(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞内で増幅された目的遺伝子の発現を高める方法であって、
哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域および哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域を具備するベクターと、目的遺伝子と、下記（ａ）または（ｂ）を含む発現促進ポリヌクレオチドとを、哺乳動物細胞に同時に導入する工程を含む方法：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加され、且つ増幅された目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
上記哺乳動物複製開始領域が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、およびβ−グロビン遺伝子座の複製開始領域のいずれか１つに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記目的遺伝子と、上記ポリヌクレオチドとが、上記ベクターに含まれた状態で、哺乳動物細胞に導入することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物細胞内で増幅された目的遺伝子の発現を高めるためのキットであって、
下記（ａ）または（ｂ）を含む発現促進ポリヌクレオチドを少なくとも備えることを特徴とするキット：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加され、且つ増幅された目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項６】
哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域と哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域とを具備するベクターをさらに備える、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
上記哺乳動物複製開始領域が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、およびβ−グロビン遺伝子座の複製開始領域のいずれか１つに由来する、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
上記核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来する、請求項６または７に記載のキット。
【請求項９】
上記ベクターは目的遺伝子が挿入されるベクターであり、
上記発現促進ポリヌクレオチドは、上記ベクターに含まれていることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１０】
哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域および哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域を具備するベクターと、目的遺伝子と、下記（ａ）または（ｂ）を含む発現促進ポリヌクレオチドとが導入されてなる哺乳動物細胞：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加され、且つ増幅された目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項１１】
上記哺乳動物複製開始領域が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、およびβ−グロビン遺伝子座の複製開始領域のいずれか１つに由来する、請求項１０に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１２】
上記核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来する、請求項１０または１１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１３】
上記目的遺伝子と、上記発現促進ポリヌクレオチドとが、上記ベクターに含まれた状態で、哺乳動物細胞に導入されていることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の哺乳動物細胞を用いた、目的タンパク質を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞内で目的遺伝子を高度に増幅した際に起こる、目的遺伝子の発現抑制を回避（または軽減）し、目的遺伝子の発現を高める方法、および当該方法を行うためのキット等に関する。より具体的には、本発明者が開発した「高度遺伝子増幅系」を用いて高度に増幅した遺伝子に起こり得る発現抑制を回避（または軽減）して、増幅遺伝子を高発現させる手段に関する。また、当該方法により、目的遺伝子の発現が高められた形質転換細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者は、哺乳動物の複製開始領域（ＩＲ；Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｇｉｏｎ）と核マトリックス結合領域（ＭＡＲ； Ｍａｔｒｉｘ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ）とを持つプラスミドベクター（「ＩＲ／ＭＡＲベクター」または「ＩＲ／ＭＡＲプラスミド」という。）をヒト由来がん細胞（ＣＯＬＯ ３２０ 大腸がん細胞株、およびＨｅＬａ細胞株）にリポフェクション法で導入し、プラスミド上に存在する薬剤耐性遺伝子（ブラストサイジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）あるいはネオマイシン（Ｎｅｏｍｙｃｉｎｅ））を利用して選択するだけで、
(1)発現させるべきタンパク質をコードする遺伝子（以下、適宜「目的遺伝子」という。）の細胞内コピー数を１万コピー程度にまで増幅できること、および、
(2)目的遺伝子はＩＲ／ＭＡＲベクターに対して同一の遺伝子構築物（シス）として導入した場合であっても、別の遺伝子構築物（トランス）として導入した場合であっても、高度に増幅することができるということを見出し、上記ＩＲ／ＭＡＲベクターを用いて目的遺伝子を高度に増幅する系（「高度遺伝子増幅系」または「ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅系」という。）を完成させるに至った（例えば、特許文献１、特許文献２、非特許文献１、および非特許文献２参照を参照のこと。）。ここで、高度遺伝子増幅系（ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅系）を用いた遺伝子増幅法を、「ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法」と呼ぶ。
【０００３】
ところが、ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法によって遺伝子増幅を行った場合、増幅した領域には目的遺伝子による単純反復配列が形成される。一般的に、反復配列は、頻繁にRepeat-Induced Gene Silencing（ＲＩＧＳ）と呼ばれる現象によって、ヘテロクロマチン化が起こり、転写抑制されることが知られている。また反復配列はＲＮＡｉ系を高効率的に活性化し、ＤＮＡのメチル化を誘導することも知られている。このため、ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法によって増幅した遺伝子は、コピー数とその発現量とが必ずしも比例しない場合があった（非特許文献３を参照のこと。）。
【０００４】
遺伝子の反復配列に起因する転写抑制を解除する方法としては、例えばtrichostatin A等のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で細胞を処理する方法が知られている（非特許文献４を参照のこと。）。
【０００５】
本発明者は、上記のようなＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法における反復配列に起因する遺伝子発現抑制の問題点を解決する手段を見出した（特許文献３を参照のこと。）。特許文献３には、(a)ＩＲ／ＭＡＲベクターおよび目的遺伝子を哺乳動物細胞に導入する際に、λ−ファージＤＮＡ等の１０ｋｂｐ以上のポリヌクレオチド、またはインシュレーター配列を含むポリヌクレオチドをコトランスフェクションする、(b)ＩＲ／ＭＡＲベクターおよび目的遺伝子が導入された哺乳動物細胞を、漸増濃度の薬剤を含有する培地で培養して選抜する、(c)目的遺伝子の発現を誘導するプロモーター活性を、転写活性化因子を用いて向上させる、(d)ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法を用いて増幅した遺伝子領域を、Cre-LoxP Systemで染色体外に切り出す、(e)ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法により遺伝子増幅が起こった細胞を5-aza-2’-deoxycytidineで処理を行ないＤＮＡのメチル化のレベルを低下させる、(f)ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法による遺伝子増幅がダブルマイニュート染色体上で起こっている上記哺乳動物細胞を選択するという手段が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−２４５０８３号公報（公開日：平成１５（２００３）年９月２日）
【特許文献２】特開２００４−３３７０６６号公報（公開日：平成１６（２００４）年１２月２日）
【特許文献３】国際公開第２００６／０５４５６１号パンフレット（国際公開日：２００６年５月２６日）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Noriaki Shimizu, et al. (2001) Plasmids with a Mammalian Replication Origin and a Matrix Attachment Region Initiate the Event Similar to Gene Amplification. Cancer Research vol.61, no.19, p6987-6990.
【非特許文献２】Noriaki Shimizu, et al (2003) Amplification of plasmids containing a mammalian replication initiation region is mediated by controllable conflict between replication and transcription. Cancer Research, vol.63, no.17, p5281-5290.
【非特許文献３】Shimizu, N., Hanada, N., Utani, K., and Sekiguchi, N. (2007). Interconversion of intra- and extra-chromosomal sites of gene amplification by modulation of gene expression and DNA methylation. Journal of cellular biochemistry 102, 515-529.
【非特許文献４】McBurney, M. W. et al, Exp Cell Res (2002), vol 274, p1-8
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記のようなＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法における反復配列に起因する遺伝子発現抑制の問題点を解決し得る、新たな手段を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者はＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法においてコピー数が増えても反復配列のために発現抑制されるという独自の問題点を解決するために、ＩＲ／ＭＡＲ配列を持って自発的に遺伝子増幅し得るプラスミド（ＩＲ／ＭＡＲベクター）をベクターとして用いた独自のスクリーニング方法によって検討した結果、ヒトの第２番染色体短腕１６．１の遺伝子密度の低い領域に由来する３，２７１（ｂｐ）のヒトゲノム断片（以下、「Ｂ−３−３１」という。）を見出すことに成功し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は以下の発明を包含する。
【００１０】
