(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれる少なくとも一の微生物について、バンコマイシンである糖ペプチドに対する耐性の少なくとも一のマーカーを検出する方法であって、前記微生物の少なくとも一のペプチドを、ＭＲＭであるＭＳ／ＭＳ型質量分析法により検出することを含み、前記耐性マーカーが、配列番号５から１６、２９から３５、５９から７１、８０から８３、８５から９１、９５から１０２、１０４から１２０、１２２から１３９又は１４１から１５４の配列のペプチドから選択されるＶａｎ型のペプチドである、検出方法。
【請求項２】
前記試料を前記糖ペプチドに前もって接触させることによって耐性の機序を誘導することからなる工程を検出工程の前に含む、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記耐性マーカーが、配列番号５から配列番号１６の配列のペプチドから選択されるＶａｎＡ型のタンパク質である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
前記耐性マーカーが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６の配列のペプチドから選択されるＶａｎＡ型のマーカーである、請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
前記耐性マーカーが、配列番号５から配列番号１６の配列のペプチドから選択されるＶａｎＡ型のペプチドである、請求項２に記載の検出方法。
【請求項６】
前記耐性マーカーが、配列番号２９から配列番号３５の配列のペプチドから選択されるＶａｎＢ型のマーカーである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項７】
前記耐性マーカーが、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２及び配列番号３３の配列のペプチドから選択されるＶａｎＢ型のマーカーである、請求項２に記載の検出方法。
【請求項８】
前記耐性マーカーが、配列番号５９から配列番号７１の配列のペプチドから選択されるＶａｎＣ型のマーカーである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項９】
前記耐性マーカーが、配列番号８０から配列番号８３の配列のペプチドから選択されるＶａｎＤ型のマーカーである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項１０】
前記耐性マーカーが、配列番号８０、配列番号８１及び配列番号８３の配列のペプチドから選択されるＶａｎＤ型のマーカーである、請求項９に記載の検出方法。
【請求項１１】
前記耐性マーカーが、配列番号８０、配列番号８１及び配列番号８３の配列のペプチドから選択されるＶａｎＤ型のマーカーである、請求項２に記載の検出方法。
【請求項１２】
前記耐性マーカーが、配列番号８５から配列番号９１の配列のペプチドから選択されるＶａｎＥ型のマーカーである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項１３】
前記耐性マーカーが、配列番号８９の配列のペプチドに対応するＶａｎＥ型のマーカーである、請求項２に記載の検出方法。
【請求項１４】
前記耐性マーカーが、配列番号９５から配列番号１０２の配列のペプチドから選択されるＶａｎＧ型のマーカーである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項１５】
前記耐性マーカーが、配列番号９７及び配列番号１００の配列のペプチドから選択されるＶａｎＧ型のマーカーである、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
前記耐性マーカーが、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号１００及び配列番号１０２の配列のペプチドから選択されるＶａｎＧ型のマーカーである、請求項２に記載の検出方法。
【請求項１７】
前記耐性マーカーが、配列番号１０４から配列番号１２０の配列のペプチドから選択されるＶａｎＬ型のマーカーである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項１８】
前記耐性マーカーが、配列番号１２２から配列番号１３９の配列のペプチドから選択されるＶａｎＭ型のマーカーである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項１９】
前記耐性マーカーが、配列番号１４１から配列番号１５４の配列のペプチドから選択されるＶａｎＮ型のマーカーである、請求項１に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、試料から得られた少なくとも一の微生物の糖ペプチドに対する耐性の少なくとも一の、機序の質量分析法による検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
パスツールによる微生物の発見以来、微生物は、顕微鏡法や生化学分析により研究されている。これら伝統的な方法は、時間がかかり面倒であることが多く、代替となる分析法がやがて必要となった。而して、１９７５年に、Ｊ．Ａｎｈａｌｔ及びＣ．Ｆｅｎｓｅｌａｕにより、質量分析法による細菌の分析が始まった［１］。
【０００３】
この予備的研究に続いて、微生物の細胞壁の脂肪酸を研究するために、質量分析と組み合わせたガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＭＳ）が使用された［２］。この方法は、脂肪酸メチルエステルを表すＦＡＭＥという英語名の下で普及した。ＦＡＭＥは、今は、分類学的研究のための標準的方法となっている。しかしながら、その使用は、試料を鹸化、加水分解及び誘導により処理することができる所定の専門的実験室に依然として限定されている。
【０００４】
１９９６年に、Ｍ．Ｃｌａｙｄｏｎ等［３］やＴ．Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ及びＰ．Ｒｏｓｓ［４］による研究は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間）型の質量分析計で様々な細菌種を同定することができることを示した。分析では、質量スペクトルの獲得と専門的ソフトウェアによる解釈とを組み合わせる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは極めて簡単で、数分間で実施することができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは現在は医学分析実験室において採用されている［５］。しかしながら、その臨床的使用は、細菌種及び酵母の同定に限定されている。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、抗微生物剤に対する耐性を同定するためには常套的には使用されていない。
【０００５】
今では、抗生物質などの抗微生物剤に対する耐性の同定が、最適な患者ケアを確保するための不可欠な要素である。
これらの必要性に対処するために、他の質量分析法、特に、タンデム質量分析法が提案されている。例として、β−ラクタマーゼを四重極ＴＯＦ（Ｑ−ＴＯＦ）により同定することについてのＣ．Ｆｅｎｓｅｌａｕ等の研究［６］を挙げることができる。
【０００６】
しかしながら、これらの研究結果は、日常的な臨床用途には適用可能ではない。これらの研究結果は、高い技能を有する研究員を必要とする研究用機器を用いて得られた。分析時間は、１試料当たり１時間を超えることが多く、微生物学的分析実験室の作業負荷には適合しない。
【０００７】
より最近になって、Ｓ．Ｈｏｆｓｔａｄｌｅｒ等［７］が、ＰＣＲによる微生物ゲノムの増幅を、エレクトロスプレーＴＯＦ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）によるＰＣＲ産物の検出と組み合わせる方法を提案した。この方法は今は完全に自動化されている［８］。しかし、この方法は、分子生物学に固有の欠陥、すなわち、抽出収量、プローブのコストなどの欠陥を伴うＰＣＲによる増幅を必要とする。
【発明の概要】
【０００８】
この文脈において、本発明の目的は、先行技術による方法の欠点を克服することを可能とする、糖ペプチドに対する耐性の機序を検出する方法を提案すること、すなわち、特に分子生物学の方法と比較して、それぞれの種に特異的な試薬を用いない低コストの方法であって、１時間より短い短時間で結果をもたらし、かつ高い技能を有する研究員を必要とすることなく、日常的臨床診療において使用することができる方法を提案することである。
この目的のために、本発明は、試料中に含まれる少なくとも一の微生物について、糖ペプチドに対する耐性の少なくとも一のマーカーを検出する新規方法であって、前記微生物の少なくとも一のペプチド又はタンパク質を質量分析法により検出することを含む検出方法を提案する。
【０００９】
有利には、数種の異なる抗微生物剤に対する耐性のマーカーが同時に検出されうる。
驚いたことに意外にも、本発明の方法は、誘導の不在下で耐性の誘導機序の存在を検出することを可能にする。
国際公開第２０１１０４５５４４号の出願に示される通り、微生物の分類及び／又は病原性のマーカーを、耐性マーカーの機序の検出の前又はそれと同時に、質量分析法により同様に検出することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
「糖ペプチドのクラスの少なくとも一の抗微生物剤に対する耐性のマーカー」とは、前記耐性に特徴的であるタンパク質由来の分子を意味する。
糖ペプチドは、バンコマイシン、テイコプラニン、テラバンシン、ブレオマイシン、ラモプラニン、及びデカプラニン等の抗生物質である。バンコマイシンは真の糖ペプチドであり、テイコプラニンはリポ糖ペプチドである。これら二つの分子はペプチドグリカンの合成阻害によって細菌壁の合成を阻害する。実際、そのポケット状の三次元構造がペプチドグリカンの合成のジペプチドＤ−Ａｌａ Ｄ−Ａｌａ前駆体を覆い、グリコシルトランスフェラーゼ及びトランスペプチダーゼの作用を妨げ、ペプチドグリカンの伸長をブロックする。糖ペプチドに対する耐性は、低親和性の前駆体の形成を触媒する酵素と宿主細菌によって産生される高親和性前駆体を排除する酵素をコードするオペロンの存在によるものである。オペロンに存在する酵素に応じて、様々なタイプの耐性が知られている。糖ペプチドに対する耐性の分類は、様々なタイプの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）がオーバーラップする度合いで、糖ペプチドに対する耐性のレベルよりもむしろ、耐性リガーゼの構造遺伝子の一次配列に基づく。９種の耐性の型が同定されている。８種は獲得耐性から生じ（ＶａｎＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｌ、Ｍ及びＮ）、一つ（ＶａｎＣ）はエンテロコッカス・ガリナルム（E．gallinarum）とエンテロコッカス・カセリフラブス（E. casseliflavus）に存在する天然耐性である。（概説には、[9], Sujatha,S.及びPraharaj,I. Glycopeptide Resistance in Gram-Positive Cocci: A Review. Interdiscip. Perspect. Infect. Dis 2012, 781679 (2012)を参照のこと）
【００１１】
耐性のＶａｎＡ型は、バンコマイシンとテイコプラニンに対する高レベルの誘導性耐性によって特徴付けられる。ＶａｎＡ型の黄色ブドウ球菌への感染は実証されているが、それにもかかわらず、非常に希である。
耐性のＶａｎＢ型は、バンコマイシンに対する中程度から高レベルの誘導性耐性によって特徴付けられ、テイコプラニンに対して感受性である。
一般に、ＶａｎＡ及びＶａｎＢ表現型は最も重要な臨床例であり、しばしばエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）及びエンテロコッカス・フェシウム（E.faecium）に見出される。
耐性のＶａｎＤ型は、バンコマイシンとテイコプラニンに対する中程度レベルの構成的耐性によって特徴付けられる。
ＶａｎＣ、Ｅ、Ｇ、Ｌ及びＮの耐性型は、バンコマイシンに対する低高レベルの耐性とテイコプラニンに対する感受性によって特徴付けられる。
【００１２】
耐性は抗生物質の不存在下で発現され得、その場合、構成的と呼ばれる。耐性はまた所定の濃度の抗生物質の存在下で発現され得、その場合は誘導性と呼ばれる。所定の濃度の抗生物質の存在下での微生物の培養は、その場合、誘導培養と呼ばれる。
少なくとも一の抗微生物剤に対する耐性の決定とは、各抗生物質に特徴的な薬力学的及び薬物動態学的パラメータの関数として定まった濃度で細菌を破壊するか又はその増殖を阻害することができないことを意味する。
少なくとも一の抗生物質に対する耐性の機序の決定とは、殆どの場合は抗生物質又はその代謝標的の構造の改変により、あるいは細菌中へのその浸透の低減により、抗生物質の作用を、少なくとも部分的に逃れることを可能にする、細菌により合成される少なくとも一の化合物を検出することを意味する。
【００１３】
本発明の方法は、細菌中の糖ペプチドに対する耐性の機序を検出するために用いることができる。従って、例えば、本発明の方法により糖ペプチドに対する耐性の機序を調べることができる細菌としては、以下のものを非網羅的に挙げることができる：エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）、エンテロコッカス・デューランス（Enterococcus durans）、エンテロコッカス・アビウム（Enterococcus avium）、エンテロコッカス・ラフィノーサス（Enterococcus raffinosus）又は黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）。感染の主な原因である病原体は腸球菌であり、より詳細にはエンテロコッカス・フェカリス及びエンテロコッカス・フェシウムである。
従って、本発明による方法は、前記抗生物質に対する耐性の機序を検出することもまた可能にする。
【００１４】
「試料」とは少量部又は少量の単離量の分析のための物質を意味する。本発明の方法が実施されうる試料は、標的の微生物を含む場合がある任意の試料である。試料は、動物、植物、又はヒトである生物由来でありうる。その場合、試料は、生体液（例えば、全血、血清、血漿、尿、脳脊髄液、有機分泌物）、組織試料又は単離細胞に相当しうる。この試料は、そのままの状態で使用される、つまり、糖ペプチドに対する細菌の耐性の機序のマーカーが潜在的に被験試料中で直接検出可能であるか、あるいは分析前に、当業者に知られた方法に従って、富化、抽出、濃縮、精製、培養のような準備処理を受ける場合もある。
【００１５】
試料は、工業由来の場合があり、又は非網羅的な列挙によれば、空気の試料、水の試料、地表面から採取された試料、物品もしくは製造品、食物由来の生成物でありうる。食物由来の試料の中では、乳製品（ヨーグルト、チーズ）、肉、魚、鶏卵、果物、野菜、水、飲料（ミルク、果汁、ソーダなど）の試料を非網羅的に挙げることができる。これらの食物由来の試料はまたソース又は調理済み食品にも由来しうる。最後に、食物試料は、特に動物の餌などの動物用を意図した飼料にも由来しうる。
【００１６】
質量分析による検出の上流では、分析される試料を、試料中に存在する全てのタンパクからペプチドを作製するために前処理し、例えば、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）による消化を介して、又は化学的試薬の作用を介して、これらのタンパク質をペプチドに断片化することが好ましい。実際、タンパク質の切断は、物理化学的処理により、生物学的処理により、又は２つの処理の組合せにより、実施することもできる。使用可能な処理の中では、特に、Ｈ２Ｏ２を伴うヒドロキシルラジカルによる処理を挙げることができる。ヒドロキシルラジカルによる処理はペプチド結合の切断を生じさせ、これはタンパク質の任意のペプチド結合においてランダムに生じる。ヒドロキシルラジカルの濃度は、実施される切断の数を決定し、従って、得られるペプチド断片の長さを決定する。また、例えば、メチオニル残基のカルボキシル基のレベルでペプチド結合を特に切断する臭化シアン（ＢｒＣＮ）処理などの他の化学的処理法も用いることができる。また、トリフルオロ酢酸中１０００℃でタンパク質溶液を加熱することにより、アスパルチル残基のレベルで部分的な酸切断を実施することも可能である。
