(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の第１の標的分子の存在または不存在を検出するための方法であって、
（ａ）試料を、
ブロッカーオリゴヌクレオチド（ＢＬ）および第１の触媒核酸酵素を含む少なくとも１つの分子複合体、ここで、ＢＬは、相補的塩基対合により第１の触媒核酸酵素にハイブリダイズしている第１と第２のセグメント、および第１のイニシエーター酵素の第１の基質を含む第１と第２のセグメントの間の中間セグメントを含み、該第１の基質の少なくとも一部分は該第１の触媒核酸酵素にハイブリダイズしていない、
第１のイニシエーター酵素、および
レポーター基質
と接触させること、
ここで、第１のイニシエーター酵素は第１の標的分子および該中間セグメントの第１の基質に対する結合特異性を有し、第１の標的分子が第１のイニシエーター酵素にハイブリダイズすると第１のイニシエーター酵素の触媒活性が誘導され、それによって、第１のイニシエーター酵素にハイブリダイズしたときの第１の基質の切断が促進され、
該第１の基質の切断により、該分子複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドと第１の触媒核酸酵素のハイブリダイズしていた鎖が解離し、
該分子複合体の第１の触媒核酸酵素は、レポーター基質に対する結合特異性を有し、該解離後、レポーター基質にハイブリダイズしてこれを切断し、それによって試料中の第１の標的分子の存在を示す検出可能なシグナルをもたらすことができる、および
（ｂ）該検出可能なシグナルが該接触により生じるかどうかを判定すること、ここで、シグナルの検出は第１の標的分子が存在することを示し、シグナルを検出できないことは第１の標的分子が不存在であることを示す、
を含む方法。
【請求項２】
第１と第２の分子複合体に試料を接触させることを含み、
第１の分子複合体が、該ＢＬおよび該第１の触媒核酸酵素を含み、該ＢＬの第１と第２のセグメントの間の中間セグメントが該第１の基質と第２の基質とを含み、
第２の分子複合体が、第２のＢＬおよび第２の触媒核酸酵素を含み、該第２のＢＬが、相補的塩基対合により該第２の触媒核酸酵素にハイブリダイズしている第１と第２のセグメント、および該第１の基質のコピーと第３の基質とを含む第１と第２のセグメントの間の中間セグメントを含み、
該第１のイニシエーター酵素が第１の標的分子および各中間セグメントの第１の基質に対する結合特異性を有し、第１の標的分子が第１のイニシエーター酵素にハイブリダイズすると第１のイニシエーター酵素の触媒活性が誘導され、それによって、第１のイニシエーター酵素にハイブリダイズしたときの各中間セグメントの第１の基質の切断が促進され、
各中間セグメントの第１の基質の切断により各分子複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドと触媒核酸酵素のハイブリダイズしていた鎖が解離し、
第１の触媒核酸酵素が該第３の基質に対する結合特異性を有し、第２の触媒核酸酵素が該第２の基質に対する結合特異性を有し、
各分子複合体の解離後、第１の触媒核酸酵素が第２の分子複合体の第３の基質にハイブリダイズして、それを切断することができ、第２の触媒核酸酵素が第１の分子複合体の第２の基質にハイブリダイズして、それを切断することができ、それによって検出可能なシグナルが増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該第１、第２または第３の基質が該レポーター基質と同一である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該分子複合体の中間セグメントの基質がレポーター基質と同一であり、
ブロッカーオリゴヌクレオチドからの該解離により、該第１の分子複合体の第１の触媒核酸酵素が該第２の分子複合体の中間セグメントの基質にハイブリダイズして、それを切断することができ、それによって検出可能なシグナルの増幅が促進される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
試料に接触している該分子複合体に、触媒核酸酵素の５’末端と対向するブロッカーオリゴヌクレオチドの５’末端が備わっており、そして
レポーター基質が第２の基質と同一であり、該分子複合体の該第１の触媒核酸酵素が第２の基質にハイブリダイズして、それを切断することができる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
第１の触媒核酸酵素、第１の基質、第１のイニシエーター酵素、およびレポーター基質のうちのいずれか１つまたは複数が不溶性支持体に連結されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
該第１のイニシエーター酵素がアプタマーを含み、
第１の標的分子の不存在下ではアプタマーは第１のイニシエーター酵素の触媒活性を妨げる立体構造を採り、
第１の標的分子の存在下ではアプタマーは第１の標的分子に結合して、第１のイニシエーター酵素の触媒活性を可能にし、それによって分子複合体の基質を切断する立体構造を採る、
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第１の触媒核酸酵素および／または第１のイニシエーター触媒核酸酵素が、リボザイム、ＤＮＡザイム、アプタザイム、ＭＮＡザイムまたはアプタＭＮＡザイムである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
第２の触媒核酸酵素がリボザイム、ＤＮＡザイム、アプタザイム、ＭＮＡザイムまたはアプタＭＮＡザイムである、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）相補的塩基対合により第１のブロッカーオリゴヌクレオチド（ＢＬ）にハイブリダイズしている第１の触媒核酸酵素またはその触媒部分を含む、第１の分子複合体、
ここで、該第１のＢＬが、それぞれが相補的塩基対合により該第１の触媒核酸酵素またはその触媒部分の別個のハイブリダイジングアームにハイブリダイズしている、第１と第２のセグメント、および第１と第２のセグメントの間の中間セグメントを含み、
該中間セグメントが、第２の触媒核酸酵素に対する基質を含み、該基質の少なくとも一部分は、第１の触媒核酸酵素またはその触媒部分にハイブリダイズしておらず、少なくとも１つの第１の触媒核酸酵素またはその触媒部分の触媒コアヌクレオチドが、該第１のＢＬにハイブリダイズしており、
第１の触媒核酸酵素がアプタザイムではない、
および
（ｉｉ）第１の触媒核酸酵素による触媒的改変が可能である第１の核酸基質
を含む、組成物。
【請求項１１】
中間セグメントが、該第１の核酸基質および該第２の触媒核酸酵素に対する基質を含み、各基質の少なくとも一部分が、第１の触媒核酸酵素またはその触媒部分にハイブリダイズしていない、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
中間セグメントの何れの基質も制限酵素に対する部分的認識部位を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
該第１のＢＬ、該第１の触媒核酸酵素もしくはその触媒部分または該核酸基質のうちのいずれかが不溶性支持体に連結されている、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
相補的塩基対合により第２のＢＬにハイブリダイズしている、該第２の触媒核酸酵素を含む第２の分子複合体をさらに含み、
該第２のＢＬが、それぞれが相補的塩基対合により該第２の触媒核酸酵素の別個のハイブリダイジングアームにハイブリダイズしている、第１と第２のセグメント、および第１と第２のセグメントの間の中間セグメントを含み、
該中間セグメントが、該第１の基質のコピーおよび第３の基質を含んでもよく、各基質の少なくとも一部分は第２の触媒核酸酵素にハイブリダイズしておらず、
該第１の触媒核酸酵素が、第３の基質にハイブリダイズして、それを切断することができ、該第２の触媒核酸酵素が、該第２の基質にハイブリダイズして、それを切断することができる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
キットに含まれる、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照による組み込み
本出願は、２０１２年６月１８日提出のオーストラリア特許仮出願第２０１２９０２５５１号、２０１２年８月１０日提出のオーストラリア特許仮出願第２０１２９０３４６２号、および２０１３年４月３日提出のオーストラリア特許完全出願第２０１３２０２３５４号からの優先権を主張するものであり、それぞれの全内容は相互参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は標的分子の検出のための組成物および方法、ならびに検出アッセイにより生じる検出可能シグナルの増幅に関する。さらに具体的には、本発明は、標的分子（例えば、核酸およびタンパク質）の存在を示すシグナルを生じさせ、かつ／またはそれを増幅する触媒核酸酵素を利用する方法、ならびにその方法において使用するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
現在、試料中の標的分子の検出のために数多くのアッセイを利用することができる。一部は酵素、特に以下に記載のものを含む核酸の改変を触媒する酵素の使用に頼っている。
【０００４】
ヌクレアーゼ
ヌクレアーゼは核酸のヌクレオチドサブユニット間のリン酸ジエステル結合を切断する酵素である。デオキシリボヌクレアーゼはＤＮＡに作用し、一方リボヌクレアーゼはＲＮＡに作用するが、一部のヌクレアーゼは基質としてＤＮＡとＲＮＡの両方を利用する。ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼとしてさらに分類することができるが、一部の酵素は複数の機能を有しエンドヌクレアーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性の両方を示すことがある。エンドヌクレアーゼはポリヌクレオチド鎖内のリン酸ジエステル結合を切断する。これとは対照的に、エキソヌクレアーゼはポリヌクレオチド鎖の末端でリン酸ジエステル結合を切断する。エキソヌクレアーゼは５’末端もしくは３’末端のどちらかからまたはＤＮＡもしくはＲＮＡ鎖の両末端からヌクレオチドを除去することができる。
【０００５】
タンパク質エキソヌクレアーゼの非限定的な例には、エキソヌクレアーゼＩ［大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）］、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（大腸菌）、エキソヌクレアーゼＶＩＩおよびＴ７エキソヌクレアーゼが含まれる。エキソヌクレアーゼＩＩＩ（ExoIII）は平滑末端または３’陥凹二重鎖ＤＮＡの３’末端からモノヌクレオチドの段階的除去を触媒するエキソヌクレアーゼである。エキソヌクレアーゼＩＩＩは二重鎖ＤＮＡ内のニックで作用することもできる。ExoIIIは、少なくとも４ｎｔの一本鎖突出末端を有する一本鎖ＤＮＡまたは二重鎖ＤＮＡに対して最小の活性を有する。
【０００６】
触媒核酸酵素
触媒核酸酵素は特定の基質を改変することができる非タンパク質酵素である。触媒核酸酵素には、ＤＮＡ分子（当技術分野ではＤＮＡザイム、デオキシリボザイム、またはＤＮＡ酵素としても知られている）、ＲＮＡ分子（当技術分野ではリボザイムとしても知られている）、ならびに複数のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子で構成された多成分核酸酵素（当技術分野ではＭＮＡザイムとしても知られている）が含まれる。触媒核酸酵素は、例えば、切断またはライゲーションにより特定の核酸基質配列を改変することができる。独特の種類の触媒核酸酵素（当技術分野では西洋ワサビペルオキシダーゼ模倣ＤＮＡザイムとして知られている）は、特定の化学的基質を、例えば、色の変化を生じるまたは蛍光もしくは化学発光シグナルをもたらすことができるその酸化生成物に変換するペルオキシダーゼ反応を触媒することができる。
【０００７】
ＲＮＡ基質、ＤＮＡ基質および／またはキメラＤＮＡ／ＲＮＡ基質を切断するまたはライゲートすることができるＤＮＡザイムおよびリボザイムは、一般に最小の配列要件を満たす標的核酸基質を改変することができるだけである。例えば、基質は酵素の基質結合アームに十分な塩基対相補性を示すべきであり、触媒的改変の部位に特定の配列も必要とする。触媒的切断部位でのそのような配列要件の例には、ＤＮＡザイム切断（１０〜２３モデル）ではプリン：ピリミジン配列に対する要件およびハンマーヘッドリボザイム(hammerhead ribozyme)では配列ウリジン：Ｘ（ＸはＡ、ＣまたはＵに等しいがＧではない）に対する要件が含まれる。１０〜２３ＤＮＡザイムは特定のＲＮＡリン酸ジエステル結合で核酸基質を切断することができるＤＮＡザイムである。このＤＮＡザイムは、２つの基質認識ドメイン（アーム）が隣接している１５デオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。
【０００８】
ＭＮＡザイムは触媒核酸酵素の別の範疇である。これらの多成分核酸酵素はその集合および触媒活性のためにアセンブリーファシリテーター(assembly facilitator)（例えば、標的核酸）を必要とする。ＭＮＡザイムは、１つまたは複数のアセンブリーファシリテーターの存在下で自己集合して基質を触媒的に改変することができる触媒的に活性なＭＮＡザイムを形成する複数のパート酵素またはパートザイムで構成されている。パートザイムは、アセンブリーファシリテーター（例えば、標的核酸）に結合するセンサーアーム、基質に結合する基質アーム、および複数のパートザイム成分が集合すると結合して完全な触媒コアをもたらす部分的触媒コア配列を含む複数のドメインを有する。ＭＮＡザイムは、例えば、異なる標的核酸配列を含む広範囲のアセンブリーファシリテーターを認識するように設計することができる。アセンブリーファシリテーターの存在下では、触媒的に活性なＭＮＡザイムはパートザイム成分から集合し、次に基質に結合して触媒的に改変し出力シグナルをもたらすことができる。アセンブリーファシリテーターは、生体試料または環境試料中に存在する標的核酸であってもよい。そのような場合には、ＭＮＡザイム触媒活性は標的の存在を示している。核酸基質を切断することができるいくつかのＭＮＡザイムが報告されており、核酸基質をライゲートすることができるさらなるＭＮＡザイムも当技術分野では公知である。
【０００９】
アプタザイムは、その活性がアプタマードメインに結合することができる標的分析物／リガンドの存在に依存しているようにアロステリックに核酸酵素を調節するアプタマードメインと連結されている特定種類の触媒核酸（ＤＮＡザイム、リボザイムまたはＭＮＡザイム）である。相補的調節因子オリゴヌクレオチドは、アプタザイム内のアプタマーと触媒的核酸ドメインの一部の両方に結合することにより標的分析物の不存在下でアプタザイムの活性を阻害するのに使用されてきた。アプタザイムの触媒活性の阻害は、アプタマー部分に標的リガンドが結合しこうして調節因子オリゴヌクレオチドの除去を促進することにより可逆的であった。本発明者らは、アプタマーと結合していない触媒核酸（すなわち、アプタザイムではない触媒核酸）の触媒活性による核酸基質の改変を可逆的に阻害し、それにより阻害が触媒核酸の触媒コアまたはその一部に結合するオリゴヌクレオチドのより媒介されるように設計されたオリゴヌクレオチドを用いる方法についての以前のいかなる開示も知らない。
【００１０】
鎖置換型ポリメラーゼ
ＤＮＡポリメラーゼはデオキシリボヌクレオチドのＤＮＡ鎖への重合化を触媒する。ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ複製の原因となる天然に存在する酵素であり、ポリメラーゼは無傷のＤＮＡ鎖を鋳型（テンプレート）として「読み取り」それを使用して新しい鎖を合成する。一部のＤＮＡポリメラーゼは５’−３’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を含有しており、それによって合成中に遭遇するいかなる下流鎖も分解する（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）。これとは対照的に、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは合成中に遭遇するいかなる下流鎖も置換する能力を有する。下流鎖は分解されず、無傷のままである。鎖置換ＤＮＡポリメラーゼの例には、Ｐｈｉ２９、ＤＮＡポリメラーゼＩ  Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＶｅｎｔＲおよびＢｓｔポリメラーゼラージフラグメントが含まれる。
【００１１】
キナーゼおよびホスファターゼ
キナーゼは、ＡＴＰからタンパク質中の特定のアミノ酸へのγリン酸の転移および核酸末端への転移も触媒することができる。ホスファターゼはエステル化リン酸の加水分解によりリン酸基の除去を触媒することができ、リン酸イオンおよび遊離のヒドロキシル基を有する分子が生じる。キナーゼによるタンパク質リン酸化およびホスファターゼによる脱リン酸化は細胞内のシグナル伝達経路を調節するのに重要であり、従って、代謝、細胞周期進行、細胞運動およびアポトーシスなどの細胞プロセスにおける極めて重要な機能を果たす。分子生物学では、オリゴヌクレオチドの３’末端のリン酸化は、ポリメラーゼによるそれらの伸長を防ぐ方法として使用することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドの３’末端の脱リン酸化は、ポリメラーゼによるそれらの伸長を可能にする方法として使用することができる。
【００１２】
標的およびシグナル増幅技術
標的検出の感度を高めるために、標的増幅またはシグナル増幅のための戦略が用いられており、その多くはＤＮＡおよび／またはＲＮＡポリメラーゼ酵素を利用する。標的増幅を用いる既存の方法の例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写物媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、または核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれる。増幅を鎖置換に依存している方法、例えば、ＳＤＡ、ＲＣＡおよびＬＡＭＰは、鎖置換活性を有するポリメラーゼの使用が必要である。ニッキングエンドヌクレアーゼを含むヌクレアーゼを利用するシグナル増幅カスケードも記載されている（例えば、ＮＥＳＡ）。
【００１３】
触媒核酸を利用するシグナル増幅カスケードも記載されてきた。一例には、リボヌクレオチド接合部により結合される２つの隣接するペルオキシダーゼ模倣ＤＮＡザイムからなるオリゴヌクレオチドの使用が含まれる。このオリゴヌクレオチドの末端は、それぞれの末端をハイブリダイズして疑似環(quasi-circle)構造を形成する短いリンカーＤＮＡにより互いに連結される。この構造の形成によりＤＮＡザイムの触媒活性は一時的に阻害される。その標的アセンブリーファシリテーター分子の存在下で集合するＭＮＡザイムはＤＮＡザイムに直接ハイブリダイズしてその間のリボヌクレオチド接合部を切断する。ＤＮＡザイムを含有するオリゴヌクレオチドが切断されると互いからおよび短いリンカーＤＮＡから２つのＤＮＡザイムが分離し、ＤＮＡザイムが活性化される。この戦略の限界は、シグナルの増幅が、ＭＮＡザイム切断事象ごとに活性化される２つのＤＮＡザイムのみに限られることであり、これらのペルオキシダーゼ模倣ＤＮＡザイムには核酸基質を改変する能力がないので、これらのＤＮＡザイムが追加のＤＮＡザイム分子を活性化する機構は存在しない。従って、その戦略は指数関数的シグナル増幅が可能な循環フィードバックカスケードにおける第１ステップとしては不適切である。さらに、ＭＮＡザイムアームとＤＮＡザイムの間の相補性は、最初の切断事象が起こるのに必要であるが、ＤＮＡザイム分子が疑似環構造から放出されるとＤＮＡザイム分子の隔離をもたらすこともあり、潜在的に反応の感受性を制限する。
【００１４】
他の既存のシグナル増幅法には多くの限界がはっきり表れている。例えば、多くの技法では反応速度が試料中に最初に存在する標的ＤＮＡ分子の数により制限される。従って、これらのおよび他の方法には臨床応用に必要な速度と感度が欠けていることが多い。他の方法は、触媒核酸分子の不適切な阻害のため標的の不存在下で偽の陽性シグナル発生に悩まされている。ＤＮＡ鎖置換を利用する数多くの方法は時間がかかり標的増幅法の感度に欠けている。主に独特の認識部位に頼っているアッセイは、ユニバーサル標的配列の検出を妨げることがある、または新しい標的配列ごとに新しいプローブを必要とすることがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、シグナル増幅を組み込む核酸配列および他の標的を検出し定量するための方法の必要性が継続して存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、本明細書に記載される組成物、キットおよび方法を提供することにより、既存の標的分子検出および／またはシグナル増幅法においてはっきり表れている不都合な点のうちの少なくとも１つに取り組むものである。
【００１７】
本発明は、以下の態様１〜１７４に少なくとも部分的に関する。
【００１８】
態様１：（ｉ）相補的塩基対合により第１のブロッカーオリゴヌクレオチド（ＢＬ）にハイブリダイズしている、第１の触媒核酸酵素、もしくはその触媒部分、または酵素もしくはその触媒部分に相補的であるヌクレオチド配列を含み、少なくとも１つの第１の酵素もしくはその触媒部分の触媒コアヌクレオチド、または触媒コアヌクレオチドに相補的である配列のヌクレオチドが第１のＢＬにハイブリダイズしており、第１の触媒核酸酵素がアプタザイムではない、第１の分子複合体、および（ｉｉ）第１の触媒核酸による触媒的改変が可能である核酸基質を含む組成物。
【００１９】
態様２：少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの第１の酵素の触媒コアヌクレオチドもしくはその触媒部分、または触媒コアヌクレオチドに相補的である配列のヌクレオチドが、第１のブロッカーオリゴヌクレオチドまたはその部分にハイブリダイズしている、態様１に記載の組成物。
【００２０】
態様３：ただ１つの第１の酵素の触媒コアヌクレオチドもしくはその触媒部分、または触媒コアヌクレオチドに相補的である配列のヌクレオチドが、第１のブロッカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていない、態様１または態様２に記載の組成物。
【００２１】
態様４：少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの第１の酵素の触媒コアヌクレオチドもしくはその触媒部分、または触媒コアヌクレオチドに相補的である配列のヌクレオチドが、第１のブロッカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていない、態様１から３のいずれか１つに記載の組成物。
【００２２】
態様５：ブロッカーオリゴヌクレオチドが、それぞれが相補的塩基対合により該第１の酵素またはその該触媒部分の別個のハイブリダイジングアームにハイブリダイズしている第１と第２のセグメント、および第１と第２のセグメントの間の中間セグメントであって、第２の触媒核酸酵素に対する基質を含み、基質の少なくとも１つのセグメントが第１の酵素、またはその触媒部分にハイブリダイズしていない中間セグメントを含む、態様１から４のいずれか１つに記載の組成物。
【００２３】
態様６：中間セグメントが、第１の触媒核酸酵素もしくはその触媒部分の触媒コア、または触媒コアに相補的である相補的ヌクレオチド配列のヌクレオチドに部分的にまたは完全に及ぶ、態様１から５のいずれか１つに記載の組成物。
【００２４】
態様７：その触媒部分がパートザイムである、態様１から６のいずれか１つに記載の組成物。
【００２５】
態様８：第１のブロッカーオリゴヌクレオチドの５’末端が第１の触媒核酸酵素もしくはその触媒部分、または相補的ヌクレオチド配列の３’末端と対向する、態様１から７のいずれか１つに記載の組成物。
【００２６】
態様９：第１のブロッカーオリゴヌクレオチドの５’末端が第１の触媒核酸酵素もしくはその触媒部分、または相補的ヌクレオチド配列の５’末端と対向する、態様１から７のいずれか１つに記載の組成物。
【００２７】
態様１０：中間セグメントが第１の基質および適宜第２の基質を含み、それぞれの該基質の少なくとも１つのセグメントが第１の酵素もしくはその触媒部分、または相補的ヌクレオチド配列にハイブリダイズしていない、態様５から９のいずれか１つに記載の組成物。
【００２８】
態様１１：第１と第２の基質が異なるヌクレオチド配列を含む、態様１０に記載の組成物。
【００２９】
態様１２：中間セグメントが第１および第２の基質とは異なるヌクレオチド配列を含む第３の基質をさらに含み、第３の基質の少なくとも１つのセグメントが第１の酵素もしくはその触媒部分、または相補的ヌクレオチド配列とハイブリダイズしていない、態様１０または態様１１に記載の組成物。
【００３０】
態様１３：それぞれの該基質の少なくとも一部分が同じヌクレオチド配列を含む、態様１０から１２のいずれか１つに記載の組成物。
【００３１】
態様１４：中間セグメントの何れの該基質も制限酵素に対する部分的認識部位を含む、態様１０から１３のいずれか１つに記載の組成物。
【００３２】
態様１５：該第１のＢＬ、該第１の酵素もしくはその触媒部分、触媒コアヌクレオチドに相補的である配列の該ヌクレオチド、または該核酸基質のうちのいずれも不溶性支持体に連結されている、態様１０から１４のいずれか１つに記載の組成物。
【００３３】
態様１６：基質がストレプトアビジン−ビオチン相互作用によって連結されている、態様１５に記載の組成物。
【００３４】
態様１７：相補的塩基対合により第２のＢＬにハイブリダイズしている、該第２の触媒核酸酵素を含む第２の分子複合体をさらに含み、第２のＢＬが、それぞれが相補的塩基対合により該第２の酵素の別個のハイブリダイジングアームにハイブリダイズしている第１と第２のセグメント、および第１と第２のセグメントの間の中間セグメントを含み、中間セグメントが該第１の基質のコピーおよび第３の基質を含んでもよく、それぞれ該基質の少なくとも１つのセグメントが第２の酵素にハイブリダイズしておらず、該第１の酵素が第３の基質にハイブリダイズして、それを切断することができ、該第２の酵素が該第２の基質にハイブリダイズして、それを切断することができる、態様１０に記載の組成物。
【００３５】
態様１８：第１および第２の触媒核酸酵素が異なる基質特異性を有する、態様５から９のいずれか１つに記載の組成物。
【００３６】
態様１９：第１および第２の触媒核酸酵素が同じ基質特異性を有する、態様５から９のいずれか１つに記載の組成物。
【００３７】
態様２０：どの該分子複合体の中間セグメントにおいてもヌクレオチドの数が触媒コアヌクレオチドの数を上回っている、態様５から１９のいずれか１つに記載の組成物。
【００３８】
態様２１：どの該複合体の中間セグメントにおいてもヌクレオチドの数が触媒コアヌクレオチドの数に等しい、態様５から１９のいずれか１つに記載の組成物。
【００３９】
態様２２：第１のブロッカーオリゴヌクレオチドの１つの末端を、第１の触媒核酸酵素もしくはその触媒部分、または相補的ヌクレオチド配列の１つの末端に連結させるヘアピンループをさらに含む、態様５から２１のいずれか１つに記載の組成物。
【００４０】
態様２３：第１と第２のブロッカーオリゴヌクレオチドおよび第１と第２の触媒核酸酵素を含み、第１と第２の酵素がそれぞれ２つの別々のハイブリダイジングアームを含み、第１のブロッカーオリゴヌクレオチドが、それぞれ第１と第２の酵素の単一のハイブリダイジングアームにハイブリダイズしている第１と第２のセグメントを含み、第２のブロッカーオリゴヌクレオチドが、それぞれ第１と第２の酵素の単一のハイブリダイジングアームにハイブリダイズしている第１と第２のセグメントを含み、第１と第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの第１と第２のセグメントがそれぞれ異なるハイブリダイジングアームにハイブリダイズしており、第１と第２のブロッカーオリゴヌクレオチドがそれぞれ第１と第２のセグメントの間の中間セグメントを含み、ここで、それぞれの中間セグメントが第１の酵素にも第２の酵素にもハイブリダイズしておらず、中間セグメントのどちらかまたは両方が触媒核酸酵素に対する基質を含む、態様１から４のいずれか１つに記載の組成物。
【００４１】
態様２４：第１の酵素もしくはその触媒部分、または相補的ヌクレオチド配列のそれぞれのヌクレオチドが第１のＢＬにハイブリダイズしている、態様１から４のいずれか１つに記載の組成物。
【００４２】
態様２５：ハイブリダイズしているブロッカーオリゴヌクレオチドが、第１の分子複合体から伸長している一本鎖３’または５’オーバーハングセグメントをもたらす、態様１から４のいずれか１つに記載の組成物。
【００４３】
態様２６：オーバーハングセグメントまたはその一部分が、オーバーハング部分にハイブリダイズし、第１の触媒核酸酵素またはその触媒部分をＢＬから解離させることができるリリーサーオリゴヌクレオチド（ＲＬ）に相補的である、態様２５に記載の組成物。
【００４４】
態様２７：リリーサーオリゴヌクレオチドが、第１の触媒核酸酵素またはその触媒部分と同じヌクレオチド配列を含まない、態様２６に記載の組成物。
【００４５】
態様２８：該第１の酵素が複合体から伸長している一本鎖３’オーバーハングセグメントをもたらす、態様２５から２７のいずれか１つに記載の組成物。
【００４６】
態様２９：ブロッカーオリゴヌクレオチドの１つの末端を該第１の酵素の１つの末端に連結するヘアピンループをさらに含む、態様１から４のいずれか１つに記載の組成物。
【００４７】
態様３０：第２の分子複合体を形成する第２の触媒核酸酵素にハイブリダイズしている第２のＢＬをさらに含み、第１のヘアピンループが第１のＢＬを第１の触媒核酸酵素に連結し、第２のヘアピンループが第２のＢＬを第２の触媒核酸酵素に連結し、第１と第２のブロッカーオリゴヌクレオチドがそれぞれ第１と第２の分子複合体から伸長している一本鎖オーバーハングセグメントをもたらし、第１の分子複合体のオーバーハングセグメントの一部分が相補的塩基対合により第２の分子複合体のオーバーハングセグメントの一部分にハイブリダイズしており、それぞれのオーバーハングセグメントのハイブリダイズしていない部分が結合してリリーサーオリゴヌクレオチド（ＲＬ）の中間セグメントに塩基対相補性を含むセグメントを形成する、態様１から４のいずれか１つに記載の組成物。
【００４８】
態様３１：ブロッカーオリゴヌクレオチドが、それぞれが相補的塩基対合により該第１の酵素にハイブリダイズしている第１と第２のセグメント、および制限エンドヌクレアーゼ認識部位の一本鎖成分を含む第１と第２のセグメントの間の中間セグメントを含む、態様２５から２９のいずれか１つに記載の組成物。
【００４９】
態様３２：制限エンドヌクレアーゼ認識部位の一本鎖成分を含有する該ブロッカーオリゴヌクレオチドのヌクレオチドが第１の酵素にハイブリダイズしていない、態様３１に記載の組成物。
【００５０】
態様３３：制限エンドヌクレアーゼ認識部位がニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位である、態様３１または態様３２に記載の組成物。
【００５１】
態様３４：ヘアピンループが、１つの鎖が鎖置換型ポリメラーゼにより伸長可能であるプライマーの結合部位をもたらすステムを含み、ならびに／またはブロッカーオリゴヌクレオチドおよび／もしくは第１の酵素がそれぞれ３’リン酸化されている、態様２９に記載の組成物。
【００５２】
態様３５：鎖置換型ポリメラーゼが、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、Ｂｓｔ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ２．０、Ｖｅｎｔ、Ｐｈｉ２９、Ｐｙｒｏｐｈａｇｅ３１３７またはその任意の変異体からなる群より選択される、態様３４に記載の組成物。
【００５３】
態様３６：第１の触媒核酸酵素またはその部分がＤＮＡザイム、リボザイム、またはＭＮＡザイムの成分である、態様１から３５のいずれか１つに記載の組成物。
【００５４】
態様３７：第２の触媒核酸酵素がＤＮＡザイム、リボザイム、またはＭＮＡザイムである、態様５から２２のいずれか１つに記載の組成物。
【００５５】
態様３８：ＤＮＡザイム、リボザイム、またはＭＮＡザイムが基質を切断することができる、態様３６に記載の組成物。
【００５６】
態様３９：ＤＮＡザイム、リボザイム、またはＭＮＡザイムが基質を切断することができる、態様３７に記載の組成物。
【００５７】
態様４０：第１の触媒核酸酵素がＤＮＡザイムである、態様３６から３９のいずれか１つに記載の組成物。
【００５８】
態様４１：態様１から４０のいずれか１つに記載の組成物を含むキット。
【００５９】
態様４２：態様５から２３のいずれか１つに記載の組成物、ならびに以下の成分：第１および／または第２の触媒核酸酵素により触媒的に改変されると検出可能なシグナルをもたらすことができるレポーター基質；中間セグメントの基質に特異的な、イニシエーター触媒核酸酵素、またはその触媒成分のうちのどちらかまたは両方を含むキット。
【００６０】
態様４３：イニシエーター触媒酵素がＤＮＡザイム、リボザイム、アプタザイム、アプタＭＮＡザイム、またはＭＮＡザイムである、態様４２に記載のキット。
【００６１】
態様４４：どの該ＢＬも制限酵素の部分的認識部位を含み、キットが該制限酵素をさらに含む、態様４２または態様４３に記載のキット。
【００６２】
態様４５：態様２５から３０のいずれか１つに記載される組成物、および以下の成分：ブロッカーオリゴヌクレオチドに相補的な配列を含み、第１の触媒核酸酵素に相補的な領域にブロッカーオリゴヌクレオチドに対する結合親和性を有するリリーサーオリゴヌクレオチド；第１の触媒核酸酵素により触媒的に改変されると検出可能なシグナルをもたらすことができるレポーター基質；エキソヌクレアーゼ；ブロッカーオリゴヌクレオチドのセグメントに相補的な配列を含み、ブロッカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたとき、エキソヌクレアーゼ活性を動員することができるヌクレアーゼ認識フラグメントのうちのいずれか１つまたは複数を含むキット。
【００６３】
態様４６：エキソヌクレアーゼが、Exonuclease IIIおよびＴ７エキソヌクレアーゼからなる群より選択される、態様４５に記載のキット。
【００６４】
態様４７：第２の触媒核酸酵素がリボザイム、ＤＮＡザイム、またはＭＮＡザイムである、態様４５または態様４６に記載のキット。
【００６５】
態様４８：態様３１から３３のいずれか１つの組成物、および以下の成分：ブロッカーオリゴヌクレオチドに相補的な配列を含み、第１の触媒核酸酵素に相補的な領域にブロッカーオリゴヌクレオチドに対する結合親和性を有するリリーサーオリゴヌクレオチド；第１の触媒核酸酵素により触媒的に改変されると検出可能なシグナルをもたらすことができるレポーター基質；リリーサーオリゴヌクレオチドとブロッカーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると形成される認識配列に特異的な制限エンドヌクレアーゼのうちのいずれか１つまたは複数を含むキット。
【００６６】
態様４９：リリーサーオリゴヌクレオチドによりもたらされる認識配列の成分が、制限エンドヌクレアーゼによるリリーサーオリゴヌクレオチドの切断を阻止するホスホロチオエート連結を含む、態様４８に記載のキット。
【００６７】
態様５０：認識配列がニッキングエンドヌクレアーゼに対するものであり、制限エンドヌクレアーゼがニッキングエンドヌクレアーゼである、態様４８に記載のキット。
【００６８】
態様５１：態様３４または態様３５に記載の組成物、および以下の成分：該結合部位に特異的なプライマー；鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分；第１の触媒核酸酵素により触媒的に改変されると検出可能なシグナルをもたらすことができるレポーター基質；のうちのいずれか１つまたは複数を含むキット。
【００６９】
態様５２：相補的塩基対合によりブロッカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしている第１の触媒核酸酵素およびブロッカーオリゴヌクレオチドの１つの末端を触媒核酸第１酵素の１つの末端に連結するヘアピンループ；第１の触媒核酸酵素により触媒的に改変されると検出可能なシグナルをもたらすことができるレポーター基質；標的分子に特異的なイニシエーター触媒核酸酵素；ヘアピンループのセグメントに特異的なプライマーオリゴヌクレオチド；鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分；プライマーがヘアピンループの該セグメントにハイブリダイズし、適宜ブロッカーオリゴヌクレオチドを鋳型（テンプレート）として使用して該鎖置換型ポリメラーゼにより続いてプライマーが伸長すると形成される認識配列に特異的な制限エンドヌクレアーゼを含むキット。
【００７０】
態様５３：ヘアピンループのセグメントによりもたらされる認識配列の成分が、制限エンドヌクレアーゼによるセグメントの切断を阻止するホスホロチオエート連結を含む、態様５２に記載のキット。
【００７１】
態様５４：認識配列がニッキングエンドヌクレアーゼに対するものであり、制限エンドヌクレアーゼがニッキングエンドヌクレアーゼである、態様５２に記載のキット。
【００７２】
態様５５：第１の酵素のそれぞれのヌクレオチドがＢＬにハイブリダイズしている、態様５２から５４のいずれか１つに記載のキット。
【００７３】
態様５６：鎖置換型ポリメラーゼが、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、Ｂｓｔ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ２．０、Ｖｅｎｔ、Ｐｈｉ２９、Ｐｙｒｏｐｈａｇｅ３１３７またはその任意の変異体からなる群より選択される、態様５２から５５のいずれか１つに記載のキット。
【００７４】
態様５７：第１の触媒核酸酵素がＤＮＡザイム、リボザイム、またはＭＮＡザイムである、態様４１から５６のいずれか１つに記載のキット。
【００７５】
態様５８：試料中の第１の標的分子の存在または不存在を検出するための方法であって、
（ａ）試料を、相補的塩基対合により第１の酵素にハイブリダイズしている第１と第２のセグメント、および触媒核酸酵素の第１の基質を含む第１と第２のセグメントの間の中間セグメントであって、第１の基質の少なくとも１つのセグメントが第１の酵素にハイブリダイズしていない中間セグメントを含むＢＬおよび第１の触媒核酸酵素を含む少なくとも１つの分子複合体、第１のイニシエーター酵素、ならびにレポーター基質に試料を接触させることであって、第１のイニシエーター酵素が第１の標的および該中間セグメントの第１の基質に対する結合特異性を有し、標的が第１のイニシエーター酵素にハイブリダイズすると第１のイニシエーター酵素の触媒活性を誘導し、それによって、第１のイニシエーター酵素にハイブリダイズしているときに第１の基質の切断を促進し、第１の基質の切断によりブロッカーオリゴヌクレオチドと該分子複合体の第１の触媒核酸酵素のハイブリダイズしていた鎖が解離し、該分子複合体の第１の酵素がレポーター基質に対する結合特異性を有し、該解離後、レポーター基質にハイブリダイズしてこれを切断し、それによって試料中の第１の標的の存在を示す検出可能なシグナルをもたらすことができることと、（ｂ）検出可能なシグナルが該接触により生じるかどうかを判定することであって、シグナルの検出は第１の標的分子が存在することを示し、シグナルを検出できないことは第１の標的分子が不存在であることを示すこととを含む方法。
【００７６】
態様５９：試料に接触している該分子複合体に、触媒核酸酵素の５’末端と対向するブロッカーオリゴヌクレオチドの５’末端がもたらされている、態様５８に記載の方法。
【００７７】
態様６０：試料に接触している該分子複合体に、触媒核酸酵素の３’末端と対向するブロッカーオリゴヌクレオチドの５’末端がもたらされている、態様５８に記載の方法。
【００７８】
態様６１：第１と第２の分子複合体に試料を接触させることを含み、第１の分子複合体が該ＢＬおよび該第１の触媒核酸酵素を含み、該第１と第２のセグメントの間の中間セグメントが第１の基質と第２の基質を含み、第２の分子複合体が、相補的塩基対合により第２の酵素にハイブリダイズしている第１と第２のセグメント、および該第１の基質のコピーと第３の基質を含む第１と第２のセグメントの間の中間セグメントを含む第２のＢＬおよび第２の触媒核酸酵素を含み、該イニシエーター酵素が標的およびそれぞれの該中間セグメントの第１の基質に対する結合特異性を有し、標的がイニシエーター酵素にハイブリダイズするとイニシエーター酵素の触媒活性を誘導し、それによって、イニシエーター酵素にハイブリダイズしているときにそれぞれの該中間セグメントの第１の基質の切断を促進し、それぞれの該中間セグメントの第１の基質の切断によりブロッカーオリゴヌクレオチドとそれぞれの該分子複合体の触媒核酸酵素のハイブリダイズしていた鎖が解離し、第１の酵素が該第３の基質に対する結合特異性を有し、第２の酵素が該第２の基質に対する結合特異性を有し、それぞれの該分子複合体の解離後、第１の酵素が別の第２の分子複合体の第３の基質にハイブリダイズして、それを切断することができ、第２の酵素が別の第１の分子複合体の第２の基質にハイブリダイズして、それを切断することができ、それによって該検出可能なシグナルを増幅する、態様５８または態様５９に記載の方法。
【００７９】
態様６２：該第１、第２または第３の基質が該レポーター基質と同一である、態様６１に記載の方法。
【００８０】
態様６３：該分子複合体の中間セグメントの基質がレポーター基質と同一であり、ブロッカーオリゴヌクレオチドからの該解離により、第１の該分子複合体の第１の触媒核酸酵素が第２の該分子複合体の中間セグメントの基質にハイブリダイズして、それを切断することができ、それによって検出可能なシグナルの増幅を促進する、態様６１に記載の方法。
【００８１】
態様６４：第１と第２のセグメントの間の中間セグメントが第１の基質の該少なくとも１つのセグメントを含むヘアピンループ構造を形成する、態様６０に記載の方法。
【００８２】
態様６５：中間セグメントが第２のイニシエーター触媒核酸酵素に対する第２の基質を含み、方法が、試料を第２のイニシエーター触媒核酸酵素に接触させることをさらに含み、第２のイニシエーター酵素が標的および該中間セグメントの第２の基質に対する結合特異性を有し、標的が第２のイニシエーター酵素にハイブリダイズすると第２のイニシエーター酵素の触媒活性を誘導し、それによって、第２のイニシエーター酵素にハイブリダイズしているときに第２の基質の切断を促進し、第２の基質の切断によりブロッカーオリゴヌクレオチドと該分子複合体の第１の触媒核酸酵素のハイブリダイズした鎖が解離し、それによって第１の触媒核酸酵素をレポーター基質にハイブリダイズさせてこれを切断し、それによって検出可能なシグナルをもたらす、態様５９に記載の方法。
【００８３】
態様６６：第２のイニシエーター酵素が該第１の標的とは別個である第２の標的に対する結合特異性を有する、態様６５に記載の方法。
【００８４】
態様６７：第２のイニシエーター酵素が該第１の標的に対する結合特異性を有する、態様６６に記載の方法。
【００８５】
態様６８：中間セグメントが第３のイニシエーター触媒核酸酵素に対する第３の基質を含み、方法が、試料を第３のイニシエーター触媒核酸酵素に接触させることをさらに含み、第３のイニシエーター酵素が標的および該中間セグメントの第３の基質に対する結合特異性を有し、標的が第３のイニシエーター酵素にハイブリダイズすると第３のイニシエーター酵素の触媒活性を誘導し、それによって、第３のイニシエーター酵素にハイブリダイズしているときに第３の基質の切断を促進し、第３の基質の切断によりブロッカーオリゴヌクレオチドと該分子複合体の第１の触媒核酸酵素のハイブリダイズした鎖が解離し、それによって第１の触媒核酸酵素をレポーター基質にハイブリダイズさせてこれを切断し、それによって検出可能なシグナルをもたらす、態様６５から６７のいずれか１つに記載の方法。
【００８６】
態様６９：第３のイニシエーター酵素が、第１と第２の標的とは別個である第３の標的に対する結合特異性を有する、態様６８に記載の方法。
【００８７】
態様７０：第３のイニシエーター酵素が第１の標的に対する結合特異性を有する、態様６８に記載の方法。
【００８８】
態様７１：中間セグメントの第１と第２の基質が第１の基質の５’末端と第２の基質の３’末端またはその逆を含むヌクレオチドの共通のセグメントを共有する、態様６５から７０のいずれか１つに記載の方法。
【００８９】
態様７２：ヌクレオチドの共通セグメントが第１の基質の３’部分で始まり第２の基質の５’部分で終わる、態様７１に記載の方法。
【００９０】
態様７３：レポーター基質が第２の基質と同一であり、該分子複合体の該第１の触媒核酸酵素が第２の基質にハイブリダイズして、それを切断することができる、態様５９のいずれか１つに記載の方法。
【００９１】
態様７４：レポーター基質が中間セグメントの何れの該基質とも異なり、該第１の触媒核酸酵素が中間セグメントの何れの該基質ともハイブリダイズして、それを切断することができない、態様６５から７２のいずれか１つに記載の方法。
【００９２】
態様７５：第１の触媒核酸、第１の基質、第１のイニシエーター酵素、およびレポーター基質のうちのいずれか１つまたは複数が不溶性支持体に連結されている、態様５８から７４のいずれか１つに記載の方法。
【００９３】
態様７６：中間セグメントの基質がストレプトアビジン−ビオチン相互作用により支持体に連結されている、態様７５に記載の方法。
【００９４】
態様７７：（ａ）それぞれが相補的塩基対合により追加の酵素にハイブリダイズしている２つの末端セグメント、および追加の触媒核酸酵素に対する少なくとも１つの追加の基質を含む２つの末端セグメント間の中間セグメントであって、追加の基質の少なくとも一部分が追加の酵素にハイブリダイズしていない中間セグメントを含む追加のＢＬおよび追加の触媒核酸酵素を含む追加の分子複合体、追加のイニシエーター触媒核酸酵素、ならびに追加のレポーター基質に試料をさらに接触させることであって、追加の標的が第１の標的とは別個であり、中間セグメントの少なくとも１つの追加の基質が該第１の基質とは別個であり、追加のレポーター基質が該第１のレポーター基質とは別個であり、追加のイニシエーター触媒核酸酵素が第１のイニシエーター触媒核酸酵素とは別個であり、追加のイニシエーター酵素が追加の標的および該中間セグメントの追加の基質に対する結合特異性を有し、追加の標的が追加のイニシエーター酵素にハイブリダイズすると追加のイニシエーター酵素の触媒活性を誘導し、それによって、追加のイニシエーター酵素にハイブリダイズしているときに追加の基質の切断を促進し、追加の基質の切断により、追加のブロッカーオリゴヌクレオチドと該追加の分子複合体の追加の触媒核酸酵素のハイブリダイズした鎖が解離し、該追加の分子複合体の追加の酵素が追加のレポーター基質に対する結合特異性を有し、該解離後、追加のレポーター基質にハイブリダイズしてこれを切断し、それによって試料中の追加の標的の存在を示す追加の検出可能なシグナルをもたらすことができることと、（ｂ）追加の検出可能なシグナルが該追加の接触により生じるかどうかを判定することであって、シグナルの検出は追加の標的分子が存在することを示し、追加のシグナルを検出できないことは追加の標的分子が不存在であることを示すこととにより追加の標的を検出することを含む、態様５９から７６のいずれか１つに記載の方法。
【００９５】
態様７８：追加のレポーター基質が少なくとも１つの追加の基質と同一であり、該追加の分子複合体の該追加の触媒核酸酵素が少なくとも１つの追加の基質にハイブリダイズして、それを切断することができる、態様７７に記載の方法。
【００９６】
態様７９：追加のレポーター基質が少なくとも１つの追加の基質とは別個であり、該追加の分子複合体の該追加の触媒核酸酵素が少なくとも１つの追加の基質にハイブリダイズして、それを切断することができない、態様７７に記載の方法。
【００９７】
態様８０：どの該分子複合体の何れの該基質も部分的制限酵素認識部位を含み、どの該標的も該部分的制限酵素認識部位の相補的部分を含み、該方法が、試料を、制限酵素認識部位を認識して切断することができる制限酵素に接触させることをさらに含み、
該標的が相補的塩基対合により部分的認識部位を含む該ＢＬにハイブリダイズすることができ、それによって制限酵素認識部位を完成させ、それによって該制限酵素に部分的認識部位を含むＢＬを切断させて、ブロッカーオリゴヌクレオチドと該分子複合体の触媒核酸酵素のハイブリダイズした鎖を解離し、該分子複合体の触媒核酸酵素がレポーター基質に対する結合特異性を有し、該解離後、レポーター基質にハイブリダイズしてこれを切断し、それによって試料中の該標的の存在を示す検出可能なシグナルをもたらすことができる、態様５９に記載の方法。
【００９８】
態様８１：レポーター基質が、該分子複合体の該触媒核酸酵素により切断される基質と同一である、態様８０に記載の方法。
【００９９】
態様８２：レポーター基質が、部分的認識部位を含む基質および該分子複合体の該触媒核酸酵素とは別個である、態様８０に記載の方法。
【０１００】
態様８３：どの該イニシエーター酵素もアプタマーを含み、標的の不存在下ではアプタマーはイニシエーター酵素の触媒活性を妨げる立体構造を採り、標的の存在下ではアプタマーは標的に結合して、イニシエーター酵素の触媒活性を可能にし、それによって分子複合体の基質を切断する立体構造を採る、態様５８から７９のいずれか１つに記載の方法。
【０１０１】
態様８４：試料中の標的分子の存在または不存在を検出するための方法であって、（ａ）試料をレポーター基質、ならびに相補的塩基対合により第１の酵素にハイブリダイズしている第１と第２のセグメントおよびアプタマーを含む第１と第２のセグメントの間の中間セグメントであって、アプタマーの少なくとも１つのセグメントが第１の酵素にハイブリダイズしていない中間セグメントを含むＢＬおよび第１の触媒核酸酵素を含む少なくとも１つの分子複合体に接触させることであって、試料に接触している該分子複合体に、触媒核酸酵素の５’末端と対向するブロッカーオリゴヌクレオチドの５’末端および該アプタマーを含む第１と第２のセグメントの間の中間セグメントがもたらされ、標的がアプタマーに対する結合親和性を有し、標的がアプタマーにハイブリダイズすると第１の酵素の触媒活性を誘導し、それによって第１の基質の切断を促進し、標的がＢＬのアプタマー部分に結合するとブロッカーオリゴヌクレオチドと該分子複合体の第１の触媒核酸酵素のハイブリダイズした鎖が解離し、該分子複合体の第１の酵素がレポーター基質に対する結合特異性を有し、該解離後、レポーター基質にハイブリダイズしてこれを切断し、それによって試料中の第１の標的の存在を示す検出可能なシグナルをもたらすことができることと、（ｂ）検出可能なシグナルが該接触により生じるかどうかを判定することであって、シグナルの検出は第１の標的分子が存在することを示し、シグナルを検出できないことは第１の標的分子が不存在であることを示すこととを含む方法。
【０１０２】
態様８５：（ａ）試料を、第１と第２の分子複合体であって、該第１の複合体が第１のＢＬおよび第１の触媒核酸酵素を含み、該第２の複合体が第２のＢＬおよび第２の触媒核酸酵素を含み、第１と第２のＢＬがそれぞれ相補的塩基対合により酵素にハイブリダイズしている第１と第２のセグメントおよび触媒核酸酵素に対する基質を含む第１と第２のセグメントの間の中間セグメントであって、基質の少なくとも１つのセグメントが第１または第２の酵素にハイブリダイズしていない中間セグメントを含む第１と第２の分子複合体、、ならびにイニシエーター酵素に接触させることであって、イニシエーター酵素が標的および該第１の分子複合体の基質に対する結合特異性を有し、標的がイニシエーター酵素にハイブリダイズするとイニシエーター酵素の触媒活性を誘導し、それによって、イニシエーター酵素にハイブリダイズしているときに基質の切断を促進し、第１の分子複合体の基質の切断によりブロッカーオリゴヌクレオチドと該第１の分子複合体の触媒核酸酵素のハイブリダイズした鎖が解離し、該第１の分子複合体の触媒核酸酵素が、該解離後、第２の分子複合体の基質にハイブリダイズして切断し、ブロッカーオリゴヌクレオチドと該第２の分子複合体の触媒核酸酵素のハイブリダイズした鎖を解離させることができ、該第２の分子複合体の触媒核酸酵素が、該解離後、追加の該第１の分子複合体の基質にハイブリダイズして切断し、ブロッカーオリゴヌクレオチドと追加の該第１の分子複合体の触媒核酸酵素を解離させることができ、第１と第２の分子複合体のどちらかまたは両方の基質が、切断されると検出可能なシグナルをもたらすことができるレポーター基質であることと、（ｂ）検出可能なシグナルが該接触により生じるかどうかを判定することであって、シグナルの検出は標的分子が存在することを示し、シグナルを検出できないことは標的分子が不存在であることを示すこととを含む、試料中の標的分子の存在または不存在を検出するための態様５８に記載の方法。
【０１０３】
態様８６：第１と第２の分子複合体のどちらかまたは両方が、ブロッカーオリゴヌクレオチドの１つの末端を触媒核酸酵素の１つの末端に連結するヘアピンループを含む、態様６３または態様８５に記載の方法。
【０１０４】
態様８７：試料中の複数の標的分子の存在または不存在を検出するための方法であって、（ａ）第１と第２のブロッカーオリゴヌクレオチドおよび第１と第２の触媒核酸酵素を含む分子複合体であって、第１と第２の酵素がそれぞれ２つの別々のハイブリダイジングアームを含み、第１のブロッカーオリゴヌクレオチドがそれぞれ第１と第２の酵素の単一ハイブリダイジングアームにハイブリダイズしている第１と第２のセグメントを含み、第２のブロッカーオリゴヌクレオチドがそれぞれ第１と第２の酵素の単一ハイブリダイジングアームにハイブリダイズしている第１と第２のセグメントを含み、第１と第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの第１と第２のセグメントのそれぞれが異なるハイブリダイジングアームにハイブリダイズしており、第１と第２のブロッカーオリゴヌクレオチドのそれぞれが第１と第２のセグメントの間の中間セグメントを含み、ここで、それぞれの中間セグメントが第１または第２の酵素のどちらにもハイブリダイズしておらず、中間セグメントのどちらかまたは両方が触媒核酸酵素に対する基質を含む分子複合体、ならびに複数のイニシエーター触媒核酸酵素、ならびに複数のレポーター基質に試料を接触させることであって、第１イニシエーター触媒核酸酵素が第１の標的分子に対する結合特異性を有し、第２イニシエーター触媒核酸酵素が第２の標的分子に対する結合特異性を有し、第１と第２のイニシエーター酵素が該分子複合体の第１と第２のブロッカーオリゴヌクレオチドのどちらかまたは両方の中間セグメントの基質に対する結合特異性を有し、それぞれの該標的がそれぞれの該イニシエーター酵素にハイブリダイズするとそれぞれの該イニシエーター酵素の触媒活性を誘導し、それによって、イニシエーター酵素にハイブリダイズしているときにそれぞれの該ブロッカーオリゴヌクレオチドの基質の切断を促進し、それぞれの該基質の切断により第１と第２のブロッカーオリゴヌクレオチドのハイブリダイズした鎖が該分子複合体の第１と第２の触媒核酸酵素のハイブリダイジングアームから解離し、それぞれの該触媒核酸酵素が少なくとも１つのレポーター基質に対する結合特異性を有し、該解離後、該レポーター基質の少なくとも１つにハイブリダイズしてこれを切断し、それによって試料中の標的分子の存在を示す検出可能なシグナルをもたらすことができることと、（ｂ）検出可能なシグナルが該接触により生じるかどうかを判定することであって、シグナルの検出は標的分子が存在することを示し、シグナルを検出できないことは標的分子が不存在であることを示すこととを含む方法。
【０１０５】
態様８８：分子複合体の該第１と第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの中間セグメントが同一の基質を含む、態様８７に記載の方法。
【０１０６】
態様８９：分子複合体の該第１と第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの中間セグメントが同一ではない基質を含む、態様８８に記載の方法。
【０１０７】
態様９０：複数の標的分子が異なるイニシエーター酵素によりハイブリダイズされている同一ではない標的分子を含む、態様８７から８９のいずれか１つに記載の方法。
【０１０８】
態様９１：複数のレポーター基質が同一ではないレポーター基質を含む、態様８７から９０のいずれか１つに記載の方法。
【０１０９】
態様９２：該分子複合体の第１と第２の触媒核酸酵素が異なる基質特異性を有し、それぞれの該酵素が異なるレポーター基質にハイブリダイズして切断する、態様８７から９１のいずれか１つに記載の方法。
【０１１０】
態様９３：どの該分子複合体も相補的塩基対合により触媒核酸にハイブリダイズしているブロッカーオリゴヌクレオチド（ＢＬ）を含み、酵素の少なくとも１つであるが全てではない触媒コアヌクレオチドがＢＬにハイブリダイズしている、態様５８から９３のいずれか１つに記載の方法。
【０１１１】
態様９４：該接触が試料を態様１から１０および１７から２１のいずれか１つに記載の組成物に接触させることを含む、態様５８から６３、８５および８６のいずれか１つに記載の方法。
【０１１２】
態様９５：該接触が試料を態様２３に記載の組成物に接触させることを含む、態様８７から９２のいずれか１つに記載の方法。
【０１１３】
態様９６：試料中の標的分子の存在または不存在を検出するための方法であって、（ａ）試料を、相補的塩基対合により第１の酵素にハイブリダイズしている第１と第２のセグメントおよび第１の酵素にハイブリダイズしていない第１と第２のセグメントの間の中間セグメントであって、ブロッカーオリゴヌクレオチドが分子複合体から伸長している一本鎖３’または５’オーバーハングセグメントをもたらす中間セグメントを含むブロッカーオリゴヌクレオチドおよび第１の触媒核酸酵素を含む少なくとも１つの分子複合体、ならびにイニシエーター触媒核酸酵素、前駆体基質、およびレポーター基質に接触させることであって、イニシエーター酵素が標的に対する結合特異性を有し、標的がイニシエーター酵素にハイブリダイズするとイニシエーター酵素の触媒活性を誘導し、イニシエーター酵素にハイブリダイズしている場合、前駆体基質の触媒的改変を促進し、それによってリリーサーオリゴヌクレオチドをもたらし、リリーサーオリゴヌクレオチドが、該分子複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドによりもたらされるオーバーハングセグメントの少なくとも一部分、および相補的塩基対合により該分子複合体の第１の触媒核酸酵素にハイブリダイズしているブロッカーオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に塩基対相補性を有する配列を含み、リリーサーオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が触媒核酸酵素のヌクレオチド配列と同じではなく、リリーサーオリゴヌクレオチドが、存在する場合、ブロッカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして二重鎖を形成し、それによって第１の触媒核酸酵素と該分子複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした鎖を解離することができ、該分子複合体の第１の触媒核酸酵素が、該解離後、レポーター基質にハイブリダイズして切断し、それによって検出可能なシグナルをもたらすことができることと、（ｂ）検出可能なシグナルが該接触により生じるかどうかを判定することであって、シグナルの検出は標的分子が存在することを示し、シグナルを検出できないことは標的分子が不存在であることを示すこととを含む方法。
【０１１４】
態様９７：該分子複合体が、ブロッカーオリゴヌクレオチドの１つの末端を第１の触媒核酸酵素の１つの末端に連結するヘアピンループを含む、態様９６に記載の方法。
【０１１５】
態様９８：該接触が複数の該分子複合体を試料に接触させることを含み、第１の該分子複合体のオーバーハングセグメントの一部分が相補的塩基対合により第２の該分子複合体のオーバーハングセグメントの一部分にハイブリダイズしており、リリーサーオリゴヌクレオチドが該第１の複合体の該オーバーハングセグメントの一部分および該第１の分子複合体の第１の触媒核酸酵素にハイブリダイズしているブロッカーオリゴヌクレオチドの一部分に対する塩基対相補性を有する第１のセグメント、該第２の分子複合体のオーバーハングセグメントの一部分および該第２の分子複合体の第１の触媒核酸酵素にハイブリダイズしているブロッカーオリゴヌクレオチドの一部分に対する塩基対相補性を有する第２のセグメント、ならびにそれぞれの該ブロッカーオリゴヌクレオチドのオーバーハングセグメントの少なくとも一部分に塩基対相補性を有する第１と第３のセグメントの間の中間セグメントを含み、リリーサーオリゴヌクレオチドの第１のセグメントが相補的塩基対合により該第１の分子複合体の第１の触媒核酸酵素にハイブリダイズしている該第１の分子複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドの一部分に対する結合親和性を有し、リリーサーオリゴヌクレオチドの第２のセグメントが相補的塩基対合により該第２の分子複合体の第１の触媒核酸酵素にハイブリダイズしている該第２の分子複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドに対する結合親和性を有し、リリーサーオリゴヌクレオチドが、存在する場合、それぞれの該ブロッカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして、それぞれの該分子複合体の触媒核酸とブロッカーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした鎖を解離することができ、それぞれの該分子複合体の第１の触媒核酸酵素が、該解離後、レポーター基質にハイブリダイズして切断し、それによって検出可能なシグナルをもたらすことができ、（ｂ）検出可能なシグナルが該接触により生じるかどうかを判定し、シグナルの検出は標的分子が存在することを示し、シグナルを検出できないことは標的分子が不存在であることを示す、態様９７に記載の方法。
【０１１６】
態様９９：前駆体基質が標的であるかまたは標的を含む、態様９６から９８のいずれか１つに記載の方法。
【０１１７】
態様１００：試料を、リリーサーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているとき、ブロッカーオリゴヌクレオチドを消化することができるエキソヌクレアーゼに接触させることにより、検出可能なシグナルを増幅することをさらに含み、該消化がリリーサーオリゴヌクレオチドを遊離させ、次いでリリーサーオリゴヌクレオチドが第２の該分子複合体に結合して追加の検出可能なシグナルの発生を開始することができる、態様９６に記載の方法。
【０１１８】
態様１０１：リリーサーオリゴヌクレオチドがブロッカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることにより形成される二重鎖が、少なくとも４つのヌクレオチドの３’オーバーハングセグメントおよび対向する平滑末端を含む、態様１００に記載の方法。
【０１１９】
態様１０２：エキソヌクレアーゼがExoIIIおよびＴ７エキソヌクレアーゼから選択される、態様１００または態様１０１に記載の方法。
【０１２０】
態様１０３：試料を、リリーサーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているとき、ブロッカーオリゴヌクレオチドを切断し、それによってリリーサーオリゴヌクレオチドを該二重鎖から遊離させ、リリーサーオリゴヌクレオチドを第２の該分子複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、追加の検出可能なシグナルの発生を開始することができるニッキングエンドヌクレアーゼに接触させることにより、検出可能なシグナルを増幅することをさらに含む、態様９６に記載の方法。
【０１２１】
態様１０４：試料を、リリーサーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているとき、ブロッカーオリゴヌクレオチドを切断し、それによりリリーサーオリゴヌクレオチドを該二重鎖から遊離させ、リリーサーオリゴヌクレオチドを第２の該分子複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、追加の検出可能なシグナルの発生を開始することができる制限エンドヌクレアーゼに接触させることにより、検出可能なシグナルを増幅することをさらに含む、態様９６に記載の方法。
【０１２２】
態様１０５：制限エンドヌクレアーゼがリリーサーオリゴヌクレオチドとブロッカーオリゴヌクレオチドのセグメントにより形成される認識部位に結合した後、ブロッカーオリゴヌクレオチドを切断し、それぞれの該セグメントが部分的認識部位を含み、リリーサーオリゴヌクレオチドセグメントによりもたらされる部分的認識配列が制限エンドヌクレアーゼによるリリーサーオリゴヌクレオチドの切断を阻止するホスホロチオエート連結を含み、ブロッカーオリゴヌクレオチドの部分的認識部位が該分子複合体の第１の触媒核酸酵素にハイブリダイズしていない、態様１０４に記載の方法。
【０１２３】
態様１０６：制限エンドヌクレアーゼがニッキングエンドヌクレアーゼであり、ニッキングエンドヌクレアーゼがリリーサーオリゴヌクレオチドとブロッカーオリゴヌクレオチドのセグメントにより形成される認識部位に結合した後、ブロッカーオリゴヌクレオチドを切断し、それぞれの該セグメントが部分的認識部位を含み、ブロッカーオリゴヌクレオチドの部分的認識部位が該分子複合体の第１の触媒核酸酵素にハイブリダイズしていない、態様１０４に記載の方法。
【０１２４】
態様１０７：試料をプライマーオリゴヌクレオチドと鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に接触させることにより、検出可能なシグナルを増幅することをさらに含み、該分子複合体がブロッカーオリゴヌクレオチドの１つの末端から伸長しているヘアピンループをさらに含み、第１の触媒核酸酵素がヘアピンループ末端に隣接するブロッカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしており、ヘアピンループが１つの鎖がプライマーの結合部位をもたらすステムを含み、ブロッカーオリゴヌクレオチド、第１の触媒核酸酵素およびリリーサーオリゴヌクレオチドが、存在する場合、それぞれが３’リン酸化されており、リリーサーオリゴヌクレオチドが、存在する場合、ブロッカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして二重鎖を形成し、それによって第１の触媒核酸酵素と該分子複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした鎖を解離させ、プライマー結合部位を含む３’オーバーハングセグメントを形成することができ、プライマーが結合部位とハイブリダイズして、それによって鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に遊離の３’ヒドロキシル基をもたらしてブロッカーオリゴヌクレオチドとの塩基対相補性を有する新しいポリヌクレオチドの合成を開始することができ、該合成が二重鎖からリリーサーオリゴヌクレオチドを遊離させ、リリーサーオリゴヌクレオチドを第２の該分子複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、追加の検出可能なシグナルの発生を開始する、態様９６に記載の方法。
【０１２５】