本発明は、哺乳動物細胞内で増幅された目的遺伝子の発現を高める方法であって、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域および哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域を具備するベクターと、目的遺伝子と、下記（ａ）または（ｂ）を含む発現促進ポリヌクレオチドとを、哺乳動物細胞に同時に導入する工程を含む方法である：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加され、且つ増幅された目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
【００１１】
また、本発明において、上記哺乳動物複製開始領域が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、およびβ−グロビン遺伝子座の複製開始領域のいずれか１つに由来するものであってもよい。
【００１２】
また、本発明において、上記核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来するものであってもよい。
【００１３】
また、本発明は、上記目的遺伝子と、上記ポリヌクレオチドとが、上記ベクターに含まれた状態で、哺乳動物細胞に導入することを特徴とする方法であってもよい。
【００１４】
また、本発明は、哺乳動物細胞内で増幅された目的遺伝子の発現を高めるためのキットであって、下記（ａ）または（ｂ）を含む発現促進ポリヌクレオチドを少なくとも備えることを特徴とするキットである：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加され、且つ増幅された目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
【００１５】
本発明のキットは、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域と哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域とを具備するベクターをさらに備えていてもよい。
【００１６】
また本発明のキットにおいて、上記哺乳動物複製開始領域が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、およびβ−グロビン遺伝子座の複製開始領域のいずれか１つに由来するものであってもよい。
【００１７】
また本発明のキットにおいて、上記核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来するものであってもよい。
【００１８】
また本発明のキットにおいて、上記ベクターは目的遺伝子が挿入されるベクターであり、上記発現促進ポリヌクレオチドは、上記ベクターに含まれていてもよい。
【００１９】
また本発明は、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域および哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域を具備するベクターと、目的遺伝子と、下記（ａ）または（ｂ）を含む発現促進ポリヌクレオチドとが導入されてなる哺乳動物細胞である：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加され、且つ増幅された目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
【００２０】
また本発明の哺乳動物細胞において、上記哺乳動物複製開始領域が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、およびβ−グロビン遺伝子座の複製開始領域のいずれか１つに由来するものであってもよい。
【００２１】
また本発明の哺乳動物細胞において、上記核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来するものであってもよい。
【００２２】
また本発明の哺乳動物細胞において、上記目的遺伝子と、上記発現促進ポリヌクレオチドとが、上記ベクターに含まれた状態で、哺乳動物細胞に導入されていてもよい。
【００２３】
また本発明は、上記本発明の哺乳動物細胞を用いた、目的タンパク質を生産する方法をも包含する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法によって形成される目的遺伝子の反復配列に起因する遺伝子発現抑制の問題点を解決することができ、所望のタンパク質を高発現させることが可能となるという効果を奏する。それゆえ本発明によれば、遺伝子増幅の手法により、有用タンパク質を大量に生産する系を樹立することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】Ｂ−３−３１の塩基配列（３，２７１ｂｐ、配列番号１）を示す図である。
【図２】本発明の実施例において使用した各種プラスミドの構築手順を示す模式図である。
【図３】本発明の実施例において使用したプラスミドp△BM d2EGFP-Asc Ｉの構築手順を示す模式図である。
【図４】本発明の実施例において使用した大腸菌１次ゲノムライブラリーのプラスミドの構築手順を示す模式図である。
【図５】LibraryB-3 3926 31 3.0 kbpが導入されたＣＨＯ  ＤＧ４４細胞およびコントロールのベクターＤＮＡが導入されたＣＨＯ  ＤＧ４４細胞のそれぞれのＧＦＰ発現強度を示すヒストグラムを重ねて表示したものであり、（ａ）（ｃ）（ｅ）はLibraryB-3 3926 31 3.0 kbpが導入されたＣＨＯ  ＤＧ４４細胞のＧＦＰ発現強度を示すヒストグラムを前面に表示した場合、（ｂ）（ｄ）（ｆ）はコントロールのベクターＤＮＡが導入されたＣＨＯ  ＤＧ４４細胞のＧＦＰ発現強度を示すヒストグラムを前面に表示した場合である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
＜１．哺乳動物細胞内で増幅された目的遺伝子の発現を高める方法＞
本発明の一実施形態は、哺乳動物細胞内で増幅された目的遺伝子の発現を高める方法（以下、適宜「本発明の方法」という。）に関する。本発明の方法は、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域および哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域を具備するベクターと、目的遺伝子と、下記（ａ）または（ｂ）を含む発現促進ポリヌクレオチドとを、哺乳動物細胞に同時に導入する工程を含むことを特徴としている。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加され、且つ増幅された目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。特に、本発明は培養細胞等を用いたEx vivoの系において好ましく実施され得る。
【００２７】
（１−１）発現促進ポリヌクレオチド
本発明の方法は、ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法によって目的遺伝子が高度に増幅されたにもかかわらず、目的遺伝子の発現量が必ずしも比例しない場合があるという課題を解決するための方法である。換言すれば、ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法において、目的遺伝子の発現量を向上するための方法である。上記の課題は、ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法によって目的遺伝子の反復配列が生じ、これに起因して目的遺伝子の発現抑制が起こると考えられた。本発明者が考案した独自のスクリーニング方法によりスクリーニングを行った結果、ヒトゲノムから目的遺伝子の発現を高める活性を備えるポリヌクレオチド「Ｂ−３−３１」を見出すことに成功した。本発明の方法は、当該Ｂ−３−３１を発現促進ポリヌクレオチドとして利用する。「発現促進ポリヌクレオチド」とは、増幅された目的遺伝子の発現を高める活性（「発現促進活性」ともいう。）を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００２８】
Ｂ−３−３１は、配列番号１に示される塩基配列からなる。よって本発明の方法において使用する発現促進ポリヌクレオチドの一実施形態としては、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものであるといえる。ただし、本発明の方法に使用する発現促進ポリヌクレオチドはこれに限定されるものではなく、増幅された目的遺伝子の発現を高める活性（「発現促進活性」ともいう。）を有するポリヌクレオチドであれば、配列番号１に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド（すなわち「変異ポリヌクレオチド」。）であってもよい。上記「数個」とは、例えば３０個以下、好ましくは１５個以下、より好ましくは１０個以下、最も好ましくは５個以下の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。
【００２９】
また配列番号１に示されている塩基配列を、クエリーとしてＢＬＡＳＴＮ  ２．２．１などの相同検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋやＥＭＢＬ、ＤＤＢＪなどのデータベースに対して相同検索を行うことで得られた塩基配列からなるポリヌクレオチドを、本発明の方法において発現促進ポリヌクレオチドとして利用することは可能である。上記の変異ポリヌクレオチドまたは相同検索を行うことで得られたポリヌクレオチドと、配列番号１に示されるポリヌクレオチドとの相同性は、例えば、９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がさらに好ましく、９９％以上が最も好ましい。
【００３０】
Ｂ−３−３１は、ヒトゲノムから見いだされたポリヌクレオチドであるが、本発明の方法に用いられ得る発現促進ポリヌクレオチドとしては、発現促進活性を有しているポリヌクレオチドであれば、ヒト由来に限定されるものではなく、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウシ、ブタ、等の哺乳動物細胞由来であってもよい。
【００３１】
なお、あるポリヌクレオチドが発現促進活性（増幅された目的遺伝子の発現を高める活性）を有しているか否かは、当該ポリヌクレオチドをＰＣＲや化学合成等公知の手段を用いて取得し、これを後述する実施例において検討したように、ＩＲ／ＭＡＲベクター、目的遺伝子（実施例の場合はＥＧＦＰ遺伝子（Enhanced Green Fluorescent Protein遺伝子））、および当該ポリヌクレオチドを、哺乳動物細胞（実施例の場合はＣＨＯ  ＤＧ４４細胞）に導入した場合の目的遺伝子の発現量と、当該ポリヌクレオチドを導入せずＩＲ／ＭＡＲベクターおよび目的遺伝子を導入した場合の目的遺伝子の発現量とを比較し、前者の発現量よりも後者の発現量が上回っていた場合に、当該ポリヌクレオチドが発現促進活性を有していると判断できる。
【００３２】
本発明の方法に用いられる発現促進ポリヌクレオチドとしては、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドやその変異ポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが用いられ得る。なお、当該ポリヌクレオチドが発現促進活性を有していることは言うまでもない。
【００３３】
上記「ストリンジェントな条件」とは、相同性が少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上の時にハイブリダイゼーションが起こる得る条件を意味する。上記ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、また塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（つまりハイブリダイズし難くなる）。例えば、４２℃、６×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ  サケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト液（ただし、１×ＳＳＰＥ；０．１８Ｍ  塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭ  ＥＤＴＡ。５×デンハルト液；０．１％  牛血清アルブミン、０．１％  フィコール、０．１％  ポリビニルピロリドン）が、ストリンジェントな条件の一例として挙げられる。
【００３４】
さらに本発明の方法に用いられる発現促進ポリヌクレオチドとしては、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドやその変異ポリヌクレオチドの全長のポリヌクレオチドのみならず、これらのポリヌクレオチド断片が利用され得る。本発明の方法に利用するに当たり、当該ポリヌクレオチド断片が発現促進活性を有していることは言うまでもない。ポリヌクレオチド断片が発現促進活性を備えているか否かは、配列番号１にかかるポリヌクレオチドやその変異ポリヌクレオチドの断片を調製し、上述の実験により当該ポリヌクレオチド断片が発現促進活性を有しているかどうか確認すればよい。なお、本発明者の解析によれば、Ｂ−３−３１には、Stress-Induced Duplex Destabilization （ＳＩＤＤ）とinverted repeatとが隣接して存在する。このような領域は、ＭＡＲ活性を示す可能性が示唆されている。よって、この領域を少なくとも含むポリヌクレオチドであれば発現促進活性を有している可能性があると判断できる。