【００１７】
にもかかわらず、タンパク質の構造をより多くを保存し、制御が容易であるため、酵素的消化によるタンパク質の処理が、物理化学的処理よりも好まれる。「酵素的消化」とは、適切な反応条件下での一又は複数の酵素の単一又は組み合わせ作用を意味する。プロテアーゼと呼ばれる、タンパク質分解を実施する酵素は、タンパク質を、特定の場所で切断する。各プロテアーゼは一般にアミノ酸の配列を認識し、その中で常に同じ切断を施す。ある種のプロテアーゼは単一のアミノ酸又はその間で切断を実施する２つのアミノ酸の配列を認識し、他のプロテアーゼは長い配列を認識するのみである。これらのプロテアーゼは、エンドプロテアーゼの場合もあり、エキソプロテアーゼの場合もある。既知のプロテアーゼの中で、国際公開第２００５／０９８０７１号に記載される通り、以下のものを挙げることができる：
−  Ａｒｇ残基及びＬｙｓ残基のカルボキシル基のレベルでペプチド結合を切断するトリプシン、リシンの−ＣＯ基のペプチド結合を切断するエンドシリン、芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ）のカルボキシル基のレベルでペプチド結合を加水分解するキモトリプシン、芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐ）をＮＨ２基のレベルで切断するペプシン、Ｇｌｕ残基のカルボキシル基のレベルでペプチド結合を切断する黄色ブドウ球菌のＶ８株由来のプロテアーゼＶ８などの特異的酵素；
−  疎水性アミノ酸（Ｘａａ−Ｔｈｅ、Ｘａａ−Ｉｌｅ、Ｘａａ−Ｐｈｅ）のＮＨ２基のペプチド結合を加水分解する、細菌バチルス・テルモプロテオリティクス（Bacillus thermoproteolyticus）に由来するサーモリシン、制御された反応条件（酵素濃度及び反応時間）下で、実質的に全ての結合を加水分解し、タンパク質をオリゴペプチドに転換しうる細菌プロテアーゼであるスブチリシン及びプロナーゼなどの非特異的酵素。
【００１８】
数種のプロテアーゼを、それらの作用態様が適合性である場合は同時に用いることもでき、あるいは逐次的に用いることもできる。本発明の文脈内で、試料は、プロテアーゼ酵素、例えばトリプシンの作用によって好ましくは消化される。
化学的試薬又はプロテアーゼを用いるペプチドの生成は、溶液中の簡単な反応をによって得ることができる。ペプチドの生成はまた電子レンジにより実施することもでき［１０］、又が圧力下で実施することもでき［１１］、他には超音波装置で実施することもできる［１２］。これら直前の３つの場合には、プロトコールが更に迅速となろう。
【００１９】
このようにして得られたペプチドの中で、タンパク質に特異的なペプチドが、タンパク質分解性ペプチドと呼ばれる。これらが質量分析により決定されるものである。
本発明によれば、糖ペプチドに対する細菌の耐性の機序のマーカーは、糖ペプチドに対する耐性の機序が探索される細菌に由来するタンパク質である。特に、前記タンパク質は、好ましくは酵素により、より好ましくはトリプシンにより、消化される。
【００２０】
更に、糖ペプチドに対する細菌の耐性の機序を特徴づけるタンパク質マーカーを含む試料もまた精製を目的として前処理されうる。この精製のための前処理は、上述のペプチド生成工程の前又は後で使用することができる。
試料精製の前処理は、当業者に一般に知られており、特に、遠心分離法、濾過法、電気泳動法、又はクロマトグラフィー法を使用することができる。これらの分離技術を単独で、又は互いに組み合わせて使用して、多次元分離を得ることができる。例えば、多次元クロマトグラフィーは、Ｔ．Ｆｏｒｔｉｎ等［１３］、又はＨ．Ｋｅｓｈｉｓｈｉａｎ等［１４］により記載される通り、イオン交換クロマトグラフィーによる分離を、逆相クロマトグラフィーによる分離と組み合わせることにより、用いることができる。これらの研究では、クロマトグラフィー媒体は、カラム中に又はカートリッジに入れられうる（固相抽出）。
【００２１】
タンパク質分解性ペプチドの電気泳動又はクロマトグラフィーによる画分（又は一次元もしくは多次元クロマトグラフィーにおける保持時間）は各ペプチドに特徴的であり、従って、これらの技法を利用することにより、アッセイされるべきタンパク質分解性ペプチド又はペプチド群を選択することが可能となる。このような作製されたペプチドの分画は、後続の質量分析によるアッセイの特異性を増大させることを可能とする。
ペプチドを分画するための電気泳動法又はクロマトグラフィー法に対する代替法は、とりわけ、Ｎ−糖ペプチドの精製からなる（［１５］及び国際公開第２００８／０６６６２９号の特許出願）。しかし、この種の精製が定量化することを可能とするのは、Ｎ−グリコシル化による翻訳後修飾を受けたペプチドに限られる。とはいえ、全てのタンパク質がグリコシル化されるわけではなく、従って、その使用は限定される。
【００２２】
本発明の方法において用いられる質量分析は、異なる種類の分子を分析及び検出するための強力なツールとして当業者には広く知られている。一般に、イオン化することが可能な任意の種類の分子は、質量分析計を使用して、その分子量の関数として検出することができる。検出される分子がタンパク質由来であるか又は代謝由来であるかの性質により、特定の質量分析法がより適切となりうる。にもかかわらず、検出のために如何なる質量分析法を用いるのであれ、その質量分析法は、標的分子をいわゆる分子イオンにイオン化する工程を含み、この場合には、特徴づけマーカーをイオン化する工程と、得られた分子イオンをそれらの質量の関数として分離する工程を含む。
【００２３】
全ての質量分析計は、以下を備える：
−  分析される試料中に存在するマーカーをイオン化する、すなわち、正又は負の電荷をこれらのマーカーに付与するための、イオン化源；
−  イオン化されたマーカー又は分子イオンを、それらの質量対電荷比（ｍ／ｚ）の関数として分離するための質量分析器；
−  分子イオンにより直接的に、又は以下で詳述される通り、分子イオンから作製されたイオンによりもたらされるシグナルを測定するための検出器。
【００２４】
質量分析を実施するのに必要なイオン化工程は、当業者に知られた任意の方法によって実施されうる。イオン化源は、アッセイされる分子を、気体のイオン化状態に転換することを可能とする。イオン化源は、陽イオンについて研究するための陽イオンモードで用いることもでき、又は陰イオンについて研究するための陰イオンモードで用いることもできる。数種のイオン源が存在し、必要とされる結果及び解析される分子に応じてこれらが用いられることになる。特に、以下について言及することができる：
−  電子イオン化（ＥＩ）、化学イオン化（ＣＩ）、及び脱離化学イオン化（ＤＣＩ）
−  高速原子衝撃（ＦＡＢ）、準安定原子衝撃（ＭＡＢ）、又はイオン衝撃（ＳＩＭＳ、ＬＳＩＭＳ）
−  誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）
−  大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）及び大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）
−  電子噴霧化又はエレクトロスプレー（ＥＳＩ）
−  マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、表面活性化レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）、又はシリコン上の脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）
−  準安定分子種との相互作用によるイオン化／脱離（リアルタイムでの直接分析、ＤＡＲＴ）。
【００２５】
特に、イオン化は、次の通りに実施することができる：標的分子を含む試料をイオン化源中に導入し、そこで、分子が気体状態でイオン化させられ、従って、初期分子に対応する分子イオンに転換される。エレクトロスプレー型のイオン化（ＥＳＩ）源は、液体状態から気体状態に転換させながら、分子をイオン化することを可能にする。そのときに得られる分子イオンは、陽イオンモードでは、１つ、２つの、もしくは更には３つの、又はこれを超える更なるプロトンを伴って、液体状態で存在する分子に対応し、従って、１つ、２つの、もしくはさらには３つの、又はこれを超える電荷を保有する。例えば、標的分子がタンパク質である場合、標的タンパク質の分画分後に得られるタンパク質分解性ペプチドの、陽イオンモードで機能するエレクトロスプレーイオン源を介するイオン化により、１つ、２つの、もしくは更には３つの、又はこれを超える更なるプロトンを伴い、従って、１つ、２つの、もしくは更には３つの、又はこれを超える電荷を担い、液体状態から気体状態に移行することを可能とする、気体状態のポリペプチドイオンがもたらされる［１６］。この種のイオン源は、標的分子又は得られたタンパク質分解性ペプチドが逆相液体クロマトグラフィーによりあらかじめ分離されている場合に特に適する。にもかかわらず、この試料中に存在する分子のイオン化収量は、存在する異なる種の濃度及び性質に応じて変化しうる。この現象により、当業者によく知られたマトリックス効果がもたらされる。
【００２６】
ＭＡＬＤＩ用のイオン化源は、固体状態の試料に由来する分子のイオン化を可能とすることになる。
イオン化されたマーカーをそれらの質量対電荷比（ｍ／ｚ）により分離する工程を実施する質量分析計は、当業者に知られた任意の質量分析計である。イオントラップアナライザーとも呼ばれる、四重極（Ｑ）、３Ｄイオントラップ（ＩＴ）、又はリニアタイプ（ＬＩＴ）の低分解度の分析計と、分析物の正確な質量を測定することを可能とし、特に電気セクターに連結された磁気セクター、飛行時間（ＴＯＦ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）Ｏｒｂｉｔｒａｐを使用する高分解度の分析計を挙げることができる。
【００２７】
それらのｍ／ｚ比の関数としての分子イオンの分離は、１回だけ（単回の質量分析、又はＭＳ）実施され得、又は数回にわたる逐次的なＭＳ分離が実施されうる。２回にわたる逐次的なＭＳによる分離が実施される場合、この分析はＭＳ／ＭＳ又はＭＳ２と呼ばれる。３回にわたる逐次的なＭＳ分離が実施される場合、この分析はＭＳ／ＭＳ／ＭＳ又はＭＳ３と呼ばれ、より一般的に、ｎ回にわたる逐次的なＭＳによる分離が実施される場合、分析はＭＳｎと呼ばれる。
【００２８】
数回の逐次的な分離を用いる技法の中では、単一の標的分子を検出もしくはアッセイする場合のＳＲＭモード（選択的反応モニタリング）、又は数種の標的分子を検出もしくはアッセイする場合のＭＲＭモード（多重反応モニタリング）が、ＭＳ２分離で特に用いられる。同様に、ＭＲＭ３モードは、ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ分離の特定の応用である。これは、標的化質量分析と呼ばれる。
【００２９】
単一のＭＳモードで検出する場合、検出される標的分子と相関されるのは、得られる分子イオンの質量／電荷比である。
【００３０】
ＭＳ／ＭＳモードで検出する場合、ＭＳ定量と比較して、本質的に以下の２つの工程が付加される：
−  分子イオンをフラグメント化する工程であって、プリカーサーイオンと呼ばれるイオンをもたらし、ついで、一次フラグメントイオンと呼ばれるイオンをもたらす工程、及び
−  一次フラグメントイオンと呼ばれるイオンを、それらの質量（ｍ／ｚ）２の関数として分離する工程で、比（ｍ／ｚ）１は、プリカーサーイオンの比（ｍ／ｚ）に対応する。
【００３１】
従って、検出される標的分子と相関するのは、このようにして得られる一次フラグメントイオンの質量／電荷比である。一次フラグメントイオンとは、フラグメント化の工程の後でプリカーサーイオンから派生するイオンを意味し、その質量対電荷比であるｍ／ｚはプリカーサーイオンとは異なる。
（ｍ／ｚ）１と（ｍ／ｚ）２との対はトランジションと呼ばれ、検出される特徴的なイオンを表す。
【００３２】
標的分子と相関させるために検出される特徴的なイオンは、当業者により、標準的な方法に従って選択される。それらの選択は、有利には、再現性及び信頼性の点で、可能な限り最も高感度で、特異的で、頑健なアッセイをもたらすであろう。タンパク質分解性ペプチド（ｍ／ｚ）１、及び第１世代のフラグメント（ｍ／ｚ）２を選択するために開発された方法では、選択は反応の強度に本質的に基づく。更なる詳細については、Ｖ．Ｆｕｓａｒｏ等［１７］を参照することが可能である。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ又はＭＲＭａｉｄによるＭＩＤＡＳソフトウェア及びＭＲＭ Ｐｉｌｏｔソフトウェア［１８］などの市販のソフトウェアが、全ての可能なトランジション対を予測するために当業者によって使用されうるであろう。研究者集団により記載されているペプチドのＭＲＭトランジションの全てをまとめるために、Ｆ  Ｄｅｓｉｅｒｅ等［１９］により構築された、ＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓと呼ばれるデータベースを使用することもできる。このＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓデータベースは、インターネット上で無償で入手できる。非タンパク質分子では、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（アメリカ合衆国）によるＣｌｉｑｕｉｄソフトウェアを介してアクセス可能なデータベースを用いることもまた可能である。
【００３３】
タンパク質分解性ペプチド（ｍ／ｚ）１及び（ｍ／ｚ）２を選択するための代替法は、他の研究で得られたＭＳ／ＭＳフラグメント化スペクトルを用いることからなる。この研究は、例えば、プロテオーム解析によるバイオマーカーの発見及び同定の段階でありうる。この手法は、使用者会議においてＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃにより提案された［１８］。これは、ＳＩＥＶＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ソフトウェアにより実験的に同定されたペプチドから、候補トランジションのリストを作成することを可能とする。イオン（ｍ／ｚ）１及び（ｍ／ｚ）２の選択についての所定の基準は、Ｊ．Ｍｅａｄ等［１８］により詳述されているが、これを以下に詳述する：
−  リシン又はアルギニンにプロリンが後続するのでない限り、内部切断部位、すなわち、内部リシン又は内部アルギニンを伴うペプチドは、回避されなければならない；
−  アスパラギン又はグルタミンを伴うペプチドは、脱アミノ化しうるために、回避されなければならない；
−  Ｎ末端にグルタミン又はグルタミン酸を伴うペプチドは、自発的に環化しうるために、回避されなければならない；
−  メチオニンを伴うペプチドは、酸化しうるために、回避されなければならない；
−  システインを伴うペプチドは、チオール官能基の変性、還元、及びブロックの任意工程中に再現不可能な形で修飾されうるために、回避されなければならない；
−  プロリンを伴うペプチドは、それらが一般に、ＭＳ／ＭＳにおいて極めて強い単一のピークを伴う強いフラグメントを作製するために、好適であると考えることができる。しかし、極めて強い単一のフラグメントは、複雑な混合物中におけるトランジションの識別の検証を可能としない。実のところ、数種の特徴的なフラグメントの同時的な存在だけが、必要とされるプリカーサーイオンが実際に検出されたことの検証を可能とする；
−  プロリンがＣ末端に隣接する（ｎ−１位）か又はＣ末端から２番目にある（ｎ−２位）ペプチドは、この場合、第１世代のペプチドフラグメントのサイズが、十分に特異的であるためには余りに小さすぎると一般に考えられるために、回避されるべきである；
−  特異性を促進するために、プリカーサーを超える質量を有するフラグメントの選択に優先性を与えるべきである。この目的のためには、二価に帯電したプリカーサーイオンを選択し、プリカーサーを超える質量を有する、強度の最も強い第１世代のイオンフラグメント、すなわち、一価に帯電した一次フラグメントイオンを選択することが必要である。
【００３４】
