(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子として多糖類、および発熱物質を含む海藻抽出物を処理する方法であって、
前記発熱物質を不活性化するため、前記抽出物を有効量の酸化剤および塩基と接触させるステップ、および／または
濾過により前記発熱物質を除去するステップ、
を含み、前記抽出物の発熱性の減少をもたらす、方法。
【請求項２】
前記抽出物を有効量の以下：界面活性剤、活性炭、ゼオライトのうちの１つ以上と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抽出物を有効量の酸化剤、塩基、および界面活性剤と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
標的分子として多糖類、および発熱物質を含む海藻抽出物を処理する方法であって、
前記発熱物質を不活性化するため、前記抽出物を有効量の活性炭および塩基と接触させるステップ、および／または
濾過により前記発熱物質を除去するステップ、
を含み、前記抽出物の発熱性の減少をもたらす、方法。
【請求項５】
前記抽出物を有効量の以下：酸化剤、界面活性剤、ゼオライトのうちの１つ以上と接触させることをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記酸化剤が、過酸化物であり、
前記過酸化物が、少なくとも３０％（ｗ／ｗ、過酸化物の質量対多糖類の質量に基づく）の量で使用される、請求項１、２、３または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記界面活性剤が、生物系界面活性剤である、請求項２、３、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項２、３、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記界面活性剤が、少なくとも５０％（ｗ／ｗ、界面活性剤の質量対多糖類の質量に基づく）の量で使用される、請求項２、３、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記塩基が、７．０超かつ１２．５未満のｐＨをもたらすのに十分な量で使用される、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記活性炭またはゼオライトが、少なくとも１０％（ｗ／ｗ、吸着剤の質量対多糖類の質量）の量で使用される、請求項２または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
多糖類に対する回収率が、少なくとも３０％である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
多糖類に対する回収率が、少なくとも６０％である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも５０％の発熱物質が除去され、かつ／または不活性化される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも９９％の発熱物質が除去され、かつ／または不活性化される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記多糖類が、硫酸化多糖類、任意にフコイダンまたはウルバンである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１３年１月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／７５６，５７０号の利益を主張し、その明細書の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
技術
本発明は、海藻などの海洋生物からの抽出物を処理するための方法に関する。より具体的には、本発明は、創傷管理および外科手術に使用するための非経口医薬組成物の製造に有用な、実質的に発熱因子を含まない抽出物の生成に関する。
【背景技術】
【０００２】
フコイダンおよびウルバンなどの多糖類成分を含む、様々な海藻生物の生物学的活性を示すために多大な量の作業が費やされてきた。フコイダンは、多くの種の褐藻の細胞壁に見られる硫酸化多糖類である。インビトロ研究は、フコイダンが抗癌、抗血管新生（Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｈ，Ｔａｍａｕｃｈｉ  Ｈ，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｍ，Ｎａｋａｎｏ  Ｔ．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  Ｍｅｋａｂｕ  ｆｕｃｏｉｄａｎ  ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｓｐｏｒｏｐｈｙｌｌ  ｏｆ  Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ．Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ２００３；１７（３）：２４５−２４９、Ｈａｎｅｊｉ  Ｋ，Ｍａｔｓｕｄａ  Ｔ，Ｔｏｍｉｔａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｕｃｏｉｄａｎ  ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ  ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ  ｔｏｋｉｄａ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｄｕｌｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｔｒ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００５；５２（２）：１８９−２０１、Ｌｉｕ  ＪＭ，Ｂｉｇｎｏｎ  Ｊ，Ｈａｒｏｕｎ−Ｂｏｕｈｅｄｊａ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆｕｃｏｉｄａｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５；  ２５（３Ｂ）：２１２９−２１３３、Ｋｏｙａｎａｇｉ  Ｓ，Ｔａｎｉｇａｗａ  Ｎ，Ｎａｋａｇａｗａ  Ｈ，Ｓｏｅｄａ  Ｓ，Ｓｈｉｍｅｎｏ  Ｈ．Ｏｖｅｒｓｕｌｆａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｃｏｉｄａｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｉｔｓ  ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００３；６５（２）：１７３−１７９、Ａｌｅｋｓｅｙｅｎｋｏ  ＴＶ，Ｚｈａｎａｙｅｖａ  ＳＹ，Ｖｅｎｅｄｉｋｔｏｖａ  ＡＡ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｎｄ  ａｎｔｉｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｆｕｃｏｉｄａｎ，ａ  ｓｕｌｆａｔｅｄ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｏｋｈｏｔｓｋ  Ｓｅａ  Ｆｕｃｕｓ  ｅｖａｎｅｓｃｅｎｓ  ｂｒｏｗｎ  ａｌｇａ．Ｂｕｌｌ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２００７  Ｊｕｎ；１４３（６）：７３０−２、Ｎａｇａｍｉｎｅ  Ｔ，Ｈａｙａｋａｗａ  Ｋ，Ｋｕｓａｋａｂｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆｕｃｏｉｄａｎ  ｏｎ  Ｈｕｈ７  ｈｅｐａｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＸＣＬ１２．Ｎｕｔｒ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００９；６１（３）：３４０−７）、抗ウイルス（Ｌｅｅ  ＪＢ，Ｈａｙａｓｈｉ  Ｋ，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｍ，Ｎａｋａｎｏ  Ｔ，Ｈａｙａｓｈｉ  Ｔ．Ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｆｕｃｏｉｄａｎ  ｆｒｏｍ  ｓｐｏｒｏｐｈｙｌｌ  ｏｆ  Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ（Ｍｅｋａｂｕ）．Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｋｙｏ）２００４  Ｓｅｐ；５２（９）：１０���１−４、Ｈａｙａｓｈｉ  Ｋ，Ｎａｋａｎｏ  Ｔ，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｍ，Ｋａｎｅｋｉｙｏ  Ｋ，Ｈａｙａｓｈｉ  Ｔ．Ｄｅｆｅｎｓｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａ  ｆｕｃｏｉｄａｎ  ｆｒｏｍ  ｂｒｏｗｎ  ａｌｇａ  Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００８  Ｊａｎ；８（１）：１０９−１６．）、および免疫調節作用（Ｒａｇｈａｖｅｎｄｒａｎ  ＨＲ，Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  Ｐ，Ｒｅｋｈａ  Ｓ．Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｆｕｃｏｉｄａｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｓｐｉｒｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１１  Ｆｅｂ；１１（２）：１５７−６３）を有することを示す。これらの作用は、ナチュラルキラー細胞を刺激することにより、および細胞増殖に関与するＡＰ−Ｉを下方制御することによりもたらされる。フコイダンは、神経保護（Ｄｏ  Ｈ，Ｐｙｏ  Ｓ，Ｓｏｈｎ  ＥＨ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉＮＯＳ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｆｕｃｏｉｄａｎ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ３８  ＭＡＰＫ，ＪＡＫ／ＳＴＡＴ，ＡＰ−１  ａｎｄ  ＩＲＦ−１，ａｎｄ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ−  ａｎｄ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｃ６  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００９  Ｊｕｌ  １、Ｌｕｏ  Ｄ，Ｚｈａｎｇ  Ｑ，Ｗａｎｇ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．  Ｆｕｃｏｉｄａｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００９  Ｓｅｐ  １；６１７（１−３）：３３−４０．、放射線防護（Ｂｙｏｎ  ＹＹ，Ｋｉｍ  ＭＨ，Ｙｏｏ  ＥＳ，ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆｕｃｏｉｄａｎ  ｏｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．２００８  Ｄｅｃ；９（４）：３５９−６５）、および抗潰瘍（Ｃｈｏｉ  ＪＩ，Ｒａｇｈａｖｅｎｄｒａｎ  ＨＲ，Ｓｕｎｇ  ＮＹ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆｕｃｏｉｄａｎ  ｏｎ  ａｓｐｉｒｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｕｌｃｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．２０１０  Ｊａｎ  ５；８３（１）：２４９−５４）特性も示す。
【０００３】
他の研究では、フコイダンは、抗凝血（Ｃｏｌｌｉｅｃ  Ｓ，Ｆｉｓｃｈｅｒ  ＡＭ，Ｔａｐｏｎ−Ｂｒｅｔａｕｄｉｅｒｅ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｆｕｃｏｉｄａｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１９９１  Ｏｃｔ  １５；６４（２）：１４３−５４、Ｉｒｈｉｍｅｈ  ＭＲ，Ｆｉｔｔｏｎ  ＪＨ，Ｌｏｗｅｎｔｈａｌ  ＲＭ．Ｐｉｌｏｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｔｏ  ｅｖａｌｕａｔｅ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｆｕｃｏｉｄａｎ．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ．２００９  Ａｕｇ  １８）、および抗血栓（Ｃｈｕｒｃｈ  ＦＣ，Ｍｅａｄｅ  ＪＢ，Ｔｒｅａｎｏｒ  ＲＥ，Ｗｈｉｎｎａ  ＨＣ．Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｆｕｃｏｉｄａｎ．Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｃｏｉｄａｎ  ｗｉｔｈ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ＩＩ，ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＩＩＩ，ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ．Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９  Ｆｅｂ  ２５；２６４（６）：３６１８−２３）作用を示し、抗凝血剤と共に摂取する場合、相加的作用を有し得る。
