(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素；
Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｙ’、Ｒ、およびＲ’は独立に、水素、アルキル、アルコキシ、またはこれらの組み合わせであり、ここでアルキル基またはアルコキシ基が存在する場合は、それは４以下の炭素原子を有する、式ＩＩＩ：
【化１】
0006437430.tif 000018
のベンジジンタイプの発色反応生成物；および
Ｒが、メチル、エチル、またはプロピル、またはこれらの混合物である、式Ｉ：Ｒ−ＳＯ３Ｈの化合物であるスルホン酸を含む、比色分析用組成物。
【請求項２】
上記スルホン酸が、０．０２Ｍから２．０Ｍの範囲にある量で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記組成物のｐＨが、０．２から４の範囲にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
上記発色反応生成物が、酸化テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
上記酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、大豆ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ＮＡＤＨペルオキシダーゼＮＡＤＰＨペルオキシダーゼ、脂肪酸ペルオキシダーゼ、およびカタラーゼから選択されるペルオキシダーゼおよび／またはオキシダーゼである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
（ａ）酵素および
Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｙ’、Ｒ、およびＲ’は独立に、水素、アルキル、アルコキシ、またはこれらの組み合わせであり、ここでアルキル基またはアルコキシ基が存在する場合は、それは４以下の炭素原子を有する、式ＩＩＩ：
【化２】
0006437430.tif 000019
のベンジジンタイプの発色基質を含む反応組成物を提供するステップ；
（ｂ）上記反応組成物にベンジジンタイプの発色反応生成物を形成させるステップ；
（ｃ）Ｒがメチル、エチル、またはプロピル、またはこれらの混合物である、式Ｉ：Ｒ−ＳＯ３Ｈの化合物であるスルホン酸を、上記ベンジジンタイプの発色反応生成物を含む上記組成物に添加するステップ；および
（ｄ）ステップ（ｃ）のあと、上記反応生成物を含む上記組成物において、比色分析を行うステップを含む、比色分析の実施方法。
【請求項７】
上記方法が、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）であり、ステップ（ａ）において、上記組成物が、抗体およびアナライトをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）により請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物が形成される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｙ’、Ｒ、およびＲ’は独立に、水素、アルキル、アルコキシ、またはこれらの組み合わせであり、ここでアルキル基またはアルコキシ基が存在する場合は、それは４以下の炭素原子を有する、式ＩＩＩ：
【化３】
0006437430.tif 000020
のベンジジンタイプの発色反応生成物を形成することができるベンジジンタイプの発色基質、および
Ｒがメチル、エチル、またはプロピル、またはこれらの混合物である、式Ｉ：Ｒ−ＳＯ３Ｈの化合物であるスルホン酸を含む、比色分析用キット。
【請求項１０】
上記式ＩのＲがメチルである、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
下記成分（ａ）〜（ｄ）の一以上をさらに含む、請求項９に記載のキット：
（ａ）ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシダーゼもしくはオキシダーゼのコンジュゲート；
（ｂ）アナライト特異的結合メンバー；
（ｃ）アナライトのポジティブコントロール、アナライトのネガティブコントロール、またはこれらの混合物；
（ｄ）比色分析が行われ得る分析プレート。
【請求項１２】
式Ｉ：Ｒ−ＳＯ３Ｈの化合物であり、ここで、Ｒはメチル、エチル、またはプロピル、またはこれらの混合物である、スルホン酸を、酵素および
Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｙ’、Ｒ、およびＲ’は独立に、水素、アルキル、アルコキシ、または
これらの組み合わせであり、ここでアルキル基またはアルコキシ基が存在する場合は、それは４以下の炭素原子を有する、式ＩＩＩ：
【化４】
0006437430.tif 000021
のベンジジンタイプの発色反応生成物を含む反応組成物に添加するステップ：
を含む、ベンジジンタイプの発色反応生成物を含む組成物中の反応を停止するための方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願との相互参照〕
仮出願ではない本願は、シリアル番号６１／６１４，６０２を有し、２０１２年３月２３日に提出され、スルホン酸化合物を含むインビトロの診断テスト用組成物および方法と表題をつけ、一般に所有された仮出願の利益を請求している。この仮出願は、全文にわたって、本明細書に引用されている。
〔技術分野〕
本発明は、インビトロ診断テスト用およびインビトロ比色測定テスト用の、組成物および方法に関連する。
〔背景技術〕
研究と診断の手順では、生物組織または生体液のような生物学的サンプルに低濃度で存在する物質（アナライト）について、迅速で、正確で、かつ定性的および／または定量的な決定を必要とする。例えば、血液、尿、唾液、歯垢、歯肉の裂け目からの液体および他の生物学的な試料などの中にある薬品、麻薬、ホルモン、ステロイド、ポリペプチド、プロスタグランジンまたは感染性生物などの存在は、適した診断または処置のために、正確で迅速な形式によって望ましく決定される。
【０００２】
多くの場合、アナライトは、その化学的特徴を特異的に認識する化合物を使用して、サンプル中で特定される。アナライトの一つまたは複数の化学的なエピトープに特異的なモノクローナル抗体がよく使われる。抗体とアナライトによって形成された複合体は、様々な既知の方法によって検出され得る。もっとも一般的に使われる方法では、抗体にすでに結合している、またはさらなる反応により結合するようになるいくつかのタイプのシグナル発生部位を採用している。たとえばアビジンとビオチンとの複合体の形成において、この複合体は、アビジンまたはビオチン分子へのラベルを使うことで検出され得る。そのようなラベルは放射性同位体またはアビジンもしくはビオチンに結合させた酵素であり得る。あるいは、アビジン−ビオチン複合体は、その複合体のどちらか一方のパーツまたは両方のパーツに特異的なラベルされた分子とのさらなる反応により検出され得る。抗原とそれらに対応する抗体に同様のことをすることは一般的に知られている。
【０００３】
適切なトレーニングにより医局または診療所にて、迅速で簡単に使用できるように設計された診断テストにおいて、目的物質の特異的な結合リガンド（感染性病原体からの抗原）は酵素ラベルとそれに対応する基質との反応から生じる比色、蛍光または化学発光のシグナルを使い、よく検出される。
【０００４】
もしリガンドが存在したら、迅速で強力なシグナルを生成する必要がある。これは一般的に比色検出試薬を使用して行われる。検出試薬の添加により、有色の生成物が生成される。多くのアッセイの中で、色の生成は限定されていない。その結果を最適に定量するために、正確な定量を可能にするために色の形成を停止させ、安定したレベルで保つための停止試薬を採用する。硫酸および塩酸などの酸はペルオキシダーゼを特異的な結合反応におけるラベルとして使うときに、検出可能なシグナルの生成を停止するために使われる。ところがこれらの酸の使用は、その酸に関わる問題、すなわち腐食性、短いシグナルの時間、毒性の問題がある。
【０００５】
本発明者は非腐食性の停止試薬、および、広範なダイナミックレンジとこれまでの酸がもたらしたものよりも長く、より安定したシグナル時間とを可能にする停止試薬を提供する必要性を見出した。
〔発明の概要〕
概して、本発明は、比色分析によって検出できる発色基質と、発色反応生成物を含む反応組成物を停止させ安定化するための停止試薬とを使用する、サンプル中のアナライトの決定のための組成物、キット、および方法を提供する。停止試薬はスルホン酸である。
【０００６】
本発明を伴う実験的な研究は、スルホン酸の停止試薬では、従来の停止試薬を使用したアッセイに比べ著しく長い時間、発色反応生成物の吸収特性を安定化させるということを思いがけずに見いだした。加えて、本発明の停止試薬は、特に高いアナライトレベルにおける、広範なダイナミックレンジを超えて行われる比色分析を可能にした。
好都合なことに、本発明の停止試薬は、硫酸および塩酸の腐食性の特徴を有しておらず、それは本キットの成分と組成物、ならびに発明の方法を扱いやすくしている。
【０００７】
従って、本発明の一態様は、比色アッセイを行うための成分を含むキットを提供する。このキットは、比色分析を使うことにより検出される発色反応形成物の形成を可能にする発色基質と、発色反応生成物を停止し安定化する化合物とを含んでおり、その化合物はスルホン酸である。キットは、発色基質を発色反応生成物に変化させるために使うことができるペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ基質、オキシダーゼおよびオキシダーゼ基質などの、一以上のレドックス化合物のようなほかの成分を、任意で含んでいることができる。別の任意の成分は、生物学的サンプル中のアナライトの特異的な検出を可能にする抗体などのアナライト結合メンバーである。キット中の他の任意の成分はマルチウエルプレートなどの容器であり、その中で、比色分析が行われ、分光光度計を用いて発色反応生成物が計測される。