選択されたプリカーサーイオンのフラグメント化は、イオンを分離することをまた可能な三連四重極型［２０］、又はイオントラップ型［２１］、又は飛行時間（ＴＯＦ）型［２２］のモデルなどのフラグメント化セル内で実施される。１回又は複数回のフラグメント化は常套的に、電場内のアルゴンもしくは窒素などの不活性ガスとの衝突により、強い光源を用いる光励起もしくは光解離により、例えば、飛行時間チューブ内で電位差を印加することを介して、電子もしくはラジカル種との衝突により、又は他の任意の活性化モードにより実施される。電場の特徴は、フラグメント化の強度及び性質を決定する。従って、例えば、四重極内、不活性ガスの存在下で印加される電場により、イオンにもたらされる衝突エネルギーが決定される。この衝突エネルギーは、決定されるトランジションの感度を増大させるように、当業者により最適化されるであろう。例として述べると、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、アメリカ合衆国）によるＡＢ ＳＣＩＥＸ ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００質量分析計のｑ２では、衝突エネルギーを５〜１８０ｅＶの間で変化させることが可能である。同様に、衝突工程の持続時間、及び例えばイオントラップ内の励起エネルギーも、最高感度のアッセイをもたらすように、当業者により最適化されるであろう。例として述べると、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社によるＡＢ ＳＣＩＥＸ ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００質量分析計のＱ３では、励起時間と称するこの持続時間を０．０１０〜５０ｍｓの間で変化させ、励起エネルギーを０〜１（任意単位）の間で変化させることが可能である。
【００３５】
最後に、選択された特徴的なイオンの検出は、特に、検出器及び処理システムを使用して、従来の方式で実施される。検出器は、イオンを回収し、その強度が回収されたイオンの量に依存する電気シグナルを発生させる。ついで、得られたシグナルが、コンピュータで処理しうるように増幅される。データ処理コンピュータシステムにより、検出器により受け取られたデータを質量スペクトルに変換することが可能となる。
【００３６】
ＳＲＭモード、又はＭＲＭモードの原理は、プリカーサーイオンを選択し、特にそれをフラグメント化し、ついで、とりわけ、そのフラグメントイオンのうちの１つを選択することである。このような応用では、三連四重極型、又はイオントラップ三連四重極ハイブリッドの装置が一般に使用される。
【００３７】
標的タンパク質を決定し又は検出するためにＭＳ２モードで使用される三連四重極装置（Ｑ１ｑ２Ｑ３）の場合、第１の四重極（Ｑ１）は、先の消化工程において得られた、アッセイされるタンパク質に特徴的なタンパク質分解性ペプチドに対応する分子イオンを、それらの質量対電荷比（ｍ／ｚ）の関数としてフィルタリングすることを可能とする。必要とされるタンパク質分解性ペプチドの質量／電荷比の（ｍ／ｚ）１と呼ばれる比を有するペプチドだけが第２の四重極（ｑ２）に伝送され、後続のフラグメント化のためのプリカーサーイオンとして作用する。ｑ２分析計は、質量／電荷比（ｍ／ｚ）１のペプチドを一次フラグメントイオンにフラグメント化させうる。フラグメント化は一般に、ｑ２における、前駆体ペプチドの、窒素又はアルゴンなどの不活性ガスとの衝突を介して得られる。一次フラグメントイオンは、一次フラグメントイオンを、（ｍ／ｚ）２と呼ばれる特定の質量対電荷比の関数としてフィルタリングする第３の四重極（Ｑ３）に伝送される。必要とされるタンパク質分解性ペプチドに特徴的なフラグメントの質量／電荷比（ｍ／ｚ）２を有する一次フラグメントイオンだけが、検出器に伝送されて、検出されるか、又は更には定量される。
【００３８】
この操作モードは、一方でプリカーサーイオンの選択に関して、他方で一次フラグメントイオンの選択に関して、二重の選択性を示す。従って、定量化には、ＳＲＭ又はＭＲＭモードでの質量分析が有利である。
【００３９】
本発明の方法において用いられる質量分析がタンデム質量分析（ＭＳ２、ＭＳ３、ＭＳ４、又はＭＳ５）である場合、幾つかの質量分析計を一緒に連結することができる。例えば、第１の分析計がイオンを分離し、衝突セルがイオンをフラグメント化することを可能とし、第２の分析計がフラグメントイオンを分離する。イオントラップ又はＦＴ−ＩＣＲなど、所定の分析計が、幾つかの分析計を一体に構成し、イオンをフラグメント化し、フラグメントを直接的に解析することを可能とする。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明の方法は、次の特徴のうちの一又は複数を含む：
−  少なくとも一種の抗微生物剤に対する潜在的な耐性の性質のために用いられる質量分析が、ＭＳ／ＭＳタイプの質量分析であって、検出されるか又は定量化される分子に特異的なフラグメントを作製し、従って、アッセイ法に大きな特異性をもたらす利点を有するという特徴；
−  ＭＳ／ＭＳ質量分析が、ＭＲＭであって、質量分析計において、数十ミリ秒にわたる解析サイクル時間であり、多数の異なる分子を、マルチプレックス様式で、高感度に検出又は定量化することを可能とする解析サイクル時間を用いる利点を有するという特徴；
−  適用可能な場合、分類特性及び病原性因子の決定を、少なくとも一種の抗微生物剤に対する耐性のマーカーを決定する質量分析装置と同じ質量分析装置において、好ましくは同時に用いられるという特徴であって、解析時間を短縮し、測定器の費用を節減し、また、結果の処理及び作成も容易とする利点を有する特徴。
【００４１】
抗生物質に対する耐性を決定することに加えて、試験試料中に存在する一又は複数種の微生物を同定することが適切である。
微生物の同定方法は、例えば、Ｍｕｒｒａｙ Ｐ．Ｒ．ら、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、９版により、とりわけ、細菌及び酵母についてはＩ巻、ＩＩＩ節、１５及び１６章により、ウイルスについては、ＩＩ巻、ＶＩ節、８２章により、原虫についてはＩＩ巻、Ｘ節、１３５章により記載される通り、当業者に広く知られている。従来の同定法の例として、例えば、ＶＩＴＥＫ２（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）同定カードを用いることによる生物学的プロファイルの決定、又は更には特定の遺伝子の存在についての研究、及びそれらの配列についての研究に基づく同定基準を伴う分子生物学法を用いることによる生物学的プロファイルの決定について言及することができる。
【００４２】
同定は、同定が行われる試料から直接的に実行することもでき、試料中に含有される微生物を、Ｍｕｒｒａｙ Ｐ．Ｒ．ら、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、９版、Ｉ巻、ＩＩＩ節、１４章により、特に、細菌についてはＩ巻、ＩＶ節、２１章により、ウイルスについては、ＩＩ巻、ＶＩ節、８１章により、酵母についてはＩＩ巻、ＶＩＩＩ節、１１７章、原虫についてはＩＩ巻、Ｘ節、１３４章により記載される通り、探索される微生物種に照らして調整した最適培養培地及び培養条件により、当業者によく知られた方法を用いて培養することもできる。
従って、一般に、生化学的方法を用いて検体中の細菌を同定する場合、例えば、寒天上に播種した後に、純粋な培養物中の細菌を得ることがまず必要である。所定の場合には、分子生物学（ＰＣＲ）を、分析される試料に直接的に適用することができる。
【００４３】
微生物を培養する代わりに、活性表面を介して試料中の微生物を直接的に捕捉することにより濃縮することもできる。このような方法は、Ｆｅ３Ｏ４／ＴｉＯ２活性化表面を伴う磁気ビーズを使用して異なる細菌種を捕捉したＷ．−Ｊ．Ｃｈｅｎ等［１０］により記載された。また、レクチンによる捕捉［２３］、又は抗体による捕捉［２４］、又はバンコマイシンによる捕捉［２５］など、他の手段を介する捕捉も可能である。捕捉により、微生物を濃縮し、従って、培養工程を縮小し、又は更には除外することが可能となる。これにより、大幅な時間の節減が結果としてもたらされる。
同定はまた、上に記載されている技法に従う質量分析、好ましくはＭＳにより、ＭＳ／ＭＳにより、又は更には、本発明の一実施形態を構成する、ＭＳにＭＳ／ＭＳを後続させた質量分析によっても実施することができる。この場合にもまた、試料を、あらかじめ、寒天への播種など、培養工程に供することができる。
【００４４】
ＭＳによる同定法の使用は、数分間で実施することができ、単一のアナライザーを備えた質量分析計を必要とする、すなわち、ＭＳ／ＭＳにおいて使用されるタンデム質量分析計ほど複雑ではない機器を必要とする点で有利である。
また、ＭＳにＭＳ／ＭＳ型の質量分析計を後続させたものによる同定法の使用もまた有利である。これは、ＭＳにおいて観察されたイオンの識別を確実にすることを可能とし、これにより、解析の特異性が増大する。
ＭＲＭ型のＭＳ／ＭＳによる同定法の使用は、従来のＭＳにＭＳ／ＭＳを後続させた手法より高感度でより簡素である利点を有する。この方法は、ＭＳスペクトルの獲得とＭＳ／ＭＳスペクトルの獲得との間の情報を処理するために必要である強力なソフトウェアを必要とせず、ＭＳスペクトル、ついでＭＳ／ＭＳスペクトルを連続させるのに必要なマシン変数の再設定を必要としない。
【００４５】
ＭＳによる同定法は、Ｓ．Ｖａｉｄｙａｎａｔｈａｎ等［２６］又はＲ．Ｅｖｅｒｌｅｙ等［２７］により記載される通り、クロマトグラフィーによる分離後で、生試料に対して、エレクトロスプレーイオン源を用いて実施することができる。ついで、異なるｍ／ｚ範囲により、微生物を同定することが可能となる。Ｓ．Ｖａｉｄｙａｎａｔｈａｎ等は２００〜２０００Ｔｈの間の範囲を用い、Ｒ．Ｅｖｅｒｌｅｙ等は、６２０〜２４５０Ｔｈの間の範囲を用いた。また、質量スペクトルをデコンボリュートして、それらの荷電状態とは独立にタンパク質の質量を見出すこともできる。従って、Ｒ．Ｅｖｅｒｌｅｙ等は、約５０００〜５００００Ｄａの間の質量を用いた。あるいは、ＭＳによる同定法もまた、Ｃｌａｙｄｏｎ等［３］並びにＴ．Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ及びＰ．Ｒｏｓｓ［４］により記載されている通り、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用して実施することができる。解析では、質量スペクトルの獲得と、専門的ソフトウェアによる解釈とを組み合わせる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、極めて簡単であり、数分間で実施されうる。この同定法は、今では医療分析実験室において採用されている［５］。
【００４６】
試料中に存在するそれらのタンパク質を介する、ＭＳ／ＭＳを後続させたＭＳによる細菌の同定は、多数の研究チームにより広く適用されている。例として述べると、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）のペプチドームについて研究した、Ｍａｎｅｓ，Ｎ．等［２８］の近年の研究、又はトリプシンによるタンパク質の消化後における細菌のプロテオームについて研究したＲ．Ｎａｎｄａｋｕｍａｒ等［２９］もしくはＬ．Ｈｅｒｎｙｃｈｏｖａ等［３０］の研究について言及することができる。従来の手法は、ｉ）ＭＳスペクトルを獲得すること、ｉｉ）強いシグナルを伴うＭＳスペクトルで観察される各プリカーサーイオンを逐次的に選択すること、ｉｉｉ）各プリカーサーイオンを逐次的にフラグメント化し、そのＭＳ／ＭＳスペクトルを獲得すること、ｉｖ）Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、英国）、又はＳＥＱＵＥＳＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、アメリカ合衆国）などのソフトウェアを介して、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ又はＮＣＢＩなどのタンパク質データベースを調べて、観察されたＭＳ／ＭＳスペクトルに相当する確率が高いペプチドを同定することからなる。種に特徴的なタンパク質又はペプチドが同定される場合は、この方法により、微生物の同定がもたらされうる。
【００４７】
質量分析を使用する利点の一つは、質量分析が、特に、分子、本発明の場合は、糖ペプチドに対する細菌の耐性の機序のマーカーを定量するのに有用である点にある。この目的のために、標的分子の量と比例する、検出される電流の強さが使用される。このようにして測定される電流の強さは、存在する標的分子の量を決定するための定量的な指標となり得、これは、モル／ｍ３単位もしくはｋｇ／ｍ３単位との国際単位系（ＳＩ）単位の表現により、又はこれらの単位の倍数もしくは約数により、又はその倍数もしくは約数を含めたＳＩ単位の通常の派生単位により特徴づけられる。非限定的な例として、ｎｇ／ｍｌ又はｆｍｏｌ／ｌなどの単位は、定量的な測定値を特徴づける単位である。
【００４８】
しかしながら、測定されるピーク面積であって、検出されるイオンにより誘導される電流の強さに対応するピーク面積を、アッセイされる標的分子の量と相関させることができるように較正が必要である。このため、本発明の文脈内では、質量分析において常套的に使用される較正が使用されうる。ＭＲＭアッセイは、外部標準を使用して、又は好ましくはＴ．Ｆｏｒｔｉｎ等［１３］により記載される内部標準を使用して常套的に較正される。標的分子が、対象のタンパク質のアッセイを可能とするタンパク質分解性ペプチドである場合は、測定されたシグナルを、アッセイされる量が既知である標準シグナルと比べて較正することにより、定量的な測定値と、標的のタンパク質分解性ペプチドとの間、その後、定量的な測定値と対象のタンパク質の量との間の相関が得られる。較正は、例えば、以下で詳述されるＡＱＵＡ法、ＱｃｏｎＣＡＴ法、又はＰＳＡＱ法に従い、例えば、標準のタンパク質分解性ペプチドを異なる濃度で逐次的に注入すること（外部較正）により、又は好ましくは内部標準としての重ペプチドを使用する内部較正により得られる検量線を用いて実施することができる。「重ペプチド」とは、タンパク質分解性ペプチドに対応するが、一又は複数の炭素１２（１２Ｃ）原子が、炭素１３（１３Ｃ）により置き換えられ、及び／又は一又は複数の窒素１４（１４Ｎ）原子が窒素１５（１５Ｎ）により置き換えられたペプチドを意味する。
【００４９】
内部標準（ＡＱＵＡ）としての重ペプチドの使用はまた米国特許出願第２００４／０２２９２８３号においても提案されている。その原理は、通常の天然同位体より重い同位体を含むアミノ酸を人工的に伴うタンパク質分解性ペプチドを合成することである。この種のアミノ酸は、例えば、炭素１２（１２Ｃ）原子の一部を、炭素１３（１３Ｃ）で置き換えることにより、又は窒素１４（１４Ｎ）原子の一部を、窒素１５（１５Ｎ）で置き換えることにより得られる。このようにして合成された人工ペプチド（ＡＱＵＡ）は、天然ペプチドと厳密に同じ（質量が大きいことを除き）物理化学的性質を有する。ＡＱＵＡペプチドは一般に、質量分析によるアッセイの上流で、例えば、対象の試料中のタンパク質の切断に至る処理と、処理工程の後で得られるペプチドの分画との間で、与えられた濃度で試料に添加される。従って、ＡＱＵＡペプチドは、ペプチドの分画中に、アッセイされる天然ペプチドと共に共精製される。従って、２つのペプチドが、アッセイのために質量分析計に同時に注入される。ついで、２つのペプチドは、イオン源内で同じイオン化量に供される。天然ペプチドのピーク面積と、その濃度が既知であるＡＱＵＡペプチドのピーク面積との比較により、天然ペプチドの濃度を計算すること、従って、アッセイされるタンパク質の濃度に到達することが可能となる。ＡＱＵＡ法の変法は、ＱｃｏｎＣＡＴという名称の下に、Ｊ．−Ｍ．Ｐｒａｔｔ等［３２］により提案された。この変法はまた特許出願国際公開第２００６／１２８４９２号にも記載されている。この変法は、様々なＡＱＵＡペプチドを連鎖させ、組換え重タンパク質の形態で人工ポリペプチドを作製することからなる。組換えタンパク質は、重同位体を含むアミノ酸で合成される。このようにして、数種のタンパク質に対する同時のアッセイを較正するための標準物質を低コストで得ることができる。ＱｃｏｎＣＡＴ標準物質は、タンパク質の切断に至る処理の上流で、タンパク質の分画、変性、還元、及びタンパク質のチオール官能基が存在する場合はそれらのブロックの工程の前でまさに最初から添加される。従って、ＱｃｏｎＣＡＴ標準物質は、天然タンパク質と同じ、タンパク質の切断に至る処理サイクルを受け、これがタンパク質の切断に至る処理工程の収量を考慮することを可能とする。実際、天然タンパク質の特に消化による処理は、完全でない場合がある。この場合、ＡＱＵＡ標準物質を用いれば、天然タンパク質の量を過小評価することになろう。従って、完全なアッセイのためには、タンパク質の切断に至る処理の収量を考慮することが重要でありうる。しかし、Ｖ．Ｂｒｕｎ等［３３］は、しばしばＱｃｏｎＣＡＴ標準物質が、ＱｃｏｎＣＡＴタンパク質とは異なる三次元立体構造のために疑いなく、特に天然タンパク質の消化による処理収量を正確に再現しなかったことを示した。