【０００４】
フコイダンはまた、外科手術後の癒着を予防することにおいても特に有望性を示してきた。Ｃａｓｈｍａｎらの研究（Ｃａｓｈｍａｎ  ＪＤ，Ｋｅｎｎａｈ  Ｅ，Ｓｈｕｔｏ  Ａ，Ｗｉｎｔｅｒｎｉｔｚ，Ｓｐｒｉｎｇａｔｅ  ＣＭＫ，Ｆｕｃｏｉｄａｎ  Ｆｉｌｍ  Ｓａｆｅｌｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  Ｒａｔ  Ｍｏｄｅｌ，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．２０１１  Ｄｅｃ  １７１（２）：４９５−５０３）は、いくつかの化合物を試したが、フコイダンを最も安全かつ最も有効であると特定した。フコイダン付加膜は、対照膜と比較して癒着スコアを約９０％減少させた。合計５０％〜１００％の動物が、癒着を有する全対照膜動物と比較して、０．３３％〜３３％ｗ／ｗのフコイダン膜付加で癒着がなかった。約３０ｍｇフコイダン／体重ｋｇに相当する３３％ｗ／ｗフコイダン膜からは有害作用は観察されなかった。
【０００５】
フコイダンは、創傷管理、および特に火傷の治癒に有用であることも提案されている。Ｓｅｚｅｒらの研究（Ｓｅｚｅｒ  ＡＤ，Ｈａｔｉｐｏｇｌｕ  Ｆ，Ｃｅｖｈｅｒ  Ｅ，Ｏｇｕｒｔａｎ  Ｚ，Ｂａｓ  ＡＬ，ａｎｄ  Ａｋｂｕｇａ  Ｊ，Ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｆｉｌｍ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｆｕｃｏｉｄａｎ  ａｓ  ａ  ｗｏｕｎｄ  ｄｒｅｓｓｉｎｇ  ｆｏｒ  ｄｅｒｍａｌ  ｂｕｒｎ  ｈｅａｌｉｎｇ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ＡＡＰＳ  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．２００７  Ｊｕｎｅ；８（２）：Ｅ９４−Ｅ１０１）を参照。これらの著者は、ウサギの火傷モデルにおいて、経皮乳頭形成の再生が最も良好である、上皮再形成が最も良好である、および創傷の閉鎖が最も速いことがフコイダン−キトサン膜処置群において見出されたことを示した。
【０００６】
ウルバン（フコイダンに類似する）は、緑藻類から抽出され、臨床用途における可能性を有する。例えば、ウルバンは、薬物送達ビヒクルとして、また免疫調節因子としての生体材料の製造における足場としてかなり有望である。
【０００７】
海洋生物から抽出した多糖類が多様で臨床的に重要な用途において使用の可能性を有することは、前述から明らかであろう。これらの分子の利益の活用における大きな問題は、抽出物中の発熱物質の存在である。疾患の兆候が非経口投与、創傷もしくは外科部位への直接適用、または体内移植を必要とする場合、これらの多糖類抽出物の使用は、発熱因子により誘発された発熱、毒素ショック、およびさらには死の危険に関連するため、禁忌である。
【０００８】
「グラム陰性菌内毒素」に対立するものとして「細菌性発熱因子」は、多くの異なる物質の一般記述用語となった。しかしながら、発熱性物質は、一部のグラム陽性菌、マイコバクテリア、真菌、および同様にウイルスにより生成され得るが、グラム陰性菌により生成される発熱因子、すなわち、内毒素は、薬学および医療用インプラント分野にとって重要性を持つ。
【０００９】
先行技術は、医薬品に使用するために溶液の発熱物質を除去するための様々な方法を開示している。多くの方法が発熱物質の破壊に依存する。しかしながら、そのような方法は、多くの場合、溶液中の所望の分子の損傷または破壊をもたらす。これは、特に所望の分子が天然に誘導される場合にそうである。
【００１０】
発熱物質除去の他の方法は、クロマトグラフィーおよび濾過などの手段による発熱物質の物理的除去を対象とする。そのような方法は、不安定な分子を含む溶液の処理には明らかにより好適であるが、これらの方法を商業的規模の量を処理するように拡大するには大きな問題が生じる。多くの場合、工業規模の分離方法は、媒体の費用、および媒体を常に交換または再生する必要性により経済的に実現可能ではない。特に海藻抽出物は分離媒体の閉塞または汚れを生じる残留物および沈殿物を含んでいることが知られている。
【００１１】
海藻抽出物によるさらなる問題は、多くの場合処理中に生じる望ましくない褐色の変色が存在することである。この変色は、アルカリ条件の使用により生じると考えられ、典型的には、最終製品まで持続する。抽出物がヒトへの注入可能組成物として製剤化される場合、投与前の注入液の視覚検査を容易にするために、無色の溶液が特に好ましい。
【００１２】
本発明の態様は、発熱性および／または着色を減少させるように海藻抽出物を処理するための改善された方法を提供することにより、先行技術の問題を克服する、または軽減することである。さらなる態様は、既存の処理方法の代替を提供することである。
【００１３】
文献、作用、材料、デバイス、物品等の論考は、単に、本発明の内容を提供する目的のために本明細書に含まれる。本出願の各主張の優先日前に存在したため、これらの問題のいずれかまたは全ては、本発明に関する分野における先行技術の基本原理の一部を形成する、または共通の一般知識であることを示唆しない、または表さない。
【発明の概要】
【００１４】
第１の態様では、本発明は、標的分子および発熱物質を含む海藻抽出物を処理する方法を提供し、本方法は、発熱物質を不活性化するステップ、および／または発熱物質を除去するステップを含み、本方法は、抽出物の発熱性の減少をもたらす。本方法は、抽出物を有効量の以下：酸化剤（過酸化物など）、界面活性剤（非イオン性界面活性剤など）、塩基（水酸化物など）、活性炭、ゼオライトのうちの１つ以上と接触させることを含み得る。
【００１５】
標的分子は、多糖類、好ましくは、フコイダンまたはウルバンなどの多糖類であってよい。
【００１６】
本方法内の好ましい組み合わせは、（ｉ）酸化剤と塩基、（ｉｉ）酸化剤、塩基、および界面活性剤、（ｉｉｉ）活性炭と塩基を含む。
【００１７】
別の態様では、本発明は、実質的に発熱物質除去された海洋生物抽出物を提供する。処理された抽出物は、ＬＡＬにより決定するとき、約１００ＥＵ／ｍｇ未満の発熱物質レベルを有し得、かつ／またはウサギ発熱性試験に合格できる。抽出物は、本明細書に記載される方法によって生成され得る。
【００１８】
薬剤的に許容される賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載される、実質的に発熱物質除去された海洋生物抽出物を含む医薬組成物も提供する。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、病態の治療または予防を必要とする哺乳類に、本明細書に記載される生体材料の医薬組成物を投与すること、または移植することを含む、病態を治療する、または予防するための方法である。
【００２０】
別の態様は、医薬品における本明細書に記載される医薬組成物または生体材料の使用を提供する。本明細書に記載される実質的に発熱物質除去された海洋生物抽出物、または病態を治療もしくは予防するための薬剤の製造における、本明細書に記載される医薬組成物の使用も提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
この説明を考慮すると、当業者は、本発明が様々な代替実施形態および代替用途においてどのように実施されるか明らかであろう。しかしながら、本発明の様々な実施形態が本明細書において記載されるが、これらの実施形態が単に例として提示され、制限するものではないことを理解する。このため、この様々な代替実施形態の説明は、本発明の範囲または幅を制限するものと解釈されるべきではない。さらに、利点または他の態様の記述は、特定の例示的な実施形態に適用され、特許請求の範囲によって網羅される全ての実施形態に必ずしも適用されない。
【００２２】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、用語「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」ならびに「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの本用語の変形は、他の付加物、成分、整数、またはステップを排除することを意図しない。
【００２３】
本明細書を通して、「一実施形態（ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「１つの実施形態（ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」への言及は、実施形態に関して記載される特定の特徴、構造、または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。よって、本明細書全体の様々な箇所における句「一実施形態では」または「１つの実施形態では」の出現は、全てが必ずしも同じ実施形態を指すわけではないが、そうである場合がある。
【００２４】
第１の態様では、本発明は、標的分子および発熱物質を含む海藻抽出物を処理する方法を提供し、本方法は、発熱物質を不活性化するステップ、および／または発熱物質を除去するステップを含み、本方法は、抽出物の発熱性の減少をもたらす。
【００２５】
出願者は、海藻および海洋動物の抽出物が効率的に発熱物質除去され、ヒトへの使用を安全にすることを見出した。重要なことに、および予想外に、除去および不活性化は、抽出物中に存在する活性標的分子に対してわずかな有害作用しかもたらさないことを示した。さらに、標的分子の回収は、商業的に許容可能であることが示された。
【００２６】
一実施形態では、標的分子は、多糖類、好ましくは硫酸化多糖類である。一実施形態では、多糖類は、フコイダンまたはウルバンである。
【００２７】
前述の背景技術のセクションから理解されるように、この発見は、当該技術分野において大きな前進であり、フコイダンおよびウルバンなどの海洋生物の活性分子のインビボ医療用途、および同時に薬学的製剤または医療用インプラントの作製におけるこれらの活性物質の常用使用の可能性のより完全な調査を可能にする。
【００２８】
本方法の一実施形態では、発熱物質を不活性化するステップは、抽出物を、有効量の以下：酸化剤、界面活性剤、塩基、活性炭、ゼオライトのうちの１つ以上と接触させることを含む。
【００２９】
理論に制限されることなく、本方法が酸化剤の使用を含む場合、酸化剤が発熱物質を不活性化するように作用することが提案される。しかしながら、発熱性の減少に有効であった酸化剤のレベルが抽出物の多糖類分子に対して実質的に有害な変化を誘発しなかったことに留意する。いくつかの実施形態では、フコイダン分子またはウルバン分子は、実質的に生物学的活性を維持する。本明細書で使用される、用語「生物学的に活性」は、生物学的分子に対する構造的および／または機能的変化を誘発する、または生物学的系もしくは経路における変化を誘発する、または生体材料として作用する、または生物学的系において薬物送達物質として作用する任意の能力を指す。
【００３０】
通常の酸化剤は、分子酸素、オゾン、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、および他の無機過酸化物、フッ素（Ｆ２）、塩素（Ｃｌ２）、および他のハロゲン、硝酸（ＨＮＯ３）および硝酸化合物、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、ペルオキシ二硫酸（Ｈ２Ｓ２Ｏ８）、ペルオキシ一硫酸（Ｈ２ＳＯ５）、亜塩素酸塩、塩素酸、過塩素酸、および他の類似ハロゲン化合物、次亜塩素酸塩および他の次亜ハロゲン酸化合物（家庭用漂白剤（ＮａＣｌＯ）を含む）、六価クロム化合物（クロム酸および重クロム酸ならびに三酸化クロム、塩化クロム酸ピリジニウム（ＰＣＣ）、およびクロム酸塩／二クロム酸塩化合物など）、過マンガン酸塩化合物（ＫＭｎＯ４、過ホウ酸ナトリウム、亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）、酸化銀（Ａｇ２Ｏ）、四酸化オスミウム（ＯｓＯ４）、トレンス試薬、および２，２’−ジピリジルジスルフィド（ＤＰＳ）を含む。
【００３１】
一実施形態では、酸化剤は、過酸化物、オゾン、または分子酸素などの酸素系酸化剤である。一実施形態では、酸化剤は、過酸化水素である。酸化反応を増強するために、第二鉄イオンなどの触媒が酸化反応混合物に含まれてよい。過酸化物を使用する利点は、海藻類に多くの場合見られる有色色素複合体が漂白され、それによって、実質的に透明な溶液をもたらすことである。
【００３２】
過酸化物の量は、種および抽出物の純度に依存し得るが、約１０％〜約１００％（ｗ／ｗ、過酸化物の質量対多糖類の質量に基づく）の範囲が有効であることが見出されている。本明細書に開示される実験研究は、許容可能な発熱因子減少レベルが触媒として１％のクエン酸第二鉄の存在下で約３０％の水酸化物（フコイダンのｗ／ｗ）で達成され得ることを示す。したがって、本方法の一実施形態では、過酸化物の量は、約３０％（ｗ／ｗ）を超える。
【００３３】