【０００８】
本発明は、スルホン酸と、比色分析を使うことで検出可能な発色反応生成物とを含む組成物も提供する。発色反応生成物は、スルホン酸の存在下において安定化することができる。組成物は、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ基質、オキシダーゼおよびオキシダーゼ基質などの発色反応生成物を生み出すために使用されることができる他の成分を任意で含むことができる。
【０００９】
当該方法は、比色分析を行うための方法をさらに提供する。当該方法は、発色反応生成物を含む組成物にスルホン酸を添加する工程を少なくとも含む。スルホン酸の添加は、発色反応生成物を安定化する。この発色反応生成物は、その後、分光光度計などの機器を使用するか、または代わりに視覚化によって、比色的に分析することができる。当該方法は、スルホン酸のグループを化合物に加えるステップの上流に、一以上のステップを任意で含むことができる。例えば、当該方法は、アナライトを有する生物学的サンプルを提供するステップ、アナライト結合化合物とアナライトとを接触させるステップ、基質の変化を促進させるペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ基質、オキシダーゼおよびオキシダーゼ基質などの一以上の多くの成分を用いてアナライト／アナライト結合化合物の複合体を検出するステップ、および、比色分析をつかうことにより検出可能な反応生成物の形成を、任意で含むことができる。
〔図面の簡単な説明〕
図１は、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と、西洋ワサビペルオキシダーゼ（３００ ｐｇ/ｗｅｌｌ）と過酸化水素との発色反応混合物へのあらゆる酸性の停止試薬の添加後におけるＴＭＢの吸収の変化を表したグラフである。
【００１０】
図２は、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と、西洋ワサビペルオキシダーゼ（４０ｐｇ/ｗｅｌｌ）と過酸化水素との発色反応混合物へのあらゆる酸性の停止試薬の添加後におけるＴＭＢの吸収の変化を表したグラフである。
【００１１】
図３は、ＴＭＢと、西洋ワサビペルオキシダーゼと過酸化水素との発色反応混合物への０．５Ｍ硫酸停止試薬添加後のそれぞれ違う時間において測定された、アナライトを増加させていく条件下（ＩｇＧ濃度により反映されている）におけるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の吸収差異を表すグラフである。
【００１２】
図４は、ＴＭＢと、西洋ワサビペルオキシダーゼと過酸化水素との発色反応混合物への０．１５Ｍメタンスルホン酸停止試薬添加後のそれぞれ違う時間において測定された、アナライトを増加させていく条件下（ＩｇＧ濃度により反映されている）におけるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の吸収差異を表すグラフである。
【００１３】
図５は、ＴＭＢと、西洋ワサビペルオキシダーゼと過酸化水素との発色反応混合物への０．２Ｍスルファミン酸停止試薬添加後のそれぞれ違う時間において測定された、アナライトを増加させていく条件下（ＩｇＧ濃度により反映されている）におけるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の吸収差異を表すグラフである。
〔発明の詳細な説明〕
本明細書に記載された本発明の実施形態は、以下の詳細な説明に開示された正確な形態に本発明を徹底すること、または本発明を限定することを意図していない。むしろ、本実施形態は、他の当業者が本発明の原理および実施を認識して、かつ理解できるように選択され、かつ記載される。
【００１４】
本明細書で言及されたすべての刊行物および特許は参照として本明細書に組み込まれる。本明細書に開示された刊行物および特許は、単にこれらの開示のために提供される。
本明細書では、いずれの刊行物および／または特許（これらに引用されているいずれの刊行物および／または特許を含む）より先行する資格を本発明者らが与えられていないという自認としては、何も作成されてはいない。
【００１５】
本発明は、組成物、キット、そしてスルホン酸を使用する比色アッセイを行うための方法を対象とする。スルホン酸は、一つ以上のスルホン酸基（―ＳＯ３Ｈ）を含む化合物である。硫酸（Ｈ２ＳＯ４）はスルホン酸ではない。本発明に伴う実験の中で、発色反応生成物が比色分析によって検出されるアッセイにおいて、スルホン酸停止試薬の使用は明確な利益を提供することが見いだされた。停止試薬を添加したあとの、反応生成物のシグナル強度のロスまたは吸光度のロスを最小化するように、本発明のスルホン酸停止試薬は発色反応生成物を安定化することが示された。例えば、色またはシグナル生成反応が行われたあと、望ましい色特性（例えば、光吸光度によって測定されるような）またはシグナル強度を長期間にわたって維持するために、反応組成物に停止試薬を加える。比較によれば、既知の硫酸などの停止試薬（組成物の中で唯一の停止試薬として）を使ったときは、色特性（例えば、光吸光度によって測定されるような）において、より急速な変化が観察される。
【００１６】
シグナル強度または吸光度のロスの最小化は、サンプル中のアナライトのさらに正確な定量を提供することができる。それは、比色分析を行うためのさらなる融通性を使用者に与えることができ、そしてそれゆえに、使用者は、必要に応じて分析プロセスをもっと複雑化させることもできるし、必要に応じて分析の処理量を増やすこともできる（例えば、より多くのサンプルを分析する）。またはそれら両方を行うことも可能である。サンプルが多量のアナライトを含有するときに、硫酸などの既知の停止試薬を使用することによるシグナル強度の減少は特に顕著である。本発明に伴うさらなる実験的研究において、本発明のスルホン酸停止試薬の使用は、高アナライトレベル状況下におけるシグナル強度のロスを顕著に最小化することが示されている。従って、本発明の停止試薬が比色分析において使用される場合、これは検出のダイナミックレンジを改善する。
【００１７】
典型的なスルホン酸停止試薬は、一つ以上のスルホン酸基（―ＳＯ３Ｈ）を含むが、しかし硫酸（Ｈ２ＳＯ４）を含まない。本明細書に記載された化合物を含め、スルホン酸停止試薬として使用することができる化合物は、商業的に入手可能であり、または化学合成の技術における既知の方法に従って準備することができる。典型的なスルホン酸停止試薬は非ポリマー化合物、及びポリマー化合物を含むことができる。
【００１８】
いくつかの実施形態において、キット、組成物、および方法は式Ｉ：Ｒ−ＳＯ３Ｈのスルホン酸停止試薬を使用し、ここで、Ｒは、アルキル、アミノアルキレン、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、アリール、アミン、フルオロアルキル、ペルフルオロアルキル、および
【００１９】
【化１】
0006437430.tif 000002
【００２０】
からなる群から選択され、ここでＲ１は分枝鎖または直鎖アルキレン基である。
【００２１】
典型的なアルキルスルホン酸は、Ｒがメチル、エチル、またはプロピルであるアルキルスルホン酸を含み、それらはメタンスルホン酸（メチルスルホン酸；ＣＨ３ＳＯ３Ｈ）、エタンスルホン酸（エチルスルホン酸；ＣＨ３ＣＨ２ＳＯ３Ｈ）、プロパンスルホン酸（プロピルスルホン酸；ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３Ｈ）をそれぞれ与える。
【００２２】
いくつかのケースでは、スルホン酸はアミン基を含む。例えば、Ｒが−ＮＨ２である場合には、化合物は、スルファミン酸（アミドスルホン酸、アミド硫酸、アミノスルホン酸、およびスルファミド酸; Ｈ２ＮＳＯ３Ｈとしても知られている）である。他のアミン基を含むスルホン酸は、アミノメタンスルホン酸、２−アミノエタンスルホン酸（タウリン）、およびアミノプロアンスルホン酸などのアミノアルキレンスルホン酸である。
【００２３】
いくつかのケースではスルホン酸は、ｐ−トルエンスルホン酸（ＰＴＳＡ；トシル酸）、キシレンスルホン酸、およびクメンスルホン酸などのアリールスルホン酸である。
【００２４】
さらに詳細な実施形態では、Ｒが、
【００２５】
【化２】
0006437430.tif 000003
【００２６】
である場合、式ＩＩの化合物が提供される：、
【００２７】
【化３】
0006437430.tif 000004
【００２８】
（ＩＩ）
典型的なＲ１基は、メチレン（−（ＣＨ２）−）、エチレン（−（ＣＨ２ＣＨ２）−）、メチルメチレン、
【００２９】
【化４】
0006437430.tif 000005
【００３０】
ジメチルメチレン、
【００３１】
【化５】
0006437430.tif 000006
【００３２】
メチルエチレン、
【００３３】
【化６】
0006437430.tif 000007
【００３４】
およびジメチルエチレン、
【００３５】
【化７】
0006437430.tif 000008
【００３６】
を含み、ここで式ＩＩは２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−アクリルアミドプロパンスルホン酸、および２−アクリルアミドエタンスルホン酸などの化合物を含む。
【００３７】
