(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離又は組換え製造ペプチダーゼＤ（ＰＥＰＤ）及び少なくとも１種の薬学的に許容されるキャリアを含む、ＥｒｂＢ２陽性癌の予防及び／又は治療に使用するための医薬製剤。
【請求項２】
前記ＰＥＰＤが、融合タンパク質の構成成分である、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３】
前記融合タンパク質が、前記ＰＥＰＤとポリヒスチジンタグを含む、請求項２に記載の医薬製剤。
【請求項４】
前記ＰＥＰＤが、化学療法剤に結合されている、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項５】
前記融合タンパク質が、前記ＰＥＰＤ及び免疫グロブリンのＦｃ領域を含む、請求項２に記載の医薬製剤。
【請求項６】
前記ＰＥＰＤが、配列番号１の配列を有するＰＥＰＤと比べて、より少ないジペプチド加水分解活性を有する、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項７】
前記ＰＥＰＤが、配列番号１の２７８位におけるグリシンの変異を有する、請求項６に記載の医薬製剤。
【請求項８】
さらに凝固阻害剤を含む、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項９】
ＥｒｂＢ２陽性癌の予防及び／又は治療に使用するための製品であって、ペプチダーゼＤ（ＰＥＰＤ）含有医薬製剤を含む少なくとも１つの密封容器を含み、
当該製品は、前記医薬製剤が、個体におけるＥｒｂＢ２陽性癌の予防及び／又は治療に使用するためのものである表示を提供する印刷物を含む、
ＥｒｂＢ２陽性癌の予防及び／又は治療に使用するための製品。
【請求項１０】
前記ＰＥＰＤが、配列番号１の配列を有するＰＥＰＤと比べて、より少ないジペプチド加水分解活性を有する、請求項９に記載の製品。
【請求項１１】
さらに凝固阻害剤、及び／又は、前記医薬製剤が凝固阻害剤と併用するためのものである表示を含む、請求項９に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、2013年8月26日に出願された、米国出願第61/870,054号に基づく優先権を主張し、その開示は、参照により本明細書中に包含される。
【０００２】
［連邦支援研究に関する声明］
本発明は、国立がん研究所によって授与された契約番号R01CA120533、R01CA124627及びR01CA164574の下で政府支援を受けて完成した。政府は、本発明に所定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、一般に、ヒトの健康の分野、特にErbB2の発現と正の相関を有する癌及び／又は他のコンディションの予防及び治療のための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ErbB2は、v-erb-b2、トリ赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子homolog2、Her2、Neu、CD340、癌原遺伝子C-ErbB2としても知られており、広く研究されている細胞膜結合受容体チロシンキナーゼのErbBファミリーのメンバーであり、このファミリーは、ErbB1、ErbB3及びErbB4(それぞれ、EGFR/Her1、Her3及びHer4としても知られている)も含む。これらの受容体は、胚発生、正常生理機能及び様々な病気の進行において重大な役割を果たすことが証明されている。４つのErbB受容体は全て、細胞外ドメイン(ECD)、膜貫通ドメイン及び、シグナル伝達分子と相互作用する細胞内ドメインを含んでいる。これらの受容体のECDへのリガンド結合は、ホモ-又はヘテロ-二量体化、それに続く細胞内ドメインにおける内在性タンパク質チロシンキナーゼの活性化及びチロシン自己リン酸化、及び、これらのサイトへのシグナル伝達タンパク質の動員並びに活性化をもたらす。特に、ErbB3は、キナーゼ障害性であり、活性化のためにヘテロ二量体化を必要とする。ほぼ３０年前のその発見以来(Coussens et al. Science 1985; 230: 1132-1139; Schechter et al. Science 1985; 229: 976-978)、今日まで、ErbB1、ErbB3及びErbB4のための多数のリガンドが同定されたものの、ErbB2のためのリガンドは発見されていない。しかしながら、ErbB2は、他のリガンド結合ErbBらのための望ましい二量体化パートナーである。
【０００５】
ErbB2は、ヒト乳癌におけるその関与のために最もよく知られている。ErbB2遺伝子増幅は、乳癌の２０〜３０％で発生し、癌組織におけるErbB2タンパク質発現に有意に相関している。ErbB2遺伝子増幅又はタンパク質過剰発現は、病気の予後不良の強力な予測因子である。ErbB2-標的治療、特に化学療法と組み合わせたヒト化モノクローン抗体トラスツズマブは、かなりの臨床効果を示す。しかしながら、多くのErbB2陽性癌は、そのような治療への初めからの耐性又は獲得耐性を示す。それゆえ、ErbB2のリガンドを同定し、少なくとも一部はそのようなリガンドに基づく治療方法を開発するという、継続している、満たされていない要求が存在する。本開示は、これらの要求を満たす。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、ErbB2陽性癌の予防及び／又は治療に有用な組成物及び方法を提供する。前記組成物及び方法は、プロリダーゼがErbB2受容体のリガンドであるという発見に関連する。さらに、この開示は、ErbB2リガンドの最初の記述であると考えられる。
【０００７】
プロリダーゼは、ペプチダーゼD(PEPD)、Xaa-Proジペプチダーゼもしくはプロリンジペプチダーゼ、又はイミドジペプチダーゼとしても知られており、カルボキシ末端にプロリン又はヒドロキシプロリンを有するジペプチドを加水分解するプロテアーゼである。PEPDは、偏在的に発現する細胞質タンパク質であり、ホモダイマーとして存在する(ヒトPEPDの単量体分子量：54kD；ヒトプロリダーゼのアミノ酸配列を提供する配列番号１で示される493個のアミノ酸)。複数の実施形態において、本開示の組成物及び方法のために使用されるPEPDは、哺乳類のPEPDである。一実施形態では、前記PEPDは、ヒトPEPDである。複数の実施形態において、前記PEPDは、酵素的に活性であっても、減じられた酵素活性を有していても、あるいは、検出可能な酵素活性を有していなくてもよい。
【０００８】
前記組成物は、単離された及び／又は精製されたPEPD、又は組換え及び／又は改変PEPDを含有し、さらに、凝固阻害剤等のさらなる剤を含有してもよい医薬製剤を含む。複数の実施形態において、前記PEPDは改変されている。複数の実施形態において、前記PEPDは、融合タンパク質の構成成分である。複数の実施形態において、前記融合タンパク質は、前記PEPD及び組換えで製造されたPEPDの精製に役立つアミノ酸配列を含む。
【０００９】
前記方法は、ErbB2陽性癌の予防及び／又は治療の必要がある個体に、本開示のPEPDを含有する組成物を投与することを含み、さらに、前記個体に凝集阻害因子を投与することを含むことができる。また、PEPD製剤で治療する必要のある個体を特定する方法及び、そのような個体のための治療プロトコルを作る方法も提供される。
【００１０】
複数の実施形態において、本開示はさらに、単離及び／又は精製PEPD又は組換えPEPDを含む医薬製剤を含む製品を提供し、この製品は、ErbB2陽性癌の予防及び／又は治療のために前記製剤の使用を説明する印刷物も含むことができる。複数の実施形態において、前記製品は、凝集阻害因子も含む。非限定的な複数の実施形態において、前記ErbB2陽性癌は、乳癌、卵巣癌、胃癌、又は子宮漿液子宮内膜癌等の侵襲性形態の子宮癌である。複数の実施形態において、ErbB2陽性癌細胞は、ErbB2を過剰発現する、又は、非癌細胞に対してERBB2遺伝子のより多くのコピー数を保有する癌細胞である。複数の実施形態において、ErbB2陽性癌細胞は、癌性ではない同じタイプの細胞等の参照よりも、多くのErbB2を発現する細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】PEPDがErbB2 ECDのサブドメイン３に結合し、ErbB2二量体化を急速に促進することを実証するデータ。(ａ)0.04μM(+)、0.2μM(++)又は1μM(+++)のPEPDは、ErbB2/ECD-Fc(0.04μM)、ErbB3/ECD-Fc(0.04μM)、ErbB4/ECD-Fc(0.04μM)又はFc(0.04μM)とともにインキュベートされ、プロテインＧ-セファロースでプルダウンされ、SDS-PAGEで分離され、銀で染色された。(ｂ)CHO-K1細胞は、pCMV6-XL5-ERBB2又は空ベクターをトランスフェクトされた。２４時間後、細胞溶解物が調製され、ウエスタンブロット法で分析された。グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素(GAPDH)が、ローディングコントロールとしてここ及びその他で使用された。(ｃ)ErbB2へのPEPD結合が、ｂからの細胞溶解物を使用してELISAで測定された(n＝3)；全てのサンプルで同量の溶解物を使用(サンプルあたり25μgタンパク質)。エラーバーはSDを示す。(ｄ)ErbB2及びその変異体；全ての遺伝子導入は、同量のDNAを使用し、２４時間続けられた。細胞溶解物は、ウエスタンブロット法で分析された。(ｅ)ErbB2及びその変異体へのPEPD結合が、ｄからの細胞溶解物及び等量のErbB2又はその変異体を使用して、ELISAで測定された(n＝3)。エラーバーはSDを示す。(ｆ)ErbB2を安定に過剰発現しているCHO-K1細胞(CHO-K1/ErbB2細胞)が、PEPDで処理された。PEPD処理細胞及びコントロール細胞は、その後、架橋剤 ビス(スルホスクシンイミジル)スベラート(BS3)(2 mM、30分)で処理された。細胞溶解物は、ErbB2抗体を使用するウエスタンブロット法で分析された。
【図２】PEPDによるErbB2活性化及び低下を示すデータ。(ａ−ｃ)細胞は、PEPD又はビヒクルで処理された。細胞溶解物は、ウエスタンブロット法で分析された。(ｄ)細胞は、ポジティブコントロールとして、4-アミノフェニル水銀酸(APMA)(1 mM)を使用して、PEPD(270 nM)有り又は無しで処理された。細胞溶解物及び培養液は、ウエスタンブロット法で分析された。(ｅ)細胞は、PEPD(2.7 nM、６時間)有り又は無しで処理され、そこから、全RNAがRT-PCR用に単離された。GAPDHがコントロールとして使用された。(ｆ)細胞は、PEPD(270 nM)有り又は無しで処理され、その後、ErbB2及びPEPDの免疫蛍光染色及び共焦点顕微鏡観察が行われた。スケールバー：10μm。(ｇ)細胞は、ユビキチン(pMT107-His-Ub)をトランスフェクトされ、24時間後に、PEPD(2.7 nM、0.5時間)有り又は無しで処理された。細胞溶解物は、ErbB2抗体とともにインキュベートされ、プロテインＧアガロースでプルダウンされ、ウエスタンブロット法で分析された。
【図３】PEPDが、ErbB2を直接活性化するが、そのジペプチダーゼ機能は関与していないことを示すデータ。(ａ)CHO-K1細胞は、ErbB2あるいは変異体をトランスフェクトされ(全て pCMV6-XL5で運ばれた)、２４時間後、ビヒクルあるいはPEPDで処理された。細胞溶解物は、ウエスタンブロット法で分析された。(ｂ)CHO-K1細胞は、ErbB2をトランスフェクトされ、２４時間後、ビヒクル、PEPDあるいはその変異体で処理された。前記変異体に関するさらなる情報は、図１０に示される。細胞溶解物は、ウエスタンブロット法で分析された。
【図４】ErbB2に対する細胞内PEPDの効果はないが、PEPDは細胞から放出されることを示すデータ。(ａ)細胞は、ヒトPEPD(pCMV6-XL5-PEPD)を発現しているプラスミド又は空ベクターを２４時間トランスフェクトされた。細胞溶解物は、ウエスタンブロット法で分析された。(ｂ)細胞は、ヒトPEPD又は空ベクターをトランスフェクトされた；２４時間後、前記細胞は洗浄され、新鮮培地(〜1×106細胞/2ml培地)でさらに２４時間培養され、その後両方の細胞及び培地が収集された。細胞溶解物中のPEPDレベルが、ウエスタンブロット法で測定され、培地中のPEPD濃度がELISAによって測定された(n＝3)。エラーバーは、SDを示す。
【図５】PEPDがErbB2-Srcシグナル伝達を抑制することを示すデータ。(ａ，ｂ)細胞は、溶媒又はPEPD(2.7nM)で処理された。細胞溶解物は、ウエスタンブロット法で分析された。(ｃ)細胞は、PEPD(2.7 nM、0.5時間)有りで又は無しで処理された。細胞溶解物は、ErbB2抗体とともにインキュベートされ、プロテインＧアガロースでプルダウンされ、ウエスタンブロット法で分析された。(ｄ)細胞は、PEPD(2.7 nM)有りで又は無しで処理され、その後、細胞溶解物中のSrcキナーゼ活性及びPI3K活性を測定された(n＝3)。エラーバーは、SDを示す。(ｅ)細胞は、PEPD(2.7nM)有り又は無しで処理された。細胞溶解物は、ウエスタンブロット法で分析された。(ｆ)細胞は、過バナジン酸(30μM、10分)で処理され、その後、PEPD(2.7nM、0.5時間)有り又は無しで処理された。細胞溶解物は、PTEN抗体とともにインキュベートされ、プロテインＧアガロースでプルダウンされ、ウエスタンブロット法で分析された。(ｇ)細胞は、溶媒又はPEPD(2.7 nM、１時間)で処理された；細胞質画分及び膜画分が調製され、ウエスタンブロット法で分析された。GAPDH及びpro-TGFαの両方がローディングコントロールとして使用された。
【図６】PEPDによるErbB2調節のパラダイムを示す図、及び、PEPDによる、ErbB2を過剰発現する細胞の選択的阻害を示すデータ。モノマー及びチロシン-リン酸化ダイマーの両方が、ErbB2を過剰発現している細胞中に存在する。PEPDは、ホモダイマーとして、ErbB2に結合する；各PEPDサブユニットが、１つのErbB2 ECDサブドメイン３に結合する。PEPDは急速に、ErbB2ダイマーに結合し、ErbB2からのSrc解離を生じさせることによって、ErbB2-Srcシグナル伝達を抑制する。PEPDはErbB2モノマーにいくぶんゆっくり結合するが、ErbB2二量体化とリン酸化をもたらし、下流シグナル伝達の活性化を引き起こす。PEPDは、PEPD-誘発ErbB2内部移行及び分解の結果として生じる強く持続的なErbB2低下ももたらす。(ｂ)６ウェルプレート中で増殖された細胞は、ビヒクル又はPEPDで、４８時間処理され、その後、BrdU取り込みによってDNA合成が測定された。(ｃ)６ウェルプレート中の軟寒天中で増殖された細胞は、ビヒクル又はPEPDで、２１日間処理され(３〜４日ごとに培地を交換した)、その後、コロニー形成について試験された。(ｄ)浸潤チャンバー中で増殖された細胞は、ビヒクル又はPEPDで、４８時間処理された；マトリゲル膜を通って浸潤した細胞がカウントされた。ｂ−ｄ中のエラーバーはSDを示す(n＝3)。
【図７】ErbB3及びErbB4のECDへのニューレグリン-１(NRG-1)の結合を示すデータ。0.2μMのNRG-1は、Fc(0.04μM)、ErbB3/ECD-Fc(0.04μM)あるいはErbB4/ECD-Fc(0.04μM)とともにインキュベートされ、プロテインＧ-セファロースでプルダウンされ、SDS-PAGE(15％)で分離され、銀で染色された。これは、ErbB3/ECD-Fc及びErbB4/ECD-Fcの両方が、図１に示される結果に関して、生理学的な機能を持つことを実証する。
【図８】本開示で使用された細胞株の検証、及び、ヒトErbB2の膜貫通及び細胞内領域へのPEPDの結合の欠損を示すデータ。(ａ)CHO-K1細胞は、ErbB2発現プラスミド(pCMV6-XL5-ERBB2)又は空のプラスミドを２４時間一過性にトランスフェクトされた。ヒト膀胱癌RT-4細胞及びヒト乳癌MCF-7細胞が、未処理のまま、ErbB1、ErbB3及びErbB4のポジティブコントロールとして使用された。細胞溶解物は、ウエスタンブロット法で分析された。GAPDHはローディングコントロールである。(ｂ)ErbB2を安定発現するCHO-K1細胞(CHO-K1/ErbB2細胞)が、1 mM APMAで、0.25時間処理された。細胞溶解物がその後調製され、ウエスタンブロット法で分析された(右の第一レーン)。同じ細胞溶解物が、1μM PEPDと混合され、それはその後、PEPD抗体又はアイソタイプマッチド IgGとともにインキュベートされ、プロテインＧ-アガロースでプルダウンされ、ウエスタンブロット法で分析された。結果は、APMAがErbB2 ECD切断を引き起こし、予想通り、p95フラグメント(マイナスECD)を生成するが、PEPDは無傷のErbB2と共沈するだけで、p95フラグメントとは共沈しないことを示し、これはPEPDがErbB2の膜貫通又は細胞内領域に結合しないことを示唆している。
