大豆のような容易に利用可能な多様な起源から手軽に獲得することができ、ＰＰＣは、前記起源からヘキサンを使用して、機械的または化学的に抽出される。ＰＰＣは、脂肪蓄積を防止し、脂肪肝によって誘導される肝機能喪失（ｌｉｖｅｒ  ｆａｉｌｕｒｅ）、心筋虚血（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）、脳血管疾患及び痴呆を治療するのに使用される。また、ＰＰＣは、最近では、米国、ヨーロッパ、及び世界他の国々で、肥満治療のために導入された。
【０００５】
ＤＣＡは、腸バクテリアの代謝副産物である二次胆汁塩（ｂｉｌｅ  ｓａｌｔｓ）の一種である。ＤＣＡは、その発見以来、人間医学の多様な分野において使用され、脂肪溶解注射においては、ＰＰＣと共に混合し、公然に使用される。ＤＣＡは、ＰＰＣ、及びさらに最近では、アムホテリシンＢ、タキソール及びジアゼパムのような薬剤の水溶性を向上させるために使用されてきた。高度に精製されたＰＰＣは、ＤＣＡ、抗微生物剤、ベンジルアルコール、及び水と組み合わされて急速滅菌され、静脈投与のために使用することができる安定して混合されたミセル製剤を形成することができる。
【０００６】
１９６６年には、研究者らがＰＰＣ含有溶液を静脈投入することにより、脂肪塞栓（ｆａｔｅｍｂｏｌｉ）を除去することができるという事実を明らかにした。その後、５％  ＰＰＣ及び４．７５％  ＤＣＡを含むＬｉｐｏｓｔａｂｉｌ（登録商標）と呼ばれる薬物製剤がドイツで承認され、脂肪塞栓症、異常脂質血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、及びアルコール誘導された肝硬変（ａｌｃｏｈｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）の治療に使用された。
【０００７】
界面活性剤のうち、胆汁塩は、脂肪二重膜の特に強力な溶解剤（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｒ）である。全ての生物学的細胞膜は、同一の二重脂質層構造（ｂｉ−ｌｉｐｉｄ  ｌａｙｅｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）で構成されており、ゆえに界面活性剤により可溶化（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）される。界面活性剤による細胞膜の可溶化は、脂質二重層間の前記界面活性剤の分配、二重層の脱安定化、崩壊、及びそれに続いて、混合されたミセル（界面活性剤及び細胞膜脂質から構成される）の形成を含む。胆汁塩、及び他の界面活性剤は、非混和性物質（ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ）の境界で表面張力を低減させ、大きい凝集物をさらに小さい粒子に破壊させる。組織では、かような作用剤は、細胞膜を溶解させ、細胞溶解（ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ）を引き起こす。炎症反応は、細胞溶解によって発生し、身体が界面活性剤に溶解した物質を除去することを引き起こす。
【０００８】
最近では、米国に位置する民間企業であるＫｙｔｈｅｒａ  ＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓがＰＰＣを含まないＤＣＡを使用した脂肪溶解注射を開発している。ＰＰＣが、ＤＣＡにおいて、乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）として機能し、高脂血症の治療に使用されるということに基づいて、ＰＰＣは、脂肪溶解注射において、活性成分として見なされてきた。かような先行技術の組成物のうち、ＤＣＡのような界面活性剤は、活性成分と見なされるＰＰＣを、分散または溶解させるために単純に添加された。しかし、実際には、ＤＣＡが局所化された脂肪乳化において活性成分であることが明らかとなった。
【０００９】
ＤＣＡが胆汁塩系において強い界面活性剤の一種であるため、ＰＰＣ及びＤＣＡ、またはＤＣＡ単独による治療は、所望しない有害な結果を引き起こしてしまう。ＤＣＡの投与は、注射部位から周辺組織が破壊される現象がもたらされる。また、ＤＣＡを使用した身体脂肪除去は、痛症、火傷感覚（ｂｕｒｎｉｎｇ  ｓｅｎｓａｔｉｏｎ）、しびれ、あざ、浮腫、はれ、色素沈着及び硬化を含む重大な有害事例と関連性を有する。さらに、従前の研究者らは、ＤＣＡ曝露後、乳癌または大腸癌の危険性が増大するという点を提示している。
【００１０】
一部成功した側面も存在するが、従来技術及び組成物は、一定の制約を受ける。従って、外科手術、または遅延された回復時間を必要とせず、かつ、現在利用可能な方法に比べて有害な副作用が少ない、局所化された脂肪蓄積を減少させる方法が望まれている。本発明は、かようなニーズを満足するものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、対象において局所化された脂肪沈着（ｆａｔ  ｄｅｐｏｓｉｔ）を非手術的に除去するための製剤を提供する。一実施形態において、前記製剤は、９未満のｐＨを有する薬学的に許容される製剤において、脂肪溶解濃度のコレート（ｃｈｏｌａｔｅ）及びケノデオキシコレート（ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）のうち１以上を含む。一実施形態において、前記製剤は、８未満のｐＨを有する。他の実施形態において、前記製剤は、７．５未満のｐＨを有する。
【００１２】
一実施形態において、前記製剤は、脂肪溶解濃度のコレート及びケノデオキシコレートのうち１以上を、約０．５％ないし約４．０％の濃度で含む。他の実施形態において、前記濃度は、約０．５％ないし約２．０％である。
【００１３】
一実施形態において、前記製剤は、抗炎症剤、鎮痛剤、分散剤及び透過増強剤からなる群より選択される少なくとも１つの追加的な活性成分をさらに含む。
【００１４】
一実施形態において、前記製剤は、抗微生物剤、抗血栓剤、抗凝集剤、泡抑制剤、抗炎症剤、麻酔剤、鎮痛剤、ステロイド、鎭静剤、抗分散剤及び筋肉弛緩剤からなる群より選択される治療剤をさらに含む。
【００１５】
一実施形態において、前記製剤は、注射可能な製剤である。他の実施形態において、前記製剤は、脂肪溶解注射製剤である。
【００１６】
本発明はまた、局所化された脂肪蓄積（ｆａｔ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）を有する患者において局所化された脂肪沈着を非手術的に除去するための方法を提供する。一実施形態において、前記方法は、９未満のｐＨを有する薬学的に許容される製剤において、脂肪溶解濃度のコレート及びケノデオキシコレートのうち１以上を含む製剤を投与する段階を含む。
【００１７】
一実施形態において、前記投与段階は、皮下注射を含む。
【００１８】
一実施形態において、前記局所化された脂肪蓄積は、下眼瞼脂肪ヘルニア（ｌｏｗｅｒ  ｅｙｅｌｉｄ  ｆａｔ  ｈｅｒｎｉａｔｉｏｎ）、脂肪腫（ｌｉｐｏｍａｓ）、脂肪異栄養症（ｌｉｐｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）及びセルライト関連性脂肪蓄積（ｆａｔ  ｄｅｐｏｓｉｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｌｕｌｉｔｅ）からなる群より選択される。
【００１９】
一実施形態において、前記脂肪沈着は、前記対象の目の下、あごの下、腕の下、臀部、ふくらはぎ、背、太股、足首または胃に局所化されている。
【００２０】
本発明はまた、（ａ）９未満のｐＨを有する薬学的に許容される製剤において、脂肪溶解濃度のコレート及びケノデオキシコレートのうち１以上を含む対象において、局所化された脂肪沈着を非手術的に除去するための製剤を含む第１容器、並びに（ｂ）手術を使用せず、対象において脂肪沈着を減少させるための製剤を使用するためのマニュアル（ｗｒｉｔｔｅｎ  ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を含むキットを提供する。
【００２１】
一実施形態において、前記第１容器は、抗微生物剤、抗血栓剤、抗凝集剤、泡抑制剤、抗炎症剤、麻酔剤、鎮痛剤、ステロイド、鎭静剤、抗分散剤及び筋肉弛緩剤からなる群より選択される治療剤を含む。
【００２２】
一実施形態において、第２容器をさらに含み、前記第２容器は、抗微生物剤、抗血栓剤、抗凝集剤、泡抑制剤、抗炎症剤、麻酔剤、鎮痛剤、ステロイド、鎭静剤、抗分散剤及び筋肉弛緩剤からなる群より選択される第２治療剤を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
下記本発明の望ましい実施形態に係る詳細な説明は、添付図面と共に読まれる場合、さらに良好に理解されるであろう。本発明の説明のために、図面には、現在望ましい実施形態が図示されている。しかし、本発明が、図面に図示された実施形態の正確な配列及び手段にのみ限定されるものではないということが理解されなければならない。
【図１】３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞の分化を示した一連のイメージである。３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞（図１Ａ）は、分化培地（ＭＤＩ培地）で処理し、分化された脂肪細胞（図１Ｂ）は、洗浄及び固定した。０．２％  ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で透過させた後、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ（図１Ｃ）で染色し、２００Ｘ倍率で撮影した。
【図２】３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞において、界面活性剤の細胞溶解効果を図示した一連のイメージである。分化された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞をデオキシコレート（ＤＣＡ）、ケノデオキシコレート（ＣＤＣＡ）、タウロウルソデオキシコレート（ＴＵＤＣＡ：ｔａｕｒｏｕｒｏｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）及びコレート（ＣＡ）（０〜０．１％）（図２Ａ）、及びＴＵＤＣＡ及びＣＡ（０〜２％）（図２Ｂ）、及びウルソデオキシコレート（ＵＤＣＡ）、ヒオデオキシコレート（ＨＤＣＡ：ｈｙｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）及びＣＡ（０〜１％）（図２Ｃ）に１時間露出させ、細胞生存度を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）分析法によって測定した。ＴＵＤＣＡを除いた全ての界面活性剤は、用量依存的な細胞溶解効果を示した。実験は、各処理当たり３回反復した。結果は、未処理対照群対比の生存細胞の総百分率でもって表現した。
【図３】ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＨＤＣＡ及びＣＡで処理した後、脂肪パッド（ｆａｔ  ｐａｄ）溶解の測定を示した一連のチャートである。９５〜１００ｍｇ脂肪組織を、食餌誘導された肥満マウスから切開し、多様な濃度のＤＣＡ、ＣＤＣＡ及びＣＡ（図３Ａ）、並びにＨＤＣＡ（図３Ｂ）に露出させた。脂肪組織の生存度は、ＭＴＴ分析によって測定し、相対吸光度（ＯＤ５７０）は、分光光度計で測定した。界面活性剤の濃度を上昇させるにつれ、脂肪組織溶解がさらに著しかった。実験は、各処理当たり５回反復して行った。
【図４】高脂肪食餌を食べさせたマウスからの平均体重増加を示したグラフである。体重は、毎２週ごとにモニタリングした。
【図５】１％  ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＣＡ及びリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で注射された肥満マウスの体重（図５Ａ）、及び鼠蹊部（ｉｎｇｕｉｎａｌ）脂肪パッド重量（図５Ｂ）を図示した一連のチャートである。胆汁塩（ＤＣＡ、ＣＤＣＡ及びＣＡ）溶液は、マウスの右側鼠蹊部脂肪パッドに注射した。マウスの左側鼠蹊部脂肪パッドには、対照群として、同一体積のＰＢＳを注射した。注射は、２週間４回さらに反復した。マウスは、最終注射以後、４日経過時点で剖検し、鼠蹊部脂肪パッドを切開した後、その重量を測定した。
【図６】胆汁塩投与されたマウスからの脂肪パッドで観察される組織学的変化を図示したイメージである。胆汁塩及びＰＢＳの注射以後、注射された領域の脂肪組織を切開した。切開された組織は、パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンブロック内に含浸させた後、スライドガラスに断片化した。組織損傷及び懐死は、Ｈ＆Ｅ染色によって観察した。
【図７】懐死領域測定のための代表的過程である。注射後２４時間経過時点で得られた２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）染色された脂肪パッドのイメージを図示したものである。正常組織は、赤色で染色され、懐死領域は、白色で染色され、映像分析システムを使用して定量した。懐死領域（白色、未染色領域）は、映像分析システム（ＩｍａｇｅＪ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、米国）を使用して測定した。