本発明は、ジスルホン酸などの二つ以上のスルホン酸基を有する停止試薬も意図している。商業的に入手可能なジスルホン酸は、例えば２−ナフトール−３，６ジスルホン酸、フェノールジスルホン酸、エタンジスルホン酸、およびアニリンジスルホン酸を含む。上記において、記載されたアクリルアミド由来のポリマーによって例示された、二つ以上のスルホン酸基を含むポリマーも意図される。
【００３８】
状況に応じて、本発明の停止試薬を、「スルホン酸誘導体」と称することができ、それは、例えば本明細書に記載されたスルホン酸化合物および式によって表される化合物を参照し、かつ硫酸ではない。
【００３９】
いくつかの実施形態において、下記の表１で、典型的なスルホン酸の構造が示されている。
【００４０】
【表１】
0006437430.tif 000009
【００４１】
0006437430.tif 000010
【００４２】
0006437430.tif 000011
【００４３】
スルホン酸は、その酸解離定数（ｐＫａ；または酸イオン化定数）によって記述することもできる。本発明のスルホン酸停止化合物は、その化合物のプロトンを与える放出性の性質または両性イオン性の性質によって二つ以上の酸解離定数を有するだろう。議論の目的のために、化合物が二つ以上の酸解離定数を有している場合、その化合物のｐＫａは、そのもっとも低い（もっとも酸性の）酸解離定数を参照する。いくつかのケースでは、スルホン酸停止化合物は、約４から−３の範囲にあるか、または約４から約−２．５の範囲にあるか、または約４から約−２の範囲にあるか、または約３から約−２．５の範囲にあるか、または約２から約−２．５の範囲にあるか、または約１から約−２．５の範囲にさえあるｐＫａを有する。
【００４４】
スルホン酸化合物は、その液体溶解度によっても記述することができる。比色分析は、緩衝化された水溶液など、水をベースにした溶液の中で一般的に行われるため、多くの実施形態において、スルホン酸停止化合物は、水に少なくとも少しは溶解する。溶解度の記述的表現は、本技術において使用される標準的な表現である（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed. (2000), Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore MDを参照）。ここで、“少し溶解する”とは、溶媒１００部から１０００部あたり薬剤１部の溶解度を有する化合物について言及しており、“わずかに溶解する”とは、溶媒３０部から１００部あたり薬剤１部の溶解度を有する化合物について言及しており、“溶解する”とは、少なくとも、溶媒１０部から３０部あたり化合物１部の溶解度を有する化合物について言及しており、“多く溶解する”とは、少なくとも、溶媒１部から１０部あたり薬剤１部の溶解度を有する化合物について言及しており、そして、“とても溶解する”は、溶媒１部あたり薬剤１部より多くの溶解度を有する化合物について言及している。
【００４５】
もし望むのであれば、必要に応じて、組成物中の成分（例えば、停止試薬）の溶解度を改善することができる水溶性の共溶媒または水溶性の成分を含むように、水溶液をベースとした本発明の組成物は、調整され得る。有用な任意の共溶媒の例は、アルコール類（すなわち、メタノール、エタノール、プロパノール）、ポリアルコール類（すなわち、グリセロール、プロピレングリコール）、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、および同様の溶媒である。溶解度を改善する他の溶媒は、インビトロ診断用途のための製剤技術分野においてよく知られており、それらの溶媒は、本発明の組成物に必要に応じて含ませることができる。米国仮出願Ｎｏ．６１／７５１、６５２（２０１３年１月１１日;Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ）に記載されているような他の溶解度増強成分を、本発明の組成物、および／またはキットに含ませることができる。
【００４６】
いくつかのケースにおいて、本発明のスルホン酸停止試薬は、本発明の一つ以上の他のスルホン酸停止試薬と混合することができる。例えば、本発明のキット、組成物、および方法はメタンスルホン酸およびスルファミン酸の混合物を含むことができる。必要に応じて、本発明の停止試薬は、比色分析技術において既知の一つ以上の他の停止試薬と混合することができる。
【００４７】
本発明のスルホン酸停止試薬は、化合物の特性、およびキットまたは組成物の望まれる配合の特性に従って、固体または液体の形態で提供される。スルホン酸停止試薬が周囲状況下で液体である場合、それは未希釈の形態で供給および／または使用することができ、または水などの適当な溶媒によって希釈することができる。いくつかの実施形態において、スルホン酸停止試薬は乾燥した形態（例えば、粉末、細粒、ペレット等）で供給することができ、その後、使用前に、適当な溶媒を使うことによって溶解することができる。さらに他の実施形態においては、スルホン酸停止試薬は、既知の液状停止試薬（例えば、Ｈ２ＳＯ４）を混合することによって溶解することができる。
【００４８】
本発明のキット、組成物、および方法は、発色基質（または基質の反応生成物；“発色反応生成物”）を、比色分析のために含むこともできる。アッセイにおいて、発色基質を化学反応させる、これは酵素反応を伴う反応などであり、比色分析を使用すると検出可能な発色反応生成物に結果としてなる。例えば、アッセイにおいて、発色基質は、化学的酸化または還元を受け得るか、もしくは発色基質における官能基の付加、脱離、または転移による化学的修飾を受け得る。反応生成物は、例えば、発色基質の酸化形態または発色基質の還元形態、もしくは発色基質の化学的修飾体を、比色分析によって検出可能であるような生成物であり得る。
【００４９】
いくつかの実施形態において、発色基質は無色の化合物、または第一色を有する化合物、またはシグナルを放出しない化合物、またはそれらの組み合わせであり得る。発色反応生成物は、呈色させることができ、第一色と違う（第二）色を有することができるか、または一つのシグナルを放射できるか、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかのケースでは、発色反応生成物は、二つの出発化合物の反応によって形成される。その反応は、発色基質を生成する。その基質は酸化されると、呈色した発色反応生成物を生成する発色基質である。
【００５０】
比色分析のための種々の既知の発色基質が、本発明のキット、化合物、及び方法において使用され得る。本発明に使用することが意図される発色基質はベンジジン、オルトトリジン、オルトジアニシジンを含み、それはペルオキシダーゼを含む成分の存在下で、色が変化し得る。いくつかの実施形態において、本発明のキット、組成物、および方法は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンなどのベンジジン誘導体を使用する。ベンジジン誘導体は式ＩＩＩの誘導体を含む。
【００５１】
【化８】
0006437430.tif 000012
【００５２】
ここでＸ、Ｘ’、Ｙ、Ｙ’、Ｒ、およびＲ’は独立に、水素、アルキル、アルコキシ、またはこれらの組み合わせであり、アルキル基、またはアルコキシ基が存在する場合は、それは６以下の炭素原子を有する。より特定した式ＩＩＩの態様では、Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｙ’、Ｒ、およびＲ’は独立に水素、アルキル、アルコキシ、またはこれらの組み合わせであり、ここでアルキル基、またはアルコキシ基が存在する場合は、それは４以下の炭素原子を含む。ベンジジンタイプの化合物は３，３，５，５’−テトラメチルベンジジン、ｏ−トリジン、ｏ−ジアニシジン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−テトラメチルベンジジンである。例えば、米国特許Ｎｏ.６，３７６，２５２を参照すること。
【００５３】
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）および過酸化水素の存在下では、テトラメチルベンジジン（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン；ＴＭＢ）は酸化され、呈色した生成物を形成する。Ｊｏｓｅｐｈｙらに記載されているように（１９８２；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３６６９−３６７５）、ＴＭＢ（λｍａｘ２８５）は酸化され、酸化ＴＭＢである青色生成物（λｍａｘ６５２）を形成する。当該青色生成物は一電子酸化生成物である。そしてさらにそれは酸化され、黄色生成物（λｍａｘ４５０）を形成する。当該黄色生成物は二電子酸化生成物である。反応生成物の比色分析および比色測定は、典型的に４５０ｎｍにおいて行われるが、裸眼によって観察することもできる（反応過程Ａ）。
【００５４】
【化９】
0006437430.tif 000013
【００５５】
他の発色原料は、Ｔｒｉｎｄｅｒ試薬を含み、その試薬はフェニルピラゾン誘導体、および、フェノールアミン化合物または芳香族アミン化合物を使用する。Ｔｒｉｎｄｅｒ試薬を含むペルオキシダーゼ反応の化学において、二つの無色有機分子が、ペルオキシダーゼおよび過酸化水素水の存在下で、有色生成物を形成する。
【００５６】
典型的なフェニルピラゾン誘導体は、４−アミノアンチピリンを含み、そして、典型的なフェノールは、クレゾールおよびサリチルアミドを含む。他の典型的なフェニルピラゾン誘導体およびフェノールは、米国特許Ｎｏ．ＲＥ２９，４９８に記載されている。典型的な芳香族アミンは、米国特許Ｎｏ．５，２０６，００６に記載されているような、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアニリン化合物、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ｍ−トルイジン化合物、トルイジンスルホプロピル誘導体およびアニリンスルホプロピル誘導体、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジンおよびＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ｍ−トルイジンである。