【図９】ErbB2に対して上皮増殖因子(EGF)及びNRG-1は影響を与えない。(ａ、ｂ)ヒトErbB2を安定に過剰発現するCHO-K1細胞(CHO-K1/ErbB2細胞)が、組換えEGF又は組換えNRG-1で処理された。細胞溶解物がその後調製され、ウエスタンブロット法で分析された。(ｃ，ｄ)我々の実験で使用されるEGF(ErbB1のリガンド)及びNRG-1(ErbB3及びErbB4のリガンド)がどちらも生理活性を有することを確認するために、それらは、ErbB1及びErbB3を比較的低いレベルで発現するBT-474細胞内で評価された。予想通り、EGFは、ErbB1リン酸化を有意に刺激し、NRG-1はErbB3リン酸化を有意に刺激した。
【図１０】ヒトPEPD及びその変異体の配置を示すデータ。(ａ)野生型ヒトPEPD及びアミノ酸(aa)は、その変異体において変化する。(ｂ)組換え野生型ヒトPEPD及びその変異体が、バクテリア中で産生され、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され、非還元SDS-PAGE及び銀染色で分析された。メモ：タンパク質負荷はレーンによって変化した。「WT-PEPD＋βME」と示されたレーンにおいて、野生型PEPDは、非還元ゲル電気泳動の前に、PBS中の10％のβ-メルカプトエタノールとともにインキュベートされた。
【図１１】細胞中のErbB2分布を示すデータ。ヒトErbB2を安定に過剰発現するCHO-K1細胞(CHO-K1/ErbB2細胞)、又は24時間一過性にErbB2(pCMV6-XL5-ERBB2)をトランスフェクトされたCHO-K1細胞から調製された、膜画分及び膜を除いた溶解物が、ウエスタンブロット法で分析された。GAPDHとpro-TGF-αがローディングコントロールとして使用された。特に、上述した実験(図３参照)において、PEPDあるいはそのG278D変異体は、ErbB2タンパク質レベルの低下を引き起こさなかったが、PEPDは、安定にあるいは恒常的にErbB2を過剰発現する細胞中で明白なErbB2低下を引き起こした(図２ａ及び２ｃ参照)。我々は、ここに示すように、一過性にErbB2を過剰発現するCHO-K1細胞中で、ErbB2分子の大多数が、細胞内に存在する一方、ErbB2を安定に過剰発現するCHO-K1細胞において、ErbB2分子の大多数が、細胞表面上に発現していることを発見した。これは、3時間のPEPD処理が、ErbB2を一過性に過剰発現する細胞中で、明確なErbB2タンパク質減少を引き起こさなかった理由を説明する(図３)。
【図１２】CHO-K1細胞中のPEPDによるERKリン酸化の誘発が、ErbB2に依存することを示すデータ。CHO-K1細胞は、２４時間、野生型ヒトErbB2又はキナーゼデッド(kinase-dead)変異体(ErbB2/K753M)を一過性にトランスフェクトされ、その後、PEPDあるいはビヒクルで処理され、その後ウエスタンブロット法が行われた。
【図１３】ErbB2の過剰発現が有る又は無い細胞に対する、PEPD、G278D-PEPD及びトラスツズマブの増殖抑制効果を示すデータ。細胞は、９６ウェルプレート中(１ウェルあたり500 CHO-K1細胞又はCHO-K1/ErbB2細胞、あるいは、１ウェルあたり2,000 BT-474細胞；１ウェルあたり150μl培養液)で一晩増殖され、その後、１ウェルあたり200μl培養液中のビヒクル、PEPD、G278D-PEPD又はトラスツズマブで７２時間処理され、その後、３時間３７℃にて、メチルチアゾリルジフェニル-テトラゾリウムブロミド(MTT)(培養液中9.2 mM)とともにインキュベートされた。培養液を除いた後、細胞は、ジメチルスルホキシドで処理され(150μl／ウェル)、MTTから形成されたホルマザンを570nmで分光学的に測定することによって、細胞密度が測定された(n＝3)。エラーバーはSDを示す。
【図１４】PEPDの血漿濃度に対する血液凝固阻害剤の影響を示すデータ。(ａ)組換えヒトPDPEが、マウスに、0.2 mg/kg体重あるいは10 mg/kgで腹腔内注射により投与された；マウスはPEPD投与後１，６又は２４時間目に殺され、PEPDの血漿濃度が、コントロールマウスのものと共に、ELISAで測定された。(ｂ)血液凝固阻害剤であるエノキサパリン(EP)が、マウスに、１日１回、2.5 mg/kgで腹腔内注射により投与された；４回目のEP投与後１時間目に、PEPDが前記マウスに、0.2 mg/kgで腹腔内注射により投与された；マウスはPEPD投与後１又は２４時間目に殺され、血漿PEPD濃度が、コントロールマウスのものと共に、ELISAで測定された。各値は、平均±SDである。結果は、EPの助けにより、血漿PEPD濃度が少なくとも５０倍上昇することを示す。
【図１５】インビボでのPEPDと凝固阻害剤EPの影響を示すデータ。CHO-K1/ErbB2細胞は、少量のPBS：マトリゲルミックス中、メスの胸腺欠損ヌードマウス(生後６〜７週間)の側腹部に、１部位当たり1×106細胞にて、皮下接種された；細胞接種後４日から始まり、マウスは、１日１回腹腔内注射により、ビヒクル又はエノキサパリン(EP)のいずれかを2.5 mg/kgで投与された。EP処理の３日後(細胞接種後７日目)、腫瘍体積が約41mm3に達した際、EP処理マウスのサブセットは、腹腔内注射により0.02 mg/kgあるいは 0.2 mg/kgのPEPD(１週間に３回投与；月曜日、水曜日、金曜日)でも処理された。EPとPEPDが両方投与される日には、PEPDはEPの１時間後に投与された。腫瘍体積は、１週間に３回測定された(月曜日、水曜日、金曜日)。マウスは最後の処理(細胞接種後２４日目、且つ、合計８回のPEPD処理後)から２４時間後に殺され、ELISA分析によるPEPDの血漿濃度の測定のために、マウスから血液サンプルが採取された。(ａ)各値は、平均値±SEM(n＝8〜11)である。(ｂ)各値は、平均値±SD(n＝3)である。PEPDは、腫瘍増殖を強く抑制したが、EPは効果を示さなかった。
【図１６】インビボでのPEPDと凝固阻害剤EPの影響を示すデータ。CHO-K1細胞は、少量のPBS：マトリゲルミックス中、メスの胸腺欠損ヌードマウス(生後６〜７週間)の側腹部に、１部位当たり1×106細胞にて、皮下接種された；細胞接種後４日から始まり、マウスは、１日１回腹腔内注射により、2.5 mg/kgのEPで処理された。３日後(細胞接種後７日目)、腫瘍体積が約26mm3に達した際、マウスは、腹腔内注射により0.2 mg/kgのビヒクル又はPEPD(１週間に３回投与；月曜日、水曜日、金曜日)でも処理された。EPとPEPD/ビヒクルが両方投与される日には、PEPD/ビヒクルはEPの１時間後に投与された。腫瘍体積は、１週間に３回測定された(月曜日、水曜日、金曜日)。マウスは、細胞接種後２１日目に行われた最後の処理(合計７回のPEPD処理)から２４時間後に殺され、PEPDの血漿濃度の測定のために、マウスから血液サンプルが採取された。(ａ)各値は、平均値±SEM(n＝8〜11)である。(ｂ)各値は、平均値±SD(n＝3)である。これは、PEPDが、ErbB2過剰発現のない腫瘍を標的にしないことを示す。注目すべきことに、これらの腫瘍細胞は、図８ａに示されるように、ErbB1、ErbB3又はErbB4を発現しない。
【図１７】PEPDによる同所性乳腺腫瘍の強い抑制、及び、酵素的不活性PEPD(PEPDG278D)による前記腫瘍のより強い抑制を示すデータ。メスの胸腺欠損ヌードマウス(生後６〜７週間)はそれぞれ、乳腺脂肪パッドへの乳癌BT-474細胞の同所性接種(少量のPBS：マトリゲルミックス中、１部位あたり2×106細胞)の前に、６０日リリースの17β-エストラジオールペレット(1.7mgのエストラジオール)を皮下に(背中の)植え込まれた。(ａ)経時的な腫瘍サイズ増大のプロット。EP(0.5 mg/kg)は、腹腔内注射により毎日投与された。注目すべきことに、この用量のEPは、PEPDの血漿濃度上昇において2.5 mg/kgと同程度に効果的であった。EP投与は、常に、PEPD又はPEPDG278Dより４日早く開始された。PEPD及びPEPDG278Dは、週に３回(月曜日、水曜日、金曜日)、腹腔内注射によりそれぞれ2 mg/kgで投与された。各値は、平均値±SEMである。(ｂ)パネルａに示されたグラフの５８日目における、EP、PEPD及びPEPDG278D処理を考慮した血漿PEPDを示すグラフ；各値は、平均値±SDである。
【図１８】ErbB2及び下流シグナルへの影響に対するPEPD-FcとPEPDの比較のため、CHO-K1/ErbB2細胞は、３又は６時間、ビヒクル、PEPD-Fc(27 nM)又はPEPD(27 nM)で処理され、その後ウエスタンブロットで分析された。ヒトPEPD-ヒトFcハイブリッド(FcはPEPDのカルボキシ末端にフレーム内でリンク)が我々によって、標準組換えテクノロジーを用いて調製された。
【図１９】rhPEPD又はrhPEPDG278Dによって処理された腫瘍における腫瘍抑制及び分子変化を要約したデータ。rhPEPD又はrhPEPDG278Dは、前述したPEPD又はPEPDG278DもしくはG278D-PEPDと同じである。図１７に示される複数の実験グループにおける腫瘍は、分子解析には小さすぎた。(ａ)ビヒクル、EP、EP＋rhPEPD又はEP＋rhPEPDG278Dで処理された、乳腺脂肪パッドBT-474細胞異種移植から生じた腫瘍サイズ。EP：腹腔内に毎日体重1kgあたり0.5mgで、rhPDPD又はrhPEPDG278Dの４日前からスタートした。rhPEPD又はrhPEPDG278D；腹腔内に体重1kgあたり2mgで、２容量のみを２日に分けた。エラーバーはs.e.m.(n＝3〜6)。(ｂ)ａに示される最終投与後２４時間目に得られた腫瘍検体における主要細胞シグナル伝達の変化を比較する免疫ブロット。各サンプルは一つの腫瘍を代表する。(ｃ，ｄ)ａに示される最終投与から２４時間後に得られた腫瘍検体におけるSRCキナーゼ活性及びPI3K活性。エラーバーはs.d.(n＝3)である。(ｅ)ａに示される最終投与後２４時間目に得られた腫瘍検体におけるHIF-1αシグナル伝達の変化を比較する免疫ブロット。各サンプルは一つの腫瘍を代表する。HIF-1α及び関連因子(血管内皮細胞増殖因子[VEGF]及びグルコース輸送体1[GLUT-1])は、生存促進性因子であるため、この結果は、rhPEPDG278D が、rhPEPDより強力な抗腫瘍薬である理由を少なくとも部分的に説明する。これらの生存促進性因子に対するrhPEPDの刺激効果は、そのジペプチダーゼ活性に依存すると考えられる。rhPEPDとrhPEPDG278Dはどちらも、明らかにErbB2を経て腫瘍細胞によって内部移行された(それらのHisタグによって測定、図１９ｅ)。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本開示は、少なくとも１部は、PEPDがErbB2レセプターのリガンドであり、それをErbB2陽性癌の増殖の抑制のために使用できるという我々の発見に基づいている。特定の理論に拘束されることを意図しないが、特に、我々は、本開示において、PEPDがErbB2細胞外ドメインのサブドメイン３に結合するErbB2リガンドであることを実証する。PEPDはホモダイマーとしてErbB2に結合し、各サブユニットは１つのErbB2モノマーに明確に結合している。PEPDが、既存のErbB2ダイマーに結合する際、それは急速にErbB2-Src/CK2-PTEN-AKTシグナル伝達系を抑制する。PEPDは、ErbB2モノマーにも結合し、ErbB2二量体化とチロシンリン酸化を引き起こす。しかしながら、PEPDはすぐにErbB2内部移行及び分解に起因する深刻なErbB2低下をもたらし、PEPDはErbB2を過剰発現する細胞の増殖を選択的に阻害するため、PEPDによるErbB2活性化は、明らかにわずかである。また、ここに提示されたデータから、PEPDは、それが細胞外スペースに存在する場合にのみErbB2を攻撃し、その酵素活性を伴わないと考えられる。このように、本開示は、PEPDがErbB2レセプターのリガンドであるが、ErbB2のシグナル伝達を抑制する；PEPDの酵素活性はErbB2ターゲティングに関与しない；PEPDは、それが細胞外スペースに存在する場合のみErbB2に作用する；及び、PEPDはErbB2を過剰発現する細胞を選択的に阻害する、という新事実を含むが、これに限定されない。ここに提示されたデータは、PEPD及びその酵素的に不活性な誘導体が、臨床的に関連する動物モデルにおいて有効な抗-Erb2＋癌効果を有することを実証する。特に、ここに提示されたデータは、PEPD及びその酵素的に不活性な変異体が、ErbB2を過剰発現する腫瘍を特異的に標的にすること、Erb2＋腫瘍の抑制が、同所性乳癌モデルにおいて確認されることを実証する。さらに、ここに開示されたデータは、本開示の組成物及び方法が、PEPD製剤による治療の休止後、少なくともいくつかのErb2＋腫瘍の再発を防ぐのに効果的であることを実証する。
【００１３】
ErbB2のアミノ酸配列は、GenBank受入番号NM 004448.2で提供されている。ErbB2の変異体は当該分野において既知であり、本方法は、そのErbB2変異体が細胞外ドメインを有する限り、いかなるErbB2変異体でも機能すると予期される。前記細胞外ドメインは当該分野において既知であり、上述のGenBank受入番号の一次アミノ酸配列におけるアミノ酸番号23〜652を含む。
【００１４】
より具体的には、本開示及びここに提示された実施例から、ErbB2シグナル伝達に対するPEPDの効果が、新規なリガンド-誘発ErbB2シグナル伝達、並びに、新規なPEPD機能を意味することが明らかにされるであろう。この関係の非限定的な図解は、ErbB2を過剰発現する細胞のPEPDによる選択的阻害が、どのように、ヒトにおいてErbB2陽性乳癌及び他の癌に対するPEPDの治療的有用性を発揮し得るかを実証する図６に描写される(理論に拘束されることを意図しない)。
【００１５】
PEPDは比較的高親和性のリガンド(Kd＝7.3 nM、図１ｃ)であり、ErbB2シグナル伝達に対する強力な影響を発揮する。結合に関与する正確な残基は不明のままであるが、PEPDはErbB2 ECDのサブドメイン３に結合する。ErbB2 ECDが、リガンド活性化状態(直接的リガンド結合の不存在下でホモ-又はヘテロ-二量体化できる状態にする)と似ている固定立体構造をとることは、以前に示唆されている(Cho HS, et a. Nature 2003, 421(6924): 756-760)が、本開示はこのモデルが不完全であることを示す。PEPDは、二段階のErbB2シグナル伝達のシャットダウンを引き起こす。PEPD治療から数分以内に、すでに組み立てられていたシグナル複合体ErbB2-Src-CK2は破壊される。SrcとCK2の両方が、ErbB2から解離し、不活性となり、下流シグナルを変化させる：PTEN脱リン酸化と細胞膜への再配置、及びAKT脱リン酸化(おそらくPTENによるPIP3脱リン酸化に起因する)。しかしながら、PEPDは、ErbB3を経てErbB2と明らかに会合しているPI3Kには影響を及ぼさない。しかしながら、インビボの腫瘍組織内で、PEPD及び PEPDG278Dは、明らかにErbB2-ErbB3会合を破壊することによって、ErbB3及びPI3Kを抑制し(図１９)、これは、比較的短いPEPD治療時間のため、我々のインビトロの研究では検出されなかった。Src及びCK2へのPEPDの影響が、明白なErbB2低下が存在しなくても生じるため、PEPDのErbB2ダイマーへの結合は、後者の構造変化をもたらし、それがSrcを保持できない状態にすると思われる。PEPDは、ErbB2モノマーとも結合し、ErbB2二量体化と活性化を引き起こすが、それはいくぶんゆっくりと発生する(ErbB2とERKのピークリン酸化濃度が、PEPD治療の３時間後に検出されたため)。しかしながら、PEPDが、ErbB2の重度且つ持続的な低下も生じさせる(PEPD治療の１〜３時間後に明確になり、６時間で低下が最大になり、少なくとも７２時間持続する)ため、PEPD-誘発ErbB2活性化は機能的にわずかと思われる。PEPDはほぼ完全なErbB2の枯渇を引き起こすことができた(図２ｃ)。PEPD-誘発ErbB2低下は、PEPDがErbB2 ECD切断に影響がなく、またそれはErbB2遺伝子発現を調節しないため、ErbB2内部移行及び分解に完全に起因すると思われる。このように、本開示は、PEPDの根本的に異なり且つ新しい機能を明らかにする。PEPDは細胞質ジペプチダーゼとして知られてきた。我々は今、PEPDがErbB2リガンドであるだけでなく、そのジペプチダーゼ活性の99.4％を失ったPEPD変異体が、野生型タンパク質と同程度に効果的であることを見い出した。さらに、インビボにおいて、前記PEPD変異体は、ErbB2陽性腫瘍と戦うために、PEPDそれ自体より効果的である(図１７)。細胞内PEPDは、ErbB2には影響がないが、本開示にて明らかにされるように、PEPDは細胞から放出され、且つ、より多くのPEPDがダメージを受けた組織及び細胞から放出される。