【００５０】
ついで、Ｖ．Ｂｒｕｎ等［３３］は、ＰＳＡＱと称され、特許出願第国際公開第２００８／１４５７６３号に記載された方法を使用することを提案した。この場合には、内部標準は、天然タンパク質と同じ配列を有するが、重アミノ酸により合成された組換えタンパク質である。合成は、重アミノ酸を用いてエクスビボで実施される。この標準は、天然ペプチドと厳密に同じ（質量が大きいことを除き）物理化学的性質を有する。この標準は、タンパク質の分画工程が存在する場合、その前に当初から添加される。従って、この標準は、タンパク質の分画工程中に天然タンパク質と共に共精製される。この標準は、天然タンパク質と同じ処理収量であって、特に、消化による同じ処理収量を呈する。ペプチドの分画工程が実施される場合はまた切断の後で得られる重ペプチドも、天然ペプチドと共に共精製される。従って、２つのペプチドが質量分析計に同時に注入されて、定量的にアッセイされる。ついで、２つのペプチドは、イオン源内で同じイオン化量に供される。天然ペプチドのピーク面積と、ＰＳＡＱ法における基準ペプチドのピーク面積との比較により、アッセイ手順の工程の全てを考慮して、アッセイされるタンパク質の濃度を計算することが可能となる。
【００５１】
本発明の枠組み内で、質量分析アッセイに使用され、特に、ＭＲＭ又はＭＳアッセイに使用されるこれらの技法の全て、すなわち、ＡＱＵＡ法、ＱｃｏｎＣＡＴ法、もしくはＰＳＡＱ法、又は他の任意の較正法を使用して、較正を実施することができる。
【００５２】
本発明に係る検出方法において使用される質量分析は、ＭＳ／ＭＳ型であることが好ましい。質量分析はＭＲＭであることがより好ましい。
【００５３】
本発明の方法は、耐性マーカーとして少なくとも一のペプチドを検出することを特徴とする、糖ペプチドに対する耐性の検出を可能にする。好ましくは、本発明に係る方法はバンコマイシンに対する耐性の少なくとも一のマーカーを検出することを可能にする。
一実施態様によれば、本発明に係る方法は、糖ペプチドに対する耐性を、試料中に潜在的に存在する微生物を前記糖ペプチドに接触させることなく、つまり前記耐性の誘導工程を伴わないで、直接検出することを可能にする。
他の実施態様によれば、本発明の方法は、前記試料を前記糖ペプチドに接触させることにより耐性の機序を誘導することからなる更なる工程を、検出工程の前に含む。
好ましくは、前記耐性マーカーはＶａｎ型のタンパク質、例えば、ＶａｎＡ、ＶａｎＢ、ＶａｎＣ、ＶａｎＤ、ＶａｎＥ、ＶａｎＧ、ＶａｎＬ、ＶａｎＭ及びＶａｎＮ型の各変異体のタンパク質から由来するペプチドである。
【００５４】
本発明の一実施態様によれば、タンパク質ＶａｎＡの発現に関連した、糖ペプチドに対する耐性の機序の検出は、配列番号１から配列番号４の配列のタンパク質ＶａｎＡ及びその異なった変異体に属する少なくとも一のペプチドを検出することを特徴とする。
配列番号１： 
MKKPLKTVWILKGDRSMNRIKVAILFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANINKEKYEPLYIGITKSGVWKMCEKPCAEWENDNCYSAVLSPDKKMHGLLVKKNHEYEINHVDVAFSALHGKSGEDGSIQGLFELSGIPFVGCDIQSSAICMDKSLTYIVAKNAGIATPAFWVINKDDRPVAATFTYPVFVKPARSGSSFGVKKVNSADELDYAIESARQYDSKILIEQAVSGCEVGCAVLGNSAALVVGEVDQIRLQYGIFRIHQEVEPEKGSENAVITVPADLSAEERGRIQETAKKIYKALGCRGLARVDMFLQDNGRIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGIALPELIDRLIVLALKG 
配列番号２：
MNRIKVAILFGGCSEEHDVSLKSAIEIAANINKEKYEPLYIGITKSGVWKMCEKPCAEWENDNCYSAVLSPDKKMHGLLVKKNHEYEINHVDVAFSALHGKSGEDGSIQGLFELSGIPFVGCDIQSSAICMDKSLTYIVAKNAGIATPAFWVINKDDRPVAATFTYPVFVKPARSGSSFGVKKVNSADELDYAIESARQYDSKILIEQAVSGCEVGCAVLGNSAALVVGEVDQIRLQYGIFRIHQEVEPEKGSENAVITVPADLSAEERGRIQETAKKIYKALGCRGLARVDMFLQDNGRIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGIALPELIDRLIVLALKG 
配列番号３：
MNRIKVAILFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANINKEKYEPLYIGITKSGVWKMCEKPCAEWENDNCYSAVLSPDKKMHGLLVKKNHEYEINHVDVAFSALHGKSGEDGSIQGLFELSGIPFVGCDIQSSAICMDKSLTYIVAKNAGIATPAFWVINKDDRPVAATFTYPVFVKPARSGSSFGVKKVNSADELDYAIESARQYDSKILIEQAVSGCEVGCAVLGNSAALAVGEVDQIRLQYGIFRIHQEVEPEKGSENAVITVPADLSAEERGRIQETAKKIYKALGCRGLARVDMFLQDNGRIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGIALPELIDRLIVLALKG 
配列番号４：
MNRIKVAILFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANINKEKYEPLYIGITKSGVWKMCEKPCAEWENDNCYSAVLSPDKKMHGLLVKKNHEYEINHVDVAFSALHGKSGEDGSIQGLFELSGIPFVGCDIQSSAICMDKSLTYIVAKNAGIATPAFWVINKDDRPVAATFTYPVFVKPARSGSSFGVKKVNSADELDYAIESARQYDSKILIEQAVSGCEVGCAVLGNSAALVVGEVDQIRLQYGIFRIHQEVEPEKGSENAVITVPADLSAEERGRIQETAKKIYKALGCRGLARVDMFLQDNGRIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGIALPELIDRLIVLALKG 
【００５５】
ＶａｎＡ型の前記ペプチドは、好ましくは、以下に記載された配列番号５から配列番号１６の配列のペプチドから選択される：
0006370781.tif 000002
有利には、配列番号５から配列番号１６の配列のペプチドから選択されるＶａｎＡ型のマーカーは、耐性の機序の誘導後に検出される。
有利には、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５及び配列番号１６の配列のペプチドから選択されるＶａｎＡ型のマーカーは誘導工程なしに検出される。
【００５６】
本発明の他の実施態様によれば、タンパク質ＶａｎＢの発現に関連した、糖ペプチドに対する耐性の機序の検出は、配列番号１７から配列番号２８の配列のタンパク質ＶａｎＢ及びその異なった変異体に属する少なくとも一のペプチドを検出することを特徴とする。
配列番号１７：
MNKIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANINTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPCTEWEADSLPAIFSPDRKTHGLLVMKEREYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGLFELSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIEKGDKPEARTLTYPVFVKPARSGSSFGVTKVNSTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVMGNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMIIVPADIPVEERNRVQETAKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMAAAAGITLPALIDSLITLAIER 
配列番号１８：
MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPCTEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGLFELSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTYPVFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVMGNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQETAKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGITLPALIDSLITLALKR 
配列番号１９：
MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPCTEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGLFVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQIIDKGDKPEAGALTYPVFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVMGNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQETAKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMVAAAGITLPALIDSLITLALKR 
配列番号２０：
MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPCTEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGLFVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQIIDKGDKPEAGALTYPVFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVMGNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQETAKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTMPGFTSYSRYTRMVAAAGITLPALIDSLITLALKR 
配列番号２１：
MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPCTEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGLFVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTYPVFVKPARSGSSFGLTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVMGNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQETAKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGITLPALIDSLITLALKR 
配列番号２２：
MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPCTEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGLFVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTYPVFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVMGNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQETAKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGITLPALIDSLITLALKR 
配列番号２３：
MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPCTEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGLFVLSGIPYVGCDIQSSAVCMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTYPVFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVMGNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQETAKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMVAAAGITLPALIDSLITLALKR 
配列番号２４：
MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPCTEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGGGEDGAIQGLFVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTYPVFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVMGNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQETAKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGITLPALIDSLITLALKR 
配列番号２５：
MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANINTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPCTEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGLFELSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTYPVFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVMGNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQETAKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMVAAAGITLPALIDSLITLALKR 
配列番号２６：
MNRIKVATIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPCTEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGLFVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTYPVFVKPARAGSSFGLTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVMGNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQETAKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGITLPALIDSLITLALKR 
配列番号２７：
MNRIKVATIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPCTEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGLFVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTYPVFVKPARSGSSFGLTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVMGNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQETAKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGITLPAMIDSLITLALKR 
配列番号２８：
MNRIKVATIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPCTEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGLFVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTYPVFVKPARSGSSFGVTKVNGPEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVMGNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQETAKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMVAAAGITLPALIDSLITLALKR 
【００５７】
ＶａｎＢ型の前記マーカーは、好ましくは、以下に記載される配列番号２９から配列番号３５の配列のペプチドから選択される：
0006370781.tif 000003
有利には、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２及び配列番号３３の配列のペプチドから選択されるＶａｎＢ型のマーカーは、耐性の機序の誘導後に検出される。
【００５８】
本発明の他の実施態様によれば、タンパク質ＶａｎＣの発現に関連した、糖ペプチドに対する耐性の機序の検出は、配列番号３６から配列番号５８の配列のタンパク質ＶａｎＣ及びその異なった変異体に属する少なくとも一のペプチドを検出することを特徴とする。特に、変異体ＶａｎＣ１は、配列番号３６から配列番号４３の配列のタンパク質ＶａｎＣ１及びその異なる変異体に属する少なくとも一のペプチドを検出することを特徴とし、変異体ＶａｎＣ２又はＶａｎＣ３は、配列番号４６から配列番号５１及び配列番号５３から配列番号５７の配列のタンパク質ＶａｎＣ２又はＶａｎＣ３及びその異なる変異体に属する少なくとも一のペプチドを検出することを特徴とし、変異体ＶａｎＣ４は、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５２及び配列番号５８の配列のタンパク質ＶａｎＣ４及びその異なる変異体に属する少なくとも一のペプチドを検出することを特徴とする。
配列番号３６：
MKKIAVLFGGNSPEYSVSLASAASVIQAIDPLKYEVMTIGIAPTMDWYLYQGNLANVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQGLLELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATIDRFIQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIGCGILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQLLYRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILVEQLIALAEEDKR
配列番号３７：
MKKIAVLFGGNSPEYSVSLASAASVIQAIDPLKYEVMTIGIAPTMDWYWYQGNLANVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQGLLELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATIDRFIQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIGCGILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQLLYRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILVEQLIALAEEDKR
配列番号３８：
MKKIAVLFGGNSPEYSVSLASAASVIQAIDPLKYEVMTIGIAPTMDWYWYQGNLANVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQGLLELMNLPYVGCHVAATALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATIDRFIQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIGCGILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQLLYRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILVEQLIALAEEDKR
配列番号３９：
MKKIAVLFGGNSPEYSVSLTSAASVIQAIDPLKYEVMTIGIAPTMDWYWYQGNLANVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQGLLELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATIDRFIQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIGCGILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQLLYRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILVEQLIALAEEDKR
配列番号４０：
MKKIAVLFGGNSPEYSVSLTSAASVIQAIDPLKYEVMTIGIAPTMDWYWYQGNLANVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQGLLELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATIDRFIQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIGCGILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQLLYRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILVEKLIALAEEDKR
配列番号４１：
MKKIAVLFGGNSPEYSVSLTSAESVIQAINPLKYEVMTIGIAPTMDWYWYQGNLANVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQGLLELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATIDRFIQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIGCGILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQLLYRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILVEQLIALAEEDKR
配列番号４２：
MMKKIAVLFGGNSPEYSVSLASAASVIQAIDPLKYEVMTIGIAPTMDWYWYQGNLANVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQGLLELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATIDRFIQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIGCGILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQLLYRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILVEQLIALAEEDKR
配列番号４３：
MMKKIAVLFGGNSPEYSVSLTSAASVIQAIDPLKYEVMTIGIAPTMDWYWYQGNLANVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQGLLELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATIDRFIQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIGCGILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQLLYRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILVEQLIALAEEDKR
配列番号４４：
MKKIAIIFGGNSPEYAVSLASATSAIEALQSSPDDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGELENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEAQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDGSIQGLFELMKLPYVGCGVAASALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQQDQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKNIAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETKVKEQAQLLYHSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAIGLSYQELLQKLLVLAKEEVK
配列番号４５：
MKKIAIIFGGNSPEYAVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGELENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDGSIQGLFELMKLPYVGCGVAASALCMNKWLLHQAAEAIGVQSAPTILLTNQDNQQRQIEAFIQTHDFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIAPALKEAFAYCSAVLLQKNIAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVEGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETKVKEQAQLLYHSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAIGLSYQELLQKLLVLAKEEGK
配列番号４６：
MKKIAIIFGGNSPEYAVSLASATSALEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGELENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDGSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQQEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKNIAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETKVKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAVGLSYQELLQKLLVLAKEEVK
配列番号４７：
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGELENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDGSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQQEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKNIAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETKVKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAVGLSYQELLQKLLVLAKEEVK
配列番号４８：
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGELENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDGSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQQEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKNIAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETKVKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTERGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAVGLSYQELLQKLLVLAKEEVK
配列番号４９：
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGELENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDGSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQQEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKNIVGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETKVKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAVGLSYQELLQKLLVLAKEEVK
配列番号５０：