【００５７】
他の発色原料はＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン）を含む。ＯＰＤは、４５０ｎｍの波長において検出可能な黄色生成物を生成する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の水溶性基質である。ＯＰＤ反応生成物に酸を添加すると、吸光最大波長４９２ｎｍをともなう黄橙色を呈する。
【００５８】
チラミンは、ドーパミン−ベータ−ヒドロキシラーゼ（ＤＢＨ）アッセイ中の基質として使用される。ＤＢＨは、３，４−ジヒドロキシフェニルエチルアミン（ドーパミン）を神経伝達物質であるノルエピネフリンに化学変化させる。チラミンは、ＤＢＨによってオクトパミンに化学変化され、それから、オクトパミンは、過ヨウ素酸ナトリウムによって、パラヒドロキシベンズアルデヒドに酸化される。酸化は、メタ重亜硫酸ナトリウムによって停止される。次いで、パラヒドロキシベンズアルデヒドは、３３０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、定量される。
【００５９】
水可溶性のＨＲＰ基質、２，２’−アジノ−ジ（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）は、ペルオキシダーゼによる反応において、緑色の最終生成物を産する。緑色の生成物は、４１０ｎｍおよび６５０ｎｍの二つの吸光度のピークを有する。ＡＢＴＳは、ＥＬＩＳＡの応用において、ＯＰＤおよびＴＭＢより感度が低い。ＡＢＴＳは、より酸化されにくく、そして、その発色は遅い（おおよそ２０分から６０分）。
【００６０】
本発明の方法、キット、および組成物において、使用され得る他の発色原料はテトラゾリウム染料であるＭＴＴを含む。ＭＴＴは、紫色で不可溶性のホルマザンに還元され得る。
【００６１】
本開示のいくつかの実施形態の態様は、比色アッセイを含むスルホン酸停止試薬の使用と関連している。一般的に、比色分析は、サンプル中のアナライトの存在および／またはアナライトの量を決定するために、行われ得る。アナライトという用語は、分析中のサンプルの任意の物質または任意の化学的成分を言及している。アナライトは、例えば生物によって生成される、天然化合物であり得る。または、アナライトは非天然化合物であり得る。非天然化合物は、例えば、薬剤、殺虫剤、または除草剤のような、生物に影響を与える作用物質として使用される合成化合物などである。本発明の方法、組成物、およびキットは、多くの産業的な用途において、アナライトの決定のために使用され得る。産業的な用途は、健康管理、食品製造および食品加工、化学的分析および化学的生成、農業、環境管理などを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着測定法）は、アナライトの検出のために使用され、そして、ＥＬＩＳＡおよび／またはＥＬＩＳＡを行うために使用されるキットは、本発明のスルホン酸停止試薬を組み入れている。
【００６２】
本明細書に記載されているように、いくつかの実施形態では、比色分析、または比色アッセイは、本技術分野において知られている、分析中の溶液の波長および／または吸光度を定量および測定する専門機器を使用することにより、行われ得る。このような機器は、ＵＶ−可視分光光度計およびマルチウエルプレートリーダーを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、比色分析または比色アッセイは、裸眼を使用して行われ、終点は決定されるだろう。
【００６３】
さまざまな種類のアナライトは、本発明の方法を使用することにより、サンプル中で検出され、および定量化され得る。いくつかの態様では、アナライトの検出は、抗体などのアナライト結合メンバーによって容易になる。いくつかの他の態様では、本発明の方法は、アナライト結合メンバーを利用せずに、アナライトの検出を提供する。限定されない典型的なアナライトは、薬剤、薬剤代謝物質、バイオマーカー、ホルモン、抗体、食品サプリメント、食品添加物、自然発生的な汚染物質、染料、微生物およびこれらの毒素、菌類、ウイルス、殺虫剤、除草剤、放流された廃液の有機成分、組織特異的マーカー、組織特異的酵素、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、レセプターリガンド、酵素、核酸、脂質、ならびにグルコースおよび過酸化水素などの小有機分子を含む。
【００６４】
たとえば、飼いならされた動物および家畜動物と同様に、人のための食品加工業および食品製造業において、ＥＬＩＳＡは、種々のアナライト検出のために使用される。アナライトは、アレルゲンになり得る大豆タンパクおよび大豆グルテンなどのポリペプチド、および抗生物質もしくはホルモンなどの他の化合物である。
【００６５】
他の限定しない例のように、ヘルスケア産業では、ＥＬＩＳＡｓは、血液、尿、および他の体液中の種々のアナライトの検出のために使用される。ＥＬＩＳＡによって検出されるアナライトは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、人絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、成長ホルモンなどである。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本発明のキット、組成物、または方法は核酸アナライトの検出のために構成される。相補的核酸配列と相互作用できる任意のタイプの核酸も、アナライトとして検出し得る。典型的なアナライトは、バクテリア、ウイルス、および真核細胞のＤＮＡの核酸断片（例えば、制限酵素によって切断されたＤＮＡ）を含む。このＤＮＡはゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡミトコンドリアＤＮＡを含み、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｉＲＮＡ（免疫性リボ核酸）、リボザイム、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、およびｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）も同様に含む。
【００６７】
検出されるアナライトを含むサンプルは、生物学的または非生物学的サンプルであり得る。
【００６８】
生物学的サンプルは生物から採取される任意の物質であり得る。この物質は哺乳類からの体液、生物に由来する物質、または生物が含まれているサンプルなどである。生物学的サンプルは、特定の組織、または体液を含む。体液は、血液、痰、尿、唾液、粘液、硝子体液、関節液、精液、脳脊髄液、骨髄、羊水、胆汁、汗、などである。生物学的サンプルは、患者から得ることができる。そして、生物学的サンプルは、病態に伴うアナライトの有無を分析され得る。アナライトの定量は、病態の有無、または病態の程度を決定するために使用され得る。生物学的サンプルは、組織切片をも含む。この組織断片は、病態に伴うアナライトの分析がなされ得る、組織学的目的のための凍結切片などである。
【００６９】
生物学的サンプルを含む他のサンプルは、発酵、細胞培養、バイオ燃料生産、汚水処理および農業に由来するサンプルであり得る。これらは、ミルク、ワイン、ビールなどのような食品生産物、化学流水、または化学プラントからの廃液流、川などを含む。最初から、サンプルが、混合物、固体、または粘着質である場合、サンプルは、任意で抽出などにより処理される。もしくは、免疫学的検定における使用のための適切な特徴を有するサンプルを取得するために、サンプルは溶解または希釈され得る。
【００７０】
非生物学的サンプルの例は化学合成成分の組成物である。この組成物は、人の治療のための合成薬、または農業用の合成殺虫剤などである。
【００７１】
アナライト検出および発色分析は、適切なアッセイ容器中で行われる。アッセイ容器は、この中で、ＥＬＩＳＡなどによるアナライト検出、および発色アッセイが行われ得る任意の適切な入れ物である。アッセイ容器は、ガラス（例えば、表面修飾ガラス）、石英、またはポリスチレン、ポリプロピレンおよびポリカーボネートなどのプラスチック等の物質から作成され得る。典型的なアッセイ容器は、シングルプレート、およびマルチウエルプレートである。このプレートは、６、２４、９６、３８４、ならびに１５３６ウエルプレートのなどの、ミディアムウエルプレート、スモーラーウエルプレートなどである。これらは、本技術分野において、マイクロタイタープレート、マイクロプレート、またはマイクロウエルプレートとして一般的に知られている。発色アッセイ用の典型的なプレートの各々のウエルに、マイクロリットルからミリリットルの液量を入れられる。分析に使用され得る他のタイプのアッセイ容器は、キャピラリーチューブを含む。アッセイ容器は、任意で、キット中に含ませることができる。または、アッセイ容器は、本明細書に記載されているような発色アッセイ方法を行うために、使用者によって提供され得る。
【００７２】
例えば、いくつかの実施形態では、９６ウエルプレートは、アナライト検出、および発色アッセイのために使用される。９６ウエルプレートにおける個々のウエルは、一般的に、おおよそ３００μＬから３５０μＬまでの液体を保持できる。そして、この容量のすべてまたは部分は、本発明の方法におけるステップの間に使用され得る。これは、ＥＬＩＳＡ発色アッセイにおけるステップにとって便利な容量を提供する。このＥＬＩＳＡ発色アッセイにおけるステップは、抗体固定化、アナライト固定化、ならびに酵素固定化、生物学的サンプルの分注、洗浄ステップ、発色基質の分注、および比色分析のための停止試薬の添加を含む。３６０μＬウエルの底面の面積は、おおよそ０．３２ｃｍ２である。