【００１６】
PEPDを含む組成物は、ヒトにおけるErbB2陽性乳癌及び他の癌の予防及び／又は治療に有用であると考えられる。ErbB2-陽性乳癌において主要な役割を果たす、ErbB2-Src/CK2-PTEN-AKTシグナル伝達経路を急速に抑制(silence)する、及び、ErbB2の明白で持続的な低下を引き起こすその能力と一致して、我々はPEPDが、最小限のErbB2発現を有する細胞にほとんど影響を与えない一方、ErbB2を過剰発現する細胞の増殖、足場非依存性コロニー形成及び浸潤/遊走を有意に抑制することを示し、且つ、上述した通りそして以下により詳細に説明する通り、我々はPEPDとその酵素的不活性誘導体の抗がん作用を、ErB2＋腫瘍を有する臨床的に関連する動物モデルを使用して実証する。ErbB2に対するPEPDの抑制的影響は、他のErbBリガンドのそれらのレセプターへのよく知られている刺激的影響とは際立って対照的である。ErbB2シグナル伝達及びErbB2を過剰発現する細胞へのPEPDの影響は、トラスツズマブのそれを思わせる。クリニックにおけるトラスツズマブ使用の高いコストを考えると(１用量あたりの現在のコストは1,000ドルを超え、フルコースの治療では約70,000ドルである)、PEPDは、それが量産でき、さらに以下に記載するように比較的低コストであるという利点を有し、それゆえ、所定の実施形態において、トラスツズマブの重要でより安価な代替手段となると予期される。インビボでは、トラスツズマブはErbB2発現を下方調整もせず、癌組織におけるErbB2チロシンリン酸化も阻害しない(Gennari et al., Clin Cancer Res, 10, 5650-5655, 2004; Gijsen et al., PLoS Biol, 8, e1000563, 2010)；むしろ、その抗腫瘍活性は、主に、そのFcドメインを経た抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用(ADCC)に依存する(Barok et al., Mol Cancer Ther, 6, 2065-2072, 2007; Clynes et al., Nature Med, 6, 443-446, 2000)。このように、PEPDあるいはその変異体は、トラスツズマブを補完するかもしれず、患者におけるトラスツズマブへの耐性をある程度克服するかもしれない。
【００１７】
いかなるPEPDも、本開示の組成物及び方法における使用に好適であると予期される。複数の実施形態において、前記PEPDは原核生物あるいは真核生物によって産生されるPEPDである。複数の実施形態において、前記PEPDは原核生物を起源とする。非限定的な複数の実施形態では、前記PEPDは、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス(Pseudoalteromonas haloplanktis)によって(すなわち、GenBank no. AAA99824.1のアミノ酸配列を含むPEPD)、あるいはパイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)によって(すなわち、GenBank no. WP 011011876.1のアミノ酸配列を含むPEPD)産生される。多数の哺乳類PEPDアミノ酸配列を含む、多数の真核生物のPEPDアミノ酸配列も、当該分野において既知である。複数の実施形態において、前記PEPDは、げっ歯類(すなわち、マウス又はラット)PEPD、あるいは非ヒト霊長類(チンパンジー又はアカゲザル等)PEPDの配列を有する。マウスプロリダーゼのアミノ酸配列は、GenBank受入番号NP 032846.2として提供され、ラットプロリダーゼはNP 001009641.1として提供され、アカゲザルプロリダーゼは、AFJ71215.1として提供され；チンパンジープロリダーゼはNP 001267459.1として提供されている。配列番号１のヒトプロリダーゼ(PEPD)のアミノ酸配列は、当該分野において既知である。配列番号１及びそれをコードするcDNA配列は、GenBank受入番号 J04605.1によりアクセス可能である；前記アミノ酸配列は、GenBank受入番号AAA60064としても提供されている。ある例示的で非限定的な一実施形態において、酵素的に活性なヒトPEPDは、配列番号１の配列を有する：
【数１】
0006353052.tif 000002
【００１８】
配列番号１において、278位のＧが影付きにされ、ボールド体及びイタリック体にされ、PEPDを酵素的に不活性な状態にするG278D変異の位置を表す。複数の実施形態において、前記変異は、278位のグリシンの、アスパラギン酸以外のアミノ酸への変更である。
【００１９】
本開示において参照される前記GenBank受入番号の下で提供されるアミノ酸及びポリヌクレオチド配列の全ては、それらの配列が、この出願の出願日にGenBankを通じて利用可能であったため、参照により本明細書中に包含される。本開示はまた、ここに記載されている、あるいはそうでなければ本開示の利益を考慮して当業者に知られるであろうPEPD及びその全ての変異体をコードする全てのポリヌクレオチドを含む。
【００２０】
げっ歯類(マウス及びラット)PEPDアミノ酸配列は、ヒト配列と８６％を超えて類似しており、アカゲザル等の非ヒト霊長類PPEDアミノ酸配列は、ヒトPEPDアミノ酸配列と９５％より多く類似している。複数の実施形態において、前記PEPDは、ヒトPEPDアミノ酸配列を含むか、それからなる。複数の実施形態において、本開示の組成物及び／又は方法において使用されるPEPDは、少なくとも８５．０％と９９．９％の間(包括的であり、その間に存在する小数第一位の全ての数字を含む)で配列番号１の配列に類似する。一実施形態において、前記PEPDは、配列番号１の配列に少なくとも９５％類似するアミノ酸配列を含む。
【００２１】
様々な実施形態において、本開示は、野生型PEPD(例えば、配列番号１のPEPD)又は改変(修飾)PEPD、あるいは、それらの組み合わせを含む組成物を含む。一般に、本発明での使用に適切なPEPDへの改変は、本開示の利益を考慮して、通常の技術を使用して当業者によって決定されることができる。複数の実施形態において、改変PEPDは、配列番号１の改変を含む。本開示は、前記PEPDが、ErbB2に結合する能力を保持し、細胞表面からErbB2の減少を引き起こす限り、配列番号１の全ての改変を含む。複数の実施形態において、改変PEPDは、ホモダイマーを形成する能力を保持する。複数の実施形態において、ErbB2陽性細胞と、本開示の改変(又は野生型)PEPDを接触させると、その後、ErbB2結合とErbB2のエンドサイトーシスが続き、ErbB2の低下をもたらす。これらの機能的特質のいくつかあるいは全てを維持している改変PEPDは、アミノ酸の挿入、欠損及び置換を含んでもよい。例えば、本開示は、一般にＲ基置換体の関連のある類似性に基づく保存的アミノ酸置換によって改変されたPEPDを含む。そのような置換の非限定的な例は、alaに対するgly又はser；argに対するlys；asnに対するgln又はhis；aspに対するglu；cysに対するser；glnに対するasn；gluに対するasp；glyに対するala；hisに対するasn又はgln；ileに対するleu又はval；leuに対するile又はval；lysに対するarg；metに対するleu又はtyr；serに対するthr；trpに対するtyr；tyrに対するphe；及びvalに対するile又はlerを含む。このように、何らかの単一の保存的アミノ酸置換、又は保存的アミノ酸置換の何らかの組み合わせを含むPEPDは、それらが少なくともErbB2に結合する能力を保持でき、それに続く細胞表面からのErbB2の枯渇を伴う限り、本開示に含まれる。特定の改変PEPDがErbB2に結合できるかどうかを決定する方法は、当業者に自明である。複数の実施形態において、前記改変PEPDは、ELISA分析を使用して測定された際、推定Kd値7.3nMにてErbB2細胞外ドメインと結合することができる。
【００２２】
野生型PEPDは、酵素的に活性である。改変PEPDは、配列番号１における変更を含み、酵素的に活性又は酵素的に不活性でありうるPEPDである。この関連で、当該分野において、PEPDのイミノジペプチダーゼ活性における欠陥はプロリダーゼ欠損症と関係があり、コラーゲン代謝に関する非常にまれな常染色体劣性遺伝疾患であり、結合組織に影響を与えることが知られている。このように、PEPDの酵素活性は重要であることは既知である。しかしながら、複数の実施形態において、酵素的不活性PEPDが本開示の組成物及び方法で使用される。酵素的不活性PEPDは、配列番号１の配列を含むか又はそれからなる参照タンパク質によって示される加水分解の量よりも、そのカルボキシ末端にプロリン又はヒドロキシプロリンを持つ基質ジペプチドに対しより少ない加水分解を示すPEPDであると考えられる。複数の実施形態において、酵素的に不活性なPEPDは、参照PEPDと比較して、少なくとも0.0〜99.9％(包括的であり、少数第一位まで、その間の全ての数字を含む)少ないジペプチド加水分解活性を有しうる。一実施形態では、酵素的不活性PEPDは、参照PEPDの0.6％以下のジペプチド加水分解活性を有する。一実施形態では、前記参照PEPDは、配列番号１の配列を含むか、又はそれからなる。プロリダーゼ活性の一単位は、標準分析条件下で、１時間当たり１μmolのプロリンを放出する酵素の量と定義されることができる。一実施形態では、酵素的不活性PEPDは、検出可能なPEPDジペプチド加水分解活性を有さない。ある実施形態では、酵素的不活性PEPDは、G278D変異を有する。複数の実施形態において、本開示は、本明細書に開示された何らかの１の又は何らかの組み合わせのPEPD変異を含み、したがって、本発明から、何らかの単一の又は何らかの組み合わせのそのような変異体が排除されることができるという条件を含む。
【００２３】
本開示の実施形態で使用されるPEPDは、その望ましい特性(例えば、腫瘍細胞又は腫瘍微小環境に結合又は侵入する能力、あるいは循環時間、生物学的利用率、安定性、又は、ErbB2-陽性細胞-標的殺傷、又はErbB2-陽性細胞画像化に関連する使用を増大する能力)を強化する改変を含むことができる。本開示で使用できるPEPDタンパク質は、配列番号１又はその改変を含むポリペプチドを含み、及び、複数の実施形態では、より大きいポリペプチドの中にそのようなPEPDポリペプチドも含む。配列番号１の改変は、酵素活性を抑止するあるいは減らす改変、及び／又は、ErbB2に結合する改変PEPDの能力に影響を与えない変更を含む。このように、配列番号１のPEPDは、一般にＲ基置換体の関連する類似性に基づく保存的アミノ酸置換によって改変されることができる。考えられるそのような置換の非限定的な例には、alaに対するgly又はser；argに対するlys；asnに対するgln又はhis；aspに対するglu；cysに対するser；glnに対するasn；gluに対するasp；glyに対するala；hisに対するasn又はgln；ileに対するleu又はval；leuに対するile又はval；lysに対するarg；metに対するleu又はtyr；serに対するthr；trpに対するtyr；tyrに対するphe；及びvalに対するile又はlerが含まれるが、これらに限定されない。このように、何らかの単一の保存的アミノ酸置換、又は、保存的なアミノ酸置換の何らかの組み合わせを含むPEPDは、それらが、それらのErbB2結合特性を保持し、且つ、ErbB2陽性細胞の増殖を阻害できる限り、本開示に含まれる。このように、本開示は、配列番号１又はその改変を含むポリペプチド配列を含み、及び、さらなる改変(追加のアミノ酸、及び／又は、他の組成物との複合体の一部として提供されることを含むが、必ずしもそれらに限定されない)を含むことができる。このように、前記PEPDポリペプチドは、融合タンパク質等のより大きなタンパク質の一部であってもよく、あるいはそれらは他の成分に結合されることができる。したがって、前記PEPDタンパク質は、ErbB2陽性癌の予防及び／又は治療に応じて、それらの機能的性能を改善すると予期される何らかの望ましい成分と共有結合的にあるいは非共有結合的に結合することができる。
【００２４】
一般に、前記PEPDタンパク質(及び必要に応じて、それと共に単一の融合タンパク質を作るポリペプチド配列)は、従来技術を使用して作られることができる。例えば、複数の実施形態において、PEPDタンパク質／融合タンパク質は、原核生物又は真核生物の発現系を使用して作られることができる。このように、本開示は、作るのに費用と時間がかかる、ErbB2をターゲットとするmAbsのような他のErbB2結合パートナーを超える製造上の利点を提供する。ここに記載されるPEPDを含む又はそれからなるタンパク質の組換え製造のために、一般に、前記PEPDをコードするいかなるポリヌクレオチドも発現ベクターによって提供されることができる。「発現ベクター」とは、前記PEPDコード配列に動作可能に結合されるタンパク質発現制御配列を含むベクターを意味する。前記発現ベクターは、発現のためのシスエレメントを含むことができ、これは、選択された発現系に依存して、プロモーターエレメント、エンハンサーエレメント、複製開始点、選択可能マーカー、転写開始点、翻訳開始点をコードする配列、及び、タンパク質発現のために望ましい何らかの他の配列を含むが、それらに限定されない。PEPDをコードするポリヌクレオチド配列(それぞれのPEPDコード配列は本開示に包含される)を発現するために設計されることができる適切なタンパク質発現ベクターは、当該分野において既知のもの全てを含み、その例には、PEPDをコードする組換えポリヌクレオチドを含むコスミド、プラスミド及びウイルス由来の系が含まれるがこれらに限定されない。本発明の組換えPEPDタンパク質を発現するために使用される系は、いかなる適切な生物であってもよく、哺乳類細胞発現系、昆虫細胞発現系(例えば、バキュロウイルス由来系)、イースト発現系、植物細胞発現系、及び原核生物発現系を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、大腸菌がPEPD発現のために使用される。一実施形態では、PEPDキメラタンパク質が、前記キメラタンパク質がヒト特異的グリコシル化を含むように、哺乳類発現系を使用して組換えで発現される。
【００２５】