態様１０８：ヘアピンループがブロッカーオリゴヌクレオチドに連結している、態様１０７に記載の方法。
【０１２６】
態様１０９：前駆体基質が前駆体基質を含むブロッカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているリリーサーオリゴヌクレオチドを含む前駆体複合体の成分であり、ヘアピンループがブロッカーオリゴヌクレオチドの１つの末端をリリーサーオリゴヌクレオチドの１つの末端に連結させ、リリーサーオリゴヌクレオチドが、相補的塩基対合によりそれぞれが該前駆体複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドの別々のセグメントにハイブリダイズしている第１と第２のセグメント、および前駆体基質の少なくとも一部分にハイブリダイズしていない第１と第３のセグメントの間の中間セグメントを含み、該イニシエーター触媒核酸酵素により前駆体基質が切断されると、ブロッカーオリゴヌクレオチドとリリーサーオリゴヌクレオチドのハイブリダイズした鎖を解離させる、態様９６から９８および態様１０８のいずれか１つに記載の方法。
【０１２７】
態様１１０：前駆体基質がレポーター基質であり、前駆体基質が相補的塩基対合により前駆体基質を含むブロッカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているリリーサーオリゴヌクレオチドを含む前駆体複合体の成分であり、リリーサーオリゴヌクレオチドが、相補的塩基対合によりそれぞれが前駆体複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドの別々のセグメントにハイブリダイズしている第１と第２のセグメント、および前駆体基質の少なくとも一部分にハイブリダイズしていない第１と第２のセグメントの間の中間セグメントを含み、該分子複合体の第１の触媒核酸酵素が、該解離後、前駆体基質にハイブリダイズして切断し、それによって検出可能なシグナルをもたらすことができる、態様９６に記載の方法。
【０１２８】
態様１１１：該前駆体複合体が、ブロッカーオリゴヌクレオチドの１つの末端をリリーサーオリゴヌクレオチドの１つの末端に連結させるヘアピンループを含む、態様１１０に記載の方法。
【０１２９】
態様１１２：試料中の標的分子の存在または不存在を検出するための方法であって、
（ａ）相補的塩基対合により第１の酵素にハイブリダイズしている第１と第２のセグメント、および第１の酵素にハイブリダイズしていない第１と第２のセグメントの間の中間セグメントを含むブロッカーオリゴヌクレオチドであって、該ブロッカーオリゴヌクレオチドが分子複合体から伸長している一本鎖３’または５’オーバーハングセグメントをもたらすブロッカーオリゴヌクレオチド、ならびに第１の触媒核酸酵素を含む少なくとも１つの分子複合体、ならびに
イニシエーター触媒核酸酵素、エキソヌクレアーゼ、前駆体基質、およびレポーター基質
に試料を接触させることであって、イニシエーター酵素が標的に対する結合特異性を有し、標的がイニシエーター酵素にハイブリダイズするとイニシエーター酵素の触媒活性を誘導し、イニシエーター酵素の触媒活性が、イニシエーター酵素にハイブリダイズしている場合、前駆体基質の触媒的改変を促進し、それによってヌクレアーゼ認識断片をもたらし、ヌクレアーゼ認識断片が、該分子複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドの３’または５’オーバーハングセグメントの少なくとも一部分に塩基対相補性を有する第１のセグメントおよび該分子複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドと塩基対相補性を共有していない少なくとも４ヌクレオチド長の第２のセグメントを含み、ヌクレアーゼ認識断片が、存在する場合、該分子複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして、エキソヌクレオアーゼによるブロッカーオリゴヌクレオチドの分解を開始することができる二重鎖を形成することができ、エキソヌクレオアーゼによる二重鎖の分解がブロッカーヌクレオチドを消化して、ヌクレアーゼ認識断片と該分子複合体の第１の触媒核酸を別々の実体として遊離させ、第１の触媒核酸酵素が、該分解後、レポーター基質にハイブリダイズして切断し、それによって検出可能なシグナルをもたらすことができ、ヌクレオアーゼ認識断片が第２の該分子複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドの３’または５’オーバーハングセグメントの少なくとも一部分に結合することができることと、
（ｂ）検出可能なシグナルが該接触により生じるかどうかを判定することであって、シグナルの検出は標的分子が存在することを示し、シグナルを検出できないことは標的分子が不存在であることを示すことと
を含む方法。
【０１３０】
態様１１３：前駆体基質がレポーター基質であり、前駆体基質が、前駆体基質を含むブロッカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているヌクレアーゼ認識断片を含む前駆体複合体の成分であり、ヘアピンループがブロッカーオリゴヌクレオチドの１つの末端とリリーサーオリゴヌクレオチドの１つの末端を連結し、該前駆体複合体のヌクレアーゼ認識断片が、それぞれが相補的塩基対合により前駆体複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドの別々のセグメントにハイブリダイズしている第１と第２のセグメント、および前駆体基質の少なくとも一部分にハイブリダイズしていない第１と第３のセグメントの間の中間セグメントを含み、該分子複合体の第１の触媒核酸酵素が、エキソヌクレアーゼによる二重鎖の該分解後、前駆体基質にハイブリダイズして切断し、それによって検出可能なシグナルをもたらすことができる、態様１１２に記載の方法。
【０１３１】
態様１１４：試料中の標的分子の存在または不存在を検出するための方法であって、（ａ）相補的塩基対合によりブロッカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしている第１の触媒核酸酵素、またはその成分を含む分子複合体、イニシエーター触媒核酸酵素、前駆体基質、レポーター基質、第１の制限エンドヌクレアーゼ、および鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に試料を接触させることであって、イニシエーター酵素が標的に対する結合特異性を有し、標的がイニシエーター酵素にハイブリダイズするとイニシエーター酵素の触媒活性を誘導し、イニシエーター酵素にハイブリダイズしている場合、前駆体基質の触媒的改変を促進し、それによってプライマーオリゴヌクレオチドをもたらし、ブロッカーオリゴヌクレオチドが、第１の制限エンドヌクレアーゼの第１の部分的認識部位を含む分子複合体から伸長している一本鎖オーバーハングセグメントをもたらし、オーバーハングセグメントがプライマーの結合部位を形成するヌクレオチドを含み、プライマーが結合部位とハイブリダイズして、それによって鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に遊離の３’ヒドロキシル基をもたらして、ブロッカーオリゴヌクレオチドとの塩基対相補性を有する第２の触媒核酸酵素の合成を開始することができ、第２の触媒核酸酵素の該合成により第１の触媒核酸酵素とブロッカーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしているセグメントが解離され、第１の触媒核酸酵素が、該解離後、レポーター基質にハイブリダイズして切断し、それによって検出可能なシグナルをもたらすことができ、プライマーの該ハイブリダイジングおよび／または該合成が第１の部分的認識部位を完成させ、第１の制限エンドヌクレオアーゼがプライマーと第２の触媒核酸酵素の間の接合部に一本鎖ニックを導入し、それによって鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に遊離の３’ヒドロキシル基をもたらして、ブロッカーオリゴヌクレオチドとの塩基対相補性を有する第３の触媒核酸酵素の合成を開始することができ、第３の触媒核酸酵素の該合成により第２の触媒核酸酵素とブロッカーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしているセグメントを解離させ、第２の触媒核酸酵素が、該解離後、レポーター基質にハイブリダイズして切断し、それによって検出可能なシグナルをもたらすことができることと、（ｂ）検出可能なシグナルが該接触により生じるかどうかを判定することであって、シグナルの検出は標的分子が存在することを示し、シグナルを検出できないことは標的分子が不存在であることを示すこととを含む方法。
【０１３２】
態様１１５：オーバーハングセグメントによりもたらされる部分的認識部位が、制限エンドヌクレアーゼによるその切断を阻止するホスホロチオエート連結を含む、態様１１４に記載の方法。
【０１３３】
態様１１６：第１の制限エンドヌクレアーゼがニッキングエンドヌクレアーゼであり、オーバーハングセグメントがニッキングエンドヌクレアーゼの部分的認識部位を含む、態様１１４に記載の方法。
【０１３４】
態様１１７：オーバーハングセグメントが改変されて、ブロッカーオリゴヌクレオチドの１つの末端を酵素の１つの末端に連結するヘアピンループを形成し、ヘアピンループの少なくとも１つのセグメントの対向するヌクレオチドが塩基対相補性を共有しておらず、ヘアピンループのセグメントが制限エンドヌクレアーゼの部分的認識部位およびプライマーの結合部位を形成するヌクレオチドを含む、態様１１４から１１６のいずれか１つに記載される方法。
【０１３５】
態様１１８：前駆体基質がレポーター基質であり、前駆体基質が、前駆体基質を含むブロッカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているプライマーを含む前駆体複合体の成分であり、ヘアピンループがブロッカーオリゴヌクレオチドの１つの末端をプライマーの１つの末端に連結し、該前駆体複合体のプライマーが、それぞれが相補的塩基対合により前駆体複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドの別々のセグメントにハイブリダイズしている第１と第２のセグメント、および前駆体基質の少なくとも一部分にハイブリダイズしていない第１と第３のセグメントの間の中間セグメントを含み、第１、第２または第３の触媒核酸酵素のいずれか１つまたは複数が、該解離後に、該前駆体基質にハイブリダイズして切断し、それによって検出可能なシグナルをもたらすことができる、態様１１４から１１７のいずれか１つに記載の方法。
【０１３６】
態様１１９：プライマーオリゴヌクレオチドが、相補的塩基対合により前駆体基質を含むブロッカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているプライマーオリゴヌクレオチドを含む前駆体複合体の成分であり、プライマーオリゴヌクレオチドが、それぞれが相補的塩基対合により前駆体複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドの別々のセグメントにハイブリダイズしている第１と第２のセグメント、および前駆体基質の少なくとも一部分にハイブリダイズしていない第１と第３のセグメントの間の中間セグメントを含み、イニシエーター触媒核酸酵素が、標的の存在下で前駆体基質にハイブリダイズすることができるＭＮＡザイムであり、ＭＮＡザイムにより試料中の標的が認識されると、ＭＮＡザイムによる前駆体基質の切断が促進され、それによってプライマーオリゴヌクレオチドを放出する、態様１１４から１１７のいずれか１つに記載の方法。
【０１３７】
態様１２０：ヘアピンループが、該前駆体複合体においてブロッカーオリゴヌクレオチドの１つの末端をプライマーオリゴヌクレオチドの１つの末端に連結する、態様１１９に記載の方法。
【０１３８】
態様１２１：それぞれがプライマーに相補的であるヌクレオチド配列を含む第１の５’セグメントと第２の３’セグメント、および制限エンドヌクレアーゼ認識部位の一本鎖成分を含む第１と第２のセグメントの間の中間セグメントを含む鋳型オリゴヌクレオチドをもたらすこと、鋳型をプライマーオリゴヌクレオチド、追加の制限酵素、および鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に接触させることにより検出可能なシグナルを増幅することをさらに含み、プライマーが鋳型の第１のセグメントにハイブリダイズし、それによって鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に遊離の３’ヒドロキシル基をもたらして、鋳型に相補的である新しい鎖の合成を開始し、プライマーの該ハイブリダイジングおよび／または該合成が部分的認識部位を完成させて、該第２のセグメントに相補的であるプライマーの第１のコピーをもたらし、完成した部分的認識部位がプライマーの第１のコピーに隣接したその５’側に置かれて接合部を形成し、追加の制限エンドヌクレアーゼが接合部に一本鎖ニックを導入して、それによって鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に遊離の３’ヒドロキシル基をもたらして、該第２のセグメントに相補的であるプライマーの第２のコピーの合成を開始し、プライマーの該第１のコピーを置き換え、それによって追加の検出可能なシグナルの発生を開始する、態様１１４から１１７のいずれか１つに記載の方法。
【０１３９】
態様１２２：鋳型オリゴヌクレオチドが、相補的塩基対合により鋳型の該第２および中間セグメントの少なくとも一部分にハイブリダイズしている第２の鎖を含むヘアピン構造の成分としてもたらされ、該第１のセグメントの少なくとも一部分が、第１と第２の鎖の末端を連結する該鋳型の１つの末端で形成されるヘアピンループ中に存在し、プライマーに相補的である該第１のセグメントのヌクレオチド配列が鋳型または第２の鎖にハイブリダイズしていない、態様１２１に記載の方法。
【０１４０】
態様１２３：イニシエータープライマーに相補的であるヌクレオチド配列を含む第１の５’セグメント、プライマーに相補的であるヌクレオチド配列を含む第２の３’セグメント、および制限エンドヌクレアーゼ認識部位の一本鎖成分を含む第１と第２のセグメントの間の中間セグメントを含む鋳型オリゴヌクレオチドをもたらすこと、鋳型をイニシエータープライマー、追加の制限酵素、および鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に接触させることにより、複数の該プライマーオリゴヌクレオチドを産生することをさらに含み、イニシエータープライマーが鋳型の第１のセグメントにハイブリダイズし、それによって鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に遊離の３’ヒドロキシル基をもたらして鋳型に相補的である新しい鎖の合成を開始し、イニシエータープライマーの該ハイブリダイジングおよび／または該合成が部分的認識部位を完成させ、該第２のセグメントに相補的である該プライマーオリゴヌクレオチドの第１のコピーをもたらし、完成した部分的認識部位が該プライマーオリゴヌクレオチドの第１のコピーに隣接した５’側に置かれて接合部を形成し、追加の制限エンドヌクレアーゼが接合部に一本鎖ニックを導入し、それによって鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に遊離の３’ヒドロキシル基をもたらして、該第２のセグメントに相補的である該プライマーオリゴヌクレオチドの第２のコピーの合成を開始し、該プライマーオリゴヌクレオチドの第１のコピーを置き換える、態様１１４から１１７のいずれか１つに記載の方法。
【０１４１】
態様１２４：該中間セグメント中の制限エンドヌクレアーゼ認識部位の成分が、追加の制限エンドヌクレアーゼによるその切断を阻止するホスホロチオエート連結を含む、態様１２１から１２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１４２】
態様１２５：追加の制限エンドヌクレアーゼがニッキングエンドヌクレアーゼである、態様１２１から１２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１４３】
態様１２６：該分子複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドが、プライマーオリゴヌクレオチドに相補的であるヌクレオチド配列を含む第２のセグメントをさらに含み、
ブロッカーオリゴヌクレオチドと塩基対相補性を有する第２の触媒核酸酵素の該合成がプライマーオリゴヌクレオチドの第１のコピーをもたらす、態様１１４から１１８のいずれか１つに記載の方法。
【０１４４】
態様１２７：プライマーに相補的であるヌクレオチド配列を含むブロッカーオリゴヌクレオチドの該第２のセグメントが、第１の触媒核酸酵素に相補的であるヌクレオチド配列を含む該ブロッカーオリゴヌクレオチドの第１のセグメントの３’側に置かれている、態様１２６に記載の方法。
【０１４５】
態様１２８：ブロッカーオリゴヌクレオチドが該第１と第２のセグメントの間の中間セグメントを含み、該中間セグメントが制限エンドヌクレアーゼの第２の部分的認識部位を含み、ブロッカーオリゴヌクレオチドと塩基対相補性を有する第２の触媒核酸酵素の該合成がプライマーオリゴヌクレオチドの第１のコピーをもたらし、第２の部分的認識部位を完成させ、該部位は次に追加の制限エンドヌクレアーゼによる認識と切断が可能である、態様１２６または態様１２７に記載の方法。
【０１４６】
態様１２９：追加の制限エンドヌクレアーゼが該第１の制限エンドヌクレアーゼと同じである、態様１２１から１２５および１２８のいずれか１つに記載の方法。
【０１４７】
態様１３０：追加の制限エンドヌクレアーゼが該第１の制限エンドヌクレアーゼとは異なる、態様１２１から１２５および１２８のいずれか１つに記載の方法。
【０１４８】
態様１３１：該試料を該追加の制限エンドヌクレアーゼに接触させることをさらに含む、態様１３０に記載の方法。
【０１４９】
態様１３２：追加の制限エンドヌクレアーゼが、第２の触媒核酸酵素とプライマーの第１のコピーとの間の接合部に一本鎖ニックを導入し、それによって鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に遊離の３’ヒドロキシル基をもたらしてプライマーの第２のコピーの合成を開始しＢＬからプライマーの第１のコピーを解離させることができる、態様１２６から１３１のいずれか１つに記載の方法。
【０１５０】
態様１３３：制限エンドヌクレアーゼの第２の部分的認識部位が、制限エンドヌクレアーゼによるその切断を阻止するホスホロチオエート連結を含む、態様１２８から１３２のいずれか１つに記載の方法。
【０１５１】
態様１３４：追加の制限エンドヌクレアーゼがニッキングエンドヌクレアーゼである、態様１２８から１３３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５２】
態様１３５：試料中の標的分子の存在または不存在を検出するための方法であって、（ａ）相補的塩基対合によりブロッカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしている第１の触媒核酸酵素、またはその成分を含む分子複合体、イニシエーター触媒核酸酵素、前駆体基質、レポーター基質、ホスファターゼ活性を有する酵素、および鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に試料を接触させることであって、イニシエーター酵素が標的に対する結合特異性を有し、標的がイニシエーター酵素にハイブリダイズするとイニシエーター酵素の触媒活性が誘導され、イニシエーター酵素にハイブリダイズしている場合、前駆体基質の触媒的改変を促進し、それによってその３’末端に２’３’環状リン酸基を含む不活性型のプライマーオリゴヌクレオチドをもたらし、ホスファターゼ活性を有する酵素が該不活性型のプライマーオリゴヌクレオチドから２’３’環状リン酸基を除去し、それによって活性型のプライマーオリゴヌクレオチドをもたらすことができ、該分子複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドの一部分が一本鎖であり、活性型のプライマーオリゴヌクレオチドの結合部位の全てまたは一部分を形成するヌクレオチドを含み、活性型のプライマーオリゴヌクレオチドが相補的塩基対合により結合部位にハイブリダイズし、それによって鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に遊離の３’ヒドロキシル基をもたらして、ブロッカーオリゴヌクレオチドと塩基対相補性を有する第２の触媒核酸酵素の合成を開始することができ、第２の触媒核酸酵素の該合成により第１の触媒核酸酵素とブロッカーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたセグメントを解離させ、第１の触媒核酸酵素が、該解離後、レポーター基質にハイブリダイズして切断し、それによって検出可能なシグナルをもたらすことができることと、（ｂ）検出可能なシグナルが該接触により生じるかどうかを判定することであって、シグナルの検出は標的分子が試料中に存在することを示し、シグナルを検出できないことは標的分子が試料中に不存在であることを示すこととを含む方法。
【０１５３】
態様１３６：試料を制限エンドヌクレアーゼに接触させることをさらに含み、活性型のプライマーオリゴヌクレオチドの結合部位の全てまたは一部分を含むブロッカーオリゴヌクレオチドの該一本鎖セグメントが該制限エンドヌクレアーゼの部分的認識部位をさらに含み、活性型のプライマーの該ハイブリダイジングおよび／または該合成が部分的認識部位を完成させ、制限エンドヌクレアーゼがプライマーと第２の触媒核酸酵素の間の接合部に一本鎖ニックを導入し、それによって鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に遊離の３’ヒドロキシル基をもたらして、ブロッカーオリゴヌクレオチドと塩基対相補性を有する第３の触媒核酸酵素の合成を開始することができ、第３の触媒核酸酵素の該合成により第２の触媒核酸酵素とブロッカーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたセグメントを解離させ、第２の触媒核酸酵素が、該解離後、レポーター基質にハイブリダイズして切断し、それによって検出可能なシグナルをもたらすことができる、態様１３５に記載の方法。
【０１５４】
態様１３７：試料中の標的分子の存在または不存在を検出するための方法であって、（ａ）相補的塩基対合によりブロッカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしている触媒核酸酵素、またはその成分に対する第１の鋳型（ＡＳＤｚ）を含む分子複合体、イニシエーター触媒核酸酵素、前駆体基質、レポーター基質、ホスファターゼ活性を有する酵素、制限エンドヌクレアーゼ、および鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に試料を接触させることであって、イニシエーター酵素が標的に対する結合特異性を有し、標的がイニシエーター酵素にハイブリダイズするとイニシエーター酵素の触媒活性が誘導され、イニシエーター酵素にハイブリダイズしている場合、前駆体基質の触媒的改変を促進し、それによってその３’末端に２’３’環状リン酸基を含む不活性型のプライマーオリゴヌクレオチドをもたらし、ホスファターゼ活性を有する酵素が該不活性型のプライマーオリゴヌクレオチドから２’３’環状リン酸基を除去し、それによって活性型のプライマーオリゴヌクレオチドをもたらすことができ、該分子複合体のブロッカーオリゴヌクレオチドの一部分が一本鎖であり、活性型のプライマーオリゴヌクレオチドの結合部位の全てまたは一部分を形成するヌクレオチドを含み、該結合部位が該制限エンドヌクレアーゼの部分的認識部位を含み、活性型のプライマーオリゴヌクレオチドが相補的塩基対合により結合部位にハイブリダイズし、部分的認識部位を完成させ、鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に遊離の３’ヒドロキシル基をもたらして、ＡＳＤｚ鋳型と塩基対相補性を有する触媒核酸酵素の合成を開始し、それによって（ｉ）ＢＬと（ｉｉ）ＡＳＤｚ鋳型がハイブリダイズしているセグメントを解離させることができ、制限エンドヌクレアーゼがプライマーと第２の触媒核酸酵素の間の接合部に一本鎖ニックを導入し、それによって鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に遊離の３’ヒドロキシル基をもたらして、ＡＳＤｚ鋳型と塩基対相補性を有する第２の触媒核酸酵素の合成を開始することができ、第２の触媒核酸酵素の該合成により第１の触媒核酸酵素とＡＳＤｚ鋳型がハイブリダイズしたセグメントを解離させ、第１の触媒核酸酵素が、該解離後、レポーター基質にハイブリダイズして切断し、それによって検出可能なシグナルをもたらすことができることと、（ｂ）検出可能なシグナルが該接触により生じるかどうかを判定することであって、シグナルの検出は標的分子が試料中に存在することを示し、シグナルを検出できないことは標的分子が試料中に不存在であることを示すこととを含む方法。
【０１５５】
態様１３８：ブロッカーオリゴヌクレオチドの該一本鎖部分が、ブロッカーオリゴヌクレオチドの１つの末端を第１の核酸酵素の１つの末端に連結するヘアピンループの形態であり、ヘアピンループの少なくとも１つのセグメントの対向するヌクレオチドが塩基対相補性を共有しておらず、ヘアピンループの該少なくとも１つのセグメントが該活性型のプライマーの結合部位である、態様１３５から１３７のいずれか１つに記載の方法。
【０１５６】
態様１３９：イニシエーター触媒核酸酵素による前駆体基質の該触媒的改変が不活性型のプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端で該２’３’環状リン酸基を形成する、態様１３５から１３８のいずれか１つに記載の方法。
【０１５７】
態様１４０：ホスファターゼ活性を有する該酵素がポリヌクレオチドホスファターゼ活性を有する酵素である、態様１３５から１３９のいずれか１つに記載の方法。
【０１５８】
態様１４１：ホスファターゼ活性を有する該酵素がＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素である、態様１３５から１４０のいずれか１つに記載の方法。
【０１５９】
態様１４２：前駆体基質がレポーター基質でもある、態様１３５から１４１のいずれか１つに記載の方法。
【０１６０】
態様１４３：試料中の標的分子の存在または不存在を検出するための方法であって、相補的塩基対合によりプライマー鋳型鎖にハイブリダイズしているブロッカーオリゴヌクレオチド（ＢＬ）鎖を含むヘアピン型プライマー鋳型であって、プライマー鋳型鎖が、第１のプライマーオリゴヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドの第１のセグメントと第２のプライマーオリゴヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドの第２のセグメント、および第１と第２のセグメントの中間の部分的制限酵素認識部位を含み、ＢＬとプライマー鋳型鎖が、相補的塩基対合により互いに最適にハイブリダイズしている場合少なくとも１つの内部にミスマッチしたヌクレオチドを含み、ＢＬ鎖とプライマー鋳型鎖が、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの結合部位をもたらすハイブリダイズしていないヌクレオチドを含むヘアピン部分により共に連結されているヘアピン型プライマー鋳型、鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分、第１の制限エンドヌクレアーゼ、および標的と前駆体基質に対する結合特異性を有するイニシエーター酵素であって、標的がイニシエーター酵素にハイブリダイズすると、イニシエーター酵素の触媒活性が誘導され、イニシエーター酵素にハイブリダイズしている場合、前駆体基質の触媒的改変を促進し、それによって第２のプライマーオリゴヌクレオチドを産生するイニシエーター酵素に試料を接触させることであって、イニシエーター酵素により産生される第２のプライマーオリゴヌクレオチドが相補的塩基対合によりヘアピンループ部分の結合部位にハイブリダイズし、それによって鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に遊離の３’ヒドロキシル基をもたらして、プライマー鋳型鎖と塩基対相補性を有する第１の新しいオリゴヌクレオチド鎖の合成を開始し、同時にプライマー鋳型鎖からＢＬのハイブリダイズした部分を解離し、新しいオリゴヌクレオチド鎖が、最初の第１と第２のプライマーオリゴヌクレオチドおよびプライマー鋳型鎖の部分的制限酵素認識部位の相補体である第１と第２のプライマーオリゴヌクレオチドの中間に位置する部分的制限酵素認識部位を含み、新しいオリゴヌクレオチド鎖の生成が、第１の制限エンドヌクレアーゼの切断部位をもたらすプライマー鋳型鎖の部分的認識部位を完成し、第１の制限エンドヌクレアーゼが新しいオリゴヌクレオチド鎖に一本鎖ニックを導入し、それによって鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に遊離の３’ヒドロキシル基をもたらして、プライマー鋳型鎖のヌクレオチドの第１のセグメントと塩基対相補性を有する追加の第１のプライマーの合成を開始することができ、追加の第１のプライマーオリゴヌクレオチドの該合成により、プライマー鋳型鎖にハイブリダイズしている最初の第１のプライマーオリゴヌクレオチドが解離されること、および相補的塩基対合によりブロッカーオリゴヌクレオチドを含む第２の鎖にハイブリダイズしている第１の触媒核酸酵素またはその成分に対する鋳型を含む第１の鎖を含む分子複合体であって、ＢＬが、第１の触媒核酸酵素またはその成分に対する該鋳型と塩基対相補性を共有していない少なくとも１つの置換された触媒コアヌクレオチドを有する第１の触媒核酸酵素の部分的ヌクレオチド配列を含み、第１の触媒核酸酵素またはその成分が分子複合体の１つの末端で一本鎖オーバーハングセグメントをもたらす分子複合体、鋳型をオーバーハングとして使用して第１の触媒核酸酵素またはその成分の全長に沿ってＢＬ配列を伸長することができるポリメラーゼ、第２の制限エンドヌクレアーゼおよびレポーター基質に試料をさらに接触させることであって、分子複合体の第１と第２の鎖は、追加のプライマーオリゴヌクレオチド結合部位および第２の制限エンドヌクレアーゼに対する追加の部分的認識部位を含むヘアピン部分により連結されており、追加のプライマーオリゴヌクレオチドは追加のプライマーオリゴヌクレオチド結合部位にハイブリダイズし、それによって鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に遊離の３’ヒドロキシル基をもたらして、第１の鎖鋳型と塩基対相補性を有する第１の触媒核酸酵素またはその成分の合成を開始することができ、追加のプライマーオリゴヌクレオチドの該ハイブリダイジングおよび／または該合成が追加の部分的認識部位を完成させ、第２の制限エンドヌクレオアーゼが追加のプライマーオリゴヌクレオチドと第２の触媒核酸酵素の間の接合部に一本鎖ニックを導入し、それによって鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に遊離の３’ヒドロキシル基をもたらして、第１の鎖鋳型と塩基対相補性を有する追加の触媒核酸酵素またはその成分の合成を開始することができ、追加の触媒核酸酵素の該合成により第１の触媒核酸酵素と第１の鎖鋳型がハイブリダイズしているセグメントを解離させ、第１の触媒核酸酵素が、該解離後、レポーター基質にハイブリダイズして切断し、それによって検出可能なシグナルをもたらすことができることと、（ｂ）検出可能なシグナルが該接触および追加の接触により生じるかどうかを判定することであって、シグナルの検出は標的分子が存在することを示し、シグナルを検出できないことは標的分子が不存在であることを示すこととを含む方法。
【０１６１】
態様１４４：第１と第２の制限エンドヌクレアーゼが同一である、態様１４３に記載の方法。
【０１６２】
態様１４５：第１と第２の制限エンドヌクレアーゼが別個である、態様１４４に記載の方法。
【０１６３】
態様１４６：第１のプライマーと追加のプライマーが同一である、態様１４３から１４５のいずれか１つに記載の方法。
【０１６４】
態様１４７：第１のプライマーと追加のプライマーが別個である、態様１４３から１４５のいずれか１つに記載の方法。
【０１６５】
態様１４８：試料中の標的分子の存在または不存在を検出するための方法であって、（ａ）試料を、プライマーならびに相補的塩基対合によりプライマーにハイブリダイズしている第１と第２のセグメントおよび触媒核酸酵素に対する第１の基質を含む第１と第２のセグメントの間の中間セグメントであって、第１の基質の少なくとも１つのセグメントがプライマーにハイブリダイズしていない中間セグメントを有する第１のブロッカーオリゴヌクレオチド（ＢＬ）を含む部分的ヘアピン型プライマー複合体であって、第１のＢＬが部分的ヘアピン型プライマー複合体の１つの末端で第１の一本鎖オーバーハングセグメントをもたらす、部分的ヘアピン型プライマー複合体；第２のＢＬにハイブリダイズしている第１の触媒核酸酵素またはその成分に対する鋳型鎖を含む部分的ヘアピン型分子複合体であって、第２のＢＬが、該鋳型鎖と塩基対相補性を共有していない少なくとも１つの置換された触媒コアヌクレオチドを有する第１の触媒核酸酵素またはその成分の部分的ヌクレオチド配列を含み、部分的ヘアピン型分子複合体が、プライマー複合体のプライマーに対する結合部位および制限エンドヌクレアーゼに対する部分的認識部位をもたらすハイブリダイズしていないヌクレオチドを含むヘアピンループ部分を含み、そして鋳型が分子複合体の１つの末端で第２の一本鎖オーバーハングセグメントをもたらす、部分的ヘアピン型分子複合体；第１のオーバーハングセグメントを鋳型として使用して、部分的ヘアピン型プライマー複合体中の第１のＢＬの全長に沿ったプライマー鎖の伸長を促進して、完全なヘアピン型プライマー複合体を形成する第１のポリメラーゼ；第２のオーバーハングセグメントを鋳型として使用して、部分的ヘアピン型分子複合体中の鋳型鎖の全長に沿った第２のＢＬの伸長を促進して、完全なヘアピン型分子複合体を形成する第２のポリメラーゼ；第２の触媒核酸酵素であって、第１のＢＬの中間セグメントに特異的にハイブリダイズして切断し、第１のＢＬとプライマーがハイブリダイズしたセグメントを解離させることができ、プライマーが、該解離後、相補的塩基対合により完全なヘアピン型分子複合体のヘアピンループ部分にハイブリダイズし、それによって遊離の３’ヒドロキシル基をもたらすことができる第２の触媒核酸酵素；遊離の３’ヒドロキシル基を使用して、分子複合体の鋳型鎖と塩基対相補性を有する第１の触媒核酸酵素またはその成分の合成を開始することができ、プライマーオリゴヌクレオチドの該ハイブリダイジングおよび／または該合成は部分的認識部位を完成させる鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分；第２の制限エンドヌクレアーゼであって、プライマーと第１の触媒核酸酵素の間の接合部に一本鎖ニックを導入し、それによって鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分に遊離の３’ヒドロキシル基をもたらして、分子複合体の鋳型鎖と塩基対相補性を有する追加の第１の触媒核酸酵素またはその成分の合成を開始することができ、追加の第１の触媒核酸酵素の該合成により第１の触媒核酸酵素と分子複合体の鋳型鎖がハイブリダイズしているセグメントを解離させ、第１の触媒核酸酵素が、該解離後、レポーター基質にハイブリダイズして切断し、それによって検出可能なシグナルをもたらすことができる第２の制限エンドヌクレアーゼ、に接触させることと、（ｂ）検出可能なシグナルが該接触により生じるかどうかを判定することであって、シグナルの検出は標的分子が存在することを示し、シグナルを検出できないことは標的分子が不存在であることを示すこととを含む方法。
【０１６６】
態様１４９：どの該分子複合体も相補的塩基対合により触媒核酸にハイブリダイズしているブロッカーオリゴヌクレオチド（ＢＬ）を含み、酵素の少なくとも１つであるが全てではない触媒コアヌクレオチドがＢＬにハイブリダイズしている、態様９６から１４８のいずれか１つに記載の方法。
【０１６７】
態様１５０：試料を態様２３から２９のいずれか１つに記載の組成物に接触させることを含む、態様９６、９７および９９から１１１のいずれか１つに記載の方法。
【０１６８】
態様１５１：試料を態様３０に記載の組成物に接触させることを含む、態様９８または９９に記載の方法。
【０１６９】
態様１５２：試料を態様３３から３５のいずれか１つに記載の組成物に接触させることを含む、態様１０３から１０６および１０９のいずれか１つに記載の方法。
【０１７０】
態様１５３：試料を態様３６または態様３７に記載の組成物に接触させることを含む、態様１０７から１０９のいずれか１つに記載の方法。
【０１７１】
態様１５４：標的が、該イニシエーター触媒核酸酵素の触媒活性のための補因子として必要とされるイオン化合物である、態様５８から１５３のいずれか１つに記載の方法。
【０１７２】
態様１５５：標的が一価または二価の金属イオンである、態様１５４に記載の方法。
【０１７３】
態様１５６：標的が、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋およびＰｂ２＋のうちのいずれか１つまたは複数から選択される、態様１５４または態様１５５に記載の方法。
【０１７４】
態様１５７：前駆体基質が標的分子であるかまたはこれを含む、態様１００から１０９、１１２、および１１４から１１７のいずれか１つに記載の方法。
【０１７５】
態様１５８：第１の触媒核酸酵素がリボザイム、ＤＮＡザイム、アプタザイム、ＭＮＡザイムまたはアプタＭＮＡザイムである、態様５８から１５７のいずれか１つに記載の方法。
【０１７６】
態様１５９：イニシエーター触媒核酸酵素がリボザイム、ＤＮＡザイム、アプタザイム、ＭＮＡザイムまたはアプタＭＮＡザイムである、態様５８から１５８のいずれか１つに記載の方法。
【０１７７】
態様１６０：第２の触媒核酸酵素がリボザイム、ＤＮＡザイム、アプタザイム、ＭＮＡザイムまたはアプタＭＮＡザイムである、態様８７から９３、９５および１１４から１４２のいずれか１つに記載の方法。
【０１７８】
態様１６１：第３の触媒核酸酵素がリボザイム、ＤＮＡザイム、アプタザイム、ＭＮＡザイムまたはアプタＭＮＡザイムである、態様１１４から１３４、１３６および１３７のいずれか１つに記載の方法。
【０１７９】
態様１６２：標的分子がＤＮＡ、ＲＮＡ、リガンドまたはその組合せを含む核酸である、態様５８から１５３のいずれか１つに記載の方法。
【０１８０】
態様１６３：鎖置換型ポリメラーゼまたはその成分が、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、Ｂｓｔ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ２．０、Ｖｅｎｔ、Ｐｈｉ２９、Ｐｙｒｏｐｈａｇｅ３１３７鎖置換型ポリメラーゼまたはその任意の変異体からなる群より選択される、態様１０７から１０９、１１１、および１１４から１４２のいずれか１つに記載の方法。
【０１８１】
態様１６４：ニッキングエンドヌクレアーゼが、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、ＮＴ．ＢｈａＩＩＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、Ｎｂ．Ｍｖａ１２６９Ｉ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩからなる群より選択される、態様１０３、１０６、１１６、１２５、１３６および１３７のいずれか１つに記載の方法。
【０１８２】
態様１６５：ブロッカーオリゴヌクレオチドが、それぞれが相補的塩基対合により該第１の酵素またはその該触媒部分の異なるハイブリダイジングアームにハイブリダイズしている第１と第２のセグメント、および第１と第２のセグメントの間の中間セグメントを含み、第１のブロッカーオリゴヌクレオチドの５’末端が第１の触媒核酸酵素またはその触媒部分の３’末端と対向し、中間セグメントがアプタマーを含み、アプタマーの少なくとも１つのセグメントが第１の酵素またはその触媒部分にハイブリダイズしていない、態様１から４のいずれか１つに記載の組成物。
【０１８３】
態様１６６：ブロッカーオリゴヌクレオチドの１つの末端が少なくとも自己相補性の部分を含むヘアピンループをさらに含む、態様１から４に記載の組成物。
【０１８４】
態様１６７：ＤＮＡザイム、リボザイム、アプタザイム、ＭＮＡザイムまたはアプタＭＮＡザイムからなる群より選択されるイニシエーター触媒核酸酵素またはその触媒成分をさらに含み、イニシエーター触媒核酸酵素またはその触媒成分が中間セグメントの基質を触媒的に改変することができる、態様５から３５のいずれか１つに記載の組成物。
【０１８５】
態様１６８：第１の酵素が第１の基質および／または第２の基質を触媒的に改変することができる、態様１０に記載の組成物。
【０１８６】
態様１６９：ＢＬの第１または第２のセグメントが、ヘアピンループセグメントを介して該第１の酵素またはその該触媒部分のハイブリダイジングアームに結合している、態様５に記載の組成物。
【０１８７】
態様１７０：本発明の一態様では、ブロッカーオリゴヌクレオチドは触媒核酸酵素の標的分子にハイブリダイズすることができない。
【０１８８】
態様１７１：本発明の一態様では、方法はインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）またはエキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で実施される。
【０１８９】
態様１７２：本発明の一態様では、試料は生体試料または環境試料である。
【０１９０】
態様１７３：本発明の一態様では、方法は動物、ヒト、哺乳動物、非ヒト動物、または非ヒト哺乳動物における疾患または感染を診断するために生体試料で実施される。
【０１９１】
態様１７４：本発明の一態様では、方法は疾患または感染を診断するためには実施されない。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】図１は、ブロッカーオリゴヌクレオチド（ＢＬ）とのハイブリダイゼーションによるＤＮＡザイム分子の可逆的不活性化を表す。ＢＬは、第１のＭＮＡザイム（Ｍｚ１）によって切断され得、ＤＮＡザイム（Ｄｚ）のＢＬからの分離をもたらし、従って、ＤＮＡザイムの触媒活性を活性化する／元通りにする基質配列（基質１）を含有する。次いで、ＤＮＡザイムは、フルオロフォア（白丸）およびクエンチャー（黒丸）の間の基質を切断でき、この切断が、蛍光シグナルの増大をもたらし得る。この戦略の３つの非限定的な例が実証されている（パネルｉ）〜ｉｉｉ））。例示的戦略の例示の全てにおいて、開始事象は、Ｍｚ１による切断であるが、全ての場合において、開始事象は、同一基質（基質１）を切断することができる別の異なる触媒核酸（例えば、ＤＮＡザイムまたはアプタザイム）によって促進され得る。ＭＮＡザイムが使用される場合には、例えば、開始は、基質１を切断することができる任意のＭＮＡザイムのアセンブリーファシリテーター（ＡＦ１）として機能し得る任意の特異的標的の存在に依存性にされ得る。
【図２】図２は、１種および２種の不活化ＤＮＡザイム（それぞれ、図１パネルｉｉ）およびｉｉｉ）において図表で表される）のいずれかを用いる、環からのＤＮＡザイム疑似環戦略から達成された蛍光シグナルを表す経時変化グラフを提供する。これらの場合には、反応はＤＮＡザイムによって開始された。
【図３】図３パネルｉ）は、ＭＮＡザイム（Ｍｚ１）の、ＢＬ内に存在する基質（基質１）を切断し、従って、ＤＮＡザイム（Ｄｚ２）の触媒活性を活性化する／元通りにする能力を実証するための、図１パネルｉ）において概説された、ブロックされたＤＮＡザイム戦略の使用を表す。次いで、Ｄｚ２は、フルオロフォアおよびクエンチャーの間の基質２を切断でき、この切断が、蛍光シグナルの増大をもたらし得る。パネルｉｉ）は、パネルｉ）において図表で表される戦略から達成された蛍光シグナルを表す経時変化グラフを提供する。シグナルの増幅に使用され得る、ＤＮＡザイム分子の連続的放出および活性化に関与するカスケードも例示されている。このような戦略の２つの非限定的な例が例示されている（パネルｉｉｉ）およびｉｖ））。第１のもの（パネルｉｉｉ）は、ＢＬ分子内に存在する基質配列が、ＢＬによって一時的に不活化されていたＤＮＡザイムと同一基質を切断するよう設計されているＭＮＡザイムによって切断され得る「自己触媒性」カスケードの概要を示す。第２のもの（パネルｉｖ）は、各々、対向する分子スイッチの基質配列を切断する可能性があり得る、逆もまた同様のＤＮＡザイムを含有する２つの分子スイッチ複合体が存在する、「相互触媒性」カスケードの概要を示す。両方の例において、分子スイッチは、アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１）として作用し得る標的分子の存在下での活性ＭＮＡザイム（Ｍｚ１）によるＢＬＡの切断によって、カスケード開始が起こるまで、ＢＬ分子（ＢＬＡおよびＢＬＢ）による阻害のために不活性状態で存在し得る。この図中の例示的戦略の例示の全てにおいて、ＤＮＡザイムとＢＬの間のハイブリダイゼーションは、ＤＮＡザイムとＢＬの間の５’および３’末端対合として存在する（図１パネルｉ）に概説される）が、さらに、二本鎖の一方の末端は、ヘアピン型構造を形成する非相補的配列によって連結されている。対合は、実際、ヘアピンループを連結せずに存在し得るか、または代わりに、ＤＮＡザイムとＢＬの間の５’および５’末端対合（１つの構造内で２種以上のＤＮＡザイムとＢＬからなる対合を含む）またはハイブリダイゼーション法の組合せを含み得、その非限定的な例は、図１に見られる。この図中の例示的戦略の例示の全てにおいて、開始事象は、Ｍｚ１による切断であるが、全ての場合において、開始事象は、同一基質（基質１）を切断することができる別の異なる触媒核酸（例えば、ＤＮＡザイムまたはアプタザイム）によって促進され得る。ＭＮＡザイムが使用される場合には、開始は、基質１を切断することができる任意のＭＮＡザイムのアセンブリーファシリテーター（ＡＦ）として機能し得る任意の特異的標的の存在に依存性にされ得る。
【図４】図４は、リリーサーオリゴヌクレオチド（ＲＬ）分子（パネル（ｉ））を作製する方法およびＢＬ分子（ｉｉ、ｉｉｉおよびｉｖ）とのハイブリダイゼーションによって最初に不活性であるＤＮＡザイム分子を活性化するためのＲＬの使用を例示する。例示された非限定的な例では、ＢＬ分子は、別個のＤＮＡザイムまたはＭＮＡザイムによる切断のための基質配列を含有しない。代わりに、ＤＮＡザイムは、「トーホールド(toehold)」としても知られる一本鎖突出でＢＬと結合し、ＢＬの残部とハイブリダイズするよう進行するＲＬによってＢＬから分離され、そのように、あらかじめ結合していたＤＮＡザイムと置換する。これは、ＢＬから、ここで分離され、元通りの触媒活性を有する遊離ＤＮＡザイムをもたらす。ＲＬ活性化の方法は、パネルｉ）に表わされており、これでは、ヘアピン型複合体中で最初に不活性であるか、別個のＢＬとハイブリダイズするＲＬを含む。その標的の存在下でのＭＮＡザイムによるＢＬ内に存在する基質の切断は、活性ＲＬ分子の生成をもたらす。３つの非限定的な例（パネルｉｉ）〜ｉｖ））において、ＤＮＡザイムを活性化するＲＬの能力が例示されている。第１の戦略では、ＤＮＡザイムおよびＢＬは、２つの別個のオリゴヌクレオチドであり、ＲＬの作用は、２種のオリゴヌクレオチドの完全な分離をもたらす（パネルｉｉ））。第２の戦略では、ＤＮＡザイムおよびＢＬ分子は、ヘアピン型ＤＮＡ構造中で単一オリゴヌクレオチドとして存在するように連結しており、ＲＬの作用は、ヘアピンの開環をもたらし得る（パネルｉｉｉ））。第３の戦略では、ヘアピン型ＤＮＡ構造の２種を共に連結する複合体は、単一ＲＬ分子の作用によって開環され得る（パネルｉｖ））。
【図５】図５は、単一ヘアピン型ＤＮＡザイムおよび２種の連結したヘアピン型ＤＮＡザイム（それぞれ、図４パネルｉｉｉ）およびｉｖ）において図表で表される）の両方からのＲＬ媒介性ＤＮＡザイム活性化戦略から達成される蛍光シグナルを表す経時変化グラフを提供する。
【図６】図６パネルｉ）は、Exonuclease III(ExoIII)として知られるタンパク質酵素の使用をさらに含むＢＬ分子からのＤＮＡザイムのＲＬ媒介性置換（図４に記載される）を実証する。ExoIIIは、平滑または陥凹二重鎖ＤＮＡの３’末端からのモノヌクレオチドの段階的除去を触媒し、ここで、ＲＬとハイブリダイズされる場合にＢＬを分解するために使用される。これは、ＲＬ分子の「再利用」を促進し、その結果、いくつかのＤＮＡザイムを連続的に置換し、活性化するよう機能し得る。パネルｉｉ）は、パネルｉ）に表わされたExoIII戦略から達成された蛍光シグナルを実証する。
【図７】図７パネルｉ）は、ＢＬ分子から離れるＤＮＡザイムのＲＬ媒介性置換（図４に記載される）を実証するが、「ニッキング酵素」として知られる、ＤＮＡ二重鎖のうち一方のみを選択的に切断する制限酵素の使用を含む。ニッキング酵素を使用して、ここで、ＢＬ鎖を、二本鎖認識配列の一方の鎖を含有するＲＬの領域と二重鎖を形成している場合に選択的に切断する。これは、ＲＬ分子がＢＬと再ハイブリダイズするのにもはや熱力学的に好都合ではないので、ＲＬ分子の「再利用」を促進する。次いで、ＲＬは、さらなるＤＮＡザイムを連続的に置換し、活性化するよう機能し得る。パネルｉｉ）は、パネルｉ）に表わされるニッキング酵素戦略から達成された蛍光シグナルを実証する。
【図８】図８パネルｉ）は、ＢＬ分子から離れるＤＮＡザイムのＲＬ媒介性置換（図４に記載される）を実証するが、ポリマー合成の間に鋳型鎖とあらかじめ結合していたＤＮＡ鎖と置換する能力を有するＤＮＡポリメラーゼ酵素の使用をさらに含む。従って、鎖置換型ポリメラーゼ使用して、ＲＬ／ＢＬ二重鎖からＲＬを置換し、ＢＬとのＤＮＡザイムまたはＲＬの再ハイブリダイゼーションを防止するＢＬと相補的である鎖を合成する。これは、ＲＬ分子の「再利用」を促進し、その結果、それらは、さらなるＤＮＡザイムを連続的に置換し、活性化するよう機能し得る。パネルｉｉ）は、パネルｉ）に表わされる鎖置換型ポリメラーゼ戦略から達成された蛍光シグナル実証する。
【図９】図９パネルｉ）は、ＲＬを最初に不活性化するためのＲＬのＢＬ分子（ＢＬＡ）とのプレハイブリダイゼーションを実証する。このＢＬは、触媒核酸（例えば、例示されるＤＮＡザイム（Ｄｚ１）または反応が標的依存性であるＭＮＡザイム）の基質を含有し得、その結果、この基質の切断が、ＲＬ分子の活性化をもたらし、その結果、次いで、第２のＤＮＡザイムをその自身のＢＬ（ＢＬＢ）（図４に最初に記載される）と分離することによって、第２のＤＮＡザイム（Ｄｚ２）などの別のさらなる分子を活性化するよう機能し得る。パネルｉｉ）は、パネルｉ）において概要を示される戦略から達成された蛍光シグナルを実証する。この戦略はまた、ＲＬによって活性化される触媒核酸が、次いで、ＲＬ／ＢＬ分子スイッチからのＢＬＡ分子内に存在する基質を切断するよう機能し得、これが、ＲＬ分子および触媒核酸両方の連続活性化をもたらし、従って、シグナルの増幅のために使用され得る環カスケード（パネルｉｉｉ））を作製するために使用され得る。
【図１０】図１０は、Exonuclease III（ExoIII）などのヌクレアーゼ酵素の使用によるＤＮＡザイムなどの触媒核酸の直接活性化を実証する。ExoIIIは、平滑または陥凹二重鎖ＤＮＡの３’末端からのモノヌクレオチドの段階的除去を触媒し、ここで、ＢＬ／ＤＮＡザイム分子スイッチのＢＬ部分を分解するために使用される。ExoIII活性は、ＢＬの一部と部分的にハイブリダイズし、ExoIIIによるその分解を促進し得る活性ヌクレアーゼ認識断片（ＮＲＦ）の存在によって引き起こされる。これは、ＤＮＡザイムの活性化およびＮＲＦの再利用をもたらし得、その結果、同一方法によってさらなるＤＮＡザイムを連続的に活性化するよう機能し得る（パネルｉ））。この戦略はまた、ＮＲＦによって促進されるExoIII分解事象によって活性化されるＤＮＡザイムが、次いで、ＮＲＦ／ＢＬ分子スイッチからＢＬＡ分子内に存在する基質を切断するよう機能し得る環カスケードを作製するために使用され得る。これは、ＮＲＦ分子（同様に再利用される）の連続活性化およびＤＮＡザイムの活性化の両方をもたらし得、シグナルの増幅のために使用され得る（パネルｉｉ））。
【図１１】図１１は、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（３’−５’エキソ−）などの鎖置換型ポリメラーゼ酵素の使用によるＤＮＡザイムなどの触媒核酸の直接活性化を実証する。パネルｉ）に示されるように、酵素は、ここで、ＢＬの一部またはヘアピン構造中でＤｚ／ＢＬが共に連結している態様におけるループ配列のいずれかとハイブリダイズし得るプライマーの伸長によって、Ｄｚ／ＢＬ分子スイッチからのＤＮＡザイム部分を置換するために使用される。鎖置換プライマー伸長は、鋳型としてＢＬ部分を使用し、伸長されたプライマーおよびＢＬの間に不活性二重鎖をもたらすが、Ｄｚは、ここで、一本鎖であり、活性である。さらに、制限酵素（ＲＥ）の使用も、新規プライマーの生成をもたらすその活性とともに表され、新規プライマーは、ポリメラーゼによって伸長されて、活性ＤＮＡザイムのさらなるコピーを合成し、置換し得る。パネルｉｉ）は、パネルｉ）において表される戦略から達成される蛍光シグナルを実証する。この戦略はまた、活性化されているＤＮＡザイムが合成され（ポリメラーゼ単独またはＲＥと組み合わせたポリメラーゼの活性から）、次いで、プライマー／ＢＬ分子スイッチ（パネルｉｉｉ））からのＢＬ分子内に存在する基質を切断するよう機能し得る環カスケードを作製するために使用され得る。これは、プライマーおよびＤＮＡザイム両方の連続活性化をもたらし得（ＲＥも使用される場合には、新規活性ＤＮＡザイムの合成に加えて）、シグナルの増幅のために使用され得る。
【図１２】図１２は、活性プライマー分子の作製のための例示的方法の概要を示す。各場合において（パネルｉ）、パネルｉｉ）およびパネルｉｉｉ））、触媒核酸（例えば、活性ＤＮＡザイム、活性アプタザイムまたはその標的の存在下で集合した活性ＭＮＡザイムによる基質の切断によって活性プライマーが生成し得る（例示される）。
【図１３】図１３は、プライマーの増幅のための例示的方法の概要を示し、これは、次いで、図１１に概要を示されるように、新規ＤＮＡザイムを活性化および／または合成するために使用され得る。パネルｉ）〜ｉｉｉ）に示される例示的方法は、最初のプライマー（活性プライマー）の、鋳型とのハイブリダイゼーションを含み、これは鎖置換型ポリメラーゼによって伸長されて、ＲＥ認識部位が先行するプライマーの新規コピー（新規プライマー）を作製する。次いで、ＲＥニッキングおよび重合の連続サイクルが起こり、新規プライマーを連続的に合成し得る。
【図１４】図１４は、ＤＮＡザイムおよびプライマー両方の増幅のための例示的方法の概要を示し、次いで、図１１に最初に概要を示されるように、その両方とも、新規ＤＮＡザイムを活性化および／または合成するために使用され得る。パネルｉ）およびｉｉ）に示される例示的方法は、最初のプライマー（活性プライマー）の、ヘアピン型ＤＮＡザイム／ＢＬとのハイブリダイゼーションを含み、これは、鎖置換型ポリメラーゼによって伸長されて、ＢＬのためにこれまでは不活性であったＤＮＡザイムを活性化し、ＤＮＡザイムの新規に合成されたコピーを作製し、それに、プライマーの新規コピー（新規プライマー）がさらに続き得る。新規プライマーにはまた、ニッキングＲＥ認識部位が先行し得、その結果、新規ＤＮＡザイムを連続的に合成するだけでなく、新規プライマーも連続的に合成するためにニッキングおよび重合の連続サイクルが使用され得る。
【図１５】図１５は、標的アセンブリーファシリテーターの存在下でのＭＮＡザイムによる環のＢＬ部分の切断によって活性化された、１種および２種の両不活性化ＤＮＡザイムを用いる環からのＤＮＡザイム疑似環戦略から達成された蛍光シグナルを示す（それぞれ、図１パネルｉｉ）およびｉｉｉ）に図表で表される）。
【図１６】図１６パネルｉ）は、２つのＤＮＡザイム疑似環、環Ａおよび環Ｂの間の相互触媒性カスケードを表す。環Ａは、Ｄｚ３；環ＢのＢＬＢ内に存在する基質３ａを切断することができるＤＮＡザイムを含有する。環Ｂは、Ｄｚ２；環ＡのＢＬＡ内に存在する基質２ａを切断することができるＤＮＡザイムを含有する。ＢＬＡおよびＢＬＢはまた各々、Ｍｚ１；標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１）の存在下で形成されたＭＮＡザイムによって切断され得る基質１を含有する。パネルｉｉ）は、単一濃度のＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーターを使用する、環Ａのみ対環ＡおよびＢ一緒の活性化からの蛍光シグナルを比較するパネルｉ）に概要が示された相互触媒性ＤＮＡザイム疑似環戦略から達成された蛍光シグナルを表す経時変化グラフを提供する。パネルｉｉｉ）は、環Ａおよび環Ｂを共に、ＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーター濃度の滴定と両方用いる、パネルｉ）に概要が示される相互触媒性ＤＮＡザイム疑似環戦略から達成された蛍光シグナルを表す経時変化グラフを提供する。
【図１７】図１７は、ホスファターゼ活性を有する酵素（例えば、Ｔ４  ＰＮＫ）および適宜ＲＥと共に、鎖置換型ポリメラーゼ酵素を使用することによる（パネルｉｉ）に示されるように）、ＤＮＡザイムなどの触媒核酸の活性化（パネルｉ））またはその合成（パネルｉｉ）を実証する。ＭＮＡザイムが、基質を切断する場合には、３’末端での２’３’環状リン酸基の存在のために不活性である不顕性プライマーが放出される。次いで、Ｔ４  ＰＮＫを使用して、２’３’環状リン酸基を除去し、それによって、プライマーを活性にできる。次いで、活性プライマーを、ＢＬの一部と、またはＢＬが、ヘアピン構造内で二重鎖である態様では（パネルｉ）およびｉｉ））ループ配列のいずれかとハイブリダイズし得る。パネルｉ）では、鎖置換型ポリメラーゼによるプライマー伸長は、鋳型としてＢＬ部分を使用し、伸長されたプライマーとＢＬの間に不活性の二重鎖が得られるのに対して、Ｄｚは、ここで、一本鎖であり、活性であり、従って、基質を切断して、シグナルをもたらすことができる。パネルｉｉ）は、鎖置換型ポリメラーゼによる活性化されたプライマーの伸長が、ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を作製する例示的態様を示す。ＢＬは、ＤＮＡザイムの不活性アンチセンス（ＡＳＤｚ）ならびにニッキングＲＥの二重鎖認識部位の一方の鎖を含有するオリゴヌクレオチドと二重鎖を形成する。ＢＬは、不活性部分および／または突然変異ＤＮＡザイムを含有するが、ニッキングＲＥの二重鎖認識部位の第２の鎖を形成するのに必要であろう相補配列を含有しない。適当なＲＥを使用して、プライマーの伸長によって形成された新規二重鎖の完全認識部位の一方の鎖にニックを入れ、従って、それから鎖置換型ポリメラーゼが、鋳型としてＡＳＤｚを使用して新規Ｄｚ分子を合成し得る新規プライマーを作製してもよい。この系は、新規Ｄｚ分子の連続合成を提供し、パネルｉｉ）は、合成されたＤＮＡザイムが、ＭＮＡザイムによって切断されるものと異なる基質を切断し得る例示的線形カスケードを示す。パネルｉｉｉ）は、パネルｉｉ）に概要が示される線形カスケード戦略から達成された蛍光シグナルを示す。
【図１８】図１８パネルｉ）およびｉｉ）は、新規に活性化され、合成された触媒核酸酵素（ＤＮＡザイムとして、この場合には表される）が、カスケード反応を開始するＭＮＡザイムと同一基質を切断するよう設計される、それぞれ、図１７パネルｉ）およびｉｉ）に概要が示される戦略からの環フィードバックカスケードを実証する。
【図１９】図１９パネルｉ）は、触媒核酸配列（例えば、ＤＮＡザイム）を、図１１に概要が示されるように連続的に合成するために使用され得る４種の異なる構造を表す。構造Ａは、ヘアピンのＤｚ領域が、触媒活性に必要な完全配列を含み、ひとたび、プライマーおよび鎖置換型ポリメラーゼの置換作用によって、ヘアピンが開環されると活性になり得る、「完全」ヘアピン型ＤＮＡザイム／ＢＬからなる。構造Ｂは、ＤＮＡザイム合成の鋳型として機能することができるアンチセンスＤＮＡザイム（ＡＳＤｚ）配列をブロックする不活性部分ＤＮＡザイム配列（触媒コアから必要不可欠な塩基がない）を含む不活性オリゴヌクレオチドを含有するＢＬからなる。構造Ｃは、ＤＮＡザイム合成の鋳型として機能することができるＡＳＤｚ配列をブロックする、不活性な部分ＤＮＡザイム配列（触媒コア内に突然変異された必要不可欠な塩基を有する）を含む不活性オリゴヌクレオチドを含有するＢＬからなる。ポリメラーゼの存在下で、ＢＬ鎖は、伸長され得るが、Ｄｚコア領域内の突然変異された塩基対は、このオリゴヌクレオチドを不活性のままにする。従って、構造ＢおよびＣは両方とも、プライマーによって開環される場合に機能的ＤＮＡザイムを露出しない。構造Ｄは、ブロックされていないＤｚ鋳型（ＡＳＤｚ）および隣接するプライマー結合部位を含む。構造Ｂ、ＣおよびＤは各々、ＤＮＡザイム合成の鋳型を提供することができるが、生成した活性ＤＮＡザイムからの、シグナルの相当な変動が達成される。パネルｉｉ）は、パネルｉ）において表される構造Ａ〜Ｄの各々から生成した活性ＤＮＡザイムから達成された蛍光シグナルを実証する。
【図２０】図２０は、複数のイニシエーター触媒酵素（例えば、ＭＮＡザイムＭｚ１、Ｍｚ２、Ｍｚ３））が使用されて、各々、標的分子を検出し、疑似環ＤＮＡザイムのＢＬ中に組み込まれた複数の基質または基質成分の１種の触媒的改変によって検出可能なシグナルの発生を促進し得る２つの戦略を例示する（元々、図１パネルｉｉ）に概要が示される）。第１の戦略（パネルｉ））は、各基質配列が、独立イニシエーター触媒酵素（例えば、ＭＮＡザイム）によって触媒的に改変され得るＢＬの中間領域内への複数の独立した隣接する基質配列の包含を含む。第２の戦略（パネルｉｉｉ））は、各基質または基質成分が、独立イニシエーター触媒酵素（例えば、ＭＮＡザイム）によって触媒的に改変され得る、独立した基質配列およびその成分の両方の包含を含む。パネルｉｉ）およびｉｖ）は、それぞれ、パネルｉ）およびｉｉｉ）において表される戦略から達成された蛍光シグナルを実証する。
【図２１】図２１、パネルｉ）は、図１パネルｉｉ）に元々概要が示される疑似環戦略を含む自己触媒性カスケード反応を実証する。疑似環のＢＬＡは、２つの隣接する基質配列；基質１および基質２ａを含む。基質１は、その標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１）の存在下でＭＮＡザイム（Ｍｚ１）によって切断され得、ＤＮＡザイム（Ｄｚ２）の放出および活性化をもたらす。次いで、Ｄｚ２は、基質２を切断し得る。これは、基質２がまた、疑似環中に存在する場合に（パネルｉ）中の基質２ａ）、さらなるＤｚ２分子の放出をもたらし、従って、ＢＬＡ切断事象の指数関数的カスケードを引き起こし得る。Ｄｚ２はまた、独立した蛍光標識された基質２を切断し、シグナルの発生および増幅につながり得る。パネルｉｉ）およびｉｉｉ）では、ＢＬＢおよびＢＬＣ分子が基質２を含有しないので、自己触媒的にフィードバックする可能性を有さない疑似環が表される。パネルｉｖ）は、パネルｉ）〜ｉｉｉ）に表わされる戦略から達成された蛍光シグナルを実証する。
【図２２】図２２パネルｉ）は、フルオロフォアおよびクエンチャー色素対を用いて標識された独立した実体として提供される、その基質（基質１）を切断するＭＮＡザイム（Ｍｚ１）を表す。あるいは、パネルｉｉ）は、自己触媒性疑似環のＢＬ内に存在する同一Ｍｚ１切断性基質１（元々、図２１パネルｉにおいて概要が示される）を表し、それによって、基質１の切断は、ＤＮＡザイム（Ｄｚ２）の放出および活性化ならびにその後の自己触媒性カスケードの開始（Ｄｚ２によるＢＬ内の基質２（パネルｉｉ）中の基質２ａ）の切断による）をもたらす。活性Ｄｚ２はまた、フルオロフォアおよびクエンチャー色素対を用いて標識された別個の実体として提供される基質２を切断し得る。パネルｉｉｉ）は、パネルｉ）およびｉｉ）に表わされる２つの戦略から達成された蛍光シグナルを実証し、比較する。
【図２３】図２３パネルｉ）は、標的依存的に新規ＤＮＡザイム分子の合成を開始するための、部分ヘアピン型プライマーおよび部分的にブロックされたヘアピン型Ｄｚ鋳型（アンチセンスＤＮＡザイム；ＡＳＤｚ）分子の両方の使用を表す。ＢＬＢは、コア領域内に少なくとも１つの不活化突然変異を有し、その結果、ポリメラーゼによるその伸長が、活性ＤＮＡザイムをもたらすことができない不完全Ｄｚ配列である。最初に、両部分ヘアピン型分子が３’末端からポリメラーゼによって伸長され、完全ヘアピン型構造を生成し得る。ＭＮＡザイム（Ｍｚ１）は、その標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１）の存在下で形成し、ヘアピン型プライマーのＢＬＡ内に存在する基質１を切断し得る。この切断は、機能的プライマーの放出をもたらし得、これは、順に、ヘアピン型Ｄｚ鋳型と結合し、ここで、伸長し、蛍光標識された基質を切断して、検出可能な蛍光シグナルをもたらし得る活性ＤＮＡザイム分子を合成し得る。パネルｉｉ）は、パネルｉ）に表わされる戦略から達成された蛍光シグナルを実証する。
【図２４】図２４パネルｉ）は、自己触媒性ＤＮＡザイム疑似環（図２１パネルｉ））の、固相支持体との接着を表す。疑似環のＢＬが、ＢＬをストレプトアビジンコートされたシリカマイクロスフェアと接着するための、例えば、ビオチンの使用による接着戦略によって固相支持体に繋ぎ止められる例示的戦略の概要が示される。環のＢＬは、ＢＬがビオチン−ストレプトアビジン結合によってマイクロスフェアと接着できるよう、３’末端がビオチン部分を用いて改変されたさらなるスペーサー領域を含む。次いで、ＤＮＡザイムは、ワトソン−クリック塩基対形成によってＢＬとハイブリダイズする。疑似環が、固体表面と結合したままで、起こり得る自己触媒性カスケード反応を開始するために、その標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１）の存在下で集合するＭＮＡザイム（Ｍｚ１）が利用され得る。パネルｉｉ）は、パネルｉ）に表わされる戦略から達成される蛍光シグナルを実証する経時変化グラフを提供する。
【図２５】図２５パネルｉ）は、プライマー（プライマー２）が、ヘアピン型プライマー鋳型分子とハイブリダイズして、異なるプライマー（プライマー１）の合成を開始できる、図１３パネルｉｉｉ）に表わされる戦略を広げる。次いで、各プライマー１は、部分的にブロックされたヘアピン型Ｄｚ鋳型（図１７パネルｉｉ）および図２３パネルｉに先に概要が示された）とハイブリダイズすることによって活性ＤＮＡザイム（Ｄｚ１）分子の合成を開始できる。次いで、各Ｄｚ１は、フルオロフォア(fluorphore)およびクエンチャー色素対を用いて標識され得る基質１を切断でき、その結果、切断は、蛍光シグナルの検出可能な増大をもたらす。パネルｉｉ）は、パネルｉ）に表わされる戦略から達成された蛍光シグナルを実証する経時変化グラフを提供する。
【図２６】図２６パネルｉ）は、２つの独立した自己触媒性疑似環（環Ａおよび環Ｂ）を含むマルチプレックス検出反応を例示する。各カスケード反応は、同一反応チャンバー中に共にある全ての成分にもかかわらず、独立に機能すると示される。カスケードは、各々、その特有の標的配列との集合後に機能し得る異なるＭＮＡザイムによって切断される、各ＢＬ内に存在する異なる基質の切断によって開始される。各カスケードは、２つの反応間を区別するため、また各標的の存在を示すために各プローブにも使用される異なる蛍光色素を用いる異なる蛍光リポーター基質の改変をもたらす。パネルｉｉ）は、パネルｉ）に表わされるマルチプレックス反応戦略における、両蛍光リポータープローブからの蛍光シグナルを実証する２つの経時変化グラフを提供する。