【図８】ｉｎ  ｖｉｖｏ懐死領域の定量化を図示したチャートである。多様な濃度の胆汁塩（ＤＣＡ、ＣＤＣＡ及びＣＡ）及びＰＢＳで注射された脂肪パッドを切開し、懐死領域をＴＴＣ染色（各グループ当たりｎ＝８）によって測定した。界面活性剤の濃度を上昇させるほど、さらに著しい脂肪パッド溶解が発生した。
【図９】多様な胆汁塩（ＤＣＡ、ＣＡ、ＣＤＣＡ）及びビヒクル（ＰＢＳ）で処理された後、ＴＴＣ染色された脂肪パッドを図示した代表的イメージである。
【図１０】正常ＰＢＳと比較した組織生存度（図１０Ａ）、及びＭＴＴ分析以後の相対吸光度（図１０Ｂ）を示した一連のグラフである。マウス鼠蹊部脂肪パッドは、ＣＡ、ＤＣＡ及びＣＤＣＡを含むリン酸緩衝溶液における多様な塩濃度（０〜２００ｍＭ塩化ナトリウム）中に曝露された。９５〜１００ｍｇの脂肪組織を、多様な塩濃度におけるＤＣＡ、ＣＤＣＡ及びＣＡのＥＣ５０濃度（正常ＰＢＳにおいて、５０％の組織生存度低下を示す濃度）でインキュベーションした。実験は、各処理当たり５回反復した。
【図１１Ａ】ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＣＡ、ＨＤＣＡ及びＰＢＳと共に、多様なｐＨ条件（ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０）中に曝露されたマウス鼠蹊部脂肪パッドの生存度（図１１Ａ、図１１Ｃ）及び相対吸光度（図１１Ｂ、図１１Ｄ）を示した一連のイメージである。９５〜１００ｍｇの脂肪組織を、多様なｐＨ条件において、ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＨＤＣＡ及びＣＡのＥＣ５０濃度で培養した。脂肪組織の生存度は、ＭＴＴ分析法によって測定し、吸光度（ＯＤ５７０）は、分光光度計で測定した。実験は、各処理当たり５回反復して行った。
【図１１Ｂ】ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＣＡ、ＨＤＣＡ及びＰＢＳと共に、多様なｐＨ条件（ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０）中に曝露されたマウス鼠蹊部脂肪パッドの生存度（図１１Ａ、図１１Ｃ）及び相対吸光度（図１１Ｂ、図１１Ｄ）を示した一連のイメージである。９５〜１００ｍｇの脂肪組織を、多様なｐＨ条件において、ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＨＤＣＡ及びＣＡのＥＣ５０濃度で培養した。脂肪組織の生存度は、ＭＴＴ分析法によって測定し、吸光度（ＯＤ５７０）は、分光光度計で測定した。実験は、各処理当たり５回反復して行った。
【図１１Ｃ】ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＣＡ、ＨＤＣＡ及びＰＢＳと共に、多様なｐＨ条件（ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０）中に曝露されたマウス鼠蹊部脂肪パッドの生存度（図１１Ａ、図１１Ｃ）及び相対吸光度（図１１Ｂ、図１１Ｄ）を示した一連のイメージである。９５〜１００ｍｇの脂肪組織を、多様なｐＨ条件において、ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＨＤＣＡ及びＣＡのＥＣ５０濃度で培養した。脂肪組織の生存度は、ＭＴＴ分析法によって測定し、吸光度（ＯＤ５７０）は、分光光度計で測定した。実験は、各処理当たり５回反復して行った。
【図１１Ｄ】ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＣＡ、ＨＤＣＡ及びＰＢＳと共に、多様なｐＨ条件（ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０）中に曝露されたマウス鼠蹊部脂肪パッドの生存度（図１１Ａ、図１１Ｃ）及び相対吸光度（図１１Ｂ、図１１Ｄ）を示した一連のイメージである。９５〜１００ｍｇの脂肪組織を、多様なｐＨ条件において、ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＨＤＣＡ及びＣＡのＥＣ５０濃度で培養した。脂肪組織の生存度は、ＭＴＴ分析法によって測定し、吸光度（ＯＤ５７０）は、分光光度計で測定した。実験は、各処理当たり５回反復して行った。
【図１２Ａ】相対懐死領域を図示した一連のグラフである。多様な濃度のＤＣＡ、ＣＤＣＡ及びＣＡ（図１２Ａ）、ＵＤＣＡ（図１２Ｂ）、ＨＤＣＡ（図１２Ｃ）で注射された脂肪パッドを切開し、懐死領域をＴＴＣ染色（各グループ当たりｎ＝１０）によって測定した。懐死領域（白色、未染色領域）は、映像分析システムを使用して測定した。界面活性剤をさらに高い濃度で注射した場合、脂肪組織溶解がさらに著しかった。
【図１２Ｂ】相対懐死領域を図示した一連のグラフである。多様な濃度のＤＣＡ、ＣＤＣＡ及びＣＡ（図１２Ａ）、ＵＤＣＡ（図１２Ｂ）、ＨＤＣＡ（図１２Ｃ）で注射された脂肪パッドを切開し、懐死領域をＴＴＣ染色（各グループ当たりｎ＝１０）によって測定した。懐死領域（白色、未染色領域）は、映像分析システムを使用して測定した。界面活性剤をさらに高い濃度で注射した場合、脂肪組織溶解がさらに著しかった。
【図１２Ｃ】相対懐死領域を図示した一連のグラフである。多様な濃度のＤＣＡ、ＣＤＣＡ及びＣＡ（図１２Ａ）、ＵＤＣＡ（図１２Ｂ）、ＨＤＣＡ（図１２Ｃ）で注射された脂肪パッドを切開し、懐死領域をＴＴＣ染色（各グループ当たりｎ＝１０）によって測定した。懐死領域（白色、未染色領域）は、映像分析システムを使用して測定した。界面活性剤をさらに高い濃度で注射した場合、脂肪組織溶解がさらに著しかった。
【図１３】胆汁塩を投与した以後、マウス脂肪パッドで観察される組織学的変化を図示した一連のイメージである。脂肪組織を切開し、パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンブロックに含浸させた後、１．５％  ＣＡ、１．５％  ＨＤＣＡ及び１．５％  ＵＤＣＡ溶液の注射後に、スライドガラスに断片化した。多形核（ＰＭＮ：ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ）細胞の脂肪パッド組織内への浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）が、Ｈ＆Ｅ染色したＨＤＣＡ処理またはＵＤＣＡ処理された組織で観察された。
【図１４】３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞において、多様な胆汁塩が細胞溶解効果を示す一連のチャートを図示したものである。分化された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、タウロコレート（ＴＣＡ）、グリココレート（ＧＣＡ）、ＣＡ、タウロデオキシコレート（ＴＤＣＡ）、グリコデオキシコレート（ＧＤＣＡ）、ＤＣＡ、タウロケノデオキシコレート（ＴＣＤＣＡ）及びＣＤＣＡ（図１４Ａ−図１４Ｃ）に１時間曝露させ、細胞生存度をＭＴＴ分析法によって測定した。全ての界面活性剤は、用量依存的細胞溶解効果を示した。タウリン、グリシンの接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、ＣＡ、ＤＣＡ及びＣＤＣＡの細胞溶解活性に影響を及ぼさない。実験は、各処理当たり３回反復して行った。結果は、未処理対照群対比の生存細胞の総百分率でもって表示した。
【図１５】ＣＡ、ＧＣＡ、ＴＣＡ溶液及びビヒクル（ＰＢＳ）の多様なｐＨ条件（ｐＨ６．０、６．５、７．０、８．０、９．０）中に曝露されたマウス鼠蹊部脂肪パッドの組織生存度を示した一連のイメージである。９５〜１００ｍｇの脂肪組織を、多様なｐＨ条件で、０．１％  ＧＣＡ、ＴＣＡ及びＣＡで培養した。脂肪組織の生存度は、ＭＴＴ分析により、光学密度（図１５Ａ）及び相対吸光度（図１５Ｂ）としてモニタリングした。実験は、各処理当たり５回反復して行った。
【図１６】ＤＣＡ、ＣＡ及びＰＢＳの注射後１４日経過時点で、マウス尾に対する組織学的検査を示したイメージである。Ｈ＆Ｅ染色は、処理された尾において、皮下脂肪の懐死を示している。また、筋肉及び皮膚層の組織構造も、処理された尾で観察される。
【図１７Ａ】ラットの後足に、１％  ＤＣＡ、１．５％  ＣＡ、０．８％  ＣＤＣＡ、１．５％  ＵＤＣＡ、１．５％  ＨＤＣＡ及びＰＢＳを注射した後、足外形（図１７Ａ、図１７Ｃ）及び足厚み（図１７Ｂ、図１７Ｄ、図１７Ｅ）を示した一連の映像である。
【図１７Ｂ】ラットの後足に、１％  ＤＣＡ、１．５％  ＣＡ、０．８％  ＣＤＣＡ、１．５％  ＵＤＣＡ、１．５％  ＨＤＣＡ及びＰＢＳを注射した後、足外形（図１７Ａ、図１７Ｃ）及び足厚み（図１７Ｂ、図１７Ｄ、図１７Ｅ）を示した一連の映像である。
【図１７Ｃ】ラットの後足に、１％  ＤＣＡ、１．５％  ＣＡ、０．８％  ＣＤＣＡ、１．５％  ＵＤＣＡ、１．５％  ＨＤＣＡ及びＰＢＳを注射した後、足外形（図１７Ａ、図１７Ｃ）及び足厚み（図１７Ｂ、図１７Ｄ、図１７Ｅ）を示した一連の映像である。
【図１７Ｄ】ラットの後足に、１％  ＤＣＡ、１．５％  ＣＡ、０．８％  ＣＤＣＡ、１．５％  ＵＤＣＡ、１．５％  ＨＤＣＡ及びＰＢＳを注射した後、足外形（図１７Ａ、図１７Ｃ）及び足厚み（図１７Ｂ、図１７Ｄ、図１７Ｅ）を示した一連の映像である。
【図１７Ｅ】ラットの後足に、１％  ＤＣＡ、１．５％  ＣＡ、０．８％  ＣＤＣＡ、１．５％  ＵＤＣＡ、１．５％  ＨＤＣＡ及びＰＢＳを注射した後、足外形（図１７Ａ、図１７Ｃ）及び足厚み（図１７Ｂ、図１７Ｄ、図１７Ｅ）を示した一連の映像である。
【図１８】ＤＣＡ、ＣＡ及びＰＢＳを多様な濃度で（ｐＨ７．４溶液において０．５〜１．５％）皮下注射した後、マウス皮膚の外形（図１８Ａ）及び皮膚病変の重症度（図１８Ｂ）を示した一連のイメージである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるコレートの脂肪溶解効果がｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏで観察されるコレートの活性からは予測可能ではないという予期せぬ発見に基づいたものである。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏではコレートがデオキシコレート及びケノデオキシコレートに比べて低い溶解活性を示したにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｖｏではコレートが卓越した結果を示した。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでコレートを処理した場合、デオキシコレートを処理した場合と比較して、皮膚で著しく低減した有害事象（ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔｓ）を示した。特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏの結果から予測できない濃度で、ｉｎ  ｖｉｖｏで低減した有害事象を有するコレートが予期せぬ脂肪溶解効果を示すことは、脂肪溶解注射においてコレートを活性成分として使用できることを裏付ける。
【００２５】
本発明は、脂肪沈着を減少させるための非手術的方法を提供することにより、動物で局所化された脂肪蓄積の問題点を解決する。一実施形態において、本発明は、薬学的に許容される製剤において、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上を、脂肪溶解濃度の有効量で投与する段階を含む。
【００２６】
本発明は、動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくは人間において、脂肪を減少させるための、胆汁酸またはその塩の使用に関する。一実施形態において、前記胆汁酸またはその塩は、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上である。
【００２７】
一実施形態において、本発明は、薬学的に許容される製剤を標的部位に局所的に投与することにより、哺乳類における皮下脂肪蓄積を減少させるためのコレート及びケノデオキシコレートのうち１以上の使用に関するものである。一実施形態において、前記製剤は、脂肪溶解注射形態である。
【００２８】
本発明は、脂肪沈着をコレート及びケノデオキシコレートのうち１以上を含む製剤と接触させる段階を含む、哺乳類における脂肪沈着を減少させる方法に関する。
【００２９】
他の実施形態において、本発明は、セルライト及び余分脂肪沈着に関連する脂肪細胞を溶解するために、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上でセルライト及び余分脂肪沈着を処理する方法に関する。
【００３０】
他の実施形態において、本発明は、製剤のｐＨを調節し、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上の活性を向上させることにより、脂肪除去する方法に関する。一実施形態において、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上を含む前記製剤は、約９未満の適当なｐＨを有するように製剤化される。
【００３１】
定義
別段定義されない限り、本明細書で使用された全ての技術的及び科学的な用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって、一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本発明の実施にあたり本明細書に記載されるものと類似するか等価ないかなる方法および材料が用いられてもよいが、好ましい方法および材料を記載する。