【００７３】
いくつかのケースでは、抗体などのアナライト結合メンバーによって、生物学的サンプル中のアナライト（検出すべき）を同定する必要はない。いくつかのアッセイは、サンプル中の決まった生物学的物質を測定するために、酵素を使用する。例えば、いくつかのアッセイは、サンプル中に存在する過酸化物を測定するために、ペルオキシダーゼ酵素を使用する。反対に、いくつかのアッセイは、酵素に対応する基質を使用し、生物学的酵素の存在を検出する。例えば、サンプルへの過酸化水素の添加は、サンプル中のペルオキシダーゼ酵素活性の検査に使用され得る。
【００７４】
本発明のいくつかの態様では、スルホン酸停止試薬は、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）において使用される。一般的に、ＥＬＩＳＡは、液状サンプル中のアナライトの存在を検出するために、固相免疫学的アッセイを使用する。種々のＥＬＩＳＡの形態は、本技術分野において知られており、そして、これらの任意のＥＬＩＳＡの形態は、本発明のスルホン酸停止試薬と合わせて使用され得る。抗体は、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるが、任意の形態のアナライト結合メンバーは、アナライト特異的相互作用を提供する抗体と取って代わることができる。このように、本発明のキット、組成物、および方法は、酵素固相アナライト結合アッセイとともに使用され得る。本発明の方法は、酵素の存在下において比色アッセイを使用して検出され得る発色試薬に加えて、固相上に固定された任意のアナライト結合試薬を含むことができる。本発明は、任意の形態のアナライト結合アッセイ、または任意の形態のアナライト結合メンバーに限定されない。しかし、本発明の態様を例証するために、いくつかの例が論じられている。採用される特定の免疫学的アッセイ形態は、特定のアナライト特性、サンプル特性、使用可能な試薬などによるだろう。ありふれたＥＬＩＳＡ形態の一例は、“ダイレクト、アンチゲンダウン”ＥＬＩＳＡである。このＥＬＩＳＡは、測定される生物学的物質が抗体である場合、よく使用される。この形態において、精製されたタンパク質（抗原）が、マルチウエルプレートのプラスチック表面上に吸収される。プレートは、余分な抗原を取り除くために洗浄される。次いで、このプレートは、抗体の非特異的結合を防ぐために、タンパク質が主成分、または合成であり得るブロッキング作用物質によってブロックされる。次に、抗体を含むサンプルを、ウエルに添加する。この抗体は、プラスチック表面上で固定化された抗原と、特異的に結合する。次いで、余分なサンプルは、洗浄される。洗浄のあと、生物学的サンプル中の動物抗体に特異的である、ペルオキシダーゼ酵素に結合した二次抗体を添加する。例えば、サンプルが人の場合、抗ヒト抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧ）が、検出のために使用される。次いで、過酸化水素などの発色基質および反応物質をペルオキシダーゼのために添加することによって、発色反応が行われ得る。次いで、本発明のスルホン酸停止試薬は、発色反応へ添加され得る。そして比色分析が、分光光度計を使用して行われ得る。
【００７５】
他のケースにおいては、例えば、サンドウイッチＥＬＩＳＡは、アナライト結合メンバー（例えば、アナライト“捕捉”抗体）を、プラスチックウエルなどの固体上に、最初から固定化することにより行われ得る。次いで、一般的に、次のステップにおいてウエルへ生物学的サンプルを添加する場合、このサンプル由来の成分の付着を防ぐために、プラスチック表面は非特異的なタンパク質でブロックされる。ウエルに添加された生物学的サンプルからのアナライトは、プレート上の固定化された抗体と特異的に相互作用する。プレートは洗浄され、次いで、二次アナライト結合メンバー（ペルオキシダーゼ酵素に結合された抗体などであり、検出抗体と呼ばれている。）の溶液が添加される。このメンバーは、プラスチック結合抗体によってすでに固定化されたアナライトと相互作用する。それゆえに、アナライトは、効果的に、プレート上に吸収された抗体と酵素結合抗体との間に“サンドウイッチされる”ようになる。それから、過酸化水素などの発色基質および反応物質をペルオキシダーゼのために添加することにより、発色反応が行われ得る。次いで、本発明のスルホン酸停止リガントが、発色反応へ添加され得る。そして、比色分析が、分光光度計を使用することにより行われ得る。
【００７６】
あるいは、“サンドウイッチ”アプローチは、アナライトを有する生物学的サンプルと酵素結合抗体とを最初に混合することにより行われ得る。酵素結合抗体は、過剰に使用され、そしてアナライト−酵素結合抗体複合体が、サンプル中で形成する。次いで、サンプルは、アッセイプレートのウエルに移す。このウエル上には、固定化されたアナライト捕捉抗体がある。アナライト捕捉抗体は、アナライト−酵素結合抗体複合体と結合する。次いで、ウエルは、非結合物質を取り除くために洗浄され得る。それから、発色反応が行われ得る。そして、スルホン酸停止試薬が、記載のとおり添加され得る。
【００７７】
本発明のキットは、スルホン酸停止試薬および発色基質の他に、ＥＬＩＳＡを実行するために有用な一以上の成分を含み得る。キットは、抗体、酵素（例えば、ＨＲＰ結合抗ＩｇＧ抗体など）、および酵素基質のようなアナライト結合メンバーなどの任意の成分を含むことができる。キットは、マルチウエルプレートなど、その中で発色反応を起こしそして分析され得る容器も含むことができる。キットは、可溶性増強成分も含むことができる。本明細書およびいくつかの態様に記載されているように、アッセイは、アナライトに特異的な親和性を有する化合物を使用する。特異的な親和性のある化合物は、本明細書で“結合成分”として言及されている。この化合物は、アナライトと結合できるまたはアナライトと相互作用できる任意の種類の化学的原子団を言及している。結合成分は自然発生分子、または自然発生分子の誘導体、または小有機分子などの合成分子、または、ポリマーなどの合成により調整されたより大きな分子を含むことができる。結合成分の例は、ポリペプチド、核酸、多糖類、および標的種に結合し得る、これらの形態の部分を含む。サンプル中の標的核酸アナライトに相補的ハイブリダイゼーションを受けさせるのに十分な長さを有するオリゴヌクレオチドなどの核酸は、アナライト結合成分として使用され得る。
【００７８】
結合成分は抗体であり得る。この抗体は、アナライト上の特定のエピトープを認識するタンパク質である。この点で、アナライトは、記載されている抗体−抗原相互作用として一般的であるのと同様に、“抗原”としても言及され得る。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または特異的結合ペアの対応するメンバーに結合できる遺伝学的に設計された分子であり得る。本発明において、結合成分として使用され得るポリペプチドの一つのクラスは、抗体および抗体断片を含む。
【００７９】
所望のアナライトに特異性を有する抗体および抗体断片は、商業的に入手可能であり、および本技術分野で知られている技術により調整され得る。例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、培地における継代細胞株により、抗体分子の生成を提供する任意の技術により得られることができる。これらの技術は、例えば、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５））；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２（１９８３）；およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６（１９８５））を含む。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびこれらの任意のサブクラスを含む免疫グロブリンクラスの抗体であり得る。
【００８０】
ＦａｂまたはＦａｂ’２断片は、各々パパイン消化またはペプシン消化を含む標準的な技術によって、モノクローナル抗体から生成され得る。ＦａｂまたはＦａｂ’２断片を生成するためのキットは、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から、商業的に入手可能である。
【００８１】
いくつかの実施形態では、アナライト結合メンバーは、核酸を含む。例えば、ストリンジェントな条件下において核酸アナライトとハイブリダイズできる配列を有する核酸が、プラスチックまたはガラス表面上に固定化され、そして、本発明のキットまたは方法において使用され得る。生物学的サンプルなどのサンプルからの核酸は、固定化された核酸がある表面と接触するように乗せられ得る。核酸アナライトは、細胞を破裂させて、そして必要に応じてアナライトの核酸を豊富にするように処理された細胞サンプルからも存在し得る。アナライトの核酸は、固定化された核酸に相補的結合することによってハイブリダイゼーションを受け得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、本技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８９）中を参照すること）。次いで、アナライトの存在は、フリープローブ（固定されていない）核酸によって検出され得る。この核酸は、核酸アナライトにハイブリダイズでき、かつ、酵素に直接結合されているか、または酵素に間接的に結合され得る。
【００８２】