【００３５】
本発明の方法に用いられる発現促進ポリヌクレオチドを構成するポリヌクレオチドの鎖長は特に限定されるものではないが、特許文献３が１０ｋｂｐ以上のポリヌクレオチドを用いることを規定している為、これとの差別化のためには、上限として１０ｋｂｐ未満であるとことが好ましい。また発現促進ポリヌクレオチドを構成するポリヌクレオチドの鎖長の下限としては、発現促進活性を有する最小限の鎖長ということができる。
【００３６】
なお、本発明の方法に用いられる発現促進ポリヌクレオチドにかかるポリヌクレオチドは、その５’側または３’側には、クローニングのためのリンカーＤＮＡや、マルチクローニングサイト等の制限酵素サイトにかかる塩基配列などが付加されていてもよい。
【００３７】
（１−２）ＩＲ／ＭＡＲベクターおよび目的遺伝子
本発明にかかる方法は、上述の発現促進ポリヌクレオチドとともに、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域および哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域を具備するベクター（「ＩＲ／ＭＡＲベクター」という。）と、目的遺伝子とを、哺乳動物細胞に同時に導入する工程を含む方法である。
【００３８】
上記複製開始領域（ＩＲ）としては哺乳動物細胞内で機能するものであれば特に限定されるものではなく、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（以下、適宜「ＤＨＦＲ」という。）遺伝子座、β−グロビン遺伝子座等の複製開始領域が挙げられる。なおｃ−ｍｙｃ遺伝子座の複製開始領域については、例えば「McWhinney, C. et al., Nucleic Acids Res. vol. 18, p1233-1242 (1990) 」に記載されている。ＤＨＦＲ遺伝子座の複製開始領域については、例えば「Dijkwel, P.A. et al., Mol. Cell. Biol. vol.8, p5398-5409 (1988) 」に記載されている。β−グロビン遺伝子座の複製開始領域については、例えば「Aladjem, M. et al., Science vol. 281, p1005-1009 (1998) 」に記載されている。
【００３９】
また核マトリックス結合領域（ＭＡＲ）としては、哺乳動物細胞内で機能するものであれば特に限定されるものではなく、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子座等の核マトリックス結合領域に由来する配列が挙げられる。なお、Ｉｇκ遺伝子座の核マトリックス結合領域については、例えば「Tsutsui, K. et al., J. Biol. Chem. vol. 268, p12886-12894 (1993) 」に記載されている。ＳＶ４０初期領域の核マトリックス結合領域については、例えば「Pommier, Y. et al., J. Virol., vol 64, p419-423 (1990) 」に記載されている。ＤＨＦＲ遺伝子座の核マトリックス結合領域については、例えば「Shimizu N. et al., Cancer Res. vol. 61, p6987-6990 」に記載されている。
【００４０】
本発明の方法において利用されるＩＲ／ＭＡＲベクターには、ＩＲおよびＭＡＲの他、適宜目的に応じて、大腸菌内でクローニングを行なうために必要な配列、あるいは、マーカータンパク質として薬剤耐性遺伝子(ブラストサイジン抵抗性遺伝子、ネオマイシン抵抗性遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子、等)またはＥＧＦＰ遺伝子等の蛍光タンパク質遺伝子等を選択マーカーとして有してもよい。これらの選択マーカーを指標としてＩＲ／ＭＡＲベクターが導入された細胞を選別できる。
【００４１】
一方、本発明の方法において利用される「目的遺伝子」とは、発現させるべきタンパク質（「目的タンパク質」という。）をコードするポリヌクレオチドのことである。よって、目的遺伝子は、特に限定されるものではなく、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを適宜選択の上、採用すればよい。当該ポリヌクレオチドは、その塩基配列情報を元にＰＣＲ等の公知の技術を用いて取得すればよい。
【００４２】
目的遺伝子は、プロモーターに制御可能に連結されていることが好ましい。上記プロモーターは、導入される哺乳動物細胞において機能するものであれば特に限定されるものではなく、転写因子等による所定の操作によって、プロモーターの転写活性が活性化または不活性化されるプロモーター（「転写活性調節型プロモーター」という。）であっても、恒常的に転写活性が活性化されている恒常型プロモーターであってもよい。「転写活性調節型プロモーター」は、上記特性を有するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、ＴＲＥプロモーター（クロンテック社製）、Ｔ−ＲＥＸプロモーター（インビトロジェン社製）等の市販品が本発明にかかる方法において利用可能である。恒常型プロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期領域由来プロモーター（ＳＶ４０プロモーター）、SRalphaプロモーター（ＳＲαプロモーター）、ＬＴＲプロモーター、ＭＭＴＶプロモーター等が利用可能である。
【００４３】
目的遺伝子は、その他、ターミネーター等目的遺伝子の発現に必要なポリヌクレオチドや、制限酵素サイトや薬剤耐性遺伝子等のクローニングに必要なポリヌクレオチドが含まれていてもよい。
【００４４】
（１−３）導入工程
本発明にかかる方法は、ＩＲ／ＭＡＲベクターと、目的遺伝子と、発現促進ポリヌクレオチドとを、哺乳動物細胞に同時に導入する工程（「導入工程」という。）を含む方法である。
【００４５】
ここで、上記哺乳動物細胞としては、特に限定されるものではなく、各種哺乳動物由来の細胞（例えば、各種哺乳動物由来の培養細胞）が本発明において利用され得る。例えば、チャイニーズハムスター由来のＣＨＯ細胞や、各種腫瘍細胞等が挙げられる。ＣＨＯ細胞としては、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ATCC CCL-61、RIKEN RCB0285、RIKEN RCB0403等）や、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞は、現在、医薬等の有用タンパク質の実生産に用いられており、安全性が確認されている細胞であり、本発明の方法が適用される哺乳動物細胞としては好ましい。ただし、遺伝子増幅効率が高いという点では、無限増殖能を有する腫瘍細胞が好ましい。上記腫瘍細胞としては、例えば、ＨｅＬａ細胞（入手先：例えば、ATCC CCL-2、ATCC CCL-2.2、RIKEN RCB0007、RIKEN RCB0191等）、ヒト大腸がんCOLO 320DM細胞（入手先：例えば、ATCC CCL-220）、ヒト大腸がんCOLO 320HSR細胞（入手先：例えば、ATCC CCL-220.1）、ＮＳ０細胞（入手先：例えば、RIKEN RCB0213）等が挙げられる。なおヒト大腸がんCOLO 320DM細胞については、「Shimizu, N., Kanda, T., and Wahl, G. M. Selective capture of acentricfragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat. Genet., 12: 65−71, 1996.」を参照のこと。
【００４６】
なお、導入工程は、ＩＲ／ＭＡＲベクターと、目的遺伝子と、発現促進ポリヌクレオチドとが同時に哺乳動物細胞へ導入される態様であれば特に限定されるものではなく、ＩＲ／ＭＡＲベクターに、目的遺伝子と発現促進ポリヌクレオチドと挿入して同一の遺伝子構築物として導入してもよいし、それぞれが別体の遺伝子構築物として導入してもよい。また上記３つエレメントの内の２つのエレメントが同一の遺伝子構築物で、残り一つのエレメントが別体の遺伝子構築物として導入してもよい。遺伝子構築物の形態については、プラスミドであってもコスミドであってもよい。なお実施例では、全てのエレメントが同一の遺伝子構築物として導入された場合の結果のみが示されているが、各エレメントがそれぞれ別体の遺伝子構築物として導入しても遺伝子増幅が起こる点については、ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法の特徴点として知られている事実である（例えば、特許文献１等を参照のこと）。よって、実施例において実験するまでもなく、当業者であれば、各エレメントがそれぞれ別体の遺伝子構築物として導入しても本発明の方法の効果が得られることを理解する。
【００４７】
本発明の方法における導入工程は、特に限定されるものではなく、リポフェクション、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等公知の方法を適宜選択の上、利用可能である。またその詳細な条件については、導入される哺乳動物や、各エレメント等に応じて適宜最適な条件を検討の上、採用すればよい。
【００４８】
（１−４）その他の工程
なお本発明にかかる方法には、上記導入工程の他に、目的遺伝子とベクターと発現促進ポリヌクレオチドとが導入された哺乳動物細胞を分離する工程（以下、「選抜工程」という）や、当該選抜工程によって選抜された哺乳動物細胞（すなわち形質転換細胞）を培養する培養工程（以下、「培養工程」という）が含まれていてもよい。また、上記培養工程によって生産された目的タンパク質を精製する方法（以下、「精製工程」という）が含まれていてもよい。すなわち本発明は、目的遺伝子とベクターと発現促進ポリヌクレオチドとが導入された哺乳動物細胞を用いた目的タンパク質を生産する方法をも包含する。
【００４９】
上記「選抜工程」は、目的遺伝子とベクターと発現促進ポリヌクレオチドとが導入された哺乳動物細胞を分離する工程である。より詳細には、選抜工程は、目的遺伝子とベクターと発現促進ポリヌクレオチドとが導入されていない哺乳動物細胞、および目的遺伝子とベクターと発現促進ポリヌクレオチドとが導入された哺乳動物細胞が含まれる細胞の多クローン性集団から後者の細胞を選抜する工程である。かかる選抜工程によって、哺乳動物細胞に導入された目的遺伝子を高発現し得る哺乳動物細胞を選抜することができる。
【００５０】
上記選抜工程の具体的方法は特に限定されるものではないが、例えば、目的遺伝子とベクターと発現促進ポリヌクレオチドとを哺乳動物細胞へ導入する際に用いた遺伝子構築物に薬剤耐性遺伝子が含まれている場合、その薬剤耐性を利用して目的遺伝子とベクターと発現促進ポリヌクレオチドとが導入された哺乳動物細胞を選抜すればよい。また、ＰＣＲ法やサザンブロット法によって、哺乳動物細胞に含まれる目的遺伝子、ＩＲ／ＭＡＲベクター、または発現促進ポリヌクレオチド由来のポリヌクレオチドを検出することによっても選抜工程を行い得る。上記薬剤耐性、ＰＣＲ法、サザンブロット法の具体的な方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法が適宜利用され得る。
【００５１】
上記「培養工程」は、上記選抜工程によって既に選抜された哺乳動物細胞を培養する工程である。かかる培養工程によって、目的遺伝子を哺乳動物細胞において高発現させることができる。上記培養工程の具体的方法は特に限定されるものではなく、培養する哺乳動物細胞に最適な条件を検討の上、適宜採用すればよい。
【００５２】
上記「精製工程」は、上記培養工程によって生産された目的タンパク質を精製する方法である。本精製工程におけるタンパク質精製の具体的方法としては、例えば、哺乳動物細胞をＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）等の緩衝溶液に懸濁した後、ホモジェナイザーまたは超音波等で細胞を破砕し、遠心分離をして上清を回収する。上記緩衝溶液には、タンパク質の可溶化を促進するための界面活性剤や、タンパク質の立体構造を安定化するための還元剤、タンパク質の分解を防止するためのプロテアーゼインヒビターを適宜添加することもできる。上記界面活性剤としては、CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio-1-propanesulfonate]、Triton X-100、Nikkol、ｎ−オクチルグリコシド等を利用することができる。また、上記還元剤としては、ＤＴＴ（dithiothreitol）、ＤＥＴ（dithioerythritol）等を利用することができる。また、上記プロテアーゼインヒビターとしては、アプロチニンや、ロイペプチンを利用することができる。
【００５３】
上記上清から、目的タンパク質をアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過クロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィーを用いて、精製することができる。また、精製されたタンパク質溶液を適当な緩衝液に透析することで不要な塩を除去することもできる。上記のタンパク質の精製工程は、タンパク質の分解を抑えるために低温条件下で行われることが好ましい。特に４℃下で精製工程が行われることが好ましい。なお、上記精製工程の具体的方法は、この限りではなく、公知の方法を適宜利用され得る。