出願者は、海藻抽出物の界面活性剤処理の有効性も示す。理論によって決して制限されないが、発熱物質は界面活性剤によって可溶化され、可溶化された物質がより容易に不活性化される（例えば、酸化剤により）か、または除去される（例えば、濾過により）ことが提案される。界面活性剤は、生物系界面活性剤、多くの場合、細胞成分を可溶化するために生化学で使用される種類のもの、および他の天然に存在する分子であってよい。界面活性剤は、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネート、３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート分子内塩双極性イオン洗剤、ＡＳＢ−１４、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８平均Ｍｎ、約１１２４、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（大豆）≧９９％からのＬ−α−リゾホスファチジルコリン、凍結乾燥粉末、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８主成分：エイコサエチレングリコールヘキサデシルエーテル、Ｂｒｉｊ（登録商標）Ｌ２３溶液３０％（ｗ／ｖ）、Ｂｒｉｊ（登録商標）Ｌ２３主成分：トリコサエチレングリコールドデシルエーテル、Ｃ７ＢｚＯ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯなどの、組織培養に有用なものであってよい。コール酸、デオキシコール酸、ジギトニン、グリココール酸、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム≧９８％、ヘキサエチレングリコールモノドデシルエーテル、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、ドデシル硫酸リチウム、Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミン、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、オクチルＤ−グルコピラノシド、オクチルα−Ｄ−グルコピラノシド、オクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシド、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８、ポリオキシエチレン（２０）、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、サポニン、コール酸ナトリウム水和物、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、グルココール酸ナトリウム水和物、タウロデオキシコール酸ナトリウム水和物、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ８０、タウロコール酸ナトリウム塩水和物、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ウルソデオキシコール酸、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド。
【００３４】
界面活性剤は、２−シクロヘキシルエチルβ−Ｄ−マルトシド、３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ピリジニオ）−１−プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネート、３−（１−ピリジニオ）−１−プロパンスルホネート、３−（ベンジルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート、３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート、３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル（３−パルミトイルアミノプロピル）アンモニオ］−プロパンスルホネート、５−シクロヘキシルペンチルβ−Ｄ−マルトシド、ＡＳＢ−１４、ＡＳＢ−Ｃ８０、シクロヘキシルメチルβ−Ｄ−マルトシド、デシルβ−Ｄ−グルコピラノシド、デシルβ−Ｄ−マルトピラノシド、デシル−β−Ｄ−１−チオマルトピラノシド、デシル−β−Ｄ−マルトシド、ジメチルデシルホスフィンオキシド、ジメチルエチルアンモニウムプロパンスルホネート、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、ＥＭＰＩＧＥＮ（登録商標）ＢＢ洗剤、塩化ヘキサデシルピリジニウム一水和物、ヘキサエチレングリコールモノデシルエーテル、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）ＯＰ  ２０００、ＭＥＧＡ−８、Ｎ，Ｎ−ビス［３−（Ｄ−グルコンアミド）プロピル］デオキシクロルアミド、Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミン、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−ラウロイルサルコシン、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ポリ（無水マレイン酸−ａｌｔ−１−デセン）、３−（ジメチルアミノ）−１−プロピルアミン誘導体、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン、タウロデオキシコール酸ナトリム水和物≧９５％、スクロースモノデカノエート、ｎ−ヘプチルβ−Ｄ−チオグルコピラノシドなどの、膜およびタンパク質の可溶化に有用なものであってよい。
【００３５】
界面活性剤は、非イオン性界面活性剤であってよい。一実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ｎモルのエチレンオキシド（ｎは約１２であってよい）でエトキシ化されたアルコールＣ１２−１５、アルキルアルコールポリエトキシレート非イオン性界面活性剤Ｇ１２  Ａ１２、ドデカノールエトキシレート非イオン性洗剤、ドデシルアルコール、エトキシ化直鎖アルコール、ラウリルポリエチレングリコールエーテル、ポリエチレングリコールモノドデシルエーテル、ラウリン酸アルコールエトキシレートであり、代表的な形態はＴｅｒｉｃ  Ｇ１２Ａ１２（ＩＣＩ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）または等価物である。
【００３６】
一実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ソルビタンモノラウレートのポリオキシエチレン誘導体であるポリソルベートである。一実施形態では、界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎシリーズ（または等価物）のうちの１つであり、一実施形態では、Ｔｗｅｅｎ  ８０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）または等価物である。
【００３７】
一実施形態では、非イオン性界面活性剤は、親水性ポリエチレンオキシド鎖（任意に、約９．５エチレンオキシド単位を有する）、および芳香族炭化水素親油基または疎水基を有するものである。炭化水素基は、４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニル基であってよい。界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎシリーズ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）のうちの１つ、またはＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズ（ＢＡＳＦ）などの等価物である、特にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００であってよい。
【００３８】
界面活性剤は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、および９０％（ｗ／ｗ、界面活性剤の質量対多糖類の質量に基づく）の量で使用され得る。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、発熱因子負荷において１０倍の減少をもたらすことができる少なくとも約５０％ｗ／ｗの量で使用される。
【００３９】
特に、７５％ｗ／ｗ比率で添加されたＴｅｒｉｃ（登録商標）Ｇ１２Ａ１２、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、およびＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００は、有用なレベルの発熱因子減少をもたらした。
【００４０】
界面活性剤を使用するさらなる利点は、最大１００％の多糖類収率がいくつかの実施形態において得られる可能性があることである。
【００４１】
本方法は、抽出物を塩基と接触させることを含み得る。決して理論に制限されることなく、塩基は発熱物質を不活性化するように作用することが提案される。アルカリ条件（すなわち、ｐＨ＞７）の利用が、海洋生物抽出物の発熱物質除去において示された。好適な塩基は、金属酸化物、水酸化物、アルコキシド、およびアンモニアを含み得る。抽出物の工業規模の処理に関して、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、および水酸化カルシウムなどの容易にアクセス可能であり、費用効率が良い塩基が好適であり得る。一実施形態では、ｐＨは、約１０．５〜約１１．０の数値に調節される。
【００４２】
一実施形態では、塩基は、好ましくは約０．５モルの溶液において水酸化ナトリウムである。その実施形態では、少なくとも約５０ｍＬの溶液の量で使用され得る５０ｍｌの容量が１グラム当たりの多糖類に添加される。５０ｍｌが使用された場合には、発熱性負荷における許容可能な減少が見られた。高レベルの水酸化物（５０ｍＬの０．１Ｍ水酸化ナトリウム）は、５０％の減少をもたらした。
【００４３】
活性炭およびゼオライトは、存在する少なくともある割合の発熱物質を吸着するのに十分な量で抽出物に添加される。少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、および５０％（ｗ／ｗ、吸着剤の質量対多糖類の質量に基づく）の量が使用され得る。少なくとも約１０％ｗ／ｗの量が発熱因子負荷の減少をもたらすことが示された。
【００４４】
酸化剤、界面活性剤、塩基、活性炭、およびゼオライトの使用は、単独で、または５つの任意の組み合わせで、または任意の４つの任意の組み合わせで、または任意の３つの任意の組み合わせで、または任意の２つの任意の組み合わせであってよいことを理解するべきである。
【００４５】
好ましい組み合わせは、酸化剤と塩基のものである。様々な時間の間、様々な温度での多糖類質量の１０〜２００％（ｗ／ｗ、多糖類に対するＭＯＨ）の範囲の量のＭＯＨ（Ｍ＝ＮａまたはＫの場合）、およびＨ２Ｏ２（多糖類に対して１０％〜１００％ｗ／ｗ過酸化物）による処理を含む実験は、相乗的に大幅な発熱因子の減少をもたらすように作用することが示された。
【００４６】
一実施形態では、塩基の量は、約７．０〜約１２．５のｐＨをもたらすのに十分である。好ましい組み合わせは、酸化剤、塩基、および界面活性剤のものである。過酸化水素とＴｅｒｉｃ−Ｇ１２Ａ１２の組み合わせは、連続過酸化物処理よりも低い発熱因子負荷をもたらさなかったが、塩基（水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムなどの添加により、低発熱因子レベルへの相乗効果をもたらした。
【００４７】
さらに好ましい組み合わせは、活性炭と塩基のものである。酸性およびアルカリ条件の両方で活性炭を試験し、アルカリ条件に関して発熱因子負荷の大幅な減少が観察されたが、酸性に関しては観察されなかった。
【００４８】
方法が発熱物質を除去するステップを含む場合、方法は、抽出物を以下のうちの１つ以上：活性炭、ゼオライト、発熱物質に実質的に特異的に結合することが可能なリガンドと結合させるステップと、結合した発熱物質を標的分子から実質的に分離するステップとを含む。当業者は、分離が達成され得る多くの方法に精通している。例えば、所定の量の抽出物が槽内で処理され、結合された発熱物質が複合体を沈降または凝結させることにより標的分子から分離される場合、バッチ処理方法を利用することができる。あるいは、結合された発熱物質は、遠心分離法により、または磁気ビーズ分離手段により分離することができる。
【００４９】
一実施形態では、発熱物質に実質的に特異的に結合することが可能であるリガンドは、ポリミキシンＢである。
【００５０】
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｈ．Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｔｒａｕｂ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）のテキストに示されるように（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）、標準的な分取クロマトグラフィー法は、当業者に既知である。
【００５１】