ある実施形態では、PEPDタンパク質は、キメラPEPD/Ig分子を提供するために、免疫グロブリン(Ig)又はそのフラグメントに抱合されることができる。そのような構築物は、ErbB2＋細胞の標的殺傷を促進するために、個体の免疫応答の様々な面への関与に有用であると思われる。前記免疫グロブリン又はそのフラグメントは、いかなるIgタイプ又はサブタイプであってもよい。この関連で、従前の研究は、抗体依存性細胞傷害(Fcレセプターによって媒介される)が、ErbB2陽性乳癌のトラスツズマブによる標的化において重大な役割を果たすことを示した(Clynes et al., Nature Med, 6, 443-446, 2000; Spiridon et al., Clin Cancer Res, 10, 3542-3551, 2004)。本開示は、同様に、PEPD-Fcキメラタンパク質及びそれらを含む医薬組成物を包含する。Fc-キメラタンパク質の製造方法は、当該分野において既知である。例えば、pFUSE-Fcベクターは、InvivoGeneから市販されており、PEPD-Fc融合ハイブリッドを生成するために使用できる。このように、一実施形態において、本開示は、融合タンパク質を含む組成物、ここで、前記PEPDは当該融合タンパク質の一成分であり、当該融合タンパク質はヒトIgのFc領域を含む。様々な実施形態において、前記Fc領域は、IgA、IgG又はIgE抗体由来のFc領域又はそのフラグメントであり、しかし、他の抗体タイプ由来のFc領域でもよく、また、合成／人口Fc領域も使用されることができる。複数の実施形態において、前記Fc領域はヒトIgG2a又はヒトIgG1又はそのようなFc領域のフラグメントである。前記Fc領域は、ヒト等の哺乳類によって製造されるFc領域と同一のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなってもよい。様々な実施形態において、前記Fc領域は、マウス及び／又はヒトによって製造されるFc領域と８０％〜１００％(その間の全ての整数を含む)のアミノ酸配列類似性を有していてもよい。前記Fc領域は無傷のFc領域(全Fc領域を意味する)であってもよく、あるいは前記Fc領域のフラグメントであってもよい。当業者は、抗体の「Fc領域」が、抗体の「Fragment crystallizable」領域を意味し、抗体のクラスに依存する２又は３の定常ドメイン(CD)に寄与する２つの重鎖を含むことを認識するであろう。Fc領域をコードするヌクレオチド配列、及び、マウス及びヒトの免疫グロブリンのFc領域のアミノ酸配列は、当該分野において周知である。一実施形態では、前記融合タンパク質のFc領域は、抗体重鎖(単数又は複数)のみを含む。当業者は、マウス動物モデルを使用する本発明の実証のためには、前記融合タンパク質のFc部は、IgG2a又はIgG2b FcマウスIg部であってもよいが、ヒトの疾患の治療及び／又は予防のためには、前記Fc部が好ましくはIgG1又はIgG3 Fc部であることを認識するであろう。特定の実施形態において、ここで提示される融合タンパク質のFc部は、抗原認識部位を含まない(すなわち、前記融合タンパク質の抗体部は、抗体可変領域を含まない)。このように、前記融合タンパク質は、抗原結合部位を含む抗体とは異なる。Fc-融合PEPDタンパク質をコードするDNA構築物は、当業者に周知の何らかの従来技術を使用して作ることができる。例えば、前記Fc-融合コード構築物は、市販の試薬を使用して作ることができる。例えば、INVIVOGENは、免疫グロブリン(Ig)のFc領域に所定のタンパク質をコードする配列を融合させることによって、Fc-融合タンパク質の構築を促進���るために開発されたプラスミドのpFUSE-Fcファミリーを提供する。この構築物において、前記Fc領域は、IgG重鎖のCH2及びCH3ドメインと、ヒンジ領域を含む。前記ヒンジは、Fc融合タンパク質の２つの部分の間のフレキシブルスペーサーとして働き、前記融合タンパク質の各部が、必要に応じて独立して機能することを可能にする。
【００２６】
上述の通り、本開示は、PEPDタンパク質を、当該PEPDタンパク質と同じオープンリーディングフレーム中で発現することが望ましい何らかの他のアミノ酸配列を含みうる融合タンパク質の構成成分として含み、且つ、タンパク質の単離及び／又は精製を促進するのに関連するアミノ酸配列、溶解性、分泌、あるいは他の機能のためのアミノ酸配列（これらに限定されない）を含むことができる。前記PEPDポリペプチドは、製造しようとする特定の融合タンパク質に応じて、前記融合オープンリーディングフレームに設計されたＮ末端又はＣ末端であってもよい。例えば、前記PEPDタンパク質は、適切なポリヒスチジンタグ等のヒスチジンタグを付与されることができる。複数の実施形態において、前記ヒスチジンタグは、配列中に少なくとも６つのヒスチジンを含む。ある実施形態では、前記Hisタグは、ヘキサ-ヒスチジンペプチド配列である。ある実施形態では、PEPD発現系は、必要に応じて、例えば、tobacco etch virus(TEV)によって切断可能なＮ末端ヘキサ-ヒスチジンタグを含むことによって、ヒスチジンタグが除去可能なように構成されることができる。
【００２７】
非限定的な実施形態において、前記PEPDポリペプチドは、化学療法剤、又は細胞傷害活性を有する他の剤、又はErbB2陽性細胞/組織の検出及び／又は画像化のために有用な剤と併用又は共役されることができる。例えば、PEPD抱合体は、酵素的に活性な毒素及びそのフラグメントあるいは低分子を含んでもよい。好適な酵素活性毒素及び低分子は、ドセタキセル、ミトキサントロン、タキサン、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エクソトキシンＡ鎖(緑膿菌由来)、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、ニガウリ・インヒビター、クルシン、クロチン、サボンソウ・インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセン、微小管標的剤、又は抗血管新生薬(単数又は複数)を含むがこれらに限定されない。
【００２８】
PEPDタンパク質と化学療法剤(あるいは、造影剤等の他の剤)の抱合体及び組み合わせは、適切な技術を使用して作られてもよい。様々な実施形態において、前記PEPDタンパク質は、化学療法剤とは別に製造され、その後化学的にそれに共役させることができ、また、タンパク剤の場合は、前記PEPDタンパク質は、新規なキメラタンパク質を得るために、PEPD/タンパク質融合体として製造されることができる。化学カップリングのために、N-サクシニミジル-3-(2-ピリジルジチオール)プロピオネート(SPDP)、サクシニミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート、イミノチオラン(IT)、イミドエステル類の二官能性の誘導体(アジプイミド酸ジメチルHCL等)、活性エステル類(スベリン酸ジサクシンイミジル等)、アルデヒド類(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン2,6-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン等)などの、様々な二官能性タンパク質カップリング剤が、PEPDと化学療法剤又は他の剤(造影剤等)を共有結合的に結合するために使用できる。
【００２９】
別の実施形態では、前記PEPDは、放射性薬剤に結合されてもよい。PEPDが結合するErbB2陽性細胞又は組織が、画像化され又は選択的に破壊されるように、様々な放射性同位元素が、タンパク質への結合のために利用できる。細胞の選択的破壊のために、前記ペプチドは、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及びLuの放射性同位元素等の高放射性原子に結合されることができる。ErbB2陽性細胞を同定するために、前記PEPD抱合体は、シンチグラフ検査用の放射性原子、例えば、Tc99m(準安定テクネチウム-99)、I123又は核磁気共鳴及び／又は磁気共鳴画像法のためのスピン標識(I123、I131、In111、F19、C13、N15、O17またはガドリニウム(III)またはマンガン(II)等)を含むことができる。前記放射標識は、既知の方法で、前記PEPDタンパク質中に組み込まれてもよい。
【００３０】
前記PEPDタンパク質は、それらを、何らかの適切な薬学的に許容されるキャリア、賦形剤及び／又は安定剤に配合することによって、投与用の医薬組成物として提供されてもよい。薬学的に許容されるキャリア、賦形剤及び安定剤のいくつかの適切な例が、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy(2005)21st Edition, Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins」に開示されている。さらに、PEPDを長時間にわたって放出する徐放送達製剤などの、適切な送達ビヒクルが、本発明において使用されることができる。必要に応じて、前記医薬組成物は、PEPDと凝固阻害剤を両方とも含むことができる。
【００３１】
ここに記載されたPEPD含有製剤の投与は、適切な投与ルート(非経口的、腹腔内、肺内、経口、及び腫瘍内を含むが、これらに限定されない)を使用して行うことができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内及び皮下投与が含まれる。
【００３２】
組成物中に含まれる及び／又は前記方法で使用されるPEPD及び他の活性薬剤の量は、本開示の利益を考慮して、当業者によって決定されることができる。このように、一実施形態では、本発明の組成物の有効量が投与される。有効量は、ErbB2を発現している個体において細胞の増殖を抑制する組成物の量、又は、個体の生存時間を延長する量、又は前記個体においてErbB2の発現に関連する病気の症状を緩和する量、又は、ErbB2を過剰発現する細胞の悪性形質を抑制する量であってもよい。複数の実施形態において、本発明の組成物を投与される個体は、ErbB2陽性癌の発生及び／又は再発を有するか、疑いがあるか、又はリスクを有する。複数の実施形態において、前記ErbB2陽性癌は、乳癌、膀胱癌、卵巣癌、胃癌、又は侵襲型の子宮癌(子宮漿液子宮内膜癌等)、又はErbB2を過剰発現する他の癌、 又は、その幹細胞がErbB2を過剰発現する癌、又はErbB2を過剰発現する転移性癌である。
【００３３】
治療又は予防目的のための適切な投与量は、当業者によって決定されることができ、少なくとも部分的に、その個体の年齢、性別、大きさ及び健康、使用する送達システムの種類、疾患のステージ、及び、当業者に自明な他の因子の考慮に基づく。複数の実施形態において、ヒト患者に対するPEPD投薬は、トラスツズマブの投薬(一般に、週に2〜4 mg/kg)と同程度又は同一であってもよい。
【００３４】
本開示の組成物は、化学療法剤、受動免疫療法、ワクチン、アジュバントのような、連続的又は同時投与を含む、何らかの従来の治療計画と併用して投与されることができる。特定の実施形態において、前記方法は、ErbB2陽性細胞と関連する病気又は疾患の治療を目的とする従来の治療と併用して実施されることができる。例えば、ここに記載された組成物の投与は、PEPD投与の前、同時、又は後に行われることができる化学療法、外科的処置、及び放射線療法を含むがこれらに限定されない治療法と併用されることができる。複数の実施形態において、本開示は、PEPDとセツキシマブ(ErbB1に対し臨床的に使用されるモノクローナル抗体)を含む組成物を含む。複数の実施形態において、本開示は、臨床的に使用される二重ErbB1/ErbB2キナーゼ阻害薬ラパチニブと共にPEPDを含む組成物を含む。複数の実施形態において、本開示は、PEPDとトラスツズマブを含んでいる組成物を含む。複数の実施形態において、本開示は、PEPDとペルツズマブ(臨床的に使用されるもう一つの抗-ErbB2モノクローナル抗体)を含む組成物を含む。
【００３５】
複数の実施形態において、本開示は、PEPDタンパク質に加えて、血液凝固阻害剤を含む組成物、及び当該組成物を使用する方法を含む。一実施形態において、前記凝固阻害剤は、患者に必要なPEPD投与量を減らせるように、インビボでPEPD分解を抑制する薬剤である。一実施形態では、前記凝固阻害剤は、プロトロンビンのトロンビンへの変換を阻害、又は血栓形成におけるトロンビンの関与を阻害する。ある実施形態では、前記凝固阻害剤は、第X因子及び第II因子として知られる血栓促進タンパク質の凝固関連機能を妨害する。複数の実施形態において、前記凝固阻害剤は、アンチトロンビンIIIに結合及び活性化し、その結果として、凝固因子Xa及びIIaが阻害される。ある実施形態では、前記凝固阻害剤は、未分画へパリン製剤、又は低分子量ヘパリン等のヘパリンである。低分子量へパリンは、当該分野において既知である(Weitz JI; Weitz, Jeffrey I.(1997). "Low-molecular-weight heparins” N Engl J Med 337(10): 688-98)。ある実施形態では、前記低分子量ヘパリンは、エノキサパリン、あるいはエノキサパリンナトリウム等のその薬学的に許容される塩である。ある実施形態では、前記阻害剤は、商品名リバーロキサバン、アピキサバン又はエドキサバンで販売されている薬剤を含むがこれらに限定されない、経口又は非経口の直接Xa阻害薬である。ある実施形態では、前記凝固阻害剤は、第XII、XI及びVII因子を含むがこれらに限定されない他の血液凝固因子の阻害剤であってもよい。複数の実施形態において、前記低分子量ヘパリン又は他の凝固阻害剤は、適切なビヒクル及び投与ルートを使用して投与される。複数の実施形態において、前記凝固阻害剤は、皮下注射で投与される。一実施形態では、前記凝固阻害剤は経口で投与される。前記凝固阻害剤の投与量は、前記個体レシピエントの体重及び本開示の利益を考慮して当業者によって認識される他のパラメーターに基づいて決定される。複数の実施形態において、前記凝固阻害剤は、前記PEPD組成物の前に、同時に、又は後に投与されることができ、且つ、前記PEPD投与と同じ回数とタイミングで投与されてもよく、又は、前記PEPD投与と異なるスケジュールに従って投与されてもよい。
【００３６】
別の実施形態では、本開示は、ある個体が、PEPDを含む組成物を用いて治療する対象であるかどうかを特定する方法を提供する。前記方法は、前記個体から生体サンプルを採取し、当該サンプルがErbB2陽性癌細胞を含むかどうか決定することを含み、ここで、前記生体サンプルがErbB2陽性癌細胞を含むという決定は、前記個体が前記治療の対象となることを示し、そして、前記生体サンプルがErbB2陽性癌細胞を含まないという決定は、前記個体が前記治療の対象ではないことを示す。このように、複数の実施形態において、本開示は、ある個体がPEPDを含む組成物で治療する必要があるとの診断の補助又は診断することを提供する。複数の実施形態において、前記方法は、前記生体サンプル中のErbB2陽性癌細胞の存在又は不存在の決定を、医療提供者に、当該医療提供者が、一実施形態において、PEPDを含む組成物による治療を推薦できるように連絡することを含む。複数の実施形態では、前記方法はさらに、PEPDを含む組成物を前記個体に投与することを含む。ErbB2陽性癌細胞の存在の決定は、個体における又はErbB2を過剰発現するその個体の癌細胞から得られた生体サンプルにおける検出を含む。
【００３７】
ある実施形態では、個体が、PEPDを含む組成物で治療する対象であるかどうかを特定する方法は、前記個体から生体サンプルを採取すること、及び、当該サンプルが、ErbB2陽性癌細胞及び／又はErbB2過剰発現細胞を含むかどうかを、当該サンプルと、検出可能に標識されたPEPDとを接触させることによって決定することを含む。ErbB2＋と検出可能に標識されたPEPDとの複合体の検出は、その個体が、ここに記載されたPEPDを含む組成物で治療する対象であることを示す。ある実施形態では、前記ErbB2＋と検出可能に標識されたPEPDとの複合体は、ErbB2-陽性細胞を含む疑いのある腫瘍の生検で検出される。別の実施形態では、ErbB2-陽性細胞と結合したPEPDは、検出可能に標識されたPEPD結合パートナーを使用することによって検出されることができる。複数の実施形態において、ErbB2陽性癌細胞は、参照より多くのErbB2を発現する。前記参照は、対応対照、標準値(すなわち、曲線下面積)、及び／又はサンプル内の同じ組織型の細胞によって発現されるErbB2量の値(当該ErbB2細胞は癌細胞ではない)等の、何らかの適切な参照であればよい。一般的に、特定の実施形態では、ヒト患者がPEPD製剤で治療する対象であるとの特定は、ある個体がトラスツズマブで治療する対象であると特定する(臨床的に確立されたパラメーターに基づき、当業者に理解される)のと、同じ又は同様の基準を使用して行われる。例えば、免疫組織化学(IHC)は、腫瘍生検サンプル中に存在するErbB2量を測定するために頻繁に使用され、またその他に、蛍光インサイツハイブリダイゼーション法(FISH)は、遺伝子のコピー数を測定するために使用される(例えば、Carlson RW et al., J Natl Compr Canc Netw 2006, Suppl 4, S1-22; Her2 testing in breast cancer: NCCN Task Force report and recommendations.参照)。複数の実施形態において、IHCスコアが０又は１＋、平均ErbB2遺伝子／染色体17の比が１．８未満、又はFISHで測定される平均ErbB2遺伝子コピー数／細胞が４以下の腫瘍は、ErbB2陰性であると考えられる。IHCスコアが３＋、FISHによる平均ErbB2遺伝子／染色体17の比が２．２を超える、又は平均ErbB2遺伝子コピー数／細胞が６以上の腫瘍サンプルは、ErbB2を標的とする薬剤を使用する癌治療の対象である個体を特定する状況において、ErbB2陽性であると考えられる。
【００３８】