【００５４】
＜２．哺乳動物細胞内で増幅された目的遺伝子の発現を高めるためのキット＞
上述した発現促進ポリヌクレオチドを少なくとも含むことで、哺乳動物細胞内で増幅された目的遺伝子の発現を高めるためのキット（「本発明のキット」という。）を構成することができる。本発明のキットによれば、ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法によって高度に増幅された目的遺伝子の発現量を高めることができる。発現促進ポリヌクレオチドに関する説明については、前項の説明を援用する。なお、本発明に係るキットは、遺伝子増幅によって生じた反復配列が原因で起こる発現抑制を回避または軽減することによって、目的遺伝子の発現を高めることを原理としている為、ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法のみならず、他の遺伝子増幅法においても奏功する可能性が有る。
【００５５】
本発明のキットは、特にＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法に好ましく適用され得るため、本発明のキットには、発現促進ポリヌクレオチドに加え、ＩＲ／ＭＡＲベクターが含まれていてもよい。ＩＲ／ＭＡＲベクターの説明については、前項の説明を援用する。
【００５６】
目的遺伝子としては、本発明のキットの使用者が適宜選択し得る為、本発明のキットには目的遺伝子は含まれていなくてもよい。ただし、試行用の目的遺伝子サンプルとして、ＥＧＦＰ遺伝子等の公知のタンパク質をコードする遺伝子が含まれていてもよい。
【００５７】
本発明のキットにＩＲ／ＭＡＲベクターが含まれている場合、ＩＲ／ＭＡＲベクター上には発現促進ポリヌクレオチドが挿入されていてもよいし、ＩＲ／ＭＡＲベクターと発現促進ポリヌクレオチドとが別体となっていてもよい。
【００５８】
本発明のキットには、形質転換に必要な機器や試薬、宿主となる哺乳動物細胞、その他取扱説明書などがさらに含まれていてもよい。
【００５９】
＜３．本発明の哺乳動物細胞＞
本発明は、ＩＲ／ＭＡＲベクターと、目的遺伝子と、発現促進ポリヌクレオチドとが導入されてなる哺乳動物細胞をも包含する。当該哺乳動物細胞は、本発明の方法が施された哺乳動物細胞の形質転換体であり、高度に増幅された目的遺伝子が高発現し得る細胞である。当該哺乳動物細胞を培養することによって、目的タンパク質を大量に生産することが可能となる。ＩＲ／ＭＡＲベクター、目的遺伝子、発現促進ポリヌクレオチド、哺乳動物細胞等の説明については、前項の説明を援用する。
【００６０】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００６１】
＜１．方法＞
（１）プラスミドの構築
本実施例に用いたプラスミド名と構築法を示す。全てのプラスミドは、HighPure Plasmid Midiprep Kit（Invitrogen社）を用いて、推奨されるプロトコルに従って精製されたものが使用された。
【００６２】
（１−１）pSFVdhfr、pSFV-V、pSFV-V △BN 
pSFVdhfr（１０，９８６ｂｐ、図２参照のこと。）はJohn Kolman博士とGeoffrey M.Wahl博士（The Salk Institute, CA）から供与された。このプラスミドは、チャイニーズハムスターＤＨＦＲ遺伝子座由来の４．６ｋｂｐのＩＲを持つ。このＩＲはＤＨＦＲ遺伝子座内で優先的に複製が開始するOriβ領域に由来する（参考文献：Altman, A.L., and Fanning, E. (2001). Molecular and cellular biology21, 1098-1110.、およびPelizon, C., Diviacco, S., Falaschi, A., and Giacca, M. (1996). Molecular and cellular biology 16, 5358-5364.）。また上記ＩＲは、その中にＭＡＲ活性を示す配列が存在する（参考文献：Shimizu, N., Miura, Y., Sakamoto, Y., and Tsutsui, K. (2001). Cancer research 61, 6987-6990.）。このプラスミドは、ブラストサイジン抵抗性遺伝子（ＢＳＲ）およびヒグロマイシン抵抗性遺伝子（Ｈｙｇ）の２つの薬剤耐性遺伝子を持つ。
【００６３】
pSFVdhfrからＤＨＦＲ遺伝子由来の配列をＮｏｔＩ消化により除いたものがpSFV-V（６，３３５ｂｐ、図２参照のこと。）である。また、pSFV-VからＨｙｇ領域をＢａｍＨＩおよびＮｒｕＩ切断により除いて構築したプラスミドがpSFV-V △BN（４，０８３ｂｐ、図２参照のこと。）である。
【００６４】
（１−２）p△BM-MCS
p△BM-MCSは、以下のようにして構築された（参考文献：Harada, S., Uchida, M., and Shimizu, N. (2009).J Biol Chem 284, 24320-24327.、図２参照のこと。）。
【００６５】
すなわち、pSFVdhfrをＢａｍＨＩおよびＭｌｕＩで切断することでＨｙｇ遺伝子領域を除き、この位置に合成マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）２本鎖ＤＮＡをコヒーシブエンドライゲーションで挿入することにより、p△BM-MCS（８，８２４ｂｐ）が構築された。ＭＣＳの配列は、ＩＲ／ＭＡＲ下流よりＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ−ＡｓｃＩ−ＳａｌＩ−ＳｗａＩ−ＡｓｉｓＩ−ＳｂｆＩ−ＢａｍＨＩ−ＭｌｕＩと続く６２ｂｐの配列からなる。
【００６６】
（１−３）p△BM-d2EGFP
p△BM-d2EGFPは以下のようにして、構築された（参考文献：Harada, S., Uchida, M., and Shimizu, N. (2009).J Biol Chem 284, 24320-24327.、図２参照のこと。）。
【００６７】
まずp△BM-MCSをそのＭＣＳ内に存在するＡｓｃＩおよびＡｓｉｓＩで切断した。一方で、pCMV-d2EGFP（Clontech社）のd2EGFP発現カセット部分をＰｖｕＩおよびＢｓｓＨＩＩで切り出した。ＡｓｃＩとＰｖｕＩ、ＡｓｉｓＩとＢｓｓＨＩＩ断片とは、それぞれコヒーシブである。そこで、d2EGFP 発現カセットをp△BM-MCS内にコヒーシブエンドライゲーションにより挿入することで、p△BM-d2EGFP（１１，１６９ｂｐ）が構築された。
【００６８】
（１−４）p△BM d2EGFP-Asc Ｉ
p△BM d2EGFP-Asc Ｉは、以下のようにして構築された（図３を参照のこと。）。
【００６９】
まずp△BM d2EGFPをそのＭＣＳ内に存在するＭｌｕＩで切断した。この直鎖状ＤＮＡと、図３に示す合成リンカーＤＮＡ（センス鎖：配列番号２およびアンチセンス鎖：配列番号３）とを、In-Fusion（登録商標）酵素（タカラバイオ株式会社）で連結することにより、p△BM d2EGFP-Asc Ｉ（１１，２１３ｂｐ）は構築された。ここで用いられた合成リンカーは、中央にＡｓｃＩサイトを持ち、その両端に、ヒトゲノム断片の両端に付与した配列と同じ１５塩基配列、ＭｌｕＩサイト、およびｐ△BM d2EGFPをＭｌｕＩで切断した両末端の塩基配列からなる。
【００７０】
（２）動物細胞株と、その培養方法
（２−１）COLO320DM細胞株：神経内分泌細胞由来ヒト大腸がん細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２０）。COLO 320DM細胞は、がん遺伝子ｃ−ｍｙｃを含む単一の増幅単位が、ＤＭの形態で、約６２倍に増幅した細胞である。増幅遺伝子は分裂期中期染色体標本中に見られる平均して43.6±27.6個のＤＭ上に位置している（参考文献：Alitalo, K., Schwab, M., Lin, C.C., Varmus, H., and Bishop, J.M. (1983). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80, 1701-1711.、およびShimizu, N., Kanda, T., and Wahl, G.M. (1996). Nat Genet 12, 65-71.）。
【００７１】
この細胞株の培養にはＣＯ２インキュベーター（MCO-17AIC、三洋電機株式会社製）を用い、培養温度は３７℃、ＣＯ２濃度は５％（ｖ/ｖ）に設定した。培養液にはRPMI 1640 培地（日水製薬製）を用い、規定通り溶解後オートクレーブ滅菌（１２０℃、１５分）を行った。その後、炭酸水素ナトリウム（ナカライテスク株式会社）を適量加え、Ｌ−グルタミン（片山化学工業株式会社）を０．０３％（ｗ/ｖ）、ＦＣＳ（Fetal Calf Serum；Euroclone社）を１０％（ｗ/ｖ）となるように加えて使用した。約３日ごとに継代培養を行った。
【００７２】
（２−２）ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞株：ＣＨＯはChinese Hamster Ovaryの略でチャイニーズハムスターの卵巣から樹立された正常不死化線維芽細胞株である。ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞は、ガンマ線を使用した突然変異誘導でｄｈｆｒ遺伝子座を完全に除去したＣＨＯ細胞である（参考文献：Urlaub, G., and Chasin, L.A. (1980). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 77, 4216-4220.）。Dhfr（ジヒドロ葉酸還元酵素；dihydrofolate reductase）はグリシン、プリン、チミジル酸の合成のための必須酵素である。この細胞株の細胞培養にはＣＯ２インキュベーター（MCO-17AIC、三洋電機株式会社製）を用い、培養温度は３７℃、ＣＯ２濃度は５％（ｖ/ｖ）に設定した。培養液にはHam’s F-12培地（和光純薬工業株式会社製）を用いた。ＦＣＳを１０％（ｗ/ｖ）となるように加えて使用した。細胞の継代は、ＰＢＳ（日水製薬製）とTrypLEＴＭ Express（Life Technologies Corporation）を用いて約３日ごとに行われた。
【００７３】
（３）１次ゲノムライブラリーの構築
ベクタープラスミドｐ△BM d2EGFP-Asc Iに、ランダムに断片化したヒトゲノムＤＮＡを挿入することで、１次ゲノムライブラリーを構築した。以下にその工程を記す。
【００７４】
（３−１）ヒトゲノムＤＮＡの抽出
対数増殖期のヒトCOLO 320 DM細胞培養液を５０ｍＬ遠心管（住友ベークライト社製）に移し、遠心分離を行った（ＴＳローター、１，０００ｒｐｍ、５分間、室温、トミー精工LC06-SSｐ遠心機、以下同じ。）。上清を除いた後、ＰＢＳ（−）５０ｍＬで再懸濁し、遠心分離を行うという遠心洗浄を２回繰り返した。１０ｍＬのＤＮＡ lysis buffer（５０ｍＭ Tris-Cl, pH 8.0、1 mM EDTA-Na, pH8.0、0.5 % SDS）を、細胞の沈殿に加えて穏やかに混合した。続いて、RNase A （シグマ−アルドリッチ社）を１００μｇ／ｍＬの濃度で３７℃、１時間処理することによりＲＮＡを消化した後、Proteinase K （シグマ−アルドリッチ社）を１００μｇ／ｍＬの濃度で５０℃、一晩処理した。その溶液を１時間以上かけてフェノール処理し、フェノール／クロロホルム処理を２回（１時間および３０分間）行った後、エタノール沈殿法によってＤＮＡを回収した。これにＴＥを１ｍＬ加え、ＤＮＡ塊が融解するまで５０℃で加温し、融解後４℃で保存した。
【００７５】
（３−２）ヒトゲノムＤＮＡの断片化
ヒトゲノム断片をベクタープラスミドに組み込むため、予めヒトゲノムＤＮＡを超音波処理により、ランダムに１，０００〜３，０００ｂｐ程度に断片化した。
【００７６】
まず、ヒトCOLO 320DM細胞から抽出したＤＮＡをＴＥで希釈し、液量５００μＬ、濃度１００μｇ/ｍＬに調製した。これをEpiShearＴＭ Probe Sonicator （ACTIV MOTIF社）を用いて、１，０００〜３，０００ｂｐのＤＮＡ断片が最も多く得られる条件（Duty＝３０、Output＝２、１５秒間）で超音波処理を行った。
【００７７】
（３−３）Polyethylene Glycol（ＰＥＧ）沈殿
高分子量のポリエチレングリコールを添加して遠心すると、短いＤＮＡは沈殿せずに長いＤＮＡのみを沈殿させることが出来る。前項で断片化したＤＮＡ５０μgをＴＥに溶かし全量を２００μＬとした。これに２０％（ｗ/ｖ）のＰＥＧ８０００（Powder Molecular Biology Grade, Promega社）／３０ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液１００μＬを混ぜ（終濃度約６．７％  ＰＥＧ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、ボルテックスミキサーにかけた。その後、ただちに１５，０００ｒｐｍ、室温、１０分間、遠心分離を行い、上清を除いた。７０％（ｖ/ｖ）エタノールを３００μＬ加え、１５，０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離を行い、上清を除いてドライアップした後、２０μＬの超純水に溶かした。この操作により約６００ｂｐ以下のサイズのヒトゲノム断片を除いた。