検出の他のいくつかの態様において、サンプルからの核酸は、ガラス基質またはプラスチック基質上で固定化されている。次いで、アナライトの存在は、フリープローブ（固定されていない）核酸によって検出され得る。この核酸は、核酸アナライトにハイブリダイズでき、かつ、酵素に直接結合されているか、または酵素に間接的に結合され得る。
【００８３】
いくつかのケースにおいては、結合成分は、本明細書に記載されているような比色分析を容易にする別の化合物に、結合されている。
【００８４】
本発明のいくつかの態様では、本発明の方法、組成物、またはキットはオキシダーゼまたはペルオキシダーゼを含む。一般的な事情として、オキシダーゼまたはペルオキシダーゼは、ラジカルを生成させ、これにより一つの成分から別の成分への電子の移動を生じさせるために使用され得る。発色基質が存在する場合、発色基質は、本発明のスルホン酸停止試薬と合わせて使用される発色生成物へと酸化される。
【００８５】
いくつかのケースでは、オキシダーゼまたはペルオキシダーゼは、アナライトの検出のために結合成分に結合されている。これらのケースにおいて、オキシダーゼまたはペルオキシダーゼは、簡単に、過酸化水素などの過酸化化合物の還元を起こすために働くことができ、所望の呈色した反応生成物への発色基質の酸化のための化学的環境を提供する。本明細書に記載されているような、商業的に入手可能なペルオキシダーゼコンジュゲートが使用され得る。
【００８６】
他のケースにおいて、オキシダーゼまたはペルオキシダーゼは、生物学的サンプル中の標的アナライトへの特異性を有する。例えば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）（ＥＣ１．１．３．４）は、過酸化水素およびＤ−グルコノ−δ−ラクトンへのグルコースの酸化を触媒するオキシドレダクターゼである。生物学的サンプル中のグルコースの量を定量するために、グルコースオキシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼは、直接、サンプルに添加し得る。過酸化水素の形成を起こすグルコースオキシダーゼは、発色基質の酸化を生じさせる条件を提供するように還元され得る。キサンチンオキシダーゼは、基質としてヒポキサンチンおよびキサンチンを使用することにより過酸化水素を生成する、別の酵素である。Ｌ−グルオノラクトンオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．８）は、Ｌ−キシロ−ヘキス−３−グルオノラクトンおよび過酸化水素へのＤ−グルクロノラクトンの反応を触媒する。この形態のアプローチを使用するとき、アナライトまたはアナライト結合メンバーは、ＥＬＩＳＡを使用して行われたような固体表面上への固定化はされてはいない。他のオキシダーゼは、ガラクトースオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびピラノースオキシダーゼを含む。
【００８７】
本発明の方法に有用なペルオキシダーゼ酵素は、植物などの種々の原料から入手され得る。商業的に入手可能な通常のペルオキシダーゼは、西洋ワサビおよび大豆由来である。西洋ワサビペルオキシダーゼは、おおよそ４４ｋＤａの分子量を有しており、Ｃａ２＋が付加したヘミンを含むジスルフィド結合を有する１本鎖ポリペプチドである。ＨＲＰの特異的活性は、ピロガロール単位（１ピロガロール単位は、ｐＨ６．０、２０℃において、２０秒間で、ピロガロールから１．０ｍｇプルプロガリンを形成するものである）またはＡＢＴＳ単位（１ＡＢＴＳ単位は、２５℃、ｐＨ５．０において、１分あたり、１μｍｏｌｅのＡＢＴＳを酸化するものである）で表現され得る。ＨＲＰは、アジ化ナトリウム、Ｌ−シスチン、重クロム酸塩、エチレンチオ尿素、ヒドロキシルアミン、硫化物、ｐ−アミノ安息香酸、Ｃｄ＋２、Ｃｏ＋２、Ｃｕ＋２、Ｆｅ＋３、Ｍｎ＋２、Ｎｉ＋２およびＰｂ＋２により阻害され得る。
【００８８】
他のペルオキシダーゼは、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ＮＡＤＨペルオキシダーゼ、ＮＡＤＰＨペルオキシダーゼ、脂肪酸ペルオキシダーゼ、およびカタラーゼを含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、“ペルオキシダーゼコンジュゲート”は、アナライトの検出のための方法において、使用され得る。コンジュゲートは、一般的に２つの物質を含む化合物について言及している。ここで、この物質の一方は、他方に結合している。コンジュゲートの結合は、共有結合または非共有結合であり得る。ペルオキシダーゼコンジュゲートは、アナライトを検出する結合成分にペルオキシダーゼ酵素が結合したものであるか、またはアナライトを検出する結合成分を検出する結合成分にペルオキシダーゼが結合したものであり得る。商業的に入手され得る例示的なペルオキシダーゼは、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製の、アビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート、モノクローナル抗ＦＬＡＧＴＭ  Ｍ２−ペルオキシダーゼコンジュゲート、抗グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ペルオキシダーゼコンジュゲート、抗マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼコンジュゲート、抗ヤギ／ヒツジＩｇＧ−ペルオキシダーゼコンジュゲート、プロテインＧ−ペルオキシダーゼコンジュゲート、プロテインＡ−ペルオキシダーゼコンジュゲート、抗ウサギＩｇＧ−ペルオキシダーゼコンジュゲート、およびストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを含む。
【００９０】
アナライトを含む生物学的サンプルは、マルチウエルプレートにおけるウエルなどの分析容器中に乗せられ得る。これにより、アナライトは固定化され得、次いで、本発明の方法を使用することで検出され得る。一般的に、アナライトの固定化またはアナライト結合メンバー（例えば、抗体）の固定化、アナライトへのアナライト結合メンバーの結合、および続いてのアナライト−アナライト結合メンバー複合体の結合のためのステップは、インキュベーションバッファー、ブロッキングバッファー、および洗浄バッファーを含む適当な溶液を使用して行われ得る。アナライトおよび／またはアナライト結合メンバーのプラスチック表面上における吸収を保持するため、ならびに適切な結合および酵素活性のためのタンパク質の形状を保持するために、溶液はバッファー化された水溶液であり得る。ブロッキング溶液は、ウシ血清アルブミンなどの非特異的タンパク質を含ませることができる。このタンパク質は、ＥＬＩＳＡ処理において、第一コーティング手順のあとに残存している容器中の結合サイトを、効果的にブロックする（例えば、５％ＢＳＡ−ＰＢＳ）。洗浄バッファーは、Ｔｗｅｅｎなどの界面活性剤を含み得る（例示的な洗浄バッファーであるＰＢＳ−Ｔは、１０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む。）。
【００９１】
いくつかの実施形態では、容器の固体表面上に一定量のペルオキシダーゼが固定化されている、分析容器（マルチウエルプレートなど）が提供される。さらに、ペルオキシダーゼは、結合メンバーへのコンジュゲーションにより固定化され得る。この結合メンバーは、先に容器表面上で固定化されたアナライトに直接または間接的に結合しているものであり、このアナライトは、アナライト結合メンバーを使用して固定化されているか、または容器表面上に直接吸収されて固定化されている。固定化されたペルオキシダーゼ量は、固定化されたアナライトの量と相関性を持ち得る。固定化されたアナライトの量は、サンプル中に存在するアナライトの量と相関性を持つ。コントロールウエルにおいて、アナライトの量が既知である基準が使用され得る。
【００９２】
本発明の実施形態を説明するために、例示的な実施形態において、アナライトの固定化は、９６ウエルプレートの各々のウエルの表面上に、ピコグラム単位の量の西洋ワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼの、相当量の固定化を生じさせる。この量は、おおよそ０．１ｐｇからおおよそ１００ｎｇ（１０００００ｐｇ）、おおよそ１ｐｇからおおよそ１０ｎｇ（１００００ｐｇ）、またはおおよそ１ｐｇからおおよそ１ｎｇ（１０００ｐｇ）の範囲にある量などである。この場合、ペルオキシダーゼ酵素は、酵素基質および発色試薬を添加する前に、固定化される。
【００９３】
一般的な事情として、過酸化物基質は、容器表面上で固定化されているペルオキシダーゼ、または容器内の溶液中に存在しているペルオキシダーゼに添加される。ペルオキシダーゼ反応を行うための費用対効果の良い基質は、過酸化水素である。ＨＲＰは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）と結合し、そしてＨ２Ｏ２の酸素−酸素結合の不均等開裂を行い得る。複合体は、広い種類の発色基質を酸化し得る。次いで、反応は、本明細書に記載されているもののようなスルホン酸停止試薬の添加により、停止され得る。
【００９４】