【図２７】図２７パネルｉ）は、カスケードが、標的配列（標的１）の、ＢＬ内のＲＥ基質（基質１）とのハイブリダイゼーションによって開始され、ＲＥの、ＢＬに選択的にニックを入れる活性を漸加する自己触媒性疑似環構造（図２１パネルｉ））を表す。基質１および標的１は各々、ＲＥ認識配列の一本鎖を含み、その結果、２つが共に結合すると、完全認識部位の形成をもたらし、ＲＥによるＢＬのニッキングを引き起こす。ＢＬ内の基質２（基質２ａ）、遊離基質２（フルオロフォア／クエンチャー色素対を用いて標識された）は、環からのそのＲＥ媒介性放出後にＤｚ２によって両方とも切断され得る。パネルｉｉ）は、パネルｉ）に表わされる戦略から達成された蛍光シグナルを実証する経時変化グラフを提供する。
【図２８】図２８は、標的分析物／リガンドを認識し、ＤＮＡザイム触媒活性の回復をもたらし得る、別の機能的分子、この場合には、ＤＮＡザイムからのＢＬの分離を促進するためのアプタマーの使用のための戦略を表す。この戦略の２つの非限定的な例が、パネルｉ〜ｉｉ）に表わされている。パネルｉ）は、その標的分析物／リガンドの存在下でのみ機能する、分子スイッチ複合体のＢＬ内に存在する基質（基質１）を切断するためのアプタザイムの使用の概要を示す。アプタザイムは、ＤＮＡザイムドメイン（Ｄｚ１ドメイン）およびアプタマードメインから構成される。アプタマードメインの存在は、アプタザイムのＤＮＡザイムドメインの一時的な不活性化をもたらす。標的分析物／リガンドの存在下では、アプタマー領域は、分析物と結合し、アプタザイム構造の立体構造変化をもたらし、これは、順に、ＤＮＡザイムドメインが活性立体構造を採ること、従って、その触媒活性を回復することを可能にする。活性アプタザイムによる基質１（基質１）の切断は、最初にＢＬとハイブリダイズされた第２のＤＮＡザイム（Ｄｚ２）の放出をもたらす。次いで、活性Ｄｚ２は、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を用いて標識された場合に、蛍光シグナルの増大をもたらすその基質（基質２）を切断し得る。  パネルｉｉ）は、分子スイッチのＢＬ内に直接アプタマーを包含することを含む例示的戦略を表す。パネルｉｉ）では、ＤＮＡザイム（Ｄｚ）は、ＢＬとハイブリダイズされ、一時的不活性化をもたらす。ＢＬは、Ｄｚと相補的ではないが、アプタマー配列から構成される中心部分によって接続される、Ｄｚとハイブリダイズする５’および３’末端からなる。標的分析物（リガンド）の存在下で、アプタマーは、ＢＬの立体構造変化をもたらし得る分析物と結合し、ＤｚからのＢＬの分離をもたらし、Ｄｚの触媒活性を回復し得る。次いで、活性Ｄｚは、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を用いて標識され得るその基質（基質）を切断するよう機能し得、切断は、蛍光シグナルの増大をもたらし得る。  パネルｉｉｉ）は、パネルｉ）に表わされる戦略から達成された蛍光シグナルを実証する。
【発明を実施するための形態】
【０１９３】
定義
以下に説明する意味を持つある種の用語および語句が本明細書では使用される。
【０１９４】
本出願において使用されているように、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本文中に他に特記されなければ、複数の指示対象を含む。例えば、用語「ＭＮＡザイム」は複数のＭＮＡザイムも含む。文脈中に他に特記されることも具体的に反対のことを述べてもいなければ、単数形の整数、ステップまたは要素として本明細書で列挙されている本発明の整数、ステップ、または要素は、列挙されている整数、ステップまたは要素の単数形と複数形の両方を明確に包含する。
【０１９５】
違った形で示されていなければ、用語「含む(comprising)」および「有する(having)」は、「主として含むが、必ずしもそれだけではない」を意味する。さらに、「含む(comprise)」および「含む(comprises)」などの単語「含む(comprising)」の変形は、対応して様々な意味を有する。従って、例えば、標的分子Ａを「含む(comprising)」試料とはもっぱら標的分子Ａからなるまたは１つもしくは複数の異なる種類（複数可）の標的分子（例えば、標的分子Ｂおよび／または標的分子Ｃ）を含むことがある。同様に、ホスファターゼ活性を「有する(having)」酵素はホスファターゼ活性のみを有することもあれば、他の追加の活性（例えば、キナーゼ活性）も有することがある。
【０１９６】
用語「ブロッキングオリゴヌクレオチド」、「ブロッカー」、「ブロッカー分子」および「ＢＬ」は本明細書では互換的に使用され、同じ意味を有する。ＢＬは相補的塩基対合により第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、それによって第２のオリゴヌクレオチドがＢＬの不存在下であれば果たすことができる機能を果たすのを防止することができるオリゴヌクレオチドである。例えば、ＢＬは、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしている場合、他のオリゴヌクレオチド（複数可）とハイブリダイズするその能力を阻害することによりおよび／または活性な立体構造を形成するその能力を阻害することにより、第２のオリゴヌクレオチドが機能するのを防止することができる。ＢＬとのハイブリダイゼーションにより阻害される第２のオリゴヌクレオチドの特定の機能には、例えば、基質を触媒的に改変する、活性ＭＮＡザイムに成分パートザイムをもたらす、核酸二重鎖の１つの鎖を置換することができる「リリーサーオリゴヌクレオチド」として機能する、ポリメラーゼ媒介伸長が可能なプライマーの役割を果たす、相補鎖のポリメラーゼ媒介合成のための鋳型の役割を果たす、かつ／またはエンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼによる認識および消化が可能な二重鎖を形成する能力が含まれる。ＢＬの存在下で阻害される第２のオリゴヌクレオチドの特定の機能には、リガンドがアプタザイムに結合するのをブロックする能力が含まれないことがある。ＢＬは相補的塩基対合により第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしない１つまたは複数のセグメントを含むことがある。あるいは、ＢＬの全てのヌクレオチドが第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができることがある。ＢＬは、第２のオリゴヌクレオチドに相補的である領域にＢＬに対する結合親和性を有する別の実体［例えば、下に定義される「リリーサーオリゴヌクレオチド」（ＲＬ）］の付加によりＢＬがハイブリダイズしている第２のオリゴヌクレオチドから解離されることがある。例えば、ＲＬはＢＬのハイブリダイズしている鎖間に形成される二重鎖におけるＢＬによりもたらされるオーバーハングセグメント（「トーホールド」）に相補的塩基対合によりハイブリダイズして、第２のオリゴヌクレオチドを機能的に不活性化することがある。ＲＬは、同じＢＬまたはそのセグメントに対する第２のオリゴヌクレオチドの結合親和性と比べてＢＬまたはそのセグメントに対してより強い、等しい、または減少した結合親和性を有することがある。ＢＬは、個別の実体、より大きなオリゴヌクレオチドのセグメント、または、例えば、連結核酸配列（例えば、ヘアピンループリンカー配列）によりもしくは他の任意の手段［例えば、Ｃ３ホスホラミドスペーサーなどのスペーサー改変およびスペーサー９とスペーサー１８などのエチレングリコールスペーサー（それぞれがヘアピン構造のループを形成するのに使用することができる）を含む非核酸化学］により別のオリゴヌクレオチド（例えば、第２のオリゴヌクレオチド）に連結していることもある。ＢＬは触媒核酸酵素の１つまたは複数の基質を含むこともある。ＢＬは、１つまたは複数の標的分析物による認識のための１つまたは複数のアプタマー基質を含むこともあるが、そのような場合、ＢＬは相補的結合によるアプタザイムの機能を阻害することができないことがあるまたは阻害することができない。ＢＬは、アプタマー配列（複数可）と標的分析物（複数可）の間の相互作用により、ＢＬがハイブリダイズしている第２にオリゴヌクレオチドから解離されることがある。
【０１９７】
用語「リリーサーオリゴヌクレオチド」、「リリーサー」、「リリーサー分子」および「ＲＬ」は本明細書では互換的に使用され、同じ意味を有する。ＲＬは所与の核酸二重鎖の第１の鎖と相補的塩基対合によりハイブリダイズし、それによって二重鎖の第２の鎖を置換して第２の鎖が第１の鎖と再ハイブリダイズするのを実質的にまたは完全に防止することができるオリゴヌクレオチドである。ＲＬは、第２の鎖に相補的である領域における二重鎖の第１の鎖に対する結合親和性を有するために二重鎖のハイブリダイズしている鎖の解離に影響を与え、結合に続いてＲＬは第２のオリゴヌクレオチドを置換する。ＲＬは相補的塩基対合により第１の鎖とハイブリダイズしない１つまたは複数のセグメントを含むことがある。ＲＬは、相補的塩基対合により最初は所与の核酸二重鎖の第１の鎖によりもたらされるオーバーハングセグメント（「トーホールド」）にハイブリダイズすることがある。ＲＬは、第２の鎖が同じ第１の鎖またはそのセグメントに対して有する結合親和性と比べて、第１の鎖またはそのセグメントに対してより強い、同じ、または減少した結合親和性を有することがある。非限定的な例として、ＲＬは相補的塩基対合により、下で定義されている「分子スイッチ」の成分であるＢＬにハイブリダイズすることがある。ＲＬとＢＬのハイブリダイズにより、ＢＬは、それが以前ハイブリダイズしていた分子スイッチの別の成分（例えば、触媒核酸酵素）から隔離され、それによって酵素を触媒的に活性な状態で放出することがある。この筋書きでは、ＢＬは、ＲＬを含むオリゴヌクレオチドの成分である、独立したオリゴヌクレオチドとしてもたらされることがある、またはＲＬに連結していることもある（例えば、連結核酸または非核酸スペーサー配列により）。
【０１９８】
本明細書で使用される用語「分子スイッチ」とは、ＲＬ、ＮＲＦ、プライマー、触媒核酸酵素、および／または触媒核酸酵素成分のいずれか１つまたは複数を含有する複合体のことであり、この複合体は、ＢＬへのハイブリダイゼーションによる不活性化、または相補的塩基対合によりスイッチにハイブリダイズしているＢＬの除去（例えば、ＢＬの切断またはＲＬによる置換により）による活性化を含むが、これらに限定されない種々の方法により機能的に不活性または活性にすることができる。
【０１９９】
用語「鋳型」、「ポリメラーゼ鋳型」、「ポリメラーゼに対する鋳型」、「ポリメラーゼに対する核酸鋳型」、および「核酸ポリメラーゼ鋳型」は本明細書では互換的に使用され同じ意味を有し、鋳型配列と塩基対相補性を有する核酸の新しい配列を生成するポリメラーゼに対する鋳型としての働きをする核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）の一本鎖配列のことである（すなわち、核酸の新しい配列は鋳型のアンチセンスである）。本発明においては様々な種類の鋳型が有用である。鋳型の非限定的な例には、ＤＮＡザイムのアンチセンス核酸配列を含む「ＤＮＡザイム鋳型」、「Ｄｚ鋳型」または「Ｄｚ−鋳型」が含まれ、これらの鋳型は活性ＤＮＡザイムを合成するためにポリメラーゼにより使用されることが可能である。鋳型の他の例には、プライマーのアンチセンス核酸配列を含む「プライマー鋳型」または「プライマー合成のための鋳型」が含まれ、これらの鋳型は活性プライマーを合成して別の分子の合成を開始するためにポリメラーゼにより使用されることが可能である。鋳型の追加の例には、二重鎖ＲＥ認識部位の１つの鎖を含む「ＲＥ鋳型」が含まれ、この鋳型をポリメラーゼによりコピーして、二重鎖ＲＥ認識部位の第２の鎖を合成し、こうしてＲＥにより切断可能な機能的配列を作り出すことができる。
【０２００】
本明細書で使用される用語「標的」および「標的分子」とは、本明細書に記載される分子複合体による検出が可能である核酸、タンパク質、プリオン、小有機化合物、触媒核酸酵素補因子（例えば、二価または一価イオン）および全生物を含むが、これらに限定されない任意の分子のことである。例えば、標的は、ＭＮＡザイムの集合を指示するアセンブリーファシリテーターとして働く核酸、アプタマーに結合し、アプタマーへの結合によりＡｐｔａ−ＭＮＡザイムもしくは他のアプタザイムを活性化することができる任意の分子、またはＢＬ分子からの触媒核酸、ＲＬ、プライマーもしくはＮＲＦの放出を促進することができる任意の分子である。
【０２０１】
本明細書で使用される用語「ヌクレアーゼ認識断片」および「ＮＲＦ」とは、相補的塩基対合により第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、それによってヌクレアーゼ酵素の認識部位を作り出すことができるオリゴヌクレオチドのことである。認識部位の作製によりＮＲＦと第２のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより形成される二重鎖の成分に対する酵素の活性が開始される（例えば、エキソヌクレアーゼによる第２のオリゴヌクレオチドの消化）。ＮＲＦは第２のオリゴヌクレオチドにその全長にわたって相補的であってもよい。あるいは、ＮＲＦの１つまたは複数のセグメントは第２のオリゴヌクレオチドに相補的であり、１つまたは複数の他のセグメントは相補的でなくてもよい。
【０２０２】
用語「プライマー」、「プライマー配列」および「プライマーオリゴヌクレオチド」は本明細書では互換的に使用され同じ意味を有する。プライマーとは、相補的塩基対合により別の核酸の一本鎖セグメントにハイブリダイズし、それによって一本鎖セグメントに塩基対相補性を有する核酸の新しい鎖のポリメラーゼ酵素による合成を促進することができる短いオリゴヌクレオチド（例えば、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１５、または１０ヌクレオチド長未満）のことである。
【０２０３】
用語「触媒核酸分子」、「触媒核酸」、「触媒核酸酵素」、「核酸酵素」および「触媒核酸配列」は本明細書では互換的に使用され同じ意味を有する。これらの用語は、１つまたは複数の基質の特定の認識および触媒的改変が可能である任意の核酸を包含する。例えば、基質（単数または複数）は核酸であることがあり、触媒的改変はライゲーションまたは切断であることがある。本明細書で使用される触媒核酸酵素には、ＤＮＡ分子またはＤＮＡ含有分子、ＲＮＡまたはＲＮＡ含有分子、およびＤＮＡ−ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡ含有分子が含まれる。触媒核酸酵素の非限定的な例には、ＤＮＡザイム（ＤＮＡ酵素およびデオキシリボザイムとしても知られている）、リボザイム（ＲＮＡ酵素およびＲＮＡザイムとしても知られている）および多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）が含まれる。触媒核酸酵素は本明細書では「イニシエーター触媒核酸酵素」または「イニシエーター酵素」と呼ばれることもあり、これらの酵素は本発明に従ってカスケードの第１ステップを開始する原因となる触媒核酸酵素のことである。「イニシエーター触媒核酸酵素」または「イニシエーター酵素」には、アプタマーまたはＭＮＡザイム成分がアプタマーに連結されているアプタ−ＭＮＡザイムにＤＮＡザイムまたはリボザイムが連結されているアプタザイムも含まれることがある。
【０２０４】
本明細書で使用されるように、用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は互換的に使用され同じ意味を有し、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレマイクロＲＮＡおよびプリマイクロＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、その誘導体、そのアンプリコンまたはその任意の組合せを含むが、これらに限定されないデオキシリボヌクレオチドおよび／もしくはリボヌクレオチド塩基の一本鎖もしくは二本鎖ポリマー、またはその類似体、誘導体、変異体、断片もしくは組合せのことである。非限定的な例として、核酸の供給源は、合成、哺乳動物、ヒト、動物、植物、真菌、細菌、ウイルス、古細菌またはその任意の組合せを含む群から選択されることがある。
【０２０５】
本明細書で使用されるように、用語「オリゴヌクレオチド」および「オリゴ」は互換的に使用され同じ意味を有し、ＤＮＡもしくはＤＮＡ含有核酸分子、ＲＮＡもしくはＲＮＡ含有分子、またはＤＮＡ−ＲＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡ含有分子のことである。オリゴヌクレオチドの非限定的な例には、核酸標的、ＢＬ、ＲＬ、ＮＲＦ、触媒核酸酵素（例えば、ＤＮＡザイム、リボザイム、ＭＮＡザイム）、基質、例えば、ＭＮＡザイム、ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムにより改変されることが可能な基質；本明細書に記載されるカスケードにおいて使用されるプライマーなどのプライマー；ならびにＭＮＡザイムの成分が含まれる。オリゴヌクレオチドは、下の表１に記載される付加または置換の任意の１つまたは複数を含むが、これらに限定されない少なくとも１つの付加または置換を含むことがある。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、ＤＮＡザイム、パートザイムまたはアプタマーとして機能することがある。本明細書で言及されるオリゴヌクレオチドは、例えば、化学合成（例えば、成分ヌクレオチドからまたはオリゴヌクレオチドの既存の断片へのヌクレオチド（複数可）の付加）によりを含むいかなる方法によっても合成することができる。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの複数の断片をライゲートするまたは他の方法で結合させることにより構築することもできる。本明細書で言及される「ライゲーション産物」は、リガーゼ酵素により互いに結合（ライゲート）されている２つ以上のオリゴヌクレオチドで構成されているオリゴヌクレオチドを含む核酸である。
【０２０６】
本明細書で使用される用語「ヌクレオチド」および「ヌクレオチド残基」および「塩基」は同じ意味を有し、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＵ、ならびにその誘導体または類似体を含むヌクレオチドを包含する（その非限定的な例は表１に収載されている）。
【０２０７】
核酸またはヌクレオチドとの関連で本明細書に使用される用語「誘導体」には、一体的に生成される（例えば、組換え手段により）または合成後に付加される（例えば、化学的手段により）任意の融合分子を含む、任意の機能的に等価な核酸またはヌクレオチドが含まれる。そのような融合物は、ＲＮＡもしくはＤＮＡがそこに付加されているまたはポリペプチド（例えば、ピューロマイシンまたは他のポリペプチド）、小分子（例えば、ソラレン）、もしくは抗体にコンジュゲートされている本発明のオリゴヌクレオチドを含むことがある。
【０２０８】
核酸またはヌクレオチドとの関連で本明細書に使用される用語「類似体」には、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子または残基に関係している物理的構造を有する化合物が含まれ、ＤＮＡもしくはＲＮＡ残基またはその類似体と水素結合を形成することができることがある（すなわち、類似体はＤＮＡもしくはＲＮＡ残基またはその類似体とアニールして塩基対を形成することができる）が、そのような結合は該化合物が用語「類似体」内に包含されるのにそれほど必要ではない。そのような類似体は、それが構造的に関係しているリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド残基とは異なる化学的および生物学的特性を有することがある。メチル化、ヨウ素化、臭素化またはビオチン化残基は類似体の例である。デオキシイノシン、Ｃ−５−イミダゾールデオキシウリジン、３−（アミノプロピニル）−７−デアザーｄＡＴＰ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、２’Ｏ−メチルキャップを含むヌクレオチド類似体を含有する活性なＤＮＡザイムが記載されている。他の類似体も、ＤＮＡザイム、リボザイムおよびＭＮＡザイムなどの触媒核酸酵素の触媒活性に適合性であり得る。例えば、１つの塩基の別の塩基での置換による、類似体の塩基での置換による、触媒活性のある核酸の変更、または糖成分もしくはリン酸ジエステル骨格の変更は当業者には複雑ではない。例えば、合成中にまたは合成後の特定の塩基の改変により変更することができる。塩基変更または塩基類似体などの変更を組み込んでいる触媒核酸を実験により試験すれば、触媒活性に対する変更された配列、または特定の類似体の効果を評価することができる。塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵの類似体は当技術分野では公知であり、サブセットは表１に収載されている。ヌクレアーゼ消化を阻害することができる類似体の非限定的な例も当技術分野では周知である。そのような類似体は戦略的にオリゴヌクレオチド内に置いて、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼによる切断を防止することができる。例として、ホスホロチオエート連結のＳｐ立体異性体は、制限エンドヌクレアーゼ、Ｌａｍｂｄａエキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（大腸菌）、エキソヌクレアーゼＩ（大腸菌）、エキソヌクレアーゼＴおよびＲｅｃＪを含むがこれらに限定されない多くのヌクレアーゼの切断を大いに阻害することで知られている。複数のホスホロチオエート連結を含めば、ヌクレアーゼ活性をブロックするのに極めて効果的であることが可能である。
【０２０９】
【表１】
0006336443.tif 000002
【表２】
0006336443.tif 000003
【０２１０】
本明細書で使用される用語「ＭＮＡザイム」および「多成分核酸酵素」とは、ＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーター分子（例えば、標的分析物）の存在下でのみ、集合して、１つまたは複数の基質を触媒的に改変することができる触媒的に活性な核酸酵素を形成する２つ以上のオリゴヌクレオチド配列（例えば、パートザイム）のことである。例えば、パートザイムＡおよびＢはそれぞれが標的分析物に結合することがある（例えば、核酸標的との相補的塩基対合により）。ＭＮＡザイムは、パートザイムＡおよびＢのセンサーアームが標的上で互いに隣接してハイブリダイズする場合にのみ形成される。ＭＮＡザイムの基質アームは基質に結合して、その基質の改変（例えば、切断またはライゲーション）はパートザイムＡおよびＢ上の部分的触媒ドメインの相互作用により形成されるＭＮＡザイムの触媒コアにより触媒される。本明細書で使用される用語「ＭＮＡザイム」および「多成分核酸酵素」が、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ／２００７／０４１７７４、ＷＯ／２００８／０４００９５、ＷＯ２００８／１２２０８４ならびに関連する米国特許出願公開第２００７−０２３１８１０号、第２０１０−０１３６５３６号、および第２０１１−０１４３３３８号のいずれか１つまたは複数に開示されているＭＮＡザイムを含む全ての既知のＭＮＡザイムおよび改変ＭＮＡザイムを包含することは理解されるであろう（これらの文書それぞれの内容は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる）。用語「ＭＮＡザイム」および「多成分核酸酵素」に包含されるＭＮＡザイムおよび改変ＭＮＡザイムの非限定的な例には、切断触媒活性のあるＭＮＡザイム（本明細書に例示されている）、１つまたは複数のアセンブリー阻害剤を含む分解しているまたは部分的に集合しているＭＮＡザイム、１つまたは複数のアプタマーを含むＭＮＡザイム（「アプタ−ＭＮＡザイム」）、１つまたは複数の切断型センサーアームおよび適宜１つまたは複数の安定化オリゴヌクレオチドを含むＭＮＡザイム、１つまたは複数の活性阻害剤を含むＭＮＡザイム、多成分核酸不活性プロ酵素（ＭＮＡｉ）、ならびにリガーゼ触媒活性のあるＭＮＡザイム（「ＭＮＡザイムリガーゼ」）が含まれ、これらＭＮＡザイムのそれぞれがＷＯ／２００７／０４１７７４、ＷＯ／２００８／０４００９５、ＷＯ２００８／１２２０８４、ＵＳ２００７−０２３１８１０、ＵＳ２０１０−０１３６５３６、および／またはＵＳ２０１１−０１４３３３８の１つまたは複数に詳細に記載されている。
【０２１１】
本明細書で使用される用語「アプタザイム」とは、アプタマードメインに連結していて、標的分析物の存在に依存するようにアロステリックにその活性を調節する触媒核酸（ＤＮＡザイムまたはリボザイムまたはＭＮＡザイム）のことである。アプタマーを触媒核酸または触媒核酸成分に組み込むための方法には、触媒核酸もしくは触媒核酸成分の１つもしくは複数のドメインへのアプタマーの直接コンジュゲーション、触媒核酸の非機能的領域へのアプタマーの組込み、または触媒核酸の機能的領域に隣接したアプタマーのコンジュゲーション（両方が調節因子オリゴヌクレオチドに部分的にハイブリダイズしていて分析物の不存在下ではアプタザイムの触媒活性を阻害する）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１２】
用語「アセンブリーファシリテーター分子」、「アセンブリーファシリテーター」、「ＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーター分子」、および「ＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーター」は本明細書では互換的に使用されており、１つまたは複数のパートザイム成分のセンサーアームとハイブリダイズして、それによって触媒的に活性なＭＮＡザイムの集合を促進することができる実体（例えば、核酸）のことである。アセンブリーファシリテーターは、切断、リガーゼまたは他の酵素活性を有するＭＮＡザイムの集合を促進することができる。アセンブリーファシリテーターは単一分子であるまたは１つまたは複数のオリゴヌクレオチド「パートザイム」のセンサーアームにハイブリダイズする複数の別々の分子を含んでいることがある。アセンブリーファシリテーターは検出されるまたは定量される標的（例えば、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレマイクロＲＮＡおよびプリマイクロＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、その誘導体、アンプリコン、またはその任意の組合せからなる群より選択される核酸）であることもある。
【０２１３】
本明細書で使用されるように、用語「パートザイム」、「パートザイム成分」および「パートザイムオリゴヌクレオチド」は互換的に使用され同じ意味を有し、それぞれがＤＮＡ含有および／またはＲＮＡ含有オリゴヌクレオチドのことであり、その２つ以上がＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーター分子の存在下でのみ、共になって「ＭＮＡザイム」を形成することができる。パートザイムは３つのドメイン、すなわち、化学的改変を触媒するＭＮＡザイムの触媒コアの一部を形成する「触媒」ドメイン、アセンブリーファシリテーター（例えば、標的分析物）と会合するおよび／またはこれに結合する「センサーアーム」ドメイン、ならびに基質と会合するおよび／またはこれに結合する「基質アーム」ドメインを含む。
【０２１４】
用語「基質」および「基質分子」は本明細書では互換的に使用され、触媒分子（例えば、触媒核酸酵素またはタンパク質酵素）による認識および触媒的改変が可能である任意の分子のことである。基質は、例えば、触媒核酸酵素による特定の認識および触媒的改変が可能である一本鎖または二本鎖核酸を含むことがある。触媒的に改変される基質は、間接的および／または直接的手段により検出され得る。例えば、基質の触媒的改変は、基質が触媒的に改変されることに頼っているカスケードの１つまたは複数のそれに続くステップにより間接的に検出され得る。さらにまたはあるいは、基質の触媒的改変は、例えば、１つもしくは複数の改変された基質産物および／または基質の改変により直接生じる他の任意のシグナル（例えば、基質を切断しそれによって改変されていない基質上に存在する以前は対になっていたフルオロフォアとクエンチャー分子を空間的に分離することにより生じる蛍光シグナル）を直接検出することにより検出され得る。触媒分子により触媒的に改変されると直接検出することができる基質は、本明細書では「レポーター基質」または「レポータープローブ基質」とも呼ばれる。
【０２１５】
本明細書で使用されるように、用語「アプタマー」は、より高いレベルの構造、例えば、三次元結合ドメインまたはポケットのため高親和性および特異性を有する１つまたは複数のリガンドを認識する能力を有する核酸またはペプチド配列を包含する。アプタマーは、核酸、タンパク質、プリオン、小有機化合物、または全生物に結合することができる。本明細書で好ましいアプタマーは、吸着、回収、および繰り返し増幅の反復プロセスにより合成核酸の複雑なライブラリーから単離することができる短い一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーである。アプタマーは、アミノ酸、または抗生物質などの小分子からタンパク質、核酸構造物またはホールセルまでに及ぶ、ほとんどどんな標的に対しても作製することができる。
【０２１６】
本明細書で使用される用語「リガンド」とは、タンパク質、プリオン、ポリペプチド、ペプチドまたは核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、小有機化合物、ホールセルおよび全生物を含むが、これらに限定されない、高親和性および特異性でアプタマーに結合することができる任意の分子のことである。リガンドは「標的分析物」または「分析物」とも呼ばれることがある。
【０２１７】
２つ以上の核酸間での「ハイブリダイゼーション」への、または「ハイブリダイズ」している２つ以上の核酸への本明細書での言及は、核酸の全てまたは一部の間で相補的塩基対合を必要とすることは理解されるであろう。
【０２１８】
略語
以下の略語は本明細書でおよび本明細書を通じて使用される。
ＡＳ：アンチセンス
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸
ＢＬ：ブロッキングオリゴヌクレオチド
ＲＬ：リリーサーオリゴヌクレオチド
ＮＲＦ：ヌクレアーゼ認識断片
ExoIII：エキソヌクレアーゼＩＩＩ
ＮＥＳＡ：ニッキングエンドヌクレアーゼシグナル増幅
ＳＤＡ：鎖置換増幅
ＬＡＭＰ：ループ媒介等温増幅
ＲＣＡ：ローリングサークル増幅
ＴＭＡ：転写物媒介増幅
３ＳＲ：自家持続配列複製
ＮＡＳＢＡ：核酸配列ベース増幅
ＭＮＡザイムまたはＭｚ：多成分核酸酵素
ＤＮＡザイムまたはＤｚ：デオキシリボ核酸酵素
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
Ｆ：フルオロフォア色素分子
Ｑ：クエンチャー分子
ｄＮＴＰα：αチオデオキシヌクレオチド
ＪＯＥまたは６−ＪＯＥ：６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン
ＦＡＭまたは６−ＦＡＭ：６−カルボキシフルオレセイン
ＴｘＲ：テキサスレッド
オリゴ：オリゴヌクレオチド
ＩＢ：アイオワブラック
ＩＤＴ：集積ＤＮＡ技術
Ｐｏｌ：ポリメラーゼ
ＲＥ：制限エンドヌクレアーゼ
Ｔ４  ＰＮＫ：Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
【０２１９】
詳細な説明
以下の詳細な説明は、当業者が本発明を実行することができるのに十分に詳細に本発明の例示的態様を伝える。記載されている種々の態様の特長または限界は本発明の他の態様または本発明全体を必ずしも限定するものではない。従って、以下の詳細な説明は本発明の範囲を限定するものではなく、本発明は特許請求の範囲によってのみ定義される。
【０２２０】
上記の通り、現在利用可能なアッセイにより生じるシグナルを増幅するように設計された標的分子検出および方法のためのアッセイには数多くの限界がはっきり表れている。これらの限界の１つまたは複数に、本発明の組成物、キットおよび方法は取り組んでいる。
【０２２１】
標的の検出、同定および／または定量のための組成物、方法およびキットが提供される。
【０２２２】
本発明のいくつかの態様は分子スイッチとして機能する能力を有する分子複合体に関する。これらの複合体は、例えば、ＢＬへのハイブリダイゼーションにより機能的に不活性になることがあるＲＬ、ＮＲＦ、プライマー、触媒核酸酵素、触媒核酸酵素成分、またはポリメラーゼ鋳型のうちのいずれか１つまたは複数を含むことがある。複合体からＢＬを取り除けば残りの成分（複数可）は機能的に活性になることがある。あるいは、組成物は、例えば、ＢＬにハイブリダイズしておらず、ＢＬへのハイブリダイゼーションにより機能的に不活性になることがある機能的に活性なＲＬ、ＮＲＦ、プライマー、触媒核酸酵素、触媒核酸酵素成分、またはポリメラーゼ鋳型のうちのいずれか１つまたは複数を含むことがある。
【０２２３】
本発明の他の態様は、本発明の分子複合体を利用して標的分子および／またはシグナル増幅を検出するための方法に関する。方法は一般に、触媒核酸、ポリメラーゼ鋳型、プライマー、ＮＲＦもしくはＲＬ分子とＢＬ分子の間でのハイブリダイゼーションにより形成されることがある分子スイッチのための成分を含む組成物の使用を含む。このハイブリダイゼーションにより、ＢＬがそこから解離されるなどの時間まで、触媒核酸、ＮＲＦ、ＲＬまたはポリメラーゼ鋳型は機能的に不活性になることがある。これらの分子スイッチをもたらすことにより、検出およびシグナル増幅カスケードの展開は促進されてきた。
【０２２４】
例えば、ＢＬは、基質の１つまたは複数が切断されると、ＢＬが１つまたは複数の他の分子、例えば、相補的塩基対合により以前はＢＬにハイブリダイズしていた異なる触媒核酸、プライマー、ＮＲＦ、ＲＬおよび／またはポリメラーゼ鋳型から分離されるように、１つまたは複数の異なる触媒核酸分子の１つまたは複数の基質配列を含有することがある。ＢＬは、１つまたは複数の標的分析物が結合することができる１つまたは複数のアプタマーを含むことがある。アプタマー（複数可）への標的分析物（複数可）の結合により、ＢＬまたはさらに多くの他の分子、例えば、相補的塩基対合により以前はＢＬにハイブリダイズしていた異なる触媒核酸、プライマー、ＮＲＦ、ＲＬおよび／もしくはポリメラーゼ鋳型が分離することができる。ＢＬからの分離により、そのそれぞれの機能を果たす、すなわち、基質改変を触媒する、新しい核酸の合成をプライムする、ヌクレアーゼ活性を開始する、二重鎖中のオリゴヌクレオチドを放出する、またはポリメラーゼが鋳型の相補体であるヌクレオチドの配列を合成するための鋳型として働くこれらの分子の能力を回復することができる。
【０２２５】
別の例では、ＢＬへのハイブリダイゼーションにより機能的に不活性になった触媒核酸分子は、ＲＬ分子によりＢＬから分離され、それによってその触媒活性を回復させることができる。ＲＬは酵素の放出に続いてＢＬにハイブリダイズするが、そのプロセスは、ＤＮＡザイム、ＭＮＡザイムもしくは他の触媒核酸酵素、ニッキング酵素、他のエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼを含むがこれらに限定されない制限酵素、および／または鎖置換型ポリメラーゼ酵素などの酵素の活性により自律的に繰り返されることがあり、これらの酵素は単独でまたは組み合わされて機能し、ＲＬを形成されたＲＬ／ＢＬ複合体から遊離させることができる。このため、順々にＲＬはＢＬ隔離の追加のラウンドに関与して、それによってＢＬ／酵素複合体から追加の触媒酵素を放出することができる。
【０２２６】
追加の例では、ＢＬへのハイブリダイゼーションにより機能的に不活性になった触媒核酸は、その活性がＮＲＦまたはプライマーをもたらすことにより開始することができるヌクレアーゼ（例えば、ＲＥまたはエキソヌクレアーゼ）または鎖置換型ポリメラーゼの活性により直接活性化することができる。ＲＥを鎖置換型ポリメラーゼと共に使用して、ＲＥ切断（一本鎖ニッキングを含む）、プライマー伸長および鎖置換活性のサイクルを通じて新しい触媒核酸を連続して合成することができる。
【０２２７】
本明細書に記載される分子スイッチを使用して、最初の活性な触媒核酸（例えば、その標的アセンブリーファシリテーターの存在下でのＭＮＡザイム）によるＢＬの切断、および／または標的分析物がＢＬ内のアプタマーに結合することによるＢＬの除去が引き金となって機能的分子（例えば、別の触媒核酸、プライマー、ＮＲＦ、ＲＬまたはポリメラーゼ鋳型）が活性化され得る循環カスケードを構築することができる。機能的分子は別の触媒核酸を直接的にまたは間接的に（ヌクレアーゼまたはポリメラーゼなどのタンパク質酵素を動員することにより）活性化することができ、次に核酸がＢＬを切断するように機能し、追加の機能的分子を活性化することができる。循環フィードバックカスケードを標的の検出に続くシグナルの増幅のために使用することができる。
【０２２８】
本発明の他の態様は、本明細書に記載される分子複合体および適宜本発明の方法を実施するのに必要な他の成分（複数可）（例えば、ＭＮＡザイムおよびその成分、ＤＮＡザイム、ならびに／またはリボザイムなどの触媒核酸、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＬ、ＢＬ、ＮＲＦ、プライマー、ポリメラーゼ鋳型、基質および同類のもののうちのいずれか１つまたは複数）を含むキットに関する。
【０２２９】
組成物およびキット
本発明の方法を実行するための組成物およびキットが本明細書で提供される。ただの非限定的な例として、組成物およびキットは、触媒核酸酵素（例えば、ＭＮＡザイムおよび／もしくはそのパートザイム成分、ＤＮＡザイム、ならびに／またはリボザイム）、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＬ、ＢＬ、ＮＲＦ、プライマー、ポリメラーゼ鋳型、および基質（例えば、触媒核酸酵素、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼの基質）のいずれか１つまたは複数を含むことがある。
【０２３０】
組成物およびキットの様々な成分は機能的に不活性化された形態で提供し得る。例えば、成分は、ＢＬが成分にハイブリダイズしており、それによって成分がＢＬの不存在下で機能すると考えられるように機能するのを防止するＢＬを含む分子複合体で提供することができる。組成物およびキットに他の成分（例えば、ＲＬ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、ＮＲＦ、プライマー、および／または他の触媒核酸酵素）を含んでいれば、成分をＢＬから解離し、それによって成分の機能的能力を回復させる手段を提供することができる。
【０２３１】
さらにまたはあるいは、組成物およびキットの様々な成分は機能的に活性な形態で提供し得る。成分にハイブリダイズすることができるＢＬを含んでいれば、成分を不活性化する手段を提供し得る。
【０２３２】
従って、組成物およびキットの様々な成分は、成分がそれに続いて、ＢＬへのハイブリダイゼーションによる不活性化、または成分にハイブリダイズしていたＢＬの除去による活性化（例えば、ＢＬの切断、ＲＬによる置換または標的分析物がＢＬ内のアプタマーに結合することにより）を含むがこれらに限定されない様々な方法により機能的に不活性または活性になることができる分子スイッチの形態で提供することができる。
【０２３３】
組成物およびキット中に含まれるのが適している成分の非限定的な例は下に提供されている。
【０２３４】
触媒核酸酵素
本発明の組成物およびキットは、１つもしくは複数の異なる種類の触媒核酸酵素および／または１つもしくは複数のその成分（例えば、１つもしくは複数のパートザイムおよび／またはアセンブリーファシリテーター）および／または触媒核酸酵素もしくはその成分の相補体を含むことがある。
【０２３５】
触媒核酸酵素および／またはその成分は、酵素またはその成分が別のエレメント（例えば、ＢＬ）とのハイブリダイゼーションのため触媒的に不活性になる分子複合体で提供することができる。そのような場合、複合体の他のエレメント（複数可）からの触媒核酸酵素またはその成分の解離により、酵素は触媒活性が可能になり、それによって分子スイッチをもたらすことができる。
【０２３６】
さらにまたはあるいは、触媒核酸酵素および／またはその成分は、分子複合体の成分ではなく基質および／または標的の存在下で触媒活性が可能である個別の実体として提供し得る。そのような場合、酵素またはその成分は基質を改変することができ得る。いかなる特定の制限も課すことなく、基質はＢＬの成分、プライマーオリゴヌクレオチドまたはレポーター基質でもよい。この形態で与えられると、触媒核酸酵素またはその成分は、組成物もしくはキットの別の構成要素および／またはレポーター基質構成要素の成分である基質に対する特異性を有することがある。基質は触媒的に改変されると検出可能なシグナルをもたらすことができる。例えば、基質は１つまたは複数の検出可能な標識（例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー）を含むことがある。
【０２３７】
組成物およびキットは適切ないかなる触媒核酸酵素（複数可）（その非限定的な例にはＤＮＡザイム、ＭＮＡザイム、リボザイムおよび／またはアプタザイム）および／またはその成分（例えば、パートザイム（複数可）および／またはアセンブリーファシリテーター（複数可））も含むことができる。
【０２３８】
例えば、本発明の組成物およびキットはＤＮＡザイムを含むことがある。適切ないかなるＤＮＡザイムも利用することができる。ＤＮＡザイムは既知の／既存のＤＮＡザイムでもまたはインビトロ選択により新たに作製してもよい。ＤＮＡザイムはＲＮＡまたはＤＮＡ分子を切断するまたはライゲートすることができることがある。例えば、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、および／またはＰｂ２＋などの二価の金属イオンは、ＤＮＡザイムの補因子として与えてもよい。ＤＮＡザイムは、標的基質に特異的に結合する配列の領域である２つの非保存基質結合ドメイン（「ハイブリダイジングアーム」）に隣接している触媒ドメイン（触媒コア）を含むことがある。適切なＤＮＡザイムの非限定的な例には、２つの基質認識アームに隣接する１５デオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを含む１０：２３ＤＮＡザイムおよび８：１７ＤＮＡザイムが含まれる。
【０２３９】
さらにまたはあるいは、組成物およびキットはリボザイムを含むことがある。適切などんなリボザイムも利用し得る。リボザイムは天然のリボザイムでも人工的に作製されたリボザイムでもよい。リボザイムはＲＮＡまたはＤＮＡ分子を切断するまたはライゲートすることができることがある。例えば、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、および／もしくはＰｂ２＋などの二価の金属イオンならびに／または一価の陽イオンをリボザイムの補因子として与えてもよい。リボザイムは、標的基質に特異的に結合する配列の領域である２つの非保存基質結合ドメイン（「ハイブリダイジングアーム」）に隣接している触媒ドメイン（触媒コア）を含むことがある。あるいは、構造体が別々の標的および基質結合アームおよび触媒コアを含むことがある他のリボザイム構造体を想定している。適切なリボザイムの非限定的な例には、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、分岐リボザイム、マキシザイム、グループＩリボザイム、グループＩＩイントロンリボザイム、ＨＤＶリボザイム、ＲＮアーゼＰ、ＣＰＥＢ３リボザイム、ｇｌｍＳリボザイム、ペプチジルトランスフェラーゼ２３Ｓ  ｒＲＮＡ、ＶＳリボザイム、ＣｏＴＣリボザイムおよびＧＩＲ１リードザイムが含まれる。
【０２４０】
さらにまたはあるいは、本発明の組成物およびキットはＭＮＡザイム、触媒的に活性なＭＮＡザイムを形成することができるパートザイム成分、ＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーター、および／またはＭＮＡザイム基質のいずれか１つまたは複数を含むことがある。当業者には周知であるように、ＭＮＡザイムは、適切なアセンブリーファシリテーター（例えば、標的）にハイブリダイズすると２つ以上のパートザイムから自己集合する触媒的に活性な核酸酵素である。それぞれのパートザイム成分は部分的触媒コアを含み、このコアはＭＮＡザイムに集合すると結合して、基質を改変することができる単一の触媒コアを形成する。
【０２４１】
適切なＭＮＡザイムおよびその作製のための方法の非限定的な例は、例えば、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ／２００７／０４１７７４、ＷＯ／２００８／０４００９５、ＷＯ２００８／１２２０８４ならびに関連する米国特許出願公開第２００７−０２３１８１０号、第２０１０−０１３６５３６号、および第２０１１−０１４３３３８号のいずれか１つまたは複数に開示されている（これらの文書それぞれの内容は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる）。適切なＭＮＡザイムには、切断触媒活性のあるＭＮＡザイム、ライゲーション活性のあるＭＮＡザイム、１つまたは複数のアセンブリー阻害剤を含む分解しているまたは部分的に集合しているＭＮＡザイム、１つまたは複数のアプタマーを含むＭＮＡザイム（「アプタ−ＭＮＡザイム」）、１つまたは複数の切断型センサーアームおよび適宜１つまたは複数の安定化オリゴヌクレオチドを含むＭＮＡザイム、１つまたは複数の活性阻害剤を含むＭＮＡザイム、多成分核酸不活性プロ酵素（ＭＮＡｉ）、ならびにリガーゼ触媒活性のあるＭＮＡザイム（「ＭＮＡザイムリガーゼ」）が含まれ、これらＭＮＡザイムのそれぞれがＷＯ／２００７／０４１７７４、ＷＯ／２００８／０４００９５、ＷＯ２００８／１２２０８４、ＵＳ２００７−０２３１８１０、ＵＳ２０１０−０１３６５３６、および／またはＵＳ２０１１−０１４３３３８の１つまたは複数に詳細に記載されている。パートザイムオリゴヌクレオチドはＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーターの存在下で自己集合してＭＮＡザイムを形成する。一部の態様では、ＭＮＡザイムの存在を検出することができ、標的の存在を示している。なぜならば、ＭＮＡザイムはアセンブリーファシリテーターを含む標的の存在下でのみ形成されるからである。ＭＮＡザイムは、ＰＣＴ／ＡＵ２００６／００１４７３（ＷＯ２００７／０４１７７４として公表されている）におよびＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１５１７（ＷＯ２００８／０４００９５として公表されている）にさらに詳細に記載されており、これらの特許文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【０２４２】
当業者には公知のように、ＭＮＡザイム構造物は１つまたは複数のＤＮＡザイム（例えば、１０：２３および８：１７ＤＮＡザイム）および／またはリボザイムを土台としている。ＭＮＡザイムはリボヌクレオチド塩基および／またはデオキシリボヌクレオチド塩基および／またはその類似体を含むことがある。例えば、センサーアーム、基質アーム、またはＭＮＡザイムの触媒コアの１つもしくは複数は、１つもしくは複数のリボヌクレオチド塩基および／または１つもしくは複数のデオキシリボヌクレオチド塩基および／または１つもしくは複数のその類似体を含むことがある。一部の態様では、ＭＮＡザイムは、ＭＮＡザイムの触媒コア内に少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体を含む。デオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体は触媒活性に必要とされることがある。
【０２４３】
組成物およびキットのＭＮＡザイムは、当業者には周知の、類似体、誘導体、改変されたもしくは変更された塩基、リボヌクレオチド、糖もしくはリン酸骨格の変更、種々の欠失、挿入、置換、重複もしくは他の改変、またはこれらの任意の組合せなどの１つまたは複数の置換を含有することがある。分子が触媒活性を保持するように、そのような改変、置換、欠失、挿入、等を、センサーおよび／もしくは基質アームにおいてならびに／または触媒コア部分において加えてもよい。基質またはアセンブリーファシリテーターに結合させるアームへの置換および改変は十分に許容され、異なる基質／アセンブリーファシリテーターに分子を適合させることが可能になることがある。例えば、センサーアームを改変すれば、異なるアセンブリーファシリテーターに適合させることが可能になり、基質アームを改変すれば異なる基質に適合させることが可能になる。
【０２４４】
さらにまたはあるいは、本発明の組成物およびキットは、触媒核酸酵素の１つまたは複数の成分を含むことができる。例えば、組成物およびキットはＭＮＡザイムの個々の成分（複数可）（例えば、１つもしくは複数のパートザイムおよび／または１つもしくは複数のアセンブリーファシリテーター）を含むことがある。
【０２４５】
非限定的な例として、組成物およびキットは標的分子を認識すると、自己集合して、１つまたは複数の基質を改変することができる触媒的に活性なＭＮＡザイムを形成することができる個々のパートザイム（複数可）を含むことができる。このようにして形成されるＭＮＡザイムは、パートザイムセンサーアームがある種のアセンブリーファシリテーター［特定の標的分子（複数可）になることがある］にハイブリダイズする場合にのみ集合するかつ／またはＭＮＡザイムの基質アーム（複数可）にハイブリダイズすることができるある種の特定の基質（複数可）を触媒的に改変するだけであるように設計することができる。従って、組成物およびキットに含まれるＭＮＡザイムは、本発明に従って検出および／またはシグナル増幅カスケードを開始することができる「イニシエーター酵素」として使用するために設計することができる。
【０２４６】
例えば、パートザイムのセンサーアームのみを変更することにより、しかし基質アームはそのままにしておくことにより、その全てが検出のためにユニバーサルＭＮＡザイム基質を利用することができる様々な標的に特異的な多種多様のＭＮＡザイムを設計することができる。当業者であれば、標的ごとにそれに対応させたまたは他にない基質が必要になる面倒を省くことに関してこれにより提供される利点を認識されるであろう。それぞれの新しい標的はセンサーアーム部分の１つまたは複数において１つまたは複数の変更が必要なだけであり、基質アーム部分および触媒コア部分は一定のままであることが可能である。従って、ＭＮＡザイムを使用する単一の標的、および変更されたＭＮＡザイムを使用する一連のアッセイにおける複数の標的に単一のＭＮＡザイム基質を使用することができる。複数のＭＮＡザイム基質があれば、複数のＭＮＡザイムを標的ごとに１つ使用して単一のアッセイにおいて複数の標的を検出するマルチプレックス化が可能になる。ＭＮＡザイムを使用するそのようなマルチプレックス化された方法は溶液においてまたは支持システムに付着させて容易に実現される。このように、マルチプレックス化アッセイは、基質の１つもしくは複数、またはＭＮＡザイムパートザイムもしくはアセンブリーファシリテーター、または追加の酵素活性を本明細書に記載される支持体に付着させることを含むシステムにおいて実現することが可能であることが本明細書では想定されている。
【０２４７】
同様に、ＭＮＡザイムを操作してある種の標的基質に特異的にハイブリダイズさせ、これを触媒的に改変することができる。例えば、パートザイムの基質アームのみを変更することにより、しかしセンサーアームはそのままにしておくことにより、所与の標的に特異的であり一連の異なるＭＮＡザイム基質を認識し触媒的に改変する多種多様のＭＮＡザイムを設計することができる。いかなる特定の制限も課すことなく、基質は、ＲＬ、ＮＲＦ、プライマーオリゴヌクレオチド、ＢＬ、触媒核酸酵素またはその成分の成分を含むまたは成分であるオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡザイム、リボザイム、パートザイム、アセンブリーファシリテーター）であり得る。基質は、ＭＮＡザイムにより触媒的に改変されると検出可能なシグナルをもたらすことができるレポーター基質であり得る。
【０２４８】
ある特定の態様では、組成物およびキットのＭＮＡザイムを操作して、ユニバーサルまたはジェネリック基質に特異的にハイブリダイズし触媒的に改変することができる。ユニバーサルＭＮＡザイム基質を使用して、容易な設計変更を可能にして異なる標的を認識する新しいＭＮＡザイムを作り出すことにより迅速なアッセイ開発を可能にすることができる。基質アーム部分およびパートザイムの触媒コア部分はそのままにしておき、新しい標的に対して必要な１つまたは複数のパートザイムのセンサーアーム部分のみを変更することが可能である。ユニバーサル基質配列が与えられ、したがって同じ基質を多くの異なる標的のためにアッセイに組み込むことができる。さらに、同じ基質は、基質が溶液中に遊離しているまたは支持体に連結されているもしくは付着しているアッセイを含む、本明細書の様々な態様において方法に組み込むことができる。一連のユニバーサル基質はマルチプレックス反応において使用することができ、複数の標的の同時検出が可能になる。ユニバーサル基質を使用するＭＮＡザイム戦略は、それぞれの新しい標的に特異的なプローブの設計および使用が必要なＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＢｅａｃｏｎｓまたはハイブリダイゼーションプローブなどの検出技術よりも大きな利点を提供する。ＭＮＡザイム基質は普遍的でありいかなる標的にも有能なので、このユニバーサルＭＮＡザイム基質が切断されるといかなる標的の存在下でもシグナルの発生および増幅が可能になる。
【０２４９】
本発明の組成物およびキットに含まれるＤＮＡザイム、リボザイム、パートザイム、アセンブリーファシリテーターおよび／またはＭＮＡザイム基質は、標的に結合することができるアプタマーを含むことがある。好ましいアプタマーは、吸着、回収、および繰り返し増幅の反復プロセスにより合成核酸またはペプチドの複雑なライブラリーから単離することができる短い一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはペプチドを含むことがある。従って、アプタマーは、アミノ酸または抗生物質などの小分子からタンパク質および核酸構造物に及ぶほとんどどんな標的に対しても作製することができる。好ましい態様では、アプタマーには、例えば、好ましくは進化および選択技法により作製される核酸結合分子が含まれる。アプタマーは、例えば、上の表１のようにヌクレオチド類似体を含むが、これに限定されないＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子または両方の組合せを含むことがある。
【０２５０】
アプタマーの使用をリボザイムまたはＤＮＡザイムと組み合わせる戦略は当技術分野では公知である。そのような分子は一般にキメラであり、アプタマードメインとＤＮＡザイムまたはリボザイムドメインの両方を含有し、標的リガンドの存在により活性化される。アプタザイム機能的活性はアプタマードメインのその分析物への結合に応答してスイッチを入れることができる。アプタザイムを作製するための戦略には、リボザイムまたはＤＮＡザイムを、コミュニケーションドメイン(communication domain)を介してアプタマードメインと共に融合させることが含まれるが、これに限定されない。コミュニケーションドメインは、インビトロ選択法により進化させて、標的分析物の存在下でのみリボザイムまたはＤＮＡザイム活性を可能にするその能力を改良することができる。別の例となる戦略は、リボザイムまたはＤＮＡザイムにおいて構造的役割を果たしているだけの非機能的ステムループまたはヘアピンにアプタマーを組み込むことを含む。アプタマーはＤＮＡザイムまたはリボザイムに連結させてもよく、アプタマードメインと酵素ドメインの両方を、分析物の不存在下では酵素ドメインの触媒活性を阻害するのに使用される調節因子オリゴヌクレオチドに部分的にハイブリダイズしていてもよい。分析物の存在下では、アプタマーは分析物に結合して、酵素ドメインから調節因子オリゴヌクレオチドを放出しその触媒活性を回復させることができる。この場合、分析物の存在はアプタマーをＤＮＡザイムまたはリボザイムから除去し、その触媒活性を回復させることがある。アプタマーを使用して、ＤＮＡザイムまたはリボザイムの２つ以上の成分を互いに架橋し、次に酵素がその基質を改変することができるようにすることもできる。ヘミンに対するアプタマーを含有しヘミンの存在下ではペルオキシダーゼの活性を模倣して、様々な化学基質を触媒し蛍光、化学発光および比色シグナルを生じさせることができる独特の種類のＤＮＡザイムも存在する。好ましい態様では、アプタザイムは核酸分析物および／または非核酸分析物を検出するために使用されることがあり、アプタザイムもライゲーション産物も含まない核酸に相補的であるＢＬ分子内に存在する１つまたは複数の基質を改変することができる触媒核酸として作用することにより本明細書に記載されるカスケード反応を開始するのに使用することができる。
【０２５１】
アプタマーの使用とＭＮＡザイムを組み合わせる戦略も当技術分野では公知である。アプタマーに連結されたＭＮＡザイム成分を含有するアプタザイムはアプタ−ＭＮＡザイムと呼ばれることもある。例えば、ＭＮＡザイムの少なくとも１つのパートザイムはアプタマー（アプタ−パートザイム）ならびにヘアピンを形成ししたがってＭＮＡザイム集合を阻害することができる相補的配列を組み込むことができる。検出される分析物または標的はアプタ−パートザイムに結合し、こうして活性なＭＮＡザイムの集合を可能にすることがある。標的分析物の不存在下では、アプタ−パートザイムは、活性なＭＮＡザイムの集合を阻害するヘアピン構造を採用する。標的分析物の存在下では、標的分析物はアプタ−パートザイムのアプタマードメインに結合し、こうしてヘアピン構造を破壊して、アプタ−パートザイムが活性なＭＮＡザイムの集合に関与することが可能になる。次に、活性なＭＮＡザイムはＢＬ分子の一部として存在することのあるＭＮＡザイム基質を改変できることがあり、その後、分子スイッチ複合体内では以前は不活性であったＤＮＡザイムもしくは他の触媒核酸、ポリメラーゼ鋳型、またはプライマー、ＮＲＦもしくはＲＬ分子の機能を回復することができる。
【０２５２】
他の態様では、アプタマーは、アプタマーならびにヘアピン構造を形成することができる相補的阻害因子配列を組み込むアセンブリーファシリテーターの一部分として存在することがある。標的分析物の不存在下では、アセンブリーファシリテーターは、この成分の能力を阻害して活性なＭＮＡザイムの集合を指示するヘアピン構造を採用する。標的分析物の存在下では、標的分析物はアセンブリーファシリテーターのアプタマードメインに結合し、こうしてヘアピン構造を破壊して成分が活性なＭＮＡザイムの集合を指示することができるようになる。次に、活性なＭＮＡザイムはＢＬ分子の一部分として存在することがあるＭＮＡザイム基質を改変し、次に、分子スイッチ複合体内では以前は不活性であった触媒核酸、ポリメラーゼ鋳型、またはプライマー、ＮＲＦもしくはＲＬ分子の機能を回復することができる。
【０２５３】
当業者であれば、アプタマーをアセンブリーファシリテーター分子（複数可）のどちらかの末端に組み込むことができることは認識されるであろう。さらに、複数のアプタマーをパートザイムオリゴヌクレオチド成分の１つまたは複数に組み込むことができることは認識されるであろう。
【０２５４】
好ましい態様では、本発明の組成物およびキットに含まれるＤＮＡザイム、リボザイム、ＭＮＡザイム、もしくはその成分、および／またはその核酸基質を含む触媒核酸酵素は、標的分子に結合することができるアプタマーを含む第１のＢＬに完全にまたは部分的に相補的であってもよい。標的分析物などの標的分子の存在下では、標的分析物は、触媒核酸、触媒核酸成分、および／またはその核酸基質から第１のＢＬを分離させ得るアプタマーに結合し、触媒核酸または成分がその基質、および／または追加の触媒核酸成分とハイブリダイズする能力を回復させて、機能的触媒核酸酵素／基質複合体を形成することができる。次に、これを使用して、ＢＬ分子にハイブリダイズしている相補的オリゴヌクレオチドの機能性を阻害する第２のＢＬ分子内に存在する基質を改変し得る触媒核酸として作用することにより本明細書に記載されるカスケード反応を開始することができ、該相補的オリゴヌクレオチドはアプタザイムではない。
【０２５５】
他の好ましい態様では、１つまたは複数のアプタマー配列またはその部分はＢＬ分子内に存在していることがある。標的分析物の存在下では、標的分析物はアプタマーに結合し、これがアプタマーの立体構造を変化させることができ、ＢＬから触媒核酸、ＲＬ、プライマーまたはＮＲＦが分離されて、それに続いてそれぞれそれらの触媒、放出、プライミングおよびヌクレアーゼ開始活性が回復するが、該触媒核酸はアプタザイムではない。
【０２５６】
さらなる態様では、アプタマー配列は、活性な開始アプタ−ＭＮＡザイムが標的分析物の存在下でのみ形成される立体配置でパートザイム（アプタ−パートザイム）の末端に組み込みことができる。この場合、検出戦略に必要なパートザイムには、標準パートザイム、アプタマーがその末端の１つに組み込まれているパートザイムであるアプタ−パートザイム、アプタ−パートザイムとパートザイムの両方に結合して活性な開始アプタ−ＭＮＡザイムの集合（標的の存在下で）を可能にするアセンブリーファシリテーター、基質、およびアプタマー配列の少なくとも一部分とパートザイム配列の基質結合アームの一部分に及ぶ領域でアプタ−パートザイムにハイブリダイズするアセンブリー阻害剤が含まれる。標的の不存在下では、アセンブリー阻害剤はアプタ−パートザイムに結合して、レポータープローブ基質の切断を防止する。標的の存在下では、標的はアプタ−パートザイムのアプタマー配列に結合し、アセンブリー阻害剤の結合を防止して、開始アプタ−ＭＮＡザイムによるＭＮＡザイム基質の結合および切断を可能にする。従って、活性開始アプタ−ＭＮＡザイムは標的の存在下でのみ形成され、ＭＮＡザイム基質を改変することができる。
【０２５７】
さらに、アセンブリー阻害剤は別々の分子であることが可能であるまたはＭＮＡザイム複合体に関与する成分の１つに組み込むことができることは当業者であれば認識されるであろう。
【０２５８】
１つまたは複数のアプタマーは、パートザイム、アセンブリーファシリテーターまたはＭＮＡザイム基質を含むオリゴヌクレオチド成分のいずれにでも組み込むことができることも当業者であれば認識されるであろう。さらに、アプタマーはこれらのオリゴヌクレオチドのいずれか１つのどちらかの末端に組み込まれ得る。１つまたは複数のアプタマーはＢＬに組み込まれ得る。アプタマーは、例えば、どちらかの末端にまたは内部に組み込まれ得る。
【０２５９】
本発明の組成物およびキット中の触媒核酸酵素（例えば、ＤＮＡザイム、リボザイム、ＭＮＡザイム、パートザイム、アセンブリーファシリテーター、基質、および／またはアプタザイム）は相補的塩基対合により他の分子（複数可）とハイブリダイズしている分子複合体の成分としてもたらすことができる。
【０２６０】
一部の態様では、組成物およびキットは、相補的塩基対合により１つまたは複数のブロッカーオリゴヌクレオチド（複数可）にハイブリダイズしている触媒核酸酵素（例えば、ＤＮＡザイム、リボザイムまたはＭＮＡザイム）を含む分子複合体を含むことがある。触媒核酸酵素からＢＬ（複数可）が解離すると、酵素は基質（例えば、レポーター基質または第２の分子複合体中に存在する基質）とハイブリダイズしてこれを触媒的に改変することができる。このようにして、ＢＬの除去は分子スイッチを活性化するように機能することができる。
【０２６１】
一部の態様では、組成物およびキットは、相補的塩基対合により少なくとも１つの他のＢＬにハイブリダイズしているＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを含む分子複合体を含むことがある。ＢＬはＤＮＡザイムまたはリボザイムに全体的にまたは部分的にハイブリダイズしていてもよい。ＤＮＡザイムまたはリボザイムは、ＢＬ（複数可）とのハイブリダイゼーションのため機能的に不活性になることがある。ＢＬ（複数可）からＤＮＡザイムまたはリボザイムが解離すると、ＤＮＡザイムまたはリボザイムが触媒活性を回復できる。このように、１つまたは複数のＢＬ（複数可）にハイブリダイズしているＤＮＡザイムまたはリボザイムを含む分子複合体は分子スイッチをもたらし得る。
【０２６２】
一部の態様では、分子複合体中の触媒核酸にハイブリダイズしているＢＬは、相補的塩基対合によりＤＮＡザイムまたはリボザイムにハイブリダイズしている２つ以上のセグメント、および２つのハイブリダイズしているセグメント間に位置する少なくとも１つの中間セグメントであって、中間セグメント（複数可）が相補的塩基対合によりＤＮＡザイムまたはリボザイムにハイブリダイズしていない中間セグメントを含むことがある。ＢＬは触媒核酸酵素の基質を含むこともあれば含まないこともある。
【０２６３】
例えば、ＢＬは、ＢＬがハイブリダイズしているＤＮＡザイムもしくはリボザイムの１つもしくは複数の基質、および／または異なる触媒核酸酵素の１つもしくは複数の基質を含むことがある。いかなる特定の制限もなしに、ＢＬの１つもしくは複数の中間セグメント（複数可）は、ＢＬがハイブリダイズしているＤＮＡザイムもしくはリボザイムの基質、または異なる触媒核酸酵素の基質を含むことがある。基質のヌクレオチド配列は、ＤＮＡザイムまたはリボザイムの触媒コアのヌクレオチド配列に部分的に相補的である、全体的に相補的である、または全体的に非相補的であることもある。従って、複合体のＢＬ中の基質は、ＤＮＡザイムまたはリボザイムの触媒コアに部分的であるが不完全にハイブリダイズしている、全体的にハイブリダイズしている、または全体的にハイブリダイズしていないこともある。
【０２６４】
非限定的な例として、ＢＬは、それぞれが相補的塩基対合によりＤＮＡザイムまたはリボザイムの触媒コアの別個のハイブリダイジングアームおよび領域にハイブリダイズしている第１と第２のセグメント、ならびに第１と第２のセグメントの間に位置する中間セグメントを含むことがある。中間セグメントは触媒核酸酵素の基質を含むことがある。中間セグメントは、ＤＮＡザイムまたはリボザイムの触媒コアヌクレオチドのいくつかまたは全てにまたがるがハイブリダイズしていないことがある。あるいは、ＢＬの中間セグメントはＤＮＡザイムまたはリボザイムのいかなる触媒コアヌクレオチドにもまたがっていないことがある。従って、中間セグメントはＤＮＡザイムまたはリボザイムの触媒コアに部分的にしかし不完全にハイブリダイズしている、または全体的にハイブリダイズしていないことがある。一部の態様では、中間セグメントの基質はＤＮＡザイムまたはリボザイムの触媒コアに部分的にしかし不完全にハイブリダイズしている、または全体的にハイブリダイズしていないことがある。従って、中間セグメント内の基質を含むがこれに限定されないＢＬの中間セグメントは、一部の態様では、ＤＮＡザイムまたはリボザイムの１つまたは複数の触媒コアヌクレオチドにハイブリダイズしているが、全ての触媒コアヌクレオチドにハイブリダイズしているわけではないことがある。中間セグメント内の基質を含むがこれに限定されないＢＬの中間セグメントは、ＤＮＡザイムまたはリボザイム触媒コアの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチドを除く全てにハイブリダイズしていることがある。
【０２６５】
一部の態様では、ＢＬの中間セグメント内の１つまたは複数の基質（複数可）は分子複合体中でＢＬにハイブリダイズしていない同じＤＮＡザイムまたはリボザイムの基質であることがある（すなわち、それは異なる触媒核酸の基質である）。そのような場合、ＢＬにハイブリダイズしているＤＮＡザイムまたはリボザイムは基質を切断することができない。
【０２６６】