複数の実施形態において、本開示はさらに、製品、例えば、PEPD医薬製剤を含む製造品を提供する。前記製品は、単離及び／又は精製PEPDを含む。前記PEPDは、酵素的に活性又は不活性な形態のPEPDであってもよい。前記製造品は、パッケージング及び／又は印刷物を含む。一実施形態では、本開示は、PEPD製剤を含む密閉又は密封パッケージを含む。特定の実施形態では、前記パッケージは、一以上の密閉又は密封バイアル、ボトル、ブリスター(バブル)パック、又は、PEPD医薬品の販売、あるいは配布、あるいは使用に適切な他の包装を含むことができる。前記印刷物は、印刷された情報を含むことができる。前記印刷された情報は、ラベル上、又は挿入紙上で提供され、又はその包装材上に印刷されることができる。前記印刷された情報は、前記パッケージ内の前記PEPD剤、他の活性及び／又は不活性成分の量と種類を示す情報、前記組成物を服用する際の指示(一定期間にわたる投与回数等)、及び／又は、薬剤師及び／又は医師等の他の医療提供者、又は患者向けの情報を含むことができる。前記PEPD剤と別々に又は併用して提供される凝固阻害剤等のさらなる薬剤を、前記キットは含むことができ、且つ前記印刷された情報は特定することができる。前記印刷物は、前記キットで提供される前記PEPD医薬組成物及び／又は他の薬剤が、ErbB2陽性癌の治療用であることの表示を含むことができる。前記製品は、容器に入れられた治療的有効量のPEPD組成物を含むキットとして提供されることができ、当該キットはさらに、容器に付着された又は容器に入れられたラベルを含み、当該ラベルは、当該容器の中身を記載し、且つ、ErbB2陽性癌の治療のために、前記容器の中身を使用することに関する表示及び／又は指示を提供する。
【００３９】
以下の実施例は、本発明を説明することを意図し、限定を意図しない。
［実施例１］
本実施例は、ヒトPEPDが、ヒトErbB2 ECD内のサブドメイン３に結合し、ErbB2二量体化を引き起こすことを実証する。
組換えヒトPEPDは、以下に記載するように細菌中で生成され、0.04μMのErbB2/ECD-Fc［ヒトErbB2 ECD(Thr23-Thr652)と、ヒトIgG1のFcフラグメントの組換えキメラ］又はコントロールとしての0.04μMのFCとともに、0.04、0.2又は１μMでインキュベートされた。PEPDは前記ECDと特異的に結合し、各PEPDサブユニットは、ECDの一つのコピーに最大限に結合した(図１ａ)。もしPEPDとErbB2/ECD-Fc(Fcに起因)が両方とも溶液中でホモダイマーを形成するならば、上記結果は、一つのPEPDダイマーが一つのECDダイマーに結合することを示す。PEPDはまた、0.04μMのErbB3/ECD-Fc［ヒトErbB3のECD(Ser20-Thr643)とFcのキメラ］又は0.04μMのErbB4/ECD-Fc［ヒトErbB4のECD(Gln26-Arg649)とFcのキメラ］とともに、１μMでインキュベートされたが、結合は検出できなかった(図１ａ)。予想通り、ニューレグリン-1(NRG-1)は、ErbB3及びErbB4のECDと結合した(図７)。このように、PEPDは、ErbB3又はErbB4のリガンドではない。我々はさらに、低レベルのErbB2を発現するが、他のErbB類は発現しないチャイニーズハムスター卵巣CHO-K1細胞を使用して、ErbB2へのPEPD結合を研究した(図８ａ)。CHO-K1細胞中のヒトErbB2の過剰発現は、遺伝子導入によって容易に達成された(図１ｂ)。ErbB2-過剰発現細胞の溶解物を使用した酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)において、PEPDはErbB2に7.3nMの推定Kd値にて結合し、他方、コントロールCHO-K1細胞の溶解物に結合するPEPDはほとんどなかった(図１ｃ)。PEPDは、ErbB2の膜貫通及び細胞内領域に結合しなかった(図８ｂ)。次に、我々は、ErbB2発現プラスミド pCMV6-XL5-ERBB2をテンプレートとして使用して、ヒトErbB2の４つのECDサブドメインを一つずつ取り除いた(図１ｄ)。ErbB2及びその変異体の類似したタンパク質発現レベルが、前記プラスミドで一過性にトランスフェクトされたCHO-K1細胞中で検出された(図１ｄ)。ウエスタンブロット定量化に基づき等量のErbB2及びその変異体が、上述したのと同じELISAで使用された。サブドメインD1の欠損は、PEPD-ErbB2結合にほとんど影響を与えなかった；サブドメインD2及びD4除去後の結合親和性はそれぞれ、3.5倍と51.0倍減少したが、完全なPEPD結合が、PEPD濃度を上昇させることによって達成された；サブドメインD3の除去は、PEPD結合を完全に消失させた(図１ｅ)。このように、PEPDは、D3に結合し、D2及びD4には結合しないが、後者は特に、ErbB2へのPEPD結合を促進するかもしれない。
【００４０】
細胞中のErbB2の過剰発現は、自発的な二量体化を引き起こすことが知られている。予想通り、ErbB2を安定に過剰発現するCHO-K1細胞中に、ErbB2のモノマーとダイマーの両方が存在した(図１ｆ)。細胞は、収集及びウエスタンブロット解析前に、架橋剤であるビス(スルホスクシンイミジル)スベラート(BS3)で処理された。PEPDは、明らかにErbB2結合の２段階を経験した：既存のErbB2ホモダイマーへのPEPDホモダイマーの急速な結合(PEPD処理10分後、ErbB2モノマーレベルには変化がなく、ErbB2ダイマーレベルは減少し、２つのErbB2と２つのPEPDのヘテロテトラマーが形成された)、それに続く、ErbB2モノマーへのPEPDホモダイマーの結合、この結合は、PEPD処理30分で明白になった(ErbB2モノマーレベルの減少、１つのErbB2と２つのPEPDのヘテロトリマーの形成、新しいErbB2ホモダイマーの形成、さらに２つのErbB2と２つのPEPDのヘテロテトラマーの増加)(図１ｆ)。特に、PEPD処理後、PEPDと連結しなかったErbB2ホモダイマーの存在は、BS3による２つのタンパク質の不完全な架橋結合に起因すると思われる。
【００４１】
［実施例２］
この実施例は、PEPDが、ErbB2リン酸化をゆっくり且つ一過性に誘発するが、明白で持続的なErbB2低下を引き起こすことを実証する。ヒトErbB2を安定に過剰発現するCHO-K1/ErbB2細胞及びErbB2を恒常的に過剰発現するヒト乳癌BT-474中で、ErbB2上の２つの主要チロシンリン酸化サイトであるpY1221/1222及びpY1196が測定された。両サイトにおけるErbB2チロシンリン酸化は、2.7nMのPEPD処理後0.5〜１時間で明白に増加し、３時間でピークに達し、２４時間で基礎レベルまで大きく戻った(図２ａ、２ｂ)。より高いPEPD濃度(27と270nM)では、これらのサイトにおけるErbB2チロシンリン酸化は、さらに増加し、より長く持続した(図２ｃ)。PEPDによって誘発された比較的遅いErbB2チロシンリン酸化は、ErbB2モノマーへの比較的遅いPEPD結合及びそれに続く二量体化と一致する(図１ｆ)。PEPDは、既存のErbB2ダイマーに急速に結合する(図１ｆ)が、そのようなダイマーは自己チロシンリン酸化されることが知られている。予想通り、上皮増殖因子(EGF)もNRG-1(他のErbB類のリガンド)のどちらも、CHO-K1/ErbB2細胞中のErbB2を活性化しなかった(図９)。2.7nMのPEPDで処理した細胞内で、ErbB2タンパク質レベルは、１時間で減少し始め、６時間で最低レベルに達し、これは少なくとも７２時間持続し(図２ａ)、他方、ビヒクル処理細胞中のErbB2レベルに変化はなかった(図２ｂ)。PEPDがErbB2タンパク質レベルに与える影響は、用量依存的であり、270nMにてPEPDは、ほぼ全てのErbB2消失をもたらした(図２ｃ)。PEPDがどのようにErbB2低下を引き起こすかを理解するために、我々は、CHO-K1/ErbB2細胞をPEPDで処理した後(ErbB2はECD脱落を受けることができるため)、培地中のErbB2 ECD及び、細胞溶解物中のErbB2-p95(マイナス ECD)を測定した。4-アミノフェニル水銀酸(APMA)は、ErbB2 ECD 切断を引き起こすことが知られており、予想通り、細胞溶解物中にp95フラグメント(マイナスECD)及び培養液中にECDを生成した(図２ｄ)。しかしながら、細胞はたとえ270nMのPEPDで最大６時間処理された場合でも、ErbB2 ECD 脱落を生じなかった(図２ｄ)。このように、PEPDは、ErbB2 ECD 切断を引き起こさなかった。また、６時間のPEPD処理後、CHO-K1/ErbB2細胞又はBT-474細胞のどちらでもErbB2 mRNAレベルに変化はなく(図２ｅ)、このことは、PEPDが誘発するErbB2低下は、ERBB2遺伝子発現の阻害にも起因していないことを示す。次に、CHO-K1細胞とCHO-K1/ErbB2細胞の両方を、ビヒクル又はPEPDで処理し、その後、ErbB2とPEPDの免疫蛍光染色と、共焦点顕微鏡観察による検出を行った。細胞は、検出を増強させるため、高濃度(270nM)のPEPDで処理された。CHO-K1細胞におけるErbB2染色は無視できるほどであり、PEPD染色は観察されず(図２ｆ)、これはこれらの細胞内の非常に低いErbB2発現と一致した。CHO-K1/ErbB2細胞内では、ErbB2は細胞膜内で強く染色され、そして0.25時間のPEPDとのインキュベーション後、細胞膜内の強いPEPD染色も検出され、これはErbB2と共存し(図２ｆ)、ErbB2へのPEPD結合と一致した。しかしながら、PEPDで２時間処理したCHO-K1/ErbB2細胞内では、細胞膜中の両タンパク質の染色強度は減少し、細胞質内の染色の増加が同時に発生し(図２ｆ)、これはErbB2とPEPDが内部移行したことを示唆する。ErbB2は、クラスリン-非依存性エンドサイトーシス、ユビキチン化、及び分解を受けることが従前に示されている。実際に、細胞が2.7nMのPEPDで0.5時間処理された場合、ユビキチン化ErbB2のレベルは有意に増加した(図２ｇ)。
【００４２】
［実施例３］
この実施例は、ErbB2リン酸化が、直接PEPD結合の結果として生じるが、PEPDのジペプチダーゼ機能は関与していないことを実証する。我々は、PEPDによるErbB2リン酸化の刺激が、２つのタンパク質の間の直接相互作用の結果として生じるかどうかを分析した。まず、CHO-K1細胞は、キナーゼデッドErbB2変異体(K753M)を２４時間トランスフェクトされ、その後、270nMのPEPDで３時間(野生型ErbB2の最大のリン酸化を引き起こすことが示された条件)処理された。前記ErbB2変異体は、遺伝子導入後、細胞中で過剰発現されたが、PEPDは、そのリン酸化を刺激せず、他方、同じ実験条件下で、PEPDは野生型ErbB2のリン酸化を刺激した(図３ａ)。次に、CHO-K1細胞は、ECDサブドメインのないErbB2変異体(図１ｄ)を、２４時間トランスフェクトされ、その後、270nMのPEPDで３時間処理された。ErbB2/delD1及びErbB2/delD2のどちらでも、pY1221/1222及びpY1196の両方におけるPEPD-誘発ErbB2リン酸化は、WT-ErbB2のものと比較でき、ErbB2/delD3では欠けており、ErbB2/delD4では減弱し(図３ａ)、これは、これらの変異体へのPEPD結合とよく相関する(図１ｅ)。これらの結果は、細胞内におけるPEPDによるErbB2活性化が、ErbB2へのPEPDの直接結合に完全に起因することを示唆する。
【００４３】
ヒトPEPDの４つの変異体である、R184X-PEPD(C-末端から309番目のアミノ酸欠損)、R265X-PEPD(C-末端から228番目のアミノ酸欠損、G278D-PEPD(アミノ酸＃278 G→D)、及びX265R-PEPD(N-末端から228番目のアミノ酸欠損)が、ErbB2リガンドとしてのPEPDをより理解するために、生成され評価された(図１０ａ)。CHO-K1細胞は、野生型のヒトErbB2を２４時間トランスフェクトされ、その後、270nMの野生型PEPD及びその各変異体で、３時間処理された。前記PEPD変異体は、ErbB2活性化の点でWT-PEPDと同一であるG278D-PEPDを除いて、ErbB2リン酸化を誘発しなかった(図３ｂ)。しかしながら、G278D-PEPDは酵素的に不活性である(例えば、Ledoux P, et al. Expression and molecular analysis of mutations in prolidase deficiency. Am J Hum Genet 1996; 59: 1035-1039参照)。興味深いことに、WT-PEPDとG278D-PEPDだけが、ホモダイマーを形成できた(図１０ｂ)。このように、PEPDのジペプチダーゼ活性は、ErbB2活性化に関与せず、PEPDのホモ二量体化が、PEPDがErbB2に結合し活性化するのに必要であると思われる。
【００４４】
特に、上述した実験において、PEPDあるいはそのG278D変異体は、ErbB2タンパク質レベルの減少を引き起こさず、他方、PEPDはErbB2を安定に又は恒常的に過剰発現する細胞において明白なErbB2低下を引き起こした(図２ａ及び図２ｃ)。我々は、ErbB2を一過性に過剰発現するCHO-K1細胞中では、ErbB2分子の大多数が細胞内に存在する一方、ErbB2を安定に過剰発現するCHO-K1細胞では、ErbB2分子の大多数が、細胞表面に発現していることを見つけた(図１１)。これは、３時間のPEPD治療が、ErbB2を一過性に過剰発現する細胞において、明確なErbB2タンパク質の減少を引き起こさない理由を説明するかもしれない。
【００４５】
［実施例４］
この実施例は、細胞内PEPDがErbB2を調節しないことを実証する。PEPDは、主に細胞質タンパク質である。CHO-K1/ErbB2細胞及びBT-474細胞中の内因性PEPDレベルは、比較的低いが、PEPDレベルは、遺伝子導入によりこれらの細胞中で容易に上昇させることができる。中程度又は強いPEPD過剰発現が、ヒトPEPD発現プラスミドのトランスフェクション後２４時間で検出されたが、ErbB2チロシンリン酸化とErbB2タンパク質発現のどちらも、PEPD過剰発現後に変化しなかった(図４ａ)。細胞がPEPDを放出するかどうかを確認するために、PEPD-過剰発現細胞とコントロール細胞は、２４時間、培養液中で培養され、その後、ウエスタンブロット法により当該細胞溶解物中の、及びELIASにより当該培養液中のPEPDレベルの測定が行われた。PEPD-過剰発現細胞の培養液中のPEPD濃度は、コントロール細胞の培養液中より、5.9倍(CHO-K1/ErbB2細胞)及び10.3倍(BT-474細胞)高かった(図４ｂ)。全ての細胞が形態的に正常且つ健康に見えたため、上記結果は、PEPDが前記細胞によって能動的に放出された可能性を示唆する。しかしながら、培地による明らかに過度の希釈に起因し、細胞外PEPD濃度は、ErbB2に影響を与えるには低すぎた(＜0.3 nM)(図４ｂ)。
【００４６】
［実施例５］
この実験は、PEPDがErbB2-Srcシグナル伝達を急速に抑制(silence)することを実証する。ERKはErbB2の下流に位置する。予想通り、PEPD処理(2.7 nM)は、ErbB2リン酸化と一致する時間枠内でERK活性化をもたらし(図５ａと図２ａの比較)、これは、活性化ErbB2からERKへの急速なシグナル伝送を示唆している。実際に、キナーゼデッドErbB2変異体 K753Mを発現するCHO-K1細胞において、PEPDは、ErbB2リン酸化(図３ａ)もERKリン酸化(図１２)も引き起こさなかった。AKTも、ErbB2の下流に位置するが、その機能にとって重要であるそのS473リン酸化は、時間依存的に、CHO-K1/ErbB2細胞及びBT-474細胞のどちらにおいても、PEPD(2.7 nM)によって減少し(図５ａ)、他方、ビヒクルによる処理は、AKTリン酸化に影響を与えなかった(図５ｂ)。このことは、PEPDが、付加的なメカニズムによりErbB2シグナル伝達を調節することを示唆した。前述したように、ErbB2過剰発現は、自発的な二量体化及び自己チロシンリン酸化を引き起こす。また、SrcとPI3Kが、チロシン-リン酸化ErbB2ホモダイマー又はヘテロダイマーに結合された際に活性化され、AKTの活性化につながることも既知である。CHO-K1/ErbB2細胞において、ErbB2は、CK2、Src基質及び多面的セリン／トレオニンタンパク質キナーゼとともにSrcと会合するが、PI3Kは検出されず、他方、BT-474細胞では、ErbB2は、Src、CK2及びPI3Kと会合した(図５ｃ)。PEPD(2.7 nM)を用いたこれらの細胞のわずか0.5時間の処理は、ErbB2からSrcとCK2の著しい解離をもたらしたが、PI3KはErbB2と会合したままであった(図５ｃ)。したがって、Scrキナーゼ活性は、CHO-K1/ErbB2細胞及びBT-474細胞のどちらにおいても、PEPDによって有意に減弱されたが、他方PI3K活性は変化しなかった(図５ｄ)。しかしながら、SrcもPI3Kも、CHO-K1細胞中ではPEPDによって有意に調節されなかった(図５ｄ)。さらなる実験は、Y419でのScrリン酸化(そのキナーゼ機能に重要である)が、わずか１０分間のPEPD(2.7 nM)による処理の後、CHO-K1/ErbB2細胞とBT-474細胞の両方で、有意に減少したことを示し(図５ｅ)、これはErbB2ダイマーへの急速なPEPD結合と、ErbB2-Srcシグナル伝達ユニットの急速な破壊を示唆する。Srcに対するPEPDの影響が、ErbB2リン酸化と発現における明確な変化の前に発生したと考えると、特にCHO-K1/ErbB2細胞において(図２ａ)、PEPDは、既存のErbB2ダイマーの立体構造を変化させ、ErbB2からのSrc解離を引き起こすと思われる。
