(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボツリヌス神経毒と、キトサンおよびナドロパリンからなる群から選択されるムコ多糖と、生理学的に許容できる賦形剤とを含んでなり、前記ボツリヌス神経毒と前記ムコ多糖の重量比が約１：１０３〜約１：１０９であり、前記キトサンが、約８５％〜約１００％の脱アセチル度を有するものであり、心不整脈または動脈性高血圧の予防および／または治療に用いるための、組成物。
【請求項２】
前記ムコ多糖がキトサンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記キトサンが、約１００ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａの平均分子量（Ｍｗ）を有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ボツリヌス神経毒とムコ多糖の重量比が、約１：１０６〜約１：１０８である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ボツリヌス神経毒とムコ多糖の重量比が、約１：１．５×１０７〜約１：５×１０７である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ボツリヌス神経毒が、Ａ型ボツリヌス神経毒である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
以下の成分：
Ａ型ボツリヌス毒素  １〜２００Ｕ／ｍｌ、
ムコ多糖            ０．１〜５０ｍｇ／ｍｌ、
食塩水              ０．１〜５０ｍｌ
を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
約２０〜約２００ＵＩのボツリヌス毒素を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
薬剤として使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、医薬製剤である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、注射可能な製剤である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、クラスＩ、ＩＩまたはＩＩＩの少なくとも１つの抗不整脈性物質を更に含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
心房細動の予防または治療のための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
区画に分かれた形態で、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物を含む第１の区画または一連の区画と、注射用の注射器を備える第２の区画または一連の区画とを、使用説明書と共に備えてなる、心不整脈または動脈性高血圧の予防および／または治療に用いるための医薬キット。
【請求項１５】
区画に分かれた形態で、ボツリヌス毒素溶液を含む第１の区画または一連の区画と、キトサン粉末を含む第２の区画または一連の区画と、場合により、製剤調製のためのバイアルとを、使用説明書と共に備える、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物の調製のための医薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬に関し、即ち、臨床において、好ましくは心不整脈の治療のための心臓学において使用するためのボツリヌス神経毒を含む医薬組成物の調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、最も一般的に使用されているボツリヌス神経毒は、Ａ型ボツリヌス神経毒（Ａ型ボツリヌス毒素）である。この神経毒は、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）株の存在下で発酵中に生成される。
【０００３】
臨床において、ボトックス（Ｂｏｔｏｘ）、ディスポート（Ｄｙｓｐｏｒｔ）、ゼオミン（Ｘｅｏｍｉｎ）またはラントクス（Ｌａｎｔｏｘ）などのＡ型ボツリヌス毒素を基礎とする薬物はほとんど使用されていない。これらの薬物に関して、多くの国において多数の登録された治療用途があり、そして、現在開発中であり、かつまだ登録されていない治療用途がある（Ｓｈｅｎｇ  Ｃｈｅｎ、２０１２年、Ｔｏｘｉｎｓ、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ」、第４巻，９１３〜９３９ページ）。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により確認された用途としては、以下のものが挙げられる。眼科学において、斜視の治療；神経学において、眼瞼けいれん、片側顔面けいれん、痙性斜頸（頸部ジストニア）、慢性片頭痛（頭蓋内の痛み）、排尿筋過活動、成人および２歳以上の児童の局所性筋けいれん（これは脳性まひおよび痙縮を含む）、腋窩多汗症、唾液分泌過多の治療；美容薬において、顔のしわの除去；泌尿器学において、下部尿路機能障害の治療；胃腸病学において、胃腸系障害の治療；耳鼻咽喉学において、けいれん性発声障害の治療がある。
【０００４】
現在、Ａ型ボツリヌス毒素を基礎とする薬物の以下の用途が研究中である。歯科医学において、顎関節機能不全の治療；神経学において、慢性筋骨格痛の治療および糖尿病性神経障害；婦人科学において、腟痙の治療；外傷外科および一般外科において、創傷治癒の改善；心臓学において、心不整脈の治療がある。
【０００５】
心不整脈は、心イベントの広汎にわたる複雑な群である。この疾患の唯一の有効かつ合理的な外科治療は、高周波アブレーション（高周波数の電流を使用して心臓の催不整脈領域を焼灼すること）である。しかし、この方法は効果的が十分ではなく（６０％未満）、３０％を超えるケースにおいて、心嚢血腫、経食道ろう、アブレーション後（ｐｏｓｔ−ａｂｌａｔｉｏｎ）、心房粗動、横隔神経麻痺、壁在血栓などのような合併症の危険性が高い（Ｃａｍｍら、２０１０年、「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｔｒｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ」、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ、第３１巻、２３６９〜２４２９ページ）。
【０００６】
ボツリヌス神経毒を使用した心不整脈の治療に特化した最近の論文があるが、心房細動の抑制に対する効果は、１週間を超えては持続しなかった（Ｏｈら、２０１１年、「Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  Ａｕｔｏｎｏｍｉｃ  Ｇａｎｇｌｉａ  Ｔｅｍｐｏｒａｒｉｌｙ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  Ｖａｇａｌｌｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ」、Ａｔｒｉａｌ  Ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃ  Ａｒｒｈｙｔｈｍ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ、第４巻、５６０〜５６５ページ）。この効果の期間は、臨床診療においては許容可能でない。