本発明の方法は、様々な分子量の多糖類分画を得るために、加水分解ステップ、および任意に、分画ステップを含み得る。同じ多糖類源の様々な分子量分画の生物活性に対して検証を行い、顕著な相違を見出した。高分子量のフコイダンの分画は、肝臓線維症の阻害において、未分画の粗フコイダンより有効であることが分かった（Ｎａｋａｚａｔｏ  ｅｔ  ａｌ；Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ  ｆｕｃｏｉｄａｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ  ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１０；２５：１６９２−１７０１）。別の研究は、マウスにおいて、３つの異なるフコイダンの分画を比較した（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ；Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｆｕｃｏｉｄａｎ  ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｏｋｉｎａｗａ  Ｍｏｚｕｋｕ（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ  ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ）Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉ．２００５；５１：３９４−３９７）。この研究は、低分子量フコイダンを与えられた動物と比較して、高分子量のフコイダン分画を与えられた動物の脾臓においてＣＤ８の発現が大幅に増加した、差次的免疫作用を示した。
【００５２】
加水分解は、部分的または完全であってよく、酸性条件、酵素処理、または当業者に既知の任意の他の手段によって達成することができる。
【００５３】
分画は、例えば、クロマトグラフィー手段（例えば、セファロースなどのサイズ排除樹脂の使用により）、または限外濾過などの周知の方法により達成することができる。
【００５４】
あるいは、本方法は、既に加水分解され、かつ／または分画された多糖類の調製物に適用することができる。
【００５５】
有利に、本方法のいくつかの実施形態は、多糖類の商業的に望ましい収率を提供し、同時に、尚も効率的に発熱物質除去された生成物を提供する。収率は、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％を超えてよい。一実施形態では、収率は約３０％を超える。別の実施形態では、収率は、約６０％を超える。前述の収率は、回収された多糖類の重量に基づき表されるが、生物学的活性または他のパラメータは適所に使用され得ることを理解する。
【００５６】
出願者は、発熱因子負荷を尚も９９％減少させながら、キログラム量の乾燥フコイダン生成物を使用して標的フコイダンの商業的に有用な回収を示すことにより、本発明の方法の拡張性のさらなる利点を示した。本明細書の実施例２０を参照。いくつかの実施形態では、本方法は、出発材料として、少なくとも約０．１ｋｇ、０．５ｋｇ、１ｋｇ、２ｋｇ、３ｋｇ、４ｋｇ、５ｋｇ、６ｋｇ、７ｋｇ、８ｋｇ、９ｋｇ、１０ｋｇ、２０ｋｇ、３０ｋｇ、４０ｋｇ、５０ｋｇ、６０ｋｇ、７０ｋｇ、８０ｋｇ、９０ｋｇ、または１００ｋｇの乾燥多糖類を利用することができる。
【００５７】
発熱物質の不活性化または除去は、当業者に既知の任意の方法によって測定することができる。他の好適な試験は、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）アッセイである。Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＭＡ）が販売する「Ｃｈｒｏｍｏ−ＬＡＬ」キットなどのいくつかのキットが利用可能である。この試験では、共凍結乾燥されたＬＡＬおよび基材試薬をマイクロプレート内で試験試料と混合し、３７±１℃で、読取装置内でインキュベートした。吸光度測定値をＣｈｒｏｍｏ−ＬＡＬの添加後、経時的に収集し、好適なソフトウェアにより分析した。試料が特定の吸光度（開始ＯＤ）に達するのに要する時間（開始時間）が計算され、標準内毒素のログ開始時間とログ濃度との間の線形相関を示す標準曲線が生成された。標準曲線の内毒素濃度の最大範囲は、０．００５ＥＵ／ｍＬ〜５０ＥＵ／ｍＬである。アッセイの感度（λ）は、標準曲線に使用された最低濃度として定義される。この試験の最大感度は、０．００５ＥＵ／ｍＬである。
【００５８】
未知の試料の対応する開始時間の内毒素濃度は、開始時間ｖｓ標準濃度のログ−ログプロット、または開始時間のログｖｓ標準濃度のログの算術プロットである標準曲線から読み取られる。例示的な標準曲線について生成されたログ−ログ線方程式は、Ｙ＝−０．２Ｘ＋３．１４であり、式中、Ｙ＝ログ開始時間であり、Ｘ＝ログ内毒素濃度である。平均開始時間が１６３０秒の未知の試料における内毒素の濃度は、開始時間をそのログ値である３．２１２に変換し、Ｘについて方程式を解き、Ｘの真数を取り、濃度を得ることにより計算されるだろう。
［数１］
Ｘ＝（Ｙ−３．１４）／−０．２
Ｘ＝（３．２１２−３．１４）／−０．２
Ｘ＝−０．３６
真数（−０．３６）＝０．４４ＥＵ／ｍＬ（またはＥＵ／ｍｇ）
【００５９】
典型的には、ＬＡＬにより測定される、海藻抽出物の内毒素レベルは、５，０００〜１０，０００ＥＵ／ｍｇである。本発明の発熱物質除去法は、約９０００、８０００、７０００、６０００、５０００、４０００、３０００、２０００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ＥＵ／ｍｇ未満のレベルに内毒素を減少させることができる。
【００６０】
発熱物質の不活性化または除去を示すのに有用である別の試験は、米国薬局方ウサギ発熱因子試験（ＵＳＰ＜１５１＞）である。ウサギ発熱因子試験は、定性的に発熱因子を検出するためのインビボ試験である。ウサギは、ヒトと類似する発熱因子耐性を有するため、ウサギにおける体温の変化を観察することにより、発熱因子の存在を決定することが可能である。この方法は、非細菌性内毒素発熱因子ならびに細菌性内毒素を検出することができる。
【００６１】
適切な量の生成物を投与された際に、ウサギがそのそれぞれの対照温度を超える０．５℃以上の個々の温度上昇を示さない場合、生成物は発熱因子不在の要件を満たす。いずれかのウサギが０．５℃以上の個々の温度上昇を示す場合、試験は他の５匹のウサギを使用して継続される。８匹のウサギのうちの３匹以下が０．５℃以上の個々の温度上昇を示す場合、かつ８匹の個々の最大温度上昇の合計が３．３℃を超えない場合、検査中の材料は、発熱因子不在の要件を満たす。
【００６２】
本方法の一実施形態では、処理された抽出物を注入することにより、ウサギはそのそれぞれの対照温度を超える０．５℃以上の個々の温度上昇を呈さない。一実施形態では、さらに５匹のウサギを使用して試験が継続される場合、処理された抽出物を注入することにより、８匹のウサギのうちの３匹以下が０．５℃以上の個々の温度上昇を示し、かつ８匹の個々の最大温度上昇の合計が３．３℃を超えない。
【００６３】
ＬＡＬおよびＵＳＰウサギ発熱因子試験の両方が非経口製剤の安全性の検証に容認できるとして米国食品医薬品局により認識されている。
【００６４】
本方法のいくつかの実施形態では、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、９９．９９％、または９９．９９９％の発熱物質が除去され、かつ／または不活性化される。一実施形態では、米国食品医薬品局、または欧州医薬品庁、またはオーストラリア医薬品局（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｇｏｏｄｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、またはカナダ保健省などの政府規制機関の要件は本願の出願日において指定されているため、発熱物質は、これらの機関に容認されるレベルに除去され、かつ／または不活性化される。好ましくは、本方法は、少なくとも約５０％、９０％、または９９％の除去および／または不活性化をもたらす。一実施形態では、本方法により生成されたフコイダン組成物は、ＵＳＰウサギ発熱因子試験および／またはＬＡＬ試験に合格できる組成物を生成することが可能である。一実施形態では、本方法は、ＬＡＬにより測定される、約１００ＥＵ／ｍＬ未満の発熱因子レベルを有する溶液を生成することが可能である。
【００６５】
海洋生物抽出物は、褐藻（Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ）網、コンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａｌｅｓ）目（例えば、翅藻科（Ａｋｋｅｓｉｐｈｙｃａｃｅａｓｅ）、チガイソ科（Ａｌａｒｉａｃｅａｅ）、ツルモ科（Ｃｈｏｒｄａｃｅａｅ）、スジメ（Ｃｏｓｔａｒｉａｃｅａｅ）、コンブ科（Ｌａｍｉｎａｒｉａｃｅａｅ）、レッソニア科（Ｌｅｓｓｏｎｉａｃｅａｅ）、およびニセツルモ科（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｄａｃｅａｅ））、またはヒバマタ（Ｆｕｃａｌｅｓ）目（例えば、ビフルカリオスダセア科（Ｂｉｆｕｒｃａｒｉｏｐｓｄａｃｅａｅ）、ドゥルビラエアセア科（Ｄｕｒｖｉｌｌａｅａｃｅａｅ）、ヒバマタ科（Ｆｕｃａｃｅａｅ）、ヒマンサラセア科（Ｈｉｍａｎｔｈａｌｌａｃｅａｅ）、ホルモシラセア科（Ｈｏｒｍｏｓｉｒａｃｅａｅ）、ノセイセア科（Ｎｏｔｈｅｉａｃｅａｅ）、ホンダワラ科（Ｓａｒｇａｓｓａｃｅａｅ）、およびセイロコッカセア科（Ｓｅｉｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ））の褐藻から得ることができる。コンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａｌｅｓ）目海藻の例としては、ウンダリア（Ｕｎｄａｒｉａ）属（これらに限定されないが、ワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、またはアラリア・エスクレンタ（Ａｌａｒｉａ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、サッコリザ・ポリサッカライド（Ｓａｃｃｏｒｈｉｚａ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、ヒロメ（Ｕｎｄａｒｉａ  ｕｎｄａｒｉｏｉｄｅｓ）、アオワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｅｔｅｒｓｅｎｉａｎａ）などの関連種）、およびコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ）種（ラミナリア・ディジタータ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｄｉｇｉｔａｔａ）、ラミナリア・ヒペルボレア（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｈｙｐｅｒｂｏｒｅａｎ）、ラミナリア・オクロロイカ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｏｃｈｒｏｌｅｕｃａ）、ラミナリア・サッカリナ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉｎａ）、ラミナリア・アガーディ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ａｇａｒｄｈｉｉ）、ラミナリア・アングスタータ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ａｎｇｕｓｔａｔａ）、ラミナリア・ボンガルディナ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｂｏｎｇａｒｄｉｎａ）、ラミナリア・クネイフォリア（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｃｕｎｅｉｆｏｌｉａ）、ラミナリア・デンティゲラ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｄｅｎｔｉｇｅｒａ）、ラミナリア・エフェメラ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｅｐｈｅｍｅｒａ）、ラミナリア・ファルロウィ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｆａｒｌｏｗｉｉ）、ラミナリア・グロエンランディカ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｇｒｏｅｎｌａｎｄｉｃａ）、ラミナリア・ジャポニカ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、ラミナリア・ロンギクルリス（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｌｏｎｇｉｃｒｕｒｉｓ）、ラミナリア・ニグリプス（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｎｉｇｒｉｐｅｓ）、ラミナリア・オンテルメディア（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｏｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ラミナリア・パリダ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｐａｌｌｉｄａ）、ラミナリア・プラチメリス（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｐｌａｔｙｍｅｒｉｓ）、ラミナリア・サッカリナ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉｎａ）、ラミナリア・セトケリ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｓｅｔｃｈｅｌｌｉｉ）、ラミナリア・シンクライリ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｓｉｎｃ��ａｉｒｌｉ）、ラミナリア・ソリダングラ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｓｏｌｉｄｕｎｇｕｌａ）、およびラミナリア・ステノフィラ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）など）の種が挙げられる。ヒバマタ目海藻類の例としては、これらに限定されないが、フカス・ベシクロサス（Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｉｏｓｕｓ）、フカス・セラノイド（Ｆｕｃｕｓ  ｃｅｒａｎｏｉｄｅｓ）、フカス・カローニィ（Ｆｕｃｕｓ  ｃｈａｌｏｎｉｉ）、フカス・コットーニィ（Ｆｕｃｕｓ  ｃｏｔｔｏｎｉｉ）、フカス・ディスティシャス（Ｆｕｃｕｓ  ｄｉｓｔｉｃｈｕｓ）フカス・エバネセス（Ｆｕｃｕｓ  ｅｖａｎｅｓｃｅｓ）、フカス・ガードネリ（Ｆｕｃｕｓ  ｇａｒｄｎｅｒｉ）、フカス・ネレイデウス（Ｆｕｃｕｓ  ｎｅｒｅｉｄｅｕｓ）、フカス・セラタス（Ｆｕｃｕｓ  ｓｅｒｒａｔｕｓ）、フカス・スペルモフォラス（Ｆｕｃｕｓ  ｓｐｅｒｍｏｐｈｏｒｕｓ）、フカス・スピラリス（Ｆｕｃｕｓ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、フカス・テンド（Ｆｕｃｕｓ  ｔｅｎｄｏ）、およびフカス・ビルソイド（Ｆｕｃｕｓ  ｖｉｒｓｏｉｄｅｓ）などのヒバマタ属の種が挙げられる。