【００３２】
本明細書では、下記の用語はそれぞれ本項においてこれに関連する意味を有する。
【００３３】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、前記冠詞の文法的対象において、１以上（すなわち、少なくとも一つ）を示すために、本明細書で使用される。例えば、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素、またはそれ以上の要素を意味する。
【００３４】
量、時間的長さのような測定可能な数値を指す場合、本明細書で使用されているような「約（ａｂｏｕｔ）」は、変移が開示された方法を遂行するために適切であるように、明示された数値から、±２０％、±１０％、±５％、±１％または±０．１％の変移を含むことを意味する。
【００３５】
疾病または障害の症状の深刻度、患者が経験するかような症状の頻度、または両者がいずれも低下する場合、疾病または障害は、「軽減して（ａｌｌｅｖｉａｔｅｄ）」いる。
【００３６】
本明細書で使用される用語「胆汁酸（ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ）」は、ステロイド酸（及び／またはそのカルボン酸陰イオン）及びその塩を含み、動物（例えば、人間）の胆汁で発見されるものであり、それに係わる非制限的な例としては、コール酸（ｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、コレート、デオキシコール酸（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、デオキシコレート、ヒオデオキシコール酸（ｈｙｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ヒオデオキシコレート、グリコール酸、グリココレート、タウロコール酸（ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、タウロコレート、ケノデオキシコール酸（ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ケノデオキシコレート、リトコール酸（ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、リトコレートなど（及びその塩）を挙げることができる。
【００３７】
用語「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」、「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」、「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」などは、本明細書において、互いに交換可能に使用され、本明細書に記載された方法に順応するｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｓｉｔｕでも、任意の動物またはその細胞を指す。特定非制限的な実施形態において、前記患者、対象または個体は、人間である。
【００３８】
本明細書で使用される用語「組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」または「薬剤組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、本発明の少なくとも１つの化合物と、担体（ｃａｒｒｉｅｒｓ）、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁液剤、増粘剤（ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、及び／または賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）のような他の化学成分の混合物を意味する。前記薬剤組成物は、前記化合物の有機体（ｏｒｇａｎｉｓｍ）への投与を促進する。
【００３９】
本明細書で使用される用語「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」、「薬学的に有効な量（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」及び「治療上有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は、非毒性であるが、所望する生物学的結果を提供するに十分な量を示す。前記結果は、兆候、症状、または疾病原因の減少及び／または軽減、または生物学的システムの任意の他の所望する変化（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）でもある。任意の個別的事案において、適する治療量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｍｏｕｎｔ）は、通常の実験を使用して、通常の技術者によって決定されてもよい。
【００４０】
本明細書で使用される用語「効能（ｅｆｆｉｃａｃｙ）」は、分析方法内で達成される最大効果（Ｅｍａｘ）を示す。
【００４１】
本明細書で使用される「指示的物質（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌ）」は、本明細書に言及された多様な疾病または障害の軽減を発揮するためのキットにおいて、本発明の化合物、組成物、ベクターまたは伝達システムの有用性を伝達するのに使用される刊行物、記録（ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）、ダイヤグラム、または任意の他の表現媒体を含む。選択的には、または代案として、前記指示的物質は、哺乳類の細胞内または組織内において、疾病または障害の軽減に対する１以上の方法を記載することができる。本発明の前記キットの前記指示的物質は、例えば、本発明の前記確認された化合物、組成物、ベクターまたは伝達システムを含む容器に付着することができるか、または前記確認された化合物、組成物、ベクターまたは伝達システムを含む容器と共に出荷（ｓｈｉｐ）される。
【００４２】
代案的には、前記指示的物質は、前記指示的物質及び前記化合物が、収容体によって協同して使用されることを意図し、前記容器とは別途に出荷されてもよい。
【００４３】
「局所的投与（ｌｏｃａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」は、薬剤学的成分を非全身的経路によって、患者の筋肉または皮下位置（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ  ｌｏｃａｔｉｏｎ）に、またはその周辺に投与することを意味する。従って、局所的投与は、静脈投与または口腔投与のような全身的経路を介した投与を排除する。
【００４４】
「末梢投与（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」は、局所的投与とは反対に、症状的位置（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ｌｏｃａｔｉｏｎ）から離れた位置に投与することを意味する。
【００４５】
「薬学的に許容される（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、組成、製剤、安定性、患者受容性及び生物利用可能性について、薬理学的／毒性学的な観点、及び物理的／化学的な観点で製造する薬剤学的化学者に、受容可能な特性及び／または物質を示す。「薬学的に許容される担体」は、活性成分の生物学的活性の有効性（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）を妨害せずに投与されるホストに毒性を示さない媒体を示す。
【００４６】
「治療的（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、兆候または症状を低減させたり除去したりするための目的で、病理の兆候または症状を示す対象に投与される治療である。
【００４７】
本明細書で使用される用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、本明細書で考慮された状態、本明細書で考慮された状態の症状、または本明細書で考慮された状態に進む潜在性を、治療（ｃｕｒｅ）、治癒（ｈｅａｌ）、軽減（ａｌｌｅｖｉａｔｅ）、緩和（ｒｅｌｉｅｖｅ）、変化（ａｌｔｅｒ）、救済（ｒｅｍｅｄｙ）、改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）、向上（ｉｍｐｒｏｖｅ）したり、影響を与えたりするために、治療的作用剤、すなわち、本発明の化合物（単独、または他の薬剤学的成分作用剤との組み合わせ）を患者に適用または投与すると定義されるか、または（例えば、診断またはｅｘ  ｖｉｖｏ適用のため）患者から分離された組織または細胞株に、治療的作用剤を適用または投与すること（例えば、診断またはｅｘ  ｖｉｖｏ適用のため）と定義され、前記本明細書で考慮された状態、本明細書で考慮された状態の症状（ｓｙｍｐｔｏｍｓ）、または本明細書で考慮された状態に進む潜在性を有している。前記治療は、薬理学分野から得られた知識に基づいて、具体的に合わせられるか、あるいは変形されもする。
【００４８】
「治療上有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は、患者に投与される場合、疾病の症状を改善する本発明の化合物の量である。「治療上有効な量」を構成する本発明の化合物の量は、前記化合物、疾病状態及びその深刻性、治療される患者の年齢などによって変化する。治療的に有効な量は、自分の知識、及び本開示を考慮し、当分野で当業者によって一般的に決定される。
【００４９】
範囲：本開示全般にわたって、本発明の多様な様相が範囲形式によって提案される。範囲形式の記載は、単に、便宜性及び簡略性のためのものであり、本発明の範囲に係わる融通性ない制限（ｉｎｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）として解釈されるものではないと理解されなければならない。従って、範囲の記載は、前記範囲内の個別的な数値だけではなく、全ての可能な下部範囲（ｓｕｂｒａｎｇｅ）を具体的に開示したものであると考慮されなければならない。例えば、１ないし６のような範囲の記載は、前記範囲内の個別的数値、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６だけではなく、１ないし３、１ないし４、１ないし５、２ないし４、２ないし６、３ないし６のような下部範囲を具体的に開示したものであると見なされなければならない。それは、範囲の幅にかかわらず適用される。
【００５０】
説明
胆汁塩の安定性及び活性は、そのｐＨ条件によって大きく影響を受ける。本発明は、ｐＨ条件を調整することで胆汁塩注入の安定性が向上するという観察と部分的に関連する。
【００５１】
本発明は、有害事象を減少させることによる所望する治療的結果の達成において、適切なｐＨ範囲における胆汁塩の適切な濃度範囲の組み合わせが重要であるという発見と関連がある。例えば、ｐＨ条件が低いほうが胆汁塩の細胞溶解活性を向上させるため、低いｐＨ製剤内では低濃度の胆汁塩が使用される。好ましくは、使用されるｐＨが低いほうが、胆汁塩製剤の有害効果を増大させない。従って、有害効果は、適したｐＨ条件において、細胞溶解活性から区別されうる。従って、一部の場合において、さらに低いｐＨ製剤において、より低濃度の胆汁塩を使用することにより、胆汁塩の細胞溶解活性が低下することなく、有害効果を低減させることができる。
【００５２】
デオキシコレートの場合、デオキシコレートの沈澱は、より低いｐＨ溶液で観察された。結果として、デオキシコレートに対して、より高いｐＨの緩衝溶液が求められる。しかし、生理的ｐＨより高いｐＨ溶液は、有害事象を示す。従って、本発明は、デオキシコレート製剤と比較して、有害事象の減少等のさらなる利点を提供する、生理的ｐＨかつ低濃度のコレート溶液及びケノデオキシコレート溶液のうち１以上の製剤を提供する。
【００５３】
本発明は、他のデオキシコレートが有害効果を示す濃度ではコレートがレシピエントに対して有害効果を示さない、ｉｎ  ｖｉｖｏでのコレートの予期しない脂肪溶解効果に基づくものである。従って、本発明は、デオキシコレート濃度より高いコレート濃度であるが、患者において低減された有害効果を示す、コレートを含む製剤を提供する。他の様態において、本発明は、デオキシコレート濃度と同一のコレート濃度はであるが、患者においてさらに高い脂肪溶解効果を示しながらも低減された有害効果を示す、コレートを含む製剤を提供する。従って、本発明は、デオキシコレートを使用する場合に比べ、有害効果を示さないコレートを有効濃度として含む、さらに安全な脂肪溶解注射剤（ｌｉｐｏｌｙｓｉｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を提供する。
【００５４】
一実施形態において、本発明は、哺乳類において、脂肪減少のための活性成分として、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上を使用する組成物及び方法を提供する。一実施形態において、本発明は、脂肪溶解注射剤において、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上を使用する組成物及び方法を提供する。
【００５５】