過酸化水素および発色基質は、反応溶液中に存在し得る。この過酸化水素および発色基質は、ペルオキシダーゼ酵素を含む反応容器に添加され得る。反応溶液は、発色基質、過酸化水素、反応バッファーを含むキットの成分から調整され得る。いくつかの実施形態では、過酸化水素および発色基質は、使用準備済みの一つの構成組成物または溶液に含まれて、供給される。他の実施形態では、発色基質および過酸化水素は、キット中で、別々に使用者に提供される。例えば、過酸化水素は、濃縮ストック溶液として提供され得る（例えば、〜２−３％）。濃縮過酸化水素は、反応溶液中で希釈され得る。例示的な量は、おおよそ０．１ｍＭからおおよそ５０ｍＭ（〜３Ｘ１０−４％から〜０．１７％）、またはおおよそ０．５ｍＭからおおよそ１０ｍＭ（〜０．００１７％から〜０．０３４％）の範囲にある。キットは、乾燥形態または濃縮形態で提供されるリン酸ナトリウム（ｐＨ７−８）などの反応バッファーを含むこともできる。例えば、バッファーは、５倍または１０倍濃縮として供給され、次いで反応組成物中で、おおよそ１０ｍＭからおおよそ７５ｍＭの範囲にあるような使用濃度へと希釈され得る。
【００９５】
発色基質は、任意で、乾燥形態から再構成され得るか、またはストック溶液から希釈され得、次いで反応溶液に添加され得る。発色基質の溶解が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの成分を使用して容易になるのであれば、発色基質のタイプによって、キットは、このような別の液体を一以上含み得る。発色基質の使用濃度は、分析されているサンプル中の発色基質のタイプ、過酸化水素量、および／またはアナライト量（および対応するペルオキシダーゼ）などの要素に基づいて選択され得る。発色基質の例示的な範囲は、おおよそ０．５μＭからおおよそ１０ｍＭ、おおよそ１０μＭからおおよそ５ｍＭ、またはおおよそ１００μＭからおおよそ３ｍＭである。
【００９６】
必要に応じて、共溶媒を、アナライト、酵素、および発色基質をともなう反応組成物中に含ませ得る。共溶媒は、反応中または停止試薬添加などの後で、反応組成物の試薬の可溶形態を保持し、そしてこれを溶液から沈殿させない。例示的な共溶媒は、アルコール（すなわち、メタノール、エタノール、プロパノール）、ポリアルコール（すなわち、グリセロール、プロピレングリコール）、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、および同様の溶媒を含む。溶解度を向上させる他の溶媒は、インビトロの診断用途のための製剤技術においてよく知られており、そして、これらの溶媒は本明細書に記載されているものが含まれる。共溶媒は、おおよそ１％（ｖ／ｖ）からおおよそ５０％（ｖ／ｖ）、またはおおよそ５％（ｖ／ｖ）からおおよそ２５％（ｖ／ｖ）の範囲にある例示的な濃度で、反応組成物中で使用され得る。
【００９７】
米国仮出願  Ｎｏ．６１／７５１，６５２（２０１３年１月１１日；Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ）に記載されているような溶解度増強成分は、必要に応じて、反応組成物に含ませ得る。
【００９８】
いくつかの実施形態では、次いで、発色基質の発色に十分な成分を含む反応溶液を、ペルオキシダーゼ酵素を含む容器に直接加え得る。あるいは、キットの成分は、ウエルの中で直接混合され得る。マルチウォールプレートを使用する場合、反応溶液は、例えば、ウエル中で手動でピペッティングするか、または自動装置を使用することで調合され得る。マルチチップピペッティング装置は、調合およびまたは混合手順のスピードを向上するために使用され得る。９６ウエルプレートフォーマットを使用すると、典型的な反応容量は、おおよそ２５μＬからおおよそ２００μＬ、またはおおよそ５０μＬからおおよそ１５０μＬの範囲に及ぶ。
【００９９】
発色生成物への反応基質の変化を生じるペルオキシダーゼ反応は、所望の温度において、所望の時間の間、行われ得る。反応は、組成物の発色を決定するために、視覚的、または分光光度計によりモニターされ得る。インキュベーションステップはおおよそ５０℃の範囲における温度が採用され得るが、一般的には室温で生じる。インキュベーション時間は、一般的におおよそ１分からおおよそ６０分の範囲にあるか、またはもっと通常ではおおよそ５分からおおよそ４５分の範囲にある。
【０１００】
本発明の態様を記載すると、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）は、固定化されたＨＲＰ酵素（アナライトと結合した）および過酸化水素の存在下で発色基質として使用される。ＴＭＢは、前記のように、ＨＲＰおよびＨ２Ｏ２存在下で酸化され、青色生成物（λｍａｘ６５２）を形成する。反応は視覚的に観察され得る、または反応の吸光度を、青色に対応する吸光度の値を得るために、分光光度計によりモニターされ得る（例えば、おおよそ６５０ｎｍにおいて）。停止試薬は、反応が所望の色に到達した時、または特定の吸光度の値に到達した時に、添加され得る。例えば、ＴＭＢ酸化の場合、または酸化されると同様の吸光度特性を有する他の発色基質の場合、停止試薬は、もっとも高いシグナルを有するウエルが６５０ｎｍにおいておおよそ１．６吸光度単位までの吸光度に到達した時、反応組成物に添加され得る。停止試薬の添加は、青色反応生成物を、おおよそ４５０ｎｍに最大吸光度がある黄色生成物に変化させる。黄色ＴＭＢ生成物の吸光係数は、青色ＴＭＢの吸光係数のおおよそ２．３倍である。青色生成物は、６５０ｎｍにおいておおよそ１．５または１．６吸光度へと発色することを考慮すると、停止試薬の添加により３．５から４吸光度単位の吸光度になる。これは吸光示度の実用的な最高位を表す。
【０１０１】
式１の化合物（すなわち、Ｒ−ＳＯ３Ｈ、ここでのＲは本明細書において定義されている。）などの本発明のスルホン酸停止試薬は、次いで反応組成物に添加される。例示的な実施形態において、試薬は、メタンスルホン酸またはスルファミン酸、またはこれらの混合物である。停止試薬は、反応組成物中で可溶であり、そして混合は、それゆえに急速であり得る。例示的な実施形態において、停止試薬は２倍、またはおよそ２倍に濃縮されており、そのため、ウエルに添加する停止試薬の容量は、おおよそ、ウエル中の反応容量と同じである。例えば、１００μＬの停止試薬は、１００μＬの反応組成物に添加される。停止試薬の例示的な濃度はおおよそ１．５倍からおおよそ５倍の範囲にあり、この濃度は、停止試薬および反応成分の急速な混合を容易にすることに使われ得る。
【０１０２】
いくつかの態様では、停止試薬は、反応組成物に添加され、おおよそ０．０２Ｍからおおよそ２．０Ｍ、おおよそ０．０２Ｍからおおよそ１Ｍ、おおよそ０．０２Ｍから０．５Ｍ、またはおおよそ０．０２Ｍから０．２Ｍの範囲の停止試薬の最終濃度を提供する。
【０１０３】
停止試薬の添加後、反応組成物は、必要に応じて、ｐＨで記述され得る。停止試薬の酸性の性質は、一般的に、添加後に反応組成物のｐＨの低下を生じる。いくつかのケースでは、反応組成物のｐＨは、おおよそ０．２からおおよそ４の範囲にあり、またはより特定すると、おおよそ０．５からおおよそ２の範囲にある。
【０１０４】
必要に応じて、使用されている特定の停止試薬によって、および発色基質のタイプによっても、共溶媒は、停止試薬組成物に含ませ得る。前述したように、共溶媒は、反応組成物の試薬を可溶形態に保たせ、停止試薬の添加後でも、試薬を溶液から沈殿させないことができる。上記のようなアルコール、ポリアルコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、および同様の溶媒などの共溶媒は、停止試薬添加後においておおよそ１％（ｖ／ｖ）からおおよそ５０％（ｖ／ｖ）、またはおおよそ５％（ｖ／ｖ）からおおよそ２５％（ｖ／ｖ）の範囲にある最終濃度にて使用され得る。
【０１０５】
発色化合物としてＴＭＢを使用する方法において、反応組成物の色は、ＴＭＢ（λｍａｘ４５０）の二電子酸化生成物に相当する黄色に変化し得る。本発明の停止試薬は、二電子酸化生成物を安定化することができ、分光光度計によりモニターされるときにおおよそ４５０ｎｍにおいて高レベルな吸光度を保っている黄色組成物が得られる。
【０１０６】
反応混合物の分析は、“停止された”条件下で行われる。これにより、反応を、予定していた時間の間進行させ、次いで本発明の停止試薬で止めることが可能となることを意味している。理論に束縛されることはないが、少なくとも、停止試薬の添加は、酵素活性のために通常存在している金属イオンを隔離するなどの酵素の非特異的な阻害物質であることによって、反応を止めると考えられる。しかし、本発明のスルホン酸停止試薬は、反応停止後における発色反応生成物を安定化する利点を提供する。例えば、本発明の停止試薬は、これの添加後における発色反応生成物の吸光度特性の変化を最小限にするように、発色反応生成物の色を安定化することができる。
【０１０７】
例えば、図１を参照すると、０．２Ｍスルファミン酸または０．１５Ｍメタンスルホン酸などの本発明の停止試薬の存在下において、停止された組成物は、０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４、１Ｍ  リン酸、または０．２５Ｍ  ＨＣｌの従来の停止試薬と比較して、長期間、４５０ｎｍにおける吸光度のロスがわずかであることを示した。これは、アナライト分析の質において、重要な改良を提供でき、そして、サンプル中のアナライト量のより正確な測定に導くことができる。分析が、マルチウエル型（９６ウエルプレートなど）を使用して行われる時、ウエルに停止試薬添加および混合をするために必要な時間は、特に分析が手によるピペッティング手順を使用して行われる場合、重要だろう。従来のアプローチを使用（例えば、０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を使用）して見られた吸光度のロスは、サンプル中のアナライトの実際の量を正確に表していないであろうサンプル間の変動に、導く可能性がある。本発明の停止試薬の使用は、吸光度のロスを最小化し、アナライト量のもっと正確な測定に帰着する。これは、アッセイを行うためのより多くの時間を使用者に与える。この時間は、一回の反応バッチ中でのアッセイのスループット（すなわち、行われるアッセイの数）を増加させることができる。
【０１０８】