【００７８】
（３−４）ＤＮＡ末端の平滑化
ランダムに断片化されたヒトゲノムＤＮＡの末端を、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持つKOD DNA Polymerase（東洋紡株式会社）を用いて平滑化（Blunting）した。すなわち、10×KOD Buffer （東洋紡株式会社）５．０μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰ（東洋紡株式会社）５．０μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２．０μＬ、KOD DNA polymerase  （２．５Ｕ/ｍＬ）  ２．５μＬを、前項でＰＥＧ沈殿を行なったＤＮＡ断片溶解液に加え、超純水を加えて全量５０μＬにメスアップした。この溶液を７２℃で５分間反応させ、ＤＮＡ末端を平滑化した。
【００７９】
（３−５）Asc I-S/Asc I-AS アニーリングによるリンカーの作製
ベクタープラスミド（ｐ△BM d2EGFP-Asc I）をAsc Iで切断した時の末端１５塩基対と相同な２本鎖ＤＮＡを合成した。すなわち、ＡｓｃＩ-Ｓ鎖（5'-aagcagtggtatcaaggcgcgcc-3'：配列番号４）およびＡｓｃＩ−ＡＳ鎖（3'-ggcgcgccttgataccactgcttac-5'：配列番号５）の各１０ｐＭの溶液を１００μＬずつ混合し、これに５Ｍ  ＮａＣｌ  ４μＬを加え、９５℃、１０分間、熱変性した後、３０秒毎に０．５℃ずつ温度を低下させ、１２℃まで反応さることにより、リンカーＤＮＡ（ＡｓｃＩ−Ｓ／ＡｓｃＩ−ＡＳ  リンカーＤＮＡ）を作製した。
【００８０】
（３−６）リンカーライゲーション反応
前項にて作製したリンカーＤＮＡを、ヒトゲノム断片の末端にライゲーションした。すなわち、Bluntingを行ったヒトゲノム断片と作製したリンカーＤＮＡとを、ヒトゲノム断片：リンカーＤＮＡのモル比が１:１０００で全量１００μＬになるように溶液を調製した。この溶液にLigation high（東洋紡株式会社）を５０μＬ加え、１６℃で１時間反応させた。その後、ＰＣＲ精製カラム（Roche High pure PCR cleanup micro kit）を用いて付属のプロトコル通りにＤＮＡ溶液を精製し、さらに、ＰＥＧ沈殿（終濃度１０％（ｗ/ｖ））を行うことで余分なリンカーＤＮＡを除去した。
【００８１】
（３−７）In-Fusion反応と大腸菌１次ゲノムライブラリーの構築
リンカーＤＮＡを付加したヒトゲノム断片とＡｓｃＩで切断した直鎖状ベクターｐ△BM d2EGFP-Asc IをIn-Fusion（登録商標） HD Cloning Kit（タカラバイオ株式会社）を用いて連結した（図４を参照のこと。）。その後、In-Fusion反応液で大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセルを形質転換し、Ampicillin sodium salt（ナカライテスク株式会社）１００μg／ｍＬを含むＬＢ寒天培地上にまき広げて３７℃で一晩培養した。多数の異なる大きさのヒトゲノム断片を含む大腸菌コロニーから成る、大腸菌１次ゲノムライブラリーを得た。
【００８２】
（３−８）コロニーＰＣＲによるヒトゲノム領域の増幅
各ライブラリーで、コロニーごとの挿入ヒトゲノム断片の鎖長を確認するため、ヒトゲノム断片が挿入された領域がＰＣＲで増幅されるように、ヒトゲノム断片にライゲーションしたリンカーＤＮＡの配列とアニールするようなプライマー（in-fusion ＡｓｃＩ−Ｓ：5'-aagcagtggtatcaagg-3'：配列番号６）を設計した。このプライマーと Blend Taq（登録商標） -Plus-（東洋紡株式会社）を使用して、各大腸菌１次ライブラリーについてコロニーＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液１０μＬは１×Blend Taq（登録商標） Buffer（東洋紡株式会社）、２００μＭ ｄＮＴＰｓ（東洋紡株式会社）、０．２５units Blend Taq（登録商標） -Plus-（東洋紡株式会社）、２ｐＭプライマーを含む。大腸菌コロニーのピックには２００μＬ  ピペットチップ（WATSON社）を用いた。チップの先端部でシングルコロニーをピックアップし、ＰＣＲ反応液に浸すことで、菌体内で複製されたプラスミドを反応液内に溶かし出し、ＰＣＲの鋳型とした。ＰＣＲ反応条件は、変性を９４℃、３０秒間、アニーリングを５９℃、３０秒間、伸長を７２℃、２分間とし、３５サイクル行った。反応産物は、１．０％アガロースゲルで１００Ｖ、３０分間、アガロースゲル電気泳動することで解析した。
【００８３】
（３−９）ライブラリープラスミドの回収
１０ｃｍ dishのＬＢ寒天培地上の大腸菌コロニーに、プレート１枚あたりＬＢ液体培地を１０ｍＬ加え、コンラージ棒を使用して掻き取り、PureLinkＴＭ Hipure Plasmid Midiprep Kit（Invitrogen社）を用いて付属のプロトコルに従いプラスミドＤＮＡを精製した。その後、大腸菌プレート３枚から精製したプラスミドＤＮＡあたり、ＴＥ  １００μＬに溶解した。
【００８４】
（４）哺乳動物細胞の形質転換
全ての形質転換には、Lipofectamine（登録商標） 2000 （Invitrogen社）を用いて、リポフェクション法により行った。初めに、対数増殖期にあるＣＨＯ  ＤＧ４４細胞（４．０×１０５ cells／ｍＬ、２ｍＬ）を、３ｃｍ  dish（住友ベークライト株式会社）に植え継ぎ、ＣＯ２インキュベーター内で１日培養した。次にＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Life Technologies社）２５０μＬに対し、導入するプラスミドＤＮＡ（４．０μg）を加え、ピペッティングにより混合して「ＤＮＡ希釈液」を調製した。１０．５μＬのLipofectamine（登録商標）2000と２６２．５μＬのＯｐｔｉ-ＭＥＭとを混ぜ、ピペッティングした後、５分間静置し、「Lipofectamine（登録商標）希釈液」を調製した。Lipofectamine（登録商標）希釈液  ２６０μＬをＤＮＡ希釈液に加え、ピペッティング操作でよく混合した後、２０分間静置した。この溶液を培養しておいた細胞に全量加え、４時間後に新鮮なＦ−１２培地（１０％（ｗ/ｖ）ＦＢＳを含む）と入れ替えた。さらに翌日（トランスフェクション１日後）、細胞を１０ｃｍ  dish（住友ベークライト株式会社）にスケールアップし、全量１０ｍＬとした。さらに、その翌日（トランスフェクション２日後）に Blasticidin S Hydrochloride（フナコシ株式会社）を終濃度１０μg/ｍＬで加え、形質転換された細胞を選択した。その後、細胞がコンフルエントになったら植え継ぎ、ブラストサイジンによる薬剤選択圧を終濃度１００μg/ｍＬに上げて培養した。増殖の程度を見ながら、培地を一部交換して培養を続け、約４週間培養することで安定した形質転換体を得た。
【００８５】
（５）大腸菌１次ゲノムライブラリーのスクリーニング
（５−１）FACS AriaによるＧＦＰ高発現細胞のソーティング
ＦＡＣＳ（Fluorescence activated Cell Sorter）は、一点に集められたレーザー光を、フローセル中を通過する細胞に照射し、そこから生じる散乱光と、蛍光を同時に測定する。加えて、その情報に基づき特定の細胞だけを、生きたまま分取することが可能である。
【００８６】
対数増殖期にある安定した形質転換細胞を細胞培養フラスコ（Orange Scientific社）で培養した。これらについて、FACS Aria（Becton, Dickinson and Company）を用いてＧＦＰ発現強度を解析し、発現上位０．１％〜２．０％の細胞を、接着細胞用マルチプレート96 F（住友ベークライト株式会社）に１ウェル当たり１〜１０個ずつソートした。９６ウェル プレートには、新鮮なＦ−１２倍地とＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を培養したConditioned Mediumとを７：３の割合で混合し、ブラストサイジンおよびペニシリンを１０μg/ｍＬになるように、各ウェルに１００μＬずつ前もって加えた。分取した細胞をＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で培養した。
【００８７】
（５−２）蛍光顕微鏡観察によるＧＦＰ高発現細胞の選別
９６ウェルプレートにソートした細胞を、培地が蒸発してしまわないようにＦ−１２培地（１０μg/ｍＬのブラストサイジンを含む）を加えて３〜４週間培養した。その後、蛍光顕微鏡を用いて各細胞コロニーのＧＦＰ発現を観察し、特に発現の強い細胞コロニーを２４ウェルプレートにスケールアップし、更に１週間程度培養した。再び蛍光顕微鏡で各細胞コロニーのＧＦＰ発現を観察し、発現の特に強い細胞については個別に細胞を回収し、比較的弱い細胞については１０ウェル程度の細胞をまとめて回収した。
【００８８】
（５−３）細胞からのＤＮＡ抽出
Dishから剥がした細胞を遠心分離（ＴＳローター、１０００ｒｐｍ、５分、室温、トミー精工LC06-SSｐ遠心機、以下同じ。）して沈殿とした後、上清を除き、回収したときの培地と等量のＰＢＳ（−）を加えて、遠心することによる遠心洗浄を２回繰り返した。細胞濃度が２×１０６ cells/ｍＬとなるようにlysis buffer（６５ｍＭ Tris HCl, ｐＨ８．８、１６．６ｍＭ ammonium sulfate、１ｍＭ mercaptoethanol、６．７ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ TritonX-100）を加え、Proteinase Kを終濃度０．０６ｍｇ/ｍＬとなるように加えた。ウォーターバスで５０℃、１時間以上加温し、その後、９４℃で１２分間加温して１．５ｍＬチューブに移し、１０，０００ｇ、３分間、室温で遠心分離を行い、上清を回収して４℃で保存した。
【００８９】
（６）２次ゲノムライブラリーの構築
前項で抽出した１次ゲノムライブラリー導入ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞のＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によりヒトゲノム断片を増幅した。この時プライマーとしてin-fusion ＡｓｃＩ−Ｓを使用した。ＰＣＲ反応条件は、変性を９４℃、３０秒間、アニーリングを５９℃、３０秒間、伸長を７２℃、２分間とし、３０サイクル行なった。ＰＣＲ産物と、ＡｓｃＩで切断した直鎖状ベクターｐ△BM d2EGFP-Asc IとをIn-Fusion反応で連結した。その後、In-Fusion反応液で大腸菌コンピテントセルＤＨ５αを形質転換し、大腸菌２次ゲノムライブラリーを構築した。そして、大腸菌１次ライブラリーと同じようにコロニーＰＣＲ法により挿入ヒトゲノム断片の鎖長と割合を計測した。
【００９０】
大腸菌１次ライブラリーと同じ手法で、大腸菌２次ライブラリーからプラスミドＤＮＡを回収し、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞へのトランスフェクションを行い、薬剤選択を経て安定した形質転換細胞を獲得した。
【００９１】
（７）フローサイトメーターによる解析
（７−１）細胞の調製
対数増殖期にある細胞培養液５ｍＬを１５ｍＬ容の遠心管に回収し、遠心して上清を除き、ＰＢＳ  ２ｍＬで懸濁した。測定を行うまで細胞懸濁液を氷中で保存し、測定直前に５ｍＬ容のポリスチレンチューブ付きセルストレーナー（Becton, Dickinson and Company）に通して細胞凝集塊を除いた。
【００９２】
（７−２）FACS Caliburを用いたＧＦＰ発現強度の計測
Becton Dickinson社のFACS Caliburを使用し、Cell Quest Pro Softwareを用いて細胞あたりの蛍光強度を測定した。細胞の大きさ（前方散乱光 forward scatter、ＦＳＣ）、内部構造（side scatter、ＳＳＣ）を測定し、この情報をもとに生細胞についてのみゲートをかけた。ゲートをかけた２０，０００の細胞集団について、ＧＦＰの蛍光強度を定量した。測定条件は下記の通り。
測定条件；
Detectors/Amps：
Parameter P1;Detector：FCS、Voltage：E00、AmpGain：1.50、Mode：Lin、
Parameter P2;Detector：SSC、Voltage：350、AmpGain：1.35、Mode：Lin、
Parameter P3;Detector：FL1、Voltage：600、AmpGain：1.00、Mode：Log。
【００９３】
（８）陽性２次ライブラリーを構成するプラスミドのクローン化