【００４７】
PEPDによって誘発されるSrc及びCK2の抑制は、ビヒクルで処理されたコントロール(図５ｂ)と比較して、S380でのPTENリン酸化の減少を伴った(図５ａ)。CK2によるこの部位でのPTENリン酸化は、PTEN活性の阻害に寄与することが知られている。またPTENは、膜結合PIP3を脱リン酸化し、それによって、AKTリン酸化を抑制すること、及び、Srcもチロシン残基上でPTENを直接リン酸化することによって細胞膜へのPTEN転移を妨げることが知られている。実際に、PEPD(2.7 nM、0.5 h)は、CHO-K1/ErbB2細胞及びBT-474細胞の両方で、PTENチロシンリン酸化を阻害し(図５ｆ)、細胞質から細胞膜へのPTEN転移は、PEPD処理(2.7 nM、1 h)後に増加した(図５ｇ)。
【００４８】
［実施例６］
この実験はPEPDが、ErbB2を過剰発現する細胞を標的とすることを実証する。PEPDのErbB2への結合とその後の変化に関する我々の発見が、図６ａに要約される。ErbB2腫瘍形成において主要な役割を果たすSrcの、強いErbB2低下をともなう急速な抑制は、PEPDが、ErbB2を過剰発現する細胞を阻害した可能性を示唆した。CHO-K1細胞、CHO-K1/ErbB2細胞及びBT-474細胞に対するPEPDの潜在的な阻害効果が、以下に記載する３つの分析を使用して評価された。
【００４９】
DNA合成に対するPEPDの影響が、フローサイトメトリーを用いて、BrdU取り込みによって測定された。細胞は、４８時間、2.7及び27 nMのPEPDで処理された。PEPDはCHO-K1細胞中では効果を示さない一方、それは、BrdU-陽性CHO-K1/ErbB2細胞及びBT-474細胞の数を、それぞれ最大65％及び50％まで減少させた(図６ｂ)。足場非依存性増殖に対するPEPDの影響を測定するために、細胞は軟寒天中で増殖され、2.7及び27 nMのPEPDで21日間処理され、３〜４日ごとに培地が交換された。コロニー形成は、CHO-K1細胞では、PEPDによって有意な影響を受けなかったが、CHO-K1/ErbB2細胞及びBT-474細胞のどちらでも、PEPDによって著しく阻害された。PEPDは、CHO-K1/ErbB2細胞及びBT-474細胞において、直径100μｍ以上のコロニーの数を、それぞれ５０％及び５７％まで減少させた(図６ｃ)。細胞浸潤及び遊走に対するPEPDの影響が、BD BioCoatマトリゲル浸潤チャンバーを使用して測定された。細胞は、上方チャンバー内で増殖され、溶媒又は2.7及び27 nMのPEPDで４８時間処理され、上方チャンバーの底のマトリゲル膜を通って浸潤した細胞が、カウントされた。PEPDは、CHO-K1では効果を示さなかったが、CHO-K1/ErbB2細胞及びBT-474細胞の浸潤及び遊走を、それぞれ50％及び51％まで抑制した(図６ｄ)。まとめると、これらの結果は、ErbB2に対するPEPDの影響が主に抑制的であることを確認し、且つ、PEPDがErbB2を過剰発現する細胞を選択的に標的とすることも示す。
【００５０】
本開示が、ErbB2がオーファン受容体であると信じられてきた長い期間をブレイクすることが、前述データから明らかであろう。ErbBレセプターの他のリガンドと比較して、ヒトPEPDの複数の独特な特性は注目に値する：それはEGFモチーフを有さない；それは明白にホモダイマーとしてErbB2に結合する；及び、それはErbB2の発癌性シグナル伝達を抑制する。PEPDは、ErbB2モノマー及びErbB2ダイマーの両方に結合するが、図１ｆに示すように、PEPDは、ErbB2モノマーよりも急速にErbB2ホモダイマーに結合する。このことは、PEPDが、ErbB2-Srcシグナル伝達の非常に急速な破壊を生じるが(図５)、ErbB2リン酸化がやや遅い理由を説明する(図２ａ)。
【００５１】
細胞の成長と増殖に対するその効果を評価した際、PEPDは、ErbB2を低レベルで発現するCHO-K1細胞では影響を与えなかったが、ErbB2-過剰発現CHO-K1細胞(CHO-K1/ErbB2細胞)及びBT-474細胞細胞では、DNA合成、足場非依存性増殖、及び浸潤と遊走の抑制(図６ｂ−６ｄ)を含む、強い抑制活性を示した。CHO-K1/ErbB2細胞はCHO-K1細胞に由来していたため、これは、PEPDがErbB2癌遺伝子依存性をターゲットにすることを示す；少なくとも２つのメカニズムが関与している可能性がある：PEPDがErbB2内部移行と分解を誘発することによって、ErbB2低下を引き起こし、及び、PEPDが、それらの会合を破壊することによって、ErbB2-Srcシグナル伝達を阻害する(図５)。ErbB2に対するPEPDの効果は、ErbB2 ECDのサブドメイン４に結合する、ErbB2標的モノクローナル抗体であり、ErbB2-陽性乳癌を治療するために現在使用されているトラスツズマブの効果と似ている。先の実施例で示されたデータは、PEPDあるいはそのG278D変異体によるCHO-K1/ErbB2細胞及びBT-474細胞の増殖阻害が、トラスツズマブによるものより優れているとは言わないまでも、等モル濃度にて、同程度であり、その一方、前記剤のいずれも、CHO-K1細胞中で抑制的活性を示さなかった(図１４)ことを示す。バクテリア中で産生される組換えヒトPEPDあるいはその変異体は、哺乳類の細胞中で産生されなければならない非常に高価なトラスツズマブの低コスト代替品になる可能性がある。さらに、前述したように、生体内において、トラスツズマブは、ErbB2発現を下方制御せず、癌組織中のErbB2チロシンリン酸化も阻害しない；むしろ、その抗腫瘍活性は、そのFcドメインを経る抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用(ADCC)に主に依存する。このように、PEPDあるいはその変異体は、トラスツズマブと協同するか、患者におけるトラスツズマブに対する耐性をある程度克服する可能性がある。PEPDは、ErbB3及びErbB4に結合しない(図１ａ)が、ErbB2がこれらのErbB類の好ましいヘテロ二量体化パートナーであることは周知である。このことは、PEPDによるErbB2発癌性シグナル伝達の遮断が、ErbB2ヘテロダイマーシグナル伝達ユニットの阻害も含む可能性があるかどうかという疑問を提起する。特に、ヒト乳癌において、ErbB2の発癌活性は、ErbB3に非常に依存する。本開示が、ヒトPEPDの基本的に新規な機能：そのジペプチダーゼ活性に依存しないErbB2リガンド、を明らかにすることが当業者に理解されるであろう。多数の種に由来するPEPDが、ヒトPEPDと高い配列相同性を有しており、ErbB2と結合し調節するかもしれない。
【００５２】
ErbB2陽性癌を治療する薬剤としてのPEPDの使用を強力に支持する実施例１〜６に示されたインビトロの結果を考慮して、我々は、以下の実施例に示すように、臨床的に関連する動物モデルにおいて、ErbB2陽性癌に対するその有効性を決定するために、PEPD及びその酵素的不活性体をインビボで試験した。
【００５３】
［実施例７］
本実施例は、抗癌剤としての、組換えヒトPEPD及びその変異体であるPEPDG278Dの、インビボでの使用を実証する。実施例１〜６に示されたインビトロ実験のケースと同様、本実施例で示されたデータは、カルボキシ末端が６×Hisタグ化された組換えヒトPEPD及びその変異体PEPDG278D(大腸菌中で産生され、これらのタンパク質中に設計されたHisタグを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製された)を使用して得られた。これらの生成物は、以下の実験で使用された。
【００５４】
まず、我々は用量設定実験を実施した。インビトロで、2.7nMの低濃度のPEPDは、ErbB2-過剰発現細胞に対し、有効であった。成体のC57BL/6マウスは、PEPDの単回腹腔内投与量を投与され、投与後１、６、又は２４時間目に、血液採取のために殺された。10 mg/kgのPEPD投与が、コントロールマウスの0.9 nMと比較して、血漿PEPDを投与後１時間で16.5 nMに、２４時間で13.6 nMに上昇させる一方、0.2 mg/kgでのPEPD投与は、意外にも、血漿PEPDレベルの51〜61％の減少をもたらした(図１４ａ)。しかしながら、我々は、0.2 mg/kgのPEPD投与後のPEPDの血漿濃度が、EP処理無しのマウスと比べEP前処理マウスで６４倍まで高くなることから、PEPD剤とエノキサパリン(EP：臨床的に使用されている低分子量ヘパリンであり、第Xa因子と他の凝固因子を阻害することが知られている)の併用が、PEPDの持続をもたらすことを発見した(図１４ｂ)。何らかの特定の理論に拘束されることを意図しないが、EPはPEPDの分解を減少させる可能性があると思われる。他の凝固阻害剤も生体内でPEPD血漿濃度を維持するのに有効であると思われる。次に、我々はPEPDが生体内でErbB2-過剰発現腫瘍の増殖を抑制するかどうか分析した。ヒトErbB2を安定に過剰発現するが、他のErbBファミリーレセプターを発現するCHO-K1/ErbB2細胞が、少量のPBS：マトリゲルミックスで、メスの胸腺欠損ヌードマウス(生後６〜７週間)の側腹部に、１部位あたり1×106細胞で皮下接種された：細胞接種の４日後から始まり、前記マウスは、１日１回の腹腔内注射により、2.5 mg/kgのビヒクル又はEPのいずれかを投与された。EP治療開始から３日後(細胞接種後７日目)、腫瘍体積が約41 mm3に達したとき、前記EP処理マウスは、腹腔内注射により0.02 mg/kg又は0.2 mg/kgのビヒクル又はPEPD(１週間に３回、月曜日、水曜日、金曜日に投与)でも治療された。特に、EP及びビヒクル/PEPDの両方が投与される日には、ビヒクル又はPEPDは、常にEP投与後１時間目に投与された。腫瘍体積は、１週間に３回(月曜日、水曜日、金曜日)、長さ×幅2／２で測定された。前記マウスは、細胞接種から２４日(合計８回のPEPD治療)後に行われた最後の治療から２４時間後に殺され、ELISAによるPEPDの血漿濃度の測定のために、血液サンプルが当該マウスから採取された。EPが腫瘍増殖に影響を与えない一方、EPプラス0.02及び0.2 mg/kgのPEPDは、それぞれ、腫瘍増殖を２７％(統計的に有意でない)及び６５％(統計的に非常に有意)まで抑制した(図１５ａ)。当該実験の最後における合計PEPD(内因性マウスPEPD＋ヒトPEPD)の血漿濃度は、EPのみのグループでは1.9 nMであり、EP＋低用量PEPDグループでは5.5 nMであり、EP＋高用量PEPDグループでは33.0 nMであり、コントロールマウスより、1.4倍、4.2倍、24.8倍高かった(図１５ｂ)。
【００５５】
我々は次に、PEPDが生体内でErbB2-過剰発現腫瘍を特異的に標的にするかどうかを分析した。ErbB2を無視できる程度に発現し、他のErbB類は発現しないCHO-K1細胞が、少量のPBS：マトリゲルミックスで、メスの胸腺欠損ヌードマウス(生後６〜７週間)の側腹部に、１部位あたり1×106細胞で皮下接種された：細胞接種の４日後から始まり、前記マウスは、１日１回の腹腔内注射により、2.5 mg/kgのEPで治療された。３日後(細胞接種後７日目)、腫瘍体積が約26 mm3に達したとき、前記マウスは、腹腔内注射により0.2 mg/kgのビヒクル又はPEPD(１週間に３回、月曜日、水曜日、金曜日に投与)でも治療された。EP及びPEPD/ビヒクルの両方が投与される日には、PEPD/ビヒクルは、常にEP投与後１時間目に投与された。腫瘍体積は、１週間に３回(月曜日、水曜日、金曜日)測定された。前記マウスは、細胞接種から２１日(合計７回のPEPD治療)後に行われた最後の治療から２４時間後に殺され、血液サンプルが、PEPDの血漿濃度の測定のために、当該マウスから採取された。血漿濃度が予想通り上昇したにもかかわらず(図１６ｂ)、PEPD治療は腫瘍増殖に影響を与えなかった(図１６ａ)。このように、ここに示された我々のデータは、PEPDがErbB2を過剰発現する細胞を含む腫瘍を特異的に標的にすることを実証する。
【００５６】
次に、PEPDの効果は、同所性乳腺腫瘍モデルで評価された。ヒト乳癌BT-474細胞は、ErbB2を恒常的に発現し、抗-ErbB2治療の評価のために同所性乳腺腫瘍を生成するために広く使用されてきた。メスの胸腺欠損ヌードマウス(生後６〜７週間)はそれぞれ、乳腺脂肪パッドへのBT-474細胞の同所性接種(少量のPBS：マトリゲルミックス中、１部位あたり2×106細胞)の前に、６０日リリースの17βエストラジオールペレット(1.7mgのエストラジオール、Innovative Research of Americanから購入)を皮下に植え込まれた。癌細胞接種から２３日後、全てのマウスは、腹腔内注射により、１日0.5 mg/kgの毎日のEP治療を開始した。特に、用量設定実験は、0.5 mg/kgのEPが血中でPEPD濃度を維持するのに、2.5 mg/kgと同程度に有効であることを示した。また、17β-エストラジオールを植え込まれ、その後BT-474細胞を接種されたもう一つのマウスグループは、EPそれ自体が腫瘍増殖に何ら効果を有さないことを確認するために、非治療コントロールとして維持された。前記非治療マウスは、癌細胞接種後５８日間維持された(図１７ａ)。前記EP治療マウスは、毎日EP治療を続ける一方、ビヒクル、PEPD、及びPEPDG278Dを受けるために、無作為に３つのグループに分けられた。CHO-K1/ErbB2腫瘍モデルにおけるPEPDを用いた我々の経験に基づき、我々は、2 mg/kgのPEPDあるいはその変異体でマウスを治療することを決定した。ビヒクル、PEPDあるいはその変異体を用いた治療は、EP治療の開始後４日目(癌細胞接種後２７日目)に始まり、それぞれ、１週間に３回(月曜日、水曜日、金曜日)、腹腔内注射により投与された。EPも同日に投与される場合、それは常に他の薬剤より１時間早く投与された。腫瘍体積は、毎週、月曜日、水曜日、金曜日に測定された。図１７ａに示されるように、EPは腫瘍増殖に影響を与えなかったが、PEPD及びPEPDG278Dはどちらも、急速に腫瘍収縮を引き起こした。PEPDG278DはPEPDより有効であった(２つのグループ間の腫瘍体積の差は統計的に有意である)。薬剤の強い抗腫瘍効果を考慮して、全ての治療は１ヶ月後に中止され(最後の投薬は、癌細胞接種後５８日目に行われた)、前記マウスは観察のために維持された。また、少量の血液が、血漿PEPDレベルの測定のために、最終投薬の２４時間後、マウスから採取された。EPのみで治療されたマウスの血漿PEPDレベルは1.9 nMであり、治療無しのマウスより1.4倍高く(図１７ｂ)、再度、EPが内因性マウスPEPDの持続を有意に促進することを示した。さらに、EP＋PEPD及びEP＋PEPDG278Dで治療されたマウスの血漿PEPDレベルは、それぞれ154.3 nMと128.6 nMであり、治療無しのマウスより、111.0倍及び92.5倍高かった(図１０ｂ)。二番目の17β-エストラジオールペレットが、癌細胞接種後５９日目に、各マウスに植え込まれた。治療中止後３週間(癌接種後８０日目)で、PEPDあるいはその変異体で以前治療された数匹のマウスの腫瘍は再増殖した。しかしながら、PEPDG278Dで治療されたマウスの５０％は腫瘍無しのままであり、PEPDで治療されたマウスの２７％は腫瘍無しのままであり(図１７ａ)、PEPDG278DがPEPDより効果的であるもう一つの示唆である。腫瘍の再増殖を伴う全てのマウスは、EP＋PEPDG278Dで再治療された：腹腔内注射による0.5 mg/kgの毎日のEP投与が、癌細胞接種後８９日目に開始され、PEPDG278Dは腹腔内注射により2 mg/kgで、１日おきに合計４回投与された。前述したように、EPとPEPDG278Dの両方が投与される日には、EPは１時間早く投与された。実験は、最後のPEPDG278D投与後、２４時間で終了した。図１７ａに示されるように、全ての腫瘍はなおPEPDG278Dに非常に感受性であり、腫瘍の再増殖が、PEPD又はPEPDG278Dに耐性を示す癌細胞の存在に起因しておらず、むしろ、癌細胞の不完全な初回の根絶に起因することを示唆した。さらに、EPのみで以前治療されたマウスは、１日１回0.5 mg/kgのEPで再治療され(癌細胞接種後８２日目に開始)、４日後、マウスは２つのグループに分割された：ビヒクル処理又は2 mg/kgのPEPDG278Dによる治療は、腹腔内注射により、１週間に３回(月曜日、水曜日、金曜日)、合計５回行われた。この実験は、最終投与後２４時間で終了した。図１７ａに示されるように、PEPDG278Dは、腫瘍が治療開始時には非常に大きかったにも関わらず、腫瘍体積の急速な収縮を引き起こした。PEPD及びPEPDG278Dの有意な抗腫瘍効果は、いかなる毒性とも関係が無いことが認められたことも重要である：マウスの体重増加又は、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺及び胃等の臓器の重量に対する影響はなかった。このことは、前記治療的有効量の薬剤が毒性ではないことを示す。