他の態様では、ＢＬの中間セグメント内の１つまたは複数の基質（複数可）は分子複合体中でＢＬにハイブリダイズしている同じＤＮＡザイムまたはリボザイムの基質であることがある。そのような場合、ＤＮＡザイムまたはリボザイムは、ＢＬの中間領域よりもＢＬの第１と第２のセグメントとハイブリダイズしている量のほうが多いため、基質を切断することを妨げられることがある。
【０２６７】
一部の態様では、中間セグメントの基質内のヌクレオチドの数を含むがこれに限定されないＢＬの中間セグメント中のヌクレオチドの数は、分子複合体中でＢＬにハイブリダイズしているＤＮＡザイムまたはリボザイムの触媒コアヌクレオチドの数を上回る（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５の追加のヌクレオチドだけ）ことがある。特定の制限なしで、基質はＤＮＡザイムまたはリボザイムにハイブリダイズしていないままであるループ構造内にもたらされることがある。
【０２６８】
他の態様では、中間セグメントの基質内のヌクレオチドの数を含むがこれに限定されないＢＬの中間セグメント中のヌクレオチドの数は、分子複合体中でＢＬがハイブリダイズしているＤＮＡザイムまたはリボザイムの触媒コアヌクレオチドの数を上回らないことがある。
【０２６９】
一部の態様では、ＤＮＡザイムまたはリボザイムの触媒コアとＢＬの中間セグメントの間に少なくとも１つの塩基対ミスマッチ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ミスマッチ）が存在することがある。
【０２７０】
一部の態様では、ＤＮＡザイムまたはリボザイムの触媒コアとＢＬの中間セグメント内の基質配列の間に少なくとも１つの塩基対ミスマッチ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ミスマッチ）が存在することがある。
【０２７１】
一部の態様では、ＤＮＡザイムまたはリボザイムのアンチセンス触媒コアとＢＬの中間セグメントの間に少なくとも１つの塩基対ミスマッチ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ミスマッチ）が存在することがある。
【０２７２】
一部の態様では、ＤＮＡザイムまたはリボザイムのアンチセンス触媒コアとＢＬの中間セグメント内の基質配列の間に少なくとも１つの塩基対ミスマッチ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ミスマッチ）が存在することがある。
【０２７３】
組成物およびキットは、ＢＬ全体が触媒核酸と、および／または触媒コア残基を含む触媒核酸のセグメントとハイブリダイズしていることがあるＢＬおよび触媒核酸（例えば、ＤＮＡザイム、ＭＮＡザイムまたはリボザイム）を含む分子複合体を含むことがある。例えば、ＤＮＡザイムまたはリボザイムの触媒コアおよびＢＬの配列が全体的に相補的であることがあり、したがってＢＬと酵素が相補的塩基対合により全体的にハイブリダイズすることがある。そのような場合、ＢＬが酵素による触媒的改変を促進する特定の残基（複数可）［例えば、特定のリボヌクレオチド（複数可）］を含まないために、酵素はハイブリダイズしたＢＬを触媒的に改変することはない。
【０２７４】
本発明の組成物およびキットは、リンカーがブロッカーオリゴヌクレオチドの１つの末端を触媒核酸の１つの末端に結合させる分子複合体を含むことがある。例えば、ＤＮＡザイムもしくはリボザイムの５’末端はＢＬの３’末端に連結していることがある、またはＤＮＡザイムもしくはリボザイムの３’末端はＢＬの５’末端に連結していることがある。適切ないかなる手段でも使用してＢＬをＤＮＡザイムまたはリボザイムに連結することができる（例えば、連結核酸配列または非核酸化学を使用することにより）。
【０２７５】
例えば、分子複合体は、ブロッカーオリゴヌクレオチドの１つの末端をＤＮＡザイムまたはリボザイムの１つの末端に連結するヘアピンループを含むことがある。ヘアピンループは対向するヌクレオチドが塩基対相補性を共有するステム部分を含むことがある。あるいは、ヘアピンループは１つまたは複数の対向するヌクレオチドが塩基対相補性を共有しないステム部分を含むことがある。ヘアピンループまたはそのセグメント（例えば、ステム部分またはループ部分の鎖）はプライマーオリゴヌクレオチドの結合部位を含むことがある。
【０２７６】
さらにまたはあるいは、分子複合体は複合体から伸長している少なくとも１つの一本鎖オーバーハングセグメント（例えば、３’オーバーハングおよび／または５’オーバーハング）を含むことがある。一本鎖オーバーハングセグメント（複数可）は、ＢＬのハイブリダイズしていないセグメントまたはＤＮＡザイムもしくはリボザイムのハイブリダイズしていない一本鎖セグメントにより形成されることがある。一本鎖オーバーハングセグメント（複数可）は、別のオリゴヌクレオチドまたはそのセグメント（例えば、プライマー、ＮＲＦ、ＲＬ、またはそのセグメント）の結合部位を含むことがある。
【０２７７】
一部の態様では、組成物およびキットは、イニシエーター触媒核酸酵素および／またはスイッチの触媒核酸酵素の触媒機能に必要な補因子（例えば、例えば、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、および／もしくはＰｂ２＋などの二価の金属イオンならびに／または一価の陽イオン）を除いて、本明細書に記載される分子スイッチを活性化するのに必要な成分を全て含むことがある。ただの非限定的な例として、組成物およびキットは、イニシエーター触媒核酸酵素およびＢＬにハイブリダイズしている第１の触媒核酸酵素を含む分子スイッチを含むことがある。特定の補因子の存在下で、イニシエーター触媒核酸酵素はＢＬを直接触媒的に改変してＢＬと第１の触媒核酸酵素を解離させ、それによって検出可能なシグナルの発生を促進（直接的にまたは間接的に）できることがある。あるいは、イニシエーター触媒核酸酵素は、特定の補因子の存在下で、組成物またはキット中に与えられる別の成分を触媒的に改変することができ得る。この触媒的改変は、順に、分子スイッチと相互作用することができる成分（例えば、ＲＬ、ＮＲＦ、プライマー）をもたらし、（直接的にまたは間接的に）酵素とＢＬを解離させて、それによって検出可能なシグナルの発生を促進することがある。
【０２７８】
ＢＬ分子
本発明の組成物およびキットはブロッカーオリゴヌクレオチド（ＢＬ）分子を含むことがある。
【０２７９】
ＢＬは、相補的塩基対合により第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、それによって他の分子と相互作用することから第２のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるその能力を阻害すること、および／または活性な立体構造を形成するその能力を阻害することにより第２のオリゴヌクレオチドが機能を果たすのを防止することができるオリゴヌクレオチドである。このようにして、ＢＬの存在は第２のオリゴヌクレオチドがＢＬの不存在下の場合と同じように機能するのを防止する。ＢＬの存在下で阻害される第２のオリゴヌクレオチドの特定の機能には、基質を触媒的に改変する能力、活性なＭＮＡザイムのための成分パートザイムをもたらす能力、核酸二重鎖の１つの鎖を置換することができる「リリーサーオリゴヌクレオチド」として機能する能力、ポリメラーゼ媒介伸長が可能なプライマーとして働く能力、相補鎖のポリメラーゼ媒介合成の鋳型として働く能力、および／またはエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる認識および消化が可能である二重鎖を形成する能力が含まれ得る。ＢＬの存在下で阻害される第２のオリゴヌクレオチドの特定の機能には、リガンドがアプタザイムに結合するのをブロックする能力は含まれないことがある。例えば、ＢＬは、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしている場合、第２のオリゴヌクレオチドが他のオリゴヌクレオチド（複数可）とハイブリダイズするのを防止することができる。ＢＬは、第２のオリゴヌクレオチドに相補的であるＢＬの少なくとも１つのセグメントに結合親和性を有する別の実体［例えば、リリーサーオリゴヌクレオチド（ＲＬ）］の添加により、ＢＬがハイブリダイズしている第２のオリゴヌクレオチドから解離することができる。ＲＬはいくつかの場合、鎖置換を促進することができる。この場合、ＲＬは、ＢＬまたはそのセグメントに対する第２のオリゴヌクレオチドの結合親和性と比べて、同じＢＬまたはそのセグメントに対してより強い、等しい、または減少した結合親和性を有することがある。従って、本発明の組成物およびキットにＢＬを組み込めば、ＢＬのハイブリダイゼーションを使用して所与の成分を機能的に不活性化することができ、ＢＬの除去を使用して所与の成分を機能的に活性化することができる分子スイッチの提供が促進される。
【０２８０】
ＢＬまたはＢＬのセグメントは全標的オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセグメントと塩基対相補性を共有していることがある。ＢＬに相補的であるオリゴヌクレオチドは、例えば、プライマー、ＮＲＦ、ＲＬ、オリゴヌクレオチド基質、触媒核酸分子またはその成分（例えば、ＤＮＡザイム、リボザイムまたはＭＮＡザイム、アプタ−ＭＮＡザイムまたはアセンブリーファシリテーター）であり得る。一部の態様では、ＢＬまたはＢＬのセグメントは、アプタザイムまたはアセンブリーファシリテーターと塩基対相補性を有しないまたはハイブリダイズすることができないことがある。
【０２８１】
ＢＬは、ＢＬの全長に沿って第２のオリゴヌクレオチドに相補的であるように設計することができる。あるいは、ＢＬは相補的塩基対合により第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない１つまたは複数のセグメントを含むことがある。
【０２８２】
ＢＬは別個のオリゴヌクレオチドとして組成物およびキット中に与えられることがあり、そのような場合、ＢＬは別のオリゴヌクレオチドまたはそのセグメントとハイブリダイズする可能性がある。そのような場合、１つの分子の３’末端はもう一方の５’末端とハイブリダイズし、逆の場合も同じであることがある（図１、パネルｉ）参照）。あるいは、同じ末端（すなわち、５’と５’、３’と３’）がハイブリダイズして２つの成分間で疑似環構造を作り出すことがある（図１、パネルｉｉ）参照）。
【０２８３】
ＢＬは、例えば、プライマー、ＮＲＦ、ＲＬ、オリゴヌクレオチド基質、触媒核酸分子またはその成分を含む、ＢＬを設計してハイブリダイズさせるオリゴヌクレオチドなどの別のオリゴヌクレオチドの成分として与えられることがある。一部の態様では、ＢＬは、連結核酸または非核酸スペーサー配列によりもう一方のオリゴヌクレオチドに結合させることができる。例えば、ＢＬの５’末端はもう一方のオリゴヌクレオチドの３’末端に連結させることができる、またはＢＬの３’末端はもう一方のオリゴヌクレオチドの５’末端に連結させることができる。適切などんな手段を使用してＢＬをもう一方のオリゴヌクレオチドに連結することができる（例えば、連結核酸配列または非核酸化学を使用することにより）。ＢＬは、ブロッカーオリゴヌクレオチドの１つの末端をもう一方のオリゴヌクレオチドの１つの末端に連結させるヘアピンループによりもう一方のオリゴヌクレオチドに連結させることができる。ヘアピンループは対向するヌクレオチドが塩基対相補性を共有しているステム部分を含むことがある。ヘアピンループまたはそのセグメント（例えば、ステム部分またはループ部分の鎖）は、プライマーオリゴヌクレオチドの結合部位を含むことがある。
【０２８４】
ＢＬとプライマー、ＮＲＦ、ＲＬまたは触媒核酸分子もしくはその成分との間でハイブリダイズするとプライマー、ＮＲＦ、ＲＬまたは触媒核酸の可逆性の機能的不活性化が生じ、それによって分子スイッチをもたらすことができる。
【０２８５】
第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしている複合体中にＢＬがもたらされると、複合体は少なくとも１つの一本鎖オーバーハングセグメント（例えば、３’オーバーハングおよび／または５’オーバーハング）を含むことがある。一本鎖オーバーハングセグメント（複数可）は、ＢＬのハイブリダイズしていないセグメントまたはＢＬがハイブリダイズしている第２のオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡザイムまたはリボザイム）のハイブリダイズしていない一本鎖セグメントにより形成されることがある。一本鎖オーバーハングセグメント（複数可）は、別のオリゴヌクレオチドの、または別のオリゴヌクレオチドのセグメント（例えば、プライマー、およびＮＲＦまたはＲＬ）の結合部位を含むことがある。
【０２８６】
ＢＬは触媒核酸酵素（例えば、ＤＮＡザイム、リボザイム、および／またはＭＮＡザイム）の１つの基質、または複数の基質（例えば、１つ、２つ、３つ以上の基質）を含むことがある。ＢＬが複数の基質を含む態様では、基質（複数可）の１つまたは複数が第１の触媒核酸酵素の基質（複数可）であることがあり、基質（複数可）の１つまたは複数が第１の触媒核酸酵素とは異なる基質特異性を有する第２の異なる触媒核酸酵素の基質（複数可）であることがある。あるいは、複数の基質はそれぞれが、同じ基質特異性を有する触媒核酸酵素により認識されることがある。
【０２８７】
ＢＬは１つまたは複数のアプタマー配列を含むことがある。標的分析物の存在下で、標的分析物がアプタマーに結合し、アプタマーの立体構造が変化することがあり、触媒核酸、パートザイム、ＲＬ、プライマーまたはＮＲＦがＢＬから分離し、それに続いてそれぞれそれらの触媒、放出、プライミングおよびヌクレアーゼ開始活性が回復することがある。
【０２８８】
ＲＬ分子
本発明の組成物およびキットはリリーサーオリゴヌクレオチド分子（ＲＬ）を含むことがある。
【０２８９】
ＲＬは、所与の核酸二重鎖の第１の鎖とハイブリダイズし、それによって所与の核酸二重鎖の第２の鎖を置換し、第２の鎖の第１の鎖への再アニーリングを実質的にまたは完全に防止することができるオリゴヌクレオチドである。ＲＬは、第１の鎖またはそのセグメントに対する第２のオリゴヌクレオチドの結合親和性と比べて、同じ第１の鎖またはそのセグメントに対してより強い、等しい、またはいくつかの場合は減少した結合親和性を有することがある。第１の鎖に対するこの結合親和性にもかかわらず、ＲＬは、相補的塩基対合により第１の鎖とハイブリダイズしない１つまたは複数のセグメントを含むことがある。
【０２９０】
ＲＬ分子は、ＢＬオリゴヌクレオチドを含むがこれに限定されない第２の分子に全体的にまたは部分的に相補的であることがある。
【０２９１】
ＲＬは、以前は他のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていたＢＬを置換し（例えば、置き換え）または除去し、それによってそれらの他のオリゴヌクレオチドが機能する能力を回復することができる成分として本発明の組成物およびキット中に与えられることがある。従って、ＲＬは、ハイブリダイズしたＢＬを含む複合体からＢＬを隔離し、それによって分子スイッチを機能的に活性にするように設計されている別個の実体として与えられることがある。
【０２９２】
例えば、別個の実体として与えられる場合、ＲＬは、触媒核酸もしくはその成分（例えば、ＤＮＡザイム、リボザイム、ＭＮＡザイムパートザイム、アセンブリーファシリテーター）、ＮＲＦ、プライマー、オリゴヌクレオチド基質、または第２のＲＬのいずれかと二重鎖になっているＢＬにより形成される３’または５’オーバーハングセグメントに結合するように設計することができる。これらの態様では、ＲＬは、放出を目的とするオリゴヌクレオチドに相補的な領域でＢＬとの結合親和性を有し、したがって以前はＢＬにハイブリダイズしていたオリゴヌクレオチド（複数可）の置換（すなわち、ＲＬは、最初は二重鎖であったオリゴヌクレオチドに代わってＢＬにハイブリダイズする）を促進するように設計されている。ＢＬに対するＲＬの結合親和性を、当業者には公知の標準技法を使用して最適化し測定することが可能である。一部の態様では、ＲＬの長さはＢＬが結合しているオリゴヌクレオチドの長さを（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドだけ）上回っていることがある。
【０２９３】
さらにまたはあるいは、ＲＬは分子複合体の成分として与えられることがあり、したがって機能的に不活性な形態で与えられることがある（図４、パネルｉ））。いかなる特定の制限も課すことなく、ＲＬは、ＢＬ、触媒核酸酵素またはその成分（例えば、ＤＮＡザイム、リボザイム、パートザイム、アッセンブリーファシリテーター）などの別のオリゴヌクレオチドの成分に連結している、または成分であるオリゴヌクレオチドであることがある。ＲＬは、連結核酸または非核酸スペーサー配列によりもう一方のオリゴヌクレオチドに結合していることがある。例えば、ＲＬの５’末端はもう一方のオリゴヌクレオチドの３’末端に連結していることがある、またはＲＬの３’末端はもう一方のオリゴヌクレオチドの５’末端に連結していることがある。適切ないかなる手段も使用してＲＬをもう一方のオリゴヌクレオチドに連結することができる（例えば、連結核酸配列または非核酸化学を使用することにより）。ＲＬは、ＲＬの１つの末端をもう一方のオリゴヌクレオチドの１つの末端に連結する核酸配列のヘアピンループによりもう一方のオリゴヌクレオチドに連結していることがある。ヘアピンループは対向するヌクレオチドが塩基対相補性を共有するステム部分を含むことがある。あるいは、ヘアピンループは、１つまたは複数の対向するヌクレオチドが塩基対相補性を共有していないステム部分を含むことがある。ヘアピンループまたはそのセグメント（例えば、ステム部分またはループ部分の鎖）はプライマーオリゴヌクレオチドの結合部位を含むことがある。
【０２９４】
ＮＲＦ分子
本発明の組成物およびキットはヌクレアーゼ認識断片（ＮＲＦ）分子を含むことがある。
【０２９５】
ＮＲＦは、相補的塩基対合により第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、それによってヌクレアーゼ酵素の認識部位を作り出すことができるオリゴヌクレオチドである。認識部位の創造により、ＮＲＦと第２のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより形成される二重鎖の成分に対するヌクレアーゼ酵素の活性（例えば、エキソヌクレアーゼによる第２のオリゴヌクレオチドの消化、またはエンドヌクレアーゼによる第２のオリゴヌクレオチドのニッキング）が開始される。ＮＲＦはその全長に沿って第２のオリゴヌクレオチドに相補的であることがある。あるいは、ＮＲＦの１つまたは複数のセグメントは第２のオリゴヌクレオチドに相補的であることがあり、１つまたは複数の他のセグメントは第２のオリゴヌクレオチドに相補的ではないことがある。本発明の組成物およびキット中に含まれるためのＮＲＦは、標的核酸の配列と同一であるまたは標的核酸の配列に相補的であるヌクレオチドの配列を部分的にまたは全体的に含むことがある。
【０２９６】
本発明の組成物およびキット中に含まれるためのＮＲＦは、２つのオリゴヌクレオチドの二重鎖（例えば、ＢＬと別のオリゴヌクレオチドの間で形成される二重鎖）中に存在するオーバーハングセグメントに相補的塩基対合によりハイブリダイズするように設計することができる。ＮＲＦがオーバーハングセグメントにハイブリダイズすると、ヌクレアーゼにより認識され、したがってそのようにして形成された二重鎖の少なくとも１つの鎖のヌクレアーゼ消化を促進することができる配列をもたらすまたは完成させることができる。さらに、ＮＲＦは二重鎖のどちらかのオリゴヌクレオチドに相補的ではないセグメント（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド長）を含むように設計することができる。これは、残りがオーバーハングセグメントにハイブリダイズしていて、それによってＮＲＦをヌクレアーゼによる消化に対して抵抗性にするのに役立つ場合、ＮＲＦのハイブリダイズしていない一本鎖部分をもたらすのに役立つことがある。ＮＲＦのハイブリダイズしているおよびハイブリダイズしていないセグメントはＮＲＦの対向する末端に位置付けることができる。
【０２９７】
本発明の組成物およびキット中のＮＲＦは、本明細書に記載される分子スイッチにハイブリダイズして活性化することができる別個の成分として与えることができる。例えば、ＮＲＦは本明細書に記載される分子スイッチ中のＢＬにより形成される３’オーバーハングセグメントにハイブリダイズするように設計することができる。ＮＲＦの第１の５’セグメントは、相補的塩基対合によりＢＬの３’オーバーハングにハイブリダイズして、それによってヌクレアーゼ認識鋳型を形成するように設計することができ、ＮＲＦの第２の３’セグメント（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド長）はＢＬ（または、スイッチ内でＢＬがハイブリダイズしているオリゴヌクレオチド）と配列相補性を共有していないように設計することができる。
【０２９８】
さらにまたはあるいは、ＮＲＦは分子複合体の成分として与えられることがあり、したがって機能的に不活性な形態で与えられることがある。いかなる特定の制限も課すことなく、ＮＲＦはＢＬ、ＲＬ、触媒核酸酵素またはその成分（例えば、ＤＮＡザイム、リボザイム、パートザイム、アッセンブリーファシリテーター）などの別のオリゴヌクレオチドに連結している、または別のオリゴヌクレオチドの成分として与えられることがある。例えば、ＮＲＦはＢＬにハイブリダイズしているヘアピン型構造で与えることができる。ＮＲＦは、相補的塩基対合によりＢＬにハイブリダイズしている第１と第２のセグメント、およびＢＬにハイブリダイズしていない第１と第２のセグメントの間の中間セグメントを含むことがある。ＮＲＦにハイブリダイズしていないＢＬの部分は触媒核酸酵素（例えば、イニシエーター触媒核酸酵素）の基質を含むことがある。ＮＲＦは、連結核酸または非核酸スペーサー配列によりもう一方のオリゴヌクレオチドに結合していることがある。例えば、ＮＲＦの５’末端はもう一方のオリゴヌクレオチドの３’末端に連結していることがある、またはＮＲＦの３’末端はもう一方のオリゴヌクレオチドの５’末端に連結していることがある。適切ないかなる手段も使用してＮＲＦをもう一方のヌクレオチドに連結することができる（例えば、連結核酸配列または非核酸化学を使用することにより）。ＮＲＦは、ＮＲＦの１つの末端をもう一方のオリゴヌクレオチドの１つの末端に連結する核酸配列のヘアピンループによりもう一方のオリゴヌクレオチドに連結していることがある。ヘアピンループは対向するヌクレオチドが塩基対相補性を共有するステム部分を含むことがある。あるいは、ヘアピンループは、１つまたは複数の対向するヌクレオチドが塩基対相補性を共有していないステム部分を含むことがある。ヘアピンループまたはそのセグメント（例えば、ステム部分またはループ部分の鎖）はプライマーオリゴヌクレオチドの結合部位を含むことがある。
【０２９９】
プライマー
本発明の組成物およびキットはプライマーオリゴヌクレオチドを含むことがある。
【０３００】
プライマーは、相補的塩基対合により別の核酸の一本鎖セグメントにハイブリダイズし、それによってポリメラーゼ酵素による一本鎖セグメントに対して塩基対相補性を有する核酸の新しい鎖の合成を促進することができる短いオリゴヌクレオチド（例えば、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１５、または１０ヌクレオチド長未満）である。プライマーがハイブリダイズする別の核酸の単一セグメントは、ポリメラーゼに鋳型をもたらすことができ、この鋳型は本明細書ではポリメラーゼ鋳型とも呼ばれる。プライマーの伸長を介してポリメラーゼにより合成される核酸の新しい鎖は鋳型の相補体であるヌクレオチドの配列を含む。そのようなものとしての鋳型の機能はポリメラーゼによって読み取られる配列を与え、そのようにして相補的ヌクレオチドの正確な配列での挿入を指示することである。
【０３０１】
本発明の組成物およびキットに含まれるプライマーは、別個のオリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖オリゴヌクレオチド、オーバーハングまたは非相補的ヌクレオチドのループを含む二本鎖オリゴヌクレオチド）にハイブリダイズするように設計することができる。非限定的な例には、ＲＬ、ＢＬ、ＮＲＦ、基質オリゴヌクレオチド、触媒核酸またはその成分（例えば、ＤＮＡザイム、リボザイム、ＭＮＡザイム、パートザイム、アッセンブリーファシリテーター）が含まれる。
【０３０２】
さらにまたはあるいは、本発明の組成物およびキットに含まれるプライマーは、複合体（例えば、分子スイッチ）中に存在するオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように設計することができる。例えば、プライマーは複合体中の二本鎖オリゴヌクレオチドのオーバーハングセグメントと、または非相補的ヌクレオチドを含む複合体中のヘアピンループセグメントにハイブリダイズするように設計することができる。
【０３０３】
一部の態様では、プライマーはＢＬにハイブリダイズしているヘアピン型構造で与えられることがある。ＢＬは相補的塩基対合によりプライマーにハイブリダイズしている第１と第２のセグメント、およびプライマーにハイブリダイズしていない第１と第２のセグメントの間の中間セグメントを含むことがある。プライマーにハイブリダイズしていないＢＬの部分は触媒核酸酵素（例えば、イニシエーター触媒核酸酵素）の基質を含むことがある。
【０３０４】
他の態様では、プライマーは触媒核酸酵素（例えば、ＤＮＡザイム、リボザイム、ＭＮＡザイム、アプタザイム）の基質の成分として与えられることがある。プライマーは機能的に不活性な形態で（例えば、分子複合体内で隔離されているためおよび／またはより長い基質配列の成分であるため）基質内に存在することがある。触媒核酸により基質が切断されると、プライマーが放出（すなわち、活性化）されることがある。一部の態様では、触媒核酸酵素により基質が切断されるだけで活性化されたプライマーを放出するのに十分であり得る。他の態様では、基質の切断後のプライマーの改変が必要なこともある（例えば、その３’末端の近位でまたは内でのプライマーの改変）。ただの非限定的な例として、プライマーは、適切な酵素（例えば、Ｔ４  ＰＮＫ）によりその３’末端で２’３’環状リン酸を除去する改変が必要になることがある。
【０３０５】
プライマーは、ポリメラーゼもしくはその成分による伸長に適しておりおよび／またはヌクレアーゼ酵素の完全なもしくは部分的な認識部位を含むことがある。
【０３０６】
本発明の組成物およびキットに含まれるプライマーは、別個の成分として与えられることがある。さらにまたはあるいは、プライマーは分子複合体の成分として与えられることがあり、したがって機能的に不活性な形態で与えられることがある。いかなる特定の制限も課すことなく、プライマーは、ＢＬ、ＲＬ、触媒核酸酵素もしくはその成分（例えば、ＤＮＡザイム、リボザイム、パートザイム、アッセンブリーファシリテーター）、または触媒核酸酵素の基質（例えば、ＭＮＡザイム基質）などの別のオリゴヌクレオチドに連結している、または別のオリゴヌクレオチドの成分として与えられることがある。プライマーは、連結核酸または非核酸スペーサー配列によりもう一方のオリゴヌクレオチドに結合していることがある。例えば、プライマーの５’末端はもう一方のオリゴヌクレオチドの３’末端に連結していることがある、またはプライマーの３’末端はもう一方のオリゴヌクレオチドの５’末端に連結していることがある。適切ないかなる手段も使用してプライマーをもう一方のオリゴヌクレオチドに連結することができる（例えば、連結核酸配列または非核酸化学を使用することにより）。プライマーは、プライマーの１つの末端をもう一方のオリゴヌクレオチドの１つの末端に連結するヘアピンループによりもう一方のオリゴヌクレオチドに連結していることがある。ヘアピンループは対向するヌクレオチドが塩基対相補性を共有するステム部分を含むことがある。
【０３０７】
オリゴヌクレオチド
ＤＮＡザイム、リボザイム、アプタザイム、ＭＮＡザイム、およびそのそれぞれの基質、ＭＮＡザイム成分（例えば、パートザイム、アッセンブリーファシリテーター）、プライマー、ポリメラーゼ鋳型、ＮＲＦ、ＢＬならびにＲＬ分子などの本発明の組成物およびキットに含まれるオリゴヌクレオチドは、当業者には周知である、類似体（例えば、表１に収載されている類似体）、誘導体、改変されたもしくは変更された塩基、リボヌクレオチド、糖もしくはリン酸骨格の変更、様々な欠失、挿入、置換、重複もしくは他の改変、またはこれらの任意の組合せなどの１つまたは複数の置換を含有することがある。そのような改変、置換、欠失、挿入、等は、オリゴヌクレオチドがその機能を保持する限りいかなる位置で行ってもよい。オリゴヌクレオチドへの置換および改変は十分に許容され、ある種の条件下でまたは反応の効率の改善のために機能するように分子を適合させることを可能にし得る。例えば、１つまたは複数のヌクレオチド類似体を含むことによるＢＬ分子の改変は、その標的の存在下での第２のＤＮＡザイムまたはＭＮＡザイムによる基質領域の切断に続いて、ＤＮＡザイムまたは他の触媒核酸分子の改良された放出を促進することができる。
【０３０８】
当業者であれば、ＤＮＡザイム、リボザイム、ＭＮＡザイム、およびそのそれぞれの基質、ＭＮＡザイム成分（例えば、パートザイム、アッセンブリーファシリテーター）、プライマー、基質、ポリメラーゼ鋳型、ＮＲＦ、ＢＬまたはＲＬ分子がデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、または両方を含むことがあることは認識されるであろう。オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含むことがあり、いくつかの場合にはデオキシリボヌクレオチドおよび／またはその類似体からなることがある。
【０３０９】
制限酵素
組成物およびキットは１つまたは複数の制限酵素を含むことがある。制限酵素はタイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩまたはタイプＩＶ制限酵素であってもよい。制限酵素は一般に、サブユニット組成、切断位置、配列特異性および補因子要件に基づいてこれらのタイプに分類されている（表２参照）。
【０３１０】
【表３】
0006336443.tif 000004
【０３１１】
本発明の組成物およびキットに含めるのに適した制限酵素の非限定的な例は表２に収載されている。当業者であれば、広範囲の制限酵素が、鎖置換型ポリメラーゼ酵素の活性、ＮＲＦにより一度始動される触媒核酸の直接的活性化またはＲＬ分子の再利用による触媒核酸の間接的活性化と共同した触媒核酸の合成を含む反応に適合することは認識されるであろう。例えば、制限酵素データベース、ＲＥＢＡＳＥ（ｈｔｔｐ：／／ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｒｅｂａｓｅ／ｒｅｂａｓｅ．ｈｔｍｌ）に収載されている多くの制限酵素はそのような反応の展開に適合することになる。下の表３は、本発明における変動する特異性および特徴の制限酵素の例を与えている。
【０３１２】
【表４】
0006336443.tif 000005
【表５】
0006336443.tif 000006
【表６】
0006336443.tif 000007
【０３１３】
当業者であれば、α−チオ−デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰα）を含むがこれに限定されないヌクレオチド類似体を組み込むことによってＤＮＡ二重鎖の１つの鎖を保護することにより、標準ＲＥを操作してニッキング酵素として機能させることもできることは認識されるであろう。
【０３１４】
一部の態様では、ニッキング酵素クラスのＲＥが組成物およびキット中に与えられる。ニッキング酵素を含む制限酵素は、鎖置換型ポリメラーゼ酵素と共に含まれることがある。
【０３１５】
エキソヌクレアーゼ活性のある酵素
ＲＥおよび触媒核酸酵素に加えて、核酸配列を切断する能力のある他のタンパク質酵素が本明細書に記載される組成物およびキット中に含まれることがある。これらの酵素のいくつかは、核酸の末端からヌクレオチドの除去をもたらすエキソヌクレアーゼ活性を有する。エキソヌクレアーゼの適切で非限定的な例には、ヌクレアーゼＢＡＬ−３１、エキソヌクレアーゼＩ（大腸菌）、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（大腸菌）、Ｔ７エキソヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼＴが含まれる。エンドヌクレアーゼの例には、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩおよびリョクトウヌクレアーゼが含まれる。有用なヌクレアーゼのサブセットの特性は表４Ａに収載されている。
【０３１６】
ホスファターゼ活性のある酵素
組成物およびキットはホスファターゼ活性を含む１つまたは複数の酵素を含むことがある。ホスファターゼ活性を含む酵素は核酸からのリン酸基（複数可）の除去を触媒することができる。核酸に対するホスファターゼ活性を示す酵素の非限定的な例には、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４  ＰＮＫ）および仔牛腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）が含まれる。酵素（例えば、Ｔ４  ＰＮＫ）はポリヌクレオチドの３’末端からのリン酸基（複数可）の除去を触媒することができる。
【０３１７】
【表７】
0006336443.tif 000008
【０３１８】
鎖置換型ポリメラーゼ酵素
本発明の組成物およびキットはポリメラーゼ（例えば、鎖置換活性のあるポリメラーゼ）を含むことがある。
【０３１９】
当業者に公知であるように、鎖置換とは合成中に遭遇するハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を置換するポリメラーゼの能力を言い表す。この置換された下流オリゴヌクレオチド鎖は分解されず無傷のままでいる。適切な鎖置換型ポリメラーゼの非限定的な例には、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント、Ｐｙｒｏｐｈａｇｅ３１７３、およびＳｅｑｕｅｎａｓｅ２．０ポリメラーゼまたはその変異体が含まれる。
【０３２０】
基質
本発明の組成物およびキットは酵素（例えば、ＤＮＡザイム、リボザイム、アプタザイムおよび／またはＭＮＡザイムもしくはアプタ−ＭＮＡザイム）による改変が可能である基質を含むことがある。
【０３２１】
基質は、触媒核酸酵素を含む酵素により認識される、作用を受けるまたは改変されることが可能な、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレマイクロＲＮＡおよびプリマイクロＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、その誘導体、そのアンプリコンまたはその任意の組合せ（デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチド塩基の混合ポリマーを含む）を含むが、これらに限定されないデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド塩基の任意の一本鎖または二本鎖ポリマー、またはその類似体、誘導体、変異体、断片もしくは組合せであることがある。
【０３２２】
基質は切断またはライゲーションを含むが、これらに限定されない様々な酵素活性により改変されることがあり、酵素による基質の改変は、酵素の触媒活性を示す検出可能な効果をもたらすことができる。
【０３２３】
核酸酵素の基質は、アミノ酸、ペプチドもしくはタンパク質または（“New strategies in Chemical synthesis and Catalysis”, B.Pignataro in Wiley-VCH, 2012）の表６．１に概略を述べている任意の化学的構成要素などの非核酸構成要素も含むこともある。
【０３２４】
基質は、酵素の触媒活性のため生じる改変型の基質の定量および／または検出を促進する１つまたは複数の特長を含むレポーター基質であることがある。レポーター基質は、溶液中で遊離しているまたは、例えば、表面に、もしくは別の分子に結合している（または「連結されている」）ことがある。レポーター基質は、例えば、フルオロフォア（クエンチャーなどの１つまたは複数の追加の成分と共にまたはなしで）、放射性標識、ビオチン（例えば、ビオチン化）または化学発光標識を含む多種多様な手段のいずれによっても標識することができる。これら種々の標識は、触媒核酸酵素により改変（例えば、切断）されると検出可能なシグナルを生じさせる手段をもたらすことができる。
【０３２５】
基質は複数の触媒核酸酵素により認識され、触媒的に作用を受けるユニバーサル基質であることがある。ユニバーサル基質は固体支持体に繋ぎ止められることがある。本発明の組成物およびキットに含まれる基質は、触媒核酸による認識および改変が可能な別個の成分として与えることができる。本発明の他の態様は１つよりも多い触媒核酸により認識され切断することができる基質に関する。例として、単一核酸基質は、ＤＮＡザイムの基質結合アームとＭＮＡザイムのパートザイム成分の基質結合アームが両方とも同じ該単一核酸基質に相補的である限り、ＤＮＡザイムとＭＮＡザイムの両方により切断可能であり得る。そのような場合、ＤＮＡザイムの特定の触媒コア配列およびＭＮＡザイムのパートザイム対の触媒コア部分は基質内の「切断」部位での切断と適合することがある。
【０３２６】
さらにまたはあるいは、基質は分子複合体の成分として与えられることがあり、従って、機能的に不活性な形態で与えられることがある。いかなる特定の制限も課すことなく、１つまたは複数の基質は、ＢＬ、ＲＬ、ＮＲＦ、触媒核酸酵素もしくはその成分（例えば、ＤＮＡザイム、リボザイム、パートザイム、アッセンブリーファシリテーター）などの別のオリゴヌクレオチドに連結している、または別のオリゴヌクレオチドの成分として与えられることがある。基質は、連結核酸または非核酸スペーサー配列によりもう一方のオリゴヌクレオチドに結合していることがある。例えば、基質の５’末端はもう一方のオリゴヌクレオチドの３’末端に連結していることがある、または基質の３’末端はもう一方のオリゴヌクレオチドの５’末端に連結していることがある。適切ないかなる手段も使用して基質をもう一方のオリゴヌクレオチドに連結することができる（例えば、連結核酸配列または非核酸化学を使用することにより）。基質は、基質の１つの末端をもう一方のオリゴヌクレオチドの１つの末端に連結するヘアピンループによりもう一方のオリゴヌクレオチドに連結していることがある。ヘアピンループは対向するヌクレオチドが塩基対相補性を共有するステム部分を含むことがある。あるいは、ヘアピンループは１つまたは複数の対向するヌクレオチドが塩基対相補性を共有していないステム部分を含むことがある。ヘアピンループまたはそのセグメント（例えば、ステム部分またはループ部分の鎖）はプライマーオリゴヌクレオチドの結合部位を含むことがある。
【０３２７】
さらにまたはあるいは、基質はプライマーとして機能することができる１つまたは複数の成分を含むことがある。一般に、プライマーは基質の成分として存在する場合は不活性形態であることがある（例えば、分子複合体中に隔離されているためおよび／またはより長い基質配列の成分であるため）。触媒核酸により基質が切断されるとプライマーが放出（すなわち、活性化）されることが可能である。一部の態様では、触媒核酸酵素により基質が切断されるだけで活性化されたプライマーを放出するのに十分であることがある。他の態様では、基質の切断後のプライマーの改変が必要なこともある（例えば、その３’末端の近位でまたは内でのプライマーの改変）。ただの非限定的な例として、プライマーは、適切な酵素（例えば、Ｔ４  ＰＮＫ）によりその３’末端で２’３’環状リン酸を除去する改変が必要になることがある。
【０３２８】
検出、定量およびシグナル増幅のための方法
本発明は、少なくとも１種の標的の検出、同定および／または定量のための種々の方法を提供する。
【０３２９】
さらに、本発明は、これらの方法によって生じたシグナルの増幅のための種々のカスケードを提供する。
【０３３０】
本方法は、本発明の組成物およびその成分を利用する。特に、本方法は、検出およびシグナル増幅カスケードを作製するための本明細書に記載される分子スイッチを利用する。
【０３３１】
標的検出：内部酵素基質を有するＢＬ
本発明によれば、標的を検出し、標的検出から生じたシグナルを増幅するための種々の方法は、触媒核酸酵素基質を含むＢＬを利用する。
【０３３２】
従って、本方法において使用されるＢＬは、１種または複数の触媒核酸分子の１種または複数の基質として作用する配列を含有し得る。これは、ＢＬを別のオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー、ＮＲＦ、ＲＬ、ポリメラーゼ鋳型または触媒核酸）を連結するヘアピンループ配列の一部として、またはそれに加えて存在し得る。このような態様では、１種または複数の基質配列の切断は、ＢＬからポリメラーゼ鋳型、プライマー、ＮＲＦ、ＲＬまたは触媒核酸を放出し得、これは、それぞれ、鋳型オリゴヌクレオチドまたは触媒活性からのプライミング、ヌクレアーゼ開始、放出、合成などの、その他のオリゴヌクレオチドの機能的能力の復元をもたらし得る。
【０３３３】
ある特定の態様では、２種以上のＢＬは、２種以上の触媒核酸分子を不活性化するために使用され得る。この例では、各々の基質配列は、同一であり得、第２の触媒核酸分子によって切断され、全てこれまでは不活性の触媒核酸分子の復元をもたらし得る（図１、パネルｉｉｉ））。あるいは、基質配列は、異なっており、第２および第３の触媒核酸分子によって切断され得る。
【０３３４】
ある特定の態様では、１種または複数のＭＮＡザイムまたはアプタザイム基質は、ＢＬ分子内に組み込まれ得る。これは、標的分子を特異的に検出し、それを行うとＢＬの基質を改変するためのイニシエーター酵素としての１種または複数のＭＮＡザイムおよび／または１種または複数のアプタザイムの使用を促進し得る。一態様では、ＢＬは、ＭＮＡザイムまたはアプタザイムによるこの基質の切断が、第２の完全または部分的に相補的なオリゴヌクレオチドからＢＬを分離し得るＭＮＡザイムまたはアプタザイムの基質の配列を含有する。基質の切断は、各々、切断されていないＢＬよりも低い融解温度を有する２種以上のより短いオリゴヌクレオチド断片へのＢＬの切断をもたらし得る。反応温度で、これらの短い切断された断片は、もはや、第２の相補的オリゴヌクレオチドと実質的にハイブリダイズしない。第２の相補的オリゴヌクレオチドは、例えば、別の触媒核酸またはそのパートザイム成分、プライマー、ポリメラーゼ鋳型、ＮＲＦまたはＲＬ分子であり得、従って、ＢＬからのこれらの放出は、これらの分子のそのそれぞれの機能を発揮する、すなわち、基質改変を触媒する、合成をプライムする、核酸鎖の合成の鋳型を提供する、またはヌクレアーゼ活性の開始のための配列を提供する、またはオリゴヌクレオチドを放出する（例えば、鎖置換によって）能力を回復させ得る。一部の態様では、第２の相補的オリゴヌクレオチドは、ＭＮＡザイムのアセンブリーファシリテーターではない。
【０３３５】
図１を参照すると、標的分子を検出し、ＢＬ中に組み込まれた基質の触媒的改変による検出可能なシグナルの発生を促進するために、イニシエーター触媒酵素（例えば、ＭＮＡザイム）が使用され得る種々の検出戦略が例示される。戦略は、ＢＬ分子とハイブリダイズされるＤＮＡザイムを含む種々の分子複合体を表す。当業者であれば、１種または複数のパートザイムがまた、同様の方法でＢＬ分子とハイブリダイズされ得ることは理解されよう。戦略（ｉ）は、通常のＤＮＡ二重鎖について存在するように、各々の５’および３’末端が対を形成する、ＤＮＡザイム（Ｄｚ２）およびＢＬ分子の末端同士のハイブリダイゼーションを含む。戦略（ｉｉ）は、ＤＮＡザイム（Ｄｚ２）およびＢＬの各々の同一末端、すなわち、各分子対の５’末端のハイブリダイゼーションを、各分子の３’末端が行うのと同様に含む。しかし、正しい極性を有するハイブリダイゼーションを維持するためには、各分子は、対向する方向にねじれなければならず、結果として、次いで、Ｄｚ２およびＢＬの間で「疑似環」または環様構造が形成される。戦略（ｉｉｉ）は、大きな環が、各々、１種または複数のＢＬ（例えば、ＢＬＡおよびＢＬＢ）の単一のＭＮＡザイム（Ｍｚ１）の切断活性によって放出され得る、存在する２種以上のＤＮＡザイム（例えば、ＤｚＡおよびＤｚＢ）を用いて構築され得る疑似環設計に特有の特徴を実証する。
【０３３６】
図１パネルｉ）では、ＤＮＡザイム（Ｄｚ２；太い黒色線）は、基質配列（基質１；太い黒色破線）によって連結される２つの細い黒色線として描かれるＢＬ分子（ＢＬ）とハイブリダイズされる。ＢＬの３’末端は、Ｄｚ２の５’末端とハイブリダイズし、逆も同様である。第２の基質（基質２；細い黒色破線）は、フルオロフォア（白丸）およびクエンチャー（黒丸）を用いて標識され得、Ｄｚ２によって切断されるよう設計される。最初は、Ｄｚ２は、この基質がＢＬとハイブリダイズされているので、これを切断できない。ＭＮＡザイム（Ｍｚ１；太い灰色線）が、標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１；太い灰色破線）の存在下で集合すると、これは、基質１の切断およびその後の切断されたＢＬ分子からのＤｚ２の放出をもたらす。次いで、Ｄｚ２は、基質２と結合し、これを切断でき、これは、検出可能な蛍光シグナルをもたらすフルオロフォアおよびクエンチャーの分離をもたらし得る。
【０３３７】
図１パネルｉｉ）は、５’末端および３’末端が、基質配列（基質１ａ；太い黒色破線）によって連結されている２本の細い黒色線として描かれるＤＮＡザイム（Ｄｚ２；太い黒色線）およびＢＬ分子（ＢＬ）の間でハイブリダイズする疑似環戦略を実証する。これらの分子が共にハイブリダイズされると、次いで、疑似環を形成し、これによって、Ｄｚ２がその基質（基質２；細い黒色破線）と結合し、それを切断することが防止される。基質２は、フルオロフォア（白丸）およびクエンチャー（黒丸）を用いて標識され得る。ＭＮＡザイム（Ｍｚ１；太い灰色線）がその標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１；太い灰色破線）の存在下で集合すると、これは、基質１ａの切断およびその後の切断されたＢＬからのＤｚ２の放出をもたらし、疑似環構造を破壊し得る。Ｄｚ２は、基質２と結合し、これを切断でき、これは、フルオロフォアおよびクエンチャーの分離をもたらし、検出可能な蛍光シグナルを引き起こし得る。
【０３３８】
図１パネルｉｉｉ）は、２種のＢＬ分子によって両方とも一時的に阻害される２種の独立したＤＮＡザイムを含有する疑似環を実証する。２種のＤＮＡザイム、ＤｚＡ（太い黒色線）およびＤｚＢ（太い黒色破線）は、太い黒色破線として描かれる基質１配列（基質１ａおよび基質１ｂ）と連結される、両方とも細い黒色線として描かれる、２種のＢＬ分子、ＢＬＡおよびＢＬＢの各々とハイブリダイズする。最初はＤｚＡおよびＤｚＢは両方とも、両方とも細い黒色破線として描かれる、その基質、それぞれ、基質Ａおよび基質Ｂを切断できない。基質Ａおよび基質Ｂは、異なるフルオロフォア（基質Ａの白丸および基質Ｂの灰色丸）を用いて、および黒丸として描かれるクエンチャーを用いて標識され得る。その標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１；太い灰色破線）の存在下で集合したＭＮＡザイム（Ｍｚ１；太い灰色線）の存在下で、Ｍｚ１が、ＢＬＡおよびＢＬＢ分子内に存在する基質１を切断し得る場合に、ＢＬＡおよび／またはＢＬＢの切断は、それぞれＤｚＡおよびＤｚＢからのその分離、従って、疑似環構造の破壊をもたらし得る。結果として、ＤｚＡおよびＤｚＢの両方が、それぞれ、基質Ａおよび基質Ｂを結合し、これらを切断し、フルオロフォアおよびクエンチャーの分離を引き起こし、得られた検出可能な蛍光シグナルをもたらし得る。基質Ａおよび基質Ｂの切断によって生じた蛍光シグナルは、同一である場合も異なる場合もあり得る。
【０３３９】
当業者であれば、別の異なる触媒核酸酵素（例えば、アプタザイム）が、図１（パネル（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ））において表されるＭＮＡザイムの代わりに使用され得ることは認識するであろう。
【０３４０】
ここで、図３パネルｉ）を参照すると、図１パネルｉ）に概要が示される例示的なブロックされたＤＮＡザイム戦略は、単一分子としてＤｚをＢＬと共に連結するヘアピンループ配列を含むよう拡大される。当業者であれば、パートザイムが同様の方法でＢＬとハイブリダイズされ得ることは理解するであろう。ヘアピン型ＤＮＡザイム（ヘアピン型Ｄｚ２）は、太い黒色破線として描かれる基質配列（基質１）によって連結される２種の細い黒色線として描かれるＢＬ部分とハイブリダイズされる、太い黒色線として示されるＤＮＡザイム部分を含む。ＤＮＡザイム配列およびＢＬ配列は、非相補的ループ配列（同様に、太い黒色線）によって共に連結されて、ヘアピン構造を形成し、Ｄｚ２を不活性にする。細い黒色破線として描かれる第２の基質（基質２）は、フルオロフォア（白丸）およびクエンチャー（塗りつぶし黒色丸）を用いて標識され得、ひとたびＤｚ２が活性であると、Ｄｚ２によって切断されるよう設計される。最初は、Ｄｚ２はＢＬとハイブリダイズされているので、この基質を切断できない。ＭＮＡザイム（Ｍｚ１；太い灰色線）が、その標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１；太い灰色破線）の存在下で集合すると、基質１を切断し、その後のヘアピン分子からのＤｚ２の放出を引き起こし得る。次いで、活性Ｄｚ２分子は、基質２と結合し、これを切断し得、検出可能な蛍光シグナルをもたらすフルオロフォアおよびクエンチャーの分離をもたらし得る。当業者であれば、別の異なる触媒核酸酵素（例えば、アプタザイム）が、図３パネル（ｉ）において表されるＭＮＡザイムの代わりに使用され得ることを認識するであろう。
【０３４１】
図２０を参照すると、複数のイニシエーター触媒酵素（例えば、例示されるＭＮＡザイムまたはあるいは、アプタザイム）が、単一の標的分子または複数の標的分子を各々検出する、またＢＬ中に組み込まれた複数の基質のうち１種の触媒改変による検出可能なシグナルの発生を促進するために使用され得る種々の検出戦略が例示される。パネル（ｉ）は、ＢＬの中間領域内に複数の独立した隣接する基質配列を包含することを含み、それによって、独立したイニシエーター触媒酵素（例えば、ＭＮＡザイムまたはアプタザイム）によって各基質配列が触媒的に改変され得る戦略を表す。パネル（ｉｉｉ）は、独立した基質配列またはその成分を包含することを含み、それによって、独立したイニシエーター触媒酵素（例えば、ＭＮＡザイムまたはアプタザイム）によって各基質が触媒的に改変され得る戦略を表す。
【０３４２】
図２０パネルｉ）では、３つの独立した隣接する基質配列を含有する疑似環が例示される。５’末端および３’末端の各々は、ＤＮＡザイム（Ｄｚ４；太い黒色線）および３種の基質配列；基質１（細い灰色線）、基質２（細い黒色線）および基質３（細い黒色破線）によって連結されている２つの細い黒色線として描かれるＢＬ分子の間でハイブリダイズする。次いで、両分子は、疑似環を形成し、Ｄｚ４が、太い黒色線として描かれるその基質（基質４）と結合し、それを切断するのを防止する。基質４は、フルオロフォア（白丸）およびクエンチャー（黒丸）を用いて標識され得る。ＭＮＡザイムのパートザイム成分は存在し、基質１（Ｍｚ１、太い灰色線）、基質２（Ｍｚ２、細い黒色線）または基質３（Ｍｚ３、細い黒色破線）のいずれかを切断するよう設計され得る。ＭＮＡザイムは、それぞれ、Ｍｚ１、Ｍｚ２およびＭｚ３について、その標的アセンブリーファシリテーターＡＦ１（太い灰色破線）、ＡＦ２（細い黒色破線）およびＡＦ３（細い黒色線）の存在下で集合する。これは、Ｍｚ１による基質１、Ｍｚ２による基質２および／またはＭｚ３による基質３の切断をもたらし、その後の切断されたＢＬからのＤｚ４の放出、従って、疑似環構造の破壊を引き起こし得る。次いで、Ｄｚ４は、基質４と結合し、これを切断でき、これは、フルオロフォアおよびクエンチャーの分離をもたらし、検出可能な蛍光シグナルを引き起こし得る。
【０３４３】
図２０パネルｉｉｉ）では、ＤＮＡザイム（Ｄｚ３；太い黒色線）は、共通配列を共有する基質１および２の隣接する配列によって連結される２つの細い黒色線として描かれるＢＬ分子とハイブリダイズし、ここでは、基質１（基質１；細い灰色線として描かれる５’の半分、基質２の５’の半分としても働く細い灰色破線として描かれる３’の半分）および３’の半分の基質２（太い黒色線として描かれる）。触媒イニシエーター酵素（例えば、ＭＮＡザイム、Ｍｚ１およびＭｚ２）の、その基質、それぞれ、基質１および基質２内の切断部位として働くリボヌクレオチド接合部（細い黒色Ｘとして描かれる）、基質１の切断部位は、ＢＬ内の基質２のものの５’に位置する。ＢＬは、Ｄｚ３とハイブリダイズして、疑似環を形成し、従って、Ｄｚ３がその基質（基質３；太い黒色線）を切断するのを防止する。基質３は、フルオロフォア（白丸）およびクエンチャー（黒丸）を用いて標識され得る。ＭＮＡザイムのパートザイム成分は、存在し、基質１の５’の半分と、共有される共通配列（基質１の３’の半分および基質２の５’半分）（Ｍｚ１、太い灰色線として描かれる、細い灰色破線として描かれる共有される共通配列と結合する部分を除く）の間のリボヌクレオチド接合部と結合し、これを切断するよう設計され得るか、または共有される共通配列と、基質２の３’の半分（Ｍｚ２、太い黒色線、細い灰色破線として描かれる共有される共通配列と結合する部分を除く）の間のリボヌクレオチド接合部と結合し、これを切断するよう設計され得る。Ｍｚ１およびＭｚ２は、それぞれ、その標的アセンブリーファシリテーターＡＦ１（太い灰色破線）およびＡＦ２（細い黒色破線）の存在下で集合する。いずれかのリボヌクレオチド接合部での切断は、切断されたＢＬからのＤｚ３の放出、疑似環構造の破壊をもたらし得る。次いで、Ｄｚ３は、基質３と結合し、これを切断することができ、これは、フルオロフォアおよびクエンチャーの分離をもたらし、検出可能な蛍光シグナルを引き起こし得る。
【０３４４】
当業者であれば、異なる触媒核酸酵素（複数可）（例えば、アプタザイム（複数可））が、１種または複数の図２０パネル（ｉ）またはパネル（ｉｉｉ）において表されるＭＮＡザイムの代わりに使用され得ることを認識されよう。
【０３４５】
シグナル検出および増幅：内部酵素基質を有するＢＬ
一部の態様では、ＢＬ分子内に存在する基質配列が、ＢＬによって一時的に不活性化された触媒核酸と同一基質を切断するよう設計される触媒核酸によって切断され得る自己触媒性カスケードが、作製され得る。他の態様では、各々、対向する分子スイッチの基質配列を切断する可能性があり得る、逆もまた同様の触媒核酸分子を含有する２種以上の分子スイッチ複合体が存在する相互触媒性カスケードが作製され得る。両態様では、分子スイッチは、活性触媒核酸による切断によるカスケード開始まで、ＢＬ分子による阻害のために不活性状態で存在し得る。例えば、アセンブリーファシリテーター（例えば、標的核酸）の添加は、１種または複数のＢＬ分子を切断して、カスケード反応を開始することができる活性ＭＮＡザイムの集合をもたらし得、これでは、ＢＬは、開始ＭＮＡザイムの基質配列を含有する。あるいは、リガンド（例えば、アプタザイムのアプタマー部分と結合することができる標的リガンド）の存在は、１種または複数のＢＬ分子を切断して、カスケード反応を開始することができるアプタザイムを活性化でき、これでは、ＢＬは、アプタザイムを開始するための基質配列を含有し得る。開始ＢＬ切断事象は、触媒核酸分子の連続活性化およびその後のシグナルの増幅をもたらし得る。あるいは、リガンド（例えば、ＢＬ内に存在するアプタマーと結合することができる標的リガンド）の存在は、アプタマーと結合し、触媒核酸分子からＢＬを放出し得る。この分離は、遊離された触媒核酸分子が、次いで、第２の触媒核酸とハイブリダイズされた第２のＢＬ分子を切断し得るカスケード反応を開始するための代替法として使用され得る。
【０３４６】
ここで、図３パネルｉｉｉ）およびｉｖ）を参照して、シグナルの増幅のために使用され得る、連続的放出およびＤＮＡザイム分子の活性化を含むカスケードを作製するために、図３パネルｉ）に概要が示される例示的なブロックされたＤＮＡザイム戦略が使用される。
【０３４７】
図３パネルｉｉｉ）では、太い黒色線として示される第１のＤＮＡザイムが、太い黒色破線として描かれる基質配列（基質１）によって連結される２つの細い黒色線として描かれるＢＬ分子（ＢＬ）とハイブリダイズされる例示的自己触媒性カスケード戦略が例示される。Ｄｚ１およびＢＬは、非相補的ループ配列（同様に、太い黒色線）によって共に連結されて、ヘアピン構造を形成し、Ｄｚ１を不活性にする（不活性のＤｚ１）。標的分子の検出の際に、その標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１；太い灰色破線）の存在下で開始ＭＮＡザイム（Ｍｚ１；太い灰色線）が形成し、基質１を切断し、その後のヘアピン分子からのＤｚ１の放出を引き起こし得る。次いで、活性Ｄｚ１分子は、さらなる不活性Ｄｚ１／ＢＬヘアピン型分子上の基質１と結合し、これを切断し得、これは、ＢＬ切断およびＤｚ１活性化事象のカスケードをもたらし得、これは、シグナルの増幅のために使用され得る。あるいは、リガンド（例えば、アプタザイムのアプタマー部分と結合することができる標的リガンド）の存在は、１種または複数のＢＬ分子を切断して、カスケード反応を開始することができるアプタザイムを活性化でき、ここで、ＢＬは、開始アプタザイムおよび活性Ｄｚ１の両方によって切断可能な基質配列を含有し得る。あるいは、リガンド（例えば、ＢＬ内に存在するアプタマーと結合することができる標的リガンド）の存在は、アプタマーと結合し、Ｄｚ１からＢＬを放出し得る。この分離は、遊離されたＤｚ１が、次いで、別の複合体のＢＬ内に存在する基質１を切断し得るカスケード反応を開始するための代替法として使用され得る。
【０３４８】
図３パネルｉｖ）では、２種のＤＮＡザイム、不活性Ｄｚ１および不活性Ｄｚ２（それぞれ、太い黒色および細い灰色線）が両方とも、各々２つの細い黒色線として描かれ、各々異なる基質配列によって連結している異なるＢＬ分子（それぞれ、ＢＬＢおよびＢＬＡ）とハイブリダイズする相互触媒性カスケード戦略が例示される。不活性Ｄｚ１は、ＢＬＢおよび基質２（細い黒色破線）と連結され、不活性Ｄｚ２は、ＢＬＡおよび基質１（太い黒色破線）と連結される。２種のＤＮＡザイムは、非相補的ループ配列（同様に、太い黒色線）によってそのそれぞれのＢＬと連結され、ヘアピン構造を形成し、ＤＮＡザイムを不活性にする。活性ＭＮＡザイム（Ｍｚ１；太い灰色線）が、その標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１；太い灰色破線）の存在下で形成する場合、ＭＮＡザイムは、基質１を切断し、その後のヘアピン分子からのＤｚ２の放出を引き起こし得る。次いで、ここで、活性Ｄｚ２分子は、基質２と結合し、これを切断し、Ｄｚ１の放出および活性化をもたらし得、次いで、ＢＬＡ中の基質１を切断し、従って、ＢＬ切断ならびにＤｚ１およびＤｚ２活性化事象のカスケードを引き起こし得、これは、シグナルの増幅のために使用され得る。あるいは、リガンド（例えば、アプタザイムのアプタマー部分と結合することができる標的リガンド）の存在は、ＢＬＡ分子を切断して、カスケード反応を開始することができるアプタザイムを活性化でき、ここで、ＢＬＡは、開始アプタザイムおよび活性Ｄｚ１の両方によって切断可能な基質１配列を含有し得る。あるいは、リガンド（例えば、ＢＬ内に存在するアプタマーと結合することができる標的リガンド）の存在は、アプタマーと結合し、例えば、Ｄｚ２からＢＬＡを放出し得る。この分離は、遊離されたＤｚ２が、次いで、ＢＬＢ内に存在する基質２を切断し、それによって、Ｄｚ１を遊離し得るカスケード反応を開始するための代替法として使用され得る。
【０３４９】
ここで、図１６を参照して、図１パネルｉｉ）に概要が示される例示的ＤＮＡザイム疑似環戦略は、シグナルの増幅のために使用され得る、ＤＮＡザイム分子の連続的放出および活性化を含むカスケードを作製するために使用される。２つの相互触媒性環が示され、各環のＢＬは、２つの基質を含有する。第１の基質は、標的アセンブリーファシリテーターの存在下でＭＮＡザイムによって切断され得、さらなる基質が対向する環のＤＮＡザイムによって切断され得る。
【０３５０】
図１６パネルｉ）では、環Ａおよび環Ｂ間の例示的相互触媒性戦略が例示される。第１の基質配列（基質１；細い灰色線）は、疑似環ＡおよびＢ両方に存在し、標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１；太い灰色の破線）の存在下でのみＭＮＡザイム（Ｍｚ１；太い灰色線）によって切断される。２つの疑似環は各々、それぞれ、環ＢからＤｚ２によって（細い黒色破線）、環ＡからＤｚ３によって（太い黒色線）切断され得る第２の基質配列、基質２（環Ａ内の基質２ａ；細い黒色破線）および基質３（環Ｂ内の基質３ａ；太い黒色線）を含有する。２つのＤＮＡザイムＤｚ３およびＤｚ２は、それぞれ、ＢＬＡおよびＢＬＢと結合している場合に不活性である。Ｍｚ１による環ＡまたはＢのいずれか上の基質１の切断は、Ｄｚ２またはＤｚ３いずれかの放出およびその後の再活性化をもたらし、２つの環の間のＢＬ切断事象の指数関数的カスケードを引き起こし、それによって、Ｄｚ２は、環Ａ中の基質２を切断し、Ｄｚ３は、環Ｂ中の基質３を切断する。さらなる基質配列はまた、リポーター基質、この例示では、フルオロフォア（白丸）およびクエンチャー（黒丸）を用いて標識される基質３として含まれ得る。あるいは、またはさらに、標識された基質２が付加され得る。さらなるリポーター基質（複数可）の切断は、フルオロフォアおよびクエンチャーの分離と、それに続く、検出可能な蛍光シグナルをもたらす。あるいは、相互触媒性カスケードは、ＢＬＡおよびＢＬＢ内の基質１を切断して、カスケード反応を開始することができるアプタザイムを活性できるリガンド（例えば、アプタザイムのアプタマーブ部分と結合することができる標的リガンド）の存在によって開始され得る。あるいは、リガンド（例えば、ＢＬ内に存在するアプタマーと結合することができる標的リガンド）の存在は、アプタマーと結合し、例えば、Ｄｚ３からＢＬＡを放出し得る。この分離は、遊離されたＤｚ３が、次いで、ＢＬＢ内に存在する基質３を切断し、それによって、Ｄｚ２を遊離し得るカスケード反応を開始するための代替法として使用され得る。
【０３５１】
ここで、図２１を参照して、図１パネルｉｉ）に概要が示される例示的ＤＮＡザイム疑似環戦略は、シグナルの増幅のために使用され得る、ＤＮＡザイム分子の連続的放出および活性化を含むカスケードを作製するために使用される。
【０３５２】
図２１パネルｉ）では、疑似環（環Ａ）が、２つの基質配列；基質１（細い灰色線）および基質２（基質２ａ；太い黒色線）によって連結されている、ＤＮＡザイム（Ｄｚ２；太い黒色線）および２つの細い黒色線として描かれるＢＬ（ＢＬＡ）からなる自己触媒性カスケードが表される。さらに、基質２は、フルオロフォア（白丸）およびクエンチャー（黒丸）を用いて標識され得る、別個の独立した分子（同様に、太い黒色線として描かれる）として提供され得る。Ｄｚ２とＢＬＡの間のハイブリダイゼーションによって起こる疑似環形成は、Ｄｚ２が、ＢＬＡ内か、または別個の実体として存在する基質２と結合し、これを切断することを防止する。基質１を切断するよう設計されるＭＮＡザイム（Ｍｚ１；太い灰色線）が、その標的アセンブリーファシリテーターＡＦ１（太い灰色破線）の存在下で集合する場合には、Ｍｚ１による基質１の切断とその後の切断されたＢＬＡからのＤｚ２の放出、疑似環構造の破壊をもたらし得る。次いで、Ｄｚ２は、独立した基質２分子と結合し、これを切断することができ、これは、フルオロフォアおよびクエンチャーの分離をもたらし、検出可能な蛍光シグナルを引き起こし得る。Ｄｚ２はまた、ＢＬＡ内に存在する基質２と結合し、これを切断し、さらなるＤｚ２分子の放出をもたらし、従って、ＢＬ切断事象の指数関数的カスケードを引き起こし、シグナルの増幅につながり得る。あるいは、リガンド（例えば、アプタザイムのアプタマー部分と結合することができる標的リガンド）の存在は、ＢＬＡ内の基質１を切断することができるアプタザイムを活性化して、カスケード反応を開始し得、これでは、ＢＬＡは、開始アプタザイムおよび活性Ｄｚ２の両方によって切断可能な基質配列を含有し得る。あるいは、リガンド（例えば、ＢＬ内に存在するアプタマーと結合することができる標的リガンド）の存在は、アプタマーと結合し、例えば、Ｄｚ２からのＢＬＡを放出し得る。この分離は、遊離されたＤｚ２が、次いで、さらなるＢＬＡ分子内に存在する基質２を切断し、それによって、Ｄｚ２を連続的に遊離し得るカスケード反応を開始するための代替法として使用され得る。
【０３５３】
図２１パネルｉｉ）およびｉｉｉ）では、表される疑似環（それぞれ、環Ｂおよび環Ｃ）は、自己触媒的にフィードバックする可能性を有さない。両疑似環について、基質２は、もはやＢＬ内に存在しない。環Ｂについては、ＢＬ（ＢＬＢ）は、基質１および基質３（太い黒色破線）からなる。環Ｃについては、ＢＬ（ＢＬＣ）は、基質１のみからなる。
【０３５４】
当業者であれば、上記のカスケードが単に例示目的でＤＮＡザイムを使用すること、またその他の触媒核酸酵素（例えば、リボザイム）または触媒核酸酵素成分（例えば、パートザイム）が、ＢＬのハイブリダイゼーションが触媒活性を阻害し得る分子スイッチ構造中に組み込まれ得る／分子スイッチ構造中のＤＮＡザイムと置き換えられ得ることを認識するであろう。
【０３５５】
標的検出：リリーサーオリゴヌクレオチド
ＢＬオリゴヌクレオチドは、分子スイッチ複合体中の相補的な第３のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされ得る別個の分子として存在し得るか、あるいは、分子スイッチのＢＬ部分として存在し得、これでは、ＢＬ部分は、リンカー配列によって第３の相補的オリゴヌクレオチドと連結され、ヘアピン構造を形成し得る。
【０３５６】
このようにして、第１のＲＬオリゴヌクレオチドは、分子スイッチのＢＬオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、第３の相補的オリゴヌクレオチドの置き換えをもたらし得る。第３の相補的オリゴヌクレオチドは、ＢＬとハイブリダイズされる場合には、不活性であり得るが、ひとたび、ＢＬから置き換えられると、この第３のオリゴヌクレオチドは、触媒核酸酵素、プライマー、ポリメラーゼ鋳型、ＮＲＦまたは別のＲＬとして機能することができ得る。第３のオリゴヌクレオチドが触媒核酸を含む態様では、ＢＬは、分子スイッチ中の全触媒核酸配列とハイブリダイズするよう設計されず、その結果、ＲＬは触媒活性に必要な全配列を含有せず、従って、ＲＬ分子は、それ自体核酸酵素として機能できない。他の態様では、単一ＲＬ分子は、２種以上のＢＬから２種以上の触媒核酸を置き換えるよう機能でき、これまでは不活性状態で存在していた複数の触媒核酸分子の触媒活性の同時復元をもたらす。
【０３５７】
ＲＬは、イニシエーター酵素（例えば、ＭＮＡザイム、ＤＮＡザイム、リボザイムまたはアプタザイム）の触媒活性によって標的依存的に提供され得、それによって、イニシエーター酵素の基質は、イニシエーター酵素の触媒活性を誘導する標的分子が存在する場合にのみＲＬをもたらすよう改変される。非限定的な例として、標的依存的なＲＬの作製は、図４パネルｉ）に例示されるように達成され得る。この機序は、図４パネルｉｉ）、ｉｉｉ）およびｉｖ）に、図６パネルｉ）、図７パネルｉ）および図８パネルｉ）に例示される下流反応を開始するよう使用され得る。
【０３５８】