再現性良くＧＦＰ高発現を示すライブラリーのプラスミドＤＮＡで、大腸菌コンピテントセルＳＵＲＥ２株（Agilent Technologies社）を形質転換し、コロニーを形成させた。ＳＵＲＥ２はこれまで用いてきた大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに比べて、反復配列（Inverted Repeat）や、Ｚ−ＤＮＡなどの二次構造を作りやすい不安定な配列をもつＤＮＡのクローニングに適したコンピテントセルである。Tks Gflex（登録商標） DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社）を用いたコロニーＰＣＲ法により、各大腸菌コロニーのヒトゲノム断片の有無、及びその鎖長を確認した。ＰＣＲ反応液１０μＬは１×Tks Gflex（登録商標） DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社）、２× Gflex（登録商標） PCR Buffer（Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ plus)（タカラバイオ株式会社）、２ｐＭ Primer （in-fusion ＡｓｃＩ-Ｓ）を含む。ＰＣＲ反応条件は（３−８）の項で示した条件と同条件で行った。さらに、同じ鎖長のＰＣＲ産物を区別するために、４塩基認識制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（タカラバイオ株式会社）で３７℃、９０分間処理した後、電気泳動で解析することも行った。このようにして単離した大腸菌を、アンピシリン  １００μｇ/ｍＬを含むＬＢ液体培地５０ｍＬ、３７℃、１４０ｒｐｍの条件で１２時間、振盪培養を行った。大量培養した大腸菌はPureLinkＴＭ Hipure Plasmid Midiprep Kit（Invitrogen社）を用いて付属のプロトコルに従い精製を行った。精製したプラスミドはオートクレーブ・フィルター滅菌済みＴＥ  １００μＬに溶解し、４℃で保存した。
【００９４】
（９）ヒトゲノムＤＮＡの塩基配列決定
（９−１）ＤＮＡシークエンス反応
４種類の蛍光色素で標識されたｄｄＮＴＰを含むＤＮＡ合成系（Dye Terminator法）を利用して、標識されたＤＮＡフラグメントを内径５０μｍのキャピラリー管の中で電気泳動を行い、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン）それぞれの蛍光をＣＣＤカメラで検出し、塩基配列を読み取った。
【００９５】
シークエンス用試料の調製にはBigDye（登録商標） Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied biosystems社）を用いた。反応溶液は、BigDye（登録商標） Terminater mix １．０μＬ、５× Dilution Buffer ３．５μＬ、鋳型ＤＮＡ ２００ｎｇ、primer ３．２ｐｍｏｌ、脱イオン水で２０μＬにすることで調製された。シークエンス反応は、９６℃、１分間後、変性を９６℃、１０秒間、アニーリングを５０℃、５秒間、伸長を６０℃、４分間行った。シーケンス産物に、１２５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ５μＬおよび１００％（ｖ/ｖ）エタノール６０μＬを加えて混合し、室温に１５分間静置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、室温、２０分間）を行って、上清を除いた。得られた沈殿を７０％（ｖ/ｖ）エタノール１００μＬで遠心洗浄し（１０分間）、上清を除いた。得られた沈殿を風乾し、HiDiＴＭホルムアミド１０μＬを加えてピペッティングで溶解した。９５℃、２分間変性し、即座に氷中に移した。このようにして精製した試料を、ABI PRISM（登録商標） 310 Genetic Analyzer（Applied biosystems社）を用いて解析し、塩基配列を決定した。（３−８）の項で構築したPrimer in-fusion ＡｓｃＩ−Ｓでは、１種類のプライマーでヒトゲノム断片の両方からＤＮＡ伸長が起こるため、シークエンス解析には用いることができない。そこで、ゲノム挿入領域からそれぞれ５０ｂｐ程度離れた位置にプライマーを構築し、シークエンスに使用した。
【００９６】
ヒトゲノムを挿入していないp△BM d２EGFP Asc Ｉを鋳型としたＰＣＲでプライマーに、GFP Cter Asc1 PCR S（5'-acgatcgccctgcagggga-3'：配列番号７）およびAsc1 PCR AS（3'-aattcgaacacgcagatgcag-5'：配列番号８）を用いた場合には１３５ｂｐ、primer F BMd2E long（5'-tatgcagtgctgccataacc-3'：配列番号９）およびprimer R BMd2E long（3'-ggtgtccccggaagaaata-5'：配列番号１０）を用いた場合にには２６８ｂｐの断片が増幅される。従って、シークエンスで得られた配列を解析に用いる際には、これらの配列を除かなければならない。
【００９７】
（９−２）塩基配列解析
シーケンスにより読み取った挿入ヒトゲノム断片の塩基配列について、ヒト染色体上での位置を同定するためにＮＣＢＩのHomo sapiens (human) Nucleotide BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=OGP__9606__9558）を使用した。さらに、塩基配列の物理的特性を解析する目的には、次に示すウェブ上のツールを使用した。non-B DB Motif Search Tool (http://nonb.abcc.ncifcrf.gov/apps/nBMST/default/) は、塩基配列からB型DNA立体構造以外の構造、例えばクルシフォーム構造やヘアピン構造、Ｚ−ＤＮＡといった構造を取りやすい領域を検索するツールである。MARSCAN（http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/marscan）は、ＭＡＲ活性を示す領域に認められるモチーフ配列８ｂｐ（aataayaa）と１６ｂｐ（awwrtaannwwgnnnc：配列番号１１）とを、２００ｂｐの範囲内に持つ領域を検索するツールである。SIDD/ZDNA Analysis（http://benham.genomecenter.ucdavis.edu/sibz/）は、熱や塩によるストレスより誘導されるＤＮＡの不安定化、すなわちStress-induced Duplex Destabilization（ＳＩＤＤ）を起こしやすい領域を検索するツールである。
【００９８】
（１０）ＦＩＳＨ法
ＦＩＳＨ法は、ある塩基配列に特異的なＤＮＡもしくはＲＮＡプローブを、細胞内のＤＮＡもしくはＲＮＡにハイブリダイズさせた後、蛍光物質によりプローブを可視化させ、それを蛍光顕微鏡下で検出する方法である。この技術は、遺伝子マッピングや間期細胞における染色体分布など、幅広い分野で必須の手法となっている。本実施例では、様々な種類のプラスミドを導入した細胞について、プラスミド配列をＦＩＳＨ法により検出した。
【００９９】
（１０−１）分裂中期染色体標本（メタフェイズスプレット）の調製
各ライブラリー導入細胞の遺伝子増幅の度合いと、コントロールとして作製したヒトゲノム配列を含まないｐ△BM d2EGFP-Asc IをトランスフェクションしたＣＨＯ  ＤＧ４４細胞の遺伝子増幅の度合いを比較することを目的として染色体標本を調製した。
【０１００】
細胞の固定にはメタノール酢酸固定法を用いた。この方法は、アルコールによりタンパク質を変性させて固定する方法で、ギムザ染色、Ｇバンド染色、Ｒバンド染色のほか、ＦＩＳＨ法により染色体診断など染色体を観察するのに一般的によく用いられる。
【０１０１】
まず、対数増殖期にある細胞培養液５〜１０ｍＬを１５ｍＬ容の遠心管（住友ベークライト社製）に入れて遠心分離（ＴＳローター、１，０００ｒｐｍ、５分間、室温、トミー精工LC06-SSｐ遠心機、以下同じ。）を行った後、上清を２００μＬ程度残して取り除き、穏やかなタッピングにより完全に懸濁した。次に、３７℃に保温しておいた７５ｍＭ  ＫＣｌ溶液を１０ｍＬ加えた。この際、最初の１ｍＬは１滴加えるたびにタッピングを行いつつ徐々に加えた。これを３７℃で１０分間保温した後、４℃のカルノア固定液（メタノール（ナカライテクス）：酢酸（ナカライテクス）＝３：１）を３、４滴加え、穏やかに混合した。その後直ちに遠心分離を行い、上清を少量残して取り除いた。得られた沈殿を穏やかなタッピングにより完全に懸濁した後、４℃のメタノール酢酸溶液を１０ｍＬ加えた。この際、先程と同様に最初の１ｍＬは１滴ごとに攪拌しつつ加えた。これを氷中で２０分間静置した後、遠心分離を行った。同様の操作を、カルノア固定液を５ｍＬ、３ｍＬと繰り返して行い、最後にカルノア固定液１ｍＬを１滴ずつ攪拌しながら加えた。保存は短期間では氷中、長期では‐２０℃で行った。長期保存した場合、使用する際にカルノア固定液を交換した。
【０１０２】
スライドグラス（松浪硝子工業株式会社）への細胞固定は、以下の方法で行った。超純水で十分に湿らせたキムワイプ（日本製紙クレシア株式会社）でスライドグラスを拭き、薄い水の層を作った後、すぐにカルノア固定した細胞溶液５０μＬ程度を数滴滴下した。スライドグラスを十分に乾燥させた後、位相差での検鏡を行い細胞が適切な密度で広がっていることを確認した。細胞が固定されたスライドグラスは、作製から１週間以内にＦＩＳＨ法に用いられた。
【０１０３】
（１０−２）プローブの調製
ＤＩＧ（digoxigenen）標識プローブを、 BioPrime DNA Labeling System（Invitrogen社）を用いてランダムプライム法により行った。鋳型となるＤＮＡは、プラスミドを用いる場合は、制限酵素処理で直鎖状ＤＮＡとしたものを用いた。鋳型ＤＮＡ２００ｎｇに、２．５×Random Primers Solution（１２５ｍＭ Tris-HCl（pH 6.8）、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ2-mercaptoethanol、７５０μｇ/ｍＬoligodeoxyribonucleotide primers（random octamers）を２０μＬと、高純水を加えて４４μＬにした。熱湯で５分間処理した後、氷中で急冷し、ＤＮＡを変性させた。１０×DIG DNA Labeling Mixture (１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、０．６５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．３５ｍＭ DIG-dUTP（Roche社））を５μＬ加えて混合した後、Klenow Fragment（large fragment of DNA polymerase I、４０Ｕ/μＬ  invitrogen社製）を１μＬ加えてゆっくり混和させ、３７℃で１時間反応させた。反応後、氷中に移し、Stop buffer（１０ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を５μＬ加えて反応を停止させた。未反応ヌクレオチドの除去には、High pure PCR cleanup micro kit（Roche社）を付属のプロトコルに従い用いた。精製したプローブ溶液を本実施例において用いた。鋳型となるＤＮＡにはpSFV-V △BNを用いた。pSFV-V △BNは、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞に存在しないＤＮＡ配列であるブラストサイジン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、大腸菌複製開始領域を持つプラスミドであり、これをプローブとすることで導入したプラスミドに特異的にハイブリダイズする。
【０１０４】
（１０−３）ハイブリダイゼーション
標本に、終濃度１００μｇ/ｍＬのRNaseA（シグマ‐アルドリッチ社）を含む２×ＳＳＣ溶液を８０μＬ滴下し、その上にカバーグラス（松浪硝子工業株式会社）を被せ、モイストチャンバー内で３７℃、３０分間処理した。処理後、カバーグラスを除き、２×ＳＳＣで洗浄した。次に７０、８０、９０、１００％（ｖ/ｖ）エタノール中でそれぞれ３分間ずつ順に脱水処理を行った。十分に乾燥させ、５〜１０分間ヒートブロック（DRI-BLOCK DB-3L、エムエス機器株式会社）上で７０℃まで温めた後、７０％（ｖ/ｖ）ホルムアミド（シグマ‐アルドリッチ社）を含む２×ＳＳＣ溶液中で７２℃、２分間処理し、ＤＮＡを変性させた。変性の後、すぐに‐２０℃であらかじめ保冷しておいた７０、８０、９０、１００％（ｖ/ｖ）エタノール中で、それぞれ３分間ずつ順に脱水処理を行った。スライドグラス１枚分のハイブリダイゼーション溶液は以下の手順で調製した。ＦＩＳＨ用プローブ２０ｎｇに、１０ｎｇ/ｍＬ Salmon Sperm DNA（GIBCO  BRL）を０．７μＬ、超純水を加え、２０μＬとした。さらに、１／１０量の３Ｍ  酢酸ナトリウムを加え、十分に混合した後、２．１倍量の１００％（ｖ/ｖ）エタノールを加えた。これを−８０℃で３０分間静置し、１４，０００ｒｐｍ、１５分間遠心してエタノール沈殿を行った。上清を除いて風乾後、超純水３μＬを加え、完全に溶解させ、６０％（ｖ/ｖ）ホルムアミド、１２％（ｗ/ｖ）Dextran Salfateを含む２×ＳＳＣ溶液を１２．５μＬ加えた。その後、７５℃で５分間処理してＤＮＡを変性させた。スライドグラスにハイブリダイゼーション溶液をそれぞれ１５μＬずつ滴下し、２２ｍｍ×４０ｍｍカバーグラス（松浪硝子工業株式会社）をのせた。パラフィルムをのせ、標本の乾燥を防ぐためにハイブリパック（コスモ・バイオ株式会社）に入れてポリシーラー（富士インパルス株式会社）で密封し、３７℃で一晩保温した。その後、カバーグラスをスライドグラスから慎重に取り除き、４５℃のウォーターバス（SM-05、タイテック株式会社）中で、５０％（ｖ/ｖ）ホルムアミドを含む２×ＳＳＣ溶液で３回、２×ＳＳＣで３回、３分間ずつ順に洗うことで、非特異的に結合しているプローブを除いた。