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGELENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDGSIQGLFELMKLPYVGCGVASSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQQEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKNIVGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLEDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETKVKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAVGLSYQELLQKLLILAKEEVK
配列番号５１：
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGELENIRQDTWLLDTKHTQKIKPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDGSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQQEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKNIAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETKVKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAVGLSYQELLQKLLVLAKEEVK
配列番号５２：
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGELENIRQDTWLLDTKHTQKIQPLFEGNGFWISEAQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDGSIQGMFELMKLPYVGCGVAASALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQQRQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIAPALKEAFAYCSAVLLQKNIAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETKVKEQAQLLYHSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAVGLSYQELLQKLLVLAKEEGK
配列番号５３：
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGELENIRQDTWLLDTKQKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDGSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNHANQQEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKNIAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETKVKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAVGLSYQELLQKLLVLAKEEVK
配列番号５４：
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGELENIRQDTWLLDTKQKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDGSIQGLFELMKLPYVGCGVASSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQQEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKNIVGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLEDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETKVKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAVGLSYQELLQKLLILAKEEVK
配列番号５５：
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGELENIRQDTWLLDTKQKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDGSIQGMFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNHANQQEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKNIAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETKVKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAVGLSYQELLQKLLVLAKEEVK
配列番号５６：
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGITPDAMDWYLYTGELENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDGSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQQEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKNIAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETKVKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAVGLSYQELLQKLLVLAKEEVK
配列番号５７：
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGITPDAMDWYLYTGELENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDGSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQQEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKNIVGVEIGCGILGNDSLTVGACDTISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETKVKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAVGLSYQELLQKLLVLAKEEVK
配列番号５８：
MKKIAIIFGGNSSEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGELENIRQDTWLLDTKHTQKIQPLFEENGFWLSEAQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDGSIQGLFELMKLPYVGCGVAASALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQDNQQQQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIAPALKEAFAYCSAVLLQKNIAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVEGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETKVKEQAQLLYHSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAIGLSYQELLQKLLVLAKEEGK
【００５９】
ＶａｎＣ型の前記マーカーは、好ましくは、以下に記載される配列番号５９から配列番号７１の配列のペプチドから選択される：
0006370781.tif 000004
0006370781.tif 000005
【００６０】
本発明の他の実施態様によれば、タンパク質ＶａｎＤの発現に関連した、糖ペプチドに対する耐性の機序の検出は、配列番号７２から配列番号７９の配列のタンパク質ＶａｎＤ及びその異なった変異体に属する少なくとも一のペプチドを検出することを特徴とする。
配列番号７２：
MFKIKVAVLFGGCSEEHNVSIKSAMEIAANIDTKKYQPYYIGITKSGVWKMCEKPCLEWEQYAGDPVVFSPDRSTHGLLIQKDKGYEIQPVDVVLPMIHGKFGEDGSIQGLLELSGIPYVGCDIQSSVTCMDKALAYTVVKNAGIAVPGFRILQEGDRLETEDFVYPVFVKPARSGSSFGVNKVCKAEELQAAIEEARKYDSKILIEEAVTGSEVGCAILGNGNDLMAGEVDQIELRHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAALPDEVRERIQKTAMKIYRILGCRGLARIDLFLREDGCIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTAAGFTLTEILDRLIELSLRR
配列番号７３：
MFKIKVAVLFGGCSEEHNVSIKSAMEIAANIDTKKYQPYYIGITKSGVWKMCEKPCLGWEQYAGDPVVFSPDRSTHGLLIQKDTGYEIQPVDVVFPMIHGKFGEDGSIQGLLELSGIPYVGCDIQSSVICMDKALAYTVVKNAGIAVPGFRILQEGDRLETEDLVYPVFVKPARSGSSFGVNKVCKAEELQAAIREARKYDSKILIEEAVTGSEVGCAILGNENDLMAGEVDQIELRHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAALPDEVRERIRKTAMKIYRILGCRGLARIDLFLREDGCIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTAAGFTLSEILDRLIEFSLRR
配列番号７４：
MFRIKVAVLFGGCSEEHNVSIKSAMEIAANIDTKKYQPYYIGITKSGVWKMCEKPCLEWEQYAGDPVVFSPDRSTHGLLIQKDKGYEIQPVDVVFPMIHGKFGEDGSIQGLLELSGIPYVGCDIQSSVICMDKALAYTVVKNAGITVPGFRILQEGDRLETEDFVYPVFVKPARSGSSFGVNKVCKAEELQAAIEEARKYDSKILIEEAVTGSEVGCAILGNGNDLMAGEVDQIELRHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAALPDEVREQIQETAMKIYRILGCRGLARIDLFLREDGCIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTAAGFTLSEILDRLIELSLRR
配列番号７５：
MFRIKVAVLFGGCSEEHNVSIKSAMEIAANIDTKKYQPYYIGITKSGVWKMCEKPCLEWEQYAGDPVVFSPDRSTHGLLIQKDTGYEIQPVDVGLPMIHGKFGEDGSIQGLLELSGIPYVGCDIQSSVTCMDKALAYTVVKNAGIAVPGFRILQEGDRLETEDFVYPVFVKPARSGSSFGVNKVCKAEELQAAIEDARKYDSKILIEEAVTGSEVGCAILGNGNDLMAGEVDQIELRHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAALPDEVIERIQKTAMKIYRILGCRGLARIDLFLREDGCIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTAAGFTLTEILDRLIELSLRR
配列番号７６：
MYKLKIAVLFGGCSEEHDVSVKSAMEVAANINKEKYQPFYIGITKSGAWKLCDKPCRDWENYAGYPAVISPDRRIHGLLIQKDGGYESQPVDVVLPMIHGKFGEDGTIQGLLELSGIPYVGCDIQSSVICMDKSLAYMVVKNAGIEVPGFRVLQKGDSLEAETLSYPVFVKPARSGSSFGVNKVCRAEELQAAVTEAGKYDSKILVEEAVSGSEVGCAILGNGNDLITGEVDQIELKHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAALPDEVREQIQETAKKIYRVLGCRGLARIDLFLREDGSIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTAAGFTLSEILDRLIGLSLRR
配列番号７７：
MYKLKIAVLFGGCSEEHDVSVKSAMEVAANINKEKYQPFYIGITKSGAWKLCDKPCRDWENYAGYPAVISPDRRIHGLLIQKDGGYESQPVDVVLPMIHGKFGEDGTIQGLLELSGIPYVVCDIQSSVICMDKSLAYMVVKNAGIEVPGFRVLQKGDSLEAETLSYPVFVKPARSGSSFGVNKVCRAEELQAAVTEAGKYDSKILVEEAVSGSEVGCAILGNGNDLITGEVDQIELKHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAALPDEVREQIQETAKKIYRVLGCRGLARIDLFLREDGSIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTAAGFTLSEILDRLIGLSLRR
配列番号７８：
MYKLKIAVLFGGCSEEHDVSVKSAMEVAANINKEKYQPFYIGITKSGAWKLCDKPCRDWENYAGYPAVISPDRRTHGLLIQKDGGYESQPVDVVLPMIHGKFGEDGTIQGLLELSGIPYVGCDIQSSVTCMDKSLAYMVVKNAGIEVPGFRVLQKGDSLKAETLSYPVFVKPARSGSSFGVNKVCRAEELQAAVTEAGKYDCKILVEEAVSGSEVGCAILGNENALMAGEVDQIELRHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAVLPDEVRERIQKTAMKIYRILGCRGLARIDLFLREDGCIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTAAGFTLTEILDRLIELSLRR
配列番号７９：
MYRINVAVLFGGCSEEHTVSIKSAMELAANIDTEKYQPFYIGITKSGVWKLCEKPCLDWEQYAKYPVVFSPGRNTHGFLIQKEDRYEIQPVDVVFPIIHGKFGEDGSIQGLLELSGIPYVGCDIQSSVICMDKSLAYTTVKNAGIEVPDFQIIQDGDSPKTECFSFPLFVKPARSGSSFGVNKVDKAEDLCAAINEARQYDRKVLIEQAVSGSEVGCAVLGTGTDLIVGEVDQISLKHGFFKIHQEAQPEKGSENATIEVPADLPAKVRERIQKTAKKIYQVLGCRGLARIDLFLREDGHIVLNEVNTMPGFTSYSRYPCMMTAAGFTLSELIDRLIELALRR
【００６１】
ＶａｎＤ型の前記マーカーは、好ましくは、以下に記載される配列番号８０から配列番号８３の配列ペプチドの配列から選択される
0006370781.tif 000006
有利には、配列番号８０、配列番号８１及び配列番号８３の配列のペプチドから選択されるＶａｎＤ型のマーカーは、耐性の機序の誘導後に検出される。
有利には、配列番号８０、配列番号８１及び配列番号８３の配列のペプチドから選択されるＶａｎＤ型のマーカーは誘導工程なしに検出される。
【００６２】
本発明の他の実施態様によれば、タンパク質ＶａｎＥの発現に関連した、糖ペプチドに対する耐性の機序の検出は、配列番号８４の配列のタンパク質ＶａｎＥに属する少なくとも一のペプチドを検出することを特徴とする。