図４パネルｉ）に記載される態様を具体的に参照して、ＲＬ（太い黒色破線）は、最初に、ＢＬ（黒色実線）とハイブリダイズされ、ＲＬを不活性にし得る。ＲＬは、黒色実線として描かれる非相補的ヘアピンループによってＢＬと連結され得る（「ヘアピン型ＲＬ」）か、または別個の実体としてのままであり（「ブロックされたＲＬ」）、これは、それぞれ、パネルの上の左、および下の左の部分に示される。ＢＬ部分は、それぞれ、灰色の実線および太い灰色破線として描かれる、標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１）の存在下で集合し得るＭＮＡザイム（Ｍｚ１）としてここで示される触媒核酸酵素によって切断され得る基質配列、基質１（細い黒色破線）を含有し得る。ＭＮＡザイムによるＢＬの切断は、活性ＲＬ（活性ＲＬ）の作製をもたらし得る。あるいは、リガンド（例えば、アプタザイムのアプタマー部分と結合することができる標的リガンド）の存在は、ＲＬを活性化し得るＢＬ内の基質１を切断することができるアプタザイムを活性化し得る。ＭＮＡザイムまたはアプタザイムによる基質１の切断のために、もはやＢＬとハイブリダイズしない活性ＲＬ分子は、図４パネルｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）に例示される下流反応を開始するための機序を提供し得る。
【０３５９】
図４パネルｉｉ）〜ｉｖ）に記載される態様は、ＢＬ分子とハイブリダイズされるＤＮＡザイムを表し、これは、次いで、ＲＬのＢＬとのハイブリダイゼーションによってＢＬ分子から分離される。当業者であれば、パートザイムもまた、ＢＬ分子とハイブリダイズされ、同様の方法で放出され得るということを理解するであろう。
【０３６０】
図４パネルｉｉ）に記載される態様では、ＤＮＡザイム（Ｄｚ；太い黒色線）は、ＢＬ分子（ＢＬ；細い灰色線）とハイブリダイズされて、二重鎖を形成する。Ｄｚ配列の小さい部分は、ＢＬとハイブリダイズせず、二重鎖の中心にループ構造として示される。基質配列（基質；細い黒色破線）は、フルオロフォア（白丸）およびクエンチャー（黒丸）を用いて標識され、Ｄｚによって切断されるよう設計されるが、Ｄｚは、ＢＬの最初の結合のために、その基質を切断できない。活性ＲＬ（太い黒色破線）が存在する場合には、ＢＬと結合し、ＤｚをＢＬ分子から置き換え得る。ＲＬは、ＤｚおよびＢＬの間に不完全ハイブリダイゼーションがある領域において一部の必須配列を欠くので、触媒分子として機能できない。ＲＬおよびＢＬは、次いで、不活性二重鎖を形成し得るが、Ｄｚは、次いで、基質と結合し、これを切断することができ、これは、フルオロフォアおよびクエンチャーの分離および検出可能な蛍光シグナルの発生をもたらす。
【０３６１】
図４パネルｉｉｉ）に示される態様では、ヘアピンループ（太い黒色線）として作用する短い非相補的配列によって連結されている単一オリゴヌクレオチド中にＤＮＡザイム部分（太い黒色線）およびＢＬ部分（太い灰色線）を含有するヘアピン型ＤＮＡザイム（ヘアピン型Ｄｚ）が存在する。さらに、Ｄｚ配列の小さい部分は、ヘアピンの残部（ＢＬ配列）とハイブリダイズせず、二重鎖の中心にループ構造として示される。基質配列（基質；細い黒色破線）は、フルオロフォア（白丸）およびクエンチャー（黒丸）を用いて標識され、Ｄｚによって切断されるよう設計されるが、Ｄｚ配列は、ヘアピン構造内に拘束されているので、最初は、Ｄｚはその基質を切断できない。活性ＲＬ分子（ＲＬ；太い黒色破線）が存在する場合には、それがヘアピンＤｚトーホールド（ＢＬ配列を含有する鎖）と結合でき、ヘアピンＤｚ分子のＢＬ部分とハイブリダイズできる。ＲＬは、触媒活性に必須の一部の配列を欠く（Ｄｚ中に存在する塩基を欠くが、ヘアピンのＤｚおよびＢＬ領域の間の不完全ハイブリダイゼーションのためにループして出ている）ので、触媒分子として機能できない。ヘアピンのＢＬ部分およびＲＬは、次いで、不活性な二重鎖を形成し得、これによって、Ｄｚ部分が解放される。次いで、Ｄｚ部分は、基質と結合し、これを切断することができ、これは、フルオロフォアおよびクエンチャーの分離および検出可能な蛍光シグナルの発生をもたらす。
【０３６２】
図４パネルｉｖ）は、ＤＮＡザイム部分およびＢＬＡ部分（両方とも灰色の実線として描かれる）からなるヘアピン型Ｄｚ１  ＆  ＤＮＡザイム部分およびＢＬＢ部分（両方とも黒色の実線として描かれる）からなるヘアピン型Ｄｚ２と呼ばれる２つのヘアピン型ＤＮＡザイム（図４パネルｉｉｉ）に記載される）を連結することを含む例示的戦略の概要を示し、これでは、両ヘアピン分子は各々伸長されて、他方と相補的であるさらなるステム配列を含有し、従って、共に連結する。最初に、ヘアピン型Ｄｚ１およびヘアピン型Ｄｚ２は、そのそれぞれの基質、両方とも細い黒色破線として描かれる基質１および基質２を切断できない。基質１および基質２は両方とも、異なるフルオロフォア（基質１については灰色丸および基質２については白丸）を用いて標識され、両方とも黒丸として描かれるクエンチャーを用いて標識される。活性ＲＬが存在する場合には、各ヘアピン型Ｄｚのトーホールド配列（相補的ステム領域のために共に閉じられている）と結合し、両ヘアピン型Ｄｚを同時に開環できる。結果として、ヘアピン型Ｄｚ分子の両Ｄｚ部分は、それぞれの基質と結合し、これらを切断でき、フルオロフォアおよびクエンチャーの分離をもたらし、従って、２種の異なるフルオロフォアの各々の検出可能な蛍光シグナルを生じさせる。
【０３６３】
シグナル検出および増幅：リリーサーオリゴヌクレオチド
標的の検出の際にイニシエーター酵素によって生成されるＲＬは、ハイブリダイズした触媒核酸酵素からＢＬを解離し（すなわち、分子スイッチを活性化する）、それによって、酵素がリポーター基質を触媒的に改変し、検出可能なシグナルを生じさせることを可能にし得る。そうすることにおいて、ＲＬは、ＢＬとハイブリダイズし、それによって、不活性にされる。
【０３６４】
ＲＬを利用するシグナル増幅カスケードが、本明細書において提供される。一般に、これらのカスケードは、ＢＬをＲＬから解離することができ、それによって、ＲＬが、触媒核酸酵素とハイブリダイズされたより多くのＢＬを解離するのを可能にする成分の使用を含む。このようにして、単一標的検出事象から生じるシグナルは、ＢＬ／核酸酵素複合体のＲＬ媒介性解離の連続ラウンドによって何度にもわたって増幅され得る。
【０３６５】
一部の態様では、エキソヌクレアーゼ、例えば、ExoIIIは、ＲＬ分子が、ExoIIIの活性によって再利用されるシグナル増幅のために使用され、連続的放出およびその後の複数の触媒核酸分子の活性化につながり得る。この場合には、触媒核酸分子のＲＬ媒介性活性化に、ExoIIIによる分子スイッチ中のＢＬの選択的分解が続く。従って、ＲＬ分子は未変化(intact)のままであり、次いで、別のＢＬとハイブリダイズすることができる。次いで、活性化サイクルが反復され、このプロセスの間、毎回新規触媒核酸分子が放出され、シグナルの増幅につながる。
【０３６６】
図６は、シグナル検出およびＲＬ分子の再利用を惹起する増幅カスケードの１つの例示的戦略を提供する。図６パネルｉ）は、ＤＮＡザイム（Ｄｚ；太い黒色線）が、ＢＬ分子（ＢＬ；細い灰色線）とハイブリダイズする戦略を表す。各分子の３’末端は、Ｄｚ／ＢＬ二重鎖をExoIII媒介性分解に対して抵抗性にするために二重鎖から少なくとも４ヌクレオチドだけ突出している。基質配列（基質；細い黒色破線）は、フルオロフォア（白丸）およびクエンチャー（黒丸）を用いて標識され、Ｄｚによって切断されるよう設計されるが、ＢＬとハイブリダイズされる間、Ｄｚは不活性であり、その基質を切断できない。イニシエーター酵素（例えば、ＭＮＡザイム、ＤＮＡザイム、リボザイムまたはアプタザイム）の触媒活性によって、イニシエーター酵素の触媒活性を誘導する標的分子が存在する場合にのみイニシエーター酵素の基質がＲＬをもたらすよう改変されている標的依存的に、ＲＬが提供され得る。非限定的な例として、標的特異的な方法でのＲＬの生成は、図４パネルｉ）に例示されるように達成され得る。
【０３６７】
活性ＲＬが存在する（ＲＬ；太い黒色破線）が場合には、ＢＬと結合し、ＢＬ分子からＤｚを置き換えることができる（図６パネルｉ）。ＲＬおよびＢＬは、次いで、表されるように、ＲＬの３’末端が、二重鎖から突出しているが、ＢＬの３’末端が、ここで、平滑である（またはあるいは、ＲＬの５’末端に対して陥凹している）二重鎖を形成できる。ExoIII（灰色のセグメント化された環として描かれる）は、次いで、その３’末端からＢＬ分子を消化でき、ＲＬ分子は未変化のままである。ＲＬは、次いで、再利用され、このプロセスを反復できる。各Ｄｚは、ひとたび置き換えられると、次いで、その基質と結合することができ（各々の３’末端は、突出しており、それらをExoIIIに対して抵抗性にしている）、フルオロフォアおよびクエンチャーの分離ならびに検出可能な蛍光シグナルの発生をもたらす基質を切断できる。これは複数回起こり得るので、次いで、環カスケード反応によってもたらされるシグナルの増幅がある。
【０３６８】
他の態様では、制限酵素（例えば、ニッキング酵素）は、ＲＬ分子が、制限酵素の活性によって再利用され、ＤＮＡザイムの連続的放出およびその後の活性化につながるシグナル増幅のために利用され得る。ＢＬ分子からの触媒核酸分子のＲＬ媒介性置換の間に、次いで、ＲＬおよびＢＬ分子の間の二重鎖内に新規認識部位が作製される。次いで、制限酵素は、この部位を認識し、ＢＬを選択的に切断することができるが、ＲＬ分子は、未変化のままである。ＲＬの切断は、認識部位のＢＬ鎖のみを切断し、ＲＬ鎖は切断しないニッキング制限酵素の認識部位を作製する（使用する）ことによって回避され得る。あるいは、両鎖を切断することができる制限酵素が使用され得、この場合には、認識部位のＲＬ鎖は、制限酵素によるＲＬ鎖の切断を阻止するホスホロチオエート連結を含み得る。ＢＬの短い「ニックが入った」断片は各々、ここで、未変化ＢＬが有するのと同一のＲＬに対する親和性をもはや有さず、結果として、ＲＬと安定な二重鎖ＤＮＡ構造をもはや形成しない。次いで、ＲＬは、別のＢＬと結合することができ、環が反復され、このプロセスの間、毎回触媒核酸が活性化される。
【０３６９】
図７、パネルｉ）を見てみると、ＤＮＡザイム（Ｄｚ；太い黒色線）が、ＢＬ（ＢＬ；細い灰色線）とハイブリダイズする例示的戦略が表されている。ＢＬは、Ｄｚ／ＢＬ二重鎖からループして出ている、ＤＮＡザイムと非相補的であり、ニッキング酵素の二本鎖認識配列の一方の鎖を形成する幾分かのさらなる配列（細い灰色破線として描かれる）を含有する。ニッキング酵素、例えば、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ（黒色塗りつぶし三角として描かれる）も存在するが、その完全二本鎖認識配列がＤｚおよびＢＬ二重鎖内に存在しないので、ＢＬを切断できない。基質配列（基質；細い黒色破線）は、フルオロフォア（白丸）およびクエンチャー（黒丸）を用いて標識され、Ｄｚによって切断されるよう設計されるが、ＢＬとのハイブリダイゼーションのために、Ｄｚはその基質を切断できない。イニシエーター酵素（例えば、ＭＮＡザイム、ＤＮＡザイム、リボザイムまたはアプタザイム）の触媒活性によって、イニシエーター酵素の触媒活性を誘導する標的分子が存在する場合にのみ、イニシエーター酵素の基質がＲＬをもたらすよう改変される標的依存的にＲＬが提供され得る。非限定的な例として、標的特異的な方法でのＲＬの生成は、図４パネルｉ）に例示されるように達成され得る。図７パネルｉ）に表されるように、二本鎖ニッキング酵素認識配列（それ自体、ＲＬ分子の中央に灰色破線として描かれる）のもう一方の鎖を含有する活性ＲＬ分子（ＲＬ；太い黒色破線）が存在する場合には、ＢＬと結合して、ＤｚをＢＬ分子から置き換える。次いで、ＲＬおよびＢＬは、ここで、完全ニッキング酵素認識配列を含有する二重鎖を形成する。結果的に、ニッキング酵素は、ここで、ＢＬを切断でき、一方で、ＲＬ分子は未変化のままである。次いで、ＲＬは再利用され、このプロセスを反復することができる。各Ｄｚは、ひとたび置き換えられると、次いで、フルオロフォアおよびクエンチャーの分離ならびに検出可能な蛍光シグナルの発生をもたらす、その基質と結合し、これを切断することができる。これは、複数回起こり得るので、従って、シグナルの増幅がある。当業者であれば、上記の例示的戦略はニッキング酵素を使用するが、このプロセスは、ＲＬおよびＢＬのハイブリダイゼーションによって形成される認識部位の両鎖を切断することができる制限酵素の使用に対応するよう改変され得ることは認識するであろう。このような場合には、ＲＬの切断は、認識部位のＲＬ鎖を、ホスホロチオエート連結を組み込み、従って、制限酵素によるＲＬ鎖の切断を防止するよう改変することによって回避され得る。
【０３７０】
他の態様では、シグナル増幅のために、鎖置換型ポリメラーゼが使用され得る。適したプライマーオリゴヌクレオチドと組み合わせて提供される場合には、核酸の下流の鎖を置換し、従って、置換された鎖を一本鎖にする目的で、プライマー配列の伸長によって核酸の新規鎖を合成する能力を有する鎖置換型ポリメラーゼが使用され得る。これは、二本鎖である場合に非機能的であるが、一本鎖である場合に機能性を回復する分子の機能の活性化のための機序として使用され得る。プライマー／ポリメラーゼ媒介性鎖置換のプロセスは、ＢＬ分子と結合している場合にこれまで不活性にされていた触媒核酸分子の活性化を促進するために使用され得る。一態様では、プライマーは、ＲＬ分子による触媒核酸の置換後にＢＬ分子とハイブリダイズでき、鎖置換型ポリメラーゼ酵素によってその３’末端で伸長され得る。これは、ＢＬからのＲＬの置換をもたらし、次いで、ＢＬおよび伸長されたプライマーの間で不要な複合体が形成される。次いで、ＲＬは再利用され、ＢＬ分子からのさらなる触媒核酸を置換するよう機能し得、シグナルの増幅をもたらす。
【０３７１】
図８、パネルｉ）を参照すると、ＤＮＡザイム（Ｄｚ；太い黒色線）がＢＬ分子（ＢＬ；細い灰色線）とハイブリダイズする例示的戦略が表されている。ＢＬは、その末端の一方に小さいヘアピンを形成する幾分かのさらなる配列を含有するが、ＤＮＡザイムおよびＢＬは、別個のオリゴヌクレオチドである。この小さいヘアピンのステムは、プライマー結合領域を含有するが、プライマー（先のとがった末端を有する短い黒色線として描かれる）は、この領域がヘアピンステム内にブロックされているので、この領域と結合できない。Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（３’−５’エキソ−）などの鎖置換型ポリメラーゼが使用される（塗りつぶし黒色丸として描かれる）場合には、それもまた、プライマーがその結合部位と結合できないのでプライマーを伸長できない。領域（ｒｅａｇｉｏｎ）混合物中の全てのオリゴヌクレオチドのうち、残りのオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼによるその伸長をブロックするよう３’リン酸化されているので、プライマーのみがポリメラーゼによって伸長される可能性を有する。基質配列（基質；細い黒色破線）は、フルオロフォア（白丸）およびクエンチャー（黒丸）を用いて標識され、Ｄｚによって切断されるよう設計されるが、ＢＬとのハイブリダイゼーションのために、Ｄｚは、その基質を切断できない。ＲＬは、イニシエーター酵素（例えば、ＭＮＡザイム、ＤＮＡザイム、リボザイムまたはアプタザイム）の触媒活性によって、イニシエーター酵素の触媒活性を誘導する標的分子が存在する場合にのみ、イニシエーター酵素の基質がＲＬをもたらすよう改変されている標的依存的に提供され得る。非限定的な例として、標的特異的な方法でのＲＬの生成は、図４パネルｉ）に例示されるように達成され得る。図８パネルｉ）を参照すると、活性な一本鎖ＲＬ分子（ＲＬ；太い黒色破線）が存在する場合には、ＢＬと結合して、ＤｚをＢＬ分子から置き換え、またＢＬの末端でのヘアピンの開環を促進し、従って、プライマー結合部位を曝露する。結果的に、プライマーは、ＢＬの末端で結合し、鎖置換型ポリメラーゼによって伸長され、このプロセスにおいてＲＬを置き換える。伸長されたプライマーおよびＢＬは、次いで、不活性の二重鎖を形成し、一方で、ＲＬは、次いで、再利用され、このプロセスを反復することができる。各Ｄｚは、ひとたび置き換えられると、次いで、基質と結合し、これを切断することができ、これは、フルオロフォアおよびクエンチャーの分離をもたらし、検出可能な蛍光シグナルが続く。これは複数回起こり得るので、次いで、シグナルの増幅がある。
【０３７２】
シグナル検出および増幅：ブロックされたＲＬ
一部の態様では、ＲＬ分子は、それ自体、別のＢＬ分子とのハイブリダイゼーションによって最初に不活性化され得る。ＢＬは、別個のオリゴヌクレオチドとして存在し得るか、またはＲＬと同一オリゴヌクレオチド内に存在し得、ここで、それらは、ヘアピン構造のループを形成し得る核酸または非核酸スペーサー配列を連結することによって接続され得る。ＢＬおよびＲＬ間のハイブリダイゼーションは、ＲＬの可逆的不活性化をもたらし得、この状態で、ここで「分子スイッチ」と呼ばれる。ＢＬ分子は、触媒核酸の基質配列を含有し得る。これは、ヘアピンループ配列の一部として、またはＲＬおよびＢＬの両方が共に連結される場合にはそれに加えて存在し得る。このような態様では、ＲＬのその他のオリゴヌクレオチドを「放出」する能力（例えば、鎖置換活性によって）の復元をもたらし得る基質配列の切断は、ＲＬをＢＬから放出し得る。このような態様では、１種または複数の不活性ＲＬ分子が、１種または複数の不活性触媒核酸分子と共存するフィードバックカスケードが作製され得、これでは、ＲＬおよび触媒核酸の両方とも、そのそれぞれのＢＬ分子とのハイブリダイゼーションによって不活性化されている（図９、パネルｉｉｉ）。ＭＮＡザイムのアセンブリーファシリテーターなどの活性触媒核酸分子を完成するための活性触媒核酸分子または最終成分の添加は、ＲＬ機能性および／または触媒核酸触媒作用のいずれかの活性化をもたらす１種または複数のＢＬ分子の切断をもたらし得る。これは、２つの異なる分子スイッチ間のＢＬ切断およびＲＬ媒介性置換事象のカスケードを開始でき、ＲＬおよび触媒核酸分子の連続活性化ならびにその後のシグナルの増幅をもたらす。
【０３７３】
例えば、図９パネルｉ）は、リリーサー（ＲＬ；太い黒色破線）がＢＬ分子（ＢＬＡ、太い黒色線として描かれる）とプレハイブリダイズされ、ヘアピン構造のループを形成する非相補的配列によって２者が共に連結される（全複合体は、ヘアピン型ＲＬと呼ばれる）戦略を表す。ＢＬＡは、標的依存的にイニシエーター触媒核酸酵素によって切断され得る基質配列、細い黒色破線として描かれる基質１を含有する。さらに、ヘアピン型ＤＮＡザイム（ヘアピン型Ｄｚ２、太い黒色実線）が存在し、単一オリゴヌクレオチド中に、ヘアピンループとして作用する短い非相補的配列によって連結されているＤＮＡザイムおよび対応するＢＬ配列（ＢＬＢ）の両方を含有する。図４パネルｉｉｉ）に最初に記載されたように、Ｄｚ配列の小さい部分は、ヘアピンの残部（ＢＬＢ配列）とハイブリダイズせず、二重鎖の中心にループ構造として示される。図９パネルｉ）を参照すると、基質配列（基質２；細い黒色破線）は、フルオロフォア（白丸）およびクエンチャー（黒丸）を用いて標識され、Ｄｚ２によって切断されるよう設計されるが、一方で、Ｄｚ２配列は、ヘアピン構造内に拘束されており、最初は、その基質を切断できない。ヘアピン型ＲＬ複合体のＢＬＡ部分が、触媒核酸（Ｄｚ１（太い灰色実線）として例示されるが、ＭＮＡザイムまたはアプタザイムなどの異なる触媒核酸酵素も使用され得る）によって切断されると、ＢＬＡは、ＲＬから解離する。次いで、ＲＬは活性であり、ヘアピン型Ｄｚ２のＢＬＢ部分と自由にハイブリダイズし、ここで、それはヘアピンＤｚ２分子を開環するよう機能する。ＲＬは、いくつかの触媒活性に必須の配列を欠く（Ｄｚ２中に存在するが、Ｄｚ２およびヘアピンのＢＬＢ領域間の不完全ハイブリダイゼーションのためにループして出される塩基を欠く）ので、触媒分子自体として機能できない。ヘアピン型Ｄｚ２複合体のＢＬＢ部分およびＲＬは、次いで、不活性二重鎖を形成し、これが、Ｄｚ２部分を解放する。次いで、Ｄｚ２部分は、基質２と結合し、これを切断することができ、これは、フルオロフォアおよびクエンチャーの分離および検出可能な蛍光シグナルの発生をもたらす。
【０３７４】
図９パネルｉｉｉ）は、ヘアピン型ＲＬのＢＬＡ領域内に存在する基質配列が、ＲＬによってその後活性化される触媒核酸によって切断されるよう設計される場合に起こり得る例示的環カスケード反応の概要を示す。ヘアピン型ＲＬは、ＲＬ部分（太い黒色破線）およびＢＬ部分（ＢＬＡ、太い黒色線）を含み、これらは、ヘアピン構造（太い黒色線）のループを形成する非相補的配列によって共に連結され得る。ＢＬＡ部分は、標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１太い灰色破線）の存在下で集合したＭＮＡザイム（Ｍｚ１（太い灰色実線）として例示されるが、アプタザイムまたはＤＮＡザイムなどの異なる触媒核酸酵素も使用され得る）によって切断され得る基質配列（基質１；細い黒色破線）を含有する。さらに、ＤＮＡザイム１（Ｄｚ１）はまた、ヘアピン構造（全複合体は、ヘアピン型Ｄｚ１と呼ばれる、細い灰色線として描かれる）内のＢＬ配列（ＢＬＢ）とのハイブリダイゼーションによって不活性状態で存在し得る。活性Ｍｚ１の不在下では、２種のヘアピン型分子が、不活性状態で共に存在し、互いに相互作用しない。しかし、活性Ｍｚ１が存在する場合には、これは、ヘアピン型ＲＬのＢＬＡ部分の切断およびその後のこの分子のＲＬ部分の活性化をもたらし得る。ＲＬは、次いで、ヘアピン型Ｄｚ１のＢＬＢ部分とハイブリダイズし、ヘアピン構造を開環し、この分子のＤｚ１部分を活性化するよう機能し得る。活性Ｄｚ１は、次いで、別のヘアピン型ＲＬ分子内の基質１を切断し、従って、さらなるＲＬ分子の活性化をもたらすよう機能し得る。ＲＬ分子が、ＤＮＡザイムを連続的に活性化し、逆もまた同様である環カスケードが、次いで、作製され得、このカスケードは、シグナルの増幅のために使用され得る。
【０３７５】
標的検出およびシグナル増幅：ＮＲＦ
上記で記載されるように、ＮＲＦは、ヌクレアーゼによる認識のための配列を提供することができ、従って、ヌクレアーゼ酵素の活性の開始を可能にするオリゴヌクレオチドである。一部の態様では、ＮＲＦは、ＢＬと全体的または部分的にハイブリダイズし、従って、ヌクレアーゼ、例えば、ExoIIIなどのエキソヌクレアーゼの基質を生成し、ＢＬの選択的切断または分解につながり得る。ＢＬが、触媒核酸などの第３の機能的分子とハイブリダイズされる場合には、ＢＬのヌクレアーゼ切断または消化は、次いで、触媒核酸の活性化およびその機能の回復をもたらし得る。次いで、ＮＲＦは、再利用されて、別のＢＬ分子とハイブリダイズし得、このプロセスが反復される。さらに好ましい態様では、ＮＲＦは、別のＢＬ分子とハイブリダイズされ、その一時的な不活性化、すなわち、ヌクレアーゼ活性を開始するのに必要な配列鋳型を提供するよう機能する能力の喪失をもたらす。ＢＬは、別個のオリゴヌクレオチドとして存在し得るか、またはそれらがヘアピン構造のループを形成する核酸または非核酸スペーサー配列を連結することによって接続され得るＮＲＦと同一オリゴヌクレオチド内に存在し得る。一態様では、ＢＬはまた、触媒核酸分子の基質として作用する配列を含有し得る。これは、ヘアピンループ配列の一部として、またはＮＲＦおよびＢＬの両方が共に連結される場合にはそれに加えて存在し得る。このような態様では、基質配列の切断は、ＢＬからＮＲＦを放出し得、これは、ＮＲＦとして機能するその能力の復元をもたらし得る。
【０３７６】
他の態様では、ＮＲＦおよび触媒核酸の両方が、そのそれぞれのＢＬ分子とのハイブリダイゼーションのために両方不活性状態で存在するカスケードが作製され得る。ＮＲＦは、ＢＬ／触媒核酸分子スイッチの対向するＢＬとハイブリダイズし、エキソヌクレアーゼによるその消化を開始する可能性を有する。触媒核酸はまた、ＢＬ／ＮＲＦ分子スイッチの対向するＢＬ内に存在する基質を切断し、ＮＲＦの活性化をもたらす可能性も有する。ＭＮＡザイムのアセンブリーファシリテーターなどの活性触媒核酸分子を完成するための活性触媒核酸分子または最終成分の添加は、ＮＲＦ機能性または触媒核酸触媒作用のいずれかの活性化をもたらす１種または複数のＢＬ分子の切断をもたらし得る。これは、ＢＬ切断および２つの異なる分子スイッチ間のＮＲＦ媒介性ＢＬヌクレアーゼ消化事象のカスケードを開始でき、ＮＲＦおよび触媒核酸分子の連続活性化をもたらす。
【０３７７】
図１０、パネルｉ）を見てみると、ヘアピン型ＤＮＡザイム分子（ヘアピン型Ｄｚ１）が存在し、ＤＮＡザイム部分を示す細い灰色線および残りのＢＬを示す太い黒色線、トーホールドおよびヘアピンループ部分として描かれる戦略を図表で表している。細い黒色破線として描かれた基質配列（基質１）は、フルオロフォア（白丸）およびクエンチャー（黒丸）を用いて標識され、ヘアピン型Ｄｚ１分子のＤｚ１部分によって切断されるよう設計されるが、ＢＬ部分とハイブリダイズされるので、Ｄｚ１は不活性であり、その基質を切断できない。ＮＲＦは、イニシエーター酵素（例えば、ＭＮＡザイム、ＤＮＡザイム、リボザイムまたはアプタザイム）の触媒活性によって、イニシエーター酵素の触媒活性を誘導する標的分子が存在する場合にのみ、イニシエーター酵素の基質がＮＲＦをもたらすよう改変される標的依存的に提供され得る。非限定的な例として、標的特異的な方法でのＮＲＦの生成は、図１０パネルｉｉ）に例示されるように達成され得る。図１０パネルｉ）を参照すると、活性ＮＲＦは、太い黒色破線として描かれ、ヘアピン型Ｄｚ１のＢＬ部分の３’末端とハイブリダイズされ、これは、最初は、二重鎖をExoIII分解に対して抵抗性にするために、二重鎖から少なくとも４ヌクレオチドだけ突出しているその３’末端を有する。しかし、ＮＲＦのＢＬとのハイブリダイゼーションは、ExoIIIに適した平滑末端または３’陥凹末端を有する二本鎖基質を提供する（灰色のセグメント化された環）。ExoIIIは、その３’末端からＢＬ分子を選択的に消化でき、一方で、ＮＲＦ分子は未変化のまま残り、ヘアピン型Ｄｚ分子を一本鎖にし、従って、ＢＬ部分を分解するが、ここでは、活性であろうＤｚ１部分を残す。ＮＲＦは、次いで、再利用され得、このプロセスを反復することができる。ひとたび活性であると、各Ｄｚ１は、その基質（各々、突出しており、それらをExoIIIに対して抵抗性にする３’末端を有する）と結合し、フルオロフォアおよびクエンチャーの分離ならびに検出可能な蛍光シグナルの発生をもたらす基質を切断し得る。
【０３７８】
図１０パネルｉｉ）に示される態様は、ヘアピン型ＮＲＦのＢＬ領域内に存在する基質配列は、その後に、ＮＲＦによって開始されるヌクレアーゼ活性によって活性化される触媒核酸によって切断されるよう設計される場合に起こり得る環カスケード反応を表す。ヘアピン型ＮＲＦは、太い黒色破線として描かれるＮＲＦ部分およびＢＬ部分、太い黒色線として描かれるＢＬＡからなり、ヘアピン構造（同様に、太い黒色線）のループを形成する非相補的配列によって共に連結され得る。ＢＬＡ部分は、その標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１；太い灰色破線）の存在下で集合する活性ＭＮＡザイム（Ｍｚ１；太い灰色線）によって切断され得る基質配列（基質１；細い黒色破線）を含有し得る。さらに、ＤＮＡザイムは、ヘアピン構造内で不活性状態で存在し得る（ヘアピン型Ｄｚ１；ＤＮＡザイム部分を示す細い灰色線ならびにヘアピンループおよびＢＬＢ部分を示す太い黒色線）。任意の活性ＭＮＡザイムの不在下では、２種のヘアピン型分子が、不活性状態で共に存在し得、互いに相互作用しない。しかし、活性ＭＮＡザイムが存在する場合には、これは、ヘアピン型ＮＲＦのＢＬＡ部分内の基質１の切断およびその後の分子のＮＲＦ部分の活性化をもたらし得る。このステップは、イニシエーター酵素（例えば、ＭＮＡザイムまたはアプタザイム）の触媒活性によるＮＲＦを、図１０パネルｉ）に論じられるように標的依存的に提供するための方法の非限定的な例を提供する。図１０パネルｉｉ）を参照すると、次いで、ＮＲＦは、ヘアピン型Ｄｚ１のＢＬＢ部分とハイブリダイズし、ヘアピン構造を開環して、分子のＤｚ１部分を活性化するよう機能し得る（パネルｉ）に概要が示されるように）。ＮＲＦの再利用に加えて、次いで、活性Ｄｚ１はまた、別のヘアピン型ＮＲＦ分子の基質を切断し、従って、さらなるＮＲＦ分子の活性化をもたらすよう機能し得る。次いで、ＮＲＦ分子（再利用される）が、ＤＮＡザイムを連続的に活性化する、逆もまた同様である、シグナルの増幅のために使用され得る環カスケードが作製され得る。
【０３７９】
他の態様では、ＮＲＦは、標的を全体的または部分的に含み得る。図２７パネルｉ）を具体的に参照すると、自己触媒性疑似環カスケード（図２１パネルｉ）中のものなど）は、標的配列（標的１；太い灰色破線）の、疑似環のＢＬ内の基質（基質１；細い灰色線）とのハイブリダイゼーションによって開始される。基質１および標的１は各々、ＲＥ認識配列（太い黒色破線）の一方の鎖を含み、その結果、２者を共に結合すると完全認識部位の形成をもたらす。従って、標的１は、ＲＥ（塗りつぶし黒色三角）の活性を漸加して、ＢＬに選択的にニックを入れるのでＮＲＦとして機能する。ＢＬ分子は、ＤＮＡザイム（Ｄｚ２；太い黒色線）とハイブリダイズして、Ｄｚ２の一時的不活性化をもたらす、その５’および３’末端の配列（太い黒色線）からなる。ＢＬはまた、ひとたびＤｚ２が、基質１のニッキングによってＢＬから放出されると、Ｄｚ２によって切断することができる、基質１に隣接する第２の基質配列基質２（基質２ａ、太い黒色線）を含有する。さらに、基質２はまた、ＤＮＡザイム切断反応をモニタリングするために、フルオロフォア（白丸）およびクエンチャー（塗りつぶし黒色丸）を用いて改変された独立した実体として提供される。標的１およびＲＥが両方とも存在する場合にのみ、基質１にニックが入れられ、自己触媒性カスケードの開始および蛍光シグナルの発生をもたらす。
【０３８０】
標的検出およびシグナル増幅：ヘアピン型ＤＮＡザイム
別の戦略では、制限酵素（例えば、ニッキング酵素）は、触媒核酸分子を連続的に合成し、触媒核酸分子を相補的ＢＬ鋳型から置き換えるために共に含まれ、鎖置換型ポリメラーゼ酵素と協調して使用され得る。このような態様では、鎖置換型ポリメラーゼによるプライマーの伸長は、ＲＥの上流認識部位の形成をもたらす。ＲＥのエンドヌクレアーゼ活性は、触媒核酸分子の上流のニックの生成（例えば、ニッキング酵素を使用し、認識部位の一方の鎖にホスホロチオエート連結を組み込むことによる）をもたらし、従って、鎖置換型ポリメラーゼ酵素によって伸長し得る新規プライマーを形成し、触媒核酸分子の新規コピーを合成し、同時に、既存の触媒核酸分子を置き換え得る。次いで、２種のタンパク質酵素は、協力して働き続け、新規触媒核酸分子を連続的に合成し、置換し得、これは、シグナルの増幅に使用され得る。
【０３８１】
例えば、図１１、パネルｉ）は、ヘアピン型ＤＮＡザイム分子（ヘアピン型Ｄｚ）が存在し、太い黒色破線として描かれるＤｚ部分およびＢＬ部分および太い黒色線として描かれるヘアピンループを有するこの性質の戦略を表す。ヘアピンループは、ＲＥ、例えば、ニッキング酵素Ｎｔ．ＡｌｗＩ（黒色実線三角）のＲＥ認識部位の一方の鎖に必要な塩基のうち全てではないが幾分かを含有する、従って、ヘアピン型Ｄｚ中のＲＥ認識部位が不完全である。基質配列（基質；細い黒色破線）は、フルオロフォア（白丸）およびクエンチャー（黒丸）を用いて標識され、ヘアピン型Ｄｚ分子のＤｚ部分によって切断されるよう設計されるが、ＤｚのＢＬ部分とのハイブリダイゼーションのために、Ｄｚは不活性であり、その基質を切断できない。プライマーは、イニシエーター酵素（例えば、ＭＮＡザイム、ＤＮＡザイム、リボザイムまたはアプタザイム）の触媒活性によって、イニシエーター酵素の触媒活性を誘導する標的分子が存在する場合にのみ、イニシエーター酵素の基質がプライマーをもたらすよう改変される標的依存的に提供され得る。非限定的な例として、プライマーの供給は、図１２ｉ）およびｉｉ）に例示される戦略を使用して達成され得る。図１１パネルｉ）を参照すると、太い灰色線として描かれるプライマーが存在する場合には、ヘアピン型Ｄｚの一本鎖ループとハイブリダイズし得、塗りつぶし黒色丸として描かれるＫｌｅｎｏｗフラグメント（３’−５’エキソ−）などの鎖置換型ポリメラーゼによって伸長され得る。ポリメラーゼは、鋳型としてヘアピン型ＤｚのＢＬ部分を使用し、Ｄｚの新規コピーを合成し、従って、ヘアピンを開環でき、既存のＤｚが一本鎖で、活性であることを可能にする。さらに、プライマー伸長は、Ｎｔ．ＡｌｗＩ認識部位を完成し、Ｎｔ．ＡｌｗＩが、上流プライマーおよび下流Ｄｚ配列の間で新規に合成された鎖に選択的にニックを入れるのを促進する。従って、ニックは、新規プライマーを作製し、これはＫｌｅｎｏｗによって伸長されて、新規Ｄｚコピーを合成し、既存のＤｚを置き換えることができる。次いで、両酵素は、Ｄｚ分子を連続的に合成し、置き換えるよう共に機能し得る。各Ｄｚは、ひとたび置き換えられ、活性であると、次いで、基質と結合することができ、フルオロフォアおよびクエンチャーの分離ならびに検出可能な蛍光シグナルの発生をもたらす基質を切断できる。当業者であれば、上記の例示的戦略は、ニッキング酵素を使用するが、このプロセスは、ハイブリダイゼーションおよび／またはプライマーの伸長および酵素をＢＬと連結するヘアピンループセグメントによって形成される認識部位の両鎖を切断することができる制限酵素の使用に対応するよう改変され得ることは認識するであろう。このような場合には、認識部位のヘアピンループ鎖の切断は、ヘアピンループ鎖を、ホスホロチオエート連結を組み込み、従って、制限酵素によるヘアピンループ鎖の切断を防止するよう改変することによって回避され得る。
【０３８２】
他の態様では、プライマーおよび触媒核酸両方が、そのそれぞれのＢＬ分子とのハイブリダイゼーションによって、最初は両方とも不活性状態で存在するカスケードが、作製され得る。例えば、プライマーは、最初は、ＢＬ分子とハイブリダイズされ、その一時的な不活性化をもたらす。ＢＬは、プライマーに対して別個のオリゴヌクレオチドとして存在し得るか、またはヘアピン構造のループを形成する、連結核酸または非核酸スペーサー配列によって接続される、プライマーと同一オリゴヌクレオチド内に存在し得る。プライマーと結合されるＢＬはまた、触媒核酸分子の基質として作用する配列を含有し得る。これは、ヘアピンループ配列の一部として、またはプライマーおよびＢＬの両方が共に連結される場合にそれに加えて存在し得る。基質配列の切断は、ＢＬからプライマーを放出し得、これはそのプライミング活性の復元をもたらし得る。プライマーは、ヘアピンループ配列などのＢＬ／触媒核酸分子スイッチの対向するＢＬの一部とハイブリダイズし、ポリメラーゼ酵素によるプライマーの伸長を開始し、これが触媒核酸のＢＬからの分離およびその触媒活性の復元をもたらし得る可能性を有し得る。触媒核酸はまた、ＢＬ／プライマー分子スイッチの対向するＢＬ内に存在する基質を切断し、プライマーの活性化をもたらす可能性を有し得る。しかし、両分子スイッチは、ＭＮＡザイムのアセンブリーファシリテーターなどの活性触媒核酸分子を完成するための、活性触媒核酸分子または最終成分の添加まで不活性であり、これは、プライマー機能性または触媒核酸触媒作用のいずれかの活性をもたらす１種または複数のＢＬ分子の切断をもたらし得る。これは、２種の異なる分子スイッチ間のＢＬ切断およびプライマー伸長事象のカスケードを開始し、プライマーおよび触媒核酸分子の連続活性化ならびにその後のシグナルの増幅をもたらし得る。
【０３８３】
非限定的な例として、図１１パネルｉｉｉ）は、ヘアピン型プライマーのＢＬ領域内に存在する基質配列（基質１）が、プライマー−ポリメラーゼ活性によってその後活性化されるＤＮＡザイムによって切断されるよう設計される場合に起こり得る環カスケード反応の概要を示す。ヘアピン型プライマーは、ヘアピン構造（同様に、太い黒色線）のループを形成する非相補的配列によって共に連結される、プライマー部分（太い灰色線）およびＢＬ部分（ＢＬＡ、太い黒色線）を含む。ＢＬＡ部分は、標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１太い灰色破線）の存在下で集合した活性ＭＮＡザイム（Ｍｚ１；太い黒色破線）によって切断され得る基質１配列（細い黒色破線）を含有する。さらに、Ｄｚ１は、ヘアピン構造内で不活性状態で存在し得（ヘアピン型Ｄｚ１）、そのＤｚ１部分は、太い黒色破線として描かれ、ＢＬ部分（ＢＬＢ）およびヘアピンループは、太い黒色線として描かれる。Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ；塗りつぶし黒色丸）およびＲＥ、例えば、Ｎｔ．ＡｌｗＩニッキング酵素（塗りつぶし三角）も、反応において存在し得る。任意の活性Ｍｚ１の不在下で、２種のヘアピン型分子が、不活性状態で共に存在し得、互いに相互作用しない。しかし、活性Ｍｚ１が存在する場合、これは、ヘアピン型プライマーのＢＬＡ部分の基質１の切断およびその後の分子のプライマー部分の活性化をもたらし得る。次いで、活性プライマーは、ヘアピン型Ｄｚ１のループとハイブリダイズし、ヘアピン構造を開環して、分子のＤｚ１部分を活性化するよう機能し得る。さらに、プライマー結合および／または伸長は、ＲＥ（例えば、Ｎｔ．ＡｌｗＩ）認識部位を完成し、ＲＥが、上流プライマーと下流Ｄｚ配列の間で新規に合成された鎖に選択的にニックを入れるのを促進し得る。従って、ニックは、新規プライマーを作製し、これは、Ｋｌｅｎｏｗによって伸長されて、新規Ｄｚコピーを合成し、既存のＤｚを置き換え得る。次いで、両酵素は、Ｄｚ１分子を合成し、置換するよう共に機能し得（パネルｉ）に概要が示されるように）、その各々は、ヘアピン型プライマーのＢＬＡ部分中に存在する基質１を切断し、従って、新規活性プライマーを作製するよう機能し得る。次いで、活性プライマー分子が、活性Ｄｚ１分子の連続活性化および合成に関与している、逆もまた同様である環カスケードが作製され得、シグナルの増幅のために使用され得る。当業者であれば、上記の例示的戦略は、ニッキング酵素を使用するが、このプロセスは、プライマーおよびヘアピン型Ｄｚ１のループのハイブリダイゼーションおよび／または伸長によって形成される認識部位の両鎖を切断することができる制限酵素の使用に対応するよう改変され得ることは認識されよう。このような場合には、認識部位のループ鎖の切断は、ループ鎖を、ホスホロチオエート連結を組み込み、従って、制限酵素によるループ鎖の切断を防止するよう改変することによって回避され得る。
【０３８４】
他の態様では、触媒核酸分子（例えば、ＤＮＡザイム）の連続合成の鋳型を形成するヘアピン構造は、代わりに、部分触媒核酸配列のみからなるＤｚ領域を含み得る。これが起こる場合には、ポリメラーゼおよびＲＥの両方の活性が、反応中に存在する任意の活性触媒核酸があるために必須である。このような鋳型の使用は、バックグラウンド「プライマー独立性」シグナルを排除し、従って、より大きな特異性をもたらすのに有用であり得る。
【０３８５】
例えば、図１９パネルｉ）は、ＤＮＡザイムの連続合成のための鋳型を形成し得る４つの特有の構造（構造Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）を表す。Ｄｚ合成の鋳型部分はまた、構造ＡのＢＬであり（太い黒色線で表される）、これは、最初はＢＬのハイブリダイゼーションのために不活性であるＤＮＡザイム（Ｄｚ；太い破線）とハイブリダイズされる。構造Ｂ〜Ｄにおける新規ＤＮＡザイムの合成のための鋳型（Ｄｚ鋳型（ＡＳＤｚ；アンチセンスＤＮＡザイム配列；太い黒色線）は、機能的ＤＮＡザイムのアンチセンスを含む。構造ＢおよびＣのＢＬ部分は、太い黒色破線として描かれている。構造Ａ〜Ｃのプライマー結合領域（ヘアピンループ部分）と、また構造Ｄのプライマー結合領域と結合する活性プライマー（短い太い灰色線）が示されている。構造Ａは、分子のＤｚ部分が、完全触媒Ｄｚ配列（図１１パネルｉ）において元々表される）を含む「完全」ヘアピン型Ｄｚと呼ばれる。図１９パネルｉ）を参照すると、構造Ｂは、「完全にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型と呼ばれ、完全Ｄｚ配列の４ヌクレオチドを除く全てからなり、これらの塩基が触媒コア領域から除去されるＤｚ部分を含有するＢＬを含む。構造ＢのＤｚ鋳型（ＡＳＤｚ）は、ＢＬのＤｚ部分から除去されるそれらのヌクレオチドを含むＤＮＡザイムの完全相補体（アンチセンス）を含有する。従って、これは、４つの対を形成しないヌクレオチドがあるＤｚ鋳型内のバルジの形成をもたらす。構造Ｃは、「部分的に」ブロックされたヘアピン型Ｄｚ鋳型」と呼ばれ、ＢＬ内の小さいバルジとして示されるＢＬのＤｚコア部分と突然変異したミスマッチした塩基対形成を含有し得る。ポリメラーゼ（塗りつぶし黒色丸）の存在下で、部分的にブロックされたヘアピン型Ｄｚ鋳型の３’末端は、コピーするための鋳型としてＡＳＤｚ鋳型を使用して伸長され得るが、ＢＬのコア領域内の突然変異した塩基対のために、プライマーの後の伸長によって開環される場合に、機能的Ｄｚを露出しない。構造Ｄは、「Ｄｚ鋳型」（ＡＳＤｚ）と呼ばれ、隣接するプライマー結合部位を有するＤｚと相補的である配列だけを含む。Ｄｚ鋳型分子は、ＢＬと結合されない。
【０３８６】
さらなる態様では、ヘアピン型プライマー（図１２パネルｉ）に概要が示される）およびヘアピン型ＤＮＡザイム分子（図１１パネルｉｉｉ）に概要が示される）の両方が、代わりに、それぞれ、部分ヘアピン型プライマーおよび部分ヘアピン型ＤＮＡザイム分子であり得る。部分ヘアピン型プライマーは、最初、プライマー領域の部分のみを含み得、従って、部分的ヘアピン型Ｄｚ鋳型（元々、図１９パネルｉ）に記載される）と、低下した相補性を有し得、２種の分子間の任意の望まれない結合を最小にし、その後、反応が、標的依存的に開始され得る。ポリメラーゼの存在下では、部分プライマー領域は、鋳型としてＢＬ領域を使用して伸長され、従って、ヘアピン型プライマーの配列を完成する。図２３に例示される、２つの部分分子（部分ヘアピン型プライマーおよび部分的にブロックされたヘアピンＤｚ鋳型）の使用は、バックグラウンド「標的独立性」シグナルを排除するのに、従って、より大きな特性をもたらすのに有用であり得る。
【０３８７】
図２３パネルｉ）では、細い灰色線として示される部分プライマー領域、細い黒色破線として描かれる基質１によって連結される２つの細い黒色線としてのＢＬ領域（ＢＬＡ）を有する部分ヘアピン型プライマーが存在する。ポリメラーゼ酵素（塗りつぶしの大きな黒色丸）の存在下で、部分ヘアピン型プライマーの３’末端は、鋳型としてＢＬＡ領域を使用して伸長され、従って、プライマー領域を完成し、完全ヘアピン型プライマーの形成をもたらし得る。さらに、太い黒色破線として描かれたＢＬ領域（ＢＬＢ）および太い黒色破線としてのＤｚ２鋳型（ＡＳＤｚ）領域を有する、部分的にブロックされたヘアピン型Ｄｚ２鋳型もまた存在する。ＢＬＢは、完全ＤＮＡザイムに対して、触媒的に不活性化する突然変異を構成する、ＢＬＢのＤｚコア内に突然変異した塩基（複数可）を含有するＤＮＡザイムの部分配列を含む。ＢＬＢ中の突然変異体コア塩基は、小さいバルジとして示される。ポリメラーゼの存在下で、部分的にヘアピン型Ｄｚ鋳型鎖の３’末端は、コピーするための鋳型としてＤｚ２鋳型部分を使用して伸長され得るが、ＢＬＢ内の突然変異した塩基のために、プライマーによる伸長によって部分的ヘアピン型Ｄｚ鋳型構造が開環される場合に機能的Ｄｚは露出されない。その標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１；太い灰色破線）の存在下で集合する、基質１（Ｍｚ１；太い黒色破線）を切断するよう設計されたＭＮＡザイムが存在し得る。これは、Ｍｚ１による基質１の切断およびその後の部分的ヘアピン型プライマーからのプライマー領域の放出をもたらし、その誘導能力の回復をもたらし得る。次いで、活性プライマーは、部分的にブロックされたヘアピン型Ｄｚ２鋳型構造のループとハイブリダイズし、図１１に概要が示される、ポリメラーゼ伸長およびＲＥニッキング活性（塗りつぶし黒色三角として描かれるＲＥ）によって活性Ｄｚ２分子（太い黒色破線）の合成をプライムし得る。図２３パネルｉ）を参照すると、次いで、活性Ｄｚ２分子は、フルオロフォア（灰色星）およびクエンチャー（塗りつぶしの小さい黒色丸）を用いて標識され得る基質２（細い灰色破線）を切断し得、検出可能な蛍光シグナルをもたらす。
【０３８８】
図１２は、触媒核酸酵素の標的依存的活性に頼るプライマーオリゴヌクレオチドの作製のための例示的戦略を提供する。パネルｉ）では、プライマー（太い灰色線）は、最初、ＢＬ分子（ＢＬＡ、太い黒色線）とハイブリダイズされ、両者は、ヘアピン型分子（同様に、太い黒色線）のループを形成する非相補的配列によって連結され得る。ＢＬＡは、その標的（ＡＦ１：太い灰色破線）の存在下でＭＮＡザイム（Ｍｚ１）によって切断され得る基質配列（細い黒色破線）を含有し得る。基質の切断は、ＢＬＡからプライマーを放出し、プライマーを活性にし得る。次いで活性プライマーは、完全ヘアピン型ＤＮＡザイム構造（ヘアピン型Ｄｚ２；太い黒色破線として描かれるＤｚ２、太い黒色実線として描かれるＢＬＢ）のループとハイブリダイズし得、新規ＤＮＡザイムを活性化および／または合成するよう進行し得る（例えば、図１１に概要が示されるように）。パネルｉｉ）では、プライマー（太い灰色線）は、最初に、別個のＢＬ分子（ＢＬＡ、太い黒色線）とハイブリダイズされ得るが、両者は、パネルｉ）におけるように共に連結され得ず、２種の別個のオリゴヌクレオチドとして存在する。次いで、プライマーが、パネルｉ）に概要が示されるものと同様の方法で活性化され得る。パネルｉｉｉ）では、プライマーは、ＭＮＡザイムの基質の成分として存在し得る（プライマーは、基質分子の左部分に太い灰色線として表され、基質の残部は、右に細い黒色破線として示される）。その標的（ＡＦ１；太い灰色破線）の存在下でＭＮＡザイム、（Ｍｚ１；太い黒色破線）は、基質を切断し、その他の切断された断片からのプライマーの分離をもたらし得る。プライマーは、ＭＮＡザイム切断反応の生成物である、３’末端での２’３’環状ホスフェート（塗りつぶし黒色五角形の形）の存在のために切断後に不活性のままである。プライマーの活性化をもたらす２’３’環状ホスフェートの除去を触媒するために、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４  ＰＮＫ、塗りつぶし灰色星型として示される）または別の適当な酵素が使用され得る。次いで、活性プライマーは、完全ヘアピン型ＤＮＡザイム（ヘアピン型Ｄｚ２；太い黒色破線として描かれたＤｚ２、太い黒色実線として描かれたＢＬ）のループとハイブリダイズし、例えば、図１１において概要が示されるように、新規ＤＮＡザイムを活性化および／または合成するよう進行し得る。
【０３８９】
さらなる態様では、線形カスケードが、基質のＭＮＡザイム切断によるプライマーの活性化および切断された基質断片のその後の脱リン酸化によって引き起こされ得る（例えば、図１２、パネルｉｉｉ）ならびに図１７、パネルｉ）およびｉｉ）に概要が示されるように）。これらの線形カスケードでは、最初のＭＮＡザイムによって切断されたプライマーを含む基質は、ヘアピンＤｚ／ＢＬ複合体から放出された、または部分的ヘアピン型Ｄｚ鋳型／ＢＬ複合体においてＤｚ鋳型をコピーすることによって合成されたＤｚによって最終的に切断された基質とは異なる。
【０３９０】
図１７は、開始のためのプライマー活性化のための戦略を利用する２つの例示的線形カスケードを表す。カスケードは、図１１に概要が示される、新規ＤＮＡザイムを活性化および／または合成するための、完全ヘアピン型（パネルｉ））または部分的ヘアピン型Ｄｚ鋳型構造のループとハイブリダイズする活性プライマーの使用に基づく。図１７パネルｉ）では、ＭＮＡザイム（Ｍｚ１；太い黒色破線）は、その標的（ＡＦ１；太い灰色破線）の存在下で集合し得、その基質（基質１、左および右部分を含有する線として描かれる；左は、不活性プライマーを表す太い灰色線を含有し、右は、細い黒色破線として示される）を切断し得る。基質１は、フルオロフォア（白丸）およびクエンチャー（塗りつぶしの小さい黒色丸）を用いて標識され得る。ＭＮＡザイムによる基質１の切断は、その他の切断された断片からのプライマーの分離をもたらし得、そうすることで、検出可能なシグナルが生成し得る。プライマーは、ＭＮＡザイム切断反応の生成物であり得る、３’末端での２’３’環状ホスフェート（塗りつぶし黒色五角形の形）の存在のために、切断後に不活性のままであり得る。プライマーの活性化をもたらす２’３’環状ホスフェートの除去を触媒するためにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４  ＰＮＫ；塗りつぶし灰色星型）または同様の適当な酵素が使用され得る（すなわち、相補的核酸とハイブリダイズすることができ、適したポリメラーゼ酵素による核酸の新規鎖の合成を開始するために利用され得るという意味で）。活性プライマーは、従って、完全ヘアピン型ＤＮＡザイム（ヘアピン型Ｄｚ２；太い黒色破線として描かれるＤｚ２部分、太い黒色線として描かれるＢＬ部分およびヘアピンループ）のループとハイブリダイズし得、鎖置換型ポリメラーゼ（Ｐｏｌ；大きな塗りつぶし黒色丸）によって伸長され得る。ポリメラーゼは、鋳型としてＢＬ部分を使用し、Ｄｚ２の新規コピーを合成し、従って、ヘアピンを開環でき、既存のＤｚ２が一本鎖になり、活性であることを可能にする。各Ｄｚ２は、ひとたび置き換えられ、活性であると、次いで、その基質（基質２；細い灰色破線）と結合し、これを切断できる。基質２は、基質１と同一または異なるフルオロフォア（塗りつぶしの灰色星型として示される）およびクエンチャー（塗りつぶし黒色丸）を用いて標識され得る。Ｍｚ１による基質１および活性Ｄｚ２による基質２の切断は、フルオロフォアおよびクエンチャーの分離および２種のフルオロフォアのうち１種が、基質１および２を標識するために使用されるかどうかに応じて、１種または２種の検出可能な蛍光シグナルの発生をもたらし得る。
【０３９１】
ＲＥを組み込むと、新規ＤＮＡザイム分子の連続合成をもたらす別の線形カスケードが拡大され得る（図１１に概要が示されるように）。図１７パネルｉｉ）では、「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型（元々、図１９パネルｉ）Ｃに概要が示される）が使用され得る（部分的にブロックされたヘアピン型Ｄｚ２鋳型（ＡＳＤｚ）；太い黒色線）。太い黒色破線として描かれる部分Ｄｚ部分は、ＢＬ部分中に存在し、ヘアピンループは、太い黒色線として描かれる）。Ｄｚ２鋳型（ＡＳＤｚ）部分は、機能的ＤＮＡザイム、Ｄｚ２のアンチセンスである。ＢＬＢは、完全ＤＮＡザイムに対する触媒的に不活性化する突然変異を構成する、ＢＬのＤｚコア内に突然変異した塩基（小さいバルジとして示される）を含有するＤＮＡザイムの部分配列を含む。ポリメラーゼの存在下で、ＢＬ鎖は伸長され得るが、突然変異のために、プライマーによって開環される場合に機能的Ｄｚを合成し得ない。パネルｉｉ）に示される態様では、Ｄｚ鋳型鎖はまた、ＲＥの認識部位の一方の鎖を含有し、その結果、ループおよびＤｚ鋳型部分に沿ったプライマーの伸長は、完全ＲＥ認識部位の形成をもたらし得る。結果的に、ＲＥ（塗りつぶし黒色三角の形として示される）は、新規に合成された鎖に上流プライマーおよび下流Ｄｚ２配列の間で選択的にニックを入れることができる。ニックは、新規プライマーを作製し、これは、鎖置換型ポリメラーゼによって伸長され、新規Ｄｚ２コピーを合成し、既存のＤｚ２を置き換え得る。次いで、両酵素は、Ｄｚ２分子を合成し、置き換えるよう共に機能し得、その各々は、基質２を切断し、フルオロフォアおよびクエンチャーを分離し、検出可能な蛍光シグナルをもたらすよう機能し得る。
【０３９２】
さらなる態様では、図１７パネルｉ）およびｉｉ）に概要が示される線形カスケードは、環フィードバックカスケードを作製し、それによって、ＭＮＡザイム標的認識事象後にシグナルの増幅をもたらすよう改変され得る。図１８パネルｉ）およびｉｉ）は、それぞれ図１７パネルｉ）およびｉｉｉ）に概要が示される線形カスケードをループする閉じたフィードバックを表す。各場合において、生成される活性Ｄｚは、ＭＮＡザイムと同一基質（基質１）を認識し、切断し、従って、新規活性プライマー分子の生成につながるよう設計され得る。
【０３９３】
さらなる例示的態様では、反応内に、プライマーの合成および増幅の鋳型として働き得るさらなる分子（複数可）が存在し得る。図１３に示される例示的戦略を参照すると鋳型は、プライマーと相補的であり、ＲＥの認識部位の一方の鎖によって分離されている２つの領域を含有する。図１３パネルｉ）を参照すると、「プライマー１と呼ばれるプライマーの、プライマー鋳型の第１の相補的領域とのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズされ得る多数のヌクレオチドがあるよう設計されているので、最初は支持される。次いで、プライマーがポリメラーゼによって伸長され得、これは、完全な二本鎖ＲＥ認識部位と、それに続くさらなるプライマー１配列の合成をもたらし得る。次いで、ＲＥ活性は、ＲＥ切断、次いで、鎖置換型ポリメラーゼによる伸長のサイクルによるプライマー１の連続合成を可能にし得る。さらなるプライマー製造性鋳型分子は、図１３パネルｉ）に表されるように線形一本鎖鋳型として、または最初のプライマーが第２の相補的領域とハイブリダイズすることを、この事象がさらなるプライマー１合成をもたらさないので防止するのに役立つ、一方の鎖はプライマー合成の鋳型を含有し、もう一方は、プライマー鋳型と部分的に相補的である、図１３パネルｉｉ）に表されるようにヘアピン型ＤＮＡ分子として存在し得る。さらなるプライマー製造性鋳型分子はまた、異なるプライマーの伸長によって開始され得、例えば、図１３パネルｉｉｉ）に表されるように、これでは、プライマー２がプライマー１を製造する。
【０３９４】
より詳細に図１３に示される例示的態様を参照すると、パネルｉ）は、最初のプライマー（プライマー１；灰色実線）が、プライマー鋳型（プライマー鋳型；黒色実線）とハイブリダイズし得る方法を示し、これでは、プライマー１は、次いで、鎖置換型ポリメラーゼ（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ；塗りつぶし黒色丸）によって伸長され、完全ＲＥ認識部位（黒色実線）とそれに続く新規プライマー１（灰色実線）の両方を合成し得る。ＲＥ（塗りつぶし黒色三角）は、次いで、新規に合成された鎖を、ＲＥ部位と新規プライマー１の間で切断して、ニックを作製し得、次いで、これが、ポリメラーゼによって伸長されて、別の新規プライマー１を合成し得、一方で、これまで結合していたプライマー１を置き換える。これは、新規プライマーを連続的に合成するための、ＲＥ切断および重合および鎖置換の連続サイクルもたらし得る。
【０３９５】
図１３のパネルｉｉ）では、最初のプライマー１は、より多くの新規プライマー１の連続合成を開始するために使用され得、パネルｉ）に概要が示されたスキームと同様であるが、パネルｉｉ）は、ヘアピン型プライマー鋳型（黒色実線）を使用し得る戦略を例示する。ヘアピン分子の下の鎖は、プライマー鋳型を含有し得、上の鎖は、プライマー鋳型と部分的に相補的である配列を含有し得、両者はヘアピンのループを形成する非相補的配列によって連結される。最初のプライマー１は、ループとハイブリダイズし得、次いで、コピーするための鋳型としてプライマー鋳型（ヘアピンの下の鎖）を使用してポリメラーゼによって伸長され得る。
【０３９６】
図１３パネルｉｉｉ）では、パネルｉ）に概要が示される同一プロセスによって新規プライマー１の連続合成を開始するために、異なるプライマー（プライマー２；黒色破線）が使用され得る。
【０３９７】
図２５パネルｉ）では、元々、図１１パネルｉ）に概要が示される方法を使用してＤＮＡザイム合成の開始を促進するためのプライマー鋳型分子の使用を実証するために図１３パネルｉｉｉ）に表される戦略が拡大される。ここで、プライマー鋳型（ヘアピン型プライマー鋳型）は、一方の鎖が、ＲＥ認識部位の一方の鎖と隣接するプライマー１の合成のための鋳型を含有し（細い黒色線によって全て表される）、他方、プライマーヘアピンのもう一方の鎖（細い黒色破線）が、鋳型と部分的に相補的であるヘアピン構造から構成される。部分的に相補的な鎖は、それと、鋳型鎖の間でミスマッチした塩基対形成（小さいバルジとして描かれる）ならびに３’末端にさらなる塩基（小さい黒色丸）を含有し、ここで、後者は、プライマー配列の一部ではない。内部のミスマッチした塩基対は、ヘアピン型プライマー鋳型の部分的に相補的な鎖と、部分的ヘアピン型Ｄｚ１鋳型分子のプライマー１結合部位の間の親和性を低減する。３’末端のさらなる塩基は、この塩基が、プライマー１結合部位と相補性を共有しないので、部分的に相補的な鎖がプライマーとして作用することを防止する。従って、部分的に相補的な鎖の目的は、プライマー２が新規に合成されたプライマー１分子を捕捉することを防止するために、プライマー鋳型鎖を、プライマー２の伸長がなく二本鎖形態で維持することである。
【０３９８】
ヘアピン型プライマー鋳型構造のループ鎖（太い黒色線）は、プライマー２（太い灰色破線）と相補的であり、その結果、プライマー２がこのループと結合すると、プライマー２は、鎖置換型ポリメラーゼによって伸長され得、ヘアピン型プライマー鋳型の同時開環ならびに完全ＲＥ認識部位および隣接するプライマー１（太い灰色線）両方の合成をもたらす。ニッキング制限酵素（塗りつぶし黒色三角）が存在する場合には、完成されたＲＥ認識部位を認識し、上流プライマー２と下流プライマー１配列の間の領域で新規に合成された鎖に選択的にニックを入れることができる。従って、ニッキングは、新規プライマーを作製し、これは、別のプライマー１コピーを合成し、鋳型鎖から予め存在しているコピーを置き換える両方のために、鎖置換型ポリメラーゼ（塗りつぶし黒色丸）によって伸長される。ニッキング、重合および置換のこのサイクルは、次いで自律的に起こり、複数の活性プライマー１分子を生成する。次いで、各プライマー１は、図１７パネルｉｉ）および図２３パネルｉ）に先に概要が示されている部分的にブロックされたヘアピン型Ｄｚ鋳型法を使用して、活性ＤＮＡザイム分子の合成を開始し得る。その他の例示的態様では、ＢＬ分子はまた、さらなるプライマーの相補的配列を含有し得、その結果、ＢＬ鋳型上での元のプライマーの伸長は、さらなるプライマーと連結された完全ＤＮＡザイムの新規コピーの両方を合成し得る（図１４パネルｉ））。図１４パネルｉ）に例示されるように、最初の活性プライマー（太い灰色線）は、ヘアピン型ＤＮＡザイム（ヘアピン型Ｄｚ）／ＢＬ複合体のループとハイブリダイズする。ヘアピン型Ｄｚ／ＢＬ複合体の上の鎖は、ＤＮＡザイム（太い黒色破線）であり、ＢＬ（太い黒色線）を含有する下の鎖とハイブリダイズされて示され、これでは、両者は、非相補的ループ（同様に、太い黒色線）によって共に連結されている。鎖置換型ポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ；塗りつぶし黒色丸）による活性プライマーの伸長は、ヘアピン型ＤＮＡザイム／ＢＬ複合体を開環し、鋳型としてＢＬを使用して新規鎖を合成する。新規に合成された鎖は、ＤＮＡザイムのさらなるコピーおよび新規プライマーを含有する。新規ＤＮＡザイムコピーは、制限酵素の完全認識部位に先行し、その結果、ＲＥ（塗りつぶし黒色三角）による切断は、ニックの入ったオリゴヌクレオチドをもたらし、これは、Ｋｌｅｎｏｗによって伸長されて、ＤＮＡザイムの新規コピーおよび新規プライマーをもたらし、一方で、既存のコピーを置き換え得る。ニックは、プライマーハイブリダイゼーションおよび／または伸長によって形成された認識部位中の鎖を切断することだけできるニッキング酵素の認識部位を作製すること（および使用すること）によって生成され得る。あるいは、ニックは、両鎖を切断することができる制限酵素の認識部位を作製することおよびループ鎖をホスホロチオエート連結を組み込み、従って、制限酵素によるループ鎖の切断を防止するよう改変することによって生成され得る。ニッキングおよび伸長のこのサイクルは、一方の末端にプライマーを含有する新規ＤＮＡザイムを連続的に合成するよう働く。各ＤＮＡザイム／プライマー鎖の新規プライマー部分は、次いで、新規ヘアピン型ＤＮＡザイムループとハイブリダイズして、サイクルを再開し得る。
【０３９９】
新規に合成されたプライマーはまた、さらなるＲＥ認識部位に先行し得、その結果、ＲＥ活性によって、さらなるプライマーの連続合成が可能となる（図１４ｉｉ））。図１４パネルｉｉ）に例示されるように、パネルｉ）からのさらなるＤＮＡザイムおよびプライマー合成の同一プロセスの概要が示されるが、さらなるプライマー自体が、ＲＥの完全認識配列に先行する。結果として、新規ＤＮＡザイムコピーを作製するためのニッキングおよび伸長のサイクルに加えて、これはまた、新規ＤＮＡザイムからは離れたオリゴヌクレオチドである新規プライマーを作製するために起こり得、２つのサイクルは同時に起こる。ニッキングは、ニッキング酵素を使用することまたは非ニッキング制限酵素によるループ鎖の切断を防止するためにホスホロチオエート連結を組み込むことによって促進され得る。
【０４００】
イオン性化合物の検出
別の戦略では、サンプル（例えば、環境サンプルまたは生体サンプル）において、イオン性化合物がないことを決定する、イオン性化合物の存在を検出する、および／またはイオン性化合物を定量するための方法が提供される。イオン性化合物は、一価または二価イオンであり得る。イオン性化合物は、触媒核酸酵素の活性に必要な金属イオン補因子であり得る。
【０４０１】
方法は、本明細書に記載される分子複合体（分子スイッチ）およびスイッチを活性化することができる少なくとも１種のさらなる成分を提供し、それによって、検出可能なシグナルを提供することを含む。さらなる成分の機能活性は、試験されるべきサンプル中のイオン性化合物の存在に依存し得る。例えば、方法は、イオン性化合物を含有する疑いのあるサンプルを、ブロッカーオリゴヌクレオチドによってハイブリダイズされ、機能的に不活性化された第１の触媒核酸酵素およびイニシエーター触媒核酸酵素（例えば、ＤＮＡザイム、リボザイム、集合したＭＮＡザイムまたはＭＮＡザイムに集合することができる成分）を含む分子スイッチと接触させることを含み得る。
【０４０２】
イオン性化合物の存在下で、イニシエーター触媒核酸酵素は、ＢＬおよび複合体の第１の触媒核酸酵素を直接的に解離することができ、それによって、第１の触媒核酸酵素を機能的に活性な、検出可能なシグナルを（直接的または間接的に）提供することができるようにし得る（例えば、図１、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７または１８のいずれか１つに例示されるように）。
【０４０３】
あるいは、イオン性化合物の存在下で、イニシエーター触媒核酸酵素は、サンプルと接触される別のさらなる成分を触媒的に改変し、それによって、分子複合体と相互作用し、第１の触媒核酸酵素およびＢＬを（直接的または間接的に）解離することができる成分（例えば、ＲＬ、ＮＲＦ、プライマー、ポリメラーゼ鋳型）を提供することができ得る。解離は、第１の触媒核酸酵素を機能的に活性に、検出可能なシグナルを（直接的または間接的に）提供することができるようにし得る（例えば、図１、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７または１８のいずれか１つに例示されるように）。
【０４０４】
いずれかの場合には、イニシエーター触媒核酸の触媒機能は、イニシエーター酵素の触媒機能の補因子として必要であるイオン性化合物の存在に依存する。イオン性化合物の不在下で、イニシエーター触媒核酸酵素は、機能できず、従って、第１の触媒核酸酵素の、またはＢＬからのＲＬもしくはＮＲＦの解離に影響を及ぼすことはできない。
【０４０５】
イオン性化合物は、さらに、複合体の第１の触媒核酸酵素の触媒活性に必要な補因子であり得る。
【０４０６】
結果的に、方法は、サンプル（例えば、環境または生体サンプル）中の金属イオンの存在を検出する、または不在を決定するために、触媒活性のために特異的金属イオン補因子を必要とする触媒核酸（例えば、ＤＮＡザイム、リボザイム、アプタザイムおよび／またはＭＮＡザイム）を利用し得る。例えば、本方法は、水などの環境サンプル中のＰｂ２＋のＤＮＡザイム媒介性検出を促進し得る。
【０４０７】
複数の標的を分析するために複数の酵素を使用する方法
当業者であれば、本明細書において提供される方法は、反応あたり単一標的を検出するために、または単一反応あたり複数の標的を検出するために使用され得ることは認識するであろう。複数の標的を検出する場合には、アッセイおよび検出されるべきものに応じて１種または複数のＭＮＡザイムが使用され得る。例えば、単一ＭＮＡザイムは、例えば、重大な配列（ＭＮＡザイムによって認識される）を共有するおよび例えば、長さのみまたは重大な配列の外側の配列のみが変動する配列の群といった、複数の関連構造を検出する場合には十分であり得る。重大な配列を有する任意の配列が検出され得る。わずかに単一ヌクレオチドが異なっている関連配列を検出する場合には、または大いに異なっている標的が検出されるべきであり、各々の有無を知ることが望ましい場合には、複数のＭＮＡザイムが有用であると考慮される。同様に、一部の態様では、単一ＭＮＡザイム基質は、十分であるが、その他のものでは、いくつかの標的の各々の検出を可能にするために、特有のＢＬにとって特有のＭＮＡザイム基質が必要である。一部の態様では、方法は、一反応において種々の異なる種類の標的（例えば、核酸標的およびタンパク質）の検出を可能にし得る。
【０４０８】
図２６を具体的に参照すると、２つの独立した自己触媒性疑似環（図２１パネルｉ））が、同一反応チャンバー中に共に入れられる複数の標的検出スキームが実証されている。２つの疑似環（環Ａおよび環Ｂ）は、独立に機能し得、２つの独立した標的配列の検出後にシグナルを増幅するために利用される。環Ａは、ＤＮＡザイム（Ｄｚ２、太い黒色線）およびＤｚ２とハイブリダイズし、Ｄｚ２の一時的不活性化をもたらす、その５’および３’末端の配列からなるＢＬＡ（細い黒色線）から構成される。ＢＬＡはまた、基質１（太い灰色線）および基質２（基質２ａ；太い黒色線）の隣接する配列からなる中間領域も含有する。基質１は、その標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１、太い灰色破線）の存在下でＭｚ１（太い灰色線）によって切断され得る。基質２は、ひとたび、Ｄｚ２が、基質１のＭｚ１切断によってＢＬＡから放出されると、Ｄｚ２によって切断することができる。
【０４０９】
環Ｂは、ＤＮＡザイム（Ｄｚ４、太い黒色破線）およびＤｚ４とハイブリダイズし、Ｄｚ４の一時的不活性化をもたらす、その５’および３’末端の配列からなるＢＬＢ（細い黒色線）から構成される。ＢＬＢはまた、基質３（細い灰色線）および基質４（基質４ａ；太い黒色破線）の隣接する配列からなる中間領域も含有する。基質３は、その標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ３、細い灰色破線）の存在下でＭｚ３（細い灰色線）によって切断され得る。基質４は、ひとたび、Ｄｚ４が、基質３のＭｚ３切断によってＢＬＢから放出されると、Ｄｚ４によって切断され得る。各カスケード反応を独立にモニタリングするために、基質２および基質４も、それぞれ、Ｄｚ２およびＤｚ４による切断を個別にモニタリングするために、異なるフルオロフォア（基質２については白丸および基質４については塗りつぶしの灰色丸）およびクエンチャー（塗りつぶし黒色丸）を用いて改変されている線形配列として提供される。
【０４１０】
不溶性および固相支持体を使用する方法
マルチプレックス化されていようと、なかろうと、一般に、方法は、溶液中で適用可能であり、または不溶性支持体または固相支持体と組み合わせる場合には、その上に、ＢＬ分子、ＲＬ分子、プライマー、ＮＲＦ、ＤＮＡザイム、ＭＮＡザイム成分（基質、パートザイムまたはアセンブリーファシリテーター／標的）、ＲＥ、ポリメラーゼ鋳型、エキソヌクレアーゼおよび／または鎖置換型ポリメラーゼを含めた群のうち１種または複数が結合され、接着されるか、または繋ぎ止められ得るということも理解されなければならない。このような系の特徴は、方法および本明細書において論じられる変法に知識のある当業者には一般的に理解される。従って、本発明は、本明細書において文献の教示に限定して考慮されてはならず、本明細書において提供される教示また当技術分野の知識の原理および範囲と一致して改変および変更することができる。
【０４１１】
例えば、ＢＬがハイブリダイズされるよう設計されている、ＭＮＡザイム基質、ＤＮＡザイムまたは任意のその他の触媒核酸を含有するＢＬのいずれかが、支持体に繋ぎ止められる、ＭＮＡザイムを使用して標的を検出する方法が、本明細書において考慮される。一部の態様では、ＢＬは、支持体と結合される。支持体は、基質を保持し、それが反応混合物のバルク中で自由に動くことを排除する、不溶性材料またはマトリックスであり得る。核酸標的を含めた基質を固定または配置するためのこのような支持体は、当技術分野で公知である。当業者であれば、支持体は、多種多様なマトリックス、ポリマーなどから、マイクロアレイにおいて使用するのに好都合なビーズを含めた種々の形態で、ならびに反応条件に適合するその他の材料から選択され得るということは理解するであろう。ある特定の態様では、支持体は、プラスチックビーズまたはウェーハーなどのプラスチック物質または特定のアッセイが実施されるウェルもしくは試験管のものであり得る。ある特定の態様では、支持体は、マイクロキャリアまたはナノキャリアであり得る。ある特定の態様では、支持体は、コード化され得る。