【０００７】
現在、ボツリヌス毒素を基礎とする薬物の製造者は、毒素の貯蔵寿命および標的器官に対するその有効な送達を向上させるための種々のタンパク質、アミノ酸、多糖類およびその他の成分などの安定化剤の使用の開発に関与している。
【０００８】
種々の血清型のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧ型およびＳ型ボツリヌスから選択されるボツリヌス神経毒と、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジンもしくはポリオルニチンを含む群から選択されるポリアミン酸とを含む、医薬組成物が開発されてきた（ＲＵ２０１１１２５７７５Ａ号、ＷＯ２０１０／０７８４２号）。
【０００９】
ＬＤ５０（５０％致死量）が約５０〜２５０単位の生物活性を有する、６ｐｇ〜３０ｎｇの量のＡ型ボツリヌス毒素と、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコールから選択される、緩衝剤ｐＨ、賦形剤、希釈剤、凍結防止剤、および／または安定剤などの付加成分とを含む、その他の医薬組成物が開発されてきた（特許ＲＵ２４５３３３３Ｃ２、ＷＯ２００８／０００４９０）。
【００１０】
しかし、これらの既知の組成物は、持続性作用を有せず、また、ボツリヌス毒素の治療効果を増加させず、かつ心不整脈を治療することを意図するものではない。これらの製剤は、最適効果のための心臓の組織における曝露が不十分であり、体循環中へ活性成分を迅速に排泄する場合がある。
【００１１】
液体医薬組成物として、（ａ）溶液１ｍＬ当たりＬＤ５０が５０〜１０，０００単位の濃度であるボツリヌス神経毒素複合体（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ型）または高純度ボツリヌス神経毒（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ型）と、（ｂ）界面活性剤（ＳＡＳ）、好ましくは０．００５〜０．０２容積％の量のポリソルベート８０を含む安定化剤と、（ｃ）結晶化剤として、０．１５〜０．３Ｍの濃度の塩化ナトリウムと、（ｄ）１０〜２０ｍＭの濃度の二糖類、好ましくはスクロース、（ｄ）ｐＨ５．５〜７．５を維持するための緩衝剤、主としてヒスチジンと、水とを含むものも開発されている（ＲＵ２４０７５４１Ｃ２号、ＷＯ２００６／００５９１０号）。しかし、それらの既知の組成物は、心調律の障害を治療することを意図するものではなく、いかなる適応症もしくはいかなる持続作用の徴候も、または治療量および副作用の減少もなしに、ボツリヌス毒素に対する安定効果を誘発することが言われている。
【００１２】
したがって、持続的な効果をもたらし、かつ潜在的な副作用が限定され得るような、心不整脈、特に心房細動の治療の新規の戦略について重要なニーズがある。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、心不整脈を治療するために有用な、特に、治療効果が高く、効果が長く持続し、副作用が少ないボツリヌス神経毒の医薬組成物に関する。
【００１４】
出願人は、予想できないことだが、本発明の組成物が、Ａ型ボツリヌス毒素の薬理活性の増加、単回投与によって所望の治療効果が既に達成されること、ボツリヌス毒素効果の持続を達成しつつ、ボツリヌス毒素の副作用は減少することを見出した。更に、本発明の組成物は、所望の特性を有する組成物を調製して個別化医療のために直接臨床へ用いることを可能にし、そのまま導入することができる溶液中で維持する場合、長期間の活性を提示する。
【００１５】
本発明の第１態様は、ボツリヌス毒素、特にＡ型ボツリヌス毒素、および１：（１０３〜１０９）、好ましくは１：（１０６〜１０８）の重量比をとる、キトサンおよびナドロパリンからなる群から選択されるムコ多糖、および薬学的に許容できる賦形剤を含む組成物であり、また以下：
ボツリヌス毒素    １〜２００Ｕ／ｍｌ、
ムコ多糖    ０．１〜５０ｍｇ／ｍｌ、
食塩水    ０．１〜５０ｍｌ
含有する組成物を提供する。
【００１６】
本発明の第２態様は、薬剤として使用するための、本発明による医薬製剤に関する。
【００１７】
本発明の第３態様は、心不整脈、特に、心房細動または動脈性高血圧を予防および／または治療するための医薬品を製造するための本発明の組成物の使用に関する。
【００１８】
本発明の第４態様は、心不整脈、特に、心房細動または動脈性高血圧の予防および／または治療を必要とする被験者を、予防および／または治療する方法に関するものであり、このような方法は、本発明による医薬製剤を前記被験者に投与することを含む。
【００１９】
本発明の第５態様は、区画に分かれた形態で、本発明の組成物を含む第１の区画または一連の区画と、注射用の注射器を備える第２の区画または一連の区画とを、使用説明書と共に備える医薬キットに関する。
【００２０】
本発明の第６態様は、区画に分かれた形態で、ボツリヌス毒素溶液を含む第１の区画または一連の区画と、キトサン粉末と場合により製剤調製のためのバイアルを備えていてもよい第２の区画または一連の区画とを、使用説明書と共に備える、本発明の組成物の調製のための医薬キットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】ラットの大腿筋の電子刺激閾値（ボルトで測定される）の変化で表される、本発明の医薬組成物の効果を表し、これは、実施例９に記載されているように、市販製剤（Ｘｅｏｍｉｎ）と、ボツリヌス毒素および別のムコ多糖を含む比較製剤と比較されている。Ａ：製剤Ｎｏ．２（−キトサン）；Ｂ：製剤Ｎｏ．６（−ナドロパリン）；Ｃ：比較製剤Ｎｏ．１１（−ヒアルロン酸ナトリウム）；Ｄ：比較製剤Ｎｏ．４（−ヘパリン）；（−−−−−）Ｘｅｏｍｉｎ。
【図１Ｂ】図１Ａ参照。
【図１Ｃ】図１Ａ参照。
【図１Ｄ】図１Ａ参照。
【図２】ラットの大腿筋の電子刺激閾値（ボルトで測定される）の変化で表される、本発明の医薬組成物の効果およびその持続時間を表し、これは、実施例１１に記載されているように、ＲＵ２４０７５４１号特許の記載に基づく二糖類およびＡ型ボツリヌス毒素を含有する組成物と比較されている。
【図３】実施例１３に記載されているように、ラットの大腿筋の電子刺激閾値（ボルトで測定される）の変化で表される、異なる濃度のキトサンの２つの本発明の医薬組成物の効果と、市販組成物（Ｘｅｏｍｉｎ）の効果とを比較した効果を示す。（−−−Ｘｅｏｍｉｎ）、（−製剤Ｎｏ．１）、（・・・製剤Ｎｏ．２）。
【図４】実施例１２に記載されているように、右前ＧＰ（Ａ）、右下ＧＰ（Ｂ）および左上ＧＰ（Ｃ）を含有する心外膜脂肪塊への造影剤注射［Ｖｉｓｉｐａｑｕｅ（登録商標）（イオジキサノール）］の写真を示す。心膜腔（Ｄ）に穿刺したカテーテルの出力（Ｏｕｔｐｕｔ）針。
【図５】実施例１１に記載されているように、ＡＦを誘発したラットの大腿筋の電子刺激閾値（ボルトで測定される）の変化で測定されるような、刺激の閾値を示す。（・・・ベースライン）、（−−−Ｘｅｏｍｉｎ）、（−製剤Ｎｏ．２）。