【００５７】
［実施例８］
本実験は、PEPD-Fcハイブリッド(融合)タンパク質の製造の実証を提供する。
ErbB2細胞外ドメインのサブドメイン４に結合するトラスツズマブは、最も成功的且つ最も広く使用されている乳癌の抗ErbB2剤である。しかしながら、トラスツズマブの奏効率は中程度に留まり、一次及び二次抵抗性は、臨床上の課題のままである。トラスツズマブのFcドメインは、Fcレセプターを免疫エフェクター細胞上に結合させ、抗体依存性細胞介在性細胞傷害を誘発することにより、その抗腫瘍活性に重要である。実際に、臨床研究は、ErbB2陽性乳癌を治療するために使用される投与量レベルのトラスツズマブが、癌組織におけるErbB2タンパク質を下方制御する能力がないことを見い出した(Gennari R, et al. Clinical Cancer Research 2004, 10(17): 5650-5655)。Fcは、抗体の血中残留性を促進することも知られている。しかしながら、PEPDはFcドメインを持たない。
【００５８】
我々は、PEPDへのFc添加がその抗腫瘍活性を後押しする可能性が高いかどうかを実施・決定する目的の試験を行った。前記PEPD-Fcハイブリッド分子も、PEPDより長い時間、より高いレベルで血中に保持される可能性がある。我々は、PEPD-Fcを作成した(モノマー分子量：80.9 kD)。手短に言えば、ヒトPEPDの完全なコード配列が、ヒトIgG1のFc配列にそのＣ末端でフレーム内リンクされている、pFUSE-hIgG1-Fcベクター(InvivoGen)にサブクローニングされた。その結果得られた構築物(pFUSE-PEPD-Fc)は、配列決定により検証され、CHO-K1細胞にトランスフェクトされ、細胞溶解物中の発現ハイブリッドタンパク質は、タンパク質Ａ-セファロースを使用して精製された。高純度のPEPD-Fcが、SDS-PAGEによって確認された。PEPD-Fcの生理活性が、PEPDの生理活性と比較された。CHO-K1/ErbB2細胞は、ビヒクル、PEPD-Fc又は PEPD(両方とも27 nM)で、３時間又は６時間処理された。PEPD-Fcは、時間依存性且つ有意なErbB2タンパク質低下を引き起こしたが、PEPDよりいくぶん効果が低かった(図１８)。PEPD-Fcは、単に、ErbB2低下を引き起こすのがPEPDよりわずかに遅いだけで、治療時間の増加により、PEPD-Fcは、ErbB2に対して同程度の影響(PEPDがするように)を達成できる可能性がある。それにもかかわらず、図１８に示されるように、２つの薬剤は、ErbB2リン酸化及びERKリン酸化に対し、及びErbB2-Srcシグナル伝達の抑制に対し、非常に類似した影響を示した(Src、PTEN及びAKTのリン酸化の減少)。我々の結果は、PEPD-Fcが、PEPDのErbB2調節活性を完全とは言わないものの大部分保持することを示す。PEPD-Fcが生体内で免疫細胞に結合すると予想されることを考えれば、それは、ErbB2陽性癌と戦う際、PEPD又はPEPDG278Dよりも有意に強力かもしれない。
【００５９】
本開示の利益の下、PEPD-Fcハイブリッド及びPEPDG278D-Fcは、動物モデルにおいて容易に評価されることができる。複数の実施形態において、これらのハイブリッドは、Fc機能に必須であるFcのN297でのグリコシル化を確実にするために、哺乳類の細胞(例えば、CHO-K1細胞)中で産生されるであろう。興味深いことに、特定の変異を伴うグリコシル化Fcは、その生理活性を維持する(FcT299A及びFcE382V/M428Iを含むがこれらに限定されない)。このように、本発明の利益の下、Fc配列への特異的変異を伴うさらなるハイブリッドが、例えば大腸菌中で産生され、従来の技術を使用して評価されることができる。
【００６０】
［実施例９］
rhPEPD又はrhPEPDG278Dで治療された腫瘍中の生体内変化を測定することによって得られたデータを要約した図１７ａ及び図１９(ａ)〜(ｅ)から分かるように、rhPEPDG278Dは、生体内で腫瘍体積を減少するのに関して、rhPEPDよりも優れていた(図１７ａ及び図１９(ａ))。何らかの特定の理論に拘束されることを意図しないが、我々は、これが、rhPEPDG278DがHIF-1αシグナル伝達を刺激しないが、PEPDは刺激するという新規な発見に関連していると信じる(図１９(ｅ))。この関連で、VEGFとGLUT-1がHIF-1αの下流のターゲットであり、これらのマーカーに対する異なる影響が、HIF-1αに対する影響と類似していることが、当該分野において周知である。３つはいずれも周知の生存促進性因子である。しかしながら、我々は、PEPD及びPEPDG278Dがどちらも、腫瘍組織内で、ErbB2シグナル伝達を消し去り、ErbB3を不活性化し、及び、アポトーシスを活性化することも観察した。両方の薬剤が、腫瘍組織内で、ErbB-2低下、ErbB2脱リン酸化(不活性化)、SRC、AKT、ERK、ErbB3の脱リン酸化(不活性化)、抗アポトーシス性のBcl-2の下方制御、アポトーシス促進性のBAX、及び、マルチプルカスパーゼの活性化を引き起こした(図１９ｂ)。両方の薬剤はまた、腫瘍組織内で、SRCキナーゼ活性及びPI3K活性も減少させた(図１９ｃ)。我々は、それらのHisタグによって測定されるように、PEPD及びPEPDG278Dの両方が、同程度、腫瘍細胞によって内部移行されることを発見した(図１９ｅ)。この発見は、前述したように、抗癌効果を増強するために、PEPD又はPEPDG278Dが毒素又は癌化学療法剤に抱合されてもよいというコンセプトをサポートする。
【００６１】
生体内で、トラスツズマブ／ハーセプチンが、癌組織内で、ErbB2発現を下方制御せず、ErbB2チロシンリン酸化を阻害もしないことは注目に値する (Gennari et al.,  Clinical Cancer Research, 10, 5650-5655, 2004; Gijsen et al., PLoS Biology, 8, e1000563, 2010)。むしろ、ハーセプチンは主に抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用(ADCC)に依存する。このように、ここに提示されたデータに基づけば、rhPEPDG278Dがハーセプチンを補完する、あるいはある種のハーセプチン抵抗性を克服するかもしれないということは真実味がある。
【００６２】
［実施例１０］
この実施例は、実施例１〜９に記載されたデータを得るために使用された物質及び方法の説明を提供する。
試薬  ヒトErbB2/ECD-Fc(1129-ER-050)、ヒトErbB3/ECD-Fc(348-RB-050)及びヒトErbB4/ECD-Fc(1131-ER-050)を含む組換えキメラ、及び、ヒトIgG1の組換えFc(110-HG-100)は、Ｒ＆Ｄシステムから入手した。組換えヒトEGF(236-EG-200)及びヒトNRG-1(5218)は、Ｒ＆Ｄシステム及びCell Signalingからそれぞれ購入した。トラスツズマブ(Genentech)は、Roswell Park Cancer Institute Pharmacyから入手した。4-アミノフェニル水銀酸(APMA)、クリスタルバイオレット、メチルチアゾリルジフェニル-テトラゾリウムブロミド(MTT)及びバナジン酸塩は、Sigma-Aldrichから得た。以下の抗体が使用された：抗-PEPD(Abcam、ab86507)、抗-PTEN(Santa Cruz、sc-7974)、抗-p-PTEN(Santa Cruz、sc-101789)、抗-p-Tyr(PY99)(Santa Cruz、sc-7020)、抗-CK2α(Santa Cruz、sc-12738)、ErbB2の抗-ECD(Santa Cruz、sc-134481)、抗-ErbB3(Santa Cruz、sc-285)、抗-TGFα(Santa Cruz、sc-9043)、抗-ErbB2(Cell Signaling、2165)、抗-p-ErbB2(Y1196)(Cell Signaling、6942)、抗-p-ErbB2(Y1221/1222)(Cell Signaling、2243)、抗-ErbB1(Cell Signaling、2232)、抗-ErbB4(Cell Signaling、4795)、抗-PI3K p85(Cell Signaling、4257)、抗-p-Src(Cell Signaling、6943)、抗-Src(Cell Signaling、2123)、抗-AKT(Cell Signaling、4691)、抗-p-AKT(Cell Signaling、4060)、抗-ERK(Cell Signaling、9102)、抗-p-ERK(Cell Signaling、9101)、抗-ユビキチン(Santa Cruz、sc-8017)、抗-GAPDH(Millipore、MAB374)、Fc検出用の抗-ヒトIgG1(Santa Cruz、sc-2453)、FITC-結合抗-Hisタグ(Abcam、ab1206)、ビオチン-結合抗-Hisタグ(Bethyl、A190-113B)、及びTRITC-結合ヤギ-抗-ラビット(Jackson、111-025-003)。 HRP-結合ストレプトアビジン(N100)は、Thermo Scientificから入手した。
【００６３】
組換えヒトPEPD及びその変異体(カルボキシ末端が６×Hisタグ化)が、細菌中で産生され、ニッケルアフィニティークロマトグラフィー(Qiagen)を使用して精製された。各タンパク質の純度は、ゲル電気泳動及び銀染色(図１０ｂ)で確認された。PEPD及びその変異体並びに他の試薬の調製の詳細が以下に示される。
【００６４】
細菌pBAD/TOPO ThioFusion発現系(Invitrogen)が、PEPD及びPEPD変異体を製造し精製するために使用された。手短に言えば、６×Hisタグ化されたカルボキシ末端(しかし、Ｎ末端Thioを有しない)を有する天然タンパク質としてPEPDを発現するために設計された、プライマーFor-5’-AATACGACTCACTATAGGGCG-3’(配列番号２)及びRev-5’-CTTGGGGCCAGAGAAGG-3’(配列番号３)を使用するPCRによって、完全長ヒトPEPDを増幅するために、pCMV6-XL5-PEPD(Origene)がテンプレートとして使用された。その結果得られたPCRフラグメントは、TAクローニングにより、pBAD/Thio-TOPO発現ベクター内にサブクローニングされた。構築物は、全コード配列の完全性を確実にするために、配列決定された。発現及び精製は、製造者の指示に従って行われた。Ｎ末端184アミノ酸フラグメント、Ｎ末端265アミノ酸フラグメント、及びＣ末端265アミノ酸フラグメントを含む、PEPD G278D変異体及び他の変異体は、QuikChange Lightning多部位特異的変異誘発キット(Agilent Technologies)を使用して、及び、テンプレートとして上述のPEPD発現ベクターを使用する部位特異的変異誘発によって産生された。当該構築物は、正確な変異を確認するために配列決定された。野生型PEPD及び変異体PEPDの両方が、Ni-NTAアガロースクロマトグラフィー(Qiagen)により精製された。前記タンパク質は、さらに、Ultracel YM-30 Centricon(Millipore)を使用して精製された。SDS-PAGEは、変性及び還元コンディション下で、８〜１０％のアクリルアミド・ゲル中で行われ、前記ゲルは、タンパク質純度を試験するために銀染色で染色された。標本はまた、製造者の指示にしたがって、E-TOXATEキット(Sigma)を使用して、リポ多糖類の汚染可能性をチェックされたが、リポ多糖類は検出されなかった(検出限界：0.1 mlサンプルあたり、0.005エンドトキシン単位)。
【００６５】
細胞株及び細胞培養  BT-474細胞及びCHO-K1細胞は、ATCCから入手した。CHO-K1/ErbB2細胞は、pcDNA3-ERBB2をCHO-K1細胞にトランスフェクトすることによって産生され、G418下で選択された。CHO-K1細胞及びCHO-K1/ErbB2細胞は、10％FBS(Gibco)を補充されたF-12K培養液(Gibco)中で培養された。BT-474細胞は、50％高グルコースDMEM(Mediatech)／10％FBSを補充された50％F-12K培養液中で培養された。ATCCからの、ヒト乳癌MCF-7細胞及びヒト膀胱癌RT-4細胞は、この研究でも使用された。MCF-7細胞及びRT-4細胞は、高グルコースDMEM＋10％FBS及びMcCoy’5A培養液＋10％FBS中でそれぞれ培養された。全ての細胞が、5％CO2を含む３７℃の加湿インキュベーター中で培養された。
【００６６】
遺伝子導入及びプラスミド  細胞は、６ウェルプレート中で増殖され、FuGENE HD(Promega)又は Lipofectamine 2000(Invitrogen)を使用するプラスミドをトランスフェクトされた。野生型ヒトPEPDを発現するpCMV6-XL5-PEPDは、Origeneから入手した。pMT107-His-Ubはユビキチンを発現するために使用された。ヒトErbB2を発現するpCMV6-XL5-ERBB2は、哺乳類の発現ベクターpCMV6-XL5(Origene)に完全長ヒトERBB2コード配列をクローニングすることによって産生された。ヒトErbB2を発現するpCMV6-XL5-ERBB2を構築するために、完全長ヒトERBB2コード配列が、NotI-順方向プライマー(5’-ATAAGAATGCGGCCGCAGCTGAGATTCCCCTCCATT-3’)(配列番号４)及びNotI-逆方向プライマー(5’-ATAGTTTAGCGGCCGCCTTGATGCCAGCAGAAGTCA-3’)(配列番号５)を使用するLNCaP cDNAのPCRによって増幅された。増幅されたPCR産物は、NotI(New England BioLabs)によって消化され、続いて、同じ制限酵素で前消化されたpCMV6-XL5(Origene)中へのライゲーションが行われた。挿入物の配向は、順方向プライマー5’-CAAATGGGCGGTAGGCGTGTA-3’(配列番号６)(プラスミドに局在)及び逆方向プライマー5’-ATTGGTGGGCAGGTAGGTGAGTTC-3’(配列番号７)(当該挿入物の先頭にアニールされた)を使用するコロニーPCRによって決定された。構築物は、全コード配列の完全性を確認するために配列決定された。ERBB2遺伝子中の全ての部位特異的な変異及び欠損は、QuikChange Lightning部位特異的変異誘発キットを使用して、pCMV6-XL5-ERBB2で実施された。これらの構築物は、K753M変異(pCMV6-XL5-ERBB2/K753M)、ErbB2 ECDサブドメイン１の欠損(pCMV6-XL5-ERBB2/delD1、アミノ酸1-195の欠損)、ErbB2 ECDサブドメイン２の欠損(pCMV6-XL5-ERBB2/delD2、アミノ酸196-320の欠損)、ErbB2 ECDサブドメイン３の欠損(pCMV6-XL5-ERBB2/delD3、アミノ酸321-488の欠損)、及びErbB2 ECDサブドメイン４の欠損(pCMV6-XL5-ERBB2/delD4、アミノ酸489-560の欠損)を有するErbB2を含む。全ての構築物は、正確な変異／欠損を確認するために配列決定された。
【００６７】