【００６６】
褐藻類の他の目は、アスコセイラ（Ａｓｃｏｓｅｉｒａｌｅｓ）、ムチモ（Ｃｕｔｌｅｒｉａｌｅｓ）、ウルシグサ（Ｄｅｓｍａｒｅｓｔｉａｌｅｓ）、アミジグサ（Ｄｉｃｔｙｏｔａｌｅｓ）、ディスコスポランギウム（Ｄｉｓｃｏｓｐｏｒａｎｇｉａｌｅｓ）、シオミドロ（Ｅｘｔｏｃａｒｐａｌｅｓ）、イシゲ（Ｉｓｈｉｇｅａｌｅｓ）、ネモデルマ（Ｎｅｍｏｄｅｒｍａｔａｌｅｓ）、オンスロウィア（Ｏｎｓｌｏｗｉａｌｅｓ）、イソガワラ（Ｒａｌｆｓｉａｌｅｓ）、カヤモノリ（Ｓｃｙｔｏｓｉｐｈｏｎａｌｅｓ）、シトタムヌス（Ｓｃｙｔｏｔｈａｍｉｎａｌｅｓ）、クロガシラ（Ｓｐｈａｃｅｌａｒｉａｌｅｓ）、ケヤリモ（Ｓｐｏｒｏｃｈｎａｌｅｓ）、ウスバオオギ（Ｓｙｒｉｎｇｏｄｅｒｍａｔａｌｅｓ）、ティロプテリス（Ｔｉｌｏｐｔｅｒｉｄａｌｅｓ）、およびＩｎｃｅｒｔａｅｓｅｄｉｓを含む。
【００６７】
特定の褐藻類は、アスコセイラ（Ａｓｃｏｓｅｉｒａ）、カトレリア（Ｃｕｔｌｅｒｉａ）、ミクロゾニア（Ｍｉｃｒｏｚｏｎｉａ）、ザナルディニア（Ｚａｎａｒｄｉｎｉａ）、アスロクロアディア（Ａｒｔｈｒｏｃｌａｄｉａ）、デスマレスチア（Ｄｅｓｍａｒｅｓｔｉａ）、ヒマントサルス（Ｈｉｍａｎｔｏｔｈａｌｌｕｓ）、フェウラスム（Ｐｈａｅｕｒｕｓｍ）、ジクチオテリス（Ｄｉｃｔｙｏｐｔｅｒｉｓ）、ジクチオタ（Ｄｉｃｔｙｏｔａ）、ジロファス（Ｄｉｌｏｐｈｕｓ）、ジストロミウム（Ｄｉｓｔｒｏｍｉｕｍ）、グロソフォラ（Ｇｌｏｓｓｏｐｈｏｒａ）、ホモエオストリカス（Ｈｏｍｏｅｏｓｔｒｉｃｈｕｓ）、ロボフォラ（Ｌｏｂｏｐｈｏｒａ）、ロボスッピラ（Ｌｏｂｏｓｐｉｒａ）、ニューハウシア（Ｎｅｗｈｏｕｓｉａ）、パチジクチオン（Ｐａｃｈｙｄｉｃｔｙｏｎ）、パジナ（Ｐａｄｉｎａ）、パトグロサム（Ｓｐａｔｏｇｌｏｓｓｕｍ）、スチポポジウム（Ｓｔｙｐｏｐｏｄｉｕｍ）、タオニア（Ｔａｏｎｉａ）、ゾナリア（Ｚｏｎａｒｉａ）、スコレスビエラ（Ｓｃｏｒｅｓｂｙｅｌｌａ）、コリストカルプス（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｃａｒｐｕｓ）、ディスコスポランジウム（Ｄｉｓｃｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）、アシネトスポラ（Ａｃｉｎｅｔｏｓｐｏｒａ）、フェルドマンニア（Ｆｅｌｄｍａｎｎｉａ）、ゲニノカルプス（Ｇｅｍｉｎｏｃａｒｐｕｓ）、ヒンクシア（Ｈｉｎｃｋｓｉａ）、ポゴトリクム（Ｐｏｇｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ピラエラ（Ｐｙｌａｉｅｌｌａ）、アデノキスティス（Ａｄｅｎｏｃｙｓｔｉｓ）、セピジウム（Ｃａｅｐｉｄｉｕｍ）、ユトリキュリジウム（Ｕｔｒｉｃｕｌｉｄｉｕｍ）、アクロトリックス（Ａｃｒｏｔｈｒｉｘ）、アスコセロフィラ（Ａｓｃｏｓｅｉｒｏｐｈｉｌａ）、アスペロコッカス（Ａｓｐｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、オウストロフィラム（Ａｕｓｔｒｏｆｉｌｕｍ）、コルダリア（Ｃｈｏｒｄａｒｉａ）、クラドシフォン（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ）、コリカス（Ｃｏｒｙｃｕｓ）、デラマレア（Ｄｅｌａｍａｒｅａ）、ジクチオシフォン（Ｄｉｃｔｙｏｓｉｐｈｏｎ）、エラキスタ（Ｅｌａｃｈｉｓｔａ）、オイデスム（Ｅｕｄｅｓｍｅ）、キラウディア（Ｇｉｒａｕｄｉａ）、ゴノネマ（Ｇｏｎｏｎｅｍａ）、ハロスリックス（Ｈａｌｏｔｈｒｉｘ）、ハプログロイア（Ｈａｐｌｏｇｌｏｉａ）、ヘカトネマ（Ｈｅｃａｔｏｎｅｍａ）、ヘテロサンダーセラ（Ｈｅｔｅｒｏｓａｕｎｄｅｒｓｅｌｌａ）、ヒュミア（Ｈｕｍｍｉａ）、イシュモプレア（Ｉｓｔｈｍｏｐｌｅａ）、ラミナリオコラックス（Ｌａｍｉｎａｒｉｏｃｏｌａｘ）、ラミナイオネマ（Ｌａｍｉｎａｒ  ｉｏｎｅｍａ）、リーセシア（Ｌｅａｔｈｅｓｉａ）、レプトネマテラ（Ｌｅｐｔｏｎｅｍａｔｅｌｌａ）、リトシフォン（Ｌｉｔｏｓｉｐｈｏｎ）、ミクロスポンジウム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｎｇｉｕｍ）、ミクロシファー（Ｍｉｋｒｏｓｙｐｈａｒ）、マイエロフィカス（Ｍｙｅｌｏｐｈｙｃｕｓ）、マイリオグロエア（Ｍｙｒｉｏｇｌｏｅａ）、マイリオネマ（Ｍｙｒｉｏｎｅｍａ）、マイリオトリキア（Ｍｙｒｉｏｔｒｉｃｈｉａ）、パペンフッシエラ（Ｐａｐｅｎｆｕｓｓｉｅｌｌａ）、ペトロスポンジウム（Ｐｅｔｒｏｓｐｏｎｇｉｕｍ）、プリュロクラ���ア（Ｐｌｅｕｒｏｃｌａｄｉａ）、ポリトレタス（Ｐｏｌｙｔｒｅｔｕｓ）、プロセラキスタ（Ｐｒｏｓｅｌａｃｈｉｓｔａ）、プロテクトカルプス（Ｐｒｏｔｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ）、パンクタリア（Ｐｕｎｃｔａｒｉａ）、クロモズク（Ｓａｕｖａｇｅａｕｇｌｏｉａ）、ソランセラ（Ｓｏｒａｎｔｈｅｒａ）、ソロカルプス（Ｓｏｒｏｃａｒｐｕｓ）、スペルマイオクヌス（Ｓｐｅｒｍａｉｏｃｈｎｕｓ）、スファエロトリキア（Ｓｐｈａｅｒｏｔｒｉｃｈｉａ）、サメズグサ（Ｓｔｉｃｔｙｏｓｉｐｈｏｎ）、ヤドリミドロ（Ｓｔｒｅｂｌｏｎｅｍａ）、ヨコジマノリ（Ｓｔｒｉａｒｉａ）、シチャポビア（Ｓｔｓｃｈａｐｏｖｉａ）、フトモズク（Ｔｉｎｏｃｌａｄｉａ）、コルダリオプシス（Ｃｈｏｒｄａｒｉｏｐｓｉｓ）、アステロクラドン（Ａｓｔｅｒｏｃｌａｄｏｎ）、シオミドロ（Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ）、ククキア（Ｋｕｃｋｕｃｋｉａ）、メソスポラ（Ｍｅｓｏｓｐｏｒａ）、アステロトリキア（Ａｓｔｅｒｏｔｒｉｃｈｉａ）、ナンカイシオミドロ（Ｂａｃｈｅｌｏｔｉａ）、ビフルカリオプシス（Ｂｉｆｕｒｃａｒｉｏｐｓｉｓ）、ダービリア（Ｄｕｒｖｉｌｌａｅａ）、アスコフィルム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）、フカス（Ｆｕｃｕｓ）、ヘスペロフィクス（Ｈｅｓｐｅｒｏｐｈｙｃｕｓ）、ペルベチア（Ｐｅｌｖｅｔｉａ）、ペルベチオプシス（Ｐｅｌｖｅｔｉｏｐｓｉｓ）、シルベチア（Ｓｉｌｖｅｔｉａ）、クシフォフォア（Ｘｉｐｈｏｐｈｏｒａ）、ヒマンサリア（Ｈｉｍａｎｔｈａｌｉａ）、ホルモシラ（Ｈｏｒｍｏｓｉｒａ）、ノセイア（Ｎｏｔｈｅｉａ）、アンソフィカス（Ａｎｔｈｏｐｈｙｃｕｓ）、アキシラリエラ（Ａｘｉｌｌａｒｉｅｌｌａ）、ビフルカリア（Ｂｉｆｕｒｃａｒｉａ）、ビフルカリオプシス（Ｂｉｆｕｒｃａｒｉｏｐｓｉｓ）、カルポグロッサム（Ｃａｒｐｏｇｌｏｓｓｕｍ）、カウロシスティス（Ｃａｕｌｏｃｙｓｔｉｓ）、コッコフォラ（Ｃｏｃｃｏｐｈｏｒａ）、シストフォラ（Ｃｙｓｔｏｐｈｏｒａ）、シストセイラ（Ｃｙｓｔｏｓｅｉｒａ）、ハリドリス（Ｈａｌｉｄｒｙｓ）、ヒジキ（Ｈｉｚｉｋｉａ）、ホルモフィサ（Ｈｏｒｍｏｐｈｙｓａ）、ジョロモク（Ｍｙａｇｒｏｐｓｉｓ）、マイオグロプシス（Ｍｙｏｇｒｏｐｓｉｓ）、マイリオデスマ（Ｍｙｒｉｏｄｅｓｍａ）、サルガッサム（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ）、タービナリア（Ｔｕｒｂｉｎａｒｉａ）、シストファエラ（Ｃｙｓｔｏｐｈａｅｒａ）、マルギナリエラ（Ｍａｒｇｉｎａｒｉｅｌｌａ）、フィロスポラ（Ｐｈｙｌｌｏｓｐｏｒａ）、セイロコッカス（Ｓｅｉｒｏｃｏｃｃｕｓ）、イシゲ（Ｉｓｈｉｇｅ）、コンブモドキ（Ａｋｋｅｓｉｐｈｙｃｕｓ）、アラリア（Ａｌａｒｉａ）、オーレオフィカス（Ａｕｒｅｏｐｈｙｃｕｓ）、ドルエリア（Ｄｒｕｅｈｌｉａ）、オーアラリア（Ｅｕａｌａｒｉａ）、ヒロメ（Ｈｉｒｏｍｅ）、レッソニオプシス（Ｌｅｓｓｏｎｉｏｐｓｉｓ）、プルロフィカス（Ｐｌｅｕｒｏｐｈｙｃｕｓ）、テリョゴフォラ（Ｐｔｅｒｙｇｏｐｈｏｒａ）、ウンダリア（Ｕｎｄａｒｉａ）、ウンダリエラ（Ｕｎｄａｒｉｅｌｌａ）、ウンダリオプシス（Ｕｎｄａｒｉｏｐｓｉｓ）、コルダ（Ｃｈｏｒｄａ）、アガラム（Ａｇａｒｕｍ）、コスタリア（���ｏｓｔａｒｉａ）、ジクチオネウラム（Ｄｉｃｔｙｏｎｅｕｒｕｍ）、サラッシオフィラム（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｐｈｙｌｌｕｍ）、アースロサムナス（Ａｒｔｈｒｏｔｈａｍｎｕｓ）、コスツラリア（Ｃｏｓｔｕｌａｒｉａ）、シマセレ（Ｃｙｍａｔｈｅｒｅ）、フェジチア（Ｆｅｄｉｔｉａ）、ギガント（Ｇｉｇａｎｔｅａ）、ラミナリア（Ｌａｍｉｎａｒｉａ）、マクロシスティス（Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）、ネレオシスティス（Ｎｅｒｅｏｃｙｓｔｉｓ）、ペラゴフィカス（Ｐｅｌａｇｏｐｈｙｃｕｓ）、ペラゴフィカス×マクロシスティス（Ｐｅｌａｇｏｐｈｙｃｕｓ  ×  Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）、フィコカスタナム（ＰｈｙｃｏＣａｓｔａｎｕｍ）、フィラリエラ（Ｐｈｙｌｌａｒｉｅｌｌａ）、ポリシデア（Ｐｏｌｙｓｃｈｉｄｅａ）、ポステルシア（Ｐｏｓｔｅｌｓｉａ）、シュードレッソニア（Ｐｓｅｕｄｏｌｅｓｓｏｎｉａ）、サッカリナ（Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ）、ストレプトフィロプシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｌｌｏｐｓｉｓ）、エクロニア（Ｅｃｋｌｏｎｉａ）、エクロニオプシス（Ｅｃｋｌｏｎｉｏｐｓｉｓ）、エグレギア（Ｅｇｒｅｇｉａ）、エイセニア（Ｅｉｓｅｎｉａ）、レッソニア（Ｌｅｓｓｏｎｉａ）、シュードコルダ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｄａ）、ネモデルマ（Ｎｅｍｏｄｅｒｍａ）、オンスロウィア（Ｏｎｓｌｏｗｉａ）、ベロスファセラ（Ｖｅｒｏｓｐｈａｃｅｌｌａ）、ネオラルフシア（Ｎｅｏｒａｌｆｓｉａ）、バシスポラ（Ｂａｓｉｓｐｏｒａ）、ハパロスポンギジオン（Ｈａｐａｌｏｓｐｏｎｇｉｄｉｏｎ）、ジョンソニア（Ｊｏｎｓｓｏｎｉａ）、リソデルマ（Ｌｉｔｈｏｄｅｒｍａ）、ミリオネモプシス（Ｍｙｒｉｏｎｅｍｏｐｓｉｓ）、ペトロデルマ（Ｐｅｔｒｏｄｅｒｍａ）、ポルテリネマ（Ｐｏｒｔｅｒｉｎｅｍａ）、シュードリソデルマ（Ｐｓｅｕｄｏｌｉｔｈｏｄｅｒｍａ）、イソガアラ（Ｒａｌｆｓｉａ）、ムラチドリ（Ｃｈｎｏｏｓｐｏｒａ）、フクロノリ（Ｃｏｌｐｏｍｅｎｉａ）、ヒドロクラスラス（Ｈｙｄｒｏｃｌａｔｈｒｕｓ）、ペタロニア（Ｐｅｔａｌｏｎｉａ）、ロゼンビゲア（Ｒｏｓｅｎｖｉｎｇｅａ）、Ｓｃｙｔｏｓｉｐｈｏｎ、ボンダネラ（Ｂｏｄａｎｅｌｌａ）、コエロクラジア（Ｃｏｅｌｏｃｌａｄｉａ）、ヘリバウジエラ（Ｈｅｒｉｂａｕｄｉｅｌｌａ）、ファエオストロマ（Ｐｈａｅｏｓｔｒｏｍａ）、アステロネマ（Ａｓｔｅｒｏｎｅｍａ）、シトサムヌス（Ｓｃｙｔｏｔｈａｍｎｕｓ）、ステレオクラドン（Ｓｔｅｒｅｏｃｌａｄｏｎ）、スプラキニジウム（Ｓｐｌａｃｈｎｉｄｉｕｍ）、クラドステファス（Ｃｌａｄｏｓｔｅｐｈｕｓ）、スファセラリア（Ｓｐｈａｃｅｌａｒｉａ）、スファセラ（Ｓｐｈａｃｅｌｌａ）、アレソクラダス（Ａｌｅｔｈｏｃｌａｄｕｓ）、ハロプテリス（Ｈａｌｏｐｔｅｒｉｓ）、スティポカウロン（Ｓｔｙｐｏｃａｕｌｏｎ）、オーストロネレイア（Ａｕｓｔｒｏｎｅｒｅｉａ）、ベロチア（Ｂｅｌｌｏｔｉａ）、カルポミトラ（Ｃａｒｐｏｍｉｔｒａ）、エンシオサリア（Ｅｎｃｙｏｔｈａｌｉａ）、ネレイア（Ｎｅｒｅｉａ）、ペリスポロキヌス（Ｐｅｒｉｓｐｏｒｏｃｈｎｕｓ）、ペリサリア（Ｐｅｒｉｔｈａｌｉａ）、スポロキネマ（Ｓｐｏｒｏｃｈｎｅｍａ）、ス��ロキナス（Ｓｐｏｒｏｃｈｎｕｓ）、トマクロプシス（Ｔｏｍａｃｕｌｏｐｓｉｓ）、シンゴデルマ（Ｓｙｎｇｏｄｅｒｍａ）、ハロシフォン（Ｈａｌｏｓｉｐｈｏｎ）、マソノフィカス（Ｍａｓｏｎｏｐｈｙｃｕｓ）、フィラリオプシス（Ｐｈｙｌｌａｒｉｏｐｓｉｓ）、サッコリザ（Ｓａｃｃｏｒｈｉｚａ）、シチャポビア（Ｓｔｓｃｈａｐｏｖｉａ）、ハプロスポラ（Ｈａｐｌｏｓｐｏｒａ）、ファエオシフォニエラ（Ｐｈａｅｏｓｉｐｈｏｎｉｅｌｌａ）、ティロプテリス（Ｔｉｌｏｐｔｅｒｉｓ）、ネオレピオネウマ（Ｎｅｏｌｅｐｉｏｎｅｕｍａ）、アナリパス（Ａｎａｌｉｐｕｓ）、およびファエオストロフィオン（Ｐｈａｅｏｓｔｒｏｐｈｉｏｎ）の種を含む。
【００６８】
特定の褐藻類は、アデノシスティス（Ａｄｅｎｏｃｙｓｔｉｓ）、アラリア（Ａｌａｒｉａ）、アスコフィルム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）、コルダ（Ｃｈｏｒｄａ）、クラドシフォン（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ）、デスマレスチア（Ｄｅｓｍａｒｅｓｔｉｓ）、ジクチオタ、ダービリア、エクロニア、シオミドロ、エグレギア、フカス、ハリドリス、ヒマンサリア、ホルモシナ（Ｈｏｒｍｏｓｉｎａ）、レセシア（Ｌｅｔｈｅｓｉａ）、レッソニア（Ｌｅｓｓｏｎｉａ）、マクロシスティス、ネレオシスティス、パジナ（Ｐａｄｉｎａ）、ペラゴフィカス、ペルバチア（Ｐｅｌｖａｔｉａ）、ピライエラ（Ｐｉｌａｉｅｌｌａ）、ポステルシア、サッカリザ（Ｓａｃｃｒｈｉｚａ）、サルガッサム、スファセラリア、およびタービナリアの種を含む。