【図６】４つの主要な心外膜脂肪塊の可視領域への本発明の組成物の投与の一例を示す。Ａ：第１心外膜左心房脂肪塊は、右上肺静脈（ＰＶ）の前に位置しており、右前神経叢（ＧＰ）に相当する；Ｂ：第２心外膜脂肪塊は、右下肺静脈の下後方に位置しており、右下ＧＰに相当する；Ｃ：第３脂肪塊は、左上ＰＶと左下ＰＶの前（ＰＶと左心耳（ＬＡＡ）との間）に位置しており、マーシャル靭帯ＧＰと左上ＧＰに相当する；Ｄ：第４脂肪塊は、左下ＰＶの下方に位置しており、後方に延在し、左下ＧＰに相当する。針先は、目で直接見て制御しながら、脂肪塊の心外膜面上の幾つかの位置に手動で配置され、最適な注射を確保する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
用語「ボツリヌス毒素」は、Ａ、Ｂ、Ｅ、ＦおよびＧ型から選択される任意の型のボツリヌス毒素を指す。ボツリヌス毒素（ＢＴＸ）は、神経筋接合部のシナプス前終末からのアセチルコリンの放出を阻害することによって作用する。異なるクロストリジウム・ボツリヌム株によって産生される、７つの異なる抗原性のボツリヌス毒素（ＢＴＸ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ）が、すでに記載されている。人間の神経系は、５つの毒素の血清型（ＢＴＸ−Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）に感受性があり、２つ（ＢＴＸ−Ｃ、Ｄ）によっては影響を受けない。ボツリヌス神経毒は、１５０ｋＤａの不活性なポリペプチドとして産生され、これは、トリプシン様細菌プロテアーゼにより切断されて、毒素の２本鎖活性型を生成する。１本鎖毒素と２本鎖毒素との比率は、毒素の血清型、および菌株が適切なプロテアーゼを発現するか否かに依存する。１００ｋＤａの重（Ｈ）鎖と５０ｋｄの軽（Ｌ）鎖は、熱に弱いジスルフィド結合および非共有結合力によって、互いに結合している。Ｈ鎖とＬ鎖は、熱および沸騰によって解離し、毒素を不活性化するが、それは、神経毒がＨ鎖およびＬ鎖両方を必要とするからである。
【００２３】
用語「Ａ型ボツリヌス毒素」は、例えば、ＢＯＴＯＸ（登録商標）、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）、Ｋｓｅｏｍｉｎ（登録商標）、Ｌａｎｔｏｋｓ（登録商標）などの、本発明で使用可能なＡ型ボツリヌス毒素を基礎とする全ての市販の製品を指す。
【００２４】
通常、ボツリヌス毒素血清型Ａは、約１５０ｋＤａの分子量を有し、ジスルフィド架橋によって結合される重鎖および軽鎖からなる２本鎖ポリペプチドの形態のタンパク質である。ヒトでは、重鎖によって、シナプス前コリン作動性神経終末との固定および毒素の細胞取り込みが生じる。軽鎖は、毒性作用の原因であると考えられており、亜鉛エンドペプチダーゼとして作用し、膜融合の原因となる特異タンパク質を分割する。ボツリヌス毒素は、細胞内の膜融合の過程を破壊して、シナプス間隙のアセチルコリンの放出を阻む。神経筋伝達におけるボツリヌス毒素の最大効果により、神経筋伝達が遮断され、事実、筋肉の神経が麻痺する。ボツリヌス毒素はまた、他の末梢のコリン作動性シナプスにおいて活性を有し、唾液量および発汗の減少を引き起こす。ボツリヌス毒素血清型Ａは、米国特許第７，１８９，５４１号（ボツリヌス毒素製造方法）、米国特許第６，８１８，４０９号（クロストリジウム・ボツリヌム毒素の単離および精製）に記載されているように細菌クロストリジウム・ボツリナムの培養からの精製および単離によって得ることができ、または米国特許第６，９６７，０８８号（可溶性組換えボツリヌス毒素タンパク質）に記載されているように、組み換え技術によって産生されてもよい。
【００２５】
用語「キトサン」は、キチンの部分的なアルカリＮ−脱アセチル化から実質的なアルカリＮ−脱アセチル化によって得られるキチン誘導体として、ポリ（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）とも呼ばれ、例えば、Ｋｕｍａｒ、２０００年、「ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」、第４６（１）巻、１〜２７ページ、およびＹｏｇｅｓｈｋｕｍａｒ、２０１３年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第４（１）巻、３１２〜３３１ページ、Ｄａｖｉｓら、１９８４年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第１３０（８）巻、２０９５〜１０２ページに記載されているように、パンダラス・ボレアリス（Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）および真菌の細胞壁を含む、エビ、カニおよびその他の海洋甲殻類などの甲殻類の殻から抽出することができる、天然に存在するバイオポリマーであるものを指す。
【００２６】
キトサンは、天然材料としてこの分野で広く調査されてきたが、それは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分であるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に類似したその構造のゆえである。キトサンは、キチン質の部分脱アセチル化誘導体であり、直鎖多糖類であり、β（１−４）グリコシド結合によって結合したグルコサミンとＮ−アセチルグルコサミン単位で構成される。この構造により、キトサンは、血管内膜のポリマー内壁に類似しており、ヒト組織との完全な生体適合性を有し、低毒性であることを特徴とする（Ｃｈａｏ  Ｄｅｎｇら、２０１０年、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．、第２９７巻、１３８〜１４６ページ）。
【００２７】
特定の実施形態によれば、本発明のキトサンは、カニ穀由来であり、機械的粉砕および脱アセチル化工程の後、得られる。
【００２８】
別の特定の実施形態によれば、本発明のキトサンは、約８５％〜約１００％の脱アセチル化度を有する。
【００２９】
別の特定の実施形態によれば、本発明のキトサンは、約１００ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａの平均分子量（Ｍｗ）を有する。
【００３０】
用語「ヘパリン」は、抗凝固直接作用を有し、かつボツリヌス毒素の分子量と同等の分子量を有する、ムコ多糖を指す。これは、粉砕されたウシ肺から抽出することができ、またはＬｉｎｈａｒｄｔら、２０１２年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第１２（２）巻、２１７〜２１９ページに記載されているように、組み換え技術によって産生することができる。
【００３１】
用語「ナドロパリン」は、抗凝固直接作用を有するムコ多糖を指し、分子量が１桁以上かつボツリヌス毒素の桁未満である低分子ヘパリンである。これは、哺乳類の組織から単離することができ（米国特許第２，８８４，３５８号）、またはＤ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基が交互に並ぶポリマーとして、ＵＤＰ−糖前駆体から合成する（危険物質データバンク（ＨＳＤＢＲ））ことができる。