【０４１２】
ＢＬの支持体との接着は、ＢＬのＤＮＡザイムまたはその他の触媒核酸とのハイブリダイゼーションの際に、分子スイッチ複合体を形成し、過剰のＤＮＡザイムまたはその他の触媒核酸が固相支持体から洗浄除去され、例えば、分子スイッチを構成する２種の分子間の１：１比が残るよう設計され得る。フルオロフォア（Ｆ）およびクエンチャー（Ｑ）を用いて標識されたＢＬの、第２のＤＮＡザイムまたはＭＮＡザイムによる切断の結果、フルオロフォアは反応混合物のバルク中に放出され、支持体と接着しているクエンチャーは残り得る。従って、クエンチャー部分および検出可能な部分が切断の際に分かれるので、検出可能なシグナルは大いに増大し得る。代替態様では、フルオロフォアを含有する検出可能な部分は、切断後に接着されたままであり得る。これによって、支持体上でのシグナルの局在化が可能となり得る。特定の場合には、フルオロフォアが溶液中で遊離型であり得ることが考慮される。さらに、ＤＮＡザイムまたはその他の触媒核酸も、固相支持体と接着したままであるＢＬから離れて溶液中に放出され得、ＢＬ切断後の何らかの望まれない再ハイブリダイゼーションを防ぐ。
【０４１３】
図２４パネルｉ）は、自己触媒性ＤＮＡザイム疑似環（図２１に概説される）のＢＬが、シリカマイクロスフェアに繋ぎ止められる固相支持体戦略の一例の概要を示す。ここで、疑似環のＢＬは、基質１（細い灰色線）および基質２（基質２ａ；太い黒色線）の隣接する配列によって連結される２つのＤＮＡザイム結合領域（細い黒色線）から構成される。さらなるスペーサー領域が、ＤＮＡザイム結合領域の３’に存在し、ビオチン部分（塗りつぶし黒色六角形）を用いて極めて３’末端で改変されている。ＢＬは、ＤＮＡザイム（Ｄｚ２；太い黒色線）とハイブリダイズし得、両方とも、ストレプトアビジンコートされている（大きな灰色丸として描かれた）シリカマイクロスフェア（ビーズ）とともにインキュベートされる。従って、ＢＬおよびマイクロスフェアは、ビオチン−ストレプトアビジン結合によって互いに接着し、Ｄｚ２は、ワトソン−クリック塩基対形成によってＢＬとハイブリダイズする。繋ぎ止められた疑似環を含有するマイクロスフェアが、その標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１；太い灰色破線）の存在下で集合するＭＮＡザイム（Ｍｚ１；太い塗りつぶした灰色線）と接触する位置にある場合には、Ｍｚ１は、ＢＬ中の基質１を切断し得、これが、Ｄｚ２がＢＬから放出され、その他の接着されたＢＬ分子内の基質２を切断し得る自己触媒性カスケードを開始する。Ｄｚ２はまた、この実施例では、マイクロスフェアと接着していないが、フルオロフォア（白丸）およびクエンチャー（塗りつぶした黒色丸）を用いて標識され得る、別個の独立した基質２（太い黒色線）を切断し得、その結果、基質２の切断結果が、検出可能な蛍光シグナルである。
【０４１４】
あるいは、ＭＮＡザイムによる基質１および／またはＤｚ２による基質２のいずれかの切断が、溶液中で遊離型であるシグナルをもたらし得る（接着部位に対して、クエンチャーがフルオロフォアよりも近い場合）；または、ビーズと関連しているシグナルをもたらし得る（接着部位に対して、フルオロフォアがクエンチャーよりも近い場合）ように、ビーズと接着しているＢＬが直接標識され得る。
【０４１５】
方法の最適化
当業者であれば、本明細書に記載された方法は、標的の検出、同定および／または定量を増強するために、種々の実験パラメータを使用して最適化され得るということは容易に理解するであろう。最適化される特定の実験パラメータおよびこのような最適化のレベルは、使用されている特定の方法および検出、同定および／または定量されようとする特定の標的に応じて変わる。このようなパラメータとして、それだけには限らないが、時間、温度、ｐＨ、塩およびバッファーの濃度および同一性、オリゴヌクレオチドの濃度、タンパク質酵素（ＲＥ、エキソヌクレアーゼ、鎖置換型ポリメラーゼ）、補因子、界面活性剤、陽イオンならびにそれだけには限らないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＥＤＴＡ、ＡＴＰ、グリセロールを含めたその他の試薬の濃度、相補性の長さ、ＭＮＡザイム、分子スイッチ複合体、ＢＬ／ＲＬ複合体、ＢＬ／ＮＲＦ複合体、Ｄｚ鋳型／ＢＬ複合体およびＢＬ／プライマー複合体の核酸成分のＧＣ含量および融点（Ｔｍ）が挙げられる。
【０４１６】
いくつかの態様、例えば、特定の核酸配列の検出を含む方法では、方法が実施される温度を含めた実験パラメータは、ＭＮＡザイム成分の配列変動を含むか、含まない標的核酸と結合間を区別するために最適化され得る。このような方法が実施され得る温度は、約２０℃〜約９６℃、約２０℃〜約７５℃、２０℃〜約６０℃または約２０〜約５５℃の範囲であり得る。
【０４１７】
ある特定の態様では、本明細書に記載された方法を実施するための最適化された反応が提供される。このような最適化された反応では、検出されるシグナルは、最適化されていない反応を上回って最大１０％、２０％または３０％増大される。より好ましい反応条件は、検出されるシグナルを、少なくとも３５％または４０％、好ましくは、最大５０％またはそれ以上改善し得る。他の態様では、最適化された反応は、５０％超、最大６６％、７５％またはさらには１００％の触媒活性の増大を提供し得る。さらに他の態様では、完全に最適化された反応法は、シグナル検出の１００％、２００％またはさらには３００％またはそれ以上の増大を提供し得る。その他の好ましい反応条件は、最適化されていない反応条件を用いて実施した方法を上回って、触媒活性を最大１０００％またはそれ以上改善し得る。本明細書において提供される方法を最適化するための高度に好ましい反応条件は、特定の二価カチオンを含めることである。ほとんどの核酸酵素およびタンパク質核酸改変酵素の触媒活性は、二価カチオンの濃度によって濃度依存的に影響を受け得る。好ましい最適化された反応は、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋およびＰｂ２＋のうち１種または複数について最適化される。
【０４１８】
アプタマー
当業者であれば、本明細書に記載された方法が、アプタマーを用いて実施され得、ここで、該アプタマーは、核酸以外の標的を含めた標的の検出、同定および／または定量を促進し得ることは容易に理解するであろう。
【０４１９】
非核酸実体を含めた標的を検出するためにＭＮＡザイムを使用するという方法が考慮される。このような方法は、１種または複数のリガンドを認識する能力を有する、核酸またはタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドまたはそれらの組合せを含み得るアプタマーを使用し得る。アプタマーは、標的リガンド、例えば、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、全生物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたは任意の誘導体、一部またはその組み合わせまたは任意のその他の実体と結合し得る。
【０４２０】
本明細書において、好ましいアプタマーは、吸着、回収および再増幅の反復プロセスによって、合成核酸またはペプチドの複合体ライブラリーから単離され得る短い一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーまたはペプチドを含み得る。従って、アプタマーは、アミノ酸または抗生物質などの小分子からタンパク質および核酸構造の範囲のありとあらゆる標的／リガンドに対して作製され得る。一部の態様では、アプタマーは、例えば、好ましくは、進化および選択技術によって作製される核酸結合分子を含む。アプタマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子またはそれだけには限らないが、例えば、上記の表１のようにヌクレオチド類似体を含めた両方の組合せを含み得る。
【０４２１】
当業者であれば、アプタマーは、ＤＮＡザイム、リボザイムまたはＭＮＡザイム成分のいずれか中に組み込まれ得ることを理解するであろう。アプタマーと結合されるＤＮＡザイムおよびリボザイムは、アプタザイムとして当技術分野で公知である。このようなアプタザイムは、そのアプタマー成分に対して親和性を有するリガンドの存在によって、スイッチオンまたはスイッチオフされるその触媒活性を有し得る。さらに、当然のことではあるが、パートザイムオリゴヌクレオチド成分の１種または複数の中に複数のアプタマーが組み込まれてもよい。図２８パネルｉ）を具体的に参照すると、ＤＮＡザイムドメイン（Ｄｚ１ドメイン、太い灰色破線）およびアプタマードメイン（太い黒色破線）から構成されるアプタザイムが表されている。この実施例では、アプタマードメインの存在は、アプタザイムのＤＮＡザイムドメインの一時的な不活性化をもたらす。分析物（リガンド、大きな灰色丸）の存在下では、アプタマードメインは、リガンドと結合し、アプタザイム構造の立体構造変化をもたらし、これが、順に、ＤＮＡザイムドメインが活性立体構造を採ること、従って、ＤＮＡザイムドメインの触媒活性を活性化することを可能にする。次いで、活性アプタザイムは、例えば、ＢＬが、第２のＤＮＡザイム（Ｄｚ２、太い黒色線）とハイブリダイズされる疑似環構造からなる第２の分子スイッチのＢＬ（細い黒色線）内に存在する基質（基質１、細い灰色破線）を切断するよう機能し得る。アプタザイムによる基質１の切断は、Ｄｚ２のＢＬからの分離、Ｄｚ２の触媒活性の回復をもたらす。次いで、活性Ｄｚ２は、その基質（基質２、同様に、太い黒色線）を切断し得、これは、フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｐｈｏｒｅ）（小さい白丸）およびクエンチャー（小さい塗りつぶされた黒色丸）を用いて標識されると、フルオロフォアがここで、星型として描かれるように蛍光シグナルの増大をもたらす。
【０４２２】
さらなる例示的態様では、アプタマー配列は、活性ＭＮＡザイムが標的分析物の存在下でのみ形成される立体構造のパートザイムの末端に組み込まれ得る（アプタ−パートザイム）。この場合には、ＭＮＡザイム検出戦略のためのパートザイムとして、標準パートザイム；その末端の一方にアプタマーが組み込まれたパートザイムであるアプタ−パートザイム；活性ＭＮＡザイムの集合を可能にする（標的の存在下で）、アプタ−パートザイムおよびパートザイムの両方と結合するアセンブリーファシリテーター；基質；および少なくともアプタマー配列の一部およびパートザイム配列の一部に及ぶ領域中のアプタ−パートザイムとハイブリダイズするアセンブリー阻害剤が挙げられる。標的の不在下では、アセンブリー阻害剤は、アプタ−パートザイムと結合し、従って、リポータープローブ基質の結合（および切断）をブロックする。標的の存在下では、標的は、アプタ−パートザイムのアプタマー配列と結合し、アセンブリー阻害剤の結合を防止し、ＭＮＡザイム基質の結合および切断を可能にする。従って、活性ＭＮＡザイムは、標的の存在下でのみ、ＭＮＡザイム基質を形成し、改変し得る。
【０４２３】
標的がＭＮＡザイムの集合に必要ではないその他の例示的態様では、アプタマーは、アセンブリーファシリテーター中に組み込まれ得る。アプタマー配列が、活性ＭＮＡザイムが、標的の存在下でのみ形成される立体配置で、パートザイム（アプタ−パートザイム）の末端に組み込まれる関連戦略もまた予測される。このような検出戦略のためのオリゴヌクレオチド成分として、標準パートザイム；その末端の一方にアプタマーが組み込まれたパートザイムであるアプタ−パートザイム；活性ＭＮＡザイムの集合を可能にする（標的の存在下で）、アプタ−パートザイムおよびパートザイムの両方と結合するアセンブリーファシリテーター；ＭＮＡザイム基質；および少なくともアプタマー配列の一部およびパートザイム配列の一部に及ぶ領域中のアプタ−パートザイムとハイブリダイズするアセンブリー阻害剤が挙げられる。標的リガンドの不在下で、アセンブリー阻害剤は、アプタ−パートザイムと結合し、従って、ＭＮＡザイム基質の結合（および切断）をブロックする。リガンドの存在下では、リガンドは、アプタ−パートザイムのアプタマー配列と結合し、アセンブリー阻害剤の結合を防止し、ＭＮＡザイム基質の結合および切断を可能にする。従って、活性ＭＮＡザイムは、標的リガンドの存在下でのみ、形成し、蛍光シグナル発生を引き起こし得る。
【０４２４】
さらに、アセンブリー阻害剤は、別個の分子であり得るか、またはＭＮＡザイム複合体に参加する成分のうち１種に組み込まれ得ることは当業者によって理解されよう。
【０４２５】
上記の戦略では、阻害剤配列は、別個の分子であり得るか、またはＭＮＡザイム複合体に参加する成分のうち１種に組み込まれ得ることは当業者によって理解されよう。さらに、１種または複数のアプタマーは、パートザイム、アセンブリーファシリテーターまたは基質を含めたいずれかのオリゴヌクレオチド成分中に組み込まれ得る。さらに、アプタマーは、これらのオリゴヌクレオチドのうちいずれか１種のいずれかの末端に組み込まれ得る。
【０４２６】
当業者であれば、アプタマーは、ＤＮＡザイム、リボザイムまたはいずれかのＭＮＡザイム成分に対して塩基対相補性を共有し得、これが、それらの触媒活性の一時的な不活性化をもたらし得ることは理解されよう。標的分析物が存在する場合には、それはアプタマーと結合して、それを、ＤＮＡザイム、リボザイムまたはＭＮＡザイム成分から分離し得、これは、ＤＮＡザイム、リボザイムまたはＭＮＡザイム成分の触媒活性の回復をもたらし得、次いで、ＢＬ分子内に存在する基質を改変し得る触媒核酸として働くことによって、本明細書に記載されるカスケード反応を開始するために使用され得る。
【０４２７】
さらなる例示的態様では、１種または複数のアプタマー配列またはその一部は、ＢＬ分子内に存在し得る。標的リガンドの存在下では、標的リガンドは、アプタマーと結合し得、これは、アプタマーの立体構造を変更し得、ＢＬからの触媒核酸、ＲＬ、プライマー、ポリメラーゼ鋳型またはＮＲＦの分離およびそれぞれ、それらの触媒、放出、プライミング、鋳型およびヌクレアーゼ開始活性のその後の回復をもたらし得る。図２８を具体的に参照すると、パネルｉｉ）は、分子スイッチのＢＬ内のアプタマーを含めることを表す。パネルｉｉ）では、ＤＮＡザイム（Ｄｚ、太い黒色線）は、ＢＬとハイブリダイズされ、その一時的不活性化をもたらす。ＢＬは、Ｄｚと相補的でないが、アプタマー配列（太い黒色破線）から構成される中心部分によって接続される、Ｄｚ（太い黒色線）とハイブリダイズする５’および３’末端からなる。標的分析物（またはリガンド、大きな塗りつぶした灰色丸）の存在下では、アプタマーは、リガンドと結合し得、これは、ＢＬの立体構造変化をもたらし得、ＤｚからのＢＬの分離をもたらし、Ｄｚの触媒活性を回復する。次いで、活性Ｄｚは、その基質（基質、太い黒色線）を切断するよう機能し得、これは、フルオロフォア（小さい白丸）およびクエンチャー（小さい塗りつぶされた黒色丸）を用いて標識され得、フルオロフォアがここで、星型として描かれるように蛍光シグナルの増大をもたらし得る。
【０４２８】
キット
本発明は本明細書に開示されている方法を実行するためのキットも提供する。典型的には、本発明の方法を実行するためのキットは、方法を実行するのに必要な全ての試薬を含有する。
【０４２９】
キットは本発明に従ったいかなる組成物またはその成分（複数可）も含むことができる。ただの非限定的な例として、キットは触媒核酸酵素（例えば、ＭＮＡザイムおよび／もしくはそのパートザイム成分、ＤＮＡザイム、アプタザイムならびに／またはリボザイム）、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＬ、ＢＬ、ＮＲＦ、プライマー、ポリメラーゼ鋳型および基質（例えば、触媒核酸酵素、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼの基質）を含むことがある。基質は１つまたは複数のプライマーを含むことがある。
【０４３０】
キットは本明細書に定義される断片化キットでも組合せキッドでもよい。断片化キッドは別個の容器に収納される試薬を含み、小ガラス容器、プラスチック容器またはプラスチックもしくは紙のストリップを含むことがある。そのような容器は、試料と試薬の相互汚染を回避しつつ１つの区画から別の区画に試薬を効率よく移動させ、それぞれの容器の作用薬または溶液を定量的様式で１つの区画から別の区画に添加させることができる。そのようなキットは試験試料を受け入れる容器、アッセイにおいて使用される試薬を含有する容器、洗浄試薬を含有する容器、および検出試薬を含有する容器も含むことがある。典型的には、本発明のキットは、キット成分を使用して適切な方法を行うための使用説明書も含むことになる。本発明のキットおよび方法は、例えば、リアルタイムＰＣＲ装置を含むがこれに限定されない自動分析機器およびシステムと併せて使用することができる。
【０４３１】
例えば、キットは第１の容器と第２の容器を含むことがある。第１の容器は、ＢＬとのハイブリダイゼーションのため機能的に不活性な形態で存在する触媒核酸（例えば、ＤＮＡザイム）を含む分子スイッチを含むことがある。第２の容器は、標的依存的または標的非依存的な様式で酵素からＢＬを解離することができる１つまたは複数のオリゴヌクレオチドまたはタンパク質成分を含むことがある。キットは本明細書に定義される断片化キットでも組合せキッドでもよい。
【０４３２】
キットは、例えば、本発明の方法を実施するのに必要な洗浄試薬、および／または他の試薬を含有する１つまたは複数の他の容器も含むことがある。
【０４３３】
異なる標的の検出、同定または定量の適用では、本発明の単一のキットが適用可能である、またはあるいは、例えば、それぞれの標的に特異的な試薬を含有する異なるキットが必要とされることもある。本発明の方法およびキットは、いかなる実体も検出する、同定するまたは定量するのが望ましいいかなる状況においても適用される。
【０４３４】
本発明は以下の特定の実施例を参照することにより、この時点ではるかに詳細にさらに説明されることになり、この実施例は決して本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【０４３５】
【実施例１】
【０４３６】
以下の実施例は、相補的ブロッキングオリゴヌクレオチド（ＢＬ）とのハイブリダイゼーションによるＤＮＡザイムの不活性化を実証する。ＢＬは、第２の独立した触媒核酸（この場合には、別のＤＮＡザイム）の基質として作用する非相補的領域によって接続されている、ＤＮＡザイムに対して配列相補性の２種の領域を含有する。ＢＬの５’および３’末端は、（ｉ）ＤＮＡザイム（Ｄｚ２）の、それぞれ３’および５’末端とハイブリダイズして、切断可能な基質配列がループして出ている線形二重鎖構造を形成するよう設計するか（図１パネルｉ）に図表で表される）、または（ｉｉ）それらは、それぞれ、５’および３’末端とハイブリダイズして、疑似環構造（図１パネルｉｉ）およびｉｉｉ）に図表で表される）を形成するよう設計した。この実施例では、疑似環構造は、実証され、図１パネルｉｉ）に表される、基質領域（基質１ａ）の切断は、ＭＮＡザイムではなくＤＮＡザイム（Ｄｚ１）によって実施される。基質領域の切断は、これまでは不活性のＤＮＡザイム（Ｄｚ２）の放出およびその後の再活性化をもたらすはずである。
【０４３７】
−オリゴヌクレオチド
本実施例では、ＢＬ（配列番号１；Ｃ（４）Ｓｕｂ４５（２４：２４）（２）−ＦＢ）は、（ｉ）Ｄｚ２（配列番号２；ＤｚＫ（１０：９））の一部と相補的である５’および３’末端と、（ｉｉ）基質１の配列（配列番号３；Ｓｕｂ４５）と同等であるが、５’末端「Ａ」ヌクレオチドおよび３’末端「ＧＡＡ」ヌクレオチドを欠く基質１ａからなる５’および３’末端を接続する中心部分とから構成される。ＢＬは、５’末端から１５番目のヌクレオチド（「Ｔ」）で、６−フルオレセイン（「６−ＦＡＭ」）部分を用い、５’末端から３４番目のヌクレオチド（「Ｔ」）でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー１（「ＢＨＱ１」）部分を用いて内部標識した。従って、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を、基質１ａ領域およびＤＮＡザイム相補性領域の接合部に配置した。ＢＬを使用して、ＢＬをＤｚ２とプレハイブリダイズすることによって、Ｄｚ２の活性をブロックする。
【０４３８】
ＤＮＡザイム（Ｄｚ１−配列番号４；Ｄｚ４５（９：１０））は、ＢＬの基質１ａ部分を切断するために利用される。この切断事象は、Ｄｚ２の放出を促進し、基質２（配列番号５；Ｓｕｂ２）に対して作用することを可能にする。この実施例では、基質２を、５’末端でテキサスレッド部分を用い、３’末端でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー２（「ＢＨＱ２」）部分を用いて末端標識した。
【０４３９】
Ｄｚ１によるＢＬの切断の有効性を測定するために、ＢＬの切断からのシグナルを、Ｄｚ１による独立した基質基質１の切断の陽性対照１シグナルと比較した。基質１は、Ｄｚ１と相補的である任意のさらなる５’および３’配列を含有せず、５’末端で６−ＦＡＭ部分を用い、３’末端でＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（ＩＢ）クエンチャー部分を用いて末端標識した。
【０４４０】
これらの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、Ｄｚ２の一部と相補的であるＢＬ中の領域を表す。イタリック体の塩基は、ＢＬ分子内の基質配列に対応する領域を意味する。四角で囲まれた塩基は、ＤＮＡザイムの触媒コアを表す。灰色で強調されたヌクレオチドは、ＢＬ分子中の下線が引かれた塩基と相補的であり、それによってブロックされるＤｚ２中の塩基を表す。
【０４４１】
【表８】
0006336443.tif 000009
【０４４２】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは、これまでの節において列挙されたオリゴヌクレオチドおよび図１パネルｉｉ）に例示される構造に関連して、表４Ｂに列挙される以下のオリゴヌクレオチドを含有するよう設定した。反応ＥおよびＦについて、ＢＬおよびＤｚ２を共に、室温で３０分間最初にプレハイブリダイズし、その後、任意のさらなるオリゴヌクレオチド成分を添加した。
【０４４３】
【表９】
0006336443.tif 000010
【０４４４】
オリゴは、Integrated DNA Technologies(IDT)またはBiosearch technologiesから購入した。全ての反応物は、１×ＰＣＲバッファーＩＩ(Applied Biosystems)、ヌクレアーゼ不含水(Ambion)および２５ｍＭのＭｇＣｌ２(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで４５℃で２連で実施し、チャネル１（ＦＡＭ）およびチャネル３（ＴｘＲ）の両方で蛍光シグナルを同時に測定して、それぞれ、ＦＡＭおよびテキサスレッドをモニタリングし、合計４０分間、５秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：全てのチャネル）。
【０４４５】
−結果
図２パネルｉ）は、１種のＤＮＡザイム分子を含有する疑似環から得た結果を示す。ここで、ＢＬ分子の一部として存在する基質１ａは、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャーでそれ自体標識される。Ｄｚ２によって切断され得る基質２は、ＴｘＲフルオロフォアおよびクエンチャーで標識され、従って、Ｄｚ２の放出および活性化は、ＴｘＲの蛍光の変化によってモニタリングされ得る。結果として、両切断事象は、両フルオロフォア発光波長からの蛍光シグナルを測定することによって別個にモニタリングされ得る。パネルｉ）の上のグラフは、ＦＡＭフルオロフォアからの、下のグラフは、ＴｘＲフルオロフォアからの蛍光シグナルの概要を示す。疑似環が、それ自体で存在する反応Ｅ（三角記号を有する線として示される「ブロッカーのみ」）については、反応の間、基質１ａの切断はなく、結果として、ＦＡＭシグナルの増大はなく、さらに、ＴｘＲシグナルの大幅な増大はなく、これは、ＢＬと複合体を形成した場合にＤｚ２が不活性であることを示す。これは、それぞれ、基質１および基質２のみを含有する、反応ＡおよびＣに対応するＦＡＭおよびＴｘＲの陰性対照（「陰性対照」、四角記号を含有する線）に対する比較において示される。しかし、Ｄｚ１が存在し、基質１ａを切断し得る反応Ｆ（「ＤＮＡザイム１存在」；丸記号を含有する線）については、ＦＡＭシグナルの即時増大があり、これは、基質１ａが切断されたことを示す。これはまた、ＴｘＲシグナルの段階的増大をもたらし、これは、Ｄｚ２がＢＬから放出され、基質２を切断していることを示す。これは、反応Ｆにおいて存在するものとそれぞれ同一濃度の、ＦＡＭについては基質１およびＤｚ１、ならびにＴｘＲについては基質２およびＤｚ２を各々含有する、それぞれ反応ＢおよびＤ（「陽性対照」、菱形記号を含有する線）に対応するＦＡＭおよびＴｘＲの陽性対照との比較において示される。
【実施例２】
【０４４６】
以下の実施例は、以下を実証する：
（ｉ）２種の相補的ブロッキングオリゴヌクレオチド（ＢＬ）、ＢＬ（Ａ）およびＢＬ（Ｂ）とのハイブリダイゼーションによる、２種の独立したＤＮＡザイム、Ｄｚ（Ａ）およびＤｚ（Ｂ）の不活性化。
（ｉｉ）Ｄｚ（Ａ）およびＤｚ（Ｂ）の放出をもたらす、ＢＬ（Ａ）およびＢＬ（Ｂ）の基質部分を切断することができる第３のＤＮＡザイム、Ｄｚ（Ｃ）の存在下でのＤｚ（Ａ）およびＤｚ（Ｂ）のその後の活性化。実施例は、この実施例のＤｚ（Ｃ）が、第１の触媒核酸（図のようにＭｚ１）と同等である、図１パネルｉｉｉ）に例示される系を実証する。
【０４４７】
−オリゴヌクレオチド
ＢＬ（Ａ）（配列番号６；Ｃ４Ｓｕｂ４５（２２：２３））は、（ｉ）Ｄｚ（Ａ）（配列番号７；ＤｚＫ（８：７））の５’末端と相補的である５’末端と、（ｉｉ）基質１（配列番号３、Ｓｕｂ４５）の配列と同等であるが、５’末端「Ａ」ヌクレオチドおよび３’末端「ＧＡＡ」ヌクレオチドを欠く基質１ａからなる中心部分と、（ｉｉｉ）Ｄｚ（Ｂ）（配列番号８；Ｄｚ６（８：７））の３’末端と相補的である３’末端とからなる。
【０４４８】
ＢＬ（Ｂ）（配列番号９；Ｃ４Ｓｕｂ４５Ｔ（２１：２４））は、（ｉ）Ｄｚ（Ｂ）の５’末端と相補的である５’末端と、（ｉｉ）基質１の配列と同等であるが、５’末端「ＡＣ」ヌクレオチドおよび３’末端「ＧＡＡ」ヌクレオチドを欠く基質１ｂからなる中心部分と、（ｉｉｉ）Ｄｚ（Ａ）の３’末端と相補的である３’末端とからなる。
【０４４９】
この実施例では、２種の不活性ＤＮＡザイムを含有する疑似環構造が、２種のＢＬ分子形態によって結びつくよう（図１パネルｉｉｉ）に概説されるように）、ＢＬ（Ａ）およびＢＬ（Ｂ）の５’および３’末端が、Ｄｚ（Ａ）およびＤｚ（Ｂ）の５’および３’末端とハイブリダイズするよう設計される。
【０４５０】
第３のＤＮＡザイム、Ｄｚ（Ｃ）（配列番号１０；Ｄｚ４５（８：９））は、ＢＬ（Ａ）の基質１ａ部分およびＢＬ（Ｂ）の基質１ｂ部分を切断することができ、疑似環構造からのＤｚ（Ａ）およびＤｚ（Ｂ）の放出をもたらす。
【０４５１】
Ｄｚ（Ａ）は、この実施例では、５’末端で６−フルオレセイン（「６−ＦＡＭ」）部分および３’末端でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー１（「ＢＨＱ１」）を用いて標識される基質Ａ（配列番号５、Ｓｕｂ２）を切断する。
【０４５２】
Ｄｚ（Ｂ）は、この実施例では、その５’末端でＴｘＲ部分およびその３’末端でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー２（「ＢＨＱ２」）部分を用いて標識される基質Ｂ（配列番号１１、Ｓｕｂ６）を切断する。
【０４５３】
上記のオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’に列挙される。
【０４５４】
大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、ＤＮＡザイムの一部と相補的であるＢＬ中の領域を表す。イタリック体の塩基は、ＢＬ分子内の基質配列に相当する領域を意味する。四角で囲まれた塩基は、ＤＮＡザイムの触媒コアを表す。灰色で強調されたヌクレオチドは、ＢＬ分子中の下線が引かれた塩基と相補的であり、それによってブロックされるＤＮＡザイム中の塩基を表す。
【０４５５】
【表１０】
0006336443.tif 000011
【０４５６】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは、これまでの節において列挙されたオリゴヌクレオチドおよび図１パネルｉｉｉ）に例示される構造に関連して、表５に列挙される以下のオリゴヌクレオチドを含有するよう設定した。反応ＥおよびＦについて、ＢＬ分子；ＢＬ（Ａ）、ＢＬ（Ｂ）およびＤＮＡザイムＤｚ（Ａ）およびＤｚ（Ｂ）を共に、室温で３０分間最初にプレハイブリダイズし、その後、任意のさらなるオリゴヌクレオチド成分を添加した。
【０４５７】
【表１１】
0006336443.tif 000012
【０４５８】
オリゴは、ＩＤＴまたはBiosearch Technologiesから購入した。全ての反応物は、１×ＰＣＲバッファーＩＩ(Applied Biosystems)、ヌクレアーゼ不含水(Ambion)および２５ｍＭのＭｇＣｌ２(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで４５℃で２連で実施した。蛍光シグナルは、チャネル１（ＦＡＭ）およびチャネル３（ＴｘＲ）の両方で同時に測定して、それぞれ、ＦＡＭおよびテキサスレッドをモニタリングし、合計４０分間、５秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：全てのチャネル）。
【０４５９】
−結果
図２パネルｉｉ）は、存在する２種のＤＮＡザイムを含有する疑似環から得た結果を示す。この場合には、両ＢＬ分子の一部として存在する基質配列（ＢＬＡの基質１ａおよびＢＬＢの基質１ｂ）は標識されなかった。その放出および活性化後にＤｚ（Ａ）によって切断され得る基質配列（基質Ａ）は、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャー色素を用いて標識され、その放出および活性化後にＤｚ（Ｂ）によって切断され得る基質（基質Ｂ）は、ＴｘＲフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識される。結果として、両切断事象は、両フルオロフォア発光波長からの蛍光シグナルを可視化することによって別個にモニタリングされ得る。上のグラフは、ＦＡＭフルオロフォアからの、下のグラフは、ＴｘＲフルオロフォアからの蛍光シグナルの概要を示す。疑似環がそれ自体で存在する反応Ｅ（三角記号を有する線として示される「ブロッカーのみ」）については、基質１ａまたは基質１ｂの切断はなく、結果として、ＦＡＭまたはＴｘＲシグナルの増大はほとんどないし全くなく、これは、無傷のＢＬ分子と複合体を形成した場合に、Ｄｚ（Ａ）およびＤｚ（Ｂ）が不活性であることを示す。これは、同じ蛍光標識基質Ａおよび基質Ｂ配列のみを含有する、それぞれ、反応ＡおよびＣ（「陰性対照」、四角記号を含有する線）に対応するＦＡＭおよびＴｘＲ両方の陰性対照との比較において示される。ＤＮＡザイムＣが存在する反応Ｆ（丸記号を含有する線）については、ＦＡＭおよびＴｘＲフルオロフォア両方からのシグナルの段階的な増大があり、これは、疑似環からＤｚ（Ａ）およびＤｚ（Ｂ）両方が放出され、ここで、そのそれぞれの基質を切断していることを示す。これは、反応Ｆにおいてとそれぞれ同一濃度の、ＦＡＭについては基質ＡおよびＤｚ（Ａ）、ならびにＴｘＲについては基質ＢおよびＤｚ（Ｂ）を各々含有する、それぞれ、反応ＢおよびＤ（「陽性対照」、菱形記号を含有する線）に対応するＦＡＭおよびＴｘＲの陽性対照との比較において示される。
【実施例３】
【０４６０】
以下の実施例は、（図４パネルｉｉｉ）に概説される、ＤＮＡザイムのヘアピン構造（ヘアピン型Ｄｚ）への組込みによるＤＮＡザイムの不活性化を実証する。ＤＮＡザイムは、ヘアピンのＢＬ部分と十分に相補的である（ここで、ＢＬは、完全ＤＮＡザイム配列に対して部分的にのみ相補的である）リリーサーオリゴヌクレオチド（ＲＬ）の存在下で活性にされ得る。ＲＬは、完全ＤＮＡザイム配列を欠き、従って、自身が触媒ＤＮＡザイムとして機能しない。
【０４６１】
−オリゴヌクレオチド
本実施例では、基質（配列番号３；Ｓｕｂ４５）を切断することができるヘアピン型ＤＮＡザイム（配列番号１２；ｈｐ（Ｒ６）Ｄｚ４５ＢＵＢ０（４））を使用した。この実施例では、Ｓｕｂ４５は、５’末端で６−フルオレセイン（「６−ＦＡＭ」）部分および３’末端でＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋクエンチャー部分（「ＩＢ」）を用いて標識された。ＲＬ（配列番号１３；ＲＬ−Ｄｚ４５ＢＵＢ０（４））を使用して、ヘアピン型ＤＮＡザイムを活性化した。ヘアピン型ＤＮＡザイムの触媒活性を、対応する非ヘアピン型ＤＮＡザイム、（配列番号４；Ｄｚ４５（９：１０））のものと比較した。
【０４６２】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’に列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、ＲＬと相補的であるヘアピン中のＢＬ領域を表す。イタリック体の塩基は、ヘアピン構造内のＤＮＡザイム配列を意味する。四角で囲まれた塩基は、ヘアピンのＢＬ部分と非相補的であり、従って、ヘアピンのステムから出てループしているＤＮＡザイムの触媒コアの一部を表す。
【０４６３】
【表１２】
0006336443.tif 000013
【０４６４】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、これまでの節において列挙されたオリゴヌクレオチドおよび図４パネルｉｉｉ）に例示される構造に関連して、表６に列挙される以下のオリゴヌクレオチドを含有するよう設定した。
【０４６５】
【表１３】
0006336443.tif 000014
【０４６６】
オリゴは、ＩＤＴまたはBiosearch technologiesから購入した。全ての反応物は、１×ＰＣＲバッファーＩＩ(Applied Biosystems)、ヌクレアーゼ不含水(Ambion)および２５ｍＭのＭｇＣｌ２(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで４５℃で２連で実施した。蛍光シグナルは、チャネル１（ＦＡＭ）で測定し、合計４０分間、１０秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：ＦＡＭのみ）。
【０４６７】
−結果
図５、パネルｉ）は、単一ＤＮＡザイム分子を含有するヘアピン型ＤＮＡザイムから得た結果を示す。ＲＬによるその活性化後にＤＮＡザイムによって切断され得る基質配列は、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識される。グラフ（ＦＡＭ）は、このＦＡＭフルオロフォアからの蛍光シグナルの概要を示す。反応Ｃについては、ヘアピン型Ｄｚがそれ自体で存在する場合には（三角記号を有する線として示される「ヘアピンのみ」）、基質の切断はなく、結果として、ＦＡＭシグナルの増大はなく、これは、ＤＮＡザイム部分がヘアピン構造内で不活性で維持されることを示す。これは、同一蛍光標識された基質配列のみを含有する反応Ａ（「陰性対照」、四角記号を含有する線）に対応する陰性対照に対する比較において示される。反応Ｄについては、ヘアピンを開環するためのＲＬが存在する場合には（「リリーサー存在；丸記号を含有する線）、ＦＡＭシグナルの即時増大があり、これは、ＤＮＡザイム部分が遊離し、基質が切断されたことを示す。これは、反応Ｄにおいて存在するものと同一濃度の基質および非ヘアピン型対照ＤＮＡザイムを含有する反応Ｂ（「陽性対照」、菱形記号を含有する線）に対応する陽性対照との比較において示される。
【実施例４】
【０４６８】
以下の実施例は、２種のヘアピンＤＮＡ構造：ヘアピン型Ｄｚ１およびヘアピン型Ｄｚ２（図４パネルｉｖに概説される）内にそれらを置くことによる２種の独立したＤＮＡザイムの不活性化を実証する。各ヘアピンは、さらなる配列を含有し、ヘアピン型Ｄｚ１については、さらなる配列は、そのＢＬＡステムの５’末端にあり、ヘアピン型Ｄｚ２については、さらなる配列は、そのＢＬＢステムの３’末端にある。これらのさらなる配列は、２種のヘアピンＤＮＡザイムが共に連結されるよう互いに相補的である。これは、ＤＮＡザイムを近接近させ、その結果、単一ＲＬ分子が、ＢＬＡおよびＢＬＢの両方に存在するその相補配列と結合し、ヘアピンの両方を同時に開環し、各ＤＮＡザイムを放出でき、その結果、それらは、次いで、その基質を切断できる。ＲＬは、触媒的に活性であるために十分なＤＮＡザイム配列を含有しないので、それ自体はＤＮＡザイムとして作用できない。
【０４６９】
−オリゴヌクレオチド
本実施例では、ヘアピン型Ｄｚ１（配列番号１４；ｄｈｐ６Ｄｚ２（５）Ｍ４）は、基質１（Ｓｕｂ２、配列番号５）を切断することができるＤＮＡザイム配列を含有し、ヘアピン型Ｄｚ２（配列番号１５；ｄｈｐ５Ｄｚ６（３））は、基質２（Ｓｕｂ６、配列番号１１）を切断することができるＤＮＡザイム配列を含有する。基質１は、５’末端で６−フルオレセイン（「６−ＦＡＭ」）部分および３’末端でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー１（「ＢＨＱ１」）を用いて標識され（Ｓｕｂ２−ＦＢ）、基質２は、その５’末端でテキサスレッド部分およびその３’末端でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー２（「ＢＨＱ２」）部分を用いて標識された（Ｓｕｂ６−ＴＲＢ２）。ＲＬ（配列番号１６；ＲＬ−ｄｈｐ６）を使用して、ヘアピン構造からＤＮＡザイムを放出した。各ヘアピン型ＤＮＡザイムの活性を、対応する非ヘアピン型対照ＤＮＡザイム、対照ＤＮＡザイム１（Ｄｚ２、配列番号１７）および対照ＤＮＡザイム２（Ｄｚ６、配列番号１８）と比較した。
【０４７０】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’に列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、ＲＬと相補的であるヘアピン中の領域を表す。イタリック体の塩基は、ヘアピン構造内の完全ＤＮＡザイム配列を意味するが、四角で囲まれた塩基は、ヘアピンステム中のロックされているＤＮＡザイムの部分（ＢＬ部分と相補的である）を表す。ヘアピン型Ｄｚ１およびヘアピン型Ｄｚ２中の灰色の強調された配列は相補的である。
【０４７１】
【表１４】
0006336443.tif 000015
【０４７２】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは、これまでの節において列挙されたオリゴヌクレオチドおよび図４パネルｉｖ）に例示される構造に関連して、表７に列挙される以下のオリゴヌクレオチド断片を含有するよう設定した。
【０４７３】
【表１５】
0006336443.tif 000016
【０４７４】
オリゴは、ＩＤＴまたはBiosearch technologiesから購入した。全ての反応物は、１×ＰＣＲバッファーＩＩ(Applied Biosystems)、ヌクレアーゼ不含水(Ambion)および２５ｍＭのＭｇＣｌ２(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで４０℃で２連で実施した。蛍光シグナルを、チャネル１（ＦＡＭ）およびチャネル３（ＴｘＲ）で測定し、合計４０分間、５秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：全てのチャネル）。
【０４７５】
−結果
図５パネルｉｉ）には、二重ヘアピン型ＤＮＡザイム分子の結果が示されている。その開環および活性化後にヘアピン型Ｄｚ１によって切断され得る基質配列（基質１）は、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識され、その開環および活性化後にヘアピン型Ｄｚ２によって切断され得る基質（基質２）は、ＴｘＲフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識される。結果として、両切断事象は、両フルオロフォア発光波長からの蛍光シグナルを可視化することによって別個にモニタリングされ得る。上のグラフは、ＦＡＭフルオロフォアからの、下のグラフは、ＴｘＲフルオロフォアからの蛍光シグナルの概要を示す。反応Ｅについて、両ヘアピン型Ｄｚ構造がそれ自体で存在する場合には（三角記号を有する線として示される「ヘアピンのみ」）、各基質の切断はほとんどないし全くなく、結果として、ＦＡＭおよびＴｘＲシグナルの増大はほとんどないし全くなく、これは、両ＤＮＡザイム部分が、そのそれぞれのヘアピン型構造内で不活性で維持されることを示す。これは、同一蛍光標識された基質配列のみを含有する、それぞれ、反応ＡおよびＣ（「陰性対照」、四角記号を含有する線）に対応するＦＡＭおよびＴｘＲの陰性対照との比較において示される。しかし、反応Ｆについては、単一ＲＬが存在し、両ヘアピンを同時に開環する場合には（「リリーサー存在；円記号を含有する線）、ＦＡＭおよびＴｘＲシグナル両方の増大があり、これは、両ＤＮＡザイム部分が、ここで遊離しており、そのそれぞれの基質を切断することを示す。これは、反応Ｆにおいて存在するものと同一濃度の各基質および非ヘアピン型対照ＤＮＡザイムを各々含有する、それぞれ、反応ＢおよびＤ（「陽性対照」、菱形記号を含有する線）に対応する、ＦＡＭおよびＴｘＲの陽性対照との比較において示される。
【実施例５】
【０４７６】
本実施例は、ＲＬがExoIIIの活性によって再利用され、ＤＮＡザイムの連続的放出およびその後の活性化につながる、シグナル増幅の方法を実証する（図６パネルｉ）に概説される）。実施例３と同様に、ＤＮＡザイムは、ＢＬとハイブリダイズされることによって不活化されるが、本実施例５では、ＤＮＡザイムの２つ以上のヌクレオチドがＢＬにおいて相補性（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）を有さず、従って、ＤＮＡザイム配列がＢＬと結合する場合に、それがループして出される実施例３とは対照的に、ＤＮＡザイムおよびＢＬ配列の間に単一のミスマッチが存在する。本実施例５では、ＤＮＡザイムおよびＢＬ間の単一のミスマッチは、ＲＬが、ＤＮＡザイムの触媒活性に必要な全配列を含有しないことを意味する。実施例５では、ＤＮＡザイムは、ＲＬによって活性化され得、ひとたびＢＬがＲＬと結合すると、ＢＬはExoIIIによって分解され得るが、ＲＬ分子は、未変化のままである。次いで、ＲＬは、別のＢＬと結合することができ、サイクルは反復され、このプロセスの間、毎回ＤＮＡザイムが放出される。
【０４７７】
−オリゴヌクレオチド
本実施例では、Ｄｚ（配列番号２０；Ｄｚ２（２１：１０）のその基質（配列番号２２；Ｓｕｂ２ｈ−ＦＢ）に対する触媒活性をブロックするために、ハイブリダイズするＢＬ（配列番号１９；ＢＬ（ＭＭ１）−Ｄｚ２）が使用される。Ｓｕｂ２ｈ−ＦＢは、その５’末端で６ＦＡＭ部分を用い、その３’末端から位置６のＡ塩基で内部にＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー１（「ＢＨＱ１」）部分を用いて標識された。ＤｚおよびＢＬのハイブリダイゼーション後、ＤＮＡザイムおよびＢＬ両方の３’末端が、少なくとも５つのヌクレオチドだけオーバーハングし、このため、各々がExoIII活性に対して抵抗性であることが可能になる。ＲＬ（配列番号２２；ＲＬ（ＭＭ１）（＋５）−Ｄｚ２）は、ＢＬからＤＮＡザイムを放出するために使用される。ＲＬの５’末端は、ＢＬとハイブリダイズされると、ＢＬの３’末端とハイブリダイズして平滑末端を形成し、従って、ＢＬをExoIII分解に対して感受性にするよう設計される。
【０４７８】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’に列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、ＤＮＡザイムおよびＢＬの間の相補性の領域を表す。四角で囲まれた塩基は、ＢＬに対して相補的な(complimentary)ＲＬ中の領域を表す。
【０４７９】
【表１６】
0006336443.tif 000017
【０４８０】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは、これまでの節において列挙されたオリゴヌクレオチドおよび図６パネルｉ）に例示される構造に関連して、表８に列挙される以下のオリゴヌクレオチドおよびExoIII酵素を含有するよう設定した。反応Ｃ〜Ｆについて、ＤＮＡザイムおよびＢＬは、室温で３０分間共にプレハイブリダイズし、その後、さらなるオリゴヌクレオチド成分を添加した。
【０４８１】
【表１７】
0006336443.tif 000018
【０４８２】
オリゴは、ＩＤＴまたはBiosearch technologiesから購入した。Exonuclease III（ExoIII）は、New England Biolabsから購入した。全ての反応物は、１×ＮＥＢバッファー２（New England Biolabs）およびヌクレアーゼ不含水(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで４５℃で２連で実施した。蛍光シグナルをチャネル１（ＦＡＭ）で測定し、合計４０分間、１０秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：ＦＡＭのみ）。
【０４８３】
−結果
図６パネルｉｉ）は、図６パネルｉ）に表わされるExoIII戦略から達成された蛍光シグナルを実証する。その活性化後にＤＮＡザイムによって切断され得る基質配列は、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャー色素を用いて標識される。グラフ（ＦＡＭ）は、このＦＡＭフルオロフォアからの蛍光シグナルの概要を示す。反応ＣおよびＤについては、ＤｚおよびＢＬ二重鎖がそれ自体で存在する場合には（三角記号を有する線として示される「ＢＬのみ−ExoIII」および丸記号を有する線として示される「ＢＬのみ＋ExoIII」）、Ｄｚの置換はなく、従って、基質の切断およびＦＡＭシグナルの対応する増大はない。これは、同一蛍光標識された基質配列のみを含有する陰性対照、反応Ａ（「陰性対照」、四角記号を含有する線）との比較において示される。ＢＬ（２００ｎＭ）およびＤｚ（１００ｎＭ）の濃度それぞれに対して低濃度のＲＬ（５０ｎＭ）が存在する反応ＥおよびＦについては（「ＲＬ存在−ExoIII」、２本の斜めの交差線および１本の垂直の交差線からなる記号を含有する線および「ＲＬ存在＋ExoIII」、２本の斜めの交差線からなる記号を含有する線）、ＲＬを含有し、ExoIIIを含まない反応Ｅについてはシグナルの小さい増大があるが、ＲＬおよびExoIIIの両方を含有する反応Ｆについては、シグナルのかなり大きな即時の増大がある。両方の場合において、ＲＬは、ＤＮＡザイムを置換するよう機能しているが、ExoIIIが存在しない場合には、少ないＲＬ分子の各々が極めて遅いＢＬからの解離速度しか有さず、従って、大部分はＢＬと不活性二重鎖を作製するので、極めて少ない置換しか起こらない。ExoIIIが存在する場合には、ＢＬ／ＲＬ二重鎖からＢＬを分解するよう機能し、結果として、各ＲＬは、再利用され、より多くのＤｚ分子を連続的に置換できる。これは、反応Ｆにおけるものと同一濃度で基質および遊離対照ＤＮＡザイムのみを含有する陽性対照（「陽性対照」、菱形記号を含有する線）を含有する反応Ｂとの比較において示される。
【実施例６】
【０４８４】
以下の実施例は、ＲＬがニッキング酵素の活性によって再利用され、ＤＮＡザイムの連続的放出およびその後の活性化につながる、シグナル増幅の方法を実証する（図７パネルｉ）に概説される）。実施例３と同様に、ＤＮＡザイムは、ＢＬによって不活化され、ＲＬによって再活性化され得るが、本実施例５では、ひとたび、ＢＬがＲＬと結合されると、ＲＬ／ＢＬ二重鎖内にニッキング酵素の完全な二本鎖認識部位が作製される。ニッキング酵素は、この部位を認識し、ＢＬに選択的にニックを入れるのに対し、ＲＬ分子は未変化のままである。ＢＬの「ニックの入った」断片は各々、ここで、もはや未変化ＢＬと同様のＲＬに対する親和性を有さず、結果として、複合体は解離する。これによって、ＲＬが、別のＢＬと結合することが可能になり、サイクルが反復され、このプロセスの間、毎回ＤＮＡザイムが放出される。
【０４８５】
−オリゴヌクレオチド
本実施例では、Ｄｚ（配列番号１７；Ｄｚ２）のその基質（配列番号５；Ｓｕｂ２−ＴＲＢ２）に対する触媒活性をブロックするために、ハイブリダイズするＢＬ（配列番号２３；ＢＬ−Ｄｚ２Ｎｉｃ７−ＦＢ）が使用される。Ｓｕｂ２−ＴＲＢ２は、その５’末端でテキサスレッド部分を用い、その３’末端でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー２（「ＢＨＱ２」）部分を用いて末端標識された。ＢＬは、ＤＮＡザイムと相補的ではない、二本鎖ニッキング酵素認識配列の一本鎖を形成する配列を含有する。ＢＬが、ＤＮＡザイムとハイブリダイズされる場合には、このさらなるＢＬ配列は、二重鎖から突出する一本鎖ループとして存在する。さらに、ＢＬは、５’末端から７番目のヌクレオチド（「Ｔ」ヌクレオチド）で６−フルオレセイン（「６−ＦＡＭ」）部分を用いて、また５’末端から３０番目のヌクレオチド（「Ｔ」ヌクレオチド）でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー１（「ＢＨＱ１」）部分を用いて内部標識された。ＢＬからＤＮＡザイムを放出し、同時に、ＲＬ／ＢＬ複合体から、制限酵素Ｎｔ．ＢｓｐＱＩの完全な二本鎖認識部位を作製するために、ＲＬ（配列番号２４；ＲＬ−Ｄｚ２Ｎｉｃ７ａ）が使用される。
【０４８６】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’に列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、ＤＮＡザイムおよびＢＬの間の相補性の領域を表す。四角で囲まれた塩基は、ＲＬと相補的であるＢＬ中の領域を表す。
【０４８７】
【表１８】
0006336443.tif 000019
【０４８８】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは、これまでの節において列挙されたオリゴヌクレオチドおよび図７パネルｉ）に例示される構造に関連して、表９に列挙される以下のオリゴヌクレオチドおよびニッキング酵素（Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ）を含有するよう設定した。反応Ｃ〜Ｆについては、ＤＮＡザイムおよびＢＬを、室温で３０分間共にプレハイブリダイズし、その後、さらなるオリゴヌクレオチド成分を添加した。
【０４８９】
【表１９】
0006336443.tif 000020
【０４９０】
オリゴは、ＩＤＴまたはBiosearch technologiesから購入した。ニッキング酵素、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩは、New England Biolabsから購入した。全ての反応物は、１×ＮＥＢバッファー３（New England Biolabs）およびヌクレアーゼ不含水(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで５２℃で２連で実施した。蛍光シグナルをチャネル３（ＴｘＲ）で測定し、合計４０分間、１０秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：全てのチャネル）。
【０４９１】
−結果
図７パネルｉｉ）は、図７パネルｉ）において表され、上記で記載される、ニッキング酵素戦略から達成された蛍光シグナルを実証する。ひとたび、ＤＮＡザイムがＢＬから放出され、従って、活性化されると、ＤＮＡザイムによって切断され得る基質配列は、ＴｘＲフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識される。グラフ（ＴｘＲ）は、このＴｘＲフルオロフォアからの蛍光シグナルの概要を示す。ＤｚおよびＢＬ二重鎖がそれ自体で存在する反応ＣおよびＤについては（三角記号を有する線として示される「ＢＬのみ−Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ」および丸記号を有する線として示される「ＢＬのみ＋ＢｓｐＱＩ」）、Ｄｚの置換はなく、従って、基質の切断およびＴｘＲシグナルの対応する増大はない。これは、同一蛍光標識された基質配列のみを含有する陰性対照（「陰性対照」、四角記号を含有する線）を含有する反応Ａとの比較において示される。ＢＬ（２００ｎＭ）およびＤｚ（１００ｎＭ）の濃度それぞれに対して低濃度のＲＬ（１０ｎＭ）が存在する反応ＥおよびＦについては（「ＲＬ存在−Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ」、２本の斜めの交差線および１本の垂直の交差線からなる記号を含有する線および「ＲＬ存在＋Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ」、２本の斜めの交差線からなる記号を含有する線）、ＲＬを含有し、ニッキング酵素を含まない反応Ｅについてはシグナルの増大はほとんどないし全くないが、ＲＬおよびＮｔ．ＢｓｐＱＩの両方を含有する反応Ｆについては、経時的にシグナルの段階的増大がある。両方の場合において、ＲＬは、ＤＮＡザイムを置換するよう機能しているが、ニッキング酵素が存在しない場合には、少ないＲＬ分子の各々が極めて遅いＢＬからの解離速度しか有さず、従って、大部分はＢＬと不活性二重鎖を作製するので、極めて少ない置換しか起こらない。ニッキング酵素が存在する場合には、ＢＬ／ＲＬ二重鎖からＢＬを選択的に切断するよう機能し、結果として、各ＲＬは、再利用され、Ｄｚ分子を連続的に置換できる。これは、反応Ｆにおいて存在するものと同一濃度の基質および遊離対照ＤＮＡザイムを含有する陽性対照（「陽性対照」、菱形記号を含有する線）との比較において示される。
【実施例７】
【０４９２】
以下の実施例は、ＲＬが鎖置換型ポリメラーゼ酵素の活性によって再利用され、ＤＮＡザイムの連続的放出およびその後の活性化につながる、シグナル増幅の方法を実証する（図８パネルｉ）に概説される）。実施例３においてと同様に、ＤＮＡザイムは、ＢＬとのハイブリダイゼーションによって最初不活化され、ＲＬによって再活性化され得る。この本実施例７では、ＢＬは、ＢＬの末端でヘアピンを形成する配列を含有し、これは、ＲＬによって開環され得る。ヘアピンステムは、ＲＬの存在下でのみ曝露されるプライマー結合部位を含有する。ひとたび、プライマーがこの部位と結合できると、ＢＬ鋳型から任意の上流のプレハイブリダイズされた鎖を置換することができるポリメラーゼ酵素によって伸長される。結果的に、鎖置換型ポリメラーゼ酵素によるプライマー伸長は、ＢＬからのＲＬの置換をもたらし、ＢＬ鋳型と新規に合成された鎖の間に不要な二重鎖が作製される。次いで、ＲＬは、別のＢＬと結合することができ、サイクルが反復され、このプロセスの間、毎回ＤＮＡザイムが放出される。
【０４９３】
−オリゴヌクレオチド
ＢＬ（配列番号２５；ｈｐＢＬｒ−Ｄｚ２ＢＵＢ０（４）−Ｐ）は、Ｄｚ（配列番号２６；Ｄｚ２（９：８））の、その基質（Ｓｕｂ２、配列番号５）を切断することができる活性をブロックするよう設計した。この実施例では、Ｓｕｂ２−ＦＢは、位置６のＴヌクレオチドで６−ＦＡＭ部分を用い、また３’末端でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー１（「ＢＨＱ１」）部分を用いて内部標識された。ＲＬ（配列番号２７；ＲＬｒ−Ｄｚ２ＢＵＢ０（４）（−２）−Ｐ）を使用して、ＤＮＡザイムを放出し、プライマーの結合部位（配列番号２８；ＰＲ（３）−ＢＬＤｚ２（１０））を露出した。
【０４９４】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、ＤＮＡザイムおよびＢＬの間の相補性の領域を表す。四角で囲まれた塩基は、ＲＬと相補的であるＢＬ中の領域を表す。灰色で強調された領域は、プライマー結合部位として作用するＢＬ中の配列を表す。／３Ｐｈｏｓ／は、３’末端リン酸化、ポリメラーゼ酵素によるオリゴヌクレオチドの伸長を妨げる改変を示す。
【０４９５】
【表２０】
0006336443.tif 000021
【０４９６】
反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは、これまでの節におけるオリゴヌクレオチドおよび図８パネルｉ）に例示される構造に関連して、表１０に列挙される以下のオリゴヌクレオチドおよびポリメラーゼ酵素を含有するよう設定した。反応Ｃ〜Ｆについては、ＤＮＡザイム、ＢＬおよびプライマーを、室温で３０分間プレインキュベートし、その後、反応ＤおよびＦにポリメラーゼを添加し、反応ＥおよびＦにＲＬを添加した。
【０４９７】
【表２１】
0006336443.tif 000022
【０４９８】
オリゴは、ＩＤＴまたはBiosearch technologiesから購入した。鎖置換型ポリメラーゼ酵素、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（３’→５’エキソ−）は、New England Biolabsから購入した。全ての反応物は、１×ＮＥＢバッファー２（New England Biolabs）、２００μＭ  ｄＮＴＰ(Bioline)およびヌクレアーゼ不含水(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで４０℃で２連で実施した。蛍光シグナルをチャネル１（ＦＡＭ）で測定し、合計４０分間、１０秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：ＦＡＭのみ）。
【０４９９】
−結果
図８パネルｉｉ）は、図８パネルｉ）において表される鎖置換型ポリメラーゼ戦略から達成された蛍光シグナルを実証する。その活性化後にＤＮＡザイムによって切断され得る基質配列は、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識される。グラフ（ＦＡＭ）は、このＦＡＭフルオロフォアからの蛍光シグナルの概要を示す。ＤｚおよびＢＬ二重鎖がそれ自体で存在する反応ＣおよびＤについては（三角記号を有する線として示される「ＢＬのみ−Ｋｌｅｎｏｗ」および丸記号を有する線として示される「ＢＬのみ＋Ｋｌｅｎｏｗ」）、Ｄｚの置換はなく、従って、基質の切断およびＦＡＭシグナルの対応する増大はない。これは、同一蛍光標識された基質配列のみを含有する陰性対照（「陰性対照」、四角記号を含有する線）を含有する反応Ａとの比較において示される。ＢＬ（２００ｎＭ）およびＤｚ（１５０ｎＭ）の濃度それぞれに対して低濃度のＲＬ（１０ｎＭ）が存在する反応ＥおよびＦ（「ＲＬ存在−Ｋｌｅｎｏｗ」、２本の斜めの交差線および１本の垂直の交差線からなる記号を含有する線および「ＲＬ存在＋Ｋｌｅｎｏｗ」、２本の斜めの交差線からなる記号を含有する線）については、ＲＬを含有し、Ｋｌｅｎｏｗを含まない反応Ｅについては、シグナルの増大はないが、ＲＬおよびＫｌｅｎｏｗの両方を含有する反応Ｆについては、シグナルの即時増大がある。ポリメラーゼが存在しない場合には（反応Ｅ）、少ないＲＬ分子の各々が極めて遅いＢＬからの解離速度しか有さず、従って、大部分はＢＬと不活性二重鎖を作製するので、極めて少ない置換しか起こらない。プライマーは、その結合部位と結合できるが、伸長され得ない。しかし、ポリメラーゼが存在する場合には（反応Ｆ）、プライマーを伸長し、ＲＬを置換できる。結果的に、各ＲＬは、再利用され、Ｄｚ分子を連続的に置換できる。プライマーの伸長はまた、ＢＬ鋳型と新規に合成された鎖の間に不要なヘアピン二重鎖も作製する。これは、反応Ｆにおいて存在するものと同一濃度の基質および遊離対照ＤＮＡザイムからなる陽性対照（「陽性対照」、菱形記号を含有する線）を含有する反応Ｂとの比較において示される。
【実施例８】
【０５００】
以下の実施例は、図９、パネルｉ）に表わされる、ヘアピンＲＬ／ＢＬ構造へのその組込みによるＲＬの最初の不活性化を実証する。ヘアピン型ＲＬ（ＢＬＡ）のＢＬ部分は、ＤＮＡザイム１（Ｄｚ１）によって切断され得、ＲＬの活性化をもたらす基質配列（基質１）を含有する。次いで、活性ＲＬは、ＢＬ部分（ＢＬＢ）とハイブリダイズすることによってＤＮＡザイム２（ヘアピン型Ｄｚ２）を含有する別のヘアピンを開環するよう機能し得る。次いで、ヘアピン型Ｄｚ２／ＢＬＢ構造のＤｚ２部分は活性であり、次いで、蛍光標識された基質２を切断するよう機能し得、蛍光シグナルの生成をもたらす。
【０５０１】
−オリゴヌクレオチド
本実施例では、基質２（配列番号３；Ｓｕｂ４５）を切断することができるヘアピン型Ｄｚ２（配列番号２９；ｈｐ（Ｒ３ａ）Ｄｚ４５ＢＵＢ０（４））を使用した。この実施例では、基質２（Ｓｕｂ４５−ＦＩＢ）は、５’末端で６−フルオレセイン（「６−ＦＡＭ」）部分を用い、また３’末端でＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋクエンチャー部分（「ＩＢ」）を用いて標識された。ひとたび、ヘアピン型ＲＬのＢＬＡ成分内の基質１がＤｚ１、（ＤｚＫ（８：７）配列番号７）によって切断されると、ヘアピン型ＲＬ（配列番号３０；ｈｐＲＬｂ（Ｒ４）−Ｓｕｂ２）を使用してヘアピン型Ｄｚ２を活性化した。ヘアピン型ＤＮＡザイムの触媒活性を、対応する非ヘアピン型Ｄｚ２、（陽性対照Ｄｚ２：配列番号４；Ｄｚ４５（９：１０））のものと比較した。
【０５０２】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、ヘアピン型ＲＬおよびヘアピン型Ｄｚ２間で相補的である領域を表す。イタリック体の塩基は、ヘアピン型ＤＮＡザイム内のＤＮＡザイム配列を意味する。四角で囲まれた塩基は、ヘアピン型Ｄｚ２のＢＬ部分と非相補的であり、従って、ヘアピンのステムから出てループしているＤＮＡザイムの触媒コアの部分を表す。
【０５０３】
【表２２】
0006336443.tif 000023
【０５０４】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、これまでの節において列挙されたオリゴヌクレオチドおよび図９パネルｉ）に例示される構造に関連して、表１１に列挙される以下のオリゴヌクレオチド断片を含有するよう設定した。
【０５０５】
【表２３】
0006336443.tif 000024
【０５０６】
オリゴは、ＩＤＴまたはBiosearch technologiesから購入した。全ての反応物は、１×ＰＣＲバッファーＩＩ(Applied Biosystems)、ヌクレアーゼ不含水(Ambion)および２５ｍＭのＭｇＣｌ２(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで４５℃で２連で実施した。蛍光シグナルをチャネル１（ＦＡＭ）で測定し、合計４０分間、１０秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：ＦＡＭのみ）。
【０５０７】
−結果
図９パネルｉｉ）は、図９パネルｉ）に概説される戦略から達成された蛍光シグナルを実証する。ヘアピン型Ｄｚ２によって、そのヘアピン構造から放出され活性化された後に、切断され得る基質２は、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識される。グラフ（ＦＡＭ）は、このＦＡＭフルオロフォアからの蛍光シグナルの概要を示す。ヘアピン型Ｄｚ２がそれ自体で存在する反応Ｃについては（三角記号を有する線として示される「ｈｐＤｚのみ」）、基質２の切断はなく、結果として、ＦＡＭシグナルの増大はなく、これは、ＤＮＡザイム部分が、ヘアピン構造内で不活性で維持されることを示す。同様に、ヘアピン型ＲＬおよびヘアピン型Ｄｚが両方存在する反応Ｄについては（丸記号を含有する線として示される「ｈｐＤｚ＋ｈｐＲＬのみ」）、ＦＡＭシグナルの極めて少ない増大しかなく、これは、それぞれのヘアピンのＲＬおよびＤｚ２部分の両方が、そのヘアピン型構造内で不活性で維持されることを示す。これは、基質２のみを含有する陰性対照（「陰性対照」、四角記号を含有する線）を含有する反応Ａとの比較において示される。基質１を切断するためにＤｚ１が存在する反応Ｅについては（「ｈｐＤｚ＋ｈｐＲＬ＋ＤＮＡザイム１」；２本の斜めの交差線および１本の垂直の交差線からなる記号を含有する線）、ＦＡＭシグナルの段階的に増大があり、これは、基質１の切断が、ヘアピン型ＲＬのＲＬ部分を活性化し、次いで、ＲＬが、基質２を切断できるヘアピン型Ｄｚ２を活性化するよう機能し得ることを示す。これは、反応Ｅにおいて存在するものと同一濃度の基質２および非ヘアピン型陽性対照ＤＮＡザイム２からなる陽性対照（「陽性対照」、菱形記号を含有する線）を含有する反応Ｂとの比較において示される。
【実施例９】
【０５０８】
実施例９は、ＲＬ分子の使用を含まない、図１１、パネルｉ）に表わされるＤＮＡザイム分子を直接的に活性化するプライマーの使用を実証する。実施例３に概要が示されるように、不活性ＤＮＡザイムを含有するヘアピン型分子が存在する。しかし、この本実施例９では、ヘアピン型Ｄｚ／ＢＬ複合体のＢＬ部分は、非相補的ループによって連結された２つを有する全ＤＮＡザイム配列と完全にハイブリダイズされる。この構造ではヘアピンループは、ニッキング酵素の部分認識配列を形成するヌクレオチドからなる。プライマーが存在する場合には、ループ配列とハイブリダイズし、鎖置換型ポリメラーゼによってその３’末端で伸長される。プライマー伸長は、ヘアピン構造からのＤＮＡザイムの同時置換および鋳型としてのＢＬ配列の使用によるＤＮＡザイムの新規コピーの合成をもたらす。置換されたＤＮＡザイムは、ここで、活性であり、その基質を切断し得る。プライマーの伸長はまた、二本鎖ニッキング酵素認識部位の完成をもたらす。ニッキング酵素は、この部位を認識し、上流プライマーと下流の新規に合成されたＤＮＡザイム配列の間の領域で、新規に合成された鎖に選択的にニックを入れることができる。従って、ニッキングは、新規プライマーを生成し、これは、ポリメラーゼによって伸長されて、別のＤＮＡザイムコピーを合成し、またＢＬ鋳型から既存のコピーを置換する。次いで、ニッキング、重合および置換のこのサイクルは、自律的に起こり、いくつかの複数のＤＮＡザイム分子を生成し得る。
【０５０９】
−オリゴヌクレオチド
ヘアピン型Ｄｚ／ＢＬ複合体（配列番号３１；ｈｐ（Ｒ６ｂ）Ｄｚ４５）は、ＢＬから放出され、従って、活性である場合に、基質（Ｓｕｂ４５、配列番号３）を切断することができるＤｚを含有する。この実施例では、Ｓｕｂ４５は、５’末端で６−フルオレセイン（「６−ＦＡＭ」）部分を用い、３’末端でＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋクエンチャー部分（「ＩＢ」）を用いて標識された。プライマー（配列番号３２；ＰＲ（Ｒ６）Ｄｚ４５（１０））を使用して、ＤＮＡザイムを活性化し、そのさらなるコピーを合成した。ヘアピン型ＤＮＡザイムの触媒活性を、対応する非ヘアピン型陽性対照ＤＮＡザイム、（配列番号４；Ｄｚ４５（９：１０））のものと比較した。
【０５１０】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。イタリック体の塩基は、ヘアピン型Ｄｚ／ＢＬ構造内のＤＮＡザイム配列を意味する。下線が引かれた塩基は、プライマーおよびヘアピン型ＤＮＡザイムの間の相補性の領域を表す。四角で囲まれた塩基は、ヘアピン型Ｄｚ／ＢＬ内に存在する部分ニッキング酵素認識部位およびプライマーを表す。
【０５１１】
【表２４】
0006336443.tif 000025
【０５１２】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨは、これまでの節におけるオリゴヌクレオチドおよび図１１パネルｉ）に例示される構造に関連して、表１２に列挙される以下のオリゴヌクレオチド、ポリメラーゼおよびニッキング酵素を含有するよう設定した。
【０５１３】