配列番号８４：
MKTVAIIFGGVSSEYEVSLKSAVAIIKNMESIDYNVMKIGITEEGHWYLFEGTTDKIKKDRWFLDESCEEIVVDFAKKSFVLKNSKKIIKPDILFPVLHGGYGENGAMQGVFELLDIPYVGCGIGAAAISMNKIMLHQFAEAIGVKSTPSMIIEKGQDLQKVDAFAKIHGFPLYIKPNEAGSSKGISKVERKSDLYKAIDEASKYDSRILIQKEVKGVEIGCGILGNEQLVVGECDQISLVDGFFDYEEKYNLVTAEILLPAKLSIDKKEDIQMKAKKLYRLLGCKGLARIDFFLTDDGEILLNEINTMPGFTEHSRFPMMMNEIGMDYKEIIENLLVLAVENHEKKLSTID
【００６３】
ＶａｎＥ型の前記マーカーは、好ましくは、以下に記載される配列番号８５から配列番号９１の配列ペプチドの配列から選択される
0006370781.tif 000007
有利には、配列番号８９の配列のペプチドに対応するＶａｎＥ型のマーカーは、耐性の機序の誘導後に検出される。
【００６４】
本発明の他の実施態様によれば、タンパク質ＶａｎＧの発現に関連した、糖ペプチドに対する耐性の機序の検出は、配列番号９２から配列番号９４の配列のタンパク質ＶａｎＧ及びその異なる変異体に属する少なくとも一のペプチドを検出することを特徴とする。
配列番号９２：
MIKKRIAIIFGGNSTEYEVSLQSASAVFENINTKKFDIVPIGITRNGDWYHYTGKKEKIANNTWFEDNENLYSVAVSQNRSVKGFIEFKEEKFYIIKVDLIFPVLHGKNGEDGTLQGLFELAGIPVVGCDTLSSALCMDKDKAHKLVSLAGISVPKSVTFKFSGKKAALKKIEKELSYPLFVKPVRAGSSFGITKVTKQQELENAIQLAFEHDAEVIVEETINGFEVGCAVLGIDELIVGRVDEIELSSGFFDYTEKYTLKSSKIYMPARIDAEAEKRIQETAVTIYKALGCSGFSRVDMFYTPSGEIVFNEVNTIPGFTSHSRYPNMMKGIGLSFAQMLDKLIGLYVE
配列番号９３：
MQNKKIAVIFGGNSTEYEVSLQSASAVFENINTNKFDIIPIGITRSGEWYHYTGEKEKILNNTWFEDSKNLCPVVVSQNRSVKGFLEIASDKYRIIKVDLVFPVLHGKNGEDGTLQGIFELAGIPVVGCDTLSSALCMDKDRAHKLVSLAGISVPKSVTFKRFNEEAAMKEIEANLTYPLFIKPVRAGSSFGITKVIEKQELDAAIELAFEHDTEVIVEETINGFEVGCAVLGIDELIVGRVDEIELSSGFFDYTEKYTLKSSKIYMPARIDAEAEKRIQEAAVTIYKALGCSGFSRVDMFYTPSGEIVFNEVNTIPGFTSHSRYPNMMKGIGLSFSQMLDKLIGLYVE
配列番号９４：
MQNKKIAVIFGGNSTEYEVSLQSASAVFENINTNKFDIIPIGITRSGEWYHYTGEKEKILNNTWFEDSKNLCPVVVSQNRSVKGFLEIASDKYRIIKVDLVFPVLHGKNGENGTLQGIFELAGIPVVGCDTLSSALCMDKDRAHKLVSLAGISVPKSVTFKRFNEEAAMKEIEANLTYPLFIKPVRAGSSFGITKVIEKQELDAAIELAFEHDTEVIVEETINGFEVGCAVLGIDELIVGRVDEIELSSGFFDYTEKYTLKSSKIYMPARIDAEAEKRIQEAAVTIYKALGCSGFSRVDMFYTPSGEIVFNEVNTIPGFTSHSRYPNMMKGIGLSFSQMLDKLIGLYVE
【００６５】
ＶａｎＧ型の前記マーカーは、好ましくは、以下に記載される配列番号９５から配列番号１０２の配列ペプチドの配列から選択される
0006370781.tif 000008
有利には、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号１００及び配列番号１０２の配列のペプチドから選択されるＶａｎＧ型のマーカーは、耐性の機序の誘導後に検出される。
有利には、配列番号９７及び配列番号１００の配列のペプチドから選択されるＶａｎＧ型のマーカーは誘導工程なしに検出される。
【００６６】
本発明の他の実施態様によれば、タンパク質ＶａｎＬの発現によって誘導される、糖ペプチドに対する耐性の機序の検出は、配列番号１０３の配列のタンパク質ＶａｎＬに属する少なくとも一のペプチドを検出することを特徴とする。
配列番号１０３：
MMKLKKIAIIFGGQSSEYEVSLKSTVSVLETLSTCNFEIIKIGIDLGGKWYLTTSNNKDIEYDVWQTDPSLQEIIPCFNNRGFYNKTTNKYFRPDVLFPILHGGTGEDGTLQGVFELMNIPYVGCGVTPSAICMDKYLLHEFAQSVGVKSAPTLIIRTRNCKDEIDKFIEKNDFPIFVKPNEAGSSKGINKVNEPDKLEDALTEAFKYSKSVIIQKAIIGREIGCAVLGNEKLLVGECDEVSLNSDFFDYTEKYQMISAKVNIPASISVEFSNEMKKQAQLLYRLLGCSGLARIDFFLSDNNEILLNEINTLPGFTEHSRYPKMMEAVGVTYKEIITKLINLAEEKYYG
【００６７】
ＶａｎＬ型の前記マーカーは、好ましくは、以下に記載される配列番号１０４から配列番号１２０の配列ペプチドの配列から選択される：
0006370781.tif 000009
【００６８】
本発明の他の実施態様によれば、タンパク質ＶａｎＭの発現によって誘導される、糖ペプチドに対する耐性の機序の検出は、配列番号１２１の配列のタンパク質ＶａｎＭに属する少なくとも一のペプチドを検出することを特徴とする。
配列番号１２１：
MNRLKIAILFGGCSEEHNVSVKSAAEIANNIDIGKYEPIYIGITQSGVWKTCEKPCIDWDNEHCRSAVLSPDKKMHGLLIMQDKGYQIQRIDVVFSVLHGKSGEDGAIQGLFELSGIPYVGCDIQSSAVCMDKSLAYIIAKNAGIATPEFQVIYKDDKPAADSFTYPVFVKPARSGSSYGVNKVNSADELDSAIDLARQYDSKILIEQGVLGYEVGCAVLGNSFDLIVGEVDQIRLQHGIFRIHQEAEPEKGSENATITVPAELSAEERERIKEAAKNIYKALGCRGLSRVDMFLQDNGRIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMVSAGITIPELIDHLIVLAVKE
【００６９】
ＶａｎＭ型の前記マーカーは、好ましくは、以下に記載される配列番号１２２から配列番号１３９の配列ペプチドの配列から選択される：
0006370781.tif 000010
【００７０】
本発明の他の実施態様によれば、タンパク質ＶａｎＮの発現によって誘導される、糖ペプチドに対する耐性の機序の検出は、配列番号１４０の配列のタンパク質ＶａｎＮに属する少なくとも一のペプチドを検出することを特徴とする。
配列番号１４０：
MKKIALIFGGTSAEYEVSLKSAASVLSVLENLNVEIYRIGIASNGKWYLTFSDNETIとLWLQDKKLNEITPSFDGRGFYDQAEKVYFKPDVLFPMLHGGTGENGTLQGVFECMQIPYVGCGVASSAICMNKYLLHQFAKSVGVMSTPTQLISSTDEQQVIKNFTELYGFPIFIKPNEAGSSKGISKVHTEAELTKALTEAFQFSQTVILQKAVSGVEIGCAILGNDQLLVGECDEVSLATDFFDYTEKYQMTTAKLTVPAKIPVATSREIKRQAQLLYQLLGCQGLARIDFFLTEAGEILLNEINTMPGFTNHSRFPAMMAATGITYQELISTLITLAEDK
【００７１】
ＶａｎＮ型の前記マーカーは、好ましくは、以下に記載される配列番号１４１から配列番号１５４の配列ペプチドの配列から選択される：
0006370781.tif 000011
【００７２】
本発明の方法とその利点は、該方法の幾つかの非限定的な実施例を提供する本明細書の残りの部分から明らかとなるであろう。
【実施例】
【００７３】
実施例１：微生物富化による一次尿試料の調製：
次のプロトコールが１６工程（工程５〜１２は任意であり、富化された試料が、後で実施例６とそれ以降の実施例に従って処理される場合は、省略されうる）で実施される：
１．２０００ｇで３０秒間、５ｍＬの夾雑物を含む尿を遠心分離
２．上清の回収
３．１５０００ｇで５分間、遠心分離
４．上清の廃棄
５．再懸濁により、３ｍＬの蒸留水でペレットを洗浄
６．１５０００ｇで５分間、遠心分離
７．上清の廃棄
８．ペレットを溶媒（１容量のメタノールに対して８容量アセトン）に接触させて１／１０に希釈
９．−２０℃で１時間、静置
１０．１５０００ｇで５分間、遠心分離
１１．上清の廃棄
１２．ペレットを溶媒（１容量のメタノールに対して８容量アセトン）に接触させて１／１０に希釈
１３．−２０℃で１時間、静置
１４．１５０００ｇで５分間、遠心分離
１５．上清の廃棄
ペレットは、微生物が富化された試料を構成する。
【００７４】
実施例２：抗生物質の不存在下での培養培地における試料の培養：
至適培養培地及び至適培養条件は、微生物の種に応じて異なる。初期設定では、試料は、次の様々な培地上に播種される：
・  好気性又は嫌気性雰囲気中、３５℃で１８から２４時間にわたる、Ｃｏｌｕｍｂｉａヒツジ血液寒天（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ照会番号４３０４１）；
・  ３７℃で１８から２４時間にわたる、ＴＳＡ寒天（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ照会番号４３０１１）。
【００７５】
実施例３：抗生物質の存在下での培養培地における試料の培養：
試料は次の培地に播種される：
・  好気性又は嫌気性雰囲気中、３５℃で１８から２４時間にわたる、ＶＲＥ寒天（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ照会番号４３００２）。この培地はバンコマイシンを含む。
【００７６】
実施例４：生化学的プロファイルによる微生物の同定：
同定は次の通りに実施される：
１．実施例２又は実施例３に従って、又は実施例１に係る一次試料中に存在する微生物の富化によって、得られた単離コロニーを選択する
２．無菌条件を守り、３．０ｍＬの水性滅菌生理食塩液（０．４５−０．５０％のＮａＣｌ、ｐＨ４．５から７．０）を透明プラスチック（ポリスチレン）試験管に移す
３．棒又は滅菌スワブを使用し、十分な数の同一のコロニーを、工程２で調製された生理食塩液の試験管に移し、細菌懸濁液を、ＶＩＴＥＫ（登録商標）の較正ＤＥＮＳＩＣＨＥＫにより、０．５０から０．６３マクファーランドの間に調整する
４．細菌懸濁液の試験管及びＶＩＴＥＫ（登録商標）同定カードを、ＶＩＴＥＫ（登録商標）カートリッジに取付ける
５．カートリッジをＶＩＴＥＫ（登録商標）機器に装填する
６．充填、密封、インキュベーション及び読取りの操作は自動である
７．生化学的プロファイルを獲得する
既知の株の生化学的プロファイルとの比較により、ＶＩＴＥＫ（登録商標）システムでの同定が実施される。
【００７７】
実施例５：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる試料の微生物の同定
同定は次の通りに実施される：
１．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析のために、１μｌのループを使用して、実施例２又は３に従って得られた微生物コロニーの一部、あるいは実施例１に従い富化された試料を移し、プレート上で均一に沈着させる
２．沈着物を１μｌのマトリックスで覆う。用いられるマトリックスは、有機溶媒（５０％のアセトニトリル及び２．５％のトリフルオロ酢酸）中のＨＣＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸）の飽和溶液である
３．周囲温度で乾燥させる
４．プレートを質量分析計に導入する
５．質量スペクトルを獲得する
６．得られたスペクトルを、知識ベースに含まれるスペクトルと比較する
７．得られたピークを知識ベースのものと比較することにより、微生物を同定する
【００７８】
実施例６：ＥＳＩ−ＭＳによる試料の微生物の同定
同定は次の通りに実施される：
１．実施例２又は３に従って得られた微生物コロニー、あるいは実施例１に従い富化された試料をサンプリングし、１００μｌの脱塩水に懸濁させる。
２．３０００ｇで５分間、遠心分離する。
３．上清を廃棄する。
４．１００μｌの脱塩水中に再懸濁させる。
５．３０００ｇで５分間遠心分離する。
６．上清を廃棄する。
７．１００μｌのアセトニトリル、脱塩水、及びギ酸の混合物（５０／５０／０．１％）に再懸濁させる。
８．細孔径が０．４５μｍのフィルターで濾過する。
９．単一ＭＳモードで質量分析計に注入する。
１０．質量スペクトルを獲得する。
１１．得られたスペクトルを、知識ベースに含まれるスペクトルと比較する。
１２．基準スペクトルを参照することにより、微生物を同定する。
【００７９】
実施例７：微生物からの消化タンパク質の取得
次のプロトコールは１７工程で実施される：
１．実施例２又は３に従って得られた微生物コロニー、又は実施例１に従って富化された試料をサンプリングし、１０から１００μｌの塩酸グアニジン６Ｍ溶液、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０中に懸濁させる。
２．ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加して５ｍＭの最終濃度を得る。
３．水浴中９５℃で２０分間還元する。
４．試験管を周囲温度まで冷却する。
５．ヨードアセトアミドを添加して、１２．５ｍＭの最終濃度を得る。
６．周囲温度、暗所内で４０分間アルキル化させる。
７．５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３溶液、ｐＨ＝８．０で６倍に希釈して、塩酸グアニジンの最終濃度１Ｍを得る。
８．１μｇのトリプシンを添加する。
９．３７℃で６時間、一晩、消化させる。
１０．ｐＨが４を下回るまでギ酸を添加して、反応を停止させる。
１１．試料容量を、水／ギ酸０．５％（ｖ／ｖ）を用いて１ｍＬにする。
１２．Ｗａｔｅｒｓ Ｏａｓｉｓ ＨＬＢカラムを、１ｍｌのメタノール、ついで、１ｍｌのＨ２Ｏ／ギ酸０．１％（ｖ／ｖ）で平衡化する。
１３．重力により流下する試料を沈着させる。
１４．１ｍｌのＨ２Ｏ／ギ酸０．１％（ｖ／ｖ）で洗浄する。
１５．８０％のメタノールと２０％の水／ギ酸０．１％（ｖ／ｖ）との混合物１ｍＬで溶出させる。
１６．溶出物を、ＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標）ＳＰＤ２０１０型のエバポレータ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、アメリカ合衆国）で、２時間にわたり蒸発させて、約１００μｌの容量を得る。
溶出物はついで２００μｌにするのに十分な量（ＱＳ）の水／ギ酸０．５％（ｖ／ｖ）溶液に取り上げられる。
【００８０】
実施例８：ＶａｎＡ、ＶａｎＢ、ＶａｎＣ１、ＶａｎＤ、ＶａｎＥ及びＶａｎＧ型の誘導なしの糖ペプチドに対する耐性の同定：
試料Ｓｍｐ１からＳｍｐ１３が、実施例１から６に記載される方法の一つに従って同定される。種の同定は表１に報告される。
0006370781.tif 000012
【００８１】
試料Ｓｍｐ１からＳｍｐ１１は、Ｖａｎ型の耐性機序を有しうる種に対応する。ついで、次の方法が、そのような機序を調べるために用いられる。
微生物コロニーが実施例２に従って得られ、実施例７に従って処理され、ついで、容量５０μｌの消化されたタンパク質が注入され、次の条件に従って分析される：
・  Ｄｉｏｎｅｘ社（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、米国）からのＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００クロマトグラフィーチェイン。