ウエスタンブロット解析  細胞溶解物の調製、タンパク質濃度の測定及びウエスタンブロットは、標準技術を使用して行われた。細胞膜、サイトゾル画分又は細胞溶解物から細胞膜を除いたものが、Mem-PER真核生物膜たんぱく質抽出試薬キット(Thermo Scientific)を使用して調製された。細胞培地は、分析前に、Centricon(Millipore)を使用して２０倍に濃縮された。ErbB2 ECD、ErbB3 ECD又はErbB4 ECDへのPEPD又はNRG-1の結合を測定する実験において、銀染色キット(Invitrogen)が、ゲル電気泳動後、タンパク質を表示するために使用された。ErbB2受容体二量体化を検出するために、PEPD-処理細胞及びコントロール細胞は、氷冷PBSで洗浄され、2 mMの架橋剤BS3(Pierce)とともに、室温で３０分間インキュベートされた。架橋結合反応は、50 mM Trisを添加することによって終結され(最終、pH7.5)、続いて、１５分間室温でインキュベートされた。細胞溶解物は、ウエスタンブロット法(3.5％SDS-PAGE)によって分析された。非還元ゲル電気泳動が、野生型ヒトPEPDの他に、G278D-PEPD、R184X-PEPD、R265X-PEPD、及びX265R-PEPDを含むその変異体のいずれかが、ホモダイマーとして存在するかどうか決定するために使用された。簡単に記載すると、各タンパク質サンプルは、非還元サンプルバッファー(β-メルカプトエタノールを含まないサンプル負荷緩衝液)と混合され、その後、銀染色の前に、10％SDS-PAGEによって分離された。全ての標本のタンパク質濃度は、ビシンコニン酸アッセイ(BCA)キット(Pierce)によって測定された。
【００６８】
免疫沈降  PEPDは、ErbB2/ECD-Fc、ErbB3/ECD-Fc、ErbB4/ECD-Fc又はFcとともに、結合バッファー中で２時間３７℃でインキュベートされ、続いて、プロテインＧ-セファロースビーズを用いてプルダウンされた。免疫沈降物は、IP洗浄バッファーで洗浄され、ウエスタンブロット法で分析された。ErbB2、ErbB3又はErbB4へのPEPD又はNRG-1の直接且つ特異的な結合を検出するために、組換えヒトPEPD又はNRG-1は、組換えヒトErbB2/ECD-Fc、組換えヒトErbB3/ECD-Fc、組換えヒトErbB4/ECD-Fcあるいは組換えヒトFcとともに、0.4 mlの結合バッファー中でインキュベートされた。全ての溶液は、３７℃にて２時間インキュベートされ、続いて、室温にて１時間プロテインＧ-セファロースビーズとともにインキュベートされた。免疫沈降物は、IP洗浄バッファーで洗浄され、その後、ウエスタンブロット解析にかけられた。全細胞溶解物を使用する実験において、細胞は、プロテイナーゼ・インヒビター・ミックス(Roche Applied Science)を補充されたM-PERバッファー中に溶解され、当該溶解物は、４℃にて一晩、特異的抗体とともにインキュベートされ、続いてプロテインＧ-アガロースでプルダウンされた。免疫沈降物は、IP洗浄バッファーで洗浄され、ウエスタンブロット法で分析された。PTENチロシンリン酸化に対するPEPDの影響を測定するために、細胞は、関連性のあるチロシンホスファターゼを阻害するために、30μMの過バナジン酸で１０分間前処理され、その後PEPD又はビヒクルで処理され、続いて、分析用の細胞溶解物の調製が行われた。過バナジン酸は、室温にて１５分間10 mM 過酸化水素とともに、10 mM バナジン酸塩をインキュベートすることによって、新たに調製され、続いて、残留している過酸化水素を除去するため、カタラーゼ(Sigma)が、最終濃度0.2 mg/mlになるように添加された。
【００６９】
PEPD、及びErbB2と結合しているPEPDの測定(ELISAに基づく)  ヒトErbB2あるいはその欠損変異体へのPEPD結合を測定するために、ELISAプレートは、100μl/ウェルの10μg/ml ErbB2抗体(ErbB2の細胞質側末端に結合する)で、４℃にて一晩被覆された。PBSTで３回ウェルを洗浄した後、ウェル内の残余タンパク質結合サイトは、300μl／ウェルの1％BSA(PBS中)を用いて室温で２時間インキュベーションすることによってブロックされた。60μlの連続的に希釈された組換えヒトPEPDを各ウェルに添加した後で、サンプルあたり25μgの総タンパク質を含む(注：サンプルあたり最大250μgまでの総タンパク質を使用する予備実験は、ErbB2へのPEPD結合に関し同様の結果を示した)、60μlの細胞溶解物(空ベクターを２４時間トランスフェクトされたCHO-K1細胞及び野生型ErbB2を２４時間トランスフェクトされたCHO-K1細胞から調製)が各ウェルに添加され、２時間３７℃にてインキュベートされた。PBSTで３回洗浄した後、100μlのビオチン結合抗-His抗体(1：10,000希釈；PEPDはHisタグ化されている)が各ウェルに添加され、室温で２時間インキュベートされた。PBSTでもう一度洗浄した後、100μlのストレプトアビジン-結合HRP(1：10,000希釈)が、各ウェルに添加され、室温で４５分間インキュベートされた。PBSTでもう一度洗浄した後、100μl／ウェルの１×基質溶液(3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン)が添加され、十分な発色現像の後、100μl／ウェルの停止液(1 N H2SO4)が添加され、450nmでの吸光度リーディングが記録された。野生型ErbB2及びその欠損変異体(ErbB2 ECDのサブドメイン１、２、３又は４の欠損)へのPEPD結合を比較する実験において、等量の野生型のErbB2タンパク質及びその変異体が使用された。各タンパク質を発現するプラスミドをトランスフェクトされた細胞(２４時間)の溶解物が、まず、ウエスタンブロット解析にかけられ、続いて、各タンパク質を同量送達する溶解物の量を計算するために、ローディングコントロールで標準化された特異的タンパク質結合の濃度測定が行われた(25μgの総タンパク質／サンプルが、野生型ErbB2を含む溶解物のために使用された)。
【００７０】
ELISAによるPEPD濃度の測定  PEPD濃度を測定するために、96ウェルELISAプレートは、100μｌ／ウェルの希釈抗-PEPDマウスモノクローナル抗体(2.5μg/ml)で、４℃にて一晩被覆された。前記プレートはその後、Tween 20(PBST)を含むリン酸緩衝食塩水で３回洗浄され、200μl／ウェルのブロッキングバッファーでブロックされた(室温で少なくとも２時間のインキュベーション)。前記プレートは、PBSTで洗浄され、その後100μl／ウェルのPEPDスタンダード又はサンプル(適切に希釈された)とともに、室温で２時間インキュベートされた。前記プレートは、PBSTで３回洗浄され、各ウェルはその後100μlの検出抗体(抗-PEPDラビットポリクローナル抗体)とともに、室温で２時間インキュベートされた。PBSTで３回プレートを洗浄した後、100μlの第二試薬(ヤギ-抗-ラビットIgG-HRP)が各ウェルに添加され、続いて室温で１時間のインキュベーションが行われた。前記プレートは、再びPBSTで３回洗浄され、各ウェルはその後100μlのHRP基質溶液(3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン基質：Cell Signaling社、#7004)でインキュベートされた。十分な発色現像の後、100μlの停止液(Cell Signaling社 #7002)が各ウェルに添加され、450nmでの吸光度が、マイクロタイタープレートリーダーで記録された。純PEPDがスタンダードとして使用された。
【００７１】
免疫蛍光染色及び共焦点顕微鏡観察  細胞は、チャンバースライドで一晩増殖され(1.5×104細胞／ウェル)、続いて、PEPD又はビヒクルで処理された。前記細胞はその後、氷冷PBSで洗浄され、4％のパラホルムアルデヒドで室温で１５分間固定され、氷冷PBSで再洗浄され、PBS中の1％BSAで室温で４５分間ブロックされた。前記細胞はその後、室温で１時間ErbB2抗体とともにインキュベートされ、PBSで洗浄され、FITC-結合Hisタグ抗体(PEPD検出用)及びTRITC-結合二次抗体(ErbB2検出用)とともに、室温で１時間インキュベートされ、PBSで再度洗浄された。前記細胞は、その後、Zeiss LSM 510共焦点顕微鏡を用いて試験された。
【００７２】
RT-PCR  全RNAがRNeasy Mini Kit(Qiagen)を使用して単離され、潜在的ゲノムDNA汚染を除去するためのTURBO DNaseによる処理後、サンプルあたり500ngのRNAが、TaqMan逆転写試薬(Invitrogen)を使用して、25μlの反応物中のcDNA内に逆転写された。前記RT反応は、１０分間２５℃で行われ、続いて、３０分間４８℃で、その後５分間９５℃で加熱された。各PCR増幅は、10 μlのGoTaq Master Mix(2x)(Promega)、0.5〜1μlの逆転写混合物(cDNA)、0.25μMの各特異的順方向及び逆方向プライマーを含む20μl体積中で実施された。前記プライマーは以下の通りである：ヒトERBB2、フォワード、5’-CTGTTTGCCGTGCCACCCTGAGT-3’(配列番号８)、リバース、5’-CTTCTGCTGCCGTCGCTTGATGAG-3’(配列番号９)；ヒトGAPDH、フォワード、5’-CCAGGGCTGCTTTTAACTC-3’(配列番号１０)、リバース、5’-GCTCCCCCCTGCAAATGA-3’(配列番号１１); チャイニーズハムスターGAPDH、フォワード、5’-TGGAATCTACTGGCGTCTTC-3’(配列番号１２)、リバース、5’-CACCACCTTCTTGATGTCCT-3’(配列番号１３)。全ての反応で使用されたPCRコンディションは、以下の通りである： ９４℃で３分間、２８サイクル(ヒトERBB2)／３０秒間、９４℃(変性)で２５サイクル(GAPDH)、６３℃(ヒトERBB2)／６０℃(ヒトGAPDH)／５６℃(チャイニーズハムスターGAPDH)で３０秒(アニーリング)、及び７２℃で３０秒間(伸長)；最終伸長は５分間、７２℃で行われた。PCR産物は、１％のアガロースゲルを用いた電気泳動で分析され、臭化エチジウムで染色され、UV光下で可視化された。
【００７３】
BrdUアッセイ  DNAへのBrdU取り込みが、FITC BrdUフローキット(BD Pharmingen)を使用して測定された。手短に述べると、細胞は６ウェルプレート中で一晩増殖され(CHO-K1細胞及びCHO-K1/ErbB2細胞では0.15×106細胞／ウェル、BT-474細胞では0.4×106細胞／ウェル；2mlの培養液／ウェル)、ビヒクル又はPEPDで48時間処理され、その後、培養液中10μMのBrdUとともに、３０分間(CHO-K1細胞及びCHO-K1/ErbB2細胞)又は１８時間(BT-474細胞)インキュベートされた。前記細胞はその後収集され、固定／透過処理バッファー中で固定化及び透過処理され、３７℃で１時間NDaseで処理され、室温で２０分間、BrdU抗体とともにインキュベートされ、続いて、7-アミノ-アクチノマイシンＤを用いてDNA染色された。染色された細胞は、サンプルあたり0.5〜1mlの染色バッファー中に再懸濁され、サンプルあたり10,000細胞をカウントする、フローサイトメトリー(BD FACS Calibur、BD Biosciences)で分析された。BrdU取り込みは、WinMDI 2.8ソフトウェアを用いてモデル化された。
【００７４】
軟寒天コロニー形成アッセイ  培地中0.8％のultrapure Noble Agar(USB、cat#10907)1mlが、６ウェルプレートの各ウェル内で凝固された後、37℃で培地中の0.4％アガー中に懸濁された1mlの細胞(2×104 BT-474細胞、1×103 CHO-K1細胞又は 1×103 CHO-K1/ErbB2細胞)が、各ウェルに添加され、その後、凝固された。PEPD又はビヒクルがその後、各ウェルに2ml培養液で添加され、合計２１日間、３〜４日ごとに交換された。この処理の最後に、直径100μm以上の細胞コロニーが、解剖顕微鏡(Axiovert 40 CFL、Carl Zeiss)下で、ImageJを用いて、ウェルあたり１０の異なる視野においてカウントされた(10×拡大率)。
【００７５】
細胞浸潤及び遊走アッセイ  細胞浸潤及び遊走は、BD BioCoatマトリゲル浸潤チャンバー(BD Biosciences)を用いて測定された。手短に述べると、下方チャンバーは、10％FBSを含む0.75mlの培養液で満たされ、上方チャンバーは、ビヒクル又はPEPDを含む0.5mlの無血清培地中に懸濁された4×104細胞とともに静置された。前記チャンバーは、３７℃の細胞培養インキュベーター中に４８時間置かれた。インキュベーションの終わりに、浸潤チャンバーの底に置かれたフィルター挿入物上にコーティングされたマトリゲルマトリクス層を通して浸潤された細胞は、100％メタノールで固定され、0.5％クリスタルバイオレットで染色され、顕微鏡(Eclipse 50i)下で、フィルターあたり１０の異なる視野(20×拡大率)において、ImageJを用いてカウントされた。
【００７６】
PI3キナーゼアッセイ  PI3-キナーゼ活性ELISAキット(Echelon、K-1000s)が使用された。手短に述べると、PI3Kは、PI3K抗体(抗-PI3K p85)を使用する全細胞溶解物(サンプルあたり約1×106細胞から調製)からプルダウンされ、免疫沈降物は、30μlのKBZ反応バッファーと混合され、その後30μlの10μM PI(4,5)P2基質と混合され、続いて３７℃で２時間インキュベートされた。前記キナーゼ反応は、各反応溶液に90μlのキナーゼ停止液を添加することによって終結され、60μlの各停止キナーゼ反応溶液は、60μlのPIP3検出液とともに、インキュベーションプレート中の各ウェルに移された。室温による６０分間のインキュベーション後、インキュベーションプレートから、サンプルあたり100μlが検出プレートの対応ウェルに移され、室温で６０分間インキュベートされた。前記プレートはTBSTで洗浄され、その後HRP-結合二次検出体とともに３０分間インキュベートされ、続いてTBSTで洗浄され、固定化HRPが、基質として3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンを使用する、標準比色分析法で測定された。
【００７７】
Srcキナーゼアッセイ  細胞溶解物中のSrc活性が、ユニバーサル・チロシンキナーゼ・アッセイキット(TaKaRa、#MK410)を用いて測定された。手短に説明すると、溶解物(サンプルあたり約1×106細胞から調製)は、Src抗体を用いるIP前に、タンパク質Ａ-アガロースビーズで事前にクリアにされた。免疫沈降物は洗浄され、150μlのキナーゼ反応溶液中の10 mM β-メルカプトエタノールとともにインキュベートされた。各サンプル(40μl)は、10μlの40 mM ATP-2Na溶液と混合され、PTK基質で被覆されたマイクロタイタープレート・ウェルに移され、続いて３７℃で３０分間インキュベートされた。TBSTによる洗浄後、HRP-結合抗-ホスホチロシン(PY20)溶液が、各ウェルに添加され、３７℃で３０分間インキュベートされた。TBSTでもう一度洗浄した後、固定化HRPは、基質として3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンを使用する、標準比色分析法で測定された。
【００７８】
MTT細胞増殖アッセイ  細胞は９６ウェルプレート中で一晩増殖され(ウェルあたり、500 CHO-K1細胞又はCHO-K1/ErbB2細胞、ウェルあたり2,000 BT-474細胞；ウェルあたり150μl培養液)、ウェルあたり200μl培養液中のビヒクル、PEPD、G278D-PEPD又はトラスツズマブで７２時間処理され、続いてMTT(培養液中9.2 mM)とともに37℃で３時間インキュベートされた。前記細胞はその後PBSで洗浄され、ジメチルスルホキシド(ウェルあたり150μl)と混合され、細胞密度が、MTTの減少を測定することによって、570nmでホルマザン分光学的に決定された。
【００７９】
統計解析  スチューデントＴ検定及びANOVAが、２グループ比較及び多グループ比較のためにそれぞれ使用された。全てのテストは両側で、名目有意水準0.05(すなわち、統計学的に有意と考えられるP値0,05以下)で行われた。
【００８０】
本発明は、具体的な実施例を用いて説明されてきたが、通常の変更は当業者に自明であり、そのような変更は本発明の範囲内であるとみなされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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