【表２５】
0006336443.tif 000026
【０５１４】
オリゴは、ＩＤＴまたはBiosearch technologiesから購入した。鎖置換型ポリメラーゼ酵素、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（３’→５’エキソ−）およびニッキング酵素、Ｎｔ．ＡｌｗＩは、New England Biolabsから購入した。全ての反応物は、１×ＮＥＢバッファー２（New England Biolabs）、１００μＭ  ｄＮＴＰ(Bioline)およびヌクレアーゼ不含水(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、５０μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで３７℃で２連で実施した。蛍光シグナルを、チャネル１（ＦＡＭ）で測定し、合計１００分間、１０秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：ＦＡＭのみ）。
【０５１５】
−結果
図１１パネルｉｉ）は、図１１パネルｉ）において表される戦略から達成された蛍光シグナルを実証する。その活性化後にＤＮＡザイムによって切断され得る基質配列は、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識される。グラフ（ＦＡＭ）は、このＦＡＭフルオロフォアからの蛍光シグナルの概要を示す。タンパク質酵素が存在しないが、ヘアピン型Ｄｚがそれ自体で存在する（三角記号を有する線として示される「ｈｐＤｚのみ」）、およびプライマーとともにヘアピン型Ｄｚが存在する（丸記号を有する線として示される「ｈｐＤｚ＋プライマー」）反応ＣおよびＤについては、シグナルの増大はほとんどなく、これは、プライマーの伸長がないこと、Ｄｚのその後の活性化がないこと、従って、基質の切断およびＦＡＭシグナルの対応する増大がないことを示す。これは、同一蛍光標識された基質配列のみを含有する陰性対照（「陰性対照」、四角記号を含有する線）を含有する反応Ａとの比較において示される。Ｋｌｅｎｏｗが存在し、ヘアピン型Ｄｚが存在し、プライマーを含まない（「ｈｐＤｚのみ＋Ｋｌｅｎｏｗのみ」、２本の斜めの交差線および１本の垂直の交差線からなる記号を含有する線）およびプライマーを含む（「ｈｐＤｚ＋プライマー＋Ｋｌｅｎｏｗのみ、２本の斜めの交差線からなる記号を含有する線）反応ＥおよびＦについては、プライマーを含有する反応Ｆについては、シグナルの段階的な増大があり、これは、プライマーがＫｌｅｎｏｗによって伸長され、ヘアピン型ＤｚのＤｚ部分の活性化をもたらすことを示す。しかし、ＫｌｅｎｏｗおよびＮｔ．ＡｌｗＩの両方が存在し、ヘアピン型Ｄｚが溶液中にあり、プライマーを含まない（反応Ｇ−「ｈｐＤｚのみ＋Ｋｌｅｎｏｗ＋Ｎｔ．ＡｌｗＩ」、１本の垂直の交差線を有する記号を含有する線）およびプライマーを含む（反応Ｈ−「ｈｐＤｚ＋プライマー＋Ｋｌｅｎｏｗ＋Ｎｔ．ＡｌｗＩ」、中黒四角からなる記号を含有する線）場合には、プライマーを含有する反応Ｈについてはシグナルの増大があり、Ｋｌｅｎｏｗのみを有する反応Ｆより迅速に進行し、これは、Ｎｔ．ＡｌｗＩ酵素の存在が、ヘアピン内の既存のコピーを活性化することに加えて、さらなるＤｚコピーの合成を促進することを示す。これは、反応Ｈにおいて存在するものと同一濃度の基質および遊離陽性対照ＤＮＡザイムからなる陽性対照（「陽性対照」、菱形記号を含有する線）を含有する反応Ｂとの比較において示される。プライマーの存在下またはプライマーの不在下であるがＮｔ．ＡｌｗＩのみを含有し、ヘアピン型Ｄｚを含有する各反応も、この酵素が単独で、さらなるシグナル生成に関与しないことを確認するために実施した。これらの反応は、ＦＡＭ蛍光の増大をもたらさなかった（データは示さず）。
【実施例１０】
【０５１６】
以下の実施例は、相補的ブロッキングオリゴヌクレオチド（ＢＬ）とのハイブリダイゼーションによるＤＮＡザイムの不活性化を実証する。ＢＬは、第２の独立した触媒核酸（この場合には、ＭＮＡザイム）の基質として作用する非相補的領域によって接続している、ＤＮＡザイムと相補的である配列の２つの領域を含有する。ＢＬの５’および３’末端は、（ｉ）ＤＮＡザイムのそれぞれ、３’および５’末端とハイブリダイズして、ループが外に出た切断可能な基質配列を有する線形二重鎖構造を形成するよう設計され得るか、または（ｉｉ）それらは、それぞれ、５’および３’末端とハイブリダイズして、疑似環構造（この実施例において、それぞれ、図１パネルｉｉ）およびｉｉｉ）において図表で概説されるように）を形成するよう設計され得る。その標的（ＡＦ１）の存在下でのＭＮＡザイム（Ｍｚ１）による基質（基質１ａ）領域の切断は、これまでは不活性のＤＮＡザイムの放出およびその後の再活性化をもたらす。
【０５１７】
−オリゴヌクレオチド
本実施例では、ＢＬ（配列番号１；Ｃ（４）Ｓｕｂ４５（２４：２４）（２）−ＦＢ）は、（ｉ）Ｄｚ２（配列番号２；ＤｚＫ（１０：９））の一部と相補的である５’および３’末端と、（ｉｉ）基質１の配列（配列番号３；Ｓｕｂ４５）と同等であるが、５’末端「Ａ」ヌクレオチドおよび３’末端「ＧＡＡ」ヌクレオチドを欠く基質１ａからなる、５’および３’末端を接続する中心部分とからなる。ＢＬは、５’末端から１５番目のヌクレオチド（「Ｔ」ヌクレオチド）で６−フルオレセイン（「６−ＦＡＭ」）部分を用い、５’末端から３４番目のヌクレオチド（「Ｔ」ヌクレオチド）でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー１（「ＢＨＱ１」）部分を用いて内部標識された。従って、フルオロフォアおよびクエンチャーを、基質領域およびＤＮＡザイム相補性領域の接合部に配置した。ＢＬを使用して、ＢＬをＤｚ２とプレハイブリダイズすることによって、Ｄｚ２の活性をブロックする。
【０５１８】
パートザイム（パートザイムＡ、配列番号３３；ＴＦＲＣＡ４／４５−ＰおよびパートザイムＢ、配列番号３４ＴＦＲＣＢ５／４５−Ｐ）およびアセンブリーファシリテーター標的（ＡＦ１、配列番号３５ＡＦ−ＴＦＲＣ）からなるＭＮＡザイム（Ｍｚ１）は、ＢＬの基質１ａ部分を切断するために利用される。この標的依存性切断事象は、Ｄｚ２の放出を促進し、基質２（配列番号５；Ｓｕｂ２）に対して作用することを可能にする。この実施例では、Ｓｕｂ２は、５’末端でテキサスレッド部分を用い、３’末端でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー２（「ＢＨＱ２」）部分を用いて末端標識された。
【０５１９】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、ＤＮＡザイムの一部と相補的であるＢＬ中の領域を表す。イタリック体の塩基は、ＢＬ分子内の基質配列に対応する領域を意味する。四角で囲まれた塩基は、それぞれ、ＤＮＡザイムまたはパートザイムの触媒コアまたは部分触媒コアを意味する。灰色で強調されたヌクレオチドは、ＢＬ分子中の下線が引かれた塩基と相補的であり、それによってブロックされるＤＮＡザイム中の塩基を表す。／３Ｐｈｏｓ／は、３’末端リン酸化を示す。
【０５２０】
【表２６】
0006336443.tif 000027
【０５２１】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧは、これまでの節において列挙されるオリゴヌクレオチドおよび図１パネルｉｉ）に例示される構造に関連して、表１３に列挙される以下のオリゴヌクレオチドを含有するよう設定した。反応Ｅ、ＦおよびＧについては、ＢＬおよびＤＮＡザイムを最初に、室温で３０分間共にプレハイブリダイズし、その後、任意のさらなるオリゴヌクレオチド成分を添加した。
【０５２２】
【表２７】
0006336443.tif 000028
【０５２３】
オリゴは、ＩＤＴまたはBiosearch technologiesから購入した。全ての反応物は、１×ＰＣＲバッファーＩＩ(Applied Biosystems)、ヌクレアーゼ不含水(Ambion)および２５ｍＭのＭｇＣｌ２(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで４５℃で２連で実施し、蛍光シグナルをチャネル１（ＦＡＭ）およびチャネル３（ＴＲ）の両方で測定して、それぞれ、ＦＡＭおよびテキサスレッドをモニタリングし、合計４０分間、５秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：全てのチャネル）。
【０５２４】
−結果
図１５パネルｉ）は、その標的アセンブリーファシリテーターの存在下でＭＮＡザイムによる環のＢＬ部分の切断によって活性化された、単一の不活性化ＤＮＡザイムを含有する環からのＤＮＡザイム疑似環戦略から達成された蛍光シグナルを示す。
【０５２５】
ここで、ＢＬ分子の一部として存在する基質配列（基質１ａ）は、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャーを用いてそれ自体標識される。その放出および活性化後にＤｚ２によって切断され得る基質配列（基質２）は、ＴｘＲフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識される。結果として、両切断事象は、両フルオロフォア発光波長からの蛍光シグナルを可視化することによって別個にモニタリングされ得る。上のグラフは、ＦＡＭフルオロフォアからの、また下のグラフは、ＴｘＲフルオロフォアからの蛍光シグナルの概要を示す。疑似環がそれ自体で存在する反応Ｅ（三角記号を有する線として示される「ブロッカーのみ」）およびアセンブリーファシリテーターを欠くパートザイムの存在下での反応Ｆ（丸記号を有する線として示される「パートザイム存在（ＡＦ１なし）」）については、基質１ａの切断はなく、結果として、ＦＡＭシグナルの増大はない。さらに、これらの反応の間のＴｘＲシグナルの大幅な増大はなく、これは、Ｄｚ２は、ＢＬと複合体を形成する場合には不活性であることを示す。これは、それぞれ、２種の蛍光標識された基質配列のみを含有する反応ＡおよびＣ（「陰性対照」、四角記号を含有する線）に対応するＦＡＭおよびＴｘＲの陰性対照との比較において示される。しかし、ＭＮＡザイムのアセンブリーファシリテーターが存在する反応Ｇについては（「パートザイム＋ＡＦ１存在」；２本の斜めの交差線および１本の垂直の交差線からなる記号を含有する線）、ＦＡＭシグナルの即時増大があり、これは、ＢＬ中の基質１ａが切断されたことを示す。これはまた、ＴｘＲシグナルの段階的増大をもたらし、これは、Ｄｚ２がここで、ＢＬから放出されており、基質２を切断していることを示す。これは、反応Ｇにおいて存在するものと同一濃度の、それぞれ、ＦＡＭについては基質１ａおよび基質１ａを切断するＭＮＡザイムならびにＴｘＲについては基質２および基質２を切断するＭＮＡザイムを含有する、それぞれ、反応ＢおよびＤに対応する、ＦＡＭおよびＴｘＲの陽性対照（「陽性対照」、菱形記号を含有する線）との比較において示される。
【実施例１１】
【０５２６】
以下の実施例は、以下を実証する：
（ｉ）２種の相補的ブロッキングオリゴヌクレオチド（ＢＬ）、ＢＬ（Ａ）およびＢＬ（Ｂ）とのハイブリダイゼーションによる、２種の独立したＤＮＡザイム、Ｄｚ（Ａ）およびＤｚ（Ｂ）の不活性化、
（ｉｉ）Ｄｚ（Ａ）およびＤｚ（Ｂ）の放出をもたらす、ＢＬ（Ａ）およびＢＬ（Ｂ）の基質部分を切断することができる活性ＭＮＡザイムの存在下での、２種の独立したＤＮＡザイム、Ｄｚ（Ａ）およびＤｚ（Ｂ）のその後の活性化。
【０５２７】
−オリゴヌクレオチド
ＢＬ（Ａ）（配列番号６；Ｃ４Ｓｕｂ４５（２２：２３））は、（ｉ）Ｄｚ（Ａ）（配列番号７；ＤｚＫ（８：７））の５’領域と相補的である５’末端と、（ｉｉ）基質１（配列番号３；Ｓｕｂ４５）の配列と同等であるが、５’末端「Ａ」ヌクレオチドおよび３’末端「ＧＡＡ」ヌクレオチドを欠く基質１ａからなる中心部分と、（ｉｉｉ）Ｄｚ（Ｂ）（配列番号８；Ｄｚ６（８：７））の３’領域と相補的である３’末端とからなる。ＢＬ（Ｂ）（配列番号９；Ｃ４Ｓｕｂ４５Ｔ（２１：２４））は、（ｉ）Ｄｚ（Ｂ）の５’領域と相補的である５’末端と、（ｉｉ）基質１の配列と同等であるが、５’末端「ＡＣ」ヌクレオチドおよび３’末端「ＧＡＡ」ヌクレオチドを欠く基質１ｂからなる中心部分と、（ｉｉｉ）Ｄｚ（Ａ）の３’領域と相補的である３’末端とからなる。
【０５２８】
この実施例では、２種の不活性ＤＮＡザイムを含有する疑似環構造が、２種のＢＬ分子形態によって共に結びつくよう（図１パネルｉｉｉ）に概説されるように）、ＢＬ（Ａ）およびＢＬ（Ｂ）の５’および３’末端が、Ｄｚ（Ａ）およびＤｚ（Ｂ）の５’および３’末端とハイブリダイズするよう設計される。パートザイム（パートザイムＡ、配列番号３３；ＴＦＲＣＡ４／４５−ＰおよびパートザイムＢ、配列番号３４  ＴＦＲＣＢ５／４５−Ｐ）およびアセンブリーファシリテーター（ＡＦ１、配列番号３５  ＡＦ−ＴＦＲＣ）からなるＭＮＡザイム（Ｍｚ１）は、ＢＬ（Ａ）の基質１ａ部分およびＢＬ（Ｂ）の基質１ｂ部分を切断することができ、疑似環構造からのＤｚ（Ａ）およびＤｚ（Ｂ）の放出をもたらす。Ｄｚ（Ａ）は、この実施例では、５’末端で６−フルオレセイン（「６−ＦＡＭ」）部分を用い、３’末端でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー１（「ＢＨＱ１」）を用いて標識される、基質Ａ（配列番号５、Ｓｕｂ２）を切断する。Ｄｚ（Ｂ）は、この実施例では、５’末端でテキサスレッド部分を用い、その３’末端でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー２（「ＢＨＱ２」）部分を用いて標識される、基質Ｂ（配列番号１１、Ｓｕｂ６）を切断する。
【０５２９】
上記のオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、ＤＮＡザイムの一部と相補的であるＢＬ中の領域を表す。イタリック体の塩基は、ＢＬ分子内の基質配列に対応する領域を意味する。四角で囲まれた塩基は、ＤＮＡザイムまたはパートザイムの触媒コアを表す。灰色で強調されたヌクレオチドは、ＢＬ分子中の下線が引かれた塩基と相補的であり、それによってブロックされるＤＮＡザイム中の塩基を表す。／３Ｐｈｏｓ／は、３’末端リン酸化を示す。
【０５３０】
【表２８】
0006336443.tif 000029
【０５３１】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧは、これまでの節において列挙されたオリゴヌクレオチドおよび図１パネルｉｉｉ）に例示される構造に関連して、表１４に列挙される以下のオリゴヌクレオチドを含有するよう設定した。反応Ｅ、ＦおよびＧについては、ＢＬ分子；ＢＬ（Ａ）、ＢＬ（Ｂ）およびＤＮＡザイムＤｚ（Ａ）およびＤｚ（Ｂ）を共に、室温で３０分間最初にプレハイブリダイズし、その後、任意のさらなるオリゴヌクレオチド成分を添加した。
【０５３２】
【表２９】
0006336443.tif 000030
【０５３３】
オリゴは、ＩＤＴまたはBiosearch technologiesから購入した。全ての反応物は、１×ＰＣＲバッファーＩＩ(Applied Biosystems)、ヌクレアーゼ不含水(Ambion)および２５ｍＭのＭｇＣｌ２(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで４８℃で２連で実施した。蛍光シグナルは、チャネル１（ＦＡＭ）およびチャネル３（ＴｘＲ）の両方で同時に測定して、それぞれ、ＦＡＭおよびテキサスレッドをモニタリングし、合計４０分間、５秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：全てのチャネル）。
【０５３４】
−結果
図１５パネルｉｉ）は、２種のＤＮＡザイムが存在する疑似環から得た結果を示す。この場合には、基質配列（ＢＬＡの基質１ａおよびＢＬＢの基質１ｂ）は、標識されないままである。その放出および活性化後にＤｚ（Ａ）によって切断され得る基質配列（基質Ａ）は、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャー色素を用いて標識され、その放出および活性化後にＤｚ（Ｂ）によって切断され得る基質（基質Ｂ）は、ＴｘＲフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識される。結果として、両切断事象は、両フルオロフォア発光波長からの蛍光シグナルを可視化することによって別個にモニタリングされ得る。上のグラフは、ＦＡＭフルオロフォアからの、下のグラフは、ＴｘＲフルオロフォアからの蛍光シグナルの概要を示す。反応Ｅ、疑似環がそれ自体で存在する場合には（三角記号を有する線として示される「ブロッカーのみ」）および疑似環およびパートザイムが存在するが、ＡＦ１が存在しない反応Ｆ（丸記号を有する線として示される「パートザイム存在（ＡＦ１なし）」）については、基質１ａまたは基質１ｂの切断はなく、結果として、ＦＡＭまたはＴｘＲシグナルの増大はほとんどないし全くなく、これは、Ｄｚ（Ａ）およびＤｚ（Ｂ）の両方が、未変化ＢＬ分子と複合体を形成している場合には不活性であることを示す。これは、同一蛍光標識された基質Ａおよび基質Ｂ配列のみを含有する、それぞれ、反応Ａ  ＆  Ｃ（「陰性対照」、四角記号を含有する線）に対応するＦＡＭおよびＴｘＲの両方の陰性対照との比較において示される。疑似環、パートザイムおよびＡＦ１を含有する反応Ｇ（「パートザイム＋ＡＦ１存在、２本の斜めの交差線および１本の垂直の交差線からなる記号を含有する線）については、ＦＡＭおよびＴｘＲフルオロフォア両方からのシグナルの段階的増大があり、これは、Ｄｚ（Ａ）およびＤｚ（Ｂ）の両方が、疑似環から放出され、ここで、そのそれぞれの基質を切断していることを示す。これは、反応Ｇにおいて存在するものと同一濃度の、それぞれ、ＦＡＭについては基質ＡおよびＤｚ（Ａ）ならびにＴｘＲについては基質ＢおよびＤｚ（Ｂ）を含有する、それぞれ、反応ＢおよびＤ（「陽性対照」、菱形記号を含有する線）に対応する、ＦＡＭおよびＴｘＲの陽性対照との比較において示される。
【実施例１２】
【０５３５】
以下の実施例は、実施例１においてこれまでに実証された、疑似環構造内の相補的ＢＬ分子とのハイブリダイゼーションによる、ＤＮＡザイムの不活性化を実証する。しかし、この実施例では、各々、ｉ）対向する環のＢＬ内に存在する基質を切断することができるＤＮＡザイムおよびｉｉ）２種の隣接する独立した基質を含有するＢＬを含有する、２つの環が存在する。両疑似環中に存在する第１の基質配列（基質１）配列は、標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１）の存在下でＭＮＡザイム（Ｍｚ１）によって切断される。２つの疑似環は、対向する環中に組み込まれたＤＮＡザイム（それぞれ、Ｄｚ２またはＤｚ３）によって切断することができる第２の基質配列（基質２ａまたは基質３ａのいずれか）を各々含有する。２種のＤＮＡザイムは、両ＢＬ分子の存在によって不活性で維持される。活性Ｍｚ１によるいずれかの環での基質１の切断は、これまでは不活性のＤＮＡザイムの放出およびその後の再活性化をもたらす。各ＤＮＡザイムが、対向する環ＢＬを切断することができるので、この最初の活性化はまた、２つの環（図１６パネルｉ）において図表で表される）の間のＢＬ切断事象の指数関数的カスケードおよび単一疑似環の切断と比較したＤＮＡザイム活性化の速度の増大を引き起こす。これは、シグナル増幅につながる。
【０５３６】
−オリゴヌクレオチド
本実施例では、環Ａは、（ｉ）Ｄｚ３（配列番号３７；Ｄｚ６（９：９））の一部と相補的である５’および３’末端と、（ｉｉ）基質１および基質２ａ両方の隣接する配列からなる５’および３’末端を接続する中心部分とから構成されるＢＬＡ（配列番号３６；Ｃ（Ｒ１５ａ）Ｓｕｂ４５＿２）からなり、ＢＬＡは、ＢＬＡをＤｚ３とプレハイブリダイズすることによってＤｚ３の活性をブロックするために利用される。環Ｂは、（ｉ）Ｄｚ２の一部（配列番号２６；Ｄｚ２（９：８））と相補的である５’および３’末端と、（ｉｉ）基質１および基質３の配列（配列番号１１；Ｓｕｂ６）と同等であるが、５’末端「Ａ」ヌクレオチドおよび３’末端「Ｇ」ヌクレオチドを欠く基質３ａ両方の隣接する配列からなる５’および３’末端を接続する中心部分とから構成されるＢＬＢ（配列番号３８；Ｃ（Ｒ１６ｄ）Ｓｕｂ４５＿６）からなる。ＢＬＢは、ＢＬＢをＤｚ２とプレハイブリダイズすることによってＤｚ２の活性をブロックするために利用される。
【０５３７】
パートザイム（パートザイムＡ、配列番号３３；ＴＦＲＣＡ４／４５−ＰおよびパートザイムＢ、配列番号３４  ＴＦＲＣＢ５／４５−Ｐ）およびアセンブリーファシリテーター標的（ＡＦ１、配列番号３５  ＡＦ−ＴＦＲＣ）からなるＭＮＡザイム（Ｍｚ１）は、ＢＬＡまたはＢＬＢのいずれかの基質１部分を切断するために利用される。この標的依存性切断事象は、Ｄｚ３またはＤｚ２のいずれかまたは両方の放出を促進し、これによって、それぞれ、ＢＬＢまたはＢＬＡに対して作用することが可能となる。Ｄｚ３はまた、疑似環の成分ではない基質３に対して作用し得る。この実施例では、この独立した基質３は、５’末端でＦＡＭ部分を用い、３’末端でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー１（「ＢＨＱ１」）部分を用いて末端標識された。
【０５３８】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、Ｄｚ３の一部と相補的であるＢＬＡ中の領域およびＤｚ２の一部と相補的であるＢＬＢ中の領域を表す。イタリック体の塩基は、ＢＬ分子内の基質配列に対応する領域を意味する。四角で囲まれた塩基は、ＤＮＡザイムおよびパートザイムの触媒コアを表す。灰色で強調されたヌクレオチドは、それぞれ、ＢＬＡおよびＢＬＢ分子中の下線が引かれた塩基と相補的であり、それによってブロックされるＤｚ３およびＤｚ２中の塩基を表す。／３Ｐｈｏｓ／は、３’末端リン酸化を示す。
【０５３９】
【表３０】
0006336443.tif 000031
【０５４０】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、これまでの節において列挙されたオリゴヌクレオチドおよび図１６パネルｉ）に例示される構造に関連して、表１５に列挙される以下のオリゴヌクレオチドを含有するよう設定した。
【０５４１】
【表３１】
0006336443.tif 000032
【０５４２】
オリゴは、Integrated DNA Technologies(IDT)またはBiosearch technologiesから購入した。全ての反応物は、１×ＰＣＲバッファーＩＩ(Applied Biosystems)、ヌクレアーゼ不含水(Ambion)および２５ｍＭのＭｇＣｌ２(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで５０℃で２連で実施し、蛍光シグナルを、チャネル１（ＦＡＭ）で測定し、合計１００分間、３０秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：ＦＡＭのみ）。
【０５４３】
−結果
図１６パネルｉｉ）は、１つ対２つのＤＮＡザイム疑似環が存在する場合に蛍光シグナルを比較する結果を示す。これらの反応では、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識される基質３は、Ｄｚ３によって切断され得、従って、Ｄｚ３の放出および活性化は、ＦＡＭの蛍光の変化によってモニタリングされ得る。基質３およびパートザイムならびに反応Ａについては疑似環のみ（四角記号を有する線として示される「環Ａのみ、ＡＦ１なし」）または反応Ｃについては疑似環ＡおよびＢの両方（三角記号を含有する線として示される「環ＡおよびＢ、ＡＦ１なし」）のいずれかが存在する反応ＡおよびＣについては、基質３の切断は極めて少なく、結果として、経時的なＦＡＭシグナルの最小の増大しかない。これは、ＤＮＡザイムが、ＭＮＡザイムによる基質１の切断を引き起こすためのＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーター（ＡＦ１）が存在しない場合に、ＢＬと複合体を形成する場合に不活性であることを示す。反応Ｂは、反応Ａと同一成分を含有するが、ＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーターが添加されており（「環Ａのみ、ＡＦ１存在、菱形記号を有する線）、最初の遅滞期と、それに続く、経時的なＦＡＭシグナルの段階的増大をもたらし、これは、最終的には、およそ９０分で反応時間の最後に向けてプラトーに到達する。反応Ｄは、反応Ｃと同一成分を含有するが、ＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーターが添加されており（「環ＡおよびＢ、ＡＦ１存在」、丸記号を含有する線）、最初の遅滞期と、それに続く、ＦＡＭシグナルの迅速な増大をもたらし、およそ４０分でプラトーに達し、これは、両サイクルが存在する場合には相互触媒性フィードバックカスケードが起こっており、これが、Ｄｚ３活性化、ひいては、基質３の切断の速度を増大することを示す。
【実施例１３】
【０５４４】
以下の実施例は、実施例１２において元々概要が示される相互触媒性ＤＮＡザイム疑似環カスケードを実証する。しかし、この実施例では、ＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーターの濃度を滴定して下げて、カスケードの、バックグラウンドを上回る検出限界を決定し、全てのアセンブリーファシリテーター濃度でのシグナルの指数関数的増幅を実証した。環Ａおよび環Ｂは、両方とも存在するが（図１６パネルｉ）において図表で表される）、蛍光標識された基質３が、環Ｂからのその放出および活性化後にＤｚ２によって切断される蛍光標識された基質２によって代わりに置換される。
【０５４５】
−オリゴヌクレオチド
本実施例では、環Ａは、（ｉ）Ｄｚ３の一部（配列番号４０；Ｄｚ６（９：８））と相補的である５’および３’末端と、（ｉｉ）基質１（配列番号３；Ｓｕｂ４５）および基質２（配列番号５；Ｓｕｂ２）と同等であるが、５’末端「ＡＧＧ」ヌクレオチドを欠く基質２ａの両方の隣接する配列からなる５’および３’末端を接続する中心部分とから構成されるＢＬＡ（配列番号３６；Ｃ（Ｒ１５ａ）Ｓｕｂ４５＿２）からなる。ＢＬＡは、ＢＬＡをＤｚ３とプレハイブリダイズすることによって、Ｄｚ３の活性をブロックするために利用される。環Ｂは、（ｉ）Ｄｚ２の一部（配列番号２６；Ｄｚ２（９：８））と相補的である５’および３’末端と、（ｉｉ）基質１および基質３ａの両方の隣接する配列からなる５’および３’末端を接続する中心部分から構成されるＢＬＢ（配列番号３８；Ｃ（Ｒ１６ｄ）Ｓｕｂ４５＿６）からなる。ＢＬＢは、ＢＬＢをＤｚ２とプレハイブリダイズすることによって、Ｄｚ２の活性をブロックするために利用される。
【０５４６】
パートザイム（パートザイムＡ、配列番号３３；ＴＦＲＣＡ４／４５−ＰおよびパートザイムＢ、配列番号３４  ＴＦＲＣＢ５／４５−Ｐ）およびアセンブリーファシリテーター標的（ＡＦ１、配列番号３５  ＡＦ−ＴＦＲＣ）からなるＭＮＡザイム（Ｍｚ１）は、ＢＬＡまたはＢＬＢいずれかの基質１部分を切断するために使用される。この標的依存性切断事象は、Ｄｚ３またはＤｚ２のいずれかまたは両方の放出を促進し、これによって、それぞれ、ＢＬＢまたはＢＬＡに対して作用することが、またはＤｚ２が、この実施例では、５’末端でＦＡＭ部分を用い、３’末端でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー１（「ＢＨＱ１」）部分を用いて末端標識された別個の基質２に作用することが可能となる。
【０５４７】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、Ｄｚ３の一部と相補的であるＢＬＡ中の領域およびＤｚ２の一部と相補的であるＢＬＢ中の領域を表す。イタリック体の塩基は、ＢＬ分子内の基質配列に対応する領域を意味する。四角で囲まれた塩基は、ＤＮＡザイムおよびパートザイムの触媒コアを表す。灰色で強調されたヌクレオチドは、それぞれ、ＢＬＡおよびＢＬＢ分子中の下線が引かれた塩基と相補的であり、それによってブロックされるＤｚ３およびＤｚ２中の塩基を表す。／３Ｐｈｏｓ／は、３’末端リン酸化を示す。
【０５４８】
【表３２】
0006336443.tif 000033
【０５４９】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは、これまでの節において列挙されたオリゴヌクレオチドおよび図１６パネルｉ）に例示される構造に関連して、表１６に列挙される以下のオリゴヌクレオチド断片を含有するよう設定した。全ての反応について、ＢＬおよびＤＮＡザイムを共に、室温で３０分間最初にプレハイブリダイズし、その後、任意のさらなるオリゴヌクレオチド成分を添加した。
【０５５０】
【表３３】
0006336443.tif 000034
【０５５１】
オリゴは、Integrated DNA Technologies(IDT)またはBiosearch technologiesから購入した。全ての反応物は、１×ＰＣＲバッファーＩＩ(Applied Biosystems)、ヌクレアーゼ不含水(Ambion)および４５ｍＭのＭｇＣｌ２(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで４８．５℃で２連で実施し、蛍光シグナルを、チャネル１（ＦＡＭ）で測定し、合計１４０分間、３０秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：ＦＡＭのみ）。
【０５５２】
−結果
図１６パネルｉｉｉ）は、ＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーター滴定を用いる、２つのＤＮＡザイム疑似環からの蛍光シグナルを示す。ここで、Ｄｚ２によって切断され得る基質２は、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識され、従って、Ｄｚ２の放出および活性化は、ＦＡＭの蛍光の変化によってモニタリングされ得る。反応の各々：反応Ａ（菱形記号を有する線として示される「環ＡおよびＢ、１ｎＭ  ＡＦ１」）、反応Ｂ（三角記号を含有する線として示される「環ＡおよびＢ、５００ｐＭ  ＡＦ１」）、反応Ｃ（「環ＡおよびＢ、２５０ｐＭ  ＡＦ１」丸記号を含有する線）、反応Ｄ（「環ＡおよびＢ、１００ｐＭ  ＡＦ１」２本の斜めの交差線および１本の垂直の交差線からなる記号を含有する線）、反応Ｅ（「環ＡおよびＢ、２５ｐＭ  ＡＦ１」２本の斜めの交差線からなる記号を含有する線）および反応Ｆ（「環ＡおよびＢ、ＡＦ１なし」四角記号を含有する線）については、蛍光の小さい直線的増大からなる最初の遅滞期と、それに続く、ＦＡＭシグナルの急な増大があり（シグナル増幅の指数関数期を示す）、その後、プラトーに到達する。各反応が、指数関数期を経験する時間は、ＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーターの濃度と相関しており、反応Ａは、最も早く指数関数期を経験し、順に、反応Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥが続く。標的アセンブリーファシリテーターを欠く対照反応Ｆは、アセンブリーファシリテーターを含有する全ての反応が、シグナルをもたらした後までシグナルをもたらさず、それによって、最低濃度の標的ＡＦ１を有する反応物を標的ＡＦ１を欠くものから区別することが可能となる。
【実施例１４】
【０５５３】
実施例１４は、実施例９において先に概要が示されるように、ＤＮＡザイム分子を合成するためのプライマーの使用を実証する。しかし、この実施例では、プライマーは、ＭＮＡザイム基質の成分として不活性形態で最初に存在する（図１２パネルｉｉｉにおいて表されるように）。標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１）が存在する場合には、ＭＮＡザイム（Ｍｚ１）は、活性であり、その基質を切断でき、基質の５’および３’末端に対応する２つの切断された断片（切断された基質）をもたらす。５’末端は、ここで、新規３’末端を含有し、それは、２’３’環状リン酸基によるポリメラーゼによる伸長からブロックされたままである。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４  ＰＮＫ）は、核酸の３’末端からのリン酸基の除去を触媒し得る酵素である。Ｔ４  ＰＮＫの存在下では、２’３’環状リン酸は、切断されたＭＮＡザイム基質から除去され、結果的に、プライマーは、ここで、活性プライマーである。図１７パネルｉｉ）に概説されるこの反応では、１つの基質−結合アームおよび触媒コア配列のおよそ半分を含有する部分ＤＮＡザイムを含むＢＬ部分からなるヘアピン型分子が存在する。この部分触媒コアはまた、不活性化する突然変異した塩基も含有する。ポリメラーゼ酵素の存在下では、ヘアピン分子の３’末端で不活性ＤＮＡザイムの配列をコピーし、ひいては、完成するための鋳型としてＤｚ鋳型を使用してこの配列を伸長できる。しかし、ＤＮＡザイムは、コア領域中の突然変異のために、ヘアピンが開環される場合でも不活性のままである。この実施例では、ヘアピンループは、ニッキング酵素の部分認識配列を形成するヌクレオチドからなる。
【０５５４】
プライマーは、ＭＮＡザイム基質切断およびＴ４  ＰＮＫ活性の両方によって活性化されると、ヘアピンのループ配列とハイブリダイズし、コピーするために鋳型としてＤｚ鋳型鎖を使用する鎖置換型ポリメラーゼによってその３’末端で伸長される。プライマー伸長は、ＤＮＡザイムの新規の完全なコピーの合成をもたらす。プライマーの伸長はまた、二本鎖ニッキング酵素認識部位の完成をもたらす。ニッキング酵素は、この部位を認識し、上流プライマーと下流ＤＮＡザイム配列の間の領域で、新規に合成された鎖に選択的にニックを入れることができる。従って、ニッキングは、新規プライマーを生成し、これは、ポリメラーゼによって伸長されて、別のＤＮＡザイムコピーを合成し、またＤｚ鋳型から既存のコピーを置換する。次いで、ニッキング、重合および置換のこのサイクルは、自律的に起こり、その自身の基質を切断することができるいくつかの活性ＤＮＡザイム分子を生成し得る。
【０５５５】
−オリゴヌクレオチド
パートザイム（パートザイムＡ、配列番号４１；ＴＦＲＣＡ４／２−ＰおよびパートザイムＢ、配列番番号４２  ＴＦＲＣＢ５／２−Ｐ）およびアセンブリーファシリテーター（ＡＦ１）標的（配列番号３５  ＡＦ−ＴＦＲＣ）からなるＭＮＡザイム（Ｍｚ１）は、基質１（ＳｕｂＫ１（１４：１２）、配列番号４３）を切断するために利用される。この実施例では、ＳｕｂＫ１（１４：１２）は、５’末端で６−フルオレセイン（「６−ＦＡＭ」）部分を用い、３’末端でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー１（「ＢＨＱ１」）を用いて標識された。基質２（Ｓｕｂ４５、配列番号３）を切断することができる合成されるべきＤＮＡザイムの鋳型を提供する「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型（配列番号４４；ｈｐ（Ｒ２２ａ）ＡＤｚ４５）を利用した。この実施例では、Ｓｕｂ４５は、５’末端でＱｕａｓａｒ６７０（「Ｑ６７０」）部分を用い、３’末端でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー２（「ＢＨＱ２」）を用いて標識された。「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型から合成されたＤＮＡザイムの触媒活性を、対応する陽性対照Ｄｚ、（配列番号４５；Ｄｚ４５（９：９））のものと比較した。
【０５５６】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。イタリック体の塩基は、ヘアピン型ＤＮＡザイム構造内のＤＮＡザイム配列を意味する。下線が引かれた塩基は、プライマーおよびヘアピン型ＤＮＡザイムの間の相補性の領域を表す。強調された塩基は、部分ニッキング酵素認識部位を表す。四角で囲まれた塩基は、ＤＮＡザイムおよびパートザイムの触媒コアを表す。／３Ｐｈｏｓ／は、３’末端リン酸化を示す。
【０５５７】
【表３４】
0006336443.tif 000035
【０５５８】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは、これまでの節におけるオリゴヌクレオチドおよび図１７パネルｉｉ）に例示される構造に関連して、表１７に列挙される以下のオリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ、Ｔ４  ＰＮＫおよびニッキング酵素を含有するよう設定した。
【０５５９】
【表３５】
0006336443.tif 000036
【０５６０】
オリゴは、ＩＤＴまたはＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ポリメラーゼ酵素、Ｂｓｔ  ２．０ウォームスタート、ニッキング酵素、Ｎｔ．ＡｌｗＩおよびＴ４  ＰＮＫは全て、New England Biolabsから購入した。全ての反応物は、１×ＮＥＢバッファー２（New England Biolabs）、２００μＭ  ｄＮＴＰ(Bioline)およびヌクレアーゼ不含水(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで５１℃で２連で実施した。蛍光シグナルをチャネル１（ＦＡＭ）およびチャネル４（Ｑ６７０）で測定し、合計１５４分間、３０秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：全てのチャネル）。
【０５６１】
−結果
図１７パネルｉｉｉ）は、図１７パネルｉｉ）に表わされる戦略から達成された蛍光シグナルを実証する。活性ＭＮＡザイムによって切断され得る基質１は、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャー部分を用いて標識される。グラフ（ＦＡＭ）は、このＦＡＭフルオロフォアからの蛍光シグナルの概要を示す。合成されたＤＮＡザイムによって切断され得る基質２は、Ｑ６７０フルオロフォアおよびクエンチャー部分を用いて標識される。グラフ（Ｑ６７０）は、このＱ６７０フルオロフォアからの蛍光シグナルの概要を示す。反応Ａ（四角記号を有する線として示される「ＰＮＫなし、ＡＦ１なし」）およびＣ（三角記号を有する線として示される「ＰＮＫ存在、ＡＦ１なし」）については、活性ＭＮＡザイムを集合させるためのＡＦ１は存在しない。結果的に、ＦＡＭシグナルの増大はなく、これは、基質１の切断はなく、ならびに、Ｑ６７０シグナルの増大もないことを示し、基質２を切断するために合成される活性ＤＮＡザイムがないことを示す。このＱ６７０シグナルは、基質２のみを含有する陰性対照（「陰性対照」、２本の斜めの交差線および１本の垂直の交差線からなる記号を含有する線）を含有する反応Ｅとの比較において示される。
【０５６２】
反応Ｂ（菱形記号を有する線として示される、「ＰＮＫなし、１０ｎＭ  ＡＦ１」）およびＤ（丸記号を有する線として示される「ＰＮＫ存在、１０ｎＭ  ＡＦ１」）については、ＡＦ１が存在し、活性ＭＮＡザイムの形成をもたらす。結果として、ＦＡＭシグナルの段階的増大があり、これは、基質１が、ＭＮＡザイムによって切断されていることを示す。反応Ｄについて、短い遅延後、次いで、Ｑ６７０シグナルの段階的増大があり、Ｔ４  ＰＮＫが、切断された基質１からリン酸基を除去することを示し、これは、それがプライマーとして作用することを可能にし、その後、基質２を切断するＤＮＡザイムの合成をもたらす。このＱ６７０シグナルは、基質２およびＭＮＡザイムＡＦ１のものと同一濃度の遊離陽性対照ＤＮＡザイムからなる陽性対照（「陽性対照」、２本の斜めの交差線からなる記号を含有する線）を含有する反応Ｆとの比較において示される。陽性対照において提供されるものよりも多くのＤＮＡザイムを示す陽性対照のものより速い反応Ｄプラトーからのシグナルは、反応時間の間に合成されている。Ｔ４  ＰＮＫ酵素を含有しないので、反応ＢについてはＱ６７０シグナルの増大はなく、これは、次いで、その３’末端が改変されるまで、切断された基質１がプライマーとして作用できないことを示す。
【実施例１５】
【０５６３】
実施例１５は、実施例９に元々記載される、ＤＮＡザイム分子を直接的に活性化するプライマーの使用を実証する。しかし、この実施例は、不完全な、不活性ＤＮＡザイム配列を代わりに含有するヘアピン型分子を用いて起こる改善された特異性を具体的に実証する。また、アンチセンスＤｚ鋳型を使用することと比較して、ヘアピン型分子を使用して起こる改善された速度も実証する。図１９パネルｉ）に表わされる４種の異なる分子複合体が比較される。第１のもの（パートＡ）は、実施例９において元々記載される、「完全」ヘアピン型Ｄｚである。ＢＬ部分が、触媒コア配列の４つのヌクレオチドを欠くＤＮＡザイム配列を含有し、このＢＬが、活性ＤＮＡザイムを生成するようポリメラーゼによってコピーされ得るアンチセンスＤＮＡザイム鋳型をブロックするので、第２のもの（パートＢ）は「完全にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型と呼ばれる。第３のもの、「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型（パートＣ）では、ＢＬ部分は、１つの基質−結合アームおよび触媒コア配列のおよそ半分を含有する部分ＤＮＡザイムを含有する。触媒コアはまた、ＢＬの伸長によって形成されたＤＮＡザイムを触媒的に不活性にする、領域中の不活性化する突然変異した塩基も含有する。パートＣのＢＬは、活性ＤＮＡザイムを生成するようポリメラーゼによってコピーされ得るアンチセンスＤＮＡザイム鋳型をブロックする。ポリメラーゼ酵素の存在下では、ＢＬは、コピーするための鋳型としてＤｚ鋳型を使用して、この配列を伸長できるが、コア領域中の突然変異のために、ヘアピンが開環される場合に活性ＤＮＡザイムは曝露されない。
【０５６４】
「完全にブロックされた」および「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型分子の両方について、Ｄｚ鋳型（ＡＳＤｚ）配列は、それぞれ、「完全」および「部分的に」ブロックされたヘアピンＤｚ鋳型中のＢＬ中で欠失しているか、または突然変異しているコア領域中のヌクレオチドの相補体を含めた活性ＤＮＡザイム配列の完全相補体を含有する。３種のヘアピン型分子全てについて、ＢＬとＤＮＡザイム配列を連結するヘアピンループまたはその相補体は、ニッキング酵素の部分認識配列を形成するヌクレオチドからなる。最終複合体（パートＤ）は、プライマー−結合部位およびニッキング酵素の部分認識配列と隣接する、ブロックされていないアンチセンスＤＮＡザイム配列である。この複合体では、ＢＬ配列は最初に存在せず、ヘアピン形成もない。
【０５６５】
プライマーが存在する場合には、プライマー−結合領域（３種のヘアピン型構造のループ配列である）とハイブリダイズし、鎖置換型ポリメラーゼによってその３’末端で伸長される。プライマー伸長は、ＢＬ（部分Ａ）または鋳型（部分Ｂ、ＣおよびＤ）としてのアンチセンスＤｚ鋳型配列の使用によって、触媒活性に必要な完全配列を含有する新規ＤＮＡザイムの合成をもたらす。プライマーの伸長はまた、二本鎖ニッキング酵素認識部位の完成をもたらす。ニッキング酵素は、この部位を認識し、上流プライマーと下流ＤＮＡザイム配列の間の領域で、新規に合成された鎖に選択的にニックを入れることができる。従って、ニッキングは、新規プライマーを生成し、これは、ポリメラーゼによって伸長されて、別の完全ＤＮＡザイム配列を合成し、またＢＬ（部分Ａ）またはアンチセンスＤｚ鋳型（部分Ｂ、ＣおよびＤ）から既存のＤＮＡザイムを置換する。次いで、ニッキング、重合および置換のこのサイクルは、自律的に起こり、いくつかの活性ＤＮＡザイム分子を生成し得る。「完全にブロックされたヘアピン型Ｄｚ」および「部分的にブロックされたヘアピン型Ｄｚ」分子の、および「ブロックされていないＤｚ鋳型」の特異性の改善は主に、活性ＤＮＡザイムが、反応物中に存在することの前に、プライマー伸長およびニッキング酵素活性の両方が絶対要件であることから起こる。完全に、および部分的にブロックされたＤｚ鋳型は、ヘアピンがその最初の閉じた立体構造にある場合には対向するＢＬ鎖と、ヘアピンが開環立体構造にある場合には、対向する新規に合成されたＤｚ鎖（プライマーの伸長）とハイブリダイズされるので、「ブロックされていないＤｚ鋳型」のものを上回る「完全にブロックされたヘアピン型Ｄｚ」および「部分的にブロックされたヘアピン型Ｄｚ」からの速度の改善が主に起こると想定される。これは、Ｄｚ鋳型が二本鎖形成において常であるように、Ｄｚ鋳型鎖の新規に合成された一本鎖Ｄｚ分子を捕捉する能力を最小にする。
【０５６６】
−オリゴヌクレオチド
基質（Ｓｕｂ４５、配列番号３）を切断するＤＮＡザイムを直接的に切断または合成することができる、「完全」ヘアピン型Ｄｚ（配列番号３１；ｈｐ（Ｒ６ｂ）Ｄｚ４５）、「完全にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型（配列番号４６；ｈｐ（Ｒ８ｂ）ＡＤｚ４５）、「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型（配列番号４７；ｈｐ（Ｒ１１ｂ）ＡＤｚ４５）およびブロックされていないＤｚ鋳型（配列番号４８；（Ｒ１５ａ）−Ｄｚ４５）を利用した。この実施例では、Ｓｕｂ４５は、５’末端で６−フルオレセイン（「６−ＦＡＭ」）部分を用い、３’末端でＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋクエンチャー部分（「ＢＨＱ１」）を用いて標識された。プライマー１（配列番号３２；ＰＲ（Ｒ６）Ｄｚ４５（１０））を使用して「完全」ヘアピン型Ｄｚを活性化し、ＤＮＡザイムのさらなるコピーを合成した。プライマー２（配列番号４９；ＰＲ（Ｒ８ｂ）Ｄｚ４５（１４））を使用して、「完全にブロックされたヘアピン型Ｄｚ鋳型」および「部分的にブロックされたヘアピン型Ｄｚ鋳型」から、また「ブロックされていないＤｚ−鋳型」からＤＮＡザイムのコピーを合成した。
【０５６７】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。イタリック体の塩基は、ヘアピン型ＤＮＡザイム構造内のＤＮＡザイム配列を意味する。下線が引かれた塩基は、プライマーおよびヘアピン型ＤＮＡザイムまたはアンチセンスＤＮＡザイム鋳型の間の相補性の領域を表す。影のついた塩基は、部分ニッキング酵素認識部位を表す。四角で囲まれた塩基は、ＤＮＡザイムの触媒コアに対応する塩基を表す。
【０５６８】
【表３６】
0006336443.tif 000037
【０５６９】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨは、これまでの節におけるオリゴヌクレオチドおよび図１９パネルｉ）に例示される構造に関連して、表１８に列挙される以下のオリゴヌクレオチド断片、ポリメラーゼおよびニッキング酵素を含有するよう設定した。
【０５７０】
【表３７】
0006336443.tif 000038
【０５７１】
オリゴは、ＩＤＴまたはBiosearch technologiesから購入した。ポリメラーゼ酵素、Ｂｓｔ  ２．０ウォームスタートおよびニッキング酵素、Ｎｔ．ＡｌｗＩは、New England Biolabsから購入した。全ての反応物は、１×ＮＥＢバッファー２（New England Biolabs）、２００μＭ  ｄＮＴＰ(Bioline)およびヌクレアーゼ不含水(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで５４℃で２連で実施した。蛍光シグナルをチャネル１（ＦＡＭ）で測定し、合計１４８分間、３０秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：ＦＡＭのみ）。
【０５７２】
−結果
図１９パネルｉｉ）は、図１９パネルｉ）に表わされる戦略から達成された蛍光シグナルを実証する。その活性化および／または合成後にＤＮＡザイムによって切断され得る基質配列は、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャー色素を用いて標識される。グラフ（ＦＡＭ）は、このＦＡＭフルオロフォアからの蛍光シグナルの概要を示す。それぞれ、「完全」ヘアピン型Ｄｚ分子（四角記号を有する線として示される、「構造Ａ−ＰＲなし」）および（菱形記号を有する線として示される、「構造Ａ−ＰＲ存在」）を含有する反応ＡおよびＢについては、両方についてほとんど同一である、ＦＡＭシグナルの即時増大がある。これは、プライマーの不在下でシグナルがもたらされるので、この構造は、これらの条件下で特異性を欠くことを示す。それぞれ、「完全にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型分子（三角記号を有する線として示される、「構造Ｂ−ＰＲなし」）および（丸記号を有する線として示される、「構造Ｂ−ＰＲ存在」）を含有する反応ＣおよびＤについては、プライマーを含有する反応Ｄについては、シグナルの即時の迅速な増大があり、プライマーを欠く反応Ｃについては、シグナルのかなり遅い段階的増大がある。もたらされるシグナルを大幅に増大するために、プライマーが必要とされるが、依然として幾分かのプライマー独立性活性があるので、これは、「完全」ヘアピン型Ｄｚ構造に対して特異性が改善されたことを示す。
【０５７３】
それぞれ、「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型分子（「構造Ｃ−ＰＲなし、２本の斜めの交差線および１本の垂直の交差線からなる記号を含有する線）および（「構造Ｃ−ＰＲ存在、２本の斜めの交差線からなる記号を含有する線）を含有する反応ＥおよびＦについては、プライマーが存在しない反応Ｅについては、シグナルの増大はないが、プライマーを含有する反応Ｆについては、シグナルの即時の迅速な増大がある。従って、プライマー独立性シグナルがないので、「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型は、「完全」および「完全にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型分子の特異性を改善する。最後に、それぞれ、「ブロックされていない」Ｄｚ鋳型（「構造Ｄ−ＰＲなし」、１本の垂直な交差線を有する記号を含有する線）および（「構造Ｄ−ＰＲ存在」、中黒四角からなる記号を含有する線）を含有する反応ＧおよびＨについては、プライマーが存在しない反応Ｇについては、シグナルの増大はないが、プライマーを含有する反応Ｈについては、シグナルの段階的増大がある。「ブロックされていない」Ｄｚ鋳型は、部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型構造と同一特異性を含有するが、「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型構造が行うのと同様に迅速には、プライマーの存在下でシグナルをもたらさない。これは、新規に合成されたＤＮＡザイムが、空のアンチセンスＤｚ鋳型と再ハイブリダイズでき、必然的に反応を減速するからである。「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型を用いた場合には、Ｄｚ鋳型自体が、ヘアピン構造内でブロックされ、常に、二本鎖のままであるので、これは起こるとは思われない。
【実施例１６】
【０５７４】
実施例１６は、ＢＬ分子とのそのハイブリダイゼーションによる、プライマーの不活性化を実証し、図２３パネルｉ）に表わされるように、その両方は、非相補的ループによって連結されて、ヘアピン構造を形成する。分子を、プライマー配列の一部のみが存在する「部分」ヘアピン型プライマーとして最初に提供する。プライマー配列の合成を完成するために、ポリメラーゼ酵素の存在下で、分子の３’末端が鋳型としてＢＬＡを使用して伸長され得る。ヘアピン型プライマーのＢＬＡは、ＭＮＡザイムの基質を含有し、その結果、その標的アセンブリーファシリテーターの存在下で、ＭＮＡザイムは、ＢＬ内に存在する基質を切断し、ＢＬからのプライマーの放出をもたらし、プライマーを活性にできる。実施例１５に最初に記載されるように、１つの基質−結合アームおよび触媒コア配列のおよそ半分を含有する部分ＤＮＡザイムからなるＢＬＢ部分からなる「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型もまた存在する。この部分触媒コアはまた、不活性化する突然変異体塩基も含有する。ポリメラーゼ酵素の存在下で、ＢＬＢは、ヘアピン分子の３’末端で不活性ＤＮＡザイムの配列をコピーし、ひいては、完成するための鋳型としてＤｚ鋳型（ＡＳＤｚ）を使用して伸長され得る。しかし、コア領域中の突然変異のために、ＤＮＡザイムは、ヘアピンが開環される場合でさえ不活性である。
【０５７５】
プライマーは、ひとたび活性であると、実施例９に最初に記載されるように、「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型のループとハイブリダイズし、鎖置換型ポリメラーゼによってその３’末端で伸長されるよう機能し得る。プライマー伸長は、コピーするための鋳型としての「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型配列の使用によって、ＤＮＡザイムの新規の完全コピーの合成をもたらす。プライマーの伸長はまた、二本鎖ニッキング酵素認識部位の完成をもたらす。ニッキング酵素は、この部位を認識し、上流プライマーと下流のＤＮＡザイム配列の間の領域で、新規に合成された鎖に選択的にニックを入れることができる。従って、ニッキングは、新規プライマーを生成し、これは、ポリメラーゼによって伸長されて、別のＤＮＡザイムコピーを合成し、またＤｚ鋳型から既存のコピーを置換する。次いで、ニッキング、重合および置換のこのサイクルは、自律的に起こり、その自身の基質を切断することができる、いくつかの活性ＤＮＡザイム分子を生成し得る。
【０５７６】
−オリゴヌクレオチド
基質２（Ｓｕｂ４５、配列番号３）を切断することができる、合成されるべきＤｚ２の鋳型を提供する「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型（配列番号４７；ｈｐ（Ｒ１１ｂ）ＡＤｚ４５）を利用した。この実施例では、Ｓｕｂ４５は、５’末端で６−フルオレセイン（「６−ＦＡＭ」）部分を用い、３’末端でＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋクエンチャー部分（「ＩＢ」）を用いて標識された。部分ヘアピン型プライマー（配列番号５０；ｈｐＰＲ（Ｒ１５ｈ）Ｓｕｂ２）を使用して、活性化し、Ｄｚ２のさらなるコピーを合成し、ひとたびポリメラーゼによって伸長されると、その後、ＭＮＡザイム（Ｍｚ１）によって切断された。Ｍｚ１は、パートザイムＡ（ＫｒａｓＡ４／２−Ｐ、配列番号５１）、パートザイムＢ（ＫｒａｓＢ５／２−Ｐ、配列番号５２）およびアセンブリーファシリテーター１（「ＡＦ１」、ＡＦ−Ｋｒａｓ、配列番号５３）からなる。切断されたヘアピンプライマーの、新規Ｄｚ２分子の合成をプライムする能力を、非ヘアピン型線形プライマー（ＰＲ（Ｒ８ｂ）Ｄｚ４５（１４）、配列番号４９）のものと比較した。ヘアピン型鋳型から合成されたＤｚ２の触媒活性も、対応する非ヘアピン型陽性対照Ｄｚ２、（配列番号４；Ｄｚ４５（９：１０））のものと比較した。
【０５７７】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。イタリック体の塩基は、「部分的にブロックされた」ヘアピン型ＤＮＡザイム鋳型構造内の部分ＤＮＡザイム配列を、またヘアピン型プライマー構造内のプライマー配列を意味する。下線が引かれた塩基は、プライマーおよび「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型の間の相補性の領域を表す。強調された塩基は、部分ニッキング酵素認識部位を表す。四角で囲まれた塩基は、パートザイムおよびＤＮＡザイムの触媒コアに対応する塩基を表す。／３Ｐｈｏｓ／は、３’末端リン酸化を示す。
【０５７８】
【表３８】
0006336443.tif 000039
【０５７９】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは、これまでの節におけるオリゴヌクレオチドおよび図２３パネルｉ）に例示される構造に関連して、表１９に列挙される以下のオリゴヌクレオチド断片、ポリメラーゼおよびニッキング酵素を含有するよう設定した。
【０５８０】
【表３９】
0006336443.tif 000040
【０５８１】
オリゴは、ＩＤＴまたはBiosearch technologiesから購入した。ポリメラーゼ酵素、Ｂｓｔ  ２．０ウォームスタート（３’→５’エキソ−）およびニッキング酵素、Ｎｔ．ＡｌｗＩは、New England Biolabsから購入した。全ての反応物は、１×ＮＥＢバッファー２（New England Biolabs）およびヌクレアーゼ不含水(Ambion)を含有していた。反応Ｃ〜Ｆはまた、２００μＭ  ｄＮＴＰ(Bioline)も含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで５４℃で２連で実施した。蛍光シグナルをチャネル１（ＦＡＭ）で測定し、合計１０５分間、３０秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：ＦＡＭのみ）。
【０５８２】
−結果
図２３パネルｉｉ）は、図２３パネルｉ）に表わされる戦略から達成された蛍光シグナルを実証する。「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型から、その合成後にＤｚ２によって切断され得る基質２は、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャー色素を用いて標識される。グラフ（ＦＡＭ）は、このＦＡＭフルオロフォアからの蛍光シグナルの概要を示す。「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型がそれ自体で存在する（反応Ｃ、三角記号を有する線として示される、「部分的にブロックされた」ヘアピン型鋳型のみ」）または「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型が存在し、ヘアピン型プライマーを含むが、ＡＦ１を含まない（反応Ｅ、１本の垂直な交差線および２本の斜めの交差線からなる記号を有する線として示される、「部分的にブロックされたヘアピン型鋳型＋ヘアピン型プライマー、ＡＦ１なし」）のいずれかである、反応ＣおよびＥについては、シグナルの増大はほとんどなく、これは、プライマーの伸長がほとんどないし全くなく、Ｄｚ２のその後の合成がほとんどないし全くなく、従って、基質２の切断およびＦＡＭシグナルの対応する増大がほとんどないし全くないことを示す。これは、同一蛍光標識された基質２のみを含有する、陰性対照（「陰性対照」、四角記号を含有する線）を含有する反応Ａとの比較において示される。
【０５８３】
活性線形プライマーが存在する反応Ｄ（「「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型＋線形プライマー」、丸記号を含有する線）については、およそ１０分内にプラトーに迅速に到達するシグナルの迅速な増大がある。ヘアピン型プライマーおよびＡＦ１を含有する反応Ｆ（「「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型＋ヘアピン型プライマー、ＡＦ１存在」、２本の斜めの交差線からなる記号を含有する線）については、シグナルの段階的増大があり、およそ６０分でプラトーに到達する。反応ＤおよびＦの両方については、シグナルの増大は、プライマーが、コピーするための鋳型として「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型を使用して伸長されており、ポリメラーゼおよびニッキング酵素の相乗作用による活性ＤＮＡザイムの合成をもたらすことを示す。ヘアピン型プライマー活性化からのシグナルは、ＢＬがＭＮＡザイムによって切断された後に、プライマーがそのＢＬから分離されるために必要な時間のためにより遅い。反応ＤおよびＦからのシグナルは、同一濃度の基質２および遊離陽性対照Ｄｚ２からなる陽性対照（「陽性対照」、菱形記号を含有する線）を含有する反応Ｂとの比較において示される。反応Ｄからのシグナルは、反応Ｂのものよりもわずかに速く完了し、これは、２０ｎＭの線形プライマーからのＤｚ２の合成が、陽性対照における同一濃度のＤｚ２の触媒活性のものよりも速い速度で進行していることを実証する。
【実施例１７】
【０５８４】
以下の実施例は、実施例１において先に実証された、疑似環構造内の相補的ＢＬ分子とのハイブリダイゼーションによるＤＮＡザイムの不活性化を実証する。しかし、この本実施例１７では、ＢＬ内に３種の異なる基質配列が存在する。活性ＭＮＡザイムによる基質１、基質２または基質３のいずれかの切断は、これまでに不活性のＤＮＡザイムの放出およびその後の再活性化をもたらす（図２０パネルｉ）に図表に表わされる）。
【０５８５】
−オリゴヌクレオチド
本実施例では、（ｉ）Ｄｚ４の一部（Ｄｚ４５（９：１０）、配列番号４）と相補的である５’および３’末端と、（ｉｉ）基質１、基質２および基質３の隣接する配列と同等である５’および３’末端を接続する中心部分とから構成されるＢＬ（配列番号５４、Ｃ（Ｒ１９ｂ））。ＢＬは、ＢＬをＤｚ４とプレハイブリダイズすることによって、Ｄｚ４の活性をブロックするために利用される。パートザイム（パートザイム１Ａ、配列番号５６；ＴＦＲＣＡ４／７７−Ｐおよびパートザイム１Ｂ、配列番号５７；ＴＦＲＣＢ５／５５−Ｐ）およびアセンブリーファシリテーター標的、ＡＦ１（配列番号３５  ＡＦ−ＴＦＲＣ）からなるＭｚ１は、ＢＬの基質１部分を切断するために利用される。パートザイム（パートザイム２Ａ、配列番号５８；ＫｒａｓＡ４／６−Ｐおよびパートザイム２Ｂ、配列番号５９；ＫｒａｓＢ５／６−Ｐ）およびアセンブリーファシリテーター標的、ＡＦ２（配列番号５３  ＡＦ−Ｋｒａｓ）からなるＭｚ２は、ＢＬの基質２部分を切断するために利用される。パートザイム（パートザイム３Ａ、配列番号６０；ＲＯ５Ａ４／２−Ｐおよびパートザイム３Ｂ、配列番号６１；ＲＯ５Ｂ５／２−Ｐ）およびアセンブリーファシリテーター標的、ＡＦ３（配列番号６２；ＡＦ−ＲＯ５）からなるＭｚ３は、ＢＬの基質３部分を切断するために利用される。Ｍｚ１、２または３のいずれかについては、標的依存性切断事象は、Ｄｚ４の放出を促進する。次いで、Ｄｚ４は、基質４（配列番号３；Ｓｕｂ４５）に対して作用し得、これは、この実施例では、５’末端でＦＡＭ部分を用い、３’末端でＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（「ＩＢ」）部分を用いて末端標識される。
【０５８６】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、Ｄｚ４の一部と相補的であるＢＬ中の領域を表す。イタリック体の塩基は、ＢＬ分子内の基質配列に対応する領域を意味する。四角で囲まれた塩基は、ＤＮＡザイムおよびパートザイムの触媒コアまたは部分触媒コアを表す。灰色で強調されたヌクレオチドは、ＢＬ分子中の下線が引かれた塩基と相補的であり、それによってブロックされるＤｚ４中の塩基を表す。／３Ｐｈｏｓ／は、３’末端リン酸化を示す。
【０５８７】
【表４０】
0006336443.tif 000041
【０５８８】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは、これまでの節において列挙されたオリゴヌクレオチドおよび図２０パネルｉ）に例示される構造に関連して、表２０に列挙される以下のオリゴヌクレオチドを含有するよう設定した。全ての反応について、ＢＬおよびＤｚ４を共に、室温で３０分間最初にプレハイブリダイズし、その後、任意のさらなるオリゴヌクレオチド成分を添加した。
【０５８９】
【表４１】
0006336443.tif 000042
【０５９０】
オリゴは、Integrated DNA Technologies(IDT)またはBiosearch technologiesから購入した。全ての反応物は、１×ＰＣＲバッファーＩＩ(Applied Biosystems)、ヌクレアーゼ不含水(Ambion)および４５ｍＭのＭｇＣｌ２(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで４８℃で２連で実施し、蛍光シグナルをチャネル１（ＦＡＭ）で測定し、合計１０５分間、３０秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：ＦＡＭのみ）。
【０５９１】
−結果
図２０パネルｉｉ）は、ＢＬ内の３種の異なる基質を含有するＤＮＡザイム疑似環の蛍光シグナルを比較する結果を示す。これらの反応では、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識される基質４は、ひとたびＤｚ４がＢＬから放出されると、Ｄｚ４によって切断され得、従って、Ｄｚ４の放出および活性化は、ＦＡＭの蛍光の変化によってモニタリングされ得る。疑似環（ＢＬとハイブリダイズされるＤｚ４）、基質４およびＭｚ１、Ｍｚ２またはＭｚ３の唯一のパートザイムがそれぞれ存在する、反応Ａ（四角記号を有する線として示される、「Ｍｚ１、ＡＦなし」）、反応Ｃ（三角記号を有する線として示される、「Ｍｚ２、ＡＦ２なし」）および反応Ｅ（１本の垂直な交差線および２本の斜めの交差線からなる記号を有する線として示される、「Ｍｚ３、ＡＦ３なし」）については、基質４の極めて少ない切断しかなく、結果として、経時的にＦＡＭシグナルの最小の増大しかない。これは、Ｄｚ４が、３種の別個の隣接する基質配列を含有するＢＬと複合体を形成する場合に不活性であることを示す。反応Ｂは、反応Ａと同一成分を含有するが、ＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーターが添加されている（「Ｍｚ１、ＡＦ１存在」、菱形記号を有する線）。反応Ｄは、反応Ｃと同一成分を含有するが、ＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーターが添加されている（「Ｍｚ２、ＡＦ２存在」、丸記号を含有する線）。反応Ｆは、反応Ｅと同一成分を含有するが、ＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーターが添加されている（「Ｍｚ３、ＡＦ３存在」、２本の斜めの交差線からなる記号を含有する線）。反応Ｂ、ＤおよびＦの各々では、ＦＡＭシグナルの即時増大があり、これは、ＢＬが切断されており、Ｄｚ４が放出され、基質４を切断し得ることを示す。反応Ｂ、ＤおよびＦの各々からのシグナルの増大が、およそ同一の速度で起こっており、これは、ＢＬの増大した長さにもかかわらず、ＢＬの中間領域中の任意の点での単一切断事象が、Ｄｚ４がＢＬから放出されるのに必要である全てであることを示す。
【実施例１８】
【０５９２】
以下の実施例は、実施例１において先に実証される、疑似環構造内の相補的ＢＬ分子とのハイブリダイゼーションによるＤＮＡザイムの不活性化を実証する。しかし、この実施例では、１種の基質配列（基質１）が、８：１７ＭＮＡザイム（Ｍｚ１）によって切断され得るＢＬ内に存在し、別の基質（基質２）が、１０：２３ＭＮＡザイム（Ｍｚ２）によって切断され得るＢＬ内に存在する。基質１は、２つのパートからなり、第１の５’パートは、基質１に特有である配列であり、基質のその他の３’パートは、基質２の５’パートとしても機能する配列である。８：１７ＭＮＡザイム（Ｍｚ１）は、基質１を認識し、切断し得る。従って、このＭｚ１は、８：１７ＭＮＡザイム基質の半分および１０：２３ＭＮＡザイム基質の半分から構成される配列を認識、切断するよう設計され得る。それぞれ、Ｍｚ１による基質１またはＭｚ２による基質２のいずれかの切断は、これまで不活性のＤｚ３の放出およびその後の再活性化をもたらす（図２０パネルｉｉｉ）において図表で表される）。
【０５９３】
−オリゴヌクレオチド