【０１０５】
（１０−４）プローブの検出
非特異的に結合しているプローブを除いた後、ブロッキング溶液（４％（ｗ/ｖ）Block Ace（大日本住友製薬株式会社）、０．１％（ｗ/ｖ）Tween20（シグマ‐アルドリッチ社）を含む２×ＳＳＣ溶液）１００μＬをスライドグラスに滴下して３７℃、３０分間処理し、シグナル検出のための抗体が非特異的に結合するのを防いだ。次に、一次抗体の終濃度が１０μｇ/ｍＬになるように調製した溶液（一次抗体、１％（ｗ/ｖ）Block Aceを含む１×ＰＢＳ（−）溶液）を９０μＬ滴下してパラフィルムを被せ、モイスチャーチャンバー内で３７℃、６０分間処理した。抗体を反応させた後、１×ＰＢＳ（−）、０．０５％（ｗ/ｖ）Ｔween20／１×ＰＢＳ（−）、１×ＰＢＳ（−）、１×ＰＢＳ（１）中で、それぞれ３分間ずつ順に洗浄し、非特異的に結合した一次抗体を除いた。ＤＩＧ標識したプローブの検出にFITC-conjugated Anti-DIG, Fab fragments（Roche社）を用いた。プローブの検出を行った後、蛍光褪色防止剤であるVECTASHIELD Mounting Medium（VECTOR Laboratories社）を用いて１μｇ/ｍＬに希釈したＰＩ（propidium iodide）を、スライドグラスに１５μＬ滴下し、ＤＮＡの染色を行った。２２×４０ｍｍカバーグラスを気泡が入らないように被せた後、４℃で遮光保存した。
【０１０６】
（１１）蛍光顕微鏡による観察
蛍光顕微鏡はECLIPSE TE2000-U（株式会社ニコン）を用い、６０倍の油浸対物レンズ（Nikon Plan Fluor, NA 1.40 oil）によりスライドを観察した。画像の撮影には、ＣＣＤカメラ(株式会社ニコン、DIGITALSIGHT DS-QilMc）を用い、画像の取り込みにはCamera Control Pro2（株式会社ニコン）を用いた。その後、Photoshop（登録商標） R CS（Adobe Systems Incorporated）により画像処理を行った。
【０１０７】
（１２）電気泳動
ＤＮＡサンプルを、１．０％（ｗ/ｖ）アガロースゲル、ＴＡＥ（Tris Acetate EDTA）緩衝溶液中で１００Ｖ、３０分間、室温で電気泳動することにより分画した。泳動槽にはMupid（登録商標） - 2X（株式会社アドバンス）、泳動マーカーには６×Loading Buffer（東洋紡株式会社）を用いた。電気泳動後、０．５μｇ/ｍＬ ethidium bromide（ＥｔＢｒ）溶液中で１５分間染色した後、紫外線を照射し、ＦＡＳＩＩ（東洋紡株式会社）により写真を撮影した。
【０１０８】
＜２．結果＞
（１）１次ゲノムライブラリーの構築
大腸菌ＤＨ５αを宿主とした大腸菌１次ゲノムライブラリー６種類（ライブラリーＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ）構築した。独立コロニーの総数は約２３０,０００個であり、コロニーＰＣＲによりインサートの有無を確認した結果、ヒトゲノム断片が挿入されたプラスミドの割合は約４５％で、インサートの平均鎖長はおよそ１．２７ｋｂｐであった。この結果から１次ゲノムライブラリー全体で１．３×１０７ｂｐのヒトゲノムを含むことになるため、ヒト全ゲノム３．０×１０９ｂｐのおよそ４．２％をカバーしていることが分かった。
【０１０９】
（２）１次ゲノムライブラリーのスクリーニング
ライブラリーＡのＤＮＡを導入したＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を、ブラストサイジン存在下で４週間培養することにより安定した形質転換体を選択した。これらについて、FACS Ariaを用いてＧＦＰ発現強度を解析し、ＧＦＰ強度で上位０．５％の細胞２，２８０個、および上位２．０％の細胞２，２８０個を、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１〜１０個の細胞が入るようにソートした。同様に、ライブラリーＢについても同様にした。また、ライブラリーＣ〜Ｆをそれぞれ導入したＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を混合した細胞集団より、ＧＦＰ強度上位０．１％の細胞１，８２４個、および上位０．３％の細胞２，０１６個を、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１〜１０個の細胞が入るようにソートした。ソートした細胞の入った９６ウェルプレートは、さらに３週間程度培養してから、さらに蛍光顕微鏡観察により、ＧＦＰ発現の高い細胞が増殖しているウェルを選別し、それらを２４ウェルへとスケールアップして１週間程度培養してから、６ウェルプレートにスケールアップした。また、ＧＦＰ発現は中程度であるが、コロニー全体がＧＦＰの発現を示している細胞については５〜６個のウェルからまとめて６ウェルプレートにスケールアップして培養した。
【０１１０】
その結果、ライブラリーＡより５種類、ライブラリーＢより８種類、ライブラリーＭｉｘ（Ｃ〜Ｆ）より１３種類、合計２６種類のＧＦＰ高発現細胞集団と、ＧＦＰが中程度に発現した細胞集団（「ＧＦＰ中程度発現細胞集団」）をミックスした４種類の集団を分離した。これらの細胞集団は、それぞれ形質転換で生じた大腸菌一次コロニー２３万個からなっていた。
【０１１１】
（３）２次ゲノムライブラリーの構築
上記で得られたＧＦＰ高発現細胞集団２６種類と、ＧＦＰ中程度発現細胞集団をミックスした細胞集団４種類から、ゲノムＤＮＡを抽出し、それを鋳型として、ＰＣＲ法によりベクターに挿入されていたヒトゲノム断片を増幅した。この際、５種類のＧＦＰ高発現細胞集団のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物からは、電気泳動でバンドが検出されなかった。これはヒトゲノム断片を持たないコントロールベクターが、遺伝子導入時に染色体上で活発に転写されるような領域の近くに組み込まれた結果生じた位置効果により、ＧＦＰの高発現を示した形質転換細胞がソートされたためだと考えられた。増幅バンドが検出されたＰＣＲ産物を、ベクターp△BM d2EGFP Asc ＩのＡｓｃＩサイトにIn-Fusion反応により連結し、大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換して、大腸菌を宿主とした２次ゲノムライブラリーを計２５種類構築した。それぞれのライブラリーのコロニー数は約１０，０００個程度であった。ランダムに選んだコロニーから、コロニーＰＣＲによりヒトゲノム断片を増殖させ、その平均鎖長を求めると１．７１ｋｂｐであった。１次ライブラリーの段階ではインサートの平均鎖長は１．２７ｋｂｐであり、これに比べて平均鎖長が長くなっていたことから、スクリーニングにより、発現に影響を与えない短い断片が除かれたことが考えられた。
【０１１２】
（４）２次ゲノムライブラリー導入細胞の評価
大腸菌２次ライブラリーのプラスミドＤＮＡでシングルウェルから回収したＧＦＰ高発現細胞集団２１種類、および複数ウェルの細胞を混合した細胞集団４種類、合計２５種類、および、コントロールとして用いたベクターＤＮＡ（ｐ△BM d2EGFP-Asc I）をＣＨＯ  ＤＧ４４細胞に導入し、ブラストサイジン存在下で４週間ほど培養して得られた安定形質転換細胞について、ＧＦＰ発現量をFACS Caliburを用いて測定した。
【０１１３】
その結果、ＧＦＰ発現がコントロールよりも高い細胞集団が６種類、同程度の細胞集団が１３種類、低い細胞集団が６種類であった。
【０１１４】
次に（３）で得られた各細胞集団から染色体標本を調製し、ＦＩＳＨ法によりプラスミド配列を検出して、プラスミド配列の増幅構造の形成頻度を間期の核内で評価した。その結果、各ライブラリーで遺伝子増幅構造の形成頻度（「遺伝子増幅頻度」ともいう。）に差が見られたことから、遺伝子増幅構造に影響を与えるヒトゲノム断片がライブラリーに含まれている可能性が示唆された。
【０１１５】
コントロールと比較したＧＦＰ発現の程度および遺伝子増幅頻度を基準にして、２次ライブラリーを９通りに分類した。ＧＦＰ発現と遺伝子増幅頻度がともに高まった細胞集団が３種類あった。この２次ライブラリーの中には遺伝子増幅を促進するようなヒトゲノム配列が存在する可能性が示唆された。また、遺伝子増幅頻度は変化しなかったが、ＧＦＰ発現が高まった細胞集団が２種類あった。この２次ライブラリーには、ヘテロクロマチン化によるサイレンシングを解除するようなヒトゲノム配列が含まれている可能性が期待された。
【０１１６】
（５）ＧＦＰ高発現２次ライブラリーの再現性
コントロールと比較してＧＦＰ発現が高まった６種類の２次ライブラリー（Library A9 E3、Library B-3、Library Mix9 G10、Library Mix6 C4、Library Mix9 D8、Library Mix7 F7）と、コントロールのベクター（ｐ△BM d2EGFP-Asc I）について、それらのＤＮＡを再度ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞へ導入し、約４週間ブラストサイジン存在下で培養して安定した形質転換体を獲得した。それらの細胞について、FACS Caliburを用いてＧＦＰ発現をコントロールと比較した。
【０１１７】
その結果、６種類のうち４種類（Library A9 E3、Library B-3、Library Mix9 G10、Library Mix6 C4）の２次ライブラリー導入細胞は、コントロールに比べ、発現が顕著に高かった。すなわち、これら４種類の２次ライブラリーでＧＦＰ発現が高いという結果の再現性が確認できた。これら４種類の２次ライブラリーを陽性２次ライブラリーと称する。
【０１１８】
（６）陽性２次ライブラリーを構成するヒトゲノム断片のクローン化
前項で同定された４種類の陽性２次ライブラリーＤＮＡを用いて、大腸菌コンピテントセルを形質転換した。この時、４種類の陽性２次ライブラリーのうち、２つ（Library A 9E3、Library Mix 6C4）についてはこれまでと同じ大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに形質転換を行った。残りの２つの陽性２次ライブラリー（Library mix9 G10、Library B-3）については大腸菌ＳＵＲＥ２のコンピテントセルに形質転換を行なった。これは、これまで用いてきた大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルでは逆位反復配列やＺ-ＤＮＡといった不安定なＤＮＡを含むプラスミドのクローニングには適しておらず、そのような配列の取りこぼしが起きていた可能性が考えられた。そこで、不安定な配列のクローニングに適した大腸菌ＳＵＲＥ２のコンピテントセルを用いてのクローニングを行った。
【０１１９】
大腸菌ＤＨ５αを形質転換した２つの陽性２次ライブラリー（Library A 9E3、Library Mix 6C4）については、これまでと同様にBlend Taq（登録商標） -Plus- DNA polymerase を使用して、シングルコロニーを鋳型としたコロニーＰＣＲにより挿入ヒトゲノム断片を増幅した。一方、大腸菌ＳＵＲＥ２を形質転換した２つのライブラリー（Library mix9 G10、Library B-3）は、Tks Gflex（登録商標） DNA Polymerase を使用して、シングルコロニーを鋳型としたコロニーＰＣＲにより挿入ヒトゲノム断片を増幅した。Tks Gflex（登録商標） DNA Polymeraseは、これまで用いてきたBlend Taq（登録商標） -Plus- DNA Polymeraseのような通常のＰＣＲ酵素では増幅が困難な、ＧＣ−リッチやＡＴ−リッチな領域を含む塩基配列に対するＰＣＲ増幅の成功率を向上させたＰＣＲ酵素であり、ＧＣ−リッチやＡＴ−リッチな領域を含む塩基配列の取りこぼしを減らすことが期待して、今回から用いた。
【０１２０】
上記のようにして得られたＰＣＲ産物を電気泳動にすることにより、増幅されたヒトゲノム断片のバンドを確認した。一方、同じ鎖長の塩基配列は電気泳動では区別することができないため、４塩基認識の制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを用いてＰＣＲ産物を消化し、電気泳動を行うことも行った。その結果得られた塩基の鎖長と、その全コロニーに占める割合を計測した。
【０１２１】
その結果、Library A9 E3から６種類の、Library Mix6 C4から２種類の、Library Mix9 G10から５種類の、LibraryB-3から８種類の、それぞれ異なるヒトゲノム断片を持つクローン化プラスミドＤＮＡが得られた。これらのプラスミドを持つ大腸菌を、それぞれ大量培養し、クローン化プラスミドＤＮＡを精製した。
【０１２２】
（７）クローン化ヒトゲノム断片導入細胞のＧＦＰ発現