【００３２】
組成物
本発明は、被験者、詳細には哺乳類被験者、より詳細には、心不整脈、特に心房細動に、または心不整脈、特に心房細動を生じるリスクを有するヒト患者を治療するための医薬品組成物および方法を提供する。
【００３３】
特定の実施形態では、本発明は、薬剤として使用するための本発明の医薬品組成物を提供する。
【００３４】
本発明による医薬組成物は、安定剤、抗菌剤、緩衝剤、染色剤、補助剤などのような１つ以上の薬学的に許容できる付加成分（類）を更に含んでもよい。
【００３５】
本発明による組成物は、従来から用いられる補助剤、担体、希釈剤または賦形剤と共に、医薬品組成物の形態およびこれらの単位用量の内に置かれてもよく、インプラントもしくは充填カプセルなどの固体、または溶液、懸濁液、エマルション、エリキシル剤などの液体、もしくはそれらを充填したカプセルなどの形態で、滅菌注射剤の形態で、注射または持続注入による非経口（皮下を含む）使用のために、用いられてもよい。通常、注射用組成物は、注射可能な滅菌食塩水、またはリン酸緩衝食塩水、または当該技術分野において既知のその他の注射可能な担体を基礎とする。このような医薬品組成物およびその単位用量形態は、付加活性化合物または原理の有無にかかわらず、従来の比率の成分を含んでもよく、このような単位用量形態は、用いられる意図された用量範囲に応じた、活性成分の任意の好適な有効量を含有してもよい。特定の実施形態によれば、本発明による組成物は、注射可能である。
【００３６】
更なる材料ならびに製剤加工技術などは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ著「Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」のパート５、第２２版、２０１２年、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａおよびＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ刊、に提示されており、その内容は本明細書に援用される。
【００３７】
１つの態様によれば、薬学的に許容できる賦形剤のために、食塩水（例えば、０．９％塩化ナトリウム）を使用することが好ましい。本発明の組成物は、場合によりｐＨ緩衝剤、賦形剤、希釈剤、凍結防止剤および／または安定剤などの付加成分を含んでもよい。
【００３８】
１つの態様によれば、本発明の組成物は、ボツリヌス神経毒、特にＡ型ボツリヌス毒素とムコ多糖との重量比が、約１：１．５×１０７〜約１：５×１０７、例えば、１：４．４×１０７である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物を含む。
【００３９】
別の態様によれば、本発明の組成物は、ボツリヌス神経毒、特にＡ型ボツリヌス毒素とムコ多糖との重量比が、約１：１．５×１０７〜約１：５×１０７、例えば、１：７６×１０７である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物を含む。
【００４０】
１つの態様によれば、本発明の組成物は、１回の注射手順のために、用量が約２０〜約２００ＵＩ（典型的には５０ＵＩ）のボツリヌス毒素、特に、Ａ型ボツリヌス毒素を含む。
【００４１】
別の態様によれば、本発明の組成物は、２，０００μＬの注射手順での投薬容積の形態である。
【００４２】
投与様式
本発明による組成物は、心房細動の治療の場合、特に心外膜領域へ（特に主要な心外膜脂肪塊の可視領域を含む）、任意の様式によって投与されてもよい。ある種の実施形態では、また、異なる投与経路の組み合わせを使用してもよい。注入血管内カテーテルによる心筋内投与、標的器官（心臓、腎臓）に供給する動脈への血管内注入などの方法を、本発明の組成物の投与のために使用することができる。
【００４３】
組成物の正確な用量は、薬物動態学的特性、患者の状態および特徴（性別、年齢、体重、健康、サイズ）、症状の範囲、併用療法、治療の頻度および所望の効果を含む、様々な要因に依存し、当業者によって容易に測定される。
【００４４】
１つの実施形態によれば、本発明の組成物は、冠動脈バイパス移植術の前または開始時に投与される。１つの実施形態によれば、手術の主要段階の後、本発明の組成物は、４つの主要な心外膜脂肪塊（図６に図示されるようなもの）の全ての可視領域内に注射される。
【００４５】
更なる実施形態によれば、本発明の組成物は、ボツリヌス毒素の用量が約５０Ｕ／１ｍＬになるように、少なくとも１つの心外膜脂肪塊に、好ましくはそれぞれの脂肪塊に、投与される。
【００４６】
組合せ
本発明によれば、本発明の医薬製剤を、単独で、または心不整脈、特に心房細動もしくは動脈性高血圧の予防および／もしくは治療に有用な助剤、例えば、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩクラスの抗不整脈性物質（例えば、プロカインアミド、アミオダロン（ａｍｉｄａｒｏｎ）、ソタロール）から選択される助剤などと組み合わせて、投与することができる。
【００４７】
本発明は、心不整脈、特に心房細動または動脈性高血圧の予防または治療において、他の治療／予防療法または助剤の前に、それらと同時にまたは連続的に（例えば、併用療法）、治療上有効量で、医薬製剤を個体へ投与することを包含する。前記助剤と同時に投与される医薬製剤は、同一のまたは異なった組成物（類）中に、同一のまたは異なる投与経路（単数または複数）によって、投与されてもよい。
【００４８】
患者
一実施形態では、本発明による患者は、心不整脈、特に心房細動および動脈性高血圧から選択される障害を患う患者である。
【００４９】
別の実施形態では、本発明による患者は、心不整脈、特に心房細動から選択される障害を患う危険性がある患者であり、例えば、術後期初期に心房細動の３０％の危険性と関連する、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）術、心臓弁手術または他の開心術を受けている患者である（Ｆｉｌａｒｄｏら、２００９年、Ｃｉｒｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｑｕａｌ．Ｏｕｔｃｏｍｅｓ、第２巻、１６４〜１６９ページ）。
【００５０】
特定の実施形態では、本発明による患者は、心不整脈を患う患者である。
【００５１】
別の特定の実施形態では、本発明による患者は、動脈性高血圧を患う患者である。
【００５２】
本発明による使用
本発明の一態様によれば、本明細書に記載された製剤または組合せを使用して、被験者の心不整脈、特に心房細動の減少を誘発するための方法が提供される。
【００５３】
本発明の別の態様に従って、本明細書に記載された製剤または組合せを使用することによる、レニンの放出および／または血圧の減少を誘発することを必要とする被験者において、レニンの放出および／または血圧の減少を誘発する方法が提供される。
【００５４】
本発明の製剤または組合せは、心不整脈および／または血圧の減少を誘発するために効果的である投与計画および量に従って、投与される。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、心不整脈、特に、心房細動または動脈性高血圧を予防するか、抑制するか、または治療する方法が提供され、前記方法は、本発明による医薬製剤の治療上の有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む。