一実施形態において、本発明は、局所化された脂肪沈着の非手術的減少を必要とする患者に、局所化された脂肪沈着の非手術的減少に有用な組成物及び方法を提供し、前記方法は、薬理学的に活性である胆汁酸またはその塩、例えば、コレート及びケノデオキシコレートを含む組成物を使用する段階を含む。本発明の組成物は、抗炎症剤、鎮痛剤、分散剤、及び薬学的に許容される賦形剤のような他の作用剤をさらに含んでもよい。本発明の組成物は、哺乳類の臀部、ふくらはぎ、背、太股、足首、または胃だけではなく、目、あご、または腕の下の脂肪沈着を含む、脂肪の局所化された蓄積の治療に有用である。他の実施形態において、本発明の方法は、例えば、眼瞼脂肪ヘルニア、脂肪腫、脂肪異栄養症、バッファローハンプ脂肪異栄養症（ｂｕｆｆａｌｏ  ｈｕｍｐ  ｌｉｐｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、またはセルライト関連性脂肪沈着のような脂肪沈着の特定タイプを低減させることができる。一実施形態において、前記脂肪減少は、脂肪吸引のような手術的過程を必要としない。
【００５６】
一実施形態において、本発明の組成物は、手術的介入の必要性なしに、脂肪減少を必要とする患者の治療部位内に直接注射するのに適して製剤化されもする。
【００５７】
一実施形態において、脂肪除去の非手術的方法は、脂肪吸引術、脂肪整形術または吸引切除術を含まない。
【００５８】
一実施形態において、本発明は、弛緩した皮膚の引き締め（ｔｉｇｈｔｅｎｉｎｇ  ｌｏｏｓｅ  ｓｋｉｎ）と同様に皮下脂肪沈着を減少させるための組成物、方法、及びキットを提供する。
【００５９】
組成物
本発明は、局所化された脂肪沈着の非手術的な減少または除去を必要とする患者において、局所化された脂肪沈着の非手術的な減少または除去に有用な組成物を提供する。一実施形態において、前記組成物は、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上の有効脂肪溶解量を含む。一実施形態において、本発明の組成物は、他のものうちでも、下眼瞼脂肪ヘルニア、脂肪異栄養症及びセルライト関連性脂肪沈着を含む局所化された脂肪蓄積の治療に有用である。好ましくは、本発明の組成物は、脂肪吸引のような手術的過程を必要としないために使用される。
【００６０】
一実施形態において、本発明は、水性ビヒクルのうち、１以上の、薬理学的に活性である胆汁酸及びその塩、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、生物学的に適合する胆汁酸及びその塩の組成物を提供する。特に、薬理学的に活性である胆汁酸またはその塩が脂肪の溶解に使用されることは、本発明の範囲内である。
【００６１】
いくつかの胆汁酸及びその塩が本発明に含まれる。例えば、本発明に含まれる前記胆汁酸及びその塩は、コール酸、ケノデオキシコール酸、及びその任意の塩から選択される。多様な態様において、任意の胆汁酸または胆汁酸接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は、生理的に許容可能な塩、例えば、コール酸またはケノデオキシコール酸のナトリウム塩、またはタウリンまたはグリシンとの接合の形態でもある。一態様において、用語「コール酸（ｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）」は、コール酸のナトリウム塩を示す。一実施形態において、コール酸（コレート）は、本発明の製剤において、活性成分である。他の態様において、用語「ケノデオキシコール酸（ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）」は、ケノデオキシコール酸のナトリウム塩を示す。一実施形態において、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコレート）は、本発明の製剤において、活性成分である。
【００６２】
一部の場合において、用語コレート化合物、コレート及びコール酸は、相互変換可能に使用される。一部の場合において、用語ケノデオキシコレート化合物、ケノデオキシコレート及びケノデオキシコール酸は、相互変換可能に使用される。
【００６３】
一実施形態において、定義された薬剤学的組成物として適する胆汁酸の適合量（ａｄｅｑｕａｔｅ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ）が本明細書で提供される。一態様において、特定のコレート薬剤学的組成物及びケノデオキシコレート薬剤学的組成物は、動物起源の全ての残基（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）、及び哺乳類及び／またはバクテリアの発熱性物質（ｐｙｒｏｇｅｎｓ）が存在しない。他の態様において、定義された薬剤学的組成物として適する１以上のコレート及びケノデオキシコレートの適合量が提供され、それは、関連組成物と共に、局所化された脂肪除去のための注射可能な薬剤組成物として使用される。本発明の定義された１以上のコレート注射物及びケノデオキシコレート注射物（ｉｎｊｅｃｔａｔｅｓ）は、脂肪死滅を引き起こす分子と組み合わされる。
【００６４】
一部の実施形態において、前記胆汁酸は、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、リチウム（Ｌｉ＋）、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）、バリウム（Ｂａ２＋）、ストロンチウム（Ｓｒ２＋）及びアンモニウム（ＮＨ４＋）からなる群より選択される陽イオンを含む。一実施形態において、界面活性剤は、胆汁酸と、アルカリ金属またはアルカリ土類金属である陽イオンとを含む。好ましくは、前記アルカリ金属は、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）またはリチウム（Ｌｉ＋）であり、前記アルカリ土類金属は、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）、バリウム（Ｂａ２＋）またはストロンチウム（Ｓｒ２＋）である。特定の実施形態において、本明細書で記載される前記方法及び組成物に使用される胆汁酸塩は、非制限的な例であり、そのナトリウム塩及びカリウム塩を含む、薬学的に許容される塩である。
【００６５】
特定の実施形態において、本発明の１以上のコレート組成物及びケノデオキシコレート組成物の濃度は、本発明の組成物において、重量または体積で、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、またはそれらに由来する任意の範囲でもある。従って、前記コレート組成物及びケノデオキシコレート組成物のうち１以上は、任意の組み合わせまたは百分率範囲において、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上を含んでもよいと考慮される。
【００６６】
一実施形態において、本明細書の前記組成物は、溶液である。好ましくは、前記溶液は、水性である。
【００６７】
一実施形態において、本発明は、（ｉ）１以上の薬理学的に活性であるコレート及びケノデオキシコレートの治療上有効な量、及び（ｉｉ）薬剤学的、獣医学的または美容的な賦形剤を含む、皮下注射のための溶液に関する。
【００６８】
一部の実施形態において、前記溶液は、抗微生物剤、血管収縮剤、抗血栓剤、抗凝集剤、泡抑制剤、抗炎症剤、鎮痛剤、分散剤、抗分散剤、透過強化剤、ステロイド、鎭静剤、筋肉弛緩剤、及び抗下痢剤からなる群より選択される第２治療剤をさらに含んでもよい。
【００６９】
一部の実施形態において、溶液は、５００ｍＬまで溶液を含む容器内に存在する。前記容器は、注射器、または注射器搭載可能な容器でもある。
【００７０】
前記組成物（例えば、溶液）は、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上の治療上有効量を含む。前記治療上有効量は、皮下脂肪沈着を減少させるか、または有害効果を有する弛緩された皮膚領域を引き締めるのに効果的である。
【００７１】
本発明の溶液のうち１以上のコレート及びケノデオキシコレートは、約０．００１ないし１０、０．０１ないし５、または０．１ないし２％ｗ／ｗ、ｗ／ｖまたはｖ／ｖの濃度でもある。好ましくは、前記溶液のうち１以上のコレート及びケノデオキシコレートは、約０．１ないし５％ｗ／ｗ、またはさらに好ましくは、約１％ｗ／ｗの濃度でもある。
【００７２】
一実施形態において、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上は、前記コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上が脂肪溶解に効果的であるように、約９未満のｐＨに製剤化されている。一実施形態において、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上は、前記コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上が、脂肪溶解に効果的であるように、約８未満のｐＨに製剤化されている。一実施形態において、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上は、前記コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上が、脂肪溶解に効果的であるように、約７．５未満のｐＨに製剤化されている。一実施形態において、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上は、前記コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上が、脂肪溶解に効果的であるように、約７．０未満のｐＨに製剤化されている。好ましくは、前記製剤は、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上が、２５℃で安定した形態である液体製剤である。本明細書で使用されるように、安定した形態は、ゲル化形態または沈澱形態ではない。
【００７３】
一実施形態において、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上は、約０．５％ないし約４．０％であるように製剤化されている。一実施形態において、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上は、約０．５％ないし約２．０％であるように製剤化されている。好ましくは、前記製剤は、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上が、２５℃で安定した形態である液体製剤である。本明細書で使用されるように、安定した形態は、ゲル化形態または沈澱形態ではない。
【００７４】
一実施形態において、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上は、約９未満のｐＨ緩衝溶液において、約０．５％ないし約４．０％の濃度に製剤化されている。一実施形態において、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上は、約８未満のｐＨ緩衝溶液において、約０．５％ないし約４．０％の濃度に製剤化されている。一実施形態において、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上は、約７．５未満のｐＨ緩衝溶液において、約０．５％ないし約４．０％の濃度に製剤化されている。一実施形態において、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上は、約７未満のｐＨ緩衝溶液において、約０．５％ないし約４．０％の濃度に製剤化されている。好ましくは、前記製剤は、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上が、２５℃で安定した形態である液体製剤である。本明細書で使用されているように、安定した形態は、ゲル化形態または沈澱形態ではない。
【００７５】
一実施形態において、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上は、約９未満のｐＨ緩衝溶液において、約０．５％ないし約２．０％の濃度に製剤化されている。一実施形態において、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上は、約８未満のｐＨ緩衝溶液において、約０．５％ないし約２．０％の濃度に製剤化されている。一実施形態において、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上は、約７．５未満のｐＨ緩衝溶液において、約０．５％ないし約２．０％の濃度に製剤化されている。一実施形態において、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上は、約７未満のｐＨ緩衝溶液において、約０．５％ないし約２．０％の濃度に製剤化されている。好ましくは、前記製剤は、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上が、２５℃で安定した形態である液体製剤である。本明細書で使用されるように、安定した形態は、ゲル化形態または沈澱形態ではない。
【００７６】
一実施形態において、本発明は、２５℃で安定した形態であり、約８未満のｐＨ緩衝溶液において、約０．５％ないし約２．０％の濃度を有するコレート及びケノデオキシコレートのうち１以上の製剤を提供する。本発明の製剤の利点は、生理的ｐＨであり低濃度である前記胆汁塩溶液が、より高いｐＨ溶液およびより高濃度の胆汁塩溶液を使用する場合の有害効果を低減させることができる点にある。