前項で得られた、Library A9 E3由来の６種類のプラスミド、Library Mix6 C4由来の２種類のプラスミド、Library Mix9 G10由来の５種類のプラスミド、LibraryB-3由来の８種類のプラスミド、及びコントロールのベクター（ｐ△BM d2EGFP-Asc Ｉ）をそれぞれＣＨＯ  ＤＧ４４細胞へ導入し、約４週間ブラストサイジン存在下で培養して安定した形質転換体を獲得した。これらについてFACS Caliburを用いてＧＦＰの発現強度を解析し、コントロールと比較した。
【０１２３】
その結果を図５に示す。図５（ａ）および（ｂ）はLibraryB-3 3926 31 3.0 kbpが導入された細胞、およびコントロールのベクターが導入された細胞のそれぞれのＧＦＰ強度を示すヒストグラムを重ねて表示したものであり、図５（ａ）はLibraryB-3 3926 31 3.0 kbpが導入された細胞のＧＦＰ強度を示すヒストグラムを前面に表示した場合、図５（ｂ）はコントロールのベクターが導入された細胞のＧＦＰ強度を示すヒストグラムを前面に表示した場合である。図５（ａ）および（ｂ）において、コントロールのベクターが導入された細胞のＧＦＰ強度を示すヒストグラムよりも、LibraryB-3 3926 31 3.0 kbpが導入された細胞のＧＦＰ強度を示すヒストグラムの方が右側にシフトしていることから、LibraryB-3 3926 31 3.0 kbpが導入された細胞においてＧＦＰ強度が高い細胞数が増えていることが分かる。よって、LibraryB-3由来の３．０ｋｂｐのヒトゲノム断片を含むプラスミドＤＮＡ（LibraryB-3 3926 31 3.0 kbp）が導入された細胞は、コントロールのベクターが導入された細胞と比較してＧＦＰの発現量が高いことが分かった。
【０１２４】
同様な実験を独立してさらにもう２回行い、コントロールとのＧＦＰ強度の比較を行なった。その結果、LibraryB-3由来の３．０ｋｂｐのヒトゲノム断片を含むプラスミドＤＮＡ（LibraryB-3 3926 31 3.0 kbp）は、独立した計３回の実験で、再現性良くＧＦＰ発現量の増強効果が見られた（図５（ａ）〜（ｆ）を参照のこと）。図５（ｃ）および（ｄ）はLibraryB-3 3926 31 3.0 kbpが導入された細胞、およびコントロールのベクターが導入された細胞のそれぞれのＧＦＰ強度を測定した再現実験（１回目）の結果であり、図５（ｃ）は、LibraryB-3 3926 31 3.0 kbpが導入された細胞のＧＦＰ強度を示すヒストグラムを前面に表示した場合、図５（ｄ）はコントロールのベクターが導入された細胞のＧＦＰ強度を示すヒストグラムを前面に表示した場合である。図５（ｅ）および（ｆ）はLibraryB-3 3926 31 3.0 kbpが導入された細胞およびコントロールのベクターが導入された細胞のそれぞれのＧＦＰ強度を測定した再現実験（２回目）の結果であり、図５（ｅ）は、LibraryB-3 3926 31 3.0 kbpが導入された細胞のＧＦＰ強度を示すヒストグラムを前面に表示した場合、図５（ｆ）はコントロールのベクターが導入された細胞のＧＦＰ強度を示すヒストグラムを前面に表示した場合である。
【０１２５】
また、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞に代えてCOLO 320DM細胞を用いて上記と同様の実験を行ったところ、LibraryB-3 3926 31 3.0 kbpが導入された細胞の方がコントロールのベクターが導入された細胞よりもＧＦＰ強度が高かった。しかも、LibraryB-3 3926 31 3.0 kbpのＧＦＰ発現量の増強効果は、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を用いた場合よりも顕著であった(データは省略する。）。
【０１２６】
（８）LibraryB-3 3926 31 3.0 kbpを導入したＣＨＯ  ＤＧ４４細胞の遺伝子増幅
LibraryB-3 3926 31 3.0 kbpを導入したＣＨＯ  ＤＧ４４細胞の染色体標本を作製し、プラスミド配列をプローブとしたＦＩＳＨ法により、プラスミド配列の増幅構造を観察した。
【０１２７】
その結果、コントロールとの間で、遺伝子増幅構造の形成頻度に大きな差は見られなかった。このことから、LibraryB-3 3926 31 3.0 kbpは遺伝子増幅を促進する作用ではなく、増幅した遺伝子からの発現を増強する働きを持つことが示唆された。
【０１２８】
（９）ヒトゲノム断片（LibraryB-3 3926 31 3.0 kbp）の塩基配列
コントロールと比較して再現性良くＧＦＰ高発現が確認できたLibraryB-3 3926 31 3.0 kbp中のヒトゲノム由来の塩基配列をABI PRISM（登録商標）310 Genetic Analyzer（Applied biosystems社）を用いて決定した。その結果、両末端から約３００ｂｐの塩基配列が得られた。この配列を用いて、ヒト染色体上で相同性が高い領域を、ＮＣＢＩのHomo sapiens nucleotide BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)で検索したところ、ヒト２番染色体上の３，２７１ｂｐ（位置番号57,315,359 から 57,318,630）のＤＮＡであることが分かった（図１を参照のこと。）。この鎖長は、LibraryB-3 3926 31 3.0 kbpのアガロースゲル電気泳動での結果と良く一致していたことから、間違いないと判断した。
【０１２９】
この塩基配列についてウェブ上の遺伝子解析ツールnon-B DNA Motif Search Toolを利用して解析を行った。この塩基配列はＧＣ含量３２％、ＡＴ含量６８％と塩基配列の分布に偏りがあり、９つのInverted repeat、１つのMirror repeat、１つのG-Quadruplex forming repeat、１つのSINE elementを含んでいることが分かった。また、MARSCANを用いた解析では２，２７５ｂｐ〜２，２９３ｂｐの間にＭＡＲが存在することが示唆された。また、SIDD/ZDNA Analysisを用いた解析では１，５００ｂｐ付近と１,８００ｂｐ付近にStress-Induced Duplex Destabilizationを受けやすい不安定な領域が存在することが示唆された。また、染色体上で付近に遺伝子が存在するかを確認したところ、偽遺伝子が４０ｋｂｐ程度上流にあることが分かった。
【０１３０】
＜３．考察＞
（１）ＩＲ/ＭＡＲ遺伝子増幅法の増幅遺伝子の発現を増強させるヒトゲノム配列
本実施例で、ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法で増幅させた遺伝子からの発現を増強させるヒトゲノム配列をスクリーニングした結果、２次ライブラリーLibraryB-3 に含まれていたクローン3926-31の３．０ｋｂｐ断片が、所望の配列として単離された。このような発現増強効果は、３回の独立した実験で、再現性が得られた。この配列の存在により、ＩＲ/ＭＡＲプラスミドによる増幅構造の形成自体には変化がなかったことから、このヒトゲノム配列（「Ｂ−３−３１」）は、遺伝子増幅の過程には影響を与えず、増幅された遺伝子からの発現を高める配列であることが示唆された。
【０１３１】
このヒトゲノム断片の塩基配列を決定し、公開されているヒトゲノム配列に対してBLAST検索を行ったところ、ヒト２番染色体短腕バンド２Ｐ１６．１にある３，２７１ｂｐの塩基配列であることが判明した。この塩基配列は、全体としてＧＣ含量３２．２％、ＡＴ含量６７．８％と塩基配列の分布に大きな偏りがあった。ヒト２番染色体上で、ランダムに３，２００ｂｐの領域を５０箇所選択し、それぞれのＡＴ含量を計測した結果、Ｂ−３−３１の配列のＡＴ含量は最も高かった。このような高ＡＴ含量の領域は、３，２７１ｂｐの領域全体に及んでいたが、特に塩基番号１,４００〜１,８００の領域はＡＴ含量７６．０％と極めてＡＴ含量が高い領域であった。
【０１３２】
一方、このＢ−３−３１をnonB-DNA motif search toolで解析したところ、９つのInverted repeat （６〜８塩基のリピートで中央に０〜４塩基のスペーサーを含む。）、１つのG-Quadruplex forming repeat、１つのSINE elementを含んでいた。また、SIDD/ZDNA analysisで解析したところ、環境ストレスにより２本鎖構造が変性するStress-Induced Duplex Destabilization （ＳＩＤＤ）領域が１，５００ｂｐ周辺と、１，９００ｂｐ周辺に存在することが示唆された。さらに、MARSCANによる解析で、１つのMAR/SAR recognition siteが予測された。さらに、NCBI Map Viewerを用いて２番染色体上の遺伝子を持つ領域を検索し、染色体上のこの配列近傍に遺伝子が存在するか否かを検討した。その結果、この遺伝子は遺伝子の少ないサブバンドに局在していたため、タンパク質をコードしている遺伝子は周辺１Ｍｂ以内には存在せず、およそ４０ｋｂ上流に偽遺伝子が存在するのみであった。このことから、エンハンサーのように、何らかの遺伝子の近傍で働いている配列ではないことが示唆された。
【０１３３】
このようなＢ−３−３１の特徴を、代表的な（１）複製開始領域、（２）MAR配列、および、（３）プロモーター配列について、同じ解析ツールを用いて同様な検討を行い、相互に比較した。すなわち、（１）複製開始領域として、ＤＨＦＲ遺伝子座由来ＩＲ配列、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来ＩＲ配列、β-globin RepP由来ＩＲ配列、（２）ＭＡＲ配列として、Igκ遺伝子のイントロン由来の強力なＭＡＲを含むＡＲ１配列、および、（３）プロモーター配列として、ＥＦ１ａプロモーター配列について解析を行って比較検討した。その結果、本研究で得られたＢ−３−３１、（１）の複製開始領域３種、（２）のＭＡＲ配列１種について、SIDD siteとinverted repeatが隣接して存在する領域が共通して存在した。３つのＩＲ配列についてのこのような領域は、発明者によるMAR Finder programを用いた解析の結果、ＭＡＲ活性を持つ領域として予測された配列（ＤＨＦＲ遺伝子座由来ＩＲの１，９００〜２，８００ｂｐ、β-globin RepP由来ＩＲでは８００〜１，６００ｂｐ、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来ＩＲでは５００〜９００ｂｐ）と一致した。よって、Ｂ−３−３１に存在する、１，４００〜１，５００ｂｐの間と、１，８００〜１，９００ｂｐ間に存在するSIDD siteとinverted repeatとが隣接して存在する領域は、ＭＡＲ活性を示す可能性が示唆された。
【０１３４】
（２）スクリーニング方法
本実施例では、ヒトゲノムＤＮＡのスクリーニングにおいて、通常の大腸菌（ＤＨ５α）を宿主としたライブラリーの構築と、通常のＰＣＲ酵素（Blend taq（登録商標） -Plus-）によるヒトゲノム領域の増幅を行なった。大腸菌を用いたプラスミドＤＮＡのクローニングでは、Inverted RepeatやＺ−ＤＮＡなどの二次構造を作りやすい配列を含んでいる場合、大腸菌の修復システムにより組み換えられたり、削除されたりしてしまうことがある。また、ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅においても、ＡＴ−リッチやＧＣ−リッチな配列や、Inverted Repeatの増幅は困難である。一方、発現を促進するプロモーター配列やＭＡＲ配列にはＡＴ−リッチな領域や二次構造を作りやすい配列が含まれていることが多く、これらの配列を取りこぼしている可能性が考えられる。
【０１３５】
今回はスクリーニング実験の終盤にあたるシングルプラスミド単離の段階で、４つのライブラリーの内、３つについては大腸菌とＰＣＲ酵素とを変更して実験を行った。大腸菌はＤＨ５αのコンピテントセルから、ＳＵＲＥ２のコンピテントセルに変更した。ＳＵＲＥ２は不安定なＤＮＡのクローニングに適した大腸菌で、ＵＶ修復システムの遺伝子と、ＳＯＳ修復システムの遺伝子を削除することで長い反復配列を持つＤＮＡのクローニング効率を向上させている。ＰＣＲ酵素はBlend taq（登録商標） -Plus- DNA PolymeraseからTks Gflex（登録商標） DNA Polymeraseに変更した。Tks Gflex（登録商標） DNA PolymeraseはＧＣ−リッチやＡＴ−リッチなどの通常のＰＣＲ酵素では増幅が困難な鋳型からの増幅も成功率が著しく向上したＰＣＲ酵素である。本実施例では、大腸菌とＰＣＲ酵素とを変更して行われたスクリーニングによって、所望の活性を有するＢ−３−３１を見出すことに成功した。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
上記説示したように、本発明によれば、ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法によって形成される目的遺伝子の反復配列に起因する遺伝子発現抑制の問題点を解決することができ、所望のタンパク質を高発現させることが可能となるという効果を奏する。それゆえ、本発明によれば、所望のタンパク質（例えば、有用タンパク質）を大量に生産することが可能になるという効果を奏する。
【０１３７】
したがって、本発明はタンパク質の生産を行う産業、例えば、医薬品、化学、食品、化粧品、繊維等種々広範な産業において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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