【００５６】
別の態様によれば、本発明の製剤を、ボツリヌス毒素のみが使用される医学の異なる領域において、即ち、心拍障害治療のためのみ以外にも、使用することができるが、それは、本発明の製剤によって達成される主作用が、神経系のシナプス前終末からの神経メディエーターの放出を阻害し、人体上の他の領域において、これらのシナプス組成物間で、主要な組織学的および細胞学的違いがないからである。
【００５７】
１つの態様によれば、本発明の製剤は、心筋内ＧＰおよび心外膜脂肪塊内に投与される。
【００５８】
本発明の製剤の調製の方法
本発明の組成物を、所定の比率で成分の水溶液を混合することにより、調製することができる。
【００５９】
本発明の製剤の利点は、これを純粋Ａ型ボツリヌス毒素から、またはＡ型ボツリヌス毒素を基礎とする市販の製品から調製することができ、入手可能な成分から必要な溶液を調製して直接臨床診療に用いることを可能にすることである。
【００６０】
本発明の製剤は、Ａ型ボツリヌス毒素の効果の増大を達成することを可能にしながら、身的な効果の副作用を減少させ、免疫抵抗性を生じさせる（本発明の物質はムコ多糖類を使用して、分子の機械的保護を生成し、標的位置からのボツリヌス毒素分子の分布を遅延させる）。キトサンの分子は中性で、ボツリヌス毒素の免疫反応の中心を機械的に包含する（Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｂｏｗｍａｎら、２００６年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１（２）巻、１１７〜１２８ページ）。
【００６１】
本発明のボツリヌス毒素組成物の利点は、必要な治療用量を減少させることを可能にしつつ、薬物効果の持続期間を増加させ、ならびに、使っていない筋肉の望ましくない除神経および全身効果の発現のような副作用を減少させることである。
【００６２】
付加的利点は、適用の標的に基づいて、市販の製品から直接臨床においてそれを調製し、必要な特性を微調整することができる可能性である。心房細動の治療は、組成物の心外膜投与を必要とし、キトサンの優先特性は、ボツリヌス毒素の持続放出である（Ａ型ボツリヌス毒素とキトサンの重量比は、１〜４．４×１０７である）。動脈性高血圧の治療は、組成物の腎動脈内注入を必要とし、キトサンの優先特性は、糸球体近接膜に対するボツリヌス毒素の接着性の増加である(Ａ型ボツリヌス毒素とキトサン重量比は、１〜４×１０５である）。
【００６３】
活性成分の比率（本発明のＡ型ボツリヌス毒素／ムコ多糖）が、重量比で１：１０９を超えて増加すると、治療的に許容可能な注射用製剤を調製することは困難である。例えば、Ａ型ボツリヌス毒素／キトサンの重量比１：１０９、およびボツリヌス毒素活性４０Ｕ（１ｎｇと同等である）で、キトサンの必要量は１グラムであり、これは、２％注射におけるキトサンの臨床的に関連性のある濃度について、５０ｍｌ量の注入量をもたらす。この量は、治療には過剰である。組成物中の活性成分の重量比（Ａ型ボツリヌス毒素／ムコ多糖）が１：１０３未満に減少すると、組成物の効率は、著しく低下し、Ａ型ボツリヌス毒素の従来の製剤の効率に近づく。別の実施形態では、区画に分かれた形態で、本発明の組成物を含む第１の区画または一連の区画、および注射用の注射器を備える第２の区画または一連の区画を、使用説明書と共に備える医薬キットが提供される。
【００６４】
本発明を示す実施例は、以下のより詳細な方法にて、図において提示される実施例を参照することによって、記載されるであろう。
【実施例】
【００６５】
以下の実施例により、本発明を説明する。
【００６６】
実施例１：Ａ型ボツリヌス毒素とキトサンを１対４．４×１０７の重量比で含有する医薬品組成物（Ｎｏ．１）の調製
Ａ型ボツリヌス毒素の溶液を調製するために、全ての実験において、Ａ型ボツリヌス毒素の市販製剤である、ＭＥＲＺ  ＰＨＡＲＭＡ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．，ＫＧａＡ（ドイツ）によって作製されたゼオミン（登録商標）（登録番号ＬＳＲ−００４７４６／０８）、補助剤、スクロースおよびヒト血清アルブミン、または（蘭州生物製品研究所（中国）によって作製されたラントクス（登録商標）（登録番号ＬＳＲ−００１５８７／０８）、補助剤、ゼラチン、デキストランおよびスクロースを使用した。
【００６７】
どちらの場合も、ボツリヌス毒素１００単位を含有するバイアルを使用した。それぞれのバイアル中に、滅菌食塩水１０００μＬを添加した。得られた溶液を、後述のように得られたキトサン溶液との混合に使用した。種々のキトサン溶液の調製のために、「Ｂｉｏａｖａｎｔａ」によって作製された薬物である「ｃｈｉｔｏｓｏｌ」（コルツォヴォ、ノボシビルスク地方、このキトサンの脱アセチル化度は少なくとも９０％、その平均分子量は約５００ｋＤａであり、カニ殻から調製される）を使用した。２．２％Ｃｈｉｔｏｓｏｌ溶液１００ｍｌを調製するために、シシン（ｓｉｃｃｉｎｅ）酸１．１ｇと塩化ナトリウム０．９ｇを、マイクロ波オーブン内において加熱下で、蒸留水１００ｍｌに溶解した。酸および塩が完全に溶解した後、Ｃｈｉｔｏｓｏｌ２．２ｇを少量ずつ導入してから、全ての添加物を完全に溶解させて混合し、パレットによって粉砕した。
【００６８】
マイクロ波オーブン内で、１時間、パルスモード（６００Ｗの能力で１／６時間）で、加熱を実施する。凝集物の形成をなくすために、溶液に、１０分間（キトサンを添加した後に）、超音波洗浄機で処理を実施した。
【００６９】
医薬品組成物を、ルアーロックチップのシステムを備えた１ｍｌ注射器内で、Ａ型ボツリヌス毒素溶液１００μＬ（Ａ型ボツリヌス毒素１０Ｕまたは０．２５ｎｇを含有する）と２．７５％キトサン溶液４００μＬ（１１ｍｇのキトサンを含有する）を混合することによって調製した。結果は、以下の成分を含む、液体医薬組成物であった。
Ａ型ボツリヌス毒素  ２０ＩＵ／ｍｌ（０．５ｎｇ／ｍｌ）
キトサン            ２２ｍｇ／ｍｌ
食塩水              ０．５ｍｌ
【００７０】
実施例２：Ａ型ボツリヌス毒素とキトサンを１対１．７６×１０７の重量比で含有する医薬品組成物（Ｎｏ．２）の調製
医薬品組成物を、２ｍｌ注射器中で混合することによって調製した。食塩水４００μＬ中のボツリヌス毒素１００単位の溶液を調製して、これを使用し（これは、Ａ型ボツリヌス毒素１００単位または２．５ｎｇを含有する）、２．７５％キトサン溶液１６００μＬ（キトサン４４ｍｇを含有する）と混合した。
【００７１】
結果は、以下の成分を含む、液体医薬組成物であった。
Ａ型ボツリヌス毒素  ５０ＩＵ／ｍｌ（１．２５ｎｇ／ｍｌ）
キトサン            ２２ｍｇ／ｍｌ
食塩水              最大２ｍｌ
【００７２】
実施例３：Ａ型ボツリヌス毒素とヘパリンを１対１．６×１０７の重量比で含有する医薬品組成物（Ｎｏ．３）の調製（比較製剤、本発明の製剤ではない）