本実施例では、（ｉ）Ｄｚ３の一部（Ｄｚ６（８：７）、配列番号８）と相補的である５’および３’末端と、（ｉｉ）基質１および基質２の隣接する配列と同等である５’および３’末端を接続する中心部分とから構成されるＢＬ（配列番号６３、Ｃ（Ｒ１４ｂ）Ｓｕｂ１＿２）。ＢＬは、ＢＬをＤｚ３とプレハイブリダイズすることによって、Ｄｚ３の活性をブロックするために利用される。パートザイム（パートザイム１Ａ、配列番号６５；ＰＰＩＡＡ２／１−Ｐおよびパートザイム１Ｂ、配列番号６６；ＰＰＩＡＢ３／２（９））およびアセンブリーファシリテーター標的、ＡＦ１（配列番号６７；ＡＦ−ＰＰＩＡ）からなるＭｚ１は、ＢＬの基質１部分を切断するために利用される。パートザイム（パートザイム２Ａ、配列番号５１、ＫｒａｓＡ４／２−Ｐおよびパートザイム２Ｂ、配列番号５２、ＫｒａｓＢ５／２−Ｐ）およびアセンブリーファシリテーター標的、ＡＦ２（配列番号５３、ＡＦ−Ｋｒａｓ）からなるＭｚ２は、ＢＬの基質２部分を切断するために利用される。Ｍｚ１またはＭｚ２のいずれかについては、標的依存性切断事象は、Ｄｚ３の放出を促進する。次いで、Ｄｚ３は、この実施例では、５’末端でＦＡＭ部分を用い、３’末端でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー（「ＢＨＱ１」）部分を用いて末端標識される基質３（配列番号１１；Ｓｕｂ６）に作用し得る。
【０５９４】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、Ｄｚの一部と相補的であるＢＬ中の領域を表す。イタリック体の塩基は、ＢＬ分子内の基質配列に対応する領域を意味する。四角で囲まれた塩基は、ＤＮＡザイムおよびパートザイムの触媒コアを表す。灰色で強調されたヌクレオチドは、ＢＬ分子中の下線が引かれた塩基と相補的であり、それによってブロックされるＤｚ中の塩基を表す。／３Ｐｈｏｓ／は、３’末端リン酸化を示す。
【０５９５】
【表４２】
0006336443.tif 000043
【０５９６】
−反応成分
反応Ａ、ＢおよびＣは、これまでの節において列挙されたオリゴヌクレオチドおよび図２０パネルｉｉｉ）に例示される構造に関連して、表２１に列挙される以下のオリゴヌクレオチドを含有するよう設定した。全ての反応について、ＢＬおよびＤｚ３を共に、室温で３０分間最初にプレハイブリダイズし、その後、任意のさらなるオリゴヌクレオチド成分を添加した。
【０５９７】
【表４３】
0006336443.tif 000044
【０５９８】
オリゴは、Integrated DNA Technologies(IDT)またはBiosearch technologiesから購入した。全ての反応物は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）バッファー（Ｉｎ  ｈｏｕｓｅ）、ヌクレアーゼ不含水(Ambion)および５０ｍＭのＭｇＣｌ２(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで４４℃で２連で実施し、蛍光シグナルをチャネル１（ＦＡＭ）で測定し、合計４８分間、１０秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：ＦＡＭのみ）。
【０５９９】
−結果
図２０パネルｉｖ）は、８：１７ＭＮＡザイム（Ｍｚ１）または１０：２３ＭＮＡザイム（Ｍｚ２）のいずれかによって切断され得る共有配列を含有する、基質１および基質２を含有するＤＮＡザイム疑似環の蛍光シグナルを比較する結果を示す。これらの反応では、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識される基質３は、Ｄｚ３によって切断され得、従って、Ｄｚ３の放出および活性化は、ＦＡＭの蛍光の変化によってモニタリングされ得る。反応Ａ（四角記号を有する線として示される、「ＡＦなし」）については、基質３の極めて少ない切断しかなく、結果として、経時的にＦＡＭシグナルの最小の増大しかない。これは、Ｄｚ３が、ＢＬと複合体を形成する場合に不活性であることを示す。反応Ｂは、反応Ａと同一成分を含有するが、８：１７ＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーター、ＡＦ１が添加されている（「ＡＦ１存在」、菱形記号を有する線）。反応Ｃはまた、反応Ａと同一成分を含有するが、１０：２３ＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーター、ＡＦ２が添加されている（「ＡＦ２存在」、三角記号を含有する線）。反応ＢおよびＣの両方については、ＦＡＭシグナルの即時増大があり、これは、ＢＬが切断されており、Ｄｚ３が放出され、基質３を切断し得ることを示す。反応ＢおよびＣの各々からのシグナルの増大が、およそ同一の速度で起こっており、これは、ＢＬの増大した長さにもかかわらず、ＢＬの中間領域中の任意の点での単一切断事象が、Ｄｚが、ＢＬから放出されるのに必要な全てであることを示す。
【実施例１９】
【０６００】
以下の実施例は、実施例１において先に実証される、疑似環構造内の相補的ＢＬ分子とのハイブリダイゼーションによるＤＮＡザイムの不活性化を実証する。しかし、この本実施例１９では、自己触媒性シグナル増幅は、３種の異なる環（環Ａ、ＢおよびＣ、それぞれ、図２１パネルｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）において図表で表される）を比較することによって実証される。３種の環の各々は、別個の基質２を切断することができるＤＮＡザイム（Ｄｚ２）およびその標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１）の存在下でＭＮＡザイム（Ｍｚ１）によって切断され得る基質１を含有するＢＬを含む。さらに、環ＡのＢＬはまた、基質１に隣接しており、ひとたび、Ｍｚ１による基質１の切断によって放出されるとＤｚ２によって切断することができるさらなる基質２ａを含有する。従って、環ＡからのＤｚ２は、自己触媒的にフィードバックする可能性を有する（すなわち、それでこれまで結合していた同一ＢＬを切断する）。環ＢのＢＬは、基質１に隣接するが、Ｍｚ１またはＤｚ２のいずれかによって切断することができないさらなる基質３を含有する。環ＣからのＢＬは、単一基質、基質１のみを含有する。従って、環ＢおよびＣからのＤＮＡザイムは、自己触媒的にフィードバックする可能性を有さない。ＡＦ１が存在する場合には、環Ａを含有する反応は、環ＢおよびＣを含有する反応が行うよりも比較できるほどに速い蛍光シグナルをもたらし、これは、環ＡからのＤｚ２は、自己触媒的にフィードバックして、ＢＬ中の基質２を切断し、ひいては、より多くのＤｚ２を活性化することを示す。
【０６０１】
−オリゴヌクレオチド
本実施例では、環Ａ（ＢＬＡ；配列番号６８；Ｃ（Ｒ２２ｈ））、環Ｂ（ＢＬＢ；配列番号６９；Ｃ（Ｒ３１ｃ））および環Ｃ（ＢＬＣ；配列番号７０；Ｃ（Ｒ３１ｄ））からのＢＬ分子は、Ｄｚ２の一部（配列番号７１；Ｄｚ７７＿５５（８：９））と相補的である５’および３’末端から構成される。ＢＬＡはまた、基質１および基質２の配列（Ｓｕｂ７７＿５５、配列番号５５）に対して同等であるが、３’末端「Ｃ」ヌクレオチドを欠く基質２ａ両方の隣接する配列である、５’および３’末端を接続する中心部分からなる。ＢＬＢはまた、基質１および基質３の両方の隣接する配列と同等である５’および３’末端を接続する中心部分からなる。ＢＬＣはまた、基質１の配列と同等である５’および３’末端を接続する中心部分からなる。各環について、ＢＬは、ＢＬをＤｚ２とプレハイブリダイズすることによって、Ｄｚ２の活性をブロックするために利用される。
【０６０２】
パートザイム（パートザイムＡ、配列番号７４；ＬＴＦＲＣＡ４／７２およびパートザイムＢ、配列番号７５；ＬＴＦＲＣＢ５／７２）およびアセンブリーファシリテーター（ＡＦ１、配列番号７６；ＡＦ−ＬＴＦＲＣ）からなるＭＮＡザイム（Ｍｚ１）は、ＢＬＡ、ＢＬＢまたはＢＬＣのいずれかの基質１部分を切断するために利用される。この標的依存性切断事象は、Ｄｚ２の放出を促進し、これによって、別個の独立した分子として提供される基質２に対して作用することが可能となる。この実施例では、独立した基質２は、５’末端でＦＡＭ部分を用い、３’末端でＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋクエンチャー部分（「ＩＢ」）を用いて末端標識された。
【０６０３】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、Ｄｚの一部と相補的であるＢＬ中の領域を表す。イタリック体の塩基は、ＢＬ分子内の基質配列に対応する領域を意味する。四角で囲まれた塩基は、ＤＮＡザイムおよびパートザイムの触媒コアを表す。灰色で強調されたヌクレオチドは、ＢＬ中の下線が引かれた塩基と相補的であり、それによってブロックされるＤｚ中の塩基を表す。／３Ｐｈｏｓ／は、３’末端リン酸化を示す。
【０６０４】
【表４４】
0006336443.tif 000045
【０６０５】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは、これまでの節において列挙されたオリゴヌクレオチドおよび図２１パネルｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）に例示される構造に関連して、表２２に列挙される以下のオリゴヌクレオチドを含有するよう設定した。全ての反応について、ＢＬおよびＤｚ２を共に、室温で３０分間最初にプレハイブリダイズし、その後、任意のさらなるオリゴヌクレオチド成分を添加した。
【０６０６】
【表４５】
0006336443.tif 000046
【０６０７】
オリゴは、Integrated DNA Technologies(IDT)またはBiosearch technologiesから購入した。全ての反応物は、１×ＰＣＲバッファーＩＩ(Applied Biosystems)、ヌクレアーゼ不含水(Ambion)および４５ｍＭのＭｇＣｌ２(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで５４℃で２連で実施し、蛍光シグナルを、チャネル１（ＦＡＭ）で測定し、合計１５４分間、３０秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：ＦＡＭのみ）。
【０６０８】
−結果
図２１パネルｉｖ）は、環Ａ、ＢおよびＣの各々からの蛍光シグナルを比較する結果を示す。ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識される基質２は、Ｄｚ２によって切断され得、従って、Ｄｚ２の放出および活性化は、ＦＡＭの蛍光の変化によってモニタリングされ得る。反応Ａ、（四角記号を有する線として示される、「環Ａ、ＡＦ１なし」）、反応Ｃ（三角記号を有する線として示される、「環Ｂ、ＡＦ１なし」）および反応Ｅ（「環Ｃ、ＡＦ１なし」、２本の斜めの交差線および１本の垂直な交差線からなる記号を有する線）については、基質２の極めて少ない切断しかなく、結果として、経時的にＦＡＭシグナルの極めて少ない増大しかない。これは、Ｄｚ２が、それぞれ、反応Ａ、ＣおよびＥの、ＢＬＡ、ＢＬＢおよびＢＬＣとのそのハイブリダイゼーションによって、かなり不活性で維持されることを示す。
【０６０９】
反応Ｂ（菱形記号を含有する線として示される、「環Ａ、ＡＦ１存在」）について、ＦＡＭシグナルの最初の遅滞期と、それに続く、迅速にプラトーに到達する即時増大がある。このシグモイド曲線は、ＦＡＭシグナルが指数関数的に累積していることを示し、これは、環ＡからのＤｚ２が、基質１のＭｚ１切断によってその自身のＢＬＡから最初に放出された後、フィードバックし、さらなるＢＬＡ分子中に存在する基質２ａを切断していることを示す。対照的に、反応Ｄ（「環Ｂ、ＡＦ１存在」、丸記号を含有する線）および反応Ｆ（「環Ｃ、ＡＦ１存在」、２本の斜めの交差線からなる記号を含有する線）は、ＦＡＭシグナルの比較できるほどに遅い増大をもたらし、これは、それぞれ、反応ＤおよびＦについては、基質２ａがＢＬＢおよびＢＬＣ内に存在しないので、フィードバックが起こっていないことを示す。
【実施例２０】
【０６１０】
以下の実施例は、実施例１９において先に実証された、自己触媒的疑似環構造内の相補的ＢＬ分子とのハイブリダイゼーションによるＤＮＡザイムの最初の不活性化を実証する。この本実施例２０では、２種のＭＮＡザイム標的検出反応；自己触媒的環が存在する第１のもの（図２２パネルｉｉ））および環不在である第２のもの（すなわち、ＭＮＡザイムのみ、図２２パネルｉ））を比較することによってシグナル増幅が実証される。両反応において、同一ＭＮＡザイム（Ｍｚ１）は、同一標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１）を認識し、結合するよう、またフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて改変されている線形配列として提供される基質１または環のＢＬ分子の中間領域内に存在する基質１ａのいずれかを切断するよう設計されている。ＢＬ分子は、その５’および３’末端で、ＤＮＡザイム（Ｄｚ２）とハイブリダイズして、Ｄｚ２の一時的な不活性化をもたらす配列からなる。ＢＬはまた、ひとたび、Ｄｚ２が基質１のＭＮＡザイム切断によってＢＬから放出されると、それによって切断することができる、基質１ａに隣接する第２の基質配列（基質２ａ）を含有する。さらに、基質２は、ＤＮＡザイム切断反応をモニタリングするためにフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて改変されている線形配列として提供される。ＡＦ１が存在する場合には、自己触媒的環を含有する反応は、ＭＮＡザイム単独を含有する反応が行うよりも、比較できるほどに速い蛍光シグナルをもたらし、さらに、ＭＮＡザイム単独からのシグナルによって可視化され得ない標的濃度の検出をもたらし得る。
【０６１１】
−オリゴヌクレオチド
本実施例では、（ｉ）Ｄｚ２の一部（配列番号７１；Ｄｚ７７＿５５（８：９））と相補的である５’および３’末端と、（ｉｉ）基質１（Ｓｕｂ７２、配列番号７２）と同等である基質１ａおよび基質２（Ｓｕｂ７７＿５５、配列番号５５）の配列と同等であるが、３’末端「Ｃ」ヌクレオチドを欠く基質２ａの隣接する配列である５’および３’末端を接続する中心部分とから構成されるＢＬ（配列番号６８；Ｃ（Ｒ２２ｈ））。ＢＬは、ＢＬをＤｚ２とプレハイブリダイズすることによって、Ｄｚ２の活性をブロックするために利用される。
【０６１２】
パートザイム（パートザイムＡ、配列番号７４；ＬＴＦＲＣＡ４／７２およびパートザイムＢ、配列番号７５；ＬＴＦＲＣＢ５／７２）およびアセンブリーファシリテーター標的（ＡＦ１、配列番号７６；ＡＦ−ＬＴＦＲＣ）からなるＭＮＡザイム（Ｍｚ１）は、ＢＬの基質１ａ部分を切断するために利用される。この標的依存性切断事象は、Ｄｚ２の放出を促進し、これによって、それがＢＬ内に存在する基質２ａに対して作用することが可能となる。ＭＮＡザイムはまた、疑似環の成分ではない別個の独立した基質１に作用し得る。この実施例では、この独立した基質１は、５’末端でＦＡＭ部分を用い、３’末端でＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋクエンチャー部分（「ＩＢ」）を用いて末端標識された。Ｄｚ２はまた、疑似環の成分ではない、別個の独立した基質２に作用し得る。この実施例では、この独立した基質２は、５’末端でＦＡＭ部分を用い、３’末端でＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋクエンチャー部分（「ＩＢ」）を用いて末端標識された。
【０６１３】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、Ｄｚの一部と相補的であるＢＬ中の領域を表す。イタリック体の塩基は、ＢＬ分子内の基質配列に対応する領域を意味する。四角で囲まれた塩基は、ＤＮＡザイムおよびパートザイムの触媒コアを表す。灰色で強調されたヌクレオチドは、ＢＬ中の下線が引かれた塩基と相補的であり、それによってブロックされるＤｚ中の塩基を表す。
【０６１４】
【表４６】
0006336443.tif 000047
【０６１５】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは、これまでの節において列挙されたオリゴヌクレオチドおよび図２２パネルｉ）およびｉｉ）に例示される構造に関連して、表２３に列挙される以下のオリゴヌクレオチドを含有するよう設定した。ＢＬおよびＤｚ２を含有する全ての反応について、これらの２種のオリゴを共に、室温で３０分間最初にプレハイブリダイズし、その後、任意のさらなるオリゴヌクレオチド成分を添加した。
【０６１６】
【表４７】
0006336443.tif 000048
【０６１７】
オリゴは、Integrated DNA Technologies(IDT)またはBiosearch technologiesから購入した。全ての反応物は、１×ＰＣＲバッファーＩＩ(Applied Biosystems)、ヌクレアーゼ不含水(Ambion)および４５ｍＭのＭｇＣｌ２(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで５２℃で２連で実施し、蛍光シグナルは、チャネル１（ＦＡＭ）で測定し、合計１５４分間、３０秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：ＦＡＭのみ）。
【０６１８】
−結果
図２２パネルｉｉｉ）は、ＭＮＡザイムのみ対ＭＮＡザイムおよび自己触媒性環が存在する蛍光シグナルを比較する結果を示す。ＭＮＡザイムのみの反応では、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識される基質１は、Ｍｚ１によって切断され得、これは、ＦＡＭの蛍光の変化によってモニタリングされ得る。自己触媒的環とともにＭｚ１を含有する反応については、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識される基質２は、Ｄｚ２によって切断され得、従って、Ｄｚの放出および活性化は、ＦＡＭの蛍光の変化によってモニタリングされ得る。
【０６１９】
反応Ａ（四角記号を有する線として示される、「Ｍｚ１のみ、ＡＦ１」）では、基質１の切断は全くなく、結果として、経時的にＦＡＭシグナルの増大は全くない。これは、ＭＮＡザイムが、標的アセンブリーファシリテーターの不在下では活性でないからである。反応Ｂは、反応Ａと同一成分を含有するが、１００ｐＭのＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーターが添加されており（「Ｍｚ１のみ、１００ｐＭ  ＡＦ１存在」菱形記号を有する線）、経時的にＦＡＭシグナルの遅い直線的増大をもたらし、これは、反応時間の間にプラトーに到達しない。反応Ｃは、反応Ａと同一成分を含有するが、１０ｐＭのＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーターが添加されており（「Ｍｚ１のみ、１０ｐＭ  ＡＦ１存在」、三角記号を含有する線）、反応時間の経過にわたって、ＦＡＭシグナルの増大はあったとしても極めて少なく、これは、極めて少ない基質１しか切断されないことを示す。
【０６２０】
反応Ｄ（丸記号を有する線として示される、「Ｍｚ１および環、ＡＦ１なし」）では、経時的にＦＡＭシグナルの段階的であるが、わずかしかない増大があり、これは、反応の最後の３０分以内に増大し始める。バックグラウンド蛍光レベルは、ＭＮＡザイムのみの反応のものよりも高く、これは、基質２の、環成分との幾分かのハイブリダイゼーションがあり得ることおよび／または基質２は、基質１よりもあまり効率的にクエンチされないことを示す。反応の最後に向けたシグナルの増大は、カスケードが、ＭＮＡザイムトリガーの不在下で機能し始めていることを示し得る。反応Ｅは、反応Ｄと同一成分を含有するが、１００ｐＭのＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーターが添加されており（「Ｍｚ１および環、１００ｐＭ  ＡＦ１存在」、２本の斜めの交差線および１本の垂直な交差線からなる記号を有する線）、ＦＡＭシグナルの迅速な指数関数的増大をもたらし、これは、およそ３０分後にプラトーに到達する。同一ＭＮＡザイムファシリテーター濃度を含有するが環を含まない反応Ｂとの比較では、ＦＡＭシグナルのこの増大は、相当に速く、これは、環の存在が、１００ｐＭの標的アセンブリーファシリテーターのシグナルの増幅および結果的に、より速い検出をもたらすことを示す。反応Ｆは、反応Ｄと同一成分を含有するが、１０ｐＭのＭＮＡザイムアセンブリーファシリテーターが添加されており（「ＭＮＡザイムおよび環、１０ｐＭ  ＡＦ１存在」、２本の斜めの交差線からなる記号を含有する線）、最初の遅滞期と、それに続く、ＦＡＭシグナルの迅速な、指数関数的増大があり、これは、およそ１２０分後にプラトーに到達する。同一ＭＮＡザイムファシリテーター濃度を含有するが、環を含まない反応Ｃとの比較では、ＦＡＭシグナルの増大は、相当に速いだけではなく、標的ではない反応（反応Ｄ）の前に検出可能である。この場合には、環の存在は、シグナルの増幅をもたらし、その結果、バックグラウンドシグナルに先立つ１０ｐＭの標的アセンブリーファシリテーターの検出が可能であり、これは、環が、ＭＮＡザイム標的検出の速度および感度の両方を増大することを示す。
【実施例２１】
【０６２１】
以下の実施例は、相補的ＢＬ分子とのハイブリダイゼーション、それによって、ＤＮＡザイムおよびＢＬが、非相補的ヘアピンループ（ヘアピン型Ｄｚ２）によって連結されることによるＤＮＡザイムの不活性化を実証する。この実施例では、ＢＬはまた、その標的アセンブリーファシリテーター分子（ＡＦ１）の存在下でＭＮＡザイム（Ｍｚ１）によって認識および切断され得るさらなる基質配列（基質１）を含有する。Ｍｚ１による基質１の切断は、これまでに不活性のヘアピン型Ｄｚ２の放出およびその後の再活性化をもたらす（図３パネルｉ）において図表に表わされる）。
【０６２２】
−オリゴヌクレオチド
本実施例では、基質２（配列番号５；Ｓｕｂ２）を切断することができるヘアピン型Ｄｚ２（配列番号７７；ｈｐＢＬ（Ｒ３ａ）−Ｄｚ２＿Ｓｕｂ６）を利用した。この実施例では、基質２は、５’末端でＦＡＭ部分を用い、３’末端でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー１（「ＢＨＱ１」）部分を用いて標識される。パートザイムＡ（配列番号５８；ＫｒａｓＡ４／６−Ｐ）、パートザイムＢ（配列番号５９；ＫｒａｓＢ５／６−Ｐ）およびＡＦ１（配列番号５３；ＡＦ−Ｋｒａｓ）からなるＭｚ１を使用して、ヘアピン型Ｄｚ２分子内の基質１を切断し、ひいては、活性Ｄｚ２をもたらした。活性Ｄｚ２の触媒活性を、対応する非ヘアピン型対照Ｄｚ２（配列番号２６；Ｄｚ２（９：８））のものと比較した。
【０６２３】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、Ｄｚ２の一部と相補的であるＢＬ中の領域を表す。イタリック体の塩基は、ＢＬ分子内の基質配列に対応する領域を意味する。四角で囲まれた塩基は、ＤＮＡザイムおよびパートザイムの触媒コアを表す。灰色で強調されたヌクレオチドは、ＢＬ分子中の下線が引かれた塩基と相補的であり、それによってブロックされるＤｚ２中の塩基を表す。／３Ｐｈｏｓ／は、３’末端リン酸化を示す。
【０６２４】
【表４８】
0006336443.tif 000049
【０６２５】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、これまでの節において列挙されたオリゴヌクレオチドおよび図３パネルｉ）に例示される構造に関連して、表２４に列挙される以下のオリゴヌクレオチドを含有するよう設定した。
【０６２６】
【表４９】
0006336443.tif 000050
【０６２７】
オリゴは、Integrated DNA Technologies(IDT)またはBiosearch technologiesから購入した。全ての反応物は、１×ＰＣＲバッファーＩＩ(Applied Biosystems)、ヌクレアーゼ不含水(Ambion)および４５ｍＭのＭｇＣｌ２(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで５２℃で２連で実施し、蛍光シグナルは、チャネル１（ＦＡＭ）で測定し、合計１２６分間、３０秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：ＦＡＭのみ）。
【０６２８】
−結果
図３パネルｉｉ）は、Ｍｚ１によるヘアピン型Ｄｚ２の活性化の蛍光シグナルの結果を示す。これらの反応では、基質２は、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャー色素を用いて標識され、活性Ｄｚ２によって切断され得る。ヘアピン型Ｄｚ２の放出および活性化は、ＦＡＭの蛍光の変化によってモニタリングされ得る。反応Ｃ（三角記号を有する線として示される、「ヘアピン型Ｄｚ２のみ」）および反応Ｄ（丸記号を有する線として示される、「ヘアピン型Ｄｚ２＋Ｍｚ１、ＡＦ１なし」）については、ＦＡＭシグナルの増大はほとんどないし全くなく、これは、ヘアピン型Ｄｚ２が、基質２を切断できないことを示す。このシグナルは、同一蛍光標識された基質配列のみを含有する反応Ａ（四角記号を含有する線として示される「陰性対照」）との比較において示される。
【０６２９】
反応Ｅ（２本の斜めの交差線および１本の垂直な交差線からなる記号を有する線として示される、「ヘアピン型Ｄｚ２＋Ｍｚ１、ＡＦ１存在」）については、経時的にＦＡＭシグナルの段階的増大があり、反応時間の最後に向けてプラトーに到達する。これは、ＡＦ１の添加が、活性Ｍｚ１をもたらし、これが、次いで、ヘアピン型Ｄｚ２の部分として存在する基質１を切断できること示す。次いで、Ｄｚ２成分は、活性になり、基質２を切断でき、蛍光シグナルの増大をもたらす。反応Ｅのシグナルは、反応Ｅと同一濃度の対応する非ヘアピン型Ｄｚ２からなる反応Ｂ（「陽性対照」、菱形記号を含有する線）のものとの比較において示され、シグナルの迅速な増大をもたらし、反応の３０分以内にプラトーに到達する。反応Ｅのシグナルは、Ｍｚ１が基質１を切断するのに必要な時間、Ｄｚ２のその後の活性化および基質２のその切断のために反応Ｂよりも遅い。
【実施例２２】
【０６３０】
以下の実施例は、固体表面への自己触媒的ＤＮＡザイム疑似環（実施例１９において先に実証される）の接着を実証する。ここで、疑似環のＢＬを、ＤＮＡザイム（Ｄｚ２）とともにビオチン部分を用いて３’末端で改変し、ストレプトアビジンコートされているシリカマイクロスフェアとともにインキュベートする。従って、ＢＬおよびマイクロスフェアは、ビオチン−ストレプトアビジン結合によって互いに接着し、Ｄｚ２は、ワトソン−クリック塩基対形成によってＢＬとハイブリダイズする（図２４パネルｉ））。インキュベーションプロセス後、マイクロスフェアをバッファーを用いて数回洗浄して、結合していないオリゴヌクレオチドをいずれも除去する。マイクロスフェアの集団は、繋ぎ止められた自己触媒的疑似環を含有したままであり、マイクロスフェアが、ＢＬ中に存在する基質１を切断できるＭＮＡザイム（Ｍｚ１）を有する溶液中に入れられると、その標的分子（ＡＦ１）による集合後にカスケードが開始され得る。
【０６３１】
−オリゴヌクレオチド
本実施例では、ＢＬ分子（配列番号７８；Ｃ（Ｒ２２ｈ）−Ｂｉｏ）は、Ｄｚ２の一部（配列番号７１；Ｄｚ７７＿５５（８：９））と相補的である５’および３’領域から構成される。極めて３’末端でＤｚ２−結合領域と隣接して、ＢＬは、Ｄｚ２と相補的ではない５ヌクレオチドのポリＡテールを含有し、これは、３’末端に結合されたビオチン部分を含有する。５’および３’末端を接続するＢＬの中心部分は、基質１および基質２（Ｓｕｂ７７＿５５、配列番号５５）の配列と同等であるが、３’末端「Ｃ」ヌクレオチドを欠く基質２ａの両方の隣接する配列から構成される。ＢＬは、ＢＬをＤｚ２とプレハイブリダイズすることによって、Ｄｚ２の活性をブロックするために利用される。パートザイム（パートザイムＡ、配列番号７４；ＬＴＦＲＣＡ４／７２およびパートザイムＢ、配列番号７５；ＬＴＦＲＣＢ５／７２）およびアセンブリーファシリテーター（ＡＦ１、配列番号７６；ＡＦ−ＬＴＦＲＣ）からなるＭＮＡザイム（Ｍｚ１）は、ＢＬの基質１部分を切断するために利用される。この標的依存性切断事象は、Ｄｚ２の放出を促進し、これによって、ＢＬ内に存在する基質２ａまたは別個の独立した分子として提供される基質２に作用することが可能となる。この実施例では、独立した基質２は、５’末端でＦＡＭ部分を用い、３’末端でＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋクエンチャー（「ＩＢ」）部分を用いて末端標識された。
【０６３２】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、Ｄｚの部分と相補的であるＢＬ中の領域を表す。イタリック体の塩基は、ＢＬ分子内の基質配列に対応する領域を意味する。四角で囲まれた塩基は、ＤＮＡザイムおよびパートザイムの触媒コアを表す。灰色で強調されたヌクレオチドは、ＢＬ中の下線が引かれた塩基と相補的であり、それによってブロックされるＤｚ中の塩基を表す。／３Ｂｉｏ／は、３’末端ビオチン化を示す。
【０６３３】
【表５０】
0006336443.tif 000051
【０６３４】
−反応成分
３μｍシリカ、ストレプトアビジンコートマイクロスフェア（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、貯蔵バッファー（１００ｍＭホウ酸塩、ｐＨ８．５＋０．０１％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ＋≦０．１％  ＮａＮ３）中の１％（ｗ／ｖ）固体として提供された。２μＬ／反応のマイクロスフェア懸濁液を回収し、使用に先立って、１×ＰＢＳＴバッファー（１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．３〜７．５、１３７ｍＭ塩化ナトリウムおよび２．７ｍＭ塩化カリウム（Ａｍｒｅｓｃｏ）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｐｒｏｍｅｇａ））で３回洗浄した。手短には、これは、１００μＬの１×ＰＢＳＴバッファー中のマイクロスフェアの懸濁液を含み、続いて、１３０００×ｇで３０秒間遠心分離して、マイクロスフェアペレットを形成する。次いで、上清を除去し、マイクロスフェアペレットを新鮮な１×ＰＢＳＴバッファーに再懸濁する。このプロセスを、さらに２回反復し、続いて、元の２μＬ／反応容量の新鮮な１×ＰＢＳＴバッファーに再懸濁した。次いで、洗浄されたマイクロスフェアを、１００ｎＭのＢＬ（Ｃ（Ｒ２２ｈ）−Ｂｉｏ）および７５ｎＭのＤｚ２（Ｄｚ７７＿５５（８：９））とともにインキュベートした。インキュベーション混合物を共に、室温で３０分間プレハイブリダイズし、続いて、１×ＰＢＳＴバッファーでさらに３回洗浄した。
【０６３５】
マイクロスフェアインキュベーション混合物を、これまでの節において列挙されたオリゴヌクレオチドおよび図２４パネルｉ）に例示される構造に関連して、表２５に列挙される以下のオリゴヌクレオチドに添加した。
【０６３６】
【表５１】
0006336443.tif 000052
【０６３７】
オリゴは、Integrated DNA Technologies(IDT)またはBiosearch technologiesから購入した。全ての反応物は、１×ＰＣＲバッファーＩＩ(Applied Biosystems)、ヌクレアーゼ不含水(Ambion)および４５ｍＭのＭｇＣｌ２(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで５４℃で２連で実施し、蛍光シグナルは、チャネル１（ＦＡＭ）で測定し、合計１４８分間、３０秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：ＦＡＭのみ）。
【０６３８】
結果
図２４パネルｉｉ）は、反応ＡおよびＢからの蛍光シグナルを実証する。ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識される基質２は、Ｄｚ２によって切断され得、従って、Ｄｚ２の放出および活性化は、ＦＡＭの蛍光の変化によってモニタリングされ得る。反応Ａ、（四角記号を有する線として示される、「ＡＦ１なし」）については、極めて少ない基質２の切断しかなく、結果として、経時的にＦＡＭシグナルのわずかな増大しかない。これは、Ｄｚ２が、ＢＬとのそのハイブリダイゼーションによって、かなり不活性で維持されることを示す。反応Ｂ（菱形記号を含有する線として示される、「ＡＦ１存在」）については、最初の遅滞期と、それに続く、経時的にＦＡＭシグナルの段階的増大があり、これは、Ｍｚ１が基質１を切断していることを示し、これは、環のＢＬ内の基質２ａまたは代わりに別個の蛍光標識された基質２を切断するよう機能する場合には、環からのＤｚ２の放出をもたらす。反応Ｂからの蛍光シグナルの増大はまた、両反応物へのその添加に先立って厳密に洗浄されたマイクロスフェア集団が、マイクロスフェアに繋ぎ止められた疑似環を含有することおよびこれらの疑似環が、溶液中で遊離のものと同様に機能し得ることを示す。
【実施例２３】
【０６３９】
実施例２３は、図１３パネルｉｉｉ）において元々表されたように、異なるプライマー（プライマー２）によって開始されるプライマー（プライマー１）の合成を指示する鋳型分子の使用を実証する。しかし、この実施例では、プライマー鋳型は、一方の鎖が、ＲＥ認識部位に隣接する新規プライマー１の合成のための鋳型を含有するのに対し、もう一方が、鋳型と部分的に相補的であるヘアピン構造（図２５パネルｉ））から構成される。この部分的に相補的な鎖は、それが活性プライマー１のように実施することを防ぐために３’末端にミスマッチした塩基対を含有し、また、それと部分的にブロックされたヘアピン型Ｄｚ１鋳型のループ内に存在するプライマー１結合部位の間の可能性あるハイブリダイゼーションを破壊するために、配列の中心内に別のミスマッチを有する。このミスマッチした塩基対は、より熱力学的に安定なヘアピン構造内に存在する場合には、ヘアピン型プライマー鋳型中のプライマー１結合部位とのそのハイブリダイゼーションには影響を及ぼさない。従って、この部分的に相補的な鎖の唯一の目的は、使用していないそれらのプライマー鋳型が、閉じたヘアピン立体構造（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）で維持されるので、新規に合成されたプライマー１が、その他のプライマー鋳型と再ハイブリダイズすることを防ぐのに役立つことである。ヘアピン型プライマー鋳型構造のループ鎖は、プライマー２と相補的であり、その結果、プライマー２がこのループと結合する場合には、それは鎖置換型ポリメラーゼによって伸長され得、ヘアピンの同時開環ならびに完全ＲＥ認識部位および隣接するプライマー１両方の合成をもたらす。ニッキング酵素が存在する場合には、完成されたＲＥ認識部位を認識し、上流プライマー２と下流プライマー１配列の間の領域で、新規に合成された鎖に選択的にニックを入れることができる。従って、ニッキングは、新規プライマー２を生成し、これは、ポリメラーゼによって伸長されて、別のプライマー１コピーを合成し、また鋳型鎖から既存のコピーを置換する。次いで、ニッキング、重合および置換のこのサイクルは、自律的に起こり、いくつかの活性プライマー１分子を生成し得る。
【０６４０】
実施例１５において最初に記載されるように、１つの基質−結合アームおよび触媒コア配列のおよそ半分を含有する部分ＤＮＡザイムであるＢＬ部分からなる「部分的にブロックされた」ヘアピン型ＤＮＡザイム鋳型もまた存在する。この部分触媒コアはまた、不活性化する突然変異塩基も含有する。ポリメラーゼ酵素の存在下で、ＢＬの３’末端は、ヘアピン分子の３’末端で不活性ＤＮＡザイムの配列をコピーし、ひいては、完成するための鋳型としてＤｚ鋳型を使用して、この配列を伸長できる。しかし、コア領域中の突然変異のために、突然変異体ＤＮＡザイムは、ヘアピンが開環される場合でさえ不活性である。プライマー１は、ひとたび合成され、鋳型から置換されると、実施例９に最初に記載されるように、「部分的にブロックされた」ヘアピン型ＤＮＡザイム鋳型構造のループとハイブリダイズし、鎖置換型ポリメラーゼによってその３’末端で伸長され得る。プライマー１伸長は、コピーするための鋳型としての部分的にブロックされたヘアピン型ＤＮＡザイム鋳型の使用によって、ＤＮＡザイムの新規の完全コピーの合成をもたらす。プライマー１の伸長はまた、二本鎖ニッキング酵素認識部位の完成をもたらす。ニッキング酵素は、この部位を認識し、上流プライマー１と下流のＤＮＡザイム配列の間の領域で、新規に合成された鎖に選択的にニックを入れることができる。従って、ニッキングは、新規プライマー１を生成し、これは、ポリメラーゼによって伸長されて、別のＤＮＡザイムコピーを合成し、またＤｚ鋳型から既存のコピーを置換する。次いで、ニッキング、重合および置換のこのサイクルは、自律的に起こり、その自身の基質を切断することができる、いくつかの活性ＤＮＡザイム分子を生成し得る（図２５パネルｉ）に表わされる）。
【０６４１】
−オリゴヌクレオチド
ヘアピン型プライマー鋳型（配列番号７９；ｈｐＰＲＦ（Ｒ１２ｂ））を使用して、プライマー２（配列番号８０；ＰＲ（Ｒ１２ｂ）ＰＲＦ）の伸長によるプライマー１（配列番号４９；ＰＲ（Ｒ８ｂ）Ｄｚ４５（１４））の合成のための鋳型を提供した。「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ１鋳型（配列番号４７；ｈｐ（Ｒ１１ｂ）ＡＤｚ４５）を使用して、基質１（Ｓｕｂ４５、配列番号３）を切断することができるＤｚ１が合成されるための鋳型を提供した。この実施例では、Ｓｕｂ４５は、５’末端で６−フルオレセイン（「６−ＦＡＭ」）部分を用い、３’末端でＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋクエンチャー（「ＩＢ」）部分を用いて標識された。ヘアピン型Ｄｚ１鋳型から合成されたＤｚ１の触媒活性をまた、対応する非ヘアピン型陽性対照Ｄｚ１、（配列番号４５；Ｄｚ４５（９：９））のものと比較した。
【０６４２】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。イタリック体の塩基は、「部分的ヘアピン型」ＤＮＡザイム鋳型構造内のＤＮＡザイム配列およびヘアピン型プライマー鋳型内のプライマー１配列を意味する。下線が引かれた塩基は、プライマー１配列とヘアピン型ＤＮＡザイム鋳型の間の相補性の領域を表す。強調された塩基は、部分ニッキング酵素認識部位を表す。四角で囲まれた塩基は、ＤＮＡザイムの触媒コアに対応する塩基を表す。
【０６４３】
【表５２】
0006336443.tif 000053
【０６４４】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨは、これまでの節におけるオリゴヌクレオチドおよび図２５パネルｉ）に例示される構造に関連して、表２６に列挙される以下のオリゴヌクレオチド断片、ポリメラーゼおよびニッキング酵素を含有するよう設定した。
【０６４５】
【表５３】
0006336443.tif 000054
【０６４６】
オリゴは、ＩＤＴまたはBiosearch technologiesから購入した。ポリメラーゼ酵素、Ｂｓｔ  ２．０ウォームスタート（３’→５’エキソ−）およびニッキング酵素、Ｎｔ．ＡｌｗＩは、New England Biolabsから購入した。全ての反応物は、１×ＮＥＢバッファー２（New England Biolabs）およびヌクレアーゼ不含水(Ambion)を含有していた。反応Ｃ〜Ｆはまた、２００μＭ  ｄＮＴＰ(Bioline)も含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで５２℃で２連で実施した。蛍光シグナルをチャネル１（ＦＡＭ）で測定し、合計１４８分間、３０秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：ＦＡＭのみ）。
【０６４７】
−結果
図２５パネルｉｉ）は、図２５パネルｉ）に表わされる戦略から達成された蛍光シグナルを実証する。「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型から、その合成後にＤｚ１によって切断され得る基質１は、ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャー色素を用いて標識されている。グラフ（ＦＡＭ）は、このＦＡＭフルオロフォアからの蛍光シグナルの概要を示す。「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型がそれ自体で存在する反応Ｃ（反応Ｃ、三角記号を有する線として示される、「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型のみ−ＰＲなし」）およびプライマー２とともに配置される反応Ｅ（反応Ｅ、１本の垂直な交差線および２本の斜めの交差線からなる記号を有する線として示される、「「部分的にブロックされたヘアピン型Ｄｚ鋳型のみ−ＰＲ２存在」）については、Ｄｚ１の合成を開始するためのプライマー１が全く存在せず、従って、基質１の切断が全くないので、蛍光シグナルの増大はほとんどないし全くない。「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型が、ヘアピン型プライマー鋳型とともに提供される場合（反応Ｆ、２本の斜めの交差線からなる記号を有する線として示される、「「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型＋ヘアピン型プライマー鋳型−ＰＲなし」）には、プライマー１が存在せず、合成され得ないので、同様に蛍光シグナルの増大はほとんどないし全くない。反応Ｃ、ＥおよびＦは、同一蛍光標識された基質１のみを含有する、陰性対照（「陰性対照」、四角記号を含有する線）を含有する反応Ａとの比較において示される。
【０６４８】
反応Ｄ（「「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型のみ−ＰＲ１存在」、丸記号を含有する線）およびＧ（「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型＋ｈｐプライマー鋳型−ＰＲ１存在」、１本の垂直交差線および水平交差線からなる記号を含有する線）は両方とも、「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型およびプライマー１を含有し、反応Ｇはまた、ヘアピン型プライマー鋳型も含む。これらの反応では、プライマー１の存在のために、シグナルの迅速な増大があり、およそ２０分以内にプラトーに迅速に到達し、これは、プライマー１がＤｚ１の合成を開始しており、これが、順に、基質１を切断することを示す。蛍光シグナルは、２つの反応間で極めて類似しており、これは、反応Ｇ中のヘアピン型プライマー鋳型の存在は、これを阻止しないということを示す。「部分的にブロックされた」ヘアピン型ＤＮＡザイム鋳型、ヘアピン型プライマー鋳型およびプライマー２を含む反応Ｈ（「「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型＋ｈｐプライマー鋳型−ＰＲ２存在」、中黒四角記号を含有する線）については、最初の遅滞期と、それに続く、シグナルの段階的増大があり、これはおよそ７０分でプラトーに到達する。プライマー２は、Ｄｚ１の合成を直接的にプライムできないので、これは、プライマー２がヘアピン型プライマー鋳型と結合しており、プライマー１の合成を開始していることを示す。従って、プライマー１は、「部分的にブロックされた」ヘアピン型Ｄｚ鋳型によってＤｚ１の合成をプライムでき、基質１を切断するＤｚ１分子の製造をもたらす。反応Ｈからのシグナルは、プライマー１が、順に、Ｄｚ１を合成できる前に合成されるために必要な時間のために、反応ＤおよびＧのものより遅い。反応Ｄ、ＧおよびＨからのシグナルは、同一濃度の基質１および遊離陽性対照Ｄｚ１からなる陽性対照（「陽性対照」、菱形記号を含有する線）を含有する反応Ｂとの比較において示される。
【実施例２４】
【０６４９】
以下の実施例は、実施例１９に先に実証された、自己触媒的疑似環構造内の相補的ＢＬ分子とのハイブリダイゼーションによる、ＤＮＡザイムの不活性化を実証する。この本実施例２４（図２６パネルｉ）において表される）では、２つの独立した自己触媒的疑似環が、同一反応試験管中に共に入れられるマルチプレックス検出反応が実証される。各カスケード反応は、各々、その特有の標的配列によって媒介される集合後に機能し得る、異なるＭＮＡザイムによるＢＬ内に存在する基質の切断によって開始される。環Ａは、ＤＮＡザイム（Ｄｚ２）およびＢＬＡから構成される。ＢＬＡは、Ｄｚ２の一部とハイブリダイズするその５’および３’末端の配列からなり、Ｄｚ２の一時的な不活性化をもたらす。ＢＬＡはまた、基質１および基質２ａに隣接する配列からなる中間領域も含有する。基質１は、その標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ１）の存在下でＭｚ１によって切断され得る。基質２ａは、ひとたび、Ｄｚ２が、基質１のＭｚ１切断によってＢＬＡから放出されると、それによって切断することができる。
【０６５０】
環Ｂは、ＤＮＡザイム（Ｄｚ４）およびＢＬＢからなる。ＢＬＢは、Ｄｚ４の一部とハイブリダイズするその５’および３’末端の配列からなり、Ｄｚ４の一時的な不活性化をもたらす。ＢＬＢはまた、基質３および基質４ａの隣接する配列からなる中間領域も含有する。基質３は、その標的アセンブリーファシリテーター（ＡＦ３）の存在下でＭｚ３によって切断され得る。基質４ａは、ひとたび、Ｄｚ４が、基質３のＭｚ３切断によってＢＬＢから放出されると、それによって切断することができる。各カスケード反応を独立にモニタリングするために、線形配列として、それぞれ、Ｄｚ２およびＤｚ４による切断を個々にモニタリングするために、異なるフルオロフォアおよびクエンチャー対を用いて標識された基質２および基質４も提供される。
【０６５１】
−オリゴヌクレオチド
本実施例では、ＢＬＡ（配列番号６８；Ｃ（Ｒ２２ｈ））は、（ｉ）Ｄｚ２の一部（配列番号７１；Ｄｚ７７＿５５（８：９））と相補的である５’および３’末端と、（ｉｉ）２種の隣接する基質配列、基質１および基質２（Ｓｕｂ７７＿５５、配列番号５５）と同等であるが、３’末端「Ｃ」ヌクレオチドを欠く基質２ａである、５’および３’末端を接続する中心部分から構成される。ＢＬＡは、ＢＬＡをＤｚ２とプレハイブリダイズすることによって、Ｄｚ２の活性をブロックするために利用される。パートザイム（パートザイム１Ａ、配列番号７４；ＬＴＦＲＣＡ４／７２およびパートザイム１Ｂ、配列番号７５；ＬＴＦＲＣＢ５／７２）およびアセンブリーファシリテーター標的（ＡＦ１、配列番号７６；ＡＦ−ＬＴＦＲＣ）からなるＭＮＡザイム（Ｍｚ１）が、ＢＬＡの基質１部分を切断するために利用される。この標的依存性切断事象は、Ｄｚ２の放出を促進し、これによって、それがＢＬＡ内に存在する基質２ａに対して作用することが可能となる。
【０６５２】
ＢＬＢ（配列番号８１；Ｃ（Ｒ２７ａ））は、（ｉ）Ｄｚ４の一部（配列番号８２；Ｄｚ３（８：９））と相補的である５’および３’末端と、（ｉｉ）基質３および基質４（Ｓｕｂ３、配列番号８３）の配列と同等である基質４ａの隣接する配列である、５’および３’末端を接続する中心部分から構成される。ＢＬＢは、ＢＬＢをＤｚ４とプレハイブリダイズすることによって、Ｄｚ４の活性をブロックするために利用される。パートザイム（パートザイム３Ａ、配列番号８４；ＲＯ５Ａ４／５６−Ｐ）およびパートザイム３Ｂ、配列番号８５；ＲＯ５Ｂ５／５６−Ｐ）およびアセンブリーファシリテーター標的（ＡＦ３、配列番号６２；ＡＦ−ＲＯ５）からなるＭＮＡザイム（Ｍｚ３）が、ＢＬＢの基質３部分を切断するために利用される。この標的依存性切断事象は、Ｄｚ４の放出を促進し、これによって、それがＢＬＢ内に存在する基質４ａに対して作用することが可能となる。
【０６５３】
Ｄｚ２およびＤｚ４は両方とも、疑似環の成分ではない、それぞれ、基質２および基質４の別個の独立した型に作用できる。この実施例では、独立した基質２は、５’末端でＦＡＭ部分を用い、３’末端でＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋクエンチャー部分（「ＩＢ」）を用いて末端標識された。独立した基質４は、５’末端でテキサスレッド（ＴＲ）部分を用い、３’末端でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー２（「ＢＨＱ２」）部分を用いて末端標識された。
【０６５４】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、Ｄｚの一部と相補的であるＢＬ中の領域を表す。イタリック体の塩基は、ＢＬ分子内の基質配列に対応する領域を意味する。四角で囲まれた塩基は、ＤＮＡザイムおよびパートザイムの触媒コアを表す。強調された塩基は、ＢＬ中の下線が引かれた塩基と相補的であり、それによってブロックされるＤｚ中の塩基を表す。／３Ｐｈｏｓ／は、３’リン酸化を示す。
【０６５５】
【表５４】
0006336443.tif 000055
【０６５６】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは、これまでの節において列挙されたオリゴヌクレオチドおよび図２６パネルｉ）に例示される構造に関連して、表２７に列挙される以下のオリゴヌクレオチドを含有するよう設定した。ＢＬＡおよびＤｚ２ならびに／またはＢＬＢおよびＤｚ４を含有する全ての反応について、各ＤＮＡザイムおよびＢＬの組合せを、室温で３０分間、別個に最初にプレハイブリダイズし、その後、任意のさらなるオリゴヌクレオチド成分を添加した。
【０６５７】
【表５５】
0006336443.tif 000056
【０６５８】
オリゴは、Integrated DNA Technologies(IDT)またはBiosearch technologiesから購入した。全ての反応物は、１×ＰＣＲバッファーＩＩ(Applied Biosystems)、ヌクレアーゼ不含水(Ambion)および４５ｍＭのＭｇＣｌ２(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで５２℃で２連で実施し、蛍光シグナルは、チャネル１（ＦＡＭ）およびチャネル３（ＴｘＲ）で測定し、合計１５４分間、３０秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：全てのチャネル）。
【０６５９】
−結果
図２６パネルｉｉ）は、反応試験管中に別個にまたは共に入れられる場合の、２つの独立した自己触媒的ＤＮＡザイム疑似環からの蛍光シグナルを比較する結果を示す。ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識される基質２は、Ｄｚ２によって切断され得、従って、Ｄｚ２の放出および活性化は、ＦＡＭの蛍光の変化によってモニタリングされ得る。あるいは、基質４は、ＴｘＲフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識され、Ｄｚ４によって切断され得、従って、Ｄｚ４の放出および活性化は、ＴｘＲの蛍光の変化によってモニタリングされ得る。グラフ「ＦＡＭ」および「ＴｘＲ」は、それぞれＦＡＭおよびＴｘＲフルオロフォアからの蛍光シグナルの概要を示す。
【０６６０】
グラフＦＡＭでは、環Ａがそれ自体で存在し、全くＡＦ１が存在しない反応Ａ、（四角記号を有する線として示される、「環Ａのみ、ＡＦなし」）については、基質２の最初の極めて少ない切断しかなく、結果として、反応時間の間にＦＡＭシグナルのわずかな増大しかない。これは、Ｄｚ２が、疑似環複合体内で不活性で維持されることを示す。これは、両方とも、１つの反応に環ＡおよびＢを共に含有し、どのＡＦも存在しない（反応Ｅ）またはＡＦ３のみ存在する（反応Ｇ）、反応Ｅ（２本の斜めの交差線および１本の垂直交差線からなる記号を有する線として示される、「環Ａ＋環Ｂ、ＡＦなし」）および反応Ｇ（「環Ａ＋環Ｂ、ＡＦ３存在」、１本の垂直交差線および１本の水平交差線からなる記号を含有する線）との比較において示される。環Ａがそれ自体で存在し、ＡＦ１も存在する反応Ｂ、（「環Ａのみ、ＡＦ１存在」、菱形記号を含有する線）では、わずかな遅れとそれに続く、ＦＡＭシグナルの即時増大があり、プラトーに迅速に到達する。これは、ＡＦ１が、基質１を切断するＭｚ１を集合させ、それによって、Ｄｚ２活性化および基質２（および基質２ａ）切断事象のカスケードを引き起こすことを示す。このシグナルは、１つの反応において環ＡおよびＢの両方が一緒であり、ＡＦ１が存在する反応Ｆ（「環Ａ＋環Ｂ、ＡＦ１存在」、２本の斜めの交差線からなる記号を含有する線）のものとの比較において示される。ＦＡＭシグナルは、反応Ａ、ＥおよびＧのものと反応ＢおよびＦのものの間で極めて類似しており、これは、環Ｂの存在が、環Ａの活性に最小にしか影響を及ぼさないことおよび環ＢからのＤｚ４の放出が、ＦＡＭチャネルのシグナルをもたらさないことを示し、これは、この系において応答または非特異性がないことを示す。
【０６６１】
ＴｘＲのグラフでは、環Ｂがそれ自体で存在し、ＡＦ３が全く存在しない反応Ｃ、（三角記号を有する線として示される、「環Ｂのみ、ＡＦなし」）については、基質４の極めて少ない切断しかなく、結果として、ＴｘＲシグナルの極めて少ない増大しかなく、これは、反応時間の最後に向けてわずかに増大し始めるだけである。これは、Ｄｚ４が、疑似環Ｂ複合体内で不活性で維持されることを示す。これは、両方とも、１つの反応において共に環ＢおよびＡからなり、ＡＦが全く存在しない（反応Ｅ）か、またはＡＦ１のみが存在する（反応Ｆ）のいずれかである反応ＥおよびＦとの比較において示される。環Ｂがそれ自体で存在し、ＡＦ３も存在する反応Ｄ、（「環Ｂのみ、ＡＦ３存在」、丸記号を含有する線）では、わずかな遅れと、それに続く、ＴｘＲシグナルの増大がある。これは、ＡＦ３が、基質３を切断するＭｚ３を集合させ、それによって、Ｄｚ４活性化および基質４（および基質４ａ）切断事象のカスケードを引き起こすことを示す。このシグナルは、１つの反応において環ＢおよびＡの両方が一緒であり、ＡＦ３が存在する反応Ｇのものとの比較において示される。ＴｘＲシグナルはまた、反応Ｃ、ＥおよびＦのものと反応ＤおよびＧのものの間で極めて類似しており、これは、環Ａの存在が、環Ｂの活性に最小にしか影響を及ぼさないことおよび環ＡからのＤｚ２の放出が、ＴｘＲチャネルのシグナルをもたらさないことを示し、これは、この系において応答または非特異性がないことを示す。反応ＦについてＦＡＭチャネル中に、また反応ＧについてＴｘＲチャネル中に存在するシグナルはまた、２種の標的が同時に検出され得ることを示す。
【０６６２】
もたらされる蛍光シグナルは、環ＡまたはＢのいずれか自体からなる反応の間で、または環ＡおよびＢが反応試験管内で共に複合体形成される場合に同等である。これは、２種の環の間に最小の望まれない相互作用しかないことおよびそれらは２種の特有の標的配列の検出後にシグナルを増幅するよう使用され得ることを示す。
【実施例２５】
【０６６３】
以下の実施例は、実施例１９において先に実証された、自己触媒的疑似環構造内の相補的ＢＬ分子とのハイブリダイゼーションによるＤＮＡザイムの不活性化を実証する。この本実施例２５では、カスケードは、標的配列（標的１）のＢＬ内の基質（基質１）とのハイブリダイゼーションによって開始され、これは、ＲＥの、ＢＬに選択的にニックを入れる活性を漸加する（図２７、パネルｉ））。基質１および標的１は各々、ＲＥ認識配列に必要な二重鎖の一方の鎖を含み、その結果、２種を共に結合すると、完全な二本鎖認識部位が結果として形成される。ＢＬ分子は、その５’および３’末端で、ＤＮＡザイム（Ｄｚ２）の一部とハイブリダイズする配列からなり、Ｄｚ２の一次的な不活性化をもたらす。ＢＬはまた、基質１に隣接する第２の基質配列、すなわち、ひとたび、Ｄｚ２が、基質１の標的依存性ＲＥ媒介性ニッキングによってＢＬから放出されると、Ｄｚ２によって切断することができる基質２ａを含有する。さらに、基質２は、Ｄｚ２切断反応をモニタリングするために、フルオロフォアおよびクエンチャーを用いて改変されている線形配列として提供される。標的１およびＲＥが両方とも存在する場合にのみ、基質１にニックが入れられ、その結果、自己触媒的カスケードが開始される。
【０６６４】
−オリゴヌクレオチド
本実施例では、Ｄｚ２の一部（配列番号７１；Ｄｚ７７＿５５（８：９））と相補的である５’および３’末端と、（ｉｉ）基質１および基質２（Ｓｕｂ７７＿５５、配列番号５５）と同等であるが、この配列の３’末端「Ｃ」ヌクレオチドを欠く基質２ａの隣接する配列からなる５’および３’末端を接続する中心部分から構成されるＢＬ（配列番号８６；Ｃ（Ｒ３９ｃ））。ＢＬは、ＢＬをＤｚ２とプレハイブリダイズすることによって、Ｄｚ２の活性をブロックするために利用される。
【０６６５】
標的１（配列番号８８；ＡＦ−（Ｒ３８ｅ））は、ＲＥの、ＢＬの基質１部分を選択的に切断する活性を漸加するために利用される。この標的依存性切断事象は、Ｄｚ２の放出を促進し、これによって、それがＢＬ内に存在する基質２ａに対して作用することが可能となる。Ｄｚ２はまた、疑似環の成分ではない、別個の独立した基質２に作用し得る。この実施例では、この独立した基質２は、５’末端でＦＡＭ部分を用い、３’末端でＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋクエンチャー部分（「ＩＢ」）を用いて末端標識された。
【０６６６】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、Ｄｚの一部と相補的であるＢＬ中の領域を表す。イタリック体の塩基は、ＢＬ分子内の基質配列に対応する領域を意味する。四角で囲まれた塩基は、ＤＮＡザイムの触媒コアを表す。灰色で強調されたヌクレオチドは、（ａ）ＢＬ中の下線が引かれた塩基と相補的であり、それによってブロックされるＤｚ中の塩基および（ｂ）ＢＬおよび標的１内の部分ＲＥ認識部位の両方を表す。
【０６６７】
【表５６】
0006336443.tif 000057
【０６６８】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、これまでの節において列挙されたオリゴヌクレオチドおよび図２７パネルｉ）に例示される構造に関連して、表２８に列挙される以下のオリゴヌクレオチドを含有するよう設定した。ＢＬおよびＤｚ２を含有する全ての反応について、これらの２種のオリゴを共に、室温で３０分間最初にプレハイブリダイズし、その後、任意のさらなるオリゴヌクレオチド成分を添加した。
【０６６９】
【表５７】
0006336443.tif 000058
【０６７０】
オリゴは、Integrated DNA Technologies(IDT)またはBiosearch technologiesから購入した。全ての反応物は、１×ＰＣＲバッファーＩＩ(Applied Biosystems)、ヌクレアーゼ不含水(Ambion)および２５ｍＭのＭｇＣｌ２(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで５２℃で２連で実施し、蛍光シグナルは、チャネル１（ＦＡＭ）で測定し、合計１２６分間、３０秒毎に読まれるようプログラムした（スキャンモード：ＦＡＭのみ）。
【０６７１】
−結果
図２７パネルｉｉ）は、標的１およびＲＥ両方の存在下または不在下の蛍光シグナルを比較する結果を示す。ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識される基質２は、Ｄｚ２によって切断され得、従って、Ｄｚの放出および活性化は、ＦＡＭの蛍光の変化によってモニタリングされ得る。
【０６７２】
反応Ａ、（四角記号を有する線として示される、「ＲＥなし、標的１なし」）、反応Ｂ（菱形記号を有する線として示される「ＲＥなし、標的１存在」）および反応Ｃ（三角記号を有する線として示される、「ＲＥ存在、標的１なし」）では、基質２の極めて少ない切断しかなく、結果として、経時的にＦＡＭシグナルの最小の増大しかない。反応ＡおよびＢについては、これは、ＲＥが存在せず、そのため、ＢＬとハイブリダイズするための標的１が存在するかどうかにかかわらず、依然として、基質１を切断するために利用可能であるＲＥはなく、このＤｚ２が、疑似環から放出されないためである。反応Ｃについては、ＲＥは利用可能であるが、標的１が存在せず、そのため、ＲＥ認識部位は、完成されておらず、Ｄｚ２は疑似環から放出されない。対照的に、反応Ｄ（「ＲＥ存在、標的１存在」、丸記号を含有する線）については、反応の過程を通じてＦＡＭシグナルの段階的増大があり、これは、標的１が、基質１とハイブリダイズでき、これが二重鎖ＲＥ認識部位の形成、従って、ＲＥの、基質１に選択的にニックを入れる能力をもたらし得ることを示す。次いで、基質１のニッキングは、Ｄｚ２の放出および活性化をもたらし、Ｄｚ２活性化および基質２ａ切断事象の自己触媒的カスケードを引き起こす。基質２はまた、独立した蛍光標識された型として提供されるので、蛍光シグナルの蓄積が起こる。従って、この結果は、ＤＮＡザイム疑似環戦略を利用する自己触媒的カスケードが、標的依存的にＲＥ切断によって開始され得ることを実証する。
【実施例２６】
【０６７３】
以下の実施例は、実施例１に先に実証された、疑似環構造内の相補的ＢＬ分子とのハイブリダイゼーションによる、ＤＮＡザイムの不活性化を実証する。この本実施例２６では、ＢＬ内の基質（基質１）の切断は、アプタザイム（図２８、パネルｉ））によって起こる。アプタザイムは、アプタマードメインと共有結合によって連結されたＤＮＡザイムドメイン（Ｄｚ１）からなる。この実施例では、アプタマーは、リガンドデオキシ−アデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）と結合する。Ｄｚ１は、ｄＡＴＰの不在下で、Ｄｚ１と幾分かの塩基対相同性を共有するアプタマードメインの存在のために不活性にされる。しかし、ｄＡＴＰの存在下で、アプタマードメインは、ｄＡＴＰと結合でき、これは、アプタザイム構造の立体構造の変化につながる。これは、ＤＮＡザイムドメインの立体構造の変化をもたらし、Ｄｚ１の触媒活性を回復させ、その結果、ここで、Ｄｚ１は疑似環内の基質１を切断できる。基質１の切断は、疑似環からのＤｚ２の放出をもたらし、これは、その触媒活性を回復させ、Ｄｚ２がその基質（基質２）を切断することを可能にする。基質２は、切断が、検出可能な蛍光シグナルの生成をもたらすよう、フルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識されている。ヌクレオチド三リン酸ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰなどの密接に関連する分析物の存在下では、蛍光シグナルの増大はなく、これは、アプタザイムが、本発明のＢＬ分子からの触媒核酸の放出を開始するよう標的特異的に活性化され得ることを示す。
【０６７４】
−オリゴヌクレオチド
本実施例では、（ｉ）Ｄｚ２の一部（配列番号７３；Ｄｚ３（８：１０））と相補的である５’および３’末端と、（ｉｉ）基質１からなる５’および３’末端を接続する中心部分とから構成されるＢＬ（配列番号６４；Ｃ（Ｒ４３ｅ））。ＢＬは、ＢＬをＤｚ２とプレハイブリダイズすることによってＤｚ２の活性をブロックするために利用される。アプタザイム分子（配列番号８７；Ｄｚ１−（Ｒ４０ａ））は、ｄＡＴＰの存在によって活性化される場合に、ＢＬの基質１部分を切断するために利用される。この標的依存性切断事象は、ＢＬからのＤｚ２の放出を促進し、これによって、それが基質２（配列番号８３；Ｓｕｂ３）に対して作用することが可能となる。この実施例では、基質２は、５’末端でＦＡＭ部分を用い、３’末端でＩｏｗａＢｌａｃｋ（「ＩＢ」）部分を用いて末端標識された。
【０６７５】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に５’から３’で列挙される。大文字の塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり、小文字の塩基は、リボヌクレオチドである。下線が引かれた塩基は、Ｄｚの一部と相補的であるＢＬ中の領域を表す。イタリック体の塩基は、ＢＬ分子内の基質配列に対応する領域を意味する。四角で囲まれた塩基は、ＤＮＡザイムの触媒コアを表す。灰色で強調されたヌクレオチドは、（ａ）ＢＬ中の下線が引かれた塩基と相補的であり、それによってブロックされるＤｚ２中の塩基および（ｂ）アプタザイム内のアプタマードメインの両方を表す。
【０６７６】
【表５８】
0006336443.tif 000059
【０６７７】
−反応成分
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、これまでの節において列挙されたオリゴヌクレオチドおよび図２８パネルｉ）に例示される構造に関連して、表２９に列挙される以下のオリゴヌクレオチドおよびリガンドを含有するよう設定した。全ての反応について、ＢＬおよびＤｚ２を共に、室温で３０分間、最初にプレハイブリダイズし、その後、任意のさらなるオリゴヌクレオチドまたはリガンド成分を添加した。
【０６７８】
【表５９】
0006336443.tif 000060
【０６７９】
オリゴは、Integrated DNA Technologies(IDT)またはBiosearch technologiesから購入した。ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ溶液は、Ｂｉｏｌｉｎｅから購入した。全ての反応物は、１×Ｉｍｍｏｂｕｆｆｅｒ(Bioline)、ヌクレアーゼ不含水(Ambion)および４５ｍＭのＭｇＣｌ２(Ambion)を含有していた。全ての反応物の総容量は、２５μＬとした。全ての反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで２連で実施した。反応は、２段階の熱サイクルプロフィール下で実施し、第１の工程は、４２℃で３０分間からなり、第２の工程は、５２℃で６０分間からなる。蛍光シグナルは、第２の工程の間、１０秒毎にチャネル１（ＦＡＭ）で測定した（スキャンモード：ＦＡＭのみ）。
【０６８０】
−結果
図２８パネルｉｉｉ）は、疑似環ＤＮＡザイム構造のアプタザイム開始によってｄＡＴＰ標的分析物の存在下で特異的に活性化される蛍光シグナルを実証する。ＦＡＭフルオロフォアおよびクエンチャーを用いて標識される基質２は、Ｄｚ２によって切断され得、従って、Ｄｚ２の放出および活性化は、ＦＡＭの蛍光の変化によってモニタリングされ得る。
【０６８１】
反応Ａ、（四角記号を有する線として示される、「リガンドなし」）、反応Ｃ（三角記号を有する線として示される、「ｄＣＴＰ存在」）、反応Ｄ（丸記号を有する線として示される、「ｄＧＴＰ存在」）および反応Ｅ（２本の垂直交差線および１本の水平交差線からなる記号を有する線として示される、「ｄＴＴＰ存在」）では、基質２の極めて少ない切断しかなく、結果として、経時的にＦＡＭシグナルの最小の増大しかない。これは、アプタザイムのＤｚ１ドメインが、アプタマードメインの存在によって不活性にされたためである。しかし、反応Ｂ（「ｄＡＴＰ存在」、菱形記号を含有する線）では、ＦＡＭ蛍光シグナルの即時増大があり、これは、ｄＡＴＰが、アプタザイムのアプタマードメインと結合しており、アプタザイムの立体構造の変化をもたらしていること、その結果、Ｄｚ１ドメインがここで活性であることを示す。次いで、活性Ｄｚ１は、疑似環のＢＬ内に存在する基質１を切断できる。次いで、Ｄｚ２は、疑似環のＢＬから放出され、基質２を切断し、蛍光シグナルの増大をもたらすことができる。その他の密接に関連するヌクレオチド三リン酸分子ではなく、ｄＡＴＰの存在からのシグナルは、アプタザイムが、標的依存的なＢＬ分子からの触媒核酸の放出を特異的に開始する酵素として使用され得、従って、カスケード反応を開始するために有用であり得ることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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