必要に応じて、本発明の態様は、発色生成物の吸収特性を参照することで、決められた時間の間、発色生成物を安定化させる停止試薬の能力によって、記載され得る。例えば、いくつかの態様において、停止試薬の能力が、停止試薬添加後６０分における吸光度の１５％未満の低下、１０％未満の低下、または５％未満の低下、停止試薬添加後１２０分における吸光度の２０％未満の低下、１５％未満の低下、または１０％未満の低下、停止試薬添加後１８０分における吸光度の３０％未満の低下、２５％未満の低下、２０％未満の低下と示すように、停止試薬は、発色基質を安定化する。
【０１０９】
本明細書に記載されているような直接免疫学的アッセイ分析またはサンドウイッチ免疫学的アッセイの使用などの分析、および採用される試薬のいくつかの方法において、分光光度測定方法により決定されるような発色生成物の吸光度は、サンプル中のアナライト量に正比例するだろう。アナライト濃度の決定に対する定量的な結果またはアナライト量が予定した閾値を超えたかどうかを決定するような準定量的な結果に興味がある場合、ペルオキシダーゼおよび／または発色基質の量は、アナライトの不存在または予定した値未満のアナライトと比較して明瞭なシグナルを提供するために、選ばれ得る。
【０１１０】
定量のために、吸光度は、必要に応じて、適切なハードウエアおよび適切なソフトウエアを使用して、正確に測定される。コントロールは採用され得る。ここでアナライト濃度に対するシグナルが決定され、これによりシグナルは、分析中のサンプルにおけるアナライトの濃度に直接関係することができる。この方法において、サンプル中のアナライトの存在および量は決定され得る。サンプルの吸光度を決定できる１７５ｎｍから９００ｎｍの波長のＵＶ／ＶＩＳ分光光度計が、商業的に入手可能であり、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社から得ることができる。サンプルの分析において、光学的フィルターまたはモノクロメーターによって選択されるような特定の波長の光は、サンプル中を透過する。そして、検出器は、初期値に対するサンプルを透過した光のパーセンテージを測定する。透過した光量は、一般的に、サンプル中のアナライト量に反比例する。
【０１１１】
他の実施形態において、分析は、マイクロプレートリーダーを使用して行われる。９６ウエルプレートのウエルにおいてサンプルの収容、およびサンプルの吸光度の分析ができる種々のマイクロプレートは、商業的に入手可能であり、例えば、ＢｉｏＴｅｋ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）から得ることができる。
【０１１２】
（実施例１）
メタンスルホン酸およびスルファミン酸が、ＨＲＰ、ＴＭＢ反応を停止および安定化させる硫酸、塩酸およびリン酸の従来の停止試薬と比較された。
【０１１３】
１２ｍＬのＴＭＢ基質（ＴＭＢＷ，ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．）の一定分量に、３５μＬまたは５μＬの１μｇ／ｍＬ西洋ワサビ（ＨＲＰ）が添加された。溶液は混合され、そしてＨＲＰが足された基質は、９６ウエルプレート（１００μＬ／ｗｅｌｌ）中に分注された。これは、ＨＲＰ２レベルを含むＴＭＢ、３００ｐｇ／ｗｅｌｌまたは４０ｐｇ／ｗｅｌｌに帰着した。また、１００マイクロリットル単位のＴＭＢＷが、ＨＲＰブランクがないようなウエルのセットに添加された。３００ｐｇ／ｗｅｌｌ条件が６５０ｎｍにおいておおよそ１．５の吸光度を有するように、青色が発色した後（おおよそ１５分）、１００μＬの停止試薬が、添加された。次いで、４５０ｎｍの吸光度は、３時間の間、毎分ごとの記録を伴い、モニターされた。各々のＨＲＰレベル／停止試薬の組合せのために３つのＮ、およびブランクのために２つのＮがあった。
【０１１４】
表２および図１および図２は、実験結果を要約している。スルホン酸は、１８０分全体にわたって、とても安定したシグナルを有した。表１は、停止試薬添加後５分におけるシグナルと比較した３時間後のシグナルの比を提供している。メタンスルホン酸およびスルファミン酸は、参考の酸より、さらに安定したシグナルを示した。そして、この違いは、より高いＨＲＰレベルにおいてさらに顕著だった。
【０１１５】
【表２】
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【０１１６】
（実施例２）
アナライトとしてビオチン化マウスＩｇＧを使用したモデルアッセイが、異なった停止試薬にともなう結果として生じる標準曲線の安定性を調査するために行われた。抗体およびストレプトアビジン−ＨＲＰは、Ｊａｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから手に入れた。プレートはウサギ抗マウス抗体（０．１μｇ／ｗｅｌｌ）によりコーティングされた。コーティングされたプレートは、ビオチン化マウスＩｇＧの一連の希釈液でインキュベートされた。次いで、プレートはＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄され、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ（１μｇ／ｍＬ）で２０分間インキュベートされた。洗浄後、１００μＬのＴＭＢ基質が、各々のウエルに添加された。プレートは、もっとも高い吸光度が６５０ｎｍにおいておおよそ１．５になるまで（おおよそ１５分）発色させた。次いで、１００μＬの異なった停止試薬が添加された。
【０１１７】
０．１５Ｍメタンスルホン酸、０．２Ｍスルファミン酸および０．５Ｍ硫酸の三つの停止試薬が使用された。次いで、４５０ｎｍにおける吸光度は８時間モニターされ、２．５分おきに記録された。各々のマウスＩｇＧレベル／停止試薬の組合せのために４つのＮがある。図３から図５は、選択された時点において生じたマウスＩｇＧ標準曲線（４ＰＬ  Ｆｉｔｓ）を示した。図３は、硫酸の比較のための結果である。この図は３０分後においてさえ、ダイナミックレンジにわたって正確に定量する能力が、より高いアナライト濃度において行われ得ないことを示している。図４および図５は、メタンスルホン酸およびスルファミン酸の結果を表している。標準曲線は、２時間のあいだ、とても安定しており、また、停止試薬添加後８時間においてさえ、よくフィットされる。
【０１１８】
（実施例３）
ＨＲＰアッセイは、実施され、ＨＲＰアッセイにおいて硫酸と他のスルホン酸とを比較した。実験は、プレートが９０分間だけ記録されることを除いて実施例１に記載されているようにＨＲＰのみを使用し、行われた。表２から表４は、安定性の相違がもっとも顕著な３００ｐｇ／ｗｅｌｌの条件における結果を報告している。
【０１１９】
表３に反映されているように、パラ−トルエンスルホン酸（ｐ−ＴＳＡ）および１−アクリルアミド−２メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）が、停止試薬として使用され、そして硫酸と比較された。ｐ−ＴＳＡは、水のみに溶解しているときは、ウエル中で試薬の沈殿を引き起こした。ＴＭＢは、停止試薬溶液に２０％ＤＭＳＯを添加することによって、反応に悪影響をおよぼすことなく、または反応生成物を分析する能力を失わずに、溶液中で保持され得る。表４および表５は、エタンスルホン酸およびプロパンスルホン酸の両方とも、また、硫酸の参考条件より、より安定したシグナルを生成することを示した。
【０１２０】
【表３】
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【０１２１】
【表４】
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【０１２２】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１は、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と、西洋ワサビペルオキシダーゼ（３００ ｐｇ/ｗｅｌｌ）と過酸化水素との発色反応混合物へのあらゆる酸性の停止試薬の添加後におけるＴＭＢの吸収の変化を表したグラフである。
【図２】図２は、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と、西洋ワサビペルオキシダーゼ（４０ｐｇ/ｗｅｌｌ）と過酸化水素との発色反応混合物へのあらゆる酸性の停止試薬の添加後におけるＴＭＢの吸収の変化を表したグラフである。
【図３】図３は、ＴＭＢと、西洋ワサビペルオキシダーゼと過酸化水素との発色反応混合物への０．５Ｍ硫酸停止試薬添加後のそれぞれ違う時間において測定された、アナライトを増加させていく条件下（ＩｇＧ濃度により反映されている）におけるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の吸収差異を表すグラフである。
【図４】図４は、ＴＭＢと、西洋ワサビペルオキシダーゼと過酸化水素との発色反応混合物への０．１５Ｍメタンスルホン酸停止試薬添加後のそれぞれ違う時間において測定された、アナライトを増加させていく条件下（ＩｇＧ濃度により反映されている）におけるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の吸収差異を表すグラフである。
【図５】図５は、ＴＭＢと、西洋ワサビペルオキシダーゼと過酸化水素との発色反応混合物への０．２Ｍスルファミン酸停止試薬添加後のそれぞれ違う時間において測定された、アナライトを増加させていく条件下（ＩｇＧ濃度により反映されている）におけるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の吸収差異を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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