５０００ＩＵ／ｍｌの濃度を有するヘパリン溶液（ロシア国クルガンのＳｙｎｔｈｅｓｉｓ社の生産、医薬品登録番号Ｐ  Ｎ０００１１６／０１）を使用した。ヘパリン１単位は、国際標準ヘパリン０．００７７ｍｇに等しい、即ち、１ｍｇは、１３０ＩＵを含有する（Ｐｅｒｓｈｙｎ  ＧＮ『Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ』モスクワ、Ｍｅｄｇｉｚ刊、１９６１年、ｓ．４０５ページ）。
【００７３】
Ａ型ボツリヌス毒素溶液１００μＬ、（Ａ型ボツリヌス毒素１０Ｕまたは０．２５ｎｇを含有する）、ヘパリン４ｍｇ（約５２０ＩＵ）を含有するヘパリン溶液１０４μＬ、および食塩水５００μＬを混合することによって、医薬品組成物を調製した。
医薬組成物は、以下のものを含む。
Ａ型ボツリヌス毒素  ２０ＩＵ／ｍｌ（０．５ｎｇ／ｍｌ）
ヘパリン            １０４０ＩＵ／ｍｌ（８ｍｇ／ｍｌ）
食塩水              ０．５ｍｌ
【００７４】
実施例４：Ａ型ボツリヌス毒素とヘパリンを１対５．３×１０６の重量比で含有する医薬品組成物（Ｎｏ．４）の調製（比較製剤、本発明の製剤ではない）
実施例３に類似して、医薬組成物を得るために、Ａ型ボツリヌス毒素溶液３００μＬ（Ａ型ボツリヌス毒素３０Ｕまたは０．７５ｎｇを含有する）、ヘパリン４ｍｇ（約５２０ＩＵ）を含有するヘパリン溶液１０４μＬ、および食塩水５００μＬを混合した。医薬組成物は、以下のものを含む。
Ａ型ボツリヌス毒素  ６０ＩＵ／ｍｌ（１．５ｎｇ／ｍｌ）
ヘパリン            １０４０ＩＵ／ｍｌ（８ｍｇ／ｍｌ）
食塩水              最大５００μＬ
【００７５】
実施例５：Ａ型ボツリヌス毒素とナドロパリンを１対８×１０６の重量比で含有する医薬品組成物（Ｎｏ．５）の調製
フラキシパリン（ナドロパリン）（Ｓａｎｏｆｉ  Ｗｉｎｔｈｒｏｐ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、フランス、登録番号Ｐ  Ｎ０１２４８６／０１）の溶液を、１ｍＬあたり９５００ＩＵの濃度で実験に使用した。低分子ヘパリンであるナドロパリンの作用の１単位（平均分子量は、４０００〜７０００Ｄａである）がヘパリン１単位、即ち、０．００７７ｍｇに等しいことを認めた。
【００７６】
医薬組成物の調製のために、Ａ型ボツリヌス毒素溶液１００μＬ（Ａ型ボツリヌス毒素１０単位または０．２５ｎｇを含有する）、ヘパリン２ｍｇ（約２６０ＩＵ）を含有するナドロパリン溶液２７μＬ、および食塩水最大５００μＬを混合した。医薬組成物は、以下のものを含む。
Ａ型ボツリヌス毒素  ２０ＩＵ／ｍｌ（０．５ｎｇ／ｍｌ）
ナドロパリン        ５２０ＩＵ／ｍＬ（４ｍｇ／ｍｌ）
食塩水              ０．５ｍｌ
【００７７】
実施例６：Ａ型ボツリヌス毒素とナドロパリンを１対２．６７×１０６の重量比で含有する医薬品組成物（Ｎｏ．６）の調製
医薬品組成物を調製するために、Ａ型ボツリヌス毒素溶液３００μＬ（Ａ型ボツリヌス毒素３０Ｕまたは０．７５ｎｇを含有する）、ナドロパリン２ｍｇ（約２６０ＩＵ）を含有するナドロパリン溶液２７μＬ、および食塩水５００μＬを混合した。医薬組成物は、以下のものを含む。
Ａ型ボツリヌス毒素  ６０ＩＵ／ｍｌ（１．５ｎｇ／ｍｌ）
ナドロパリン        ５２０ＩＵ／ｍＬ（４ｍｇ／ｍｌ）
食塩水              ０．５ｍｌ
【００７８】
実施例７：Ａ型ボツリヌス毒素とキトサンを１対２×１０８の重量比で含有する医薬品組成物（Ｎｏ．１０）の調製
実施例１に類似して、キトサン５％食塩水溶液を調製した。この溶液１０ｍｌを使用して、１００ＵのＡ型ボツリヌス毒素を溶解した（Ａ型ボツリヌス毒素の１００ｎｇまたは２．５単位およびキトサン５００ｍｇを含有する）。結果は、以下の成分を含む液体医薬組成物であった。
Ａ型ボツリヌス毒素  １０ＩＵ／ｍｌ（０．２５ｎｇ／ｍｌ）
キトサン            ５０ｍｇ／ｍｌ
食塩水              最大１０ｍｌ
【００７９】
実施例８：Ａ型ボツリヌス毒素とヒアルロン酸ナトリウムを含有する医薬品組成物の調製(比較実施例、本発明の実施例ではない）
医薬品組成物を、ルアーロックチップのシステムを備えた１ｍｌ注射器内で、Ａ型ボツリヌス毒素溶液１００μＬ（Ａ型ボツリヌス毒素２０Ｕまたは０．５ｎｇを含有する）、および１％ヒアルロン酸ナトリウム４００μＬ（ヒアルロン酸ナトリウム４ｍｇを含有する、シグマ・アルドリッチ  カテゴリー番号５３７４７）を混合することによって調製した。結果は、以下の成分を含む液体医薬組成物であった。
Ａ型ボツリヌス毒素        ２０Ｕ／ｍｌ（０．５ｎｇ／ｍｌ）
ヒアルロン酸ナトリウム    １０ｍｇ／ｍｌ
生理食塩水                ０．５ｍｌの体積にするのに必要な量
【００８０】
実施例９：得られた医薬品組成物の動物実験
本発明の医薬組成物（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．６）の有効性および安全性については、Ａ型ボツリヌス毒素の市販製剤の食塩水溶液と、Ａ型ボツリヌス毒素とキトサンとは別のムコ多糖、つまりヘパリンを含む医薬品組成物（Ｎｏ．３およびＮｏ．４）とを、単位で表される同一用量で比較して実施した。
【００８１】
この試験を、『Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ』の枠組みの範囲内で、動物の処理の法的および倫理的標準および地方倫理委員会の承認に従って、実施した。実験ごとに、１０匹の実験動物（ウィスター系ラット）の２つの群を使用した。それぞれの群について、０．９％塩化ナトリウム溶液（食塩水）で希釈したＡ型ボツリヌス毒素を右大腿に注射し、医薬品組成物（Ｎｏ．６）を左大腿に投与した。
麻酔：エーテル
注射量：各大腿に０．５ｍｌ。
投与の方法：筋肉内投与、３つの注入点（大腿の後ろ、中間、横方向の表面）に、それぞれ０．１６ｍｌ。
【００８２】
電気刺激に応答する大腿の筋肉の減少を評価することによって、製剤の比較を実施した。筋肉内電子刺激の閾値最低変化を、経時で比較した。電子刺激閾値の測定を、２つの滅菌済み鋼鉄微小電極およびＥＲＡ  ３００装置（Ｂｉｏｔｒｏｎｉｃ、米国）を使用して、筋肉内で実施した。これらの微小電極を、測定の期間中、一時的にマウス大腿の外側領域において、約４ｍｍの深さに、互いに１０ｍｍ離して筋肉内に挿入した。例えば、筋肉内電子刺激の最小閾値が、組成物Ｎｏ．１については４．０±０．２Ｖ、かつ対照については２．０±０．１２Ｖである場合、測定時の組成物Ｎｏ．１の生理学的効果は、ボツリヌス毒素の市販製剤と比較して、２倍に増加する。
【００８３】
注射前に、異なる群の実験動物において、全体的に活発な動作（ネズミかご内への移動）を観察した。
【００８４】
注射手順後の１日目の間に、動物は、薬物鎮静の残留現象にさらされた。
【００８５】
注射の１週間後、全てのラットにおいて、下肢の麻痺、しかし上肢による移動が観察された（ボツリヌス毒素が作用している臨床的証拠）。筋肉内電気刺激の最大閾値は、組成物について、以下の通りであった：Ｎｏ．１：４．０±０．１Ｖ（対照２．５±０．１Ｖ、初期値１．５±０．１Ｖ）、Ｎｏ．２：１０．０±０．４Ｖ（対照３．０±０．１Ｖ、初期値１．０±０．１Ｖ）。
【００８６】
注射の２週間後、全てのラットにおいて、当該下肢の不随、しかし上肢による移動が観察された。ラットは、体重が減少し、食餌および水の拒否を示した。筋肉内電気刺激の最大閾値は、組成物について、以下の通りであった：Ｎｏ．１：６．０±０．３Ｖ（対照２．５±０．２Ｖ）、Ｎｏ．２：１０．０±０．５Ｖ（対照２．３±０．１）。