【００６９】
他の好適な海洋生物は、緑藻類およびウニおよびナマコなどの棘皮動物を含む。緑藻類の例としては、アオサ種（Ｕｌｖａ  ｓｐ）、アオノリ種（Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ  ｓｐ）、ミル種（Ｃｏｄｉｕｍ  ｓｐ）、イワヅタ種（Ｃａｕｌｅｒｐａ  ｓｐ）、およびハリマラ種（Ｈａｌｉｍａｌａ  ｓｐ）が挙げられる。
【００７０】
１つの実施形態では、抽出物は、ワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、フカス・ベシクロスス（Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ）、またはアオサ種から供給される。
【００７１】
フコイダンは、ツルモ（Ｃｈｏｒｄａ  ｆｉｌｕｍ）、オキナワモズク（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ  ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ）、ワカメ、ネバリモ（Ｌｅａｔｈｅｓｉａ  ｄｉｆｆｏｒｍｉｓ）、アスコフィラム・ノドサム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ）、クロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ  ｋｕｒｏｍｅ）、ペルヴェチアファスチジアタ（Ｐｅｌｖｅｔｉａｆａｓｔｉｇｉａｔａ）、モツキチャソウメン（Ｓａｕｎｄｅｒｓｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ）、またはナガマツモ（Ｃｈｏｒｄａｒｉａｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）にも由来し得る。
【００７２】
よって、抽出物は、任意の褐藻もしくは緑藻、または任意の刺皮動物から供給され得る。
【００７３】
海洋生物が植物である場合、抽出物は、植物全体、または葉、茎、胞子、もしくはこれらの組み合わせの植物の任意の部分から供給され得る。抽出物の調製用の出発材料は、新鮮な、凍結、または乾燥材料であってよい。
【００７４】
抽出物は、浸軟、滲出、煎出、抽出、還流下、超音波の補助による抽出、溶媒相間に分配することにより補助される抽出、および共溶媒を用いた、または用いない超臨界抽出などの手順を使用して調製され得る。海藻の酸または塩基処理は、本発明の方法のための出発材料として有用な抽出物を形成するためにも使用され得る。一実施形態では、本方法は、炭水化物の単離のため、特に多糖類の単離のためである。多糖類は、アルギン酸塩、または硫酸化多糖類であってよい。
【００７５】
一実施形態では、硫酸化多糖類は、フコイダンまたはフコイダン誘導体である。本発明の文脈において、用語「フコイダン」は、多くの海洋植物および動物に見られる種類の硫酸化α−Ｌ−フカンを意味するものとする。
【００７６】
一実施形態では、硫酸化多糖類は、ウルバンまたはウルバン誘導体である。本発明の文脈において、用語「ウルバン」は、様々な程度の硫酸化ラムノース、キシロース、グルクロン酸、およびイズロン酸残基からなる緑藻類からの硫酸化細胞壁成分を意味するものとする。
【００７７】
加えて、用語「フコイダン」および「ウルバン」は、その生物学的に活性な断片、誘導体、または類似体をさらに含む。より大きな分子の分解（例えば、加水分解）により生成されたフコイダンまたはウルバンの断片も含まれる。分解は、個別に単離されても、されなくてもよい、分解されたフコイダンまたはウルバンを得るために、酸、塩基、熱、または酵素で処理することにより達成することができる。フコイダンおよびウルバンは、化学的に変更されてもよく、これらに限定されないが、硫酸化、ポリ硫酸化、アセチル化、エステル化、およびメチル化を含む修飾を有し得る。
【００７８】
一実施形態では、本方法は、石綿、リポ多糖体−解毒酵素、グアニジン塩酸、硫酸アンモニウム、クロマトグラフィー樹脂、Ａｃｔｉｃｌｅａｎ  ｅｎｄｏｔｏｘ、不動化ヒスタミン、もしくはＴｒｉｔｏｎシリカ、または本出願の出願日に市販されている任意の他の発熱物質除去フィルタの使用を必要とするステップがない。
【００７９】
一態様では、本発明は、実質的に発熱物質除去された海洋生物抽出物を提供する。好ましくは、抽出物は、ＬＡＬにより決定される約１００ＥＵ／ｍＬ未満の発熱物質レベルを有し得、かつ／またはウサギ発熱性試験に合格できる。
【００８０】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される方法により生成された抽出物を提供する。
【００８１】
一実施形態では、抽出物は、少なくとも一部、本明細書に開示される方法により生成される。本発明の方法は、発熱物質の減少および／または除去のための他のステップで拡大することができることを理解する。
【００８２】
処理された抽出物は、フコース、ガラクトース、ラムノース、キシロース、ウロン酸、重金属汚染、硫酸化、アセチル化、対イオン、および水を含む、分子量、炭水化物含量など、含まれる多糖類の純度および様々な特性に関して分析され得る。これらに限定されないが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、元素組成分析、レーザー光散乱（ＬＬＳ）、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）、紫外線−可視分光法（ＵＶ−Ｖｉｓ）、およびＧＣ−ＭＳを含む、多糖類試料を特徴付けるために、いくつかの分析技法を使用することができる。いくつかの実施形態では、処理された抽出物中のフコイダンは、未処理のフコイダンと比較した場合、前述の特性のうちの１つ以上に対して実質的に類似する。
【００８３】
別の態様では、本発明は、薬剤的に許容される賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載される方法により生成された多糖類を含む医薬組成物を提供する。例示的な賦形剤は、炭水化物、無機塩、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝剤、酸、塩基、およびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。注入可能組成物に好適な賦形剤は、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、植物油、リン脂質、および界面活性剤を含む。糖などの炭水化物、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖、および／または糖ポリマーなどの誘導体化された糖が賦形剤として存在し得る。具体的な炭水化物賦形剤は、例えば、単糖類（フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなど）、二糖類（ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど）、多糖類（ラフィノース、メレチトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど）、およびアルジトール（マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトールなど）を含む。賦形剤は、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、第１リン酸ナトリウム、第２リン酸ナトリウム、およびこれらの組み合わせなどの無機塩または緩衝剤も含み得る。
【００８４】
本発明の組成物は、微生物の成長を防止または阻止するための抗菌剤も含み得る。本発明に好適な抗菌剤の非限定的な例としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメロソール（ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００８５】
組成物は、酸化を阻害し、それによって、フコイダンまたは調製物の他の成分の劣化を防止するために抗酸化剤を含み得る。本発明に使用するのに好適な抗酸化剤は、例えば、アスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、ポリフェノール、重亜硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびこれらの組み合わせを含む。
【００８６】
界面活性剤は、賦形剤として存在し得る。例示的な界面活性剤は、「Ｔｗｅｅｎ  ２０」および「Ｔｗｅｅｎ  ８０」などのポリソルベート、ならびにＦ６８およびＦ８８（ＢＡＳＦ）などのプルロニクス；ソルビタンエステル；レシチンおよび他のホスファチジルコリンなどのリン脂質、ホスファチジルエタノールアミン、脂肪酸、ならびに脂肪族エステルなどの脂質；コレステロールなどのステロイド；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ならびに亜鉛および他のそのような好適なカチオンを含む。
【００８７】
酸または塩基は、組成物中の賦形剤として存在し得る。使用され得る酸の非限定的な例としては、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるそれらの酸が挙げられる。好適な塩基の例としては、これらに限定されないが、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される塩基が挙げられる。
【００８８】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される方法により生成された多糖類を含む生体材料を提供する。ウルバンは、生物学的セメント（例えば、骨セメント）として、または新しい組織の成長を容易にするための３次元の足場を形成するために使用され得る。さらに、ウルバンは、生分解性ヒドロゲルとして使用され得、薬物送達ビヒクルとして潜在的に有用である。その文脈において、ウルバンは、例えば、生分解性ヒドロゲルを得るために、ラジカル重合性基を移植することにより官能化され得る。
【００８９】
本発明の発熱物質除去されたフコイダンは、１つ以上の臨床用途もしくは無菌エクスビボ用途において、特に、凝集、線維素溶解の調節因子として、抗癌剤として、抗ウイルス剤として（特に出願者の公開国際特許出願第ＷＯ／２０１１／１００８０５号を参照、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）、または血液幹細胞もしくは他の種類の幹細胞移動剤（ｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）として利用性を有する。
【００９０】
本発明の発熱物質除去されたフコイダン抽出物が利用性を有し得る他の臨床適応は、炎症を含む。フコイダンは、セレクチン遮断活性、スカベンジャー受容体遮断、および炎症細胞の蓄積の調節を介して作用し得る。急性および慢性炎症状態は、喘息、アレルギー皮膚炎、心臓血管疾患、虚血後炎症、および他の感染または病変後の炎症を含む。
【００９１】
発熱物質除去されたフコイダン抽出物は、癌患者の幹細胞を保護するために、放射線および化学療法補助剤の文脈において、幹細胞移動剤として作用し得る。抽出物は、直接的な抗癌剤または補助的な抗癌剤として有用であり得る。障害を取り去るための治療用途がさらに想定される。特に、エタノールもしくは他の薬剤、またはヘリコバクターピロリおよびクロストリジウム・ディフィシレなどの感染に起因する胃の病態が想定される。
【００９２】
ヘルペスウイルス感染（ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、およびこれらの薬物耐性株）、サイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、インフルエンザウイルス、ＨＩＶの治療を含む抗ウイルス用途がさらに想定される。局所または経口送達は、これらの状況において典型的であろうが、いくつかのヘルペス感染は、注入または他の方法を介して部位に直接適用することが必要とされ得る。
【００９３】
単核細胞、ＮＫ細胞、および樹状細胞などの免疫細胞の数および活性を含む、フコイダンが免疫機能を増強する能力を考えると、免疫調節を伴う病態も適している可能性がある。フコイダンは、抗病原性または抗癌作用をもたらすために、これらの細胞の活性を増強することが知られている。
【００９４】
さらに想定される使用は、外科手術用途における癒着を予防するための抗癒着療法である。
【００９５】
さらに想定される使用は、凝集、グルコース代謝、マトリックスタンパク質代謝回転の調節、ならびにエクスビボおよびインビボの両方の他の酵素プロセスに関連するものを含む酵素機能の調節においてである。本発明のフコイダン抽出物は、ＴＧＦβおよびそれらの受容体などの成長因子の活性を調節するためにも採用され得る。
【００９６】
本発明の発熱物質除去された抽出物は、神経疾患（アミロイド蓄積に依存するものを含む）、凝固障害（抗血栓、血栓溶解、または抗凝固物質もしくは凝固亢進を含む）、ならびに血友病、局所化粧用クリーム、歯科用途、眼科用途において、およびＰセレクチン撮像用の放射能マーカーの担体として使用され得る。さらに、本発明の発熱物質除去されたフコイダン抽出物は、抗生物質もしくは他の活性剤用の離型剤または担体として使用され得る。
【００９７】
発熱物質除去された抽出物は、好適な方法により身体に、および臨床医によって必要または適切と思われる任意の身体の一部に送達され得る。
【００９８】