【００７７】
方法
本発明の組成物は、多様な臨床的状況に適用されてもよい。本発明は、かような製剤を、標的部位に局所的に投与することにより、哺乳類において、皮下脂肪蓄積を減少させるための薬理学的に活性であるコレート及びケノデオキシコレートのうち１以上の使用に関する。該組成物に係る他の使用は、脂肪腫、脂肪の溶解、メゾセラピー（ｍｅｓｏｔｈｅｒａｐｙ）、組織分離、腫瘍減少、癌減少、癌治療、および、身体の部分または領域から、ワックス、脂肪、タンパク質または炭水化物を、弛緩し、除去し、身体消費または溶解を補助するのに使用することを所望する任意の他の臨床的状況が含まれる。例えば、脂肪腫の治療において、前記組成物は、脂肪腫と接触して皮下に注射され、脂肪腫を溶解させることができる。脂肪腫に対する他の適する適用方法も使用される。
【００７８】
一実施形態において、本発明の組成物は、対象において、脂肪沈着を減少させるために使用される。一部の場合において、脂肪沈着は、肥満、脂肪再分配症侯群、下眼瞼脂肪ヘルニア、脂肪腫、ダーカム病（Ｄｅｒｃｕｍ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、脂肪異栄養症、バッファローハンプ脂肪異栄養症、後頚部脂肪（ｄｏｒｓｏｃｅｒｖｉｃａｌ  ｆａｔ）、内臓脂肪過多症（ｖｉｓｃｅｒａｌ  ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）、乳房拡大症、高度肥満症（ｈｙｐｅｒａｄｉｐｏｓｉｔｙ）、わき腹周辺及び腕周辺の拡散された身体脂肪、及びセルライトに関連する脂肪沈着からなる群より選択される状態と関連がある。好ましい実施形態において、本発明の方法は、対象に手術を行うことを含まない。
【００７９】
本発明の組成物は、肉芽腫（ｇｒａｎｕｌｏｍａｓ）、傷痕、腫瘍、にきび嚢胞（ａｃｎｅｃｙｓｔｓ）、皮脂嚢胞（ｓｅｂａｃｅｏｕｓ  ｃｙｓｔｓ）、皮脂過形成（ｓｅｂａｃｅｏｕｓ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、皮脂の疾患、にきび関連皮膚病、皮下脂肪の疾患、腫瘍、入墨除去、感染及びバイオフィルム、セルライト、脂肪沈着、脂肪組織、及び関連状態の治療に有用である。また、本発明の組成物は、皮膚輪郭欠陥（例えば、皮膚フィラで過多矯正した後、または注射に対する身体の過多反応後の乳房非対称または唇非対称）を広げるのに（ｅｖｅｎ  ｏｕｔ）使用されてもよい。前記過程は、生きている組織において、身体から分離された組織において、または病理的検査もしくは欠陥検査の補助のために遂行されてもよい。前記過程は、組織、血清、または任意の他の身体部分に対しても遂行される。ヒト医療に加え、前記組成物は、動物医療にも適用可能である。
【００８０】
一実施形態において、本発明は、対象において脂肪を減少させるための方法に関する。前記方法は、本発明の組成物を、標的領域に局所的に（ｌｏｃａｌｌｙ）投与する段階を含む。
【００８１】
一部の実施形態において、前記投与段階は、本発明の組成物を、皮下注射または経皮注射を介して伝達する段階を含む。
【００８２】
一部の実施形態において、前記投与段階は、本発明の組成物を皮膚パッチ、ポンプ、または皮下層保存（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ  ｄｅｐｏｔ）を介して伝達する段階を含む。
【００８３】
一部の実施形態において、前記投与段階は、本発明の組成物を局所的に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）または皮下に伝達する段階を含む。
【００８４】
一部の実施形態において、治療される標的部位の領域は、目の下、あごの下、腕の下、臀部、頬、額、ふくらはぎ、背、太股、足首または胃である。
【００８５】
一部の実施形態において、対象において脂肪を減少させるために使用される前記組成物は、皮膚緊張溶液（ｓｋｉｎ  ｔｉｇｈｔｅｎｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）と共に製剤化されている。前記皮膚緊張溶液は、抗微生物剤、血管収縮剤、抗血栓剤、抗凝集剤、泡抑制剤、抗炎症剤、鎮痛剤、分散剤、抗分散剤、透過強化剤、ステロイド、鎭静剤、筋肉弛緩剤及び抗下痢剤からなる群より選択される第２治療剤をさらに含んでもよい。
【００８６】
一部の実施形態において、本発明の方法は、対象に対する手術を行う段階を含まない。
【００８７】
特定の実施形態において、本発明の第１治療と第２治療との時間間隔は、少なくとも１週、少なくとも２週、少なくとも１月、少なくとも２月、少なくとも１２週、少なくとも１３週、少なくとも１４週、少なくとも１５週、少なくとも１６週、少なくとも１７週、少なくとも１８週、少なくとも１９週、少なくとも２０週、少なくとも２１週、少なくとも２２週、少なくとも２３週、少なくとも２４週、少なくとも２５週、少なくとも２６週、少なくとも２７週、少なくとも２８週、少なくとも２９週、少なくとも３０週、少なくとも３１週、少なくとも３２週、少なくとも３３週、少なくとも３４週、少なくとも３５週、少なくとも３６週、少なくとも３７週、少なくとも３８週、少なくとも３９週、少なくとも４０週、少なくとも４１週、少なくとも４２週、少なくとも４３週、少なくとも４４週、少なくとも４５週、少なくとも４６週、少なくとも４７週、少なくとも４８週、少なくとも４９週、少なくとも５０週、少なくとも５１週、少なくとも５２週またはそれ以上である。
【００８８】
薬剤組成物
一実施形態において、本発明は、約９未満、約８未満、約７．５未満または約７未満のｐＨ緩衝溶液において、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上を含む液体薬剤組成物を提供する。一実施形態において、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上は、２５℃で、液体薬剤組成物中で安定している。一実施形態において、２５℃で、液体薬剤組成物中で安定しているということは、コレート及びケノデオキシコレートのうち１以上がゲル化された形態または沈澱形態ではないということを意味する。
【００８９】
本明細書に記載された前記薬剤組成物の製剤は、薬理学分野で知られた、またはその後開発された任意の方法によって製造されてもよい。一般的に、前記製造方法は、活性成分を、担体、または１以上の他の付随成分と結合させる段階の後、必要に応じてまたは所望する場合には、産物を所望する単一または多重の投与単位で、成形または包装する段階を含む。
【００９０】
本明細書で提供された薬剤組成物の記載が、主に人間への倫理的投与に適する薬理学的組成物に係るものであるとしても、かような組成物が、全種の動物への投与にも一般的に適することは、当業者によって理解されるであろう。
【００９１】
人間への投与に適する薬剤組成物を変形し、多様な動物への投与に適する組成物を製造することは周知であり、通常の技術を有する獣医薬物学者であれば、必要に応じて単なる普通の実験を介して、かような変形を考案及び遂行することができるであろう。本発明の薬剤組成物投与が考慮される対象は、これらに制限されるものではないが、人間及び他の霊長類、非人間霊長類、家畜、豚、馬、羊、猫及び犬のような商業的に関連性ある哺乳類を含む哺乳動物を含む。
【００９２】
本発明の方法において有用な薬剤組成物は、目（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ）、口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻腔内、頬（ｂｕｃｃａｌ）、または他の投与経路に適する製剤として、製造、包装または販売されてもよい。他の考慮された製剤は、突出したナノ粒子（ｐｒｏｊｅｃｔｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、リポソーム製剤、活性成分を含む再密封された赤血球、及び免疫学的に基づく製剤を含む。
【００９３】
本発明の薬剤組成物は、単一ユニット用量、または複数の単一ユニット用量でもって、製造、包装またはバルクで販売されてもよい。本明細書で使用される「ユニット用量（ｕｎｉｔ  ｄｏｓｅ）」は、既定量の活性成分を含む薬剤組成物の区別される量（ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ａｍｏｕｎｔ）である。前記活性成分の量は、一般的に、対象に投与される活性成分の投与量（ｄｏｓａｇｅ）、または例えば、かような投与量の半分または３分の１のような投与量の便利な分画と一般的に同一である。
【００９４】
本発明の薬理組成物において、活性成分、薬学的に許容される担体、及び任意の追加的成分の相対的量は、治療される対象の特性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、大きさ及び状態によって、また前記組成物が投与される経路によって変わる。例えば、前記組成物は、０．１％ないし１００％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでもよい。
【００９５】
本発明の薬剤組成物の調節された（または、持続された）放出製剤は、一般的な技術を使用して製造される。
【００９６】
前記薬剤組成物は、滅菌注射可能な水性または油性の懸濁液または溶液の形態で製造、包装または販売される。該懸濁液または溶液は、周知の技術によって製剤化され、活性成分に加え、本明細書で記載された分散剤、湿潤剤または懸濁液剤のような追加成分を含んでもよい。前記殺菌注射可能製剤は、例えば、水または１，３−ブタンジオールのような非毒性非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒を使用して製造される。他の許容可能な希釈剤及び溶媒は、これらに制限されるものではないが、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、及び合成モノグリセリドまたはジグリセリドのような固定されたオイルを含む。有用な他の非経口的に投与可能な製剤は、活性成分を微細結晶形態内、リポソーム製剤内、または生分解可能なポリマーシステムの成分として含むものなどを含む。持続した放出または移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）のための組成物は、エマルジョン、イオン交換樹脂、難溶性ポリマーまたは難溶性塩のような薬学的に許容されるポリマー性または疎水性物質を含んでもよい。
【００９７】
本発明の薬剤組成物は、頬（ｂｕｃｃａｌ）投与に適する製剤として製造、包装または販売される。前記製剤は、例えば、一般的な方法を使用して製造された錠剤（ｔａｂｌｅｔｓ）形態またはロゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）形態であってもよく、例えば、０．１ないし２０％（ｗ／ｗ）の活性成分、口腔溶解可能であるか、あるいは分解可能な組成（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を含む残分（ｂａｌａｎｃｅ）、及び必要に応じて、本明細書に記載される１以上の追加的成分であってもよい。あるいは、頬投与に適する製剤は、前記活性成分を含む粉末、またはエアゾール化されたり霧化（ａｔｏｍｉｚｅｄ）されたりする溶液、または懸濁液を含んでもよい。前記粉末化、エアゾール化またはエアゾール化された製剤は、分散される場合、好ましくは、約０．１ないし約２００ｎｍ範囲の平均粒子サイズまたは平均液滴サイズを有し、本明細書に記載される１以上の追加的な成分をさらに含んでもよい。
【００９８】
本明細書で使用される「追加的成分（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ）」は、これらに制限されるものではないが、賦形剤、表面活性剤、分散剤、非活性希釈剤、顆粒化剤及び崩壊剤（ｇｒａｎｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、着色剤、保存剤、ゼラチンのような生理的に分解可能な組成物、水性ビヒクル及び溶媒、油性ビヒクル及び溶媒、懸濁液剤、分散または湿潤剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ  ｏｒ  ｗｅｔｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、乳化剤、粘滑剤（ｄｅｍｕｌｃｅｎｔｓ）、緩衝剤、塩、増粘剤（ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、フィラ、抗酸化剤、抗生物質、抗真菌剤、安定化剤、及び薬学的に許容されるポリマーまたは疎水性物質のうち１以上を含む。本発明の薬剤組成物に含まれる他の「追加的な成分（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ）」は、当技術分野において周知であり、例えば、援用によって本明細書に含まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８５，  Ｇｅｎａｒｏ  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ）に記載されている。
【実施例】
【００９９】
本発明は、下記実施例を参照し、詳細にさらに説明される。下記実施例は、単に説明の目的で提供されるものであり、別段明示されない限り、本発明の範囲を制限する意図ではない。従って、本発明は、決して下記実施例にのみ制限されるものであると解釈されるものではなく、むしろ本明細書で提供される教示の結果として明白になる任意及び全ての変形を含むものであると解釈されなければならない。