【００８７】
注射の３週間後、全てのラットにおいて、当該下肢の不随、しかし上肢による移動が観察された。ラットの活動は、力強くなった。ラットは、盛んに飲み、普通に食べた。筋肉内電気刺激の最大閾値は、組成物について、以下の通りであった：Ｎｏ．１：４．０±０．１Ｖ（対照２．０±０．１Ｖ）、Ｎｏ．２：５．０±０．２Ｖ（対照１．８±０．１）。
【００８８】
注射後の４週後、ラットは客観的に活発であり、下肢の不随だけはまだ観察された。筋肉内電気刺激の最大閾値は、組成物について、以下の通りであった：Ｎｏ．１−４．０±０．２Ｖ（対照２．０±０．１２Ｖ）、Ｎｏ．２−５．０±０．３Ｖ（対照２．０±０．２）。
【００８９】
組成物Ｎｏ．３〜Ｎｏ．６に関して、最大効果は注射後の第１週間中に観察されず、第２週間中に見出されたが、対照との違いの絶対値は、キトサンの場合ほど大きくなかった。したがって、比較組成物Ｎｏ．３では、筋肉内電気刺激の最大閾値は、第２週間中に１．８±０．１Ｖ（対照２．３±０．１Ｖ、１．０±０．１初期値Ｖ）であり、組成物Ｎｏ．５では、２．２±０．１Ｖ（対照１．５±０．１Ｖ、初期値１．２±０．１Ｖ）、比較組成物Ｎｏ．１１では、１．５±０．１Ｖ（対照２．６±０．２Ｖ、初期値１±０．１Ｖ）であった。
【００９０】
おそらくヘパリンは、市販製剤と比較すると、Ａ型ボツリヌス毒素をしっかりと保持して、生物学的影響を予防するが、低分子ナドロパリンは、対照的に、ボツリヌス毒素の作用を高める。これは、本発明の製剤Ｎｏ．６と比較すると、比較製剤４の著しい効果の欠如によって更に支持される。
【００９１】
本発明の組成物を、実験動物の内臓器官の組織学的検査を通して、組織学的研究によって、潜在的毒性について評価した。肝臓、腎臓、脾臓、心臓、骨格筋および脳のホルマリン固定パラフィン包埋組織試料の顕微鏡分析をすると、病変の形態学的徴候は、見られなかった。したがって、試験用量（ｔｅｓｔｅｓ  ｄｏｓｅｓ）で、実験動物の組織および器官に対して、Ａ型ボツリヌス毒素および本発明の医薬品組成物の有害な影響はない、との結論を下した。
【００９２】
実施例１０：Ａ型ボツリヌス毒素を含有する医薬組成物を心外膜脂肪塊中へ注射することによって、心房細動の誘発を抑制することの調査
試験を、医薬組成物Ｎｏ．２を使用して１０匹のイヌ群に実施した。心外膜脂肪塊は、左心房の右中央神経叢を含有し、右側開胸術によって位置を定めた。
【００９３】
経験群（５匹のイヌ）において、２つの右脂肪塊のそれぞれの内へ、５０ＵのＡ型ボツリヌス毒素＋キトサンの溶液１ｍｌ（Ａ型ボツリヌス毒素１００単位、２ｍｌ、組成物Ｎｏ．２）を導入した。対照群（５匹のイヌ）において、２つの脂肪塊のそれぞれの中へ、（Ａ型ボツリヌス毒素の５０Ｕ溶液１ｍｌ＋０．９％塩化ナトリウム）（Ａ型ボツリヌス毒素１００単位、２ｍｌ）を導入した。
【００９４】
注射後の１、２、３および４週後に、頸部迷走神経刺激によって、およびそれによらずして、電子生理的効果を評価した。心房細動は、イヌの両方の群において、頸部迷走神経刺激を通して得られた。この効果は、両方の群において上記の用量および領域で、ボツリヌス毒素の試験溶液および対照溶液の投与によって阻害された。対照群において、迷走神経効果の阻害は、注射後８日目（観察期間）に消滅した。経験群において、迷走神経効果の阻害は、注射後３０日以上間持続した。したがって、頸部迷走神経刺激（左心房心外膜脂肪塊へのボツリヌス毒素注射によって誘発された心房細動）の一時的な抑制は、本発明の組成物Ｎｏ．２を使用して３０日を超えて（４回以上）延長された。
【００９５】
これらの結果は、Ａ型ボツリヌス毒素を使用して、本発明の医薬組成物は、毒素の薬理活性を増加させ、かつボツリヌス毒素の副作用を減少させ得るという所望の治療効果を得るのに必要な単回投与を減少させ得ることを示す。類似の結果が組成物Ｎｏ．６について得られた。比較製剤４および比較製剤１１は、この効果を達成することができなかった（図１）。
【００９６】
実施例１１：二糖類組成物と比較した、本発明の医薬組成物の効果
ボツリヌス毒素およびキトサン（Ｎｏ．２）を含む本発明の医薬組成物と、二糖類を含む登録市販組成物（比較製剤Ｎｏ．１１）との効果の有効性および持続時間の比較を、以下の通り実施した。比較製剤Ｎｏ．１１は、以下のａ）〜ｅ）を含有する。
ａ）Ａ型ボツリヌス神経毒、（２０Ｕ／ｍｌ（０．５ｎｇ／ｍｌ））
ｂ）安定化剤ポリソルベート８０（０．０２重量％）
ｃ）スクロース、濃度２０ｍＭ
ｄ）ｐＨを５．５〜７．５に維持するための緩衝剤ヒスチジン
ｅ）体積０．５ｍｌにするための生理食塩水（塩化ナトリウムの０．９％食塩水）。
【００９７】
注射後、ラット大腿の筋肉内電気刺激の閾値を、上記のように測定した。
群１−製剤Ｎｏ．２
群２−比較製剤Ｎｏ．１１
【００９８】
結果を図２に示す。筋肉内電気刺激の最大閾値は、それぞれ以下の通りである。群１（９．８±０．３Ｖ）対群２（２．６±０．１Ｖ）；初期値１．２±０．１Ｖ対１．０±０．１Ｖ。
２週後：群１：１０．０±０．４Ｖ対群２：２．５±０．１Ｖ。
４週後：群１：５．０±０．２Ｖ対群２：２．０±０．１Ｖ。
６週後：群１：３．３±０．２Ｖ；群２の刺激閾値は、初期値（１．５±０．１Ｖ）近くに減少した。
【００９９】
これらのデータは、キトサンおよびボツリヌス毒素を含む本発明の製剤が、ＲＵ２４０７５４１号特許に記載されているような二糖類およびボツリヌス毒素を含む登録された市販組成物よりも有効性が良好であり、持続時間が長いことを裏付けている。
【０１００】
実施例１２：キトサン＋Ａ型ボツリヌス毒素組成物Ｎｏ．１（１：１．７６×１０７）および市販製剤のボツリヌス毒素を使用した、心房細動誘発性の抑制の有効性および安全性
前の動物実験は、心外膜脂肪塊へのボツリヌス毒素注射が、心房細動（ＡＦ）誘発性を抑制することができることを示唆する。本試験の目的は、ＡＦを予防するために、キトサン＋Ａ型ボツリヌス毒素（１：１．７６×１０７）（本発明の製剤Ｎｏ．２）およびボツリヌス毒素の市販製剤を使用して、心外膜脂肪塊および心筋内左心房神経叢（ＧＰ）への心臓内ボツリヌス毒素注射の有効性および安全性を比較することであった。
【０１０１】
３０匹のイヌにおいて、経静脈カテーテルを、左心房に通した。迷走神経反射が高周波刺激（ＨＦＳ）によって引き起こされた部位は、磁気立体マッピング装置（ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｔｏｍｉｃ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）上でタグが付けられ、次に、注射のために指定される。ボツリヌス毒素の心筋内注射（それぞれ１０Ｕ／０．２ｍＬ）は、イヌ１匹当たり７部位で投与された。加えて、イヌ１匹当たり３回の注射が、右前、右下、および左上ＧＰを含有する心外膜脂肪塊に、また心臓内へのアプローチ（図４）によって、なされた（それぞれ５０Ｕ／１ｍＬ）。注入前に、次に２週ごとに、正確なカテーテル再留置、および以前に記録されたマップ上にしるしのついたＧＰ部位に対する刺激によってベースラインに対する全ての変化が回復するまで、ＨＦＳおよびＡＦ誘発性による迷走神経反射を評価した。３０匹のイヌのうちの１５匹に、キトサン＋Ａ型ボツリヌス毒素組成物（１：１．７６×１０７）を注射し、３０匹のイヌのうちのその他の１５匹に、ボツリヌス毒素（Ｘｅｏｍｉｎ、ドイツ）を注射した。