したがって、本発明は、本明細書に記載される組成物を使用して、ヒトおよび他の哺乳類におけるそのような病態を治療する方法を提供する。
【００９９】
本発明は、ここで、以下の非限定的な実施例を参照することによりさらに完全に説明される。
【０１００】
実施例１：ワカメから精製されたフコイダンの発熱物質除去
出発材料は、天然炭水化物（約５０％〜２７．５％のフコース、２２．５％のガラクトース）、硫酸塩（２６％）、アセチル部分（３％）、および対イオン（８％）を含む、フコイダンに関して前に約８７％に精製された凍結乾燥生成物であった。
【０１０１】
この方法に使用される全ての水は、使用前に発熱物質除去フィルタを通して濾過された。全ての機器を使用前に消毒し、発熱物質除去された水で洗浄した。
【０１０２】
２．８６ｋｇの凍結乾燥されたフコイダン生成物を、５０倍（１４３Ｌ）の０．０５Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。
【０１０３】
溶解は、最初に約１１４．４ＬのＤＩ水（すなわち、１４３Ｌの８０％）を反応槽内に設置することにより行われた。５．９４ｋｇのＮａＯＨをＤＩ水に添加し、１４３ＬのＤＩ水の残りを添加した。次いで、混合しながら、固体フコイダン（２．８６ｋｇ）を添加した。全ての固体が完全に溶解されるまで混合しながら、溶液を４０℃に加熱した。次いで、溶液を、１０分間４０℃に維持した。
【０１０４】
３ｋｇのＳｐｅｅｄｐｌｕｓ濾過助剤（Ｄｉｃａｌｉｔｅ，ＰＡ）を溶液に添加し、圧力濾過機を使用して濾過を行った。１８０Ｌの濾液を回収し、新しい反応槽に移した。
【０１０５】
２．６ＬのＨ２Ｏ２（５０％ｗ／ｗ）を濾液に添加し、混合している間、溶液を１時間、６０℃に維持した。次いで、溶液を４５℃に冷却し、Ｈ２ＳＯ４（３６％ｗ／ｗ）でｐＨを１０．０〜１０．５に調節した。１０．４４の最終ｐＨに達した。
【０１０６】
公称カットオフが３０ｋＤａの、７７ｆｔ２の膜（Ｓｙｎｄｅｒ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ＣＡ）を使用して、ｐＨを調節した溶液を限外濾過した。
【０１０７】
ＵＦ機器を組み立て、４５〜５０℃の１００ＬのＤＩ水当り１５０ｍｌのＮａＯＣｌの溶液（ｐＨ１０〜１１）を３０分間再循環させることにより消毒した。機器を少なくとも２００Ｌの発熱物質除去されたＤＩ水で洗浄した。フコイダン溶液を保持液槽に添加し、保持液が元の容量の約２０％に濃縮されるまで限外濾過を行った。限外濾過ステップを通して、供給圧は２．０バール、保持液圧は１．０バールに維持された。浸透液流朿を１２．５Ｌ／分で開始し、限外濾過の終わりには１０．８Ｌ／分に降下した。
【０１０８】
次いで、発熱物質除去されたＤＩ水（１６０Ｌ）を使用して、濃縮したフコイダン溶液（４０Ｌ）を透析濾過した。供給圧を２．０バール、保持液圧を１．０バールに維持した。浸透液流朿は、２０分かけて１０．９Ｌ／分から７．５Ｌ／分に低下した。
【０１０９】
次いで、Ｈ２ＳＯ４でｐＨを８に調節し、さらに４容量（１６０Ｌ）の発熱物質除去されたＤＩ水で透析濾過を継続した。供給圧を２．０バール、保持液圧を１．０バールに維持した。浸透液流朿は、２７分の透析濾過にわたって、７．５Ｌ／分から６．０Ｌ／分に低下した。
【０１１０】
次いで、溶液を４０Ｌの容量まで濃縮した。
【０１１１】
濃縮物を新しいＣｕｎｏ  １  ＤＥＰＬ発熱物質除去フィルタに通し、後に凍結乾燥させた。合計１８２０ｇの固体を回収した。凍結乾燥した生成物を、Ｃｏｍｉｌ  ０３２スクリーンを通して粉砕した。
【０１１２】
プロセス収率は６３％であると計算された。９０％の発熱因子の減少（ＬＡＬにより測定された）が見られた。
【０１１３】
実施例２：ゼオライトと接触させ、続いて限外濾過することによりワカメから精製されたフコイダンの発熱物質除去。
フコイダン（１５．００ｇ）を３００ｍＬの蒸留水に溶解し、ガラスファイバフィルタを通して濾過した。蒸留水を用いて濾液を３００ｇにした。４０ｍＬのフコイダン溶液のアリコートを、蒸留水で１００ｍＬに希釈し、０．２ｇのゼオライトを添加した。ガラスファイバフィルタを通して濾過する前に、懸濁液を１４時間攪拌した。次いで、４０ｍＬの最終容量に濃縮し、凍結乾燥させる前に、濾液を、Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して限外濾過し、保持液を１００ｍＬの蒸留水で洗浄した。
１％の発熱因子の減少（ＬＡＬにより測定された）が見られた。
【０１１４】
類似するが、ゼオライト接触ステップがないプロセスでは、９２．５％のフコイダン収率をもたらし、発熱因子の減少はなかった。
【０１１５】
実施例３：低レベルのアルカリおよび活性炭と接触させ、続いて限外濾過によりワカメから精製されたフコイダンの発熱物質除去。
フコイダン（１５．００ｇ）を３００ｍＬの蒸留水に溶解し、ガラスファイバフィルタを通して濾過した。蒸留水を用いて濾液を３００ｇにした。４０ｍＬのフコイダン溶液のアリコートを、０．５％のＮａＯＨで１００ｍＬに希釈し、０．２ｇの活性炭を添加した。ガラスファイバフィルタを通して濾過する前に、懸濁液を１４時間攪拌した。次いで、４０ｍＬの最終容量に濃縮し、凍結乾燥させる前に、濾液を、Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して限外濾過し、保持液を１００ｍＬの発熱物質除去された蒸留水で洗浄した。６６％の発熱因子の減少（ＬＡＬにより測定された）が見られた。
【０１１６】
実施例４：界面活性剤と接触させ、続いて限外濾過することによりワカメから精製されたフコイダンの発熱物質除去。
フコイダン（１０．００ｇ）を、３００ｍＬの発熱物質除去された水に溶解した。ガラスファイバフィルタを通して溶液を濾過し、透明な褐色の溶液（約２８０ｍＬ）を得た。
【０１１７】
７５ｇのフコイダン溶液のアリコートを蒸留水で１５０ｍＬに希釈し、１．８ｇのＴｅｒｉｃ（登録商標）Ｇ１２Ａ１２を添加した。ガラスファイバフィルタを通して濾過する前に、懸濁液を１時間攪拌した。次いで、４０ｍＬの最終容量に濃縮し、凍結乾燥させる前に、濾液を、Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して限外濾過し、保持液を１００ｍＬの発熱物質除去された蒸留水で洗浄した。９３％の発熱因子の減少（ＬＡＬにより測定された）が見られた。
【０１１８】
７５ｇのフコイダン溶液のアリコートを蒸留水で１５０ｍＬに希釈し、１．８ｇのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を添加した。ガラスファイバフィルタを通して濾過する前に、懸濁液を１時間攪拌した。次いで、４０ｍＬの最終容量に濃縮し、凍結乾燥させる前に、濾液を、Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して限外濾過し、保持液を１００ｍＬの発熱物質除去された蒸留水で洗浄した。
【０１１９】
７５ｇのフコイダン溶液のアリコートを蒸留水で１５０ｍＬに希釈し、１．８ｇのＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００を添加した。ガラスファイバフィルタを通して濾過する前に、懸濁液を１時間攪拌した。次いで、４０ｍＬの最終容量に濃縮し、凍結乾燥させる前に、濾液を、Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して限外濾過し、保持液を１００ｍＬの発熱物質除去された蒸留水で洗浄した。
【０１２０】
実施例５：低レベルの過酸化物と接触させ、続いて限外濾過によりワカメから精製されたフコイダンの発熱物質除去。
フコイダン（６．００ｇ）を、２５０ｍＬの蒸留水に溶解した。０．５Ｍ  ＮａＯＨを分配する自動滴定装置を使用して、ｐＨを７．００に維持した。溶液を攪拌しながら、ホットプレート上で９０℃に加熱し、次いで、３．０ｍＬの３０％ｗ／ｗ  Ｈ２Ｏ２を添加した。１時間後、反応は４．３７ｍＬのアルカリを消費した。ガラスファイバフィルタを通して濾過する前に、溶液を一晩室温で放置した。次いで、５０ｍＬに濃縮し、凍結乾燥させる前に、濾液を、Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して濾過し、保持液を５０ｍＬの発熱物質除去された蒸留水で洗浄した。
【０１２１】
８３％の発熱因子の減少（ＬＡＬにより測定された）が見られた。
【０１２２】
実施例６：第二鉄触媒の存在下で過酸化物と接触させ、続いて限外濾過することによりワカメから精製されたフコイダンの発熱物質除去。
フコイダン（１０．００ｇ）を、２５０ｍＬの蒸留水に溶解した。０．５Ｍ  ＮａＯＨを分配する自動滴定装置を使用して、ｐＨを７．００に維持した。溶液を攪拌しながら、ホットプレート上で６０℃に加熱し、次いで、１０．０ｍＬの３０％ｗ／ｗ  Ｈ２Ｏ２および０．１ｇのクエン酸Ｆｅｌｌｌを添加した。４時間後、１４．９２ｍＬのアルカリが消費された。ガラスファイバフィルタを通して濾過する前に、溶液を一晩室温で放置した。次いで、５０ｍＬに濃縮し、凍結乾燥させる前に、濾液を、Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して濾過し、保持液を５０ｍＬの発熱物質除去された蒸留水で洗浄した。
【０１２３】
９４％の発熱因子の減少（ＬＡＬにより測定された）が見られた。
【０１２４】
実施例７：第二鉄触媒の存在下で高レベルの過酸化物と接触させ、第２の過酸化物で処理し、続いて限外濾過することによりワカメから精製されたフコイダンの発熱物質除去。
フコイダン（１０．００ｇ）を、２５０ｍＬの蒸留水に溶解した。０．５Ｍ  ＮａＯＨを分配する自動滴定装置を使用して、ｐＨを７．００に維持した。溶液を攪拌しながら、ホットプレート上で６０℃に加熱し、次いで、１０．０ｍＬの３０％ｗ／ｗ  Ｈ２Ｏ２および０．１ｇのクエン酸Ｆｅｌｌｌを添加した。２時間後、１２．１０ｍＬのアルカリが消費された。さらに５．０ｍＬの３０％ｗ／ｗ  Ｈ２Ｏ２を添加した。１０時間後、合計１５．２３ｍＬのアルカリが消費された。ガラスファイバフィルタを通して濾過する前に、溶液を一晩室温で放置した。次いで、５０ｍＬに濃縮し、凍結乾燥させる前に、濾液を、Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して限外濾過し、保持液を５０ｍＬの発熱物質除去された蒸留水で洗浄した。
【０１２５】
９９％の発熱因子の減少（ＬＡＬにより測定された）が見られた。
【０１２６】
実施例８：第二鉄触媒および界面活性剤の存在下で高レベルの過酸化物と接触させ、続いて限外濾過によりワカメから精製されたフコイダンの発熱物質除去。
フコイダン（１０．００ｇ）を、２５０ｍＬの蒸留水に溶解した。０．５Ｍ  ＮａＯＨを分配する自動滴定装置を使用して、ｐＨを７．００に維持した。溶液を攪拌しながら、ホットプレート上で７０℃に加熱し、次いで、１０．０ｍＬの３０％ｗ／ｗ  Ｈ２Ｏ２および０．１ｇのクエン酸Ｆｅｌｌｌを添加した。１時間後、１２．２２ｍＬのアルカリが消費された。ガラスファイバフィルタを通して濾過する前に、溶液を冷却し、一晩室温で放置した。Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して限外濾過する前に、１２５ｍＬの濾液のアリコートを、２．０ｇのＴｅｒｉｃ（登録商標）Ｇ１２Ａ１２で１時間処理した。３０ｍＬに濃縮し、凍結乾燥させる前に、保持液を１７０ｍＬの発熱物質除去された蒸留水で洗浄した。
【０１２７】
９９％の発熱因子の減少（ＬＡＬにより測定された）が見られた。
【０１２８】
実施例９：高レベルのアルカリと接触させ、続いて限外濾過によりワカメから精製されたフコイダンの発熱物質除去。
フコイダン（２．００ｇ）を、４０℃に温めながら１００ｍＬの０．５Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。１０分後、固体を遠心分離により分離し、破棄した。ガラスファイバフィルタを通して上清を濾過し、３時間、５０ｍＬのアリコートを６０℃に加熱した。次いで、反応混合物を、発熱物質除去された蒸留水で１００ｍＬに希釈し、Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して５ｍＬの濃度に限外濾過した。次いで、保持液を７５ｍＬの発熱物質除去された蒸留水で洗浄し、５ｍＬに濃縮し、凍結乾燥させた。
【０１２９】
＞９９％の発熱因子の減少（ＬＡＬにより測定された）が見られた。
【０１３０】
実施例１０：低レベルの過酸化物および高レベルのアルカリと接触させ、続いて限外濾過によりワカメから精製されたフコイダンの発熱物質除去。
フコイダン（２．００ｇ）を、４０℃に温めながら１００ｍＬの０．５Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。１０分後、固体を遠心分離により分離し、破棄した。ガラスファイバフィルタを通して上清を濾過し、５０ｍＬのアリコートを、３時間、６０℃の１．００ｍＬの３０％ｗ／ｗ  Ｈ２Ｏ２で処理した。次いで、反応混合物を、発熱物質除去された蒸留水で１００ｍＬに希釈し、Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して５ｍＬの濃度に限外濾過した。次いで、保持液を７５ｍＬの発熱物質除去された蒸留水で洗浄し、５ｍＬに濃縮し、凍結乾燥させた。
【０１３１】
＞９９％の発熱因子の減少（ＬＡＬにより測定された）が見られた。
【０１３２】
実施例１１：低レベルの過酸化物および高レベルのアルカリと接触させ、続いて限外濾過によりエクロニア・マキシマから精製されたフコイダンの発熱物質除去。
フコイダン（８．００ｇ）を、４５℃に温めながら４００ｍＬの０．５Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。１０分後、１時間、６５℃の４．００ｍＬの３０％ｗ／ｗ  Ｈ２Ｏ２で溶液を処理した。次いで、ガラスファイバフィルタを通して、反応混合物を濾過した。濾液のｐＨを、５０％  Ｈ２ＳＯ４で１３．０から１０．５に調節し、次いで、Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して限外濾過し、２０ｍＬの容量に濃縮した。次いで、保持液を５０ｍＬの発熱物質除去された蒸留水で洗浄し、２０ｍＬに再濃縮した。５０ｍＬの洗浄および再濃縮をさらに２回繰り返した。次いで、最終濃縮された保持液を凍結乾燥させた。