【０１００】
さらなる説明が無くとも、当業者であれば、前述の記載及び下記の例示的な実施例を使用して、本発明の化合物を製造及び利用し、請求項に係る方法を実施できると考えられる。従って、下記実施例は、本発明の望ましい実施形態を具体的に指し、決して前記開示の残りを制限するものであると解釈されるものではない。
【０１０１】
実施例１：脂肪減少のための胆汁酸及び塩
本実施例で示される結果は、コレートの脂肪溶解効果により、コレートが脂肪溶解注射の活性成分として、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏの結果からは予想されない濃度で使用されうるという予期しない発見を立証するものである。
【０１０２】
下記実験において採用された物質及び方法を以下に記載する。
【０１０３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、細胞培養及び脂肪細胞分化
３Ｔ３−Ｌ１細胞を、３７℃において、５％  ＣＯ２／９５％加湿雰囲気（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ  ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）下、１０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉａ）内でコンフルエントに達するまで培養した。脂肪細胞分化を誘導するために、３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞（ｐｒｅ−ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）を、９６ウェルプレートに接種し（５Ｘ１０３細胞／ウェル）、コンフルエント以後２日目（ｄａｙ  ０）まで成長させ、成長培地プラスＭＤＩ（０．５μΜメチルイソブチルキサンチン、１μΜデキサメタゾン及び１０μｇ／ｍｌインシュリン；全ての物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、米国から購入）で２日間処理し、続けて１０μｇ／ｍｌインシュリンのみを含む培地で２日間処理した。培地は、その後８日間で２日ごとに交換した。
【０１０４】
Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色
分化誘導後、７日ないし１０日目に、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回リンスし、１０％ホルマリンで１時間固定した後、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を、濾過されたＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ（０．３％）作業溶液で２０分間染色させた後、染色された細胞を蒸溜水で３回洗浄した。イメージは、オリンパスデジタルカメラを搭載したオリンパス逆相顕微鏡を使用して収集した。
【０１０５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの界面活性剤による細胞溶解効果
９６ウェルプレート中の分化した脂肪細胞をＰＢＳで２回洗浄し、多様な濃度の胆汁塩の無血清ＤＭＥＭ中でインキュベーションした。３７℃で１時間インキュベーションした後、培地を変え、２０μｌのＭＴＴ溶液（ＰＢＳ中の５ｍｇＭＴＴ／ｍｌ）を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。結果物であるホルマザン産物を、１００μｌのＤＭＳＯ／ウェル内で溶解させ、細胞生存度は、マイクロプレートリーダーを使用して、５７０ｎｍ（ＯＤ５７０）での光学的密度を測定することによって決定した。
【０１０６】
マウスからの脂肪細胞組織の採取及びｅｘ  ｖｉｖｏ脂肪溶解分析
鼠蹊部脂肪パッド（皮下脂肪）を、食餌誘導された肥満マウスから切開し、ほぼ同一サイズに切った。１００ｍｇ組織サンプルを４８ウェルプレートに移し、多様な濃度及びｐＨのＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＣＡ及びリン酸緩衝溶液３５０μｌと共に、１０分間インキュベーションした。７０μｌのＭＴＴ溶液（ＰＢＳにおいて５ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれのウェルに添加し、３７℃で一晩インキュベーションした。溶液を除去し、沈澱したホルマザン産物を３００μｌのＤＭＳＯに溶解させた。組織生存度は、マイクロプレートリーダーを使用して、５７０ｎｍでの光学的密度（ＯＤ５７０）を測定することによってモニタリング（観察）した。
【０１０７】
マウスの食餌誘導肥満の誘導
４週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスをＯｒｉｅｎｔ  Ｂｉｏ（Ｓｕｎｇｎａｍ、韓国）から購入した。マウスに、４週齢から１８週まで、高脂肪食餌（カロリーの５８％は脂肪から、カロリーの１６．４％はタンパク質から、およびカロリーの２５．５％は炭水化物からなり、主にスクロースからなるＤ  １２３３１；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，  Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，  ＮＪ、米国）を供給した。マウスは、気候調節された環境（２２．８±２．０℃、４５〜５０％湿度）で、１２時間明／１２時間暗のサイクルで飼育した。水、及び指定された食餌は、自由に（ａｄ  ｌｉｂｉｔｕｍ）供給した。それぞれのマウスの体重を隔週でモニタリングした。
【０１０８】
胆汁塩誘導された脂肪減少のｉｎ  ｖｉｖｏモニタリング
雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスをケージに閉じこめ、１２週間その脂肪食餌を供給した。胆汁塩のｉｎ  ｖｉｖｏ効果は、皮下脂肪組織に胆汁塩に直接注射することによってモニタリングした。要約すれば、食餌誘導された肥満以後、マウスをケタミン及びジャイルラジン（それぞれ６０ｍｇ／ｋｇ及び１２．５ｍｇ／ｋｇ；腹腔内注射によって投与）で麻酔した。マウスの注射部位を電気バリカンで剃り落とした。１００μｌの胆汁塩（ＤＣＡ、ＣＤＣＡ及びＣＡ、１％ｗ／ｖ）を肥満マウスの右側鼠蹊部脂肪パッド内に注射した。注射は、２週間で４回繰り返した。マウスの左側鼠蹊部脂肪パッドには、対照として、同一体積のＰＢＳを注射した。最終注射後、４日経過時点でマウスを剖検した。各グループマウスの体重及び鼠蹊部脂肪パッド重量を測定した。注射された領域の脂肪組織を切開し、１０％ホルマリンで固定し、組織学検査のために、パラフィンブロック内に含浸（ｅｍｂｅｄｄｅｄ）させた。
【０１０９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ懐死領域の定量化
食餌誘導肥満の誘導後、マウスをケタミン及びジャイルラジン（それぞれ６０ｍｇ／ｋｇ及び１２．５ｍｇ／ｋｇ；腹腔内注射によって投与）で麻酔した。マウスの注射部位を電子クリッパで剃り落とした。多様な濃度の胆汁塩（ＤＣＡ、ＣＤＣＡ及びＣＡ）のＰＢＳ１００μｌ溶液を肥満マウスの鼠蹊部脂肪パッドに注射した。マウスは、注射１日経過後に剖検した。マウス鼠蹊部脂肪パッドを、ＰＢＳにおいて２％  ＴＴＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、米国）で２時間染色させることによって非懐死領域及び懐死領域を確認し、続けて対照を明らかにするために、１０％ホルマリン内に浸漬させた。懐死領域は、ＴＴＣによって染色されていない領域として表示された。懐死脂肪領域の出現及び面積をキャプチャした後、スキャナで映像化した。ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＣＡ及びＰＢＳで処理された脂肪パッドの懐死領域は、ＩｍａｇｅＪによって計算した。
【０１１０】
水性溶液における胆汁塩の安定性
胆汁塩の溶解度及び安定性を試験するために、多様なｐＨのリン酸緩衝溶液（１０ｍＭ；ｐＨ６．５，６．７，７．０，７．２，７．４，７．６，７．８，８．０，８．３）を、二価塩基リン酸ナトリウム（ｄｉｂａｓｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及び一価塩基リン酸ナトリウム（ｍｏｎｏｂａｓｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を水に溶解させて製造した。０．０１ｇの胆汁酸（ＵＤＣＡ、ＤＣＡ、ＣＤＣＡ及びＣＡ）を１ｍｌのリン酸緩衝溶液に溶解させ、室温で１０日間放置した。
【０１１１】
胆汁塩の組織特異的効果に対するｉｎ  ｖｉｖｏモニタリング
１００μｌのＤＣＡ及びＣＡ（１％、０．５％及び０．２５％）及びＰＢＳを、雌ＩＣＲマウスの尾内に（根側に１ｃｍの尾部）注射した。マウスは、その後１４日経過時点で剖検し、その際、注射部位の組織を収集し、４％ホルマリン内に固定させた。標準組織学断片を、注射部位５ｍｍ以内において、尾の長軸方向に垂直に切断した。続けて、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色するために、サンプルを製造した。オリンパスデジタルカメラを搭載したＯｌｙｍｐｕｓ顕微鏡でイメージをキャプチャした。
【０１１２】
皮膚に対する有害事象（ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔｓ）のｉｎ  ｖｉｖｏモニタリング
皮膚に対する胆汁塩の有害事象をモニタリングするために、多様な濃度（１００μｌ体積中で、１．５％、１％及び０．５％）のＤＣＡ、ＣＡ及びＰＢＳをマウスの脇腹に皮下注射した。注射は、最初の注射後、３日経過時点で１回さらに反復した。最終注射後、４日経過時点でマウスを剖検した。皮膚病変の深刻度を下記基準によって検査した。総皮膚重症度点数は、病変の下記特性それぞれ及び長さに係わる個別点数の和で定義した。病変の長さは、確認された最大病変の最大径を測定することによって決定した。測定される長さは、病変のみを含まなければならず、臨床的に正常である皮膚を横切ってはならない。それぞれの注射部位内の病変包含長さは、０ないし３で採点し、ここで「０」は影響が無い（ｎｏ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）；「１」は≦０．２ｃｍ、「２」は０．２〜０．５ｃｍ、「３」は＞０．５ｃｍである。病変の特性は、０ないし３で採点し、ここで、「０」は病変無し、「１」は１ヵ所のみの擦過傷または１つの小さい斑点皮（＜２ｍｍ）、「２」は多重の小さい斑点皮（ｐｕｎｃｔｕａｔｅ  ｃｒｕｓｔ）または複合皮（ｃｏａｌｅｓｃｉｎｇ  ｃｒｕｓｔ）（＞２ｍｍ）、「３」はただれまたは潰瘍である。
【０１１３】
胆汁酸誘導された足部浮腫（ｐａｗ  ｅｄｅｍａ）
雄ＳＤラット（６週齢）は、Ｋｏａｔｅｃｈ  Ｃｏ．（Ｓｅｏｕｌ、韓国）から購入し、１週適応後に使用した。ラット（２００〜２３０ｇ）は、無作為に選択し、完全なラット足部の体積は、全てのグループでデジタルカリパス（Ｂｌｕｅｂｉｒｄ，Ｓｅｏｕｌ、韓国）を使用して測定した。足部浮腫を誘導させる前に、ラットをケタミン及びジャイルラジン（それぞれ６０ｍｇ／ｋｇ及び１２．５ｍｇ／ｋｇ；腹腔内注射によって投与）で麻酔した。浮腫を誘導するために、ラットの後足足裏部位内に、多様な胆汁酸及びＰＢＳを１００μｌ投与した。足部体積の測定は、胆汁酸注射直前及び注射後４時間経過時点で、カリパスによって行った。
【０１１４】
実験結果を以下に記載する。
【０１１５】
胆汁酸及び塩の生物学的活性
胆汁酸分子の生物学的活性は、ヒドロキシル基の数、及び配向またはそのコンジュゲーションなど、その化学的特性と強く係わっている。かような変数は、毒性、及び界面活性剤強度の周知の予測因子（ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）である、その疎水性に直接的に影響を及ぼす。胆汁酸の親水性指数は、ヒドロキシル基の数に比例するだけではなく、両側のステロール環におけるそれらの位置によっても影響される。
【０１１６】
胆汁塩の界面活性剤能は、それらの毒性に直接的な影響を及ぼす。一般的に、高洗浄性（ｈｉｇｈ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）であるほど高毒性を示す。ＤＣＡは、胆汁塩系のうち最も強い界面活性剤のうち一つとして知られているため、細胞を溶解し（ｌｙｓｅ）、その細胞成分を溶解させる（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅ）ための生物学的界面活性剤として、しばしば使用されている。体内脂肪除去のためにＤＣＡを使用することは、著しい有害事象と関連する。深刻な副作用を回避するために、ＤＣＡを代替するさらに安全な胆汁塩を使用することが望ましい。しかし、低毒性である胆汁塩は、弱い洗浄性及び生物学的活性であると予想される。
【０１１７】