【０１０２】
手順後の２週目に、全てのイヌは、迷走神経反応の完全な除去を、そして、Ｘｅｏｍｉｎ群においては１４．７±１．５週間目で、キトサン＋ボツリヌス毒素群においては２０．１±１．８週間目で、ベースライン値に対する完全な回復を示した（ｐ＜０．０５、（図５））。ＡＦを誘発した刺激の閾値は、Ｘｅｏｍｉｎ群においてはベースライン時の４．９±０．６Ｖから２週目の１２．４±２．５Ｖに、キトサン＋ボツリヌス毒素群においてはベースライン時の５．６±１．２Ｖから２週目の１６．３±２．２Ｖに、結果的に増加した（ｐ＜０．０５）。手順関連の合併症は、生じなかった。
【０１０３】
これらのデータは、心臓内へのアプローチによる心筋内ＧＰおよび心外膜脂肪塊へのボツリヌス毒素注射が、実現可能かつ安全であり、心臓迷走神経反応の完全な消失および有意なＡＦ抑制を提供したことを示唆する。キトサン＋Ａ型ボツリヌス毒素組成物（１：１．７６×１０７）は、Ａ型ボツリヌス毒素（Ｘｅｏｍｉｎ、ドイツ）の市販製剤よりも効果的であり、持続時間が長い。
【０１０４】
実施例１３：キトサン＋Ａ型ボツリヌス毒素組成物（１：４．４×１０７）、組成物（１：１．７６×１０７）および市販製剤のボツリヌス毒素を使用した、動脈性高血圧抑制の有効性および安全性
前のインビトロ試験は、ラットの腎臓へのボツリヌス毒素注射が、能動的なレニン放出を抑制し、血圧の低下を生じさせることを示唆する（Ｍｅｎｄｅｚら、２０１３年、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第３０４巻、Ｆ４９８〜Ｆ５０４）。本試験の目的は、動脈性高血圧を予防するために、本発明の製剤、特に、キトサン＋Ａ型ボツリヌス毒素（本発明の製剤Ｎｏ．１、１：４．４×１０７）、キトサン＋Ａ型ボツリヌス毒素（本発明の製剤Ｎｏ．２、１：１．７６×１０７）、およびボツリヌス毒素の市販製剤（Ｘｅｏｍｉｎ、ドイツ）を使用して、腎動脈へのボツリヌス毒素注入の有効性および安全性を比較することであった。
【０１０５】
９匹のブタにおいて、結果として、経静脈カテーテルを左右の腎動脈へと通した。ボツリヌス毒素の腎臓内注入（５０Ｕ／１ｍＬ）を、それぞれのブタの腎臓に投与した（組成物Ｎｏ．１：３匹のブタ；組成物Ｎｏ．２：３匹のブタ；ボツリヌス毒素の市販製剤：３匹のブタ）。３匹のブタは、プラセボ群に含まれ、それぞれの腎動脈へ生理的食塩水（塩化ナトリウムの０．９％食塩水）１ｍｌが注入された。全てのプロトコルは、『実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）』と一致し、動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。手順後の１週目に、全ての腎臓を外植した。腎臓を、被膜剥離して、均質化した。得られた細胞を、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ、および５％ウシ胎児血清を含有する溶液中で、３７℃／５％ＣＯ２で、ポリ−Ｄ−リジンで被覆したプレート（０．１ｍｇ／ｍｌ）において保温した。２時間、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを含有する無血清溶液に培地を交換することによって、細胞の血清を枯渇させた。レニン放出を、１時間、フォルスコリン（１０μＭ）と３−イソブチル−１−メチルキサンチン（０．５ｍＭ）を用い、ｃＡＭＰの細胞内濃度を上昇させることによって刺激した。処理後、培地を遠心分離して、細胞残屑を除去した。上澄みを新しい管に収集し、処理するまで−２０℃で保存した。上澄み中の刺激されたレニン含量の分析を、試薬レニンＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）によって実施した。
【０１０６】
注入手順後の１週目の最後に、以下のレニン濃度（％）の平均値を、上澄み試料において測定した：本発明の製剤Ｎｏ．１（１：４．４×１０７）−２．８±０．５％；本発明の製剤Ｎｏ．２（１：１．７６×１０７）−１．５±０．２％；ボツリヌス毒素の市販製剤（Ｘｅｏｍｉｎ、ドイツ）−４．２±１．２％；プラセボ群（塩化ナトリウム０．９％の食塩水）−４．８±１．４％。手順関連の合併症は、生じなかった。
【０１０７】
これらのデータは、動脈性高血圧を予防するために、腎動脈へのボツリヌス毒素注入が、実現可能かつ安全であり、血圧の上昇の過程で鍵となる酵素であるレニンの放出の著しい減少を提供したことを示唆する。キトサン＋Ａ型ボツリヌス毒素組成物Ｎｏ．２（１：１．７６×１０７）は、キトサン＋Ａ型ボツリヌス毒素組成物Ｎｏ．１（１：４．４×１０７）およびＡ型ボツリヌス毒素の市販製剤（Ｘｅｏｍｉｎ、ドイツ）よりも効果的である。
【０１０８】
実施例１４：異なる毒素／キトサン重量比を有する、キトサンおよびボツリヌス毒素組成物の効果
キトサン＋ボツリヌス毒素の最適比を調査する一方で、注射部位に応じてボツリヌス毒素作用の効果を向上させる特性が、明らかにされた。より高含量のキトサンについては、組成物の持続放出機能が優先する。より高含量のキトサンは、脂肪組織への組成物の投与に適しており、治療的なボツリヌス毒素濃度に、徐放を通して達することができる。
【０１０９】
対照的に、組成物が腎動脈および心室筋のような標的領域へ投与されるときには、血液供給系との直接接触があり、治療濃度、およびボツリヌス毒素への暴露の増加を、急速に達成することを必要とする。この要件は、キトサンの量比を低下させることによって満たされ、そして、これにより、組成物の接着機能が優勢になることが生じる。
【０１１０】
図３に示されるように、キトサンの濃度が製剤中で増加するとき、即ち、キトサンに対するボツリヌス毒素の重量比が組成物中で小さくなると（１：１．７６×１０７（Ｎｏ．２）から１：４．４×１０７（Ｎｏ．１））、ボツリヌス毒素放出速度および特性もまた変化し、したがって、ある位置で目標とする有効性は変化する一方で、作用持続時間はわずかに変化する。それにもかかわらず、有効性は、ボツリヌス毒素の市販製剤の１つの２倍で維持される。
【０１１１】
心内膜心筋注入が実施されるとき、心外膜脂肪塊のボツリヌス毒素注入と比較して、ボツリヌス毒素はより希釈される。したがって、キトサン＋ボツリヌス毒素の心外膜注射は、別の濃度比を必要とし（１：４．４×１０７である傾向がある）、これによって、良好な有効性を得ることを可能にし、重篤な有害事象の危険性を減少させるのに対して、心内膜心筋注射は、１：１．７６×１０７である傾向があり、標的位置において、治療濃度を得ることを可能にする濃度比を必要とする。
【０１１２】
この事実は、１：４．４×１０７と１：１．７６×１０７との濃度比の有効性を、実施例１２（心筋内注射のみに用いる）に記載された手順に従って比較することにより、確認される。手順後の２週目に、全てのイヌは、迷走神経反応の完全な除去を示した。ＡＦを誘発した刺激の閾値は、１：４．４×１０７の濃度比群において、ベースライン時の５．１±０．８Ｖから２週目の８．３±３．１Ｖに、したがって、１：１．７６×１０７の濃度比群において、ベースライン時の４．９±１．１Ｖから１５．８±２．４Ｖに増加した（ｐ＜０．０５）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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