【０１３３】
実施例１２：低レベルの過酸化物および高レベルのアルカリと接触させ、続いて限外濾過によりフカス・ベシクロススから精製されたフコイダンの発熱物質除去。
フコイダン（６．３ｇ）を、４５℃に温めながら３００ｍＬの０．５Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。反応混合物を６５℃に加熱し、１時間、２．００ｍＬの３０％ｗ／ｗ  Ｈ２Ｏ２で処理した。次いで、ガラスファイバフィルタを通して、反応混合物を濾過した。濾液のｐＨを、５０％  Ｈ２ＳＯ４で１１．７から１１．０に調節し、次いで、Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して限外濾過し、２０ｍＬの容量に濃縮した。次いで、保持液を５０ｍＬの発熱物質除去された蒸留水で洗浄し、２０ｍＬに再濃縮した。５０ｍＬの洗浄および再濃縮をさらに２回繰り返した。次いで、最終濃縮された保持液を凍結乾燥させた。
【０１３４】
＞９９％の発熱因子の減少（ＬＡＬにより測定された）が見られた。
【０１３５】
実施例１３：高レベルの過酸化物および高レベルのアルカリと接触させ、続いて限外濾過によりアスコフィラム・ノドサムから精製されたフコイダンの発熱物質除去。
フコイダン（１５．００ｇ）を、４０℃に温めながら７３５ｍＬの０．５Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。反応混合物を遠心分離し、Ｄｉｃａｌｉｔｅ濾過助剤を通して上清を濾過した。濾液を６０℃に加熱し、３０．０ｍＬの３０％ｗ／ｗ  Ｈ２Ｏ２で１時間処理した。次いで、ガラスファイバフィルタを通して、ｐＨ１０．０の反応混合物を濾過した。次いで、Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して濾液を限外濾過し、３０ｍＬの容量に濃縮した。次いで、保持液を５０ｍＬの発熱物質除去された蒸留水で洗浄し、３０ｍＬに再濃縮した。５０ｍＬの洗浄および再濃縮をさらに２回繰り返した。次いで、最終濃縮された保持液を凍結乾燥させた。
【０１３６】
実施例１４：低レベルの過酸化物および高レベルのアルカリと接触させ、続いて限外濾過によりアラリア・エスクレンタから精製されたフコイダンの発熱物質除去。
フコイダン（４．０ｇ）を、４０℃に温めながら２００ｍＬの０．５Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。反応混合物を遠心分離し、Ｄｉｃａｌｉｔｅ濾過助剤を通して上清を濾過した。濾液を６０℃に加熱し、５．０ｍＬの３０％ｗ／ｗ  Ｈ２Ｏ２で３０分間処理した。次いで、ガラスファイバフィルタを通して、ｐＨ１０．７の反応混合物を濾過した。次いで、Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して濾液を限外濾過し、３０ｍＬの容量に濃縮した。次いで、保持液を５０ｍＬの発熱物質除去された蒸留水で洗浄し、３０ｍＬに再濃縮した。５０ｍＬの洗浄および再濃縮をさらに２回繰り返した。次いで、最終濃縮された保持液を凍結乾燥させた。
【０１３７】
実施例１５：低レベルの過酸化物および高レベルアルカリと接触させ、続いて限外濾過によりエクロニア・ラジアタから精製されたフコイダンの発熱物質除去。
フコイダン（４．０ｇ）を、４０℃に温めながら２００ｍＬの０．５Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。反応混合物を遠心分離し、Ｄｉｃａｌｉｔｅ濾過助剤を通して上清を濾過した。濾液を６０℃に加熱し、２．０ｍＬの３０％ｗ／ｗ  Ｈ２Ｏ２で３０分間処理した。次いで、ガラスファイバフィルタを通して、ｐＨ１０．７の反応混合物を濾過した。次いで、Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して濾液を限外濾過し、３０ｍＬの容量に濃縮した。次いで、保持液を５０ｍＬの発熱物質除去された蒸留水で洗浄し、３０ｍＬに再濃縮した。５０ｍＬの洗浄および再濃縮をさらに２回繰り返した。次いで、最終濃縮された保持液を凍結乾燥させた。
【０１３８】
実施例１６：低レベルの過酸化物および高レベルのアルカリと接触させ、続いて限外濾過によりサルガッサム・フシフォルメ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）から精製されたフコイダンの発熱物質除去。
フコイダン（４．０ｇ）を、４０℃に温めながら２００ｍＬの０．５Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。反応混合物を遠心分離し、Ｄｉｃａｌｉｔｅ濾過助剤を通して上清を濾過した。濾液を７０℃に加熱し、０．７ｍＬの３０％ｗ／ｗ  Ｈ２Ｏ２で３０分間処理した。次いで、ガラスファイバフィルタを通して、反応混合物を濾過した。次いで、Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して濾液を限外濾過し、３０ｍＬの容量に濃縮した。次いで、保持液を５０ｍＬの発熱物質除去された蒸留水で洗浄し、３０ｍＬに再濃縮した。５０ｍＬの洗浄および再濃縮をさらに２回繰り返した。次いで、最終濃縮された保持液を凍結乾燥させた。
【０１３９】
実施例１７：低レベルの過酸化物および高レベルのアルカリと接触させ、続いて限外濾過によりオオウキモ（Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｙｒｉｆｅｒａ）から精製されたフコイダンの発熱物質除去。
フコイダン（２．０ｇ）を、４０℃に温めながら２００ｍＬの０．５Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。次いで、反応混合物を６５℃に加熱し、１．０ｍＬの３０％ｗ／ｗ  Ｈ２Ｏ２で３０分間処理した。次いで、ガラスファイバフィルタを通して、反応混合物を濾過した。次いで、Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して濾液を限外濾過し、３０ｍＬの容量に濃縮した。次いで、保持液を５０ｍＬの発熱物質除去された蒸留水で洗浄し、３０ｍＬに再濃縮した。５０ｍＬの洗浄および再濃縮をさらに２回繰り返した。次いで、最終濃縮された保持液を凍結乾燥させた。
【０１４０】
実施例１８：低レベルの過酸化物および高レベルのアルカリと接触させ、続いて限外濾過によりオキナワモズクから精製されたフコイダンの発熱物質除去。
フコイダン（４．０ｇ）を、４０℃に温めながら２００ｍＬの０．５Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。反応混合物を遠心分離し、ｄｉｃａｌｉｔｅ濾過助剤を通して上清を濾過した。濾液を６５℃に加熱し、２．０ｍＬの３０％ｗ／ｗ  Ｈ２Ｏ２で３０分間処理した。次いで、ガラスファイバフィルタを通して、反応混合物を濾過した。次いで、Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して濾液を限外濾過し、３０ｍＬの容量に濃縮した。次いで、保持液を５０ｍＬの発熱物質除去された蒸留水で洗浄し、３０ｍＬに再濃縮した。５０ｍＬの洗浄および再濃縮をさらに２回繰り返した。次いで、最終濃縮された保持液を凍結乾燥させた。
【０１４１】
実施例１９：低レベルの過酸化物および高レベルのアルカリと接触させ、続いて限外濾過によりアオサ種から精製されたウルバンの発熱物質除去。
ウルバン（２．０ｇ）を、５５℃に温めながら１５０ｍＬの０．５Ｍ  ＫＯＨに溶解した。濾液を６５℃に加熱し、６．０ｍＬの３０％ｗ／ｗ  Ｈ２Ｏ２で６０分間処理した。次いで、反応混合物を５０％  Ｈ２ＳＯ４でｐＨ１２．１からｐＨ７．８に中和した。次いで、Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して濾液を限外濾過し、３０ｍＬの容量に濃縮した。次いで、保持液を５０ｍＬの発熱物質除去された蒸留水で洗浄し、３０ｍＬに再濃縮した。５０ｍＬの洗浄および再濃縮をさらに３回繰り返した。次いで、０．２μｍのフィルタを通して最終濃縮保持液を濾過し、凍結乾燥させた。
【０１４２】
＞９９％の発熱因子の減少（ＬＡＬにより測定された）が見られた。
【０１４３】
実施例２０：フカス・ベシクロススから精製されたフコイダンの発熱物質除去。
出発材料は、天然炭水化物（約６０．１％〜５４．０％のフコース、３．０％のガラクトース）、硫酸塩（２７．５％）、および対イオン（７．５％）を含む、フコイダンに関して前に約９５％に精製された．凍結乾燥生成物であった。
【０１４４】
この方法に使用された全ての水は、使用前に蒸留によって精製された。全ての機器を使用前に消毒し、精製水で洗浄した。
【０１４５】
１．９９ｋｇの凍結乾燥されたフコイダン生成物を、５０倍（１００Ｌ）の０．０４Ｍ  ＫＯＨに溶解した。
【０１４６】
溶解は、最初に約１００Ｌの精製水を反応槽内に設置することにより行われた。４Ｌの５０％  ＫＯＨを精製水に添加し、溶液を６０℃に加熱した。次いで、混合しながら、固体フコイダン（１．９９ｋｇ）を添加した。全ての固体が完全に溶解されるまで、混合している間、溶液を６０℃に維持した。溶液は１１．９のｐＨに達した。
【０１４７】
０．５ＬのＨ２Ｏ２（５０％）を濾液に添加し、混合している間、溶液を１時間、６５℃に維持した。次いで、溶液のｐＨを、Ｈ２ＳＯ４（５０％ｗ／ｗ、３．３５Ｌ）で１１．９から９．５に調節した。９．８の最終ｐＨに達した。次いで、溶液を４５℃に冷却した。
【０１４８】
公称カットオフが５ｋＤａの、各々７８ｆｔ２の３つの膜（Ｋｏｃｈ，ＭＡ）を使用して、ｐＨ調節した溶液を限外濾過した。
【０１４９】
ＵＦ機器を組み立て、１００Ｌの０．０５％ｗ／ｗ  ＫＯＨの溶液、続いて、４５〜５０℃の１００Ｌの１００ｐｐｍ  ＮａＯＣｌの溶液、そして最後に１００Ｌの０．１％ｗ／ｗ  Ｈ２Ｏ２の溶液を、各々１５分間再循環することにより消毒した。次いで、機器を少なくとも２００Ｌの精製水で洗浄した。フコイダン溶液を保持液槽に添加し、保持液が元の容量の約３０％に濃縮されるまで限外濾過を行った。限外濾過ステップを通して、保持液圧は５０ｐｓｉに維持された。浸透液流朿を２．０Ｌ／分で開始し、限外濾過の終わりには１．６Ｌ／分であった。
【０１５０】
次いで、精製水を使用して（１回分１０Ｌで１２０Ｌ）、濃縮したフコイダン溶液（３０Ｌ）を透析濾過した。保持液圧は５０ｐｓｉに維持された。浸透液流朿は、７分にわたって１．５Ｌ／分に留めた。
【０１５１】
次いで、溶液を２２Ｌの最終容量まで濃縮した。
【０１５２】
次いで、濃縮物を凍結乾燥させた。合計８２０ｇの固体を回収した。
【０１５３】
プロセス収率は４１％であると計算された。９９％の発熱因子の減少（ＬＡＬにより測定された）が見られた。
【０１５４】
実施例２１：低レベルの過酸化物および高レベルのアルカリと接触させ、続いて２段階限外濾過によりフカス・ベシクロススから精製されたフコイダンの発熱物質除去および分画。
５０℃に温めながら、フコイダン（５０ｇ）を、２Ｌの１％ｗ／ｗ  Ｈ２ＳＯ４に溶解した。この温度で反応混合物を１時間攪拌した。５０％ｗ／ｗ  ＮａＯＨを添加することにより、溶液のｐＨを１．２から４．０に上げた。
【０１５５】
さらに５０ｇの固体ＮａＯＨを添加し、１０分かけて反応混合物を６５℃に加熱した。Ｈ２Ｏ２（２６ｍＬ、３０％ｗ／ｗ）を添加し、反応混合物をさらに１時間攪拌した。
【０１５６】
５０％ｗ／ｗ  Ｈ２ＳＯ４を添加することにより、溶液のｐＨを１２．０から１０．５に下げ、一晩冷却し、次いで、Ａｄｖａｎｔｅｃ  ＡＭＩ  ＵＨＰ攪拌式セルを使用して限外濾過した。
【０１５７】
３０ｋＤａ膜を使用して、最初に反応混合物を５００ｍＬに濃縮し、次いで、保持液（＞３０ｋＤａ分画）を５００ｍＬの蒸留水で洗浄し、５００ｍＬに再濃縮した。洗浄／再濃縮をさらに３回繰り返した。透過物（＜３０ｋＤａ分画）は、濃縮、続いて、４回の洗浄および再濃縮の同じ手順を受けたが、今回は、１０ｋＤａ膜を使用した。最終保持液（両方とも１０〜３０ｋＤａおよび＞３０ｋＤａ分画）を回収し、凍結乾燥させた。
【０１５８】
９８％の発熱因子の減少（ＬＡＬにより測定された）が両分画において見られた。
【０１５９】
実施例２２：低レベルの過酸化物および高レベルのアルカリと接触させ、続いて限外濾過によりワカメからのフコイダンの原位置単離、精製、および発熱物質除去。
海藻（５．０ｇ、ワカメ）を、前に５５℃に加熱された１００ｇの０．５％ｗ／ｗ  Ｈ２ＳＯ４に懸濁した。得られたｐＨ１．８の懸濁液を、５０℃で４時間攪拌し、次いで、珪藻土で覆われたセルロースフィルタを通して濾過した。次いで、１０％ｗ／ｗ  ＮａＯＨを用いて濾液のｐＨを１１．０に上げ、攪拌しながら溶液を４５℃に加熱した。この溶液に、０．５ｍＬの３０％ｗ／ｗ  Ｈ２Ｏ２を添加し、１０％ｗ／ｗ  ＮａＯＨを添加することにより、溶液のｐＨをｐＨ１０．９超に維持した。１時間後、溶液を加熱から取り外し、１０％ｗ／ｗ  Ｈ２ＳＯ４でｐＨを５．０１に下げた。次いで、５０ｍＬに濃縮し、凍結乾燥させる前に、冷却した溶液を、Ａｍｉｃｏｎ攪拌式セルを通して濾過し、保持液を５０ｍＬの発熱物質除去された蒸留水で３回洗浄した。精製された白色のフコイダンの１０．８％の単離された収率を得た。
【０１６０】
本発明はいくつかの別個の態様に関して説明され、ある特定の実施形態および／または好ましい特徴が各態様に対して開示されてきたが、様々な実施形態または優先物（ｐｒｅｆｅｒｍｅｎｔｓ）のいずれかが任意の態様と併用して実施することが可能であることが想定されることを理解されたい。さらに、任意の所与の態様の特徴は、任意の他の態様の特徴と共に実施することができる。
【０１６１】
本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるいくつかの特徴を含むが、他の特徴を含まないが、異なる実施形態の特徴の組み合わせは、当業者によって理解されるように、本発明の範囲内であり、異なる実施形態を形成することが意図される。