この理由から、細胞生存度を測定する単純な定量的分析を使用して、ＤＣＡに対する多様な胆汁塩の細胞溶解活性を比較する実験を行った。脂肪細胞溶解活性をモニタリングするために、分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞株を使用した（図１）。細胞生存度は、ＭＴＴ分析を使用してモニタリングした。予備実験において、ＴＵＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＣＡ、ＨＤＣＡ、ＵＤＣＡ及びＤＣＡを含む胆汁酸の細胞溶解効果を多様な濃度で比較した。低濃度（例えば、０．１％未満）では、ＤＣＡ、ＣＤＣＡの２種の胆汁酸のみが脂肪細胞の生存度を低下させた（図２Ａ）。ＣＤＣＡは、類似の濃度で、ＤＣＡと類似の細胞溶解活性を示した。高濃度において、残りの胆汁塩の溶解効果を試験するために、２％以下の濃度のＣＡ及びＴＵＤＣＡを使用して実験を行った。ＴＵＤＣＡ処理は、脂肪細胞の生存度を低下させなかった。しかし、ＣＡは、かような高濃度で細胞死滅を示した（図２Ｂ）。ＨＤＣＡ及びＨＤＣＡは、類似の濃度において、ＣＡに比べ、若干高い細胞死滅効果を示した（図２Ｃ）。ＣＡ、ＨＤＣＡ及びＵＤＣＡの細胞溶解活性は、ＤＣＡ及びＣＤＣＡよりはるかに低かった。各胆汁酸の相対的細胞溶解活性を比較するために、ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＨＤＣＡ、ＵＤＣＡ及びＣＡのＥＣ５０（細胞の５０％を死滅させる濃度）を測定した。ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＨＤＣＡ、ＵＤＣＡ及びＣＡのＥＣ５０はそれぞれ０．０５１％、０．０６０％、０．４２％、０．２５％及び０．４２％であった（表１参照）。ＣＡのＥＣ５０は、ＤＣＡ及びＣＤＣＡより約７ないし８倍高かった。
【０１１８】
【表１】
0006437112.tif 000002
【０１１９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件からの結果より、ＤＣＡ及びＣＤＣＡが効果的に脂肪細胞を溶解でき、ゆえに脂肪溶解注射の成分とみなされることが示唆される。任意の特定理論にとらわれることなしに、ＴＵＤＣＡが細胞溶解効果を示さない点は、多分に界面活性が低いからであり、それは、ＴＵＤＣＡが脂肪溶解注射としては適さないということを示している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下において、ＣＡ、ＨＤＣＡ及びＵＤＣＡの非常に低い溶解活性は、脂肪溶解注射成分として、ＣＡ、ＨＤＣＡ及びＵＤＣＡの非常に高濃度を必要とするということを示している。従って、本実施例で提示されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果から、脂肪溶解注射において、ただＣＤＣＡだけが効果的にＤＣＡを代替すると判断される。
【０１２０】
しかし、本実施例において提示された結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果が常に実際のｉｎ  ｖｉｖｏ状況を代表するものではないということを立証する。例えば、培養細胞の単層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）は、完全な組織構造を反映することができない。完全な組織内に透過することは、胆汁塩の細胞溶解活性に影響を及ぼすことがあるために、多様な濃度において、ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＨＤＣＡ及びＣＡのｅｘ  ｖｉｖｏ脂肪細胞組織溶解効果を試験するための実験を行った。皮下脂肪組織は、１２週間高脂肪食餌を供給したＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスからすぐに（ｆｒｅｓｈｌｙ）分離した。脂肪組織は、多様な濃度の胆汁塩溶液において、１０分間インキュベーションした。組織溶解活性は、ＭＴＴ分析によって測定した（図３）。全４種の胆汁塩溶液は、脂肪細胞組織溶解効果を示した。ＤＣＡ及びＣＤＣＡは、培養細胞からの結果と類似した組織溶解活性を示した。ｅｘ  ｖｉｖｏ条件下において、それぞれの胆汁塩の相対溶解活性を比較するために、ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＨＤＣＡ及びＣＡのＥＣ５０を計算した。ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＨＤＣＡ及びＣＡのＥＣ５０濃度は、それぞれ０．０１７９％、０．０１８０％、０．０２５０％及び０．０７２７％であった（表２）。ＣＡ、ＨＤＣＡの溶解活性は、ＤＣＡまたはＣＤＣＡよりはるかに低かった。しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養実験において、ＣＡのＥＣ５０はＤＣＡ及びＣＤＣＡに比べて約７〜８倍高かったのに対し、ＣＡのＥＣ５０はＤＣＡまたはＣＤＣＡに比べて４倍高いだけであった。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養実験において、ＨＤＣＡのＥＣ５０はＤＣＡ及びＣＤＣＡに比べて約４〜５倍高かったのに対し、ＨＤＣＡのＥＣ５０はＤＣＡまたはＣＤＣＡに比べて１．４倍高いだけであった。
【０１２１】
【表２】
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【０１２２】
ｅｘ  ｖｉｖｏ研究の結果は、胆汁塩の溶解活性が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果から単純に推定されないことを示している。ｅｘ  ｖｉｖｏ条件は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件に比べてより複雑である。例えば、組織の構造は各胆汁塩の脂肪細胞透過に影響を与えうるし、組織内内部構造の存在も胆汁塩の溶解活性に影響を与えうる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果と比較することで、ｅｘ  ｖｉｖｏ結果から、比較的低濃度のＣＡまたはＨＤＣＡでも脂肪組織を溶解させるのに十分であることが示唆される。しかし、ＤＣＡまたはＣＤＣＡと類似した程度の脂肪溶解活性を得るためには、ＣＡの４倍高い用量が要求されるであろう。
【０１２３】
前記ｅｘ  ｖｉｖｏ結果に基づけば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏよりｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏの条件でＣＡがＤＣＡまたはＣＤＣＡと類似する脂肪組織の溶解活性を有するならば、周辺組織の損傷によって引き起こされる有害事象は、ＤＣＡ処理またはＣＤＣＡ処理から区別されると仮定した。これを試験するために、ＤＣＡ、ＣＤＣＡ及びＣＡのｉｎ  ｖｉｖｏ脂肪組織溶解活性を検査するための実験を行った。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件及びｅｘ  ｖｉｖｏ条件とは異なり、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件は、投与された薬物の分配、排泄及び代謝のようなさらに複雑な様相、並びに多くの変数を有する。胆汁塩溶液は、肥満マウスの皮下脂肪組織に直接適用した。マウスの肥満は、６０％高脂肪含有食餌をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスに供給することによって誘導された。高脂肪を１２週間食べさせた後、マウスの体重は、おおよそ５０グラムに逹した（図４）。一実験において、１％の胆汁塩溶液を鼠蹊部脂肪組織に２週間で５回適用した。食塩水が注射されたマウスと比較して、胆汁塩が注射されたマウスは、減少した体重及び皮下脂肪含量を示した。興味深いことに、減少した体重及び脂肪含量は、全３種の胆汁塩について類似している（図５Ａ、図５Ｂ）。
【０１２４】
胆汁塩の組織溶解活性を確証するために、皮下脂肪組織の注射部位を観察した（図６）。食塩水注射されたマウスからの脂肪組織においては、明らかな非正常病変が観察されなかった。胆汁塩のうち一つ（例えば、ＤＣＡ、ＣＤＣＡ及びＣＡ）が注射されたマウス由来の脂肪組織は、投与領域内に黄色病変を示し、これは懐死炎症部位を表す。組織組織学（ｔｉｓｓｕｅ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ）に対する胆汁塩の効果は、注射領域をＨ＆Ｅ染色することによってモニタリングした。食塩水の場合と比較して、全３種の胆汁塩の注射により、脂肪組織構造（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）の著しい破壊が誘導された。ＤＣＡ、ＣＤＣＡ及びＣＡが注射された領域において、線維性領域（ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ａｒｅａ）が観察された。いかなる特定の理論にとらわれることなく、胆汁塩の反復投与が、反復炎症（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）による組織線維症（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を引き起こすと考えられる。
【０１２５】
これらの結果は、全３種の胆汁塩が生存しているマウスにおいて脂肪溶解活性を有し、ＤＣＡ、ＣＤＣＡ及びＣＡのｉｎ  ｖｉｖｏ効果が、同一濃度において類似しているということを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件またはｅｘ  ｖｉｖｏ条件とは対照的に、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件において、ＣＡで反復投与することによって得られる脂肪溶解効果は、ＤＣＡまたはＣＤＣＡの効果と両立可能である。
【０１２６】
たとえマウスにおいて体重及び脂肪質量の減少が、胆汁塩処理に起因したものであったとしても、注射された胆汁塩からの有害効果及び麻酔過程も、胆汁塩処理されたマウスでの体重減少に影響を与えると判断される。胆汁塩のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を検証するために、生きているマウスにおいて、胆汁塩の組織溶解活性を直接モニタリングした（図７ないし図９）。
【０１２７】
脂肪組織の懐死領域を定量するために、ＴＴＣ溶液を使用する新しい実験方法を開発した。ＴＴＣは、特に、虚血性ショック後に、梗塞領域を示す、生物学的実験において、一般的に使用される酸化還元指示子（ｒｅｄｏｘ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）である。ＴＴＣは、多様なヒドロゲナーゼの活性によって、生きている組織のうち、赤色１，３，５−トリフェニルホルマザンで酵素的に還元される一方、懐死領域では、白色に残っている。ＴＴＣ染色後、懐死性白色領域と、生きている赤色領域との間で区別される境界が形成された（図７）。白色懐死領域は、映像分析プログラムによって容易に測定される。かような新たな方法は、胆汁塩のような化学物質の組織懐死効果のさらに正確な計算法を提供し、多様な物質の組織溶解効果の比較を可能にする。
【０１２８】
多様な用量のＤＣＡ、ＣＤＣＡまたはＣＡを、肥満Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの鼠蹊部脂肪に注射した。胆汁塩注射後１日経過時点で、注射されたマウスの皮下脂肪のうち、懐死領域を測定した（図８及び図９）。注射された胆汁塩の濃度を増加させると、懐死領域も比例して増大した。ＤＣＡ及びＣＤＣＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータ及びｅｘ  ｖｉｖｏデータを反映する同一投与量において、類似の組織懐死を示した。同一濃度において、ＣＡ処理されたマウスの懐死領域は、ＤＣＡまたはＣＤＣＡに比べて小さかった。しかし、およそ２倍高い濃度のＣＡは、ＤＣＡまたはＣＤＣＡと類似した懐死効果を示すのに十分であった。ＤＣＡ、ＣＡ、ＣＤＣＡ注射後の代表的イメージを図９に図示した。
【０１２９】
総括すると、ＤＣＡまたはＣＤＣＡに対するＣＡの相対的組織溶解効果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件、ｅｘ  ｖｉｖｏ条件及びｉｎ  ｖｉｖｏ条件で異なっていた。一般的に、活性試薬（ａｃｔｉｖｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）からのｉｎ  ｖｉｖｏ投与量効果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験またはｅｘ  ｖｉｖｏ実験によって推測される。しかし、多くの場合において、体内の予期せぬ効果が、試薬の実際の生物学的活性に影響を与える。従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果またはｅｘ  ｖｉｖｏ結果が、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件に対するものであると容易に解釈されない。本実施例で提示されたｉｎ  ｖｉｔｒｏデータ及びｅｘ  ｖｉｖｏデータは、ＣＡが組織を溶解するためには、ＤＣＡまたはＣＤＣＡと比較して４倍高い用量が要求されるということを示している。
【０１３０】
しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏデータは、実際の脂肪溶解効果を示すために、かようにさらに高い用量のＣＡは、必要ではないということを立証する。胆汁塩の界面活性剤活性は、脂肪またはタンパク質の可溶化力（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｐｏｗｅｒ）を示す。従って、細胞溶解活性は、界面活性剤の活性と比例すると予想される。ＤＣＡ及びＣＤＣＡは、ＣＡよりはさらに強い界面活性剤活性を有するために、それらもさらに高い細胞溶解活性を示す。それにもかかわらず、胆汁塩のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞溶解活性は、単に胆汁塩の界面活性剤能を示すものではない。かようなＣＡの予期しない脂肪溶解効果は、特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果及びｅｘ  ｖｉｖｏ結果から予測されなかった濃度で、脂肪溶解注射の活性成分としてのＣＡの使用を可能にする。
【０１３１】
溶液の塩濃度も、胆汁塩の界面活性剤活性に影響を与える。胆汁塩の脂肪溶解活性に対する塩化ナトリウム濃度の影響を試験した。食餌誘導された肥満マウスからの鼠蹊部脂肪組織を、異なる濃度の塩化ナトリウムを含む多様な溶液において、インキュベーションした。各胆汁塩の濃度は、ｐＨ７．４において、ＥＣ５０で調節した。しかし、ナトリウム塩の多様な濃度の処理は、個別的な胆汁塩の脂肪溶解活性にいかなる違いも引き起こさなかった（図１０）。
【０１３２】
界面活性剤溶液のｐＨは、ミセル形成及び界面活性剤活性に影響を与える。脂肪溶解活性に対する胆汁塩のｐＨ効果を試験するために、食餌誘導された肥満マウスからの鼠蹊部脂肪組織を、ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＨＤＣＡ及びＣＡの多様なｐＨ条件（ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０）内でインキュベーションした。胆汁塩溶液のｐＨは、リン酸塩緩衝溶液で調整した。各胆汁塩の濃度は、ｐＨ７．４において、ＥＣ５０で調整した。興味深いことに、溶液のｐＨが上昇すると、ＣＤＣＡ、ＨＤＣＡ及びＣＡの脂肪溶解活性が大きく低下した（図１１）。ＤＣＡの場合、低ｐＨの溶液では、ＤＣＡの沈澱が観察された。結果的には、ＣＡ、ＨＤＣＡまたはＣＤＣＡの場合と比較して、ＤＣＡの高ｐＨの緩衝液では、脂肪溶解活性は大きく低下しなかった。ｐＨ９超過のＣＡ溶液及びＣＤＣＡ溶液は、脂肪溶解活性をほぼ喪失した。従って、ＣＡ溶液またはＣＤＣＡ溶液を使用して、効果的に脂肪を溶解させるためには、９未満のｐＨが求められる。
【０１３３】
胆汁塩の安定性は、溶液のｐＨに影響を受ける。多様なリン酸塩緩衝溶液（１０ｍＭ；２５℃において、ｐＨ６．５、６．７、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．３）条件において、１％（ｗ／ｖ）胆汁塩の安定性を試験するために、実験を行った。これより低いｐＨでは、胆汁塩の沈澱またはゲル化が観察された。
【０１３４】
ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＨＤＣＡ、ＵＤＣＡ及びＣＡの水溶液は、それぞれ８．３、７．４、７．４、７．８及び７．０より低いｐＨでは、安定して維持された（表３）。一般的に、注射部位での不快感または痛症は、正常な生理的ｐＨより低いまたは高いｐＨの溶液によって引き起こされる。ＣＤＣＡ、ＨＤＣＡ及びＣＡは正常ｐＨで安定した特性を有するため、それらを注射成分として使用することで、ＤＣＡ及びＵＤＣＡのような他の胆汁塩を使用した場合に比べて不快感及び痛症が低減されると予測される。
【０１３５】
【表３】
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【０１３６】
ＤＣＡ溶液が生理的ｐＨでは安定していないという点を考慮すれば、脂肪溶解注射のためのＤＣＡ溶液の製剤は、ｐＨ８．３より高くなければならない。高いｐＨを有する胆汁塩溶液は低い組織溶解活性を示す。ＣＡ、ＣＤＣＡ、ＵＤＣＡ及びＨＤＣＡの溶液は低いｐＨで安定しているため、少量のＣＡ、ＣＤＣＡ、ＵＤＣＡ及びＨＤＣＡであっても、高ｐＨのＤＣＡ溶液と類似した組織溶解効果を示すのに十分であると予想される。それを試験するために、ｐＨ８．３条件の１％  ＤＣＡ溶液と類似した組織溶解活性を示す濃度を、多様な濃度のＣＡ（ｐＨ７．０）及びＣＤＣＡ（ｐＨ７．４）で注射した後、組織懐死領域をモニタリングすることによって選択した。ｐＨ８．３条件のＤＣＡ溶液の組織溶解活性は、ｐＨ７．４条件のＤＣＡ製剤の活性に比べ、さらに低いと観察された。同一ｐＨ条件（ｐＨ７．４）において、約２％ＣＡ溶液または約１％ＣＤＣＡ溶液の注射は、１％ＤＣＡ溶液の注射と類似した組織溶解活性を示した。しかし、１．５％ＣＡ（ｐＨ７．０）または０．６％ＣＤＣＡ（ｐＨ７．４）の濃度は、さらに高いｐＨ（ｐＨ８．３）を有する１％ＤＣＡと類似した組織溶解効果を示すのに十分であった（図１２Ａ）。生理的ｐＨ、及び低濃度の胆汁塩溶液は、有害事象の低減のようなさらなる利点を提供することができる。
【０１３７】
ＣＤＣＡ及びＣＡとは異なり、ＵＤＣＡまたはＨＤＣＡの組織溶解効果は、その濃度を増加させても比例的に増大しなかった（図１２Ｂ及び１２Ｃ）。興味深いことに、ＵＤＣＡまたはＣＤＣＡを皮下脂肪に１回注射することにより、注射された部位において黄色構造が誘導された（図１３Ａ）。Ｈ＆Ｅ染色は、多量の多形核（ＰＭＮ：ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ）細胞が注射部位に浸潤されるということを示す（図１３Ｂ）。黄色構造は、ＵＤＣＡ注射後またはＨＤＣＡ注射後に、ＰＭＮリッチ浸出物（ＰＭＮ−ｒｉｃｈ  ｅｘｕｄａｔｅｓ）（うみ）形成の結果物として予測された。ＵＤＣＡ注射またはＨＤＣＡ注射によるＰＭＮ細胞の浸潤及び炎症は、ＵＤＣＡまたはＨＤＣＡの懐死活性に影響を与える要因でもある。ＵＤＣＡまたはＨＤＣＡを皮下脂肪に注射した後、深刻な炎症が観察されることは、ＵＤＣＡまたはＨＤＣＡが、脂肪溶解注射の成分として使用されるのに適さないということを示す。
【０１３８】
胆汁塩は、肝臓において、タウリンまたはグリシンとコンジュゲーションされる。タウリンまたはグリシンが胆汁塩にコンジュゲーションされることが、脂肪細胞溶解活性にいかなる影響を及ぼすかについて、実験を行った。グリシンまたはタウリンとコンジュゲーションされた形態のＣＡ、ＣＤＣＡ及びＤＣＡを、分化した脂肪細胞に処理した（図１４及び図１５）。グリシンまたはタウリンがコンジュゲーションされた胆汁塩の細胞溶解活性は、コンジュゲーションされていない胆汁塩の細胞溶解活性とほぼ同一であった。かような結果は、グリシンまたはタウリンが、胆汁塩とコンジュゲーションされることが細胞溶解活性にほとんど影響を及ぼさないことを示している。
【０１３９】
多様な条件下において、脂肪溶解の他の様相が他の組織でも発生する。たとえｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下において、脂肪細胞の分解効果と筋肉細胞の分解効果に大きな差異が存在しないとしても、個別的な組織溶解活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で異なる。従って、もし脂肪組織に比べて一部の胆汁塩が低下した皮膚または筋肉の溶解活性をもたらすことができるのであれば、向上した安全性を有する脂肪分解試薬が開発される。それを試験するために、ｐＨ７．４溶液における多様な濃度のＤＣＡ及びＣＡをマウス尾に注射し、尾の組織完全性（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｉｅｓ）を評価した（図１６）。尾は、脂肪、筋肉及び皮膚から構成されるために、個別的な組織層の完全性は、一回で容易にモニタリングされる。尾の脂肪層は、食塩水注射と比較して、ＤＣＡ注射及びＣＡ注射のいずれによっても破壊された。興味深いことに、同一濃度のＣＡが注射された尾に比べ、ＤＣＡ注射された尾において、筋肉の損傷が著しかった。ＤＣＡ注射またはＣＡ注射されたマウスの皮膚層は、２つの場合いずれにおいても、深刻に損傷されていない。
【０１４０】
浮腫（ｅｄｅｍａ）は、ＤＣＡ注射によって引き起こされる典型的な有害事象の一つである。浮腫の深刻度は、胆汁塩注射後、ラット足の厚みによってモニタリングした（図１７）。胆汁塩溶液の製剤は、類似した組織溶解効果を示す濃度及びｐＨによって調整された（図１７Ａ及び図１７Ｂ）。同一体積のＰＢＳを注射しても、足厚みの増加は示さなかった。対照的に、胆汁塩の注射により、ラット足の厚みが増大した。たとえ全ての胆汁塩組成において組織懐死活性が類似しているとしても、浮腫の深刻性は各胆汁塩において異なっていた。ＤＣＡ投与された足が最も深刻な浮腫表現型を示した。ＤＣＡと比較と比較して、ＵＤＣＡ、ＨＤＣＡ及びＣＤＣＡは注射後に若干低い症状を示した。最も驚くべきことに、ＣＡ注射によって誘導されたはれ（ｓｗｅｌｌｉｎｇ）は、ＤＣＡと比較して非常に穏健な程度であった。ＣＡによる足厚みの増大は、ＤＣＡの場合に比べ、半分未満であった。かような結果は、同一ｐＨ（ｐＨ７．４）の胆汁塩溶液の処理によって再現された（図１７Ｃ及び図１７Ｄ）。以前の実験とほぼ同一の結果は、ｐＨが胆汁酸注射後の浮腫に影響を及ぼす要因ではないということを示す（図１７Ｅ）。
【０１４１】
次に、皮膚層における胆汁塩の有害効果について試験した。多様な濃度の胆汁塩（ｐＨ７．４に調整）及びＰＢＳを、生きているマウスの皮膚下に注射し、前記皮膚に対して観察される損傷をモニタリングした（図１８）。ＰＢＳ処理されたマウスの皮膚では、検出可能な病変が観察されなかった。ＤＣＡで処理することで、注射された領域で深刻な皮膚病変が引き起こされた。最も低い用量（０．５％）でＤＣＡを処理した場合でも、皮膚上で小さい斑点病変が誘導された。さらに高濃度でＤＣＡが注射された部位では、大きい病変、膿み（ｅｒｏｓｉｏｎ）及び潰瘍が観察された。ＤＣＡとは対照的に、ＣＡで注射した場合には、注射された領域において、著しく少ない病変が形成された。ＣＡの高用量（１．５％）で、小さい斑点病変のみが観察された。さらに低い用量では、ＣＡ処理されたマウスの皮膚においていかなる検出可能な病変も観察されなかった。皮膚損傷は、胆汁塩の注射部位上に形成された病変の大きさ及び深刻度によって点数を付けた。最も高い用量でＣＡを処理した場合でも（１．５％）、最も低い用量でＤＣＡを処理した場合に比べ（０．５％）、さらに低い損傷点数を示した。かような結果は、ＣＡ処理がＤＣＡ処理に比べて皮膚において著しく低減された有害事象を引き起こすということを示す。
【０１４２】
興味深いことに、唯一商業的に購入可能な脂肪溶解注射の成分であるＤＣＡのみが、生理的ｐＨで不安定性を示し、他の胆汁塩に比べて注射後により深刻な有害事象を引き起こした。試験された胆汁塩のうち、ＴＵＤＣＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において、細胞溶解活性を有さず、追加分析から排除された。ＵＤＣＡ及びＣＤＣＡはｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験及びｅｘ  ｖｉｖｏ試験で穏健な細胞溶解活性を示したが、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験で適した組織溶解活性を示さなかった。また、これらの化合物は注射部位で深刻な炎症を示した。結果として、ＣＤＣＡ及びＣＡが、それら試験された胆汁塩のうち脂肪溶解注射に適した成分として選択された。これらの実験の要約を下記表４に示す。
【０１４３】
【表４】
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【０１４４】
本実施例で提示された結果は、個々の胆汁塩による脂肪溶解効能を評価した最初の研究であると判断される。界面活性剤の強度は胆汁塩の脂肪溶解効果の核心的決定因子（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）であるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件、ｅｘ  ｖｉｖｏ条件及びｉｎ  ｖｉｖｏ条件における異なる用量反応は、個々の胆汁塩の溶解効果がその環境によって調節されるということを暗示する。ＣＡがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて予期せぬ高い溶解活性を示し、注射された領域において低減された有害事象を示すということは、さらに安全な脂肪溶解注射の開発を促進する。
【０１４５】
本実施例で提示された結果から、低いｐＨは胆汁塩の細胞溶解活性を向上させるため、本実施例で開示された実験で使用されたような低いｐＨでは、低濃度の胆汁塩が使用されうることが立証される。しかし、本実験で使用された低いｐＨは、胆汁塩製剤の有害効果を増大させなかった。かような結果から、適したｐＨ条件において、有害効果が細胞溶解活性から区分されることが立証される。従って、低濃度かつ低ｐＨの胆汁塩を使用することで、細胞溶解活性を低下させることなく、有害効果を低減させることができる。さらに、中性ｐＨは、注射痛症に関連する有害効果を低減させることができる。
【０１４６】
本明細書で引用されるそれぞれのまたは全ての特許、特許出願及び刊行物の開示は、それ全体として援用によって、本明細書に組み込まれる。たとえ本発明が特定の実施形態を参照して開示されているとしても、他の当業者によって本発明の他の実施形態及び変形物が本発明の真の精神及び範囲から外れることなく考案されうることは明白である。特許請求の範囲は、かような全ての実施形態、及び均等な変形物を含むものであると解釈されなければならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８】
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