・  Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ１３０ Ｃ１８カラム、内径２．１ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子サイズ３．５μｍ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｓａｉｎｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｅｎ Ｙｖｅｌｉｎｅｓ、フランス）。
・  溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸。
・  溶媒Ｂ：ＡＣＮ＋０．１％ギ酸。
ＨＰＬＣの勾配は、以下の表２に規定。
【００８２】
0006370781.tif 000013
・  クロマトグラフィーカラムから出てくる溶出物は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、米国）によるＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００質量分析計のイオン化源に直接的に注入される。
・  微生物のタンパク質の消化に由来するペプチドが、ＭＲＭモードの質量分析計により分析される。表３に示されるペプチドだけが検出される。このために、表３に示される（一又は複数の）断片が検出される。
【００８３】
0006370781.tif 000014
0006370781.tif 000015
0006370781.tif 000016
0006370781.tif 000017
表３に挙げられたトランジッションは表４及び５に示したパラメーターを使用して検出される。
【００８４】
0006370781.tif 000018
0006370781.tif 000019
0006370781.tif 000020
0006370781.tif 000021
【００８５】
0006370781.tif 000022
0006370781.tif 000023
0006370781.tif 000024
0006370781.tif 000025
【００８６】
使用される他のマシン変数は次の通りである：
走査の種類：  ＭＲＭ
ＭＲＭの設計：  あり
極性：  正
イオン化源：  Ｔｕｒｂｏ Ｖ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）
Ｑ１の設定：  ユニット分解能でのフィルタリング
Ｑ３の設定：  ユニット分解能でのフィルタリング
走査間の休止：  ５．００ｍｓ
走査速度：  １０Ｄａ／秒
カーテンガス：  ５０．００ｐｓｉ
コーン電圧：  ５５００．００Ｖ
イオン源の温度：  ５００．００℃
噴霧化ガス：  ５０．００ｐｓｉ
加熱ガス：  ４０．００ｐｓｉ
解離を誘導する衝突ガス：  ９．００ｐｓｉ
ダイナミックフィリング：  不活性化
全サイクル時間：  １．２ｓ
検出範囲：  ９０ｓ
【００８７】
トランジションの各々及び研究される微生物の各々について得られる面積を測定した。トランジションの面積が表５に記載の正の閾値より大きいか又は等しいとき、トランジションの検出は陽性とみなされ、表６で「１」とマークされる。トランジションの面積が、表５に記載の正の閾値より少ないときは、トランジションの検出は陰性と見なされ、表６で「０」とマークされる。一つの同じペプチドの３つのトランジションが「１」とマークされるとき、ペプチドの検出は陽性とみなされる。特定の一ケースはこの規則に対する例外である。数４９、５０及び５１を持つトランジションに相当するペプチドは非常に低い強度のトランジションを有している。この特定の場合では、トランジション４９及び５０が「１」とマークされる場合、このペプチドの検出は陽性とみなされる。
【００８８】
0006370781.tif 000026
0006370781.tif 000027
0006370781.tif 000028
0006370781.tif 000029
【００８９】
試料Ｓｍｐ１、Ｓｍｐ２、Ｓｍｐ４、Ｓｍｐ５、Ｓｍｐ７及びＳｍｐ９は、Ｖａｎ型の耐性に特徴的な何れのペプチドも有していない。試料Ｓｍｐ１、Ｓｍｐ２、Ｓｍｐ４、Ｓｍｐ５、Ｓｍｐ７及びＳｍｐ９中に存在する細菌はバンコマイシン又はテイコプラニン型の糖ペプチドに感受性でありうる。
試料Ｓｍｐ３、Ｓｍｐ１０及びＳｍｐ１１はＶａｎＡに特徴的な少なくとも一のペプチドを含む。よって、試料Ｓｍｐ３、Ｓｍｐ１０及びＳｍｐ１１中に存在する細菌はリガーゼＶａｎＡを発現し、これがそれらにバンコマイシン及びテイコプラニンに対する耐性を賦与する。
試料Ｓｍｐ６はＶａｎＧに特徴的な少なくとも一のペプチドを含む。よって、試料Ｓｍｐ６中に存在する細菌はリガーゼＶａｎＧを発現し、これがそれにバンコマイシンに対する耐性を賦与する。
試料Ｓｍｐ８はＶａｎＤに特徴的な少なくとも一のペプチドを含む。よって、試料Ｓｍｐ８中に存在する細菌はリガーゼＶａｎＤを発現し、これがそれにバンコマイシン及びテイコプラニンに対する耐性を賦与する。
【００９０】
従って、有利には、糖ペプチドに対する耐性の幾つかの機序が同時に調べられる。特に有利には、誘導性耐性の機序、例えばＶａｎＡの発現に関連した耐性の機序が、微生物の培養中に誘導相なしに検出される。従って、この方法は、糖ペプチドに対する耐性の機序を、その存在の先験的な可能性なしに、調べることを可能にする。
【００９１】
実施例９：ＶａｎＡ、ＶａｎＢ、ＶａｎＤ、ＶａｎＥ、及びＶａｎＧ型の誘導を伴う糖ペプチドに対する耐性の同定
試料Ｓｍｐ１からＳｍｐ１１が、実施例１から６に記載の方法の一つに従って同定される。種の同定は表７に報告される。
0006370781.tif 000030
試料Ｓｍｐ１２からＳｍｐ２０はＶａｎ型の耐性の機序を有しうる種に対応する。ついで、そのような機序を調べるために次の方法が用いられる。
微生物コロニーが実施例３に従って得られ、ついで、実施例７に従って処理され、実施例８に従って分析される。
【００９２】
トランジションの各々及び研究される微生物の各々について得られる面積を測定した。トランジションの面積が表５に記載の正の閾値より大きいか又は等しいとき、トランジションの検出は陽性とみなされ、表８で「１」とマークされる。トランジションの面積が、表５に記載の正の閾値より少ないときは、トランジションの検出は陰性と見なされ、表８で「０」とマークされる。一つの同じペプチドの３つのトランジションが「１」とマークされるとき、ペプチドの検出は陽性とみなされる。特定の一ケースはこの規則に対する例外である。数４９、５０及び５１を持つトランジションに相当するペプチドは非常に低い強度のトランジションを有している。この特定の場合では、トランジション４９及び５０が「１」とマークされる場合、このペプチドの検出は陽性とみなされる。
0006370781.tif 000031
0006370781.tif 000032
0006370781.tif 000033
0006370781.tif 000034
【００９３】
試料Ｓｍｐ１２は、Ｖａｎ型の耐性に特徴的な何れのペプチドも有していない。試料Ｓｍｐ１２中に存在する細菌はバンコマイシン又はテイコプラニン型の糖ペプチドに感受性でありうる。
試料Ｓｍｐ１９及びＳｍｐ２０はＶａｎＡに特徴的な少なくとも一のペプチドを含む。よって、試料Ｓｍｐ１９及びＳｍｐ２０中に存在する細菌はリガーゼＶａｎＡを発現し、これがそれらにバンコマイシン及びテイコプラニンに対する耐性を賦与する。
試料Ｓｍｐ１３、Ｓｍｐ１４及びＳｍｐ１８はＶａｎＢに特徴的な少なくとも一のペプチドを含む。よって、試料Ｓｍｐ１３、Ｓｍｐ１４及びＳｍｐ１８中に存在する細菌はリガーゼＶａｎＢを発現し、これがそれにバンコマイシンに対する耐性を賦与する。
試料Ｓｍｐ１５はＶａｎＧに特徴的な少なくとも一のペプチドを含む。試料Ｓｍｐ１５中に存在する細菌はリガーゼＶａｎＧを発現し、これがそれにバンコマイシンに対する耐性を賦与する。
試料Ｓｍｐ１６はＶａｎＥに特徴的な少なくとも一のペプチドを含む。試料Ｓｍｐ１６中に存在する細菌はリガーゼＶａｎＥを発現し、これがそれにバンコマイシンに対する耐性を賦与する。
試料Ｓｍｐ１７はＶａｎＤに特徴的な少なくとも一のペプチドを含む。試料Ｓｍｐ１７中に存在する細菌はリガーゼＶａｎＤを発現し、これがそれにバンコマイシン及びテイコプラニンに対する耐性を賦与する。
従って、有利には、糖ペプチドに対する耐性の幾つかの機序が同時に調べられうる。
【００９４】
実施例１０：微生物からの消化されたタンパク質の取得
次のプロトコールは、１６工程で実施される：
１．実施例８に従って得られた微生物コロニーの試料を取り上げ、０．０５ｍｍから２ｍｍの直径のガラスビーズを含む試験管中で１００μｌの重炭酸アンモニウム５０ｍＭ溶液、ｐＨ＝８．０中に懸濁させる。
２．ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加して５ｍＭの最終濃度を得る。
３．Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒプローブ（機器設定：振幅：１００、サイクル：１）において９５℃で５分間還元する。
４．試験管を周囲温度まで冷却する。
５．ヨードアセトアミドを添加して、１２．５ｍＭの最終濃度を得る。
６．周囲温度、光を遮断して５分間アルキル化させる。
７．１μｇのトリプシンを添加する。
８．５０℃で１５分間、消化させる。
９．ｐＨが４を下回るまでギ酸を添加して、反応を停止させる。
１０．１５０００ｇで５分間遠心分離し、上清を回収し、水／ギ酸０．５％（ｖ／ｖ）を用いて１ｍＬにする。
１１．Ｗａｔｅｒｓ Ｏａｓｉｓ ＨＬＢカラムを、１ｍｌのメタノール、ついで、１ｍｌのＨ２Ｏ／ギ酸０．１％（ｖ／ｖ）で平衡化する。
１２．重力により流下する試料を沈着させる。
１３．１ｍｌのＨ２Ｏ／ギ酸０．１％（ｖ／ｖ）で洗浄する。
１４．８０％のメタノールと２０％の水／ギ酸０．１％（ｖ／ｖ）の混合物１ｍｌで溶出させる。
１５．約１００μｌの容量を得るために、溶出物を、ＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標）ＳＰＤ２０１０型のエバポレータ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、アメリカ合衆国）で、２時間にわたり蒸発させる。
１６．溶出物はついで１５０μｌにするのに十分な量（ＱＳ）の水／ギ酸０．５％（ｖ／ｖ）溶液に取り上げられる。
【００９５】
実施例１１：ＶａｎＡ型の誘導を伴わない糖ペプチドに対する耐性の同定
試料Ｓｍｐ２１及びＳｍｐ２２が、実施例１から６に記載の方法の一つに従って同定される。種の同定は表９に報告される。
0006370781.tif 000035
試料Ｓｍｐ２１及びＳｍｐ２２は、Ｖａｎ型の耐性の機序を有しうる種エンテロコッカス・フェカリスに対応する。ついで、そのような機序を調べるために次の方法が用いられる。
【００９６】
以下に記載の要素は別にして、各試料は実施例１０に従って処理され、実施例８に従って分析される。
表３に記載のトランジションは表１０及び１１に示されたパラメータを使用して検出される。
0006370781.tif 000036
0006370781.tif 000037
0006370781.tif 000038
0006370781.tif 000039
【００９７】
0006370781.tif 000040
0006370781.tif 000041
0006370781.tif 000042
0006370781.tif 000043
【００９８】
使用される他のマシン変数は次の通りである：
走査の種類：  ＭＲＭ
ＭＲＭの設計：  あり
極性：  正
イオン化源：  Ｔｕｒｂｏ Ｖ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）
Ｑ１の設定：  ユニット分解能でのフィルタリング
Ｑ３の設定：  ユニット分解能でのフィルタリング
走査間の休止：  ５．００ｍｓ
走査速度：  １０Ｄａ／ｓ
カーテンガス：  ５０．００ｐｓｉ
コーン電圧：  ５５００．００Ｖ
イオン源の温度：  ５００．００℃
噴霧化ガス：  ５０．００ｐｓｉ
加熱ガス：  ４０．００ｐｓｉ
解離を誘導する衝突ガス：  ９．００ｐｓｉ
ダイナミックフィリング：  不活性化
全サイクル時間：  １．２ｓ
検出範囲：  ９０ｓ
【００９９】
トランジションの各々及び研究される微生物の各々について得られる面積を測定した。トランジションの面積が表１１に記載の正の閾値より大きいか又は等しいとき、トランジションの検出は陽性とみなされ、表１２で「１」とマークされる。トランジションの面積が、表１１に記載の正の閾値より少ないときは、トランジションの検出は陰性と見なされ、表１２で「０」とマークされる。一つの同じペプチドの３つのトランジションが「１」とマークされるとき、ペプチドの検出は陽性とみなされる。特定の一ケースはこの規則に対する例外である。数４９、５０及び５１を持つトランジションに相当するペプチドは非常に低い強度のトランジションを有している。この特定の場合では、トランジション４９及び５０が「１」とマークされる場合、このペプチドの検出は陽性とみなされる。
0006370781.tif 000044
0006370781.tif 000045
0006370781.tif 000046
0006370781.tif 000047
【０１００】
試料Ｓｍｐ２１及びＳｍｐ２２はＶａｎＡに特徴的な少なくとも一のペプチドを含む。試料Ｓｍｐ２１及びＳｍｐ２２中に存在する細菌はリガーゼＶａｎＡを発現し、これがそれらにバンコマイシン及びテイコプラニンに対する耐性を賦与する。
従って、特に有利には、誘導性耐性の機序、例えばＶａｎＡの発現に関連した耐性の機序が、３時間未満で実施される試料調製相後に、微生物の培養中の誘導相なしに検出される。従って、この方法は、糖ペプチドに対する耐性の機序を、その存在の先験的な可能性なしに、調べることを可能にする。
【０１０１】
実施例１２：誘導なしでの糖ペプチドに対する耐性の同定
試料Ｓｍｐ２３及びＳｍｐ２４が、実施例１から６に記載される方法の一つに従って同定される。種の同定は表１３に報告される。
0006370781.tif 000048
【０１０２】
試料Ｓｍｐ２３、Ｓｍｐ２４及びＳｍｐ２５は、Ｖａｎ型の耐性機序を有しうる、種エンテロコッカス・フェカリス又はエンテロコッカス・フェシウムに対応する。
ついで、次の方法が、そのような機序を調べるために用いられる。
各試料は、次の修正を伴って、実施例１０に従って処理される：
・  工程１：３ｃｍのコロニー株が（先にコロニーに対して）１０μｌのループを用いて取り上げられる。
・  工程７：２μｇのトリプシンを添加する。
各試料は、以下に記載の要素を除いて、実施例８に従って分析される。
表３に述べられたトランジションは表４及び１１に示したパラメータを使用して検出される。
実施例８における如く、陽性の面積は表１４において「１」とマークされる。陽性のペプチドは実施例８の規則に従って検出される。
0006370781.tif 000049
0006370781.tif 000050
0006370781.tif 000051
0006370781.tif 000052
【０１０３】
試料Ｓｍｐ２３はＶａｎＢに特徴的な少なくとも一のペプチドを含む。試料Ｓｍｐ２３中に存在する細菌はリガーゼＶａｎＢを発現し、これがそれらにバンコマイシンに対する耐性を賦与する。
試料Ｓｍｐ２５はＶａｎＡに特徴的な少なくとも一のペプチドを含む。試料Ｓｍｐ２５中に存在する細菌はリガーゼＶａｎＡを発現し、これがそれらにバンコマイシン及びテイコプラニンに対する耐性を賦与する。
逆に、試料Ｓｍｐ２４はＶａｎ型の耐性に特徴的な何れのペプチドも有していない。試料Ｓｍｐ２４中に存在する細菌はバンコマイシン又はテイコプラニン型の糖ペプチドに感受性でありうる。
【０１０４】
従って、特に有利には、誘導性耐性の機序、例えばＶａｎＢの発現に関連した耐性の機序が、３時間未満で実施される試料調製相後に、微生物の培養中の誘導相なしに検出される。また非常に有利には、糖ペプチドに対する耐性の機序の全てを同時に調べ検出することができる。よって、耐性の２つの機序、ＶａｎＢ及びＶａｎＡが、同じ方法を使用してそれぞれ試料Ｓｍｐ２３及びＳｍｐ２５中で検出される。従って、この方法は、その存在の先験的な可能性なしに糖ペプチドに対する耐性の機序を迅速に調べることを可能にする。
【０１０５】
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